(57)【要約】アリルアミンまたはポリアリルアミンで誘導される多孔質媒体粒子のクロマトグラフ媒体は、直接またはその表面およびさらなる官能基で機能化された媒体の表面の分子間重合経て得られている。そのような媒体は特に、生体分子を分離するのに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子表面上にアリルアミンまたはポリアリルアミンを誘導された多孔質媒体粒子を含むクロマトグラフ媒体。
【請求項２】
前記多孔質媒体粒子が、エポキシ化またはハロアルキル化された、シリカ、キトサン、セルロース、アガロース、ポリスチレン、ポリアクリレートまたはポリメタクリレート、およびポリジビニルベンゼンからなる群から選択される粒子を含む多孔質媒体粒子である、請求項１に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項３】
前記多孔質媒体粒子が、エポキシ化またはハロアルキル化されたポリアクリレートポリマーまたはポリメタクリレートポリマーを含む、請求項２に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項４】
前記粒子表面上にアリルアミンまたはポリアリルアミンを誘導された多孔質媒体粒子が、高分子樹脂の表面上のアリルアミンまたはポリアリルアミンの末端のアミノ基と少なくとも１つの他の機能化試薬との反応によりさらに官能化される、請求項１に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項５】
前記粒子表面上にアリルアミンまたはポリアリルアミンを誘導された多孔質媒体粒子が、高分子樹脂の表面上のアリルアミンまたはポリアリルアミンの末端のアミノ基と少なくとも１つの他の機能化試薬との反応によりさらに官能化される、請求項３に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項６】
前記少なくとも１つの他の機能化試薬が、酸無水物、スルホン化試薬、塩化アルキル、および第四級アンモニウム官能基を含有する塩化アルキルならびにこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項７】
前記機能化試薬が、環状カルボン酸無水物、不飽和カルボン酸無水物、亜硫酸水素塩、塩化アルキル、アルキル無水物、第四級アンモニウム官能基を含有する塩化アルキルおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項８】
前記少なくとも１つの他の機能化試薬が、グルタル酸無水物、無水コハク酸、無水マレイン酸、メタ亜硫酸水素ナトリウム、塩化ブチリル、無水酢酸、無水酪酸、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチル塩化アンモニウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項９】
前記多孔質媒体粒子が、分子量２５００未満のポリアリルアミンで誘導されている、請求項１に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項１０】
請求項１に記載のクロマトグラフ媒体で充填されているクロマトグラフィ用カラム。
【請求項１１】
請求項３に記載のクロマトグラフ媒体で充填されているクロマトグラフィ用カラム。
【請求項１２】
請求項５に記載のクロマトグラフ媒体で充填されているクロマトグラフィ用カラム。
【請求項１３】
請求項８に記載のクロマトグラフ媒体で充填されているクロマトグラフィ用カラム。
【請求項１４】
請求項１０に記載のクロマトグラフィカラムに溶液を通し、かつ前記溶液の成分を溶出する工程を含む、溶液成分の分離プロセス。
【請求項１５】
請求項１１に記載のクロマトグラフィカラムに溶液を通し、かつ前記溶液の成分を溶出することを含む、溶液成分の分離プロセス。
【請求項１６】
請求項１２に記載のクロマトグラフィカラムに溶液を通し、かつ前記溶液の成分を溶出することを含む、溶液成分の分離プロセス。
【請求項１７】
請求項１３に記載のクロマトグラフィカラムに溶液を通し、かつ前記溶液の成分を溶出することを含む、溶液成分の分離プロセス。
【請求項１８】
溶液が、生体分子を含有する溶液である、請求項１４に記載の分離プロセス。
【請求項１９】
エポキシ基またはハロアルキル基を含有する固体多孔質媒体粒子とアリルアミンまたはポリアリルアミンの誘導体とを反応させることを含むクロマトグラフ媒体の作製方法。
【請求項２０】
前記ポリアリルアミンが、アリルアミンまたは分子量２５０００以下のポリアリルアミンとの反応により、またはグラフトされたアリルアミンの分子間重合により得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｉ）エポキシ基またはハロアルキル基を含有する固体多孔質媒体粒子をアリルアミンと反応させて、アリルアミンでグラフトされたポリマーを形成する工程、および
ｉｉ）アリルアミンでグラフトされた前記ポリマーの分子間重合を開始する工程、
を含む、クロマトグラフ媒体の作製方法。
【請求項２２】
前記分子間重合を開始する工程が、ラジカル開始剤および過剰のアリルアミンで開始される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ラジカル開始剤が、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化アセチルまたは過酸化ベンゾイルからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一連の新規なクロマトグラフ媒体の調製および生体分子の分離および精製、より具体的には、抗体および他の関連するタンパク質の分離および精製を目的とした媒体の使用方法に関する。本発明は、主なリガンドとしてアリルアミンおよびポリアリルアミンに基づく新規なクロマトグラフ媒体ならびに、異なる官能基で修飾して、独特の分離特性を有するイオン交換クロマトグラフ媒体、疎水性クロマトグラフ媒体および他の機能性クロマトグラフ媒体を調製する方法を開示する。本発明は、そのクロマトグラフ媒体の独特のリガンド構造、作製方法および独特の分離性能に起因して、市販のクロマトグラフ媒体と異なる。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフ法は一般的に、生体分子の分離および精製において最も重要な手法である。上流技術の急速な発展により、治療用生体分子は、今では大量かつ高濃度で製造されうる。下流工程の出発物質の不純物プロファイルは、発現系、増殖媒体種類および滴定濃度などの種々の要因によって決まる。このことは、最少工程の粗精製法によって除去されるに違いない様々なプロセスおよび生成物に関連する不純物をもたらす。しかしながら、性能および分離効率の点で、下流での改善において増加する付随物はない。これらの要求に応えるため、性能および分離効率と結びついている高性能のタンパク質を有するクロマトグラフ媒体が、活発に開発されている。
【０００３】
一般に、ほとんどのクロマトグラフ媒体は、異なる種類の吸着および分離を与える特定の機能性リガンドを伴うシリカまたはポリマー物質に基づく。例えば、スルホン酸またはカルボン酸などのアニオン性リガンドは正に帯電した溶質を吸着し、それゆえ、カチオン交換機構に基づく分離を行い、そして適切なｐＨでアミンなどのカチオン性リガンドは負に帯電した溶質を吸着し、それゆえ、アニオン交換機構に基づく分離を行う。基本的には、リガンドの性質は、その分離機構を決定し、リガンドの密度は、媒体の性能において大きな役割を担う。当該媒体性能も、表面積および細孔容積などの多くの他の要因によって制御され、疎水性およびリガンドの構造などの要因は結合およびそれによる分離特性を決定する。加えて、リガンドおよび媒体の表面骨格に結合するスペーサーの性能もまた、スペーサーの親水性または疎水性に従う分離に影響する。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（マクロプレプ）（登録商標）イオン交換支持体（バイオラッド社）、ＰＯＲＯＳ（ポロス）（登録商標）（アプライドバイオシステムズ社）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（セファロースファストフロー）（登録商標）（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（トヨパール）（登録商標）（東ソーバイオサイエンス社）、ＰｏｌｙＰＥＩおよびＰｏｌｙＣＳｘ（アバターパホーマンスマテリアルズ社（以前のＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（ママリンクロット・ベイカー）社））などの市販のクロマトグラフ媒体は、表面に結合した異なる機能性イオン交換基および疎水性基を含有し、そして異なる種類の専用スペーサーまたはコーティングを有する。例えば、ポリアミンは、特許文献１に記載されているクロマトグラフ媒体において用いられており、ポリエチレンイミンは特許文献２に開示されているクロマトグラフ媒体生成物において用いられている。
【０００４】
特許文献１において、アニオン交換体は、高分子量ポリアミン、好ましくは少なくとも５０，０００の分子量を有するポリエチレンイミンでポリマー表面を修飾して調製された。特許文献３において、ポリマー表面は、ポリエチレンイミンで修飾されクロマトグラフィ分離のための所望の表面特性を与える。このプロセスにおいて、第一級アミノ基および第二級アミノ基は、ポリマー表面にも導入された。そのようなアミノ基は、さらに種々のクロマトグラフィリガンドとさらに反応して、強カチオン交換媒体弱カチオン交換媒体および疎水性媒体などの異なる媒体を調製するために用いられた。典型的には、修飾されたポリマーの全窒素含有量は、４〜７％であった。
【０００５】
以前の特許文献４および特許文献５において、ポリマー骨格表面は、ビニル基を含有する分子またはポリエチレンイミンのどちらかで修飾されており、クロマトグラフィ分離用媒体に所望の表面特性を与えた。それらの媒体において、第一級アミノ基および第二級アミノ基も、ポリマー表面の骨格に導入された。それらの第一級アミノ基または第二級アミノ基は、さらに種々のクロマトグラフィリガンドと反応して、強カチオン交換体、弱カチオン交換体、および疎水性の媒体などの異なる媒体を調製するために用いられた。
【０００６】
それゆえ、生体分子の分離においても適切に用いることのできる、改善されたクロマトグラフ媒体およびそれらの作製方法への要望がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１３４７２９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５５１，２４５号明細書
【特許文献３】米国特許第２００５／０２０３０２９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／００３９２２号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０９４５８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タンパク質精製用のアリルアミンおよびアリルアミン誘導体に基づく新規なクロマトグラフ媒体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、エポキシ基含有固体多孔質媒体支持体またはハロアルキル含有固体多孔質媒体支持体（例えば、アリルアミンまたは分子量２５０００以下のポリアリルアミンと反応させて直接得られるそのポリアリルアミン誘導体を伴ったエポキシ化ポリメタクリレートまたはハロアルキル化ポリメタクリレートなど）と反応させることにより、またはグラフトされたアリルアミンと分子間重合することにより、クロマトグラフ媒体および新規なクロマトグラフ媒体の調製方法を提供する。固体のクロマトグラフ媒体支持体の骨格表面にアリルアミンまたはポリアリルアミンを伴う得られた支持体は、その後、他の好適な試薬で官能化して、さらに機能化され、種々の機能性イオン交換媒体または疎水性媒体を提供してよい。アリルアミン誘導体は、置換または無置換のポリアリルアミンを包含する。エポキシ基含有ポリマーまたはハロアルキル基含有ポリマーなどの多孔質固形媒体支持体は、球形ポリマー、特に３５〜１１０ミクロンの平均直径を有するポリメタクリレートまたは同様のポリマーでありうる。本発明での使用に好適なエポキシ基またはハロアルキル基を有する他の多孔質固体支持体は、例えば、エポキシ化またはハロアルキル化されたポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルベンゼン、シリカ、キトサン、セルロース、およびアガロース系ビーズを包含する。タンパク質のクロマトグラフィ分離に用いられる高分子材料は、好ましくは、以下の特定の特性を有しているだろう、
１）細孔径は十分に大きく、樹脂粒子の内外でタンパク質と同じくらいの大きさの分子を素早く拡散させる、
２）当該樹脂粒子は硬くなり、クロマトグラフィの操作においてかけられる圧力下で圧縮および流量のロスを回避する、および
３）当該樹脂は、分離プロセスの全条件下で化学的に安定である。
【００１０】
本発明において、直接または分子間重合を通して得られるアリルアミンおよび分子量２５０００未満のポリアリルアミン誘導体は、主なリガンドとして用いられ得、そして独特の性質を有する弱アニオン性のクロマトグラフ媒体、弱カチオン性のクロマトグラフ媒体および疎水性のクロマトグラフ媒体として用いられるようにも修飾されうる。アリルアミンまたはポリアリルアミンリガンドで製造させる弱アニオン性媒体は、直接タンパク質分離に用いられ得、またはさらに強カチオン交換媒体、強アニオン交換媒体または疎水性のクロマトグラフ媒体を製造するために、さらに変性されうる。基本的に、アリルアミンまたはポリアリルアミンのアミノ基は、ポリマー中のエポキシまたはハロゲン基と反応して、直接用いられる場合、弱アニオン交換を提供しうる。加えて、残留するアミノ基は、異なる機能性試薬とさらに反応し、カチオン交換、アニオン交換または疎水性の媒体などの異なる機能性を有するクロマトグラフ媒体を生成しうる。また、アリルアミンが反応物質として用いられる場合、その二重結合は、分子間重合およびさらなる機能化の可能性を与え、新たなイオン交換媒体または疎水性媒体を提供する。
【００１１】
本発明をよりよく理解するため、他の、ならびにさらなる目的および利点と一緒に、参照点は、付随した実施例を併用して、以下の詳細な説明になさる。そして本発明の範囲は、添付する請求項に示される。以下の詳細な説明は、上記の利点を説明することで、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１に従って調製された媒体を用い、実施例２の手順によるタンパク質分離の溶出プロファイル（ＵＶ検出器で記録）のグラフである。
【図２】実施例３に従って調製された媒体を用い、実施例４の手順によるタンパク質分離の溶出プロファイル（ＵＶ検出器で記録）のグラフである。
【図３】実施例５に従って調製された媒体を用い、実施例６の手順によるタンパク質分離の溶出プロファイル（ＵＶ検出器で記録）のグラフである。
【図４】実施例７に従って調製された媒体を用い、実施例８の手順によるタンパク質の分離の溶出プロファイル（ＵＶ検出器で記録）のグラフである。
【図５】実施例９に従って決定された結合性能のチャートである。
【図６】実施例１０に従って決定された結合性能のチャートである。
【図７】実施例１１に従って決定された結合性能のチャートである。
【図８】実施例１２に従って決定された結合性能のチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、エポキシ基またはハロアルキル基を有する球形の固体多孔質媒体から新規なクロマトグラフ媒体の調製および使用に関する。本発明に従って、アリルアミンまたはそのポリアリルアミン誘導体は、多孔質媒体の変性およびその後、好適な官能基を有する異なるリガンドを用いてさらに機能化するために用いられる。本発明によれば、強カチオン交換媒体は、（１）アリルアミンをエポキシ基またはハロアルキル基を含有する多孔質固形媒体ビーズと反応させる工程、（２）得られたアリルアミンの修飾された媒体をさらに他の官能基（例えば、無水マレイン酸）と反応させる工程、ならびにその後の（３）生成物をメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２０５）と反応させる工程、によって調製されうる。反応温度および反応継続期間は、それぞれ４０℃〜８０℃および約３時間〜約１６時間で、変更されうる。アリルアミンまたはポリアリルアミン誘導体媒体粒子との反応に好適な他の好適な機能化試薬は、例えば、環状カルボン酸無水物（グルタル酸無水物およびコハク酸無水物など）、不飽和カルボン酸無水物（無水マレイン酸など）、スルホン化剤（亜硫酸水素塩およびナトリウムメタ亜硫酸水素塩など）、塩化アルキルまたは無水物（塩化ブチリルおよび無水酢酸または酪酸無水物、ならびに４級アンモニウム官能基を含有する塩化アルキル（（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチル塩化アンモニウムなど）、およびこれらの機能化試薬混合物である。
【００１４】
一実施形態において、主なリガンドの調製は、２５０００未満の分子量を有するポリアリルアミンを、アミン官能基と反応しうるエポキシ基またはハロアルキル基（例えば、クロロメチル基、ブロモメチル基など）を含有する固体多孔質粒子と反応させることにより行われる。あるいは、同様の主なアリルアミンリガンドは、アリルアミンをエポキシ基またはハロアルキル基を含有する固体多孔質粒子と反応させることにより調製され、次いで、典型的なフリーラジカルまたは他の重合プロセスのいずれかの分子間重合を経て結合したアリルアミンを重合することにより調製されうる。
【００１５】
別の実施形態において、主なリガンドの調製はアリルアミンをエポキシ基またはハロアルキル基（クロロメチル基、ブロモメチル基）を含有する固体多孔質粒子、または、他の好適な反応性部位との第１の反応によるアリルアミンの分子間重合を経、その後、グラフトされたアリルアミンを過剰のアリルアミンと重合させ、続いてアミンと反応させることにより行われ、種々の官能基を得る。
【００１６】
別の実施形態において、主なアリルアミンリガンドを有する媒体の調製は、アリルアミンをエポキシ基またはハロアルキル基を含有する固体多孔質粒子、または、アミンと反応しうる他の好適な反応性部位との反応させることにより行われ、種々の官能気を得る。
【００１７】
また別の実施形態において、他の官能性（弱カチオン交換媒体、強カチオン交換媒体、および疎水性媒体など）の調製は、以下の実施例に示すような好適な官能性の基を有する他の機能性リガンドを用いて、第１級アリルアミンリガンドから調製される。
【００１８】
本発明の他の態様は、以下を包含する。一態様は、粒子表面上にアリルアミンまたはポリアリルアミンを誘導された多孔質媒体粒子を有するクロマトグラフ媒体を包含する。別の態様は、多孔質媒体粒子がエポキシ化またはハロアルキル化されたシリカ、キトサン、セルロース、アガロース、ポリスチレン、ポリアクリレートまたはポリメタクリレート、およびポリジビニルベンゼンからなる群から選択される粒子を包含する、以上のようなクロマトグラフ媒体を包含する。さらなる態様は、多孔質媒体粒子がエポキシ化またはハロアルキル化されたポリアクリレートポリマーまたはポリメタクリレートポリマーを包含する、以上のようなクロマトグラフ媒体を包含する。また別の態様は、粒子表面上にアリルアミンまたはポリアリルアミンを誘導された多孔質媒体粒子は、さらに高分子樹脂の表面上のアリルアミンまたはポリアリルアミンの末端のアミノ基と少なくとも１つの他の機能化試薬との反応によって官能化される、以上のようなクロマトグラフ媒体を包含する。なおさらなる態様は、少なくとも１つの他の機能化試薬は、酸無水物、スルホン化試薬、塩化アルキル、および第四級アンモニウム官能基を含有する塩化アルキルならびにこれらの混合物からなる群から選択される、以上のようなクロマトグラフ媒体を包含する。さらなる態様は、機能化試薬は、環状カルボン酸無水物、不飽和カルボン酸無水物、亜硫酸水素塩、塩化アルキル、アルキル無水物、第四級アンモニウム官能基を含有する塩化アルキルならびにこれらの混合物からなる群から選択される、以上のようなクロマトグラフ媒体を包含する。別の態様は、少なくとも１つの他の機能化試薬が、グルタル酸無水物、コハク酸無水物、無水マレイン酸、メタ亜硫酸水素ナトリウム、塩化ブチリル、無水酢酸、酪酸無水物、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロライド、およびこれらの混合物からなる群から選択される、以上のようなクロマトグラフ媒体を包含する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、上述の任意のクロマトグラフ媒体で充填されているクロマトグラフィ用カラムを包含する。本発明のなおさらなる態様は、そのようなクロマトグラフィ用カラムに溶液を通し、溶液成分を溶出することを含む溶液成分の分離プロセスである。本発明のまた別の態様は、溶液が生体分子を含有する溶液である、プロセスである。
【００２０】
本発明のさらに別の態様において、クロマトグラフ媒体を作製する方法は、エポキシ基またはハロアルキル基を含有する固体多孔質媒体粒子をアリルアミンまたはポリアリルアミンの誘導体と反応させることを含有する方法を提供する。製造方法の別の態様において、ポリアリルアミンはアリルアミンまたは分子量２５０００以下を有するポリアリルアミンと反応することにより得られ、またはグラフトアリルアミンと分子間重合をすることにより得られる。
【００２１】
さらに別の態様において、クロマトグラフ媒体は、ｉ）エポキシ基またはハロアルキル基を含有する固体多孔質媒体粒子をアリルアミンと反応させてアリルアミンでグラフトされたポリマーを形成する工程、ｉｉ）アリルアミンでグラフトされた当該ポリマーの分子間重合を開始する工程により作製されうる。別の態様において、分子間重合工程はラジカル開始剤および過剰のアリルアミンで開始され、そして別の態様において、ラジカル開始剤は、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化アセチルまたは過酸化ベンゾイルの群から選択される。
【００２２】
本発明は、アリルアミンおよび直接または分子間でまたは分子間重合で得られる２５０００未満の分子量を有するポリアリルアミンのようなポリマーが、独特の性質を有する弱アニオン、弱カチオンおよび疎水性媒体として用いるために修飾されうる主なリガンドとして用いられうる。本発明で製造されるクロマトグラフ媒体は、従来技術と化学的性質および性能において完全に異なりおよび独特である。ポリエチレンイミンを使用すれば、第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンが得られ、ポリアリルアミンを使用すれば、第一級アミンのみ得られる。骨格も異なる。ポリアリルアミンは、アミン基をぶら下げた直線状アルキル鎖を有する。我々は、本発明の方法および組成物により得られたこの特徴が独特の属性を有する異なるクロマトグラフ媒体を与えることを見出した。例えば、修飾されたポリマーの全窒素含有量は、典型的には１．０〜３．５％の範囲である。製造された弱アニオン交換体は、直接タンパク質分離、または強カチオン交換クロマトグラフ媒体、強アニオン交換クロマトグラフ媒体または疎水性クロマトグラフ媒体を製造するためさらに変性される。このリガンドは、弱アニオン交換クロマトグラフ媒体を提供するポリマー中のエポキシ基を有するアリルアミンまたはポリアリルアミンのアミノ基と反応させることにより固定化される。
【００２３】
加えて、残留アミノ基は、異なる試薬とさらに反応し、カチオン交換、アニオン交換または疎水性などの異なる機能性を有するクロマトグラフ媒体を生成する。アリルアミンのアリル基も、分子間重合および官能基化などのさらなる修飾により、新しいイオン交換媒体または疎水性媒体の可能性を与える。
【実施例】
【００２４】
本発明を以下の代表例によりさらに例示するが、本発明を限定するものではなく、これらは、本発明を説明するためだけに提示され、本発明を限定するものとは解釈されないものとする。
【００２５】
実施例１：ポリアリルアミンを有する主なリガンドおよびイオン交換クロマトグラフ媒体の調製
水溶液中、分子量１５，０００のポリアリルアミンの水溶液（１５（重量／重量）％）１００ｍＬと脱イオン水３００ｍＬを撹拌機、冷却器、窒素注入口、および温度調節器を備える１Ｌの三口フラスコに入れた。活性なエポキシ基を含有するメジアン粒径３５ミクロンのポリメタクリル酸ポリマー２５ｇを、撹拌しながら反応機にゆっくり添加した。その後、フラスコを８０℃に加熱し、１６時間反応させた。反応生成物を脱イオン水で１回洗浄し、続けて１−メトキシ−２−プロパノールで４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５８．３％、Ｈ，７．３％、Ｎ，１．１％。
【００２６】
上記の反応で得られたポリマーを、その後、撹拌機、冷却器、および窒素注入口ならびに温度調節器を備える乾燥した１Ｌの３つ口フラスコに移した。１−メトキシ−２−プロパノール４００ｍＬおよび無水マレイン酸１４．５ｇを窒素下で当該フラスコに添加した。その後、当該フラスコを６０℃に加熱し、３時間反応させた。得られた生成物を脱イオン水で４回洗浄した。
【００２７】
上記の反応のマレイン化されたポリマーを同じ反応装置に戻し、ＮａＯＨ溶液（０．０１Ｍ）４００ｍＬおよびメタ重亜硫酸ナトリウム５６ｇを添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、４時間反応させた。生成物を洗浄し、得られた生成物を脱イオン水で４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５５．８％、Ｈ，７．２％、Ｎ，１．０％、Ｓ，１．０％。
【００２８】
実施例２：実施例１の媒体を用いた分離
実施例１の生成物を１００×７．７５ｍｍの内径カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ５．６緩衝液（結合緩衝液）５０ｍＭで平衡化した。平衡化の後、結合緩衝液中、オボアルブミン（２．０ｍｇ／ｍＬ）、ラビットＩｇＧ（２．０ｍｇ／ｍＬ）、リゾチーム（２．０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを０．９ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入した。その後、当該カラムをＮａＣｌ（１．０Ｍ（溶出緩衝液））を含むＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．６）０〜１００％の線状勾配で２６分間とその後１００％溶出緩衝液で別の１２分間溶出した。実施例１の媒体を用い、実施例２に従って行って得られた結果を図１のグラフに示す。
【００２９】
実施例３：分子間重合により得た第１媒体の調製
アリルアミン１０ｇを１−メトキシ−２−プロパノール４００ｍＬに溶解し、当該溶液を撹拌機、冷却器、窒素注入口および温度調節器を備える１Ｌの三口フラスコに入れた。活性なエポキシ基を含有するメジアン粒径３５ミクロンのポリメタクリル酸ポリマー２５ｇを当該反応機にゆっくり滴下した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、１６時間反応させた。反応生成物を脱イオン水で１回洗浄し、続けてアルコールで４回洗浄した。
【００３０】
上記の反応で得られたアリルアミンでグラフトされているポリマーを、その後、撹拌機、冷却器、および窒素注入口ならびに温度調節器を備える乾燥した１Ｌの３つ口フラスコに移した。エタノール４００ｍＬを窒素で前もって置換したフラスコに添加した。
【００３１】
当該フラスコを８０℃に加熱し、ΑＩΒΝ０．６ｇを添加し、次いでシリンジポンプを通してアリルアミン１５ｇを０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で添加し、６時間反応させた。得られた生成物を脱イオン水で洗浄し、その後１−メトキシ−２−プロパノールで３回洗浄した。元素分析：Ｃ，５９．０％、Ｈ，７．７％、Ｎ，３．１％。
【００３２】
上記の反応で得られたポリマーを、その後、撹拌機、冷却器、および窒素注入口ならびに温度調節器を備える乾燥した１Ｌの３つ口フラスコに移した。１−メトキシ−２−プロパノール４００ｍＬおよび無水マレイン酸１４．５ｇを窒素下で当該フラスコに添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、３時間反応させた。得られた生成物を脱イオン水で４回洗浄した。
【００３３】
上記の反応のマレイン化されたポリマーを同じ反応装置に戻し、ＮａＯＨ溶液（０．０１Ｍ）４００ｍＬおよびメタ重亜硫酸ナトリウム５６ｇを添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、４時間反応させた。得られた生成物を  脱イオン水で４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５４．５％、Ｈ，７．８％、Ｎ，３．０％、Ｓ，２．０％。
【００３４】
実施例４：実施例３の媒体を用いた分離
実施例３の生成物を１００×７．７５ｍｍの内径カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ５．６緩衝液（結合緩衝液））５０ｍＭで平衡化した。平衡化の後、結合緩衝液中、オボアルブミン（２．０ｍｇ／ｍＬ）、ラビットＩｇＧ（２．０ｍｇ／ｍＬ）、リゾチーム（２．０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを０．９ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入した。その後、当該カラムをＮａＣｌ（１．０Ｍ（溶出緩衝液））を含むＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．６）０〜１００％の線状勾配で２６分間とその後１００％の溶出緩衝液で別の１２分間溶出した。実施例３の媒体を用い、実施例４に従って行って得られた結果を図２のグラフに示す。
【００３５】
実施例５：アリルアミンを有する第１媒体の調製
アリルアミン５ｇをｌ−メトキシ−２−プロパノール４００ｍＬに溶解し、当該溶液を撹拌機、冷却器、窒素注入口および温度調節器を備える１Ｌの三口フラスコに入れた。活性なエポキシ基を含有するメジアン粒径３５ミクロンのポリメタクリル酸ポリマー１２．５ｇを、撹拌下で、当該反応機にゆっくり滴下した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、６時間反応させた。反応生成物を１−メトキシ−２−プロパノールで４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５８．９％、Ｈ，７．３％、Ｎ，２．５％。
【００３６】
上記の反応で得られたポリマーを、その後、撹拌機、冷却器、および窒素注入口ならびに温度調節器を備える乾燥した１Ｌの３つ口フラスコに移した。窒素下で、１−メトキシ−２−プロパノール２００ｍＬおよび無水マレイン酸７．３ｇをフラスコに添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、３時間反応させた。得られた生成物を脱イオン水で４回洗浄した。
【００３７】
上記の反応のマレイン化されたポリマーを同じ反応装置に戻し、ＮａＯＨ溶液（０．０１Ｍ）２００ｍＬおよびメタ重亜硫酸ナトリウム２８ｇを添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、４時間反応させた。生成物を洗浄し、得られた生成物を  脱イオン水で４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５２．４％、Ｈ，６．８％、Ｎ，２．３％、Ｓ，２．０％。
【００３８】
実施例６：：実施例５の媒体を用いた分離
実施例５の生成物を１００×７．７５ｍｍの内径カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ５．６緩衝液（結合緩衝液））５０ｍＭで平衡化した。平衡化の後、結合緩衝液中、オボアルブミン（２．０ｍｇ／ｍＬ）、ラビットＩｇＧ（２．０ｍｇ／ｍＬ）、リゾチーム（２．０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを０．９ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入した。その後、当該カラムをＮａＣｌ（１．０Ｍ（溶出緩衝液））を含むＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．６）０〜１００％の線状勾配で２６分超とその後１００％の溶出緩衝液で別の１２分間溶出した。実施例５の媒体を用い、実施例６に従って行って得られた結果を図３のグラフに示す。
【００３９】
実施例７：ポリアリルアミンを有する主なリガンドおよびイオン交換クロマトグラフ媒体の調製
水溶液中、分子量１０００のポリアリルアミンの水溶液（１５（重量／重量）％）１００ｍＬと脱イオン水３００ｍＬを撹拌機、冷却器、窒素注入口、および温度調節器を備える１Ｌの三口フラスコに入れた。活性なエポキシ基を含有するメジアン粒径３５ミクロンのポリメタクリル酸ポリマー２５ｇを、撹拌しながら反応機にゆっくり添加した。その後、フラスコを８０℃に加熱し、１６時間反応させた。反応生成物を脱イオン水で洗浄し、続けて１−メトキシ−２−プロパノールで４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５８．３％、Ｈ，７．９％、Ｎ，１．７％。
【００４０】
上記の反応で得られたポリマーを、その後、撹拌機、冷却器、および窒素注入口ならびに温度調節器を備える乾燥した１Ｌの３つ口フラスコに移した。１−メトキシ−２−プロパノール４００ｍＬおよび無水マレイン酸１４．５ｇを窒素下で当該フラスコに添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、３時間反応させた。得られた生成物を脱イオン水で４回洗浄した。
【００４１】
上記の反応のマレイン化されたポリマーを同じ反応装置に戻し、ＮａＯＨ溶液（０．０１Ｍ）４００ｍＬおよびメタ重亜硫酸ナトリウム５６ｇを添加した。その後、当該フラスコを８０℃に加熱し、４時間反応させた。生成物を洗浄し、得られた生成物を  脱イオン水で４回洗浄した。元素分析：Ｃ，５４．３％、Ｈ，７．３％、Ｎ，１．５％、Ｓ，１．２％。
【００４２】
実施例８：実施例７の媒体を用いた分離
実施例７の生成物を１００×７．７５ｍｍの内径カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ５．６緩衝液（結合緩衝液））５０ｍＭで平衡化した。平衡化の後、結合緩衝液中、オボアルブミン（２．０ｍｇ／ｍＬ）、ラビットＩｇＧ（２．０ｍｇ／ｍＬ）、リゾチーム（２．０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを０．９ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入した。その後、当該カラムをＮａＣｌ（１．０Ｍ（溶出緩衝液））を含むＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．６）０〜１００％の線状勾配で２６分間とその後１００％の溶出緩衝液で別の１２分間溶出した。実施例７の媒体を用い、実施例８に従って行って得られた結果を図４のグラフに示す。
【００４３】
実施例９：実施例７の媒体を用いた性能試験
実施例７の生成物をＶｅｒｓａＴｅｎ（１００×７．７５ｍｍ内径）カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ５．０緩衝液（電気伝導率がＮａＣｌ（結合緩衝液）により３ｍＳ／ｃｍに調節されている））５０ｍＭで平衡化した。ＩｇＧ試料溶液を調製するため、ヒトγグロブリン（シグマＰＮＧ４３８６）３６０ｍｇを結合緩衝液１８０ｍＬに溶解させた。濾過および超音波処理をした後、当該試料溶液を１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で上記カラムに注入した。試料の注入後、当該カラムを結合緩衝液で２０分間洗浄し、当該結合ＩｇＧを同じ流量でＭＥＳ（ｐＨ５．０）緩衝液５０ｍＭ中ＮａＣｌ（１．０Ｍ）で溶出した。当該溶液をＵＶ２８０ｎｍで観察した。１０％のブレークスルーにおける動的結合性能は６６．５ｍｇ／ｍＬと計算された。実施例９に従って実施例７の媒体の性能試験結果を図５に示す。
【００４４】
実施例１０：実施例１の媒体の性能試験
実施例１の生成物をＶｅｒｓａＴｅｎ（１００×７．７５ｍｍ内径）カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ５．０緩衝液（電気伝導率がＮａＣｌ（結合緩衝液）により３ｍＳ／ｃｍに調節されている））５０ｍＭで平衡化した。ＩｇＧ試料溶液を調製するため、ヒトγグロブリン３６０ｍｇを結合緩衝液１８０ｍＬに溶解させた。濾過および超音波処理をした後、当該試料溶液を１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で上記カラムに注入した。試料の注入後、当該カラムを結合緩衝液で２０分間洗浄し、当該結合ＩｇＧを同じ流量でＭＥＳ（ｐＨ５．０）緩衝液５０ｍＭ中ＮａＣｌ（１．０Ｍ）で溶出した。当該溶液をＵＶ２８０ｎｍで観察した。１０％のブレークスルーにおける動的結合性能は５２．１ｍｇ／ｍＬと計算された。実施例１０に従って実施例１の媒体の性能試験結果を図６に示す。
【００４５】
実施例１１：実施例５の媒体の性能試験
実施例５の生成物をＶｅｒｓａＴｅｎ（１００×７．７５ｍｍ内径）カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ  ５．０緩衝液（電気伝導率がＮａＣｌ（結合緩衝液）により３ｍＳ／ｃｍに調節されている））５０ｍＭで平衡化した。ＩｇＧ試料溶液を調製するため、ヒトγグロブリン４００ｍｇを結合緩衝液２００ｍＬに溶解させた。濾過および超音波処理をした後、当該試料溶液を２．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で上記カラムに注入した。試料の注入後、当該カラムを結合緩衝液で２０分間洗浄し、当該結合ＩｇＧを同じ流量でＭＥＳ（ｐＨ５．０）緩衝液５０ｍＭ中ＮａＣｌ（１．０Ｍ）で溶出した。当該溶液をＵＶ２８０ｎｍで観察した。１０％のブレークスルーにおける動的結合性能は５４．３ｍｇ／ｍＬと計算された。実施例１１に従って実施例５の媒体の性能試験結果を図７に示す。
【００４６】
実施例１２：実施例３の媒体の性能試験
実施例３の生成物をＶｅｒｓａＴｅｎ（１００×７．７５ｍｍ内径）カラムに充填した。当該カラムをＭＥＳ（ｐＨ５．０緩衝液（電気伝導率がＮａＣｌ（結合緩衝液）により３ｍＳ／ｃｍに調節されている））５０ｍＭで平衡化した。ＩｇＧ試料溶液を調製するため、ヒトγグロブリン４００ｍｇを結合緩衝液２００ｍＬに溶解させた。濾過および超音波処理をした後、当該試料溶液を２．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で上記カラムに注入した。試料の注入後、当該カラムを結合緩衝液で２０分間洗浄し、当該結合ＩｇＧを同じ流量でＭＥＳ（ｐＨ５．０）緩衝液５０ｍＭ中ＮａＣｌ（１．０Ｍ）で溶出した。当該溶液をＵＶ２８０ｎｍで観察した。１０％のブレークスルーにおける動的結合性能は５５．６ｍｇ／ｍＬと計算された。実施例１２に従って実施例３の媒体の性能試験結果を図８に示す。
【００４７】
上記に説明する実施例は本発明の実際に行った実施形態の具体的に説明を示す。そして図において説明する結果は、本発明を使用する独特および高効果的な分離特性を示す。
【００４８】
このように、本発明の好ましい実施形態であると現在信じているものを開示するが、当業者は、本発明の思想から逸脱せずに変更および修正が行われることを理解するであろうし、本発明の範囲内にあるすべての変更および修正を請求することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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