(57)【要約】細胞におけるタンパク質の輸送を研究するためのβ−ガラクトシダーゼの相補性フラグメントを用いる酵素フラグメント相補性アッセイにおいて用いられる方法および材料が開示される。標的ペプチドに結合する化合物はタンパク質の折り畳みおよび従って輸送に影響を及ぼすことが見出された。β−ガラクトシダーゼフラグメント、酵素ドナー（ＥＤ）および酵素アクセプター（ＥＡ）は標的ペプチドおよび細胞内輸送に関与する細胞内区画タンパク質と融合される。細胞の標的ペプチドに結合する化合物との接触は小胞体、ゴルジ体、原形質膜、エンドソーム、等からなる細胞内輸送経路によるタンパク質の移動の向上をもたらす。この方法を用い、標的ペプチドに結合し、正常な細胞経路によって移動するその能力を変性する化合物を容易に検出することができる。
2014519851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の標的ペプチドの細胞内区画への輸送に対する効果の検出方法であって：
その中に
（ａ）該細胞内区画に局在するペプチドおよび第１β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第１融合タンパク質；ならびに
（ｂ）変性タンパク質輸送が行われる配列を有する標的ペプチドおよび第２β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第２融合タンパク質
を発現する細胞を提供するステップにおいて；
該第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは互いに親和性を有し、活性β−ガラクトシダーゼ酵素は第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントが同じ細胞内区画中に存在する場合のみ生成される、ステップと；該細胞に試験化合物を添加するステップにおいて、試験化合物の標的ペプチドとの結合がタンパク質輸送を変化させ、β−ガラクトシダーゼ活性の変化をもたらす、ステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記標的ペプチドが細胞膜タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞膜タンパク質がＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）およびイオンチャネルからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記変性タンパク質輸送が行われる配列が単一アミノ酸変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１β−ガラクトシダーゼフラグメントが変異酵素ドナーフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２β−ガラクトシダーゼフラグメントがエンドソームに局在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化合物の標的ペプチドの輸送に対する効果の測定方法であって：
ａ．小胞体（ＥＲ）を有する細胞を提供するステップにおいて、該細胞はその中に
ｉ．第１β−ガラクトシダーゼフラグメントに融合した標的ペプチドを含む第１融合タンパク質；および
ｉｉ．第２β−ガラクトシダーゼフラグメントに融合した細胞内区画に局在するタンパク質を含む第２融合タンパク質
を含み；
ｂ．該細胞内区画は
ｉ．サイトゾル；
ｉｉ．ゴルジ体；
ｉｉｉ．原形質膜；および
ｉｖ．エンドソーム
からなる群から選択され；
ｃ．該第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは互いに親和性を有し、相補し、第１および第２β−ガラクトシダーゼユニットが近接する場合、活性β−ガラクトシダーゼ酵素を生成する、ステップと；
ｄ．該細胞にＥＲからの標的ペプチドの放出に影響を及ぼす化合物を添加するステップと；
ｅ．該細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について評価し、第１および第２融合タンパク質が、ＥＲからの標的ペプチドの放出が化合物の影響を受けた結果として、該細胞内区画中で相互作用するかどうかを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項８】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的ペプチドが細胞膜タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞膜タンパク質がＧ−タンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＣＲがβ−アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体およびアンジオテンシン受容体の１つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１β−ガラクトシダーゼフラグメントが酵素ドナーフラグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞内区画がエンドソームである、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２β−ガラクトシダーゼフラグメントが前記第２融合タンパク質中のＦＹＶＥドメインによりエンドソームに局在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的ペプチドのタンパク質輸送のモニタリングを行うためのキットであって、該標的ペプチドは真核細胞を形質転換する遺伝子構築物を含む化合物と接触することなく実質的にＥＲ中に保持され、１つ以上の発現ベクターにおける該遺伝子構築物は
（ａ）細胞内区画に局在するペプチドおよび第１ガラクトシダーゼフラグメントを含む第１融合タンパク質；ならびに
（ｂ）変性タンパク質輸送が行われる配列を有するペプチドおよび第２β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第２融合タンパク質
をエンコードする遺伝子構築物を含む、キット。
【請求項１６】
前記標的ペプチドがＥＲ結合に修飾されたＧＰＣＲである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＧＰＣＲがβ−アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体およびアンジオテンシン受容体からなる群から選択される、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明者）
トーマス  ウェーマン、ダニエル  バッソーニ、ウィリアム  ラーブ
（関連出願の相互参照）
本出願は、本明細書に参照により組み入れる、２０１１年６月２３日出願の米国仮特許出願第６１／５７１，３１５号の優先権を主張する。
【０００２】
（政府の援助に関する説明）
該当なし。
【０００３】
（配列表、コンピュータプログラム、またはコンパクトディスクの参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された配列表を含有し、その全開示を本明細書に参照により組み入れる。このテキストファイルは２０１２年６月２１日に作成され、“3817_36_1_PCT_Seq_List.txt”と名前が付けられ、サイズは１２，４１５バイトである。
【０００４】
本発明は、細胞表面受容体のような、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含有するタンパク質の細胞内移動（「輸送」）を測定するためのアッセイの分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
詳細な説明において言及される技術的特徴に関連し得るため、本発明の特定の態様の背景情報を以下に提示するが、必ずしも詳細には記載されない。すなわち、本発明において用いられる個別の要素または方法は後述する文献においてより詳細に記載され得、その文献は当業者に特許請求される本発明の特定の態様を生成または使用するためのさらなる手引きを提供し得る。以下の説明は本明細書におけるいずれかの請求項または記載される文献の先行技術効果に対する情報の重要性を認めるものと解釈されるべきでない。
【０００６】
タンパク質合成およびその処理は、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、原形質膜、エンドソーム、ファゴソームおよびリソソームを含む転写、翻訳および翻訳後レベルでしっかり精査および制御された方法で行われる高度に制御された事象である。タンパク質合成およびその折り畳みは小胞体中で起こる。タンパク質は異なる構造を取り、それらの作用部位に到達する前に成熟する。プロセスは、不適切に／誤って折り畳まれたタンパク質がＥＲ中に蓄積し、その後プロテオソーム経路によって分解されることを確保する厳しい品質管理機構を含む。この方法では、適切に折り畳まれたタンパク質のみがＥＲを出て、それらの作用部位に到達する前に成熟経路に従うことが可能である。
【０００７】
ＧＰＣＲのような膜貫通タンパク質は、細胞表面受容体の大きなファミリーの一部であり、今日の創薬研究の中心である。すべてのＧＰＣＲは、１つの細胞外Ｎ末端フラグメント、膜貫通コアを形成する７つの膜貫通ドメイン、３つのエキソループ、３つのサイトループおよび１つの細胞内Ｃ末端セグメントを有するという固有の特徴を共有する。しかしながら、異なるセクションはサイズが異なり、それらの多様な構造および機能の指標である（Attwood TK, Findlay JB, 1994, Fingerprinting G-protein coupled receptors, Protein Eng. 7 (2): 195-203;  Kolakowski LF Jr, 1994 GCRDb: a G-protein-coupled receptor database, Receptors Channels 2 (1): 1-7; Foord SM, Bonner TI, Neubig RR, Rosser EM, Pin JP, Davenport AP, Spedding M, Harmar AJ, 2005, International Union of Pharmacology. XLVI. G protein-coupled receptor list, Pharmacol Rev 57 (2): 279-88, InterPro）。ＧＰＣＲは広く、配列相同性および機能的類似性に基づき、以下のように６つのクラスに分類することができる。
クラスＡ  （ロドプシン様）
クラスＢ  （セクレチン受容体ファミリー）
クラスＣ  （代謝型グルタミン酸／フェロモン）
クラスＤ  （真菌性接合フェロモン受容体）
クラスＥ  （サイクリックＡＭＰ受容体）
クラスＦ  （フリズルド／スムーズンド）
【０００８】
ＧＰＣＲは原形質膜内にキャビティを形成する７つの膜貫通へリックスを有する三次構造を取り、キャビティはリガンド結合ドメインとして機能する。ＧＰＣＲの別の一般的な構造的特徴はＣ末端テールまたは細胞内ループの１つ以上の部位のパルミトイル化であり、これは受容体が脂質ラフトと呼ばれる原形質膜のコレステロールおよびスフィンゴ脂質に富んだミクロドメインを標的とする効果を有し、急速な受容体シグナル伝達に関与する役割を有する。
【０００９】
イオンチャネルは、生体膜にわたるイオンの拡散を促進するという重要な機能を果たす別のクラスの膜タンパク質複合体の代表である。それらは電気絶縁体として作用し、膜の疎水性内部にわたり高導電性、親水性経路を提供する。それらの作用モードは高度にゲート制御され、それらの構造を開状態と閉状態との間で切り替える。ゲート活性を制御する化学的および物理的な調節因子に応じて、イオンチャネルは以下のグループに分類することができる：
１．リガンドゲート制御チャネル
２．電圧ゲート制御チャネル
３．第２メッセンジャーゲート制御チャネル
４．機械受容チャネル
５．ギャップ結合
【００１０】
誤って折り畳まれた／変異タンパク質イオンチャネルから引き起こされ得る多数のヒト障害がある。例えば：遅発性Ｎａ＋電流を増加させ、活動電位を延長させる正常な不活性化の失敗を引き起こし得る、遺伝性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）。多数のＬＱＴ２関連変異がｈＥＲＧチャネルにおいて同定された。ＬＱＴ２疾患を発現し、これに関連する一般的な機構は、細胞膜へのチャネルの送達を減少させるタンパク質輸送欠陥を含む。ＥＲ中での合成およびコアグリコシル化後、ｈＥＲＧタンパク質は複合グリコシル化、選別および最終的な表面膜への挿入のためゴルジ体に搬出される。ゴルジ体に入ると、ｈＥＲＧチャネルでは複合グリコシル化が行われる。多数の生物学的機能は、適切なタンパク質の折り畳み、ＥＲ搬出の促進およびタンパク質安定性の制御を含む、コアおよび複合グリコシル化の結果であると示された。
【００１１】
従って、輸送の活性化および／または阻害のモニタリグは劇的な細胞効果をもたらすことができ、それらの正常な生理学的機能性における膜貫通タンパク質の役割を解明するのを助けるだろう。健康および疾患状態における輸送を制御するのに潜在的に有用な治療法および薬剤を開発すること、ならびに輸送経路によるタンパク質の運命を理解することは、細胞における異なる段階でのタンパク質の進行をモニタリングすることにかかっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】本譲受人が所有する、２０１０年２月１８日に公表された、米国特許出願第２０１０／００４１０５２号、“Receptor tyrosine kinase assays”は、β−ガラクトシダーゼの相補性の弱いフラグメントを用いる活性化後の受容体チロシンキナーゼのリン酸化の検出方法について開示する。
【特許文献２】本譲受人が所有する、２０１０年８月１２日に公表された、米国特許出願第２０１０／０２０３５５５号、“Wild-type receptor assays”は、β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む融合タンパク質を用いる受容体のリガンド活性化の測定方法について開示する。
【特許文献３】本譲受人が所有する、２０１０年５月１３日に公表された、米国特許出願第２０１０／０１２００６３号、“GPCR arrestin assays”は、そのうち１つがアレスチンと融合したβ−ガラクトシダーゼフラグメントを含む融合タンパク質を用いるＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす候補化合物のアッセイについて開示する。
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hammer et al., “A novel enzyme complementation-based assay for monitoring G-protein-coupled receptor internalization,” FASEB Journal, December, 2007, vol. 21, pp 3827-3834は、β−ガラクトシダーゼ相補性アッセイを用いるＧＰＣＲのエンドソームへの内在化のモニタリングについて開示する。
【非特許文献２】Jin et al., “Disease-associated mutations affect GPR56 protein trafficking and cell surface expression,” Human Molecular Genetics, 2007, Vol. 16, No. 16, pp 1972-1985は、変異および野生型Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＲ）５６のタンパク質輸送に対する効果について開示する。ＧＰＲ５６変異体は原形質膜への輸送特性が不十分なタンパク質または分泌タンパク質を生成し、よってタンパク質を小胞体および／またはゴルジ体中に留まらせる。
【非特許文献３】Lilley and Ploegh, “A membrane protein required for dislocation of misfolded proteins from the ER,” Nature 429:834-840 (2004)に記載されるように、小胞体（ＥＲ）への挿入後、そこで折り畳みに失敗したタンパク質は破壊される。転移と呼ばれるプロセスによって、こうした誤って折り畳まれたタンパク質はサイトゾルに到達し、そこではユビキチン化、脱グリコシル化および最後にプロテアソームタンパク質分解が不要なポリペプチドを除去する。ほとんどの誤って折り畳まれた分泌タンパク質は小胞体（ＥＲ）中に留まり、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）により分解される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以下の簡単な概要は本発明のすべての特徴および態様を含むことを意図せず、本発明がこの概要において説明されるすべての特徴および態様を含まなければならないことも示唆しない。
【００１５】
本発明は、輸送経路による標的ペプチドの進行をモニタリングするための方法および組成物を含む。本発明の１つの態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの使用を含む。特定の実施形態では、親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムは、親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーターシステムである。本方法の実施形態を実施するのに用いられるシステムおよびキットも提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、試験化合物の標的ペプチドの細胞内区画への輸送に対する効果の検出方法であって、その中に（ａ）該細胞内区画に局在するペプチドおよび第１β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第１融合タンパク質；ならびに（ｂ）変性（altered)タンパク質輸送が行われる配列を有する標的ペプチドおよび第２β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第２融合タンパク質を発現する細胞を提供するステップにおいて；該第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは互いに親和性を有し、活性β−ガラクトシダーゼ酵素は第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントが同じ細胞内区画中に存在する場合のみ生成される、ステップと；該細胞に試験化合物を添加するステップにおいて、試験化合物の標的ペプチドとの結合がタンパク質輸送を変化させ、β−ガラクトシダーゼ活性の変化をもたらす、ステップとを含む、方法を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、前記標的ペプチドが細胞膜タンパク質である、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記細胞膜タンパク質がＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）およびイオンチャネルからなる群から選択される、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、変性タンパク質輸送が行われる配列が単一アミノ酸変異を含む、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記第１β−ガラクトシダーゼフラグメントが変異酵素ドナーフラグメントである、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記第２β−ガラクトシダーゼフラグメントがエンドソームに局在する、方法を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、化合物の標的ペプチドの輸送に対する効果の測定方法であって、小胞体（ＥＲ）を有する細胞を提供するステップにおいて、該細胞はその中に第１β−ガラクトシダーゼフラグメントに融合した標的ペプチドを含む第１融合タンパク質；および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントに融合した細胞内区画に局在するタンパク質を含む第２融合タンパク質を含み；該細胞内区画はｉ．サイトゾル；ｉｉ．ゴルジ体；ｉｉｉ．原形質膜；およびｉｖ．エンドソームからなる群から選択され；該第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは互いに親和性を有し、相補し、第１および第２β−ガラクトシダーゼユニットが近接する場合活性β−ガラクトシダーゼ酵素を生成する、ステップと；該細胞にＥＲからの標的ペプチドの放出に影響を及ぼす化合物を添加するステップと；該細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について評価し、第１および第２融合タンパク質が、ＥＲからの標的ペプチドの放出が化合物の影響を受けた結果として、該細胞内区画中で相互作用するかどうかを決定するステップとを含む、方法を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、前記細胞が哺乳類細胞である、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記標的ペプチドが細胞膜タンパク質である、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記細胞膜タンパク質がＧ−タンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）である、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、ＧＰＣＲがβ−アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体およびアンジオテンシン受容体の１つであり、前記第１β−ガラクトシダーゼフラグメントが酵素ドナーフラグメントである、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記細胞内区画がエンドソームである、方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記第２β−ガラクトシダーゼフラグメントが前記第２融合タンパク質中のＦＹＶＥドメインによりエンドソームに局在する、方法を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、標的ペプチドのタンパク質輸送のモニタリングを行うためのキットであって、該標的ペプチドは真核細胞を形質転換する遺伝子構築物を含む化合物と接触することなく実質的にＥＲ中に保持され、１つ以上の発現ベクターにおける該遺伝子構築物は、（ａ）細胞内区画に局在するペプチドおよび第１β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第１融合タンパク質；ならびに（ｂ）変性タンパク質輸送が行われる配列を有するペプチドおよび第２β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第２融合タンパク質をエンコードする遺伝子構築物を含む、キットを含む。特定の実施形態では、本発明は、前記標的ペプチドがＧＰＣＲにおける誤った折り畳みの変異のためＥＲ結合に修飾されたＧＰＣＲである、キットを含む。特定の実施形態では、本発明は、前記ＧＰＣＲがβ−アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体およびアンジオテンシン受容体からなる群から選択される、キットを含む。
【００２１】
特定の実施形態では、第２融合タンパク質中のペプチドは細胞膜タンパク質のすべてまたは一部を構成するペプチドである。細胞膜タンパク質はＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）であってもよい。
【００２２】
酵素フラグメントについて、第１β−ガラクトシダーゼフラグメントは好適には酵素ドナーフラグメントである。第２β−ガラクトシダーゼフラグメントはよって酵素アクセプターフラグメントであり、エンドソームに局在することができる。
【００２３】
本発明の態様は、化合物の標的ペプチドの輸送に対する効果の測定方法であって：
（１）小胞体（「ＥＲ」）を有する細胞を提供するステップにおいて、該細胞はその中に第１β−ガラクトシダーゼフラグメントに融合した標的ペプチドを含む第１融合タンパク質および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントに融合した細胞内区画に局在するタンパク質を含む第２融合タンパク質を含み、該細胞内区画は
ａ．サイトゾル；
ｂ．ゴルジ体；
ｃ．原形質膜；および
ｄ．エンドソームからなる群から選択され；
該第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは互いに親和性を有し、相補し、第１および第２β−ガラクトシダーゼユニットが近接する場合活性β−ガラクトシダーゼ酵素を生成する、ステップと、（２）該細胞にＥＲからの標的ペプチドの放出に影響を及ぼす化合物を添加するステップと、（３）該細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について評価し、第１および第２融合タンパク質が、ＥＲからの標的ペプチドの放出が化合物の影響を受けた結果として、該細胞内区画中で相互作用するかどうかを決定するステップとを含む、方法を含む。
【００２４】
本融合構築物を含有する細胞は哺乳類細胞であってもよく、本アッセイにおいて用いられる培地で単離して増殖させてもよい。
【００２５】
標的ペプチドは細胞膜タンパク質であってもよい。特定の実施形態では、細胞膜タンパク質はＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）であり、ＧＰＣＲは：β−アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体およびアンジオテンシン受容体からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲの誤った折り畳みおよびＥＲ中での保持を引き起こす変異を含有する。
【００２６】
特定の実施形態では、第１β−ガラクトシダーゼフラグメントは酵素ドナーフラグメントである。細胞内区画はエンドソームである。第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは前記第２融合タンパク質中のＦＹＶＥドメインによりエンドソームに局在する。
【００２７】
特定の実施形態では、第１および第２融合タンパク質をエンコードする核酸が細胞中に発現するが、核酸は連続的にまたは同時に細胞に導入することができる。特定の実施形態では、方法は、評価ステップの前に細胞を化合物と接触させるステップをさらに含む。化合物は標的ペプチドとの結合について試験することができる。
【００２８】
特定の実施形態では、第１β−ガラクトシダーゼフラグメントは、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２で構成されるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い、第２β−ガラクトシダーゼフラグメントとの結合親和性を有する。特定の実施形態では、第１β−ガラクトシダーゼフラグメントは、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２で構成されるβ−ガラクトシダーゼフラグメントと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変異は置換または欠失である。特定の実施形態では、変異は残基３１と４１との間で起こる。特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。
【００２９】
標的ペプチドのタンパク質輸送をモニタリングするためのキットであって、該標的ペプチドは真核細胞を形質転換する遺伝子構築物を含む化合物と接触することなく実質的にＥＲ中に保持され、１つ以上の発現ベクターにおける該遺伝子構築物は：（１）ＥＲ中に保持された標的ペプチドおよび第１β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第１融合タンパク質ならびに（２）細胞内区画に局在するタンパク質および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む第２融合タンパク質をエンコードする遺伝子構築物を含む、キットも提供される。
【００３０】
特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼフラグメントの１つは変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである。
【００３１】
特定の実施形態では、標的ペプチドはＥＲ結合に修飾されたＧＰＣＲである。ＧＰＣＲは、β−アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体およびアンジオテンシン受容体からなる群から選択することができる。
【００３２】
キットであって：（ａ）第１β−ガラクトシダーゼフラグメントおよび標的ペプチドを含む融合タンパク質をエンコードする第１核酸；ならびに（ｂ）細胞内区画局在タンパク質および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む融合タンパク質をエンコードする第２核酸を含み；第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは、野生型β−ガラクトシダーゼフラグメントと比較して、互いに減少した親和性を有する、キットも提供される。特定の実施形態では、第１β−ガラクトシダーゼフラグメントは変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドであり、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２で構成されるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い、前記第２β−ガラクトシダーゼフラグメントとの結合親和性を有する。特定の実施形態では、第１ベクターはベクター上に配置された制限部位を含み、タンパク質コード配列が制限部位を用いてベクターに挿入される場合、ベクターはタンパク質およびβ−ガラクトシダーゼフラグメントの融合タンパク質をエンコードする。特定の実施形態では、キットは哺乳類細胞をさらに含む。特定の実施形態では、キットはβ−ガラクトシダーゼ基質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】輸送および本アッセイでのその測定を示す、膜タンパク質の生合成経路の図である。矢印１で示されるように、真核細胞における輸送に関与するタンパク質は正常にＥＲ（小胞体）からゴルジ体まで移動し；矢印２で示されるように、次にゴルジから原形質膜（ＰＭ）まで移動し；矢印３で示されるように、次にエンドソームまで移動する。そこでは、エンドソームとのアゴニスト誘導または基本混合およびエンドソームにおける酵素フラグメント相補（ＥＦＣ）が行われる。ＥＦＣは、ＥＡのＥＤ、この場合はＰｒｏｌｉｎｋ（商標）ＥＤとの接触により起こる。数字４で示されるように、研究されるタンパク質またはタンパク質フラグメント（「標的ペプチド」）は、輸送経路によって移動する際、標的ペプチドとの融合物として存在する小さな酵素フラグメントが提供される。試験化合物を用い、ＥＲ中で標的ペプチドと結合し、これにより輸送に影響を及ぼす。
【図２】「Ｐｒｏｌｉｎｋ（商標）」と称される、親和性が減少した酵素ドナー（２０２）でタグ付けされたＧＰＣＲを試験化合物と接触させる移動を示す、タンパク質輸送のＥＦＣモニタリングの別の図である。図１と同様に、ステップは１）ＥＲからゴルジまで；２）ゴルジからＰＭまでの輸送；３）エンドソームとのアゴニスト誘導または基本混合、およびエンドソームにおける相補である。標的ペプチドと結合する試験化合物の添加（図の右側）は、相補後に高い検出可能なシグナルをもたらす。低いシグナルの場合、誤って折り畳まれたタンパク質がＥＲ中に保持されるためＥＲからゴルジまでの輸送は妨げられ（図の左側）、これはバツ印のついた矢印１により示される「異常輸送」の例である。
【図３】誤って折り畳まれたｈＥＲＧタンパク質（カリウム電圧ゲート制御チャネル、サブファミリーＨ（ｅａｇ関連）、メンバー２、または「ヒトエーテルアゴーゴー関連遺伝子」遺伝子記号ＫＣＮＨ２）を示す、ＥＦＣによるタンパク質輸送のモニタリングの別の図である。ここで誤った折り畳みはＫＣＮＨ２における単一点変異からもたらされ、変異体は「ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）」と称される酵素ドナーでタグ付けされる。誤って折り畳まれたタンパク質はＥＲ中に捕捉され、低いシグナル、すなわち、ＥＤとＥＡとの間にわずかな酵素相補をもたらす。「リガンド」として示される試験化合物の添加は、ＥＲ中での標的ペプチドとの結合、そこからゴルジ、ＰＭへのタンパク質輸送および原形質膜でのＥＡとの相補をもたらす。
【図４】ＡＤＲＢ２（アドレナリン、β２、受容体、表面）（Ｗ１５８Ａ）−ＰＫを発現するクローン細胞株を濃度が増加するプロパノール、ＡＤＲＢ２アンタゴニストに一晩３７℃で曝露する場合起こる相補のグラフであり、Ｗ１５８Ａは、一般的に理解されるように、Ｗ１５８〜Ａでの変異を指す。
【図５】ＫＣＮＨ２−（変異）−ＰＫを発現するクローン細胞株を濃度が増加するクロフィリウム（Ｈｅｒｇチャネルブロッカー）、ハロペリドール、アステミゾールに一晩曝露する場合起こる相補のグラフである。
【図６】ＣＨＲＭ４（コリン受容体、ムスカリン４）（ＤＣ）−ＰＫを発現するクローン細胞株を濃度が増加する多数のリガンド（ＬＹ２０３３２９８、ＶＵ０２３９４２９、ＶＵ１００１０、ＯＸＯ  Ｍ、キサノメリンオキサレート、４−ＤＡＭＰ）に一晩曝露する場合起こる相補のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（定義）
とくに他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料を本発明の実施または試験において用いることもできるが、好適な方法および材料は記載される。一般的には、細胞および分子生物学ならびに化学に関して用いられる命名法、ならびにその技術は当技術分野において周知であり、一般的に用いられる。具体的に定義されない特定の実験技術は、一般的には当技術分野において周知であり、本明細書を通して引用および説明されるさまざまな一般的でより具体的な参照文献に記載されるような、従来方法に従って行われる。
【００３５】
本発明によると、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術は文献において十分に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A laboratory Manual (1982); “DNA Cloning: A Practical Approach, “Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide synthesis” (M.J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); “Transcription and Translation” (B.D.Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed. (1986)); “Immobilized Cells and Enzymes” (IRL Press, (1986)); B.Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984)を参照されたい。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で他に明確な指示のない限り、複数の指示物を含むことに留意すべきである。さらに、特許請求の範囲はいずれの任意の要素も除外するように草稿され得ることに留意すべきである。そのようなものとして、この記載は、請求項の要素の引用に関する「単独で」、「〜のみ」、等のような排他的な用語の使用、または「消極的な」限定の使用の先行詞としての役割を果たすことを意図する。
【００３７】
当業者にとって本開示を読めば明らかとなるように、本明細書において記載および図示される個別の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離する、またはこれと組み合わせることができる個別の構成要素および特徴を有する。いずれの引用された方法も引用された事象の順で、または論理的に可能であるその他の順で行うことができる。
【００３８】
明瞭さの目的のため、下記で以下の用語を定義する。
【００３９】
「タンパク質輸送」の語は、本明細書において用いられる場合、予め定義された一連の細胞内区画による真核細胞におけるタンパク質の移動を指す。これは小胞による粗面小胞体からゴルジ体までの翻訳されたタンパク質の移動；ゴルジによる修飾および輸送；トランスゴルジネットワークでの小胞への封入；ならびにこれらの小胞の最終目的地（例えばリソソームまたは原形質膜）への送達を含む。
【００４０】
「ペプチド」の語は、本明細書において用いられる場合、１つのアミノ酸のα−カルボキシル基と別の群のα−アミノ基との間のアミド形成により生成されるいずれかのポリマー化合物を指す。ペプチドの語は、全長タンパク質、タンパク質フラグメント、変異タンパク質、および融合タンパク質に含まれるペプチドを含む。
【００４１】
「融合タンパク質」の語は、本明細書において用いられる場合、単一ポリペプチドにおいて結合した２つ以上のタンパク質／ペプチドコード配列から遺伝子工学によって生成されるタンパク質を指す。一般的には、これは「融合遺伝子」、融合タンパク質をエンコードおよび発現する核酸を生成することにより達成される。例えば、融合タンパク質をエンコードする融合遺伝子は、第１タンパク質をエンコードする第１ＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、その後枠中に第２タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を付加することにより生成することができる。得られる融合遺伝子配列はその後細胞により単一融合タンパク質として発現されるだろう。融合タンパク質は、融合タンパク質の各ドメインの適切な折り畳みおよび活性を促進することができるリンカー（または「スペーサ―」）配列を含むことができる。融合タンパク質は、（例えば、ウエスタンブロット、免疫蛍光、等における）同定および／または精製のためのエピトープタグを含むこともできる。現在用いられるエピトープタグの非限定的な例としては：ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、および６−ＨＩＳが挙げられる。
【００４２】
「アミノ酸」の語は、本明細書において用いられる場合、天然発生アミノ酸のＬ、Ｄおよび非キラル形態（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）だけでなく、修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、および従来のオリゴペプチド合成に組み込むことができる他の化学化合物、例えば、４−ニトロフェニルアラニン、イソグルタミン酸、イソグルタミン、ε−ニコチノイル−リシン、イソニペコチン酸、テトラヒドロイソキノレイン酸、α−アミノイソ酪酸、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、４−アミノ酪酸、等を含むことを指す。アミノ酸配列は１文字コードで表される（Ａ：アラニン；Ｒ：アルギニン；Ｎ：アスパラギン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｃ：システイン；Ｑ：グルタミン；Ｅ：グルタミン酸；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｌ：ロイシン；Ｋ：リシン；Ｍ：メチオニン；Ｆ：フェニルアラニン；Ｐ：プロリン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：チロシン；Ｖ：バリン；Ｘ：いずれかの残基）。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、（J Biol. Chem. 243 (1969), 3352-59）が用いられる標準的なポリペプチド命名法に従って、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。
【００４３】
「ベクター」の語は、本明細書において用いられる場合、結合したセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメントと結合することができる、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンを指す。
【００４４】
こうしたＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡにより「形質転換」または「形質移入」されている。形質変換ＤＮＡは、細胞のゲノム中に一体化（共有結合）していてもそうでなくてもよい。例えば原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持することができる。真核細胞について、安定して形質転換された細胞は、染色体複製によって娘細胞に遺伝するように形質転換ＤＮＡが染色体中に一体化したものである。この安定性は、有糸分裂により単一細胞または共通の祖先に由来する細胞集団からなる細胞株またはクローンを構築する真核細胞の能力により示される。「細胞株」は多世代にわたりインビトロで安定して増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００４５】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、本質的により大きな分子に関連して見られないより大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡのセグメントである。よって、異種領域が哺乳類遺伝子をエンコードする場合、遺伝子は通常、供給源の生物のゲノム中のゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接するだろう。別の例では、異種ＤＮＡは、融合タンパク質生成物を生成するために２つの異なる供給源からの遺伝子の一部が結合された構築物中のコード配列を含む。対立遺伝子変異または天然発生変異事象は、本明細書において定義されるようなＤＮＡの異種領域をもたらさない。
【００４６】
「アゴニスト」の語は、本明細書において用いられる場合、受容体または酵素と結合またはそうでなければ相互作用し、その受容体または酵母の活性を増加させる分子または物質を指す。アゴニストの語は、本明細書において用いられる場合、完全アゴニストおよび部分アゴニストの両方を含む。
【００４７】
「アンタゴニスト」の語は、本明細書において用いられる場合、受容体と結合またはそうでなければ相互作用し、アゴニストによるその受容体または酵母の活性化をブロック（例えば、阻害）する分子を指す。
【００４８】
「受容体」の語は、本明細書において用いられる場合、活性化されると細胞におけるシグナル伝達カスケードをもたらす、細胞の表面上に通常見られるタンパク質を指す。
【００４９】
「Ｇタンパク質共役受容体」および「ＧＰＣＲ」の語は、本明細書において用いられる場合、オピオイド、ムスカリン、ドーパミン、アドレナリン、アデノシン、ロドプシン、アンジオテンシン、セロトニン、チロトロピン、ゴナドトロピン、物質Ｋ、物質Ｐおよび物質Ｒ受容体、メラノコルチン、代謝型グルタミン酸、またはＧタンパク質を介して共役することが知られるその他のＧＰＣＲのすべてのサブタイプを指す。この語は、Ｇタンパク質と共役することが知られるが、その特異的リガンドは知られていないオーファン受容体も含む。本発明の方法を用いて輸送について研究することができるＧＰＣＲの例としては、これらに限定されないが、ケモカイン受容体４（ＣＣＣＲ４）；コリン受容体、ムスカリン２（ＣＨＲＭ２）；コルチコトロピン放出ホルモン受容体２（ＣＲＨＲ２）；Ｇタンパク質共役受容体４４（ＣＲＴＨ２）；メラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）；オピオイド受容体ｍｕ−１（ＯＰＲＭ１）；ソマトスタチン受容体１（ＳＳＴＲ１）；ソマトスタチン受容体４（ＳＳＴＲ４）；ヒスタミン受容体Ｈ３（ＨＲＨ３）；オピオイド受容体δ１（ＯＰＲＤ１）；ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）；およびβ２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）が挙げられる。
【００５０】
「ＡＤＲＢ２」の語は、本明細書において用いられる場合、β２アドレナリン受容体、α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｄ、α２Ａ、α２Ｂ、α２Ｃ、β１およびβ３も含むＧタンパク質共役受容体のアドレナリン受容体群のメンバーを指す。ＡＤＲＢ２は、Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーである。この受容体はその最終的なエフェクター、ＣクラスＬ型カルシウムチャネルＣａ（Ｖ）１．２の１つに直接関連する。この受容体チャネル複合体は、Ｇタンパク質、アデニリルシクラーゼ、ｃＡＭＰ依存性キナーゼ、および相殺ホスファターゼ、ＰＰ２Ａも含有する。シグナル伝達複合体の組み立ては、このＧタンパク質共役受容体による特異的および急速なシグナル伝達を確保する機構を提供する。遺伝子ＡＤＲＢ２はイントロンレスである。この遺伝子の異なる多形形態、点変異、および／または下方制御は、夜間喘息、肥満および２型糖尿病に関連する。
【００５１】
「ＣＨＲＭ４」の語は、本明細書において用いられる場合、Ｇタンパク質共役受容体のより大きなファミリーに属するムスカリンコリン受容体を指す。受容体はアセチルコリンと結合し、アデニレートシクラーゼ阻害、ホスホイノシチド変性およびカリウムチャネル修飾のような細胞応答を誘導する。配列はＵＮｉＰｒｏｔエントリＰ０８１７３で得られる。
【００５２】
「ｈＥＲＧ」の語は、本明細書において用いられる場合、Ｋｖ１１．１カリウムイオンチャネルとして知られるタンパク質についてコードする遺伝子（ＫＣＮＨ２）を指す。このイオンチャネルは、心臓の鼓動を調節する心臓の電気活性へのその寄与についてもっともよく知られている。配列はＵＮｉＰｒｏｔエントリＱ６Ｕ２７９で得られる。
【００５３】
「細胞内区画局在」の語は、本明細書において用いられる場合、細胞中に存在する場合特定の細胞内区画に主に関連して見られる分子（例えば、ペプチド、タンパク質、等）を指す。目的の細胞内区画としては、これらに限定されないが、リソソーム、エンドソーム、ゴルジ体、小胞体、核、緑葉体およびミトコンドリアが挙げられる。細胞内区画局在分子は、天然発生または目的の細胞内区画に主に関連するように操作された（例えば、遺伝子操作された）ものであってもよい。局在化は、細胞において局在タンパク質の一部であることが知られ、タンパク質をその目的区画または小器官に誘導するペプチド配列により達成される。タンパク質局在化を記録するデータベースはオンラインで、rostlab.orgで“LocDB”の名称で見ることができる。実施例では、エンドフィンＦＹＶＥドメインが用いられ、他のＦＹＶＥドメインタンパク質が知られる；Seet et al. “Endofin, an endosomal FYVE domain protein,” J. Biol. Chem. 276:42445-54 (2001)参照。
【００５４】
「任意の」または「任意で」の語は、本明細書において用いられる場合、その後記載される状況が起こってもそうでなくてもよく、記載は状況が起こる例および起こらない例を含むことを意味することを指す。
【００５５】
（概要）
本方法および組成物は、タンパク質輸送および輸送経路の各種要素によるその進行を同定およびモニタリングするシステムを提供する。ＧＰＣＲのような膜タンパク質には「品質管理」プロセスが行われ、それらが原形質膜に挿入される前に適切に折り畳まれ、形成されることを確保する。一般的には、ＧＰＣＲの寿命は、それらが合成され、折り畳まれ、組み立てられるＥＲで開始する。適切に折り畳まれた受容体はリクルートされ、ＥＲ由来ＣＯＰＩＩ被覆小胞に封入される。カーゴ受容体を有する輸送小胞は、その後ＥＲからＥＲ−ゴルジ体中間複合体（ＥＲＧＩＣ）、ゴルジ体およびトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）まで移動する。それらの移動中、受容体には翻訳後修飾（例えばグリコシル化）が行われ、成熟状態に達する。成熟受容体は次にＴＧＮから原形質膜のそれらの機能目的地まで移動する。それらのリガンドによる刺激後、原形質膜のＧＰＣＲには、Ｇタンパク質受容体キナーゼによる受容体のリン酸化、およびその後のリン酸化受容体のアレスチンとの結合を含む、内在化が行われ得る。アレスチンは、輸送機構の要素をクラスリン被覆ピットにリクルートし、初期エンドソームの形成を開始するアダプタータンパク質として作用する。エンドソーム中の内在化受容体は、原形質膜への回帰のためリサイクリングエンドソームに、または分解のためリソソームに選別される。この動的細胞内輸送（すなわち搬出、エンドサイトーシスおよび分解）のバランスは、ひいては所定のシグナルに対する細胞応答の程度に影響を及ぼす、原形質膜での受容体発現のレベルを決定する。各種条件は、不適切なタンパク質の折り畳み、輸送されるタンパク質における翻訳後修飾、またはこうしたタンパク質における他の変異のような、異常なタンパク質輸送をもたらし得る。
【００５６】
本方法においてとくに重要なのはＥＲである。ＥＲ品質管理は、分泌経路に入る新たに合成されたタンパク質を精査し、正しく折り畳まれたタンパク質および完全に組み立てられたタンパク質複合体のみが最終的に細胞内のそれらの作用部位に到達することを保証する。タンパク質機能に劇的には影響しない微妙な変異さえ、変異タンパク質のＥＲ保持をもたらし得る。これは多くの重要なヒト疾患において例示される。例えば、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、α１−アンチトリプシンおよびＶ２−バソプレシン受容体（Ｖ２Ｒ）における小さな変化を生成する変異は、それぞれ、嚢胞性線維症ならびにいくつかの形態の気腫および腎性尿崩症の遠因であることが示された。
【００５７】
（本明細書では「異常輸送」と称される）小胞体中でのタンパク質の保持がもたらされるには、これらに限定されないが、不適切な構造、タンパク質分解開裂もしくは炭水化物修飾を含む細胞処理の不足、特定の結合タンパク質の不足、または標的ペプチドの結合による特定の保持を含む、多くの理由があり得る。いくつかの研究は、ＥＲ中に保持される標的ペプチドの化合物（「試験化合物」）との結合により、標的部位への輸送を修復することができることを示した。この化合物は、１つのタンパク質またはタンパク質群、ペプチド、小分子、化学化合物、等で構成することができる。あるいは、化合物は標的をＥＲ内に保持するタンパク質と相互作用し、よって標的を放出させ、その標的目的地へさらに下流に進行させることができる。標的ペプチドは、プロテアーゼによる開裂、またはＥＲ保持タンパク質の開裂によってＥＲから放出することもできる。
【００５８】
下記に、親和性が減少した酵素フラグメント相補性を用い、輸送経路による標的ペプチドの進行をモニタリングする検出システムについて記載する。輸送経路による標的ペプチドの進行をモニタリングするための方法および組成物は、親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性受容体システムを用いて提供される。本方法の実施形態を実施するのに用いられるシステムおよびキットも提供される。本発明をより詳細に記載する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして異なり得ることが理解されるべきである。
【００５９】
本発明は、β−ガラクトシダーゼ酵素（好適には「酵素ドナー」（ＥＤ））の１つのフラグメントが第１細胞区画から目的細胞区画まで移動する「標的タンパク質」または「標的ペプチド」として知られるタンパク質と融合し、第２フラグメント、好適には「酵素アクセプター」（ＥＡ）が選択される目的細胞区画中に局在するタンパク質と融合する、酵素フラグメント相補性（ＥＦＣ）を用いる。特定の態様では、本発明は、特定の分子の標的ペプチドとの結合により調節し、ＥＲから標的ペプチドを放出させ、最終的にＥＡが局在する目的区画まで移動させることができる「輸送制御」の形態として作用する小胞体（ＥＲ）の能力を利用する。例えば、ＥＡは、エンドソームタンパク質をＥＡでタグ付けすることにより、目的区画であるエンドソームに局在する。エンドソームタンパク質はＦＹＶＥドメインを含有するだろう。ＦＹＶＥドメインは、酵母から哺乳類までの種における３０より多くのタンパク質中に存在する保存配列である。これまで特徴付けられたＦＹＶＥドメインタンパク質の主な機能的役割は膜輸送である。ＦＹＶＥドメインは、Ｆａｂ１、ＹＯＴＢ／ＺＫ６３２．１２、Ｖａｃ１、およびＥＥＡ１において見られた４つのタンパク質から命名された、ＦＹＶＥ亜鉛フィンガーとしても知られるタンパク質ドメインである。ＦＹＶＥドメインは２つの亜鉛イオンを結合することが示され、８つの潜在的な亜鉛配位システイン位置を有する。このファミリーの多数のメンバーはモチーフＲ＋ＨＨＣ＋ＸＣＧ中に２つのヒスチジンも含むが、＋は荷電残基を、Ｘはいずれかの残基を表す。ＦＹＶＥ型ドメインは２つの既知のクラス：脂質二重層中のホスファチジリノシトール３−リン酸と特異的に結合するＦＹＶＥドメインおよび未定機能を有するＦＹＶＥ関連ドメインに分けられる。ホスファチジリノシトール３−リン酸と結合するものは多くの場合、膜輸送の制御に関与する脂質膜を標的とするタンパク質中に見られる。ほとんどのＦＹＶＥドメインが膜表面でホスファチジリノシトール３−リン酸と特異的に結合することにより、ペプチドはエンドソームを標的とする。コンセンサス配列はhttp://smart.embl- heidelberg. de/smart/ show_info.plから入手することができる。
【００６０】
本方法は、ＥＲ搬出に必要なドメインを除外するように修飾された、またはＥＲ中での保持を引き起こすシグナルを含有するように修飾されたＧＰＣＲの使用を含む。これは、シャペロンとして作用し、変異ＧＰＣＲをＥＲから放出させる化合物と結合するまでＥＲ中に保持されるＥＲ結合ＧＰＣＲをもたらすだろう。
【００６１】
別の例として、特定の受容体は第２タンパク質の存在下でのみ細胞表面へ移動することが示された。例えばＧＡＢＢＲ１（γ−アミノ酪酸［ＧＡＢＡ］Ｂ受容体、１）はＧＡＢＢＲ２（γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、２）の存在下でのみ原形質膜へ移動する。よって、本明細書において開示される方法および材料を用いることにより、ＧＡＢＢＲ１結合パートナーは第３タンパク質との相互作用を用いて同定することができる。この場合、標的ペプチドはＰｒｏＬｉｎｋ（商標）のような酵素ドナーと融合し、エンドソームまたは原形質膜でＥＡを発現する細胞背景において発現されるだろう。第３タンパク質、この場合ＧＡＢＢＲ２または潜在的に相互作用するタンパク質のセットがその後導入されるだろう。それぞれの得られる細胞株はその後、相補酵素の量に関して親と比較されるだろう。潜在的に相互作用するタンパク質が標的と結合し、その原形質膜局在化を向上することができた場合、シグナルゲインが検出されるだろう。
【００６２】
化学的または薬理学的操作は誤って折り畳まれたタンパク質を救出し、それらの適切な転移をもたらすことができる。例として、細胞透過性バソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）アンタゴニストの、上記でＥＲ中に蓄積することが示された変異Ｖ２Ｒのサブセットへの添加は、変異タンパク質の適切な折り畳み、ＥＲ退出、細胞表面への正しい標的化、および受容体活性の機能的救出をもたらした。別の例として、δオピオイド受容体はリガンドの存在下での細胞表面へのその輸送を増加させる。すなわち、Petaja-Repo et al., “Ligands act as pharmacological chaperones and increase the efficiency of delta opioid receptor maturation,” EMBO Journal (2002) 21, 1628 - 1637に報告されるように、新たに合成されたδオピオイド受容体のわずかのみがＥＲを出て細胞表面に到達し、残りはプロテアソームにより分解される。膜透過性オピオイドリガンドは受容体の変異およびＥＲ搬出を促進し、よって薬理学的シャペロンとして作用する。ヒト疾患をもたらす変性輸送特性を有することが知られ、分子シャペロンを同定した追加の変異７回膜貫通受容体としては、ロドプシン、スルホニル尿素受容体１（ＳＵＲ１）、スムーズンド、およびゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）が挙げられる。
【００６３】
よって、本方法はまた、変異タンパク質の妨げられた輸送を含む疾患を治療するのに有用であり得る「化学シャペロン」を同定するのを助けるのに有用性を見出す。タンパク質は、ＥＲ品質管理により正常に保持される場合でも、機能的にコンピテントな構造を取ることができる。これはグリセロール、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドおよびジメチルスルホキシドのような、いわゆる化学シャペロンの、影響されたタンパク質の標的化および機能を救出する能力により示される。これらの発見とともに、Ｖ２Ｒ、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーのメンバーが観察される。２つの非ペプチドＶ２Ｒアンタゴニストは、ＥＲ中に正常に保持されたいくつかの受容体変異体を機能的に救出することができた（Morello J-P et al. (2000).  Pharmacological chaperones rescue cell-surface expression and function of misfolded V2 vasopressin receptor mutants. J Clin Invest, 105, 887-895）。
【００６４】
（一般的な方法および材料）
（誤った折り畳みを引き起こす不安定化タンパク質変性(alterations)）
上述したように、本方法は、誤った折り畳みおよびＥＲ中での保持をもたらすタンパク質における多数の既知の変異の利点を得ることができる。細胞膜受容体およびイオンチャネルについて以下で例示する。
【００６５】
アドレナリン、β２受容体である、Ｇタンパク質共役受容体ＡＤＲＢ２における変異を例示する。完全配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリＰ０７７５０で得られ、変異Ｗ１５８は膜貫通領域中に存在することがわかる。この領域は、同様の変異がＥＲ保持も引き起こすと予想することができる多数の他のＧＰＣＲに対する実質的な配列相同性を含有する。この構造的および機能的（コレステロール結合）相同性については、２０１１年６月２日に公表された、米国特許出願公開第２０１１／０１３０５４３号、“Cholesterol consensus motif of membrane proteins,” by Stevens et al.にさらに詳細に記載される。この配列はRVIILMVWIVSGLTSFLPIQMHWY (SEQ ID NO: 1)であり、（例えばＡに）変異する残基には下線が引かれている。同様の配列はヒトドーパミン受容体Ｄ５およびＤ１、ユビキチン特異的ペプチダーゼ５２、Ｇタンパク質共役受容体ＰＧＲ２８、β−３−アドレナリン受容体、５−ヒドロキシトリプタミン４受容体、５−ＨＴ４受容体、等中に存在する。よって、さまざまなＧＣＰＲの誤った折り畳みの変異も本アッセイにおいて用途を見出すだろう。
【００６６】
いくつかの場合、本方法を用い、タンパク質輸送の減少をアッセイすることができる。例えば、オピオイド受容体（ＧＰＣＲの１クラス）は構成的に活性となり得る。変異を導入し、構成的活性をもたらし、不安定化する誤った折り畳みおよびＥＲ中での保持を引き起こすことについて化合物を試験することができる。オピオイド受容体輸送の詳細については、Petaja-Repo UE, Hogue M, Laperriere A, Walker P, Bouvier M: “Export from the endoplasmic reticulum represents the limiting step in the maturation and cell surface expression of the human delta opioid receptor,” J Biol Chem 2000, 275:13727-13736およびBrillet et al. “Enhanced spontaneous activity of the mu opioid receptor by cysteine mutations: characterization of a tool for inverse agonist screening,” BMC Pharmacology 2003, 3:14を参照されたい。
【００６７】
コネキシン（ギャップ結合タンパク質）のような他の膜タンパク質はこうした誤った折り畳みおよびＥＲ保持を示す。Dhaunchak et al. “A common mechanism of PLP/DM20 misfolding causes cysteine-mediated endoplasmic reticulum retention in oligodendrocytes and Pelizaeus-Merzbacher disease,” Proc. Nat. Acad. Sci. 104:17813-17818は、ＣＮＳミエリンの主な一体化膜タンパク質をエンコードする、ＰＬＰ１遺伝子におけるミスセンス変異の分子結果について報告する。多数のＰＬＰ１ミスセンス変異は、ＥＲ保持およびペリツェウス−メルツバッハー病（ＰＭＤ）におけるオリゴデンドロサイトの死を引き起こすが、同じ遺伝子のヌル変異は十分に耐性化され、ミエリン形成を可能にする。免疫グロブリン軽鎖タンパク質ＡＬ−０９における誤った折り畳みの変異はアミロイド症を引き起こすことも知られる（J Biol Chem. 2008 Nov 7;283(45):30950-6. Epub 2008 Sep 2, “Structural insights into the role of mutations in amyloidogenesis.”参照）。
【００６８】
加えて、本開示によると、目的のタンパク質における変異を生成することができる。既知の誤った折り畳みの変異を有する受容体、イオンチャネルまたは酵素は、変異を構造的に同様のタンパク質に導入するためのテンプレートとして機能することができる。本融合タンパク質の調製において、標的ペプチドはその全てを用いる必要はない。ペプチドに全長タンパク質と同じように変性輸送が行われる限り、フラグメントとして存在していてもよい。
【００６９】
（機能的救出）
ここでＥＲ中に保持される誤って折り畳まれたタンパク質と結合する化合物を正しい折り畳みを促進する分子テンプレートとして機能することができる小さな非ペプチド分子を含む分子と接触させることができることおよび、重要なことに、この効果を本アッセイによりモニタリングすることができることが見出された。Conn et al. “G Protein-Coupled Receptor Trafficking in Health and Disease: Lessons Learned to Prepare for Therapeutic Mutant Rescue in Vivo,” Pharmacol. Rev. 59(3): 225-250(2007)はこうした救出について記載し、こうした救出は治療用途を有し得ることを示す。救出を引き起こす小さな分子は「薬理シャペロン」と称され、著者は、ヒトおよび齧歯類ＧｎＲＨ受容体における、欠失および切断を含む、多数の（非天然発生）変異を構築し、大多数は薬理学的手段により救出することができることを見出した。
【００７０】
（ＧＰＣＲ）
ＧＰＣＲは、本明細書において例示される場合、正常な輸送経路（ＥＲ−ゴルジ−細胞−表面輸送）に従い、組み立てられ、原形質膜における標的部位に到達する。多数のＧＰＣＲ変異は誤った折り畳みおよびＥＲ中での保持を引き起こすことが知られる。
【００７１】
例えば、Ｃ末端セグメント（別名テールセグメント）が変異／修飾される場合、ＥＲはこれを不適切な構造として認識し、タンパク質を保持するだろう。テールセグメントに１つ以上のシステイン残基の修飾がある場合、修飾されたＧＰＣＲは誤って折り畳まれたタンパク質として処理され、ＥＲ中に保持されるだろう。
【００７２】
2014519851.tif 000003
【００７３】
例えば、原形質膜に導入されるため、ＧＰＣＲは通常、翻訳後脂質化（例えばシステインとのパルミチン酸結合）を必要とする。これを引き起こすＧＰＣＲの部分、例えばへリックス８を除去することにより、ＧＰＣＲはＥＲ中に保持されるだろう。しかしながら、試験化合物のＧＰＣＲとの結合は、これをＥＲから放出させ、原形質膜およびエンドソーへ移動させるだろう。このように、本方法はさまざまなＧＰＣＲに適合させることができる。本方法は標的ペプチドとのいずれかの結合手段を検出する。それらを用い、オーファンＧＰＣＲを「脱オーファン化」することができる。アンタゴニストは、アゴニスト制御の必要なく、ＧＰＣＲ輸送を引き起こすだろう。
【００７４】
他の変異／変性ＧＰＣＲがヒト疾患に関与することが知られる。こうした変異ＧＰＣＲは標的ペプチドとして調製し、本方法において用いることもできる。Ａ１１６６ＣのようなアンジオテンシスＩＩ型ＩＧＰＣＲ（ＡＴ１Ｒ）−ＡＴ１Ｒ多型は高血圧症（Bonnardeaux, A., Davies, E., Jeunemaitre, X., et al., 1994 Angiotensin-II type-1 receptor gene polymorphisms in human essential-hypertension.  Hypertension. 24, 63-69）、左心室肥大（Takami, S., Katsuya, T., Rakugi, H., et al.,1998 Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism is associated with increase of left ventricular mass but not with hypertension.  Am.J. Hypertens. 11, 316-321）、冠動脈心疾患、心筋梗塞（Tiret, L., Bonnardeaux, A., Poirier, O., et al., 1994 Synergistic effects of angiotensin-converting enzyme and angiotensin-II type-1 receptor gene polymorphisms on risk of myocardial-infarction. Lancet. 344, 910-913）、および糖尿病性腎障害の進行（Wang, J. G., and Staessen, J. A.,2000 Genetic polymorphisms in the renin-angiotensin system:  relevance for susceptibility to cardiovascular disease.  Eur. J. Pharmacol. 410, 289-302; Tomino, Y., Makita, Y., Shike, T., et al.,1999 Relationship between polymorphism in the angiotensinogen, angiotensin-converting enzyme or angiotensin II receptor and renal progression in Japanese NIDDM patients.  Nephron. 82, 139-144）に関連する。
【００７５】
ＧＰＣＲ−アドレナリン受容体の変異形態、Ｐｒｏ６４Ｇｌｙ、β３アドレナリンの変異形態はいくつかの肥満の症例に関連する（Strosberg, A. D., 1997 Structure and function of the beta (3)-adrenergic receptor. Annu. Rev.Pharmacol. Toxicol. 37, 421-450）。
【００７６】
β２アドレナリン受容体の変異体、Ｔｈｒ１６４ＩＩｅ多型は、うっ血性心不全の重症度の増加に関連する。
【００７７】
Ａｒｇ１６Ｇｌｙも肺機能の低下、家族性夜間喘息に関連する。
【００７８】
ＣＣＫβ／胃受容体のＣＣＫ（コレサイトキニン）異常発現は結腸癌に関連している。
【００７９】
プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）、Ｐｈｅ２４０Ｓｅｒ、受容体の変異体はタンパク質分解による受容体活性化を妨害し得る。
【００８０】
（イオンチャネル）
本明細書において開示される方法および材料を用い、イオンチャネルを研究することもできる、例えば、ｈＥＲＧはｋｖ１１．１カリウムイオンチャネルとして知られるタンパク質についてコードする遺伝子であり、心臓の鼓動を調節する心臓の電気活性に対するその寄与についてもっともよく知られている。細胞膜タンパク質（例えば受容体）の細胞表面への輸送に影響を及ぼす特定の因子が知られる。例えば、ＫＣＮＨ２における単一点変異は誤って折り畳まれたｈＥＲＧタンパク質をもたらし、この変異の結果として、タンパク質はＥＲ中に捕捉される。化合物の添加は、安定化およびＥＲから膜までのタンパク質の輸送をもたらす。よって、標的ペプチドは相補性アッセイの第１フラグメントと融合し、第２フラグメントは膜にある。化合物の添加後、タンパク質はＥＲ精査を出て、輸送経路にさらに従うだろう。標的ペプチドはその後第２フラグメントに遭遇し、よって、化学発光／蛍光基質を用いて検出することができるシグナルの増加が観察されるだろう。
【００８１】
よって、イオンチャネルの輸送をモニタリングする研究は創薬研究のための重要な目的であり得る。
【００８２】
本方法は、ＥＲ中でのタンパク質の保持を引き起こす変異／挿入／欠失が導入されたイオンチャネルの使用も含む。化合物の添加はよってシャペロンとして作用し、タンパク質のＥＲからの搬出をもたらし、成熟の経路に従う。
【００８３】
イオンチャネル発現制御は遺伝子転写およびｍＲＮＡ安定性のレベルで開始する。メッセンジャーＲＮＡは核から細胞質まで搬出され、そこでリボソームタンパク質はコード領域をポリペプチド鎖に翻訳する。ペプチドは次にＥＲに挿入され、そこで適切な三次構造の成熟および形成が起こる。折り畳みおよび組み立て後、タンパク質はＥＲから小胞出芽によって輸送され、細胞骨格要素に沿ってＥＲ−ゴルジ中間複合体まで移動する。よってタンパク質は適切に機能するための正しい三次構造を達成しなければならない。よって、タンパク質配列上での変異／欠失／挿入は不適切なタンパク質の折り畳みをもたらし得、タンパク質はＥＲ中に保持され、適切に機能するための成熟の経路には従わないだろう。しかしながら、化合物の導入はタンパク質が適切に成熟し、ＥＲから出て、成熟経路に従うことを助けるだろう。このように、本方法はさまざまなイオンチャネルに用いることができる。
【００８４】
（ＴＧＦ−β受容体）
本アッセイにおいて用いることができる別のクラスのタンパク質はＴＧＦ−βファミリーの受容体である。Li et al. “Bone Morphogenetic Protein Type II Receptor Mutations Causing Protein Misfolding in Heritable Pulmonary Arterial Hypertension,” Proc. Am. Thorac. Soc. 7:395-390 (Nov. 2010)は、骨形成タンパク質ＩＩ型受容体（ＢＭＰＲ−ＩＩ）、形質転換増殖因子−β／ＢＭＰスーパーファミリーの受容体をエンコードする遺伝子における変異について開示する。同定される多数の変異のなかでも、いくつかはリガンド結合ドメインまたはＢＭＰＲ−ＩＩのキナーゼドメインにおけるシステイン残基の置換を含む。これらの変異体は小胞体内での保持により特徴付けられる。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）はＴＧＦ−βスーパーファミリー内のサイトカインの最大集団である。
【００８５】
ＢＭＰＲ−ＩＩのリガンド結合ドメインでは、１０個のシステイン残基が５個のジスルフィド結合を形成する。研究されるすべてのシステイン置換変異に共通する特徴は、変異ＢＭＰＲ−ＩＩタンパク質の小胞体（ＥＲ）中での保持である。ＥＲ内に保持されるシステイン置換ＢＭＰＲ−ＩＩ変異体は、野生型ＢＭＰＲ−ＩＩではなく、ＢＭＰＩ型受容体の正常輸送も妨げる。
【００８６】
ＴＧＦβ受容体のファミリーは１回膜貫通セリン／トレオニンキナーゼ受容体である。ＴＧＦ（形質転換増殖因子）β受容体についてのさらなる詳細は、例えば、Dore Jr, J. J.; Edens, M.; Garamszegi, N.; Leof, E. B. (1998)で見ることができる。"Heteromeric and homomeric transforming growth factor-beta receptors show distinct signaling and endocytic responses in epithelial cells".  The Journal of biological chemistry 273 (48): 31770-31777。
【００８７】
（標的ペプチド融合タンパク質のモニタリング）
本発明の実施形態は、細胞における輸送経路に従う標的ペプチド（すなわちモニタリグされるタンパク質）の進行をモニタリングするための方法を提供する。方法の実施形態は、前記標的ペプチドが細胞中で細胞内区画局在化分子に遭遇したかを決定するステップを含む。１つの実施形態では、１）標的ペプチドは親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの第１フラグメントと融合し、２）親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの第２フラグメントの局在化は標的ペプチドの輸送経路内にある細胞内部位で起こる。
【００８８】
標的ペプチドが作用部位へさらに移動するように誘導されると、これは途中で親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの第２セグメントに遭遇するだろう。局在化の増加はその後レポーター酵素の増加をもたらし、評価の結果を用いて標的ペプチドが輸送経路において前記細胞内区画に遭遇したかを決定する。酵素の機能性は化学発光または蛍光基質を用いて検出することができる。
【００８９】
１つの実施形態では、１）標的ペプチドは特定の細胞内区画内に保持される親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの第１フラグメントと融合し、２）親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの第２フラグメントの局在化も同じ細胞内区画で起こる。標的ペプチドが経路中でさらに移動する場合、レポーター酵素相補性の減少をもたらし、評価の結果を用いて標的ペプチドが輸送経路においてさらに移動したかを決定する。
【００９０】
（親和性が減少した酵素相補性レポーターシステム）
方法の態様は、本明細書の終わりに記載されるように、同様にとくにその全開示を本明細書に参照により組み入れる前記参照文献、米国特許出願第２０１００２８５４５１号、“Detection of sub-cellular compartment localization of a molecule using a reduced affinity enzyme complementation reporter system”に広く記載される、親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの使用を含む。一般的に減少した親和性とは、同じ結合フラグメントのネイティブフラグメントとの親和性より少なくとも２０％低い、３０％低い、または５０％低い親和性を意味する。
【００９１】
（シグナル−ノイズ比）
親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの実施形態は、高いシグナル−ノイズ比を提供することにより特徴付けられる。
【００９２】
本発明では、親和性が減少した酵素相補性システムは、酵素サブユニットが同じ細胞内小器官に存在する場合検出される第２の検出可能なシグナルより顕著に少ない、酵素サブユニットが個別の細胞内区画中または上に存在する場合の第１の検出可能なシグナルを提供する。
【００９３】
（親和性が減少した結合フラグメント）
本明細書において開示される方法および材料による酵素相補性レポーターシステムの酵素フラグメントは互いに十分に低い結合親和性を有し、細胞内区画内または上に存在する場合、それらは互いに可逆的結合を示し、互いに結合して検出可能なシグナルを生成することができる。低い結合親和性を有する酵素相補性レポーターシステムの酵素フラグメントは（本明細書に参照により組み入れる）米国特許出願第２０１００２８５４５１号、公表日１１／１１／２０１０および高親和性β−ガラクトシダーゼ相補性レポーターシステムで用いられる概要については２００５年５月１８日出願の（本明細書に参照により組み入れる）米国特許出願第１１／１３２，７６４号において説明された多数の異なる方法を用いて生成することができる。本方法および材料による親和性が減少した酵素フラグメントとしては、結合して検出可能なシグナルを生成することができるいずれかの結合親和性が減少したフラグメントが挙げられる。方法の実施形態は、本明細書において開示される方法および材料による酵素フラグメントが、結合することができ、結合した場合、直接または間接的に推定することができる生成物を生成する反応を触媒することができるタンパク質であることを含む。
【００９４】
野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼは、本親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの基礎を形成する。野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼは大腸菌ｌａｃＺ遺伝子によりエンコードされる。上述したような目的の酵素はこれらに限定されないが、酵素フラグメントはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ラクタマーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｃｒｅ−リコンビナーゼおよびルシフェラーゼに由来し得る。
【００９５】
（酵素活性の測定）
生細胞フローサイトメトリーおよび発色基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）での組織化学的染色を含む、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する一定範囲の方法が利用可能である。例えば、Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2603-2607 (1988); and Lojda, Z., Enzyme Histochemistry: A laboratory Manual, Springer, Berlin, (1979)を参照されたい。
【００９６】
（酵素フラグメントの特徴）
本明細書において開示される方法および材料に用いられる酵素フラグメントはβ−ガラクトシダーゼフラグメントであり、フラグメントはそれらの対応する野生型β−ガラクトシダーゼ分子中に見られるアミノ酸配列を有する、またはそれらの野生型β−ガラクトシダーゼ分子中に見られる配列の変異体である配列を有することができる。特定の実施形態では、酵素相補性システムは２つ以上のβ−ガラクトシダーゼフラグメントもしくはその変異体（例えば、αもしくはωフラグメント）で構成する、または３つ以上のβ−ガラクトシダーゼフラグメント（例えば、α、μおよびωフラグメント）を含むことができる。
【００９７】
シグナル生成システムの活性レベルを測定することにより、標的ペプチドは輸送経路においてさらに移動しているかの結論を引き出すことができる。
【００９８】
本方法はネイティブＮ末端β−ガラクトシダーゼペプチドの変異体を用いることができ、ペプチドは野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端領域中に見られるアミノ酸配列、例えば、野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端の約５残基内のような、Ｎ末端の約１０残基内で開始する配列を有する。フラグメントは約６０アミノ酸長以下、例えば、約５５アミノ酸長以下、約５０アミノ酸長以下、例えば４９アミノ酸長以下、等であってもよい。
【００９９】
配列変異は、例えば点変異の形態の、挿入、欠失または置換の１つ以上であってもよい。最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドの変異体は、単一変異（例えば挿入、欠失、点変異）または２つ以上の異なる変異（例えば２つ以上の点変異）等を有することができる。特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼの第１フラグメントは、例えば、β−ガラクトシダーゼの第２フラグメントとの結合親和性が野生型フラグメントより低い場合、β−ガラクトシダーゼの第２フラグメントとの野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼの（例えば、Langley et al., J.Biol. Chem. (1975) 250: 2587-2592に記載されるような）アミノ酸残基３〜９２の完全配列を有するフラグメントの結合親和性より低い（下記でより詳細に記載する）β−ガラクトシダーゼの第２フラグメントとの結合親和性を有する。
【０１００】
特定の実施形態では、配列におけるいずれかの変異は、フラグメントの相補性システムの第２フラグメントとの相補後、第２β−ガラクトシダーゼフラグメント内の「埋没」位置にあるβ−ガラクトシダーゼフラグメントの領域中で起こる。特定の実施形態では、このドメインは、野生型配列のアミノ酸残基２９〜４１から見出される配列を含み、従ってフラグメントはこの領域、例えば、アミノ酸残基３１〜４１のようなアミノ酸残基２９〜４１における変異を含む。例えば、変異が点変異である場合、変異体はアミノ酸残基２９〜４１からのいずれかでの１つ以上の点変異を含むことができ、これらの１３のアミノ酸残基の２つ以上、３つ以上、４つ以上等を含む１つ以上を置換することができる。目的の特定の親和性が減少したアミノ酸点変異としては、これらに限定されないが：Ｈ３１（例えば、Ｈ３１Ｒ）；Ｆ３４（例えば、Ｆ３４Ｙ）；Ｅ４１（例えば、Ｅ４１Ｑ）；およびＮ３９（例えば、Ｎ３９Ｑ、Ｎ３９Ｄ）が挙げられる。
【０１０１】
例となる最小Ｎ末端、αペプチド配列としては：
SEQ ID NO. 1 (H31R)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAARPPFASWRNSEEARTDRPSQQL
SEQ ID NO: 3 (F34Y)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRCAAHPPYASWRNSEEARTDRPSQQL
SEQ ID NO. 4 (E41Q)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSQEARTDRPSQQL
SEQ ID NO. 5 (N39D)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRDSEEARTDRPSQQL
SEQ ID NO. 6 (Truncated)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRDSEEA
が挙げられる。
【０１０２】
上記配列中、指示された置換には下線が引かれている。上記で概説したように第１フラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼフラグメントである実施形態では、上記で概説したように第１フラグメントは１つ以上の追加フラグメントと併せて用いることができる。特定の実施形態では、レポーターシステムはで第１および第２β−ガラクトシダーゼフラグメントで構成される。
【０１０３】
β−ガラクトシダーゼ（酵素ドナー、または「ＥＤ」）の第１フラグメントは天然発生配列または変異配列を有することができる。とくに関心があるのは、約３６〜６０、より通常は約５０以下のアミノ酸を有する小さなフラグメントである。望ましくは、ＥＤはβ−ガラクトシダーゼ（酵素アクセプター、または「ＥＡ」）の大きなフラグメントとの低い親和性を有し、エンドソームに対する相補β−ガラクトシダーゼフラグメントのリクルートメントの非存在下での大小のフラグメントの間の複合体形成能が低い、すなわち、２つのフラグメントが他のタンパク質との融合の非存在下で組み合わされる場合、小さなフラグメントで観察されるシグナルは９０のアミノ酸を有する市販のフラグメントで観察されるシグナルより少なくとも約５０％、より通常は少なくとも約７０％少ない。高親和性β−ガラクトシダーゼ酵素ドナーフラグメントのさらなる説明については米国特許第７，１３５，３２５号“Short enzyme donor fragments”を参照されたい。変異ＥＤのさらなる説明については米国特許出願公開第２００７／０２７５３９７号“Detection of molecular interactions using a reduced affinity enzyme complementation reporter system”を参照されたい。両参照文献は、本明細書の終わりに記載されるように本明細書に組み入れる。変異ＥＤは望ましくは、約０．５より低いが少なくとも約０．１の、目的のアッセイまたは類似アッセイにおける野生型配列の活性のを有するだろう。ＥＤとＥＡとの間の親和性を増加させるため、野生型配列からの変異を含まないＥＤが用いられるだろう。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＥＤは、配列：
SEQ ID NO.7  DSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAARPPFASWRNSEEARTDR
を有するＰｒｏＬｉｎｋ（商標）ＥＤと称される低親和性（〜３０倍低い酵素アクセプターとの親和性）ペプチドだろう。
【０１０５】
第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは、β−ガラクトシダーゼの第１フラグメントと相互作用し、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を生成することができるいずれかのフラグメントであってもよい。第２β−ガラクトシダーゼフラグメントは、全長β−ガラクトシダーゼ酵素の分子量に基づき、全長β−ガラクトシダーゼ酵素の約６０％超、約８０％超、または約９０％超に対応する、β−ガラクトシダーゼ酵素の大部分を含むことができる。特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼの第２フラグメントは、（例えば、Langley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) 72: 1254-1257に記載されるような）野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼタンパク質のアミノ酸１１〜４１を欠く欠失変異であり、そのフラグメントはＭ１５アクセプターまたはωフラグメントとして知られる。目的の他の特定のアクセプター（すなわち、ω−フラグメント）としては、これらに限定されないが：Ｍ１１２二量体、β−ガラクトシダーゼ内のアミノ酸２３〜３１の欠失が挙げられる（Lin, Villarejo and Zabin, 1970, Biochem. Biophys. Res. Common. 40: 249; Celeda and Zabin, 1979, Biochem, 18: 404; Welphy, Fowler and Zabin, 1981, J.Biol. Chem. 256-6804; Langley et al., 1975, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 72, 1254）。１つの例となるωペプチド配列を以下に記載する(SEQ ID NO. 8)；
MGVITDSLAVVARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAECDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK。
【０１０６】
本発明の態様は、輸送経路に従う標的ペプチドをモニタリングするための上述した親和性が減少したレポーターシステムの使用を含む。
【０１０７】
（レポーターサブユニット）
レポーターサブユニットは、目的の分子および細胞内局在化分子に安定して結合している。特定の実施形態では、安定な結合は直接またはリンカーを介し、結合は共有結合であってもそうでなくてもよい。例えば、レポーターサブユニット、目的の分子および細胞内区画局在化分子がタンパク質である場合、それらは当技術分野において知られる結合ペプチドの方法により結合することができ、例えば、下記でより詳細に記載するように、融合タンパク質として核酸配列から発現することができる。
【０１０８】
本方法において用いられる所定の細胞はいずれかの便利なプロトコルを用いて提供することができる。例えば、異なる分子およびレポーターサブユニットの共役は、多数の異なるプロトコル、例えば、微量注入、電気穿孔もしくはさまざまなバルクローディング技術を用い、または、例えば融合タンパク質の形態の、異なる要素をエンコードする細胞核酸で提供することにより、細胞に導入することができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、レポーターサブユニットおよび目的の分子（または細胞内区画局在化分子）は、レポーターサブユニットを含み、よって細胞内でエンコード核酸から発現することができる融合タンパク質を構成することができる。このシステムは、レポーターサブユニットの酵素相補性に基づき、哺乳類細胞のような細胞における細胞内区画局在化の検出および定量化を可能にするので、特定の実施形態において有利である。特定の実施形態では、目的の分子および細胞内区画局在化タンパク質は、同じ細胞内区画と結合する場合、直接または間接的に互いに結合する。これらの実施形態では、この相互作用は、親和性が減少したレポーターサブユニット間を結合させることにより、相補性（および酵素活性）の量を増加させることができる。しかしながら、同じ細胞内区画に共局在化した場合、目的の分子と細胞内区画局在化分子との間の直接または間接的相互作用は、本発明のシステムおよび方法に必須の特徴ではない。目的の分子および細胞内区画局在化分子が近接する場合、酵素活性を生成することができる。
【０１１０】
（融合タンパク質）
本明細書において用いられる融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質、すなわち、目的のタンパク質および細胞内区画局在化タンパク質の完全または部分配列を含むアミノ酸の単一の連続的な線状ポリマーを含む。２つ以上のアミノ酸配列は、例えば、架橋剤の中間体によって化学的に結合することができる。特定の実施形態では、融合遺伝子構築物は、同じ中断されていない読み取り枠中の２つ以上の異なるタンパク質の完全または部分配列をエンコードするヌクレオチドの単一の連続的な線状ポリマーを含む。融合遺伝子構築物はまた、真核および／または原核細胞において活性な複製起点ならびに例えば、薬剤耐性をエンコードする１つ以上の選択マーカーも含有することができる。それらはまた、ウィルスパッケージングシグナル、転写および／または翻訳制御配列、ならびにＲＮＡプロセシングシグナルを含有することができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の融合遺伝子構築物は細胞に導入され、融合遺伝子構築物によりエンコードされる融合タンパク質の細胞内区画共局在化についてアッセイする。融合遺伝子構築物はまた、推定化合物をエンコードする遺伝子と正常に結合する、プロモーターならびに他の転写および／または翻訳制御配列を含有することができる。融合遺伝子構築物は、これらに限定されないが、ウィルスベクター、形質転換、共沈降、電気穿孔、中性もしくはカチオン性リポソーム媒介輸送、微量注入または遺伝子銃を含む、当技術分野において知られる核酸輸送のいずれかの方法により、細胞に導入することができる。目的のウィルスベクターとしては、これらに限定されないが：レトロウィルス、ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルスが挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムへの安定な一体化が可能であるレトロウィルスベクターが用いられる。例えば、一体化およびパッケージングシグナルをエンコードするレトロウィルス構築物、薬剤耐性マーカーならびに１つ以上の目的の融合遺伝子は、本発明の特定の実施形態の実施において有用である。
【０１１２】
固有の融合タンパク質をエンコードする異なる融合遺伝子構築物は、個別の核酸分子上または同じ核酸分子上に存在し得る。特定の実施形態では、同じベクターが用いられ、細胞による核酸の単一種のみの取り込みは両方の推定結合パートナーをエンコードする配列を細胞に導入するのに十分である。導入の順序に関して、コード配列が異なるベクター上にある実施形態では、ベクターは細胞に同時にまたは連続的に導入することができる。本融合遺伝子構築物または融合タンパク質は、培養細胞に、動物細胞にインビボで、動物細胞にエクスビボで、またはその中でタンパク質輸送を研究するのが望ましいその他のタイプの細胞に導入することができる。
【０１１３】
当業者により理解されるように、２つの融合遺伝子構築物が単一の細胞に導入される。第１は局在化ペプチドおよびＥＡβ−ガラクトシダーゼペプチドの融合物である。局在化ペプチドはＦＹＶＥドメインペプチド、細胞膜局在化ペプチド、例えばホスホリパーゼＣγのＰＨドメイン、等であってもよい。第２融合遺伝子構築物は、ＥＤβ−ガラクトシダーゼペプチドに融合した標的ペプチド配列を含む。この構築物は、本明細書に記載される遺伝子またはタンパク質データベース識別子下で得られるヌクレオチド配列を用いる既知の遺伝子操作法により生成することができる。標的ペプチドは、既知の変異誘発法を用い、誤った折り畳みの変異を有するように切断または修飾することができる。２つの遺伝子構築物は転写配列をさらに含むだろう；こうした用途について知られるプラスミドは本明細書に引用される多数の特許文献に記載されている。
【０１１４】
（試験化合物）
本方法は、試験化合物、または「化合物」（小分子、ポリペプチド、抗体、多核酸等）の標的ペプチドと結合する能力を評価するための手段を提供する。標的ペプチドとの結合は、標的ペプチドを第１細胞区画から放出させ、この放出は１つの酵素フラグメントが標的ペプチドと融合するＥＦＣによって検出することができる。以下の例は、既知の変異が受容体をＥＲ中に保持させるＧ共役受容体（ＧＰＣＲ）について記載する。標的ペプチドは、試験化合物により結合されるまでそれがＥＲを出ることを妨げる既知の変異を有するタンパク質であり得る。試験化合物は有利なことにはＥＲ中に分散することができる小分子であってもよい。標的ペプチドは、試験化合物により結合されるまでＥＲ中に保持されるように設計された変異タンパク質であり得る。
【０１１５】
（レポーターシステム活性の評価）
それぞれレポーターシステムの異なるサブユニットでタグ付けされた（すなわち、標識された）目的の分子および細胞内区画局在化分子を含む細胞の提供後、細胞は次にレポーターシステムの活性について評価され、この評価ステップの結果はレポーターシステムについての情報を提供し、この評価ステップの結果は輸送経路における標的ペプチドの運命についての情報を提供する。
【０１１６】
特定の実施形態では、評価は、活性を検出するステップならびに、次に観察された活性を参照または対照値、例えば、レポーターサブユニットが（例えば、レポーターサブユニットが異なる細胞内区画中に存在するタンパク質と融合する場合）同じ細胞内区画に共局在化されない細胞において観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルのような、以前測定された背景活性値、別名背景レベルと比較するステップを含む。以下でより詳細に記載されるように、評価は、所定のアッセイプロトコルにより必要とされ得るので、所定の観察期間中の２つ以上の時点、例えば、細胞の試験剤との接触前後、等で活性を観察するステップを含むことができる。この評価ステップは、以下でより詳細に記載するように、システムの酵素の適した基質の提供、およびそこから検出可能な生成物の酵素媒介生成の検出を含むことができる。
【０１１７】
（レポーターシステムアッセイ）
本明細書において開示されるレポーターシステムを用い、検出可能なシグナルを生成するレポーターサブユニット間の相補性によってレポーターサブユニットと結合した分子の細胞内区画共局在化をアッセイすることができる。本明細書において開示される１つの実施形態では、標的ペプチドおよび細胞内局在化タンパク質の共局在化を検出および定量化することができる。レポーターサブユニット相補体として生成されるシグナルは、輸送事象の指標として機能することができる。例となるシグナルとしては、発色、蛍光および発光シグナルが挙げられる。これらのシグナルは、視覚的にまたはフローサイトメーター、分光光度計、蛍光光度計、顕微鏡、シンチレーションカウンターまたは当技術分野において知られる他の装置の使用によって、検出および定量化することができる。
【０１１８】
本明細書において開示されるレポーターシステムの成分の結合は、溶液の因子、例えばｐＨ、イオン強度、アッセイの成分の濃度、および温度によって決まるだろう。アッセイ溶液は特定のシステムについて設計および開発することができる。本明細書において開示されるレポーターシステムを用い、緩衝化無細胞溶液、細胞内部、細胞の溶液、細胞溶解物の溶液ならび細胞画分、例えば核画分、細胞質画分、ミトコンドリア画分および膜画分の溶液のような、溶液中でアッセイを行うことができる。当技術分野において知られる、酵素アッセイ溶液のようなアッセイ溶液、細胞抽出物および細胞懸濁液の調製方法を用いることができる。例えば、リン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合可能な緩衝液を用いることができる。例えば、the series, Methods in Enzymology, Academic Press, New Yorkを参照されたい。
【０１１９】
１つの実施形態では、レポーターサブユニットは互いに相補し、基質の直接または間接的に検出可能である生成物への変換を触媒することができる酵素的に活性な複合体を形成することができる。１つの実施形態では、レポーターシステムは２つ以上の成分を含むことができ、そのそれぞれは融合タンパク質であり、融合タンパク質はそれぞれ低親和性レポーターサブユニットに融合したタンパク質（またはポリペプチド）を含む。よって、融合タンパク質をエンコードする核酸を構築し、細胞に導入し、細胞中で発現することができる。あるいは、相補性レポーターサブユニットの存在は、抗体のような、関連相補性レポーターサブユニットに特異的な標識化合物の結合を検出することにより、検出することができる。
【０１２０】
１つの実施形態では、低親和性レポーターサブユニットは、上記で詳細に記載したように、β−ガラクトシダーゼの相補性サブユニットであってもよい。システムは２つ、３つ以上のレポーターサブユニットを含むことができ、そのすべては検出可能なシグナルを生成するために結合する必要がある。当技術分野において開発された活性β−ガラクトシダーゼの反応生成物の検出方法を用いることができる。例えば、β−ガラクトシダーゼ活性は、生細胞フローサイトメトリーおよび発色基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）での組織化学的染色を含む一定範囲の方法により測定することができる。Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 85:2603-2607 (1988); and Lojda, Z., Enzyme Histochemistry:  A laboratory Manual, Springer, Berlin, (1979)。β−ｇａｌの組織化学的染色は細胞の固定化およびその後のＸ−ｇａｌへの曝露により達成することができる。
【０１２１】
Mohler and Blau, Proc.Natl.Acad.Sci., 93: 12423-12427 (1996)に記載されるようなβ−ｇａｌ活性のアッセイを用いることができる。１つの実施形態では、細胞内分析は、細胞を固定し、インジゴ生成基質Ｘ−ｇａｌで染色することにより行うことができる。固定化細胞は、Ｘ−ｇａｌまたは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（５−６−Ｘ−Ｇａｌ）と組み合わせてアゾ染料を用いる蛍光組織化学によるβ−ｇａｌ活性についてアッセイすることにより分析することもできる。目的の組み合わせは、アゾ染料赤紫ＬＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ミズーリ州セントルイス）およびＦｌｕｏｒ−Ｘ−ｇａｌと称される、５−６−Ｘ−Ｇａｌである。この組み合わせについて、蛍光顕微鏡写真は、２つ以上の他の蛍光シグナルで同時に視覚化される蛍光に基づき得ることができる。
【０１２２】
（β−ガラクトシダーゼの基質）
生細胞において用いることができる、β−ｇａｌの生体基質も、本明細書において開示される方法および材料に含まれる。例えば、生体蛍光基質、レゾルフィンβ−ガラクトシダーゼビス−アミノプロピルポリエチレングリコール１９００（ＲＧＰＥＧ）について記載されている。Minden (1996) BioTechniques 20(1): 122-129。この化合物は、微量注入、電気穿孔またはさまざまなバルクローディング技術により細胞に送達することができる。細胞内部に入れば、基質は原形質膜によって、またはギャップ結合により脱出することはできない。本明細書において開示される方法および材料の実施において用いることができる別の生体基質は、とくに蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびフローサイトメトリーによる分析に十分に適したフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）である。Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 85:2603-2607 (1988) and Rotman et al. (1963) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 50: 1-6。
【０１２３】
β−ガラクトシダーゼは化学発光アッセイを用いて検出することもできる。例えば、β−ガラクトシダーゼ融合を含有する細胞は、Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓアッセイキット（Ｔｒｏｐｉｘ、マサチューセッツ州ベッドフォード）からのＧａｌａｃｔｏｎ  Ｐｌｕｓ基質を含有する緩衝液の混合物に（架橋剤との接触の有無に関わらず）溶解される。Bronstein et al, J Biolumin. Chemilumin., 4:99-111 (1989)。発光促進剤溶液の添加後、発光は照度計またはシンチレーションカウンターにおいて測定される。
【０１２４】
分光光度または蛍光分析に適した代表的な基質としては、これらに限定されないが：ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−メチルウンベル−リフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；マプチル−ＡＳ−Ｂ１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；１−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド一水和物；Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ならびにフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、Ω−ノトロスチリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフルオレセイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。例えば、米国特許第５，４４４，１６１号を参照されたい。
【０１２５】
（追加のレポーターシステム）
β−ガラクトシダーゼ以外のレポーターシステムを用いることもできる。例えば、酵素β−ガラクトシダーゼ（ＧＵＳ）はレポーターとして用いることができ、発色および蛍光発生ＧＵＳ基質が開発された。ＧＵＳ基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）は、以下のように、発色および蛍光発生用途の両方に用いることができる。
【０１２６】
本明細書において開示される方法は、細胞溶解物、およびインタクトな細胞におけるタンパク質輸送経路で起こる事象のモニタリングを可能にする。よって、完全に折り畳まれたタンパク質間の相互作用は検出可能であり、結合部分の共翻訳発現は結合の検出には必要でない。
【０１２７】
反応生成物は間接的に、例えば、免疫蛍光標識のような免疫技術によって検出することができる。
【０１２８】
（有用性）
本発明の実施形態は、輸送経路に従う、タンパク質をモニタリングするための広範囲の研究において用いることができる。以下では、本発明の方法の異なる用途の非限定的な例が提供される。
【０１２９】
（膜輸送）
特定の実施形態では、本方法は膜タンパク質輸送を含む研究に用いられる。細胞表面受容体のほとんどは、細胞表面に達して作用を行う受容体の量／数により転写後に制御される。よって、輸送経路の活性化および阻害は劇的な細胞効果をもたらし得る。例えば、標的ペプチドは相補性アッセイの第１フラグメントと融合し、第２セグメントは標的ペプチドの輸送経路内にある細胞内位置にある。例えば、標的ペプチドがＥＲに局在する場合、第２フラグメントはエンドソーム、リソソーム、原形質膜またはゴルジ複合体に局在することができる。タンパク質がさらに移動し、その作用部位へ進行するように誘導される場合、途中で、すなわち最終区画、一般的にはエンドソームを含む、タンパク質が通過する細胞構造の１つにおいて、第２酵素フラグメントに遭遇するだろう。タグ付けされた標的が標識細胞構造に近接する場合の局在化の増加は、その後生細胞上または細胞溶解物中の化学発光または蛍光基質を用いて検出することができる機能的酵素の増加をもたらすだろう。
【０１３０】
本アッセイおよび方法は、細胞外シグナル伝達分子、増殖分化因子、ペプチド、薬剤または合成類似体等の存在下で行うこともでき、その存在または効果は特定の細胞型における目的のタンパク質の輸送経路を変性し得る。例えば、ＧＰＣＲは、実験セクションにおいてより詳細に説明されるように研究することができる。タンパク質輸送に影響を及ぼすことができる他の因子は、細胞の健康、細胞の分割または細胞の死等であり得る。
【０１３１】
しかしながら、標的ペプチドが小胞体の品質管理機構により保持される場合、タンパク質はさらに移動せず、よって相補は起こらず、従って酵素活性を検出することはできない。
【０１３２】
特定の実施形態では、本明細書において開示される方法および材料を用い、タンパク質輸送経路における結合部分の役割を評価することができる。例えば、この実施形態では、標的ペプチドが相補性アッセイの第１フラグメントと融合し、化合物が相補性アッセイの第２フラグメントと融合した変異／修飾タンパク質である。標的タンパク質は変異／修飾タンパク質であるので、小胞体の品質管理機構はタンパク質を保持し、これをさらに移動させないだろう。結合部分の添加後、小胞体の品質管理機構は、それ以上標的ペプチドを誤って折り畳まれたタンパク質として認識せず、標的ペプチドは小胞体を出て輸送経路に従い、作用部位に到達することができるだろう。
【０１３３】
特定の実施形態では、例えば、ＧＰＣＲのテールセグメントが切断／修飾される場合、本明細書において記載される方法および組成物を用い、修飾ＧＰＣＲをモニタリグすることができる。こうした例では、修飾ＧＰＣＲは相補性アッセイの第１フラグメントと融合し、第２フラグメントはＧＰＣＲの輸送経路内にある細胞内小器官中の細胞内局在化タンパク質と融合する。修飾ＧＰＣＲが輸送経路内で移動すると、これは途中で細胞内小器官の１つに保持されるだろう。これが第２融合タンパク質に遭遇する場合、シグナルゲインが観察されるだろう。このように、我々はＧＰＣＲが修飾／変異される場合に起こる変化をモニタリングすることができる。
【０１３４】
別の例では、標的ペプチド（変異／修飾タンパク質）は相補性アッセイの第１フラグメントと融合し、相補性アッセイの第２フラグメントは標的ペプチドの輸送経路内にある細胞内位置にある。結合部分の添加後、小胞体の品質管理機構はそれ以上これを誤って折り畳まれたタンパク質として認識しないだろう。タンパク質は小胞体を出て、さらに移動することができるだろう。標的ペプチドはその後途中で相補性アッセイの第２フラグメントに遭遇するだろう。局在化の増加はその後、生細胞上または細胞溶解物中の化学発光または蛍光基質を用いて検出することができる機能的酵素の増加をもたらすだろう。
【０１３５】
（ヘテロ二量体化および輸送）
細胞表面受容体の二量体化、またはより高次のオリゴマー化は多くの場合、受容体活性化および次のシグナル伝達の必須条件である。本明細書において記載される方法および組成物は、ヘテロ二量体化プロセスを研究するのに用いることもできる。
【０１３６】
特定の実施形態では、受容体の結合パートナーを同定することもできる。例えば、特定の受容体は別の／第２タンパク質の存在下でのみ細胞表面へ移動することが示された。ＧＡＢＢＲ１はＧＡＢＢＲ２の存在下でのみ原形質膜上に発現する。こうした例では、標的ペプチドは相補性アッセイの第１フラグメントと融合し、原形質膜／エンドソーム上の相補性アッセイの第２フラグメントを発現する細胞背景において発現される。この場合ＧＡＢＢＲ２である第３タンパク質は次にシステムに導入されるだろう。第３タンパク質の導入後に得られる各細胞株は、相補酵素の量に関して親と比較されるだろう。ＧＡＢＢＲ２が標的ペプチド（ＧＡＢＢＲ１）を結合し、その原形質膜／エンドソーム局在化を向上させることができる場合、シグナルゲインが検出されるだろう。
【０１３７】
（追加の有用性）
研究は多くの場合研究することが困難である味覚受容体または嗅覚受容体までさらに拡大することができる。
【０１３８】
本親和性が減少した酵素相補性レポーターシステムの追加の有用性としては、これらに限定されないが、米国特許出願公開第２００３０２１９８４８号；第２００７０２７５３９７号；第２０１００２８５４５１号；米国特許第４，３７８，４２８号；第４，７０８，９２９号；第５，０３７，７３５号；第５，１０６，９５０号；第５，３６２，６２５号；第５，４６４，７４７号；第５，６０４，０９１号；第５，６４３，７３４号；ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１９７３２号；第ＷＯ９８／０６６４８号；第ＷＯ９２／０３５５９号；第ＷＯ０１／０２１４号；第ＷＯ０１／６０８４０号および第ＷＯ００／０３９３４８号に記載されるものが挙げられ、その開示は本明細書に参照により組み入れる。
【０１３９】
（キット）
本発明により、上述した用途の１つ以上を実施するのに用いられるキットも提供される。特定の実施形態では、上記で概説したように、キットは少なくとも、標的ペプチド、細胞内区画局在化タンパク質、化合物およびレポーターサブユニットを含む１つ以上の融合タンパク質を構成的にまたは誘導的に発現する細胞を含む。特定の実施形態では、上記で概説したように、キットは、こうした細胞を生成するための成分、例えば、同じまたは異なるベクター上に存在する第１および第２融合タンパク質をエンコードする第１および第２核酸ならびに／または標準的な分子生物学技術を用いて目的のタンパク質を融合することができるレポーターサブユニットをエンコードする核酸を含む。キットは、これらに限定されないが、酵素基質、細胞増殖培地、等を含む、本発明の特定の実施形態を実施するのに用いられる１つ以上の追加の成分をさらに含むことができる。
【０１４０】
特定の実施形態では、本キットは：（ａ）（ｉ）標的ペプチドおよびβ−ガラクトシダーゼの第１フラグメントを含む第１融合タンパク質（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼの第２フラグメントおよび細胞内区画局在化タンパク質を含む第２融合タンパク質を含む細胞において；β−ガラクトシダーゼの第１および第２フラグメントは野生型フラグメントと比較して減少した互いの親和性を有する、細胞ならびに（ｂ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む。特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼのフラグメントの１つは変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである。１つの実施形態では、第２融合タンパク質の局在化は第１融合タンパク質が保持される細胞内区画以外の細胞内区画上である。１つの実施形態では、第２融合タンパク質の局在化および第１融合タンパク質は細胞中の同じ細胞内区画上にある。
【０１４１】
特定の実施形態では、キットは：（ａ）（ｉ）標的ペプチドおよび小胞体中のβ−ガラクトシダーゼの第１フラグメントを含む第１融合タンパク質（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼの第２フラグメントおよびＥＲ以外の細胞内小器官中の細胞内区画に局在するタンパク質を含む第２融合タンパク質（ｉｉｉ）化合物を含む細胞において；β−ガラクトシダーゼの第１および第２フラグメントは野生型フラグメントと比較して減少した互いの親和性を有する、細胞ならびに（ｂ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む。特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼのフラグメントの１つは変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである。１つの実施形態では、第２融合タンパク質の局在化は第１融合タンパク質が保持される細胞内区画以外の細胞内区画上で起こる。１つの実施形態では、第２融合タンパク質の局在化および第１融合タンパク質は細胞中の同じ細胞内区画上にある。
【０１４２】
特定の実施形態では、キットは（ａ）標的ペプチドおよびβ−ガラクトシダーゼの第１フラグメントを含む第１融合タンパク質をエンコードする第１核酸；（ｂ）細胞内区画局在化タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼの第２フラグメントを含む第２融合タンパク質をエンコードする第２核酸を含むことができ、β−ガラクトシダーゼの第１および第２フラグメントは野生型フラグメントと比較して互いに親和性を有する。特定の実施形態では、第１β−ガラクトシダーゼフラグメントは変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドであり、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２で構成されるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い前記第２β−ガラクトシダーゼフラグメントとの結合親和性を有する。特定の実施形態では、核酸はベクター上に存在する。特定の実施形態では、ベクターはベクター上に配置される制限部位を含み、配列をコードするタンパク質が制限部位を用いてベクターに挿入される場合、ベクターはタンパク質およびβ−ガラクトシダーゼフラグメントの融合タンパク質をエンコードする。特定の実施形態では、キットはβ−ガラクトシダーゼ基質をさらに含む。
【０１４３】
上記成分に加えて、本キットは本方法を実施するための説明書をさらに含むことができる。これらの説明書は本キット中にさまざまな形態で存在することができ、その１つ以上がキット中に存在することができる。これらの説明書が存在することができる１つの形態は、適切な媒体または基板上の印刷情報、例えば、情報が印刷された紙、キットのパッケージ、パッケージ挿入物等である。また別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、フロッピーディスク、ＣＤ、等だろう。存在することができるまた別の手段は、インターネットによって離れたサイトで情報にアクセスするために用いることができるウェブサイトアドレスである。キット中にはいずれかの便利な手段が存在することができる。
【０１４４】
本方法を用いて研究することができ、本キットにおいて発現ベクターにクローニングすることができる、例となるＧＰＣＲとしては、アドレナリン受容体（例えばＡＤＲＡ１Ａ、ＡＤＲＡ１Ｂ、ＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＡＤＲＢ２）、ヒスタミン受容体（例えばＨＲＨ１、ＨＲＨ２、ＨＲＨ３、ＨＲＨ４）、セロトニン受容体（例えばＨＴＲ１Ａ、ＨＴＲ１Ｂ、ＨＴＲ１Ｄ、ＨＴＲ１Ｆ、ＨＴＲ２Ａ、ＨＴＲ２Ｂ、ＨＴＲ２Ｃ、ＨＴＲ５Ａ、ＨＴＲ７Ｂ）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１、ＤＲＤ２）、ムスカリン受容体（例えばＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２）およびアンジオテンシン受容体（例えばＡＧＴＲ１）が挙げられる。
【０１４５】
網膜炎のモデルでは、ロドプシンＧＰＣＲをＥＤでタグ付けし、９−シスレチノールの添加に応答するその転移を研究した。用量応答曲線は相補性による影響の顕著な結果を示した。また、ＡＶＰＲ２（アルギニンバソプレシン受容体２）、アンタゴニストが治療的に用いられるＧＰＣＲをＳＲ４９０５９、小分子バソプレシンＶ１ａ受容体アンタゴニストで研究した。再び、この標的ペプチドを用いて実行可能なアッセイを開発することができたことを示す用量応答曲線を得た。ＡＶＰＲ２遺伝子における２００超の変異は、腎性尿崩症を有する人々において同定された。これらの変異のほとんどはバソプレシンＶ２受容体タンパク質を誤った三次元形状に誤って折り畳ませる。よって本アッセイは、ヒトにおいて起こる誤った折り畳みの変異の例でＡＶＰＲ２遺伝子生成物と結合する化合物を同定するのにとくに適用可能性を有する。
【０１４６】
以下のさらなる実施例は、限定ではなく、例示により提供される。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１：親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼシステム）
我々は最近、細胞におけるタンパク質輸送をモニタリングするための低親和性酵素相補性システムについて記載した。低親和性相補性を達成するためβ−ガラクトシダーゼを用い、Jacob and Monod (1961)により最初に記載された古典的αペプチドを結晶構造に基づき特定の残基で切断および変異し、オメガ（ω）フラグメントと弱く相補するαペプチド（α＊）を誘導した。区画内のタンパク質移動をアッセイするため、１つの酵素フラグメント、ωを細胞内区画の特定の領域に局在化させ、小さな相補性α＊ペプチドを目的のタンパク質と融合させた。ωに近接するα＊の濃度は用量および時間依存的に得られる酵素活性の量と相関し、局所タンパク質濃度について遺伝的にエンコードされるバイオセンサーとして作用する（T.S.Wehrman, C.L. Casipit, N.M. Gewertz, H.M. Blau, Nat Methods 2, 521 (Jul, 2005)）。それらの低親和性のため、α＊およびωβ−ガラクトシダーゼフラグメントの相互作用は、相補酵素を維持するのに十分には強くない。結果として、いずれかの所定の時間で得られるβ−ガラクトシダーゼ活性は、２つのフラグメントの動的相互作用の尺度であり、それらの局所濃度の反映である。この親和性が減少したシステムについては２００５年５月１８日出願の米国特許出願第１１／１３２，７６４号にさらに記載され、そのシステムおよびその出願の実験セクションにおいて記載されるその製造方法の開示は本明細書に参照により組み入れる。
【０１４８】
システムは、受容体タンパク質と融合したβ−ガラクトシダーゼ酵素の低親和性変異サブユニットの相補性の機能として、細胞における輸送経路に従うタンパク質をモニタリングするのにさらに用いられた。
【０１４９】
この特徴の組み合わせは、エネルギー移動（Y. Xu, D.W. Piston, C.H. Johnson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151 (Jan 5, 1999); B.A. Pollok, R. Heim, Trands Cell Biol 9, 57 (Feb, 1999)）またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（J.N. Pelletier, F.X. Campbell-Valois, S.W. Michnick, Proc. Natl. Acad. Sci USA 95, 12141 (Oct 13, 1998)）、β−ラクタマーゼ（A. Galarneau, M. Primeau, L.E. Trudeau, S.W. Michnick, Nat Biotech 20, 619 (Jun, 2002); T. Wehrman, B. Kleaveland, J.H. Her, R.F. Baliant, H.M. Blau, Proc. Natl. Acad. Sci USA 99, 3469 (Mar 19, 2002)）、ルシフェラーゼ (R. Paulmurugan, S.S.Gambhir, Anal Chem 75,1584 (Apr 1, 2003)）、および前述したβ−ガラクトシダーゼ（F. Rossi, C.A. Charlton, H.M. Blau, Proc Natl Acad Sci USA 94, 8405 (Aug 5, 1997); F.Rossi, C.A. Charlton, H.M. Blau, Proc Natl Acad Sci USA 94, 8405 (Aug 5, 1997)）を含む分解酵素に基づく他のタンパク質相互作用検出システムでは見られない。
【０１５０】
（実施例２：変異ＡＤＲＢ２、Ｇタンパク質共役受容体の輸送をモニタリングするための親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼシステムの使用）
ＡＤＲＢ２は７つの膜貫通領域を含有するＧタンパク質共役受容体である。Ｗ１５８のアラニンへの変異は小胞体中でのタンパク質の保持を引き起こし得ることが示された。受容体のＡＤＲＢ２と結合する小分子との接触は、タンパク質の原形質膜およびエンドソーム区画への移動の向上をもたらす。
【０１５１】
このシステムでは、我々は２つの融合タンパク質を用いる：
【０１５２】
用いられる第１融合タンパク質は、標的ペプチド（ＡＤＲＢ２Ｗ１５８Ａ−ＰＫ）および相補性アッセイの第１フラグメントを含む。この構築物はＷ１５８のアラニンへの変異を含む。用いられる第２融合タンパク質は、エンドソーム局在化タンパク質および相補性アッセイの第２フラグメントを含む。細胞内部での両タンパク質の発現は、ＡＤＲＢ２結合化合物により調節することができる量の相補性をもたらす。
【０１５３】
この実験では、相補性アッセイの第１フラグメント（ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）ペプチド）およびエンドソーム局在化ＥＡと融合したＡＤＲＢ２  Ｗ１５８Ａ変異体を発現する細胞を、すべてＡＤＲＢ２と結合することが知られるさまざまなアドレナリンアゴニストおよびアンタゴニストで処理した。それらは以下の表１に示す：
【０１５４】
【表１】
2014519851.tif 000004
【０１５５】
プロパノロールで得られた結果を図４においてグラフにプロットする。それらの結果の分析を以下に示す表２にまとめる。
【０１５６】
【表２】
2014519851.tif 000005
「ボトム」とは下方プラトーにおいて観察される最低濃度を指す。「トップ」とは上方プラトーにおいて観察される最高濃度を指す。「ＬＯＧＥＣ５０」とはＥＣ５０値のログを指す。「ＨＩＬＬＳＬＯＰＥ」とは曲線の勾配を指す。「ＥＣ５０」とは化合物の最大半量応答を指す。
【０１５７】
用いられるプロトコルは以下のとおりだった：
１）５０００細胞／ウェルを２０μＬアッセイ培地（ＭＥＭＥ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕｔ）に播種する。
２）細胞を一晩３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。
３）用量応答曲線の５倍の５μＬ／ウェルの化合物を細胞に添加する。
４）細胞を１６時間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。
５）１２μＬ／ウェルのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒＣＬ基質をウェルに添加する。
６）アッセイプレートを１時間室温でインキュベートする。
７）アッセイプレートをＥｎｖｉｓｉｏｎ発光読取装置上で読み取る。
８）線形回帰（可変勾配）曲線近似関数を用いるＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いてデータをプロットする。
【０１５８】
細胞を溶解し、相補活性を、化学発光β−ガラクトシダーゼ基質を用いて測定した。試験化合物を含有する各ウェルの値を、緩衝液のみを収容する対照ウェルから得られたシグナルで割った。輸送アッセイはアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の存在を検出することができるが、活性アッセイ（アレスチンおよびｃＡＭＰ）はアゴニスト化合物のみを検出することができることが上記表から明らかである。
【０１５９】
（実施例３：変異ＫＣＮＨ２（ｈＥＲＧ）、カリウムイオンチャネルの輸送をモニタリングするための親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼシステムの使用）
ＫＣＮＨ２（ｈＥＲＧ）は、Ｋｖ１１．１カリウムイオンチャネルとして知られるタンパク質についてコードする遺伝子である。ＫＣＮＨ２における変異は、ｈＥＲＧタンパク質の誤った折り畳みをもたらし、ＥＲ中でのタンパク質の保持を引き起こし得るが、結合部分の導入はタンパク質の変異経路による作用部位へ進行をもたらす。
【０１６０】
このシステムでは、我々は２つの融合タンパク質を用いる：
【０１６１】
用いられる第１融合タンパク質は、標的ペプチド（ＫＣＮＨ２−ＰＫ）および相補性アッセイの第１フラグメントを含む。単一点変異がＫＣＮＨ２に導入される。用いられる第２融合タンパク質は、原形質膜局在化タンパク質および相補性アッセイの第２フラグメントを含む。相補性アッセイの第２フラグメントは、ホスホリパーゼＣγのＰＨドメインと融合することにより、原形質膜に局在化した。細胞内部での両タンパク質の発現は、ＫＣＮＨ２結合化合物により調節することができる量の相補性をもたらす。
【０１６２】
この実験では、相補性アッセイの第１フラグメント（ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）ペプチド）および原形質膜局在化ＥＡと融合したＫＣＮＨ２変異体を発現する細胞を、イオンチャネルと結合するさまざまな化合物で処理した。
【０１６３】
さまざまな化合物（クロフィリウム、ハロペリドール、アステミゾール）で得られた結果を図５においてグラフにプロットする。これらの結果の分析は以下の表３に示す：
【０１６４】
【表３】
2014519851.tif 000006
【０１６５】
イオンチャネル輸送の別の例は、ＥＲ中に捕捉される誤って折り畳まれたｈＥＲＧタンパク質をもたらすＫＣＮＨ２における単一点変異を含む。リガンドの結合は、安定化（「救出」）およびタンパク質の膜への輸送をもたらす。−ＰＬＣ（ＰＨ）−ＥＡは膜に結合する。アッセイはＥｎｄｏ−ＥＡ細胞では機能しなかったので、このアッセイのためにｅｎｄｏ−ＥＡを発現させることはおそらく不要である。アッセイは一晩稼働させる。
【０１６６】
（実施例４：変異体Ｍ４（ＣＨＲＭ４）、アセチルコリン受容体の輸送をモニタリングするための親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼシステムの使用）
Ｍ４（ＣＨＲＭ４）は、Ｇタンパク質共役受容体のより大きなファミリーに属するムスカリンコリン受容体である。Ｃ末端での欠失はＥＲ中でのタンパク質の保持を引き起こし得る。ＣＨＲＭ４と結合するさまざまな小分子の添加は、タンパク質の原形質膜およびエンドソーム区画への移動の向上をもたらす。
【０１６７】
このシステムでは、我々は２つの融合タンパク質を用いる：
【０１６８】
用いられる第１融合タンパク質は、標的ペプチド（ＣＨＲＭ４（ＤＣ）−ＰＫ）および相補性アッセイにおいて用いられるβ−ガラクトシダーゼの第１フラグメントを含む。ＣＨＲＭ４（ムスカリンコリン受容体４）は、ＵｎｉＰｒｏｔＰ０８１７３で得られるアミノ酸配列を有する。そこでは適切なＤＮＡ配列との結合も見られる。この融合物では、ＣＨＲＭ４は融合物の輸送を妨げるＣ末端での欠失を有する。受容体の折り畳みおよびよって輸送に影響を及ぼすさまざまな変異が生成され得る；例えばZheng et al. “Conserved Extracellular Cysteine Pair in the M3 Muscarinic Acetylcholine Receptor Is Essential for Proper Receptor Cell Surface Localization but Not for G Protein Coupling,” J. Neurochem. 72:2404-2414 (1999)を参照されたい。
【０１６９】
用いられる第２融合タンパク質は、エンドソーム／原形質膜局在化タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼの第２フラグメント（ＥＡ）を含む。相補性アッセイの第２フラグメントは、ホスホリパーゼＣγのＰＨドメインと融合させることにより、原形質膜に局在化させた（Watt et al. “Subcellular localization of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate using the pleckstrin homology domain of phospholipase C delta1,” Biochem J. 363:657-686 (2002)参照）。細胞内部での両タンパク質の発現は、ＣＨＲＭ４結合化合物により調節することができる量の相補性をもたらす。
【０１７０】
この実験では、相補性アッセイの第１フラグメント（ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）ペプチド）およびエンドソーム局在化ＥＡ／原形質膜局在化ＥＡと融合したＣＨＲＭ４変異体を発現する細胞をイオンチャネルと結合するさまざまな化合物で処理した。
【０１７１】
さまざまな化合物（ＬＹ２０３３２９８、ＶＵ０２３９４２９、ＶＵ１００１０、ＯＸＯ  Ｍ、キサノメリンオキサレート、４−ＤＡＭＰ）で得られた結果を図６においてグラフにプロットする。
【０１７２】
（結論）
上記の具体的な記載は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲そのものおよび同等の範囲により定義される、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。本明細書において引用されるすべての特許文献および非特許文献は、それぞれの個別の特許文献または非特許文献を参照により組み入れると具体的および個別に示されたように本明細書に参照により組み入れ、これに関して文献が引用される方法および／または材料を開示および記載するために本明細書に参照により組み入れる。いずれの文献の引用も出願日前のその開示についてであり、先行発明により本発明にはこうした文献に先立つ権利が与えられないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される文献の公表日は実際の公表日とは異なり得、個別に確認される必要があり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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