(57)【要約】抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍を有する疑いのある患者を特定および治療する方法ならびに系が提供される。プロゲステロン受容体のフォーカス分布度を使用して、抗プロゲスチン療法による治療に感受性である腫瘍を特定することができる。
2014530812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、
ａ）腫瘍原性または癌性である疑いのある組織サンプルを患者から得ること、
ｂ）前記組織サンプルにおいてプロゲステロン受容体陽性細胞を特定すること、
ｃ）前記組織サンプル由来のプロゲステロン陽性細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定すること、および
ｄ）前記組織サンプルにおける前記フォーカス分布度が、前記プロゲステロン受容体陽性細胞の約５％よりも高い場合に、抗プロゲスチンを前記患者に投与すること
を含む方法。
【請求項２】
前記組織を抗プロゲステロン受容体抗体に曝露することにより、前記組織由来の細胞における核内の前記フォーカス分布度を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮平滑筋腫、肺および子宮組織から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗プロゲスチンが、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニルおよびウリプリスタルから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フォーカス分布度が、前記組織の前記プロゲステロン陽性細胞における前記プロゲステロン受容体の結合パターンを特定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記結合パターンが、散在性（Ｄ）、活動性（Ａ）および活動性／散在性（ＡＤ）から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの抗体が、前記フォーカス分布度を決定するのに使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、抗ＰＲ−Ａ抗体、抗ＰＲ−Ｂ抗体、および抗ＰＲ−Ａ抗体と抗ＰＲ−Ｂ抗体との混合物、ならびにＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに対する二重特異的抗体から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記プロゲステロン受容体の前記フォーカス分布度が、免疫組織化学、免疫蛍光およびウェスタンブロットから成る群から選択される検出方法により決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗プロゲスチンが、１日当たり約１０ｍｇ〜約２００ｍｇの量で前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
ａ）腫瘍原性である疑いのある組織サンプルを患者から得ること、
ｂ）前記組織を抗プロゲステロン受容体抗体に曝露すること、
ｃ）前記組織サンプルにおけるプロゲステロン受容体陽性細胞を特定すること、
ｂ）前記組織由来の細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス結合分布を決定することを含み、該フォーカス結合分布が、ＡまたはＡＤ結合パターンを伴って、組織サンプルにおいて前記プロゲステロン受容体陽性細胞の５％よりも高い場合に、抗プロゲスチンが、１日当たり約１０〜約２００ｍｇの投与量範囲で前記患者に投与される
方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮平滑筋腫、肺および子宮組織から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗プロゲスチンが、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニルおよびウリプリスタルから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記フォーカス分布度が、前記組織の前記細胞における前記プロゲステロン受容体の結合パターンを特定することにより決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合パターンが、散在性（Ｄ）、活動性（Ａ）および活動性／散在性（ＡＤ）から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、抗ＰＲ−Ａ抗体、抗ＰＲ−Ｂ抗体、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに対する二重特異的抗体、ならびに抗ＰＲ−Ａ抗体と抗ＰＲ−Ｂ抗体との混合物から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
オナプリストンによる増殖阻害に感受性の腫瘍を有する疑いのある患者を治療する方法であって、
ａ）腫瘍組織生検標本において、プロゲステロン受容体陽性細胞の細胞核内のプロゲステロン受容体の約５％よりも高いフォーカス分布を示す患者を特定すること、および
ｂ）１日当たり約１０〜約２００ｍｇの量で前記患者にオナプリストンを投与すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記患者に、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、抗ＨＥＲ２薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビンおよびシクロホスファミドから成る群から選択される抗腫瘍化合物を投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍におけるプロゲステロン受容体陽性細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布減少能に関して薬物候補をスクリーニングする方法であって、少なくとも２つの腫瘍組織検体を同じ腫瘍から得ることと、１つの腫瘍組織検体を薬物候補に曝露することと、該腫瘍組織検体を抗プロゲステロン受容体抗体に曝露することと、該腫瘍組織検体由来の前記プロゲステロン受容体陽性細胞の前記核内の前記プロゲステロン受容体の前記フォーカス分布度を決定することと、前記薬物候補に曝露した該腫瘍組織検体における前記プロゲステロン受容体の前記フォーカス分布が、前記薬物候補に曝露していない腫瘍組織検体と比較して減少するかどうかを決定することであり、前記薬物候補が、前記薬物候補に曝露した該組織検体の前記プロゲステロン受容体陽性細胞において、前記プロゲステロン受容体の前記フォーカス分布を減少させる場合、前記薬物候補は、前記腫瘍の前記プロゲステロン受容体陽性細胞における前記プロゲステロン受容体の前記フォーカス分布を減少させることができることとを含む方法。
【請求項２０】
抗プロゲスチンによる治療に感受性の腫瘍を分類するための系であって、組織サンプル、およびプロゲステロン受容体を検出できる少なくとも１つの抗体または抗体結合フラグメントを含み、該抗体または抗体結合フラグメントが、腫瘍組織検体由来の細胞のプロゲステロン受容体陽性核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定するのに使用され、プロゲステロン陽性細胞の細胞核内の該フォーカス分布度が約５％よりも高い場合に、該腫瘍が抗プロゲスチンによる治療に感受性である系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０１１年１０月４日に出願した米国仮特許第６１／５４２，９３１号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロゲステロン受容体（ＰＲ）は、２つの腫瘍アイソフォームであるＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂで細胞中に存在する。結合性プロゲスチンリガンド（例えば、プロゲステロン）の存在下で、ＰＲは特異的部位でリン酸化され、二量化して、多数の異なる細胞要素（例えば、ｐ３００およびステロイド受容体コアクチベーター）との複合体を形成して、プロゲステロン応答配列（ＰＲＥ）として知られる特異的ＤＮＡ配列に結合して、ＲＮＡへのＤＮＡ転写を開始させる。ＰＲ−リガンド複合体はまた、多数の他のコアクチベーターおよびコリプレッサーを攻撃して、細胞要素を形成して、順に特定の遺伝子を転写する。これらのＰＲ複合体（フォーカス(foci)とも称される）は、免疫組織蛍光技法を使用して蛍光凝集体として、またこの特許に記載される免疫組織化学技法を使用して高密度でかつ濃い染色核凝集体として、プロゲステロン受容体を含有する細胞の核内で可視化させることができる。
【０００３】
閉経前の女性では、エストロゲンが優性ホルモンであり、かつプロゲステロンが最小限に分泌される増殖期（月経周期の第一部）中に、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに関する正常な子宮内膜細胞の染色（例えば、免疫蛍光技法および共焦点顕微鏡法を使用して）により、散在性プロゲステロン受容体核染色パターンが明らかとなる。プロゲステロンが優性ホルモンである分泌期（月経周期の第二部）では、同じ免疫蛍光技法および共焦点顕微鏡法を使用して、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに関する染色は、容易に検出可能な蛍光核フォーカスとして現れる。
【０００４】
ＲＮＡ転写阻害剤は、ＰＲフォーカスの形成を防止することがわかっており、２６Ｓプロテアソーム阻害剤が、ＰＲ核フォーカスを崩壊させることがわかっている。したがって、細胞中のＰＲフォーカスの存在は、活動性の転写複合体に相当し、ＰＲの活性化、続く遺伝子発現を示すと考えられる。逆に、散在性核染色またはＰＲフォーカスの非存在は、転写的に不活性であるＰＲの存在を示す。正常な乳房および子宮内膜組織（これらは、生理学的にプロゲステロンに応答性である）をプロゲスチンリガンドに曝露すると、散在性核染色パターンから限局的(focal)核内構造への変化を観察することができ、プロゲステロン受容体の活性化を示している。
【０００５】
エストロゲンは、正常な乳房上皮および子宮内膜細胞に対して分裂促進性である（例えば、細胞増殖を引き起こす）のに対して、プロゲスチンの効果はより複雑である。子宮内膜では、プロゲスチンは、Ｇ１期の初期にエストロゲン誘導性細胞周期進行を阻害するのに対して、乳房では、プロゲスチンは、増殖を刺激し得るし、同様に増殖を阻害もし得る。正常な乳房組織生検標本では、増殖活性がプロゲステロンにより刺激されることが示されている（Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ、１９９７年）。この複雑さが、乳癌における実験観察の混乱につながっている。例えば、プロゲストゲンは、フェノールレッドを含まない培地で使用される場合に、インビトロで乳癌細胞に対して直接的な増殖効果を有するようである。Ｈ．Ｊ．Ｋｌｏｏｓｔｅｒｂｏｅｒ、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．４〜６、３１１〜３１８頁、１９９４年。しかしながら、乳癌細胞系で増殖を誘導する同じ避妊薬プロゲストゲンが、エストロゲン依存性ＤＭＢＡラット乳癌モデルで研究された場合、これらのプロゲストゲンは腫瘍進行を阻害した。同上。多くのかかるインビトロでの実験モデルが不適当であると近年示されている。例えば、Ｌａｎｇｅ  Ｃ．他、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、第７章、９４〜１１１頁（２０１０年）を参照されたい。プロゲステロン誘導性増殖がこれらの実験モデルで示されている一方で、増殖性細胞の大部分がＰＲを発現しなかった。したがって、これらのモデルは、抗プロゲスチンによる治療の有効性を必ずしも予測するものでもない。
【０００６】
悪性細胞もまた、核ＰＲフォーカスを示すが、それらは正常細胞のフォーカスとはサイズおよび組成が異なっている。癌で観察されるＰＲフォーカスは、細胞の悪性に関連するＰＲに対して特異的役割を示す。例えば、悪性（癌）乳房細胞中のＰＲにより活性化される遺伝子は、正常な乳房細胞でＰＲにより活性化される遺伝子とは異なる。子宮内膜癌では、ＰＲフォーカスは悪性の特徴に関連するが、ＰＲレベルは悪性の特徴に関連しない。癌細胞中のフォーカスはより大きく、それらは、癌では一般的であるクロマチンリモデリングにおける変更に起因し得る。乳癌におけるＰＲフォーカスは、ホルモン状態に関わらず（例えば、それぞれ、閉経前および閉経後の女性における循環性プロゲステロンの存在下および非存在下で）観察される。ＰＲフォーカスは、（例えば、免疫蛍光技法および共焦点顕微鏡法を使用して）ＰＲ受容体陽性ヒト乳癌生検標本のおよそ５０％の腫瘍細胞中で観察された。他の患者の腫瘍サンプルは、免疫蛍光技法および共焦点顕微鏡法を使用して腫瘍細胞中に散在性ＰＲ核染色パターンを示し、ＰＲの非活性化または非機能性形態を示していた。
【０００７】
乳癌の大部分は、ホルモン治療（すなわち、抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤）で治療することができ、これらは目下、乳癌療法で使用される最も有効な薬物療法(medications)の幾つかである。ホルモン治療は通常、癌細胞内のホルモン受容体の特定に基づいて指示される。オナプリストン（ＯＮＡ）は、本来は避妊薬用途で開発された抗プロゲスチン薬である。しかしながら、過去のホルモン療法が失敗した乳癌（例えば、抗エストロゲンタモキシフェンを投与した患者にも関わらず進行した乳癌）を有する１０１人の予後が乏しい患者の研究で１０％の応答率で、進行乳癌において実質的な活性が実証されている。第一線のホルモン治療としてＯＮＡを使用した小規模乳癌研究では、ＯＮＡは５６％の客観的応答率をもたらし、これはこの疾患において最良の利用可能な治療の上限範囲での有効性である。ＯＮＡはＰＲに結合し、ＰＲリン酸化を誘導せず、ＰＲを二量化させない。ＰＲ−ＯＮＡ複合体は、その標的ＤＮＡセグメントに弱く結合するか、または全く結合せず、したがってＤＮＡ転写に必要なプロセスであるクロマチンリモデリングを活性化しない。インビトロ系では、ＯＮＡは、ＰＲへの人工リガンドの結合により生じるＰＲ核凝集体を逆行させることがわかっている。遺伝子活性化研究により、プロゲスチンおよび他の抗プロゲスチンがプロゲステロン応答遺伝子を活性化する一方で、ＯＮＡは最小限の活性化（すなわち、３つの遺伝子）を有することが一貫して示されている。
【０００８】
さらに、ＯＮＡは、生理学的に達成され得る濃度で、純粋なＰＲアンタゴニストである。ＯＮＡは、他のステロイド受容体を妨害せず、ヒト被験体においてエストロゲン分泌を増大させない（これは、他の抗プロゲスチン（例えば、ミフェプリストン）により示される乳癌療法に関して望ましくない副作用である）。
【０００９】
オナプリストンはこれまで乳癌に関して有望な治療剤として研究されてきた一方で、毒性の懸念に起因して、その開発は停止された。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他、Ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎ，ａ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎａｔａｇｏｎｉｓｔ，ａｓ  Ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５（２）  ２１４〜２１８頁（１９９９年）。ＯＮＡおよび他の抗プロゲスチンによる治療に応答する可能性が最も高い腫瘍を有する患者のサブセットを特定することは重要であり、それに匹敵して、ＯＮＡおよび他の抗プロゲスチンによる治療に応答する可能性が最も低い腫瘍を有する患者のサブセットを特定することも重要である。患者のこれらのサブセットを特定することは、ＡＰＦを有する患者が、潜在的に有効な癌治療を利用することを可能にし、ＯＮＡまたは他の抗プロゲスチンが恩恵を提供し得ない癌を有する患者を、不要な毒性に曝露することを回避する。
【００１０】
現在、エストロゲンもしくはプロゲステロン受容体の存在または非存在は、ある特定の癌（例えば、乳癌）における内分泌治療を使用するかどうかの治療上の決定を行う際に考慮されるに過ぎない。したがって、ＰＲに関する従来のアッセイは、癌を有する患者由来の腫瘍を２つのカテゴリー、すなわちＰＲ陽性またはＰＲ陰性に分類する。アッセイの１つのタイプは、細胞の総タンパク質当たりのＰＲの量を定量化する。これらの方法は自動化させることができ、定量的であるが、細胞核内受容体構造の精度、感受性および分析に関しては満足できるものではない。アッセイの第２のタイプは、ホルマリン固定された組織検体、および受容体を標的とした蛍光または発色団標識したモノクローナル抗体（ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂそれぞれに関する抗体のいずれか、または両方を認識する単一抗体）を使用した免疫組織化学的方法を包含する。免疫組織化学的方法を用いた場合、ある特定のパーセントを上回る細胞（通常、１％以上）での任意の微視的に検出可能な核染色反応が、専門業界のガイドラインに従ってＰＲ陽性であると報告される。通常、１０％以上のＥＲまたはＰＲ陽性細胞の臨床上のカットオフを使用して、抗ホルモン治療の使用に関して治療上の決定を行う。細胞または核染色のパターンは考慮しない。相対的染色強度（すなわち、低、中、または高）もまた、ホルモン受容体陽性の定性的尺度として使用される。アッセイのこの第２のタイプは、より労働集約性であり、それは規格化されない。通常、低倍率顕微鏡検査は、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ）またはＰＲのいずれか）の存在を特定するのにＩＨＣ分析に使用される。従来の方法を使用して、細胞分布の分析は、特定されたホルモン受容体を発現する腫瘍細胞のパーセントの推定以外には行われない。ＰＲの核内分布パターンの分析は、高倍率顕微鏡法を要する。対比して、腫瘍組織におけるホルモン受容体の標準的ＩＨＣ決定には、高倍率顕微鏡法は必要とされない。したがって、ホルモン受容体決定のこれらの従来の方法は、核内ＰＲ分布に関する情報を提供することができない。
【００１１】
プロゲスチンは、特徴的な細胞を標的とし、ＰＲを発現しない細胞に対して間接的な影響をもつことにより、乳房および他のホルモン感受性組織で複雑な作用を有する。ＰＲフォーカス複合体は、正常な組織および癌性組織では定性的に同じではなく、それらは、必ずしも同じプロゲステロン受容体関連遺伝子を活性化するとは限らない。利用可能な臨床データは、ホルモン受容体陽性細胞を特定するための従来の技法が、それは抗エストロゲン関連治療に関するものであろうと、抗プロゲスチン関連治療であろうと、抗ホルモン有効性の予測であるという位置づけを完全に支持するものではない。目下、乳癌および他のホルモン感受性腫瘍を有する患者に対してホルモン治療（例えば、抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤）を利用するかの決定は、腫瘍サンプルにおけるホルモン受容体の単純な存在に基づく。ホルモン受容体陽性腫瘍の事例のほんの５０〜６０％が治療から恩恵を受けるに過ぎないと予想されるため、ホルモン受容体（ＥＲまたはＰＲ）の存在は、ホルモン治療に対する応答に関して完全には予測していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国仮特許第６１／５４２，９３１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ、１９９７年
【非特許文献２】Ｈ．Ｊ．Ｋｌｏｏｓｔｅｒｂｏｅｒ、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．４〜６、３１１〜３１８頁、１９９４年
【非特許文献３】Ｌａｎｇｅ  Ｃ．他、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、第７章、９４〜１１１頁（２０１０年）
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他、Ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎ，ａ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎａｔａｇｏｎｉｓｔ，ａｓ  Ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５（２）  ２１４〜２１８頁（１９９９年）。
【非特許文献５】Ｍ．Ｐｒｅｓｓ他（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（２００２年）６７：７７９−８１３頁）
【非特許文献６】Ｍ．Ｎａｄｊｉ（Ａｎａｔｏｍｉｃ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００５年）１２３：２１〜２７頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
不均一な「自然発生する」腫瘍に関してＯＮＡおよび他の抗プロゲスチンの有効性を予測する一貫性ある方法が必要とされている。さらに、個々の患者において癌に対するＯＮＡおよび他の抗プロゲスチンの治療上の有効性を予測するアッセイが必要である。
【００１５】
抗プロゲスチン治療に関連する重要な問題は、関連する臨床的な治療上の標的である活性化ＰＲをどのようにして特定するかである。この例示的な方法は、臨床的環境で日常的に得ることが可能なヒト腫瘍組織において機能性（活性化）状態で存在するＰＲの特性決定を目的とする。特異的抗プロゲスチンで非活性ＰＲを拮抗することは治療上無意味であるため、本方法は、抗プロゲスチンによる患者の治療を導くための新規かつ重要な情報を提供する。かかる予測診断検査は、（１）ＯＮＡおよび他の抗プロゲスチンに関して治療上の決定を行うことを支援すること、（２）治療に応答する可能性が高い個々の患者および患者集団の選定を導くこと、および（３）抗プロゲスチン治療に応答する可能性が最も低いか、または抗プロゲスチン治療から恩恵を受ける可能性が最も低い個々の患者を排除することの一貫した方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１つの態様では、オナプリストン（ＯＮＡ）のような抗プロゲスチンによる治療に最も感受性のプロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性腫瘍のサブセットの特定および治療に関する方法が提供される。本明細書中に記載されるように、高密度で限局的なＰＲ核分布パターンを示すプロゲステロン受容体陽性腫瘍は、オナプリストンのような抗プロゲスチンによる治療により感受性である。インビトロで均一実験モデルからの結果は、必ずしも自然発生する不均一腫瘍の特性を予測するとは限らない。
【００１７】
別の態様では、抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍の増殖を阻害する方法が提供される。腫瘍原性または癌性である疑いのある組織サンプルは、患者から得ることができる。組織サンプルにおけるプロゲステロン受容体陽性細胞を特定することができる。次に、組織サンプル由来のプロゲステロン陽性細胞の核内のプロゲステロン受容体フォーカスの分布度を決定することができ、組織サンプルにおけるフォーカス分布度がプロゲステロン受容体陽性細胞の約５％よりも高い場合に、抗プロゲスチンを患者に投与することができる。
【００１８】
これらの患者は、腫瘍が活性化ＰＲを発現しない患者よりも、活性化プロゲステロンフォーカス（ＡＰＦ）を不活性化し、ＡＰＦのさらなる形成を防止する抗プロゲスチン（例えば、ＯＮＡによる）による治療から恩恵を受ける可能性がより高い。ＰＲの非活性化形態は通常、散在性核ＰＲ染色として見られる。抗プロゲスチンによるＡＰＦの不活性化は、それらの構造を実質的に変更させることなく、フォーカスの解離およびフォーカスの活性化の阻害を含む様々な機構のいずれかによって行われ得る。１つの態様では、ＡＰＦ形成は、幾つかの機構を介して抗プロゲスチンにより阻害または防止することができる。例えば、オナプリストンは、個々のプロゲステロン受容体を二量化させず、ＰＲがリガンドリン酸化部位でリン酸化されるのを防止し得る。ＰＲ−ＯＮＡ複合体は、その標的ＤＮＡセグメント（ＰＲＥ）に弱く結合し得るか、または全く結合せず、ＤＮＡ転写に必要なプロセスであるクロマチンリモデリングを誘導することができない。別の例では、他の抗プロゲスチンは、ＰＲを二量化させて、ＤＮＡ転写を誘導しないコアクチベーターまたはコリプレッサーと複合体を形成し得る。
【００１９】
この例では、ＤＮＡ結合はＰＲＥで起こり得るが、転写は起こらない。ＡＰＦの特定は、その作用物質がＰＲ経路を妨害する限り、任意の抗プロゲスチン治療の決定を通知し得る。１つの態様では、ＡＰＦの特定は、活性化されているまたはいないと、ＰＲ経路の状態を決定する。例えば、メフェプリストン、またはＰＲと複合しかつＤＮＡに結合する任意のプロゲスチンの使用は、ＡＰＦの特定により通知することができる。ＰＲリン酸化を阻害して、したがってＰＲ活性化を妨害するものを含む他の作用物質の活性は、各種癌におけるＡＰＦの存在により予測される。したがって、ＡＰＦの特定は、ＰＲの機能を阻害することにより作用する各種の化合物に関する治療勧告を通知するのに使用され得る。
【００２０】
活性化ＰＲフォーカス（ＡＰＦ）を発現しない患者の腫瘍は、従来のアッセイによりＰＲ陰性であるもの、または従来のアッセイによりＰＲ陽性であるものを包含し得る。１つの態様では、ＡＰＦを示す任意の腫瘍／癌（乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮平滑筋腫、肺および子宮癌を含む）は、かかる抗プロゲスチンによる治療に関する候補である。正式には癌性状態としていまだ分類されていない肺平滑筋腫症もまた、ＡＰＦが異常組織で発現される場合には恩恵を得る可能性が高い。別の態様では、標準的な治療では管理不可能であるが、ＡＰＦを提示する良性腫瘍は、ＰＲの異常活性化により、すなわちプロゲスチン経路により腫瘍が駆動されることがＡＰＦの存在により示される場合には、抗プロゲスチンにより治療することができる。
【００２１】
別の態様は、腫瘍原性または癌性である疑いのある組織サンプルを患者から得ること、およびその組織を抗プロゲステロン受容体抗体に曝露することにより、抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。組織サンプル中のプロゲステロン受容体陽性細胞を特定することができる。組織由来の細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス結合分布度を決定することができる。フォーカス結合分布が、組織サンプルにおいてプロゲステロン受容体陽性細胞の約５％よりも高い場合に、抗プロゲスチンは、抗プロゲスチンの効力、バイオアベイラビリティおよび安全性プロフィールに応じて、１日当たり約１０〜約２００ｍｇの投与量範囲で患者に投与される。
【００２２】
別の態様では、組織は、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮平滑筋腫、肺および子宮組織から成る群から選択される腫瘍組織の検体である。
【００２３】
別の態様では、フォーカス分布の存在または非存在は、蛍光、対比染色抗体（例えば、発色団）で画像化した、比色反応（例えば、酵素反応）、放射能、およびウェスタンブロット（例えば、ＰＲの差分リン酸化）により検出される。
【００２４】
さらに別の態様では、抗プロゲスチンは、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アソプリスニルおよびウリプリスタルから成る群から選択される。
【００２５】
活性プロゲステロン受容体フォーカス分布の存在は、プロゲステロン受容体陽性細胞の約５％よりも高い核フォーカス分布度により示される。別の態様では、腫瘍は、フォーカス分布に関して不均一であってもよく、腫瘍の様々な領域において特徴的なプロゲステロン受容体フォーカスを有する活性結合パターン（Ａ）、特徴的プロゲステロン受容体フォーカスを伴わない散在性結合パターン（Ｄ）、またはＡパターンとＤパターンの混合物（ＡＤ）を示し得る。
【００２６】
上述の態様のいずれかでは、フォーカス分布（ＡまたはＡＤパターン）が存在する場合に、かかるフォーカス分布の強度または密度が定量化され得る。例えば、プロゲステロン受容体抗体は、放射標識され得るか、蛍光標識され得るか、対比染色抗体（発色団）で画像化され得るか、比色反応（例えば、酵素反応）で画像化され得るか、または標識の強度が測定および定量化され得る別の様式で標識され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】プロゲステロン受容体に対する抗体を使用したホルマリン固定かつパラフィン包埋された生検標本に由来するヒト乳癌サンプルにおける例示的な免疫組織化学の褐色核染色パターンを示す図である。
【図１Ｂ】プロゲステロン受容体に対する抗体を使用したホルマリン固定かつパラフィン包埋された生検標本に由来するヒト乳癌サンプルにおける例示的な免疫組織化学の褐色核染色パターンを示す図である。
【図２Ａ】プロゲステロン受容体に対する抗体を使用したホルマリン固定かつパラフィン包埋された生検標本に由来するヒト乳癌サンプルにおける例示的な緑色核染色パターンを示す図である。
【図２Ｂ】プロゲステロン受容体に対する抗体を使用したホルマリン固定かつパラフィン包埋された生検標本に由来するヒト乳癌サンプルにおける例示的な緑色核染色パターンを示す図である。
【図３Ａ】プロゲステロン受容体に対する抗体を使用したホルマリン固定かつパラフィン包埋された生検標本に由来するヒト乳癌サンプルにおけるＨＥＳバックグラウンド対比染色による例示的な免疫組織化学の褐色核染色パターンを示す図である。
【図３Ｂ】プロゲステロン受容体に対する抗体を使用したホルマリン固定かつパラフィン包埋された生検標本に由来するヒト乳癌サンプルにおけるＨＥＳバックグラウンド対比染色による例示的な免疫組織化学の褐色核染色パターンを示す図である。
【図４】３つの結合パターンであるＡ、ＡＤおよびＤに関するＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに対して陽性である乳癌サンプルのパーセントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書中の幾つかの例示的な態様について記載するのに先立って、本発明が、下記説明に記述される構造またはプロセスステップの詳細に限定されないことは理解されよう。本明細書中に記載される態様は、様々な様式で実施または実行することが可能である。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「腫瘍を治療する」および「腫瘍の治療」という語句は、腫瘍細胞の複製を阻害すること、腫瘍の拡がりを阻害すること、腫瘍サイズを減少させること、身体中の腫瘍細胞の数を減少または低減させること、あるいは腫瘍により引き起こされる疾患の症状を寛解または軽減させること、腫瘍の増殖を減少させること（腫瘍が進行するのにかかる時間を増大させること）または死が癌もしくは癌の二次的影響に起因する場合の患者の生存度を改善させることを意味する。この用語はまた、癌の治療も包含する。腫瘍としては、癌および非癌性腫瘍の両方を含む。死亡率および／または罹患率の減少、腫瘍関連症状の改善がみられるか、あるいは身体中の腫瘍細胞の数の低減により明示され得るような疾患の負担の減少、腫瘍サイズの減少、進行までの時間の改善、無進行生存率の改善または無病生存率の改善がみられる場合に、治療は治療的であるとみなされる。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「ＡＰＦ活性抗プロゲスチン」という用語およびその同等用語は、細胞の核内の活性化ＰＲフォーカス（ＡＰＦ）を溶解または解離させる能力、または細胞の核内のＡＰＦの形成を阻害する能力を示す抗プロゲスチン薬を指し、その作用機構は、細胞のＰＲ活性化経路を介することを示している。
【００３１】
「ＡＰＦ陽性」、「ＰＲフォーカス陽性」、「活性化ＰＲ」、「機能性状態でのＰＲ」等の用語は、細胞の核内のプロゲステロン受容体凝集体の存在を指す。
【００３２】
「フォーカス分布」という用語は、プロゲステロン陽性細胞の核内の「フォーカス」（すなわち、プロゲステロン受容体の凝集）の分布を指す。斑点または過斑点(hyperspeckled)パターンは、生物学におけるステロイド核受容体フォーカスパターンを指すのに使用することができる用語である。
【００３３】
「フォーカス分布度」という用語は、プロゲステロン陽性細胞の核内に存在するＰＲフォーカスの相対量を指す。フォーカス分布度は、定量的にまたは定性的に決定することができる。
【００３４】
例えば、比色、酵素または放射標識リガンド（例えば、プロゲステロン受容体抗体）の使用は、細胞核内のプロゲステロン受容体に結合するのに使用することができる。フォーカス分布度は、定量的に、例えば、色彩強度、蛍光を測定すること、または標識された抗体により放出される放射能のレベルを定量化することにより決定することができる。フォーカス分布度は、適切な倍率での光学顕微鏡、またはＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質プロファイリング、放射標識もしくはＡＰＦを測定するための他の代替物を含むがこれらに限定されない技法を使用して、対照サンプルと標識サンプルとの間の結合の強度を比較することにより定性的に決定することができる。
【００３５】
「散在性パターン」という用語は、フォーカス分布の非存在を示す微細粒子状パターンを指す。
【００３６】
「プロゲスチン」という用語は、プロゲステロンの作用の幾つかもしくは全てを模倣する天然または合成プロゲステロン物質を指し、プロゲステロン受容体モジュレーター（ＲＰＭ）または選択的プロゲステロン受容体モジュレーター（ＳＰＲＭ）とも称される。
【００３７】
「抗プロゲスチン」という用語は、プロゲステロン剤の形成、輸送もしくは作用を阻害するか、またはプロゲステロン剤を不活性化させる物質を指し、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アソプリスニルおよびウリプリスタルが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＲＭまたはＳＰＲＭは、幾つかの抗プロゲスチン特性を有してもよく、使用の事情に応じて抗プロゲスチンまたはプロゲスチンとみなされ得る。
【００３８】
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、抗原へ特異的に結合することが可能であるタンパク質を指し、他の物質を除外して抗原に関して特異的な結合親和性を有する任意の物質または物質の群を包含する。概して、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒトまたは動物に由来する抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒトに由来する非結合部分、動物に由来する結合部分）およびそれらのフラグメントを包含する。
【００３９】
「抗ＰＲ−Ａ」抗体および「抗ＰＲ−Ｂ」抗体という用語は、それぞれプロゲステロン受容体であるＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂのアイソフォームに対する抗体を指す。「抗ＰＲ−ＡＢ」は、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂの両方に結合できる抗体を指す。本明細書中の態様による使用に適した具体的な抗体としては、ＰｇＲ６３６およびＰｇＲ１２９４（Ｍ．Ｐｒｅｓｓ他（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（２００２年）６７：７９９−８１３頁））、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａクローン１６、クローンＳＡＮ２７、クローン１Ａ６、ＤａｋｏクローンＰｇＲ６３６、Ｖｅｎｔａｎａ、クローン１Ｅ２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ１６２］抗体クローン１０６４−Ｅ２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ１９０］抗体クローンＥＰ１５１６Ｙ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ２９４］抗体クローン６０８、Ａｂｃａｍプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ４００］抗体Ｒｅｆ  ａｂ６０９５４およびＧｅｎｅｔｅｘプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ５５４］抗体Ｒｅｆ．ＧＴＸ１１８９８７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「投与する」という用語は、薬物（単数または複数）を提供すること、１つまたは複数の薬物を処方すること、あるいは１つまたは複数の薬物を処方集(formulary)にのせることを指す。「提供すること」という用語は、任意の適した投与経路（例えば、経口、注射、静脈内、筋内および経皮等）を通じて薬物を患者に直接分配すること、または患者にそのことを行うように指示書を提供することを指す。
【００４１】
１つの態様は、腫瘍原性である疑いのある組織を患者から得ること、およびその組織由来の細胞の核内の抗プロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定することにより、抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。フォーカス分布度が約５％よりも高い場合に、抗プロゲスチン（例えば、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アソプリスニルおよびウリプリスタル）を患者に投与することができる。
【００４２】
乳癌および他の癌におけるＰＲ、プロゲスチンおよび抗プロゲスチンの役割がこれまでに研究されている一方で、その結果は決定的ではなく、患者を診断および治療する際の困難につながっている。多重モデルは、数ある因子の中でも種、株、癌タイプ、発癌物質および腫瘍環境の多数かつ複雑な相互作用を示している。理論に拘わらないが、ＰＲは、変更された生理学的特性を伴って、病理学的に活性化される可能性があり、リガンドの活性化能力に影響を及ぼして、細胞増殖および繁殖の異常または非制御刺激をもたらす。しかしながら、最も一般的に研究されるモデルは、少数の原発腫瘍に由来するものであり、したがって腫瘍型または種々の患者の腫瘍間の生理学的可変性を正確には表さない。すなわち、限られた数の癌モデルは、ヒト集団における異種遺伝子型癌の複雑さを網羅するのに不十分である。
【００４３】
ＰＲフォーカスの形成の研究は、遺伝子操作した細胞系において細胞質から核までのＰＲ移行を誘導する能力に関して化合物を検査するのに使用されてきた。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＲ（プロゲステロン受容体）Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（登録商標）アッセイのようなこれらのアッセイは、画像分析および蛍光顕微鏡法を使用して、検査化合物の存在下でＰＲの核蓄積を定量化する。対比して、本明細書中に提供される態様は、ＰＲリガンドまたは薬物の存在には関係なく、原発性腫瘍組織におけるＰＲフォーカスの分析用に設計される。１つの態様では、本明細書中に記載される例示的な方法は、自然発生する腫瘍における細胞の核内のＰＲフォーカスの存在に関し、ＰＲアンタゴニスト特性を有する抗プロゲスチンの当該患者における有効性を予測するのに使用することができるという例外を示す。別の態様では、診療所で構成的に活性化されるＰＲの特性決定により、腫瘍および癌が抗プロゲスチン（オナプリストンを含む）による治療に感受性であることが示されることが現在見出されている。
【００４４】
オナプリストン（例えば、（８Ｓ，１１Ｒ，１３Ｒ，１４Ｒ、１７Ｓ）−１１−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１７−ヒドロキシ−１７−（３−ヒドロキシプロピル）−１３−メチル−１，２，６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６−デカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オン）は下記化学構造を有する：
【００４５】
【化１】
2014530812.tif 000003
【００４６】
他の抗プロゲスチンとしては、プロゲステロン３−（６，６−エチレン−１７Ｂ−ヒドロキシ−３−オキソ−１７Ａ−プレグナ−４−エン−１７Ａ−イル）プロピオン酸Ｇ−ラクトン、３−（６，６−エチレン−１７．ベータ−ヒドロキシ−３−オキソ−１７．アルファ−プレグナ−４−エン−１７．アルファ−イル）プロピオン酸．ガンマ−ラクトンおよび下記のものが挙げられる：
【００４７】
ミフェプリストン
（１０Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１５Ｓ，１７Ｒ）−１７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１４−ヒドロキシ−１５−メチル−１４−（プロパ−１−イン−１−イル）テトラシクロ［８．７．０．０＾｛２，７｝．０＾｛１１，１５｝］ヘプタデカ−１，６−ジエン−５−オン
【００４８】
【化２】
2014530812.tif 000004
【００４９】
リロプリストン
（１１−ベータ，１７−ベータ，１７（ｚ））−ロペニル；エストラ−４，９−ジエン−３−オン、１１−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−１７−ヒドロキシ−１７−（３−ヒドロキシ−１−ｐ；１１β−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１７β−ヒドロキシ−１７−［（Ｚ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル］エストラ−４，９−ジエン−３−オン
【００５０】
【化３】
2014530812.tif 000005
【００５１】
ＯＲＧ２０５８
（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）−１６−エチル−１７−（２−ヒドロキシアセチル）−１３−メチル−２，６，７，８，９，１０，１１，１２，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オン
【００５２】
【化４】
2014530812.tif 000006
【００５３】
ロナプリサン
（８Ｓ，１１Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１１−（４−アセチルフェニル）−１７−ヒドロキシ−１３−メチル−１７−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−１，２，６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６−デカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オン
【００５４】
【化５】
2014530812.tif 000007
【００５５】
アソプリスニル
（８Ｓ，１１Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１１−［４−［（Ｅ）−ヒドロキシイミノメチル］フェニル］−１７−メトキシ−１７−（メトキシメチル）−１３−メチル−１，２，６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６−デカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オン
【００５６】
【化６】
2014530812.tif 000008
【００５７】
ウリプリスタル
（８Ｓ，１１Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−アセチル−１１−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１７−ヒドロキシ−１３−メチル−１，２，６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６−デカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オン
【００５８】
【化７】
2014530812.tif 000009
【００５９】
ＰＦ−２４１３８７３
４−［３−シクロプロピル−１−（メシルメチル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ−２，６−ジメチルベンゾニトリル
【００６０】
【化８】
2014530812.tif 000010
【００６１】
別の態様では、限局的ＰＲ結合は、現在使用される従来のＰＲアッセイよりも感受性が高くかつ予測的な検査を提供する。従来のＰＲアッセイでＰＲ陰性と分類された患者、ならびに従来よりＰＲ陽性である患者は、限局的ＰＲ核結合に関して検査で陽性となり、したがってオナプリストンのような抗プロゲスチンによる治療の候補者となり得る。したがって、従来の方法を使用してＰＲ陰性であるとこれまでに特定された患者は、オナプリストンのような抗プロゲスチンによる治療の候補者とはみなされなかったと思われる。ＰＲ陰性であると慣例的に検査された患者におけるＰＲフォーカスの存在は、これらの患者のいくらかでオナプリストンが活性であるという明らかに異例の結果を説明する。したがって、本明細書中に記載される態様は、癌を有するより多数の患者（「三重陰性」（すなわち、エストロゲン受容体（ＥＲ）、ＰＲおよびＨｅｒ２に関して陰性）と分類される乳癌を有する患者を潜在的に含む）にホルモン治療を潜在的に利用可能とさせる。
【００６２】
本明細書中に記載される態様における使用のための例示的な適した免疫組織化学的方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｍ．Ｐｒｅｓｓ他（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（２００２年）６７：７７９−８１３頁）およびＭ．Ｎａｄｊｉ（Ａｎａｔｏｍｉｃ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００５年）１２３：２１〜２７頁）により記載される。例として、分析用の原発性癌組織検体は、従来のＰＲアッセイに関して当該技術分野で既知であるように癌組織のパラフィンスライスまたは細針吸引塗抹標本(fine needle aspiration smears)として調製されてもよい。パラフィンスライスが使用される場合、パラフィンは、まずスライドガラスを加熱することにより溶融させて、キシレンを用いて脱脂させる。次に、スライドガラスを低級のエタノールで再水和させて、抗体、好ましくはＰＲ−Ａ、ＰＲ−Ｂまたはその両方に特異的に結合するモノクローナル抗体に曝露する。続いて、抗体の結合は、結合している抗体の検出に関して当該技術分野で既知の方法のいずれか１つを使用して検出される。その例を以下に記載する。
【００６３】
抗体のその標的への結合の検出に関する１つの例示的な適した方法は、比色アッセイ、通常酵素比色アッセイである。１つのかかる方法は、ペルオキシダーゼを用いて、光学顕微鏡下で可視的な着色された染色を生じる。組織検体における内因性ペルオキシダーゼは、過酸化水素を使用してブロックされ、内因性ビオチンは、抗体（単数または複数）とのインキュベーションに先立って、ビオチンブロッキング試薬を使用してブロックされる。一次抗体がマウス抗体である場合、それは続いて、ビオチン化抗マウス免疫グロブリンに結合される。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体は、酵素を抗体−標的複合体へ結合するために添加される。色彩は、ジアミノベンジジンおよび硫酸銅の添加により発色される。組織検体は、ペルオキシダーゼ染色の可視性を増大させるためにファストグリーンで対比染色させてもよい。
【００６４】
あるいは、蛍光方法を使用して、ＰＲ−Ａ、ＰＲ−Ｂまたはその両方への抗体結合を検出してもよい。この場合、蛍光標識した一次抗体をＰＲ標的に結合させて、蛍光顕微鏡下で直接検出し得る。しかしながら、ＰＲへの非標識一次抗体の結合、続いて一次抗体へ蛍光標識された二次抗体（例えば、抗マウス免疫グロブリン）を結合させることを用いる方法は、非特異的結合を低減させ得る。免疫組織化学アッセイにおける使用に関して既知の任意の蛍光標識は、本明細書中に記載される態様で使用され得る。例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、フルオレセイン  ＦＩＴＣ  ５２０ｎｍ緑色、Ａｌｅｘａ  ４８８  ５１５ｎｍ緑色、フィコエリトリン  ＰＥ  ５６５  ｎｍ  黄色、フィコエリトリン−テキサスレッド  ＥＣＤ  ６２０ｎｍ  赤色、フィコエリトリン−シアニン５  ＰＣ５  ６６５ｎｍ  深紅色、ペリジニンクロロフィル  ＰｅｒＣＰ  ６７０ｎｍ  深紅色、フィコエリスリン−シアニン５．５  ＰＣ  ５．５  ７０３ｎｍ  遠赤色、フィコエリトリン−シアニン７  ＰＣ７  ７５５遠赤色、Ｅアロフィコシアニン  ＡＰＣ  ６６０ｎｍ  深紅色、アロフィコシアニン−シアニン７  ＡＰＣ−ＣＹ７。
【００６５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体はともに、本明細書中で記載される態様において有用であり得る。適切なモノクローナル抗体の非排他的リストは、Ｍ．Ｐｒｅｓｓ他（同上）に記載されている（ホルマリン固定およびパラフィン包埋に抵抗性である２つの抗体（ＰｇＲ６３６およびＰｇＲ１２９４）を含む）。本明細書中の態様による使用に適した具体的な抗体としては、ＰｇＲ６３６およびＰｇＲ１２９４（Ｍ．Ｐｒｅｓｓ他（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（２００２年）６７：７９９−８１３頁））、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａクローン１６、クローンＳＡＮ２７、クローン１Ａ６、ＤａｋｏクローンＰｇＲ６３６、Ｖｅｎｔａｎａ、クローン１Ｅ２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ１６２］抗体クローン１０６４−Ｅ２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ１９０］抗体クローンＥＰ１５１６Ｙ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ２９４］抗体クローン６０８、Ａｂｃａｍプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ４００］抗体Ｒｅｆ  ａｂ６０９５４およびＧｅｎｅｔｅｘプロゲステロン受容体［ｐ  Ｓｅｒ５５４］抗体Ｒｅｆ．ＧＴＸ１１８９８７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
１つの態様では、抗体のＰＲへの結合は、適切な場合には光学顕微鏡または蛍光顕微鏡下での染色したスライドガラスの観察により検出される。倍率は通常、例えば抗体への結合に関して陽性である細胞のパーセントを評価するのに約２００倍または４００倍である。しかしながら、ＡＰＦの検出に関する感受性を改善するためには、核内構造の研究を容易とするのに８００倍〜１０００倍でスライドガラスを評価することが望ましい場合がある。
【００６７】
顕微鏡により明らかにＰＲ陰性であるサンプルは、フローサイトメトリーにより評価されて、光学または蛍光顕微鏡法の閾値以下の陽性サンプルを検出し得る。フローサイトメトリーが、乏しい陽性細胞を示す場合は、高倍率８００倍〜１０００倍顕微鏡法を使用して、核内構造を研究して、活性化プロゲステロン受容体フォーカス（ＡＰＦ）を特定し得る。しかしながら、フローサイトメトリーにより検出される陽性細胞があまりに乏しくて、ＡＰＦの分析に関して顕微鏡法により信頼性よく検出させることができない場合は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して、陽性細胞をそれらの蛍光に基づいて懸濁液中の細胞から分離することができる（例えば、Ｓｏｎｙ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ  ＳＨ８００、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｍｍｕｌｉｔｅ  ２０００）。陽性細胞は濃縮されるが、このプロセスにより損傷を受けないため、続く顕微鏡評価でＡＰＦを首尾よく可視化させることの信頼性および確率は実質的に増大される。
【００６８】
個々の腫瘍細胞核内のＡＰＦの存在または非存在は、光学または蛍光顕微鏡下で可視的に、あるいは蛍光または比色測定のような任意の他の適切な手段により検出され得る。１つの態様では、検出用の視覚的手段が使用される。染色の結果は、ＡＰＦの存在または非存在を表記することによって、あるいは陽性細胞の数またはパーセントを計数することによって定量化され得る。あるいは、染色の具体的な特徴を定量化してもよい。例えば、検出は、ＡＰＦの形態でのフォーカス結合が散在性核染色に付随するかどうかの表記、数またはパーセントによる陽性細胞の定量化、ならびに／あるいはＡＰＦの強度または数／密度の定量化を包含し得る。ＡＰＦ密度の定量化は、フォーカス／細胞の平均数として、または任意の尺度（例えば、「少ない」、「中程度」または「多い」）を使用して決定され得る。同様に、強度は、任意の尺度（例えば、低／中／高）または数的尺度（例えば、１〜５）を使用して決定し得る。別の態様では、患者の腫瘍組織の分析の結果は、陽性および／または陰性対照と比較される。
【００６９】
１つの態様では、腫瘍組織検体は、検体中のプロゲステロン陽性細胞の核の１〜１００％、５〜１００％、２５〜１００％または５０〜１００％がＡＰＦを示す場合にＡＰＦ陽性と判断される。さらに別の態様では、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンの治療上の有効性もまた、ＡＰＦ染色の強度と、あるいはＡＰＦの数または密度と相関させてもよく、これらのパラメータは、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンによる治療に対する腫瘍の感受性を決定するのに使用され得る。概して、かつ理論に拘わらないが、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンによる治療に対する腫瘍の感受性は、陽性細胞の数またはパーセントが増大するにつれ、ＡＰＦの強度が増大するにつれ、および／または腫瘍組織検体の細胞中のＡＰＦの数が増大するにつれ増大する。
【００７０】
さらなる態様では、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンに対する腫瘍の感受性を決定する方法は、手動であってもよく（例えば、蛍光顕微鏡を使用した視覚的検出）、あるいはそれらは、比色または蛍光標識された組織検体の迅速スキャニング、検出および定量化する方法を使用して自動化または半自動化されてもよい。例えば、完全に自動化されたスキャニングおよび分析システムは、ある特定の態様で開発および使用され得る。１つの態様では、分析されるべき腫瘍の具体的な領域の手動選定が使用され得る（例えば、ＩｎＳｃａｐｅ（登録商標）免疫組織化学システム（例えば、ＩｎＳｃａｐｅ（登録商標）免疫組織化学システム（Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ３  Ｇｉｒａｌｄａ  Ｆａｒｍｓ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ  ０７９４０）））一方で、細胞核内のＡＰＦのスキャニングおよび分析用の自動化システムを使用して、抗原特異的免疫組織化学染色検体の自動化全検体スキャニングおよび分析を提供することができる。別の態様では、画像認識を使用して、染色された組織スライス全体のデジタル画像を創出することができる。抗原特異的コンピュータアルゴリズムを使用して、全検体を表すデジタル画像の結果を分析することができる。さらに別の態様では、フォーカスを核内の散在性バックグラウンド染色と区別して、細胞ごとまたはクラスターごとにフォーカスの蛍光強度およびサイズを測定するようにソフトウェアを設定することができ、検体全体にわたって各細胞またはクラスターに関してプロセスを繰り返す。これらの自動化方法は、ある特定の態様では、コストを低減させて、手動では不可能な機能を実施することにより、精度の改善をもたらすことができる。完全自動化は、その検査を一般の医療センターにも利用可能にし得る。
【００７１】
１つの態様では、診断アッセイの結果に基づいて患者を治療するかどうかの決定は、ＡＰＦが存在する場合、ＡＰＦの数／パーセント、強度および／または密度に基づく。理論に拘わらないが、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンによる治療の有効性は、陽性細胞の数またはパーセントが増大するにつれ、ＡＰＦの強度が増大するにつれ、および／または腫瘍組織検体の細胞におけるＡＰＦの数が増大するにつれ増大することが予期される。これらのパラメータに基づいて、医療従事者はまた、治療の投薬、タイミングおよび長さを決定し得る。したがって、別の態様は、ＡＰＦ陽性腫瘍を治療するためのＡＰＦ活性抗プロゲスチンの使用に関する。
【００７２】
上記方法に従って特定または治療されるべき腫瘍は、ＡＰＦが存在し、またＡＰＦの存在を決定することができる任意の癌性または非癌性腫瘍を包含し得る。かかる癌または腫瘍としては、乳癌、肺、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、前立腺癌、脳および血管腫が挙げられる。ある特定の態様により特定または治療され得る良性腫瘍としては、髄膜腫が挙げられ、その７０％が、従来の分析によりＰＲを発現する。
【００７３】
前述の方法のＡＰＦ活性抗プロゲスチンは、ＡＰＦを不活性にさせる能力（例えば、凝集体を溶解もしくは解離させること、またはＡＰＦの形成を防止すること、または不活性ＡＰＦを形成することにより）を有する任意の抗プロゲスチン薬であり得る。かかる薬物としては、オナプリストン（ＯＮＡ）が挙げられるが、同様の作用機構をもつ他の薬物もまた、本明細書中に記載される態様における使用に適している。
【００７４】
別の態様は、腫瘍原性または癌性である疑いのある組織を患者から得ること、およびその組織を抗プロゲステロン受容体抗体に曝露することにより、抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍を特定する方法を提供する。組織サンプル中のプロゲステロン陽性細胞を特定することができる。組織サンプル由来のプロゲステロン陽性細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定することができ、組織サンプルにおけるフォーカス分布度がプロゲステロン受容体陽性細胞の約５％よりも高い場合に、抗プロゲスチンを患者に投与することができる。
【００７５】
さらに別の態様では、抗プロゲスチンによる増殖阻害に感受性の腫瘍を有する患者を治療する方法が提供される。この方法は、腫瘍原性である疑いのある組織サンプルを患者から得ること、およびその組織を抗プロゲステロン受容体抗体に曝露することを含む。組織サンプルにおけるプロゲステロン受容体陽性細胞を特定することができ、組織由来の細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス結合分布を決定することができる。フォーカス結合分布が、組織サンプルにおいてプロゲステロン受容体陽性細胞の５％よりも高いＡまたはＡＤ結合パターンである場合に、抗プロゲスチンの効力、バイオアベイラビリティおよび安全プロフィールに応じて、１日当たり約１０〜約２００ｍｇの投与量範囲で、抗プロゲスチンを患者に投与する。
【００７６】
別の態様では、フォーカス分布度は、免疫化学、免疫蛍光、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質プロファイリング、放射標識またはＡＰＦを測定する他の代替物を含む本明細書中で論述されるような適切な方法により決定することができる。
【００７７】
別の態様では、腫瘍組織は、乳房、骨髄腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮平滑筋腫、肺および子宮組織から成る群から選択される。
【００７８】
さらに別の態様では、抗プロゲスチンは、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アソプリスニルおよびウリプリスタルから成る群から選択される。
【００７９】
別の態様では、フォーカス分布度は、プロゲステロン陽性組織細胞の核内のプロゲステロン受容体の結合パターンを特定することにより決定される。不均一腫瘍としては、活性プロゲステロン受容体フォーカスまたは不活性プロゲステロン受容体フォーカスを有し得る細胞が挙げられる。したがって、細胞核内の特徴的な凝集塊により示されるような活性フォーカスを含有する細胞領域、およびより散在性のパターンを示す細胞領域が存在し得る。
【００８０】
例えば、図１は、ヒト乳癌サンプル（乳癌患者の生検標本から得られるホルマリン固定され、かつパラフィン包埋された組織サンプル）において抗プロゲステロン抗体により得られる褐色核染色由来の２つの例示的な結合パターンを表す。図１Ａは、抗プロゲスチンによる治療に感受性である可能性が低い細胞を示す散在性顆粒状パターン（Ｄ）を示す。対比して、図１Ｂは、抗プロゲスチンによる治療に感受性である可能性が高い細胞を示す斑点結合パターン（Ａ）を示す。混合パターンは、ＡおよびＤパターンの両方を示し、ＡＢと称される。
【００８１】
別の態様では、抗プロゲステロン抗体は、抗ＰＲ−Ａ抗体、抗ＰＲ−Ｂ抗体、および抗ＰＲ−Ａ抗体と抗ＰＲ−Ｂ抗体との混合物、ならびに二重特異的抗ＰＲ−ＡＢ抗体から成る群から選択される。
【００８２】
さらに別の態様では、抗プロゲスチンは、抗プロゲスチンの効力、バイオアベイラビリティおよび安全性プロフィールに応じて、１日当たり１０〜約２００ｍｇの量で投与される。理論に拘わらないが、プロゲスチンによる治療に感受性である腫瘍を有する患者を特定することにより、より低用量の抗プロゲスチンを使用して、毒性の副作用のより低いリスクをもたらし得ると考えられる。したがって、より低い投与量範囲が、プロゲステロン受容体の５％よりも高いフォーカス分布を示す患者に使用することができる。１つの態様では、ＡまたはＡＤの分類は種々の用量をもたらし得る一方で、Ｄパターンは、抗プロゲスチン治療による治療が認可されないことを示す。
【００８３】
さらに別の態様では、ＡＰＦを不活性化させる能力に関して抗腫瘍薬をスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は、例えば本明細書中に記載される方法によるＡＰＦ陽性腫瘍の治療における使用のための候補であり得るさらなる抗プロゲスチンを特定するのに有用である。１つの態様では、上記方法は、腫瘍においてプロゲステロン受容体陽性細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布減少能に関して薬物候補をスクリーニングする方法を提供する。同じ腫瘍由来の少なくとも２つの腫瘍組織検体を得ることができる。１つの腫瘍組織検体を薬物候補に曝露することができる。続いて、腫瘍組織検体を抗プロゲステロン受容体抗体へ曝露することができ、腫瘍組織検体由来のプロゲステロン受容体陽性細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定することができる。薬物候補に曝露した腫瘍組織検体におけるプロゲステロン受容体のフォーカス分布が、薬物候補に曝露していない腫瘍組織検体と比較して減少される場合、薬物候補は、腫瘍のプロゲステロン受容体陽性細胞におけるプロゲステロン受容体のフォーカス分布を減少させることが可能である。
【００８４】
別の態様は、組織サンプルおよびプロゲステロン受容体を検出できる少なくとも１つの抗体または抗体結合フラグメントを含む抗プロゲスチンによる治療に感受性の腫瘍を分類する系を提供する。抗体または抗体結合フラグメントは、腫瘍組織検体由来の細胞のプロゲステロン受容体陽性核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定するのに使用することができる。別の態様では、プロゲステロン陽性細胞の細胞核内のフォーカス分布度が約５％よりも高い場合に、腫瘍は、抗プロゲスチンによる治療に感受性である。
【００８５】
別の態様では、ＡＰＦの検出可能な染色の減少を検出することは、抗腫瘍薬のＡＰＦ不活性化活性を示すものである。ＡＰＦの検出可能な染色の実質的な減少が検出されないことは、抗腫瘍薬のＡＰＦ不活性化の欠如を示すものである。
【００８６】
別の態様では、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンは、いずれかの作用物質単独と比較した場合に、治療上の有効性の改善を達成するようにＡＰＦ不活性化機構により作用しないさらなるホルモン治療（例えば、抗エストロゲン）と組み合わせて使用されてもよい。あるいは、ＡＰＦ活性抗プロゲスチンは、いずれかの作用物質単独と比較した場合に治療上の有効性の改善を達成するようにスクリーニングアッセイにおいてＡＰＦ活性に関して陰性である１つまたは複数の従来の化学療法剤（例えば、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、抗ＨＥＲ２薬、ベバシズマブ、またはパクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビンおよびシクロホスファミドのような作用物質による化学療法）と組み合わせて使用されてもよい。例えば、エベロリムスは、アロマターゼ阻害剤と組み合わせて指示されるｍＴｏｒ阻害剤であり、将来的に抗プロゲスチンと組み合わせて指示されてもよい。
【００８７】
さらに別の態様では、核内のプロゲステロン受容体に対する抗体の限局的能力の存在を検出することは、抗腫瘍薬物で予め治療した患者の腫瘍（これは、当該薬物に耐性となっている）が、ＡＰＦ活性抗プロゲスチン（例えば、オナプリストン）に依然として感受性であることを示すものとして使用され得る。１つの態様では、上記方法は、先の化学療法に起因する腫瘍の化学療法耐性をＡＰＦ抗プロゲスチンによる治療により逆行させることができるかどうかを決定するように適応させることができる。かかる化学療法耐性の逆行は、先の化学療法およびＡＰＦ活性抗プロゲスチンの異なる作用機構に基づき得る。
【００８８】
別の態様は、抗プロゲスチンによる治療に感受性の腫瘍を分類する系に関する。上記系は、組織サンプルおよびプロゲステロン受容体を検出できる少なくとも１つの抗体または抗体結合フラグメントを含み、ここで抗体または抗体結合フラグメントを使用して、腫瘍組織検体由来の細胞の核内のプロゲステロン受容体のフォーカス分布度を決定し、またフォーカス分布度が約５％よりも高い場合に、腫瘍は抗プロゲスチンによる治療に感受性である。
【実施例１】
【００８９】
乳癌（浸潤性乳管癌腫）および子宮内膜癌を伴う患者由来の腫瘍検体を、Ｏｓｃａｒ  Ｌａｍｂｒｅｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（リール、フランス）の解剖病理部の保管資料から選定した。患者達からは、研究目的での彼らの組織の使用に関してすでに同意を受けていた。４％ホルマリン固定液中に固定して、かつパラフィン中に包埋させた乳房または子宮内膜腫瘍組織のサンプルを得た。
【００９０】
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、保管資料の乳房または子宮内膜腫瘍組織の３〜４μｍスライスで実施した。スライスを脱パラフィンさせて、水和して、作業緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６、Ｄａｋｏ、デンマーク、コードＳ３００６）で洗浄した。抗原回収は、Ｄａｋｏ標的回収溶液（改変クエン酸緩衝液、ｐＨ６．１、Ｄａｋｏ、デンマーク、コードＳ１６９９）を用いて９８℃の水浴中で２０分間行った。次に、スライスをＤａｋｏペルオキシダーゼブロック溶液で覆って、室温（ＲＴ）で５分間、内因性過酸化物をブロックして（Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）＋／ＨＲＰマウス（ＤＡＢ＋）キット、Ｄａｋｏ、デンマーク、コードＫ４００７）、洗浄して、適切な最適希釈でＲＴで６０分間、加湿チャンバ中で一次抗体とともにインキュベートした（表１）。作業緩衝液で５分間洗浄した後、Ｄａｋｏ標識ポリマー（Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）＋／ＨＲＰマウス（ＤＡＢ＋）キット、Ｄａｋｏ、デンマーク、コードＫ４００７）を、ＲＴで３０分間、一次抗体結合の検出に使用した。続いて、色素原（ＤＡＢ）を室温で５〜１０分間、基質−バッチで使用して、Ｇｉｌｌのヘマトキシリンで明るく対比染色した。
【００９１】
陰性対照は、免疫組織化学染色手順において一次抗体をアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１で（表１）または抗体希釈液のみ（洗浄緩衝液陰性対照）で置き換えることによって得られた。
【００９２】
【表１】
2014530812.tif 000011
【００９３】
免疫組織化学分析は、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｏｄｅｌ  ＲＯＨＳデジタルカメラを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ顕微鏡を使用して実施した。免疫反応性シグナルは、腫瘍細胞核の明確な褐色標識として分類された。標識の強度は、陰性に関しては０、弱に関しては＋、中に関しては＋＋、強に関しては＋＋＋と定義した。
【実施例２】
【００９４】
１２個の乳癌サンプルを、３種の抗体およびＩＨＣにおける４つの方法で分析した。６個のサンプルは、さらなる免疫組織蛍光（ＩＨＦ）分析用に加工処理することができる。
【００９５】
免疫組織蛍光は、蛍光画像の捕獲に特異的なＣＣＤカメラおよびＳｍａｒｔ  Ｃａｐｔｕｒｅソフトウェアを装備したＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して実施した。ＩＨＦは、保管資料の乳房腫瘍組織の３〜４μｍスライスで実施した。スライスを脱パラフィンさせて、水和して、作業緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６、Ｄａｋｏ、デンマーク、コードＳ３００６）で洗浄した。抗原回収は、Ｄａｋｏ標的回収溶液（改変クエン酸緩衝液、ｐＨ６．１、Ｄａｋｏ、デンマーク、コードＳ１６９９）を用いて９８℃の水浴中で２０分間行った。次に、スライスを適切な最適希釈液でＲＴで６０分間、黒色加湿チャンバ中で一次抗体とともにインキュベートした（表２）。作業緩衝液で５分間洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合させた適切な二次抗体を、ＲＴで３０分間、一次抗体結合の検出に使用した（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ、コード４４０８Ｓ、希釈１：１０００；抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ、コード４４１２Ｓ、希釈１：１０００）。続いて、全てのスライドガラスを洗浄して、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）ＨａｒｄＳｅｔ取り付け媒質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＵＳＡ、コードＨ−１４００）を使用してカバーガラスをつけ、分析するまで暗所で冷蔵保管して、蛍光を保存した。陰性対照は、免疫組織蛍光染色手順において一次抗体をアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１またはウサギ血清（ＩＨＣ表を参照）で、または抗体希釈液のみ（洗浄液緩衝液陰性対照）で置き換えることによって得られた。
【００９６】
腫瘍サンプルは全て、３つの異なる抗体に関してＰＲ陽性であった。しかしながら、核パターンの分析は、二重特異的ＡおよびＢ抗体を用いた場合に１１個のＰＲ陽性事例のうちの６個において不確定であった（１つの事例は、この抗体のみではＰＲ陰性であった）。６つの事例を、抗体全てを用いたＩＨＦ分析に付した。２つの事例では、十分な腫瘍組織が利用可能なままでなかったため、全ての抗体を用いてＩＨＦ手順を実施することができなかった。４つの事例は、ＰＲ  Ｂ抗体で分析することができた。他の抗体（ＰＲＡおよびＰＲＡ＋Ｂ）によるＩＨＦ分析は、核パターンの特性決定に関して、１つの例では不確定であった。観察されるＩＨＦ  ＰＲ核分布および結合パターンは、ＩＨＣと一致した。
【００９７】
その後、より大規模なサンプルを、抗ＰＲ  Ａ抗体、抗ＰＲ  Ｂ抗体またはその両方の混合物（以後、Ａ＋Ｂと呼ぶ）を用いてＩＨＣで分析した。
【００９８】
７５個の乳癌および２５個の子宮内膜癌サンプルを加工処理した。各標識腫瘍サンプルに関して、陽性限局性分布は、腫瘍組織全体（壊死領域は除く）における標識腫瘍細胞のパーセントと定義した。
【００９９】
見出された２つの基本的なパターンを図１に提示する。これらの画像は、（ＩＨＣ）を使用した抗ＰＲ抗体による組織サンプルの染色を示す。図１Ａは、褐色で細粒かつ散在性のＤパターンを示す。図１Ｂは、斑点凝集塊パターンを示し、陽性フォーカス結合Ａパターンを表している。図２は、ＩＨＦを使用して加工処理した同じサンプルを示す。図２Ａは、図２ＡでのＩＨＣ結果に類似した散在性Ｄパターンを示す。図２Ｂは、図２Ｂで見られるように、類似の斑点凝集塊フォーカス結合パターンを示す。図１Ａおよび図２Ａの散在性Ｄパターンは、プロゲステロンまたはプロゲステロンアゴニストが存在しない場合に蛍光受容体を発現する遺伝子操作した細胞で（Ａｒｎｅｔｔ−Ｍａｎｆｉｅｌｄ他、２００４年、１Ｃ、コントロール、１Ｄおよび１Ｅ）、また正常なヒト子宮内膜組織で、および子宮内膜癌で（Ａｒｎｅｔｔ−Ｍａｎｆｉｅｌｄ他、２００４年、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ）得られる結果に類似している。
【０１００】
ホルマリン固定され、かつパラフィン包埋された腫瘍組織で観察される活性Ａパターンは、新鮮な細胞で得られる画像とは異なり得る。このことは、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織が細胞内容物に変化をもたらし、それによりＰＲの異なるパターンをもたらすためであると予測される。ＩＨＦを利用した研究出版物に対するもう１つの違いは、上記方法に関連する。研究の場では、共焦点顕微鏡（すなわち、２つのレーザービームを使用して）は、高解像度および３Ｄの画像を提供し、組織サンプルの薄いスライス（例えば、２ミクロン）が利用される。ＩＨＣパターンは、細胞内容物を修飾する化学反応に起因する。対比して、ＩＨＣに関しては、伝統的な高視野顕微鏡は、標準的なより厚い腫瘍スライス（例えば、４ミクロン）を読み取るのに使用される。記載のＩＨＣ技法は、解像度のいくらかの損失をもたらす。
【０１０１】
ＩＨＦ技法は、それが微視的細胞構造物を変更させないという点で、腫瘍組織に関して化学的にあまり攻撃的ではない。ＩＨＦは、特殊装備、上記技法を経験した病理学者を必要とし、はるかに時間消費的である。ＩＨＦは、他の病理学分析法（例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を要する標準的な組織学）と容易に連結させることができない。したがって、１つの態様では、ＩＨＣは、日常的な病理学的実験手順として使用され得る。本明細書中で使用される開発されたＩＨＣ技法では、４マイクロメートルの組織スライス（日常的な臨床分析で一般的に使用される厚さ）を全ての分析に使用した。
【０１０２】
図３Ａおよび図３Ｂは、バックグラウンド染色とともに図１Ａおよび図１Ｂに等価である。５Ａでまたは免疫蛍光で観察される散在性パターンは、対比染色により暗くさせる。同様に、５Ｂは、巨視的核異常を実証する。しかしながら、たとえ５Ａの散在性パターンが、依然として均一核を伴って５Ａで特徴的であっても、一方で１Ｂは、５Ｂでは形成不全の核内で翻訳される。
【０１０３】
したがって、２つの基本的なパターンが見出される：活性化ＰＲの非存在を示す散在性ＰＲ核染色、および／またはＰＲフォーカスと呼ばれる凝集体が細胞の核内で認識され得る不均一染色。ＰＲフォーカスは、実質的により小さい散在性パターンの要素よりも大きい（図を参照）。
【実施例３】
【０１０４】
３つのカテゴリーまたは表現型が、本明細書中に記載されて、より高い倍率（８００倍）で観察される態様による使用に関して特定されている。対比して、標準的な倍率（４００倍）は、従来のＩＨＣ  ＰＲ状態決定に使用される。
【０１０５】
カテゴリー（高倍率で観察）
【０１０６】
Ｄ：散在性染色、ＰＲフォーカスなし（例えば、図１Ａ）
【０１０７】
ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞を結び付ける領域、またはＡより小さいサイズのＰＲフォーカスの不均一分布。
【０１０８】
Ａ：不均一式で分布した大きなフォーカス（例えば、図１Ｂ）。
【０１０９】
この分類（Ｄ、ＡＤおよびＡ）を１００個のさらなる事例に関して評価した（７５個の乳癌および２５個の子宮内膜癌組織サンプル）。場合によっては、サンプルは１つのＰＲアイソフォームに関して陽性であり、他のものには陽性でなかった（例えば、ＰＲ−Ａに関して陽性であるが、ＰＲ−Ｂに関しては陽性でない）。
【０１１０】
乳癌サンプル（６１個の事例を標準的なＰＲ発現に関して分析して、１２個の事例は、全ての抗体に関してＰＲ陰性であり、２個の事例は欠測データであった）。
【０１１１】
【表２】
2014530812.tif 000012
【０１１２】
【表３】
2014530812.tif 000013
【０１１３】
Ｃ．フォーカス分布
以下のセクションは、Ａ、ＡＤ、ＤパターンおよびＮ（陰性、ＰＲ染色なし）の頻度に記載している。全ての事例は、高倍率（８００倍）で分析した。２つの乳癌の事例は評価不可能であった。表４のデータは、使用する抗体（ＰＲＡまたはＰＲＢ）により分類が様々であること、およびＡＤパターンに関して抗体間でより多く可変性が存在することを実証している。このことは、癌組織において２つのＰＲ受容体（ＡおよびＢ）の固有の調節解除を反映する可能性が最も高い。ある特定の態様では、ＰＲアイソフォームそれぞれで標的とされる抗体を使用して、分析の結果を解釈するためのさらなる情報を提供し得る。例えば、事例は、抗ＰＲ  Ａ抗体を用いた場合には「Ｄ」、および第２の抗ＰＲ  Ｂ抗体を用いた場合には「ＡＤ」であってもよい。「ＡＤ」の後の分類に基づいて、抗プロゲスチンによる治療は、潜在的に適切である。同様に、事例は、ＰＲ  Ａに対する抗体を用いた場合には「Ａ」、およびＰＲ  Ｂに対する抗体を用いた場合には「ＡＤ」であってもよい。これは、異常ＰＲ活性により示される悪性細胞増殖のより大きな度合いのため、種々の（より高い）用量の抗プロゲスチンを潜在的に必要とし得る。ＰＲを決定するための従来のＩＨＣ方法は、それらがホルモン受容体（すなわち、ＥＲおよびＰＲ）の存在または非存在を単に示すだけであるため、この情報を提供することができない。１つの態様では、１つまたは複数の個々の抗体による分析に基づく活性化ＰＲフォーカスパターンは、活性化ＰＲフォーカスパターンを分析するためのさらなる情報を提供する。
【０１１４】
【表４】
2014530812.tif 000014
【実施例４】
【０１１５】
以下の表で概要されるデータセットでは、所定の腫瘍サンプルが、１つの抗体に対してはＡＰＦ陰性に、別の抗体に対してはＡＰＦ陽性となり、一方の抗体対他方の抗体に対して異なるＡＰＦパターンを示し得る。しかしながら、結果は概して、ＰＲ−Ａ抗体とＰＲ−Ｂ抗体との間で一致した。この一致は、以下に続くクロス集計の対角線上で示される。２つの条件組間での一致は、表の影付きテキストボックス中で強調される。これらの結果により、ある特定の態様では、１つよりも多い抗体が、ＡＰＦ核分布パターンを特定するためのさらなる情報を提供することが示される。
【０１１６】
以下の表５は、乳癌サンプルにおけるＰＲ  Ａ＋Ｂ抗体混合物と関連付けながら、ＰＲ  Ａ抗体によるＡＰＦパターンを比較する。Ａ：大きなフォーカスを伴う凝集パターン、ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞の混合物、または不均一な中程度（中間サイズ）のフォーカス、Ｄ：散在性パターン、または活性化ＰＲの非存在。縦列は、ＰＲ−Ａ抗体のみを使用して、示される結合パターンに従って事例を分類する一方で、横列は、ＰＲ−Ａ抗体＋ＰＲ−Ｂ抗体を使用して事例を分類する。対角線の強調された横列は、一致した事例、すなわち両方の方法を使用して同じ結合パターンを有する事例の数を示す。他のセルは、不一致の結果、すなわち各方法に関して異なる結合パターンを有する事例を示す。
【０１１７】
【表５】
2014530812.tif 000015
【０１１８】
表６：乳癌サンプル：抗ＰＲ  Ｂ抗体（ＰＲ  Ｂ）対抗ＰＲ  Ａと抗ＰＲ  Ｂとの混合物（ＰＲ  Ａ＋Ｂ）を用いて得られる結果のクロス集計。Ａ：大きなフォーカスを伴う凝集パターン、ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞の混合物、または不均一な中程度（中間サイズ）のフォーカス、Ｄ：散在性パターン、または活性化ＰＲの非存在。縦列は、ＰＲ−Ｂ抗体のみを使用して、示される結合パターンに従って事例を分類する一方で、横列は、ＰＲ−Ａ抗体＋ＰＲ−Ｂ抗体を使用して事例を分類する。対角線の強調された横列は、一致した事例、すなわち両方の方法を使用して同じ結合パターンを有する事例の数を示す。他のセルは、不一致の結果、すなわち各方法に関して異なる結合パターンを有する事例を示す。
【０１１９】
【表６】
2014530812.tif 000016
【０１２０】
表７：乳癌サンプル：抗ＰＲ  Ｂ抗体（ＰＲ  Ｂ）対、抗体抗ＰＲ  Ａ（ＰＲ  Ａ）を用いて得られる結果のクロス集計。Ａ：大きなフォーカスを伴う凝集パターン、ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞の混合物、または不均一な中程度（中間サイズ）のフォーカス、Ｄ：散在性パターン、または活性化ＰＲの非存在。縦列は、ＰＲ  Ｂ抗体のみを使用して、示される結合パターンに従って事例を分類する一方で、横列は、ＰＲ  Ａ抗体を使用して事例を分類する。対角線の強調された横列は、一致した事例、すなわち両方の方法を使用して同じ結合パターンを有する事例の数を示す。他のセルは、不一致の結果、すなわち各方法に関して異なる結合パターンを有する事例を示す。
【０１２１】
【表７】
2014530812.tif 000017
【０１２２】
子宮内膜癌
ＰＲ核分布の類似のパターンが、子宮内膜癌サンプルで観察される。重要なことに、正常な線維芽細胞は、生検標本サンプルで見出され、ＰＲ陽性であることが確認された。これらの正常な線維芽細胞は、Ｄ  ＰＲ核分布表現型を有し、最も可能性が高いのは患者が閉経後であり、したがって生理的レベルのプロゲステロンを生じていないために、これらの正常細胞におけるＰＲが活性化されなかったことを示した。したがって、線維芽細胞は、内因性プロゲステロンに曝露されてはいない。対比して、癌組織は、線維芽細胞パターンにより示されるように生理的プロゲステロンの非存在下でさえ、ＰＲ（ＡＰＦ）の活性化形態を提示していた。
【０１２３】
表８:子宮内膜癌サンプル：抗ＰＲ  Ａ抗体（ＰＲ  Ａ）対抗ＰＲ−Ａと抗体抗ＰＲ  Ｂとの混合物（ＰＲ  Ａ＋Ｂ）を用いて得られる結果のクロス集計。Ａ：大きなフォーカスを伴う凝集パターン、ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞の混合物、または不均一な中程度（中間サイズ）のフォーカス、Ｄ：散在性パターン、または活性化ＰＲの非存在。縦列は、ＰＲ  Ａ抗体のみを使用して、示される結合パターンに従って事例を分類する一方で、横列は、ＰＲ  Ａ抗体およびＰＲ  Ｂ抗体を使用して事例を分類する。対角線の強調された横列は、一致した事例、すなわち両方の方法を使用して同じ結合パターンを有する事例の数を示す。他のセルは、不一致の結果、すなわち各方法に関して異なる結合パターンを有する事例を示す。
【０１２４】
【表８】
2014530812.tif 000018
【０１２５】
表９：子宮内膜癌サンプル：抗ＰＲ  Ｂ抗体（ＰＲ  Ｂ）対抗ＰＲ  Ａと抗体抗ＰＲ  Ｂとの混合物（ＰＲ  Ａ＋Ｂ）を用いて得られる結果のクロス集計。Ａ：大きなフォーカスを伴う凝集パターン、ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞の混合物、または不均一な中程度（中間サイズ）のフォーカス、Ｄ：散在性パターン、または活性化ＰＲの非存在。縦列は、ＰＲ  Ｂ抗体のみを使用して、示される結合パターンに従って事例を分類する一方で、横列は、ＰＲ  Ａ抗体およびＰＲ  Ｂ抗体を使用して事例を分類する。対角線の強調された横列は、一致した事例、すなわち両方の方法を使用して同じ結合パターンを有する事例の数を示す。他のセルは、不一致の結果、すなわち各方法に関して異なる結合パターンを有する事例を示す。
【０１２６】
【表９】
2014530812.tif 000019
【０１２７】
表１０：子宮内膜癌サンプル：抗ＰＲ  Ｂ抗体（ＰＲ  Ｂ）対抗体抗ＰＲ  Ａ（ＰＲ  Ａ）を用いて得られる結果のクロス集計。Ａ：大きなフォーカスを伴う凝集パターン、ＡＤ：Ａ細胞とＤ細胞の混合物、または不均一な中程度（中間サイズ）のフォーカス、Ｄ：散在性パターン、または活性化ＰＲの非存在。縦列は、ＰＲ  Ｂ抗体のみを使用して、示される結合パターンに従って事例を分類する一方で、横列は、ＰＲ  Ａ抗体を使用して事例を分類する。対角線の強調された横列は、一致した事例、すなわち両方の方法を使用して同じ結合パターンを有する事例の数を示す。他のセルは、不一致の結果、すなわち各方法に関して異なる結合パターンを有する事例を示す。
【０１２８】
【表１０】
2014530812.tif 000020
【０１２９】
１つの態様では、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに対する抗体、またはＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂに対する二重特異的抗体の使用は、単一抗体（例えば、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ）の使用がある特定の事例でＡＤパターンを特定し得ないＡＤパターンＰＲ核分布パターンを特定するのに一緒に使用することができる。
【０１３０】
別の態様では、本明細書中に開示される方法は、例えばＩＨＣを使用して示され、かつ新鮮な組織およびＩＨＦを使用して確認される癌生検標本におけるＰＲ核パターンについて記載している。散在性パターンは、実験的および生理的条件下でプロゲスチンに曝露していない正常細胞／組織で見出される。散在性核分布パターンは、腫瘍細胞のＰＲが活性化されておらず、したがって抗プロゲスチンによる腫瘍の治療が有効的である可能性が低いことを示す。対比して、ＡＤまたはＡパターンの存在は、実験的モデルまたは正常細胞がプロゲスチンに曝露される場合に観察されるものに類似している。これらのパターンは、ＰＲが活性化されて、幾つかの細胞では転写的に活性化されていること、また抗プロゲスチンによる治療がこれらの事例では有効である可能性が高いことを示唆する。
【０１３１】
これらのパターン（例えば、ＡおよびＡＤ）の発現は、腫瘍において、および種々のサンプルにまたがって不均一であり、これは癌の特徴である。対比して、Ｄ表現型は、均一であり、ＰＲ生物学的機能の欠如と一貫性あるパターンである。本発明者達が記載してきたＰＲの発現および表現型は、発現されたＰＲアイソタイプ（ＡまたはＢ）および使用される抗体（例えば、二重特異的ＡＢ、Ａのみ、ＢのみおよびＡ＋Ｂの混合物）に従って多様である。ＰＲ核分布パターンのこの可変性は、本質的に不均一である自然発生するヒト癌において予期せぬことではない。
【実施例５】
【０１３２】
図４のプロットは、これらの結合パターンＡ、ＡＤおよびＤに関して、ＰＲ−ＡならびにＰＲ−Ｂに関して陽性である乳癌サンプルのパーセントを示す。結果は、従来の方法により決定される陽性プロゲステロン受容体状態が本明細書中に記載されるようなＰＲＦ分布の存在と相関しないとの結論を支持する。
【実施例６】
【０１３３】
表１１は、「Ａ」および「Ｄ」結合パターン細胞の両方を示す組織サンプルに関する「Ａ」結合パターン細胞のパーセントを示す。「ＡＰＲ」と表示した縦列は、組織サンプルに関して観察される全体的なパターンを示す一方で、「Ａ％」の縦列は、「Ａ」結合パターンを示すサンプルにおける細胞のパーセントを示す。横列はそれぞれ、抗ＰＲ−Ａ抗体および抗ＰＲ−Ｂ抗体の両方または各抗体単独を使用した１つの事例に関する結果を示す。
【０１３４】
【表１１】
2014530812.tif 000021
【０１３５】
本明細書中の本発明は、特定の実施形態を参照して記載してきたが、これらの実施形態は本発明の原理および用途を単に説明するに過ぎないことが理解されよう。本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載される方法および系に対して様々な改変および変更が成され得ることは、当業者に明らかである。したがって、本発明は、併記の特許請求の範囲およびそれらの同等物内にある改変および変更を包含すると意図される。
【図１Ａ】
2014530812.tif 000022
【図１Ｂ】
2014530812.tif 000023
【図２Ａ】
2014530812.tif 000024
【図２Ｂ】
2014530812.tif 000025
【図３Ａ】
2014530812.tif 000026
【図３Ｂ】
2014530812.tif 000027
【図４】
2014530812.tif 000028
【国際調査報告】
2014530812.tif 000029