(57)【要約】  本開示は、病原体不活性化剤としてグリコールを使用した、生物学的組成物中の病原体の不活性化のための使用、方法および組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体不活性化剤としてのグリコールの使用。
【請求項２】
前記グリコールがプロピレングリコールである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
生物学的組成物中の病原体を不活性化させる方法であって、前記生物学的組成物をグリコールと接触させる工程を含む方法。
【請求項４】
前記グリコールがプロピレングリコールである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的組成物が血液組成物または乳組成物である、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
前記病原体が、ウイルス、細菌、菌類、原生動物、寄生虫、およびプリオンからなる群より選択される、請求項３から５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスが、Ｘ−ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、ＢＶＤＶおよびＴＧＥＶウイルスからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記方法により、４Ｌｏｇ10ＴＣＩＤ（組織培養感染量）以上の病原体除去がもたらされ、該ＴＣＩＤがケルバーの方法および／またはスピアマン・ケルバーの方法にしたがう、請求項３から７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記接触工程後のグリコールの濃度が、前記生物学的組成物の４０％（ｖ／ｖ）と５０％（ｖ／ｖ）の間である、請求項３から８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
１５℃と２５℃の間の温度で行われる、請求項３から９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
７．０と８．０の間のｐＨで行われる、請求項３から１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
請求項３から１１いずれか１項記載の方法により得られる、グリコールを含む生物学的組成物。
【請求項１３】
前記グリコールが４０％（ｖ／ｖ）と５０％（ｖ／ｖ）の間の濃度である、請求項１２記載の生物学的組成物。
【請求項１４】
前記グリコールがプロピレングリコールである、請求項１２または１３記載の生物学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的組成物中の病原体の不活性化のための使用、方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的組成物の使用は、治療剤の開発と製造（例えば、組換えタンパク質の製造）にとって重要である。血液組成物などの生物学的組成物は、例えば、血液病を患った患者、出血した患者、または外科手術を受けた患者に関して、輸血によって多くの生命を救う。しかしながら、生物学的組成物中の病原体の存在は、重大な健康上のリスクを呈する。
【０００３】
生物学的組成物中の病原体を不活性化する方法が開発されてきた。典型的な病原体不活性化方法としては、熱処理、溶媒処理および／または洗浄剤処理、ガンマ線照射、ＵＶ処理、および白血球除去に基づく手法が挙げられる。しかしながら、それらの方法の効率および有効性は、病原体の様々な感受性およびいくつかの方法の特定の生物学的組成物との不適合性のために、ばらつきがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
新規の病原体不活性化方法および病原体不活性化剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、生物学的組成物中の病原体を不活性化するための使用、方法、薬剤および組成物に関する。
【０００６】
１つの態様において、本開示は、病原体不活性化剤としてのグリコールの使用に関する。いくつかの実施の形態において、グリコールはプロピレングリコールである。
【０００７】
１つの態様において、本開示は、生物学的組成物中の病原体を不活性化する方法であって、その生物学的組成物をグリコールと接触させる工程を含む方法に関する。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、グリコールはプロピレングリコールである。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、生物学的組成物は血液組成物または乳組成物である。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、病原体は、ウイルス、細菌、菌類、原生動物、寄生虫、およびプリオンからなる群より選択される。いくつかの実施の形態において、ウイルスは、Ｘ−ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、ＢＶＤＶおよびＴＧＥＶウイルスからなる群より選択される。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、前記方法により、ケルバー(Kaerber)の方法および／またはスピアマン・ケルバー(Spearman-Kaerber)の方法にしたがって４Ｌｏｇ10ＴＣＩＤ（組織培養感染量）以上の病原体除去がもたらされる。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、接触工程後のグリコールの濃度は、生物学的組成物の４０％（ｗ／ｗ）と５０％（ｗ／ｗ）の間である。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、接触工程後のグリコールの濃度は、生物学的組成物の４０％（ｖ／ｖ）と５０％（ｖ／ｖ）の間である。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、前記方法は１５℃と２５℃の間の温度で行われる。生物学的組成物中の病原体を不活性化するためのいくつかの実施の形態において、前記方法は、７．０と８．０の間のｐＨで行われる。
【０００８】
１つの態様において、本開示は、グリコールを含む生物学的組成物であって、ここに記載された方法のいずれかにより得られる生物学的組成物に関する。いくつかの実施の形態において、このグリコールは、４０％と５０％の間の濃度である。いくつかの実施の形態において、グリコールはプロピレングリコールである。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は乳組成物または血液組成物である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面は、本明細書の一部を構成し、本開示のいくつかの態様をさらに説明するために含まれる。本開示は、ここに提示された特定の実施の形態の詳細な説明と一緒にこれらの図面の１つ以上を参照することによって、よりよく理解されるであろう。図面は、説明目的のためだけであり、本開示の実施可能性について要求されない。
【図１】４５％のプロピレングリコールを含有するアフィニティー・クロマトグラフィー溶出液中のＴＥＧＶの不活性化を示すグラフ
【図２】４５％のプロピレングリコールを含有するアフィニティー・クロマトグラフィー溶出液中のＢＶＤＶの不活性化を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１つの態様において、本開示は、病原体不活性化剤としてのグリコールの使用に関する。１つの態様において、本開示は、生物学的組成物中の病原体を不活性化する方法であって、その生物学的組成物をグリコールと接触させる工程を含む方法に関する。１つの態様において、本開示は、グリコールを含む生物学的組成物に関する。いくつかの実施の形態において、そのグリコールを含む生物学的組成物は、ここに記載された方法のいずれかにより得られる。
【００１１】
ここに記載された使用、方法および組成物のいくつかの実施の形態において、グリコールはビシナルグリコールである。いくつかの実施の形態において、ビシナルグリコールはプロピレングリコールまたはエチレングリコールである。
【００１２】
「グリコール」（または「ジオール」）という用語は、２つのヒドロキシル基（−ＯＨ）を含有する化合物を称する。「ビシナルグリコール」という用語は、２つのヒドロキシル基が隣接した原子に結合している（例えば、近接位置に）グリコールを称する。
【００１３】
いくつかの実施の形態において、ここに記載された方法および組成物に使用されるグリコールは、２つから６つの炭素を含み、化学式Ｒ1Ｒ2−（Ｃ−ＯＨ）2−Ｒ3Ｒ4を有するビシナルグリコールであり、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、同一でも異なってもよく、各々が水素原子またはアルキル基のいずれかであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の組合せが多くとも２つの炭素原子しか含有しない。ビシナルグリコールの例には、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，２−ブタンジオールおよび１，２−ペンタンジオールがある。
【００１４】
ここに記載された使用、方法および組成物のいくつかの実施の形態において、グリコールはプロピレングリコールまたはエチレングリコールである。
【００１５】
「１，２−ジヒドロキシプロパン」または「メチルグリコール」とも称される「プロピレングリコール」という用語は、プロパン−１，２−ジオールを称し、以下に示す構造式（Ｉ）を有する。
【００１６】
「１，２−ジヒドロキシエタン」とも称される「エチレングリコール」という用語は、エタン−１，２−ジオールを称し、以下に示す構造式（ＩＩ）を有する。
【化１】
2014503305.tif 000003
【００１７】
ここに記載された使用、方法および組成物のいくつかの実施の形態において、グリコールはジェミナルグリコールである。ジェミナルグリコールは、同じ炭素原子に結合した２つのヒドロキシル基を有し、１，２−メタンジオール、１，２−エタンジオールおよび１，２−プロパンジオールを含む。ここに記載された使用、方法および組成物のいくつかの実施の形態において、グリコールは、ヒドロキシル基が同じ炭素原子または隣接する炭素原子に結合していないジオールである。そのようなグリコールの例には、１，３−ブタンジオール、１，４−ペンタンジオール、および１，３−ベンゼンジオールがある。
【００１８】
１つの態様において、本開示は、病原体不活性化剤、そのような薬剤を含む組成物およびその使用に関する。
【００１９】
「病原体」という用語は、ヒトなどの哺乳類において疾病を生じさせることのできる任意の生物学的作用物質（例えば、任意の核酸含有作用物質またはプリオンなどのタンパク質様感染性粒子）を称する。病原体という用語は、一本鎖または二本鎖の形態にある、遺伝物質としてＤＮＡまたはＲＮＡを有する単細胞または多細胞の微生物を含む。この用語は、特に、ウイルス、細菌、菌類、原生動物およびプリオンを含む。細菌の例としては、以下に限られないが、ストレプトコッカス種、エシェリキア種およびバチルス種が挙げられる；ウイルスの例としては、以下に限られないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および他のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ポックスウイルス、トガウイルス、サイトメガロウイルスおよび肝炎ウイルス（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）が挙げられる；寄生虫の例としては、以下に限られないが、マラリア原虫（プラスモジウム種）およびトリパノソーマ原虫が挙げられる。
【００２０】
本開示のいくつかの実施の形態において、不活性化すべき病原体は、ウイルス、細菌、菌類、原生動物、寄生虫およびプリオンからなる群より選択される。
【００２１】
いくつかの実施の形態において、前記病原体はウイルスである。
【００２２】
いくつかの実施の形態において、そのウイルスは、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスである。
【００２３】
エンベロープウイルスは、宿主細胞様「エンベロープ」を有するウイルスであり、その例としては、以下に限られないが、哺乳類または鳥類白血病ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィラウイルスおよびレオウイルスが挙げられる。裸のウイルスとも称される非エンベロープウイルスは、当該技術分野で周知されており、その例としては、以下に限られないが、アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルスおよびヒト乳頭腫ウイルスが挙げられる。
【００２４】
いくつかの実施の形態において、ウイルスは、Ｘ−ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、ＴＧＥＶまたはＢＶＤＶである。「ゼノトロピックマウス白血病ウイルス関連ウイルス」を表す「Ｘ−ＭｕＬＶ」という用語は、ガンマレトロウイルスを称する。「ＰＲＶ」という用語は、仮性狂犬病ウイルスを称する。「伝染性胃腸炎コロナウイルス」を表す「ＴＧＥＶ」という用語は、コロナウイルス科に属する動物ウイルスの種を称する。「牛ウイルス性下痢ウイルス」を表す「ＢＶＤＶ」という用語は、フラビウイルス科のペスチウイルスである。
【００２５】
１つの態様において、本開示は、生物学的組成物中の病原体を不活性化する方法であって、その生物学的組成物をグリコールと接触させる工程を含む方法に関する。
【００２６】
ここに用いたように、「接触させる工程」という用語は、少なくとも２種類の別個の組成物または成分を、それらが相互作用できるように接触させるプロセスを称する。
【００２７】
「生物学的組成物」という用語は、哺乳類を含む生体を起源とする組成物（または物質）を称する。生物学的組成物の例としては、以下に限られないが、血液組成物、乳（トランスジェニック哺乳類からの乳など）、尿、汗、唾液、糞および脊髄液などの臨床サンプル、細胞抽出物、組織抽出物、細胞培養媒質などが挙げられる。ここに用いたように、生物学的組成物は、代用血液などの、生物学的組成物として機能できる合成組成物、および１つ以上の精製工程または分離工程を経た組成物も含む。
【００２８】
本開示によれば、血液組成物としては、以下に限られないが、全血および血液製剤が挙げられる。「血液製剤」という用語は、全血から分離されるであろう１種類以上の成分を称し、細胞血液成分（赤血球、血小板、白血球およびその濃縮物など）、血液タンパク質（血液凝固因子、酵素、アルブミン、プラスミノゲン、イムノグロブリンなど）および血液流体成分（血漿、血漿分画および血清分画など）が挙げられる。いくつかの実施の形態において、血液組成物は、白血球除去されている（例えば、白血球が減少している）。
【００２９】
いくつかの実施の形態において、処理すべき血液組成物は、全血、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、血漿および血漿分画からなる群より選択される。
【００３０】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は乳組成物である。いくつかの実施の形態において、処理すべき乳組成物は、乳内に分泌されるタンパク質を生成するトランスジェニック動物の乳由来である。
【００３１】
いくつかの実施の形態において、前記方法は、乳組成物などの生物学的組成物の、アフィニティー・クロマトグラフィーなどによる精製のプロセスにおける溶出液に行われる。ここに用いた「病原体不活性化」または「病原体を不活性化する」などの用語は、前記病原体の複製(replication)（または繁殖(reproduction)）の抑制または阻害、および／またはそれらの破壊または除去を称する。概して、病原体不活性化剤は、病原体が適切な条件下で複製または繁殖する能力を厳しくまたは少なくとも実質的に妨げる。
【００３２】
特定の方法により、病原体の複製が抑制または阻害されるか否かを判定する方法が、当該技術分野で周知されている。概して、そのような方法は、病原体不活性化剤による処理の前に、（活性）病原体の数を決定し、処理後に（活性）病原体の数を決定する各工程を含む。活性病原体の数を決定する特定の方法は、病原体の性質に依存し、その例としては、コロニー形成アッセイ（活性細菌の数を決定する）および感染アッセイ（「活性」ウイルスの数を決定する）が挙げられる。活性ウイルスの数の尺度の１つは組織培養感染量（ＴＣＩＤ）であり、これは、例えば、ケルバーの方法および／またはスピアマン・ケルバーの方法により決定できる（例えば、Karber, G. (1931). Arch. J. Exper. Path. u. pharmakol., 162, 480; Spearman (1908). Brit. J. Psychol., 2:227-242を参照のこと）。
【００３３】
いくつかの実施の形態において、本開示の方法により、４Ｌｏｇ10ＴＣＩＤ以上の病原体除去がもたらされる。病原体除去は、実施例に説明されるように、ケルバーの方法および／またはスピアマン・ケルバーの方法により計算してよい。
【００３４】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、接触工程後には、病原体の量を、例えば、所望のレベル未満まで、不活性化させる、除去する、または低下させるのに十分な量のグリコールを含有する。いくつかの実施の形態において、接触工程後の生物学的組成物中のグリコール濃度は、組成物の１０％と７５％（ｗ／ｗ）の間、１５％と７０％（ｗ／ｗ）の間、２０％と６５％（ｗ／ｗ）の間、２５％と６０％（ｗ／ｗ）の間、３０％と６０％（ｗ／ｗ）の間、３５％と５５％（ｗ／ｗ）の間、または４０％と５０％（ｗ／ｗ）の間である。いくつかの実施の形態において、接触工程後の生物学的組成物中のグリコール濃度は、組成物の１０％と７５％（ｖ／ｖ）の間、１５％と７０％（ｖ／ｖ）の間、２０％と６５％（ｖ／ｖ）の間、２５％と６０％（ｖ／ｖ）の間、３０％と６０％（ｖ／ｖ）の間、３５％と５５％（ｖ／ｖ）の間、または４０％と５０％（ｖ／ｖ）の間である。
【００３５】
要求はされないが、一般に、病原体を含む生物学的組成物のグリコールへの曝露の長さにより、病原体の不活性化が増加することが予測される。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、病原体除去を４Ｌｏｇ10ＴＣＩＤ（細胞培養感染量）以上にできる期間に亘りグリコールに接触させられる。
【００３６】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１２００分間、少なくとも１５０分間、少なくとも１８０分間、少なくとも２１０分間、少なくとも２４０分間、少なくとも３００分間、少なくとも３６０分間、少なくとも２５００分間、少なくとも１０００分間、またはそれより長い期間に亘り、グリコールと接触させられる。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、１５分間と３６０分間の間、６０分間と２４０分間の間、または９０分間と１８０分間の間の期間に亘り、グリコールと接触させられる。いくつかの実施の形態において、グリコールは、特定の量の病原体不活性化が達成された後に、生物学的組成物から除去される。いくつかの実施の形態において、グリコールは、病原体の不活性化後に、生物学的組成物中に存在したままである。
【００３７】
いくつかの実施の形態において、ここに記載された方法は、１０℃と３０℃の間、１２℃と２８℃の間、または１５℃と２５℃の間の温度で行われる。
【００３８】
いくつかの実施の形態において、ここに記載された方法は、４と１１の間、５と１０の間、６と９の間、６．５と８．５の間、または７と８の間のｐＨで行われる。いくつかの実施の形態において、ここに記載された方法は、おおよそ７．５のｐＨで行われる。いくつかの実施の形態において、ここに記載された方法は、７．５のｐＨで行われる。当業者は、特定の生物学的組成物にとってどのｐＨ範囲が許容されるかを決定するために、文献に頼ることができる。
【００３９】
いくつかの実施の形態において、前記方法は、ナノ濾過法などのウイルス除去のさらに別の工程を含む。
【００４０】
いくつかの実施の形態において、前記方法は、生物学的組成物の、アフィニティー・クロマトグラフィーなどの精製プロセスにおいて、溶出段階で行われる。いくつかの実施の形態において、グリコールは親和溶出緩衝液に加えられる。いくつかの実施の形態において、親和溶出緩衝液は、５０ｍＭのトリス、４５％（ｗ／ｗ）のプロピレングリコール、および１．５ＭのＮａＣｌを含み、７．５のｐＨを有する。いくつかの実施の形態において、親和溶出緩衝液は、５０ｍＭのトリス、４５％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコール、および１．５ＭのＮａＣｌを含み、７．５のｐＨを有する。
【００４１】
いくつかの実施の形態において、ここに記載された方法は、生物学的組成物を多量のアブラナ油(cruciferous oil)またはアルギニンと接触させる工程を含まない。
【００４２】
ここに用いた多量のアルギニンは、接触工程後の、少なくとも０．２Ｍの、少なくとも０．０１Ｍの、または少なくとも０．００１Ｍのアルギニン濃度に相当する。
【００４３】
ここに用いた多量のアブラナ油は、接触工程後の、少なくとも０．１％の、少なくとも０．０１％の、または少なくとも０．００１％のアブラナ油の濃度に相当する。
【００４４】
１つの態様において、本開示は、病原体を不活性化するためのグリコールを含む生物学的組成物であって、ここに記載された方法のいずれかなどによって、生物学的組成物をグリコールと接触させることによって得られる生物学的組成物に関する。
【００４５】
いくつかの実施の形態において、グリコールはプロピレングリコールまたはエチレングリコールである。
【００４６】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物中のグリコール濃度は、組成物の１０％と７５％（ｗ／ｗ）の間、１５％と７０％（ｗ／ｗ）の間、２０％と６５％（ｗ／ｗ）の間、２５％と６０％（ｗ／ｗ）の間、３０％と６０％（ｗ／ｗ）の間、３５％と５５％（ｗ／ｗ）の間、または４０％と５０％（ｗ／ｗ）の間である。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物中のグリコール濃度は、組成物の１０％と７５％（ｖ／ｖ）の間、１５％と７０％（ｖ／ｖ）の間、２０％と６５％（ｖ／ｖ）の間、２５％と６０％（ｖ／ｖ）の間、３０％と６０％（ｖ／ｖ）の間、３５％と５５％（ｖ／ｖ）の間、または４０％と５０％（ｖ／ｖ）の間である。
【００４７】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、ＴＷＥＥＮ２０またはＴＷＥＥＮ８０などの洗浄剤も含む。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、ＴＮＢＰ（リン酸トリ−Ｎ−ブチル）などの溶媒も含む。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、グリコールとの接触前に洗浄剤を含んだ。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、グリコールとの接触前に、洗浄剤と接触させられる。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、グリコールとの接触と同時に、洗浄剤と接触させられる。いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、グリコールとの接触後に、洗浄剤と接触させられる。
【００４８】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、多量のアルギニンを含まない。
【００４９】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、多量のアブラナ油を含まない。
【００５０】
いくつかの実施の形態において、生物学的組成物は、多量のアルギンもアブラナ油もいずれも含まない。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本開示の方法を実施する実施の形態および組成物を製造する実施の形態のいくつかを記載している。しかしながら、これらの実施例は、説明目的のためだけであり、本開示の範囲を制限することを意図していないことが理解されよう。本出願の至る所に挙げられた文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属の特許出願を含む）の全ての中身全体は、引用により明白にここに含まれる。
【００５２】
材料および方法
アフィニティー・クロマトグラフィー溶出液中に４５％（ｖ／ｖ）で存在するプロピレングリコール（ＰＧ）による２つのエンベロープウイルス（ＴＧＥＶおよびＢＶＤＶ）の不活性化を評価した。関心のあるトランスジェニックタンパク質（乳中に分泌される、そのタンパク質を産生するトランスジェニック動物由来の乳組成物中の）の産生中に、溶出液が生成された。
【００５３】
細胞毒性、ウイルス干渉および抑制(quenching)
出発材料（溶出液）の細胞毒性、ウイルス干渉および抑制のパラメータを、ＰＧの存在下でのインキュベーションアッセイの前に判定した。細胞毒性、ウイルス干渉および抑制を判定するためのアッセイを、アフィニティー・クロマトグラフィーの溶出液サンプルについて行った。
【００５４】
細胞毒性
出発材料の細胞毒性パラメータを、表１の条件を使用して評価した：
【表１】
2014503305.tif 000004
【００５５】
サンプルマトリクスの非細胞毒性濃度は、マトリクス中にインキュベーションされた細胞の細胞外層のどのような破壊も含まないサンプルマトリクスの最初の希釈と定義される。
【００５６】
このアッセイにおいて＋３日目に得られた細胞毒性パラメータは、ウイルス干渉条件を決定するために使用され、＋６日目に確認された。
【００５７】
ウイルス干渉制御およびサンプル抑制
ウイルス干渉制御およびサンプル抑制のパラメータを同時に決定した。
【００５８】
滴定システムに関するサンプルのウイルス干渉パラメータを評価した。このアッセイは、培地中の滴定と比較した、サンプルマトリクス中のウイルスＢＶＤＶおよびＴＧＥＣの希釈滴定（第１の希釈点：先に決定した非細胞毒性マトリクス）からなる。ウイルスの適切な希釈を決定する前に、実際のアッセイには、Ｔ０、Ｔ５およびＴ１５での画分の滴定の前に、１５〜３０分間の待ち時間があるので、アッセイ環境を模倣するために、４℃での３０分間のインキュベーション期間をとった。
【００５９】
両方の滴定系（ＳＴ細胞およびＭＤＢＫ細胞）によるマトリクスの潜在的干渉を、表ＩＩに示された動作条件にしたがって、評価した。
【表２】
2014503305.tif 000005
【００６０】
１．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬを超える差が、サンプルマトリクス（溶出液）中の滴定と培地中の滴定との間に観察された場合、マトリクスによるウイルス干渉／抑制が、有意であると判定した。
【００６１】
プロセス
動作条件
プロピレングリコール（ＰＧ）によるエンベロープウイルス（ＴＧＥＶおよびＢＶＤＶ）の不活性化の反応速度(kinetics)は、これらのウイルスを２０℃（±５℃）で６時間に亘り、トランスジェニックタンパク質の精製プロセス中に得られた、４５％（ｖ／ｖ）のＰＧを含有するアフィニティークロマトグラフィーの溶出液と接触させることによって評価した。ウイルスは、５％（ｖ／ｖ）の濃度でサンプルに加えた。各ウイルスについて、アッセイは二重に行った。
【００６２】
材料
出発材料はアフィニティー・クロマトグラフィー溶出液であった。この出発材料に、５％（ｖ／ｖ）のウイルスで加えた。
【００６３】
このアッセイに使用したＴＧＥＶおよびＢＶＤＶのウイルス懸濁液の条件が、表ＩＩＩ（ＴＥＧＶ）および表Ｖ（ＢＶＤＶ）に記載されている。
【表３】
2014503305.tif 000006
【表４】
2014503305.tif 000007
【００６４】
それぞれの細胞培養培地（ＳＴ細胞およびＭＤＢＫ細胞について）を中和工程中に使用した。この中和は、細胞毒性、ウイルス干渉およびマトリクス抑制についてのアッセイにおいて決定した濃度で行った。
【００６５】
アッセイ
ビーカーを、２０℃±５℃の加熱装置に入れた。このビーカーを、マグネチックスターラー上に配置し、処理前に２０℃±５℃に維持した。
【００６６】
各アッセイについて、出発材料のアリコート（２０ｍＬ）を２０℃±５℃の水浴中で解凍した。解凍後、温度をチェックした。
【００６７】
ウイルス懸濁液の各アリコート（≧１ｍＬ）を周囲温度で解凍した。約０．１ｍＬのアリコートを−６５℃未満の温度で貯蔵した。このウイルス懸濁液を使用して、５％のウイルスを含有する出発材料のサンプルを作製した。
【００６８】
処理は、４５％のＰＧを含有する１９ｍＬのマトリクス（アフィニティー・クロマトグラフィーの溶出液から得た）１９ｍＬ中に１ｍＬ（５％）のウイルス懸濁液の添加からなる。
【００６９】
急速な均一化および混合物の温度のチェック後に、サンプルアリコート（１ｍＬ）を採取し、培地（使用した細胞株に応じて、ＳＴ細胞培養培地またはＭＤＢＫ細胞培養培地）で抑制した。添加した細胞培養培地の容積は、細胞毒性、干渉およびウイルス抑制研究において得られたデータに依存した。このサンプルは「Ｔ０」を構成した。
【００７０】
ウイルス添加材料（４５％（ｖ／ｖ）でＰＧを含有する）を「Ｔ０」サンプルに関してと同様に２０℃±５℃で６時間に亘りインキュベーションし、Ｔ＝５分、Ｔ＝１５分、Ｔ＝６０分、Ｔ＝１８０分、Ｔ＝３６０分のインキュベーション期間後に、１ｍＬのサンプルアリコートを採取（し、直ちに希釈）した。
【００７１】
溶出液マトリクスの様々なインキュベーションアッセイ中に採取したサンプル「ＦＶＩＩセレクト」（４５％でＰＧを含有する）が、表Ｖに要約されている。
【表５】
2014503305.tif 000008
【００７２】
サンプルは、滴定後に、−６５℃未満の温度で貯蔵した。それに加え、非細胞毒性かつ非干渉の濃度に希釈したマトリクスにＴＧＥＶウイルスおよびＢＶＤＶウイルスを添加することによって、低ウイルス量、平均ウイルス量および高ウイルス量で対照を作製した。
【００７３】
以下の条件が満たされた場合、４５％のＰＧを含有するマトリクスのインキュベーションアッセイは成功したと考えた：
・  ２０℃±５℃の温度および６時間のインキュベーション期間、
・  計画通りのサンプルアリコートの採取。
【００７４】
プロセスのサンプルの滴定
上述したアッセイ中に作製したサンプルの滴定は同じ日に行った。
【００７５】
滴定プロトコル
表ＩＩＩに示されたサンプルのウイルスの滴定は、ＴＧＥＶに関する研究Ｌ−５０およびＢＶＤＶに関する研究Ｌ−３１９にしたがって行った。
【００７６】
滴定は３工程で行った：９６穴プレートの播種、標準滴定またはＬＶＰ（大容量平板培養）におけるそのプレートの感染および力価の決定。
【００７７】
各ウイルスの滴定に関する９６穴プレートの播種条件が表ＶＩに記載されている。
【表６】
2014503305.tif 000009
【００７８】
各ウイルスについて：
・  第１の実験により得られたサンプル（表Ｖ）を標準プロトコルによって最初に滴定した、
・  標準プロトコルによりウイルスが検出されなかった第１の実験により得られた分画を、第２の実験により得られたサンプルに類似の大容量平板培養（ＬＰＶ）において分析した、
・  標準プロトコルにおいてウイルスが検出されなかった場合、第１のサンプルと最後のサンプル（６時間のインキュベーション後に採取したサンプル）を、ＬＶＰを使用して、最小限に滴定した。
【００７９】
滴定は、サンプルを冷凍せずに、処理アッセイ直後に行った。
【００８０】
標準滴定
培養上清を除去し、滴定すべきサンプルの２０μＬで置き換えた。
【００８１】
３７℃での１時間のインキュベーション後、１３０μＬの培地を各穴に加えた。ウイルスの増殖により、細胞外層の全破壊または部分破壊が生じた。
【００８２】
各希釈について、ケルバーの方法および／またはスピアマン・ケルバーの方法にしたがって統計分析を行えるようにするために、１２の感染複製を行った（例えば、Chapter 5 of "Virology Labfax", Bios Publishers (plus Academic Press (US), or Blackwell non-US, 1993 ; Karber, G. (1931). Arch. J. Exper. Path. u. pharmakol., 162, 480; Spearman (1908). Brit. J. Psychol., 2:227-242を参照のこと）。
【００８３】
ＬＶＰ滴定
「ｎ」の複製におけるウイルス滴定法「大容量平板培養」により、試験されるサンプル容量を増加させることができ、それゆえ、検出限界を増加させることができる。分析は、サンプル希釈を一回だけ使用して行い、１枚以上の９６穴プレートの全ての穴に配置したことを除いて、プロトコルは標準滴定と同一である。統計分析は、スピアマン・ケルバーの方法にしたがって行った。
【００８４】
対照
サンプル滴定と並行して、以下の対照を作製した：
・  各一連の滴定に、負の対照を使用した。この対照は、培地（一連の滴定に使用した）のサンプル滴定に使用した条件による滴定からなる。  
・  各一連の滴定に、正の対照も使用した。この研究において、正の対照として、ＢＶＤＶおよびＴＧＥＶを使用した。これらの正の対照の力価は、６．０８ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬ±０．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬおよび６．４１ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬ±０．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬであった。
【００８５】
滴定アッセイの有効性
滴定アッセイは、以下であれば、有効であると考えた：
・  細胞外層の破壊が負の対照に観察されなかった。  
・  サンプル滴定が、少なくとも３回の連続希釈について、０％と１００％の間の正の穴の率を示す。  
・  サンプルの少なくとも最後の希釈について、０％と等しい正の穴の率が認識される。
【００８６】
力価、負荷(charge)および減少係数の計算
６日間のインキュベーション期間後（各ウイルスについて）、各希釈の各穴について、細胞外層の全破壊または部分破壊を有した細胞の数を数量化した（４０倍および／または１００倍のサイズの顕微鏡により）。各穴のウイルス力価をＴＣＩＤ50／ｍＬ（ｌｏｇ10で）で表されたケルバーの式にしたがって決定した。
【００８７】
ウイルス懸濁液の力価は、ケルバーの方法にしたがって計算した。ウイルスの滴定は、±０．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬの不確実性で与えられ、式：
【数１】
2014503305.tif 000010
【００８８】
式中、ｐiは、希釈ｉでの正の穴の率であり、
ｑiは、希釈ｉでの負の穴の率である、
により計算した。
【００８９】
しかしながら、ウイルスが、サンプルの最初に試験した希釈時のみに観察され、その感染率が１００％未満であった場合、ＴＣＩＤ50／ｍＬで表されるウイルスの対数濃度は、スピアマン・ケルバーの方法の式：
【数２】
2014503305.tif 000011
【００９０】
式中、Ｃは、ＴＣＩＤ50／ｍＬで表されるウイルス濃度であり、
νは、穴毎の接種材料容積であり、
ｎは、各希釈についての接種した穴の数であり、
ｒは、感染した穴の数である、
にしたがって計算した。
【００９１】
デシマル値でここに表されたウイルス量および力価について、サンプル中の総ウイルス量は、以下の式：
総ウイルス量＝力価×サンプル容積（ｍＬ）
にしたがって、力価およびサンプル容積により計算した。
【００９２】
減少係数（ＲＦ）は、＜＜Ｔ０＞＞サンプル中のウイルス量と比較して計算した。
【００９３】
ＲＦ＝（「Ｔ０」における総ウイルス量）／（後の時間で採取したサンプル中の総ウイルス量）。
【００９４】
結果
アフィニティークロマトグラフィー溶出液（４５％のＰＧの存在下）についてのＴＧＥＶ研究
結果が、表ＶＩＩに記載され、図１に図示されている。
【表７】
2014503305.tif 000012
【００９５】
アフィニティークロマトグラフィー溶出液（４５％のＰＧの存在下）についてのＢＶＤＶ研究
結果が、表ＶＩＩＩに記載され、図２に図示されている。
【表８】
2014503305.tif 000013
【００９６】
アフィニティークロマトグラフィー溶出液（４５％のＰＧの存在下）についてのＸ−ＭｕＬＶ研究およびＰＲＶ研究
類似の研究を、Ｘ−ＭｕＬＶウイルスおよびＰＲＶウイルスを使用し、標準偏差の決定を含む、４５％のＰＧで溶出したアフィニティークロマトグラフィーについて行った。
【００９７】
結果が、表ＩＸおよびＸに記載されている。
【表９】
2014503305.tif 000014
【表１０】
2014503305.tif 000015
【００９８】
先に記載した明細書は、当業者が本発明を実施可能にするのに十分であると考えられる。実施例は、本発明の１つの態様のたった１つの説明であり、他の機能的に同等な実施の形態は、本発明の範囲に含まれるので、本発明は、与えられた実施例による範囲に制限されるものではない。本発明の様々な改変は、ここに示され記載されたものに加え、先の説明から当業者に明らかになり、付随の特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点および目的は、必ずしも、本発明の各実施の形態により包含されていない。
【図１】
2014503305.tif 000016
【図２】
2014503305.tif 000017
【国際調査報告】
2014503305.tif 000018
2014503305.tif 000019
2014503305.tif 000020