(57)【要約】  細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料の導管が開示される。ＥＣＭ材料の導管を使用して対象の心臓内の不良な房室弁を交換する房室弁の再生方法が開示される。ＥＣＭ材料を滅菌し、脱細胞化する方法が開示される。
2014519379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓内の心房と心室との間の環状領域に付着され、対象の心臓の心室内の複数の乳頭筋に結合された、対象の心臓内の不良な房室（ＡＶ）弁を交換するためのＡＶ弁の再生方法であって、
対象の心臓からの不良なＡＶ弁を除去する工程と、
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の導管であって、内腔を画定し、入口部分と出口部分を有するＥＣＭ材料の導管を移植する工程と、
を含み、前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部分は前記環状領域に固定され、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分は、前記複数の乳頭筋の少なくとも二つに固定されることを特徴とする再生方法。
【請求項２】
前記ＥＣＭ材料の導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、請求項１に記載の再生方法。
【請求項３】
前記ＥＣＭ材料の導管が無菌で、無細胞である、請求項２に記載の再生方法。
【請求項４】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部及び出口部分がそれぞれ外周辺を有し、前記出口部分の前記外周辺が前記入口部分の外周囲に実質的に等しい、請求項1に記載の再生方法。
【請求項５】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部及び出口部分がそれぞれ外周辺を有し、前記出口部分の前記外周辺が前記入口部分の外周囲より大きい、請求項1に記載の再生方法。
【請求項６】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部及び出口部分がそれぞれ外周辺を有し、前記出口部分の前記外周辺が前記入口部分の外周囲より小さい、請求項1に記載の再生方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭ材料の導管を移植する工程が、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分を、前記対象の心臓の前記心室内の第一の乳頭筋及び第二の乳頭筋に固定することを含み、前記ＥＣＭ材料の導管により再生された前記交換ＡＶ弁が二尖弁である、請求項１に記載の再生方法。
【請求項８】
前記不良のＡＶ弁が三尖弁である、請求項７に記載の再生方法。
【請求項９】
前記第一の乳頭筋が前記対象の心臓の右心室の前乳頭筋であり、前記第二の乳頭筋が対象の心臓の右心室の後乳頭筋である、請求項8に記載の再生方法。
【請求項１０】
前記第一の乳頭筋が前記対象の心臓の右心室の前乳頭筋であり、前記第二の乳頭筋が対象の心臓の右心室の中隔乳頭筋である、請求項８に記載の再生方法。
【請求項１１】
前記第一の乳頭筋が前記対象の心臓の右心室の後乳頭筋であり、前記第二の乳頭筋が対象の心臓の右心室の中隔乳頭筋である、請求項８に記載の再生方法。
【請求項１２】
前記不良のＡＶ弁が二尖弁である、請求項７に記載の再生方法。
【請求項１３】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分が外周辺を有し、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分が、第一の付着点において前記第一の乳頭筋に、第二の付着点において前記第二の乳頭筋に固定され、前記第二の付着点は、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分の前記外周辺に沿って前記第一の付着点から離間する、請求項７に記載の再生方法。
【請求項１４】
前記ＥＣＭ材料の導管によって画定される前記内腔が前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分に近接した中心点を有し、前記内腔の前記中心点は、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間に形成される角度の頂点に対応する、請求項１３に記載の再生方法。
【請求項１５】
前記第一の付着点と前記第二の付着点との間に形成される前記角度が、約１２０°から約１５０°の範囲の大きさを有する、請求項１４に記載の再生方法。
【請求項１６】
前記不良なＡＶ弁が三尖弁であり、前記ＥＣＭ材料の導管を移植する工程が、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分を、前記対象の心臓の心室内の第一の乳頭筋、第二の乳頭筋、及び第三の乳頭筋に固定することを含み、前記ＥＣＭ材料の導管により再生された前記交換ＡＶ弁が三尖弁である、請求項１に記載の再生方法。
【請求項１７】
前記ＥＣＭ材料の導管が、縦軸方向の長さ、第一の端、および反対側の第二の端を有し、本方法は、さらに、前記ＥＣＭ材料の導管を移植する工程の前に、多層ＥＣＭ材料の導管を形成するために、前記ＥＣＭ材料導管の前記縦軸方向の長さの少なくとも一部に沿って前記ＥＣＭ材料の導管の前記第二の端に向けて、前記ＥＣＭ材料導管の内腔へと前記ＥＣＭ材料の導管の前記第一の端を反転させる工程を含む、請求項1に記載の再生方法。
【請求項１８】
前記ＥＣＭ材料の導管が、縦軸方向の長さ、第一の端、および反対側の第二の端を有し、本方法は、さらに、前記ＥＣＭ材料の導管を移植する工程の前に、多積層ＥＣＭ材料の導管を形成するために、前記ＥＣＭ材料導管の前記縦軸方向の長さの少なくとも一部に沿って前記ＥＣＭ材料の導管の前記第二の端に向けて、前記ＥＣＭ材料の導管の前記第一の端を外へと外転させる工程を含む、請求項1に記載の再生方法。
【請求項１９】
前記対象の心臓から不良なＡＶ弁を除去する工程が、前記不良なＡＶ弁に付着された腱索の少なくとも一部を除去することを含む、請求項１に記載の再生方法。
【請求項２０】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分が複数の延長部分を含み、前記少なくとも二つの乳頭筋の各乳頭筋が、前記複数の延長部分のそれぞれに固定される、請求項１に記載の再生方法。
【請求項２１】
対象の心臓内の心房と心室との間の環状領域に取り付けられ、対象の心臓の心室内の複数の乳頭筋に結合された、対象の心臓内の不良な房室（ＡＶ）弁を交換するためのＡＶ弁を再生するためのＥＣＭ材料の導管であって、該ＥＣＭ材料の導管は内腔を画定し、入口部分と出口部分を有し、前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部分は前記対象の心臓の前記環状領域に付着される構成をもち、前記ＥＣＭ材料の導管の少なくとも一部分が多積層構造を有し、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分は複数の延長部分を含み、該複数の延長部分の各延長部分は、前記乳頭筋の少なくとも二つの乳頭筋のそれぞれに付着される構成をもつことを特徴とするＥＣＭ材料の導管。
【請求項２２】
前記ＥＣＭ材料の導管が無菌で、無細胞である、請求項２１に記載のＥＣＭ材料の導管。
【請求項２３】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部及び出口部分がそれぞれ外周辺を有し、前記出口部分の前記外周辺が前記入口部分の外周囲に実質的に等しい、請求項２１に記載のＥＣＭ材料の導管。
【請求項２４】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部及び出口部分がそれぞれ外周辺を有し、前記出口部分の前記外周辺が前記入口部分の外周囲より大きい、請求項２１に記載のＥＣＭ材料の導管。
【請求項２５】
前記ＥＣＭ材料の導管の前記入口部及び出口部分がそれぞれ外周辺を有し、前記出口部分の前記外周辺が前記入口部分の外周囲より小さい、請求項２１に記載のＥＣＭ材料の導管。
【請求項２６】
前記複数の延長部分が第一の延長部分及び第二の延長部を含み、前記第一の延長部分及び前記第二の延長部分は、それぞれ延長点で前記ＥＣＭM材料の導管に固定され、前記ＥＣＭ材料の導管によって画定された前記内腔が、前記ＥＣＭ材料の導管の前記出口部分に近接した中心点を有し、前記内腔の前記中心点は、前記第一及び第二の延長部分の前記延長点の間に形成される角度の頂点に対応する、請求項２１に記載のＥＣＭ材料導管。
【請求項２７】
前記第二の延長部分の前記第一の延長点と前記第二の延長点の間に形成される角度が、約１２０°から約１５０°の範囲の大きさを有する、請求項２６に記載ＥＣＭ材料の導管。
【請求項２８】
前記ＥＣＭ材料の導管の少なくともの一部分が多層構造を有する、請求項２１に記載のＥＣＭ材料の導管。
【請求項２９】
前記多層構造が、多積層構造を含む、請求項２８に記載のＥＣＭ材料導管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，６９３号、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，８７３号、２０１１年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９１，７２３号及び２０１２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６５０，９１１号の出願日の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の導管、及び対象の心臓の中の房室弁を再生するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の導管を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
交換心臓弁には多くの既知の種類がある。交換心臓弁の特定の種類の選択は、弁の位置、患者の年齢及び他の細目、外科医の経験及び得意かどうかなどの要因に依存する。一般的に使用される交換心臓弁は、機械的な弁、同種移植組織弁、異種移植組織弁といった三つのグループに分類することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
限定でなく例示的な、ケージドボール弁、二尖弁、傾斜ディスク弁を含む機械的な弁は、術後に機械的な弁を所定の場所に保持するために、患者の自然の組織に弁プロテーゼを縫合することができるように、典型的に、縫合リングに取り付けられる。機械的な心臓弁が有利な長期耐久性を有するが、これらの機械な弁には、患者内に血栓の形成を引き起こす傾向がある。このような血栓が機械的な弁に形成されると、それらは、弁が正しく開閉することを妨げ、または、より重要なことに、弁から外れ、脳に塞栓を引き起こし、塞栓性脳卒中を引き起こしかねない。したがって、そのような機械弁をもつ患者は、自らの残りの人生の間、全身の抗凝固薬を服用する必要がある。これらの抗凝固薬は、高価であることに加えて、血栓が、出血性脳卒中をもたらし得る異常出血を患者に引き起こす危険がある。
【０００５】
同種移植組織は、ヒトの死体のような人間から採取される。機械的な心臓弁とは異なり、同種移植組織弁は、典型的に、血栓の形成を促進せず、したがって、患者のための抗凝固薬を処方する必要性を回避できる。しかし、同種移植組織弁は、新しい心臓弁を必要とするすべての患者のニーズを満たすために利用できる十分な数がない。さらに、同種移植組織弁は、対象内の房室（ＡＶ）弁を交換するために使用されたときに、重大な合併症の問題があった。また、同種移植組織弁は、機械的な弁又は異種移植弁よりも、移植がより困難な点がある。移植におけるこれらの困難のため、同種移植組織弁に関連した手術のリスクは、多くの場合、機械的な弁及び異種移植弁に関連した手術のリスクよりも大きい。
【０００６】
異種移植組織弁は、ウシ又はブタなどの非ヒト組織源から形成されている。ほとんどの公知の異種移植組織弁は、非ヒト組織源から弁葉を縫合及び/又は構成し、ステント及び/又は縫合リングを用いて患者の心臓内の弁葉を固定することにより構成されている。これらの異種移植組織弁は、比較される機械的な弁より血栓の形成を引き起こす可能性が低く、したがって、異種移植組織弁を受ける患者は、常に抗凝固薬を服用する必要はない。しかし、異種移植組織弁は、石灰化しやすく、機械的な弁がもつ長期耐久性に掛け、その結果、機械的な弁と比較して頻繁に交換が必要とする。これらの障害に寄与し得る要因の一つは、異種移植組織弁が、典型的には、動物組織の抗原性を低減するために受ける化学処理である。これらの化学的処理なしで、異種移植組織は、（患者による組織弁の拒絶につながりかねない）患者の免疫応答をトリガすることができる。異種移植組織弁の耐久性の欠如に寄与し得る別の要因は、異種移植組織弁が正常な心臓弁の解剖学的構造に正確に近似することを妨げ得るステントおよび/または縫合リングの存在である。
【０００７】
米国特許第5480424号及び第5713950号（参照文献としてここに組み込まれる）に記載されたものを含む公知の異種移植組織弁は、公知の異種移植組織弁の制限の多くを含む様々な制限を受ける。例えば、既知の組織導管は、導管の抗原性（導管の移植後の耐久性を低下させる化学的処理を使用してアドレスされる）を受ける。さらに、これらの既知の導管は、それらが数ヶ月については有能な心臓弁の交換物として単に働くように、患者の心臓内で急速に分解される。
【０００８】
このように、当業者に必要とされていることは、対象の心臓の中で解剖学的に正確なＡＶ弁を再生するために容易に移植することができる、容易に入手でき、高耐久性をもち、そして手頃な価格の組織プロテーゼである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の導管が開示されている。一態様では、開示されたＥＣＭ材料の導管は、内腔を画定し、入口部および出口部を有している。
ＥＣＭ材料の導管の入口部分は、内腔の入口を含む。ＥＣＭ材料導管の出口部分は、内腔の出口を含む。ＥＣＭ材料の導管の入口部分及び出口部分は、それぞれ外周辺を有することができる。ＥＣＭ材料の導管は無菌であり、無細胞である。対象の心臓内の不良なＡＶ弁を交換するための房室（ＡＶ）弁を再生する方法も開示される。対象の心臓内の不良なＡＶ弁を交換する房室（ＡＶ）弁も開示されている。一態様では、本方法は、対象から不良なＡＶ弁を除去することを含む。本方法は、機能ＡＶ弁を再生するために、対象の心臓内のＥＣＭ材料の導管を移植することを含む。
【００１０】
本発明のこれらのおよび好ましい実施形態の他の特徴は、参照が添付の図面に対してなされた詳細な説明においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は人間の心臓の切り欠き図である。
【図２】図２は、本明細書に記載されるように、房室弁の環状部に及び二つの乳頭筋に付着されているＥＣＭ材料の導管の斜視図である。
【図３】図３は、図２に示されているＥＣＭ材料の導管の底面斜視図である。図３に示されているＥＣＭ材料の導管は、第一の付着点で第一の乳頭筋に及び第二の付着点で第二の乳頭筋に付着されている。
【図４】図４は、対象の心臓から取り出した後の自然の三尖弁の画像である。図４は、様々な自然のブタ及びヒトの三尖弁に実施された特定の測定に対応したマーキングを含んでいる。
【図５】図５は、自然の三尖弁を取り出し、ＥＣＭ材料の導管を移植した後のＥＣＭ材料の導管の画像である。図５は、右心の生体外における閉じた状態のＥＣＭ材料の導管を示す。
【図６】図６は、動物内の三尖弁として機能する典型的なＥＣＭ材料の導管に対する術後ドップラー心エコー画像を示している。図６（a）は、閉じた状態の弁をもつ術後、一ヶ月経過のＥＣＭ材料の導管を示す。図６（b）は、開放状態の弁をもつ手術の直後のＥＣＭ材料の導管を示す。図６（c）は、閉じた状態の弁をもつ手術の直後のＥＣＭ材料の導管を示す。
【図７】図７は、本明細書に記載される典型的なＥＣＭ材料の導管の移植後の様々な時点における、再生された三尖弁の画像である。図７（a）は、三ヶ月経過後の再生を示す。図７（b）は、五ヶ月経過後の再生を示す。図７（ｃ）は八が月経過後の再生を示す。図７（ｄ）は、十二ヶ月経過後の再生を示す。
【図８】図８に、本明細書に記載される典型的なＥＣＭ材料導管の移植後三ヶ月経過後の再生三尖弁の画像である。
【図９】図９−１０は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。図９は滅菌後の各ＳＩＳのＤＮＡガン流量を示す。
【図１０】図９−１０は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。図１０は、生の、未処理のＳＩＳ組成物から除去されたＤＮＡの割合を示す。
【図１１】図１１−１２は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図１１は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物のｂＦＧＦ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図１２】図１１−１２は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図１２は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物の活性ＴＧＦベータ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図１３】図３１は、本明細書に記載のように、急速減圧中にｂＦＧＦがＳＩＳ組成物に組み込まれた実験の結果を示す。図１３は急速減圧後の各ＳＩＳ組成物についてのｂＦＧＦの含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図１４】図１４は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、二層のＳＩＳ組成物の引張強度が測定された実験の結果を示す。図１４は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物について測定された引張強度を示す。
【図１５】図１５は、本明細書に記載の滅菌及び脱細胞化方法を含む様々な滅菌及び／又は脱細胞化方法を受けて、ＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図１５は、滅菌及び／又は脱細胞化後の各ＳＩＳ組成物についてｂＦＧＦ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図１６】図８は、様々な方法で処理された後のＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織は超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１７】図１７は、様々な方法で処理された後のＳＩＳからのＤＮＡの除去率を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織は超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２内に置かれた。比較は、滅菌されない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）で滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１８】図１８は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の活性形質転換増殖因子（ＴＧＦベータ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）洗浄剤のみで処理したものである。次に組織は超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌の処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１９】図１９は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）界面活性剤のみを用いて処理したものである。次に組織は、超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図２０】図２０は、急速減圧によるＳＩＳへの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量の追加を示す。ベースライン測定は生又は未処理のＳＩＳである。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲及びそれらの前後の記載を参照することによって、より速やかに理解されるであろう。しかしながら、本装置、システム及び／又は方法が開示され記載される前に、別に特定されない限り、本発明は開示された特定の装置、システム及び／又は方法に限定されるものではなく、従って当然に、様々であり得ることが理解されるべきである。また、本明細書の用語は、具体的な態様を記載する目的でのみ使用され、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形の「一つの（“a”）」、「一つの（“an”）」及び「その（“the”）」は、文脈が明確に別に指示しない限り、複数形の指示物を含む。従って、例えば、一つの「付着点」の参照は、文脈が別に示さない限り、二つ以上のそのような付着点を含む場合がある。
【００１４】
本明細書において、範囲は「約」一つの具体的な値から、及び／又は「約」もう一つの具体的な値までのように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、もう一つの態様では、一つの具体的な値から、及び／又は他の具体的な値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することにより、値が近似値として表現される場合、具体的な値がもう一つの態様を形成することが理解されるであろう。さらに、各々の範囲の端点が、他の端点に関係して、及び他の端点に独立して意義を有することが理解されよう。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「任意」又は「任意で」は、続いて記載される事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載は、その事象又は状況が起こる事例と起こらない事例とを含む。
【００１６】
本明細書で使用される用語「又は」は、具体的な一覧の任意の一つの要素を意味し、また、その一覧の要素の任意の組み合わせを含む。
【００１７】
別に明確に記載されない限り、本明細書に説明される方法又は態様は、そのステップを特定の順序で行うことを要するものと解釈されることを全く意図するものではない。従って、方法に係る請求項が特許請求の範囲において、または発明の詳細な説明において、ステップが特定の順序に限定されるべきであると特に記載しない場合、いかなる点においても、順序を暗示することを全く意図するものではない。このことは、本明細書に記載された、ステップの配列又は動作フローに関するロジックの事柄、文法的構成や句読点から派生する平易な意味、または、態様の数又はタイプを含む、解釈についての任意のあり得る非明示の原則に適用できる。
【００１８】
排他的な用語等を使用することなく、特許請求の範囲の「含む」という用語は、任意の付加的な要素を含むことを許容する。そのことは、所定の数の要素が特許請求の範囲に列挙されているかどうかに関わらず、また、特徴の追加が特許請求の範囲に説明される要素の本質を変質させると見なされ得るかどうかに関わらない。本明細書において特に定義されるときを除いて、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的な用語は、特許請求の範囲の妥当性を維持しながら、可能な限り広範な一般に理解される意味を与えられるべきである。
【００１９】
本明細書で使用される、「対象」は個体であり、以下に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット又は齧歯類）、魚、鳥、爬虫類又は両生類を含む。用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、成体及び新生児の対象、並びに胎児は、男性か女性かに関わらず、網羅されることが意図されている。「患者」は、疾患または疾病に苦しむ対象である。用語「患者」は、ヒトおよび家畜対象を含む。本明細書で使用される、用語「患者」と「対象」は、交互に使用され得る。
【００２０】
本明細書で使用される、用語「周辺」は、閉じた平坦な形状により画成される境界の周囲又は長さを指す。任意であるが、本明細書で使用されておいるように、「周辺」は閉じた平坦な円の周囲に対応することができる。しかし、「周辺」は、限定でなく例示的な楕円形、四角形、矩形、台形又は非対称的な閉じた平坦形状といった閉じた平坦形状の周囲に対応することができることも意図する。例えば、本明細書で使用されているように、導管の外側「周辺」は、導管の縦軸にそった特定の位置での導管の外側表面により画成される閉じた平坦形状の周囲に対応する。
【００２１】
本明細書で使用される、用語「円錐台形」は、そのベースに平行な平面によって先端が切り捨てられ、円錐の形状に対応する円錐台の形状を指す。従って、本明細書で使用される、「円錐台形」の導管は、その長手方向軸に沿って直径が変化する実質的に円形の断面を有している。本明細書に開示された「円錐台形」の導管は、各々が外周辺を有する入口部分及び出口部分を有する。任意に、開示された「円錐台形」の導管の出口部分の外周辺は、「円錐台形」の導管の入口部分の外周辺よりも大きくすることができる。あるいは、開示された「円錐台形」の導管の出口部分の外周辺は、「円錐台形」の導管の入口部分の外周辺よりも小さくすることができる。例示的な態様では、開示された「円錐台形」の導管の出口部分の外周辺は、「円錐台形」の導管の入口部の外周辺に実質的に等しくすることができる。
【００２２】
本明細書で使用される、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも８０％となるように少なくとも８０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を説明することを意図したものである。本明細書に記載のいくつかの実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９０％となるように少なくとも９０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９５％となるように少なくとも９５％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９６％となるように少なくとも９６％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらに他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９７％となるように少なくとも９７％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９８％となるように少なくとも９８％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたまたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９９％となるように少なくとも９９％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。このように、本明細書で使われる、用語「無細胞」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％及びそれらの値の間に入る任意の割合のレベルに脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。
【００２３】
本明細書で使用される、用語「添加物」は、本明細書に開示される滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物に所定の特質を与えるために、開示されるＥＣＭ材料に選択的に組み入れられ得る材料を指す。そのような添加物は、限定でなく例示的に、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、細胞及び例えば、スタチン系薬剤、副腎皮質ステロイド、抗不整脈薬、非ステロイド性抗炎症薬、他の抗炎症化合物等の薬剤、ナノ粒子及び金属化合物を含む場合がある。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「同時に」は、事象が同時に及び／又は重複して起こることを指すとともに、事象が互いに前後約３０分以内に順次的に起こることを指す。従って、第１の事象が起こり、そして第２の事象が第１の事象と同時に起こった場合、または、第１の事象の前後３０分以内に起こった場合、第２の事象が第１の事象と同時に起こったという言う場合がある。例えば、第１の方法のステップが実施され場合、第１の方法のステップの五分後に実施される第２の方法のステップは、第１の方法ステップと「同時に」行われると言う場合がある。同様に、第２の方法ステップが第３の方法ステップを行う１０分前に行われた場合、第２の方法ステップが第３の方法ステップと「同時に」行われたと言う場合がある。
【００２５】
本明細書で使用される、用語「超臨界」は、材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているときの材料の流体状態を指す。材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているとき、典型的に気体及び液体の両方の機能特性を有し、超臨界流体として機能すると言われる。従って、例えば、二酸化炭素がその臨界温度（３１．１℃）及びその臨界圧力（１，０７１ｐｓｉ）以上に保持される場合、それは超臨界二酸化炭素流体としてふるまい、例えば、流体の密度を有しながら気体の拡散特性を示し得る。
【００２６】
図１−図３は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の導管の作製及び使用方法を示す。一態様では、図２−図３に示されているように、例示的なＥＣＭ材料の導管１０は、内腔１２を画定し、入口部分１４及び出口部分１８を有することができる。この態様では、ＥＣＭ材料の導管１０の入口部分１４が内腔１２の入口１６を含み得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管１０の出口部分１８が内腔１２の出口２０を含み得ることが企図される。
【００２７】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の入口部分１４と出口部分１８は、それぞれ外周辺をもち得る。一態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の出口部分１８の外周辺がＥＣＭ材料の導管の入口部分１４の外周辺と実質的に等しくし得ることが企図される。任意に、この態様において、ＥＣＭ材料の導管１０は、実質的に円筒形であってもよい。別の態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の出口部分１８の外周辺がＥＣＭ材料の導管の入口部分１４の外周辺よりも大きくてもことが企図される。任意に、この態様において、ＥＣＭ材料の導管１０は、略円錐台状であってもよい。さらなる態様において、ＥＤＭ材料の導管１０の出口部分１８の外周辺がＥＣＭ材料の導管の入口部分１４の外周辺よりも小さくてもよいことが企図される。任意に、この態様において、ＥＤＭ材料の導管１０は、略円錐台状であってもよい。
【００２８】
一態様において、ＥＣＭ材料導管が、縦軸線２４をもち、および約１０ｍｍから約５０ｍｍの範囲の縦方向の長さをもち得ることが企図される。別の態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の入口部分１４及び出口部分１８の外周辺が約２５ｍｍから約１９０ｍｍの範囲にあり得ることが企図される。したがって、さらに、ＥＣＭ材料の導管１０の入口部分１４及び出口部分１８において、ＥＣＭ材料の導管の内腔１２が約８ｍｍから約６０ｍｍの範囲の直径を有し得ることが企図される。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の導管１０は厚さをもつ壁２２を有し得る。この態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の壁２２の厚さが約０．０５ｍｍから約３．００ｍｍの範囲にすることができることが企図される。
【００２９】
例示的な一実施態様において、ＥＣＭ材料の導管の出口部分１８は、ＥＣＭ材料の導管１０から外方に突きでる一つ以上の延長部分を含むことができる。これは、延長部分がより自然の機能を模倣する乳頭筋のために付着構成を提供するように構成し得ることが企図される。さらに、延長部分が、ＥＣＭ材料の導管１０に付着された自然の乳頭筋と本明細書に記載のようにＥＣＭ材料の導管の移植後に形成された再生ＡＶ弁の間の融合を促進するように構成され得ることが企図される。
【００３０】
例示的な態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の出口部分１８が、本明細書に記載のように少なくとも一つの延長部分を含む場合、第一、第二および第三の付着点の一つ以上が、該少なくとも一つの延長部の対応する延長部上に位置し得ることが企図される。これらの態様において、少なくとも一つの延長部分が三つの延長部分有し、第一、第二及び第三の付着点のそれぞれがそれぞれの延長部分に上に位置し得ることが企図される。
【００３１】
実施態様において、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／又は基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含む場合がある。開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ウマ、齧歯類等を含む一つ以上の哺乳動物のＥＣＭ構成要素又は材料由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。従って、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、二つ以上のウシ、二つ以上のブタ、二つ以上のイヌ又は二つ以上のヒツジ等の二つ以上の同種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。さらに、開示の滅菌された、無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、または、ウシとヒツジ等の二つ以上の異種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、又はウシとヒツジといった二つ以上の異なる哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。またさらに、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、第１の哺乳動物由来のＳＩＳ等の第１の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料、並びに、限定でなく例示的であるが、第２の哺乳動物由来のＳＳ等の第２の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。
【００３２】
種々の態様において、開示されたＥＣＭ材料の導管１０は、ＥＣＭ材料の実質的に平坦なシートから作製することができる。これらの態様において、ＥＣＭ材料の導管１０は、ＥＣＭ材料導管の内腔１２が画成されるようにＥＣＭ材料のシートの第一の縁をＥＣＭ材料のシートの対向する第二の縁に固定することによって成形することができる。ＥＣＭ材料のシートの第一の縁が、限定で例示的であるが、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科的ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む任意の従来の外科用付着手段を用いてＥＣＭ材料のシートの第二の縁に固定され得ることが企図される。例示的な態様において、非吸収性縫合糸がＥＣＭ材料のシートの第一の縁をＥＣＭ材料のシートの対向する第二の縁に固定するために使用される場合、ＥＣＭ材料の導管の内腔内に位置する縫合糸の部分を削減するために、非吸収性縫合糸がＥＣＭ材料の導管の外側表面上に位置し得ることが企図されている。任意の一態様において、ＥＣＭ材料のシートの第二の縁が、ＥＣＭ材料のシートの第一の縁と重なり合うように固定し得ることが企図される。この態様では、さらに、シートの第一の縁と第二の縁が重なりあうところで、ＥＣＭ材料の導管１０の一部分がＥＣＭ材料の導管の内腔に対して裏返され得ることが企図される。別の任意の態様において、ＥＣＭ材料のシートの第二の縁がＥＣＭ材料のシートの第一の縁と実質的に整列して固定され得ることが企図される。
【００３３】
さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料導管１０は、限定でなく例示的であるが、自然のＳＩＳ層の内腔のような傷がなく、内腔のＥＣＭ材料の少なくとも一部分を含み得る。これらの態様において、傷がないＥＣＭ材料は内腔を画定する。
【００３４】
さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料導管１０は、限定でなく例示的であるが、公知の体外法を使用して円筒形マンドレルの外側表面上の線維芽細胞のような細胞成長により成形され得る。これらの態様において、マンドレルの外表面上の細胞の増殖が、一つ以上のＥＣＭ材料の生成をもたらし得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管１０が、公知の方法を用いて、または本明細書に開示されるように脱細胞化され得ることが意図されている。
【００３５】
さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料の導管１０を公知の方法を用いて凍結乾燥することができる。さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料の導管１０が凍結乾燥された場合、ＥＣＭ材料の導管が公知の方法を用いて水和され得ることが企図される。この態様において、凍結乾燥されたＥＣＭ材料導管が、滅菌水、生理食塩水、又は平衡塩類溶液中で、約５分ないし約３０分の範囲の間、水和され得ることが意図される。
【００３６】
任意に、開示されたＥＣＭ材料導管１０がＥＣＭ材料の二層以上の多層構造とすることができる。例示的な態様において、多層ＥＣＭ材料の導管１０が、傷がないＥＣＭ材料の内腔部分から作製され得る。本明細書において使用される、用語「内腔」は、内腔を画定する材料の一部を指す。この態様において、傷のない内腔ＥＣＭは、第1の端及び第二の端を有し、内腔を定義することができる。任意に、多層ＥＣＭ材料の導管を形成するために、傷のないＥＣＭの第一の端は、第二の端に到達するまで、反転させることができる。これに代え、多層ＥＣＭ材料の導管を作成するために、傷のないＳＩＳの第一の端は第二の端に到達するまでそれ自体の上に外転することができる。さらなる態様において、多積層ＥＣＭ材料の導管を形成するために、多層ＥＣＭ材料の導管は公知の技術を用いて凍結乾燥することができる。任意の一態様において、多層ＥＣＭ材料導管は、凍結乾燥時にマンドレル上に配置することができる。これに代える他の態様において、多層ＥＣＭ材料導管の凍結乾燥中、低温バルーン（cryoballoon）が多層ＥＣＭ材料の導管の内腔内に配置され、多層ＥＣＭ材料の層と共に互いに押し付けるために、膨張させ得る。さらに、従来のラミネーション法が、多積層ＥＣＭ材料の導管を形成するために、多層ＥＣＭ材料の導管の層を積層するために使用され得ることが企図される。
【００３７】
一態様において、開示されたＥＣＭ材料の導管１０は、無菌、無細胞ＥＣＭ組成物を含むことができる。 例示的な態様において、このような無菌、無細胞ＥＣＭ組成物は、同時に滅菌及び単離されたＥＣＭ材料を脱細胞化することにより形成することができる。特に、以下の方法で開示されているように、単離されたＥＣＭ材料の所望の滅菌及び脱細胞化は、組織組成の自然の特性が維持され、ＥＣＭ材料が滅菌化及び無細胞化されるように、同時に行ってもよい。
【００３８】
例示的な態様において、ＥＣＭ材料の導管１０はＥＣＭ材料導管の入口部分及び/又は出口部に近接して多層構造を有する。これらの態様において、ＥＣＭ材料の入口部分および/または出口部分に近接して多層構造を形成するために、ＥＣＭ材料の導管の少なくとも一端が、ＥＣＭ材料の導管の長さの一部に沿って外転又は反転させ得ることが企図される。さらに、多層構造がＥＣＭ材料の導管用の縫合リングとして効果的に機能し得ることが企図される。
【００３９】
ＥＣＭ材料の導管で使用するためのＥＣＭ組成物の滅菌／脱細胞
本明細書に記載されているように、開示された方法は、単離されたＥＣＭ材料の急速減圧を利用して、ＥＣＭ材料を無細胞にする。このＥＣＭ材料の急速減圧は、以前から公知の方法で適用される減圧速度よりも非常に高速の減圧速度で起こる。本明細書に記載されるように、ＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料に所望の滅菌剤及び添加剤を組み込むために使用することができる。
【００４０】
任意に、開示のＥＣＭ材料の弁導管のＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、NovaSterilis社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（該特許は参照文献としてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたシステム等の公知の滅菌システムを使用して滅菌することができることが企図される。従って、いくつかの態様では、開示の方法を実施するために使用されるシステムは、標準の圧縮保存シリンダ及びブースター（例えば、ハスケルブースターＡＧＴ７／３０）と連動して使用される標準のエアコンプレッサを含む場合がある。他の態様では、エアコンプレッサ及びブースターは、単一のコンプレッサに置き替えることができる。実施態様において、圧縮保存シリンダは、二酸化炭素を受け入れるように構成される場合があり、ブースターは、二酸化炭素ブースターであり得る。
【００４１】
システムはさらに入口ポートを含む場合があり、それによってリザーバに収容された一つ以上の添加物を弁及び添加物ラインを通じて反応容器に加えることができる。本明細書で使用される、用語「反応容器」は、本明細書に開示されるように、ＥＣＭ材料を受け入れ、ＥＣＭ材料を一つ以上の滅菌剤及び添加物に曝露することができるように構成された内部空間を有する任意の容器を指す。実施態様において、反応容器は、限定されないが、バスケット、バケツ、外筒、箱、パウチ及びその他の公知の容器とすることができる。反応容器は再シール可能であり得ることが企図される。一つの態様では、反応容器は、ＥＣＭ材料が充填されるシリンジであり得ることが企図される。
【００４２】
限定でなく例示的に、二酸化炭素等の選択された一次滅菌剤が、弁及び供給ラインを介してヘッダーラインから反応容器に導入され得ることが企図される。さらに、限定でなく例示的に、０．５μｍフィルタ等のフィルタが、容器から材料が漏れるのを防ぐために、供給ラインに設けられ得ることが企図される。実施態様では、圧力計が、圧力を視覚的に監視することができるように、ヘッダーラインの遮断弁の下流に設けられる場合がある。逆止弁が、ブースター内への逆方向の流体流れを防ぐために、弁の上流のヘッダーラインに設けられる場合がある。ヘッダーラインに存在する過圧状態を防止するために、圧力逃がし弁が任意で設けられ得る。
【００４３】
一つの態様では、反応容器の減圧は、出口ライン及び反応容器と連通する弁を用いて達成され得る。この態様において、減圧された流体は、供給ラインを介して容器から出て、フィルタユニットにより濾過され、その後セパレータに案内され、二酸化炭素等の濾過された流体が排出ラインを介して排出され得ることが企図される。さらに、上流の構成要素の流体を単離できるように、弁が装置の様々なラインに組み込まれ得ることが企図される。
【００４４】
一つの実施態様において、反応容器は、限定でなく例示的に、３１６ゲージステンレス鋼等のステンレス鋼を含む場合がある。もう一つの実施態様において、反応容器は、実験室規模又は工業規模のいずれかで、滅菌される材料を収容するのに十分な全内部体積を有する場合がある。例えば、反応容器は、約８インチの長さ、約２．５インチの内径及び約６００ｍＬの内部体積を有する場合があることが企図される。更に他の態様において、反応容器は、振動器、温度制御ユニット、インペラと磁気駆動部とを含む機械的攪拌システムを含む場合がある。一つの任意の態様では、反応容器は、３１６ゲージのステンレス鋼を含むバスケットを収容し得ることが企図される。この態様では、バスケットは滅菌される材料を保持し、さらにインペラを保護し、所定の方法で一次滅菌剤を案内するように構成される場合があることが企図される。
【００４５】
反応容器は、飛沫や乱流による材料の損失なしに、また、逆拡散を介して圧力ラインを汚染することなしに、一定圧力又は継続的な加圧及び減圧（圧力サイクル）条件下で動作させ得ることが企図される。さらに、システム内の弁は、反応容器をシステムの他の構成要素から容易に分離及び除去することを可能にし得る場合があることが企図される。一つの態様では、反応容器の内部空間へアクセスできるようにするために、減圧時に反応容器の頂部を除去することができる。
【００４６】
任意に、システムは、ユーザが反応容器内の温度を調整可能に制御できるようにする温度制御ユニットを含む場合がある。
【００４７】
使用時には、開示された装置を本明細書に開示されるように、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製する方法に採用する場合がある。しかしながら、開示の装置は単に例示であって、開示の方法のステップを実行することが可能な任意の装置が、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが理解される。従って特許請求の範囲に係る方法は、特定の装置に限定されるものでは全くない。
【００４８】
コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の有意な低減が、開示の方法に従い、一次滅菌剤を使用し滅菌温度及び圧力条件に単離されたＥＣＭ材料をさらすことにより、達成され得ることが企図される。任意に、一次滅菌剤は、所望の滅菌を達成するために、1つ以上の二次滅菌剤と組み合わせることができることが企図される。任意に、さらに、選択された添加物が、得られるＥＣＭ組成物に所望の特性を与えるためにＥＣＭ材料に組み込まれ得ることが企図される。またさらに、開示の方法は、対象の体内に移植するための滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが企図される。
【００４９】
本明細書に記載のように、開示の方法は、ＥＣＭ材料を無細胞にするために、単離されたＥＣＭ材料の急速な減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速な減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度よりも有意に高い減圧速度で起こる。本明細書に記載のようにＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料へ所望の滅菌剤及び添加物を組み込むことを強化するために使用することができる。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、天然の増殖因子の保持率を向上させながら、ＥＣＭ材料を無細胞にすることができることが企図される。またさらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、ＥＣＭ材料の引張強度の保持率を向上させるために使用することができることが企図される。
【００５０】
開示の方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及び生体栄養特性（bioptric properties）を著しく弱めることがないだけではなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化し、並びに、ＥＣＭ組成物に様々な添加物を組み入れる性能を強化することに、より有効である。従って、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知のＥＣＭ組成物に比べて、より脱細胞化された、並びに、より多くの添加物を組み込み、その後送達するより高い性能を有するＥＣＭ組成物を提供する。さらに、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知である滅菌され脱細胞化されたＥＣＭ組成物に比べて、より多い量及び／又はより高い濃度の保持された天然の増殖因子を有し、より高い引張り強度を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【００５１】
実施態様において、一次滅菌剤は、その臨界圧力及び臨界温度条件にある、または、それに近い条件にある二酸化炭素とすることができる。しかしながら、例えば、ＥＣＭ材料の天然の特性を妨げない気体、液体又は粉末の滅菌剤を含む任意の従来の滅菌剤が一次滅菌剤として使用され得ることが企図される。
【００５２】
一つの実施態様において、開示される滅菌プロセスは、一次滅菌剤として二酸化炭素を用いて、約１，０００〜約３，５００ｐｓｉの範囲にある圧力及び約２５℃〜約６０℃の範囲にある温度で実施され得る。より好適に、超臨界二酸化炭素が使用される場合、滅菌プロセスは、１，０７１ｐｓｉ以上の圧力及び３１．１℃以上の温度で、一次滅菌剤として二酸化炭素を使用し得ることが企図される。この態様では、滅菌されるＥＣＭ材料は、そのような圧力および温度条件又はそれに近い条件にある二酸化炭素に、約１０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは、約１５分ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは、約２０分ないし約１２時間にかけてさらされる場合がある。好適に、開示のシステム及び方法に用いられる二酸化炭素は純粋であるか、または代替的に、二酸化炭素の滅菌特性を損なわない他のガスを微量のみ含むものであり得る。以下のさらなる検討を簡単にするために、用語「超臨界二酸化炭素」が使用されるが、そのような用語は、前述のような圧力及び温度範囲内にある二酸化炭素に限定されず、開示の方法の実施に十分に採用され得ることが理解されよう。開示された圧力及び温度範囲内で、二酸化炭素は気体、液体、流体又はプラズマ形態でＥＣＭ材料に与えられ得ることが企図される。
【００５３】
いくつかの態様で、開示の方法で用いる二次滅菌剤は、限定でなく例示的に、過酸化物及び／又はカルボン酸等の化学滅菌剤を含み得る。好ましいカルボン酸は、アルカンカルボン酸及び／又はアルカン過カルボン酸を含み、それらは各々任意に、α位の炭素のところで、ハロゲン、酸素、窒素グループ等の1つ以上の電子求引性置換分と置き換えられ得る。開示の方法の実施に使用される化学滅菌剤の実施例の種類は、限定でなく例示的に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、酢酸（ＡｃＡ）、過酢酸（ＰＡＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びそれらの混合物を含む。一つの実施態様において、化学滅菌剤は、酢酸、過酸化水素及び過酢酸を含む混合物であるSporeclenz（商標）滅菌剤を含み得る。
【００５４】
二次滅菌剤は、一次滅菌剤の全体積を基準に、滅菌の強化に有効な少なくとも約０．００１ｖｏｌ％以上の量で用いることができることが企図される。さらに、二次滅菌剤の量は、用いられる特定の二次滅菌剤に依存する場合があることが企図される。従って、例えば、過酢酸は約０．００５ｖｏｌ％以上の比較的少量であり、一方で酢酸は、約１．０ｖｏｌ％以上の量で用いられる場合があることが企図される。従って、二次滅菌剤の濃度は、約０．００１ｖｏｌ％ないし約２．０ｖｏｌ％の範囲にあり、典型的に、限定でなく例示的な超臨界二酸化炭素等の開示された一次滅菌剤と組み合わせて、滅菌強化作用を達成するために、本明細書に開示のように使用され得ることが企図される。
【００５５】
一つの態様では、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物の製造方法は、哺乳動物由来の選択された組織を採取する工程と、選択された組織を滅菌生理食塩水又は当業者には知られている他の生体適合性の液体（限定でなく例示的に、リンガー液又は生体平衡塩類溶液）中ですすぐ工程を含む場合がある。この態様において、選択された組織は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるもの又はないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織であり得る。もう一つの態様において、本方法は、選択された組織を約１２〜約３６時間、より好ましくは、約１８〜約３０時間、最も好ましくは、約２２〜約２６時間の範囲にある期間、凍結する工程を含む場合がある。例えば、選択された組織が凍結される期間は、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間及び前述の値の間に入る時間の任意の他の期間であり得ることが企図される。追加の態様において、本方法は、冷低張トリス緩衝液中で選択された組織を解凍する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、本方法は、選択された組織を氷上の冷低張トリス緩衝液中で、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて解凍する工程を含む場合がある。実施態様では、選択された組織を凍結及び解凍する工程は、６回まで周期的に繰り返すことができることが企図される。
【００５６】
もう一つの態様において、本方法は、選択された組織由来のＥＣＭ材料を単離する工程を含む場合がある。この態様において、ＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるもの又はないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織等の公知の細胞外マトリックス構成要素を含む任意の材料とすることができる。一つの実施例の限定しない態様において、ＥＣＭ材料を単離する工程は、哺乳動物組織からＳＩＳを単離する工程を含む場合がある。この態様では、本方法は、小腸の壁を該小腸の長手方向の軸に実質的に平行な経路に沿って切開する工程と、切開の経路に沿って小腸を開き、小腸を表面上で平らにする開き工程と、滅菌生理食塩水又は他の生体適合性の流体で小腸をすすぐ工程と、小腸のＳＩＳを周囲の平滑筋層及び漿膜層、並びに粘膜から機械的に取り、粘膜下層及び基底膜層を原則として残す、取り工程とを含み得る。しかしながら、ＥＣＭ材料は、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第５，２７５，８２６号、米国特許第５，２８１，４２２号、米国特許第５，５５４，３８９号、米国特許第６，５７９，５３８号、米国特許第６，９３３，３２６号、米国特許第７，０３３，６１１号、Voytik-Harbin等 の“Identification of Extractable Growth Factors from Small Intestinal Submucosa” J. Cell. Biochem.  Vol. 67 pp. 478-491 (1997)、Hodde等の“Virus Safety of a Porcine-Derived Medical Device: Evaluation of ＡＶiral Inactivation Method” Biotech. & Bioeng. Vol. 79 No. 2 pp. 21 1-216 (2001)、Badylak他 “The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction” Cell & Developmental Biology Vol. 13 pp. 377-383 (2002)、Robinson他 “Extracelular Matrix Scaffold for Cardiac Repair” Circulation Vol. 112 pp. I-135-I-143 (2005)、Hodde他 “Effects of Sterilization on an Extracellular Matrix Scaffold: Part I. Composition and Matrix Architecture” J. Mater. Sci.: Mater. Med. Vol. 18 pp. 537-543 (2007)、並びに、Hodde他“Effects of Sterilization on an Extracellular Matrix Scaffold: Part II. Bioactivity and Matrix Interaction” J. Mater. Sci. Mater. Med. Vol. 18 pp. 545-550 (2007)（各々が参照文献としてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたものを含む任意の従来技術を使用して単離され得ることが企図される。
【００５７】
さらなる態様において、本方法は、単離されたＥＣＭ材料を、０．５〜１％のトリトンＸ−１００／０．５〜１％のデオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Lonza Walkerville社）の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて２４〜４８時間インキュベートする工程を含む場合がある。この態様では、胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平坦なＥＣＭ材料又はシート状のＥＣＭ材料は、延伸された形態でインキュベートされ得ることが企図される。さらに、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等のＥＣＭ材料の導管又は他の内腔を有するＥＣＭ材料は、浸漬を通じて、並びに蠕動ポンプを使用することにより、様々な開示された溶液を用いて灌流され得る。
【００５８】
さらなる態様では、インキュベーション後に、本方法は、ＥＣＭ材料をＤＰＢＳですすぐ工程を含む場合がある。この態様で、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、１回、２回、３回、４回、５回又は６回を含む６回までＥＣＭ材料をすすぐこと（各々のすすぎは約３０分間持続する）を含み得ることが企図される。一つの実施態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎは約３０分持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００５９】
任意で、実施態様において、本方法はさらに、第２のインキュベーション手順を含む場合がある。これらの態様において、第２のインキュベーション手順は、ＥＣＭ材料を、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを含有する等張トリス緩衝液内で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートする工程を含み得る。等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートする工程は、人体の温度に実質的に対応する約３７℃の温度で行われ得ることが企図される。さらに、等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートする工程は、約３０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは約1時間ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは約２時間ないし約１２時間にかけての期間、行われ得ることが企図される。さらなる態様において、第２のインキュベーション手順は、さらに、ＤＰＢＳでＥＣＭ材料をすすぐ工程を含む場合がある。この態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎが約３０分間持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００６０】
またもう一つの態様では、第２のインキュベーション手順が行われるか否かに関わらず、本方法はＥＣＭ材料を、約１℃〜約１０℃、より好適に約２℃〜約６℃、最も好適に約３℃〜約５℃の範囲にある温度で保存する工程を含む場合がある。実施態様において、ＥＣＭ材料は４℃で保存される場合がある。
【００６１】
さらなる態様において、本方法は、ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に導入する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤が、ＥＣＭ材料とともに反応容器の内部空間に加えられ得る。これらの態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤は、ＥＣＭ材料の導入の前後に、またはＥＣＭ材料の導入と同時に反応容器の内部空間に加えられ得る。さらに、温度制御ユニットが、反応容器の内部空間内に所望の温度を作り出すように選択的に調整され得ることが企図される。さらなる態様において、本方法は、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力を平衡にする工程を含む場合がある。例えば、この態様では、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力が大気圧と実質的に等しい場合があることが企図される。さらに別の態様では、装置内の圧力を平衡にした後に、本方法は、反応容器のインペラを活動化させるために磁気駆動部を動作させる工程を含む場合がある。またさらなる態様では、本方法は、反応容器内が所望の圧力に達するまで、反応容器に保存シリンダから一次滅菌剤を選択的に導入する工程を含む場合がある。この態様では、反応容器に一次滅菌剤を選択的に導入する工程は、反応容器への一次滅菌剤の流れ込みを増大させるために、エアコンプレッサとブースターとを選択的に活動化させることを含み得ることが企図される。実施態様において、エアコンプレッサ及びブースターは、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素を作製するのに必要な圧力及び温度等の超臨界圧力及び温度を、約２０分から約６０分の範囲にある時間間隔の間、ＥＣＭ材料に施すように活動化される場合がある。
【００６２】
さらに、他の態様において、本発明は、反応容器の圧力を急速に減少させる工程を含む場合がある。この態様では、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素のような、所定の量の主要な滅菌剤が、減圧ラインを通して反応容器から放出され得る。主要な滅菌剤が、反応容器内の圧力を減少させることにより、反応容器に連結された弁の開放により反応容器から放出され得ることが企図される。本明細書で使用される、用語「急速減圧」は、４００ｐｓｉ／分以上の速度での反応容器の減圧を指す。例えば、反応容器は、約２．９ＭＰａ／分ないし約１８．０ＭＰａ／分（約４００ｐｓｉ／分ないし約２，６００ｐｓｉ／分）、より好適に、約５．０ＭＰａ／分ないし約１０．０ＭＰａ／分（約７００ｐｓｉ／分ないし約１，５００ｐｓｉ／分）、最も好適に、約７．０ＭＰａ／分ないし約８．０ＭＰａ／分（約１，０００ｐｓｉ／分ないし約１，２００ｐｓｉ／分）の範囲にある減圧速度で減圧され得ることが企図される。従って、これらの急速な減圧は、米国特許第７，１０８，８３２号に開示された３００ｐｓｉ／分の減圧速度よりも著しく大きい。いかなる特定の理論に拘束されることなく、開示の急速な減圧速度は、ＥＣＭ材料で達成される脱細胞化のレベルを増加させると考えられる。例えば、開示のＥＣＭ材料の急速な減圧は、結果として約９６％を超える（９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００．０％等）ＥＣＭ材料の脱細胞化のレベルをもたらす場合がある。
【００６３】
実施態様において、本方法はさらに、ＥＣＭ材料に1つ以上の添加物を組み込む工程を含む場合がある。これらの態様では、1つ以上の添加物は、粉末又は液体の形態のいずれかで提供され得ることが企図される。一つの任意の態様において、1つ以上の添加物を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程の間に、反応容器に1つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、1つ以上の添加物の導入は、従来の発泡プロセスとして特徴づけられる場合があることが企図される。別の任意の態様において、1つ以上の添加剤を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程後、反応容器内に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物は、反応容器の急速な減圧がＥＣＭ材料を増大及び／又は伸長させた後にＥＣＭ材料に添加され、それによってＥＣＭ材料への添加物の浸透を向上させることができることが企図される。さらに、実施態様において、１つ以上の添加物は、反応容器の急速減圧の後、約３０分以内にＥＣＭ材料に添加され得ることが企図される。さらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込む工程は、反応容器を急速減圧する工程の間にもその工程の後にも、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物が速い方法及び遅い、拡張された方法の両方で反応容器内に放出され得ることが企図される。またさらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程の前に、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。
【００６４】
開示の添加物は、結果として生成される滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物に選択された特性を付与するために、ＥＣＭ材料に組み込まれ得る。このように、１つ以上の添加物は、本明細書に記載のように、ＥＣＭ材料の処理中に失われるＥＣＭ材料の構成要素を置換又は補完するように選択され得ることが企図される。例えば、以下に記載されるように、１つ以上の添加物は、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、薬物又は細胞を含む場合がある。さらに、１つ以上の添加物が、ＥＣＭ材料に非天然の構成要素を組み込むように選択され得ることが企図される。例えば、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞、血管新生サイトカイン及び抗炎症性サイトカインを補充するための増殖因子を含む場合がある。またさらに、１つ以上の添加物は、スタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤等の薬剤であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、イリジウムナノ粒子、ロジウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、亜鉛ナノ粒子及びその他金属ナノ粒子等のナノ粒子であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、金属化合物であり得ることが企図される。１つの実施態様において、１つ以上の添加物は、得られるＥＣＭ組成物を対象の体内に移植した後に、対象の免疫反応を薬学的に抑制するように選択することができる。
【００６５】
一つの態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、形質転換増殖因子ベータ−１、−２、−３（ＴＧＦ−β−１、−２、−３）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られる）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む１つ以上の増殖因子を含む場合がある。
【００６６】
他の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞因子、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、アンフィレグリン、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、トロンボスポンジン３、トロンボスポンジン４、トロンボスポンジン５及びアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を含む１つ以上のサイトカインを含む場合がある。
【００６７】
追加の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ベータグリカン、シンデカン、デコリン、アグリカン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、ルミカン、エピフィカン、パールカン、アグリン、テスティカン、シンデカン、グリピカン、セルグリシン、セレクチン、レクチカン、ベルシカン、ニューロカン及びブレビカンを含む１つ以上のプロテオグリカンを含む場合がある。
【００６８】
さらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）及びコンドロイチン硫酸Ａを含む1つ以上のグリコサミノグリカンを含む場合がある。
【００６９】
またさらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、ベルシカン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリリン１、フィブリリン２、プラスミノーゲン、小ロイシンリッチタンパク質、細胞表面付随性タンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、マトリカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カドヘリン、免疫グロブリン、マルチプレキシン、細胞質領域―４４（ＣＤ−４４）、アミロイド前駆体タンパク質、テネシン、ナイドジェン／エンタクチン、フィビュリンI、フィビュリンII、インテグリン、膜通型分子及びオステオポンチンを含む１つ以上のタンパク質、ペプチド又は核酸を含む場合がある。
【００７０】
さらに別の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、セリバスタチン（cerevastatin）、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤、抗菌剤、抗生物質等のスタチン系薬剤を含む１つ以上の薬剤を含む場合がある。
【００７１】
実施態様において、反応容器中に１つ以上の添加物を導入する工程は、１つ以上添加物が、リザーバから入口ポートに流れることができるようにバルブを開けることを含む場合がある。加圧の前に、１つ以上の添加物は、シールに先だって反応容器内に直接導入、及び／又は入口ポートを介して導入され得ることが企図される。
【００７２】
開示される反応容器の急速減圧及び再加圧は、１つ以上の添加物の添加のあるなしに関わらず、任意の所望の数のサイクルで繰り返され得ることが企図される。さらに、減圧と再加圧のサイクル、ならびに一次滅菌剤及び／又は二次滅菌剤及び／又は添加物の導入は、所望の圧力条件及びサイクルを達成するためにシステムの様々な弁を選択的に開く及び／又は閉じるように構成された制御器を介して自動的に制御され得ることが企図される。
【００７３】
いくつかの態様では、開示される方法は、さらに、反応容器の内容物を攪拌する工程を含む場合がある。これらの態様では、反応容器の内容物を攪拌する工程は、振動器を用いて反応容器の内容物を周期的に攪拌することを含み得ることが企図される。さらに、反応容器の攪拌は、断続的、継続的又は連続的であり得ることが企図される。実施態様において、反応容器の内容物を攪拌する工程は、一次滅菌剤を反応容器内に導入する工程中に起こる場合がある。反応容器の内容物の撹拌は、反応容器内の流体中の空隙を排除してＥＣＭ材料と滅菌剤及び／又は添加物とをより完全に接触させることにより、滅菌剤及び／又は添加物の物質移動を向上させ得ることが企図される。さらに、反応容器の内容物を攪拌する工程は、滅菌時間、温度、加圧／減圧サイクルを最適化するように攪拌の強度および持続時間を選択的に調整することを含み得ることが企図される。
【００７４】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料の滅菌及び脱細胞化が完了した後、本方法はさらに、反応容器を減圧する工程及び攪拌翼（インペラ）の動作を停止するように磁気駆動部を非活動化させる工程を含む場合がある。最後に本方法は、結果として得られる、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を反応容器の上部を通じて取り除くステップを含む場合がある。
【００７５】
ＥＣＭ材料の導管を使用した心臓弁
また、心臓弁を再生する方法が本明細書に開示される。例示的な態様において、対象の心臓内の不良な房室（ＡＶ）弁を交換するためにＡＶ弁を再生する方法が開示される。この態様において、図１に示されているように、不良な房室弁が、対象の心臓の心房と対象の心室との間の環部に付着され、対象の心臓の心室内に複数の乳頭筋に機能的に連結されることが企図される。本明細書で使用される、用語「心室（ＡＶ）」は、対象の心臓内の僧帽（二尖）弁又は三尖弁のいずれかを指す。不良なＡＶが僧帽弁である場合に、不良なＡＶ弁が、対象の心臓の左心房と左心室との間の環部に付着され得ることが企図される。さらに、不良なＡＶ弁が三尖弁である場合に、不良なＡＶ弁が、対象の心臓の右心房と右心室との間の環部に付着され得ることが企図される。
【００７６】
一態様において、図２に示されているように、開示されたＡＶ弁を再生する方法が、対象の臓の環状領域３０を露出させるために、対象の心臓から不良なＡＶ弁を取り除くことを含み得る。本明細書で使用する、用語「環状領域」は、対象の心臓内の心房と心室の間の環部の本来の位置に近接している対象の心臓の部分を指す。環部が、対象の心臓内に位置しているときに、環状領域３０は、環部並びに該環部に近接した心筋を含む。輪部が対象の心臓から除去されたときに、環状領域３０は、対象の心臓内の環部の位置に近接する心筋を含む。
【００７７】
任意の一態様において、環状領域３０環部が不良なＡＶ弁とともに対象の心臓から除去され得ることが企図される。別の任意の態様において、不良なＡＶ弁に結合されている腱索が不良なＡＶ弁とともに対象の心臓から除去され得ることが企図される。不良なＡＶ弁を除去する工程が、対象に心肺バイパス上を配置することを含み得ることが企図される。さらに、不良なＡＶ弁を除去する工程が、対象の心臓を停止すること及び／又はフィブリル化すること、さらに対象の心臓の心房内の切開を通して不良な弁を露出することを含み得ることが企図される。
【００７８】
さらなる態様において、ＡＶ弁の再生方法が、さらに、本明細書に開示されるもののようなＥＣＭ材料の導管１０を移植することを含み得る。この態様において、本明細書にさらに開示されているように、ＥＣＭ材料の導管１０は、内腔１２を画定し、入口部分１４及び出口部分１８を有し、入口部分及び出口部分はそれぞれ外周辺を有する。ＥＣＭ材料導管１０によって画定される内腔１２が、ＥＣＭ材料の導管の出口部分１８に近接した中心点１３を有し得ることが企図される。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の導管１０を移植する工程は、ＥＣＭ材料の導管の入口部分１４を環状領域３０に固定すること、及びＥＣＭ材料導管の出口部分を複数の乳頭筋のうちの少なくとも二つに固定することを含む。この態様において、環部が、対象の心臓から除去されない場合は、ＥＣＭ材料の導管１０の入口部分１４が、環部に固定され得ることが企図される。さらに、環部が対象の心臓から除去される場合、ＥＣＭ材料の導管１０の入口部分１４を切除された輪部の元の位置に近接する心臓の筋肉に固定され得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管１０が、限定でなく例示的であるが、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科的ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて環状領域３０及び/又は乳頭筋３２に固定され得ることが企図される。任意であるが、一態様において、ＥＣＭ材料導管１０は、それが環状領域に固定される前に、乳頭筋３２に固定することができる。この態様において、ＥＣＭ材料の導管１０が乳頭筋３２に適切に固定された後、縦軸線２４に沿ったＥＣＭ材料の導管１０の長さが、環状領域３０へのＥＣＭ材料の導管の適切な付着のために、十分な組織を保持しながら、必要に応じて余分な長さを排除するためにトリミングされ得ることが企図される。他の態様において、ＥＣＭ材料の導管１０は、乳頭筋32に固定される前に、環状領域３０に固定することができる。この態様において、ＥＣＭ材料導管１０が環状領域３０に適切に固定された後、縦軸線２４に沿ったＥＣＭ材料導管の長さが、乳頭筋へのＥＣＭ材料導管の適切な付着のために、十分な組織を保持しながら、必要に応じて余分な長さを排除するためにトリミングされ得ることが企図される。
【００７９】
任意ではあるが、一態様において、図２−３に示されているように、開示された方法は、対象の心臓内の二尖ＡＶ弁を再生するために使用することができる。この態様において、ＥＣＭ材料の導管１０を移植する工程は、複数の乳頭筋の二つのみの乳頭筋（すなわち、第一の乳頭筋３２ａ及び第二の乳頭筋３２ｂ）にＥＣＭ材料の導管の出口部分１８を固定することを含むことができる。理解されているとおり、左心室は単に二つの乳頭筋を有するのに対して、右心室は三つの乳頭筋を有している。それにもかかわらず、不良なＡＶ弁は僧帽弁か又は三尖頭弁であるかに係わらず、ＥＣＭ材料の導管により再生された交換ＡＶは二尖弁であろうことが企図される。不良なＡＶ弁が三尖弁である場合に、第一の乳頭筋３２ａが右心室の前乳頭筋であり、第二の乳頭筋３２ｂが右心室の後乳頭筋であり得ることが企図される。さらに、第一の乳頭筋３２ａが右心室の前乳頭筋であり、第二の乳頭筋３２ｂが右心室の中隔乳頭筋であり得ることが企図される。それはまた、第一の乳頭筋３２ａが右心室の後乳頭筋であり、第二の乳頭筋３２ｂが右心室の中隔の乳頭筋であり得ることが企図される。
【００８０】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料導管を移植する工程は、ＥＣＭ材料導管10の出口部分を第一の付着点３４ａで第一の乳頭筋３２ａに、第二の付着点３４ｂで第二の乳頭筋３４ｂに固定することを含むことできる。この態様において、第二の付着点３４ｂが、ＥＣＭ材料導管１０の出口部分１８の外周辺に沿って第一の付着点３４ａから離間させられ得ることが企図される。さらに別の態様において、図３に示されているように、ＥＣＭ材料の導管１０の内腔１２の中心点１３が、第一の付着点３４ａと第二の付着点３４ｂとの間に形成される角度４０の頂点に対応し得ることが企図される。この態様において、第一の付着点と第二の付着点と間に形成される角度４０が所望の大きさを有し得ることが企図される。例示的な態様において、第一の付着点と第二の付着点と間に形成される角度４０の所望の大きさは約１２０°から１５０°の範囲にあってよい。この態様において、図３に示されているように、第一の付着点と第二の付着点と間に形成される角度４０が内腔１２内で相補的な角度４２を有し得ることが企図される。さらに、内腔１２内の相補的な角度４２が、約２１０°から約２４０°の範囲にある大きさを有し得ることが企図される。
【００８１】
例示的な態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の出口部分18が本明細書に記載されているように、少なくとも1つの延長部を含む場合、第一及び第二の付着点３４ａ、３４ｂの一つ以上が、該少なくとも一つの延長部の対応する延長部上に位置し得ることが企図される。これらの態様において、少なくとも一つの延長部が二つの延長部を含み、第一及び第二の付着点３４ａ、３４ｂが延長部上にそれぞれ位置することが企図される。
【００８２】
任意であるが、別の態様において、開示された方法は、対象の心臓内の三尖ＡＶ弁を再生するために使用することができる。この態様において、不良な弁が三尖弁である場合に、ＥＣＭ材料の導管１０を移植する工程は、ＥＣＭ材料の導管の出口部分１８を右心室内の三つの乳頭筋の各々に固定することを含むことができる。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の導管１０を移植する工程は、ＥＣＭ材料導管の出口部18を、第一の付着点で第一の乳頭筋に、第二の付着点で第二の乳頭筋に、第三の付着点で第三の乳頭筋に固定することを含むことができる。この態様において、第一、第二、第三の付着点が、ＥＣＭ材料の導管の出口部分の外周辺に沿って互いに離間され得ることが企図される。例示的な態様では、第一、第二、第三の付着点が、ＥＣＭ材料導管の出口部の外周辺に沿って必要に応じて実質的に均等に離間し得ることが企図される。しかし、第一、第二、第三の付着点の間隔が、生体構造及び乳頭筋の位置決めに応じて変え得ることが企図される。例示的な態様において、中隔乳頭筋と前乳頭筋の間がＥＣＭ材料の導管の周囲の４０％、前乳頭筋と後乳頭筋との間がＥＣＭ材料の導管の周囲の３０％、後乳頭筋と中隔乳頭筋の間がＥＣＭ材料の導管の周囲の３０％となるように、第一、第二、第三の付着点が離間され得ることが企図される。例示的な態様において、ＥＣＭ材料の導管１０の出口部分１８が、本明細書に記載されているように、少なくとも1つの延長部を含む場合、第一、第二及び第三の付着点の一つ以上が、該少なくとも一つの延長部の対応する延長部上に位置し得ることが企図される。これらの態様において、少なくとも一つの延長部が三つの延長部を含み、第一、第二及び第三の付着点が、延長部にそれぞれ位置し得ることが企図される。
【００８３】
ＥＣＭ材料の導管１０が環状領域へさらに乳頭筋に適宜固定された後、さらにはＥＣＭ材料の導管への必要なトリミング又は造形が完了した後、対象の心臓の心房は閉じることができ、対象の心臓は、再起動することができる。
【００８４】
本明細書に開示されるように、ＥＣＭ材料の導管の移植後、ＥＣＭ材料の導管が、適切に機能する本来の心臓組織と等しい又は実質的に等しい心臓の弁組織へとＥＣＭ材料の導管を徐々に作り直す対象に由来の細胞とともに定植され得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管が対象の心臓内の環状領域及び乳頭筋に付着される点からＥＣＭ材料の導管に幹細胞が遊走し得ることが企図される。さらに、別の上皮及び内皮前駆細胞の循環の間に、ＥＣＭ材料の導管の表面が上皮および/または内皮前駆細胞で急速に裏打ちされ、又は覆われ得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管が乳頭筋及び環状領域に付着される点が、適切に機能する本来の弁葉組織及び適切に機能する本来の腱索と同一又は実質的に同一である弁葉組織又は腱索へとＥＣＭ材料の作り直しに導く制約点として働き得ることが企図される。さらに、環部がＥＣＭ材料の導管の付着前に、環状領域から除去される場合、 ＥＣＭ材料の導管の入口部分が、正常に機能している本来の環部と同一又は実質的に同一である環部の作り直しに導き得ることが意図される。
【００８５】
例
以下の例は、当業者に、化合物、組成物、アーティクル、デバイス及び／又は特許請求の範囲に記載の方法がどのように作られ、評価されるかの完全な開示、記述を提供するものであって、単に発明を例示するのであり、発明の範囲を制限する意図はない。数字（例えば、量、温度など）の精度を確保するために細心の注意が払われたが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃表示で周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近傍のものである。
【００８６】
図４及び表１に示されているように、例示的な弁の寸法は、ブタ及びヒトの両方の弁を測定した。これらの測定は、３０ｍｍの環状直径及び約３２−３５ｍｍの範囲の長さをもつＥＣＭ材料の導管の使用をサポートする。これらの設計基準は、中隔乳頭筋と前乳頭筋との間が円周の４０％を、前乳頭筋と後乳頭筋との間が円周の３０％、後乳頭筋と中隔乳頭筋との間が円周の３０％を達成するように、遠位弁が移植されるべきであることを示唆した。
【表１】
2014519379.tif 000003
【００８７】
例２
典型的なＥＣＭ材料の導管の生体内血行動態評価が生理学的右心シミュレータにおいて達成された。乳頭筋の付着が、中隔乳頭筋と前乳頭筋の間が周囲の４０％と、前乳頭筋と後乳頭筋との間が周囲の３０％と、後乳頭筋と中隔乳頭筋との間が周囲の３０％となるように実行されるように、直径が３０ｍｍ、長さが３５ｍｍの弁構成物が移植されたとき、弁が低経弁圧力勾配、閉鎖ボリューム、逆流無しで開閉したことを、この研究は示した。生体外ループでの閉じた弁の画像が図５に示されている。これらの研究は、弁が生理学的条件下で機能していることを実証した。
【００８８】
生体外の機械的な評価がまた、三尖弁の縫い目（Ｎ＝８）について実施され、縫い目に対する最大引張破断力は５２．１＋１４．１Ｎ（１１．７＋３．１６lbf）であり、最小値及び最大値は、それぞれ３４．８Ｎ（７．８２lbf）及び７２．３Ｎ（１６．２５lbf）であることが判明した。４枚層ＥＣＭ導管の引張力、ボールバースト及び縫合糸引き抜き力は、それぞれ１９．３５＋５．５１Ｎ（４．３５＋１．２４lbf）、１２６．６＋３０．２Ｎ（６６９９＋１５９８ｍｍＨｇ）及び１１．１２＋２．０８Ｎ（２．５０＋０．４７lbf）であることが判明した。これらの値は、右心の低圧環境で、この弁に対する力の要件を満たすのに十分以上である。
【００８９】
例３
ヒツジモデルを用いた非ＧＬＰ試験では、四頭のヒツジの三尖弁は、本明細書に記載のように二層ＥＣＭ弁導管に交換された。手術は四頭の動物すべて正常に完了した。動物はすべて移植後、３月、５月、８月及び１２月のスケジュールで安楽死させた。四頭すべての動物に対する心エコーの結果（表２）は、弁葉の可動性及び機能が正常に見える（閉鎖後、弁を通る逆流が軽度のレベルにあった）ことを示した。弁は、正常な順方向の流れと軽度の逆流とを体験したことが見られた。検死の結果は、交換弁が極めて正常範囲内であり、十二ヶ月経過の時点で作り直された弁葉は自然の弁組織のように見えたことを示した。
【表２】
2014519379.tif 000004
【００９０】
交換弁交は、交換した自然の弁と著しく類似しているように見える。図７は、ＥＣＭ材料の導管を移植したヒツジからの３ヶ月、５ヶ月、８ヶ月、及び１２ヶ月経過殿移植片を図示する。
【００９１】
心エコー検査は、１２ヶ月にわたって弁の良い血行動態を示した。これらの動物は、閉じた後弁を通る逆流が軽度のレベルを呈して（「軽度」または「軽度から中等度」のように、心エコー技術者によって記録された。）。心エコー検査は、弁葉逸脱のない弁葉の完全な接合を示した（図6 ）。これらの管状の人工弁の見かけの弁閉鎖不全の程度は、原因バルブが開いているときに、シリンダ内に閉じ込められている残留流体のために、心エコー検査において誇張されている。この「閉鎖ボリューム（closing volume）」の流体は弁の閉鎖時の逆方向に排出され場合がある（ＥＣＨＯでは、実際に逆流がなくとも、逆流量であるよう移る。）。
【００９２】
図７は、右心房からみた閉じた状態の弁の画像を示す（これは、ヒツジについて、時間をかけて生じる漸進的作り直しを実証している。）。３ヶ月の時点で（図７（ａ））、作り直しは、既に弁輪で発生し、明らかに正常な弁組織を再生するために弁葉に延びている。１２ヶ月の時点で（図７の（ｄ））、弁葉は作り直され、本来の弁組織のように見える。同様に、図８に示されているように、乳頭筋の付着点は３ヶ月でほぼ完全に作り直されている。
【００９３】
Movat Pentachrom染料で染色されたCorMatrixＥＣＭ三尖弁の移植後３ヶ月、５ヶ月、８ヶ月及び１２ヶ月後のヒツジの組織を分析した。３ヶ月で、エラスチンの形成は弁の輪部ですでに明らかであり、５ヶ月で、エラスチンも乳頭筋付着領域で生成されていた。８ヶ月で、ＥＣＭの大部分は再吸収され、ホスト組織に作り直された。細胞は、弁全体に分散され、作り直された組織は、外側層にエラスチン、中間層にＧＡＧをもつ自然の弁組織に似た三層構造を形成した。
【００９４】
例４
開示された滅菌及び脱細胞化方法の実施例の適用において、選択された組織が採取され滅菌生理食塩水ですすがれた。その後選択された組織は、２４時間凍結された。凍結した組織は５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて氷上で冷低張トリス緩衝液中で解凍された。本明細書に記載されたように、細胞外マトリックス材料が次いで、各々の選択された組織から単離された。
【００９５】
単離された細胞外マトリックス材料は、０．５〜１％のトリトンＸ−１００／０．５〜１％のデオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ロンザ・ウォーカーズビル社）の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて、２４〜４８時間インキュベートされた。胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）、および膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平坦な細胞外マトリックス材料は、延伸された形態でインキュベートされた。尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等の管状の細胞外マトリックス材料は、浸漬を通じ、また蠕動ポンプを用いて溶液で灌流された。
【００９６】
インキュベーション後、各々の細胞外マトリックス材料は、ＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを使用した各々のすすぎは、３０分間持続した。その後いくつかの細胞外マトリックス材料が、２−１２時間に渡って３７℃で、１０−５０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ／０．２−０．５μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅを含有する等張トリス緩衝液中で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートされた。該インキュベーションステップの後、細胞外マトリックス材料は、再びＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを用いた各々のすすぎは３０分間持続した。細胞外マトリックス材料は４℃で保存された。
【００９７】
保存の４８時間以内に細胞外マトリックス材料は、本明細書で開示のように、超臨界二酸化炭素で２０−６０分間、３１．１℃以上の温度及び１，０７１ｐｓｉ以上の圧力で処理された。この滅菌の工程の後、細胞外マトリックス材料は、２．７ＭＰａ／１０秒（３９１．６ｐｓｉ／１０秒）の速度で１分１９秒間、急速に減圧された。この間に、細胞外マトリックス材料に適用された圧力は９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａへ急速に減少した。
【００９８】
細胞外マトリックス材料は、次いで、最終の滅菌を達成するために、３０分から６時間、本明細書に開示のように、超臨界二酸化炭素及び過酢酸（ＰＡＡ）内で処理された。この処理ステップでは、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａに増加した。得られた滅菌無細胞の細胞外マトリックス材料は、その後、流体の漏れを防止するためにプラスチック製のパウチ内にシールされたＴｙｖｅｋ（商標）（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）のパウチに詰められた。
【００９９】
表１は、ブタ尿管、ウシ心嚢及びブタ中皮の滅菌及び脱細胞化をまとめたものである。
【表３】
2014519379.tif 000005
【０１００】
例５
ＥＣＭ材料サンプルのＤＮＡ含有量が、様々な滅菌及び脱細胞化技術を用いたそれぞれのＥＣＭ材料サンプルの脱細胞化の指標として測定された。測定されたＤＮＡ含有量は、ピコグリーン（ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ）アッセイで評価され、ＤＮＡは蛍光ラベルでラベル付けされ、分光光度計で検出された。測定されたＤＮＡ含有量は、サンプルの乾燥重量で正規化された。ＤＮＡ含有量は、以下の、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２による６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたようにＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２による２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳの処理群について測定、評価された。
【０１０１】
図９は、乾燥重量で正規化されたそれぞれのサンプルの総ＤＮＡ含有量を示す。図１０は、生の、未処理のＳＩＳと比較した、各それぞれのサンプルから除去されたＤＮＡの割合を示す。これらの結果は、非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた６０分間の処理を使用して滅菌することにより、生のＳＩＳに見られるＤＮＡの９６％を超えるものが除去されたことを示し、比較して、ＳＩＳがＥｔＯによって滅菌された場合は９４％のみ、ＳＩＳがいずれの方法でも滅菌されなかった場合は９３％のみであることを示した。
【０１０２】
例６
尿管が、強くない洗浄剤（ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡ内の０．５％トリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）を用いて２４時間処理され、次いで、本明細書で開示されたように、ＤＰＢＳ内で三回すすがれた。この前処置の後に、尿管は、本明細書に開示されたように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２での処理とを利用して脱細胞化され滅菌された。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色が、以下の処理の段階、すなわち、（Ａ）天然尿管、（Ｂ）前処理された尿管、（Ｃ）前処理された尿管に、本明細書に開示のように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２での処理を用いたものの１つのサンプル尿管のために調製された。これらの染色は、急速減圧によりＤＮＡ含有量が著しく低減されたことを示した。
【０１０３】
例７
ＥＣＭ材料サンプルの増殖因子の含有量が測定された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がＥＣＭ材料サンプルに対して実施され、それぞれのサンプルの、ｂＦＧＦ及び活性型のＴＧＦベータの含有量が定量化された。以下の処理群、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた６０分間の処理を行った滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた２０分間の処理を行って滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳが評価された。ｂＦＧＦ含有量及びＴＧＦベータ含有量の測定は、各それぞれのサンプルの乾燥重量で正規化された。それらの結果が図２９及び図３０に示されている。それらの結果は、ＥｔＯにさらしたことにより、両方の増殖因子の濃度が低下したことを示した。しかしながら、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた滅菌では、増殖因子の濃度に影響はなかった。
【０１０４】
例８
本明細書に開示された方法により、超臨界ＣＯ２が、一次滅菌剤及びＳＩＳシート内へｂＦＧＦを添加するための担体として使用された。まず、それぞれのＳＩＳシートは、ｂＦＧＦの様々な量に従ってＴｙｖｅｋ（商標）パウチに入れられた。パウチは９．６ＭＰａで６０分間超臨界ＣＯ２に曝露された。パウチは、７．２０ＭＰａ／分の速度で急速に減圧された。サンプルは、２０分間、超臨界ＣＯ２において１６ｍＬのＰＡＡ中で直接処理された。以下の処理群、（１）ｂＦＧＦ無添加、（２）５μＬのｂＦＧＦ添加、（３）１５μＬのｂＦＧＦ添加が評価された。各μＬのｂＦＧＦは０．１μｇのｂＦＧＦを含有した。従って、各ＳＩＳシートは約０．５ｇの重量であったため、５μＬ及び１５μＬの群について、ｂＦＧＦの最大濃度はそれぞれ、約４１７０ｐｇ／ｍｇの乾燥重量及び約１２，５００ｐｇ／ｍｇの乾燥重量だった。それぞれのサンプルの乾燥重量に関して測定されたそれらの群のｂＦＧＦの含有量が、図３１に示されている。これらの結果は、ｂＦＧＦの測定濃度が最大の濃度に達しなかったこと、及び１５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプルは、５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプル中のｂＦＧＦの測定濃度の３倍以上のｂＦＧＦの測定濃度を有しないことを示すものであった。
【０１０５】
例９
二層のＳＩＳサンプルの引張強度が測定された。以下の処理群、（１）ＥｔＯ処理、（２）２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、（３）６０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、及び（４）１２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、が評価された。張強度試験の結果が図６に示されている。これらの結果は、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ／超臨界ＣＯ２で２０分間又は１２０分間処理されたＳＩＳのサンプルは、ＥｔＯで処理されたＳＩＳのサンプルよりも著しく強度が高いことを示すものであった。
【０１０６】
実施例１０
急速減圧は、表３（下記）に示されたＥＣＭ材料を記載の濃度及び記載の時間間隔で、強くない洗浄剤に浸漬又は灌流した後に使用された。組織は採取され、生理食塩水ですすがれた。組織は少なくとも２４時間凍結された。組織は５ｍＭのＥＤＴＡを用いて氷上の冷低張トリス緩衝液中で解凍された。重要なＥＣＭが単離された。平坦な組織（例えば、胃粘膜下層、小腸粘膜下層及び膀胱粘膜下層）について、組織は、組織の引張装置において伸展され、伸展された形態で、溶液中でインキュベートされた。管状の組織（例えば、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ）について、組織は蠕動ポンプを使用して溶液により灌流され、インキュベーション中に浸漬された。組織は、ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて０．５％のトリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸内で、２〜２４時間インキュベートされた。組織はＤＰＢＳ内で、１回につき１５〜３０分間、３回すすがれた。組織は４℃で保存された。組織の保存の４８時間以内に、組織は超臨界ＣＯ２  内で２０〜１２０分間処理され、続いて急速に減圧（ＲＤＰ）された（圧力の減少は１分１９秒で９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａ、２．７ＭＰａ／１０秒の減圧に対応）。
【表４】
2014519379.tif 000006
【０１０７】
結果は、超臨界ＣＯ２曝露後の急速減圧（ＳＣＣＯ２＋ＲＤＰ）が、ＥＣＭの増殖因子を維持しながら、細胞の残余物とＤＮＡの除去をしっかりと補助したことを示すものであった。
【０１０８】
例１３
様々なＥＣＭ組成物の増殖因子の含有量は、代表的な増殖因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて分析された。ｂＦＧＦは、それが天然のＥＣＭ組織によく見られる増殖因子であるため選択された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）が、以下のサンプル、（１）未処理（生）のＳＩＳ、（２）界面活性剤浸漬（ＴＸ−デオキシ）のみの後のＳＩＳ、（３）ＴＸ−デオキシ及びＲＤＰ（ＳＣＣＯ２を含む）の後のＳＩＳ、（４）ＴＸ−デオキシ、ＲＤＰ及びＰＡＡ（滅菌のためにＰＡＡとともにＳＣＣＯ２）の後のＳＩＳ、（５）ＴＸ−デオキシ及びＰＡＡの後のＳＩＳ、（６）ＥｔＯで滅菌されたＳＩＳ（クックバイオテック社提供）、及び（７）非滅菌ＳＩＳ（クックバイオテック社提供）、のｂＦＧＦ含有量を測定するために使用された。
【０１０９】
これらの検討において、ＳＩＳが、ＲＤＰを用いて又は用いないで処理されたＥＣＭ組成物とクックバイオテック社提供のＳＩＳとを比較するために使用された。処理されたＳＩＳのいくつかはまた、脱細胞化の後、記載されたＳＣＣＯ２＋ＰＡＡ方法により滅菌された。それぞれのＥＣＭ組成物の測定された増殖因子の含有量が図２３に示されている。
【０１１０】
それらの結果は、ｂＦＧＦ含有量の維持において、急速減圧処理が他の脱細胞化処理よりも有効であり、残渣ＤＮＡ及び細胞片を除去するための追加のＲＤＰ処理は、ｂＦＧＦの小さい損失しか生じさせないことを示すものであった。比較して、ＰＡＡ滅菌プロセスは、ＲＤＰが行われないときでさえ、ほぼすべての残余のｂＦＧＦを除去するように思われた。さらに、急速減圧プロセスは、クックの脱細胞化方法に比べ、天然ＳＩＳ内のｂＦＧＦ含有量をより多く保存した。これらの結果から、ｂＦＧＦ含有量が減少した場合、増殖因子はすべて同じようにＥＣＭ組成物に結合しているので、すべての他の増殖因子の含有量も同様に減少したものと見なされる。
【０１１１】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する最先端の技術をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【０１１２】
当業者には、本発明の範囲又は思想から逸脱することなく様々な修正及び変形が本発明においてなされ得ることは明らかであろう。本発明の他の実施形態が、本明細書に開示された本発明の詳細な説明及び実施例を考慮することにより、当業者には明らかであろう。発明の詳細な説明及び実施例は単に例示的なものと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および思想は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図２】
2014519379.tif 000007
【図３】
2014519379.tif 000008
【図１６】
2014519379.tif 000009
【図１８】
2014519379.tif 000010
【図１９】
2014519379.tif 000011
【図２０】
2014519379.tif 000012
【図１】
2014519379.tif 000013
【図４】
2014519379.tif 000014
【図５】
2014519379.tif 000015
【図６】
2014519379.tif 000016
【図７】
2014519379.tif 000017
【図８】
2014519379.tif 000018
【図９】
2014519379.tif 000019
【図１０】
2014519379.tif 000020
【図１１】
2014519379.tif 000021
【図１２】
2014519379.tif 000022
【図１３】
2014519379.tif 000023
【図１４】
2014519379.tif 000024
【図１５】
2014519379.tif 000025
【図１７】
2014519379.tif 000026
【国際調査報告】
2014519379.tif 000027
2014519379.tif 000028