(57)【要約】  本出願は、誘発剤に応答して目的のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現する遺伝子構築物に関し、この構築物は、（ｉ）前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントを含み、このエレメントが、異なる方向で動作する２種類の肝臓特異的なプロモーターにはさまれた、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、（ｉｉ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードし、第１の肝臓特異的なプロモーターに作動可能に連結している第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結する第２のヌクレオチド配列とを含んでなり、前記誘発剤が存在する状態で、かつ前記オペレーター−プロモーターのオペレーター領域に前記転写活性化因子が結合すると、前記プロモーターが誘発される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘発剤に応答して、目的のポリヌクレオチドの肝臓特異的な誘発発現を可能にする遺伝子構築物であって、
（ｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と第２の肝臓特異的なプロモーター配列とにはさまれた、前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントを含み、両肝臓特異的なプロモーター配列が異なる方向に作動する、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、
（ｉｉ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードする配列と、この転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含み、転写活性化因子をコードする配列が、第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結している、第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結するポリヌクレオチドと、前記目的のポリヌクレオチドに対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含む、第２のヌクレオチド配列とを含んでなり、
前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤の存在下で、前記オペレーター−プロモーターのオペレーター領域に前記転写活性化因子が結合することで誘発されるものである、遺伝子構築物。
【請求項２】
前記誘発剤に応答性のエレメントが、少なくとも１つのテトラサイクリン応答性エレメントを含んでなり、かつ前記転写活性化因子が、逆テトラサイクリン転写活性化因子である、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
前記テトラサイクリン応答性エレメントが、配列番号１で特定されている核酸配列を含むものである、請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
前記逆テトラサイクリン転写活性化因子が、配列番号６の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２または３に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列と前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列が同じである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列および前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、アルブミン遺伝子プロモーターまたはその機能的に等価な改変体を含むものである、請求項５に記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
前記アルブミン遺伝子プロモーターが、配列番号２および配列番号３の群から選択される配列を含むものである、請求項６に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
前記誘発性両方向性オペレーター−プロモーターが、配列番号４を含でなるものである、請求項７に記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
前記ポリアデニル化シグナルの少なくとも１つが、両方向性ポリアデニル化シグナルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記ポリアデニル化シグナルが、ＳＶ４０ウイルス由来の両方向性ポリアデニル化シグナルである、請求項９に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
前記目的のポリヌクレオチドが、ＩＬ−１２またはその機能的に等価な改変体の重鎖および／または軽鎖をコードするものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
前記目的のポリヌクレオチドが、単鎖ＩＬ−１２をコードするものである、請求項１１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含んでなる、組み換えウイルスゲノム。
【請求項１５】
前記ゲノムが組み換えアデノ随伴ウイルス由来である、請求項１４に記載のウイルスゲノム。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のウイルスゲノムを適切なパッケージング細胞内で発現させることによって得ることができる、ビリオン。
【請求項１７】
肝臓由来の細胞内で目的のポリヌクレオチドを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、この方法が、
（ｉ）前記細胞と、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項１３に記載のベクター、または請求項１４または１５のいずれか一項に記載のウイルスゲノム、または請求項１５に記載のビリオンとを、前記構築物、前記ベクターまたは前記ビリオンが前記細胞に入り込むのに十分な条件下で接触した状態におく工程と、
（ｉｉ）前記細胞と誘発剤とを、前記目的のポリヌクレオチドの発現が起こるのに必要な時間、接触させる工程とを含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項１３に記載のベクター、または請求項１４または１５のいずれか一項に記載のウイルスゲノム、または請求項１６に記載のビリオンと、医薬的に許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
医薬として用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項１３に記載のベクター、または請求項１４または１５のいずれか一項に記載のウイルスゲノム、または請求項１６に記載のビリオン、または請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
肝疾患の治療に用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項１３に記載のベクター、または請求項１４または１５のいずれか一項に記載のウイルスゲノム、または請求項１６に記載のビリオン、または請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記目的のポリヌクレオチドがＩＬ−１２またはその機能的に等価な改変体をコードし、肝癌の治療に用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項１３に記載のベクター、または請求項１４または１５のいずれか一項に記載のウイルスゲノム、または請求項１６に記載のビリオン、または請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
誘発剤によって目的の２種類のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現させるのに適した誘発性両方向性オペレーター−プロモーターであって、
（ｉ）前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントと、
（ｉｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）第２の肝臓特異的なプロモーター配列とを含んでなり、
ここで、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、前記誘発剤に応答性のエレメントに対して異なる方向に動作し、
前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤の存在下で、かつ前記応答性エレメントに結合する転写活性化因子の存在下で高まるものである、誘発性両方向性オペレーター−プロモーター。
【請求項２３】
制御可能な両方向性オペレーター−プロモーター内にある前記誘発剤に応答性のエレメントが、少なくとも１つのテトラサイクリン応答性エレメントを含むものである、請求項２２に記載の誘発性両方向性オペレーター。
【請求項２４】
前記テトラサイクリン応答性エレメントが、配列番号１で特定される核酸配列を含むものである、請求項２３に記載の誘発性両方向性オペレーター。
【請求項２５】
前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列と前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列が同じである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の誘発性両方向性オペレーター。
【請求項２６】
前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列および前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、アルブミン遺伝子プロモーターまたはその機能的に等価な改変体を含むものである、請求項２５に記載の誘発性両方向性オペレーター。
【請求項２７】
前記アルブミン遺伝子プロモーターが、配列番号２および配列番号３の群から選択される配列を含むものである、請求項２６に記載の誘発性両方向性オペレーター。
【請求項２８】
前記誘発性両方向性オペレーター−プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号４を含むものである、請求項２７に記載の誘発性両方向性オペレーター。
【請求項２９】
誘発剤によって目的のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現するのに適した遺伝子構築物であって、
（ａ）
（ｉ）前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントと、
（ｉｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）第２の肝臓特異的なプロモーター配列とを含でなる、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、
（ｂ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードし、前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結しているヌクレオチド配列と、前記転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含んでなり、
ここで、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、前記誘発剤に応答性のエレメントに対して異なる方向に動作し、
前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤の存在下で、かつ前記誘発性両方向性オペレーター−プロモーター内の応答性エレメントに結合する転写活性化因子の存在下で高まるものである、遺伝子構築物。
【請求項３０】
前記制御可能な両方向性オペレーター−プロモーター内の前記誘発剤に応答性のエレメントが、少なくとも１つのテトラサイクリン応答性エレメントを含み、前記転写活性化因子が、前記テトラサイクリンによって活性化され得るものである、請求項２９に記載の遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記テトラサイクリン応答性エレメントが、配列番号１で特定される核酸配列を含むものである、請求項３０に記載の構築物。
【請求項３２】
前記逆テトラサイクリン誘発性転写活性化因子が、配列番号２の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３０または３１のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項３３】
前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列と前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列が同じである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項３４】
前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列および前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、アルブミン遺伝子プロモーターまたはその機能的に等価な改変体を含むものである、請求項３３に記載の遺伝子構築物。
【請求項３５】
前記アルブミン遺伝子プロモーターが、配列番号２および配列番号３の群から選択される配列を含むものである、請求項３４に記載の遺伝子構築物。
【請求項３６】
前記誘発性両方向性オペレーター−プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号４を含むものである、請求項３５に記載の遺伝子構築物。
【請求項３７】
前記ポリアデニル化シグナルが、両方向性ポリアデニル化シグナルである、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項３８】
前記ポリアデニル化シグナルが、ＳＶ４０ウイルス由来の両方向性ポリアデニル化シグナルである、請求項３７に記載の遺伝子構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御可能な発現系の分野に属し、より具体的には、場所的（所与の組織内）および一時的（誘発剤の添加に応答して）に制御可能な発現形態の分野に属する。また、本発明は、制御された肝臓特異的な発現を可能にする遺伝子構築物およびビリオンに関し、また、これらを肝疾患の治療に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓の機能としては、特に、炭水化物および脂質の代謝、サイトカインの分泌、インスリンおよび他のホルモンの放出、胆汁の産生などが挙げられる。さらに、多くの遺伝疾患、心疾患、代謝性疾患、出血性疾患、癌性疾患に影響を及ぼす因子が肝臓で作られる。肝細胞は、半減期が長く、血流と直接つながっており、治療薬剤が到達しやすい。これらの理由により、肝臓は、遺伝子治療の良好な候補であると考えられる。しかし、非肝臓組織で標的遺伝子が発現することに関連する副作用を防ぐために、肝臓で目的の遺伝子を特異的に発現させる系を利用することができれば都合がよい。
【０００３】
この目的のために、目的の遺伝子を肝臓特異的なプロモーターの制御下においた構築物が使用されており、プロモーターとして、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター（ＰＥＰＣＫ）、糖新生酵素（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、５：４１７’−４２４（２００３））、α−１−抗トリプシン、アルブミン、ＦＶＩＩ、有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ−Ｃ）、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質（Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７：３７５−３８５、２００３）、チロキシン結合グロブリン（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９６：３９０６−３９１０（１９９９））がある。しかし、この種の系は、目的の遺伝子を常に発現し続けるという点で不利であり、毒性や望ましくない影響を与えてしまう可能性が存在する。
【０００４】
目的の遺伝子を常に発現し続けてしまうことから生じる影響を防ぐために、所与の誘発剤が存在するときにのみ発現が起こる誘発系が開発されている。そのため、ミフェプリストン（ＲＵ−４８６）存在下で活性が誘発されるキメラ転写因子が存在する状態で一時的かつ空間的に制御可能な誘発発現系が知られている（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９７、１５：２３９−４３を参照）。この種の調節を、組織特異的なプロモーターを用いる任意の細胞種に適用してもよい。この系は、特異的であり、可逆的であり、毒性がない。しかし、基礎状態でも発現量が高く、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用が望まれる場合に、受容されないであろう。
【０００５】
Ｚａｂａｌａら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４、６４：２７９９−２８０４）は、テトラサイクリンによって誘発可能な発現系（ｔｅｔ−ｏｎ）の種々の形態を含むプラスミドベクターを記載しており、すべて、導入遺伝子（ルシフェラーゼまたはＩＬ−１２）をコードする配列を含み、この導入遺伝子は、オペレーター−プロモーター配列によって制御される転写ユニットから転写され、そしてこのオペレーター−プロモーター配列は、アルブミンプロモーター（Ｐａｌｂ）に結合したテトラサイクリンオペレーターの７コピー（ｔｅｔＯ７）で構成されている。また、この系は、肝臓特異的なプロモーター配列制御下で、逆転写活性化因子ｒｔＴＡをコードする配列（ｒｔＴＡ２ｓ−Ｍ２）も含んでおり、このプロモーター配列は、実施形態によって異なるが、ＥＩＩＰα１ＡＴ（Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ＥＩＩの能力を高める領域と融合したヒトα−１−抗トリプシン遺伝子のプロモーターＰα１ＡＴ）、ＥａｌｂＰα１ＡＴ（アルブミン遺伝子Ｅａｌｂの能力を高める領域と融合したヒトα−１−抗トリプシン遺伝子のプロモーターＰα１ＡＴ）およびＰｈｐｘ（ヒトヘモペキシン遺伝子のプロモーター）から選択される。この研究において、基礎状態における導入遺伝子の発現は、ｒｔＴＡの発現を制御するのに用いられる肝臓特異的なプロモーターの強度に正比例し、導入遺伝子の発現を誘発する能力は、基礎状態における発現と反比例することがわかった（最弱のプロモーターＰｈｐｘを用いたときに誘発速度が最大）。しかし、誘発後の最大発現量は、プロモーターの効力に正比例し、つまり、最も強いプロモーターが、誘発後に最も多い量を発現した。一方、ｒｔＴＡ転写ユニットおよび導入遺伝子がタンデムに位置している場合、導入遺伝子の発現は、これらが反対方向に置かれたときよりも大きくなる。しかし、この研究では、導入遺伝子の発現を指令するためにＰａｌｂプロモーターを使用すると、最小サイトメガロウイルスプロモーターを使用する系で得られる値と比較して、導入遺伝子の発現量の低下を伴った。
【０００６】
Ｋｒａｍｅｒら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００３、７：３７５−３８５）は、種々のプロモーター構築物、特に、肝臓特異的なＥＩＩＰａ１ＡＴ、ＥａｌｂＰａ１ＡＴ、Ｐｈｐｘプロモーターのプロモーター活性を比較している。Ｋｒａｍｅｒらは、Ｐａ１ＡＴプロモーターは、それ自体で、またはＶＨＢウイルスのＥａｌｂエンハンサーまたはＥＩＩエンハンサーと結合して、肝細胞で安定な遺伝子発現を指令するのに最も有力であることを検証している。
【０００７】
Ｃｈｔａｒｔｏら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００３、１０：８４−９４）は、テトラサイクリンによって誘発される双方向導入遺伝子発現系から、導入遺伝子（ｅＧＦＰレポーター遺伝子、高感度ＧＦＰ）を誘発発現するＡＡＶベクターを記載している。この系は、両端を最小サイトメガロウイルスプロモーター配列（ｐＣＭＶｍ）ではさまれているｔｅｔＯ７オペレーター領域を含有する配列を含み、反対方向には、テトラサイクリンおよび導入遺伝子によって活性化され得る転写活性化因子（ｒｔＴＡ）の転写を指令し、ドキシサイクリン存在下、ｒｔＴＡ転写活性化因子が、導入遺伝子の転写または自身の転写を誘発する。また、この系は、双方向ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。この自己制御系は、腫瘍細胞株での導入遺伝子の発現および脳内でのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を誘発する能力を示す。もっと最近の論文（Ｃｈｔａｒｔｏら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００７、２０４：３８７−３９９）では、同じグループが、このベクターの改良版を記載しており、この改良ベクターは、変異したｒｔＴＡ転写活性化因子をもっており、ドキシサイクリンで治療されたラットにおいて、チロシン−ヒドロキシラーゼを抑制するような生物学的に活性な濃度で、線条体の核内でＧＤＮＦを発現させることができるが、誘発されていない対照では発現させることができない。しかし、これらのベクターが、上に特定したような条件が求められる肝臓において、導入遺伝子を発現させるのに適しているかどうかについては、データは存在しない。
【０００８】
しかし、これまでに記載した系にあるような不利な点が存在せず、目的の遺伝子の肝臓特異的な誘発発現の代替となる系の開発が依然として求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、テトラサイクリン感受性の転写活性化因子および最小ＣＭＶプロモーターを用いた誘発可能な発現ベクターが、肝臓における制御された特異的な発現にとって良好な挙動を示さないが、一方で、最小ｐＣＭＶプロモーターの代わりにヒトアルブミンプロモーター（ｐＡｌｂ）を含む異種遺伝子発現系が、肝臓特異的な基礎状態での発現量を低くするだけではなく、驚くべきことに、誘発後に、最小ＣＭＶ型の強いプロモーターを用い得らるよりも、より大きな発現量を得ることができることを明らかにした。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、誘発剤に応答して、目的のポリヌクレオチドの肝臓特異的な誘発発現を可能にする遺伝子構築物に関し、この遺伝子構築物は、
（ｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と第２の肝臓特異的なプロモーター配列とにはさまれた、前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントを含み、両肝臓特異的なプロモーター配列が異なる方向に動作する、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、
（ｉｉ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードする配列と、この転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含み、転写活性化因子をコードする配列が、第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結している、第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結するポリヌクレオチドと、前記目的のポリヌクレオチドに対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含む、第２のヌクレオチド配列とを含んでなり、
前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤の存在下で、前記オペレーター−プロモーターのオペレーター領域に前記転写活性化因子が結合することで誘発されるものである。
【００１１】
本発明の第２の態様は、本発明の遺伝子構築物を含むベクター、ウイルスゲノムまたはビリオンに関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明のウイルスゲノムを適切なパッケージング細胞内で発現させることによって得ることが可能なビリオンに関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、肝臓由来の細胞内で目的のポリヌクレオチドを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、
（ｉ）前記細胞と、本発明の遺伝子構築物、または本発明のベクター、または本発明のウイルスゲノム、または本発明のビリオンとを、前記構築物、前記ベクターまたは前記ビリオンが前記細胞に入り込むのに十分な条件下で接触した状態におく工程と、
（ｉｉ）前記細胞と誘発剤とを、前記目的のポリヌクレオチドの発現が起こるのに必要な時間、接触させる工程とを含んでなる。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、本発明の遺伝子構築物の医薬組成物、本発明のベクター、本発明のウイルスゲノム、本発明のビリオンに関し、また、薬物としてまたは肝疾患の治療に使用される、これらの使用に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、誘発剤によって目的の２種類のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現させるのに適した誘発性両方向性オペレーター−プロモーターに関し、
（ｉ）前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントと、
（ｉｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）第２の肝臓特異的なプロモーター配列とを含んでなり、
ここで、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、前記誘発剤に応答性のエレメントに対して異なる方向に動作し、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤の存在下で、かつ前記応答性エレメントに結合する転写活性化因子の存在下で高まるものである。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、誘発剤によって目的のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現するのに適した遺伝子構築物に関し、この遺伝子構築物は、
（ａ）
（ｉ）前記誘発剤に対して応答性の少なくとも１つのエレメントと、
（ｉｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）第２の肝臓特異的なプロモーター配列とを含んである、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、
（ｂ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードし、前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結しているヌクレオチド配列と、前記転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含んでなり、
ここで、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、前記誘発剤に応答性のエレメントに対して異なる方向に動作し、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤の存在下で、かつ前記誘発性両方向性オペレーター−プロモーター内の応答性エレメントに結合する転写活性化因子の存在下で高まるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明によるテトラサイクリン誘発性導入遺伝子の発現系の構成を示す図：、（１）両方向性オペレーター−プロモーター配列；（２）転写活性化因子の活性な形態に対して応答性の両方向性エレメント；（３）肝臓特異的なプロモーター（好ましくは、アルブミンプロモーター（ｐＡｌｂ）または最小アルブミンプロモーター（ｐｍＡｌｂ））を含むプロモーター配列；（４）誘発剤（好ましくはテトラサイクリン）によって活性化され得る逆転写活性化因子（ｒｔＴＡ）をコードする配列；（５）目的の導入遺伝子をコードする配列；（６）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡまたはｐＡ）。両方向性オペレーター−プロモーター配列は、転写活性化因子（好ましくはｒｔＴＡ）をコードする配列（４）と、目的の導入遺伝子をコードする配列（５）の転写を制御し、また、そのプロモーターの活性は、誘発剤（好ましくは、テトラサイクリン、またはドキシサイクリンのようなテトラサイクリン類似体）が存在する状態で、転写活性化タンパク質（好ましくはｒｔＴＡ）（４）によって誘発される。
【図２】テトラサイクリン誘発性導入遺伝子発現系が組み込まれた、実施例で使用される異なる組み換えアデノ随伴ウイルスの構造。  （Ａ）ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ：このアデノ随伴ウイルスのゲノムには、テトラサイクリン誘発性両方向性発現系が組み込まれており、この発現系は、４２塩基テトラサイクリンオペレーターの７コピー（ｔｅｔＯ７）を有しており、２つの最小サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）にはさまれたオペレーター領域を含み、このオペレーター−プロモーターは、それぞれの端に１つずつ配置されている逆転写活性化因子ｒｔＴＡ−Ｍ２をコードする配列、および目的の導入遺伝子としてルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をコードする配列の発現を制御し、両方向性ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）ｔとして組み込まれており、２型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）の５’−ＩＴＲ（末端逆位配列）および３’ＩＴＲは、隣接する発現カセットに含まれている。  （Ｂ）ｒＡＡＶ−Ｔｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ：このアデノ随伴ウイルスのゲノムには、テトラサイクリン誘発性両方向性発現系が組み込まれており、この発現系は、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃウイルスと同じエレメントを含み、最小ｐＣＭＶプロモーターがアルブミン遺伝子プロモーター（ｐＡｌｂ）配列と置き換わっている点のみが異なる。  （Ｃ）ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２：このアデノ随伴ウイルスのゲノムには、テトラサイクリン誘発性両方向性発現系が組み込まれており、この発現系は、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃウイルスと同じエレメントを含み、ルシフェラーゼ遺伝子が、マウス単鎖ＩＬ１２配列と置き換わっている点のみが異なる（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ，Ｇ．Ｊ．，ら、ｍ  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９７．１５：３５−４０）。
【図３】ＣＣＤカメラによって得られた生物発光画像。この画像は、ルシフェラーゼ活性レベルが測定される選択した領域を示している。（Ａ）上腹部（肝臓を含む）、および（Ｂ）動物の全身から発せられる生物発光のレベル。
【図４】組み換えｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃウイルスのゲノムを含むビリオンまたはウイルス粒子を注射された雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるルシフェラーゼ活性（光子／秒）の測定（各群に、マウスあたりの投与量がそれぞれ１×１０１０、３×１０１０、および１×１０１１のウイルスゲノム（ｖｇ））。注射したビリオンは、ＡＡＶ２／８ビリオンであり、ＡＡＶ２ウイルスＩＴＲで構築されたゲノムを含むが、ＡＡＶ８カプシド（血清型８のＡＡＶに対応するカプシドタンパク質で構成されている）にパッケージングされている。ルシフェラーゼの発現を誘発するために、ウイルスベクターを投与して２１日後に、それぞれの動物にドキシサイクリンを投与し（５０ｍｇ／体重ｋｇ、腹腔内経路）、飲料水にドキシサイクリン（ｄｏｘ）を入れて（ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍｌ、５％ショ糖）７日間投与してから２４時間後に、誘発は維持されていた。線は、１回目のドキシサイクリン腹腔内投与（０日）からの日数ｔ（日）で表現した、時間を関数として測定したルシフェラーゼ活性を示している。肝臓領域での活性レベルは、実線であらわされており、動物全身の活性レベルは破線であらわされている。
【図５】ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃウイルスのゲノムを含むＡＡＶ２／８ビリオンを注射されたマウスにおけるルシフェラーゼ活性（光子／秒）の測定（投与量１×１０１０、３×１０１０、１×１０１１ｖｇ／マウス）。ドキシサイクリンの投与量（ｍｇ／ｋｇ、腹腔内経路）を上げつつ、１５日間の間に分割して繰り返し誘発させた後に測定を行った。ドキシサイクリンを腹腔内投与してから２４時間経過した後に、上腹部または肝臓領域でルシフェラーゼ活性を測定した。
【図６】組み換えｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃウイルスのゲノムを含むＡＡＶ２／８ビリオン（１×１０１１ｖｇ／マウス）を静脈内経路によって注射した雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて測定されたルシフェラーゼ活性（光子／秒）。活性は、ドキシサイクリンで誘発する前の基礎状態（投薬０）、５０ｍｇ／体重ｋｇを腹腔内投与してから２４時間後の誘発状態（投薬５０）で測定され、これらの測定は、上腹部（肝臓）および動物全身（全体）で行われた。
【図７】ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃまたはｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃのゲノムを含むＡＡＶ２／８ビリオン（１×１０１１ｖｇ／マウス；静脈内経路）を注射された雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、基礎状態（投薬０）、ドキシサイクリン５０ｍｇ／体重ｋｇを腹腔内投与してから２４時間後の誘発状態（投薬５０）で測定されたルシフェラーゼ活性（光子／秒）の比較。測定は、上腹部（肝臓）で行われた。
【図８】ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃウイルスのゲノムが組み込まれたＡＡＶ２／８ビリオンを注射された雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるルシフェラーゼ活性（光子／秒）（各群に、それぞれ投与量１×１０１１、１×１０１０ｖｇ／マウス、静脈内経路）。活性は、基礎状態（誘発０）、ドキシサイクリン５０ｍｇ／ｋｇを４回の誘発サイクルで誘発させてから（それぞれ、誘発１、２、３、４）２４時間後に測定された。誘発１と誘発２の間、誘発２と誘発３の間に、１５日間が経過し、誘発３と誘発４の間に８０日間が経過した。
【図９】（Ａ）基礎状態と、異なる投与量のドキシサイクリンを用いて誘発した後の誘発状態において測定した、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃゲノムを含むＡＡＶ２／８ビリオン（１×１０１１ｖｇ／マウス；静脈内経路）を注射された雌および雄のＣ５７ＢＬ／６のルシフェラーゼ活性（光子／秒）。各マウス群（Ｎ＝５）に異なる投与量のドキシサイクリンを投与した（ｍｇ／体重ｋｇでの投与量；腹腔内経路）。対応するウイルスを注射して１４日目に基礎状態の活性を測定し、このウイルスを注射して２２日後で、所定投与量のドキシサイクリンを投与した２４時間後に誘発状態での測定を行った。  （Ｂ）Ａに示した活性データの対数変換［Ｌｏｇ１０（光子／秒）］。
【図１０】基礎状態（０日）、および飲料水にドキシサイクリンを入れて（２ｍｇ／ｍｌ＋５％ショ糖）所定期間投与している間の異なる日に、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃを含むＡＡＶ２／８ビリオン（１×１０１１ｖｇ／マウス；静脈内経路）を注射された雌および雄のＣ５７ＢＬ／６において測定したルシフェラーゼ活性（光子／秒）。
【図１１】ｅｘ  ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ活性の生体内分布。ＢＡＬＢ／ｃの雌（Ａ）およびＣ５７ＢＬ／６（Ｂ）株（Ｎ＝４〜８）に、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃまたはｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃを含むＡＡＶ２／８ビリオンを注射した（投与量１×１０１１ｖｇ／マウス、静脈内経路）。ウイルスを注射して２１日後に、ドキシサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内経路）を投与してルシフェラーゼの発現を誘発し、誘発して２４時間後に、動物を犠牲死させ、臓器を抽出し、それぞれについてルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を測定し、タンパク質の合計量を用いて正規化した（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）。
【図１２】ｅｘ  ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ活性の生体内分布。ＢＡＬＢ／ｃの雄（Ａ）およびＣ５７ＢＬ／６（Ｂ）株（Ｎ＝４〜８）に、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃまたはｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃを含むＡＡＶ２／８ビリオンを注射した（投与量１×１０１１ｖｇ／マウス、静脈内経路）。ウイルスを注射して２１日後に、ドキシサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内経路）を投与して発現を誘発し、誘発して２４時間後に、動物を犠牲死させ、臓器を抽出し、それぞれについてルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を測定し、タンパク質の合計量を用いて正規化した（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）。
【図１３】ＭＣ３８同系腫瘍株由来の細胞を移植した後、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与する抗腫瘍治療プロトコルの図。０日目に、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２を含むＡＡＶ２／８  ビリオンを３種類の異なる投与量（３×１０１０、１×１０１０、３×１０９ｖｇ／マウス）で投与し、あるマウス群には、ベクターを投与しないまま残しておいた（Ｎ＝５）。３０日後、５×１０５ＭＣ３８細胞を肝内移植した。移植から１０日後（プロトコル４０日目）、ドキシサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することによって、この系の誘発を開始した。次の日に、飲料水（ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍｌ＋５％ショ糖）で誘発を続け、その後６日間継続した（プロトコル４７日目まで）。９０日目に、最も高用量のベクターを接種した２つの群に１×１０６ＭＣ３８細胞／マウスを用いて皮下再抗原チャレンジを行ない、５匹の未治療マウスをコントロールとして用いた。腫瘍の大きさを、抗原チャレンジから１３日、２３日、４２日後に測定した（プロトコル１０３日目、１１３日目、１３２日目）。１１３日目に、マウスを出血させ、ＰＢＬを抽出した。最後に、１３２日目に、動物を犠牲死させ、完全に保護されていなかったマウスから皮下腫瘍を抽出した。赤色の垂直の線は、血清パラメーターを測定するために出血させた日を示す。青色の垂直線は、再抗原チャレンジ後の腫瘍の大きさを測定した日を示す。
【図１４】ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２を含むＡＡＶ２／８ビリオンを３×１０１０、１×１０１０、３×１０９ｖｇ／マウスの３種類の異なる投与量で注射した雌Ｃ５７ＢＬ／６動物の血清中のトランスアミナーゼ、ＡＬＴ（Ａ）、ＡＳＴ（Ｂ）の量。基礎状態（誘発０日目）、誘発０日目に５０ｍｇ／ｋｇのドキシサイクリンを最初に腹腔内投薬してから１日後、４日後、７日後、その後、飲料水（２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリン＋５％ショ糖）を投与したときの量を示している。
【図１５】図１３に記載したプロトコルを適用したＣ５７ＢＬ／６マウスについて、時間経過に伴う生存率。説明文は、プロトコル開始時に静脈内経路で接種された各群のウイルスの投与量（ｖｇ／マウス）を示す。コントロール群は、ベクターを接種されなかった。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア）を用い、統計的評価を行った（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１６】未治療マウスコントロール群（Ａ）と比較した、１×１０６  ＭＣ３８細胞／マウスで皮下再抗原チャレンジを受けた治療したマウス（Ｂ）の腫瘍の大きさ。（Ｂの）括弧内は、図１３に記載のプロトコルにしたがって各マウスに接種したウイルスの投与量（ｖｇであらわされている）を示している。（Ｃ）は、実験終了時（プロトコル１３２日目）に、異なる群によって到達した腫瘍の大きさを示す。括弧内は、図１３に記載のプロトコルにしたがって各マウスに接種したウイルスの投与量（ｖｇであらわされている）を示している。
【図１７】ＣＤ８＋／Ｔｅｔ＋  ＰＢＬ（ＭＣ３８）の割合。再抗原チャレンジから２３日後（図１３に記載のプロトコル１１３日目）にマウスから血液を抽出し、ＰＢＬを得て、これを抗ＣＤ８＋抗体およびＭＣ３８細胞特異性ペプチドを保持するテトラマーで標識した。ＣＤ８＋−ＭＣ３８Ｔｅｔ＋  ＰＢＬの割合を、ＦｌｏｗＪｏコンピュータープログラムを用いて分析した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用い、統計的評価を行った（＊ｐ＜０．０５）。
【図１８】ＭＣ３８テトラマーに特異的であり、活性化マーカーＣＤ４４に陽性の腫瘍内ＣＤ８＋リンパ球の割合。これら（Ａ）の有意差がなかったため、治療したマウス群を一緒にした。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、コントロール群と、治療群の１つから、代表的なマウスに関するポイントダイヤグラムを示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用い、統計的評価を行った（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１９】雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与された治療的な抗腫瘍治療のプロトコル図。０日目に、同系腫瘍株ＭＣ３８細胞を移植した。７日後、単回投与量の１×１０１０  ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２ウイルスゲノム（ｖｇ）をマウスに注射し、あるマウス群には、ベクターを投与しないまま残しておいた（Ｎ＝５）。１５日後、ドキシサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与（腹腔内）することによって、この系の誘発を開始した。次の日に、飲料水（ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍｌ＋５％ショ糖）で誘発を続け、その後６日間継続し、この後、両群で生存率を分析した。
【図２０】図１９に記載したプロトコルを適用したＣ５７ＢＬ／６マウスの長期間にわたる生存率。凡例は、治療した動物が接種されたウイルスの投与量（ｖｇ／マウス）を示す。コントロール群には、ベクターを投与しなかった。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア）を用い、統計的評価を行った（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明による遺伝子構築物
本発明者らは、一時的かつ場所的という両方の観点で、肝臓で目的のポリヌクレオチドを正確に発現させることが可能なポリヌクレオチドの発現系を開発した。この目的のために、本発明者らは、誘発剤が存在する状態で、両方向性プロモーターの発現を活性化させる転写活性化因子の発現を制御する第１の肝臓特異的なプロモーターと、目的の遺伝子の発現を制御する第２の肝臓特異的なプロモーターとを伴う、活性化可能な両方向性オペレーター−プロモーターを用いた。基礎状態（誘発されていない状態）では、肝臓特異的なプロモーターは、転写活性化因子と導入遺伝子を両方とも少量発現するように指令し、系の残余発現（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれる状態になる。誘発剤が存在しないとき、転写活性化因子は、両方向性プロモーターのオペレーター部位と構造的に結合することができず、したがって、両方向性プロモーターの転写を活性化することができない。
【００１９】
誘発因子が存在すると、誘発因子が、細胞内に存在する残存転写活性分子と結合し、誘発性両方向性プロモーター−オペレーターと結合することができるように構造変化を起こし、その転写を活性化する。この様式で、導入遺伝子と転写活性化因子の発現が両方とも誘発される。このようにして新しく合成された転写活性分子は、細胞内の遊離した誘発剤と結合することができ、
（ａ）すべてのオペレーター部位が、誘発剤−転写活性化因子複合分子で占められた状態；または
（ｂ）過剰に投与しなかった場合には、細胞内の遊離した誘発剤が消費され、合成された転写活性分子が、オペレーター部位に結合し続けることができない状態になるまで、正のフィードバックループが作られる。
【００２０】
したがって、誘発因子を投与した後に、誘発工程または誘発状態が始まる。転写活性化因子および導入遺伝子の両方の発現レベルは、投与される誘発剤の投与量に依存して変わる。誘発因子がなくなると、転写活性化因子は、不活性な構造状態に戻り、オペレーター部位と効率的に結合することができなくなり、初期状態または基礎状態に戻るまで、導入遺伝子の発現が低下する。すべてのオペレーター部位が誘発剤−転写活性化因子複合分子で占められているときに、最大の発現量が得られる。
【００２１】
本発明者らは、驚くべきことに、開発したベクターが、誘発後に肝臓特異的に発現し、この発現が、基礎状態での発現量がもっと高いプロモーターを含むベクターを用いて得られるレベルよりも、さらに高いレベルに達することを明らかにした。したがって、これまでに報告された誘発系の最大発現量は、基礎状態でのプロモーターの効力と正の相関をもつものとされたが、ユビキタスなＣＭＶ型プロモーターよりも一般的に弱い組織特異的なプロモーターを用いる本発明の系にあっては、誘発後の基礎状態での発現量は、ＣＭＶを用いて得られるものよりも高くなる。具体的には、本発明の実施例２において、誘発剤投与後の本発明の肝臓特異的な系を用いて得られたレポーター遺伝子の誘発変化量が、ユビキタスなＣＭＶプロモーターによる系の誘発変化量に対し約８５倍も高いことが見て取れるであろう（図７を参照）。この結果は、サイトメガロウイルス最小プロモーターを使用する系を用いて得られた結果と比較して、導入遺伝子の発現を指令するＰａｌｂプロモーターを使用すると、導入遺伝子の発現量が低下したという、Ｚａｂａｌａら（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）によって得られた結果と一致しない。さらに、この投与量のドキシサイクリンで、誘発状態での両系の差はきわめて顕著である。それに対し、本発明の肝臓特異的な誘発発現系によって制御されるレポーター遺伝子の肝臓での発現は、ユビキタスなＣＭＶプロモーターによる系よりも高いルシフェラーゼ活性誘発レベルに達する（図１１を参照）。
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様は、誘発剤に応答して、目的のポリヌクレオチドの肝臓特異的な誘発発現を可能にする遺伝子構築物に関し、
（ｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と第２の肝臓特異的なプロモーター配列にはさまれた、前記誘発剤に対して応答性のエレメントを含み、両肝臓特異的なプロモーター配列が異なる方向に配向している、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、
（ｉｉ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードする配列と、この転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含み、活性化可能な転写活性化因子をコードする配列が、第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結している、第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）前記第２の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結するポリヌクレオチドと、前記目的のポリヌクレオチドに対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含む、第２のヌクレオチド配列とを含み、
前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤が存在する状態で、前記オペレーター−プロモーターのオペレーター領域に前記転写活性化因子が結合すると誘発される。
【００２３】
「遺伝子構築物」という表現は、本明細書で使用する場合、単鎖または二本鎖の核酸を指し、発現させることが可能な領域と、場合により、上述の核酸の前につく制御配列（非コード５’配列）または上述の核酸の後につく制御配列（非コード３’配列）とを含む。「遺伝子構築物」および「核酸構築物」という表現は、本発明では相互に置き換え可能に使用される。
【００２４】
「発現」という用語は、１つ以上の遺伝子または遺伝子構築物を転写し、構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡを産生することを指し、その後にこのＲＮＡをタンパク質に翻訳する場合と翻訳しない場合がある。
【００２５】
「誘発発現」という表現は、本明細書で使用する場合、活性化因子／誘発因子に応答して発現量が増え得るという事実を指す。
【００２６】
「目的のポリヌクレオチド」という表現は、本明細書で使用する場合、細胞または被検体に対して部分的または全体的に異種であり、導入され、目的のポリヌクレオチドに対して５’側または３’側に発現制御領域が存在することに起因して、転写され、最終的に、所望の生体活性をもつポリペプチドを産生するために翻訳されうる核酸配列を指す。「目的のポリヌクレオチド」という表現は、単にあるポリペプチドをコードする能力を有するポリヌクレオチドのみを意味すると理解されるべきではなく、この表現を使用して、導入され、その結果、転写の後に、細胞または被検体の内因性ポリヌクレオチドに対して部分的または全体的に相補性の核酸配列であって、内因性ポリヌクレオチドの発現をハイブリダイズし、阻害することが可能なＲＮＡ分子（マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を生成するようなものを指すこともできる。目的のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。
【００２７】
「誘発剤」という表現は、本明細書で使用する場合、遺伝子の転写を高めることが可能な任意の分子を指す。通常は、誘発剤に応答して転写が誘発される遺伝子は、転写制御領域の作動制御下にあり、この転写制御領域は、誘発剤が存在する状態で活性が高まる転写活性化因子に対する結合部位を有する。したがって、本発明にあっては、目的の遺伝子の転写制御領域を指すため、「誘発剤に応答性のエレメント」という表現は、誘発剤が結合することによって活性が高まる転写活性化因子に対する結合部位を指すために用いられる。好ましくは、誘発剤は、投与が容易で、体内で容易に行きわたり、系を活性化させるのに使用される投与量で無毒な化合物である。さらに、誘発剤は、所望の組織または臓器に浸透させることができなければならず、数時間の半減期を有している(数分でも数日でもなく)。
【００２８】
制御可能な両方向性オペレーター−プロモーター
本発明による遺伝子構築物のエレメント（ａ）は、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターを含み、この誘発性両方向性オペレーター−プロモーターは、転写活性化因子に応答性のエレメントを活性な形態で含み、このエレメントが第１の肝臓特異的なプロモーター配列と第２の肝臓特異的なプロモーター配列にはさまれており、両肝臓特異的なプロモーター配列が異なる方向に配向している。
【００２９】
「制御可能な両方向性オペレーター−プロモーター」という表現は、本明細書で使用する場合、所与のシグナルが存在する状態で、上述の「オペレーター−プロモーター」とは反対方向に、特定のポリヌクレオチドの転写を活性化させることができるプロモーターを指す。
【００３０】
「誘発剤に応答性のエレメント」という用語は、シス作用性であり、プロモーターに対し、エレメントと、転写因子または転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用に応答して転写を活性化させる能力を与え、この転写活性が、通常は、誘発剤への結合から生じる転写活性化因子の構造変化に起因して、誘発剤が存在する状態で誘発される、１つ以上のＤＮＡエレメントを指す。したがって、「誘発剤に応答性のエレメント」という表現は、誘発剤が存在する状態で転写活性化因子に応答性のエレメントを意味すると理解されなければならない。転写因子または転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインは、プロモーターに対して３’側に位置している遺伝子の転写を開始または阻害するために、活性化剤が存在する状態または存在しない状態で、応答性のエレメントのＤＮＡ配列に結合することができる。「応答性のエレメント」という用語は、「転写応答性のエレメント」またはＴＲＥと相互に置き換え可能に使用される。
【００３１】
好ましい態様において、制御可能な両方向性プロモーター−オペレーターは、少なくとも１つの転写活性化因子に応答性のエレメントを含み、Ｂａｒｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９５、１７：３６０５−３６０６）に最初に記載されたように、このエレメントは、抗生物質によって活性化されてもよく、好ましくはテトラサイクリン応答性エレメント、より好ましくはテトラサイクリン応答性エレメントであり、さまざまなコピー数の４２塩基対オペレーター配列（ＴｅｔＯと呼ばれる）を含む。ＴｅｔＯのコピー数は、少なくとも２、少なくとも５であってもよく、好ましくは、７以下であってもよい。この種のテトラサイクリン応答性エレメントは、Ｇｏｓｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２７８：１７６６−１７６９）に最初に記載されるように、逆テトラサイクリンによって活性化される転写活性化因子（またはその類似体であるドキシサイクリン）が存在する状態で双方向の転写を活性化してもよい。好ましい態様において、転写活性化因子＋テトラサイクリンに応答性のエレメントは、オペレーター配列の７コピーを含み、この場合、ＴｅｔＯ７と呼ばれる。さらに好ましい形態では、オペレーター−プロモーターは、配列番号１の配列を含むか、またはこの配列からなる。
【００３２】
遺伝子構築物のエレメント（ａ）は、そのほかに、第１の肝臓特異的なプロモーター配列および肝臓特異的なプロモーター配列を含む。
【００３３】
「転写プロモーター配列」という表現は、本明細書で使用する場合、宿主細胞に認識され、プロモーター領域に対して３’側に存在する核酸配列の転写を活性化する核酸配列を指す。一般的には、プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドを発現させることが可能な転写制御配列を含む。
【００３４】
「肝臓特異的な」という表現は、本明細書で使用する場合、転写プロモーター領域を指し、この領域が、肝細胞または肝細胞に由来する細胞株での転写を選択的に活性化することができるということを指す。本発明に適した肝臓特異的なプロモーターとしては、これらに限定されないが、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）のプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンのプロモーター、α胎児型タンパク質のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター、ＩＧＦ−ＩＩのプロモーター、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）のプロモーター、ＨＢＶベーシックコアタンパク質（つまりＢＣＰ）のプロモーターおよびそのＰｒｅＳ２プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）のプロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩのハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメント（Ｅａｌｂ）と組み合わせたＡＡＴプロモーター、アポリポタンパク質Ｅのプロモーター、低密度リポタンパク質のプロモーター、ピルビン酸キナーゼのプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのプロモーター、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のプロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）のプロモーター、トランスフェリンのプロモーター、トランスチレチンのプロモーター、α−フィブリノゲンおよびβ−フィブリノゲンのプロモーター、α−１−アンチキモトリプシンのプロモーター、α−２−ＨＳ糖タンパク質のプロモーター、ハプトグロビンのプロモーター、セルロプラスミンのプロモーター、プラスミノーゲンのプロモーター、補体タンパク質（ＣＩｑ、ＣＩｒ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、補体のＩ因子およびＨ因子）のプロモーター、補体Ｃ３活性因子のプロモーター、ヘモペキシンのプロモーター、α−１−酸糖タンパク質のプロモーターが挙げられる。Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＴｉＰｒｏＤ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊ４：Ｄ１０４−Ｄ１０７（２００６））中に、さらなる組織特異的なプロモーターを見つけることができる。または、肝臓特異的なエンハンサーと、肝臓特異的なプロモーターとを含むハイブリッドプロモーターを使用することも可能である。この種のプロモーターには、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩのハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメント（Ｅａｌｂ）と組み合わせたＡＡＴプロモーター、アポリポタンパク質Ｅのプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサー（Ｅａｌｂ）と、マウスα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）のプロモーターとから作られるハイブリッドプロモーター（Ｅａｌｂ−ＡＡＴｐ）が挙げられる。
【００３５】
好ましい態様において、第１発現カセットの一部分である肝臓特異的なプロモーターは、マウス由来またはヒト由来のアルブミン遺伝子プロモーターである。具体的には、本発明は、全アルブミン遺伝子プロモーター（配列番号２）、または配列番号２で特定される全プロモーターのヌクレオチド１１３〜１９６に対応する、このプロモーターの最小領域（配列番号３）の使用を検討している。本発明は、少なくとも最小プロモーター（配列番号２の残基１１３〜１９６）を含むプロモーターの任意のフラグメントの使用を検討している。
【００３６】
本発明において、肝臓特異的なプロモーターとは、肝臓以外の他の体組織と比較して、肝臓での活性が高いプロモーターである。典型的には、肝臓特異的なプロモーターの活性は、肝臓以外の他の組織に比べ、肝臓でかなり大きいものとされる。例えば、このようなプロモーターは、肝臓以外の他の細胞種よりも肝臓組織で少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きいものとされてよい。参照の細胞に対し、肝臓由来の細胞におけるこのプロモーターの活性は、他の細胞または組織での発現を防ぎつつ、予め定められた組織での発現を指令する能力によって決定されてもよい。結果として、肝臓特異的なプロモーターは、肝臓にある遺伝子の有効な発現を可能にし、他の細胞または組織での発現を防ぐことができる。
【００３７】
当業者は、第１および第２の肝臓特異的な転写プロモーター領域が同じであってもよく、異なっていてもよいことに気づくだろう。好ましい実施態様では、両転写制御領域は、同じである。さらになお好ましい実施態様では、第１の転写プロモーター領域および第２の転写プロモーター領域は、両方ともアルブミン遺伝子プロモーターを含む。さらにより好ましい態様において、第１および／または第２の転写プロモーター領域を形成するアルブミン遺伝子プロモーターは、配列番号２および配列番号３の群から選択される配列を含む。
【００３８】
好ましい実施態様にあっては、制御可能な両方向性プロモーター−オペレーターは、誘発剤（好ましくはテトラサイクリン）によって活性化され得る転写活性化因子に対する７箇所の結合部位によって作られるテトラサイクリン応答性エレメントを含み、異なる方向に配向する２個のアルブミン遺伝子プロモーターにはさまれている。さらにより好ましい態様において、ＴｅｔＯ７オペレーターと２個のアルブミンプロモーターとを含むオペレーター−プロモーターは、配列番号４の配列を含む。
【００３９】
肝臓特異的なプロモーター活性をもつ配列は、オペレーター領域に対して異なる方向に配向している。「異なる配向」という表現は、本明細書で用いる場合、複数の肝臓特異的なプロモーターであって、プロモーター対の第１のプロモーターが介在する転写活性化が、ＤＮＡ分子鎖の片方で起こり、それによって、ＲＮＡポリメラーゼが５’−３’方向に作用し、一方、第２のプロモーターが反対側の鎖に作用し、ＲＮＡポリメラーゼが反対方向に置き換えられ、第１のプロモーターと一緒に作用するプロモーター対を指す。
【００４０】
本発明の遺伝子構築物の両方向性オペレーター−プロモーターを形成するエレメントは、第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、誘発剤が存在する状態で、オペレーター−プロモーターのオペレーター領域に転写活性化因子が結合すると誘発されるような様式で組織化されている。当業者は、転写プロモーター活性の誘発が、さまざまな因子の中でも特に、オペレーターエレメントと肝臓特異的なプロモーター配列との間の距離に依存するだろうことに気づくだろう。好ましくは、オペレーターと第１または第２のプロモーター配列との間の距離は、０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは、０〜２０、さらに好ましくは０〜１５ヌクレオチド長の間で変動してもよい。
【００４１】
本発明による遺伝子構築物の第１のヌクレオチド配列
本発明によれる遺伝子構築物のエレメント（ｂ）は、誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードし、第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結する配列と、転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置するポリアデニル化シグナルとを含む、ヌクレオチド配列である。
【００４２】
「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という表現は、単鎖形態または二本鎖形態での、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」)またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルまたはこれらの類似するリン酸エステル（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）のポリマー形態について述べる場合、本発明で相互に置き換え可能に使用される。したがって、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡによって作られるらせんも可能である。「核酸配列」という用語、特に、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、単に、分子の一次構造または二次構造を指し、特定の種類の三次構造に限定されない。したがって、この用語には、線形または環状のＤＮＡ分子、超コイルＤＮＡプラスミドおよび染色体であらわされるような二本鎖ＤＮＡが含まれる。
【００４３】
「誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子」という表現は、本明細書で使用する場合、誘発剤と結合したときに、所与の遺伝子の非コード領域にあるポリペプチドの特定の認識領域に結合することによって、所与の遺伝子の転写を促進することができるポリペプチドを指す。つまり、その活性は、さらなる因子によって調節されてもよく、このさらなる因子は、制御因子に特異的に結合する部位を含む遺伝子の転写を促進する必要性によって、供給されてもよく、除外されてもよい。当業者であれば、本発明の第１のヌクレオチド配列によってコードされる転写活性化因子が、誘発剤に応答性のエレメントを含むオペレーター−プロモーターの領域に結合することができ、その結果、誘発剤が存在する状態で、オペレーター−プロモーターのオペレーター領域に結合した後、転写活性化因子が、第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列の転写を活性化すると理解するであろう。
【００４４】
さらに、当業者は、本発明が、最小の基礎状態での転写を含む制御された発現が可能な限り、転写制御因子の発現を制御するあらゆる方法を考慮していることに気づくだろう。具体的には、本発明は、転写制御因子の発現量が増えることによってではなく、誘発剤に対する結合に応答する構造変化によって誘発が起こり、転写因子が核に転座し、核で効果を発揮するか、または、転写活性を高めるような転写制御因子の使用を考慮している。この種の転写制御因子は、通常は、ＤＮＡ結合ドメイン（つまりＤＢＤ）、リガンド結合ドメイン（つまりＬＢＤ）および転写活性化ドメイン（つまりＡＤ）で構成される。
【００４５】
ＤＮＡ結合ドメインは、既知の特定の結合エレメントが存在する任意のドメインであってもよく、合成、キメラまたは類似のＤＮＡ結合ドメインが含まれる。本発明に適したＤＮＡ結合ドメインとしては、（ｉ）ホメオドメイン（Ｓｃｏｔｔら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９８９：２５−４８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：８９７−９０７）、一般的に、約６１アミノ酸の鎖で構成され、３個のαラセンで構成される二次構造で存在する）、（ｉｉ）一般式Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を有し、タンデムに整列している２〜３ダースのＤＮＡフィンガーによって作られるジンクフィンガー（例えば、ＴＦＩＩＩＡ、Ｚｉｆ２６８、ＧｌｉおよびＳＲＥ−ＺＢＰ）（ここで、各モジュールは、３〜５塩基対のＤＮＡ領域と接触させることが可能なαらせんを含み、高アフィニティＤＮＡ結合部位を作成するのに少なくとも３個のジンクフィンガーが必要であり、低アフィニティＤＮＡ結合部位を作成するのに少なくとも２個のジンクフィンガーが必要である）、（ｉｉｉ）ヘリックスターンヘリックスまたはＨＬＨと呼ばれるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＴｅｔＲ、ＭＡＴ１、ＭＡＴ２、ＭＡＴａ１、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｐａｉｒｅｄ、Ｆｕｓｈｉ  ｔａｒａｚｕ、ＨＯＸ、Ｕｎｃ８６、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ２およびＰｉｔ−１、（ｉｖ）ロイシンジッパー型ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−Ｆｏｓ／ｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＢが挙げられる。本発明に適したＤＮＡ結合ドメインの例としては、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、転写因子、グループＨの核内受容体、ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーの核内受容体のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。当業者は、本発明が、構成エレメントが異なるＤＮＡ結合部位を認識可能な数種類のＤＮＡ結合モチーフハイブリッドＤＮＡ結合ドメインの使用を考慮していることに気づくだろう。これにより、ジンクフィンガーとホメオボックスの結合によって作られるＤＮＡ結合ドメインを使用することが可能である。好ましい態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｅｔ転写抑制因子から得られるドメインである。
【００４６】
本発明において用いられるのに適した配列を含み、転写活性化因子の核局在化を促進することができるリガンド結合配列としては、１５−デオキシ−δ−プロスタグランジンＪ２が存在する状態で核に転座される、ＰＰＡＲに由来する局在化配列（ペルオキシソーム活性化因子によって活性化される受容体）、９−ｃｉｓ−レチノイン酸のα、βまたはγ異性体が存在する状態で核に転座されるレチノイン酸受容体、レチノイン酸およびＴＴＮＰＢによって活性化され得るファルネソイドＸ受容体、２４−ヒドロキシコレステロールによって活性化され得る肝臓Ｘ受容体、４−アミノ−ブチルベンゾエートによって活性化され得るベンゾエートＸ受容体、プレグノン−１６−カルボニトリルによって誘発され得る構成的アンドロスタン受容体、プレグナン受容体、リファンピシンによって誘発され得るステロイドおよび生物異体の受容体、メドロキシプロゲステロンによって活性化され得るプロゲステロン受容体、およびミフェプリストンおよび１９−ノルテストステロン誘導体のアゴニストおよびアンタゴニスト、糖コルチコイドによって活性化され得る糖コルチコイド受容体、Ｔ３および／またはＴ４によって活性化され得る甲状腺ホルモン受容体、エストロゲンおよびその誘導体（例えば、１７−β−エストラジオールおよびエストラジオール）によって活性化され得るエストロゲン受容体、「ｔｅｔ−ｏｆｆ」テトラサイクリン／ドキシサイクリンによって活性化され得るｔＴＡ転写活性化因子（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１）、「ｔｅｔ−ｏｎ」テトラサイクリンによって活性化され得るｒｔＴＡ転写活性化因子（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９）、ムリステロンＡまたはエクジソン受容体に類似のリガンドによって誘発され得る転写活性化因子（Ｎｏら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１）、ＲＳＬ１リガンドによって活性化され得る転写活性化因子（例えば、最初にＰａｌｌｉらによって記載されたＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ系（２００３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：１３０８−１３１５））、ラパマイシンまたはラパマイシンの類似体によって活性化され得る転写活性化因子（Ｈｏら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：８２２−８２６；Ａｍａｒａら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１０６１８−１０６２３）、およびそれぞれ誘発因子および抑制因子として競争的に作用するクーママイシン／ノボビオシンによって活性化され得る転写活性化因子（Ｚｈａｏら、２００３、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１４：１６１９−１６２９）が挙げられる。
【００４７】
最後に、転写活性化ドメインは、酸性活性化ドメイン、プロリンを豊富に含む活性化ドメイン、セリン／スレオニンを豊富に含む活性化ドメインおよびグルタミンを豊富に含む活性化ドメインであってもよい。酸性活性化ドメインの例は、アミノ酸７５３〜８８１によって作られるＶＰ１６領域およびＧＡＬ４領域を含む。プロリンを豊富に含む転写活性化ドメインの例は、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸３９９〜４９９およびＡＰ２のアミノ酸３１〜７６を含む。セリン／スレオニンを豊富に含む活性化ドメインの例は、ＩＴＦ１のアミノ酸１〜４２７、ＩＴＦ２のアミノ酸２〜４５２を含む。グルタミンを豊富に含む活性化ドメインの例は、Ｏｃｔ１のアミノ酸１７５〜２６９およびＳｐ１のアミノ酸１３２〜２４３を含む。上述のそれぞれの領域の配列および他の転写活性化ドメインは、Ｓｅｉｐｅｌ、Ｋ．ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９２）１３：４９６１−４９６８）に記載されている。さらに、当該技術分野で既知の方法を用い、上述のものから他の転写活性化ドメインを得てもよい。さらに、活性化ドメインは、グループＨの核内受容体の活性化ドメイン、甲状腺ホルモンまたはステロイドホルモンの核内受容体の活性化ドメイン、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢ、Ｂ４２、ＢＰ６４またはｐ６５の活性化ドメインであってもよい。
【００４８】
好ましい態様において、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスビリオンのタンパク質１６（以下、ＶＰ１６）であり、そのアミノ酸配列は、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ｊ．ら（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９８８、２：７１８−７２９）に記載されている。このドメインは、ＶＰ１６のＣ末端の約１２７アミノ酸によって作られていてもよい。または、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６のＣ末端の１１アミノ酸によって作られていてもよく、転写を活性化する能力を維持している。転写活性化ドメインとして使用するのに適したＶＰ１６のＣ末端領域は、Ｓｅｉｐｅｌ、Ｋ．ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９２）１３：４９６１−４９６８）によって記載されている。さらにより好ましい態様において、転写活性化因子は、Ｂａｒｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９９７、２５：２７２３−２７２９）によって記載されるような、配列ＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号５）を有する、１３アミノ酸によって作られるタンパク質の最小領域を含む。
【００４９】
好ましい態様において、転写活性化因子は、テトラサイクリンまたはその類似体によって活性化され得る転写活性化因子である。
【００５０】
「テトラサイクリン類似体」という用語は、本明細書で使用する場合、テトラサイクリン抑制因子（ＴｅｔＲ）に結合する能力のＫａが少なくとも約１０−６Ｍ−１である、テトラサイクリンに構造的に関連する化合物を指す。好ましくは、テトラサイクリン類似体は、ＴｅｔＲに対するアフィニティが少なくとも１０−９Ｍ−１である。本発明に適したテトラサイクリン類似体の例としては、これらに限定されないが、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エポキシテトラサイクリン（ｅｐｉｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、シアノテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、およびＨｌａｖｋａおよびＢｏｏｔｈｅの「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」７８、Ｒ．Ｋ．Ｂｌａｃｋｗｏｏｄら（編集）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５の「Ｔｈｅ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ」；Ｌ．Ａ．Ｍｉｔｓｃｈｅｒ、「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９７８；Ｎｏｙｅｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ「Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．、第２巻、１９６９；Ｒ．Ｃ．Ｅｖａｎｓ、「Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  １、Ｑｕａｄｒａｎｇｌｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９６８；およびＨ．Ｆ．Ｄｏｗｌｉｎｇ、「Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ」、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、ｎｏ．３、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９５５に記載されているその他のものが挙げられる。
【００５１】
好ましい態様において、テトラサイクリンによって活性化され得る転写活性化因子は、いわゆる逆テトラサイクリン抑制タンパク質（つまり逆ｔｅｔＲ）であってもよく、（ｉ）誘発剤に対し特異的なアフィニティを示し、（ｉｉ）誘発剤に結合すると、ｔｅｔ型の応答性のエレメントに対し特異的なアフィニティを示し、（ｉｉｉ）誘発剤に結合していない場合、ｔｅｔエレメントとは離れた位置にあるポリペプチドを指す。この活性化因子は、天然の形態およびその機能的誘導体の両方を含む。好ましい態様において、テトラサイクリンによって制御されてもよい活性化因子は、いわゆる逆テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒｔＴＡ）であってもよく、この因子は、テトラサイクリンまたはその類似体が存在する状態で、転写活性化因子になるような構造変化を起こし、一方、テトラサイクリンが存在しない状態では不活性であることが特徴である。この様式で、テトラサイクリンが存在しない状態で、本発明のテトラサイクリン応答性エレメントが存在する遺伝子の転写を活性化してしまい、テトラサイクリンが存在する状態で、転写の活性化が止まってしまうといった、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｅｔＲ抑制因子から誘導される転写活性化因子に関連する問題は除かれる。逆テトラサイクリン依存性転写活性化因子（ｒｔＴＡ）としては、好ましくは、ｒｔＴＡ転写活性化因子、またはＵｒｌｉｎｇｅｒ、Ｓ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０００；９７：７９６３−７９６８）に記載されるｒｔＴＡの任意の改変体が挙げられる。好ましい態様において、ｒｔＴＡの改変体は、ｒｔＴＡ−Ｍ２として知られる改変体であり、活性化するために、元々のｒｔＴＡに必要なドキシサイクリン濃度よりも１０分の１の低い濃度ですむという特徴がある。ｒｔＴＡ−Ｍ２転写活性化因子は、配列番号６の配列をもつポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
【００５２】
本発明による遺伝子構築物の第１のヌクレオチド配列のエレメント（ｂ）は、そのほかに、転写活性化因子をコードするポリヌクレオチドに対して３’側に位置するポリアデニル化配列を含む。「ポリアデニル化配列」または「ポリアデニル化シグナル」という表現は、本明細書で使用する場合、転写停止シグナルを含み、ＲＮＡ転写物中に存在すると、ポリアデニルトランスフェラーゼ活性をもつ酵素が存在する状態で、転写物をポリアデニル化することができる核酸を指す。「ポリアデニル化」は、本明細書で使用する場合、ｍＲＮＡの３’末端にポリアデニン伸長部を付加することを指す。本明細書で使用するのに適したポリアデニル化シグナルとしては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期−後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼのポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子のポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ＥＩｂのポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、成長ホルモンのヒト改変体のポリアデニル化シグナルおよび類似のものが挙げられる。
【００５３】
好ましい態様において、ポリアデニル化シグナルは、両方向性ポリアデニル化シグナルである。両方向性ポリアデニル化シグナルの使用は、本発明による遺伝子構築物が、停止配列が特定の転写プロモーター活性をもつウイルスベクターを用いて発現する場合（具体的には、ＡＡＶ、レンチウイルス）、特に有益である。これにより、この誘発系の干渉が抑えられ、それによって、基礎状態の活性が低下する。さらにより好ましい態様において、両方向性ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに対応する。さらにより好ましい態様において、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、配列番号７の配列を含む。
【００５４】
本発明による遺伝子構築物の第２のヌクレオチド配列
本発明による遺伝子構築物は、そのほかに、第２の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結するポリヌクレオチドと、目的のポリヌクレオチドに対して３’側に位置するポリアデニル化シグナルとを含む。
【００５５】
「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「肝臓特異的なプロモーター配列」、「作動制御」、および「ポリアデニル化シグナル」という用語は、上に定義されており、第１のヌクレオチド発現配列と同じ様式で、第１のヌクレオチド配列で使用される。「目的のポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、その操作が異なる理由のために望ましいＤＮＡ配列を指し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体、およびタンパク質またはＲＮＡ分子を作ることが可能な対応するアンチセンス分子、例えば、非限定的な様式で、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートループＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｌｏｏｐ  ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）またはリボザイムが挙げられる。
【００５６】
好ましい態様において、目的のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子型の遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの改変体（ＥＧＦＰ、ＹＦＰまたはＢＦＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、カテコールデヒドロゲナーゼであってもよい。
【００５７】
または、目的のポリヌクレオチドとは、肝臓または肝細胞におけるその発現が、そのポリペプチドの発現が有益である肝障害を正常な状態に戻すのに有用であるポリペプチドをコードするものである。したがって、肝臓の変化の治療に用いられるのに適したポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、インターフェロンα、具体的には、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α８によって構成される群から選択されるＩＦＮ−α、オンコスタチン、カルジオトロフィン、ＩＬ−６、ＩＧＦ−Ｉおよびこれらの改変体、アンフィレグリン、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＰＢＧＤ、抗体、ＴＧＦ−β１阻害剤、例えば、国際特許公開第ＷＯ００３１１３５号、第ＷＯ２００５１９２４４号および第ＷＯ０３９３２９３号（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されているペプチドＰ１７およびＰ１４４、ＩＬ−１０阻害剤、ＦｏｘＰ３阻害剤、ＴＮＦα阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤およびＣＤ１５２阻害剤が挙げられる。
【００５８】
好ましい態様において、目的のポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２またはその機能的に等価な改変体をコードする。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、主にマクロファージおよび樹状細胞で分泌するＩ型サイトカインであり、天然ＩＬ−１２および組み換え様式で調製されたＩＬ−１２の両方を含み、（１）細胞障害性Ｔ細胞の応答を高め、（２）天然の細胞溶解性細胞（ＮＫ、ナチュラルキラー）の活性化、（３）天然の細胞溶解性細胞およびＴリンパ球の増殖を高め、（４）Ｉ型ヘルパーＴ細胞亜系（Ｔｈ１、Ｔヘルパー１）の分極を誘発、（５）抗血管新生効果の誘発といった多くの機構によって抗腫瘍免疫を高めることができる。これらの活性の多くは、天然細胞溶解性細胞および活性化Ｔリンパ球によるインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）の産生および分泌が介在している。
【００５９】
サイトカインＩＬ−１２は、重鎖（ｐ４０）と軽鎖（ｐ３５）で構成されるヘテロダイマーである。ヒト由来の軽鎖および重鎖の配列は、Ｇｕｂｌｅｒら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、１９９１、８８：４１４３）に記載されている。目的のポリヌクレオチドは、軽鎖が外から供給される場合、重鎖をコードしてもよく、重鎖が外から供給される場合、軽鎖をコードしてもよく、または、両方の鎖をコードしてもよい。ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドは、内部リボソーム導入部位によって分割されている２個のオープンリーディングフレームを含む単鎖ＲＮＡを産生し、各オープンリーディングフレームから各鎖を発現する。好ましくは、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドは、１個のオープンリーディングフレームを含み、このオープンリーディングフレームは、ＷＯ９６２４６７６号およびＬｉｅｓｃｈｋｅ  Ｇ．Ｊ．ら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、１５：３５−４０）によって記載されているように、リンカーによって互いに結合した軽鎖および重鎖を含む融合タンパク質をコードする。好ましい形態では、単鎖ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８の配列を含む。
【００６０】
「機能的に等価な改変体」という用語は、本明細書で使用する場合、１個以上の挿入部、欠失部または置換によってＩＬ−１２の配列とは異なるが、ＩＬ−１２の生体活性を実質的に維持しているポリペプチドを指す。本発明で使用するのに適した、ＩＬ−１２の機能的に等価な改変体は、上述のサイトカインとの配列同一性が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を示す。改変体と免疫を刺激するサイトカインとの同一性の程度は、当業者には広く知られているコンピューターアルゴリズムおよび方法によって決定される。２つのアミノ酸配列の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定される［ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２１５：４０３−４１０（１９９０）］。所与のポリペプチドがＩＬ−１２の機能的に等価な改変体であるかどうかを決定するためにモニタリングしてもよいＩＬ−１２の機能としては、これらに限定されないが、Ｔｈ１細胞中の未成熟Ｔ細胞の分化、Ｔ細胞の成長および機能の刺激、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞によるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの合成、ＩＬ−４が介在するＩＦＮ−γ抑制の低下、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋リンパ球の細胞毒性活性の増加、ＩＬ−１２受容体のβ１鎖およびβ２鎖の発現の刺激、抗血管新生活性が挙げられる。好ましくは、改変体のＩＬ−１２活性は、例えば、Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、２００７［Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．４７（６）：８０７−８１５］に記載されているアッセイを用いて決定されるような抗腫瘍免疫を高める能力を測定することによって決定される。
【００６１】
本発明によるベクター、ウイルスゲノムおよびビリオン
本発明による遺伝子構築物は、単離された形態で存在していてもよい。しかし、遺伝子構築物の操作および繁殖を容易にするために、構築物をベクターに組み込むのが簡便である。したがって、本発明の別の態様は、本発明の遺伝子構築物を含むベクターに関する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子を細胞内で操作または導入し得る媒体を指す。ベクターは、線形または環状のポリヌクレオチドであってもよく、または、もっと大きなポリヌクレオチドまたは任意の他の種類の構築物（例えば、ウイルスゲノムに由来するＤＮＡまたはＲＮＡ、ビリオンであってもよく、またはＤＮＡを細胞内で操作するか、または細胞内に導入することができる任意の他の生物学的構築物であってもよい。「組み換えベクター」および「組み換え系」という表現は、「ベクター」という用語と相互に置き換え可能に使用されてもよいことが理解される。当業者は、ベクターが、繁殖に適したクローニングベクターであってもよく、接合体を精製するのに適した異なる異種有機体中で適切なポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物または発現ベクターを得るためのベクターであってもよいため、使用可能なベクターの種類について制限はないことに気づくだろう。したがって、本発明の適切なベクターとしては、原核生物内の発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびこれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージおよび「シャトル」ベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８、酵母内の発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミド型のベクター、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドおよび同様のもの、昆虫細胞内の発現ベクター、例えば、ｐＡＣ群およびｐＶＬ群のベクター、植物内の発現ベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ群および同様のものに由来するベクター、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスおよびレンチウイルス）および非ウイルスベクターに由来するもっと高度な真核細胞内の発現ベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌが挙げられる。
【００６３】
本発明のベクターを使用し、このベクターによって形質転換され、トランスフェクトされ、または感染されやすい細胞を形質転換するか、トランスフェクトするか、または感染させてもよい。この細胞は、原核生物であってもよく、真核生物であってもよい。一例として、ＤＮＡ配列が導入されるベクターは、プラスミドであってもよく、または、宿主細胞に導入されたら、この細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体（または複数の染色体）とともに複製するベクターであってもよい。このベクターを得ることは、当業者が既知の従来からある方法によって行われてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、上に引用）。
【００６４】
したがって、本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含む細胞に関する。この目的のために、上述の細胞が、本発明によって与えられる構築物またはベクターによって形質転換され、トランスフェクトされるか、または感染される。形質転換されるか、トランスフェクトされるか、または感染された細胞は、当業者が既知の従来からある方法によって得られてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、上に引用）。特定の実施形態では、上述の宿主細胞は、適切なベクターでトランスフェクトされているか、または感染した動物細胞である。
【００６５】
本発明の接合体を発現させるのに適した宿主細胞としては、これらに限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および微生物に由来する細胞が挙げられる。微生物細胞としては、これらに限定されないが、グラム陽性菌由来の細胞、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のような種に由来する細胞、グラム陰性菌由来の細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のような種に由来する細胞が挙げられる。真菌細胞としては、好ましくは、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）に由来する細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、これらに限定されないが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられる。植物細胞としては、特に、栽培植物（例えば、穀類、医療用植物、観賞用植物または球根）由来の細胞が挙げられる。本発明に適した哺乳動物細胞としては、上皮細胞株（ブタなど）、骨肉腫細胞株（ヒトなど）、神経芽腫細胞株（ヒトなど）、上皮性腫瘍（ヒトなど）、グリア細胞（マウスなど）、肝細胞株（サル由来など）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＮＴＥＲＡ−２  ＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ株のＤ３細胞、ヒト胚幹細胞、例えば、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７細胞、ｈＭＳＣ細胞が挙げられる。
【００６６】
または、本発明の遺伝子構築物は、組み換えウイルスゲノムの一部分であってもよい。したがって、別の形態の実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子構築物を含む組み換えウイルスゲノムに関する。「ウイルスゲノム」という用語は、本明細書で使用する場合、完全であるか、または必須ではないエレメントが除去され、必須のエレメントが保存されているような様式で操作されているかどうかにかかわらず、標的細胞内で目的のヌクレオチド配列を感染させ、形質導入し、導入するのに十分な機能性を維持しているウイルスの遺伝的相補体を指す。
【００６７】
好ましい態様において、本発明の構築物を含むウイルスゲノムは、組み換えアデノ随伴ウイルスのゲノムである。本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＶＶ）という用語は、任意の血清型のＡＡＶを含む。一般的に、ＡＡＶの血清型は、アミノ酸および核酸のレベルで顕著なホモロジーを有するゲノム配列をもち、同一の遺伝的機能を与え、物理的および機能的な観点で本質的に等価なビリオンを与え、実質的に同じ機構によって複製し、整列する。具体的には、本発明を、ＡＡＶの血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現時点で知られているか、または将来的に発見されるであろう任意の他のＡＡＶを用いて行ってもよい。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。近年、ＡＡＶからクローン化された多くの新規の推定血清型が同定されている（例えば、Ｇａｏら、（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：６３８１−６３８８；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：３７５−３８３を参照）。ＡＡＶのいくつかの血清型および自律的に増殖するパルボウイルスのゲノム配列、および末端逆位配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野の技術常識として知られている。このような配列は、文献または公共のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）中に見つけることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照。これらに関する情報は、バルボウイルスおよびＡＡＶに由来する核酸配列およびアミノ酸配列の教示について、本明細書に参考として組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３９；Ｘｉａｏら（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら（１９８６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら（２００４）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：３��５−３８３；国際特許公開第ＷＯ  ００／２８０６１号、第ＷＯ  ９９／６１６０１号、第ＷＯ  ９８／１１２４４号；米国特許第６１５６３０３号も参照。これらに関する情報は、ＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列の記載について、本明細書に参考として組み込まれる。
【００６８】
典型的には、「組み換えＡＡＶゲノム」（または「ｒＡＡＶゲノム」）は、目的のポリヌクレオチド、目的の遺伝子または「導入遺伝子」のうち、１つ以上の配列を含むベクターを指し、バルボウイルスまたはＡＡＶに由来する少なくとも１つの末端逆位配列配列（ＩＴＲ）にはさまれている。このようなｒＡＡＶベクターは、このベクターが、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の産物（すなわち、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞中に存在するとき、感染性ウイルス粒子内で複製され、パッケージングされてもよい。ｒＡＡＶベクターが、大きな核酸構築物（例えば、染色体または別のベクター、例えば、クローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドまたはバキュロウイルス）に組み込まれるとき、ｒＡＡＶベクターは、典型的には、「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶのパッケージング機能および必要なヘルパー機能が存在する状態で、複製およびカプシド形成によって「レスキュー」されてもよい。
【００６９】
したがって、好ましい態様において、本発明の組み換えウイルスゲノムは、本発明の遺伝子構築物と、ＡＡＶ由来の少なくとも１つのＩＴＲとを含む。好ましくは、本発明の遺伝子構築物は、ＡＡＶ由来のＩＴＲにはさまれている。末端逆位配列（ＩＴＲ）は、典型的には、ＡＡＶベクターの中に少なくとも２つのコピーに存在し、典型的には、本発明の遺伝子構築物の両側に存在する。典型的には、ＩＴＲは、本発明の遺伝子構築物の５’末端および３’末端に位置していると思われるが、遺伝子構築物に隣接している必要はない。この末端反復は、同じであってもよく、互いに異なっていてもよい。「末端反復」という用語は、任意のウイルス末端反復および／またはヘアピン構造を形成し、末端逆位配列として作用する部分的または完全に合成の配列、例えば、Ｓａｌｍｕｌｓｋｉら、米国特許５４７８７４５号に記載されているような「ダブルＤ配列」を含む。「ＡＡＶの末端反復」は、任意のＡＡＶから誘導されてもよく、これらに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２、または現時点で知られているか、または将来的に開発されるであろう他のＡＡＶから誘導されてもよい。ＡＡＶの末端反復は、野生の配列である必要はなく（例えば、野生の配列が、挿入、欠失、先端の切断またはナンセンス突然変異によって変わっていてもよい）、一方、末端反復は、例えば、複製、スプライシング、ウイルスのパッケージング、組み込みおよび／またはプロウイルスのレスキュー、および同様の機能のような望ましい機能に介在する。ベクターゲノムは、ＡＡＶの１つ以上の（例えば２つの）末端反復を含んでいてもよく、この末端反復は、同じであってもよく、互いに異なっていてもよい。さらに、ＡＡＶの１つ以上の末端反復は、ＡＡＶカプシドのような同じＡＡＶ血清型を有していてもよく、異なっていてもよい。特定の形態の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２、具体的には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ４の末端反復を含む。好ましい態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来していてもよく、配列番号９（５’−ＩＴＲ）および配列番号１０（３’−ＩＴＲ）によって特定されてもよい。
【００７０】
カプシド遺伝子をコードする核酸配列が、パッケージング細胞または第２のベクターによってトランスで与えられることが好ましいが、本発明は、上述のポリヌクレオチド配列をパッケージングするカプシドの１つ以上のタンパク質をコードする配列をさらに含むＡＡＶゲノムを用いることも考慮している。本発明の観点で使用されるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２血清型のいずれかに由来していてもよく、より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、または例えば、カプシド混合技術およびＡＡＶカプシドライブラリから得られたＡＡＶに似た新しく開発された粒子であってもよい。カプシドタンパク質およびＩＴＲをコードする配列が、異なるＡＡＶ血清型に由来する場合、ＡＡＶゲノムは、国際特許公開第ＷＯ  ００／２８００４号およびＣｈａｏら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００、２：６１９）に記載されているように、「ハイブリッド」ＡＡＶゲノムとして知られている（つまり、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶの末端反復が、異なるＡＡＶに由来するもの）。本明細書に記載されているように、ｒＡＡＶベクターは、現在知られているか、または将来開発されるであろう適切な任意のｒＡＡＶベクターであってもよい。または、カプシド遺伝子をコードする配列は、このカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのパッケージング細胞内で同時トランスフェクションによってトランスで与えられてもよい。好ましい態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ４に由来するＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８に由来する１つ以上または全部のカプシド遺伝子とを含んでいる。
【００７１】
場合により、本発明のＡＡＶゲノムは、Ｒｅｐタンパク質をコードするさらなる配列を含んでいてもよい。Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８およびＲｅｐ５２／４０）をコードする配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ４に由来する。ＡＡＶのＲｅｐ配列およびＩＴＲ配列は、特に、ほとんどの血清の中に保存されている。いくつかのＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば、同一性が８９％より大きく、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６のヌクレオチド配列の全体の同一性は、ゲノムレベルで約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：９３９−９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列およびＩＴＲが、有効なトランス補体であり（すなわち、互いに機能的に代替物であり）、哺乳動物細胞中のＡＡＶ粒子の産生において他の血清型の対応する配列であることはよく知られている。ＵＳ２００３１４８５０６号は、ＡＡＶのＲｅｐ配列およびＩＴＲが、昆虫細胞のＡＡＶの他のＲｅｐ配列およびＩＴＲの有効なトランス補体でもあることを開示している。
【００７２】
ＡＡＶのＶＰタンパク質が、ＡＡＶビリオンの向細胞性を決定づけることはよく知られている。ＶＰタンパク質をコードする配列は、ＡＡＶの異なる血清型の中で、Ｒｅｐタンパク質およびゲノムよりも、保存されている配列が顕著に少ない。Ｒｅｐ配列およびＩＴＲが、他の血清型の対応する配列をトランスに相補する能力によって、ＡＡＶのある血清型（例えば、ＡＡＶ５）のカプシドタンパク質と、別の血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ配列および／またはＩＴＲ配列とを含む偽型ｒＡＡＶ粒子を産生することができる。このような偽型ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部分である。
【００７３】
本発明の別の態様は、適切なパッケージング細胞内で本発明のウイルスゲノムを発現することによって得ることができるビリオンに関する。「ビリオン」、「組み換えウイルス粒子」および「ウイルスベクター」という用語は、本明細書で相互に置き換え可能に使用され、カプシド中、また、場合により、カプシドの周囲にある脂質エンベロープ中にパッケージングされたウイルスゲノムを含む複製欠損性の感染性ウイルス粒子を指す。好ましい態様において、ビリオンは、ＡＡＶビリオンである。別の形態の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターをパッケージングすることによってビリオンが得られる場合、本発明のビリオンは、「組み換えＡＡＶビリオン」である。「組み換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」という用語は、本明細書で使用する場合、両端をＡＡＶのＩＴＲではさまれた本発明の遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドをカプシドに封入したＡＡＶタンパク質骨格で構成される複製欠損性の感染性ウイルスを指す。
【００７４】
「Ｃａｐタンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、ＡＡＶに由来する天然Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の機能的活性の例としては、カプシドの生成を誘発し、モノカテナリー（ｍｏｎｏｃａｔｅｎａｒｙ）ＤＮＡの蓄積を促進し、ＡＡＶ由来のＤＮＡをカプシド内にパッケージングしやすくし(すなわち、カプシド形成)、細胞受容体を結合し、ビリオンを宿主細胞に導入しやすくする能力が挙げられる。好ましい態様において、ｃａｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶ８のｃａｐ遺伝子に対応する。ＡＡＶビリオンの骨格は、正２０面体対称形を示し、通常は主要なＣａｐタンパク質、通常はもっと小さなＣａｐタンパク質、１つまたは２つの少数Ｃａｐタンパク質を含む。
【００７５】
「Ｒｅｐタンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、ＡＡＶ由来の天然Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能的活性」は、ＡＡＶ由来のＤＮＡ複製源を認識、結合およびスプライシングすることによってＤＮＡ複製を促進すること、ＤＮＡヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性である。さらなる機能としては、ＡＡＶプロモーター（または他の異類）の転写の調節、および宿主染色体へのＡＡＶ  ＤＮＡの部位特異的な組み込みが挙げられる。好ましい態様において、ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２由来のｒｅｐ遺伝子に対応する。
【００７６】
当業者は、本発明のＡＡＶビリオンが、ＡＡＶの任意の血清型に由来するカプシドタンパク質を含んでいてもよいことを理解するだろう。しかし、ＡＡＶの既知の血液型が、異なる細胞に対する異なる向性を有するために、ＡＡＶビリオンは、肝細胞の分布のためにもっと十分なカプシドタンパク質を含有するだろう。肝細胞の形質導入のために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８およびＡＡＶ５由来のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが好ましい（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２００７、Ｂｌｏｏｄ  １０９：１４１４−１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａら、２００６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １８６：６５−７３）。
【００７７】
Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８およびＲｅｐ５２／４０）をコードする配列は、ＡＡＶの任意の血清型に由来していてもよいが、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ４に由来する。しかし、本発明の観点で使用されるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、４２の既知の血清型のいずれか、より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８から得られてもよい。
【００７８】
また、本発明は、カプシドと、組み換えウイルスゲノムとを含み、外来性の標的配列が天然カプシドに挿入されているか、または置換されているようなビリオンも考慮している。ビリオンは、好ましくは、カプシドの外来性標的配列の置換または挿入によって標的化されている（つまり、特定の１つ以上の種類の細胞を標的とする）。言い換えると、外来性標的配列は、好ましくは、ビリオンに改変された向性を与える。さらなる代わりの説明として、標的配列は、細胞を標的とするベクターの分布効率を高める。
【００７９】
外来性標的配列は、カプシドサブユニット全体または一部分、または２つ以上のカプシドサブユニットを変えるか、または置換してもよい。さらなる代わりのものとして、２つ以上の外来性標的配列（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の配列）が、ビリオンカプシドに導入されてもよい。代替形態の実施形態では、少数カプシドサブユニット内の挿入または置換が好ましい（例えば、ＡＡＶのＶＰ１およびＶＰ２）。ＡＡＶカプシドの場合、ＶＰ２およびＶＰ３内の挿入または置換も好ましい。
【００８０】
より好ましい態様において、外来性標的配列は、ペプチドまたはタンパク質をコードするアミノ酸配列であってもよく、このアミノ酸配列は、ビリオンの向性を変更するために、ビリオンカプシドに挿入または置換される。天然ビリオンの向性は、アミノ酸配列を挿入または置換することによって、減る場合もあり、なくなる場合もある。または、外来性アミノ酸配列を挿入または置換することで、ビリオンが特定の細胞種を標的とするようにしてもよい。外来性標的配列は、ビリオンの向性を変えるタンパク質またはペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であってもよい。特定の形態の実施形態では、標的ペプチドまたは標的タンパク質は、天然由来であってもよく、または完全または部分的に合成であってもよい。例示的なペプチドおよびタンパク質としては、アポリポタンパク質ＥについてＳｒ−Ｂ１受容体に結合可能なリガンド、ガラクトースおよびラクトースに特異的なレシチン、低密度リポタンパク質受容体に由来するリガンド、アシアロ糖タンパク質（末端がガラクトース）に由来するリガンドおよび類似のものを含む、肝細胞中に存在する細胞表面受容体に結合するリガンドおよび他のペプチドが挙げられる。
【００８１】
または、外来性標的配列は、抗体であってもよく、抗体を認識する抗原群であってもよい。「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むあらゆる種類の免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の種に由来するものであってもよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマまたはヒト由来であってもよく、またはキメラ抗体であってもよい。「抗体」という用語は、当業者にとって既知の二重特異性抗体や「ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）」抗体も含む。本発明の範囲内の抗体フラグメントとしては、例えば、フラグメントＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ、および異なるＩｇＧ抗体から得られる対応するフラグメントが挙げられる。このようなフラグメントは、当該技術分野で知られる技術によって作られてもよい。本発明のｒＡＡＶを標的化するのに使用され得る肝臓の表面マーカーとしては、これらに限定されないが、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＬＤＬ表面抗原が挙げられる。
【００８２】
ビリオンカプシド中に挿入される外来性アミノ酸配列は、ビリオンの精製または検出を容易にする配列であってもよい。本発明のこの態様によれば、外来性アミノ酸配列が、改変されたバルボウイルスビリオンを変更する必要はない。例えば、外来性アミノ酸配列は、当業者なら知っているように、ニッケルカラムでビリオンを精製するのに有用なポリヒスチジン配列を含んでいてもよく、または、抗原性ペプチドまたはタンパク質を使用し、標準的な免疫精製技術によってビリオンを精製してもよい。または、アミノ酸配列は、アフィニティ精製または当該技術分野で既知の任意の他の方法（例えば、粒径、密度、電荷、または異なる等電点に基づく精製技術、イオン交換クロマトグラフィー、またはペプチドクロマトグラフィー）によって改変されたビリオンを精製するために使用可能な受容体リガンドまたは任意の他のペプチドまたはタンパク質をコードしてもよい。任意のカプシドタンパク質に外来性標的配列または精製配列を挿入してもよいが、ただし、この挿入は、タンパク質を整列させる能力には関与しない。具体的には、ＡＡＶの少量Ｃａｐサブユニット（例えば、ＡＡＶのＶＰ１およびＶＰ２サブユニット）に外来性アミノ酸配列を挿入することが好ましい。または、ＶＰ２またはＶＰ３に挿入を行うことも可能である。宿主の応答を減らすように、好ましいＡＡＶビリオンを改変してもよい（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３−２６０４）、ＵＳ２００８０００８６９０、およびＺａｌｄｕｍｂｉｄｅおよびＨｏｅｂｅｎ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８：２３９−２４６）を参照）。
【００８３】
本発明の組み換えビリオンは、ＡＡＶを調製する標準的な技術を用いて調製されてもよい。典型的には、ｒＡＡＶは、本発明にしたがってウイルスゲノムを適切な宿主細胞に導入し、この細胞内で、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質、ＡＡＶのｃａｐタンパク質、場合により、ＡＡＶが複製に依存するウイルスおよび／または細胞の機能をコードする核酸配列を同時発現させることによって調製される。
【００８４】
パッケージングを容易にするために、組み換えベクターゲノムは、一般的に、野生型のゲノムサイズの約８０％〜１０５％の大きさであり、適切なパッケージングシグナルを含む。ＡＡＶカプシドへのパッケージングを容易にするために、ゲノムは、好ましくは、約５．２ｋｂ以下の大きさである。他の形態の実施形態では、ゲノムは、好ましくは、長さが約３．６ｋｂ、３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、４．２ｋｂまたは４．４ｋｂより大きく、および／または約５．４ｋｂ、５．２ｋｂ、５．０ｋｂまたは４．８ｋｂ未満である。言い換えると、異種ヌクレオチド配列は、典型的には、ＡＡＶカプシドによって組み換えゲノムのパッケージングを容易にするために、長さが５．０ｋｂ未満（より好ましくは、約４．８ｋｂ未満、さらにもっと好ましくは、約４．４ｋｂ未満、さらにもっと好ましくは、約４．２ｋｂ未満）であろう。
【００８５】
本発明のビリオンを産生するのに必要な核酸配列は、いわゆる「ＡＡＶヘルパー機能」であり、ＡＡＶの主要なＯＲＦの片方または両方（つまり、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする領域、またはその機能的ホモログ）を含む。本発明の方法で使用されるｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をコードする適切な核酸配列については、本発明のビリオンに関し、上に詳細に記載している。しかし、当業者は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をコードするヘルパー配列が、いくつかの組み合わせで１種、２種またはそれ以上のベクターによって与えられてもよいことに気づくだろう。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語としては、適切な制御エレメントと会合して複製することが可能であり、遺伝子配列を細胞間で移動してもよい任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどが挙げられる。したがって、この用語には、クローニング媒体および発現媒体、およびウイルスベクターが含まれる。または、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子は、これらの遺伝子を安定な様式で発現するパッケージング細胞によって与えられてもよい（例えば、Ｇａｏら（１９９８）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２３５３；Ｉｎｏｕｅら（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７０２４；米国特許第５８３７４８４号；ＷＯ  ９８／２７２０７号；米国特許第５６５８７８５号；ＷＯ  ９６／１７９４７号を参照）。
【００８６】
好ましい態様において、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、通常はＡＡＶヘルパー機能ベクターと呼ばれる１個の個別のベクターによって与えられてもよい。本発明とともに用いるのに適したベクターの例としては、米国特許第６００１６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９、米国特許第６１５６３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられ、これらに関する完全な情報は、本明細書に参考として組み込まれる。
【００８７】
別の好ましい態様において、さらなる配列は、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質および／またはカプシドタンパク質をコードするハイブリッドヘルパーウイルスであってもよいヘルパーアデノウイルスの形態である。ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を発現するＡｄ／ＡＡＶハイブリッドヘルパーベクター、およびこれらの試薬を用いてＡＡＶ予備品を製造する方法は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５５８９３７７号、米国特許第５８７１９８２号、米国特許第６２５１６７７号、米国特許第６３８７３６８号を参照)。好ましくは、本発明のハイブリッドＡｄは、ＡＡＶのカプシドタンパク質（つまり、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を発現する。これに代えて、またはこれに加えて、ハイブリッドアデノウイルスは、ＡＡＶの１つ以上のＲｅｐタンパク質（つまり、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８）を発現してもよい。ＡＡＶ配列は、組織特異的または誘発性のプロモーターと作動可能に会合していてもよい。
【００８８】
組み換えビリオンを生成するための任意要素は、ＡＡＶ由来ではないウイルス機能および／またはＡＡＶが複製によって異なる細胞機能（すなわち、「補助機能」）をコードする核酸配列を含んでいてもよい。補助機能としては、これらに限定されないが、ＡＡＶ遺伝子の転写活性化、ＡＡＶ  ｍＲＮＡの各段階に特異的な調節、ＡＡＶ  ＤＮＡの複製、ＡＡＶカプシドのｃａｐ発現産物およびその集合体の合成に関与する機能群を含む、ＡＡＶの複製に必要な機能が挙げられる。ウイルスに由来する補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純ヘルペスウイルスとは異なる）およびワクチンウイルスのような既知の任意のヘルパーウイルスに由来するものであってもよい。典型的には、本発明のＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、ヘルパーウイルスＤＮＡ配列として、Ａｄ５のＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子を含み、これらの遺伝子は、独国特許出願第ＤＥ１９６  ４４  ５００．０−４１号に開示されているｐＤＧプラスミドに由来してもよく、それぞれの元々のプロモーターまたは異種プロモーターによって制御可能である。
【００８９】
または、ＡＡＶの構造要素を発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでカプシド形成が起こるような様式で、本発明のウイルスゲノムと接触させることができる。構造タンパク質を調製するために、任意の種類の適切な宿主細胞を使用してもよい。好ましくは、Ｕｒａｂｅら（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２、１３：１９３５−１９４３；ＵＳ６７２３５５１およびＵＳ２００４０１９７８９５）に記載されるような昆虫細胞を使用する。ｒＡＡＶの構造要素を発現するのに適した細胞株としては、これらに限定されないが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、または蚊の細胞株（例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の細胞株）が挙げられる。好ましい昆虫細胞または細胞株は、バキュロウイルスに感染しやすい昆虫種由来であり、例えば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲｌ、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−Ｉ、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍＩ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（商標）（ＵＳ  ６，１０３，５２６；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ＣＴ、ＵＳＡ）である。
【００９０】
本発明のビリオンを作ったら、これらの要素から、ビリオンの一部になっていない要素を分離するために精製することができる。典型的には、ビリオンを、密度勾配（典型的には、ヨージキサノール勾配）を用い、残りの要素と分離する。ｒＡＡＶを含有する画分を回収した後、その後の精製は、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーであってもよい）を用いることができる。この種の精製は、ＡＡＶの血清型１および５のタンパク質を含むカプシドが入ったビリオンを精製するのに好ましい。これらの血清型は、ヘパリンカラムに結合しないからである。
【００９１】
ｒＡＡＶ２ビリオンを精製するために、ヘパリン−寒天クロマトグラフィーが好ましい。例えば、米国特許第６１４６８７４号を参照。
【００９２】
また、ビリオンを、密度勾配による遠心分離を用いずに、クロマトグラフィーを用いて精製する。一例として、感染した細胞の溶解物を、ｒＡＡＶビリオンを精製するために直接クロマトグラフィーにかけてもよい。クロマトグラフィーを含むｒＡＡＶベクターを大量製造する方法としては、Ｐｏｔｔｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２００２、３４６：４１３-４３０）を参照。
【００９３】
組み換えビリオンを用いてもよく、または、ビリオンベクターに、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を用い、さらなるアフィニティ精製工程を行ってもよい。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。特に適切な抗体は、ラクダ科の単鎖抗体またはそのフラグメントであり、例えば、ラクダまたはラマから得てもよい(例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２を参照）。好ましくは、ｒＡＡＶをアフィニティ精製するための抗体は、ＡＡＶのカプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体であり、エピトープは、好ましくは、ＡＡＶの２種類以上の血清型のカプシドタンパク質中に存在するエピトープである。例えば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドに特異的に結合するという原理に基づいて産生されるか、または選択されてもよいが、同時に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３およびＡＡＶ５のカプシドにも特異的に結合してよい。
【００９４】
目的のポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法
本発明の遺伝子構築物、ベクターおよびビリオンは、肝臓由来の細胞内で目的のポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現することができる。したがって、本発明の別の態様は、肝臓由来の細胞内で目的のポリヌクレオチドを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、
（ｉ）前記細胞と、本発明の遺伝子構築物、または本発明のベクター、または本発明のウイルスゲノム、または本発明のビリオンとを、前記構築物、前記ベクターまたは前記ビリオンが前記細胞に入り込むのに十分な条件下で接触させる工程と、
（ｉｉ）前記細胞と誘発剤とを、前記目的のポリヌクレオチドの発現が起こるのに必要な時間、接触させる工程とを含む。
【００９５】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を用いて目的のポリヌクレオチドを発現させることが可能な肝臓由来の細胞としては、肝細胞の一次培養物から得られる細胞だけではなく、肝臓由来の不死化細胞、例えば、ＨｅｐＧ２肝癌、ＣＯＬＯ  ５８７、ＦａＯ、ＨＴＣ、ＨｕＨ−６、ＨｕＨ−７、ＰＬＣ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＢＰＲＣＬ、ＭＣＡ−ＲＨ７７７、ＢＥＬ−７４０４、ＳＭＭＣ−７２２１、Ｌ−０２、ＣＹＮＫ−１、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＭＣＡ−ＲＨ８９９４から得られる細胞株、およびウイルスまたは細胞の癌遺伝子の発現によって実験的に不死化させた株、例えば、Ｆａ２Ｎ−４株およびＥａ１Ｃ−３５株から得られる細胞が挙げられる。
【００９６】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現方法は、肝臓由来の細胞を、遺伝子構築物、ベクターまたはビリオンが細胞に入り込むのに十分な条件下で本発明の遺伝子構築物、ベクター、ウイルスゲノムまたはビリオンと接触させておく第１の工程を含む。核酸を細胞内部へ導入しやすくするのに適した方法としては、これらに限定されないが、裸のＤＮＡを直接注入、バリスティック法、リポソームによる移動、受容体による移動（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウムを用いた沈殿が挙げられる（例えば、ＵＳ  ４９７０１５４号、ＷＯ  ９６／４０９５８号、ＵＳ  ５６７９５５９号、ＵＳ  ５６７６９５４号、ＵＳ  ５５９３８７５号を参照）。遺伝子構築物がビリオンの形態で供給される場合には、遺伝子物質の細胞への導入は、ビリオンが肝細胞表面に結合し、遺伝子物質を内部に放出する固有の能力によって行われる。この観点で、上述のように、すでに記載されているように、カプシドタンパク質が血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ８およびＡＡＶ５に属するｒＡＡＶを使用することが好ましい（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２００７、Ｂｌｏｏｄ  １０９：１４１４−１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａら、２００６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １８６：６５−７３）。
【００９７】
本発明の方法の第２の工程では、本発明の遺伝子構築物を内部に含む細胞を、誘発剤と接触させ、その結果、転写活性化因子および目的のポリヌクレオチドの転写が活性化される。誘発剤の最適濃度、および細胞を誘発剤とともにインキュベーションする最適時間は、実験的に決定されなければならない。
【００９８】
誘発剤に応答する目的のポリヌクレオチドの発現は、サンプル中のｍＲＮＡ量を決定する分野の当業者には既知の技術（ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットおよび同様の技術）またはタンパク質の量を決定する分野の既知の技術（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡおよび同様の技術）を用いて決定されてもよい。
【００９９】
本発明の医薬組成物および治療への使用
本発明の化合物は、治療目的をもつ産物を一時的に制御された状態で肝臓特異的に発現させるのに有用である。したがって、本発明の別の態様は、治療に有効な量の本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明のビリオンと、医薬的に許容される媒体（担体）または賦形剤とを含む医薬製剤に関する。
【０１００】
本発明の別の態様は、医薬で使用される、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、または本発明のビリオンに関する。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、腸内、局所、舌下または直腸経路を含む任意の経路で投与してよい。有効な原理による異なる投与形態、使用される賦形剤、これらの製造方法の総説は、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ」、Ｃ．  Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、１９９３、および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集）、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ、ＵＳＡ（２０００）中に見つけることができる。当業者に知られた医薬的に許容される担体の例が存在し、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルション）、さまざまな種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。上述の担体を含む組成物を、当該技術分野で既知の従来からある方法によって配合してもよい。
【０１０２】
核酸（本発明のポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子構築物またはウイルスベクター）を投与する場合、本発明は、上述の核酸を投与するために特に調製された医薬組成物を考慮している。医薬組成物は、裸の形態で（つまり、核酸が体内のヌクレアーゼによって分解しないように保護する化合物が存在しない状態で）核酸を含んでいてもよく、このとき、トランスフェクションに使用される試薬に関連する毒性がないという利点がある。この裸の化合物を投与する適切な経路としては、血管内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所および経口が挙げられる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、２００２、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２１：８５７−８６７）。または、核酸を、リポソームの一部分として、コレステロールと接合して、または細胞膜を介した移動を促進することが可能な化合物（例えば、ＨＩＶ−１のＴＡＴペプチドに由来するＴａｔペプチド、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のホメオドメインの第３らせん、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、ＷＯ０７０６９０９０号（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ、Ａ．ら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ、２１：９９−１０３；Ｓｃｈｗａｒｚｅ、Ｓ．Ｒ．ら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：４５−４８；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ｍ．ら、２００３、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１４３−１５０；およびＳｎｙｄｅｒ、Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ、Ｓ．Ｆ．、２００４、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）に記載されるようなアルギニンおよびペプチドのオリゴマー）と接合して投与してもよい。
【０１０３】
ビリオンが投与される場合、ビリオンの投与量および投与時間は、状況によって変わると思われ、それぞれの場合に、当業者が標準的な技術を用いて最適化しなければならない。したがって、単回投与によって、例えば、このような治療を受ける患者に治療上の利点を与えるのに十分な量の感染性粒子を１回注射することによって、治療に有効な量の本発明のビリオンを投与することができる。または、ある状況では、ビリオン組成物の投与を管理する医師によって決定され得るように、ビリオン組成物を比較的短期間または比較的長期で複数回または連続して投与して供給することが望ましい場合がある。例えば、哺乳動物に投与される感染性粒子の数は、治療される特定の疾患または障害の治療に必要であると思われるように、約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、またはそれ以上の感染性粒子／単回投与で供給されるｍｌであってもよく、２回以上の投与に分けられてもよい。実際に、特定の形態の実施形態では、特定の治療パターンの望ましい効果を達成するために、異なるビリオンベクターの２種以上の組成物をそれ自体、または１種以上の薬物と組み合わせて投与することが望ましい場合がある。ほとんどのビリオン系遺伝子治療パターンでは、肝臓特異的なプロモーターを使用して目的のポリヌクレオチドの発現を制御すると、従来の遺伝子治療プロトコルと比較して、本発明のビリオンを用いた場合に必要な感染性粒子の名称が少なくなるだろう。
【０１０４】
別の実施態様において、本発明の組成物およびポリヌクレオチドは、Ｌｉｕ、Ｆ．ら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９９、６：１２５８−６６）に記載されているように、いわゆる「hydrodynamic administration」にて投与される。この方法によれば、化合物が、血管内経路によって高速かつ高用量で体内に導入され、よりよく拡散分布した高いトランスフェクションレベルが得られる。細胞内に入り込む効力は、投与される流体容積および注射速度に直接依存することがわかっている（Ｌｉｕら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５：１４３７−１４４１）。マウスの場合、３〜５秒間に１ｍｌ／体重１０ｇの値で投与が最適化された（Ｈｏｄｇｅｓら、２００３、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ、３：９１−９１８）。hydrodynamic administrationの後、ポリヌクレオチドを用い、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションすることが可能な実際の機構は、まだ完全にはわかっていない。マウスの場合、尾の静脈に投与すると、ある割合で心拍が上がり、投与した流体が上大静脈に蓄積すると考えられる。この流体は、次に、血管の開口によって臓器の血管に入った後、血管外の空間に入る。この様式で、ポリヌクレオチドは、血管と混合する前に標的臓器細胞と接触し、それにより、ヌクレアーゼによって分解する可能性が低下する。
【０１０５】
本発明による組成物を、ＲＮＡ薬剤を体重１ｋｇあたり１０ｍｇ未満、好ましくは、体重１ｋｇあたり、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５または０．００００１ｍｇ未満、２００ｎｍｏｌ未満、つまり、体重１ｋｇあたり、４．４×１０１６コピー、または体重１ｋｇあたり、１，５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５または０．０７５ｎｍｏｌ未満の投与量で投与してもよい。注射、吸入または局所投与によって単位投与量を投与してもよい。ＡＡＶビリオンが投与される場合、肝細胞に向性があるので、肝臓に入るだろうと思われるため、ＡＶＶビリオンを全身に投与してもよい。しかし、本発明の遺伝子構築物または本発明のプラスミドを投与する場合、これらは、好ましくは、例えば、Ｗｅｎら（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００４、１０、２４４−９）、Ｍｕｒａｏら（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２００２、１９、１８０８−１４）、Ｌｉｎら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００３、１０、１８０−７）、Ｈｏｎｇら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００３、５４、５１−８）、Ｈｅｒｒｍａｎｎら（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ、２００４、１４９、１６１１−７）、Ｍａｔｓｕｎｏら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００３、１０、１５５９−６６）に記載されているように、肝臓の動脈への投与または当該技術分野で既知の他の肝臓投与系によって、標的化された様式で肝臓に投与されなければならない。この組成物を、０．００００１ｍｇ〜３ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜０．００１ｍｇ、さらにもっと好ましくは、約０．０３〜３．０ｍｇ／臓器、約０．１〜３．０ｍｇ／臓器、または０．３〜３．０ｍｇ／臓器の投与量で投与してもよい。
【０１０６】
投与される本発明による組成物の投与量は、治療される状態の重篤度および応答によって変わり、数日間から数ヶ月間にわたって変わってもよく、または、状況が収まったことが観察されるまでであってもよい。最適投与量は、患者の体内での薬剤濃度を周期的に測定することによって決定されてもよい。最適投与量は、以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは動物モデルのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて得られるＥＣ５０値から決定されてもよい。単位投与量を１日に１回投与してもよく、または１日に１回未満、好ましくは、２日、４日、８日または３０日ごとに１回未満投与してもよい。または、初期投薬の後、１回または数回の維持投薬を一般的には初期投与量よりも少ない量で投与することができる。維持スキームは、１日あたり０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／体重ｋｇの範囲の投与量、例えば、１日あたり１０、１、０．１、０．０１、０．００１または０．００００１ｍｇ／体重ｋｇの投与量で患者を治療することを含んでいてもよい。維持投薬は、好ましくは、最大で５日、１０日または３０日ごとに投与される。治療は、所定期間続けられなければならず、この期間は、患者が患う変化の種類、その重篤度、患者の状態によって変わるだろう。治療の後、疾患が治療に応答しない場合には、投与量を増やさなければならないかどうかを決定するために、患者の変化を監視しなければならず、または、疾患の進行がみられる場合、または望ましくない二次的影響がみられる場合には、投与量を減らす。
【０１０７】
特定の状況に応じて、１日の投与量を単回投薬または２回以上の投薬で投与してもよい。繰り返し投与または頻回投与が望ましい場合、投与デバイス（例えば、ポンプ、半永久性カテーテル（静脈内、腹腔内、嚢内または関節内）または容器）の移植が推奨される。
【０１０８】
構築物を含む細胞が誘発剤と接触した状態にあるときに、本発明による構築物が制御された様式で目的のポリヌクレオチドを発現することができることから、本発明による遺伝子構築物の治療的使用のために、誘発剤を投与する第２の工程が検討される。誘発剤は、プロドラッグ、塩、溶媒和物または包接化合物の形態で投与されてもよく、単離された形態またはさらなる活性薬剤と組み合わせた形態で投与されてもよい。本発明で使用するのに好ましい賦形剤としては、糖、デンプン、セルロース、ゴムおよびタンパク質が挙げられる。固体投与医薬形態（例えば、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、坐剤、再構築して液体形態を与え得る結晶またはアモルファスの滅菌固体など）、液体投与医薬形態（例えば、溶液、懸濁物、エマルション、エリキシル剤、ローション、軟膏など）または半固体投与医薬形態（ゲル、軟膏、クリームおよび類似の形態）になるように配合された誘発剤が投与されてもよい。誘発剤の投与量、投与経路および遺伝子構築物またはビリオンを投与するまでの待機時間、誘発剤の投与は、当業者によってそれぞれの特定の用途において通常の作業によって決定されてもよい。
【０１０９】
本発明による構築物は、肝臓で一時的または場所的に制御された発現を可能にする能力が与えられているため、これらの構築物は、肝疾患の治療および予防に有用な機能をもつポリペプチドを肝臓で発現させるのに特に適している。したがって、本発明の別の態様は、肝疾患の治療に使用される、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明のウイルスゲノム、本発明のビリオン、または本発明の医薬組成物に関する。または、本発明は、肝疾患の治療に使用される薬物の製造における、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明のウイルスゲノム、本発明のビリオン、または本発明の医薬組成物の使用に関する。または、本発明は、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明のウイルスゲノム、本発明のビリオン、または本発明の医薬組成物を、これを必要とする被検体に投与することを含む、肝疾患を治療するように設計された方法に関する。
【０１１０】
「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、この用語が適用される障害または状態の進化、またはこのような障害または状態の１つ以上の症状を逆行させ、向上させ、または抑制する作用を指す。
【０１１１】
「予防」という用語は、本明細書で使用する場合、この用語が適用される疾患、障害または状態、またはこのような疾患、障害または状態の１つ以上の症状の発生または存在を予防するか、または開始または再発を遅らせる作用を指す。
【０１１２】
本発明の構築物、ベクターおよびビリオンを用いることによって十分に治療または予防され得る肝臓障害は表１に示されるとおりであり、また、ともに、目的のポリヌクレオチドによってコードされるべきポリペプチドも示されるとおりである。
【表１】
2014503173.tif 000002
【表２】
2014503173.tif 000003
【０１１３】
好ましい態様において、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明のウイルスゲノム、本発明のビリオン、または本発明の医薬組成物を肝癌の治療に使用する場合、目的のポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２または機能的に等価な改変体をコードする。「肝癌」という用語は、本明細書で使用する場合、任意の種類の原発性腫瘍から生じる癌を含む原発性の癌および続発性の癌の両方を指す。肝癌の種類としては、これらに限定されないが、肝細胞癌（時に、ヘパトーマまたはＨＣＣ）、癌腫、線維層板状ＨＣＣ、胆管癌、血管腫、肝臓アデノーマ、限局性結節性過形成、血管肉腫および肝芽腫が挙げられる。
【０１１４】
（一般的な用途のための本発明の構築物およびベクター）
当業者は、本発明の両方向性肝臓特異的なプロモーターが、必ずしも、転写活性化因子および目的のポリヌクレオチドをさらに含む遺伝子構築物の一部分を形成しなければならないわけではなく、他のベクター、ウイルスゲノムまたは遺伝子構築物の必須エレメントとして単離中に使用されてもよいことに気づくだろう。
【０１１５】
したがって、本発明の別の態様は、
（ｉ）誘発因子が存在する状態で、活性形態で転写活性化因子に応答性の少なくとも１つのエレメントと、
（ｉｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）第２の肝臓特異的なプロモーター配列とを含んでなり、
ここで、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列は、前記誘発剤に応答性のエレメントに対して異なる方向で動作し、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、誘発剤を投与した後、転写活性因子が存在する状態で高まり、応答性のエレメントに結合する、誘発剤によって目的の２種類のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現するのに適した誘発性両方向性オペレーター−プロモーターに関する。
【０１１６】
誘発性両方向性オペレーターを構成するエレメント、具体的には、活性形態で転写活性化因子に応答性のエレメント、第１の肝臓特異的なプロモーター配列および第２の肝臓特異的なプロモーター配列は、上に詳細に記載されており、本発明の遺伝子構築物に関連して上に記載したのと同じ様に解釈される。
【０１１７】
好ましい態様において、制御可能な両方向性オペレーター−プロモーターは、転写活性化因子＋テトラサイクリンに対して応答性の少なくとも１つのエレメントを含む。さらにより好ましい態様において、テトラサイクリン応答性エレメントは、配列番号１で特定される核酸配列を含む。
【０１１８】
別の好ましい態様において、第１の肝臓特異的なプロモーター配列と第２の肝臓特異的なプロモーター配列は同じである。さらにより好ましい態様において、第１の肝臓特異的なプロモーター配列および第２の肝臓特異的なプロモーター配列は、アルブミン遺伝子プロモーターまたはその機能的に等価な改変体を含む。さらにより好ましい態様において、アルブミン遺伝子プロモーターは、配列番号２および配列番号３により成る群から選択される配列を含む。
【０１１９】
別の好ましい態様において、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターは、配列番号４を含む。
【０１２０】
したがって、本発明の別の態様は、誘発剤によって目的のポリヌクレオチドを肝臓特異的に誘発発現するのに適した遺伝子構築物に関し、この遺伝子構築物は、
（ａ）
（ｉ）誘発因子が存在下で活性形態となる、転写活性化因子に応答性の少なくとも１つのエレメントと、
（ｉｉ）第１の肝臓特異的なプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）第２の肝臓特異的なプロモーター配列とを含む、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターと、
（ｂ）前記誘発剤によって活性化され得る転写活性化因子をコードし、前記第１の肝臓特異的なプロモーター配列に作動可能に連結しているヌクレオチド配列と、前記転写活性化因子をコードする領域に対して３’側に位置しているポリアデニル化シグナルとを含んでなり、
ここで、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列が、前記誘発剤に応答性のエレメントに対して異なる方向で動作し、前記第１および第２の肝臓特異的なプロモーター配列のプロモーター活性が、前記誘発剤が存在し、かつ前記誘発性両方向性オペレーター−プロモーター内の応答性エレメントに結合する転写活性化因子が存在する状態で高まるものである。
【０１２１】
誘発性両方向性オペレーターを構成するエレメント、具体的には、誘発剤に応答性のエレメント、転写活性化因子の種類、第１の肝臓特異的なプロモーター配列、第２の肝臓特異的なプロモーター配列、ポリアデニル化シグナルは、上に詳細に記載されており、本発明の第１の遺伝子構築物に関連して上に記載したのと同じ様に解釈される。
【０１２２】
好ましい態様において、制御可能な両方向性オペレーター−プロモーターは、少なくとも１つのテトラサイクリン応答性エレメントを含む。さらにより好ましい態様において、テトラサイクリン応答性エレメントは、配列番号１で特定される核酸配列を含む。
【０１２３】
別の好ましい態様において、転写活性化因子は、逆テトラサイクリン依存性転写活性化因子である。さらにより好ましい態様において、テトラサイクリンによって活性化し得る逆転写活性化因子ｒｔＴＡは、ｒｔＴＡ−Ｍ２である。
【０１２４】
別の好ましい態様において、第１の肝臓特異的なプロモーター配列と第２の肝臓特異的なプロモーター配列は同じである。さらにより好ましい態様において、第１の肝臓特異的なプロモーター配列および第２の肝臓特異的なプロモーター配列は、アルブミン遺伝子プロモーターまたはその機能的に等価な改変体を含む。さらにより好ましい態様において、アルブミン遺伝子プロモーターは、配列番号２および配列番号３によって作られる群から選択される配列を含む。
【０１２５】
別の好ましい態様において、誘発性両方向性オペレーター−プロモーターは、配列番号４を含む。
【０１２６】
別の好ましい態様において、ポリアデニル化シグナルは、両方向性ポリアデニル化シグナルである。さらにより好ましい態様において、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ウイルス由来の両方向性ポリアデニル化シグナルである。
【０１２７】
本発明の第２の遺伝子構築物は、単離された形態で共有されてもよく、または、好ましくは、繁殖および操作を容易にするために、ベクターの一部分として供給されてもよい。好ましい態様において、ベクターは、さらに、活性化剤の添加に応答し、肝臓特異的な様式で発現可能なように、第２の肝臓特異的なプロモーター配列に対して３’側に、目的のポリヌクレオチドのクローニングを可能にする１つまたはいくつかの部位を含む。好ましくは、クローニングベクター中にクローニング部位が頻繁にあらわれるため、複数のクローニング部位を生成するようにクローニング部位をグループ分けする。したがって、「複数のクローニング部位」という用語は、本明細書で使用する場合、互いに近い位置にある２つ以上の一連の制限エンドヌクレアーゼ標的配列を含む核酸配列を指す。複数のクローニング部位は、平滑末端、５’粘着末端または３’粘着末端を有するフラグメントを挿入することができる制限エンドヌクレアーゼ標的を含む。目的のポリヌクレオチドの挿入は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されているように、標準的な分子生物学法を用いて行われる。
【０１２８】
本発明を以下の実施例を用いて以下に記載し、以下の実施例は単に具体的な特徴を有しており、いかなる場合にも本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【０１２９】
実施例１．組み換えｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃウイルスの構築および特性決定
主な目的は、投与される誘発因子の投与量を変えることによって、よい時期に導入遺伝子の発現を制御することが可能であり、具体的には、導入遺伝子の発現が肝細胞を標的とし、それによって、本発明者らの治療のための標的部位で作用し、導入遺伝子の潜在的な毒性の有害な影響を予防するＡＡＶ８に基づく誘発性ベクターを得ることであった。ＡＡＶ８が、主に肝臓で非常に効率よく形質導入するため、本発明者らは、尾の静脈を介して静脈内経路で投与する場合、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系が、上に説明した特徴を満たすかどうかを決定することにした。
【０１３０】
この系は、Ｃｈｔａｒｔｏら（Ｃｈｔａｒｔｏ、Ａ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００３．１０：８４−９４）によってすでに特性決定されているが、このときは大脳内投与されており、全身投与した後のこの系の生体内分布は知られていなかった。
【０１３１】
この目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として使用し、この遺伝子の定量に加え、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入遺伝子発現の生体内分布を分析することができた。この目的のために、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系（図２Ａ）を得るために、Ｄｒ．Ｌｉｌｉａｎｎｅ  Ｔｅｎｅｎｂａｕｍによってブリュッセルのブリュッセル自由大学の好意により供給されたプラスミドに存在するｅＧＦＰ遺伝子を、蛍ルシフェラーゼ遺伝子と置き換え、これとともに、本発明者らは、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃビリオンを製造した。
【０１３２】
１．１  ベクターの構築
具体的には、誘発性ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（ｐＡＣ１Ｍ２−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ）系を有する組み換えＡＡＶゲノムを含むプラスミドを以下の様式で作成した。ｐＡｌｂ−ｌｕｃプラスミド（Ｋｒａｍｅｒ  Ｇ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００３、７：３７５−３８５）から、５’末端にＳａｌＩ部位（センスプライマー）およびＮｏｔＩ部位（アンチセンスプライマー）を含むプライマーＡ（センスプライマー）およびＢ（アンチセンスプライマー）（Ａ：ＧＴＣＧＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＣ（配列番号１１）およびＢ：ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ（配列番号１２））を用い、ルシフェラーゼ遺伝子を増幅させた。このフラグメントを、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、上述の酵素で消化することによって抽出した。抽出したフラグメントを、上と同じ酵素であらかじめ消化しておいたｐＡＣ１Ｍ２−ＥＧＦＰベクターに挿入し（Ｃｈｔａｒｔｏ、Ａ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００３．１０：８４−９４；Ｃｈｔａｒｔｏ、Ａ．ら、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、２００７、２０４：３８７−３９９）、ｐＡＣ１Ｍ２−ｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドを得た。
【０１３３】
ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系を含むプラスミドを得たら、以下のプロトコルにしたがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中、ＰＥＩでトランスフェクトすることによってｒＡＡＶ２／８ビリオンを製造した。
【０１３４】
トランスフェクションを行う時点で７０〜８０％のコンフルエンスを達成するために、トランスフェクションの２４時間前に、直径１５０ｍｍのプレート中、８.５×１０６細胞／プレートを完全ＤＭＥＭ培地に接種した（約３０プレート／製造）。トランスフェクションの直前に、培地を１％〜２％ＤＭＥＭに変えた。
【０１３５】
ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を以下の様式で調製した。
（ａ）ＤＮＡ溶液の調製：食塩水溶液または滅菌食塩水溶液中、適切な量のｐδＦ６（４０μｇ／プレート）プラスミドおよびｐ５１８（２０μｇ／プレート）プラスミド、ならびに、対応する組み換えＡＡＶ−２ゲノム（２０μｇ／プレート）を含むプラスミドを用い、最終容積が１ｍｌ／プレートのＤＮＡ溶液を調製した。これを混合し、室温で５分間インキュベートした。このプロトコルの最後にプラスミドの特徴を記載している。
（ｂ）ＰＥＩ溶液の調製：ＤＮＡ溶液の調製と同時に、最終容積が１ｍｌ／プレートの滅菌食塩水溶液のトランスフェクション剤ＰＥＩの溶液を調製した。食塩水溶液／プレートに溶解した１０ｍＭ  ＰＥＩの容積を算出するために、我々は、下記式
【数１】
2014503173.tif 000004
を用い、式中、μｇＤＮＡ＝８０；Ｎ／Ｐの割合＝１０；ＰＥＩ濃度＝１０ｍＭである。算出した容積のＰＥＩを混合し、周囲温度で５分間インキュベートした。
（ｃ）５分経過したら、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を作成し、安定化するために、上のＤＮＡにＰＥＩ溶液を加え、ボルテックスを用いて１５秒間はげしく撹拌した後、周囲温度で３０分間インキュベートした。
【０１３６】
その後、プレートあたり２ｍｌのＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を、μピペットを用いて１滴ずつ加え、これをプレート全体に広げた。このプレートを十字型の形態でゆっくりと撹拌し、３７℃で４〜６時間インキュベートした。この時間が経過した後、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地をプレートあたり１０ｍｌ加え、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１３７】
トランスフェクション４８時間後、細胞から培地を除去し、スクレーパー（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて機械的に除去した。各プレートを３ｍｌの透明ＤＭＥＭ培地で洗浄し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管に集めた。細胞を１，８００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、上澄みを捨てた。細胞全体を１８．５ｍｌの透明ＤＭＥＭ媒体に再び懸濁させ、その後の精製のために−８０℃で凍結させた。
【０１３８】
２９３Ｔ細胞内で産生したウイルスを取り出すために、それぞれ−８０℃および３７℃の凍結解凍工程を３回連続して行った。次いで、細胞残渣を取り除くために、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離処理した。上澄みを、プレートあたり０．１ｍｇのＤＮＡｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、３７℃で３０分間インキュベートし、孔径０．２２μｍのフィルタ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて濾過した。
【０１３９】
注：（ａ）ｐδＦ６プラスミドは、ＡＭＴ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）社の好意により供給された。このプラスミドは、ＡＡＶのウイルス複製に必要なアデノウイルス遺伝子を含んでおり、（ｂ）ｐ５１８プラスミドは、ＡＭＴ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）社の好意により供給された。このプラスミドは、血清型ＡＡＶ−２のＲｅｐタンパク質と血清型８のＶＰタンパク質とをコードする遺伝子を含んでいる。
【０１４０】
アデノ随伴ベクターを精製するために、ヨージキサノール勾配による超遠心分離法を使用した。この相を調製するために、新鮮な７．４×ＰＢＳ−ＭＫバッファを調製した（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含まないＰＢＳ  ５００ｍｌ＋１Ｍ  ＭｇＣｌ２  ５０ｍｌ＋１Ｍ  ＫＣｌ  １２５ｍｌ）。第２表は、使用した勾配相の調製をまとめたものである。
【表３】
2014503173.tif 000005
【０１４１】
各相の調製する各容積は、それぞれの場合に行う精製の数によって変わる。
【０１４２】
このプロトコルで使用するバッファを、孔径０．２２μｍのフィルタ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いた濾過によってすべて滅菌した。超遠心分離のために、２５×８９ｍｍ  Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌ−Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ管（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用した。２３ｍｍガラス製パスツールピペットを用い、ヨードキサノール勾配を作成した。この管の底にピペットを挿入し、アデノ随伴ベクターを豊富に含む細胞溶解物（１８．５ｍｌ）で構成される密度が高くない相によって、上の勾配の調製を始め、次いで、１５％でヨードキサノール溶液９ｍｌ、２５％でこの溶液５ｍｌ、４０％でこの溶液５ｍｌ、最後に、６０％でこの溶液３ｍｌであった。管を平衡状態にし、密閉した。その後、Ｂｅｃｋｍａｎ  ７０  Ｔｉローターを用い、６９，０００ｒｐｍ、１６℃で１時間、超遠心分離を行った。
【０１４３】
超遠心分離の後、この管の底部に、針を付けた５ｍｌシリンジで穴をあけることによって、ヨードキサノール４０％〜６０％の中間相中で濃縮されたＡＡＶ粒子を集めた。ウイルス粒子を豊富に含む５ｍｌ（画分１）が得られ、これを洗浄し、５％ショ糖／ＰＢＳ中、セントリコン（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ−ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて濃縮した。この目的のために、セントリコンを５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離処理した。洗浄回数および遠心分離時間は、各製造においてさまざまであり、ヨードキサノールに典型的な粘度がみられなくなるまで行った。ウイルスを１ｍｌの５％ショ糖／ＰＢＳ中で濃縮し、使用するまで−８０℃で保存した。回収率は約９４％であった。
【０１４４】
１．２  ＣＣＤカメラを用いて生物発光を決定することによって、生きた動物中のルシフェラーゼ活性の測定
誘発性ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系を含むｒＡＡＶ２／８ビリオンを投与した後に得られるルシフェラーゼ活性を測定するために、ケタミン／キシラジンでマウスに麻酔をかけ、１００μｌのＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ａｌａｍｅｄａ、ＵＳＡ）をＰＢＳで希釈し、濃度３０ｍｇ／ｍｌにしたものを腹腔内経路で投与した。５分後、動物を、暗室の発光カメラ（ＣＣＤ：冷却電荷結合デバイス、ＩＶＩＳ、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、アラメダ、ＵＳＡ）に置き、グレースケールの写真に重ね合わせ、発酵画像を得た。発光画像は、色スケールを用いて光の強度をあらわし、青色は最も低い強度に関し、赤色は、最も高い強度に関する。これらの画像をＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅコンピュータープログラム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、アラメダ、ＵＳＡ）を用いて処理し、シグナルの定量を可能にする。生物発光を測定するために使用される単位は、光子／秒である。使用される方法論の根拠は、以下の文献に記載されている。Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  Ｉら、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４．２１９：ｐｐ．１９６−１８１；およびＣｏｎｔａｇ  ＣＨら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．、２００２．４：ｐｐ．２３５−６０。
【０１４５】
１．３  ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、基礎状態での発現およびこの系の誘発
ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ  ｓｙｓｔｅｍ系の特性決定を最初に概算する場合、我々は、３種類の異なる投与量のウイルスをＢＡＬＢ／ｃ雌４群のうち、３群に、１×１０１１、３×１０１０、１×１０１０ｖｇ／マウスの量で静脈内経路によって注射した。我々は、１５日間待機し（ｒＡＡＶ８による肝臓への形質導入が、最大発現量に達するまで約１４日かかるため（Ｐａｎｅｄａ、Ａ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００９、２０：９０８−９１７））、我々は、誘発因子が存在しない状態で、ルシフェラーゼ活性レベルを測定した（すなわち、基礎状態での発現）。注射から１５日後に、我々は、５０ｍｇ／ｋｇのドキシサイクリンを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、次の日に、我々は、飲料水にドキシサイクリン（ｄｏｘ）を入れて（ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍｌ、５％ショ糖）投与し、誘発状態を維持した。この誘発プロトコルは、別のＴｅｔＯＮ誘発系について我が部署で作成したものであり（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）、誘発因子による毒性レベルに達しない状態で、最も高い導入遺伝子誘発レベルが得られたものであった。
【０１４６】
ルシフェラーゼ活性の測定は、ユーザーにより選択した領域を定めて行う。この場合、我々は、図３Ａに円形であらわされている上腹部または肝臓と、図３Ｂに楕円形であらわされている動物の体表面全体を選択した。
【０１４７】
時間経過に伴う生物発光の測定を図４に示している。
【０１４８】
図４からわかるように、基礎状態および誘発状態の両方で、全誘発期間の間、全ルシフェラーゼ活性レベル（つまり、動物の全身を分析したとき）が、上腹部または肝臓領域のみを測定したときに得られる値よりも顕著に高く、このことは、導入遺伝子が、肝臓に加え、他の臓器でもかなりの程度発現していることを示しており、また、ＣＣＤカメラで得た生物発酵画像からもわかるように、グレースケールで解釈することができない色コードをもつため、示されていない。
【０１４９】
一方、この系の基礎活性または残存活性は、投与されたウイルスの投与量によって変わる。選択した領域での生物発光カメラのバックグラウンドノイズが約１×１０５であることを考慮すると、肝臓領域における基礎状態のルシフェラーゼ活性は、３種類の場合ですべて比較的低く、使用したウイルスの投与量が最も低い場合、バックグラウンドノイズと非常に近いことを述べることができるだろう。
【０１５０】
図４からわかるように、ドキシサイクリンを投与した後、肝臓領域および動物の全身で、すべての群でルシフェラーゼの発現が約３倍〜４倍増加していることが観察されている。一方、導入遺伝子の発現は、飲料水に混ぜてドキシサイクリンを投与して７日間誘発させている間、安定なままであることがわかる。
【０１５１】
この系の誘発性の速度論に関して、ドキシサイクリンを腹腔内投与して１０時間後に、導入遺伝子が、２４時間後と同じ発現レベルに達していることが観察されている（もはや飲料水にドキシサイクリンを加えていない）。したがって、以下、ドキシサイクリンを腹腔内注射によって投与した後、誘発状態でのルシフェラーゼ活性は、薬物を投与して２４時間後に測定している。
【０１５２】
１．４  ドキシサイクリンに対する系の用量応答および毒性
誘発状態で得られるルシフェラーゼ活性レベルが非常に低かったという事実から、誘発因子の投与量を上げることに決めた。この目的のために、１００および２００ｍｇ／ｋｇという２種類の連続した投与量を、間を１４日あけて腹腔内経路で投与した。
【０１５３】
肝臓領域でのルシフェラーゼ活性を誘発２４時間後に測定した。誘発状態でのルシフェラーゼ活性を比較すると、投与したドキシサイクリンの投与量に対し、線形応答がみられる（図５）が、ドキシサイクリンの投与量が２００ｍｇ／ｋｇに達すると、この線形の特徴は失われている。この点に到達すると、何匹かのマウスは死に、ドキシサイクリンによる毒性の症状（熱、腹部癒着など）がすでにあらわれていたため、残りを犠牲死させた。これらの症状は、ベクターを与えなかったコントロールマウスでもみられた。ドキシサイクリンの投与量が１００ｍｇ／ｋｇのときに、このシステムの最大誘発速度に達し、約１０倍である。
【０１５４】
１．５  ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃの生体内分布
両株および両性別のマウスにおいて、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系の誘発後に得られた導入遺伝子活性の生体内分布を調べるために、グループあたり、４〜８匹のマウスを誘発させ（感染させてから２１日後に、対応する誘発系を用い、１×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ２／８／マウスを用いた）、ドキシサイクリン５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。２４時間後、ルシフェラーゼ活性をＣＣＤカメラを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで決定した後、動物を犠牲死させ、臓器のいくつかを抽出し、それぞれのルシフェラーゼ活性を後で測定し、タンパク質合計量によって正規化するために、すぐに凍結させておいた。
【０１５５】
図１１において、試験した２種類の株（ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６）の両方から雌について、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系が肝臓および心臓、子宮、卵巣で発現していることが明らかに観察され、この結果は、発光カメラから集めたｉｎ  ｖｉｖｏ画像と一致しており、動物全体の生物発光の分散分布は、下腹領域ではもっと高い（データは示していない）。また、これらのデータは、我々のグループで行った、数種類の血清型のＡＡＶを用いた試験からの観察結果を裏付けるものである（Ｐａｎｅｄａ、Ａ．ら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００９、２０：９０８−９１７）。さらに、他の臓器（例えば、膵臓、骨格筋など）に形質導入しており、この結果は、血清型ＡＡＶ８と構成的プロモーターとの関係について、何人かの著者が行った観察結果と一致している（Ｎａｋａｉ、Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、２００５、７９：２１４−２２４；Ｗａｎｇ、Ｚ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５、２３：３２１−３２８）。
【０１５６】
雄の場合、両系でのルシフェラーゼ活性の生体内分布パターンは、両マウス株で非常に似ており（図１２）、雌で観察されているのと同様に、殺す前にＣＣＤカメラを用いて得られた生物発光画像と一致している（データは示していない）。我々は、ルシフェラーゼが肝臓および心臓で主に発現しており、これに次いで、腎臓、胃、腸、筋肉であることがわかった。
【０１５７】
結論として、最大誘発速度に制限があるため（約１０）設計されているｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃウイルスは、肝臓での導入遺伝子発現を制御するのには適しておらず、導入遺伝子活性の生体内分布は、主に肝臓に限定されず、いくつかの動物臓器にも広がっている。
【０１５８】
実施例２．組み換えｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃウイルスの構築および特性決定
ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系を含むベクターが、肝臓以外の場所で非常に低い誘発性および顕著な発現量を示すことを確認した後、我々は、片方で以前のものよりも最大誘発速度が大きく、一方で、目的の臓器（肝臓）において導入遺伝子の局所的な発現を達成することが可能な系を構築することに挑戦した。この目的のために、最少ＣＭＶプロモーターを、アルブミンプロモーター（ｐＡｌｂ）と置き換えた。Ｚａｂａｌａらによって行われた研究（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）は、他の誘発系で使用すると、ｐＡｌｂが、残余発現が低く（最少ｐＣＭＶよりも低く）、ＴｅｔＯ７部位に近い位置にあるとき、非常に高い誘発速度を示すことが示されている。他方で、この発現が肝細胞特異的であることがすでに知られている（Ｆｒａｉｎ、Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９０、１０：９９１−９９９；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ、Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、１９８７、５０：６２７−６３３）。しかし、転写活性化因子が、ＣＭＶプロモーターから出発して構成的に発現するテトラサイクリン誘発系の観点で、ＴｅｔＯ７部位が前についているプロモーターを用いて達する最大誘発レベルは、最少ＣＭＶプロモーターを用いて得られるレべルよりも顕著に高かった（これも、ＴｅｔＯ７部位が前についている）（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）。
【０１５９】
この新しい系は、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ（図２Ｂ）である。
【０１６０】
２．１  ベクターの構築
誘発性ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系を有する組み換えＡＡＶゲノムを含むプラスミド（ｐＡＣ１Ｍ２−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ）を以下の様式で作成した。７テトラサイクリン応答性オペレーター部位およびアルブミンプロモーターを含むフラグメント（ＴｅｔＯ７−ｐＡｌｂ）を、我々が作成した、プライマーＣ（センスプライマー）およびＤ（アンチセンスプライマー）（Ｃ：ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ（配列番号１３）；Ｄ：ＧＴＣＧＡＣ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ（配列番号１４））を含み、その５’末端に、ＡｆｅＩ（センスプライマー）部位およびＳａｌＩ（アンチセンスプライマー）部位を含むｐＴｏｎＬ２（Ｔ）−ｍＩＬ１２プラスミドから増幅した（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）。このフラグメントをｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でサブクローン化し、これをｐＣＤＮＡ３．１−ＴｅｔＯ７−ｐＡｌｂと呼んだ。
【０１６１】
一方、アルブミンプロモーターを、プライマーＥ（センス）およびＦ（アンチセンス）（Ｅ：ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＡＡ（配列番号１５）；Ｆ：ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ（配列番号１６））を含み、その５’末端に、ＡｆｅＩ部位（センスプライマー）およびＡｆｅＩ部位、ＥｃｏＲＩ（アンチセンスプライマー）を含む、ｐＡｌｂ−ｌｕｃプラスミドから増幅した（Ｋｒａｍｅｒ  Ｇ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００３、７：３７５−３８５）このフラグメントをｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でサブクローン化し、これをｐＣＤＮＡ３．１−ｐＡｌｂと呼んだ。ＡｆｅＩで消化し、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴｅｔＯ７−ｐＡｌｂプラスミドに挿入することによってアルブミンプロモーターをこのベクターから抽出し、同じ酵素で消化した。これらのプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩｆｒで消化し、約７００ｐｂのバンド（ｐＡｌｂ−ＴｅｔＯ７−ｐＡｌｂフラグメントに対応している）が得られ、これを選択した。この消化プラグメントをｐＡＣ１Ｍ２−ｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドに挿入し、同じ酵素で消化し、ｐＡＣ１Ｍ２−ｐＡｌｂ−ｌｕｃプラスミドを得た。
【０１６２】
前の誘発系について記載したのと同じ様式で、ｒＡＡＶ８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃべクターの産生および精製を行った。
【０１６３】
２．２  ＢＡＬＢ／ｃマウスの系における、基礎状態での発現および誘発性
最初の概算として、４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、投与量１×１０１１ｖｇ／マウスのｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃウイルス静脈内経路で注射し、基礎状態のルシフェラーゼ活性（ベクターを静脈内注射した１４日後）および誘発状態のルシフェラーゼ活性（ドキシサイクリン５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した２４時間後、およびベクターを投与して２２日後）を、肝臓領域および動物全身で測定した。ドキシサイクリンの腹腔内投薬を使用すると、誘発因子の過剰投薬に起因する望ましくない毒性の影響が生じないことを確認した。
【０１６４】
基礎状態および誘発状態の両方のルシフェラーゼ活性を比較すると、上腹部領域（肝臓）および動物全身において、この両者で顕著な差はみられず（図６）、このことは、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉｐＡｌｂ−ｌｕｃ系が肝臓領域で特異的に発現していることを示している。このため、以下、ルシフェラーゼ活性データを示す場合、マウスの肝臓領域での測定値について述べる。
【０１６５】
一方、肝臓領域についての測定データと、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系（同じ投与量のベクター、同じ投与量のドキシサイクリンを投与する）に対応する測定データを比較すると、基礎状態で、ルシフェラーゼ活性が、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系を用いた場合に、無視できないレベルで顕著に低いことが観察されている（図７）。
【０１６６】
しかし、最も突出した発見は、投与量５０ｍｇ／ｋｇのドキシサイクリンを腹腔内投与した後に新規ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系で得られた誘発速度が約２５０倍であり（図７）、この値は、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系の誘発速度よりもほぼ８５倍大きく、Ｚａｂａｌａらのすでに引用されている研究（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）によって得られる結果の観点で、予想されない発見であった。さらに、この投与量のドキシサイクリンについて、誘発状態で両系の差は、非常に顕著である。
【０１６７】
２．３  系の長期間にわたる再誘発性
任意の誘発系が満たさなければならない重要な特徴のひとつは、時間経過に伴って再誘発させる能力であり、このために、我々は、ドキシサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ）を、１５日間隔（１回目と２回目の誘発の間、２回目と３回目の誘発の間）および８０日間隔（３回目と４回目の間）で腹腔内に繰り返し投与した。ルシフェラーゼの発現を誘発２４時間後に測定した。図８は、１×１０１０および１×１０１１ｖｇ／マウスの両投与量で、この系の再誘発能力が少なくとも４ヶ月間維持されることを示している。しかし、最も少ない投与量のウイルスを用いて得られた速度は約１０であり、一方、高い投与量を用いて得られた速度は２５０であることを考慮すると、最大誘発速度は投与されるウイルスの投与量に依存することが観察されるものと思われる。
【０１６８】
２．４  Ｃ５７Ｂ６／Ｌマウスにおけるドキシサイクリンに対する用量応答、この系の誘発性の性別間比較
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス  対  雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、基礎状態およびｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系を用いた誘発状態で得られたルシフェラーゼレベルを比較すると、我々は、Ｃ５７ＢＬ／６雌において、両レベルが顕著に高いことが観察され、ｒＡＡＶ２／８が、ＢＡＬＢ／ｃ株よりも、このマウス株の肝臓に良好に形質導入することを示唆しているが、我々は、この実験の誘発速度に顕著な差を発見しなかった。以下、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでにおいて誘発性ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系の特性決定を続ける。
【０１６９】
一方、本我々は、誘発状態での導入遺伝子活性と投与される誘発因子の投与量との間の依存性を評価したいと考えた。両パラメーター間に線形の相関が存在することで、導入遺伝子発現を正確に制御することができ、このことは、導入遺伝子の治療範囲が制限されているとき、またはその毒性が、導入遺伝子のレベルを厳しく制御する必要がある場合に重要である。
【０１７０】
一方、ｒＡＡＶ８の肝臓での形質導入において、性別差があるため、この誘発系の影響を調べることは興味深いと思われる。このため、ドキシサイクリンの投与量応答を、同じ株の雌および雄について測定した。
【０１７１】
この目的のために、それぞれ５匹の動物の５グループを作り、それぞれの性別について、投与量１×１０１１ｖｇ／マウスのｒＡＡＶ２／８−ＴｅｔｂｉｄｉｐＡｌｂ−ｌｕｃウイルスを注射した。ウイルスを注射してから１４日後（導入前）に基礎状態での活性を測定し、ベクターを注射して２１日後に、各グループについて、投与量２、１０、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇのドキシサイクリンを腹腔内投与した。ルシフェラーゼ活性を誘導２４時間後に測定した。
【０１７２】
投与量が２ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまでのドキシサイクリンでの誘発状態で、雄と雌でルシフェラーゼレベルに顕著な差が観察され、ルシフェラーゼ活性は、雌よりも雄で多い（図９Ａ）。投与量１００ｍｇ／ｋｇで、雌の場合に、この株のｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系の最大誘発速度６５０に達し（もっと高い投与量では、ドキシサイクリンの毒性の影響が、ルシフェラーゼレベルでの増加を観察するのを不可能にするため）、一方、雄の場合に、投与量５０ｍｇ／ｋｇで４５０に達する。
【０１７３】
投与量１００ｍｇ／ｋｇのドキシサイクリンを投与した後、雄および雌の両方で、同様のルシフェラーゼ活性レベルに達することが観察される。この事実を、ドキシサイクリン５０および１００ｍｇ／ｋｇで誘発させる場合、雄が同じルシフェラーゼ活性に達するという事実と組み合わせると、この系の飽和状態に達しており、細胞内に存在するこの系のオペレーター部位がすべて転写活性化因子−誘発因子複合体で占められていることが示唆される。
【０１７４】
図９Ｂは、図９Ａで観察したルシフェラーゼ活性の対数値を示しており、飽和可能な系に典型的なＳ字曲線に沿っており、これにより、我々は、各曲線の線形範囲（雄の場合、ドキシサイクリン２〜２５ｍｇ／ｋｇ、雌の場合、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ）なら、所与の投与量の誘発因子でルシフェラーゼ活性を概算することができる。
【０１７５】
２．５  誘発因子について、経口投与経路の評価
次に思い至った別の課題は、投与経路による誘発性薬物の毒性である。毒性に関連する観点で、動物モデルにおいて、ドキシサイクリンの経口投与は、腹腔内投与よりもかなり安全であることが記載されている。腹腔内投与を動物モデルで使用するのは、再現性の理由があるからであり、というのは、研究者が計算どおりの投与量を正しく投与することができるからであり、一方、経口投与（小さな動物の場合は、飲料水に入れる）は、それぞれの動物が異なる量の水を消費してしまい、データが分散してしまう危険性がある。ある場合に、この抗生物質を経口投与する臨床的な形態によって、正しい投与量の薬物を確実に投与する。これらすべての理由によって、我々は、この系の誘発性が、誘発因子に使用する投与経路に影響を受けるかどうかを調べることを決め、この目的のために、我々は、飲料水にドキシサイクリンを入れて（２ｍｇ／ｍｌ＋５％ショ糖）経口投与によってこの系を誘発させた。図１０からわかるように、薬物を経口投与することによって得られた誘発状態でのルシフェラーゼ活性レベルは、ドキシサイクリン５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内によって誘発した２４時間後で得られるレベルよりもいくらか小さく（約５０％）、このことは、この系を誘発するのに経口経路を有効かつ安定に使用してもよいことを示しているが、最も高い投与量のドキシサイクリンを腹腔内投与することによって達したレベルより高いレベルには達しない。飲料水中のドキシサイクリンの濃度が大きい場合は評価しなかったが、その代わりに、テトラサイクリン誘発系の文献にすでに記載されているのと同様なプロトコルを使用した。
【０１７６】
２．６  ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃの生体内分布
ＣＣＤカメラを用いて肝臓領域と動物全身で測定した値を比較したとき、肝臓に対するルシフェラーゼ活性に制限があることはすでに観察されている（図６）。
【０１７７】
ここでは、より詳細に実施するため、両株および両性別のマウスにおいて、新しい系を誘発した後に得られる導入遺伝子活性の生体内分布の包括的な試験のために、我々は、グループあたり４〜８匹のマウスを、５０ｍｇ／ｋｇのドキシサイクリンを用い、腹腔内で誘発した（１×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ２／８／マウスを用い、２１日前に感染させておき、対応する誘発系を用いた）。２４時間後、我々は、ＣＣＤカメラを用いてルシフェラーゼ活性をｉｎ  ｖｉｖｏで測定し、次いで、我々は、動物を犠牲死させ、臓器をいくつか抽出し、それぞれのルシフェラーゼ活性を後で測定し、タンパク質合計量によって正規化するために、すぐに凍結させておいた。このプロトコルは、前に述べた誘発系に適用したのと同じものである。
【０１７８】
雌および雄の両方において、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系を用いた両株の動物の肝臓において、ルシフェラーゼ発現が排他的に観察される（図１１および図１２）。それぞれの臓器について試験する場合、この系によって生じる発現は、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系によって生じる発現よりも常に大きい（ほとんどすべての場合に、顕著に大きい）が、肝臓だけは例外である。肝臓において、我々は、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系が、両株で、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＣＭＶ−ｌｕｃ系よりも大きな誘発レベルのルシフェラーゼ活性に達し、この結果は、両方の系で、肝臓領域で行われたｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光測定で行われる予測結果と一致する。この様式で、雌および雄のマウスにおいて、誘発性ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系が肝臓特異性であることがわかる。
【０１７９】
結論として、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｌｕｃ系は、アデノウイルス随伴ベクターについて最初に記載された肝臓特異的な誘発系であり（水圧注入による肝臓特異的な誘発系（Ｚａｂａｌａ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：２７９９−２８０４）および大容量アデノウイルスによる、その大きさがｒＡＡＶによって受け入れられる最大値よりも大きい誘発系（Ｗａｎｇ、Ｌ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００４．１２６：２７８−２８９）がすでに記載されている）、治療範囲が限定されている（肝臓の肝硬変モデルにおけるＩＧＦ−１の場合）ため、または制御されない様式で発現すると毒性の影響がある（数種類の免疫を高めるサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮαなどの場合）ため、導入遺伝子の発現を厳しく制御する必要がある肝疾患の長期間にわたる治療にとって非常に重要なツールをあらわす。
【０１８０】
実施例３．  組み換えｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ＩＬ１２ウイルスの構築および特性決定
多くの前臨床試験は、ＩＬ−１２の遺伝子移動から生じる抗腫瘍効果を示した。これらのデータによって、ＩＬ−１２を含む第１世代アデノウイルスを用い、消化系腫瘍の治療の第Ｉ相臨床試験が行われた（Ｓａｎｇｒｏ、Ｂ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００４、２２：１３８９−１３９７）。臨床試験は、治療効果を得るために、ＩＬ−１２をもっと長期間にわたって発現する必要性があることを示した。この観点で、我々は、誘発性ＩＬ−１２発現系を含む長期間発現ウイルスベクターを開発する研究を行っている（Ｗａｎｇ、Ｌ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００４．１２６：２７８−２８９）。
【０１８１】
我々が入手可能なウイルスベクターの中で、ＡＡＶは、長期間発現ベクターであり、その臨床グレードの製品は、高用量ですでに示されているため、ＡＡＶは非常に有望な候補物質である（Ｍｅｇｈｒｏｕｓ、Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２００５、２１：１５４−１６０）。
【０１８２】
このため、我々は、誘発性、肝臓特異的な誘発様式でＩＬ−１２を製造することができるアデノ随伴ベクターを開発し、動物モデルで抗腫瘍活性を試験しようと試みた。
【０１８３】
同系マウスの肝臓に特定の結腸癌株を移植すること（例えば、Ｃ５７マウスにＭＣ３８株）は、免疫治療および他の前臨床治療アプローチに広く用いられている肝癌内モデルの一種であり（Ｈｅｉｊｓｔｅｋ、Ｍ．Ｗ．ら、Ｄｉｇ  Ｓｕｒｇ、２００５、２２：１６−２５）、したがって、このモデルは、新しい治療用ベクターを試験するために選択されるモデルである。
【０１８４】
１種類のタンパク質配列にサブユニットｐ４０およびｐ３５が融合した単鎖ｍＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２  ｓｃ）を使用した。ｍＩＬ−１２は、ＩＬ−１２を発現するのに常々用いられている構築物よりもかなり小さく、サブユニットＰ３５、ＩＲＥＳ（内部リボソーム導入部位）エレメント、サブユニットＰ４０で構成されている（Ｗａｅｈｌｅｒ、Ｒ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００５、１６：３０７−３１７）。これにより、ｒＡＡＶのウイルスフレームワーク内でサブクローン化し、対応する組み換えウイルスを作成することが可能になる。さらに、この構築物の発現から得られるタンパク質が、内部リボソーム導入配列またはＩＲＥＳによって両サブユニットが会合している構築物から得られるタンパク質よりも活性であることが記載されている。
【０１８５】
したがって、ルシフェラーゼ遺伝子をｍＩＬ−１２  ｓｃ遺伝子と置き換え、図２Ｃに示される構築物を得た。この新しい構築物は、ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２と呼ばれる。次に、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２ウイルスを製造した。
【０１８６】
３．１  ベクターの構築
誘発性ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２系を有する組み換えＡＡＶゲノムを含むｐＡＣ１Ｍ２−ｐＡｌｂＩＬ１２プラスミドを作成するために、ｐＣＤＮＡ３．１−ｍＩＬ１２ｓｃプラスミドからＰＣＲによってｍＩＬ１２ｓｃを増幅させた（我々の部門内において、好意によりＤｒ．Ｃｒｅｔｔａｚによって供給された）。この構築物およびｍＩＬ１２ｓｃの配列は、Ｌｉｅｓｃｈｋｅ、Ｇ．Ｊ．ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、１５：３５−４０）に詳細に記載されており、プライマーＧ（センス）およびＨ（アンチセンス）（Ｇ：ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ（配列番号１７）、Ｈ：ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＣＣ（配列番号１８））を含み、その５’末端に、ＳａｌＩ（センスプライマー）部位およびＮｏｔＩ（アンチセンスプライマー）部位を含む。このフラグメントをｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でサブクローン化し、上述の酵素で消化することによって抽出した。抽出したフラグメントを、すでにＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化しておいたｐＡＣ１Ｍ２−ｐＡｌｂ−ｌｕｃベクターに挿入し、ｐＡＣ１Ｍ２−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２ｓｃプラスミドを得た。
【０１８７】
ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２ウイルスの産生および精製は、すでに記載した他のベクターについて記載されているのと同じ様式で行った。
【０１８８】
３．２  抗腫瘍プロトコル
腫瘍モデルの説明
上述のように、我々は、Ｃ５７ＢＬ／６同系マウスの肝臓にＭＣ３８細胞を移植することによって、結腸直腸癌の肝臓転移モデルを使用することした。使用する方法は、５００，０００個のＭＣ３８細胞を肝臓の大きい方の葉に肝臓移植すること（開腹術による）からなる。細胞を肝臓移植して７日後、直径４〜６ｍｍの腫瘍を観察し（開腹術による）、移植から約３０〜５０日後にマウスが死ぬまで、中断することなく成長する。
【０１８９】
以下のプロトコルを使用した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス３群（Ｎ＝５）に、３×１０１０、１×１０１０および３×１０９ｖｇ／マウスの３種類の異なる投与量のｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ＩＬ１２ベクターを静脈内経路で投与した。ベクターを注射して１ヶ月後、５×１０５のＭＣ３８細胞を肝臓の大きい方の葉に移植し（ベクターを投与しなかった５匹のコントロールマウスを加え）、１０日後に、ドキシサイクリン５０ｍｇ／ｋｇで誘発を行い、５％ショ糖を含む飲料水（ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍｌ）を用い、１週間継続した。本発明者らは、ベクターを投与してすぐ後には存在すると思われる、ｒＡＡＶ８カプシドについてあり得る免疫応答を防ぐために、腫瘍細胞を移植するまで１ヶ月間待機した。何点かの時間点でマウスから血液を抽出し、ｍＩＬ１２ｓｃ、ｍＩＦＮγ、トランスアミナーゼの血清濃度を測定した（図１３）。
【０１９０】
誘導状態でのｍＩＬ−１２  ｓｃおよびｍＩＦＮｇａｍｍａの量と、投与したウイルスの投与量とに線形の相関があることを確認した。ｍＩＬ１２ｓｃの発現は一時的であり、誘発から７日後には、検出できない濃度まで低下していた（ｍＩＦＮｇａｍｍａが介在する阻害、すでに、Ｒｅｂｏｒｅｄｏ、Ｍ．ら（Ｒｅｂｏｒｅｄｏ、Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８、１５：２７７−２８８）によって記載されている）。ｍＩＦＮｇａｍｍａの量は、誘発から７日後に発現ピークに達した。両サイトカインの発現は、ＥＬＩＳＡによって測定すると、基礎状態でウイルスを３種類の投与量で投与したとき、誘発前には検出することができなかった。
【０１９１】
３．３  毒性がないこと
ＩＬ−１２を抗腫瘍剤として用いたときの最も顕著な問題のひとつは、発現量が高く、制御されないときに全身毒性が高いことである。このために、肝臓内のベクターによってｍＩＬ−１２  ｓｃを発現させることによって引き起こされる毒性の影響を分析することに決めた。この目的のために、誘発中および誘発後に、血清トランスアミナーゼ（ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼ）を測定した。
【０１９２】
動物において、目立つ毒性の影響が観察されない場合には、血清トランスアミナーゼの測定値は、肝不全が存在せず、ドキシサイクリンによって腹腔内から誘発させて主に２４時間目に、所定の時間には顕著であり（図１４）、これらに限定されないが、両酵素で一時的な増加が観察されていることを示す。このことは、ＩＬ−１２の制御された誘発が、毒性の観点から安全であることを示す。
【０１９３】
３．４．  予防的な抗腫瘍効能：生存率
この治療の抗腫瘍効能を測定する第１の様式は、ある時間に異なるマウス群の生存率を決定することであった。この実験は、プロトコルを１３２日間で終了するように考えられており、１３２日目は、腫瘍細胞の移植後１０２日目に対応する（図１３）。この日に生存しているマウスには、肝臓内に腫瘍はなかったが、試験中に死んだ動物には、すべて大きな腫瘍があった（約４ｃｍ３）。ＩＬ−１２の発現による死亡は観察されなかった。コントロールマウス、最も低用量のウイルスを注射したマウスはすべて死んだが、低用量のウイルスを注射したマウスでは、腫瘍の成長はわずかに遅れたことが観察された。図１５は、ｒＡＡＶ２／８−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ−ｍＩＬ１２ウイルスの最小治療投与量が１×１０１０ｖｇ／マウスであることを示しており、１００％が腫瘍をもたないマウスであった。投与量が３×１０１０ｖｇ／マウスだと、腫瘍をもたないマウスは８０％であった。
【０１９４】
３．５  抗腫瘍効能：メモリー免疫応答の評価
ベクターの投与によって誘発されたメモリー免疫応答の効能を評価するために、我々は、ＭＣ３８細胞（１×１０６細胞／マウス）をマウスに皮下投与する再抗原チャレンジ（または第２の抗原チャレンジ）を行った。図１６は、５匹の未治療コントロールマウスと比較して、あらかじめ治療しておいたマウスについて、時間経過に伴って腫瘍が成長しているのを示している。あらかじめ治療しておいたマウスの４０％で保護が観察され、一方、実験終了時（再抗原チャレンジ４２日目、プロトコル１３２日目）の腫瘍の大きさは、未治療マウスよりも治療群で顕著に小さかった。これらのデータは、治療したマウスにおいて、未治療マウスと比較して、有効なエフェクターメモリー応答が進んでいることを示す。
【０１９５】
一方、すべての群について、再抗原チャレンジから２３日後（プロトコル１１３日目）に存在するＣＤ８＋−ＭＣ３８Ｔｅｔ＋  ＰＢＬの割合（ＭＣ３８株に由来する免疫優性ペプチドとともに保持された特定のテトラマー）を標識し、分析した。２種類の最も高い投与量のベクターを用いて治療したマウス群である治療群は、両者で有意な差がないため、未治療コントロールよりもこれらのリンパ球濃度が有意に高いことが観察された（図１７）。
【０１９６】
最後に、腫瘍の周囲でのこれらのエフェクターリンパ球の存在を測定し、この目的のために、動物を犠牲死させ、腫瘍ホモジネート中に存在するＣＤ８＋を標識した。ＦＡＣＳおよびＦｌｏｗＪｏプログラム、上で使用した、活性化マーカーＣＤ４４に陽性のＭＣ３８テトラマー特異性ＣＤ８＋リンパ球の割合を用いて分析した。治療群間で有意な差がみられなかったため、図１８にはまとめたデータを示している。あらかじめ治療しておいたマウスとコントロールとの間には有意な差がみられ、このことは、末梢血中にエフェクターメモリー細胞が存在するだけではなく、腫瘍中にもあり、腫瘍内で細胞毒性機能を発揮していることを示している。ＣＤ８＋エフェクターリンパ球の５０％がテトラマー特異的であり、治療を受けたマウスの体内で活性化される。
【０１９７】
結論として、単鎖ｍＩＬ１２をコードする誘発性ｒＡＡＶ−ｐＴｅｔｂｉｄｉ−ｐＡｌｂ系は、結腸直腸癌腫の肝臓転移にとって良好な抗腫瘍治療であり、ＩＬ−１２の発現に関連する毒性の影響はなく、有効な細胞応答が向上する。さらに、本発明者らは、変換された同じ細胞を用いて治療したマウスを再抗原チャレンジしたときに、有効なメモリー型細胞応答のベクターが介在する誘発を観察する。これにより、本研究で提示した肝臓特異的な誘発系を適用することができる。
【０１９８】
３．６  治療的な抗腫瘍効能：生存率
この治療が腫瘍の進行を抑えることができることを調べた後、その治療が、すでに移植した腫瘍をなくすことができるかどうかを調べた。この目的のために、ＭＣ３８腫瘍細胞をまず移植し、７日後、単回投与量の治療用ベクターを注射した。ベクターを注射して７日後、ＩＬ−１２の発現が開始した（図１９）。この実験は、腫瘍細胞を移植してから１００日後に終了するように検討した。この日に生存しているマウスには、肝臓内に腫瘍はなかったが、試験中に死んだ動物には、すべて大きな腫瘍があった（約４ｃｍ３）。ＩＬ−１２の発現による死亡は観察されなかった。コントロールマウスはすべて死んだ（図２０）。
【図１】
2014503173.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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