(57)【要約】  本発明は、クローン病の分野にあり、詳細には、抗ＩＬ−１３抗体を用いるクローン病における瘻孔の治療に関する。抗体は、ＩｇＧであってよく、詳細には抗ＩＬ−１３抗体０１９５ｉ／Ｇ１２であってよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病を罹患している患者での瘻孔の治療または予防における使用のための、ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する抗ＩＬ−１３抗体。
【請求項２】
クローン病を罹患している患者での瘻孔の治療または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する抗ＩＬ−１３抗体の使用。
【請求項３】
ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する抗ＩＬ−１３抗体をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、クローン病を罹患している患者での瘻孔の形成を治療または予防する方法。
【請求項４】
前記抗体が、（ａ）配列番号１、２、６または７に示すＶＨ  ＣＤＲ１（ｂ）配列番号３または８に示すＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４、５、９または１０に示すＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１１、１６、１７または１８に示すＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１２または１９に示すＶＬ  ＣＤＲ２、（ｆ）配列番号１３、１４、１５、２０、２１または２２に示すＶＬ  ＣＤＲ３からなるリストから選択されるＣＤＲの１つまたは複数を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号３１に記載の重鎖可変領域および配列番号３３に記載の軽鎖可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号４１に記載の重鎖および配列番号３９に記載の軽鎖を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項８】
前記抗体が、１×１０−９Ｍ以下のＫＤでＩＬ−１３に結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項９】
前記抗体が、薬学的に許容される担体と共に製剤化される、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項１０】
前記抗体が、抗炎症治療剤と共に逐次的にまたは同時に共投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体、使用または方法。
【請求項１１】
第一成分および第二成分を含むキットであって、第一成分が抗ＩＬ−１３抗体または抗ＩＬ−１３抗体を含む医薬組成物であり、第二成分が説明書である、キット。
【請求項１２】
シリンジもしくは他の送達デバイス、アジュバントまたは薬学的に許容される製剤化溶液の１つまたは複数を含む第三成分をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クローン病の分野にある。詳細には、抗ＩＬ−１３抗体を用いるクローン病における瘻孔の治療に関する。抗体は、ＩｇＧであってよく、詳細には抗ＩＬ−１３抗体０１９５１／Ｇ１２であってよい。
【背景技術】
【０００２】
クローン病（ＣＤ）は、胃腸（ＧＩ）管の慢性、再発性／寛解性炎症性疾患である。ＣＤによって最も頻繁に冒されるＧＩ管の領域は、小腸および肛門直腸を含む結腸である。ＣＤの炎症および潰瘍は、小腸および大腸の両方の腸壁の全ての層全体に拡がる場合がある。ＣＤの一般的な症状は、下痢、腹部痛、直腸出血および体重減少ならびに腸管膿瘍、瘻孔および腸管閉塞などの合併症を含む。ＣＤは、線維狭窄性（fibrostenotic）（狭窄）もしくは非穿孔性、非狭窄性（炎症性）または主に穿孔性（瘻孔形成（fistulizing））の疾患を含む多数のさまざまな状態で臨床的に顕在化する場合がある。瘻孔形成ＣＤを有する患者は、より侵襲的な疾患経過となる傾向がある。瘻孔は、外部的（腸管皮膚または肛門周囲）または、腸−腸内（entero-enteral）もしくは腸嚢胞性などの内部的でありうる。ＣＤ瘻孔の累積罹患率は、診断後１０年および２０年でそれぞれ３３％および５０％である。
【０００３】
死亡率は、瘻孔形成疾患を有する患者において非常に増加し、患者の生活の質に相当な悪影響をもたらす。肛門周囲瘻孔は、便失禁、膿瘍形成および肛門狭窄をもたらす場合があり、これらは疼痛、膿瘍および排膿をさらに伴う場合がある。瘻孔の治療は、位置、重症度および既往手術歴を含む多数の要因に依存する。
【０００４】
全般に、ＣＤ瘻孔は治療が困難で、ほとんど自然治癒せず、しばしば手術を必要とする。生物製剤の導入以前は、ほとんどの瘻孔は外科的介入を必要とし、瘻孔の再発率は３０〜４０％と推定された（１〜３）。現在の標準治療は、抗生物質（メトロニダゾール／シプロフロキサシン−第一選択）、免疫抑制剤（６−ＭＰ／アザチオプリン−第二選択）、および生物製剤（抗ＴＮＦα−第三選択、または「トップダウン」第一選択）である。カルシニューリン阻害物質は試験中である。注目すべきことに、瘻孔形成クローン病のための標準的治療法のいくつか（例えばアザチオプリンおよび６−ＭＰ）は催奇形性である。
【０００５】
生物製剤の出現は、治療的処置の選択肢を広げ、瘻孔についての開業医の治療目標を瘻孔からの漏出低減から瘻孔管の真の閉鎖に変えた。しかしおよそ５０％の患者は抗ＴＮＦαに応答せず、したがって、積極的な外科的手技に伴う失禁の危険性を考慮すれば、クローン病における瘻孔治療のための新規の改善された療法の医学的必要性はいまだ満たされていないままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＬ−１３依存性シグナル伝達が、クローン病に罹患している患者での瘻孔の形成の一因となる可能性があることが発見された。したがって本発明は、クローン病を罹患している患者での瘻孔の治療または予防における使用のための、ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する抗ＩＬ−１３抗体を提供する。クローン病を罹患している患者での瘻孔の治療または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する抗ＩＬ−１３抗体の使用も、ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する抗ＩＬ−１３抗体をそれを必要とする対象に投与するステップを含むクローン病を罹患している患者での瘻孔の形成を治療または予防する方法と同様に提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
好ましくは本発明の抗体は、（ａ）配列番号１、２、６または７に示すＶＨ  ＣＤＲ１（ｂ）配列番号３または８に示すＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４、５、９または１０に示すＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１１、１６、１７または１８に示すＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１２または１９に示すＶＬ  ＣＤＲ２、（ｆ）配列番号１３、１４、１５、２０、２１または２２に示すＶＬ  ＣＤＲ３からなるリストから選択されるＣＤＲの１つまたは複数を含む。
【０００８】
好ましくは本発明の抗体は、配列番号７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０００９】
提供される抗体は、好ましくは配列番号３１に記載の重鎖可変領域および配列番号３３に記載の軽鎖可変領域を含み、より好ましくは前記抗体は配列番号４１に記載の重鎖および配列番号３９に記載の軽鎖を含む。
【００１０】
提供される抗体は好ましくは、１×１０−９Ｍ以下のＫＤでＩＬ−１３に結合する。提供される抗体は、好ましくは薬学的に許容される担体と共に製剤化される。
【００１１】
抗体、使用および方法が提供される本発明の好ましい実施形態では、抗体は抗炎症治療剤と共に逐次的にまたは同時に共投与される。
【００１２】
本発明は、第一成分および第二成分を含むキットであって、第一成分が抗ＩＬ−１３抗体または抗ＩＬ−１３抗体を含む医薬組成物であり、第二成分が説明書である、キットをさらに提供する。
【００１３】
提供されるキットは、以下：シリンジもしくは他の送達デバイス、アジュバントまたは薬学的に許容される製剤化溶液の１つまたは複数を含む第三成分をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】結腸瘻孔粘膜固有層線芽細胞（ＣＬＰＦ）からのＴＧＦβ誘導ＩＬ−１３分泌を示す図である。非瘻孔形成疾患（ｎ＝２）または瘻孔形成疾患（ｎ＝３）を有する患者由来のＣＬＰＦをＴＧＦβ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ヒストグラムは、（Ａ）ＳＮＡＩＬ１の、または（Ｂ）ＳＬＵＧのｍＲＮＡレベルをそれぞれの未処理対照と比較して示す。（Ｃ）非瘻孔（ｎ＝３）および瘻孔（ｎ＝５）のＣＬＰＦをＴＧＦβで処理した。ヒストグラムは、細胞上清中のＩＬ−１３濃度をｐｇ／ｍｌで示す。（Ｄ）瘻孔ＣＬＰＦをＴＧＦβ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、ＰＴＰＮ２および添加対照であるβ−アクチンのタンパク質レベルを典型的ウエスタンブロット（ｎ＝３）によって示す。ヒストグラムは、上のウエスタンブロットで示す細胞の細胞上清中のＩＬ−１３濃度を示す。（Ｅ）Ｔ８４細胞は非特異的ｓｉＲＮＡ構築物またはＰＴＰＮ２特異的ｓｉＲＮＡ構築物のいずれかを形質移入され、ＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理された。ヒストグラムは、細胞上清中のＩＬ−１３濃度をそれぞれの対照（ｎ＝４）の百分率として示す。（Ｆ）ＴＧＦβ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＨＴ２９  ＩＥＣにおけるＰＴＰＮ２および添加対照であるβ−アクチンのタンパク質レベルを典型的ウエスタンブロット（ｎ＝３）によって実証する。星印は、未処理非瘻孔ＣＬＰＦ（Ｃ）またはそれぞれの対照（Ｅ）との有意差を記す（＊＝ｐ＜０．０５）。＃＝ｐ＜０．０５対対照ｓｉＲＮＡ細胞の２４時間ＴＮＦ処理。
【図２】ＣＤ患者由来の瘻孔標本におけるＩＬ−１３およびＩＬ−１３Ｒα１タンパク質を示す図である。外科的に切除された瘻孔は免疫組織化学的に染色された（Ａ）ＩＬ−１３は、瘻管を覆う細胞において（灰色矢印）および瘻孔に隣接する変形した陰窩のＩＥＣにおいて明らかに見られた。正常な外観を有する陰窩のＩＥＣは、ほとんどＩＬ−１３染色されなかった（白色矢印）。（Ｂ）ＩＬ−１３Ｒα１は、ＩＬ−１３と類似した染色パターンを明らかにした。それは瘻孔管を覆う細胞においておよび瘻孔に隣接する変形した陰窩のＩＥＣにおいて明らかに検出可能であった。各染色について、２名の別々の患者の２つの異なる瘻孔由来の画像が示され、それらは調査した全ての瘻孔（ｎ＝７）についての典型例である。右列の図は、左列の図（５倍拡大）の拡大図（４０倍拡大）を表す。
【図３】ＩＬ−１３は、ＨＴ２９  ＩＥＣにおいてＳＬＵＧおよびｂ６−インテグリンのｍＲＮＡレベルを誘導する。ＨＴ２９細胞はＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間または２４時間それぞれ処理された。ヒストグラムは、各対照と比較した（Ａ）ＳＬＵＧ（ｎ＝３）の、（Ｂ）β６−インテグリン（ｎ＝３）の、（Ｃ）ＳＮＡＩＬ１（ｎ＝３）の、（Ｄ）ＴＧＦβ（ｎ＝３）のおよび（Ｅ）ＰＴＰＮ２のｍＲＮＡレベルを表す。（Ｆ）ＨＴ２９細胞は非特異的ｓｉＲＮＡ構築物またはＳＬＵＧ特異的ｓｉＲＮＡ構築物のいずれかを形質移入され、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理された。ヒストグラムは、それぞれの対照と比較したβ６−インテグリンのｍＲＮＡレベルを示す。星印は、それぞれの対照と比較した有意差を記す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。＃＝ｐ＜０．０５対対照ｓｉＲＮＡ細胞の２４時間処理。
【図４】ＩＬ−１３は、ＨＴ２９細胞においてＳＴＡＴ６およびＥＲＫ１／２のリン酸化およびクローディン−２の発現を誘導する。細胞はＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間または２４時間でそれぞれ処理された。（Ａ）典型的ウエスタンブロットは、リン酸化（Ｔｙｒ６４１）および総ＳＴＡＴ６ならびにリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）および総ＥＲＫ１／２（ｎ＝３）のレベルを実証する。（Ｂ）典型的ウエスタンブロットは、β−カテニンおよび添加対照であるβ−アクチンのタンパク質レベルを示す。ヒストグラムは、３回の類似実験の濃度測定分析を表す。（Ｃ）クローディン−２および添加対照であるβ−アクチンのタンパク質レベルは、典型的なウエスタンブロットによって実証される。３回の類似実験の濃度測定分析は、下のヒストグラムによって表される。（Ｄ）典型的なウエスタンブロットは、Ｅ−カドヘリン、オクルディンおよび添加対照であるβ−アクチン（ｎ＝３）のタンパク質レベルを示す。星印は、それぞれの対照に対する有意差を示す（＊＊＝ｐ＜０．０１）。
【図５】ＴＧＦβの慢性投与は、ＨＴ２９  ＩＥＣスフェオイド（spheoid）モデルにおいてＥＭＴを誘導するがＩＬ−１３はしない。ＨＴ２９細胞は「懸滴」として７日間播種された。次いで細胞をさらなる７日間について、未処理のままとした、ＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理したまたはＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した、のいずれかとした。未処理スフェロイドは、細胞形成においていかなる変化も示さなかった。ＴＧＦβ処理スフェロイドは、７日後にほとんど完全に崩壊され、これらの細胞におけるＥＭＴの発生を示唆する。対照的にＩＬ−１３処理は、明らかな細胞崩壊を生じず、ＩＬ−１３がこの細胞モデルにおいてＥＭＴを誘導しないことを示唆している。各画像は、条件当たり３回の類似実験についての典型例である。カラム２および４の図は、カラム１および３（２０倍拡大）の拡大図（４０倍拡大）を表す。
【図６】ＴＧＦβは、ＨＴ２９スフェロイドにおいてＩＬ−１３およびＳＮＡＩＬ１のｍＲＮＡレベルを誘導する。ＨＴ２９スフェロイドはＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ）で７日間まで処理された。ヒストグラムは、各対照と比較した（Ａ）ＩＬ−１３の、（Ｂ）ＳＮＡＩＬ１の、（Ｃ）β６−インテグリンのおよび（Ｄ）ＳＬＵＧのｍＲＮＡレベルを表す（各ｎ＝３）。星印は、それぞれの対照と比較して有意差を示す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）
【図７】ＩＬ−１３は、ＨＴ２９スフェロイドにおいてＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンのｍＲＮＡレベルを誘導する。ＨＴ２９スフェロイドはＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ）で７日間まで処理された。ヒストグラムは、（Ａ）ＳＬＵＧの、（Ｂ）β６−インテグリンのおよび（Ｃ）ＳＮＡＩＬ１のｍＲＮＡレベルを表す（各ｎ＝３）。（Ｄ）典型的ウエスタンブロットは、未処理のままとした、またはＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）もしくはＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理した、のいずれかとしたスフェロイドにおけるＥ−カドヘリン、クローディン−２および添加対照であるβ−アクチンのタンパク質レベルを示す。各ｎ＝３。星印は、それぞれの対照と比較した有意差を示す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図８】ＳＬＵＧ、β６−インテグリンおよびＭＭＰ−１３の基礎レベルは、瘻孔ＣＬＰＦでは上昇する。ヒストグラムは、非瘻孔形成ＣＤ（ｎ＝３）または瘻孔形成ＣＤ（ｎ＝３）を有する患者由来のＣＬＰＦにおける（Ａ）ＳＬＵＧのおよび（Ｂ）β６−インテグリンのｍＲＮＡレベルをそれぞれ示す。次いでこれらのＣＬＰＦは、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間または２４時間それぞれ処理された。（Ｃ）典型的なウエスタンブロットは、非瘻孔形成ＣＤ（ｎ＝３）または瘻孔形成ＣＤ（ｎ＝３）を有する患者由来のＣＬＰＦにおけるリン酸化（Ｔｙｒ６４１）のおよび総ＳＴＡＴ６のならびにリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）および総ＥＲＫ１／２のレベルをそれぞれ示す。（Ｄ）典型的なウエスタンブロットは、非瘻孔形成ＣＤ（ｎ＝３）または瘻孔形成ＣＤ（ｎ＝３）を有する患者由来のＣＬＰＦにおける全長および切断された（活性化された）ＭＭＰ−１３のならびに添加対照であるβ−アクチンのタンパク質レベルをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
病態生理学的に、ＣＤの壁内炎症特徴によって患者に瘻孔形成が生じやすくなり、創傷治癒不良が関連していると考えられる。この徴候をさらに探索するために利用可能である前臨床動物モデルはないが、慢性壁内炎症の状況において生じる調節不全組織再構築プロセスに瘻孔形成ＣＤが関与していると考えられる。組織修復および継続的線維症（consecutive fibrosis）は、タンパク質分解／ＥＣＭ分解酵素の低下した活性と併せて増強された筋線維芽細胞活性による過剰な細胞外マトリクス（ＥＣＭ）合成から生じるが、一方炎症誘発潰瘍形成（すなわち組織破壊）は、酸化代謝物、活性化免疫細胞ならびにマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼなどの上方制御されたＥＣＭ分解酵素によって推進される。
【００１６】
ＣＤの状況におけるＩＬ−１３の役割についての現時点での理解に基づいて（３５）、ＩＬ−１３は抗炎症特性を有する可能性がある。したがって抗ＩＬ−１３治療は、ＣＤ患者において炎症活性度の増悪を導く場合がある。ＣＤにおける抗ＩＬ−１３療法は、したがって通常考慮される選択肢ではない。
【００１７】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）関連事象がＣＤ関連瘻孔中および付近に存在することが近年実証された（６）。ＥＭＴは、分化し、分極した上皮細胞から、筋線維芽細胞表現型を表す間葉様細胞への形質転換を表す。特異的特徴としてこれらのＥＭＴ細胞は、それらの細胞間結合を下方制御し、Ｅ−カドヘリンまたはサイトケラチン８および２０などの上皮マーカーならびにビメンチンまたはα−ＳＭＡなどの間葉系マーカーの両方を示す（７〜８）。機能的レベルではＥＭＴは、胚形成、器官発達および創傷修復に必須であるが、組織線維症ならびに腫瘍増殖および転移にも関連する（７〜９）。
【００１８】
ＣＤ関連瘻孔の約３分の２は、非上皮化瘻孔であり、筋線維芽細胞様「移行細胞」（ＴＣ）によって覆われている（６）。ＣＤ関連瘻孔管の中および周辺に本発明者らは、転写因子ＳＮＡＩＬ１およびＳＬＵＧの核局在化を検出し、それらの活性およびβ６−インテグリン、ＴＧＦβおよびＴＮＦのレベルの上昇が示唆された。対照的に本発明者らは、細胞接着分子、Ｅ−カドヘリンなどの上皮マーカーのタンパク質発現の低下を観察した（６）。ＴＧＦβは、ＥＭＴの鍵となるメディエーターとして周知であり、ＳＮＡＩＬ１発現を誘導し、ＴＮＦと同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＭＴを誘導できる（１０〜１４）。注目すべきことにβ６−インテグリンおよびＳＬＵＧは、腫瘍細胞の浸潤可能性およびＥＭＴの程度と正に相関していた（１５〜１７）。
【００１９】
サイトカインＩＬ−１３は、免疫細胞、特にＴｈ２細胞によって主に分泌される（１８）。それは、２つの異なる受容体、ＩＬ−１３受容体アルファ１（ＩＬ−１３Ｒα１）およびＩＬ−１３Ｒα２に結合でき、それゆえＩＬ−１３Ｒα１はシグナル伝達受容体として、およびＩＬ−１３Ｒα２はデコイ受容体として主に見なされる（１９）。ＩＬ−１３は、気道過敏症、アレルギー性炎症または肥満細胞症などの反応性亢進免疫系を特徴とする疾患の病変形成に関係している（１８）。興味深いことにＩＬ−１３は、肺または肝臓などの器官系の組織線維化の病変形成にも関係している（２０〜２１）。この環境においてＩＬ−１３は、コラーゲン合成のために重要であるプロリンの産生を引き起こし、または線維芽細胞に直接作用し線維化促進効果を誘発する場合もある（１８）。ＩＬ−１３のさらなる線維化誘導経路は、ＴＧＦβの分泌および活性化に関与し、増殖因子がサイトカインの下流メディエーターとなりうることを示唆している（２２）。対照的に、ＩＬ−１３が卵巣がんおよび膵臓がんの増大した浸潤性および転移性に近年関連付けられているが（２３〜２６）、ＩＬ−１３は腫瘍増殖（例えば乳がんまたは腎細胞がんの増殖）を明白に阻害する場合もある（２７〜２８）ことから、腫瘍増殖および浸潤におけるＩＬ−１３の役割についてデータは相反している。
【００２０】
本明細書において本発明者らは、ＴＧＦβがＣＤ患者由来の原発性ヒト結腸粘膜固有層線芽細胞（ＣＬＰＦ）におけるＳＮＡＩＬ１およびＩＬ−１３  ｍＲＮＡの発現を誘導することを実証する。高レベルのＩＬ−１３およびＩＬ−１３Ｒα１がＣＤ関連瘻管を覆うＴＣにおいて検出された。ＥＭＴの腸上皮細胞（ＩＥＣ）モデルにおいて、ＩＬ−１３はＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンレベルを誘導する一方で、慢性的なＴＧＦβ投与は、ＳＮＡＩＬ１およびＩＬ−１３  ｍＲＮＡ発現の同時上昇をもたらす。しかしメディエーターは、相反する動力学でそれらの効果を及ぼす。本発明者らのデータは、ＩＬ−１３がＣＤ関連瘻孔に存在し、浸潤性細胞増殖に関連する遺伝子の発現を誘導することを示し、そのような瘻孔の病変形成におけるサイトカインに関する重要な役割を示唆している。
【００２１】
本発明者らはこれらの知見が、ＩＬ−１３がＣＤにおける瘻孔形成に伴う組織修復の推進に関与し、それにより抗ＩＬ−１３療法がこの患者群に対する有用な治療であることを示唆すると解釈した。
【００２２】
ＩＬ−１３ポリペプチドは下の配列を有する。Ｎ末端３４アミノ酸残基（斜字体）はシグナルペプチドである。したがって成熟サイトカインは、１１２アミノ酸残基を有する。抗ＩＬ−１３抗体は、成熟ポリペプチド上のエピトープに結合する。インターロイキン１３アミノ酸配列：
1   MHPLLNPLLL ALGLMALLLT TVIALTCLGG FASPGPVPPS TALRELIEEL VNITQNQKAP
61  LCNGSMVWSI NLTAGMYCAA LESLINVSGC SAIEKTQRML SGFCPHKVSA GQFSSLHVRD
121 TKIEVAQFVK DLLLHLKKLF REGRFN（配列番号４３）
【００２３】
本発明において用いられる抗体
原則として、ＩＬ−１３の活性を阻害または中和する任意の抗ＩＬ−１３抗体が本発明において用いられうる。そのような抗体は当技術分野において周知であり、例えばＷＯ２００５／００７６９９、ＵＳ６４６８５２８、ＷＯ０３００７６８５、ＷＯ０３０３４９８４、ＵＳ２００３０１４３１９９、ＵＳ２００４０２８６５０、ＵＳ２００４０２４２８４１、ＵＳ２００４０２３３３７、ＵＳ２００４０２４８２６０、ＵＳ２００５００５４０５５、ＵＳ２００５００６５３２７、ＷＯ２００６／１２４４５１、ＷＯ２００６／００３４０７、ＷＯ２００５／０６２９６７、ＷＯ２００６／０８５９３８、ＷＯ２００６／０５５６３８、ＷＯ２００７／０３６７４５、ＷＯ２００７／０８０１７４またはＷＯ２００７／０８５８１５を参照されたい。
【００２４】
好ましい実施形態では抗体は、０１９５１／Ｇ１２（配列番号３１および３３）であり、ＷＯ２００７／０４５４７７にさらに記載されている。
【００２５】
一実施形態では本発明において用いられる抗体は、低いｐＭ範囲でＩＬ−１３に対する親和性を有しており、約１０ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−１３誘導シグナル伝達を阻害する。低いｐＭ範囲によって本発明者らは、１００ｐＭ以下、好ましくは５０ｐＭ以下、好ましくは１０ｐＭ以下、より好ましくは１ｐＭ以下を意味する。
【００２６】
ＩＬ−１３の活性の阻害または中和は、例えばＷＯ２００７／０４５４７７に開示のとおりヒト肺線維芽細胞からのエオタキシン放出を用いて炎症メディエーター放出の阻害を測定することによって評価されうる。好ましい実施形態では本発明の抗ＩＬ−１３抗体は、ヒト肺線維芽細胞からのＩＬ−１３誘導エオタキシン放出を１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．０ｎＭ、０．５ｎＭ未満またはそれより低いＩＣ５０を有して阻害する。
【００２７】
好ましい実施形態では本発明において用いられる抗体は、次のＣＤＲの１つまたは複数を含む。表３ａおよび４ａに列挙するＣＤＲはカバト定義によって決定された（E.Kabat et al, 1991,Sequences of Proteins of immunological Interest,5th edition,public health Service,HIH,Bethesda,MD。
【００２８】
【表１】
2014507436.tif 000002
【００２９】
【表２】
2014507436.tif 000003
【００３０】
【表３】
2014507436.tif 000004
【００３１】
【表４】
2014507436.tif 000005
【００３２】
前述の表の抗体の配列（フレームワーク領域を含む）は下に示される。全長ＩｇＧ１抗体軽鎖および重鎖定常領域も、例として抗体０１９５１／Ｇ１２の可変領域（太字で示す）を組み込んで下に示される。
【００３３】
０１４７１／Ｇ６抗体配列
（ｉ）ＨＣ可変領域
０１４７１／Ｇ６についてのＨＣ可変アミノ酸配列は配列番号２３に示され、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化１】
2014507436.tif 000006
【００３４】
（ｉｉ）ＬＣ可変領域
０１４７１／Ｇ６についてのＬＣ可変アミノ酸配列は配列番号２５に示され、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化２】
2014507436.tif 000007
【００３５】
０３１６１／Ｈ２抗体
（ｉ）ＨＣ可変領域
０３１６１／Ｈ２についてのＨＣ可変アミノ酸配列は配列番号２７に示され、配列番号配列番号２８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化３】
2014507436.tif 000008
【００３６】
（ｉｉ）ＬＣ可変領域
０３１６１／Ｈ２についてのＬＣ可変アミノ酸配列は配列番号２９に示され、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化４】
2014507436.tif 000009
【００３７】
０１９５１／Ｇ１２抗体配列
（ｉ）ＨＣ可変領域
０１９５１／Ｇ１２についてのＨＣ可変アミノ酸配列は配列番号３１に示され、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化５】
2014507436.tif 000010
【００３８】
（ｉｉ）ＬＣ可変領域
０１９５１／Ｇ１２についてのＬＣ可変アミノ酸配列は配列番号３３に示され、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化６】
2014507436.tif 000011
【００３９】
０１７７１／Ｅ１０抗体配列
（ｉ）ＨＣ可変領域
０１７７１／Ｅ１０についてのＨＣ可変アミノ酸配列は配列番号３５に示され、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化７】
2014507436.tif 000012
【００４０】
（ｉｉ）ＬＣ可変領域
０１７７１／Ｅ１０についてのＬＣ可変アミノ酸配列は配列番号３７に示され、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【化８】
2014507436.tif 000013
【００４１】
抗体０１９５１／Ｇ１２の可変領域（太字で示す）を組み込んでいる完全な抗体ＩｇＧ１軽鎖配列
ＬＣアミノ酸配列は配列番号３９に示され、配列番号４０のヌクレオチド配列によってコードされる。
【化９】
2014507436.tif 000014
【化１０】
2014507436.tif 000015
【００４２】
抗体０１９５１／Ｇ１２の可変領域（太字で示す）を組み込んでいる完全な抗体ＩｇＧ１重鎖配列
ＨＣアミノ酸配列は配列番号４１に示され、配列番号４２のヌクレオチド配列によってコードされる。
【化１１】
2014507436.tif 000016
【化１２】
2014507436.tif 000017
【化１３】
2014507436.tif 000018
【００４３】
新規ＶＨおよびＶＬ配列が、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明において有用なモノクローナル抗体について本明細書で示すＣＤＲ配列由来の構造的に類似する配列で置換することによって作出されうることは、当業者に容易に明らかである。
【００４４】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、上に記載のエピトープ（例えばＩＬ−１３において見出されるエピトープ）に特異的に結合および該エピトープを認識する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはその断片を含むポリペプチドを意味する。したがって用語抗体は、１本鎖全抗体およびその抗原結合断片を含む全抗体（whole antibody）（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体など）を含む。用語「抗体」は、可変領域を単独でまたは、次のポリペプチド要素：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全体もしくは部分との組合せで含みうる１本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片を含む。同様に定義内に含まれるのは、可変領域およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの任意の組合せである。抗体断片は、例えばこれだけに限らないがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片を含む。例は：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２個のＦａｂ断片を含む２価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一腕部のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al.,Nature 341:544-546,1989;Muyldermans et al.,TIBS 24:230-235,2001）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。用語「抗体」は、単一ドメイン抗体、マキシボディー（maxibodies）、ミニボディー（minibodies）、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖを含む（例えばHollinger & Hudson,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136(2005)を参照されたい）。抗体の抗原結合部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づくスキャホールドに移されうる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディーを記載している米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。抗原結合部分は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成するタンデム型Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む１本鎖分子に組み込まれうる（Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００４５】
好ましくは本発明において用いられる抗体は、ＩＬ−１３に特異的に結合する。好ましくは本発明において用いられる抗体は、ＩＬ−１３以外の抗原と交差反応しない。
【００４６】
本明細書において用いられる、「ＩＬ−１３に特異的に結合する」抗体は、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下または１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでＩＬ−１３に結合する抗体を意味すると意図される。「ＩＬ−１３以外の抗原と交差反応する」抗体は、その抗原に０．５×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下または２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を意味すると意図される。
【００４７】
代替的実施形態では本発明において用いられる抗体は、上に引用した抗体の１つまたは複数を交差ブロックするものである。「交差ブロック」によって本発明者らは、別の抗体がＩＬ−１３に結合することを妨害する抗体を意味する。そのような妨害は、例えばＢｉａｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡを用いる拮抗アッセイを用いて検出されうる。そのような拮抗アッセイは、ＷＯ２００８／１３３７２２に記載されている。
【００４８】
治療をモニタリングするための方法
本発明の範囲に含まれるのは、抗ＩＬ−１３抗体を用いるＣＤ患者での瘻孔の治療が成功しているかどうかをモニタリングする方法である。最も簡単な（しかし最も正確なのではない）方法は、治療された対象が症状の改善に気づいているかどうかである。
【００４９】
他の方法は、ＴＧＦ−β、ペリオスチン、エオタキシン−１、プロコラーゲンＩ型Ｃ末端プロペプチド（ＰＩＣＰ）およびコラーゲンＩＩＩ型のＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、ＩＬ−４などの種々のバイオマーカーの発現およびＳＴＡＴ６のリン酸化の程度を検出するステップを含む。
【００５０】
そのような方法は、治療された対象における選択したバイオマーカーの発現レベルを評価するステップおよび前記発現レベルを対照レベル（治療前の対象における発現レベルまたは未治療対象におけるレベルなど）と比較するステップを含み、前記対照レベルと異なるレベルは治療された対象が治療に応答している指標である。
【００５１】
方法は：
ａ）瘻孔形成の指標となるバイオマーカーの発現を治療前の患者において測定するステップ；
ｂ）患者を抗ＩＬ−１３抗体で治療するステップ；
ｃ）治療後に患者における前記バイオマーカーの発現を測定するステップ；
ｄ）治療前の発現レベルと比較して治療後のバイオマーカー発現における変化を検出するステップであって、発現における前記変化が抗ＩＬ−１３抗体治療への応答を示すステップ
を含んでもよい。
【００５２】
上記測定ステップ（ａ）および（ｃ）は、患者から得られた組織試料について実行されてもよい。分析される組織試料は、血液、尿、唾液または組織生検由来の他の組織であってもよい。
【００５３】
代替的としてステップ（ｄ）は、治療前後のバイオマーカー発現を対照バイオマーカー発現レベルと比較するステップを含んでもよく、ここでこれらの対照レベルからの逸脱は抗ＩＬ−１３抗体での治療への応答を示す。そのような対照レベルは、ＣＤを有さない患者、プラセボで治療された患者、または従来の抗瘻孔薬物療法で治療された患者由来であってよい。
【００５４】
測定されうるバイオマーカーの例は、ＴＧＦ−β、ペリオスチン、エオタキシン−１、ＰＩＣＰおよびＰＩＩＩＮＰ、ＩＬ−４ならびにＳＴＡＴ６のリン酸化の程度を含むがこれだけに限らない。
【００５５】
医薬組成物
本発明において用いられる抗体は、モノクローナル抗体の１つまたは組合せを含み、薬学的に許容される担体と共に製剤化される組成物（例えば医薬組成物）として一般に製剤化される。例えば本発明において用いられる医薬組成物は、ＩＬ−１３のさまざまなエピトープに結合するまたは相補活性を有する抗体の組合せを含む場合がある。
【００５６】
本発明において用いられる医薬組成物は、併用療法においても（すなわち他の薬剤と組み合わされて）投与されうる。例えば併用療法は、抗炎症剤と組み合わされた抗ＩＬ−１３抗体を含みうる。そのような組合せは、同時にまたは逐次的に投与されうる。逐次的に投与される場合は、各薬剤の投与の間の期間は１週間以下であってもよい（例えば１日以下、１２時間以下、６時間以下、１時間以下、３０分間以下）。組成物は、好ましくは生理学的ｐＨで製剤化される。
【００５７】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング（coating）、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に好適であるべきである。投与の経路に応じて、活性化合物（例えば抗体、免疫コンジュゲートまたは二重特異性分子）は、酸および、化合物を不活性化する場合がある他の天然状態の作用から化合物を保護するために材料にコートされてもよい。
【００５８】
そのような医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例は：アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（butylated hydroxyanisole）（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤を含む。
【００５９】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含んでもよい。微生物の存在の阻止は、上記滅菌手順によってならびに種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなど）の含有によっての両方によって確実にされうる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含むことも望ましい場合がある。付加的に注射可能な薬学的形態の吸収遅延は、アルミニウムモノステアリン酸およびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらされる場合がある。
【００６０】
薬学的に許容される担体は、滅菌水性溶液または分散剤および滅菌注射可能溶液もしくは分散剤の即時調製用の滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用は考慮される。補助的活性化合物も組成物に組み込まれうる。
【００６１】
治療用組成物は、典型的には滅菌されていなければならず、製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬物濃度に好適な他の指示された構造として製剤化されうる。担体は、溶液または、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する分散媒およびこれらの好適な混合物であってよい。適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、ならびに界面活性剤の使用によって例えば維持されうる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）または塩化ナトリウムを組成物中に含みうる。注射可能な組成物の吸収遅延は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸塩およびゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらされうる。
【００６２】
滅菌済み注射可能溶液は、必要に応じて上に列挙された成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込むことに続く滅菌精密ろ過によって調製されうる。一般に分散剤は、基礎分散媒体および上に列挙するものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分に加えて任意の追加的な望まれる成分の粉末を予め滅菌ろ過されたそれらの溶液からもたらす真空乾燥および凍結乾燥（freeze-drying）（凍結乾燥（lyophilization））である。
【００６３】
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされうる活性成分の量は、治療される対象および投与の特定の様式に応じて変化する。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされうる活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量である。１００パーセントのうち、一般に薬学的に許容される担体との組合せにおいてこの量は活性成分約０．０１パーセントから約９９パーセント、約０．１パーセントから約７０パーセントまたは活性成分約１パーセントから約３０パーセントの範囲である。
【００６４】
投与計画は、最適な望まれる応答（例えば治療的応答）を提供するために調整される。例えば単回の急速投与が投与される場合があり、いくつかの分割投与は経時的に投与される場合があり、または投与量は治療状況の応急性によって示唆されるとおり比例的に低減または増加されうる。投与の簡便化および投与量の均一性のために非経口組成物を投与単位形態で製剤化することは特に有利である。本明細書において用いられる投与単位形態は、治療される対象への単位投与量として好適な物理的に分離された単位を意味し；各単位は、望まれる治療効果をもたらすために計算されて予め決定された量の活性化合物を必要な薬学的担体と共に含有する。本発明の投与単位形態についての規格は、活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体における治療感受性のためにそのような活性化合物を配合する当技術分野に固有の制限によって指示されるおよび直接依存する。
【００６５】
抗体の投与について投与量は、宿主体重の体重１ｋｇあたり約０．０００１から約１００ｍｇ、より一般的には約０．０１から約５ｍｇの範囲である。例えば投与量は体重１ｋｇあたり約０．３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇ、または１ｋｇあたり約１から約３０ｍｇ、または１ｋｇあたり約１から約１０ｍｇであってよい。例示的治療計画は、１週間に約１回、２週間ごとに約１回、３週間ごとに約１回、４週間ごとに約１回、１カ月に約１回、３カ月ごとに約１回、３から６カ月ごとに約１回、６カ月ごとに約１回、または１年に約１回の投与を必要とする。本発明の抗ＩＬ−１３抗体のための投与計画は、静脈投与による体重１ｋｇあたり約１ｍｇまたは体重１ｋｇあたり約３ｍｇを含み、抗体は、以下の投薬計画：約４週間ごとの６回投与、次いで約３カ月ごと；約３週間ごと；体重１ｋｇあたり約３ｍｇを１回に続く体重１ｋｇあたり１ｍｇを３週間ごとの１つを用いて与えられる。
【００６６】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時にまたは逐次的に投与され、その場合投与される各抗体の投与量は示された範囲内にある。組合せは抗ＩＬ−１４抗体と組み合わされた抗ＩＬ−１３抗体であってよい。通常抗体は複数回投与される。単回投与の間の間隔は、例えば１週間ごと、１カ月ごと、３カ月ごと、６カ月ごとまたは１年ごとであってよい。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定するステップによって指示されるとおり不定期であってもよい。いくつかの方法では投与量は、約１から約１０００μｇ／ｍｌの、いくつかの方法では約２５から約３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するために調整される。
【００６７】
代替的に抗体は、徐放性製剤として投与される場合があり、そのような場合は少ない頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般にヒト抗体は、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の量および頻度は、治療が予防的または治療的のいずれであるかに応じて変化する場合がある。予防的適用では、比較的低い投与量が比較的頻繁ではない間隔で長期にわたって投与される。患者によっては、その後の生涯にわたって治療を受け続ける。治療的適用の場合、比較的短い間隔での比較的高い投与量が、疾患の進行が低下するもしくは停止するまでまたは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで時には必要である。その後患者は予防的計画で投与される場合もある。
【００６８】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式について望まれる治療応答を、患者に毒性となることなく達成するために有効な活性成分の量を得るために変更される場合がある。選択された投与量レベルは、用いた本発明の特定の組成物（またはそのエステル、塩もしくはアミド）の活性、投与の経路、投与の時期、用いられた特定の化合物の排出速度、治療期間、用いられた特定の化合物との組合せで用いられた他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身状態および既往歴ならびに医療分野において十分に周知の同様の要因を含む種々の薬物動態学的要因に依存する。
【００６９】
本発明の抗ＩＬ−１３抗体の「治療有効量」は、疾患症状の重症度の減少、疾患の症状が無い時期の頻度および期間の増加または疾患の苦痛による機能障害または能力障害の予防をもたらす。
【００７０】
本発明において用いられる組成物は、当技術分野において周知の種々の方法の１つまたは複数を用いる１つまたは複数の投与経路によって投与されうる。当業者によって理解されるとおり、投与の経路および／または様式は、望まれる結果に応じて変化する。本発明の抗体の投与のための経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄内または他の非経口投与経路（例えば注射または注入による）を含む。本明細書において用いられる句「非経口投与」は、経腸的および局所投与以外の、通常注射による投与様式を意味し、非限定的に静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内（intrastemal）での注射および注入を含む。静脈内および皮下投与は特に好ましい。
【００７１】
代替的に本発明において用いられる抗体は、局所、表皮または粘膜経路（例えば鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、舌下または局所）の投与などの非経口ではない（nonparenteral）経路によって投与されうる。
【００７２】
活性化合物は、放出制御製剤などのように急速な放出から化合物を保護する担体（埋込物（implant）、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む）と共に調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーも用いられうる。そのような製剤の調製のための多数の方法は、特許請求されているまたは当業者に一般に周知である。例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R. Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New   York,1978を参照されたい。
【００７３】
治療用組成物は、当技術分野において周知の医療用デバイスで投与されてもよい。例えば一実施形態では組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に示されるデバイスなどの無針皮下注射デバイスで投与されうる。本発明において有用な周知の埋込物およびモジュールの例は：調節された速度で薬物を投薬するための埋め込み可能なマイクロ注入ポンプを示すＵＳ４，４８７，６０３；皮膚を通して薬剤を投与するための治療用デバイスを示すＵＳ４，４８６，１９４；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを示すＵＳ４，４４７，２３３；持続的薬物送達のための変流量の埋め込み可能な注入装置を示すＵＳ４，４４７，２２４；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示すＵＳ４，４３９，１９６；および浸透圧薬物送達系を示すＵＳ４，４７５，１９６を含む。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数の他のそのような埋込物、送達系およびモジュールは、当業者に周知である。
【００７４】
本発明は、第一構成要素および第二構成要素を含むキットであって、第一構成要素が抗ＩＬ−１３抗体または上に記載の医薬組成物であり、第二構成要素が説明書であるキットも提供する。一実施形態では前記説明書は、瘻孔形成ＣＤを治療するための抗体の使用を説明する。キットは、以下：シリンジもしくは他の送達デバイス、アジュバントまたは薬学的に許容される製剤化溶液の１つまたは複数を含む第三構成要素をさらに含んでもよい。
【００７５】
概要
用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」および「からなる（consisting）」を意味し、例えばＸを「含む（comprising）」組成物は、排他的にＸ「からなる（consisting）」場合があり、または付加的な何かを含む（include）場合がある（例えばＸプラスＹ）。
【００７６】
数値ｘに関連する用語「約（about）」は、例えばｘ±１０％を意味する。２つのアミノ酸配列間の配列同一性百分率は、（配列比較される場合）２つの配列を比較して同じであるアミノ酸の百分率を意味する。この配列比較および相同性または配列同一性の百分率は、当技術分野において周知のソフトウエアプログラム、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al.,eds., 1987)Supplement 30の７．７．１８節に記載のものを用いて決定されうる。好ましい配列比較は、１２のギャップオープンペナルティーおよび２のギャップエクステンションペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスでアフィンギャプ（affine gap）検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489に開示されている。
【実施例１】
【００７７】
ＴＧＦβは、ＣＤ瘻孔ＣＬＰＦからのＩＬ−１３分泌を誘導する
ＥＭＴ関連転写因子ＳＮＡＩＬ１が、ＣＤ関連瘻孔の瘻管に沿ったＴＣ細胞において強く検出可能であることが、近年示された（Scharl、印刷中）。したがって本発明者らは、ＣＤ患者由来のＣＬＰＦにおいてＴＧＦβがＳＮＡＩＬ１レベルを誘導できるかどうかを研究した。非瘻孔形成疾患を有する患者由来のＣＬＰＦにおいて、ＴＧＦβでの処理はＳＮＡＩＬ１  ｍＲＮＡ発現における２倍の増加を誘導し、この効果は瘻孔形成疾患を有する患者由来のＣＬＰＦにおいて増強された（約６倍増加、図１Ａ）。対照的にＳＬＵＧ  ｍＲＮＡレベルは、瘻孔形成または非瘻孔形成ＣＬＰＦのいずれにおいてもＴＧＦβ処理で影響されなかった（図１Ｂ）。非瘻孔ＣＬＰＦではＴＧＦβはＩＬ−１３の分泌を誘導するために十分ではなかった。しかし瘻孔ＣＬＰＦは、ＩＬ−１３の明らかに上昇した基礎分泌レベル（６６．２＋／−１４．６ｐｇ／ｍｌ対１１＋／−１０ｐｇ／ｍｌ）を表し、ＴＧＦβの２４時間の添加は細胞上清中のＩＬ−１３分泌における強く顕著な増加をもたらした（４５５＋／−１９３．６ｐｇ／ｍｌ）（図１Ｃ）。次いで本発明者らは、ＣＤ病変形成において重要な役割を演じるＴＮＦが瘻孔ＣＬＰＦからもＩＬ−１３分泌を誘導できるかどうかを検査した。しかし瘻孔ＣＬＰＦのＴＮＦでの処理はＩＬ−１３分泌を上昇させるために十分ではなく、しかしタンパク質非受容体２型チロシンホスファターゼ（ＰＴＰＮ２）のタンパク質発現を誘導した。対照的に、ＩＬ−１３分泌を誘導できたＴＧＦβは、ＰＴＰＮ２タンパク質レベルを誘導した（図１Ｄ）。ＰＴＰＮ２レベルと、サイトカインまたは増殖因子がＩＬ−１３分泌を刺激する能力との直接的な相関関係を実証するために、本発明者らはｓｉＲＮＡ構築物によってＴ８４ＩＥＣにおいてＰＴＰＮ２をノックダウンした。ＴＮＦ処理はＰＴＰＮ２コンピテント細胞でＩＬ−１３分泌を誘導するために十分ではなかったが、ＰＴＰＮ２欠損細胞の細胞上清中へのＩＬ−１３の強い分泌をもたらした（図１Ｅ）。本発明者らの知見と同様に、瘻孔線維芽細胞におけるＴＧＦβでのＨＴ２９−ＩＥＣの処理は、ＰＴＰＮ２タンパク質レベルをわずかに減少させたが依然として維持させ（図１Ｆ）、これらの細胞からのＴＧＦβ誘導ＩＬ−１３分泌を妨げるために明らかに十分であった（データ不記載）。これらのデータは、ＴＧＦβが瘻孔ＣＬＰＦからのＩＬ−１３の分泌を誘導し、ＩＬ−１３分泌の程度がＰＴＰＮ２タンパク質レベルと相関することを実証する。
【実施例２】
【００７８】
ＩＬ−１３およびＩＬ−１３受容体α１（ＩＬ−１３Ｒα１）はＴＣ細胞において強く検出可能である
本発明者らが、ＴＧＦβが瘻孔ＣＬＰＦからのＩＬ−１３分泌を誘導することを実証したことから、本発明者らは、ＣＤ患者由来瘻孔切除物（resectate）からの組織標本を分析した。免疫組織化学的検査により本発明者らは、瘻管に広がるＴＣにおいてＩＬ−１３についての強い染色を観察した（図２Ａ）。付加的に本発明者らは、瘻管に隣接する変形した陰窩の上皮細胞においておよび瘻管に隣接する炎症性浸潤においてＩＬ−１３染色を見出したが、通常の結腸陰窩のＩＥＣはＩＬ−１３染色をほとんど示さなかった（図２Ａ）。同様の染色パターンがＩＬ−１３Ｒα１についても観察できた。サイトカイン受容体は、ＣＤ瘻孔のＴＣにおいておよび瘻孔に隣接する陰窩様構造を覆う上皮様細胞において強い染色を示した（図２Ｂ）。これらの知見は、ＩＬ−１３およびＩＬ−１３Ｒα１がＴＣ細胞ならびに、ＣＤ関連瘻孔に沿うおよび隣接する変形した陰窩の上皮細胞において発現されることを実証し、ＣＤ瘻孔病変形成におけるＩＬ−１３の関与を示唆する。
【実施例３】
【００７９】
ＩＬ−１３は、ＨＴ２９−ＩＥＣにおいてＳＬＵＧおよびβ６−インテグリン発現を誘導する
次に本発明者らは、ＩＬ−１３がＩＥＣにおけるＥＭＴ関連効果に関与する場合があるかどうかを評価した。ＨＴ２９−ＩＥＣを１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３で３０分間または２４時間それぞれ処理した。ＩＬ−１３の投与はＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンのｍＲＮＡレベルを２４時間処理で誘導したが（図３Ａ＋Ｂ）、検査したいずれの時点でもＳＮＡＩＬ１、ＴＧＦβおよびＰＴＰＮ２  ｍＲＮＡ発現には効果を有さなかった（図３Ｃ−Ｅ）。ＩＬ−１３がどのようにβ６−インテグリンレベルに影響しうるのかを研究するために、本発明者らは、ＳＬＵＧ  ｍＲＮＡレベルにおける明らかな低下をもたらすＳＬＵＧ特異的ｓｉＲＮＡ構築物を用いてＳＬＵＧノックダウン研究を実施した（データ不記載）。前述同様に、ＩＬ−１３は２４時間処理によってβ６−インテグリンｍＲＮＡレベルを誘導した。この効果は、ＳＬＵＧノックダウン細胞において少なくとも部分的に、減少した（図３Ｆ）。タンパク質レベルでは、ＩＬ−１３はリン酸化を誘導し、３０分間の処理によってシグナル伝達中間体、ＳＴＡＴ６およびＥＲＫ１／２の活性化を示唆した。ＩＬ−１３は、３０分間の処理によりこの経路を介するシグナル伝達の増加を（これが統計的に有意でないことを本発明者らは認めるが）示唆するβ−カテニンのレベルにおける増加ももたらし、２４時間処理後にβ−カテニンタンパク質のレベルは未刺激対照細胞におけるものと同様であった（図４Ｂ）。一方細胞間ポアタンパク質、クローディン−２のレベルは、２４時間ＩＬ−１３処理によって増加したが（図４Ｃ）、細胞間接着分子、Ｅ−カドヘリンおよび密着結合分子オクルディンのタンパク質レベルは未処理対照細胞と比較した時点では影響されなかった（図４Ｄ）。これらのデータは、ＩＬ−１３がＨＴ２９ＩＥＣにおいて細胞浸潤に関与する遺伝子の発現を誘導し、それにより組織に侵入するＣＤ関連瘻孔の侵襲性に寄与しうることを示唆している。
【実施例４】
【００８０】
ＨＴ２９−スフェロイド細胞モデルにおいてＴＧＦβはＥＭＴを誘導するが、ＩＬ−１３は誘導しない
本発明者らが、ＩＬ−１３が細胞浸潤に関与する分子の発現を誘導することを示したことから、次に本発明者らは、ＩＬ−１３がＥＭＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて上皮細胞形成の崩壊を誘導できるかどうかを研究した。本発明者らは、ＨＴ２９細胞をスフェロイドとして７日間播種した。次いでスフェロイドを未処理のままとするか、またはＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で追加的に７日間処理するかのいずれかにした。顕微鏡により本発明者らは、経時的なＨＴ２９−スフェロイドの形態学的発達を観察した。検査した全てのスフェロイドは、播種の７日後に充実細胞（compact cell）としての形成を表した。未処理ＨＴ２９スフェロイドは、１４日後でさえも細胞形成の境界を示す明らかな黒色線を伴って類似の外観を示した。対照的にＴＧＦβ処理は、増殖因子処理の７日後にＥＭＴの発生を示唆する細胞形成のほぼ完全な崩壊を生じた。崩壊した単一細胞が検出できなかったようにＩＬ−１３処理スフェロイドは、ＥＭＴの発生について明らかな形態学的徴候は示さなかった。しかし細胞形成の周縁部は、未処理対照スフェロイドと比較して幾分か散在性に限定された（図５）。これらの知見は、ＴＧＦβとは対照的にＩＬ−１３単独ではＩＥＣにおいてＥＭＴを誘導するために十分ではないことを示唆する。
【実施例５】
【００８１】
ＴＧＦβは、ＨＴ２９−スフェロイドにおいてＩＬ−１３およびＳＮＡＩＬ１のｍＲＮＡ発現を誘導する
本発明者らは、本発明者らの細胞モデルにおいてＥＭＴの誘導に寄与できるＴＧＦβによって誘導される遺伝子発現パターンにおける変化を次に評価した。本発明者らは、ＴＧＦβ処理が処理の７日後に統計的有意に達するＩＬ−１３  ｍＲＮＡにおける経時的増加をもたらすことを見出した（図６Ａ）。しかしこれらのスフェロイドの上清中のＩＬ−１３の濃度は、本発明者らが用いたＥＬＩＳＡ系の検出レベルを下回った（データ不記載）。本発明者らは、これらのスフェロイドにおいてＴＧＦβがＥＭＴ関連転写因子、ＳＮＡＩＬ１のｍＲＮＡ発現を時間依存的動力学に従って増加させ、７日後にピークに達したことも見出した（図６Ｂ）。上に示したとおり、ＨＴ２９スフェロイドが完全に崩壊した時点は、これらの細胞におけるＥＭＴの発生を示唆する（図５）。これらの知見は、ＴＣが瘻管を覆っていることを示す（したがって現在ＥＭＴが生じている）ＣＤ患者由来の瘻孔標本における本発明者らの観察結果とも関連し、ＩＬ−１３について（図２Ａ）およびＳＮＡＩＬ１について（Scharl、印刷中）強い染色を表す。対照的にＴＧＦβ処理は、処理の７日後にβ６−インテグリン発現の顕著な減少をもたらし（図６Ｃ）、調査したいかなる時点でもＳＬＵＧ  ｍＲＮＡに（顕著に）影響しなかった（図６Ｄ）。これらのデータは、ＴＧＦβがＨＴ２９−スフェロイドにおいてＥＭＴ関連転写事象を誘導することを示し、増殖因子がＣＤ瘻管に沿ったＴＣ細胞において観察されたＩＬ−１３発現の原因であるというさらなる手がかりを提供する。
【実施例６】
【００８２】
ＩＬ−１３は、ＥＭＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてＳＬＵＧおよびβ６インテグリン発現を誘導する
ＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンは、ＴＣおよびＣＤ瘻孔の瘻孔周囲細胞において明らかに検出可能であった（６）（Scharl、印刷中）。本明細書において本発明者らは、ＩＬ−１３がＨＴ２９単層においてこれらの遺伝子の両方の発現を誘導することを示した。興味深いことに、ＥＭＴが生じているＨＴ２９−スフェロイドでは、ＴＧＦβ刺激はＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンのｍＲＮＡ発現を誘導するために十分ではなかった。次に本発明者らは、ＩＬ−１３がＥＭＴ細胞モデルにおいてそれらのｍＲＮＡレベルを誘導できるかどうかを研究した。ＩＬ−１３でのＨＴ２９スフェロイドの処理は、１日のインキュベーション後で既にＳＬＵＧ  ｍＲＮＡレベルを９倍まで誘導した。５日後および７日後にＳＬＵＧ発現レベルは、未処理対照細胞においてのものと同様であった（図７Ａ）。同様の知見がβ６−インテグリンについて観察された。ＩＬ−１３は、その遺伝子発現を１日のインキュベーションによって誘導し、ｍＲＮＡレベルは経時的に対照細胞におけるものと等しいレベルに低下した（図７Ｂ）。注目すべきことに、ＩＬ−１３処理は、１日後にＳＮＡＩＬ１のｍＲＮＡレベルを低下させたが、処理の７日後にＳＮＡＩＬ１  ｍＲＮＡ発現における増加をもたらし、ＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンについて観察されたのとは反対のＩＬ−１３誘導発現パターンをＳＮＡＩＬ１について示唆している（図７Ｃ）。タンパク質レベルでは、ＴＧＦβおよびＩＬ−１３処理は、処理の７日後にＥ−カドヘリンレベルのわずかな低下をもたらした。ＴＧＦβ投与はクローディン−２タンパク質に影響しなかったが、ＩＬ−１３は（予測されたとおり）クローディン−２タンパク質レベルにおける強い増加を処理の１日後に既におよび７日後にも生じた（図７Ｄ）。これらのデータは、ＴＧＦβがＩＥＣにおいてＥＭＴ特異的遺伝子発現パターンを誘導するのに対して、ＩＬ−１３は細胞浸潤に関連する遺伝子の発現を誘導するという仮説をさらに支持する。
【実施例７】
【００８３】
ＳＬＵＧ、β６−インテグリンおよびＭＭＰ−１３のレベルは、ＣＤ瘻孔ＣＬＰＦにおいて増加している
本発明者らが、ＩＬ−１３がＩＥＣにおけるＳＬＵＧおよびβ６−インテグリン遺伝子発現に影響を与えることを示したことから、本発明者らは、これらの遺伝子の基礎発現が、非瘻孔形成ＣＤを有する患者から単離されたＣＬＰＦと比較した場合瘻孔形成ＣＤを有する患者から単離されたＣＬＰＦにおいて異なるかどうかを検査した。本発明者らは、ＳＬＵＧ  ｍＲＮＡレベルが非瘻孔形成ＣＤを有する患者由来のＣＬＰＦにおいてよりも瘻孔形成ＣＤを有する患者由来のＣＬＰＦにおいてが約４倍高かったことを見出した（図８Ａ）。同様の知見がβ６−インテグリンｍＲＮＡレベルについて得られた（図８Ｂ）。次いで本発明者らは、これらの細胞のサイトカインへの応答性における潜在的な差異を研究するために本発明者らのＣＬＰＦをＩＬ−１３で処理した。しかし研究した時点ではシグナル伝達中間体ＳＴＡＴ６およびＥＲＫ１／２のリン酸化を刺激するＩＬ−１３の能力において差異は検出できなかった。付加的にそれらのベースラインリン酸化における明らかな差異は観察できなかった（図８Ｃ）。次いで本発明者らは、全長および切断ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）のベースラインおよびＩＬ−１３誘導レベルを調査した。ＭＭＰ−１３の切断されたアイソフォームは、乳がんの例においてＥＣＭ分解に関与し、腫瘍転移に関連する活性化タンパク質を表す（２９）。全長および切断ＭＭＰ−１３のベースラインレベルは、非瘻孔形成疾患を有する患者由来のＣＬＰＦにおいてよりも瘻孔ＣＬＰＦにおいてが明らかに高かった。しかしＩＬ−１３処理は、ＭＭＰ−１３の両方のアイソフォームのレベルにおいていかなる明らかな変化も生じなかった（図８Ｄ）。これらのデータは、瘻孔形成疾患を有するＣＤ患者由来のＣＬＰＦが、非瘻孔形成疾患を有する患者由来のＣＬＰＦよりも細胞浸潤に関連する分子のより高いレベルを示すことを実証する。
【００８４】
考察
本発明者らは、ＩＬ−１３が瘻管を覆うＴＣにおいておよびＣＤ関連瘻孔に隣接する変形した陰窩のＩＥＣにおいて検出可能であることを実証した。ＥＭＴの最も強力な誘導因子ＴＧＦβは、瘻孔形成疾患を有するＣＤ患者由来のＣＬＰＦからのＩＬ−１３分泌を誘導できた。ＨＴ２９  ＩＥＣを用いるＥＭＴ細胞モデルでは、慢性暴露によってＴＧＦβはＩＬ−１３  ｍＲＮＡも誘導した。機能的レベルにおいて、ＩＬ−１３は細胞浸潤に関連する遺伝子の発現の増加をもたらし、ＣＤ瘻孔の病変形成におけるＩＬ−１３についての役割を示唆した。
【００８５】
本発明者らが既に示したとおり、ＣＤ関連瘻管を覆うＴＣは、ＥＭＴの発生を強く支持するいくつかの様相を示す。詳細には、それらは転写的に活性なＳＮＡＩＬ１を高レベルで発現し、Ｅ−カドヘリンの下方制御ならびに上皮マーカー（サイトケラチン−８および２０）および間葉系マーカー（ビメンチン）の同時発現を表す。付加的に相当レベルのＴＧＦβが瘻管を覆うＴＣで検出できる（６）。瘻孔病変形成でのＥＭＴ発生へのさらなる手がかりは、瘻孔ＣＬＰＦがＳＮＡＩＬ１  ｍＲＮＡレベルを強く上方制御する（瘻孔を有さないＣＤ患者由来のＣＬＰＦにおいて観察できなかった）という事実である。
【００８６】
本明細書において本発明者らは、瘻管を覆うＴＣ細胞においておよび瘻孔に隣接する変形した陰窩の上皮細胞においてＩＬ−１３およびその受容体ＩＬ−１３Ｒα１についての強い染色を実証した。この観察結果は、ＩＬ−１３が免疫細胞（特にＴｈ２細胞）によって主に発現されると考えられていたことから、ある程度予期されないものであった（１８）。ＩＬ−１３はこれまでのところＥＭＴと関連しないが、肺線維症、肝線維症または全身性硬化症などの組織線維症の出現に明らかに関連している（２０〜２１、３０）。本発明者らは、ＴＣなどの隣接する組織層への浸潤性および貫通性の細胞増殖を表す細胞中においてＩＬ−１３の高いレベルを示した。興味深いことに本発明者らは、ＩＬ−１３それ自体が自己分泌様式でこれらの細胞に影響を及ぼすことを示唆する高レベルのＩＬ−１３Ｒα１も見出した。
【００８７】
次いで本発明者らは、ＴＣまたはＩＥＣそれぞれにおけるＩＬ−１３の発現のための潜在的推進力を調査した。ＣＬＰＦ培養物をＴＧＦβで刺激することによって本発明者らは、増殖因子は瘻孔ＣＬＰＦからのＩＬ−１３の分泌を誘導するが、非瘻孔ＣＬＰＦからは誘導しないことを見出した。付加的に瘻孔形成ＣＤを有する患者から単離されたＣＬＰＦは、瘻孔を有さないＣＤ患者由来の細胞よりも高い基礎レベルのＩＬ−１３分泌も表した。ウエスタンブロッティングにより、本発明者らはＴＧＦβ処理瘻孔ＣＬＰＦが、これらの細胞からの上昇したＩＬ−１３分泌とは反対に低下したレベルのＰＴＰＮ２を示すことを見出した。ＣＤ病変形成について中心的役割を演じると広く示されている（３１）ＴＮＦは、瘻孔ＣＬＰＦからのＩＬ−１３分泌のさらなる上昇のためには十分でないが、ＰＴＰＮ２発現を強く誘導した。ＩＬ−１３分泌に関してＰＴＰＮ２に対して示唆された制御的役割は、ＩＥＣを用いてさらに定義されうる。本明細書においてＴＮＦは、瘻孔ＣＬＰＦにおいてと同様、ＰＴＰＮ２コンピテント細胞におけるＩＬ−１３分泌を誘導するために十分ではなかった。しかしＰＴＰＮ２ノックダウンは、ＴＮＦがＩＬ−１３を誘導することを可能にした。ＴＧＦβはＩＥＣにおいてＰＴＰＮ２タンパク質レベルを低下させたが、処理の４８時間後にこれらの細胞からＩＬ−１３分泌を誘導するためにはまだ十分ではなく、処理７日後には十分であった。これは、機能的ＰＴＰＮ２の一定の基礎がＩＥＣにおけるＩＬ−１３分泌を妨げうることを示唆する。ＰＴＰＮ２遺伝子中の単一のヌクレオチド多型が貫通性ＣＤ疾患経過と近年関連していることから（３２）これらの観察結果は特別な関心事である。それにもかかわらず、ＴＧＦβがＩＥＣからのＩＬ−１３の分泌を刺激できるようにするためには、付加的事象が必要であると考えられる（恐らくＴＧＦβへの長期間暴露に続くこれらの細胞中でのＳＮＡＩＬ１転写因子の同時発現またはエピジェネティック修飾（本発明者らはこれが正式に実証されていないことを認める））。しかし全体として本発明者らのデータは、ＰＴＰＮ２活性がＩＥＣおよびＣＬＰＦにおけるＩＬ−１３分泌を調節できることを示唆し、機能的側面（遺伝的ＰＴＰＮ２変種がどのように貫通性ＣＤ表現型の出現に寄与しうるか）を明らかにしている。
【００８８】
ＴＣは、ＥＭＴを生じるＩＥＣを本来は表す。しかしそれらの形質転換的潜在力に加えて、それらが瘻孔の侵襲性先端で見出されうることから、それらは隣接する組織層へ貫通する重要な能力を明らかに示す。本発明者らは、ＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンが瘻管周辺のＴＣまたは間葉系様細胞で発現されることを以前見出した（Scharl、印刷中）（６）。これらの遺伝子の両方が腫瘍侵襲性および細胞浸潤に関連している（１５〜１７）。したがって本発明者らは、ＩＥＣがＥＭＴ経過においてこれらの両方の分子の発現を上方制御することを推測した。しかしＴＧＦβでのＨＴ２９スフェロイドの慢性処理は上皮細胞形成のＥＭＴ様崩壊およびＳＮＡＩＬ１  ｍＲＮＡのＥＭＴ典型的上方制御をもたらしたが、ＳＬＵＧまたはβ６−インテグリンのｍＲＮＡ発現を誘導するために十分でなく、ＩＬ−１３のｍＲＮＡレベルの増加を生じた、本発明者らがＴＣにおいてＩＬ−１３およびＩＬ−１３Ｒβ１について強い染色ならびに非瘻孔形成ＣＤ由来のものと比較して瘻孔形成ＣＤを有する患者由来のＣＬＰＦにおいてＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンの上昇したレベルを見出したことから、本発明者らは、ＩＬ−１３が細胞浸潤に関与する遺伝子の発現を誘導するために自己分泌様式でＴＣに作用できるという仮説をたてた。この仮説を検討するために、本発明者らはＨＴ２９  ＩＥＣをＩＬ−１３で処理した。本発明者らは、ＨＴ２９単層においておよびスフェロイドモデルにおいてサイトカインがＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンのｍＲＮＡレベルを誘導できたことを見出した。しかし後者においてＩＬ−１３は、これらの細胞のＥＭＴ表現型を誘導するためには十分ではなく、これらの観察結果はＩＬ−１３が膵臓がんにおける細胞浸潤の増加に関与することを示す近年の知見（２３〜２６）と良く一致する。全体としてこれらの観察結果は、ＣＤ関連瘻孔の病変形成におけるＩＬ−１３の以前は未知であった役割を強く支持する。
【００８９】
ＨＴ２９スフェロイドのＴＧＦβ処理は、ＳＮＡＩＬ１  ｍＲＮＡの時間依存的上方制御をもたらすが、β６−インテグリンおよびＳＬＵＧの下方制御をもたらし、７日後に記載した全ての効果についてピークに達する。逆も同様に、ＩＬ−１３はＳＬＵＧおよびβ６−インテグリンレベルを処理後１日で既に誘導し、それらの発現レベルは７日後には対照レベルに低下する。興味深いことにＳＮＡＩＬ１  ｍＲＮＡ発現は、対照細胞においてよりもＩＬ−１３処理７日後に３倍高かった。これらの観察結果は、ＳＮＡＩＬ１がＩＥＣにおいてＳＬＵＧおよびβ６−インテグリン発現の抑制因子として作用しうることを示唆する。この知見は、ＴＧＦ  ／ＳＮＡＩＬ１誘導ＥＭＴは活発なＣＤの際に存在すると慢性炎症および組織破壊の部位で創傷治癒および組織再生の機構として作用する（３３）が、ＣＤ瘻孔において観察されうる侵襲性潜在力を表さないということをある程度説明できる。対照的にＩＥＣのＴＧＦβへの慢性暴露後に発現されるＩＬ−１３は、ＥＭＴ細胞の侵襲的潜在力を自己分泌様式で推進する。この観察結果は、線維化の際にＩＬ−１３がＴＧＦβの上流に作用することから以前の知見とは反対であると考えられ、一方で細胞浸潤の状況ではサイトカインは増殖因子によって制御されると考えられる。
【００９０】
要約すると本発明者らのデータは、ＣＤ関連瘻孔の病変形成におけるＴＧＦβおよびＩＬ−１３についての機能的役割を初めて示す。両方のメディエーターは、上皮細胞形成の崩壊を生じることによってＴＧＦβがＥＭＴを誘導し、ＩＬ−１３が最終的にＥＭＴ細胞がより深い組織層に浸透できるようにする相乗的段階的な工程において協働すると考えられている。これらの知見は、ＴＧＦβおよび／またはＩＬ−１３誘導効果の調節不全がＣＤ関連瘻孔の病変形成について中心的役割を演じることを示唆し、ＣＤ経過において瘻孔の発症をもたらす詳細な機構のさらなる調査の重要性を強調する。付加的にこれらの観察結果は、そのような瘻孔の治療のための新規でより効果的な治療戦略の開発のための新たな手段をひらく可能性がある。
【００９１】
実施例１〜７についての材料および方法
ヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）、ＴＧＦβ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、ＴＮＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、マウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、マウス抗ＰＴＰＮ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、マウス抗クローディン−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびウサギ抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）は記載した供給元から得た。ウサギ抗ホスホＥＲＫ１／２−（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ウサギ抗ＳＴＡＴ６、ウサギ抗ホスホＳＴＡＴ６−（Ｔｙｒ５４１）、ウサギ抗β−カテニン、ウサギ抗Ｅ−カドヘリン、ウサギ抗オクルディン抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡから得た。ウサギ抗ＭＭＰ−１３（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）抗体は全長および切断の両方、タンパク質変種の全てを検出した。他の全ての試薬は分析用であり、商業的に入手した。
【００９２】
細胞培養
ヒトＴ８４ＩＥＣを１０％ＣＯ２を含む加湿した雰囲気中で、１０％仔ウシ血清を補充した４．５％高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養した。ヒトＨＴ２９  ＩＥＣを１０％ＣＯ２を含む加湿した雰囲気中で、１０％ウシ胎児血清を補充したマッコイ５Ａ培地（ＪＲＨ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）で培養した。細胞をトリプシン処理によって分離した。単層で増殖させた場合、細胞１×１０６個を１２ｍｍＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＨＡ  ｓｅｍｉ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上に播種した。処理前に細胞を５〜７日間培養した。それらの受容体局在に応じて、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＧＦ  （５０ｎｇ／ｍｌ）を基底外側から添加した。スフェロイドについては、１ウエルあたりＨＴ２９細胞４５００〜５０００個をＴｅｒａｓａｋｉ  ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種し、７日間増殖させた。次いで細胞をＩＬ−１３またはＴＧＦβを培地に添加することによってさらに７日間刺激した。スフェロイドの形態学的発達を８、１０、１２および１４日目にＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４．７．２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ）上のＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｃ５（Ｚｅｉｓｓ）を用いて透過型顕微鏡によってモニターした。
【００９３】
患者試料
免疫組織化学のためにＣＤ患者由来の肛門周囲瘻孔標本をＣＤを有するおよび有さない男性および女性個体から予め収集した。本発明者らは、ＣＤ患者７名からのホルマリン固定組織試料中の瘻孔７個を調査した。瘻孔は外科的に切除され、直ちに４％ホルマリンに移され、さらなる分析まで４℃で保存された。初代ＣＬＰＦ培養物は、ＣＤ患者７名（平均年齢５３±５歳）の腸管粘膜の瘻孔形成領域からまたは非瘻孔形成ＣＤを有する患者５名（平均年齢４５±１３歳）の腸管粘膜から得た。試料は男性および女性患者から収集し、ＣＬＰＦ培養物は外科的標本から収集した。書面によるインフォームドコンセントを標本収集前に得て、研究は地域の倫理委員会によって承認された。
【００９４】
ヒトＣＬＰＦの単離および培養
手順は、以前記載のとおり実施した（３４）。生検をＣＬＰＦの単離のために直接用いた一方で、外科的標本由来の粘膜は最初に１ｍｍ片に切断し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するダルベッコ変法イーグル高グルコース培地（ＤＭＥＭ；ＰＡＡ、Ｃｏｌｂｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からなる線維芽細胞培地中で洗浄し、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（８μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびアムホテリシンＢ（１μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭを含む２５ｃｍ２培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｂｏｄｅｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で培養した。組織をリンスし、３０分間、３７℃でＣａ２＋およびＭｇ２＋（ＰＡＡ）、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．３ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および２ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）中で消化した。単離後、細胞をリンスした。非接着細胞の除去を複数回の培地交換によって実施し、残った細胞を３から８回継代の間で用いた。
【００９５】
ヒトＣＬＰＦの刺激
細胞２×１０６個を既に記載のとおり播種し、２４時間、３７℃で培養した（３４）。培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ（５０ｎｇ／ｍｌ）をＦＣＳを含まないＤＭＥＭに添加した。対照細胞は無血清培地（ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ）にそれぞれ保持した。
【００９６】
免疫組織化学
免疫組織化学研究をホルマリン固定、パラフィン包埋組織標本において、既に記載のとおりジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原と共にペルオキシダーゼに基づく方法を用いて実施した２３。簡潔には、組織試料をキシロールと共に、エタノール濃度を低下させながらインキュベートした。抗原修復をクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、３０分間、９８℃で実施した。内在性ペルオキシダーゼを０．９％過酸化水素との１５分間、室温（ＲＴ）でのインキュベーションによって除去し、３％ＢＳＡを用いて１時間、ＲＴでブロッキングを実施した。次いで抗体を最適濃度で一晩、ウェットチャンバーに添加した。ウサギ抗ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ−１３Ｒα１（Ａｂｃａｍ）抗体を記載した供給元から得た。二次抗体（ＤＡＫＯからのＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ−Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）を１時間、ＲＴで添加し、抗体結合をＬｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）によって可視化した。次いで試料をヘマトキシリンで対比染色し、濃度を上昇させたエタノールとキシロール溶液中でインキュベートし、最後にマウントした。顕微鏡評価をＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４．７．２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ）上のＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｃ５（Ｚｅｉｓｓ）を用いて行った。
【００９７】
リアルタイムＰＣＲ
細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に再懸濁し、シリンジに付けた２４ゲージ針を用いて溶解した。ｍＲＮＡをシュレッダーを含むＱＩＡ−Ｃｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いるＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、ＤＮＡをＤＮａｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ）によって製造者の説明書に従って除去した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０および２８０ｎｍでの吸光度によってアッセイした。ｃＤＮＡ合成をＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＴａｑＭａｎ  ＡｓｓａｙｓおよびＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。リアルタイムＰＣＲをＳＤＳ  ２．２  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍで実施した。３種類の測定を実施し、ヒトβ−アクチンを内在性標準として用いた。次いで結果をΔΔＣＴ−法によって分析した。リアルタイムＰＣＲは４０サイクルを含んだ。
【００９８】
全細胞可溶化物の調製
全細胞可溶化物をＭ−Ｐｅｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造者の説明書に従って用いて作製した。タンパク質含有量をＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。
【００９９】
ウエスタンブロッティング
各可溶化物の一定分量をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４ｘＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０ｍＭジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ）と混合し、５分間、９６℃で煮沸した。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。膜を１％ブロッキング溶液でブロックし、ウサギ抗ＳＮＡＩＬ１抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ）を一晩添加した。膜を１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（１％ＴＢＳＴ）で１時間洗浄し、ＨＲＰ標識二次抗ウサギＩｇＧ抗体（１：３０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を３０分間添加し、膜を１％ＴＢＳＴで１時間洗浄した。最後に免疫反応性タンパク質をｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）を用いて検出した。
【０１００】
ＥＬＩＳＡ
細胞上清を回収し、さらなる処理まで−８０℃で保存した。ヒトＩＬ−１３を検出するＥＬＩＳＡキットは、Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。アッセイは、１反応あたり５０μｌの試料量を用いて製造者の説明書に従って実行した。４５０ｎｍでの吸光度をＧｅｎ  ５  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いてＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダーで検出した。測定は２回ずつ実施した。
【０１０１】
ｓｉＲＮＡ形質移入
ＨＴ２９（２×１０６個）細胞を形質移入の前に５日間播種した。３種の異なるａｎｎｅａｌｅｄ  ＳＬＵＧ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の１００ｐｍｏｌをＡｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いてＨＴ２９細胞に形質移入した。形質移入後、ＩＥＣを処理前にフィルター膜上で４８時間培養した。非特異的対照ｓｉＲＮＡ（ＡＢＩ）（形質移入１回あたり１００ｐｍｏｌ）を陰性対照として用いた。
【０１０２】
統計解析
データを一連のｎ回の実験について平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。統計解析をＡＮＯＶＡに続いて必要に応じてスチューデント−ニューマン−ケウルスポストホックテスト（Student-Newman-Keuls post hoc test）またはスチューデントのｔ検定によって実行した。Ｐ値＜０．０５を有意とした。
【実施例８】
【０１０３】
ＣＤ患者における瘻孔の治療
本実施例は、特定の抗体でのＣＤ患者における瘻孔の治療がどのように実施されうるかおよび評価された効果を示す。例えば正確な投薬量および投与計画は用いられる特定の抗体に応じて変化する場合があるが、他のＩＬ−１３抗体が同様の様式において用いられうることは当業者に明らかである。
【０１０４】
用量／治療計画、治療期間の理論的根拠
提案された試験の有効性は、瘻孔を閉鎖に導くような変化を必要とする。現在の考えは、瘻管を覆っている細胞におけるＩＬ−１３の高い局所的発現が組織再構築および線維症の鍵となるメディエーターであると仮定している。したがって閉鎖への効果を達成するためには、瘻孔組織中の局所的ＩＬ−１３の阻害が必要である。ＩＬ−１３を阻害するために瘻孔において必要な０１９５１／Ｇ１２の量は、原則として０１９５１／Ｇ１２とＩＬ−１３との間の結合平衡を記す式から導くことができる。しかし局所的ＩＬ−１３濃度は未知である。付加的に０１９５１／Ｇ１２に関する瘻孔組織到達性は未知であり、したがって局所０１９５１／Ｇ１２濃度は血漿濃度から予測できない。結果として十分に高い用量が０１９５１／Ｇ１２の瘻孔組織への浸透を導くために用いられるべきである。０１９５１／Ｇ１２に局所ＩＬ−１３を阻害する最良の機会を与えるために、０１９５１／Ｇ１２、１０ｍｇ／ｋｇを３週間ごとの用量を提案する。
【０１０５】
ガラスバイアル中の溶液用０１９５１／Ｇ１２  １５０ｍｇ粉末
それぞれ０１９５１／Ｇ１２  １５０ｍｇを凍結乾燥ケーキとして含有する溶液用０１９５１／Ｇ１２  １５０ｍｇ粉末をガラスバイアル中で提供する。バイアルは、０１９５１／Ｇ１２の標示量の完全な回収を可能にするために２０％過充填を含有する。溶液用０１９５１／Ｇ１２粉末についての製造工程は、標準的製造工程：希釈、混合／撹拌、予備および滅菌ろ過、無菌充填ならびに凍結乾燥からなる。薬物製品は、２から８℃で保存すれば薬物製品の表示に記される日付まで安定であると考えられる。継続中の安定性研究の結果に基づいて、再試験期間は適切に調整される。投与の直前に注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）をバイアルに添加し、粉末を（使用前に希釈される必要がある）単回使用注入用溶液濃縮物をもたらすように使用の準備のために溶解する。続く静脈投与のために得られた注入用溶液濃縮物は、すぐに使用できる注入用０１９５１／Ｇ１２溶液にさらに希釈される必要がある。
【０１０６】
注入用０１９５１／Ｇ１２溶液
０１９５１／Ｇ１２  １５０ｍｇ溶液用粉末の１．０ｍＬ  ＳＷＦＩでの再構成は、０１９５１／Ｇ１２  １５０ｍｇ／ｍｌの濃度で最終総体積１．２ｍｌの注入用溶液濃縮物を生成する。注入用溶液濃縮物は、スクロース、グリシンおよびポリソルベート８０を含有するヒスチジン（ｐＨ６．０±０．５）緩衝溶液として利用できる。製剤用量は、単回用量投与のためだけに使用されることから保存剤を含有しない。この濃度を下に提供する使用のための説明書に従って次に５％グルコース／デキストロース溶液を含む注入用バッグ中に希釈する。０１９５１／Ｇ１２がタンパク質であることから、再構成バイアルは、わずかな半透明の粒子を含有する場合がある。したがって注入用溶液は０．２ミクロンインラインフィルターを通して注入されなければならない（「用いられた材料」のフィルター供給者要求事項を参照されたい）。
【０１０７】
・注入用溶液濃縮物を対象に直接注射してはならず、下の調製説明書に従うこと。
【０１０８】
用量／体積算出
注：バイアルは０１９５１／Ｇ１２の２０％過充填を含有する。下に記載される用量／体積算出は、正確に遵守されるべきである。
【０１０９】
対象への投与のための用量は、ベースライン来診時に測定した個々の対象の体重から算出される。
【０１１０】
１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルが投与されうる。
・用量算出：
・用量（ｍｇ）＝患者の体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）
・体積算出：
【０１１１】
必要である０１９５１／Ｇ１２注入用溶液濃縮物の体積を得るために、算出された用量は注入用溶液濃縮物の濃度（すなわち１５０ｍｇ／ｍＬ）で割られる。
【０１１２】
例：
対象体重：６５ｋｇ
用量レベル：１０ｍｇ／ｋｇ
算出された用量：６５０ｍｇ
算出された体積：６５０ｍｇ／１５０ｍｇ／ｍＬ＝４．３ｍＬ
算出されたバイアル数：４．３／１．２＝１用量あたり４本
【０１１３】
用いられた材料
静脈フィルターセットを含む注入セットは、製造者によって供給される説明書に従って調製されなければならない（各国ごとである場合があるため製品参照番号は記載しない）。
【０１１４】
・注入用バッグ：
・Ｂａｘｔｅｒ  Ｖｉａｆｌｅｘ  ５％ブドウ糖注射２５０ｍＬ
・５％グルコース添加Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｅｃｏｆｌａｃ、２５０ｍＬ
・注入ライン：
・オスルアーロックアダプターを含むＢａｘｔｅｒ溶液セット１０１”（２．６ｍ）
・Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｉｎｆｕｓｏｍａｔ  ｔｕｂｉｎｇ、標準型（２５０ｃｍ）
・Ａｌａｒｉｓ  Ｐｕｍｐ  ｍｏｄｕｌｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｓｅｔ：０．２ミクロン（低タンパク質結合）フィルターおよび１インジェクションポート（２８５ｃｍ）を有する低吸着セット
・インラインフィルター（ＢａｘｔｅｒまたはＢ．Ｂｒａｕｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｌｉｎｅｓを使用する場合は取り付けなければならない）：
・Ｐａｌｌ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅ（登録商標）ＥＬＤ  ０．２μｍ静脈フィルターセット
・算出された用量を分注するために十分な０１９５１／Ｇ１２  １５０ｍｇ溶液用粉末バイアル（上記用量の下を参照されたい）．
・凍結乾燥物の再構成を実施するための１ｍＬ目盛り付きディスポーザブルシリンジ（１．０ｍＬ測定用）
・希釈を実施するために適切な容量のシリンジ
・再構成および再構成された溶液の回収に好適なサイズの針（例えば２１Ｇｘ２”）
・注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）
【０１１５】
調製
・０１９５１／Ｇ１２の凍結乾燥ケーキを含有するバイアルにＳＷＦＩ  １．０ｍＬをゆっくり注入することにより各バイアルを再構築する。希釈剤は凍結乾燥ケーキに直接注がれるべきである。次いでバイアルを角度およそ４５°傾け、指先で穏やかに約１分間回転させる。
【０１１６】
・さらにバイアルを室温で最低１０分間実験台に立てて、上に記載のとおり時折回転させながら（３〜５回／１５分間、それぞれ２０〜６０秒間）インキュベートする。溶液の起泡はよくあることであることに注意されたい。バイアルを振盪または反転させない。
・バイアルをおよそ５分間静置する。得られた溶液は、本質的に目に見える粒子を含まず、乳白色で清澄、無色である。
・個々の対象それぞれについて用いる０１９５１／Ｇ１２注入用溶液濃縮物の体積を体重および用量レベルにより算出する（上記用量／体積算出の下を参照されたい）。
・注入用バッグからこの体積を回収し、廃棄。
・０１９５１／Ｇ１２注入用溶液濃縮物の算出した体積をバイアルから好適なシリンジに注意深く回収。
・０１９５１／Ｇ１２注入用溶液濃縮物を注入用バッグにゆっくり注入し、バッグを穏やかに撹拌することによって混合する。起泡を避けるために振盪しない。
【０１１７】
投与
０１９５１／Ｇ１２は、上に指定した材料（注入バッグの調製を参照されたい）を用いて流速約２ｍＬ／分（総投与時間：およそ１２０分間）で注入として投与されるべきである。０１９５１／Ｇ１２注入は、重力法での投与によってまたは注入ポンプ（例えば、Ｂａｘｔｅｒ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｌｉｎｅを用いる場合はＣｏｌｌｅａｇｕｅ  ＣＸＥ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ注入ポンプ；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｆｕｓｏｍａｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｌｉｎｅを用いる場合はＩｎｆｕｓｏｍａｔ（登録商標）ｆｍＳ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ注入ポンプ、Ａｌａｒｉｓポンプモジュール注入ラインを用いる場合はＡｌａｒｉｓ  Ｇｅｍｉｎｉ注入ポンプ）を用いて実施されうる。
【０１１８】
瘻孔活動度の臨床的評価
瘻孔閉鎖は、試験責任医師によって臨床的に評価される。瘻孔活動度の臨床評価は、
・硬化、色および皮膚瘻孔開口部（複数可）の領域の推定の記載を含む瘻孔（複数可）の位置および外観；
・瘻孔端に穏やかな圧力をかけた後に放出された化膿性瘻孔の量
の評価および文書化を含む。付加的に瘻孔活動度が前回来診と比較して増加した、未変化または低下したかどうかも評価されうる。
【０１１９】
写真記録
写真記録は、瘻孔治癒の文書化を可能にするために本研究において利用される。
【０１２０】
ＭＲＩ評価
ＭＲＩは、広い視野を有して優れた軟部組織の識別を提供し、放射線障害を有さないことから骨盤を研究するための有用な技術である。本研究では骨盤ＭＲＩが肛門周囲瘻孔の複雑度および挙動を経時的に評価するために用いられる。ＭＲＩ画像は、（Van Assche,et al 2003）に記載されたとおり、瘻管周辺の解剖学的変化および活動性炎症の両方を反映するスコアを作るために分析される。
【０１２１】
健康関連の生活の質（ＳＩＢＤＱ）
短い炎症性腸疾患質問票（ＳＩＢＤＱ）を本研究に含む目的は、瘻孔形成クローン病を有する対象における疾患特異的健康関連の生活の質を評価するためである。ＳＩＢＤＱは、臨床試験および研究において広く用いられる有効、高感度で信頼できる測定である。ＳＩＢＤＱは、４個のサブスケール（腸症状、全身症状、情緒機能、社会的機能を含む）に分類される１０項目を含む。各項目は１点（最悪）から７点（最良）の範囲の７点リッカートスケールで採点される。
【０１２２】
内視鏡的生検手順
瘻管からの生検は、スクリーニングの際および０１９５１／Ｇ１２の最初の適用の１週間後（Ｄ８±２日）に内視鏡的に得られる。目的は、瘻管の内膜からそれらの管腔開口部を介して生検を得るためである。管腔開口部が到達不可能である場合、試験責任医師はどのように進めるかについて症例ごとに試験依頼者の助言および双方の同意を求める。そのような場合、例えば粘膜生検が内部瘻孔開口部のすぐ近くから得られる場合もある。
【０１２３】
内視鏡的技術の選択は、試験責任医師の裁量であり、ほとんどの患者は生検手順のために適切に鎮痛−鎮静（analgo-sedated）される必要がある。視覚制御下で試験責任医師は瘻管の壁から１から２個の標準的生検を採取する。生検１個は直ちにＲＮＡ保存培地に入れ、他の生検は１０％緩衝ホルマリン溶液を含むチューブに入れ組織学的検査のために処理する。手順は別の指示書により詳細に記載される。
【０１２４】
組織学のために処理された試料は、瘻管の壁における形態学的変化を評価するために病理医によって調査され、残りのパラフィンブロックはさらなる調査（免疫組織化学および／またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）のために保存する。
【０１２５】
遺伝子発現プロファイリングを目的とする試料は、ＲＮＡマイクロアレイ分析のために処理する。
【０１２６】
ＴＧＦ−β、ペリオスチン、エオタキシン−１、ＰＩＣＰおよびＰＩＩＩＮＰ、ＩＬ−４
を含むがこれだけに限らない可溶性バイオマーカー
【０１２７】
原理
血清および血漿試料をＩＬ−１３経路の下流バイオマーカーまたは他の線維化機構との関連で評価するために収集する。最終的なバイオマーカーパネルは、ＴＧＦ−β、ペリオスチン、エオタキシン−１、ＰＩＣＰ、ＰＩＩＩＮＰおよびＩＬ−４を含むがこれだけに限らない。ＩＬ−１３受容体などのさらなるバイオマーカーを評価できるかどうかは、関連するアッセイの有効性に依存する。
【０１２８】
バイオマーカーと臨床応答との間の潜在的関係が探究される。
【０１２９】
ある特定のレベルでの任意の特異的バイオマーカー（またはそれらの組合せ）が他よりも処理への臨床応答のより重要な予測因子であるかどうかという問題を標的集団のより良い定義を可能にするために調査する。血漿用の追加的血液（１時点あたり４ｍＬ）をさらなる調査の可能性のために採取する。
【０１３０】
ＴＧＦ−β、ペリオスチン、エオタキシン−１、ＰＩＣＰおよびＰＩＩＩＮＰのための試料収集手順
・血清
１４ｍｌ血液試料１個を９ｍｌ血清を確保するために取る。
【０１３１】
全ての血液試料は、直接静脈穿刺または前腕静脈に挿入した留置カニューレのいずれかによって採取し、滅菌チューブに回収する。血液回収後、血液試料は３０分間、室温で凝血させる。次いでチューブは氷上に置かれなければならない。次いで試料は直ちに４℃、２０００ｇ×１０分間遠心分離される。遠心分離後、上清を新たな滅菌ポリプロピレンチューブに移し、反転により穏やかに混合する。
【０１３２】
血清試料は、０．５ｍｌポリプロピレンクライオバイアル（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｎｏ．７２．７３０．００６または同等品）に２５０μｌで分注し、少なくとも−２０℃で（＝−７０℃が好ましい温度であるが、試料は等しく扱われなければならない）静脈穿刺の４５分間以内に直ちに凍結する。発送はドライアイス上で回収当日に実施されなければならない。中央研究所および分析地へ到着したら、試料は−７０℃で保存されなければならない。
【０１３３】
凝血時を除いて、処理中に試料を室温に置くことは（ほんの数分間でも）避けなければならない。処理中に試料を氷上（２〜４℃）に置くことは合計で４５分間を超えてはならない。試料は研究所マニュアルに指定されるとおり発送されなければならない。
・血漿
血漿２ｍＬを確保するために静脈血試料４ｍｌ  １個をＥＤＴＡチューブに回収するべきである。
【０１３４】
各チューブの血液を取った直後にチューブ内容物（例えば抗凝血剤）の混合を確実にするために穏やかに数回反転させる。試料のゴム栓との長期間の接触は避ける。遠心分離までチューブを氷を敷き詰めた試験管立てに直立させる。３０分以内に試料を３から５℃で１０分間、およそ２５００ｇ（または清澄な血漿層を得るための十分な設定）で遠心分離する。遠心分離後、直ちに上清血漿を２５０μｌ一定分量で０．５ｍｌポリプロピレンクライオバイアル（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｎｏ．７２．７３０．００６または同等品）に移し、少なくとも−２０℃で（−７０℃が好ましい温度であるが、試料は等しく扱われなければならない）静脈穿刺の４５分間以内に直ちに凍結する。発送はドライアイス上で回収当日に実施されなければならない。中央研究所および分析地へ到着したら、試料は−７０℃で保存されなければならない。
【０１３５】
便カルプロテクチンおよびラクトフェリンレベル
便カルプロテクチンおよびラクトフェリンレベルは、クローン病活動度の評価および経過観察のために広く用いられるバイオマーカーであり、内視鏡所見に相関し、非侵襲性、炎症疾患マーカーを提供する。
【０１３６】
試料収集手順
それぞれの計画された試料採取時点について２個の便試料（各およそ５ｇ）を２個の３０ｍＬ便回収チューブに回収し、直ちに−１８℃から−２０°に保存する。試料はドライアイス上で（次に利用可能な発送で）中央研究所に発送できる。
【０１３７】
試料分析方法
ＥＬＩＳＡによる非侵襲性、炎症疾患マーカーとしての便カルプロテクチンおよびラクトフェリンのレベルにおける変化は、臨床的有効性とのそれらの関係に関して探索される。
【０１３８】
臨床試験の予備評価
上に記載された試験治療に対する生物学的応答の予備評価は、瘻孔を有する患者が０１９５１／Ｇ１２  ＩＬ−１３抗体での治療に応答したことを示した。患者での瘻孔全体の活動度は低下し、観察された特定の改善は疼痛減少および瘻孔からの粘液排出の消失を含んでいた。結論は、ＩＬ−１３抗体が瘻孔活動度を低下させるポジティブな臨床効果を有していたことである。
【０１３９】
本発明が単なる例として記載され、本発明の範囲および精神内に留まったままで変更がなされうることは理解される。
（参考文献）
【化１４】
2014507436.tif 000019
【化１５】
2014507436.tif 000020
【化１６】
2014507436.tif 000021
【化１７】
2014507436.tif 000022
【図１】
2014507436.tif 000023
【図２】
2014507436.tif 000024
【図３】
2014507436.tif 000025
【図４】
2014507436.tif 000026
【図５】
2014507436.tif 000027
【図６】
2014507436.tif 000028
【図７】
2014507436.tif 000029
【図８】
2014507436.tif 000030
【配列表】
2014507436000001.app
【国際調査報告】
2014507436.tif 000031
2014507436.tif 000032
2014507436.tif 000033
2014507436.tif 000034
2014507436.tif 000035
2014507436.tif 000036