(57)【要約】  本発明は、疎水性と親水性という逆の特性を持つ安定ナノ粒子から、活性薬剤の放出を保護及び制御する二重ナノカプセル化の独自の方法の使用に関する。この活性薬剤の保護は、保護すべき薬剤を、サブミクロンのナノ粒子に順次カプセル化されたナノキャリアに装填することによって行われる。サブミクロン粒子の形成は、新規なナノスプレィ技術を使用して行った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のナノキャリアをカプセル化するナノ粒子において、当該ナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均径が４００乃至９５０ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
ナノスプレィによって得られることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子及び／又はナノキャリアが架橋していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤がｓｉＲＮＡであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５】
請求項４に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアが更に、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）であるポリカチオン性脂質を含むことを特徴とするナノ粒子。
【請求項６】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアがナノスプレィによって作成されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が：
（ｉ）前記活性薬剤が疎水性の場合、前記ナノキャリア材料が疎水性であり前記ナノ粒子材料が親水性である；
（ｉｉ）前記活性薬剤が親水性である場合、前記ナノキャリア材料が親水性であり前記ナノ粒子材料が疎水性である；
（ｉｉｉ）前記活性薬剤が疎水性である場合、前記ナノキャリア材料が疎水性であり前記ナノ粒子材料が疎水性である；及び
（ｉｖ）前記活性薬剤が疎水性である場合、前記ナノキャリア材料が疎水性であり前記ナノ粒子材料が疎水性である；
から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子の平均径が１ミクロンより小さいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項９】
請求項８に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子の平均径が９５０ｎｍより小さいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項１０】
請求項９に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子の平均径が約４００乃至９５０ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアの平均径が約３００ｎｍより小さいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアの平均径が約５０乃至３００ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアの平均径が約５０乃至１００ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１４】
ナノカプセル又はナノスフェアの形であることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアが、ナノカプセル、ナノスフェア、又はこれらの混合物から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１５に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアがナノスプレィによって得られることと特徴とするナノ粒子。
【請求項１７】
請求項７に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が疎水性である場合に、前記ナノキャリア材料が疎水性であり前記ナノ粒子材料が親水性であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１８】
請求項７に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が親水性である場合に、前記ナノキャリア材料が親水性であり前記ナノ粒子材料が疎水性であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１９】
請求項７に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が疎水性である場合に、前記ナノキャリア材料が疎水性であり前記ナノ粒子材料が疎水性であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２０】
請求項７に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が親水性である場合に、前記ナノキャリア材料が親水性であり前記ナノ粒子材料が親水性であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２１】
請求項７乃至２０のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一の疎水性材料が、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）ホモポリマ、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−α−メトキシ−ω−メタクリレート共重合体、ポリシアノアクリレート、ポリアンヒドライドポリマ、及びこれらの組み合わせから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２２】
請求項２１に記載のナノ粒子において、前記疎水性材料が、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）及びこれらの組み合わせから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２３】
請求項２２に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡの分子量が約４，０００乃至１００，０００Ｄａであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子材料が疎水性であり、当該ナノ粒子の外側表面が少なくとも一のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合することを特徴とするナノ粒子。
【請求項２５】
請求項７乃至２４のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記親水性材料が、デキストラン、ヒアルロン酸塩、通常の又は架橋したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、通常の又は架橋したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キトサン、セラック、コラーゲン、ゼラチン、アラビア糊、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、及びこれらの組み合わせから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２６】
請求項２５に記載のナノ粒子において、前記親水性材料がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はヒアルロン酸塩であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２７】
請求項２６に記載のナノ粒子において、前記ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の平均分子量が約６６，５００Ｄａであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２８】
請求項２６に記載のナノ粒子において、前記ヒアルロン酸塩の平均分子量が約２０，０００から最大１，０００，０００Ｄａであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２９】
請求項１乃至２８のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が、ビタミン、タンパク質、抗酸化剤、核酸、短い又は長いオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡとその化学派生物、ペプチド、ポリぺプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、抗体、モノクロナール抗体、ワクチン、予防薬、薬剤、診断剤、造影剤、栄養剤、小分子、電解質、免疫学的薬剤、及びこれらの組み合わせから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３０】
請求項２９に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤がｓｉＲＮＡであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３１】
請求項７乃至３０のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアが少なくとも一の親水性活性薬剤を含むことを特徴とするナノ粒子。
【請求項３２】
請求項３０に記載のナノ粒子において、前記親水性活性薬剤が、治療用ペプチド又はタンパク質から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３３】
請求項３０に記載のナノ粒子において、前記親水性活性薬剤が、エクセナチド、インスリン、成長ホルモン、トリプトレリンアセテート、ブセレリン、及びナファレリンから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３４】
請求項７乃至３３に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアが少なくとも一の疎水性薬剤を含むことを特徴とするナノ粒子。
【請求項３５】
請求項３４に記載のナノ粒子において、前記疎水性薬剤が、鎮痛剤又は抗炎症剤；駆虫剤；抗不整脈剤；抗菌剤；抗血液凝固剤；抗鬱剤；抗肥満剤；抗てんかん剤；抗カビ剤；抗痛風剤；降圧剤；抗マラリア剤；抗偏頭痛剤；抗ムスカリン剤；抗神経可塑剤又は免疫抑制剤；抗原虫剤；抗甲状腺剤；抗不安、鎮静、催眠、又は神経抑制剤；βブロッカ；強心剤；コルチコステロイド；利尿剤；抗パーキンソン剤；胃腸薬；ヒスタミンＨ１−レセプタアンタゴニスト；脂質調整剤；硝酸塩又は強心剤；栄養剤；ＨＩＶプロテーゼ阻害剤；オピオイド鎮痛剤；性ホルモン；及び興奮剤；から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３６】
少なくとも一の標的薬剤に結合する外側表面を有することを特徴とする請求項１乃至３５のいずれ１項に記載のナノ粒子。
【請求項３７】
請求項３６に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一の標的薬剤が、モノクロナール抗体；小分子；ヒアルロン酸又はヒアルロナン；腫瘍透過性ペプチド；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフェリン；フェリチン；アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド；上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）；細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；血管作動性腸管ペプチド；ＣＡ１５−３抗原；ＭＵＣ１タンパク質；ＣＤ２０；ＣＤ３３；インテグリン；リンパ管標的部分（ＬｙＰ−１等）；アプタマ；及びオリゴ糖；から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３８】
請求項３７に記載のナノ粒子において、前記モノクロナール抗体が；トラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ＡＭＢＬＫ８；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；リツキシマブ（Ｍａｂ  Ｔｈｅｒａ（登録商標））；ラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））；及びベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））；から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３９】
請求項３８に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一の標的薬剤が、ラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））；及びベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））；から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４０】
請求項３７に記載のナノ粒子において、前記小分子が、葉酸と葉酸塩から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４１】
請求項１乃至４０のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアの各々が、ポリマ材、又は金属、又は金属を含む非金属材料であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４２】
請求項４１に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアがポリマ材であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４３】
請求項４１に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアが金属であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４４】
請求項４３に記載のナノ粒子において、前記ナノキャリアが金であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４５】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が、前記ナノキャリア内に含まれる又はその外側表面の領域に結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４６】
請求項４２又は４３に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が、前記ナノキャリアの外側領域に結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４７】
請求項４６に記載のナノ粒子において、前記結合が直接結合している、又は連結基を介して結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４８】
請求項１乃至４７に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一のナノキャリアが、少なくとも一の更なる標的薬剤と結合した外側表面を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項４９】
請求項４８に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一の標的薬剤が、前記少なくとも一の更なる標的薬剤と同じであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５０】
請求項４８に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一の標的薬剤が、前記少なくとも一の更なる標的薬剤と異なることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５１】
請求項１乃至５０のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記少なくとも一の活性薬剤が負又は正に荷電していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５２】
請求項５１に記載のナノ粒子において、前記活性薬剤が負に荷電しており、前記ナノキャリアが更に、カチオン性脂質又は細胞透過性たんぱく質を含むことを特徴とするナノ粒子。
【請求項５３】
請求項５２に記載のナノ粒子において、前記前記カチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）、ステアリルアミン、及びオレイルアミンから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５４】
請求項５３に記載のナノ粒子において、前記カチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５５】
請求項５２に記載のナノ粒子において、前記細胞透過性ペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ペネトラチン、グラミシジンＳ、ＭＳＩ−１０３、ＭＳＩ−１０３−Ａｒｇ、ＰＧＬａ、ＰＧＬａ−Ａｒｇ、マゲイニン２、マゲイニン−２−Ａｒｇ、ＫＩＧＡＫＩ、ＢＰ１００、ＭＡＰ、ＭＡＰ−Ａｒｇ、ＳＡＰ、ＰＥＰ−１、トランスポータン、及びＦＰ２３から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５６】
請求項１乃至５５のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が所定のサイズの一またはそれ以上のオリフィスを有するスクリーンを透過させるステップを具えるプロセスで作成したものであり、複数のナノキャリアとナノ粒子材料を液状媒体中に含むコロイド状成分を具え、少なくとも一の活性薬剤と前記ナノ粒子材料を含む前記複数のナノキャリアが、少なくとも部分的に前記液状媒体に溶解し、前記オリフィスのサイズが前記ナノ粒子のサイズを決定することを特徴とするナノ粒子。
【請求項５７】
請求項５６に記載のナノ粒子において、前記コロイド状成分が、複数のナノキャリアを液状媒体中でナノ粒子材料と混合することによって作成されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５８】
請求項５６又は５７に記載のナノ粒子が更に、前記ナノ粒子を乾燥させるステップを具えることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５９】
請求項５８に記載のナノ粒子において、前記乾燥が凍結乾燥、乾燥、減圧、あるいは溶媒抽出であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項６０】
請求項１乃至５９のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項６１】
請求項６０に記載の組成物が医薬組成物であり、更に、薬学的に許容可能なキャリアを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６２】
請求項６１に記載の組成物が、静脈注射（ｉ．ｖ．）または経口投与に適合していることを特徴とする組成物。
【請求項６３】
請求項６０に記載の組成物において、前記ナノ粒子が凍結乾燥されていることを特徴とする組成物。
【請求項６４】
請求項１乃至５９のいずれか１項に記載のナノ粒子の医薬組成物の作成における使用。
【請求項６５】
請求項６４に記載の使用において、前記医薬組成物が、対象の循環系に、局所に、経口で、非経口で又は静脈注射で治療用薬剤を輸送する送達システムに適合していることを特徴とする使用。
【請求項６６】
請求項６４又は６５に記載の使用において、前記送達システムが、活性薬剤の促進標的治療送達及び制御放出投与に適合していることを特徴とする使用。
【請求項６７】
請求項６４乃至６６に記載の組成物と、その使用指示書を具えるキット。
【請求項６８】
請求項１乃至５９のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子を具えることを特徴とする送達システム。
【請求項６９】
対象の循環器系に少なくとも一の活性薬剤を送達するように構成された請求項６８に記載の送達システム。
【請求項７０】
請求項１乃至５９のいずれか１項に記載のナノ粒子を取得するプロセスにおいて：
（ａ）少なくとも一のナノキャリアであって、少なくとも一の活性薬剤を含むナノキャリアを取得するステップと；
（ｂ）前記ナノ粒子に前記少なくとも一のナノキャリアをカプセル化するステップと；
を具えることを特徴とするプロセス。
【請求項７１】
請求項７０に記載のプロセスにおいて、前記ナノキャリアが疎水性ポリママトリックスを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項７２】
請求項７１に記載のプロセスにおいて、前記ナノキャリアを：
有機溶剤に疎水性ポリマを溶かして、有機相を形成するステップと；
前記有機相を水性相に接触させてナノキャリアを取得するステップであって、前記水性相が選択的に界面活性剤を含み；
前記ナノキャリアを前記活性剤溶液と共にインキュベートして、前記活性薬剤を前記ナノキャリアの表面の少なくとも一部に結合させるステップと；
によって取得することを特徴とするプロセス。
【請求項７３】
請求項７２に記載のプロセスにおいて、前記有機溶剤が水混和性であることを特徴とするプロセス。
【請求項７４】
請求項７３に記載のプロセスにおいて、前記有機混和溶媒が、アセトン、エタノール、メタノール、クロロホルムジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジエチルエーテル、アセトン及びアセトニトリル（ＡＣＮ）から選択されることを特徴とするプロセス。
【請求項７５】
請求項７０に記載のプロセスにおいて、前記ナノキャリアが、親水性ポリママトリックスを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項７６】
請求項７５に記載のプロセスにおいて、前記ナノキャリアを：
親水性ポリマを前記活性薬剤の水性溶液に溶かして、水性相を形成するステップと；
前記ナノキャリアを形成できるｐＨで脱溶媒和剤を含む有機相を前記水性相に連続的に加えて、当該活性薬剤を前記ナノキャリア内に分布させるステップと；
によって取得することを特徴とするプロセス。
【請求項７７】
請求項７６に記載のプロセスが、選択的に、前記親水性ポリママトリックスを架橋するステップを具えることを特徴とするプロセス。
【請求項７８】
請求項７６又は７７に記載のプロセスにおいて、前記適切なｐＨが６から９の間であることを特徴とするプロセス。
【請求項７９】
請求項７６乃至７８のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、前記脱溶媒和剤が、アセトン、エタノール、及びアセトニトリルから選択されることを特徴とするプロセス。
【請求項８０】
請求項７６乃至７９のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、前記有機相が更に、カチオン性脂質を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項８１】
請求項７０乃至８０のいずれか１項に記載のプロセスが更に、前記ナノ粒子の外側表面の少なくとも一部を少なくとも一の標的部分で官能化するステップを具えることを特徴とするプロセス。
【請求項８２】
請求項８１に記載のプロセスにおいて、前記少なくとも一部が、前記ナノ粒子の全表面であることを特徴とするプロセス。
【請求項８３】
請求項８１に記載のプロセスにおいて、前記少なくとも一の標的部分が、ＰＥＧ、トラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ＡＭＢＬＫ８、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、小分子、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、腫瘍透過性ペプチド、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、伝達フェリチン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、血管作動性腸管ペプチド、ＣＡ１５−３抗原、ＭＵＣ１タンパク質、ＣＤ２０、ＣＤ３３、インテグリン、リンパ管ターゲッティング分子、アプタマー又はオリゴ糖から選択されることを特徴とするプロセス。
【請求項８４】
請求項７０乃至８３のいずれか１項に記載のプロセスが更に、前記ナノ粒子を凍結乾燥させるステップを具えることを特徴とするプロセス。
【請求項８５】
請求項１乃至５９のいずれか１項に記載のナノ粒子を取得するナノスプレィプロセスにおいて：
液状媒体内に複数のナノキャリアとナノ粒子材料を含むコロイド状組成物を所定のサイズの一またはそれ以上のオリフィスを有するスクリーンを通過させるステップを具え、前記複数のナノキャリアが、少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子材料が前記液状媒体に少なくとも部分的に溶解しており、前記オリフィスのサイズが前記ナノ粒子のサイズを決定する；
ことを特徴とするプロセス。
【請求項８６】
請求項８５に記載のナノスプレィプロセスにおいて、前記コロイド状組成物を、複数のナノキャリアを水性媒体中のナノ粒子材料と混合することによって作成することを特徴とするプロセス。
【請求項８７】
請求項８５又は８６に記載のナノスプレィプロセスが、更に、前記ナノ粒子を乾燥させるステップを具えることを特徴とするプロセス。
【請求項８８】
請求項８７に記載のナノスプレィプロセスにおいて、前記乾燥させるステップが、凍結乾燥、乾燥、減圧、あるいは溶媒抽出によることを特徴とするプロセス。
【請求項８９】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子がナノスプレィによって取得できることを特徴とするナノキャリア。
【請求項９０】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子がナノスプレィによって取得できることを特徴とするナノキャリア。
【請求項９１】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子及び／又は前記ナノキャリアがナノスプレィによって取得できることを特徴とするナノキャリア。
【請求項９２】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子が：
前記活性薬剤が疎水性である場合、前記ナノキャリア材料が疎水性であり、前記ナノ粒子材料が親水性であり：前記ナノ粒子材料が選択的に更に架橋されて水性媒体中のその溶解度が低減されている；あるいは
前記活性薬剤が親水性であり、前記ナノキャリア材料が親水性であり、選択的に架橋されて、前記ナノキャリア材料が疎水性である；
ものから選択されることを特徴とするナノキャリア。
【請求項９３】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子及び／又は前記ナノキャリアがそれぞれ架橋しており；
前記活性薬剤が疎水性であり、前記ナノキャリア材料が疎水性であり、前記ナノ粒子材料が親水性であり；前記ナノ粒子材料が選択的に更に架橋されて水性媒体中のその溶解度が低減されている；あるいは
前記活性薬剤が親水性であり、前記ナノキャリア材料が親水性であり、選択的に架橋されており、前記ナノ粒子が疎水性である；
ものから選択されることを特徴とするナノキャリア。
【請求項９４】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子及び／又は前記ナノキャリアがナノスプレイによって取得され；
前記活性薬剤が疎水性であり、前記ナノキャリア材料が疎水性であり、前記ナノ粒子材料が親水性であり；前記ナノ粒子材料が選択的に更に架橋されて水性媒体中のその溶解度が低減されている；あるいは
前記活性薬剤が親水性であり、前記ナノキャリア材料が親水性であり、選択的に架橋されており、前記ナノ粒子が疎水性である；
ものから選択されることを特徴とするナノキャリア。
【請求項９５】
ナノ粒子をカプセル化した複数のナノキャリアにおいて、当該複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性薬剤を含み、前記ナノ粒子の平均粒径が４００乃至９５０ｎｍであり、前記ナノ粒子がナノスプレィによって取得され、前記ナノ粒子及び／又は前記ナノキャリアが架橋しており；
前記活性薬剤が疎水性であり、前記ナノキャリア材料が疎水性であり、前記ナノ粒子材料が親水性であり；前記ナノ粒子材料が選択的に更に架橋されて水性媒体中のその溶解度が低減されている；あるいは
前記活性薬剤が親水性であり、前記ナノキャリア材料が親水性であり、選択的に架橋されており、前記ナノ粒子が疎水性である；
ものから選択されることを特徴とするナノキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、ナノ送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見は、生物学と薬学の全く新しい分野の扉を開いた。特にサイレンス標的遺伝子へのＲＮＡｉの能力は、基本的なリサーチを生み出したばかりでなく、ＲＮＡｉに基づく薬剤開発の概念を惹起した。ＲＮＡｉは、配列特異的マッチングを介するｍＲＮＡの標的化を通じて作用し、標的ｍＲＮＡの劣化又はその翻訳阻害を生じさせ、タンパク質発現のロスを引き起こしている。これは、薬理学的には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、小さい１９−２１ｂｐ  ｄｓＲＮＡ分子の導入を介して達成される。１０年前のその発見以来、ｓｉＲＮＡは、癌、神経変性疾患及び感染症といった、様々な疾患の治療における有用性を求めて、インビトロで広く研究されてきた。
【０００３】
ｓｉＲＮＡの更なる開発への主な障害は、分子量が大きいこと（例えば、１３ｋＤａ）とポリアニオン特性（例えば、４０負リン酸電荷）のために、インビボでのｓｉＲＮＡを効率良く送達ができないことであった。裸のｓｉＲＮＡは、細胞メンブレインと自由に交差しない。更に、修飾されていない裸のｓｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼやエクソヌクレアーゼによって急速に分解するので、血液や血清中で比較的不安定である。すなわち、このｓｉＲＮＡはインビボでの半減期が短い。通常、化学修飾は、ＲＮＡ二重鎖構造に導入されて、遺伝子サイレンシング活性に悪影響を与えることなく生物学的安定性を強化することができる。代替的に、化学修飾は、細胞取り込みを強化するのみならず、生物学的安定性を提供する送達システムで策定することができる。ＲＮＡの骨格、塩基、又は糖へのいくつかの化学修飾を用いて、ｓｉＲＮＡの安定性と活性を強化していた。しかしながら、その作用の細胞内部位へのｓｉＲＮＡのアクセスを容易にする送達システムが求められている。
【０００４】
実際、全身投与後の標的組織へのｓｉＲＮＡの取り込みを強化する様々な送達システムが開発されてきた。これらのシステムには、ポリマ［１］、脂質［２］、又はナノ粒子［３，４］の使用が含まれる。これらのベクターのほとんどは、カチオン性であり、負に荷電したｓｉＲＮＡで十分に粒子が相互作用して、その細胞への侵入を容易にするようにしている。しかしながら、これらのカチオン性粒子のｓｉＲＮＡを全身に送達する能力は、網内系（ＲＥＳ）器官［５］による迅速な取り込みによって、良好でないことがあり、これによって、対象部位へのこれら粒子の送達を妨げている。この問題を克服するために、これらの粒子のＲＥＳ取り込みを低減するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をその処方に広く使用していた。「血管透過性・滞留性亢進効果」現象によって、このペグ化によっても腫瘍などの欠陥のある脈管構造が存在する部位に粒子が蓄積される。
【０００５】
脂質ベースの送達ベクターについては、ポリヌクレオチドを付加したペグ化粒子を作成する様々な方法が今日報告されており、これには、ポストインサーション法［７］、逆相蒸発法［８］、洗浄剤透析法［９］、及びエタノール透析法［１０］が含まれる。しかしながら、これらの方法は、ほとんど、有効ではあるが、比較的複雑かつ冗長な作成手順が必要であり、結果物としての粒子が水性状態に浮遊している。このことが、粒子の劣化及び／又は溶解、脂質の加水分解、及び水性環境におけるｓｉＲＮＡヌクレオチドの不安定性を含む、長期にわたる保存の問題を引き起こす。更に、これらの作成は、搬送中に生じる撹拌又は温度変動といったストレスによって影響を受ける傾向にある［１１］。これらの問題は、既存の作成手順を用いたこれらの粒子の大量生産に必要な更なる大きな努力を伴い、クリニックにおけるｓｉＲＮＡを含有する脂質ベースの製品の幅広い採用を制限することになる。明らかに、最終製品が長期保存にも適しているｓｉＲＮＡを付加したナノキャリアを作成する比較的シンプルで有効な方法の開発が必要である。
【０００６】
この２０年間、１−１０００ｎｍの範囲のナノサイズ粒子に基づくいくつかの治療法が、癌、痛み、及び感染症の治療に成功裏に導入されてきた。親水性の生体高分子（ペプチドやｓｉＲＮＡなど）は、通常、低い膜透過率と、環境状態（熱、ｐＨ、酵素分解）への高い感度を示し、ナノキャリアによる細胞内送達の適切な候補と考えられている。このようなナノキャリアは、半減期が短く迅速に除去されるこれらの高分子の血液循環時間を延ばすことができる。しかしながら、このような目的に使用される臨床的な関連ナノキャリアの数は少なく、主な解決すべき課題、特に、非経口投与ルートによる効率のよい送達に関する課題が残っている。ｓｉＲＮＡは、完全な治療可能性を十分に引き出すのに適当なナノキャリアのアプリケーションが最も必要とされているクラスの親水性生体高分子を代表している。
【０００７】
[引用文献]
2014527980.tif 000002
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ｓｉＲＮＡ（あるいは、コレステロールで標識したｓｉＲＮＡなど、その様々な化学的誘導体）などの、疎水性又は親水性薬剤である活性薬剤の、逆の特性（疎水性又は親水性）をもつ安定ナノ粒子からの放出を防ぎ制御する二重ナノカプセル化の独自の方法論を使用している。この活性薬剤の保護は、保護すべき薬剤をナノキャリアに入れることによって達成される。これは、続いて、サブミクロンのナノ粒子にカプセル化される。サブミクロンのナノ粒子（ナノカプセル又はナノスフェア）の形成は、新規なナノスプレィ技術を用いて成功裏に達成される。
【０００９】
本発明の送達システムは、親水性生体高分子（ｓｉＲＮＡなど）又は疎水性生体高分子の全身送達のためのプラットフォームを提供して、薬剤の半減期、生体内分布、及び薬物動態を改善する。
【００１０】
このように、本発明は、また、二重カプセル化活性薬剤を含む薬剤送達システムに関連するものであり、親水性又は疎水性の活性薬剤の安定化を図り、細胞内へのその標的送達を可能にする。
【００１１】
本発明の一態様では、複数のナノキャリア（一またはそれ以上）をカプセル化したナノ粒子を提供し、この複数のナノキャリアの少なくとも一つが、少なくとも一の活性薬剤を含み、このナノ粒子の平均径が４００乃至９５０ｎｍである。
【００１２】
いくつかの実施例では、本発明に係るナノ粒子を形成する活性薬剤の二重カプセル化は、本明細書に詳細に説明するように、ナノスプレイ法によって入手可能である。ナノスプレイ法の手順は、更に、ナノスプレイ法によって取得したナノ粒子を乾燥するステップを具える。この乾燥ステップは、例えば、凍結乾燥、熱乾燥、減圧、溶媒抽出、その他の技術を用いた溶剤の蒸発によって達成される。
【００１３】
更なる実施例において、ナノ粒子は以下から選択される：
ｉ．活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合；
ｉｉ．活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子材料が疎水性である場合；
ｉｉｉ．活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が疎水性である場合；
ｉｖ．活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合。
【００１４】
別の実施例では、活性薬剤がｓｉＲＮＡである。活性薬剤がｓｉＲＮＡであるいくつかの実施例では、ナノキャリアが更に、ポリカチオン性脂質を含む。いくつかの実施例では、このポリカチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）である。
【００１５】
この分野の当業者には理解できるように、用語「材料」は、ナノ粒子又はナノキャリアができている物質を意味する。したがって、「ナノキャリア材料」は、ナノキャリアができている物質を意味する。同様に、「ナノ粒子材料」は、ナノ粒子ができている物質を意味する。複数のナノキャリアは、異なる物質でできていてもよい。ナノキャリア材料は、いくつかの実施例では、ナノ粒子材料と異なる。
【００１６】
いくつかの実施例では、ナノキャリアは、金属材料でできていてもよく、あるいは非金属材料と組み合わせた金属材料を含んでいてもよい。いくつかの実施例では、ナノキャリアは、金のナノスフェアである。
【００１７】
材料の疎水性又は親水性は、以下にさらに説明するように水に対するその材料固有の挙動によるものであるか、あるいは、その材料を一またはそれ以上の架橋することでその材料を修飾して、その材料の誘導体化によって、その材料へ電荷を導入することによって（正あるいは負に荷電する）、その材料を別の材料に複合させる又はコンジュゲートさせることによって、及びこの分野で知られているその他の手段によって、達成することができる。
【００１８】
このように、本発明によれば、材料の選択は、その材料の固有の特性に基づく、あるいは、その材料の疎水性又は親水性を高める又は低下させる上述した修飾を行う能力に基づいている。
【００１９】
いくつかの実施例では、ナノ粒子材料及び／又はナノキャリア材料は、材料の親水性を低減（水性媒体中における溶解度を低減）するために架橋していてもよい。
【００２０】
本発明の別の態様では、複数のナノキャリアをカプセル化したナノ粒子を提供しており、この複数のナノキャリアの少なくとも一つ（一またはそれ以上）が、少なくとも一の活性薬剤を含み、このナノキャリアが本明細書で定義したナノスプレイによって作成される。
【００２１】
いくつかの実施例では、ナノ粒子の平均径が４ミクロンより小さい。その他の実施例では、ナノ粒子の平均径が２ミクロンより小さい。その他の実施例では、ナノ粒子の平均径が１ミクロンより小さい。更なる実施例では、ナノ粒子の平均径が９５０ｎｍより小さい。その他の実施例では、形成したナノ粒子の平均径が４００乃至９５０ｎｍの間である。
【００２２】
いくつかの実施例では、ナノ粒子が以下から選択される：
ｉ．活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合；
ｉｉ．活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子材料が疎水性である場合；
ｉｉｉ．活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が疎水性である場合；
ｉｖ．活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合。
【００２３】
更なる実施例では、ナノ粒子材料及び／又はナノキャリア材料を、材料の親水性を低減（水性媒体中における溶解度を低減）するために架橋してもよい。
【００２４】
その他の実施例では、活性薬剤がｓｉＲＮＡである。活性薬剤がｓｉＲＮＡであるいくつかの実施例では、ナノキャリアが更に、ポリカチオン性脂質を含む。いくつかの実施例では、このポリカチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）である。
【００２５】
本発明の別の態様では、複数のナノキャリア（一またはそれ以上）をカプセル化したナノ粒子を提供しており、この複数のナノキャリアの少なくとも一つが、少なくとも一の活性薬剤を含み：この活性薬剤は疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が親水性であり；ナノ粒子材料が選択的に、更に架橋して水性媒体中のその溶解度を低減している；または、この活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、選択的に架橋しており、ナノ粒子材料が疎水性である。
【００２６】
いくつかの実施例では、ナノ粒子の平均径が４ミクロンより小さい。その他の実施例では、ナノ粒子の平均径が２ミクロンより小さい。その他の実施例では、ナノ粒子の平均径が１ミクロンより小さい。更なる実施例では、ナノ粒子の平均径が９５０ｎｍより小さい。その他の実施例では、形成したナノ粒子の平均径が４００乃至９５０ｎｍの間である。
【００２７】
いくつかの実施例では、ナノ粒子がナノスプレイ乾燥法によって形成される。
【００２８】
その他の実施例では、活性薬剤が親水性である。活性薬剤がｓｉＲＮＡであるいくつかの実施例では、親水性活性薬剤がｓｉＲＮＡである。このような実施例では、ナノキャリアが更に、ポリカチオン性脂質を含む。いくつかの実施例では、ポリカチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）である。
【００２９】
本発明のもう一つの態様では、複数のナノキャリアをカプセル化したナノ粒子が提供されており、この複数のナノキャリアの少なくとも一つ（一またはそれ以上）が、少なくとも一の活性薬剤を含む。このナノ粒子の平均径は４００乃至９５０ｎｍの間である。活性薬剤は疎水性であり、ナノキャリア材料は疎水性であり、ナノ粒子材料は親水性であり、ナノ粒子材料が、選択的に更に架橋されており、水性媒体中のその溶解度が低い。または、活性薬剤が親水性であり、ナノ粒子材料が親水性であり、選択的に架橋されており、ナノ粒子材料は疎水性である。
【００３０】
いくつかの実施例では、ナノ粒子がナノスプレィ法で形成されている。
【００３１】
その他の実施例では、活性薬剤が親水性である。いくつかの実施例では、活性薬剤がｓｉＲＮＡであり、親水性活性薬剤がｓｉＲＮＡである。このような実施例では、ナノキャリアが更に、ポリカチオン性脂質を含む。いくつかの実施例では、ポリカチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）である。
【００３２】
本発明のもう一つの態様では、複数のナノキャリア（一またはそれ以上）をカプセル化したナノ粒子が提供されており、この複数のナノキャリアの少なくとも一つが、少なくとも一の活性薬剤を含む。このナノ粒子の平均径は４００乃至９５０ｎｍの間である。活性薬剤は疎水性であり、ナノキャリア材料は疎水性であり、ナノ粒子材料は親水性であり、ナノ粒子材料が、選択的に更に架橋されており、水性媒体中のその溶解度が低い。または、活性薬剤が親水性であり、ナノ粒子材料が親水性であり、選択的に架橋されており、ナノ粒子材料は疎水性である。ここで、ナノ粒子はナノスプレイ法で形成される。
【００３３】
更なる態様では、本発明は、複数のナノキャリア（一またはそれ以上）をカプセル化したナノ粒子を提供しており、この複数のナノキャリアの少なくとも一つが、少なくとも一の活性薬剤を含む。このナノ粒子の平均径は４００乃至９５０ｎｍの間であり、このナノ粒子は本明細書で規定しているようなナノスプレイ法で形成される。
【００３４】
いくつかの実施例では、ナノ粒子は以下より選択される：
ｉ．活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合；
ｉｉ．活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子材料が疎水性である場合；
ｉｉｉ．活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が疎水性である場合；
ｉｖ．活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合。
【００３５】
更なる実施例では、ナノ粒子材料及び／又はナノキャリア材料が、材料の親水性を低減（水性媒体中における溶解度を低減）するために架橋していてもよい。
【００３６】
その他の実施例では、活性薬剤がｓｉＲＮＡである。活性薬剤がｓｉＲＮＡであるいくつかの実施例では、ナノキャリアが更に、ポリカチオン性脂質を含む。いくつかの実施例では、このポリカチオン性脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）である。
【００３７】
本発明の「ナノ粒子」は、粒子キャリア、ナノカプセル（ＮＣ）又はナノスフェア（ＮＳ）であり、生体適応性があり、化学的及び／又は物理的破壊に対して十分に耐性があるので、ヒト又は動物の身体内に投与された後、所望の標的器官（組織）に到達するまでの十分な時間、十分な量のナノ粒子が無償のままである。一般的に、ナノ粒子は、最大平均粒径２μｍ（ミクロン）の形状が球形であり、このナノ粒子の大多数が平均粒径が１μｍ（ミクロン）より小さい。
【００３８】
上述した通り、本発明のいくつかの態様及び実施例では、ナノ粒子が平均粒径が１ミクロンより小さい。いくつかの態様及び実施例では、ナノ粒子の平均粒径が約４００乃至９５０ｎｍの間である。その他の実施例では、ナノ粒子の平均粒径が約４００乃至９００ｎｍの間である。いくつかのその他の実施例では、ナノ粒子の平均粒径が約４００乃至８００ｎｍの間である。更なる実施例では、平均粒径が４００乃至７００ｎｍの間である。更なる態様及び実施例では、ナノ粒子の平均粒径が４００乃至６００ｎｍである。
【００３９】
この粒子の平均粒径は、当業者に知られている方法で測定することができる。用語「平均粒径」とは、測定した径の算術平均を意味し、この径は、平均の±２５％ｍ、±１５％、±１０％、±５％の範囲にある。ナノ粒子が球形でない場合は、この用語は、粒子の最大寸法である有効平均径を意味する。
【００４０】
本発明のナノ粒子は、内在化できるように十分に小さなサイズであると共に、複数のナノキャリアを保持できるように十分大きくなくてはならない。
【００４１】
本発明のナノ粒子内に含まれる複数（一又はそれ以上）の「ナノキャリア」は、それ自体が粒子キャリアであり、各々が平均径が３００ｎｍより小さいか、２５０ｎｍより小さいが、２００ｎｍより小さい。このナノキャリアは、ナノカプセル（ＮＣ）又はナノスフェア（ＮＳ）の形である。一般的に、ナノキャリアは球形である。ナノキャリアの形状は球形ではなく、その径とは、粒子の最も長い寸法をいう。
【００４２】
本発明に係る一のナノ粒子内にカプセル化されているナノキャリアの数は、例えば、ナノキャリアのサイズ又はナノキャリアとナノ粒子の相対的サイズによって変わる。通常、各ナノ粒子は、１乃至数（６−７）ダースのナノキャリア（負複数のナノキャリア）を含んでいる。いくつかの実施例では、各ナノ粒子が２乃至５０のナノキャリアを含む。いくつかの実施例では、各ナノ粒子が２乃４０のナノキャリアを含む。いくつかの実施例では、各ナノ粒子が２乃至３０のナノキャリアを含む。いくつかの実施例では、各ナノ粒子が２乃２０のナノキャリアを含む。いくつかの実施例では、各ナノ粒子が２乃至１０のナノキャリアを含む。
【００４３】
いくつかの実施例では、各ナノ粒子が、２以上のナノキャリアを含む。
【００４４】
このナノキャリアは、少なくとも一の活性薬剤を「含む」ものを言う。以下に例示するように、少なくとも一の活性薬剤は、ナノキャリアのコアに含まれるか、及び／又は、ナノキャリアを作っている材料マトリックスに含まれるか、及び／又はナノキャリアの表面領域（一またはそれ以上、又は全表面）に結合していてもよい。
【００４５】
ナノ粒子が例えば、金のナノスフェアなどの金属粒子であるいくつかの実施例では、少なくとも一の活性薬剤が、その金属粒子の表面領域（一またはそれ以上、又は全表面）に関連している。
【００４６】
いくつかの実施例では、以下に述べるように、ナノ粒子自体が、ナノスプレイ法で形成される。
【００４７】
いくつかの実施例では、ナノキャリアの平均径が約５０ｎｍである。
【００４８】
いくつかの実施例では、ナノキャリアの平均粒径が約１００乃至３００ｎｍである。その他の実施例では、平均径が約２００乃至３００ｎｍである。その他の実施例では、平均径が約５０乃至３００ｎｍである。その他の実施例では、平均径が約５０乃至２５０ｎｍである。その他の実施例では、平均径が約５０乃至２００ｎｍである。更なる実施例では、平均径が約５０乃至１５０ｎｍである。更なる実施例では、平均径が約５０乃至１００ｎｍである。
【００４９】
当業者には、材料の「親水性」は、水に対する親和性を示す材料の特性であり、「疎水性」は、水に対する逆の反応であることは自明である。
【００５０】
水性媒体中のナノ粒子の溶解度又は不溶性は、ナノキャリア又は最終ナノ粒子を架橋することによって、このような媒体中の最終ナノ粒子の溶解度を上げる又は下げることによって変わる。
【００５１】
選択されたアプリケーションについて、ナノ粒子及び／又はナノキャリアは、「ナノカプセル」、すなわち、空であるか、あるいは、少なくとも一の油性又は水性相を含むポリマーシェル又はコアを有する、コア／シェル構造を有する形であってもよい。代替的に、ナノ粒子及び／又はナノキャリアは、実質的に、明確なコア／シェル構造ではなく、均一な組成、すなわち、連続する物質の「ナノスフェア」（ＮＳｓ）であってもよい。
【００５２】
いくつかの実施例では、本発明のナノ粒子及びそれに含まれる複数のナノキャリアは、ナノカプセル形状をしている。別の実施例では、ナノ粒子及びナノキャリアが両方ともナノスフェアである。いくつかのその他の実施例では、ナノ粒子がナノカプセル形状であり、ナノキャリアがナノスフェア形状であってもよい。更なる実施例では、ナノ粒子がナノスフェア形状であり、ナノキャリアがナノカプセル形状をしている。
【００５３】
用語「カプセル化」（あるいは、その言語的変形）は、例えば、少なくとも一のナノキャリアをナノ粒子内に閉じ込めること、あるいは、ナノキャリア中の活性物質（上に規定）を閉じ込めることを意味する。したがって、いくつかの実施例によれば、ナノ粒子は、一またはそれ以上のナノキャリアをカプセル化するものであるといえる。
【００５４】
いくつかのその他の実施例では、ナノ粒子がナノカプセルから選択された複数のナノキャリア、ナノスフェア、及びこれらの混合物をカプセル化している。ナノキャリアの極性の形（ＮＳ及び／又はＮＣ）にかかわらず、本発明のナノ粒子は、異なる物質及び／又は異なる活性材料でできた複数のナノキャリアをカプセル化できる。例えば、本発明のナノ粒子は、同じポリマー物質（したがって、同じ親水性／疎水性特性を有する）の複数のナノキャリアを、一またはそれ以上の異なる活性材料と共に含んでいてもよい。同様に、本発明のナノ粒子は、異なるポリマ物質であるが、各々が同じ活性物質を含む複数のナノキャリアを含んでいてもよい。
【００５５】
本発明のいくつかの態様では、本発明のナノ粒子の混合物が提供されており、この混合物が一またはそれ以上の種類のナノ粒子を含み、この一またはそれ以上のナノ粒子の種類が：
１．ナノキャリア材料
２．ナノ粒子材料
３．活性物質
４．ナノ粒子／ナノキャリア型（ＮＳ又はＮＣ）
５．ナノ粒子／ナノキャリアのサイズ
の少なくともいずれか一つによって互いに異なる。
【００５６】
上述した通り、本発明のいくつかの態様及び実施例では、ナノ粒子をナノスプレイによって得ることができる。このプロセスは、所定のサイズ（径）の一またはそれ以上のオリフィス（孔、開口、穴、ピンホール）を有するスクリーン（例えば、メッシュ）を通って移動させる（例えば、送達、スプレイ）ステップを具え、コロイド状組成物が、液状媒体中に例えば、ポリマ剤など、複数のナノキャリアとナノ粒子剤を含み、この複数のナノキャリアが少なくとも一の活性剤とを含み、ナノ粒子剤が少なくとも部分的に液状媒体中に可溶であり、オリフィスのサイズが、ナノ粒子の（最大）サイズ（径）を決定する。
【００５７】
いくつかの実施例では、オリフィスによって平均径が４ミクロンより小さい、又は２ミクロンより小さい、又は１ミクロンより小さい、又は９５０ｎｍより小さい、又は４００乃至９５０ｎｍの間、又は４００乃至９００ｎｍの間、又は４００乃至８００ｎｍの間、又は４００乃至７００ｎｍの間、あるいは４００乃至６００ｎｍの間の、ナノ粒子を作ることができる。
【００５８】
このようなナノ粒子サイズにするには、オリフィスのサイズ（ホール径）が、７ミクロン乃至１ミクロンの範囲で選択される。いくつかの実施例では、スクリーンが４ミクロン乃至６ミクロンのメッシュサイズである。いくつかの実施例では、スクリーンが４ミクロンのメッシュサイズである。
【００５９】
いくつかの実施例では、コロイド状組成物を、液状媒体中で複数のナノキャリアを例えば、ポリマ材などのナノ粒子剤と混合することによって作成する。
【００６０】
いくつかの実施例では、ナノスプレイ法が更に、ナノ粒子を乾燥させるステップを具える。
【００６１】
いくつかの実施例では、ナノキャリアがナノスプレイで得られる。
【００６２】
本発明のナノ粒子は、主にポリマでできている。用語「ポリマ」には、ホモポリマ、例えば、ブロックポリマ、グラフトポリマ、ランダムポリマ、及び交互コポリマなどのコポリマ、並びにターポリマを含む。また、これらの派生物、組み合わせ、及びブレンドを含む。上記に加えて、この用語は、リニア、ブロック、グラフト、ランダム、交互、分岐構造及びこれらの組み合わせのすべての幾何学的形状を含む。
【００６３】
ナノ粒子の構成に用いられるポリマは生分解性である。すなわち、インビボで使用中に分解する。一般的に、生分解性に起因する分解は、生分解性ポリマをその構成サブユニットへの分解、例えば、酵素によって行われる生化学プロセスによる、ポリマのより小さい被ポリマサブユニットへの消化を含む。この分解は：ポリママトリックス中の結合の開裂を含む生分解であって、通常モノマとオリゴマができる生分解、あるいは、側鎖への内部結合の開裂あるいは側鎖のポリマ主鎖へ連結する生分解；のうちの一方又は両方で行われる。いくつかの実施例では、生分解は、一般的な形の生分解をも意味する。ポリマは更に、生体適合性である。すなわち、実質的に非毒性であるか、あるいは、接触する生体組織又は生体系への有害な衝撃がない。
【００６４】
本発明のナノ粒子は、薬剤送達用プラットフォームとして使用して、活性成分を目標細胞に、あるいは細胞内の細胞小器官に浸透させ放出させることができる。細胞膜貫通を容易にするために、本発明のナノ粒子は、様々な標的薬剤と結合することができる。
【００６５】
いくつかの実施例では、ナノ粒子の外側表面が、少なくとも一の標的薬剤と結合している。このような実施例では、この少なくとも一の標的薬剤が固形腫瘍中に過剰発現したＨＥＲ−２受容体を認識するトラスツブマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ登録商標）；Ｈフェリチンを認識するＡＭＢＬＫ８；ＥＧＦＲ受容体を認識するセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ登録商標）；ＣＤ２０を認識するリツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ登録商標）；新生血管の形成を刺激する「血管内皮細胞増殖因子」（ＶＥＧＦ）と呼ばれる天然タンパク質の機能を阻害するベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ登録商標）；ＶＥＧＦ−Ａへのより強い結合を提供するラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ登録商標）；葉酸又は葉酸塩などの小分子；ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩；腫瘍透過性ペプチド、通常約６−１５ｋＤａ；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフェリン；フェリチン；アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド；上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）；細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；血管作動性腸管ペプチド；ＣＡ１５−３抗原；ＭＵＣ１タンパク質；ＣＤ２０；ＣＤ３３；インテグリン；リンパ管ターゲッティング分子（ＬｙＰ−１など）；ＰＳＭＡアプタマー又はＶＥＧＦアプタマーなどのアプタマー；オリゴ糖、及びその他；などのモノクロナール抗体から選択される。
【００６６】
いくつかの実施例では、標的薬剤がベバシツマブ（Ａｖａｓｔｓｉｎ登録商標）または、ラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ登録商標）である。
【００６７】
ここで用いられているように、用語「結合」又はその言語的変形は、二つの実態を互いに保持する化学的又は物理的相互作用（例えば、ナノ粒子とその標的薬剤、リンカー部分又は活性成分を有するナノキャリア表面、あるいはこれらを意味する相互作用）を意味する。この相互作用は、当業者に知られているあらゆるタイプの化学的又は物理的結合相互作用であってもよい。このような相互作用（関係）の非限定的な例には、イオン結合、共有結合、配位結合、錯体形成、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性−親水性相互作用、その他がある。いくつかの実施例では、この関係は共有結合を介している。別の実施例では、この関係は、配位結合を介している。当業者は、いくつかのケースで、二つの原子間、あるいは二つの化学的物質間の結合する相互作用は、一以上のタイプの化学的及び／又は物理的相互作用を含むと理解するであろう。
【００６８】
インビボ又はインビトロの生体細胞内に入ると、活性物質が正しい小器官に送達されなければならない、あるいは代替的に、エンドソーム又はリソソームなどの細胞小細胞内への区分けを避けなければならず、細胞間で吸収され利用される。したがって、いくつかの実施例では、少なくとも一のナノキャリアがカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰなど）又は細胞透過性ペプチドを有しており、これは、アルギニン又はリシン残基など、様々なアミノ酸を含み、ペプチドに正電荷を与えている。これらのペプチドは、細胞を透過することができ、サイトプラズマ内のナノキャリアの積荷を放出する。このようなペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ペネトラチン、グラミシジンＳ，ＭＳＩ−１０３、ＭＳＩ−１０３−Ａｒｇ，ＰＧＬａ、ＰＧＬａ−Ａｒｇ、マガイニン−２、マガイニン−２−Ａｒｇ、ＫＩＧＡＫＩ、ＢＰ１００、ＭＡＰ、ＭＡＰ−Ａｒｇ、ＳＡＰ、ＰＥＰ−１、トランスポータン、ＦＰ２３、その他から選択することができる。
【００６９】
いくつかの実施例では、カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである。
【００７０】
上述したように、ナノ粒子は、少なくとも一のナノキャリアを含むことができ、このナノキャリアは、親水性マトリックス（物質）を含むナノスフェアであり、少なくとも一の活性物質が親水性であり、疎水性マトリックス内に分散される。
【００７１】
いくつかの実施例では、ナノスフェア親水性物質が、デキストラン、ヒアルロン酸、通常のあるは架橋したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、通常のあるは架橋したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キトサン、セラック、コラーゲン、ゼラチン、アラビア糊、ポリビニルアルコール、シクロデキトリン、から選択される。これらは、各々単独であるか、上述の一またはそれ以上と組み合わせであってもよい。その他の実施例では、親水性物質がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はヒアルロン酸である。
【００７２】
いくつかの実施例では、疎水性物質が、平均分子量約６６，５００Ｄａのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または、平均分子量が２０，０００乃至最大１，０００，０００Ｄａの範囲のヒアルロン酸である。
【００７３】
このような実施例によれば、親水性活性物質が、エクセナチド、インスリン、成長ホルモン、酢酸トリプトレリン、ブセレリン、ナファレリン、その他；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はそのは生物又は断片から選択される。
【００７４】
いくつかの実施例では、親水性薬剤がｓｉＲＮＡである。
【００７５】
いくつかの実施例では、ｓｉＲＮＡが、配列番号：１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１、又は１２の核酸シーケンスを有する。
【００７６】
いくつかの実施例では、親水性物質が架橋しており、水性媒体中のナノキャリアの水溶性を下げている。
【００７７】
いくつかの実施例では、ナノキャリアが天然の状態で親水性である場合、ナノ粒子は、疎水性殻を有するナノカプセルの形をしている（すなわち、疎水性ナノキャリアをカプセル化した疎水性ナノ粒子）。この構成により、通常、安定性と送達性が問題である、親水性物質のカプセル化性と安定性を確実なものにする。
【００７８】
このような実施例において、疎水性殻は、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）ホモポリマ、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−α−メトキシ−ω−メタクリレート共重合体、ポリシアノアクリレート、ポリアンヒドライドポリマ、及びこれらの組み合わせから選択されたポリマである。
【００７９】
いくつかの実施例において、疎水性殻は、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）ホモポリマ、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−α−メトキシ−ω−メタクリレート共重合体、ポリシアノアクリレート、ポリアンヒドライドポリマ、及びこれらの組み合わせの、ペグ化された派生物である。
【００８０】
その他の実施例では、疎水性殻は、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）及びこれらの組み合わせから選択される。これには、ペグ化した派生物（単独で、あるいは組み合わせで）が含まれる。このようの実施例では、ＰＬＧＡが、約４，０００乃至１００，０００Ｄａの分子量を有する。
【００８１】
細胞膜の抑止を小さくするために、疎水性殻は、少なくとも一のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と結合した外側表面を有する。
【００８２】
本発明のその他の実施例では、ナノ粒子は、少なくとも一のナノキャリアを含み、このナノキャリアは疎水性ポリママトリックスを含むナノスフェアである。このナノスフェアに含まれる少なくとも一の活性成分も、疎水性である。
【００８３】
このような実施例では、疎水性ポリママトリックスは、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）ホモポリマ、ポリ（２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−α−メトキシ−ω−メタクリレート共重合体、ポリシアノアクリレート、及びこれらの組み合わせ、及びそのペグ化された派生物から、選択される。
【００８４】
その他の実施例では、疎水性ポリママトリックスが、乳酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）及びこれらの組み合わせから選択される。これには、ペグ化した派生物（単独で、あるいは組み合わせで）が含まれる。
【００８５】
いくつかのその他の実施例では、ＰＬＧＡが、約４，０００乃至１００，０００Ｄａの分子量を有する。
【００８６】
更なる実施例では、疎水性活性物質が、鎮痛薬又は抗炎症薬（アロキシプリン、オーラノフィン、アザプロパゾン、ベノリレート、ジフルニサル、エトドラク、フェンブフェン、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロレン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカン又はスリンダックなど）；駆虫薬（アルベンダゾール、ベフェニウムヒドロキシナフトエート、カムベンザゾール、ジクロロフェン、イベルメクチン、メベンダゾール、オキサムニキン、オクスフェンダゾール、オキサンテルエンボネート、プラジカンテル、ピランテルエンボネート、又はチアベンダゾールなど）；抗不整脈剤（アミオダロン、ジソピラミド、酢酸フレカイニド、又は硫酸キニジンなど）；抗菌剤（べネタミンペニシリン、シノキサチン、シプロフロキサチン、クラリスロマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、デメクロシクリン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、エチオナミド、イミペネム、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、リファンピシン、スピラマイシン、スルファベンズアミド、スルファドキシン、スルファアセトアミド、スルファアメラジン、スルファジアジン、スルファフラゾール、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、テトラサイクリン、又はトリメトプリムなど）；抗凝血剤（ジクマロール、ジビリダモール、ニクマロン、フェニンジオンなど）；抗鬱剤（アモキサピン、マプロチリン、ミアンセリン、ノルトリプチリン、トラゾドン、又はマレリン酸トリミプラミンなど）；高糖尿病剤（アセトヘキサミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、トラザミド、又はトルブタミドなど）；抗癇癪剤（ベクラミド、カルバマゼピン、クロナゼピン、エトトイン、メトイン、メトスクシミド、メチルフェノバルビトン、オキシカルバゼピン、パラメタジオン、フェナセミド、フェノバルビトン、フェニロイン、フェンスクシミド、プリミドーン、スルチアム、又はバルプロ酸など）；抗カビ剤（アンホテリシン、硝酸ブトコナゾール、クロトリマゾール、硝酸エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナタマイシン、ナイスタチン、硝酸スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、又はウンデシレン酸など）；抗痛風剤（アロプリノール、プロベネシド、又はスルフィンピラゾンなど）；抗高血圧剤（アムロジピン、ベニジピン、ダロジピン、ジリタゼム、ジアゾキシド、フェロジピン、酢酸グアナベンズ、イスラジピン、ミノキシジル、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、フェノキシベンズアミン、プラゾシン、レセルピン、又はテラゾシンなど）；抗マラリア剤（アモジアクイン、クロロクイン、クロルプログアニル、ハロファントリン、メフロクイン、プロガニル、ピリメタミン、又は酢酸キニーネなど）；抗片頭痛薬（メシル酸ジヒドロエルゴタミン、タルタル酸エルゴタミン、マレイン酸メチセルギド、マレイン酸ピゾチフェン、又はコハク酸スマトリプタンなど）；抗ムスカリン剤（アトロピン、ベンズヘキソール、ビペリデン、エトプロパジン、ヒヨスチアミン、臭化メペンゾラート、オキシフェンシクリミン、又はトロピカミドなど）；抗腫瘍剤又は免疫抑制剤（アミノグルテチミド、アムサクリン、アザチオプリン、ブスルファン、クロランブシル、シクロスポリン、ダカルバジン、エストラムスチン、エトポシド、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトミシン、ミトタン、ミトザントロン、プロカルバジン、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、タクロリムス、又はシロリムスなど）；抗原虫剤（ベンズニダゾール、クリオキノール、デコキネート、ジイオドヒドロキシキノリン、ジロキサニドフロエード、ジニトルミド、フルオゾリドン、メトロニダゾール、ニモラゾール、ニトロフラゾン、オルニダゾール又はチニダゾールなど）；抗甲状腺剤（カルビマゾール、又はプロピルチオウラシルなど）；抗不安剤、鎮静剤、睡眠剤又は神経弛緩剤（アルパルゾラム、アミロバルビトン、バルビトン、ベンタゼパム、ブロマゼパム、ブロムペリドール、ブロチゾラム、ブトバルビトン、カルブロマール、クロルジアゼポキシド、クロルメチアゾール、クロルプロマジン、クロバザム、クロチアゼパン、クロザピン、ジアゼパム、ドロペリドール、エチナメート、フルアニソン、フルニトラゼパム、フルオプロマジン、フルペンチキソールデカノアート、フルフェナジンデカノアート、フルラゼパム、バロペリドール、ロラゼパム、ロルメタゼパム、メダゼパム、メプロバメート、メタカロン、ミダゾラム、ニトラゼパム、オキサゼパム、ペントバルビトーン、ペルフェナジン、プリモジド、プロクロルペラジン、スルピリド、テマゼパム、チオリダジン、トリアゾラム、又はゾピクロンなど）；β−ブロッカ（アセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ラベタロール、メトプロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、又はプロプラノロールなど）；強心剤（アムリノン、ジギトキシン、ジゴキシン、エノキシモン、ラナトシドＣ、又はメジゴキシンなど）；副腎皮質ステロイド（ベクロメタゾーン、ベータメタゾーン、ブデソニド、酢酸コルチゾーン、デソキシメタゾーン、デキサメタゾーン、酢酸フルドロコルチゾーン、フルニソリド、フルコルトローン、プロピオン酸フルチカゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、又はトリアムシノロンなど）；利尿剤（アセタゾールアミド、アミロライド、ベンドフルアジド、ブメタナイド、クロロチアジド、クロルタリドン、エタクリニック酸、フルセミド、メトラゾーン、スピロノラクトーン、又はトリアムテレンなど）；抗パーキンソン剤（メシル酸ブロモクリプチン、又はマレイン酸リスリド）；胃腸薬（ビサコジル、シメチジン、シサプリド、ジフェノキシレート、ドンペリドン、ファモチジン、ロペラミド、メサラジン、ニザチジン、オメプラゾール、オンダンセトロン、ラニチジン、又はスルファサラジンなど）；ヒスタミンＨ１−受容体拮抗剤（アクリバスチン、アステミゾール、シンナリジン、シクリジン、シプロヘプタジン、ジメンヒドリナード、フルナリジン、ロラタジン、メクロジン、オキサトミド又はテルフェナジンなど）；脂質調整剤（ベザフィブレ���ト、クロフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、又はプロブコールなど）；硝酸又は抗狭心症剤（硝酸アミル、三硝酸グリセリル、硝酸イソソルビド、一硝酸イソソルビド、又は三硝酸ペンタエリスリトールなど）；栄養剤（ベータカロチン、ビタミンＡ、ビタミンＢ２、ビタミンＤ、ビタミンＥ又はビタミンＫなど）；ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ネルフィナビルなど）；オピオイド鎮痛剤（コデイン、デキストロプロポシキフェン、ジアモルフィン、ジヒドロコデイン、メプタジノール、メタドーン、モルフィネ、ナルブヒン、又はペンタゾシンなど）；性ホルモン（クエン酸クロミフェン、ダナゾール、エチニルエストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン、メストラノール、メチルテストステロン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、エストラジオール、コンジュゲートオエストロゲン、プロゲステロン、スタノゾロール、スチベストロール、テストステロン、又はチボロンなど）；又は興奮剤（アメフェタミン、デクスアンフェタミン、デクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、又はマジンドールなど）；から選択される。
【００８７】
ナノキャリアが疎水性であるいくつかの実施例では、ナノ粒子が親水性殻を有するナノカプセルであってもよい。このような実施例では、この親水性殻は、デキストラン、ヒアルロン酸塩、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キトサン、セラック、コラーゲン、ゼラチン、アラビア糊、ポリビニルアルコール、シクロデキストリンから、単独であるいは組み合わせで選択される。必要があれば、これらのポリマはそれぞれ、架橋することができる。
【００８８】
いくつかの実施例によれば、親水性物質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はヒアルロン酸である。
【００８９】
その他の実施例によれば、親水性マトリックスが、平均分子量が約６６，５００Ｄａのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
【００９０】
本発明の薬剤送達システムは、運ばれる活性薬剤（物質）に基づいて調製し、修飾する。複数のナノキャリアを運ぶナノ粒子を用いて、一またはそれ以上の活性物質を運び送達する。例えば、疎水性の活性物質を、親水性のナノキャリア（ナノスフェア又はナノカプセル）にカプセル化して、天然の親水性の更なる活性物質を、ナノ粒子材料でできた疎水性物質マトリックス内に取り込むことができる。同様に、親水性のナノキャリアが、一またはそれ以上の疎水性活性物質をカプセル化して、疎水性ナノ粒子材料が一またはそれ以上の疎水性活性物質を保持することができる。
【００９１】
最終的なアプリケーション及び／又は送達システムの特性に応じて、活性物質が疎水性であるか親水性であるかは、化学結合（上記に規定した通り、例えば極性結合、イオン結合、ファンデルバール結合、等）を介し、ポリアニオン巨大分子については「ヘルパー脂質」（ＤＯＴＡＰ等）を介して、一次ナノキャリア（疎水性又は親水性である）に結合している。この活性物質のナノキャリア又はナノ粒子に対する化学会合は、活性物質の漏れを防ぐとともに、カプセル化プロセスの有効性が維持又は固定される（この方法は、最終アプリケーション又は特定の送達システムによっては、有益である）。
【００９２】
複数のナノキャリア内又はナノキャリア及び／又はナノ粒子のポリママトリックス内にカプセル化する「活性物質」は、ビタミン、タンパク質、抗酸化剤、核酸、長い又は短いオリゴヌクレオチド（配座が異なる）、ｓｉＲＮＡ及びその化学誘導体、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、抗体、モノクロナール抗体、ワクチン及びその他の予防薬、医薬品、診断用薬、造影剤、栄養剤、小分子（分子量が約１０００Ｄａより小さい、あるいは約５００Ｄａより小さい）、電解質、免疫学的物質、及びこれらの組み合わせ、から選択される。
【００９３】
いくつかの実施例では、本発明のシステムにカプセル化する特定の物質が、エクセナチド、インスリンなどを含む。
【００９４】
その他の実施例では、この活性物質がｓｉＲＮＡである。
【００９５】
更なる実施例では、カプセル化するｓｉＲＮＡが、核酸配列番号１乃至１２のいずれかのｓｉＲＮＡから選択される。
【００９６】
所定の活性物質の疎水性／親水性を変更するには、当該物質に負電荷又は正電荷、又は親油性（疎水性）部分が付加されている。
【００９７】
いくつかの実施例では、この活性物質が負に荷電されており、ナノキャリアも負に荷電されている。このような実施例では、カチオン脂質が、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）、ステアリルアミド、及びオレイルアミドから選択される。
【００９８】
いくつかの実施例によれば、カチオン脂質がＤＯＴＡＰである。
【００９９】
いくつかの実施例によれば、活性物質が少なくともナノキャリア表面の領域に結合している場合、その結合（上記に定義した）は直接、あるいは、両面領域を活性物質に化学的又は物理的に結合している一またはそれ以上の結合基を介して結合している。この結合基は、単一原子であっても、原子群であってもよく、チオール、水酸化物、アミン、アルキル基、リン酸塩、カルボン酸塩、ＰＥＧｓ、などこの分野で知られているものから非限定的に選択することができる。
【０１００】
本発明は、複数（一またはそれ以上）のナノキャリアをカプセル化したナノ粒子を提供するものであり、この複数のナノキャリアの少なくとも一つが少なくとも一の活性物質を含み、この活性物質がｓｉＲＮＡである。
【０１０１】
いくつかの実施例では、ナノキャリアが更に、ポリカチオン脂質を含み、このポリカチオン脂質が１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）である。
【０１０２】
いくつかの実施例では、このナノキャリアの平均粒径が４００乃至９５０ｎｍである。
【０１０３】
いくつかのその他の実施例では、ナノ粒子材料が疎水性である。このような実施例では、ナノ粒子材料が、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ及びこれらの混合物から選択される。
【０１０４】
本発明のもう一つの態様では、本明細書に開示されているように、複数のナノ粒子を含む組成物が提供されている。いくつかの実施例では、この組成物が医薬組成物であり、さらに、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【０１０５】
本明細書に言う「薬学的に許容可能なキャリア」は例えば、ビークル、アジュバント、賦形剤、あるいは希釈剤など、この分野の当業者に良く知られているものであり、公に容易に入手可能である。薬学的に許容可能なキャリアは、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用状態において有害な副作用又は毒性がないものであることが好ましい。
【０１０６】
キャリアの選択は、部分的に、特定の活性化合物、並びに、その化合物の処理に用いた特定の方法による。したがって、本発明の医薬組成物には広範囲にわたる好適な剤形がある。以下の、経口、非経口、静脈内、筋肉内、又は腹腔内投与用の剤形は、単なる例示であり、限定するものではない。
【０１０７】
医薬組成物は、経口、経直腸、経膣、皮下、静脈内、筋肉内、肺、局所又は皮膚、点眼、経鼻腔を含む様々なルートによる投与用に適合させることができる。このような医薬組成物は、医薬の分野で良く知られた方法で作成することができる。本発明の医薬組成物を作成するに当たり、通常上述の成分を賦形剤と混合して、賦形剤によって希釈し、あるいは所望の形状コントロールできるようにキャリア内にカプセル化する。特定の投与モードに基づいて、医薬組成物をタブレット、ピル、カプセル、サシェ、顆粒、紛体、チューインガム、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、無水性又は含水性局所製剤及び溶液にすることができる。
【０１０８】
薬学的に許容可能なキャリア、例えば、ビークル、アジュバント、賦形剤又は希釈剤は、当業者には良く知られており、公に容易に入手可能である。薬学的に許容可能なキャリアは、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用状態において有害な副作用又は毒性がないものであることが好ましい。
【０１０９】
キャリアの選択は、部分的に、特定の活性化合物、並びに、その化合物の処理に用いた特定の方法による。したがって、本発明の医薬組成物には広範囲にわたる好適な剤形がある。
【０１１０】
いくつかの実施例では、医薬組成物が、治療薬剤を経口、非経口、静脈を介して対象の循環系（心臓血管系）に運搬する送達システムとして構成されている。
【０１１１】
経口投与に適した剤形は、（ａ）有効量のナノ粒子、あるいは水、生理食塩水又はジュース（例えば、オレンジジュース）などの希釈剤に溶かしたナノ粒子を含む組成物の溶液；（ｂ）所定量の活性成分を、固形又は顆粒で含む、カプセル、サシェ、タブレット、薬用キャンディ、トローチ；（ｃ）紛体；（ｄ）適当な液体中の浮遊物；及び（ｅ）適宜のエマルジョンからなる。液状剤形は、水や、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコールなどのアルコールなどの希釈剤を含んでいてもよい。希釈剤には、薬学的に許容可能な界面活性剤、懸濁化剤、又は乳化剤を加えても、加えなくてもよい。カプセル形状は、通常のハード又はソフトシェルゼラチン型であり、例えば、界面活性剤、潤滑剤ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、及びコーンスターチなどの、不活性充填剤を含む。タブレット形状は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギニン酸、微小結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアゴム、コロイド状二酸化シリコン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及びその他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤化剤、保存剤、芳香剤、及び薬学的に相溶性であるキャリアを含んでいてもよい。薬用キャンディの形状は、香味料中の活性成分、通常スクロースとアカシア、又はトラガカント、並びに、例えばゼラチンやグリセリンなどの不活性ベース中の活性製剤、又はスクロースとアカシア、エマルジョン、ジェルなどを含むトローチ、その他、活性製剤に加えて、この分野で知られているキャリアなどを含むものであってもよい。
【０１１２】
非経口剤形は、通常、溶液中に約０．５乃至約２５重量％の活性成分を含む。適当な保存剤と緩衝剤をこのような剤形に用いることができる。注入部位における刺激を最小にするあるいはなくすために、このような組成物は、親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）が約１２乃至約１７の一またはそれ以上の非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。このような剤形中の界面活性剤の量は、約５乃至１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤には、ソルビタンオレイン酸モノエステルなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルや、疎水性ベースを有する高分子量付加物の酸化エチレンがあり、プロピレングリコールを有する酸化プロピレンを凝縮させて作る。非経口剤形は、単回投与又は複数回投与の、アンプルやバイアルといった密封コンテナとすることができ、凍結乾燥状態で保存することができる。凍結状態は、使用の直前に、注入用に例えば、水などの無菌液体キャリアを加えるだけでよい。即時の注入溶液及び懸濁液は、上述した種類の、無菌パウダ、顆粒、及びタブレットから作ることができる。
【０１１３】
本発明の化合物は、注入可能な剤形に作ることができる。注入可能な組成物用の有効な医薬キャリアとして必要なものは、当業者には良く知られている。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｏｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ  ２３８−２５０（１９８２）及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ６２２−６３０（１９８６）。
【０１１４】
いくつかの実施例では、送達システムを、ターゲットを容易にした治療薬送達及び治療的有効量の活性物質の放出投与を制御するように適合させている。
【０１１５】
知られているように、ここで目的とする「有効量」とは、この分野で知られているこのような考察によって決定することができる。この量は、とりわけ、治療を行う疾病のタイプと重篤度、及び治療計画によって、所望の治療効果を得るために有効でなくてはならない。有効量は、通常、定義に設計された臨床トライアル（投与レンジの研究）において決定され、当業者にはこのトライアルをどのように適正に実行して有効量を決めるかが知られている。一般的に知られているように、有効量は、受容体に対するリガンドの親和性、身体内のその分布プロファイル、身体内の半減期など様々な薬理学的パラメータ、もしあれば、所望しない副作用、年齢、性別、その他といった要因を含む、様々な要因に依存している。
【０１１６】
本発明による活性物質を含むナノ粒子は、例えば「治療効果」といった少なくとも一の効果を誘発するのに用いることができ、あるいは、少なくとも一の効果又は副作用を、対象の好ましくない症状又は疾病を治療又は防止することによって、誘発、強化、停止、又は現象させる少なくとも一のその他の物質と協働させるようにしてもよい。この少なくとも一のその他の物質（物質、分子、要素、化合物、実態、又はこれらの組み合わせ）は、治療薬、すなわち、治療的に有効量を投与した時に治療効果を発揮する又は調整する薬剤、及び非治療薬、すなわち、それ自体では治療効果を発揮したり調整することはないが、選択された特徴を有するナノ粒子を授ける薬剤、から選択される。これについては以下にさらに説明する。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、ナノ粒子内に含まれる活性物質に依存して、病状あるいは症状を治療、防止又は診断するために選択される。用語「治療」あるいはこの言語上の変化形は、ここで使用されているように、疾病に関連する好ましくない症状を改善する、このような症状の兆候をそれが発現する前に予防する、疾病の進行を遅らせる、症状の悪化を遅らせる、寛解期の開始を早める、疾病の進行性慢性ステージで生じる回復不能な損傷を減らす、この信仰ステージの開始を遅らせる、疾病の重篤度を下げるあるいは治療する、回復率を改善する又はより速い回復を改善する、または疾病が生じないようにする、又はこれらの２又はそれ以上の組み合わせるための、本発明の治療量の組成物又はシステムの投与を意味する。
【０１１８】
もう一つの態様では、本発明は、ここに述べた本発明の組成物を含むキット又は商用パッケージと、使用指示書を提供する。いくつかの実施例では、本発明の組成物又はそれから取り出される断片を、別々のコンパートメント又はバイアルにあるキットに入れることができる。
【０１１９】
このキットは、更に、活性物質の溶解に役立つ、又は一般的には、組成物の調整用の、少なくとも一のキャリア、希釈剤、又は溶剤を含んでいてもよい。この組成物は、備え付けの指示書に従って、あるいは、エンドユーザ（消費者又は医療従事者）の経験及び／又は訓練に応じて、エンドユーザが調整するようにしてもよい。
【０１２０】
このキットは、各成分（アッセイ成分及び／又はキャリア）の重量、体積、あるいは濃度を測定するツールを具えていてもよい。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、ここに述べた本発明のナノ粒子を取得するプロセスを提供している。このプロセスは：
少なくとも一のナノキャリアを取得するステップであって、このナノキャリアが少なくとも一の活性物質を含む、ステップと；
少なくとも一のナノキャリアをナノ粒子内にカプセル化するステップと；
を具える。
【０１２２】
本発明のシステムに含有させる活性薬剤（物質）又は複数の活性薬剤（物質）の性質に応じて、本発明のプロセスは様々な形で実行することができる。通常、このプロセスは：
活性薬剤が疎水性か親水性かに基づいて疎水性又は親水性の特徴を有するポリマを選択するステップと；
このポリマと活性薬剤を液状媒体中に溶解させるステップと；
このポリマと活性薬剤を含む液状媒体を更なる液体（液状媒体が有機である場合、更なる液体は水性であり、逆も言える）で処理するステップと；
ナノキャリアを単離するステップと；
を具える。
【０１２３】
いくつかの実施例では、活性薬剤が疎水性であり、ナノキャリア材料が疎水性であり、ナノ粒子材料が親水性である場合、本発明のナノ粒子を調整するプロセスは：
選択的な水混和性有機溶剤中に疎水性ポリマを溶解させて、有機相を形成するステップであって、この有機溶剤が、いくつかの実施例では、エタノール、メタノール、クロロフォルム、ジクロロメタン（ＤＣＭ）ジエチルエーテル、アセトン及びアセトニトリル（ＡＣＮ）から選択される、ステップと；
この有機相を水性相に接触させるステップであって、水性相が選択的に界面活性剤を含む、これによってナノキャリアを取得するステップと；  
活性薬剤の溶液と共にナノキャリアをインキュベートして、活性薬剤をナノキャリアの表面の少なくとも一部に結合させるステップと；
を具える。
【０１２４】
いくつかの実施例では、有機水混和性溶剤が、エタノール、メタノール、クロロフォルム、ジクロメタン（ＤＣＭ）、ジエチルエーテル、アセトン及びアセトニトリル（ＡＣＮ）から選択される。
【０１２５】
ここで用いられているように、用語「接触」又はその言語的変形は、有機相と水性相を、これらの相間が密接に接触するようにすることを意味する。
【０１２６】
用語［溶液］は、最も広い意味で用いられており、一の成分が完全に別のあるいは液状媒体中に、別の又は媒体中の前駆体溶液の一又はそれ以上の成分の液状エマルジョン（ナノエマルジョン又は微小エマルジョン）中に、分散状態（ナノ分散又はミクロ分散）及び別の又は媒体中の前駆体溶液の一またはそれ以上の成分中に、溶けている液状状態に及ぶ。
【０１２７】
いくつかの実施例では、活性薬剤が親水性であり、ナノキャリア材料が親水性であり、ナノ粒子が疎水性である場合、このプロセスは：
活性薬剤の水性溶液中に親水性ポリマを溶かして、水性相を作るステップと；
続いて、ナノキャリアを形成できるｐＨで溶解剤を含む相を水性相に加えるステップであって、活性薬剤がナノキャリア内に分散している、ステップと；を具える。
【０１２８】
いくつかの実施例では、このプロセスが選択的に親水性ポリママトリックスを架橋するステップを具える。
【０１２９】
その他の実施例では、ｐＨが６から９の間である。いくつかの実施例では、ｐＨが７である。
【０１３０】
更なる実施例では、溶解剤がアセトン又はエタノール、及びアセトニトリルから選択される。
【０１３１】
本発明のプロセスで使用される有機相は、更に、本明細書で定義したように、正に荷電した脂質（カチオン性脂質）を含む。
【０１３２】
本発明のナノ粒子を調整するすべての方法において、複数のナノキャリアの周りにナノ粒子コーティングを行う最終ステップが、ナノキャリアを、ナノポリマ材料を含む溶液にナノスプレイすることによって行われる。その他の実施例によれば、このナノキャリアは、ナノスプレイドライヤで行われるカプセル化によって得られる。
【０１３３】
いくつかの実施例では、本発明のプロセスが更に、ナノ粒子の外側表面の少なくとも一部を、少なくとも一の標的部分で官能化するステップを具える。その他の実施例では、この少なくとも一部が、ナノ粒子の全表面である。
【０１３４】
いくつかの実施例では、少なくとも一の標的部位が、ＰＥＧ、固体腫瘍に過剰発現したＨＥＲ−２と結合するトラスツマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ登録商標）；Ｈフェリチンと結合するＡＭＢＬＫ８；ＥＧＦＲ受容体と結合するセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ登録商標）；ＣＤ２０と結合するリツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ登録商標）；新生血管を刺激する「血管内皮細胞増殖因子」（ＶＥＧＦ）と呼ばれる天然たんぱく質の機能を阻害するベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ登録商標）；ＶＥＧＦ−Ａにより強く結合するラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ登録商標）；葉酸又は葉酸塩などの小分子；ヒアルロン酸又はヒアルロナン；通常約６−１５ｋＤａの腫瘍貫通ペプチド；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフェリン；フェリチン；アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド；上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）；細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；血管作動性腸管ペプチド；ＣＡ１５−３抗原；ＭＵＣ１タンパク質；ＣＤ２０；ＣＤ３３；インテグリン；リンパ管標的部分（ＬｙＰ−１など）；ＰＳＭＡアプタマーや、ＶＥＧＦアプタマーなどのアプタマー；オリゴ糖、などから選択される。
【０１３５】
いくつかの実施例では、標的薬剤が、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ登録商標）、又は、ラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ登録商標）である。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
本発明を理解し、どのように実施するのかを理解するために、非限定的な例として、図面を参照して実施例を以下に説明する。
【図１】図１Ａ乃至１Ｂは、ナノスプレイドライヤの動作原理を示す図（図１Ｂ）と、このドライヤから得られるナノ粒子を示す図（図１Ａ）である。
【図２】図２Ａ乃至２Ｂは、１時間のインキュベーション後、洗浄したＰＬＧＡ  ＮＳｓの限外濾過液からの、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ用ゲルシフト法（ＰＡＧＥ８％）による完全性評価を示す図である。図２Ａ：剤形Ａ及びＢからの限外濾過液−レーン番号１−ラダー、レーン番号２−対照としての１００ｎｇＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ。レーン番号３、４は、Ａ１及びＡ２の１０μｌの限外濾過液を伴う。レーン番号５、６は、Ａ３及びＡ４の４μｌの限外濾過液を伴う。レーン番号７、８は、Ｂ１及びＢ２の１０μｌの限外濾過液を伴う。レーン番号９、１０は、Ｂ３及びＢ４の４μｌの限外濾過液を伴う。図２Ｂ：剤形Ｄ及びＣからの限外濾過液：レーン番号１−ラダー、レーン番号２−対照としての１００ｎｇＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを伴う。レーン番号３、４は、Ｃ１及びＣ２の１６μｌの限外濾過液を伴う。レーン番号５、６は、Ｃ３及びＣ４の１６μｌの限外濾過液を伴う。レーン番号７、８は、Ｄ１及びＤ２の１６μｌの限外濾過液を伴う。レーン番号９、１０は、Ｄ３及びＤ４の１６μｌの限外濾過液を伴う。全てのサンプルにおいて、番号１、２のストランドは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ５０μｇでインキュベートした剤形から複写する、番号３、４のストランドは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ１００μｇでインキュベートした剤形から複写する。
【図３】図３Ａ乃至３Ｂは、高度希釈した架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（平均サイズ５８±３０ｎｍ、ＺＰ−３８±９）のＳＥＭ特性を示す。
【図４】図４Ａ乃至４Ｂは、ｓｉＲＮＡをカプセル化した、０．０３ｍｇＤＯＴＡＰを伴う高度希釈した架橋ＨＳＡ  ＮＳｓのＳＥＭ特性を示す。（図４Ａ：Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを伴うＮＳｓ、図４Ｂ：ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを伴うＮＰｓ）
【図５】図５は、０．０３ｍｇＤＯＴＡＰとｐＨ８の２００μｇｓｉＲＮＡとでできた架橋ＨＳＡ  ＮＳｓから抽出したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、及び、同じ勾配で注入した処理を行っていないＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ対照のＨＰＬＣクロマトグラムである。太線は、２６０ｎｍにおける吸収度であり、細線は、２８０ｎｍにおける吸収度である。ｓｉＲＮＡでは（タンパク質やペプチドと異なり）、比率Ａ２６０／２８０が、１．８乃至２の範囲にある。約７．５におけるピークは、架橋ＨＳＡ  ＮＳｓから抽出したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの存在に起因している。
【図６】図６は、ＤＯＴＡＰ０．０３ｍｇと、ｐＨ８のｓｉＲＮＡ２００μｇでできた架橋ＨＳＡ  ＮＳｓから抽出したＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、及び、同じ勾配で注入した処理を行っていないＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ対照のＨＰＬＣクロマトグラムである。太線は、２６０ｎｍにおける吸収度であり、細線は、２８０ｎｍにおける吸収度である。ｓｉＲＮＡでは（タンパク質やペプチドと異なり）、比率Ａ２６０／２８０が、１．８乃至２の範囲にある。約２５．０におけるピークは、架橋ＨＳＡ  ＮＳｓから抽出したＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの存在に起因している。
【図７】図７Ａ乃至７Ｂは、ＰＬＧＡ  ＮＳｓをカプセル化したＤｅｘｔｒａｎ  ＮＣｓのＳＥＭマイクログラフである。ＤＤＷ（４０ｍｇ）中に０．４％（ｗ／ｖ）のＤｅｘｔｒａｎ４０のスプレィ乾燥法で作ったＮＣｓは、３０ｍｇのＰＬＧＡ  ＮＳｓからなる（〜１００ｎｍ、−３３ｍＶのＺＰ）。
【図８】図８Ａ乃至８Ｈは、一次ＰＬＧＡ  ＮＳｓをカプセル化したＨＳＡ  ＮＣｓのＳＥＭマイクログラフである。ＤＤＷ中の異なる％（ｗ／ｖ）でＨＳＡのスプレィ乾燥法で作ったＮＣｓは、ＰＬＧＡ  ＮＳｓからなる（〜１００ｎｍ）。図８Ａ乃至８Ｂは、負に荷電したＰＬＧＡのＮＳｓ（ＺＰ  −３３ｍＶ）３０ｍｇをカプセル化した、１．６％のＨＳＡ（２００ｍｇ）。図８Ｃ乃至８Ｄは、正に荷電したＰＬＧＡのＮＳｓ（ＺＰ  ＋６６ｍＶ）１５ｍｇをカプセル化した、０．７５％のＨＳＡ（５６ｍｇ）。図８Ｅ乃至８Ｆは、負に荷電したＰＬＧＡのＮＳｓ（ＺＰ  −３３ｍＶ）１４ｍｇをカプセル化した、０．５％のＨＳＡ（５６ｍｇ）。図８Ｇ乃至８Ｈは、負に荷電したＰＬＧＡのＮＳｓ（ＺＰ  −３３ｍＶ）７ｍｇをカプセル化した、０．２５％のＨＳＡ（２８ｍｇ）。
【図９】図９Ａ乃至９Ｂは、一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓをカプセル化したＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＣｓのＳＥＭマイクログラフである。アセトン中でのＰＥＧ−ＰＬＧＡ（１０．５ｍｇ）のスプレィ乾燥プロセスで作成したＮＣｓは、１．６ｍｇＨＳＡ  ＮＳｓ（〜１００ｎｍ、ＺＰ  −５１ｍＶ）からなる。スプレィプロセス中に、スプレィヘッド上にクラストが生じて、ＮＣｓを溶融させることが観察された。
【図１０】図１０Ａ乃至１０Ｂは、一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓをカプセル化したＰＬＧＡ  ＮＣｓのＳＥＭマイクログラフである。アセトン中でのＰＬＧＡ（９．８ｍｇ）のスプレィ乾燥プロセスで作成したＮＳｓは、１．６ｍｇＨＳＡ  ＮＣｓ（〜１００ｎｍ、ＺＰ  −５１ｍＶ）からなる。
【図１１】図１１Ａ乃至１１Ｂは、（Ａ）１．６ｍｇの一次架橋ＨＳＡ  ＮＰｓをカプセル化したＰＬＧＡ  ＮＣｓと、（Ｂ）１．６ｍｇの一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓをカプセル化したＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＣｓのＳＥＭマイクログラフ、及びＥＤＳ（エネルギー分散Ｘ線分光法）を用いた要素解析である。窒素は、ＨＳＡ  ＮＳｓからのみ生じうる。
【図１２】図１２は、一次架橋ＨＳＡ  ＮＰｓをカプセル化したポリマ性ＮＣｓのＳＥＭマイクログラフである。図１２Ａは、ＰＬＧＡ  ＮＣｓであり、図１２Ｂは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＣｓである。アセトニトリル中でのポリマ（１６ｍｇ）のスプレィ乾燥プロセスを行って作ったＮＣｓは、１０ｍｇの架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（〜１００ｎｍ、ＺＰ  −４３ｍＶ）からなる。
【図１３】図１３Ａ乃至１３Ｂは、サンプルＡＯ―５７のサイズ分布とＳＥＭマイクログラフであり、一次架橋したＨＳＡ  ＮＳｓをカプセル化したＰＬＧＡ（５０ｋＤａ）ＮＣｓである。図１３Ｃは、４日後に水に分散させたＮＣｓである。
【図１４】図１４Ａ乃至１４Ｂは、サンプルＡＯ―６６のサイズ分布とＳＥＭマイクログラフであり、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを入れた一次架橋したＨＳＡ  ＮＳｓをカプセル化したＰＬＧＡ（５０ｋＤａ）ＮＣｓである。４０ｍｌのアセトニトリル中でポリマ（４２ｍｇ）のスプレィ乾燥プロセスを行って作ったＮＣｓは、１２．６ｍｇの架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（〜１００ｎｍ、ＺＰ  −４３ｍＶ）からなる。
【図１５】図１５Ａ乃至１５Ｂは、サンプルＡＯ―６８のサイズ分布とＳＥＭマイクログラフであり、Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを入れた一次架橋したＨＳＡ  ＮＳｓをカプセル化したＰＬＧＡ（５０ｋＤａ）ＮＣｓである。６０ｍｌのアセトニトリル中でポリマ（６４ｍｇ）のスプレィ乾燥プロセスを行って作ったＮＣｓは、１５ｍｇの架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（〜１００ｎｍ、ＺＰ  −４３ｍＶ）からなる。
【図１６】図１６Ａ乃至１６Ｂは、様々な条件に露出させたのちの、フリーｓｉＲＮＡの完全性を評価するための、ゲルシフト法（ＰＡＧＥ８％）を示す。完全性の評価は、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（図１６Ａ）について、及びＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（図１６Ｂ）について、行った。レーン番号１−ラダー、レーン番号２、３は、それぞれ、１００ｎｇと５０ｎｇの未処理ｓｉＲＮＡでの対照である。レーン番号４、６、及び８は、それぞれ、ｐＨ７、８、及び９に露出させたｓｉＲＮＡである。レーン番号５、７及び９は、それぞれ、グルタルアルデヒド（０．０１４％（ｖ／ｖ）中でｐＨ７、８及び９に露出させたｓｉＲＮＡである。
【図１７】図１７Ａ乃至１７Ｂは、抽出したｓｉＲＮＡを評価するための、ゲルシフト法（ＰＡＧＥ８％）を示す。完全性の評価は、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（図１７Ａ）について、及びＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（図１７Ｂ）について、行った。レーン番号１−ラダー、レーン番号２は、１００ｎｇの未処理ｓｉＲＮＡでの対照である。レーン番号３乃至８は、第１の架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（様々なｐＨ条件で作成した）から抽出したｓｉＲＮＡである。レーン番号９及び１０は、第１の架橋ＨＳＡを入れたＮＣｓから抽出したｓｉＲＮＡである。
【図１８】図１８Ａは、Ｖｉｖａｓｐｉｎ技術を用いて調整及び洗浄した後のＢＳＡ  ＮＳｓのＳＥＭ画像である。ＮＳｓは、１滴を分散させて広げた後、スライド上で室温で乾燥させた。図１８Ｂは、Ｖｉｖａｓｐｉｎ技術を用いて調整及び洗浄した後のＢＳＡ  ＮＳｓのＳＥＭ画像である。このＮＳｓは、１滴を分散させて広げた後、スライド上で室温で乾燥させた。
【図１９】図１９Ａ乃至１９Ｂは、ＣＬＳＭを用いて、Ａ−４３１細胞中での、２％のＦＩＴＣでラベル化したＨＳＡ  ＮＰｓの取り込みを示す図である。３７℃でのインキュベーション後、４時間後（図１９Ａ）と２２時間後（図１９Ｂ）の取り込みである。ＮＰｓ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ（１．５ｍｌ／ウエル）である。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
本発明では、ｓｉＲＮＡなどの、大きな疎水性又は親水性薬剤の放出を防止し、制御するのに、二重ナノカプセル化が用いられている。防止の第１ラインは、ｓｉＲＮＡを一次ナノキャリア（〜１００ｎｍ）に装填することによって達成され、安定性である第２ラインは、一次ナノキャリアをサブミクロンナノ粒子、通常、その表面に固定したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を伴う粒子にカプセル化することによって得られる。これらのナノ粒子の形成（通常、ナノカプセル又はＮＣｓ）は、ナノスプレィ乾燥法［１６，２３，２４］を用いておこなわれる。
【０１３８】
ここでは、以下の２つのタイプのナノ粒子について説明する。
（ａ）ナノカプセルに装填したＰＬＧＡ（Ｐｏｌｙ  Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ＮＰｓは、親水性コーティングポリマを用いて作成した；
（ｂ）ナノカプセルに装填したＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）ＮＰｓは、疎水性コーティングポリマを用いて作成した。
【０１３９】
両方とも、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｌｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）を一次ＮＰｓに加えて、負に荷電させたｓｉＲＮＡを効率よく装填し、ＮＰｓ細胞を内在化させた後のｓｉＲＮＡのエンドソーム経路を容易にした。全ての成分はＦＤＡの認可を受けているので、このような送達システムは、親水性生体巨大分子（ｓｉＲＮＡなど）の全身送達用プラットフォームを提供し、薬剤の半減期、生体内分布、及び薬物動態を改善する。
【０１４０】
薬剤送達においては、ナノ粒子（ＮＰｓ）がマイクロ粒子より好まれる。これは、ナノ粒子の薬効を強化する能力によるばかりではなく、ナノ粒子が静脈内投与可能であるため、選択した薬剤の薬物動態を好ましく変更できるためである。更に、このようなナノサイズのシステムは、振とう特性及び特定の細胞タイプを標的にすることにおいて、マイクロ粒子より優れている［１２］。ＮＰｓの標的効率と長い循環時間は、薬剤送達への良好なアプリケーションにおける二つの最も重要な要因である［１３］。標的ＮＰｓは、（細胞標的部位における受容体に特異的なリガンドが付着する間）能動的であり、あるいは受動的である。受動的標的化では、小さいＮＰｓが、「血管透過性」（ＥＰＲ）効果として知られている現象によって固体腫瘍内に蓄積する傾向が利用されている［１４］。ＮＰｓの細胞取り込みは、ＮＰｓのサイズ、ジオメトリ、電荷、及び細胞タイプに依存して見られる。一般的に、１μｍより小さい粒子は、いくつかのエンドサイトーシス経路を通って細胞内に内在化されうる［１３］。更に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のＮＰｓ表面への付着によって、凝集を低下させ、プラズマタンパク質吸収（オプソニン化）、並びに細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みを導き、一方で血流時間を長くする立体障害が生じる［１５］。最終的に、水性相の廉価を防止し、長期保存を行う時のＮＰｓの安定性を確実なものにするためには、乾燥粉末製剤が必要である。通常、抗凍結賦形剤を伴う凍結乾燥（フリーズドライ）、又はスプレィ乾燥法は、このような目的に用いられる、より確立された二つの主な製法である。
【０１４１】
スプレィ乾燥は、液体又は懸濁液を、連続的な単一ステップのプロセスで乾燥粉末に代えるプロセスである。しかしながら、この技術は、＜２μｍの細かい粒子を効率よく形成し回収することができない［１６］。近年、新型の実験室スケールのスプレィ乾燥機が、Ｂｕｃｈｉによって開発され、少ないサンプル量（数ミリグラム又はミリリットル）では３００ｎｍ乃至５μｍの範囲のサイズで、高収率（＞７０％）で粒子の生成が可能となった。この技術によって、スプレィ乾燥によるＮＰｓの形成が可能となり、複数のナノキャリアであって、活性薬剤を含むナノキャリアを含むナノ粒子である図１Ａに示す一般的な構造のものができた。このナノスプレィ乾燥機（ＮＳＤ）は、図１Ｂに線図的に示されており、細かいドロップレットの生成に、振動メッシュ技術を使用している。一般的に言うと、圧電クリスタル駆動スプレィヘッドが、正確なミクロンサイズの孔アレイを有する薄い穿孔膜（スプレィメッシュ）を具える小スプレィキャップと共に組み込まれており、振動時に、３−１５μｍの範囲の数万個のドロップレットを作る（メッシュサイズによるが、通常は、メシアン径５−７μｍ）。更に、乱流で動作する従来のスプレィ乾燥機と違って、この新規技術は、層流で作動する。したがって、ゆっくり加熱することができ、このシステムを熱に弱い生物医薬品に適合させることができる。
【０１４２】
過去１０年間において小分子薬剤に加えて、ＮＰｓ／ＮＣをキャリアとして用いたｓｉＲＮＡなどの生物薬剤送達が、治療として考えられている。ＲＮＡ分子の短いシーケンス（１９−３０ｂｐ長の二本鎖）である、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）は、しっかり規定されたメカニズムにおいて、その相補ｍＲＮＡの分解を誘発して、特定の遺伝子の発現を抑えるのに使用することができる。ｓｉＲＮＡの発見以来、ｓｉＲＮＡに基づく薬剤を開発するいくつもの試みがなされた。しかしながら、その物理化学的特性のため、ｓｉＲＮＡの送達が主な障害であった。ｓｉＲＮＡは、大きな（〜１３ｋＤａ）、親水性の、負に荷電した分子であるため、細胞膜を貫通して、細胞質ゾルへのアクセスを得るには、トランスフェクションビークルが必要である。更に、細胞を貫通（通常エンドサイトーシスによって）した後は、「エンドソーム離脱」メカニズムが必要である。更に、自由ｓｉＲＮＡの全身送達は、血液中における非常に短い半減期と、早い腎クリアランスによって妨げられる。インビボでのｓｉＲＮＡの送達におけるこれらの不利益を克服するために、様々な化学修飾をｓｉＲＮＡ分子に導入して、その活性を保持し、これによって、ＲＮＡｓｅｓ開裂に対する抵抗を改良し、ヒト血清におけるその半減期を延ばすようにしている［１８］。更に、裸のあるいは化学的に修飾したｓｉＲＮＡｓを、非ウイルス性脂質（コレステロール、リポソーム）、タンパク質キャリア（融合性又は細胞透過性ペプチド）、カチオン性脂質と協働する、あるいは協働しない、シクロデキシトリン又は生体分解性ポリラクチド共ポリマナノ粒子に基づいて、様々な送達システムに組み込んだ。
【０１４３】
本発明のナノキャリアは、理論に縛られることなく、カプセル化した親水性生体巨大分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）に、保護、生体適合性、改良された安定性、所望の生体分布及び、薬物動態プロファイルを提供して、改良された治療特性を伴うユニークな送達システムを提供する。
【０１４４】
材料と方法
材料
ＰＬＧＡ：Ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  （５０：５０）（Ｒ５０４Ｈ）ＭＷ  ４８，０００Ｄａと、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ（ＲＧＰ５０１０５）ＭＷ  ５，０００＋４５，０００  Ｄａを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社から購入した。以下の材料を、以下の会社から購入した。Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０（ＭＷ４０，０００Ｄａ），Ｔｅｖａ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）；Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｙｌｕｒｏｎａｔｅ（ＨＡ），ＭＷ  ２０００，０００Ｄａ，Ｂｉｏｂｅｒｉｃａ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）；ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐｎａｅ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｓａｌｔ），ＭＷ  ６９８．５  Ｄａ，Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨ（Ｆｒｉｇｅｎｓｔｒａｓｓｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；点滴注射用のＣｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ）２０％  溶液（Ｚｅｎｌａｂ  ２０又はＢｉｏｔｅｓｔ）、Ｋａｍａｄａ（Ｂｅｉｔ−Ｋａｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）及びＨａｄａｓｓａｈ  ｈｏｓｐｉｔａｌから供給。ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した、ＨＳＡ，ＭＷ  ６６，５００Ｄａ，Ｍａｃｒｏｇｏｌ  １５  ヒドロキシステアリン酸（Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ＭＷ４，０００Ｄａ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、グルタアルデヒド８％水溶液、トリプシン（豚の膵臓から）、リボヌクレアーゼ及びデオキシヌクレアーゼフリー超純水、及びリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ，ｐＨ７．４）、をすべてＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。アセトン、エタノール、ジクロロメタン、クロロフォルム、及びアセトニトリルは、すべてＨＰＬＣグレードである。その他の化学物質及び溶剤は、分析試薬グレードであり、更に精製することなく使用した。ｓｉＲＮＡを用いたすべての実験について、超純水を使用し（Ｓｉｇｍａ社又はＢｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ社）、その他のすべてのブランクシステム（ｓｉＲＮＡを用いていない）については、試験を通じて再蒸留水（ＤＤＷ）を使用した。
【０１４５】
ｓｉＲＮＡ：
抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ）（２１ｂｐ、ＭＷ１３，４００Ｄａ）と、スクランブルｓｉＲＮＡ（２１ｂｐ，ＭＷ  １３，８２１Ｄａ）を、対照用に、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）社から購入した。
ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ：
2014527980.tif 000003
スクランブルｓｉＲＮＡ：
2014527980.tif 000004
【０１４６】
上述の配列中、化学修飾は、多少のＬＮＡ修飾からなる。小文字＝ＤＮＡベース。
【０１４７】
抗緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）（２１ｂｐ、ＭＷ  １４，３５２Ｄａ）と、コレステロール修飾ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）（２１ｂｐ、ＭＷ  １５，０７９Ｄａ）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ，ＧｍｂＨ）によって提供され、ほとんどの実験で使用した（特に、薬剤装填の見積もりに用いた）。
2014527980.tif 000005
【０１４８】
上述の配列中、化学修飾は：小文字＝２’Ｏ−メチル化ヌクレオシド、ｄＴ＝デソキシ−チアミン、ｓｄＴ＝デソキシ−チアミン  ホスホロチオエート、下線＝オーバーハング、である。
ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを用いて「インハウス」で合成した抗−ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ：
2014527980.tif 000006
及び
2014527980.tif 000007
【０１４９】
上述の配列中、化学修飾は：下線＝２’Ｏ−メチル化ヌクレオシド、小文字＝ＤＮＡベース、５位に（Ｃｈｏｌ）−リンカ又はＮＩＲ染料分子の追加＊もなされる。
【０１５０】
方法及び実験方法
ＰＬＧＡ  ＮＳｓの作成
ナノスフェアの作成は、「ポリマ界面蒸着」法に基づいて行った［１９］。簡単に言うと、ポリマＰＬＧＡ  ４８ｋＤａを水混和性有機溶媒（アセトン）に溶かした。次いで、迅速に、かつ撹拌しながら（〜９００ＲＰＭ）この有機層を、通常界面活性剤（Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５）を含む水性相に加えた。水性相へのアセトンの迅速な離脱が生じるので、疎水性ポリマが、球形の負に荷電したナノメートル球形粒子（５０〜２００ｎｍ）を自然に形成する。
【０１５１】
正に荷電したＰＬＧＡ  ＮＳｓを形成するには、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｓａｌｔ）を、パーセンテージが異なるアセトン相に加えた。この製剤を蒸発させて（３７℃）、アセトンの痕跡をすべて除去し、更に、５ｍｌの水性相の最終容量に濃縮し、１０分間、４，０００ＲＰＭで遠心分離し（沈殿物を取り除き、乾燥させた。１％（ｗ／ｗ）を超えるものはみられなかった）、Ｔｗｅｅｎのパーセンテージを下げるために、ＶｉｖａＳｐｉｎ−６（３００ｋＤａ，Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＤＤＷで洗浄した（×１０）。洗浄した剤形中の各成分の最終パーセンテージは：１．５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡと、０％、０．０４％、０．２％、又は０．４％（ｗ／ｖ）ＤＯＴＡＰ（それぞれ、製剤Ａ、Ｂ、Ｄ及びＣ）、であった。
【０１５２】
一次ＮＳｓのサイズ、サイズ分布、及びゼータ電位測定
一次ＮＳｓ（ＰＬＧＡから、又は架橋ＨＳＡから作った）の物理化学的特徴を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて、動的光散乱で測定した。測定前に、全てのサンプルをＨＰＬＣグレードの水（ｐＨ＝５．５）で１：１００に希釈した。ｓｉＲＮＡを装填したＮＳｓの特性を示す場合、ＮａＣｌ  ０．０１％を含むＲＮａｓｅを含まない水を用いた（ｐＨ＝５．５）。
【０１５３】
ＰＬＧＡ  ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡの装填効率
ｓｉＲＮＡをインキュベートするために、上述した方法と同じように製剤を作成した。ただし、水性相として水（ＨＰＬＣグレード）を用いる代わりに、形成及び洗浄ステップに、ＲＮａｓｅを含まない水（ＲＮＦＷ）を使用した。簡単に述べると、洗浄した０．１ｍｌのＰＬＧＡ  ＮＳｓを各製剤（１．５ｍｇのＰＬＧＡ成分）から取り出して、様々な量のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（５０μｇ、１００μｇ）で、１時間、室温でゆっくり振動させながら、インキュベートした。インキュベーション後、各製剤をＲＮＦＷ（３００ｋＤａ，Ｎａｎｏｓｅｐ遠心分離セントリコン、Ｐａｌｌを用いて）で洗浄（×１０）し、総限外濾過液を回収し、凍結乾燥させて、５００μｌのＲＮＦＷで再構築した。これから、１５０μｌをＨＰＬＣに注入した。限外濾過液中のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ成分を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で作ったキャリブレーション曲線に基づいて計算した。
【０１５４】
高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
使用した様々なｓｉＲＮＡについてのキャリブレーション曲線を、Ｃｌａｒｉｔｙ
３μｍＯｌｉｇｏ−ＲＰカラム５０×４．６ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）を具えるＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０１０Ｃ）を用いて作成した。ｓｉＲＮＡは、注入前に、ＲＮＦＷ又はＲＮＦ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０Ｍｍ  Ｔｒｉｓ）に溶解させた。移動相：Ａ―ＲＮａｓｅを含まない緩衝液（１００ｍＭ  ＴＥＡＡ）、Ｂ−アセトニトリル。長勾配（コレステロール修飾ｓｉＲＮＡ用）：  ４０分以内で、Ｂ／Ａ（１０：９０）対（９０：１０）、次の１０分で、Ｂ／Ａ（１０：９０）。短勾配（無コレステロール修飾ｓｉＲＮＡ）：１５分以内に、Ｂ／Ａ（１０：９０）が（４０：６０）へ、更に１０分でＢ／Ａ（１０：９０）に。流速：１ｍｌ／分、ＵＶ−検出：２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ。
【０１５５】
ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を用いた電気泳動
ｓｉＲＮＡの完全性（安定性）評価のために、８％の（１９：１）の天然ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を使用した。ランニングバッファとしてＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＥ（ＴＢＥ）中で、電気泳動を２００Ｖで５０分間行った。ｓｉＲＮＡの染色には、０．０１％のＥｔＢｒを用いた。ゲルは、撤照器（ＵＶトランスイルミネーター）の下で可視化した。
【０１５６】
ＰＬＧＡ  ＮＳｓ上でのＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの装填効率の評価プロトコル
ＰＬＧＡ  ＮＳｓを、透明溶液が形成されるまで、クロロホルムに溶かし、当量のＲＮＦＷを加えた。サンプルをボルテックスして、遠心分離にかけた（５分間、４，０００ＲＰＭ）。上側水性相（フリーｓｉＲＮＡを伴う）を回収した。この手順を２回繰り返す。次いで、回収した水性相を凍結乾燥させた。ＲＮＦバッファ中に凍結乾燥させたサンプルを再構築した後、ｓｉＲＮＡ成分の測定をＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。ＤＯＴＡＰとｓｉＲＮＡを伴うＮＳｓが、「イオン対」を形成した後、軽く浸透させて３７℃で１時間のインキュベーションの後、水性相に加えたヘパリン（高い負に荷電した分子）を調べて、すべてのｓｉＲＮＡがそのフリーフォームに放出されていることを確認した。
【０１５７】
一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓの作成
使用に先立って、市販のＨＳＡを、Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ  ｒｏａｄ，Ｌｏｎｄｏｎ）から入手したセルロース膜（ＭＷＣＯ１４，０００）を用いてＤＤＷ中で２４時間脱塩して、塩と、微量の保存料をすべて除去した。ナノメータＨＳＡ  ＮＰｓを作成するために、良く知られているｐＨ液滴形成法（脱溶媒和技術ともいう）を適用した。簡単に言うと、特定のｐＨに調整したＨＳＡ溶液を、脱溶媒和剤を、室温での一定の急速撹拌（〜９６０ＲＰＭ又は４０Ｈｚ）を行い、連続（〜１ｍｌ／分）追加することで、ナノスフェアに変換した。十分な濁度が現れるまで続け（通常、脱溶媒和剤の４０乃至８０％（ｖ／ｖ））、次いでグルタルアルデヒドを用いて、室温で少なくとも２時間、粉砕振とうしながら、脱溶媒和剤を追加した。架橋後、脱溶媒和剤を蒸発させ（３７℃）、１０分間、４，０００ＲＰＭで遠心分離した（沈殿物を除去し、乾燥させて、重量測定法で測定した）。ＮＳｓを、ビバスピン３００ｋＤａ（Ｖｉｖａ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、３つの異なる遠心分離サイクル（４，０００ＲＰＭ、４℃）で、ＤＤＷで洗浄（×１０）した。幾つかのケースで、アセトン相がＤＯＴＡＰを含んでいた。
【０１５８】
架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ上でのｓｉＲＮＡ装填効率
架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ内へｓｉＲＮＡをカプセル化するために、脱溶媒和相を加える前に、ｓｉＲＮＡをＨＳＡに加えたＤＤＷを使用する代わりにＲＮＡｓｅフリー水（ＲＮＦＷ）を使用した場合は、残りの手順を、上述したものと同様に正しく行った。架橋後、ＮＳｓを洗浄して、限外濾過液をすべて回収し、凍結乾燥させて、５００μｌのＲＮＦＷで再構築した。これから、１６０μｌをＨＰＬＣに注入した。限外濾過液中にフリーｓｉＲＮＡの部分的分解が観察されたので、ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡ成分を測定する好ましい方法は、限外濾過液中の粒子のｓｉＲＮＡの成分を直接測定する（蒸解後）ことであり、限外濾過液中のフリーｓｉＲＮＡ（未カプセル化）に基づくものではない。
【０１５９】
架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡ成分の測定用プロトコル
１００μｌの懸濁液（洗浄後）当たりのＨＳＡの総重量を、重量測定法で計測した。次いで、ｓｉＲＮＡをカプセル化し１−２ｍｇの洗浄ＨＳＡ  ＮＰｓを、１ｍｌのＲＮａｓｅフリーＰＢＳ緩衝液（０．５ＭのＮａＯＨ溶液で、Ｐｈ＝７．５に調整した）に希釈して、２０乃至１５０μＧのトリプシンで６０、９０、又は１８０分間、暗所で、３７℃で緩やかに浸透させて、透明溶液ができるまで分解させた。サンプルがＤＯＴＡＰを含む場合、トリプシンを追加した０又は６０分後に、ヘパリン（９０μｇ）を加えた。トリプシンが存在する場合としない場合の、フリーｓｉＲＮＡの量を、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定した。
【０１６０】
トリプシンと、分解したＨＳＡの断片は、（フェノール／クロロフォルム）（１：１）混合物を用いて、沈殿させて除去できる。
【０１６１】
ナノスプレィドライヤを用いたＰＬＧＡ  ＮＳｓのＮＣｓへのカプセル化−水性モード
ＮＣｓを、ナノスプレィドライヤＢ−９０（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でのスプレィ乾燥によって作成し、「開ループ」モードで作動させたところ、空気がシステム内に流れ込んだ。全ての実験で、ガス流速は、約１２０ｌ／ｍｉｎであった。全ての実験で１００％のスプレィと４μｍメッシュサイズの膜を使用した。
【０１６２】
ナノスプレィドライヤを用いたＨＳＡ  ＮＳｓのＮＣｓへのカプセル化−有機モード
ＮＣｓを、ナノスプレィドライヤＢ９０でのスプレィ乾燥によって作成し、「閉ループ」モードで作動させたところ、空気の代わりにＮ２（ｇ）とＣＯ２（ｇ）がシステム内に流れ込んだ。全ての実験で、ガス流速は、約１２０ｌ／ｍｉｎであった。揮発性蒸気と湿気を含んだ空気が、Ｄｅｈｕｍｉｄｉｆｉｅｒユニットに送られ、乾燥及び濃縮され、循環路においてシステムに戻って乾燥した。４μｍメッシュサイズの膜を用いて、スプレイ乾燥を低温（Ｔｉｎ＝３０−６０℃）で行った。
【０１６３】
ｓｉＲＮＡの融点測定
サンプル温度を１℃／分のレートで２０℃から８５℃に上昇させて、ＵＶ可視分光光度計（Ｃａｒｙ  ３００）を用いて、使用した様々なｓｉＲＮＡｓ（２１−ｍｅｒ）の融点測定を２６０ｎｍで行った。全てのｓｉＲＮＡを緩衝液（４８ｍＭ  Ｔｒｉｓ，９６ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．１）中で分解させて、４−１０ｎｇ／μｌの濃度を得た。
【０１６４】
示差走査熱量計（ＤＳＣ）による熱分析
ポリマ（ＰＬＧＡ４８ｋＤａと、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ５０ｋＤａ）についてＤＳＣの測定を行った。これは、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  １  Ｓｔａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（標準のキャリブレート）を用いて、窒素雰囲気下で。１０℃／分の加熱速度で、−２０乃至２２０℃の温度範囲で行った。
【０１６５】
ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）とＥＤＳ（エネルギィ分散Ｘ線分光学）
スプレィ乾燥させたＮＣｓ（及びカプセル化ＮＳｓ）のジオメトリ、サイズ、および表面モルホロジーを、高安定性ショットキィ電界放出源を持つ高分解能走査型電子顕微鏡（ＨＲ−ＳＥＭ）（Ｓｉｒｉｏｎ，ｍｏｄｅｌ：Ｑｕａｎｔａ  ２００  ＦＥＩ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、５ｋＶで観察した。撮像前に、カーボン付着性タブの上にサンプルを分散させ、金とパラジウムの合金を９０−１２０秒被覆した。水中に分散している一次ＮＳｓの場合は、サンプルが良く希釈され、ガラス上に飛び散り、一晩おいて蒸発させる。Ｘ−ＭＡＸ２０  ＳＤＤ  Ｉｎｃａ４５０ＥＤＳ  ＬＮ２フリー検出器（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）が付いているＥＤＳ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ  Ｘ−ｒａｙ  Ｓｐｅｃｔｏｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて検体の元素分析を行った。分析は、５ｋＶの低電圧を用い、１２９ｅＶのスペクトル分解能で行った。
【０１６６】
スプレィ乾燥ＮＣｓのサイズ分布の評価方法
標準Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳは、４μｍより小さい粒子の測定、並びに比較的一様な分散に制限されるため、スプレィ乾燥したＮＣｓ用の十分な粒子サイズ分布は、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００Ｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕ．Ｋ）を用いたレーザ解析法によってのみ作ることができる。１２０ｍｌの分散剤で、これを分散するには、各測定について約４ｍｇのサンプルが必要であった。
【０１６７】
スパン値は：
スパン＝（ｄ９０−ｄ１０）／ｄ５０
で計算する。ここで、ｄ５０は体積メジアン径；ｄ９０は、体積の９０％がｄ９０よりサイズが小さい；ｄ１０は、体積の１０％がｄ１０よりサイズが小さい。
低いスパン値は、サイズ分布が狭いことを表している。
【０１６８】
スプレィ乾燥カプセル化効率の測定プロトコル
サイズが異なるＮＣｓ母集団の分離に、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いた。次いで、大きなＰＬＧＡ  ＮＣｓの特定母集団にカプセル化されたＨＳＡ  ＮＳｓの成分を測定するために、クロロフォルム中のＰＬＧＡ  ＮＣｓの第１の脱溶媒和を行った。次いで、遠心分離（１０，０００ＲＰＭ、１５分）時に、一次ＨＳＡ  ＮＰｓを、沈殿物として分離して、単離し、その成分を、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキットで、あるいは、窒素成分（単純な微量分析で検出）によって、確認した。一次ＰＬＧＡ  ＮＰｓをカプセル化したＨＳＡ  ＮＣｓについては、既知の重量のＮＣｓを、トリプシン（ＰＢＳ緩衝液、３７℃でｐＨ７．５）でインキュベーション時に分解し、ついで、ＨＳＡ成分を、ＢＣＡを用いて定量化し、減算してＰＬＧＡ量を推定した。一次ＮＳｓをカプセル化したＮＣｓにｓｉＲＮＡを装填するときに、単離したｓｉＲＮＡの全容量を決定する（ＮＣｓの分解とＮＳｓの蒸解後）。
【０１６９】
ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡのインビトロでの放出動態プロファイルの決定
一次ＮＳｓと二次ＮＣｓから放出されたＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡの動態プロファイルを、Ｈａｇｉｇｉｔ  ｅｔ  ａｌ．に詳細が記載されている方法［２１］と同じ方法で、インビトロで測定する。
【０１７０】
細胞培養
Ａ−４３１ヒト扁平上皮癌細胞とその他の結腸直腸癌を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００００Ｕ／ｍｌペニシリンと、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、維持する。培地は２日おきに取り替える。細胞は、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃、６％ＣＯ２で成長する。合流型フラスコは、０．２５ｍｌのトリプシン溶液（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ａｆｕｌａ，Ｉｓｒａｅｌ）で培地をトリプシン化した後、１：１０の割合で分かれる。全ての実験は、ＩＳＯ７の条件（１００００粒子／ｍ３）に従ったクリーンルーム内で行った。
【０１７１】
細胞培養媒体中でのＮＰｓ安定性
Ａ−４３１細胞培養媒体中で異なる時間インキュベーションを行った後、［２２］で説明した方法と同様にして、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを用いたサイズの測定を、ＮＳｓについて行った。
【０１７２】
ＮＣｓ安定性評価
Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  Ｘを用いたサイズの測定と、ＳＥＭを用いた携帯分析評価を、異なる条件（４℃及び３７℃）で４、８、及び１２週保存した後、最終ＮＣｓについて行った。
【０１７３】
Ａ−４３１細胞中のＮＰｓの細胞毒性
細胞増殖を、各ウエルに付き、５、１、０．１及び０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮＰｓ濃度で、［２１］に記載した方法と同様にして、１４４時間にわたって試験をした。
【０１７４】
Ａ−４３１細胞中のＦＩＴＣ−標識化ＨＳＡ  ＮＳｓの取り込み
４ｍｌの２％ＨＳＡ溶液に、１．９ｍｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加えて、２％のＦＩＴＣ−標識化ＨＳＡ  ＮＳｓを作成した。上述した方法と同じ方法で、暗条件下で粒子を作成した。次いで、セルロースアセテートスルホン酸フィルタ（０．２μｍ、Ｗｈｉｔｍａｎ）を通して、洗浄したＮＳｓをろ過した。次いで、ＦＩＴＣ−標識化ＨＳＡ  ＮＰｓのアリコート（６１．２μｌと１２２．４５μｌ）を、ＤＭＥＭ緩衝液で希釈して総容量１．５ｍｌとし、それぞれ、ウエル当たり、１ｍｇ／ｍｌと２ｍｇ／ｍｌの濃度にした。細胞の標識化には、１５０，０００Ａ−４３１細胞をカバースライド上において、一晩放置して接着させた。次の日に、接着した細胞を、ＦＩＴＣ−標識化ＨＳＡ  ＮＳｓのありコートで、４時間又は２２時間インキュベートした後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、細胞を４％のパラフォルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。陰性対照実験では、ＦＩＴＣ−標識化ＨＳＡ  ＮＳｓインキュベーションステップを行わずに、その他のステップは同様に行った。Ｆｌｕｏ  Ｖｉｅｗ  ＦＶ３００共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で細胞を検査した。
【０１７５】
細胞内ＮＩＲモデルを用いた。Ａ−４３１細胞における抗ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ抑制効果の評価
抗ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ抑制効果は、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ．Ａｌ［２３］で開発され説明されている新規方法に基づいて行った。ＥＧＦＲ−ｍＲＮＡのノックダウン効果が、関連するプライ間を用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ鎖反応）によって確認され、ＥＧＦＲタンパク質レベルが、ウエスタンブロット法で定量化した。
【０１７６】
マウスにおける異種移植腫瘍
Ａ−４３１腫瘍細胞を培養する。ほぼ飽和状態（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にした細胞（７０％〜８０％）を、０．２５％のトリプシンで簡単に処理し、Ｈａｎｋのバランスの食塩水再懸濁させて稙菌させたのち、集菌する。腫瘍細胞の懸濁液（３−５×１０６細胞）０．２ｍｌの容量のＳＣに注入して、各マウス右わき腹に注射する。８乃至１０匹のマウスを各治療群にランダムに振り分け、最大４週間治療を行う。適宜の投与量の二重ナノビークルを頸静脈に注入した。腫瘍の地用は、手動キャリパを用いて定期的に（少なくとも１週間の一度）行われ、腫瘍の大きさは周期的にマニュアルキャリパで作成することができる；０．５２×長さ×幅２の式を用いて計算することができる。研究の後半で、腫瘍を切除して重量を測り、他の研究を行う。これと共に腫瘍をＮＩＲ標識化ＥＧＦプローブと共に、非侵襲的に生体画像化した。
【０１７７】
結果
有機相におけるＰＬＧＡ  ＮＳｓの作成
第１タイプの一次ＮＳｓを、カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ）を加えて、あるいは加えることなく、ＰＬＧＡ  ４８ｋＤａ（Ｐｏｌｙ  Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、５０：５０）から作成し、負に又は正に荷電したＮＳｓを得た。このＮＳｓは、「ポリマ界面沈着」法の良く確立された技術を用いて作成した。４つの異なるブランク配合を選択して、界面相互作用（静電作用及び疎水作用）を介して試験ｓｉＲＮＡ装填効率を試験した。４つの配合（表１参照）は、ＤＯＴＡＰ成分が異なっている（配合Ａ、Ｂ、Ｄ及びＣは、０％、０．０４％、０．２％、及び０．４％（ｗ／ｖ）のＤＯＴＡＰをそれぞれ含む）。
【０１７８】
物理化学的特性化
ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（５０及び１００μｇ）でのインキュベーション（室温で１時間）を行う前と後に、ＰＬＧＡ  ＮＳｓについて物理化学的特性化を行った。結果を表１に示す。
【０１７９】
これらの結果に基づいて、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ吸収を明確に観察し、ＮＳｓの物理化学的性質（ＺＰ、ＰＤＩ及びサイズ）の変化を引き出した。負に荷電したＮＰｓ（配合Ａ）のＺＰは負に維持され、配合Ｂは、５０μｇのＧＦＰ−ｓｉＲＮＡでも若干性から負に変化した。明らかな正荷電（配合Ｄ及びＣ−４０ｍＶ以上のＺＰ）をもつＮＳｓについては、特に配合Ｄについて、ＺＰに低下がみられた。
【０１８０】
2014527980.tif 000008
表１：ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡインキュベーション（室温で１時間）の前後におけるＰＬＧＡ  ＮＳｓの物理化学的特性化
【０１８１】
ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡインキュベーション前後の、正又は負に荷電した一次ＰＬＧＡ  ＮＳｓの、サイズ分布の多分散性（ＰＤＩ）、平均流体力学直径、及びζ電位（ＺＰ）、Ｎ＝３
【０１８２】
一次ＰＬＧＡ  ＮＳｓへのｓｉＲＮＡの効率のよい装填
様々なＰＬＧＡ  ＮＳｓでのインキュベーション語のｓｉＲＮＡの装填効率を決めるために、ＮＳｓを洗浄して、回収した限外濾過液中の非結合ｓｉＲＮＡ成分を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって定量化した（表２）。ＮＳｓに結合したｓｉＲＮＡのパーセンテージを、総ｓｉＲＮＡと、限外濾過液中のフリーｓｉＲＮＡの差から計算した。
【０１８３】
表２によれば、０．２％（ｗ／ｖ）のＤＯＴＡＰを含む配合と上述の配合（配合Ｃ及びＤ）では、完全なｓｉＲＮＡ吸収が生じる。これらの結果は、ＰＬＧＡ  ＮＳｓ表面に〜５０の正ζ電位が、ＮＳｓ１．５ｍｇ当たり１００ｎｇのｓｉＲＮＡという強く効率のよい吸収を誘発することを示している。若干正に荷電しているＮＳｓ（配合Ｂ）では不十分な装填が生じ、負に荷電しているＮＳｓ（配合Ａ）では中間の値が生じる。これらの結果は、ゲルシフト法によってさらに認証され、配合Ｃ及びＤの限外濾過液中にフリーｓｉＲＮＡが見つからないことを示している（逆に、配合Ａ及びＢの限外濾過液中にはフリーｓｉＲＮＡがみられる）。
【０１８４】
2014527980.tif 000009
表２：１．５ｍｇのＰＬＧＡ  ＮＳｓ上のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの装填効率（校正曲線＊に基づいて、ＲＰ−ＨＰＬＣによる検出に必要なｓｉＲＮＡの最小量は、３６０ｎｇ（５０μｇの０．７％）であり、したがって、結合するｓｉＲＮＡの存在は、９９．３％の精度でのみ決定できる。ＮＤ−検出されず）。
【０１８５】
配合Ｂが装填能力が低いことの観察は、低い安定性と劣化傾向（通常、ＺＰの値が２０ｍＶより小さい粒子について）によって説明できる。フリーｓｉＲＮＡの断片化がないことが、ＨＰＬＣクロマトグラム、又は、ゲルシフト法（ＰＡＧＥ８％）による評価時に見られる。図２参照。
【０１８６】
水性相におけるＨＳＡ  ＮＳｓの作成
架橋ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）から作成した一次ＮＳｓ〜１００ｎｍを検査した。ｐＨ−液滴形成法をこの目的に適用した。様々なパラメータ（使用した脱溶媒和剤（エタノール又はアセトン）のｐＨ、タイプ及び量、溶液中のＨＳＡパーセンテージ、及び撹拌速度）を制御することによって、形成したＮＳｓのサイズを達成した。最良の結果は、アセトンを脱溶媒和剤に用い、２％のＨＳＡ溶液で得られた。選択された結果を表３に示す。これは、最も小さい粒子が、ｐＨ７と９で、アセトンを用いて得られたことを示す。
【０１８７】
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表３：ＨＳＡ  ＮＰｓについての物理化学的特性化（大きな沈殿物がみられた（６４％（ｗ／ｗ）。その他のサンプルでは、沈殿物は無視できる程度であった。
【０１８８】
物理化学的特性化
架橋ＨＳＡ  ＮＳｓの物理化学的特性化は、小さい、球形の負に荷電したＮＳｓが形成され、そのサイズ分布（４０から３００ｎｍ）と多分散性は、脱溶媒和剤のｐＨとタイプに影響されることを示している（表３及び図３Ａ−３Ｂ）。試験を行ったすべてのｐＨで、アセトンが、エタノールに比べてより高いＰＤＩ値でより小さいＮＳｓを作成した。
【０１８９】
サイズ分布の多分散性（ＰＤＩ）は、脱溶媒和剤としてアセトン又はエタノールを用いた異なるｐＨで、〜９６０ＲＰＭで撹拌した４ｍｌ（２％ＨＳＡ  溶液）から作成した、一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓの流体力学直径とζ電位（ＺＰ）、Ｎ＝３を意味する。
【０１９０】
ＨＳＡの等電点は約５．０である。水性溶液のｐＨがよりベーシックであるので、ＨＳＡ分子を反発する表面上により負に荷電したカルボン酸基を得ることができる。この考えにもＴづいて、より小さい分子（〜１００ｎｍ）がｐＨ９で形成される。しかしながら、上述のプロセスを利用することによって、所望のサイズのＨＳＡ  ＮＳｓは、エタノールに代えてアセトンを用いることで、ｐＨ７ですでに得られている（表３）。
【０１９１】
一次ＨＳＡ  ＮＳｓにおけるｓｉＲＮＡの効率的な装填
架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ内のｓｉＲＮＡを効率よくカプセル化するために、縮小プロセスを行って、パラメータの更なる調整を必要とする。４ｍｌに代えて０．６ｍｌの２％ＨＳＡ溶液で作業した。更に、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（エンドサイトーシス剤）を更に加えて、ｓｉＲＮＡのカプセル化効率を高めた。表４に示すブランクシステム（ｓｉＲＮＡなし）は、いくつかのケースでは、ＮＳｓの形成に伴って大量の沈殿物が見られたことを示した。最良の結果は、ｐＨ８と９で得られ（サンプル５、９及び１０）、沈殿物のパーセンテージが最小の小さなＮＳｓが形成された。
【０１９２】
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表４：一次ＨＳＡ  ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡ装填
【０１９３】
これらの発見に基づいて、２００μｇのｓｉＲＮＡのカプセル化を、基本ｐＨでも行った（表５）。
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表５：一次ＨＳＡ  ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡ装填、２００μｇ  ｓｉＲＮＡ
【０１９４】
大量の脱溶媒和剤（７０−８０％（ｖ／ｖ）を加えて、ＨＳＡ  ＮＳｓの形成を促進するのみならず、十分なｓｉＲＮＡのカプセル化も誘発した。高カプセル化を行うもう一つの戦略は、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（５’−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ，すなわち、Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）の脂溶性誘導体を含めることであって。表５に詳細を示す結果は、ｐＨ８と７において、ＤＯＴＡＰを含むサンプルを用いて、ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ又はＣｈｏｌ−ＧＦＰ）を追加が、沈殿物の発現を劇的に低減させることを示している（１．５ｍｌのアセトンを加えた特に、ブランクサンプルに見られる−表４）。ｐＨ９では、同じ現象は、Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを用いた時にのみ見られた。
【０１９５】
サイズ分布の多分散性（ＰＤＩ）、平均流体力学直径とゼータ電位（ＺＰ）、Ｎ＝３、及び、一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓの形成時に生じた沈殿物の重量パーセンテージは、異なるアセトン量で、異なるｐＨで０．６ｍｌ（２％ＨＳＡ溶液）から作成した。（＋／−）は、０．０３ｍｇのＤＯＴＡＰを伴う、あるいはＤＯＴＡＰを伴わない（０．０１５ｍｇＤＯＴＡＰを伴うａ−アセトン相）を意味する。
【０１９６】
一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓの物理化学的特性は、２００μｇのＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ又はＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡのカプセル化の際にアセトン用いて行った。（＋／−）は、０．０３ｍｇのＤＯＴＡＰを伴う、あるいはＤＯＴＡＰを伴わないアセトン相を意味する。ＤＯＴＡＰ：ｓｉＲＮＡのモル比は３：１である。
【０１９７】
新規の架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（ＤＯＴＡＰ及びｓｉＲＮＡを装填）に対するＳＥＭ特性化を行った（図４Ａ−４Ｂ）。ＤＯＴＡＰの追加、並びにｓｉＲＮＡのカプセル化（ＧＦＰ又はＣｈｏｌ−ＧＦＰ）はブランクシステム（図３）で観察された形成したＮＰｓの球形を変えなかった。
【０１９８】
架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡのカプセル化効率を測定するために、洗浄したＮＳｓをトリプシンと共に、透明な液が形成されるまで撹拌して、総ｓｉＲＮＡ含有量を、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて検出し、ＡＵＣに基づいて計算した。我々の研究室で開発したプロトコル（詳細は§Ｅを参照）によれば、放出したｓｉＲＮＡの定量化のこのような方法の信頼性は、非常に有効である（図５及び６）。異なるｐＨ状態で作成したＨＳＡ  ＮＳｓのカプセル化効率を図６にまとめた。いくつかの傾向が結論付けられた。ＤＯＴＡＰが存在する場合、最良のカプセル化（〜４０％）は、低いベーシックなｐＨ（ｐＨ８と７）で見られた。ｐＨ９では、ＮＳｓからのＤＯＴＡＰの除去が、カプセル化効率を下げた。この効果は、非コレステロールで修飾したｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）を用いた場合に、より明らかである。
【０１９９】
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表６：  ＨＳＡ  ＮＳｓ、２００μｇのｓｉＲＮＡのカプセル化効率−０．０３ｍｇのＤＯＴＡＰを加えてあるいは加えることなく、異なるｐＨ条件（ｐＨ７、８、又は９）で、２００μｇのｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ又はＣｈｏｌ−ＧＦＰ）で作成した架橋ＨＳＡ  ＮＳｓについてのカプセル化効率のまとめ。２回実験を行い、平均値を表示した。測定は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって行った。
【０２００】
ナノスプレイ乾燥法による一次ＮＳｓのＮＣｓへのナノカプセル化
親水性被覆ポリマを用いたＰＬＧＡ  ＮＳ装填ナノカプセルの作成
安定で、小さく、球形のＮＣｓ（空の、又は一次ＰＬＧＡ  ＮＳｓ装填）を、無傷のエンベロープで、かつ高収率で作成するために、パラメータの異なる多数の処方を調べた。
（１）デキストラン４０（ＭＷ＝４０ｋＤＡ）、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、ＭＷ＝２００ｋＤａ）、及びヒト血漿アルブミン（ＨＳＡ、ＭＷ＝６６．５ｋＤａ）を含む水溶性ポリマのタイプ；（２）水分散相における親水性ポリマのパーセンテージ（ｗ／ｖ）とＰＬＧＡ  ＮＳｓ；（３）Ｔｉｎ（Ｔｉｎは、入り口温度であり、リニアに流れる乾燥エア／ガスの温度）、及び（４）界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）の追加。最小サブミクロン液滴を形成するために、最小メッシュサイズのメンブレイン（４μｍ）を使用した。
【０２０１】
実験した多くの処方の全体的な結果が、以下の観察につながった：
（１）ＨＡを用いたスプレイ工程は、粘度が高い（０．１％（ｗ／ｖ）溶液でも）ため、不十分であった。
（２）デキストランを用いたＰＬＧＡ  ＮＳｓが、穿孔表面を持つ球形ＮＣｓを作成した（図７）。
（３）最良の結果は、水性相でＨＳＡを０．１％乃至１．６％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で用いた場合に得られた。
（４）空のＨＳＡ  ＮＣｓがうまく作成され、同様に様々な量のＰＬＧＡ  ＮＳｓ（正及び負に荷電）を含むＨＳＡ  ＮＣｓもうまく作成できた。
（５）ＳＥＭ測定で：（ａ）すべてのケースで、小さい、表面が無傷の球形のＮＣｓが形成され；（ｂ）ＤＤＷ中のＨＳＡ濃度が下がると、最も小さいＮＣｓが形成された（図８Ａ−８Ｈ）；ことを確認した。図８Ａ−８Ｈから、ＨＳＡ濃度の１．６％から０．２５％（ｗ／ｖ）への低下によって、サイズが小さくなったＮＣｓが形成されると、推定される。特に、ＮＣｓの小片が７から２μｍに小さくなり、最大ＮＣｓ群が２から０．５μｍに小さくなった。
【０２０２】
ナノカプセル化工程の最適化
以下のパラメータについてのみスプレィ乾燥工程の最適化を行った：
（１）表面形態  上述した通り、ＨＳＡを用いた時に最良の結果が得られた。
（２）粒子サイズ  上述した通り、水性相中の固体濃度が低下すると、最小ＮＣｓ（０．３−２μｍ）が得られた。
（３）収率  界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０）を０．０６％（ｗ／ｖ）を加えることで、行程中で達成された収率に有意な改善がなされ、いくつのケースでは、スプレィ率が改善された（表７）。
【０２０３】
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表７：水性モードで行ったナノスプレィ乾燥工程の最適化
（＊モル比４：１  ＨＳＡ：ＰＬＧＡの負に荷電したＰＬＧＡ  ＮＳｓ）
【０２０４】
動作温度−乾燥ＮＣｓを作成するために、異なる温度の乾燥エア（Ｔｉｎ）を試験した（８０、１００、及び１２０℃）。７０℃で乾燥ＮＣｓを形成する試みは、有効でなかった。ｓｉＲＮＡが含まれていない場合、８０℃でのスプレイ乾燥が、我々の処方に非常に有効であることがわかった。
【０２０５】
５０％のｓｉＲＮＡストランドが変性する温度が、融点、又はＴｍと呼ばれる。我々の研究で使用した様々なｓｉＲＮＡｓ（２１  ｍｅｒｓ）のＴｍを測定し、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、及びＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡの融点が、それぞれ７８℃、７７℃及び７２℃であることがわかった。試験を行ったすべてのｓｉＲＮＡｓについて、６０℃ですでに分離の開始が観察された（データは示さず）。
【０２０６】
これらの結果に基づいて、ｓｉＲＮＡｓを６０℃以上の温度に露出させることは推奨されず、低温（≦６０℃）でナノスプレイ工程を行うことが好ましく、通常、揮発性有機溶媒を用いて行うと効率が良いことがわかった。
【０２０７】
疎水性コーティングポリマを用いたＨＳＡ  ＮＳ装填ナノカプセルの作成
表面が平滑な所望の球形サブミクロンＮＣｓ（空の、あるいは一次ＨＳＡ  ＮＳを装填した）を高収率で作成するために、低温（≦６０℃）でのスプレィ乾燥と共に、様々なパラメータを変更して試験した：（１）有機分散層のタイプ；（２）Ｔｉｎ；（３）カプセル化に用いる疎水性ポリマのタイプ−ＰＬＧＡ４８ｋＤａと、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ５０ｋＤａ（ＰＥＧ  ５ｋＤａ＋ＰＬＧＡ  ４５ｋＤａ）；（４）有機分散相中の疎水性ポリマと架橋ＨＳＡ  ＮＳｓのパーセンテージ（ｗ／ｖ）；（５）界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０  又はＰＥＧ  ４０００）の追加；及び（６）スプレィのパーセンテージ。水性モードでＮＳＤ  Ｂ−９０を用いたことで得た我々の経験に基づいて、メッシュサイズのメンブレイン（４μｍ）をすべての実験に用い、比較的小さいパーセンテージの固体、０．０７乃至０．２６％（ｗ／ｖ）を有機相中に分散させて、＜１μｍのサイズのＮＣｓを作成した。
【０２０８】
（１）追加の分散相（としていくつかの揮発性有機溶剤を試験した（エタノール、メタノール、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、アセトン、およびアセトニトリル）。アセトンとアセトニトリル（ＡＣＮ）で最良の結果が得られ、したがって、大多数のカプセル化実験は、これらの溶剤で行った。
【０２０９】
（２）ＡＣＮを使用したときは６０℃又は５０℃の温度で、また、より揮発性があるアセトンを用いたときは、４０℃又は３０℃でスプレイ乾燥を行った
【０２１０】
（３）行ったすべての実験で、収率が低かった（最大３５％）。これは、おそらく、溶剤の揮発特性によるものであり、スプレィヘッドの周囲に皮殻状沈殿（ｃｒｕｓｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ができた（固相集合体又は結晶の発現）。このような沈殿が、振動メンブレインをブロックして、その結果、収率が低く、多分散性が高い、良好でないプロセスとなる。この現象は、ＡＣＮに代えてアセトンを用いた場合により生じる。
【０２１１】
（４）界面活性剤の追加：Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．０６％  ｗ／ｖ）、ＰＥＧ  ４０００（０．０３％  ｗ／ｖ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（０．００８％  ｗ／ｖ）、又は、トレハロース（０．００８％  ｗ／ｖ）又はスクロース（０．００８％  ｗ／ｖ）などの抗溶解（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）剤は、皮殻状沈殿を防止できず、サンプルの高いた分散性を下げることができなかった。これらを加えた場合、特に、Ｔｗｅｅｎを使用した場合の収率は無視できるほどであり、形成したＮＣｓの多分散性が高かった。
【０２１２】
（５）低パラメータのスプレィを行った場合（１００％ではなく、６０％）、スプレイヘッドの温度（Ｔｈ）は、Ｔｉｎより１２℃高く、図９Ａ−９Ｂに示すように、形成したＮＣｓの溶解を引き起こす。１００％のスプレィを行う場合、Ｔｈは、Ｔｉｎより７−８℃高いだけである。
【０２１３】
（６）すべてのテストサンプルで球形ＮＣｓを作成したＰＬＧＡ（図１０）とは異なり、ＰＥＧ−ＰＬＧＡは、ヘッドの加熱により反応することがわかった。したがって、いくつかのケースでは、図９Ａ−９Ｂに示すように、非晶質ＮＣｓを産生した。ＤＳＣの測定は、ＰＬＧＡとＰＥＧ−ＰＬＧＡのガラス遷移（Ｔｇ）値が、それぞれ、４６．５℃と３１℃でこの仮定を支持している。
【０２１４】
（７）サンプル中の固体含有物を２倍低減する（０．２１％から０．１３％へ）ことで、収率を２倍上げる（１６％から３５％）ことができる。
【０２１５】
（８）サンプルの希釈（１０ｍｌでなく、２０ｍｌのアセトン）によって、収率を下げることなく（〜２０％）、分散ＨＳＡ  ＮＳｓの量を６倍（１．６ｍｇから１０ｍｇへ）に増やすことができた。
【０２１６】
図１１に示すように、有機ポリマ（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡ）内の一次ＨＳＡ  ＮＳｓのカプセル化を、ＥＤＳ（エネルギィ分散Ｘ線分光分析）を用いて評価した。
【０２１７】
スプレィヘッド周辺の大きなクラスト形成の防止を伴う、分散架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ量の増加は、分散有機相として主にＡＣＮを使用することで達成された。更に、ＡＣＮを使用し、Ｔｉｎが６０℃から５０℃に下がった場合、皮殻状沈殿が生じず、全スプレィプロセスを通じてメンブレインがきれいで、ＰＬＧＡ又はＰＥＧ−ＰＬＧＡを用いた場合に球形のサブミクロンＮＣｓが形成された（図１２）。しかしながら、比較的引く収率（〜３０％）となった。このパラメータは、更に試験を行って最適化されるであろう。
【０２１８】
装填したＮＣｓのサイズ分布
固体含有率０．１％の二つのアンプルをＡＣＮ中で作り（サンプルＡＯ−６６とＡＯ−６８）、ｓｉＲＮＡをカプセル化したＨＳＡ  ＮＰｓを装填したＰＬＧＡ  ＮＣｓを形成した。固体含有率１％で、空の５０ｋＤＡ  ＰＬＧＡ  ＮＣｓのもう一つのサンプル（サンプルＡＯ−６７）を比較用に作成した。
【０２１９】
すべてのＰＬＧＡ  ＮＣｓ（空の及び一次ＨＳＡ  ＮＰｓを装填した）を、ナノスプレィドライヤＢ−９０で作成し、有機相（アセトニトリル，Ｔｉｎ５０℃ ）５０℃で操作した。乾燥したＮＣｓを、特性化を行う前に、暗室で４℃で、密封したバイアル中で保存した。
【０２２０】
Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００Ｅを用いて乾燥させたＮＣｓを特性化するために、ボルテックスを用いて各サンプルを水中（ＤＤＷ、２ｍｇ／ｍｌ）で分散させ、アイスバスに一晩おいて、混濁した均一な分散が形成されるまで撹拌した（攪拌機で）。
【０２２１】
Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００Ｅにおけるすべての測定は、ステンレススチールのサンプル分散ユニット（１２０ｍｌ容量）で、早く撹拌しながら行った（超音波処理や、界面活性剤の追加は不要）。この結果（量又は数で計算した）を、乾燥サンプルについて前に行ったＳＥＭ測定による画像と比較した。
【０２２２】
Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００Ｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたレーザー解析技術で行った量によるサイズの測定に基づくと、サンプルＡＯ−６８については、ＮＣｓの８０％が１μｍ以下であり（５６％が０．７２４μｍ以下）、スパン値は１．４７２であった。サンプルＡＯ−６６ではより良い結果が得られた。ＮＣｓの９４％が１μｍ以下であり（８６％が０．７２４μｍ以下）、スパン値は２．０７７であった。低スパン値は、低い多分散性を意味する（図１３−１５）。比較のために、１％の固体（ＰＬＧＡ）含有量のサンプルも測定して（サンプルＡＯ−５７）、より大きいＮＣｓの形成を顕在化した。９４％のＮＣｓが２．５μｍ以下（４２％が１μｍ以下であり、４％が０．７２４μｍ以下）であった。これらの結果は、固体含有率が〜０．１％の良く希釈された処方で作ったナノカプセル化技術についての可能性を示している。
【０２２３】
カプセル化ｓｉＲＮＡの完全性評価
ＨＳＡ  ＮＳｓ中のｓｉＲＮＡの一次カプセル化プロセスの間に、基本ｐＨ条件や、グアニン、アデニン、又はシトシンといった核酸基中に存在する主要アミンと相互作用するクロスリンカの存在といった破壊的な可能性をもつ物質（グルタルアルデヒド）に露出される。したがって、ｓｉＲＮＡの感染性評価が必要とされる。まず、自由ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡとＣｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）の完全性評価を行った。ｓｉＲＮＡを架橋ＨＳＡ  ＮＳｓの作成に用いた条件と同じ条件（ｐＨ７、８又は９の水性溶液で、グルタルアルデヒドの存在下で、あるいは存在なしで、３時間）に露出させ、次いで、各サンプルからの断片をＨＰＬＣ（データは示さず）とゲルシフト法（ＰＡＧＥ８％）を用いて分析した（図１６）。その結果、ｐＨがよりベーシックになるとｓｉＲＮＡの感度が上がる一方で、Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡに比べてベーシックｐＨ（８及び９）への耐性が改善されることが明らかになった。一方、この二つのタイプのｓｉＲＮＡは、試験を行ったすべてのｐＨで、クロスリンカの存在に感度が高く、そのゲルで「重」種のランシャワーができて、ｓｉＲＮＡに生じる破壊的架橋プロセスの可能性を暗示していることがわかった。
【０２２４】
後に、一次架橋ＨＳＡ  ＮＳｓ（異なるｐＨ条件で作成）からｓｉＲＮＡが抽出され、その完全性を、ＨＰＬＣ（データは示さず）とゲルシフト法（ＰＡＧＥ８％）を用いて評価した（図１７）。更に、ナノスプレィ乾燥技術を用いて二次カプセル化プロセスを加熱して（Ｔｉｎは５０℃）行い、一次要架橋ＨＳＡを装填したＮＣｓから抽出したｓｉＲＮＡの安定性も試験した（図１５、レーン番号９及び１０）。図１７に示すＰＡＧＥの結果に基づいて、ｓｉＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ＧＦＰ−、又はＧＦＰ）が、一次又は二次ＮＣｓにカプセル化され、無傷のままで、処理をしていないｓｉＲＮＡ（レーン番号２）のように流れ、崩壊は生じないことがわかった。ＨＰＬＣの結果に基づいて、正確な量のカプセル化ｓｉＲＮＡを測定した。将来は、抽出したｓｉＲＮＡの活性を「インビトロ」で検証することが必要となるであろう。
【０２２５】
プロトコルＩ−ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）またはベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）のナノスフェア表面へのコンジュゲーション
ＭＡｂ洗浄と量の決定
ラニビズマブとベバシズマブを、８．５ｃｍの透析袋（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１２−１４Ｋ）を用いて洗浄し、ヒスチジンやグリシンといった、ＬＣ−ＳＭＣＣスペーサと相互作用し、ＭＡｂ活性に影響を及ぼすアミノ酸を除去した。ラニビズマブを加える前に、透析袋を２リットルのＤＤＷで洗浄した。次いで、約５００μｌのＡｂを、総容量３リットルのＰＢＳ、濃度×１０で洗浄した。ｐＨ７．４のＤＤＷで希釈したマグネシウム及びカルシウムはなかった。一晩の洗浄の後、Ａｂ総容量を調節して、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌＡｂの濃度とし、Ａｂを４℃で、１４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離にかけて、透析袋からグリコールの残渣を除去した。ラニビズマブ濃度を、２８０ｎｍの波長で、分光光度計を用いて測定した。
【０２２６】
スペーサＬＣ−ＳＭＣＣを用いたＭＡｂの活性化
ＭＡｂのアミン基（ＮＨ２）と、ＬＣ−ＳＭＣＣのエステル基（−Ｒ−ＣＯＯ）を反応させて、アミド結合を作った。反応は、回転数１８０ｒｐｍ、４℃、で２時間行った。ＭＡｂとＬＣ−ＳＭＣＣのモル比は、１：１００であった。より詳しくは、ＤＭＳＯ（１ｍｇ／１００μｌ）中のスペーサ溶液５０μｌを、２ｍｇのＭＡｂ（１ｍｌ）に加えた。ＤＭＳＯの最終濃度は、５％を超えなかった。必要があれば、非活性ＭＡｂを検証するために、０．５ｍｇの残渣ＭＡｂを、約１２．５μｌのＤＭＳＯに加えて、ＤＭＳＯとＭＡｂの比率を同じに保ち、同じ条件でインキュベートした。活性化させたのち、ラニビズマブを、１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間エッペンドルフ型遠心分離にかけ、上澄をすて、洗浄して、ＭＡｂと反応しないＬＣ−ＳＭＣＣの残渣を取り除き、１ｍｇ／ｍｌ  Ａｂの最終濃度とした。ＰＢＳ×２．５（ｐＨ＝７）中の総容量１５ｍｌで、３００００ＭＷＣＯのビバスパンを用いて、４０００ｒｐｍ、４℃で２ｍｇ（１ｍｌ）を１０−１５分間洗浄した。このプロセスを、非活性化ＭＡｂにも行った。
【０２２７】
ＮＳｓ作成プロセス
同じプロトコルで二つの製剤を作成した。ＮＰｓを作成するのに、７５ｍｇのＲｅｓｏｍｅｒ  ５０４Ｈ、７５ｍｇのＰＬＧＡ  ５０−５０  ４５０００  ＰＥＧ  ５０００（５０，０００ＫＤ）、１０ｍｇＯＣＡリンカを、２５ｍｌのアセトンに溶かした。５０ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＲＨを含む５０ｍｌの水性相に、９００ｒｐｍで撹拌しながら有機相を注入した。注入後同じ条件で１５分間撹拌を続け、次いで、製剤を、３７℃、撹拌速度３０ｒｐｍ、で１時間蒸発させた。蒸発終了時に、ＮａＯＨ  ０．１ＮでｐＨを６．８−７にして、最終容量を、ＨＰＬＣ用の水と共に５ｍｌとした。最後に、製剤を４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離にかけて、ポリマ沈殿物を除去した。
【０２２８】
ラニビズマブとベバシズマブを用いたＮＳｓのインキュベーション−ナノＭＡｂの作成
ＯＣＡリンカのチオール基と、スペーサとしてのマレイミドを室温で一晩反応させた。２ｍｇＭＡｂ（１ｍｇＭＡｂ／ｍｌの溶液濃度）を持つ２ｍｌの製剤を、シンチレーションボトルで、軽く撹拌（５００ｒｐｍ）して反応させた。非活性化ＭＡｂも、同様の条件で一晩、ＮＳｓと共にインキュベートした。
【０２２９】
ナノＭＡｂ洗浄
翌朝、サンプルをＨＰＬＣ用の水で、３００，０００ＭＷＣＯビバスピンを用いて、４０００ｒｐｍ、４℃で洗浄し、ＮＳｓと反応しなかったＭＡｂの残渣を取り除いた。洗浄液容量は、製剤容量の×１０であった。非活性ナノＭＡｂとＮＳｓを同じ条件で洗浄した。残渣を、１５ｍｌのポリプロピレン管に集めて、凍結乾燥するまで−８０℃に維持し、一方で、製剤を濃縮して、洗浄前の元の要領の製剤を作った。
【０２３０】
ＮＳｓとナノＭＡｂの特性化
覚せい剤から１００μｌを１０００μｌの水でＨＰＬＣ用に希釈し、０．２μｍＰＶＤＦフィルタで濾し、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ  ＵＫ）を用いて分析して、ζ電位と粒子の直径サイズを測定した。
【０２３１】
プロトコル２−架橋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたナノカプセル化ラニビズマブとベバシズマブ
一次架橋ＢＳＡ  ＮＳｓの作成
ナノメータのＢＳＡ  ＮＳｓを作成するために、ｐＨ液滴形成（脱溶媒和技術としても知られている）の公知の方法を適用した。簡単に言うと、特定のｐＨに調整したＢＳＡ溶液を、一定の、迅速な撹拌（〜９６０ＲＰＭ又は４０Ｈｚ）を室温で行って、脱溶媒和剤を連続的に（〜１ｍｌ／分）加えることでナノ粒子に変形した。脱溶媒和剤の添加は、十分な濁度が生じ（通常、４０乃至８０％（ｖ／ｖ）の脱溶媒剤）るまで続け、次いで、破砕撹拌で詩ウオン、少なくとも２時間、グルタールアルデヒドを用いて行った。架橋後、脱溶媒和剤を蒸発させ（３７℃）、１０分間、４，０００ＲＰＭで遠心分離にかけた（沈殿物を除去し、乾燥させ、重量測定法で測定した）。ＮＳｓを、３つの異なるサイクルの遠心分離（４０００ＲＰＭ、４℃）において、３００ｋＤａのビバスピン（Ｖｉｖａ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＤＤＷで洗浄した（１０回）。
【０２３２】
アバスチンダブルナノ−ナノスプレイを用いた非架橋ＢＳＡ  ＮＳｓのカプセル化
ベバシズマブを、透析によって、ポリソルベート２０溶液に転写した。（１４ＫＤａを切り捨て、５００ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０（０．４ｍｇ／ｍｌ）中で、室温で、２時間、３回）。Ａｂを、上述したＢＳＡを用いてナノカプセル化した。ペプチドとアルブミンを含む水性溶液にアセトンを注入して強い渦流で、ＢＳＡ  ＮＳｓを形成させ。上澄の０．７５ｍｌのアリコートを捨てて、撹拌して、直ちに２４ｍｌのアセトニトリル含有する１６ｍｇのＰＬＧＡ（５０Ｋ）に組み入れた。この上澄を、ナノスプレィ乾燥機を用いて蒸発させた。最終溶液：ＤＤＷ１．０１％、アセトン２．０２％、アセトニトリル９６．９７％であった。固形成分：Ａｂ  １．９％、アルブミン３７．７％、ＰＬＧＡ６０．４％であった。全ての溶液の最終固体濃度は、０．１０４％であった。ナノスプレイ条件は、４μｍメッシュ、５０℃であった。
【０２３３】
ナノスプレィドライヤを用いたＢＳＡ  ＮＳｓのカプセル化−有機モード
ＮＣｓを、閉ループモードで動作するＮＳＤ  Ｂ−９０上でスプレィ乾燥させて作成した。エアに代えて、Ｎ２（ｇ）とＣＯ２（ｇ）をシステムに流した。全ての実験で、ガス流は約１２０リットル／分であった。揮発性蒸気と湿気に吸収されたエアは、乾燥と濃縮のために除湿ユニットに送られ、その後、循環パスをシステムに戻して乾燥させた。スプレイ乾燥を低温（Ｔｉｎ＝３０−６０℃）で、４μｍのメッシュサイズメンブレインで行った。
【０２３４】
架橋ＢＳＡ  ＮＳｓへのラニビズマブとベバシズマブの装填効率
ラニビズマブ又はベバシズマブを架橋ＢＳＡ  ＮＳｓ内にカプセル化するために、脱溶媒和相を加える前に、ラニビズマブ又はベバシズマブをＢＳＡ溶液に加えた。残りの手順を、上述した方法と同じ方法で正確に行った。架橋後、ＮＣｓを洗浄し、限外濾過液をすべて回収して、凍結乾燥させ、５００μｌＤＤＷで再構築した。
【０２３５】
物理化学的特性化
各製剤から１００μｌを、ＨＰＬＣ用の１０００μｌの水で希釈して、０．２μｍＰＶＤＦフィルタでろ過し、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｒｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ  ＵＫ）で分析して、ζ電位と粒子直径サイズを測定した。
【０２３６】
ＳＥＭとＥＤＳ
スプレイ乾燥したＮＣｓ（及びカプセル化したＮＳｓ）の寸法、サイズ、および表面形態を、高安定性ショットキー場放出源（Ｓｉｒｉｏｎ，ｍｏｄｅｌ：Ｑｕａｎｔａ  ２００  ＦＥＩ，Ｇｅｒｍａｎｙ）付５ｋＶの高解像度走査電子顕微鏡（ＨＲ−ＳＥＭ）によって、観察した。画像化する前に、サンプルをカーボン粘着タブの上に分散させて、金とパラジウム混合物を９０−１２０秒、被覆した。水に分散した一次ＮＣｓの場合は、サンプルを高く希釈して、ガラスにスパッタリングして、一晩おいて乾燥させた。ＥＤＳ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ  Ｘ−ｒａｙ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で、Ｘ−ＭＡＸ２０  ＳＤＤ  Ｉｎｃａ  ４５０  ＥＤＳ  ＬＮ２フリー検出器を用いて、試料の元素分析を行った。
【０２３７】
ＥＤＳで検出したアミン基は、製剤中にその他の賦形剤は、アミン基を含まないため、ナノ粒子中のアルブミンナノキャリアの存在からのみ由来する。
【０２３８】
表８は、プロトコル−２で作成した二つの製剤（架橋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ナノカプセル化アバスチン）の物理化学的プロファイルをまとめたものである。一方、表９は、プロトコル−１で作成した製剤（ナノスフェア表面へのアバスチンのコンジュゲーション）の物理化学的プロライルをまとめたものである。ブランクのバッチは、Ａｂバッチの状態がタンパク質を装填した製剤に関するものである、タンパク質を除いた製剤用に製造された。
【０２３９】
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表８：ビバスピン洗浄後のＢＳＡ−ＮＰｓのサイズとゼータ電位
【０２４０】
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表９：ビバスピン洗浄後のＩＮＰｓのサイズとゼータ電位
【０２４１】
ゲル電気泳動によるＢＳＡ−ＮＰ中の自由Ａｂの評価（プロトコル−２）を、以下のパラメータを用いて行った。ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、勾配４−１２％、変性サンプル、ただし低減なし、ＭＯＰＳ連続バッファ、クマシーブルーＧ−２５０染色（検出限界０．１μｇのタンパク質）。バッチ形成後、電気泳動を１５日行った。
【０２４２】
結果（結果は示さず）からわかるように、結合密度を定量化して、Ａｂ濃度を取得した。製剤洗浄にＡｂがみられなかったということは、すべてのＡｂがＢＳＡ−ＮＰｓにカプセル化されたことを示す。電気泳動中にカプセル化したＡｂが若干低放出された。ＮＰｓを編成させ、Ａｂを放散させる有効な手順は、見つかっていない。
【０２４３】
インビトロ評価
一次ＨＳＡ  ＮＳｓのＡ−４３１細胞における取り込み
２％ＦＴＴＣ−ラベル化架橋ＨＳＡ  ＮＳｓを、Ａ−４３１細胞（ウエル当たり、濃度１ｍｇ／ｍｌ及び２ｍｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃で、４時間及び２２時間以上インキュベートした。共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）に基づいて、ちょうど４時間後（二つの濃度を調べるために）に高レベルでの取り込みが観察された。インキュベーション２２時間後は、細胞の外にＮＰｓのスポットは見られなかった（図１９Ａ−１９Ｂ）。
【０２４４】
これらの発見は、ＨＳＡ  ＮＳｓの装填した薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を標的細胞へ送達する能力を実証している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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