(57)【要約】【課題】親ポリペプチドと比較して改変された機能を有するグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ）変異体の設計方法および生成方法を提供する。【解決手段】  本発明は、親ポリペプチドと比較して改変された機能を有するグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ）変異体の設計方法および生成方法を提供する。本発明はさらに、親ポリペプチドと比較して改変された機能を有するＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードする核酸を提供する。本発明の様々な側面によれば、ＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞および乳酸の生成方法も提供される。【選択図】１【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアラニンがセリン、スレオニン、グリシン、またはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換されたグリセロール脱水素酵素の配列および／またはアスパラギン酸がグルタミンまたはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換されたグリセロール脱水素酵素の配列を含み、
前記フェニルアラニンは、配列番号３の２４５番目に位置するフェニルアラニンに対応し、前記アスパラギン酸は、配列番号３の１２１番目に位置するアスパラギン酸に対応する
単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、配列番号１を含む
ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、フェニルアラニンがセリン、スレオニン、グリシン、またはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換されたグリセロール脱水素酵素の配列を含み、
前記フェニルアラニンは、配列番号３の２４５番目に位置するフェニルアラニンに対応する
ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、アスパラギン酸がグルタミンまたはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換されたグリセロール脱水素酵素の配列を含み、
前記アスパラギン酸は配列番号３の１２１番目に位置するアスパラギン酸に対応する
ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがセリンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がグルタミンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがスレオニンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がグルタミンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがスレオニンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がアスパラギンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがグリシンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がグルタミンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがグリシンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がアスパラギンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがアスパラギンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がグルタミンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンがアスパラギンで置換され、配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がアスパラギンで置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、
配列番号３の２４５番目に位置する前記フェニルアラニンに対応するフェニルアラニンが、セリン、スレオニン、グリシン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換されたグリセロール脱水素酵素の配列、または
配列番号３の１２１番目に位置する前記アスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がグルタミンもしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換されたグリセロール脱水素酵素の配列
を含む
ポリペプチド。
【請求項６】
担体および請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む
組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む
ベクターまたは遺伝子構築物。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸で形質転換された、
単離された微生物細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離された微生物細胞であって、
前記微生物細胞は、請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたは遺伝子構築物を含む
微生物細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の単離された微生物細胞であって、
前記微生物細胞は、グラム陰性菌細胞またはグラム陽性菌細胞である
微生物細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離された微生物細胞であって、
前記グラム陰性菌細胞はEscherichia属、Zymomonas属、Acinetobacter属、Gluconobacter属、Geobacter属、Shewanella属、Salmonella属、Enterobacter属、またはKlebsiella属から選択される細菌細胞であり、前記グラム陽性菌細胞は、Bacillus属、Clostridium属、Corynebacterium属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Oenococcus属、Streptococcus属、およびEubacterium属から選択される細菌細胞である
微生物細胞。
【請求項１３】
請求項９または１０に記載の単離された微生物細胞であって、
前記微生物細胞は、Escherichia coliまたはKlebsiella oxytocaである
微生物細胞。
【請求項１４】
請求項９または１０に記載の単離された微生物細胞であって、
前記微生物細胞は、Thermoanaerobes、Bacillus spp.、Paenibacillus spp.、またはGeobacillus spp.から選択される
微生物細胞。
【請求項１５】
請求項９または１０に記載の単離された微生物細胞であって、
前記微生物細胞は、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、またはYarrowiaから選択される酵母細胞である
微生物細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離された微生物細胞であって、
前記酵母細胞は、Kluyveromyces lactis、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis、Saccharomyces oviformis、または Yarrowia lipolyticaである
微生物細胞。
【請求項１７】
請求項９または１０に記載の単離された微生物細胞であって。
前記微生物細胞は、 Acremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Bjerkandera、Ceriporiopsis、Chrysosporium、Coprinus、Coriolus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes、またはTrichodermaから選択される真菌細胞である
微生物細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離された微生物細胞であって、
前記真菌細胞は、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Bjerkandera adusta、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、Chrysosporium inops、Chrysosporium keratinophilum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium tropicum、Chrysosporium zonatum、Coprinus cinereus、Coriolus hirsutus、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Phanerochaete chrysosporium、Phlebia radiata、Pleurotus eryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、またはTrichoderma virideの細胞である
微生物細胞。
【請求項１９】
Ｄ−乳酸の生成が可能な条件下で、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の形質転換された微生物細胞を培地で培養することを含む
Ｄ−乳酸の生成方法。
【請求項２０】
培地および請求項９〜１８のいずれか１項に記載の形質転換された微生物細胞を含む
組成物。
【請求項２１】
請求項６または２０に記載の組成物であって、
前記担体または培地組成物は、バイオマス、ヘミセルロース・バイオマス、リグノセルロース・バイオマス、またはセルロース・バイオマス由来の加水分解物を含む
組成物。
【請求項２２】
請求項１９に記載のＤ−乳酸生成方法であって、
前記培地はバイオマス、ヘミセルロース・バイオマス、リグノセルロース・バイオマス、またはセルロース・バイオマス由来の加水分解物を含む
Ｄ−乳酸生成方法。
【請求項２３】
配列番号５６またはtcgagaaaaa cttgacacat acCAAAAATA AGTTATGATG GAATTGTGCT TGTTATATTT TTCAC （配列番号５６の８４番目から１４８番目のヌクレオチド）を含む
単離された核酸。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド配列に作用可能に結合した配列番号５６または tcgagaaaaa cttgacacat acCAAAAATA AGTTATGATG GAATTGTGCT TGTTATATTT TTCAC（配列番号５６の８４番目から１４８番目のヌクレオチド）を含む
単離された核酸。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸を含む
ベクターまたは単離された宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドと、
ジオールおよび／またはポリオールと
を含む
組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物であって、
前記ジオールは、１、３−ブタンジオールである
組成物。
【請求項２８】
１、３−ブタンジオールを４−ヒドロキシ−２−ブタノンに酸化させる条件下において、１、３−ブタンジオールを請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドと接触させることを含む
４−ヒドロキシ−２−ブタノンの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するグリセロール脱水素酵素の変異体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は２０１１年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／５４３００３号の利益を主張するものであり、すべての図、表、およびアミノ酸配列または拡散配列を含むその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、米国エネルギー省助成金番号ＤＥ−ＦＧ３６−０４ＧＯ１４０１９およびＤＥ−ＦＧ３６−０８ＧＯ８８１４２ならびに米国農務省の食品・農業研究所（２０１１−１０００６−３０３５８）の下において、政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
石油は、自動車の主要な燃料源としての役割だけでなく、有機化学物質およびプラスチック類の主要な原料としての役割も果たしている。石油埋蔵量は有限であること、および石油の使用が環境に悪影響を及ぼすことから、再生可能な代替原料に関心が移っている（非特許文献１〜４参照）。炭水化物を発酵させることにより、様々な短鎖ヒドロキシ酸だけでなく、重合によりプラスチック類となる他の化学物質も生成できることが示唆されている。この化学物質を石油の代替として利用することができる（非特許文献５参照）。純粋細菌培養を利用した乳酸の商業生産は１８９５年には既に始まっており（非特許文献６参照）、現在の年間生産量は３００，０００トン以上である。乳酸は主に食品産業および薬品工業で使用されている。しかし、ポリ乳酸（ＰＬＡ）バイオポリマーの生産コストを低減することができれば、ＰＬＡの生産における乳酸の使用量は、他の使用量を上回ることが予想される（非特許文献７および８参照）。
【０００５】
乳酸を縮合すると二量体ラクチドとなり、精製・重合すると熱可塑性物質となる（非特許文献７および９参照）。Ｄ（−）−乳酸ポリマーおよびＬ（＋）−乳酸ポリマーを混合することで、それらポリマーが有する様々な物理的特性および熱化学的特性、ならびに生分解速度を実質的に制御することができる（非特許文献９参照）。乳酸は石油から合成することができるが、化学合成の場合、ＰＬＡには適さない異性体の混合物が生成されてしまう。ＰＬＡの合成に必要とされる光学的に純粋な乳酸は、微生物発酵によって容易に生成することができる（非特許文献８参照）。Ｌ（＋）−乳酸は、LactobacillusおよびLactococcusなどの乳酸菌により商業生産される。これら乳酸菌は、３０℃〜４０度の温度範囲でグルコースおよびスクロースから高力価のＬ（＋）−乳酸を高い収率で生成することができる（非特許文献８および１０参照）。Escherichia coli変異株はＤ（−）−乳酸を商業生産できる唯一の株として知られており（非特許文献１１および１２参照）、これら株も４０度以下の温度で最も活発に活動する。
【０００６】
乳酸を生成するための原料として食品炭水化物（グルコースおよびスクロース）を使用しないようにするために、リグノセルロース・バイオマスなどの発酵性糖類および改良された微生物生体触媒といった代替物が必要である（非特許文献１３参照）。しかし、セルロースを原料として用いると、商用真菌セルラーゼの場合、かなりの処理コストがかかってしまう。真菌セルラーゼにとっての最適条件下（ｐＨ５．０、５０℃）において効果的に原料を発酵させる耐熱性生体触媒を開発することができれば、このコストを低減することができる（非特許文献１４および１５参照）。
【０００７】
工業で使用される乳酸生体触媒は、ホスホケトラーゼ経路により（ヘミセルロースに含まれる）ペントース糖類を代謝し、これら糖類の乳酸への効率的な変換を妨げている。この経路によりペントース類から生成された乳酸は、等モル量の酢酸で汚染される（図１、非特許文献８、１６〜１８参照）。これら乳酸菌のキシロース発酵特性を改善しようとする試みは、ある程度の成果しかあげていない（非特許文献１８および１９参照）。ヘミセルロースに含まれるすべてのペントース類は、E. coli変異株によって、ペントース・リン酸経路により、効率的にＤ（−）−乳酸またはＬ（＋）−乳酸に発酵される。しかし、この生体触媒の温度許容度またはｐＨ許容度は、工業用セルラーゼの最適温度（５０℃）または最適ｐＨ（５．０）でセルロース発酵を行うには不十分である（非特許文献２０参照）。
【０００８】
Bacillus coagulansはリグノセルロース糖類を乳酸に発酵させるための多くの望ましい特性を有する。この細菌は、商用真菌セルラーゼの最適条件下である５０〜５５℃およびｐＨ５．０の条件下で、高効率なペントース・リン酸経路（図１参照）により、ヘキソース類およびペントース類の両方をＬ（＋）−乳酸に発酵する（非特許文献１５、１７、および２１参照）。野生株は、１８０ｇＬ−１もの濃度の光学的に純粋なＬ（＋）−乳酸をグルコースまたはキシロースから流加発酵により生成し、真菌セルラーゼを利用したセルロースの同時糖化発酵（ＳＳＦ）を行っている間、活発に活動する（非特許文献２１および２２参照）。B. coagulans の発酵の最適条件と真菌セルラーゼ活性の最適条件とが一致したことにより、中温細菌生体触媒を用いたＳＳＦの場合と比較して、セルラーゼの還元量が４倍となった（非特許文献２１参照）。B. coagulans は、複合栄養素を必要とする乳酸菌とは対照的に、安価なトウモロコシ浸出液（０．２５％、ｗ／ｖ）を添加した無機塩培地でも増殖して、糖類を発酵する（非特許文献８、１５、および１８参照）。B. coagulansは、セルロースを光学的に純粋なＬ（＋）−乳酸に変換するための生体触媒として高い可能性を有するが、乳酸のＤ（−）−異性体をそれと同等に生成できる微生物は、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
親ポリペプチドと比較して改変された機能を有するグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ）変異体の設計方法および生成方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、親ポリペプチドと比較して改変された機能を有するグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ）変異体の設計方法および生成方法を提供する。本発明はさらに、親ポリペプチドと比較して改変された機能を有するＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードする核酸を提供する。本発明の様々な側面によれば、ＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞および乳酸の生成方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂにおけるグルコースおよびキシロースの嫌気的代謝経路を示す。太い矢印は、野生株の嫌気性増殖下における好ましいルートとしてのＬ−乳酸（破線）へのグルコースフラックスまたはキシロースフラックスと、本研究において構築されたＱＺ１９株におけるＤ−乳酸へのグルコースフラックスまたはキシロースフラックスを示す。破線矢印（Ｌ−ＬＤＨおよびＡＬＳ）は、本研究において導入された２つの変異経路を表す。比較として、ホスホケトラーゼ経路を利用したL. lactis などの乳酸菌におけるキシロース発酵経路も示されている。ホスホケトラーゼ経路では、等モルの乳酸および酢酸が生成される。B. coagulansおよびL. lactis によるペントース発酵の詳細については、非特許文献１７（Patel et al.）を参照。
【図２】Ｄ−乳酸生成B. coagulans株ＱＺ１９の発酵プロファイルを示す。５０℃の条件下の発酵におけるグルコース濃度は、１１０ｇＬ−１（０．６Ｍ）であり、培地のｐＨは、Ｃａ（ＯＨ）２を添加することにより５．０に維持した。
【図３】５０℃およびｐＨ５．０の条件下における、B. coagulans株ＱＺ１９による結晶セルロースのＤ−乳酸への同時糖化発酵を示す。Lactococcus lactisに関するデータは、非特許文献２２（Ou et al.）から入手し、比較のために記載した。初期のセルロース（Solka Floc（登録商標））濃度は４０ｇＬ−１であった。
【図４】Ｄ−乳酸生成ＱＺ１９株が得られるまでの様々なB. coagulans株の粗抽出液に含まれるタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。ＬＢ＋グルコース（３０ｇＬ−１）培地においてｐＨを制御（５．０）した発酵を行うことにより増殖した指数増殖中期〜指数増殖後期の培養物を採取し、細胞抽出物を調整して解析した。一番左の列は基準となる分子量を示し、その左に付された数字は、タンパク質中の対応する分子量（キロダルトン）を表す。一番右の列は、ＱＺ１９株の純粋ＧｌｙＤＨ＊を示す。
【図５】gldA発現を促進するB. coagulans株ＱＺ１３のgldA遺伝子の上流領域におけるＤＮＡの挿入を示す。イタリック体で示した挿入ＤＮＡ（１，８２１ｂｐ）は、gldA遺伝子の（ＡＴＧの「Ａ」を＋１番目として）−６２番目の「Ｃ」の後から始まり、上流に続く。（楕円で囲った）１１個の塩基からなる直接反復配列が挿入部分の各末端に存在し、１つは挿入部分の５'末端に、もう１つは挿入部分の３'末端直後にあるgldA遺伝子の５'末端に存在する。推定ＤｅｏＲファミリー調節因子であるＯＲＦ１、挿入ＤＮＡにおけるＯＲＦ２およびＯＲＦ３、推定トランスポーゼース、グリセロール脱水素酵素gldA、推定−１０配列、−３５配列、およびシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列が示されている。
【図６Ａ】B. coagulans野生株Ｐ４−１０２Ｂの発酵プロファイルを示す。小さな発酵槽内で、ＬＢ＋グルコース（０．１６Ｍ）培地にＫＯＨを自動添加してｐＨを５．０に制御し、５０℃の条件で発酵させた。
【図６Ｂ】図６Ａと同様に、B. coagulans野生株Ｐ４−１０２Ｂのldh変異株（ＱＺ４株）の発酵プロファイルを示す。
【図６Ｃ】図６Ａと同様に、B. coagulans野生株Ｐ４−１０２Ｂのldh・als変異株（ＱＺ５株）の発酵プロファイルを示す。
【図７】小さな発酵槽におけるB. coagulans株ＱＺ５のＤ−乳酸生成ＱＺ１９株への代謝進化を示す。代謝進化中の乳酸の力価は３日毎に求めた。他の詳細は本文を参照。
【図８】小さな発酵槽においてｐＨ７．０の条件下でグルコース濃度を増加させたＬＢ＋グルコース培地でのB. coagulans株ＱＺ１４の代謝進化を示す。培地には、０．２ＭのＣａＣＯ３も添加した。初期グルコース濃度は、５０ｇＬ−１（０．２８Ｍ）であった。３回目の植菌の後、グルコース濃度を６０ｇＬ−１（０．３３Ｍ）に増加させた。５回目の植菌の後の培地のグルコース濃度は、１００ｇＬ−１（０．５６Ｍ）であった。培養物の乳酸の力価は、各植菌の３日後に求めた。培養を開始してから６０日後、約０．８Ｍの乳酸を生成するＱＺ１５株を単離した。ＱＺ１５株への代謝進化のさらに６３日後、ＱＺ１９株を単離した。
【図９】ｐＨ５．０および５０℃の条件下におけるB. coagulans株ＱＺ１９によるグルコースのＤ−乳酸への流加発酵を示す。発酵はＬＢ＋グルコース培地においてｐＨを制御して行い、グルコースの初期濃度は１００ｇＬ−１（０．５６Ｍ）であった。７２時間後、さらに１００ｇＬ−１（０．５６Ｍ）のグルコースを添加した。培養物のｐＨは、ＣＡ（ＯＨ）２を添加することにより５．０に維持した。
【図１０】５０℃およびｐＨ５．０の条件下におけるB. coagulans株ＱＺ１９によるキシロースのＤ−乳酸への発酵を示す。ＬＢ培地には、８０ｇＬ−１（０．５３Ｍ）のキシロースおよび０．２ＭのＣａＣＯ３を添加した。
【図１１】B. coagulans株ＱＺ１９におけるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するグリセロール脱水素酵素のアミノ酸配列を示す。大文字で示すアミノ酸配列は、トリプシン分解およびフラグメントのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの後に決定した。
【図１２】B. coagulans野生株Ｐ４−１０２Ｂ（配列番号３）のグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ）のアミノ酸配列およびＧｌｙＤＨに２つの変異を有するB. coagulans野生株Ｐ４−１０２ＢのＤ−乳酸生成変異ＱＺ１９株（配列番号１）のグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ＊）のアミノ酸配列を示す。
【図１３】Swiss-Modelによって構築したB. stearothermophilusのＧｌｙＤＨ（ＰＤＢ：１ＪＰＵ）に基づくB. coagulansのＧｌｙＤＨのモデルを示す。野生型酵素はグリーンで着色され、ＱＺ１９の酵素（ＧｌｙＤＨ＊）はシアンで着色され、両者は重ね合わせられている。アミノ酸１２１およびアミノ酸２４５は強調表示されている。野生型のアミノ酸はイエロー、改変されたアミノ酸（ＱＺ１９株）はマゼンタで表示されている。図中下部には、B. stearthermophilusの酵素構造に基づく活性部位のアミノ酸のみが示されている。左側には、活性部位におけるグリセロールを有する野生型ＧｌｙＤＨを示し、右側には、活性部位におけるピルビン酸を有するＧｌｙＤＨ＊（Ｄ１２１ＮおよびＦ２４５Ｓ）を示す。
【図１４Ａ】様々なＧｌｙＤＨポリペプチド（配列番号５−３２）の配列を提供する。これら配列に示すように、配列番号３の１２１番目および２４５番目に位置するアミノ酸に対応するアスパラギン酸およびフェニルアラニンは全てのポリペプチド中において保存されている。
【図１４Ｂ】図１４Ａと同様に、様々なＧｌｙＤＨポリペプチド（配列番号５−３２）の配列を提供する。
【図１４Ｃ】図１４Ａと同様に、様々なＧｌｙＤＨポリペプチド（配列番号５−３２）の配列を提供する。
【図１４Ｄ】図１４Ａと同様に、様々なＧｌｙＤＨポリペプチド（配列番号５−３２）の配列を提供する。
【図１４Ｅ】図１４Ａと同様に、様々なＧｌｙＤＨポリペプチド（配列番号５−３２）の配列を提供する。
【図１５】野生型タンパク質のグリセロール脱水素酵素活性およびＤ−乳酸生成に対するB. coagulansの増殖に基づく選択によって得られた酵素の改変された形態を示す。
【図１６】野生型タンパク質の乳酸脱水素酵素活性およびＤ−乳酸生成に対するB. coagulansの増殖に基づく選択によって得られた酵素の改変された形態を示す。
【図１７】Bacillus coagulans株ＱＺ１９（配列番号５３）におけるgldA遺伝子上流の挿入配列を示す。
【図１８Ａ】gldA遺伝子を有するBacillus coagulans株ＱＺ１９におけるgldA遺伝子上流の挿入配列を示す。小文字は挿入配列を表し、大文字はgldA配列およびそのすぐ上流から挿入位置までの配列を表す（「ＡＴＧ」における「Ａ」を＋１番目として、−６２番目の後）。小文字、太字、イタリック体で示す波下線付きの配列「ttgaca」（配列番号５４の１８２２−１８２７番目の位置）は、gldA上流の配列に挿入配列により導入された推定−３５配列である。野生型のgldA上流の配列は、推定−３５配列を有しなかった。挿入によるこの新しい−３５配列の導入により、gldA遺伝子を発現させ、ＱＺ１３株およびその派生株において高レベルにタンパク質を生成することが可能となった。野生型のgldA遺伝子の推定−１０配列も強調表示されている（太字、イタリック体、および二重下線）。
【図１８Ｂ】図１８Ａと同様に、gldA遺伝子を有するBacillus coagulans株ＱＺ１９におけるgldA遺伝子上流の挿入配列を示す。
【図１９】挿入配列のない野生型のgldA配列を示す。挿入位置は矢印で示されている（配列番号５５の２１９番目の塩基の後）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は同じ意味で用いることができ、本発明によれば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはこれらＤＮＡの転写産物（例えばＲＮＡ分子）を意味すると理解される。なお、本発明は、自然環境または自然状態のゲノムヌクレオチド配列には関しない。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、またはヌクレオチド配列は単離・精製（または部分精製）することができる。単離の方法として、イオン交換クロマトグラフィー、分子サイズ排除クロマトグラフィー、もしくは遺伝子操作法、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子操作法には、増幅、差引きハイブリダイゼーション、クローニング、サブクローニング、および化学合成が含まれる。
【００１４】
タンパク質相同性および核酸配列相同性は、当該技術分野において周知の様々な配列比較アルゴリズムおよび配列比較プログラムを利用して評価してもよい。このようなアルゴリズムおよびプログラムには、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷが含まれるが、これらに限定されない。配列比較は、典型的には、メーカーにより提供される初期パラメータ、または上記参考文献に記載のパラメータを利用して実施され、本明細書にその全体が参照として組み込まれる。以下に説明するように、ＧｌｙＤＨ配列をアラインすることにより、配列番号３の２４５番目および１２１番目の位置にそれぞれ対応するフェニルアラニンのアミノ酸残基およびアスパラギン酸のアミノ酸残基を特定することができる。その後、これらアミノ酸をセリンまたはアスパラギンなどの他のアミノ酸で置換することができる。
【００１５】
本発明はまた、ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。本明細書に開示の遺伝子構築物は、プロモーターおよびエンハンサーなどの制御因子をさらに含んでもよく、また、選択可能なマーカーを任意に含んでもよい。また、本明細書に記載の遺伝子構築物を含有するベクターもしくは発現カセット、または制御因子に作用可能に結合した本開示のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドも、本発明の範囲内に含まれる。ベクターおよび発現カセットは、転写制御配列をさらに含んでもよい。ベクターおよび発現カセットは、選択可能なマーカーをさらに含んでもよい。発現カセットは、制御因子に作用可能に結合し、微生物に同時形質転換される少なくとも１つの遺伝子をさらに含有してもよい。あるいは、当該遺伝子および制御因子は、複数の発現カセット内に含めてもよい。このような発現カセットには、本発明の配列を挿入するための複数の制限部位が提供され、発現カセットは制御領域の転写制御を受ける。発現カセットは、制御因子に作用可能に結合した選択可能なマーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【００１６】
発現カセットは、転写の５'−３'方向に、転写および翻訳開始領域、本発明のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終了領域を含む。翻訳開始領域であるプロモーターは、宿主細胞に対して、野生型もしくは相同、または外来もしくは非相同であってもよい。「外来」とは、翻訳開始領域を導入する微生物内で翻訳開始領域が発見されなかったことを意味する。
【００１７】
本発明はまた、ポリペプチドを発現させること、および発現されたポリペプチドを任意に戻すことが可能な条件下で、上記ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞の培養物を含む本開示のポリヌクレオチド配列でコードされた、ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体の発現を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、ＧｌｙＤＨ変異体（例えば配列番号１）をコードするポリヌクレオチドだけでなく、ＧｌｙＤＨ変異体をコードする核酸または組換えベクターを含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞が提供される。一実施形態によれば、配列番号１のＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドは配列番号２を含む。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するＧｌｙＤＨポリペプチド変異体が提供される。本発明の様々な実施形態によれば、配列番号３の２４５番目の位置に対応するフェニルアラニンがセリンで置換され（Ｆ２４５Ｓ）、および／または配列番号３の１２１番目の位置に対応するアスパラギン酸がアスパラギンで置換され（Ｄ１２１Ｎ）ようにＧｌｙＤＨポリペプチドが変異（改変）される。一実施形態によれば、ＧｌｙＤＨ変異体は単一アミノ酸置換（Ｆ２４５ＳまたはＤ１２１Ｎ）を有する。他の実施形態によれば、２つのアミノ酸置換（Ｆ２４５ＳおよびＤ１２１Ｎ）を有するＧｌｙＤＨ変異体が提供される。さらに別の実施形態によれば、配列番号１を含むＧｌｙＤＨ変異体またはＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するそのフラグメントが提供される。ある好ましい実施形態によれば、本開示のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体のフラグメントは、全長ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体の少なくとも１つの特性又は活性を保持する。このような特性または活性の例として、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性が挙げられる。本発明の他の実施形態によれば、２４５番目に位置するフェニルアラニンに対応するアミノ酸のセリンと同義のアミノ酸（例えばスレオニン、グリシン、またはアスパラギン）による置換が提供される。配列番号３の１２１番目の位置に対応するアスパラギン酸は、アスパラギンと同義のアミノ酸（例えばグリシン）で置換される。
【００２０】
本発明の他の側面によれば、本開示のＧｌｙＤＨ変異体を含む組成物が提供される。様々な実施形態において、このような組成物は、典型的には、本明細書に開示のＧｌｙＤＨ変異体と組み合わせた緩衝液や他の培養液などの担体を含む。
【００２１】
本発明のさらに別の側面によれば、プロモーターに作用可能に結合した核酸配列の構成的発現を増加させるプロモーターが提供される。この新しく再構築したプロモーター（図５参照）は、構造的に機能するようであり、このプロモーターからの転写レベルは高い（表１：gldAのｍＲＮＡレベル；ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質レベル―図４）。このプロモーターは、Bacillus coagulans（グラム陽性）およびE. coli（グラム陰性）において機能する。「−１０」配列および「−３５」配列は、実質的にE. coliのコンセンサス配列であり、トランスポゾンの挿入によって得られる。ある実施形態によれば、ヌクレオチドcga aaattacacc gagcaagtaa agcacggtag ccgaaagtgt acaaaaagag tgtcttggaa tacccgatat ttaaaccttg tcgagaaaaa cttgacacat acCAAAAATA AGTTATGATG GAATTGTGCT TGTTATATTT TTCAC （配列番号56） or tcgagaaaaa cttgacacat acCAAAAATA AGTTATGATG GAATTGTGCT TGTTATATTT TTCAC（配列番号５６の８４−１４８番目のヌクレオチド）を、非相同遺伝子配列の発現を活発にするために、非相同配列に作用可能に結合させることができる。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
本発明のさらに別の側面によれば、基準となる細菌細胞、真菌細胞、および酵母細胞（本明細書に開示のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体を生成しない細胞）と比較してＤ−乳酸の生成量が増加した（Ｄ−乳酸脱水素酵素活性が上昇した）細菌細胞、真菌細胞、および酵母細胞が提供される。細菌細胞は、グラム陰性細菌でもグラム陽性細菌でもよい。この側面によれば、グラム陰性細菌細胞は、Escherichia属、Zymomonas属、Acinetobacter属、Gluconobacter属、Geobacter属、Shewanella属、Salmonella属、Enterobacter属、およびKlebsiella属からなる群より選択することができる。グラム陽性菌は、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Lactobacillus、Lactococcus、Oenococcus、StreptococcusおよびEubacterialの細胞からなる群より選択することができる。本明細書に開示のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体の発現により、Thermoanaerobes （例えばThermoanaerobacterium saccharolyticum）などの様々な好熱性細菌細胞を乳酸の生成量を増加させるように遺伝子操作することができる。他の好熱性微生物には、Bacillus coagulans株、Bacillus licheniformis株、Bacillus subtilis株、Bacillus amyloliquifaciens株、Bacillus megaterium株、Bacillus macerans株、Paenibacillus spp.などのBacillus spp.またはGeobacillus stearothermophilus株などのGeobacillus spp.が含まれるが、これらに限定されず、遺伝子組換えすることができる。他のBacillus株は、ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）などのカルチャー・コレクション（微生物株保存機関）から入手することができ、本開示の１つまたは複数のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体の発現により乳酸脱水素酵素活性が増加するように遺伝子組換え（１つまたは複数のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドで形質転換）することができる。諸実施形態によれば、特に、野生型の（遺伝子組換えされていない）状態のB. coagulansＱＺ１９株（２０１０年１１月４日、アメリカ合衆国６１６０４イリノイ州ピオリア、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５にあるアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（米国の農業研究サービス機関の系統保存）に、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０４４３として寄託した）は除かれる。
【００２４】
他の実施形態によれば、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性の増加した酵母細胞または真菌細胞が提供される。この酵母細胞は、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、もしくはSchizosaccharomyces、またはKluyveromyces lactis、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis、Saccharomyces oviformis、もしくはYarrowia lipolytica細胞などのYarrowia細胞でもよい。
【００２５】
他の実施形態によれば、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性の増加した細胞は、真菌細胞でもよい。本明細書で使用する「真菌」には、Ascomycota門、Basidiomycota門、Chytridiomycota門、Zygomycota門、およびOomycota門、ならびに、すべての栄養胞子形成菌が含まれる。真菌細胞は、酵母細胞でもよい。本明細書で使用する「酵母」には、有子嚢胞子酵母（Endomycetales）、担子菌酵母、および不完全真菌（Blastomycetes）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来変化する可能性があるので、本発明の目的のために、酵母は「Biology and Activities of Yeast （Skinner、F. A.、Passmore、S. M.、and Davenport、R. R.、eds、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980）」に記載されているとおり定義されるものとする。
【００２６】
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞でもよい。「糸状菌」には、Eumycota亜門およびOomycota亜門（Hawksworthらによる定義、1995、上記分類）のすべての糸状体が含まれる。糸状菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類からなる菌糸壁によって特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化は、偏性好気性である。対照的に、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は発酵性でもよい。
【００２７】
糸状菌宿主細胞は、Acremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Bjerkandera、Ceriporiopsis、Chrysosporium、Coprinus、Coriolus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes、またはTrichoderma 細胞でもよい。例えば、糸状菌宿主細胞は、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Bjerkandera adusta、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、Chrysosporium inops、Chrysosporium keratinophilum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium tropicum、Chrysosporium zonatum、Coprinus cinereus、Coriolus hirsutus、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Phanerochaete chrysosporium、Phlebia radiata、Pleurotus eryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、またはTrichoderma viride細胞でもよい。
【００２８】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む処理により、それ自体が周知の様式で形質転換してもよい。Aspergillus宿主細胞および Trichoderma宿主細胞を形質転換させるための適切な方法は、「EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474」、および「Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422」に記載されている。Fusarium種を形質転換するための適切な方法は、「Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156」、および「WO 96/00787」に記載されている。酵母は、「Becker and Guarente, In Abelson, J. N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York」、「Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163」、および「Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920」に記載されている方法を利用して形質転換してもよい。
【００２９】
本発明の様々な側面によれば、乳酸を生成する方法が提供される。これら側面によれば、周知の細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞は、本明細書に開示のＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドにより形質転換され、Ｄ−乳酸の生成に利用される。様々な実施形態によれば、この方法は、本明細書に開示のＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞を、Ｄ−乳酸の生成を可能にする条件下で培養することを含む。
【００３０】
本明細書で使用する「単離」は、細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞に対して、他の細菌の混入が部分的にまたは完全にないことを指す。単離された細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞（細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞）は、当該単離された細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞（例えば、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性が増加した細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞）の特性や機能に影響しない他の細菌がわずかに存在していたとしても、増殖することができる。単離された細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞は、一般的に、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％純粋である。好ましくは、本発明の単離された細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞は、すくなくとも９８％または少なくとも９９％純粋である。「組換え細胞」は、非相同ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に開示のＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチド）を含む細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞である。
【００３１】
野生型の細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞は、典型的な微生物または株であり、例えば、自然に発生する突然変異のない細菌細胞である。野生型は、自然個体群の中でもっとも頻度の高い表現型を指す。「親細菌株、親真菌株、または親酵母株」、「親細菌株」、「親真菌株」、または「親酵母株」は、所与の細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞の遺伝子型および表現型の参照基準であり、「基準株」または「基準細菌細胞、基準真菌細胞、または基準酵母細胞」と呼ぶこともある。「親細菌株、親真菌株、または親酵母株」は、その用語が使用される文脈に応じて、遺伝子操作されたものでもよく、また「野生型」の細菌細胞でもよい。遺伝子組換え細菌細胞、遺伝子組換え真菌細胞、または遺伝子組換え酵母細胞においてＤ−乳酸脱水素酵素の発現が増加している場合、基準株または基準細菌細胞、基準真菌細胞、もしくは基準酵母細胞は、野生型の細菌細胞、真菌細胞、又は酵母細胞となる。
【００３２】
様々な実施形態によれば、本明細書に開示のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドで形質転換された細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞などの微生物細胞を含む組成物が提供される。これら組成物は、本明細書に開示のＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドで形質転換された特定の微生物細胞に適した培地を含んでもよい。
【００３３】
増加（「increasing」、「increase」、「increased」、または「increases」）という用語は、比活性（例えば、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性の増加またはＤ−乳酸生成量の増加）が少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００％、またはそれ以上増加することを指す。
【００３４】
本発明の様々な側面によれば、Ｄ−乳酸生成のための様々な加水分解物の使用が提供される。加水分解物には、バイオマス、ヘミセルロース・バイオマス、リグノセルロース・バイオマス、またはセルロース・バイオマス由来の加水分解物が含まれるがこれに限定されない。本発明のさらに別の側面によれば、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性が増加した、Ｄ−乳酸を生成する細菌細胞、真菌細胞、または酵母細胞が提供される。
【００３５】
本発明の別の側面によれば、親ポリペプチドと比較して機能が改変されたグリセロール脱水素酵素（ＧｌｙＤＨ）変異体を設計・生成する方法が提供される。本発明はさらに、親ポリペプチドと比較して機能が改変された（例えば、配列番号３の２４５番目に位置するフェニルアラニンに対応するフェニルアラニンが、セリン、グリシン、スレオニン、またはアスパラギンに置換され、および／または配列番号３の１２１番目に位置するアスパラギン酸に対応するアスパラギン酸がアスパラギンまたはグルタミンに置換されるような宿主細胞内における野生型ＧｌｙＤＨポリペプチドの改変または他のＧｌｙＤＨポリペプチドの改変）ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体をコードする核酸を提供する。本発明の様々な側面によれば、ＧｌｙＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞および乳酸を生成する方法も提供される。
【００３６】
本発明の一側面によれば、親ポリペプチドと比較して機能が改変されたＧｌｙＤＨ変異体を設計・生成する方法が提供される。この方法は、一般的に、ａ）ＧｌｙＤＨポリペプチドのライブラリを提供すること、およびアミノ酸配列をアラインすること、ｂ）１つまたは複数のＧｌｙＤＨポリペプチドを選択すること、ｃ）配列番号３の２４５番目に位置するフェニルアラニンに対応するアミノ酸をセリン、グリシン、スレオニン、またはアスパラギンに改変すること、および／または配列番号３の１２１番目に位置するアスパラギン酸に対応するアミノ酸をアスパラギンまたはグルタミンに改変すること、およびｄ）乳酸を生成する能力のために改変されたＧｌｙＤＨポリペプチドを任意に試験すること、を含む。いくつかの実施形態によれば、ＧｌｙＤＨポリペプチドの機能における単一アミノ酸置換（配列番号３の２４５番目の位置に対応するフェニルアラニンまたは１２１番目の位置に対応するアスパラギン酸のどちらか）の個々の効果が決定される。他の実施形態によれば、ＧｌｙＤＨポリペプチドの機能における２個のアミノ酸置換（配列番号３の２４５番目の位置に対応するフェニルアラニンおよび１２１番目に対応するアスパラギン酸の置換）の効果が決定される。
【００３７】
本発明の他の側面によれば、ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体は、親ＧｌｙＤＨポリペプチドと比較して改変された基質特異性および／または改変された活性を有する。特に、ＧｌｙＤＨポリペプチド変異体を利用して、Ｄ−乳酸（Ｄ−乳酸）を生成することができる。本発明の当該側面の一実施形態によれば、Ｄ−乳酸の生成を触媒またはＤ−乳酸脱水素酵素活性を有する配列番号１またはそのフラグメントを含むポリペプチドが提供される。
【００３８】
「含む（comprising）」、「からなる（consisting of）」、および「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語は、その一般的な意味に従って定義される。これら用語は、各用語と関連した具体的な意味を付与するために、本願を通して相互に置換してもよい。「単離された」または「生物学的に純粋」という語句は、ある材料において、天然の状態であればその材料に付随しているのが通常である構成要素が実質的にまたは本質的に含まれていないことを指す。したがって、本発明に係る単離されたペプチドは、in situ環境において当該ペプチドと関連のあるのが通常である材料を含有していないのが好ましい。
【００３９】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示だけを目的としており、それを考慮した様々な改変や変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。さらに、本開示の発明およびその実施形態のいかなる構成要素または限定も、他のいかなる構成要素もしくは限定および／または他のすべての構成要素もしくは限定（個別に、または組み合わせにより）または本開示のいかなる発明もしくはその実施形態と組み合わせることができる。このようなすべての組み合わせは、これに限定されないが、本発明の範囲によって企図される。
【００４０】
本明細書において参照し、または引用したすべての特許、特許出願、仮特許出願、および刊行物は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、すべての図および表を含むその全体が参照として組み込まれる。
【００４１】
以下は、本発明を実施するための方法を示す実施例である。これら実施例は、限定的に解釈されるべきではない。特に断りのない限り、すべての百分率は重量によるものであり、すべての溶媒混合比は体積によるものである。
【００４２】
＜実施例１＞
［材料および方法］
（株およびプラスミド）
本研究で用いる株、プラスミド、およびプライマーの一覧を表２および３に示す。野生株として用いられるB. coagulans 株Ｐ４−１０２Ｂについては既に記載されている（非特許文献１７参照）。プラスミドｐＧＫ１２は、数種のグラム陽性菌およびE. coliにおいて複製され（非特許文献３０および３１参照）、その複製は、必然的に４２℃以下の温度に限定される。プラスミドｐＧＫ１２の複製における温度感受性が５０℃になれば、５０−５５℃で増殖できるB. coagulans の染色体ＤＮＡ成分を選択するための機会がもたらされる。
【００４３】
【表２】
2014530020.tif 000003
【００４４】
【表３】
2014530020.tif 000004
【００４５】
（培地および増殖条件）
増殖条件および発酵条件は、既に記載されている（非特許文献１５、２１〜２３参照）。培養物は、必要に応じて、Ｌ−ブロス（ＬＢ）にて、ｐＨ５．０または７．０の条件下で増殖させた。滅菌グルコースを添加した後、植菌を行った。
【００４６】
（B. coagulansにおける遺伝子欠失）
B. coagulansの欠失変異株の構築は、既に記載されている方法（非特許文献３２参照）に基づいて行った。B. coagulansへＤＮＡを導入するための主要な媒体として、プラスミドｐＧＫ１２を用いて欠失変異株を構築した。３７℃の温度条件下において母集団（１０９ＣＦＵｍｌ−１）内の各細胞にプラスミドが存在することにより、プラスミドＤＮＡのB. coagulansへの形質転換効率の低さが改善され、プラスミドを５０〜５５℃の増殖条件により除外することにより、その母集団における染色体成分は容易に識別された。
【００４７】
（代謝進化）
ｐＨを制御した小さな発酵槽内において所望の条件下で継代培養することにより代謝進化を実施した。増殖が可能な限り、植菌（２％接種；ｖ／ｖ）は１〜３日毎に連続して実施した。
【００４８】
（酵素測定）
培養物は、指数増殖期まで（ｐＨを制御した発酵槽内のＬＢ−グルコース培地において）増殖させ、採取し、既に記載されている酵素測定（非特許文献２３参照）に用いた。特異的硫酸アンモニウム沈殿法およびその後のアニオン交換・疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、ＱＺ１９株が有するグリセロール脱水素酵素を精製した。Ｎ−末端Ｈｉｓタグ酵素として、ＧｌｙＤＨおよびＧｌｙＤＨ＊も精製した（非特許文献３３参照）。ＧｌｙＤＨおよびＬＤＨは、一般的な方法を用いて測定した（非特許文献３４および３５参照）。
【００４９】
（解析方法）
グルコースおよび発酵産物は、既に記載されているＨＰＬＣにより測定した（非特許文献３６参照）。Ｄ−（−）−乳酸およびＬ−（＋）−乳酸の光学異性体は、２ｍＭの硫酸銅（ＩＩ）を移動相として用い、Ｄ−乳酸脱水素酵素（シグマ・ケミカル社、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）を酵素として用いてＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒｅｘ３１２６（Ｄ）ペニシラミン・カラム；１５０×４．６ｍｍ、５μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）により測定した。
【００５０】
（B. coagulansにおける乳酸脱水素酵素遺伝子）
B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂは、典型的には、Ｄ−異性体のレベルが低い（非特許文献１５および１７参照）または検出不能なＬ−乳酸を生成する（表４参照）。関連するB. coagulans株３６Ｄ１（ＧｅｎＢａｎｋ、寄託番号ＣＰ００３０５６）の注釈付きゲノム配列を指針として用い、Ｐ４−１０２Ｂ株におけるＬ−乳酸脱水素酵素（ldh）活性およびＤ−乳酸脱水素酵素（ldhA）活性をコードする相同遺伝子をＰＣＲにより増幅させ、シークエンシングにより確認した。Ｐ４−１０２Ｂ株におけるＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子も、E. coli変異株（ldhA、pflB）の嫌気性増殖の異常を抑制する能力により同定し、その後、対応するクローニングしたldhA遺伝子の配列を決定した。競合経路（図１参照）を阻害するような欠失を有することで、この微生物は、野生型の遺伝子のみを用いてＤ（−）−乳酸またはＬ（＋）−乳酸を生成する可能性を有する。
【００５１】
【表４】
2014530020.tif 000005
【００５２】
（野生型Ｌ−（＋）−乳酸脱水素酵素（ldh）およびアセト乳酸合成酵素（alsS）遺伝子の欠失）
B. coagulans株Ｐ４−１０２Ｂは、ｐＨ５．０の条件下において少量の酢酸塩およびエタノールとともに、主要発酵産物としてＬ−乳酸を生成した（表４、図６参照）。B. coagulansのために開発された方法を用いて、Ｌ（＋）−乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＤＨ）（ＱＺ４株）をコードするldh遺伝子を欠失させることにより、ＮＡＤＨ酸化の主要経路が除外され、増殖速度および糖代謝速度が低下した。しかし、２、３−ブタンジオールの生成量が劇的に増加し、Ｄ（−）−乳酸の生成増加量はわずかであった（表４、図６参照）。ｐＨ７．０の条件下では、関連する３６Ｄ１株のldh変異株ですでに分かっているように（非特許文献２３参照）、主要発酵産物はエタノールであった。
【００５３】
ＱＺ４株は、２、３−ブタンジオールの生成（図１参照）に必須であるアセト乳酸合成酵素（alsS）を欠失させることによりさらに改変した。得られた株（ＱＺ５）は、ｐＨ７．０の条件下でグルコースを急速に代謝し、主要生成物はエタノール、酢酸塩、およびギ酸塩であった（表４参照）。この株およびｐＨ７．０の条件下において、Ｄ−乳酸へのピルビン酸フラックスは、全体のわずか５％であった。しかし、ＱＺ５株は、同じ培地で培養しても、ｐＨ５．０の条件下では嫌気的に増殖しなかった。ｐＨ５．０の条件下におけるＱＺ５株の発酵プロファイルは、増殖を支持するために気相における空気により培養を開始することで決定した。細胞密度の増加により、培地においてＯ２が失われた。これにより、細菌は嫌気性代謝を開始・維持した。Ｏ２制限下でｐＨを５．０に維持したときのＱＺ５株によるグルコース消費の比率（０．９ｍモルｈ−１ｇ細胞−１）は、同様の条件下でｐＨを７．０にして培養した場合（５．９ｍモルｈ−１ｇ細胞−１）の約１５％であった。グルコース消費量およびギ酸塩力価が６分の１程度であること（表４）は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）活性により、ｐＨ５．０の条件下でのＱＺ５株の嫌気性増殖が抑制されていることを示唆する。ＱＺ５株もまた、ＱＺ４株と比較して高いＤ−ＬＤＨ活性を有し、それに対応してldhAのｍＲＮＡが増加した（表１参照）。しかし、ＱＺ５ブロスにおけるＤ（−）−乳酸力価は、培養ｐＨに関係なく約１０ｍＭ程度であった。代謝された１グルコース当たりの乳酸の収量は０．１５未満（１グルコース当たりの理論的収量は２）であった。
【００５４】
二重変異株は多量のギ酸塩およびＰＦＬ活性を示す他の生成物を生成したので、ＰＦＬを欠く三重変異株を構築した。しかし、Ｌ−ＬＤＨ活性、ＡＬＳ活性、およびＰＦＬ活性を欠くこの三重変異株は、試験したすべての条件化において嫌気的に増殖することができなかったので、それ以上検討しなかった。
【００５５】
（増殖に基づく選択によるＤ（−）−乳酸の生成量の増加）
ＱＺ５株において、特にｐＨ５．０の条件下で、ＮＡＤＨ酸化の不適切な経路により、糖代謝、ＡＴＰ生成、および嫌気性増殖が制限されたのは明らかである。（表４、図１参照）。ＱＺ５株により生成されるＤ（−）−乳酸のレベルを増加させることにより、二重変異株の嫌気性増殖のレベルをＬ（＋）−乳酸を生成している間の親株と同様のレベルまで回復することが期待される。増殖に基づく代謝進化は、有利な突然変異を選択するための強力なツールであるが（非特許文献２４参照）、選択が適切に行われるように設計する必要がある。ＱＺ５株は、ｐＨ５．０の条件下でＰＦＬ活性が低い生成物を生成した。この活性は、ブロスにおけるギ酸塩の相対濃度により測定される（表４参照）。ｐＨ５．０の条件下で嫌気性増殖するこの株の代謝進化により、Ｄ−乳酸の生成の増加を副選択する経路が提供される。
【００５６】
ＬＢ＋グルコース培地において、ｐＨ５．０の条件下でＱＺ５株に発酵を行わせ、高い細胞収率の株を１１３日間にわたり選択したところ、代謝進化により増殖率が増加した変異体が生産された。この株（ＱＺ１３）の細胞収率はＱＺ５株の細胞収率より高く、Ｄ−（−）−乳酸の生成量は約２０倍に増加した（表４、図７参照）。Ｄ−乳酸の収率および力価をさらに増加させるために、ＬＢ＋グルコース培地にＣａＣＯ３を添加してｐＨ７．０の条件下でＱＺ１３株に発酵を行わせることにより代謝進化させた。培地にＣａＣＯ３を添加することにより、B. coagulansの発酵における乳酸生成の抑制を克服できることおよび流加発酵において力価を２Ｍに近づけられることが既に示されている（非特許文献２２参照）。固体のＣａＣＯ３は、ｐＨ５．０よりもｐＨ７．０の条件下で培地のｐＨをよく中和するので、ｐＨ７．０の条件下でさらに代謝進化させた。４２日間の選択の後、ＱＺ１４株を単離し、試験を実施した。ＱＺ１４株において、Ｄ（−）−乳酸は、総発酵産物の９０％以上を示し、発酵グルコースの収率は８８％であった（表４参照）。
【００５７】
グルコース濃度を増加させながら（図７および８参照）、ｐＨ７．０の条件下でさらに６０日間植菌を連続して実施した後、ＱＺ１５株を単離した。ｐＨ７．０の条件下におけるＱＺ１５株のＤ（−）−乳酸の７２時間後の力価はほぼ１Ｍであった（表４参照）。１００ｇＬ−１（０．５６Ｍ）のグルコースを用いてＱＺ１５株の代謝進化を継続させたところ、乳酸へのグルコースフラックスがさらに増加した。植菌開始６３日後に、ＱＺ１９株を単離した（図８参照）。ＱＺ１９株は、ｐＨ７．０の条件下において４８時間で約１．０ＭのＤ（−）−乳酸を生成した（表４参照）。ｐＨ５．０におけるＱＺ１９株によるグルコースの発酵は、少し間をおいて開始した（図２参照）。７２時間後の乳酸の力価は１．１Ｍであった。高レベルの乳酸を生成するＱＺ１５株およびＱＺ１９の発酵ブロスにおいて、ギ酸塩は検出されなかった。これら株はギ酸ヒドロゲンリアーゼ活性を欠くので、ギ酸塩はＰＦＬ活性の指標となる。ＱＺ１９株が生成した少量のエタノールおよび酢酸塩（グルコース炭素の５％未満）は、おそらくピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によって生成されたアセチルＣｏＡに由来する（非特許文献２５参照）。
【００５８】
これら結果は、ldh遺伝子およびalsS遺伝子の欠失と代謝進化との組み合わせにより、B. coagulansの主要発酵産物が、Ｌ（＋）−乳酸からＤ（−）−乳酸に改変されたということを示す。pfl遺伝子は依然として存在し、ＱＺ４株（総ＲＮＡの約１．２ｎｇｍｌ−１）と同程度にＱＺ１９株内で転写されるものの、ＰＦＬを通したグルコースフラックスは、発酵ブロスにおいてギ酸塩が存在しないことから分かるように、最小であった。これは、増殖に基づく選択による、ＰＦＬを通したピルビン酸のアセチルＣｏＡへの代謝フラックスに置き換わったＤ−乳酸への代謝フラックスの増加の影響であることは明らかである（表４参照）。
【００５９】
（Ｄ−乳酸生成ＱＺ１９株の発酵特徴）
ＱＺ１９株は、グルコースの流加発酵においてｐＨ５．０の条件下で、ほぼ２ＭのＤ−乳酸を生成した（図９参照）。この流加発酵において、１００ｇＬ−１（０．５６Ｍ）のグルコースが最初に発酵されたのは５０時間後であり、乳酸生成率はこの期間において一定であったが、次に１００ｇＬ−１（０．５６Ｍ）のグルコースが発酵されたのはさらに７２時間を要した。ＱＺ１９株はまた、少し遅れて、キシロースをＤ−乳酸に発酵した。７２時間で約８０ｇＬ−１（０．５３Ｍ）のキシロースが９０％の重量収率でＤ（−）−乳酸に変換された（図１０参照）。
【００６０】
（ＱＺ１９株によるセルロースのＤ−乳酸への同時糖化発酵（ＳＳＦ））
乳酸生成のための微生物生体触媒としてB. coagulansを用いると、高い活動温度および低いｐＨのためにセルロースの乳酸へのＳＳＦにおけるセルラーゼ酵素負荷を低減させる点で有利である。高い活動温度および低いｐＨは、商用セルラーゼ活性の最適条件（５０℃およびｐＨ５．０）に適合する（非特許文献１４および１５参照）。ＱＺ１９株は、結晶セルロースを原料として、約７．５ＦＰＵで、Ｄ−乳酸に対する最大の容積生産性に到達した（ｇセルロース）−１（図３参照）。この酵素負荷により、４０℃における典型的な乳酸菌 Lactococcus lactisの生産性は、ＱＺ１９株の１／３に過ぎなかった。これら結果は、改変されていないB. coagulans による最適なＬ−乳酸生成に対する、他の乳酸菌と比較して低いセルラーゼ要求性に関する過去の研究と一致している（非特許文献２１参照）。ＱＺ１９株は、セルロースのＤ−乳酸へのＳＳＦにより適しており、この食品でない炭水化物の費用対効果の高い代謝のために必要なセルラーゼのレベルがかなり低い。
【００６１】
（ＱＺ１９株におけるＤ（−）−ＬＤＨ活性の起源としてのグリセロール脱水素酵素の識別）
ＱＺ１９株の無細胞抽出物は、D（-）-乳酸脱水素酵素活性（タンパク質１ｍｇ当たり０．２ｕｎｉｔ）を有していたが、野生型B. coagulansは検出可能なＤ−ＬＤＨ活性を有していなかった（表１参照）。観察されたＱＺ１９株におけるＤ−ＬＤＨ活性はＱＺ５株と比較して３０倍に増加していたが、これはＤ−ＬＤＨをコードしていることが同定されたldhA遺伝子のｍＲＮＡの１．３倍の増加と相関はなかった。異常に高いＤ−乳酸脱水素酵素活性の原因となりうる、Ｄ−ＬＤＨタンパク質における突然変異の可能性を特定するために、Ｐ４−１０２Ｂ株およびＱＺ１９株のldhAおよびその付近に位置するＤＮＡの配列を決定した。しかし、どちらの配列も同一であった。これにより、Ｄ−ＬＤＨをコードするldhAは、ＱＺ１９株においてＤ（−）−乳酸生成が大幅に増加した原因ではないことが示された。ldhAの単一コピーもまたＱＺ１９株およびＰ４−１０２Ｂ株の染色体において発見された。これにより、Ｄ（−）−乳酸生成の原因としての遺伝子重複の可能性が排除された。この結論はさらに、ＱＺ１９株のldhAのｍＲＮＡレベルと、その進化前の親株であるＱＺ５株のldhAのｍＲＮＡレベルが同程度であることにより支持される（表１参照）。これら株におけるldhAのｍＲＮＡレベルが野生型のものと比較して高いことは、株ＱＺ５及び他の進化株が少量のＤ（−）−乳酸を生成する説明となり得るが、ＱＺ１９株で観察される高いＤ−乳酸力価および収率を説明することにはならない。ＱＺ１９株におけるldhAのｍＲＮＡ（Ｄ−ＬＤＨ）のレベルは、最高でも親株における主要な発酵経路であるＬ（＋）−ＬＤＨをコードするldhのｍＲＮＡのレベルの約１０％に過ぎなかった（図１、表１参照）。これら結果により、Ｄ−ＬＤＨ活性を有する他の酵素がＱＺ１９株に存在し、高いＤ−乳酸力価に貢献していることが示唆される。
【００６２】
ＱＺ１３株からＱＺ１９株までの無細胞抽出物は、豊富なタンパク質（見かけの分子量は３７ＫＤａ）を含有していた。このタンパク質は、野生株Ｐ４−１０２Ｂおよび進化前のＱＺ５株には含まれていなかった（図４参照）。これら株の抽出物において、算出されたこのタンパク質の含量は総蛋白の１１％であった。Ｄ−ＬＤＨ活性を有するタンパク質を、ＱＺ１９株から精製した。精製したタンパク質の分子量は３７ＫＤａであり、進化株で新しく発見された豊富なタンパク質と同程度であった。Ｄ−ＬＤＨ活性を有するこのタンパク質をトリプシン分解した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりフラグメントを分離して同定した。生成された２２個のペプチドのうち９個は、比較配列解析によりグリセロール脱水素酵素（gldA）と同定されたB. coagulans株３６Ｄ１ゲノム（Ｂｃｏａ＿１９１９；寄託番ＡＥＰ０１１０６．１）におけるタンパク質から予測されたトリプシン・ペプチドと同一であった（非特許文献２６及び図１１参照）。B. coagulans株３６Ｄ１のgldA遺伝子配列に基づいてＰ４−１０２Ｂ株およびＱＺ１９株のgldA遺伝子を増幅し、クローニングし、配列決定した。ＱＺ１９株の gldA遺伝子は、野生型の遺伝子と比較してＧ３６１ＡおよびＴ７３４Ｃという２つの突然変異を有していた。これら２つの突然変異により、Ｄ１２１ＮおよびＦ２４５Ｓというアミノ酸変化が引き起こされた。対立遺伝子をgldA101と指定し、そのタンパク質をＧｌｙＤＨ＊と指定した（図１２参照）。コード領域におけるこれら２つの突然変異に加えて、１，８２１ｂｐのＤＮＡフラグメントが、ＱＺ１９のgldA遺伝子上流の（ＡＴＧの「Ａ」を＋１番目として）−６２番目の位置に挿入されていることが発見された（図５参照）。この挿入において２つのＯＲＦ（アミノ酸長は１０３および２３２）が同定され、両者はLactobacillus helveticus株Ｈ１０の推定トランスポーゼース（ＩＳＬｈｅ１５）が類似していた（25%の同一性および48%の類似性）（非特許文献２７参照）。
【００６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける３７ＫＤａのタンパク質に対応するＱＺ１９株の精製タンパク質は、グリセロール酸化活性およびピルビン酸還元活性を有していた。ＧＤＨ活性（グリセロールのジヒドロキシアセトンへの酸化）は、タンパク質１ｍｇ当たり１．２ｕｎｉｔｓ（μモルｍｉｎ−１）であり、ピルビン酸のＤ−乳酸への還元活性は、タンパク質１ｍｇ当たり０．８ｕｎｉｔであった。組換E. coliから生成された野生型の酵素は、タンパク質１ｍｇ当たり、７．１ｕｎｉｔｓのＧｌｙＤＨ活性および０．０１ｕｎｉｔのＬＤＨ活性を有していた。これら結果は、ＱＺ１９株の代謝進化の間に生じた２つの突然変異により、B. coagulansゲノム内のＧｌｙＤＨがＤ−ＬＤＨ活性を取得したということを示唆している。このタンパク質の高レベルの発現は、遺伝子上流へのトランスポゾンの挿入によるものであることは明らかである。
【００６４】
（ＱＺ１９株のＧｌｙＤＨ＊によるE. coliにおけるＤ−ＬＤＨ活性）
ＱＺ１９株におけるgldA101対立遺伝子がＤ−ＬＤＨ活性をコードしていることを確認するため、この遺伝子をＱＺ１９株（プラスミドｐＱＺ１１５）から複製し、E. coli株ＡＨ２４２に導入した。E. coli 株ＡＨ２４２は、ldhAおよびpflBにおける突然変異により、解糖により生成されたＮＡＤＨを酸化する能力を喪失し、嫌気要求性となっている（非特許文献２５参照）。ＡＨ２４２株の嫌気性増殖能は、Ｄ（−）−乳酸を発酵産物とするプラスミドｐＱＺ１１５により回復した。ＧｌｙＤＨ＊のＣ−末端の１０個のアミノ酸を欠くプラスミドｐＱＺ１０９を有するＡＨ２４２株は、嫌気的に増殖しなかった。これは、この短縮されたタンパク質がＤ−ＬＤＨ活性を欠いていることを示す。これら結果により、B. coagulans株ＱＺ１９のＧｌｙＤＨ＊がＤ（−）−ＬＤＨ活性を有するということが裏付けられた。
【００６５】
株ＱＺ１９のgldA101はＤ−ＬＤＨ活性を有するタンパク質をコードしていることをさらに確認するために、この遺伝子を株ＱＺ１９（プラスミドｐＱＺ１１３）から複製し、Ｎ−末端Ｈｉｓタグを付された組換えE. coli内で発現させてタンパク質を精製した。組換えＧｌｙＤＨ＊は、ＧｌｙＤＨ活性およびＤ−ＬＤＨ活性も有していた。グリセロールおよびＮＡＤ＋を有するこの酵素の比活性は、タンパク質１ｍｇあたり０．６８ｕｎｉｔであった。ピルビン酸およびＮＡＤＨを基質として用いると、（ＬＤＨ反応）、このタンパク質の比活性は、１ｍｇ当たり６．９ｕｎｉｔｓと予想外に高く、反応産物は、ＨＰＬＣにより、Ｄ−乳酸と同定された。逆反応において、この酵素はＤ（−）−乳酸およびＮＡＤ＋を基質とした場合のみ活性であった（比活性はタンパク質１ｍｇ当たり０．１７ｕｎｉｔ）。Ｌ（＋）−乳酸を基質とした活性は、検出不能であった。
【００６６】
これら結果は、ＱＺ５株の代謝進化の間に、野生型のＧｌｙＤＨがＤ−ＬＤＨ活性を取得したということを示す。野生型のB. stearothermophilusのＧｌｙＤＨは、ＬＤＨ活性を欠くことが報告されており（非特許文献２８参照）、これと一致して、組換えE. coliから精製された野生型B. coagulansのＧｌｙＤＨのＬＤＨ活性は、ＧｌｙＤＨ活性の０．１５％未満であった。
【００６７】
（Ｄ−乳酸生成株におけるＤＮＡの挿入によるgldA転写の増加）
酵素のＤ−ＬＤＨとしての進化に加えて、ＱＺ１９株におけるgldA101の発現のレベルは、本研究において解析した遺伝子の中で最も高かった（表１参照）。転写の増加は、進化株におけるgldA101の発現のための強力なプロモーターに影響するgldA101遺伝子上流への１，８２１ｂｐのＤＮＡ挿入によるものであることは明らかである（図５参照）。
【００６８】
シャイン・ダルガノ（GGAG）および−１０領域（TATGAT）に対応するコンセンサス配列は、野生型のgldA遺伝子の上流にあるＤＮＡにおいて特定することができるものの、対応する−３５領域は識別することができなかった。６塩基対のステムおよび１１塩基対のループを有する逆方向反復配列が予測された−３５領域において発見され、野生型の細菌においてこの遺伝子の発現が最高でも中程度のものにすぎないことが示唆された。ＱＺ１９株におけるgldA遺伝子の上流領域に１，８２１ｂｐ配列を挿入することで、−３５領域コンセンサス配列をgldAに導入した（図５参照）。ＱＺ１９株におけるgldA遺伝子およびＧＤＨ＊タンパク質の高レベルの発現（表１参照）は、ＱＺ１３株および強力なプロモーターを生産するその変異体におけるgldA上流領域の再生によるものであるのは明らかである。
【００６９】
（ＱＺ１９株におけるＤ−乳酸生成への進化経路）
B. coagulans株ＱＺ５から約４８時間で９０ｇ以上のＤ−乳酸を生成したＱＺ１９株への進化経路において、重大なイベントが３つ生じたのは明らかである。すなわち、ＧｌｙＤＨにおける２つの突然変異（Ｄ１２１ＮおよびＦ２４５Ｓ）、ならびに挿入によるｇｌｄＡ１０１のプロモーター構造における変化の３つである。進化経路における様々な中間体株のＤＮＡ配列解析により、ＱＺ１３株においてトランスポゾンＤＮＡが初めて挿入されたことが明らかになった。これは、ＱＺ１３株および当該株の他の変異体におけるgldAのｍＲＮＡレベルおよびＧｌｙＤＨ活性のレベルの上昇と一致している。ＱＺ１３株におけるgldAのｍＲＮＡレベルおよびＧｌｙＤＨ活性のレベルは、ＱＺ５株のそれぞれ約１００倍および５０倍以上である（表１参照）。ＱＺ１３株におけるＧｌｙＤＨ活性が高いことにより、Ｄ−ＬＤＨ活性もわずかに上昇した。しかし、当該株におけるＤ−ＬＤＨ活性とＧｌｙＤＨ活性との比率は、０．００３に過ぎなかった。これは、依然として、ＧｌｙＤＨがＤ−ＬＤＨ活性を著しく欠いていることを示唆している。gldAの転写が増加した後、最初のＧｌｙＤＨ変異（Ｆ２４５Ｓ）がＱＺ１５株において検出された。この変異により、Ｄ−ＬＤＨ／ＧｌｙＤＨ比率が約７倍の０．０２へと増加した（表１参照）。次の突然変異（（Ｄ１２１Ｎ）は、ＱＺ１５株からＱＺ１９株への進化の間に生じた。この変異により、Ｄ−ＬＤＨ／ＧｌｙＤＨ比率は約１０倍の０．２２に増加した。なお、Ｄ−ＬＤＨ活性の増加により、酵素はＧｌｙＤＨ活性の一部を喪失した。ＱＺ１９株における２つの突然変異による酵素のＤ−ＬＤＨ活性の増加（ＱＺ１４に対して約１０倍）により、ＧｌｙＤＨ活性はＱＺ１４株の約７分の１に低下した（表１参照）。このタンパク質バンドは依然として総蛋白の約１１％を占めるので、ＱＺ１９株の抽出物におけるＧｌｙＤＨ活性の喪失が、当該細胞におけるタンパク質レベルが低いことによるものでないことは明らかである（図４参照）。
【００７０】
ＱＺ１９株のＧｌｙＤＨにおける突然変異は、ＮＡＤ＋のニコチンアミド環がB. stearothermophilus の酵素に結合する深いポケットを構成する９個の必須アミノ酸のうち２個において生じた（非特許文献２９参照）。B. coagulansのＧｌｙＤＨのモデルもまた、変異したアミノ酸を末端に有する酵素の２つのドメイン間の深い裂け目を示す（図１３参照）。グリセロールＣ１およびＣ３は、Ｐｈｅ２４７のベンジル環によるファンデルワールス相互作用によりB. stearothermophilusのＧｌｙＤＨにおいて安定化することが報告されている。B. coagulansのＧｌｙＤＨの対応するＰｈｅ２４５をセリンに変化させることにより、この相互作用が喪失されることが予想される。その結果、ＱＺ１９株から当該酵素のグリセロール酸化活性の還元が観察された。ピルビン酸がグリセロールＣ１およびＣ２と相互作用することにより、Ａｓｎ１２１およびＳｅｒ２４５は活性部位においてピルビン酸を安定化させると考えられる（図１３参照）。その結果、ＬＤＨ活性が観察された。
【００７１】
これら結果は、２つの突然変異によりgldAの発現レベルが増加したことおよびＧｌｙＤＨがＤ−ＬＤＨ活性を取得したことが、B. coagulans株ＱＺ１９による発酵におけるＤ−乳酸力価が増加した原因であるということを示している（表４参照）。
【００７２】
（野生型および変異された様々なB. coagulansのグリセロール脱水素酵素の生化学的特性）
D-乳酸生成 B. coagulans 変異株（QZ19株）を開発している間に、２つの突然変異（Ｄ１２１ＮおよびＦ２４５Ｓ）を有するグリセロール脱水素酵素（ＧＤＨ）は、ピルビン酸のＤ−乳酸への還元を触媒するように進化した（表４および図７参照）。かなり高い力価のＤ−乳酸を生成した最初の変異体であるＱＺ１５株は、２４５番目に位置するアミノ酸であるフェニルアラニンがセリンに変化した単一突然変異を有していた。ＱＺ１５の中でも乳酸の生成量が多いものが選択された結果、ＧＤＨタンパク質は、１２１番目のアミノ酸において第２の突然変異を取得した（Ｄ１２１Ｎ）（図１５参照）。これら２つの突然変異の組み合わせにより、ＱＺ１９株は、ｐＨを制御した発酵により、ｐＨ５．０および５０℃の条件下において４８時間で約１００ｇ／Ｌの力価のＤ−乳酸を生成するようになった。ピルビン酸のＤ−乳酸への還元の触媒作用において、これら２つの突然変異のぞれぞれの役割を評価するために、２つの置換（Ｄ１２１ＮまたはＦ２４５Ｓ）のどちらかを有するＧＤＨ／ＬＤＨ酵素およびこれら２つの置換を有するＧＤＨ／ＬＤＨ酵素をE. coliにおいて発現させ、精製して、その生化学的特性を判定した。
【００７３】
野生型のＧＤＨは、５５℃の条件下において約２２．５ｕｎｉｔ（μモルｍｉｎ−１．ｍｇタンパク質−１）の比活性でグリセロールを酸化した（表５参照）。この酵素の比活性は、室温の約８．６ｕｎｉｔから活性最適温度である５５℃の２２．５ｕｎｉｔに増加した。５５℃は、B. coagulansの最適増殖温度でもある。野生型の酵素のＧＤＨ活性は、約２０ｍＭのグリセロールで飽和した。これは１１．７ｍＭのグリセロールの酵素の見かけのＫｍと一致している（図１６、表６参照）。
【００７４】
【表５】
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【００７５】
【表６】
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【００７６】
野生型の酵素はまた、他のいくつかの基質も酸化した（表５参照）。エタン−１、２−ジオールおよびプロパン−１、２−ジオールとの活性のレベルは、グリセロールとの活性よりも著しく低かったものの、２、３−ブタンジオールとの比活性は、グリセロール酸化率のほぼ２倍高かった。１、２−ブタンジオールおよび１、３−ブタンジオールもまた、野生型の酵素に対する基質としての役割を果たしていた。これら結果は、B. coagulansのＧＤＨ酵素は、広い基質特異性を有するということを示唆する。この酵素はピルビン酸還元活性（Ｄ−ＬＤＨ）を示すものの、当該活性は、グリセロール酸化活性（ＬＤＨ活性のＧＤＨ活性に対する比率は０．０１３）より１．５％低かった。ピルビン酸還元に加えて、この酵素は、ほんのわずかであるが検出可能なレベルの（２−ヒドロキシ酪酸への）２−ケト酪酸還元活性も有していた。この酵素のピルビン酸還元活性が低いことは、ピルビン酸に対する見かけのＫｍ（１Ｍ；グリセロールに対する活性の約１００倍）が非常に高いことに起因している可能性がある（表６参照）。野生型の酵素は、ＮＡＤＨを利用したピルビン酸還元よりも、電子受容体としてのＮＡＤ＋によるグリセロール酸化において約１０００倍効率的である。
【００７７】
ＱＺ５株の変異株であるB. coagulans株ＱＺ１５は、５５℃の温度条件下でグルコースを発酵し、７２時間で約８０ｇ／ＬのＤ−乳酸を生成した。この株におけるＧＤＨは、２４５番目の位置におけるアミノ酸変異を有し、すなわちフェニルアラニンがセリンに置換されている（図７参照）。この変異により、ＬＤＨのＧＤＨに対する比率が、ＧＤＨ活性における還元が最小である野生型の酵素の０．０１から０．１６へと大幅に変化した（表５、図１５参照）。重要なピルビン酸還元活性（ＬＤＨ）（図１６参照）を取得したのに加えて、このＦ２４５Ｓ変異酵素も、基質としての１、２−プロパンジオールおよび１、２−ブタンジオールとの活性が野生型の酵素に比較して高かった（表５参照）。Ｆ２４５Ｓ変異酵素のＧＤＨ活性およびＬＤＨ活性における違いは、グリセロールに対する見かけのＫｍの増加（野生型の酵素の１１．７ｍＭに対して７８．６ｍＭ）およびピルビン酸に対する見かけのＫｍの低下（野生型の酵素の０．２３Ｍに対して１．０Ｍ）に起因している可能性がある（表６）。
【００７８】
B. coagulans株ＱＺ１５の選択に基づくさらなる増殖および発酵により、ＱＺ１９株が得られた。ＱＺ１９株は、ｐＨ５．０および５５℃の条件下において４８時間で約１００ｇ／ＬのＤ−乳酸を生成した。この株のＧＤＨ酵素は、Ｆ２４５Ｓに加えて、第２の突然変異であるＤ１２１Ｎを有する。Ｄ１２１Ｎ変異のみを有するＧＤＨは、グリセロールおよび試験した他のジオールに対する活性が著しく低かった（表５参照）。グリセロールに対する見かけのＫｍがわずかに上昇したのは、比活性が約７分の１に減少した理由とはならなかった（表６参照）。Ｄ１２１Ｎ変異により、グリセロール酸化活性は減少したものの、この変異は、酵素のピルビン酸還元活性（Ｄ−ＬＤＨ）において検出可能な効果を有さず、この還元活性は野生型の酵素における還元活性と同等であった。
【００７９】
グリセロールおよび他のジオールの酸化におけるＤ１２１Ｎ変異の悪影響は、たとえこの変異がＦ２４５Ｓ変異酵素に導入されたとしても保持される。これら変異（Ｆ２４５ＳおよびＤ１２１Ｎ）を有する酵素のＬＤＨ／ＧＤＨ活性比は、野生型の酵素のＬＤＨ／ＧＤＨ活性比が０．０１であったのに対して、約１．８であった（表５参照）。Ｄ１２１Ｎ変異により、ピルビン酸に対する見かけのＫｍも減少した。すなわち、Ｆ２４５Ｓ変異のみを有する酵素のＫｍは２３１ｍＭであったが、Ｆ２４５ＳおよびＤ１２１Ｎを有する酵素のＫｍは５１ｍＭであった（表６参照）。これはおそらく、ピルビン酸を基質とした高い触媒効率の主要な原因である。これら結果は、Ｄ−ＬＤＨ生成のために開発されたＱＺ１９株において、酵素がＤ−ＬＤＨとして機能するためにこれら変異が必須であるということを示している。Ｄ１２１Ｎ変異はタンパク質のＧＤＨ活性を著しく低下させたものの、Ｆ２４５Ｓ変異により酵素のＤ−ＬＤＨ活性が増加した。これにより、Ｄ−ＬＤＨ活性がさらに増加した。
【００８０】
B. coagulansのＧＤＨアミノ酸配列と４７％同一であるGeobacillus stearothermophilusのGDHの結晶構造（非特許文献２９参照）に基づいて、１２１番目の位置のアスパラギン酸はグリセロールのＣ２位置における酸素と水素結合を構成する。グリセロールのＣ２位置における第２級アルコール（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）は、グリセロールのジヒドロキシアセトンへの酸化において、Ｃ＝Ｏに酸化されるものである。アスパラギン酸をアスパラギンと置換することにより、基質グリセロールとの相互作用を最小限に抑えたと考えられる。また、２４５番目の位置におけるフェニルアラニンは、グリセロールのＣ１およびＣ３と相互作用することが予想され、一方、Ｃ２−ＯはＤ１２１と相互作用する。フェニルアラニンをセリンと置換することにより、この酵素の基質グリセロールとの相互作用を最小限に抑えることができた。これは、これら様々な変異酵素において観察された見かけのKmが高いことの原因となりうる。しかし、これら結果からは、Ｆ２４５Ｓのみ、またはＦ２４５ＳとＤ１２１Ｎが基質としてのピルビン酸とＧＤＨ酵素との相互作用を支持するであろうということ、および変異酵素がＤ−ＬＤＨとして機能するであろうことは予測できない。
【００８１】
これらの結果は、野生型の酵素が、実際には、広い基質特異性を有するポリオール脱水素酵素であるということを示唆している。様々な短鎖ジオール類を有するＦ２４５Ｓ酵素の高い活性と好熱性（最適温度は５５℃）とを組み合わせることにより、立体選択性を有する対応するケトン類に対する様々なジオール類およびポリオール類の生物変換においてこれら酵素は有用なものとなった。例えば、１、３−ブタンジオールは、商業的関心がある医薬品中間体の候補である４−ヒドロキシ−２−ブタノンに酸化することができる。４−ヒドロキシ−２−ブタノンは現在、化学工業により生産されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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