(57)【要約】  本発明は、試料内の標的分子を検出するための装置に関し、当該装置は、前記試料内の標的分子の測定のための試料容器、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子、及び、フラットセンサを覆うか又は第２の粒子上に存在する、第２の結合分子を含む表面構造体を含み、前記第１の粒子は、前記表面構造体の前記第２の結合分子に直接又は間接的に結合する能力を持ち、前記第１及び／又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して前記第１及び／若しくは第２の粒子の粒子表面、並びに／又は、フラットセンサの表面に間接的に付着し、前記リンカー分子の長さ及び堅牢性は、６０ｎｍを超える前記リンカーの平均伸展長さを生じるように選択され、さらに、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、前記試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する。さらなる態様において、本発明は、試料内の標的分子の存在又はその量を検出する方法に関する。本発明は、試料内の標的分子を検出するための、本発明による粒子の使用も記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の標的分子を検出するための装置であって、
（ａ）前記試料内の標的分子の測定のための試料容器、
（ｂ）前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子、及び、
（ｃ）フラットセンサを覆うか又は第２の粒子上に存在する、第２の結合分子を含む表面構造体、
を含み、
前記第１の粒子は、前記表面構造体の前記第２の結合分子に直接又は間接的に結合する能力を持ち、前記第１及び／又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して前記第１及び／若しくは第２の粒子の粒子表面、並びに／又は、フラットセンサの表面に間接的に付着し、前記リンカー分子の長さ及び堅牢性は、６０ｎｍを超える前記リンカーの平均伸展長さを生じるように選択され、さらに、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、前記試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する、装置。
【請求項２】
前記第１及び／又は第２の粒子は磁気粒子である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１及び／又は第２の粒子の直径は、少なくとも約１００ｎｍであり、さらに、前記平均伸展長さは、前記直径の少なくとも１０％である、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
剛直なリンカー分子は、該リンカー分子の輪郭長さの少なくとも２０％の平均伸展長さを有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記第１の結合分子が、抗体若しくはその断片、アプタマー、リガンド又は相補的な核酸である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記リンカー分子は、核酸分子又は非生物学的ポリマーであるか若しくは該核酸分子又は非生物学的ポリマーを含み、好ましくは、前記リンカー分子は、ｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ分子、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位及びＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位等の二本鎖核酸分子から成る群から選択される分子であるか又は該分子を含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記第１の粒子は、該粒子の表面に直接付着する反発的な表面構造体をさらに含み、該反発的な表面構造体は、前記粒子の特定の実効電荷及び／又は立体反発力を生じるように前記粒子の表面を覆い、さらに、前記反発的な表面構造体は、前記粒子上の押す効果を前記センサ表面に向けて運び、好ましくは、前記リンカー分子は、前記反発的な表面構造体よりも長い、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記反発的な表面構造体は、好ましくはｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位及びＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位等の核酸分子、ハイドロゲル並びにポリマーから成る群から選択される分子を含む電荷を持った構造体、又は、立体コーティングである、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記リンカー分子及び／又は前記反発的な表面構造体は、デオキシリボヌクレアーゼ、及び／又は、二本鎖核酸分子を切断する能力を持つ制限酵素によって切断可能ではない、請求項７又は８に記載の装置。
【請求項１０】
前記リンカー分子は、少なくとも１つの短い屈曲性のスペーサー、好ましくは、一本鎖核酸を含む短い屈曲性のスペーサーをさらに含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
試料内の標的分子の存在又はその量を検出する方法であって、
（ａ）請求項１乃至１０に記載の装置において、前記試料と、第１の粒子に付着した第１の結合分子とを接触させるステップ、
（ｂ）前記試料を、
ｉ）平らな表面又は第２の粒子に付着する能力を持つ第２の結合分子であり、前記第１の結合分子及び／又は前記第２の結合分子は、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ、第２の結合分子、及び、任意選択で、
ｉｉ）前記平らな表面又は第２の粒子に付着した標的アナログ分子であり、前記標的分子が、前記標的アナログ分子への前記第１の結合分子の結合に干渉する能力を持つ、標的アナログ分子、
に接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記平らな表面又は第２の粒子に結合した第１の粒子の数を検出するステップ、
を含み、
粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、前記試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する、方法。
【請求項１２】
前記粒子のクラスタ形成を促進するように、磁力が加えられて、前記粒子を前記固体の支持体又は互いの近くに導く、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記平らな表面又は第２の粒子への前記第２の結合分子の付着は、前記標的分子への前記第２の結合分子の結合に先立ち、又は、該結合の後に発生する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料内の標的分子を検出するための、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の粒子の使用。
【請求項１５】
前記標的分子は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又は副甲状腺ホルモンである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の装置、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の方法、又は、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内の標的分子を検出するための装置に関し、当該装置は、試料内の標的分子の測定のための試料容器、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子、及び、フラットセンサを覆うか又は第２の粒子上に存在する、第２の結合分子を含む表面構造体を含み、前記第１の粒子は、表面構造体の前記第２の結合分子に直接又は間接的に結合する能力を持ち、前記第１及び／又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して前記第１の粒子及び／若しくは第２の粒子の粒子表面、並びに／又は、フラットセンサの表面に間接的に付けられ、前記リンカー分子の長さ及び堅牢性は、６０ｎｍを超える前記リンカーの平均伸展長さ（ａｖｅｒａｇｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）を生じるように選択され、さらに、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する。さらなる態様において、本発明は、試料内の標的分子の存在又はその量を検出する方法に関する。本発明は、試料内の標的分子を検出するための、本発明による粒子の使用も記載する。
【背景技術】
【０００２】
普及力のある効果的な健康管理に対する要求が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断の世界を、統合されたランダムアクセス及びポイントオブケアでの解決の方向に動かしている。そのような解決の達成は要求の厳しいものであり、テストが迅速、敏感、定量的且つ正確である必要がある。さらに、テストが行われるプラットフォームは、使用するのが容易で且つコンパクトである必要がある。
【０００３】
アフィニティーアッセイは、生物学的分子を使用して、試料から特定の標的分子を捕獲し、さらに、その濃度の決定を可能にする。典型的に、アフィニティー捕獲は、捕獲分子で被覆されたナノ粒子又は微粒子を、試料液内に分散させることによって成し遂げられる（Ｌｕｃｈｉｎｉ等、２００８、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．、８（１）、３５０〜３６１）。典型的な親和性に基づくアッセイは、従って、診断アッセイ、タンパク質、ペプチド及び核酸等の研究における生体分子の検出等、莫大な数の用途において使用され、その結果、特定の生体分子に対する高い結合親和性によって典型的に特徴づけられる例えば抗体等のアフィニティー分子を使用している。原則として、官能性を持った磁気粒子はセンサ表面に引きつけられ、そこで粒子は、表面上に印刷された抗体等の捕獲プローブに間接的に、すなわち捕獲された解析物によって、又は、直接結合する。結合した粒子の数は、試料に存在する標的分子の量に正比例して又は逆比例して関連する。典型的に、そのようなバイオセンサ用途において、粒子は、表面のそばの粒子に敏感ないかなる技術も使用して検出することができ、そのような技術は、例えばＢｒｕｌｓ等、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００９、９．２５０４〜３５１０に記載されているように、散乱光又は内部全反射（ＦＴＩＲ）の検出等、光学的検出に基づいていることが多くある。
【０００４】
ＷＯ２００８／０８３３  Ａ１は、作用物質の検出のための方法、試薬及び装置を開示している。従来の直接及び間接的なサンドイッチアッセイに基づいた、試料における関心のある１つ又は複数の作用物質の検出に対するアッセイ型式が記載されている。
【０００５】
ＵＳ２００４／１１０２２０  Ａ１は、核酸を検出するための方法及び装置を開示している。特に、検出システムは、主に、オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子に基づいており、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合する（ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合物）。この明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の一部分（認識部分）に相補的な一部分を有し、標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする。
【０００６】
ＷＯ２００９／００５５５２  Ａ２は、試料内の構成要素の多価結合及び定量的捕獲のための方法及び組成物を記載している。特に、明白なＫｄを増やすための多価の「結合活性の」結合剤を生じるような従来のサンドイッチアッセイ型式の修正が記載されている。これは、２つ以上の抗体又は抗原を、「足場」につけることによって成し遂げられ、足場は、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ等、一本鎖又は二本鎖核酸等の主鎖ポリマーであってもよい。
【０００７】
ＵＳ２００９／１４８８６３は、官能性を持たせたナノ粒子に基づく検出プラットフォームを開示している。特に、ナノ粒子は、生物学的部分に結合するように適応され、次に、解析物に結合するよう適応させることができる第１の単層要素を含む。ナノ粒子表面は、表面上の第１の単層要素の曝露に寄与する第２の単層要素をさらに含み得る。ナノ粒子は、第１及び第２の単層を介して、例えば抗体等の捕獲分子に結合し、リアルタイムでの単一分子検出を可能にする。
【０００８】
ＥＰ１４４１２１７  Ａ２は、ＴＩＲ要素内に向けられた光の散乱の検出に基づく光導波路結合アッセイ、又は、種々の手段による特異的結合メンバー（ＳＢＭ）の固定化を介した導波路装置を記載している。
【０００９】
ＵＳ２００５／００４８５９９は、固定された基板上での微生物の検出を開示している。結合は、サンドイッチ構成の提供に基づいており、さらに、標的に特異的な手段（例えば、抗体又はアプタマー等）を介してタグを標的に結合させるタグ結合要素を介して生じる。指標要素は、検出器によって検出可能である。
【００１０】
しかし、従来技術のアフィニティーアッセイの重要な欠点は、標的分子を表面に結合させる官能性を持った粒子の結合が依然として非常に遅く、律速で非効率的であるという事実である。この遅い反応に対する１つの理由は、特に、小さな（例えば〜１０ｎｍの）標的分子を介して比較的大きな（例えば〜５００ｎｍの）粒子を表面に結合させることの難しさにある。標的及び粒子の相対的サイズを例示した図３において不均衡が描かれている。結果として、効率的な結合を生じる粒子−標的複合体の方向付けが多く存在するわけではない。粒子は、表面と接触した場合に回転することができるけれども、結合の確率は、それにもかかわらず、かなり小さい。
【００１１】
従って、フラットセンサの表面又は粒子の表面等、表面に効率的に結合する能力を持つ新規の粒子−標的構造を設計する必要がかなりある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、これらの要求に取り組み、表面に対する粒子の結合効率を高めるための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的は、特に、試料内の標的分子を検出するための装置によって達成され、当該装置は、試料内の標的分子の測定のための試料容器、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子、及び、フラットセンサを覆うか又は第２の粒子上に存在する、第２の結合分子を含む表面構造体を含み、前記第１の粒子は、表面構造体の前記第２の結合分子に直接又は間接的に結合する能力を持ち、前記第１及び／又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して前記第１の粒子及び／若しくは第２の粒子の粒子表面、並びに／又は、フラットセンサの表面に間接的に付けられ、前記リンカー分子の長さ及び堅牢性は、６０ｎｍを超える前記リンカーの平均伸展長さを生じるように選択され、さらに、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する。
【００１４】
本発明は、どのようにして表面に対する大きな粒子の結合の確率を、特定の長さを有する粒子リンカー分子に標的を付けることによって有意に上げることができるかを記載している。意外にも、長く剛直なリンカー又はスペーサー分子の提供によって、従来技術において使用される粒子の結合の難しさが克服され、従って、より効果的な結合が可能になるということを観察することができる。
【００１５】
図４は、本発明の根底にある原理を例示している。粒子が表面に結合することができるあり得る向きの数は、付着点が粒子からかなり離れて位置する場合に非常に増える。しかし、長いスペーサー分子の使用は、問題を必ずしも解決するわけではない。図５は、例えばＰＥＧ分子等の非常に長いリンカーが使用された場合であっても、分子の屈曲性がむしろ折り畳みをもたらし、球状構造を生じ、従って、粒子表面からの捕獲分子の小さな伸展を生じることを例示している。
【００１６】
理論に縛られることなく、観察された結合効率の増加に対する１つの説明は、粒子表面から離して結合分子を位置付けるための長く剛直なリンカー分子の使用によって、粒子を表面に結合することの結合キネティクス（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）が有意に高められるということである。本願の発明者等は、結果として生じる末端間距離が、分子の平均伸展長さ、輪郭長さ（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｌｅｎｇｔｈ）及び剛直性の関数であるということを認め、さらに、これらの特徴は観察された高められた結合キネティクスに対して有意に寄与することを実証することができた。
【００１７】
５００ｎｍのストレプトアビジンで被覆されたナノ粒子、及び、可変長のリンカー分子として剛直なｄｓＤＮＡ分子を使用した実験において、特に、結合した粒子の数はｄｓＤＮＡリンカーの長さと共に増えるということを示すことができた（図６を参照）。特に、本発明者等は、粒子上のリンカー分子の長さがセンサの表面にて結合した粒子の数に本質的に寄与するということを実証することができた。これらの発見、及び、本明細書において詳細に記載される他の発見は、改善されたリンカー設計の開発をもたらした。従って、本明細書において記載されるリンカー構造は、高められた結合キネティクスの原因であり、従って、ナノ粒子ベースのアフィニティーアッセイの速度、有効性及び精度を改善する。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、第１及び／又は第２の粒子は磁気粒子である。
【００１９】
さらに好ましい実施形態において、前記第１及び／又は第２の粒子の直径は、少なくとも約１００ｎｍである。さらに好ましい実施形態において、上記のリンカーの平均伸展長さは、少なくとも約１００ｎｍの直径を有する粒子の直径の少なくとも１０％である。
【００２０】
さらに別の好ましい実施形態において、前記剛直なリンカー分子は、前記リンカー分子の輪郭長さの少なくとも２０％の平均伸展長さを有する。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態において、第１の結合分子は、抗体若しくはその断片、アプタマー、リガンド又は相補的な核酸である。
【００２２】
本発明の特定の実施形態において、前記リンカー分子の剛直性及び長さは、リンカーの末端間距離の二乗平均√＜Ｒ２＞を介して決定され、ここで、＜Ｒ２＞は、以下の式
【００２３】
【数１】
2014533831.tif 000002
に従って記載することができ、式中、Ｐはポリマーの持続長であり、さらに、ｌはリンカーの輪郭長さである。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、リンカー分子は、核酸分子又は非生物学的ポリマーであるか若しくはそれを含む。特に好ましい実施形態において、リンカー分子は、ｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ分子、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位及びＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位等の二本鎖核酸分子から成る群から選択することができる。
【００２５】
さらに別の特に好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、ｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位又はＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位である。
【００２６】
本発明の最も好ましい実施形態において、リンカー分子はｄｓＤＮＡである。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態において、第１の粒子は、該粒子の表面に直接付着する反発的な表面構造体をさらに含み、該反発的な表面構造体は、粒子の特定の実効電荷（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）及び／又は立体反発力を生じるように粒子の表面を覆い、さらに、前記反発的な表面構造体は、前記粒子上の押す効果（ｐｕｓｈｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を前記センサ表面に向けて運ぶ。
【００２８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、リンカー分子は、前記反発的な表面構造体よりも長い。
【００２９】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記反発的な表面構造体は、電荷を持った構造体である。
【００３０】
特に好ましい実施形態において、電荷を持った構造体は、例えばｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位及びＲＮＡ−ＤＮＡ等、二本鎖核酸等の核酸、ハイドロゲル並びにポリマーから成る群から選択される分子であるか又は該分子を含む。
【００３１】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態において、前記反発的な表面構造体は立体コーティング（ｓｔｅｒｉｃ  ｃｏａｔｉｎｇ）である。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施形態において、リンカー分子及び／又は前記反発的な表面構造体は、二本鎖核酸分子を切断する能力を持つデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）及び／又は制限酵素によって切断可能ではない。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態において、リンカー分子は、少なくとも１つの短く屈曲性のスペーサーをさらに含む。
【００３４】
さらに別の好ましい実施形態において、短く屈曲性のスペーサーは、一本鎖核酸を含む。
【００３５】
本発明は、さらなる態様において、試料内の標的分子の存在又はその量を検出する方法に関し、当該方法は、
（ａ）本発明による装置において、試料と、第１の粒子に付着した第１の結合分子とを接触させるステップ、
（ｂ）前記試料を、
ｉ）平らな表面又は第２の粒子に付着する能力を持つ第２の結合分子であって、第１の結合分子及び／又は第２の結合分子は、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ、第２の結合分子、
ｉｉ）平らな表面又は第２の粒子に付着した標的アナログ分子であって、標的分子が、標的アナログ分子への第１の結合分子の結合に干渉する能力を持つ、標的アナログ分子、
に接触させるステップ、並びに
（ｃ）第２の結合分子への第１の結合分子の結合によって平らな表面又は第２の粒子に結合した第１の粒子の数を検出するステップ、
を含み、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する。
【００３６】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、粒子のクラスタ形成を促進するように、磁力が加えられて、粒子を前記固体の支持体又は互いの近くに導く。
【００３７】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、平らな表面又は第２の粒子への前記第２の結合分子の付着は、標的分子への第２の結合分子の結合に先立ち、又は、該結合の後に発生する。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態において、結合した粒子の検出は、表面付近の前記結合した粒子からの内部全反射（ＦＴＩＲ）を介して、若しくは、散乱光の測定を介して、又は、クラスタ形成の光学的検出を介して発生する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、試料内の標的分子を検出するための、本明細書に記載された粒子の使用を記載する。
【００４０】
本発明の特に好ましい実施形態において、本明細書において先に記載した装置、方法又は使用と関連して述べた標的分子は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又は副甲状腺ホルモンである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＦＴＩＲ検出の原理を示した図である。光源からの光がカートリッジに入り、カートリッジ／液体インターフェースから反射され、さらに、検出器上で画像化される。このインターフェース上に生じるエバネッセント場において粒子が存在する場合、反射光の強度は低下する。
【図２】Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ技術を使用したサンドイッチイムノアッセイを示した図である。パネル（１）において、標的に対して作られた一次抗体で被覆された磁気粒子が試料内で分散され、標的に結合する。パネル（２）において、上部及び底部のコイルが、パルスの様式で磁気粒子を作動させ、センサ表面への結合を生じ、該センサ表面では、二次抗体が、結合した標的分子に結合することができる。パネル（３）において、結合していない粒子がセンサ表面から除去され、さらに、エバネッセント場を使用して、結合した粒子が検出される。
【図３】センサ表面と５００ｎｍの粒子（完全には表示されず）との間にはさまれた１０ｎｍの標的分子（黒）の相対的サイズを例示した図である。左の図において、粒子は結合を形成するよう適切に方向づけられ、右の図において、粒子は結合を形成するよう適切に方向づけられていない。
【図４】付着点（小さな黒の円によって表される）が粒子からさらに伸展される場合に粒子が表面に結合することができる増加した数の向きを例示した図である。
【図５】ＰＥＧリンカー（左）又はｄｓＤＮＡリンカー（右）を介して表面に付着した抗体の伸展の比較を示した概略図であり、どちらも同じ輪郭長さを有している。
【図６】ＤＮＡリンカー長の関数として、結合した粒子の数を示したグラフである。５００ｎｍのストレプトアビジンで被覆された粒子を、可変長のｄｓＤＮＡと共にインキュベートした。各ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の一末端にて１つのビオチン部分を含有し、分子のもう一方の末端にてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子を含有した。粒子及びＤＮＡを含有した溶液をカートリッジ内に注入し、磁気引力を使用して、抗Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ抗体で被覆したセンサ表面に結合させた。結合していない粒子を表面から除去した短い磁気洗浄ステップの後で、表面に結合した粒子の数を繰返し登録することによって、（時間単位にあたり結合した粒子の数で表される）結合率を決定した。
【図７】ＤＮＡリンカー長の関数として、結合した粒子の数を示した図である。詳細は、図６の詳細と類似しているが、１０００ｎｍの直径を有した粒子を使用した。
【図８】高いリンカー分子の表面密度を有した粒子を示した図である。リンカー分子は比較的伸びているけれども、高い立体障害がリンカーの移動度を減少させる。
【図９】結合キネティクスに対するリンカー表面密度の効果を描写した図である。アッセイ型式の概略図を示した上の図において、ストレプトアビジンで被覆された５００ｎｍの粒子（オレンジ）が、１つの標的分子に結合しており、一末端にビオチンを有し、もう一方の末端にはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子が付着したｄｓＤＮＡ鎖（青いひし形）は、抗Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ抗体で被覆したセンサ表面に結合するのに利用できる。後に、異なる量の官能性を持っていない同じ長さの（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子を欠いた）ｄｓＤＮＡも、粒子に結合させ、さらに、センサ表面に結合する粒子の能力が比較される。中央の図において、１９９９ｂｐのｄｓＤＮＡを使用した粒子の負荷実験が、１つの官能性を持ったＤＮＡ分子のみを有した粒子と比較した、官能性を持っていないＤＮＡの負荷後に結合した粒子の相対量を表示している。下の図において、同じグラフが、４９７ｂｐのＤＮＡに対して示されている。
【図１０】長く剛直なリンカーを介して表面に付着した捕獲分子を予め負荷した粒子を示した図である。アッセイの間、標的分子（ひし形）は粒子に結合し、後に、表面に結合する。
【図１１】表面に直接付着した捕獲分子を予め負荷した粒子を描写した図である。アッセイの間、標的分子（ひし形）は、粒子、及び、標的を認識する第２の捕獲分子に結合し、第２の捕獲分子は、長く剛直なリンカーに接続されている。リンカーのもう一方の末端は、認識要素（例えばビオチン）に接続されており、認識要素は、センサ表面上の適合性のある捕獲分子（例えばストレプトアビジン）に結合することができる。
【図１２】特異的相互作用（左）又は非特異的相互作用（右）を介して表面に結合した粒子を示した図である。
【図１３】あり得るリンカー設計を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、試料内の標的分子を検出するための手段及び方法に関する。本発明は特定の実施形態に関して記載されるけれども、この記載は、限定的な意味で解釈されることはない。
【００４３】
本発明の例証的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するのに重要な定義が与えられる。
【００４４】
本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の不定冠詞は、その前後で何か他に明確に指示していない限り、それぞれの複数形も含む。
【００４５】
本発明と関連して、「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的に、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、及び、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を示している。
【００４６】
「含む」という用語は限定的ではないと理解すべきである。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう規定される場合、これは、好ましくはこれらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。
【００４７】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された順序以外の順序で操作できることを理解されたい。
【００４８】
「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「ｉ」、「ｉｉ」等の用語が方法又は使用又はアッセイのステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において上記又は下記に定められたように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。
【００４９】
本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、試薬等は変わり得るためこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されたい。定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５０】
上記のように、本発明は、一態様において、試料内の標的分子を検出するための装置に関し、当該装置は、試料内の標的分子の測定のための試料容器、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子、及び、フラットセンサを覆うか又は第２の粒子上に存在する、第２の結合分子を含む表面構造体を含み、前記第１の粒子は、表面構造体の前記第２の結合分子に直接又は間接的に結合する能力を持ち、前記第１及び／又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して前記第１の粒子及び／若しくは第２の粒子の粒子表面、並びに／又は、フラットセンサの表面に間接的に付けられ、前記リンカー分子の長さ及び堅牢性は、６０ｎｍを超える前記リンカーの平均伸展長さを生じるように選択され、さらに、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する
本発明によって構想されるのは、好ましくはバイオセンサシステムを使用した標的分子の検出のための適した装置である。試験試料又は試料体積内の解析物の存在及び／又は量を検出するための種々の解析手順は当技術分野において既知である。典型的に、そのような検出システムは、関心のある解析物に結合するために適した結合分子で官能性を持たせた粒子を光学的に検出することができる。解析物の存在又は量は、粒子に結合した解析物の数から結論づけることができる。解析物の存在又は量は、粒子クラスタの数からも結論づけることができる。本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載された装置を含むバイオセンサシステムは、本明細書に記載されたフラットセンサに結合した単一の粒子、又は、粒子クラスタの存在を検出する、及び、磁場発生装置によって生じた磁場により粒子を作動させる能力を持ち得る。
【００５１】
本明細書において使用される場合「磁場発生装置」は、典型的に、本明細書において記載される、サンプルチャンバを有した磁場を発生させるための光磁気装置内に１つ又は複数の磁石を含み、前記磁場は、接触表面に向けて磁気粒子を導くべきである。磁場は、典型的には、磁気（双極子）粒子に対して磁力を及ぼすことを可能にするゼロでない勾配を有する。そのような磁場発生装置の適した例、又は、そのような磁場発生装置を含む適したシステムは、当業者には既知である。本発明の特定の実施形態において、磁場発生装置は、Ｂｒｕｌｓ等、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００９、９．２５０４〜３５１０に記載された磁場発生装置であってもよく、又は、Ｒａｎｚｏｎｉ等、２０１１、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．、１１、２０１７〜２０２２に記載されたシステムに含まれるか若しくはその一部であってもよい。
【００５２】
典型的には、磁気粒子は、解析手順を速めることができるように、磁場を加えることによって作動させることができる。本発明の特定の実施形態において、磁場の使用によって、非特異的に結合した粒子が除去されるため、バックグラウンド信号を減らすことができるということも構想される。図２は、どのようにして粒子を作動させて、本明細書において記載されるフラットセンサから非特異的に結合したか又は結合していない粒子を効果的に除去することができるかという一例を示している。パルスの様式で作動させることができる上下のマグネットは、結合していない粒子を効率的に除去するため、結合した粒子がセンサ表面にて検出される。
【００５３】
本発明と関連して使用される磁気作動は、異なって、すなわち、試料内の磁気粒子を一続きに配置して、粒子のクラスタ形成を速めるために使用することができる。形成されたクラスタの存在及び量を決定するために、磁気作動を使用して、粒子クラスタを振動及び回転させることも本発明によって構想される。特定の実施形態において、粒子の磁気作動は、パルスとして生じてもよく、すなわち、作動場（ａｃｔｕａｔｉｏｎ  ｆｉｅｌｄ）は、少なくとも一度、休止期によって中断される。繰返しパルスによる動的作動は、非特異的相互作用を減らし、さらに、結合事象の数を増やすと分かってきている。粒子クラスタの検出に基づき使用する標的分子の検出に関するさらなる詳細及びパラメータは、当業者には既知であるか、又は、Ｒａｎｚｏｎｉ等、２０１１、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．、１１、２０１７〜２０２２から得ることができる。
【００５４】
本発明における使用に適したバイオセンサシステムは、例えば、試料容器を含むバイオセンサカートリッジ、粒子を感知するためのセンサ装置、検出システム、及び任意で、磁場発生装置を含んでもよい。当該システムは、さらなる実施形態において、例えばスクリーン又はプリンター等の読み取りシステム、データベース又はコンピュータシステムのためのインターフェース、較正ユニット、ハイスループット装置との直接又は間接的な接続性等、１つ又は複数のさらなる機能ユニットを含んでもよい。本発明によって特に構想されるのは、アッセイ型式を含むカートリッジを挿入することができる、迅速且つ即時の解析のためのハンドヘルド装置である。典型的に、そのような装置は、好ましくは充電式電池の形の電源、ディスプレイ、迅速なデータベースアクセス、又は、研究所情報システムへのアクセスのためのＷＬＡＮ等の無線接続性を含む。本発明に関連して使用することができる例証的なバイオセンサシステムは、Ｂｒｕｌｓ等、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００９、９．２５０４〜３５１０に記載されている。
【００５５】
特に好ましいのは、表面付近又は表面での粒子の光学的検出に基づく感知装置である。限定されることなく、光源及び光検出システムを含む例証的な装置が図１において例示されている。
【００５６】
本明細書において使用される場合「試料」は、本明細書において規定される標的分子を含むいかなる試料も意味する。そのような試料は、例えば、便、全血、血清、血漿、涙、唾液、鼻からの液体、痰、耳からの液体、生殖器液、乳房からの液体、母乳、初乳、胎盤からの液体、羊水、汗（ｐｅｒｓｐｉｒａｔｅ）、滑液、腹水、脳脊髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸水、心膜液、精液、上気道液、腹水、免疫応答の部位から収集した液体、プールされた回収部位から収集した液体、気管支肺胞洗浄液、尿、例えば肺、筋肉、脳、肝臓、皮膚、膵臓、胃等、例えば全ての適した臓器からの生検材料、有核細胞試料、粘膜表面、髪、若しくは皮膚と付随する液体由来の試料又は上記を含む試料を含んでもよい。加えて、例えば水の試料、肉又は家禽の試料、あり得る汚染源からの試料等、環境源由来の試料を使用してもよい。
【００５７】
本明細書において使用される場合「標的分子」という用語は、結合分子によって結合したいかなる分子も意味し、例えば、生体分子、好ましくはバイオマーカー、複合体、細胞分画、又は複数の細胞等、生物学的物質であってもよい。好ましくは、本発明と関連した標的分子は、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド等、核酸である。さらにより好ましいのは、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、タンパク質若しくはポリペプチドの断片、機能タンパク質若しくはポリペプチドのドメイン、薬物分子、小分子、又はビタミン等の標的分子である。
【００５８】
標的分子は、本明細書において先に記載された試料から直接得ることができる。他の状況において、試料は、例えば、結合パートナー、すなわち、本明細書において規定されるアフィニティー分子に対して標的分子をより利用できるようにする部分精製を含む、例えば標準的な手順に基づく試料調製技術に晒してもよい。例えば、血液試料を遠心分離して、血清からの細胞全体又は膜を含む分画を分けることができ、便試料を区分して、生理学的に受け入れられる緩衝液及び界面活性剤でホモジナイズすることができ、痰試料を液化及び分画することができる。さらに、抗生物質又は殺菌剤を試料に加えて、存在するいかなる生物のさらなる成長も防ぐことができる。細胞全体を除去することもでき、又は、溶解してその内容物を放出することができる。
【００５９】
本明細書において使用される場合「試料容器」は、ガラス、いかなる透明なプラスチック、又は、半導体のようないかなる適した材料から作製される容器も意味し、その中で試料は測定される。本明細書において記載される磁気粒子は、試料が導入される場合に試料容器内にすでに存在していてもよく、試料と共に導入されてもよく、又は、試料容器内に試料が注入された後に導入されてもよい。試料容器は、第２の結合分子を含むセンサ表面をさらに含んでもよい。好ましくは、センサ表面は、試料容器の底に置かれる。試料容器は、特定の実施形態において、例えば、センサ装置とは分けられた独立型の要素内等、交換可能なカートリッジ内に置いてもよい。試料でのあり得る汚染のため、そのようなカートリッジは、好ましくは、例えば射出成形によってプラスチックから作製された使い捨てのアイテムであってもよい。さらに構想されるのは、例えば、洗浄若しくは滅菌することができるカートリッジ又はカートリッジの一部等、再利用可能なカートリッジ又は再利用可能なカートリッジの一部である。
【００６０】
本明細書において使用される場合「フラットセンサ」は、実際のセンサ事象が発生するか又は検出される領域を画定している。典型的に、フラットセンサは、試料容器の底に置かれる。フラットセンサは、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する結合した粒子の数の検出に役立ち得る。本発明に関連して使用することができるそのようなフラットセンサ及び対応するセンサの例は、Ｂｒｕｌｓ等、２００９、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、９、３５０４〜３５１０において提供されている。
【００６１】
本明細書において使用される場合「粒子」という用語は、体積又は質量等の物理的特性が基づき得る小さい局在した物体を意味する。本発明に関連して、粒子は、当業者には既知のいかなる適した材料も含むか又は該材料から成り、例えば粒子は、無機若しくは有機材料を含むか、又は、該材料から成る若しくは該材料から本質的に成ってもよい。典型的に、粒子は、金属若しくは金属の合金又は有機材料を含むか、又は、それから成る若しくはそれから本質的に成ってもよく、或いは、炭水化物要素を含むか、又は、該要素から成る若しくは該要素から本質的に成ってもよい。構想される材料の例として、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ、及び、強磁性金属、合金、又は、組成材料が挙げられる。特に好ましいのは、磁性若しくは強磁性の金属、合金又は組成物である。本発明に有用な特に好ましい粒子は、超常磁性の粒子である。本明細書において使用される場合「超常磁性」という用語は、小さい強磁性又は強磁性のナノ粒子に現れる磁性の形を記載している。十分に小さいナノ粒子において、温度の影響下で磁化が無作為に向きを反転することは当技術分野において既知である。２つの反転間の時間は、ネール緩和時間と呼ばれる。外部磁場の非存在下で、ナノ粒子の磁化を測定するために使用される時間がネール緩和時間よりもはるかに長い場合、磁化は、平均ゼロである、すなわち、常磁性状態にあるようにみえる。そのような状態において、外部磁場は、常磁性体と同様にナノ粒子を磁化することができる。しかし、磁化率は、常磁性体の磁化率よりもはるかに大きい。さらなる好ましい実施形態において、材料は、特定の特性を有してもよい。材料は、例えば、磁性又は非磁性であってもよい。材料は、他の実施形態において、疎水性又は親水性であってもよい。さらなる特定の実施形態において、粒子は、プラスチック粒子である。プラスチック粒子の例として、例えば精製に一般的に使用されるラテックス又はポリスチレンビーズが挙げられる。さらに別の実施形態において、粒子は、細胞様粒子であってもよい。本明細書において使用される場合「細胞様粒子」という用語は、生物学的システムに存在するか、又は、生物学的システム若しくは生物学的システムの一部の形及び／又は機能を有する生物学的若しくは半生物学的構造体を意味する。好ましい例又は細胞様粒子はリポソームである。
【００６２】
本明細書において使用される場合「リポソーム」という用語は、例えば二重層等、例えば脂質又はリン脂質の膜若しくは層を含む小胞を意味する。典型的に、リポソームは、例えば薬物分子又は医薬組成物等、分子で満たすことができ、さらに、そのような分子を、例えば癌細胞又は感染領域等の標的部位まで送達するために使用することができる中空構造体である。リポソームは、好ましくは、リン脂質から作製される複合構造体であってもよく、さらに、例えば、（エッグホスファチジルエタノールアミンのような）混合した脂質鎖又は他の界面活性剤を有した天然由来のリン脂質から構成される少量の他の分子を含有してもよい。リポソームは、ナノメートル範囲から数１０マイクロメートルまでサイズを変えてもよい。さらなる特定の実施形態において、粒子は、セファロース又はアガロースを含む、セファロース又はアガロースから本質的に成る、若しくは、セファロース又はアガロースから成ってもよい。
【００６３】
さらに、粒子は、その輸送及び特性の観点から全ユニット（ｗｈｏｌｅ  ｕｎｉｔ）のように本質的に振る舞う。粒子は、従って、対称的な、球状、本質的に球状若しくは球形のものであってもよく、又は、不規則な非対称の形状若しくは形のものであってもよい。
【００６４】
本発明によって構想される粒子のサイズは、典型的に、５０ｎｍから５０μｍに及ぶ。好ましいのは、ナノメートルから数マイクロメートルまでのマイクロメートルの範囲の粒子である。さらに好ましい実施形態において、粒子直径は１００ｎｍよりも大きい。本明細書において使用される場合「直径」という用語は、粒子の中心を通り且つその端点が粒子表面上にあるいかなる直線の部分も意味する。非球形又は半球形の粒子の場合、直径は、粒子の中心を通り且つその端点が粒子表面上にある最大及び最短の直線部分の平均直径として理解される。本明細書において規定される粒子の半径は、本明細書において先に規定されたその直径の半分であることがさらに理解される。特に好ましいのは、例えば、約１００ｎｍから１０マイクロメートル、より好ましくは１００ｎｍから３μｍ、さらにより好ましくは、例えば３００ｎｍ、３１０ｎｍ、３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍ、３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、６２０ｎｍ、６５０ｎｍ、６７０ｎｍ、７００ｎｍ、７２０ｎｍ、７５０ｎｍ、７７０ｎｍ、８００ｎｍ、８２０ｎｍ、８５０ｎｍ、８７０ｎｍ、９００ｎｍ、９２０ｎｍ、９５０ｎｍ、９７０ｎｍ、１０００ｎｍ又はこれらの間のいかなる値等、３００ｎｍから１０００ｎｍの直径の粒子等のナノ粒子である。さらにより好ましいのは、約５００ｎｍの直径を有するナノ粒子である。
【００６５】
好ましくは、本発明による粒子は、第１の結合分子又は第２の結合分子で官能性を持たせている。本明細書に記載される電荷を持った構造体をさらに含む粒子も、本発明の特定の実施形態によって構想される。
【００６６】
特に好ましい実施形態において、前記材料は磁気材料である。さらなる特に好ましい実施形態において、本明細書において先に規定された表面構造体が存在するか、又は、本発明による第１若しくは第２の結合分子が付着する実体は、磁気ナノ粒子である。
【００６７】
本発明の特に好ましい実施形態において、材料、又は、例えばナノ粒子等の粒子は超常磁性の粒子であってもよく、超常磁性の粒子は、典型的に、水溶液において分散され、さらに、例えば負若しくは正の電荷等、小さい電荷を保持するか、又は、特定のゼータ電位を所有してコロイド安定性を確実にし、粒子を分けたままにし且つ非特異的なクラスタ形成を回避している。
【００６８】
本発明によって構想されるのは、少なくとも２つのタイプの粒子、すなわち、第１及び第２の粒子である。
【００６９】
本明細書において使用される場合「第１の粒子」という用語は、第１の結合分子で官能性を持たせた本明細書において記載される粒子を意味する。第１の結合分子は、関心のある標的分子に特異的に結合する能力を持ついかなる分子であってもよい。第１の粒子は、従って、捕獲粒子として機能する。第１の結合分子は、本明細書において規定される長く剛直なリンカー分子を介して間接的に表面に付着することができる。第１の粒子の表面は、本明細書において記載される電荷を持った構造体等のさらなる構造体によってさらに修飾することができる。
【００７０】
本明細書において使用される場合「第２の粒子」という用語は、第２の結合分子で官能性を持たせた本明細書において記載される粒子を意味する。本発明によって構想されるのは、第２の粒子が、第２の結合分子を含む本明細書において記載される表面構造体を含むということである。さらに本発明によって構想されるのは、第２の粒子は、標的分子の結合によって第１の粒子に結合することができるということである。第２の粒子は、従って、第２の結合分子の結合を介して標的分子に結合する能力を持つ。標的分子を捕獲した第１の粒子の、第２の粒子に対する構想される結合は粒子クラスタを形成し、粒子クラスタは、本明細書において記載のように検出することができる。粒子クラスタの数は、従って、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する。
【００７１】
本明細書において使用される場合「結合分子」という用語は、第２の分子、すなわち、相互作用パートナーに対して高い結合親和性を有するいかなる分子も意味する。本発明という意味での結合分子は、典型的に、生体分子若しくはバイオマーカー等の本明細書に規定される特異的な標的分子に結合する能力を持つか、或いは、例えばウイルス、又は、細胞若しくは細胞断片、又は、組織由来の材料等、分子含有標的実体に結合する能力を持つ結合又は捕獲部分を含む。
【００７２】
特に好ましい実施形態において、結合分子は、アプタマー、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、特に、相補的な核酸、分子インプリントポリマー、リガンド又は受容体、及びレクチンから成る群から選択され、結合分子は、好ましくは、抗体若しくはその断片、又は、相補的な核酸である。
【００７３】
結合分子と関連して使用される場合「アプタマー」は、本明細書において規定される標的分子、好ましくは、本明細書において規定される核酸標的分子に結合する能力を持つ、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＰＮＡ分子等の短い核酸分子、又は、当業者には既知のいかなる他の適した核酸型式であってもよい。さらに、本発明は、ペプチドアプタマー、すなわち、１つ又は複数の特定のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドに特異的に結合することができるアプタマーを構想する。典型的に、１つ又は複数のペプチドアプタマーは、例えば１０から２０のアミノ酸を含む１つ又は複数の可変のペプチドループである。本発明と関連して、１つ又は複数のペプチドアプタマーは、特定の実施形態において、１つ又は両方の末端にて、足場構造体に付着させることができる。足場構造体は、いかなる分子、好ましくは、例えば、優れた溶解特性を有するタンパク質等のタンパク質であってもよい。適した足場分子は、当業者には既知であるだろう。本発明と関連して使用されることになる適した足場分子の例は、細菌タンパク質のチオレドキシンＡである。アプタマーペプチドループは、好ましくは、足場分子の還元活性部位内に挿入することができる。或いは、ブドウ球菌プロテインＡ及びそのドメイン、並びに、プロテインＺ又はリポカリン等のこれらのドメインの誘導体を、本発明と関連して足場構造体として使用してもよい。核酸又はペプチドアプタマーは、例えばＰＣＲ若しくは分子合成アプローチ、又は、酵母ツーハイブリッドアプローチを介して等、当業者には既知のいかなる適した方法に従っても作製することができる。
【００７４】
「ペプチド」は、アミノ酸鎖から成る。結合分子と関連して使用される場合、ペプチドは、２から３５のアミノ酸、アミノ酸誘導体若しくはその混合物のひと配列を含んでもよく、又或いは、該ひと配列から成ってもよい。ペプチドは、直線的、分枝状、環状又はその混合であってもよい。ペプチドアフィニティー分子も、本明細書において先に規定された足場構造体に付着させることができる。
【００７５】
「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーであり、１つのポリペプチド鎖、又は、生物学的に機能的な方法で典型的に一緒にされた２つ以上のポリペプチド鎖を含んでもよい。結合分子と関連して使用される場合、タンパク質は、約３５を超えるアミノ酸、アミノ酸誘導体若しくはその混合物のひと配列を含んでもよく、又或いは、該ひと配列から成ってもよい。タンパク質は、直線的、分枝状、環状の形を有してもよく、又は、これらの形の混合を含んでもよい。タンパク質結合分子も、本明細書において先に規定された足場構造体に付着させることができる。
【００７６】
結合分子と関連して使用される場合「オリゴヌクレオチド」は、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、好ましくは、約１５から６０ヌクレオチドのひと配列等、約５から１２０ヌクレオチドのひと配列を含んでもよく、又或いは、該ひと配列から成ってもよい。オリゴヌクレオチド結合分子は、好ましくは、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＰＮＡ分子、又は、その混合物であってもよい。構想されるのは、相補的な核酸分子の結合分子である。「相補的な核酸分子」という用語は、一本鎖が互いに対して相補的である規定された配列の分子を意味する。塩基対の形成のため、二本鎖核酸分子の相補的な鎖が、互いに対して強い親和性を有するということは当技術分野において既知である。さらに構想されるのは、本明細書において規定されるリンカー分子構造体に付着されるか又は該構造体に組み込まれる一本鎖のオリゴヌクレオチド配列である。特に好ましい実施形態において、そのような適したリンカーも、核酸分子を含むか又は核酸分子から成る。一本鎖のひと配列は、関心のある相補的なヌクレオチド配列を認識し、且つ、高い親和性で該配列とハイブリッド形成する能力を持つ。そのような解析において、標的分子は、結合分子に相補的又はほぼ相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００７７】
本明細書において使用される場合「分子インプリントポリマー」という用語は、後に抽出され、相補的な空洞を残す分子の存在下で形成したポリマーを意味する。典型的には、分子インプリントポリマーは、元の分子に対する特定の化学的親和性を示す。分子インプリントポリマーは、当業者には既知のいかなる適したポリマー単位（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｕｎｉｔ）で構成されてもよい。その生成に対する技術は、塊状重合、沈殿重合、乳化重合、懸濁重合、分散重合、ゲル重合、及び、多段階膨潤重合等の重合技術を含む。特に好ましいのは、階層的インプリンティング法である。
【００７８】
結合分子と関連して使用される場合「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を意味し、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ等）いかなるタイプ、（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２等）クラス、又は、サブクラスの免疫グロブリン分子でもあり得る。本発明の抗体は、認識又は特異的に結合する、例えば本発明のポリペプチド等の標的遺伝子の１つ又は複数のエピトープ若しくはタンパク質の観点から記載又は特定してもよい。特異的なエピトープ及びその抗体との相互作用は、当業者には既知であるだろう。本明細書において使用される場合「特異的に結合する」という用語は、免疫特異的な検出、及び、抗原エピトープに対する抗体の結合を意味する。「特異的に結合する」という用語は、非特異的な結合を除くが、他の抗原、特に、存在する抗体によって検出される同じ抗原エピトープを含む抗原との交差反応性を必ずしも除くというわけではない。
【００７９】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多選択性抗体、ヒト抗体、ヒト化若しくはキメラ抗体、単鎖抗体であってもよく、又は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されるフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、完全長免疫グロブリン分子、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、ＶＨＨ含有抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び、上記のいずれかの１つ又は複数のいかなるエピトープ結合フラグメントを構成してもよい。最も好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、さらに、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、並びに、ＶＬ又はＶＨドメインを含むフラグメントを含む。
【００８０】
本発明による抗体は、鳥類及び哺乳類を含むいかなる動物由来であってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ（例えばマウス及びラット）、ロバ、サル、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリの抗体である。
【００８１】
本発明による抗体は、単一特異性、二特異性、三特異性の抗体、又は、さらなる多選択性のものであってもよい。多選択性抗体は、例えば本発明によるポリペプチド等の標的分子の異なるエピトープに対して特異的であってもよく、又は、例えば本発明によるポリペプチド等の標的分子に対しても、異種ポリペプチド等の異種エピトープ又は固体の支持材料に対しても特異的であってもよい。好ましくは、単一特異性の抗体である。
【００８２】
本明細書において使用される場合「リガンド」という用語は、一般的に、生体分子等の標的分子との複合体を形成し、従って、高い結合親和性で分子に特異的に結合することができる物質を意味する。特に、リガンドは、標的タンパク質上の部位に結合する能力を持つ信号トリガ分子であってもよい。リガンドは、受容体と呼ばれることが多くある結合パートナーに結合することが多い。標的分子の検出において使用するための受容体−リガンド結合システムは、当技術分野において既知である。典型的には、受容体に結合するリガンドは、受容体タンパク質の化学的な高次構造、すなわち三次元形状を変える。受容体タンパク質の立体構造は、受容体の機能状態を決定する。本発明と関連した適したリガンドは、例えば、酵素基質、酵素阻害物質、受容体アゴニスト及びアンタゴニスト、ＤＮＡ結合タンパク質等のアクチベーター又は神経伝達物質を含んでもよい。
【００８３】
本明細書において使用される場合「レクチン」という用語は、複雑な複合糖質の糖鎖を特異的に認識する能力、及び、認識されたグリコシルリガンドのいずれの共有結合構造も変えることなく前記糖鎖に可逆結合する能力を持つタンパク質又は糖タンパク質を意味する。本発明と関連した適したレクチンの例として、細胞壁又は膜内の糖部分に結合することができる、細菌性及び植物性毒素のような一価レクチンが挙げられる。本発明の意味の範囲内の他の適したレクチンは、マンノース結合レクチン、ガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトースアミン結合レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合レクチン又はフコース結合レクチンである。
【００８４】
本明細書において使用される場合「第１の結合分子」という用語は、試料内の標的分子に特異的に結合する能力を持つ、本明細書において記載される結合分子を意味する。第１の結合分子は、本明細書において記載される長く剛直なリンカー分子を介して、当業者には既知のいかなる適した方法によっても、又は、いかなる適した様式でも粒子表面に付着することができる。
【００８５】
本明細書において使用される場合「粒子表面又はフラットセンサ表面に付着する」という用語は、粒子表面に対する第１の結合分子又は第２の結合分子の共有若しくは非共有結合又はカップリングを意味する。特に、そのようなカップリングは、例えば、層間の共有結合、ファンデルワールス結合又は静電結合であってもよい。表面への付着は、例えば、ｐＨ、温度、イオンの濃度を変えることによって、光で照射することによって、酵素的分解若しくは酵素的切断によって等、可逆的であってもよく、又は、終結可能（ｔｅｒｍｉｎａｔａｂｌｅ）であってもよい。
【００８６】
第１又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して粒子表面又はフラットセンサ表面に付着するということを理解されたい。これは、第１及び／又は第２の結合分子どちらも、以下に規定される長く剛直なリンカー分子に結合することができるということを意味するものとする。第１の粒子と第２の粒子の間、又は、第１の粒子とフラットセンサ表面の間に特定の距離を提供することが本発明によって構想される。この目的のため、少なくとも１つの結合分子が長く剛直なリンカーに結合され、構想される平均伸展長さを提供しなければならないということが、当業者によってすぐに正しく理解されることになる。例えば、第１の結合分子が長く剛直なリンカー分子に結合する場合、第２の結合分子は、第２の粒子の表面又はフラットセンサ表面に直接付着されてもよい。第２の結合分子に長く剛直なリンカーが提供される場合、第１の結合分子は、第１の粒子の表面に直接付着されてもよい。第１の結合分子にも第２の結合分子にも、長く剛直なリンカーが提供され、有利な距離を確立するということも考えられる。本発明と関連して、第１の結合分子にも第２の結合分子にもリンカー構造体が提供されていない図１２（右のパネル）において描かれている状況は、そのような構成が、構想される結合キネティクスの増加を達成するには不十分であるかもしれない本明細書において規定される最小の平均伸展長さのみを生じるかもしれないため、回避されるべきであるということを理解されたい。
【００８７】
特定の実施形態において、第１の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して粒子の表面に付着する。さらなる特定の実施形態において、第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して粒子の表面に付着しない。
【００８８】
本発明の特定の実施形態において、例えば磁気粒子等の粒子若しくは粒子表面、又は、フラットセンサ表面への第１及び／又は第２の結合分子のカップリング、結合又は付着は、直接又は間接結合であってもよい。
【００８９】
本明細書に置いて使用される場合「直接結合」という用語は、第１の結合分子が、中間の架橋若しくは接続分子又は機能の存在なく、例えば磁気粒子等の粒子へのじかの接続を有することを意味する。
【００９０】
本明細書に置いて使用される場合「間接結合」という用語は、結合分子が、例えば磁気粒子等の粒子の表面に直接付着してはいないが、例えば他の結合分子、リンカー分子又は電荷を持った構造体等、さらなる中間の架橋若しくは接続分子を介して間接的に連結され得ることを意味する。例えば、アビジン、ストレプトアビジン誘導体、（ストレプト）アビジン、アビジン関連タンパク質、タマビジン１及び２、ブラダビジン、ニュートラアビジン等のアビジン様実体等は、例えば磁気粒子等の粒子と、ビオチン等の適合性のある結合部分を含む相互作用分子との接続物として使用してもよい。
【００９１】
特定の実施形態において、例えば磁気粒子等の粒子は、アビジン又はストレプトアビジン接続物で被覆されるか若しくは該接続物によって覆われてもよい。接続分子として有用な相互作用結合のさらに好ましい例は、ビオチン／アビジン、例えば抗ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ、抗テキサスレッド／テキサスレッド、抗ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン等のいかなる抗体／抗原結合、及び、本明細書において先に述べた核酸相補鎖である。本発明によって構想されるのは、特に、ほぼ無制限の特異的組み合わせによる高度な多重化のため、核酸相補鎖の使用である。核酸配列から成るか又は核酸配列を含むそのような接続分子は、リンカー構造体に容易に組み込むことができるということも当業者によって正しく理解される。
【００９２】
本発明による「表面構造体」は、フラットセンサ表面又は粒子表面等の表面を覆うのに適した分子又は分子のネットワークを含むいかなる構造体でもあり得る。構想される表面構造体は、従って、関心のある標的分子を捕獲している第１の粒子の認識、結合及び後の検出に役立つ。
【００９３】
本明細書に置いて使用される場合「フラットセンサ」は、実際のセンサ事象が起こる又は検出される領域を画定する。典型的には、フラットセンサは、試料容器の底に置かれる。フラットセンサは、試料に存在する標的分子の量に正比例して又は逆比例して関連づけられる結合した粒子の数の検出に役立ち得る。そのようなフラットセンサ、及び、本発明と関連して使用することができる対応するセンサの例は、Ｂｒｕｌｓ等、２００９、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、９、３５０４〜３５１０において提供されている。
【００９４】
本明細書に置いて使用される場合「第２の結合分子」という用語は、表面構造体内に含まれ、且つ、本明細書において記載されるフラットセンサ表面、又は、本明細書において記載される第２の粒子の表面に直接若しくは間接的に付着する結合分子を意味する。第２の結合分子は、第１の結合分子と同じタイプの分子であってもよく、又は、異なる分子であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、第１及び第２の結合分子は、同じタイプ又はクラスの分子である。本発明の特定の実施形態において、第２の結合分子は、抗体又はその断片であり、好ましくは、本明細書において先に規定された抗体である。本発明の特に好ましい実施形態において、第２の結合タンパク質は、試料内の標的分子を特異的に認識する及び該分子に特異的に結合するが、第１の結合分子によって認識されるのとは異なる標的分子の結合部位又はエピトープにて行う能力を持つ。さらに好ましい実施形態において、第２の結合分子は、本明細書において先に規定された抗体であってもよい例えば第１の抗体等の第１の結合分子を認識する、例えば本明細書において先に規定された抗体等、第２の抗体であってもよい。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「前記第１の粒子は、直接又は間接的に表面の前記第２の結合分子に結合する能力を持つ」という用語は、第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子が、標的分子への結合によって第２の結合分子に結合することを意味するものとする。対照的に、本明細書において規定される標的分子によって媒介されない表面構造体への第１の粒子のいかなる他の結合も、非特異的な結合であるとみなされる。
【００９６】
この状況において「直接結合する」は、従って、捕獲分子として作用する第１の結合分子が標的分子を認識する及び該標的分子に結合し、その結果、捕獲複合体を形成し、次に、表面構造体の第２の結合分子によって結合及び認識されることを意味する。この点で、「間接的に結合する」は、第１の粒子が、１つ又はいくつかの捕獲複合体を介して第２の結合分子に結合されることを意味する。いくつかの標的分子−結合分子集合体又は複合体が、表面構造体の第２の結合分子への第１の粒子の間接結合を媒介すると同時に、その結合は、標的遺伝子によって媒介されるため、依然として特異的であるとみなされることも考えられる。
【００９７】
本明細書において記載される場合、「リンカー分子」という用語は、表面への第１の結合分子及び／又は第２の結合分子の付着を提供するのに適したいかなる構造体でもあり得る。当業者は、リンカー分子を粒子表面又はフラットセンサ表面に結合させるための手段及び方法に気づくかもしれない。本発明のさらなる特定の実施形態によると、本明細書において記載される高められた結合キネティクスに必要とされる増加した末端間距離は、フラットセンサ表面の表面構造体に、十分長い平均伸展を有するリンカー分子を提供することによって達成することができる。
【００９８】
この目的のため、表面及び／又はリンカー分子は、リンカーを表面に結合させる能力を持つアンカー部分を含んでもよい。本明細書において使用される場合「アンカー部分」は、本明細書において規定されるリンカー分子と、表面、若しくは、粒子表面上に直接ある１つ又は複数の表面分子との接続物として理解されることになる。特に関係があるのは、従って、本明細書において記載されるいかなる架橋又は接続分子でもある。例えば、アビジン、ストレプトアビジン誘導体、（ストレプト）アビジン、アビジン関連タンパク質、タマビジン１及び２、ブラダビジン、ニュートラアビジン等のアビジン様実体等を、本明細書において記載されるリンカー分子と表面又は表面構造体との固定のために使用してもよい。例えば、アンカー部分はビオチンを含んでもよく、一方、表面は、ストレプトアビジンで被覆されるか又は官能性を持たされる。ストレプトアビジンで表面を被覆するための手段及び方法は当業者には既知であるか、又は、適したテキスト若しくは文献資料から得ることができる。
【００９９】
固定のための接続分子として適した相互作用結合のさらなる好ましい例は、ビオチン／アビジン、例えば抗ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ、抗テキサスレッド／テキサスレッド、抗ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン等のいかなる抗体／抗原結合、及び、本明細書において先に述べた核酸相補鎖である。アンカー部分は、ほぼ無制限の特異的組み合わせによる高度な多重化のため、核酸相補鎖を含んでもよい。核酸配列から成るそのような接続分子は、リンカー構造体に容易に組み込むことができるということも当業者によって正しく理解される。
【０１００】
表面又は表面に結合した分子に対するカップリング作用によって共有結合的に連結する（例えば架橋結合する）ことができる化学基を含むか又は化学基から成るアンカー部分も、本発明によって構想される。架橋は、バイオコンジュゲーションと呼ばれる場合が多くある共有結合によって２つ以上の分子を化学的に連結するプロセスである。典型的には、架橋試薬（又はクロスリンカー）は、例えば、一級アミン（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、スルフヒドリル若しくはカルボニル（−ＣＨＯ）等のタンパク質官能基、又は、カルボジイミド（例えばＥＤＣ等）、ＮＨＳエステル、イミドエステル、ＰＦＰエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、ハロアセチル（ブロモ−若しくはヨード−）、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヒドラジド、ジアジリン、アリールアジド若しくはイソシアネート等の架橋反応基等、タンパク質又は他の分子上の特異的な官能基に化学的に付着する能力を持つ２つ以上の反応性末端を含有する分子である。
【０１０１】
スペーサー分子として作用するように、すなわち、結合分子と粒子表面との特定の距離を提供するようにリンカー分子が特定の長さを有するということも、本発明によって構想される。そのような距離の提供は、いくつか他の利点を提供することができると理解される。
【０１０２】
例えば、特定の距離は、他の分子及び互いに対する粒子の非特異的結合をより少なくし得る。さらに、通常発生する、例えば磁気粒子等の粒子の非特異的なクラスタ形成は、最小限にすることができる。
【０１０３】
本発明によるリンカー分子は、従って、接続分子の機能及び／又はスペーサーの機能を有してもよい。この目的のため、これらのポリマー分子は、好ましくは、特定の長さ、強度及び／又は剛直性を有して、ポリマー繊維のように作用することができる。
【０１０４】
例えば二量体形成又は高次の多量体形成によって集合して繊維を構築するポリマーの使用も、本発明によって構想される。構想される利点は、本明細書において規定される剛直性を上げることができるということである。構想される剛直性を有する高次構造を確立するのに寄与し、それによって、次に、構想されるリンカーの平均伸展長さをもたらす「補助分子」の使用も構想される。１つの構想される例は、集合して二量体らせん構造を構築することができ、次に、補助分子と組み合わさることができる一本鎖核酸分子である。補助分子に対する他の構想される例は、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ若しくはその両方等の核酸に結合する能力を持つタンパク質（例えばＤＮＡ結合タンパク質等）、又は、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ若しくはその両方等の核酸に結合する能力を持つタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質等）である。そのような因子又はタンパク質の結合は、好ましくは、結合タンパク質により認識される、例えばｄｓＤＮＡ若しくはｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ等の核酸分子において存在し得る特異的結合モチーフによって導くことができる。そのような結合因子が核酸分子上で結合すると、リンカーの剛直性を高めることができ、さらに、増加した平均伸展長さを有するリンカーを生じることができる。そのようなリンカー修飾は、アッセイの前又はアッセイ中に実行することができる。本発明のさらなる特定の実施形態において、ＲＮＡ又はＤＮＡ結合タンパク質等の補助分子は、例えばＳＨ３、ＰＤＺ、１４−３−３、ＳＨ２ドメイン等のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、又は、当業者には既知のいかなる他の適したドメインを含んでもよい。適合性のある認識ドメイン又は相互作用ドメインを含む二次結合因子を、従って、提供することができ、補助分子によって結合された核酸を含む複合体のアセンブリを可能にし、次に、二次相互作用分子によって結合することができる。さらなる実施形態において、剛直なリンカー構造体は、例えばコラーゲンの形及び／若しくは分子同一性、又は、Ｓｃｌ１、Ｓｃｌ２、ＳｃｌＡ若しくはＳｃｌＣ等のコラーゲン様タンパク質に基づき、ポリマーポリペプチドの形で提供することができる。これらの分子は、さらに、他のリンカー分子又は本明細書において規定される官能基と組み合わせてもよい。
【０１０５】
本発明のさらなる特定の実施形態において、ポリマーリンカー分子は、適した条件下で自己集合する能力を持つポリマー分子であってもよい。従って、ポリマー分子は、粒子と組み合わせて提供することができ、粒子の表面上でポリマーのアセンブリをもたらす。自己集合は、例えば、重合に必要なモノマー又はポリマー単位の濃度、モノマー又はポリマー単位に対する架橋因子の濃度、反応環境のｐＨ、温度、イオンの存在、タンパク質等の補助因子の存在等、適したパラメータによって制御することができる。自己集合したポリマーは、さらなる実施形態において、例えばｐＨの変化、因子又はモノマーの濃度の増減、温度の変化等によるそのような適した条件の変化後に分解してもよい。
【０１０６】
リンカー分子が、本明細書において規定される電荷を持った構造体を含むか又は該構造体から成る、又は、本明細書において記載される立体表面構造に組み込まれるということも考えられる。
【０１０７】
本発明のさらなる特定の実施形態において、リンカー分子は、直線的、環状若しくは分枝様分子又はその混合物であってもよい。
【０１０８】
本発明と関連した適したリンカー分子は、例えば、核酸、リボ核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、脂質、ポリエチレングリコール、多糖、デンドリマー、デンドロン、ナノチューブ若しくはいかなる適した誘導体、又は、その組み合わせであってもよい。
【０１０９】
本明細書において先に規定した核酸分子は、「核酸リンカー分子」として有利に使用することもできる。これらのリンカー分子は、一本鎖及び／又は二本鎖核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ分子又はそのいかなるタイプの誘導体を含んでもよい。ＤＮＡは、例えば、Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ若しくはＺ−ＤＮＡの形、又は、これらの形のいかなる混合であってもよい。リンカー分子は、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ若しくはＡＮＡ分子、又は、いかなるその混合若しくは組み合わせ、又は、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ等のいかなるタイプの核酸等の、本明細書に規定される他のリンカー分子とのいかなる混合若しくは組み合わせであってもよい。
【０１１０】
「ＰＮＡ」という用語は、ペプチド核酸、すなわち、生物学的研究及び医療処置において使用されるが、自然に発生するとは知られていないＤＮＡ又はＲＮＡと類似した人工的に合成されたポリマーに関する。ＰＮＡバックボーンは、典型的に、ペプチド結合によって連結される反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。種々のプリン及びピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によってバックボーンに連結される。ＰＮＡは、一般的に、ペプチドのように描かれ、第１（左）位置にてＮ末端、及び、右にてＣ末端を有している。ＤＮＡ及びＲＮＡはデソキシリボース及びリボース糖バックボーンをそれぞれ有しているけれども、ＰＮＡバックボーンは、ペプチド結合によって連結される反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。ＰＮＡオリゴマーも、相補ＤＮＡに結合することにおいてより高い特異性を示すということが当技術分野において既知である。さらなる詳細を、例えばＮｉｅｌｓｅｎ、ＰＥ、Ｅｇｈｏｌｍ  Ｍ（１９９９）、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１（２）：８９〜１０４等、いかなる適した文献資料又はテキストからも得ることができる。
【０１１１】
「ＣＮＡ」という用語は、アミノシクロヘキシルエタン酸核酸に関する。さらに、当該用語は、シクロペンタン核酸、すなわち、例えば、２′−デオキシカルバグアノシンを含む核酸分子に関する。
【０１１２】
「ＨＮＡ」という用語は、ヘキシトール核酸、すなわち、標準的な核酸塩基及びリン酸化１，５−アンヒドロヘキシトールバックボーンから構築されるＤＮＡ類似体に関する。
【０１１３】
「ＬＮＡ」という用語は、ロックド核酸に関する。典型的には、ロックド核酸は、修飾された、従って、近づきにくいＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２′及び４′炭素を接続する特別の橋（ｅｘｔｒａ  ｂｒｉｄｇｅ）で修飾することができる。そのような橋は、３′−エンド配座構造でリボースをロックする。ロックドリボース構造は、塩基スタッキング及びバックボーン前組織化を高める。これは、熱安定性、すなわちオリゴヌクレオチドの融解温度を有意に増す。
【０１１４】
「ＡＮＡ」という用語は、アラビノ核酸又はその誘導体に関する。本発明と関連した好ましいＡＮＡ誘導体は、２′−デオキシー２′−フルオローベータ−Ｄ−アラビノヌクレオシド（２′Ｆ−ＡＮＡ）である。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態において、核酸リンカー分子は、二本鎖又は二重鎖の形で存在してもよく、すなわち、鎖間の塩基対によって付随した核酸分子の１つの鎖、及び、相補的又は逆平行の対鎖、又は、核酸分子のセンス若しくはアンチセンス鎖を含んでもよい。本明細書において使用される場合「センス鎖」という用語は、タンパク質に翻訳されるか又は翻訳することができるメッセンジャーＲＮＡコピーの配列と同じ配列を含む分子を意味する。当該用語は、本発明と関連して、さらに、その相補的な対鎖と同一ではない二重鎖核酸分子の１つの鎖を含む分子を意味する。従って、「アンチセンス鎖」という用語は、本明細書において使用される場合、先に規定したセンス鎖に対する相補的又は反対の鎖を含む分子を意味する。さらなる特定の実施形態において、核酸リンカー分子は、二本鎖又は二重鎖リボ核酸分子であってもよい。或いは、核酸リンカー分子は、一本鎖核酸又は一本鎖リボ核酸分子を含んでもよい。
【０１１６】
特定の実施形態において、リンカー分子は、リボ核酸分子、又は、リボ核酸の、他の上記の核酸分子のいずれかとの、若しくは、本明細書において規定されるいかなる他のリンカー分子、好ましくはＲＮＡ分子とのいかなる混合物、又は、いかなるタイプのその誘導体である。ＲＮＡは、例えばｐＲＮＡ、すなわちピラノシルＲＮＡの形、又は、ヘアピンＲＮＡ若しくはステムループＲＮＡのような構造的に修飾された形であってもよい。
【０１１７】
リボ核酸分子を含む核酸は、本明細書に規定されるように、種々の塩基組成及び／又は長さのものであってもよい。リンカー分子の長さは、粒子のサイズ若しくは直径、本明細書において規定される電荷を持った構造体分子の存在、サイズ若しくは長さ、特に、核酸分子はリンカーとして使用された場合、粒子に特定の実効電荷を提供することができるため、構想される粒子の特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面とのいかなる構想される末端間距離、又は、リンカー分子のいかなる構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性に応じて作ることができる。本発明の特定の実施形態において、核酸リンカー分子は、電荷を持った又は無電荷の分子であってもよい。本明細書において使用される場合「無電荷の核酸リンカー分子」という用語は、約０の分子の実効電荷に関する。
【０１１８】
本発明の特に好ましい実施形態において、リンカー分子は、二本鎖又はｄｓＤＮＡ、二本鎖又はｄｓＲＮＡ、ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位、及び、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位から成る群から選択される分子であるか若しくは該分子を含む。
【０１１９】
本発明のさらなる好ましい実施形態によって同様に構想される１つの有利な態様は、ＰＮＡ及びＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖部位がヌクレアーゼ又はプロテアーゼによって容易に認識されず、それらを酵素的分解に抵抗性であるようにすることである。
【０１２０】
本発明のさらなる実施形態において、適した核酸は、異なる塩基組成及び／又は長さの一本鎖ＤＮＡ分子も含むか又は該分子から成ってもよい。一本鎖分子は、例えば、完全にランダムである、若しくは自然由来である、若しくは、例えばＡＡＡ、ＴＴＴ、ＣＣＣ、若しくはＧＧＧ等、１つの塩基のみのものである塩基配列の反復を包含してもよく、又は、例えばＡ及びＣ又はＣ及びＴのみから成るそのような一塩基領域の広がりを含んでもよい。
【０１２１】
ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、その形、剛直性及び高次構造により、適したリンカーであり得る。ペプチド分子リンカーは、異なるアミノ酸組成及び／又は長さのものであってもよい。ペプチド分子リンカーの長さは、約３のアミノ酸から約３５のアミノ酸の間で変わり得る。他の長さ又は示された範囲内のいかなる長さの値も構想される。ペプチドリンカー分子は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又はそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。アミノ酸組成物は、例えば、自然に産生されたアミノ酸若しくはいかなるその誘導体のうち、又は、合成的に入手可能なアミノ酸のうち１つのみ等、単一アミノ酸組成物から、全ての既知のアミノ酸を含むか若しくは該アミノ酸から選択される完全にランダムなアミノ酸組成物まで変わり得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５、又はそれ以上の異なるアミノ酸を含む組成物も構想される。アミノ酸は、同一のアミノ酸の広がりにおいて存在するか、又は、パターン若しくはモチーフの形で提供されるか、又は、ランダムに分布されてもよい。
【０１２２】
ペプチド分子リンカー分子の長さは、特定の実施形態において、粒子のサイズ若しくは直径、本明細書において規定される電荷を持った構造体分子の存在、サイズ若しくは長さ、特に、ペプチド分子はリンカーとして使用された場合、粒子に特定の実効電荷を提供することができるため、構想される粒子の特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面とのいかなる構想される末端間距離、又は、リンカー分子のいかなる構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性に応じて作ることができる。本発明の特定の実施形態において、ペプチドリンカー分子は、電荷を持った又は無電荷の分子であってもよい。本明細書において使用される場合「無電荷のペプチドリンカー分子」という用語は、約０の分子の実効電荷に関する。
【０１２３】
タンパク質又はポリペプチドリンカー分子は、異なるアミノ酸組成及び／又は長さのものであってもよい。タンパク質又はポリペプチド分子の長さは、約３５のアミノ酸から約５００又はそれ以上のアミノ酸の間で変わり得る。他の長さ又は示された範囲内のいかなる長さの値も構想される。ペプチド分子は、例えば、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０若しくは５００のアミノ酸又はそれ以上の長さを有してもよい。
【０１２４】
タンパク質又はポリペプチドリンカー分子の長さは、特定の実施形態において、粒子のサイズ若しくは直径、本明細書において先に規定した電荷を持った構造体分子の存在、サイズ若しくは長さ、特に、タンパク質又はポリペプチド分子はリンカーとして使用された場合、粒子に特定の実効電荷を提供することができるため、構想される粒子の特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面とのいかなる構想される末端間距離、又は、リンカー分子のいかなる構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性に応じて作ることができる。本発明の特定の実施形態において、ポリペプチド又はタンパク質リンカー分子は、電荷を持った又は無電荷の分子であってもよい。本明細書において使用される場合「無電荷のポリペプチド又はタンパク質分子」という用語は、約０の分子の実効電荷に関する。
【０１２５】
「糖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）分子」は、その形、剛直性及び高次構造により、適したリンカーであり得る。そのような糖は、異なる組成及び／又は長さのものであってもよい。分子の長さは、約５つのＣ原子から約１００のＣ原子又はそれ以上の間で変わり得る。他の長さ又は示された範囲内のいかなる長さの値も構想される。糖分子は、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００のＣ原子、又は、示された値間のいかなる他の数のＣ原子の長さを有してもよい。
【０１２６】
糖リンカー分子の長さは、特定の実施形態において、粒子のサイズ若しくは直径、本明細書において規定される電荷を持った構造体分子の存在、サイズ若しくは長さ、特に、糖分子はリンカーとして使用された場合、粒子に特定の実効電荷を提供することができるため、構想される粒子の特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面とのいかなる構想される末端間距離、又は、リンカー分子のいかなる構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性に応じて作ることができる。本発明の特定の実施形態において、糖リンカー分子は、電荷を持った又は無電荷の分子であってもよい。本明細書において使用される場合「無電荷の糖分子」という用語は、約０の分子の実効電荷に関する。
【０１２７】
「脂質」は、その形、剛直性及び高次構造により、適したリンカー分子であり得る。脂質は、脂肪、ワックス、スチロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ等）、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質を含むがそれに限定されない自然発生分子の広範な群を構成する。そのような脂質は、典型的には、脂質尾部及び頭部から構築される。適した脂質の例として、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、エッグホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質が挙げられる。特に好ましいのは、リン脂質ＭＰＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００又はＬｉｓｓ  Ｒｈｏｄ  ＰＥである。当該脂質は、異なる組成及び／又は長さのものであってもよい。分子の長さは、約５つのＣ原子から約１００のＣ原子又はそれ以上の間で変わり得る。他の長さ又は示された範囲内のいかなる長さの値も構想される。脂質分子は、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００のＣ原子、又は、示された値間のいかなる他の数のＣ原子の長さを有してもよい。
【０１２８】
脂質リンカー分子の長さは、特定の実施形態において、粒子のサイズ若しくは直径、本明細書において規定される電荷を持った構造体分子の存在、サイズ若しくは長さ、特に、脂質分子はリンカーとして使用された場合、粒子に特定の実効電荷を提供することができるため、構想される粒子の特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面とのいかなる構想される末端間距離、又は、リンカー分子のいかなる構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性に応じて作ることができる。本発明の特定の実施形態において、脂質スペーサー分子は、電荷を持った又は無電荷の分子であってもよい。本明細書において使用される場合「無電荷の脂質分子」という用語は、約０の分子の実効電荷に関する。
【０１２９】
さらなる好ましい実施形態において、リンカー構造は、非生物学的ポリマーを含むか又は該ポリマーから成ってもよい。本明細書において使用される場合「非生物学的ポリマー」という用語は、生物源由来（バイオポリマー）ではない化学的に合成されたポリマーを意味する。この目的に対する適したポリマーは、（例えばＲａｔｎｅｒ，Ｂ．Ｄ．；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．；Ｓｃｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．；Ｌｅｍｏｎｓ，Ｊ．Ｅ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２ｎｄ  Ｅｄ．；Ｅｄｓ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｌｏｎｄｏｎ、２００４によって等）当技術分野において記載されてきた。適した非生物学的ポリマーの例は、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）若しくはポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）若しくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、又は、そのコポリマーであって、２つ（以上）のモノマー種由来のヘテロポリマーとも呼ばれるコポリマー等、生物学的に分解可能なポリマーである。本明細書において使用される場合「ブロックポリマー」という用語は、共有結合によって連結された２つ以上のホモポリマーサブユニットを含むコポリマーを意味する。２つ又は３つの別のブロックを有したブロックコポリマーは、ジブロックコポリマー及びトリブロックコポリマーとそれぞれ呼ばれる。好ましいブロックコポリマーは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＥＰ−ＰＰＯ）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＰ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＥＧ−ＰＬＬＡ）、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（カプロラクトン）（ＰＥＧ−ＰＣＬ）、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（α−ヒドロキシ酸）（ＰＥＧ−ＰＨＡ）又はプルロニックＰ−１０５を含むが、それに限定されない。
【０１３０】
ポリエチレングリコール分子は、特に、その形、潜在的剛直性及び高次構造により、本発明と関連して「ポリエチレングリコールリンカー分子」として使用してもよい。本発明によって構想されるポリエチレングリコールは、異なる組成及び／又は長さのものであってもよい。好ましいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）変異体は、多分散又は単分散のＰＥＧ分子を含む。特に好ましいのは、単分散のＰＥＧである。ＰＥＧはさらに、例えば、セントラルコア群から出る３から１０ＰＧＥ鎖を有して等、枝分かれさせてもよく、セントラルコア群から出る１０から１００ＰＥＧ鎖を有するスター（ｓｔａｒ）ＰＥＧであってもよく、又は、多数のＰＥＧ鎖を異なるポリマー又は直鎖ＰＥＧ主鎖にグラフトさせたコム（ｃｏｍｂ）ＰＥＧであってもよい。ＰＥＧの平均分子量によると、構想されるＰＥＧは、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ１２，０００、ＰＥＧ１５，０００、ＰＥＧ２０，０００、又は、より大きな分子量を有するＰＥＧであってもよい。特に好ましいのは、ＰＥＧ１０，０００よりも大きいＰＥＧである。
【０１３１】
例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００又はＰＥＧ８０００等のより小さなＰＥＧ分子も、リンカー構造の一部として、例えば、本明細書において規定される１つ又は複数のリンカー分子と組み合わせて、使用することができる。
【０１３２】
ポリエチレングリコールリンカー分子の長さは、特定の実施形態において、粒子のサイズ若しくは直径、本明細書において規定される電荷を持った構造体分子の存在、サイズ若しくは長さ、特に、電荷を担持するポリエチレングリコール分子誘導体が使用された場合の構想される粒子の特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面とのいかなる構想される末端間距離、又は、リンカー分子のいかなる構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性に応じて作ることができる。本発明の特定の実施形態において、ポリエチレングリコールリンカー分子、特に、その誘導体若しくはその改変されたバージョンは、電荷を持った又は無電荷の分子であってもよい。本明細書において使用される場合「無電荷のポリエチレングリコール分子」という用語は、約０の分子の実効電荷に関する。
【０１３３】
「デンドリマー」又は「デンドリメリックリンカー分子」は、いかなる繰返し枝分かれされたおよそ球状の大きな分子であってもよい。そのようなデンドリマーは、異なる組成及び／若しくは長さ、並びに／又は、枝分かれの程度のものであってもよい。その長さは、構想される特定の全実効電荷、結合分子と粒子表面との構想される末端間距離、構想されるリンカー分子の屈曲性、剛直性若しくは安定性、及び／又は、構想される１つの粒子あたりの電荷を持った分子の数に応じて作ることができる。本発明によって構想されるデンドリマーは、低分子量又は高分子量の種を含んでもよい。本発明によるデンドリマーは、好ましくは、無電荷であり、すなわち、分子は０の実効電荷を示す。
【０１３４】
リンカーの一部としての本発明によるデンドリマーの使用も本発明によって構想される。この目的のため、デンドリマーは、特定の実施形態において、例えば親水性基等の官能基を分子表面上に含んでもよく、又或いは、内部官能性を有してもよい。本発明の目的で構想されるデンドリマーは、第１、第２、第３、第４又はそれ以上の世代のデンドリマーであってもよい。好ましいデンドリマーは、例えば、ニューコムデンドリマー又はアルボロール、及び、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）を含む。デンドリマーが、粒子表面又は平らな表面上に多量の立体表面構造を提供するために有利に使用することができる構造体を生じ、本明細書において先に記載したリンカー分子はそのような構造の一部であるか又はその中に埋め込まれるということが、当業者によって正しく理解される。本発明と関連して使用されることになるさらなる変異体も合成方法等も、当業者には既知であるか、又は、“Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ”Ｆｒｅｃｈｅｔ  ａｎｄ  Ｔｏｍａｌｉａ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ等の適した文献から得ることができる。
【０１３５】
「デンドロン」又は「デンドロニックリンカー分子」は、単一の化学的に処理可能なデンドリマーの基、すなわち、本明細書において先に規定したデンドリマーの中心点を含有するとして理解される。本発明によるデンドロンは、好ましくは、無電荷であり、すなわち、分子は０の実効電荷を示す。本発明の特定の実施形態において、デンドロンは、本明細書において規定されるリンカーの一部として使用することができる。
【０１３６】
本明細書において使用される場合「ナノチューブ」という用語は、カーボンナノチューブ、すなわち、円筒形のナノ構造を有した炭素の同素体を意味する。そのようなナノチューブは、単層ナノチューブ又は多層ナノチューブであってもよい。本発明は、例えば球状若しくは楕円体のバッキーボール形、バッキーボールフラーレン、又は、バッキーボールを有したナノチューブの組み合わせ等、異なるタイプ、形及び複雑さのフラーレン構造ファミリーのリンカー分子も構想する。本発明によるナノチューブ、又は、当業者には既知のリンカー分子に適した他のリンカーは、好ましくは、無電荷であり、すなわち、分子は０の実効電荷を示す。
【０１３７】
本発明によるリンカー分子は、好ましくは、結合キネティクスを改善するために表面に対する粒子の結合確率を上げることができるように特定の長さ及び堅牢性を有する。先行技術において、リンカー又はスペーサーは、表面に対する結合分子の接続に対して、及び、結合分子の近づきやすさという点で単に考慮されてきただけである。しかし、リンカーの長さは、特に、粒子からの最大の伸展に関しては、以前には記載されていなかった。従って、本願によって構想されるのは、粒子表面又はフラットセンサ表面から離れた、本明細書において規定される結合分子の付着点を伸展させることに適した、特定の長さを有する適したリンカー分子を提供することである。図４において見ることができるように、構想されるアプローチは、粒子が表面に結合することができる向きの増加した数を開発する。
【０１３８】
従って、本明細書において規定される特定の平均伸展長さを有するリンカー分子を介して捕獲又は結合分子が粒子表面に付着する本明細書において規定される粒子も、本発明によって構想される。本発明の特定の例において、リンカーとしての長く剛直なｄｓＤＮＡ分子の使用は、表面から結合分子の有意な平均伸展を生じる。構想されるアプローチは、本明細書に規定されるフラットセンサ又は粒子表面に粒子を結合させることのキネティクスの有意な増強を生じる。図６及び７から得ることができるように、結合した粒子の数が、リンカーの長さの関数であるということを実証することができた。これらの例において、５００ｎｍ及び１０００ｎｍのストレプトアビジンで被覆された粒子を、可変長のｄｓＤＮＡリンカーと共にインキュベートした。各ｄｓＤＮＡリンカー分子は、一末端にて１つのビオチン分子、及び、もう一方の末端にてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子を含有し、さらに、フラットセンサ表面を、抗Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ抗体で被覆した。図６及び７によるグラフは、ｄｓＤＮＡリンカー分子の長さ（ｂｐ）の増加に伴う、結合した粒子の数の増加を示している。５００ｎｍの粒子に対する７００ｂｐよりも長い最適な長さは、２４０ｎｍを超える輪郭長さ、及び、１４０ｎｍを超える平均伸展長さに相当する。図７において見ることができるように、最適なリンカー長は１０００ｂｐであり、（例えば１０００ｎｍの）より大きな粒子に対する３４０ｎｍの輪郭長さ、及び、約１７０ｎｍの平均伸展長さに相当する。最適なリンカー長は、従って、粒子のサイズ次第であり、さらに、本発明の特定の実施形態において、例えば、本明細書において以下の実施例部分に記載される実験結果に基づき、粒子のサイズ又は粒子の直径に適応させてもよい。
【０１３９】
本明細書において使用される場合「平均伸展長さ」という用語は、リンカーの末端間距離の二乗平均平方根√＜Ｒ２＞として定義され、以下のみみず鎖モデル、
【０１４０】
【数２】
2014533831.tif 000003
に従って記載することができ、ここで、Ｐは、ポリマーの持続長であり、ｌは、リンカーの輪郭長さである。
【０１４１】
本明細書において使用される場合「輪郭長さ」という用語は、最大の物理的に可能な伸展での長さとしてのポリマー鎖の輪郭長さを意味する。
【０１４２】
いくつかの生物学的に重要なポリマーは、二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ、構造不定のＲＮＡ及び構造不定のポリペプチドを含むみみず鎖として効果的にモデルを作ることができる。Ｋｒａｔｋｙ−Ｐｏｒｏｄのみみず鎖モデルが、半屈曲性ポリマーのモデリングに適しており、末端間距離及び持続長を概算する。しかし、当業者は、例えば以下に記載されるもの等、末端間距離及び持続長を概算するための数多くの他の理論的モデルに気付く。
【０１４３】
本明細書において使用される場合「持続長、Ｐ」という用語は、ポリマー又は糸の堅さ若しくは剛直性を定量化する基本的な機械的特性を意味し、さらに、正接の方向における相関関係がなくなる長さとして定義される。化学においては、漠然と長い鎖における結合ｉに対する全ての結合ｊ≧ｉの射影の合計の平均として定義することもできる（Ｆｌｏｒｙ，Ｐａｕｌ  Ｊ．（１９６９）、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｈａｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。角度θが、位置０（ゼロ）にてポリマーに対して正接であるベクターと、位置０からの距離Ｌでの接ベクトルとの角度である場合、その角度の余弦の期待値、
【０１４４】
【数３】
2014533831.tif 000004
は、距離と共に指数関数的に低下し、ここで、Ｐは持続長であり、さらに、山形角括弧は全開始位置の平均を示す。ＰＥＧ等の屈曲性ポリマーは、Ｆｌｏｒｙモデル（ランダムウォーク）を使用して記載することができる。
【０１４５】
Ｍｏｆｒａｄ，Ｍ．Ｒ．Ｋ、“Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、２００６において記載されているように、持続長は、曲げ剛性Ｂｓ、ヤング率Ｅ及びポリマー鎖のセグメントを使用して定義することもできる。
【０１４６】
【数４】
2014533831.tif 000005
剛直及び均一のロッドの場合、Ｉは、
【０１４７】
【数５】
2014533831.tif 000006
として表すことができ、ａは半径である。
【０１４８】
ポリマー科学において、持続長は、Ｋｕｈｎ長の半分、すなわち、鎖が自由に連結しているとして考慮することができる仮想セグメントの長さとしても定義することができる。持続長は、無限の鎖長の範囲における鎖の末端での鎖の輪郭に対する正接上の末端間ベクトル射影の平均に等しい。
【０１４９】
図５において見ることができるように、リンカー分子の長さそれ自体は、長い末端間距離を生成する、すなわち、粒子表面又はフラットセンサ表面から離して結合分子を置くには十分な基準ではない。図５は、ＰＥＧリンカー（左）とｄｓＤＮＡリンカー（右）を介して表面に付着する抗体の伸展を比較する略図を例証的に示しており、どちらも同じ輪郭長さを有している。輪郭長さという点で非常に長いが屈曲性でもある分子又はポリマーの使用は、しかし、分子の折りたたみを生じ、さらに、最終的には、より短い伸展を有した球状構造を生じ得る。従って、本明細書において記載される長く且つ剛直なリンカーの提供によって達成することができる、表面からの強化された結合分子の伸展、又は、増えた末端間距離が構想される。図５で例示されている例において、本明細書において記載される剛直とみなされる１７０ｎｍのｄｓＤＮＡ分子の平均伸展長さは、同じ輪郭長さのＰＥＧ分子の平均伸展長さの１０倍である。しかし、結果として生じる平均伸展が構想される効果を提供するのに十分長い場合は、長い輪郭長さを有した非常に屈曲性のリンカーを使用することも想到可能である。
【０１５０】
本明細書に規定される平均伸展長さが増やされ、結合キネティクスが高められる適した条件を提供することも本願によって構想される。本発明の特に好ましい実施形態において、適した長く剛直なリンカーに対する例は、二本鎖核酸に基づく分子である。例えば、高い剛直性のため、７００ｂｐのｄｓＤＮＡリンカー√＜Ｒ２＞は、１４０ｎｍまでと等しくなり、１０００ｂｐのリンカーは、ほぼ１７０ｎｍまでの√＜Ｒ２＞を生じるであろう。
【０１５１】
本発明の特定の実施形態において、リンカー分子は、少なくとも約６０ｎｍ、好ましくは約５００ｎｍまでの平均伸展長さ、好ましくは、少なくとも約６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ又は１００ｎｍの平均伸展長さ、さらにより好ましくは、少なくとも約１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ又は２００ｎｍの平均伸展長さ、さらにより好ましくは、少なくとも約２２０ｎｍ、２５０ｎｍ、２７０ｎｍ又は３００ｎｍの平均伸展長さ、最も好ましくは、少なくとも３２０ｎｍ、３５０ｎｍ、３７０ｎｍ又は４００ｎｍの平均伸展長さを有してもよい。さらなる実施形態において、リンカー分子の平均伸展長さは、４００ｎｍよりも長くあってもよい。リンカー分子は、示された値間のいかなる他の適した平均伸展長さも有してよい。
【０１５２】
本発明の特定の実施形態において、最適なリンカー分子の平均伸展長さは、本明細書に記載される粒子の直径の少なくとも１／１０、好ましくは少なくとも１／９、好ましくは１／８、より好ましくは少なくとも１／４、さらに、最も好ましくは２／３である。
【０１５３】
さらに好ましい実施形態において、平均伸展長さは、本明細書に記載される粒子の直径の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％又は１９％、より好ましくは２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％又は２９％、さらにより好ましくは３０％、３１％、３２％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、最も好ましくは４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％である。
【０１５４】
特に好ましい実施形態において、約５００ｎｍの直径の粒子は、粒子直径の約２５から３０％、より好ましくは約２７％の平均伸展長さを示すリンカー分子を含んでもよい。さらに好ましい実施形態において、約１０００ｎｍの直径の粒子は、粒子直径の約１５から２０％、より好ましくは約１７％の平均伸展長さを示すリンカー分子を含んでもよい。
【０１５５】
リンカー分子の立体構造変化及び／又はリンカー分子の剛直特徴の変化をもたらす、検出条件の提供又はｐＨシフト若しくは温度シフト等の検出条件における変更も、本発明によって構想される。例えば、長い輪郭長さを有するが剛直性は低い、折りたたまれているリンカー分子は、構想されるアプローチによって伸展され得る。本明細書において先に規定したようにリンカー分子の剛直性を上げる、及び、リンカー分子の平均伸展を高めるようにリンカー分子と相互作用又は反応し得るさらなる化合物、組成物、分子、溶媒及び／又はイオンを加えることも想到可能である。
【０１５６】
リンカー分子の表面密度を上げることによって伸展の増加を強制することも想到可能である。図８において見ることができるように、球状構造の形成により屈曲性ポリマーの平均伸展長さは減らされるけれども、粒子又はフラットセンサの表面上のリンカー分子の密度の増加は、リンカー分子が互いに安定化させることができるように分子の重なり合いを生じ得るということが正しく理解される。しかし、図９において示されている結果は、リンカーの屈曲性が、高められる結合キネティクスに寄与する重要な態様であるということを実証している。図９における図表は、さらなるｄｓＤＮＡ分子で表面に過負荷をかけると同時に減らされた可動性の結果として、結合キネティクスが減らされるということを実証している。従って、構想される結合キネティクスの増加に到達するためにリンカー分子の種々の方向づけを行うには十分な程度の可動性を依然として保持し得る長く剛直なリンカー分子が構想される。リンカー分子の数及び／又は長さは、従って、粒子の特性、特に粒径に適応させることができる。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、「剛直性」又は「剛直な」、さらに「堅さ」という用語は、変形に抵抗する固形体の特性を定義している。リンカー分子の剛直性は、本質的に、平均伸展長さに寄与するということが正しく理解される。本明細書において使用される場合「屈曲性」は、従って、容易に変形することができる固形体の特性を意味する。本発明と関連して、屈曲性の分子、ポリマー又はリンカーは、従って、本明細書において規定されるように、分子を曲げる及び折りたたみ得る低い剛直性を有する。
【０１５８】
本発明の特定の実施形態において、リンカー分子の剛直性は、先に規定したように、リンカーの末端間距離の二乗平均√＜Ｒ２＞を介して決定される。特定の実施形態において、剛直性は、従って、本明細書において規定されるその輪郭長さに比較したリンカーの末端間距離の二乗平均又は平均伸展長さの観点から測定することができる。従って、例えば、リンカー分子の平均伸展長さと本質的に同じであるリンカー分子の輪郭長さは、高いリンカー分子の剛直性を示している。一方、リンカー分子の平均伸展長さよりも有意に大きい前記リンカー分子の輪郭長さは、低いリンカー分子の剛直性を示している。
【０１５９】
本発明の好ましい実施形態において、リンカー分子の剛直性及び長さは、リンカーの末端間距離の二乗平均√＜Ｒ２＞が、粒子の直径に対して少なくとも約５％、１０％又は１５％、好ましくは約２０％、２５％、３０％又は３５％、さらにより好ましくは約４０％、４５％又は５０％、最も好ましくは約５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％であるように選択される。
【０１６０】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記リンカー分子の剛直性及び長さは、リンカーの末端間距離の二乗平均√＜Ｒ２＞が、粒子の直径に対して少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％又は１９％、より好ましくは２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％又は２９％、さらにより好ましくは３０％、３１％、３２％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、最も好ましくは４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％であるように選択される。
【０１６１】
本発明の特に好ましい実施形態において、感度及び結合キネティクスのさらなる増加を、表面構造のどちらも、すなわち、粒子の表面もフラットセンサの表面も、本明細書において先に記載した長く剛直なリンカーを含む場合に達成することができる。
【０１６２】
アッセイに先立ち、すなわち標的分子の捕獲に先立ちリンカーが粒子に提供されるということも本願によって構想される。図１０は、本明細書において先に規定した長く剛直なリンカー分子を介して表面に付着している結合分子で前もって負荷をかけられた粒子を示している。
【０１６３】
本発明の特に好ましい実施形態において、フラットセンサ表面の表面構造は、長いリンカーに付着した第２の結合分子が、第１の結合分子に結合した標的分子を認識した後に形成される。図１１に例示されているように、第２の結合分子はリンカー分子に付着される。リンカー分子のもう一方の末端は、表面に対するリンカー分子の固定のための分子を含む。この目的に対する例証的な分子は、例えば、センサ表面上のストレプトアビジンに結合することができるビオチンである。このアプローチの構想される効果は図１２において示されており、図１２では、特異的結合が、増加した粒子の末端間距離をもたらす長いリンカーを有した第２の結合分子と、フラットセンサ表面との結合によってのみ生じ得る。
【０１６４】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において規定される第１及び／又は第２の粒子は、反発的な表面構造体をさらに含んでもよい。本明細書において使用される場合「反発的な表面構造体」という用語は、本明細書において記載される粒子の表面に直接又は間接的に付着することができる構造体を意味する。反発的な表面構造体は、本発明の意味において、反発力を与える能力を持つ分子、ポリマー及び／又は分子の網目を含む。本明細書において使用される場合「反発力」という用語は、分子又は粒子の反発をもたらす力を意味する。好ましくは、磁気粒子の反発が本発明によって構想される。一般に、粒子間の反発力は、ポリマーで覆われた表面間の排除体積反発力、静電反発力、エントロピー力又は立体反発力等、粒子間の力の結果であり得る。「排除体積反発力」という用語は、固体粒子間、又は、適用可能な場合、粒子上に存在する表面構造体を含む固体粒子間でのいかなる重なり合いの不可能性も意味する。粒子間の「静電反発力」は、粒子が正味の電荷を担持する場合に観察される。２つの粒子が同じ実効電荷、すなわち、正又は負の電荷を担持する場合、それらの粒子は互いに反発することになる。「エントロピー力」という用語は、熱力学の第二法則に基づく力を意味し、エントロピーが最大にされる状態まで進むシステムの傾向を表している。これは、例えば磁気粒子等の球体間に効果的な反発力を生じ得る。「立体反発力」という用語は、立体効果に基づいている。原子レベルでは、分子内の各原子が特定の量の空間を占めるという事実から立体効果は生じるということを理解されたい。原子が互いに近くに寄せられる場合、付随するエネルギーの犠牲は、重なり合う電子雲により高く（Ｐａｕｌｉ又はＢｏｒｎの反発力）、さらに、分子の好ましい形状又は立体構造及び反応性に影響を与え得る。従って、立体障害又は立体効果は、個々の原子の電子雲間の反発として見ることができ、さらに、原則として、原子レベルでの静電反発力の結果として定義することができる。
【０１６５】
本明細書において使用される場合「前記反発的な表面構造体は、前記粒子上の押す効果を前記センサ表面に向けて運ぶ」という表現は、粒子のアンサンブル全体がセンサ表面に向けて押されることを意味する。この全押す効果は、例えば２つ以上の粒子間の静電的な押す効果等の粒子の反発する表面構造体の静電的な押す効果、若しくは、例えば２つ以上の粒子間の立体の押す効果等の粒子の反発する表面構造体の立体の押す効果、又は、例えば２つ以上の粒子間等の粒子の静電的な押す効果と立体の押す効果との組み合わせに基づいているか、又は、該効果によって引き起こされる。全押す効果は、例えば、アッセイにおける粒子の数、センサ表面付近における粒子の数、２つ以上の粒子の総電荷、静電的な押し対立体の押しの割合、及び、当業者には既知のさらなるパラメータ次第であってもよい。これらのパラメータは、本明細書において実行される装置又はアッセイの実施形態の特定のニーズ及び必要性に従って、調整及び／又は修正することができる。
【０１６６】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において先に規定した全押す効果は、表面相互作用の増加を測定することによって決定される。本明細書において使用される場合「表面相互作用の増加」という用語は、本発明による、例えば磁気粒子等の粒子間の反発力の結果としてセンサ表面にて又はその近くに存在している粒子の量又は数の増加を意味する。言い換えると、表面相互作用の増加は、従って、センサ表面との粒子の相互作用の増加を意味する。表面相互作用の増加は、センサ表面と密に接触して粒子が費やす時間の量を介して測定することができる。「密に接触」という用語は、適切な測定方法を使用して、例えば光信号等、センサ表面の十分近くにある場合に信号を生じるように、粒子が表面の近く又は表面にあるということを意味する。センサ表面の近く又はセンサ表面にある粒子の測定に対する適した方法は、当業者には既知であり、さらに、例えばＢｒｕｌｓ等、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００９、９．２５０４〜３５１０において記載されている。
【０１６７】
本発明の好ましい実施形態において、表面相互作用における増加は、アッセイ中の信号振幅を測定することによって決定される。限定されることなく、表面相互作用の増加を決定することの１つの構想される例は、本明細書において記載される内部全反射（ＦＴＩＲ）を介した信号振幅の測定である。結果として生じるＦＴＩＲ信号振幅は、従って、エバネッセント場に存在する粒子の数に相当する。
【０１６８】
表面相互作用の増加は、官能性を持っていない粒子、すなわち、いかなる反発的な表面構造体も有していない例えば磁気粒子等の粒子を使用した測定から生じる信号振幅との関連における、本明細書において先に規定した反発的な表面構造体で官能性を持たせた、例えば磁気粒子等の粒子を使用した測定から生じる信号振幅から計算される。例えば、表面接触の増加が２倍に増えた、すなわち、反発的な表面構造体で官能性を持たせた磁気粒子を使用した信号振幅が、官能性を持っていない例えば磁気粒子等の粒子の信号振幅の２倍である場合、表面相互作用における増加は１００％である。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態において、粒子とセンサ表面との表面相互作用の増加は、少なくとも約１％であってもよい。表面相互作用の増加は、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３２０％、３４０％、３６０％、３８０％、４００％、４２０％、４４０％、４６０％、４８０％、５００％、又は、５００％を超えてもよい。
【０１７０】
本発明の特に好ましい実施形態において、反発的な表面構造体は、例えば磁気粒子等の粒子上に存在する電荷を持った構造体又は立体コーティングであってもよい。
【０１７１】
本明細書において使用される場合「立体コーティング」は、コーティングの形状で粒子上に存在し得る、及び、粒子間の反発力を提供する表面構造体を意味する。本発明によって構想される１つの重要な効果は、そのような立体コーティングの存在が、粒子の相互反発力を増やし、その反発力が、次に、押す力の形成をもたらし、従って、当技術分野において記載されるように粒子の濃度を増やすことを必要とすることなく、フラットセンサに向けて粒子を押す（押す効果）ということである。従って、構想されるアプローチは、粒子の表面接触が粒子の反発力と共に増え、従って、反応速度を上げ、最終的には、アッセイの終わりの信号変化を増やすという効果を有する。
【０１７２】
本発明は、どのようにしてこの効果を達成することができるかという１つの方法、すなわち、立体コーティング若しくはバリアとして作用して、関連のない分子の非特異的結合を防ぎ得る、又は、他の分子若しくは粒子を特定の距離で保つ、粒子表面上の分子の網目を提供することによってこの効果を達成することができるということを表している。例えば分子の網目を含むコーティングの形状のそのような立体コーティングを有する粒子は、特定の立体反発力を及ぼし得るということが当業者によって正しく理解されることになる。
【０１７３】
粒子上のコーティングは、分子のネットワーク又は網目を形成するようにあってもよい。従って、本発明によるコーティングの層は、同じ又は類似の化学的、物理的及び／若しくは生物学的特性を有する小さな単位又は実体で構成され得る。好ましくは、本明細書において記載されるコーティングの層は、特定の長さのポリマーを形成する能力を持つ生物学的又は化学的分子を含んでもよい。適したポリマーは、例えば、糖、脂質、ポリエチレングリコール、多糖、デンドリマー、デンドロン、ナノチューブ又はその組み合わせである。好ましくは、これらのポリマーの実体は、リンカー又はスペーサー分子において含まれる。本発明の特定の実施形態において、コーティングは、単一表面層又は多層の殻構造で構成され得る。
【０１７４】
本明細書において使用される場合「スペーサー分子」という用語は、スペーサーの機能を主として有する分子を意味する。この目的のため、これらのポリマー分子は、特定の長さ及び強度を有して、ポリマー繊維のように作用することができる。
【０１７５】
本発明の特定の実施形態において、スペーサー分子は、例えば約４５０、４００、３５０、３００、２５０ｎｍ、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｎｍまで等、約５００ｎｍまでの長さを有してもよい。
【０１７６】
本発明のさらなる特定の実施形態において、スペーサー分子は、直線的、環状若しくは分枝状の分子又はその組み合わせであってもよい。スペーサー分子が分子状である場合、例えば、２、３、４、４又はさらなる階層的レベルを示す等、異なる程度の分枝であってもよい。本発明は、ネットワーク、層又は殻構造内のスペーサー分子の、例えば直線的及び分枝状等、異なるタイプ、異なる分枝の程度、異なるスペーサーの長さ等の組み合わせをさらに構想する。本発明の別の実施形態において、スペーサー分子又はスペーサー分子の組み合わせは、均一な網目又はネットワーク、すなわち、本質的に同じサイズの開口部を有した等置された網目又はネットワークを提供する。網目には開口部が提供されるということも構想される。網目がそのように均一であるため、分子の近づきやすさに関する網目の機能特性及び分子の運動による自由度が均一である場合に特に好ましい。これらのパラメータは、スペーサー分子の長さ、分枝の程度等によって調整することができる。
【０１７７】
さらなる好ましい実施形態において、リンカー分子は、表面構造体よりも長い。本明細書において使用される場合「長い」という用語は、リンカー分子の平均伸展長さが表面構造体の平均伸展長さよりも長いということを意味する。平均伸展長さにおける差は、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％又はそれ以上であってもよい。
【０１７８】
本発明のさらに特定の実施形態において、スペーサー分子は、三次元の分子の網目を形成するように、直接又は間接的に連結させることができる。そのような連結は、分子の末端、又は、例えば分枝が構想される場合に分子の中心に位置する官能基に基づき得る。連結の制御、その程度等は、例えば“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ又は“Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ”、Ｆｒｅｃｈｅｔ  ａｎｄ  Ｔｏｍａｌｉａ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ等の認定されたテキストから、当業者には既知の原理及び方法に従って実行することができる。
【０１７９】
本発明と関連して適したスペーサー分子は、例えば、本明細書において規定される糖、脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖、デンドリマー、デンドロン若しくはナノチューブ、又は、そのいかなる適した誘導体若しくは組み合わせであってもよい。スペーサー分子の群は、炭化水素ベースの界面活性物質、コレステロール、糖脂質、胆汁酸、サポニン、脂肪酸、合成両親媒性ブロックコポリマー、天然物のような卵黄リン脂質をさらに含んでもよい。
【０１８０】
立体コーティングに適したスペーサー分子の好ましい例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。ポリエチレングリコール分子は、表面上の分子の高密度且つ多量の網目を形成する能力を持つ。ＰＥＧ分子を連結させて、本明細書において先に記載した適した立体コーティングを形成することができるということも当業者によって正しく理解されることになる。ＰＥＧ分子の連結に対する適した分子は、本明細書において記載されるコネクター分子である。長さは、結果として生じるコーティング層の構想される全厚、リンカー分子の構想される長さ、リンカー分子の構想される屈曲性、剛直性若しくは安定性、及び／又は、１つの粒子あたりの構造体分子の構想される数に応じて作ることができる。
【０１８１】
粒子上に付着するポリエチレングリコール分子の数も、本発明によって構想される。密度が高いほどさらなる分子が粒子に付着され、さらに、コーティング層の厚さが、立体効果を介して粒子間反発をもたらすということを理解されたい。従って、粒子の立体反発力は、コーティング層の厚さ次第であり、コーティング層の厚さは、磁気粒子上のＰＥＧ分子の数、ＰＥＧ分子の長さ、及び、ＰＥＧ分子間の束縛の数次第であるということを理解されたい。１つの粒子あたりの分子の数は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、より好ましくは少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、さらにより好ましくは少なくとも約３００、３５０、４００又は４５０、さらに、最も好ましくは少なくとも約５００又は１０００であってもよい。
【０１８２】
本発明のさらなる実施形態において、粒子に付着した、本明細書において先に規定したポリエチレングリコール分子の数は変えることができる。特定の実施形態において、１つの粒子あたりのポリエチレングリコール分子の数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、より好ましくは約１００、１５０、２００、２５０、さらにより好ましくは約３００、３５０、４００又は４５０、さらに、最も好ましくは約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００に設定してもよい。さらなる実施形態において、１つの粒子あたりのポリエチレングリコール分子の数は、約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１１００００、１２００００、１５００００又はそれ以上に設定してもよい。１つの粒子あたりのポリエチレングリコール分子の数は、さらに、粒子のサイズ若しくは直径、付着が可能である若しくは適している領域、粒子のサイズ若しくは直径と粒子の長さとの比、ポリエチレングリコール分子の分子同一性、又は、当業者には既知のいかなる他の適したパラメータに応じても作ることができる。
【０１８３】
さらなる実施形態において、ポリエチレングリコール分子による粒子の表面被覆率は、粒子の全表面の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、又は、これらの値の間のいかなる値であってもよい。
【０１８４】
さらなる実施形態において、本明細書において規定される立体コーティングは、本明細書において規定される粒子の半径の少なくとも約１０５％という、本発明による粒子の水力学的半径を示唆する。本明細書において使用される場合「粒子の水力学的半径」という用語は、溶液中の立体コーティングを含む水和粒子の効果的な半径、又は、溶液中の立体コーティングを含む粒子の見えの大きさを意味する。好ましくは、立体コーティングは、本明細書において記載される立体効果に寄与する多数の分子、例えば該分子のうち全てを意味する。本明細書において規定される立体コーティングを含む粒子の水力学的半径は、本明細書において規定される粒子の半径、特に、そのような立体コーティングを含まない粒子の半径の少なくとも約１０５％であってもよい。本明細書において規定される立体コーティングを含む粒子の水力学的半径は、例えば、本明細書において規定される、例えば磁気粒子等の粒子、特に、そのような立体コーティングを含まない粒子の半径の約１０５％、１１０％、１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、若しくは、これらの値の間のいかなる値、又はそれ以上であってもよい。
【０１８５】
本発明の他の特に好ましい実施形態において、粒子は、粒子間の反発力を生成するために電荷を持った構造体を含んでもよい。本明細書において使用される場合「電荷を持った構造体」という用語は、本発明による粒子の実効電荷に寄与する実体を意味する。本発明による電荷を持った構造体は、正又は負であり得る実効電荷を有してもよい。電荷を持った構造体は特定のタイプ又は形状の分子に限定されないということを理解されたい。電荷を持った構造体は、例えば、分子の１つのタイプのポリマー、若しくは、分子の２つ以上の異なるタイプのポリマー、異なる分子若しくは実体の複合体、又は、正若しくは負の全実効電荷を生じる、例えば異なる正の電荷、異なる負の電荷、若しくは、（異なる）正及び負の電荷等、異なる電荷を有するいくつかの分子を含む化合物を含んでもよい。電荷計算のためのツール及び方法は、例えばＤｅｗａｒ，Ｍ．Ｊ．Ｓ．、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ａｎｄ  Ｉｎｃ．、１９６９、又は、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５、７２等から当業者には既知である。
【０１８６】
本発明の特定の実施形態において、電荷を持った構造体は、特定の粒子の実効電荷を生じるように、直接又は間接的に粒子に付着させてもよい。特定の実効電荷は、正又は負であり得る。異なる電荷を持った構造体が、同じ粒子上で付着されて、電荷を持った構造体の混合を生じるということも想到可能である。本発明と関連して、電荷を持った構造体は、特定の実効電荷を有する全面的な電荷を持った分子を提供するように粒子の表面を覆うことができる。ナノ粒子の実効電荷は、例えばゼータ電位の測定を介して決定することができるということが当業者には既知である。
【０１８７】
１つの構想される利点は、粒子、好ましくは磁気粒子上の増加した電荷の存在により増加した反発力が、静電反発力の増加をもたらし、静電反発力は、次に、非特異的な粒子のクラスタ形成を最小限にするということである。非特異的なクラスタ形成の減少は、界面活性剤を使用することなく背景レベルを減らすことに寄与し、従って、本明細書において記載される光磁気検出アッセイにおけるブランクレベルを改善し、従って、検出の限界を改善し得る。本発明によって構想される別の重要な効果は、負又は正の電荷である粒子上の増加した電荷の存在が、粒子の相互静電反発力を上げ、次に、静電の「押す」力の形成をもたらし、従って、当技術分野において記載される粒子濃度を上げることを必要とすることなくフラットセンサに向けて粒子の押しを生じるということである。構想されるアプローチは、粒子の表面接触が粒子の電荷と共に増加し、従って、反応速度を上げ、最終的には、アッセイの終わりの信号変化を増やし得るという効果を有する。
【０１８８】
さらに好ましい実施形態において、粒子上の増加した電荷の存在は、電荷を持った構造体を含むか若しくは該構造体から成る本明細書において記載されるリンカー分子を提供することによって、又は、リンカー分子に加えて、粒子に付着した電荷を持った構造体を提供することによって達成することができる。
【０１８９】
本発明の特定の実施形態において、電荷を持った構造体は、特定の実効電荷を有する全面的な電荷を持った分子を提供するように、粒子の全表面を覆うことができる。別の実施形態において、電荷を持った構造体は、例えば、粒子の全表面の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％、又は、それ未満、或いは、これらの値の間のいかなる値等、粒子のうちの部分、領域、又は区分のみを覆うことができる。
【０１９０】
本発明のさらなる実施形態において、粒子に付着する電荷を持った構造体分子の数は、例えば構想される粒子の全実効電荷に従って変更することができる。粒子の全実効電荷は、例えば、粒子に付着している電荷を持った分子の数と共に増える又は減る等、変わるということを理解されたい。ゼータ電位（ｍＶ）は、従って、粒子の量の増加と共に、並びに、分子の長さの増加と共に（負に）増え得る。従って、粒子上に存在する電荷の合計は全実効電荷に寄与するということが想到可能である。粒子の全実効電荷は、特に、磁気粒子上に存在する分子の数及び分子の長さ、その正又は負の電荷等の関数であるということをさらに正しく理解されたい。特定の実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持った構造体分子の数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１１００００、１２００００、１５００００又はそれ以上に設定することができる。１つの粒子あたりの電荷を持った構造体分子の数は、異なってもよく、又は、粒子のサイズ若しくは直径、付着が可能であるか若しくは適している領域、粒子のサイズ若しくは直径と粒子の長さとの比、電荷を持った構造体分子の分子同一性若しくは化学的同一性、例えばアッセイ等の構想される使用、又は、当業者には既知のいかなる他の適したパラメータに応じて作ってもよい。
【０１９１】
本明細書において記載されるこの静電の押す効果を得るための適した電荷を持った構造体は、核酸、リボ核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、糖、脂質若しくは多糖、又は、そのいかなる適した誘導体若しくは組み合わせ等、特定の実効電荷に寄与する能力を持つ生物学的又は化学的構造体若しくは化合物を含んでもよい。ハイドロゲル及びポリマーの電荷を持った構造体も構想される。好ましいのは、核酸に基づく電荷を持った構造体分子の使用である。
【０１９２】
「核酸に基づく電荷を持った構造体分子」は、いかなる核酸分子、又は、その誘導体若しくは類似体であってもよい。そのような電荷を持った構造体分子は、例えば、一本鎖及び／若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、或いは、いかなるタイプのその誘導体を含んでもよい。そのような電荷を持った構造体分子はさらに、本明細書において先に規定したＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ若しくはＡＮＡ分子、又は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ及びＡＮＡのいずれか１つの組み合わせ、若しくは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ塩基とのＬＮＡヌクレオチドの混合等、いかなるその混合若しくは組み合わせ、又は、本明細書に規定されるいかなる他の電荷を持った構造体分子とのいかなる混合若しくは組み合わせを含んでもよく、又は、それらから成ってもよい。核酸に基づく電荷を持った構造体と関連して、核酸又はその類似体には、電荷を担持する化学基又は化学ユニットを加えて提供してもよい。例えば、リン酸基、電荷を持った窒素誘導体、又は、電荷を持った硫黄誘導体を含めるか又は加えることができる。さらに、電荷は、例えばＤＮＡを含む二重鎖等、少なくとも１つの分子が電荷を含む二重鎖分子を提供することによって蓄積することができる。
【０１９３】
本発明の特に好ましい実施形態において、例えば磁気粒子等の粒子は、可変の長さを有し得る例えば一本鎖又は二本鎖核酸、特にｄｓＤＮＡ等、電荷を持った構造体で官能性を持たせてもよい。粒子上の電荷は、従って、そのゼータ電位によって測定することができる。本発明によって構想されるのは、粒子の表面接触が、粒子の電荷と共に増え、従って、反応速度を上げ、最終的には、アッセイの終わりの信号変化を増やすということである。本発明の特定の実施形態において、核酸等の電荷を持った構造体は、二本鎖又は二重鎖の形状で、すなわち、鎖間の塩基対によって結合した核酸分子の１つの鎖、及び、相補的又は逆平行の反対の鎖、又は、核酸分子のセンス若しくはアンチセンス鎖を含んで存在し得る。或いは、電荷を持った構造体は、一本鎖核酸又は一本鎖リボ核酸分子を含んでもよい。
【０１９４】
本発明の特に好ましい実施形態において、電荷を持った構造体は、二本鎖又はｄｓＤＮＡ、二本鎖又はｄｓＲＮＡ、ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位、及び、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位から成る群から選択される分子を含む。本発明のさらなる好ましい実施形態によって同様に構想される１つの有利な態様は、ＰＮＡ及びＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖部位がヌクレアーゼ又はプロテアーゼによって容易に認識されず、それらを酵素的分解に抵抗性であるようにすることである。
【０１９５】
本発明のさらなる実施形態において、適した核酸に基づく電荷を持った構造体分子は、異なる塩基組成及び／又は長さの一本鎖ＤＮＡ分子も含むか又は該分子から成ってもよい。一本鎖分子は、例えば、塩基配列の反復を包含してもよく、完全にランダムであってもよく、若しくは自然由来であってもよく、又は、一塩基のみのものであってもよい。
【０１９６】
本明細書において先に規定した核酸に基づく電荷を持った構造体分子又はその組み合わせは、異なる塩基組成及び／又は長さのものであってもよい。分子の長さは、約５ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドまで、好ましくは約５０ヌクレオチドから約３０００ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチドから約２０００ヌクレオチドまで、最も好ましくは約４００ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドまで変わり得る。他の長さ、又は、示された範囲内のいかなる長さの値も構想される。分子は、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００ヌクレオチド若しくはそれ以上、又は、前述の値の間のいかなる数のヌクレオチドの長さを有してもよい。
【０１９７】
核酸に基づく電荷を持った構造体分子の長さは、構想される特定の全実効電荷、構想されるリンカー分子の長さ、構想されるリンカー分子の屈曲性、剛直性若しくは安定性、及び／又は、１つの粒子あたりの構想される電荷を持った構造体分子の数に応じて作ることができる。実効電荷の計算に対する適した方法は、当業者には既知であるか、又は、適した文献資料から得ることができる。
【０１９８】
本発明のさらなる実施形態において、粒子に付着する、本明細書において先に規定した核酸に基づく電荷を持った構造体分子の数は、例えば構想される粒子の全実効電荷に従って変更することができる。粒子の全実効電荷は、例えば、粒子に付着している核酸に基づく電荷を持った構造体分子の数と共に増える又は減る等、変わるということを理解されたい。特定の実施形態において、１つの粒子あたりの核酸に基づく電荷を持った構造体分子の数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、より好ましくは約１００、１５０、２００、２５０、さらにより好ましくは約３００、３５０、４００又は４５０、さらに、最も好ましくは約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００に設定することができる。さらなる実施形態において、１つの粒子あたりの核酸に基づく電荷を持った構造体分子の数は、約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１１００００、１２００００又は１５００００に設定することができる。１つの粒子あたりの核酸に基づく電荷を持った構造体分子の数は、さらに、粒子のサイズ若しくは直径、付着が可能であるか若しくは適している領域、粒子のサイズ若しくは直径と粒子の長さとの比、核酸に基づく電荷を持った構造体分子の分子同一性、又は、当業者には既知のいかなる他の適したパラメータに応じて作ってもよい。さらなる実施形態において、核酸に基づく電荷を持った構造体分子による粒子の表面被覆率は、粒子の全表面の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、又は、これらの値の間のいかなる値であってもよい。
【０１９９】
例えば本明細書において先に規定したペプチド分子、ポリペプチド分子又はタンパク質分子は、アミノ酸内の電荷を持った実体の存在のため、適した電荷を持った構造体であってもよいか、又は、該構造体を含んでもよい。アミノ酸内に存在するアミン及びカルボン酸の官能基は、アミノ酸が両性の特性を有することを可能にするということが当技術分野において記載されている。カルボン酸基（−ＣＯ２Ｈ）は、脱プロトン化してカルボン酸陰イオン（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（−ＣＯ２−）になることができ、さらに、アルファ−アミノ基（ＮＨ２−）は、プロトン化して陽のアルファ−アンモニウム基（＋ＮＨ３−）になることができる。当業者は、カルボン酸基のｐＫａよりも大きいｐＨ値にて、カルボン酸陰イオンが優勢であるということも既知である。アルファ−アンモニウム基のｐＫａよりも低いｐＨ値にて、窒素は、主に、正の電荷を持つアルファ−アンモニウム基としてプロトン化される。当業者は、さらに、アミノ酸の実効電荷は、ｐＨ及びｐＫａ値次第であるという事実を知っている。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の実効電荷を計算するツール及び方法は、当業者には既知であるか、又は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ若しくはＴｒＥＭＢＬ）エントリーのリストに対する、又は、ｕｓｅｒ  ｅｎｔｅｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  Ｅ．等：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｓｅｒｖｅｒ；（Ｉｎ）Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５））に対する理論的なｐＩ（等電点）及びＭｗ（分子量）の算出を可能にするＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／Ｍｗツール等の適した文献資料から得ることができる。そのようなペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の電荷を持った構造体は、異なるアミノ酸組成及び／又は長さのものであってもよい。その長さは、構想される特定の全実効電荷、構想されるリンカー分子の長さ、構想されるリンカー分子の屈曲性、剛直性若しくは安定性、及び／又は、１つの粒子あたりの構想される電荷を持った構造体分子の数に応じて作ることができる。粒子の全実効電荷は、例えば磁気粒子等の粒子上のタンパク質又はペプチド分子の数、及び、分子の長さの関数であるということを理解されたい。
【０２００】
本発明のさらなる実施形態において、粒子に付着する、本明細書において先に規定した電荷を持ったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の数は、例えば構想される粒子の全実効電荷に従って変更することができる。特定の実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持ったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、より好ましくは約１００、１５０、２００、２５０、さらにより好ましくは約３００、３５０、４００又は４５０、さらに、最も好ましくは約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００に設定することができる。さらなる実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持ったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の数は、約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１１００００、１２００００、１５００００又はそれ以上に設定することができる。１つの粒子あたりの電荷を持ったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の数は、さらに、粒子のサイズ若しくは直径、付着が可能であるか若しくは適している領域、粒子のサイズ若しくは直径と粒子の長さとの比、電荷を持ったポリペプチド又はタンパク質分子の分子同一性、又は、当業者には既知のいかなる他の適したパラメータに応じて作ってもよい。さらなる実施形態において、電荷を持ったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子による粒子の表面被覆率は、粒子の全表面の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％、又は、これらの値の間のいかなる値であってもよい。
【０２０１】
電荷を持った構造体は、さらなる実施形態において、粒子上の全実効電荷に寄与する能力を持つ電荷を持った実体を含む、例えば本明細書において先に規定した糖分子であってもよく、又は、該分子を含んでもよい。そのような糖は、異なる組成及び／又は長さのものであってもよい。その長さは、構想される特定の全実効電荷、構想されるリンカー分子の長さ、構想されるリンカー分子の屈曲性、剛直性若しくは安定性、及び／又は、１つの粒子あたりの構想される電荷を持った構造体分子の数に応じて作ることができる。
【０２０２】
本発明のさらなる実施形態において、粒子に付着する、本明細書において先に規定した電荷を持った糖分子の数は、例えば構想される粒子の全実効電荷に従って変更することができる。特定の実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持った糖分子の数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、より好ましくは約１００、１５０、２００、２５０、さらにより好ましくは約３００、３５０、４００又は４５０、さらに、最も好ましくは約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００に設定することができる。さらなる実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持った糖分子の数は、約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１１００００、１２００００、１５００００又はそれ以上に設定することができる。１つの粒子あたりの電荷を持った糖分子の数は、さらに、粒子のサイズ若しくは直径、付着が可能であるか若しくは適している領域、粒子のサイズ若しくは直径と粒子の長さとの比、電荷を持った糖分子の分子同一性、又は、当業者には既知のいかなる他の適したパラメータに応じて作ってもよい。さらなる実施形態において、電荷を持った糖分子による粒子の表面被覆率は、粒子の全表面の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％、又は、これらの値の間のいかなる値であってもよい。
【０２０３】
適した電荷を持った構造体は、さらに、粒子上の全実効電荷に寄与する能力を持つ電荷を持った実体を含む、例えば本明細書において先に規定したいかなる脂質分子であってもよい。脂質、特にリン脂質における電荷は、典型的に、頭部の電荷によって決定される。脂質分子の実効電荷を与える能力を持つ適した頭部の好ましい例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、又は、そのいかなる組み合わせから成る群から選択される頭部である。
【０２０４】
そのような脂質は、異なる組成及び／又は長さのものであってもよい。その長さは、構想される特定の全実効電荷、構想されるリンカー分子の長さ、構想されるリンカー分子の屈曲性、剛直性若しくは安定性、及び／又は、１つの粒子あたりの構想される電荷を持った構造体分子の数に応じて作ることができる。
【０２０５】
本発明のさらなる実施形態において、粒子に付着する、本明細書において先に規定した電荷を持った脂質分子の数は、例えば構想される粒子の全実効電荷に従って変更することができる。特定の実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持った脂質分子の数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０、より好ましくは約１００、１５０、２００、２５０、さらにより好ましくは約３００、３５０、４００又は４５０、さらに、最も好ましくは約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００に設定することができる。さらなる実施形態において、１つの粒子あたりの電荷を持った脂質分子の数は、約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１１００００、１２００００、１５００００又はそれ以上に設定することができる。１つの粒子あたりの電荷を持った脂質分子の数は、さらに、粒子のサイズ若しくは直径、付着が可能であるか若しくは適している領域、粒子のサイズ若しくは直径と粒子の長さとの比、電荷を持った脂質分子の分子同一性、又は、当業者には既知のいかなる他の適したパラメータに応じて作ってもよい。さらなる実施形態において、電荷を持った脂質分子による粒子の表面被覆率は、粒子の全表面の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％、又は、これらの値の間のいかなる値であってもよい。
【０２０６】
電荷を持った構造体を含む「ハイドロゲル」は、水が分散媒であるコロイドゲルとして存在することもある、親水性である三次元のポリマー鎖のネットワークを意味する。典型的には、ハイドロゲルは、非常に吸収性であり、すなわち、９９．９％を超える水、天然又は合成のポリマーを含有することができ、ネットワーク構造を保存しながら多量の水を保持することができる。ハイドロゲルは、その有意な水含有量のため、天然組織と非常に類似した屈曲性の程度も有してよい。高い水含有量の結果として、ハイドロゲルは、一般的に、生体適合性材料として考慮され、それは、ハイドロゲルを生物医学的用途及び医薬用途に対して特に関心のあるものにする。ハイドロゲルの共通の成分は、例えば、豊富な親水基を有したポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー及びアクリレートコポリマーを含んでもよい。アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び、他の天然に得たポリマーを含む材料等、天然のハイドロゲル材料も構想される。ハイドロゲルが、粒子表面の電荷を持ったコーティングとして使用することができる電荷を持ったポリマー又はいかなる他の電荷を持った分子若しくは部分等の電荷を持った要素をさらに含む、含む、又はそれらから成るということがさらに好ましい。同種のハイドロゲル構造体は、粒子の全実効電荷に有利に寄与し、粒子の静電反発力をもたらし得る。特定の実施形態において、リンカー分子及びコーティング又は表面構造体の他の構成要素を、水性のハイドロゲルフレームワークシステム内に埋め込むことができ、特定の分子の安定性をさらに提供することができる。当業者は、どのようにして適した電荷を持ったポリマーを選択し、全実効電荷を有したハイドロゲルを得るかを既知であるだろう。加えて、適したハイドロゲルを生成する、及び、これらを粒子表面上で付着させるための手段及び方法は、当技術分野において既知であるだろう。本明細書において先に記載したハイドロゲルは、本明細書において記載されるポリマーの電荷を持った分子も含んでよい。
【０２０７】
電荷を持った構造体は、さらなる実施形態において、「ポリマーの電荷を持った分子」であってもよい。本明細書において使用される場合「ポリマーの電荷を持った分子」又は「電荷を持ったポリマー」という用語は、負又は正の電荷を持った反復単位から選択される複数の反復単位を含むポリマー又はコポリマーを意味する。そのようなポリマー又はコポリマーは、従って、高分子電解質（ａｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ）として機能する。電荷は、反復単位内の負又は正の電荷を持った基から得ることができるということを理解されたい。特に好ましいのは、四級アンモニウム基、一級アミン基、二級アミン基、三級アミン基、四級ホスホニウム基、三級ホスホニウム基、アミド基、芳香族窒素基及びスルホニウム基から成る群から選択される正の電荷を持った基である。
【０２０８】
結果として生じる正の電荷を持ったポリマーは、カチオンポリマーとも名付けられる。ポリマーの電荷を持った分子の正の電荷は、コイルドポリマーの形成を有利に防ぐことができる。これは、伸展したポリマーはより空間を必要とするため、ポリマーがその伸展した状態での粘性にさらに寄与するのを可能にする。
【０２０９】
好ましい負の電荷を持ったポリマーは、硫酸エステル基、カルボン酸エステル基、リン酸エステル基、スルホン基、スルフィド基、ジスルフィド基、オルトエステル基、無水物基及びベータ−ケトスルホン基、又は、そのいかなる組み合わせも含むが、それらに限定されない。
【０２１０】
高分子電解質は、高分子電解質多層（ＰＥＭ）として既知の新たなタイプの材料の形成において利用されてきた。これらの薄膜は、交互積層（ＬｂＬ）堆積技術を使用して構築される。ＬｂＬ堆積の間、（通常は電荷を持った）適した成長用基板は、正及び負の電荷を持った高分子電解質溶液の希釈槽間を往復して漬けられる。それぞれの浸漬の間、少量の高分子電解質が吸収されて、さらに、表面電荷が逆にされ、漸進的且つ制御された、ポリカチオン−ポリアニオン層の静電気的に架橋した膜の積層を可能にする。そのような高分子電解質多層は、正又は負の全実効電荷を有した本発明の粒子を提供するのに適しているということが正しく理解されることになる。
【０２１１】
本発明の特に好ましい実施形態において、本明細書において規定されるリンカー分子、及び／又は、本明細書において規定される反発的な表面構造体は、デオキシリボヌクレアーゼによって切断可能ではない。本発明のさらなる特定の実施形態において、本明細書において規定されるリンカー分子、及び／又は、本明細書において規定される反発的な表面構造体は、リボヌクレアーゼによって切断可能ではない。加えて又或いは、本明細書において規定されるリンカー分子、及び／又は、本明細書において規定される反発的な表面構造体は、二本鎖核酸分子を切断する能力を持つ制限酵素によって切断可能でなくてもよい。そのようなデオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ又は制限酵素による非切断性は、デオキシリボヌクレアーゼ酵素に対する基質又は認識モチーフを表さないリンカー分子又は反発的な表面構造体を提供することによって達成することができる。典型的には、その効果は、本明細書において規定されるＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ若しくはＡＮＡ分子等のＤＮＡ類似体を使用することによって、又は、ＰＥＧ等のポリマー分子を使用することによって達成することができる。
【０２１２】
本発明の別の好ましい実施形態において、本明細書において規定されるリンカー分子は、少なくとも１つの短い屈曲性のスペーサーをさらに含む。従って、本明細書において規定されるリンカー構造体、好ましくは本明細書において規定される長く剛直なリンカーは、一末端又は両末端にて、短い屈曲性のスペーサーを担持するということが本発明によって構想される。好ましいリンカー設計は、図１３において示されている。そのような屈曲性のスペーサーの存在による特定の屈曲性が、剛直なリンカー分子に加えられるということを正しく理解されたい。屈曲性のスペーサー構造体は、従って、その全体の剛直性を保持しながらリンカー分子の可動性に寄与する屈曲性の結合部として役立ち得る。図４において示されているように、あり得る方向づけの数は、そのような屈曲性のスペーサーによって増えるか又は促進される。屈曲性のスペーサーは、いかなる適した屈曲性の分子、例えば、ポリマー分子、ペプチド、化学基等であってもよい。
【０２１３】
特に好ましい実施形態において、短い屈曲性のスペーサーは、例えば、本明細書において規定される一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子等の一本鎖核酸、又は、本明細書において規定されるか若しくは当業者には既知であるいかなる他の一本鎖核酸形状も含む。
【０２１４】
本発明は、さらなる態様において、試料内の標的分子の存在又はその量を検出する方法に関し、当該方法は、
（ａ）本明細書において先に記載した装置において、試料と、第１の粒子に付着した第１の結合分子とを接触させるステップ、
（ｂ）前記試料を、
ｉ）平らな表面又は第２の粒子に付着する能力を持つ第２の結合分子であって、第１の結合分子及び／又は第２の結合分子は、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ、第２の結合分子、及び、任意選択で、
ｉｉ）平らな表面又は第２の粒子に付着した標的アナログ分子であって、標的分子が、標的アナログ分子への第１の結合分子の結合に干渉する能力を持つ、標的アナログ分子、
に接触させるステップ、並びに
（ｃ）平らな表面又は第２の粒子に結合した第１の粒子の数を検出するステップ、
を含み、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する。
【０２１５】
本発明によって構想されるのは、標的分子の存在及び／又はその量の検出に対する典型的な競合アッセイ又は非競合アッセイであり得るアッセイ型式である。本明細書において記載される装置、並びに、本発明による方法は、そのような分析を行うのに適しているということが当業者によって正しく理解されることになる。
【０２１６】
構想される非競合アッセイ型式において、第１の結合分子も第２の結合分子も、標的分子に特異的に結合する能力を持つ。第１のステップにおいて、第１の粒子上に存在する第１の結合分子が標的を認識して結合することができるということが想到可能である。第２のステップにおいて、標的分子に結合した第１の粒子は、拡散又は磁気作動によって、第２の粒子上又はフラットセンサ表面上に存在する第２の結合分子に向けることができる。第２の粒子又はフラットセンサの表面への結合は、標的分子への第２の結合分子の結合によって媒介される。非特異的に結合した粒子が表面から除去される１つ又は複数の洗浄ステップも構想される。本発明の特定の実施形態において、そのような洗浄ステップは、パルス磁気作動を介して発生する。結合した粒子の数は、本明細書において先に規定したように、粒子クラスタの数によって、又は、フラットセンサ表面に結合した粒子の量を介して、後に検出される。決定した結合した粒子の数は、試料内の標的分子の数に直接的に一致する。
【０２１７】
典型的には競合相手又は標的アナログの存在を要する競合アッセイに基づくアッセイ型式も構想される。本明細書において使用される場合「標的アナログ分子」という用語は、本明細書において規定される第１の結合分子への結合において標的分子と競合するいかなる分子も意味する。そのような場合、標的分子は、標的アナログ分子への第１の結合分子の結合に干渉することができる。第１の結合タンパク質が、本明細書において先に規定した平らな表面又は粒子の表面上で付着した標的アナログ分子に結合することができる競合又は阻害アッセイ型式が本発明によって構想される。この結合は、本明細書において記載される標的分子が試料内に存在する場合、及び、この標的分子が抗体に第一に結合する場合に防ぐことができる。例えば、小さな薬物分子を、薬物分子のアナログが例えばフラットセンサ表面に固定化される場合に、構想される方法を使用して検出することができる。薬物分子が試料内に存在しない場合、結合分子が標的分子を認識した粒子の全てが、表面上の標的アナログ分子に結合することができる。しかし、この結合に干渉する薬物（標的）分子の存在下で、抗薬物結合分子は、表面上の標的アナログに結合することはできないか、又は、表面上の標的アナログに結合するのはより少ない。そのような場合、表面上の粒子の量は、標的分子の量に逆比例して関係する。
【０２１８】
分析的手順を速めることができるように磁場を適用することによって作動することができる、本明細書において先に規定した磁気粒子の特定の使用が、本発明によってさらに構想される。磁場の使用が、非特異的に結合した粒子を除去するために背景信号を減らすことができるということも本発明によって構想される。本発明による検出方法に適した例証的な光磁気システムが、図１において例示されている。
【０２１９】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、磁力が適用され、粒子のクラスタ形成を促進するように、粒子を平らな表面又は互いの近くに運ぶ。
【０２２０】
「平らな表面又は第２の粒子に付着する能力を持つ」という用語は、第２の結合分子が必ずしも絶えず平らな表面若しくは第２の粒子に結合するか、又は、所定の様式で付着するのでないということを意味し、それは、アッセイの開始にてすでに表面に付着されていることを意味する。直接又は本明細書において先に規定したリンカー分子を介した表面への第２の結合分子の付着は、アッセイの間のいかなる時点でも発生し得るということを理解されたい。選択的な付着の時点によって、アッセイを行うことの広範囲の可能性が開拓されるということが当業者によって正しく理解されることになる。従って、その表面への結合とは関係なく別のモジュールとして作用し得る第２の結合分子−リンカー複合体が本発明によって構想される。そのような複合体は、例えば、図１１において描かれている。平らな表面にて絶えず固定されている又は付着しているわけではない第２の結合分子−リンカー複合体は、いくつかの利点を有し得るということがすぐに当業者によって正しく理解されることになる。１つの構想される利点は、付着していない第２の結合分子−リンカー複合体は、自由に且つ迅速に拡散し、従って、標的分子への結合を介した捕獲複合体への結合を高めることができるということである。「捕獲複合体」という用語は、第１の粒子に直接又は間接的に付着している第１の結合分子又は捕獲分子が標的分子を捕獲している状態を表している。この例において、第１の結合分子によって捕獲された標的分子への第２の結合分子／リンカー分子の結合は、時間的に独立して発生してもよく、すなわち、表面へのその付着に先立ち発生してもよい。
【０２２１】
特に好ましい実施形態において、平らな表面又は第２の粒子への前記第２の結合分子の付着は、標的分子への第２の結合分子の結合に先立ち又はその後に発生する。本発明の特定の実施形態において、第２の結合分子は、本明細書において先に規定した試料が添加される時点であるアッセイの第１のステップにおいて又はアッセイの開始に先立ち、好ましくは、本明細書において規定されるリンカー分子を介して表面に付着するのが可能にされる。そのような場合、捕獲複合体が第一に形成され、後のステップにおいて、表面に付着した第２の結合分子を含む予め形成された表面構造体に結合する。
【０２２２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、第２の結合分子−リンカーモジュールは、第一に標的分子へのその特異的結合によって捕獲複合体に結合し、さらに、全体の捕獲−第２の結合分子−リンカー複合体は、後に、捕獲複合体を表面に連結させるように、平らな表面又は第２の粒子の表面まで導かれる。構想されるアイデアは、図１１において例示されている。この例において、第１の結合分子が第１の粒子の表面に直接付着しながら、有利な距離は、第２の抗体に付着した長いリンカーによって生じる。言い換えると、長く剛直なリンカーに付着した第２の結合分子は、結合キネティクスを高める効果を生じる。この特定の例は、第２の結合分子による捕獲複合体認識の速度を、本明細書において先に記載したモジュール様付着のため、最大にすることができるということを実証している。重要なことに、当技術分野に対して主要なことは、本明細書において先に記載した長く剛直なリンカーの存在が、結合キネティクスを高めるのに要求される距離をもたらすということである。従って、この例は、高められた結合キネティクスを得るための長く剛直なリンカーの原理が、決して、第１の粒子への第１の結合分子の付着のためのリンカーに限定されないということを実証している。
【０２２３】
しかし、どちらの結合分子も、長いリンカーに結合されて、第１の粒子と平らな表面又は第２の結合分子の表面との有利な距離をさらに増やすか又は積み重ねるということも想到可能である。
【０２２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、例えば磁気粒子等の結合した粒子の検出は、表面付近の前記結合した粒子からの内部全反射（ＦＴＩＲ）を介して、若しくは、散乱光の測定を介して、又は、クラスタ形成の光学的検出を介して発生する。
【０２２５】
特に好ましいのは、粒子、特に磁気粒子の光学的検出に基づくセンシング装置である。対応する詳細は、図１に例示されている例証的な装置から得ることができ、該装置は、光源及び光検出システムを含み、さらに、本発明による特定の実施形態を構築している。検出のために使用される光学的方法は、典型的に、光信号における変化を測定し、その変化は、磁気粒子から反射される光における差を意味し、さらに、光学的手段によって検出することができる。例えば、そのような方法は、散乱光の検出、又は、全反射（ＴＩＲ）若しくは内部全反射（ＦＴＩＲ）に基づく検出等の技術を含んでもよい。好ましくは、光信号における変化は、それらの磁気粒子のみが、センサ表面への第２の結合分子の結合によって結合していることを意味する。詳細は、当業者には既知であるか、又は、Ｂｒｕｌｓ等、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００９、９．２５０４〜３５１０等の適した参照文献から得ることができる。
【０２２６】
本明細書において使用される場合「全反射」は、１つの材料に、特定の角度よりも大きい入射の角度で、より高い屈折率を有した別の材料から光が入る場合に特定の材料に存在する状態を表している。これが発生する特定の角度は、両方の材料の屈折率次第であり、臨界角とも呼ばれ、さらに、数学的に計算することができる（スネルの法則、屈折の法則）。例えば磁気粒子等の粒子を欠く時は、屈折は発生せず、光源からの光ビームは完全に反射される。例えば磁気粒子等の粒子が、表面の近くにあるか、又は、表面と接触している場合、光線は、粒子によって阻まれていると言われ、そのポイントでの反射は、もはや全反射ではない。
【０２２７】
全反射の信号の減少として定めることができる信号を計算することができる。その信号は、表面上の粒子の濃度（表面密度
【数６】
2014533831.tif 000007
）にほぼ一次従属している。信号は、
【０２２８】
【数７】
2014533831.tif 000008
として表すことができ、ここで、Ｓは、％で表される測定された信号変化であり、さらに、βは、表面密度から信号変化への変換係数である。
【０２２９】
本発明の好ましい実施形態において、例えば磁気粒子等の結合した粒子の検出は、表面付近の前記結合した粒子からの内部全反射（ＦＴＩＲ）を介して、又は、散乱光の測定を介して発生する。
【０２３０】
Ｂｒｕｌｓ等、２００９、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、９、３５０４〜３５１０において記載された、粒子クラスタの測定に基づく方法も構想される。本発明の別の好ましい実施形態において、検出は、例えば磁気粒子等の少なくとも２つの粒子、及び、少なくとも１つの標的分子を含むクラスタの検出を介して実行してもよい。例えば、本明細書において先に規定した例えば磁気粒子等の粒子は、少なくとも１つの検出されることになる標的分子が存在する場合には、例えば磁気粒子等のさらなる少なくとも１つのさらなる粒子とクラスタ形成することができ、その標的分子は、両方の粒子を架橋するか又は組み合わせる能力を持つ。特定の実施形態において、粒子クラスタは、本明細書において記載される第１及び第２の粒子を含む。検出は、特に好ましい実施形態において、光磁気システムにおいて実行してもよく、ここで、前記粒子は、定常の試料流体において磁気的に作動され且つ光学的に検出される磁気粒子であり、この光磁気システムは、（ｉ）例えば本明細書において先に規定したような標的分子捕獲、（ｉｉ）磁気作動、及び、（ｉｉｉ）検出のステップを含む。
【０２３１】
別の態様において、本発明は、例えば本明細書において先に規定した試料等の試料内の標的分子を検出するための、例えば磁気粒子等の本明細書において規定される粒子の使用に関する。
【０２３２】
本発明の特に好ましい実施形態において、本明細書において先に記載した装置、方法又は使用と関連して述べられる標的分子は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又は副甲状腺ホルモンである。本発明は、さらなる標的分子又はクラスタ若しくは標的分子の検出も目標とする。特に好ましいのは、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）である。
【実施例１】
【０２３３】
リンカーとしての長いｄｓＤＮＡの使用
リンカーの長さ（伸展）を、一組の実験において分析した。この目的を達成するために、非常に剛直な分子であり、従って表面から遠い伸展も生じる長いｄｓＤＮＡをリンカーとして使用した。特に、５００ｎｍのストレプトアビジンで被覆された粒子を、可変長のｄｓＤＮＡと共にインキュベートした。各ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の一末端にて１つのビオチン部分、分子のもう一方の末端にてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子を含有した。粒子及びＤＮＡを含有した溶液をカートリッジ内に注入し、磁気引力を使用して抗Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ抗体で被覆されたセンサ表面に結合させた。表面から非結合粒子を除去した磁気洗浄ステップの後、表面に結合した粒子の量を決定した。
【０２３４】
粒子を表面に結合させることのキネティクスを有意に高めたということが分かった。例えば、５００ｎｍまでの平均直径を有した磁気ナノ粒子に対して、２４０ｎｍまでの輪郭長さに相当する７００塩基対（ｂｐ）までのｄｓＤＮＡの最適な長さ、及び、１４０ｎｍまでの平均伸展を観察した（図６参照）。
【０２３５】
同様の実験を、１０００ｎｍのストレプトアビジンで被覆された粒子を用いて行った。図７において見ることができるように、（３４０ｎｍまでの輪郭長さに相当する）１０００ｂｐという最適なリンカーの長さも、およそ２倍の長さである。これらの測定から、最適なＤＮＡ輪郭長さは、粒子の半径のおよそ２／３であると思われる。
【実施例２】
【０２３６】
結合キネティクスに対するリンカー表面密度の効果
結合キネティクスに対するリンカー表面密度の効果を、１つの「標的分子」に結合されるストレプトアビジンで被覆された５００ｎｍの粒子、抗Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子抗体で被覆されたセンサ表面に結合するのに有用な、一末端にビオチン及びもう一方の末端に付着したＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ分子を有したｄｓＤＮＡ鎖（図９、左のパネル、ひし形参照）を使用したアッセイ型式においてテストした。後に、異なる量の官能性を持っていない同じ長さの（しかしＴｅｘａｓ  Ｒｅｄｂｕｎｎｓｈｉは欠いている）ｄｓＤＮＡを粒子にも結合させ、センサ表面に結合する粒子の能力を比較した。
【０２３７】
さらなる実験において、粒子に１９９９ｂｐのｄｓＤＮＡを負荷した。図９の真ん中のパネルは、１つの「官能基の」ＤＮＡ分子のみを有した粒子と比較した、官能性を持っていないＤＮＡでの負荷後の粒子結合の相対量を示している。
【０２３８】
さらなる実験において、粒子に４９７ｂｐのｄｓＤＮＡを負荷した。図９の下のパネルは、１つの「官能基の」ＤＮＡ分子のみを有した粒子と比較した、官能性を持っていないＤＮＡでの負荷後の粒子結合の相対量を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月16日(2014.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の標的分子を検出するための装置であって、
（ａ）前記試料内の標的分子の測定のための試料容器、
（ｂ）前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たせた第１の粒子、及び、
（ｃ）フラットセンサを覆うか又は第２の粒子上に存在する、第２の結合分子を含む表面構造体、
を含み、
前記第１の粒子は、前記表面構造体の前記第２の結合分子に直接又は間接的に結合する能力を持ち、前記第１及び／又は第２の結合分子は、長く剛直なリンカー分子を介して前記第１及び／若しくは第２の粒子の粒子表面、並びに／又は、フラットセンサの表面に付着し、前記リンカー分子の長さ及び堅牢性は、６０ｎｍを超える前記リンカーの平均伸展長さを生じるように選択され、さらに、粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、前記試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する、装置。
【請求項２】
前記第１及び／又は第２の粒子は磁気粒子である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１及び／又は第２の粒子の直径は、少なくとも約１００ｎｍであり、さらに、前記平均伸展長さは、前記直径の少なくとも１０％である、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
剛直なリンカー分子は、該リンカー分子の輪郭長さの少なくとも２０％の平均伸展長さを有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記第１の結合分子が、抗体若しくはその断片、アプタマー、リガンド又は相補的な核酸である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記リンカー分子は、核酸分子又は非生物学的ポリマーであるか若しくは該核酸分子又は非生物学的ポリマーを含み、好ましくは、前記リンカー分子は、ｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ分子、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位及びＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位等の二本鎖核酸分子から成る群から選択される分子であるか又は該分子を含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記第１の粒子は、該粒子の表面に直接付着する反発的な表面構造体をさらに含み、該反発的な表面構造体は、前記粒子の特定の実効電荷及び／又は立体反発力を生じるように前記粒子の表面を覆い、さらに、前記反発的な表面構造体は、前記粒子上の押す効果を前記センサ表面に向けて運び、好ましくは、前記リンカー分子は、前記反発的な表面構造体よりも長い、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記反発的な表面構造体は、好ましくはｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位及びＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖部位等の核酸分子、ハイドロゲル並びにポリマーから成る群から選択される分子を含む電荷を持った構造体、又は、立体コーティングである、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記リンカー分子及び／又は前記反発的な表面構造体は、デオキシリボヌクレアーゼ、及び／又は、二本鎖核酸分子を切断する能力を持つ制限酵素によって切断可能ではない、請求項７又は８に記載の装置。
【請求項１０】
前記リンカー分子は、少なくとも１つの短い屈曲性のスペーサー、好ましくは、一本鎖核酸を含む短い屈曲性のスペーサーをさらに含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
試料内の標的分子の存在又はその量を検出する方法であって、
（ａ）請求項１乃至１０に記載の装置において、前記試料と、第１の粒子に付着した第１の結合分子とを接触させるステップ、
（ｂ）前記試料を、
ｉ）平らな表面又は第２の粒子に付着する能力を持つ第２の結合分子であり、前記第１の結合分子及び／又は前記第２の結合分子は、前記標的分子に特異的に結合する能力を持つ、第２の結合分子、及び、任意選択で、
ｉｉ）前記平らな表面又は第２の粒子に付着した標的アナログ分子であり、前記標的分子が、前記標的アナログ分子への前記第１の結合分子の結合に干渉する能力を持つ、標的アナログ分子、
に接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記平らな表面又は第２の粒子に結合した第１の粒子の数を検出するステップ、
を含み、
粒子クラスタの数又は結合した粒子の数は、前記試料に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関係する、方法。
【請求項１２】
前記粒子のクラスタ形成を促進するように、磁力が加えられて、前記粒子を前記固体の支持体又は互いの近くに導く、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記平らな表面又は第２の粒子への前記第２の結合分子の付着は、前記標的分子への前記第２の結合分子の結合に先立ち、又は、該結合の後に発生する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料内の標的分子を検出するための、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の粒子の使用。
【請求項１５】
前記標的分子は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又は副甲状腺ホルモンである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の装置、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の方法、又は、請求項１４に記載の使用。
【国際調査報告】
2014533831.tif 000022
2014533831.tif 000023
2014533831.tif 000024