(57)【要約】    【課題】本発明は、重合脂質ナノ粒子、及びその作製方法を提供すること等を課題する。    【解決手段】本発明は、重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、重合脂質殻が約１５％〜約２０％の重合性脂質、約１〜１５％の負荷電脂質、約２０〜４５％の中性荷電分子（コレステロールなど）、及び約３０％〜６０％の双性イオン荷電脂質を含む、重合脂質ナノ粒子等を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、前記重合脂質殻が約１５％〜約２０％の重合性脂質、約１〜１５％の負荷電脂質、約２０〜４５％の中性荷電分子（コレステロールなど）、及び約３０％〜６０％の双性イオン荷電脂質を含む、重合脂質ナノ粒子。
【請求項２】
重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、前記重合脂質殻が約１５％〜約２０％の１０，１２−ペンタコサジイン酸誘導体及び約３０％〜約４０％の飽和リン脂質を含む、重合脂質ナノ粒子。
【請求項３】
重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、前記重合脂質殻が約１５％のＣ２５尾部脂質及び約５０％〜約５５％のＣ１８尾部脂質を含む、重合脂質ナノ粒子。
【請求項４】
重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、前記重合脂質殻が尾部のサイズが少なくとも炭素数７個分だけ異なる少なくとも２つの脂質を３．５：１の比率で含む、重合脂質ナノ粒子。
【請求項５】
重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、標的化剤及び治療剤を含み、前記重合脂質ナノ粒子が従来のリポソームＰＥＧ化製剤の少なくとも２倍の力価を有する、重合脂質ナノ粒子。
【請求項６】
重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子であって、標的化剤及び治療剤を含み、治療剤と脂質のモル比が０．１５である、重合脂質ナノ粒子。
【請求項７】
前記重合性脂質がＣ２５尾部脂質である、請求項１に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項８】
前記負荷電脂質がＣ１８尾部脂質である、請求項１に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項９】
前記双性イオン荷電脂質がＣ１８尾部脂質である、請求項１に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１０】
前記重合脂質ナノ粒子が、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍのサイズである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１１】
治療剤を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１２】
Ｌ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ2000、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］及びＰＥ−ＰＥＧ2000−ビオチンからなる群から選択される少なくとも１つの非重合性脂質を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
前記重合性脂質がジアセチレン脂質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
前記重合脂質ナノ粒子が、前記脂質殻を重合するように作製された後、約２〜３５分間ＵＶ処理される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
前記重合脂質ナノ粒子が、押し出し直後であるが重合前に、５〜１０℃で一晩冷却することによって調製される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１６】
前記重合脂質ナノ粒子が、標的化剤、造影剤、治療剤、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１７】
前記標的化剤が、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１８】
前記標的化剤が細胞表面分子に対して特異的である、請求項１６に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項１９】
前記細胞表面分子が、構造タンパク質、細胞接着分子、膜受容体、キャリアタンパク質及びチャネルタンパク質を含む細胞膜タンパク質である、請求項１８に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２０】
前記細胞表面分子が、活性化白血球接着分子（ＣＤ−１６６）、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、卵巣癌抗原（ＣＡ−１２５）、乳癌抗原（ＭＵＣ−１及び上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ））、チロシナーゼ悪性メラノーマ抗原及びメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓの異常抗原性生成物、ｐ５３、ユーイング肉腫抗原（ＣＤ−１９）、白血病抗原（ＣＤ−９９及びＣＤ−１１７）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項１８に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２１】
前記標的化剤がエンドサイトーシス又は細胞膜融合を増強する、請求項１６に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２２】
前記造影剤が、ガドリニウムなどの磁気共鳴イメージングの造影剤、超音波造影剤、及びＴｃ−９９、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｔｌ−２０１、及びＹ−９０などの核イメージング用造影剤（nuclear imaging agent）からなる群から選択される、請求項１６に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２３】
前記重合脂質ナノ粒子が、少なくとも約３時間から少なくとも約４時間の循環半減期を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２４】
前記重合脂質ナノ粒子が、約３０分後に細胞のエンドソームコンパートメントに取り込まれる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの非重合性脂質がＰＥＧを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２６】
前記ＰＥＧが１０００〜５０００ダルトンの質量を有する、請求項２５に記載の重合脂質ナノ粒子。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の複数の重合脂質ナノ粒子を含む、重合脂質ナノ粒子の集合。
【請求項２８】
個体の治療方法であって、
必要としている個体に重合脂質ナノ粒子を投与する工程を含み、
前記重合脂質ナノ粒子が重合脂質殻、標的化剤及び治療剤を含み、前記重合脂質殻が約１５％〜約２０％の重合性脂質、約１〜１５％の負荷電脂質、約２０〜４５％の中性荷電脂質、及び約３０〜６０％の双性イオン荷電脂質を含む、方法。
【請求項２９】
前記非重合性脂質が、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ２０００、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、又はＰＥ−ＰＥＧ２０００−ビオチンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記重合性脂質がジアセチレン脂質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的化剤が抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的化剤が細胞表面分子に特異的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記重合性脂質粒子が約３０ｎｍ〜約２００ｎｍのサイズである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記重合性脂質がＣ２５尾部脂質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記負荷電脂質がＣ１８尾部脂質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記双性イオン荷電脂質がＣ１８尾部脂質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記重合脂質ナノ粒子が、投与から３０分後に細胞のエンドソームコンパートメントに取り込まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
個体の治療方法であって、
請求項１〜２６に記載の前記重合脂質ナノ粒子、又は請求項２７に記載の重合脂質ナノ粒子の集合を投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれかに記載の重合脂質ナノ粒子、又は請求項１〜３８のいずれかに記載の方法であって、前記治療剤が、抗腫瘍剤、血液製剤、生体応答調節剤（biological response modifiers）、抗菌剤、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝結剤、循環系作用薬、代謝相乗剤、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗原虫薬、抗リウマチ剤、麻酔薬、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静薬、局所麻酔、全身麻酔、放射性化合物、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ分子などのアンチセンス核酸、及びプロドラッグを含む群から選択される、重合脂質ナノ粒子又は方法。
【請求項４０】
対象の癌を治療する方法であって、
化学療法剤を含有する、重合リポソームナノ粒子（ＰＬＮ）又はハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）に共役したｃｙｓ−ダイアボディを含むコンジュゲートを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
前記癌が膵臓癌又は骨肉腫である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｃｙｓ−ダイアボディが、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディ又は抗ＡＬＣＡＭｃｙｓ−ダイアボディである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学治療剤が、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、ミトマイシン、パクリタキセル、及びｓｉＲＮＡなどの細胞毒性剤である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本出願は、２０１１年５月１１日出願の米国仮特許出願第６１／４８５，０２４号、２０１１年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６１／５６０，４４３号、及び２０１１年１０月４日出願の米国仮特許出願第６１／５４３，１９３号の利益を主張し、上記各特許出願は参照により全体を本明細書に組み込むものとする。本明細書で言及する公報、特許、及び特許出願はすべて、個々の公報、特許、又は特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるものと具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
（連邦政府後援の研究に関する声明）
[0002]  本発明は、退役軍人省の退役軍人キャリア開発賞による政府の支援で、及び米国衛生研究所からの交付金ＣＡ−９２８６５、ＣＡ−１６０４２及びＡＩ−２８６９７により実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  哺乳類への薬物の全身送達は疾患の治療における一般的なプラクティスである。この送達形態は、治療する状態が全身性である場合に適切である。しかし、心血管疾患又は癌などの局所性疾患という一部のケースでは、投薬の全身送達を使用して治療部位に有効濃度を提供すると、その結果、患者の全身の薬物濃度が高くなる場合がある。これらの高い薬物濃度は、有害又は毒性の副作用を生じる場合がある。それ故、局所送達法は、患者全身への投薬の全身濃度をはるかに低減することができる。この濃度差によって、局所送達が副作用を軽減し、結果を向上させることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]  ナノテクノロジー及びナノ粒子は、高用量の薬物又は他の生物活性薬剤を身体のいずれの標的領域にも送達するとともに、このような治療が標的外の組織に及ぼすバイススタンダー効果や用量制限効果を制限する機会を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は重合脂質殻を含み、重合脂質殻は約１５％〜約２０％の重合性脂質、約１〜１５％の負荷電脂質（negatively charged lipid）、約２０〜４５％の中性荷電分子（コレステロールなど）、及び約３０〜６０％の双性イオン荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合脂質殻は、約１５〜約２０％の１０，１２−ペンタコサジイン酸誘導体及び約３０％〜約４０％の飽和リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合脂質殻は、約１５％のＣ２５尾部脂質（tail lipid）及び約５０〜約５５％のＣ１８尾部脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合脂質殻は、尾部のサイズが少なくとも炭素数７個分だけ異なる少なくとも２つの脂質を３．５：１の比率で含む。
【０００６】
[0006]  幾つかの実施形態では、本発明は標的化剤（targeting agent）及び治療剤を含む重合脂質殻を含む重合脂質ナノ粒子を含み、重合脂質ナノ粒子は、従来のリポソームＰＥＧ化製剤よりも少なくとも２倍高い効力を有する。
【０００７】
[0007]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は標的化剤及び治療剤を含む重合脂質殻を含み、脂質に対する治療剤のモル比は０．１５である。
【０００８】
[0008]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子はＣ２５尾部脂質である重合脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子はＣ１８尾部脂質である負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子はＣ１８尾部脂質である双性イオン荷電脂質を含む。
【０００９】
[0009]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は約３０ｎｍ〜約２００ｎｍのサイズである。
【００１０】
[0010]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は治療剤を含む。幾つかの実施形態では、治療剤は、抗腫瘍薬、血液製剤、生体応答調節剤、抗菌剤、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝結剤、循環系作用薬、代謝増強剤、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗原虫薬、抗リウマチ剤、麻酔薬、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静薬、局所麻酔薬、全身麻酔薬、放射性化合物、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ分子などのアンチセンス核酸、及びプロドラッグを含む群から選択される。
【００１１】
[0011]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ２０００、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］及びＰＥ−ＰＥＧ２０００−ビオチンからなる群から選択される少なくとも１つの非重合性脂質を更に含む。
【００１２】
[0012]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、ジアセチレン脂質である重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、脂質殻を重合するために生成後約２〜３５分間、ＵＶ処理する。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、押し出し（extrusion）直後であるが重合する前に５〜１０℃で一晩冷却することによって調製される。
【００１３】
[0013]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は標的化剤を含む。幾つかの実施形態では、標的化剤は、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、標的化剤は細胞表面分子に特異的である。幾つかの実施形態では、標的化剤はエンドサイトーシス又は細胞膜融合を増強する。
【００１４】
[0014]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、少なくとも約３時間から少なくとも約４時間の循環半減期を有する。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、約３０分後に細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。
【００１５】
[0015]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は非重合性脂質を含み、少なくとも１つの非重合性脂質はＰＥＧを含む。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは１０００〜５０００ダルトンの質量を有する。
【００１６】
[0016]  幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の重合脂質ナノ粒子を含む重合脂質ナノ粒子の集合を提供する。
【００１７】
[0017]  幾つかの実施形態では、本発明は、必要とする個体に重合脂質ナノ粒子を投与することを含む個体を治療する方法を提供し、上記重合脂質ナノ粒子は重合脂質殻、標的化剤及び治療剤を含み、重合脂質殻は約１５％〜約２０％の重合性脂質、約１〜１５％の負荷電脂質、約２０〜４５％の中性荷電脂質及び約３０〜６０％の双性イオン荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、非重合性脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ2000、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］又はＰＥ−ＰＥＧ2000ビオチンである。幾つかの実施形態では、重合性脂質はジアセチレン脂質である。幾つかの実施形態では、標的化剤は、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、標的化剤は細胞表面分子に特異的である。
【００１８】
[0018]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は、投与から３０分後に細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。
【００１９】
[0019]  幾つかの実施形態では、本発明は、重合脂質ナノ粒子を投与することを含む個体の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
[0020]  本発明の新規の特徴を添付の特許請求の範囲で詳述する。本発明の原理を用いた例示的実施形態について説明する以下の発明を実施するための形態、及び添付図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点が更によく理解される。
【図１】[0021]ＡＬＣＡＭの発現を示す骨肉腫細胞株のイムノブロッティングである。
【図２】[0022]ＡＬＣＡＭの発現を示す骨肉腫細胞株の蛍光画像である。
【図３】[0023]ＡＬＣＡＭの発現を示す腫瘍サンプルの画像である。
【図４】[0024]ＰＬＮの骨肉腫細胞株への標的化結合を示す画像である。
【図５】[0025]骨肉腫細胞株へのＰＬＮ結合の時間経過の蛍光画像である。
【図６】[0026]表示温度における骨肉腫細胞株での標的化ＰＬＮの取り込みを示す。
【図７】[0027]ドキソルビシンを含むリポソームナノ粒子の細胞傷害性を示す棒グラフである。
【図８】[0028]リポソームナノ粒子の薬物装填効率及び封じ込めを示す表である。
【図９】[0029]ドキソルビシンを含むリポソームナノ粒子による細胞傷害性の平均ＩＣ５０を示す表である。
【図１０】[0030]抗体及び抗体フラグメントの概略図である。
【図１１】[0031]（ａ）及び（ｂ）は精製した抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを示し、（ｃ）は溶出プロファイルを示す。
【図１２】[0032]抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの結合特異性を示す（ａ）フローサイトメトリのヒストグラム、（ｂ）免疫蛍光検査画像、及び（ｃ）グラフである。
【図１３】[0033]４時間及び２０時間における異種移植片のマイクロＰＥＴ及びマイクロＣＴによる画像である。
【図１４】[0034]重合脂質ナノ粒子とｃｙｓ−ダイアボディとの間の共役結合反応の概略図である。
【図１５】[0035]（ａ）ＭｉａＰａｃａ−２細胞及び（ｂ）ＢｘＰＣ３細胞中の抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役標的化のフローサイトメトリのヒストグラム及び画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0036]  本発明はリポソームナノ粒子の生成及び使用に関する。幾つかの実施形態では、脂質又は他のナノ粒子成分を重合して、重合リポソームナノ粒子（ＰＬＮ）を形成することができ、これはナノ粒子の安定性及び他の望ましい特徴を増強することができる。幾つかの実施形態では、ＰＬＮは、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）とすることができる。幾つかの実施形態では、本発明のＰＬＮは、標的化薬物送達を含む薬物送達に使用することができる。幾つかの実施形態では、本発明のＰＬＮは、標的化剤、治療剤、コントラスト増強薬剤、細胞の取り込みを改善する薬剤、ＰＬＮ中の他の薬剤を増強又は安定化する薬剤、又はそれらの組み合わせを含むことができる。幾つかの実施形態では、ＨＰＬＮのようなＰＬＮは自然蛍光性とすることができる。
【００２２】
[0037]  本発明は本明細書で説明する特定の方法、プロトコル、及び試薬などに制限されず、これらは変更してよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２３】
[0038]緒言
[0039]  正常細胞を免除しながら、抗癌療法を腫瘍に送達するなど、標的治療区域に薬物を優先的に送達できるようにするという長期にわたって追究された目的は、現在の治療法の欠陥に重大な影響を及ぼした可能性がある。この点に関して、送達媒体（delivery vehicles）として薬物装填可能なナノ粒子の使用は有望のようである。天然及び／又は合成脂質で構成されたリポソーム単層小胞は、特に集中的に研究されてきたシステムである。抗癌剤の封じ込め対制御放出との問題は、リポソーム薬物送達の課題であった。一方で、リポソームは、治療剤の効率的なパッケージング及び正常な細胞外環境における薬物の安定した封じ込めを可能にするように配合する必要がある。他方で、腫瘍に局所化したリポソームは、治療効果を得るためにはそのペイロード（payload）を放出できる必要がある。この後者の属性は、標準的なリポソーム製剤内にプログラムすることが特に困難であった。したがって、幾つかの実施形態では、本発明はそのペイロードを標的に、例えば細胞、器官又は組織に放出することができるリポソームナノ粒子を提供する。
【００２４】
[0040]  幾つかの実施形態では、標的化の戦略は、標的表面上で発現する１つ又は複数のマーカ、例えば正常な組織の場合より高レベルで発現する腫瘍関連分子を含む。幾つかの実施形態では、これらのマーカを認識する分子（例えば抗体）でコーティングしたナノ粒子を使用して、標的、例えば腫瘍細胞に結合させる。幾つかの実施形態では、細胞表面でリガンド又はタンパク質と結合すると、マーカは取り込まれる。いかなる理論にも制限されることなく、標的ナノ粒子はこの相互作用を利用し、受容体が媒介するエンドサイトーシスを通して治療ペイロードを腫瘍細胞内に送達することができる。
【００２５】
[0041]  ＰＬＮなどのリポソームナノ粒子は、室温又は体温で固体、液体又は気体の状態を含むことができる。
【００２６】
[0042]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子は約３ｎｍ〜５μｍの直径サイズ範囲を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約５０ｎｍ〜約５μｍの直径サイズ範囲を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約１０ｎｍ〜１．５μｍの直径サイズ範囲を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約５０ｎｍ〜１２０ｎｍの直径サイズ範囲を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約９０ｎｍの直径サイズ範囲を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約１００ｎｍの直径サイズ範囲を有する。別の実施形態では、ナノ粒子は約１１０ｎｍの直径サイズ範囲を有する。
【００２７】
[0043]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子は１つ又は複数の脂質を含む。脂質という用語は、両親媒性を呈し、それによって水中の器質化した構造を自発的に採用し、分子の疎水性部分が水性相から分離される薬剤を含む。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は１つ又は複数の脂質を含み、少なくともその１つは重合性である。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は脂質殻の内部に１つ又は複数の物質を含む。ナノ粒子は任意選択で標的化剤、治療剤及び／又は他の機能性分子も含むことができる。本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の構成に適切であるような当業者に知られた任意の他の材料又はそれらの組み合わせも含むことができる。
【００２８】
[0044]脂質
[0045]  一態様では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の脂質を含む。使用される脂質は天然及び／又は合成の起源とすることができる。このような脂質は、脂肪酸、リゾリピド、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロール、コレステロールへミスクシネート、トコフェロールヘミスクシネート、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−イノシトール、リゾリピド、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴリピド、グルコリピド、グリコリピド、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、ジアセチルリン酸塩、ステアリルアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、炭素数６〜８の長さの短鎖脂肪酸を有するリン脂質、不斉アシル鎖（例えば炭素数６の１本のアシル鎖及び炭素数１２の別のアシル鎖）を有する合成リン脂質、６−（５−コレステン−３β−イロキシ）−１−チオ−θ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３β−イロキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３β−イロキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド、ジベヘノイル−ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、及びジオレオイル−ホスファチジルコリン、及び／又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
[0046]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の重合性脂質を含む。重合性脂質の例としては、ジインＰＣ及びジインＰＥ、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも２５％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも５０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約１０％〜約３０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約１５％〜約２５％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合性脂質は、脂質分子に付着する重合性基を含むことができる。ナノ粒子は、重合性ではない脂質、（標的化剤又は治療剤などの）機能性部分に共役する脂質、及び正電荷、負電荷又は中性電荷を有する脂質も含むことができる。
【００３０】
[0047]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、脂質層に埋め込まれた１つ又は複数の中性分子を含む。中性分子の例としては、コレステロールが挙げられるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の中性分子を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも１０％の中性分子を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも３０％の中性分子を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約３２％の中性分子を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも４５％の中性分子を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約２０％〜約４５％の中性分子を含む。
【００３１】
[0048]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の中性リン脂質を含む。中性リン脂質の例としては、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイル−、ジステアロイル−及びジアラシドイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＡＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の中性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも１０％の中性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも３０％の中性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも４５％の中性リン脂質を含む。
【００３２】
[0049]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の負荷電リン脂質を含む。負荷電リン脂質の例としては、ジパルミトイル及びジステアロイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）、ジパルミトイル及びジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳ）、ジパルミトイル及びジステアロイルホスファチジルグリセロールのようなホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ）、ｍ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥ及びｍａｌ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも５％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも６％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも１０％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２５％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも３０％の負荷電リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約１％〜約１５％の負荷電リン脂質を含む。
【００３３】
[0050]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の反応性リン脂質を含む。反応性リン脂質の例としては、ポリエチレングリコール、ビオチニル、グルタリル、カプロイル、マレイミド、スルヒドラル、二硫化ピリジン又はスクシニルアミンと結合したホスファチジルエタノールアミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の反応性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２％の反応性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも４．５％の反応性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも５％の反応性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも１０％の反応性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２５％の反応性リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも３０％の反応性リン脂質を含む。
【００３４】
[0051]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、１つ又は複数の双性イオン脂質、例えば水素化ダイズＰＣを含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の双性イオン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約３０％〜約６０％の双性イオン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２０％の双性イオン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも３５％の双性イオン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも４５％の双性イオン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも５０％の双性イオン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約４７％の双性イオン脂質を含む。
【００３５】
[0052]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約２％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約３％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約４％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約５％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約６％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約７％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約８％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約９％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約１０％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。
【００３６】
[0053]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約２％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約３％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約４％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約５％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約６％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約７％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約８％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約９％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３５％の双性イオン脂質、約１０％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。
【００３７】
[0054]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約２％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約３％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約３０％の双性イオン脂質、約４％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約５％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約６％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約７％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約８％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約９％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４０％の双性イオン脂質、約１０％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。
【００３８】
[0055]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約２％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約４５％の双性イオン脂質、約３％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約４％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約４５％の双性イオン脂質、約５％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約６％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約７％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約８％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約９％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約４５％の双性イオン脂質、約１０％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。
【００３９】
[0056]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約２％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約５０％の双性イオン脂質、約３％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約４％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約５０％の双性イオン脂質、約５％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約６％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約７％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約８％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約９％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０％の双性イオン脂質、約１０％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。
【００４０】
[0057]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約２％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約３％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約４％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約５％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約６％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約７％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約８％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約９％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５５％の双性イオン脂質、約１０％の負荷電脂質、及び残りは非荷電脂質を含む。
【００４１】
[0058]  幾つかの実施形態では、非荷電脂質のあるパーセンテージは重合性脂質とすることができる。幾つかの実施形態では、負荷電脂質のあるパーセンテージはマレイミドのような連結基（linking group）を含むことができる。
【００４２】
[0059]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ダイズレシチン、一部精製したレシチン、水素化したリン脂質、リゾリン酸塩、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、セレブロシド、セラミド、ホスファチジルコリンの他のエステル類似化合物（ＰＡＦ、リソＰＡＦ）などの１つ又は複数の脂質及びリン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、Ｌ−ａ−レシチン（ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジリノロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン）などの１つ又は複数の合成リン脂質；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−アシル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ジニトロフェニル−及びジニトロフェニルアミノカプロイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、Ｎ−ビオチニル−ＰＥ、Ｎ−カプロイルアミンＰＥ、Ｎ−ドデシルアミン−ＰＥ、Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ、Ｎ−ＰＤＤ−ＰＥ、Ｎ−スクシニル−ＰＥ、Ｎ−グルタリル−ＰＥなどのホスファチジルエタノールアミン誘導体；ジ−アセチレン脂質；ホスファチジン酸（１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩、１−アシル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩；１，２−ジアシル−ｓｎグリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］ナトリウム塩、１−アシル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］ナトリウム塩、リゾホスファチジン酸などのホスファチジルセリン；１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性脂質を含む。
【００４３】
[0060]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子はアジド及びアルキン基などのクリックケミストリに適切な１つ又は複数の脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ホスファチジルエタノール、ホスファチジルプロパノール及びホスファチジルブタノール、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−モノメチル、１，２−ジステアロイル（ジブロモ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどの多変量頭部を有する１つ又は複数のリン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、一部又は全部がフッ素化したコレステロールを有する１つ又は複数のリン脂質を含むか、又は当業者に一般的に知られているように、非荷電脂質の代わりにコレステロール誘導体を使用することができる。
【００４４】
[0061]  ナノ粒子の表面は、当業者にとって明白である手順を使用して、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーで修飾することもできる。脂質は、金属に付着するために表面官能基を含むことができ、これは放射性同位体又は治療要素として働く他の物質のキレート化を提供する。脂質の任意の種類を使用することができるが、脂質又は脂質の組み合わせ、及び脂質基質内に組み込まれる関連物質は関係する生理学的状況下でナノ粒子を形成しなければならない。当業者に認識されるように、ナノ粒子の組成物を変更して、結果となるナノ粒子の生体内分布及びクリアランス特性を調整することができる。
【００４５】
[0062]  本発明の精神に賛同し、当業者にとって明白である他の有用な脂質又はそれらの組み合わせも、本発明に包含される。例えば、米国特許第４，３１０，５０５号に記載されているように、インビボ標的化のために脂質を含む炭水化物を使用することができる。
【００４６】
[0063]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の重合性脂質を含む。本発明に使用することができる重合性脂質は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする米国特許第５，５１２，２９４号及び第６，１３２，７６４号、及び米国特許公開第２０１０／０１１１８４０号に記載されているものを含む。
【００４７】
[0064]  幾つかの実施形態では、重合性脂質の疎水性尾部基（tail group）は、紫外光又は他のラジカルアニオン性又はカチオン性開始種に曝露した場合に、ナノ粒子の表面における官能基の分布を維持しながら、可逆的に架橋、すなわち重合するジアセチレン基などの重合性基で誘導することができる。その結果となる重合ナノ粒子は、細胞膜又は他のナノ粒子と融合しないように安定化し、酵素分解するように安定化する。重合ナノ粒子のサイズは、本明細書に記載する方法で制御することができるが、当業者に知られている他の方法、例えば押し出しによっても制御することができる。
【００４８】
[0065]  重合ナノ粒子は、重合性脂質で構成することができるが、飽和脂質及び非アルキン不飽和脂質を含むこともできる。重合ナノ粒子は、露出した親水性表面上に様々な官能基を提供する脂質の混合物とすることができる。例えば、一部の親水性頭基（head group）は、表面官能基、例えばビオチン、アミン、シアノ、カルボン酸、イソチオシアネート、チオール、ジスルフィド、α−ハロカルボニル化合物、α，β−不飽和カルボニル化合物及びアルキルヒドラジンを有することができる。これらの基は、所望の細胞表面分子への特異的な標的化及び結合のために抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸又はそれらの組み合わせなどの標的化剤を結合する、及び薬物、治療効果がある核酸コード化遺伝子などの治療剤又は放射性同位体を結合するために使用することができる。他の頭基は、重合ナノ粒子が結合する特定の生物学的分子における、又はその付近の生物学的部位と相互作用するために、例えば抗体、ホルモン及び薬物などの結合又は封入した治療剤を有することができる。他の親水性頭基は金属に結合するために、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレンジニトリルテトラ酢酸、テトラアゾシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ポルホリンキレート及びシクロヘキサン−１，２−ジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ジ酢酸塩、並びにこれらの化合物の誘導体の表面官能基を有することができ、これは放射性同位体又は治療要素として働く他の物質のキレート化を提供する。キレート頭基を有する脂質の例が、参照により全体を本明細書に組み込むものとする米国特許第５，５１２，２９４号で提供されている。
【００４９】
[0066]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子はハイブリッド重合性リポソームナノ粒子である。ハイブリッドＰＬＮは、荷電脂質、非荷電脂質、コレステロール、及びその任意の組み合わせなど、リポソームナノ粒子に関して本明細書に記載されている脂質のいずれかを含むことができる。荷電脂質は、正荷電脂質、ｍ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥ及びｍａｌ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥなどの負荷電脂質、及びＬ−α−ホスファチジルコリン水素化ダイズ（ヒドロソイＰＣ）などの双性イオン荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、ＨＰＬＮは重合性非荷電脂質Ｎ−（５’−ヒドロキシ−３’−オキシペンチル）−１０−１２−ペンタコサジンアミド（ｈ−Ｐｅｇ1−ＰＣＤＡ）を含む。好ましい実施形態では、ＨＰＬＮはコレステロール、ｍ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥ及びｍａｌ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥのｈ−Ｐｅｇ1−ＰＣＤＡ、ヒドロソイＰＣを含む。
【００５０】
[0067]  重合ナノ粒子の成分脂質は、標準的な既知の技術を使用して精製し、個別に特徴付けして、次に制御された方法で化合して最終粒子を生成することができる。重合ナノ粒子を合成して、エチレングリコール誘導体のような潜在的な免疫原性を軽減することができる自然の細胞膜を模倣するか、又は機能性を提示することができる。また、重合ナノ粒子は透過電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡などの既知の物理的技術によって特徴付けることができる明瞭に画定された構造を有する。
【００５１】
[0068]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子は本技術分野で知られている任意の適切な方法により脂質溶液から形成することができる。
【００５２】
[0069]標的化剤
[0070]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は標的化剤を含む。標的化剤という用語は、生物学的標的に特異的に結合する分子、高分子、又は分子の集合を含む。生物学的に適合する任意の天然又は人工の分子を標的化剤として使用することができる。標的化剤の例としては、アンフェタミン、バルビツール酸、スルホンアミド、モノアミンオキシダーゼ阻害薬基質、抗体（抗体から誘導されたＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ及びｓｃＦｖなど、特異的結合を保持する抗体フラグメント及び他の抗体誘導分子を含む）；受容体に特異的に結合するホルモン又は他の分子などの受容体結合リガンド；細胞の機能性に影響し、免疫、炎症又は造血反応に関連する細胞間の相互作用を調節するポリペプチドであるサイトカイン；酵素阻害物質などの酵素に結合する分子；細胞膜に特異的なリガンド；酵素、脂質、核酸リガンド又はアプタマ、降圧剤、神経伝達物質、アミノ酸、オリゴペプチド、放射線増感剤、ステロイド（例えばエストロゲン及びエストラジオール）、一水化物又は炭水化物（グルコース誘導体など）、脂肪酸、ムスカリン性受容体及び基質（３−キヌクリジニルベンジレート）、ドーパミン受容体及び基質（スピペロンなど）、ビオチン又はイミノビオチン及びアビジン又はストレプトアビジン及びペプチドなどの特異的に結合する相互作用の１つ又は複数の要素、及び特異的受容体を結合することができるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
[0071]  幾つかの実施形態では、標的化剤は血管細胞に見られる受容体又は抗原に特異的に結合する分子である。幾つかの実施形態では、標的化剤は血管由来の新生血管系又は受容体に見られる抗原又はマーカ、又は腫瘍血管系に関連する抗原又はマーカに特異的に結合する分子である。腫瘍血管系に関連する受容体、抗原又はマーカは、血管の細胞上に発現することができ、腫瘍に浸透するか、又はその中に位置するか、又は腫瘍の内周又は外周に限定される。一実施形態では、本発明は腫瘍血管床からの既存の漏出又は誘発された漏出を利用する。この実施形態では、腫瘍細胞抗原も、循環から腫瘍間質体積中へ通過する薬剤で直接的に標的化することができる。
【００５４】
[0072]  幾つかの実施形態では、標的化剤は、体液又は受容体、又は体液に隣接するか又は体液中にある組織又は細胞中で上方制御された他の標的を通してアクセス可能である内皮受容体、組織又は他の標的を標的とする。重合ナノ粒子に結合する標的化剤、すなわち、本発明の連結キャリアは、炭水化物などの小分子リガンド、及び米国特許第５，７９２，７８３号に開示されているような化合物（小分子リガンドとは、本明細書では約１０００ダルトン以下の分子量の有機分子と定義され、血管標的又は血管細胞マーカ用のリガンドとして働く）、又は抗体及び成長因子などのタンパク質、又は（例えば米国特許第５，８６６，５４０号に記載されているような）ＲＧＤ含有ペプチド、ボンベシン又はガストリン放出ペプチド、米国特許第５，４０３，４８４号に記載されているようなファージ表示技術によって選択されたペプチド、及び腫瘍発現受容体と相補的であるように新規に設計されたペプチドなどのペプチド類、又は抗原決定基、又は他の受容体標的化基を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
これらの頭基を使用して、重合ナノ粒子の体内分布、非特異的接着、及び血液プール半減期を制御することができる。例えば、β−Ｄ乳糖を表面に結合させて、循環する血液プールと接触している肝臓細胞に見られるアシアログリコプロテイン（ＡＳＧ）を標的とする。市販されている脂質（ＤＡＧＰＥ）又はＰＥＧ−ＰＤＡアミンをそのイソシアネートに変換し、その後にトリエチレングリコールジアミンスペーサで処理して、アミン末端のチオカルバメートリピドを生成することにより、標的化剤として使用するためのグリコリピドを誘導することができ、これは炭水化物リガンドのｐ−イソチオシアノフェニル配糖体で処理することにより、所望の標的化グリコリピドを生成する。この合成は、ナノ粒子の内部構造又は核を形成する脂質と、細胞表面受容体に結合するリガンドとの間に離間して配置された水溶性の軟性スペーサ分子を提供し、これによってリガンドを、細胞表面上のタンパク質受容体にいつでもアクセス可能にすることができる。炭水化物リガンドは、広範囲が市販されているか、又は化学的方法又は酵素学的方法を使用して容易に合成することができるｐ−ニトロフェニルグリコシドなどの還元糖又は配糖体から誘導することができる。
【００５６】
[0073]  幾つかの実施形態では、標的化剤は細胞表面をナノ粒子の標的にする。ナノ粒子のエンドサイトーシス、又は細胞の外側への結合を通して、治療剤又は造影剤の送達を実行することができる。このような送達は当技術分野で知られている。例えば、Mastrobattista他の「Immunoliposomes for the Targeted Delivery of Antitumor Drugs」、Adv. Drug Del. Rev. (1999) 40:103-27を参照されたい。
【００５７】
[0074]  幾つかの実施形態では、標的化剤は安定化要素に結合する。一実施形態では、結合は共有結合手段による。別の実施形態では、結合は非共有結合手段による。例えば、抗体標的化剤は、コーティングした重合ナノ粒子上で様々な市販のビオチン化抗体を使用できるように、ビオチン−アビジンのビオチン化抗体のサンドイッチにより結合することができる。本発明で使用する特定の血管系標的化剤は抗ＶＣＡＭ−１抗体（ＶＣＡＭ＝血管細胞接着分子）と、抗ＩＣＡＭ−１抗体（ＩＣＡＭ＝細胞間接着分子）と、抗インテグリン抗体（例えば、国際特許出願ＷＯ８９／０５１５５号及びCheresh他の「J. Biol. Chem.」(262:17703-11(1987))に記載されているＬＭ６０９、及び国際特許出願ＷＯ９８３３９１９号及びWu他の「Proc. Natl. Acad. Sci.」（USA 95(11): 6037-42(1998)）に記載されているＶｉＴａｘｉｎなどのαvβ3に対する抗体と、Ｐ−及びＥ−セレクチン、プレイオトロピン及びエンドシアリン、エンドグリン、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＭＭＰ、及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する抗体とを含む（しかしこれらに限定されない）。他の標的がE. Ruoslahtiにより「Nature Reviews: Cancer」（2, 83-90(2002)）で説明されている。
【００５８】
[0075]  本発明の一実施形態では、標的化剤は腫瘍細胞を直接標的とする薬剤と結合する。この実施形態は、腫瘍を囲む新生血管系は往々にして高度に透過性すなわち「漏れやすく」、それによって物質が血流から腫瘍を囲む間質腔内に直接通過できるという事実を利用する。あるいは、標的化剤自体が腫瘍血管系内で透過性を誘発することができる。例えば、薬剤が放射性治療剤を運搬する場合、血管組織に結合してその組織を照射すると、その後に血管上皮の細胞死が生じ、血管系の完全性が低下する。
【００５９】
[0076]  幾つかの実施形態では、カルボジイミド、マレイミド、ジスルフィド、又はビオチン−ストレプトアビジン結合などの当技術分野で知られている任意の実行可能な方法を使用して、標的化剤をナノ粒子に結合することができる。
【００６０】
[0077]治療剤
[0078]  幾つかの実施形態では、治療剤をナノ粒子に組み込むことができる。抗腫瘍薬、血液製剤、生体応答調整物質、抗真菌薬、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝結薬、循環器系作用薬、代謝増強剤、抗ウイルス物質、抗狭心症薬、抗生物質、消炎剤、抗原虫薬、抗リウマチ薬、麻酔剤、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静薬、局所麻酔薬、全身麻酔薬、放射性化合物、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ分子のようなアンチセンス核酸、及びプロドラッグなどの様々な薬物及び他の生物活性化合物をナノ粒子に組み込むことができる。
【００６１】
[0079]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子に組み込むことができる生体活性化合物の一部はｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ分子のような組み換えＲＮＡ及びＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを含む天然又は合成起源の核酸、ＲＮＡ及びＤＮＡ、プラスミド、ファージミド、コスミド、イースト人工染色体（ＹＡＣ）、及び欠陥又は「ヘルパー」ウイルスのような発現ベクター上に担持された遺伝子、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡ両方の抗遺伝子核酸及びその同等物などの遺伝物質；バソプレシン、オキシトシン、プロゲスチン、エストロゲン及びアンチエストロゲン及びそれらの誘導体、グルカゴン、及びヨウ素生成物及び抗甲状腺薬のような甲状腺薬剤などのホルモン生成物；ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド、微生物細胞壁成分、リンホカイン（例えばリポ多糖類、マクロファージ活性因子などの細菌内毒素）、細菌のサブユニット（ミコバクテリウム、コリネバクテリウム）、合成ジペプチドＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−ジソグルタミンなどの生体応答調整物質；キレート剤及び水銀利尿薬及び強心配糖体などの心血管生成物；非経口的鉄、ヘミン、ヘマトポルフィリン及びそれらの誘導体などの血液製剤；キサンチン誘導体（テオフィリン及びアミノフィリン）などの呼吸生成物；アミノグリコシド、抗真菌薬（アンフォテリシン、ケトコナゾール、ナイスタチン、グリセオフルビン、フルシトシン（５−ｆｃ）、ミコナゾール、アンフォテリシンＢ、リシン、及び１３−ラクタム抗生物質（例えばスルファゼシン））などの抗感染薬、ペニシリン、アクチノマイシン及びセファロスポリンなどの抗生物質、ジドブジン、リバビリン、アマンタジン、ビダラビン、及びアシクロビルなどの抗ウイルス剤、抗蠕虫薬、抗マラリア薬、及び抗結核薬；免疫血清、抗毒素及び抗蛇毒素、狂犬病予防製品、細菌ワクチン、ウイルスワクチン、類毒素などの生物学的製剤；ニトロソウレア、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ダカルバジン、ミトタン、窒素マスタード、代謝拮抗物質（フルオロウラシル）、プラチナ化合物（例えばスピロプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチン）、メトトレキサート、アドリアマイシン、タキソール、ミトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリシン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン（例えばＰＡＭ、Ｌ−ＰＡＭ又はフェニルアラニンマスタード）、メルカプトプリン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、ミトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼ）エルウィニアアスパラギナーゼ、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド（ＶＭ−２６）、硫酸ビンブラスチン（ＶＬＢ）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ブレオマイシン、アラビノシル、及びメタロセン二ハロゲン化物のアルキル化誘導体などの抗新生物薬；エトポシド及びビンカアルカロイド���どの分裂阻害物質、放射性ヨウ素及びリン製品などの放射性医薬品；並びにインターフェロン（インターフェロンα−２ａ及びα−２ｂ）、アスパラギナーゼ及びサイクロスポリンを含む。
【００６２】
[0080]  生物活性物質は、単独で、又は相互に組み合わせて、又はアジュバントのように生物活性効率を向上させる目的で追加の物質と組み合わせてナノ粒子に組み込むことができる。生物活性物質は、脂質に直接、又は脂質に共役した部分にナノ粒子の表面を（エステル、置換エステル、無水物、炭水化物、ポリラクチド、又は置換無水物結合剤のように共有結合で、又はストレプトアビジン連結又はイオン結合のように非共有結合で）結合する、脂質膜に直接組み込む、又はナノ粒子の内部に含めることができる。好ましい実施形態では、標的化剤はマレイミド連結を通してＰＬＮの表面に化学共役することができる。
【００６３】
[0081]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子は、撮像又は治療的処置のために標的化剤を含み、特定領域にナノ粒子を選択的に濃縮することができる。画像指向化方法は、腫瘍又はアテローム斑の位置を決定する画像診断法に特に適している。標的化は、標的化をしない場合は他の器官に重大な二次作用を引き起こす可能性がある（そして引き起こす）有害物質の局所投与も促進し、このような薬物は例えばアンフォテリシンＢ又はＮＳＡＩＤ、又はデキサメタゾン、インスリン、ビタミンＥなどのように長期間にわたる投与が必要な薬物を含む。この方法は、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼなどの血栓溶解剤、又はタキソールなどの抗腫瘍性化合物の投与にも適している。
【００６４】
[0082]  ナノ粒子が溶解するまで薬剤及びアクチベータが分離されるように、プロドラッグ及びその他の非活性薬剤も、不活化ペプチドを除去するプロテアーゼのように、アクチベータとともにナノ粒子に組み込むことができる。あるいは、薬剤が標的部位でのみ選択的に活性化するように、薬剤及びアクチベータを様々な母集団のナノ粒子に組み込み、同じ位置を標的にすることができる。
【００６５】
[0083]造影剤
[0084]  幾つかの実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子が例えば診断用に、又は薬物送達中に治療を可視化するために、撮像を増強する物質も含むことができる。当技術分野で知られている任意の適切な造影剤をナノ粒子に組み込むことができる。それには、磁気共鳴イメージングに磁化率造影剤として使用するために、Ｍｎ+2、Ｇｄ+2、及びＦｅ+3などの常磁性イオンなどの常磁性物質が含まれる。ナノ粒子は、Ｘ線造影剤として使用するために、ヨウ素、バリウム、臭素又はタングステンなどの放射線不透過性金属イオンを含有することができる。
【００６６】
[0085]キャリア
[0086]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子は連結キャリアを含む。連鎖単体という用語は、ナノ粒子に対する連結剤、例えば標的化剤及び／又は治療剤として働く要素を含む。幾つかの実施形態では、連結キャリアは治療剤と標的化剤を連結する働きをする。幾つかの実施形態では、連結キャリアはナノ粒子に追加の有利な特性を与える。それらの追加となる利点の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、１）多価結合。これは、ｉ）複数の治療剤及び／又は標的化剤をナノ粒子（例えば同じ治療剤の幾つかのユニット、又は異なる治療要素の１つ又は複数のユニット）に結合して、標的部位に送達される治療要素の有効「ペイロード」を増加させるか、又はｉｉ）複数の標的化剤をナノ粒子（例えば同じ又は異なる治療剤の１つ又は複数のユニット）に結合する能力と定義される。更に、２）循環寿命の改善であり、これは細網内皮系による特定のクリアランス率を達成するために、粒子のサイズを調整することを含むことができる。
【００６７】
[0087]  幾つかの実施形態では、連結キャリアは生体適合性ポリマー（デキストランなど）、又は生体適合性成分の高分子集合体（ＰＬＮなど）である。連結キャリアの例としては、リポソームナノ粒子、重合リポソームナノ粒子、他の脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、キャッピングされたポリリシン、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、デキストラン、及びコーティングしたポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい連結キャリアは、重合リポソームナノ粒子である。別の好ましい連結キャリアはデンドリマーである。
【００６８】
[0088]  連結キャリアは、関連する特定の化学的性質に応じて、様々な方法で標的化剤及び／又は治療剤に結合することができる。結合は共有結合又は非共有結合とすることができる。標的化要素及び治療要素を連結キャリアに結合するのに適した様々な方法が、Hermansonの「Bioconjugate Techniques」（Academic Press、ニューヨーク、１９９６）、及びS.S. Wongの「Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking」（CRC Press、１９９３）に見られる。特定の結合方法としては、二官能性リンカーの使用、カルボジイミド濃縮、ジスルフィド結合の形成、及び対の一方の成分が連結キャリア側にあり、対の別の成分が治療成分又は標的化成分側にある特異的結合対、例えばビオチン−アビジン相互作用の使用などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
[0089]安定化要素
[0090]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子は安定化要素を含む。本明細書で使用する「安定化」とは、ナノ粒子に追加の利点、例えば物理的安定性、すなわち半減期の延長、コロイド安定性、及び／又は多価結合の容量、すなわち標的化剤を結合するために多数の部位があることによるペイロード容量の増加を与える能力を指す。安定化要素は高分子又はポリマーを含み、これは任意選択で、安定化要素をナノ粒子の表面に結合させる、及び／又はその後に治療剤及び／又は標的化剤を結合させるための化学的官能性を含むことができる。ポリマーは水溶液に対して生体適合性でなければならない。本発明のナノ粒子を安定化するために有用なポリマーは、天然、半合成（改質した天然）又は合成起源とすることができる。キサンタンガム、アカシア、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸塩、アルギン酸ナトリウム、カラゲーナン、ゼラチン、ガーゴム、トラガカントゴム、イナゴマメ、バソリン、カラヤゴム、アラビアゴム、ペクチン、カゼイン、ベントナイト、非精製ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマ、及びコロイド状ベントナイトなど、本発明で使用することができる様々な安定化要素が入手可能である。
【００７０】
[0091]  他の天然ポリマーとしては、例えばアラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリンなど）、レバン、フコイダン、カラゲーナン、ガラトカロロース、ペクチン酸、ペクチン、例えばアミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストロース、デキストリン、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンガム、澱粉及び、以下のアルドース、ケトース、酸又はアミンのうち１つ又は複数を含むような様々な他の天然ホモポリマー又はヘテロポリマー、すなわち、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキストロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸、及び天然に発生するそれらの誘導体などの天然に発生する多糖類が挙げられる。他の適切なポリマーには、アルブミンなどのタンパク質、ポリアルギネート、及びポリラクチド−グリコリドコポリマー、セルロース、セルロース（微晶性）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びカルシウムカルボキシメチルセルロースが含まれる。
【００７１】
[0092]  例示的半合成ポリマーには、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、及びメトキシセルロースが含まれる。本発明に使用するのに適切な他の半合成ポリマーには、カルボキシデキストラン、アミノデキストラン、デキストランアルデヒド、キトサン、及びカルボキシメチルキトサンが含まれる。
【００７２】
[0093]  例示的合成ポリマーにはポリ（エチレンイミン）及び誘導体、ポリホスファゼン、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイトポリマー、ポリエチレン（例えばポリエチレングリコール、すなわち、Pluronics.RTMと呼ばれ、BASF（ニュージャージー州パーシッパニー）から市販されているクラスの化合物、ポリオキシエチレン、及びポリエチレンテレフタレートなど）、ポリプロピレン（例えばポリプロピレングリコールなど）、ポリウレタン（例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニル及びポリビニルピロリドンなど）、ナイロンなどのポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ化炭化水素ポリマー、フッ化炭素ポリマー（例えばポリテトラフルオロエチレンなど）、アクリレート、メタクリレート、及びポリメチルメタクリレート、及びそれらの誘導体、ポリソルベート、カルボマー９３４Ｐ、珪酸アルミニウムマグネシウム、モノステアリン酸アルミニウム、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポビドン、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールが含まれる。ナノ粒子組成物を安定化させるためにポリマーを使用するナノ粒子の調製方法は、参照により上記開示の全体を本明細書に組み込むものとするUngerの米国特許第５，２０５，２９０号に記載され、そこで言及されているような当技術分野で知られている情報と組み合わせて、本開示を鑑み、当業者には容易に明白になる。
【００７３】
[0094]  幾つかの実施形態では、安定化要素はデキストランである。幾つかの実施形態では、安定化要素はアミノデキストランなどの変性デキストランである。他の好ましい実施形態では、安定化要素はポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）である。理論に拘束されることなく、デキストランはＰＥＧと同様の方法でナノ粒子の循環回数を増加できると考えられる。また、各ポリマー鎖（すなわち、アミノデキストラン又はサクシニル化アミノデキストラン）は標的化剤の多数の結合部位を含み、脂質構成全体のペイロードを増加させる能力を提供する。このペイロードを増加させる能力は、本発明の安定化剤をＰＥＧから差別化する。ＰＥＧの場合は結合部位が１つのみであり、したがってＰＥＧ（鎖毎に１つの結合部位がある）の標的化剤の負荷容量は、複数の結合部位があるポリマー系に対して制限される。
【００７４】
[0095]  幾つかの実施形態では、以下のポリマー及びそれらの誘導体が使用される。すなわち、ポリ（ガラクツロン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸−Ｌ−チロシン）、ポリ［Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸］、ポリ（イノシン酸カリウム塩）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エタノールスルホン酸ナトリウム塩）、ポリ（メチルヒドロシロキサン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、及びヒアルロン酸である。他の好ましい実施形態では、少なくとも１つの反応部位、及び好ましくはコポリマーをナノ粒子又は他の分子に結合する複数の反応部位を有するモノマーを含むコポリマーである。
【００７５】
[0096]  幾つかの実施形態では、ポリマーは、標的化剤、治療要素、タンパク質、又はＤＴＰＡのようなキレート剤、及びそれらの誘導体を結合するためのヘテロ又はホモ二官能性連結剤として作用することができる。
【００７６】
[0097]  幾つかの実施形態では、安定化要素は共有結合手段によってナノ粒子に関連付けられる。別の実施形態では、安定化要素は非共有結合手段によってナノ粒子に関連付けられる。標的化要素をナノ粒子に結合する共有結合手段は、当技術分野で知られ、参照により全体を本明細書に組み込み、「Stabilized Therapeutic and Imaging Agents」と題した米国特許公開第２０１０／０１１１８４０号で説明されている。
【００７７】
[0098]  標的化要素をナノ粒子と結合する非共有結合手段としては、イオン、水分子又は他の溶媒が媒介となるものなどの水素結合相互作用、疎水性相互作用、又はその任意の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
[0099]  幾つかの実施形態では、安定化剤はナノ粒子上にコーティングを形成する。
【００７９】
[00100]  幾つかの実施形態では、本発明のリポソームナノ粒子は凝集の傾向、血漿タンパクのオプソニン処理による結合、細胞による取り込み、及び血流内の安定性などのナノ粒子の特性を変質させるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などの機能性薬剤に連結することもできる。
【００８０】
[00101]他の薬剤
[00102]  幾つかの実施形態では、本発明のリポソームナノ粒子は、ナノ粒子の標的化、安定性、検出性又はエンドサイトーシスと、治療剤の活性、安定性又は特異性などを含むが、これらに限定されないナノ粒子の特性を調整する他の生物活性薬剤、薬剤キャリア、又は他の物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、本発明のリポソームナノ粒子は、細胞の取り込み又はエンドサイトーシスを増強するマーカを含むことができ、これは標的細胞又は組織によって実行することが好ましい。幾つかの実施形態では、ナノ粒子はナノ粒子と細胞膜との融合を増強する膜融合タンパク質を含むことができる。このような膜融合タンパク質の例としては、Ｇｐ４１、ＦＡＳＴ、ＳＮＡＰ、及びＳＮＡＲＥタンパク質、例えばＶＡＭＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、ナノ粒子はオプソニン又はそのフラグメントなどの活性化するとエンドサイトーシスをトリガする細胞表面受容体のリガンド、及び受容体が媒介するエンドサイトーシスをトリガすることができる任意のリガンドを含むことができる。このようなリガンドは、標的細胞又は組織内でどの受容体が発現するかに応じて変化することがあり、ＡＬＣＡＭ、脂質、ＬＤＬ、インスリン、ＥＧＦ、成長ホルモン、ＴＳＨ、ＮＧＦ、カルシトニン、グルカゴン、プロラクチン、ＬＨ、ＴＨ、ＰＤＧＦ、インターフェロン、カテコールアミン、トランスフェリン、トランスコバラミン、卵黄タンパク質、ウイルスタンパク質、毒素、及びその任意の誘導体などの受容体に対する抗体など、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡなどの抗体を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子のサイズは、標的細胞によって取り込まれているＨＰＬＮから治療剤のエンドサイトーシス及び放出を増強するように選択することができる。
【００８１】
[00103]  多数の治療剤を１つのリポソームナノ粒子に結合することができ、これもインビボで標的表面に付着するために数個から約１０００個の標的化剤を有することができる。複数の標的化要素によって伝達された結合の改善は、インビボで内皮細胞受容体への細胞付着を薬剤で遮断するために使用することもできる。これらの受容体の遮断は、炎症及び転移癌などの病理学的過程の制御に有用なことがある。例えば、多価シアリルルイスＸ誘導のナノ粒子を使用して、好中球の結合を遮断することができ、重合リポソームナノ粒子上のＶＣＡＭ−１に対する抗体を使用して、リンパ球結合、例えばＴ細胞を遮断することができる。重合ナノ粒子は、非特異的付着及び細網内皮系の取り込みを制御する基も含むことができる。例えば、リポソームのＰＥＧ化が循環半減期を延長することが示されている。例えば、参照により全体を本明細書に組み込むものとする国際特許出願ＷＯ９０／０４３８４号を参照されたい。
【００８２】
[00104]ＰＬＮの生成
[00105]  本明細書で説明するナノ粒子は、音波処理、剪断、高温又は低温均質化、乳化、蒸発、噴霧乾燥、不混和液の存在下での脂質溶液の振盪、又はその任意の組み合わせのように、当業者に知られている任意の適切な方法で調製することができる。脂質溶液は、このようにリポソームナノ粒子に組み込まれた治療剤又は他の物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、本明細書で説明するリポソームナノ粒子は、封入する溶液のミクロ液体流を包囲する脂質の水溶液中に集束させることにより調製される。生成されたナノ粒子が異質なサイズの母集団を形成する場合、ナノ粒子のサイズは、孔径が固定されたフィルタを通した押し出しなどにより更に調整することができる。好ましい実施形態では、ＰＬＮは適切な脂質を混合し、溶液を蒸発して薄膜を形成することにより集合させる。次に、薄膜を再懸濁して音波処理し、フィルタを通して押し出すことができる。
【００８３】
[00106]  集合時に、ナノ粒子は重合性脂質の架橋部分に応じて例えば２〜３５分間ＵＶ光で、又は任意の他の重合手段によって重合することができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子はＵＶ光により２、５、１０、１５、２０、３０、４５、５０又は６０分間で重合することができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子はＵＶ光により１、２、５、１０又は１５時間で重合することができる。ＵＶ露光が長いほど、一般的にナノ粒子がより硬質になる。ナノ粒子の組成物及び用途に応じて、ＵＶ露光の長さを変更することができる。ＵＶの波長はＵＶ波長の範囲内、すなわち２００〜４００ｎｍとすることができる。
【００８４】
[00107]  幾つかの実施形態では、本発明は重合リポソームナノ粒子を提供する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は１つ又は複数の脂質を含み、少なくともその１つは重合性である。重合性脂質は、当技術分野で知られている任意の適切な方法で重合することができる。例えば、重合性脂質は、触媒を添加して架橋を誘導する、必要なリンカー分子を添加するか、又は光架橋により、又はＵＶ光で重合することができる。幾つかの実施形態では、重合性脂質をＵＶ光で重合することができる。
【００８５】
[00108]  例示的実施形態では、ＵＶ 処理前に水溶液中のナノ粒子を９６ウェルプレートのウェルに分配し、ピペットで分散させることができる。次に、プレートを３０ＷのＴ８ＵＶ殺菌灯（General Electric、コネチカット州フェアフィールド）の真下６インチ（１５．２ｃｍ）に配置し、ＵＶ光に２〜５分、３０分、又は数時間も曝露することができる。
【００８６】
[00109]  幾つかの実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子はマイクロ液体流の集束により生成される。マイクロ液体流の集束は小さい口を通して不混和性流体を流し、物理的制約により一定間隔で粒子の摘み取りを引き起こすことにより、エマルジョンを生成する方法である。この方法は、マイクロエマルジョンの生成に使用され、成功している（Anna他、２００３、「Appl. Phys. Lett. 82, 364-366」、Gafian-Calvo他、２００１、「Phys. Rev. Lett. 87, 274501」、Garstecki 他、２００５、「Phys. Rev. Lett. 94, 164501」、Cubaud他、２００５、「Phys Rev. E72, 037302」）。粘度が粒子のサイズ及び分布を制御することが示されている（De Menech他、２００８、「J. Fluid Mech, 595, 141-161」）。したがって、脂質溶液の粘度を変化させることにより、ナノ粒子のサイズ及びサイズ分布を変化させることができる。油中に水があるエマルジョンでは、流量及び流の比率が粒子のサイズを制御することが示されている（Anna他、２００３、「Appl. Phys. Lett. 82, 364-366」）。この方法は、様々なパラメータを通してサイズ分布が制御されたナノ粒子を生成する。
【００８７】
[00110]  幾つかの実施形態では、ＰＬＮはマレイミド基を含む成分と集合させることができる。これらの成分をリポソーム中に集合させた後、治療剤を能動的に装填し、標的部分をマレイミド基に結合することができる。幾つかの実施形態では、システイン残基を含む標的薬剤を装填したＰＬＮとともにインキュベートすることができ、その結果、ＰＬＮ外面に共有結合した標的薬剤になる。
【００８８】
[00111]  幾つかの実施形態では、マレイミド基を使用せずに、ＰＥＧ化リポソーム又は重合したＰＬＮを使用して、治療剤を装填した標的化ＰＬＮを調製することができる。この方法が好ましいのは、マレイミド部分が水性緩衝剤中で迅速に分解し、マレイミド部分を含むＰＬＮの保存が更に困難になるからである。マレイミドを含有しないハイブリッドリポソーム又はＰＬＮに、治療剤を同様に装填し、任意選択で標的化剤を添加する前に長期間保存することができる。
【００８９】
[00112]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子はナノ粒子を標識ミセルに曝露することにより、標的化剤で標識することができる。例えば、Iden他、（「In vitro and in vivo comparison of immunoliposomes made by conventional coupling techniques with those made by a new post-insertion approach.」 Biochimica et Biophysica Acta 1513 (2001) 207-216）が説明するように、抗体又はダイアボディを標的化部分としてミセルに添加する。所望の還元した抗体又はダイアボディを調製した後、あるパーセンテージのマレイミド末端ＰＥＧ脂質を含有し、好ましくはナノ粒子の脂質を含む新しいミセル混合物の調整品とともに、タンパク質をインキュベートすることができる。これで生じた抗体共役ミセルを、次に薬物を装填したリポソームナノ粒子とともにインキュベートし、脂質の移動を可能にすることができ、これにより標的化タンパク質がナノ粒子の膜に組み込まれる。この方法は、経時劣化しない保存可能な大きなＰＬＮバッチの調製及び特徴付けを促進する。ミセル形成脂質は、標的化剤を調製するまで、乾燥粉末として保存することができる。次に、ミセル混合物を水和し、標的化剤とともにインキュベートして、いつでもＰＬＮを挿入することができるコンジュゲートを生成することができる。
【００９０】
[00113]一般的方法
[00114]  一態様では、本発明は、重合リポソームナノ粒子などのリポソームナノ粒子の作製及び使用に関する。本発明の一実施形態は、状態の分類、診断、予後、状態ステージの判断、治療に対する応答の判断、状態の転帰の監視及び予測にリポソームナノ粒子を使用することを含む。本発明の別の実施形態は、状態の転帰の監視及び予測に本明細書で説明するナノ粒子を使用することを含む。本発明の別の実施形態は、特定の疾患にどの薬物が有用であるかを判断するために、薬物スクリーニングに本明細書で説明するナノ粒子を使用することを含む。本発明の別の実施形態は、状態の治療に本明細書で説明するナノ粒子を使用することを含む。
【００９１】
[00115]  本明細書で使用する「動物」又は「動物被験体」又は「個体」という用語は、ヒト、更に他の哺乳類を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は１つ又は複数の状態の治療に１つ又は複数のナノ粒子を投与することを含む。薬剤の組み合わせを使用して、１つ又は複数の状態を治療する、又は組み合わせ中の１つ又は複数の薬剤の副作用を調節することができる。
【００９２】
[00116]  本明細書で使用する「治療」という用語及びその文法上同等の語は、治療上の利益及び／又は予防上の利益を達成することを含む。治療上の利益とは、治療中の基礎状態の根絶又は寛解を意味する。また、治療上の利益は、患者がまだ基礎状態に悩んでいる場合があっても、患者の改善が観察されるように、患者の基礎状態に関連する生理学的症状のうち１つ又は複数の根絶又は寛解により達成される。予防上の利益については、組成物は、特定の疾患を発現する危険を冒して患者に投与されるか、又は疾患の１つ又は複数の生理的症状を訴える患者に、この疾患の診断がまだ実行されていない場合であっても投与することができる。
【００９３】
[00117]  本明細書で使用する「診断する」又は状態の「診断」という用語は、状態を予測又は診断すること、状態の素因を判断すること、状態の治療を監視すること、疾患の治療の応答を診断すること、及び状態の予後、状態の進行、及び状態の特定の治療に対する応答を診断することを含む。
【００９４】
[00118]  幾つかの実施形態では、本発明はリポソームナノ粒子の単分散サイズ分布の母集団を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態では、重合ナノ粒子は、音波処理などの伝統的な手段を使用して生成され、その結果、多分散サイズ分布になる。
【００９５】
[00119]  幾つかの実施形態では、本発明は、重合リポソームナノ粒子（ＰＬＮ）の作製及び使用を提供する。本発明のＰＬＮは、インビボ及びインビトロの両方で様々な診断及び治療目的に使用することができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子表面における重合脂質の量を変化させることにより、脂質表面の機械的強度を向上させることができる。ＰＬＮは、標的化しないか、又は任意選択で標的部位を特異的に認識する標的化剤を含有することができ、それによって１つ又は複数の治療剤の撮像又は治療薬送達を選択的に増強することができる。
【００９６】
[00120]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子を使用して、診断目的の撮像を増強することができる。本発明のナノ粒子は、上述したような物質も含有して、例えば診断用などの撮像を増強するか、薬物送達中に治療を可視化することができる。
【００９７】
[00121]  例えば診断及び治療用途などでリポソームナノ粒子を生成し、それを使用するための重合性脂質を使用することには、幾つかの利点がある。臨床診断又は治療に使用するナノ粒子を作製する際に重合性脂質を使用すると、造影剤又は薬物／遺伝子送達媒体の特性が制御され、それによって所与の用途に合わせて特性を調節し、最適化することができる。幾つかのリポソームナノ粒子の特性の例には、機械的弾性、免疫系の取り込みに対するナノ粒子の集合及び非反応性の低下、循環時間量の増加、及び標的化リガンドの結合がある。
【００９８】
[00122]  幾つかの実施形態では、本発明は、様々なサイズ及び分布の重合リポソームナノ粒子の生成に使用することができる方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は診断及び治療目的における重合脂質の使用を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、様々な特性を得るために、脂質製剤の変更、脂質頭基へのＰＥＧの添加、又は重合脂質基の修飾を提供する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、標的化用途のために様々な化学的方法を通して抗体又はペプチドと共役するか、非特異的目的のために標的化部分がない状態で使用することができる。幾つかの実施形態では、薬物及び遺伝子治療における送達用途のために、脂質殻において局所化する脂肪親和性薬物を使用するか、又は薬物を殻に共有結合させるなど、ペイロードの装填に使用することができる。
【００９９】
[00123]  幾つかの実施形態では、本発明は、安定性が向上した重合リポソームナノ粒子を提供する。幾つかの実施形態では、安定性の向上は、重合脂質の分子部分を増加させることによって達成される。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分後もそのままである。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間後も残る。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は２日後もそのままである。
【０１００】
[00124]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の循環時間が増加している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分後もそのまま循環している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間後もそのまま循環している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は２日後もそのまま循環している。
【０１０１】
[00125]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は半減期が延長している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分の半減期を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間の半減期を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は２日間の半減期を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は２時間の半減期を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子の９０％は１時間後にそのままであるが、投与から３〜４時間後には系から完全に除去される。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、投与から１時間より前ではなく、３〜４時間後に完全に系から除去される。
【０１０２】
[00126]  幾つかの実施形態では、本発明は、治療剤を含むナノ粒子を提供する。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質との重量比は、約０．０００１：１〜約１０：１、又は約０．００１：１〜約５：１、又は約０．０１：１〜約５：１、又は約０．１：１〜約２：１、又は約０．２：１〜約２：１、又は約０．５：１〜約２：１、又は約０．１：１〜約１：１とすることができる。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質との重量比は１：２である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質との重量比は１：１である。幾つかの実施形態では、治療剤は脂質層中の油：薬物相中にある。何故なら、油と治療剤は両方とも疎水性だからである。幾つかの実施形態では、薬物と油との比率は１：２である。幾つかの実施形態では、薬物と油との比率は１：１である。
【０１０３】
[00127]  幾つかの実施形態では、本発明は治療剤を含むナノ粒子を提供する。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は約０．１３〜約０．１８である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は０．１５である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は０．２０である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は０．２５である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は０．３０である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は０．４５である。幾つかの実施形態では、治療剤と脂質とのモル比は０．５０である。
【０１０４】
[00128]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、生理学的状態で治療剤を保持する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、治療剤の５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％を保持する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は治療剤の少なくとも７０％を保持する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は治療剤の８０％を保持する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は治療剤の９０％を保持する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は治療剤の１００％を保持する。
【０１０５】
[00129]  幾つかの実施形態では、いかなる理論にも制限されることなく、重合は治療剤が生理学的状態で何日間も漏出を防止する。本発明の一部又は完全に重合したナノ粒子は、漏出に対して安定しているが、遠隔制御された薬物送達のために瞬時に放出することができる。重合は溶液中の安定性を向上させ、ナノ粒子の破壊に対する反撃を，補助する機械的安定性を増大させることができる。溶解速度は、殻中のポリマーの量を制御することによって調整可能である。
【０１０６】
[00130]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子の特性を最適化して、所与の用途のために効率を最大にする、標的部位における結合を最大にするために剛性を上昇又は低下させる、又は遺伝子送達を最適化するために安定性を調節する。
【０１０７】
[00131]  幾つかの実施形態では、本発明は重合脂質殻及び液体を含むナノ粒子を提供し、液体は殻に入れられる。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の重合性脂質を含む。重合性脂質の例としては、ジインＰＣ及びジインＰＥ、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ナノ粒子の重合脂質殻は少なくとも１つの重合性脂質及び少なくとも１つの非重合性脂質を含み、約５〜５０％のパーセンテージの重合性脂質を有する。幾つかの実施形態では、重合性脂質のパーセンテージは、ナノ粒子を作製する脂質混合物合計の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０である。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２５％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも５０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つの重合性脂質はジアセチレン脂質である。
【０１０８】
[00132]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は１つ又は複数の負荷電リン脂質を含む。負荷電リン脂質の例としては、ジパルミトイル及びジステアロイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）、ジパルミトイル及びジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳ）、ジパルミトイル及びジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ）などのホスファチジルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
[00133]  一実施形態では、少なくとも１つの非重合性脂質はＬ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ２０００（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００又はＰＥ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの群から選択される。一実施形態では、重合脂質殻は約１〜２０％のＰＥＧ化脂質のパーセンテージを含む。幾つかの実施形態では、ナノ粒子中のＰＥＧ化脂質のパーセンテージは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０である。一実施形態では、脂質は非重合性でＰＥＧ化される。一実施形態では、脂質は重合性であり、ＰＥＧ化される。
【０１１０】
[00134]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも５％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも１０％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２５％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも３０％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約１％〜約１５％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約５％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約６％の負荷電脂質を含む。
【０１１１】
[00135]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約２％の負荷電脂質及び約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約５％の負荷電脂質及び約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約１０％の負荷電脂質及び約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約２５％の負荷電脂質及び約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約３０％の負荷電脂質及び約１５％〜約２０％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は同じパーセンテージの負荷電脂質と重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、負荷電脂質と重合性脂質は同じである。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は少なくとも２つの負荷電脂質を含むが、２つの負荷電脂質のうち一方のみが重合性である。
【０１１２】
[00136]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約１５％〜約２０％の重合性脂質、約１〜１５％の負荷電脂質、約２０〜４５％の中性荷電脂質及び約３０〜６０％の双性荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、重合性脂質はＣ２５尾部脂質である。幾つかの実施形態では、負荷電脂質はＣ１８尾部脂質である。幾つかの実施形態では、双性荷電脂質はＣ１８尾部脂質である。幾つかの実施形態では、重合性脂質はジアセチレン脂質である。
【０１１３】
[00137]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約１５〜約２０％の１０，２０−ペンタコサジイオン酸誘導体及び約３０％〜約４０％の飽和リン脂質を含む。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は約１５％のＣ２５尾部脂質及び約５０〜約５５％のＣ１８尾部脂質を含む。
【０１１４】
[00138]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は３．５：１の比率の少なくとも２つの脂質を含み、これは尾部のサイズが少なくとも炭素数７個分異なる。幾つかの実施形態では、一方の脂質がＣ２５尾部脂質であり、他方の脂質がＣ１８尾部脂質である。
【０１１５】
[00139]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は標的化剤及び治療剤を含み、重合脂質ナノ粒子は従来のリポソームＰＥＧ化製剤の少なくとも２倍の力価を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は標的化剤及び治療剤を含み、治療剤と脂質とのモル比は０．１５である。
【０１１６】
[00140]  一実施形態では、ナノ粒子は標的化剤（例えば細胞受容体のリガンド）と共役し、共役は標的化剤を脂質殻につなぐ（tether）ことによって実行される。標的化剤をリポソームナノ粒子につなぐ方法は当技術分野で周知であり、例えばカルボジイミド、マレイミド、又はビオチン−ストレプトアビジン結合を使用する（Klibanov、２００５、「Bioconjug. Chem.」、16, 9-17）。ビオチン−ストレプトアビジンは最も普及した結合方式である。何故なら、ストレプトアビジンに対するビオチンの親和性が非常に強力であり、リガンドにビオチンで標識することが容易だからである。幾つかの実施形態では、標的化剤は、モノクローナル抗体、及び対象とする細胞タイプ、例えば炎症細胞、血管系細胞、又は腫瘍細胞によって発現した受容体（例えばＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−選択）に結合する他のリガンドを含む。
【０１１７】
[00141]  幾つかの実施形態では、標的化剤は、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、標的化剤は細胞表面分子に特異的である。幾つかの実施形態では、標的化剤はエンドサイトーシス及び／又は細胞膜融合を増強する。
【０１１８】
[00142]  一実施形態では、ナノ粒子は治療剤（例えば、薬物又は化学物質）又は任意の要素を殻中に封入する。幾つかの実施形態では、殻中の治療薬物又は要素はナノ粒子によって標的位置に送達される。
【０１１９】
[00143]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は対象への投与から約１、５、１０、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０分後に標的細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は対象への投与から約１、１．５、２、２．５、３、３．５、又は４時間後に標的細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は対象への投与から約３０分後に標的細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は対象への投与から約６０分後に標的細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は対象への投与から約２時間後に標的細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子は対象への投与から約４時間後に標的細胞のエンドソーム区画に取り込まれる。
【０１２０】
[00144]  幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子中の治療剤は、標的細胞への取り込みから約１、５、１０、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０分後に標的細胞内に放出される。幾つかの実施形態では、重合脂質ナノ粒子中の治療剤は、標的細胞への取り込みから約１、１．５、２、２．５、３、３．５又は４時間後に標的細胞内に放出される。
【０１２１】
[00145]  一実施形態では、ナノ粒子は作製後約２〜３５分間ＵＶ処理して、脂質殻を重合する。殻内に様々な／所望のレベルの重合を達成するために、２．０分から数時間の間のいずれかの期間だけ、形成したナノ粒子をＵＶ処理できることが理解される。幾つかの実施形態では、ナノ粒子を約２、５、１０、１５、２０、３０、４５、５０又は６０分間ＵＶ処理する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約１、２、５、１０又は１５時間ＵＶ処理する。ＵＶ波長は、ＵＶ波長の範囲内、すなわち２００〜４００ｎｍとすることができる。殻の材料はナノ粒子の機械的弾性に影響する。殻の重合のレベルは機械的弾性に影響する。ＵＶ処理の時間を変化させることにより、殻の重合の量を調整することができ、例えば低重合にするには２又は３分間、高重合にするには４〜３０分間になる。一実施形態では、ナノ粒子を約２分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約３分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約４分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約５分間ＵＶ処理する。他の実施形態では、ナノ粒子を約２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８又は４．９分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約１０分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約２０分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約３０分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約６０分間ＵＶ処理する。別の実施形態では、ナノ粒子を約２時間ＵＶ処理する。
【０１２２】
[00146]  一実施形態では、ナノ粒子は約４００〜５８０μｍの波長で吸光性を有する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は約４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０又は５８０μｍの波長で吸光性を有する。一実施形態では、約４００〜５８０ｎｍでの波長の吸光性は、ナノ粒子の殻を形成する重合性脂質の重合が成功したことの指標である。これは、重合性脂質がジアセチレン脂質である場合、特に当てはまる。別の実施形態では、ナノ粒子は青又は紫に見え、青は重合したジアセチレン脂質の一形態を示し、紫は重合したジアセチレン脂質の赤と青の形態の混合物を示す。
【０１２３】
[00147]  一実施形態では、リポソームナノ粒子の集合は単分散であり、単分散度は集合中のナノ粒子の平均サイズの約２０％である。一実施形態では、ナノ粒子の集合は単分散であり、単分散度は集合中のナノ粒子の平均サイズの約１５％である。一実施形態では、ナノ粒子の集合は単分散であり、単分散度は集合中のナノ粒子の平均サイズの約１０％である。一実施形態では、ナノ粒子の集合は単分散であり、単分散度は集合中のナノ粒子の平均サイズの約５％である。一実施形態では、ナノ粒子の集合は単分散であり、単分散度は集合中のナノ粒子の平均サイズの約１％である。
【０１２４】
[00148]  幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の９０％は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の９０％は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の９０％は、２日後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の８０％は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の８０％は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間後もそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の８０％は、２日後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の５０％は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の５０％は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間後にもそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の５０％は２日後もそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の９０％は９０分後もそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の５０％は１５時間後もそのままである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の５０％は２日後もそのままである。
【０１２５】
[00149]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は循環時間が延長している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分後もそのまま循環している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間後もそのまま循環している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は２日後もそのまま循環している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合の９０％が約３から４時間後もそのまま循環している。
【０１２６】
[00150]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は半減期が延長している。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は、２、３、４、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０分という半減期を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０時間という半減期を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は、２日間という半減期を有する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子の集合は、約３〜４時間後もそのまま循環しているが、その後に系から排出される。
【０１２７】
[00151]  幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約３０ｎｍ〜５μｍである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約５０ｎｍ〜５μｍである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約３０ｎｍ〜１．５μｍである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約５０ｎｍ〜１２０ｎｍである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約９０ｎｍである。幾つかの実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約１００ｎｍである。別の実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約１１０ｎｍである。他の実施形態では、集合中のナノ粒子の平均サイズは約９０、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６又は１１０ｎｍである。
【０１２８】
[00152]  幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は約１５％の重合性脂質を含む。幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は約２０％の重合性脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つの重合性脂質はジアセチレン脂質である。
【０１２９】
[00153]  幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は１つ又は複数の負荷電脂質を含む。一実施形態では、集合のナノ粒子は約１〜２０％というＰＥＧ化脂質のパーセンテージを有する。
【０１３０】
[00154]  幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は少なくとも２％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は少なくとも５％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は少なくとも１０％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は少なくとも２５％の負荷電脂質を含む。幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は少なくとも３０％の負荷電脂質を含む。
【０１３１】
[00155]  幾つかの実施形態では、集合のナノ粒子は本明細書で説明するようなナノ粒子を含む。
【０１３２】
[00156]薬物送達
[00157]  幾つかの実施形態では、１つ又は複数の治療剤を、脂質層に組み込まれたナノ粒子の表面に結合するか、又は脂質殻中に捕捉することができる。ナノ粒子は、ナノ粒子を標的部位に補充する１つ又は複数の標的化剤を更に含むことができる。
【０１３３】
[00158]  治療剤は任意選択で、ナノ粒子を破壊せずにナノ粒子から解放することができる。ナノ粒子内に封入された薬剤が脂質膜を通過できるように、ナノ粒子を振動又は分裂させることができる。脂質に結合した薬剤を、酵素加水分解などによってナノ粒子表面から分割することができる。
【０１３４】
[00159]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子を標的細胞によるエンドサイトーシス又は食作用に曝露することができる。ナノ粒子は、エンドサイトーシスを増強する膜タンパク質などのマーカを含むことができる。好ましい実施形態では、マーカはＡＬＣＡＭである。エンドサイトーシス後、ナノ粒子は標的細胞のエンドソーム又はリソソームのような膜媒体中に存在する。幾つかの実施形態では、次にナノ粒子はエンドソーム膜と融合して、その内容を細胞質中に放出することができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子をエンドソーム内で分裂させて、その内容をエンドソーム内に放出することができ、ここで薬物又は他の治療剤がエンドソームから他の細胞区画又は細胞質へと拡散するか、又は移動することができる。幾つかの実施形態では、薬物又は他の治療剤は、ｐＨが低下すると、エンドソームがエンドサイトーシス路を通って進行し、例えば後期エンドソーム又はリソソームになるにつれて生じ得るように、ナノ粒子から放出することができる。幾つかの実施形態では、薬物又は他の治療剤は、リソソーム加水分解酵素などの酵素力によってナノ粒子から放出することができる。このような放出は、例えば薬物又は治療剤とナノ粒子との結合を破壊するか、又はナノ粒子全体を分裂させることによって実行することができる。幾つかの実施形態では、薬物又は治療剤はナノ粒子から膜小胞の残りの部分へと、及び任意選択で小胞から細胞の他の領域へと拡散することができる。
【０１３５】
[00160]  幾つかの実施形態では、リポソームナノ粒子は細胞膜と融合することができる。幾つかの実施形態では、膜融合はナノ粒子の内容を細胞質内に直接放出することができる。幾つかの実施形態では、薬物又は治療剤は共有結合又は非共有結合でナノ粒子膜の成分に結合することができ、膜融合後に細胞膜に組み込むことができる。薬物又は治療剤は、例えば受容体のエンドサイトーシス又は能動的輸送によって、任意選択で細胞に取り込まれることができる。
【０１３６】
[00161]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子の脂質組成物は薬物の装填又は送達を改善するように選択することができる。幾つかの実施形態では、ＰＣＤＡ脂質含有率を上昇させて、ナノ粒子の力価を上昇させることができる。幾つかの実施形態では、重合性脂質の濃度は薬物装填の効率を改善するために約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満とすることができる。
【０１３７】
[00162]組成物
[00163]  本発明はまた、本発明の治療／診断薬剤を含む治療／診断用組成物も指向する。ナノ粒子のサイズは、用途によって異なってもよい。一般的な血管撮像及び治療の場合、サイズは直径約３０ｎｍ〜約１０μｍの範囲、好ましくは直径約２μｍと約５μｍの間とすることができる。幾つかの実施形態では、サイズは約２μｍ〜約４μｍの範囲とすることができる。幾つかの実施形態では、腫瘍、又は肝臓などの器官に適用する場合、比較的小さいナノ粒子（直径２μｍ未満）が好ましい。直腸内又は鼻腔内の撮像又は送達に使用する場合は、直径約１００μｍ以内の比較的大きいナノ粒子を使用することができる。
【０１３８】
[00164]   幾つかの実施形態では、本発明の治療用送達システムは、水又は食塩水などの水性懸濁液（例えばリン酸緩衝食塩水）の形態で投与される。水は無菌であることが好ましい。また、食塩水は等張食塩水であることが好ましいが、所望に応じて食塩水は低張食塩水（例えば約０．３〜約０．５％のＮａＣｌ）でもよい。溶液は、約ｐＨ５〜約ｐＨ７．４のｐＨ範囲にするために、所望に応じて緩衝することもできる。更に、媒質にデキストロースが含められることが好ましい。ＰＳＭの投与に使用することができる他の溶液には、アーモンド油、トウモロコシ油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、ピーナツ油、杏仁油、ゴマ油、ダイズ油、及びスクアレンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
[00165]  本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、アジュバント及び／又はキャリアなどの他の化合物も含むことができる。例えば、本発明の組成物は治療する動物が耐性を示すことができる賦形剤で処方することができる。このような賦形剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、マンニトール、ハンクス液、及び他の生理的平衡食塩水が挙げられる。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、又はトリグリセリドなどの非水系媒体も使用することができる。有用な他の製剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの増粘剤を含む懸濁液がある。賦形剤は、等張性及び化学的安定性を増大させる物質などの少量の添加剤も含むことができる。緩衝剤の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン、クエン酸、及びグリシン、又はそれらの混合物が挙げられ、保存剤の例としては、チロメサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方は、注射液、又は注入するために懸濁液又は溶液として適切な液体に取り込むことができる固体とすることができる。したがって、非液体の処方では、賦形剤はデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤などを含むことができ、投与前にそれらに滅菌水又は食塩水を添加することができる。
【０１４０】
[00166]  本発明の一実施形態では、組成物はアジュバント又はキャリアなどの免疫賦活薬も含むことができる。アジュバントは通常、特定の抗原に対する免疫反応を一般的に増強させる物質である。適切なアジュバントとしては、フロイントのアジュバント、他の細菌細胞膜成分、アルミニウム系塩、カルシウム系塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド、血清タンパク質、ウイルス外殻タンパク質、他の細菌由来の製剤、ガンマインターフェロン、ハンターのタイターマックスアジュバント（VaxcelTM, Inc.、ジョージア州ノークロス）などのブロック共重合体アジュバント、Ribiアジュバント（モンタナ州ハミルトンのRibi ImmunoChem Research, Inc.から入手可能）、Quil A（デンマークのSuperfos Biosector A/Sから入手可能）などのサポニン及びそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。キャリアは通常、治療動物の体内で治療用組成物の半減期を延長する化合物である。適切なキャリアとしては、ポリマー制御放出製剤、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、油、エステル、及びグリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
[00167]  本発明の一実施形態は、本発明の組成物を動物の体内にゆっくり放出することができる制御放出製剤である。本明細書で使用する制御放出製剤は、制御放出媒体中の本発明の組成物を含む。適切な制御放出媒体としては、生分解性ポリマー、他のポリマー基質、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフィア、経皮送達システムが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の他の制御放出製剤には、動物に投与するとその場で固体又はゲルを形成する液体が含まれる。好ましい制御放出製剤は生分解性（すなわち、生侵食性）である。
【０１４２】
[00168]  一般的に、本発明で使用する治療／診断薬剤は、有効量が動物に投与される。一般的に、有効量とは（１）治療を目指す状態の症状を軽減する、（２）治療を目指す状態の治療に関連する薬理学的変化を誘発する、又は（３）インビボ又はインビトロでナノ粒子を検出するのに有効な量である。例えば癌の場合、有効量は腫瘍のサイズを縮小するか、腫瘍の成長速度を低減するか、転移を防止又は抑制するか、又は罹患動物の余命を延長するのに有効な量を含む。
【０１４３】
[00169]  治療／診断薬剤の有効量は所望の効果をもたらすのに十分な任意の量又は容量とすることができ、部分的には癌の状態、タイプ及び位置、患者のサイズ及び状態、並びに当業者に容易に分かる他の要素によって決定される。投与量を単一用量で、又は数回の容量で、例えば数週間にわたって分割して与えることができる。
【０１４４】
[00170]  本発明はまた、本発明の治療用組成物を使用した治療方法も指向する。方法は、治療剤をこのような投与を必要とする対象に投与することを含む。
【０１４５】
[00171]  本発明の治療剤は、例えば非経口、表面、経口又は局所投与、例えば注射又はエアロゾルによる皮内投与など、本明細書で説明する任意の適切な手段で投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、薬剤を注射で投与する。このような注射は、任意の患部に局所的に投与することができる。治療用組成物は、投与方法に応じて様々な単位量形態で投与することができる。例えば、動物の経口投与に適切な単位量形態には粉末、錠剤、丸剤及びカプセルが含まれる。本発明の治療用組成物に好ましい送達方法には、静脈内投与、及び例えば注射又は表面投与による局所投与が含まれる。特定の送達モードでは、本発明の治療用組成物を本発明の賦形剤で処方することができる。本発明の治療試薬は、任意の動物、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトに投与することができる。
【０１４６】
[00172]  特定の投与モードは、治療する状態に応じて決定される。本発明の薬剤の投与は、任意の体液を介して、又は体液を通してアクセス可能な任意の標的又は任意の組織を介して実行できることが想定される。
【０１４７】
[00173]  本発明の細胞表面標的治療剤の好ましい投与経路は、静脈内、腹膜内、又は皮下注射によるものであり、それには静脈又はリンパ系への投与が含まれる。標的薬剤は、例えば滑液、眼液、又は髄液など、任意の流体、体組織、及び体腔内に存在するマーカに集束するように設計することができる。したがって、例えば薬剤を髄液に投与することができ、抗体は髄液からアクセス可能な病理部位を標的にする。例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）−血液バリアの脈絡膜叢内皮に位置する標的の場合、鞘内送達、すなわち脊髄及び脳が浸されている脳脊髄液への投与が適切なことがある。
【０１４８】
[00174]  体液を通した投与の１つの治療経路の一例は、治療する状態がリウマチ様関節炎である場合である。本発明のこの実施形態では、本発明はリウマチ様関節炎に罹患した人々の炎症性滑液の治療に治療剤を提供する。このタイプの治療剤は放射線滑膜切除用薬剤である。滑液を通る投与経路は変形性関節炎の治療にも有用な場合がある。炎症を抑制する、分解酵素を阻害する、及び疼痛を軽減するために標的キャリアを滑液に注入することによって薬剤を送達することが、本発明の幾つかの実施形態で想定されている。
【０１４９】
[00175]  もう１つの投与経路は眼液を通る。目の血管系を標的とする場合、標的は血管系のいずれかの側に存在し得ることを認識されたい。目の組織への本発明の薬剤送達は、静脈内、眼、及び表面など、多くの形態で実行することができる。眼表面投与の場合、本発明の薬剤は、水性懸濁点眼液のような水性点眼液、粘性点眼液、ゲル、水溶液、エマルジョン、軟膏などの形態で調製することができる。このような処方の調製に適切な添加剤が当業者に知られている。目の徐放性送達システムの場合、徐放性送達システムを眼瞼の下に配置するか、結膜、鞏膜、網膜、視神経鞘に、又は眼内又は眼窩内の位置に注射することができる。目への薬剤の硝子体内送達も想定される。このような硝子体内送達法が当業者に知られている。送達は、Averyに帰される米国特許第６，２５１，０９０号に記載されているような装置を介した送達を含むことができる。
【０１５０】
[00176]  他の実施形態では、本発明の治療剤は遺伝子治療に有用である。本明細書で使用する「遺伝子治療」という用語は、遺伝的又は後天的状態を治療又は防止するために対象とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を受容者に移送することを指す。対象とする遺伝物質は、インビボで生成することが望ましい生成物（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチド又は機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば、対象とする遺伝物質は治療的価値があるホルモン、受容体、酵素又はポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、本発明は、参照により全体を本明細書に組み込むものとするHughes他の米国特許第６，１６９，０７８号に記載されているように核酸と合成することができる非ウイルス性遺伝子治療で使用するために、あるクラスの脂質分子を使用することができ、この場合、脂質の極性頭基と脂肪親和性尾部基との間にジスルフィドリンカーを設ける。
【０１５１】
[00177]  本発明のこれらの治療化合物は、ＤＮＡと効果的に合成され、異種ＤＮＡで形質転換する細胞の細胞内空間へのＤＮＡの細胞膜を通した移動を促進する。更に、これらの脂質分子は、細胞質内の異種ＤＮＡの放出を促進し、それによりヒト又は動物の遺伝子治療中の遺伝子移入を増加させる。
【０１５２】
[00178]  本発明のリポソームナノ粒子は、乾燥状態で保存するか、又は蒸留水などの様々な溶液中、又は水溶液中に懸濁させることができる。水溶液はＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸塩、酢酸、クエン酸、リン酸塩、重炭酸塩、又は他の緩衝剤によって適切なｐＨ範囲（約５〜約７．４）へと緩衝することができ、等張性（約０．９％のＮａＣｌ）又は低張性（約０．３〜約０．５％のＮａＣｌ）塩濃度を含むことができる。
【０１５３】
[00179]  溶液はまた、乳化剤及び／又は可溶化剤を含んでもよい。このような薬剤としては、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ及びジグリセリド、モノ−エタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマ、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５カストール油、ポリオキシル１０オキシルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、二酢酸プロピレングリコール、一酢酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、及び乳化ワックスが挙げられるが、これらに限定されない。脂質又はナノ粒子溶液とともに使用することができる懸濁剤及び／又は増粘剤としては、アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース、カルシウム及びナトリウム及びナトリウム１２、カラギーナン、セルロース、デキストリン、ゼラチン、ゴーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、珪酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化シリコン、アルギン酸ナトリウム、トラガカンス、及びキサンタンガムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
[00180]  細菌発育阻止剤もナノ粒子に含めて、保存時の細菌分解を防止することができる。適切な細菌発育阻止剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、メチルパラベン、フェノール、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、及びソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
[00181]投与
[00182]  上記方法は、例えば状態の診断及び／又は治療のために、１つ又は複数のナノ粒子を投与することを含む。幾つかの実施形態では、例えば他の治療剤などの他の薬剤も投与する。２つ以上の薬剤を同時投与する場合は、任意の適切な方法で、例えば別個の組成物として、同じ組成物で、同じ投与経路により、又は異なる投与経路により同時投与することができる。
【０１５６】
[00183]  本発明のナノ粒子は、血管内、リンパ管内、腸管外、皮下、筋肉内、鼻腔内、直腸内、腹膜内、間質、ネブライザを介して気道内に、高圧、経口、表面、又は腫瘍内などの様々な方法で様々な投薬形態を用いて投与することができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子を静脈注射する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子を動脈注射する。ナノ粒子は、組織生検を使用する診断に有用な場合のように、インビトロで使用することもできる。
【０１５７】
[00184]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、例えば急性状態の治療の場合、単一用量で投与する。通常、このような投与は注射によって実行する。しかし、他の経路も適宜使用することができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は複数用量で投与する。投薬は１日に約１回、２回、３回、４回、５回、６回又は７回以上とすることができる。投薬は１カ月に約１回、２週間に１回、１週間に１回、又は１日おきに１回とすることができる。一実施形態では、ナノ粒子は１日に約１回から１日に約６回投与する。別の実施形態では、ナノ粒子の投与は約７日間未満継続する。更に別の実施形態では、投与は約６日、１０日、１４日、２８日、２カ月、６カ月、又は１年を超えて継続する。幾つかの事例では、継続的投薬を必要な限り長く達成して維持する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は連続的に、又は脈動により、例えばミニポンプ、パッチ又はステントで投与する。
【０１５８】
[00185]  本発明のナノ粒子の投与は必要な限り長く継続することができる。幾つかの実施形態では、本発明の薬剤は１、２、３、４、５、６、７、１４、２８日又は１年を超えて投与する。幾つかの実施形態では、本発明の薬剤は２８、１４、７、６、５、４、３、２又は１日未満だけ投与する。幾つかの実施形態では、本発明の薬剤は、例えば慢性効果の治療の場合、継続的に慢性投与する。
【０１５９】
[00186]  診断及び／又は治療を連続的に、例えば治療後の一連の診断検査として実行する必要がある場合、診断及び／又は治療は、固定した間隔で、最も新しい１回又は複数の診断検査の状態によって、又は個体の他の特徴によって決定された間隔で、又はその何らかの組み合わせで実行することができる。例えば、診断及び／又は治療は約１、２、３又は４週間の間隔で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１カ月の間隔で、約１、２、３、４、５、又は６年以上の間隔で、又はその何らかの組み合わせで実行することができる。間隔は、診断及び／又は治療に対する個体の可用性、及び診断／治療施設の可用性にしたがって厳密でなくてもよく、したがって意図された間隔体系に対応するおおよその間隔が本発明に含まれることが認識される。一例として、癌の治療を受けてきた個体は、治療後の最初の６カ月から１年間は比較的頻繁に（例えば、毎月又は３カ月毎に）検査／治療し、次に異常が発見されない場合、その後は頻度を下げることができる（例えば、６カ月と１年の間の時間）。しかし、その間の任意の時に何らかの異常又は他の状況が発見された場合、間隔を変更することができる。
【０１６０】
[00187]  一実施形態では、定期検査中に明らかに健康な個体で診断検査を実行し、個体の全体的健康状態を評価するように分析することができる。別の実施形態では、診断検査を実行して、一般的に発生する疾患をスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングは、単一の疾患、関連する疾患群の検査、又は複数の関連のない疾患の一般的スクリーニングを含むことができる。スクリーニングは毎週、２週間毎、毎月、２カ月毎、数カ月おき、毎年、又は数年の間隔で実行することができ、既存のスクリーニングの様式と置き換わるか、又はそれを相補することができる。
【０１６１】
[00188]  投与したナノ粒子製剤が選択部位に向かう循環中の進行は、本明細書に記載したものを含めて当技術分野で知られている任意の適切な方法で、例えば超音波映像手段によって、又は製剤がこのような撮像用の薬剤を含む場合はＭＲＩ又はＸ線撮影によって監視することができる。幾つかの実施形態では、投与したナノ粒子製剤の選択部位に向かう循環は、超音波映像手段を使用して監視する。超音波照射は、反射エコー信号を同時に監視し、それにより照射部位の画像を提供するような構成である改造型超音波検査用プローブで実行することができる。監視信号は１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲でよく、２ＭＨｚと７ＭＨｚの間であることが好ましい。
【０１６２】
[00189]  投与する脂質ナノ粒子の有用な用量及び投与モードは、年齢、体重、及び治療する哺乳類、及び意図される特定の用途（治療／診断）に応じて変化する。通常、用量は比較的低レベルで開始し、所望の治療効果又は診断感度が達成されるまで増加させる。
【０１６３】
[00190]状態
[00191]  幾つかの実施形態では、本発明は状態の診断及び／又は治療のための組成物及び方法を提供する。
【０１６４】
[00192]  幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は例えば腫瘍を視覚化するために、ＭＲＩ又は他の撮像技術で使用することができる。治療目的にリポソームナノ粒子を使用することを制限する可能性があるのは、微小な泡に結合可能な薬物又は他の治療剤のみである。幾つかの非限定的な例として、血管新生抑制薬に連結したナノ粒子を腫瘍の治療に使用することができ、抗アテローム性硬化症剤に連結したナノ粒子を血管内のプラークの治療に使用することができ、又は局所麻酔薬に連結したナノ粒子を対象とする特定領域を麻酔するために使用することができる。ＰＬＮなどのナノ粒子は極めて高い安定性を有することができるので、一定で好ましくは低用量の治療薬を提供するために、徐放性カプセルとして使用するのに投与することもできる。
【０１６５】
[00193]  本明細書で説明する方法、システム及び組成物は、例えばアテローム性動脈硬化症などの状態の診断及び治療に使用することができる。アテローム性動脈硬化症は動脈の慢性炎症であり、プラーク形成及び破裂の結果、心臓発作及び脳卒中になることがある。研究で米国の成人の大多数がアテローム硬化型病変を有することが示されている（Tuzcu他、２００１、Circulation 103, 2705-2710）。現在の診断技術は、患者へのリスクを判断するためにプラークのサイズに集中している。しかし、破壊しやすいプラークが安定したプラークと異なるのは分子組成であって、サイズではない（Virmani他、２００６、J. Am. Coll. of Card. 47, C13-18）。このような理由から、心血管系の分子撮像は、脆弱なプラークを識別する手段を提供し、現在の技術に対して大幅な改良となる。プラークの標的撮像のために、アテローム性動脈硬化症のプラークを標的にしたナノ粒子に、ＭＲＩ検出を増強する造影剤を装填することができる。
【０１６６】
[00194]  撮像への適用に加えて、標的化したリポソームナノ粒子は薬物送達用途のために循環系に使用することができる。動脈閉塞を治療する血管形成及び／又はステント術の後には、往々にして再狭窄が発生し、動脈が再び閉塞する。例えば頚動脈血管形成及びステント術の後、１年後の再狭窄率は約６パーセントである（Groschel他、２００５、Stroke 36, 367-373）。薬剤溶出ステントは再狭窄のリスクを低下させてきたが、血栓形成性及び炎症の可能性があるので、長期安全性の懸念が生じる。最近のステント内血栓症は薬物溶出ステントより高い場合があり、剥き出しの金属ステントに対して１年後の発生率が４倍であると記録された報告が１件ある（Carlsson他、２００７、Clin. Res. Cardiol. 96, 86-93）。問題を悪化させる可能性がある追加ステントの配置の必要性をなくすために、パクリタキセルを炎症部位に送達する代替方法が現在の研究の主題となっている（Herdeg他、２００８、Thrombosis Res. 123, 236-243；Spargias他、２００９、J. Interv. Cardiol. 22, 291-298；Unverdorben他、２００９、Circulation 119, 2986-2994）。本発明のナノ粒子を使用して、再狭窄の可能性がある部位にパクリタキセルなどの薬剤を選択的に投与することができる。この非侵襲的方法は、損傷部位で再狭窄を防止するのにより安全な送達ツールを提供することができる。
【０１６７】
[00195]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子を炎症状態の治療に使用する。例えば、ナノ粒子を使用して脳脊髄炎を治療することができる。更に、他の実施形態ではナノ粒子を閉塞性肺疾患の治療に使用する。これは、完全には可逆性でない空気流の制限を特徴とする病態である。空気流の制限とは通常、漸進性であると同時に、有毒粒子又はガスに対する肺の異常な炎症反応を伴う。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）とは、空気流の障害又は制限を特徴とする気道疾患の群の包括的用語である。この包括的用語に含まれる状態には、慢性気管支炎、肺気腫、及び気管支拡張症がある。
【０１６８】
[00196]  別の実施形態では、ナノ粒子を喘息の治療に使用する。また、ナノ粒子を内毒素血症及び敗血症の治療に使用する。一実施形態では、ナノ粒子をリウマチ様関節炎（ＲＡ）の治療に使用する。別の実施形態では、ナノ粒子を乾癬の治療に使用する。更に別の実施形態では、ナノ粒子を接触性又はアトピー性皮膚炎の治療に使用する。接触性皮膚炎には、刺激性皮膚炎、光毒性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、光アレルギー性皮膚炎、接触性蕁麻疹、全身性接触型皮膚炎などが含まれる。皮膚が特定の物質に対して敏感な場合、皮膚上に使用する物質が多すぎると刺激性皮膚炎が生じる場合がある。アトピー性皮膚炎は湿疹と呼ばれることもあり、ある種の皮膚炎、すなわちアトピー性の皮膚疾患である。
【０１６９】
[00197]  更に、ナノ粒子は糸球体腎炎の治療に使用することができる。また、ナノ粒子は滑液嚢炎、狼瘡、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、小児脂肪便症、クローン病、糖尿病（１型）、グッドパスチャ症候群、甲状腺機能亢進症、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、眼球クローヌス筋クローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オード甲状腺炎、変形性関節炎、ブドウ膜網膜炎、天疱瘡、多発関節炎、原発性胆汁性肝硬変、ライター症候群、高安病、巨細胞性動脈炎、温暖自己抗体溶血性貧血、ウェゲネル肉芽腫症、全身性脱毛症、シャガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、子宮内膜症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、神経ミオトニ、類肉腫症、鞏皮症、潰瘍性大腸炎、白斑、陰門痛、虫垂炎、動脈炎、関節炎、眼瞼炎、気管支梢炎、気管支炎、子宮頸炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、副睾丸炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、肝炎、汗腺炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、骨髄炎、心筋炎、筋肉炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎／耳管炎、静脈洞炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、膣炎、脈管炎、又は外陰炎の治療に使用することができる。
【０１７０】
[00198]  幾つかの実施形態では、ナノ粒子を癌の治療に使用することができる。幾つかの実施形態では、本発明は乳腺の管組織の腺管癌、髄様癌、膠様癌、管様癌、炎症性乳癌などの乳癌の治療方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は卵巣の腺癌及び卵巣から腹腔内へと転移した腺癌などの上皮卵巣腫瘍の治療方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は扁平上皮癌及び腺癌などの頚部上皮の腺癌のような子宮頸癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は腺癌又は骨転移している腺癌から選択された前立腺癌のような前立腺癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は膵管組織の類上皮癌及び膵管の腺癌などの膵癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は膀胱の移行上皮癌、尿路状皮癌（移行上皮癌）、膀胱を裏打ちする尿路細胞の腫瘍、扁平状皮癌、腺癌、及び小細胞癌などの膀胱癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、好ましくは末梢血の急性前骨髄球性白血病の治療方法を提供する。同様に、本発明は扁平上皮癌、腺癌、及び大細胞未分化癌に分割される非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び小細胞肺癌などの肺癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は基底細胞癌、メラノーマ、扁平上皮癌、及び扁平上皮癌になることがある皮膚状態の紫外線角膜炎などの皮膚癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は眼網膜芽腫の治療方法を提供する。同様に、本発明は眼内（眼）メラノーマの治療方法を提供する。同様に、本発明は原発性肝臓癌（肝臓で始まった癌）の治療方法を提供する。同様に、本発明は腎臓癌の治療方法を提供する。別の態様では、本発明は乳頭、小胞、髄及び未分化などの甲状腺癌の治療方法を提供する。同様に、本発明はびまん性大Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫及び非開裂小細胞リンパ腫などのエイズ関連リンパ腫の治療方法を提供する。同様に、本発明はカポジ肉腫の治療方法を提供する。同様に、本発明はウイルスが原因の癌の治療方法を提供する。主要なウイルス悪性疾患系にはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及び肝細胞癌と、ヒトリンパ球ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫と、ヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ）及び子宮頸癌とがある。同様に、本発明は膠癌（星状細胞腫、未分化星状細胞腫、又は多形性神経膠芽腫）、乏突起神経膠細胞、脳室上皮腫、髄膜腫、リンパ腫、神経鞘腫、及び骨芽細胞腫を含む原発性脳腫瘍などの中枢神経系癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は神経繊維腫及び神経鞘腫のような聴神経腫及び悪性末梢神経鞘腫（ＭＰＮＳＴ）などの末梢神経系（ＰＮＳ）癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は口腔及び口腔咽頭癌の治療方法を提供する。同様に、本発明はリンパ腫、胃間質癌、及び類癌腫などの胃癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は精上皮癌及び非精上皮癌を含む生殖細胞腫（ＧＣＴ）、及びライディッヒ細胞腫及びセルトリ細胞腫を含む生殖腺間質腫などの睾丸癌の治療方法を提供する。同様に、本発明は胸腺腫、胸腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫類癌腫又は類癌腫などの胸腺癌などの精巣癌の治療方法を提供する。
【０１７１】
[00199]  幾つかの実施形態では、本発明を使用して骨肉腫などの骨癌を治療することができる。骨肉腫は小児及び青年の骨の最も一般的な原発性悪性新生物であり、原始類骨生成間葉細胞の無秩序なクローン性増殖を特徴とする。この３０年間にわたる新アジュバント細胞毒性剤化学療法の体系の発達により、骨肉腫患者の最終結果が劇的に改善された。多薬剤の体系と外科切除術の洗練が加わった結果、限局性疾患を呈する患者の長期生存率が６５〜７５％になった（Gurney他、１９９９、Malignant bone tumors. In: Cancer Incidence and Survival Among Children and Adolescents: United States SEER Program 1975-1995）。これは大きな改善であるが、現在の多様式体系にはまだ重大な欠点がある。第一に、診断時に顕性転移がある患者、又は癌が再発した患者の場合、見通しは暗いままである。第二に、現在使用されている化学療法の体系は骨肉腫には効果的であるが、正常細胞にも広範に破壊し、その結果、急性で場合によっては生命に危険がある合併症を引き起こすことがある。現在では、小児癌患者を細胞毒性剤性化学療法に曝すと、その腫瘍を根絶してから数十年後に続発性悪性疾患及び他の内科的疾患につながり得ることも認識されている。幾つかの実施形態では、標的化したリポソームナノ粒子を使用して、正常細胞への副作用を軽減した状態で化学療法又は他のタイプの薬剤を腫瘍に選択的に送達することができる。幾つかの実施形態では、標的化したナノ粒子を臨床的に検出可能である腫瘍に結合することができる。
【０１７２】
[00200]キット
[00201]  本発明はまた、キットも提供する。キットは、適切な包装に入れた本明細書で説明するナノ粒子、及び使用指示書、臨床検査の検討、副作用のリストなどを含むことができる書類を含む。適切な包装及び追加の使用品目（例えば、液体製剤の測定カップ、空気への曝露を最小化する箔ラッピングなど）が当技術分野で知られており、キットに含めることができる。
【０１７３】
[00202]  ナノ粒子は乾燥状態で、又は保存溶液に入れて提供することができ、前重合するか、例えばＵＶ光曝露などによって投与前に重合することができる。ナノ粒子溶液は、即座に投与する準備が整った状態にするか、又は投与前に追加の化合物又は溶液に懸濁させるか、又はそれと混合することができる。提供されるナノ粒子は、使用するために既に治療剤、標的化剤、又は造影剤を含有するか、又はこのような薬剤を現場でナノ粒子に連結又は組み込むことができる。ナノ粒子は更に、様々な投与経路に合わせて特定のサイズで提供するか、又は不均一なサイズ分布で構成することができる。
【０１７４】
[00203]  試薬は、緩衝剤及び安定化剤、例えば多糖類などの補助剤も含むことができる。キットは更に、必要に応じて検査の背景干渉を軽減する薬剤、制御試薬、検査を実施する器具などを含むことができる。キットは任意の適切な方法で包装することができ、通常は検査を実行するための印刷指示書とともにすべての要素を単一の容器に入れる。
【０１７５】
[00204]  このようなキットは、本明細書で説明する状態のような、患者の細胞及び組織の臨床検出、予後、及びスクリーニングのために適切であるナノ粒子の検出を可能にすることができる。
【０１７６】
[00205]  このようなキットは、追加的に１つ又は複数の治療剤を含むことができる。キットは更にデータ分析用のソフトウェアパッケージを含むことができ、これは検査結果との比較のために基準データを含むことができる。
【０１７７】
[00206]  このようなキットは科学的文献、添付文書資料、臨床検査結果、及び／又はこれらの要約などの情報も含むことができ、これは組成の活性及び／又は利点を示すか立証する、及び／又は用量、投与、副作用、薬物相互作用、又は医療従事者にとって有用なその他の情報を説明している。このような情報は様々な研究、例えばインビボモデルに含まれる実験動物を使用した研究、及びヒト臨床検査に基づく研究などの結果に基づいていてもよい。本明細書で説明するキットは医師、看護師、薬剤師、処方職員などの医療従事者に提供、販売及び／又は奨励することができる。キットは、幾つかの実施形態では消費者に直接販売することもできる。
【０１７８】
[00207]  本発明を、以下の実施例で更に例証するが、これは制限的であるとは見なされない。本出願を通して引用するすべての参考文献、並びに図面及び表の内容は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１７９】
[00208]  本明細書で本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、このような実施形態は例としてのみ提供されていることが当業者には明白である。本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、及び代用品が当業者には想起される。本発明を実践する際には、本明細書で説明する本発明の実施形態の様々な代替物を使用できることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、それによってこれらの特許請求の範囲に入る方法及び構造、及びその同等物が含まれるものとする。
【０１８０】
実施例
実施例１−ＡＬＣＡＭ発現骨肉腫細胞株へのＨＰＬＮの結合
[00209]  骨肉腫は小児及び青年の骨の最も一般的な原発性悪性新生物であり、原始類骨生成間葉細胞の無秩序なクローン性増殖を特徴とする（Huvos AG、１９９１、Bone tumors: diagnosis, treatment, and prognosis, pp viii, 784 p）。１９７０年以前には、外科手術のみで治療した骨肉腫患者の予後は惨憺たる１０〜２０％という全体的生存率であった。積極的外科手術で大半の患者は総体的に腫瘍がなくなるが、大多数が２年以内に致命的な進行性転移疾患を発現することになる。このことは、初期診断時には多くの患者で臨床的に検出不可能な腫瘍が既に離れた部位に広がっており、効果的な全身の抗癌療法が必要であったことを示唆している（Dahlin他、１９９７、Osteosarcoma of bone and its important recognizable varieties, American Journal of Surgical Pathology）。
【０１８１】
[00210]  この３０年間にわたる新アジュバント細胞毒性剤化学療法の体系の発達により、骨肉腫患者の最終結果が劇的に改善された。多薬剤の体系と外科切除術の洗練が加わった結果、限局性疾患を呈する患者の長期生存率が６５〜７５％になった（Gurney JG SA他、１９９９、Malignant bone tumors. In: Cancer Incidence and Survival Among Children and Adolescents: United States SEER Program 1975-1995. SEER program, National Cancer Institute, Bethesda, MD, pp 99-110）。これは大きな改善であるが、現在の多様式体系にはまだ重大な欠点がある。第一に、診断時に顕性転移がある患者、又は癌が再発した患者の場合、見通しは暗いままである。第二に、現在使用されている化学療法の体系は骨肉腫には効果的であるが、正常細胞も広範に破壊し、その結果、急性で場合によっては生命に危険がある合併症を引き起こすことがある。現在では、小児癌患者を細胞毒性剤性化学療法に曝すと、その腫瘍を根絶してから数十年後に続発性悪性疾患及び他の内科的疾患につながり得ることも認識されている（Janeway KA、Grier HE、２０１０、Sequelae of osteosarcoma medical therapy: a review of rare acute toxicities and late effects. Lancet Oncol 11:670-678）。
【０１８２】
[00211]  これらの基準に留意すると、細胞表面受容体ＡＬＣＭ（Activated Leukocyte Adhesion Molecule、CD-166）は、標的骨肉腫にとって魅力的な候補である。このグリコプロテインは免疫グロブリン上科の一員であり、細胞移動、神経形成、造血及び免疫反応に関与する重要な細胞−細胞相互作用を仲介すると考えられる（Swart GW、２００２、Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. Eur J Cell Biol 81:313-321）。より最近では、ＡＬＣＡＭ発現の増加が膵臓、胸部、前立腺、及び結腸直腸の癌腫及びメラノーマなどの様々な癌に関連付けられている（Ofori-Acquah SF、King JA、２００８、Activated leukocyte cell adhesion molecule: a new paradox in cancer, Transl Res；Kristiansen G他、２００３、ALCAM/CD166 is up-regulated in low-grade prostate cancer and progressively lost in high-grade lesions, Prostate；King JA他、２００４、Activated leukocyte cell adhesion molecule in breast cancer: prognostic indicator, Breast Cancer Res）。更に、組み換え型抗ＡＬＣＡＭモノクローナル抗体でコーティングされた免疫リポソームが、この抗原を発現する前立腺癌細胞株によって取り込まれることを発見した研究者もいた（Liu B他、２００７、Anti-CD166 single chain antibody-mediated intracellular delivery of liposomal drugs to prostate cancer cells, Molecular Cancer Therapeutics）。
【０１８３】
[00212]  この実施例では、ＡＬＣＡＭが骨肉腫由来の細胞株及び１次生検試料で過剰発現することを実証する。この細胞表面分子を活用して、骨肉腫細胞によるナノ粒子の結合及び取り込みを増強させることを示す。脂質と飽和及びジアセチレン含有アシル鎖の混合物で構成された新しい重合リポソーム製剤を提示する。
【０１８４】
方法
[00213]  材料。従来のハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）をNanoValent Pharmaceuticals, Inc.（モンタナ州ボーズマン）から入手した。従来のリポソームを構成する成分はＬ−α−ホスファチジルコリン水素化ダイズ、（「水素化ダイズＰＣ」）、コレステロール及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（「ｍ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥ」）、(Avanti Polar Lipids、アラバマ州アラバスター）である。ＨＰＬＮはＮ−（５’−ヒドロキシ−３’−オキシペンチル）−１０−１２−ペンタコサジインアミド（「ｈ−Ｐｅｇ1−ＰＣＤＡ」）、水素化ダイズＰＣ、ｍ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥ、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（「ｍａｌ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥ」）及びコレステロールで構成される。
【０１８５】
従来のリポソーム及びＨＰＬＮの調製
[00214]  従来のリポソームは、上述した方法（R.E. Bruehl、F. Dasgupta、T. Katsumoto、J.H. Tan、C.R. Bertozzi、W. Spevak、D.J. Ahn、S.D. Rosen、J.O. Nagy、「Polymerized Liposome Assemblies: Bifunctional Macromolecular Selectin Inhibitors Mimicking Physiological Selectin Ligands」、Biochem., 2001, 40, 5964-5974）により、５７．５：３７．５：５の分子比率の水素化ダイズＰＣ、コレステロール及びｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ、１５：４７：３２：６の分子比率のｈ−ＰＥＧ1ＰＣＤＡから調製した非標的性ＨＰＬＮ、水素化ダイズＰＣ、コレステロール及びｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ、及び１５：４７：３２：４．５：１．５の分子比率のｈ−ＰＥＧ1ＰＣＤＡから調製された標的性ＨＰＬＮ、水素化ダイズＰＣ、コレステロール、ｍａｌ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ及びｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥから調製した。要するに、脂質を混合し、真空中で蒸発させて薄膜にした。２５ｍＭ（脂質とコレステロール合計）の懸濁液になるように、脱イオン水又は３００ｍＭの硫酸アンモニウムを薄膜に添加した。懸濁液をプローブ先端の超音波処理器（Fisher sonic dismembrator model 300）で７０〜８０℃の超音波処理により５分間加熱した。結果となる乳状溶液を、次に二重シリンジ押し出し器（LiposoFast-Basic、Avestin, Inc.、カナダオンタリオ州オタワ）で積み重ねたポリカーボネート膜（１００ｎｍ）に１１回通して、６５℃に加熱した。ほぼ透明なリポソーム溶液を、１２時間で５℃まで冷却した。周囲温度まで暖めた後、ＰＣＤＡ脂質を含有する水充填リポソームを、Spectrolinker XL-1000 UV Crosslinker（Spectronics Corp.）でＵＶ光照射（２５４ｎｍ）により１０分間重合した。その結果の青いＨＰＬＮを６５℃まで５分間加熱し、これを赤い（蛍光）形態に変換する。微量の不溶性汚染物質を除去するために、０．２μｍの酢酸セルロースフィルタを通して色付き溶液をシリンジ濾過した。
【０１８６】
ドキソルビシンの装填
[00215]  硫酸アンモニウムを含有する従来の重合性リポソームを（２０ｍＭのＨＥＰＥＳで洗浄した）G50 Sephadexカラム上に通し、外部緩衝剤を交換した。次に、リポソームを６５℃に加熱しながら塩酸ドキソルビシン（Shandong Tianyu Fine Chemical Co., Ltd.）で２０分間インキュベートし、それは１μＭのドキソルビシン対３．２μＭの脂質の割合であった。７μｇのドキソルビシン対１μＬの充填樹脂の割合でアニオン性交換樹脂（BioRex 70、BioRad Inc.）とともに５分間振盪することにより、封入されていないドキソルビシンを除去した。Pierce Spin Cupを通して濾過することにより、リポソームを樹脂から分離した。１０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に入れて、Zetasizer Nano-S（Malvern Inst.）上で平均粒子サイズの測定を実施した。
【０１８７】
ＡＬＣＡＭ抗体共役ＨＰＬＮの調製
[00216]  参照により全体を本明細書に組み込むものとするLiu他、（Liu B.他、（２００７）J. Mol. Med. (Berl) 85:1113-1123参照）で説明されているように、抗ＡＬＣＡＭ抗体は以前にｃｙｓ−ダイアボディ（単鎖抗体フラグメントとＣ末端システイン残基の交差対二量体）に改変されている。リポソームにドキソルビシンを装填し、次に抗ＡＬＣＡＭｃｙｓ−ダイアボディを粒子表面に共役した。ＴＣＥＰ（５００ｍＭ）をｃｙｓ−ダイアボディ（１〜４μｇ／ｕＬ）溶液に添加して、最終濃度を１０ｍＭにし、室温で３０分間インキュベートして、ダイアボディの末端システイン残基を還元した。次に、還元α−ＡＬＣＡＭｃｙｓ−ダイアボディをリポソーム混合物（２．５〜１０μｇ／ｕＬの脂質）に、ダイアボディ／脂質の割合が１μｇのダイアボディ：７．５μｇの総脂質という割合で添加し、室温で２時間インキュベートして、ＰＬＮ上のマレイミド残基と共役できるようにした。結合していないマレイミド残基を２０ｍＭのシステイン溶液で３０分間急冷した。Amicon Ultra- 0.5 mL 100K遠心分離フィルタ（Millipore）を通す濾過を使用して、結合していないダイアボディ、遊離システイン及びＴＣＥＰを除去した。サンプルをＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で１：２に希釈し、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、ドキソルビシン装填のＡＬＣＡＭダイアボディ共役サンプルを濃縮した。
【０１８８】
捕捉したリポソームドキソルビシンの定量化
[00217]  ドキソルビシンを、１２，５００というモル吸光係数に基づいて分光光度法で定量化した。Bio-Rex 70を使用して、未捕捉ドキソルビシンを除去した。ドキソルビシン装填粒子を、０．０７５ｍＭのＨＣｌ溶液で１：２０に希釈したイソプロパノールを使用して分解し、次に少なくとも３０秒間渦巻にして、確実に膜を完全破壊した。Beckman Coulter DU800分光測光計上の４８０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１８９】
総脂質の定量化
[00218]  比色分析アッセイを使用して、ＰＬＮサンプルの合計脂質含有量を測定した。ＰＬＮサンプルの４μＬのアリコートを真空乾燥し、アンモニウムフェロチオシアネート／クロロホルム溶液中に再懸濁させ、次に１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。次に、Beckman Coulter DU800分光測光計で有機相の４８８ｎｍにおける吸光度を測定した。次にサンプルのＯＤ４８８を既知の脂質濃度値の標準曲線と比較した。
【０１９０】
ＭＴＴアッセイ
[00219]  骨肉腫細胞株ＫＨＯＳ２４０Ｓ、ＨＯＳ又はＭＮＮＧ−ＨＯＳをDulbeccoのModified Eagle Medium（HyClone Cat #SH30022.01）に入れて、１０％のウシ血清（Gemini Bioproducts）とともに培養した。細胞を、９６ウェルのフォーマット、細胞５×１０３個／ウェルの濃度、ペニシリン／ストレプトマイシンの１００μＬの媒質体積で接種し、一晩インキュベートした。翌日に、ウェルをドキソルビシンを装填した標的化ＰＬＮ、標的化していないＰＬＮ、従来のリポソーム又は遊離ドキソルビシンで４時間の期間処理し、次に新しい媒質で洗浄した。０．０１〜１００μＭ及び０ｎＭのログスケールの範囲のドキソルビシン濃度に基づいて、用量を添加した。０ｎＭのウェルはＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で処理した。各処理は３通りで実施した。細胞を標準のＣＯ2状態で７２時間、３７℃にしてインキュベートした。７２時間で、全ウェルを、リン酸緩衝食塩水中の初期濃度が５μｇ／μＬのチアゾリルブルー臭化テトラゾリウム（Sigma）溶液１０μＬで処理し、４時間インキュベートする。反応がなくなり、１００μＬの１５％ドデシル硫酸ナトリウム／１５ｍＭのＨＣｌ溶液を添加して細胞を溶離し、暗所に入れて室温で一晩インキュベートした。Bio-radマイクロプレート読み取り装置を使用して、５７０ｎｍでプレートの吸光度を読み取った。背景吸光度を考慮に入れるために、空のウェルのＯＤ５７０の算術平均を全処理ウェルのＯＤ５７０読み取り値から引いた。各プレートの算術平均を計算し、１００％生存度と見なした。次に、残りのウェルをこの平均で割り、各ウェル内の名目生存率を取得した。生存度をログ薬物濃度に対してプロットし、非加重非線形回帰を使用して、４パラメータシグモイド用量反応モデル（Prism Software、Graphpad）を使用し、各処理のログ（ＩＣ５０）を推定した。最低値のパラメータをゼロに固定して、最低値を変数できる分析よりも良い残基パターン及び安定したHillの勾配推定値を生成した。細胞株の実験毎に、４つの処理媒体を比較する作業を異なる日に３〜７回繰り返した。各細胞系列内で、線形混合効果モデルにより、バッチの変動性よりもはるかに大きいログ（ＩＣ５０）の変動源として日毎の変動性が明らかになり、実験日における遮断により、処理と処理との間で推定される差の精度が改良された。複数の細胞株にわたってＩＣ５０の結果を評価する際に、処理の相互作用による重大な細胞株が検出され、これはまさにＭＮＮＧ−ＨＯＳ細胞株で（他の３つの処理に対する）従来のリポソーム力価のシフトをモデリングすることによって説明することができた。
【０１９１】
ＰＬＮ結合の蛍光電子顕微鏡アッセイ
[00220]  骨肉腫細胞株を４ウェルのLab-tek II Chamber Slides（Thermo Scientific）に接種し、一晩で８０％の集密に到達した。細胞を、ウェル毎に５０μｇ／ｍＬの抗ＡＬＣＡＭダイアボディ共役ＰＬＮで処理した。細胞を３７℃で４時間インキュベートした。媒質を除去し、ウェルを１ｍＬの新しい媒質で洗浄した。細胞固定は、リン酸緩衝食塩水中の３．７％ホルムアルデヒドで４℃にして１５分間実施した。VectaShield封入剤を使用しＤＡＰＩ（Vector Laboratories）とともに細胞を標本にした。正及び負の対照標準細胞株は、それぞれ膵臓細胞株ＨＰＡＦ及びMiaPacaであった。Carl Zeiss AxioImager D1蛍光顕微鏡を使用して、細胞を観察した。細胞は２０倍の倍率で観察した。ブルー／シアンのフィルタでＤＡＰＩを視覚化した。Rhodamineフィルタを使用し、１秒の露光で結合したナノ粒子を視覚化した。
【０１９２】
ウェスタンイムノブロッティング
[00221]  イムノブロッティングに使用する抗体は、モノクローナルマウスの濃度１：４００の抗ＣＤ１６６（Vector Laboratories、Cat# VP-C375）、及び濃度１：３０００の抗アクチンＣ−１１（Santa Cruz Biotechnology、Cat#sc-1615）であった。
【０１９３】
免疫組織化学
[00222]  UCLA Tissue Procurement Core Laboratory（IRB Exempt）から、識別されていないヒト患者の骨肉腫をパラフィンに埋め込んだサンプルを入手した。４マイクロメートルの切片を切り取り、スライドに載せた。次にサンプルを脱パラフィン、再水和して、熱由来のエピトープを抽出した。スライドを抗ＣＤ１６６のマウスモノクローナル抗体（ベクター）の１：５０希釈液で２時間、室温でインキュベートし、マウスのEnVision+ System-HRP（DAB）キット（Dako）を使用して信号を検出した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。Zeiss AxioImagerを使用し、２０倍の倍率で像を観察し、取得した。
【０１９４】
結果
[00223]ＡＬＣＡＭは原発性骨肉腫試料と腫瘍由来の細胞株との両方で高度に発現している。
[00224]  骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳの分子調査で、これらの細胞の表面にＡＬＣＡＭが発現することが実証された（Nelissen JM他、２０００、Molecular analysis of the hematopoiesis supporting osteoblastic cell line U2-OS. Exp Hematol）。これらの観察結果は、ヒト骨肉腫におけるＡＬＣＡＭ発現の更に綿密な調査を促した。腫瘍由来の６細胞株の集まりにおけるＡＬＣＡＭ発現の評価を初期プラットホームとして使用した。細胞溶解産物を、組織培養で増殖したサブ半集密の付着培養物から収穫し、抗ＡＬＣＡＭ抗血清を使用してイムノブロッティング法により分析した。ＡＬＣＡＭの発現が高い（ＨＰＡＦ）、及び発現がない（MiaPaCa）膵臓癌細胞株を、対照標準として使用した。６つの骨肉腫細胞株はすべてＡＬＣＡＭを発現し、６つのうち５つはＨＰＡＦ対照標準に見られたレベルで高い発現を実際に示した（図１）。ＡＬＣＡＭ発現の質を蛍光免疫組織化学で更に確認したが、これは主に骨肉腫細胞株のＡＬＣＡＭ発現に対する膜性表面成分を示している（図２）。
【０１９５】
[00225]  出願人の細胞株の集合ではＡＬＣＡＭ発現の頻度が高かったが、これは腫瘍由来の細胞株を生成する際に付きものの選択プロセスに由来するかもしれないとの懸念が常にある。また、骨肉腫の患者ではインビボで、組織培養はインビトロでという増殖状態の違いも、ＡＬＣＡＭ発現の変化の原因であるかもしれない。
【０１９６】
[00226]  これらの懸念に対応するために、原発部位と転移部位の両方からのヒト骨肉腫（ＯＳ）腫瘍サンプルを、免疫細胞化学によりＡＬＣＡＭ発現に関してアッセイした。匿名患者の保存試料を固定し、切断して、抗ＡＬＣＡＭ抗血清でインキュベートした。洗浄後に、比色分析アッセイを使用して現場でＡＬＣＡＭ発現を検出し、光学顕微鏡で評価した。組織を強度の陽（＋＋＋）、中位の陽（＋＋）、弱い陽（＋）又は陰（−）と等級付けた。ＯＳ腫瘍サンプルはすべてＡＬＣＡＭに対して陽に染色された。１０個の局所性及び転移性ＯＳサンプルのうち、局所性ＯＳ組織のうち５個がＡＬＣＡＭに対して弱から強度の陽に染色され、転移性ＯＳサンプルのうち５個も中位から強度のＩＨＣ染色となった。骨肉腫細胞は、細胞質体及び膜性ＡＬＣＡＭの両方の発現を呈した（代表的ＩＨＣ像を図３に示す）。
【０１９７】
骨肉腫細胞株に強力に結合した抗ＡＬＣＡＭ結合ハイブリッド重合リポソームナノ粒子
[00227]  ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を、ＡＬＣＡＭを発現する骨肉腫細胞を標的とし得る潜在的な治療送達媒体として評価した。ＨＰＬＮは従来のリポソームと構造的属性の多くが共通している。これは、リポソームに使用されているものと同じ化学結合の方式を使用して修飾することができる表面を有する自己集合単層球である。リポソームと異なり、ＨＰＬＮは内因性蛍光になるように製造することができる。紫外線照射はそのアシル鎖に存在するジアセチレン残基の架橋につながり、高度に着色された青い粒子になり、ＨＰＬＮ小胞を熱処理すると、変色し、蛍光体が形成される（Eckhardt, H.、Boudreaux, D.S.、Chance, R.R.、J. Chem. Phys. 1986, 85, 4116.、JI Olmsted及びM Strand、J. Phys. Chem. 1983, 87, 4790）。蛍光発光スペクトルは６３５ｎｍを中心とし、４８０〜５８０ｎｍに広く複雑な励起スペクトルがある。その結果、蛍光形態に変化したＨＰＬＮは、標的細胞に結合した時から細胞下構造内に付着してコンパートメント化するまで容易に追跡することができる。
【０１９８】
[00228]  標的となるＨＰＬＮは、組み換え型抗ＡＬＣＡＭモノクローナル抗体をその表面に化学結合することによって生成した。ＨＰＬＮは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子表面の遠位端にマレイミド反応性基を含むように合成した。上述したＳｃＦｖに由来する二価抗ＡＬＣＡＭダイアボディを遺伝子工学でＣ末端システインを含有するように改変した（McCabe KE他、２０１１、An Engineered Cysteine-Modified Diabody for Imaging Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM)-Positive Tumors. Mol Imaging Biol）。これら２つの成分を混合すると、システインのチオールとマレイミド部分との間で凝縮反応が誘発され、その結果、抗ＡＬＣＡＭダイアボディがＨＰＬＮ表面に共有結合した。負の対照標準として、標的化されていないＨＰＬＮを、遊離システインをナノ粒子に結合することにより、同じ方法で作製した。
【０１９９】
[00229]  結合試験を実施して、抗ＡＬＣＡＭ結合ＨＰＬＮ（α−ＡＬ−ＨＰＬＮ）と標的化されていないＰＬＮとの骨肉腫細胞株に対する相対的親和性を比較した。４時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡でα−ＡＬ−ＨＰＬＮ結合を検出した。α−ＡＬ−ＨＰＬＮは、標的化されていない負の対照標準と比較して、はるかに効率的に出願人のパネルの骨肉腫細胞株の全部に結合した（図４）。この相互作用は、細胞ＡＬＣＡＭの発現によって決定されていた。標的化したＨＰＬＮと標的化していないＨＰＬＮは両方とも、細胞表面ＡＬＣＡＭを発現しないMiaPaCa細胞に同等に結合した。
【０２００】
[00230]  α−ＡＬ−ＨＰＬＮと骨肉腫細胞との相互作用の速さを測定するために、時間経過試験を実施した。骨肉腫細胞をα−ＡＬ−ＨＰＬＮとともに４時間以内の様々な期間だけインキュベートし、洗浄して、次に蛍光顕微鏡で評価した。α−ＡＬ−ＨＰＬＮの結合は３０分と早くに検出され、４時間までに最高値に到達した（図５）。核周囲に強力な蛍光信号が存在することは、標的化されたナノ粒子が細胞のエンドソームコンパートメントへと迅速に取り込まれたことを示唆する。これを更に評価するために、細胞のエンドサイトーシスを阻害する４℃で結合試験を実施した。これらの状態で、核周囲に核の局所化がない状態で強力な膜蛍光信号が検出され、このことは、α−ＡＬ−ＨＰＬＮが細胞表面に結合しているが、取り込まれていないことと一致する（図６）。
【０２０１】
検討
[00231]  そのデータは骨肉腫におけるＡＬＣＡＭ発現の増大を明白に実証しているが、その生物学的因果関係は測定が困難である。ＡＬＣＡＭの正常な生理学的役割は未だに明らかになっていないが、その分子構造、及び密着結合でのクラスタ形成は、細胞接着及び移動に関与し得ることを示唆している（Bowen MA, Aruffo A, 1999, Adhesion molecules, their receptors, and their regulation: Analysis of CD6-activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM/CD166) interactions, Transplantation Proceedings 31:795-796）。この状況で、ＡＬＣＡＭの発現を調節すると、骨肉腫などの高度悪性疾患に見られる侵襲性かつ転移性の挙動を強化し得ると考えたくなる。しかし、すべての癌にわたってＡＬＣＡＭの発現レベルと患者の生存率との間に一定の相関関係はない。例えば、より高いステージで進行性の悪性メラノーマでは、ＡＬＣＡＭ発現の増加が見られる（van Kempen LCLT, van den Oord JJ, van Muijen GNP, Weidle UH, Bloemers HPJ, Swart GWM 2000 Activated leukocyte cell adhesion molecule/CD166, a marker of tumor progression in primary malignant melanoma of the skin. American Journal of Pathology 156:769-774）。対照的に、高度のＡＬＣＡＭは、低級で進行性が低い前立腺癌の症例と相関する（Kristiansen G他、２００３）。出願人の小さいコホートの骨肉腫でさえ、高いＡＬＣＡＭの発現頻度が高いことを考えると、この疾患の患者の高いリスクと低いリスクとを区別できないことがある。
【０２０２】
[00232]  ＡＬＣＡＭは、骨肉腫の予後マーカとしては限界があることがあるが、治療時にこの腫瘍を標的にする手段の分子として働く可能性がある。抗ＡＬＣＡＭダイアボディでコーティングされた蛍光性ナノ粒子は、比較的低レベルでＡＬＣＡＭを発現するものでも、骨肉腫細胞株に優先的に結合する（データは示さず）。前立腺癌細胞で見られるように、ＡＬＣＡＭ標的化ナノ粒子は骨肉腫細胞により迅速に取り込まれたが、このことは抗癌剤の細胞内送達の戦略を示唆している。
【０２０３】
重合性薄膜及び小胞を生成するためにジアセチレン含有脂質を使用することが、バイオセンサを生成するために集中的に研究されており（Cabral ECM他、２００３、Preparation and characterization of diacetylene polymerized liposomes for detection of autoantibodies, Journal of Liposome Research 13:199-211.；及びMA Reppy、BA Pindzola、Biosensing with polydiacetylene materials, structure, optical properties and applications. Chem. Commun. 2007, 4317-4338）、癌の診断及び送達媒体として探索されている（Guo CX他、２０１０、Polydiacetylene vesicles as a novel drug sustained-release system, Colloids and Surfaces B-Biointerfaces 76:362-365; Puri A他、２０１１, A novel class of photo-triggerable liposomes containing DPPC:DC(8,9)PC as vehicles for delivery of doxorubcin to cells, Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1808:117-126；Li Z他、２０１１、Partially polymerized liposomes: stable against leakage yet capable of instantaneous release for remote controlled drug delivery, Nanotechnology 22；Sipkins DA, Cheresh DA, Kazemi MR, Nevin LM, Bednarski MD, LiKC. (1998) Detection of tumor angiogenesis in vivo by alphaVbeta3-targ
eted magnetic resonance imaging. Nat Med 4(5): 623-6；Li L, Wartchow CA, Danthi SN, Shen Z, Dechene N, Pease J, Choi HS, Doede T, Chu P, Ning S, Lee DY, Bednarski MD, Knox SJ. (2004) A novel antiangiogenesis therapy using an integrin antagonist or anti-Flk-1 antibody coated 90Y-labeled nanoparticles. Int J Radiat Oncol Biol Phys 58(4): 1215-27；Kien Vuu, Jianwu Xie, Michael A. McDonald, Marcelino Bernardo, Finie Hunter, Yantian Zhang, King Li, Mark Bednarski、及びSamira Guccione, Gadolinium-Rhodamine Nanoparticles for Cell Labeling and Tracking via Magnetic Resonance and Optical Imaging Bioconjugate Chem. 2005, 16, 995-999；及びAMICHAI YAVLOVICH, BRANDONSMITH, KSHITIJ GUPTA, ROBERT BLUMENTHAL, & ANU PURI, Light-sensitive lipid-based nanoparticles for drug delivery: design principles and future considerations for biological applications Molecular Membrane Biology, October 2010; 27(7): 364-381）。これらの膜を紫外線照射で処理すると、結果となる脂質内架橋は濃いブルーの発色団を形成する。熱、剪断又はｐＨストレスなどの生理化学的動揺に曝露すると、これらの膜は（以前に引用したように：Eckhardt, H
.、Boudreaux, D.S.、Chance, R. R.J. Chem. Phys. 1986, 85, 4116., JI Olmsted and M Strand J. Phys. Chem. 1983, 87, 4790）、青の非蛍光状態から赤い蛍光状態へとシフトする。ＰＬＮ蛍光に対する明白な利点は、光脱色がほとんど、又は全く生じないことである。これらの特性を利用して、ＵＶ照射及び熱で処理してある赤い蛍光ＡＬＣＡＭ標的化ＰＬＮ（α−ＡＬ−ＰＬＮ）の結合及び取り込みを追跡することができた。ＵＶ照射のみを受け。したがって溶液中で青く非蛍光性であったα−ＡＬ−ＰＬＮの同様の製剤を使用しても同じ結果が得られたことは、興味あることである。結合したダイアボディ分子と細胞表面のＡＬＣＡＭタンパク質との相互作用が、結合したα−ＡＬ−ＰＬＮを蛍光状態にシフトさせるのに十分なストレスを与えたようである。
【０２０４】
実施例２−潜在的な治療用送達媒体としてのＨＰＬＮの処方
[00233]  この実施例では、ドキソルビシンを装填した場合、ＨＰＬＮは骨肉腫細胞に対する細胞毒性剤性の上昇を呈したことを示す。最初のＰＬＮ処方は全体が１０，１２−ペンタコサジイン酸（ＰＣＤＡ）誘導体で構成され、重合すると、容易に検出できる高度に蛍光性の粒子を形成した。しかし、これらのナノ粒子は、治療の送達に適用しようとすると問題になることが証明された。小胞形成中に封入するか、重合したリポソームを使用したイオン勾配により、それに細胞毒性剤性化学療法剤を効果的に装填しようとしたが、複数のレベルで失敗した。この理由から、多くのリポソーム製剤で見られる飽和リン脂質と混合したＰＣＤＡ脂質で構成されたハイブリッドＰＬＮを生成した。
【０２０５】
[00234]  この問題に取り組むために、分子比率５７．５：３７．５：５の水素化ダイズＰＣ（主要成分はジアステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である）、コレステロール及びポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ）からなる標準的なリポソーム製剤で開始した。次に、不飽和ＰＣＤＡ脂質を増量して添加した。非常に短いＰｅｇ鎖ＰＣＤＡ誘導体、すなわちｈ−Ｐｅｇ１−ＰＣＤＡを選択した。何故なら、これが極めて反応性が高い架橋脂質であり、荷電脂質と混合すると良好な水性分散性を有し、全体的な表面の電荷を変更しないように、それ自体が非荷電であり、小さい極性頭部が標的化剤の共役と干渉しないからである。音波処理及び押し出しの後、小胞の動的光散乱法によるサイズを、及びＵＶ照射及び熱処理した場合に蛍光粒子を形成する能力を評価する。１５モル％のｈ−Ｐｅｇ１−ＰＣＤＡしか含めないと、明るい蛍光性粒子になるが、この信号はｈ−Ｐｅｇ１−ＰＣＤＡの割合が減少するにつれ漸進的に減衰することが判明した。
【０２０６】
[00235]  出願人のＨＰＬＮが脂質と２つの非常に異なるアシル鎖構造との不均質混合物であったことを考えると、溶液の安定性が主要な懸念であった。特定のハイブリッド製剤が、押し出し後に数時間以内で不溶性凝集体を形成した。押し出し直後であるが重合前に１０℃で一晩冷却することが、安定したＨＰＬＮの生成において重大であることが証明された。この方法で処理した粒子は冷蔵しても室温でも、数週間安定していた。この冷却ステップがない状態で構成した同じ脂質組成物のＨＰＬＮは、取り返しが付かないほど不安定であった。長鎖ジアセチレン脂質と短鎖ホスファチジルコリン脂質との同様の混合物に関して発表された研究に見られる証拠は、脂質タイプ間で相の分離が生じることを示唆している（Moran-Mirabal JA, Aubrecht DA, Craighead HG, 2007, Phase separation and fractal domain formation in Phospholipid/Diacetylene-Supported lipid bilayers. Langmuir 23: 10661-10671；及びGaboriaud, R.Volinsky, A.Berman, R.Jelinek, J. Colloid Interface Sci. 2005, 287, 191-197）。リポソームの相分離形は、音波処理と押し出しの直後に得られた均質混合の脂質形よりも安定していると推測される。この初期形成ステップの後に急速かつ長期間冷却すると、より迅速な安定化を促進するようである。
【０２０７】
[00236]  これらの研究から、分子比率１５：４７：３２：６のｈ−ＰＥＧ1ＰＣＤＡ、水素化ダイズホスファチジルコリン、コレステロール及びｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥで構成され、最適化されたハイブリッドＨＰＬＮ製剤が実験で誘導された。この製剤を使用してＨＰＬＮを作製し、イオン勾配を生成することによりドキソルビシンをこれに能動的に装填する能力を評価した（Elijah M. Bolotin、「Rivka Cohen」、Liliana K. Bar, a Noam Emanuel、「Sami Ninio」、Danilo D. L.asic、b及びYechezkel Barenholza* AMMONIUM SULFATE GRADIENTS FOR EFFICTENT AND STABLE REMOTE LOADTNG OF AMPHIPATHIC WEAK BASES INTO LIPOSOMES AND LIGANDOLIPOSOMES. JOURNAL OF LIPOSOME RESEARCH, 4(1), 455-479 (1994)）。この方法を使用して、ドキソルビシンをＨＰＬＮ中に、０．４４（０．３５〜０．４９の範囲）の平均モル比まで装填することができるＰＣＤＡ脂質がない従来のＰＥＧリポソームと比較して、０．１５（０．１３〜０．１８の範囲）の平均最終薬物／脂質モル比まで装填することができた。４℃で保存した装填済みＨＰＬＮの封じ込め研究で、１週間の間に、ドキソルビシンの８０％超が封入されたままであることが判明したが、これに対してＰＥＧリポソーム製剤は１週間における封じ込めが９７％を超えていた（図８）。
【０２０８】
検討
[00237]  完全にジアセチレン含有脂質で構成された小胞は優れた検出特性を有していたが、治療送達媒体としての能力は制限されていた。小胞形成中に受動的に封入しても、形成した小胞のイオン勾配により能動的にしても、これらのリポソームにドキソルビシンを安定的に装填することはできなかった。ホスホチジルコリン誘導体の１：１の混合物で構成されたハイブリッドリポソームに二鎖ジアセチレン脂質と別のリン脂質を受動的に装填できた研究者もいる（Guo他、Colloids and Surfaccs B - Biointerfaccs, 2010）。しかし、装填効率は低く、この戦略は疎水性ペイロードに限定されることがある。ＨＰＬＮ中のドキソルビシンなどの両親媒性分子、及び単鎖中性ＰＣＤＡ脂質の場合、効率的な装填を実行するには重合性脂質の濃度が２０モル％以下である必要がある（データは示さず）。
【０２０９】
実施例３−標的化されていないドキソルビシン装填ＨＰＬＮは、リポソームドキソルビシン製剤よりも骨肉腫細胞に対して細胞毒性剤性が高い。
[00238]  この実施例では、組み換え型抗ＡＬＣＡＭ抗体を有するハイブリッドリポソームが、骨肉腫細胞株の細胞毒性剤性死滅を更に改善することを示す。ドキソルビシンは現在の骨肉腫治療の大黒柱であるので、ＨＰＬＮが治療送達媒体として働けるか否かを検査するために初期ペイロードとして選択した。実施例１で上述したように、短時間音波処理した後に１００ｎｍのポリカーボネートフィルタを通して押し出すことにより乾燥した脂質薄膜の水和により、ＨＰＬＮ及び標準的なリポソームを作製した。ＨＰＬＮとリポソームのサイズはほぼ同じであり、バッチ毎に９０〜１１０ｎｍまで変化して、典型的な多分散指数は約０．１であった。硫酸アンモニウムの勾配を使用して、両方の粒子にドキソルビシンを装填した（Haran他、Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochim Biophys Acta, 1993）。細胞を調薬する前に、装填したナノ粒子をアニオン性交換樹脂（BioRex 70、BioRad Inc.）で短時間インキュベートし、封入されていない（遊離）ドキソルビシンがあればすべて除去した。次に、非集密骨肉腫細胞株を様々な濃度の３通りのドキソルビシン装填ＨＰＬＮ又はリポソームで４時間インキュベートした。遊離ドキソルビシンに曝露した細胞が、正の対照標準の働きをした。調薬後、細胞を新しい媒質で洗浄し、合計７２時間インキュベートした。次に、細胞の生存度をＭＴＴアッセイで数値化し、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を計算した。骨肉腫細胞株毎に、ＨＰＬＮ及びリポソームの少なくとも２つの異なるバッチを使用して、この実験を３〜７回実施した。
【０２１０】
[00239]  各ドキソルビシン製剤のＩＣ５０絶対値は、骨肉腫細胞株にしたがって変化した（図７）。しかし、これらの製剤の相対的力価を反映する傾向は、検査した細胞株すべてにわたって一貫性があった。他の細胞モデルで以前に見られたように、遊離ドキソルビシンはリポソームドキソルビシンよりも５０倍力価が高い（参考文献が必要）。装填したＨＰＬＮ（ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ）は中間の力価を示し、それは従来のＰＥＧ化リポソーム製剤よりも約６倍高かった。
【０２１１】
[00240]  ＨＰＬＮ／Ｄｏｘによって仲介された増殖抑制の増大が、この製剤のＰＣＤＡ脂質の量と関係しているか否かを判断するために、追跡実験を実施した。ＰＣＤＡを減少させたＨＰＬＮ／Ｄｏｘを作製し、ＫＨＯＳ２４０Ｓ骨肉腫細胞株でインキュベートした。これらの変形のＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤は、同様のサイズで、ドキソルビシンを同様に良好に装填してあったが、ＰＣＤＡ脂質組成物が減少した結果、増殖抑制力価が低下したナノ粒子になった（データは示さず）。
【０２１２】
ＡＬＣＡＭ標的化はドキソルビシン装填ＰＬＮの増殖抑制効果を増大させる。
[00241]  抗ＡＬＣＡＭダイアボディをＰＬＮの表面に結合すると、骨肉腫細胞株に対するその結合親和性を向上させることは既に示した。この同じ効果が、α−ＡＬ−ＨＰＬＮを使用して見られた（データは示さず）。この標的化機能が、骨肉腫細胞株の成長を抑制するドキソルビシン装填ＨＰＬＮの能力を改善するか判断するために、実験を実施した。モル比１５：４７：３２：４．５：１．５のｈ−Ｐｅｇ１−ＰＣＤＡ、水素化ダイズホスホチジルコリン、コレステロール、Ｍａｌ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ、及びｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥを使用して、標的可能なＨＰＬＮを作製した。マレイミドＤＳＰＥの割合は、抗ＡＬＣＡＭダイアボディに結合すると骨肉腫細胞への結合が増強される最低量として実験的に決定される（データは示さず）。ドキソルビシンを装填した後、ＨＰＬＮを以前のように抗ＡＬＣＡＭダイアボディに結合し、α−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘとした。次に、上述したように骨肉腫細胞をα−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘでインキュベートした。
【０２１３】
[00242]  標的化されていないハイブリッドで見られたように、α−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘに対する絶対感度は、異なる骨肉腫細胞株によって変化した（図９）。しかし、いかなる場合でも標的化したＨＰＬＮは標的化していないＨＰＬＮの同等物に対して全細胞株で約２倍の追加の増殖抑制力価を実際に示した（図７）。まとめると、α−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘは、細胞毒性剤性がＫＨＯＳ２４０ｓ及びＨＯＳ細胞株の従来の標的化していないＰＥＧリポソームドキソルビシン製剤よりログオーダ（１２倍）増加があり、化学療法抵抗性ＭＮＮＧ−ＨＯＳ細胞株では２０倍の増加があった。このことは、α−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘが細胞に特異的に結合することができ、それと同時にドキソルビシンを送達して従来の標的化していないリポソームナノ粒子製剤より高い細胞毒性剤性を達成できることを暗に示している。
【０２１４】
検討
[00243]  出願人のＨＰＬＮは最初はその安定した薬物装填特性のために処方されていたが、驚くことにインビトロ検査で治療的力価が上昇したことも証明された。３つの独立した骨肉腫腫瘍由来の細胞株中の標的化していないドキソルビシン装填ハイブリッドＰＬＮのＩＣ５０濃度は、ＰＥＧ化飽和リン脂質で構成された標準的なリポソームドキソルビシンよりも少なくとも６倍低かった。この力価の増大はＰＣＤＡ脂質の含有率に依存しているようである。何故なら、ＰＣＤＡ濃度が最適値の１５〜２０モル％から滴定して下がるにつれ、徐々に低下するからである（データは示さず）。この時点から、ＨＰＬＮ中のＰＣＤＡ脂質濃度が低下するにつれ、骨肉腫モデル中のＩＣ５０は高くなる。最近では、光化学的手段又は熱衝撃によって選択的に不安定化できるリポソームを生成するために、ジアセチレン脂質とリン脂質との混合物を使用している研究者もいる（Yavlovich他、J Therm Anal Calorim (2009)98(1): 97-104；Yavlovih他、Biochim Biophys Acta. (2011) 1808(1): 117-26；Guo他、(2009), Langmuir, 2009, 25(22), 13114-13119）。ターゲットは、時間−空間を制御した方法でペイロードを放出する治療媒体を生成することであった。
【０２１５】
[00244]  不安定化させる外部刺激を与えなくても、ＨＰＬＮは標準的なリポソーム製剤よりも効果的な治療送達媒体になり得ることが判明した。この効果の裏にあるメカニズムは不明瞭であり、さらなる調査が必要である。出願人のハイブリッド製剤にＰＣＤＡが存在していたことは、インビトロアッセイの（ｉ）細胞へのナノ粒子結合から（ｉｉ）細胞取り込み、更に（ｉｉｉ）細胞毒性剤性ペイロードを細胞内放出するまで、複数のステップにて効果を有する可能性があった。この最終ステップが特に、速度を制限することがある。出願人の骨肉腫細胞株で見られた遊離ドキソルビシンと標準的なリポソームドキソルビシンとでＩＣ５０が５０倍異なることは、以前に発表されたモデルシステムと一致している。Haglund C.他（１９８６）のBr. J. Cancer 53:189-195を参照されたい。これは主にリポソームドキソルビシンを取り込んでいる細胞のエンドサイトーシスコンパートメントからの遊離薬物の放出が遅れたことが原因であると示した研究者もいる（de Menezes DEL、Kirchmeier MJ、Gagne JF、Pilarski LM、Allen TM 1999 Cellular trafficking and cytotoxicity of anti-CD19-targeted liposomal doxorubicin in B lymphoma cells. Journal of Liposome Research 9:199-228）。
【０２１６】
[00245]  ＰＣＤＡ脂質は骨肉腫細胞が取り込んでいるＨＰＬＮからのドキソルビシンの放出を増大できると仮説を立てたくなる。その分子構造の違いを考慮すると、ＰＣＤＡ脂質とＨＰＬＮの表面上のリン脂質分子との間に微小分離が生じている可能性が高い。幾つかのモデルシステムで、ジアセチレン脂質とリン脂質との混合物に相分離があることが以前より実証されている（Gaboriaud他（２００５）、J Colloid Interface Sci. 1;287(1):191-7）。これらのＰＣＤＡ脂質アイランドが、細胞内環境に曝露すると薬物放出を増強できる不安定化点として働ける可能性がある。
【０２１７】
[00246]  骨肉腫を標的とするドキソルビシン装填ＨＰＬＮ（α−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ）を生成した結果、ＨＯＳ及びＫＨＯＳ２４０ｓ骨肉腫細胞株において、標的化していないＨＰＬＮ／Ｄｏｘに対して細胞毒性剤性が２倍増加し、従来のＰＥＧリポソーム製剤に対して細胞毒性剤性が１２倍増加した。これらの結果は、骨肉腫におけるＡＬＣＡＭの標的化が治療の増分効果を付加することを示唆する。興味深いことに、ＭＮＮＧ−ＨＯＳ細胞株では、α−ＡＬ−ＨＰＬＮ／ＤｏｘはＰＥＧリポソーム製剤に対して細胞毒性剤性が更に増加していた（２０倍の増加）。ＭＮＮＧ−ＨＯＳ細胞株は、ドキソルビシンに対して化学療法耐性がある多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）の発現レベルが高い（Gomes CM, van Paassen H, Romeo S, Welling MM, Feitsma RI, Abrunhosa AJ, Botelho MF, Hogendoorn PC, Pauwels E, Cleton-Jansen AM 2006 Multidrug resistance mediated by ABC transporters in osteosarcoma cell lines: mRNA analysis and functional radiotracer studies. Nucl Med Biol 33:831-840）。ＭＮＮＧ−ＨＯＳ化学療法抵抗性細胞株が従来の製剤よりもα−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤に対する感度が高いことは、多剤耐性を克服できる治療効果があることを示す。このα−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤の標的化及び改善された薬物徐放性は、化学療法抵抗性を仲介する薬物流出タンパク質を回避するか、圧倒し、それにより細胞毒性剤性を改善するのに役立てると仮定することができる。
【０２１８】
[00247]  結論として、ヒト骨肉腫ＡＬＣＡＭの新規の表面マーカを発見し、これを使用して、改変した新規の薬物装填ハイブリッドＰＬＮ処方抗ＡＬＣＡＭ免疫複合体で骨肉腫細胞を特異的に標的にした。これらのα−ＡＬ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子は、従来の標的化していないＰＥＧリポソームドキソルビシン製剤に対して細胞毒性剤性が改良され、骨肉腫の治療送達プラットホームになる可能性がある有望性を示す。この新しいリポソームナノ粒子製剤は、現在の標準的な標的化していない全身性化学療法が一般的に有効ではなく、予後が不良である抵抗性、難治性かつ転移性の骨肉腫の潜在的治療用途にとって特に魅力的である。更に、全身性化学療法のバイスタンダ及び線量限度の副作用は重大である。これまで、この処方は組織培養に基づくアッセイでしか検査していなかったので、これらの発見を確証するには腫瘍発生動物モデルでのさらなる評価が次の重大なステップである。これらの実験は現在進行中である。
【０２１９】
実施例４−リポソームナノ粒子を使用したメラノーマの治療
[00248]  ｍａｌ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥを含有するリポソームナノ粒子を、以上の実施例で説明したように生成することができる。ＲＧＤ配列又はその変形を含むペプチドを、余分なシステイン残基を介してｍａｌ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥに共有結合することができる。ＲＧＤ配列は、腫瘍又は血管形成細胞の表面上のインテグリンに選択的に結合する。リポソームナノ粒子は、そのアシル鎖にジアセチレン残基を含有する脂質分子を含むことになり、ジアセチレン残基を架橋し、ナノ粒子が６３５ｎｍで蛍光を発することができるように、ＵＶ放射で処理する。ナノ粒子は、５−フルオロウラシル又はシスプラチンなどの化学療法剤も含む。ナノ粒子は、以上の実施例で説明した方法を使用して、ＮＷ−１４５細胞、すなわちヒトメラノーマ細胞株を標的にするか検査することができる。ナノ粒子を様々な濃度でＮＷ−１４５細胞に、及び制御細胞に添加する。次に、結合していないナノ粒子を洗い落とし、結合ナノ粒子を蛍光顕微鏡で検出する。細胞は、数時間又は数日間インキュベートし、細胞死を観察することによってナノ粒子の細胞毒性剤性を測定することもできる。
【０２２０】
実施例５−リポソームナノ粒子を使用して骨肉腫を治療する臨床試験
[00249]  本発明のリポソームナノ粒子は、２つの腫瘍関連マーカ、すなわち、ＡＬＣＡＭ及びヒアルロナン受容体（それぞれＣＤ１６６及びＣＤ４４）を含んで、以上の実施例で説明したように標的化の特異性が増大するように生成することができる。選択された骨肉腫患者をランダムに２つの群に分割する。一方の群は、ドキソルビシン、シスプラチン、及びメトトレキサートの標準的な組み合わせ（まとめてＭＡＰと呼ぶ）で治療する。他方の群は６人のコホートに分割し、３つのＭＡＰ成分をすべて含む標的化リポソームナノ粒子の用量を増加して治療する。治療は、１日目に標的化リポソームナノ粒子を３０〜６０分間というクールを含み、このクールを、最大累積用量がドキソルビシン当たり５００ｍｇ／ｍ2になるまで２１〜２８日毎に濃度を上げて繰り返す。ナノ粒子と標準治療との両方の副作用を測定し、リポソームナノ粒子の最大耐量（ＭＴＤ）が決定される。ＭＴＤは、患者６人中１人が線量限度の毒性を経験する直前の用量と定義される。疾患の進行を辿るために標準的測定法も使用する。
【０２２１】
[00250]  この臨床試験の後にＩＩ相試験を実行することができ、追加の患者コホートを補充して、決定されたＭＴＤのリポソームナノ粒子で治療する。試験後少なくとも２年間、全患者を追跡調査する。治療が成功した場合は、追加の追跡調査を実施して、リポソームナノ粒子で治療した患者が、従来のＭＡＰ化学療法で治療した患者と比較して、続発性悪性疾患を発症する可能性が低下したか否かを決定する。
【０２２２】
実施例６−膵臓癌のＰＥＴ撮像にリポソームナノ粒子を使用する
[00251]  この実施例では、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディフラグメントを改変し、ナノ粒子を膵臓癌に標的化させた。
【０２２３】
[00252]  抗体は、細胞表面の抗原に対して非常に優れた特異性を有することができる独特のクラスの標的化剤である。抗原特異性を保持した最小の改変抗体フラグメントは、アミノ酸リンカーで結合された可変軽（ＶL）鎖と可変重（ＶH）鎖で構成された単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである（Kenanova他、Tailoring antibodies for radionuclide delivery. Expert Opin Drug Deliv, 2006）。リンカー配列の長さは、ダイアボディ、すなわち、２個のｓｃＦｖ鎖の非共有結合二量体の形成を促進するように調整することができる（Kortt他、Dimeric and trimeric antibodies: high avidity scFvs for cancer targeting. Biomol Eng, 2001）。ダイアボディは、ｓｃＦｖと比較して優れた結合親和性及び結合活性を呈することが示されており、これは抗原に対する二価性による可能性が高い（Adams他、Avidity-mediated enhancement of in vivo tumor targeting by single-chain Fv dimers. Clin Cancer Res, 2006）。更に、Ｃ末端システイン残基をｓｃＦｖのＤＮＡ構成に改変することによって２個のｓｃＦｖ鎖の共有結合二量体（ｃｙｓ−ダイアボディ）を生成することができる（Olafsen他、Covalent disulfide-linked anti-CEA diabody allows site-specific conjugation and radiolabeling for tumor targeting applications. Protein Eng Des Sel, 2004）。ｃｙｓ−ダイアボディは、ジスルフィド結合の還元後にシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を通して蛍光体又は放射性同位体と部位特異的に共役する能力を有する（Olafsen他、２００４）。Carmichael他の研究が、抗ＣＥＡダイアボディの結晶構造を解明し、Ｃ末端がタンパク質の抗原結合ポケットの反対端にあり、それによってシステイン残基を改変するのに魅力的な部位になることを示した（Carmichael他、The crystal structure of an anti-CEA scFv diabody assembled from T84.66 scFvs in V(L)-to-V(H)orientation: implications for diabody flexibility. J. Mol Biol, 2003）。この研究は更に、この方法での修飾は、これらのシステイン残基を通して放射性核種に標識すると、ダイアボディの親和性を変化させなかったことを実証した（Carmichael他、２００３）。これらのシステイン残基に部位特異的に共役するこの独特の能力により、シスダイアボディフラグメントは治療用途にとって魅力的なフラグメントになる。特に、治療用ナノ粒子の部位特異的共役に使用することができ、したがって標的治療を癌細胞に送達する潜在力を有することができる。
【０２２４】
[00253]  本実施例の目的は、システイン残基をタンパク質に改変することによって抗ＣＡ１９−９ダイアボディを修飾し、新しく生成したシステイン修飾抗ＣＡ１９−９ダイアボディ（抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディ）を特徴付け、単独で、並びにＰＬＮに共役しながら標的化の潜在力を保持する能力を確認することであった。それを実行するために、最初にシステイン残基を改変して抗ＣＡ１９−９ダイアボディのＣ末端にし、マイクロＰＥＴ／ＣＴを使用してインビトロ及びインビボでその抗原特異的結合能力を評価した。次に、還元システイン残基の遊離スルフヒドリル基を介して抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディをナノ粒子の表面に共役した。最後に、免疫蛍光検査及びフローサイトメトリを使用して、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役がＣＡ１９−９陽性細胞を陰性細胞から区別する能力を評価した。
【０２２５】
方法
材料
[00254]  重合リポソームナノ粒子（ＰＬＮ）は、NanoValent Pharmaceuticals, Inc.（モンタナ州ボーズマン）から入手した。ＰＬＮを含む脂質はＮ−（５’−ヒドロキシ−３’−オキシペンチル）−１０−１２−ペンタコサジインアミド（「ｈ−Ｐｅｇ1−ＰＣＤＡ」）、Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］−１０−１２−ペンタコサジインアミド（「ｍ−Ｐｅｇ７５０−ＰＣＤＡ」）、Ｎ−（５’−スルホ−３’−オキシペンチル）−１０，１２−ペンタコサジインアミド、ナトリウム塩（「スルホ−Ｐｅｇ1−ＰＣＤＡ」）及びＮ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−１５００］−１０−１２−ペンタコサジインアミド（「ｍａｌ−Ｐｅｇ１５００−ＰＣＤＡ」）である。
【０２２６】
[00255]抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの構成
[00256]  抗ＣＡ１９−９ダイアボディのために以前に改変されたｐＵＣ１８ベクター（New England Biolabs、マサチューセッツ州ビバリー）のｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲを実施してシステイン残基をｓｃＦｖのＣ末端に添加するテンプレートとして使用した（Sirk他、Site-specific, thio-mediated conjugation of fluorescent probes to cysteine-modified diabodies targeting CD20 or HER2. Bioconjug Chem, 2008）。これは、ＧＧＣＣＧアミノ酸配列（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡ−３’、IDT Integrated DNA Technologiesカリフォルニア州サンディエゴ）を挿入する４８塩基対プライマとともに標準のＰＣＲ反応成分（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して遂行した。この構成を、ｐＵＣ１８ベクターから切断し、選択用のグルタミン合成遺伝子及び高発現用のｈＣＭＶプロモータを含有するｐＥＥ１２哺乳類発現ベクター（Lonza Biologics、英国スロー）に連結したＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２２７】
発現、選択、及び精製
[00257]  ＮＳ０マウスの骨髄腫細胞(5.0 ×106)に、電気穿孔法で２０μｇの線形化ｐＥＥ１２  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ構成を形質移入した。細胞を、上述したようにグルタミン欠損ＤＭＥＭ／高修飾媒質（JRH Biosciences、カンザス州レネクサ）中で選択した（Galfre及びMilstein、Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol, 1981；Kenanova他、Tailoring the pharmacokinetics and positron emission tomography imaging properties of anti-carcinoembryonic antigen single-chain Fv-Fc antibody fragments. Cancer Res, 2005）。形質移入体は、ｃｙｓ−ダイアボディの発現のためにウェスタンブロット法でスクリーニングし、この方法ではニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を１μｇの抗体-ペンタヒスＩｇＧ抗体(Sigma-Aldrich、ペンシルベニア州ベルフォント）で、及び１μｇのアルカリ性ホスファターゼ共役ヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch Labs、ペンシルベニア州ウェストグローブ）で順番にインキュベートし、BCIP/NCP Color Development Substrate（Promegaウィスコンシン州マディソン）で発生させた。ウェスタンブロット解析に基づき、トリプルフラスコ内に膨張するように高生産性クローンを選択した（Nunclon、ニューヨーク州ロチェスター）。細胞が増殖し、トリプルフラスコステージで枯渇した後、上澄みを採取し、遠心分離して細胞残渣を除去し、次にｃｙｓ−ダイアボディを精製するためにAKTA Purifier（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して１ｍＬ／分の流量で１ｍＬのHiTrap Chelating HPカラム（GE Healthcare）に適用した。結合タンパク質をＰＢＳ中の２５０ｎＭイミダゾールで溶離した。ｃｙｓ−ダイアボディを含有するフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、貯留させて、精製したタンパク質を緩衝交換して、不純物がないことを確実にするために、分子量のカットオフが１０，０００ダルトンの状態でSlide-A-Lyzer Dialysis Cassette（Thermo Fisher Scientific、イリノイ州ロックフォード）を使用してＰＢＳに対して透析分離した。次に、精製して緩衝交換したｃｙｓ−ダイアボディを、スピンカラム（Vivaspin 20、１０ｋＤａカットオフ、Thermo Fisher Scientific）を使用して濃縮し、最終的なｃｙｓ−ダイアボディタンパク質を４℃で保存した。
【０２２８】
精製した抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディタンパク質の生化学的特徴付け
[00258]  精製した抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを、プレキャストした４〜２０％のゲル（Bio-Rad Laboratories）に載せてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質サンプルを、ジスルフィド結合の効率的な還元を確保するために１００ｍＭの濃度の還元剤、すなわちジチオスレイトール（ＤＴＴ）がある状態で、及びそれがない状態でインキュベートした。タンパク質検出のために、ゲルをMicrowave BlueTM（Protiga Inc.、メリーランド州フレデリック）で染色した。サンプルは、Superdex 75 HR 10/30カラム（GE Healthcare）上でサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）でも分析した。約５０μｇのタンパク質をカラムに塗布し、AKTA Purifier上で０．５ｍＬ／分の流量にしてＰＢＳ中で均一濃度にて実施した。溶出時間を取得し、炭酸脱水酵素（３０ｋＤａ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ）標準（Sigma）と比較した。
【０２２９】
細胞株
[00259]  ＮＳ０マウスの骨髄腫細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Invitrogen）及び１％のグルタミン（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ／高修飾媒質で維持した。ヒト膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ３及びＭｉａＰａｃａ−２（American Type Culture Collection. ATCC、バージニア州マナッサス）を、それぞれＲＰＭＩ−１６４０及びＤＭＥＭで維持した。媒質全部に１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）及び１０％のＦＢＳを補充した。ＭｉａＰａｃａ−２細胞株用の媒質には、ATCCの推奨通りに２．５％のウマ血清（Invitrogen）も補充した。
【０２３０】
重合リポソームナノ粒子（ＰＬＮ）の調製
リポソームは、上述した方法に従ってｈ−Ｐｅｇ１−ＰＣＤＡ、ｍ−Ｐｅｇ７５０−ＰＣＤＡ、スルホ−Ｐｅｇ１−ＰＣＤＡ、ｍａｌ−Ｐｅｇ１５００−ＰＣＤＡ（６．７：２．６：０．５：０．２、モル比）から調製した（Bruehl他、Polymerized liposome assemblies: bifunctional macromolecular selectin inhibitors mimicking physiological selectin ligands. Biochemistry, 2001）。要するに、脂質を混合し、in vacuoで薄膜に蒸着させた。２４ｍＭ（総脂質）の懸濁液になるように、薄膜に脱イオン水を添加した。プローブ先端の音波処理器（Fisher sonic dismembrator model 300）で１０分間、７０〜８０℃で音波処理し、懸濁液を加熱した。その結果の透明溶液を、次に５℃まで２０分間冷却し、周囲温度まで２０分間温めて、Spectrolinker XL-1000 UV Crosslinker（Spectronics Corp.）で１０分間ＵＶ光照射（２５４ｎｍ）することにより重合した。その結果の青いＰＬＮを６５℃まで５分間加熱し、それを赤い（蛍光）形態に変換した。微量の不溶性汚染物質を除去するために、０．２μｍの酢酸セルロースフィルタに通して着色溶液をシリンジ濾過した。Zetasizer Nano-S（Malvern Inst.）で１０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中の平均粒子サイズを測定した。
【０２３１】
抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディのＰＬＮとの共役
[00260]  マレイミドの化学的性質を使用して、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディをＰＬＮと共役した。５０μＬのＰＢＳ中の約５０μｇのｃｙｓ−ダイアボディを、１００μＬの固定化トリス（２−カルボキシエチレン）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で３０分間、室温で還元した。その後、ＴＣＥＰをセルローススピンカップ（Thermo Fisher Scientific）中で溶液から遠心分離した。即座に還元ｃｙｓ−ダイアボディをＰＬＮ溶液（NanoValent Pharmaceuticals, Inc.、モンタナ州ボーズマン）に、２５０μｇのＰＬＮに対して５０μｇのｃｙｓ−ダイアボディの割合で添加した。この混合物を室温で２時間インキュベートし、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette（MW cutoff、１００ｋＤａ）を使用してＰＢＳ中で一晩透析分離し、結合していない遊離ｃｙｓ−ダイアボディがあればすべて除去した。
【０２３２】
フローサイトメトリ及び免疫蛍光検査によるインビトロ結合アッセイ
[00261]  フローサイトメトリ及び免疫蛍光検査を使用して、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディと抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役との両方の結合能力を評価した。ヒト膵臓細胞株をすべて採取し（細胞１×１０６個）、２５０μＬのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で再懸濁させ、氷に載せた４μｇのｃｙｓ−ダイアボディで１時間インキュベートした。細胞を１０００×ｇでの遠心分離により１０分間洗浄し、上澄みを廃棄して、細胞を別の２５０μＬのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で再懸濁させた。細胞を再び氷に載せた２次抗体、すなわち４μｇの抗ペンタヒスＩｇＧ抗体（Sigma）で１時間インキュベートした。更に１回洗浄し、最後に細胞を氷に載せた４μｇの３次抗体、すなわちＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）共役ヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的抗体（Jackson Immunoresearch Labs）で１時間インキュベートした。最終の洗浄を実施し、細胞を５００μＬのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で再懸濁させた。ScanXフローサイトメータ（Becton Dickinson、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用して結合データを取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.、オレゴン州アシュランド）を使用して解析した。
【０２３３】
[00262]  同様に、６ウェルプレート（Becton Dickinson）を使用し、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディ、２次抗体、及び３次抗体の一連のインキュベーションステップで、インキュベーションの間に洗浄ステップを入れて免疫蛍光検査を実施した。全ステップが終了すると、ウェルをNikon 90S蛍光顕微鏡（Nikon Inc.、ニューヨーク州メルヴィル）で視覚化し、５．１メガピクセルのＣＣＤカメラ（Nikon）で像を取得した。像は、Nikonのソフトウェアを使用して解析し、Photoshop Elements 4（Adobe Systems Inc.、カリフォルニア州サンノゼ）を使用してコントラスト及び輝度を処理した。
【０２３４】
[00263]  フローサイトメトリと免疫蛍光検査の両方で、負の対照標準サンプルには、細胞のみ、又は１次抗体がない状態で２次及び３次抗体でインキュベートした細胞を有するサンプルが含まれた。実験用サンプルは、ｃｙｓ−ダイアボディ、２次、及び３次抗体でインキュベートした細胞であった。正の対照標準サンプルは、親の無損傷（intact）のｍＡｂ及び３次抗体でインキュベートした細胞であった。
【０２３５】
[00264]  更に、フローサイトメトリ及び免疫蛍光検査を、１次抗体として抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役を使用し、同じ方法で実施した。ＰＬＮはＲ−ＰＥと同じ紫外線範囲で自己蛍光を呈するので、２次又は３次抗体は使用しなかった。実験には、負の対照標準として細胞のみ、ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役でインキュベートした細胞、及びＰＬＮのみでインキュベートした細胞が含まれた。
【０２３６】
細胞ベースの競合ＥＬＩＳＡ
[00265]  抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの相対的な結合親和性を決定するために、細胞ベースの競合ＥＬＩＳＡを実施した。ＣＡ１９−９陽性細胞ＢｘＰＣ３を採取し、数えて、一晩接着のために９６ウェルプレートに等分した（細胞５０，０００個／ウェル）。翌日、細胞媒質を取り出し、各ウェルを１５０μＬのＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄した。洗浄液も取り出し、ｍＡｂを生成することが知られている１１６−Ｎ−１９−９ハイブリドーマ細胞の上澄みを精製することによって得られる親の無損傷の抗ＣＡ−１９−９ｍＡｂの１ｎＭ濃縮液１５０μＬで１時間、室温にて各ウェルをインキュベートした（Koprowski他、Colorectal carcinoma antigens detected by hybridoma antibodies. Somatic Cell Genet, 1979）。インキュベーション後、ウェルを同様に洗浄し、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度の抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディ１５０μＬで１時間、室温でインキュベートした。再びウェルを洗浄し、ＡＰ共役ヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的抗体（Jackson Immunoresearch Labs）の１：２５００μＬ希釈液１５０μＬでインキュベートした。１時間後、ウェルを再び洗浄し、１０ｍＬのＡＰ緩衝液に１０ｍｇのホスファターゼタブ（Sigma）を溶解させた溶液１５０μＬで発生させた。１５分間、反応が進行できるようにし、次にGENiosマイクロプレート読み取り装置（Tecan、ノースカロライナ州ダーラム）を使用して紫外線吸光度を評価した。同じ実験を３回実施した。親の無損傷抗ＣＡ１９−９ｍＡｂの５０％を置換するのに必要なｃｙｓ−ダイアボディの量と定義される解離定数（Ｋｄ）を計算するために、各サンプルの紫外線吸光度値に基づいて、飽和結合プロットを生成した。
【０２３７】
放射性ヨウ素化
[00266]  説明されている通りにIodo-Gen法を使用し、陽電子放射同位体のヨウ素１２４（124Ｉ）で抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの放射標識を実施した（Richardson他、An improved iodogen method of labelling antibodies with 123I. Nucl Med Commun, 1986）。２００μｇの精製ｃｙｓ−ダイアボディ（２００μＬ）及び８００μｇＣｉのＮａ124Ｉ(IBA Molecular、バージニア州ダレス）で標識反応を実施した。Tec-Controlキット（Biodex Medical Systems、ニューヨーク州シャーリー）を使用した瞬間薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を使用して、標識効率を測定した。陽性細胞株に対して余分な抗原があるように、放射性ヨウ素化ｃｙｓ−ダイアボディ（約１００，０００ｃｐｍ）をＰＢＳ／２％ＦＢＳ中のＢｘＰＣ３細胞及びＭｉａＰａｃａ−２細胞でインキュベートすることにより、放射標識後に細胞への結合能力を保持するｃｙｓ−ダイアボディの画分と定義される免疫反応性を決定した。ＣＡ１９−９に対して陰性であるＭｉａＰａｃａ−２細胞を使用して、放射標識後でもｃｙｓ−ダイアボディの結合に変化がないことを確認した。放射性ヨウ素化ｃｙｓ−ダイアボディを、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２０分間洗浄できるようにした。細胞に結合していないｃｙｓ−ダイアボディが、したがって放射能が上澄み中にあれば、すべて採取し、Wizard 3' 1480 Automatic Gamma Counter（Perkin-Elmer、カリフォルニア州コビーナ）で測定した。この画分を細胞でインキュベートした総放射能で割り、非結合放射能（すなわち、非結合ｃｙｓ−ダイアボディ）の部分を出した。この画分を１から引くと、結合ｃｙｓ−ダイアボディ（すなわち、免疫反応性）の部分と等しくなる。
【０２３８】
異種移植片の撮像及び体内分布の調査
[00267]  動物の取り扱いは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）のChancellor's Animal Research Committeeが承認したプロトコルに従って実施した。抗原陽性の（ＢｘＰＣ３）異種移植片モデルを、マウス４匹の左肩に皮下注射した１×１０６個の細胞で定着させた。同じ４匹のマウスで、抗原陰性細胞株（MiaPaca-2）を負の対照標準として右肩に注射した。約３週間、腫瘍が発生できるようにした。124Ｉ−抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを尾部静脈に注射する３０分前に、２００μＬのＰＢＳ中に１．５ｍｇの過塩素酸カリウムで胃洗浄を実施した。また、放射性ヨウ素化ｃｙｓ−ダイアボディを注射する２４時間前に、飽和ヨウ化カリウムを飲料水に添加する（０．５ｍＬ／水１００ｍＬ）ことにより、放射性ヨウ素の甲状腺摂取を遮断した。マウスには、尾部静脈を介してＰＢＳ／２％ＦＢＳ中の124Ｉ−抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディ（比放射能４．０３±１．８μＣｉ／μｇ）を約２５μｇ注射した。マイクロＰＥＴを注射後４時間及び２０時間に実施した。これらの撮像時点は、以前に測定したダイアボディフラグメントの半減期に基づいて選択し、それぞれ約１半減期及び５半減期に対応する（Olafsen他、２００４；McCartney他、Engineering disulfide-linked single-chain Fv dimers [(sFv')2] with improved solution and targeting properties: anti-digoxin 26-10 (sFv')2 and anti-c-erbB-2 741F8 (sFv')2 made by protein folding and bonded through C-terminal cysteinyl peptides. Protein Eng, 1995；Williams他、Numerical selection of optimal tumor imaging agents with application to engineered antibodies. Cancer Biother Radiopharm, 2001）。また、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディのインビボ標的化能力を抗ＣＡ１９−９ダイアボディと適切に比較するために、抗ＣＡ１９−９ダイアボディに関して以前に発表されたものと同じ時点で撮像実験を実施した（Girgis他、Anti-CA19-9 diabody as a PET imaging probe for pancreas cancer. J Surg Res, 2011 170:169-178、参照により全体を本明細書に組み込むものとする）。マウスを２％イソフルランで麻酔し、マイクロＰＥＴのベッドに載せ、Focus microPETスキャナ（Concorde Microsystems Inc.、テネシー州ノックスビル）で撮像した。捕捉時間は１０分であった。すべての画像をＦＢＰアルゴリズムで再構築し、AMIDEソフトウェアパッケージで表示した（Defrise他、Exact and approximate rebinning algorithms for 3-D PET data. IEEE Trans Med Imaging, 1997；Loening及びGambhir、AMIDE：多モード医療画像解析用のフリーソフトウェアツール、Mol Imaging、２００３）。１匹のマウスは、マイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）でも撮像し、解剖学的基準にするためにマイクロＰＥＴの画像と同時登録した。最後の撮像時点の後にマウスを安楽死させ、器官、腫瘍及び血液を採取して計量した。体内分布分析のためにガンマカウンタで器官の放射能摂取を計数し、減衰補正の後に組織１グラム当たりの放射能の注射量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）に変換した。
【０２３９】
結果
抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの構成
[00268]  テンプレートとして抗ＣＡ１９−９ダイアボディＤＮＡを使用して、ＰＣＲを実施し、Ｃ末端システイン残基を挿入した。遺伝子の配列を決定し、公開されている配列と比較して、成功を確認した（Tonge他、Cloning and characterization of 1116NS19.9 heavy and light chain cDNAs and expression of antibody fragments in Escherichia coli. Year Immunol, 1993）。その結果であり、ＮＳ０細胞のトランスフェクションに使用するＤＮＡ構造を図１０Ｂに示す。
【０２４０】
発現、選択、及び精製
[00269]  ＮＳ０骨髄腫細胞内でｃｙｓ−ダイアボディを発現させた。これらのクローンが最高レベルのタンパク質を発現したか否かを決定するために、細胞培養物の上澄みを採取し、ウェスタンブロット法で分析した。これらは、トリプルフラスコ（Nunclon）内に膨張するように選択された。選択されたクローン発現は１０〜４５ｍｇ／Ｌの範囲であった。抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディのＣ末端上に改変された６ｘＨｉｓタグをタンパク質の精製に使用した。約１００ｍＬの培養物の上澄みから１〜４．５ｍｇの純粋なタンパク質が生成された。
【０２４１】
抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの生化学的特徴付け
[00270]  高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製で取得した分離ｃｙｓ−ダイアボディの純度（図１１Ａ及び図１１Ｂ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法で確認した。ＳＥＣを実施して、２つのｓｃＦｖフラグメントの間にｃｙｓ−ダイアボディを形成するのに適切な共有結合的相互作用が存在するか評価した（図１１Ｃ）。図示のように、ＢＳＡ（２０．７５分）及び炭酸脱水酵素（２４．７５分）の標準と比較すると、ｃｙｓ−ダイアボディの溶出時間は２３．９８分であった。ｃｙｓ−ダイアボディの溶出時間は、５６ｋＤａというその予測分子量と一致した。
【０２４２】
抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを特徴付けるためのインビトロ結合アッセイ
[00271]  ＣＡ１９−９の認識及び結合を、フローサイトメトリ及び免疫蛍光検査法で評価した。抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディは、フローサイトメトリによりＣＡ１９−９陽性細胞株ＢｘＰＣ３とＣＡ１９−９陰性細胞株、ＭｉａＰａｃａ−２とを識別する能力を実証した（図１２Ａ）。親の無損傷の抗ＣＡ１９−９抗体と比較すると、ｃｙｓ−ダイアボディはわずかに低い結合効率を呈した。ＭｉａＰａｃａ−２はＣＡ１９−９の発現を示さず、負の対照標準の働きをした。免疫蛍光検査法のデータは、フローサイトメトリのデータに従っていた（図１２Ｂ）。ＭｉａＰａｃａ−２細胞株は無損傷の抗ＣＡ１９−９ｍＡｂ又はｃｙｓ−ダイアボディの結合を示さなかったが、ＢｘＰＣ３細胞株は２つの抗体間に同等の結合を示した。
【０２４３】
細胞ベースの競合ＥＬＩＳＡ
[00272]  説明されたような競合結合アッセイを実施して、マウスの抗ＣＡ１９−９無損傷抗体と比較した場合の抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの相対的結合親和性を確認した。各サンプルで取得した吸光度値を平均し、飽和結合プロット上に記入した。ダイアボディで観察された相対的結合親和性は、１０ｎｍｏｌ／Ｌ未満であった（図１２Ｃ）。
【０２４４】
放射性ヨウ素化、異種移植片の撮像、及び体内分布の調査
[00273]  抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディのインビボ腫瘍標的化をマイクロＰＥＴの撮像で評価した。ＣＡ１９−９陽性（BxPC3）及びＣＡ１９−９陰性（MiaPaca-2）の腫瘍を有するヌードマウスに、124Ｉで標識した抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを注射した。抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディ上の124Ｉの標識効率は９６％であった。124Ｉで標識した抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの免疫反応性は、ＢｘＰＣ３細胞では７５％、ＭｉａＰａｃａ−２細胞では１％であった。平均５５ｍｇ（２１〜１２８ｍｇの範囲）のＢｘＰＣ３腫瘍を有する４匹でマイクロＰＥＴ撮像調査を実施し、ｃｙｓ−ダイアボディの注射後４時間及び２０時間で取得した。図１３は、各調査の代表的画像を示す。２０時間の時点の後、マウス４匹を全部屠殺し、放射能を測定して腫瘍標的化の定量的エビデンスを提供するために器官を採取した。これらのデータを使用して、各動物の腫瘍と血液との比率を計算した。ＢｘＰＣ３腫瘍を有するマウス４匹では、陽性腫瘍活性は平均して１グラム当たり注射量の０．８％（％ＩＤ／ｇ）であり、０．５〜１．２％ＩＤ／ｇの範囲であった。このモデルの陰性腫瘍活性は平均して０．１％ＩＤ／ｇ（０．０３〜０．２％ＩＤ／ｇの範囲）であった。平均的腫瘍と血液の比率は３：１で、陽性腫瘍と陰性腫瘍との比率は８：１であった。臓に高い摂取率が認められた（データは示さず）。
【０２４５】
マレイミドＰＬＮの構成及び特徴付け
[00274]  脂質の自己集合によりＰＬＮを合成して、小さい単層リポソームにした。重合性脂質は脂肪酸尾部にジアセチレン基を含有する。市販のＰＣＤＡ脂質（GFS Chemicals）のカルボキシル基に化学的に共役させることにより、メトキシ及びマレイミド末端のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをリポソーム形成脂質に付加した。脂質相遷移より高い温度まで加熱しながら、脂質の水性分散液を音波処理し、透明の溶液に見えるリポソームを生成した。重合した（ポリジアセチレン）ＰＬＮを得るには、脂質鎖を膜二重層の一部として密に詰まった固体様の状態にしなければならない（Haglund他、Gastrointestinal cancer-associated antigen CA 19-9 in histological specimens of pancreatic tumours and pancreatitis. Br J Cancer, 1986）。これは、リポソーム溶液を５℃まで２０分間冷却することによって達成される。温めた後、溶液にＵＶ光を照射してラジカル重合プロセスを開始すると、深い青紫色のＰＬＮ溶液になる。
【０２４６】
[00275]  青紫の形態のＰＬＮはわずかしか蛍光を発せず、蛍光性が高い粒子を得るには、溶液を短時間加熱する。その結果、ポリジアセチレンポリマーのバックボーンがわずかに動揺し、その結果、色及び蛍光に色シフトが生じる（Loy他、Distribution of CA 19-9 in adenocarcinomas and transitional cell carcinomas. An immunohistochemical study of 527 cases. Am J Clin Pathol, 1993）。蛍光発光スペクトルは６３５ｎｍを中心とし、４８０ｎｍ〜５８０ｎｍまで広く複雑な励起スペクトルがある。非蛍光ＰＬＮを細胞が取り込むと、それを迅速に蛍光形態に変換するという何らかの証拠が見られた（非公開データ）。しかし、細胞の取り込みを調査するために、ＰＬＮを予熱し、これをすべて蛍光形態に変換した。ＰＬＮ蛍光に対する明白な利点は、光脱色がほとんど、又は全く生じないことである。
【０２４７】
[00276]  この脂質製剤の簡単なプローブ先端の音波処理で得られたＰＬＮは、極めて密集した母集団で小さいサイズの粒子を提供する。粒子サイズの分析によると、通常は３０〜５０ｎｍの範囲のサイズで、平均サイズは約３８ｎｍを中心とする。膜の押し出しによって、更に軽いサイズ範囲を生成する試みは実行しなかったが、この技術はリポソーム調製ステップに適用可能であり、今後の研究で後にインビボで投与する物質については実施される。
【０２４８】
抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディとＰＬＮの共役
[00277]  約２００μｇの抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを、１０００μｇのＰＬＮとの共役に使用した（図１４）。反応時間は２時間であった。反応効率は、緩衝液交換後に残ったｃｙｓ−ダイアボディの量の計算によって測定し、約８０％であった。また、すべての実験を共役から１カ月後に再現し、同様の結果であったので、この共役は１カ月以上安定していた。
【０２４９】
抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役を特徴付けるインビトロ結合アッセイ
[00278]  抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役のフローサイトメトリは、非共役の抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディと比較すると同様の結果を示した（図１５）。ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役は、免疫蛍光検査法及びフローサイトメトリの両方で、陽性と陰性細胞株を区別することができた。更に、ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役の免疫蛍光検査法は、細胞膜の外表面に局所化したパターンを実際に示した（図１５）。
【０２５０】
結論
[00279]  ＣＡ１９−９を選択したのは、すべての膵臓癌の９０％以上が罹患し、細胞膜の外表面でアクセス可能だからである（Haglund他、１９８６；Loy他、１９９３；Makovitzky、The distribution and localization of the monoclonal antibody-defined antigen 19-9 (CA19-9) in chronic pancreatitis and pancreatic carcinoma. An immunohistochemical study. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol, 1986；Ohshio他、Immunohistochemical studies on the localization of cancer associated antigens DU-PAN-2 and CA19-9 in carcinomas of the digestive tract. J Gastroenterol Hepatol, 1990）。広範囲の罹患率及びアクセス性に加えて、非常に大量にあり、発現量は細胞１個当たり１００万〜２００万個の抗原になると推定される。これらの属性に基づき、これは理想的な腫瘍標的になる。抗ＣＡ１９−９ダイアボディを使用して、ＣＡ１９−９の標的化をインビトロ及びインビボで実証することができた（Girgis他、CA19-9 as a Potential Target for Radiolabeled Antibody-based Positron Emission Tomography of Pancreas Cancer, Internat'l J. of Molec.. Imaging, 2011, 1-9、参照により全体を本明細書に組み込むものとする）。これらの結果に促されて、ダイアボディをｃｙｓ−ダイアボディに修飾し、このフラグメントに対して部位特異的に共役する独特の能力を探求した。そのために、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを改変、生成、及び特徴付けした。出願人のｃｙｓ−ダイアボディが他の改変ｃｙｓ−ダイアボディと同様の生化学的性質を呈し、５６ｋＤａの分子量を示して、共有結合二量体を形成することを示す（Olafsen他、２００４：Sirk他、Site-specific, thiol-mediated conjugation of fluorescent probes to cysteine-modified diabodies targeting CD20 or HER2. Bioconjug Chem, 2008）。また、フローサイトメトリ及び免疫蛍光検査法によりＣＡ１９−９とｃｙｓ−ダイアボディの特異的標的化を実証し、親の抗ＣＡ１９−９ダイアボディと比較して同様の結合親和性であった。
【０２５１】
[00280]  Ｃ末端システイン残基の修飾がダイアボディのインビボ結合特性を変化させないことを確認するために、ＢｘＰＣ３異種移植片及びＭｉａＰａｃａ−２異種移植片を有するマウスに尾部静脈を介して124Iで標識した抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを注射することにより、ｃｙｓ−ダイアボディがＣＡ１９−９を標的にする能力を調査した。４時間でのマイクロＰＥＴ画像は、親抗ＣＡ１９−９ダイアボディと同様に、抗体フラグメントがＢｘＰＣ３異種移植片（ＣＡ１９−９陽性）を迅速に標的にすることを実証した。また、２０時間の時点でマイクロＰＥＴ画像上に信号が残存していることに基づき、ｃｙｓ−ダイアボディが異種移植片の部位に保持されていることを示した。したがって、注射後２０時間での体内分布データにより、マイクロＰＥＴ画像が客観的に確認される。注射時間に合わせて補正された体内分布データは、組織１グラム当たりの放射能の注射量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）で表現した生の数値を提供し、陽性及び陰性腫瘍、並びに血液及び器官について確認されている。予想されるように、マイクロＰＥＴ画像で肝臓に信号が存在することを説明する高い％ＩＤ／ｇを実際に示す。この現象は、６ｘＨｉｓタグがある、又はないＨｅｒ２アフィボディを特徴付けて、６ｘＨｉｓタグがあるアフィボディはタグがないＨｅｒ２アフィボディと比較して肝臓の取り込み量が大幅に増加したことを述べたAhlgren他によって最もよく説明されている（Ahlgren他、Targeting of HER2-expressing tumors with a site-specifically 99mTc-labeled recombinant affibody molecule, ZHER2:2395, with C-terminally engineered cysteine. J Nucl Med, 2009）。この現象は、ヒトでは詳細に説明されていないが、６ｘＨｉｓタグで改変したタンパク質の臨床への翻訳にとって潜在的な障害となり、６ｘＨｉｓタグを必要としない代替的な精製技術で克服することができる。更に重要なことは、腫瘍と血液の３．０という比率、及び陽性と陰性の８．０という腫瘍比率が得られた。これらの値は、画像が腫瘍と血液（すなわち、背景）とを視覚化するのに十分なコントラストを表示することを示す。これらのデータは、ＢｘＰＣ３異種移植片の抗原特異的標的化を示すばかりでなく、膵臓癌の標的化剤としての抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの潜在力のエビデンスも提供する。
【０２５２】
[00281]  ｃｙｓ−ダイアボディがＣＡ１９−９陽性細胞を抗原特異的に標的にする能力をインビトロとインビボの両方で確認した後、出願人の抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを出願人の重合リポソームナノ粒子（ＰＬＮ）の表面に添加する部位特異的共役反応の開発を開始した。Ｃ末端システイン残基のジスルフィド結合を還元することにより、マレイミドの化学的性質を使用してＰＬＮに共役するために遊離スルフヒドリルが使用可能になる。マレイミド基を、ＰＬＮ形成脂質の１つに付着させることにより、集合ステージからすぐにＰＬＮ表面に組み込んだ。ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役が生成され、抗原特異的に細胞に結合したことを確認するために、幾つかの調査を実施した。ＰＬＮの本質的な自己蛍光性を考慮すると、ＰＬＮ結合した細胞は、追加の検出方法が全くない状態でフローサイトメトリ検出器で捕捉されると想定された。陰性細胞株は、ＰＬＮのみで、又は共役溶液がある状態で蛍光を示さず、ＢｘＰＣ３細胞はｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役のみで蛍光を示し、ＰＬＮのみでは示さなかった。これらの結果で、共役反応が成功し、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディの特異的な抗体と抗原の相互作用を通して、ＰＬＮがインビトロで癌細胞を標的にできることが確認された。出願人の知る限り、ダイアボディとその抗原との相互作用を通してＰＬＮが癌細胞を標的にできることを示したのは、出願人が最初である。
【０２５３】
[00282]  この成果は更に、標的治療を癌細胞に送達する潜在力を規定する。ＰＬＮが化学療法剤の媒体として働く能力により、標的化剤、すなわち抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを標的治療の送達に適用することができる方法を提供することができる。ｃｙｓ−ダイアボディＰＬＮ共役がインビボで膵臓癌を標的にする能力を評価するさらなる調査を実施する必要があるが、化学療法剤を送達する抗原特異的技術の潜在力は有望である。
【０２５４】
[00283]  要するに、ダイアボディは、腫瘍抗原の標的化に使用することができる高度に特異的な薬剤である小さい二価抗体フラグメントである。この調査では、部位特異的にＰＬＮに共役する能力を探求するために、抗ＣＡ１９−９ｃｙｓ−ダイアボディを改変することによって抗ＣＡ１９−９ダイアボディでの以前の結果を発展させる。ダイアボディをｃｙｓ−ダイアボディに修飾した後、抗体フラグメントがインビトロ及びインビボでその抗原特異性を保持し、マウスモデルで膵臓癌異種移植片の抗原特異的なマイクロＰＥＴ画像を提供することを示す。また、ｃｙｓ−ダイアボディは、腫瘍抗原ＣＡ１９−９に対する免疫反応性を保持しながら、ＰＬＮと共有結合で共役できることを実証した。これは、ｃｙｓ−ダイアボディのナノ粒子との部位特異的共役を使用して、これらのリポソーム媒体の柔軟な性質により、多種多様な想定し得る治療及び診断用途に対する門戸を開放する最初の報告である。ＥＲＰ効果を介した受動的標的化は、正常組織と比較して腫瘍にて重大な治療の優位を生じるには十分でないことがある。抗ＣＡ１９−９−ＰＬＮ免疫共役を生成することにより、抗体と抗原の認識を通して「能動的標的化」を達成することができ、これは治療薬の腫瘍特異的送達を改善して、これらの細胞毒性剤から正常細胞へのバイスタンダ効果を最小化することができる。このような方法で、抗原特異的に細胞毒性剤ペイロードを癌細胞に送達する潜在力を有する。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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