(57)【要約】  本発明は、(i)脂質混合物をイソプロパノールに溶解して均質混合物を形成させるステップと、(ii)均質混合物からイソプロパノールを除去して脂質膜を形成させるステップと、を含む、脂質膜の製造方法であって、該脂質混合物が脂質およびコレステロールを含む、上記方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(i)脂質混合物をイソプロパノールに溶解して均質混合物を形成させるステップと、
(ii)均質混合物からイソプロパノールを除去して脂質膜を形成させるステップと、
を含む、脂質膜の製造方法であって、該脂質混合物が脂質およびコレステロールを含む、上記方法。
【請求項２】
脂質混合物が更にリポ多糖を含む、請求項１に記載の脂質膜の製造方法。
【請求項３】
リポ多糖がMPLである、請求項２に記載の脂質膜の製造方法。
【請求項４】
均質混合物から蒸発によって溶媒を除去する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂質膜の製造方法。
【請求項５】
均質混合物から真空蒸留によって溶媒を除去する、請求項５に記載の脂質膜の製造方法。
【請求項６】
以下のステップ：
a)請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって脂質膜を製造するステップと、
b)水和溶液（hydrating solution）で脂質膜を水和して粗リポソーム懸濁液を形成させるステップと、
c)ステップb)で得られた粗リポソーム懸濁液のサイズを高せん断および高圧ホモジナイザーで小さくしてリポソームを形成させるステップと、
を含む、リポソームの製造方法。
【請求項７】
水和溶液が緩衝剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
緩衝剤がリン酸緩衝剤である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
更に
d)リポソームを滅菌するステップ
を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって製造される脂質膜またはリポソーム。
【請求項１１】
コレステロールおよびイソプロパノールを含むリポソーム。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のリポソームを含む、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームの製造方法に関する。特に、本発明は、イソプロパノールを用いたコレステロール含有リポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
南アメリカの木キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する、アジュバント活性を有する免疫学的活性サポニン画分は当分野において公知である。例えば、QS21は、キラヤ・サポナリア・モリナの木に由来するHplc精製画分であるQA21としても知られ、その製造方法は米国特許第5,057,540号に（QA21として）開示されている。キラヤサポニンはまた、Scottら、Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409にアジュバントとして開示されている。しかしながら、アジュバントとしてのQS21の使用は、特定の不利益と関連する。例えば、QS21を遊離の分子として哺乳動物に注射した場合、注射部位で壊死、すなわち局所的な組織の死が起こることが観察されている。
【０００３】
驚くべきことに、QS21およびステロールの組合せを含む製剤の使用によって、注射部位での壊死が回避可能であることが見出された。好ましいステロールとしてはβ-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが挙げられる。これらのステロールは当分野において周知であり、例えばコレステロールはメルクインデックス、第11版、第341頁に動物の脂肪中に見られる天然のステロールとして開示されている。
【０００４】
ここ数十年の間に、リポソーム（二重層脂質ベシクルとしても知られる）は、薬剤化合物をカプセル化し、送達するための使用が増大してきている。リポソームは1種以上の脂質および／またはリン脂質の二重層からなり、他の分子、例えばタンパク質または炭水化物をその構造中に含むことができる。リポソーム上の脂質層は、リポソームが目的地に到達して標的癌細胞の外膜に付着するまで内包された薬剤化合物を閉じ込めて保護する。このプロセスによって、健康な細胞に対する薬剤の毒性を最小限にし、治療効率を高めることができる。構造中に脂質および水相の双方が存在するために、リポソームは両親媒性化合物に加えて水溶性物質および脂溶性物質のカプセル化あるいは封入（entrapment）に利用することができる。
【０００５】
リポソームの製造は、脂質／リン脂質分子を水性媒体中に分散させるためのエネルギーを加えることが必要である。リポソームの生成のための基本的なメカニズムは、リン脂質と水分子との親水性−疎水性相互作用である。リポソーム調製のための方法のほとんどは成分をクロロホルムおよびメタノール等の有機溶媒に可溶化することを含む。
【０００６】
本発明者等はコレステロールを含むリポソームの大規模製造に関連する多くの問題を見出した。本発明はこれらの問題に対処するものである。
【発明の概要】
【０００７】
リポソーム製造の最初のステップは脂質膜の調製である。このプロセスは、脂質混合物を有機溶媒に溶解して均質混合物を生成させ、次に混合物から溶媒を除去して、混合物が含まれる反応容器の表面上に脂質膜を生成させることを含む。
【０００８】
本発明者等は、コレステロールを含む脂質混合物をエタノールに溶解した場合、全てのエタノールを除去する前に均質混合物の沈殿が生じることを見出した。一旦沈殿が生じると、成分が「スラッジ（sludge）」を形成し、そこからの溶媒の除去はほとんど不可能であるため、得られた混合物を十分に乾燥させることは非常に困難である。得られた沈殿混合物は廃棄せざるを得ず、商業的損失を生じていた。
【０００９】
本発明者等は、エタノールをイソプロパノールに置き換えることで、この沈殿を回避可能であることを見出した。従って本発明は、(i)脂質混合物をイソプロパノールに溶解して均質混合物を形成させるステップ；および(ii)均質混合物から溶媒を除去して脂質膜を形成させるステップ、を含む、脂質膜の製造方法であって、脂質混合物が脂質およびコレステロールを含む、上記方法を提供する。
【００１０】
本方法は、迅速かつ効率的なコレステロール含有リポソームの製造を可能とする。更に、本方法は多くの更なる利点を有する。
【００１１】
第一に、上記したように、本方法は脂質膜の形成中のコレステロールの沈殿が回避される。第二に、脂質膜形成のための全処理時間が短縮される。従って、脂質混合物を乾燥する際の脂質混合物成分の分解が低減される。最後に、脂質膜中に存在する残存溶媒が工業的規模の製造中の脂質膜の水和を可能とするために必要であるため、毒性の低い有機溶媒を用いた操作が必須である。
【００１２】
理論に拘束されるものではないが、本発明者等は、均質な反応混合物の温度低下および溶媒除去時間の短縮は、他の有機溶媒と比較してイソプロパノールの揮発性が高いことによってもたらされると考えている。温度低下および溶媒除去時間の短縮のために、より高温では不安定であり得る脂質混合物中の任意の更なる成分、例えばモノホスホリルリピドＡ（MPL）がより低い温度とより短時間の加熱にさらされることとなり、結果的にこれらの安定性のために有益である。
【００１３】
第二に、リポソームを製造する場合、脂質混合物を溶解するために使用した溶媒の残存量が最終のリポソーム製剤中に残っていることは通常のことである。残存量の溶媒は脂質膜の再水和のために非常に重要であり、また脂質膜の再水和の際にリポソームが反応容器の壁に付着することを抑制する。しかしながら、これらの残存溶媒は、揮発性有機不純物（organic volatile impurities, OVI）として知られ、治療的有益性はなく、ヒトの健康および環境に有害であり得る（Dwivedi, 2002）。従って、有機溶媒は、無毒であるか、または少なくとも低毒性であることが望ましい。本発明の方法で使用するイソプロパノールは毒性の低いクラス３の溶媒であり、従って、本発明の方法を使用して製造されたリポソームと関連してのヒトの健康に対するリスクは低いと考えられる。
【００１４】
一実施形態において、脂質混合物は更にリポ多糖を含有する。別の実施形態において、リポ多糖はMPLである。
【００１５】
一実施形態において、イソプロパノールは蒸気蒸留によって均質混合物から除去される。別の実施形態において、イソプロパノールは蒸発真空蒸留によって均質混合物から除去される。更なる実施形態において、イソプロパノールは均質混合物を噴霧乾燥することによって除去することができる。
【００１６】
本発明はまた、a)本発明の方法に従って脂質膜を製造するステップ；b)脂質膜を水和溶液で水和して粗リポソーム懸濁液を形成させるステップ；c)ステップb)で製造した粗リポソーム懸濁液のサイズを高せん断および高圧ホモジナイザーで低下させてリポソームを形成させるステップ、を含む、リポソームの製造方法を提供する。
【００１７】
一実施形態において、脂質膜を水和するために使用する溶液は緩衝剤を含む。別の実施形態において、緩衝剤はリン酸緩衝剤である。
【００１８】
一実施形態において、ステップc)は、c')粗リポソーム懸濁液を高せん断ミキサーでプレホモジナイズするステップと；c'')ステップc')で製造した溶液を高圧ホモジナイザーでホモジナイズするステップ、を含む。
【００１９】
一実施形態において、本方法はリポソームを滅菌する更なるステップd)を含む。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法によって製造された脂質膜またはリポソームを含む。
【００２１】
更なる実施形態において、本発明は、コレステロールおよびイソプロパノールを含有するリポソームを提供する。この実施形態において、イソプロパノールは残存量で存在する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ステップ(i)
本発明の方法のステップ(i)は、脂質混合物をイソプロパノールに溶解して均質混合物を形成させることを含む。このステップは、第１の反応容器（container）中で行う。本発明において使用するための好適な反応容器は多量の（a volume of）液体を保持することができるものであり、限定するものではないが、反応容器（vessel）、エバポレーターフラスコ、および試験管が挙げられる。
【００２３】
脂質混合物
ステップ(i)で使用する脂質混合物は、少なくとも1種の脂質を含むが、2種、3種、4種、5種、またはそれ以上の異なる脂質を含んでいても良い。一実施形態において、脂質はリン脂質である。別の実施形態において、脂質はジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）である。
【００２４】
脂質混合物中に存在する脂質の量は、通常約40-90％(w/w)の範囲内、例えば約40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89または90％(w/w)である。別の実施形態において、脂質混合物中に存在する脂質の量は77％である。
【００２５】
コレステロール
脂質混合物はまた、コレステロールを含有する。コレステロールは細胞膜中に見られるロウ状のステロイド代謝産物であり、全ての動物の血漿中に輸送される。これは哺乳動物の細胞膜の必須の構造成分であり、適切な膜の透過性および流動性を確立するために必要とされる。コレステロールは式（C27H46O）を有しており、(3β)-コレスト-5-エン-3-オールとしても知られている。コレステロールは386.65 g/molのモル質量と、0.095 mg/L（30℃）の水溶性を有する白色結晶性粉末である。
【００２６】
脂質混合物中に存在するコレステロールの量は、通常約5-40％(w/w)の範囲内、例えば約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40％(w/w)である。別の実施形態において、脂質混合物中に存在するコレステロールの量は19.2％である。
【００２７】
リポ多糖
別の実施形態において、脂質混合物は更にTLR-4アゴニストである免疫刺激剤を含有する。例えば、これはリポ多糖であり得る。リポ多糖は、本発明の方法を用いて作製したリポソームにおける免疫刺激剤として機能することが意図される。
【００２８】
一実施形態において、リポ多糖はリピドＡの非毒性の誘導体、例えばモノホスホリルリピドＡ、またはより具体的には3-脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（3D-MPL）である。3D-MPLはグラクソスミスクラインバイオロジカルズS.A.からMPLの名称で販売されており、本明細書を通じてMPLまたは3D-MPLという。例えば米国特許第4,436,727号、4,877,611号、4,866,034号、および4,912,094号を参照されたい。3D-MPLは主としてIFN-γ（Th1）表現型でCD4+のT細胞応答を促進する。3D-MPLはGB2220211 A号に開示された方法に従って製造することができる。化学的には、これは3、4、5または6本のアシル化された鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。本発明の組成物においては小粒子3D-MPLを使用することができる。小粒子3D-MPLは、0.22μmのフィルターを通して滅菌濾過することができるような粒径を有している。このような調製物はWO94/21292号に記載されている。
【００２９】
使用可能な他のTLR-4リガンドはアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）であり、例えばWO 98/50399号または米国特許第6,303,347号（AGPの調製方法も開示されている）に開示されたもの、好適にはRC527もしくはRC529、または米国特許第6,764,840号に開示されたようなAGPの薬学上許容される塩である。いくつかのAGPはTLR-4アゴニストであり、いくつかはTLR-4アンタゴニストである。双方共が免疫刺激剤として有用であると考えられる。
【００３０】
含める場合には、脂質混合物中に存在するリポ多糖の量は、通常約0.5-10％(w/w)の範囲内、例えば約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9または10％であろう。一実施形態において、脂質混合物中に存在するリポ多糖の量は3.8％である。
【００３１】
上記の脂質混合物の種々の成分は、通常乾燥粉末の形態であろう。しかしながら、本発明の方法は、液状、例えば油または溶液状の成分を含めることも意図される。
【００３２】
スケール
本発明者等は、エタノールに溶解させた、コレステロールを含む脂質混合物の沈殿が、小規模および大規模の双方で生じることを見出したが、大規模で脂質膜を製造する場合に特に問題であることを見出した。従って、一実施形態において、イソプロパノールに溶解させる脂質混合物の総量は、200g以上、例えば200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、7500、10000gまたはそれ以上である。
【００３３】
イソプロパノール
本発明の方法は、脂質混合物をイソプロパノール（CAS 67-63-0）に溶解することを必要とする。イソプロパノール（C3H8O）は、イソプロピルアルコール、プロパン-2-オール、または2-プロパノールとしても知られており、強い臭気を有する無色で可燃性の化学化合物である。第2級アルコールの最も簡単な例であり、アルコールの炭素が2個の別の炭素に結合しており、(CH3)2CHOHと記載される場合がある。これはプロパノールの構造異性体である。イソプロパノールはモル質量60.1 g mol-1、密度0.786 g/cm3（20℃）および沸点82.5℃（356K）を有する。
【００３４】
一実施形態において、脂質混合物1kgを約0.5-5リットルの範囲、例えば約0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、または5.0リットルの量のイソプロパノールに溶解させる。
【００３５】
均質混合物
ステップ(i)で必要な溶解は、溶液全体が均一な組成物を確実に得ることを意図するものである。これは、限定するものではないが、撹拌（agitation）、機械的もしくは手動による撹拌（stirring）または反復的ピペッティングを含む、任意の好適な手段によって達成することができる。
【００３６】
ステップ(ii)
本発明の方法のステップ(ii)は、均質混合物からイソプロパノールを除去して脂質膜を形成させることを含む。
【００３７】
イソプロパノールは蒸気蒸留によって除去する。蒸気蒸留は当分野において周知であり、第１の反応容器を予め決められた温度に加熱して均質混合物からイソプロパノールを蒸発させる。溶液は、蒸発を促進するために真空下としても良い。一実施形態において、イソプロパノールはロータリーエバポレーター、例えばBuchi社によって供給されているRotavaporをエバポレーター用フラスコと組み合わせて用いて除去する。その名が示す通り、ロータリーエバポレーターは除去／加熱プロセスの間、第１の反応容器を回転させ、イソプロパノールのより効率的な除去を可能とする。本発明の方法で使用するエバポレーター用フラスコは、通常約0.2-50リットルの範囲内、例えば約0.2、0.5、1.0、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、40または50リットルの容積のものである。
【００３８】
イソプロパノールの除去の間、第１の反応容器は通常約20-100℃の範囲の温度、例えば約20、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100℃に加熱する。一実施形態において、第１の反応容器は55℃に加熱する。一実施形態において、第１の反応容器は水浴で加熱する。
【００３９】
脂質膜（Lipidic film）
第１の反応容器からイソプロパノールが蒸発するにつれて、脂質が反応容器の表面上に脂質膜を形成し始める。この相は均質な油相としても知られている。
【００４０】
本発明の方法において使用する脂質混合物はコレステロールをも含む。従って、脂質膜もコレステロールを含む。更に、脂質膜は、本発明の方法が脂質混合物が更なる成分、例えばリポ多糖を含むことを必要とするような実施形態において、更なる成分も含むことができる。
【００４１】
上記の通り、残存量のイソプロパノールが脂質膜中に、従って第１の反応容器中に残っていることが有利である。この残存量は、脂質膜の水和において重要な役割を果たす。従って本発明の方法は、イソプロパノールの完全な除去を含む。しかしながら、本発明の方法は、ステップ(ii)の後に第１の反応容器中に当初のイソプロパノールの一部が保持されている場合を含むことが意図される。第１の反応容器中に保持されるイソプロパノールの量は通常使用する最初のイソプロパノールの約0.01％-20％の範囲内、例えば約0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10、12.5、15、17.5または20％であり得る。
【００４２】
リポソーム
本発明の方法によって製造される脂質膜は、主としてリポソームの製造のために使用することが意図される。脂質膜は水和溶液で水和され、得られた混合物を次いでホモジナイズしてリポソームを形成させる。
【００４３】
用語「リポソーム」は当分野において周知であり、水相（aqueous space）を囲む1以上の脂質二重膜を含むベシクル一般を規定する。本発明の方法によって製造されるリポソームは約10-300nmの範囲、例えば約10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275および300nmの直径を有し得る。一実施形態において、本発明の方法によって製造されるリポソームは50-150nmの直径を有し得る。リポソームの直径は、例えば既知の孔径のふるいもしくはメッシュを通してリポソーム組成物を押し出すことによって影響され得る。この方法、およびリポソームのサイズを調節する更なる方法は当分野において周知であり、例えばMayhewら（1984）Biochim. Biophys. Acta 775:169-174またはOlsonら (1979) Biochim.  Biophys. Acta 557:9-23に記載されている。
【００４４】
水和溶液（Hydrating solution）
脂質膜を水和させるために使用する水和溶液は、通常緩衝剤を含有する。一実施形態において、緩衝剤はリン酸ベースの緩衝剤である。水和溶液は通常、約5-9、例えば約5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、8.5、8.75または9のpHを有する。
【００４５】
水和溶液は、脂質膜を含む第一の反応容器に添加する。水和溶液の添加は、脂質膜の懸濁、および第一の反応容器の壁からのその除去を確実なものとすることを意図するものである。これは、限定するものではないが、撹拌（agitation）、機械的もしくは手動の撹拌（stirring）を含む任意の手段によって達成し得る。得られた溶液は、粗（coarse）リポソーム懸濁液と呼ばれる。
【００４６】
本発明の一実施形態において、粗リポソーム懸濁液は高せん断ミキサーによってプレホモジナイズされる。このステップは粗リポソームのサイズを小さくすることを意図するものである。ローターもしくはインペラーは、ステーターとして知られる固定要素と共に、あるいはローターおよびステーターのアレイは、混合すべき溶液を含むタンク中、または溶液が通過するパイプ中で使用され、せん断力を生じさせる。高せん断ミキサーを使用して、エマルジョン、懸濁液、リオゾル（液体中に分散された気体）および顆粒状の生成物を作製することができる。
【００４７】
一実施形態において、プレホモジナイズされた粗リポソーム懸濁液を、高圧ホモジナイザーを用いて更にホモジナイズする。このプロセスは当分野で周知であり、通常標準的なホモジナイザーを使用する。溶液は第一の反応容器中でホモジナイズしても良く、またはホモジナイズの前に第二の反応容器に溶液を移しても良い。第二の反応容器として使用するために好適な反応容器は多量の液体を保持可能なものであり、限定するものではないが、ステンレススチールタンク等のタンク、フラスコまたはビーカーが挙げられる。一実施形態において、粗リポソーム懸濁液はホモジナイズ中に加圧される。
【００４８】
一実施形態において、粗リポソーム懸濁液は、高せん断ホモジナイザーを高圧ホモジナイザーと直列に（in-line）つないで使用してホモジナイズする。このような技術は当分野で周知であり、ホモジナイゼーションは通常、5000-30000psiの範囲の圧力、すなわち5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000または30000psiの圧力で行う。
【００４９】
滅菌
一実施形態において、本発明の方法によって製造されたリポソームを滅菌する。一実施形態において、リポソームはろ過によって滅菌する。一実施形態において、リポソームは照射、特にγ線照射によって滅菌する。
【００５０】
脂質膜／リポソーム
本発明はまた、本発明の方法によって製造された脂質膜、またはリポソームを含む。これらの脂質膜およびリポソームはコレステロールおよび残存イソプロパノールを含むため、当分野で公知のものと識別可能である。従って本発明はまた、コレステロールおよびイソプロパノールを含むリポソームを含む。
【００５１】
残存イソプロパノールはリポソーム中に20-2000μg IPA/ml、例えば50-1900μg IPA/mlリポソーム、100-1800μg IPA/mlリポソーム、150-1500μg IPA/mlリポソーム、200-1300μg IPA/mlリポソーム、250-1200μg IPA/mlリポソーム、300-1100μg IPA/mlリポソーム、350-1000μg IPA/mlリポソーム、または400-900μg IPA/mlリポソームの量で存在し得る。
【００５２】
本発明のリポソームは、更なる免疫刺激剤または抗原もしくは抗原性調製物を更に含み得る。
【００５３】
この実施形態の一態様において、上記１以上の免疫刺激剤はサポニンであり得る。
【００５４】
免疫原性組成物
本発明はまた、本発明の方法によって製造されたリポソームを含む免疫原性組成物を包含する。一実施形態において、免疫原性組成物は、単一のリポソーム集団またはリポソーム集団の混合物と、抗原または抗原性調製物とから本質的に構成される。
【００５５】
一実施形態において、抗原は細菌、ウイルスまたは癌抗原である。一実施形態において、組み換えタンパク質は原核生物のタンパク質である。一実施形態において、抗原は組み換えタンパク質である。
【００５６】
抗原は、ウィルムス腫瘍遺伝子によって発現されるWT-1、もしくはアミノ酸1-249をほぼ含むそのN-末端断片WT-1Fを含むか、またはこれから構成され得る。WT-1は最初に小児の腎臓癌、ウィルムス腫瘍で過剰発現していることが見出されたタンパク質である。使用可能な抗原は、ほぼ完全長のタンパク質を抗原として含む。一実施形態において、抗原は、12merの切断されたtat配列およびWT1配列のアミノ酸2-281からなる292アミノ酸の組み換え融合タンパク質である、WT1-A10タンパク質を含むか、これから構成され得る。
【００５７】
PRAME（DAGEとしても知られる）は、本発明の腫瘍関連抗原として使用可能なもう一つの抗原である。
【００５８】
抗原およびその調製は、米国特許第5,830,753号に記載されている。PRAMEは登録番号U65011.1、BC022008.1、AK129783.1、BC014974.2、CR608334.1、AF025440.1、CR591755.1、BC039731.1、CR623010.1、CR611321.1、CR618501.1、CR604772.1、CR456549.1、およびCR620272.1で、註釈付きのヒト遺伝子データベースH-Inv DBに見出される。
【００５９】
PRAME抗原を含む融合タンパク質も使用可能である。PRAMEまたはその断片もしくは誘導体を、場合によって異種の融合パートナーとの融合タンパク質の形態で使用することができる。特に、PRAME抗原を、B型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae B）のプロテインDまたはその一部もしくはその誘導体との融合タンパク質の形態で好適に使用することができる。好適に使用可能なプロテインDの一部は、分泌配列またはシグナル配列を含まない。好適には、融合パートナータンパク質は、融合タンパク質配列のN-末端またはその内にアミノ酸Met-Asp-Proを含み、融合パートナータンパク質はプロテインDの分泌配列またはシグナル配列を含まない。例えば、融合パートナータンパク質はおよそ、または正確に、プロテインDのアミノ酸17-127、18-127、19-127または20-127を含むか、またはこれからなる。プロテインDとの融合タンパク質に基づく好適なPRAME抗原はWO2008/087102に記載されており、この文献全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００６０】
NY-ESO-1は、本発明の腫瘍関連抗原として使用可能なもう一つの抗原である。NY-ESO-1またはその断片もしくは誘導体は、場合によって異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で使用することができる。NY-ESO-1はUS5804381号に記載されており、この文献を参照によりその全体を本明細書中に組み入れる。タンパク質NY-ESO-1はおよそ180アミノ酸の長さであり、3つの領域から構成されると記載することができる：(a)ほぼアミノ酸1-70のN-末端領域；(b)ほぼアミノ酸71-134の中央領域；およびほぼアミノ酸71-180であるC-末端領域。NY-ESO-1は、融合タンパク質、例えば更なるCT抗原であるLAGE-1、またはその断片との融合物として使用することができる。参照によりその全体を本明細書中に組み入れるWO 2008/089074号を参照されたい。NY-ESO-1の断片を使用する場合、これらは好適には1以上のMHCクラス１またはクラス２エピトープ、例えばA31、DR1、DR2、DR4、DR7、DP4、B35、B51、Cw3、Cw6およびA2として知られているもの（WO 2008/089074号を参照）を含む。
【００６１】
本発明において使用可能な更なる抗原は、例えばMAGE-3ファミリーのMAGE抗原（MAGE-A3等）である。MAGE-3抗原は、例えばNY-ESO-1と組み合わせて製剤化するのに適していると記載されている。参照によりその全体を本明細書に組み入れるWO2005/105139を参照のこと。
【００６２】
MAGE-A3等のMAGE抗原は、そのままで、または誘導体、例えば化学修飾された誘導体の形態で、および／もしくは異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で使用することができる。例えば、MAGE抗原は遊離のチオールを形成する還元されたジスルフィド架橋を含み、例えばカルボキシアミドまたはカルボキシメチル基で誘導体化することができる。参照によりその全体を本明細書中に組み入れるWO 99/40188号を参照されたい。特に、MAGE抗原は、好適にはB型インフルエンザ菌のプロテインDまたはその一部もしくはその誘導体との融合タンパク質の形態で使用することができる。例えばプロテインDの最初の三分の一程度、またはプロテインDのN-末端の100-110アミノ酸を融合パートナーとして使用することができる。WO 99/40188号を参照されたい。
【００６３】
抗原は、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）またはプラスモジウム・ビバックス（Plasmodium vivax）等のマラリアを引き起こす寄生虫由来の調製物を含むか、またはこれらからなることができる。
【００６４】
プラスモジウム・ファルシパルム由来の可能な抗原としては、スポロゾイト周囲タンパク質（CSタンパク質）、RTS、PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-I、MSP-3、LSA-I、LSA-3、AMA-IおよびTRAPが挙げられる。他のP. ファルシパルム抗原としてはEBA、GLURP、RAPl、RAP2、セクエストリン（Sequestrin）、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230および他のプラスモジウム種におけるこれらの類似体が挙げられる。抗原は全タンパク質であってもその免疫原性断片であっても良い。
【００６５】
プラスモジウム・ファルシパルムのCSタンパク質由来の抗原は、ハイブリッド融合タンパク質の形態であり得る。融合タンパク質は、別のタンパク質またはその断片に融合したP. ファルシパルムのCSタンパク質由来のタンパク質を含み得る。融合タンパク質はP. ファルシパルムのCSタンパク質のN-末端またはC-末端断片を含み得る。あるいは、もしくはこれに加えて、融合タンパク質はP. ファルシパルムのCSタンパク質の中央領域の1以上の反復単位（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9またはそれ以上の反復単位）を含み得る。一実施形態において、融合タンパク質は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）またはその免疫原性断片と共にCSタンパク質由来の抗原を含むハイブリッド融合タンパク質である。典型的には、B型肝炎表面抗原はS抗原として知られる主要表面タンパク質、例えばadw血清型由来のS抗原を含む。
【００６６】
特に、融合タンパク質は、P. ファルシパルムのCSタンパク質の実質的に全てのC-末端部分、CSタンパク質の免疫優性領域の4個以上のタンデムリピート、およびB型肝炎表面抗原（HBsAg）を含み得る。一態様において、融合タンパク質は、CSタンパク質のC-末端部分と実質的に相同な少なくとも160個のアミノ酸を含む配列を含む。特にCSタンパク質の「実質的に全ての」C末端部分は、疎水性のアンカー配列を欠くC末端を含む。CSタンパク質はC末端の最後の12-14個（例えば12個）のアミノ酸を欠くものであり得る。
【００６７】
一実施形態において、本発明における使用のための融合タンパク質は、P. ファルシパルムのCSタンパク質の一部を含むタンパク質であり、これはHBsAgのN末端に線状リンカーを介してインフレームで融合された、NF54株（Caspers等、上掲）由来のP. ファルシパルム3D7クローンのアミノ酸207 395に実質的に対応するものである。リンカーはHBsAg由来のpreS2領域の一部または全てを含み得る。
【００６８】
本発明における使用のための特定の融合タンパク質は、WO 93/10152およびWO 98/05355に記載された、RTSとして知られる融合タンパク質である。RTSはRTS,S混合粒子（「S」は融合していないモノマーを示す）の形態で、またはRTSとして存在し得る。RTS,S粒子は2つのポリペプチドRTSおよびSを含み、これらは同時に合成され、例えば精製の間に自発的に複合体粒子構造（RTS,S）を形成することができる。これらの粒子はウイルス様粒子（VLP）と呼ばれることもある。こうした粒子は数多くの方法で、例えば融合タンパク質を酵母もしくは細菌等の好適な宿主中で発現させることによって調製することができる。
【００６９】
B型肝炎由来の表面抗原の存在とRTS,S粒子の形成とがハイブリッドタンパク質のCSタンパク質部分の免疫原性を高め、タンパク質の安定性を増し、および／または再現性のある製造を補助すると考えられている。
【００７０】
CSタンパク質は、寄生虫のライフサイクルのスポロゾイト段階または前赤血球段階、例えば肝臓段階で発現する任意の抗原から選択される、例えば以下に示す別の抗原と組み合わせて使用することができる：肝ステージ抗原（liver stage antigen）-1 (LSA-1)、肝ステージ抗原-3 (LSA-3)、トロンボスポンディン関連アノニマスタンパク質（thrombospondin related anonymous protein）(TRAP)、メロゾイト表面タンパク質-1 (MSP1) 主要メロゾイト表面タンパク質、およびアピカルメレゾイト抗原（apical merezoite antigen）-1 (AMA-1)。CS抗原と組み合わせて使用するための他の好適な抗原としては、PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-3、LSA-3、AMA-I、TRAP、GLURP、RAPl、RAP2、セクエストリン（Sequestrin）、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230が挙げられる。
【００７１】
本明細書に記載した任意の抗原の免疫原性断片は、抗原の少なくとも1つのエピトープを含み、マラリア抗原性を示し、好適な構築物中に提示された場合、例えば他のマラリア抗原もしくは他の非-マラリア抗原と融合させた場合に、または担体上に提示された場合に、免疫応答を生じさせ得るものであり、この免疫応答は天然の抗原に対するものである。典型的には、免疫原性断片は、マラリア抗原由来の少なくとも20個、または少なくとも50個、または少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。
【００７２】
P. ビバックス由来の可能な抗原としては、スポロゾイト周囲タンパク質（CSタンパク質）に基づく抗原およびDuffy抗原結合タンパク質およびその断片、例えばPvRII（例えばWO 02/12292を参照のこと）が挙げられる。
【００７３】
可能なCSタンパク質ベースの抗原は、P. ビバックスのCSタンパク質由来の配列を含む融合タンパク質を含み得る。一実施形態において、融合タンパク質はハイブリッド融合タンパク質である。本明細書におけるハイブリッドタンパク質は、P. ビバックスのI型およびII型由来のタンパク質を含み得る。特に、ハイブリッド融合タンパク質は、別のタンパク質またはその断片に融合したP. ビバックスのI型およびII型由来のタンパク質を含み得る。
【００７４】
一態様において、ハイブリッド融合タンパク質は、P. ビバックスのCSタンパク質（CSV）とB型肝炎由来表面抗原、一般的にはS抗原として知られる主要表面タンパク質、例えばadw血清型由来のS抗原とに由来するハイブリッドタンパク質を含む。
【００７５】
好ましくは、融合タンパク質は、
a. P. ビバックスのI型スポロゾイト周囲タンパク質の中央反復セクションからの少なくとも1個の反復単位、
b. P. ビバックスのII型スポロゾイト周囲タンパク質の中央反復セクションからの少なくとも1個の反復単位、および
c. B型肝炎ウイルス由来の表面抗原S
を含む、免疫原性ハイブリッド融合タンパク質である。
【００７６】
本発明のCSV由来の抗原成分は一般的にSタンパク質のアミノ末端側に融合される。より具体的には、CSV断片のC-末端側がS抗原のN-末端に融合される。
【００７７】
例えば、好適な融合タンパク質は、WO2008/009652に記載されたCSV-Sである。
【００７８】
酵母細胞では、一旦発現されると、ハイブリッド融合タンパク質（S抗原を含む）は、上記タンパク質（またはVLP）の多くのモノマーから構成されるリポタンパク質構造／粒子を自発的に組み立てることができる。そのような粒子は、酵母または細菌等の好適な宿主中で融合タンパク質を発現させることによって調製することができる。
【００７９】
選択されたレシピエント酵母株が、B型肝炎のS発現カセットの1以上の統合されたコピーもそのゲノム中に有する場合、得られた株は融合タンパク質としてハイブリッドタンパク質を、また非-融合S抗原を合成する。これらはハイブリッド融合タンパク質のモノマーとS抗原のモノマーとを含むリポタンパク質粒子に自発的に組み立てられ得る。
【００８０】
また、CSV-Sおよび／またはRTS単位を含むVLPが提供される。この粒子は本質的にCSV-SおよびRTS単位からなるものであり得る。あるいはまた、生成した粒子は本質的にCSV-S、RTSおよびS単位を含むからこれらからなるものである。このような混合粒子は例えばWO 2008/009650に記載されている。
【００８１】
結核の分野で興味ある抗原はMtb72fおよびその変異体、例えばWO 2006117240号に開示されたものを含む。特に興味ある抗原はM72であり、そのポリペプチド配列はWO 2006117240号の配列番号４に示されるものであり、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものである。
【００８２】
本発明において使用可能な更なる抗原は、結核抗原Rv1753およびその変異体、例えばWO2010010180号に開示されたもの、例えばWO2010010180号の配列番号１および２−７から選択されるRv1753配列、特に配列番号１のものである。結核の分野で興味ある別の抗原はRv2386およびその変異体、例えばWO2010010179号に開示されたもの、例えばWO2010010179号の配列番号１および２−７から選択されるRv2386配列、特に配列番号１のものである。結核の分野で興味ある別の抗原はRv3616およびその変異体、例えばWO2011092253号に開示されたもの、例えばWO2011092253号の配列番号１および２−７から選択される天然のRv3616配列、またはWO2011092253号の配列番号１６１−１６９、１７９および１８０から選択されるもの等の改変されたRv3616配列、特に配列番号１６７のものである。興味ある更なる抗原はHBHA、例えばWO97044463号、WO03044048号およびWO2010149657号に開示されたものである。
【００８３】
結核抗原はポリペプチドの形態で好適に利用されるが、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で提供されても良い。
【００８４】
本発明において使用可能な更なる抗原は、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）由来のものである。本発明において使用するためのVZV抗原は任意の好適なVZV抗原またはその免疫原性誘導体であり、好適には精製されたVZV抗原である。
【００８５】
用語「免疫原性誘導体」は、ヒトに投与した後にVZVに対する免疫応答を誘導する能力を保持する任意の分子を包含する。
【００８６】
誘導体の作製のための好適な方法は当分野において周知であり、例えばSambrook等、[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press]に開示された標準的な分子生物学の技術、例えばアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは再配置、またはその化学的改変のための技術を含む。一態様において、誘導体は、例えば切断物または他の断片を含む。
【００８７】
一態様において、本発明の文脈における誘導体はエピトープ、すなわち、ポリペプチドの免疫原特性に実質的に関連し、免疫応答を誘起することができる抗原決定基、一態様において、T細胞エピトープを含むアミノ酸配列である。
【００８８】
一態様において、免疫原性誘導体の免疫原活性のレベルは、好適には上記の免疫アッセイ技術によって評価して、それが由来するポリペプチドの免疫原性の少なくとも約50％、一態様では少なくとも約70％、一態様では少なくとも約90％またはそれ以上である。本発明のいくつかの態様では、免疫原性部分は、対応する完全長ポリペプチドよりも高い免疫原活性レベルを有するもの、例えば約100％を超えるまたは150％、またはそれ以上の免疫原活性を有すると同定され得る。一態様において、VZV抗原は糖タンパク質であり、一態様においてgE抗原（gp1としても知られる）、またはその免疫原性誘導体である。
【００８９】
gE抗原、そのアンカーのない誘導体（これも免疫原性誘導体である）およびその製造は、EP0405847号及びその参考文献に記載されている（Vafai A. Antibody binding sites on truncated forms of varicalla-zoster virus gpI(gE) glycoprotein Vaccine 1994 12:1265-9も参照されたい）。EP192902号もまた、gEおよびその製造を開示している。
【００９０】
一態様において、gEは本出願の図１の配列を有する切断型gEであり、参照により本明細書に完全に組み込まれるVirus research, vol 40, 1996 p199 ffに開示されたものである。gEへの言及は以後、文脈から他の意味であることが明らかでない限り、切断型gEへの言及を含むものとする。
【００９１】
更なる実施形態において、抗原または抗原性組成物は、本明細書に記載されたいずれかの抗原の誘導体であり得る。本明細書で使用する用語「誘導体」とは、その天然の形態に対して改変された抗原をいう。本発明の誘導体は、抗原特性を保持し、天然の抗原に対して生起される免疫応答を可能とし得るように天然の抗原と十分類似したものである。所定の誘導体がそのような免疫応答を生じるか否かは、ELISAまたはフローサイトメトリー等の好適な免疫学的アッセイによって測定することができる。
【００９２】
本発明は更に、疾患の治療において使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。この実施形態の具体例として、本発明は、上記の抗原と関連する疾患の治療において使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、癌、マラリア、結核またヘルペスの治療において使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌または黒色腫からなる群から選択される。
【００９３】
本発明は更に、本明細書に記載の免疫原性組成物の有効量を個体に提供するステップを含む、それを必要とする個体における癌、マラリア、結核またはヘルペスの治療または予防方法を提供する。
【実施例１】
【００９４】
初期実験
［実験１］
材料および方法
800gのDOPC＋200gのコレステロールを20Lのガラスフラスコ中の4Lエタノールに溶解
55℃の水浴中で溶解し、ロータリーエバポレーターで撹拌
水浴温度55℃、かつ以下の真空圧プログラムでエタノールを蒸発
600mbarで5分間
600-210mbarで15分間
210mbarで30分間
210-135mbar
結果
脂質混合物の溶解は成功した。蒸留プログラムはコレステロールの結晶化のために最終段階で中断された。
考察
使用した圧力はコレステロールの結晶化を避けることができなかった。実験２では新たな圧力プログラムで行った。
【００９５】
［実験２］
材料および方法
800gのDOPC＋200gのコレステロールを20Lのガラスフラスコ中の4Lエタノールに溶解
55℃の水浴中で溶解し、ロータリーエバポレーターで撹拌
水浴温度55℃、かつ以下の真空圧プログラムでエタノールを蒸発
600mbarで5分間
600-400mbarで2分間
400-230mbarで15分間
230mbarで165分間
230-20mbarで60分間
結果
脂質混合物の溶解は成功した。蒸留プログラムはコレステロールの結晶化のために132分後に中断された。
考察
より高い圧力およびより長時間の圧力プラトーではコレステロールの結晶化を避けることができなかった。実験３では手動による圧力設定で行った。
【００９６】
［実験３］
材料および方法
800gのDOPC＋200gのコレステロール＋40gのMPLを20Lのガラスフラスコ中の2Lエタノールに溶解
55℃の水浴中で溶解し、ロータリーエバポレーターで撹拌
脂質混合物の温度を≧50℃に維持するために、脂質混合物中に更なる温度プローブを設置して制御して、水浴温度55℃、かつ手動で設定した真空圧でエタノールを蒸発させた。
結果
脂質混合物の溶解は成功した。エタノールは200分で蒸発させることができた。
考察
本実験では、エタノール蒸留時間にわたって真空圧を手動で設定することで、コレステロールの結晶化を回避した。この作業方法は、工業において必要とされる堅固なプロセスとはならないため、工業的プロセスでは許容できない。脂質1040gの規模で脂質膜のプロセスを実施するにはエタノール溶媒は適切ではない。
【実施例２】
【００９７】
イソプロパノールの選択
材料および方法
3種の溶媒：エタノール、イソプロパノール、ヘプタン、を比較した。
50℃の各溶媒に溶液が飽和するまでコレステロールを徐々に加えた。
一旦飽和が達成されると、溶液のサンプルを採取し、ロータリーエバポレーターおよび／またはオーブンで溶媒を蒸発させる。コレステロールの乾燥した残渣を秤量し、溶解度値を決定する。
結果
50℃で測定したコレステロールの溶解度はそれぞれエタノール中で6.7％、ヘプタン中で4.3％、イソプロパノール中で12.1％である。
考察
これらの結果に基づき、イソプロパノールがエタノールの代替となる良好な溶媒であり得ると思われた。従ってイソプロパノールを用いた脂質膜実験を開始した。
【実施例３】
【００９８】
濃縮リポソームのバルク調製
濃縮リポソームのバルクは2つのステップで調製される。第１のステップは脂質膜の調製であり、第２のステップは濃縮リポソームバルクの調製である。
【００９９】
脂質膜の調製
脂質膜製造の第１ステップとして、DOPC（ジオレオイルホスファチジルコリン）、MPLおよびコレステロールを順次イソプロパノール（IPA）に溶解する。最初に780-820gのDOPCおよび39-41gのMPLを、55℃（50-60℃の範囲）の水浴中に置いた20Lの丸底フラスコ内の4LのIPAに懸濁し、大気圧下で30-45分間75 rpm（70-80 rpmの範囲）で回転させた。次いで、55℃（50-60℃の範囲）の水浴中に維持したDOPC/MPL溶液に195-205gのコレステロールを添加し、大気圧下で60-90分間75 rpm（70-80 rpmの範囲）で回転させて、コレステロールの完全な溶解を達成する。
【０１００】
原材料の溶解が完了した後、IPAを撹拌（70-80rpmの範囲）しながら除去し、55℃（50-60℃の範囲）の水浴中で次第に減圧して膜の残渣を得る。圧力は最初に2分間で1000から600、5分間で600から200mbar、次いで30分間で200から50mbarに落とす。次いで50mbarの状態を60分間維持する。続いて圧力を最終目標の0mbarに10分間で落とす。0mbarでの最終乾燥を90分間行って、1014-1080gの脂質膜重量を得る。
【０１０１】
得られた脂質膜は、直後に用いない場合は31日間まで2-8℃で保存する。
【０１０２】
濃縮リポソームバルク調製の最初のステップは、緩衝液中で脂質膜を水和させてリポソームの粗懸濁液を形成させることである。20Lの丸底フラスコ中に第1の半量（9.2-9.7kg）のPBS（9 mM Na2HPO4, 41 mM KH2PO4, 100 mM NaCl pH 6.1）を添加して、脂質膜を水和させる。フラスコを室温（15-25℃の範囲）の水浴中で79-81rpmで60-120分間回転させる。得られたリポソーム懸濁液を次いでステンレススチールタンクに移し、第2の半量（9.2-9.7kg）の同じ改変PBSで希釈して、52g/Lの脂質膜の目標濃度を達成する。脂質膜懸濁液を室温（15-25℃の範囲）で15分間、350rpmで撹拌して、大きなリポソームを得る。
【０１０３】
この水和ステップの後、リポソーム懸濁液をを高圧ホモジナイザーとつないだ高せん断ミキサーでホモジナイズして所望のナノサイズのリポソームを作製する。リポソーム懸濁液（19.5-20.5kg）を2barの給気圧下、140-160rpmの撹拌、および130-140kg/hの流速中で再循環させる。11500-13500psiのホモジナイゼーション圧を加え、高圧となる容器（surging vessel）中で生成物の懸濁液温度を20-25℃に維持する。ホモジナイゼーションシステムを10回程度通過させた後、ホモジナイゼーションプロセスを停止する。
【０１０４】
得られた濃縮バルクのリポソームを無菌（グレードＡ／クラス100）領域またはアイソレーター中で0.22μmのPES膜を通して濾過する。生成物を無菌のガラス容器またはHDPEバッグ中で＋2〜＋8℃で3年間まで保存する。
【実施例４】
【０１０５】
アジュバント系AS01への製剤化
ステンレススチールタンク容器に必要量の水を満たす。
濃縮した100mM PO4のリン酸緩衝液および1500mMのNaCl溶液を注射用水で希釈して、AS01製剤中の最終濃度を10mM PO4および150mM NaClとする。緩衝溶液を室温で15-45分間撹拌する。
濃縮リポソームのバルクを緩衝溶液に最終濃度25-50μg／AS01用量で添加する。希釈したリポソームのバルクを15-45分間撹拌する。
QS21の液体バルクを最終濃度25-50μg／AS01用量でリポソーム溶液に添加してAS01最終バルクを形成する。AS01溶液を室温で15-45分間撹拌する。
AS01バルクを無菌（グレードＡ／クラス100）またはアイソレーター領域で0.22μmのPES膜を通して濾過する。生成物を＋2〜＋8℃のタンク中で30日間まで保存し、無菌のガラスバイアルに充填する。
【国際調査報告】
2014526974.tif 000002
2014526974.tif 000003
2014526974.tif 000004
2014526974.tif 000005