(57)【要約】  リニア光センサを使用して血球計算を実施するためのシステムおよび方法。照明場、リニア光センサによってスキャンされるライン、またはその両方が、結像の対象となる細胞を横切って掃引される。細胞と掃引される照明との間の相対的運動は、細胞をプレートに付着させかつプレートを搬送することによって、または他の技法によって、１つまたは複数の可動光学コンポーネントを使用して生成される。
2014507662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球計算を実施するためのシステムにおいて、
光源と、
スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を前記光源からの光に照明させるための光整形要素と、
少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットと、
前記スキャン領域の照明された部分の画像を前記リニア光センサセット上にフォーカスさせるための光学系と、
可動光学コンポーネントであって、結像の対象となる細胞を横断する方式にて、前記長尺状またはスリット状の照明場と、前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の部分との両方を掃引するための、可動光学コンポーネントとを備え、
前記長尺状またはスリット状の照明場および前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の前記部分が、結像の対象となる細胞を横断して掃引される間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する、システム。
【請求項２】
前記可動光学コンポーネントは回転自在のミラーを備える請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記可動光学コンポーネントを移動させるガルバノメータをさらに備える請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記光源はレーザを備える請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記光整形要素は円柱レンズを備える請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は結合された結果、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記画像は、前記スキャン領域内の実質的に同じそれぞれの場所に対応するそれぞれの画像からのピクセル値をデジタル的に結合することによって結合される請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記画像は、時間遅延積分によって結合される請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
蛍光によって前記細胞から発する光を前記リニア光センサセットに優先的に提供するように構成された波長選択性フィルタをさらに備える請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
対物レンズと、
前記可動光学コンポーネントと前記対物レンズとの間の４ｆ光学系とをさらに備える請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記可動光学コンポーネントは、スキャン中にシステムの唯一の可動コンポーネントである請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
少なくとも１つのリニア光センサを備える第２のセットをさらに備え、前記第２のセットは、前記第１のセットによって受信される光と異なる波長帯域の光を受信する請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
両方のリニア光センサセットから画像データを受信し、下流画像処理を使用して前記画像を結合する処理ユニットをさらに備える請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
血球計算を実施するためのシステムにおいて、
光源と、
スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を前記光源からの光に照明させるための光整形要素と、
少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットと、
前記スキャン領域から発する光を収集し、前記収集された光の少なくとも一部を前記リニア光センサセットに送る光ファイバ束と、
結像の対象となる細胞と前記光ファイバ束の一端との間の相対的運動を生成するためのメカニズムとを備え、
細胞が前記スキャン領域を通過する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する、システム。
【請求項１５】
前記長尺状またはスリット状の照明場および前記光ファイバ束の端部は、結像される前記細胞と前記スキャン領域との間の相対的運動を生成するよう移動する請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は結合された結果、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
血球計算を実施するためのシステムにおいて、
スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を照明する光源と、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットと、前記スキャン領域の照明された部分の画像を前記リニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系とを備える、光学モジュールと、
結像の対象となる細胞用のホルダと、
前記スキャン領域が前記細胞を横断する方式で前記細胞に対して前記光学モジュールを相対移動させるためのメカニズムとを備え、
前記スキャン領域が前記細胞を横断する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得するシステム。
【請求項１８】
前記セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は結合された結果、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
血球計算を実施するための方法において、
長尺状またはスリット状の照明場によってスキャン領域を照明する工程と、
前記スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセット上にフォーカスする工程と、
可動光学コンポーネントであって、前記スキャン領域内にて結像の対象となる細胞を横切る方式で、前記長尺状またはスリット状の照明場と、前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の部分との両方を掃引するための、可動光学コンポーネントを移動する工程と、
前記長尺状またはスリット状の照明場と、前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の前記部分とが、結像の対象となる細胞を横断して掃引される間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する工程とを備える、血球計算
を実施するための方法。
【請求項２０】
可動光学コンポーネントを移動させる工程は、回転自在のミラーを回転させることを含んでなる、請求項１９に記載の血球計算を実施するための方法。
【請求項２１】
可動光学コンポーネントを移動する工程は、ガルバノメータを回転させることを含んでなる、請求項１９に記載の血球計算を実施するための方法。
【請求項２２】
前記セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、方法は、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合する工程であって、それにより、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、画像を結合する工程をさらに備える、請求項１９に記載の血球計算を実施するための方法。
【請求項２３】
前記スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも１つのリニア光センサを備える第２のセット上にフォーカスさせる工程をさらに備え、前記第２のセットは、前記第１のセットと異なる波長帯域の光を受信する、請求項１９に記載の血球計算を実施するための方法。
【請求項２４】
血球計算を実施するための方法において、
長尺状またはスリット状の照明場によってスキャン領域を照明する工程と、
光ファイバ束を使用して前記スキャン領域から発する光を収集する工程であって、前記光ファイバ束は、前記収集された光の少なくとも一部を少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットに送る、前記スキャン領域から発する光を収集する工程と、
結像の対象となる細胞と前記光ファイバ束の一端との間の相対的運動を生成する工程と、
細胞が前記スキャン領域を通過する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する工程とを備える、方法。
【請求項２５】
前記セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、方法は、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合する工程であって、それにより、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、画像を結合する工程をさらに備える、請求項２４に記載の血球計算を実施するための方法。
【請求項２６】
血球計算を実施するための方法において、
結像の対象となる細胞をスキャン領域内に保持する工程と、
前記細胞に対して光学モジュールを相対移動させる工程であって、光学モジュールは、スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を照明する光源と、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットと、前記スキャン領域の照明された部分の画像を前記リニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系とを備える、光学モジュールを相対移動させる工程と、
前記スキャン領域が前記細胞を横断する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する工程とを備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラインスキャン血球計算システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血球計算は、生体細胞の計数および特徴付けに関する技術である。図１は、流れ血球計算として知られている１つの技法の簡略図を示す。流れ血球計算の基本形態では、細胞１０１は流体に懸濁され、狭い透明チューブ１０２内にて１列になって連なるエントレインメントが生じる。エントレインメントは、流体力学的絞り込みを含むいくつかの方法のうちの任意の方法によって達成されうる。光源１０３は、各細胞１０１が測定場所１０４を通過するときに各細胞１０１を照明する。光源１０３は、たとえばレーザとすることができる。光源１０３からの光は、測定される細胞１０１によって散乱する。一部の光１０５は、細胞１０１に達するために進んできたのと全体的に同じ方向に散乱する。光１０５は、「前方散乱」と呼ばれることがあり、前方センサ１０６によって収集することができる。一部の光は、他の方向にも散乱する場合がある。この光は、「側方散乱」と呼ぶことができ、側方散乱光１０７の一部を、１つまたは複数の他のセンサ１０８によって収集することができる。センサ１０６および１０８からの出力信号は、コンピュータ１０９に送られ、コンピュータ１０９は、信号を記憶し解析することができる。散乱光の量および分布を解析することによって、各細胞に関する情報、たとえば細胞のサイズおよび細胞の内部構造に関する一部の情報を識別することが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
流れ血球計算は、散乱光を直接測定し、または、蛍光を利用することができる。蛍光血球計算では、細胞を、１つまたは複数の蛍光体でマーク付けすることができ、蛍光体は、光源１０３からの光によって励起されて、蛍光による光を生成する。放出光の性質は、細胞に関してさらなる情報を明らかにする場合がある。
【０００４】
図１に示す技法は、専ら散乱光の測定によって、細胞構造に関する情報を推測するが、任意の特定の細胞の画像を生成しない。「画像血球計算(image cytometry)」（個々の細
胞の画像）と呼ばれる別の技法は、カメラまたは顕微鏡によって記憶することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様によれば、血球計算を実施するためのシステムは、光源と、光整形要素であって、光源からの光に、スキャン領域において長尺状のまたはスリット状の照明場を照明させる、光整形要素と、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットとを備える。システムはまた、スキャン領域の照明された部分の画像をリニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系と、可動光学コンポーネントであって、長尺状のまたはスリット状の照明場およびリニア光センサによって結像されるスキャン領域の部分の両方に、結像される対象の細胞を横切って掃引させる、可動光学コンポーネントとを含む。システムは、長尺状のまたはスリット状の照明場およびリニア光センサによって結像されるスキャン領域の部分が、結像の対象となる細胞を横切って掃引される間に、リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する。いくつかの実施形態では、可動光学コンポーネントは回転自在のミラーを備える。いくつかの実施形態では、システムは、可動光学コンポーネントを移動させるガルバノメータをさらに備える。光源はレーザを備えることができる。光整形要素は円柱レンズを備えることができる。いくつかの実施形態では、セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は、結合されて、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較
して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する。いくつかの実施形態では、画像は、スキャン領域内の実質的に同じそれぞれの場所に対応するそれぞれの画像からのピクセル値をデジタル的に結合することによって結合される。画像は、時間遅延積分によって結合される。システムは、蛍光によって細胞から発する光をリニア光センサセットに優先的に提供するように構成された波長選択性フィルタをさらに備える。
いくつかの実施形態では、システムは、対物レンズと、可動光学コンポーネントと対物レンズとの間の４ｆ光学系とをさらに備える。可動光学コンポーネントは、スキャン中にシステムの唯一の可動コンポーネントとすることができる。システムは、少なくとも１つのリニア光センサを備える第２のセットをさらに備え、第２のセットは、第１のセットによって受信される光と異なる波長帯域の光を受信する。いくつかの実施形態では、システムは、両方のリニア光センサセットから画像データを受信し、下流画像処理を使用して画像を結合する処理ユニットをさらに備える。
【０００６】
別の態様によれば、血球計算を実施するためのシステムは、光源と、光整形要素であって、光源からの光に、スキャン領域において長尺状のまたはスリット状の照明場を照明させる、光整形要素と、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットと、スキャン領域から発する光を収集し、収集された光の少なくとも一部をリニア光センサセットに送る光ファイバ束と、結像の対象となる細胞と光ファイバ束の一端との間の相対的運動を生成するためのメカニズムとを備える。システムは、細胞がスキャン領域を通過する間に、リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する。いくつかの実施形態では、長尺状のまたはスリット状の照明場および光ファイバ束の端部は、結像の対象となる細胞とスキャン領域との間の相対的運動を生成するよう移動する。いくつかの実施形態では、セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は、結合されて、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する。
【０００７】
別の態様によれば、血球計算を実施するためのシステムは、光学モジュールであって、スキャン領域において長尺状のまたはスリット状の照明場を照明する光源、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセット、及びスキャン領域の照明された部分の画像をリニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系を含む、光学モジュールを備える。システムは、結像の対象となる細胞用のホルダと、スキャン領域が細胞を横断するように細胞に対して光学モジュールを移動させるためのメカニズムとを含む。システムは、スキャン領域が細胞を横断する間に、リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する。
いくつかの実施形態では、セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は、結合されて、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する。
【０００８】
別の態様によれば、血球計算を実施するための方法は、長尺状のまたはスリット状の照明場によってスキャン領域を照明すること、スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセット上にフォーカスさせること、および、可動光学コンポーネントであって、長尺状のまたはスリット状の照明場およびリニア光センサによって結像されるスキャン領域の部分の両方に、スキャン領域内で、結像の対象となる細胞を横切って掃引させる、可動光学コンポーネントを移動させることを含む。方法は、長尺状のまたはスリット状の照明場およびリニア光センサによって結像されるスキャン領域の部分が、結像の対象となる細胞を横切って掃引される間に、リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得することをさらに含む。いくつかの実施形態では、可動光学コンポーネントを移動させることは、回転自在のミラーを回転させることを含む。いくつかの実施形態では、可動光学コンポーネントを移動させることは、ガルバノメータ
を回転させることを含む。セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、方法は、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合することであって、それにより、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、結合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも１つのリニア光センサを備える第２のセット上にフォーカスさせることをさらに含み、第２のセットは、第１のセットと異なる波長帯域の光を受信する。
【０００９】
別の態様によれば、血球計算を実施するための方法は、長尺状のまたはスリット状の照明場によってスキャン領域を照明すること、光ファイバ束を使用してスキャン領域から発する光を収集することであって、光ファイバ束は、収集された光の少なくとも一部を少なくとも１つのリニア光センサを備えるセットに送る、収集すること、結像の対象となる細胞と光ファイバ束の一端との間の相対的運動を生成すること、および、細胞がスキャン領域を通過する間に、リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得することを含む。いくつかの実施形態では、セットは、少なくとも２つのリニア光センサを備え、方法は、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合することであって、それにより、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、結合することをさらに含む。
【００１０】
別の態様によれば、血球計算を実施するための方法は、結像の対象となる細胞をスキャン領域内に保持すること、および、細胞に対して光学モジュールを移動させることを含み、光学モジュールは、スキャン領域において長尺状のまたはスリット状の照明場を照明する光源、少なくとも１つのリニア光センサを備えるセット、及びスキャン領域の照明された部分の画像をリニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系を備える。方法は、スキャン領域が細胞を横断する間に、リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】流れ血球計算として知られる技法の略図。
【図２】ある実施形態による高速高分解能ラインスキャン画像血球計算システムの略概念図。
【図３Ａ】画像形成プロセスを示す図。
【図３Ｂ】画像形成プロセスを示す図。
【図３Ｃ】画像形成プロセスを示す図。
【図４】本発明の別の実施形態によるシステムの正投影図。
【図５】本発明の別の実施形態によるシステムの正投影図。
【図６】本発明の別の実施形態によるシステムの正投影図。
【図７】本発明のさらに別の実施形態によるシステムの正投影図。
【図８】別の実施形態によるシステムの正投影図。
【図９Ａ】長尺状照明場を生成するためのシステムの実施形態を示す図。
【図９Ｂ】長尺状照明場を生成するためのシステムの実施形態を示す図。
【図９Ｃ】長尺状照明場を生成するためのシステムの実施形態を示す図。
【図１０】静止細胞を横切って照明場を掃引する例示的なシステムの側面図。
【図１１】本発明の他の実施形態による、血球計算を実施するためのシステムの側面図。
【図１２Ａ】本発明の他の実施形態による、血球計算を実施するためのシステムの斜め図。
【図１２Ｂ】図１２Ａのシステムの一部分の側面図。
【図１３】本発明の実施形態による、細胞がマイクロスライドに付着され、光学系に対して搬送されて、細胞がスキャンされるシステムを示す図。
【図１４】本発明に従って取得された画像を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図２は、ある実施形態による高速高分解能ラインスキャン画像血球計算システム２００の略概念図を示す。図２のシステムは、流れ血球計算システムであるが、本発明の実施形態を他の種類の血球計算でも利用することができることを当業者は認識するであろう。
【００１３】
細胞１０１は、１列でチューブ１０２を通って進むように流体内にて連なる。システムを、多くの異なる種類の細胞を特徴付けるために使用することができるが、典型的な適用形態では、細胞１０１は、たとえば直径約１０〜２０マイクロメートルとすることができ、また、たとえば１０ミリメートル／秒の速度でチューブ１０２を通って進むことができる。光源２０１は、チューブ１０２上に光の場２０３を提供する。光源２０１は、レーザ、発光ダイオード、白熱光源、蛍光光源、または別の種類の光源とすることができる。光源２０１は、実質的に単色の光、広領域スペクトル光、または２つ以上の狭い波長帯域を含む光を生成することができる。オプションの光整形要素２０２は、細胞１０１がそこを通って搬送される長尺状のまたはスリット状の場２０３内に光源２０１からの光を集中させるために、種々のレンズ、プリズム、反射体、または他の光学コンポーネントを含むことができる。以下で述べるように、狭いライン画像だけがスキャンされることになるため、目的場全体が照明される従来の落射照明と対照的に、狭い場だけが照明される必要がある。光整形要素２０２によって実現される集中は、通常の対称的な落射照明と比較して、２桁〜６桁ほどだけ有効照明レベルを増加させる。
【００１４】
光源２０１からの一部の光は、細胞のうちの１つの細胞１０１（少なくともその一部分は、場２０３内にある）を透過するまたはそれによって散乱する。光の一部は、１つまたは複数のレンズ２０４によってリニアセンサ２０５上に向け直される。リニアセンサ２０５は、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ、相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）センサ、または列に配列された複数の光感応性部位を有する別の種類のセンサとすることができる。レンズ２０４およびセンサ２０５は、ドイツのアーレンスブルグのＢａｓｌｅｒ  ＡＧから入手可能なＢａｓｌｅｒ  ＳｐｒｉｎｔラインスキャンＣＭＯＳカメラなどのラインスキャンカメラの一部とすることができる。個々のセンサ部位は、「ピクセル(pixel)」と
呼ばれることがある。センサピクセルによって検知されるスキャンラインの対応する部位もまた、「ピクセル」と呼ばれる。センサ２０５は、たとえば、ピクセルの１つまたは複数の列であって、各列が５１２、１０２４、２０４８、または別の適切な数のピクセルを含む、ピクセルの１つまたは複数の列を備えることができる。ピクセルの列上に入射する光の強度は、ピクセルアレイであって、所定の露出時間の間、ピクセル部位内に電荷が蓄積することを可能にし、蓄積された電荷量を、光強度を表す数値に変換する、ピクセルアレイをクリアすることによって読取ることができる。このプロセスは、細胞がスキャンエリアを通過するときに繰返し実施される。１つの例示的な実施形態では、システムは、２０マイクロ秒ごとにまたは５０ｋＨｚのスキャンレートで測定値を取得する（「ラインをスキャンする(scan a line)」）ことができる。１０ミリメートル／秒の細胞搬送速度お
よび５０ｋＨｚのスキャンレートを使用することは、２００ｎｍの結像ピクセルサイズをもたらす。他の搬送速度およびスキャンレートが可能であり、他の結像ピクセルサイズをもたらすことができる。結果として得られる測定アレイは、細胞の適切な画像に再構成されうる。
【００１５】
図３Ａ〜３Ｃは、画像形成プロセスを示す。図３Ａでは、スキャンライン３０１は、ピクセルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅを含む。細胞１０１は、図３Ｂに示すようにスキャンライン３０１を通過して搬送され、図３Ｂは、連続するサンプル時間Ｔ１〜Ｔ７において細胞１０１に重ね合わされたスキャンライン３０１を示す。（図３Ｂは、１サンプル時間について正確に１つのピクセルを横断する細胞を示すが、これは、要件ではなく、実際には
、細胞移動速度、サンプルレート、およびピクセルサイズの特定の組合せについて起こることになるだけである。実際には、連続するスキャンラインは、結像される細胞上でオーバラップする場合がある、または、連続するスキャンラインによって読取られる細胞のエリア間にギャップが存在する場合がある。）ピクセルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅによって読取られる光量は、細胞１０１の構造によって影響を受ける。たとえば、細胞がスキャンライン３０１を全く横切らないとき、比較的高い光量が登録される。細胞１０１の比較的透明な部分がピクセルを横切るとき、そのピクセルによって登録される光量はある程度減少する。細胞１０１の核がピクセル内にあるとき、そのピクセルにおいて登録される光量は、大幅に減少する場合がある。図３Ｃは、時間の関数として、ピクセルａ、ｂ、およびｃにおいて登録された光量（０〜１の範囲の任意のスケール上）のトレースを示す。図３Ｄは、いくつかの連続するラインスキャン中にスキャンされるデータを共に積重ね、それぞれの数値的な光の測定値を印刷されたグレースケールで表すことによって形成された再構成画像を示す。図３Ｄは、少数の時間でサンプリングされた少数のピクセルだけを使用して構築され、したがって、細胞１０１の比較的粗い図を示すが、実際には、本発明の実施形態によるシステムは、各細胞の通過中に、より多くのまたはより少ないラインをスキャンすることができ、各ラインは、図示するよりも多くのまたは少ないピクセルを含むことができる。一実施形態では、システムは、各細胞の通過中に約５０ラインをスキャンすることができ、各ラインは、約５０ピクセルを含むことができる。スキャンされるラインおよび各細胞について影響を受けるピクセルの正確な数は、細胞のサイズ、ラインスキャン周波数、スキャンラインを通過して細胞が流れる速度、ならびに使用される特定のセンサおよび光学コンポーネントに依存することになる。
【００１６】
システムの理論的分解能は、対物レンズの品質に主に依存する。システムの実用的なスキャン分解能はまた、スキャンレート、スキャンラインを通過して細胞を搬送する速度、ならびに使用される特定のセンサおよび光学系に依存する。Ｙ方向のピクセル分解能は、特定のレンズおよびセンサを含む結像システムによって決定される。Ｘ方向のピクセル分解能は、ν・ｄｔに等しく、ここで、νはサンプル送出速度であり、ｄｔはカメラの露出時間である。好ましくは、νは、特定の流れ実験の前に予め決定されるかまたはシステムを通した細胞の通過の過程中に測定される既知のパラメータである。理想的には、スキャンされる細胞は、スキャンラインの通過中に回転なしでかつジッタなしの状態であるべきである。
【００１７】
図２のシステムの動作は、光源２０１からの散乱光がセンサ２０５によって測定される直接光結像の文脈で上述される。同じ原理に基づいて動作するシステムは、蛍光結像を実施するために使用することができ、実際には、システムは、蛍光結像において特に有用である場合がある。その場合、光源２０１からの光は、測定される細胞１０１内で蛍光を励起することになり、結果として得られる放出光は、センサ２０５によって収集され測定されることになる。放出光は、一般に、光源２０１からの励起光より長い波長であることになる。蛍光結像では、光源光が、蛍光によって放出される光の測定を圧倒しないようまたは光の測定に干渉しないように、種々のフィルタまたはコンポーネントの幾何学的配置構成を使用して、センサ２０５が光源２０１からの光を受信しないようにすることが望ましい場合がある。通常、蛍光によって放出される光は、光源光より強烈ではなく、より長い露出時間、より強い照明、または感度が高いセンサが、直接結像に比べて蛍光結像に必要とされる場合がある。同様に、図３Ｃに示す蛍光結像の時間的信号変化の形状は、直接結像の場合と異なる。直接結像では、細胞内のさらなる構造が、より少ない光がセンサ２０５の対応するピクセルによって受信されることをもたらす傾向がある。蛍光結像では、さらなる構造が、さらなる蛍光体を運び、構造がほとんどない細胞部分に対応するピクセルと比較して、より多くの光が、対応するセンサピクセルに達することをもたらす場合がある。
【００１８】
図４は、本発明の別の実施形態によるシステム４００の正投影図を示す。図４の実施形態は、単色蛍光結像血球計算に特に適する場合がある。図４の実施形態では、光源４０１は光を放出する。光源４０１は、レーザ、発光ダイオード、白熱光源、蛍光光源、または別の種類の光源とすることができる。光源４０１は、実質的に単色の光、広領域スペクトル光、または２つ以上の狭い波長帯域を含む光を生成することができる。１つの例示的な実施形態では、光源４０１は、４８８ｎｍの公称波長の光を放出するレーザである。励起フィルタ４０２が利用されて、特に光源４０１が広領域スペクトル光である場合にシステムによって利用される光の波長帯域をさらに狭くするか、またはそうでなければ、特定の血球計算実験にとって望ましくない波長を生成することができる。オプションの光整形要素またはコンデンサレンズ４０３は、細胞１０１がそこを通って搬送されるスキャン領域４０４に放出光を集中させることができる。好ましくは、細胞１０１は、光源４０１からの光によって励起されると蛍光を発する１つまたは複数の蛍光体でマーク付けされている。米国、カルフォルニア州、カールスバッドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な蛍光体のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）シリーズを含む多くの異なる蛍光体が知られている。光整形要素またはコンデンサレンズによって実現される集中は、細胞１０１の有効照明を改善し、より強い蛍光信号をもたらす。より強い信号は、システムで使用されるセンサの露出時間に対して少ない制約をもたらす。長尺状のまたはスリット状の照明場は、非対称照明パターンを自然に有する光源、たとえば、半導体レーザまたは発光ダイオードによく適する。
【００１９】
細胞１０１から散乱する光は、対物レンズ４０５によって採取され、向け直され、ダイクロイックミラー４０８から反射し、チューブレンズ４０８を通過し、ラインスキャンカメラ４０９に達し、そこで、スキャン領域４０４の順次ライン画像が、処理ユニット４１０による解析のために採取される。エミッションフィルタ４０７が、システム内に設置されて、カメラ４０９に送出される光の波長帯域を狭くすることができる。ダイクロイックミラー４０８もまた、フィルタリングを提供することができる。このフィルタリングは、細胞１０１によって散乱される場合がある光源４０１からの直接光の影響を低減することができる。対物レンズ４０５およびチューブレンズ４０８は、好ましくは、「無限空間(infinity space)」が両者間に生成されるように、無限遠補正光学系を形成する。こうしたシステム（当技術分野で知られている）では、システムの性能は、対物レンズとチューブレンズとの距離に対して比較的感度がなく、ダイクロイックミラー４０８とエミッションフィルタ４０７などの他のコンポーネントの挿入用の空間を可能にする。
【００２０】
図５は、本発明の別の実施形態によるシステム５００の正投影図を示す。図５のシステムは、同時二色蛍光結像血球計算のために構成される。図５のシステムでは、２つの波長帯域を含む励起光が、結像される細胞１０１に提供される。これは、実線と破線で示す異なる波長の光を生成する２つの光源５０１によって図５に示される。光を、１つまたは複数のフィルタ５０２によってさらに調節することができる。他の配置構成が可能である。たとえば、単一の広領域スペクトル光源を利用することができ、特定の波長帯域が、フィルタ５０２によって優先的に選択される。または、単一光源が使用されて、２つの異なる蛍光波長を励起しうる。好ましい実施形態では、光源５０１は、２つのレーザを備え、１つのレーザは、５３２ｎｍの公称波長の第１の狭帯域の光を生成し、他のレーザは、６３３ｎｍの公称波長の第２の狭帯域の光を生成する。光は、光整形要素またはコンデンサレンズ５０３によってスキャン領域５０４に集中することができる。要素５０３は、種々のレンズ、プリズム、反射体、または他の光学コンポーネントを、単独でまたは組合せて備え、好ましくは、スキャン領域５０４の長尺状のエリア上に光源５０１によって生成される光を集中させることができる。
【００２１】
好ましくは、細胞１０１は、１つまたは複数の蛍光体でマーク付けされ。それにより、蛍光体は、光源１０３からの励起光が細胞１０１に達すると、少なくとも２つの異なる色
特性の光が蛍光によって生成される。たとえば、１つの蛍光体は、５３２ｎｍの励起光に強く反応し、約５５０ｎｍの放出ピークを有する放出光を生成することができ、第２の蛍光体は、６３３ｎｍの励起光に強く反応し、約６５０ｎｍの放出ピークを有する放出光を生成することができる。これらの異なる放出は、励起光の２つの色が示されるのと同様な方法で、破線と実線を使用して図５におおよそ示されるが、放出後に特定のラインタイプで示す光は、一般に、同じラインタイプで示す励起光と同じスペクトル特性を持たないことが理解される。
【００２２】
スキャン領域５０４からの光は、その後、対物レンズ５０５によって採取され、ダイクロイックミラー５０６に送られる。ミラー５０６は、主にある波長帯域からの光が、ミラー５０６から反射され、残りの光が通過するように、あるフィルタリングを提供することができる。ミラー５０６から反射される光は、別のエミッションフィルタ５０７を通過して、光のスペクトル特性をさらに制限し、その後、チューブレンズ５０８を通過し、カメラ５０９に達する。そのため、カメラ５０９は、細胞１０１内の第１の蛍光体マーカによって放出される光を優先的に受信し、光源５１０の光または第２の蛍光体マーカによって放出される光による汚染をほとんど受けない。すなわち、カメラ５０９に達する光は、好ましくは、第１の蛍光体の蛍光放出から選択される第３の波長帯域内に入る。
【００２３】
ダイクロイックミラー５０６を通過した光は、その後、別のダイクロイックミラー５１０から反射され、別のダイクロイックエミッションフィルタ５１１を通過し、第２のチューブレンズ５１２を通過し、カメラ５１３に達することができる。そのため、カメラ５０９は、細胞１０１内の第２の蛍光体マーカによって放出される光を優先的に受信し、光源５１０の光または第１の蛍光体マーカによって放出される光による汚染をほとんど受けない。すなわち、カメラ５１３に達する光は、好ましくは、第２の蛍光体の蛍光放出から選択される第４の波長帯域内に入る。
【００２４】
カメラ５０９および５１３は、その後、異なる放出スペクトルで細胞１０１の同時画像をスキャンできる。カメラ５０９および５１３の出力は、その後、記憶、解析、表示、または他の目的のために処理ユニット５１４に渡される。処理ユニット５１４は、たとえばコンピュータシステムまたは画像データを処理することが可能な他のプロセッサベースシステムとすることができる。処理ユニット５１４は、外部の独立型デバイスとすることができる、または、試験機器に一体化することができる。
【００２５】
多くの変形がシステムについて可能である。たとえば、ダイクロイックミラー５１０を、省略し、フィルタ５１１、チューブレンズ５１２、およびカメラ５１３を、ダイクロイックミラー５０６を通過した光を直接受信するために配置することができる。システム内のフィルタの一部は、使用される特定の光源および蛍光材料に応じて、オプションとすることができる。光源、フィルタ、ミラー、レンズ、またはカメラのさらなるセットを付加することができ、それにより、３つ、４つ、またはさらに多くの異なるスペクトル帯域で、同時結像を実施することができる。
【００２６】
こうして述べたダイクロイックミラーおよびフィルタが、完全な波長弁別または完全な効率を持たないことを当業者は認識するであろう。特定のフィルタによって通過されることを意図される波長帯域内の一部の光は、吸収または反射される場合がある。しかし、フィルタおよびミラーは、システムが異なる放出光色を効果的に弁別できるように、指定された波長を優先的に通過または阻止するように十分にうまく働く。他の変形では、ダイクロイック以外のコンポーネントは、プリズム、格子、または他の光学コンポーネントを含む色分離のために使用することができる。
【００２７】
図６は、本発明の別の実施形態によるシステム６００の正投影図を示す。システム６０
０は、システム５００と同様であり、追加のスリットアパーチャ６０１および６０２がカメラ６０１および６０２の前部に設置される。スリットアパーチャ６０１および６０２は、システムの焦点面以外の場所から採取される一部の光がそれぞれのカメラに達するのを阻止または排除する傾向がある効果を持つ。この効果は、細胞１０１の上の焦点外の場所から発する細かい破線の光線束６０３によって図６に示される。レンズ５０８から発する、結果として得られる光線束６０４は、システムの焦点面からの光よりもレンズ５０８に接近してフォーカスすることになる。束６０４内の光がスリットアパーチャ６０１に達するときまでに、束６０４は、既に分散し始めているため、束６０４の中心のほんのわずかな部分が、スリット６０１を通過し、カメラ５０９に達しうる。こうして、システムは、細胞１０１においてシステムの焦点面からの光を優先的に受信し、他の深さの場所から受信される少なくとも一部の光を排除する。
【００２８】
単一センサによって受信される光を制限するために、小さな円形アパーチャが、こうして使用されると、この技法は、共焦点結像と呼ばれる。図６のシステムでは、アパーチャ６０１および６０２は、スリットであり、したがって、１つだけの軸内で光を排除する。この開示のために、これは、「半共焦(semi-confocal)」結像と呼ばれる。この技法は、
半共焦結像を利用しないシステムによって記録される画像と比較して、システムによって記録される画像のコントラストを改善する。
【００２９】
本発明を具現化する血球計算システムの別の利点は、血球計算システムを、点検出器スタイルシステムに修正することができる、または、点検出器スタイルシステムになるよう構成可能にすることができることであり、点検出器スタイルシステムでは、リニア検出器の中央の少数のピクセルだけが動作中であるか、または、列内の一部のピクセルまたは全てのピクセルが１ピクセルまたは少数のピクセルにビニングされる。これは、リニア光センサの長さに対応する次元（図６のＹ方向）において分解能が減少する画像をもたらす。光センサのそれぞれの露出は、たとえばセンサピクセルの全てがビニングされる場合、センサ上に入射する光の量の単一数値表現をさらにもたらすことができる。任意選択で、照明場は、ずっと小さな円または楕円に整形されて、そのモードで動作するときのシステムの速度を高めうる。この種のシステムの利点は、細胞の非常に高速の単一断面画像が生成されうることである。この種のシステムは、電子通信帯域幅が制限されるが、十分な照明が利用可能であるときに特に有用である場合がある。このように構成可能なシステムは、ラインスキャン結像血球計算と非結像型流れ血球計算の両方に適用可能である場合がある。
【００３０】
図７は、本発明のさらに別の実施形態によるシステム７００の正投影図を示す。図７のシステムでは、同時二色蛍光結像血球計算が、１つのリニア光センサまたはラインスキャンカメラだけを使用して可能になる。システム７００内の照明システムは、たとえば、図５に示すシステム５００に関して上述した照明システムの任意のシステムとすることができる。すなわち、１つまたは複数の光源が、たとえば細胞１０１内の２つの異なる蛍光体から、２つの異なる蛍光スペクトルを励起する。細胞１０１からの蛍光によって放出される光の一部は、対物レンズ５０５によって取込まれ、向け直され、ダイクロイックミラー７０１に向かう。図７の実線と破線は、２つの異なる蛍光スペクトルを含む光がダイクロイックミラー７０１に達することを示す。ミラー７０２は、光を選択的にフィルタリングするため、１つの波長帯域が優先的にミラー７０１から反射し、他の波長が、優先的にミラー７０１を通過し、継続してミラー７０２に向かう。所望に応じて光を送り調節するさらなるミラーおよびフィルタを、光学系内に設置することができる。たとえば、ミラー７０３は、ミラー７０２からの光を向け直してチューブレンズ７０５に向かわせ、ミラー７０３はまた、さらなるフィルタリングを提供することができる。同様に、ミラー７０４は、ミラー７０１からの光を向け直してチューブレンズ７０５に向かわせ、ミラー７０４はまた、さらなるフィルタリングを提供することができる。エミッションフィルタ７０７お
よび７０８などの１つまたは複数のさらなるフィルタを、光学経路内に設置することができる。チューブレンズ７０５は、リニア光センサ７０６上に光を再フォーカスし、リニア光センサ７０６は、ラインスキャンセンサの一部とすることができ、処理ユニット５１４によって読取られうる。
【００３１】
ミラーの配置構成は、センサ７０６に達する光の２つの帯域間に幾何学的オフセットを提供するため、センサ７０６の一部は、蛍光スペクトルの１つのスペクトルで放出される光から選択される１つの波長帯域内の光を受信し、センサ７０６の別の部分は、他の蛍光スペクトルで放出される光から選択される他の波長帯域内の光を受信する。たとえば、センサ７０６が、列で配列された５１２のピクセルを含む場合、ほぼ第１の２５６ピクセルは、１つの波長帯域内の光を受信することができ、一方、ほぼ残りの２５６ピクセルは、他の波長帯域内の光を受信することができる。上記のように、処理ユニット５１４は、センサ７０６から繰り返されるラインスキャンを受信し、細胞１０１の２つの画像（各波長帯域について１つの画像）を再構築できる。こうしたシステムは、１つのリニア光センサまたはラインスキャンカメラだけを必要とし、２つのリニア光センサまたはラインスキャンカメラを有するシステムと比較して低減されたコストで構築することができる。他の種類の光学系はまた、２つの波長帯域内の光を、リニア光センサの別個の部分に送るために使用することができる。たとえば、こうした光学系は、光学格子を備えることができる。スリットアパーチャを、システム７００などのシステム内に含むことができるため、システムは半共焦結像を実施する。
【００３２】
図８は、さらに別の実施形態によるシステム８００の正投影図を示す。システム８００は、図４に示すシステム４００の変形として示すが、システム８００のさらなる特徴を、多色結像、蛍光結像、または他の技法を実施するシステムを含む他のシステムで使用することができることを当業者は認識するであろう。
【００３３】
システム８００は、密接配置された３つのセンサの平行列８０２、８０３、８０４を有する例示的なカメラ８０１を使用する。（センサ列は図８で端を前向きで示される。）システムの光学部品の動作によって、列のそれぞれは、細胞１０１上の異なる「ストライプ(stripe)」を結像させる。そのため、カメラ８０１は、細胞１０１がスキャン領域４０４のそばを通過するときに細胞１０１の任意の特定の部分を結像するための３つの異なる機会を有する。すなわち、細胞１０１の特定の部分が、最初に列８０２上に結像されることになる。細胞１０１のその同じ部分は、後の時間に列８０３上に結像され、さらに後の時間に、列８０４上に結像されることになる。図８では、不必要な詳細までシステムの動作を曖昧にしないように、細胞１０１をセンサ列８０２、８０３、８０４に接続する中心光線束だけが示される。
【００３４】
一技法では、３つの異なる画像を、細胞１０１から採取することができ、１つの画像はセンサ列８０２、８０３、８０４のそれぞれによって作られる。異なる画像は、互いに対して時間的にシフトされる、または、空間的に、Ｘ方向にシフトされると考えることができる。これらの複数の画像を使用して、信号対雑音特性が改善された複合画像を生成することができる。たとえば、３つの画像が、アライメントがとられるようデジタル的にシフトバックされ、細胞１０１上の実質的に同じ場所に対応する３つの画像からのピクセル値が加算される場合、結果として得られる複合画像は、個々の画像の任意の１つの画像と比較して約√３の倍数だけ改善した信号対雑音比を有することになる。カメラ８０１が３つのスキャンラインを有するものとして示されたが、スキャンラインは、２、４、または任意の使用可能な数ｎを有することができる。ｎラインを有するカメラによるこのデジタル的加算および平均技法によって生成される複合画像は、単一画像と比較して、約√ｎの倍数だけ改善した信号対雑音比を有することになる。画像の結合を、スキャンされる画像ラインが利用可能であるため「その場で(on the fly)」行うことができるため、単一リニア
センサによって作られる特定の細胞の完全な画像は全く構築されない。
【００３５】
ピクセルの複数の列を有するカメラ」８０１は、付加的にまたは別法として、時間遅延積分（ＴＤＩ）を実施するように構成することができる。ＴＤＩでは、細胞１０１に対する露出から得られる種々のピクセル内の電荷は、デジタル値に変換される前に、ピクセル列内に蓄積される。細胞１０１に対するセンサの露出は、実質的に同期されるため、細胞１０１上の特定の場所が、１つの露出中にセンサ列８０２に、次の露出中にセンサ列８０３に、次の露出中にセンサ列８０４に露出される。１回目の露出中に列８０２内で蓄積される電荷は、列８０３内にシフトされ、２回目の露出によって加算され、結果として得られる電荷は、列８０４内にシフトされ、３回目の露出によって加算される。蓄積された電荷は、その後、デジタル値に変換される。ＴＤＩはまた、単一画像と比較して信号対雑音比の約√ｎの改善をもたらす。
【００３６】
デジタル画像結合と共に使用するためであれ、ＴＤＩと共に使用するためであれ、同時の平行画像ラインをスキャンすることの１つの利点は、その技法が、利用可能な照明をよりよく利用することである。要素４０３などの光整形要素は、一般に、スキャンラインの単一ピクセル幅のストリップ上に光をフォーカスしないことなる。照明場は、ある程度の認識可能な幅を有することになり、照明の一部は、単一ラインカメラシステム内で無駄にされる場合がある。
【００３７】
こうしたシステムの別の利点は、分解能が、信号対雑音特性を改善するためにピクセルを単にビニングするシステム内のものであるため、分解能が低下しないことである。
図５に示すシステム５００のようなシステムはまた、各カメラ５０９、５１３が２つ以上のリニア光センサのセットを含むように適合されうることを当業者は認識するであろう。結像は、カメラ８０１に関して上述したように各カメラ５０９、５１３によって実施されるため、多色結像を、デジタル画像結合またはＴＤＩによって達成することができる。
【００３８】
同様に、図７に示すシステム７００のようなシステムは、センサ７０６が、少なくとも２つのリニア光センサのセットで置換されるように適合されうる。システムは、その後、波長選択された光を、リニア光センサのセットの２つの部分に別々に送ることになる。
【００３９】
図２、４、５、６、および７のシステムは、単一リニア光センサを有する「セット(set)」を含むものと考えることができる。
さらに、デジタル画像結合によるのであれ、時間遅延積分によるのであれ、少なくとも２つの平行リニア光センサから画像を結合することは、ビニングまたは他の分解能減少技法によって結合されうる。ビニングは、分解能が減少するが、信号対雑音特性がさらに改善された画像を生成することができる。
【００４０】
図９Ａ〜９Ｃは、ラインスキャン血球計算を実施するのに好都合な長尺状照明場を生成するためのさらなる技法を示す。
ラインスキャン血球計算技法は、全ての実施形態において長尺状照明場の使用を必要としない場合がある。従来の円形落射照明を利用することができ、照明パワーが十分に高いことを実現する。散乱した非蛍光光を使用した結像の場合、照明源の十分なパワーを達成することが難しくない場合がある。しかし、蛍光によって放出する光を実際に検知する場合、長尺状場内に励起光を集中させることが、ずっとエネルギー効率的であり、たとえば、必要とされる励起レーザパワーを、数十〜数百ワットで測定されるレベルから数十〜数百ミリワットで測定されるレベルまで低減しうる。
【００４１】
図９Ａは、長尺状照明場を提供するための技法の実施形態を含むシステム９００の１つの図を示す。システム９００は、図４に示すシステム４００のものと同様のいくつかのコ
ンポーネントおよび配置構成を使用するが、図９Ａに示す照明技法は、他の検知配置構成と共に使用することもできることを当業者は認識するであろう。システム９００では、照明が、検知が実施されるのと同じ方向からレーザ９０１によって提供されるため、サンプルの上の空間が遮るものがないままである。したがって、この配置構成は、サンプルステージとコンデンサレンズとの間の距離より厚くないサンプルに制限する場合がある、以前に述べた配置構成に比べてずっと大きなサンプルを収容することができる。図９Ａのシステムの別の利点は、対物レンズ４０５が、照明場の形成に関与することである。対物レンズ４０５は、通常、非常に高品質のレンズであるため、対物レンズ４０５が作る照明場を明確に画定することができる。
【００４２】
図９Ａの例示的なシステムでは、レーザ９０１は、細胞１０１に送られるビーム９０２を生成する。ビーム９０２は、円柱レンズ９０３を通過する。この開示のために、円柱レンズは、１つだけの次元で湾曲を有する任意のレンズである。しかし、円柱レンズは、円柱によって画定される湾曲表面を有する必要がない。図９Ａの図では、円柱レンズ９０３は、その円柱軸がＸ方向に平行な状態で配置され、レンズ９０３は、ビーム９０２に影響を及ぼさないように見える。ビーム９０２は、継続してダイクロイックミラー４０６を通り、対物レンズ４０５に達し、対物レンズ４０５は、ビームを細胞１０１上にフォーカスする。細胞１０１から発する光は、対物レンズ４０５を通過し、ミラー４０６から優先的に反射し、１つまたは複数のフィルタ４０７に当たり、レンズ４０８を通過し、カメラ４０９に達することができる。
【００４３】
図９Ｂは、Ｘ軸に沿う図からの、図９Ａの照明部分の実施形態を示す。すなわち、図９Ｂは、図９Ａの図から９０°回転した図を示す。この図では、チューブ１０２は、円として投影され、円柱レンズ９０３は、湾曲プロファイルを有するものとして示される。図９Ｂの例示的な実施形態では、円柱レンズ９０３の材料および寸法は、レンズ９０３が、比較的長い−円柱レンズと対物レンズとの間の距離より大きい−焦点長を有するように選択される。円柱レンズ９０３を通過した後、ビーム９０２は、この図で見られるように、比較的徐々に収束するのが見られる。対物レンズ４０５は、その後、照明場が幅広化されるように、Ｙ方向にビームを収束させ再拡張する。図９Ａで示すように、対物レンズ４０５は、同時に、Ｘ方向にビームをフォーカスする。結果として得られる照明場は、細胞１０１に当たるとき、明確に画定された長尺状形状を有することができる。
【００４４】
図９Ｃは、Ｘ軸に沿う図からの、図９Ａの照明部分の別の実施形態を示す。この実施形態では、円柱レンズ９０３の材料および寸法は、レンズ９０３が、比較的短い−円柱レンズと対物レンズとの間の距離より短い−焦点長を有するように選択される。円柱レンズ９０３を通過した後、ビーム９０２は、収束し、その後、対物レンズ４０５に達する前に再び再分散するのが見られる。対物レンズ４０５は、ビーム９０２が再び収束するが、ビーム９０２が細胞１０１に達するときに、ビーム９０２がカメラ４０９によってスキャンされるラインの少なくとも一部分にまたがるのに依然として十分に広くなるようにビーム９０２を向け直す。再び、対物レンズ４０５は、同時に、Ｘ方向にビームをフォーカスする。結果として得られる照明場は、細胞１０１に当たるとき、明確に画定された長尺状形状を有することができる。
【００４５】
他の実施形態では、スキャンは、細胞が静止して結像されることを維持し、照明場、システムによって結像されるライン、または両方を細胞にわたって掃引することによって達成することができる。図１０は、このように動作する例示的なシステム１０００の側面図を示す。システム１０００では、細胞１０１は、スライド、ステージ、または他のホルダ１００１上でのスキャン中にスキャン領域内で静止して保持される。対物レンズ１００２およびチューブレンズ１００３は協働して、カメラの一部とすることができるリニアラインセンサ１００４（図１０で端を前向きで観察される）上に細胞１０１の画像を形成する
。リニアラインセンサ１００４は、正方形またはほぼ正方形である感光性ピクセル部位を有することができる、または、感度の改善をもたらす場合がある細長いアスペクト比を有するピクセルを含むことができる。細長いピクセルを有するセンサの例は、米国、コネチカット州、ストラトフォートのＯｒｉｅｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能なＯｒｉｅｌ  ＬｉｎｅＳｐｅｃ  ＣＣＤ検出器である。
【００４６】
対物レンズ１００２およびチューブレンズ１００３は、好ましくは、他の光学コンポーネントを収容するために無限空間が両者間に生成されるように無限遠補正光学系を形成する。光源１００５は、スキャン用の照明光を提供する。光源１００５は、たとえば、レーザまたは他の種類の光源とすることができる。光整形要素１００６は、照明光がスキャン領域において長尺状照明場を照明するように照明光を整形する。光整形要素１００６は、光源からの光を集中させるために、種々のレンズ、プリズム、反射体、または他の光学コンポーネントを含むことができる。たとえば、光整形要素１００６は、図１０に示すように、円柱レンズを含むことができる。
【００４７】
図１０の配置構成では、ダイクロイックミラー１００７は、光源１００５からの光を送り、フィルタリングする。ダイクロイックミラー１００７は、たとえば、光源１００５によって生成される波長の光を実質的に反射するが、他の波長の光を実質的に透過させることができる。
【００４８】
照明光は、可動光学コンポーネントによってさらに操向される。可動光学コンポーネントの例は、個々のレンズ１０１０および１０１１を含む４ｆ光学系と連携して動作する回転自在のミラー１００８である。回転自在のミラー１００８は、たとえばガルバノメータによって作動することができ、スキャン中のシステム１０００の唯一の可動コンポーネントとすることができる。４ｆ光学系は、通常、それぞれが焦点長ｆを有する一対の同様のレンズを備え、レンズは、２＊ｆの距離だけ離間する、図１０の例では、レンズ１０１０および１０１１は、回転自在のミラー１００８から距離ｆ、対物レンズ１００２から距離ｆ、それぞれ離間する。系は、回転自在のミラー１００８の角度が変化するときに、対物レンズ１００２へのエントリ位置を実質的に変化させることなく、光が対物レンズ１００２に入る角度を変化させるという効果を持つ。
【００４９】
系はまた、長尺状照明場と結像されるラインが一致するように、照明場が操向されるときに、リニア光センサ１００４上で結像されるラインを操向するという効果を持つ。細胞１０１から発する光は、こうして対物レンズ１００２によって収集され、４ｆ光学系１００９および回転自在のミラー１００８によって操向されて、チューブレンズ１００３の光学軸に実質上追従し、リニア光センサ１００４上に結像される。光は、反射によって、蛍光によって、または両方によって、細胞１０１から発することができる。ダイクロイックミラー１００７は、細胞１０１の特徴に関連する蛍光体の蛍光に対応する波長の光を優先的に透過させるように構成することができる。
【００５０】
動作時、システム１０００は、照明光および結像されるラインが細胞１０１にわたって掃引される間に、リニア光センサ１００４上に入射する光の測定値を繰返し取得する。測定値を、上述したように、記憶、処理、表示、または他の使用のためにコンピュータまたは他の処理ユニット１０１２によって収集することができる。スキャンが終了すると、細胞１０１を、スキャン領域から移動させ、別の細胞を、スキャンのために所定場所にもたらすことができる。たとえば、ホルダ１００１を、別のモーションシステム（図示せず）によって移動させることができる、または、細胞がエントレインする流体を、スキャン領域にわたって流れさせることができる。こうして、細胞の数を特徴付けることができる。
【００５１】
例示的なシステム１０００では、リニア光センサ１００４は、単一光センサを含むセッ
トと考えることができる。他の実施形態では、リニア光センサのセットは、２つ以上のセンサを含むことができ、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は、結合されて、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成することができる。たとえば、画像が、時間遅延積分を使用して結合される場合がある、時間遅延および平均法を使用して結合される場合がある、ピクセルビニングを使用して結合される場合がある、デジタル的に結合される場合がある、または、他の方法によって結合される場合がある。
【００５２】
図１１は、本発明の他の実施形態による、血球計算を実施するためのシステム１１００の側面図を示す。図１１の構成では、細胞１０１などの細胞を、適切なホルダ内のウェル１１０１に含む場合があるか、または、特徴付けのためにその他の方法で所定場所に保持する場合がある。小型光学スキャン用モジュール１１０２は、ハウジング１１０６内に共に搭載された、光源１１０３、光学系１１０４、およびリニア光センサ１１０５を含む。光源１１０３は、光整形要素を含み、好適にはスキャン領域において長尺状照明場を照明することができる。光学系１１０４は、１つまたは複数のレンズ、プリズム、ミラー、フィルタ、または他の光学要素を含み、スキャン領域の一部の画像をリニア光センサ１１０５上にフォーカスすることができる。リニア光センサ１１０５は、１つまたは複数の光センサのセットを含むことができる。スキャン領域が細胞を横断するように、任意の適したモーションコントロールシステム（図示せず）によって、モジュール１１０２を、特徴付けされる細胞に対して搬送することができる。モーションコントロールシステムは、ステッパモータ、サーボモータ、リニアモータ、ベルトドライブ、親ネジ、マイクロポジショニングステージ、あるいは他のコンポーネントまたはコンポーネントの組合せを利用することができる。リニア光センサ１１０５からの信号を、記憶、解析、表示、または他の目的のために処理ユニット１１０７に渡すことができる。たとえば、信号を、ケーブル１１０８を使用してまたは他の方法によってモジュール１１０２から処理ユニットに渡すことができる。中間コントローラ１１０９が、存在する場合があり、タイミング信号、アナログ−デジタル変換、代替的に、これらの機能の任意のまたは全ての機能は、処理ユニット１１０７によってまたはモジュール１１０２内の回路によって実施されうる。照明、結像光学部品、およびリニア光センサがモジュール１１０２内に存在する限り、機能を、モジュール１１０２とコントローラ１１０９（存在する場合）と処理ユニット１１０７との間で割当てることができる。
【００５３】
これまで述べた他のシステムの場合と同様に、システム１１００は、複数のリニア光センサによって生成された画像を、たとえば時間遅延積分、ピクセルビニング、デジタル的結合、またはその他の方法によって結合して、単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成することができる。
【００５４】
図１２Ａは、本発明の他の実施形態による、血球計算を実施するためのシステム１２００を示す。例示的なシステム１２００は、長尺状照明場および結像される細胞が相対的運動を受ける点で、システム１１００の動作と同様の原理に基づいて動作するが、システム１２００は異なる検知技術を使用し、モーションコントロールにおける利点を有することができる。
【００５５】
図１２Ａの構成では、細胞１０１などの細胞を、適切なホルダ１２０５内のウェル１２０１に含むことができるか、または、別の方法で配置することができる。たとえば、細胞１０１が、プレートに付着する場合がある、可動性流体内で搬送される場合がある、または、その他の方法で、特徴付けのために存在する場合がある。光源１２０２は、光整形要素を含み、好ましくは、スキャン領域において長尺状照明場を照明することができる。収集光学部品１２０３は、スキャン領域内の特定の場所からリニア光センサ１２０４に光を別々に収集し送る特徴を含む、ファイバ束、内視鏡アレイ、または他の要素で作ることが
できる。他の実施形態の場合と同様に、リニア光センサ１２０４は、１つまたは複数のリニア光センサのセットを備えることができる。図１２Ａに示す実施形態などのいくつかの実施形態では、収集光学部品１２０３は、スキャン領域の場所のリニアなセットからリニア光センサ１２０４上の場所へ光を送るファイバのリニアアレイになるよう形成されるファイバ束を含む。好ましくは、ファイバのリニアアレイは、結像される細胞１０１とスキャン領域との間の相対的運動の方向に全体的に垂直に配設される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ファイバ束は、柔軟性があるため、スキャン領域に隣接する端部だけが、細胞とスキャン領域との間の相対的運動を生成するために移動する必要がある。そのため、可動コンポーネントの総重量は、考えられる他の設計と比較して、低減される場合があり、モーションコントロールシステム（図示せず）について厳しくない負荷をもたらす。
【００５７】
図１２Ｂは、システム１２００の一部分を側面図で示し、ファイバ束１２０３の端部上に細胞の画像を形成するために存在することができる中継光学部品１２０６を示す。たとえば、中継光学部品１２０６は、１つまたは複数のレンズあるいは他のコンポーネントを備えることができる。
【００５８】
これまで述べた他のシステムの場合と同様に、システム１２００は、複数のリニア光センサによって生成された画像を、たとえば時間遅延積分、ピクセルビニング、デジタル的結合、またはその他の方法によって結合して、単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成することができる。
【００５９】
本発明の実施形態による機器および技法はまた、細胞付着技法のために適する。たとえば、細胞を、マイクロスライドまたは他のキャリアに付着させることができ、マイクロスライドまたは他のキャリアは、次に、電動ステージに搭載される。図１３は、細胞１０１などの細胞がマイクロスライド１３０１に付着され、光学系に対して搬送されて、細胞をスキャンするシステム１３００を示す。システム１３００は、細胞搬送技法を除いて、図７に示すシステム７００と同様である。この送出技法または同様の送出技法を、本明細書でも述べる他の実施形態と連携して利用することができる。
【００６０】
システム７００に関して先に説明したように、システム１３００は、リニア光センサ７０６の異なる部分を使用して、細胞の２つの異なる画像を同時に取込む。いくつかの適用形態では、２つの画像を、異なる波長帯域を使用して取込むことができる。たとえば、細胞１０１の一部の構造を、第１の蛍光体でタグ付けし、他の構造を、第２の蛍光体でタグ付けすることができる。システム内のコンポーネント、たとえばフィルタ７０７および７０８は、リニア光センサ７０６のある部分に、１つの蛍光体によって放出される光を主に受信させ、リニア光センサ７０６の別の部分に、他の蛍光体によって放出される光を主に受信させる。異なる細胞構造が、裸眼で識別することが難しいほどに、２つの蛍光体の放出ピークが共に近くても、システム１３００は、構造の可視化の向上を可能にすることができる。スペクトルリニア分離などの画像処理技法が利用されて、構造の弁別をさらに向上させることができる。
【００６１】
図１４は、本発明の実施形態に従って取得された画像を示す。タグ付けされた皮膚細胞のオリジナル画像１４０１は、リニア光センサ７０６の２つの異なる部分によって同時に記録された２つの半分１４０２および１４０３を含む。この実験では、細胞内のアクチンが第１の蛍光体でタグ付けされ、ミトコンドリアが第２の蛍光体でタグ付けされた。
【００６２】
画像の半分１４０２および１４０３のサブセクション１４０４および１４０５が例証のために使用される。サブセクション１４０４および１４０５は、異なる蛍光体に対応する
異なる波長帯域で取得されるが、たとえば２つの蛍光体の放出スペクトルのオーバラップのせいで、２つの画像間にかなりのクロストークが存在する。図１４の例では、タグ付けされたアクチンを示す第１のサブセクション１４０４の特徴は、第２のサブセクション１４０５内で特に見ることができる。スペクトル分離は、画像間のクロストークの量を低減するために適用され、画像１４０６および１４０７をもたらす。所望される場合、処理済み画像１４０６および１４０７で見ることができる特徴を、誤った色および融合画像を対比させて割当てることができる。分離技法は、同様に他の光学的配置構成によって、たとえば図５に示すシステム５００によって得られる画像について実施することができることが認識されるであろう。他の種類の下流画像処理またはデータ解析も使用することができる。
【００６３】
本発明の実施形態は、電気泳動、圧力駆動流、光ピンセット、電動並進ステージなどを含む広範囲の細胞送出技法のうちの任意の細胞送出技法を使用するシステムで利用することができる。細胞は、油エマルションのペイロードとして、エレクトロウェッティング作動式液滴のペイロードとして、または磁気ビードタギングで支援された磁気搬送によって運ぶことができる。
【００６４】
添付された特許請求の範囲において、用語「ある(a)」または「ある(an)」は、「１つ
または複数(one or more)」を意味することを意図される。用語「備える(comprise)」な
らびに「備える(comprises)」および「備える(comprising)」などのその変形は、ステッ
プまたは要素の列挙に先行するとき、さらなるステップまたは要素の追加がオプションであり、排除されないことを意味することを意図される。本発明は、ここで、明確さおよび理解のために詳細に述べられた。しかし、特定の変更および修正を、添付特許請求の範囲内で実施することができることを当業者は理解するであろう。
【図３Ａ】
2014507662.tif 000003
【図３Ｂ】
2014507662.tif 000004
【図３Ｄ】
2014507662.tif 000005
【図９Ｂ−９Ｃ】
2014507662.tif 000006
【図１２Ａ】
2014507662.tif 000007
【図１２Ｂ】
2014507662.tif 000008
【図１】
2014507662.tif 000009
【図２】
2014507662.tif 000010
【図３Ｃ】
2014507662.tif 000011
【図４】
2014507662.tif 000012
【図５】
2014507662.tif 000013
【図６】
2014507662.tif 000014
【図７】
2014507662.tif 000015
【図８】
2014507662.tif 000016
【図９Ａ】
2014507662.tif 000017
【図１０】
2014507662.tif 000018
【図１１】
2014507662.tif 000019
【図１３】
2014507662.tif 000020
【図１４】
2014507662.tif 000021
【国際調査報告】
2014507662.tif 000022