(57)【要約】  Ｃ１−ＩＮＨと免疫グロブリン、たとえばヒト血漿由来の免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）との組合せを用いる脳虚血を治療する方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳虚血後の炎症損傷または再灌流障害の影響を予防、治療または低減する方法であって、免疫グロブリンを含む組成物およびＣ１−インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物を投与すること含む方法。
【請求項２】
免疫グロブリンが血漿由来の免疫グロブリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫グロブリンがヒト血漿由来の免疫グロブリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト由来の免疫グロブリンがヒト血漿由来の静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脳虚血後にＣ１−ＩＮＨを単独で投与したときと比較して、ＩＶＩＧとＣ１−ＩＮＨとの組合せが梗塞体積において少なくとも約５０％の低減を生じるような十分な濃度でＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨを投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＩＶＩＧとＣ１−ＩＮＨとの組合せが、脳虚血後に最適濃度のＩＶＩＧを単独で投与したときに観察される低減と少なくともほぼ同等の梗塞堆積の低減を生じるような十分な濃度でＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨを投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
Ｃ１−ＩＮＨを約０．０１Ｕ／ｋｇ体重から２０００Ｕ／ｋｇ体重までの範囲の濃度で投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ＩＶＩＧを約０．０１ｇ／ｋｇ体重から３．０ｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
治療がない場合の梗塞体積と比較して、組合せが梗塞体積における少なくとも４０％の低減を生じるような十分な濃度で免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
免疫グロブリンを最初に投与するか、またはＣ１−ＩＮＨを最初に投与し、免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを順に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ１−ＩＮＨを免疫グロブリンの少なくとも１０分後に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリンをＣ１−ＩＮＨの少なくとも１０分後に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨの組合せを脳虚血の約６時間後までに投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを静脈内に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを、水性または凍結乾燥形態で提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
凍結乾燥された治療成分を、薬学的に許容される担体中に溶解することによって、投与前にそれらを再構成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体が滅菌注射用水である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脳虚血の治療のためのキットであって、
（ａ）免疫グロブリン；
（ｂ）Ｃ１−ＩＮＨ；および
（ｃ）場合により、少なくとも１つのさらなる治療活性化合物または薬物
を含む、キット。
【請求項２０】
少なくとも１つのさらなる治療活性化合物または薬物が、ビタミン、抗生物質、抗ウイルス薬剤、または脳内の血餅形成を除去または阻害することを目的とする化合物である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
血餅形成を除去または阻害することを目的とする化合物がアスピリン、クロピドグレルまたはジピリダモールである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
免疫グロブリンがＩＶＩＧである、請求項１９のキット。
【請求項２３】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを、水性または凍結乾燥形態で提供する、請求項１９のキット。
【請求項２４】
凍結乾燥された成分を、薬学的に許容される担体中に溶解することによって投与前にそれらを再構成する、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
薬学的に許容される担体が滅菌注射用水である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを、単独での投与の最適濃度より低い濃度で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
免疫グロブリンとＣ１−ＩＮＨとの組合せ投与が、免疫グロブリンまたはＣ１−ＩＮＨのいずれかを単独で最適濃度で投与したときに観察される低減と少なくともほぼ同等の梗塞体積の低減または神経障害の低減を生じる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを、脳出血のリスクを低減する濃度で投与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨを、脳虚血の約１８時間後までに投与する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年９月２４日出願の米国仮特許出願第６１／５３８,８３２号に対して米国特許法第１１９条の下で優先権を主張し、それは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所の国立老化研究所（The National Institute on Aging, National Institutes of Health）によって与えられた共同契約＃２９４６６−０９の下で部分的に政府支援により行った。政府は、本発明に相当の権利を有する。
【０００３】
本開示は、一般に脳虚血の治療におけるＣ１−インヒビター（Ｃ１エステラーゼインヒビターまたはＣ１−ＩＮＨ）および免疫グロブリン、たとえば血漿由来の免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）は、重要な公衆衛生問題であり、高い割合で死亡および生存者の永続的な神経障害を生じる。酵素的血栓溶解の形態の現在の介入治療は、わずかなパーセンテージの患者にしか有益でない。米国における全ＡＩＳ患者の６％未満は、主に短い治療域（たとえば、通常、脳卒中後、約１時間）のため、組換え組織プラスミノーゲンアクチベータｒｔＰＡによる酵素的血栓溶解といったような現在の標準ケア治療の対象となる。非特許文献１。ｒｔＰＡのような治療は、患者の脳出血を誘発するリスクを高めることもありうる。したがって、ＡＩＳの改善された治療、特に脳卒中後にしばらく経って投与したときに有効である治療が必要である。
【０００５】
補体系は、約３０の循環血漿タンパク質および関連する細胞膜タンパク質のタンパク質分解カスケードである。血漿タンパク質は、一般に肝臓で合成され、通常、不活性な前駆体として循環する。補体プロテアーゼによる前駆体切断によって、炎症を含むさまざまな先天性免疫応答に関与しているサイトカインシグナル伝達カスケードが開始される。補体活性化は、脳虚血に関連する炎症を含むさまざまな免疫炎症反応に関与している。
【０００６】
脳虚血後の再灌流中、循環の回復により脳組織に炎症的および酸化的損傷を招くことがある。再灌流と同時に組織に進入する白血球は、インターロイキンおよびフリーラジカルを含む炎症性因子の宿主を放出する。戻る血液による酸素の再導入が、細胞および形質膜に損傷を与えることもある。補体系は、再灌流障害をもたらす脳の虚血カスケードの開始に関与してきた。したがって、補体系を阻害または調節する技術は、再灌流障害を治療または予防する機会を提供するはずである。
【０００７】
静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）のような血漿由来の免疫グロブリンは、多数の献血者から抜き取ってプールした免疫グロブリンを含む静脈内に投与された血液製剤（blood products）である。ＩＶＩＧは、さまざまな免疫不全および炎症性疾患における使用が示される。ＩＶＩＧは、脳の活性補体断片を除去することが示されており、脳虚血および再灌流に伴う損傷を防ぐ。非特許文献２。
【０００８】
Ｃ１−インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）は、補体系に関連する循環プロテアーゼの自発活性化を妨げるセリンプロテアーゼインヒビター、特にＣ１ｒおよびＣ１ｓ、ならびにＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２である。補体の古典的経路の調節におけるＣ１−ＩＮＨの中心的な役割および再灌流障における補体が介在する炎症の関与を前提として、Ｃ１−ＩＮＨ投与は、脳卒中後の神経障害および梗塞サイズにおけるその効果について研究されてきた。
【０００９】
非特許文献３；また、非特許文献４を参照のこと。以前の研究は、Ｃ１−ＩＮＨが脳虚血のマウスモデルにおいて強力な神経保護的性質を有することを示している。提案されたＣ１−ＩＮＨ神経保護に関連する機構としては、１）補体阻害、２）損傷に対する炎症反応の減弱、３）アポトーシスの減弱、および４）白血球−内皮細胞接着の低減が挙げられる。血漿由来のＣ１−ＩＮＨによる補体活性化の阻害は、マウスと同様にラットでも有益であることが示された。非特許文献５；非特許文献６。しかし、これらの研究で観察された治療域は、虚血後１時間未満であった。同上。このことは、組換えＣ１−ＩＮＨが後の時点で（たとえば、ＭＣＡＯ後１８時間までに与えたとき）脳梗塞サイズを低減可能であるという最近の発見とは対照的である。非特許文献７。これまでの一般的な概念では、血漿由来のＣ１−ＩＮＨは、その短い治療域のため、ヒトにおける脳卒中を治療するための組換えＣ１−ＩＮＨとして有望ではないということであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Adeoye O, Hornung R, Khatri P, Kleindorfer D. Stroke 42(7):1952-1955 (2011)
【非特許文献２】Arumugam et al., PNAS 104(35): 14104-14109 (2007)
【非特許文献３】De Simoni et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 23(2): 232-239 (2003)
【非特許文献４】Longhi et al., Crit. Care Med. 37(2): 659-665 (2009)
【非特許文献５】De Simoni et al., Am J Pathol 164: 1857-1863 (2004)
【非特許文献６】Akita et al., No To Shinkei 53: 641-644 (2001)
【非特許文献７】Gesuete et al., Ann Neurol 66:332-342 (2009)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
動物実験によれば、Ｃ１−ＩＮＨおよびＩＶＩＧは、それぞれ、脳の再灌流障害の影響を調節するのに有効であることが示唆されているが、脳虚血に伴う再灌流障害を治療するためのより有効な低用量かつ費用効率の高い方法を開発する必要性が残っている。したがって、ここに開示するのは、予防的投与または虚血後の時点での投与のいずれかによって、脳虚血に伴う再灌流障害および炎症性損傷を治療、低減または予防するためのＣ１−ＩＮＨとＩＶＩＧのような免疫グロブリンとを用いる組合せ療法である。いくつかの実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨとＩＶＩＧのような免疫グロブリンとの組合せの使用は、いずれかの成分単独がより低い治療効果をもたらす後の時点で、再灌流障害および炎症性損傷を治療または予防するために用いることができる。いくつかの実施態様では、この組合せを、脳虚血の約６時間後までに、または各々の成分の最大用量未満で投与したが、有益な効果をもたらした。いくつかの実施態様では、この組合せを、脳虚血の６時間後より後に投与してもよい。したがって、Ｃ１−ＩＮＨとＩＶＩＧのような免疫グロブリンとの組合せを用いることによって、治療結果を向上させることができ、それと同時に治療投与量を減らすことができ、それによってコストが下がるだけでなく、治療化合物に対する有害反応のリスクを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｃ１−ＩＮＨ用量反応曲線。Ｃ１−ＩＮＨの用量を３００Ｕ／ｋｇ（動物当たり７．６Ｕ）、１５０Ｕ／ｋｇ（動物当たり３．８Ｕ）および７５Ｕ／ｋｇ（動物当たり１．９Ｕ）と減らし、虚血期間（Ｉ）の終了後１時間でマウスの群（ｎ＝１２〜２１）を処置した。Ｃ１−ＩＮＨ濃度（Ｕ／ｋｇ）は、縦軸の梗塞体積（％）の低減に対して横軸にプロットされている。
【図２】ＩＶＩＧ用量反応曲線。ＩＶＩＧの用量を減らして虚血１時間後に動物の群（１２〜２２）を処置し、１ｇ／ｋｇ体重で出発し、半分の用量、０．５ｇ／ｋｇおよび０．２５ｇ／ｋｇ（または２５〜３０ｇである成体マウスの平均体重を考慮するとｍｇ／ｇ）に減らして継続した。ＩＶＩＧ用量（ｇ／ｋｇ）は、縦軸の梗塞体積の低減（％）に対して横軸にプロットされている。
【図３】Ｃ１−ＩＮＨ／ＩＶＩＧ併用治療。虚血後１時間で、０．５０ｍｇ／ｇ体重の単回ＩＶＩＧ用量をマウスに与え、続いて３０分後、７５Ｕ／ｋｇのＣ１−ＩＮＨの単回ｉ．ｖ．注射（ｎ＝１９）した。７２時間の再灌流期間後、脳梗塞体積を決定し、梗塞体積のパーセント阻害を、Ｃ１−ＩＮＨ単独またはＩＶＩＧ単独のパーセント阻害に対して比較した。
【図４】Ａ−Ｂは、虚血開始の６時間後、１ｇ／ｋｇのＩＶＩＧ（ｎ＝１１）、３００Ｕ／ｋｇのＣ１−ＩＮＨ（ｎ＝９）または組合せ（ｎ＝１０）でマウスを処置し、虚血後７２時間で梗塞領域（図４Ａ）および神経障害スコア（図４Ｂ）を決定した（*Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
具体的な実施態様の説明
ここで、本開示による特定の例となる実施態様を詳細に参照することにし、この特定の例は添付の図面に図示されている。本願において、特に明記しない限り、単数の使用は複数を含む。また、本願において、特に明記しない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらにまた、「含んでいる」という用語、ならびに「含む」および「含まれた」などの他の形態の使用は、非限定的である。本明細書に記述された任意の範囲は、端点および端点の間のすべての値を含むと理解される。
【００１４】
節の見出しは、構成的な目的のためだけにあって、記述された主題を限定するものとして解釈すべきではない。特許、特許出願、記事、書物および論文を含むが、それらに限定されない本願に引用したすべての文書または文書の一部は、いかなる目的においてもそれらの全体として参照により本明細書に明白に組み込まれる。参照により組み込まれた刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる本発明と矛盾する場合、本明細書はあらゆる矛盾材料に優先されることになる。
【００１５】
免疫グロブリンおよび補体プロテアーゼＣ１のインヒビターを開示する。Ｃ１−ＩＮＨのようなＣ１−インヒビターとプールされた静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）のような免疫グロブリンとの組合せを用いて脳虚血に伴う炎症性損傷および再灌流障害を治療、予防または低減することができる。いくつかの実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨとＩＶＩＧのような免疫グロブリンとの組合せの使用を用いて、いずれかの成分単独では治療効果または他の有益な効果が少ししか得られない後の時点で、再灌流障害および炎症性損傷を治療または予防することができる。いくつかの実施態様において、この組合せは、脳虚血後約６時間もしくはそれより長時間まで、またはいずれかの成分の最大用量未満で投与することができるが、有益な効果が得られる。また、この組合せを単独で用いることもできるし、またはさらなる治療化合物、たとえば脳の血餅形成を除去もしくは阻害することを目的とする化合物を投与することもできる。
【００１６】
免疫グロブリン
本明細書に用いるように、「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、脳内の活性補体断片に結合し、かつ／または脳内の活性補体断片を除去するなんらかの免疫グロブリン（抗体としても知られる）またはその断片のことをいう。また、この文脈における「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、補体断片に対するいくらかの結合性（binding）をなお保持している誘導体またはその断片も含む。このような断片には、とりわけ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2またはＦｃ断片がある。抗体が活性補体断片と類似の結合親和性を血漿由来の抗体と共有していれば、この抗体は、ドナー血漿から誘導してもよいし、または別の方法（下に議論する）を用いて調製してもよい。
【００１７】
「補体断片」という用語は、補体免疫に含まれるシグナル伝達カスケードに関連したなんらかの循環している小分子、タンパク質または酵素のことをいう。これらのカスケードとしては、炎症カスケード、サイトカインシグナル伝達カスケードおよび当分野で知られている他の補体カスケードが挙げられる。
【００１８】
「血漿由来の免疫グロブリン」という用語は、哺乳動物に由来するなんらかのポリクローナル抗体分画、好ましくはヒト血漿を意味するものとする。これに関して、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」という用語と同じ意味で用いてもよい。特定の実施態様では、多数の（一般に１０００人またはそれ以上）健常なドナーの血漿をプールし、場合によりさらに処理する。いくつかの実施態様では、プールされた血漿から免疫グロブリン分画を富化（enrich）する。好ましくは、プールされた血漿から免疫グロブリンを精製する。より好ましくは、免疫グロブリンを精製し、濃縮する。種々の実施態様では、精製および濃縮された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いる。この文脈における血漿由来の免疫グロブリンは、補体断片に対する結合性をなお保持している誘導体またはその断片も含む。このような断片は、とりわけ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2またはＦｃ断片を含む。また、血漿由来の免疫グロブリンを含む組成物は、血漿由来の免疫グロブリンに非血漿由来の抗体を加えたものを含むこともできる。
【００１９】
「静脈内免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンを含む組成物の静脈内送達のことをいう。好ましくは、静脈内に送達された免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、より好ましくは血漿由来のＩｇＧ、さらにより好ましくはヒト由来の静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）である。ＩＶＩＧは、多数の健常人の血漿から得られた多特異性免疫グロブリンＧをプールした治療製剤である。「健常人」という用語は、献血に関する現在（提供時）の標準適格基準が絶え間なく改善および変更されていることを踏まえて、このような適格基準を満たす人を意味する。
【００２０】
特定の実施態様において、ＩＶＩＧは、微量のＩｇＡまたはＩｇＭのような異なるＩｇ種の免疫グロブリン（好ましくは２％未満のＩｇＭまたはＩｇＡ、より好ましくは１％未満）を含んでもよい。さまざまな実施態様において、免疫グロブリンは、＞９０％ＩｇＧ、より好ましくは＞９５％ＩｇＧ、さらにより好ましくは＞９８％ＩｇＧである。
【００２１】
別の実施態様において、静脈内に送達された免疫グロブリンは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）または免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、より好ましくは血漿由来のＩｇＡまたはＩｇＭ、さらにより好ましくはヒト由来の静脈内ＩｇＡ（ＩＶＩＡ）またはＩｇＭ（ＩＶＩＭ）である。ＩＶＩＡおよびＩＶＩＭは、多数の健常人、好ましくは少なくとも１０００人の血漿から得られた多特異性免疫グロブリンＡまたは免疫グロブリンＭをプールした治療製剤である。特定の実施態様において、ＩＶＩＡまたはＩＶＩＭは、微量の異なるＩｇ種の免疫グロブリン（好ましくは２％未満の他の免疫グロブリン種、より好ましくは１％未満）を含んでもよい。さまざまな実施態様において、免疫グロブリンは、＞９０％のＩｇＡまたはＩｇＭ、より好ましくは＞９５％のＩｇＡまたはＩｇＭ、さらにより好ましくは＞９８％のＩｇＡまたはＩｇＭである。別の実施態様において、静脈内に送達された免疫グロブリンは、血漿由来のＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡの組合せである。特定の実施態様において、組合せ静脈内免疫グロブリンは、少なくとも５０％のＩｇＧ、好ましくは少なくとも７０％のＩｇＧおよびより好ましくは少なくとも９０％のＩｇＧである。
【００２２】
ＩＶＩＧは、生産品だけでなく、好ましい投与経路（静脈内投与）を表す。好ましい実施態様において、ＩＶＩＧは、静脈内投与に適した全溶液中に少なくとも５％（ｗ／ｖ）の免疫グロブリンを含む溶液として提供される。別の実施態様において、ＩＶＩＧは、少なくとも約６％の免疫グロブリン、より好ましくは少なくとも８％、１０％、１５％、２０％、または２５％の免疫グロブリン（またはそれらの間の任意のパーセンテージ）を含む溶液として提供される。この溶液は、さらなる成分、たとえば安定剤、たとえばアミノ酸、たとえばプロリンもしくはグリシン、またはスクロース、マルトース、ソルビトール、アルブミン、ニコチンアミド、ＰＥＧ、またはその他を含んでもよい。
【００２３】
特定の実施態様において、ＩＶＩＧは、PRIVIGEN(R)（ＣＳＬベーリング）またはSANDOGLOBULIN(R)／CARIMUNE(R)（ＣＳＬベーリング）である。PRIVIGEN(R)は、体液性免疫の欠陥に関連する原発性免疫不全症の患者の補充療法として示される。
【００２４】
別の実施態様において、免疫グロブリンは皮下免疫グロブリンＧ（ＳＣＩＧ）である。ＳＣＩＧと略された「皮下免疫グロブリンＧ」という用語は、ＩＶＩＧと類似しているが皮下投与のために調製された免疫グロブリンＧをプールした治療製剤を意味する。ＳＣＩＧも、また生産品だけでなく好ましい投与経路（皮下投与）を表す。特定の実施態様において、ＳＣＩＧは、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の免疫グロブリン、より好ましくは少なくとも１５％の免疫グロブリン、最も好ましくは訳２０％の免疫グロブリンを含む溶液として提供される。この溶液は、さらなる成分、たとえば安定剤、たとえばアミノ酸、たとえばプロリンもしくはグリシン、またはスクロース、マルトース、ソルビトール、アルブミンニコチンアミド、ＰＥＧ、ポリソルベート８０またはその他を含んでもよい。特定の実施態様において、ＳＣＩＧは、VIVAGLOBIN(R)またはHIZENTRA(R)（いずれもＣＳＬベーリング）である。
【００２５】
別の実施態様において、本開示は、活性補体断片と同様に結合する血漿由来の抗体と共有する非血漿由来の抗体（たとえば、活性補体断片のスカベンジャーとして作用する抗体）の使用を企図する。抗体は、単独で、または上述の血漿由来の免疫グロブリンに対する添加剤として用いることができる。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであることができる。本明細書に用いることができる抗体としては、Ｉｇ種ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ（好ましくはＩｇＧ）が挙げられる。「抗体」という用語には、結合性をなお保持している誘導体またはその断片が含まれる。このような断片には、とりわけ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ誘導体またはＦｃ断片が含まれる。また、加える抗体としては、組換え型の、キメラの、ヒト化された、炭水化物構造に最適化された、および完全なヒト抗体および断片のような実施態様が挙げられる。また、組換え抗体は、たとえば、スイッチングアイソタイプ、親和性成熟技術、エフェクター機能を変える修飾、グリコシル化を変える修飾、などによってもさらに修飾することができる。
【００２６】
Ｃ１インヒビター
「Ｃ１インヒビター」、「Ｃ１エステラーゼインヒビター」および「Ｃ１−ＩＮＨ」という用語は、補体系に関連する循環プロテアーゼ、好ましくはプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓ、ならびにＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２の自発活性化を妨げるセリンプロテアーゼインヒビターとして機能するタンパク質またはその断片のことをいう。さらに、Ｃ１−ＩＮＨは、セレクチンが介在する白血球の内皮細胞への接着を低減する抗炎症性分子の役割を果たすことができる。ここで用いるＣ１−ＩＮＨは、天然のセリンプロテアーゼインヒビターもしくはその活性断片であることができ、または類似の機能性、たとえば、プロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓ、ならびに／もしくはＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２の阻害を提供する組換えペプチド、合成ペプチド、ペプチドミメティックもしくはペプチド断片を含むことができる。Ｃ１−インヒビターの構造および機能に関するさらなる開示については、米国特許第４，９１５，９４５号；米国特許第５，９３９，３８９号；米国特許第６，２４８，３６５号；米国特許第７，０５３，１７６；およびＷＯ２００７／０７３１８６を参照し、それらはその全体として本明細書に組み込まれる。
【００２７】
Ｃ１−インヒビターを含む市販製品は、たとえば、血漿由来のCINRYZE(R)（バイロファーマ（Viropharma））、組換えRUCONEST(R)またはRHUCIN(R)（いずれもファーミング（Pharming））、および血漿由来のBERINERT(R)（ＣＳＬベーリング）である。BERINERT(R)は遺伝性血管性浮腫および先天性欠損の治療に指示される。
【００２８】
免疫グロブリンおよびＣ１−インヒビターの製造
さまざまな実施態様において、免疫グロブリンおよびＣ１−インヒビターは、当業者に知られている方法にしたがって製造することができる。たとえば、血漿由来の免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨは、数人のドナーから血漿を採取することによって調製することができる。血漿のドナーは、当分野で定義されたとおり健常でなければならない。好ましくは、何人か（１０００人またはそれ以上）の健常なドナーの血漿をプールし、場合によりさらに処理する。血漿由来の免疫グロブリン（この場合、ＩＶＩＧ）を調製する例示的方法は、米国特許第２０１０／０３３００７１Ａ１号に見いだすことができ、この開示は全体として本明細書に組み込まれる。市販ＩＶＩＧ製品の例は、PRIVIGEN(R)（ＣＳＬベーリング）およびSANDOGLOBULIN(R)／CARIMUNE(R)である。
【００２９】
活性補体断片を結合する非血漿由来の抗体および断片を製造する技術は、当分野でよく知られており、たとえば、Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988およびHarlow and Lane“Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998に記述されている。また、トランスジェニック動物を用いて完全ヒト抗体またはその断片を発現させてもよい。モノクローナル抗体を調製するには、細胞系統の連続的培養によって産生された抗体を提供するあらゆる技術を用いることができる。このような技術の例としては、ヒト抗体を産生する技術によってさらに開発され、Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)によって最初に記述されたハイブリドーマ技術が挙げられる。また、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, Immunology Today 4: 72 (1983)）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96）も含まれる。非血漿由来の抗体は、細胞中で発現させてもよく、たとえば、抗体核酸構築物は、とりわけ、ウイルスまたはプラスミドベクターを介して形質移入および／または形質導入してもよい。また、小または大スケールで産生するための他の組換え技術を用いてもよい。
【００３０】
Ｃ１−ＩＮＨを調製する方法は当分野で知られている。たとえば、治療目的でＣ１−インヒビターを産生する方法は、米国特許第４，９１５，９４５号に開示されており、この開示は、全体として本明細書に組み込まれる。別法として、いくつかの実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨは、当分野で知られている技術を用いて天然組織源から集めて濃縮することができる。Ｃ１−インヒビターを含む市販製品は、たとえば、血漿由来のCinryze(R)（バイロファーマ）、組換えRuconest(R)またはRhucin(R)（いずれもファーミング）であり、血漿由来のBERINERT(R)（ＣＳＬベーリング）組換えＣ１−ＩＮＨは、知られている方法によって調製することができる。
【００３１】
医薬組成物
特定の実施態様では、Ｃ１−ＩＮＨを含む医薬組成物および血漿由来および／または非血漿由来の免疫グロブリン含む医薬組成物を脳虚血の治療に使用するために製造する。Ｃ１−ＩＮＨを含む医薬組成物および免疫グロブリンを含む医薬組成物を製造する方法は、当分野で知られている。たとえば、Ｃ１−ＩＮＨまたは免疫グロブリンの粉末または凍結乾燥形態（たとえば、凍結乾燥によって）を提供し、かつ水性医薬が所望である場合、この粉末を、医薬製剤の水性成分と混合することによって溶解し、ボルテックスまたは穏やかな撹拌のような適した技術を用いて撹拌することができる。別法として、水性医薬が所望であり、かつＣ１−ＩＮＨまたは免疫グロブリンがすでに水性形態である場合、これらの成分を投与前に直接組み合わせることができる。特定の実施態様では、Ｃ１−ＩＮＨを凍結乾燥形態で提供し、患者に投与する前に水性免疫グロブリン組成物と組み合わせる。別の実施態様では、免疫グロブリンを凍結乾燥形態で提供し、投与前に水性Ｃ１−ＩＮＨ組成物と組み合わせる。さらに別の実施態様では、両Ｃ１−ＩＮＨを凍結乾燥形態で提供し、投与前に水性薬学的成分（たとえば、さらなる活性成分または賦形剤、安定剤、溶媒もしくは担体のような不活性成分）と組み合わせる。さらに別の実施態様では、Ｃ１−ＩＮＨおよび免疫グロブリンを水溶液で提供し、別々に投与してもよいし、または患者に投与する前に合わせてもよい。
【００３２】
特定の実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの添加剤、たとえば賦形剤、増量剤、緩衝剤、安定剤、または賦形剤を含むことができる。標準医薬製剤技術は、当業者によく知られている（たとえば、2005 Physicians' Desk Reference(C)、Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Gennado 等, 編. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000を参照のこと）。適した薬学的添加剤としては、たとえば、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、ナトリウムクロリド、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。特定の実施態様において、医薬組成物はｐＨ緩衝試薬および湿潤剤または乳化剤を含んでもよい。さらなる実施態様において、組成物は防腐剤または安定剤を含んでもよい。
【００３３】
医薬組成物の製剤は、意図する経路投与および他のパラメータに応じて変えてもよい（たとえば、Rowe 等, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第4版, APhA Publications, 2003を参照のこと）。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、凍結乾燥されたケークまたは粉末であってもよい。凍結乾燥組成物は、静脈注射による投与のため、たとえば注射用滅菌水（ＵＳＰ）を用いて再構成しもよい。別の実施態様において、組成物は非発熱性の滅菌溶液であってもよい。なおさらなる実施態様では、組成物を丸剤または錠剤中の粉末形態で送達する。
【００３４】
記述された医薬組成物は、単独の活性化合物としてＣ１−ＩＮＨおよび／もしくは免疫グロブリンを含んでもよいし、または少なくとも１つの他の化合物、組成物もしくは生物学的物質と組み合わせて送達してもよい。このような化合物の例としては、ビタミン、抗生物質、または脳内の血餅形成を除去または阻害することを目的とする化合物（たとえば、アスピリン、クロピドグレル、またはジピリダモール）が挙げられる。
【００３５】
また、脳虚血の治療用キットも開示されている。特定の実施態様において、このキットは、（ａ）ＩＶＩＧのような免疫グロブリン；（ｂ）Ｃ１−ＩＮＨ、（ｃ）脳虚血の治療に使用するための説明書および場合により（ｄ）少なくとも１つのさらなる治療活性化合物または薬物を含む。
【００３６】
このキットの成分は、１つまたは異なる容器、たとえば１つまたはそれ以上のバイアルに入っていてもよい。抗体は、有効期間を延長するため液体または固体形態（たとえば、凍結乾燥後）であってもよい。液体形態の場合、免疫グロブリンは、添加剤、たとえば安定剤および／または防腐剤、たとえばプロリン、グリシンもしくはスクロースまたは有効期間を延長する他の添加剤を含んでもよい。同様に、Ｃ１−ＩＮＨは、液体または固体形態（たとえば、凍結乾燥後）であってもよい。液体形態の場合、Ｃ１−ＩＮＨは、添加剤、たとえば安定剤および／または防腐剤、たとえばプロリン、グリシンもしくはスクロースまたは有効期間を延長する他の添加剤を含んでもよい。
【００３７】
特定の実施態様において、キットは、さらなる化合物、たとえば免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨの投与前に、それと同時に、またはその後に投与することになっている治療活性な化合物または薬物を含んでもよい。このような化合物の例としては、ビタミン、抗生物質、抗ウイルス薬剤などが挙げられる。別の実施態様では、脳内の血餅形成を除去または阻害することを目的とする化合物（たとえば、アスピリン、クロピドグレル、またはジピリダモール）をキットに含めることができる。
【００３８】
さまざまな実施態様において、キットの使用説明書には、脳虚血の治療におけるキット成分の使用指示書が含まれることになる。この説明書は、免疫グロブリンおよびＣ１−インヒビターを調製する（たとえば、凍結乾燥タンパク質の場合、希釈または再構成する）方法に関する情報をさらに含んでもよい。この説明書は、投与量および投与頻度に関する指針をさらに含んでもよい。
【００３９】
治療の方法
特定の実施態様では、脳虚血の影響を治療、予防または低減する方法を提供する。本明細書に用いる「脳虚血」という用語は、１つまたはそれ以上の脳動脈の閉塞のため、脳の少なくとも一部に不十分な血流があるなんらかの状態のことをいう。この定義は、局所性および広範囲の虚血を包含する。この用語は、不十分な血流のすべての医学的原因、たとえば、脳低酸素、外傷性脳損傷および脳卒中（血栓症、脳血管性塞栓症、虚血性脳卒中、周産期脳卒中および脳梗塞を含む）を包含する。
【００４０】
たとえば、脳虚血の治療は、脳の活性補体断片を除去するＣ１−ＩＮＨおよび免疫グロブリンを患者に投与することを含むことができる。好ましくは、免疫グロブリンはＩＶＩＧである。いくつかの実施態様では、この組合せを投与して脳虚血後の炎症損傷または再灌流障害の影響を予防、治療または低減する。免疫グロブリンおよびＣ１−インヒビターは、一緒にまたは別々に投与することができる。これらの化合物は、なんらかの適した送達経路によって投与することができ、非経口、硬膜下、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。免疫グロブリンがＩＶＩＧである特定の実施態様では、この化合物を静脈内に送達する。免疫グロブリン化合物がＳＣＩＧである別の実施態様では、この化合物を皮下に送達する。
【００４１】
免疫グロブリンおよびＣ１−ＩＮＨは、一緒にまたは別々に投与してもよい。特定の実施態様では、Ｃ１−ＩＮＨおよび免疫グロブリンを１回の静脈内投与で一緒に投与する。別の実施態様では、免疫グロブリンを最初に投与し、続いてＣ１−ＩＮＨを投与する。特定の実施態様では、免疫グロブリンを投与した約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０または１２０分後に（またはそれらの間の任意の時間に）、Ｃ１−ＩＮＨを投与する。別の実施態様では、Ｃ１−ＩＮＨを最初に投与し、続いて免疫グロブリンを投与する。特定の実施態様では、Ｃ１−ＩＮＨを投与した約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０または１２０分後に（またはそれらの間の任意の時間に）、免疫グロブリンを投与する。
【００４２】
Ｃ１−ＩＮＨおよびＩＶＩＧのような免疫グロブリンを用いた治療は、脳虚血の直後または約６時間後までに行うことができる。特定の実施態様では、脳虚血後、約１０、２０、３０、４０もしくは５０分、または１、２、３、４、５もしくは６時間に（またはそれらの間の任意の時間に）治療を行う。脳卒中後に６時間経ても（たとえば、脳虚血後、約７、８、９、１０、１５、１８もしくは２４時間またはそれらの間の任意の時間に）治療が利益となることがある。いくつかの実施態様では、各々の成分単独では低い治療効果または他の有益な効果しか得られない後の時点で、Ｃ１−ＩＮＨとＩＶＩＧのような免疫グロブリンとの組合せの使用を用いて再灌流障害および炎症損傷を治療または予防することができる。いくつかの実施態様において、この組合せは、各々の成分の最大用量未満で投与することができるが、有益な効果が得られる。いくつかの実施態様では、脳虚血後約３時間（たとえば、最大約６時間）経って組合せ療法を施すことにより、これらの後の時点で免疫グロブリンまたはＣＩ−ＩＮＨを単独で投与したときに観察された効果を超える有益な効果を得ることができる。
【００４３】
患者への投与は、単回投与または反復投与で、かつさまざまな生理学的に許容される形態のいずれかで、かつ／または医薬組成物の一部として許容される薬学的担体および／もしくは添加剤と共に行ってもよい。
【００４４】
Ｃ１−ＩＮＨを含む組成物およびＩＶＩＧのような免疫グロブリンを含む組成物は、治療有効量で患者に投与してもよい。一般に、治療有効量は、対象の年齢、全身状態および性別、ならびに対象における医学的状態の重症度に応じて変化してもよい。投与量は医師によって決定され、必要に応じて、観察された治療効果に合わせて調整してもよい。特定の実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨの用量は、約０．０１Ｕ／ｋｇから２０００Ｕ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。さまざまな実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨの用量は、０．０１、０．０５、０．１０、０．５０、１．０、５．０、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、１０００、１５００または２０００Ｕ／ｋｇ体重（またはそれらの間の任意の値）である。Ｃ１−ＩＮＨ投与の例となる治療範囲は、米国特許第５，９３９，３８９にも開示されており、この開示は全体として組み込まれる。いくつかの実施態様において、免疫グロブリンはＩＶＩＧであり、用量は、０．０１、０．０５、０．１０、０．２０、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５または３．０ｇ／ｋｇ体重（またはそれらの間の任意の値）である。ＩＶＩＧ投与の例となる治療範囲は、Arumugam et al., PNAS 104(35):14104-14109 (2007)にも開示されており、この開示は全体として本明細書に組み込まれる。
【００４５】
投与する医薬組成物は、単独の活性化合物としてＣ１−ＩＮＨおよび／または免疫グロブリンを含んでもよいし、または少なくとも１つの他の化合物、組成物もしくは生物学的物質と組み合わせて送達してもよい。このような化合物の例としては、ビタミン、抗生物質または脳内の血餅形成を除去もしくは阻害することを目的とする化合物（たとえば、アスピリン、クロピドグレルまたはジピリダモール）が挙げられる。
【００４６】
特定の実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨと免疫グロブリンとの組合せを用いた脳虚血の治療は、Ｃ１−ＩＮＨまたは免疫グロブリン療法のいずれか単独の治療効果を増強することができる。いくつかの実施態様において、組合せ療法は、脳虚血後の梗塞体積または神経障害の低減において相加効果をもたらす。さらなる実施態様において、この組合せは相乗的に作用してＣ１−ＩＮＨまたは免疫グロブリン療法のいずれか単独で見られる影響を増強する。特定の実施態様において、組合せ療法は、Ｃ１−ＩＮＨ療法単独で観察される脳梗塞体積における低減を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％（またはそれらの間の任意のパーセント）高める。いくつかの実施態様では、組合せ療法は、免疫グロブリン療法単独で観察される脳梗塞体積における低減を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％（またはそれらの間の任意のパーセント）高めるか、または脳虚血後に最適濃度の免疫グロブリンを単独で投与したときに観察される低減と少なくともほぼ同等の梗塞体積の低減を生じる。
【００４７】
特定の実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨとＩＶＩＧとを組み合せた投与は、脳虚血後にＣ１−ＩＮＨを単独で投与したときに観測される梗塞体積の約１／２または１／３に梗塞体積を低減する。いくつかの実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨとＩＶＩＧとの組合せの投与は、脳虚血後にＩＶＩＧを単独で投与したときに観測された梗塞体積の約１／２に梗塞体積を低減するか、または脳虚血後に最適濃度のＩＶＩＧを単独で投与したときに観察された梗塞体積と少なくともほぼ同等の梗塞堆積に梗塞体積を低減する。
【００４８】
組合せ療法の特定の実施態様では、個別に投与したときの最適濃度と比較して低減された投与量でＣ１−ＩＮＨおよびＩＶＩＧを投与する。これらの実施態様では、組合せ療法により、治療効果または他の有益な効果を維持しながら、低減された濃度の使用が可能にとなり、それによってコストおよび治療剤に対する有害反応のリスクが下がる。さらに、特定の実施態様において、低減された投与量での組合せ療法の投与は、高い用量のＣ１−ＩＮＨまたはＩＶＩＧに伴う出血のリスクを低減または回避するのを助けることができる。Bundesarztekammer, Dtsch Arztebl 97: B-864 (2000), Stieh et al., Biomed Prog. 9:13-8211;16 (1996), Horstick et al., Circulation 104: 3125-3131 (2001).また、特定の実施態様において、低減された投与量の使用は、患者耐性の忍容性を高めることができる。いくつかの実施態様において、急性虚血性脳卒中に有効な治療レジメンは、最初にＩＶＩＧ治療、続いて１つまたはそれ以上の早期に作用する治療剤（たとえば、ナトリウムまたはカルシウムチャネルのインヒビター）の投与、最後にＩＶＩＧ／Ｃ１−ＩＮＨの組合せの投与からなることができる。
【００４９】
ヒト脳卒中の罹病者の治療では、確立された標準治療に従って患者を治療しなければならない。特に、脳損傷が出血性である場合、ＩＶＩＧまたはＣ１−ＩＮＨの投与が禁忌となることがあるため、可能ならば、脳損傷が虚血性または出血性であるかどうかを決定するＭＲＩまたは他の方法によって患者を検査しなければならない。
【００５０】
実施例
以下の実施例は、本開示を説明するのに役立つが、それによって本開示が限定されるわけではない。
【００５１】
実施例１：Ｃ１−ＩＮＨ用量反応
マウスの中大脳動脈（ＭＣＡＯ）を１時間閉塞させた後、７２時間再灌流させることによって脳虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）損傷を誘発させた。Arumugam et al., PNAS 104: 14104-14109 (2007); Wang et al., Eur. J. Neurosci. 28(1): 51-61 (2008)。無処置（Ｉ／Ｒのみ）マウスでは、この手順により罹患した脳半球の脳梗塞平均値は３６％になった。
【００５２】
Ｃ１−ＩＮＨ濃度の効果を評価するため、３００Ｕ／ｋｇ（動物当たり７．６Ｕ）、１５０Ｕ／ｋｇ（動物当たり３．８Ｕ）および７５Ｕ／ｋｇ（動物当たり１．９Ｕ）でＣ１−ＩＮＨ（BERINERT(R)、ＣＳＬベーリング）の用量を減らして虚血期間終了後１時間にマウスの群（ｎ＝１２〜２１）を処置した。脳梗塞サイズの低減（５０％）における最大の効果は、１５０Ｕ／ｋｇでピークに達し、ＩＣ50効果（２５％低減）は、７５Ｕ／ｋｇ、すなわち１．９Ｕ／動物で達成された。図１を参照のこと。
【００５３】
単一用量のＣ１インヒビターを３００Ｕ／ｋｇで、虚血３０分前ならびに虚血後１時間、３時間および６時間で再灌流中に投与すると、ビヒクル処置マウスに対して脳梗塞サイズが、それぞれ６９％、４８％、５０％および６７％低減した。また、Ｃ１−ＩＮＨ処置も機能障害をかなり低減しており、これはビヒクル単独を投与したマウスとの比較における神経障害スコアの低減（ＭＣＡＯ後４８時間および７２時間で）が示すとおりである。ＩＶＩＧ用量反応実験でみられるように、Ｃ１−ＩＮＨ用量を１５０Ｕ／ｋｇおよび７５Ｕ／ｋｇに減らしても、対応して実験的な脳卒中エンドポイントの増悪を生じることはなかった。それどころか、脳梗塞の阻害度虚血後７２時間での神経障害、およびＣ１−ＩＮＨの３つの用量間の死亡率に有意な差はなかった。
【００５４】
実施例２：ＩＶＩＧ用量反応
動物の群（ｎ＝１２〜２２）を、虚血の１時間後にＩＶＩＧ（PRIVIGEN(R)、ＣＳＬベーリング）の用量を減らして処置し、１ｇ／ｋｇ体重で出発し、半分の用量０．５ｇ／ｋｇおよび０．２５ｇ／ｋｇ（または成体マウスの平均体重を２５〜３０ｇであるとみなしてｍｇ／ｇで測定する）を着実に減らして継続した。ＩＶＩＧ用量の減らすことと脳梗塞サイズの低減との間には直線的相関性があった。ＩＣ50値は、約０．５ｇ／ｋｇ（ｍｇ／ｇ）であった。図２を参照のこと。
【００５５】
ＭＣＡＯの３０分前および１時間後のＩＶＩＧ処置（１ｇ／ｋｇ）、ならびに虚血後３時間および６時間のＩＶＩＧ処置（２ｇ／ｋｇ）により、梗塞サイズが、それぞれ５６％、８０％５８％および５９％低減した。対象試薬、２５０ｍＭ  Ｌ−プロリン（これはPRIVIGEN(R)中の免疫グロブリン分子のためのビヒクルまたは安定剤として役立つ）またはビヒクル溶液中の１ｇ／ｋｇのヒトアルブミン（ＩＶ使用のため）を用いた処置は、無処置マウスと比較したときに、梗塞サイズにおける有意な影響がなかった。
【００５６】
ＩＶＩＧ処置マウスで観察された虚血性脳損傷の顕著な低減が機能障害を低減したか決定するため、最終的に屠殺してマウスにおいてＭＣＡＯ後２４、４８および、７２時間で神経障害を毎日評価して脳梗塞測定値を得た。Murakami et al., J. Neurosci. 18: 205-213 (1998)。ＩＶＩＧ処置は、虚血後４８および７２時間で、神経障害を有意に低減した。また、ＩＶＩＧは、虚血性脳損傷の結果においても用量依存的効果をもたらした。PRIVIGEN(R)の用量を半減（１．０ｇ／ｋｇ、０．５ｇ／ｋｇおよび０．２５ｇ／ｋｇ）させると、脳梗塞サイズ、７２時間の神経障害、および死亡率における段階的増加が観察された。
【００５７】
実施例３：BERINERT(R)の治療域
実験的な脳卒中にかけたマウスを、虚血終了の３時間後に１５０Ｕ／ｋｇ（動物当たり３．８Ｕ）でBERINERT(R)処置した。脳梗塞サイズを測定し、梗塞サイズの低減を決定した。虚血終了の３時間後の処置から生じた梗塞サイズにおける低減は、虚血１時間後に投与したときの同用量の効果と統計学的に異ならなかった（脳梗塞の約５０％低減）。この所見は、血漿由来のＣ１−ＩＮＨ（Baxter-Immuno、ピサ、イタリア）が、脳虚血後１時間しか治療域がないことを示すDe Simoni et al., The Powerful Neuroprotective Action of C1-Inhibitor on Brain Ischemia-Reperfusion Injury Does Not Require C1q, Am. J. Pathol. 164: 1857-63 (2004)によって以前に公開された結果と対照的である。
【００５８】
実施例４：Ｃ１−ＩＮＨおよびＩＶＩＧ併用処置
併用処置としてのＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨの神経保護の可能性を決定するため、虚血後１時間で単一用量の０．５０ｍｇ／ｇＩＶＩＧをマウスに与え、続いて３０分後、７５Ｕ／ｋｇのＣ１−ＩＮＨのｉ．ｖ．注射１回（ｎ＝１９）を行った。脳梗塞体積は、７２時間再灌流期間後に決定した。この併用処置により、７５Ｕ／ｋｇ用量のＣ１−ＩＮＨの効果がほぼ３倍増強され（２６％から７６％まで）脳梗塞体積の低減における０．５ｍｇ／ｇのＩＶＩＧの効果がざっと２倍になった（４０％から７６％まで）。この併用処置は、最適Ｃ１−ＩＮＨ用量（３００Ｕ／ｋｇ）と比較したときに、より神経保護性であった。併用処置により、死亡率および梗塞サイズが、３００Ｕ／ｋｇのＣ１−ＩＮＨを注入した動物と比較して約５０％低減した。併用処置は、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）の最適用量と同じくらい有効であり、死亡率および梗塞サイズは、２群の動物間で有意に差がなかった。図３を参照のこと。Ｉ／Ｒのみの群との比較においてＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨの両方を投与したマウスでは、神経障害がすべての時点（虚血後２４、４８および７２時間）で有意に低減され、ＩＶＩＧ（０．５０ｍｇ／ｇ）またはＣ１−ＩＮＨ（７５Ｕ／ｋｇ）の最適以下の用量で単独で処置したマウスよりも１７％〜２４％低かった。
【００５９】
組合せ投与は、虚血６時間後に適用したときでも、脳梗塞のサイズを低減する観点からＩＶＩＧまたはＣ１−ＩＮＨ単独と等しく有効であった（無処置動物との比較において６７％）。図４ａ。虚血後６時間での併用処置の結果、神経障害スコアが７１％改善された。この効果は、ＩＶＩＧまたはＣ１−ＩＮＨの個々の最適用量で処置したマウスと比較して有意により顕著であった。図４ｂ。
【００６０】
実施例５：ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨは、老齢マウスおよび雌マウスを損傷から保護する。
ヒト脳卒中は、両性別に等しく影響を及ぼし、その発生率は年齢とともに上昇する。そのため、本発明者らは、雌マウスにおけるＩＶＩＧ、Ｃ１−ＩＮＨおよび併用処置の有効性を試験した。また、本発明者らは、虚血後６時間の１３〜１４ヵ月の雄マウス（以前に試験したよりも老齢）における効果を試験した。老齢の雄マウスおよび雌マウスは、ＩＶＩＧ単独１ｇ／ｋｇ、Ｃ１−ＩＮＨ単独３００Ｕ／ｋｇで注入したときだけでなく連続して投与した両者の最大半量阻害（ＩＣ50）濃度で注入したときも同様に、無処置動物と比較して虚血後７２時間で有意に低減された梗塞サイズおよび神経障害度を示した。老齢マウスでは、組合せ療法は、梗塞サイズおよび神経障害スコアの低減という観点から、約５０％および７０％有効であった。
【００６１】
実施例６：ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨは、原位置でのＣ３ｂの蓄積を低減する。
Ｉ／Ｒ損傷を受けたマウスからの脳試料において、第３補体成分の活性断片、Ｃ３ｂのレベルにおけるＩＶＩＧ／Ｃ１−ＩＮＨ併用処置の効果を評価した。正常動物および偽手術された動物の脳で観察されたＣ３ｂの基礎レベルは、Ｉ／Ｒマウスの反対側の（非損傷）脳半球におけるＣ３ｂレベルと類似していた。Ｉ／Ｒ損傷後、損傷部位（同側脳半球中）のＣ３ｂは、皮質で５倍、線条体で１５倍上昇した。再灌流の開始１時間後に投与したＩＶＩＧ（１．０ｇ／ｋｇで）およびＣ１−ＩＮＨ（３００Ｕ／ｋｇで）は、罹患した脳半球の皮質および線条体の両方においてＣ３ｂ発現を約３倍低下させた。このデータは、脳虚血に反応して補体系が活性化され、原位置での活性断片の沈着を導くことを示唆している。補体除去および阻害は、Ｃ３ｂ沈着によって誘発される神経損傷の低減に有効であると考えられる。梗塞の線条体部分におけるＣ３ｂのより顕著な沈着は、その領域におけるより広範な解剖学的損傷の以前の所見と関連しており、Ｉ／Ｒ脳損傷と補体活性化との間の因果関係のさらなる証拠を提供している。
【００６２】
実施例６：補体活性化は、虚血性脳卒中においてＴＬＲ２を上方制御する。
補体系およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、宿主の先天性免疫防御系の最前線となり、侵入してくる病原体および変化した自己抗原に対してパターン認識を介して反応する。したがって、虚血性脳卒中の補体およびＴＬＲ経路の同時活性化の可能性を評価した。ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨによる両経路の減弱は、Ｃ３ｂおよびＴＬＲ２に対する抗体を用いて二重標識免疫組織化学を実施することによって評価した。Ｉ／Ｒ損傷の２４時間後に脳のペナンブラ領域から採取した組織切片では、抗体シグナルのピクセル強度を定量化することによって決定したところ、９０％を超える脳細胞が、偽手術した動物から採取した同じ切片中より１１倍（Ｃ３）および２８倍（ＴＬＲ２）高い内因性Ｃ３およびＴＬＲ２発現レベルを示した。虚血後１時間にＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）およびＣ１−ＩＮＨ（３００Ｕ／ｋｇ）で処置したマウスでは、Ｃ３およびＴＬＲ２シグナルが有意に抑制された。Ｃ３およびＴＬＲ２についての二重標識免疫蛍光染色は、ほとんどすべての脳細胞中に、これらの２つの分子が共存することを示した。ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨの両方で処置したマウスの切片では、共存シグナルが個々のシグナルと同じくらい効果的に抑制された。
【００６３】
実施例７：ＩＶＩＧ療法、Ｃ１−ＩＮＨ療法および組合せ療法の比較
ＩＶＩＧ（PRIVIGEN(R)、ＣＳＬベーリング）およびＣ１−ＩＮＨ（BERINERT(R)、ＣＳＬベーリング）は、いずれも、虚血の３０分前または１時間後に与えたときに、脳梗塞サイズ、神経障害スコア、および損傷部位でのＣ３ｂ断片の沈着を用量反応的に有意に低減する。最適用量のＩＶＩＧは、最適用量のＣ１−ＩＮＨよりも神経保護をもたらす（それぞれ、脳梗塞体積の低減８５％対４８％および神経障害の阻害３５％対２２％）。ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨの代わりにヒト血清アルブミンおよびビヒクル（溶液を安定化する）を用いた処置は、無処置対照で観察される脳損傷の規模を改善しなかった。このデータは、補体減弱が脳卒中の新規な介入療法と考えられることを示唆している。
【００６４】
Ｃ１−ＩＮＨは、補体活性化を阻害するが、すでに生成された補体活性化断片を中和するわけではないのに対して、ＩＶＩＧは新たな補体活性化を阻害しないが、活性化された補体断片を除去する。脳卒中のような補体介在性疾患では、補体活性化の新たな期間が散発的に発生し、新たな病原性補体産物を生成する。インヒビターとスカベンジャーとの組合せは、既存の活性断片を除去し、かつさらなる補体活性化を予防するための改善された治療戦略を提供する。ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨの両方の最適以下用量の組合せは、個々濃度の効果を超えるだけでなく、最適Ｃ１−ＩＮＨ濃度の効果も超え、かつ併用処置がＩＶＩＧ単独と比較して優れた脳保護を示した老齢マウスを除いて、１ｇ／ｋｇのＩＶＩＧの治療可能性に匹敵した。
【００６５】
ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨはいずれも他のヒト障害の治療にすでに用いられており、かつ安全であることが示されているため、組合せ療法は、ヒトにおける脳卒中の治療に利益を提供することができる。
【００６６】
実施例８：物質および方法
局所性の脳虚血／再灌流モデル。すべての実験的なプロトコールおよび手順は、アメリカ国立老化研究所の実験動物員会（Animal Care and Use Committee of the National Aging Institute）によって承認されており、ＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）を遵守して実施した。３ヵ月齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２５〜３０ｇ）をイソフルラン（誘導５．０％、維持１．５〜２．０％）で麻酔した。次いで、腔内フィラメント法（intraluminal filament method）を用いて動物を一過性中大脳動脈閉塞（ＴＭＣＡＯ）にかけた。簡潔には、左総頸動脈、外頸動脈（ＥＣＡ）および内頸動脈（ＩＣＡ）を、頸部正中切開（midline neck incision）により露出させた。次いで、ケイ素コーティングされたモノフィラメント（コーティングを含めた直径０．２３＋／−０．０２ｍｍ）を切開によりＥＣＡ内腔に導入し、耐光性（light resistance）が感知されるまでＥＣＡからＩＣＡ内腔まで進めた。１時間後、モノフィラメントを除去して最長７２時間まで再灌流を開始した。偽手術したマウスに、閉塞を生じるフィラメントの挿入を除く同様の処置をした。
【００６７】
処置レジメン
これらの実施例で用いるＩＶＩＧ製剤（PRIVIGEN(R)、ＣＳＬベーリングAG、ベルン、スイス）は、＞９８％のＩｇＧおよび＞０．０２５ｍｇ／ｍｌのＩｇＡを含有する１０％タンパク質溶液であった。PRIVIGEN(R)中のＩｇＧ分子は、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−プロリン（ビヒクル）で安定化されている。凍結乾燥された血漿由来のヒトＣ１ｓエステラーゼインヒビター、Ｃ１−ＩＮＨ（BERINERT(R)、ＣＳＬベーリング社、マールブルク、ドイツ）を、滅菌水１０ｍｌで再構成して１０ｍｇ／ｍｌのグリシン、８．５ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌおよび３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウムを含有するビヒクル溶液中で５００Ｕの最終Ｃ１−ＩＮＨ用量を達成した。再構成したＣ１−ＩＮＨを＋４℃に保ち、１４日以内に用いた。ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨは、３０分前（前処置）またはＭＣＡＯ後指定された時点（処置後１時間および３時間）のいずれかでゆっくり注入することによって大腿静脈中に投与した。両療法のビヒクル溶液（上の実施例に記述したとおり）は、ＩＶＩＧおよびＣ１−ＩＮＨの最適用量が送達されるのと等しい体積で対照動物に注入した。
【００６８】
神経障害評価
局所性の脳Ｉ／Ｒ損傷の機能性結果は、脳卒中後の指定された時点で、６点神経障害スコア（０、欠陥なし；１、右足の伸展不良；2、右に旋回３、右に転倒；４、自発歩行不能および５、死亡）を用いて評価した。各マウスを、少なくとも２人の研究者によって盲検化方式で評価した。
【００６９】
脳梗塞の定量
マウスに麻酔をかけ、断頭し、その脳を摘出した。齧歯動物脳マトリックス（Kent Scientific、トリントン、ＣＴ）を用いて２ミリメートルの冠状切片を調製し、リン酸緩衝液中の２％２,３,５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド一水和物（ＴＴＣ、シグマ、セントルイス、ＭＯ）を用いて３７℃で２０分間染色した。切片をスキャンし、ＮＩＨ画像分析ソフトウェア（ImageJ；アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）、ベセスダ、ＭＤ）を用いて梗塞サイズを評価した。
【００７０】
ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
ＩＶＩＧ処置マウスおよびＣ１−ＩＮＨ処置マウス、ならびに適当なビヒクル対照マウスからの脳皮質および線条体試料を、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ β−グリセロリン酸、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．１％トリトン−Ｘを含有する溶解緩衝液中にプロテアーゼインヒビターとともに入れた。超音波処理装置（ＶＣ１３０ PB、ソニックアンドマテリアルズ社（Sonic & Materials Inc.）、ニュータウン、ＣＴ）を用いて４℃で３０秒の超音波処理によって組織を溶解し、細胞抽出物を１８，０００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、BioRad（ハーキュリーズ（Hercules）、ＣＡ）からのビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイキットによってタンパク質含量を決定した。上清試料を１０％ＳＤＳゲル上で分離し、分離したタンパク質を０．４５μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社、ベッドフォード、ＭＡ）に電気泳動的に移動させた。ブロットを、一次抗Ｃ３ｂ抗体（セルサイエンシズ（Cell Sciences）、カントン、ＭＡ）および抗βアクチンモノクローナル抗体（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ＭＯ）と共に４℃で一夜インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次ＩｇＧを用いて１時間インキュベーションした後、増強化学発光アッセイ（アマシャム社、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて反応生成物を視覚化した。タンパク質発現における相対的変化は、Scion Imageプログラム（オレム、ＵＴ）を用いて各タンパク質バンドの平均画素密度から算定した。
【００７１】
免疫組織化学的評価
免疫組織化学的研究用に指定されたマウスに、再灌流２４時間後、深麻酔にかけ、流出物が透明になるまでＰＢＳで経心的に灌流させた。固定は、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて行った。脳を解剖し、同じ固定液中、４℃で一夜置いた。前頭部の脳を、パラフィン切片用に処理した。連続的な冠状切片を切断し（厚さ５μｍ）、ガラススライドガラス上に取り付けた。切片を脱パラフィンし、再水和させ、高ｐＨのＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ緩衝液を用いて抗原賦活化にかけた。すべての細胞計数を、すべての切片にわたって維持された所定の領域において実施した。非特異的抗体結合を遮断した後、切片を、一次ウサギポリクローナル抗Ｃ３抗体（サンタクルスバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）、サンタクルス、ＣＡ）およびラットモノクローナル抗ＴＬＲ２、（バイオレジェンド（Biolegend）、ＣＡ）と共に４℃で一夜インキュベートした。適当なAlexa Fluor 568（赤色蛍光）およびAlexa Fluor 488（緑色蛍光）に結合した二次抗体（インビトロゲン（Invitrogen）、カールズバッド、ＣＡ）と共に４５分間インキュベートし、ヘキスト３３２５８で対比染色した後、オリンパス蛍光顕微鏡で画像を得た。画像は、入力レベルを、得られたシグナル強度の範囲にわたって調整してフォトショップ７．０（アドビシステムズ、サンノゼ、ＣＡ）で処理した。画素強度は、ＩＰラボソフトウェア（IP Labs Software）（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて定量化した。
【００７２】
統計分析
統計的比較は、スチューデントｔ検定、フィッシャーの正確検定、ＡＮＯＶＡ、および対比較のためのニューマンクールス事後試験（Newman-Keuls post hoc tests）を用いて行った。上記の実施例は、説明のためのものであって、本開示を限定するわけではない。開示されたデバイスおよび方法の他の実施態様は、本明細書の検討ならびに本明細書に開示されたデバイスおよび方法の実施から当業者に明らかとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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