(57)【要約】本発明は、血液増殖性疾患の処置のための診断法および治療法を提供する。2014527054.tif 000006
2014527054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液増殖性疾患細胞が実質的にEphA3−であり、かつ骨髄内の異常血管系がEphA3＋である、血液増殖性疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法が治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体が（i）EphA3を活性化し、かつ／または（ii）ADCCを誘導する、方法。
【請求項２】
血液増殖性疾患細胞が5%以下のレベルでEphA3を発現し、かつ血液増殖性疾患が急性骨髄性白血病（AML）である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
血液増殖性疾患細胞が5%以下のレベルでEphA3を発現し、かつ血液増殖性疾患が慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、骨髄異形成症候群（MDS）、真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、または特発性骨髄線維症（IM）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
血液増殖性疾患が慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
抗EphA3抗体がヒト重鎖のγ-1またはγ-3定常領域を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
抗EphA3抗体が、低フコシル化または無フコシル化抗体調製物の状態で提供される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
抗EphA3抗体が、mAb IIIA4が結合するEphA3上のエピトープに結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
抗EphA3抗体が組換え抗体またはキメラ抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
抗EphA3抗体がヒト抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
抗EphA3抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
抗EphA3抗体がポリクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
抗EphA3抗体が、Fab、Fab'、またはFvを含む多価抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
抗EphA3抗体がADCCを誘導する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
抗EphA3抗体が、エフリンA5リガンドのEphA3への結合を阻止する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1種の付加的な治療薬を投与する段階をさらに含む方法であって、該少なくとも1種の付加的な治療薬が化学療法薬である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
血液増殖性疾患を有する患者が抗EphA3抗体による処置の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する骨髄試料を提供する段階；および
該骨髄内に存在している異常血管系上のEphA3の発現を検出する段階
を含む、方法。
【請求項１７】
患者が、AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
EphA3の発現が異常血管系の内皮層血管において検出される、請求項16または17記載の方法。
【請求項１９】
EphA3の発現が異常血管系の血管の中膜または外膜において検出される、請求項16または17記載の方法。
【請求項２０】
EphA3の発現を検出する段階が、抗EphA3抗体を前記試料と接触させる段階を含む、請求項16または17記載の方法。
【請求項２１】
抗EphA3抗体が、特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）に寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2；または特許寄託指定番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
EphA3＋異常骨髄血管系を伴う血液増殖性疾患を有する患者の処置の有効性をモニターする方法であって、
血液増殖性疾患に対する治療処置後に、該患者から骨髄試料を採取する段階；および
異常血管系上のEphA3の発現を検出する段階
を含む、方法。
【請求項２３】
患者が、AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
発現が異常血管系の内皮層血管において検出される、請求項22または23記載の方法。
【請求項２５】
発現が異常血管系の血管の中膜または外膜において検出される、請求項22または23記載の方法。
【請求項２６】
EphA3の発現を検出する段階が、抗EphA3抗体を前記試料と接触させる段階を含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項２７】
抗EphA3抗体が、特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）に寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2；または特許寄託指定番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
EphA3の発現を検出するための少なくとも1種の試薬を含有するキットであって、該少なくとも1種の試薬がモノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体が、特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）に寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2であるか；特許寄託指定番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7であるか；またはEphA3のC末端領域にアミノ酸955〜983において結合する、キット。
【請求項２９】
特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項３０】
請求項29記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項３１】
特許寄託指定番号PTA-12228を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項３２】
請求項31記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年8月12日に提出された米国仮出願第61/523,104号の恩典を主張するものであって、その出願はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
EphA3は、特定の固形腫瘍の表面上および固形腫瘍の血管系上に発現する受容体型チロシンキナーゼである（WO 2008/112192（特許文献1）を参照されたい）。加えて、EphA3は、移行期および急性転化期にある慢性骨髄性白血病（CML）患者におけるCD34＋細胞上で過剰発現することが報告されている（Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008（非特許文献1））。EphA3は、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、骨髄異形成症候群（MDS）、真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、または特発性骨髄線維症（IM）を有する患者から得られた骨髄および末梢血試料中の、新生物骨髄幹細胞を含む新生物骨髄細胞の表面上でも発現する（WO 2010/102244（特許文献2）を参照されたい）。
【０００３】
血管新生は、AMLおよび骨髄線維症の患者の骨髄において増大しており（例えば、Padro et al., Blood 95:2637, 2000（非特許文献2）；Gianelli et al, Am. J. Clin, Path. 128:966, 2007（非特許文献3）を参照されたい）、高い微小血管密度はAMLにおいて予後不良の因子である（例えば、Kukzu et al, Leukemia and Lymphoma 45:1185, 2004（非特許文献4））。エンドスタチンによる抗血管新生処置は、マウスモデルにおいてAMLの進行を阻害する（Schuch et al., Leukemia 19:1312, 2005（非特許文献5））。さらに、新たな血管形成は、多発性骨髄腫、急性白血病、および血液増殖性新生物等の他の血液悪性腫瘍においても観察される（例えば、Medinger & Mross, J. Angiogenesis Res. 2:10, 2010（非特許文献6）；およびFrater et al., Diagnostic Pathol. 3:16, 2008（非特許文献7）を参照されたい）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO 2008/112192
【特許文献２】WO 2010/102244
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008
【非特許文献２】Padro et al., Blood 95:2637, 2000
【非特許文献３】Gianelli et al, Am. J. Clin, Path. 128:966, 2007
【非特許文献４】Kukzu et al, Leukemia and Lymphoma 45:1185, 2004
【非特許文献５】Schuch et al., Leukemia 19:1312, 2005
【非特許文献６】Medinger & Mross, J. Angiogenesis Res. 2:10, 2010
【非特許文献７】Frater et al., Diagnostic Pathol. 3:16, 2008
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、血液増殖性疾患を有する患者に由来する骨髄内の血管系がEphA3を発現するという発見に一部基づいている。活性化EphA3抗体等の、EphA3を標的とする剤を、新生物細胞自体はEphA3を発現しないかまたは低レベルのEphA3を発現する患者における血液増殖性疾患の処置に利用することができる。いくつかの態様において、患者は、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、多発性骨髄腫（MM）、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、骨髄異形成症候群（MDS）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、肥満細胞症、真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、または特発性骨髄線維症（IM）を有する。
【０００７】
血液増殖性疾患を有する患者の骨髄内の異常血管系上にEphA3が選択的に発現することは、本発明者らの発見である。ゆえに、1つの局面において、本発明は、血液増殖性疾患を有する患者を処置する方法であって、EphA3が血液増殖性疾患細胞の表面上に発現しないかまたは血液増殖性疾患細胞上に低レベルで発現する、血液増殖性疾患を有する患者に抗EphA3抗体を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、患者はAMLを有する。いくつかの態様において、患者は、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、またはIMを有する。いくつかの態様において、患者は、CLL、MM、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、MCL、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する。理論に拘束されることはないが、治療用抗EphA3抗体は、EphA3を発現する細胞、例えば血管内皮細胞を殺傷するが、該抗体は内皮細胞の増殖および血管新生を防ぎ得ないという意味では、それは必ずしも抗血管新生性ではない。
【０００８】
いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体はEphA3を多量体化する。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、EphA3を活性化して、標的細胞に形態学的変化、例えば円形化をもたらす。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導することによって標的細胞を殺傷する。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、（i）EphA3を活性化し、かつ（ii）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導する。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、EphA3を選択的に発現する異常骨髄血管系を有するが、血液増殖性疾患細胞が表面上にEphA3を発現しないかまたはEphA3を低レベルで発現する血液増殖性疾患患者を処置する方法であって、該方法は治療有効量の抗EphA3抗体を患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体はEphA3を活性化し、かつ／またはADCCを誘導する、方法を提供する。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明の方法における使用のための治療用抗EphA3抗体は、組換え抗体またはキメラ抗体である。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体はヒト抗体である。治療用抗EphA3抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、Fab、Fab'、またはFvを含む多価抗体である。いくつかの態様において、抗体はF(ab')2である。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、EphA3結合についてmAb IIIA4と競合する。いくつかの態様において、治療用抗体は、mAb IIIA4と同じエピトープに結合する。典型的な態様において、治療用抗体は、EphA3へのエフリンリガンドの結合、例えばエフリンA5の結合を阻止しない。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、mAb IIIA4のVHおよびVL領域を含む。いくつかの態様において、治療用抗EphA3抗体は、mAb IIIA4のVHおよびVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの態様において、治療用抗体は、mAb IIIA4のVH領域のCDR3およびVL領域のCDR3を含む。いくつかの態様において、治療用抗体はADCCを誘導する。ゆえに、いくつかの態様において、治療用抗体は活性アイソタイプを有し、例えば該抗体は、γ-1またはγ-3領域であるヒト重鎖定常領域を有する。いくつかの態様において、治療用抗体はADCCを誘導せず、例えば該抗体は、γ-2もしくはγ-4領域であるヒト重鎖定常領域を有するか、または多量体フラグメントである。
【００１１】
本発明との関連において、「EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体」とは、（i）EphA3を活性化する、（ii）ADCCを誘導する、または（iii）活性化しかつADCCを誘導する抗体を指す。
【００１２】
本発明のいくつかの態様において、血液増殖性疾患患者は、本明細書において記載される抗EphA3抗体で処置され、かつ疾患のための別の治療薬による処置も受ける。ゆえに、いくつかの態様において、前記方法は、1種または複数種の付加的な治療薬を投与する段階を含む。例えば、血液増殖性疾患がCMLである場合は、付加的な治療薬には、メシル酸イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、または別の化学療法薬が含まれる。血液増殖性疾患がAMLである場合は、付加的な治療薬は、例えば単独のまたはダウノルビシンと併用した、シトシンアラビノシドであってよい。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、抗EphA3抗体による処置の候補である、血液増殖性疾患を有する血液増殖性疾患患者を同定する方法であって、血液増殖性疾患患者における異常骨髄血管系上のEphA3発現を検出する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、患者はAMLを有する。いくつかの態様において、患者は、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、またはIMを有する。いくつかの態様において、患者は、CLL、MM、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、NHL、MCL、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明は、EphA3を発現する異常骨髄血管系を有する血液増殖性疾患患者の処置の有効性をモニターする方法であって、血液増殖性疾患に対する治療薬で処置されている患者から骨髄試料を採取する段階；および異常骨髄血管系上のEphA3の発現を検出する段階を含む方法を提供する。
【００１５】
一般に公知の技術を用いることによって、EphA3発現を検出することができる。ゆえに、いくつかの態様において、EphA3の発現を検出する段階は、例えば免疫組織化学を用いて、血管系上のタンパク質発現を検出する段階を含む。いくつかの態様において、異常血管系上のEphA3発現を検出するために用いられる抗体は、治療用抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、該抗体は、ブダペスト条約の規定の下で2011年11月8日にアメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ATCC）、10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, USAに寄託され、特許寄託番号PTA-12227を付されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体SL-2である。いくつかの態様において、該抗体は、ブダペスト条約の規定の下で2011年11月8日にATCCに寄託され、特許寄託番号PTA-12228を付されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体SL-7である。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、例えば異常血管系上のEphA3発現の検出のためのモノクローナル抗体を提供する。一態様において、モノクローナル抗体は、ATCC寄託番号PTA-12227の下で寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2である。一態様において、モノクローナル抗体は、ATCC寄託番号PTA-12228の下で寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である。本発明は、モノクローナル抗体SL-2および／またはSL-7を含むキットをさらに提供する。そのようなキットは、例えば免疫組織化学分析のための試薬等の付加的な試薬を含有してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】EphA3への抗体結合を実証するELISAからの例証的なデータを提供する。6種のハイブリドーマからの上清をPBS中で5μg/mlに希釈し、EphA3を被覆したプレートに適用した。ヤギ抗マウスHRPコンジュゲートを用いて結合を検出した。Prizm 5.0ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【図２】FACSによって分析された、精製されたSL抗体のLK63細胞への結合を示す例証的なデータを提供する。抗体の結合（白抜きのヒストグラム）は、無関係のアイソタイプの対照抗体（塗りつぶされたヒストグラム）と比較して示されている。LK63細胞への（A）25nMマウスmAb IIIA4、（B）25nM SL-2、（C）25nM SL-5、および（D）25nM SL-7抗体が示されている。各試料についてのデータは、死細胞を除いた10,000個の事象を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用する「血液増殖性疾患」という用語は、白血病、リンパ腫、ならびに種々の骨髄性新生物および異形成を含む、血液細胞の異常増殖を伴う特定の疾患を指す。したがって、本発明において、血液増殖性疾病には、慢性血液増殖性疾患（CMPD）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、多発性骨髄腫（MM）、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、骨髄異形成症候群（MDS）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、肥満細胞症、真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、および特発性骨髄線維症（IM）が含まれる。「JMML」という用語は、若年性慢性骨髄性白血病（JCML）、乳児慢性骨髄単球性白血病、および乳児モノソミー7症候群と称されるすべての診断を包含する。血液増殖性疾患は、例えば世界保健機関（WHO）基準、フランス−アメリカ−イギリス（FAB）分類システム、国際予後判定システム（IPSS）等の公知の基準を用いることによって診断され得る。2008 WHO分類では、CMPDは血液増殖性新生物（MPN）と称されている。血液増殖性疾患は、特定の変異の存在を特徴とする場合が多い。例えば、CMLはBCR-ABLの存在を特徴とする。PV、ET、およびIMは、これらの疾患がBCR-ABLを有しないという理由で、「非BCR-ABL」（本明細書においては、「BCR-ABLマイナス」または「BCR-ABL陰性」とも称される）CMPDである。しかしながら、BCR-ABL陰性疾患は、CMLでは稀であるJAK2変異の存在を特徴とする場合が多い。本明細書において使用するとき、「CML」という用語には、フィラデルフィア染色体陽性CMLおよびフィラデルフィア染色体陰性CMLの両方が含まれる。
【００１９】
本発明との関連において使用する「血液増殖性疾患細胞」という用語は、血液増殖性疾患に特有である新生物血液細胞を指す。「新生物」という用語は、例えば骨髄異形成症候群に特有である骨髄細胞等の、悪性であるとまだ認められ得ない細胞、および悪性急性白血病細胞等の悪性細胞を包含する。「血液増殖性疾患細胞」は、芽細胞および幹細胞の両方を包含するが、血液増殖性疾患を有する患者、例えばAML患者の骨髄において生じる異常な血管新生に付随した異常骨髄血管系を含まない。
【００２０】
本出願との関連において使用するとき、「異常な骨髄血管新生」とは、正常な骨髄における血管新生のレベルおよび正常な骨髄における血管系の構造と比較して、増大し、かつ構造的に正常でない血管新生を指す。本明細書において使用するとき、「異常血管系」とは、以下を含む、微小血管構築の異形を指す：形状の不規則性および蛇行の増加、繊維の増大、微小血管密度の増大、ならびに不規則な形状をした洞の複雑な分岐（例えば、Kvansnicka & Thlele, Histol. Pathol. 19:1245-1260, 2004を参照されたい）。
【００２１】
発現との関連においてEphA3発現に適用される「選択的に発現した」という用語、または異常血管系上の「EphA3の選択的発現」という用語は、正常血管系ではなく、異常血管系上のEphA3発現を指す。EphA3は、異常血管系の内皮において、または血管の他の部分、例えば中膜または外膜において発現し得る。
【００２２】
本発明との関連において、血液増殖性疾患細胞上でのEphA3の「低レベル」または「最小限」の発現とは、フローサイトメトリーまたは当技術分野において公知の他の手段によって評価すると、血液増殖性疾患細胞の50%未満、またはいくつかの態様において、40%未満、30%、20%、10%、もしくは5%未満がEphA3を発現するというような、細胞の集団における発現を指す。いくつかの態様において、CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMMLにおける血液増殖性疾患細胞は、フローサイトメトリーで評価すると、血液増殖性疾患細胞集団の5%以下のレベルでEphA3が発現するという、EphA3の低レベルな発現を呈する。
【００２３】
異常血管系上の発現との関連において使用するとき、「EphA3＋」という用語は、バックグラウンドを上回るEphA3発現を指す。新生物血液疾患細胞上のEphA3の発現との関連において、「実質的にEpha3−」という用語は、発現なし、すなわちいずれの細胞上でも発現が観察されない、または新生物細胞の50%未満、典型的には40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、もしくは5%未満がEphA3を発現することを指す。
【００２４】
本明細書で使用する「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、新生物細胞を指すものとして互換的に用いられる。本用語は、良性および悪性である細胞を含む。新生物形質転換は、腫瘍細胞の由来元の細胞型に対する腫瘍細胞の表現型変化を伴う。この変化には、形態変化、および異常増殖が含まれ得る（Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd edition, 1994)を参照されたい）。
【００２５】
本発明との関連における「血液増殖性疾患細胞の増殖を阻害すること」とは、増殖を遅延させること、および/または血液増殖性疾患を有する患者の癌細胞負荷を減少させることを指す。したがって、「癌の増殖を阻害すること」、例えばAMLは、癌細胞を殺傷することを含む。
【００２６】
本明細書で使用する「EphA3」は、Eph受容体A3を指す。この受容体は、「ヒト胚キナーゼ」、「hek」、「eph様チロシンキナーゼ1」、「etk1」、または「tyro4」とも称されている。EphA3は、タンパク質-チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーに属する。EPHおよびEPH関連受容体は、発生上の事象の媒介に関連づけられている。EPHサブファミリーの受容体は、典型的に、単一のキナーゼドメイン、ならびにCysリッチドメインおよび2つのフィブロネクチンIII型反復を含む細胞外ドメインを有する。エフリン受容体は、それらの細胞外ドメイン配列の類似性、ならびにエフリン-Aおよびエフリン-Bリガンドとの結合に関するそれらの親和性に基づいて、2つの群に分類される。EphA3はエフリン-Aリガンドと結合する。EphA3の核酸配列およびタンパク質配列は公知である。ヒトEphA3アミノ酸配列の一例は、アクセッション番号EAW68857に基づいて入手可能である。
【００２７】
本発明との関連において、「EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体」とは、（i）EphA3を活性化する、（ii）ADCCを誘導する、または（iii）活性化しかつADCCを誘導する抗体を指す。
【００２８】
本発明の目的のため、EphA3の「活性化」は、EphA3のリン酸化を引き起こす。EphA3を活性化する抗体、すなわち「活性化抗体」は、EphA3のリン酸化および内皮細胞の形状変化、例えば円形化を引き起こし、したがって本発明との関連においてアゴニストと見なされる。EphA3は二量体化により活性化され得、それによって内皮細胞の形状変化、例えば円形化が起こり、アポトーシスが起こり得る。いくつかの態様において、EphA3を活性化する抗体は、EphA3への結合においてmAb IIIA4と競合する。典型的に、「活性化」抗体は、アミノ酸残基131、132、および136が結合に重要であるリガンド結合ドメイン(EphA3のアミノ酸29〜202)に結合する。いくつかの態様において、活性化抗体は、ヒトEphA3タンパク質のリガンド結合ドメイン内の残基131、132、および136を含む部位に結合する。
【００２９】
本願において、「EphA3抗体」または「抗EphA3抗体」という用語は互換的に用いられ、EphA3に特異的に結合する抗体を指す。いくつかの態様において、抗体は、EphA3を二量体化し得る。本用語は、エフリンリガンド(例えば、エフリン-A5)結合の存在下においてEphA3に結合する抗体、およびリガンド結合部位に結合する抗体を包含する。
【００３０】
「エフリンリガンドの結合の存在下においてEphA3に結合するEphA3抗体」とは、エフリン-A5などのエフリンリガンドのEphA3に対する結合を有意に妨げない抗体を指す。EphA3およびエフリンリガンド、例えばエフリン-A5を含む結合反応物中にそのような抗体が存在すると、EphA3に対するエフリンリガンド結合は約30%未満、典型的には20%または10%未満減少する。
【００３１】
「mAb IIIA4」という用語は、EphA3をアフィニティー単離するために、元々はLK63ヒト急性プレB白血病細胞に対して産生されたモノクローナル抗体IIIA4を指す(Boyd, et al. J Biol Chem 267:3262-3267, 1992)。mAb IIIA4は、天然EphA3球状エフリン結合ドメインに結合する(例えば、Smith, et al., J. Biol. Chem 279:9522-9531, 2004)。これは、アクセッション番号91061920の下で、欧州動物細胞培養収集機関(European Collection of Animal Cell Cultures)に寄託されている(例えば、欧州特許第EP0590030号を参照されたい)。
【００３２】
本明細書で使用する「活性アイソタイプを有する抗体」とは、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するヒトFc領域を有する抗体を指す。「活性アイソタイプ」には、IgG1、IgG3、IgM、IgA、およびIgEが含まれる。本用語は、Fcエフェクター機能を調節する変異、またはFcエフェクター機能を調節する糖組成および/もしくはグリコシル化レベルに対する変化などの修飾を含むヒトFc領域を有する抗体を包含する。
【００３３】
「Fc領域」とは、第1定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を指す。したがって、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインの可動性ヒンジN末端を指す。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含み得る。IgGの場合、Fcは免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3、ならびにCγ1とCγとの間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むよう規定され、その際、番号付けはKabatらによるEU指数(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service、バージニア州、スプリングフィールド)に従うことが、当技術分野において理解されている。「Fc領域」という用語は、単離体としてのこの領域を指す場合もあれば、または抗体もしくは抗体断片との関連におけるこの領域を指す場合もある。「Fc領域」は、Fc領域の天然の対立遺伝子変種、およびエフェクター機能を調節する修飾を含む。Fc領域はまた、生物学的機能に変化をもたらさない変種も含む。例えば、生物学的機能を実質的に喪失させることなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。このような変種は、活性に最小の影響を及ぼすように、当技術分野で公知の一般規則に基づいて選択することができる(例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい)。
【００３４】
本明細書で使用する「抗体」とは、結合タンパク質として機能的に定義され、かつ抗体を産生する動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むとして構造的に定義されるタンパク質である。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認識されている免疫グロブリン遺伝子にはκ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。
【００３５】
典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」鎖(約25 kD)および1本の「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３６】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、結合特異性を保持する抗体断片も含む。例えば、いくつかの十分に特徴づけられた抗体断片が存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域内のジスルフィド結合のC末端で抗体を消化して、それ自体はジスルフィド結合によってVH-CH1に結合している軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を生じる。F(ab)'2を穏和な条件下で還元してヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それによりF(ab')2二量体からFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的にヒンジ領域の部分を伴うFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。無傷の抗体の消化に関して様々な抗体断片が規定されるが、当業者は、化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることによりそのような断片を新規に合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用する抗体という用語はまた、抗体全体の修飾によって生じるか、または組換えDNA方法論を用いて合成される抗体断片を含む。
【００３７】
抗体には、可変重鎖領域と可変軽鎖領域が共に結合して(直接またはペプチドリンカーを介して)、連続したポリペプチドを形成する一本鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)のような一本鎖抗体(単一のポリペプチド鎖として存在する抗体)を含む、VH-VL二量体が含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接結合しているか、またはペプチドコードリンカーによって結合しているVHコード配列およびVLコード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合したVH-VLである(例えば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。VHとVLは単一ポリペプチド鎖として互いに結合しているが、VHドメインおよびVLドメインは非共有結合によって会合する。または、抗体は別の断片であってもよい。他の断片もまた、例えば組換え技法を用いて、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ法から得られる断片として作製することができる。抗体には、二抗体(diantibody)およびミニ抗体も含まれ得る。本発明の抗体は、ラクダ科動物に由来する抗体のような重鎖二量体も含まれる。本発明の目的のために、抗体は、血液増殖性細胞の表面上に存在するEphA3を活性化し得る形態、または血液増殖性細胞をADCCによって死滅させ得る形態で使用する。したがってある態様において、抗体は、二量体である。別の態様においては、抗体は活性アイソタイプを有する単量体型である。他の態様において、抗体は、EphA3を架橋し得る多価型、例えば三価または四価型である。
【００３８】
本明細書で使用する「V領域」とは、B細胞分化の際の重鎖および軽鎖のV領域遺伝子の再編成の結果としてVセグメントに付加されるセグメントであるCDR3およびフレームワーク4を含めた、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指す。
【００３９】
本明細書で使用する「相補性決定領域(CDR)」とは、軽鎖および重鎖の可変領域によって確立される4つの「フレームワーク」領域を中断する、各鎖における3つの超可変領域を指す。CDRは主に、抗原のエピトープに対する結合を担う。各鎖のCDRは典型的に、N末端から順に番号付けしてCDR1、CDR2、およびCDR3と称され、典型的に、特定のCDRが位置する鎖によっても特定される。したがって、VH CDR3はそれが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、VL CDR1はそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
【００４０】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成成分である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域が組み合わさったものであり、三次元空間にCDRを配置し、整列させるように働く。
【００４１】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、例えば、Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database(IMGT)、およびAbM(例えば、Johnson et al.、前記；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883；Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)を参照されたい)といった当技術分野で周知の種々の定義を用いて決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下の文献にも記載されている：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001)；MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991)；Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。
【００４２】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸から、またはタンパク質の三次折りたたみによって隣接した非連続アミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは典型的に、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは典型的に、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは典型的に、独特の空間的高次構造中に少なくとも3アミノ酸、より一般的には少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、x線結晶解析および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００４３】
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、(a) 定常領域またはその一部が改変、置換、または交換され、その結果として抗原結合部位(可変領域)が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、または例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物等といったキメラ抗体に新たな特性を付与する完全に異なる分子に結合しているか；または(b) 可変領域またはその一部が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域もしくはその一部により；または別の種由来もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラス由来の対応する配列により、改変、置換、または交換された免疫グロブリン分子を指す。
【００４４】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」とは、ドナー抗体由来のCDRがヒトフレームワークに移植された免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列内にドナー起源の残基を含み得る。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合がある。ヒト化は、「超ヒト化(superhumanizing)」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002)および「表面再処理(resurfacing)」(例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006；およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994)などの技法を含む、当技術分野で公知の方法(例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992；米国特許第4,816,567号)を用いて行うことができる。
【００４５】
本発明との関連における「HUMANEERED(商標)」抗体とは、参照抗体の結合特異性を有する改変ヒト抗体を指す。本発明において使用するための改変ヒト抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子を有する。いくつかの態様において、改変ヒト抗体は、参照抗体のCDR3領域に由来する最小必須結合特異性決定基のみを保持し得る。典型的に、改変ヒト抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域による結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列をヒトVHセグメント配列に結合し、参照抗体由来の軽鎖のCDR3 BSDをコードするDNA配列をヒトVLセグメント配列に結合することによって改変される。「BSD」とは、CDR3-FR4領域、または結合特異性を媒介するこの領域の一部を指す。したがって、結合特異性決定基は、CDR3-FR4、CDR3、CDR3の最小必須結合特異性決定基(これは、抗体のV領域中に存在する場合に結合特異性を付与する、CDR3よりも小さな任意の領域を指す)、Dセグメント(重鎖領域に関する)、または参照抗体の結合特異性を付与するCDR3-FR4の他の領域であってよい。ヒト抗体を改変する方法は、米国特許第7,981,843号および米国特許出願公開第20060134098号に提供されている。
【００４６】
本明細書で使用する「ヒト」抗体という用語は、実質的にヒトである、すなわちヒト免疫系に由来するFR領域、および多くの場合にCDR領域を有する抗体を指す。したがって、本用語は、「HUMANEERED(商標)」抗体、ならびにヒト免疫系で再構成されたマウスから単離された抗体、およびディスプレイライブラリーから単離された抗体を含む。
【００４７】
「低フコシル化」抗体調製物とは、α1,6-フコースの平均含量が、天然IgG抗体調製物中に見出されるα1,6-フコースの平均含量の50%未満である抗体調製物を指す。当技術分野において理解されるように、「低フコシル化」は抗体の集団に関して用いられる。
【００４８】
「無フコシル化」抗体は、IgG重鎖のCH2ドメインに付着するα1,6-フコースを欠いている。
【００４９】
本明細書で使用する「治療用」抗体とは、血液増殖性疾患を有する患者に投与されるヒト抗体および/またはキメラ抗体を指す。
【００５０】
核酸の部分に関して使用する場合の「異種の」という用語は、核酸が、天然では相互にこれと同じ関係で通常見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、このような核酸は典型的に組換えにより作製され、例えば新たな機能的核酸を創出するように配置された無関係の遺伝子由来の2つまたはそれ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質とは、天然では相互にこれと同じ関係で見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を指すことが多い。
【００５１】
例えば細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用する場合の「組換え体」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸もしくは異種タンパク質の導入または天然核酸もしくは天然タンパク質の変更により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は天然(非組換え)型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を発現するがこれが別の方法で異常に発現される、低発現される、もしくは全く発現されない。本明細書における「組換え核酸」という用語は、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、一般的に核酸の操作により最初にインビトロで形成された、天然に通常見出されない形態の核酸を意味する。このようにして、異なる配列の機能的な連結が達成される。したがって、通常は結合していないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された線状形態の単離核酸または発現ベクターはいずれも、本発明の目的に関して組換え体とみなされる。組換え核酸を作製し、宿主細胞または生物体に再導入すると、これは非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製する。しかし、このような核酸は、組換えにより作製されると続いて非組換え的に複製するが、それでもなお本発明の目的に関して組換え体とみなされることが理解される。同様に、「組換えタンパク質」とは、組換え技法を用いて、すなわち上記の組換え核酸の発現を通して作製されたタンパク質である。
【００５２】
タンパク質またはペプチドに言及する場合の、抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「〜と特異的に(または選択的に)免疫反応性である」という語句は、関心対象のたんぱく質に抗体が結合する結合反応を指す。本発明との関連において、抗体は典型的に、他の抗原に対するその親和性よりも少なくとも100倍優れた親和性でEphA3に結合する。
【００５３】
「平衡解離定数(KD)」という用語は、会合速度定数(ka、時間-1、M-1)で除した解離速度定数(kd、時間-1)を指す。平衡解離定数は、当技術分野における任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は高親和性抗体である。このような抗体は、500 nMよりも優れた、多くの場合には50 nMまたは10 nMよりも優れた親和性を有する。したがっていくつかの態様において、本発明の抗体は、500 nM〜100 pMの範囲、または25 nM〜100 pMの範囲、または25 nM〜50 pMの範囲、または25 nM〜1 pMの範囲の親和性を有する。
【００５４】
本明細書において使用する「血液増殖性疾患治療薬」とは、血液増殖性疾患、例えばAMLの患者に治療有効用量で投与した場合に、疾患および疾患に伴う合併症の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に停止させる薬剤を指す。いくつかの態様において、治療薬は化学療法薬であってもよい。
【００５５】
2つまたはそれ以上のポリペプチド(または核酸)配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、以下に記載する初期設定パラメータでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アライメントおよび目視検査により測定した場合に(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)、同一であるかまたは特定の割合のアミノ酸残基(またはヌクレオチド)が同一である(すなわち、比較領域または指定領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合の、特定領域にわたる約60%の同一性、好ましくは70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性)2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、本明細書において「実質的に同一である」とも称される。「実質的に同一である」配列には、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然の変種、例えば多型または対立遺伝子変種、および人為的変種もまた含まれる。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等について説明し得る。好ましくは、タンパク質配列同一性は、少なくとも約25アミノ酸長の領域にわたり、またはより好ましくは50〜100アミノ酸長の領域にわたり、またはタンパク質の全長にわたり存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「比較領域」には、2つの配列を最適にアライメントした後に、同じ数の連続位置の参照配列に対して1つの配列を比較することができる、典型的に20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される数の連続位置のうちの1つのセグメントに対する言及が含まれる。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI)により、または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい)によって行うことができる。
【００５７】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するには、BLASTおよびBLAST 2.0を本明細書に記載されるパラメータで使用する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、初期設定としてワード長(W) 11、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムでは、初期設定としてワード長3、および期待値(E) 10、およびBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００５８】
2つのポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第1ポリペプチドが、第2ポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的に第2ポリペプチドと実質的に同一である。
【００５９】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見出される通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定する。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。いくつかの態様における「精製された」という用語は、タンパク質が電気泳動ゲルで本質的に1本のバンドを生じることを表す。好ましくは、これは、タンパク質が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００６１】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、例えば、α炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基が結合している、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００６２】
アミノ酸は、本明細書中では、IUPAC-IUB生化学命名委員会により推奨されている一般に知られている3文字記号または1文字記号により参照され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に是認されている1文字コードにより参照され得る。
【００６３】
「保存的修飾変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する保存的修飾変種とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すが、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一のまたは関連する配列、例えば天然の連続した配列を指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一である核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを記載の対応するコドンの別のものに変更することができる。このような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的修飾変種の1種である。ポリペプチドをコードする本明細書内のすべての核酸配列は、核酸のサイレント変化も表す。当業者は、特定の状況において、核酸内の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一である分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、発現産物に関して記載された配列では、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変化が暗に意味されるが、実際のプローブ配列に関してはそのようなことはない。
【００６４】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列内の単一アミノ酸またはほんの小数のアミノ酸を変化、付加、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変化によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的修飾変種」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的修飾変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に付加されるものであり、これらを排除するものではない。典型的な相互の保存的置換：1) アラニン(A)、グリシン(G)；2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4) アルギニン(R)、リジン(K)；5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7) セリン(S)、スレオニン(T)；および8) システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。
【００６５】
「1つの(a)」または「1つの(an)」という用語は、特記しない限り「1つまたは複数」を意味することが意図される。
【００６６】
序論
本発明は、血液増殖性疾患、例えばAML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、CLL、MM、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、NHL、MCL、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する患者における異常血管新生によって生じる骨髄血管系が、EphA3を選択的に発現するという発見に一部基づいている。異常血管系におけるEphA3発現は、新血管系の内皮層にある場合が多いが、より大きな血管の内皮外の層（extraendothelial layer）において、例えば中膜および／または外膜においても観察され得る。ゆえに、抗EphA3活性化抗体および／またはADCCを誘導する抗EphA3抗体を投与することによって、血液増殖性疾患細胞がEphA3を発現しないかまたはEphA3を低レベルで発現する、血液増殖性疾患を有する患者を処置することができる。したがって、1つの局面において、本発明は、患者が血液増殖性疾患細胞上でEphA3を発現しないかまたはEphA3を5%以下のレベルで発現する、CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMMLの患者を処置する方法であって、患者に活性化抗EphA3抗体を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、患者はAMLを有する。いくつかの態様において、患者は、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、またはIMを有する。いくつかの態様において、患者は、CLL、MM、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、NHL、MCL、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する。いくつかの態様において、本発明の方法は、患者が血液増殖性疾患細胞上にEphA3を発現しない、CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMMLの患者に、ADCCを誘導する抗EphA3抗体を投与する段階を含む。いくつかの態様において、血液増殖性疾患細胞上にEphA3を発現しない、CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMML患者に投与される抗EphA3抗体は、（i）活性化抗EphA3抗体であり、かつ（ii）ADCCを誘導する。
【００６７】
いくつかの態様において、本発明において使用するための抗EphA3抗体は、エフリン、例えばエフリン-A5に対するEphA3の結合を阻止しない。いくつかの態様において、該抗体はEphA3を二量体化する。いくつかの態様において、該抗体はEphA3を架橋する。いくつかの態様において、該抗体はEphA3への結合においてmAb IIIA4と競合する、例えばそのような抗体はmAb IIIA4と同じエピトープに結合し得る。いくつかの態様において、該抗体は活性アイソタイプを有し、この場合、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に重鎖定常ドメインが結合して、ADCCを引き起こし得る。
【００６８】
治療用抗EphA3抗体
本発明の方法において使用するための抗EphA3抗体は、EphA3タンパク質もしくは断片に対して産生することができ、または組換えにより作製することもできる。数多くの技法を用いて、抗体結合特異性を決定することができる。例えば、抗体の特異的免疫反応性を決定するために使用できる免疫測定法の形式および条件の記載については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照されたい。
【００６９】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である(例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory manual (1988); Methods in Immunology)。ポリクローナル抗体は、免疫剤および必要に応じてアジュバントを1回または複数回注射することによって、哺乳動物において産生させることができる。免疫剤には、EphA3受容体タンパク質またはその断片が含まれる。
【００７０】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975)によって記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発するために、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物に典型的に免疫剤を免疫化する。または、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
【００７１】
ヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991))を含む、当技術分野で公知の種々の技法を用いて作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の調製には、ColeらおよびBoernerらの技法も利用できる(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77 (1985)、およびBoerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991))。同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。抗原投与するとヒト抗体の産生が認められるが、これは、遺伝子再編成、構築、および抗体レパートリーを含め、すべての点でヒトにおいて見られるものとよく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、および以下の科学論文：Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)；Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。
【００７２】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体はキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。前記の通り、ヒト化型の抗体は、ヒト抗体のCDRが、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のCDRによって置換されているキメラ免疫グロブリンである。
【００７３】
本発明において使用する抗体は多くの形式であってよい。いくつかの態様において、抗体は、Fc領域、例えばヒトFc領域を含み得る。例えば、このような抗体には、EphA3と結合し、かつ活性アイソタイプを有するIgG抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、活性化断片（たとえば、それはEphA3を二量体化し得る）を含み得、またはFab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、または単一ドメイン抗体(「dAb」)などの、抗体の誘導体を含み得る。たとえば、いくつかの態様において、抗体はF(ab')2であってもよい。本発明において使用することができる抗体のその他の例示的な態様には、活性化ナノボディまたは活性化ラクダ科動物抗体が含まれる。このような抗体はさらに、当業者に周知の方法によって組換えにより操作することができる。上記の通り、このような抗体は公知の技法を用いて作製することができる。当業者によって理解される通り、いくつかの態様では、抗体が一価であり得る形式、例えばFvまたはFab形式である場合、該抗体は三価または四価抗体などの多価抗体として使用され得る。多価抗体を作製する方法は公知である（King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994を参照されたい)。
【００７４】
多くの態様において、本発明において使用するための抗体は、例えば免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するといったエフェクター機能を有するFc定常領域を有する。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合；補体依存性細胞傷害；Fc受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)；食作用；細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御等が含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、公知のアッセイ法を用いて評価することができる(例えば、以下に引用する参考文献を参照されたい)。
【００７５】
活性アイソタイプを有し、マクロファージ、単球、好中球、およびNK細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体に結合する抗EphA3抗体は、ADCCによる細胞死を誘導し得る。
【００７６】
Fc領域は、天然IgG1、またはIgG3、IgM、IgA、およびIgEを含むその他の活性アイソタイプに由来し得る。「活性アイソタイプ」には、Fc領域が、Fc受容体に対する結合を増大させるため、またはさもなくば抗体の効力を向上させるための修飾を含む抗体が含まれる。このようなFc定常領域は、Fc受容体に対する結合を増大させる変異、そのように増大させるグリコシル化レベルに対する変化等の修飾を含み得る。Fc領域を修飾する多くの方法が当技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第20060039904号は、1つまたは複数のFcリガンド(例えば、FcγR、C1q)に対する結合親和性の修飾を含む、エフェクター機能が強化されたFc受容体の変種を記載している。さらに、このようなFc変種は、変化した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有する。その他のFc変種には、Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997；Duncan et al, Nature 332:563-564, 1988；Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991；Lund et al, Mol Immunol 29:53-59, 1992；Alegre et al, Transplantation 57:1537-1543, 1994；Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett. 44:111-117, 1995；Lund et al., FASEB J 9:115-119, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett 54:101-104, 1996；Lund et al, J Immunol 157:4963-4969, 1996；Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999；Idusogie et al, J Immunol 164:4178-4184, 200；Reddy et al, J Immunol 164:1925-1933, 2000；Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000；Idusogie et al, J Immunol 166:2571-2575, 2001；Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001；Jefferis et al, Immunol Lett 82:57-65. 2002；Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006；米国特許第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；および第7,317,091号；ならびにPCT公開WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919、およびWO 04/029207によって開示されているものが含まれる。
【００７７】
いくつかの態様では、Fc領域の天然のグリコシル化を修飾することができる。例えば、修飾は、例えば抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を取り除くことによる非グリコシル化であってよい。このようなアプローチは、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号においてさらに詳述されている。また、フコシル残基の量が減少した低フコシル化Fc変種、または二分岐GlcNAc構造が増加したFc変種など、グリコシル化の型が変化したFc領域を作製することもできる。このような糖質修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。哺乳類細胞、酵母、および植物を含む、グリコシル化経路が変化した細胞は当技術分野において記載されており、これを宿主細胞として使用し、そこで本発明の組換え抗体を発現させて、グリコシル化が変化した抗体を産生することができる。グリコシル化を修飾するための技法には、例えば、Umana et al, Nat. Biotechnol 17:176-180, 1999；Davies, et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001；Shields et al, J Biol Chem 277:26733-26740, 2002；Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003；Niwa et al. Clinc. Cancer Res. l-:6248-6255, 2004；Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Kanda et al, Glycobiology 17:104-118, 2006；米国特許第6,602,684号；第6,946,292号；および第7,214,775号；米国特許出願公開第20070248600号；第20070178551号；第20080060092号；第20060253928号；PCT公開WO 00/61739；WO 01/292246；WO 02/31114；およびWO 02/30954；ならびにPotelligent(商標)技術(Biowa, Inc. ニュージャージー州、プリンストン)；およびGlycoMAb(商標)グリコシル化操作技術(GLYCART biotechnology AG、スイス、チューリッヒ)に開示されているものが含まれる。非グリコシル化抗体もまた、ProBioGen技術を使用して産生され得る(von Horsten et al., Glycobiology 20(12): 1607-1618, 2010)。低フコシル化抗体の調製において、通常は抗体分子の少なくとも50〜70％が、しばしば少なくとも抗体の80％が、または少なくとも抗体の90％が、フコースを失う。
【００７８】
本発明のいくつかの態様では、例えば抗体が反復投与に適するように、抗体をさらに操作して免疫原性を低減させる。免疫原性が低減した抗体を作製する方法には、ヒト化およびヒューマニア化（humaneering）手順、ならびに例えば1つまたは複数のフレームワーク領域において抗体をさらに操作して、T細胞エピトープを除去する脱免疫化などの改変技法が含まれる。
【００７９】
いくつかの態様において、抗体はHUMANEERED（商標）抗体である。HUMANEERED（商標）抗体は、参照抗体の重鎖のCDR、典型的にはCDR3による結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列をヒトVHセグメント配列に結合し、参照抗体の軽鎖のCDR、典型的にはCDR3によるBSDをコードするDNA配列をヒトVLセグメント配列に結合することによって得られる、参照抗体の結合特異性を有する操作されたヒト抗体である。このような抗体の産生方法は、米国特許第7,981,843号および米国特許出願公開第20060134098号に提供されている。
【００８０】
抗体をさらに脱免疫化して、抗体のV領域から1つまたは複数の予測T細胞エピトープを除去することができる。このような手順は、例えばWO 00/34317に記載されている。
【００８１】
いくつかの態様において、可変領域はヒトV遺伝子配列からなる。例えば、可変領域配列は、ヒト生殖系列V遺伝子配列と少なくとも80%の同一性、または少なくとも85%もしくは少なくとも90%、またはそれ以上の同一性を有し得る。
【００８２】
本発明において使用する抗体は、ヒト定常領域を含み得る。軽鎖の定常領域は、ヒトκまたはλ定常領域であってよい。重鎖定常領域は多くの場合、γ鎖定常領域、例えばγ-1またはγ-3定常領域である。
【００８３】
例えば抗体が断片であるいくつかの態様では、例えばインビボでの半減期の延長をもたらすために、ポリエチレングリコール(PEG化)または血清アルブミンなどの別の分子に抗体を結合させることができる。抗体断片のPEG化の例は、Knight et al., Plateles 15:409, 2004(アブシキシマブについて)；Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994(抗CEA抗体について)；およびChapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999に提供されている。
【００８４】
抗体特異性
本発明の方法において使用するための抗体は、EphA3を活性化し、かつ／またはEphA3+細胞をADCCにより死滅させる。本発明との使用に適した例示的な抗体は、mAb IIIA4の結合特異性を有する抗体である。モノクローナル抗体mAb IIIA4は、天然EphA3球状エフリン結合ドメインに結合する(Smith, et al., J. Biol. Chem. 279:9522-9531, 2004；およびVearing et al., Cancer Res. 65:6745-6754, 2005)。EphA3表面に対する高親和性のmAb IIIA4結合は、エフリン-A5のEphA3との相互作用についての全体的な親和性にほとんど影響を及ぼさない。
【００８５】
いくつかの態様では、EphA3に対する結合においてmAb IIIA4と競合するか、またはmAb IIIA4と同じエピトープと結合するモノクローナル抗体を使用する。いくつの競合結合アッセイ法のいずれかを用いて、同じ抗原に対する結合における2つの抗体間の競合を測定することができる。例えば、この目的にサンドイッチELISAアッセイ法を用いることができる。例示的なアッセイ法では、ウェルの表面を被覆するために捕獲抗体を使用することによって、ELISAを行う。次に、飽和濃度未満のタグ化抗原を捕獲表面に添加する。このタンパク質は、特異的な抗体:抗原相互作用を介して抗体に結合する。洗浄後、検出可能部分に結合している第2抗体をELISAに添加する。この抗体が捕獲抗体と同じ抗原上の部位に結合するか、またはその部位への結合を妨げるのであれば、この部位はもはや結合に利用できないため、この抗体は標的タンパク質に結合することができない。しかしながら、この第2抗体が抗原上の異なる部位を認識するのであれば、この抗体は結合することができる。結合は、結合している検出可能な標識の量を定量することによって検出することができる。バックグラウンドは、単一の抗体を捕獲抗体および検出抗体の両方として用いることによって規定され、最大シグナルは、抗原特異的抗体で捕獲し、抗原上のタグに対する抗体で検出することによって確立することができる。参照としてバックグラウンドおよび最大シグナルを用いることによって、抗体を対様式で評価して、特異性を決定することができる。特定の抗体が別の抗体と同じエピトープを認識する能力は、典型的にこのような競合アッセイ法によって決定される。
【００８６】
上記のアッセイ法のいずれかを用いて、第1抗体の存在下で、抗原に対する第2抗体の結合が少なくとも30%、通常少なくとも約40%、50%、60%、または75%、多くの場合少なくとも約90%減少する場合に、第1抗体は第2抗体の結合を競合的に阻害するとみなされる。
【００８７】
いくつかの態様において、抗体はmAb IIIA4と同じエピトープに結合する。mAb IIIA4およびヒト改変誘導体のエピトープは、EphA3のN末端球状リガンド結合ドメイン(以下の部分的ヒトEphA3配列中のアミノ酸29〜202)内に存在する：
2014527054.tif 000003
【００８８】
mAb IIIA4抗体は、受容体に対するエフリンA5の結合に隣接して結合するが、これを実質的に妨げない。mAb IIIA4のエピトープは、部位特異的変異誘発を用いて、Smith et al., J. Biol. Chem. 279: 9522, 2004によりさらに特徴づけられている。この解析において、132位のグリシンのグルタミン酸への変異(G132E)により、mAb IIIA4への結合が消失する。バリン133のグルタミン酸への変異(V133E)により、mAb IIIA4抗体へのEphA3の結合がおよそ1/100に減少する。その後、本発明者らにより、アルギニン136もまたエピトープの一部であることが観察された。ラットの高度に保存されたEphA3タンパク質の配列においてこの残基をロイシンに変更する(R136L)。ラットEphA3は、mAb IIIA4とも、mAb IIIA4のヒト改変誘導体とも結合しない。したがって、G132、V133、およびR136(上記配列において太字および下線で表示)は、mab IIIA4エピトープ内の重要なアミノ酸である。
【００８９】
結合親和性
いくつかの態様において、本発明との使用に適した抗体は、ヒトEphA3に対して高親和性結合を有する。本発明の目的のため、抗体の解離定数(KD)が＜約10 nM、例えば約5 nM、または約2 nM、または約1 nM、またはそれ未満である場合に、抗体と抗原との間に高親和性結合が存在する。当業者に周知のように、表面プラズモン共鳴アッセイ法、飽和アッセイ法、またはELISAもしくはRIAなどの免疫測定法などの種々の方法を用いて、抗体のその標的抗原に対する結合親和性を決定することができる。結合親和性を決定するための例示的な方法は、Krinner et al., (2007) Mol. Immunol. Feb;44(5):916-25. (Epub 2006 May 11)に記載されているように、CM5センサーチップを使用するBIAcore(商標) 2000装置(Biacore AB、ドイツ、フライブルク)での表面プラズモン共鳴解析によるものである。
【００９０】
治療用抗EphA3抗体は、EphA3の任意の細胞外領域に結合し得る。いくつかの態様において、抗EphA3抗体はEphA3を活性化する。多くの場合、該抗体はEphA3を多量体化、例えば二量体化する。いくつかの態様において、該抗体はEphA3をクラスター化する。いくつかの態様では、IgG1、IgG3、IgM、IgA、またはIgEなどの活性アイソタイプを有し、ADCCを介して血液増殖性疾患細胞に対して細胞傷害性である抗EphA3抗体を使用することもできる。本発明において使用するための抗体はまた、架橋またはさもなくば多量体化して多価抗体を形成する単量体の形態を含む多価であってもよい。
【００９１】
いくつかの態様では、本発明において使用する抗体は、EphA3に対する結合においてEphA3リガンドと競合しないが、他の態様では、本発明において使用するためのEphA3抗体は、エフリン、例えばエフリン-A5などのEphA3リガンドのEphA3に対する結合と競合し得る。EphA3に対する結合においてリガンドと競合する抗体は、上記の技法を用いて同定することができ、この場合、競合解析には、もう一方の抗体の代わりにエフリン-A5などのエフリンリガンドを使用する。
【００９２】
例示的な態様において、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のVL領域およびVH領域を含む。他の態様において、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のCDR1、2、および3を含む。いくつかの態様おいて、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のCDR3を含む。表1は、mAb IIIA4と同じエピトープに結合する抗体のCDR配列(Kabatの番号付けに従って規定される)を提供する。EphA3抗原に対する親和性はELISAによって決定した。したがって本発明の抗体はまた、表1に示す重鎖および/または軽鎖のCDRを有し得る。
【００９３】
（表１）
2014527054.tif 000004
【００９４】
本発明における使用のための治療用抗体の例は、例えば、参照により組み入れられるWO2011/053465に記載されている。
【００９５】
本発明における使用のための本明細書に記載される抗体を、関心対象の特徴についての公知のアッセイを用いることによって同定することができる。ゆえに、EphA3を活性化する能力について（例えば、リン酸化アッセイ、および／または円形化等の細胞形態の変化についてのスクリーニングを用いて）、ADCCを誘導する能力について、ならびに結合特異性および親和性についてスクリーニングすることによって、抗体を同定することができる。そのようなアッセイは、当技術分野において周知である。
【００９６】
診断用抗体
診断のために、治療用抗体を用いてもよい。したがって、上記の抗体のいずれかを、異常血管系上のEphA3発現を同定するために利用してよい。
【００９７】
EphA3発現を検出するために、細胞外ドメイン以外の領域に結合する抗EphA3抗体を用いてもよい。例えば、5E11F2（Invitrogenから市販されている）は、C末端ペプチドのアミノ酸955〜983に結合し、診断に使用され得る。EphA3発現を検出する目的で、血管系上に存在しているEphA3に結合し得る形式で抗体を利用する。
【００９８】
典型的な態様において、骨髄血管系上のEphA3発現の免疫組織化学分析に抗体を用いる。免疫組織化学における使用に適した抗体は、ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋、ならびにキシレンおよびエタノール抽出に供されたEphA3に結合する。IHCにおける使用のための抗体は、EphA3に選択的であり、かつ細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを含むEphA3の任意の領域に結合し得る。ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体は、本発明のこの局面における使用に適している。いくつかの態様において、抗体は、マウスモノクローナル抗EphA3抗体等のモノクローナル抗体である。好ましくは、免疫組織化学のために選択される抗体は、治療用抗体によって認識されるエピトープとは異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、EphA3発現の検出のための抗体は、モノクローナル抗体IIIA4によって認識されるエピトープとは異なるエピトープに結合し、EphA3への結合についてmAb IIIA4と競合しない。
【００９９】
いくつかの態様において、Epha3発現を検出するための抗体は、アクセッション番号PTA-12227を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2；またはアクセッション番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である。
【０１００】
本発明は、異常血管系上のEphA3発現を検出するために使用され得るモノクローナル抗体、例えばSL-2またはSL-7、および該抗体を含有するキットも提供する。本発明のキットは、SL-2もしくはSL-7抗体、またはその両方を含み、発現を分析するための他の試薬、例えば二次抗体、緩衝液、および他の試薬を含んでよい。
【０１０１】
治療のための非抗体EphA3結合剤
EphA3に結合し、かつEphA3受容体を二量体化または活性化する他のタンパク質を、血液増殖性疾患細胞がEphA3を発現しないかまたは最小限に発現する、血液増殖性疾患を有する患者に投与してもよい。そのようなタンパク質には、可溶性エフリンA5-Fcタンパク質が含まれる。
【０１０２】
その他のEphA3結合剤には、EphA3と結合する骨格タンパク質が含まれる。したがって、EphA3結合剤は、抗体と類似の様式で抗原を標的とし、これに結合する「抗体模倣体」であってよい。抗体模倣体を使用する場合、模倣体の形態は、それがEphA3を多量体化するものである。例えば、抗体模倣体は二量体化、若しくは多価形式で使用され得る。
【０１０３】
ある種の抗体模倣体は、抗体の可変領域のための代替タンパク質フレームワークとして、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する。例えば、Ku et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6552-6556, 1995)は、シトクロムb562のループのうちの2つを無作為化し、ウシ血清アルブミンに対する結合について選択した、シトクロムb562に基づく抗体の代替物を開示している。個々の変異体は、抗BSA抗体と同様にBSAと選択的に結合することが見出された。
【０１０４】
米国特許第6,818,418号および第7,115,396号は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質骨格および少なくとも1つの可変ループを特色とする抗体模倣体を開示している。Adnectinとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的化リガンドに対する高い親和性および特異性を含め、天然抗体または改変抗体と同じ特徴の多くを示す。これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の可変領域の構造と類似している。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と性質および親和性が類似している抗原結合特性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体および抗体断片を上回るある種の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は、天然折りたたみの安定性をジスルフィド結合に依存せず、よって通常では抗体を分解する条件下で安定している。加えて、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造はIgG重鎖の構造と類似しているため、インビボにおける抗体の親和性成熟の過程に類似したループの無作為化およびシャフリングの過程をインビトロで利用することができる。
【０１０５】
Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903, 1999)は、リポカリン骨格に基づく抗体模倣体(Anticalin(登録商標))を開示している。リポカリンは、βバレルとタンパク質の末端における4つの超可変ループから構成される。ループがランダム突然変異誘発に供され、例えばフルオレセインとの結合について選択された。変種3つがフルオレセインとの特異的結合を示し、変種1つが抗フルオレセイン抗体と類似の結合を示した。さらなる解析から、無作為化の位置はすべて異なることが明らかになり、Anticalin(登録商標)が抗体の代替物として使用するのに適していることが示された。したがって、Anticalin(登録商標)は典型的に160〜180残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生成コストの削減、貯蔵安定性の増加、および免疫学的反応の低下を含め、抗体を上回るいくつかの利点を提供する。
【０１０６】
米国特許第5,770,380号は、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を、結合部位として用いる複数の可変ペプチドループと付着させて使用する合成抗体模倣体を開示している。ペプチドループはすべて、互いに、カリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出している。この幾何学的高次構造のために、すべてのループが結合に利用でき、リガンドに対する結合親和性が増加する。しかし、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は全くペプチドだけからなるわけではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃に強い。この骨格は純粋にペプチド、DNA、またはRNAからなるわけではなく、この抗体模倣体が極端な環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味している。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応を生じる可能性が低い。
【０１０７】
Murali et al. (Cell Mol Biol 49:209-216, 2003)は、抗体を縮小してより小さなペプチド模倣体にする方法論を記載しており、この模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」(ABiP)と命名され、これもまた抗体の代替物として有用であり得る。
【０１０８】
WO 00/60070は、CTL4A様βサンドイッチ構造を有するポリペプチド鎖を開示している。このペプチド骨格は、βストランドを6つ〜9つ含み、ポリペプチドβループのうちの2つまたはそれ以上が、抗原結合断片などの他の分子に対する結合ドメインを構成する。骨格の基本設計はヒト起源のものであり、したがって免疫応答を誘導するリスクが低くなる。βサンドイッチ骨格は、この分子が第2の非免疫グロブリンジスルフィド架橋を含むために、標準的な抗体と比較した場合に、インビボにおいて、向上した安定性および薬物動態学的特性を有し得る。抗原結合ドメインを単一ペプチド鎖の逆末端に位置づけることができるため、βサンドイッチにより二重特異性単量体分子の設計も容易になる。
【０１０９】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、RNA分子および非天然オリゴマーを含む化合物においても抗体特性が模倣されている(例えば、プロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、およびβターン模倣体)。したがって、非抗体EphA3結合剤にはこのような化合物も含まれ得る。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明において使用するEphA3結合剤は、EphA3に対する結合においてmAb IIIA4と競合する。このような結合剤は、本明細書に記載する例示的な競合アッセイ法などの公知のアッセイ法を用いて同定することができる。
【０１１１】
抗EphA3による処置の候補である患者の同定
本発明は、血液増殖性疾患を有する患者が抗EphA3抗体による処置の候補であるかどうかを判定する方法も提供する。該方法は、患者における異常骨髄血管系上のEphA3の発現を検出する段階を含む。
【０１１２】
当技術分野において周知の方法を用いることによって、EphA3発現を検出することができる。しばしば、異常骨髄血管系上のEphA3発現を検出するために、免疫組織化学を利用した免疫学的アッセイが用いられる。あるいは、異常骨髄血管系におけるEphA3をコードするmRNAを検出することによって、EphA3発現を検出することができる。例えば、RT-PCRを含む核酸増幅法が利用され得る。
【０１１３】
処置の候補である患者を評価する際に、EphA3発現を評価するために、血液増殖性疾患細胞を含む骨髄試料を患者から採取する。異常血管系がEphA3を発現する場合は、患者は、抗EphA3抗体による処置の候補であると見なされる。したがって、本明細書において使用する「EphA3＋患者」とは、異常骨髄血管系上でEphA3発現を示す血液増殖性疾患患者である。
【０１１４】
血液増殖性疾患の処置
1つの局面において、本発明の方法は、EphA3を発現する異常骨髄血管系を有するが、EphA3-の血液増殖性疾患細胞の発現を有する、血液増殖性疾患を有する患者に、抗EphA3剤、典型的には抗EphA3抗体を投与する段階を含む。いくつかの態様において、抗体等の抗EphA3剤を患者に投与する。いくつかの態様において、患者はAMLを有する。いくつかの態様において、患者は、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、またはIMを有する。いくつかの態様において、患者は、CLL、MM、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、NHL、MCL、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する。
【０１１５】
フローサイトメトリー等の免疫学的方法およびPCR法を含む種々の方法を利用して、血液増殖性疾患細胞がEphA3を発現するかどうかを同定することができる。フローサイトメトリーを用いた免疫表現型検査等の一般に用いられる技術によって、またはインビトロの細胞培養技術もしくはインビボの移植実験によって、白血病および他の血液増殖性疾患の細胞を同定することができる。
【０１１６】
幹細胞は、自己再生能を有する細胞として機能的にさらに定義され得る多能性前駆細胞である(例えば、Reya et al., Nature 414:105-111, 2001、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい)。このことは、例えば、照射した骨髄間質フィーダー細胞上で細胞を培養する長期培養開始細胞(LTC-IC)アッセイにおいて実証され得る。このアッセイでは、長期間(例えば、少なくとも5週間)にわたりコロニーを連続して移行させる能力によって、幹細胞の存在が明らかにされる(例えば、Guan and Hogge (2000) Leukemia 14: 2135)。連続的移行アッセイは、幹細胞由来コロニーを、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-3(IL-3)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびエリスロポエチン(EPO)の組み合わせなどの増殖因子の存在下で、メチルセルロース中で培養することによって実施することもできる。
【０１１７】
幹細胞を同定するためのインビボ移植は、免疫系が欠損しているマウス(SCID/NODマウス)において、連続移植により継代することによって実施する(van Rhenen et al., Clin. Cancer. Res. 11: 6520-6527, 2005)。
【０１１８】
フローサイトメトリー解析において、白血病または慢性骨髄増殖性疾患(CMPD)の幹細胞は典型的に、CD34陽性、CD38陰性細胞区画中に存在する(しかしながら、AML症例のおよそ10%はCD34陰性である)。白血病またはCMPD幹細胞は、CD123陽性細胞としてCD38陰性細胞区画中に同定され得るが(Jordan et al., Leukemia 14: 1777-1784, 2000)、CD117、CD45RA、またはCD133の存在を含む他のマーカーを用いて、幹細胞を同定してもよい。
【０１１９】
芽細胞は、顆粒球生成に関与し得る単能性細胞である。芽細胞は、通常のヒトの単核および多形核血液細胞よりも大きな細胞であり、血液スメアの顕微鏡観察により、または単球および顆粒球と比較した高い前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)に基づいてフローサイトメトリー解析により、同定することができる。
【０１２０】
様々な薬物送達系において使用するために、患者に投与するための抗EphA3組成物を製剤化することができる。適切な製剤化のために、生理的に許容される1つまたは複数の賦形剤または担体もまた、組成物中に含めることができる。本発明において使用するのに適した製剤は、Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lipponcott Williams & Wilkins, 2005に見出される。薬物送達の方法の簡潔な総説については、Langer, Science s249: 1527-1533 (1990)を参照されたい。
【０１２１】
本発明の方法において使用するための抗EphA3抗体は、注射用滅菌等張水溶液など、患者への注射に適した溶液として提供する。許容される担体に、抗EphA3抗体を適切な濃度で溶解または懸濁する。いくつかの態様において、担体は水性であり、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等である。組成物は、pH調製剤および緩衝剤、浸透圧調整剤等のような、おおよその生理的状態に必要とされる補助的な薬学的物質を含み得る。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物は、疾患または疾患およびその合併症の症状を少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、異常骨髄血管系はEphA3を発現するが血液増殖性疾患細胞はEphA3を発現しない、血液増殖性疾患を有する患者に投与する。これを達成するのに適した量を「治療有効用量」と定義する。治療有効用量は、治療に対する患者の反応をモニターすることにより決定する。治療有効用量を示す典型的な基準は、疾患に応じて当技術分野で公知である。例えば、治療効果は、血液や骨髄における特定の骨髄増殖疾患の特徴である骨髄細胞異常が減少することによって示され得る。
【０１２３】
抗EphA3抗体の用量は、患者に効果的な治療を提供するように選択され、約0.1 mg/kg体重〜約10 mg/kg体重の範囲、または約1 mg〜約1 g/患者の範囲である。用量は多くの場合、約0.5 mg/kgもしくは約1 mg/kg〜約10 mg/kg、またはおよそ約50 mg〜約1000 mg/患者の範囲である。いくつかの態様において、抗体は、約0.1 mg/kg体重未満の量、例えば約20 mg/患者もしくはそれ未満の量で投与する。用量は、抗体の薬物動態(例えば、循環中の抗体の半減期)および薬力学的反応(例えば、抗体の治療効果の持続)に応じて、1日に1回〜3ヵ月ごとに1回の範囲であり得る適切な頻度で繰り返すことができる。インビボ半減期が約7日〜約25日である抗体または修飾抗体断片のいくつかの態様では、抗体の投薬を1週間に1回〜3ヵ月ごとに1回繰り返す。他の態様では、抗体を1ヵ月に約1回投与する。
【０１２４】
有効な投与量は、年齢、体重、性別、投与経路等の他の要因を含め、疾患の重症度および患者の健康の全般的状態に依存する。患者により必要とされかつ許容される投与量および頻度に応じて、抗EphA3抗体の単回投与または複数回投与を施与することができる。いずれにしても、本方法は、血液増殖性疾患を効果的に処置するために十分量の抗EphA3抗体を提供する。
【０１２５】
例えばEphA3を多量体化または活性化する抗EphA3抗体または抗EphA3アゴニスト結合剤は、血液増殖性疾患を処置するための1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。抗EphA3結合剤と併用して投与することができる治療薬には、MYLOTARG(登録商標)(注射用ゲムツズマブオゾガマイシン)などの化合物；メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))、ニロチニブ(TASIGNA(登録商標))、およびダサチニブ(SPRYCEL(登録商標))などのチロシンキナーゼ阻害剤；インターフェロン-α、ならびに様々な化学療法薬が含まれる。
【０１２６】
いくつかの態様では、患者由来の白血病幹細胞がEphA3を発現する慢性骨髄性白血病を有する患者を処置するために、抗EphA3活性化抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。このような治療薬には、様々な化学療法薬およびメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))が含まれる。
【０１２７】
いくつかの態様では、急性骨髄性白血病を処置するために、例えば活性化抗体などの抗EphA3抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。このような治療薬には、単独の、およびダウノルビシンと併用した、シトシンアラビノシドが含まれる。
【０１２８】
いくつかの態様では、BCR-ABL陰性CMPDを有する患者を処置するために、抗EphA3活性化抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。このような阻害剤には、当技術分野で公知であり、かつ臨床評価を受けているJAK2阻害剤が含まれる。
【０１２９】
患者は、併用療法としてこれらの付加的な治療薬の1つまたは複数を投与され得る。あるいは、患者は、付加的な治療薬で連続して処置されてもよい。
【０１３０】
いくつかの態様では、抗EphA3活性化抗体を、骨髄移植を受けた患者に投与し、ここで該患者は、EphA3発現が陰性である血液増殖性疾患細胞を有する。
【０１３１】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体または他の活性化EphA3結合剤は、任意の適切な経路、典型的には静脈内経路を介して、注射または注入により投与する。いくつかの態様では、抗EphA3抗体を注射用生理食塩水溶液に希釈してから、患者に投与する。抗体は、例えば、15分〜2時間という時間をかけて静脈内注入により投与する。
【０１３２】
以下の実施例は説明のためのみに提供するものであって、限定のために提供するものではない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正することができる、重要ではない種々のパラメータを容易に理解するであろう。
【実施例】
【０１３３】
実施例1−免疫組織化学における使用のための抗EphA3モノクローナル抗体の同定
ヒトEphA3-Fc融合タンパク質によるマウスの免疫化によって、EphA3の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体のパネルを作製した。免疫化マウスに由来する脾臓細胞をSP2/0ハイブリドーマと融合させた。それぞれがマウスIgG1アイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する7種のハイブリドーマ（SL-1〜SL-7と名付けた）からの上清を、EphA3結合についてELISAによってアッセイした（図1）。ELISAプレート（Costar、カタログ番号3590）を37℃で1時間、50ng/ウェルのEphA3-Fcで被覆した。ウェルを0.1% Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBST）で1回洗浄し、PBST中の5%スキムミルク（Marvel）で37℃にて1時間ブロッキングした。PBSTによる1回の洗浄の後、PBS中の2倍希釈系列の抗体上清（50μl/ウェル）をプレートにわたって添加した（10個の希釈物）。このプレートを室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μlの1:2000希釈のヤギ抗マウスHRP（DAKO、カタログ番号P0447）を各ウェルに添加した。プレートを室温で45分間インキュベートした。プレートをPBST中で3回、PBS中で1回洗浄し、100μl/ウェルのTMB試薬（Sigma、T0440-1L）で発色させた。100μlの2M H2SO4で反応を停止させ、450nmで吸光度を測定した（Spectramax Plus、Molecular Devices）。ForteBio Octetバイオセンサーを用いたバイオレイヤー干渉法によって、上清中の抗体濃度を定量化した。
【０１３４】
各々の抗体は、組換えEphA3に結合した。SL-2抗体は、最も高い親和性を有した（EC50＝0.24nM）。
【０１３５】
最も高い親和性を有する4つの抗体SL-2、SL-5、SL-6、およびSL-7を、他のEphとの交差反応性について試験した。ELISAプレートを6種の異なるEph（EphA1、EphA2、EphA3、EphA5、EphB4、およびEphB6）で被覆し、SL-2、SL-5、SL-6、およびSL-7でプローブした。4つの抗体はすべて、EphA3に特異的に結合し、他のEphタンパク質またはFc融合タンパク質への検出可能な結合を示さなかった。
【０１３６】
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ハイブリドーマの上清から抗体を精製した。0.7〜4.2リットルの範囲の細胞上清を、P-50ポンプ（GE Healthcare）を用いて、4℃にて3.7mL/分で、25mL rProtein A FFカラム（GE Healthcare）上にロードした。細胞上清をロードした後、このカラムをAKTA Prime Purification System（GE Healthcare）に移し、10カラム容量の緩衝液A（PBS pH7.0）を用いて、4mL/分の流速で洗浄した。緩衝液B（0.3M Arg、0.15M NaCl pH2.8）を用いて、カラムから9mL画分中に抗体を溶出した。各画分を1mLの2M トリス pH8.0で中和した。抗体を含有する画分をSDS-PAGE（4-20% トリス-グリシンゲル；Invitrogen；カタログ番号EC60252）によって同定した。選択された画分をプールし、Slide-A-Lyze透析カセット（ThermoFisher；カタログ番号17-5080-01）を用いて、4℃で一晩、1×PBS pH7.0へと緩衝液交換をおこなった。緩衝液交換後、透析カセットから試料を取り出し、0.22umフィルターを通して濾過した。
【０１３７】
細胞表面上に発現した天然EphA3への精製モノクローナル抗体の結合を、EphA3陽性細胞株LK63を用いたフローサイトメトリーによって確認した。フローサイトメトリー分析のために、LK63細胞を5分間200gで遠心分離によって回収し、dPBS（Invitrogen、カタログ番号14190）中で1回洗浄し、dPBS中の2%ウシ血清アルブミン（BSA）＋10μg/mlラットIgGで氷上にて25分間ブロッキングした。前記細胞を25nMの精製抗EphA3抗体と氷上で30分間インキュベートし、冷dPBS＋0.5% BSA中で1回洗浄し、1:100希釈のFITCコンジュゲート抗マウス二次抗体（Jackson Immunoresearch 115-096-062）中で氷上にて20分間インキュベートした。前記細胞を、FACS分析のために0.5mlの冷dPBS中に再懸濁する前に、冷dPBS＋0.5% BSA中で1回洗浄した。ヨウ化プロピジウム（1μl/試料、Sigmaカタログ番号P4864）を用いて、FITCチャネルの読み取りから非生存細胞を排除し、FACSCaliber機器（Beckton Dickinson）を用いてフローサイトメトリーを実施した。
【０１３８】
図2に示されるように、精製されたSL-2、SL-5、およびSL-7抗体は、マウスIIIA4抗EphA3陽性対照抗体と同等のレベルでLK63細胞に結合した。
【０１３９】
実施例2−AML腫瘍血管系上のEphA3の発現
AML患者の骨髄内の細胞に対する抗EphA3抗体の結合についての免疫組織化学による分析のために、標準的な骨髄生検ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（FFPE）切片を用いた。切片をキシレンの2回の交換で処理して（それぞれ5分間）パラフィンを除去し、エタノール系により水和し、蒸留水中ですすいだ。加湿チャンバー内で37℃にて10分間、プロテイナーゼK（IHC world、カタログ番号IW-1101）を用いて抗原回復を行い、続いて0.1% Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水pH7.4（TBST）中で4分間すすいだ。ユニバーサルブロッキング溶液（Vector Laboratories Inc.、カタログ番号SP-2001）を用いてスライドを10分間ブロッキングし、その後、15分間のアビジン溶液および15分間のビオチン溶液が続いた。新鮮な抗体ブロッキング溶液（0.07gスキムミルク、＋210ulヤギ血清、＋14ml抗体希釈液）を室温で20分間スライドに添加し、スライドをTBSTですすいだ。一次抗体（SL-2、SL-5、またはSL-7）またはアイソタイプ対照抗体を抗体希釈液（IHC World、カタログ番号IW-1000）中で25μg/mlへと希釈し、室温で1時間スライドに添加した（スライド1枚につき0.5ml）。次いで、スライドをTBST中で2回すすいだ。ビオチン-SPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG：（Jackson ImmunoResearch Laboratories、カタログ番号115-065-166）二次抗体を抗体希釈液中に1:500で希釈し、スライドに添加した。スライドを室温で30分間インキュベートし、TBST中で2回すすいだ。2〜3滴のホスファターゼ標識ストレプトアビジン（KPL、カタログ番号：71-00-45）も添加し、スライドを室温で30分間インキュベートした。2回のすすぎの後、メーカーの指示書に従ってNew Fuchsin Substrate System（Dako、カタログ番号K0698）を用いて、スライドを発色させた。
【０１４０】
SL-2抗体は、ヒトAML患者由来の骨髄内のEphA3陽性細胞を免疫組織化学で検出した。AML骨髄において（表2）、EphA3は腫瘍の新血管系において内皮上で検出された。細動脈等のより大きな血管においては、EphA3は内皮層に隣接した血管組織で発現していた。対照的に、正常な骨髄においてはEphA3は検出されなかった。
【０１４１】
（表２）SL-2モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、正常な骨髄またはAML患者由来の骨髄からの生検組織切片におけるEphA3の検出。患者の疾患サブタイプは、フランス−アメリカ−イギリス（FAB）分類スキームを用いて評価されている。n/aは、同定されていないことを意味する。
2014527054.tif 000005
【０１４２】
本明細書において引用した出版物、特許出願、アクセッション番号、およびその他の参考文献はすべて、個々の出版物または特許出願が詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2014527054.tif 000007
【図２】
2014527054.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月7日(2014.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
いくつかの態様において、抗体はmAb IIIA4と同じエピトープに結合する。mAb IIIA4およびヒト改変誘導体のエピトープは、EphA3のN末端球状リガンド結合ドメイン(以下の部分的ヒトEphA3配列(SEQ ID NO:1)中のアミノ酸29〜202)内に存在する：
2014527054.tif 000009
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
（表１）
2014527054.tif 000010
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、例えば異常血管系上のEphA3発現の検出のためのモノクローナル抗体を提供する。一態様において、モノクローナル抗体は、ATCC寄託番号PTA-12227の下で寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2である。一態様において、モノクローナル抗体は、ATCC寄託番号PTA-12228の下で寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である。本発明は、モノクローナル抗体SL-2および／またはSL-7を含むキットをさらに提供する。そのようなキットは、例えば免疫組織化学分析のための試薬等の付加的な試薬を含有してもよい。
[本発明1001]
血液増殖性疾患細胞が実質的にEphA3−であり、かつ骨髄内の異常血管系がEphA3＋である、血液増殖性疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法が治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体が（i）EphA3を活性化し、かつ／または（ii）ADCCを誘導する、方法。
[本発明1002]
血液増殖性疾患細胞が5%以下のレベルでEphA3を発現し、かつ血液増殖性疾患が急性骨髄性白血病（AML）である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
血液増殖性疾患細胞が5%以下のレベルでEphA3を発現し、かつ血液増殖性疾患が慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、骨髄異形成症候群（MDS）、真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、または特発性骨髄線維症（IM）である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
血液増殖性疾患が慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
抗EphA3抗体がヒト重鎖のγ-1またはγ-3定常領域を含む、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
抗EphA3抗体が、低フコシル化または無フコシル化抗体調製物の状態で提供される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
抗EphA3抗体が、mAb IIIA4が結合するEphA3上のエピトープに結合する、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
抗EphA3抗体が組換え抗体またはキメラ抗体である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
抗EphA3抗体がヒト抗体である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1010]
抗EphA3抗体がモノクローナル抗体である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1011]
抗EphA3抗体がポリクローナル抗体である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1012]
抗EphA3抗体が、Fab、Fab'、またはFvを含む多価抗体である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1013]
抗EphA3抗体がADCCを誘導する、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1014]
抗EphA3抗体が、エフリンA5リガンドのEphA3への結合を阻止する、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1015]
少なくとも1種の付加的な治療薬を投与する段階をさらに含む方法であって、該少なくとも1種の付加的な治療薬が化学療法薬である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
血液増殖性疾患を有する患者が抗EphA3抗体による処置の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する骨髄試料を提供する段階；および
該骨髄内に存在している異常血管系上のEphA3の発現を検出する段階
を含む、方法。
[本発明1017]
患者が、AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
EphA3の発現が異常血管系の内皮層血管において検出される、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
EphA3の発現が異常血管系の血管の中膜または外膜において検出される、本発明1016または1017の方法。
[本発明1020]
EphA3の発現を検出する段階が、抗EphA3抗体を前記試料と接触させる段階を含む、本発明1016または1017の方法。
[本発明1021]
抗EphA3抗体が、特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）に寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2；または特許寄託指定番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
EphA3＋異常骨髄血管系を伴う血液増殖性疾患を有する患者の処置の有効性をモニターする方法であって、
血液増殖性疾患に対する治療処置後に、該患者から骨髄試料を採取する段階；および
異常血管系上のEphA3の発現を検出する段階
を含む、方法。
[本発明1023]
患者が、AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、または肥満細胞症を有する、本発明1022の方法。
[本発明1024]
発現が異常血管系の内皮層血管において検出される、本発明1022または1023の方法。
[本発明1025]
発現が異常血管系の血管の中膜または外膜において検出される、本発明1022または1023の方法。
[本発明1026]
EphA3の発現を検出する段階が、抗EphA3抗体を前記試料と接触させる段階を含む、本発明1022または1023の方法。
[本発明1027]
抗EphA3抗体が、特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）に寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2；または特許寄託指定番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
EphA3の発現を検出するための少なくとも1種の試薬を含有するキットであって、該少なくとも1種の試薬がモノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体が、特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）に寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-2であるか；特許寄託指定番号PTA-12228を有する、ATCCに寄託されたハイブリドーマによって産生されるSL-7であるか；またはEphA3のC末端領域にアミノ酸955〜983において結合する、キット。
[本発明1029]
特許寄託指定番号PTA-12227を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマ。
[本発明1030]
本発明1029のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
[本発明1031]
特許寄託指定番号PTA-12228を有する、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマ。
[本発明1032]
本発明1031のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014527054000001.app
【国際調査報告】
2014527054.tif 000011
2014527054.tif 000012
2014527054.tif 000013
2014527054.tif 000014