(57)【要約】本発明は、生物のリステリア・グレイＤＳＭ  ２０６０１（Listeria grayi DSM 20601）、エンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラムＥＧ２（Enterococcus gallinarum EG2）及びエンテロコッカス・カッセリファバス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を異種発現させることにより、微生物においてメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産を増大させるための組成物及び方法を特徴とする。
2014519811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、
ａ．Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
ｂ．Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
ｃ．Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、並びに
ｄ．Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
ｉ．前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及び
ｉｉ．イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸、を更に含み、
ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞と比較して、イソプレンの生産量が増大している、細胞。
【請求項２】
前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸が、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、及び（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）及びポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）からなる群から選択される、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドが、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）のイソプレン合成酵素ポリペプチドである、請求項５に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸が、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種核酸である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ＩＤＩポリペプチドが、酵母ＩＤＩポリペプチドである、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸が、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
前記１つ以上の核酸が、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記１つ以上の核酸が、マルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記１つ以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、グラム陽性細菌細胞若しくはグラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞又は酵母細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
イソプレンの生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項１に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）イソプレンを生産させる工程と、を含む、方法。
【請求項２０】
（ｃ）前記イソプレンを回収する工程、を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
イソプレノイド前駆体の生産量を増大させる事のできる組み換え細胞であって、
（ａ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｂ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｃ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、及び
（ｄ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド前駆体生産細胞と比較して、多量にイソプレン前駆体を生産する、細胞。
【請求項２２】
前記１つ以上の核酸が、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記１つ以上の核酸が、マルチコピープラスミドにクローン化される、請求項２１〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記１つ以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項２１〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞又は酵母細胞である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記イソプレノイド前駆体が、メバロン酸（ＭＶＡ）である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
イソプレノイド前駆体の生産方法であって、（ａ）イソプレノイド前駆体の生産に好適な条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養する工程、並びに（ｂ）前記イソプレノイド前駆体を生産させる工程、を含む、方法。
【請求項３０】
（ｃ）前記イソプレノイド前駆体を回収する工程、を更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞であって、
（ａ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｂ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
（ｃ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、及び
（ｄ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、前記ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子が、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、前記細胞が、
ｉ．前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及び
ｉｉ．ポリプレニルピロリン酸合成酵素をコードしている１つ以上の核酸、
を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド生産細胞と比較して、イソプレノイドの生産量が増大している、細胞。
【請求項３２】
前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸が、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、及び（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項３１又は３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記１つ以上の核酸が、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
前記１つ以上の核酸が、マルチコピープラスミドにクローン化される、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
前記１つ以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞又は酵母細胞である、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項３６に記載の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、大腸菌（E. coli）である、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpenes）及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４４】
イソプレノイドの生産方法であって、（ａ）イソプレノイドの生産に好適な培養条件下で請求項３１に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）前記イソプレノイドを生産させる工程と、を含む、方法。
【請求項４５】
（ｃ）前記イソプレノイドを回収する工程、を更に含む、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年４月２９日出願の、米国特許仮出願番号第６１／４８１，０９８号の優先権を主張する。この特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、組成物、並びに微生物におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体分子の生産を向上させる方法、並びにこれを生産するための方法、に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｒ−メバロン酸は、アセチルＣｏＡをイソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリールジホスフェートに変換するメバロン酸依存性生合成経路の中間体である。アセチルＣｏＡのメバロン酸への変換は、メバロン酸依存性生合成経路上流（ＭＶＡ経路）の、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性により触媒され得る。解糖によるグルコースのアセチルＣｏＡへのモル当量での変換（molar conversion）に基づき、ＭＶＡ経路上流の酵素であるチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を用いメバロン酸を生産させた場合、理論上の質量収率は５４．８％である。
【０００４】
商業分野では、メバロン酸は、従来、生分解性ポリマーを製造する際の添加剤として化粧品に使用されており、他の化学物質を合成する際のキラル体の構成成分としての価値を有する。
【０００５】
メバロン酸依存性経路の生成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、イソプレン並びにイソプレノイドの前駆体である。イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は天然ゴムのモノマーであり、かつその他の、総じてイソプレノイドと呼ばれる非常に多様な天然化合物に一般的な構造モチーフでもある。更に、イソプレンは、各種合成ポリマー、特に合成ゴムの重要な出発物質である。
【０００６】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから誘導される化合物である。これまでに２９，０００種以上のイソプレノイド化合物が同定されており、かつ毎年新規のイソプレノイドが発見されている。イソプレノイドは、主な構成単位としてイソプレノイド前駆体分子を使用して、より複雑なイソプレノイド構造を形成する、微生物及び植物種などの天然物から単離することができる。イソプレノイドは、細胞膜の流動性及び電子輸送を維持する手だてとなるため、多くの生命体及び細胞にとって非常に重要である。天然では、イソプレノイドは、植物に含まれる天然の駆虫成分として多様な役割を果たし、桂皮、丁子及びショウガには特有の香りをもたらす。更に、製薬及び化学業界では、イソプレノイドを、薬剤、栄養補助剤、矯味矯臭剤、及び病害虫防除剤として使用する。これまでに、生態系における重要性及び広範な用途における有用性が考慮され、イソプレノイドは、科学者らによる関心を十分に集めている。
【０００７】
メバロン酸及びイソプレノイドを得る際の従来法としては、生物材料（例えば、植物、微生物及び動物）からの抽出、並びに製造所における部分合成又は全有機合成が挙げられる。しかしながら、このような手法は、殆どの場合十分なものではないことが判明している。特に、イソプレノイドに関しては、多くの場合その分子構造が複雑な性質を有していることを考慮すると、一般的に複数の工程が必要とされる有機合成を実施して所望の生成物を得るのは難しい。加えて、これらの化学合成の工程は、生物材料からイソプレノイドを抽出し得る毒性の溶媒を使用することを伴う。更に、一般的に、生物材料はイソプレノイド分子をほんの微量でしか含有しないことから、通常、これらの抽出及び精製方法では、所望のイソプレノイドの収率は比較的低くなる。残念なことに、イソプレノイドを比較的大量に得ることが難しいため、生物材料からのイソプレノイドの抽出の実用は限定されていた。
【０００８】
これまでにも各種速度、力価及び純度でのイソプレン及びイソプレノイドの生産方法が開示されている（例えば、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）及び米国特許第７，９１５，０２６号を参照されたい）。しかしながら、イソプレン及びイソプレノイドの生産を向上させること、並びにこれらの収率を上昇させることが引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書では、メバロン酸依存性生合成経路の中間体としてのメバロン酸の生産量を増加させ、並びにイソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドなどのメバロン酸に由来する分子の生産量を増加させるための、組成物及び方法を開示することにより、このような改良法を提供する。
【００１０】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に提供される発明は、特に、組み換え細胞によるイソプレンの生産量を増大させるための組成物及び方法を開示する。本発明は、生物のリステリア・グレイＤＳＭ  ２０６０１（Listeria grayi DSM 20601）、エンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラムＥＧ２（Enterococcus gallinarum EG2）及びエンテロコッカス・カッセリファバス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現させる（例えば、異種発現）ことにより、微生物においてメバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産を増大させるための組成物及び方法も提供する。
【００１２】
適宜に、本明細書では、イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え細胞が提供され、細胞は、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、及びＬ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、ＭＶＡ経路の下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞と比較して、イソプレンの生産量が増大している。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸には、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、及び（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。一部の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（ウラジロハコヤナギ（Populus alba））ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）及びポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）からなる群から選択される。一部の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）イソプレン合成酵素ポリペプチドである。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、細胞は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。一部の態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種核酸である。一部の態様では、ＩＤＩポリペプチドは酵母のＩＤＩポリペプチドである。一部の態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータの下に配置される。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化される。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞、大腸菌細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞又は酵母細胞である。一部の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。一部の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。
【００１３】
他の態様では、本明細書は、本明細書で提供される任意の態様で開示される宿主細胞を、イソプレン生産に好適な培養条件下で培養する工程、並びにイソプレンを生産させる工程を含む、イソプレンの生産方法が提供される。一態様では、方法は更に、イソプレンを回収する工程、を含む。
【００１４】
更なる態様では、本明細書では、イソプレノイド前駆体の生産量を増大させることのできる組み換え細胞が提供され、細胞は、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、並びにＬ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド前駆体生産細胞と比較して、イソプレノイド前駆体の生産量が増大している。一部の態様では、１つ以上の核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータの下に配置される。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化される。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞又は酵母細胞である。一部の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。一部の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、イソプレノイド前駆体は、メバロン酸（ＭＶＡ）である。
【００１５】
他の態様では、本明細書では、本明細書で開示される任意の態様に記載される宿主細胞を、イソプレノイドの生産に好適な培養条件下で培養する工程、並びにイソプレノイドを生産させる工程を含む、イソプレノイド前駆体の生産方法が提供される。一態様では、方法は、イソプレノイド前駆体を回収する工程を更に含む。
【００１６】
更に他の態様では、本明細書では、イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞が提供され、細胞は、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、並びにＬ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及びポリプレニルピロリン酸合成酵素をコードしている１つ以上の核酸を更に含み、細胞は、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド生産細胞と比較して、イソプレノイドの生産量が増大している。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸には、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、及び（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。一部の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータの下に配置される。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化される。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、１つ以上の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞又は酵母細胞である。一部の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．��ンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。一部の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpenes）及びポリテルペンからなる群から選択される。一部の態様では、イソプレノイドは、セスキテルペンである。本開示の任意の態様に関し、一部の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される。
【００１７】
他の態様では、本明細書で開示される任意の態様に記載される宿主細胞を、イソプレノイドの生産に好適な培養条件下で培養する工程、並びにイソプレノイドを生産させる工程を含む、イソプレノイドの生産方法が提供される。一態様では、方法は更に、イソプレノイドを回収する工程、を包含する。
【００１８】
一態様では、本発明は、メバロン酸の生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、及び（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まない細胞（細菌細胞など）と比較して、より高い質量収率でメバロン酸を生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータの調節下又は常時発現型プロモータの調節下に配置することができる。一態様では、１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞（細菌細胞など）の染色体に組み込まれる。一態様では、細胞は、グラム陽性細胞又はグラム陰性細胞のいずれかの細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）���胞からなる群から選択される細菌細胞である。他の態様では、細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。
【００１９】
他の態様では、本発明は、メバロン酸の生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まない細胞（細菌細胞など）と比較して、高い最大力価でメバロン酸を生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータの調節下又は常時発現型プロモータの調節下に配置することができる。一態様では、１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞（細菌細胞など）の染色体に組み込まれる。一態様では、細胞は、グラム陽性細胞又はグラム陰性細胞のいずれかの細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細���からなる群から選択される細菌細胞である。他の態様では、細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。
【００２０】
他の態様では、本発明は、メバロン酸の生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まない細胞（細菌細胞など）と比較して、高い細胞生産性指数（ＣＰＩ）を有する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータの調節下又は常時発現型プロモータの調節下に配置することができる。一態様では、１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞（細菌細胞など）の染色体に組み込まれる。一態様では、細胞は、グラム陽性細胞又はグラム陰性細胞のいずれかの細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）���胞からなる群から選択される細菌細胞である。他の態様では、細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。
【００２１】
他の態様では、本発明は、メバロン酸の生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まない細胞（細菌細胞など）と比較して、より高い質量収率でメバロン酸を生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータの調節下又は常時発現型プロモータの調節下に配置することができる。一態様では、１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞（細菌細胞など）の染色体に組み込まれる。一態様では、細胞は、グラム陽性細胞又はグラム陰性細胞のいずれかの細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞から���る群から選択される細菌細胞である。他の態様では、細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。
【００２２】
他の態様では、本発明は、メバロン酸の生産量を増加させる方法を提供し、方法は、（ａ）（ｉ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｉｉ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｉｉｉ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子及び（ｉｖ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含む細胞を培養する工程、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードする、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含む。一部の態様では、方法は更に、メバロン酸を回収する工程、を含む。一部の態様では、細胞は３４℃で培養する。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、低〜中間コピー数プラスミドで発現させる。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、高発現型プロモータの調節下にある。
【００２３】
他の態様では、本発明は、イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、かつ細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及び（ｉｉ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して、多量のイソプレンを生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素並びに（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus��・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドである。一態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来の、あるいはウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はプエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）及びポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）からなる群から選択される。他の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチドである。一態様では、細胞（細菌細胞など）は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。他の態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種核酸である。他の態様では、ＩＤＩポリペプチドは、酵母のＩＤＩポリペプチドである。一態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。更に別の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。他の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。
【００２４】
他の態様では、イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、（ｉｉ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸、及び（ｉｉｉ）ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して、多量のイソプレンを生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素並びに（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、からなる群から選択される酵素を含む。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドである。一態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来の、あるいはウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はプエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）及びポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）からなる群から選択される。他の態様では、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチドである。一態様では、細胞（細菌細胞など）は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。他の態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種核酸である。他の態様では、ＩＤＩポリペプチドは、酵母のＩＤＩポリペプチドである。一態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである。一態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）へと変換する酵素、（ｂ）１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）へと変換する酵素、（ｃ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）へと変換する酵素、（ｄ）４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）へと変換する酵素、（ｅ）２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）へと変換する酵素、（ｆ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）へと変換する酵素、並びに（ｇ）（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１イルジホスフェートを���ソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）へと変換する酵素、からなる群から選択される酵素を含む。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。更に別の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。他の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。
【００２５】
他の態様では、本発明は、イソプレンの生産量を増大させる方法を提供し、方法は、（ａ）（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）を培養する工程、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸並びに（ｉｉ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して、多量のイソプレンを生産する。一部の態様では、細胞は、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、方法は、イソプレンを回収する工程を更に含む。一部の態様では、細胞は３４℃で培養する。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、染色体外のプラスミドで発現させる。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞（細菌細胞の染色体など）の染色体に組み込まれる。
【００２６】
他の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸並びに（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも多量のイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。更に別の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。他の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。一態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素並びに（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、から選択される酵素を含む。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。他の態様では、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼを含む。他の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpene）及びポリテルペンからなる群から選択される。他の態様では、イソプレノイドはセスキテルペンである。一部の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される。
【００２７】
他の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）を提供し、細胞は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸並びに（ｉｉｉ）ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して、多量のイソプレンを生産する。一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号１と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号２と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号３と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号４と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子は、配列番号５と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号６と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子、配列番号７と一致する核酸を含む。他の態様では、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ遺伝子は、配列番号８と一致する核酸を含む。一態様では、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸は、コドン最適化されている。一態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素並びに（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、からなる群から選択される酵素を含む。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。他の態様では、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼを含む。一態様では、細胞（細菌細胞など）は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。他の態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種核酸である。他の態様では、ＩＤＩポリペプチドは、酵母のＩＤＩポリペプチドである。一態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードしている核酸は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである。一態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）へと変換する酵素、（ｂ）１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）へと変換する酵素、（ｃ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）へと変換する酵素、（ｄ）４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）へと変換する酵素、（ｅ）２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）へと変換する酵素、（ｆ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）へと変換する酵素、並びに（ｇ）（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）へと変換する酵素、からなる群から選択される酵素を含む。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータ下に配置される。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、マルチコピープラスミドにクローン化されている。他の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。更に別の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である。他の態様では、細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。他の態様では、細胞は大腸菌（E. coli）である。
【００２８】
他の態様では、本発明は、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子の生産量を増大させる方法を提供し、方法は、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．ファシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子並びに（ｄ）Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の異種核酸を含む細胞を培養する工程、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒活性を有するポリペプチドをコードしており、細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸並びに（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸合成酵素をコードしている異種核酸、を更に含み、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を含まないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子生産細胞（細菌細胞など）と比較して、多量のイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子を生産する。一部の態様では、細胞は、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、方法は、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子を回収する工程、を更に含む。一部の態様では、細胞は３４℃で培養する。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、染色体外のプラスミドで発現させる。一部の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞（細菌細胞の染色体など）の染色体に組み込まれる。
【００２９】
他の態様では、本発明は、メバロン酸の生産量を増大させることのできる組み換え宿主（例えば、細菌）細胞を提供し、細胞は、次の生物、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）又はＬ．グレイ（L. grayi）の１つ以上に由来し、分解耐性を示すｍｖａＥ遺伝子産物を含む。
【００３０】
他の態様では、本発明は、イソプレンの生産量を増大させることのできる組み換え宿主（例えば、細菌）細胞を提供し、細胞は、イソプレンを生産する次の生物、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）又はＬ．グレイ（L. grayi）の１つ以上に由来し、分解耐性を示すｍｖａＥ遺伝子産物を含む。
【００３１】
他の態様では、本発明は、イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え宿主（例えば、細菌）細胞を提供し、細胞は、イソプレンを生産する次の生物、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）又はＬ．グレイ（L. grayi）の１つ以上に由来し、分解耐性を示すｍｖａＥ遺伝子産物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】グルコースからのメバロン酸の質量収率を示すグラフ。エラーバーは、２回の反復試行により示される標準偏差を表す。
【図２】ｐＤＷ３４のプラスミドマップ。
【図３】発酵開始から４０時間後のＥ．フェカリス（E. faecalis）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及びＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）のＭＶＰ濃度。
【図４】各１５Ｌスケールでの発酵により、経時的にグルコースに対して得られるイソプレン収率を示す。Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）（それぞれ三角形及び四角形）を使用して実施したすべての試験では、グルコースに対するイソプレン収率（％）は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）の上流経路の酵素を使用して実施した２試験（白抜き及び黒塗りの菱型）よりも高かった。グルコースに対する収率（％）は、総イソプレン量（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］として算出した。式中、０．５９はグルコース供給溶液中のグルコースの重量％であり、８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵容器にバッチ供給（feed batched）したグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。
【図５】各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、容積生産量を経時的に示す。Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）（それぞれ三角形及び四角形）を使用して実施したすべての試験では、総容積生産量は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）の上流経路の酵素を使用して実施した２試験（白抜き及び黒塗りの菱型）よりも高かった。容積生産量は、次式を使用して算出した：容積生産量（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝［Σ（ＨＧＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］。式中、総和はｔ０〜ｔである。タンクのターンアラウンド・タイム（turnaround time）は係数に含めなかった。
【図６】各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、比生産量を経時的に示す。Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）（それぞれ三角形及び四角形）を使用して実施したすべての試験では、最大比生産量は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）の）上流経路の酵素を使用して実施した２試験（白抜き及び黒塗りの菱型）よりも高かった。比生産量は、次式を使用して算出した：比生産量（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（Evolution Rate）（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）である。ＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。
【図７】遺伝子操作し、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ又はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを大腸菌（E. coli）染色体上で発現させた大腸菌（E. coli）株の、小規模試験における生育及びイソプレン生産量。
【図８】大腸菌（E. coli）の１５Ｌスケールでの発酵時のＭ．マゼイ（M. mazei）及びＭ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼの発現。
【図９】株ＤＷ３２６由来のｍｖａＥが可視化されたウェスタンブロット。第１レーン−基準マーカー、第２レーン−０．４ｕｇの精製ｍｖａＥ、第３〜７レーン−０、２５、５０、１００、２００μＭのＩＰＴＧにより誘導を行った株ＤＷ３２６由来の可溶化サンプル。
【図１０】Ｓａｆｅｓｔａｉｎにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。各レーンは次のサンプルを含有している：第１レーン−基準マーカー、第２〜１５レーン−Ｈｉｓ−ｔａｇ標識を利用し精製し、ニッケルカラムから溶出させたｍｖａＥタンパク質画分。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
細菌細胞などの微生物細胞は、組み換えタンパク質の生産に広く使用される宿主である。これらの細胞は、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及びイソプレノイドなどの他の産物の生産に使用することもできる。本発明は、微生物リステリア・グレイＤＳＭ  ２０６０１（Listeria grayi DSM 20601）、エンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラムＥＧ２（Enterococcus gallinarum EG2）及び／又はエンテロコッカス・カッセリファバス（Enterococcus casseliflavus）に由来するｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子によりコードされるポリペプチドを異種発現している細胞（細菌細胞など）を使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及びイソプレノイドの収率及び力価を増大させて生産するための組成物及び方法を特に提供する。
【００３４】
メバロン酸依存型生合成経路は、イソプレノイド前駆体分子のメバロン酸（ＭＶＡ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生産に特に重要である。メバロン酸経路上流の酵素は、グルコースから生成されたアセチルＣｏＡを、３つの酵素反応によりメバロン酸へと変換する。統合して、上記細菌種由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子は、メバロン酸経路上流の酵素活性を保有しているポリペプチドをコードする。理論に束縛されるものではないが、メバロン酸依存性生合成経路の上流において、これら３つの酵素活性の効率及び生産性を向上させることで、メバロン酸の細胞内濃度が、ひいては下流のイソプレノイド前駆体分子（ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰなど）の濃度が実質的に上昇すると考えられる。したがって、これらの株によるメバロン酸の生産収率の増加は、商業用途に有利なものである。
【００３５】
これまでに、異なる細菌種（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を大腸菌（E. coli）株に組み込み、予めメバロン酸を生産させるという手法が示されている（米国特許出願公開番号２００５／０２８７６５５（Ａ１）号；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１，２００４を参照されたい）。しかしながら、本発明者らは、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及びＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現している細胞（細菌細胞など）で生産されるメバロン酸の質量収率は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）株により生産されるメバロン酸の質量収率も大きくなることを発見した。したがって、本発明の組成物及び方法は、これまでに当該技術分野で実施されているものと比較して、メバロン酸の生産量を増大させるのに利用可能な微生物株の数、並びにこれらの細胞（細菌細胞など）により生産されるメバロン酸の量の両方で、改善を示す。
【００３６】
一般的技術
本発明の実施においては、特に断らないかぎりにおいて、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。これらの手法は、次の文献：「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９年）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．、１９８７年）；「酵素学的実験法（Methods in Enzymology）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．、１９８７年、定期的に改定）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４年）。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）第２版」、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４年）、及びＭａｒｃｈ「有機化学反応、機序及び構造第４版（Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed.）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）中に十分に説明されており、これらの文献は、本出願で使用される数多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
【００３７】
用語の定義
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで、揮発性のＣ５炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、生産方法を限定されることを意図しない。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。
【００４０】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００４２】
「組み換え核酸」とは、目的の核酸が由来する生物に天然に生じるゲノムにおいて、目的の核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、目的の核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。
【００４３】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。例えば、大腸菌（E. coli）を形質転換させるか、又は大腸菌の染色体に組み込むかされる、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及びＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子によりコードされる核酸は、異種核酸である。
【００４４】
本明細書において使用するところの「発現制御配列」とは、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現制御配列は、常時発現型若しくは誘導型のプロモータ又はエンハンサなどのプロモータであり得る。発現制御配列は「ネイティブ」な配列又は異種性の配列であり得る。ネイティブな発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同様の生物、種又は株に由来する配列である。異種性の発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモータ」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモータである。
【００４５】
「調節可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモータなど）及び第２の核酸配列間の機能的連結を意味し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal mediａ）」は、細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有し、概してアミノ酸の存在していない増殖培地を指す。最少培地は、典型的には（１）細胞（細菌細胞など）の生育用の炭素供給源、（２）各種塩類（細胞種（例えば、細菌細胞種など）及び生育条件に応じ変更することができる）及び（３）水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選択するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の生育を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選択するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレノイド」は、２つ以上の炭化水素単位からなり、各単位は、特定の様式で配置された５つの炭素原子からなる、天然に生じる有機化合物類の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。本明細書で使用するとき、「イソプレン」は、明らかに「イソプレノイド」の定義から除外される。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」は、多様な様式で組み立てられ及び修飾され、構成員として使用されたイソプレノイド単位の数に基づき分類される、炭素数５のイソプレノイド単位に由来する有機分子の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。ヘミテルペノイドは、イソプレノイド単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレノイド単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレノイド単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレノイド単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレノイド単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ超有する。
【００４９】
本明細書で使用するとき、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイド又はイソプレノイドの生合成時に生物により使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定例としては、例えば、メバロン酸（ＭＶＡ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「質量収率」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、細胞（細菌細胞など）により消費されたグルコースの質量より除算し、１００を乗じたものを指す。
【００５１】
「比生産量」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、生産物の生産にかかった時間、細胞密度及び培養体積により除したものを意味する。
【００５２】
「力価」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、培養体積により除したものを意味する。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「細胞生産性指数（ＣＰＩ）」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、培養により生産された細胞（細菌細胞など）の質量により除したものを指す。
【００５４】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
【００５５】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００５６】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００５７】
イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）の生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びＮ−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の生産に重要であり、並びにテルペン、テルペノイド、イソプレノイド、及びイソプレンの生合成時の主成分として機能するイソプレノイド前駆体分子のＭＶＡ、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの主要な供給源を提供する。
【００５８】
ＭＶＡ経路の上流において、細胞の代謝により生産されたアセチルＣｏ−Ａは、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドの作用により、メバロン酸に変換される。はじめに、アセチルＣｏ−Ａは、チオラーゼの作用によりアセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階となる。次に、メバロン酸は、メバロン酸キナーゼの作用により５−ホスホメバロン酸に変換され、５−ホスホメバロン酸は、続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性により、５−ジホスホメバロン酸に変換される。最後に、酵素の５−ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性により、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが形成される。
【００５９】
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子
Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及びＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）においては、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードしている。実際に、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真性細菌で見られる、ＩＰＰ生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６０】
したがって、細胞（細菌（例えば、大腸菌（E. coli））細胞など）は、イソプレン前駆体（例えば、メバロン酸）の生産量、最大力価及び細胞生産性を増大させるために、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を１つ以上発現するよう遺伝子操作することができる１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【００６１】
Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子に関しては、単独での使用、あるいはＭＶＡ経路上流のタンパク質をコードしているその他の１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を組み合わせての使用といった各種選択も、本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、表１において企図される任意の遺伝子の組み合わせを、上記の任意の手法において、細胞（細菌細胞など）に発現させることができる。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
ｍｖａＥポリペプチド及び核酸例
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドの酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＥポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００６４】
変異型ｍｖａＥポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＥポリペプチド活性（すなわち、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力並びに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【００６５】
ｍｖａＥポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＥポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力及び／又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＥポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＥポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【００６６】
一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産する際には、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥタンパク質を使用することができる。使用することのできる、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥ遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及びＬ．グレイ（L. grayi）に由来するものが挙げられる。当業者は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてｍｖａＥタンパク質を発現させ、任意の標準的な分子生物学手法により断片が存在していないか調べることができる。例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇを利用して精製した後、すなわちメバロン酸、イソプレン又イソプレノイドを生産する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１において発現させた後、本明細書に記載の検出法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色することにより、断片が存在していないことを確認することができる。
【００６７】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２，Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）に記載のものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性並びにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有しているか評価することができる。代表的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性は、アセトアセチルＣｏＡの形成又はリオリシスに伴う吸光度の変化を分光光度計により３０２ｎｍにて監視することで測定できる。アセトアセチルＣｏＡ合成を判定するための各反応に関する標準的なアッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス（ｐＨ  １０．５）というものであり、反応は酵素の添加により開始される。アッセイは最終用量２００μＬで実施できる。アッセイに関し、１酵素単位（ｅｕ）は、１分間で１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡを合成又はチオリシスすることを意味する。他の代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、分光光度計により、３４０ｎｍでのＮＡＤＰ（Ｈ）の出現又は消失をもとに監視することもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元的脱アシル化について測定した各反応の標準的なアッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ及び１００ｍＭのＫｘＰＯ４（ｐＨ  ６．５）というものである。アッセイは最終用量２００μＬで実施する。反応は酵素の添加により開始される。アッセイに関し、１ｅｕは、１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）が代謝回転されることを意味する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡ又はメバロン酸が代謝回転することに相当する。
【００６８】
あるいは、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）で測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【００６９】
ｍｖａＥ核酸の例としては、ｍｖａＥポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ｍｖａＥ核酸の例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１に対し、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号１〜８のうちのいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、���１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有する核酸によりコードされ得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号１〜８のうちのいずれか１つを有する核酸によりコードされ得る。
【００７０】
ｍｖａＥポリペプチドの例としては、ｍｖａＥポリペプチドに関する活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ペプチド又は融合ポリペプチド断片が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチドの例としては（andinclude）、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体変異体が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチドの例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＥポリペプチドが挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１１に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、配列同一性を有し得る。他の態様では、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１１に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１３に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１３に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号９に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号９に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１５に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１５に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号９〜１６のうちのいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有するポリペプチドによりコードされ得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号９〜１６のうちのいずれか１つを有するポリペプチドによりコードされ得る。
【００７１】
ｍｖａＥ核酸は、細胞（バクテリア細胞など）において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＥ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＥ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【００７２】
ｍｖａＳポリペプチド及び核酸例
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を変換させることができる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００７３】
変異型ｍｖａＳポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＳポリペプチド活性（すなわち、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＳポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【００７４】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９〜１６４）に記載のものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するか評価することもできる。代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の活性は、３０３ｎｍでの吸光度の変化を監視することにより、エノール形態のアセトアセチルＣｏＡの消失を分光光度を元に評価することで、検定できる。３０℃下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する標準的な１ｍＬのアッセイ系に、５ｍＭのアセチルリン酸、１０，Ｍ−アセトアセチル−ＣｏＡ及び５μＬの抽出サンプルを加え、続いてアセチルＣｏＡ（１００ｕＭ）及び１０ユニットのＰＴＡを同時に加えることができる。次に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を、アセチルＣｏＡ添加前及び添加後の速度（rate）の差として測定する。使用した条件下（ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）での、アセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１である。定義によると、１ユニットの酵素活性により、１分当たり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡが変換されることになる。
【００７５】
あるいは、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい。この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）又はＨＰＬＣ（米国特許出願公開番号第２０１１／０１５９５５７（Ａ１）号を参照されたい。この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）により測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【００７６】
ｍｖａＳ核酸の例としては、ｍｖａＳポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。核酸の例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＳが挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号２に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号２に対しても、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号４に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号４に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。
【００７７】
ｍｖａＳポリペプチドの例としては、ｍｖａＳポリペプチドに関する活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ペプチド又は融合ポリペプチド断片が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチドの例としては、天然に生じるポリペプチド、並びに本明細書に記載の任意の生物資源由来のポリペプチド並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチドの例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＳポリペプチドが挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１２に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１２に対しても、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１４に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１４に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１０に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１０に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１６に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１６に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。
【００７８】
ｍｖａＳ核酸は、細胞（バクテリア細胞など）において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＳ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＳ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【００７９】
宿主細胞例
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモータ、及びエンハンサが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
【００８０】
遺伝子の異種発現に使用することのできる任意の微生物又はそれらの子孫微生物を使用して、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来の１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現させることができる。異種発現させるために組み換え細胞を作製して、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来の１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現させるために使用することができる。グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞を使用して、上記の任意のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現させることができる。詳細には、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子は、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞のいずれかにおいて発現させることができる。加えて、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子は、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）又はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）などの任意のラクトバチルス種（Lactobacillus spp.）で発現させることができる。
【００８１】
本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気生細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドを生産するよう遺伝子操作を行った絶対嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物用の宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができる。この場合、存在する酸素量は嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害なものではない。
【００８２】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドを生成するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性の宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
【００８３】
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ  ＆  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｔ．コニンギ（T. koningii）、Ｔ．ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウム属（Penicillium sp.）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、Ｈ．グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）、Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム属（Gliocladium sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）（例えば、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori））、フザリウム属（Fusarium sp.）（例えば、Ｆ．ロゼウム（F. roseum）、Ｆ．グラミニウム（F. graminum）、Ｆ．セレアリス（F. cerealis）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はＦ．ベネナタム（F. venenatum））、ニューロスポラ属（Neurospora sp.）（例えば、Ｎ．クラッサ（N. crassa）、ヒポクレア属（Hypocrea sp.）、ムコール属（Mucor sp.）（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、リゾプス属（Rhizopus sp.）又はエメリセラ属（Emericella sp.）のいずれか由来のものであってよい。一部の態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．アクレタス（A. aculeatus）、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）又はＦ．ソラニ（F. solani）である。特定の実施形態では、本明細書において使用するプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開番号第２０１１／００４５５６３号（この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
【００８４】
宿主細胞は、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）などの酵母であってもよい。一部の態様では、サッカロマイセス種（Saccharomyces sp.）は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３〜４８８を参照されたい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、本明細書において使用するプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許第７，６５９，０９７号及び米国特許出願公開番号第２０１１／００４５５６３号に記載のものが挙げられる（これらの特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷａｒｍｂｒｏｄｔ、「藻類及び酵母などの菌類における遺伝子発現（Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast）」（１９９３年），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい。これらの特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、本明細書において使用するプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開番号第２０１１／００４５５６３号（この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。一部の態様では、宿主細胞は、形態学に基づき次の群：クロオコッカス目（Chroococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるラン藻である。特定の実施形態では、本明細書において使用するプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許広報第２０１０／０２９７７４９号、米国特許第２００９／０２８２５４５号及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが挙げられる（これらの特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８６】
本明細書に記載の組成物及び方法において、大腸菌（E. coli）宿主細胞を使用して、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来の１種以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを発現させることができる。一態様では、宿主細胞は、メバロン酸を生産することができ、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を発現する大腸菌（E. coli）株組み換え細胞又はそれらの子孫細胞である。大腸菌（E. coli）宿主細胞は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を異種発現しないことを除き同一の細胞と比較して、上回る生産量、ピーク力価及び細胞生産性でメバロン酸を生産することができる。加えて、大腸菌（E. coli）において異種発現させる、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、染色体コピーであってよい（例えば、大腸菌（E. coli）染色体に組み込まれる）。他の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は培養物である。
【００８７】
細胞培養培地例
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media））」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に１種以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には、（１）細胞（例えば、細菌）の生育用の炭素源、（２）各種塩類（細胞（例えば、細菌）種及び生育条件に応じ変更することができる）及び（３）水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選択するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の生育を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選択するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００８８】
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。最少培地の処方例としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、１Ｌにつき（１）２００ｍＬの滅菌Ｍ９塩類（１Ｌ当たりＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ（６４ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１５ｇ）、ＮａＣｌ（２．５ｇ）及びＮＨ４Ｃｌ（５．０ｇ））；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（重量／体積）グルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）を含有する。ＴＭ３最少培地は、１Ｌにつき（１）１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４；（２）１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４；（３）２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）２ｇのクエン酸一水和物；（５）０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム；（６）３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；（７）０．２ｇの酵母エキス；及び（８）１ｍＬの１０００Ｘ微量元素溶液を含有する。ｐＨは約６．８に調整し、溶液はろ過滅菌する。１０００Ｘ微量元素は、（１）４０ｇのクエン酸一水和物；（２）３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ；（３）１０ｇのＮａＣｌ；（４）１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ；（５）１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（６）１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；（７）１００ｍｇのＨ３ＢＯ３；及び（８）１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを含有する。ｐＨは約３．０に調節する。
【００８９】
その他の最小培地の例は、（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）、（６）１０００Ｘ改変微量金属溶液、（７）硫酸５０％（重量／体積）、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び（９）微量塩溶液を３．３６ｍＬ含有する。成分のすべてを一緒に加え、脱イオン水に溶解させ、次に加熱滅菌する。続いて室温に冷却し、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後にビタミン溶液及びスペクチノマイシンを加え、ｐＨを調整する。
【００９０】
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝させることのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。
【００９１】
一部の態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。一部の態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）、又は０．０１％（重量／体積）である。一部の態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
【００９２】
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。炭水化物の例としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
【００９３】
細胞培養条件例
本発明の組み換え細胞を維持し及び生育させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。細胞（例えば、細菌）培養物の維持及び生育に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Industrial Microbiology）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入する核酸にコードされた、ｍｖａＥ、ｍｖａＳイソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路又はＰＧＬ、のポリペプチドのうちの、１種以上を発現させる条件下で、培地中で培養される。
【００９４】
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。一部の態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）にて増殖及び維持される。一部の態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で増殖する。一部の態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（例えば、約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。細胞は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で生育させることができる。加えて、細胞を培養するにあたり、より特異的な細胞培養条件を使用することができる。例えば一部の実施形態では、細胞（例えば、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞）は、３４℃下で、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどをコードしている１つ以上の異種核酸を、高発現型プロモータの調節下の低〜中間コピー数のプラスミドにより発現する。
【００９５】
使用することのできる標準的な培養条件、並びに回分式、流加式、又は連続式発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている（これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。回分式発酵及び流加式発酵は一般的かつ当該技術分野では周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
【００９６】
一部の態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同様である。一部の態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。一部の態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
【００９７】
一部の態様では、細胞（細菌細胞など）は回分式培養で生育させる。細胞（細菌細胞など）は、流加式培養又は連続式培養により生育させることもできる。加えて、細胞（細菌細胞など）は、限定するものではないが、上記のいずれかの最少培地などの最少培地で培養することができる。最少培地には、更に１．０％（重量／体積）グルコース又は任意の他の６単糖以下の糖などを添加してもよい。具体的には、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。加えて、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスを添加してもよい。具体的には、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。あるいは、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。
【００９８】
イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）の生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞を上回る濃度で、イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）を生産する能力を有する。一実施形態では、本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、所望により最少培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞を上回る濃度で、メバロン酸を生産する能力を有する。一部の場合では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。細胞（細菌細胞など）は、メバロン酸又はその他のイソプレノイド前駆体を約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超で生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ又は２００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値で、メバロン酸又はその他のイソプレノイド前駆体を生産することができる。
【００９９】
本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞を上回る最大力価で、イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）を生産する。一実施形態では、本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、所望により最少培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞を上回る最大力価で、メバロン酸を生産する。細胞（細菌細胞など）は、発酵開始から４８時間後に、約１０５ｇ／Ｌの最大力価でメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、発酵開始から４８時間後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ超の最大力価で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値の最大力価でメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）を生産することができる。
【０１００】
本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞を上回る細胞生産性指数（ＣＰＩ）を有する。本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、所望により最少培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞を上回る細胞生産性指数（ＣＰＩ）を有する。細胞（細菌細胞など）は、メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）に関し少なくとも約４．５（ｇ／ｇ）のＣＰＩを有し得る。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）に関し少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。
【０１０１】
本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）の、グルコースからのイソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）の質量収率は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞の質量収率を上回る。一実施形態では、本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）の、グルコースからのメバロン酸の質量収率は、所望により最少培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まないことを除き同一の細胞の質量収率を上回る。細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約３８％の質量収率で、グルコースからメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％又は５５％並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値の質量収率でグルコースからメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）を生産できる。
【０１０２】
一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、メバロン酸生産細胞である。一態様では、メバロン酸生産細胞は、メバロン酸を生産することのできる野生型細胞である。他の態様では、メバロン酸生産細胞は、非天然のＭＶＡ経路上流のポリペプチドを１つ以上含有するよう遺伝子操作を施した、非天然に生じる細胞である。
【０１０３】
組み換え細胞（細菌細胞など）を使用してイソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）を多量に生産する方法
本明細書では、メバロン酸などのイソプレノイド前駆体の生産方法も提供する。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、（ａ）イソプレノイド前駆体を生産することのできる組み換え細胞（本明細書に記載の任意の細菌細胞を含む）又はそれらの子孫細胞を含む組成物を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産させる工程、を含む。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体を生産させるのに好適な条件下で、本明細書に記載の任意の組み換え細胞を培養する工程、並びに組み換え細胞にイソプレノイド前駆体を生産させる工程、を含む。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体を回収する工程を更に含む。
【０１０４】
一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、（ａ）メバロン酸を生産することのできる組み換え細菌細胞（上記の任意の細菌細胞を含む）又はそれらの子孫細胞を含む組成物を培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含む。一部の態様では、メバロン酸を生産させる方法は、メバロン酸の生産に好適な条件下で、本明細書に記載の任意の組み換え細胞を培養する工程、並びに組み換え細胞にメバロン酸を生産させる工程、を含む。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１０５】
メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産方法には、（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有さない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を、所望により最少培地で培養する工程、細胞は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）を生産させる工程、を含ませることもできる。細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどをコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高濃度でメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）を生産できる。一部の場合では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
【０１０６】
イソプレノイド前駆体の生産に関する本発明の方法では、約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超でイソプレノイド前駆体を生産することができる。あるいは、イソプレノイド前駆体は、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ又は２００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超の量で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値の量で、生産させることができる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体を回収する工程を更に含む。
【０１０７】
メバロン酸の生産にあたり、本開示の方法では、約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超でメバロン酸を生産できる。あるいは、メバロン酸は、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ又は２００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超のメバロン酸で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値で、生産させることができる。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１０８】
イソプレノイド前駆体の生産方法には、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含させることができる：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有していない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現している、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産させる工程、細胞（細菌細胞など）は、発酵開始から４８時間後に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同一の細胞を上回る最大力価で、イソプレノイド前駆体を生産する。所望により、上記の細胞は最少培地で培養する。
【０１０９】
イソプレノイド前駆体の生産に関する本発明の方法では、発酵開始から４８時間後に、約１０５ｇ／Ｌ超のピーク力価でイソプレノイド前駆体を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、発酵開始から４８時間後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ又は２００ｇ／Ｌ超の最大力価で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値の最大力価でイソプレノイド前駆体を生産させることができる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体を回収する工程、を更に含む。
【０１１０】
メバロン酸の生産方法には、同様に、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含させることができる：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有さない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を、所望により最少培地で培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、細胞（細菌細胞など）は、細胞を最少培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上の異種コピーを含まない同一の細胞を上回る最大力価で、メバロン酸を生産する。
【０１１１】
メバロン酸生産にあたり、本開示の方法では、発酵開始後４８時間で約１０５ｇ／Ｌを超えるピーク力価でメバロン酸を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、４８時間の発酵後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ又は２００ｇ／Ｌ超のピーク力価で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のピーク力価で、メバロン酸を生産し得る。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１１２】
イソプレノイド前駆体の生産方法には、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含させることができる：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有していない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産させる工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上の異種コピーを含まない同一の細胞を上回るＣＰＩを、イソプレノイド前駆体に関して有する。所望により、上記の細胞は最少培地で培養する。
【０１１３】
イソプレノイド前駆体の生産に関する本発明の方法では、イソプレノイド前駆体に関し少なくとも４．５（ｇ／ｇ）のＣＰＩを有する細胞を使用してイソプレノイド前駆体を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体を回収する工程を更に含む。
【０１１４】
メバロン酸の生産方法には、同様に、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含させることができる：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有さない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、細胞（細菌細胞など）は、細胞を最少培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上の異種コピーを含まない同一の細胞を上回るＣＰＩを、メバロン酸に関して有する。
【０１１５】
メバロン酸生産に関する本方法は、メバロン酸のＣＰＩが少なくとも４．５（ｇ／ｇ）である細胞を使用することによりメバロン酸を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１１６】
本明細書では、メバロン酸生産量及び／又はその他のイソプレノイド前駆体の生産量が増大している上記の任意の細胞を使用する方法が提供される。細胞によるメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増大させることができる。メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産量と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０１１７】
本開示の任意の方法による、細胞によるメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）生産量は増大させることができる（例えば、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増大させることができる）。メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産量は、天然に生じる細胞（例えば、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞）によるメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）生産量と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０１１８】
メバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産量は、天然に生じる細胞による、すなわちＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるメバロン酸（又はその他のイソプレノイド前駆体）の生産量と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍のいずれかだけ増大させることもできる。
【０１１９】
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含する；（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有さない細胞を、３４℃下最少培地で培養する工程（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを、低〜中間コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモータの調節下で発現する、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。他の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含する；（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有さない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を、３４℃下で、最小培地で培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドの１つ以上のコピーを、低〜中間コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモータの調節下で異種発現する、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産させる工程。一部の態様では、イソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体を回収する工程を更に含む。
【０１２０】
イソプレンの生産性を向上させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
【０１２１】
イソプレンは、イソプレンシンターゼの触媒作用によりＤＭＡＰＰから製造される。したがって、理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、細胞（細菌細胞など）において、イソプレノイド前駆体の生産（cellular production）を増大させることは、より多量のイソプレンを生産させるのと同様であると考えられる。グルコースからのイソプレノイド前駆体生産量のモル収率を増大させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレンのモル収率の増大につながる。理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸生産を増大させることは、より多量のイソプレンを生産させるのと同様であると考えられる。グルコースからのメバロン酸生産量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
【０１２２】
メバロン酸又は上記のその他のイソプレノイド前駆体の生産量を増大させることのできるＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現している任意の宿主細胞には、イソプレンの生産量を増加させることもできる。一部の態様では、これらの細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。一部の態様では、これらの細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。
【０１２３】
一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、イソプレン生産細胞である。一態様では、イソプレン生産細胞は、イソプレンを生産することのできる野生型細胞である。他の態様では、イソプレン生産細胞は、非天然に生じる細胞であり、異種の、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド、ＭＶＡ経路下流の異種ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、ＤＸＰ経路の異種ポリペプチド、及び／又はＩＤＩポリペプチドのうちの１つ以上を含有するよう遺伝子操作を施されている。更なる態様では、イソプレン生産細胞は、内在性及び異種性の、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、及び／又はＩＤＩポリペプチドを両方含有するよう遺伝子操作を施されている。
【０１２４】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上更に含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【０１２５】
メバロン酸生合成経路の下流は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路の下流は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流の１種以上のポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。より詳細には、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノコッカシド（Methanococcoides）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群のものであってよい。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。
【０１２６】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。一部の態様では、異種ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、メタノコッカシド・バートニイ（Methanococcoides burtonii）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流の異種ポリペプチドは、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）由来のメバロン酸キナーゼである。
【０１２７】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
【０１２８】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものであってよく、更に詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。ＭＶＡ経路下流のポリぺプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、ＭＶＫ経路下流のポリペプチド及びＭＶＫ経路下流のポリペプチド変異体に関し参照によりその全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードしている内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。ＩＤＩポリペプチドの例としては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１３０】
特に、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路下流の核酸の例としては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産量を増加させるような、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【０１３１】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチド及びメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、からなる群から選択される。本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
【０１３２】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、経路の内在性イソプレンシンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作する。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチドである。
【０１３３】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。
【０１３４】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【０１３５】
イソプレンシンターゼの核酸の例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。イソプレンシンターゼポリペプチドの例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、イソプレンシンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。
【０１３６】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中のイソプレン合成酵素ポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５に記載のとおりに測定することができる。代表的なアッセイでは、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップとテフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬヘッドスペースバイアルに、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）を入れ、ここに細胞抽出物２５μＬを加え、振盪させながら３７℃で１５分間培養した。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせＬ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
【０１３７】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）に由来するイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ハコヤナギ属（Populus）由来のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドはクズのイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体（variant）由来のポリペプチドである。
【０１３８】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、マメ科、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）（ＣＡＣ３５６９６）Ｍｉｌｌｅｒｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）、アスペン（aspen）（ヤマナラシなど）Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）（Ｚｉｍｍｅｒｅｔ  ａｌ．、国際特許出願公開第９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ・トレムロイド（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）又はポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）由来のイソプレンシンターゼ、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼであるか、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はこれらの変異体由来のイソプレンシンターゼ）をコードしている核酸は、コドンを最適化されている。
【０１３９】
一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【０１４０】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して、触媒活性が向上しているなど、活性が向上している。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して、可溶性が向上している。可溶性の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然型イソプレンシンターゼ変異体であり、かつ天然型イソプレンシンターゼと比較して、安定性が向上している（熱安定性など）。
【０１４１】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの活性の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの配列類似性を保有し得る。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。
【０１４２】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼ内に変異を持つ。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換を有する。一部の態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレンシンターゼとしては、植物由来の任意のイソプレンシンターゼを挙げることができ、例えば、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼ、ポプラ（poplar）イソプレンシンターゼ、ヨーロッパナラ（English oak）イソプレンシンターゼ、及びヤナギ（willow）イソプレンシンターゼが挙げられる。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼ変異体は、少なくとも一箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、切断型のウラジロハコヤナギ（Populus alba）イソプレンシンターゼである。一部の態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレンシンターゼを発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。
【０１４３】
一部の態様では、変異体は、次の表（表２）に記載の、ウラジロハコヤナギ（P. alba）のアミノ酸配列と一致させた変異を１つ以上（すなわち、２、３、４、５、６など）含む。
【０１４４】
【表２】
2014519811.tif 000004
【０１４５】
本開示のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、米国特許出願第２０１０／００８６９７８号に記載のいずれかのイソプレン合成酵素又はイソプレン合成酵素変異体であってよい。これらの文献に記載される、イソプレン合成酵素及びイソプレン合成酵素変異体に関係するすべての内容は、参照により本開示に明示的に組み込む。
【０１４６】
本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において定義される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのイソプレンシンターゼの発現を駆動させることができる。
【０１４７】
好適なイソプレンシンターゼとしては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。本開示のイソプレンシンターゼをコードしている微生物の製造法を含む組成物又は方法のうちのいずれか１つに使用することのできるイソプレンシンターゼの種類は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号にも記載されている。
【０１４８】
ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞は、ＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路の他のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、１つの核酸は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、マルチコピープラスミド（multiple plasmids）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
【０１４９】
ＤＸＳポリペプチドの例としては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５０】
ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの例としては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１つ、又は２つ以上有するＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＤＸＰ経路に関する核酸の例としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、並びにＤＸＰ経路のポリペプチド活性を測定する方法については、国際公開第２０１０／１４８１５０号に、より詳細に記載されている。
【０１５１】
ＤＸＳポリペプチドの例としては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５２】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５３】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５４】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５５】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５６】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５７】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５８】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５９】
ＭＶＡ経路下流、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関する生物資源
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路下流の核酸（及びそれらにコードされるポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路下流の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの生産に関係するＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼの核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得ることができる。したがってＭＶＡ経路の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＤＸＰ経路の核酸は、例えば、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得ることができる。
【０１６０】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノバクテリアから単離することができる。生物資源の例としては、例えば、酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）種（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae））、バクテリア、例えば、エシェリキア（Escherichia）種（例えば、大腸菌（E. coli））、又はメタノサルシナ（Methanosarcina）種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））、植物、例えばクズ又はポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、又はウラジロハコヤナギｘヤマナラシＣＡＣ３５６９６（Populus alba x tremula CAC35696））又はアスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドに関係し、使用することのできる資源例は、同様に、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号に記載されている。
【０１６１】
一部の態様では、生物資源は酵母であり、例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）又はカンジダ属（Candida sp）である。
【０１６２】
一部の態様では、宿主細胞は、Ｂ．リケノフォルミス（B. lichenoformis）又は枯草菌（B. subtilis）などのバチルス株、Ｐ．シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス属（Pseudomonas）株、Ｓ．リビダンス（S. lividans）又はＳ．ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトマイセス（Streptomyces）株、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター株（Enterobacter）、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）などの古細菌株である。
【０１６３】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレービス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サークランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、属には、これまでに再分類された種、限定するものではないが、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されているＢ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）などの生物を包含するものと意図される。酸素存在下での、耐久性の高い内生胞子の形成は、バチルス属を定義する特性であると考慮されるものの、この特性は、現在、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus）と命名されている属にも当てはまる。
【０１６４】
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス株（例えば、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、又はＳ．グリセウス（S. griseus））及びバチルス株が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。
【０１６５】
一部の態様では、微生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
【０１６６】
一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【０１６７】
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス（Chroococcales）、プレウロカプサ（Pleurocapsales）、ユレモ（Oscillatoriales）、ネンジュモ（Nostocales）、又はスティゴネマ（Stigonematales）のいずれかに分類される、ラン藻である。
【０１６８】
ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸を１つ以上（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性のホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【０１６９】
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／又はフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明されるとおりホスホケトラーゼを発現させることにより、炭水化物資源から生成されるアセチルリン酸量を増加させることができる。このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡへと変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを生成させることができる。したがって、炭水化物基質より生成されるこれらの化合物量を増加させることができる。あるいは、細胞内濃度の上昇という形式で生成性の向上が反映されずとも、アセチル−Ｐ及びＡｃＣｏＡの生成量を増加させることができる。特定の実施形態では、細胞内アセチル−Ｐ又はアセチルＣｏＡ濃度は、ホスホケトラーゼによる反応が生じた場合でさえ変化せず一定であり、又は減少する場合すらある。
【０１７０】
ホスホケトラーゼの核酸の例としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ホスホケトラーゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。一部の態様では、ホスホケトラーゼの核酸は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸である。
【０１７１】
標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）へと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。本発明での使用には、本明細書に記載されるとおりホスホケトラーゼペプチド活性を有するとして判定された任意のポリペプチドが好適である。
【０１７２】
他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書において使用することのできるホスホケトラーゼ酵素のその他の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７８５，８５８号に記載されている。
【０１７３】
エントナー・ドゥドロフ経路に関与する経路
エントナー・ドゥドロフ（ＥＤ）経路は、エムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路とは異なる経路である。大腸菌（E. coli）などの一部の生物がＥＤ経路及びＥＭＰ経路の両方を内包するのに対し、その他の生物はいずれか１つの経路のみを有する。枯草菌（Bacillus subtilis）は、ＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５〜３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９〜８８０；Ｄａｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５〜８０３）。
【０１７４】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートから一分子のＨ２Ｏを除去して２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート６−リン酸を生成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）はアルドール縮合を触媒する（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８〜４６４６）。２つの遺伝子はオペロンの関係である。
【０１７５】
ホスホケトラーゼ経路に指向する代謝経路をＥＤ経路に迂回させることもできる。ＥＤ経路に取り込まれる代謝産物が損失することを回避するため、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコナーゼ６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性を減弱させる。１つの手法としては、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることで減弱を行うことができる。この欠失は、クロラムフェニコール又はカナマイシンカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。これらの酵素活性を存在させずとも、ホスホケトラーゼ酵素によってより多くの炭素を取り込むことができ、ひいてはメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの収率を増加させることができる。
【０１７６】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性は、酵素に関係する他の分子操作により減少させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して、任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１７７】
一部の場合では、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、多量の炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることになる。
【０１７８】
ペントースリン酸経路の酸化経路に関与する経路
大腸菌（E. coli）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソース及びペントースを分解し、各種代謝経路に関係する中間体を細胞に提供する。この経路は、ＮＡＤＰＨの主要な生成経路でもある。ペントースリン酸経路は、酸化経路（グルコース６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）又は６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）などの酵素による）及び非酸化経路（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素による）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４〜３３０）。
【０１７９】
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ペントースリン酸経路の非酸化分岐経路（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ）の発現を調節して（例えば、酵素の活性を増強させて）、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させることもできる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性を増加させることで、活性を操作しなかった場合と比較して、比活性又は総活性を任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％上昇する。一部の態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増強させることにより調節される。このような上昇は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子のプロモータを常時高発現型の合成プロモータにより置き換えることで得られる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードしている遺伝子を、プラスミド上の適切なプロモータの後にクローン化させてもよい。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増大させることにより、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現を増加させていない細胞と比較して、多量の炭素をメバロン酸依存型の生合成経路に取り込ませることができる。
【０１８０】
ホスホフルクトキナーゼに関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、解糖系でフルクトース６−リン酸のリン酸化を触媒する重要な酵素である。大腸菌（E. coli）はｐｆｋＡ及びｐｆｋＢによりコードされる２種のイソ酵素を有する。細胞におけるホスホフルクトキナーゼ活性の大部分はｐｆｋＡによるものである（Ｋｏｔｌａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３８１：２５７〜２６８）。
【０１８１】
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ホスホフルクトキナーゼの発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させることもできる。ホスホフルクトキナーゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して、任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％低下させる。一部の態様では、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることにより、ホスホフルクトキナーゼの活性を調節する。このような調節は、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータと置き換えることにより行うことができる。ホスホフルクトキナーゼをコードしている遺伝子を欠失させてもよい。ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、ホスホフルクトキナーゼの発現を低下させていない細胞と比較して、増大させることができる。
【０１８２】
宿主細胞変異
本発明は、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増大させる追加の宿主細胞変異も企図する。炭素の取り込み量を増大させることで、イソプレン、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドをより多量に生産できるようになる。本明細書に記載される通りの組み換え細胞は、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド、及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量を増大させるよう遺伝子操作することもでき、その際、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、及び（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼからなる群の酵素の１つ以上の活性を調節する。一部の態様では、本明細書において参照した任意の酵素の調節により、発現（例えば、転写又は翻訳）、生産、翻訳後修飾又は任意の他の酵素機能に影響を与えることができる。一部の実施形態では、組み換え細胞の酵素機能（例えば、触媒能）は、このような調整に関する遺伝子操作を行っていない細胞と比較して、上昇又は低下している。一実施形態では、酵素機能（例えば、活性）は、遺伝子操作を行っていない細胞と比較して、上昇している。他の実施形態では、酵素機能（例えば、活性）は、遺伝子操作を行っていない細胞と比較して、減少している。
【０１８３】
クエン酸シンターゼによる経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００〜２９０５）（図５）。大腸菌（E. coli）では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、枯草菌（Bacillus subtilis）ＮＡＤＨ感受性クエン酸シンターゼによる置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
【０１８４】
クエン酸シンターゼによる触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチルＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼの発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、メバロン酸及びイソプレンの最終的な生産量を増加させることができる。クエン酸シンターゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して、任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、あるいは枯草菌（Bacillus subtilis）から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸シンターゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸シンターゼの発現を低下させていない微生物と比較して、増加させることができる。
【０１８５】
ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０〜５５８）は、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）は、アセチル−Ｐと酢酸の可逆性の変換を触媒する。これらの遺伝子は、大腸菌（E. coli）においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）及び／又は酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減弱させて、利用可能なアセチルＣｏ−Ａを増加させることができる。減弱させる手法の一つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌（E. coli）により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡ−ｐｔａはアセチルＣｏＡを消費することから、これらの遺伝子を欠失させると、炭素は酢酸へと変換されなくなり、メバロン酸、イソプレノイド、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレンの収率が増加することになる。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ様酵素活性（例えば、限定するものではないが、大腸菌（E. coli）及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの生物におけるｅｕｔＤ遺伝子）を示すｅｕｔＤ遺伝子を減弱させる又は欠失させる。
【０１８６】
一部の態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。酢酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１８７】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して、任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）低下する。
【０１８８】
一部の場合では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１８９】
乳酸デヒドロゲナーゼの関与する経路
大腸菌（E. coli）では、Ｄ−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ酵素（ｌｄｈＡ−図５）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸生産（並びに必要に応じてイソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産）への炭素の取り込みを向上させるため、当業者は、酵素活性を低下させるなどして乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
【０１９０】
したがって、一態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸デヒドロゲナーゼの関与する経路を操作することで、組み換え微生物の生成する乳酸量は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定のアッセイ法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１９１】
乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）低下する。
【０１９２】
したがって、一部の場合では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
【０１９３】
リンゴ酸酵素の関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌（E. coli）ではｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する（ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を用いる）アナプレロティックな酵素である：
【０１９４】
【数１】
2014519811.tif 000005
【０１９５】
したがって、この酵素の２種の基質は（Ｓ）−リンゴ酸及びＮＡＤ（Ｐ）＋であり、これらにより３種の生成物、すなわち、ピルビン酸、ＣＯ２、及びＮＡＤＰＨが生成される。
【０１９６】
ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ−図５）（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５〜１３６５）を発現させて、１）ＴＣＡサイクルから放出された炭素を、アセチルＣｏＡの直接的な前駆体でありそれ自体がメバロン酸経路の直接的な前駆体であるピルビン酸へと戻し、２）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の反応に使用され得る過剰なＮＡＤＰＨを生成することにより、メバロン酸及び／又はイソプレンの収率の上昇を助けることができる（Ｏｈ，ＭＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５〜１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５９３７〜５９４６）。
【０１９７】
そのため、リンゴ酸酵素の活性及び／又は発現を増加させるなどして調節することにより下流でのメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレノイド及び／又はイソプレン生産に関係する開始基質（ピルビン酸又はアセチルＣｏＡ）がより多く得られる。ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子であってよい。非限定的な手法の１つとしては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の内在性遺伝子プロモータを、常時発現型の合成発現プロモータにより置き換えるというものが挙げられる。酵素活性を増加させる手法のその他の非限定例としては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を用いるものが挙げられる。当業者は、容易に利用可能な分子生物学手技を用い、発酵又は培養する際に、ｍａｅＢ  ＲＮＡの発現をモニターすることができる。
【０１９８】
したがって、一部の実施形態では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生産量が増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１９９】
ピルビン酸生成量の増加は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。ピルビン酸の生産量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加する。
【０２００】
リンゴ酸酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により増加させることもできる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して、任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加させる。
【０２０１】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節して、アセチルＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性及び／又は発現（例えば、常時発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−ラムダプロモータ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６）などの強力な常時発現型プロモータをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモータを１種以上用いることにより行うことができる。
【０２０２】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。これらの遺伝子のうちの任意の１つ、２つ、又は３つを操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を増加させることができることは理解される。他の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させることができる。
【０２０３】
一部の場合では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるその他の方法としては、微生物に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群に由来するポリペプチを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
【０２０４】
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節されていない微生物と比較して、組み換え微生物によるアセチルＣｏ−Ａの生産量を増加させることができる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
【０２０５】
変異の組み合わせ
本開示の酵素及び／又は酵素経路の何れかに関し、本開示の酵素及び／又は酵素経路の任意の組み合わせ（これらのうち２、３、４、５、又は６の組み合わせ）を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせて詳細説明することを容易にする目的で、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）はＡと表記し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと表記し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと表記し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）はＤと表記し、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ又はｍａｅＢ）はＥと表記し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及び／又はｌｐｄＡ）はＦと表記する。上記の通り、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３種の酵素のうち２種を、又は３種の酵素のうち３種を使用して、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を増加させることができる。
【０２０６】
したがって、酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の２種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ及びＥＦを使用できる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の３種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＤＥＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ及びＣＥＦを使用できる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の４種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＣＤＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＥＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ及びＡＤＥＦを使用できる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の５種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＤＥＦ、ＢＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＦ及びＡＢＣＥＦを使用できる。他の態様では、６種の全ての酵素：ＡＢＣＤＥＦを使用する。
【０２０７】
したがって、本開示に記載する通りの組み換え微生物は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸生産を増加させることができ、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸酵素、並びに（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体からなる群の１つ以上の酵素の活性を調節することで、組み換え微生物における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向する。
【０２０８】
イソプレン生産量を増加させるその他の制御因子及び要因
他の分子的操作を使用して、イソプレン生産に向かう炭素取り込み量を増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモータに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸及び／又はイソプレンの生産性を向上させることができる。
【０２０９】
他の態様では、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産性を向上させるために、ＰＧＬを欠損している微生物（各種大腸菌（E. coli）株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。ＰＧＬは、染色体への組み込み、又はプラスミドなどの染色体外のビヒクルを用い、導入することができる。他の態様では、ＰＧＬを発現している細胞（例えば、各種大腸菌（E. coli）株などの微生物）のゲノムから、内在性のＰＧＬを欠失させて、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産を増大させることもできる。一部の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの瞬間的な収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、細胞生産性指数が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、容積生産量が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、最大比生産量が高くなる。一部の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、より長い期間、最大比生産量が維持されることになる。
【０２１０】
イソプレンの生産性を向上させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、最小培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含まない同一の細胞と比較して、高濃度でイソプレンを生産することができる。一部の場合では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも５％多量にイソプレンを生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけ多量にイソプレンを生産することができる。
【０２１１】
本発明の一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、を含む細胞（細菌細胞など）が提供される。細胞には、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含ませてもよい。１つ以上の異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結させることができ、調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができ、あるいは調節可能なように誘導型及び常時発現型プロモータと組み合わせて連結させることができる。１つ以上の異種核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータ、低発現型プロモータ及び／又は強度が発現が中程度のプロモータに連結させることができる。Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドは、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞に安定的に発現させることができる。加えて、１つ以上の異種核酸は、ベクター上に存在させることもできる。
【０２１２】
本明細書に記載の任意の組成物又は方法によるイソプレンの生産量は、増大させることができる（例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド並びに／あるいはＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドの発現を増加させることにより）。本明細書で使用するとき、イソプレン生産量の「増大」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレンに関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）、イソプレンの力価、イソプレンの質量収率及び／又はイソプレンの比生産量が、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを有さない細胞によるものと比較して、上昇していることを指す。イソプレンの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレン生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレン生産量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０２１３】
イソプレンの生産量は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍のうちの任意の割合だけ増加させることもできる。
【０２１４】
組み換え細胞を使用してイソプレンを生産する方法
本明細書では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を１つ以上含む細胞（細菌細胞など）を培養する工程を含む、イソプレンの生産方法も提供する。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。六炭糖（グルコースなど）などの炭水化物からイソプレンを生産する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
【０２１５】
したがって、本明細書では、イソプレンの生産に好適な条件下で、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程を含む、イソプレンの生産方法も提供する。細胞は、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のイソプレン合成酵素ポリペプチド（例えば、プエラリア（Pueraria）のイソプレン合成酵素）をコードしている１つ以上の核酸分子を更に含み得る。一部の態様では、細胞（細菌細胞など）は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のイソプレン合成酵素又はこれらの変異体、本明細書に記載の任意の微生物株（例えば、細菌など）又は植物細胞、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターも、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意のその他の六炭糖）を使用するイソプレンの生産に使用することができる。一部の態様では、イソプレンの生産方法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
【０２１６】
一部の態様では、生産されるイソプレン量は、純生産量（absolute productivity）が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し純生産量が最大であるとは、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、生産されたイソプレンの量は、比生産量が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し比生産量が最大であるとは、本明細書で開示される、細胞あたりの任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、生産されたイソプレンの総量は累積値として測定される。一部の態様では、細胞の累積生産量は、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、生産されるイソプレン量は、容積生産量が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し容積生産量が最大であるとは、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、イソプレンの生産量は、その時点までのグルコースに対する累積収率（％）を測定するものである。一部の態様では、グルコースに対する累積収率（％）は、本明細書に開示される任意の凡そのイソプレン量を指していうものである。
【０２１７】
一部の態様では、本明細書に記載の、任意の細胞（例えば、培養物中の細胞）は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００又は５，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌｅ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒであり、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。一部の態様では、イソプレンの量は約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０２１８】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００又は１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌｅ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）値でイソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈであり、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
【０２１９】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｍｇ）／ブロス（Ｌ）（ｍｇ／Ｌブロス、ブロス体積には、細胞及び細胞培地の体積を含む）値の累積力価（総量）でイソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスであり、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスなどである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０２２０】
一部の態様では、細胞により、培養時に生産されるイソプレンは、発酵時排出気体（fermentation offgas）の体積の少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０又は２５％を構成する。一部の態様では、イソプレンは、排出気体の体積の約１〜約２５％を構成し、例えば、約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％又は約１〜約１０％を構成する。
【０２２１】
本明細書では、イソプレンの生産性を向上させた細胞が提供される。細胞によるイソプレンの生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、の発現を増加させることにより増大させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレン生産量の「増大」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレンに関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）、イソプレンの力価、イソプレンの質量収率、容積生産量及び／又はイソプレンの比生産量が、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを有さない細胞によるものと比較して、上昇していることを指す。イソプレンの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレン生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを内因的に有していない細胞によるイソプレン生産量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０２２２】
本開示の任意の方法による、細胞によるイソプレンの生産量は、増大させることができる（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることで増大させることができる）。イソプレンの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレンの生産は、天然に生じる細胞（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞）によりイソプレンを生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）に増加させることができる。イソプレンの生産量は、天然に生じる細胞によるイソプレン生産量、すなわち、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレン生産量と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍に増大させることもできる。
【０２２３】
イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
イソプレノイドは、多くの生物において、ＭＶＡ経路により生成されるイソプレノイド前駆体分子の合成により生産させることができる。上記のように、イソプレノイドは、重要な部類の化合物として存在し、例えば、食品及び飼料用サプリメント、風味及び臭気化合物、並びに抗癌、抗マラリア、抗真菌及び抗菌化合物を含む。
【０２２４】
分子の部類の際には、イソプレノイドは、化合物を構成しているイソプレン単位の数に基づき分類される。モノテルペンは１０個の炭素原子又は２個のイソプレン単位を含み、セスキテルペンは１５個の炭素原子又は３個のイソプレン単位を含み、ジテルペンは２０個の炭素原子又は４個のイソプレン単位を含み、セステルテルペンは２５個の炭素原子又は５個のイソプレン単位を含む。ステロイド（一般的に、炭素原子を約２７個含む）は、イソプレノイドを分解又は再構成した生成物である。
【０２２５】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから生成することができる。これらの多様な化合物は、これらのより単純で一般的な前駆体から誘導され、及び保存されているポリプレニルピロリン酸合成酵素群により合成される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。多様な鎖長を有するこれらの直鎖プレニルピロリン酸はそれぞれに特有の生理機能を示し、及びポリプレニルピロリン酸合成酵素の非常に発達した活性部位により、一般的にアリル基（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、相当する数のイソペンテニルピロリン酸との縮合反応を介し、認識される（Ｃ５−ＩＰＰ）（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。
【０２２６】
Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現しており、メバロン酸又はイソプレノイド前駆体又は上記のイソプレンの生産量を増大させることのできる任意の組み換え宿主細胞では、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増大させることもできる。一部の態様では、これらの細胞は、上記のように、ＭＶＡ経路下流、ＩＤＩ及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、細胞（細菌細胞など）において、イソプレノイド前駆体の生産（cellular production）を増大させることにより、結果的により多量のイソプレノイドを生産させることができる。グルコースからのイソプレノイド前駆体生産量のモル収率を増大させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイドのモル収率の増大につながる。同様に、理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産を増大させることで、同様に、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドなどのより高分子量の生成物の生産も増大するものと考えられる。グルコースからのメバロン酸生産量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
【０２２７】
一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、イソプレノイド生産細胞である。一態様では、イソプレノイド生産細胞は、イソプレノイドを生産することのできる野生型細胞である。他の態様では、イソプレノイド生産細胞は、ＭＶＡ経路上流の１種以上の異種ポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＩＤＩポリペプチドを含有するよう遺伝子操作した、非天然に生じる細胞である。更なる態様では、イソプレン生産細胞には、内因性及び異種性の、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＩＤＩポリペプチドを両方含有させることもできる。
【０２２８】
イソプレノイドの種類
本発明の細胞（細菌細胞など）のイソプレノイド生産量は増大させることができる。イソプレノイドの例としては、限定するものではないが、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより高分子量のポリテルペノイドが挙げられる。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンであってよい。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンであってよい。一部の態様では、トリテルペノイドは、スクアレン又はラノステロールであってよい。イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（α-famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択することもできる。
【０２２９】
一部の態様では、テトラテルペノイドは、リコピン又はカロチン（カロチノイド）である。本明細書で使用するとき、用語「カロチノイド」は、クロロプラスト中で、並びに植物、何らかの他の光合成生物、例えば藻類、ある種の真菌、ある種のバクテリア、のクロロプラスト中で生産される、天然に生じる有機色素群を指す。カロチノイドとしては、酸素を含有しているキサントフィル及び酸素を含有していないカロテンが挙げられる。一部の態様では、カロチノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。一部の態様では、カロチノイドは、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、β−クリプトキサンチン又はリコピンである。
【０２３０】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチドをコードしている異種核酸
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、細胞は、更に、上記の通りにメバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドを１つ以上コードしている核酸、並びにポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであってよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結させてよく、あるいは同様に、調節可能なように誘導型プロモータに連結させてもよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータと連結させてもよい。あるいは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように低発現型プロモータと連結させてもよい。詳細には、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
【０２３１】
一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含む。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結されている。
【０２３２】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクター上に存在させてもよい。
【０２３３】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ゲラニルジホスフェート（geranyl diphosposphate）（ＧＰＰ）合成酵素、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）合成酵素、及びゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素、又はその他の任意の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなど、ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチドをコードしている核酸を挙げることができる。
【０２３４】
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、細胞は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）合成酵素をコードしている１つ以上の核酸を更に含む。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドは、内在性遺伝子によりコードされている内在性ポリペプチドであってもよい。一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドは、大腸菌（E. coli）において内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされている。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結させることができ、あるいは同様に調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができる。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータに連結させることができる。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
【０２３５】
一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含み得る。一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結されている。
【０２３６】
ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【０２３７】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＩＰＰをイソプレノイドへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。これらの手法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０；Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１  Ａｐｒ  １２  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１  Ｍａｒ  ２４  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｋｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ  ７；１１：４３；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ  ２１；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ  ＆  Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｄｅｃ；１５４（４）：１９９８〜２００７；ａｎｄ  Ｋｏｌｌｎｅｒ  ＆  Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０  Ａｕｇ  ２０；７５（１６）：５５９０〜６００に記載されている。
【０２３８】
イソプレノイドの生産量を増大させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、所望により最小培地で培養した場合に、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含まない同一の細胞と比較して、高濃度でイソプレノイドを生産することができる。一部の場合では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus））由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを含まないイソプレノイド生産細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも５％多量にイソプレノイドを生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけ多量にイソプレノイドを生産することができる。
【０２３９】
本発明の一態様では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸並びにポリプレニルピロリン酸合成酵素をコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）が提供される。細胞には、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含ませてもよい。更に、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドであってよい。１つ以上の異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結させることができ、調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができ、あるいは調節可能なように誘導型及び常時発現型プロモータと組み合わせて連結させることができる。１つ以上の異種核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータ、低発現型プロモータ及び／又は強度が発現が中程度のプロモータに連結させることができる。Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、及びポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドは、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞に安定的に発現させることができる。加えて、１つ以上の異種核酸は、ベクター上に存在させることもできる。
【０２４０】
本明細書では、イソプレノイドの生産量を増大させるために上記の任意の細胞を使用する方法を提供する。細胞によるイソプレノイドの生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、の発現を増加させることにより増大させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレノイド生産量の「増大」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレノイドに関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）、イソプレノイドの力価、イソプレノイドの質量収率、及び／又はイソプレノイドの比生産量が、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを有さない細胞によるものと比較して、上昇していることを指す。イソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増大させることができる。イソプレノイドの生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレノイドの生産量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０２４１】
他の態様では、本開示の任意の方法による、細胞によるイソプレノイドの生産量は、増大させることができる（例えば、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸の発現を増加させることにより）。イソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増大させることができる。イソプレノイドの生産量は、天然に生じる細胞（例えば、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞）によるイソプレノイド生産量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０２４２】
イソプレノイドの生産量は、天然に生じる細胞による、すなわちＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレノイドの生産量と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍，２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍に増大させることができる。
【０２４３】
組み換え細胞を使用してイソプレノイド分子を生産する方法
本明細書では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及びポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸を１つ以上含む細胞（細菌細胞など）を培養する工程を含む、イソプレノイドの生産方法も提供する。イソプレノイドは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。六炭糖（グルコースなど）などの炭水化物からイソプレノイドを生産する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
【０２４４】
したがって、本明細書では、イソプレノイドの生産に好適な条件下で、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産させる工程を含む、イソプレノイドの生産方法も提供する。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、細胞（細菌細胞など）は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のポリプレニルピロリン酸合成酵素又はこれらの変異体、任意の微生物株（例えば、細菌）又は本明細書に記載の植物細胞、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターを使用し、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意の他の六炭糖）を利用して、イソプレノイドを生産することもできる。一部の態様では、イソプレノイドの生産方法は、イソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２４５】
イソプレノイドの生産方法には、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含させることができる：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有していない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する、並びに（ｂ）イソプレノイドを生産させる工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドを含まないイソプレノイド生産細胞よりも多量にイソプレノイドを生産する。
【０２４６】
イソプレノイドの生産に関する本発明の方法では、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを含まないイソプレノイド生産細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも５％多量にイソプレノイドを生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけイソプレノイドを生産することができる。一部の態様では、イソプレノイドの生産方法は、イソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２４７】
本明細書では、イソプレノイドの生産量を増大させるために上記の任意の細胞を使用する方法を提供する。細胞によるイソプレノイドの生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、の発現を増加させることにより増大させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレノイド生産量の「増大」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレノイドに関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）、イソプレノイドの力価、イソプレノイドの質量収率、及び／又はイソプレノイドの比生産量が、ポリプレニルピロリン酸合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを有さない細胞によるものと比較して、上昇していることを指す。イソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増大させることができる。イソプレノイドの生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレノイドの生産量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増大させることができる。
【０２４８】
イソプレノイドの生産量は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレノイドの生産量と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍に増大させることもできる。
【０２４９】
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、一部の態様では、イソプレノイドの生産方法は、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を包含する；（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及び／又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内因的に有さない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を、３４℃下で培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを、低〜中間コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモータの調節下で異種発現する、並びに（ｂ）メバロン酸などのイソプレノイドを生産させる工程。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２５０】
ベクター
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。例えば、好適なベクターを使用して、嫌気性菌での、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド、イソプレン合成酵素、ポリプレニルピロリン酸合成酵素及び／又は１つ以上のＭＶＡ経路ポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーの発現を、最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは使用せずに、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ核酸の１つ以上のコピー、イソプレン合成酵素、ポリプレニルピロリン酸合成酵素並びに／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの１つ以上の核酸を宿主細胞のゲノムに組み込む。
【０２５１】
本開示の実施例において特徴づけられ又は使用される任意の１つのベクターを使用することができる。
【０２５２】
形質転換法
Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．ファシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ核酸、イソプレン合成酵素及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドのうちの、１つ以上のコピーをコードしている核酸を、適切な手法により微生物に挿入することができる。更に、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸、又はこれらを含むベクターは、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えばリポフェクション介在型若しくはＤＥＡＥ−デキストラン介在型トランスフェクション、又は組み換えファージウイルスを使用した形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコーティングした微粒子を用いる高速遺伝子銃照射、及びプロトプラスト融合などの、宿主細胞内にＤＮＡコンストラクト又はベクターを導入するための標準的な技術を使用して宿主細胞（例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）内に挿入することができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である（例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング（Molecular Cloning）」：「実験室マニュアル（A Laboratory Manual）第２版」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選択することができる。形質転換体を選択するのに好適な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開２００９／１３２２２０号及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号が挙げられる。
【０２５３】
精製方法例
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、生産された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは、吸着ストリッピング法により回収される（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号を参照されたい。この特許文献の内容は、参照によりその全体が、特に吸着ストリッピング法及び精製法についての記載が、本明細書に組み込まれる）。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種ポリペプチドを回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロチノイドを回収する工程を含む。
【０２５４】
好適な精製方法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号により詳細に記載されている。
【０２５５】
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
【実施例】
【０２５６】
実施例１：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ４５１（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ１．２  ｇｌｔＡを含有）、ＣＭＰ４５２及びＣＭＰ４５３の構築
ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）の前に位置するプロモータを、常時低発現型プロモータ、すなわちＧＩ１．２（米国特許第７，３７１，５５８号）により置き換えた。ｇｌｔＡに関して報告されている２種の野生型プロモータ（Ｗｉｌｄｅ，Ｒ及びＪ．Ｇｕｅｓｔ．１９８６．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３２３９〜３２５１）及び合成プロモータを、遠位プロモータの−３５領域の直後に挿入した。プライマーＵｐｇｌｔＡＣｍ−Ｆ（５’−ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧ−３’）及びＤｎｇｌｔＡ１．ｘｇｉＣｍ−Ｒ（５’−ＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＨＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’）、並びにテンプレートとしてＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のプラスミドＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴを使用し、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、λ  ｒｅｄを用いる組み換えに製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載の通りに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選択した。プロモータ領域は、プライマーｇｌｔＡＰｒｏｍＳｅｑＦ：５’−ＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣ−３’及びｇｌｔＡｐｒｏｍＳｅｑＲ：５’−ＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’と、テンプレートとしてコロニーから抽出したＤＮＡ（コロニーを３０μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、９５℃で４分加熱し、スピンダウンしたもの。５０μＬのＰＣＲ反応には、この溶液のうち２μＬをテンプレートとして使用する）とを使用しＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、３種の異なるプロモータＧＩ１．２、ＧＩ１．５及びＧＩ１．６（米国特許第７，３７１，５５８号）を保有しているコロニーを、更なる使用のため保存した（ＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２及びＣＭＰ１４３；表３）。
【０２５７】
【表３】
2014519811.tif 000006
【０２５８】
ＣＭＰ２５８（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）をＭＣＭ５２１株のＰ１可溶化液により形質導入し（米国特許出願公開番号第２０１１／０１５９５５７号を参照されたい）、２０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したルリア・ベルターニプレートでコロニーを選択して、ＭＤ０９−３１３株を構築した。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載の方法に従ってＰ１可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カナマイシンマーカーを除去し、ＭＤ０９−３１４株を作製する。
【０２５９】
株ＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２、及びＣＭＰ１４３からＰ１可溶化液を調製し、これらを株ＭＤ０９−３１４に形質導入し、それぞれＣＭＰ４４０、ＣＭＰ４４１及びＣＭＰ４４２を生成した（表３）。製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により推奨されるプロトコルを用い、クロラムフェニコールマーカーを除去し、それぞれ株ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ４５２、及びＣＭＰ４５３を生成した（表３）。
【０２６０】
実施例２：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６０４（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍを含有）の構築
クロラムフェニコールマーカーにより破壊させたａｃｋＡ−ｐｔａ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を、クロラムフェニコールマーカーを含有しているＴｒｉｐｌｅ  Ｔｒｉｐｌｅ株（米国特許第７，７４５，１８４（Ｂ２）号）をテンプレートとして使用し、及びプライマーａｃｋＡＣＦ（５’−ＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＴＣＡＧＣＧＧ）及びｐｔａＣＲ（ＣＡＣＣＡＡＣＧＴＡＴＣＧＧＧＣＡＴ  ＴＧＣＣ−３’）を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ２５８株のａｃｋＡ−ｐｔａ座に組み入れた（米国特許出願第１２／９７８，３２４号）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＭＤ４９１と名づけた。ＭＤ４９１のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ４５１株の形質導入に使用した。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ６０４と名づけた。
【０２６１】
実施例３：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６２０（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍ  ｌｄｈＡ：：Ｋａｎを含有）及びＣＭＰ６３５（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｃｋＡ−ｐｔａ  ｌｄｈＡを含有）の構築
Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）のＪＷ  １３７５株をテンプレートとして使用し、プライマーはｌｄｈＡｓｅｑＲ（５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’）及びｌｄｈＡｓｅｑＦ２（５’−ＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＣＣＧＡＧＣ−３’）を使用し、を使用し、カナマイシンマーカーにより破壊されたｌｄｈＡ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＭＤ０９−３１３株のｌｄｈＡ座に組み入れた。ＬＢ＋２０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ３７４と名づけた。ＣＭＰ３７４のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ６０４株の形質導入に使用した。ＬＢ＋２０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ６２０と名づけた。株に電気穿孔法によりｐＣＰ２０を導入して、クロラムフェニコール及びカナマイシンマーカーを同時に除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＆  Ｗａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜５）、３０℃下でＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンで２つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、４２℃下でＬＢプレートに再画線した。これらのプレートからＣｍＳ及びＫａｎＳコロニーを選択し、ＣＭＰ６３５と名づけた。
【０２６２】
実施例４：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６７６（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｃｋＡ−ｐｔａ  ｌｄｈＡ  ａｔｔＢ：：Ｃｍを含有）の構築
λ挿入部位ａｔｔＢの上流及び下流に対するＤＮＡ相同体と隣接しているクロラムフェニコールマーカーを含有しているＤＮＡ断片を、プラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＆  Ｗａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜５）をテンプレートとして使用し、及びプライマーＣＭＰ１７１（５’−ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ−３’）及びＣＭＰ１７２（５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＧＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ−３’）を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）における組み換え反応に使用し、λ挿入部位ａｔｔＢに組み入れた。これにより生成されたＣＭＰ６４６株を、ＬＢ＋５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにて選択した。ＣＭＰ６４６のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ６３５株に対する形質導入反応に使用し、この株の染色体からメバロン酸経路下流（メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ）を除去した。形質導入反応物をＬＢ＋クロラムフェニコール５ｕｇ／ｍＬに播種し、１つのコロニーを選択しＣＭＰ６７６と名づけた。
【０２６３】
実施例５：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６８０（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｃｋＡ−ｐｔａ  ｌｄｈＡ  ａｔｔＢ：：Ｃｍ，ｐＣＨＬ２７６）の構築及びメバロン酸の探知
電気穿孔法により、プラスミドｐＣＨＬ２７６（実施例６（ｉｉｉ）を参照されたい）をＣＭＰ６７６に導入した。コロニーをＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンにて選択した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ６８０と命名した。
【０２６４】
（ｉ）メバロン酸収率アッセイ
５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した２ｍＬのＬＢブロスを入れた振盪チューブに、上記の株の一晩培養物を接種した。次に、培養物を、３４℃下２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。次に、１％グルコース、最終濃度０．１％の酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加した２ｍＬのＴＭ３培地を入れた５ｍＬの４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、最終的なＯＤが０．２となるまで培養物を希釈した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離した。２５０μＬの上清に、１９μＬの２０％硫酸を添加し、氷上で５分間インキュベートした。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収した。２００μＬの上清を、ＨＰＬＣに適した９６ウェル円錐底ポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定した。製造元（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定した。
【０２６５】
（ｉｉ）ＨＰＬＣによるメバロン酸の検出：
５０℃でインキュベートし、ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）を取り付けた３００ｍｍｘ７．８ｍｍ  ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（カタログ番号１２５−０１４０）を使用し、屈折率検出器を系に包含させたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＨＰＬＣ系でＨＰＬＣ解析を実施した。移動相に０．０１Ｎ硫酸を使用し、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで試料のＨＰＬＣ解析を実施した。屈折率検出器によりメバロン酸を検出した。
【０２６６】
実施例６：リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及びエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株ＭＣＭ１３７３−１３７７の構築
（ｉ）遺伝子の同定及び選択
Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ遺伝子産物をクエリーとして使用する一次配列相同性検索を、ＮＣＢＩウェブサイトに存在するＢＬＡＳＴｐプログラムにより実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「ギャップ考慮型ブラスト及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新規タンパク質データベース検索プログラムの作成（Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）。対象とする配列は検索結果から選択した。
【０２６７】
概して、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子に関し対象とする配列は、それぞれ野生型Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ核酸及びタンパク質配列に対し、５９〜６６％ヌクレオチド配列同一性（コドン最適化済み；表４を参照されたい）及び５９〜７１％アミノ酸配列同一性（表５）を示した。
【０２６８】
【表４】
2014519811.tif 000007
【０２６９】
【表５】
2014519811.tif 000008
【０２７０】
（ｉｉ）プラスミドｐＤＷ８３、ｐＭＣＭ１２２３〜ｐＭＣＭ１２２５
エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ＥＣ１０由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳのコード配列を大腸菌（Escherichia coli）（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ）での発現のため最適化させ、発現ベクターＭＣＭ８２にサブクローニングし（米国特許出願公開番号第２０１０／０１９６９７７号、［１０２３］段落）、ｐＤＷ８３を生成した。具体的には、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＰｍｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、一般的な分子生物学的手法により、クローニングベクターＧｃＤ１２６（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ）から、ｍｖａＥＳオペロンを包含しているカセットを切り出した。次にこの断片を、酵素ＢａｍＨＩ及びＰｍｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用い予め制限酵素により消化しておいたＭＣＭ８２に連結し（Ｒｏｃｈｅ、ラピッド・ライゲーション）、続いてアガロースゲルにより分離し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅ−ゲル）、一般的な分子生物学的手法により、ｍｖａＥＳをコードしている発現カセットをエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）から除去した。製造元の推奨するプロトコルに従って、ライゲーション混合物によりケミカルコンピテントセルＴｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。スペクチノマイシン耐性陽性形質転換体を、液体ＬＢ培地で生育させ、プラスミドを精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、プライマーＥｃ  Ｓｅｑ  １Ｆ〜４Ｒ（表６）を使用して配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行い、確認した。
【０２７１】
【表６】
2014519811.tif 000009
【０２７２】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、リステリア・グレイ（Listeria grayi）及びエンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードしているプラスミドを、表７に記載の設計を使用しＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により構築した。ｍｖａＥ−ＲＢＳ−ｍｖａＳをコードしている合成ＤＮＡを作成し、次にｐＭＣＭ８２のＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ認識部位間に存在しているオペロンと置き換えてクローン化した。ベクターによりｍｖａＥ用のＲＢＳを提供した。
【０２７３】
【表７】
2014519811.tif 000010
【０２７４】
（ｉｉｉ）ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））−ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（ｐＣＨＬ２７６）
ＭＣＭ８２プラスミドのｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））から余分なＲＢＳを除去するべくプライマー（ＣＬ４８３Ｆ：５’−ＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＡＣ−３’；ＣＬ４８４Ｒ：５’−ＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣ−３’）を設計した。ＰＣＲ反応液の組成は、テンプレートＤＮＡのＭＣＭ８２（１００ｎｇ）、５０ｕＭの各順方向及びリバースプライマー、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５μＬの１０ＸのＰｆｕ  ＩＩ反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、１μＬのＰｆｕ  ＩＩ融合酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）及び４０μＬの水から構成された。Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーにより、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒及び６８℃で９分、更に６８℃で１０分の処理を行う温度プロファイルで、１８サイクルを実施した。ＰＣＲ反応の実施後にＤｐｎＩ（１μＬ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。更に１μＬのＤｐｎＩを加え、３７℃で一晩インキュベートした。２μＬの反応液によりＴＯＰ１０  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンに播種した。配列決定により適切なクローンであることが確認された。
【０２７５】
（ｉｖ）ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））−ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（ｐＣＨＬ２７７）
ｐＤＷ８３プラスミドのｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））から余分なＲＢＳを除去するべくプライマー（ＣＬ４８５Ｆ：５’−ＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＣ−３’；ＣＬ４８６Ｒ：５’−ＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＧ−３’）を設計した。ＰＣＲ反応液の組成は、テンプレートＤＮＡのｐＤＷ８３（１００ｎｇ）、５０ｕＭの各順方向（ＣＬ４８３Ｆ）及び逆方向（ＣＬ４８４Ｒ）プライマー、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５μＬの１０ｘのＰｆｕＩＩ反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、１μＬのＰｆｕ  ＩＩ融合酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）及び４０μＬから構成された。Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーにより、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒及び６８℃で９分、更に６８℃で１０分の処理を行う温度プロファイルで、１８サイクルを実施した。ＰＣＲ反応後にＤｐｎＩ（１μＬ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。更に１μＬのＤｐｎＩを添加し、３７℃で一晩インキュベートした。２μＬの反応液によりＴＯＰ１０  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンに播種した。配列決定により適切なクローンであることが確認された。
【０２７６】
（ｖ）高収率のＭＶＡ生産株ＭＣＭ１３７３〜１３７７の構築
宿主ＣＭＰ６７６を対数増殖期の中期まで３７℃にてＬＢで生育させ、電気穿孔に備え、培養物の１／２当量の氷冷ｄｄＨ２Ｏにより３回洗浄し、培養物の１／１０当量の氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液と１μＬのプラスミドＤＮＡを組み合わせ、２ｍｍの電気穿孔法キュベットに移し、２５ｕＦＤ、２００ｏｈｍｓ、２．５ｋＶで電気穿孔を行い、直ちに５００μＬのＬＢによりクエンチした。３７℃で１時間振盪して細胞を回復させ、次に、５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを添加したＬＢプレートにより、３７℃で一晩形質転換体を選択した。３７℃下で、ＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンにより、ＯＤ６００がおよそ１になるまで単一のコロニーを生育させた。５００μＬのブロスに１ｍＬの５０％グリセロールを混合し、ドライアイス上で凍結させた。凍結させた保存液を−８０℃で保管した。
【０２７７】
実施例７：遺伝子操作を受け、メバロン酸経路の遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株を、１５Ｌスケールの流加式培養により増殖させた場合の、メバロン酸生産量の調査
（ｉ）材料
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（７．５ｇ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ）（２ｇ）、クエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ）（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（ＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７）（０．３４ｇ）、酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）（０．５ｇ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１．５ｍＬ）、硫酸５０％  ｗ／ｖ（２．２６ｍＬ）、ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（０．８３ｍＬ）、微量塩溶液（３．３６ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。試験温度に冷却した後、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後に、供給溶液（Feed solution）＃１（１６．７ｇ）、ビタミン溶液（１１．９ｍＬ）及びスペクチノマイシン溶液（５ｍＬ）を加え、ｐＨを調整した。
【０２７８】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２７９】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０２８０】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０２８１】
スペクチノマイシン溶液（１Ｌ当たり）：
脱イオン水により５０ｇスペクチノマイシンを適量にし、０．２２μｍのフィルタによりろ過滅菌した。
【０２８２】
供給溶液＃１（１ｋｇ当たり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９４ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及びＦｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９４ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。
【０２８３】
（ｉｉ）実験法
表８に記載の大腸菌（E. coli）ＢＬ２１株により１５Ｌのバイオリアクタで発酵を行った。各株には同一の条件で発酵を２回実施し、すなわち生産性についての結果は２回の試行の平均として記録することができた。
【０２８４】
【表８】
2014519811.tif 000011
【０２８５】
大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、２．８Ｌの三角フラスコ内でトリプトン−酵母エキス培地（ＬＢ培地（ミラー））に接種し、バイオリアクタ用の接種菌液として使用した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
【０２８６】
本実験は、所望の発酵ｐＨ  ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのメバロン酸発酵をモニターするために実施した。培養を行っている間、８標準リットル／分の速度で空気を吹き込み、測定値７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）の背圧を保持し、インペラにより８５０ｒｐｍで撹拌を行い、かつ液体培地に伝わる力を調節して、好気性条件を維持した。
【０２８７】
グルコース供給溶液はパルス様供給プログラムにより供給した。バッチのグルコースが枯渇するとすぐに、ｐＨの上昇（ｐＨ＞＝７．０５）によりシグナルを受け、３ｇ／分のパルスを２０分供給した。以降、グルコースの供給はｐＨの上昇（ｐＨ＞＝７．０５）に応じ実施した。パルスは３０分持続させ、規模（ｇ／ｍｉｎ）は、ブロス中に残留するグルコースを過剰な状態に保つのに必要とされる既定の係数により、総二酸化炭素放出速度（ｍｍｏｌ／ｈｒ）を除したものに等しかった。５２時間の発酵期間にバイオリアクタに供給されたグルコースの供給総量は株によって異なった。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が４になったなら、４００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。バイオリアクタからの放出気体中の酸素、窒素及び二酸化炭素濃度は、Ｈｉｄｅｎ質量分析器により測定した。実験工程の間、各バイオリアクタから４時間おきにブロス試料を採取した。ブロスのグルコース、クエン酸及びメバロン酸濃度はＨＰＬＣにより測定した。吸光度は、希釈したブロス懸濁液の５５０ｎｍでの吸光度を測定し、希釈係数をかけて決定し、得られた値（ＯＤ５５０）を記録した。ＯＤ５５０読み取り値は、予め、発酵の時間経過にわたってＯＤ５５０と細胞の乾燥重量を比較することで生成した係数を用い、乾燥細胞質量へと変換した。上記所定の定義を使用し、質量収率に関係する生産指数、比生産量、力価及び細胞生産性指数を、各２回の試行時の相当する時間で得られた結果の平均として記録した（「定義」の項を参照されたい）。
【０２８８】
（ｉｉｉ）小規模メバロン酸収率アッセイ
２ｍＬのＬＢブロスに凍結保存品由来の５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有させたものを入れた振盪チューブに、一晩培養物を接種した。次に、培養物を、３４℃下２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。次に、１％グルコース、最終濃度１％の酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加した２ｍＬのＴＭ３培地を入れた５ｍＬの４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、最終的なＯＤが０．２となるまで培養物を希釈した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離した。２５０μＬの上清に、１９μＬの２０％硫酸を添加し、氷上で５分間インキュベートした。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収した。２００μＬの上清を、ＨＰＬＣに適した９６ウェル円錐底ポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定した。製造元（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定した。
【０２８９】
（ｉｖ）ＨＰＬＣによるメバロン酸の検出：
５０℃でインキュベートし、ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）を取り付けた３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（カタログ番号１２５−０１４０）を使用し、Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ２３０１屈折率検出器を系に包含させたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  ＡｌｌｉａｎｃｅのＨＰＬＣ系でＨＰＬＣ解析を実施した。移動相に０．０１Ｎ硫酸を使用し、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで試料のＨＰＬＣ解析を実施した。各試料の屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液により作成した検量線に対し比較して、いずれものメバロン酸濃度を定量する。
【０２９０】
生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の回分式培養において、メバロン酸は、質量収率３４．８％〜４１．１％でグルコースから生成された（図１、表９）。
【０２９１】
【表９】
2014519811.tif 000012
【０２９２】
１５Ｌ培養槽による、生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の流加式培養において、メバロン酸は、質量収率３９．１％〜４３．４％でグルコースから生成された（表１０）。
【０２９３】
【表１０】
2014519811.tif 000013
【０２９４】
生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の、１５Ｌ発酵槽による流加式培養では、メバロン酸は、最大比生産量８７．５〜１００．１ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤでグルコースから生成された（表１１）。
【０２９５】
【表１１】
2014519811.tif 000014
【０２９６】
最終的に、生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の、メバロン酸力価１０８．２〜１１５．４ｇ／Ｌの範囲であり（表１２）、かつＣＰＩは４．８６〜５．８０メバロン酸（ｇ）／グルコース（ｇ）の範囲であった（表１３）。
【０２９７】
【表１２】
2014519811.tif 000015
【０２９８】
【表１３】
2014519811.tif 000016
【０２９９】
実施例８：イソプレン生産株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、ＣＭＰ６７６にメバロン酸経路の下流を形質導入することができる（表３を参照されたい）。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。プラスミドｐＭＣＭ１２２３（L. grayi）、ｐＭＣＭ１２２４（E. faecium）、ｐＭＣＭ１２２５（Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum））、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））又はｐＣＨＬ２７７（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））を、プラスミドｐＤＷ３４変異体と同時に電気穿孔した（米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７号；図２を参照されたい）。ｐＤＷ３４変異体のプラスミドは、活性の向上しているイソプレンシンターゼ変異体を含有している。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０ｕｇ／ｍＬでコロニーを選択することができる。
【０３００】
実施例９：Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）又はＥ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のＭＶＡ経路上流を利用したＭＶＰ濃度の増大
Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）又はＥ．ガリナラム（E. gallinarum）のいずれか由来のＭＶＡ経路上流を利用させた場合に、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のＭＶＡ経路上流を利用させた場合と比較して、５−ホスホメバロン酸（ＭＶＰ）濃度が顕著に増大することが、これらの試験により強調される。メバロン酸５−リン酸は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）の基質である。適宜に、理論に束縛されるものではないが、細胞中のＭＶＰ濃度を上昇させると、ＭＶＡ経路上流に取り込まれる炭素原子量が増加することになる。
【０３０１】
（ｉ）材料及び方法
大腸菌（E. coli）の代謝産物抽出物：９ｍＬの氷冷無水メタノールを入れたチューブに約３ｍＬの培養物を加え、発酵槽で生育させた細菌細胞の代謝を迅速に不活性化させた。得られた試料を計量し、試料としたブロス量を算出し、以降の解析に備え−８０℃で保管した。代謝産物の抽出並びに濃縮の際には、０．２５ｍＬの細胞懸濁液アリコート（ＯＤ６００で測定した時の培養物の細胞密度が５０を下回る場合には０．４ｍＬのアリコートを使用する）を１．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１，ｖ／ｖ）を使用して希釈し、４分間遠心分離し細胞片をペレット化させた。上清を回収し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（３３μｍ  ３０ｍｇ／３ｍＬＰｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｗｅａｋ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ）のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに充填する。まず１．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（６：１ｖ／ｖ）を使用し、次に１．５ｍＬのメタノール／酢酸アンモニウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ＝８．０）混合液（１：１ｖ／ｖ）を使用して、細胞ペレットを２回抽出した。いずれの抽出の際にも細胞は遠心分離によりペレット化し、次に、得られる上清は同一のＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに充填した。抽出−遠心沈降処理の間、細胞を含む試料は４℃以下に保った。１ｍＬの水及び１ｍＬのメタノールによりカラムを洗浄した後、はじめに０．３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール（１：１４，ｖ／ｖ）混合液を使用し、次に０．３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（１：１２：２，ｖ／ｖ／ｖ）混合液を使用して、対象とする代謝産物をカラムから溶出させた。得られた溶離液に２０μＬの氷酢酸を加えて中和し、次に遠心分離を行い清澄化した。
【０３０２】
代謝産物の定量代謝産物の解析には、ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  ＴＳＱシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、質量分析を行った。システムの調節、データ収集及び質量スペクトルデータの評価の全ては、ソフトウェアのＸＣａｌｉｂｕｒ及びＬＣＱｕａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析は、ＣＣ  ８／４  Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨガードカートリッジを使用してキラルＮｕｃｌｅｏｄｅｘ  β−ＯＨ  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム（１００×２ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。移動相には表１４に記載のとおりに濃度勾配を与えた。移動相Ａは１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ等級，Ｓｉｇｍａ）のミリＱ水等級の緩衝水溶液（ｐＨ＝８）であり、移動相ＢはミリＱ水等級の水であり、移動相ＣはＬＣ−ＭＳ等級のアセトニトリル（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ，Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）である。カラム及びサンプルトレー温度はそれぞれ５℃及び４℃に下げた。充填量は１０μＬであった。
【０３０３】
【表１４】
2014519811.tif 000017
【０３０４】
エレクトロスプレーイオン化質量分析をネガティブモードで使用して質量検出を実施した（ＥＳＩスプレー電圧：３．０ｋＶ、イオントランスファーチューブ温度：３９０℃）。前駆イオンには次のｍ／ｚ値を選択して、対象とする代謝産物をＳＲＭモードで検出した：ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに関しては２４５．０、ＧＰＰに関しては３１３．１、ＦＰＰに関しては３８１．１、ＭＶＰに関しては２２７．０、かつＭＶＰＰに関しては３０７．１。質量分析を実施する間、感度にわずかにばらつきが生じることを考慮し、一様に標識した１３Ｃ１０−ＡＤＰも、試料及び内部標準としての校正物質（Ｉｓｏｔｅｃ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た１３Ｃ１０−ＡＴＰを酵素処理し、１３Ｃ１０−ＡＤＰを調製した；ｍ／ｚ＝４３６．１）の両方に当量ずつ（最終濃度１９．６ｕＭ）添加した。ＰＯ３−プロダクトイオン（ｍ／ｚ＝７９．０）により精製されたピーク強度を積分して、試料／内部標準応答比をもとに代謝産物の濃度を測定した。標準の注入により得られた検量線を使用して、細胞抽出物中の代謝産物濃度を算出した。ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ及びＦＰＰ標準はＥｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃから購入し、ＭＶＰ及びＭＶＰＰ（Ｒ−ｆｏｒｍｓ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０３０５】
結果
発酵開始後４０時間の時点では、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及びＥ．カッセリファバス（E. casselflavis）由来するＭＶＡ経路上流を使用した場合のＭＶＰ濃度は、いずれもＥ．フェカリス（E. faecalis）よりも高かった（図３）。
【０３０６】
実施例１０：別のメバロン酸経路上流を保有しているプラスミドを株に含有させた場合、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）の上流経路を有する経路を含有させた場合と比較して、イソプレンの生産量は増大する
（ｉ）材料
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地をろ過滅菌する。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０３０７】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３０８】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有（２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ））により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイによりイソプレンのオフガス分析を行う。１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れ密閉し、３４℃かつ２００ｒｐｍで３０分間インキュベートする。７０℃で５分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。記録される比生産量は、イソプレン量のＧＣによる読み取り値（ｕｇ／Ｌ）を、インキュベート時間（３０分）及びＯＤ６００測定値で除算した値である。
【０３０９】
（ｉｉｉ）結果：
ｐＭＣＭ１２２３（Ｌ．グレイ（L. grayi））、ＭＣＭ１２２４（Ｅ．フェカリス（E. faecium））、ｐＭＣＭ１２２５（Ｅ．ガリラナラム（E. gallinarum））又はｐＣＨＬ２７７（Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus））を株に含有させた場合、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））を含有しており同一のバックグラウンドを有する株と比較して、比生産性、収率、ＣＰＩ及び／又はイソプレン力価の増大が観察された。
【０３１０】
実施例１１：メバロン酸経路上流の遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）によるイソプレン生産
本実施例では、導入したメバロン酸経路由来の遺伝子を発現させ、１５Ｌスケールで流加式培養により生育させた大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）におけるイソプレン生産量を評価した。ＭＶＡ経路上流の酵素の遺伝子は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）（ＤＷ７０９株及びＤＷ７１７株）、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）（ＤＷ７１８）又はＥ．ガリナラム（E. gallinarum）（ＤＷ７１９、ＭＣＭ２１５８）のいずれかに由来した。
【０３１１】
（ｉ）材料及び方法
株構築：生産宿主株として、大腸菌（Escherichia coli）を、イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）変異体と、異なる４種のＭＶＡ経路上流のうちの１種を含有させたプラスミドとにより同時形質転換させて、株ＤＷ７０９、ＤＷ７１７、ＤＷ７１８、及びＤＷ７１９を作製した。以降の標準的な分子生物学的な手法に従い、宿主株ＣＭＰ１１３３（ＢＬ２１  Δｐｇｌ  ＰＬ．２ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ  ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ）に、ＩｓｐＳ変異体を保持しているｐＤＷ２４０（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  ＭＥＡ−ｍＭＶＫ（Ｃａｒｂ５０））、及びｐＭＣＭ８２（米国特許出願公開番号第２００９／０２０３１０２号）、ｐＣＨＬ２７６（（ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）−ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ）、ｐＣＨＬ２７７（ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）−ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ）又はｐＭＣＭ１２２５（表７を参照されたい）のいずれかを電気穿孔により導入した。細胞を回復させ、選択培地に播種したところ、それぞれスペクチノマイシン及びカルベニシリンに耐性を示す株ＤＷ７０９、ＤＷ７１７、ＤＷ７１８及びＤＷ７１９が得られた。これらのイソプレン生産株は、ＩｓｐＳ変異体と、それぞれエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のＭＶＡ経路上流、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｌｅａｄｅｒｌｅｓｓＭＶＡ経路上流、エンテロコッカス・カッセリファバス（Enterococcus casseliflavus）由来のＭＶＡ経路上流、又はエンテロコッカス・ガリラナラム（Enterococcus gallinarum）由来のＭＶＡ経路上流のいずれかとを発現していた（表１５を参照されたい）。
【０３１２】
【表１５】
2014519811.tif 000018
【０３１３】
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３１４】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３１５】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３１６】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０３１７】
供給溶液（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液（５．５４ｍＬ）、ビタミン溶液（６．５５ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（０．８２ｍＬ）である。
【０３１８】
本実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。イソプレン生産株を使用し流加式発酵工程を行った。
【０３１９】
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／ｍｉｎ以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６４〜６８時間にわたって発酵を行った。
【０３２０】
解析法：イソプレンは揮発性であり、注入ガスにより槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタのオフガス中のイソプレン濃度は、２つの質量分析器ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）及びＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分析器を使用して測定した。オフガス中の酸素、窒素及びＣＯ２濃度は、同様の質量分析ユニットにより測定した。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。
【０３２１】
４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折計による測定値と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
【０３２２】
（ｉｉ）結果：
【０３２３】
【表１６】
2014519811.tif 000019
【０３２４】
表１６に要約する通り、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）のＭＶＡ経路上流を使用する発酵と比較して、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はＥ．カッセリファバス（E. casseliflavus）のいずれかのＭＶＡ経路上流の酵素を使用する発酵の方が、合計質量収率が高く（図４）、最大容積生産量が大きく（図５）、最大比生産量が高かった（図６）。加えて、細胞中アセチルＣｏ−Ａ濃度は、Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus）又はＥ．ガリナラム（E. gallinarum）の経路を含有させた株と比較して、低かった（表１７）。このアセチルＣｏＡ濃度の低下は、細胞中でＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量が増加していることの指標となる。
【０３２５】
【表１７】
2014519811.tif 000020
【０３２６】
実施例１２：Ｍ．バートニイ（M. burtonii）又はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを大腸菌（E. coli）染色体上で発現している大腸菌（E. coli）株の生育及びイソプレン生産
本実施例は、遺伝子操作し、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ又はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを大腸菌（E. coli）染色体上で発現させた大腸菌（E. coli）株の、生育及びイソプレン生産量に関する小規模試験を詳述する。
【０３２７】
材料及び方法
生育アッセイ：冷凍保存品からカルベニシリン５０μｇ／ｍＬ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加したＬＢブロス２ｍＬを入れた振盪チューブに一晩培養物を接種した。次に、培養物を、３４℃下２４０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。次に、１％グルコース、０．０２％酵母エキス、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを添加した２ｍＬのＴＭ３培地を入れた、５ｍＬ４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ  ０．４の時点で、２００μＭのＩＰＴＧにより培養物に誘導を行った。誘導の１時間後に、最終濃度が０、２、４、８、１６、３２ｍＭになるよう培地にメバロン酸を加えた。ＩＰＴＧによる誘導の直後、１、２、３、４、及び５時間後にＯＤを測定した。
【０３２８】
【表１８】
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【０３２９】
イソプレンの生産量：遺伝子操作型大腸菌（E. coli）のＧＣ／ＭＳによりイソプレン生産量を解析するための試料を、誘導から１、２、３、４及び５時間後に回収した。１００μμＬの培養ブロスを９８ウェルガラス製深底ブロックに回収し、アルミニウム製シーラー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりシールした。ガラスブロックを３４℃の水浴で３０分間インキュベートした後、８０℃の水浴に移し、２分間加熱滅菌した。ガラスブロックを冷却し、イソプレンを測定するためにＧＣ／ＭＳに移した。
【０３３０】
ＧＣ／ＭＳによるイソプレンの検出：ヘッドスペースモードで作動するＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーと適合させたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＭＳシステムを使用し、ＧＣ／ＭＳを実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ；０．２５μｍフィルム厚）を使用して分析物を分離した。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして、流速１ｍＬ／分でヘリウムを使用した。注入部は、分割比５０：１に設定し、２５０℃で保持した。炉の温度は、解析中３７℃で２分保持した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ５７９３Ｎ質量検出器は、ｍ／ｚ６７で単一イオン検出（ＳＩＭ）モードで作動させた。１．４〜１．７分経過時点で検出器のスイッチを切り、永久ガスを溶出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）が１．７８分で溶出することを観察した。較正表を使用して、イソプレンの絶対量を定量したところ、１μｇ／Ｌ〜２０００μｇ／Ｌに相当することが判明した。この手法から、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌであると推定された。
【０３３１】
（ｉｉ）結果：
ＭＣＭ２１３１の生育は、０〜１６ｍＭ濃度のメバロン酸では阻害されなかった。ＭＣＭ２１３１は、３２ｍＭのメバロン酸を加えた場合に最も比生産量が高くなったことから（３０〜４２ｍｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）、上流経路からの非常に多量の取り込みを支持し得る。
【０３３２】
染色体にメバロン酸キナーゼのコピーを１つ有する、遺伝子操作株ＭＣＭ２１２５、ＭＣＭ２１２７及びＭＣＭ２１３０は、１６ｍＭのメバロン酸を供給した場合に４０ｍｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤの比生産量を実現することができる。メバロン酸濃度が０〜１６ｍＭである場合にも、株の生育は阻害されなかった（図７）。
【０３３３】
実施例１３：大腸菌（E. coli）におけるＭ．マゼイ（M. mazei）及びＭ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼのプラスミド及び染色体による発現
染色体のみでマゼイ（Mazei）ＭＶＫ  ｏｆｆを発現させた場合の効果をＭＣＭ２１２６株及びＭＣＭ２１２７株において評価した。
【０３３４】
材料及び方法
（ｉ）溶液
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸１．６ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３３５】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３３６】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０３３７】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍ径のフィルタによりろ過滅菌した。
【０３３８】
供給溶液＃１（１ｋｇ当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液（５．５４ｍＬ）、ビタミン溶液（６．５５ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（０．８２ｍＬ）である。
【０３３９】
（ｉｉ）方法
試料を解凍し、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ  ７．６）、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、及び０．５ｍＭのＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド）によりＯＤ＝２０に規格化した。ＯＤを規格化した細胞懸濁液を、４８２６．３ｋＰａ（７００ｐｓｉ）に設定したフレンチプレスセルに繰り返し通過させて、溶解させた。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。清澄化させた可溶化液に含まれる総タンパク質量を、ブラッドフォードアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，５００−０００６）を使用し評価した。次に試料を規格化し、４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で泳動した。ｉＢｌｏｔ転写装置（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ＢｅｎｃｈＰｒｏ（商標）４１００ウェスタンカード・プロセッシング・ステーション（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰｒｏＳｃｉ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄの生成酵素に対するウサギ一次ポリクローナル抗体、並びにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８により蛍光標識した抗ウサギＩｇＧヤギ２次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ−１１００８）により、ニトロセルロース膜上でＭ．マゼイ（M. mazei）及びＭ．バートニイ（M. burtonii）ＭＶＫを検出した。イメージャーのＳｔｏｒｍ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、特異的なタンパク質定量化を行った。
【０３４０】
（ｉｉｉ）結果
ウェスタンブロット解析によるタンパク質定量に基づくと、ＭＣＭ２１２５におけるＭ．バートニイ（M. burtonii）のメバロン酸キナーゼの発現は、ＤＷ７０８株におけるＭ．マゼイ（M. mazei）のメバロン酸キナーゼの発現と比較して、少なくとも１５倍以下であった（図８）。
【０３４１】
実施例１４：発現コンストラクト及びラクトバチルス（Lactobacillus）株によるメバロン酸の生産
Ｉ．ＭＶＡ経路上流をコードしているプラスミドの構築
ベクターｐＤＭ２０は大腸菌（E. coli）−ラクトバチルス（Lactobacillus）シャトルベクター（米国特許出願公開第２０１０／００８１１８２号：この特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）である。このベクターはｐＬＦ１レプリコン（約０．７Ｋｂｐ）を最小数と、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＡＴＣＣ１４９１７プラスミドｐＬＦ１由来のｐｅｍＫ−ｐｅｍＩ  ｔｏｘｉｎ−ａｎｔｉｔｏｘｉｎ（ＴＡ）、ｐＡＣＹＣ１８４由来のＰ１５Ａレプリコン、大腸菌（E. coli）及びＬ．プランタラム（L. plantarum）の両方を選択するためのクロラムフェニコール耐性マーカー並びにＰ３０合成プロモータとを含有している（Ｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）１５２：１０１１〜１０１９）。
【０３４２】
ｐＤＭ２０プラスミドは、Ｐ３０プロモータ下流のマルチクローニングサイトにｐＴｒｃ９９ａ由来のｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを加えて改変する。ターミネーター領域は、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用し、プライマーＴ１Ｔ２＿Ｆ＿Ｈｉｎｄ３＿Ｓａｌ（ＳＥＱ）及びＴ１Ｔ２  Ｒ＿Ｐｓｔ（ＳＥＱ）を使用してｐＴｒｃ９９ａから増幅させる。
【０３４３】
増幅反応は、製造元のプロトコルに従ってＨＦ緩衝液を使用し、５０μＬで実施する。サイクルパラメータは次の通りである：９８℃で３０秒、次に９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１０秒、を３０サイクル、最後に７２℃で１０分の最終伸長反応。ＰＣＲ産物のターミネーターを、製造元のプロトコルに従い、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）により精製する。
【０３４４】
ＰＣＲ産物及びｐＤＭ２０をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及び次にＰｓｔＩ（ＮＥＢ）により段階的に消化する。消化した挿入断片およびベクターをＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）により精製する。
【０３４５】
製造元の指示に従いＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ＮＥＢ）を使用し、２０μＬ用量で挿入断片及びベクターを連結させる。連結させた核酸を使用し、製造元のプロトコルに従ってＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換させる。細胞及び連結させた核酸を混合し、３０分間氷上でインキュベートし、次に細胞に４２℃で４５秒間熱ショックを与え、次に氷上で２分間インキュベートする。ＳＯＣ培地を細胞に加え、次にこの細胞を３７℃下で１時間振盪（２２０ｒｐｍ）する。２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＬＢプレートに細胞を播種する。形質転換細胞のコロニーの配列決定をする。配列決定後、Ｑｉａｐｒｅｐミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してプラスミドｐＤＭ２０＿Ｔを調製する。
【０３４６】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の２つの遺伝子、すなわちｍｖａＥ及びｍｖａＳを含むメバロン酸経路上流を、プライマーＵＰ＿ＥＦ＿ＢａｍＨＩ（ＳＥＱ）及びＵＰ＿ＥＦ  Ｒ  Ｘｈｏ（ＳＥＱ）を使用して、テンプレートｐＣＬ−ＰｔｒｃＵｐｐｅｒ（ｐＣＨＬ２７６）からＰＣＲにより増幅させる。得られるＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）を使用しゲル精製する。
【０３４７】
エンテロコッカス・ガリラナラム（Enterococcus gallinarum）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードしている遺伝子を、プライマーＵＰ＿ＥＦ＿ＢａｍＨＩ（ＳＥＱ）及びＵＰ＿ＥＧ  Ｒ  Ｘｈｏ（ＳＥＱ）を使用して、テンプレートｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−ｕｐｐｅｒ  Ｇｃ−ＭＭ１６３からＰＣＲにより増幅させる。得られるＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）を使用しゲル精製する。
【０３４８】
ベクターｐＤＭ２０＿ＴをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより２回消化し、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）により精製する。
【０３４９】
消化したベクターｐＤＭ２０＿Ｔ及びＵＰ＿ＥＦ断片を、キットの取扱説明書に従ってＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ＮＥＢ）を使用して連結させる。連結させた核酸によりＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加したＬＢプレートに播種する。形質転換体の配列決定をする。得られたプラスミドをｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＥＦと表記する。
【０３５０】
消化したベクターｐＤＭ２０＿Ｔ及びＵＰ＿ＥＧ断片を、キットの取扱説明書に従って、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ＮＥＢ）を使用して連結させる。連結させた核酸によりＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加したＬＢプレートに播種する。形質転換体の配列決定をする。得られたプラスミドをｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＥＧと表記する。
【０３５１】
ＩＩ．メバロン酸経路上流を発現しているラクトバチルス（Lactobacillus）株の作製
米国特許出願公開第２０１１／０２４４５３６（Ａ１）号に記載の手順に従い、プラスミドｐＤＭ２０＿Ｔ，ｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＵＰ＿ＥＦ及びｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＵＰ＿ＥＧによりラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ株番号ＰＴＡ−７７２７；（米国特許出願公開第２００８／０１２４７７４（Ａ１）号）を形質転換させる。１％グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した、５ｍＬのラクトバチルス（Lactobacilli）用ＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に、ＰＮ０５１２細胞を接種し、３０℃で一晩生育させる。１％グリシンを添加した１００ｍＬのＭＲＳ培地にＯＤ６００が０．１となるよう一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．７になるまで３０℃で生育させる。４℃にて３７００×ｇで８分間処理して細胞を回収し、１００ｍＬの冷１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で洗浄し、４℃にて３７００×ｇで８分間遠心分離し、１００ｍＬの冷３０％  ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で洗浄し、次に４℃にて３７００×ｇで２０分間遠心分離し、次に１ｍＬの冷３０％ＰＥＧ−１０００に再懸濁させる。電極間隔１ｍｍの冷キュベット内で、６０μＬの細胞と約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを混合し、１．７ｋＶ、２５μＦ及び４００Ωに設定したＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により電気穿孔を行う。５００ｍＭのスクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１００ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１ｍＬのＭＲＳ培地に細胞を再懸濁し、３０℃にて２時間インキュベートし、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＭＲＳ培地プレートに播種し、次に３０℃でインキュベートする。
【０３５２】
ＩＩＩ．メバロン酸についての試験
本実施例は、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）のメバロン酸経路上流を加えたラクトバチルス（Lactobacillus）株によるメバロン酸の生産量は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のメバロン酸経路上流を含有している株と比較して、増大していることを例証することを目的とする。
【０３５３】
（ｉ）材料及び方法
細胞培養：ｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＵＰ＿ＥＦ及びｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＵＰ＿ＥＧ並びに空の対照プラスミドｐＤＭ２０＿Ｔを含有しているＬ．プランタラム（L. plantarum）ＰＮ０５１２を、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加した２０ｍＬのラクトバチルス（Lactobacilli）ＭＲＳ培地で一晩生育させる。培養物を３０℃で１４時間（一晩）インキュベートする。５ｍＬの４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した２ｍＬのＭＲＳを入れ、最終ＯＤが０．２となるよう一晩培養物を希釈する。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ振とう／恒温器で、３０℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートする。各培養物１ｍＬを３，０００ｇで５分間遠心分離する。２５０μＬの上清に１９μＬの２０％硫酸を添加し、氷上で５分間インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。２００μＬの上清を、ＨＰＬＣに適した９６ウェル円錐底ポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）に移す。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。製造元（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。
【０３５４】
ＨＰＬＣによるメバロン酸の検出：５０℃でインキュベートし、ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）を取り付けた３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（カタログ番号１２５−０１４０）を使用し、Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ２３０１屈折率検出器を系に包含させたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  ＡｌｌｉａｎｃｅのＨＰＬＣ系でＨＰＬＣ解析を実施する。移動相に０．０１Ｎ硫酸を使用し、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣ解析を実施する。ＨＰＬＣを使用し、各サンプルにより得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、ブロスのメバロン酸濃度を定量することができる。
【０３５５】
（ｉｉ）結果：
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来の遺伝子によりコードされるメバロン酸経路上流を発現しているラクトバチルス（Lactobacillus）株によるメバロン酸の比生産量を、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の遺伝子によりコードされるメバロン酸経路上流を発現している株と比較する。細菌は同一条件下で生育させた。ＨＰＬＣ解析により、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）の上流経路を有する株は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の上流経路を有する株と比較して、イソプレンの比生産量が高いことが示される。Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）又はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の上流経路を発現しているいずれの株も、空の対照プラスミドを含有させた株と比較して、多量のメバロン酸を生産した。
【０３５６】
実施例１５：ラクトバチルス（Lactobacillus）を使用したイソプレン生産用の株の構築
ラクトバチルス（Lactobacillus）においてイソプレンを生産させるには、ラクトバチルス（Lactobacillus）の染色体に、ＭＶＫ、ｙＰＭＫ、ＭＶＤ遺伝子からなるメバロン酸経路の下流を組み込む必要がある。イソプレン合成酵素及びＩＤＩをコードしている遺伝子を、プラスミドのＰｌｄｈＬプロモータの調節下に、オペロンとしてクローン化する。上流経路の遺伝子（ｍｖａＥ及びｍｖａＳ）を、同一のプラスミドの、対照となるＰ３０プロモータの調節下に、オペロンとしてクローン化する。メバロン酸経路の下流を組み込んだラクトバチルス（Lactobacillus）を、ＩｓｐＳ−ＩＤＩオペロン及び上流経路のオペロンを含有しているプラスミドにより形質転換させる。
【０３５７】
Ｉ．大腸菌（E. coli）−ラクトバチルス（Lactobacillus）シャトルベクターへのＩｓｐＳ＿ＩＤＩオペロンのクローン化
Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用し、キットの取扱説明書に従って、ＨＦ緩衝液を使用し５０μＬの反応スケールで、プライマーＰｌｄｈＬ  Ｆ（ＳＥＱ）及びＰｌｄｈＬ  Ｒ（ＳＥＱ）により、テンプレートｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９２号）からＰｌｄｈＬプロモータを増幅させた。アニーリング温度は５５℃であり、伸長は７２℃で１０秒である。キットのプロトコルに従い、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）によりＰＣＲ反応物を精製する。精製したＰＣＲ産物及びベクターｐＤＭ２０＿Ｔ１を、ＰｓｔＩにより３７℃で２時間消化する。ベクター及び挿入断片を８０℃で２０分間インキュベートし、ＰｓｔＩを失活させる。ＰｓｔＩにより消化したベクターをエビアルカリホスファターゼ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＩｎｃ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により３７℃での３０分間処理する。６５℃で１５分間加熱してホスファターゼ反応を停止させる。処理したベクター及び消化したＰＣＲ産物を、いずれもキットの取扱説明書に従ってＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）により精製する。
【０３５８】
消化したＰＣＲ産物及びベクターを、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ＮＥＢ）を使用して連結させる。連結させた混合物によりケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０セル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換させる。３７℃下で、２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを添加したＬＢプレートにより形質転換体を選択する。ＤＮＡ配列の解析をもとに、形質転換体を選択する。得られたプラスミドをｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＰｌｄｈＬと呼ぶ。
【０３５９】
Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ  Ｉｎｃ.（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｉｓｐＳ遺伝子及びｙＩＤＩ遺伝子を、ラクトバチルス（Lactobacillus）用にコドン最適化して合成する。遺伝子は、それぞれ遺伝子のＡＴＧ開始コドンから始まる、ラクトバチルス（Lactobacillus）のリボソーム結合部位を有するオペロンとして合成する。ＩｓｐＳ−ｙＩＤＩオペロンをｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ−ＩＩを作製する。
【０３６０】
Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用し、５５℃でのアニーリング及び１分の伸長反応を行い、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ−ＩＩからプライマーＩＩ  Ｆ  Ａｖｒ２（ＳＥＱ）及びＩＩ  Ｒ  Ｎｄｅ（ＳＥＱ）によりｉｓｐＳ−ｙＩＤＩオペロンを増幅させる。
【０３６１】
ベクターｐＤＭ２０＿Ｔ＿ＰｌｄｈＬ及びｉｓｐＳ−ｙＩＤＩ  ＰＣＲ産物を、ＡｖｒＩＩ及びＮｄｅＩにより消化する。ベクター及び挿入断片を連結させ、ＴＯＰ１０  ｃｅｌｌｓを形質転換させた。３７℃下で、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢプレートにより形質転換体を選択する。ＤＮＡ配列の解析をもとに、形質転換体を確認する。得られたプラスミドをｐＤＭ２０＿Ｔ＿Ｐｌｄｈ−ＩＩと呼ぶ。
【０３６２】
ＩＩ．ＩｓｐＳ−ｙＩＤＩによるプラスミドへの上流経路の付加
ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによりベクターｐＤＭ２０＿Ｔ＿Ｐｌｄｈ−ＩＩを消化した。この消化したベクターを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化したＥＦ＿ＵＰ  ＰＣＲ産物と連結させる（実施例１４を参照されたい）。この消化したベクターを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化したＥＧ＿ＵＰ  ＰＣＲ産物とも連結させる（実施例１４を参照されたい）。連結させた核酸によりＴｏｐ１０  ｃｅｌｌｓを形質転換させ、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢプレートに播種し、３７℃で選択する。得られたプラスミドをｐＤＭ２０Ｔ−ＥＦ−Ｐｌｄｈ−ＩＩ及びｐＤＭ２０Ｔ−ＥＧ−Ｐｌｄｈ−ＩＩと呼ぶ。
【０３６３】
ＩＩＩ．下流経路組み込みベクター及びＰＮ０５１２ΔｌｄｈＬ１：：ＭＶＫ−ｙＰＭＫ−ＭＶＤ組み込み株の構築
本節では、ＭＶＫ、ｙＰＭＫ、ＭＶＤを発現させるため、ＭＶＡ経路下流の遺伝子をＬ．プランタラム（L. plantarum）のＰＮ０５１２株の染色体に組み込む。遺伝子は、細胞代謝に影響を及ぼさない中立な位置など染色体の異なる位置に組み込むことができ、あるいは組み込みは細胞生理を変更させるよう設計することもできる。
【０３６４】
ＰＮ０５１２株において、ＭＶＫ、ｙＰＭＫ、ＭＶＤのコード領域が、ｌｄｈＬ１プロモータの下流に配置されるように、２回の遺伝的乗り換えにより相同な領域が得られるよう、２つのＤＮＡ断片（相同断片（homologous arms））を設計する。プラスミドにクローン化した、左側及び右側の相同断片は、それぞれ約１２００塩基対である。左側及び右側の相同断片は、Ｌ．プランタラム（L. plantarum）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させる。組み込みベクターｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１−ａｒｍｓの構築法は、米国特許出願公開第２０１１／０２４４５３６（Ａ１）号に記載のものである。この特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６５】
下流経路の遺伝子は、増幅させるＭＰＭオペロンに対するテンプレートとして、大腸菌（E. coli）ＭＶＫＣＭＰ４５１（ＭＶＫ、ｙＰＭＫ、ＭＶＤ及びｙＩＤＩのコード配列を含有している）由来のゲノムＤＮＡを使用し、ＰＣＲにより増幅させる。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅ  Ｇｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ）を使用して、３７℃で定常相（stationary phase）になるまでＬＢで生育させた培養物の細胞ペレット１ｍＬから、ゲノムＤＮＡを精製する。Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＰＣＲキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、Ｘｈｏ  Ｉ部位、Ｓｐｅ  Ｉ部位、及びリボソーム結合配列を含有するプライマーＭＰＭＩ  Ｘｈｏ  Ｓｐｅ  Ｆｏｒ（表２３）、並びにＰｍｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ部位を含有しているＭＰＭ  Ｐｍｅ  Ｘｈｏ  Ｒｅｖ１（表２３）により、ＭＰＭオペロンを作製する。典型的なＰＣＲ反応液（５０μＬ）は、１Ｘ  ＨＦ緩衝液、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ、２．５μＬの１０μＭの各プライマー、０．５μＬのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ及び２５０ｎｇのゲノムＤＮＡからなる。サイクル条件：９８℃で３０秒×１サイクル、続いて９８℃で１０秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分２０秒を３０サイクル。これらのサイクルの後、反応混合物は７２℃で１０分保持する。Ｚｙｍｏ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、反応物を精製する。得られたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼのＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃下で消化する。反応物は、Ｚｙｍｏ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｃｈ）を使用して精製する。
【０３６６】
【表１９】
2014519811.tif 000022
【０３６７】
ｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１ａｒｍｓベクターを制限酵素ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化する。消化させた後、ＸｈｏＩを６５℃で２０分間処理し失活させる。次に、ベクター端をエビアルカリホスファターゼ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により脱リン酸化させる。反応物を３７℃で４５分インキュベートし、次に６５℃で１５間処理してホスファターゼを失活させる。Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を使用し、アガロースゲルからベクターを精製する。
【０３６８】
得られた、Ｘｈｏ−Ｉにより消化し脱リン酸化したベクターｐＦＰ９９６ｌｄｈＬ１ａｒｍｓ、及びＸｈｏＩ−により消化したＭＰＭ断片を、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ＮＥＢ）を使用し２５℃で５分間連結させる。連結させた核酸溶液により、ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）Ｓｔｂｌ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）セルを形質転換させる。典型的な形質転換反応は、細胞及び連結させた核酸を混合して氷上で３０分おき、４２℃で４５秒熱ショック処理を行い、氷上で２分間インキュベートし、並びにＳＯＣ培地により３０℃で１時間回復させるという工程からなる。選択を行うため、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天に形質転換体を播種する。プレートを３０℃で一晩インキュベートする。
【０３６９】
プライマーＭＰＭＩｓｅｑＦ５（表１８）及びｌｄｈｓｅｑＲ３（表１８）を使用して、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）ＲＥＤＴａｑ（登録商標）Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（商標）反応ミックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ）によるＰＣＲを行い、形質転換体のコロニーを選択した。いくつかのポジティブな形質転換体をＤＮＡ配列決定により確認する。得られた組み込みプラスミドはｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１ａｒｍｓ：：ＭＰＭと表記する。
【０３７０】
アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢで一晩生育させた、大腸菌（E. coli）Ｓｔｂｌ３／ｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１ａｒｍｓ：：ＭＰＭ株由来の細胞ペレットから、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離する。
【０３７１】
ｌｄｈＬ１プロモータにより発現されるよう、及びｌｄｈＬ１がその後欠失されるよう、ＭＰＭオペロンをラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＰＮ０５１２株の染色体に組み込む。非標識遺伝子の欠失に際し、欠失ではなく二重乗り換えにより野生型配列又は意図する組み込みが得られたこと以外は記載（Ｆｅｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６：５９６）の通り、同様の二工程の相同組み換え法を使用して、ｌｄｈＬ１プロモータから発現させたコード領域のＭＶＫ、ｙＰＭＫ、ＭＶＤのシングルコピーを染色体組込みした。
【０３７２】
ｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１ａｒｍｓ：：ＭＰＭを使用してＬ．プランタラム（L. plantarum）ＰＮ０５１２を形質転換させて、ＭＶＫ、ｙＰＭＫ、ＭＶＤコード領域を組み込んだ。０．５％グリシンを添加した５ｍＬのラクトバチルス（Lactobacilli）ＭＲＳ培地にＰＮ０５１２を接種し、３０℃で一晩生育させた。０．５％グリシンを添加した１００ｍＬのＭＲＳ培地に、ＯＤ６００が０．１となるよう一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．７になるまで３０℃で生育させる。４℃にて３７００×ｇで８分間処理して細胞を回収し、１００ｍＬの１ｍＭの冷ＭｇＣｌ２により洗浄し、４℃にて３７００×ｇで８分間遠心分離し、１００ｍＬの３０％冷ＰＥＧ−１０００により洗浄し４℃にて３７００×ｇで２０分間遠心分離し、次に１ｍＬの３０％冷ＰＥＧ−１０００に再懸濁した。電極間隔１ｍｍの冷キュベット内で、６０μＬの細胞と約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを混合し、１．７ｋＶ、２５μＦ及び４００Ωに設定したＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒにより電気穿孔を行う。細胞を、５００ｍＭのスクロース及び１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含有している１ｍＬのＭＲＳ培地に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし、次に２μｇ／ｍＬのエリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＭＲＳ培地に蒔く。
【０３７３】
オペロン特異的なプライマーＭＰＭＩｓｅｑＦ３（表１８）及びＭＰＭＩｓｅｑＲ４（表１８）を使用してＰＣＲを行い、形質転換を選択する。エリスロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を添加したラクトバチルス（Lactobacilli）用ＭＲＳ培地により、形質転換体を３０℃にて約１０継代にわたって（generations）生育させ、次にラクトバチルス（Lactobacilli）用ＭＲＳ培地に連続的に接種して３７℃にて約４０継代分にわたって生育させる。エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）を添加したラクトバチルス（Lactobacilli）用ＭＲＳ培地に培養物を蒔く。染色体特異的なプライマーのｌｄｈＬ  ｌｅｆｔ  ａｒｍ  ｃｈｅｃｋ  ＤＮ（表１８）、及びプラスミド特異的なプライマーＭＰＭＩｓｅｑＲ８を使用して、コロニーＰＣＲにより、一重乗換えが生じている分離株を選択する（表１８）。
【０３７４】
次に、一重乗り換え組み換え体をラクトバチルス（Lactobacilli）用ＭＲＳ培地に連続的に接種して、約４０継代にわたって３７℃にて生育させる。培養物をＭＲＳ培地に蒔く。コロニーをＭＲＳプレートに植継ぎ、３７℃で生育させる。次に、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）を添加したＭＲＳ培地に分離株を植継ぐ。染色体に特異的なプライマー対及び遺伝子特異的なプライマー対を使用し、野生型又は二重乗り換えの存在についてのコロニーＰＣＲを行い、エリスロマイシン感受性の単離株を選択する。ｌｄｈＬ  ｌｅｆｔ  ａｒｍ  ｃｈｅｃｋ  ＵＰ及びＭＰＭＩｓｅｑＲ８により約１４００ｂｐの増幅産物が得られ、ＭＰＭＩｓｅｑＦ６及びｌｄｈＬ  ｒｉｇｈｔ  ａｒｍ  ｃｈｅｃｋ  ＤＮ．により約１６００ｂｐの増幅産物が得られる。ＰＣＲ産物の配列決定により組み込みを確認し、確認のなされた組み込み株をＰＮ０５１２ΔｌｄｈＬ１：：ＭＰＭと命名した。
【０３７５】
ＩＶ．イソプレンを生産するＬＡＢ株の作製
上記の通りに電気穿孔法（electrocompetent）を用い、ｐＤＭ２０Ｔ−ＥＦ−Ｐｌｄｈ−ＩＩとｐＤＭ２０Ｔ  ＥＧ−Ｐｌｄｈ−ＩＩにより形質転換させ、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＬ１：：ＭＰＭを作製する。１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＭＲＳに細胞を播種する。
【０３７６】
実施例１６：ラクトバチルス（Lactobacillus）におけるイソプレン生産量の試験
本実施例は、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）のメバロン酸経路上流を加えたラクトバチルス（Lactobacillus）株によるイソプレンの生産量は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のメバロン酸経路上流を含有している株と比較して、増大していることを例証することを目的とする。
【０３７７】
（ｉ）材料及び方法
ｐＤＭ２０Ｔ−ＥＦ−Ｐｌｄｈ−ＩＩ又はｐＤＭ２０Ｔ  ＥＧ−Ｐｌｄｈ−ＩＩを収容しているＰＮ０５１２ΔｌｄｈＬ１：：ＭＰＭを含有させたＬ．プランタラム（L. plantarum）を、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＭＲＳ培地に接種し、３０℃で１４時間生育させる。株をＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ  ＴＭで生育させて、イソプレン生産量を解析する。各２４ウェルの試験用量は４．５ｍＬとする。一晩培養物を、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した４．５ｍＬのＭＲＳにより、５５０ｎｍで測定される吸光度が０．０５となるよう希釈する。温度は３０℃に維持し、ｐＨは７．０に設定し、酸素流量は２０ｓｃｃｍに設定し、撹拌速度は８００ｒｐｍとした。
【０３７８】
ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイによりイソプレンのオフガス分析を行う。サンプル調製は次の通りに行う：１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れて密封し、一定時間（３０分間）にわたって３０℃でインキュベートする。７０℃で５分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。
【０３７９】
試験期間中、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を使用し、波長５５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を得る。比産生性は、イソプレン濃度（μｇ／Ｌ）をＯＤ読み取り値により除して算出する。各２４ウェルについて、試料は小規模発酵過程にわたって３つの時点で採取する。
【０３８０】
（ｉｉ）結果：
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来の遺伝子によりコードされる上流経路を含有している、完全なメバロン酸経路を発現している株によるイソプレンの比生産量を、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のメバロン酸経路上流を含有している、完全なメバロン酸経路を発現している株による比生産量と比較する。細菌を同一の条件下で小規模発酵によろい生育させた。経時的なヘッドスペース測定（米国特許出願公開番号第２０１０／００８６９７８号を参照されたい）により、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）の上流経路を含有させた株は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の上流経路を含有させた株と比較して、イソプレンの比生産量が大きいことが示される。
【０３８１】
実施例１７：アモルファジエン又はファルネセン生産株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、ＣＭＰ６７６にメバロン酸経路の下流を形質導入する（表３を参照されたい）。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更させるか、又はプラスミドから発現させるかのいずれかにより、ファルネシル二リン酸合成酵素（ｉｓｐＡ）を過剰発現させる。プラスミドｐＭＣＭ１２２３（Ｌ．グレイ（L. grayi））、ｐＭＣＭ１２２４（Ｅ．フェシウム（E. faecium））、ｐＭＣＭ１２２５（Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum））、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））又はｐＣＨＬ２７７（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））を、プラスミドｐＤＷ３４変異体と同時に電気穿孔した（米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７号；図２を参照されたい）。ｐＤＷ３４変異体のプラスミドは、大腸菌（E. coli）用にコドンを最適化させたファルネセン合成酵素又は大腸菌（E. coli）用にコドンを最適化させたアモルファジエン合成酵素を、イソプレンシンターゼの代わりに含有する。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０ｕｇ／ｍＬでコロニーを選択する。
【０３８２】
実施例１８：その他のメバロン酸上流経路を有するプラスミドを含有させた株によるアモルファジエン又はファルネセンの生産量は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）上流経路を含有させた株と比較して、増大する
（ｉ）材料
ＴＭ３培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。次に、０．２２μｍのフィルタを用い培地をろ過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０３８３】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３８４】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有（２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ））により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。接種前に、各培養フラスコには２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を積層し、これまでに記載の通り、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，２００６）。
【０３８５】
２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、積層したドデカンを酢酸エチルに希釈し、有機層中のアモルファジエン又はファルネセン濃度を分析する。ドデカン／エチルアセテート抽出物を、従来記載されている通りの（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６〜８０２）ＧＣ−ＭＳ法により、アモルファジエンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）及び１８９ｍ／ｚフラグメントイオン又はファルネセンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）の観察により解析する。濃度既知のアモルファジエン又はファルネセン試料を装填して、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を生成する。試料中のアモルファジエン又はファルネセンの量は、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を使用し算出する。
【０３８６】
（ｉｉｉ）結果
ｐＭＣＭ１２２３（Ｌ．グレイ（L. grayi））、ＭＣＭ１２２４（Ｅ．フェシウム（E. faecium））、ｐＭＣＭ１２２５（Ｅ．ガリラナラム（E. gallinarum））又はｐＣＨＬ２７７（Ｅ．カッセリファバス（E. casseliflavus））を株に含有させた場合、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））を含有しており同一のバックグラウンドを有する株と比較して、比生産性、収率、ＣＰＩ及び／又はアモルファジエン若しくはファルネセン力価の増大が観察された。
【０３８７】
（ｉｖ）引用文献：
Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｍａｒｓｈａｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．Ｙ．，Ｎｏｗｒｏｏｚｉ，Ｆ．，Ｐａｒａｄｉｓｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００６．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｏｒｐｈａ−４，１１−ｄｉｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：６８４〜６９１。
【０３８８】
Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００３．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７９６〜８０２。
【０３８９】
実施例１９：大腸菌（E. coli）ＢＬ２１又は大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた時に分解しないＭｖａＥタンパク質の同定
細胞で異種発現させたタンパク質が分解することで、タンパク質の合成及び分解という無駄なサイクルによりＡＴＰの損失が生じる、分解するタンパク質の触媒活性が減少する、対象とするタンパク質の定常状態の細胞内濃度が減少する、細胞生理を変更し得るストレス応答を誘導する、及び生物に由来する市販の製品に有害となる可能性のあるその他の効果が生じる恐れがある（Ｓ．−Ｏ．Ｅｎｆｏｒｓ，２００４）。したがって、分解しにくい完全長のタンパク質を発現させることは、代謝工学の面から有益である。ウェスタンブロットにより検出される断片により示される通り、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子産物は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１で発現させた場合に部分的に分解する（図９）。Ｈｉｓタグ生成したサンプルを泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＳａｆｅｓｔａｉｎ染色により、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ＭｖａＥの切断断片も検出される（図１０）。分解耐性のあるｍｖａＥ遺伝子産物の同定及び使用は、メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの生産量を増加させるのに有用である。
【０３９０】
大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色して同定した後、Ｈｉｓタグにより精製を行ったところ、すなわちメバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドを生産する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて記載の検出方法を使用したところ、識別可能な断片は存在していないことが示されたことから、生物のＥ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及びＬ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥの遺伝子産物は分解していないことが立証された。
【０３９１】
（ｉ）方法：
Ｈｉｓタグを付した、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及びＬ．グレイ（L. grayi）由来のＭｖａＥをコードしているＤＮＡを含有するプラスミドを構築する。ＭｖａＥを大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、Ｎｉ−樹脂クロマトグラフィーで精製する。精製した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する。アニオン交換クロマトグラフィーにより、及び一部の場合ではゲルろ過により試料を更に精製する。均一性が９５％以上になるよう精製した試料を、ポリクローナル抗体の作製に使用する。ウェスタンブロットにより生産株を解析し、対象とするＭｖａＥに対し作製したポリクローナル抗体を用い標識した。
【０３９２】
（ｉｉ）引用文献：
Ｅｎｆｏｒｓ，Ｓ．Ｏ．，Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｔ．「バイオプロセスにおける生理的なストレス応答（Physiological Stress Responses in Bioprocesses）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２００４。
【０３９３】
配列
Ｌ．グレイ（L. grayi）ｍｖａＥ：
【０３９４】
2014519811.tif 000023
【０３９５】
Ｌ．グレイ（L. grayi）ｍｖａＳ：
【０３９６】
2014519811.tif 000024
【０３９７】
Ｅ．フェシウム（E. faecium）ｍｖａＥ：
【０３９８】
2014519811.tif 000025
【０３９９】
Ｅ．フェシウム（E. faecium）ｍｖａＳ：
【０４００】
2014519811.tif 000026
【０４０１】
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）ｍｖａＥ
【０４０２】
2014519811.tif 000027
【０４０３】
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）ｍｖａＳ：
【０４０４】
2014519811.tif 000028
【０４０５】
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）ｍｖａＥ：
【０４０６】
2014519811.tif 000029
【０４０７】
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）ｍｖａＳ：
【０４０８】
2014519811.tif 000030
【０４０９】
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）ＥＧ２（ｍｖａＥ）：
【０４１０】
2014519811.tif 000031
【０４１１】
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）ＥＧ２（ｍｖａＳ）
【０４１２】
2014519811.tif 000032
【０４１３】
Ｌ．グレイ（L. grayi）（ｍｖａＥ）：
【０４１４】
2014519811.tif 000033
【０４１５】
Ｌ．グレイ（L. grayi）（ｍｖａＳ）：
【０４１６】
2014519811.tif 000034
【０４１７】
Ｅ．フェシウム（E. faecium）（ｍｖａＥ）：
【０４１８】
2014519811.tif 000035
【０４１９】
Ｅ．フェシウム（E. faecium）（ｍｖａＳ）
【０４２０】
2014519811.tif 000036
【０４２１】
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）（ｍｖａＥ）：
【０４２２】
2014519811.tif 000037
【０４２３】
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）（ｍｖａＳ）
【０４２４】
2014519811.tif 000038
【０４２５】
イソプレンシンターゼ：
【０４２６】
2014519811.tif 000039
【０４２７】
ｉｓｐＡ：
【０４２８】
2014519811.tif 000040
【０４２９】
大腸菌（E. coli）用にコドン最適化したアモルファジエン合成酵素：
【０４３０】
2014519811.tif 000041
【０４３１】
大腸菌（E. coli）用にコドン最適化したファルネセン合成酵素：
【０４３２】
2014519811.tif 000042
【０４３３】
ｐＭＣＭ１２２３−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６１（リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１）：
【０４３４】
2014519811.tif 000043
【０４３５】
2014519811.tif 000044
【０４３６】
ｐＭＣＭ１２２４−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６２（エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium））
【０４３７】
2014519811.tif 000045
【０４３８】
2014519811.tif 000046
【０４３９】
ｐＭＣＭ１２２５−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６３（エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２）：
【０４４０】
2014519811.tif 000047
【０４４１】
2014519811.tif 000048
【図１】
2014519811.tif 000049
【図２】
2014519811.tif 000050
【図３】
2014519811.tif 000051
【図４】
2014519811.tif 000052
【図５】
2014519811.tif 000053
【図６】
2014519811.tif 000054
【図７】
2014519811.tif 000055
【図８】
2014519811.tif 000056
【図９】
2014519811.tif 000057
【図１０】
2014519811.tif 000058
【配列表】
2014519811000001.app
【国際調査報告】
2014519811.tif 000059
2014519811.tif 000060
2014519811.tif 000061
2014519811.tif 000062