(57)【要約】  生存可能なグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス、およびグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの繁殖コロニーが開示される。また、ＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスにより産生された、機能性ＮａＶ１．７をコードしない単離マウス配偶子；ＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスから単離された単離ＮａＶ１．７−／−マウス細胞、またはその子孫細胞；および、ＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスから得た初代細胞培養物または二次細胞株および組織もしくは臓器外植片またはそれらの培養物、も開示される。さらに、最初、単離ＮａＶ１．７−／−マウス細胞および骨髄腫細胞の融合により形成されたハイブリドーマ、および、抗体を産生する方法も開示される。また、ＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスを使って検証された、有望なＮａＶ１．７阻害剤の選別、および試験ＮａＶ１．７阻害剤化合物の用量範囲探索に有用なアッセイが開示される。【選択図】図８Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存可能なグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項２】
グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスが成体である、請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項３】
異系交配または戻し交配されたグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス、もしくはそれら由来のＮａＶ１．７−／−子孫マウスである、請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項４】
繁殖性である、請求項２に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項５】
雄である、請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項６】
雌である、請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項７】
ＣＤ１マウス由来である、請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項８】
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来である、請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス。
【請求項９】
請求項４に記載のＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスにより産生された、機能性ＮａＶ１．７タンパク質をコードしない単離マウス配偶子。
【請求項１０】
雄配偶子である、請求項９に記載の単離マウス配偶子。
【請求項１１】
雌配偶子である、請求項９に記載の単離マウス配偶子。
【請求項１２】
請求項１のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスから単離された単離ＮａＶ１．７−／−マウス細胞、またはその子孫細胞。
【請求項１３】
請求項１のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス由来の初代細胞培養または二次細胞株。
【請求項１４】
請求項１のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス由来の組織または臓器外植片またはそれらの培養物。
【請求項１５】
Ｂ−リンパ球、Ｔ細胞、または神経細胞である、請求項１２に記載の単離マウス細胞、またはその子孫。
【請求項１６】
最初は、請求項１５に記載のマウス細胞および骨髄腫細胞の融合により形成されたハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項４に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの少なくとも１つの繁殖ペアを含むグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの繁殖コロニー。
【請求項１８】
グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの少なくとも１つの繁殖ペアがＣＤ１背景を含む、請求項１７に記載の繁殖コロニー。
【請求項１９】
グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの少なくとも１つの繁殖ペアがＢＡＬＢ／ｃ背景を含む、請求項１７に記載の繁殖コロニー。
【請求項２０】
成体グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスを生成する方法であって、
（ａ）生存可能な新生仔または周産期グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの子を得ることと、および
（ｂ）その子が成人期に達するまで適切な栄養を与えることと、
を含む方法。
【請求項２１】
適切な栄養を与えることが、その子に手で餌を与えることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＮａＶ１．７タンパク質で免疫された請求項１に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスにより産生された、ＮａＶ１．７に対するマウス抗体をヒト化することを含む、抗体の産生方法。
【請求項２３】
請求項３に記載のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス由来の子孫であり、その遺伝子型がＮａＶ１．７＋／−である生存可能なマウス。
【請求項２４】
（ａ）哺乳動物に試験化合物を投与することと、続けて、
（ｂ）哺乳動物に、陰性対照に疼痛関連反応を誘導するのに有効な投与量のＮａＶ１．７活性化因子を投与することと、および、次いで
（ｃ）哺乳動物の疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、減少するかどうかを判定すること、
を含むアッセイ。
【請求項２５】
ＮａＶ１．７活性化因子が、ベラトリジン、デルタメトリン、またはグラヤノトキシンＩＩＩである、請求項２４に記載のアッセイ。
【請求項２６】
哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ケナガイタチ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項２４に記載のアッセイ。
【請求項２７】
疼痛関連反応が、足を持ち上げること、足をなめること、足を引っ込めること、啼声、自己報告、またはこれらの反応のいずれかの組み合わせである、請求項２４に記載のアッセイ。
【請求項２８】
（ａ）  第１の哺乳動物に、第１の投与量の試験化合物を投与することと、続けて、
（ｂ）  第１の哺乳動物に、陰性対照に疼痛関連反応を誘導するのに有効な投与量のＮａＶ１．７活性化因子を投与することと、および、次いで、
（ｃ）  陰性対照に比べて、疼痛関連反応が第１の哺乳動物で減少するかどうかを判定することと、ならびに
（ｄ）  陰性対照に比べて、疼痛関連反応が減らされる、試験化合物の、最も低い第２の投与量を決定することと、
を含むアッセイ。
【請求項２９】
ＮａＶ１．７活性化因子が、ベラトリジン、デルタメトリン、またはグラヤノトキシンＩＩＩである、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ケナガイタチ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３１】
疼痛関連反応が、足を持ち上げる、足をなめる、足を振り回す、啼声、自己報告、またはこれらの反応のいずれかの組み合わせである、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３２】
（ｅ）第２の同じ種の哺乳動物に、第２の投与量の試験化合物を投与することと、続けて、第２の哺乳動物に、陰性対照に疼痛関連反応を誘導するのに有効な投与量のＮａＶ１．７活性化因子を投与することと、および、次いで、
（ｆ）第２の哺乳動物の疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、減少するかどうかを判定すること、
をさらに含む、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３３】
（ａ）第１の哺乳動物に、第１の投与量の試験化合物および第２の同じ種の哺乳動物に、第１の投与量とは異なる第２の投与量の試験化合物を投与することと、続けて、
（ｂ）第１のおよび第２の哺乳動物に、陰性対照で疼痛関連反応を誘導するのに有効な局所投与量のＮａＶ１．７活性化因子を投与することと、および、次いで、
（ｃ）疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、第１の哺乳動物および第２の哺乳動物で減少するかどうかを判定することと、ならびに、
（ｄ）陰性対照に比べて、疼痛関連反応が減らされる、試験化合物の、最も低い第２の投与量を特定することと、
を含むアッセイ。
【請求項３４】
ＮａＶ１．７活性化因子が、ベラトリジン、デルタメトリン、またはグラヤノトキシンＩＩＩである、請求項３３に記載のアッセイ。
【請求項３５】
哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ケナガイタチ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項３３に記載のアッセイ。
【請求項３６】
疼痛関連反応が、足を持ち上げること、足をなめること、足を引っ込めること、啼声、自己報告、またはこれらの反応のいずれかの組み合わせである、請求項３３に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２１（ｃ）および１．８２１（ｅ）で要求される、コンピュータ読み取り可能形式（ＣＲＦ）および紙コピーの両方の役割を果たすＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」配列リストを含み、それは参照によってその全体が組み込まれる。２０１２年１月１７日に作成されたその「ｔｘｔ」ファイルの名称は、Ａ−１５８８−ＷＯ−ＰＣＴ−ＳｅｑＬｉｓｔ０１１８１２．ＳＴ２５．ｔｘｔで、サイズは２ｋｂである。
【０００２】
本出願全体を通し、種々の出版物が丸括弧または角括弧で囲って参照される。これらの出版物の開示は、本発明の属する最先端技術をさらに完全に記載するために、その全体が参照によって本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の考察
単離細胞株の使用（すなわち、インビトロ系）は、種々の遺伝子とタンパク質がもたらす生理的役割の理解には有用であるが、より完全な情報は、哺乳動物で（すなわち、インビボ系で）これらのタンパク質の役割の効果を直接研究することにより得ることができる。この目的のために、ある特定の遺伝子の発現レベルを変えた種々の哺乳動物が作られている。これらの哺乳動物の内の１つの種類は、いわゆる遺伝子導入哺乳動物である。これらの内の後者の哺乳動物は、新規遺伝子または複数遺伝子を有し、これらは異なる種由来であり、それらのインタクトゲノム中に挿入され、従って、「遺伝子導入」ということになる。別の種類は、ノックイン哺乳動物である。これらの動物は、自身の１つの遺伝子が削除され、その同じ遺伝子の変異体により置き換えられる。この手法は、選択遺伝子／タンパク質の発現過剰または発現低下を起こさせるために使用されることが多い。機能的リン酸化部位を有するキナーゼおよびタンパク質は、この手法での選択の標的である。最初の２つの技術の組み合わせを使用して、内在性宿主遺伝子の座位で外来性遺伝子、例えば、同等の遺伝子のマウス座位でヒト遺伝子、を発現させる「遺伝子導入−ノックイン」哺乳動物を生成できる。最後に挙げる手法は、グローバルヌル変異体、またはいわゆる、「ノックアウト」哺乳動物を生成することであり、そこでは内在性遺伝子の発現が、組換え技術か、または古典的遺伝子技術を使った遺伝子操作により抑制される。例えば、Ｎａｓｓａｒら（２００６）は、電位依存性ナトリウムチャネルＮａＶ１．３を発現できないグローバルヌル変異体マウス株を生成した（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＮａＶ１．３ヌル変異体マウスにおいて、神経損傷が強い異痛および異所性放電を誘導する（Ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ａｎｄ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅｓ  ｉｎ  ＮａＶ１．３  ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ）、Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ  ２：３３（２００６））。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）は、興奮性細胞、例えば、中枢および末梢ニューロン、心臓ならびに骨格筋筋細胞、ならびに神経内分泌細胞における活動電位の開始と伝播に関与する糖タンパク質複合体である。哺乳類のナトリウムチャネルは、ヘテロ三量体であり、中心部の、気孔形成アルファ（α）サブユニットおよび補助的ベータ（β）サブユニットから構成される。アルファサブユニット遺伝子の変異は、発作性疾患、例えば、ヒトの癲癇、ＱＴ延長症候群、および高カリウム血性周期性四肢麻痺、ならびにマウスの運動終末板疾患および小脳失調に関連づけられている（Ｉｓｏｍ、ナトリウムチャネルβサブユニット：決して補助的役割などというようなものではない（Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ：ａｎｙｔｈｉｎｇ  ｂｕｔ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ７（１）：４２−５４（２００１））。β−サブユニットは、ＶＧＳＣ中のα−サブユニットの局在化、発現および機能的特性を調節する。
【０００５】
電位依存性ナトリウムチャネルは、９つの異なるサブタイプ（ＮａＶ１．１〜ＮａＶ１．９）から構成されるファミリーを含む。表１に示すように、これらのサブタイプは、組織特異的局在化および機能的差異を示す（Ｇｏｌｄｉｎ、Ａ．Ｌ．、ナトリウムチャネル研究の復活（Ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３：８７１−９４（２００１）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、電位依存性イオンチャネル阻害剤として有用な組成物（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）、米国特許公開第２００５／０１８７２１７Ａ１号、を参照）。その遺伝子ファミリーの３つのメンバー（ＮａＶ１．８、１．９、１．５）は、よく知られたナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン（ＴＴＸ）による遮断に対し抵抗性であり、これらは、この遺伝子ファミリー中でのサブタイプ特異性を示している。変異分析により、グルタメート３８７が、ＴＴＸ結合に対し、極めて重要な残基であると特定された（Ｎｏｄａ、Ｍ．、Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ、ｅｔ  ａｌ．、「ナトリウムチャネルＩＩに関し、ただ１つの点変異が、テトロドトキシンとサキシトキシンに不感受性を付与する（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ＩＩ）」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５９（１）：２１３−６（１９８９）、参照）。
【０００６】
ＶＧＳＣファミリーとラットＴＴＸ  ＩＣ５０値。略号：ＣＮＳ＝中枢神経系、ＰＮＳ＝末梢神経系、ＤＲＧ＝脊髄後根神経節、ＴＧ＝三叉神経節。（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、電位依存性イオンチャネル阻害剤として有用な組成物（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）、米国特許公開第２００５／０１８７２１７Ａ１号；Ｇｏｌｄｉｎ、ナトリウムチャネル研究の復活（Ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ
Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３：８７１−９４（２００１）、参照）。
【０００７】
【表１】
2014507136.tif 000003
【０００８】
一般的に、電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＶ）は、神経系の興奮性組織の活動電位の急速な上昇の開始に関与し、これは、正常および異常疼痛感覚を構成し、コードする電気信号を伝達する。ＮａＶチャネルのアンタゴニストは、これらの疼痛信号を弱めることができ、限定されないが、急性、慢性、炎症性、神経障害性疼痛、等の種々の疼痛状態の治療に有用である。既知のＮａＶアンタゴニスト、例えば、ＴＴＸ、リドカイン、ブピバカイン、フェニトイン、ラモトリギン、およびカルバマゼピンは、ヒトおよび動物モデルで、疼痛を弱めるのに有用であることが示されている（Ｍａｏ、Ｊ．ａｎｄ  Ｌ．Ｌ．Ｃｈｅｎ、神経障害性疼痛軽減のための全身性リドカイン（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｉｄｏｃａｉｎｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｒｅｌｉｅｆ）、Ｐａｉｎ  ８７（１）：７−１７（２０００）；Ｊｅｎｓｅｎ、Ｔ．Ｓ．、神経障害性疼痛における抗けいれん薬：理論的根拠と臨床的証拠（ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐａｉｎ  ６（ＳｕｐｐｌＡ）：６１−６８（２００２）；Ｒｏｚｅｎ、Ｔ．Ｄ．、群発頭痛および三叉神経痛の管理における抗てんかん薬（Ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｈｅａｄａｃｈｅ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、Ｈｅａｄａｃｈｅ  ４１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２５−３２（２００１）；Ｂａｃｋｏｎｊａ、Ｍ．Ｍ．、神経障害性疼痛の治療への抗けいれん薬の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５９（５Ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ１４−７（２００２）、を参照）。
【０００９】
ＴＴＸ感受性ＮａＶ１．７チャネルのαサブユニットは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によりコードされる。ＮａＶ１．７チャネルは、脊髄後根神経節の末梢感覚ニューロンで優先的に発現し、疼痛の知覚に関与する。ヒトでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の変異は、過剰または低感受性で痛みを感ずる素因に関連づけられている。例えば、疼痛知覚でのＮａＶ１．７チャネルの役割は、最近の臨床的遺伝子連鎖解析により確立され、これにより、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の機能獲得型変異が、遺伝性疼痛症候群、例えば、原発性肢端紅痛症（ＰＥ）、遺伝性紅痛症（ＩＥＭ）、および発作性激痛症（ＰＥＰＤ）の病因学的根拠として示された（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、原発性肢端紅痛症の患者のナトリウムチャネルαサブユニットをコードするＳＣＮ９Ａの変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＳＣＮ９Ａ、ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｒｙｔｈｅｒｍａｌｇｉａ）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４１：１７１−１７４（２００４）；Ｈａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、紅痛症におけるＮａＶ１．７変異体Ａ８６３Ｐ：侵害受容性脊髄後根神経節ニューロンの興奮性に対する、活性化および定常状態不活性化の変化の影響（ＮａＶ１．７  ｍｕｔａｎｔ  Ａ８６３Ｐ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｌａｌｇｉａ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６（４８）：１２５６６−７５（２００６）；Ｅｓｔａｃｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、連続体としてのＮａＶ１．７機能獲得型変異のＡ１６３２Ｅは、紅痛症および発作性激痛症変異に関連する生理的変化を示し、両障害を発症する（ＮａＶ１．７  ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ：Ａ１６３２Ｅ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｌａｌｇｉａ  ａｎｄ  ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｐａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（４３）：１１０７９−８８（２００８）、を参照）。さらに、ＮａＶ１．７の過剰発現が、転移性の強い前立腺癌細胞株中で検出されている（Ｄｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ヒト前立腺癌用の有望な新規マーカー：インビボ発現電位依存性ナトリウムチャネル（Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ８：２６６−７３（２００５）；Ｕｙｓａｌ−Ｏｎｇａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上皮増殖因子は、インビトロ転移性挙動のヒト前立腺癌ＰＣ−３Ｍ細胞を強化する：電位依存性ナトリウムチャネルの関与（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ＰＣ−３Ｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：７６（２００７）。
【００１０】
ＳＣＮ９Ａ遺伝子機能喪失型変異は、それ以外では健康な個人が、いかなる形の疼痛感覚も感じることが完全にできなくなる状態をもたらす（例えば、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．、ＳＣＮ９Ａの停止コドン変異は、疼痛感覚の欠落を引き起こす（Ａ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＳＣＮ９Ａ  ｃａｕｓｅｓ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｐａｉｎ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１６（１７）：２１１４−２１（２００７））。
【００１１】
条件付きノックアウトによるＳＣＮ９Ａ遺伝子の細胞特異的欠失は、機械的、熱的または炎症性疼痛を知覚する能力を減らす（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、侵害受容器特異的遺伝子欠失は、急性および炎症性疼痛でのＮａＶ１．７（ＰＮ１）の主要役割を明らかにする（Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＮａＶ１．７（ＰＮ１）  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ．１０１（３４）：１２７０６−１２７１１（２００４））。
【００１２】
このような証拠に基づいて、脊髄後根神経節の末梢感覚ニューロン中でのＮａＶ１．７チャネル活性または発現レベルの低減が、例えば、慢性痛、神経障害性疼痛、および神経痛のための有効な疼痛治療法として提案されている（例えば、Ｔｈａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、疼痛の治療のためのＳＣＮ９Ａ遺伝子発現および／または機能の抑制（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＣＮ９Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｉｎ）、国際公開第ＷＯ２００９／０３３０２７Ａ２号；Ｙｅｏｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、主要求心性神経中のＮａＶ１．７ナトリウムチャネルのヘルペスベクター媒介ノックダウンによる炎症性痛覚過敏の減少（Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ｂｙ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ＮａＶ１．７  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｆｆｅｒｅｎｔｓ）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６（２）：２７１−７（２００５）；Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、強力・選択的ＮａＶ１．７ナトリウムチャネル遮断薬（Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＮａＶ１．７  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ）、国際公開第ＷＯ２００７／１０９３２４Ａ２号；Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．、新規種類のベンゾアゼピノンＮａ（ｖ）１．７遮断薬の発見：神経障害性疼痛用の有望な治療薬（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ  Ｎａ（ｖ）１．７  ｂｌｏｃｋｅｒｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７（１６）：４６３０−３４（２００７）；Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．、ベンゾアゼピノンＮａＶ  １．７遮断薬：神経障害性疼痛用の有望な治療薬（Ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ  ＮａＶ  １．７  ｂｌｏｃｋｅｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７（２２）：６１７２−７７（２００７））。
【００１３】
Ｎａｓｓａｒらは、マウス中の遺伝子切除を行い、疼痛経路におけるＮａＶ１．７の機能を調べた；しかし、グローバルＮａＶ１．７ヌル変異体は、摂食できなかったことが明らかな理由で、（ヒトとは異なり）出生後すぐに死ぬことが明らかになったと報告した（侵害受容器特異的遺伝子欠失は、急性および炎症性疼痛でのＮａＶ１．７（ＰＮ１）の主要役割を明らかにする（Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＮａＶ１．７（ＰＮ１）  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１（３４）：１２７０６−１２７１１（２００４））。実際、生き残った９２匹の子の内で、７２％は、ヘテロ接合体であり、残りはＮａＶ１．７野性型であった。Ｎａｓｓａｒら（２００４）は、「．．．全ての感覚および交感神経ニューロン中でのＮａＶ１．７欠失は、周産期致死表現型を引き起こす」と述べた（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、同上、ページ１２７０８）。  Ｎａｓｓａｒらは、認められた新生仔死亡を考慮して、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ手法を使って、侵害受容器特異的ノックアウトを生成した。  これらの組織限定ノックアウトは、感覚および交感神経ニューロンの下位の集団では、もはやＮａｖ１．７の発現はないが、身体のその他の部位ではどこでもＮａｖ１．７の発現がある動物として記述された。それらのマウスは、ＮａＶ１．８ＣｒｅデリーターマウスをｆｌｏｘＮａＶ１．７マウスと交配させ、組織限定ＮａＶ１．７−／−マウスおよび同腹子対照を生成させることにより作られた。これらの侵害受容器特異的動物は、その後、侵害受容および疼痛の機序を研究するために使用された。
【００１４】
Ｎａｓｓａｒらは、別の報告で、「ＮａＶ１．７のグローバル欠失は、Ｐ０で致死であるため、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．７の両方のグローバルノックアウトを生成することはできない」と述べた（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、神経障害性疼痛は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８の両方欠損マウスで通常通り発生する（Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｓ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ＮａＶ１．７  ａｎｄ  ＮａＶ１．８）、Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ  １−２４（２００５））。
【００１５】
上述の技術とは対照的に、本発明は、ＮａＶ１．７媒介生理機能の研究のための、および例えば、特に、疼痛および神経内分泌障害を標的とした医薬品の開発のための、特に、グローバルＮａＶ１．７ヌル変異体マウスおよび繁殖性ＮａＶ１．７ノックアウトマウス株を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１８７２１７号明細書
【特許文献２】国際公開第２００９／０３３０２７号
【特許文献３】国際公開第２００７／１０９３２４号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ａｎｄ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅｓ  ｉｎ  ＮａＶ１．３  ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ、Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ  ２：３３（２００６）
【非特許文献２】Ｉｓｏｍ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ：ａｎｙｔｈｉｎｇ  ｂｕｔ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ７（１）：４２−５４（２００１）
【非特許文献３】Ｇｏｌｄｉｎ、Ａ．Ｌ．、Ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３：８７１−９４（２００１）
【非特許文献４】Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ
【非特許文献５】Ｎｏｄａ、Ｍ．、Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ、ｅｔ  ａｌ．、Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ＩＩ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５９（１）：２１３−６（１９８９）
【非特許文献６】Ｍａｏ、Ｊ．ａｎｄ  Ｌ．Ｌ．Ｃｈｅｎ、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｉｄｏｃａｉｎｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｒｅｌｉｅｆ、Ｐａｉｎ  ８７（１）：７−１７（２０００）
【非特許文献７】Ｊｅｎｓｅｎ、Ｔ．Ｓ．、ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐａｉｎ  ６（ＳｕｐｐｌＡ）：６１−６８（２００２）
【非特許文献８】Ｒｏｚｅｎ、Ｔ．Ｄ．、Ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｈｅａｄａｃｈｅ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｎｅｕｒａｌｇｉａ、Ｈｅａｄａｃｈｅ  ４１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２５−３２（２００１）
【非特許文献９】Ｂａｃｋｏｎｊａ、Ｍ．Ｍ．、Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５９（５Ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ１４−７（２００２）
【非特許文献１０】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＳＣＮ９Ａ、ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｒｙｔｈｅｒｍａｌｇｉａ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４１：１７１−１７４（２００４）
【非特許文献１１】Ｈａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＮａＶ１．７  ｍｕｔａｎｔ  Ａ８６３Ｐ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｌａｌｇｉａ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６（４８）：１２５６６−７５（２００６）
【非特許文献１２】Ｅｓｔａｃｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮａＶ１．７  ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ：Ａ１６３２Ｅ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｌａｌｇｉａ  ａｎｄ  ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｐａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（４３）：１１０７９−８８（２００８）
【非特許文献１３】Ｄｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ８：２６６−７３（２００５）
【非特許文献１４】Ｕｙｓａｌ−Ｏｎｇａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ＰＣ−３Ｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ、Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：７６（２００７）
【非特許文献１５】Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ａ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＳＣＮ９Ａ  ｃａｕｓｅｓ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｐａｉｎ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１６（１７）：２１１４−２１（２００７）
【非特許文献１６】Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＮａＶ１．７（ＰＮ１）  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ．１０１（３４）：１２７０６−１２７１１（２００４）
【非特許文献１７】Ｔｈａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＣＮ９Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｉｎ
【非特許文献１８】Ｙｅｏｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ｂｙ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ＮａＶ１．７  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｆｆｅｒｅｎｔｓ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６（２）：２７１−７（２００５）
【非特許文献１９】Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＮａＶ１．７  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ
【非特許文献２０】Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ  Ｎａ（ｖ）１．７  ｂｌｏｃｋｅｒｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７（１６）：４６３０−３４（２００７）
【非特許文献２１】Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ  ＮａＶ  １．７  ｂｌｏｃｋｅｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７（２２）：６１７２−７７（２００７）
【非特許文献２２】Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｓ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ＮａＶ１．７  ａｎｄ  ＮａＶ１．８）、Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ  １−２４（２００５）
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、生存可能なグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスに関し、このグローバルＮａＶ１．７ノックアウト変異は、出生後０日目（Ｐ０）世代のマウスで早くも致死であるという当技術分野における教示とは驚くべき対比をなすものである（侵害受容器特異的遺伝子欠失は、急性および炎症性疼痛でのＮａＶ１．７（ＰＮ１）の主要役割を明らかにする（Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＮａＶ１．７（ＰＮ１）  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ．１０１（３４）：１２７０６−１２７１１（２００４））;  （Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、神経障害性疼痛は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８の両方欠損マウスで通常通り発生する（Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｓ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ＮａＶ１．７  ａｎｄ  ＮａＶ１．８）、Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ  １−２４（２００５））。Ｎａｓｓａｒ等により採用されたものと同じＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景下で、新生仔Ｎａｖ１．７−／−マウスにより示された活力の欠如を注意深く観察し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに比べて高められた活力を有する株であり、さらに、その中の雌がＣ５７ＢＬ／６Ｊに比べて強化された保育挙動を示す異なる株を計画的に選択することにより、我々は、これらのより活力のある株背景由来の、このような生存可能なグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスを生成できた。
【００１９】
本発明の一実施形態では、マウスは、異系交配もしくは戻し交配されたグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスであるか、または同様にＮａＶ１．７−／−であるそれら由来の子孫マウスである。グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスまたはそのＮａＶ１．７−／−子孫は、また、同じ株または異なる株のＮａＶ１．７＋／＋パートナーと交配させ、ＮａＶ１．７＋／−の遺伝子型を有する他の子孫を生成させることができる。グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスまたはそのＮａＶ１．７−／−子孫は、また、同じ株または異なる株のＮａＶ１．７＋／−パートナーと交配させて、ＮａＶ１．７＋／−またはＮａＶ１．７−／−の遺伝子型を有する他の子孫を生成させることもできる。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスは、成体である。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、ＮａＶ１．７−／−マウス細胞（例えば、Ｂ−リンパ球、Ｔ細胞、または神経細胞）は、グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスから単離でき、従って、子孫細胞、初代細胞培養または２次細胞株がグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスから得られる。
【００２２】
本発明の他の実施形態では、組織または臓器植片、またはそれらの培養物もまた、グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスから得られる。
【００２３】
本発明のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウス成体は、繁殖性雄および雌をそれぞれ含むために、本発明の別の態様は、グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの繁殖コロニーに関し、成体グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスの少なくとも１つの繁殖ペアを含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、ハイブリドーマを、上述のＮａＶ１．７−／−マウスＢ−リンパ球細胞、と骨髄腫細胞の融合により作ることができる。
【００２５】
本発明の別の態様では、ＮａＶ１．７に対する抗体の調製は、限定されないが、マウスまたはヒトＮａＶ１．７を含む。本発明のＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスにより産生された抗ヒトＮａＶ１．７抗体のＣＤＲ配列に基づいて、これらのＣＤＲを抗体中に組み込んだ、ＮａＶ１．７イオンチャネル活性に拮抗性のまたはそれを刺激するキメラまたはヒト化抗体を作り出すことができる。これは、治療に有効でありうる。
【００２６】
他の実施形態では、本発明のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスは、薬剤研究および開発、例えば、オンターゲット／オフターゲット効果の間の区別、または疼痛および鎮静効果の間の区別を行うためのインビボプロトコルに有用である。
【００２７】
例えば、本発明の一実施形態では、ＮａＶ１．７特異的生化学的刺激を伴うアッセイが、グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスを使って検証された。このアッセイは、例えば、予期されるＮａＶ１．７阻害剤の選別に対し有用であり、この選別は、研究または臨床的目的にとって有用でありうる。このアッセイは、下記を含む：
（ａ）哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ケナガイタチ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒト）に、試験化合物（候補ＮａＶ１．７阻害剤）を投与し、続けて、
（ｂ）投薬その哺乳動物に、陰性対照（試験化合物を受けていない）中で疼痛関連反応を誘導するのに有効な１回投与量のＮａＶ１．７活性化因子（例えば、ベラトリジン、デルタメトリン、またはグラヤノトキシンＩＩＩ）を投与し（このような投与は、全身性でも、局所的でもよい）；および、次いで
（ｃ）哺乳動物の疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、減少するかどうかを判定する。記載のように、哺乳動物への試験化合物投与は、全身性（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、または経口投与）であっても、または局所的（例えば、皮下、足底内、または局部投与）であってもよい。局所投与の場合は、Ｎａｖ１．７活性化因子の局所投与と同じ部位またはその近くである必要がある。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ナトリウムチャネル活性化因子は、ＮａＶ１．７特異的生化学的刺激を伴うアッセイで使用され、ＮａＶ１．７−遮断試験化合物の居所的または全身性の投与量を選択するのに有用である。臨床試験でのいずれかの試験化合物の適切な投与量の選択は、難しい仕事であり、理想的には、投与量を、ある種の、例えば、標的特異的であることがわかっているＰＥＴリガンドのバイオマーカーを置き換える量に較正することにより行われる。ナトリウムチャネル全般、および特に、ＮａＶ１．７には、今まで、このようなバイオマーカーがなかった。本明細書で、我々は、ベラトリジン、デルタメトリン、およびグラヤノトキシン、等のナトリウムチャネルの活性化因子は、適切な投与量をラットまたはマウスに注射すると、定量化可能な挙動による反応を生成することを開示する。これら３つの分子は、構造的に異なるが、それぞれがＮａＶ１．７を活性化するという点で共通の生理的機序を共有する。実施例５で、我々は、これらのナトリウムチャネル活性化因子のいずれかを注射時に、ラットとマウスが、それぞれ、定量可能な用量依存性の足を引っ込めるおよび、足をなめる挙動を示すことを初めて明らかにする。これらの挙動は、モルヒネにより減少し、非選択的ナトリウムチャネルアンタゴニストのメキシレチンにより抑制されるため、これらの挙動が疼痛を反映し、ナトリウムチャネルにより媒介されていることを立証している。
【００２９】
最も重要なこととして、我々は、本明細書の実施例５で、ＮａＶ１．７活性化因子、例えば、ベラトリジンの１μｇの、グローバルＮａｖ１．７−／−マウスの足へ注射が、足を引っ込める、または足をなめる挙動を起こさせず、他方、野性型マウスでは、この同じ１μｇ投与が、強い足を引っ込める挙動を起こさせることを示す。メキシレチン（ＮａＶ１．７ならびに他の全てのナトリウムチャネルを遮断する）の野性型マウスへの前投与が、１μｇ投与量のベラトリジンにより誘発される足を引っ込める挙動を抑制するので、ＮａＶ１．７の薬理学的遮断は、同じ効果を実現するはずである。従って、前臨床の試験で、ナトリウムチャネル活性化因子による刺激は、生きている動物に投与される所与の化合物がＮａＶ１．７を遮断するか否かの有用な試験である。さらに、この試験は、臨床的疼痛症候群を治療するＮａＶ１．７試験阻害剤の適正な投薬量を決定するために臨床的に使用でき得る。適正な臨床的投与量は、ナトリウムチャネル活性化因子の投与に対する疼痛反応を抑制する量であろう。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、試験化合物（候補ＮａＶ１．７阻害剤）の用量範囲探索に有用な下記を含むアッセイを含む：
（ａ）第１の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ケナガイタチ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒト）に、試験化合物の第１の投与量を投与し、続けて、
（ｂ）第１の哺乳動物に、陰性対照（試験化合物を受けていない）で疼痛関連反応を誘導するのに有効な（局所的または全身性）投与量のＮａＶ１．７活性化因子（例えば、ベラトリジン、デルタメトリン、またはグラヤノトキシンＩＩＩ）を投与し（このような投与は全身性でも局所的でもよい）；次に
（ｃ）疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、第１の哺乳動物で減少するか否かを判定し；さらに
（ｄ）疼痛関連反応が、陰性対照に比べて減少する試験化合物の最も少ない第２の投与量を特定する。哺乳動物への試験化合物投与は、全身性（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、または経口投与）であっても、または局所的（例えば、皮下、足底内、局部投与）であってもよい。局所的な場合は、ＮａＶ１．７活性化因子の局所投与と同じ部位か、またはその近くである必要がある。回復期間が充分で、試験化合物およびＮａＶ１．７活性化因子の効果が消滅し、いずれの残余試験化合物とＮａＶ１．７活性化因子化合物の存在も哺乳動物で検出不可能になった後に、第１とは異なる第２の投与量レベルでの投与のために、第１の哺乳動物が後で再使用できる。あるいは、アッセイは、同じ種の第２の哺乳動物に試験化合物の第２の投与量を投与し、続いて、第２の哺乳動物に、陰性対照で疼痛関連反応を誘導するのに有効な投与量のＮａＶ１．７活性化因子を投与し；さらに、疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、第２の哺乳動物で減少するかどうかを判定することをさらに含むことができる。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、試験化合物（候補ＮａＶ１．７阻害剤）の用量範囲探索に有用な下記を含むアッセイを含む：
（ａ）第１の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ケナガイタチ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒト）に、第１の投与量の試験化合物、および第２の哺乳動物（同じ種の）に、第１の投与量とは異なる第２の投与量の試験化合物を投与し、続けて、
（ｂ）第１のおよび第２の哺乳動物に、陰性対照（試験化合物を受けていない）で疼痛関連反応を誘導するのに有効な量のＮａＶ１．７活性化因子（例えば、ベラトリジン、デルタメトリン、またはグラヤノトキシンＩＩＩ）を投与し（このような投与は、全身性でも局所的でもよい）；その後、
（ｃ）疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、第１の哺乳動物と第２の哺乳動物で減少するか否かを判定し；さらに、
（ｄ）疼痛関連反応が、陰性対照に比べて、低減する試験化合物の最も少ない第２の投与量を特定する。哺乳動物に投与される試験化合物投与は、全身性（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、または経口投与）でも、または局所的（例えば、皮下、足底内、または局部投与）でもよい。局所的な場合は、ＮａＶ１．７活性化因子の局所投与と同じ部位か、またはその近くである必要がある。
【００３２】
このようにして、ＮａＶ１．７を抑制する投与量を決定し、推定上有害作用を生ずる可能性のあるより高い投与量と比較し、治療濃度域を決定できる。さらに、ＮａＶ１．７試験阻害剤の有効性の臨床試験では、このような投与量でのみ、治療の有効性をＮａＶ１．７の結果と見なすことができる。グローバルＮａＶ１．７−／−マウスにより得られる重要な知識は、ナトリウムチャネル活性化因子は、ＮａＶ１．７を介して、さらには、ＮａＶ１．７のみを介して、疼痛反応を生成することである。
【００３３】
以降の図および発明の詳細な説明を考慮すれば、多くの追加の本発明の態様および利点が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】Ａ〜Ｂは、戻し交配（図１Ａ）および異系交配（図１Ｂ）育種法の先行技術の概念を図示したものである。戻し交配は、同系交配マウス株の背景を別の同系交配背景に完全に変更することからなる（図１Ａで、指定されたＣ５７ＢＬ／６または１２９ＳＶ株は、単に例に過ぎない）。選択された約９９．９９％の新規遺伝的背景の近交系（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）が得られる場合、新規マウス株は、類遺伝子性であると見なされる。それは、ノックアウト系統を作る初期段階で（示されるように）、または初期同系交配マウス株が現在の研究にとってもはや安定ではない場合、後のいずれかの時点で生成できる。このような場合には、初期系統の９９．９９％マウスから開始し、約９９．９９％の新規選択近交系が得られるまで交配する。図１Ｂで、異系交配は、非近交系マウス株（例えば、ＣＤ１）とのただ１回の交配を含む。初期近交系の約５０％の遺伝子、および非近交系統（例えば、ＣＤ１）の約５０％の遺伝子を有するハイブリッドマウス株が得られる。
【図１Ｂ】Ａ〜Ｂは、戻し交配（図１Ａ）および異系交配（図１Ｂ）育種法の先行技術の概念を図示したものである。戻し交配は、同系交配マウス株の背景を別の同系交配背景に完全に変更することからなる（図１Ａで、指定されたＣ５７ＢＬ／６または１２９ＳＶ株は、単に例に過ぎない）。選択された約９９．９９％の新規遺伝的背景の近交系（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）が得られる場合、新規マウス株は、類遺伝子性であると見なされる。それは、ノックアウト系統を作る初期段階で（示されるように）、または初期同系交配マウス株が現在の研究にとってもはや安定ではない場合、後のいずれかの時点で生成できる。このような場合には、初期系統の９９．９９％マウスから開始し、約９９．９９％の新規選択近交系が得られるまで交配する。図１Ｂで、異系交配は、非近交系マウス株（例えば、ＣＤ１）とのただ１回の交配を含む。初期近交系の約５０％の遺伝子、および非近交系統（例えば、ＣＤ１）の約５０％の遺伝子を有するハイブリッドマウス株が得られる。
【図２Ａ】Ａ〜Ｂは、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｓｃｎ９ａｔｍ１Ｄｇｅｎ／Ｊ動物のＣＤ１との異系交配、またはＢＡＬＢ／ｃ背景との戻し交配（類似データは示さず）により、出生後７日まで動物の生存が伸び、給餌挙動を調べることが可能となったことを示す。図２Ａは、ＣＤ１マウス株を使った異系交配により得た１週齢ＮａＶ１．７−／−新生仔（黒）と対照同腹子（白）を示す。このＮａＶ１．７−／−動物は、成人期に達した。図２Ｂは、新生仔ＮａＶ１．７対照（左）とＮａＶ１．７−／−（右）を示す。両方は、胃中のミルクの存在（矢印で示す）からわかるように自力で摂食できた（皮膚は、新生仔マウスでは準透明である）。
【図２Ｂ】Ａ〜Ｂは、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｓｃｎ９ａｔｍ１Ｄｇｅｎ／Ｊ動物のＣＤ１との異系交配、またはＢＡＬＢ／ｃ背景との戻し交配（類似データは示さず）により、出生後７日まで動物の生存が伸び、給餌挙動を調べることが可能となったことを示す。図２Ａは、ＣＤ１マウス株を使った異系交配により得た１週齢ＮａＶ１．７−／−新生仔（黒）と対照同腹子（白）を示す。このＮａＶ１．７−／−動物は、成人期に達した。図２Ｂは、新生仔ＮａＶ１．７対照（左）とＮａＶ１．７−／−（右）を示す。両方は、胃中のミルクの存在（矢印で示す）からわかるように自力で摂食できた（皮膚は、新生仔マウスでは準透明である）。
【図３Ａ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図３Ｂ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図３Ｃ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図３Ｄ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図３Ｅ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図３Ｆ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図３Ｇ】Ａ〜Ｇは、ＮａＶ１．７−／−動物での中枢および末梢神経系の構造的成長が正常に見えることを示す。図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色したＮａＶ１．７−／−新生仔（生後４日（Ｐ４））の矢状切片を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）は、病理学で組織の健全性を評価するために使用される標準的組織マーカーである。細胞の核（より暗いスポット；実物は青）および残りの部分（より明るい領域；実物は、種々の色調のピンク）がＨ＆Ｅにより標識される。図３Ｂ〜Ｆは、中枢神経系の種々の領域の拡大を示し、図３Ｇは、末梢神経系の領域の拡大を示す：皮質（図３Ｂ）；海馬（図３Ｃ）；小脳（図３Ｄ；矢印参照）；嗅球（図３Ｅ）；脊髄（図３Ｆ）；および脊髄後根神経節（ＤＲＧ；図３Ｇ）。倍率は約２０倍である。
【図４Ａ】Ａ〜Ｅは、ＮａＶ１．７−／−動物で内部臓器の成長が正常に見えることを示す。図４Ａは、ＮａＶ１．７−／−新生仔（生後の４日（Ｐ４））頭部の矢状切片を示す。鼻の腔および隔膜（上の矢印）ならびに舌のそれ（下の矢印）および顎の構造的健全性に留意されたい。図４Ｂ〜Ｅは、それぞれの、および予測される次記の領域で認められる内部臓器の拡大を示す：肺（図４Ｂ）；心臓（図４Ｃ）；腎臓（図４Ｄ）；小腸（３重矢印は、管腔を示す）および膀胱（単一矢印）（図４Ｅ）。倍率は約２０倍である。
【図４Ｂ】Ａ〜Ｅは、ＮａＶ１．７−／−動物で内部臓器の成長が正常に見えることを示す。図４Ａは、ＮａＶ１．７−／−新生仔（生後の４日（Ｐ４））頭部の矢状切片を示す。鼻の腔および隔膜（上の矢印）ならびに舌のそれ（下の矢印）および顎の構造的健全性に留意されたい。図４Ｂ〜Ｅは、それぞれの、および予測される次記の領域で認められる内部臓器の拡大を示す：肺（図４Ｂ）；心臓（図４Ｃ）；腎臓（図４Ｄ）；小腸（３重矢印は、管腔を示す）および膀胱（単一矢印）（図４Ｅ）。倍率は約２０倍である。
【図４Ｃ】Ａ〜Ｅは、ＮａＶ１．７−／−動物で内部臓器の成長が正常に見えることを示す。図４Ａは、ＮａＶ１．７−／−新生仔（生後の４日（Ｐ４））頭部の矢状切片を示す。鼻の腔および隔膜（上の矢印）ならびに舌のそれ（下の矢印）および顎の構造的健全性に留意されたい。図４Ｂ〜Ｅは、それぞれの、および予測される次記の領域で認められる内部臓器の拡大を示す：肺（図４Ｂ）；心臓（図４Ｃ）；腎臓（図４Ｄ）；小腸（３重矢印は、管腔を示す）および膀胱（単一矢印）（図４Ｅ）。倍率は約２０倍である。
【図４Ｄ】Ａ〜Ｅは、ＮａＶ１．７−／−動物で内部臓器の成長が正常に見えることを示す。図４Ａは、ＮａＶ１．７−／−新生仔（生後の４日（Ｐ４））頭部の矢状切片を示す。鼻の腔および隔膜（上の矢印）ならびに舌のそれ（下の矢印）および顎の構造的健全性に留意されたい。図４Ｂ〜Ｅは、それぞれの、および予測される次記の領域で認められる内部臓器の拡大を示す：肺（図４Ｂ）；心臓（図４Ｃ）；腎臓（図４Ｄ）；小腸（３重矢印は、管腔を示す）および膀胱（単一矢印）（図４Ｅ）。倍率は約２０倍である。
【図４Ｅ】Ａ〜Ｅは、ＮａＶ１．７−／−動物で内部臓器の成長が正常に見えることを示す。図４Ａは、ＮａＶ１．７−／−新生仔（生後の４日（Ｐ４））頭部の矢状切片を示す。鼻の腔および隔膜（上の矢印）ならびに舌のそれ（下の矢印）および顎の構造的健全性に留意されたい。図４Ｂ〜Ｅは、それぞれの、および予測される次記の領域で認められる内部臓器の拡大を示す：肺（図４Ｂ）；心臓（図４Ｃ）；腎臓（図４Ｄ）；小腸（３重矢印は、管腔を示す）および膀胱（単一矢印）（図４Ｅ）。倍率は約２０倍である。
【図５Ａ】Ａ〜Ｂは、人工マウスミルクの製造を示す。図５Ａは、作成中の４リッターの人工マウスミルクバッチを示す。図５Ｂは、新生仔マウス用の一定分量の最終生成物および給餌ツールを示す。これは、２４ゲージ給餌針と組み合わせた２５−μＬガラスＨａｍｉｌｔｏｎシリンジである。
【図５Ｂ】Ａ〜Ｂは、人工マウスミルクの製造を示す。図５Ａは、作成中の４リッターの人工マウスミルクバッチを示す。図５Ｂは、新生仔マウス用の一定分量の最終生成物および給餌ツールを示す。これは、２４ゲージ給餌針と組み合わせた２５−μＬガラスＨａｍｉｌｔｏｎシリンジである。
【図６】全体としては良好な健康状態で、光沢のある毛の、ヒトの手袋をした手で保持された生後１０日目のＮａＶ１．７−／−候補に、手で給餌しているところを示す。マウスの子の目は、通常、この日齢では開いていない。
【図７Ａ】Ａ〜Ｃは、我々のＮａＶ１．７コロニーでマウスの遺伝子型を決定するのに使用されたＤＮＡ電気泳動ゲルを示す。ＡＭＡ−１６１は、最初に確認された離乳ＮａＶ１．７−／−（ＫＯ）動物（ＣＤ１背景の）であった。比較として、動物ＡＭＡ−５０は、ＮａＶ１．７＋／＋（野性型）個体であると確認された。プライマー配列をＤｅｌｔａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）から入手し、コロニー中の全動物の遺伝子型特定のために使用した。：順方向Ｓｃｎ９ａプライマー：５’−ＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号１）；順方向ネオマイシンプライマー：５’−ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号３）；および逆方向Ｓｃｎ９ａプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２）。これらのプライマーは、２６７塩基対プライマー（順方向Ｓｃｎ９ａ＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ；図７Ａのバンドを参照）の内在性（Ｅ）バンド、または３８９塩基対（プライマー順方向ネオマイシン＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ；図７Ｂのバンドを参照）の標的（Ｔ）バンドを生じた。図７Ｃは、ＤＮＡを含まないＰＣＲ反応試料である対照を示す。レーン１は、内在性生成物に対する対照ＰＣＲであり、レーン２は、標的生成物に対する対照ＰＣＲである；予想通り、どちらのレーンも、ＰＣＲバンドを生じなかった。基準分子ラダーレーン（Ｌ）は、市販品：ＴｒｉＤｙｅ（登録商標）１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；カタログ番号：Ｎ３２７１Ｓ）由来のものである。白い矢印は、バンドに対応する分子の大きさを示している。
【図７Ｂ】Ａ〜Ｃは、我々のＮａＶ１．７コロニーでマウスの遺伝子型を決定するのに使用されたＤＮＡ電気泳動ゲルを示す。ＡＭＡ−１６１は、最初に確認された離乳ＮａＶ１．７−／−（ＫＯ）動物（ＣＤ１背景の）であった。比較として、動物ＡＭＡ−５０は、ＮａＶ１．７＋／＋（野性型）個体であると確認された。プライマー配列をＤｅｌｔａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）から入手し、コロニー中の全動物の遺伝子型特定のために使用した。：順方向Ｓｃｎ９ａプライマー：５’−ＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号１）；順方向ネオマイシンプライマー：５’−ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号３）；および逆方向Ｓｃｎ９ａプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２）。これらのプライマーは、２６７塩基対プライマー（順方向Ｓｃｎ９ａ＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ；図７Ａのバンドを参照）の内在性（Ｅ）バンド、または３８９塩基対（プライマー順方向ネオマイシン＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ；図７Ｂのバンドを参照）の標的（Ｔ）バンドを生じた。図７Ｃは、ＤＮＡを含まないＰＣＲ反応試料である対照を示す。レーン１は、内在性生成物に対する対照ＰＣＲであり、レーン２は、標的生成物に対する対照ＰＣＲである；予想通り、どちらのレーンも、ＰＣＲバンドを生じなかった。基準分子ラダーレーン（Ｌ）は、市販品：ＴｒｉＤｙｅ（登録商標）１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；カタログ番号：Ｎ３２７１Ｓ）由来のものである。白い矢印は、バンドに対応する分子の大きさを示している。
【図７Ｃ】Ａ〜Ｃは、我々のＮａＶ１．７コロニーでマウスの遺伝子型を決定するのに使用されたＤＮＡ電気泳動ゲルを示す。ＡＭＡ−１６１は、最初に確認された離乳ＮａＶ１．７−／−（ＫＯ）動物（ＣＤ１背景の）であった。比較として、動物ＡＭＡ−５０は、ＮａＶ１．７＋／＋（野性型）個体であると確認された。プライマー配列をＤｅｌｔａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）から入手し、コロニー中の全動物の遺伝子型特定のために使用した。：順方向Ｓｃｎ９ａプライマー：５’−ＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号１）；順方向ネオマイシンプライマー：５’−ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号３）；および逆方向Ｓｃｎ９ａプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２）。これらのプライマーは、２６７塩基対プライマー（順方向Ｓｃｎ９ａ＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ；図７Ａのバンドを参照）の内在性（Ｅ）バンド、または３８９塩基対（プライマー順方向ネオマイシン＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ；図７Ｂのバンドを参照）の標的（Ｔ）バンドを生じた。図７Ｃは、ＤＮＡを含まないＰＣＲ反応試料である対照を示す。レーン１は、内在性生成物に対する対照ＰＣＲであり、レーン２は、標的生成物に対する対照ＰＣＲである；予想通り、どちらのレーンも、ＰＣＲバンドを生じなかった。基準分子ラダーレーン（Ｌ）は、市販品：ＴｒｉＤｙｅ（登録商標）１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；カタログ番号：Ｎ３２７１Ｓ）由来のものである。白い矢印は、バンドに対応する分子の大きさを示している。
【図８Ａ】Ａ〜Ｄは、ＮａＶ１．７ＫＯマウスの外部表現型を示す（図８Ａ〜Ｄの矢印で示されたマウスを参照）。誕生から早くも１６時間で、ＮａＶ１．７−／−動物は、同腹子よりも小さかった。ＮａＶ１．７−／−の子の外部表現型は、顕著なサイズの差を除けば、正常であった。それらの目は開き、歯は生えて、毛は順調に伸びた。それらは、２、３日の遅れはあるが、ケージ中で、それらの同腹子とほぼ同時に、動くことができた。図８Ｅは、離乳後８週にわたる大きさの比較を示す。動物（ＡＭＡ−６２７〜−６３１）は、同じＳＣｎ９ａ−ＣＤ１同腹子由来でである。
【図８Ｂ】Ａ〜Ｄは、ＮａＶ１．７ＫＯマウスの外部表現型を示す（図８Ａ〜Ｄの矢印で示されたマウスを参照）。誕生から早くも１６時間で、ＮａＶ１．７−／−動物は、同腹子よりも小さかった。ＮａＶ１．７−／−の子の外部表現型は、顕著なサイズの差を除けば、正常であった。それらの目は開き、歯は生えて、毛は順調に伸びた。それらは、２、３日の遅れはあるが、ケージ中で、それらの同腹子とほぼ同時に、動くことができた。図８Ｅは、離乳後８週にわたる大きさの比較を示す。動物（ＡＭＡ−６２７〜−６３１）は、同じＳＣｎ９ａ−ＣＤ１同腹子由来でである。
【図８Ｃ】Ａ〜Ｄは、ＮａＶ１．７ＫＯマウスの外部表現型を示す（図８Ａ〜Ｄの矢印で示されたマウスを参照）。誕生から早くも１６時間で、ＮａＶ１．７−／−動物は、同腹子よりも小さかった。ＮａＶ１．７−／−の子の外部表現型は、顕著なサイズの差を除けば、正常であった。それらの目は開き、歯は生えて、毛は順調に伸びた。それらは、２、３日の遅れはあるが、ケージ中で、それらの同腹子とほぼ同時に、動くことができた。図８Ｅは、離乳後８週にわたる大きさの比較を示す。動物（ＡＭＡ−６２７〜−６３１）は、同じＳＣｎ９ａ−ＣＤ１同腹子由来でである。
【図８Ｄ】Ａ〜Ｄは、ＮａＶ１．７ＫＯマウスの外部表現型を示す（図８Ａ〜Ｄの矢印で示されたマウスを参照）。誕生から早くも１６時間で、ＮａＶ１．７−／−動物は、同腹子よりも小さかった。ＮａＶ１．７−／−の子の外部表現型は、顕著なサイズの差を除けば、正常であった。それらの目は開き、歯は生えて、毛は順調に伸びた。それらは、２、３日の遅れはあるが、ケージ中で、それらの同腹子とほぼ同時に、動くことができた。図８Ｅは、離乳後８週にわたる大きさの比較を示す。動物（ＡＭＡ−６２７〜−６３１）は、同じＳＣｎ９ａ−ＣＤ１同腹子由来でである。
【図８Ｅ】Ａ〜Ｄは、ＮａＶ１．７ＫＯマウスの外部表現型を示す（図８Ａ〜Ｄの矢印で示されたマウスを参照）。誕生から早くも１６時間で、ＮａＶ１．７−／−動物は、同腹子よりも小さかった。ＮａＶ１．７−／−の子の外部表現型は、顕著なサイズの差を除けば、正常であった。それらの目は開き、歯は生えて、毛は順調に伸びた。それらは、２、３日の遅れはあるが、ケージ中で、それらの同腹子とほぼ同時に、動くことができた。図８Ｅは、離乳後８週にわたる大きさの比較を示す。動物（ＡＭＡ−６２７〜−６３１）は、同じＳＣｎ９ａ−ＣＤ１同腹子由来でである。
【図９Ａ】Ａ〜Ｂは、ＮａＶ１．７−／−マウスは、熱刺激試験（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ装置）により、最小限の疼痛反応を有することを示す。図９Ａは、Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１ＮａＶ１．７ＫＯマウスの結果であり、遅延疼痛反応（右足、ｎ＝３）または無反応（左足、ｎ＝５）を示す。図９Ｂは、Ｓｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣＮａＶ１．７ＫＯマウス（ｎ＝１）の結果であり、どちらの足でも、熱刺激に対し反応しなかった結果を示す。ＷＴとＨＥＴの間では、図９Ａもの場合も、図９Ｂの場合も、差が認められなかった。すなわち、全て、正常に反応した。
【図９Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＮａＶ１．７−／−マウスは、熱刺激試験（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ装置）により、最小限の疼痛反応を有することを示す。図９Ａは、Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１ＮａＶ１．７ＫＯマウスの結果であり、遅延疼痛反応（右足、ｎ＝３）または無反応（左足、ｎ＝５）を示す。図９Ｂは、Ｓｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣＮａＶ１．７ＫＯマウス（ｎ＝１）の結果であり、どちらの足でも、熱刺激に対し反応しなかった結果を示す。ＷＴとＨＥＴの間では、図９Ａもの場合も、図９Ｂの場合も、差が認められなかった。すなわち、全て、正常に反応した。
【図１０Ａ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｂ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｃ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｄ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｅ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｆ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｇ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１０Ｈ】Ａ〜Ｈは、漸増熱疼痛（すなわち、ホットプレート試験）に対するＮａＶ１．７ＫＯマウスの反応を示す。注目すべきことに、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４；およびＳｃｎ９ａ〜ＢａｌｂＣ、図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、熱疼痛に対し非感受性で、５５℃の試験可能最高温度でも反応を全く示さなかった（図１０Ｄと図１０Ｈ）。この温度では、重度の表面組織損傷を避けるために、カットオフ時間（２０秒）でマウスを取り出す必要があった。
【図１１Ａ】Ａ〜Ｂは、代表的な触覚アロディニア−Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の結果を示す。全てのＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１１Ａ；ｎ＝１６；およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ、図１１Ｂ；ｎ＝４）は、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙアロディニア刺激に対し正常に反応した。全てが１．５ｇのカットオフ閾値に達したので、ＮａＶ１．７ノックアウト動物は、機械的な圧力を正常に感知すると思われる。
【図１１Ｂ】Ａ〜Ｂは、代表的な触覚アロディニア−Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の結果を示す。全てのＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１１Ａ；ｎ＝１６；およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ、図１１Ｂ；ｎ＝４）は、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙアロディニア刺激に対し正常に反応した。全てが１．５ｇのカットオフ閾値に達したので、ＮａＶ１．７ノックアウト動物は、機械的な圧力を正常に感知すると思われる。
【図１２Ａ】Ａ〜Ｂは、嗅覚消失試験の代表的結果を示す。ＮａＶ１．７ＫＯマウスは、同年齢／同姓対照（ＷＴ／ＨＥＴ）同腹子に比べて、隠された香料入りの食物ペレットを見つけることが困難であった（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１２Ａ；ｎ＝１４）、またはそれを見つけることができなかった（Ｓｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ、図１２Ｂ；ｎ＝４）。
【図１２Ｂ】Ａ〜Ｂは、嗅覚消失試験の代表的結果を示す。ＮａＶ１．７ＫＯマウスは、同年齢／同姓対照（ＷＴ／ＨＥＴ）同腹子に比べて、隠された香料入りの食物ペレットを見つけることが困難であった（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１２Ａ；ｎ＝１４）、またはそれを見つけることができなかった（Ｓｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ、図１２Ｂ；ｎ＝４）。
【図１３Ａ】Ａ〜Ｂは、ＷＴ／ＨＥＴ同腹子とは異なり、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１３Ａ；ｎ＝１２；およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ、図１３Ｂ；ｎ＝３）は、ヒスタミン誘導痒み挙動に対し非感受性であったことを示す。ＮａＶ１．７ＫＯにより行われた掻き動作平均数は、野性型／ヘテロ接合の対照同腹子への食塩水注射の場合に類似であった。
【図１３Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＷＴ／ＨＥＴ同腹子とは異なり、ＮａＶ１．７ＫＯマウス（Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１、図１３Ａ；ｎ＝１２；およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ、図１３Ｂ；ｎ＝３）は、ヒスタミン誘導痒み挙動に対し非感受性であったことを示す。ＮａＶ１．７ＫＯにより行われた掻き動作平均数は、野性型／ヘテロ接合の対照同腹子への食塩水注射の場合に類似であった。
【図１４】ベラトリジンによるＮａＶ１．７のインビトロ調節を示す。ＨＥＫ２９３細胞中で安定に発現したｈＮａＶ１．７を通る電流は、ホールセルパッチクランプ法を使って、−１００ｍＶの保持電位から１０ｍＶ間隔の一群の脱分極性電位パルスにより誘発された。
【図１５】ベラトリジンにより誘導されたラットの足を持ち上げる／足をなめる（左パネル）および足を引っ込める（右パネル）挙動、および表示投与量のメキシレチンの、それに対する効果を示す（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する）。
【図１６】リン酸塩緩衝食塩水中の１％エタノール中表示投与量のベラトリジンの足底内（ｉ．ｐｌ．）注射後３０分間記録した雄ＣＤ１マウスの合計足の持ち上げ時間、およびメキシレチンの前投与による挙動の抑制を示す（２次群に比較して、＊＊＊はｐ＜０．００１；＃＃＃はｐ＜０．００１を意味する）。
【図１７Ａ】Ａ〜Ｂは、デルタメトリンの１０μｇ投与量（懸濁液）（図１７Ａ；ｎ＝６）または０．１μｇのグラヤノトキシンＩＩＩ投与量（リン酸塩緩衝食塩水中１％エタノール中溶液）（図１７Ｂ；ｎ＝６）に反応した雄ＣＤ１マウスの引っ込め合計時間を示す。メキシレチン（３０ｍｇ／ｋｇ）の食塩水溶液のｉ．ｐ．前投与の効果も示す（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を意味する）。
【図１７Ｂ】Ａ〜Ｂは、デルタメトリンの１０μｇ投与量（懸濁液）（図１７Ａ；ｎ＝６）または０．１μｇのグラヤノトキシンＩＩＩ投与量（リン酸塩緩衝食塩水中１％エタノール中溶液）（図１７Ｂ；ｎ＝６）に反応した雄ＣＤ１マウスの引っ込め合計時間を示す。メキシレチン（３０ｍｇ／ｋｇ）の食塩水溶液のｉ．ｐ．前投与の効果も示す（＊は
【図１８】ベラトリジン注射は、野性型ヘテロ接合体ＣＤ１マウスで、強力な足の引っ込め反応を起こしたが、他方、同じ量と容量のベラトリジンは、ＣＤ１  ＮａＶ１．７ノックアウトで、反応を起こさなかったことを示す。１μｇのベラトリジンを、成体グローバルノックアウトＮａＶ１．７マウス（ｎ＝５）および野性型ヘテロ接合体同腹子（ｎ＝６）の足に注射した。メキシレチンの野生型／ヘテロ接合体マウスへの前投与が、その投与がなければベラトリジンに誘導される足を引っ込める挙動を抑制した（＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する）。
【図１９Ａ】Ａ〜Ｃは、デルタメトリンおよびグラヤノトキシンＩＩＩが、ラットの足を引っ込める反応を誘発し、それぞれ、ＮａＶ１．７を活性化したことを示す。記録チャートは、ＨＥＫ２９３細胞株で安定に発現したヒトＮａＶ１．７のホールセルパッチクランプ法による電気生理学的記録である。図１９Ａ（対照）は、＋５ｍＶ増分の−８５ｍＶ〜＋１５ｍＶの間の一連の試験ステップ脱分極に反応した電流（重ね合わせて示した）を示す。保持電位、および再分極電位は、−８５ｍＶであった；示された電流は、リーク減算処理されていない。図１９Ｂは、１μＭデルタメトリンの浴中露出後の小さい細胞由来電流を示す。活性化の電位依存性は、変わらなかったが、ステップ脱分極の間の不完全な不活性化、および再分極時に細胞中へのナトリウムの流入に対応して拡大した内向き電流に留意されたい。Ｘ−スケールバー：１ナノアンペア、ｙ−スケールバー：２０ミリ秒。図１９Ｃに示す電流は、内液（ピペット）中の３００μＭのグラヤノトキシンＩＩＩを含む、ｈＮａＶ１．７を発現している異なる細胞由来である。−１２０ｍＶ（左）の保持電位から試験を始め、−１２０ｍＶ〜−５０ｍＶ（＋５ｍＶ増分）の試験ステップ脱分極により、ナトリウム電流を活性化した。この電流は、−９５ｍＶから開始した試験パルスの間、不活性化しなかった。保持電位を−８０ｍＶに切替えると、保持電流がより大きくなり（点線）、これはＮａＶ１．７の連続した開口を反映している。−８０ｍＶ〜−４０ｍＶのさらなるステップ脱分極は、ゆっくり不活性化する電流を誘発した。スケールバー：５００ピコアンペア、および２０ミリ秒。
【図１９Ｂ】Ａ〜Ｃは、デルタメトリンおよびグラヤノトキシンＩＩＩが、ラットの足を引っ込める反応を誘発し、それぞれ、ＮａＶ１．７を活性化したことを示す。記録チャートは、ＨＥＫ２９３細胞株で安定に発現したヒトＮａＶ１．７のホールセルパッチクランプ法による電気生理学的記録である。図１９Ａ（対照）は、＋５ｍＶ増分の−８５ｍＶ〜＋１５ｍＶの間の一連の試験ステップ脱分極に反応した電流（重ね合わせて示した）を示す。保持電位、および再分極電位は、−８５ｍＶであった；示された電流は、リーク減算処理されていない。図１９Ｂは、１μＭデルタメトリンの浴中露出後の小さい細胞由来電流を示す。活性化の電位依存性は、変わらなかったが、ステップ脱分極の間の不完全な不活性化、および再分極時に細胞中へのナトリウムの流入に対応して拡大した内向き電流に留意されたい。Ｘ−スケールバー：１ナノアンペア、ｙ−スケールバー：２０ミリ秒。図１９Ｃに示す電流は、内液（ピペット）中の３００μＭのグラヤノトキシンＩＩＩを含む、ｈＮａＶ１．７を発現している異なる細胞由来である。−１２０ｍＶ（左）の保持電位から試験を始め、−１２０ｍＶ〜−５０ｍＶ（＋５ｍＶ増分）の試験ステップ脱分極により、ナトリウム電流を活性化した。この電流は、−９５ｍＶから開始した試験パルスの間、不活性化しなかった。保持電位を−８０ｍＶに切替えると、保持電流がより大きくなり（点線）、これはＮａＶ１．７の連続した開口を反映している。−８０ｍＶ〜−４０ｍＶのさらなるステップ脱分極は、ゆっくり不活性化する電流を誘発した。スケールバー：５００ピコアンペア、および２０ミリ秒。
【図１９Ｃ】Ａ〜Ｃは、デルタメトリンおよびグラヤノトキシンＩＩＩが、ラットの足を引っ込める反応を誘発し、それぞれ、ＮａＶ１．７を活性化したことを示す。記録チャートは、ＨＥＫ２９３細胞株で安定に発現したヒトＮａＶ１．７のホールセルパッチクランプ法による電気生理学的記録である。図１９Ａ（対照）は、＋５ｍＶ増分の−８５ｍＶ〜＋１５ｍＶの間の一連の試験ステップ脱分極に反応した電流（重ね合わせて示した）を示す。保持電位、および再分極電位は、−８５ｍＶであった；示された電流は、リーク減算処理されていない。図１９Ｂは、１μＭデルタメトリンの浴中露出後の小さい細胞由来電流を示す。活性化の電位依存性は、変わらなかったが、ステップ脱分極の間の不完全な不活性化、および再分極時に細胞中へのナトリウムの流入に対応して拡大した内向き電流に留意されたい。Ｘ−スケールバー：１ナノアンペア、ｙ−スケールバー：２０ミリ秒。図１９Ｃに示す電流は、内液（ピペット）中の３００μＭのグラヤノトキシンＩＩＩを含む、ｈＮａＶ１．７を発現している異なる細胞由来である。−１２０ｍＶ（左）の保持電位から試験を始め、−１２０ｍＶ〜−５０ｍＶ（＋５ｍＶ増分）の試験ステップ脱分極により、ナトリウム電流を活性化した。この電流は、−９５ｍＶから開始した試験パルスの間、不活性化しなかった。保持電位を−８０ｍＶに切替えると、保持電流がより大きくなり（点線）、これはＮａＶ１．７の連続した開口を反映している。−８０ｍＶ〜−４０ｍＶのさらなるステップ脱分極は、ゆっくり不活性化する電流を誘発した。スケールバー：５００ピコアンペア、および２０ミリ秒。
【図２０Ａ】Ａ〜Ｂは、Ｎａｖ１．７ノックアウトマウスによる抗体生成を示す。
【図２０Ｂ】Ａ〜Ｂは、Ｎａｖ１．７ノックアウトマウスによる抗体生成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
実施形態の詳細な説明
本明細書で使われるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３６】
定義
本明細書で別段の規定がない限り、本出願に関連して使われている科学的および技術的用語は、通常、当業者により理解されている意味を持つものとする。さらに、文脈から別義が要求されない限り、単数形の用語は、複数の対象物を含み、複数の用語は、反収の対象物を含むものとする。従って、文脈から別義が明確に指示されない限り、本明細書および添付請求項で使われる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数対象物を含む。例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への参照は、複数のタンパク質を含み；「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への参照は、複数の細胞集団を含む。
【００３７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では同義に使用され、ペプチド結合を介して共有結合で結合した２つ以上のアミノ酸分子鎖を含む。これらの用語は、特定の長さの生成物を意味しない。従って、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義の内に含まれる。この用語は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、等、をされたポリペプチドを含む。さらに、タンパク質断片、類似体、変異または変種タンパク質、融合タンパク質、等は、ポリペプチドの意味の内に含まれる。この用語は、また、既知のタンパク質工学技術を使って、組換えにより発現されうる、１つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれる分子を含む。さらに、融合タンパク質は、周知の有機化学技術により本明細書記載のように誘導体化できる。
【００３８】
「組換え」という用語は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入により、人工的にまたは合成により（すなわち、非天然的に）変えられていることを示す。変更は、その天然環境または状態内の、またはそこから取り出された物質に対し行うことができる。例えば、「組換え核酸」は、核酸を、例えば、クローニング、ＤＮＡシャフリングまたは他のよく知られた分子生物学的方法の間に、組み換えることにより作られるものである。このような分子生物学的方法の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、分子クローニング。実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ（１９８２）、で見つけられる。「組換えＤＮＡ分子」は、このような分子生物学的技術により一緒に連結されたＤＮＡのセグメントから構成される。本明細書で使われる「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を使って発現されるタンパク質分子を意味する。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含む、および／または発現する細胞である。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含む単鎖および二重鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ヌクレオチド残基含有ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドであってもよく、またはいずれかのヌクレオチドの型の修飾型であってもよい。前記修飾は、塩基修飾、例えば、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体、リボース修飾、例えば、２’，３’−ジデオキシリボース、およびヌクレオチド間結合修飾、例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホラニラダートおよびホスホロアミダートを含む。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の作製での使用に対しては、単鎖でも、二重鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは、センス、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれでもよい。オリゴヌクレオチドは、標識を含んでもよく、これには、定量化または検出を容易にするための同位体標識（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、２Ｈ、１３Ｎ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、等）；アッセイ検出用の蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識、が含まれる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。
【００４１】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、本明細書で同義に使用され、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド残基の一次配列であり、これには、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡ、核酸、または、文脈によっては、ヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列を含む。いずれの特定ポリヌクレオチド配列からも、所与の核酸または相補的ポリヌクレオチド配列が決定可能である。ゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれ、単鎖でも二重鎖でも、また、センス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。別段の指定がない限り、本明細書で考察されるいずれの単鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端も、５’末端であり；二重鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と見なされる。５’から３’の新生ＲＮＡ転写物の付加方向は、転写方向と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の５’から５’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の３’から３’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【００４２】
本明細書で使用される「単離核酸分子」または「単離核酸配列」は、（１）特定され、通常自然の供給源において一緒に存在する少なくとも１つの混在核酸分子から分離されているか、または（２）クローン化され、増幅され、標識され、もしくは別の方法で背景核酸から区別され、それにより、目的の核酸の配列が特定できるようにされているか、いずれかの核酸分子である。単離核酸分子は、天然に見つかる形態または設定で存在するもの以外のものである。しかし、単離核酸分子は、通常、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチドまたは抗体）を発現する細胞中に含まれる（例えば、核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体の部位に存在する）核酸分子を含む。
【００４３】
本明細書で使用される「〜をコードする核酸分子」「〜をコードするＤＮＡ配列」および「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、また、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。従って、ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ配列およびアミノ酸配列をコードする。
【００４４】
「遺伝子」という用語は、広範に使用され、生物学的機能に関連するいずれの核酸をも意味する。遺伝子は、典型的には、コード配列、および／または、そのようなコード配列の発現に必要とされる調節配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノムまたは組換え配列、ならびにその配列デコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに適用される。「融合遺伝子」は、天然で一緒には見出されないか、または天然でそのコードされた融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）中に存在する同じ配列中に一緒には見出されない、異なるタンパク質由来の部分を含むポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。遺伝子は、また、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現核酸セグメントを含む。非発現核酸セグメントは、転写因子等の調節タンパク質が結合する転写調節領域であって、隣接または近くの配列の転写を生ずるものを含む。
【００４５】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、文脈に依存して、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（任意で、ＲＮＡの修飾、例えば、スプライシングを含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（場合により、その後のポリペプチドの翻訳後修飾を含む）、または転写と翻訳の両方を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される「コーディング領域」または「コード配列」という用語は、構造遺伝子に関連して使われる場合、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチドで見出されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を意味する。真核生物では、コーディング領域は、５’側のイニシエータのメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」および３’側の停止コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を指定する３つのトリプレットの内の１つにより境界が形成されている。
【００４７】
「制御配列」または「制御シグナル」という用語は、特定の宿主細胞中で、それが連結されているコード配列の発現およびプロセッシングに影響を与えうるポリヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の性質は、宿主生物体に依存する可能性がある。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部、および転写終止配列を含むことができる。真核生物の制御配列は、１つまたは複数の転写因子用認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列または要素、ポリアデニル化部位、および転写終止配列を含むことができる。制御配列は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短い配列のＤＮＡから構成される（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７（１９８７））。プロモーターおよびエンハンサー配列は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルスの遺伝子、等の種々の真核生物の源から単離されている（類似の調節領域、すなわち、プロモーターは、原核生物でも見出される）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、どの細胞型を使って目的のタンパク質を発現させる予定かに依存する。いくつかの真核生物のプロモーターおよびエンハンサーは、広い宿主範囲を有するが、他のものは、限られた細胞型サブセット中で機能する（概説は、Ｖｏｓｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１１：２８７（１９８６）、および、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７（１９８７）、を参照）。
【００４８】
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞中に移入するために使用されるいずれの分子または実体をも（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００４９】
本明細書で使用される「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、特定の宿主細胞中で機能的に連結されたコード配列の発現に必要な所望のコード配列および適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。発現ベクターは、限定されないが、転写、翻訳に影響するまたはこれを制御する配列、および、イントロンが存在する場合には、それに機能的に連結されたコーディング領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を含むことができる。原核生物中の発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、リボソーム結合部位および場合によっては他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列は、また、任意選択で、所望に応じ、その細胞から目的のポリペプチドのより簡単な単離を目的として、目的のコード配列に機能的に連結された発現ベクターによりコードされ、それにより、発現ポリペプチドが組換え宿主細胞により分泌されうる。このような技術は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｇｏｏｄｅｙ、Ａｎｄｒｅｗ  Ｒ．；ｅｔ  ａｌ．、ペプチドおよびＤＮＡ配列（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、米国特許第５，３０２，６９７号；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、タンパク質分泌用組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）、米国特許第６，０２２，９５２号および米国特許第６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、タンパク質発現ベクターおよびその利用（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ）、米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２７  ヒト分泌タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、米国特許公開第２００３／０１０４４００Ａ１号）。
【００５０】
本明細書で使われる「操作可能な組み合わせで」、「操作可能な順に」および「機能的に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写、および／または所望のタンパク質分子の合成を指示できる核酸分子が産生されるような形式の核酸配列の結合を意味する。この用語は、また、機能的タンパク質が産生されるような形式でのアミノ酸配列の結合を意味する。例えば、タンパク質をコードする配列に「機能的に連結」されるベクター中の制御配列は、タンパク質をコードする配列の発現が、制御配列の転写活性に適合する条件下で実現されるように、それに対し連結される。
【００５１】
「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換されているか、または、形質転換されることが可能で、それにより、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、その子孫が形態学または遺伝的構成が元の親細胞に同じであっても同じでなくても、親細胞の子孫を含む。多数の入手可能な、よく知られた宿主細胞のいずれも、本発明の実施に使用できる。特定の宿主の選択は、技術分野によって認識されているいくつかの要因に依存する。これらには、例えば、選択発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子コードされるペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、バイオセーフティおよび費用、が含まれる。これらの要因の間のバランスは、全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効なわけではないという理解と合致させなければならない。これらの一般ガイドライン内で、培養に有用な微生物の宿主細胞には、細菌（例えば、大腸菌種）、酵母（例えば、サッカロミセス種）および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞、が含まれる。修飾は、ＤＮＡレベルでも同様に行うことができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択宿主細胞に適合性のより高いコドンに変更できる。大腸菌については、最適化コドンが、当技術分野で知られている。コドンを置換して、制限酵素部位を除去する、またはサイレント制限酵素部位を含めることができ、これは、選択宿主細胞中でのＤＮＡプロセッシングを支援し得る。次いで、形質転換宿主は、培養され、精製される。宿主細胞は、従来の発酵条件下で培養し、所望の化合物を発現させることができる。このような発酵条件は、当技術分野でよく知られている。
【００５２】
「形質移入」という用語は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの取込を意味し、外因性のＤＮＡが、細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入」されている。いくつかの形質移入技術が当技術分野でよく知られており、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、同上；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、分子生物学における基礎的方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７、を参照されたい。このような技術を使用して、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ成分を適切な宿主細胞中に導入することができる。
【００５３】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を意味し、細胞は、改変されて新規ＤＮＡまたはＲＮＡを含む場合、形質転換されている。例えば、形質移入、形質導入、または他の技術による新しい遺伝物質の導入により、その自然の状態から遺伝的に改変されている場合、細胞は形質転換されている。形質移入または形質導入後、形質転換ＤＮＡは、物理的にその細胞の染色体中に組み込むことにより、細胞のＤＮＡと組み換えることができ、または、複製されることなく、エピソーム要素として一時的に維持でき、または、独立にプラスミドとして複製できる。形質転換ＤＮＡが細胞分裂により複製される場合、細胞は、「安定に形質転換」されていると見なされる。
【００５４】
同系交配マウス株（例えば、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ）を、異なる同系交配マウス株（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）に変化させるプロセスは、「戻し交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓｉｎｇ）」または「戻し交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ）」と呼ばれる。これは、マウス株が意図した研究目的に適さない場合に有用であり；株は、育種計画により遺伝的に改変できる。遺伝子型を「株Ａ」（例えば、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ）から「株Ｂ」（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）に完全に形質転換するために、マウスは、通常、少なくとも１０回、戻し交配される必要があり；その後にのみ、それらは、「類遺伝子性」と呼ぶことができる。マウスを戻し交配するために、変異体マウスは、選ばれた同系交配株（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）と交配される。この交配の出生児は、「戻し交配＃１」（または「Ｎ１」）と命名され、両方の株のハイブリッドである（例えば、約：５０％Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊおよび５０％ＢＡＬＢ／ｃ）。出生児は遺伝子型が特定でき、これらの目的の遺伝子に対するヘテロ接合体のみが、同系交配マウス株の野性型個体（例えば、野性型ＢＡＬＢ／ｃマウス）と、再度交配される。通常、この手順は、類遺伝子性ＢＡＬＢ／ｃ系統が得られるまで約１０回繰り返される。同系交配マウス株のいずれの組み合わせも、この手法を使用して選ばれた株の類遺伝子系統を作ることができる。例として、２０１０年１２月までに、我々は、同系交配ＢＡＬＢ／ｃ背景の第５戻し交配世代（「Ｎ５」）を生成し、特徴付けした。ヘテロ接合の（「ＨＥＴ」）出生児は、約９８．６％ＢＡＬＢ／ｃの遺伝的背景である。２０１１年の５月には、我々は、最初のＢＡＬＢ／ｃ類遺伝子性繁殖ペアを得た。我々は、この背景がＮａＶ１．７ＫＯ新生児の生存率を改善するか否か（すなわち、ヒトケア／給餌の要求が減ったか否か）を評価するために現在交配している。今のところ、結果は、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ−ＢＡＬＢ／ｃハイブリッドと同じであるように思われる。
【００５５】
同系交配マウス株（例えば、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ）を、非近交系マウス株（例えば、ＣＤ１）に変えるプロセスは、「異系交配（ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ）」または「異系交配（ｏｕｔｃｒｏｓｓ）」と呼ばれる。これは、同系交配マウス株からの変異体（ノックアウト）動物が衰弱の徴候を示す場合に有用であり；目的の遺伝子に対するヘテロ接合出生児は、非近交系マウス株と交配して、遺伝的変異および活力を同系交配マウス株中に導入できる。マウスの異系交配を行うために、変異マウスは、選択された非近交系株（例えば、ＣＤ１）由来の野性型マウスと交配される。この交配の出生児は、ハイブリッドである（例えば、約：５０％Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊおよび５０％ＣＤ１）。非近交系マウスは、遺伝子プール中で変異が多すぎて類遺伝子性系統を作れないために、通常は、それ以上「異系交配」されない。
【００５６】
タンパク質の「ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）」または「領域（ｒｅｇｉｏｎ）」（本明細書では同義に使用される）は、完全なタンパク質まで、およびこれを含む全体タンパク質のいずれかの部分であり、通常、完全なタンパク質より少ない部分を含む。ドメインは、（必要はないが）特定の生物学的、生化学的、または構造的機能または部位（例えば、リガンド結合ドメイン、またはサイトゾルの、膜貫通型の、もしくは細胞外のドメイン）を、残りのタンパク質鎖とは無関係に保持し、および／または、それらと関連付けられ得る。
【００５７】
「哺乳動物」は、哺乳類に分類されるいずれの動物をも意味し、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、および動物園、スポーツ、またはペット動物を含み、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、雌ウシ、ラット、マウス、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、等である。
【００５８】
「げっ歯類（ｒｏｄｅｎｔ）」および「複数げっ歯類（ｒｏｄｅｎｔｓ）」という用語は、系統学的ネズミ目の全メンバーを指し、それら由来の全ての未来の世代のいずれかのおよび全ての子孫を含む。
【００５９】
「マウス」という用語は、ファミリーネズミ科のいずれかのおよび全てのメンバーを指し、ラットおよびマウスを含む。
【００６０】
生物学的物質、例えば、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、等に関連して、本明細書全体を通して使用される「天然の」という用語は、自然で見出される物質を意味する。
【００６１】
動物、例えば、マウスまたは特に、グローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスに関し、「生存可能な」という用語は、動物が、成人期に達することができる（新生仔または幼動物の場合には）、または成人期に達していて、適切な栄養を摂ると自ら生きることができることを意味する。
【００６２】
「ノックアウト」という用語は、細胞中の内在性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質、例えば、サブユニットのナトリウムチャネル、電位依存性、タイプＩＸ（「ＮａＶ１．７」としても知られる）の少なくとも一部の発現の部分的または完全抑制を意味する。「ＮａＶ１．７ノックアウト」、「ＮａＶ１．７ＫＯ」、「ＮａＶ１．７−／−」、「ＮａＶ１．７−／−ノックアウト」および「ＮａＶ１．７ヌル変異体」という用語は、本明細書では同義に使用され、機能性ＮａＶ１．７タンパク質の発現の完全抑制を示す細胞または哺乳動物を意味する。「ｈＮａＶ１．７」という用語は、ヒトＮａＶ１．７を意味する。
【００６３】
「ノックアウト構築物」という用語は、細胞中の内在性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるか、または抑制するように設計されている核酸配列を意味する。ノックアウト構築物として使用される核酸配列は、通常、（１）抑制される遺伝子のいくつかの部分（エキソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）由来のＤＮＡ、および（２）細胞中のノックアウト構築物の存在を検出するために使用されるマーカー配列、からなる。ノックアウト構築物は、細胞中に挿入され、ネイティブＤＮＡ配列の転写を防ぐか、または阻止するような位置で、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。このような挿入は、通常、相同組換えにより起こる（すなわち、ノックアウト構築物が細胞中に挿入され、組み換えられて、ノックアウト構築物が内在性ＤＮＡの対応する位置に組み込まれる時に、内在性ＤＮＡ配列に相同なノックアウト構築物の領域が相互にハイブリダイズする）。ノックアウト構築物の核酸配列は、１）抑制される１つまたは複数の遺伝子のエキソンおよび／またはイントロンの完全または部分的配列、２）遺伝子の抑制されるプロモーターの完全または部分的配列、または３）これらの組み合わせ、を含むことができる。
【００６４】
典型的には、ノックアウト構築物は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）中に挿入され、通常、相同組換えプロセスにより、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡ中に統合される。このＥＳ細胞は、その後、発生過程の胚中に導入され、統合される。
【００６５】
「遺伝子の撹乱」および「遺伝子撹乱」という表現は、核酸配列のネイティブＤＮＡ配列の１つの領域（通常、１つまたは複数のエキソン）、および／または遺伝子のプロモーター領域中へ挿入し、遺伝子の野性型または天然配列に比べて、細胞中でのその遺伝子の発現を減らすか、または防ぐことを意味する。例として、撹乱されるＤＮＡ配列（プロモーターおよび／またはコーディング領域）に相補的なＤＮＡ配列中に挿入される抗生物質耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む核酸構築物を調製できる。その後、この核酸構築物を細胞中に形質移入すると、構築物は、ゲノムＤＮＡに統合される。従って、その時点でＤＮＡが抗生物質抵抗性遺伝子により撹乱されているために、その細胞の多くの子孫は、少なくとも一部の細胞中で、もはやその遺伝子を発現しないか、または低いレベルで発現することになる。
【００６６】
「導入遺伝子」という用語は、哺乳動物または哺乳類胚の１つまたは複数の細胞中に挿入されうる、宿主とは異なる種に由来する単離ヌクレオチド配列を意味する。導入遺伝子は、任意選択で、直接、または間接的に、細胞機構と連携して、導入遺伝子の転写および／または発現を調節する機能を果たすことができる他の遺伝的要素（例えば、プロモーター、ポリＡ配列、等）に機能的に連結されていてもよい。あるいは、または追加として、導入遺伝子は、導入遺伝子の哺乳動物細胞または胚の核の染色体ＤＮＡ中への統合を支援する（例えば、相同組換えで）ヌクレオチド配列に連結されてもよい。導入遺伝子は、哺乳動物の内在性遺伝物質中の特定のヌクレオチド配列に対し相同または異種であるか、またはハイブリッド配列（すなわち、哺乳動物の遺伝物質に対し、導入遺伝子の１つまたは複数の部分が相同で、１つまたは複数の部分が異種）であるヌクレオチド配列から構成されてもよい。導入遺伝子ヌクレオチド配列は、哺乳動物中で内因的に見出されるポリペプチドまたはポリペプチドの変異体をコードしてもよく、哺乳動物の天然に存在しないポリペプチド（すなわち、外因性のポリペプチド）をコードしてもよく、または、内在性および外因性ポリペプチドのハイブリッドをコードしてもよい。導入遺伝子がプロモーターに機能的に連結される場合は、そのプロモーターは、哺乳動物、および／または導入遺伝子に対し、相同であっても、異種であってもよい。あるいは、プロモーターは、内在性および外因性のプロモーター要素（エンハンサー、サイレンサー、サプレッサー、等）のハイブリッドであってもよい。
【００６７】
「疼痛関連反応」は、疼痛誘導刺激が加えられた場合、哺乳動物の特定の種で典型的に示される、例えば、マウスおよびラットでの足を持ち上げる、足をなめる、足を引っ込める、鳴く、またはこれらのいずれかの組み合わせの挙動のような、認識されるいずれかの挙動である。ヒト対象では、例えば、口頭または文書による疼痛の自己報告、または叫び声が「疼痛関連反応」といえる。
【００６８】
用語の「子孫」は、特定の哺乳動物、すなわち、そのゲノムＤＮＡに挿入されたノックアウト構築物を含む哺乳動物由来で、それから派生するいずれかの、および全ての未来の世代を意味する。従って、いずれかの継続的世代の子孫が本明細書で含まれ、それにより、子孫のＦ１、Ｆ２、Ｆ３、世代、等は、どこまでもこの定義に含まれる。
【００６９】
追加の実施形態
１つ、２つ、またはそれ超の追加の目的遺伝子が、マウス由来の遺伝子（改変ヌクレオチド配列を有してもよい）または導入遺伝子の挿入により「ノックアウト」、または「ノックイン」されているグローバルＮａｖ１．７ＫＯマウスが、本発明の範囲に含まれる。このような哺乳動物は、本明細書で各「ノックアウト」または遺伝子導入「ノックイン」構築物を生成するために記載された手続きを繰り返すことにより、または単一ノックアウト遺伝子を有する哺乳動物と相互に交配し、二重、または多重の、ノックアウトおよび／またはノックイン遺伝子型を有するものを選別することにより、生成できる。撹乱されるか、または組換えで発現されるＤＮＡ上の少なくとも一部の配列情報を入手でき、構築物および選別プローブの両方の調製に使用できるという条件で、ノックアウトまたはノックインされる遺伝子は、いずれの遺伝子でもよい。
【００７０】
ノックアウト遺伝子の選択
通常、ノックアウト構築物に使用されるＤＮＡは、１つまたは複数のエキソンおよび／またはイントロン領域、および／またはプロモーター領域であるが、ｃＤＮＡが充分に大きければ、ｃＤＮＡ配列であってもよい。一般的に、ＤＮＡは、少なくとも約１キロベース（ｋｂ）長、好ましくは、３〜４ｋｂの長さであり、それにより、構築物がＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに導入される場合（下記で考察）、ハイブリダイゼーションに充分な相補的配列を提供する。典型的には、ノックアウトされる目的の遺伝子は、ノックアウトした場合、致死に繋がらない遺伝子であろう。
【００７１】
選択遺伝子をノックアウトするために使用されるＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．［１９８９］）により記載されたもの、等の当技術分野でよく知られた方法を使って得ることができる。このような方法には、例えば、少なくとも一部のゲノム配列を得るための、同じ遺伝子の少なくとも一部をコードするｃＤＮＡプローブを使ったゲノムライブラリーの選別が含まれる。あるいは、ｃＤＮＡ配列がノックアウト構築物で使用される場合は、そのｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブまたは抗体を使ってｃＤＮＡライブラリーを選別することより（この場合、ライブラリーは、発現ベクター中に挿入される）得ることができる。プロモーター配列がノックアウト構築物で使用される場合は、合成ＤＮＡプローブは、プロモーター配列を含むゲノムライブラリーを選別するよう設計できる。
【００７２】
ノックアウト構築物で使用されるＤＮＡを得る別の方法は、ＤＮＡ合成装置を使って、ＤＮＡ配列を合成により作製することである。
【００７３】
ノックアウト構築物をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子操作およびＥＳ細胞への挿入に充分な量で生成されなければならない。増幅は、１）その配列を適切なベクターに配置し、急速にベクターを増幅できる細菌細胞または他の細胞を形質転換すること、２）ＰＣＲ増幅により、または３）ＤＮＡシンセサイザーを使った合成により行うことができる。
【００７４】
ノックアウト構築物の調製
ノックアウト構築物の生成に使われるＤＮＡ配列は、典型的には、新しいマーカー遺伝子をコードするＤＮＡ配列が、このＤＮＡ配列内の適切な位置に挿入されうるような部位で切断されるように選択される特定の制限酵素で消化される。マーカー遺伝子挿入用の適切な位置は、自然遺伝子の発現を防ぐように機能する位置であり；この位置は、切断される配列中の制限酵素部位、およびエキソン配列、プロモーター配列または両方の内のどれが遮断されるのか（すなわち、プロモーター機能を抑制するまたはネイティブエキソンの合成を抑制するのに必要な正確な挿入位置）、等の種々の要因に依存する。典型的には、ＤＮＡ切断用に選択される酵素は、より長いアームおよびより短いアームを生成し、より短いアームは、少なくとも約３００ベース対（ｂｐ）である。いくつかの例では、マーカー遺伝子が、ノックアウト構築物に挿入される場合、元のゲノム配列と同程度のノックアウト構築物の長さを保持するために、１つまたは複数の抑制される遺伝子のエキソンの内の一部またはさらには全てを、実際に除去するのが望ましい。これらの場合では、ゲノムＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、それにより、適切な大きさの断片が除去できる。
【００７５】
マーカー遺伝子は、検出可能な、および／またはアッセイ可能ないずれの核酸配列でもよいが、典型的には、それは、抗生物質耐性遺伝子またはゲノム中のその発現または存在が容易に検出できる他の遺伝子である。マーカー遺伝子は、通常、機能的に連結されたそれ自体のプロモーター、または挿入された細胞中で活性であるか、または容易に活性化できる任意のソース由来の別の強力プロモーターあるが、マーカー遺伝子は、抑制される遺伝子のプロモーターを使って転写でき得るので、それ自体のプロモーターが付随している必要はない。さらに、マーカー遺伝子は、通常、遺伝子の３’末端に結合したポリＡ配列を有し；この配列が遺伝子の転写を終止させる役目をする。好ましいマーカー遺伝子は、ｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）およびベータｇａｌ（ベータガラクトシダーゼ）、等のいずれかの抗生物質耐性遺伝子である。
【００７６】
ゲノムＤＮＡ配列が適切な制限酵素により消化完了した後で、マーカー遺伝子配列は、当業者によく知られた、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（同上）に記載の方法を使ってゲノムＤＮＡ配列に連結される。連結されるＤＮＡ断片の末端は、適合性でなければならない；これは、適合性末端を生成する酵素で全ての断片を切断するか、または連結反応の前に平滑末端化することにより実現される。平滑末端化は、例えば、付着末端にはめ込まれるクレノー断片（ＤＮＡポリメラーゼＩ）の使用による、等の当技術分野でよく知られた方法を使って行える。
【００７７】
連結ノックアウト構築物は、胚性幹細胞中に直接挿入さても（下記で考察）、または、最初に、挿入に先立つ増幅のために適切なベクター中に置かれてもよい。好ましいベクターは、細菌細胞中で急速に増幅されるもの、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）またはｐＧＥＭ７（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）である。
【００７８】
胚性幹細胞の形質移入
本発明は、限定されないが、ウサギ、ラット、ハムスター、およびマウスを含む任意のげっ歯類の種由来のノックアウト哺乳動物の産生を意図している。好ましいげっ歯類には、ラットおよびマウスを含むネズミ科ファミリーのメンバーが含まれる。ノックアウト生成用のＥＳ細胞が導出できるマウス株には、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９ＳＶ、ＣＤ１、またはＢＡＬＢ／ｃが含まれる。一般的に、ノックアウト哺乳動物の産生に使われる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、生成されるノックアウト哺乳動物と同じ種である。従って、例えば、マウス胚性幹細胞が、通常、ノックアウトマウスの生成に使用される。
【００７９】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、典型的には、ノックアウト構築物の生殖細胞系列伝達を生成するように、発生過程の胚の生殖細胞系列の一部中に組み込まれる能力とその一部になる能力で選択される。従って、この能力を有すると考えられるいずれのＥＳ細胞株も、本明細書での使用に適する。ＥＳ細胞の産生に通常使用される１つのマウス株は、１２９Ｊ株である。好ましいＥＳ細胞株は、マウス細胞株Ｄ３（アメリカ合衆国培養細胞株保存機関、カタログ番号：ＣＲＬ  １９３４）である。細胞を培養し、下記に記載のもの等の、当業者よく知られた方法を使ってＤＮＡ挿入用に調製される：Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ：奇形癌腫および胚性幹細胞：実践的手法（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、ｅｄ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．［１９８７］、およびＢｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：３５７−３７１［１９８６］、ならびにＨｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、マウス胚の操作：実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．［１９８６］。
【００８０】
ノックアウト構築物のＥＳ細胞中への挿入は、例えば、電気穿孔、微量注入、およびリン酸カルシウム処理（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、ｅｄ．、同上中のＬｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅを参照）等の当技術分野でよく知られた種々の方法を使って達成できる。好ましい挿入方法は、電気穿孔である。
【００８１】
細胞に挿入される各ノックアウト構築物ＤＮＡは、ノックアウト構築物がベクターに挿入されている場合は、最初に、直線化しなければならない。直線化は、ベクター配列内でのみ切断され、ノックアウト構築物配列内で切断されないように選択された適切な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化させることにより実現される。
【００８２】
ＤＮＡ配列の挿入のために、ノックアウト構築物ＤＮＡは、選択された挿入方法に適切な条件下でＥＳ細胞に加えられる。２つ以上の構築物をＥＳ細胞中に導入する場合には、各構築物をコードするＤＮＡを、同時にまたは１回で導入できる。
【００８３】
細胞を電気穿孔する場合は、ＥＳ細胞およびノックアウト構築物ＤＮＡを、電気穿孔装置を使い、メーカーの使用ガイドラインに従って電気パルスに曝す。電気穿孔後、細胞は、適切なインキュベーション条件下で回復させる。次に、細胞をノックアウト構築物の存在に関し選別する。
【００８４】
選別は、種々の方法を使って行える。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子の場合は、それ以外は致死の濃度の抗生物質の存在下で細胞を培養する。生存細胞は、おそらく統合されたノックアウト構築物を有する。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外である場合は、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロットを使って、マーカー配列のみにハイブリダイズするように設計されたＤＮＡ配列で検出できる。最後に、マーカー遺伝子がその活性を検出できる酵素（例えば、ベータガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子である場合は、酵素の基質を適切な条件下で細胞に添加し、酵素活性を解析できる。
【００８５】
ノックアウト構築物は、ＥＳ細胞ゲノム中のいくつかの部位に組み込むことができ、ランダム挿入イベントの発生に起因して、各細胞のゲノム中の異なる部位に組み込むことができ；所望の挿入部位は、ノックアウトされるＤＮＡ配列に相補的な位置にある。典型的には、ノックアウト構築物を取り込むＥＳ細胞の内の約１〜５パーセント未満が、望ましい部位にノックアウト構築物を実際に組み込まれる。ノックアウト構築物の適切な組込みを有するこれらの細胞を特定するために、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、同上、に記載の方法、等の標準的な方法を使って、細胞からＤＮＡを抽出できる。次に、ＤＮＡは、特定の制限酵素で消化されるゲノムＤＮＡに、特異的パターンでハイブリダイズするように設計されたプローブまたは複数プローブを使って、サザンブロットで検出できる。あるいは、または追加として、ゲノムＤＮＡは、特定のサイズと配列のＤＮＡ断片を増幅するように特別に設計されたプローブを使ってＰＣＲにより増幅できる（すなわち、適切な位置のノックアウト構築物を含む細胞のみが、適切なサイズのＤＮＡ断片を生成する）。
【００８６】
胚の注入／移植
適切な部位にノックアウト構築物を含む適切なＥＳ細胞が特定された後で、細胞は、胚中に挿入される。挿入は、種々の方法で実現できるが、好ましい方法は、微量注入である。微量注入では、約１０〜３０細胞がマイクロピペット中に集められ、ＥＳ細胞を発生段階の胚中に組み込むのに適した発生段階にある胚中に注入される。
【００８７】
適切な胚の発生段階は、非常に種依存であるが、マウスでは、約３．５日である。胚は、妊娠雌の子宮を灌流することにより得られる。これを実現する適切な方法は、当業者には既知であり、Ｂｒａｄｌｅｙ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、ｅｄ．、同上）により説明されている。
【００８８】
適切な年齢／発生段階のいずれの胚でも使用に適するが、好ましい胚は、雄で、ＥＳ細胞遺伝子によりコードされる毛色とは異なる毛色をコードする遺伝子を有するものである。このようにして、出生児は、モザイク毛色を探す（ＥＳ細胞が発生段階の胚中に組み込まれたことを示す）ことにより、ノックアウト構築物の存在を容易に選別できる、従って、例えば、ＥＳ細胞株が白色毛皮の遺伝子を持つ場合、選択される胚は、黒または茶色の毛皮の遺伝子を持つものとなる。
【００８９】
ＥＳ細胞が胚中に導入された後、胚は、偽妊娠養母の子宮中に移植される。いずれの養母も使用可能であるが、典型的には、うまく交配し、繁殖する能力、および子どもの世話をする能力で選択される。このような養母は、典型的には、同じ種の精管切除された雄との交配により供給される。偽妊娠養母の段階は、移植の成功にとって重要であり、それは種依存である。マウスでは、この段階は、約２〜３日の偽妊娠である。
【００９０】
ノックアウト遺伝子の存在に関する選別
概して、養母の子として生まれた出生児は、最初に、毛色選択法（上述の）が採用された場合モザイク毛色で選別できる。さらに、または代替法として、出生児の尾部組織由来のＤＮＡを、上述のように、サザンブロット、および／またはＰＣＲを使ってノックアウト構築物の存在に関し選別できる。次に、モザイク模様に見える出生児が、それらが、生殖細胞系列中にノックアウト構築物を有し、ホモ接合のノックアウト動物を生成すると考えられる場合は、相互に交配される。出生児が生殖細胞系列伝達を有するか否かが不明確な場合は、それらは親株と、または他の株と交配でき、出生児をヘテロ接合性に関し選別できる。ヘテロ接合体は、上で説明のように、サザンブロット、および／またはＤＮＡのＰＣＲ増幅により特定される。
【００９１】
次いで、ヘテロ接合体が、相互に交配され、ホモ接合のノックアウト出生児を生成できる。ホモ接合体は、この交配の産物であるマウス、ならびにヘテロ接合体および野性型マウスであるとわかっているマウス由来の等量のゲノムＤＮＡのサザンブロットにより特定できる。サザンブロットで選別するプローブは、上で説明のように設計できる。
【００９２】
他のノックアウト出生児を特定し、特徴付ける手段が利用できる。例えば、ノーザンブロット法を使って、ノックアウト遺伝子、マーカー遺伝子、または両方をコードする転写物の存在または非存在に関して、ｍＲＮＡを調べることができる。さらに、ウェスタンブロットを使用して、ノックアウト遺伝子によりコードされたタンパク質に対する抗体を用い、またはマーカー遺伝子産物に対する抗体を用いて、ウェスタンブロットを探査することにより、これらの出生児の種々の組織中のノックアウトされた遺伝子の発現レベルを、この遺伝子が発現している場合に、評価できる。最後に、出生児由来の種々の細胞のインサイツ分析（例えば、細胞の固定および抗体で標識）および／またはＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）分析を適切な抗体を使って行い、ノックアウト構築物遺伝子産物の存在または非存在を探索することができる。
【００９３】
新生仔のＮａＶ１．７ＫＯマウスは、明らかに摂食できないことを示すと報告された（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）ために、本明細書の実施例１に記載のように、手による給餌を使って、栄養を新生仔のＮａＶ１．７ＫＯマウスに与えることができる。代わりの「手での給餌」の必要のない、静脈内給餌または胃挿入管およびシリンジポンプ等を使った給餌方法／人工飼育もまた、有用になりうる。しかし、必要な付随手術は、新生仔マウスに対しかなりのリスクを課す。あるいは、各マウスの子を単独でカップ中で飼育することを含む、いわゆる「ｐｕｐ  ｉｎ  ａ  Ｃｕｐ」を使用することができる（脳の発達の研究へのｐｕｐ  ｉｎ  ａ  Ｃｕｐモデルの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｕｐ  ｉｎ  ａ  Ｃｕｐ  Ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１２３：３８２−３８５（１９９３））。しかし、付随するシリンジポンプに関連する胃手術により引き起こされうる身体的傷害に加えて、この技術は、これらの社会性動物の行動障害を誘導し、従って、このようなマウスを使って得られるインビボデータの一部の信頼性に影響を与える可能性がある。上述のような合併症を避けて、ノックアウトの生存を増やす別の可能な方法は、ノックアウトを授乳雌親と一緒に置くことであり、そこでは、授乳がマウスの子の正常な同腹子により誘導される。すなわち、ＮａＶ１．７ノックアウトマウスの子は、ＮａＶ１．７ノックアウトマウスの子への給餌の必要性に応じ、正常な同腹子と交換される。雌親が外来性ＮａＶ１．７ＫＯマウスの子を拒絶しないのを確実にするために、ノックアウトは、雌親の香りでマークされうる。時折、全ての遺伝子型の新生仔で腹部膨満が観察された。この腹部膨満は、腹部の膨満感の原因となる胃の空洞中の空気の存在を特徴とする。このような状況下では、永久取り付け型２９ゲージ１／２インチ針を装着した極細インスリンシリンジを使って、空気を手作業で除去できる。
【００９４】
導入遺伝子技術
導入遺伝子の選択
典型的には、本発明で有用な導入遺伝子は、目的のポリペプチド、例えば、神経系、免疫反応、造血、炎症、細胞成長と増殖、細胞系列分化、および／またはストレス反応に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であろう。本発明の範囲内に含まれるのは、１つ、２つ、またはそれ超の導入遺伝子の、本発明のＮａＶ１．７ノックアウトマウスへの挿入である。
【００９５】
２つ以上の導入遺伝子が本発明で使用される場合は、導入遺伝子は、別々に調製、および挿入でき、または１つの挿入用構築物として一緒に生成できる。導入遺伝子は、各導入遺伝子の発現を進めるために選択された両方のプロモーターに対し、および／または哺乳動物に対し、相同であっても、異種であってもよい。さらに、導入遺伝子は、少なくといくらかの生物活性を有する、すなわち、同じ種の野性型、非遺伝子導入哺乳動物では容易に観察されないレベル（生化学的、細胞性および／または形態学的）で効果を示す、完全長ｃＤＮＡであっても、ゲノムＤＮＡ配列であっても、またはそれらのいずれかの断片、サブユニットまたは変異体であってもよい。任意選択で、導入遺伝子は、ハイブリッドヌクレオチド配列、すなわち、相同および／または異種のｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ断片から構築された配列であってもよい。導入遺伝子は、また、任意選択で、天然ｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列、またはそれらの対立遺伝子変異体の内の１つまたは複数の変異体であってもよい。
【００９６】
それぞれの導入遺伝子は、当技術分野でよく知られた１つまたは複数の方法を使って、適切な量で単離し、得ることができる。導入遺伝子の単離に有用なこれらのおよび他の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．［１９８９］）およびＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（酵素学における方法：分子クローニング技術ガイド（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、ｖｏｌ．１５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．［１９８７］）、に記述されている。
【００９７】
それぞれの導入遺伝子のヌクレオチド配列が既知の場合は、導入遺伝子は、化学合成方法、例えば、Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８：７１６−７３４［１９８９］）に記載の方法を使って、全体または一部を合成できる。これらの方法には、特に、核酸合成ホスホトリエステル、ホスホラミダイトおよびＨ−ホスホナート法が含まれる。あるいは、導入遺伝子は、導入遺伝子ＤＮＡに選択的にハイブリダイズする１つまたは複数の核酸プローブ（クローン化される導入遺伝子に対し許容可能なレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたは、ゲノムＤＮＡ断片、等）を使って、適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを選別することにより得ることができる。別の適切な導入遺伝子を得る方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかし、この方法をうまく使うには、導入遺伝子のヌクレオチド配列に関する充分な情報が、適切なヌクレオチド配列の増幅に有用な適切なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために利用できることが必要である。
【００９８】
選択の方法に、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用が必要な場合（例えば、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー選別）には、プローブまたはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、ライブラリー選別またはＰＣＲの間に起こる非特異的結合の量を最小限にするために、適切な長さであり、一義的である必要がある。プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、別の生物体からの同じまたは類似の遺伝子由来の保存または高相同配列もしくは領域に基づく。任意選択で、プローブまたはプライマーは、変性させてもよい。
【００９９】
導入遺伝子のアミノ酸配列のみがわかっている場合は、可能性のある、機能的核酸配列は、それぞれのアミノ酸残基に対する既知で好ましいコドンを使って導入遺伝子を推測できる。そこで、この配列を、化学的に合成できる。
【０１００】
本発明は、導入遺伝子変異体配列の使用を包含する。変異体導入遺伝子は、野性型配列と比較して、１つまたは複数のヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含む導入遺伝子である。ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入により、野性型アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる遺伝子産物（すなわち、タンパク質）を生成することができる。このような変異体の調製は、当技術分野でよく知られており、また、例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ、３４：３１５［１９８５］）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、同上、に記載されている。
【０１０１】
調節の要素の選択
導入遺伝子は、典型的には、プロモーターに機能的に連結されており、そこでプロモーターは、各導入遺伝子の発現を特定の様式で調節するように選択される。
【０１０２】
２つ以上の導入遺伝子が使われる場合には、それぞれの導入遺伝子は、同じまたは異なるプロモーターにより調節できる。選択されたプロモーターは、相同（すなわち、導入遺伝子を形質移入される哺乳動物と同じ種由来）であっても、異種（すなわち、導入遺伝子を形質移入される哺乳動物の種以外の源由来）であってもよい。従って、各プロモーターの源は、いずれの単細胞、原核生物または真核生物の生物体からでもよく、またはいずれの脊椎動物または無脊椎動物生物体からのものでもよい。
【０１０３】
他のベクター成分の選択
導入遺伝子およびプロモーターに加えて、本発明の導入遺伝子の調製に有用なベクターは、典型的には、（１）導入遺伝子が挿入される哺乳動物中での導入遺伝子の最適発現、および（２）細菌または哺乳類宿主細胞中でのベクターの増幅に有用な１つまたは複数の他の要素を含む。これらの要素のそれぞれは、ベクター中で、それぞれ他の要素に対して適切に配置され、それにより、それぞれの作用を最大化する。このような位置決めは、当業者にはよく知られている。下記の要素が、任意選択で、必要に応じ、ベクター中に含むことができる。
【０１０４】
ｉ．シグナル配列要素
導入遺伝子によりコードされるポリペプチドが分泌される本発明の実施形態にでは、シグナル配列と名付けられた小さなポリペプチドが存在する場合が多く、これは、導入遺伝子によりコードされたポリペプチドをそれが合成される細胞から外部へ誘導する。典型的には、シグナル配列は、導入遺伝子のコーディング領域中の５’末端の近く、または５’末端に配置される。多くのシグナル配列が特定されており、機能的で、従って、遺伝子導入組織と適合するそれらの内のいずれも、導入遺伝子と共に使用可能である。従って、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、導入遺伝子に対し相同でも、異種でもよく、遺伝子導入哺乳動物に対し、相同でも、異種でもよい。さらに、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、上述の方法を使って、化学的に合成できる。しかし、本明細書の目的のために好ましいシグナル配列は、導入遺伝子と共に天然で生成するもの（すなわち、導入遺伝子に相同である）である。
【０１０５】
ｉｉ．膜アンカードメイン要素
いくつかの例では、導入遺伝子を、特定の細胞膜の表面またはその細胞膜上に発現させることが好ましい場合がある。天然膜タンパク質は、ポリペプチドの一部として、タンパク質を膜に係留する役割をするアミノ酸の一続きの配列を含む。しかし、膜上の天然にはないタンパク質に対して、このような一続きの配列のアミノ酸を加えて、この特徴を付与できる。頻繁に、このアンカードメインは、ポリペプチド配列の内部部分であり、そのため、それをコードするヌクレオチド配列は、導入遺伝子ヌクレオチド配列の内部領域中へ操作される。しかし、他の場合では、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、導入遺伝子ヌクレオチド配列の５’または３’末端に結合され得る。ここで、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、最初に、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列とは別の成分として、ベクター中の適切な位置に配置できる。シグナル配列に関しては、アンカードメインは、いずれの源からであってもよく、従って、導入遺伝子および遺伝子導入哺乳動物の両方に対して、相同でも、異種でもよい。あるいは、アンカードメインは、前記の方法を使って化学的に合成できる。
【０１０６】
ｉｉｉ．複製起点要素
この成分は、典型的には、市販品購入される原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞中でのベクターの増幅を支援する。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合は、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結できる。
【０１０７】
ｉｖ．転写終止要素
この要素は、ポリアデニル化またはポリＡ配列としても知られ、典型的には、ベクター中の導入遺伝子ヌクレオチド配列の３’に位置し、導入遺伝子の転写を終わらせる役割をする。この要素をコードするヌクレオチド配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として市販品の購入さえもできるが、上述のような、ヌクレオチド配列合成法を使って容易に合成することもできる。
【０１０８】
ｖ．イントロン要素
多くの場合、導入遺伝子の転写は、クローニングベクター上の１つのイントロンまたは２つ以上のイントロンの存在（エキソンに連結された）により増加する。イントロンは、導入遺伝子がゲノムＤＮＡ配列の完全長または断片である場合は特に、導入遺伝子ヌクレオチド配列内の天然配列であり得る。イントロンがヌクレオチド配列内の天然配列ではない場合は（大抵のｃＤＮＡのように）、イントロンは、別のソースから入手できる。イントロンは、導入遺伝子、および／または遺伝子導入哺乳動物に対し相同であっても、異種であってもよい。イントロンが有効であるように転写される必要があるため、プロモーターおよび導入遺伝子に対するイントロンの位置は重要である。従って、導入遺伝子がｃＤＮＡ配列である場合は、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位に対し３’位置で、ポリＡ転写終止配列に対し５’位置である。好ましくは、ｃＤＮＡ導入遺伝子に対しては、イントロンは、導入遺伝子ヌクレオチド配列を妨害しないように、導入遺伝子ヌクレオチド配列の片側またはもう一方の側（すなわち、５’または３’）に配置される。挿入される宿主細胞に適合する限りにおいて、ウイルス、原核生物および真核生物（側物または動物）生命体を含む、いずれの源由来のいずれのイントロンも、本発明の実施に使用可能である。また、本明細書では、合成イントロンも含まれる。任意選択で、２つ以上のイントロンをベクター中で使用可能である。好ましいイントロンとエキソンのセットは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ＤＮＡ配列である。
【０１０９】
ｖｉ．選択可能マーカー要素
選択可能マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖される形質移入細胞の生存および増殖に必要なポリペプチドをコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞に対してはアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン、および哺乳動物細胞に対してはネオマイシン、ヒグロマイシン、またはメトトレキサート、に耐性を付与するか、（ｂ）細胞の栄養要求欠陥を補足するか、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、桿菌培養用Ｄ−アラニンラセマーゼ、をコードする遺伝子を提供する、タンパク質をコードする。
【０１１０】
本発明で有用な上述の全てのならびに他の要素は、当業者には、よく知られ、また、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．［１９８９］）およびＢｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．（分子クローニング技術のガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．［１９８７］）、に記載されている。
【０１１１】
クローニングベクターの構築
本発明の遺伝子導入哺乳動物の調製に有用な導入遺伝子カセットの増幅に最も役立つクローニングベクターは、原核細胞宿主に適合するものである。しかし、真核細胞宿主、およびこれらの細胞に適合するベクターは、本発明の範囲内に入る。
【０１１２】
ある特定の場合では、クローニングベクター上に含められる種々の要素の一部が、市販のクローニングまたは増幅ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター、例えば、ｐＢＩＩＳＫ＋／−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、等、中に既に存在するものもある（これらの全ては、原核細胞宿主に対し安定である）。この場合、導入遺伝子をベクター中に挿入することが求められるだけである。
【０１１３】
しかし、使用される１つまたは複数の要素が、クローニングまたは増幅ベクター上に予め存在しない場合は、個別に入手し、ベクターに連結することができる。それぞれの要素の入手および連結方法は、当業者にはよく知られており、上述の導入遺伝子（すなわち、ＤＮＡ合成、ライブラリー選別、等）の入手方法に類似である。
【０１１４】
導入遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングまたは増幅用に、および／または哺乳類胚の形質移入用に使用されるベクターは、当技術分野でよく知られた方法を使って構築される。そのような方法には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、同上、に記載のように、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化の標準的な方法、連結反応、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのアガロースおよびアクリルアミドゲル精製、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのカラムクロマトグラフィー精製、ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出、ＤＮＡシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応増幅、等が含まれる。
【０１１５】
本発明の実施に使用される最終的ベクターは、典型的には、市販のベクター等の出発クローニングまたは増幅ベクターから構築される。このベクターは、完成ベクターに含まれる要素の一部を含んでも、含まなくてもよい。出発ベクター中にいかなる所望の要素も存在しない場合は、各要素は、連結される要素の末端およびベクターの末端が連結反応に適合するように、適切な制限エンドヌクレアーゼでベクターを切断することにより、個別にベクターに連結できる。いくつかの場合では、満足のできる連結反応を行うために、連結される末端を一緒に「平滑末端化する」ことが必要となり得る。平滑末端化は、最初に、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使って、４つ全てのヌクレオチドの存在下で、「付着末端」を埋めることにより実現される。この方法は、当技術分野でよく知られており、また、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、同上、に記載されている。
【０１１６】
あるいは、ベクターに挿入される２つ以上の要素を、最初に、一緒に連結し（相互に隣接して配置される場合は）、その後、ベクターに連結できる。
【０１１７】
ベクターを作成する他の１つの方法は、種々の要素の全ての連結反応を、１つの反応混合物中で同時に行うことである。ここで、要素の不適切な連結反応または挿入のために、多くのナンセンスまたは非機能性ベクターが生成されるであろうが、機能性ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化により特定、選択できる。
【０１１８】
ベクターの作成後、増幅のために、原核生物宿主細胞中に形質移入できる。増幅に使われる細胞は、代表例としては、大腸菌ＤＨ５−アルファ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）およびＤＨ５−アルファに類似の特性を有する他の大腸菌株である。
【０１１９】
哺乳類宿主細胞が使用される場合は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞；Ｕｒｌａｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７７：４２１６［１９８０］））およびヒト胚性腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９［１９７７］）等の細胞株、ならびに他の系統が適切である。
【０１２０】
増幅のためのベクターの選択宿主細胞株への形質移入は、リン酸カルシウム、電気穿孔、微量注入、リポフェクションまたはＤＥＡＥデキストラン等の方法を使って実現される。選択された方法は、部分的に、形質移入される宿主細胞型に依存する。これらおよび他の適切な方法は、当業者にはよく知られており、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、同上、に記載されている。
【０１２１】
ベクターを十分に増幅されるのに充分長い時間（通常、大腸菌細胞の場合で一晩）培養の後、ベクター（この段階では、プラスミドと呼ばれることも多い）は、細胞から単離され、精製される。典型的には、細胞は、溶解され、プラスミドが他の細胞含有物から抽出される。プラスミド精製に適する方法には、特に、アルカリ溶解ミニプレップ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、同上）が含まれる。
【０１２２】
挿入用プラスミドの調製
典型的には、導入遺伝子を含むプラスミドは、直線化され、胚への挿入の前に、選択制限エンドヌクレアーゼを使って、その一部が除去される。いくつかの例では、ベクターの他の部分から直鎖断片として、導入遺伝子、プロモーター、および調節要素を単離し、それにより、導入遺伝子、プロモーター、イントロン（使われる場合は）、エンハンサー、ポリＡ配列、および任意選択で、シグナル配列または膜アンカードメインを含む直鎖ヌクレオチド配列のみを胚に注入することが好ましい場合がある。これは、これらの要素を含む核酸配列領域を取り出すようにプラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動法または他の適切な精製方法を使ってこの領域を精製することにより実現できる。
【０１２３】
遺伝子導入またはノックアウト哺乳動物の産生
遺伝子導入またはノックアウト（ＫＯ）哺乳動物は、当業者によく知られた方法を使って容易に調製できる。例えば、遺伝子導入げっ歯類を調製するために、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、（マウス胚の操作：実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．［１９８６］）に記載のもの、等の方法を採用できる。
【０１２４】
本発明を実施するのに使用されるいずれの哺乳類種の特定の系統も、一般的に良好な健康、良好な胚収量、良好な胚中での前核視感度、および良好な生殖適応度の観点から選択される。さらに、ハプロタイプが重要な要因である。例えば、遺伝子導入マウスが産生される場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２Ｆ１等の株、またはＦＶＢ系統がよく使われる（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ、またはＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓ．、から市販品として入手可能）。好ましい株は、Ｈ−２ｂ、Ｈ−２ｄまたはＨ−２ｑハプロタイプを有するもの、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１である。本発明の実施に使われる系統は、それ自体遺伝子導入体であっても、および／またはノックアウト（すなわち、部分的に、または完全に抑制された１つまたは複数の遺伝子を有する哺乳動物）であってもよい。最初のノックアウト哺乳動物および遺伝子導入哺乳動物の両方の調製のために、同じ系統が使われるのが好ましいであろう。これは、その後の交配および戻し交配をより効率的にすることになろう。
【０１２５】
ノックアウト（ＫＯ）マウス系統の生成（所望の遺伝子に対する）は、改変胚性幹（ＥＳ）細胞の、１つのマウス株「Ｘ」から異なるマウス株「Ｙ」の胚盤胞中への移植から始まる。通常、異なる毛色のマウス株を選択して、両方の色からなる「キメラ」毛を有する動物を得るのが好都合である。例えば、改変ＥＳ細胞がアグーチ模様マウス系統（１２９／Ｓｖ）由来で、黒色マウス胚盤胞（Ｃ５７／Ｂｌ６）に挿入される場合、アグーチ模様と黒毛を有するキメラが得られる。次の重要なステップは、改変ＥＳ細胞が生殖細胞系列伝達のための生殖腺を備えているかどうかを判定することである。これは、キメラマウスを、胚盤胞ソース（Ｃ５７／Ｂｌ６）に対応する株の動物に交配することにより判定される。交配によりアグーチ模様（ＥＳ細胞色）の子を産生する場合は、Ｃ５７Ｂｌ６／１２９Ｓｖ混合背景で、生殖系列伝達が実現されたことを示す。
【０１２６】
異なるマウス株は違った挙動をするので、混合背景は、遺伝子調査で理想的なものではない。従って、１つの特定のマウス株から純粋なマウス系統を産生するのが好ましい。目的のマウスに交配する場合、戻し交配が同系交配マウス株との間で使われ、また、異系交配が非近交系マウス株との間で使われる。戻し交配は、選択同系交配マウス株に対し、凡そ９９．９９％の遺伝的同一性に達するまで、図１Ａに図示するように行われ、これは約８〜１０回の戻し交配を要し、研究目的のためには好ましい手法である。この新しい系統は、この時点で、類遺伝子性であると見なされる。異系交配（図１Ｂに図示）は、１回の交配の交配のみを含み、それぞれの親の系統の半分の遺伝コードを有するハイブリッドマウスが得られる。この系統は、類遺伝子性とは見なされず、また、系統のかなりの遺伝的変異性に起因して、類遺伝子性系統にすることができない。残念ながら、これは、近交系で特徴的なことであるように、戻し交配は、生成するマウスコロニーをより弱くする可能性があり、また、劣性遺伝性疾患になる傾向がある。異系交配は、１回（１ｘ交配）のみ行われ、遺伝的多様性を高度同系交配マウス株中に挿入することが意図されているので、純粋な系統を生成できない。この方法は、育種系統に対し、繁殖性、活力および大きさを回復する場合が多い。
【０１２７】
胚を得るために、および代用の宿主として役立たせるために使われる哺乳動物の年齢は、使われる種依存であるが、当業者なら簡単に判断できる。例えば、マウスが使われる場合は、より多くの胚を得ることができ、ホルモン注射よりよく反応することから、思春期前の雌が好ましい。
【０１２８】
同様に、種馬として使用される雄哺乳動物は、通常、他の基準の中でも特に性的成熟年齢で選択される。
【０１２９】
卵産生、交配、および／または胚の再移植用の雌を準備するのに、ホルモンまたは他の化学化合物の投与が必要な場合がある。使われるホルモン／補因子の型と量、ならびにホルモンの投与タイミングは、哺乳動物のそれぞれの種により変化する。このような配慮は、当業者には容易にわかることであろう。
【０１３０】
典型的には、準備ができた雌（すなわち、受精できる卵子を産生している雌）は、種馬の雄と交配され、得られた受精胚は、次に、導入遺伝子導入用に取り出される。あるいは、卵子と精子を、適切な雌と雄から入手し、インビトロ受精用に使用して導入遺伝子の導入に適する胚を産生できる。
【０１３１】
通常、受精胚は、前核が出現するまで適切な培地中でインキュベートされる。下記に記載のように、この頃に、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が雌または雄前核中に導入される。マウス等の一部の種では、雄前核が好ましい。
【０１３２】
導入遺伝子ヌクレオチド配列の胚中への導入は、当技術分野で既知のいずれの手段によっても、例えば、微量注入、電気穿孔、またはリポフェクションにより実現できる。導入遺伝子ヌクレオチド配列の胚への導入後、胚は、様々な時間の間、インビトロでインキュベートされるか、または代用宿主に再移植されるか、またはこれらの両方がなされる。インビトロでの成熟までのインキュベーションは、本発明の範囲内に入る。１つのよく行われる方法は、胚をインビトロで、種に応じて約１〜７日間インキュベートし、その後、代用宿主中に再移植するものである。
【０１３３】
再移植は、標準的な方法で行える。使用される雌「養母」株は、全般的耐久力および健康、ならびに、出生児の世話能力により選択される。マウスの場合、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ１またはＣＤ１、またはＢＡＬＢ／ｃ等の株が、通常、適切である。しかし、本発明のＮａｖ１．７−／−ノックアウト用には、Ｃ５７ＢＬ／６背景は特に好適ではない。理由は、子が十分な活力に欠け、雌親が、通常、十分に熱心な母ではないからである。
【０１３４】
通常、代用宿主は、麻酔され、胚が輸卵管中に挿入される。特定の宿主に移植される胚の数は、種により変化するが、通常は、種が天然で産出する出生児数と同程度である。
【０１３５】
代用宿主の遺伝子導入出生児は、いずれの適切な方法を用いても、導入遺伝子の存在および／または発現により選別できる。選別は、少なくとも一部の導入遺伝子に相補的なプローブを使って、サザンブロットまたはノーザン法分析により行われる場合が多い。導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を使ったウェスタンブロット分析を、代わりの、または追加の、導入遺伝子産物の存在に関する選別方法として採用できる。典型的には、ＤＮＡが、尾部組織（尾先端から約１ｃｍが取り出される）から調製され、導入遺伝子がサザン分析またはＰＣＲにより分析される。あるいは、最高レベルで導入遺伝子を発現していると考えられる組織または細胞が導入遺伝子の存在および発現の観点から、サザン分析またはＰＣＲを使って試験されるが、いずれの組織または細胞型も、この分析用に使用可能である。
【０１３６】
代わりの、または追加の導入遺伝子の存在の評価方法には、限定されないが、適切な生化学的アッセイ、例えば、酵素、および／または免疫学的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性用の組織学的株、フローサイトメトリー分析、等が含まれる。血液の分析もまた、血液中の導入遺伝子産物の検出、ならびに種々の型の血液細胞および他の血液成分のレベルに対する導入遺伝子の影響の評価に有用でありうる。
【０１３７】
遺伝子導入哺乳動物の子孫は、遺伝子導入哺乳動物を適切なパートナーと交配することにより、または遺伝子導入哺乳動物から入手した卵子、および／または精子のインビトロ受精により、得ることができる。パートナーと交配を行う場合は、パートナーは、遺伝子導入および／またはノックアウトであっても、そうでなくてもよく、遺伝子導入パートナーの場合は、同じまたは異なる、または両方の導入遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、パートナーは、親系統であってもよい。インビトロ受精が使われる場合は、受精胚は、代用宿主に移植して、またはインビトロでインキュベートしても、またはそれらの両方を行ってもよい。いずれかの方法を使って、上述の方法、または他の適切な方法により、導入遺伝子の存在について子孫を評価できる。
【０１３８】
ノックアウト／遺伝子導入哺乳動物の調製
２つ以上のノックアウト構築物、および／または、２つ以上の導入遺伝子を含む哺乳動物が、いくつかの方法のいずれかを使って調製される。典型的には、調製方法は、本明細書記載の、所望のノックアウト構築物または導入遺伝子の１つをそれぞれ含む一連の哺乳動物、例えば、マウスを生成するものである。このような哺乳動物は、一連の交配、戻し交配および選択により育種され、最終的には、全体が所望のノックアウト構築物、および／または導入遺伝子を含む単一哺乳動物を生成する。この場合、哺乳動物は、ノックアウト構築物、および／または導入遺伝子の存在を除けば、野性型に類遺伝子性（遺伝的に同じ）である。
【０１３９】
典型的には、交配および戻し交配は、育種プロセス中のそれぞれ特定のステップの目的に応じて、兄弟姉妹または親株を出生児と交配することで実現される。特定の例では、適切な染色体の部位にそれぞれのノックアウト構築物、および／または導入遺伝子を含む単一出生児を生成するために、多数の出生児を生成する必要がある場合もある。さらに、最終的に所望の遺伝子型を生成するために、数世代にわたり交配または戻し交配をする必要がある場合もある。
【０１４０】
ノックアウト哺乳動物の用途
一般的に、ノックアウト哺乳動物は、抑制されている遺伝子または複数遺伝子に応じて様々な用途がある。例えば、遺伝子または複数遺伝子が、免疫抑制または炎症に関与すると考えられているコードタンパク質を抑制する場合、この哺乳動物は、免疫調節に有用な薬剤、すなわち、これらの活性を強化するか、または抑制する薬剤、を選別するために使用できる。
【０１４１】
本発明のグローバルＮａＶ１．７ノックアウトマウスは、疼痛、神経内分泌障害、または前立腺癌の治療に有望な薬剤を選別するために使用できる。有用な薬剤の選別は、一連の投与量でマウスに候補薬剤を投与し、種々の時点で評価される障害に対する薬剤の効果をアッセイすることを含む。さらに、本発明の哺乳動物は、神経系の発達の評価、および特定のＮａＶ１．７遺伝子変異の効果の調査に役立つ可能性がある。本発明のＮａＶ１．７ノックアウトマウスおよびその子孫の実施形態には、また、発現されうる追加の導入遺伝子、および／または含まれるノックアウト構築物に応じて、種々の用途が考えられる。有用な薬剤の選別には、最初に、哺乳動物で、疾患の誘導、または疾患モデルの誘導、次いで、一連の投与量による候補薬剤の哺乳動物への投与、および種々の時点での評価される疾患または障害に対する薬剤の効果のアッセイを含めることができる。代わりに、または追加で、薬剤は、疾患または疾患モデルの誘導を行う前に、または同時に投与でき得る。他の実施形態では、本発明のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスは、薬剤研究および開発、例えば、オンターゲット／オフターゲット効果を識別する、または疼痛および鎮静の効果を識別するためのインビボプロトコル用として、さらに有用である。
【０１４２】
疾患または状態に使用される薬剤の選別に加えて、本発明の哺乳動物は、疾患または状態の予防または治療を目的とした治療法の設計に有用でありうる。例えば、哺乳動物は、疾患または状態の発症の前に、同時に、または後で、特定の食事、運動ルーチン、照射治療、および／または１つまたは複数の化合物または物質の組み合わせで治療でき得る。このような総合的療法または治療法は、疾患または状態と戦う上で、化合物単独による治療より、有効な場合がある。さらに、血圧、体温、体重、脈拍、挙動、毛の外観（ひだ状毛皮）、等の診断基準を評価でき得る。
【０１４３】
本発明のグローバルＮａＶ１．７−／−ノックアウトマウスは、また、１つまたは複数の細胞株を精製するのに使用できる。そのような細胞系統は、例えば、特定の組織または器官に対するノックアウトの影響の評価、および組織中でＮａＶ１．７の活性レベルに影響する可能性のある化合物の選別、等の多くの用途がある。このような化合物は、治療薬として有用であり得る。
【０１４４】
このような細胞系統の産生は、当業者に知られている種々の方法を使って実現できる。実際の培養条件は、培養される細胞の組織と型に依存する。必要以上の実験をせずに、細胞を使って、異なる濃度の多量および微量栄養素、増殖因子、血清、等を含む種々の培地が試験して、細胞の成長と増殖の最適条件を決定することができる。同様に、他の培養条件、例えば、インキュベーター中の細胞密度、培地温度、および二酸化炭素濃度も、容易に評価、最適化でき、また、このプロセスに影響する化合物を特定できる。
【０１４５】
マウスまたはヒトＮａＶ１．７等のＮａＶ１．７に対する抗体の調製（ＮａＶ１．７ＫＯマウスは、マウスＮａｖ１．７または他の種の密接に関連しているＮａｖ１．７配列、例えば、ヒトＳＣＮ９Ａ遺伝子産物、に対し自己免疫寛容ではないため）を含む他の用途は、当業者には容易にわかるであろう。本発明のノックアウトマウスにより産生された抗ヒトＮａＶ１．７抗体のＣＤＲ配列に基づいて、これらのＣＤＲを抗体中に組み込んだ、ＮａＶ１．７イオンチャネル活性に対する拮抗または刺激用のキメラまたはヒト化抗体を開発できる。拮抗的または遮断的抗ヒトＮａＶ１．７抗体の治療効果は、当業者には容易に明白となるであろう
【０１４６】
抗体の産生
ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、典型的には、適切な抗原およびアジュバントの複数部位の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物中で産生される。あるいは、抗原は、動物のリンパ節に直接注入してもよい（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１６：３８１−３８９、１９９７、を参照）。改善された抗体反応は、二官能性または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当技術分野で既知の他の薬剤を使って、適切な抗原を、免疫される種中で免疫原性のタンパク質、例えば、スカシ貝ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤、と複合体化させることにより得ることができる。
【０１４７】
動物は、例えば、（マウスに対して）１００μｇのタンパク質または複合体を、３倍量のフロイント完全アジュバントと混合し、その溶液を皮内の複数部位に注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対し免疫される。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５〜１／１０の複数部位の皮下注射により、動物は追加免疫される。追加免疫注射７〜１４日後に、動物から採血し、血清の抗体力価がアッセイされる。動物は、力価がプラトーになるまで、追加免疫される。動物は、同じ抗原の複合体で追加免疫されるのが好ましいが、異なるタンパク質と、および／または異なる架橋結合試薬を介して複合体化されたものでもよい。複合体は、また、タンパク質融合体として組換え細胞培養でも作製可能である。また、ミョウバン等の凝集剤を適切に使って、免疫反応を適切に強化できる。
【０１４８】
モノクローナル抗体。モノクローナル抗体は、当技術分野で知られているいずれの技術を用いても、例えば、免疫化計画の完結後に遺伝子導入動物から採取された脾臓細胞を不死化することによって、産生出来る。脾臓細胞は、当技術分野で知られているいずれの技術を用いても、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合しハイブリドーマを産生することにより、不死化できる。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）、によって最初に報告されたハイブリドーマ法を使って作成できる。または、組換えＤＮＡ法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、免疫グロブリンの産生方法、およびその方法で使用するベクターと形質転換宿主細胞（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｉｎ）、米国特許第６、３３１、４１５号）により作製できる。この方法には、軽鎖および重鎖、任意選択で、抗体をグリコシル化できる哺乳動物細胞系統（例えば、ＣＨＯ細胞）の全般的等モル産生を促進する「ｓｐｌｉｔ  ＤＨＦＲ」法が含まれる（例えば、抗体産生（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、欧州特許第ＥＰ０４８１７９０Ａ２号、および米国特許第５，５４５，４０３号）。
【０１４９】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主哺乳動物、例えば、ラット、ハムスターまたはマカクザルが、本明細書に記載のように免疫され、免疫化に使われるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生が可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫できる。次に、リンパ球は、適切な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使って、骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。
【０１５０】
ハイブリドーマ細胞は、調製されるとすぐに、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を抑制する１つまたは複数の物質を含む、適切な培地中に播種され、増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合は、ハイブリドーマ用の培地は、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を防ぐ物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【０１５１】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞抗体の安定な高レベル産生を支援し、さらに培地に感受性の高いものである。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロミエローマ細胞系統は、また、ヒトモノクローナル抗体の産生用として記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒｅｔａｌ．、モノクローナル抗体産生技術と適用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７））。ハイブリドーマ産生融合体法で使われる骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生性であり、高い融合効率、および酵素欠損を有し、この酵素欠陥は、特定の選択培地中での増殖を不能にし、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支援する。マウス融合体に使われる適切な細胞系統の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸＯＢｕｌ、が含まれ、ラット融合体に使われる細胞系統の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合体に有用な他の細胞系統は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１５２】
ハイブリドーマ細胞が成長している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関しアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定されるのが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはスキャチャード解析により測定できる（Ｍｕｎｓｏｎｅｔａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ペプチド免疫グロブリンコンジュゲート（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、国際公開第ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１号、実施例１０、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５３】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈法によりサブクローニングでき、標準的な方法で増殖できる（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。この目的のために適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてインビボ増殖できる。
【０１５４】
ハイブリドーマまたはｍＡｂは、さらに選別されて、特定の特性、例えば、特異的抗原または標的との結合親和性を有するｍＡｂを特定できる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製法、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、親和性クロマトグラフィー、またはいずれかの他の当技術分野で既知の他の適切な精製技術、を使って培地、腹水、または血清から、適切に分離される。
【０１５５】
抗体および他のポリペプチドの組換え産生。免疫グロブリンまたは目的のポリペプチド由来の関連アミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定により決定でき、適切なコード化ヌクレオチド配列がユニバーサルコドン表に従って設計できる。あるいは、ゲノムまたはモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡは、単離されて、このような抗体を産生している細胞から、従来の方法を使って配列決定される（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことにより、）。関連ＤＮＡ配列は、直接核酸配列決定により決定できる。
【０１５６】
ＤＮＡのクローニングは標準的な方法を使って行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）分子クローニング：研究室ガイド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ）、Ｖｏｌｓ  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、を参照。この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＡ＋ｍＲＮＡの、好ましくは、膜結合性ｍＲＮＡの逆転写により生成でき、ライブラリーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使って選別される。一実施形態では、しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖または重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの一部）が増幅される。増幅された配列は、いずれの適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター、にも容易に挿入できる。目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定できる限り、使われるクローニングの特定の方法は、重大ではないことは、理解されよう。
【０１５７】
抗体核酸の１つの源は、目的の抗原で免疫された動物由来のＢ細胞を得て、それを不死細胞に融合することにより産生されるハイブリドーマである。あるいは、核酸は、免疫された動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離できる。また別の抗体をコードする核酸の源は、例えば、ファージディスプレイ技術により生成されるこのような核酸のライブラリーである。目的のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド、をコードするポリヌクレオチドは、標準的な方法、例えば、パニングにより特定できる。
【０１５８】
免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列が、決定できるが、一部の可変領域のみ、例えば、ＣＤＲコード部分のみを配列決定することで十分な場合もある。配列決定は、標準的な方法を使って行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）分子クローニング：研究室ガイド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ）、Ｖｏｌｓ  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７、を参照。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。クローン化核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの報告されている配列と比較することにより、当業者なら、配列決定された領域に応じて、容易に以下を決定できるであろう：（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチドの生殖系列セグメント使用（重鎖のアイソタイプを含む）、および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞変異のプロセスから得られた配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの源は、国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、国立衛生研究所（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）である。
【０１５９】
単離ＤＮＡは、制御配列に機能的に連結でき、または発現ベクター中に配置でき、次いで、発現ベクターを、それ以外の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞中のモノクローナル抗体の合成を指示できる。抗体の組換え産生は、当技術分野でよく知られている。
【０１６０】
別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、核酸は、機能的に連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに機能的に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に機能的に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するような位置にある場合、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、機能的に連結されるは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には、近接して、さらに読み相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接していなければならないことはない。連結は、好都合な制限酵素部位での連結反応により行われる。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の方法に従い使用される。
【０１６１】
多くのベクターが当技術分野で知られている。ベクター成分は、以下のうちの１つまたは複数を含んでもよい：シグナル配列（例えば、抗体の分泌を指示する；例えば、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴ／／配列番号４、これは、ＶＫ−１グナルペプチド配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／配列番号５、をコードする）、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質または他の薬剤耐性を付与する、栄養要求欠陥を補充する、または重大な培地中にない重大な栄養素を供給することができる）、エンハンサー配列、プロモーター、および転写終止配列。これらは全て当技術分野でよく知られている。
【０１６２】
細胞、細胞系統、および細胞培養物は、同義に使用されることが多く、本明細書の全てのこのような呼称は子孫を含む。形質転換体および形質転換細胞は、対象一次細胞および継代の数に関係なくそれ由来の培養物を含む。全ての子孫は、計画的または偶発性変異に起因して、ＤＮＡ内容が正確に同じでない可能性があることも理解されよう。元の形質転換細胞での選別と同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【０１６３】
代表的宿主細胞には、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が含まれる。原核生物宿主細胞には、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌属等の腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス属、サルモネラ菌、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア菌、および赤痢菌属、ならびに枯草菌およびＢ．リケニホルミス、等のバシラス属、シュードモナス属、およびストレプトマイセス属、が含まれる。真核生物の微生物、例えば、糸状菌類または酵母は、組換えポリペプチドまたは抗体用の、適切なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母、すなわち一般的パン酵母は、低級真核生物宿主微生物中では、最もよく使われる。しかし、いくつかの他の属、種、および株が、通常、利用可能で、本明細書で有用であり、これらは、下記のものがある：ピキア属、例えば、Ｐ．パストリス、分裂酵母；クリベロマイセス、ヤロウイア属；カンジダ；トリコデルマ・リージア；アカパンカビ；シュワニオミセスオキシデンタリス等のシュワニオミセス属；および糸状菌類、例えば、パンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム、およびアスペルギルス宿主、例えば、偽巣性コウジ菌およびクロコウジカビ。
【０１６４】
グリコシル化抗体の発現用の宿主細胞は、多細胞の生物体から誘導できる。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに、例えば、ヨトウガ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（果実蠅）、およびカイコ、等の宿主由来の対応する許容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。このような細胞の形質移入用の種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株、等が公的に入手可能である。
【０１６５】
脊椎動物宿主細胞は、また、適切な宿主であり、このような細胞からのポリペプチド（抗体を含む）の組換え産生が定型手段になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であり、これには、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓系統（浮遊培養による増殖用にサブクローニングされた２９３または２９３細胞、［Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；ＢＵＦラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞腫細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳類骨髄腫細胞、が含まれる。
【０１６６】
宿主細胞は、ポリペプチド（抗体を含む）産生のために形質転換されるか、または上記核酸またはベクターを形質移入され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改善された従来の栄養素培地中で培養される。さらに、選択マーカーで分離された複数コピーの転写ユニットを有する新規ベクターおよび形質移入細胞系統が、抗体等のポリペプチドの発現に特に有用である。
【０１６７】
本発明に有用なポリペプチドの産生に使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養できる。市販の培地、例えば、ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）は、宿主細胞の培養に適する。さらに、下記に記載のいずれかの培地も、宿主細胞用培地として使用可能である：Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；国際公開第ＷＯ９０１０３４３０号；同ＷＯ８７／００１９５号；または米国再発行特許第３０，９８５号。これらの培地のいずれも、必要に応じ、下記を補充できる：ホルモンおよび／または他の増殖因子（多例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（登録商標）薬剤）、微量成分（μＭ範囲で最終濃度中に通常存在する無機化合物と定義される）、およびブドウ糖または等量のエネルギー源。他に必要ないずれかの補充剤も、当業者には既知の適切な濃度で含めることができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨ、等は、発現用に選択された宿主細胞で以前使われたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１６８】
宿主細胞の培養の際には、組換えポリペプチドは、細胞内で、細胞周辺腔内で、または培地中へ直接分泌できる。最初のステップとして、抗体等のポリペプチドが細胞内で産生される場合は、宿主細胞または溶解断片、等の粒子状懐死組織片は、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。
【０１６９】
抗体または抗体断片は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、目的の抗原またはタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇを親和性リガンドとして使用した親和性クロマトグラフィー、を使って、精製できる。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質の精製に使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３用に推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。機械的安定なマトリックス、例えば、気孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースの場合より、高速の流量、および短い処理時間の実現を可能とする。タンパク質が、ＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（登録商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収される抗体にもよるが、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法、等のタンパク質精製用の他の技術もまた可能である。
【０１７０】
キメラ、ヒト化、Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）モノクローナル抗体。げっ歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体は、当技術分野で既知の標準的方法を使って生成できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８４）キメラヒト抗体分子；ヒト定常領域ドメインを有するマウス抗原結合ドメイン（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、６８４１−６８５５；および、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、Ｇ．Ｌ．、ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、６４３−６４６．（１９８４）、を参照）。例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域上にグラフト化する（当技術分野で「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と呼ばれるプロセス）または（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によりひと様表面でそれらを「クローキング」する（当技術分野で「ベニアリング」と呼ばれるプロセス）または（３）それぞれの残基の抗原結合または抗体構造への関与の可能性およびその免疫原性に対する可能性に基づいて、選択非ヒトアミノ酸残基をよりヒト様に改変することによる、等の多くのヒト化または抗体配列のよりヒト様化改変技術に関して報告されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５  ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）；Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）；を参照されたい。これらのそれぞれは、参照により、その全体が、本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域上にグラフト化する（当技術分野で「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と呼ばれるプロセス）または（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によりひと様表面でそれらを「クローキング」する（当技術分野で「ベニアリング」と呼ばれるプロセス）または（３）それぞれの残基の抗原結合または抗体構造への関与の可能性およびその免疫原性に対する可能性に基づいて、選択非ヒトアミノ酸残基をよりヒト様に改変することによる、等の多くのヒト化または抗体配列のよりヒト様への改変に関する技術が、報告されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５  ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）；Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）；を参照されたい。これらのそれぞれは、参照により、その全体が、本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
抗体は、また、内在性免疫グロブリン産生のない遺伝子導入動物を使って産生でき、ヒト免疫グロブリン座位を含むように操作される（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）、参照）。例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号は、ヒトＩｇ座位を有する遺伝子導入動物を開示しており、ここでは、動物は、内在性重鎖および軽鎖座位の不活化のために、機能的内在性免疫グロブリンを産生しない。国際公開第ＷＯ９１／１０７４１号は、また、免疫原に対し免疫反応を起こすことができる遺伝子導入非霊長類哺乳類宿主を開示し、ここでは、抗体は、霊長類の定常、および／または可変領域を有し、また、内在性免疫グロブリンをコードする座位が置換または不活化される。国際公開第ＷＯ９６／３０４９８号は、定常または可変領域の全てまたは一部を置換し、改変抗体分子を形成する、等の哺乳動物で免疫グロブリン座位を改変するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。国際公開第ＷＯ９４／０２６０２号は、不活化内在性Ｉｇ座位および機能性ヒトＩｇ座位を有する非ヒト哺乳類宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内在性重鎖を欠き、１つまたは複数の異種定常領域を含む外因性の免疫グロブリン座位を発現する遺伝子導入マウスの作製方法を開示する。
【０１７３】
上述の遺伝子導入動物を使って、選択された抗原性分子に対し免疫反応を生成でき、抗体産生細胞を動物から取り出して、ヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生に使用できる。免疫化プロトコル、アジュバント、等は、当技術分野で既知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９６／３３７３５号に記載のように、遺伝子導入マウスの免疫化に使われる。モノクローナル抗体は、生物活性または対応するタンパク質の生理的な効果を抑制または中和する能力に関し試験できる。また、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）；および米国特許第５，５９１，６６９、同５，５８９，３６９号、同５，５４５，８０７号；ならびに米国特許公開第２００２０１９９２１３号、も参照されたい。米国特許公開第２００３００９２１２５号は、動物の免疫反応を所望のエピトープに偏らせる方法を記載している。ヒト抗体は、また、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても生成できる（米国特許第５，５６７，６１０号および同５，２２９，２７５号、参照）。
【０１７４】
ファージディスプレイ技術による抗体産生
繊維状バクテリオファージ表面上のコード化抗体断片の組換えヒト抗体遺伝子レパートリー作成およびディスプレイ技術開発により、ヒト由来抗体生成の別の手段が提供されるようになった。ファージディスプレイについては、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６４５０−６４５４（１９９０）、に記載されている。これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術により産生された抗体は、通常、細菌中で抗原結合断片、例えば、ＦｖまたはＦａｂ断片として産生され、従って、エフェクター機能に欠ける。エフェクター機能は、下記の２つの戦略の内の１つにより導入できる。断片を操作して、哺乳動物細胞中での発現のために完全抗体中に、またはエフェクター機能を誘発できる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片中に組み込むことができる。
【０１７５】
典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲにより別々にクローン化され、ランダムに組み合わされてコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを生成し、次に、これを、特定の抗原に対する結合に関し選択できる。抗体断片は、ファージ表面に発現され、ＦｖまたはＦａｂ（従って、抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）の抗原結合による選択は、数ラウンドの抗原結合および再増幅により実現される。この方法は、パニングと呼ばれる。抗原に特異的な抗体断片が富化され、最終的に単離される。
【０１７６】
ファージディスプレイ技術は、また、げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化のための「誘導選択」と呼ばれる手法にも使うことができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ、Ｌ．Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２、８９９−９０３（１９９４）、を参照）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片を、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせてディスプレイでき、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを、次に、抗原で選択できる。マウスＦｄ断片は、それにより、選択を誘導するテンプレートを提供する。その後、ヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。生成されたライブラリーの選択により、完全ヒトＦａｂが得られる。
【０１７７】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための種々の方法が報告されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および同５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．、ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ａ．、ＴＩＢＴＥＣＨ  １２、１７３−１８４（１９９４）、を参照）。特に、インビトロ選択および進化ｏｆファージディスプレイライブラリー由来抗体の進展産物は強力なツールになっている（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．、ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ、Ｃ．Ｆ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７、１９１−２８０（１９９４）；および、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、４３３−４５５（１９９４）；米国特許公開第２００２０００４２１５号および国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号；２００３年１０月９日公告の米国特許公開第２００３０１９０３１７号および米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号、を参照されたい）。Ｗａｔｋｉｎｓ、「ファージ発現抗体ライブラリーのキャプチャーリフト法による選別（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ）」、分子生物学の方法、抗体ファージディスプレイ：方法とプロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）１７８：１８７−１９３、および２００３年３月６日公告の米国特許公開第２００３００４４７７２号は、ファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子のキャプチャーリフト法による選別方法について記載している。この方法は、候補結合分子の固体支持上への固定化を含む方法である。
【０１７８】
本発明は、下記の実施例への参照により、さらに完全に理解されるであろう。これらの実施例は、本発明の範囲を多少なりとも限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７９】
実施例１：戻し交配および異系交配
ＮａＶ１．７ＫＯ動物の報告されている明らかに摂食できないことによる新生仔の致死性（Ｃ５７ＢＬ／６に対し少なくとも８世代戻し交配されたＤｅｌｔａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ：Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｓｃｎ９ａｔｍ１Ｄｇｅｎ／Ｊ由来ヘテロ接合のＮａｖ１．７＋／−マウス）（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）の理由で、我々は、これらの動物をＣＤ１背景に異系交配し、その系統に活力を付与し、さらに、別の戻し交配をＢＡＬＢ／ｃ系統で行い、類遺伝子性系統を生成した（２０１１年５月に受け取った最初の繁殖ペア）（図１Ａ〜Ｂ参照）。
【０１８０】
Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１ＫＯまたはＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂｃＫＯ動物に有意差は認められなかった。我々は、これらの動物を、ＮａＶ１．７ＫＯと呼び、必要に応じ、この株を指定する。本明細書にに示される全データは、単一の異系交配および戻し交配で集められた。さらなる戻し交配（ＢＡＬＢ／ｃ系統のみに対し）は、現在実行中であり、今までもところ、得られた結果は、Ｎ４に対する戻し交配世代と同じである。生存のさらなる増加は認められなかった。戻し交配の最終結果は、Ｎ７（約９９％ＢＡＬＢ／ｃ）で類遺伝子性系統に到達時に決定されなければならない。ＮａＶ１．７ＫＯマウスは、それらの同腹子と大略同じサイズと重量で誕生した（例えば、図２Ｂ）が、差異は同腹子内ですぐに明らかになった（誕生後１６時間以内；図２Ａ）。ＮａＶ１．７ＫＯマウスは、それらの同腹子ほど早く成長せず、少し弱かった。ＮａＶ１．７ＫＯ子は、資源獲得競争に苦労し、巣の底（食物供給源から離れている）までの到達で終わってしまい、ついには死亡する。明らかな摂食／ミルク哺乳の能力のために、我々は、ＮａＶ１．７ＫＯ子を野性型兄弟姉妹から離して養母と一緒に置くことが、より高い生存確率を与えるかどうかを考えた。残念ながら、それらの小さいサイズおよび相対的衰弱のために、雌親の適切な刺激が可能とはならなかった。我々は、すぐにミルク産生（授乳）の減少に気付き、新生仔のＮａＶ１．７ＫＯ動物は死亡した。Ｐ４ＮａＶ１．７ＫＯ新生仔の徹底的解剖学的評価の後で、我々は、これらの動物は、機会があれば摂食することができたという結論に達した。図３Ａ〜Ｇと図４Ａ〜Ｅに示すように、全ての必要な臓器は、正しい位置にあった。
【０１８１】
人工のマウスミルクを開発した（Ａｕｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９およびＹａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、から変更したレシピ；本明細書の実施例２参照）。
【０１８２】
最初に、我々は、誕生後２４時間の体重に従って、同腹子中の全てのＮａＶ１．７ＫＯ候補を特定した。大まかに、同腹子の最小１／４を、２５％の予測メンデル比（Ｈｅｔ  ｘ  Ｈｅｔ繁殖ペアに対し）に対応する有望なノックアウトとして特定した。より大きな「対照」動物を、下記式に従って巣から取り出した：
［候補ＫＯの数］＋２対照（ＫＯ数≦２の場合）
［候補ＫＯの数］＋３対照（ＫＯ数≧３の場合）
【０１８３】
いくつかの対照動物の存在により、雌親の十分な授乳刺激を可能とし、その少ない数により、内部同腹子競合を減らした。対照動物は、標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により測定して、両性の野性型およびヘテロ接合混合物であった。
【０１８４】
簡単に説明すると、以下のプライマーを使って、コロニー中の全ての動物の遺伝子型の特定を行った：順方向Ｓｃｎ９ａ：５’−ＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号１）；順方向ネオマイシン：５’−ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号３）および逆方向Ｓｃｎ９ａ：５’−ＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２）。これらのプライマーは、２６７塩基対の内在性（Ｅ）バンド（プライマー順方向Ｓｃｎ９ａ＋プライマー逆Ｓｃｎ９ａ）；（図７Ａのバンドを参照）、または３８９塩基対の標的（Ｔ）バンドを生じた（プライマー順方向ネオマイシン＋プライマー逆方向Ｓｃｎ９ａ）；図７Ｂのバンドを参照）。予想遺伝子型パターンは、以下の通りであった：
【０１８５】
ＷＴ（＋／＋）動物      ＝内在性（Ｅ）バンドのみ
ＨＥＴ（＋／−）動物    ＝内在性（Ｅ）＋標的（Ｔ）バンド
ＫＯ（−／−）動物      ＝標的（Ｔ）バンドのみ。
【０１８６】
ＫＯ表現型は、内在性（Ｅ）バンドの「非存在」により決定されるので、我々は、最初に、一連のＤＮＡ濃度（２５ｎｇ〜１００ｎｇ）で試験し、産物を生成するのに十分なＰＣＲ反応用のインタクトＤＮＡがあることを確認した。図７Ａに示すように、わずか２５ｎｇのＤＮＡで、野性型動物（ＡＭＡ−５０）中で視認できるＰＣＲ産物を生成するのに十分であった。同じＤＮＡ濃度の存在下で、ＫＯ動物（ＡＭＡ−１６１）中では、ＰＣＲ産物は存在しなかったが、このことは、この動物が内在性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の無傷コピーを持っていることを示唆している。図７Ｂでは、標的プライマー対に対するＰＣＲ産物（バンド）の存在により、（ｉ）ＮａＶ１．７ＫＯ  ＤＮＡ（ＡＭＡ−１６１）は、良好な質の無傷であったこと、および（ｉｉ）動物ＡＭＡ−１６１は、標的Ｎｅｏ遺伝子を持ち、従って、ＮａＶ１．７ＫＯマウスと認められることが確認される。図７Ｃでは、ＰＣＲ反応試料の対照は、ＤＮＡを含まず、従って、ＰＣＲ産物を生成しなかった。
【０１８７】
ＮａＶ１．７ＫＯであると確認された動物は、２つの方法で再確認された。最初に、それらが独特の表現型（熱疼痛感覚の欠如、および嗅覚消失の存在；本明細書の実施例４参照）を示す、一連の挙動試験を受け、さらに遺伝子型が確認される。第２に、全動物は、安楽死の際に、同じＰＣＲ方法（上述の）により遺伝子型が再特定された。
【０１８８】
ＮａＶ１．７ＫＯ候補に、１日３回を／７日間／週、これを１４〜２１日間続けて手で給餌した（図５Ｂのシリンジおよび図６の給餌を参照）。歯が生えると、追加のカロリー源として全ての新生仔マウスに対し柔らかい補助食物を利用できるようにした。合計２８匹のＮａＶ１．７ＫＯ動物を１１ヶ月間の間に生成し、２４匹はＣＤ１背景を有し、４匹はＢＡＬＢ／ｃ背景を有した。２つの背景の数の間の差異は、コロニーのサイズの反映であり、育種方法の困難さ、または結果ではない。我々は、動物は、どちらの背景のものでも非常に類似の方法で挙動を行うことを見出した（表２の「状態（ｓｔａｔｕｓ）」カラム参照）。２０１０年１２月１日現在で１８匹の動物が生存していた。８匹は、健康関連問題により失われ、試験（免疫化アッセイ）中の２匹の動物は、免疫化による健康上の合併症の後で、安楽死させる必要が生じた。それらの死は、特定の表現型に帰することはできなかった。雄雌両方の動物は、それぞれの株に対し予測比（約５０％）で存在した。確認された遺伝子型の動物は、２０１０年１２月１日現在、５４日〜７．５ヶ月の年齢であった。表２（下記）は、それぞれのＮａＶ１．７ＫＯマウスのリストである。成人期に達すると、ＮａＶ１．７ＫＯ動物は、交配できた。ＮａＶ１．７ＫＯ動物の、雄（表２Ａ）と雌（表２Ｂ）の両方が、同じ背景由来の逆の性のヘテロ接合の（ＨＥＴ）動物と交配された。雄雌両方共、繁殖可能であった。雄は、特に活気がなく、その仕事に非効率的であり、１８の別々の交配イベントで１匹の同腹子の生成に繋がった（表２Ａ）。いくつかの個体の場合に、泌尿性器の死後分析が行われ、精子数を測定し、全ての繁殖問題が調査された。繁殖性雄および不妊雄の両方が認められた。例えば、ＡＭＡ−１６１は、分析され、不妊と判定された（セルトリ細胞および精原細胞が存在したが、成熟精子は存在しなかった。しかし、類似の表現型は、一部の対照動物中でも認められた）が、一方、ＡＭＡ−３８０は、繁殖性であった。ＮａＶ１．７ＫＯ雄交配で観察された低い成功率は、ＮａＶ１．７ＫＯマウスで観察された嗅覚消失（臭い感覚の欠如）表現型に関連付けられる可能性がある。ＮａＶ１．７ＫＯ雄は、ケージ中に置かれた雌のフェロモンを受け取ることができない可能性がある。両株の雌は、生殖の観点では成功であった（４交配イベントから３匹の同腹子）（表２Ｂ）。調査した全ての雌は、妊娠、同腹子の出産、および子への授乳／給餌ができた。ケージ中に置かれた雄は、対形成を妨害する可能性のある嗅覚消失の徴候のないＮａＶ１．７ＨＥＴであったので、雌にとって、臭い感覚は交配目的には必要ないであろう。
【０１８９】
図８Ａ〜Ｅは、ＮａＶ１．７ＫＯマウスの外部表現型を示す。外部表現型は、図８Ａ〜Ｄに示すように、サイズの顕著な差異を除いて、正常であった（図８Ａ〜Ｄの矢印で示す、より小さいＮａＶ１．７ＫＯマウスを参照）。それらの目は、開かれ、歯は生え、さらに、毛はよく発達していた。それらは、同腹子とほぼ同時にケージ内で動くことができた。誕生後、１６時間の早い時期に、ＮａＶ１．７ＫＯ動物は、同腹子よりサイズが小さいことが認められた。図８Ｅは、離乳後８週間にわたるサイズ比較を示す。離乳後野性型同腹子に比べて、ＮａＶ１．７ＫＯ動物は、約２５％小さかった。このサイズ差は、成長の間に直面したカロリー制約と、従って、代償的供給源（完全な置換ではない）としての手による給餌に対する要求に起因する可能性がある。
【０１９０】
ＮａＶ１．７ＫＯマウスで観察された臨床的イベント。ＮａＶ１．７ＫＯコロニーを約１年間にわたりモニターした。これらの動物が要求する集中的新生仔ケアは別として、若干の再発性の離乳後の健康問題が認められた。これらが、遺伝的障害に関連するのか、または新生仔期間中の強い操作に起因するのかは、明らかでない。ＮａＶ１．７ＫＯの約４０％（集団の雌（８例）および雄（３例））で皮膚炎が観察された。この臨床的イベントは、下記治療により解決に成功した：週１回のＢａｙｔｒｉｌ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ、Ｉｎｃ．、Ａｒｃａｄｉａ、ＣＡ；ｃａｔ．＃２２６９）処置、続けて、三重抗生物質軟膏（Ｂｕｔｌｅｒ  Ｓｃｈｅｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＯＨ；ｃａｔ．＃０３１０８７）の毎日２回の局所的塗布を組み合わせた最適化治療。皮膚炎が目の近くに現れた場合には、局所の三重眼部軟膏（Ｗｅｂｓｔｅｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＭＡ；ｃａｔ．＃０７−８０５−４５０２）を代わりに使った。軽度の場合には、Ｂａｙｔｒｉｌ単独治療で問題を完全回復まで解決するのに十分であった。痒み行動アッセイ（本明細書の実施例４参照）から集めたデータに基づき、ジフェンヒドラミンは、Ｎａｖ１．７ＫＯマウスに対し投与されなかった。理由は、それらがヒスタミン誘導痒みに対し非感受性であるからである。ＮａＶ１．７ＫＯマウスコロニーの約２５％に拡張膀胱が認められた。これは、雌（２例）より雄（５例）で多かった。治療は、拡張膀胱領域に手で圧力をゆっくり加え、尿を放出させることから構成した。さらに、動物が脱水症の徴候を示す場合は、ＮａＣｌ液の皮下注射を組み合わせた。陰茎脱が２、３匹の雄で報告され、器官を手でその腔中に戻し、発赤が観察される場合には、局所的三重抗生物質と組み合わせることにより解決した。臨床的徴候を示す全動物は、Ｔｅｋｌａｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｓｏｆｔ  Ｂｅｄｄｉｎｇ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ；ｃａｔ．＃７０８９）に置き、標準的寝具とすり減らす作用を起こす接触を最小限にし、および／または妨害物が検出された場合には、尿産生をモニターした。
【０１９１】
【表２】
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【０１９２】
【表３】
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【０１９３】
【表４】
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【０１９４】
実施例２：人工マウスミルク（ＡＭＡ）の調製
調製された人工マウスミルクの手順と組成は、Ｙａｊｉｍａと共同研究者およびＡｕｅｓｔａｄと共同研究者による記載に厳密に従って設計した（Ｙａｊｉｍａ、Ｍ、ｅｔ  ａｌ．、「マウスの子人工飼育用のマウスミルクに同等の化学的に生成されたミルク代用品（Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｉｌｋ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｉｌｋ  ｆｏｒ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｒｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｕｐｓ）」Ｅｘｐ．Ａｍｉｎ．５５（４）、３９１−３９７、（２００６）；Ａｕｅｓｔａｄ、Ｎ、ｅｔ  ａｌ．、ラットのミルクに同等のミルク代用品；その調製、組成および人工飼育ラットの成長および代謝に対する影響（Ｍｉｌｋ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｔｏ  ｒａｔ’ｓ  ｍｉｌｋ；ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ  ｒｅａｒｅｄ  ｒａｔ）、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．６１：４９５−５１８（１９８９））。
【０１９５】
試薬と方法。入手元、使用量を含む使用試薬、溶剤と使用量、ならびに種々コメントが、表３（下記）に一覧表示されている。
【０１９６】
方法。ステップ１：水酸化ナトリウムを秤量し、１０Ｌビーカーに移した。蒸留水（１．３Ｌ）を加え、オーバーヘッドスターラーを適所に置いた。水酸化カリウムを秤量し、この溶液に加え、また、Ｌ−セリン、Ｌ−シスチンおよびＬ−トリプトファンを加えた。この溶液を水浴中、５８℃まで加熱した。都合がよければ、この溶液または混合物を、ビンに移し、その後の使用の前に、５日間まで冷蔵庫中で貯蔵できる。次に、カゼインを温かい溶液にゆっくり加え、混合物を７１℃まで９０分間加熱した。この混合物を４Ｌのガラスビーカーに移し、５０℃まで加熱した。オーバーヘッドスターラーを適所に置き、混合物を沸騰するまで加熱した（図５Ａ）。ステップ２：グリセロ燐酸カルシウム、塩化マグネシウム六水和物および塩化カルシウムを秤量し、２００ｍＬの蒸留水に溶解し、２０分間均一化した。この混合物を、カゼイン混合物に、攪拌を続けながらゆっくり添加した。ステップ３：炭酸カルシウムおよびクエン酸四水和物を秤量し、１００ｍＬの蒸留水に加え、１分間均一化し、カゼイン混合物にゆっくり加えた。ステップ４：リン酸ナトリウム二塩基性七水化物および一塩基性リン酸カリウムを秤量し、５０ｍＬの蒸留水に溶解し、カゼイン溶液にゆっくり添加した。ステップ５：ラクトース一水和物を秤量し、２２０ｍＬの蒸留水中で均一化した後、カゼイン混合物に加えた。ステップ６：硫酸鉄七水化物およびクエン酸を秤量し、５ｍＬの蒸留水に溶解し、カゼイン混合物に加えた。ステップ７：硫酸マンガン水和物、硫酸銅五水和物および硫酸亜鉛七水化物を秤量し、５ｍＬの蒸留水に溶解後、カゼイン溶液に加えた。ステップ９：フッ化ナトリウムおよびヨウ化カリウムを秤量し、５ｍＬの蒸留水に溶解し、カゼイン混合物に加えた。ステップ８および１０：乳清タンパクを秤量し、６００ｍＬの蒸留水中で均一化した。この混合物に、Ｌ−カルニチン、アルファピコリン酸ＨＣｌ、エタノールアミンおよびタウリンの１０ｍＬ蒸留水中溶液を添加した。
【０１９７】
ステップ１１および１２：パーム油、ココヤシ油、トウモロコシ油、ＭＣＴ油、大豆油およびコレステロールの混合物をホットプレート上で６０℃まで加熱した。二水素性クエン酸コリンとビタミンの混合物を秤量し、７０ｍＬの蒸留水中に懸濁した。水酸化ナトリウム（５Ｎ）を加えた。この混合物をカゼイン混合物にゆっくり加えた。オイル混合物をこのカゼイン混合物に加え、さらに蒸留水を加えて体積を４Ｌにした。混合物をビンに移し、３日以内に使用するまで冷蔵庫で貯蔵した。
【０１９８】
貯蔵した人工ミルクを冷蔵庫から取り出し、水浴中の４Ｌビーカーに移し、沸騰するまで加熱した。水中で１５分間煮沸することにより、ホモジナイザーチップを滅菌した。ステップ１３：人工ミルク混合物を、均一化し、その間に、ビタミンＫ１、ビタミンＡパルミチン酸塩およびＤＬ−トコフェロール酢酸エステルを秤量し、添加した。均一化を続けながら人工ミルクを煮沸水浴中で保持し、その間に、無菌の１５ｍＬエッペンチューブ（図５Ｂ）に分注した。人工ミルクを使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１９９】
【表５】
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【０２００】
実施例３：遺伝子型同定
下記のプライマーを使ってコロニー中の全ての動物の遺伝子型を特定した：順方向Ｓｃｎ９ａ５’ＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣ３’（配列番号１）；逆方向Ｓｃｎ９ａ５’ＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧ３’（配列番号２）および順方向ネオマイシン５’ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ３’（配列番号３）。これらのプライマーは、２６７塩基対の内在性バンド（順方向Ｓｃｎ９ａ＋逆方向Ｓｃｎ９ａ）または３８９塩基対の標的バンド（順方向ネオマイシン＋逆方向Ｓｃｎ９ａ）生じた。
【０２０１】
ＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった：
（１）９５℃で７分間、続けて、下記（２）〜（４）を３５ｘサイクル、続けて、（５）〜（６）：
（２）９６℃で１０秒間；
（３）６０℃で３０秒間；
（４）７２℃で１．５分間、
（５）７２℃で７分間；
（６）４℃に冷却。
【０２０２】
同定遺伝子型パターンは以下の通りであった：
ＷＴまたは＋／＋    ＝内在性（Ｅ）バンドのみ
ＨＥＴまたは＋／−  ＝内在性（Ｅ）＋標的（Ｔ）バンド
ＫＯまたは−／−    ＝標的にしている（Ｔ）バンドのみ
【０２０３】
約２５ｎｇ〜１μｇのＤＮＡ濃度が、各試料で最初に試験された。内在性バンドは、ＡＭＡ−１６１試料のいずれにも（または他のＮａｖ１．７ＫＯ試料のいずれにも）、最初確認した生存ＮａＶ１．７ＫＯ動物（ＣＤ１背景；図７Ａ〜Ｃ）にも、存在しなかった。動物ＡＭＡ−５０は、確認済み野性型（ＷＴ）である。ＤＮＡ不含の対照は、予想通りブランクであった。
【０２０４】
実施例４：疼痛試験
熱試験。ポーサーマルスティミュレータは、研究者が不連続の熱刺激（放射熱）を特定の領域（例えば、足）に送出することを可能とする装置である。動物は、２５℃に加熱されたガラス表面上の試験チャンバーに収容された。試験開始時、後肢の下のタイマーに連動した熱ビームのスイッチを入れる。刺激に反応した動物の足の動きが刺激を終わらせ、試験の終点としての役割を果たす。２０秒の最大カットオフ時間を設定し、組織損傷を防いだ。典型的には、動物を、少なくとも５分の試験間隔をあけて、２回試験した。最初の２回の測定値が一致しない場合は、さらに１、２回の試験を行い、動物の真の熱閾値を明確にした。熱源から足を移動するまでの潜時を評価項目として記録した。
【０２０５】
図９Ａは、ＮａＶ１．７ＫＯマウス株Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１は、熱刺激（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に対し、右足（ｎ＝３）では、明らかにごく僅かな反応があり、左足（ｎ＝５）では反応しなかったことを示す。図９Ｂは、ＮａＶ１．７ＫＯマウス株Ｓｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣは、両足ともに（ｎ＝１）反応しなかったことを示す。ＷＴとＨＥＴの間では差は認められず（図９Ａ〜Ｂ）、全て正常に反応し、熱刺激適用後１０〜１５秒以内に足を逃避させた。大部分のＮａＶ１．７ＫＯ動物は、最大カットオフ時間（２０秒）に到達するまで、熱刺激に耐えた。
【０２０６】
ホットプレート装置は、所定の温度に設定された制御可能加熱表面を有する。マウスをその装置上に置き、熱に対する反応をモニターした。反応には、足を持ち上げる、足をなめる、足を引っ込める、および／またはジャンプする挙動が含まれる。最大時間制限を常に使用したが、刺激強度（すなわち、温度）に応じて変える。急性試験に対しては、装置に許容される最大時間は、温度を基準として次の通りとした：４８℃＝６０秒；５０℃＝４０秒；５２．５℃＝３０秒；５５℃＝２０秒。反復試験では、少なくとも１０分の試験間隔をおき、試験から足を完全に回復させた。試験の開始時に、動物を試験チャンバー中に置き、タイマーをスタートさせた。反応、または最大カットオフ時間への到達のどちらかが先に発生した時点で、動物を装置から取り除いた。最初の反応までの潜時を評価項目として記録した。
【０２０７】
図１０Ａ〜Ｈは、４種の異なる温度（４８、５０、５２．５、および５５℃）の試験で、両方のＮａＶ１．７ＫＯマウス株が熱疼痛に対し非感受性であったことを示す。Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１  ＮａＶ１．７−／−ＫＯマウス（図１０Ａ〜Ｄ；ｎ＝１４）およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣＮａＶ１．７−／−ＫＯマウス（図１０Ｅ〜Ｈ；ｎ＝４）は、５５℃の最高試験可能温度であっても、熱疼痛に対し非感受性であった。この最高温度では、設定カットオフ時間（２０秒）でホットプレートから取り除き、組織損傷を避ける必要があった。
【０２０８】
触覚アロディニアＶｏｎ  Ｆｒｅｙ試験。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを使ってげっ歯類の機械的な感受性が評価される。マウスを、ワイヤメッシュフロアー上に置き、個別試験チャンバー中に収容し、落ち着くまで順化させる。次に、較正された種々の曲げ強度のフィラメントをマウスの足に押しつけ、無害触知（例えば、触覚）刺激に対する反応を測定した。一連のフィラメントに対する反応パターンおよび無反応により、動物の機械的な閾値を決定した。この閾値を、このアッセイの評価項目として使用した。
【０２０９】
図１１Ａ〜Ｂは、ＮａＶ１．７ＫＯマウス株Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１（図１１Ａ；ｎ＝１６）およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ（図１１Ｂ；ｎ＝４）が、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙアロディニア刺激に対し、野性型／ヘテロ接合対照同腹子に類似の形式で反応したことを示す。全ての試験マウスは、１．５ｇのカットオフ閾値に達した。ＮａＶ１．７ＫＯ動物は、機械的な圧力を正常に認知すると思われ、この結果は、ヒトのＮａＶ１．７欠失に関する報告された観察と一致する。
【０２１０】
嗅覚消失試験。埋設食物試験（Ｂｕｒｉｅｄ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｓｔ）を開発して、マウスの嗅覚が損なわれていないかどうかを評価した。簡単に説明すると、１つのペレットをホームケージ中に置くことにより、動物が、ニャコラーダ香料入りの食物ペレットを鑑別できるように訓練した。各動物は、翌朝、ペレットが食べられ、食物として認識されたことを保証するためチェックされた。食物を試験日の前にケージ中に１日１個ずつ３日間の３回置いた。その後、試験日の前の１８時間、動物を絶食させた。試験日に、マウスを、３ｃｍのクリーン寝具を備えた標準的マウスケージに移し、５分間順化させた。５分後、マウスを、ランダムなコーナーの寝具の下１ｃｍに埋設された食物ペレットを有する別のクリーンケージに移した。次に、マウスをケージに再導入した。食物を見つけ食べ始めるまでの潜時を記録し、試験の評価項目として使った。動物が１５分後も食物を見つけられなかった場合は、試験は中止された。
【０２１１】
図１２Ａ〜Ｂは、絶食ＮａＶ１．７ＫＯマウス株Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１（図１２Ａ；ｎ＝１４）およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ（図１２Ｂ；ｎ＝４）が、アッセイの最初の２００秒内にペレットを探し出した同年齢／同じ性別の対照（ＷＴ／ＨＥＴ）同腹子に比べて、１５分の割り当て時間の間に隠された香料入りの食物ペレットの位置を探すことが困難であった（図１２Ａ）か、またはそれができなかった（図１２Ｂ）ことを示す。
【０２１２】
痒み試験。試験日に、刺激物注射の前に、全動物を観察チャンバーに３０分間順化させた。１５０μｇのヒスタミン二リン酸エステルの注射剤を、１００μＬの量で、動物の背中の肩甲骨の間の皮内に投与した。この領域は、試験の前日注射を配置しやすくするために剪毛した。マウスを手で優しく抑制しながら、皮内注射を行った。ヒスタミン注射後、動物を観察チャンバー中に置き、掻き動作を最大４０分間数えた。痒み掻き動作の数を評価項目として記録した。
【０２１３】
図１３Ａ〜Ｂは、野性型／ヘテロ接合の同腹子とは異なり、ＮａＶ１．７ＫＯマウス株Ｓｃｎ９ａ−ＣＤ１（図１３Ａ；ｎ＝１２）およびＳｃｎ９ａ−ＢａｌｂＣ（図１３Ｂ；ｎ＝３）は、ヒスタミンに対し非感受性であり（ダイアモンド参照）、非常にわずかな掻き動作を示す（図１３Ａ）か、または掻き動作を全く示さなかった（図１３Ｂ）ことを示す。ＮａＶ１．７ＫＯマウスによる掻き動作の平均数は、野性型／ヘテロ接合の対照同腹子（逆三角形）の食塩水注射後の平均数の範囲内であった。特に、アッセイ最初の１０分の間、野性型／ヘテロ接合の動物は、激しく掻いた（正位三角形）が、一方、ＮａＶ１．７ＫＯ（ダイアモンド）は、反応しなかった。
【０２１４】
実施例５：ＮａＶ１．７阻害剤用バイオマーカーの特定のためのＮａＶ１．７ノックアウトマウスの使用
ＮａＶ１．７阻害剤用オンターゲット生化学的刺激。電位依存性ナトリウムチャネルは、神経細胞興奮性の一次決定因子であり、従って、疼痛を含む興奮性亢進の神経学的障害に対する新規治療の有望な標的である。ヒトの遺伝的障害からの臨床的証拠は、９つのナトリウムチャネルの内で、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によりコードされるＮａＶ１．７サブタイプは、疼痛の伝達に不可欠であることを示し、標的阻害剤の開発にとって魅力的なポイントとなっている。しかし、ＮａＶ１．７に対する療法の開発には、重要な課題がある。第１のハードルは、他のナトリウムチャネルサブタイプに比べて、ＮａＶ１．７に対する十分な選択性を有する分子を見つけることである；文献には、個別のＮａｖサブタイプに対する選択性のある化合物の報告が含まれている（Ｊａｒｖｉｓ、ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．、強力で、選択性のＮａｖ１．８ナトリウムチャネル遮断薬のＡ−８０３４６７が、ラットの神経障害性および炎症性疼痛を弱める（Ａ−８０３４６７、ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｎａｖ１．８  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ、ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０４（２０）：８５２０−２５（２００７）；Ｂｅａｕｄｏｉｎ、Ｓ  ｅｔ  ａｌ．、スルホンアミド誘導体（Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、国際公開第ＷＯ２０１０／０７９４４３Ａ１号）。重要な追加のステップは、候補分子の送達モード、非特異的血漿タンパク質結合、半減期および他の薬物動態学的特性を含む薬剤様の特性をインビボで最適化することである。この後で、候補化合物は、動物疾患モデルの行動上の有効性に対する前臨床種で疼痛を含む試験ができる。その後の毒性学試験で、治療濃度域が規定され、投薬の方向付けがなされる。
【０２１５】
これらの全てのステップで、候補分子が、実際に、標的に結合しているか否かを知ること（単なる有効性や暴露から把握するには困難なステップ）が重大である。例えば、非常に多くの血漿または脳暴露が標的結合に繋がらない場合もある；インビトロ透析または遠心分離実験により決定される平衡血漿タンパク質結合は、必ずしも候補分子の真の活性量を予測しない可能性がある；また、候補分子による個別または別々の多くのタンパク質の結合は、特に疼痛の動物疾患モデルの有効性を（真のまたは偽の）作り出すことができる。重大な課題は、オンターゲットバイオマーカーを介して、候補化合物がその意図した標的に到達し、機能的効果を行使したことをインビボ系で知ることである。これは、最も正確な治療濃度域を確立する上で重要である。候補分子の臨床的開発では、この課題は、さらに重要である。例えば、標的結合のないネガティブな臨床試験では、さらなる試験の必要性を示し、一方、試験された治療薬がそのバイオマーカーに結合しなかったネガティブな臨床試験では、通常、さらなる開発を終了する。
【０２１６】
ＮａＶ１．７は、電位により活性化されるナトリウムイオンチャネルであり、バイオマーカーの基準として使われる可能性のあるどの化学神経伝達物質またはリガンドによっても活性化されない。わかっている限り、ニューロンの電気スパイクを産生するのは機能であるにすぎず、何ら信号伝達経路を開始または調節するものでない。これは、下流の生化学的影響の試験によるＮａＶ１．７機能の抑制のモニタリングを非常に困難にする。従って、ＮａＶ１．７用の既知のバイオマーカー、特に、９つの全ての電位依存性ナトリウムチャネルの中でＮａＶ１．７に対し特異的であることが知られているものは、存在しない。
【０２１７】
我々は、電位依存性ナトリウムチャネル、および本明細書に記載の本発明のＮａＶ１．７グローバルＫＯマウスの非特異的モジュレーターを使って、ＮａＶ１．７阻害剤に対しバイオマーカーとして機能するインビボアッセイを開発した。ナトリウムチャネルモジュレーターであるベラトリジンは、特徴的時間経過で成長したマウスとラットの、定量可能で強力な、用量依存性、および再現可能な、足をなめる、および足を引っ込める挙動を生み出した。これらの疼痛様挙動は、一部の薬物（例えば、モルヒネ、デュロキセチン）により幾分抑制されたが、全ての既存の疼痛用薬物（例えば、ガバペンチン）に抑制されるとは限らず、また、非特異的ナトリウムチャネル遮断薬（メキシレチン）により完全に抑制された。痛みによる足を引っ込める挙動が、２つのさらなる化学的に異なるナトリウムチャネルモジュレーターである、デルタメトリン（構造は下記ＩＩ）およびグラヤノトキシンＩＩＩ（「ＧＲＡＹ３」；構造は下記ＩＩＩ）で観察され、さらに、このアッセイがナトリウムチャネルの機能を反映し、ベラトリジン固有の効果ではないという証拠が観察された。
【０２１８】
ラットのベラトリジンに誘導された足を引っ込める挙動を測定するアッセイを開発した。重要なのは、ＮａＶ１．７のないマウス（グローバルノックアウトＮａＶ１．７）の試験の場合は、ベラトリジンの効果がなく、ベラトリジンの効果は、完全にＮａＶ１．７により媒介されるということである。従って、本発明のこの態様は、実験的ＮａＶ１．７遮断薬の、マウス、ラット、ウサギ、フェレット、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒト等の哺乳類対象での、例えば、実験的ＶＲ１阻害剤の生化学的刺激マーカーとして機能するカプサイシン試験に類似の皮膚適用による試験に使われるオンターゲットおよびオンメカニズム生化学的刺激を示す（Ｃｈｉｚｈ、ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．、ＴＲＰＶ１受容体媒介活性および炎症性のヒト痛覚過敏症に与えるＴＲＰＶ１アンタゴニストＳＢ−７０５４９８の効果（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＲＰＶ１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ＳＢ−７０５４９８  ｏｎ  ＴＲＰＶ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）、Ｐａｉｎ  １３２（１−２）：１３２−１４１（２００７）；Ｇａｖｖａ  ＮＲ、Ｂａｎｎｏｎ  ＡＷ、ｅｔ  ａｌ．、バニロイド受容体ＴＲＰＶ１アンタゴニストの反復投与がＴＲＰＶ１遮断により誘発される高熱症を弱める（Ｒｅｐｅａｔｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＰＶ１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｈｙｐｅｒ  ｔｈｅｒｍｉａ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＴＲＰＶ１  ｂｌｏｃｋａｄｅ）、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３２３：１２８−１３７（２００７））。本発明のこの態様は、臨床試験用の適切な投与量の選択および臨床試験結果の解釈のための重要な利点、ならびに最良のナトリウムチャネル薬剤発見のためのツールを示している。
【０２１９】
図１４は、ベラトリジン（４α、９−エポキシ−３β−ベラトロイルオキシ−５β−セバン−４β、１２、１４、１６β、１７、２０−ヘキサオール；化学構造は、下記Ｉに示す）によるＮａＶ１．７のインビトロ調節を示す。図１４に示す電流は、減算処理されていない。３０μＭベラトリジンの添加により、記載したように、ピーク電流が低下し、定常的、持続性内向き電流を生成した。この２つ目の効果は、正に帯電したナトリウムイオンのＮａＶ１．７発現ニューロン中への連続内向き流束を生成し、後で疼痛として感知されるニューロンのスパイキングを生成することが予測できる。
【０２２０】
【化１】
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【０２２１】
【化２】
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【０２２２】
【化３】
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【０２２３】
ＨＥＫ２９３細胞中で安定に発現したｈＮａＶ１．７を通る電流が、ホールセル構成のパッチクランプ法を使って、−１００ｍＶの保持電位から１０ｍＶ間隔の一群の脱分極性電位パルスにより誘導された。
【０２２４】
ホールセルパッチクランプ電気生理学。ホールセルパッチクランプ構成を使って室温（約２２℃）で細胞を電位固定した。ピペット抵抗は、１．５〜２．０ＭΩであった。ホールセルキャパシタンスおよび直列抵抗は、補償しなかった。取込の間、電流を５ｋＨｚでフィルター（４極ベッセル型）にかけ、ｐＣｌａｍｐ９．２を使って、２０ｋＨｚでデジタイズした。細胞を培養皿から取り出し、化合物灌流用溶液交換マニホールドに連結されたマイクロピペットの前方に直接置いた。ナトリウム電流をモニターするために、−１０ｍＶまでの１０ｍｓパルスを５秒毎に送出し、デルタメトリンおよびベラトリジンの場合には、外部化合物添加の前後で電流を記録した。あるいは、グラヤノトキシンＩＩＩの場合には、細胞内の（ピペット）溶液中に含めたグラヤノトキシンＩＩＩの電流を記録した。外部溶液は、次の構成とした：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１１ｍＭブドウ糖、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節。  内部溶液は次の構成とした：６２．５ｍＭ  ＣｓＣｌ、７５ｍＭ  ＣｓＦ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ＣｓＯＨでｐＨ７．２５に調節。結果を図１９Ａ〜Ｃに示す。これらの図は、デルタメトリンおよびグラヤノトキシンがｈＮａＶ１．７を活性化したことを示し、図１４は、一群のステップ脱分極に反応して、ベラトリジンがｈＮａＶ１．７を活性化したことを示す。
【０２２５】
ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系、雄（別段の指定がなければ）、８〜１０週齢）の足に注入したベラトリジンは、２つの別々の疼痛関連挙動を引き起こした。動物は、足を持ち上げ、足をなめ、また、動物は、足を引っ込めた（図１５）。足底内にベラトリジン３０μｇを注射した。より高い投与量は、疼痛関連挙動に加えて激しい震えを含む不定の神経学的副作用を生じたが、さらに調査はしなかった。足を持ち上げるおよび足を引っ込める挙動は、ベラトリジン注射後２０分間記録され、両方の挙動は、ベラトリジン注射の１時間前の経口投与（ｐ．ｏ．）によるナトリウムチャネル遮断薬メキシレチンにより用量依存的に抑制された。
【０２２６】
既知の前臨床および臨床鎮痛剤を試験し、それらがベラトリジン誘導挙動を防げるかどうかを調べた。表４は、デュロキセチンおよびモルヒネの両方が、足を引っ込める挙動を回復させたが、足を持ち上げる挙動は回復させなかったことを示す。これは、ベラトリジン誘導反応は、疼痛を反映するが、モルヒネまたはデュロキセチンにより制御されない薬理学的に異なる構成要素を有する可能性があることを示唆している。さらなる鎮痛剤ガバペンチンおよび抗炎症性のナプロキセンは、足を持ち上げる、または足を引っ込める挙動を減らさず、ベラトリジン誘導された疼痛は、異なる経路で進むか、またはあまりに強すぎて、これらの比較的弱い薬剤では、軽減されないことを示唆している。「化合物５２」は、インビボ使用に最適化されたアミノトリアジンＮａＶ１．７遮断薬であり、Ｂｒｅｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ホルマリンモデルの持続性疼痛で経口有効性を有する強力な、状態依存性Ｎａｖ１．７阻害剤の特定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ、ｓｔａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｎａｖ１．７  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｐａｉｎ）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４（１３）：４４２７−４５、Ｊｕｌｙ  １４、２０１１；ｅｐｕｂ  Ｊｕｎｅ  ２、２０１１）、に記載されている。この薬剤は、ホルマリンモデルの持続性疼痛に有効である。ジアゼパムは、前臨床で効果的な鎮痛剤ではなく、ベラトリジンモデルでは効果がなかった抗不安薬である。この結果は、観察された足を引っ込める疼痛を示す挙動と再度一致する。
【０２２７】
表４．雄ラット（株）の疼痛試験に対する鎮痛剤化合物の効果。
化合物５２は、Ｂｒｅｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ホルマリンモデルの持続性疼痛で経口有効性を有する強力な、状態依存性Ｎａｖ１．７阻害剤の特定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ、ｓｔａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｎａｖ１．７  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｐａｉｎ）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４（１３）：４４２７−４５、Ｊｕｌｙ  １４、２０１１；ｅｐｕｂ  Ｊｕｎｅ  ２、２０１１）に記載されている。
【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
雄マウス（ＣＤ１株、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、から入手、３５ｇ〜４５ｇの体重）に注射されたベラトリジンは、この場合も用量依存性的に、同等の足を持ち上げる挙動を起こした。図１６は、１％エタノールのリン酸塩緩衝食塩水中溶液による表示投与量のベラトリジンのｉ．ｐｌ．注射３０分後に記録した、合計足を持ち上げ挙動時間を示す。ベラトリジンの効果は、１μｇベラトリジンの刺激の３０分前の、３０ｍｇ／ｋｇの非特異的ナトリウムチャネル阻害剤メキシレチンのｉ．ｐ．投与により遮断された。
【０２３０】
２種の他のナトリウムチャネルモジュレーターを、雄マウス（ＣＤ１株、Ｈａｒｌａｎから入手）に別々に注射し、それぞれが、足を持ち上げる／足をなめる反応を生成した。図１７Ａ〜Ｂに、１％エタノールのリン酸塩緩衝食塩水溶液中のデルタメトリンの１０μｇ懸濁液投与（図１７Ａ；ｎ＝６）またはグラヤノトキシンＩＩＩの０．１μｇ投与（図１７Ｂ；ｎ＝６）に反応した足を引っ込める挙動の合計時間を示す。食塩水溶液中のメキシレチンの３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．事前投与は、デルタメトリンまたはグラヤノトキシンＩＩＩに対する足を持ち上げる／足をなめる反応を抑制した。デルタメトリンで試験したマウスの体重は、３０ｇ〜４５ｇで、グラヤノトキシンＩＩＩで試験したマウスの体重は、３０ｇ〜４５ｇであった。結果は、ベラトリジン関連痛み挙動は、ベラトリジンのみに特異的ではなく、ナトリウムチャネルに対する機能的影響を共有する３つの非関連分子が、同じ結果を生成したので、むしろ、１つまたは複数のナトリウムチャネルの活性化に特異的であることを支持している。
【０２３１】
１つ、いくつか、または９つ全てのナトリウムチャネルアイソフォームの活性化は、痛み挙動を生成する可能性がある。しかし、最良のバイオマーカーは、ＮａＶ１．７（Ｓｃｎ９ａ）の特異的阻害剤を検出するものである。この目的のために、１μｇのベラトリジンが、成体グローバルノックアウトＮａＶ１．７マウス（ｎ＝５）および野性型ヘテロ接合体同腹子（ｎ＝６）の足に注射された。ノックアウトマウスは、誕生以降ＮａＶ１．７を欠いている；文献報告に反して、Ｎａｖ１．７の除去は、必ずしも新生仔の致死に繋がらない。ベラトリジン注射は、野性型ヘテロ接合体マウスでは、強力な足を引っ込める反応を起こしたが、同量、同容量のベラトリジンは、ＮａＶ１．７ノックアウトでは反応を生じなかった（図１８）。嗅覚および疼痛の欠如を除いて、この実験で使用されたような健康なＮａＶ１．７ノックアウトマウスは、全体の動きに関する開放野外試験を含め、明確な欠陥を示さない。ノックアウトのカラム中に残されている少しの「足を上げる」時間は、マウスが、３０分にわたる過程の中で行うであろう、足を持ち上げるまたは足をなめる挙動の正常な長さの時間に帰することができる。全ての挙動実験は、マウス遺伝子型または処理に関し、観察者盲検で行った。野生型ヘテロ接合体マウスのベラトリジン誘導の足を持ち上げる／足をなめる挙動は、また、メキシレチンの薬理学的投与により抑制された。
【０２３２】
この実施例５で記載の結果は、ナトリウムチャネル活性化因子が、しっかりした、定量化可能な疼痛反応を生成し、この反応が、Ｎａｖ１．７の活性化のみを介して媒介され、さらに、この反応が、ナトリウムチャネルの薬理学的抑制に対し感受性が高いことを示す。従って、本明細書に記載の本発明のベラトリジンバイオマーカーアッセイは、ＮａＶ１．７に特異的なオンターゲット生化学的刺激アッセイである。
【０２３３】
実施例６：抗Ｎａｖ１．７抗体を生成するためのＮａＶ１．７ノックアウトマウスの使用
図２０Ａ〜Ｂは、本発明のＮａＶ１．７ノックアウトマウスによる抗体生成を示す。ＮａＶ１．７ノックアウトマウスは、ヒトＮａＶ１．７を発現している細胞で免疫された。抗体分泌ハイブリドーマ細胞を、マウス脾臓融合体から標準的手法で調製し、ハイブリドーマ細胞を培養し、さらに、上清をハイブリドーマ細胞のそれぞれのウエルから単離した。
【０２３４】
図２０Ａ〜Ｂは、代表的ハイブリドーマ上清の抗ＮａＶ１．７抗体の存在に関するフローサイトメトリーを使った試験を示す。ＨＥＫ２９３細胞（親２９３細胞またはヒトＮａＶ１．７を安定発現した細胞）を、試験上清および蛍光タグ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。各細胞を、健康な細胞集団でゲーティングしたフローサイトメトリー蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使って、蛍光発光を測定した。抗体結合を測定するために、２ｘ１０５ヒトＮａＶ１．７発現細胞を１：２０希釈ＩｇＧ含有上清と共に４℃で１時間インキュベートした。非結合抗体を、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを使った２回の洗浄により除去した。細胞を、１μｇ／ｍＬのフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １０３２−０２）と共に、４℃で４５分間、インキュベートした。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、細胞を０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐ３５６６）中に再懸濁し、健康な細胞集団をゲーティングするフローサイトメトリー用ＢＤ−ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（登録商標）選別装置に供した。
【０２３５】
蛍光発光強度（下記プロットのｘ−軸；各点は単一細胞由来のデータを表す）は、２９３細胞発現ｈＮａｖ１．７の平均値（図２０Ａ）の方が、親ＨＥＫ２９３細胞（図２０Ｂ）からの平均値より大きかった。解釈は、ノックアウトマウスは抗体を産生し、これらの抗体は、ｈＮａＶ１．７を標的としていた、ということである（Ｙ−軸は、標識マーカーを反映していない）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2014507136.tif 000044
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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