(57)【要約】細胞を含む流体サンプルから回収された標的細胞の数を増大させるための方法および材料が、記載される。上記方法は、上記標的細胞をフィルタの上に単離する工程、次いで、上記標的細胞を含むフィルタを免疫不全非ヒト動物に移植する工程を包含し、ここで上記標的細胞の少なくとも一部は、増殖し得る。このような方法は、稀な循環細胞（例えば、末梢血サンプルから回収されたＣＴＣ）の数を増大させ、そして例えば、患者の腫瘍を評価し、上記細胞の転移能を評価し、異なる化学療法剤に対する上記細胞の応答性を決定するために使用され得る上記患者の腫瘍の個別化された動物モデルを作るために使用され得る。
2014526251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む流体サンプルから標的細胞の数を増大させる方法であって、該方法は：
ａ）１つまたはそれより多い標的細胞を含むフィルタを提供する工程であって、該１つまたはそれより多い標的細胞は、流体、標的細胞および非標的細胞含有サンプルから、該フィルタを含む濾過デバイスを介して該サンプルを通過させることによって得られ、ここで該フィルタにおける孔サイズは、該標的細胞を該フィルタ上もしくは該フィルタ中に保持するものである、工程；ならびに
ｂ）該フィルタおよび該フィルタ上の該１つまたはそれより多い標的細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植する工程であって、ここで移植される該フィルタ上もしくは移植される該フィルタ中の該１つまたはそれより多い細胞のうちの一部もしくは全ては、該免疫不全動物中で増殖する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記濾過デバイスを介して前記サンプルを通過させる間に、実質的に全ての前記非標的細胞は、前記フィルタを通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫不全非ヒト動物は、マウスである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マウスは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）自然変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）に関してホモ接合性であるか；ヌード自然変異（Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）に関してホモ接合性であるか；Ｒａｇ１変異に関してホモ接合性であるか；Ｒａｇ２変異に関してホモ接合性であるか；またはＲａｇ１変異およびＲａｇ２変異の両方に関してホモ接合性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、１〜４つのさらなるフィルタを提供する工程であって、該さらなるフィルタの各々は、１つまたはそれより多い標的細胞を含む、工程、および該第１のおよびさらなるフィルタを前記免疫不全非ヒト動物に移植する工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１〜４つのさらなるフィルタは、１つのさらなるフィルタである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１〜４つのさらなるフィルタは、２つのさらなるフィルタである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のおよびさらなるフィルタは、単一の濾過デバイスから得られたものである、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第１のおよびさらなるフィルタは、別個の濾過デバイスから各々得られたものである、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、前記フィルタおよび該フィルタ上の前記１つまたはそれより多い標的細胞を移植する前に、該フィルタを互いの上部に実質的に重ねて、多層化培養デバイスを生成する工程をさらに包含する、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、前記フィルタおよび該フィルタ上の前記１つまたはそれより多い標的細胞を移植する前に、該フィルタおよび該標的細胞を含む任意のさらなるフィルタの表面と、該標的細胞に対して致死的効果も毒性効果もなく、液体からゲル相へと移行し得る組成物とを接触させる工程をさらに包含する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、１種以上の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、再構成基底膜を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィルタは、該フィルタに固定化された１種以上の化合物を含む、請求項１〜４または１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなるフィルタは、該さらなるフィルタに固定化された１種以上の化合物を含む、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
１種以上の化合物は、前記免疫不全動物に投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記１種以上の化合物は、増殖因子、細胞外マトリクスタンパク質、酵素、レポーター分子、リポソーム、および核酸からなる群より選択される、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、もしくはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞外マトリクスタンパク質は、コラーゲン、ラミニン、ラミニン、フィブロネクチン、もしくはヘパラン硫酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター分子は、メタロプロテイナーゼの基質であるフルオロフォア−クエンチャー二重標識プローブを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、前記免疫不全動物における前記細胞の増殖をモニターする工程をさらに包含する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記流体、細胞含有サンプルは、末梢血細胞を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記流体、細胞含有サンプルは、尿、骨髄、リンパ、リンパ節、脾臓、脳脊髄液、管流体、生検標本、もしくは針生検吸引物に由来する細胞を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法は、前記移植する工程の前に、前記１つまたはそれより多い標的細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的細胞は、癌細胞である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的細胞は、循環癌細胞である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的細胞は、胎児細胞である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的細胞は、幹細胞である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的細胞は、内皮幹細胞もしくは間葉系幹細胞である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの移植されたフィルタを含む非ヒト免疫不全動物であって、該フィルタは、該フィルタを含む濾過デバイスを介して通過させることによって、流体、標的細胞および非標的細胞含有サンプルから得られる複数の標的細胞を含み、ここで該フィルタにおける孔サイズは、該標的細胞を該フィルタ上もしくは該フィルタ中に保持するものである、非ヒト免疫不全動物。
【請求項３１】
前記動物は、１〜４つのさらなる移植されたフィルタをさらに含み、該さらなるフィルタの各々は、１つまたはそれより多い標的細胞を含む、請求項３０に記載の動物。
【請求項３２】
前記１〜４つのさらなるフィルタは、１つのさらなるフィルタである、請求項３１に記載の動物。
【請求項３３】
前記１〜４つのさらなるフィルタは、２つのさらなるフィルタである、請求項３１に記載の動物。
【請求項３４】
前記第１のおよびさらなるフィルタは、単一の濾過デバイスから得られたものである、請求項３１〜３３のいずれかに記載の動物。
【請求項３５】
前記第１のおよびさらなるフィルタは、各々別個の濾過デバイスから得られたものである、請求項３１〜３３のいずれかに記載の動物。
【請求項３６】
前記第１のおよびさらなるフィルタは、多層化三次元培養デバイスを生成するために互いの上部に実質的に重ねられる、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の動物。
【請求項３７】
前記フィルタおよび前記標的細胞を含む任意のさらなるフィルタの表面は、該標的細胞に対して致死的効果も毒性効果もなく、液体からゲル相へと移行し得る組成物を含む、請求項３０または請求項３５に記載の動物。
【請求項３８】
前記標的細胞は、ヒト標的細胞である、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の動物。
【請求項３９】
試験細胞を含む流体サンプル中で腫瘍細胞の存在について試験する方法であって、該方法は：
ａ）フィルタを含む濾過デバイスを介して通過させることによって、流体、試験細胞含有サンプルから得られた複数の試験細胞を含む該フィルタを提供する工程であって、ここで該フィルタにおける孔サイズは、該試験細胞のうちの１つまたはそれより多くを該フィルタの上でもしくは該フィルタの中で保持するものである、工程；
ｂ）該フィルタおよび該フィルタの上もしくは該フィルタの中の該試験細胞のうちの１つまたはそれより多くを、免疫不全非ヒト動物に移植する工程；ならびに
ｃ）該免疫不全非ヒト動物を腫瘍の存在もしくは非存在に関してモニターする工程であって、ここで腫瘍の存在は、該試験細胞が腫瘍細胞を含んだことを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記試験細胞は、ヒト細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記流体、細胞含有サンプルは、末梢血細胞を含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記流体、細胞含有サンプルは、尿、骨髄、リンパ、リンパ節、脾臓、脳脊髄液、管流体、生検標本、もしくは針生検吸引物に由来する細胞を含む、請求項３９または４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は、ｄ）前記腫瘍が存在する場合に、化学療法剤を前記非ヒト動物に投与する工程；およびｅ）該化学療法剤に対する応答性について該腫瘍をモニターする工程をさらに包含する、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞を含む流体サンプルに由来する標的細胞の数を増大させる方法であって、該方法は：
ａ）流体、標的細胞および非標的細胞含有サンプルを提供する工程；
ｂ）該サンプルを、濾過デバイスを介して通過させる工程であって、該デバイスは、フィルタに固定されたフィルタ支持体、上方開口部と下方開口部とを有する区画、および該支持体に力を加え、該支持体を外すための該区画に対して可動式の手段を含む、工程；
ｃ）該デバイスから、１つまたはそれより多い標的細胞を含む該フィルタを取り外す工程；ならびに
ｄ）該フィルタおよび該フィルタの上もしくは該フィルタの中の該標的細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植する工程であって、ここで移植された該フィルタ上のもしくは移植された該フィルタの中の該１つまたはそれより多い標的細胞のうちの一部もしくは全ては、該免疫不全動物において増殖する、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２０１１年９月７日に出願された米国出願第６１／５３１，８４８号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞を含む流体サンプルから回収された標的細胞の数を増大させるための方法および材料、およびより具体的には、標的細胞をフィルタ上で単離し、次いで、上記標的細胞を含むフィルタを免疫不全非ヒト動物（ここで上記標的細胞のうちの少なくとも一部は、増殖し得る）に移植することによって、細胞を含む流体サンプルから回収された標的細胞の数を増大させるための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
固形腫瘍を診断および処置することにおけるかなりの進歩にも拘わらず、転移性疾患は、癌関連死の第１位の原因のままである。転移発生の機構は、未だ十分に解明されていないが、患者の血流中の原発性腫瘍に由来する腫瘍細胞の循環は、転移カスケードにおける基本的中間事象である。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出することは、二次的腫瘍のより早期の検出、治療に対する応答のモニタリング、および疾患進行のモニタリングを含め、多くの理由から患者のケアにとって重要である。しかし、血中のＣＴＣは非常に少数であるので（例えば、転移性癌を有する患者の末梢血中１０９個の細胞あたり約１  ＣＴＣ）、ＣＴＣを捕捉し、検出し、増殖させるための方法および材料が継続して必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本明細書は、細胞を含む流体サンプルから回収された標的細胞の数を増大させるための方法の発見に基づく。本明細書で記載されるように、標的細胞は、サイズに基づいてフィルタの上もしくはフィルタの中に保持され得、次いで、上記標的細胞を含むフィルタは、非ヒト動物、好ましくは、免疫不全非ヒト動物（ここで上記細胞が増殖し得る）へと移植され得る。このような方法は、稀な循環細胞（例えば、末梢血サンプルから回収されたＣＴＣ）の数を増大させ、そして例えば、患者の腫瘍を評価し、上記細胞の転移能を評価し、異なる化学療法剤に対する上記細胞の応答性を決定するために使用され得る上記患者の腫瘍の個別化された動物モデルを作るために使用され得る。
【０００５】
一局面において、本明細書は、細胞を含む流体サンプルに由来する標的細胞の数を増大させるための方法を特徴とする。上記方法は、１つまたはそれより多い標的細胞を含むフィルタを提供する工程であって、上記１つまたはそれより多い標的細胞は、上記フィルタを含む濾過デバイスを介して上記サンプルを通過させることによって、流体、標的細胞および非標的細胞含有サンプルから得られ、ここで上記フィルタにおける孔サイズは、上記標的細胞が上記フィルタ上でもしくは上記フィルタ中で保持されるようにするものである、工程；ならびに上記フィルタおよび上記フィルタ上の上記１つまたはそれより多い標的細胞を、非ヒト動物（例えば、免疫不全マウスのような免疫不全非ヒト動物）を移植する工程であって、ここで上記移植されたフィルタ上のもしくは上記移植されたフィルタ中の１つまたはそれより多い細胞のうちの一部もしくは全てが、上記動物において増殖する工程を包含する。上記濾過デバイスを介して上記サンプルを通過させる間に、実質的に全ての上記非標的細胞が、上記フィルタを介して通過し得る。上記免疫不全マウスは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）自然変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）に関してホモ接合性であり得るか；ヌード自然変異（Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）に関してホモ接合性であり得るか；Ｒａｇ１変異に関してホモ接合性であり得るか；Ｒａｇ２変異に関してホモ接合性であり得るか；または上記Ｒａｇ１変異および上記Ｒａｇ２変異の両方に関してホモ接合性であり得る。
【０００６】
上記方法は、１〜４つのさらなるフィルタ（例えば、１つ、２つ、３つもしくは４つのさらなるフィルタ）を提供する工程であって、さらなるフィルタの各々は、１つまたはそれより多い標的細胞を含む、工程、および上記第１のおよびさらなるフィルタを、上記免疫不全非ヒト動物に移植する工程をさらに包含し得る。上記第１のおよびさらなるフィルタは、単一の濾過デバイスもしくは別個の濾過デバイスから得られ得る。上記方法は、上記フィルタおよび上記フィルタ上の上記１つまたはそれより多い標的細胞を移植する前に、上記フィルタを、互いの上部に実質的に重ねて、多層化培養デバイスを生成する工程をさらに包含し得る。
【０００７】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、上記フィルタおよび上記フィルタ上の上記１つまたはそれより多い標的細胞を移植する前に、上記フィルタおよび上記標的細胞を含む任意のさらなるフィルタの表面と、上記標的細胞に対して致死的効果も毒性効果もなく、液体からゲル相へと移行し得る組成物とを接触させる工程をさらに包含する。上記組成物は、１種以上の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分（例えば、再構成基底膜）を含み得る。
【０００８】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記フィルタは、上記フィルタに固定化された１種以上の化合物を含み得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、１種以上の化合物は、上記免疫不全動物に投与され得る。例えば、上記１種以上の化合物は、増殖因子、細胞外マトリクスタンパク質、酵素、レポーター分子、リポソーム、および核酸からなる群より選択され得る。上記増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、もしくはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）であり得る。上記細胞外マトリクスタンパク質は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、もしくはヘパラン硫酸であり得る。上記レポーター分子は、メタロプロテイナーゼの基質であるフルオロフォア−クエンチャー二重標識プローブを含み得る。
【０００９】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記方法は、上記免疫不全動物において上記細胞の増殖をモニターする工程をさらに包含し得る。
【００１０】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記流体、細胞含有サンプルは、末梢血細胞を含み得るか、または尿、骨髄、リンパ、リンパ節、脾臓、脳脊髄液、管流体（ｄｕｃｔａｌ  ｆｌｕｉｄ）、生検標本、もしくは針生検吸引物に由来する細胞を含み得る。
【００１１】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記方法は、上記移植する工程の前に、上記１つまたはそれより多い標的細胞を培養する工程を包含する。
【００１２】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記標的細胞は、癌細胞、循環癌細胞、胎児細胞、もしくは幹細胞（例えば、内皮幹細胞もしくは間葉系幹細胞）であり得る。
【００１３】
別の局面において、本明細書は、少なくとも１つの移植されたフィルタであって、上記フィルタは、上記フィルタを含む濾過デバイスを介して通過させることによって、流体、標的細胞および非標的細胞含有サンプルから得られた複数の標的細胞を含み、ここで上記フィルタにおける孔サイズは、上記標的細胞が上記フィルタ上もしくは上記フィルタ中に保持されるようにする、フィルタを含む非ヒト免疫不全動物を特徴とする。上記動物はさらに、１〜４つのさらなる移植されたフィルタ（例えば、１つ、２つ、３つもしくは４つ）を含み得、上記さらなるフィルタの各々は、１つまたはそれより多い標的細胞を含む。上記第１のおよびさらなるフィルタは、単一の濾過デバイスもしくは別個の濾過デバイスから得られ得る。上記第１のおよびさらなるフィルタは、多層化三次元培養デバイスを生成するために、互いの上部に実質的に重ねられ得る。上記フィルタおよび上記標的細胞を含む任意のさらなるフィルタの表面は、上記標的細胞（例えば、ヒト標的細胞）に対して致死的効果も毒性効果もなく、液体からゲル相へと移行し得る組成物を含み得る。
【００１４】
本明細書はまた、試験細胞を含む流体サンプル中の腫瘍細胞の存在に関して試験するための方法を特徴とする。上記方法は、上記フィルタを含む濾過デバイスを介して通過させることによって、流体、試験細胞含有サンプルから得られた複数の試験細胞を含むフィルタを提供する工程であって、ここで上記フィルタにおける孔サイズは、上記試験細胞のうちの１以上が上記フィルタ上もしくは上記フィルタ中に保持されるようにする、工程；上記フィルタおよび上記フィルタ上もしくは上記フィルタ中の上記試験細胞のうちの１以上を、上記免疫不全非ヒト動物に移植する工程；ならびに上記免疫不全非ヒト動物を、腫瘍の存在もしくは非存在に関してモニターする工程であって、ここで腫瘍の存在は、上記試験細胞が腫瘍細胞を含んだことを示す工程、を包含する。上記試験細胞は、ヒト細胞であり得る。上記流体、細胞含有サンプルは、末梢血細胞を含み得るか、または尿、骨髄、リンパ、リンパ節、脾臓、脳脊髄液、管流体、生検標本、もしくは針生検吸引物に由来する細胞を含み得る。上記方法はさらに、腫瘍が存在する場合に、化学療法剤を上記非ヒト動物に投与する工程；および上記化学療法剤に対する応答性に関して上記腫瘍をモニターする工程を包含し得る。
【００１５】
別の局面において、本明細書は、細胞を含む流体サンプルに由来する標的細胞の数を増大させるための方法を特徴とする。上記方法は、流体、標的細胞および非標的細胞含有サンプルを提供する工程；上記サンプルを、濾過デバイスを介して通過させる工程であって、上記デバイスは、フィルタに固定化されたフィルタ支持体、上方開口部と下方開口部とを有する区画、および上記支持体に力を加え、上記支持体を外すための上記区画に対して可動式の手段を含む、工程；上記デバイスから、１つまたはそれより多い標的細胞を含む上記フィルタを取り外す工程；ならびに上記フィルタおよび上記フィルタ上もしくは上記フィルタ中の上記標的細胞を、上記免疫不全非ヒト動物に移植する工程であって、ここで上記移植されたフィルタ上もしくは上記移植されたフィルタ中の上記１つまたはそれより多い標的細胞のうちの一部もしくは全ては、上記免疫不全動物において増殖する、工程を包含する。
【００１６】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものと類似もしくは等価な方法および材料が本発明を実施するために使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が優先する。さらに、上記材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定するとは意図されない。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本明細書で記載される実施形態に従う、流体サンプルから標的細胞を回収するためのＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）濾過デバイスの斜視図である。
【図２】図２Ａおよび２Ｃは、図１に図示される部品を組み立てた、図１の実施形態の垂直軸断面である。図２Ａおよび２Ｃにおいて丸で囲まれた部分は、それぞれ、図２Ｂおよび２Ｄにおいて拡大図で示される。
【図３】図３Ａ〜３Ｏは、貯蔵配置（３Ａ）から、標的細胞を流体サンプルから単離および回収するためにデバイスを使用する各工程（３Ｂ〜３Ｏ）を通しての、図１のＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）濾過デバイスの立面図もしくは断面図である。
【図４】図４は、使用前のＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）濾過デバイスの一実施形態の斜視図である。
【図５】図５は、保護フィルムの除去後かつ吸引管（ｖａｃｕｕｍ  ｔｕｂｅ）の挿入前の、図４に図示されるＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスの実施形態を模式的に表す。
【図６】図６は、吸引管挿入後の図４および図５に図示されるＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスの実施形態を模式的に表す。
【図７】図７は、上記吸引管および保護シリンダーの除去の間の、図４〜６に図示されるＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスの実施形態を模式的に表す。
【図８】図８Ａは、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｙｔｏデバイスを介した濾過後の生きているＨ２０３０細胞の顕微鏡写真である。図８Ｂは、上記フィルタを培養培地中で４日間にわたって培養した後の、図８Ａからの細胞の顕微鏡写真である。図８Ａおよび図８Ｂの細胞は、８回の独立した実験の代表である；細胞を顕微鏡（×４０）下で観察した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
種々の図面中の類似の参照記号は、類似の要素を示す。
【００２０】
（詳細な説明）
一般に、本明細書は、標的細胞および非標的細胞を含む流体サンプルから回収された標的細胞の数を増大させるための方法および材料に基づく。用語「細胞を含む流体サンプル」とは、細胞の懸濁物を含む液体をいう。非限定的例としては、生物学的流体（例えば、血液（例えば、末梢血もしくは臍帯血）、尿、リンパ、脳脊髄液、もしくは管流体）、または生理学的溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、もしくは組織培養培地）に希釈されたこのような流体、または生物学的流体から（例えば、遠心分離によって）得られ、生理学的溶液中に懸濁された細胞が挙げられる。「細胞を含む流体サンプル」の他の例としては、骨髄吸引物、例えば、リンパ節もしくは脾臓からの針生検吸引物もしくは生検標本から得られる細胞懸濁物（生理学的溶液中の）が挙げられる。このような流体サンプルは、任意の哺乳動物被験体（ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、もしくはネコが挙げられる）から得られ得る。ヒト被験体に由来する流体サンプルは、特に有用である。上記流体サンプルが赤血球を含む実施形態において、上記赤血球は、例えば、塩化アンモニウムもしくはサポニンを含む緩衝液を使用して選択的に溶解され得るか、または例えば、密度勾配沈殿法もしくはヘタスターチ凝集（ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）によって除去され得る。
【００２１】
本明細書で記載される場合、生きている標的細胞は、フィルタ上もしくはフィルタ中に、流体サンプルから回収され得、次いで、これらは、免疫不全非ヒト動物（ここで上記標的細胞は増殖し得る）に移植され得る。標的細胞は、胎児血液細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）（すなわち、骨髄中の腫瘍細胞）、または幹細胞（例えば、癌幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは内皮幹細胞）を含み得る。例えば、胎児血液細胞は、母体血液（必要に応じて、生理学的溶液に希釈される）のサンプルから回収され得、非侵襲性出生前診断のために使用され得る。癌（例えば、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、黒色腫、膀胱癌、甲状腺癌もしくはリンパ腫）を有するかもしくは有すると疑われる患者から回収された標的細胞を含む１つ以上のフィルタは、さらなる特徴付け（ゲノムアッセイ、プロテオミクスアッセイ、免疫組織化学アッセイ、もしくは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイのうちの１種以上を含む）のために標的細胞（フィルタ中もしくはフィルタ上に捕捉された標的細胞の後代を含む）の数を増大させるために、例えば、予後決定を補助するために、免疫不全非ヒト哺乳動物に移植され得る。免疫不全動物への移植はまた、上記標的細胞が腫瘍を開始し、転移する能力の決定および／または１種以上の化学療法剤への上記細胞の応答性の決定を可能にする。
【００２２】
非標的細胞は、上記標的細胞以外の細胞を含む流体サンプル中の細胞全てである。従って、例えば、上記標的細胞がＣＴＣである血液において、非標的細胞は、赤血球、リンパ球（ＴおよびＢ）、単球、および顆粒球を含み、これら非標的細胞は、大部分の癌細胞より小さい。上記細胞を含む流体サンプルが、例えば、リンパ節組織から調製される細胞懸濁物であり、上記標的細胞が癌細胞である場合、非標的細胞は、リンパ球（ＴおよびＢ）、単球、マクロファージ、および顆粒球を含み、これら非標的細胞は、大部分の癌細胞より小さい。
【００２３】
濾過デバイス
標的細胞および非標的細胞を含む流体サンプルは、フィルタを含む濾過デバイスを介して通過させられ得、ここで上記フィルタにおける孔サイズは、上記標的細胞が上記フィルタ上もしくは上記フィルタ中で保持されるようにする。上記濾過デバイスを介して通過させるための上記サンプルを調製するために、上記サンプルは、代表的には、ウシ血清アルブミン、赤血球溶解剤（例えば、塩化アンモニウム、サポニン、もしくは炭酸水素カリウム）、殺生物剤（例えば、アジ化ナトリウムもしくは次亜塩素酸塩溶液（０．１〜２ｍＭ）、および必要に応じて、カルシウムチャネルブロッカー（例えば、アムロジピン、ベニジピン、もしくはバルニジピン）を補充した培養培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０のようなＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、もしくはＭＥＭ）を含む緩衝液で希釈され、１〜５分間（例えば、１分間、２分間、３分間、４分間、もしくは５分間）にわたってインキュベートされる。例えば、上記緩衝液には、０．２〜２ｇ（例えば、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、０．５ｇ、０．６ｇ、０．７ｇ、０．８ｇ、０．９ｇ、１．０ｇ、１．２ｇ、１．４ｇ、１．６ｇ、１．８ｇ、もしくは２．０ｇ）のＢＳＡ、０．０１〜０．１ｇ（例えば、０．０１ｇ、０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０６ｇ、０．０７ｇ、０．０８ｇ、０．０９ｇ、もしくは１．０ｇ）の赤血球溶解剤、０．１〜２ｍＭ（例えば、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、もしくは２．０ｍＭ）の殺生物剤、および５〜３０ｎＭ（例えば、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、もしくは３０ｎＭ）のカルシウムチャネルブロッカーが補充され得る。インキュベートした後、細胞培養培地（例えば、ＲＰＭＩ）は、上記希釈されたサンプルに添加され、次いで、これは、上記デバイスを介して濾過される。上記サンプルを、上記濾過デバイスを介して通過させる間に、上記非標的細胞のうちの実質的に全て（すなわち、９９％より高い）が、上記フィルタを通過する。上記流体サンプルの非標的細胞は、上記フィルタの下側に真空を付与することによって、上記フィルタを介して通過し得る。いくつかの実施形態において、上記サンプルの非標的細胞は、上記デバイス（これは、そのゴムキャップがいったん穿刺されたら、上記血液体積とチューブ中の真空との間に圧力差を確立し、血液を上記フィルタを介してチューブの中へと押しやる）のホルダーの内側に上記チューブを導入することによって、上記フィルタを通過するようにされる。
【００２４】
上記フィルタを含む濾過デバイスは、特定の構造に限定されず、上記デバイスが、ａ）上記細胞を含む流体サンプルを受容し得かつその孔サイズが、上記標的細胞を上記フィルタ上もしくはフィルタ中に保持するフィルタを支持し得る、およびｂ）上記サンプルを、上記フィルタを介して通過させた後に、上記流体を取り出すように構成されている限りにおいて、任意の形状、サイズ、もしくは材料のものであり得る。例えば、濾過デバイスは、以下のうちの１つ以上から構成され得る：１種以上のポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、もしくはポリエーテルエーテルケトン（例えば、ＰＥＥＫＴＭ））から作られるプラスチック；金属合金（例えば、ステンレス鋼（例えば、手術用スチール（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｓｔｅｅｌ））；セラミック、ガラス；または複合材。ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）（Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）の濾過デバイスは特に有用であり、本明細書で記載される方法において使用された。米国特許公開番号２０１１００７０６４２、米国特許公開番号２０１１０１０４６７０、米国特許公開番号２００９００８１７７２、米国仮特許出願第６１／４１７，５２６号、ＷＯ２０１１０５５０９１、ＷＯ２００９１０６７６０、およびＷＯ２００９０４７４３６（これらの各々は、その全体において参考として援用される）に記載される濾過デバイスもまた参照のこと。
【００２５】
一実施形態において、上記濾過デバイスは、流体サンプルを受容するための区画、および上記区画の開口部の上に（少なくとも一時的に）取り付けられたフィルタを含む。上記濾過デバイスはさらに、上記区画の開口部の上に（少なくとも一時的に）取り付けられた針を含み得る。このような実施形態において、上記フィルタは、上記針と上記区画の内部容量との間に位置する。上記取り付けられた針は、吸引管（例えば、血液吸引管）のプラグを穿刺し、上記フィルタを介して液体を吸引するために、雰囲気圧に対して陰圧を作り出すように設計される。このような濾過デバイスは、さらなる培養および／もしくは免疫不全非ヒト動物への移植と適合した条件下で、フィルタ上に生細胞を単離および集めることを可能にする。
【００２６】
図１は、レザバもしくは区画１０２、端部部品１０４、シール１０６、支持体付きフィルタ１０８、可動式手段１１０、シール１１２およびプラグ１１４を含む濾過デバイス（ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標），  Ｐａｒｉｓ-Ｆｒａｎｃｅ）の一実施形態を示す。上記区画１０２は、実質的に円筒形状である。その上端は、非浸透性であるような方法において上記プラグ１１４によってシールされ得る。上記区画１０２の下端は、その外側表面に、上記可動式手段１１０に脚をガイドする隙間がある不連続リングを有し、上記リングは、上記可動式手段１１０の本体をガイドする。
【００２７】
この可動式手段１１０は、形状がほぼ円筒形であり、２本の脚とともに供給され、これら脚は、上記端部部品１０４に向かって延び、かつ上記脚の間が分離している（この分離は、上記フィルタ支持体１０８の直径より小さい寸法である）ように、この方向で一緒に狭くなっている。実質的に図示されているように、この特定の形状（特に、互いに向かって湾曲している上記脚１１６の形状）は、上記可動式手段が上記フィルタ支持体１０８に向かって進む間に、上記可動式手段１１０が、上記端部部品１０４から外れた後に、上記フィルタ支持体が上記区画１０２からそのフィルタに沿って外されるように、上記フィルタ支持体１０８に圧力を加えることを可能にする。
【００２８】
上記可動式手段１１０の脚１１６の端部および上記区画１０２の下端は、細胞培養ボックスもしくはウェルの中に挿入されるように設計される。上記区画１０２の末端にある上記不連続リングの直径は、上記区画が細胞培養ボックスもしくはウェルの縁部の上で支持され得るように、設計される。  端部部品もしくはアダプター１０４は、上記区画１０２の下方開口部に位置する。端部部品もしくはアダプター１０４は、上記区画１０２の外壁をしっかりとつかみ、上記区画１０２より直径が小さい、下方の狭い開口部を有する。端部部品もしくはアダプター１０４は、取り外し可能であり、非透過性であり、滅菌されている。上記端部部品もしくはアダプター１０４の下方の狭い開口部は、針の開口の漏出がない機械的フィットを可能にするために十分長い（図３Ｂ〜３Ｄを参照のこと）。
【００２９】
上記区画１０２の下端（これは、側方突出部１１８を有する）の形状と調和した様式において、上記端部部品１０４は、公知の様式において上記突出部をしっかりつかむための回転ロッキング手段を有する。このようにして、上記端部部品１０４は、上記フィルタホルダーが濾過の間に適所に保持されることを可能にする。さらに、上記端部部品１０４は、上記フィルタをハネおよびあらゆる潜在的汚染から保護する。
【００３０】
取り付けられる場合、上記区画１０２の下端は、上記フィルタ支持体１０８（それ自体が正しい位置に保持されている）によって、一方では上記区画１０２の下端によって、他方では上記端部部品１０４によって保持される上記フィルタ上に吐出する開口部を有する。
【００３１】
一実施形態において、上記フィルタ支持体１０８は、リング様ディスクとして形作られる。上記フィルタは、微小穿孔され、上記フィルタ支持体１０８の下側に融合され、次いで、これに沿って上記区画１０２の下端へと挿入される。
【００３２】
上記フィルタ支持体１０８は、リング形状にされ得、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）のようなプラスチック、または手術用スチールのような金属合金から作られる。手術用スチールから作られたフィルタ支持体は、上記濾過デバイスにおいて特に有用である。上記リングの厚みは、スキャンを可能にするように設計される。上記フィルタ支持体は、集められた細胞が患者と関連づけられ得るように、識別子を含み得る。一実施形態において、上記フィルタ支持体の外径は、例えば、１２〜１３ｍｍ（例えば、１２．６ｍｍ）であり得、上記フィルタ支持体１０８が取り付けられる上記フィルタの直径は、５．５〜６．５ｍｍ（例えば、５．９ｍｍ）であり得る。
【００３３】
一実施形態において、上記区画１０２、上記端部部品１０４および上記可動式手段１１０は、例えば、ポリプロピレンから構成される。上記シール１０６および１１２は、例えば、シリコーンから作られる。
【００３４】
図２Ａおよび図２Ｃは、図１に示される実施形態の垂直軸方向の断面図である。図２Ｂおよび図２Ｄは、それぞれ、図２Ａおよび図２Ｃの丸で囲った部分の拡大図である。
【００３５】
図３Ａは、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）濾過デバイスを、その貯蔵構成において立面図で表す。図３Ｂは、針１８０（これは、吸引管プラグを穿刺するのをより容易にするように、別の非常に微細な斜角のついた端部１８２を有する）の開口１８１への、上記端部部品１０４の挿入を表す。上記針１８０の開口１８１は、優先的には、プラスチックから作られる。上記針１８０の端部１８２は、優先的には、金属製である。上記針１８０は、液体（示さず）、例えば、血液が、上記区画１０２へとその上方開口部を通って導入される前もしくは後のいずれかに、上記端部部品１０４に配置され得る。
【００３６】
図３Ｃは、上記針１８０が、いったん上記端部部品１０４に非浸透性に連絡されたら穿刺され始める上記吸引管１８５プラグ１８６を図示する。
【００３７】
図３Ｄは、陰圧吸引管１８５の内部を、上記フィルタ１０８を通って、上記目的の細胞を含む液体を保持する上記区画１０２の体積へと接続する上記針１８０によって完全に穿通されるプラグ１８６を図示する。上記吸引管１８５の内部容積は、濾過されるべき液体の体積より大きい。
【００３８】
濾過の間に、上記区画１０２に存在する上記流体サンプル中のいくつかの標的細胞（これは、直径がより大きい）は、上記液体内容物および上記標的細胞より直径が小さい細胞の実質的に全てが上記吸引管１８５へと上記フィルタ１０８を介して吸引される間に、上記フィルタ１０８によって保持される。
【００３９】
次に、図３Ｅおよび図３Ｆに図示されるように、上記端部部品１０４は、上記突出部１１８からそれを外すように回転された後に外される。次いで、図３Ｇおよび図３Ｈに図示されるように、上記区画１０２の端部は、細胞培養ボックスもしくはウェル１３０へと挿入される。
【００４０】
上記で説明されかつ図３Ｉにおいて図示されるように、上記可動式手段１１０の脚１１６に近い端部および上記区画１０２の下端は、細胞培養ボックスもしくはウェルへと挿入されるように設計される。対照的に、上記区画１０２の端部にある上記不連続リングは、上記培養ボックスもしくはウェル１３０の縁部に支持されることを可能にする直径を有する。
【００４１】
より正確であるために、図３Ｊおよび図３Ｋにおいて図示されるように、上記可動式手段１１０は、この位置において、上記区画１０２の軸に対して平行にさらに移動し得る。
【００４２】
図３Ｌ、３Ｍ、および３Ｎに図示されるように、この移動の間に、上記可動式手段の脚１１６は、オペレーターの指によって動かされる場合に、上記フィルタ支持体１０８に対して垂直下向きの圧力を加え、上記区画１０２の下端からそれを外す。次いで、上記フィルタおよびその支持体１０８は、上記細胞培養ボックスもしくはウェル１３０へと落ちる。
【００４３】
最後に、図３Ｏに図示されるように、上記区画１０２および上記可動式手段１１０は、細胞培養ボックスもしくはウェル１３０から外される。
【００４４】
図４〜７は、上記吸引管の保護ガイドシリンダーを使用するＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）濾過デバイスの特定の実施形態に関する。図４〜７は、上記区画１０２、上記可動式手段１１０、ならびに２部品接続手段５０４および５２０によって上記区画１０２に取り付けられる保護シリンダー５０２を示す。  上記保護シリンダーは、接続手段部品５０４、白くした部品（ｆｒｏｓｔｅｄ  ｐａｒｔ）５０６、透明部品５０８、および上記区画１０２に対向する開口部上に、保護フィルム５１０を含む。
【００４５】
部品５２０は、上記区画１０２の端部の内側に形成される。図７は、上記区画１０２に対して同軸関係にある円筒部品に対して側方に配置された４つの突起５２２を含む部品５２０の特定の実施形態を示す。この実施形態において、部品５０４は、上記突起の輪郭に対応する輪郭を有する４本の溝から構成される。これら溝５２４は、楕円の様式において、突起５２２に適応するように設計された開口部から、上記保護シリンダー５０２を図７中の矢印によって示されるように回転させることによって各突起５２２がその対応する溝５２４の中へと進みかつ上記保護シリンダー５０２が上記区画１０２へと締め付けられるように、上記保護シリンダー５０２の内部に向かって、延びる。
【００４６】
上記保護シリンダー５０２は、以下のように上記針１８０を有する上記端部部品に取り付けられる。上記針１８０は、上記区画５０２に面した部品である部品５０４の下方部分に埋め込まれる。部品５０４は、４つのスポークによって部品５０６に押し付けて取り付けられる（ｆｏｒｃｅ−ｍｏｕｎｔｅｄ）。上記スポークは、部品５０４に位置し、部品５０６に位置した４本の水へと挿入される。
【００４７】
部品５０６は、上記針１８０を分離および保護するように働く。上記透明部品５０８は、ユーザーが濾過の状態および完了を確認できるようにする。
【００４８】
上記保護フィルム５１０は、上記シリンダー５０２の下方開口部全体を覆ってシールし、上記シリンダー５０２から短い距離だけ延びる側方の部品とともに備えられる（図４に図示される）。この側方部品は、上記フィルム５１０が容易に外されることを可能にする。
【００４９】
上記保護フィルム５１０は、ユーザーが上記針１８０に接触しないように保護する。上記フィルム５１０はまた、上記ニードル１８０を詰まりおよび／もしくは汚染するリスクから保護する。
【００５０】
上記シリンダー５０２は、例えば、上記濾過デバイスが使用される目的（それぞれ、細胞学、分子生物学、および培養研究）に応じて青、緑もしくは黄に区別して着色され得る。
【００５１】
図５において、上記濾過されるべき液体が上記区画１０２へと導入され、上記フィルム５１０が外された後に、そのプラグ１８６に嵌められた上記吸引管１８５が上記保護ガイドシリンダー５０２に挿入されることに注意のこと。次いで、上記で説明されるように、上記針１８０が上記プラグ１８６を穿刺するように上記吸引管１８５に力が加えられる。
【００５２】
このように生成された組み立て体（図６に示される）において、上記吸引管１８５に最初に存在する陰圧は、上記区画１０２に存在する液体の濾過を生じる。
【００５３】
図７に図示されるように濾過が完了すると、上記保護シリンダー５０２およびこれが収容する上記針１８０は、いっしょに外される。
【００５４】
標的細胞を保持するためのフィルタ
本明細書で記載される方法において使用されるフィルタは、上記標的細胞が上記フィルタ上もしくは上記フィルタ中に保持されるようにする孔を含む。適切なフィルタは、５０，０００〜２００，０００孔／ｃｍ２の間（例えば、７５，０００〜１５０，０００孔／ｃｍ２、９０，０００〜１１５，０００孔／ｃｍ２、もしくは９５，０００〜１１０，０００孔／ｃｍ２）を含み得、平均直径は、５．５μｍ〜約７．５μｍである。一実施形態において、上記フィルタは、約１００，０００孔／ｃｍ２を有し、平均直径は、約６．５μｍである。任意の特定の適用において使用される孔サイズは、上記標的細胞および非標的細胞の相対的サイズに依存する。フィルタ上に保持されるべき標的細胞は、一般に、＞２０μｍかつ＜５０μｍの直径（もしくは最長寸法）を有する。当然のことながら、少なくとも、細胞を含む流体サンプル中の上記非標的細胞の大部分は、上記流体サンプル中の上記標的細胞の直径（もしくは最大寸法）より有意に小さくかつ目的のフィルタにおける孔の直径（もしくは最大寸法）より小さい直径を有する。
【００５５】
上記フィルタは、任意の生体適合性材料（例えば、生分解性もしくは非生分解性である生体適合性ポリマーが挙げられる）から構成され得る。代表的生体適合性ポリマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリ（エステルアミド）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）（例えば、ポリ（３−ヒドロキシプロパノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３−ヒドロキシヘプタノエート）およびポリ（３−ヒドロキシオクタノエート））、ポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）（例えば、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）、ポリ（４−ヒドロキシバレレート）、ポリ（４−ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（４−ヒドロキシヘプタノエート）、ポリ（４−ヒドロキシオクタノエート）および本明細書に記載される上記３−ヒドロキシアルカノエートもしくは４−ヒドロキシアルカノエートモノマーのうちのいずれかまたはこれらのブレンドを含むコポリマー）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリグリコリド、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（チロシンカーボネート）およびこれらの誘導体、ポリ（チロシンエステル）およびこれらの誘導体、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（グリコール酸−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリホスホエステル、ポリホスホエステルウレタン、ポリ（アミノ酸）、ポリシアノアクリレート、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、シリコーン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイソブチレンおよびエチレン−αオレフィンコポリマー、アクリルポリマーおよびコポリマー、ハロゲン化ビニルポリマーおよびコポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリビニルエーテル（例えば、ポリビニルメチルエーテル）、ポリハロゲン化ビニリデン（例えば、ポリ塩化ビニリデン）、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン、ポリビニル芳香族（例えば、ポリスチレン）、ポリビニルエステル（例えば、ポリビニルアセテート）、ビニルモノマーと互いおよびオレフィンとのコポリマー（例えば、エチレン−メチルメタクリレートコポリマー、アクリロニトリル−スチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂、およびエチレン−ビニルアセテートコポリマー）、ポリアミド（例えば、ナイロン６６およびポリカプロラクタム）、アルキド樹脂、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリイミド、ポリエーテル、ポリ（セバシン酸グリセリル）、ポリ（プロピレンフマレート）、ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）、ポリ（ｓｅｃ−ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート）、ポリ（ｎ−プロピルメタクリレート）、ポリ（イソプロピルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、エポキシ樹脂���ポリウレタン、レーヨン、レーヨン−トリアセテート、酢酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、セロハン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース、コポリ（エーテル−エステル）（例えば、ポリ（エチレンオキシド／ポリ（乳酸）（ＰＥＯ／ＰＬＡ））、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（エーテルエステル）、ポリアルキレンオキサレート、ポリホスファゼン、ホスホリルコリン、コリン、ポリ（アスピリン）、ヒドロキシル保有モノマー（例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、もしくはヒドロキシプロピルメタクリルアミド）のポリマーおよびコポリマー、カルボン酸含有モノマー（例えば、メタクリル酸（ＭＡ）、アクリル酸（ＡＡ）、アルコキシメタクリレート、アルコキシアクリレート、もしくは３−トリメチルシリルプロピルメタクリレート（ＴＭＳＰＭＡ））。例えば、米国特許第７，８８７，５７２号を参照のこと。このようなポリマーのうちの１種以上から構成されるトラックエッチングフィルタは、特に有用である。なぜなら、上記トラックエッチング製造プロセスは、狭い孔サイズ分布を有するより正確な孔サイズを生じるからである。一実施形態において、上記フィルタは、ポリカーボネートフィルタである。一実施形態において、上記フィルタは、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｋｅｎｔ，  ＵＫ）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｐｌａｎｏ，  Ｔｅｘａｓ）、もしくはｉｔ４ｉｐ（Ｓｅｎｅｆｆｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）製のポリカーボネートのトラックエッジ（ｔｒａｃｋ−ｅｄｇｅｄ）フィルタである。ポリカーボネートのトラックエッジフィルタは、有害な影響なく、免疫抑制マウスに移植され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、上記フィルタ（例えば、ポリカーボネートフィルタ）の表面は、例えば、１種以上の化合物の固定化によって、もしくは上記表面をより親水性にする処理によって、改変され得る。例えば、増殖因子、細胞外マトリクスタンパク質、酵素、レポーター分子、リポソーム、もしくは核酸のうちの１種以上は、上記フィルタ上に固定化され得る。増殖因子の非限定的例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）が挙げられる。細胞外マトリクスタンパク質の非限定的例としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、およびヘパラン硫酸が挙げられる。
【００５７】
一実施形態において、１種以上のレポーター分子が、上記細胞の培養の間にもしくは免疫不全非ヒト動物における移植の後に細胞増殖が検出され得るように、上記フィルタに固定化され得る。例えば、上記標的細胞が腫瘍細胞である場合、レポーター分子は、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の基質であるフルオロフォア−クエンチャー二重標識プローブを含み得る。例えば、ＭＣＡ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＰＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ（ここでＭＣＡとは、メトキシクマリンをいい、ＤＰＡとは、ジニトロフェニルをいう）のような基質が使用され得る。腫瘍増殖と関連する大部分のＭＭＰは、例えば、基質を切断し得る。蛍光ＭＣＡは、上記ペプチドがＧｌｙ残基とＬｅｕ残基との間でＭＭＰによって切断されるまで、ＤＰＡによってクエンチされる。蛍光ＭＣＡの検出は、上記細胞の増殖を示す。当業者は、フルオロフォアおよびクエンチャー分子の他の組み合わせが使用され得ることを認識する。
【００５８】
一実施形態において、上記フィルタ上に固定化された上記レポーター分子は、標的化リガンドに結合されるフルオロフォア−クエンチャー対に基づく、インビボで標的化され、活性化可能な光学的画像化プローブである。Ｏｇａｗａら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．６（２）：３８６〜３９５（２００９）を参照のこと。このシステムを用いると、蛍光は、上記標的細胞の外側で上記フルオロフォア−クエンチャー相互作用によってクエンチされるが、リポソーム／エンドソーム中での上記フルオロフォア−クエンチャー対の解離によって、上記標的細胞内で活性化される。ローダミンコアフルオロフォアＴＡＭＲＡおよびＱＳＹ７クエンチャー対は、インビボ画像化に特に有用である。適切な標的リガンドとしては、例えば、レセプターリガンド（例えば、アビジン（これは、Ｄ−ガラクトースレセプターに結合する非共有結合的に結合したホモテトラマー糖タンパク質である））が挙げられる。Ｄ−ガラクトースレセプターは、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、および膵臓癌細胞を含む多くの癌細胞上で発現される。標的化リガンドはまた、腫瘍特異的抗原（例えば、いくつかの腫瘍の細胞表面で発現されるヒト上皮増殖因子レセプタータイプ２（ＨＥＲ２））に対して結合親和性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメントであり得る。Ｏｇａｗａら、２００９（前出）を参照のこと。
【００５９】
いくつかの実施形態において、抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、フィルタ上に固定化され得る。このような抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、上記サンプルを濾過する前もしくは後に、上記フィルタに固定化され得る。しかし、上記フィルタ上の上記抗体もしくはそのフラグメントの固定化は、上記濾過プロセスの間に標的細胞の選択に実質的に寄与しないことを認識する。しかし、このような抗体もしくはそのフラグメントは、上記細胞の培養の間に、もしくは免疫不全非ヒト動物における移植の後に増殖促進リガンドとして作用するために有用であり得る。
【００６０】
「抗体」とは、本明細書でこの用語が使用される場合、一般に重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むタンパク質をいう。抗原認識および結合は、上記重鎖および軽鎖の可変領域内で起こる。１本の重鎖および１本の軽鎖を有する単一ドメイン抗体、ならびに軽鎖を欠いている重鎖抗体もまた、公知である。所定の抗体は、重鎖の５つのタイプ（α、δ、ε、γおよびμといわれ、その分類は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づく）のうちの１つを含む。重鎖のこれら異なるタイプは、５つのクラスの抗体、それぞれ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）およびＩｇＭを生じる。所定の抗体はまた、軽鎖の２つのタイプ（κもしくはλといわれ、その分類は、軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づく）のうちの１つを含む。ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体は、一般に、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖ならびに２つの抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）（各々は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）から構成される）を含む。一般に、ＩｇＡ抗体は、２つのモノマーから構成され、各モノマーは、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される（ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体に関して）；このようにして、上記ＩｇＡ分子は、４つの抗原結合ドメインを含み、繰り返すと、各々は、ＶＨおよびＶＬから構成される。特定のＩｇＡ抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成されるという点でモノマーである。分泌型ＩｇＭ抗体は、一般に、５つのモノマーから構成され、各々のモノマーは、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される（ＩｇＧおよびＩｇＥ抗体に関して）；このようにして、上記ＩｇＭ分子は、１０の抗原結合ドメインを有し、繰り返すと、各々は、ＶＨおよびＶＬから構成される。ＩｇＭの細胞表面形態もまた存在し、これは、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体に類似の２つの重鎖／２つの軽鎖構造を有する。
【００６１】
抗体の「抗原結合フラグメント」とは、本明細書でこの用語が使用される場合、上記で定義されるような完全抗体ではないが、少なくとも１つの抗原結合部位をなお保持する抗原結合分子をいう。抗体フラグメントは、しばしば、完全抗体の切断された部分を含むが、この用語は、このような切断されたフラグメントに限定されない。抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み得る。ｓｃＦｖフラグメントは、上記ｓｃＦｖが由来する抗体の上記重鎖および軽鎖可変領域の両方を含む単一ポリペプチド鎖である。他の適切な抗体もしくは抗体結合フラグメントとしては、直線状抗体、多重特異的抗体フラグメント（例えば、二重特異的、三重特異的、および多重特異的抗体（例えば、ダイアボディー（Ｐｏｌｊａｋ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１１２１〜１１２３（１９９４）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３（１−２）：１７７〜１８９（１９９４））、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ））、ミニボディー、キレート化組換え抗体（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディー（Ｈｕｓｔｏｎら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０（３−４）：１２７〜１４２（２００１）；Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８（３）：３５５−３６６（２００３）；  Ｓｔｏｃｋｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ９（２２）：９６０〜９６６（２００４））、ナノボディー、小型モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ科抗体（ｃａｍｅｌｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ラクダ科化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、およびＶＨＨ含有抗体が挙げられる。
【００６２】
増殖促進リガンドとして作用する抗体もしくはその抗原結合フラグメントの非限定的例としては、Ｔ細胞腫瘍に対する抗ＣＤ３抗体；Ｂ細胞腫瘍に対する抗Ｉｇ抗体；もしくはクラス１増殖因子レセプターのダイマー化を誘導し得る抗体が挙げられる。例えば、Ｆｕｈら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１６７７〜１６８０；Ｒｕｉら（１９９４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：１２９９〜１３０６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：４７３〜４８２；Ｍａｈａｎｔａら（２００８）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３（４）：ｅ２０５４；およびＳｐａａｒｇａｒｅｎら（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６６（３）：１７３３〜９を参照のこと。
【００６３】
免疫不全非ヒト動物におけるフィルタの移植
上記フィルタ上に１つまたはそれより多い標的細胞を回収した後、上記フィルタは、非ヒト動物、最も一般的には、免疫不全非ヒト動物（例えば、免疫不全齧歯類（例えば、免疫不全マウスもしくはラット））に移植され得る。上記免疫不全非ヒト動物は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）自然変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）に関してホモ接合性であり得るか；ヌード自然変異（Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）に関してホモ接合性であり得るか；Ｒａｇ１変異に関してホモ接合性であり得るか；Ｒａｇ２変異に関してホモ接合性であり得るか；または上記Ｒａｇ１変異および上記Ｒａｇ２変異の両方に関してホモ接合性であり得る。このような免疫不全非ヒト動物（例えば、免疫不全マウス）は、例えば、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）から市販されている。代表的には、上記フィルタは、上記免疫不全動物へと外科手術により皮下移植される。例えば、上記フィルタは、神経堤下に、副腎被膜の下に、腹腔中に、もしくは動物の側腹部に移植され得る。いくつかの実施形態において、増殖因子もしくは再構成基底膜マトリクスのような化合物は、上記フィルタが移植される前、移植している間、もしくは移植した後に、上記動物に投与され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、１〜４つのさらなるフィルタは、上記非ヒト動物に移植され、ここで各フィルタは、１つまたはそれより多い標的細胞を含む。例えば、１つ、２つ、３つ、もしくは４つのフィルタは、上記非ヒト動物に移植され得る。各フィルタは、単一の濾過デバイスから得られ得るか、または別個の濾過デバイスから得られ得る。代表的には、複数のフィルタが１匹の動物に移植される場合、上記フィルタの全ては、同じ患者から回収された細胞を含む。上記フィルタは、上記動物の異なる領域に、例えば、上記動物の各側腹部に、または側腹部と腹部とに、移植され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、移植前に、上記フィルタの表面は、上記標的細胞に対して致死的効果も毒性効果もなく、例えば、生細胞を害する（例えば、上記細胞を死滅させるかもしくは上記細胞の増殖能を阻害する）化学物質も温度も使用することなく、液体からゲル相へと移行し得る組成物と接触させられ得る。さらに、上記組成物の構成要素は、上記細胞に対して毒性でも致死的でもなく、抗増殖性であるべきでもない。例えば、上記組成物は、架橋ポリマー鎖（起源において天然もしくは合成）から構成されるヒドロゲル（例えば、３ＤＭ，  Ｉｎｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）製のＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ（合成ペプチドマトリクス）、またはＧｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，  ＵＴ）製のポリエチレン（グリコール）ジアクリレートベースの、ヒアルロン酸ベースの、もしくはコラーゲンベースのヒドロゲルであり得る。このようなヒドロゲルは、液体形態において上記フィルタへと適用され得、次いで、培養培地を添加することによって、ゲル相へと移行し得る。フィルタはまた、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）再構成基底膜マトリクスもしくはＭａｔｒｉｇｅｌＴＭおよび培養培地を含む組成物と接触させられ得る。上記組成物はまた、１種以上の細胞外マトリクス成分、例えば、プロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラタン硫酸）、ヒアルロン酸、コラーゲンタイプＩＶ、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンを含み得る。増殖因子もしくは他の分子は、上記標的細胞の培養に必要とされる場合、上記組成物に添加され得る。
【００６６】
２つ以上のフィルタが移植される実施形態において、上記フィルタは、多層化三次元培養デバイスを生成するために互いの上部に実質的に重ねられ得る。上記フィルタを重ねる前に、上記フィルタの表面は、上記標的細胞に対して致死的効果も毒性効果もなく、液体からゲル相へと移行し得る上記の組成物と接触させられ得る。例えば、上記フィルタの表面は、再構成基底膜マトリクスと接触させられ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、移植する前に、上記１つ以上のフィルタは、細胞培養デバイスの中に配置され得、例えば、生存度を評価するかもしくは細胞数を増大させるために、培養培地の存在下で培養され得る。いくつかの実施形態において、上記標的細胞の細胞数がいったん増大されたら、上記標的細胞は、上記フィルタから（例えば、洗浄によって）取り出され得、上記免疫不全動物に移植され得る。
【００６８】
上記１つ以上のフィルタを上記免疫不全非ヒト動物に移植した後、上記動物は、上記細胞の増殖もしくは腫瘍の発生について、モニターされ得る。例えば、細胞の増殖をモニターするために、上記移植されたフィルタは、上記で考察されるように、ＭＭＰの基質もしくはインビボ活性化可能な光学画像化プローブを含み得る。上記動物における腫瘍の発生は、上記流体サンプル中の腫瘍細胞の存在を確認し、上記細胞の転移能の指標となる。腫瘍は、動物から取り出され得、さらなるインビトロもしくはインビボの特徴付けに供され得る。例えば、腫瘍もしくは上記腫瘍から単離された細胞は、上記腫瘍および／もしくは細胞をさらに特徴付けるために、ゲノムアッセイ、プロテオミクスアッセイ、免疫組織化学アッセイ、もしくは他の分子アッセイに供され得る。いくつかの実施形態において、組織特異的および／もしくは腫瘍特異的試薬（例えば、抗体、プローブ、もしくはＰＣＲプライマー）は、腫瘍もしくは上記腫瘍から単離された細胞を調べるために使用され得る。
【００６９】
腫瘍細胞の増殖が上記動物モデルにおいて確認された実施形態において、１種以上の化学療法剤に対する上記細胞の応答性は、上記目的の化学療法剤を上記動物に投与し、応答性をモニターすることによって（例えば、細胞増殖もしくは細胞死をモニターすることによって）、評価され得る。
【００７０】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００７１】
（実施例１−ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）濾過デバイスの使用）
この非限定的実施例は、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）製の濾過デバイス（ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）細胞培養（ＣＣ））の一般的使用方法を提供する。上記デバイスは、１９ｃｍ長であり、滑らかで平坦かつ親水性の表面を有する円形のトラックエッチングされたポリカーボネートフィルタ（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、もしくはｉｔ４ｉｐ製）を含む。
【００７２】
上記フィルタは、上記フィルタ全体に無作為に分布した直径６．５μｍの円形の孔を含む（１×１０５孔／ｃｍ２）。上記デバイスの製造業者によれば、濾過する前に、および赤血球（ＲＢＣ）を溶解するために、３〜６ｍｌの血液サンプルを、それぞれ、３〜１ｍｌのＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）ＬＣ緩衝液で希釈する。すなわち、３ｍｌの血液を、３ｍｌの緩衝液で希釈する一方で、６ｍｌの血液サンプルを、１ｍｌの緩衝液で希釈する。上記サンプルおよび希釈緩衝液を混合し、２分間にわたって室温においてインキュベートした後、それぞれ、総容積８．６ｍｌにするように、２．６もしくは１．６ｍｌの培養培地を添加し、次いで、上記サンプルを、吸引管を取り付けた上記濾過デバイスを介して通過させる。濾過は、通常、約２分間以内に完了する。濾過の最後に、上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスのノズル／ホルダーを外し、上記濾過タンクから取り外し、上記濾過デバイスの底部分に位置したロッドを均等に押し出すことによって、上記フィルタを２４ウェル組織培養プレートのウェルの中に放出する。適切な組織培養培地および増殖因子を、上記ウェルに添加し得る。上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）ＣＣデバイスフィルタの濾過面積は、上記濾過されたサンプルのトレーサビリティーを保証するために、数字コードつきの外科手術用ｉｎｏｘ（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｎｏｘ）から作製されたＯリングによって境界を定められる。
【００７３】
サンプルから得られた稀な細胞の数を増大させるために、細胞を、同じ希釈血液サンプルの複数の部分から回収し得る。各部分は、異なる濾過デバイスを介して濾過され得る。複数のフィルタが得られる場合、上記フィルタは、上記のように互いに対して連続して置かれ得る。例えば、フィルタは、濾過デバイスから外され得、１：１  Ｍａｔｒｉｇｅｌ／培地（Ｍ／Ｍ）の１００μｌ層の上に置かれ得る。各連続フィルタは、次のフィルタを置く前に７０μｌのＭ／Ｍで覆われる。上記プロセスの最後に、最後のフィルタを、７０μｌのＭ／Ｍで覆い、十分な容積の培養培地（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培養培地）を添加して、積み重ねたフィルタを覆い、三次元培養デバイスを提供する。上記三次元デバイスは、上記細胞を移動および／もしくは培養するために使用され得、また、免疫不全動物に移植され得る。
【００７４】
（実施例２−ＣＴＣを検出するためのＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスの感度）
ＣＴＣを単離するためのＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイス（実施例１に記載される）の感度を、以下のように評価した。２５回の独立した実験を、固定Ｈ２０３０細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からの腺癌非小細胞肺癌細胞株；Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＣＲＬ−５９１４ＴＭ）で行った。上記Ｈ２０３０細胞を、１０％  ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ  １６４０を含むフラスコ中で培養し、トリプシン処理によって回収した。細胞生存度を、トリパンブルー排除によって評価した。生存度が９０％を超えると推定した場合、上記細胞を、以下に記載される実験において使用した。
【００７５】
ホルムアルデヒドで固定した後、上記Ｈ２０３０細胞を、健康なドナーから採血した末梢全血へと添加して、１ｍＬの血液あたり２もしくは５個の固定したＨ２０３０細胞の最終濃度を得、実施例１に示されるように、上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスを介して濾過した。平均濾過時間は、５０秒であった。上記フィルタ上の細胞をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、計数した。上記サンプルにおいて回収されたＨ２０３０細胞の実際の数に対する上記血液サンプルに添加されたＨ２０３０細胞の数を、表１および表２に示す。５個の細胞を添加したサンプルに関しては、回収されたＨ２０３０細胞の平均パーセンテージは、９１．２％であり、平均４．５６±０．７１個の細胞が回収された。表１を参照のこと。５個の細胞を添加したサンプルにおいて、全２５サンプルにおいて３個以上の細胞が検出された。２個の細胞を添加したサンプルに関しては、回収されたＨ２０３０細胞の平均パーセンテージは、７４％であり、平均１．４８０±０．７１個の細胞が回収された。表２を参照のこと。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
【表２】
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細胞喪失のパーセンテージが上記濾過デバイスに関連したか否かを確認するために、Ｈ２０３０細胞を上記に示されるように回収し、固定し、濾過緩衝液を含むエッペンドルフチューブの中に直接ピペットで入れた。細胞を、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機を使用して回収し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。これら条件下で、回収の平均パーセンテージは、２個の細胞を添加したサンプルに関しては８２％、および５個の細胞を添加したサンプルに関しては８８％であった。２個の細胞を添加したサンプルに関して、平均１．６４±０．５７個の細胞が回収された。５個の細胞を添加したサンプルに関しては、平均４．４０±０．７１個の細胞が回収された。直接的な細胞収集に対する上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスの相対感度を、対応のない片側スチューデント検定について計算したＰ値（２個の添加された細胞および５個の添加された細胞について、それぞれ、０．１９および０．２０）、対応のない両側スチューデント検定について計算したＰ値（２個の細胞および５個の細胞について、それぞれ、０．３９および０．４１）、およびフィッシャー検定について計算したＰ値（２個の細胞および５個の細胞について、それぞれ、０．１４および０．３４）によって評価した。これら検定から、上記Ｓｃｒｅｅｎｃｅｌｌ（登録商標）デバイスを介する、またはエッペンドルフチューブの中に直接マイクロピペットで入れられた細胞の直接収集による、２個もしくは５個の添加される腫瘍細胞の収集は、類似の感度を生じることが示された。上記Ｓｃｒｅｅｎｃｅｌｌ（登録商標）デバイスおよび直接収集を使用する異なる系列の試験を介して、２個もしくは５個の添加された腫瘍細胞の２５回の独立した収集の後に、類似の細胞数が失われた。実際に、上記Ｓｃｒｅｅｎｃｅｌｌ（登録商標）デバイスを介して喪失した細胞のパーセンテージは、２個および５個の添加されたＨ２０３０細胞に関しては、それぞれ、２６％（標準偏差（ＳＤ）は０．７１、平均喪失細胞数は０．５２であった）および９％（ＳＤは０．６５、平均喪失細胞数は０．４４であった）であった一方で、直接収集を介したものは、１８％（ＳＤは０．５７、平均喪失細胞数は０．３６であった）および１２％（ＳＤは０．７１、平均喪失細胞数は０．６０であった）であった。対応のない片側スチューデント検定のｐ値から、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｙｔｏデバイスを使用して、もしくは２個もしくは５個の腫瘍細胞での直接収集によって、類似の喪失細胞数が示された。
【００７８】
上記対応のない片側スチューデント検定のＰ値を使用して、上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスを介して、もしくは直接収集によって、５個の添加した腫瘍細胞で得られた結果に対して２個の添加した腫瘍細胞で得られた結果を比較した場合に、有意差は見いだされなかった（２個の添加した腫瘍細胞および５個の添加した腫瘍細胞に関して、それぞれ、０．１９対０．２０）。さらに、上記対応のない片側スチューデント検定のＰ値を使用して、上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスを介して（０．３４）、もしくは直接収集によって（０．１０）、５個の添加された腫瘍細胞で得られた結果に対して２個の添加された腫瘍細胞で得られた結果を比較した場合、有意差は見いだされなかった。まとめると、これら結果は、細胞がマイクロピペット操作（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）を介して本質的に失われたことおよび上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスの回収率が１００％に近かったことを示す。
【００７９】
（実施例３−ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）デバイスを介した濾過後の細胞の生存度および培養）
５回の独立した実験を行って、実施例１のＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）ＣＣデバイスを介した濾過後の腫瘍細胞の生存度を評価した。Ｈ２０３０細胞を、１０％  ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ  １６４０を含むフラスコ中で培養し、トリプシン処理によって回収した。５０個の生きたＨ２０３０細胞を、実施例１に記載されるように、上記濾過デバイスを介して濾過した。トリパンブルー排除試験を使用して、濾過直後の生存細胞を計数した。図８Ａは、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｙｔｏデバイスを介した濾過後の生きたＨ２０３０細胞の顕微鏡写真である。平均％回収は、８５％±９％であった。単離されたＨ２０３０細胞が組織培養において増殖する能力を、８回の独立した実験においてさらに評価した。各実験において、単離されたＨ２０３０細胞は、適切な組織培養条件下で、上記フィルタ上で増殖しかつ拡がる能力があった。図８Ｂは、培養培地中で４日間にわたって上記フィルタを培養した後の図８Ａからの細胞の顕微鏡写真である。
【００８０】
（実施例４−フィルタ上の標的細胞の回収および免疫不全動物への上記フィルタの移入）
ＣＴＣがヒト患者からマウスへ移入され得ることを実証するために、ヒトＨＴ２９結腸直腸癌細胞を、５０％コンフルエントになるまで増殖させ、トリプシン処理して、上記細胞を培養ディッシュの表面から外した。上記細胞をＰＢＳ中で洗浄し、希釈して、終濃度１０，０００細胞／μｌを得た。正常なヒト血液を、滅菌ＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に集め、収集して６０分間以内に使用した。１０００個もしくは１０，０００個のＨＴ２９細胞のいずれかを、６ｍｌの正常ヒト血液に添加し、上記血液を穏やかに混合した。次いで、ＨＴ２９細胞を含む６ｍｌの血液を、１ｍｌのＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）ＬＣ希釈緩衝液で希釈し、２分間にわたって室温においてインキュベートした。２分間のインキュベーション後、１．６ｍｌの培養培地を添加し、次いで、希釈血液８．６ｍｌ全体を、実施例１に記載されるＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）ＣＣデバイスを介して濾過した。濾過の完了後、上記フィルタを、１枚の滅菌ガーゼの上に出した。滅菌鉗子を使用して、上記フィルタを、１００μｌの１：１比  Ｍａｔｒｉｇｅｌ／培地を含む凝固パッドの上に置いた。この凝固Ｍ／Ｍパッドを使用して、外科手術手順の間に細胞を水和した状態に維持した。
【００８１】
上記フィルタを、Ｒａｇ２−／−免疫不全マウスの皮膚の下に移植し、触診によって細胞増殖をモニターした。上記ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（登録商標）フィルタの両側に、３週間以内に腫瘍が発生した。上記マウスを屠殺し、腫瘍が付着した上記フィルタを取り出し、ペトリ皿の中に入れた。上記腫瘍の細胞を培養し、抗体で染色して、上記腫瘍がＨＴ２９細胞に由来することを確認した。Ｈｅｒｒｍａｎｎら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０，５：１〜１０）は、インビボで選択されたＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ ＨＴ２９細胞が癌幹細胞表現型を有したことを示す。
【００８２】
（他の実施形態）
本発明は、前述の詳細な説明および実施例とともに記載されてきたが、前述の説明および実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定しないことが意図される。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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