(57)【要約】  本発明は、高親和性を有して標的に結合可能な修飾ユビキチンから取得した新規な二量体型タンパク質に関する。新規な二量体型結合タンパク質は、単量体の一方にアミノ酸置換とアミノ酸の少なくとも１つ挿入との組合せを含む。本発明はさらに、医学的な診断方法または治療方法における前記タンパク質の使用に関する。【選択図】図１
2014526881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭−尾配置で結合一体化された２つのユビキチン単量体
を含む、ヒトユビキチンの非天然標的タンパク質への結合能を有するヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、
前記ヘテロ二量体型タンパク質の両方の単量体が、少なくとも配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する少なくとも５、６、７、または８個のアミノ酸の置換により異なって修飾され、かつ
２〜１５個のアミノ酸が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記アミノ酸置換から０、１、２、または３アミノ酸離れて少なくとも一方のユビキチン単量体に挿入され、かつ
前記修飾ユビキチン単量体が、配列番号１に対して少なくとも７５％または少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有し、かつ前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンが、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍの前記非天然標的タンパク質への特異的検出可能結合親和性を有する
ことを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、６〜１０個のアミノ酸または７〜９個のアミノ酸または８個のアミノ酸が、一方または両方のユビキチン単量体に挿入されることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、アミノ酸の前記挿入が、Ｃ末端（第４）またはＮ末端（第１）のβストランドから０、１、２、３、４、または５アミノ酸離れており、任意選択で、前記挿入が、Ｎ末端（第１）のユビキチン単量体に位置することを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項４】
請求項２または３に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、前記挿入が、配列番号１のアミノ酸の位置６１および６２または位置６２および６３または位置６３および６４または位置６４および６５に対応するアミノ酸間にあり、最も好ましいのが、配列番号１の位置６１および６２に対応するアミノ酸間であることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、前記非天然標的タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、好ましくはＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームであることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、前記Ｎ末端（第１）の単量体中の置換が、Ｋ６Ｙ、Ｌ８Ｄ、Ｑ６２Ｓ、Ｋ６３Ｗ、Ｅ６４Ｍ、Ｓ６５Ｐ、Ｔ６６Ａであり、かつ／または前記Ｎ末端の単量体中の挿入が、アミノ酸配列ＤＶＡＥＹＬＧＩ（配列番号１２）を含むか、もしくはそれで構成されることを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質。
【請求項７】
医薬活性成分または診断活性成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートにおいて、前記医薬活性成分が、任意選択で、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、ユビキチン系結合タンパク質、もしくは酵素であり、または前記診断活性成分が、蛍光性化合物、光増感剤、もしくは放射性核種から選択されることを特徴とする融合タンパク質またはコンジュゲート。
【請求項８】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載のその融合タンパク質もしくはコンジュゲートからなることを特徴とする多量体。
【請求項９】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載の修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体あるいはそれらの組合せと、薬学的に許容可能な担体と、を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載の融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体と、診断的に許容可能な担体と、を含むことを特徴とする診断剤。
【請求項１１】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または請求項７に記載の修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質、請求項７に記載の融合タンパク質もしくはコンジュゲート、請求項８に記載の多量体、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１２に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、以下のステップ、すなわち、
ａ）ユビキチンタンパク質を提供するステップと、
ｂ）潜在的標的としてユビキチンの非天然標的タンパク質を提供するステップと、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有する単量体型ユビキチンタンパク質が得られるように前記ユビキチンタンパク質を修飾するステップであって、５、６、７、または８個のアミノ酸が、少なくとも配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８に対応するアミノ酸の置換により修飾され、かつさらなる２〜１５個のアミノ酸が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記置換アミノ酸から０、１、２、または３アミノ酸離れて挿入されるものとするステップと、
ｄ）前記単量体型の異なって修飾されたユビキチン単量体の２つを結合するステップと、
ｅ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｆ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合する修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を同定するステップと、任意選択で
ｇ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を単離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の同定方法において、以下のステップ、すなわち、
ａ）単量体型ユビキチンタンパク質に由来する異なって修飾されたヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質の集団を提供するステップであって、前記集団が、頭−尾配置で結合一体化された２つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含むヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を含み、前記多量体型タンパク質の各単量体が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する５、６、７、または８個のアミノ酸の置換により修飾され、かつさらなる２〜１５個のアミノ酸が、少なくとも一方の単量体ユビキチンユニット中の前記アミノ酸置換内またはそれにごく近接して、任意選択で、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記置換アミノ酸から０、１、２、または３アミノ酸離れて挿入されるものとするステップと、
ｂ）潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップと、
ｃ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｄ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合するヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップと、任意選択で
ｅ）前記結合親和性を有する前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを単離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項７に記載のヘテロ二量体型融合タンパク質またはコンジュゲートの生成方法において、以下のステップ、すなわち、
ａ）請求項１乃至６の何れか１項に記載の二量体型修飾ユビキチンを提供するステップと、
ｂ）前記修飾された二量体型修飾ユビキチンタンパク質を医薬活性成分および／または診断活性成分に融合またはコンジュゲートするステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
医学的な治療方法または診断方法で使用することを特徴とする、請求項１乃至６の何れか１項に記載のタンパク質または請求項７に記載の融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項８に記載の多量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合部位を伸長する修飾により標的への高親和結合性を有する新規な足場に関する。本発明は、ヒトユビキチンの非天然標的タンパク質への高結合能を有する二量体型修飾ユビキチン系タンパク質に関する。さらに、本発明は、前記二量体型結合タンパク質と診断活性または治療活性な成分とを含む融合タンパク質またはコンジュゲートに関する。本発明はまた、二量体型修飾ユビキチンの多量体、およびその融合タンパク質またはコンジュゲートの多量体、およびこれらの多量体を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
さらなる実施形態では、本発明は、前記新規な結合タンパク質または融合タンパク質またはコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに前記タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート、多量体、および／またはポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、前記二量体型結合タンパク質または融合タンパク質または多量体は、医薬剤または診断剤に組み込まれる。そのほかに、前記組換えタンパク質または融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体の製造方法、さらには医学的な治療方法または診断方法における前記タンパク質の使用を記載する。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリンでないアミノ酸で構成された結合分子に対する需要が高まっている。今まで、抗体は、最もよく確立されたクラスの結合分子であったが、免疫グロブリン分子は、大きな欠点を抱えているので、高い親和性および特異性を有してリガンドを標的とするために新しい結合分子の必要性が、依然として存在する。それは、かなり容易に産生可能であり、かつほとんどすべての標的を対象としうるが、かなり複雑な分子構造を有する。簡単な方法で取扱い可能なより小さい分子により抗体を代替する必要性が、引き続き存在する。この代替結合剤は、たとえば、疾患の診断、予防、および治療の医学分野で有利に使用可能である。
【０００４】
タンパク質足場として一般に参照される比較的明確な三次元構造を有するタンパク質は、前記代替結合剤の設計のための出発材料として使用されうる。この足場は、典型的には、特異的またはランダムな配列変異を受けやすい１つ以上の領域を含有し、そのような配列ランダム化は、多くの場合、特異的結合分子を選択しうるタンパク質ライブラリーを作製するために行われる。抗体よりも小さいサイズおよび標的抗原への同等のさらにはより良好な親和性を有する分子は、薬動学的性質および免疫原性の点で抗体よりも優れていると予想される。
【０００５】
たとえば、国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ）には、ユビキチンに基づく人工結合タンパク質の生成が記載されている。ユビキチンは、真核生物の間で高度に保存された小さい単量体型サイトゾルタンパク質である。生物中では、それは、膨大な範囲の生理学的過程できわめて重要な役割を果たし、ユビキチンの結合は、リン酸化に続いて２番目に多い翻訳後修飾である。
【０００６】
ユビキチンは、逆平行に配置されたβシートによりとくに特徴付けられ、αおよびβセグメントに細分される。ユビキチンタンパク質の特徴は、タンパク質の一表面に露出された逆平行βシートであり、その背面上にαヘリックスが充填されてその上に垂直に横たわる。このユビキチン様フォールディングモチーフにより、ユビキチンと他のタンパク質とが明確に区別される。
【０００７】
本発明の根底にある技術的問題およびその解決策
抗体または他の代替足場と比較して、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨの登録商標）としても参照される）は、多くの長所（すなわち、高い親和性および特異性、小さいサイズ、高い安定性、ならびに費用効果的な製造）を有する。しかしながら、高い親和性を有する新しい治療手段の観点からそのタンパク質をさらに開発する必要性が、依然として存在する。国際公開第０５／０５７３０号パンフレットには、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が記載されているが、タンパク質標的への特異的なかつ高親和性の結合を得るための二量体型ユビキチンタンパク質に関する解決策は、提供されていない。代替ユビキチン足場を用いた新規な結合タンパク質を生成する強い必要性が、当技術分野に依然として存在する。そのような新規な結合タンパク質は、医学において効果的な治療剤としての可能性を有する。
【０００８】
効率的な医学的治療剤の強い必要性が、依然として当技術分野に存在する。理想的には、結合タンパク質が一般に使用される抗体の欠点を有していない革新的な治療剤は、効率的でなければならない。これを達成するために、疾患標的は、特定の疾患にきわめて特異的でなければならず、そのような標的への結合は、高い親和性および選択性を有して行われなければならない。したがって、本発明の目的は、所与の非天然標的タンパク質に対して高い結合特異性を有する修飾ユビキチンに基づく代替足場タンパク質を提供することである。したがって、本発明の目的は、抗体と比較して有利な結合タンパク質を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、ヒトユビキチンの非天然標的タンパク質に対して高い結合特異性を有する代替ユビキチン系結合タンパク質を提供することである。そのような標的タンパク質に対する結合部位を伸長することにより、問題が解決される。この問題の解決策は、結合部位の伸長を可能にする構造を修飾ユビキチンタンパク質に挿入することである。請求項１の実施形態により記述される構造は、ユビキチン足場の全体構造および機能を維持しつつ、伸長構造（任意選択でループ構造）の形成を可能にすることにより、たとえば、非天然標的に対する伸長結合部位を形成することにより、新しい機能を生成する。
【００１０】
またさらなる目的は、前記結合タンパク質の取得方法、この新規な結合タンパク質の使用、さらには前記新規な結合タンパク質を含む融合タンパク質およびコンジュゲートを提供することである。
【００１１】
同封の独立請求項の保護対象により、以上に記載の目的が解決され、利点が達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項、さらには以下の説明、実施例、および図面に含まれる。以上の概説は、必ずしも本発明により解決されるすべての問題を記載しているわけではない。
【発明の概要】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、
頭−尾配置で結合一体化された２つのユビキチン単量体
を含む、ヒトユビキチンの非天然標的タンパク質への結合能を有するヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、
前記ヘテロ二量体型タンパク質の両方の単量体が、少なくとも配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する少なくとも５、６、７、または８個のアミノ酸の置換により異なって修飾され、かつ
２〜１５個のアミノ酸が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応する前記アミノ酸置換から０、１、２、または３アミノ酸離れて少なくとも一方のユビキチン単量体に挿入され、かつ
前記修飾ユビキチン単量体が、配列番号１に対して少なくとも７５％または少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有し、かつ前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンが、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍの前記非天然標的タンパク質への特異的検出可能結合親和性を有する
ことを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を提供する。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、医薬活性成分または診断活性成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた第１の態様に係るヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートにおいて、前記医薬活性成分が、任意選択で、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、ユビキチン系結合タンパク質、もしくは酵素であるか、または前記診断活性成分が、蛍光性化合物、光増感剤、もしくは放射性核種から選択されることを特徴とする融合タンパク質またはコンジュゲートに関する。
【００１４】
第３の態様では、本発明は、第１の態様に係るヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または第２の態様に係るその融合タンパク質もしくはコンジュゲートの多量体に関する。
【００１５】
第４の態様では、本発明は、第１の態様に係るヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または第２の態様に係る修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは第３の態様に係る多量体またはそれらと薬学的に許容可能な担体との組合せを含有する医薬組成物に関する。
【００１６】
第５の態様では、本発明は、第１の態様に係るヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質または第２の態様に係る修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは第３の態様に係る多量体と、診断的に許容可能な担体と、を含む診断剤に関する。
【００１７】
第６の態様では、本発明は、第１の態様に係るタンパク質または第２の態様に係る修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは第３の態様に係る多量体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１８】
第７の態様では、本発明は、第６の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００１９】
第８の態様では、本発明は、第１の態様に係るタンパク質または第２の態様に係る修飾ユビキチン融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは第３の態様に係る多量体または第６の態様に定義されるポリヌクレオチドまたは第７の態様に定義されるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２０】
第９の態様では、本発明は、次のステップ、すなわち、
ａ）ユビキチンを提供するステップと、
ｂ）潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップと、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するユビキチン単量体が得られるように前記ユビキチンを修飾するステップであって、５、６、７、または８個のアミノ酸が、少なくとも位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８に対応するかつそれらの位置から選択されるアミノ酸の置換により修飾され、２〜１５個のアミノ酸が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応するかつそれらの位置から選択される前記アミノ酸置換から０、１、２、または３アミノ酸離れて挿入されるものとするステップと、任意選択で
ｄ）前記異なって修飾されたユビキチン単量体の２つを結合するステップと、
ｅ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｆ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合する修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップと、任意選択で
ｇ）前記二量体型修飾ユビキチンタンパク質を単離するステップと、
を含む、第１の態様に係るヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法に関する。
【００２１】
第１０の態様では、本発明は、医学的な治療方法または診断方法で使用するための、第１の態様に係るタンパク質、第２の態様に係る融合タンパク質もしくはコンジュゲート、または第３の態様に係る多量体に関する。
【００２２】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載しているわけではない。他の実施形態は、以下の詳細な説明を精査すれば明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、挿入断片を有する異なる二量体型修飾ユビキチン結合タンパク質を示している。リンカー配列（ここでは：ＧＩＧ）は、イタリック体で示されている。ユビキチン単量体およびリンカーの置換されていないアミノ酸は、青色で示されている（強調表示）。置換アミノ酸は、強調表示されずに白色バックグラウンドで表示される。ここに示されるすべての変異体において、Ｎ末端（第１）の単量体では、修飾は、非天然タンパク質標的への新しい結合性が生成されるように置換および挿入された少なくとも１５個のアミノ酸に相当する（第１の単量体の全アミノ酸の少なくとも約２０％）。さらなる３個のアミノ酸（たとえば、位置４５、７５、および７６）は、生化学的性質が改善されるように置換されるが、ただし、標的への結合には関係しない。
【図１ａ】図１ａは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質４０４０１のアミノ酸配列を示している（配列番号２）。クローンは、両方のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６で置換され、第１のユビキチン単量体の位置６１〜６２に８個のアミノ酸の追加挿入を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質５９５１７のアミノ酸配列を示している（配列番号３）。クローンは、両方のユビキチン単量体の位置６、８、６２〜６６で置換され、８個のアミノ酸の追加挿入を示す。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する７個のアミノ酸（全アミノ酸の９％）が修飾される。
【図１ｃ】図１ｃは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質５９６４９のアミノ酸配列を示している（配列番号４）。クローンは、第１のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６および第２のユビキチンユニットの位置６、８、６２、６３、６５、および６６で置換される。タンパク質は、８個のアミノ酸の追加挿入を示す。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する６個のアミノ酸（全アミノ酸の８％）が修飾される。
【図１ｄ】図１ｄは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質６０４２３のアミノ酸配列を示している（配列番号５）。クローンは、第１のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６および第２のユビキチンユニットの位置６、８、６３〜６６で置換される。タンパク質は、８個のアミノ酸の追加挿入を示す。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する６個のアミノ酸（全アミノ酸の８％）が修飾される。
【図１ｅ】図１ｅは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質６０３２３のアミノ酸配列を示している（配列番号６）。クローンは、両方のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６で置換され、８個のアミノ酸の追加挿入を示す。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する７個のアミノ酸（全アミノ酸の９％）が修飾される。
【図１ｆ】図１ｆは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質６０３９７のアミノ酸配列を示している（配列番号７）。クローンは、第１のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６、および第２のユビキチンユニットの位置６、８、６２、６３、および６６で置換される。タンパク質は、８個のアミノ酸の挿入を示す。追加の交換は、第２のユビキチンユニットの位置５１に見いだされる。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する６個のアミノ酸（全アミノ酸の８％）が修飾される。
【図１ｇ】図１ｇは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質５９５０７のアミノ酸配列を示している（配列番号８）。クローンは、第１のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６、および第２のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６４、および６６で置換される。タンパク質は、位置６１および６２の間に８個のアミノ酸の挿入を示す。追加の交換は、第１のユビキチンユニットの位置４７に見いだされる。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する７個のアミノ酸（全アミノ酸の９％）が修飾される。
【図１ｈ】図１ｈは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質５９９８７のアミノ酸配列を示している（配列番号９）。クローンは、第１のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６、および第２のユビキチンユニットの位置６、８、６２、６４、および６５で置換される。タンパク質は、８個のアミノ酸の追加挿入を示す。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する５個のアミノ酸（全アミノ酸の６，５％）が修飾される。
【図１ｉ】図１ｉは、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質５９６０３のアミノ酸配列を示している（配列番号１０）。クローンは、両方のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６で置換され、８個のアミノ酸の挿入を示す。追加の交換は、第１のユビキチンユニット位置の４８および第２のユビキチン部分の位置２に見いだされる。したがって、第２の単量体中では、所与のタンパク質標的への新規な結合性に関与する９個のアミノ酸（全アミノ酸の１２％）が修飾される。
【図１ｊ】図１ｊは、高特異的結合性タンパク質が産生されるように置換のベースとして使用される二量体型ユビキチンのアミノ酸配列を示している（配列番号１１）。両方のユビキチンユニットの位置６、８、６２〜６６には、Ｘが付されている。リンカーのアミノ酸配列は、当技術分野で公知の任意の可能なリンカーを使用しうることもあれば、さらにはリンカーを使用しえないこともあるので、示されていない。野生型と比較して、ユビキチンは、両方の単量体の位置４５でトリプトファンにさらに修飾されることに留意されたい。この修飾は、結合に影響しない。第１の単量体の最後のＣ末端アミノ酸には、グリシンが存在するか、または第１の単量体の最後のＣ末端アミノ酸には、グリシンからアラニンへの交換が存在する。位置４５、７５、および７６でのこれらの交換は、任意選択であり、タンパク質リガンド／標的への結合に影響しない。
【図２】図２は、ＶＥＧＦ−Ａに対する結合タンパク質４０４０１（配列番号２）の高親和性結合を示している。結合は、当てはめ線により結ばれた黒丸により示されている。図は、ヒトＶＥＧＦ−Ａへの、特定的にはアイソフォーム１２１へのおよびアイソフォーム１６５へのヘテロ二量体型ユビキチン変異体の結合の濃度依存性ＥＬＩＳＡを示している。陰性対照としてＮＧＦを使用した（破線により結ばれた−星印−）。変異体４０４０１（この図ではＳＰＶＦ−１１＿１２１１＿Ａ１＿ＴｓＸ６としても参照される）は、ＶＥＧＦ−Ａ１２１（Ｋｄ＝２．５ｎＭ＝２．５×１０−９Ｍ）およびＶＥＧＦ−Ａ１６５（Ｋｄ＝２．２ｎＭ＝２．２×１０−９Ｍ）に対する高親和性結合を示す。ＶＥＧＦ−Ａ１２１およびＶＥＧＦ−Ａ１６５に対する親和性結合は非常に類似している。
【図３】図３は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））を用いた非標識相互作用アッセイによる修飾ヘテロ二量体型ユビキチン分子４０４０１の分析の結果を示している。チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定されたＶＥＧＦ１２１またはＶＥＧＦ１６５のいずれかに結合させてヘテロ二量体型変異体４０４０１とＶＥＧＦ−Ａとの間の相互作用を評価するために、さまざまな濃度のヘテロ二量体型ユビキチン変異体を選択した（０〜１０００ｎＭ）。会合曲線および解離曲線を分析したところ、ＶＥＧＦ１６５に対して２，２×１０−８ＭのＫｄ（２．４５×１０−３ｓ−１のｋｏｆｆ速度）およびＶＥＧＦ１２１に対して１．５×１０−８ＭのＫｄ（１．７６×１０−３ｓ−１のｋｏｆｆ速度）の結果が得られたことから、４０４０１とＶＥＧＦ−Ａとの複合体の半減期が長いことが示唆される。
【図４】図４は、結合タンパク質４０４０１によるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ−Ａ誘発増殖の阻害を示している。さまざまな濃度の４０４０１を一定のＶＥＧＦ−Ａ濃度のＶＥＧＦ−Ａと共に培地中でプレインキュベートし、混合物を増殖中のＨＵＶＥＣに適用した。３日後、ＷＳＴ試薬を用いて細胞増殖を定量した。用量反応曲線の当てはめを行ったところ、ＩＣ５０が８ｎＭと計算された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されるものではないことを理解すべきである。なぜなら、これらは変更しうるからである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しようとするものではないことも理解すべきである。とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。好ましくは、本明細書で用いられる用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｅｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるように定義される。本明細書で参照される配列はすべて、添付の配列リストに開示されており、その全内容および開示は、本明細書の一部である。
【００２５】
結合タンパク質としての修飾ユビキチンタンパク質
「ユビキチンタンパク質」という用語は、配列番号１に適合するユビキチンおよび以下の定義に適合するその修飾体を包含する。ユビキチンは、真核生物において高度に保存される。たとえば、現在までに研究されたすべての哺乳動物において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。とくに好ましいのは、ヒト、齧歯動物、ブタ、および霊長動物に由来するユビキチン分子である。そのほかに、任意の他の真核生物源に由来するユビキチンを使用することが可能である。たとえば、酵母のユビキチンは、野生型ヒトユビキチンと３個のアミノ酸のみ異なる。一般的には、「ユビキチンタンパク質」という前記用語に包含される非修飾単量体型ユビキチンタンパク質は、配列番号１に対して７０％超、好ましくは７５％超もしくは８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超のアミノ酸同一性、または９７％までの配列同一性を示す。
【００２６】
配列番号１と同一でないただし類似したユビキチンタンパク質に修飾が導入される実施形態を包含するように、「に対応する」という用語を使用してきた。前記同一でないただし類似したユビキチンでは、本明細書に明記されたアミノ酸の位置は、配列番号１と異なる可能性があるが、配列番号１を基準にした位置により表される位置に割り付けることが可能である。「同一でないただし類似した」とは、たとえば、非ヒト起源であるまたは配列番号１から誘導される、したがってアミノ酸配列が配列番号１と異なるユビキチンを記述する。
【００２７】
ユビキチンのポリペプチド鎖は、単量体に対応する７６個のアミノ酸で構成されて（配列番号１）、驚くほど緻密なα／β構造でフォールディングされ（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ，１９８７）、ポリペプチド鎖のほぼ８７％は、水素結合により二次構造エレメントの形成に関与する。二次構造は、３回転半のαヘリックスさらには４つのストランドで構成された逆平行βシートである。これらのエレメントの特徴的配置は、一般的には、いわゆるユビキチン様フォールディングモチーフとみなされる。さらなる構造上の特徴は、αヘリックスとβシートとの間のタンパク質内部の顕著な疎水性領域である。
【００２８】
逆平行βシートの形成に寄与する４つのβストランドのアミノ酸は、本発明によればおよび構造１ＵＢＱによれば、配列番号１の以下のアミノ酸位置、すなわち、第１のストランド（アミノ末端）：２〜７、第２のβシートストランド：１２〜１６、第３のストランド：４１〜４５、第４のストランド（カルボキシ末端）：６５〜７１に存在する。ストランドの位置は、シートを上側から見た場合（下側にアミノ末端、上側にカルボキシ末端）、左から右に、第２、第１、第４、第３のストランドであり、第１および第４のストランドの間のポリペプチド鎖は、αヘリックスを形成する。
【００２９】
「修飾ユビキチンタンパク質」という用語は、アミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失のいずれか１つまたはそれらの組合せのユビキチンタンパク質修飾を意味するが、置換が最も好ましい修飾であり、以上に記載の修飾のいずれか１つがこれに追加されていてもよい。前記修飾単量体ユビキチンユニットのそれぞれは、配列番号１に対して７５％、少なくとも８３％、少なくとも８５％％、少なくとも８７％、および少なくとも９０％の群の少なくとも１つのアミノ酸同一性を有するので、修飾の数は、厳しく制限される。したがって、多くとも、非天然標的への新規な結合性に関連する単量体ユニット中の置換の全数は、置換および欠失のみを考慮に入れて８０％のアミノ酸同一性に対応する１６個のアミノ酸に制限される。挿入を全アミノ酸同一性の計算に組み込んだ場合、配列番号１に対する前記同一性は、７５％〜８０％になりうる。二量体型ユビキチン分子中の置換アミノ酸または欠失アミノ酸の全数は、３２個までのアミノ酸でありうる。これは、非修飾二量体型ユビキチンタンパク質を基準にして約２０％のアミノ酸が置換されたことに対応する。配列番号１で示される基準単量体配列を有する二量体型非修飾ユビキチンタンパク質と比較した二量体型修飾ユビキチンタンパク質のアミノ酸同一性は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、および少なくとも９０％の群の少なくとも１つから選択される。
【００３０】
「ループ」または「ループ領域」という用語は、ユビキチンのαヘリックスやβストランドなどの規則的二次構造エレメントを結合する非繰返しコンフォメーションの領域を意味する。ヒトユビキチンの構造は、二次構造エレメントを結合する７つのリバースターン（ループ）：７〜１１、１８〜２１、３７〜４０、４５〜４８、５１〜５４、５７〜６０、６２〜６５を呈する（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；１９４（３）：５３１−４４）。
【００３１】
「挿入」という用語は、タンパク質の元のアミノ酸配列へのアミノ酸の追加を包含する。本発明では、ユビキチンが有意な構造変化を伴うことなく安定性を維持するユビキチン単量体への追加のアミノ酸を記載する。
【００３２】
二量体型ユビキチン中の挿入位置
前記単量体ユビキチンユニット（ユビキチン単量体）は、一方または両方のユビキチン単量体、好ましくは一方の単量体中に挿入を含有する。２つのユビキチン単量体は、それぞれ同一または異なる挿入を含有することも可能である。またさらなる実施形態では、一方または両方のユビキチン単量体中に２、３、または４つの挿入が組み込まれる。
【００３３】
挿入のサイズ
本発明は、好ましく、非天然標的への結合を規定するユビキチン単量体の結合領域中に２〜１５個のアミノ酸の挿入を包含する。特定的には、挿入されるアミノ酸の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個である。本発明の一実施形態は、第１のユビキチン単量体の８個のアミノ酸の挿入断片を示す（たとえば、配列番号１２を参照されたい）。しかしながら、すべての挿入のアミノ酸の全数は、修飾ユビキチンの構造完全性および非天然標的タンパク質へのその結合能を維持することにより制限される。挿入は、一方もしくは両方の単量体型ユビキチンタンパク質中に６〜１０個のアミノ酸もしくは７〜９個のアミノ酸もしくは８個のアミノ酸または２〜１５個のアミノ酸の範囲に含まれる任意の他の数（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）のアミノ酸の挿入を含みうる。単量体型ユビキチンでは、多くとも１５個のアミノ酸、好ましくは６〜１０個のアミノ酸、最も好ましい８個のアミノ酸の挿入が許容されうる。配列番号１の残基６１〜６５の領域のアミノ酸位置６１〜６２もしくは位置６２〜６３もしくは位置６３〜６４もしくは位置６４〜６５に対応するアミノ酸間に、最も好ましくは配列番号１の位置６１〜６２に対応するアミノ酸間に、または前記置換アミノ酸にごく近接して（１〜３アミノ酸）、またはβシートから０、１、２、３、４、もしくは５アミノ酸離れて、８個のアミノ酸を挿入することが最も好ましい。６〜１０個（６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸、好ましくは８個のアミノ酸の挿入は、天然ループ領域を伸長することにより、標的に対する結合部位を伸長するので、標的と修飾ユビキチンとの間の結合相互作用に有利である（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標））。
【００３４】
単量体型ユビキチン中の挿入位置
アミノ酸の挿入は、βシートストランドにごく近接して、任意選択でβシートストランドから、好ましくは第４（Ｃ末端）または第１（Ｎ末端）のβストランドから０、１、２、３、４、または５アミノ酸離れて存在することがさらに好ましく、任意選択で、前記挿入は、Ｎ末端（第１）のユビキチン単量体中に位置する。挿入は、一般的には、βシート中に位置するのでなく、βシートに近接して、任意選択でβシートから０、１、２、３、４、または５アミノ酸離れて位置することにより、βシート中の置換アミノ酸の近くに伸長構造を形成する。挿入は、第４（Ｃ末端）または第１（Ｎ末端）のβストランドから０、１、２、３、４、または５アミノ酸離れていることが好ましい。
【００３５】
挿入は、前記アミノ酸置換のＮ末端方向またはＣ末端方向に１〜３アミノ酸以内であるかまたはそれにごく近接していることが好ましい。アミノ酸の好ましい挿入は、前記修飾単量体型ユビキチンの１つのループ領域中に存在する。ユビキチン中のループ領域とは、以下にさらに規定されるように、配列番号１の残基７〜１１、１８〜２１、３７〜４０、４５〜４８、５１〜５４、５７〜６０、６２〜６５を意味する。本発明の好ましい一実施形態では、追加のアミノ酸の挿入は、Ｃ末端βシートに近接するループ領域の前（位置６１および６２の間）またはループ領域内（アミノ酸６２〜６４）に存在することにより、既存のループ領域を伸長してより大きい結合部位を形成する。ユビキチンタンパク質の天然表面露出ループ中へのアミノ酸の追加は、βシートなどの安定な構造エレメントを結合する領域中が有利である。一実施形態では、挿入は、配列番号１の残基６１〜６５のループ領域内のアミノ酸６１〜６２または６２〜６３または６３〜６４または６４〜６５に対応するアミノ酸残基間、最も好ましくは配列番号１の位置６１および６２に対応するアミノ酸間に位置する。アミノ酸の挿入は、第４のβストランド中のアミノ酸置換のＣ末端、言い換えれば、アミノ酸の挿入は、アミノ酸６２〜６５のループ領域の近くまたはループ領域内であることが最も好ましい。ＣＤスペクトルから結論付け可能なように、挿入配列は、グローバル構造に影響しないが、挿入部位は、影響する。したがって、アミノ酸の挿入は、配列番号１のヒトユビキチンの６１〜６２または６２〜６３または６３〜６４または６４〜６５に対応するアミノ酸間が好ましく、最も好ましいのは、配列番号１の位置６１および６２に対応するアミノ酸間である。第４のβストランドの近接領域中へのそのような挿入は、天然ループ領域を有意に伸長することにより、非天然標的に対する伸長結合部位を形成する。結合部位は、好ましくは修飾アミノ酸のＣ末端領域に近接するループ領域中へのアミノ酸の挿入と共に、Ｎ末端領域２〜８およびＣ末端領域６２〜６８中のアミノ酸内の置換により形成される。置換および挿入は、アミノ酸領域２〜８および６１〜６８中が好ましい。最も好ましいのは、配列番号１の領域２〜８中の置換、および置換と、ユビキチンの少なくとも一方の単量体の配列番号１のアミノ酸領域６１〜６８中への２〜１５個のアミノ酸の挿入と、の組合せである。
【００３６】
アミノ酸挿入の利点
好ましくは、１つの単量体ユビキチンユニット中に１つの挿入のみが存在する。最も好ましいのは、二量体のＮ末端（第１）の単量体ユビキチンユニット中の挿入である。前記挿入は、非天然標的タンパク質たとえばＶＥＧＦ−Ａおよびそのアイソフォームへの修飾ユビキチンの新たに生成された結合に関与しうる。挿入のさらなる好影響は、置換されうるひいては標的への結合に関与しうるアミノ酸の数の増加である。挿入断片は、任意選択で、伸長構造たとえばループ構造を形成しうる。追加のアミノ酸を加えることによるユビキチン構造の伸長は、タンパク質の全コンフォメーションおよび安定性に有意な影響を及ぼさない。置換および挿入を有する修飾ヘテロ二量体型ユビキチン足場は、溶解状態を維持する。
【００３７】
本発明は、非天然標的に対する伸長された相互作用界面を有する工学操作された新規な高親和性結合代替足場を提供する。置換アミノ酸にごく近接して伸長または延長された構造たとえばループ構造の形成は、いくつかの利点を有する。第１に、標的結合部位は、タンパク質の全体構造を破壊することなく追加のアミノ酸により伸長される。追加のアミノ酸がタンパク質に加えられるが、ユビキチン足場の全体構造および機能は、保存される。この結果、高い親和性および特異性を有して非天然標的への結合がもたらされる。第２に、伸長構造を形成することにより、コンフォメーションは、特定の標的またはエピトープに到達できるように変化されうる。構造可撓性は、結合部位が固定されないので置換アミノ酸と挿入との組合せにより形成されたそのような結合部位への標的の結合がより強くなるという好影響を有する。結合は、標的のコンフォメーションの変化により妨害されることはないであろう。したがって、Ｃ末端のβシートの近くの挿入部位は、標的への結合に関して挿入断片自体の配列よりも重要である。挿入部位が標的結合の決定要因となっている。
【００３８】
「置換」という用語はまた、たとえば、元のアミノ酸への化学基または残基の置換または追加によるアミノ酸の化学修飾も包含する。表面露出アミノ酸の置換は、とくに重要である。本発明のさらなる実施形態では、領域２〜８および６２〜６８に位置する少なくとも５、６、７、または８個のアミノ酸、特定的には位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８から選択されるアミノ酸は、置換により修飾され、さらに１〜７個の追加のアミノ酸が置換により修飾され、この置換は、任意選択で、位置３６、４４、７０、７１、７２、および７３のアミノ酸の１つ以上から選択される。本発明では、各単量体ユニット（単量体）中で、すなわち第１および第２の単量体中で、これらの各変異の組合せが可能であることを理解すべきである。たとえば、第１の単量体は、５つの修飾を含みうるが、第２のユニットは、６または７つの修飾を含み、第１の単量体は、７つの修飾、かつ第２のユニットは、５つ修飾を含みうるなどである。以上に列挙された各アミノ酸は、後で組み合わせられる第１および／または第２の単量体中で選択可能である。好ましい置換および挿入は、本明細書で以下に記載される。
【００３９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列に対するユビキチン誘導体の配列同一性の程度を決定するために、たとえば、ＳＩＭ局所類似性プログラム（Ｘｉａｏｑｕｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７，１９９１）またはＣｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用することが可能である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）。本明細書に規定される配列番号１に対する修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１で示される完全配列と対比して決定される。本発明との関連では、修飾配列とその誘導に用いられる配列（「親配列」とも称される）との間の配列同一性の程度は、とくに明記されていなければ、一般的には非修飾配列の全長に対して計算される。
【００４０】
二量体型ユビキチンタンパク質の潜在的結合パートナー
本明細書では、「標的」、「リガンド」、および「結合パートナー」という用語は、同義的に用いられ、交換可能である。本発明を実施する場合、好ましい標的、リガンド、および結合パートナーは、タンパク質、より特定的にはタンパク質上に存在する抗原エピトープである。本発明で標的、リガンド、および結合パートナーとみなされるのは、本明細書に規定される親和性を有してヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質に結合可能な任意のタンパク質である。本発明に係る標的またはリガンドまたは結合パートナーは、ヒトユビキチンに対するまたはユビキチン二量体に対する非天然標的である。このことは、結合性がｄｅ  ｎｏｖｏで生成されてヘテロ二量体型修飾ユビキチン結合タンパク質の形成前には存在しなかったことを意味する。言い換えれば、本発明に係る標的は、非修飾野生型ユビキチンに結合することはできない。
【００４１】
少なくとも一方の単量体中に２〜１５個のアミノ酸の挿入を有する二量体型修飾ユビキチンタンパク質の例示的な非天然リガンドは、たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦ−α、ＭＩＡ−２、ＮＧＦ、またＩｇＧでありうるが、これらに限定されるものではない。本発明は、これらの特定のリガンドに限定されるものではなく、当技術分野で公知のリガンドおよび標的分子のすべてまたは少なくともほとんどで実施可能である。それらの標的は、当業者であれば、当技術分野の一般知識の範囲内で選択可能である。以下では、リガンドおよび標的の一般的定義を提供するとともに、さらなる潜在的結合パートナーの選択例を提供する。
【００４２】
本発明に係る「結合可能なタンパク質」または「結合タンパク質」という用語は、標的タンパク質に対する結合ドメインを含むヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を意味する。ユビキチンに基づくそのような結合タンパク質はいずれも、結合ドメインでない追加のタンパク質ドメイン、たとえば、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、および／または非タンパク質ポリマー分子などを含みうる。非タンパク質ポリマー分子のいくつかの例は、ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。前記標的タンパク質への結合は、ｄｅ  ｎｏｖｏで生成される。修飾（置換および挿入）を含まないユビキチン単量体は両方とも、結合パートナーに結合できない。修飾後にはじめて、天然ユビキチン単量体にはこれまで存在しなかった新しい結合性が生成された。修飾を有する人工二量体型ユビキチン構造のみが、そのような非天然標的に結合する。
【００４３】
抗体およびそのフラグメントは、当業者に周知であるが、本発明に係る結合タンパク質は、抗体でもなく、ＦａｂフラグメントやｓｃＦｖフラグメントなどのそのフラグメントでもない。さらに、本発明に係る結合ドメインは、抗体中に存在する免疫グロブリンフォールドを含まない。本発明に係る結合タンパク質は、代替足場、特定的には修飾ユビキチン系二量体型タンパク質に基づく足場のみを含む。
【００４４】
「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語または「ＶＥＧＦ」と略称される用語は、配列番号１３（受託番号Ｐ１５６９２）に対して少なくとも７０％、任意選択で７５％、さらに任意選択で８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％またはそれ以上または１００％の配列同一性を示すかつＶＥＧＦの以上に規定された機能を有するすべてのタンパク質を包含する。「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語または「ＶＥＧＦ」と略称される用語はまた、ＶＥＧＦ−Ａのアイソフォームをも包含し、ＶＥＧＦ−Ａの周知のアイソフォームは、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５である。
【００４５】
ユビキチン二量体
「二量体」は、本発明では、２つの単量体型ユビキチンタンパク質（ユビキチン単量体）を含むタンパク質とみなされる。二量体が２つの異なって修飾された単量体を含む場合、それは、「ヘテロメリック二量体」または「ヘテロ二量体」と呼ばれる。本発明に係る「ヘテロ二量体型融合タンパク質」または「ヘテロ二量体型タンパク質」は、特異的結合パートナーとしての非天然標的に対する特異的結合性を一緒になって提供する結合領域を有する少なくとも２つの異なって修飾された単量体型ユビキチンタンパク質を含むタンパク質とみなされる。ヘテロ二量体は、２つの単量体型ユビキチン分子を融合することにより達成され、これらの分子は両方とも、本明細書に記載されるように異なって修飾される。本発明に係る「ホモ二量体型融合タンパク質」または「ホモ二量体型タンパク質」は、結合領域を有する２つの等しく修飾された単量体型ユビキチンタンパク質を含むタンパク質とみなされる。ホモ二量体は、２つの単量体型ユビキチン分子を融合することにより達成され、これらの分子は両方とも、本明細書に記載されるように等しく修飾される。好ましいのは、二量体型もしくは四量体型のタンパク質またはその多量体である。好ましい結合領域は、ユビキチン単量体のアミノ酸領域２〜８および６２〜６８中の置換および挿入により形成される。最も好ましいのは、配列番号１の領域２〜８中の置換、および置換と、ユビキチンの少なくとも一方の単量体の配列番号１のアミノ酸領域６１〜６８中への２〜１５個のアミノ酸の挿入と、の組合せである。
【００４６】
結合活性を有するヘテロ二量体型またはホモ二量体型の結合タンパク質を生成すべく異なってまたは等しく修飾されたユビキチン単量体の二量化の利点は、修飾可能なアミノ酸残基の全数の増加、またはタンパク質標的に対する新しい高親和結合性を生成する結合領域の二量化にある。主な利点は、さらに多くのアミノ酸が修飾されるにもかかわらず、タンパク質の化学的完全性が、非天然タンパク質標的に対する前記新たに生成された結合タンパク質のユビキチン足場の全体的安定性を低減することなく維持されることである。非天然標的に対する新規な結合部位を形成すべく修飾可能な残基の全数は、２つの単量体型修飾ユビキチンタンパク質に修飾残基を割付け可能であるので増大される。修飾の数は、修飾単量体型ユビキチン分子の数に対応するユビキチンの異なる単量体分子に多重化および分配される配列番号１の両方でありうる。ユビキチン系結合タンパク質のモジュール構造は、前記修飾アミノ酸が前記２つの単量体型ユビキチン分子上に組み込まれるので修飾アミノ酸の全数の増加を可能にする。
【００４７】
したがって、結合パートナーに対する結合部位を有する本発明に係るタンパク質の使用は、修飾残基の全量が二量体を形成する２つの単量体ユニット（単量体）全体にわたり分配されるので、最終結合分子のタンパク質の化学的完全性に過度に影響を及ぼさない増大された数の修飾残基の導入の可能性を広げる。所定の標的に結合する前記二量体型修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質のライブラリー中に存在する。本発明の一実施形態では、単量体型タンパク質は、互いに融合される。二量体化分子は、さらなる多量体化に使用可能である。二量体化ユビキチン分子に関して提供された解説は、必要な変更を加えれば、より高度の多量体化分子にもあてはまる。したがって、ＶＥＧＦ−Ａに結合するホモ二量体またはヘテロ二量体は、さらなる多量体化に使用可能である。したがって、二量体型タンパク質は、同一の二量体型タンパク質を用いてまたは異なる二量体型タンパク質を用いてさらに多量体化可能である。異なる二量体型タンパク質は、第１の二量体型タンパク質以外の他の特異性を有しうる。好ましいのは、二量体型もしくは四量体型のタンパク質またはその多量体である。その例は、Ａ−Ａ（ホモ二量体）、Ａ−Ｂ（ヘテロ二量体）、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ａ、Ａ−Ａ−Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｄである。構築物Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤおよびＡ−Ａ−Ｃ−Ｄは、２つの異なる標的に対する特異性を有する二重特異性結合タンパク質でありうる。
【００４８】
本発明によれば、１つのタンパク質リガンドに結合する２つの修飾ユビキチン単量体は、たとえば、遺伝学的方法を用いて、頭−尾融合により互いに結合されうる。「頭−尾融合」とは、本発明では、Ｎ末端からＣ末端の方向に連結することにより２つのタンパク質を融合一体化させることと理解されるものとする。この頭−尾融合では、ユビキチン単量体は、なんらリンカーを用いることなく直接結合されうる。他の選択肢として、ユビキチン単量体の融合は、リンカーたとえばポリペプチドリンカーを介して実施可能である。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、「リンカー」という用語は、共有結合または非共有結合のいずれかにより、たとえば、水素結合、イオン結合、またはファンデルワールス相互作用により、少なくとも２つの他の分子を連結する分子、たとえば、一方の相補的配列に５’末端でかつ他方の相補的配列に３’末端でハイブリダイズすることにより２つの非相補的配列を連結する核酸分子を意味する。「リンカー」は、本出願との関連では、第１のポリペプチドを少なくともさらなるポリペプチドに結合する部分と理解されるものとする。第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと同一であっても異なっていてもよい。
【００５０】
この場合には、ペプチドリンカーが好ましい。このことは、ペプチドリンカーが、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに結合するアミノ酸配列であることを意味する。本発明では、ペプチドリンカーは、２つのユビキチン単量体を結合可能なアミノ酸配列である。典型的には、ペプチドリンカーは、１〜２０アミノ酸長、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長を有する。ペプチドリンカーのアミノ配列は、ヒトに対して免疫原性でないことが好ましい。そのようなリンカーの例は、さまざまな長さのグリシンセリンリンカー、たとえば、少なくともアミノ酸配列ＧＩＧ（配列番号１４）を有するものまたは少なくともアミノ酸配列ＳＧＧＧＧを有するもの、たとえば、ＧＩＧ（配列番号１４）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号１６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号１７）、またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１８）、または（ＳＧＧＧ）ｎ（ここで、ｎは、任意の数１〜４である）である。リンカーは、２〜１６アミノ酸長を有しうる。２つのユビキチン単量体の遺伝子的融合のための他のリンカーもまた、当技術分野で公知であり、使用可能である。
【００５１】
本発明の一実施形態では、２つの単量体型タンパク質は、最も強力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後、結合一体化されないが、ただし、すでに、スクリーニングプロセスは、二量体型ユビキチンの存在下で行われている。最も強力な結合ユビキチン分子に関する配列情報を得た後、この分子は、任意の他の方法により、たとえば、化学合成により、または遺伝子工学的方法により、たとえば、２つのすでに同定された単量体ユビキチンユニット（ユビキチン単量体）を連結一体化させることにより、取得可能である。前述のことは、非天然リガンドタンパク質に対するより効率的な結合を提供する修飾ユビキチンタンパク質のホモマーにもあてはまる。
【００５２】
特異的修飾による所定の標的への高い特異性および親和性の結合
したがって、本発明の目的は、所定のタンパク質標的に特異的にかつ高い親和性を有して結合可能なユビキチンに基づく新規な二量体型タンパク質を提供することである。−天然条件下で−ユビキチンには結合しないが新規な修飾二量体型ユビキチン系タンパク質には高親和性を有して結合可能な標的（「非天然標的」）が選択される。一実施形態では、非天然標的は、ＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームである。しかしながら、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームに限定されない。置換と挿入との組合せにより二量体型ユビキチンの結合がｄｅ  ｎｏｖｏで生成されるかぎり、任意の他の標的を使用可能であることは、重要である。少なくとも一方の単量体中に置換と挿入との組合せを有する二量体型ユビキチンタンパク質は、標的またはリガンド（その発現は、本明細書では同義的に用いられる）に対する新規な結合親和性を有する工学操作された人工のタンパク質である。
【００５３】
本発明の一実施形態では、少なくとも一方の単量体中の挿入と置換とを有する修飾された新規な結合タンパク質は、非天然リガンドタンパク質としてのＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａおよびアイソフォームに結合する。ヒトでは、ＶＥＧＦ−Ａの複数のスプライシングアイソフォームが同定されている。最も一般的なアイソフォームは、１２１、１６５、および１８９個のアミノ酸で構成され、ネズミ相同体は、アイソフォーム１つあたり１個のアミノ酸を欠失する。ＶＥＧＦ１６５をはじめとするＶＥＧＦ−Ａのより長いスプライスアイソフォームは、高塩基性ヘパリン結合ドメインを含有する。しかしながら、挿入と置換とを有する修飾ユビキチン結合タンパク質は、任意の他の非天然標的に結合可能である。
【００５４】
所与の標的たとえばＶＥＧＦ−Ａに特異的な新規な結合ドメインを形成するための、すなわち、標的たとえばＶＥＧＦ−Ａに対する新規な結合性を生成するように修飾するためのアミノ酸置換は、本発明に従って任意の所望のアミノ酸を用いて実施可能である。アミノ酸が置換されるアミノ酸に類似した特定の化学性または側鎖をそれぞれ有するように注意することが絶対に必要というわけではないので、ＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性が増強されるかぎり、かつユビキチン結合分子の構造完全性が損なわれないかぎり、一般的には所望の任意のアミノ酸をこの目的に使用可能である。
【００５５】
さらなる実施形態では、本明細書に特定的に規定されたアミノ酸置換は、類似の化学的性質を有する他のアミノ酸により、たとえば、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ：脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸
Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ：非荷電ただし極性の側鎖を有するアミノ酸
Ａｓｐ、Ｇｌｕ：酸性側鎖を有するアミノ酸
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ：塩基性側鎖を有するアミノ酸
Ｇｌｙ：中性側鎖
により変更される（いわゆる「保存的置換」）。
【００５６】
所定のアミノ酸の修飾ステップは、本発明に従って、好ましくは、ランダム突然変異誘発（すなわち、所定のアミノ酸のランダム置換）による遺伝子レベルの突然変異誘発により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、それぞれのタンパク質に属するＤＮＡを変化させる遺伝子工学の方法を利用して行われる。次いで、好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現が原核生物または真核生物において行われる。
【００５７】
好ましい実施形態では、アミノ酸残基は、少なくとも一方の単量体中でアミノ酸置換と挿入との組合せにより改変される。挿入されうるアミノ酸の数は、二量体型ユビキチンタンパク質に対してユビキチン単量体で２〜１５個のアミノ酸、したがって、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸に制限される。一実施形態では、アミノ酸挿入は、二量体型ユビキチン系結合タンパク質の１つの単量体サブユニット中で、好ましくはＮ末端（第１）の単量体サブユニット中で行われる。好ましい挿入位置は、異なってもしくは等しく修飾され、かつ／または６〜１０個のアミノ酸もしくは７〜９個のアミノ酸もしくは８個のアミノ酸が、一方もしくは両方の単量体型ユビキチン単量体に挿入される。一実施形態では、アミノ酸の挿入は、前記修飾単量体型ユビキチンのループ領域内、または請求項１に明記されたアミノ酸置換内もしくはそれにごく近接して、任意選択で、請求項１に明記された置換位置のＮ末端方向もしくはＣ末端方向に０、１、２、もしくは３アミノ酸の位置に存在する。他の実施形態では、アミノ酸の挿入は、βシートストランド、好ましくは第４（Ｃ末端）または第１（Ｎ末端）のストランドにごく近接して、任意選択でそれから０、１、２、３、４、または５アミノ酸離れて存在する。好ましいのは、Ｎ末端（第１）の単量体中への挿入である。任意選択のアミノ酸挿入位置は、たとえば、置換アミノ酸位置にごく近接するヒトユビキチン位置６１〜６２または６２〜６３または６３〜６４または６４〜６５に対応する位置である。特定的には、次のアミノ酸挿入位置、すなわち、９〜１０（アミノ酸２〜７に対応する第１のβストランド）、３５〜３６（アミノ酸４１〜４５に対応する第３のβストランド）、最も好ましくは第４のβストランド（アミノ酸６５〜７１に対応する第４のβストランド）にごく近接する位置６５の前が、ヒトユビキチン位置に対応させて選択される。
【００５８】
たとえば、非ヒトユビキチンを出発タンパク質として使用するのであれば（たとえば、酵母のユビキチン）、対応するタンパク質およびアミノ酸位置を互いに割り当てるために、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）に与えられたアミノ酸位置を修飾ユビキチンにアライメントしなければならない。各単量体ユビキチンサブユニットの番号付け（およびアライメント）は、同一方法で行われる。すなわち、たとえば、二量体のアライメントは、個々の各サブユニットに対してアミノ酸位置１から開始される。
【００５９】
ヘテロ二量体用のビルディングユニットとして使用される本発明に係る単量体型ユビキチンの修飾は、修飾が置換および挿入の両者の組合せを含む場合、合計でアミノ酸の約２５％までを占める。ヘテロ二量体用のビルディングユニットとして使用される本発明に係る単量体型ユビキチンの修飾は、修飾が置換のみを含む場合、合計でアミノ酸の約１５％、好ましくは１０％までを占める。これを考慮すれば、修飾が置換および挿入を含む場合、配列番号１に対して少なくとも７５％の修飾単量体型ユビキチンタンパク質の配列同一性が存在する。これを考慮すれば、修飾が置換のみを含む場合、配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％の修飾単量体型ユビキチンタンパク質の配列同一性が存在する。本発明のさらなる実施形態では、アミノ酸レベルの配列同一性は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、さらには少なくとも９０％または少なくとも９３％の配列同一性である。標的への新しい結合の形成に関与する置換のみを考慮するのであれば（生化学的性質に関連する置換ではなく、たとえば、位置４５、７５、および７６の変化である）、アミノ酸レベルの配列同一性は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８８％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％である。標的への新しい結合の形成に関与する置換および挿入を考慮するのであれば（生化学的性質に関連する置換ではなく、たとえば、位置４５、７５、および７６の変化である）、アミノ酸レベルの配列同一性は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％である。したがって、たとえば、一実施形態では、７個のアミノ酸が置換されてかつ８個のアミノ酸が挿入されて、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性に相当する新しい結合性を形成する。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態では、２つの各ユビキチン単量体は、配列番号１の領域２〜８および６２〜６８から選択される、好ましくは位置６、８、６２、６３、６４、６５、および６６から選択される５または６または７個のアミノ酸が置換され、かつ追加的に、第１（Ｎ末端）の単量体の領域６１〜６５に、好ましくは位置６１〜６２または６２〜６３または６３〜６４または６４〜６５に、したがって、前記置換アミノ酸にごく近接する範囲内に、２〜１５個のアミノ酸が挿入される。最も好ましいのは、配列番号１の領域２〜８中の置換、および置換と、ユビキチンの少なくとも一方の単量体の配列番号１のアミノ酸領域６１〜６８中への２〜１５個のアミノ酸の挿入と、の組合せである。他の実施形態では、これらの位置で修飾されるユビキチン単量体は、すでに前修飾されたものであり、これは、標的の結合に影響しない。たとえば、より良好な安定性またはタンパク質の化学性を生成するために、さらなる修飾は、アミノ酸７５および７６にまたはアミノ酸４５に置換を含みうる。配列番号１で示される単量体型ユビキチンの少なくとも５個のアミノ酸ただし合計で９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、最大１６個までのアミノ酸、最も好ましくは５〜９個のアミノ酸が置換された修飾ユビキチン単量体を取得可能である。追加の２〜１５個のアミノ酸が配列に挿入される。一実施形態によれば、標的への新規な結合に関与する８つの置換と８個のアミノ酸の挿入とを有する修飾単量体型ユビキチンを取得可能である（たとえば、結合に影響しないさらなる３個のアミノ酸を修飾可能である）。ユビキチンのアミノ酸の全数を基準にして、これは、約２６％の全修飾パーセントに対応する（結合に関与する修飾：約２２％）。通常かなり低いパーセントであってもタンパク質のフォールディングを乱すのにすでに十分であるので、これは、きわめて驚くべき予想しえないことであった。
【００６１】
表面露出アミノ酸の突然変異誘発のために、入手可能なＸ線結晶構造に基づいて、これらを同定することが可能である。結晶構造を入手できないのであれば、コンピューター解析を利用した試行により、入手可能な一次構造に対して表面露出アミノ酸および個々のアミノ酸位置の到達性を予測したり、または３Ｄタンパク質構造をモデリングして、これにより潜在的表面露出アミノ酸に関する情報を取得したりすることが可能である。そのさらなる開示は、たとえば、Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４（３）：５３１−４４から得ることが可能である。
【００６２】
突然変異される、好ましくは置換される表面露出アミノ酸位置は、ランダム突然変異誘発に付され、その後、以前にその取出しに用いたタンパク質をコードするＤＮＡに再組込みされる。この後、所望の結合性を有する突然変異体の選択過程が行われる。「表面露出アミノ酸」とは、周囲溶媒に到達可能なアミノ酸のことである。タンパク質中のアミノ酸の到達性がモデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ中のアミノ酸の到達性と比較して８％超である場合、アミノ酸は「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域または個々のアミノ酸位置は、それぞれ、本発明に従って選択が行われる潜在的結合パートナーに対する好ましい結合部位である。それに加えて、Ｃａｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，７０９−７１３およびＳｈｒａｋｅ  ＆  Ｒｕｐｌｅｙ，１９７３  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９（２）：３５１−３７１（完全開示のために参照により本出願に組み込まれる）を参照されたい。
【００６３】
本発明の他の実施形態では、これらの所定の領域内で突然変異されるアミノ酸位置が同定される。次いで、このようにして選択されたアミノ酸位置は、部位指向突然変異誘発によりＤＮＡレベルで突然変異させることが可能であり、すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが、あらかじめ選択された特定の他のアミノ酸をコードするコドンにより置換され、または置換は、ランダム突然変異誘発の枠内で行われ、この場合、置換されるアミノ酸位置は、規定されるが、そのコドンは、まだ確認されていない新規なアミノ酸をコードする。
【００６４】
親タンパク質からそれぞれｄｅ  ｎｏｖｏで生成される人工結合部位の領域内のアミノ酸置換または／およびアミノ酸挿入が異なるユビキチンタンパク質の変異は、それぞれの配列セグメントの標的突然変異誘発により形成可能である。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性などの特定の性質を有するアミノ酸を、それぞれ、個別の他の性質を有するアミノ酸により交換または置換することが可能である。置換以外に、「突然変異誘発」および「修飾」および「交換」という用語はまた、挿入も包含する。タンパク質レベルでは、修飾はまた、当業者に公知の方法に従ってアミノ酸側鎖の化学変換により行うことが可能である。
【００６５】
ユビキチンの突然変異誘発方法
それぞれの配列セグメントの突然変異誘発の出発点として、たとえば、当業者に公知の方法により調製、改変、および増幅が可能なユビキチンのｃＤＮＡを使用することが可能である。一次配列の比較的小さい領域内のユビキチンの部位特異的改変では（約１〜３アミノ酸）、市販の試薬および方法が利用可能である（“Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ”，Ａｇｉｌｅｎｔ；“Ｍｕｔａｇｅｎｅ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ”，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。より大きい領域の部位指向突然変異誘発では、たとえば、当業者であればポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特定の実施形態を利用可能である。この目的では、たとえば、突然変異を導入するために、所望の位置に変性塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合物を使用することが可能である。これはまた、ゲノムＤＮＡ中に天然に存在しない塩基対アナログたとえばイノシンを用いることによっても達成可能である。ユビキチンの突然変異誘発の出発点は、たとえば、ユビキチンのｃＤＮＡさらにはゲノムＤＮＡでありうる。さらに、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子はまた、合成的に調製することも可能である。
【００６６】
とくに、部位特異的突然変異誘発方法、ランダム突然変異誘発方法、ＰＣＲを用いた突然変異誘発方法、または類似の方法を含めて、それ自体公知のさまざまな方法を突然変異誘発に利用可能である。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、突然変異されるアミノ酸位置は、あらかじめ決定される。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾すべきアミノ酸に関する本請求項１に記載の限定要件を満たすように行われる。いずれの場合も、それ自体公知の方法を用いてスクリーニングされるさまざまな突然変異体のライブラリーは、一般には確立されている。一般的には、修飾されるユビキチンタンパク質に関して十分な構造情報を入手可能であるので、修飾されるアミノ酸の事前選択は、とりわけ容易に行うことが可能である。
【００６８】
標的突然変異誘発方法さらにはより長い配列セグメントの突然変異誘発方法、たとえば、ＰＣＲを利用した方法、化学的突然変異誘発による方法、または細菌ミューテーター株を用いた方法はまた、先行技術に属し、本発明に従って使用可能である。
【００６９】
本発明の一実施形態では、突然変異誘発は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドのアセンブリーにより行われる。しかしながら、他のコドン（トリプレット）を使用することも可能であることを理解すべきである。突然変異は、βシート構造が好ましくは維持されるように行われる。一般的には、突然変異誘発は、タンパク質の表面上に露出した安定なβシート領域の外側で行われる。それは、部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発の両方を含む。一次構造中の比較的小さい領域を含む部位特異的突然変異誘発は（約３〜５個のアミノ酸）、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標）ファージミドｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キット）の市販のキットを用いて引き起こすことが可能である（米国特許第５，７８９，１６６号明細書、米国特許第４，８７３，１９２号明細書を参照されたい）。
【００７０】
より伸長された領域を部位特異的突然変異誘発に付す場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、この場合、突然変異される領域は、突然変異位置および不変位置を含有するオリゴヌクレオチドのアセンブリーにより得られる（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，７７２−７７７、ＭｃＣｏｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｅｓｓ，１９９５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０，４６０−４７０）。ランダム突然変異誘発は、ミューテーター株中でのＤＮＡの増殖によりまたはＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入可能である（たとえば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｇｅｎｅ  １２８，１３５  １４０）。この目的では、増大された誤り率を有するポリメラーゼが使用される。導入される突然変異誘発の程度を増強するためにまたはさまざまな突然変異を組み合わせるために、それぞれ、ＤＮＡシャフリングを利用してＰＣＲ断片の突然変異を組み合わせることが可能である（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−３９１）。酵素に対するこれらの突然変異誘発戦略のレビューは、Ｋｕｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ  （１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ  １５，５２３−５３０のレビューに提供されている。また、このランダム突然変異誘発を所定のＤＮＡ領域で行うために、突然変異誘発に使用されるＤＮＡカセットを構築しなければならない。
【００７１】
ランダム修飾は、当技術分野で十分に確立された周知の方法により行われる。「ランダム修飾されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列」とは、いくつかの位置で性質を予測できないヌクレオチドまたはアミノ酸による挿入、欠失、または置換に付されたいヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のことである。多くの場合、複数のまたは１つの挿入されたランダムヌクレオチド（アミノ酸）配列は、「完全にランダム」であろう（たとえば、ランダム合成またはランダムＰＣＲ媒介突然変異誘発の結果として）。しかしながら、ランダム配列はまた、一般的機能特性（たとえば、発現産物のリガンドとの反応性）を有する配列を含みうるし、またはランダム配列は、たとえばさまざまなアミノ酸が一様分布されて最終発現産物が完全にランダムな配列であるという意味でランダムでありうる。
【００７２】
ベクター中にランダム断片を適正に導入するために、本発明によれば、部位指向ＰＣＲ媒介突然変異誘発の原理によりランダムヌクレオチドを発現ベクター中に導入することが好ましい。しかしながら、他の選択肢が当業者に公知であり、たとえば、合成ランダム配列ライブラリーをベクター中に挿入することも可能である。
【００７３】
たとえば、融合ＰＣＲにより突然変異体またはライブラリーを作製するために、３つのＰＣＲ反応を行いうる。２つのＰＣＲ反応は、部分的にオーバーラップする中間断片を作製するために行われる。第３のＰＣＲ反応は、中間断片を融合するために行われる。
【００７４】
ライブラリーまたは突然変異体の構築方法は、所望の制限部位の周りの第１の一組のプライマー（制限部位プライマー）すなわちフォワードおよびリバースの制限プライマー、ならびにたとえば対象のコドンの上流および下流の周りの第２の一組のプライマー（突然変異原性プライマー）すなわちフォワードおよびリバースの突然変異原性プライマーを構築することを含みうる。一実施形態では、対象のコドンのすぐ上流および下流のプライマーが構築される。制限プライマーおよび突然変異原性プライマーは、第１の中間断片および第２の中間断片を構築するために使用される。２つのＰＣＲ反応では、これらの線状中間断片を生成する。これらの各線状中間断片は、少なくとも１つの対象の突然変異コドン、フランキングヌクレオチド配列、および消化部位を含む。第３のＰＣＲ反応では、２つの中間断片ならびにフォワードおよびリバースの制限プライマーを用いて融合線状生成物を生成する。線状生成物の対向するまだ未結合の末端を制限酵素により消化して線状生成物上に付着末端を形成する。ＤＮＡリガーゼを用いて線状生成物の付着末端を融合して環状生成物（たとえば、環状ポリヌクレオチド配列）を生成する。
【００７５】
中間断片を構築するために、二組のフォワードおよびリバースのプライマーの設計および合成を行う。第１の一組は、制限酵素消化部位をそのフランキングヌクレオチド配列と一緒に含有し、第２の一組は、少なくとも１つの対象の変異コドンを含有する（突然変異原性プライマー）。変異体の数が所望の変異アミノ酸修飾の数に依存することは、当業者であればわかるであろう。この過程で他の制限酵素を使用すれば、それに応じて、この消化部位の厳密な位置ならびにフォワードおよびリバースのプライマーの対応する配列を改変しうると、本発明者は考えている。他の方法を当技術分野で利用可能であり、代わりに使用しうる。
【００７６】
本発明に係る足場中に導入される発現産物のランダム断片を有する以外に、多くの場合、少なくとも１つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列に融合されたランダムヌクレオチド配列を有することにより、ランダム配列を融合パートナーに結合することが必要である。そのような融合パートナーにより、たとえば、発現産物の発現および／または精製／単離および／またはさらなる安定化を促進することが可能である。
【００７７】
単量体型ユビキチンの領域２〜８および６２〜６８から、好ましくは位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８から選択されるアミノ酸の本発明の一例に係るランダムなアミノ酸置換またはアミノ酸挿入は、挙げられた位置がタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端の近くに局在化されているので、ＰＣＲを利用してとくに容易に行うことが可能である。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡストランドの５’末端および３’末端にある。したがって、突然変異される位置２、４、６、および／または８のコドン以外の突然変異原性ＰＣＲ反応に使用される第１のオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、ユビキチンのアミノ末端のコードストランドに対応する。したがって、突然変異される位置６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８のコドン以外の第２のオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも部分的には、カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コードストランドに対応する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドを利用して、単量体型ユビキチンをコードするＤＮＡ配列を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことが可能である。
【００７８】
さらに、たとえば制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を導入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、得られた増幅産物を他のポリメラーゼ連鎖反応に追加することが可能である。本発明によれば、所定の標的への結合性を有するユビキチン変異体を単離するために、得られた遺伝子カセットを後続の選択手順で使用するのに好適なベクター系中に導入することが好ましい。
【００７９】
ユビキチン中の修飾領域
修飾領域は、基本的には、結合パートナーとしてのヒトユビキチンの前記非天然標的タンパク質、たとえばＶＥＧＦ、特定的にはＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームに到達可能であるかに関して、およびタンパク質の全体構造が修飾に対する耐容性を示すと推定されるかに関して、選択可能である。
【００８０】
とくに好ましいのは、ユビキチン単量体の領域２〜８および６２〜６８の表面露出アミノ酸の１つ以上の置換である。好ましいのは、ユビキチン単量体、好ましくは哺乳動物（ヒト）ユビキチン単量体の次の位置、すなわち、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８のアミノ酸またはこれらの位置に対応するアミノ酸から選択される置換である。任意選択で、単量体１つあたり５、６、７、８、９個の前記アミノ酸残基は、さらなるアミノ酸残基の追加と組み合わせて、たとえば、好ましくはＮ末端の単量体型ユビキチン中へのおよび前記置換アミノ酸にごく近接する２〜１５個のアミノ酸、好ましくは５〜１０アミノ酸、好ましくは８個のアミノ酸の挿入と組み合わせて、修飾される。前記置換アミノ酸にごく近接する２〜１５個のアミノ酸、好ましくは５〜１０個のアミノ酸、好ましくは８個のアミノ酸の挿入の利点は、伸長構造、任意選択でループ構造を形成することによる非天然標的に対する結合面の伸長である。
【００８１】
以上の修飾を行った後、本発明者らは、実施例に記載の修飾二量体型ユビキチン配列が非天然タンパク質標的（ここではＶＥＧＦ−Ａ）に非常に高い親和性および特異性を有して結合することを見いだした。
【００８２】
追加の挿入断片を有する修飾ユビキチン二量体
標的に対する結合活性を呈してＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍで非天然タンパク質標的に結合する本発明に係るユビキチン二量体は、
（１）第１の単量体ユニット中に、位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８に対応するかつそれらの位置から選択される５、６、７、８、または９個のアミノ酸の置換、
（２）第２の単量体ユニット中に、アミノ酸位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８に対応するかつそれらの位置から選択される５、６、７、８、または９個の置換、および
（３）そのほかに、少なくとも一方の単量体ユビキチンユニット中に、前記置換にごく近接する２〜１５個のアミノ酸の挿入
を示す。
【００８３】
一実施形態では、融合タンパク質は、第１のユビキチン単量体の位置２、４、６、８、６２〜６６、６８の置換と、たとえば、野生型ヒトユビキチンに対応する次のアミノ酸残基間６１〜６２、６２〜６３、６３〜６４、および／または６４〜６５に挿入された２〜１５個のアミノ酸と、第２のユビキチン単量体の位置２、４、６、８、６２〜６６、６８のアミノ酸残基の置換と、を有する前記ユビキチン単量体の遺伝子融合ヘテロ二量体、好ましくは図１に示されるものである。
【００８４】
好ましいのは、リガンドに対する結合タンパク質を生成する二量体型ユビキチン中の修飾、すなわち、
（１）第１の単量体ユニット中の少なくとも位置６、８、６２、６３、６４、６５、６６の置換、
（２）第１の単量体中への８個のアミノ酸の挿入、
（３）第２の単量体ユニット中の少なくとも位置６、８、６２、６３、６４、６５、６６、
である。好ましいのは、単量体型ユビキチンのｃ末端領域内への８個までのアミノ酸の挿入である。より好ましいのは、第４のβシートにごく近接する位置への挿入である（アミノ酸位置６５の前）。最も好ましいのは、前記置換にごく近接する、好ましくはアミノ酸６１および６２、６２および６３、６３および６４、６４および６５の間、最も好ましくはアミノ酸６１および６２の間への挿入である。
【００８５】
最も好ましいのは、リガンドたとえばＶＥＧＦ−Ａに対する結合タンパク質を生成する以下の修飾である（変異体４０４０１）（配列番号２）（図１ａ参照）
（４）第１の単量体ユニット中の少なくともＫ６Ｙ、Ｌ８Ｄ、Ｑ６２Ｓ、Ｋ６３Ｗ、Ｅ６４Ｍ、Ｓ６５Ｐ、およびＴ６６Ａの置換、
（５）第１の単量体中のアミノ酸６１および６２の間へのアミノ酸残基ＤＶＡＥＹＬＧＩの８個のアミノ酸の挿入、
（６）第２の単量体ユニット中の少なくともＫ６Ａ、Ｌ８Ｄ、Ｑ６２Ｒ、Ｋ６３Ｄ、Ｅ６４Ｔ、Ｓ６５Ｖ、およびＴ６６Ｓ
【００８６】
置換および挿入を有するさらなる変異を表１および図１に示す。
【００８７】
表１は、第１の単量体中への８個のアミノ酸の挿入を有するヘテロ二量体型ユビキチン系ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質中の好ましいアミノ酸置換を示している（この表に挿入は示されていない）。濃灰色（位置６、８、６２、６３、６４、６５、６６）：Ｎ末端（第１）のユビキチン単量体中の置換、薄灰色（位置６’、８’、６２’、６３’、６４’、６５’、６６’）：結合タンパク質のＣ末端（第２）のユビキチン単量体中の置換。他の位置のさらなる置換は、示されていないが、可能である。それに加えて、非天然標的への結合に関係しない置換、たとえば位置４５、７５、および７６の置換は、示されていない。「−」は、この位置に置換が存在せずに野生型アミノ酸が残存することを示している。完全な配列情報に関しては、図１ａ〜ｉを参照されたい。
2014526881.tif 000003
【００８８】
これらのＶＥＧＦ−Ａ結合変異体のコンセンサス配列として（表１および図１に示されるとおり）、以下のコンセンサス配列が観測された（より大きい文字は、９つの変異体に対して高度の同一性を示す）（表２）。
2014526881.tif 000004
【００８９】
したがって、第１（Ｎ末端）の単量体では、コンセンサス置換は、次のもの、すなわち、Ｋ６Ｙ、Ｌ８Ｄ、Ｑ６２Ｓ、Ｋ６３Ｗ、Ｅ６４Ｍ、Ｓ６５Ｐ、Ｔ６６Ａである。挿入は、第１の単量体中の第４（Ｃ末端）のβシートにごく近接して、したがって位置６２〜６６の置換アミノ酸にごく近接して（Ｎ末端方向に）、好ましくはアミノ酸６１および６２、６２および６３、６３および６４、６４および６５の間、最も好ましくはアミノ酸６１および６２の間に位置する。二量体型ユビキチンの第２の単量体ユニットは、さまざまな置換を示し、これらの実施形態では、５〜７個のアミノ酸が、配列番号１の位置６、８、６２、６３、６４、６５、および／または６６で置換される。
【００９０】
所与の標的に対する新規な結合親和性を有するタンパク質を生成する置換および挿入を有する変異体は、図１ならびに表１、表２、および表３に示される。
【００９１】
各単量体中の以上に示されたこれらの代替置換は、得られる修飾ユビキチンヘテロ二量体がＫｄ＝１０−７〜１０−１２ＭのＶＥＧＦ−Ａへの特異的結合親和性を示してＶＥＧＦ−Ａへの結合活性を呈するかぎり、かつユビキチンタンパク質の構造安定性が破壊されたり妨害されたりしないかぎり、なんら制限されることなく互いに組合せ可能である。本発明に係るタンパク質の結合親和性は、表３に示される。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム１２１および１６５に対する親和性データが示される。ＥＬＩＳＡアッセイおよびＢｉａｃｏｒｅアッセイからデータを得た。細胞増殖アッセイによりさらなるデータを得た。アッセイはすべて、実施例の節でさらに説明される。
2014526881.tif 000005
【００９２】
本発明のさらなる態様では、本発明はまた、以下でさらに説明されるように、タンパク質または修飾ユビキチン融合タンパク質またはコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを包含する。そのほかに、前記ポリヌクレオチドを含むベクターが本発明に包含される。
【００９３】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の二量体型修飾ユビキチンタンパク質もしくは融合タンパク質もしくはコンジュゲート、および／または本発明に係る前記組換えタンパク質もしくは融合タンパク質もしくはコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含有するベクター、を含む宿主細胞が包含される。
【００９４】
結合特異性（解離定数）
本発明に係るタンパク質の結合特異性は、非修飾タンパク質に対して以上に規定されたようにＫｄで与えられる。本発明によれば、「Ｋｄ」という用語は、本発明に従って１０−７〜１０−１２Ｍの範囲内にある特異的結合親和性を規定する。１０−５Ｍ以下の値は、定量可能な結合親和性とみなしうる。用途に依存して、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍの値は、たとえば、クロマトグラフィー用途に好適であり、１０−９〜１０−１２Ｍの値は、たとえば、診断用途または治療用途に好適である。さらに好ましい結合親和性は、１０−７〜１０−１０Ｍ、好ましくは１０−１１Ｍまでの範囲内である。
【００９５】
結合親和性を決定する方法は、それ自体公知であり、たとえば、次の方法、すなわち、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により提供されるもの）、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、分析用超遠心分離、ＦＡＣＳから選択可能である。
【００９６】
以上の修飾を行った後、本発明者らは、高い親和性（１０−１０ＭまでのＫｄ値）を有して標的に結合する実施例に記載のアミノ酸修飾ユビキチン配列を見いだした。
【００９７】
融合タンパク質およびタンパク質コンジュゲート
他の好ましい実施形態では、本発明は、治療活性（医薬活性）成分または診断活性成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた本発明に係る結合タンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートに関する。
【００９８】
またさらなる態様では、本発明は、診断活性成分または治療活性（医薬活性）成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた本発明に係るヘテロ二量体型結合タンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートに関する。本発明に係る融合タンパク質またはコンジュゲートは、非ポリペプチド成分、たとえば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンド、たとえば、治療または診断に関連する放射性核種を含みうる。また、小さい有機系化合物または非アミノ酸系化合物、たとえば、糖、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド、脂肪酸なども含みうる。本発明の好ましい一実施形態では、ヘテロユビキチン系結合分子は、共有結合または非共有結合により治療または診断に関連する性質を有するタンパク質またはペプチドまたは化学化合物と融合されるかまたはそれにコンジュゲートされる。
【００９９】
本発明の一実施形態は、医薬活性成分または診断活性成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた二量体型修飾ユビキチンタンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートを包含する。ただし、前記医薬活性成分は、任意選択で、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、ユビキチン系結合タンパク質、もしくは酵素であるか、または前記診断活性成分は、蛍光性化合物、光増感剤、もしくは放射性核種から選択される。
【０１００】
本明細書で用いられる「コンジュゲート」という用語は、共有結合または分子間相互作用のいずれかにより治療分子または診断分子に結合された、たとえば、化学的方法または他の好適な方法によりタンパク質または非タンパク質の化学物質に結合された多量体型修飾ユビキチンを記述する。コンジュゲート分子は、たとえば、ペプチドリンカー配列または担体分子を介して１つもしくは複数の部位で結合可能である。
【０１０１】
「融合タンパク質」という用語は、機能性成分またはエフェクター成分に融合された本発明に係る結合タンパク質または非タンパク質タンパク質を含む融合タンパク質を意味する。一実施形態では、本発明は、機能性ドメインまたはエフェクタードメインに融合された標的化部分として本発明に係るヘテロ二量体型結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。本発明に係る融合タンパク質は、非ポリペプチド成分、たとえば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンド、治療または診断に関連する放射性核種を含みうる。また、小さい有機系化合物または非アミノ酸系化合物、たとえば、糖、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド、脂肪酸なども含みうる。共有結合または非共有結合により対象のタンパク質を担体に結合する方法は、当技術分野で周知であるので、ここではこれ以上詳細に説明しない。
【０１０２】
本明細書で用いられる「融合」という用語は、共有結合または分子相互作用のいずれかにより治療分子または診断分子、たとえば、タンパク質または非タンパク質の化学物質に融合された多量体修飾ユビキチンを記述する。他のタンパク質分子またはペプチド分子との融合は、好ましくは、遺伝学的手段により行われる。しかしながら、「融合」および「コンジュゲート」という用語を限定する鮮明な境界線は、存在しないので、両者は、オーバーラップする可能性があり、こうした理由から、両方の用語は、同義的に用いられる。
【０１０３】
以下では、所与の標的たとえばＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームへの結合能力を有するユビキチン系融合タンパク質またはコンジュゲートの取得方法に関するいくつかの例を与える。
ａ）ユビキチン中に存在するリシン残基を介するタンパク質のコンジュゲーション、
ｂ）システイン残基を介するヘテロ二量体型ユビキチン系結合タンパク質のコンジュゲーション、
−Ｃ末端または任意の他の位置に位置しうる（たとえば、アミノ酸残基２４または５７）、マレイミド選択性成分とのコンジュゲーション、
ｃ）ペプチド性またはタンパク質原性のコンジュゲーション−遺伝子融合（好ましいＣ末端またはＮ末端）、
ｄ）「タグ」に基づく融合−標的タンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれかに位置するタンパク質またはペプチド。融合「タグ」、たとえば、ポリヒスチジン（とくに放射性標識に適合する）。
【０１０４】
共有結合または非共有結合により対象のタンパク質を担体に結合するこれらのおよび他の方法は、当技術分野で周知であるので、ここではこれ以上詳細に説明しない。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態では、本発明に係るヘテロ二量体型ユビキチン系結合タンパク質は、人工アミノ酸を含有しうる。
【０１０６】
本発明に係る融合タンパク質またはコンジュゲートのさらなる実施形態では、好ましくは、前記活性成分は、γ放射性同位体、好ましくは、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎの群、もしくはポジトロン放射体、好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉの群、もしくはβ放射体、好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕの群、もしくはα放射体、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔの群のいずれかの放射性核種の群、または蛍光染料、好ましくはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料もしくはＣｙ染料（Ｂｅｒｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５１（１２）：１６９９−１７１２，２００３）、または光増感剤から選択される成分である。
【０１０７】
さらなる実施形態は、血清中半減期を変調する成分、好ましくは、ポリエチレングリコール、アルブミン結合ペプチド、および免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメントからなる群から選択される成分をさらに含む本発明に係る融合タンパク質に関する。
【０１０８】
標的に特異的に結合する本発明に係るタンパク質の使用
本発明に係る修飾ユビキチン結合タンパク質は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための診断手段さらには治療手段を作製するために使用されるものとする。本発明に係るタンパク質は、たとえば、直接的エフェクター分子（モジュレーター、アンタゴニスト、アゴニスト）または抗原認識ドメインとしての使用可能である。
【０１０９】
本発明に係る医薬組成物は、癌たとえば乳癌もしくは結腸癌またはＶＥＧＦ−Ａが豊富な任意の他の腫瘍疾患の治療に使用可能である。それに加えて、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）や糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）などの眼疾患に使用可能である。
【０１１０】
組成物は、治療上有効用量を含有するように適合化される。投与される用量は、治療される生物、疾患のタイプ、患者の年齢および体重、ならびにそれ自体公知のさらなる因子に依存する。
【０１１１】
本発明は、二量体型修飾ユビキチンタンパク質または修飾ユビキチン融合タンパク質またはコンジュゲートまたはそれらの組合せと、薬学的に許容可能な担体と、を含有する医薬組成物を包含する。本発明はさらに、二量体型修飾ユビキチンタンパク質または融合タンパク質またはコンジュゲートと、診断的に許容可能な担体と、を含む診断剤を包含する。組成物は、薬学的または診断的に許容可能な担体を含有し、任意選択で、それ自体公知の助剤および賦形剤をさらに含有しうる。これらは、限定されるものではないが、たとえば、安定化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などを包含する。
【０１１２】
医薬組成物は、液体製剤、クリーム剤、局所適用に供されるローション剤、またはエアロゾル剤の形態、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、またはカプセル剤の形態、エマルジョン剤またはリポソーム製剤の形態をとりうる。組成物は、好ましくは、無菌、非発熱原性、かつ等張性であり、しかもそれ自体公知の薬学的に従来型のかつ許容可能な添加剤を含有する。米国薬局方またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）の規制をさらに参照されたい。
【０１１３】
人間医学的および獣医学的な治療および予防の分野では、本発明に従って修飾された少なくとも１種の二量体型ＶＥＧＦ−Ａ結合ユビキチンタンパク質を含有する薬学的に有効な医薬は、それ自体公知の方法により調製可能である。ガレヌス製剤に依存して、これらの組成物は、注射もしくは輸液により非経口的に、全身的に、経直腸的に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、経真皮的に、または他の従来から利用されている適用方法により投与可能である。眼疾患治療用途では、滴剤として眼内への直接適用が好ましい。医薬製剤のタイプは、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度、治療される患者、および医学分野の当業者に公知の他の因子に依存する。
【０１１４】
本発明に係る「医薬組成物」は、さまざまな活性成分と希釈剤および／もしくは担体とが互いと混合されて含まれる組成物の形態で存在しうるか、または活性成分が部分的にもしくは完全に個別の形態で存在する組合せ製剤の形態で摂取されうる。そのような組合せまたは組合せ製剤の例は、キットオブパーツである。
【０１１５】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、本発明に係る組換えユビキチンタンパク質／融合タンパク質に対しておよび１種以上の化学療法剤に対して分離された要素を提供するキットオブパーツの形態である。
【０１１６】
またさらなる態様では、本発明は、たとえば腫瘍関連タンパク質たとえばＶＥＧＦ−Ａまたはそのアイソフォームに特異的に結合する本発明に係る修飾ユビキチンを診断的に許容可能な担体と共に含む診断用組成物を開示する。たとえば腫瘍関連分子の発現増大は、腫瘍悪性度に関連付けられるので、前記腫瘍特異的標的分子への結合能を有する修飾ユビキチンは、たとえば患者のＶＥＧＦに関する情報を得るために、非侵襲性イメージング用の診断剤として使用可能である。さらに、たとえばＶＥＧＦ−Ａおよびそのアイソフォームへの結合能を有する修飾ユビキチンは、抗血管新生治療に対する患者の反応を評価するために使用可能である。そのサイズが小さくかつ親和性が高いので、ユビキチン足場に基づく放射性標識タンパク質は、たとえばＶＥＧＦ画像診断剤として使用するうえで重要性が高い。
【０１１７】
本発明のさらなる態様では、医学的な治療方法または診断方法で使用するための組換えタンパク質および／または融合タンパク質またはコンジュゲートが包含される。
【０１１８】
本発明に係る二量体型結合タンパク質の製造方法
本発明に係る結合タンパク質は、明快な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多くの従来型の周知の技術のいずれかによりまたは市販の自動合成装置により、調製されうる。一方、従来型の組換え技術単独でまたは従来型の合成技術との組合せにより、調製することも可能である。
【０１１９】
本発明の一態様では、新規な結合性を有する組換え修飾ユビキチンタンパク質の生成方法が提供される。この方法は、少なくとも以下のステップ、すなわち、
ａ）ユビキチンタンパク質を提供するステップと、
ｂ）潜在的標的としてヒトユビキチンに対する非天然標的タンパク質を提供するステップと、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有する単量体型タンパク質が得られるように前記ユビキチンタンパク質を修飾するステップであって、少なくとも５個かつ多くとも８個のアミノ酸が、位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８に対応するかつそれらの位置から選択されるアミノ酸の置換により修飾され、かつ２〜１５個のアミノ酸または６〜１０個のアミノ酸または７〜９個のアミノ酸または８個のアミノ酸が、前記単量体の少なくともの１つに挿入され、前記挿入が、少なくとも１つの単量体ユビキチンユニット中の前記アミノ酸置換内またはそれにごく近接して、任意選択で前記位置から０、１、２、または３アミノ酸離れて、好ましくはアミノ酸６１および６２、６２および６３、６３および６４、６４および６５の間に、最も好ましくはアミノ酸６１および６２の間に存在するものとするステップと、
ｄ）異なって修飾された前記単量体型タンパク質ユニットの２つを融合するステップと、
ｅ）前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｆ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的に結合する修飾ヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質をスクリーニングするステップと、任意選択で
ｇ）ｆ）の条項を満たす前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を単離するステップと、
を含む。
【０１２０】
本発明の他の態様では、修飾ユビキチンタンパク質の同定方法が提供される。この方法は、少なくとも以下のステップ、すなわち、
ａ）単量体型ユビキチンタンパク質に由来する異なって修飾されたヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質の集団を提供するステップであって、前記集団が、頭−尾配置で結合一体化された２つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含むヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を含み、前記多量体タンパク質の各単量体が、配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応するかつそれらの位置から選択される５、６、７、または８個のアミノ酸の置換により修飾され、かつさらなる２〜１５個のアミノ酸が、少なくとも１つの単量体ユビキチンユニット中の前記アミノ酸置換内またはそれにごく近接して、任意選択で配列番号１の位置２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８に対応するかつそれらの位置から選択される前記置換アミノ酸から０、１、２、または３アミノ酸離れて、好ましくはアミノ酸６１および６２、６２および６３、６３および６４、６４および６５の間に、最も好ましくはアミノ酸６１および６２の間に挿入されるものとするステップと、
ｂ）潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップと、
ｃ）前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップと、
ｄ）１０−７〜１０−１２Ｍの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合するヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップと、任意選択で
ｅ）前記結合親和性を有する前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを単離するステップと、
を含む。
【０１２１】
さらなる実施形態は、以下のステップ、すなわち、
ａ）ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを提供するステップと、
ｂ）前記修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を医薬活性成分および／または診断活性成分に融合またはコンジュゲートするステップと、
を含む、ヘテロ二量体型融合タンパク質またはコンジュゲートの生成方法を包含する。
【０１２２】
さらなる実施形態は、第１の態様で規定されたタンパク質の調製方法を包含する。前記方法は、以下のステップ、すなわち、
（ａ）第１の態様で規定されたタンパク質をコードする核酸を調製するステップと、
（ｂ）前記核酸を発現ベクター中に導入するステップと、
（ｃ）前記発現ベクターの宿主細胞内に導入するステップと、
（ｄ）宿主細胞を培養するステップと、
（ｅ）宿主細胞を融合タンパク質が前記ベクターから発現される培養条件下に付すことにより、第１の態様で規定されたタンパク質を生成するステップと、
（ｆ）任意選択で、工程（ｅ）で生成されたタンパク質を単離するステップと、
を含む。
【０１２３】
一実施形態では、工程（ｅ）で生成されるタンパク質は、封入体の形態をとる。さらなる好ましい実施形態では、この方法はさらに、次のステップ、すなわち、封入体を単離するステップと、前記封入体を可溶化させることにより可溶性融合タンパク質を取得するステップと、少なくとも２つのクロマトグラフィーステップにより前のステップで得られた可溶性融合タンパク質をさらに精製するステップと、を含む。好適なクロマトグラフィーステップは、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
任意選択で、修飾は、原核生物もしくは真核生物においてまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡレベルの遺伝子工学操作および修飾タンパク質の発現上より行われうる。さらなる実施形態では、前記修飾ステップは、化学合成ステップを含む。本発明の一態様では、異なって修飾されたタンパク質の集団は、異なって修飾された単量体型ユビキチンタンパク質をそれぞれコード化する２つのＤＮＡライブラリーを遺伝子融合することにより得られる。またさらなる態様では、前記方法は、前記修飾二量体型ユビキチンタンパク質が診断成分と融合されるように、または前記組換え修飾二量体型ユビキチンタンパク質が前記診断成分を介して生成されるように、適合化される。本発明によれば、修飾タンパク質はさらに、化学合成により調製可能である。この実施形態では、次いで、請求項１に記載のステップｃ）〜ｄが一工程で行われる。
【０１２５】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質の提供の根底をなす、以上に規定された修飾単量体型ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含有するライブラリーに関する。またさらなる本発明の態様では、以上に明記された２つのライブラリーを融合することにより得られるＤＮＡを含有する融合ライブラリーが提供され、各ライブラリーは、ホモ二量体型またはヘテロ二量体型のユビキチン融合タンパク質が得られるように等しくまたは異なって修飾されたユビキチン単量体をコードし、その単量体は、頭−尾配置で結合一体化され、前記ライブラリーは、リガンドに対する結合活性を呈するユビキチンのホモ二量体型またはヘテロ二量体型の融合タンパク質をコードする。前記結合一体化は、当業者に公知のいずれか１つのリンカーまたは本明細書に記載のリンカーのいずれかを用いて行われる。
【０１２６】
実施例１では、複合ライブラリーの作製を概説する。しかしながら、そのようなライブラリーの品質に関しては、注意しなければならない。足場技術におけるライブラリーの品質は、まず第一に、その複雑性（個々の変異体の数）さらには機能性（得られる候補の構造完全性およびタンパク質の化学的完全性）に依存する。しかしながら、両方の特徴は、互いに悪影響を及ぼし合って、足場上の修飾位置の数を増加させることによりライブラリーの複雑さを増大させると、変異体のタンパク質化学特性の劣化を招きかねない。この結果、溶解性低下、凝集、および／または低収率がもたらされうる。この理由は、エネルギー的に有利なタンパク質パッケージングを有する天然足場からの偏位の増大にある。したがって、標的に対して最適化されるようにできるかぎり多くの変異を元の配列中に導入する極限位置と、好ましくないタンパク質化学効果が回避されるようにできるかぎり多くの元の一次配列を保存する極限位置と、の間で、そのような足場ライブラリーを好適に構築するようにバランスをとる。本開示にはまた、本発明の態様または実施形態を考慮して本明細書に記載の特徴の考えられる各組合せも包含されることに、留意されたい。
【０１２７】
結合親和性を有する修飾ユビキチンタンパク質の選択および結合親和性に関与する修飾アミノ酸の決定
たとえば、各単量体ユビキチンユニット（ユビキチン単量体）中の所定のアミノ酸を異なって修飾することにより、二量体型修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるＤＮＡライブラリーを確立した後、これらのライブラリーは、ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子が得られるように、たとえばリンカー技術により、遺伝子的に融合される。これらのライブラリーのＤＮＡは、タンパク質の形態に発現され、それにより得られた修飾二量体型タンパク質は、本発明に従ってリガンドＶＥＧＦ−Ａに接触させると、任意選択で、結合親和性が存在すれば、パートナーとの相互の結合が可能になる。
【０１２８】
ホモ二量体型またはヘテロ二量体型のユビキチンタンパク質に対して接触プロセスおよびスクリーニングプロセスがあらかじめ行われることが、本発明のきわめて重要な態様である。このプロセスは、所与の標的への結合活性を提供するユビキチンタンパク質のスクリーニングを可能にする。
【０１２９】
本発明に係る接触は、好ましくは、好適な提示および選択方法を利用して、たとえば、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法、または細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ法、もしくは細菌表面ディスプレイ法、好ましくはファージディスプレイ法を利用して行われる。完全な開示のために、次の参照文献、すなわち、Ｈｏｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．．３（１９９３），５７２−５７９、Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２），５９７−６０４、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９６），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓも参照されたい。
【０１３０】
以上に挙げられた方法は、当業者に公知であり、その変法を含めて、本発明に従って使用可能である。修飾タンパク質が所定の結合パートナーに対して定量可能な結合親和性を有するかの判定は、本発明に従って、好ましくは、次の方法、すなわち、ＥＬＩＳＡ、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、および分析用超遠心分離の１つ以上により、実施可能である。
【０１３１】
二量体型結合タンパク質の特性解析
このようにして得られたユビキチン変異体のさらなる特性解析は、対応する遺伝子カセットを好適な発現ベクター中にクローニングした後、以上に詳述したように可溶性タンパク質の形態で実施可能である。適切な方法は、当業者に公知であるか、または文献に記載されている。二量体型結合タンパク質の例示的な特性解析法は、本発明の実施例の節で概説される。
【０１３２】
好ましくは、所定の結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出するステップに続いて、検出されたタンパク質を単離および／または富化するステップが行われる。
【０１３３】
本発明に係る修飾ユビキチンタンパク質の発現の後、それ自体公知の方法によりさらに精製および富化することが可能である。所定の方法は、当業者にはそれ自体公知のいくつかの因子、たとえば、使用される発現ベクター、宿主生物、意図された使用分野、タンパク質のサイズ、および他の因子に依存する。簡易精製では、本発明に係る修飾タンパク質は、分離材料に対して増大された親和性を有する他のペプチド配列に融合可能である。好ましくは、ユビキチンタンパク質の機能に有害な影響を及ぼさない融合体が選択されるか、または特異的プロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能である。そのような方法はまた、当業者にはそれ自体公知である。
【０１３４】
ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生成方法
ベクターは、１種以上の所定の宿主細胞内でベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する発現ベクターおよびクローニングベクターでありうる。一般的には、クローニングベクターでは、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは独立してベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。そのような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点は、酵母に好適であり、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞内のクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターでは必要とされない（ＳＶ４０起点は、典型的には、初期プロモーターを含有するという理由のみで、使用されることもある）。
【０１３５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、たとえば、遺伝子は、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする。
【０１３６】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含有し、修飾ユビキチン足場タンパク質をコードする核酸に機能可能に結合される。原核宿主と共に使用するのに好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーターたとえばｔａｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが好適である。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、修飾ユビキチン系足場タンパク質をコードするＤＮＡに機能可能に結合されたシャイン・ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するであろう。
【０１３７】
真核生物のプロモーター配列は、公知である。実質上すべての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０〜８０塩基上流に見いだされる他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドでありうる）である。ほとんどの真核遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のシグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列はすべて、真核発現ベクター中に好適には挿入される。
【０１３８】
好適な宿主細胞としては、原核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または細菌細胞が挙げられる。好適な細菌としては、グラム陰性またはグラム陽性の生物、たとえばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種が挙げられる。酵母、好ましくはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、たとえばＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もまた、ポリペプチドの産生に使用されうる。種々の哺乳動物細胞または昆虫細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために利用可能である。昆虫細胞内で異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６：４７）によりレビューされている。
【実施例】
【０１３９】
本発明のさらなる例示のために、以下の実施例を提供する。とくに、例としてユビキチンの修飾に関して、本発明を実証する。しかしながら、本発明は、それに限定されるものではなく、以下の実施例は、以上の説明に基づいて本発明の実用性を単に示しているにすぎない。発明の完全な開示のために、本出願書類および添付書類で引用された参照文献も参照されたい。それらはすべて、その全体が参照により組み込まれる。
【０１４０】
実施例１。
挿入断片（伸長構造）を有する修飾ユビキチンタンパク質に基づくヘテロ二量体型結合タンパク質の同定
ライブラリーの構築およびクローニング
とくに指定がないかぎり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋらにより記載されたような確立された組換え遺伝子的方法を使用した。少なくとも１４個の所定のアミノ酸位置の協奏的突然変異誘発により、高い複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを作製した。ＮＮＫトリプレットにより置換された修飾アミノ酸は、近位／Ｎ末端（第１）のユビキチン単量体中の位置６、８、６２、６３、６４、６５、６６から選択されるアミノ酸、および遠位／Ｃ末端（第２）のユビキチン単量体中の位置６、８、６２、６３、６４、６５、６６から選択されるアミノ酸を含んでいた。少なくとも配列ＧＩＧまたは少なくとも配列ＳＧＧＧＧ、たとえば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ、またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧを有するグリシン／セリンリンカーにより、両方のユビキチン単量体を遺伝子的に結合（頭−尾）したが、任意の他のリンカーが可能であり、またはリンカーなしが可能である。
【０１４１】
標的タンパク質ＶＥＧＦ−Ａ
ＶＥＧＦ−Ａは、いくつかのアイソフォームで存在する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦ−Ａ（受託番号ｐ１５６９２）の天然に豊富なアイソフォームである。ＶＥＧＦ１２１（受託番号ｐ１５６９２−９）およびＶＥＧＦ１６５（受託番号ｐ１５６９２−９）は、Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ（製造番号ＨＺ−１２０６（ＶＥＧＦ１２１）およびＨＺ−１１５３（ＶＥＧＦ１６５））から購入した。データベース項目と比較して、アイソフォームＶＥＧＦ１６５は、シグナルペプチドが含まれていないので２６アミノ酸短い。適正グリコシル化が確保されるように、両方のアイソフォームをヒト細胞内で発現させた。
【０１４２】
ＴＡＴファージディスプレイの選択
たとえばＴＡＴファージディスプレイを選択系として用いて、ヘテロ二量体型ユビキチンライブラリーをＶＥＧＦ−Ａに対して富化した。当技術分野で公知の他の選択方法を使用することが可能である。標的は、タンパク質結合表面上に非特異的に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して固定することが可能である。ビオチンを介してストレプトアビジンビーズまたはニュートラビジンストリップ上に固定することが好ましい。標的結合ファージは、溶解状態でまたは固定標的上で選択されている。たとえば、ファージと共にビオチン化および固定化された標的をインキュベートし、続いて、マトリックスに結合されたファージを洗浄し、そしてマトリックス結合ファージを溶出させる。各サイクルで、標的インキュベーション後、ビーズを溶液から磁気的に分離して、数回洗浄した。第１の選択サイクルでは、ビオチン化標的をニュートラビジンストリップに固定し、一方、サイクル２〜４では、溶解状態で選択を行い、続いて、ストレプトアビジン被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に標的ファージ複合体を固定した。洗浄後、最初の２つの選択サイクルでは、酸性溶液を用いた溶出により標的結合修飾ユビキチン分子のファージを放出させた。選択サイクル３および４では、過剰の標的を用いた競合的溶出によりファージの溶出を行った。溶出されたファージを再増幅した。結合剤の特異性を誘導するために、標的に類似したタンパク質を選択時に組み込むことが可能である。
【０１４３】
ＴＡＴファージディスプレイ選択の代替：リボソームディスプレイ選択
たとえばリボソームディスプレイを選択系として用いて、ユビキチンライブラリーを標的に対して富化した。当技術分野で公知の他の選択方法を使用することが可能である。標準的方法に従って標的をビオチン化し、ストレプトアビジン被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に固定した。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、リボソームとｍＲＮＡと新生ユビキチンポリペプチドとを含む三元複合体を集合させた。最初に４ラウンドまでの選択を行って三元複合体をインキュベートし、続いて類似の２ラウンドの選択を行った。各サイクルで、標的インキュベーション後、ビーズを溶液から磁気的に分離して、およびストリンジェンシーの増大されたリボソームディスプレイ緩衝液で洗浄した。最初の２サイクルの選択で洗浄後、ビーズを再び溶液から磁気的に分離し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により標的結合修飾ユビキチン分子のｍＲＮＡをリボソームから放した。選択サイクル３および４では、過剰の標的を用いた競合的溶出によりｍＲＮＡ複合体の溶出を行った（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００４）。各サイクル後、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＲＮＡ精製およびｃＤＮＡ合成を行った。
【０１４４】
富化プールのクローニング
第４の選択サイクルの後、合成ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、好適な制限ヌクレアーゼを用いて切断し、そして適合付着末端を介して発現ベクター中にライゲートした。
【０１４５】
単一コロニーヒット分析
ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にトランスフォームした後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２０ｇ／ｌグルコースを含有するＳＯＢ培地中でアンピシリン耐性単一コロニーを増殖させた。自動誘導培地ＺＹＭ−５０５２（Ｓｔｕｄｉｅｒ，２００５）を用いて９６ウェルディープウェルプレート中で培養することにより、ＶＥＧＦ−Ａ結合修飾ユビキチンの発現を達成した。細胞を採取し、続いて溶解させた。遠心分離後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とコンジュゲートされた４μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａおよびユビキチン特異的Ｆａｂフラグメントで被覆されたＮｕｎｃ  ＭｅｄｉＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて、得られた上清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。検出試薬としてＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を使用し、０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて黄色に発色さ、４５０ｎｍ対６２０ｎｍでプレートリーダーにより測定した。
【０１４６】
通常、数サイクル、たとえば、４サイクルの選択ディスプレイ対ＶＥＧＦ−Ａを行った。最後の２サイクルの選択で、過剰の遊離ＶＥＧＦ−Ａを用いて結合分子を溶出させた。成熟により結合分子をさらに選択した。
【０１４７】
高親和性を有する所定のＶＥＧＦ−Ａ結合クローンの成熟
ＶＥＧＦ−Ａに対して親和性ユビキチン系二量体型結合タンパク質を増強するために、所定の結合タンパク質の二量体のユビキチンビルディングユニット（単量体）をナイーブ単量体ユビキチンライブラリーに融合した。たとえば、二量体型ユビキチン結合ユニットのＮ末端またはＣ末端の単量体のいずれかを単量体ユビキチンライブラリーに融合した。数種、たとえば１〜１０種、好ましくは３種のＶＥＧＦ−Ａ結合分子を選択し、そして位置６、８、６２、６３、６４、６５、および／または６６に置換を有するかつ任意選択で位置６１〜６２に挿入を有するＮ末端ユビキチン単量体を、好適なアミノ酸リンカーたとえばＧＩＧにより、ランダム化アミノ酸位置６、８、６２、６３、６４、６５、および／または６６を有するナイーブ単量体ユビキチンライブラリーに融合した。併行して、位置６、８、６２、６３、６４、６５、および／または６６に置換を有するヘテロ二量体型結合タンパク質のＣ末端領域のユビキチン単量体を、好適なアミノ酸リンカーたとえばＧＩＧにより、ランダム化アミノ酸位置６、８、６２、６３、６４、６５、および／または６６および／または４２、４４、６８、７０、および７２〜７４を有するナイーブ単量体ユビキチンライブラリーに融合した。７つまでのランダム化位置を有する得られた二量体型ユビキチンライブラリーは、プールされ、理論数約１，５×１０１０の異なる変異体を呈し、これらは、当業者に公知の方法を用いて、各変異体の１０倍提示まで、リボソームディスプレイにより完全にディスプレイ可能であった。混合ライブラリーは、可溶性ＶＥＧＦ１２１を用いたＶＥＧＦ−Ａ結合分子の３ラウンドの競合的溶出を含めて４ラウンドのリボソームディスプレイに適用された。
【０１４８】
ＶＥＧＦ−Ａに対する高親和性を有するＶＥＧＦ−Ａ結合剤は、必ずしも長期間にわたり安定な複合体を形成するとは限らない。いくつかの複合体（ユビキチン二量体およびＶＥＧＦ−Ａ）は、高いオフ速度を有する。つまり、結合は強いが、複合体は急速に解離する。たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる決定したとき、より低いオフ速度が望ましい。したがって、高い親和性ただし高いオフ速度を有する変異体からの安定なＶＥＧＦ−Ａ結合複合体が解離されるよう、１６時間オフ速度選択で１ラウンドを行った。溶出は、１０００×非結合標的タンパク質を用いて競合的条件下が行われる（たとえばストレプトアビジンビーズに結合された標的タンパク質と比較して）。１６時間後、依然として固定標的タンパク質に結合されているすべての結合剤をさらに分析する。この選択の後、当業者に公知の標準的方法を用いて、ＶＥＧＦ−Ａ結合分子を有するプールを発現ベクターにサブクローニングし、以下で説明されるようにヒットスクリーニング（たとえばＥＬＩＳＡ）でさまざまなタイプのＶＥＧＦ−Ａへの結合に関してプローブした。
【０１４９】
挿入断片を有するいくつかの例示的なＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質（たとえば４０４０１）を図１ならびに表１、２、および３に示す。実施例２に記載されるように結合タンパク質を分析した。
【０１５０】
実施例２：ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する修飾ユビキチン系結合タンパク質の結合分析
実施例２Ａ。濃度依存性ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチン系ＶＥＧＦ結合変異体の結合分析。
ヒトＶＥＧＦ−Ａへのユビキチン系変異体の結合を濃度依存性ＥＬＩＳＡによりアッセイした。ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１またはＶＥＧＦ−Ａ１６５および陰性対照としてＮＧＦで被覆されたＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに漸増量の精製タンパク質を適用した。１ウェルあたり１〜２．５μｇ／ｍｌで抗原被覆を４℃で一晩行った。ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、ウェルを室温で２時間ブロックした。再びＰＢＳＴを用いてウェルを３回洗浄した。次いで、さまざまな濃度の修飾ユビキチン系ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質を、ウェル中、室温で１時間インキュベートした（図３参照）。ＰＢＳＴを用いてウェルを洗浄した後、ａｎｔｉ−Ｕｂｉ  ｆａｂフラグメント（ａ−Ｕｂｉ−Ｆａｂ）ＰＯＤコンジュゲートを、ＰＢＳＴ中の適切な稀釈液（たとえば１：６５００）で適用した。３００μｌ緩衝ＰＢＳＴ／ウェルでプレートを３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を各ウェルに添加してインキュベートした。０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４／ウェルを添加することにより、反応を停止させた。ＴＥＣＡＮ  Ｓｕｎｒｉｓｅ  ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを用いて、ＥＬＩＳＡプレートの読取りを行った。参照波長として６２０ｎｍを用いて、４５０ｎｍで吸光度測定を行った。図３ａは、ＶＥＧＦ−Ａへの４０４０１（配列番号２）の非常に高い親和性結合を明確に示しており、見掛けのＫＤ値は、２．２〜２．５ｎＭである。さらなる例が図３に示される。したがって、ユビキチン野生型中にごくわずかな修飾を行うだけで（各単量体中の６までの置換）、ＶＥＧＦ−Ａに対する高い親和性結合がもたらされる。図２は、ＶＥＧＦ−Ａへの４０４０１（配列番号２）の非常に高い親和性結合を明確に示しており、見掛けのＫＤ値は、２．２〜２．５ｎＭである。変異体は、対照（ＮＧＦ）への結合を示さなかった。他のＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質のさらなる結果が表２に示される（前掲）。
【０１５１】
実施例２Ｂ。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる修飾ユビキチン系ＶＥＧＦ結合変異体の結合分析。
当業者に公知の方法を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））上に固定されたＶＥＧＦへの結合に関して、さまざまな濃度の変異体を分析した（たとえば、０〜４５０ｎＭの変異体、好ましくは４０４０１）。得られたデータをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアおよび１：１ラングミュア当てはめにより処理した。図４に示されるように、ＶＥＧＦ１６５に対する４０４０１のＫＤは、２．２×１０−８Ｍであった。結合速度定数が図４および表２に示される。他のＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質のさらなる結果が表２に示される（前掲）。
【０１５２】
実施例３：本発明に係る修飾ヘテロ二量体型ユビキチン系結合タンパク質によるＶＥＧＦ刺激細胞増殖の阻害
ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害を次のアッセイにより評価した。１０％ＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂ−ＦＧＦを含むＨａｍｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ）中でＨＵＶＥＣ細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を増殖させ、第５および第６継代を使用した。１日目、６０００個の細胞をコラーゲン被覆９６ウェルプレート中の完全培地に接種した。その翌日、細胞を１００％Ｈａｍｓ  Ｆ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅと共に６時間プレインキュベートした。この後、培地をプレインキュベーションミックスと交換して、追加された５％ＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリン、およびゲンタマイシンを含有する培地を調製し、ＶＥＧＦ特異的結合タンパク質の希釈系列を１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１２１（Ｂｉｏｍｏｌ／Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）とプレミックスした。１：３ステップで希釈系列を作製し（指定どおり１．５μＭから出発して）、室温で１時間インキュベートした。各濃度を三重試験方式で試験した。ＶＥＧＦ特異的治療用モノクロナール抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）を対照として使用した（図示せず）。３日後、製造業者の説明書に従ってＷＳＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞の生存能を評価した。この阻害アッセイの結果が図４および表２に示される。他のＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質のさらなる結果が表２に示される（前掲）。本発明に係る結合タンパク質は、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ−Ａ誘発増殖の有意な阻害を明確に示す。
【図１】
2014526881.tif 000006
【図２】
2014526881.tif 000007
【図３】
2014526881.tif 000008
【図４】
2014526881.tif 000009
【配列表】
2014526881000001.app
【国際調査報告】
2014526881.tif 000010
2014526881.tif 000011
2014526881.tif 000012
2014526881.tif 000013