(57)【要約】  抗ｃ−Ｍｅｔ抗体およびこれを含むがんの予防または治療用医薬組成物に関するものである。一具体例による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体およびこれを含むがんの予防または治療用医薬組成物によれば、がんを効率的に予防または治療することができる。【選択図】    図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、
配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記配列番号４〜配列番号９はそれぞれ、下記の一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列である、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
一般式Ｉ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）
一般式ＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｔｈｒ（配列番号５）
一般式ＩＩＩ
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−Ｔｙｒ（配列番号６）
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は、存在しないかＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５は、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【請求項２】
前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２５または配列番号２６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２７または配列番号２８のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号７１のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号３７のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、
配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記配列番号７〜配列番号９はそれぞれ、下記の一般式ＩＶ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列である、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【請求項９】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１０または配列番号７１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１８〜配列番号２１、または配列番号７２のアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６８の２１番目から２２０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７０の２１番目から２２０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３を含む、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗体結合断片が、モノクローナル抗体、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記ｃ−Ｍｅｔタンパクは、ヒトｃ−Ｍｅｔ、猿ｃ−Ｍｅｔ、マウスｃ−Ｍｅｔ、またはラットｃ−Ｍｅｔである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片；および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、がんの予防用または治療用医薬組成物。
【請求項２０】
前記がんは、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球の黒色腫、直膓癌、肛門付近の癌、食道癌、小腸腫瘍、内分泌系腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｇｌａｎｄ）、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、すい臓癌、神経膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺腫瘍、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群より選択されるものである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
がんの予防または治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
配列番号７１のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードし、任意にベクター内に挿入された、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体およびこれを含むがんの予防用または治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）の受容体であり、ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼの細胞外部位に結合し、多様な正常細胞と腫瘍細胞で分裂、運動、形態発生、血管形成を誘発するサイトカインの一種である。ｃ−Ｍｅｔは、細胞表面に存在する代表的な受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）で、それ自体ががん誘発遺伝子であり、時には、リガンドのＨＧＦと関係なくても、がんの発生、がんの転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤、新生血管の生成などといった、腫瘍に関連する様々な機序に関与することから、最近、抗がん治療のためのターゲットとして注目されるタンパクタンパク質である。
【０００３】
特に、ｃ−Ｍｅｔは、従来知られている抗がん剤の作用機序において薬物耐性に関与することが知られるにつれ、より一層オーダーメイド治療の重要性が認識されている。ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）を標的とする代表的な抗がん治療剤であるエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）またはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）のような薬物は、がん発生機序に関連する信号の伝達を遮断することによって作動する。また、乳がん治療剤としてよく知られているハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）を標的として細胞の増殖に必要な信号の伝達を遮断することによって作動する。しかし、前記薬物に対する耐性がある患者のうち、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の過発現などで抗がん剤の作動を避けて細胞の増殖を誘導する他の信号伝達機序が活性化されるという研究が最近発表されている。この理由によって、ｃ−Ｍｅｔは、抗がん剤に関連して多数の製薬会社が注目している標的分子となっている。ｃ−Ｍｅｔの作用を阻害する新たながんの予防または治療用医薬組成物の開発が依然として要求されている。
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を提供することである。一例において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含むものであってよい。この時、前記配列番号４〜９は、以下に説明されるように、式Ｉ〜ＶＩで表されるものであってよい。他の例において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域と、を含むものであってよい。この時、前記配列番号７〜９は、以下に説明されるように、式ＩＶ〜ＶＩで表されるものであってよい。
【０００５】
前記抗体または抗体断片を含む核酸配列も提供される。
【０００６】
他の態様は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物および前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を投与する段階を含む、がんの予防または治療方法とこれに関連する方法および組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】所望のＣＤＲだけが突然変異したｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを確保するためのオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ重（複拡張重合酵素連鎖反応、ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）方法の使用を示すダイヤグラムである。
【図２】抗体濃度に対してプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）されたＢｒｄＵ（％）を示すグラフであって、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５抗体の効果を、ＢｒｄＵ  分析を通して示す。
【図３】抗体濃度に対してプロッティングされた相対的細胞生存率（％）を示すグラフであって、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖に対する効果を示す。
【図４】抗体処理に対してプロッティングされたＡｋｔのリン酸化（％）を示すグラフであって、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５抗体の効果を示す。
【図５】ｃ−Ｍｅｔの分解程度を測定し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５抗体の抗がん効能を確認した結果を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、期間（日）に対してプロッティングされた腫瘍の体積を示すグラフであって、異種移植Ｕ８７ＭＧ脳がんまたはＭＫＮ４５胃がんマウス動物モデルを対象として行った結果を通して、多様な濃度のｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏの抗がん効能を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、期間（日）に対してプロッティングされた腫瘍の体積を示すグラフであって、異種移植Ｕ８７ＭＧ脳がんまたはＭＫＮ４５胃がんマウス動物モデルを対象として行った結果を通して、多様な濃度のｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏの抗がん効能を示す。
【図７】抗体濃度に対してプロッティングされた相対的細胞生存率（％）を示すグラフであって、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のインビトロ細胞増殖に対する効果を示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、処理抗体に対してプロッティングされたＡｋｔのリン酸化程度（％）を示すグラフであって、抗体のアゴニスト作用（ａｇｏｎｉｓｍ）の程度を示す。図８Ａは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のＡｋｔのリン酸化程度を確認した結果であり、図８Ｂは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）とＬ３−１１ＹのＡｋｔのリン酸化程度を確認した結果である。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、処理抗体に対してプロッティングされたＡｋｔのリン酸化程度（％）を示すグラフであって、抗体のアゴニスト作用（ａｇｏｎｉｓｍ）の程度を示す。図８Ａは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のＡｋｔのリン酸化程度を確認した結果であり、図８Ｂは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）とＬ３−１１ＹのＡｋｔのリン酸化程度を確認した結果である。
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、抗体のｃ−Ｍｅｔの分解程度を測定して抗体の抗がん効果を確認した結果を示すグラフである。図９Ａは、一具体例によるｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のｃ−Ｍｅｔの分解程度を確認した結果であり、図９Ｂは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）とＬ３−１１Ｙのｃ−Ｍｅｔの分解程度を確認した結果である。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、抗体のｃ−Ｍｅｔの分解程度を測定して抗体の抗がん効果を確認した結果を示すグラフである。図９Ａは、一具体例によるｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のｃ−Ｍｅｔの分解程度を確認した結果であり、図９Ｂは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）とＬ３−１１Ｙのｃ−Ｍｅｔの分解程度を確認した結果である。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、期間（日）に対してプロッティングされた腫瘍の体積を示すグラフであって、異種移植Ｕ８７ＭＧ脳がんまたはＭＫＮ４５胃がんマウス動物モデルを対象として行って得られたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のｉｎ  ｖｉｖｏの抗がん効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、期間（日）に対してプロッティングされた腫瘍の体積を示すグラフであって、異種移植Ｕ８７ＭＧ脳がんまたはＭＫＮ４５胃がんマウス動物モデルを対象として行って得られたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のｉｎ  ｖｉｖｏの抗がん効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ここで、本発明の様々な実施形態が詳細に参照され、その実施例は添付図面に例証されているが、類似の番号は各図面を通して同一の要素を示している。この点については、この実施形態が異なる形態を持ちうること、および、ここに述べられる説明に限られているものとして解釈されるべきではない。したがって、実施形態は、図を参照することによって、この記述の様態を説明するために下記に単に記載されたのみである。ここに用いられているように、「および／または」という語は、関連する記載された項目の一つ以上のすべての組合せを含む。
【０００９】
一実施形態は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であって、前記配列番号４〜配列番号９はそれぞれ、下記の一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列である、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一般式Ｉ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）
一般式ＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｔｈｒ（配列番号５）
一般式ＩＩＩ
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−Ｔｙｒ（配列番号６）
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は、存在しないかＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５は、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【００１０】
一実施形態によれば、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２２〜配列番号２４のアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドであってよく、前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２５または配列番号２６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであってよく、前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２７または配列番号２８のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであってよい。
【００１１】
一実施形態によれば、前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２９〜配列番号３３および配列番号７１のアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドであってよく、前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３４〜配列番号３６のアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドであってよく、前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１３〜配列番号１６のアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチド、または配列番号３７のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであってよい。
【００１２】
他の一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体または抗原結合断片であって、前記配列番号７〜配列番号９はそれぞれ、下記の一般式ＩＶ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列である、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【００１３】
一実施形態によれば、前記軽鎖可変領域は、配列番号１０または配列番号７１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１３〜配列番号１６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含むものであってよい。
【００１４】
一実施形態によれば、前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域は、配列番号１８〜配列番号２１および配列番号７２からなる群より選択される１つのアミノ酸配列からなるものであってよい。
【００１５】
用語、「ｃ−Ｍｅｔ」または「ｃ−Ｍｅｔタンパク質」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、すべての哺乳類種由来のものであってよく、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６）、猿ｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ＮＰ＿００１１６２１００）などのような霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５．１）などのようなげっ歯類由来のものなどであってよい。前記タンパク質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００２４５に提供されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０００２３６に提供されたポリペプチド配列によってコードされたタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、がんの発生、がんの転移、がん細胞移動、がん細胞浸透、新生血管の生成過程などの様々な機序に関与する。
【００１６】
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来の抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与時に免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制すべくキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を利用して、抗−アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因とされる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来の抗体に比べて、抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来のアミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗−イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を抱えている。このような副作用を改善すべく開発されたのが、ヒト化抗体である。これは、キメラ抗体の可変領域中の抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して製作される。
【００１７】
ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なのは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れる最適化されたヒト抗体を選定することであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化されたヒト抗体骨格に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体の骨格に位置しながら抗原の結合に影響を与えるアミノ酸が存在する場合があるので、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在することから、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。
【００１８】
一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、またはヒト化抗体であってよい。前記抗体または抗原結合断片は、生体から分離されたものであってよい。
【００１９】
一実施形態によれば、前記抗体は、モノクローナル抗体であってよい。
【００２０】
完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と、軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００２１】
用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、および３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。
【００２２】
用語、「相補性決定領域（ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ））」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたり、主な接触残基を提供することができる。一方、用語、「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知されている意味と同じものであり、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応を行うことを意味する。
【００２３】
一実施形態によれば、前記抗体は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される抗原結合断片であってよい。
【００２４】
用語、「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体の構造に対するその断片で、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２であってよいが、これに限定しない。前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と、軽鎖の不変領域、および重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点からＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしつつ生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直接連結されていて、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得られ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断するとＦａｂが得られ、ペブシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られる）、遺伝子組換え技術によって製作することができる。
【００２５】
一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６８のアミノ酸配列（このうち１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体；配列番号６４のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体；または配列番号６６のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体であってよい。
【００２６】
他の一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７０のアミノ酸配列（このうち１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体；または配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７０または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体であってよい。
【００２７】
他の一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体；または配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体であってよい。
【００２８】
一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体、または配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる抗体であってよい。
【００２９】
アミノ酸配列において、提示されたシグナルペプチドは一例に過ぎず、シグナルペプチドの使用の有無および具体的なアミノ酸配列は適切に変更または調節することができ、これは、関連技術分野における通常の知識を有する者が容易に決定可能な事項といえる。
【００３０】
一方、配列番号６８または配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて３６番（ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う、配列番号６８内の６２番目の位置）のヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）がチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）に置換された形態のポリペプチドである。前記置換によって、一具体例による抗体の生産量が増加できる。また、前記配列番号７２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号６８のアミノ酸配列中の１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除いた、２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいてｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる２７ｅの位置（ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う、配列番号６８内の３２番目の位置；ＣＤＲ−Ｌ１の内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換されたもので、前記置換によって、前記配列を含む抗体または抗原結合断片の活性（例えば、ｃＭｅｔに対する結合親和度、ｃ−Ｍｅｔの分解活性、およびＡｋｔのリン酸化抑制活性など）がより増進できる。
【００３１】
一実施形態において、配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供され、これは、ｃ−Ｍｅｔ抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）として有用である。他の具体例において、配列番号７１の軽鎖相補性決定領域、配列番号７２の軽鎖可変領域、または配列番号７３の軽鎖を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片が提供され、前記抗体またはその抗原結合断片は、任意に前記説明されたような重鎖可変領域または重鎖、または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗体断片として提示された他の重鎖と組み合わされたものであってよい。図８Ｂおよび図９Ｂに示しているように、前記配列番号７１の軽鎖相補性決定領域を含む抗体は、より増進した抗ｃ−Ｍｅｔ活性およびＡｋｔのリン酸化抑制活性を示すことを確認することができる。
【００３２】
他の一実施形態は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量；および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、がんの予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００３３】
一具体例によれば、前記がんは、ｃ−Ｍｅｔ活性に関連するすべてのがんであってよい。前記がんは、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球の黒色腫、直膓癌、肛門付近の癌、食道癌、小腸腫瘍、内分泌系腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｇｌａｎｄ）、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、すい臓癌、神経膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺腫瘍、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群より選択されるものであってよい。
【００３４】
前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を追加的に含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常使用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム（アラビア・ゴム、gum acacia）、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むか、これらに限定されるものではない。前記医薬組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。
【００３５】
前記医薬組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与可能である。
【００３６】
前記医薬組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。前記組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。用語「薬学的有効量」または「治療的有効量」は、がんを予防または治療する上で、または血管新生による疾患を予防または治療する上で効果を奏する量を意味する。
【００３７】
前記組成物は、当該当業者が容易に実施可能な方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてよい。一方、前記組成物は、抗体または抗原結合断片を含むため、免疫リポソームで剤形化されてよい。抗体を含むリポソームは、当業界で広く知られている方法により製造できる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびポリエチレングリコール−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法によって製造できる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド−交替反応によってリポソームに接合できる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加的にリポソーム内に含まれていてもよい。
【００３８】
一具体例によれば、前記抗体または抗体断片は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の作用を行うものであってよい。
【００３９】
用語「拮抗剤（アンタゴニスト、ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」は、標的物（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）の生理活性のうちの１つ以上を部分的ながら完全に遮断、抑制または中和させるすべての分子を含む概念で解釈される。例えば、「拮抗剤」抗体は、抗体が結合する抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）の生理活性を抑制または減少させる抗体を意味する。拮抗剤は、リガンドに対する受容体の結合によって、受容体のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を減少させたり、分解を促進したり、リガンドによって活性化されていた細胞を不活性化させたり、または死滅させる作用を行うことができる。また、拮抗剤は、受容体−リガンド間の相互作用を完全に断絶すること、あるいは受容体の３次構造の変化、または減少調節（ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）することによって前記相互作用を実質的に減少させることができる。
【００４０】
さらに他の一実施形態は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体をがんの予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む、がんの予防および／または治療方法を提供する。前記抗体または抗体断片は、治療的有効量で投与されてよく、前記のような薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に製剤化された薬学組成物の形態であってよい。前記方法は、前記投与段階の前に、がんの予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含むことができる。
【００４１】
他の実施形態において、がんの予防および／または治療、またはがんの予防および／または治療のための薬剤を製造するために使用される、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００４２】
一方、前記がんの予防または治療用医薬組成物を投与可能な個体または前記がん治療方法の対象患者は、すべての動物を含むことができ、例えば、ヒト、犬、猫、マウスなどのような哺乳類であってよく、場合によっては、ヒトを除いた動物であってよい。
【００４３】
本発明の他の例は、前記のような抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、および先に説明されたポリペプチドまたはアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、任意に発現ベクターのようなベクターに挿入されたものであってよい。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態は、前記のような抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞、および前記ポリペプチドまたはアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供する。
【００４５】
さらに他の実施形態は、前記のような抗体またはその抗原結合断片を製造する方法を提供する。前記方法は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を細胞で発現させる段階を含むことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、１つ以上の実施形態について実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、１つ以上の具体例を例として説明するためのもので、発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体ＡｂＦ４６の生産
（１）マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のネズミに、１匹あたり１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、同量の完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して、４−６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射した。２週後に、前記と同様の方法で抗原（先に注射した量の半分）を不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して、マウスの腹腔内に注射した。１週後、最後のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）が行われ、３日後に、前記マウスの尾から採血して血清を得た後、１／１０００にＰＢＳで希釈して、ＥＬＩＳＡでｃ−Ｍｅｔを認知する抗体の力価が増加することを確認した。前記の結果で抗体の量が十分に得られるマウスを選別し、細胞融合過程を行った。
（２）細胞融合およびハイブリドーマの製造
細胞融合実験３日前に、５０μｇのＰＢＳに、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質の混合物を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻酔した後、ボディの左側に位置した脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで粉砕して細胞を分離し、培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合して、脾臓細胞懸濁液を作った。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。前記得られた脾臓細胞１ｘ１０８個と、骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）１ｘ１０８個を混合してから、遠心分離して細胞を沈殿させた。遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、培養培地（ＤＭＥＭ）に入っている４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍｌ）を処理し、３７℃で１分間維持させた後、培養培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを添加した。以降、培養培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌを１分間添加し、３７℃の水で５分間放置した後、５０ｍｌに合わせて再び遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地（ＨＡＴ培地）に１〜２×１０５／ｍｌ程度に再懸濁させ、９６−ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに０．１ｍｌずつ分注した後、３７℃の二酸化炭素培養器で培養して、ハイブリドーマ細胞群を製作した。
（３）ｃ−Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選別
前記（２）で製造されたハイブリドーマ細胞群の中から、ｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質とヒトのＦｃタンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法によってスクリ−ニングした。
【００４８】
マイクロタイタープレートにヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を、１ウェルあたりそれぞれ５０μｌ（２ｕｇ／ｍｌ）ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応しない抗原は洗浄して除去した。ｃ−ＭｅｔでないＦｃに結合される抗体を選別して除外させるために、ヒトのＦｃタンパク質を前記と同様の方法でプレート表面に付着させた。前記（２）で得られたハイブリドーマ細胞の培養液を、それぞれウェルに５０μｌずつを加えて１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液−トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄し、反応しない培養液を除去した。これに、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を加えて、１時間室温で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。次に、ペルオキシダーゼの基質溶液（ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応の程度は、エライザリーダー（ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍにて吸光度を測定し、ヒトのＦｃには結合されず、ヒトのｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選別した。繰り返し選別を通して得られたハイブリドーマ細胞株を限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終選別されたモノクローナル抗体生産ハイブリドーマを韓国細胞株銀行に寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０が付与された。
（４）モノクローナル抗体の生産および精製
前記（３）で得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を生産精製した。
【００４９】
まず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれている培養培地（ＤＭＥＭ）培地５０ｍｌで培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳで２回以上洗浄し、ＦＢＳの除去された状態で培養培地（ＤＭＥＭ）培地５０ｍｌを細胞沈殿物に再懸濁させた後、３日間、３７℃の二酸化炭素培養器で培養した。以降、遠心分離によって抗体を生産する細胞を除去し、抗体の分泌した培養液を分離して４℃に保管するか、直ちに集めて、５０ｍｌ〜３００ｍｌの培養液から、親和性カラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）を装着したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗体を純粋精製した後、タンパク質濃縮用フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてＰＢＳで上層液を置換し、精製された抗体を保管し、後の実験に使用した。
【００５０】
実施例２：ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６の製作
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入された時、免疫拒絶反応（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す可能性が高いことから、これを解決するために、前記実施例１で製作されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原の結合に関連する変異領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を除いた不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を、ヒトＩｇＧ１抗体の配列に置換するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６を製作した。
【００５１】
重鎖に相当する塩基配列は「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）で、軽鎖に相当する塩基配列は「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３９）で構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３９）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、キメラ抗体の発現のためのベクターを構築した。
【００５２】
前記構築されたベクターはそれぞれ、キアゲン  マキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは４：１の割合（８０ｕｇ：２０ｕｇ）で、２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０７）に２Ｍ  ＣａＣｌ２を３６０ｕｌ添加してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以降、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００５３】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに交換し、最終的にキメラ抗体ＡｂＦ４６（以下、ｃｈＡｂＦ４６と名づける）を精製した。
【００５４】
実施例３：キメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６からヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の製作
（１）重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）およびＨ３−重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）のデザインのために、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔを通して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を同定した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ酸レベルで８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をカバットのナンバリング（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に導入されるようにデザインした。前記アミノ酸番号は、カバットのナンバリングに従い、前記番号は、ＶＨ３−７１とマウス抗体ＡｂＦ４６に一般的な表現である（以下、同様である）。この時、３０番（Ｓ→Ｔ）、４８番（Ｖ→Ｌ）、７３番（Ｄ→Ｎ）、７８番（Ｔ→Ｌ）のアミノ酸は、元々、マウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列で、復帰突然変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）した。以降、Ｈ１は追加的に８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）のアミノ酸に突然変異を与え、最終的にＨ１−重鎖（ｈｅａｖｙ）（配列番号４０）とＨ３−重鎖（ｈｅａｖｙ）（配列番号４１）を構築した。前記アミノ酸番号は、カバットのナンバリングに従うもので、ＶＨ３−７１とマウス抗体ＡｂＦ４６に共通に適用される。
【００５５】
Ｈ４−重鎖のデザインのためにヒト抗体の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）配列を調べた結果、ＡｂＦ４６抗体のマウス骨格配列と配列が非常に類似すると同時に、従来の最も安定と知られているＶＨ３サブタイプを用いて、カバットのナンバリングで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を導入した。これにより、Ｈ４−重鎖（配列番号４２）を構築した。
（２）軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）（配列番号４３）およびＨ２−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）（配列番号４４）の２種のデザインのために、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルで７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットのナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１の骨格に導入されるようにデザインした。この時、Ｈ１−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）は、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を復帰突然変異し、Ｈ２−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）は、４９番のアミノ酸（Ｙ→Ｉ）１個だけを復帰突然変異して構築した。
Ｈ３−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖細胞系遺伝子を分析した結果のうち、前記ＶＫ４−１のほか、ＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０は、アミノ酸レベルで６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットのナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１の骨格に導入されるようにデザインした。この時、Ｈ３−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）は、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を復帰突然変異して構築した。
【００５６】
Ｈ４−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）配列を調べた結果、従来の最も安定と知られているＶｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅを用いて、カバットのナンバリングで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を導入した。この時、Ｈ４−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）は、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を追加的に復帰突然変異して構築した。
【００５７】
以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  抗体発現キット（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  クローニングキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）に前記重鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−重鎖（ｈｅａｖｙ）；配列番号４７、Ｈ３−重鎖（ｈｅａｖｙ）；配列番号４８、Ｈ４−重鎖（ｈｅａｖｙ）；配列番号４９）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）；配列番号５０、Ｈ２−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）；配列番号５１、Ｈ３−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）；配列番号５２、Ｈ４−軽鎖（ｌｉｇｈｔ）；配列番号５３）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。
【００５８】
前記構築されたベクターはそれぞれ、キアゲン  マキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは４：１の割合（８０ｕｇ：２０ｕｇ）で、２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０７）に２Ｍ  ＣａＣｌ２を３６０ｕｌ添加してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以降、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００５９】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに交換し、最終的にヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と名づける）を精製した。一方、以降の実施例で使用したヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重鎖、軽鎖の組み合わせは、Ｈ４−ｈｅａｖｙおよびＨ４−ｌｉｇｈｔであった。
【００６０】
実施例４：ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの製作
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを製作するための遺伝子をデザインした。それぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を‘ＶＨ−リンカー−ＶＬ’の形態となるようにし、前記リンカーは‘ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ’（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコーディングするポリヌクレオチド（配列番号５５）をバイオニア社に依頼して合成し、これを発現させるためのベクターを配列番号５６に示した。
【００６１】
以降、前記ベクターから発現した結果物を分析し、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力を示すことを確認した。
【００６２】
実施例５：親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリー遺伝子の製作
（１）標的ＣＤＲの選定およびプライマーの製作
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のために６つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を、前記製作されたマウス抗体ＡｂＦ４６から‘Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ’によって定義し、それぞれのＣＤＲは下記の表１の通りである。
【００６３】
【表１】
2014530017.tif 000002
【００６４】
抗体ＣＤＲのランダム配列導入のために、次のようにプライマーを製作した。従来のランダム配列導入方式は、突然変異を与えようとする部位に同じ割合の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が導入されるようにＮコドンを用いたが、本実施例では、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダム塩基を導入するために、各ＣＤＲのアミノ酸をコーディングする３個の野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ヌクレオチド中の１番目および２番目のヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ導入する方式を取った。また、３番目のヌクレオチドは、同一に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）が導入されるようにプライマーをデザインした。
【００６５】
（２）ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリーの製作およびｃ−Ｍｅｔに対する結合力の確認
ＣＤＲのランダム配列の導入による抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記（１）のような方法で製作されたプライマーを用いて行われた。鋳型としてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、図１に示している方法のように、２個のＰＣＲ切片を製作し、これをオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（重複拡張重合酵素連鎖反応）（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）方法により、所望のＣＤＲだけがそれぞれ突然変異したｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を確保して製作された６つのＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。
【００６６】
このように製作されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔに対する結合力を確認し、それぞれのライブラリーは、野生型に比べてｃ−Ｍｅｔに対する結合力が大部分低下する傾向を示したが、一部のｃ−Ｍｅｔに対する結合力が維持される突然変異を確認した。
【００６７】
実施例６：製作されたライブラリーから親和度の改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔに対するライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列はそれぞれ下記の表２の通りであり、これをＩｇＧ形態に変換した。下記のクローンの中から、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から生産された４種の抗体を選別して後続の実験を行った。
【００６８】
【表２】
2014530017.tif 000003
【００６９】
実施例７：選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコーディングするポリヌクレオチドは‘ＥｃｏＲＩ−シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）で構成され、重鎖の場合、親和度の成熟後に抗体のアミノ酸が変更されなかったので、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま使用した。ただし、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒトＩｇＧ１のヒンジでないＵ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）に置換した。軽鎖は‘ＥｃｏＲＩ−シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ’で構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成し、親和度の成熟後に選別された前記４種の抗体の軽鎖可変領域を含んでコーディングするポリヌクレオチド（配列番号５８〜配列番号６１）をバイオニア社に依頼して合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  抗体発現キット（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  クローニングキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）に前記重鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  クローニングキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片（Ｌ３−１由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５８、Ｌ３−２由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５９、Ｌ３−３由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６０、Ｌ３−５由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６１）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、親和力の成熟した抗体の発現のためのベクターを構築した。
【００７０】
前記構築されたベクターはそれぞれ、キアゲン  マキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは４：１の割合（８０ｕｇ：２０ｕｇ）で、２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０７）に２ＭのＣａＣｌ２を３６０ｕｌ添加してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以降、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７１】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに交換し、最終的に親和力の成熟した４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５と名づける）を精製した。
【００７２】
実施例８：選別された抗体の結合親和度の分析
前記実施例７で製作された４種の抗体のｃ−Ｍｅｔ抗原に対する親和力を、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。ＣＭ５チップ上にそれぞれの抗体を約８０〜１１０ＲＵだけ固定させた後、抗原のヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質を、１００ｎＭから０．３９ｎＭまでの濃度範囲内で互いに異なる９つの濃度で３０ｕｌ／ｍｉｎの速度で注入し、下記の表３のようにｋｏｎ値とｋｏｆｆ値を求め、これからＫＤ値を計算した。ｈｕＡｂＦ４６は、ｃ−Ｍｅｔ抗原に対して約２．１９ｎＭの結合力を示し、親和度の改善された４種の抗体は、０．０６ｎＭ〜０．５０ｎＭの範囲の結合力を示した（表３）。これは、ｓｃＦｖ形態において親和度の改善された抗体が、ＩｇＧ変換後にも最小５倍から最大約３７倍まで親和度が向上したことを表す。
【００７３】
【表３】
2014530017.tif 000004
【００７４】
実施例９：選別された親和度改善抗体のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生理活性の分析
（１）ＢｒｄＵ  分析（ａｓｓａｙ）
親和度の改善された抗体において安全性に脆弱点があるか否かを確認するために、ＢｒｄＵ  分析を行った。ヒト肺がん細胞のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（ＡＴＣＣ社製  Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１７４）をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標登録））に２ｘ１０５細胞／ｍｌで懸濁し、懸濁液を１００ｕｌずつ９６−ウェル（ｗｅｌｌ）組織培養プレート（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）に分注した。２４時間、３７℃で５％ＣＯ２の条件で培養し、培地を完全に除去した後に、抗体を希釈したＲＰＭＩ１６４０培地に交替した。２１時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した後、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、ＢｒｄＵ）を添加し、３時間を追加的に培養してから、ＢｒｄＵ  分析（Ｒｏｃｈｅ社製、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を行った。細胞をプレート上でｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ／ｆｉｘａｔｉｏｎした後に、抗−ＢｒｄＵ抗体を入れて、１時間後に基質を添加し、３７０ｎｍでＥＬＩＳＡスペクトラマックスリーダー（ｓｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で発色反応を測定した。陰性対照群には培地（メディア、ｍｅｄｉａ）だけを使用し（抗体無添加）、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）としてよく知られている５Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．＃ＨＢ１１８９５ハイブリドーマ細胞から分離精製）を陽性対照群に使用した。
【００７５】
その結果、図２から明らかなように、前記製作された４種の親和性を改善した抗体のうちの４種で作用性（ａｇｏｎｉｓｍ）の副作用が減少することが分かり、安全性が改善されたことが分かった（１０ｕｇ／ｍｌの処理濃度でそれぞれｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１  ２５％、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２  ２８％、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３  １３％、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５  ２１％改善される）。
【００７６】
（２）インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞増殖分析法
前記実施例５で製作された４種の親和度改善抗体のがん細胞増殖の抑制による抗がん効果を確認するために、ｃ−Ｍｅｔ分子を細胞表面に発現するＭＫＮ４５胃がん細胞（日本がん研究細胞株銀行、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂａｎｋ、ＪＣＲＢ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いたインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞増殖分析法を行った。
【００７７】
９６−ウェルプレートに、ウェルあたり１ｘ１０４個のＭＫＮ４５細胞を、５０μｌの５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培養液と分注し、前記製作された抗体４種を処理しないか、０．００８、０．０４、０．２または１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌを処理した後、７２時間培養してから、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標登録）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７０）を用いて、ルミノメーター（ｌｅｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、２１０４  マルチラベルリーダー（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒ））で細胞の数を定量した。
【００７８】
図３に示されているように、実験濃度のうち最低濃度の０．００８μｇ／ｍｌで親和性を改善する前の抗体（ｈｕＡｂＦ４６）の相対的細胞生存率が７７％であり、親和性の改善された抗体ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５はそれぞれ７４、７３、７２％と効能が似ており、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３は６６％と効能が確実に減少することを観察した。また、最大効能を示す０．０４μｇ／ｍｌの濃度では、前記抗体４種ともが５Ｄ５抗体の生存率である５３％以下の数値を示すことを確認することができた。したがって、親和度改善の結果、対照群に比べて、効能および安全性において確実に改善されることを確認することができた。
【００７９】
（３）Ａｋｔのリン酸化
Ａｋｔによって調節される細胞作用は、細胞増殖、細胞生存、細胞の大きさ調節、可用栄養分に対する反応性、中間代謝過程、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、組織浸潤（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）などを含む。このすべての過程は、がんの特徴を代表するもので、数多い腫瘍発生タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と腫瘍発生抑制物質（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）は、Ａｋｔ経路上で相互交差的に影響を与え、信号伝達と古典的な代謝調節の連結点で細胞の作用を微細に調節する機能を果たす。したがって、このＡｋｔの活性型であるリン酸化されたＡｋｔの程度が高いほど、がん細胞がさらに活性型であると判断することができる。本実施例では、親和度の改善された４種の抗体がＡｋｔのリン酸化をどれだけ阻害できるかを実験した。
【００８０】
前記実施例５で製作された４種の親和性を改善した抗体の作用性（アゴニズム、ａｇｏｎｉｓｍ）の程度を比較するために、Ｃａｋｉ−１細胞（韓国細胞株銀行）を用いて、Ａｋｔタンパク質のリン酸化程度を確認した。陰性対照群にはマウスのＩｇＧを使用し、作用剤（アゴニスト、ａｇｏｎｉｓｔ）としてよく知られている５Ｄ５抗体を陽性対照群に使用した。
【００８１】
２ｘ１０５細胞／ｍｌのＣａｋｉ−１細胞を９６−ウェルプレートに分注した後、２４時間後に、無血清状態でそれぞれ５ｕｇ／ｍｌの抗体を３０分間処理した。抗体の処理された細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させ、ＰａｔｈＳｃａｎ（商標登録）  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ１（Ｓｅｒ４７３）ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、ｃａｔ．ｎｏ＃７１３４Ｓ）を用いてＡｋｔのリン酸化程度を測定した後、分析した。
【００８２】
図４から明らかなように、４種の抗体とも、親和度の改善前よりＡｋｔのリン酸化をさらに阻害することを確認することができた。特に、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２のＡｋｔのリン酸化程度はそれぞれ１５．２７％および１５．７１％で、親和性の改善前（ｈｕＡｂＦ４６：２９．０６％）と比較して約４９％の阻害度を示すことが分かり、安全性の面で確実に改善されたことを確認することができた。反面、抗体５Ｄ５は、相対的Ａｋｔのリン酸化水準が１００％と非常に高くなり、これは、抗体５Ｄ５が非常に高い作用性（アゴニスト）（ａｇｉｏｎｉｓｍ）と非常に低い安全性を有することを表す。
【００８３】
（４）ｃ−Ｍｅｔの分解程度の確認
前記実施例５で製作された４種の親和性を改善した抗体の抗がん効能を確認するために、抗体と結合されたｃ−Ｍｅｔタンパク質の分解程度を確認した。これは、相対的な総ｃ−Ｍｅｔ量は、抗体がｃ−Ｍｅｔに結合して内在化を起こし、ｃ−Ｍｅｔの分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が起こることを利用して、総ｃ−Ｍｅｔ量の増減を把握し、抗体の効能を検査するものである。
【００８４】
２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  ＭＫＮ４５細胞と５ｕｇ／ｍｌの抗体を９６−ウェルプレートに同時に散布した後、２４時間培養した。以降、抗体の処理された細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させ、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ３５８）を用いて総ｃ−Ｍｅｔ量の変化を測定した後、分析した。
【００８５】
その結果、図５から明らかなように、４種の親和性を改善した抗体はいずれも、ｈｕＡｂＦ４６抗体に比べてｃ−Ｍｅｔの分解程度が増加することを確認することができた。ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１は、ｈｕＡｂＦ４６に比べて約３７％程度ｃ−Ｍｅｔの分解程度が増加し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５は、約２８％程度ｃ−Ｍｅｔの分解程度が増加したことを確認した。図４および図５から明らかなように、親和度の成熟した抗体は、抗体５Ｄ５と比較して同等以上のｃ−Ｍｅｔの分解程度を示し、より高い安全性を示した。
【００８６】
実施例１０：選別された親和度改善抗体のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）生理活性の分析
前記実施例５で製作された４種の親和性を改善した抗体の抗がん効能改善の有無を確認するために、Ｕ８７ＭＧ脳がん細胞（韓国細胞株銀行）またはＭＫＮ４５胃がん細胞（日本がん研究細胞株銀行、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂａｎｋ、ＪＣＲＢ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を投与した異種移植脳がんまたは胃がんマウス動物モデルを対象として、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で４種の親和性を改善した抗体の投与によって腫瘍の大きさが減少する否かを確認した。
【００８７】
マウス動物モデルは、５ｘ１０６個のＵ８７ＭＧ脳がん細胞またはＭＫＮ４５胃がん細胞５０μｌを、６週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（（株）オリエントバイオ）に皮下注射し、１週経過後にがんが発生するマウスを、各グループあたり１２匹ずつをランダム選別して実験に使用した。４種の親和度改善抗体は、がん細胞が生成され、静脈注射によって１０ｍｇ／ｋｇの濃度だけ週１回マウスに投与した。また、対照群として、マウスＡｂＦ４６抗体は、腹腔注射によって１０ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇの濃度で週２回投与した。
【００８８】
図６Ａおよび図６Ｂに示しているように、Ｕ８７ＭＧ脳がんまたはＭＫＮ４５胃がんマウス動物モデルにおいて２つの抗体とも確実な腫瘍成長抑制効能を示した。
【００８９】
実施例１１：不変領域および／またはヒンジ領域が置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の製造
選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和度が最も高く、Ａｋｔのリン酸化およびｃ−Ｍｅｔの分解程度が最も低いと測定されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１を対象として、ヒンジ領域または不変領域およびヒンジ領域が置換された抗体を製作した。
ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ、およびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖と、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）不変領域からなる軽鎖とからなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ、およびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖と、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖とからなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ（ｈｉｎｇｅ））、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ、およびヒトのＩｇＧ２不変領域からなる重鎖と、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖とからなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）と名づけた。また、一方、前記３種の抗体は、生産量増大のために、ヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の３６番のヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をすべてチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）に置換した。
【００９０】
前記３種の抗体を製作するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ、およびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６２）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ、およびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６４）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ、およびヒトのＩｇＧ２不変領域からなるポリペプチド（配列番号６６）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番のヒスチジンがチロシンに置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなるポリペプチド（配列番号６８）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号６９）をバイオニアに依頼して合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  抗体発現キット（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）に前記重鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。
【００９１】
前記構築されたベクターはそれぞれ、キアゲン  マキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは４：１の割合（８０ｕｇ：２０ｕｇ）で、２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０７）に２Ｍ  ＣａＣｌ２を３６０ｕｌ添加してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以降、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９２】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）に交換し、最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ））を精製した。
【００９３】
また、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域からカバットのナンバリン（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）の２７ｅで定義されたアミノ酸のセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）をトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）に置換して新たな軽鎖（配列番号７３）を製作し、先に記載した方法でこれをｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）の重鎖と結合して抗体を製造し、これをＬ３−１１Ｙと名づけた。前記実験例８と同様の方法で抗体Ｌ３−１１Ｙの結合親和度を測定した結果、ＫＤ（ｎＭ）値が０．０１以下（＜０．０１）と測定された。
【００９４】
実施例１２：不変領域および／またはヒンジ領域が置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生理活性の分析
（１）インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞増殖分析法
前記実施例１１で製作された３種の抗体のがん細胞増殖の抑制による抗がん効果を確認するために、ｃ−Ｍｅｔ分子を細胞表面に発現するＭＫＮ４５胃がん細胞（日本がん研究細胞株銀行、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂａｎｋ、ＪＣＲＢ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いたインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞増殖分析法を行った。
【００９５】
９６−ウェルプレートに、ウェルあたり１ｘ１０４個のＭＫＮ４５細胞を、５０μｌの５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培養液と分注し、前記製作された抗体３種を処理しないか、０．００８、０．０４、０．２または１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌを処理した後、７２時間培養してから、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標登録）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７０）を用いて、ルミノメーター（ｌｅｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、２１０４マルチラベルリーダー（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒ））で細胞の数を定量した。
【００９６】
図７に示されているように、前記３種の抗体ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ（ｈｉｎｇｅ））、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）は、０．０４μｇ／ｍｌ以下の濃度で処理した時、約６０％程度の数値を示すことを確認することができた。
【００９７】
（２）Ａｋｔのリン酸化
前記実施例１１で製作された３種の親和度改善抗体の作用性の程度を比較するために、Ｃａｋｉ−１細胞（韓国細胞株銀行）を用いて、Ａｋｔタンパク質のリン酸化程度を確認した。陰性対照群にはマウスのＩｇＧを使用し、作用剤（アゴニスト、ａｇｏｎｉｓｔ）としてよく知られている５Ｄ５抗体を陽性対照群に使用した。
【００９８】
２ｘ１０５細胞／ｍｌのＣａｋｉ−１細胞を９６−ウェルプレートに分注した後、２４時間後に、無血清状態でそれぞれ５ｕｇ／ｍｌの抗体を３０分間処理した。抗体の処理された細胞を溶解させ、ＰａｔｈＳｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ１（Ｓｅｒ４７３）ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、ｃａｔ．ｎｏ＃７１３４Ｓ）を用いてＡｋｔのリン酸化程度を測定した後、分析して、その結果を図８Ａに示した。
【００９９】
図８Ａから明らかなように、３種の抗体とも１８％以下の阻害度を示すことが分かり、安全性の面で確実に改善されたことを確認することができた。
【０１００】
また、前記方法でｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）と抗体Ｌ３−１１ＹのＡｋｔのリン酸化の阻害程度を測定して比較し、その結果を図８Ｂに示した。図８Ｂから明らかなように、抗体Ｌ３−１１Ｙは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）と比較して同等以上のＡｋｔのリン酸化阻害活性を示すことが確認された。
【０１０１】
（３）ｃ−Ｍｅｔの分解程度の確認
前記実施例１１で製作された３種の親和性を改善した抗体の抗がん効能を確認するために、抗体と結合されたｃ−Ｍｅｔタンパク質の分解程度を確認した。２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  ＭＫＮ４５細胞と５ｕｇ／ｍｌの抗体を９６−ウェルプレートに同時に散布した後、２４時間培養した。以降、抗体の処理された細胞を溶解させ、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＤＹＣ３５８）を用いて総ｃ−Ｍｅｔ量の変化を測定した後、分析して、その結果を図９Ａに示した。
【０１０２】
その結果、図９Ａから明らかなように、３種の抗体はいずれも、ｈｕＡｂＦ４６抗体に比べてｃ−Ｍｅｔの分解程度が増加することを確認することができた。
【０１０３】
また、前記方法でｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）と抗体Ｌ３−１１Ｙのｃ−Ｍｅｔの分解程度を測定して比較し、その結果を図９Ｂに示した。図９Ｂから明らかなように、抗体Ｌ３−１１Ｙは、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）と比較して同等程度のｃ−Ｍｅｔの分解活性を示すことが確認された。
【０１０４】
実施例１３：不変領域および／またはヒンジ領域が置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）生理活性の分析
前記実施例１１で製作された３種の抗体の抗がん効能改善の有無を確認するために、Ｕ８７ＭＧ脳がん細胞（韓国細胞株銀行）またはＭＫＮ４５胃がん細胞（日本がん研究細胞株銀行、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂａｎｋ、ＪＣＲＢ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を投与した異種移植脳がんまたは胃がんマウス動物モデルを対象として、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で３種の抗体の投与によって腫瘍の大きさが減少するか否かを確認した。
【０１０５】
マウス動物モデルは、５ｘ１０６個のＵ８７ＭＧ脳がん細胞またはＭＫＮ４５胃がん細胞５０μｌを、６週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（（株）オリエントバイオ）に皮下注射し、１週経過後にがんが発生するマウスを、各グループあたり１２匹ずつをランダム選別して実験に使用した。３種の抗体は、がん細胞が生成され、静脈注射によって１０ｍｇ／ｋｇの濃度だけ週１回マウスに投与した。また、対照群として、マウスＡｂＦ４６抗体は、腹腔注射によって１０ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇの濃度で週２回投与した。
【０１０６】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示しているように、Ｕ８７ＭＧ脳がんまたはＭＫＮ４５胃がんマウス動物モデルにおいて２つの抗体とも確実な腫瘍成長抑制効能を示し、統計的に有意な差はなかった。
【０１０７】
上記のように、一具体例による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体およびこれを含むがんの予防または治療用医薬組成物によれば、がんを効率的に予防または治療することができる。
【図１】
2014530017.tif 000005
【図２】
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【図３】
2014530017.tif 000007
【図４】
2014530017.tif 000008
【図５】
2014530017.tif 000009
【図６Ａ】
2014530017.tif 000010
【図６Ｂ】
2014530017.tif 000011
【図７】
2014530017.tif 000012
【図８Ａ】
2014530017.tif 000013
【図８Ｂ】
2014530017.tif 000014
【図９Ａ】
2014530017.tif 000015
【図９Ｂ】
2014530017.tif 000016
【図１０Ａ】
2014530017.tif 000017
【図１０Ｂ】
2014530017.tif 000018
【配列表】
2014530017000001.app
【国際調査報告】
2014530017.tif 000019
2014530017.tif 000020
2014530017.tif 000021
2014530017.tif 000022
2014530017.tif 000023