(57)【要約】  本発明は、ウイルス（様）粒子またはウイルスベクター、特に遺伝子治療のためのウイルスベクターの産生に有用な、最適化されたバキュロウイルス構築物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼおよびｐ１０が破壊されている、ｐ２６およびｐ７４バキュロウイルス遺伝子を含む組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項２】
ｐ１０遺伝子がｐ１０プロモーターを欠失せずに破壊されている、請求項１に記載の組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項３】
組換えバキュロウイルスゲノムが対象の異種配列を含む、請求項１または２に記載の組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項４】
バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼ、ｐ２６、ｐ７４およびｐ１０が破壊され、かつ組換えバキュロウイルスゲノムがウイルスベクターまたはウイルス様粒子の一部分をコードする異種配列を含む、組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えバキュロウイルスゲノムを含む、組換えバキュロウイルス。
【請求項６】
バキュロウイルスの産生が可能な条件下で、請求項１または４に記載の組換えバキュロウイルスゲノムを含有する原核細胞を培養することを含む、組換えバキュロウイルスを産生する方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えバキュロウイルスゲノムを含む細胞。
【請求項８】
請求項３に記載の組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバキュロウイルスと、適応細胞を培養する段階を含む、組換えタンパク質または核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは組換えゲノム）を産生する方法であって、対象の異種配列が組換えタンパク質または核酸をコードするものである、方法。
【請求項９】
ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生するのに有用な、対象の異種配列を保持する、組換えバキュロウイルスゲノムをそれぞれ含む、一または数個の組換えバキュロウイルスと、適応細胞を培養する段階を含む、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生する方法であって、
全ての組換えバキュロウイルスが、バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼおよびｐ１０が破壊されている、ｐ２６およびｐ７４バキュロウイルス遺伝子を含む組換えバキュロウイルスゲノムを含むものである、方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生するのに有用な、対象の異種配列を保持する、組換えバキュロウイルスゲノムをそれぞれ含む、一または数個の組換えバキュロウイルスと、適応細胞を培養する段階を含む、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生する方法であって、
全ての組換えバキュロウイルスが、バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼ、ｐ２６、ｐ７４およびｐ１０が破壊されている組換えバキュロウイルスゲノムを含むものである、方法。
【請求項１１】
組換えＡＡＶベクターの産生のための、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス（様）粒子またはウイルスベクター、特に遺伝子治療のためのウイルスベクターの産生に有用な、最適化されたバキュロウイルス構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶ）は、昆虫細胞において高レベルの組換えタンパク質を産生するために用いられる。それは一般に、ｐｏｌｈプロモーターの制御下で発現する遺伝子と置換される、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（ｐｏｌｈ）の欠失に基づく。細菌の複製起点、抗生物質耐性遺伝子およびアクセプターＴｎ７組換え部位のバキュロウイルスゲノムへの組み込み（すなわち：バクミド（ｂａｃｍｉｄ））は、この系を大幅に改善し、組換えウイルスの生成をより速くさせる（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。Ｏｘｆｏｒｄ  ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社がｆｌａｓｈＢＡＣＧＯＬＤとして、キチナーゼおよびカテプシン遺伝子が陰性である、バキュロウイルスベクターを流通させているが、最も市販されているバキュロウイルスベクターは、ｐｏｌｈ遺伝子を欠くが、その他は完全なゲノムを有する。それゆえ、この発現系が改善され得ることが予想された。ＡｃＭＮＰＶゲノム由来のキチナーゼおよびカテプシン遺伝子の欠失は、細胞内分泌組換えタンパク質の安定性に正の効果を有することが示された（Ｋａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。また、キチナーゼ、カテプシン、ｐ２６、ｐ１０およびｐ７４が欠けているＢＥＶが、非欠失ウイルスから得られるものよりも、高レベルの組換えタンパク質の産生を可能にしたことが示されている（Ｈｉｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。しかしながら、この後者の研究で得られた発現データは、単一の組換えタンパク質だけに関する。ウイルスベクター、またウイルスゲノムの場合、ウイルスベクターおよびウイルス様粒子などの複合体構造の産生のため、１つまたは多数のタンパク質を産生する必要がある。Ｈｉｔｃｈｍａｎらの結果から、キチナーゼ、カテプシン、ｐ２６、ｐ１０およびｐ７４遺伝子が欠失する場合、タンパク質の質の点から、かかる複合体構造の産生が改善され得ることは明らかではなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本研究の目的は、ウイルスベクターおよび／またはウイルス様粒子の産生のための、最適化されたバキュロウイルス発現系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の説明
本発明の一態様は、ｐ２６およびｐ７４バキュロウイルス遺伝子ＯＲＦを含むが、バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼおよびｐ１０が破壊されている、組換えバキュロウイルスゲノムに関する。一つの好ましい実施形態では、ｐ１０遺伝子がｐ１０プロモーターを欠失せずに破壊される。別の実施形態では、組換えバキュロウイルスゲノムが一以上の対象の異種配列を含む。
【０００５】
本発明の別の態様は、バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼ、ｐ２６、ｐ７４およびｐ１０が破壊され、かつ組換えバキュロウイルスゲノムがウイルスベクターまたはウイルス様粒子の一部分をコードする異種配列を含む、組換えバキュロウイルスゲノムに関する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は上述した組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバキュロウイルスを提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、バキュロウイルスの産生が可能な条件下で、本発明の組換えバキュロウイルスゲノムを含有する原核細胞を培養することを含む、組換えバキュロウイルスを産生する方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明の組換えバキュロウイルスゲノムを含む宿主細胞が提供される。
【０００９】
さらなる態様は、一または数個の本発明の組換えバキュロウイルスと、宿主細胞を培養する段階を含む、組換えタンパク質または核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子または組換えゲノム−例えばＲＮＡまたはＤＮＡゲノムである組換えゲノム）を産生する方法であって、対象の異種配列が組換えタンパク質または核酸をコードするものである、方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生するのに有用な、対象の異種配列を保持する、組換えバキュロウイルスゲノムをそれぞれ含む、一または数個の組換えバキュロウイルスと、宿主細胞を培養する段階を含む、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生する方法であって、全ての組換えバキュロウイルスがインタクトなｐ２６およびｐ７４バキュロウイルス遺伝子ＯＲＦを有する組換えバキュロウイルスゲノムを含み、かつカテプシン、キチナーゼおよびｐ１０のバキュロウイルス遺伝子ＯＲＦが破壊され、かつｐ１０遺伝子プロモーターが破壊されていないものである、方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生するのに有用な、対象の異種配列を保持する、組換えバキュロウイルスゲノムをそれぞれ含む、一または数個のバキュロウイルスと、宿主細胞を培養する段階を含む、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子を産生する方法であって、全ての組換えバキュロウイルスが、バキュロウイルス遺伝子カテプシン、キチナーゼ、ｐ２６、ｐ７４およびｐ１０が破壊されている組換えバキュロウイルスゲノムを含むものである、方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、組換えＡＡＶベクターの産生のために上記方法が実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】キチナーゼ、カテプシンおよびｐ１０  ＯＲＦが欠失し、ｐ１０プロモーターがインタクトなままである（△ＣＣ△ｐ１０）、またはｐ２６、ｐ１０、およびｐ７４遺伝子の欠失との組み合わせである（△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４）、ＡｃＭＮＰＶバクミドの概略マップ。  ＡｃＭＮＰＶバクミドはキチナーゼ、カテプシン、およびｐ１０またはｐ２６、ｐ１０、ｐ７４遺伝子が不活化されている。ＡＡＶ  ｒｅｐ２／ｃａｐ８発現カセットが、バクミドのＴｎ７部位に挿入される。同一のバクミド骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）上で、ｒＡＡＶ遺伝子（この実験ではｍＳｅＡＰ）がＴｎ７部位に移行（ｔｒａｎｓｆｅｒ）される。
【図２】バルクおよび精製サンプル中のｒＡＡＶウイルスゲノム決定。  ｒＡＡＶ産生力が、ｗｔ−；△ＣＣ△ｐ１０−；△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４−バキュロウイルス骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）で実施された産生に由来する、バルクサンプルおよび精製産物サンプルにおいて、評価された。ｒＡＡＶ力価はＱＰＣＲにより定量され、ｍＬ当たりのウイルスゲノムとして表され（ｖｇ／ｍＬ）／ｍＬ（青い棒グラフ）、コンタミネートしたバキュロウイルス力価はｖｇ／ｍｌでＱＰＣＲにより定量された（赤い点）。（ａ）ｒＡＡＶバルクサンプル（ｂ）免疫アフィニティ精製ｒＡＡＶ。
【図３】精製ｒＡＡＶベクターの特徴付け。  免疫アフィニティ精製ｒＡＡＶベクターをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブルー染色（ａ）またはＡＶＶ  ＶＰタンパク質のウェスタンブロッティング（ｂ）により解析した。１：バキュロウイルスＷＴで産生したＡＡＶ−ｍＳｅＡＰ（５ｘ１０１０  ｖｇ）２：バキュロウイルス△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４で産生したＡＡＶ８−ｍＳｅＡＰ（５ｘ１０１０  ｖｇ）３：バキュロウイルス△ＣＣ△ｐ１０で産生したＡＡＶ８−ｍＳｅＡＰ（５ｘ１０１０  ｖｇ）
【図４】ｒＡＡＶベクターのインビボ評価。  ＷＴまたは△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４または△ＣＣ△ｐ１０バキュロウイルスのいずれかで産生したｒＡＡＶ８−ｍＳｅＡＰを、１０９  ｖｇでマウスに筋肉内注射した（ｎ＝４）。（ａ）絹状（ｓｅｒｉｃ）ｍＳｅＡＰの経時的発現が測定された。（ｂ）ｍＳｅＡＰ発現の組織学的解析。筋肉切片（８μＭ）が調製され、ｍＳｅＡＰ局在に関して解析された。（ｃ）導入された筋肉でのｒＡＡＶゲノム定量。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、最適化された組換えバキュロウイルスゲノムおよびそれを用いる方法に関する。驚くべきことに、カテプシン、キチナーゼおよびｐ１０遺伝子の破壊は、昆虫細胞において産生される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子のレベルを改善しなかったが、ほ乳類細胞に対する感染力（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）が改善されたｒＡＡＶ粒子の産生を可能とすることが見出された。Ｈｉｔｃｈｍａｎら（上記参照）は、この研究はウイルスベクターの産生は報告しなかったが、カテプシン−、キチナーゼ−、ｐ２６−、ｐ１０−、およびｐ−７４が無い（ｎｕｌｌ）バキュロウイルスから産生された個別のタンパク質のより高い発現レベルを報告したため、この結果は全く予測されなかった。本明細書に示される結果は、特に、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子の発現レベルは、上述のバキュロウイルス遺伝子が破壊されるバキュロウイルスによって改善しないことを示す（この結果は、Ｈｉｔｃｈｍａｎらの開示から予測されるものとは異なる）。代わりに、ＶＰ１およびＶＰ２の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）のレベルが減少し、かつ、この欠失バキュロウイルスで産生されるｒＡＡＶ粒子は、野生型バキュロウイルス産生系バクミド、すなわちキチナーゼ、カテプシン、ｐ２６、ｐ１０、および／またはｐ７４遺伝子座について改変されていない、から産生されるｒＡＡＶ粒子と比較して、感染力の４倍の改善を示す。
【００１５】
本発明の組換えバキュロウイルスゲノムは、昆虫細胞において、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞において、優先的に（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）複製可能である。特に、ＢＡＣレプリコンを含有する任意のウイルス性バキュロウイルスゲノムを用いてもよい。特定の実施形態では、組換えバキュロウイルスゲノムはバクミドである。適したバキュロウイルス配列は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（Ａｃ）ＭＮＰＶバクミドを含む。
【００１６】
バキュロウイルスは一般に、組換えタンパク質の発現のための昆虫の感染のために用いられる。特に、昆虫における異種遺伝子の発現が、例えば、Ｕ．Ｓ．  ４，７４５，０５１；  Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６；  ＥＰ  １２７，８３９；  ＥＰ  １５５，４７６；  Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  Ｍｉｙａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８に記載されるように、達成できる。多数のバキュロウイルス株および変種ならびにタンパク質産生のために用いることができる対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６；  Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  ＭｃＫｅｎｎａ，  １９８９，  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ，  ２０１１，  およびＬｙｎｎ，  ２００７に記載されている。
【００１７】
本発明によれば、タンパク質の組換え発現および生物製剤製品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）のために一般に用いられるバキュロウイルスに由来する任意のバキュロウイルスゲノムが用いられ得る。例えば、バキュロウイルスゲノムは、例えば、ＡｃＭＮＰＶ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（Ｂｍ）ＮＰＶ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｅａｒ）ＮＰＶ）またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ（Ｓｅ）ＭＮＰＶに、好ましくはＡｃＭＮＰＶに由来し得る。特に、バキュロウイルスゲノムはＡｃＭＮＰＶクローンＣ６（ゲノム配列：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＣ＿００１６２３．１）またはＥ２（Ｓｍｉｔｈ＆Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９７９）に由来してもよい。
【００１８】
本発明は、バキュロウイルス遺伝子の破壊を実施する。この目的、特に（組換え）バキュロウイルスゲノムから選択された遺伝子（単数または複数）の変異のため、例えば欠失により、数種の方法が実施され得る。遺伝子機能を調査する周知の確立された方法は、ＥＴ（大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）ＲｅｃＥ＆ＲｅｃＴタンパク質）を用いる相同組換え、または、その後抗生物質耐性マーカーに置き換えられる、単一の遺伝子または隣接遺伝子の伸長をターゲットとするラムダレッドに基づく組換えである（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＆  Ｗａｎｎｅｒ，  ２０００；  Ｗｅｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。同一遺伝子内に複数の欠失を調製するために、いくつかの異なる選択マーカーが用いられる必要があり、あるいは、選択マーカーは、消化および再ライゲーションによる各遺伝子欠失の後の除去を可能にする、固有の制限部位に挟まれる必要がある。細菌ゲノムにおける連続的な欠失／挿入を作製する方法に由来する方法（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）は、バクミド技術にも適用されており（Ｍａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、最近の研究において効率よく用いられている。それは、連続変異を作製するために改変ｌｏｘＰ部位を用いる改変ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを実施する。相同組換えによる、選択マーカー、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ抗生物質マーカーでの第一の遺伝子の置換の後、マーカーはマーカーの両端のｌｏｘＰ部位の存在により、除去できる。用いられた設定では、それぞれ異なる変異を有する二つの改変ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１）が用いられる。ｃｒｅ−リコンビナーゼによる組換えの後、一つの代わりに二つの変異を有し、もはやｃｒｅ−リコンビナーゼによって認識できないｌｏｘ７２部位が残される（Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。これが、第二の標的遺伝子の後続する欠失を可能にする。
【００１９】
特定の実施形態では、ｃｈｉ／ｖ−ｃａｔｈ（ＡｃＭＮＰＶ遺伝子地図によるとヌクレオチド１０５２８２−１０７９５４（Ａｙｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４））遺伝子およびｐ１０（ヌクレオチド１１８８３９−１１９１２１）遺伝子が破壊される。
【００２０】
特定の実施形態では、ｐ１０遺伝子の破壊は、ｐ２６および／またはｐ７４遺伝子、好ましくはｐ２６およびｐ７４遺伝子（ヌクレオチド１１８０４４−１２１０７２）の全部または一部分の破壊と同時に作製される。
【００２１】
別の特定の実施形態では、ｐ１０遺伝子の破壊は、隣接するｐ２６およびｐ７４遺伝子のＯＲＦを破壊せずに作製される。この実施形態の一つの好ましい変形では、本発明の組換えバキュロウイルスゲノムは、ｐ１０プロモーターを未だ含む（ｐ１０コード配列は、それゆえ、ＡｃＭＮＰＶ遺伝子地図によるとヌクレオチド１１８７３９−１１８８３６に対応する、そのプロモーターを欠失せずに破壊される）。別の実施形態では、ｐ１０プロモーターも欠失させる。
そのプロモーターをインタクトのまま残し、かつｐ２６およびｐ７４遺伝子のＯＲＦを破壊しない、ｐ１０遺伝子ＯＲＦの破壊が、これらの三つの遺伝子が組換えバキュロウイルスゲノムで破壊される場合よりも、より効果的なｒＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にすることが、以下に示される。
【００２２】
本組換えバキュロウイルスゲノムを用いて、バキュロウイルスに基づく発現系の分野で周知の方法により、組換えタンパク質又は核酸を産生することができる。組換えバキュロウイルスゲノムは、それゆえ、組換えタンパク質、核酸の産生に、またはウイルスベクターおよびウイルス様粒子などの複合体構造の産生に有用な異種ヌクレオチド配列も保持することができる。
【００２３】
本発明によれば、異種ヌクレオチド配列は対象の生産物の産生に有用な配列（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド配列、ヘアピン配列などの核酸、遺伝子治療のための組換えウイルスゲノムなどのウイルスゲノム）である。
【００２４】
それゆえ、本発明はまた、異種配列を含む、上述の組換えバキュロウイルスゲノム（およびそれを含む組換えバキュロウイルスおよび宿主細胞）に関する。
【００２５】
異種配列は、挿入された配列の発現を可能にする、バキュロウイルスにおいて知られている部位または遺伝子座に挿入できる。例えば、異種ヌクレオチド配列のための挿入部位としてポリヘドリン遺伝子座が、（特に、バクミドのＴｎ７組換え部位を介して）古典的に用いられる。
【００２６】
本発明はまた、本発明の組換えバキュロウイルスゲノムを含む、組換えバキュロウイルスおよび宿主細胞に関する。
【００２７】
本発明の組換えバキュロウイルスは、ウイルスベクターおよびウイルス様粒子などの複合体構造を産生するのに良く適合している。後者の場合、複合体構造の構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は、いくつかの組換えバキュロウイルスゲノムから発現させることができ、前記ゲノムのそれぞれは複合体構造の少なくとも一つの構成成分を保有し、かつ前記構成成分のそれぞれは、本発明の異なる組換えバキュロウイルスに含まれる異種ヌクレオチド配列によりコードされる。かかる組換えバキュロウイルスのセットを用いて数個の組換え構成成分を産生する場合、好ましくは、全てのバキュロウイルスベクターがキチナーゼ、カテプシン、ｐ２６、ｐ７４およびｐ１０遺伝子において同一の改変を有する方がよい。
【００２８】
例えば、組換えＡＡＶの産生のため、三つのバキュロウイルスを含む系が用いられ得る：ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするバキュロウイルス、ＡＡＶ  Ｃａｐタンパク質をコードするバキュロウイルス、および二つのＡＡＶ  ＩＴＲの間に対象の遺伝子（例えば治療遺伝子）を含むＡＡＶ−ＩＴＲゲノムをコードするバキュロウイルス（Ｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｍｅｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ  Ｃａｐタンパク質をコードするＤＮＡ配列が一つのバキュロウイルスにより提供される、二つのバキュロウイルスを含む系（デュアル−インフェクションシステム）もまた、現在入手できる。後者のデュアル−インフェクションシステムが実施例において実施される。
【００２９】
それゆえ、本発明は、ウイルスベクターの、またはウイルス様粒子の一部分をコードする異種配列を含む、上で定義された組換えバキュロウイルスゲノム（および組換えバキュロウイルスおよびそれを含む宿主細胞）に関する。特定の実施形態では、バキュロウイルスベクターは：
−ｒＡＡＶゲノム、または
−ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質、または
−ＡＡＶ  ＣＡｐタンパク質、または
−ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＡＡＰ））
をコードする。
【００３０】
特定の実施形態では、組換えバキュロウイルスゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、好ましくは逆方向（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で含む、発現カセットを含む。
【００３１】
宿主細胞は、本発明による一以上のバキュロウイルスが感染している、組換えタンパク質、核酸、ウイルスまたはウイルス様粒子の産生のための産生細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌ）とすることができる。もちろん、組換えバキュロウイルスゲノムに存在する、異種ヌクレオチド配列の発現を制御する、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルまたはマイクロＲＮＡターゲット領域などの５’および３’非翻訳領域は、前記異種配列の産物 の発現のために用いられる宿主に、最終的には依存する。宿主細胞は昆虫細胞であるべきであり、昆虫細胞に効果的なプロモーター（例えば、ｐ１０およびポリヘドリンｖｅｒｙ  ｌａｔｅバキュロウイルスプロモーターまたはそれらの組み合わせ）が用いられる必要がある。ほ乳類産生宿主細胞の場合には、プロモーターをヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのほ乳類プロモーターとしてもよい。
【００３２】
本発明による細胞は、ほ乳類細胞、好ましくはヒト細胞、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの原核細胞からなる群から選択できる。
【００３３】
本発明を実施するのに好ましい酵母細胞は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００３４】
本発明を実施するのに好ましい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｔｏｐ１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０β、ＴＧ１、ＢＷ２３４７３、ＢＷ２３４７４、ＭＷ００３、およびＭＷ００５細胞である（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【００３５】
本発明を実施するのに好ましい昆虫細胞は、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、好ましくは、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｆ＋またはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、およびＤ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、好ましくはＳ２シュナイダー細胞である。
【００３６】
本発明を実施するのに好ましいヒト細胞は、ＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＩＭＲ３２、ＭＴ−２、膵ベータ細胞、角化細胞、骨髄線維芽細胞、ＣＨＰ２１２、初代神経細胞、Ｗ１２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、Ｓａｏｓ−２、ＷＩ３８、初代肝細胞、ＦＬＣ４、１４３ＴＫ−、  ＤＬＤ−１、胎児肺線維芽細胞、初代包皮線維芽細胞、Ｓａｏｓ−２骨肉腫、ＭＲＣ５、およびＭＧ６３細胞である。
【００３７】
以下の実施例および添付図面との関連で、以下、本発明が説明される。
【実施例】
【００３８】
実施例
材料および方法：
バキュロウイルス遺伝子欠失
野生株ＡｃＭＮＰＶバクミドからのカテプシンおよびキチナーゼの欠失が、ＡｃＭＮＰＶバクミドを（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）含有し、プラスミドｐＫＤ４６  （Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ，  ２０００）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂａｃ株から実施された。カテプシン／キチナーゼ遺伝子不活性化に必要なＰＣＲ産物が、鋳型としてｐＣＲＴｏｐｏ−ｌｏｘ−ＣＡＴ−ｌｏｘを用いて、プライマーＣＣ−ＫＯ−ＦおよびＣＣ−ＫＯ−Ｒ（表１）で生成された（Ｍａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。遺伝子不活性化はＭａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１に従って実施し、かつｃｈｉｔｉｎａｓｅ−１０５６２５Ｆおよびｃａｔｈｅｐｓｉｎ−１０７８４９Ｒプライマー（表１）を用いて評価した。カテプシン／キチナーゼが無いバクミド（Ａｃｂａｃ△ＣＣ△ｃａｔ）からのＣＡＴ遺伝子マーカー除去は上述の通り実施され（Ｍａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、かつ前述のプライマーを用いて、ＰＣＲおよび配列解析によって確認された。Ａｃｂａｃ△ＣＣ△ｃａｔからｐ１０をコードする配列を除去するための第二の遺伝子不活性化は、プライマー対ｐ１０−ＫＯ−Ｆ／ｐ１０−ＫＯ−Ｒ（表１）で生成されたＰＣＲ産物を用いて、同様に実施された。正しい遺伝子不活性化の確認は、プライマー対ｐ１０−１１８７２５−Ｆ／ｐ１０−１１９２５９−Ｒ  （表１）でのＰＣＲおよび配列解析を用いて実施された。この第二の遺伝子不活性化は、インタクトなｐ１０プロモーターを有する、カテプシン／キチナーゼが無いバクミド（Ａｃｂａｃ△ＣＣ△ｐ１０）をもたらした。あるいは、Ａｃｂａｃ△ＣＣ△ｃａｔにおいて隣接したｐ２６−、ｐ１０、およびｐ７４遺伝子の第二の遺伝子不活性化が、プライマー対ｐ２６−ＫＯ−Ｆ／ｐ７４−ＫＯ−Ｒ（表１）で生成されたＰＣＲ産物を用いて、同様に実施された。正しい遺伝子不活性化の確認は、プライマー対ｐ２６−１１７９８９−Ｆ／  ｐ７４−１２１１７６−Ｒ（表１）でのＰＣＲおよび配列解析を用いて実施された。後者の遺伝子不活性化は、カテプシン／キチナーゼ／ｐ２６／ｐ１０／ｐ７４が無いバクミド（Ａｃｂａｃ△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４）をもたらした。
【００３９】
転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）によるＡＡＶ  ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子および組換えＡＡＶゲノムのバクミドへの挿入
野生型バクミドを含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ細胞およびＡｃｂａｃ△ＣＣ△ｐ１０またはＡｃｂａｃ△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４を含有する大腸菌ＤＨ１０β細胞を、プラスミドｐＭＯＮ７１２４（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）で形質転換した。次いで、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って、ＣＭＶプロモーターにより制御され、かつＡＡＶ２の末端逆位配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＩＴＲｓ））で挟まれた、マウス分泌型アルカリホスファターゼレポーター遺伝子（ｍＳｅＡＰ）をコードする、プラスミドｐＦＢＤ−ｍＳｅＡＰで、これら３種全てのバクミド内に転位が実施された。また、ポリヘドリン  ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  プロモーター下のＡＡＶ２  ｒｅｐ７８／５２遺伝子、およびｐ１０  ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  プロモーター下のＡＡＶ８  ｃａｐ遺伝子をコードする、プラスミドｐＳＲ６６０（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）で、転位が実施された。バクミドゲノム内への効率の良い組換えが、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃプロトコールに従って確認された。これは、各セットが異なるバキュロウイルスゲノム骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を備える（ｗｔ、Ａｃｂａｃ△ＣＣ△ｐ１０、またはＡｃｂａｃ△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４）、ＩＴＲ−ｍＳｅＡＰ  ＤＮＡを保有するｒＡＡＶ粒子の産生のための、三セットの二種類のバクミドをもたらした。
【００４０】
細胞株、バキュロウイルスおよびｒＡＡＶ産生
懸濁培養中のＳｆ９細胞を１Ｌベルコスピナーフラスコにて、ＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて、２７℃で生育させた。バキュロウイルスを、上述の欠失バクミドおよび組換えバクミドから、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃプロトコールのガイドラインに従って生成し、１００ｍＬベルコスピナーにて、Ｓｆ９の懸濁培養中で増幅させた。１００ｍＬベルコスピナーにて１０６細胞／ｍＬで播種された、７０ｍＬのＳｆ９細胞培養にて、それぞれ１．６のＭＯＩで、組換えＡＡＶゲノム（ＩＴＲ−ｍＳｅＡＰ）およびＡＡＶ  ｒｅｐ２／ｃａｐ８遺伝子を保持するバキュロウイルスと、Ｓｆ９細胞のデュアル−インフェクションにより、ｒＡＡＶ産生が実施された。感染後７２時間で、１ｍLの総培養物が、精製に先立って、ｒＡＡＶ産生の直接定量のために回収され、次いで−８０℃で保管された。
【００４１】
ｒＡＡＶ精製および特徴付け
ｒＡＡＶは、（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）に従って、Ｉｍｍｕｎｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＡＶＢ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、バルクから精製された。５ｘ１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）の精製ｒＡＡＶベクターが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％（Ｎｕ−ＰＡＧＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動され、直接クーマシー染色されるか、免疫検出に先立ってニトロセルロースメンブレン（ｉＢｌｏｔ  ｇｅｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｔａｃｋ  ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスファーされた（以下のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを参照のこと）。
【００４２】
ｒＡＡＶゲノム力価の決定
定量的ＰＣＲアッセイを総培養サンプルまたは精製ｒＡＡＶサンプルに直接実施して、ｒＡＡＶ力価（生産物のｍＬ当たりのウイルスゲノム）を決定した。ウイルスＤＮＡを、Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｓｍａｌｌ  ｖｏｌｕｍｅキット（ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６，  Ｒｏｃｈｅ）を用いて、バルクまたは精製サンプルから直接抽出した。参照として用いられたプラスミドは、ＡＡＶ２の二つのＩＴＲおよびバキュロウイルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する。段階希釈を実施して解析されるサンプルの最終コピー数を計算し、陽性対照を用いて有効力価（ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を評価した。力価測定は独立したオペレーターにより、同一プレート上で同時に実施された。
【００４３】
ウェスタンブロット
バキュロウイルスバルクサンプルまたは精製ｒＡＡＶ８サンプルを、ＡＡＶ  ＶＰおよびＲｅｐタンパク質に対するウェスタンブロットで解析した。
抗ＶＰ一次抗体は、１／２５０希釈で用いられるマウスＩｇＧ１クローンＢ１（Ｐｒｏｇｅｎ）である。抗Ｒｅｐ一次抗体は、１／１００希釈で用いられるマウスＩｇＧ１クローン３０３．９（Ｐｒｏｇｅｎ）である。二次抗体は、１／５０００希釈で用いられるヤギ抗マウスＤｙｅ  ６８０（ＬＩ−ＣＯＲ）である。赤外線イメージングシステムブロッキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ）中でインキュベーションを実施し、Ｏｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）上で発色（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）を実施した。蛍光の強度はＯｄｙｓｓｅｙ  ２．１ソフトウェアで定量した。
【００４４】
インビボ注射、サンプル回収およびｍＳｅＡＰ定量
ｒＡＡＶベクター、２５μＬのリン酸緩衝生理食塩水中１０９  ｖｇ、を、６週齢のＣ５７ｂｌａｃｋ６マウスの左脛骨動脈（ＴＡ）筋肉内に、筋肉内注射した（ベクターあたりｎ＝４）。ｍＳｅＡＰ絹状（ｓｅｒｉｃ）定量のため、注射後３、７、１４、２１、２８、３５日で血液サンプルを回収した。３５日目に、動物を犠死させ、左および右のＴＡ筋肉を回収し、組織学的および酵素的解析の前に凍結させた。
【００４５】
全てのマウスは、科学上の目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＥＵ指令に従って取り扱われた。ｍＳｅＡＰ用量アッセイを１２．５μＬのマウス血清で実施した。ｍＳｅＡＰ定量はＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）を用いて実行した。サンプルをＶｉｃｔｏｒ  ＩＩルミノメーター装置上で測定した。精製ヒト胎盤型アルカリフォスファターゼの標準曲線（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、発現レベルを血清のｍＬ当たりのｍＳｅＡＰのｎｇとして表す。
【００４６】
ｍＳｅＡＰ発現の組織学的解析
筋肉切片（８μＭ）を調製し、先に説明したように（Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（Ｎｉｔｒｏ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート法を用いて、ｍＳｅＡＰ局在を解析した。筋肉切片をヌクレアファーストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ）で対比染色し、炎症および筋肉の完全性（ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、ヘマトキシリン−エオジン染色および光学顕微鏡解析によって評価した。
【００４７】
インビボでのｒＡＡＶゲノムの検出
ＦａｓｔＰｒｅｐ装置（ＱＢＩＯｇｅｎｅ）にてＦａｓｔＤＮＡキット（ＱＢＩＯｇｅｎｅ）を用いて、マウス筋肉から総ＤＮＡサンプルを抽出した。前述の段落に説明されるように、ＱＰＣＲを用いてｒＡＡＶゲノム力価測定を実施した。ｔｉｔｉｎ遺伝子の定量を用いて、標準化を実施した。
【００４８】
統計的解析
ｒＡＡＶ注射後３５日目での絹状（ｓｅｒｉｃ）ｍＳｅＡＰ発現の統計的有意性（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）を評価した。群比較が実施された。フィッシャー検定（α＝０．０５）、その後エクセルプログラムを用いるスチューデント検定により、分散分折（Ｖａｒｉａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を、を実施した。
【００４９】
結果：
ｐ１０またはｐ２６、ｐ１０、およびｐ７４遺伝子と共に、キチナーゼ、カテプシンを欠失したバキュロウイルスの生成
複数の遺伝子を除去するために、連続的な欠失がＡｃＭＮＰＶバクミドへ導入されることが必要である。遺伝子機能を調査する周知の確立された方法は、ＥＴ（大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）ＲｅｃＥ＆ＲｅｃＴタンパク質）を用いる相同組換え、または、その後抗生物質耐性マーカーに置き換えられる、単一の遺伝子をターゲットとするラムダレッドに基づく組換えである（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＆  Ｗａｎｎｅｒ，  ２０００）。同一遺伝子内に複数の欠失を調製するために、いくつかの異なる選択マーカーが用いられる必要があり、あるいは、選択マーカーは、消化および再ライゲーションによる各遺伝子欠失の後の除去を可能にする、固有の制限部位に挟まれる必要がある。細菌ゲノムにおける欠失／挿入を作製する方法に由来する方法（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）は、バクミド技術にも適用されている（Ｍａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。相同組換えによる、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ抗生物質マーカーでの第一の遺伝子の置換の後、マーカーはマーカーの両端のｌｏｘＰ部位の存在により、除去できる。用いられた設定では、それぞれ異なる変異を有する二つの改変ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１）が用いられる。ｃｒｅ−リコンビナーゼによる組換えの後、一つの代わりに二つの変異を有し、もはやｃｒｅ−リコンビナーゼによって認識できないｌｏｘ７２部位が残される（Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。これが、第二の標的遺伝子の後続する欠失を可能にする。この方法は、ｃｈｉ／ｖ−ｃａｔｈ（ＡｃＭＮＰＶ遺伝子地図によると欠失ヌクレオチド１０５２８２−１０７９５４（Ａｙｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４））およびｐ１０（欠失ヌクレオチド１１８８３９−１１９１２１）またはｐ２６／ｐ１０／ｐ７４（欠失ヌクレオチド１１８０４４−１２１０７２）遺伝子を、二つの段階において、連続的に除去されるように設定されたバクミドにおいて試験された。これらの欠失は、ＰＣＲおよび配列解析によって評価された。欠失バクミドＤＮＡのぞれぞれで、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトするのに成功した。感染から９６時間後、Ａｃ△ＣＣ△ｐ１０およびＡｃ△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４バキュロウイルスの両方の感染力を示す、バキュロウイルス感染の明らかな兆候（細胞層の破壊、より大きなＳｆ９細胞の直径および死滅）が観察された。
【００５０】
Ａｃ△ＣＣ△ｐ１０におけるｐｏｌｈ下のＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子およびｐ１０プロモーター下のＡＡＶ８  ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ−ｍＳｅＡＰ配列の転位に先立って、バクミドのＴｎ７部位への、対象の構築物を含有するトランスファーベクターからの効率の良い組換えを介在するために、異なるバクミド構築物を含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０βが、プラスミドｐＭＯＮ７１２４（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）で形質転換された（図１）。
【００５１】
組換えの後、かつＳｆ９細胞へのバクミドＤＮＡのトランスフェクションの前に、非組換えバクミドが無いことが確認された。
【００５２】
バキュロウイルスをプラーク精製し、かつ２代継代で増幅した。組換えｗｔ−、△ＣＣ△ｐ１０、および△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４バキュロウイルスの間に、バキュロウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）またはＡＡＶ  ＶＰおよびＲｅｐタンパク質レベルの点で、違いは観察されなかった。次いで、バキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶ産生を実施した。
【００５３】
キチナーゼ、カテプシンおよびｐ１０遺伝子の欠失はＳｆ９細胞におけるｒＡＡＶ生産性を改善しない。
標準的なｒＡＶＶベクター産生をスピナー培養にて実施し、組換えバキュロウイルスの産生が、野生型または△ＣＣ△ｐ１０−型または△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４−型のいずれも、それぞれ２．０９ｘ１０１１および１．３０ｘ１０１１および２．１１ｘ１０１１  ｖｇ／ｍＬの力価をもたらし、同等であったことが明らかに示された。それと同時に、ＡＡＶの産生（モデル導入遺伝子：ｍＳｅＡＰ）は、両バキュロウイルスが用いられた場合、それぞれ１．２７ｘ１０１０、１．３２ｘ１０１０および１．４０ｘ１０１０  ｖｇ／ｍＬの力価をもたらし、事実上同様であった（図２Ａ）。ＡＶＢクロマトグラフィーを用いるＡＡＶの精製は、それぞれ４．２５ｘ１０１２および２．４７ｘ１０１２、３．５２ｘ１０１２  ｖｇ／ｍＬへの力価の増大をもたらした（図２Ｂ）。これらの結果は、バキュロウイルス骨格からのいくつかの非本質的なバキュロウイルス遺伝子の除去が、ＡＡＶベクターの産生および精製に影響を与えないことを示す。
【００５４】
キチナーゼ、カテプシンおよびｐ１０またはｐ２６、ｐ１０、ｐ７４遺伝子が欠失したバキュロウイルスの使用はｒＡＡＶ粒子分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を低減させる。
ｐ１０  ＯＲＦ欠失またはｐ２６、ｐ１０およびｐ７４遺伝子の欠失と組み合わせたキチナーゼ、カテプシンの非存在は、ＡＡＶベクターの完全性に有益な影響を与えた。おそらく、バキュロウイルス由来のプロテアーゼ活性（カテプシン）の非存在が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット（ＷＢ）解析によって示されるように、ベクター粒子分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の低減をもたらした（図３）。これらの解析法は、少なくとも３つのＶＰ−特異的な「混入（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）分解バンド」の消失を明白に示した。３つのバンドの主要な混入分解バンドは、ＶＰ３の寸前に局在化する（図３）。ｗｔ−バキュロウイルスの代わりの△ＣＣ△ｐ１０または△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４の使用は、それゆえ、ｒＡＡＶベクター分解の低減および数個のＶＰ分解産物の消失をもたらす。
【００５５】
キチナーゼ、カテプシンおよびｐ１０またはｐ２６、ｐ１０、ｐ７４遺伝子が欠失したバキュロウイルスを用いて産生されたｒＡＡＶ粒子は、インビボでより高い感染力を示す。
△ＣＣ△ｐ１０または△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４バキュロウイルスを用いる場合の、ＷＢでの特定のサブサイズのタンパク質バンドの消失は、ｒＡＡＶベクター粒子が分解されるのがより少なく、より良い完全性を有し得ることを意味し、インビボ感染力／有効性が改善され得ることを示唆している。実際、３つの異なるバキュロウイルス骨格（ｗｔ、△ＣＣ△ｐ１０および△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４）で産生された精製ｒＡＡＶ−ｍＳｅＡＰ粒子を、マウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６）に筋肉内注射すると、注射後約１週間、ｍＳｅＡＰ活性が血清中に観察された。注射後３週間目で、ｗｔ−骨格、△ＣＣ△ｐ１０−および△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４−骨格を用いた場合、それぞれ、約５．８  ｎｇ／ｍＬ、２３．２  ｎｇ／ｍＬ、および９．３  ｎｇ／ｍＬのプラトー濃度まで、活性が増大した（図４Ａ）。ｒＡＡＶ産生のために△ＣＣ△ｐ１０−バキュロウイルス骨格を用いた場合、ｗｔ−バキュロウイルス骨格と比べ、約４倍の違いである（ｐ＝０．０１）。ｗｔ−骨格の代わりに△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４−骨格を用いた場合、約２倍の違いである（ｐ＝０．０５）。
【００５６】
注射後３５日、マウスを犠死させ、注射された筋肉を組織学的に解析した。ｍＳｅＡＰ活性の血清レベルの増大に関しては、△ＣＣ△ｐ１０バキュロウイルスで産生されたｒＡＡＶを注射されたマウスが、ｗｔ−バキュロウイルス系で産生されたｒＡＡＶを注射されたマウスに比べ、導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）筋肉組織におけるｍＳｅＡＰ活性の大幅な増大を示した。△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４で産生されたｒＡＡＶを導入された筋肉組織におけるｍＳｅＡＰ活性は、他の二つのバキュロウイルス骨格で産生されたｒＡＡＶに比べて、中間の範囲であることが見出された（図４Ｂ）。ｗｔ産生系に比べ、３．２５多くのゲノムコピーが送達されたことを示す、定量的ＰＣＲ（図４Ｃ）に示されるように、△ＣＣ△ｐ１０バキュロウイルスで産生されたｒＡＡＶで観察された増大したｍＳｅＡＰ活性は、ＴＡ筋肉細胞に送達されたｒＡＡＶゲノムコピー数の増大と相関する。同じような方法で、△ＣＣ△ｐ２６ｐ１０ｐ７４バキュロウイルスでの産生の後の、ＴＡ筋肉細胞に送達されたｒＡＡＶゲノムコピー数の評価は、ｗｔ−バキュロウイルス骨格で産生されたｒＡＡＶの使用に比べ、２倍の増大をもたらした。これらの値は、様々なバキュロウイルスベクターで得られたｍＳｅＡＰ活性レベルに良く一致する。
【００５７】
参考文献
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Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ  ＡＭ，  Ｋａｓｐｒｚｙｋ  ＰＧ，  Ｒａｕｍ  ＭＧ，  Ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  Ｋ，  Ｌｅｂａｃｑ  ＪＡ，  Ｂａｔｔｅｙ  ＪＦ．  （１９８８）．  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，  ３１２９−３５．
Ｌｕｃｋｏｗ  ＶＡ，  Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＭＤ  （１９８８）．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，    ４７−５５．
Ｌｕｃｋｏｗ  ＶＡ，  Ｌｅｅ  ＳＣ，  Ｂａｒｒｙ  ＧＦ，  Ｏｌｉｎｓ  ＰＯ  （１９９３）．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７（８）：  ４５６６−４５７９．
Ｌｙｎｎ  ＤＥ  （２００７）．  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ｐｐ．  １１７−１３７．
Ｍａｅｄａ  Ｓ，  Ｋａｗａｉ  Ｔ，  Ｏｂｉｎａｔａ  Ｍ，  Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈ，  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｔ，  Ｓａｅｋｉ  Ｙ，  Ｓａｔｏ  Ｙ，    Ｆｕｒｕｓａｗａ  Ｍ．  （１９８５）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，  ５９２−４．
Ｍａｎｎｏ  ＣＳ，  Ｐｉｅｒｃｅ  ＧＦ，  Ａｒｒｕｄａ  ＶＲ，  Ｇｌａｄｅｒ  Ｂ，  Ｒａｇｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｂｙ  ＡＡＶ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｉｍｐｏｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２（３）：  ３４２−３４７．
Ｍａｒｅｋ  Ｍ，  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  ＭＭ，  Ｄｅｖａｒａｊ  ＦＦ，  Ｖｌａｋ  ＪＭ，  Ｍｅｒｔｅｎ  ＯＷ  （２０１１）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｉｒｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８（５）：  １０５６−１０６７．
Ｍａｒｔｉｎ  ＢＭ，  Ｔｓｕｊｉ  Ｓ，  ＬａＭａｒｃａ  ＭＥ，  Ｍａｙｓａｋ  Ｋ，  Ｅｌｉａｓｏｎ  Ｗ，  Ｇｉｎｎｓ  ＥＩ  （１９８８）．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．  ＤＮＡ  ７，  ９９−１０６．
ＭｃＫｅｎｎａ  ＫＡ，  Ｈｏｎｇ  Ｈ，  ｖａｎ  Ｎｕｎｅｎ，  Ｇｒａｎａｄｏｓ  ＲＲ  （１９８９）．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｗ  Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７１，  ８２−９０．
Ｍｅｎｄｅｌｌ  ＪＲ，  Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ＬＲ，  Ｒｏｓａｌｅｓ  ＸＱ，  Ｃｏｌｅｙ  ＢＤ，  Ｇａｌｌｏｗａｙ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｌｉｍｂ−ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，  ｔｙｐｅ  ２Ｄ．  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６８（５）：  ６２９−６３８．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＷ，  Ｓａｆｅｒ  Ｐ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＬＫ  （１９８６）．  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．  ８  （ｅｄｓ  Ｓｅｔｌｏｗ，  Ｊ．  ＆  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，  Ａ．）  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２７７−２９８．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＬＫ  （１９８８）．  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ４２，  １７７−９９．
Ｍｉｙａｊｉｍａ  Ａ，  Ｓｃｈｒｅｕｒｓ  Ｊ，  Ｏｔｓｕ  Ｋ，  Ｋｏｎｄｏ  Ａ，  Ａｒａｉ  Ｋ，  Ｍａｅｄａ  Ｓ  （１９８７）．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ，  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ，  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３．  Ｇｅｎｅ  ５８，  ２７３−８１．
Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  Ｆ，  Ｍａｇｕｉｒｅ  ＡＭ，  Ｔｅｓｔａ  Ｆ，  Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＡ，  Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｉｓ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  １．５  Ｙｅａｒｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８（３）：  ６４３．
Ｓｍｉｔｈ  ＧＥ，  Ｊｕ  Ｇ，  Ｅｒｉｃｓｏｎ  ＢＬ，  Ｍｏｓｃｈｅｒａ  Ｊ，  Ｌａｈｍ  ＨＷ，  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ  Ｒ，  Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＭＤ  （１９８５）．  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ    Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８２，  ８４０４−８．
Ｓｍｉｔｈ  ＧＥ，  ＭＤ  Ｓｕｍｍｅｒｓ  （１９７９）．  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｍａｐｓ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  （ＭＮＰＶ）  ｖａｒｉａｎｔｓ，  Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＭＮＰＶ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ  ＭＮＰＶ  ＤＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ＳｍａＩ，  ＫｐｎＩ，  ＢａｍＨＩ，  ＳａｃＩ，  ＸｈｏＩ，  ａｎｄ  ＥｃｏＲＩ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３０：８２８−８３８．
Ｓｍｉｔｈ  ＲＨ，  Ｌｅｖｙ  ＪＲ，  Ｋｏｔｉｎ  ＲＭ  （２００９）．  Ａ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ＡＡＶ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｙｉｅｌｄｓ  Ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ｒＡＡＶ  Ｓｔｏｃｋｓ  Ｆｒｏｍ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７（１１）：  １８８８−１８９６．
Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，  Ｎｏｎａｋａ  Ｈ，  Ｔｓｕｇｅ  Ｙ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ  （２００５）．  Ｎｅｗ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇｅｎｏｍｅ，  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｌｏｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７１（１２）：  ８４７２−８４８０．
Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ  （２００７）．  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｌｏｘ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７（４）：  ８７１−８７８．
Ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  ＭＭ  （２０１１）．  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）．
Ｖｌａｋ  ＪＭ，  Ｋｌｉｎｋｅｎｂｅｒｇ  ＦＡ，  Ｚａａｌ  ＫＪ，  Ｕｓｍａｎｙ  Ｍ，  Ｋｌｉｎｇｅ−Ｒｏｏｄｅ  ＥＣ，  Ｇｅｅｒｖｌｉｅｔ  ＪＢ，    Ｒｏｏｓｉｅｎ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｌｅｎｔ  ＪＷ  （１９８８）．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐ１０  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｐ１０−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９，  ７６５−７６．
Ｗｅｓｔｅｎｂｅｒｇ  Ｍ，  Ｂａｍｐｓ  Ｓ，  Ｓｏｅｄｌｉｎｇ  Ｈ，  Ｈｏｐｅ  ＩＡ，  Ｄｏｌｐｈｉｎ  ＣＴ  （２０１０）．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ  ＭＷ００５：  Ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
ｏｒｉＶ−ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｏｓｔ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０．
【００５８】
配列表
表１：この研究で用いられたプライマー配列
【表１】
2014522658.tif 000002
【図１】
2014522658.tif 000003
【図２】
2014522658.tif 000004
【図３ａ】
2014522658.tif 000005
【図３ｂ】
2014522658.tif 000006
【図４】
2014522658.tif 000007
【配列表】
2014522658000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月20日(2014.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014522658000001.app
【国際調査報告】
2014522658.tif 000008
2014522658.tif 000009
2014522658.tif 000010
2014522658.tif 000011
2014522658.tif 000012