(57)【要約】  トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤が提供される。また、別のＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)、またはエピガロカテキン−３−ガレートとの併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療における使用のための、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項２】
式Ｉ：
【化１】
2014530842.tif 000014
［式中、
Ｒ＝−Ｃ（Ｏ）−ＰｈＣＨ３、−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−Ｃ（Ｏ）−ＮＥｔ２または−ＣＨ＝Ｃ（Ｏ）（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ３）]
のニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項３】
トルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である、請求項２に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項４】
前記トランスサイレチン関連アミロイドーシスが家族性アミロイド多発性神経障害である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項５】
前記トランスサイレチン関連アミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項６】
前記トランスサイレチン関連アミロイドーシスが軟膜アミロイドーシスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項７】
前記トランスサイレチン関連アミロイドーシスが家族性アミロイド心筋症である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項８】
別のＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびエピガロカテキン−３−ガレートからなる群から選択される付加的治療薬との併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤（ただし、前記ベンズオキサゾール誘導体は式Ｖ：
【化２】
2014530842.tif 000015
［式中、
Ｙは、ＣＯＯＲ、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＯＲであり；
Ｘは、０であり；かつ
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、水素、ハロ、ＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＣＦ３から選択され、ここで、
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロシクリル、フェニル、キシリル、ナフチル、チエニル、インドリルまたはピリジルである］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である）。
【請求項９】
前記ベンズオキサゾール誘導体が式ＶＩ：
【化３】
2014530842.tif 000016
［式中、
Ｙは、ＣＯＯＨ、またはＯＨであり；かつ
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、水素、ハロ、ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはＣＦ３から選択される］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項８に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項１０】
前記ベンズオキサゾール誘導体がタファミディスである、請求項８または９に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項１１】
前記ＣＯＭＴ阻害剤が、注射投与形、経口投与形または徐放性投与形として投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤。
【請求項１２】
トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤と、別のＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびエピガロカテキン−３−ガレートからなる群から選択される付加的治療薬との組合せ（ただし、前記ベンズオキサゾール誘導体は式Ｖ：
【化４】
2014530842.tif 000017
［式中、
Ｙは、ＣＯＯＲ、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＯＲであり；
Ｘは、０であり；かつ
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、水素、ハロ、ＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＣＦ３から選択され、ここで、
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロシクリル、フェニル、キシリル、ナフチル、チエニル、インドリルまたはピリジルである］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である）。
【請求項１３】
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤との併用療法でトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびエピガロカテキン−３−ガレートからなる群から選択される治療薬（ただし、前記ベンズオキサゾール誘導体は式Ｖ：
【化５】
2014530842.tif 000018
［式中、
Ｙは、ＣＯＯＲ、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＯＲであり；
Ｘは、０であり；かつ
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、水素、ハロ、ＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＣＦ３から選択され、ここで、
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロシクリル、フェニル、キシリル、ナフチル、チエニル、インドリルまたはピリジルである］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド疾患の分野、特に、トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスは、アミロイドタンパク質が器官および／または組織に異常に沈着する様々な病態を意味する。これらのアミロイドタンパク質は、アミロイド原線維またはアミロイド沈着物と呼ばれる異常な線維様形態で存在することがあり、身体のいたるところに形成して罹患器官の構造および機能を徐々に妨げる。異なるタイプのアミロイド疾患には異なるタンパク質が関連しており、治療は特定のアミロイドタンパク質に依存する。
【０００３】
トランスサイレチン関連アミロイドーシスは、トランスサイレチンの異常なミスフォールディング、凝集（原線維形成）および続いての沈着に特異的に関連するアミロイド疾患群の一般名である。トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質は、甲状腺ホルモンであるチロキシンおよびレチノールの血清および脳脊髄液担体である。ヒト染色体１８ｑ１２．１−１１．２に位置するＴＴＲ遺伝子の突然変異が、ＴＴＲタンパク質の不安定化(desestabilization)をもたらして異常な凝集およびトランスサイレチン関連アミロイド疾患をきたすことがある。８０を超えるＴＴＲのアミロイド形成変異体が知られているが、そのうち最も多いものはＴＴＲ  Ｖ３０Ｍと呼ばれる。
【０００４】
家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）は、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス、トランスサイレチンアミロイドーシスまたはＣｏｒｉｎｏ  ｄｅ  Ａｎｄｒａｄｅ病とも呼ばれ、常染色体優性神経変性疾患である。通常、この疾患自体は２０〜４０歳の間に発現し、疼痛、感覚異常、筋肉の脱力および自律神経機能不全を特徴とする。その終末状態では、腎臓および心臓が侵される。ＦＡＰは、ＴＴＲタンパク質のアミロイド変異体の全身沈着、特に末梢神経系における沈着を特徴とし、進行性の感覚神経性および運動神経性の多発性神経障害を引き起こす。この疾患が、世界で断然に最も多いタイプの遺伝性アミロイドーシスである。
【０００５】
他のタイプのトランスサイレチン関連アミロイドーシスとしては、心臓におけるアミロイドＴＴＲ沈着により引き起こされる家族性アミロイド心筋症および老人性全身性アミロイドーシス、ならびにＴＴＲアミロイド沈着物が軟膜の血管壁、軟膜くも膜、また軟膜下間隙にも見られる軟膜アミロイドーシスがある。後者の病態は、認知症、運動失調、および痙直としての中枢神経系障害兆候の臨床像に関連している。
【０００６】
これまでのところアミロイド沈着を遮断するかまたはその除去を速める治療はなく、アミロイド疾患の治療は罹患器官の機能を補助することを目的としている。ＴＴＲタンパク質は主として肝臓で生産されるので、肝移植がトランスサイレチン関連アミロイドーシス、特にＦＡＰの治療としてしばしば用いられてきた。突然変異ＴＴＲ遺伝子を含む肝臓の正常なトランスサイレチンタンパク質を作る肝臓での置き換えは、さらなるアミロイドの形成を防ぐことを目的とし、疾患を安定化させることができる。肝移植はＦＡＰ患者で行われており、多くの場合、大きな成功を収めている。しかしながら、肝移植は常に利用可能な選択肢というわけではなく、その上、経験が増えるにつれ、ＦＡＰに対する肝移植は神経または心臓への大きなダメージが起こってしまわないうちに行うべきであることが明らかになってきている。不幸にも、これは症状を引き起こさずに起こる場合がある。
【０００７】
原線維形成および続いてのＴＴＲ沈着に対して阻害活性を発揮するとして記載されている化合物は極めて少ない。これらのうち、ヨードジフルニサルは、Gales et al (Gales L, Macedo-Ribeiro S, Arsequell G, Valencia G, Saraiva MJ, Damas AM. “Human transthyretin in complex with iododiflunisal: structural features associated with a potent amyloid inhibitor”. Biochem J, 2005, vol. 388, p. 615-621)により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて強力なアミロイド阻害剤であると報告されている。さらに、特許出願ＷＯ２００５／１１３５２３には、ＴＴＲアミロイドタンパク質を安定化させ、従って、ＴＴＲアミロイド原線維の形成を防ぐためのベンズオキサゾール化合物が開示されている。これらの化合物は、トランスサイレチン関連アミロイド疾患の治療に有用であるとして特許請求されている。
【０００８】
特に、タファミディス（２−（３，５−ジクロロフェニル）−１，３−ベンズオキサゾール−６−カルボン酸と呼ばれるベンズオキサゾール誘導体は、ＴＴＲの異常凝集および原線維形成を阻害すると記載されており、ＦＡＰ治療のための臨床試験下にある。有望な見通しがあるのにもかかわらず、タファミディスは、主要当局医薬品登録局(main official medicine registration offices)でなお評価中である。よって、タファミディスの臨床的妥当性を明らかにする必要がなおある。
【０００９】
当技術分野でなされた多大な努力にもかかわらず、これまでにＦＡＰの治療のための有効な薬理学的療法はない。従って、ＦＡＰおよびその他のトランスサイレチン関連アミロイドーシスの治療のための代替化合物を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、驚くことに、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤がＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のために有用であることを見出した。
【００１１】
以下の実施例に示されるように、ＣＯＭＴ阻害剤トルカポンは、ＴＴＲアミロイド形成に対して高い阻害活性を有する。トルカポンの良好な阻害活性は、その低いＩＣ５０および高いアミロイドーシス減少パーセント（ＲＡ％）値により明らかとされる。
【００１２】
よって、本発明の第一の側面は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのＣＯＭＴ阻害剤に関する。この側面は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療用薬剤の調製のためのＣＯＭＴ阻害剤の使用として再定式化することができる。
【００１３】
ＣＯＭＴ阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含んでなるＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための方法も本発明の一部をなす。特定の実施態様では、予防および／または治療を必要とする対象はヒトを含む哺乳動物である。さらなる好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００１４】
ＦＡＰ治療に関してこれまでに最も進んでいる薬理化合物であるタファミディスに比べ、トルカポンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＩＣ５０は４分の１であるが、これはＴＴＲ原線維形成を５０％阻害するために必要なトルカポンの濃度がタファミディスの場合よりもはるかに低いことを意味する（下記の実施例を参照）。下記の実施例はさらに、トルカポンはＴＴＲと結合し、タファミディスよりも高い程度でＴＴＲ誘発性の細胞傷害性を妨げることを示す。
【００１５】
これらの結果によれば、トルカポンは、参照としてのタファミディス化合物よりもＴＴＲ原線維形成を低減する上でより有効である。ＴＴＲ原線維形成の防止に加え、発明者らは、トルカポンが既存のＴＴＲ原線維に対して重要な破壊活性を示すことを見出した。以下に提示される結果は、ルカポンのＴＴＲ原線維破壊活性がタファミディス(tafamidi’s)よりも高いことを実証する。
【００１６】
ＣＯＭＴ阻害剤は、現況技術において、神経伝達物質の分解に関与する酵素であるカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの作用を阻害する化合物として周知である(Mannisto and Kaakkola, Pharm. Rev., 1999, vol 51, p. 593-628)。ＣＯＭＴ阻害活性は、例えばZurcher et al (Biomedical Chromatography, 1996, vol. 10, p. 32-36)に開示されている方法など、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＣＯＭＴ阻害剤は、薬理学分野において、Ｌ−ＤＯＰＡなどのドーパミン作動薬を併用するパーキンソン病の治療に関して周知である。
【００１７】
数種のＣＯＭＴ阻害剤がすでに記載されている。トルカポン、エンタカポン、およびニテカポンは、いわゆる「第二世代ＣＯＭＴ阻害剤」に属し、強力で選択性が高く、経口活性のあるＣＯＭＴ阻害剤であることが示されている。ニトロカテコールは、これらの分子内の重要構造である(Pharm. Rev., 1999, vol 51, p. 593-628, 前掲)。よって、一つの実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療における使用のためのＣＯＭＴ阻害剤は、ニトロカテコール化合物である。特定の実施態様では、ニトロカテコール化合物は下式Ｉ：
【化１】
2014530842.tif 000002
（式中、Ｒ＝−Ｃ（Ｏ）−ＰｈＣＨ３、−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−Ｃ（Ｏ）−ＮＥｔ２または−ＣＨ＝Ｃ（Ｏ）（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ３））
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である。
【００１８】
本発明の第一の側面の別の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤はトルカポン、エンタカポンもしくはニテカポン、またはそれらの薬学上許容可能な塩である。
【００１９】
特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、トルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。トルカポン（式ＩＩ）は、相対分子量２７３．２５の、黄色、無臭、非吸湿性の結晶性化合物である。その実験式はＣ１４Ｈ１１ＮＯ５である。トルカポンの化学名は、３，４−ジヒドロキシ−４’−メチル−５−ニトロベンゾフェノンであり、そのＣＡＳ参照番号は１３４３０８−１３−７である。
【化２】
2014530842.tif 000003
【００２０】
本発明の第一の側面の別の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤はエンタカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。エンタカポン（式ＩＩＩ）は、分子量３０５．２９の黄色結晶性化合物である。その実験式はＣ１４Ｈ１５Ｎ３Ｏ５である。エンタカポンの化学名は、（２Ｅ）−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−プロペンアミドであり、そのＣＡＳ参照番号は１３０９２９−５７−６である。
【化３】
2014530842.tif 000004
【００２１】
これらの化合物は１９９８年以来、食品医薬品局（ＦＤＡ）および欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によりパーキンソン病の治療における医薬使用が承認されている薬物であるので、トルカポンおよびエンタカポンのバイオアベイラビリティおよび安全性プロフィールはいくつかの臨床試験で検討済みである。従って、これらの化合物は、ヒト用として許容される安全性特性および良好なバイオアベイラビリティを有する。それらの安全性プロフィールはＴＴＲ原線維形成に対するそれらの高い阻害活性と相まって、本ＣＯＭＴ阻害剤をＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための有望な薬物とする。
【００２２】
さらに、これらの化合物はすでにヒト疾患の治療に関する臨床試験を受けているので、新規な化学実体の古典的開発に比べて、臨床的概念実証の達成にリスクが小さい（そして速い）。この意味で、ヒトおよび動物で実施する必要のある試験がかなり少なく、ひいてはこれは低い開発コストを意味し、より重要なことには、ヒトおよび動物に苦痛が少ないことを強調することが重要である。
【００２３】
本発明の第一の側面の別の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤はニテカポン、またはその薬学上許容可能な塩である。ニテカポン（式ＩＶ）は、分子量２６５．２１の化合物である。その実験式はＣ１２Ｈ１１ＮＯ６であり、化学名は３−［（３，４−ジヒドロキシ−５−ニトロフェニル）メチレン］−２，４−ペンタンジオンであり、ＣＡＳ参照番号１１６３１３−９４−１である。
【化４】
2014530842.tif 000005
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスはＦＡＰである。別の実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスは老人性全身性アミロイドーシスである。別の実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスは家族性アミロイド心筋症である。さらに別の実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスは軟膜アミロイドーシスである。
【００２５】
上記で定義されたものなどのＣＯＭＴ阻害剤は、単独で使用することもできるし、またはＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための治療薬と併用することもできる。よって、第二の側面において、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための、ＣＯＭＴ阻害剤と付加的治療薬との組合せに関する。この実施態様は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための、ＣＯＭＴ阻害剤と付加的治療薬との組合せとして再定式化することができる。さらに、それを必要とする対象にＣＯＭＴ阻害剤と付加的治療薬との組合せを投与することを含んでなる、トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための方法もまた本発明の一部をなす。発明の第二の側面において使用するための付加的治療薬の限定されない例は、ＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびエピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）である。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。当業者ならば、上述の付加的治療薬の薬学上許容可能な塩が本発明の第二の側面の組合せにおいても使用可能であることを理解するであろう。
【００２６】
本発明の第二の側面の一つの実施態様では、トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ＣＯＭＴ阻害剤と、別のＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、およびヨードジフルニサルからなる群から選択される付加的治療薬との組合せが提供される。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００２７】
ベンズオキサゾール誘導体は、国際特許出願ＷＯ２００５１１３５２３に、天然状態のＴＴＲを安定化し、それによりタンパク質のミスフォールディングを阻害する化合物として開示されている。本発明の第二の側面の一つの実施態様では、ベンズオキサゾール誘導体は、式Ｖ：
【化５】
2014530842.tif 000006
［式中、
Ｙは、ＣＯＯＲ、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＯＲであり；
Ｘは、Ｏであり；かつ
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、水素、ハロ、ＯＲ、Ｂ（ＯＨ）２またはＣＦ３から選択され、ここで、
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロシクリル、フェニル、キシリル、ナフチル、チエニル、インドリルまたはピリジルである］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００２８】
本発明の第二の側面の特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩であり、付加的治療薬は、上記で定義された式Ｖのベンズオキサゾール誘導体またはその薬学上許容可能な塩である。
【００２９】
本発明の第二の側面の別の実施態様では、ベンズオキサゾール誘導体は、式ＶＩ：
【化６】
2014530842.tif 000007
［式中、
Ｙは、ＣＯＯＨ、またはＯＨであり；かつ
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、水素、ハロ、ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはＣＦ３から選択される］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００３０】
特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩であり、付加的治療薬は、上記で定義された式ＶＩのベンズオキサゾール誘導体またはその薬学上許容可能な塩である。
【００３１】
別の実施態様では、ベンズオキサゾール誘導体はタファミディスである。特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール  化合物またはその薬学上許容可能な塩であり、付加的治療薬はタファミディスである。別の特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤はトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩であり、付加的治療薬はタファミディスである。
【００３２】
本発明の第二の側面の別の実施態様では、付加的治療薬はヨードジフルニサルである。特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩であり、付加的治療薬はヨードジフルニサルである。別の特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤はトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩であり、付加的治療薬はヨードジフルニサルである。
【００３３】
別の特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、別のＣＯＭＴ阻害剤と組み合わせられる。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。例えば、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのトルカポンとエンタカポンの組合せを提供する。
【００３４】
本発明の第二の側面のさらなる実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ＣＯＭＴ阻害剤と、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびＥＧＣＧからなる群から選択される付加的治療薬との組合せが提供される。ＥＧＣＧは、緑茶の主要かつ最も重要なポリフェノールである。本発明の意味において、ＥＧＣＧは、単離された化合物として使用することもできるし、植物抽出液、特に茶抽出液の一部をなしてもよい。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。より好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤はトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。特定の実施態様は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、トルカポンまたはその薬学上許容可能な塩とＥＧＣＧとの組合せを提供する。
【００３５】
当業者には自明であるように、本発明の組合せは、有効成分が単一の組成物として使用される場合だけでなく、同時、逐次、または一定時間の後に個別に投与される２つの異なる組成物として使用される場合にも有効である。さらに、当業者ならば、ＣＯＭＴ阻害剤は、トランスサイレチン関連アミロイドーシスを予防および／または治療するために併用療法において他の有効成分と併用するために処方することができ、逆もまた可能であることを理解するであろう。
【００３６】
よって、本発明の第三の側面は、付加的治療薬との併用療法において、トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのＣＯＭＴ阻害剤を提供する。この実施態様は、付加的治療薬との併用療法においてトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための薬剤の調製のためのＣＯＭＴ阻害剤の使用として再定式化することができる。それを必要とする対象にＣＯＭＴ阻害剤を付加的治療と組み合わせて投与することを含んでなる、トランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための方法も本発明の一部をなす。
【００３７】
本発明の第三の側面において使用するための付加的治療薬の限定されない例は、別のＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびＥＧＣＧである。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。当業者ならば、上述の付加的治療薬の薬学上許容可能な塩も本発明の第三の側面の併用療法において使用可能であることを理解するであろう。
【００３８】
本発明の第三の側面の一つの実施態様では、別のＣＯＭＴ阻害剤、ベンズオキサゾール誘導体、およびヨードジフルニサルからなる群から選択される付加的治療薬との併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのＣＯＭＴ阻害剤が提供される。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００３９】
本発明の第三の側面の特定の実施態様では、付加的治療薬は別のＣＯＭＴ阻害剤である。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。例えば、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのトルカポンをエンタカポンと組み合わせて提供する。別の特定の実施態様では、付加的治療薬はベンズオキサゾール誘導体である。好ましくは、前記ベンズオキサゾール誘導体は、本発明の第二の側面に関して定義された式ＶもしくはＶＩの化合物またはその薬学的塩である。例えば、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのＣＯＭＴ阻害剤をタファミディスと組み合わせて提供する。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。より好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、トルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。よって、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのトルカポンをタファミディスと組み合わせて提供する。さらに別の実施態様では、付加的治療薬はヨードジフルニサルである。さらに別の実施態様では、付加的治療薬はヨードジフルニサルであり、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。よって、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩をヨードジフルニサルと組み合わせて提供する。
【００４０】
本発明の第三の側面のさらなる実施態様では、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびＥＧＣＧからなる群から選択される付加的治療薬との併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのＣＯＭＴ阻害剤が提供される。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。より好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、トルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。特定の実施態様では、本発明は、ＥＧＣＧとの併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩を提供する。
【００４１】
本発明の第四の側面は、ＣＯＭＴ阻害剤との併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ベンズオキサゾール誘導体、ヨードジフルニサル、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびＥＧＣＧからなる群から選択される治療薬を提供する。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。当業者ならば、上述の治療薬の薬学上許容可能な塩も本発明の第四の側面の併用療法において使用可能であることを理解するであろう。
【００４２】
本発明の第四の側面の一つの実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤との併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ベンズオキサゾール誘導体およびヨードジフルニサルからなる群から選択される治療薬が提供される。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００４３】
本発明の第四の側面の特定の実施態様では、治療薬はベンズオキサゾール誘導体である。好ましくは、前記ベンズオキサゾール誘導体は、本発明の第二の側面に関して定義された式ＶもしくはＶＩの化合物またはその薬学的塩である。例えば、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのタファミディスをＣＯＭＴ阻害剤と組み合わせて提供する。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。より好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤はトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。よって、本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのタファミディスをトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩と組み合わせて提供する。さらに別の実施態様では、治療薬はヨードジフルニサルである。さらに別の実施態様では、付加的治療薬はヨードジフルニサルであり、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。本発明は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のためのヨードジフルニサルをトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩と組み合わせて提供する。
【００４４】
本発明の第四の側面のさらなる実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤との併用療法によるトランスサイレチン関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するための、ジフルニサル、レスベラトロール、タウロウルソデオキシコール酸、ドキソサイクリン(doxocycline)およびＥＧＣＧからなる群から選択される治療薬が提供される。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。より好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤はトルカポンまたはその薬学上許容可能な塩である。特定の実施態様は、トルカポンまたはその薬学上許容可能な塩との併用療法によるＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療において使用するためのＥＧＣＧを提供する。
【００４５】
さらに、ＣＯＭＴ阻害剤は、ＴＴＲ関連アミロイドーシス患者における肝移植の前および／または後に補助療法として使用することができる。好ましくは、前記ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００４６】
本発明はまた、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの予防および／または治療のための、治療上有効な量のＣＯＭＴ阻害剤を薬学上許容可能な賦形剤および／または担体とともに含んでなる医薬組成物も提供する。好ましくは、前記ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００４７】
「用量」とも呼ばれる「治療上有効な量」という表現は、投与した場合に、取り扱う疾患の１以上の症状の発症を予防する、またはある程度まで緩和するのに十分な化合物の量を意味する。本発明に従って投与した化合物の特定の用量は、投与する化合物、投与経路、処置する特定の病態、および類似の考慮事項を含む、その症例を取り囲む特定の環境によって決定される。
【００４８】
「薬学上許容可能な賦形剤および／または担体」という表現は、薬学上許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各成分は、その医薬組成物の他の成分と適合するという意味で薬学上許容可能なものでなければならない。各成分はまた、妥当な利益／リスク比に対して過度な毒性、刺激作用、アレルギー反応、免疫原性または他の問題もしくは合併症なくヒトおよび動物の組織または器官と接触させて使用するのに好適なものでなければならない。
【００４９】
ＣＯＭＴ阻害剤の薬学上許容可能な塩はいずれも本発明の目的で使用可能である。「薬学上許容可能な塩」という表現は、薬学上許容可能な無毒な塩基から調製された塩を意味する。好ましくは、この塩はアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。
【００５０】
本発明の一つの実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、経口単位投与形で患者に投与される。投与形には、錠剤、散剤、カプセル剤、サシェ剤のような固体投与形、ならびに液体シロップ、懸濁液およびエリキシル剤が含まれる。ＣＯＭＴ阻害剤および賦形剤は、当技術分野で公知の方法に従って組成物および投与形に処方することができる。特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤は、錠剤、丸剤またはカプセル剤として投与される。しかしながら、ＣＯＭＴ阻害剤はまた、注射投与形の成分として患者に投与することができる。注射投与形としては、皮内、静脈内、筋肉内または皮下注射用の液体、灌流溶液、液体注射の再構成用粉末、および充填済みシリンジの液体を含み得る。本発明の意味において、それは鼻腔内もしくは吸入投与用、または例えば、クリーム、ゲル、軟膏または皮膚パッチの形態における局所投与用のＣＯＭＴ阻害剤を処方するためにも十分なものであり得る。これらの処方物の調製方法は当技術分野で公知である。さらに、ＣＯＭＴ阻害剤は、徐放性投与形として処方することもできる。徐放性投与形は当技術分野で公知であり、特に、慢性疾患の治療に、または高用量では毒性があり得る、もしくは患者に投与した際に低い半減期パターンを示す活性薬剤の投与に望ましい。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００５１】
前述のように、本発明の意味において、ＣＯＭＴ阻害剤の治療上有効な量（または用量）は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスの１以上の症状を予防する、またはある程度まで緩和するのに十分な前記化合物の量である。例えば、ヒト用のトルカポンの有効一日用量は２０〜６００ｍｇの間であり得、ヒト用のエンタカポンの有効一日用量は１６００〜２０００ｍｇの範囲であり得る。
【００５２】
よって、ＣＯＭＴ阻害剤の投与用量は０．１〜１６０００ｍｇ／日の間、または０．１〜１２０００ｍｇ／日の間、または０．１〜１００００ｍｇ／日の間、または０．１〜５０００ｍｇ／日の間、または０．１〜３０００ｍｇ／日の間であり得る。特定の実施態様では、ＣＯＭＴ阻害剤の投与用量は、１〜３０００ｍｇ／日の間である。別の実施態様では、用量は１〜２０００ｍｇ／日の間である。好ましくは、ＣＯＭＴ阻害剤は、本発明の第一の側面に関して定義された式Ｉのニトロカテコール化合物またはその薬学上許容可能な塩である。
【００５３】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含んでなる」という用語およびその用語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、または工程を排除することを意図しない。本発明のさらなる目的、利点および特徴は本明細書を精査すれば当業者には明らかとなり、または本発明の実施により教示されるであろう。以下の実施例は例示として示されるものであり、本発明を限定することを意図しない。さらに、本発明は、本明細書に記載される特定の好ましい実施態様のあり得るあらゆる組合せを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ゲル濾過によるＴＴＲ野生型（ＷＴ）に対する結合に関するＴ４との競合アッセイ：種々の化合物によるＴＴＲ  ＷＴからのＴ４置換の曲線。Ｙ軸：ＴＴＲ結合Ｔ４／全Ｔ４の量；Ｘ軸：化合物のｌｏｇ１０濃度（モル単位）。値は２反復で行った代表的実験に相当し、平均＋／−標準偏差として表した。試験化合物：チロキシン（Ｔ４）、トルカポン（ＳＯＭ）、タファミディス（ＴＡＦ）、および（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）。
【図２】種々の化合物の存在下でのＩＥＦによるＴＴＲ四量体の安定性：対照個体（Ｃ）およびＶ３０Ｍ突然変異（Ｖ３０Ｍ）家族性を有するアミロイド多発性神経障害患者からの血漿を試験化合物タファミディス（Ｔ）；トルカポン（Ｓ）；エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）で処理し、または非処理のままとし（ｎｔ）；半変性条件下で本明細書に記載の通りにＩＥＦを行った。各条件のＴＴＲ四量体／全ＴＴＲの比を計算し、平均＋／−ｓｅｍ（平均の標準誤差）として表した。
【図３】カスパーゼ−３活性化。ラット神経鞘腫細胞（ＲＮ２２細胞株）を供試化合物（２０μＭ）の不在または存在下で得られたＴＴＲ  Ｙ７８Ｆオリゴマーの不在または存在下で２４時間インキュベートした。カスパーゼ−３の活性化を細胞溶解液で測定し、蛍光／タンパク質含量として表した。サンプル：対照細胞（Ｃ１）；ＥＧＣＧで処理した細胞（Ｃ２）；タファミディスで処理した細胞（Ｃ３）；トルカポンで処理した細胞（Ｃ４）；化合物の不在下で得られたオリゴマーで処理した対照細胞（Ｏ１）；ＥＧＣＧの存在下で得られたオリゴマーで処理した細胞（Ｏ２）；タファミディスの存在下で得られたオリゴマーで処理した細胞（Ｏ３）；トルカポンの存在下で得られたオリゴマーで処理した細胞（Ｏ４）。結果は４反復の平均と標準偏差を表す。Ｏ１対照に対する有意差をスチューデントのｔ検定を用いて計算した：＊：Ｐ＜０．０５；＊＊＊：Ｐ＜０．００５。
【図４】前形成ＴＴＲ原線維の、３６μＭの種々の化合物とともに４日間インキュベートした後の透過型電子顕微鏡分析。左上から時計回りに、対照、タファミディス、ＥＧＣＧ、トルカポン。
【実施例】
【００５５】
実施例１：動態濁度アッセイ
材料
ヒトＴＴＲのＴｙｒ７８Ｐｈｅ高アミロイド形成変異体である組換えＹ７８Ｆ  ＴＴＲタンパク質を、Dolado et al (Dolado I, Nieto J, Saraiva MJ, Arsequell G, Valencia G, Planas A. “Kinetic Assay for High-Throughput Screening of In Vitro Transthyretin Amyloid Fibrillogenesis Inhibitors”. J. Comb. Chem., 2005, vol. 7, p. 246-252)で報告されているように生産した。
【００５６】
トルカポンはSanta Cruz Biotechnology, Inc. Iododiflunisalから入手し、Barluenga et al (Barluenga J, Gonzalez JM, Garcia-Martin MA, Campos PJ, Asensio G. "An expeditious and general aromatic iodination procedure. J Chem Soc Chem Commun, 1992, vol. 14, p. 1016-1017)により記載されているように、ジフルシナル(diflusinal)（Ｓｉｇｍａ）から、テトラフルオロホウ酸ビス（ピリジン）ヨードニウム（ＩＰｙ２ＢＦ４）との反応により調製した。タファミディスは、国際特許出願ＷＯ２００５１１３５２３に開示されている方法によって調製することができる。阻害剤としてアッセイする化合物の原液をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａからの分光分析グレード）に１．５ｍＭ濃度で溶解させた。保存原液をＨ２Ｏ／ＤＭＳＯ（２：１）で１：４希釈することにより、検量線用溶液を調製した。総ての場合で、ＤＭＳＯ濃度は最終反応アッセイ混合物中５％（ｖ／ｖ）に調整した。
【００５７】
方法
アッセイはDolado et al（前掲）に記載の手順に従って行った。このアッセイは、Ｙ７８Ｆタンパク質が阻害剤とともに３０分間インキュベートされる第１段階と、原線維形成がｐＨ変化により誘導され、吸光度が１．５時間測定される第２段階の２段階を含んでなる。簡単に述べれば、アッセイは次のように行った。
【００５８】
まず、以下の溶液を調製した：タンパク質Ｙ７８Ｆ原液：２０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．６中４ｍｇ／ｍＬ。インキュベーションバッファー：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６。希釈バッファー：４００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２。
【００５９】
各阻害剤について、以下のプロトコールに従った：保存原液の正確なタンパク質濃度を、Ａｂｓ２８０により測定し、この値に従い、最終タンパク質ウェル濃度を０．４ｍｇ／ｍＬとするために加えるべきＹ７８Ｆ原液の容量を計算し、９６ウェルマイクロプレートの６ウェルに分注した。種々の容量の検量線用阻害剤溶液を終濃度が０〜４０μＭの範囲になるように加え、相当する容量のＨ２Ｏ／ＤＭＳＯ（１：１）溶液を加えることにより、各ウェルの最終ＤＭＳＯ含量を５％に調整した。次に、インキュベーションバッファーを１００μＬの容量まで加えた。このプレートをサーモスタット制御のマイクロプレートリーダーにて３７℃で、１分ごとに１５秒軌道振盪しながら３０分間インキュベートした。希釈バッファーを１００μＬずつ各ウェルに分注し、混合物をマイクロプレートリーダーにて３７℃で、振盪しながら（１分ごとに１５秒）インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度を１分間隔で１．５時間モニタリングした。データを回収し、マイクロソフト・エクセルソフトウエアを用いて解析した。アッセイは総て２反復で行った。
【００６０】
結果の解析
上記に示した一般手順に従った後、経時的曲線を取得し、その曲線から原線維形成の初速度（Ｖ０）を吸光度の直線的増加の傾きとして計算した。阻害濃度に対して初速度をプロットすると、分析した総ての阻害剤で指数関数的減衰が得られた。データを式（１）：
Ｖ０＝Ａ＋Ｂ＊ｅ−Ｃ［Ｉ］（１）
［式中、Ｖ０は原線維形成の初速度（吸光度単位／時、Ａｂｓ＊ｈ−１）であり、［Ｉ］は阻害剤の濃度（μＭ）である］
に当てはめた。調節可能なパラメーターは、Ａ（Ａｂｓ＊ｈ−１）、阻害剤の高濃度での残存会合速度；Ｂ（Ａｂｓ＊ｈ−１）、原線維形成の初速度の大きさまたは最大低下；およびＣ（μＭ−１）、指数定数である。Ａ＋Ｂは、阻害剤の不在下、アッセイ条件下での原線維形成の初速度に等しい。
【００６１】
原線維形成阻害剤としての化合物の効力を評価するために以下のパラメーターを推定した：ＩＣ５０：原線維形成の初速度が阻害剤無しの場合の半分になる阻害剤の濃度。ＲＡ（％）＝１００＊Ｂ／（Ａ＋Ｂ）：［Ｉ］＝０のときの速度に対する高阻害剤濃度での原線維形成速度の低下率。アッセイ化合物の阻害特性の評価の結果を表１にまとめる。
【００６２】
【表１】
2014530842.tif 000008
【００６３】
上記の結果によりトルカポンは低いＩＣ５０と高いＲＡを示したことからＴＴＲ原線維形成の有効な阻害剤であることを見出すことができる。それらのＩＣ５０値によれば、トルカポンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最も強力なＴＴＲ原線維形成阻害剤の１つであると報告されているヨードジフルニサルと同等の阻害能を有する。さらに、ＩＣ５０によれば、トルカポンはタファミディスの４分の１のＩＣ５０を示すことから、タファミディスよりも有効である。これらの結果は、トルカポンがＦＡＰ、家族性アミロイド心筋症、老人性全身性アミロイドーシスおよび軟膜アミロイドーシスなどのＴＴＲ関連アミロイドーシスに対する有望な薬物であることを示す。
【００６４】
実施例２：ＴＴＲの家族性アミロイド心筋症突然変異体を用いたエンドポイント濁度アッセイ
材料
家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）に関連するヒトＴＴＲのアミロイド形成バリエーションである組換えＶ１２２Ｉ  ＴＴＲタンパク質を、実施例１で用いたＹ７８Ｆ変異体に関して記載したものと同じ手順に従って生産した。Ｖ１２２Ｉ突然変異体を発現するプラスミドＤＮＡは、以下のプライマー：５’−ＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＧＴ−３’および５’−ＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣ−３’を用いたこと以外は、Dolado et al（前掲）においてＹ７８Ｆに関して報告されている通りに部位特異的突然変異誘発により調製した。トルカポンおよびヨードジフルニサルは、実施例１に記載の通りに得た。
【００６５】
方法
このアッセイは、Ｙ７８Ｆ変異体よりもアミロイド形成性の低いＴＴＲ変異体に関して、動態濁度アッセイが正確な測定に十分な感度でない場合に使用する。この７２時間でのエンドポイントアッセイにより阻害剤を試験するために従った手順は、Dolado et al（前掲）に報告されている。Ｖ１２２Ｉ  ＴＴＲは、０．４ｍｇ／ｍＬ濃度のＶ１２２Ｉタンパク質および３つの異なる濃度の阻害剤：３．６、７．２および２１．８μＭ（０．５×［タンパク質］、１×［タンパク質］、および３×［タンパク質］相当）を用い、動態濁度アッセイ（実施例１）に関して上記したものと同じ条件下で阻害剤とともにインキュベートした。酸誘導（希釈バッファーの添加）の後、サンプルを振盪せずに３７℃で７２時間インキュベートし、次いで混合して存在する原線維を再懸濁させることによりホモジナイズした。３４０ｎｍで濁度を測定し、阻害剤の不在下でのアミロイド形成に対して正規化した。
【００６６】
結果
供試化合物の阻害効力を、阻害剤不含対照サンプルと比較した場合の阻害剤含有サンプルの吸光度(absorvance)減少率％として評価した。
【００６７】
【表２】
2014530842.tif 000009
【００６８】
原線維減少率％＝１００×（１−濁度サンプル／濁度ブランク）、ここで、濁度サンプルは阻害剤の存在下で測定された濁度であり、濁度ブランクは阻害剤の不在下で測定された濁度である。
【００６９】
上記の結果は、トルカポンは、阻害剤：タンパク質モル比が１：２（０．５ｘ［タンパク質］）の場合あっても、Ｖ１２２Ｉ突然変異体ＡＴＴＲによる原線維形成を効果的に阻害することを示す。これらの値によれば、トルカポンはヨードジフルニサルと同等の阻害能を有する。これらの結果は、トルカポンが、主としてＶ１２２Ｉ突然変異によって引き起こされる、家族性アミロイド心筋症を含む、ＴＴＲ関連アミロイドーシスに対する有望な薬物であることを示す。
【００７０】
実施例３〜６
実施例３〜６の材料
トルカポンおよびタファミディスは実施例１に記載の通りに得た。エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ、ＣＡＳ  Ｎｏ．９８９−５１−５）はＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（＃７０９３５）から購入した。組換え野生型ＴＴＲ（ＴＴＲ  ＷＴ）、ＴＴＲ  Ｙ７８ＦおよびＴＴＲ  Ｌ５５Ｐ変異体は、大腸菌(Escherichia coli)ＢＬ２１を用いて細菌発現系で生産した。組換えＴＴＲを、従前に記載されているように(Ferreira et al, 2009, FEBS Lett, vol. 583, p. 3569-76)単離および精製した。ＴＴＲ  Ｖ３０Ｍ異型接合体保有個体および対照個体から全血は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，ＩＢＭＣ（ポルト大学）で入手可能なサンプルコレクションから入手した。血液サンプルはＥＤＴＡの存在下で採取され、血漿分離のために遠心分離されたものであった。血漿は−２０℃で冷凍されていた。
【００７１】
実施例３：ゲル濾過によるＴＴＲ野生型（ＷＴ）との結合に関するチロキシン（Ｔ４）との競合アッセイ
ＴＴＲのＴ４結合部位に小分子リガンドが結合すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴＴＲ四量体が安定化され、四量体の解離およびアミロイド形成を緩徐化され得る。結合を評価するために、ＴＴＲ  ＷＴとの結合に関する、試験化合物のＴ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との競合を、微量の放射性標識［１２５Ｉ］Ｔ４（５０．０００ｃｐｍ相当；１２５Ｉ−Ｔ４の比活性１２５０μＣｉ／μｇ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡから）および試験化合物または種々の濃度、すなわち、０、２０、６０、２００、６００、２０００、６０００および２００００ｎＭ（終濃度０〜１０μＭ）のＴ４（陽性対照）のいずれかの溶液１００μＬとともにインキュベートした一定量のＴＴＲ（１００μＬの６０ｎＭ溶液）を用い、ゲル濾過法により定量的にアッセイした(Ferreira et al, 2011, FEBS Lett., vol. 585, p. 2424-30)。陰性対照はタンパク質と標識Ｔ４と１００μＬのＴＮＥ（競合物不在）を用いて調製した。溶液は総てＴＮＥバッファー（Ｔｒｉｓ  ０．１Ｍ、ＮａＣｌ  ０．１Ｍ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ）で調製した。総てのサンプルを２反復で調製した。放射能を各サンプルで、ガンマシンチレーションカウンターＷｉｚａｒｄ  １４７０１、Ｗａｌｌａｃにて測定した。次に、サンプルを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ＴＴＲと結合したＴ４を、Ｐ６ＤＧゲル濾過カラム（１ｍＬ、ＢｉｏＲａｄ）を通して濾過することにより、非結合Ｔ４から分離した。溶出したサンプルで放射能を測定した。結果は、試験化合物（競合物）のＬｏｇ総濃度に対するＴＴＲ結合Ｔ４／全Ｔ４の量として表した。データは、下式：Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（Ｘ−ＬｏｇＥＣ５０））を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアによる一部位結合競合非線形回帰曲線に当てはめた。
【００７２】
図１は、競合物：チロキシン（Ｔ４）、トルカポン（ＳＯＭ）、タファミディス（ＴＡＦ）、および（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）の、ＴＴＲ野生型との結合に関するＴ４との競合結果を示す。結果を、種々の化合物による、ＴＴＲ  ＷＴからのＴ４の置換曲線として示す。各用量反応曲線から、各化合物のＥＣ５０値（結合したＴ４の半数が置換される阻害剤濃度）を測定する。さらに、ＥＣ５０（Ｔ４）／ＥＣ５０（供試化合物）比と定義される、Ｔ４の結合の阻害の相対的効力も計算し、表３に示す。
【００７３】
【表３】
2014530842.tif 000010
【００７４】
これらの結果は、トルカポンおよびタファミディスはＴＴＲに対して同等の結合親和性を呈するが、ＥＧＣＧはＴＴＲとの結合に関してＴ４と競合しないことを示す。トルカポンのＥＣ５０はタファミディスの４分の１であったが、このことは、トルカポンはＴＴＲ四量体との結合により有効であることを示し、より高い抗アミロイド形成能が示唆される。
【００７５】
実施例４：等電点電気泳動（ＩＥＦ）によるＴＴＲ四量体安定性の評価
ＴＴＲ四量体の解離耐性に対する供試化合物の効果を評価するために、従前に記載されているように(Ferreira et al, 2009, FEBS Lett, vol. 583, p. 3569-76)、半変性条件でのＩＥＦによりＴＴＲ安定性を評価した。サンプルを次のように調製した。対照およびＴＴＲ  Ｖ３０Ｍ保有個体からのヒト血漿３０μＬを、試験化合物および対照（ＥＧＣＧ）化合物の１０ｍＭ溶液５μｌとともに４℃で一晩インキュベートした後、室温で１時間インキュベートした。これらの調製物に対してｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ（５％アクリルアミド）を行い、ＴＴＲを含むゲルバンドを切り取り、ＩＥＦゲル（５％アクリルアミド）に適用した。ＩＥＦは、５％（ｖ／ｖ）両性電解質ｐＨ４〜６．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有する半変性条件（４Ｍ尿素）にて、１２００Ｖで６時間行った。タンパク質をクーマシーブルーで染色し、これらのゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔプログラム（ＨＰ  Ｓｃａｎｊｅｔ  ４４７０ｃ，Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）を用いたデンシトメトリーを行った。化合物の不在下では、血漿ＴＴＲは、単量体、酸化単量体および四量体の種々の形態に相当するいくつかの低等電点（ｐＩ）バンドからなる特徴的なバンドパターンを示した。合計１２の血漿サンプル（対照５つとＴＴＲ  Ｖ３０Ｍ保有７つ）を３つのＩＥＦゲルで分析した。各処理条件について、異なるドナーから最低４サンプルを処理した。全ＴＴＲ（ＴＴＲ四量体＋単量体）に対するＴＴＲ四量体の比率を各血漿サンプルについて計算し、図２に示した。図２に見られるように、この比率は通常、異型接合性ＴＴＲ  Ｖ３０Ｍ保有個体由来血漿よりも正常個体由来血漿の方が高い。トルカポンにより処理は、正常または突然変異ＴＴＲの両方の非処理対照血漿に比べて、単量体型よりもＴＴＲ四量体の量を増やし、また、タファミディスよりも顕著であった。
【００７６】
試験化合物での処理により誘導され四量体／全ＴＴＲ比の増加を、総てのサンプルについてプールし、安定化率％として表４に示した。これらの値は、下記のように、各サンプルについて得られた四量体／全ＴＴＲ比を、対応する個々のドナーの非処理血漿で得られた比を用いて正規化した後に計算した。
【００７７】
安定化率％＝１００×（（サンプルの比−ｎｔの比）／ｎｔの比）。ここで、「サンプルの比」は、化合物の存在下での四量体／全ＴＴＲ比であり、「ｎｔの比」は、同じドナー由来の非処理血漿の四量体／全ＴＴＲ比である。
【００７８】
【表４】
2014530842.tif 000011
【００７９】
タファミディスまたはトルカポンなどのＴＴＲ安定剤での処理は、単量体型よりも四量体の比率を増した。上記に示した結果は、トルカポンがタファミディスよりもＴＴＲ四量体に対して良好な安定化効果を与えたことを明らかに示す。
【００８０】
実施例５：細胞毒性アッセイ
ＴＴＲ誘導性の細胞傷害性および供試化合物の予防効果を評価するために、ラット神経鞘腫細胞（ＲＮ２２、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣから入手）の、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコの最小必須培地での８０％コンフルエント細胞を、２μＭのＴＴＲ  Ｙ７８Ｆオリゴマーに２４時間曝した。これらのオリゴマーは、１０倍モル過剰（終濃度２０μＭ）の試験化合物または対照（ＥＧＣＧ）の存在下または不在下のいずれかで、３７℃にて６日間、可溶性ＴＴＲ  Ｙ７８Ｆをインキュベートすることにより得られたものである。次に、細胞をトリプシンで処理し、細胞溶解液を、ＣａｓｐＡＣＥ蛍光測定９６ウェルプレートアッセイシステム（Ｓｉｇｍａ）を用いたカスパーゼ−３活性化の測定に用いた。溶解液のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いて測定した。
【００８１】
各細胞培養ウェルでカスパーゼ３活性およびタンパク質定量に関して得られた結果を図３に示す。非処理ＴＴＲ  Ｙ７８Ｆオリゴマー（対照、Ｏ１）の細胞外添加は、カスパーゼ−３の細胞内レベルを高め、従って細胞死を増大させた。毒性オリゴマー種の形成を阻害する化合物の存在下で得られたＴＴＲ  Ｙ７８Ｆオリゴマー（Ｏ２−Ｏ４）は、ＲＮ２２細胞においてより低いレベルのカスパーゼ−３活性化を生じた。化合物の存在下での細胞傷害性の低下（対照Ｏ１を１００％として表す）を表５に示す。トルカポンがタファミディス（１２％）に比べてより大きな細胞傷害性低下（２９％）を示したことが見て取れる。
【００８２】
【表５】
2014530842.tif 000012
【００８３】
実施例６：原線維の破壊
ＴＴＲ原線維の破壊に対する試験化合物の効果を検討するために、本発明者らは、ＴＴＲ  Ｌ５５Ｐ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ  約３．６μＭ）の濾過した（０．２μｍフィルター）溶液を３７℃で１５日間インキュベートすることにより調製したＴＴＲ前形成原線維を用いた。次に、これらのサンプルを１０倍モル過剰（３６μＭ）（終濃度）の試験化合物の不在下（対照）または存在下のいずれかで、３７℃にて４日間インキュベートした。破壊効果を従前に記載されているように(Ferreira et al, 2009, FEBS Lett, vol. 583, p. 3569-76)、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および動的光散乱（ＤＬＳ）により評価した。
【００８４】
ＴＴＲ前形成原線維（対照）の対照サンプルは、主として大きな凝集塊および原線維（直径１０００ｎｍを超える粒子）により構成され、少量のタンパク質だけが可溶性形態で存在する（直径１０ｎｍの粒子）ことが観察された。原線維は供試化合物により破壊されるので、大きな凝集塊の相対量が減り、小さな凝集塊および可溶性タンパク質が増える（図４参照）。
【００８５】
この原線維破壊活性を、ＤＬＳ分析から、３６μＭの化合物で４日間処理した後の凝集塊および可溶性粒子の相対強度（％）として定量した（表６）。
【００８６】
【表６】
2014530842.tif 000013
【００８７】
トルカポンで処理したサンプルはより多量の小さな凝集塊および可溶性タンパク質を生じ、従って、重要な破壊活性を示すことが見て取れる。これらの結果はまた、トルカポンがタファミディスよりも高い原線維破壊活性を有することも示す。
【００８８】
実験１〜６により得られた結果は、トルカポンはＴＴＲアミロイド原線維の形成に高い阻害活性を有し、このような阻害活性は、ＦＡＰの治療向けに記載されてきたタファミディスよりも高いことを明らかに示している。さらに、トルカポンは、タファミディスよりも効果的に前形成ＴＴＲアミロイド原線維を破壊することができる。これらの結果を考え合わせると、トルカポンはあらゆるタイプのＴＴＲ関連アミロイドーシスの治療のための薬剤として効果的に使用できることを示す。
【図１】
2014530842.tif 000019
【図２】
2014530842.tif 000020
【図３】
2014530842.tif 000021
【図４】
2014530842.tif 000022
【国際調査報告】
2014530842.tif 000023
2014530842.tif 000024
2014530842.tif 000025