(57)【要約】  本発明は、アロ因子に向かう、遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種に用いるウイルスベクターに向かう、被験体が天然に曝露されるタンパク質に向かう、遺伝子改変生物に向かう、そしてアレルギー性または感染性疾患のためのワクチン投与に関連する望ましくない効果に向かう、免疫反応の防止のための方法および化合物を記載する。  【選択図】図３
2014501727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＴ細胞を活性化する能力を減少させた単離ペプチドまたはポリペプチドを得るための方法であって：
ａ．Ｐ１位および／またはＰ７位に疎水性アミノ酸残基を含む、少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープの同定
ｂ．Ｐ１位および／またはＰ７位の疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換することによる、前記エピトープ（単数または複数）の除去
の工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記疎水性残基がＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｐ１位および／またはＰ７位の少なくとも１つのＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙが、少なくとも１つの任意の天然アミノ酸、非天然アミノ酸または非芳香族アミノ酸化合物であって、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる前記アミノ酸によって置換されている、請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープがＰ４に脂肪族残基を含むことで特徴付けられる、先行する請求項のいずれか記載の方法。
【請求項５】
Ｐ４の前記脂肪族残基がＩ、Ｌ、Ｍであることで特徴付けられる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＮＫＴ細胞エピトープが［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］モチーフを含み、ここで、１位および／または７位の少なくとも１つのＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙが削除されている、先行する請求項のいずれか記載の方法。
【請求項７】
化学合成によってまたは組換え発現によって産生される、請求項１〜５にしたがって得られうる、単離ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項８】
アロ因子、ウイルスベクター、食品、餌、全身または吸入経路によって天然曝露が起こるタンパク質、ワクチン接種に用いられるアレルゲンあるいは感染性病原体由来である、請求項１〜６の方法にしたがって得られうるペプチドまたはポリペプチドであって、前記アロ因子が凝固または線維素溶解因子、酵素、ホルモン、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子または療法抗体であり、前記ウイルスベクターがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来であり、天然曝露が起こる前記タンパク質が食品または餌に用いられるタンパク質、酵素、抗ウイルスまたは抗細菌薬剤、草、樹木または雑草の花粉、接触感作物質、昆虫またはハチ類（ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の毒であり、前記アレルゲンが風媒性アレルゲン、食物アレルゲン、昆虫またはハチ類の毒であり、そして前記感染性病原体がウイルス、細菌または寄生虫である、前記ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項９】
薬剤としての、請求項１にしたがって得られうるペプチドまたはポリペプチドいずれかの使用。
【請求項１０】
薬剤としての、請求項７〜８にしたがったペプチドまたはポリペプチドいずれかの使用。
【請求項１１】
哺乳動物において、アロ因子に対する、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に用いられるウイルスベクターに対する、食品、餌、全身または吸入経路によって天然曝露が起こるタンパク質に対する免疫反応を防止するかまたは治療するための薬剤としての、請求項７〜８にしたがったペプチドまたはポリペプチドいずれかの使用。
【請求項１２】
アレルギー性疾患におけるワクチン接種のための、または感染性病原体のための、請求項７〜８にしたがったペプチドまたはポリペプチドいずれかの使用。
【請求項１３】
哺乳動物において、ＮＫＴ細胞活性化を減少させるための薬剤としての、請求項７〜８にしたがったペプチドまたはポリペプチドいずれかの使用。
【請求項１４】
ペプチドまたはポリペプチドを発現可能な核酸配列を投与する、請求項７〜８にしたがったペプチドいずれかの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然免疫原性を減少させるかまたは寛容を誘導するためのペプチドまたはポリペプチド、ならびにアロ因子（ａｌｌｏｆａｃｔｏｒｓ）に向けて、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に用いられるウイルスベクターに向けて、吸入または接触によって被験体が曝露される食品または餌において用いられる環境抗原に向けて誘発される免疫反応を防止する際の、あるいはアレルゲンまたは感染性病原体によるワクチン接種に関連する副作用を減少させるためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの場合、療法目的のためのタンパク質の投与は、療法剤に対する免疫反応を生じ、これは、前記療法剤のいかなるさらなる投与も妨げる。この例は、血友病Ａに罹患した被験体における、凝血経路の因子ＶＩＩＩの投与によって提供され：治療された被験体の約３分の１が因子ＶＩＩＩの機能を阻害する抗因子ＶＩＩＩ抗体を産生する。グリコーゲン代謝不全を患う被験体におけるアルファ−ガラクトシダーゼなどの酵素の投与は、同様に、いかなるさらなる投与も妨げる、療法剤に対する免疫反応につながる。第三の例は、療法剤として用いられ、そしてリンパ球表面分子、サイトカインまたはサイトカイン受容体に向けられる抗体によって提供される。総合して、療法剤に対する免疫を防止するであろう新規療法アプローチを見出すことが非常に望ましい。
【０００３】
遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のためのウイルスベクターの使用は、こうしたウイルスベクターが免疫反応を誘発し、これがベクターによって形質導入された細胞の迅速な排除および導入遺伝子発現の迅速な喪失を生じるという事実によって、非常に制限される。ウイルスベクターは、ウイルスベクターの性質に応じた多様な度合いの強度で、自然および適応免疫反応の活性化を誘発する。したがって、アデノウイルスベクターは、自然免疫反応を強く刺激し、その後、適応免疫反応が続く。アデノ随伴ウイルスベクターは、より弱い自然反応を誘発するが、抗体産生を誘発する。遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種両方の潜在能力は巨大である。ウイルスベクターに向けられる自然および／または適応反応による療法アプローチは、この分野における非常に有意な進歩に相当するであろう。
【０００４】
多くの被験体は、天然に曝露されるタンパク質に対して誘発される反応に苦しむ。アレルゲンは、風媒性であっても食品由来であっても、アレルギー性鼻炎および喘息、蕁麻疹、湿疹およびアナフィラキシー反応などの反応を誘発する。前記被験体がこうした反応を提示するのはなぜかに関する理由は、部分的にしか解明されていない。食物アレルゲン、セリアック病を引き起こす小麦、または職業的理由で被験体が曝露される酵素などの製品のように多様なタンパク質の自然免疫原性を減少させることが非常に有益であろう。
【０００５】
アレルギー性疾患のためのまたは感染性病原体に対するワクチン接種戦略において、療法的有効性は、しばしば、アレルゲンまたは感染性病原体の炎症親和特性によって誘発される副作用によって制限される。こうした炎症効果は、より高用量のワクチンの使用を妨げ、そしてしたがってワクチン有効性を妨げて、そして望ましくない細胞反応、例えば遅延型反応、および考慮する状態に最適ではないアイソタイプの抗体の産生に免疫反応を向ける。ワクチン接種における炎症のより優れた調節は、炎症に関連する副作用を減少させながら、免疫反応のはるかにより効率的な調節を提供するであろう。
【０００６】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、非古典的ＭＨＣ複合体分子ＣＤ１ｄによって提示される抗原を認識する非慣用的Ｔリンパ球の別個の系譜を構成する。ＮＫＴ細胞の２つのサブセットが現在記載されている。１型ＮＫＴ細胞はまた、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）とも呼ばれ、最も豊富である。これらは、マウスにおいてはＶアルファ１４であり、そしてヒトにおいてはＶアルファ２４である、インバリアント・アルファ鎖で作製されるアルファ−ベータＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって特徴付けられる。このアルファ鎖は、可変であるが限定された数のベータ鎖と会合する。２型ＮＫＴ細胞は、アルファ−ベータＴＣＲを有するが、多型アルファ鎖を伴う。しかし、ＮＫＴ細胞の他のサブセットが存在し、その表現型はなお定義が不完全であるが、これらはＣＤ１ｄ分子の背景で提示される糖脂質によって活性化される特性を共有することが明らかである。
【０００７】
ＮＫＴ細胞は、典型的には、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫ１．１を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体の組み合わせを発現する。ＮＫＴ細胞は、自然免疫系の一部であり、これらが完全なエフェクター能を獲得する前に拡大を必要としないという事実によって、適応免疫系とは区別可能である。ＮＫＴ細胞の活性化は、多様な影響を生じる。こうした細胞は、非常に多数のサイトカイン（インターロイキン（ＩＬ）−４、インターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマ、ＩＬ−２１およびＩＦＮ−アルファを含む）を含むあらかじめ形成された仲介因子を放出し、これらは抗体産生に関してＢ細胞に対する補助を提供し、そしてサイトカインの放出はまた、ＣＤ４＋  Ｔ細胞にも影響を及ぼしうることが示唆されてきている（Ｂｕｒｒｏｗｓら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９，  １０：  ６６９−６７１）。本発明の背景において、Ｂ細胞活性化および主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化両方の防止は、タンパク質免疫原性を減少させるかまたは無効にする際に役割を果たすと考えられる。
【０００８】
ＮＫＴ細胞の認識ユニット、ＣＤ１ｄ分子は、ベータ−２ミクログロブリンの存在を含めて、ＭＨＣクラスＩ分子のものとよく似た構造を有する。２つのアルファ鎖によって境界づけられ、そして脂質鎖を受け入れる非常に疎水性の残基を含有する深い間隙によって特徴付けられる。間隙は両端が開放されており、より長い鎖に適合可能である。ＣＤ１ｄの古典的リガンドは、合成アルファ・ガラクトシルセラミド（アルファＧａｌＣｅｒ）である。しかし、多くの天然代替リガンドが記載されてきており、これには、糖脂質およびリン脂質、ミエリン中に見出される天然脂質スルファチド、微生物ホスホイノシトールマンノシドならびにアルファ−グルクロノシルセラミドが含まれる。現在のコンセンサス（概説に関しては、例えばＭａｔｓｕｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２０：３５８−３６８、およびＧｏｄｆｒｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １１：  １９７−２０６を参照されたい）は、ＣＤ１ｄは、脂質鎖を含有するリガンド、または一般的にＣＤ１ｄ内部に埋め込まれる脂質テールおよびＣＤ１ｄの外側に突き出る糖残基頭基で作製される共通の構造にのみ結合するというものである。
【０００９】
ペプチドは、ＣＤ１ｄによる提示を通じてＮＫＴ細胞を活性化可能ではないようである。しかし、大きなアミノ酸残基を含有する長い疎水性ペプチドはＣＤ１ｄに結合可能であることが示唆された（Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６）。定義された生理学的関連を持たないランダム配列ペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを用いて行った観察によって、理論的なコンセンサスモチーフを確立することが可能になった（Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６、および以下を参照されたい）。
【００１０】
実際、Ｃａｓｔａｎｏらは、活性化される細胞がＣＤ８＋  Ｔ細胞、すなわちＭＨＣクラスＩ拘束細胞であって、そしてＮＫＴ細胞ではないことを示す。これらの知見は、当業者に、疎水性ペプチドがＣＤ１ｄ分子によって提示される証拠がないことを示す。Ｃａｓｔａｎｏらによって行われる請求の生理学的関連性は、慣用的な免疫プロトコル下でＮＫＴ細胞を誘発できないために、さらに疑問視された（Ｍａｔｓｕｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２０：３５８−３６８、およびＢｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  １７７：  ７６９−７７５）。ＣＤ１ｄを過剰発現するようにトランスフェクションされ、そしてオボアルブミン由来ペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで装填された細胞での免疫などの人工的な系は、ＮＫＴ細胞を誘発可能であった。同様に、プラスミドＤＮＡとともにネズミＣＤ１ｄおよび共刺激分子で皮内免疫すると、細胞溶解性ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞が誘導される（Ｌｅｅら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８，  １８７：  ４３３−４３８）。Ｐ１およびＰ７位の芳香族残基、ならびにＰ４位の脂肪族鎖で作製される構造モチーフを含有する疎水性ペプチドが、Ｃａｓｔａｎｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：  ２２３，  １９９５）によって、ＣＤ１ｄ結合エピトープのコアモチーフを含有すると請求された。上記のように、Ｃａｔａｎｏらによって導かれた結論は、データに裏付けられていない。
【００１１】
本発明者らは、疎水性アミノ酸配列を含むペプチドが、実際にＮＫＴ細胞の活性化を誘発可能であるという予期されない発見をした。
【００１２】
療法目的のために投与される、または被験体が通常曝露されている、または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種を実行する際の、あるいはアレルギー性または感染性疾患のためのワクチン接種の背景で投与されるタンパク質由来のエピトープが、ＣＤ１ｄに結合し、そしてそれによってＮＫＴ細胞を活性化する場合、前記エピトープを除去する突然変異および／または削除による前記タンパク質の改変が、免疫原性を防止するために非常に望ましいであろう。
【００１３】
こうしたエピトープの同定、次いで、アミノ酸の突然変異、付加または削除で、ＮＫＴ細胞の活性化を防止することが、本発明の基礎を形成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｕｒｒｏｗｓら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９，  １０：  ６６９−６７１
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２０：３５８−３６８
【非特許文献３】Ｇｏｄｆｒｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １１：  １９７−２０６
【非特許文献４】Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６
【非特許文献５】Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  １７７：  ７６９−７７５
【非特許文献６】Ｌｅｅら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８，  １８７：  ４３３−４３８
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、アロ因子に向かう免疫反応を防止することによる、被験体におけるこうしたアロ因子に向かって誘発される免疫反応の治療のためのペプチドまたはポリペプチドの使用に関する。
【００１６】
本発明はまた、ウイルスベクターに向かう免疫反応を防止することによる、被験体における遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に用いられるウイルスベクターに向かって誘発される免疫反応の治療のためのペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００１７】
本発明はまた、天然タンパク質への曝露によって誘発される免疫反応の被験体における防止のための、遺伝子改変生物によって作製されたペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００１８】
本発明はさらに、自然免疫の活性化が有害である場合のワクチン接種目的のためのペプチドまたはポリペプチドの使用に関する。
【００１９】
本発明はまた、ＣＤ１ｄ結合エピトープを所持するタンパク質を同定する方法、およびアミノ酸置換または削除によってこうしたエピトープを除去する方法にも関する。
【００２０】
本発明者らは、有意な比率のペプチドまたはポリペプチドが、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性化のために、ＣＤ１ｄ決定基に結合し、そしてこれによって提示されることを可能にするアミノ酸配列を所持するという予期せぬ発見を行った。こうした細胞の活性化は、サイトカイン放出を生じ、そしていくつかの場合、細胞溶解特性の獲得または増加を生じる。
【００２１】
本発明は、１つの側面において、アロ因子として用いられる少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記アロ因子に対する免疫反応を被験体において防止するための薬剤としての、ＮＫＴ細胞によって認識されるエピトープの形成に関与する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するように修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用に関する。
【００２２】
本発明はまた、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のためのウイルスベクターとして用いられる、少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記ウイルスベクターに対する免疫反応を被験体において防止するための薬剤としての、ＮＫＴ細胞によって認識されるエピトープの形成に関与する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するように修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２３】
本発明はまた、１つの側面において、遺伝子改変生物によって産生される少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記ペプチドまたはポリペプチドへの自然曝露に対する免疫反応を被験体において防止するための薬剤としての、ＮＫＴ細胞によって認識されるエピトープの形成に関与する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するように修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２４】
本発明はさらに、１つの側面において、ワクチンとして使用される少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記ワクチンに対する望ましくないまたは不適切な免疫反応を被験体において防止するための薬剤としての、ＮＫＴ細胞によって認識されるエピトープの形成に関与する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するように修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２５】
さらなる側面において、本発明はまた、アロ因子、ウイルスベクター、遺伝子改変生物またはワクチンとして用いられる少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記被験体におけるＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞によって行われる適応免疫反応に対する活性化、サイトカイン産生、細胞溶解活性および抑制活性を防止するための薬剤としての、ＮＫＴ細胞によって認識されるエピトープの形成に関与する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するように修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用もまた含む。
【００２６】
本発明は、少なくとも１つのＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞エピトープを含む疎水性ペプチドまたはポリペプチドであって、ＣＤ１ｄに対する係留残基として配置されたアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されるかまたは削除され、ＣＤ１ｄへの結合、そしてそれによってＮＫＴ細胞活性化の喪失または有意な減少を生じる、前記ペプチドまたはポリペプチドに関する。
【００２７】
ＣＤ１ｄ分子の構造は、疎水性アミノ酸残基がＣＤ１ｄ間隙の両端に位置する２つの疎水性ポケットを占める必要があり、そして脂肪族残基が間隙の中央の位を占めるべきであることを示す。したがって、ＣＤ１ｄ結合配列の一般的な例として、モチーフ［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷＴＨ］が使用可能であり、ここで、［ＦＷ］は、最初の係留残基（Ｐ１）をＦまたはＷが占有可能であり、Ｐ４位をＩ、Ｌ、またはＭのいずれかが占有可能であり、そしてＰ７をＦ、Ｗ、ＴまたはＨが占有可能であることを示す。この一般的モデルモチーフにおけるｘは、任意のアミノ酸を示す。当業者には、これらのアミノ酸残基の多様な組み合わせが可能であることが明らかであるはずである。特定の態様において、一般的モデルモチーフは、反転配列、例えば［ＦＷＴＨ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷ］として提示されてもよい。さらに別の特定の態様において、少なくとも１つのアミノ酸をＣＤ１ｄ結合モチーフ内に付加して、モチーフを破壊し、ＣＤ１ｄに結合する能力を防止して、そしてそれによってＮＫＴ細胞を活性化する能力を防止する。
【００２８】
本発明はさらに、より具体的には、Ｐ１位およびＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹが非天然アミノ酸（例えばＤ−アミノ酸）によってまたは有機化合物によって置換されているペプチドまたはポリペプチドに関する。
【００２９】
上記使用のいずれにおいても、前記アロ因子は、以下に用いられる任意のペプチドまたはポリペプチドであってもよい：（１）因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびスタフィロキナーゼを含む凝血欠陥または線維素溶解欠陥のための補充療法のため；（２）ホルモン、例えば成長ホルモンまたはインスリン；（３）サイトカインおよび増殖因子、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；（４）アレルギー性疾患における抗ＩｇＥ抗体、移植片拒絶および多様な自己免疫疾患における抗ＣＤ３および抗ＣＤ４抗体、非ホジキンリンパ腫における抗ＣＤ２０抗体を含む、免疫反応の調節のための抗体；（５）腎不全におけるエリスロポエチン、ならびに；（６）遺伝子改変抗原。
【００３０】
上記使用のいずれにおいても、前記ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルス（ガンマ−レトロウイルスおよびレンチウイルス）またはＤＮＡウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス）の任意のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。
【００３１】
上記使用のいずれにおいても、前記遺伝子改変生物は、食品または餌として、作物または製造製品を産生するために、あるいは食品または餌用のトランスジェニック動物を産生するために、あるいはストック育種のために用いられる、植物または動物起源の任意の生物であってもよい。
【００３２】
上記のいずれにおいても、ワクチン接種に用いられる前記ペプチドまたはポリペプチドは、アレルゲンまたは感染性病原体由来であってもよく、これにはウイルス、細菌および寄生虫が含まれる。アレルゲンは、例えばチリダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）由来、花粉由来、または家畜由来の風媒性アレルゲン、ピーナッツ、オボアルブミン、穀物、果物およびマメ科植物などの食物アレルゲン、ならびにラテックスなどの接触抗原であってもよい。アレルゲン感作を特徴とする疾患には、アレルギー性喘息、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシーショック、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎が含まれる。
【００３３】
本発明はまた、ＮＫＴ細胞を活性化するペプチドまたはポリペプチドを同定し、そしてアミノ酸の置換、付加または削除によって、ＣＤ１ｄ結合エピトープを改変することによって、こうした活性化を除去する方法にも関する。前記方法は、前記ペプチドまたはポリペプチドを、ＣＤ１ｄを所持する細胞とインキュベーションし、その後、ポリクローナルＮＫＴ細胞の集団を添加し、そして前記ＮＫＴ細胞の活性化を決定する工程を含む。
【００３４】
本発明はさらに、少なくとも１つの疎水性アミノ酸の置換または削除によって修飾されたアロ因子の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチド、あるいは少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基の置換または削除によって修飾されたアレルゲン由来のまたは感染性病原体由来の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドを含むことで特徴付けられる、単離ウイルスベクターを含む。ウイルスベクター自体もまた、疎水性アミノ酸残基の置換または削除によって修飾可能であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】配列番号１のペプチド（図中の４４ｐｅｐｔ）を装填したＣＤ１ｄ四量体がＮＫＴ細胞に認識されることを示す。ＣＤ１ｄ  ｃｔｌ（−）は、未装填四量体を認識するＮＫＴ細胞の％を示す。ＣＤ１ｄ  ｃｔｌ（＋）は、アルファ−ｇａｌセラミドを装填された四量体を認識するＮＫＴ細胞の％を示し、該分子はすべてのＮＫＴ細胞を補充する。最大４５％のＮＫＴ細胞が４４ｐｅｐｔを認識し、これはＣＤ１ｄレベルでは多型が存在せず、そしてＮＫＴ  Ｔ細胞受容体レベルでは非常に限定された多型しかないことと適合する。
【図２】配列番号１のペプチドおよび配列番号２のペプチドで免疫した血友病Ａマウスが、因子ＶＩＩＩに対する抗体を発展させたことを示す。
【図３】対照マウスが、因子ＶＩＩＩの４回目の注射後、高濃度の抗ＦＶＩＩＩ抗体を産生するが（左パネル）、ＮＫＴ細胞不全マウスの骨髄で再構成されたマウスは産生しなかった（右パネル）ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
用語「ペプチド」は、本明細書において、ペプチド結合によって連結された２〜２００アミノ酸の間のアミノ酸配列を含む分子を指すが、特定の態様においては、非アミノ酸構造（連結有機化合物のようなもの）を含むことも可能である。本発明にしたがったペプチドは、慣用的な２０アミノ酸またはその修飾型のいずれを含有することも可能であるし、あるいは化学ペプチド合成によって、または化学もしくは酵素修飾によって取り込まれる非天然存在アミノ酸を含有することも可能である。用語「ポリペプチド」は、本明細書において、一般的に、より長いペプチドまたはタンパク質を指す。
【００３７】
用語「エピトープ」は、本明細書において、抗体またはその一部（Ｆａｂ’またはＦａｂ２’等）、あるいはＢまたはＴ細胞リンパ球の細胞表面に提示される受容体によって特異的に認識され、そして結合され、そして前記結合によって免疫反応を誘導可能である、タンパク質の１またはいくつかの部分（コンホメーションエピトープと定義可能）を指す。
【００３８】
用語「抗原」は、本明細書において、１またはそれより多いハプテンを含み、そして／または１またはそれより多いＴ細胞エピトープを含む、巨大分子構造を指す。典型的には、前記巨大分子は、タンパク質またはペプチド（多糖を含むまたは含まない）であるか、あるいはタンパク質性組成物で作製され、そして１またはそれより多いエピトープを含む；前記巨大分子は、本明細書において、別に、「抗原性タンパク質」または「抗原性ペプチド」と称されることも可能である。
【００３９】
用語「アレルゲン」は、素因がある個体において、ＩｇＥアイソタイプの抗体を誘発する能力によって特徴付けられる抗原の特定のサブセットを指す。
【００４０】
用語「Ｔ細胞エピトープ」または「Ｔ−細胞エピトープ」は、本発明の背景において、優位の、順優位の、または微量なＴ細胞エピトープ、すなわちＴリンパ球の細胞表面の受容体によって特異的に認識されそして結合される抗原性タンパク質の部分を指す。エピトープが優位、順優位、または微量であるかどうかは、エピトープに対して誘発される免疫反応に依存する。優位性は、タンパク質のすべてのありうるＴ細胞エピトープの中で、こうしたエピトープがＴ細胞によって認識され、そしてこれらを活性化可能である頻度に応じる。特に、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子によって結合されるエピトープである。
【００４１】
用語「ＮＫＴ細胞エピトープ」は、Ｔリンパ球の細胞表面で受容体によって特異的に認識され、そして結合される抗原性タンパク質の部分を指す。特に、ＮＫＴ細胞エピトープは、ＣＤ１ｄ分子によって結合されるエピトープである。
【００４２】
用語「ＣＤ４＋エフェクター細胞」は、その機能が他の細胞、例えばＢ細胞に対する補助を提供することである、Ｔ細胞のＣＤ４陽性サブセットに属する細胞を指す。これらのエフェクター細胞は、Ｔｈ細胞（Ｔヘルパー細胞）として慣用的に報告され、異なるサブセット、例えばＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞を含む。
【００４３】
用語「ＮＫＴ細胞」は、ＮＫ１．１およびＮＫＧ２Ｄなどの受容体を所持し、そしてＣＤ１ｄ分子によって提示されるエピトープを認識するという事実によって特徴付けられる、自然免疫系の細胞を指す。本発明の背景において、ＮＫＴ細胞は、１型（インバリアント）または２型サブセットのいずれに属してもよい。
【００４４】
「ＣＤ１ｄ分子」は、両側が開放された深い疎水性の溝になるように配置された、３つのアルファ鎖およびベータ鎖の逆平行セットで作製され、そしてＮＫＴ細胞に、脂質、糖脂質または疎水性ペプチドを提示可能な、非ＭＨＣ由来分子を指す。
【００４５】
用語「免疫障害」または「免疫疾患」は、免疫系の反応が、生物における機能不全または非生理学的状況の原因となるか、またはこれを維持する、疾患を指す。本発明の背景における免疫障害は、感染性病原体および腫瘍監視によって誘導される病理を指す。
【００４６】
用語「アロ因子」は、同じ種の２個体間を比較した際、多型を示すタンパク質、ペプチドまたは因子（すなわち任意の分子）、そしてより一般的には、アロ因子を受け入れる被験体において（アロ反応性）免疫反応を誘導する任意のタンパク質、ペプチドまたは因子を指す。延いては、アロ因子にはまた、給餌のために用いられる遺伝子改変タンパク質も含まれる。
【００４７】
用語「アロ抗原」または「アロ移植抗原」は、本明細書において、ドナーからレシピエントに移植された際、レシピエントのＢまたはＴ細胞受容体の抗体によって認識されそして結合されうる、細胞または組織由来の（そこから脱落し、そして／またはその中に存在する）抗原を指す。アロ抗原は、典型的には多型遺伝子の産物である。アロ抗原は、ドナーおよびレシピエント（同じ種に属する）間で比較した際、構造上のわずかな相違を示すタンパク質またはペプチドである。レシピエントの体内でのこうしたドナー抗原の存在は、レシピエントにおいて免疫反応を誘発可能である。こうしたアロ反応性免疫反応はアロ抗原に特異的である。
【００４８】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体において、アロ因子に向かう、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に用いられるウイルスベクターに向かう、食品または餌に用いられるタンパク質に向かう、吸入によってまたは刺傷によって前記被験体が曝露されるタンパク質に向かう免疫反応を防止する方法、あるいは被験体において、アレルゲンまたは感染性病原体に向かうワクチンの使用における自然免疫の望ましくない活性化を防止する方法を提供する。
【００４９】
特に、本発明は、ＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞の拡大および機能活性を防止する方法を提供する。こうした細胞は、通常、２つの別個のサブセット、すなわちインバリアントＴＣＲアルファ鎖（マウスにおいてはＶアルファ１４、ヒトにおいてはＶアルファ２４）を所持するＮＫＴ細胞１型、または多様なアルファ鎖レパートリーを伴って提示する２型ＮＫＴ細胞に分類される。しかし、最近の証拠によれば、１型または２型カテゴリーには適合しないＮＫＴ細胞の別のサブセットが示唆されてきている。本発明の目的は、これらがＣＤ４共受容体を所持するならば、これらの非慣用的ＮＫＴ細胞を含めることである。ＣＤ１ｄに結合した抗原の提示に際して、ＮＫＴ細胞は迅速に活性化され、そして自然および適応免疫系の両方由来の他の細胞に影響を及ぼす決定因子であると考えられる、多くのサイトカインを分泌する。いくつかの状況において、前記の活性化されたＮＫＴ細胞は、細胞傷害特性を獲得するか、または増加させる。さらにさらなる状況において、前記の活性化されたＮＫＴ細胞は、クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞との相互作用によって、適応免疫反応の誘発を抑制するかまたは減少させる。
【００５０】
本発明の背景において、本発明者らは、ペプチドがＣＤ１ｄ分子によって提示されることが可能であるという、予期されぬ観察を行った。ＣＤ１ｄ分子の特徴は、２つの逆平行ベータ鎖で作製されるプラットホームの上に位置する間隙を形成する２つの逆平行アルファ鎖で作製されることである。間隙は狭くそして深く、そして古典的には脂質のみと見なされる、疎水性残基のみを受け入れる。間隙は、１位（Ｐ１）および７位の疎水性残基、およびＰ４の脂肪族残基と特徴付けられる７アミノ酸の配列に適合しうる。Ｐ１は、強制的に疎水性残基、例えばＦ、Ｗ、ＨまたはＹである。しかし、Ｐ７は許可的であり、そして極性でなければ別の残基を含有してもよい。Ｐ４の残基は、好ましくは脂肪族であるが、これは場合による。ＣＤ１ｄ結合モチーフの一般配列は、したがって、［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］である。しかし、当業者には、モチーフが対称的であり、そしてＰ７がＰ１と見なされることが可能であり、そしてＰ１がＰ７と見なされることが可能であることが明らかであるはずである。ＣＤ１ｄ結合モチーフの一般配列は、限定するいかなる意図も伴わずに、一般的な表示として、本明細書に提供される。本発明の適用が考慮されるペプチドおよびポリペプチドは、ＣＤ１ｄ分子内での提示によって、ＮＫＴ細胞を活性化する能力にしたがって定義される。
【００５１】
ＮＫＴ細胞を活性化可能であり、そしてその結果、ＣＤ１ｄ結合モチーフを所持する疎水性ペプチドまたはポリペプチドは、アロ因子、ウイルスベクター、食品または餌に用いられるタンパク質、吸入によってまたは刺傷によって前記被験体が曝露されるタンパク質、遺伝子改変タンパク質およびアレルゲンにおいて見出され、それによって前記アロ因子、ウイルスベクター、遺伝子改変タンパク質またはアレルゲンに、ＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞を活性化する能力を与える。
【００５２】
本発明は、ＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）を含有するペプチドまたはポリペプチドの産生であって、該モチーフがＮＫＴ細胞を活性化する能力を与え、そして場合によってＰ４における脂肪族残基の置換または削除を伴う、Ｐ１および／またはＰ７中の疎水性残基の置換、あるいはこれらの任意の組み合わせによって修飾されて、ＣＤ１ｄに結合するペプチドまたはポリペプチドの能力の喪失または有意な減少を生じ、そしてそれによって前記ペプチドまたはポリペプチドがＮＫＴ細胞を活性化する能力の喪失または有意な減少を生じる、前記産生に関する。
【００５３】
より具体的な態様において、Ｐ１位および／またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、非疎水性アミノ酸残基によって置換するか、あるいは場合によって、Ｐ４位のＩ、Ｌ、ＭまたはＶを非脂肪族残基によって置換するか、あるいはこれらの任意の組み合わせを行う。
【００５４】
さらに別の特定の態様において、Ｐ１位および／またはＰ７位に位置する疎水性残基、あるいは場合によって、Ｐ４に位置する脂肪族残基、あるいはこれらの任意の組み合わせを、非天然Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つの非天然アミノ酸によって、あるいは非芳香族有機化合物によって置換する。
【００５５】
さらに別の特定の態様において、Ｐ１〜Ｐ７配列内の任意の位置で、少なくとも１つのアミノ酸をＣＤ１ｄ結合モチーフ内に付加して、モチーフを破壊し、ＣＤ１ｄに結合する能力を防止して、そしてそれによってＮＫＴ細胞を活性化する能力を防止する。
【００５６】
好ましい態様において、非天然アミノ酸はＤ−アミノ酸である。
【００５７】
本発明はまた、ＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）を含有するペプチドまたはポリペプチドの産生であって、該モチーフがＮＫＴ細胞を活性化する能力を与え、そしてＰ１および／またはＰ７中の疎水性残基の削除によって、あるいは場合によってＰ４における脂肪族残基の削除によって、あるいはこれらの任意の組み合わせによって修飾されて、ＣＤ１ｄに結合するペプチドまたはポリペプチドの能力の喪失または有意な減少を生じ、そしてそれによって前記ペプチドまたはポリペプチドがＮＫＴ細胞を活性化する能力の喪失または有意な減少を生じる、前記産生にも関する。
【００５８】
被験体への投与に際して、こうしたペプチドまたはポリペプチドはＣＤ１ｄ上に装填されず、そしてそれによってＮＫＴ細胞の活性化を防止する。
【００５９】
さらなる側面において、本発明はまた、被験体において、アロ因子投与、ウイルスベクター投与、食品、餌、全身または吸入経路によって前記被験体が曝露されるタンパク質、あるいはワクチン接種目的で用いられるアレルゲンまたは感染性病原体に向かう免疫反応を防止するために、Ｐ１位またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹの少なくとも１つの置換または削除を含む、少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用も含む。
【００６０】
さらにさらなる側面において、本発明は、被験体において、アロ因子投与、ウイルスベクター投与、食品、餌、全身または吸入経路によって前記被験体が曝露されるタンパク質、あるいはワクチン接種目的で用いられるいくつかのアレルゲンまたは感染性病原体に向かうＮＫＴ細胞の活性化を防止するための、Ｐ１位またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹの少なくとも１つの置換または削除を含む、少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用を含む。
【００６１】
さらにさらなる側面において、本発明は、被験体において、アロ因子投与、ウイルスベクター投与、食品、餌、全身または吸入経路によって前記被験体が曝露されるタンパク質、遺伝子改変ペプチドまたはポリペプチド、あるいはワクチン接種目的で用いられるいくつかのアレルゲンまたは感染性病原体に向かう免疫反応を防止するための薬剤としての、Ｐ１位またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹの少なくとも１つの置換または削除を含む、少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用を含む。
【００６２】
ペプチドまたはポリペプチド中に存在するＣＤ１ｄ結合モチーフの数は非常に限定される。こうしたペプチドまたはポリペプチドの例を以下に提供する。典型的には、ポリペプチドは、これらのモチーフを１〜５、提示する。
【００６３】
本発明のさらなる利点は、ＣＤ１ｄ分子が非常に限定された度合いの多型を提示することである。したがって、当業者には、本発明にしたがった、同じアミノ酸置換、付加または削除が、被験体のすべてまたは大多数に有用なペプチドまたはポリペプチドを提供することが明らかである。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドまたはポリペプチドモチーフとは非常に対照的であり、この場合は、適切な配列を含有する多数のペプチドが示されうる。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドに課されるのは最小限の制約であるためであり、そしてクラスＩＩ分子の多型が大きいためである。
【００６４】
本発明の目的であるペプチドおよびポリペプチドは、以下のように同定される：
（１）ペプチドまたはポリペプチドアミノ酸配列を、Ｐ１およびＰ７に疎水性残基を、そしてＰ４に脂肪族残基を含有する、少なくとも１つのＣＤ１ｄモチーフの存在に関して評価する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／などの当該技術分野に周知のアルゴリズムを用いるために、［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］などの一般配列を用いてもよい。
【００６５】
この一般配列は、前記ペプチドまたはポリペプチド中のどの配列（単数または複数）が、前記ペプチドまたはポリペプチドがＮＫＴ細胞を活性化するのを可能にしうるモチーフを含有するかを同定するのを補助するツールと見なすべきである。
【００６６】
（２）ペプチドまたはポリペプチドがＣＤ１ｄに結合し、そしてＮＫＴ細胞を活性化する能力を、ＣＤ１ｄ分子を発現する細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。こうした細胞株の例は、当該技術分野に知られる（例えばＪＡＷＳ２細胞）。好ましい態様において、細胞株はＭＨＣクラスＩＩ分子を提示せず、そしてＣＤ１ｄのＤＮＡ配列を含有するウイルスベクターまたは細胞において遺伝子を導入することが当該技術分野に知られる任意の他の手段を用いたＣＤ１ｄの過剰発現のため形質導入される。細胞形質導入のための方法は、当該技術分野に知られる。細胞株は、培養において、ペプチドまたはポリペプチドを、あるいは対応する配列を含む合成ペプチドを装填される。こうした合成ペプチドは、例えば当該技術分野に周知のｆｍｏｃ固相合成を用いた合成によって、容易に産生される。次いで、ＮＫＴ細胞の活性化を測定することによって、ＣＤ１ｄ分子によるペプチド、ポリペプチドまたは対応する合成ペプチドの効率的な提示を評価する。こうした細胞は、例えば磁気選別によって末梢血から得られ、そしてサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５またはＩＬ−７の存在下で、アルファ−ｇａｌ−セラミドなどの刺激剤で培養中に維持されうる。これらの方法は、当該技術分野に記載される（例えばＧｏｄｆｒｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １１：  １９７−２０６を参照されたい）。サイトカイン産生の評価などの方法を用いて、ＮＫＴ細胞の活性化を評価する。
【００６７】
あるいは、多様なクロマトグラフィー法によって、ＣＤ１ｄ分子中でＡＰＣによって実際に提示されるペプチドを溶出させ、そして分離してもよい。こうした方法論の完全な説明は、Ｓｃｏｔｔら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １２：  ７１１−７２０，  ２０００に見出されるであろう。次いで、前記ペプチドを配列決定して、Ｐ１およびＰ７にどのアミノ酸残基が位置するかを同定する。
【００６８】
あるいは、前記合成ペプチドをＣＤ１ｄ分子の四量体上に装填して、こうしたペプチドに特異的なＮＫＴ細胞を検出してもよい。１つの可能性は、蛍光標識四量体および蛍光活性化細胞選別系（ｆａｃｓ）を用いた検出を使用することである。
【００６９】
（３）ＮＫＴ細胞を活性化可能であると同定され、そして場合によってアルゴリズムによって同定されたアミノ酸配列を、次いで、置換または削除のいずれかによって修飾する。好ましい態様において、Ｐ１位および／またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つのアミノ酸によって置換する。転写後修飾によって天然アミノ酸を修飾してもよいし、またはメチル基などの化学基で置換してもよい。別の好ましい態様において、Ｐ１位および／またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを任意の適切な代替非天然アミノ酸によって置換する。非天然アミノ酸残基の例はＤ−アミノ酸である。さらに別の態様において、Ｐ１位および／またはＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つのアミノ酸によって置換する。別の好ましい態様において、Ｐ１位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つのアミノ酸によって、適切な代替非天然アミノ酸によって、または非芳香族有機化合物によって、置換する。こうしたアミノ酸置換は、当該技術分野に周知の方法を用いて得られる。さらにさらなる好ましい態様において、Ｐ１位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを削除する。さらに別の態様において、Ｐ１位およびＰ７位のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを削除する。前記削除を実施する方法は、当該技術分野に周知である。さらに別の特定の態様において、Ｐ１〜Ｐ７配列内の任意の位置において、ＣＤ１ｄ結合モチーフ内に少なくとも１つのアミノ酸を付加する。
【００７０】
本発明にしたがって、アロ因子の投与が必要な疾患の治療に関して薬剤が想定され、例えば以下におけるものがある：
（１）多糖またはグリコーゲン代謝と関連する酵素の不全（例えばポンペ病におけるもの）、あるいはホルモン産生における不全（例えば糖尿病におけるインスリンまたは低身長症における成長ホルモン）を伴う、凝血（例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸまたは因子Ｘ）または線維素溶解に関連する因子の先天性または後天性不全、
（２）治療剤、例えばスタフィロキナーゼおよびマイクロプラスミンを含む血栓溶解剤の投与が好適である、急性または慢性状態、
（３）サイトカイン（またはその受容体）または増殖因子（例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＫＧＦまたはエリスロポエチン）を投与する必要がある免疫系の障害、
（４）慢性炎症または不適切な免疫反応によって特徴付けられる疾患であって、自己免疫疾患および移植片拒絶における抗腫瘍壊死因子、抗ＣＤ３または抗ＣＤ４抗体、リンパ球表面マーカーに対する抗体（例えば非ホジキンリンパ腫における抗ＣＤ２０抗体）、あるいは血栓症の防止における因子ＶＩＩＩに対する抗体を含む、療法抗体を投与しなければならない、前記疾患。療法抗体のリストは迅速に伸びており、そして本発明は、一般的に療法目的のために用いられる任意の抗体の使用を含むことを意図する。
【００７１】
本発明にしたがって、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種における使用であって、ウイルスベクターを利用し、そして前記ベクターに対する免疫反応が導入遺伝子発現を妨げる、前記使用もまた想定される。
【００７２】
本発明にしたがって、以下のような環境タンパク質への曝露によって誘発される疾患のための薬剤もまた想定される：
（１）前記被験体が食品または餌によって曝露されるタンパク質。これらの例は、穀物、例えば小麦、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、イネ（ｒｉｃｅ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）および菜種（ｃｏｌｚａ）、野菜、例えばジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）およびビートの根（ｂｅｅｔｒｏｏｔ）、果物、例えばバラ科（ｒｏｓａｃｅａ）、ナッツ、およびアボカド、酵素、抗ウイルスまたは抗細菌薬剤である。
【００７３】
（２）吸入、全身経路によって、または刺傷によって被験体が曝露されるタンパク質。これらの例は、花粉に対するアレルギー性反応、ラテックスに対する接触反応またはハチ類（ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）による刺傷である。
【００７４】
本発明にしたがって、以下のような免疫（ワクチン接種）のための薬剤もまた想定される：
（１）アレルゲンに対するワクチン接種
（２）ウイルス、細菌および寄生虫を含む、感染性病原体に対するワクチン接種。
【００７５】
これらの状況のどちらにおいても、前記ワクチン接種の結果に対して過剰な炎症およびその有害な結果を防止するように、自然免疫系の活性化を防止することが好適でありうる。アレルゲンまたは感染性病原体に対するワクチン接種の設定における別の利点は、ＮＫＴ細胞活性化を除去すると、前記アレルゲンまたは前記感染性病原体に対する適応性反応の発展に対する活性化ＮＫＴ細胞の抑制効果が防止されることである。
【００７６】
上記リストは包括的ではなく、そして本発明は、新規に紹介される産物、例えば抗体、サイトカイン、増殖因子または先天性もしくは後天性不全において置換のために用いられるペプチドおよびポリペプチド、ならびに遺伝子改変タンパク質を含むよう意図することを理解すべきである。
【００７７】
上に列挙するペプチドまたはポリペプチドのいずれを、遺伝子組換えのための遺伝子の形で投与してもよく、これは、ウイルスベクター、または当業者に知られる他の手段を用いて実行可能である。こうした場合、ＣＤ１ｄ結合モチーフを除去することによって、本発明にしたがって、ウイルスベクター自体を改変することが好適であると見出される可能性もある。
【００７８】
本発明の薬剤は、必ずしもではないが、通常、活性成分として、本発明のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つ、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドを発現可能な遺伝子療法ベクターを含む、（薬学的）配合物である。活性成分（単数または複数）のほかに、こうした配合物は、少なくとも１つの（薬学的に許容されうる）希釈剤を含むであろう。
【００７９】
この規則の注目すべき例外は、食品または餌のための遺伝子改変生物由来のタンパク質の使用、吸入によるまたは全身経路による曝露である。
【００８０】
一般的に、本発明のペプチドまたはポリペプチドは、自然免疫系の活性化、より具体的にはＮＫＴ細胞の活性化、より具体的には、ＮＫＴ細胞活性化に関連するサイトカイン産生を防止する。
【００８１】
本発明のペプチドまたはポリペプチドのための投与経路は、適応症および／またはペプチドまたはポリペプチドの性質にしたがって、多様でありうる。例は、凝固因子の静脈内注射、インスリンの皮下注射、および遺伝子改変タンパク質の経口投与である。本発明は、鼻内、舌下、経皮、筋内、直腸内または膣内などの他のすべてのありうる投与経路を含むことを意図する。
【００８２】
さらに詳細に説明するように、本発明のペプチドまたはポリペプチドを化学合成によって作製することも可能であり、これによって非天然アミノ酸の取り込みがさらに可能になる。本発明のペプチドまたはポリペプチドはまた、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞などの発現系を用いた組換えタンパク質の産生のために、当該技術分野に知られる方法を用いても産生可能である。
【００８３】
本発明の別の側面は、本明細書記載の本発明のペプチドおよびポリペプチドを生成するための方法に関する。こうした方法には、アロ因子、ウイルスベクター、前記被験体が食品、餌、全身または吸入経路によって曝露されるタンパク質、アレルゲンまたは特定の感染性病原体由来のＮＫＴ細胞エピトープの同定が含まれる。ＮＫＴ細胞エピトープをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定するための方法は、当該技術分野において十分に知られ、そしていくつかの側面を以後、詳細に述べる。
【００８４】
本発明の状況におけるＮＫＴ細胞エピトープの同定は、当業者に公知である。例えば、アロ因子、ウイルスベクター、前記被験体が食品、餌、全身または吸入経路によって曝露されるタンパク質、遺伝子改変タンパク質、アレルゲンまたは特定の感染性病原体から単離されたペプチド配列を、例えばＮＫＴ細胞生物学技術によって試験して、ペプチド配列がＮＫＴ細胞反応を誘発するかどうかを決定する。ＮＫＴ細胞反応を誘発すると見出されたペプチド配列を、ＮＫＴ細胞刺激活性を有すると定義する。アロ因子、ウイルスベクター、前記被験体が食品、餌、全身または吸入経路によって曝露されるタンパク質、遺伝子改変タンパク質、アレルゲンまたは特定の感染性病原体に感作された個体から得たＮＫＴ細胞を培養し、そして例えばトリチウム化チミジンの細胞取り込みによって測定した際、ペプチド／エピトープに反応して、ＮＫＴ細胞の増殖が起こるかどうかを決定することによって、哺乳動物ＮＫＴ細胞刺激活性をさらに試験することも可能である。ペプチド／エピトープに対するＮＫＴ細胞による反応に関する刺激指数は、ペプチド／エピトープに反応した最大ＣＰＭを対照ＣＰＭで割ったものとして計算可能である。バックグラウンドレベルの２倍に等しいかまたはそれより大きいＮＫＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は「陽性」と見なされる。陽性の結果を用いて、試験したペプチド／エピトープの群に関する、各ペプチド／エピトープの平均刺激指数を計算する。さらに場合によって、非天然ＮＫＴ細胞エピトープを、ＣＤ１ｄ分子に対する結合アフィニティに関して試験してもよい。ＣＤ１ｄ分子に対する非天然ＮＫＴ細胞エピトープの結合は、異なる方式で実行可能である。例えば、合成および／または化学カップリングによって可溶性ＣＤ１ｄ分子を得て、そして四量体を作製する。アフィニティクロマトグラフィーによってＣＤ１ｄ分子を精製する。可溶性ＣＤ１ｄ分子を、前記ＣＤ１ｄ分子に対する強い結合アフィニティにしたがって産生されたビオチン標識参照ペプチドとインキュベーションする。次いで、ＣＤ１ｄ結合に関して評価しようとするペプチドを、異なる濃度でインキュベーションし、そしてニュートラアビジンを添加することによって、ＣＤ１ｄ結合部位から参照ペプチドを置換する能力を計算する。方法は、ＭＨＣクラスＩＩ決定基によって提示されるペプチドに関して、例えば、Ｔｅｘｉｅｒら，  （２０００）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４，  ３１７７−３１８４に見出されうるが、該方法は、ＣＤ１ｄ拘束ＮＫＴ細胞エピトープに容易に適用可能である。本発明の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドは、２より大きいかまたは２に等しい平均ＮＫＴ細胞刺激指数を有する。２より大きいかまたは２に等しいＮＫＴ細胞刺激指数を有する免疫原性ペプチドは、本発明に記載するような、疎水性アミノ酸残基の置換または削除、あるいはＣＤ１ｄ結合モチーフ配列内のアミノ酸の付加を実施する候補として有用であると見なされる。
【００８５】
Ｔ細胞生物学技術によって決定されるように、天然ペプチドまたはポリペプチド配列と重複する領域を共有する２またはそれより多いアミノ酸配列が、ヒトＮＫＴ細胞刺激活性を有すると見出された場合、配列の一方または両方に属する残基に関して、疎水性アミノ酸残基の突然変異または削除を実行してもよい。
【００８６】
例えば細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、酵母細胞（例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種）、昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来）、植物細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ細胞）における組換え発現によって、本発明のペプチドまたはポリペプチドを産生することも可能である。その結果、必要とされる適切な発現ベクターの構築は（プロモーターおよび終結配列などのさらなる情報を含めて）、その間の標準的な組換えＤＮＡ技術を伴う。本発明の組換え的に産生されるペプチドまたはポリペプチドは、例えばペプチドまたはポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端に隣接して挿入された酵素切断部位の酵素的切断、その後の適切な精製を通じた、より大きい前駆体タンパク質由来であってもよい。
【００８７】
限定された長さのいくつかの本発明のペプチドに関しては、互いに異なるアミノ酸をカップリングすることによってペプチドが調製される、化学ペプチド合成によって調製可能である。化学合成は、例えばＤ−アミノ酸、非天然存在側鎖を持つアミノ酸またはメチル化システインなどの修飾側鎖を持つ天然アミノ酸の包含に特に適切である。化学ペプチド合成法は、よく記載され、そしてペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他の会社などの会社から注文することも可能である。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）として、または反溶液相（ｃｏｎｔｒａｒｙ  ｔｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）ペプチド合成としてのいずれかで、ペプチド合成を行ってもよい。最もよく知られるＳＰＰＳ法はｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相化学反応であり、これは当業者に十分に知られる。さらに、Ｋｅｎｔ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ＆  Ｋｅｎｔ  （１９９２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４０，  １８０−１９３）によって元来記載され、そして例えばＴａｍら（２００１）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６０，  １９４−２０５に概説されるような連結戦略（２つの保護されないペプチド断片の化学選択カップリング）を用いて、ペプチドを互いに連結して、より長いペプチドを形成してもよい。これは、ＳＰＰＳの範囲を超えたタンパク質合成を達成する潜在的可能性を提供する。１００〜３００残基のサイズを含む多くのタンパク質が、この方法によって成功裡に合成されてきている。
【００８８】
本発明のペプチドまたはポリペプチドの物理的および化学的特性（例えば溶解度、安定性）を調べて、ペプチドが療法組成物で使用するのに適しているかどうか／適しているであろうかどうかを決定する。典型的にはこれは、ペプチド配列を調整することによって最適化される。場合によって、当該技術分野に知られる技術を用いて、合成後にペプチドを修飾してもよい（例えば官能基を付加する／削除させる化学修飾）。
【００８９】
遺伝子改変生物の産生は、クローニング、部位特異的突然変異誘発および増殖を含む、当業者に周知の方法に頼る。
【００９０】
本発明はまた、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列、および例えば組換え発現のためのまたは遺伝子療法におけるその使用のための方法にも関する。特に、前記核酸配列は、本発明のペプチドを発現可能である。
【００９１】
遺伝子療法において、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする組換え核酸分子を、裸のＤＮＡとして、あるいはリポソーム中で、またはターゲット細胞への送達のための他の脂質系中で用いてもよい。細胞内へのプラスミドＤＮＡの直接トランスファーのための他の方法が、ヒト遺伝子療法における使用のため、当業者には周知であり、そしてプラスミドＤＮＡをタンパク質に複合体化することによる、細胞上の受容体へのＤＮＡのターゲティングを伴う。最も単純な形において、マイクロインジェクションのプロセスを通じて、細胞の核内に微量のＤＮＡを単に注入することによって、遺伝子トランスファーを実行してもよい。ひとたび、組換え遺伝子が細胞内に導入されたら、これらは、転写および翻訳のための細胞の正常な機構によって認識されることが可能であり、そして遺伝子産物が発現されるであろう。より多数の細胞内にＤＮＡを導入するための他の方法もまた試みられてきている。これらの方法には：ＤＮＡをリン酸カルシウムで沈殿させ、そして飲作用によって細胞内に取り込ませる、トランスフェクション；細胞を大きな電圧パルスに曝露して、膜内に穴を導入する、エレクトロポレーション；ＤＮＡを親油性小胞内にパッキングし、これをターゲット細胞と融合させる、リポフェクション／リポソーム融合；ならびに小さい発射物に結合させたＤＮＡを用いる微粒子銃が含まれる。細胞内にＤＮＡを導入するための別の方法は、化学的に修飾されたタンパク質にＤＮＡをカップリングすることである。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを脱安定化して、そして細胞内へのＤＮＡの取り込みを増進することが可能である。ＤＮＡ複合体を含有する溶液にアデノウイルスを混合するか、またはタンパク質架橋剤を用いて、アデノウイルスに共有結合させたポリリジンにＤＮＡを結合させることによって、組換え遺伝子の取り込みおよび発現が実質的に改善される。アデノ随伴ウイルスベクターもまた、血管細胞内への遺伝子送達に使用可能である。本明細書において、「遺伝子トランスファー」は、外来核酸分子を細胞内に導入するプロセスを意味し、これは一般的に、遺伝子によってコードされる特定の産物の発現を可能にするために行われる。前記産物には、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは酵素的に活性であるＲＮＡが含まれてもよい。遺伝子トランスファーを培養細胞において行ってもよいし、または哺乳動物への直接投与によって行ってもよい。別の態様において、本発明記載のペプチドをコードする核酸分子配列を含むベクターを提供する。特定の態様において、核酸分子配列が特定の組織においてのみ発現されるように、ベクターを生成する。例えば、本発明の免疫原性ペプチドをコードする配列を、１またはそれより多い組織（単数または複数）または臓器（単数または複数）において、特異的にペプチドの発現を指示するプロモーターの調節下に配置することによって、組織特異的遺伝子発現を達成する方法が当該技術分野に周知である。本発明記載のペプチド、その相同体または誘導体をコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を、ターゲットとする組織または細胞集団内に送達するために、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＲＮＡウイルスまたはウシ・パピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを用いてもよい。当業者に周知の方法を用いて、こうしたコード配列を含有する組換えウイルスベクターを構築してもよい。あるいは、本発明記載のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子を含有する、操作された細胞を、遺伝子療法に用いてもよい。
【００９２】
本発明の薬剤は、必ずしもではないが、通常（例えば食品、餌に用いられる遺伝子改変生物によって産生されるタンパク質、あるいは前記被験体が全身または吸入経路によって曝露されるもの）、本発明のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つ、前記ペプチドまたはポリペプチドを発現可能な遺伝子療法ベクターを活性成分として含む（薬学的）配合物である。活性成分（単数または複数）の他に、こうした配合物は、（薬学的に許容されうる）希釈剤の少なくとも１つを含むであろう。典型的には、薬学的に許容されうる化合物は、例えば薬局方ハンドブック（例えば米国、欧州または国際薬局方）に見出されうる。本発明の薬剤または薬学的組成物は、通常、（予防的にまたは療法的に）有効な量の活性成分（単数または複数）を含み、ここで有効性は、防止するかまたは治療しようとする状態または障害に対するものである。
【００９３】
本発明の薬剤または薬学的組成物は、前記薬剤または組成物の多数回の投与を含む、予防的または療法的措置の一部として、必要とする被験体に投与されることを必要としうる。前記多数回の投与は、通常、連続して起こり、そして２つの投与間の時間間隔は、多様であることも可能であり、そして活性成分の性質および防止するかまたは治療しようとする状態の性質に合わせて調節されるであろう。単回投与を必要とする被験体に投与される活性成分の量もまた多様であることも可能であり、そして被験体の身体状態（例えば体重および年齢）、防止するかまたは治療しようとする状態の状況、および治療する医師、内科医または看護師の経験などの要因に応じるであろう。
【００９４】
用語「希釈剤」は、例えば生理学的生理食塩水溶液を指す。用語「薬学的に許容されうるキャリアー」は、例えば前記組成物を溶解し、分散し、または拡散させることによって、治療しようとする部位への適用または散在を容易にするために、そして／またはその有効性を損なうことなく、その貯蔵、輸送または取り扱いを容易にするために、活性成分とともに配合される任意の材料または物質を意味する。これらには、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤（例えばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張性剤（例えば糖または塩化ナトリウム）等が含まれる。組成物中の活性成分の作用期間を調節するため、さらなる成分が含まれてもよい。薬学的に許容されうるキャリアーは、固形または液体または液体を形成するように圧縮されている気体であってもよく、すなわち本発明の組成物は、濃縮物、エマルジョン、溶液、顆粒、粉塵、スプレー、エアロゾル、懸濁物、軟膏、クリーム、錠剤、ペレットまたは粉末として、適切に用いられうる。前記薬学的組成物およびその配合物において使用するのに適した薬学的キャリアーは、当業者に周知であり、そして本発明内で、その選択に対する特定の制限はない。これらにはまた、薬学的実施と一致する、すなわち哺乳動物に永続的な損傷を生じないキャリアーおよび添加剤であれば、湿潤剤、分散剤、粘着剤（ｓｔｉｃｋｅｒ）、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤（例えばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張性剤（例えば糖または塩化ナトリウム）等が含まれうる。本発明の薬学的組成物を、任意の既知の方式で、例えば１工程または多工程法において、活性成分を、選択されたキャリアー材料と、そして適切な場合、他の添加剤、例えば表面活性剤と、均質に混合し、これらでコーティングし、そして／またはこれらとともに粉砕することによって、調製することも可能である。また、微粒子化によって、例えば約１〜１０μｍの直径を通常有する微小球体の形で得ることを視野に入れて、すなわち活性成分の徐放または持続放出のためのマイクロカプセルの製造のため、これらを調製してもよい。
【００９５】
本発明記載のペプチドまたはポリペプチド、その相同体または誘導体（および用語「活性成分」にすべて含まれる、その生理学的に許容されうる塩または薬学的組成物）を、防止するかまたは治療しようとする状態に適した、そして化合物、ここでは、投与しようとするペプチドまたはポリペプチドに適した、任意の経路によって投与してもよい。可能な経路には、局所、全身性、経口（固形または吸入）、直腸、鼻、局部（目、頬および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、動脈内、クモ膜下腔内および硬膜外を含む）が含まれる。投与の好ましい経路は、例えば、レシピエントの状態に応じて、あるいは防止するかまたは治療しようとする状態に応じて多様でありうる。
【００９６】
配合物を単位投薬型で好適に提示してもよいし、そして薬学業に周知の方法のいずれによって調製してもよい。経口投与に適した本発明の配合物を、あらかじめ決定された量の活性成分を各々含有するカプセル、カシェーまたは錠剤などの別個の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁物として；あるいは水中油液体エマルジョンまたは油中水液体エマルジョンとして、提示してもよい。活性成分をまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして提示してもよい。錠剤は、圧縮またはモールディングによって、場合によって１またはそれより多い附属成分とともに作製してもよい。自由流動型、例えば粉末または顆粒を、場合によって、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械の中で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適切な機械の中でモールディングすることによって、モールディングされた錠剤を作製してもよい。錠剤を、場合によって、コーティングするかまたはスコアリングしてもよく、そして中の活性成分の緩慢放出または徐放を提供するように配合してもよい。
【００９７】
遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種の目的のためのウイルスベクターは、組換え核酸技術による修飾に非常に受け入れられる。上記を考慮して、当業者は、本発明にしたがったペプチドまたはポリペプチドおよびその使用において適用されるようなウイルスベクターＮＫＴ細胞エピトープの排除を、ウイルスベクター自体に直ちに導入可能であることをさらに容易に想定するであろう。したがって、本発明は、ＣＤ１ｄ結合モチーフがアミノ酸置換または削除によって除去されている点で特徴付けられる単離ウイルスベクターと定義される修飾ウイルスベクターをさらに含む。
【００９８】
本発明はここで、以下の実施例によって例示され、該実施例は限定の意図を伴わずに提供される。さらに、本明細書記載のすべての参考文献は、本明細書に明確に援用される。
【実施例】
【００９９】
実施例１：凝固因子ＶＩＩＩ
血友病Ａを患う患者は、十分な量の因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）を欠き、これが調節されない出血傾向の理由である。こうした患者は、血漿供給源より精製されるか、または組換え技術によって産生されるＦＶＩＩＩの注入によって治療される。ＦＶＩＩＩの投与は、特異的抗体の形成を生じ、症例のおよそ３０％は、凝固補因子としてのＦＶＩＩＩの機能を阻害する。
【０１００】
アルゴリズムを用いて、本発明者らは、ＦＶＩＩＩ分子の配列内に、［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］配列モチーフにマッチするＣＤ１ｄ結合配列を所持する３つの配列を同定した。これらのモチーフは、それぞれ、Ａ１およびＡ３ドメインに位置する。
【０１０１】
Ａ１ドメイン中のＦＣＨＩＳＳＨ（アミノ酸３０９〜３１５、配列番号１）
Ａ３ドメイン中のＦＷＫＶＱＨＨ（アミノ酸１８１６〜１８２２、配列番号２）
Ａ３ドメイン中のＦＨＡＩＮＧＹ（アミノ酸１９１８〜１９２４、配列番号３）
これらの配列は、共通の（下線の）１位の芳香族残基（フェニルアラニン、Ｆ）、４位の脂肪族残基（イソロイシン、Ｉ、またはバリン、Ｖ）、および７位の芳香族残基（ヒスチジン、Ｈ、またはチロシン、Ｙ）を有する。
【０１０２】
これらの配列がｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫＴ細胞を活性化可能であるかどうかを決定するため、ＦＶＩＩＩ（２  ＩＵ）を、１週間間隔で４回、血友病Ａマウスに静脈内注射した。血友病Ａマウスは、ＦＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１６中の停止コドンのため、ＦＶＩＩＩをまったく産生しない。
【０１０３】
最後の注射の１０日後、マウスを屠殺し、脾臓を除去し、そして磁気ビーズ選別によってＣＤ４＋  Ｔ細胞を調製した。ＣＤ４の発現およびＣＤ１ｄ分子によって提示される抗原の認識によって、ＮＫＴ細胞を性質決定する。商業的供給業者からＣＤ１ｄの四量体を得て、そして長さ１５アミノ酸のＦＶＩＩＩペプチドを装填し、これには配列番号１、配列番号２および配列番号３を含有するペプチドが含まれた。これらのペプチドを装填されたＣＤ１ｄ四量体の有意な結合が観察され、これらの３ペプチドがＣＤ１ｄに結合可能であり、そしてＦＶＩＩＩの注射がＮＫＴ細胞の活性化を誘発することが示された。代表的な結果を図１に提供する。
【０１０４】
さらに、ＣＤ１ｄモチーフを含有するペプチド（配列番号１、配列番号２または配列番号３のペプチド）での直接免疫は、ＮＫＴ細胞の活性化およびＦＶＩＩＩに対する抗体の産生を誘発するのに十分であった。配列番号１のペプチドで、突出した活性化が観察された。代表的な結果を図２に提供する。
【０１０５】
骨髄キメラを構築し、ここで、血友病Ａのマウスにまず放射線照射し、そしてＮＫＴ細胞を欠くマウスの骨髄で再構築しており、これはすなわちＣＤ１ｄノックアウトマウスであった。ＮＫＴ細胞の非存在下で、マウスは、ＦＶＩＩＩに対する有意な量の抗体を産生不能であり、そして実質的にＦＶＩＩＩの機能を阻害する抗体はなかった（図３）。
【０１０６】
天然配列である、またはＦ３０９およびＨ３１５のセリンによる置換を含む（配列番号４のポリペプチド）、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインを産生した。天然配列または配列番号４のＦＶＩＩＩ  Ａ１ドメインを用いて、マウスの別個の群を免疫した。結果は、上述のような脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞より評価されるように、ＳによるＦ３０９およびＨ３１５の置換（配列番号４）が、ＮＫＴ細胞の活性化を防止するのに十分であることを示した。
【０１０７】
天然配列である、またはＦ１８１６およびＨ１８２２のセリンによる置換を含む（配列番号５のポリペプチド）、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインを産生した。天然配列または配列番号５のＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメインを用いて、マウスの別個の群を免疫した。結果は、上述のような脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞より評価されるように、ＳによるＦ１８１６およびＨ１８２２の置換（配列番号５）が、ＮＫＴ細胞の活性化を防止するのに十分であることを示した。
【０１０８】
天然配列のＢドメイン削除ＦＶＩＩＩ分子は、ＮＫＴ細胞の活性化を誘発した（上を参照されたい）。Ｆ３０９Ｓ、Ｈ３１５Ｓ、Ｆ１８１６ＳおよびＦ１９１８Ｓを含有する、４アミノ酸置換を含むＦＶＩＩＩ分子（配列番号６）を調製した。血友病Ａマウスにおいて、こうした突然変異ＦＶＩＩＩの静脈内注射は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の形成を生じず、そしてその結果、ＦＶＩＩＩの機能を阻害する抗体は生じなかった。
【０１０９】
したがって：
（１）ＦＶＩＩＩは、いくつかのＣＤ１ｄ結合モチーフを天然に含有する；
（２）これらのＣＤ１ｄはモチーフ機能性であり、そしてＮＫＴ細胞の活性化を誘発する；
（３）ＮＫＴ細胞の活性化は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の産生に必要である；
（４）アミノ酸置換によるＣＤ１ｄモチーフの除去は、抗ＦＶＩＩＩ抗体の産生を除去するのに十分である。
【０１１０】
本発明がまた、因子ＩＸなどの凝固因子の産生に関してトランスジェニックであるように作製された動物にもまた適用されることが、当業者には明らかであるはずである。
【０１１１】
図面の詳細な説明
図１
ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄによって提示される因子ＶＩＩＩエピトープを認識する
血友病Ａマウスを、１週間間隔で４回、２ＩＵの因子ＶＩＩＩで免疫した。次いで、脾臓を除去し、そして磁気ビーズ選別によって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を調製した。ＣＤ１ｄの蛍光色素標識四量体を商業的供給業者から得て、そして長さ１５アミノ酸のＦＶＩＩＩペプチドを装填し、これには配列番号１、配列番号２および配列番号３を含有するペプチドが含まれた。室温、暗所で一晩、装填を行った。次いで、四量体をＣＤ４＋  Ｔ細胞集団と４℃で３０分間インキュベーションし、そして細胞懸濁物をＦａｃｓによって分析した。
【０１１２】
図は、配列番号１のペプチド（図中の４４ｐｅｐｔ）を装填したＣＤ１ｄ四量体がＮＫＴ細胞に認識されることを示す。ＣＤ１ｄ  ｃｔｌ（−）は、未装填四量体を認識するＮＫＴ細胞の％を示す。ＣＤ１ｄ  ｃｔｌ（＋）は、アルファ−ｇａｌセラミドを装填された四量体を認識するＮＫＴ細胞の％を示し、該分子はすべてのＮＫＴ細胞を補充する。最大４５％のＮＫＴ細胞が４４ｐｅｐｔを認識し、これはＣＤ１ｄレベルでは多型が存在せず、そしてＮＫＴ  Ｔ細胞受容体レベルでは非常に限定された多型しかないことと適合する。
【０１１３】
図２
血友病ＡマウスのＣＤ１ｄ拘束ペプチドでの免疫は、抗因子ＶＩＩＩ抗体を誘発する
血友病Ａマウスを、水酸化アルミニウム上に吸着させた配列番号１のペプチド（４４ｐｅｐｔ）および配列番号２のペプチド（２５６ｐｅｐｔ）の等モル混合物５０μｇで３回、皮下免疫した。対照群には、ペプチドの代わりに生理学的血清を投与した。最後の免疫の１０日後、血漿を採取し、そして直接結合アッセイを用いて、抗因子ＶＩＩＩ抗体の存在に関して評価した。簡潔には、因子ＶＩＩＩ（１０ＩＵ／ｍｌ）をポリスチレンプレート上で不溶化し、これを洗浄し、そして１／１０希釈の血漿とインキュベーションした。さらに洗浄した後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗血清を添加し、その後、酵素基質を添加した。発色をＯＤとして読み取った。
【０１１４】
図は、配列番号１のペプチドおよび配列番号２のペプチドで免疫した血友病Ａマウスが、因子ＶＩＩＩに対する抗体を発展させたことを示す。
【０１１５】
図３
ＣＤ１ｄ  ＫＯマウス由来の骨髄で再構成した血友病Ａマウスは、因子ＶＩＩＩに対する抗体を産生しない
血友病Ａマウスに致死性に放射線照射し、そしてＮＫＴ細胞を欠く、ＣＤ１ｄ  ＫＯマウスの骨髄（５ｘ１０６／マウス）で再構築した。骨髄再構築の６週後、マウスに１週間間隔で４回、２ＩＵ／ｍｌをＩＶ注射した。最後の免疫の１０日後、マウスから出血させ、そして図２のレジェンドに記載するように、直接結合アッセイを用いて、抗因子ＶＩＩＩ抗体の存在に関して血漿をアッセイした。照射血友病Ａマウスの対照群は、正常骨髄で再構築された。
【０１１６】
図は、対照マウスが、因子ＶＩＩＩの４回目の注射後、高濃度の抗ＦＶＩＩＩ抗体を産生するが（左パネル）、ＮＫＴ細胞不全マウスの骨髄で再構成されたマウスは産生しなかった（右パネル）ことを示す。
【０１１７】
実施例２：アデノウイルス５ウイルスベクター
ウイルスベクターは、一般的に、遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種に用いられる。これらのウイルスベクターの最も一般的なものの１つは、アデノウイルス血清型５に由来する。アデノウイルス（Ａｄ）は、約３５ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを所持する、非エンベロープウイルスである。ヒトＡｄ５は、３つの主要な構造タンパク質：ヘキソン、ペントンおよび繊維からなるカプシドを有する。中和抗体はヘキソンタンパク質に向かって作製される。こうした抗体は、ウイルス感染の結果として、ヒトにおいて非常に一般的である。こうした抗体の存在は、ウイルスベクターの進入をブロックし、そしてその結果、ベクターが所持する導入遺伝子タンパク質の発現を防止する。抗Ａｄ５抗体は、適応反応の経過中に生成され、これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の背景で提示されるエピトープに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化に応じる。
【０１１８】
Ａｄ５は自然免疫系を活性化することが知られるが、これが起こる正確な機構およびこれが起こる位置は不明なままである。しかし、自然免疫系の活性化は、中和抗体が形成されるために必要な工程でありうる。
【０１１９】
アルゴリズムを用いて、本発明者らは、ヘキソン６において、ＣＤ１ｄ結合配列（配列番号７、モチーフを下線で示す）の一般的モチーフ［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］とマッチする７アミノ酸の配列を同定した。
【０１２０】
マウスに１０日間隔で３回、１０９  ＰＦＵ  Ａｄ５ベクターを静脈内注射した。次いで、磁気ビーズ選別によって、脾臓からＣＤ４＋  Ｔ細胞を調製した。同定した７配列各々に対応するペプチドを装填したＣＤ１ｄ四量体と、ＣＤ４＋  Ｔ細胞をインキュベーションした。ＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞の有意な比率（±１０％）が四量体によって標識されることが示され、Ａｄ５ベクター注射が配列番号７のペプチドに特異的なＮＫＴ細胞を活性化したことが示された。さらに、こうしたマウスは、マウスにおける中和抗体に特徴的なＩｇＧ２ａアイソタイプの特異的抗体を産生した。
【０１２１】
同定した７アミノ酸の配列各々に関して、［ＦＷ］のセリンＳによる置換を含有するウイルスベクターを調製した。この突然変異ウイルスベクター（配列番号８、モチーフを下線で示す）を用いて、天然配列に関して上述したのと同じプロトコルにしたがって、動物を免疫した。天然配列のペプチド（配列番号７）を装填した四量体を用いて評価した際のＮＫＴ細胞の比率は＜１％であり、そしてＡｄ５ウイルス特異的抗体濃度は有意に減少した（最大１０倍）。
【０１２２】
したがって、ＣＤ１ｄ結合モチーフの各Ｐ１位置中のＦからＳへの置換は、ＮＫＴ細胞活性化を減少させ、そしてそれによって抗Ａｄ５抗体の産生を減少させるのに十分であると結論づけられた。
【０１２３】
実施例３：遺伝子改変タンパク質
被験体が吸入または摂取によって曝露されるタンパク質は、しばしば、素因がある被験体において、望ましくない反応を誘発する。アレルギー性喘息は、世界中で何百万もの人々に影響を及ぼす。一方、食物アレルギーは、一般的な集団中、±２．５％の全体の有病率を有する。アレルゲンは、風媒性であっても、摂取されるかまたは皮膚浸透性であっても、ＮＫＴ細胞を活性化する特性を共有しうる。
【０１２４】
最も一般的な食物アレルゲンの１つは、リンゴ（マルス・ドメスティクス（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））であり、そしてアレルゲン性は、ほぼ独占的に、感染性病原体に対して植物を保護する長さ１５９アミノ酸のタンパク質であるＭａｌ  ｄ  １タンパク質によって生じる。コンピュータ・アルゴリズムを用いて、ＣＤ１ｄ結合配列の一般的モチーフ［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］に対応する配列モチーフを同定した。
【０１２５】
Ｍａｌ  ｄ  １のアミノ酸１４４〜１５０に対応するＦＫＬＩＥＳＹ（配列番号９）
遺伝子操作によって、Ｆ１４４およびＹ１５０がＳに突然変異されているＭａｌ  ｄ  １の組換え型を産生した。したがって、Ｍａｌ  ｄ  １の組換え型は、配列：
ＳＫＬＩＥＳＳ（配列番号１０）
のペプチドを含む。
【０１２６】
配列番号９および配列番号１０に対応する合成ペプチドを産生した。Ｍａｌ  ｄ  １に感作された個体の末梢血単球由来のヒト樹状細胞を用いて、ＮＫＴ細胞を活性化する能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定した。ＣＤ４およびＮＫＧ２Ｄなどの特異的マーカーを用いて末梢リンパ球を選別することによって、同じ個体から得たＮＫＴ細胞の存在下で、２つのペプチドの各々一方を装填された樹状細胞をインキュベーションした。配列番号９のペプチドとインキュベーションすると、有意な比率のＮＫＴ細胞が活性化されるが、配列番号１０の突然変異ペプチドは活性化しないことが観察された。さらに、配列番号９のペプチドを装填されたヒトＣＤ１ｄ四量体は、有意な比率のＮＫＴ細胞によって認識されるが、配列番号１０の突然変異ペプチドを装填された四量体は、ＮＫＴ細胞の１％未満によってしか認識されなかった。
【０１２７】
部位特異的突然変異誘発によって、２つのＦ１４４ＳおよびＹ１５０Ｓ突然変異をクローン細胞に直接導入する。次いで、慣用的成長戦略によって、完全な生物を産生する。このＧＭＯによって産生されたリンゴは、アレルギー性反応を誘発しない。
【０１２８】
本発明のペプチドまたはポリペプチドの１つの特定の適用は、セリアック病（グルテン不寛容）である。この疾患は、ヒトにおいて最も一般的であり、そしてＭＨＣクラスＩＩ決定基の背景で提示されるグリアジン・エピトープに対するＴ細胞活性化と関連する。遺伝的感受性が記載されてきており、ＨＬＡ−ＤＱ２またはＤＱ８クラスＩＩ決定基を所持するヒトは、疾患に対する素因がある。これらのクラスＩＩ決定基は、トランスグルタミナーゼによる脱アミド化に供されているペプチドを提示する。しかし、これらの事象は腸炎症反応の結果であり、自然免疫系に関連する可能性が高い。
【０１２９】
グリアジンは、２５０〜３００アミノ酸残基の単量体である。コンピュータアルゴリズムを用いたＣＤ１ｄ結合配列の一般的モチーフ［ＦＷ］−ＸＸ−［ＩＬＭ］−ＸＸ−［ＦＷＴＨＹ］の検索によって、アルファ−グリアジン中にこうした配列（配列番号１１、配列表を参照されたい）が同定された。次いで、モチーフのＦ残基がＳ残基によって置換されているアルファ−グリアジンの突然変異型（配列番号１２、補遺を参照されたい）を産生した。
【０１３０】
Ｍａｌ  ｄ  １と同じ方法にしたがって、抗原提示樹状細胞によって提示された際、配列番号１１のポリペプチドが有意な比率のＮＫＴ細胞を活性化したが、ポリペプチドの突然変異型（配列番号１２）は活性化に失敗したことが示された。Ｍａｌ  ｄ  １に関しては、配列番号１１のポリペプチド中に同定されるモチーフを提示する合成ペプチドを装填したヒトＣＤ１ｄ四量体がＮＫＴ細胞によって認識される一方、配列番号１２に示すようなモチーフの突然変異型を装填された四量体は認識されなかった。
【０１３１】
部位特異的突然変異誘発によって突然変異をクローン細胞に直接導入した。次いで、慣用的成長戦略によって、完全な生物を産生した。グリアジンの突然変異型を含有する穀物は、不寛容反応を誘発しない。
【０１３２】
当業者には、本発明はまた、例えば、殺昆虫剤、駆除剤に対する耐性を増加させるため、遺伝子改変生物に添加されるタンパク質、または有益と判断される任意の他の改変にもまた適用可能であることが明らかであるはずである。こうした改変は、新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するリスクを所持する。
【０１３３】
アレルゲン性／免疫原性が減少した遺伝子改変タンパク質のさらなる例は：
・ダイズ、ピーナッツおよびバラ科（Ｒｏｓａｃｅｏｕｓ）の果物などの食物アレルゲン
・牛乳タンパク質
・ラテックス（パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、ホソムギ（Ｒｙｅ  ｇｒａｓｓ）（ロリウム・ペレネ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））、オオアワガエリ（Ｔｉｍｏｔｈｙ）（フレウム・プラテンス（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））またはケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  ｂｌｕｅ  ｇｒａｓｓ）（ポア・プラテンシス（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））などの草の花粉
・魚パルブアルブミン
・ミツバチ・ホスホリパーゼＡ２
である。
【０１３４】
当業者にはまた、本発明がトランスジェニック植物および動物の産生を含めて、本発明のペプチドまたはポリペプチドを産生する方法に拡張されることが明らかであるはずである。
【０１３５】
実施例４  アレルゲン  Ｄｅｒ  ｐ  １
Ｄｅｒ  ｐ  １は、いわゆるチリダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）（ＨＤＭ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄ．  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）の主要アレルゲンであるシステインプロテアーゼである。ＨＤＭに対する感作は、間違いなく、世界中で最も一般的なアレルギー性喘息および鼻炎のトリガーである。Ｄｅｒ  ｐ  １は、コンピュータアルゴリズムを用いて同定されるような、一般的なＣＤ１ｄ結合モチーフ［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］にマッチする３つのモチーフを含有し、そしてこれらは：
配列番号１３：  ＦＳＧＶＡＡＴ  Ｄｅｒ  ｐ  １のアミノ酸３８〜４４
配列番号１４：  ＨＳＡＩＡＡＶＩ  Ｄｅｒ  ｐ  １のアミノ酸１３５〜１４１
配列番号１５：  ＹＰＹＶＶＩＬ  Ｄｅｒ  ｐ  １のアミノ酸２１６〜２２２
である。
【０１３６】
配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のペプチドを合成し、そしてＣＤ１ｄ四量体を装填するのに用いる。
【０１３７】
１００μｇのＤｅｒ  ｐ  １を含有する生理食塩水５０μｌを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＤｅｒ  ｐ  １を鼻内投与する。この曝露法を１週間間隔で連続３日、２回反復する。最後の点鼻の５日後、マウスを屠殺し、そして脾臓を除去した。磁気ビーズ選別によってＣＤ４＋  Ｔ細胞を精製し、そして配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のペプチドを装填したＣＤ１ｄ四量体の存在下でインキュベーションした。蛍光活性化細胞選別装置（ｆａｃｓ）測定によって、有意な割合の細胞（±１０％）が四量体とともに染色され、これらをＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞と同定した。したがって、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のペプチドは、ＣＤ１ｄへの結合に際して、そしてＮＫＴ細胞による認識に際して、機能性であると結論づけられた。
【０１３８】
上記実験から得たＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＤ１ｄ分子を発現する抗原提示細胞の存在下、培地中でインキュベーションした。こうした細胞は商業的に入手可能であり、例えばＭＨＣクラスＩＩ決定基を発現しないＪＡＷＳ２細胞がある。ＪＡＷＳ２細胞にＤｅｒ  ｐ  １を装填し、そしてＮＫＴ活性化のマーカーとしてＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−４などのサイトカイン産生を測定することによって、ＣＤ１ｄによるＤｅｒ  ｐ  １由来エピトープの提示を評価した。サイトカインの有意な産生が存在することが観察可能であり、Ｄｅｒ  ｐ  １が、ＣＤ１ｄ分子によって提示されるエピトープを含有することが確認された。
【０１３９】
次に、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のペプチドのＣＤ１ｄ結合に関して、Ｐ１位中にあると予測される３つのアミノ酸残基をセリンによって置換した、Ｄｅｒ  ｐ  １の突然変異型を遺伝子操作によって調製した。突然変異Ｄｅｒ  ｐ  １（配列番号１６）は、天然配列のＤｅｒ  ｐ  １（配列番号１７）とともに、上述のような点鼻に用いられた。こうした場合、配列番号１３のペプチド、配列番号１４のペプチドまたは配列番号１５のペプチドを装填した四量体とインキュベーションした際には、ＣＤ４＋  Ｔ細胞脾臓細胞の有意な結合は観察されず、突然変異Ｄｅｒ  ｐ  １は、これらのペプチドに特異的なＮＫＴ細胞を活性化する能力を失ったことが示された。
【０１４０】
さらに、突然変異Ｄｅｒ  ｐ  １（配列番号１６）を用いて、ＪＡＷＳ２細胞に装填し、そしてＮＫＴ細胞を活性化する能力に関して試験した。この実験のため、天然または突然変異立体配置いずれかのＤｅｒ  ｐ  １で免疫したマウスから得られるようなＮＫＴ細胞を用いた。ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−４の産生をＮＫＴ活性化の指標として用いた。天然配列Ｄｅｒ  ｐ  １で免疫したマウスから得たＮＫＴ細胞は、突然変異Ｄｅｒ  ｐ  １を装填されたＪＡＷＳ２細胞の存在下でインキュベーションされた際、活性化されないことが観察された。
【０１４１】
したがって、天然配列Ｄｅｒ  ｐ  １は、ＮＫＴ細胞を活性化する、機能性ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞エピトープを含有すると結論づけられた。さらに、突然変異によるこうした機能性ＣＤ１ｄ拘束エピトープの除去は、ＮＫＴ細胞活性化を除去するのに十分であった。
【０１４２】
実施例５：抗体
慢性炎症性疾患、例えば関節リウマチ（例えば抗ＴＮＦアルファ抗体）またはアレルギー性喘息（例えば抗ＩｇＥ抗体）から腫瘍（例えば抗ＣＤ２０抗体）に渡る多数の適応症において、療法剤として抗体が用いられている。１２０を超える療法抗体が現在、前臨床から第ＩＩＩ相試験までの多様な段階で、臨床適用のため、用いられ、そしてルーチンの臨床実施に受け入れられている。
【０１４３】
療法抗体は、キメラまたは完全ヒト化抗体であり、これは、可変部分の相補性決定領域においてのみ、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）起源の配列を含有する。こうした抗体の少数のみが、ヒトレパートリー由来であり、そしてこうしたものとして、ほとんど免疫原性がないと見なされる。しかし、療法抗体に向けられる抗体は、ヒトレパートリーに直接由来する場合であっても、治療中の患者の大部分で産生され、症例の有意な比率において、抗体産生は、療法剤の活性を中和する。
【０１４４】
コンピュータアルゴリズムを用いて、ヒトＩｇＧ抗体配列中のＣＤ１ｄ結合モチーフにマッチするエピトープに関する検索を行った。こうしたモチーフの１つが、４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）の各々のＣＨ２領域（重鎖定常部分の第二のドメイン）中に同定され、そして第二のモチーフが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＣＨ３ループ中に同定された：
配列番号１８：  ＹＲＶＶＳＶＬ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＣＨ２）
配列番号１９：  ＦＲＶＶＳＶＬ（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３のＣＨ２）
配列番号２０：  ＨＥＡＬＨＮＨ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＣＨ３ループ）
配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に対応する合成ペプチドを産生し、そしてこれを用いて、上述の例に関するように（例えばアレルゲンＤｅｒ  ｐ  １に関する実施例４を参照されたい）、ヒトＣＤ１ｄ四量体に装填した。先の５日間、療法抗体注射を受けた患者の静脈穿刺によって、末梢血細胞を得た。磁気ビーズ選別によって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を精製した。次いで、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０のペプチドを装填した四量体と細胞をインキュベーションした。ｆａｃｓによる分析は、ＮＫＴ細胞の有意な比率（±１０％）が四量体によって標識されることを同定する。
【０１４５】
ＩｇＧ４アイソタイプのモノクローナルヒト抗体を、エプスタイン−バーウイルスでの形質転換によって、末梢血Ｂリンパ球から得た。こうした抗体のゲノム配列を形質転換Ｂ細胞から得た。対応するｃＤＮＡ配列を含有するウイルスベクターを構築し、そしてＣＨＯ細胞のトランスフェクションに用いた。これらの方法はすべて、当該技術分野に知られる（例えば、Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら  Ｂｌｏｏｄ  ９２：  ４９６−５０６，  １９９８を参照されたい）。
【０１４６】
配列番号１８および配列番号２０のペプチド中の１位に位置する疎水性アミノ酸残基をセリンに突然変異させ、そして突然変異抗体を、トランスフェクションＣＨＯ細胞によって産生した。
【０１４７】
上述のように得た末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、培地中でヒト樹状細胞（当該技術分野に知られる方法によって、ヒト末梢血単球より得る）に曝露し、そして天然立体配置（配列番号２１）またはその突然変異対応物（配列番号２２）の抗体いずれかを装填した。細胞をＣＤ４＋  Ｔ細胞と５〜７日間、培養した後、天然または突然変異抗体いずれかによって活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞集団を評価した。ＮＫまたはＮＫＴ細胞のみに関連する表面マーカーであるＮＫＧ２Ｄに対する抗体を用いて、ＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞をＣＤ４＋  Ｔ細胞から分離した。
【０１４８】
天然配列の抗体を用いた場合（配列番号２１）、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞が活性化される一方、抗体の突然変異型（配列番号２２）は、クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞のみを活性化し、そしてＮＫＴ細胞を活性化しないことが観察された。
【０１４９】
ヒトＩｇＧ抗体は、［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］モチーフに対応するエピトープを含有し、ＮＫＴ細胞によって認識され、そしてこれを活性化する能力を有すると結論づけられた。さらに、こうしたモチーフ内の重要な疎水性アミノ酸残基の突然変異は、ＮＫＴ細胞の活性化を防止するのに十分であった。
【０１５０】
本明細書に提供する実施例は、包括的ではなく、そして多様な数のアミノ酸置換または削除を含有するタンパク質またはペプチドの組み合わせが、想定可能であることを理解すべきである。例えば、実施例１において、疎水性アミノ酸の置換の多様な組み合わせが記載可能である。
【０１５１】
配列表
【０１５２】
【化１−１】
2014501727.tif 000003
【０１５３】
【化１−２】
2014501727.tif 000004
【０１５４】
【化１−３】
2014501727.tif 000005
【０１５５】
【化１−４】
2014501727.tif 000006
【０１５６】
【化１−５】
2014501727.tif 000007
【０１５７】
【化１−６】
2014501727.tif 000008
【０１５８】
【化１−７】
2014501727.tif 000009
【０１５９】
【化１−８】
2014501727.tif 000010
【０１６０】
【化１−９】
2014501727.tif 000011
【０１６１】
【化１−１０】
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【０１６２】
【化１−１１】
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【０１６３】
【化１−１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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