(57)【要約】本発明は抗−ＭＩＦ抗体の製造における、特定のＣＨＯ−ＭＩＦ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株からのマクロファージ遊走阻止因子）複合体の特異的および非常に高感度の検出に関する。本発明はさらに、ＣＨＯ−ＭＩＦ検出方法に使用できる、特異的抗体の提供に関する。本発明はまた、ＣＨＯ  ＭＩＦノックアウト細胞株とその使用に関する。本発明はまた、本質的にＣＨＯ−ＭＩＦのないＣＨＯ細胞株における組換え生産物から得られた調製物を提供する。
2014530361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗−ＭＩＦ抗体調製物を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に対して親和性精製された、ポリクローナル抗−ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体と接触させる、
段階を含む、モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体調製物におけるＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を検出するための方法。
【請求項２】
ＣＨＯ−ＭＩＦが、最終ＣＨＯ細胞産生モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体、その調製物、またはその抗原結合断片の調製物を汚染する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＨＯ−ＭＩＦが、ＣＨＯ細胞によって産生された内因性ＣＨＯ−ＭＩＦである、請求項１および／または２に記載の方法。
【請求項４】
検出段階が、半定量性ウエスタンブロット分析によって実施される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＨＯ−ＭＩＦに対して親和性精製された、ウサギ抗−ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の、モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片の製造中またはモノクローナル抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片の最終調製物中のＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の検出のための使用。
【請求項６】
検出段階が、半定量性ウエスタンブロット分析によって実施される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において抗−マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、該抗体またはその抗原結合断片が本質的にＣＨＯ−ＭＩＦなしであり、請求項１から６のいずれか１項に規定される検出方法が実施される、方法。
【請求項８】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）遺伝子がノックアウトされている、ＣＨＯ−ＭＩＦノックアウト細胞株。
【請求項９】
細胞株が、プラスミドＤＳＭ  ２５１１０およびＤＳＭ  ２５１１２、またはプラスミドＤＳＭ  ２５８６１およびＤＳＭ  ２５８６２を含む、請求項８に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
【請求項１０】
細胞株が、プラスミドＤＳＭ  ２５１１１およびＤＳＭ  ２５１１３、またはプラスミドＤＳＭ  ２５８５９およびＤＳＭ  ２５８６０を含む、請求項８に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
【請求項１１】
細胞株が、プラスミドＤＳＭ  ２５１１４およびＤＳＭ  ２５１１５、またはプラスミドＤＳＭ  ２５８６３およびＤＳＭ  ２５８６４を含む、請求項８に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれかのＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株の、モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体またはその結合断片の調製物の製造のための、好ましくは、抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ９、ＲＡＢ４、ＲＡＭ０、ＲＡＭ９またはＲＡＭ４のいずれか１つの製造のための、使用。
【請求項１３】
請求項７の方法、または請求項８から１１のいずれかのＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株を用いて得られる、本質的にＣＨＯ  ＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体調製物。
【請求項１４】
請求項８から１２のいずれか１項に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株を用いることを特徴とする、本質的にＣＨＯ  ＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体調製物の製造のための方法。
【請求項１５】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中で製造される、本質的にＣＨＯ−マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のないことを特徴とする、組換えＭＩＦ結合タンパク質調製物、好ましくは（ｈ）ＭＩＦ結合ペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはＭＩＦ受容体断片のような（ｈ）ＭＩＦ結合タンパク質の調製物、または抗−（ｈ）ＭＩＦ抗体調製物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法、または請求項１〜４または７のいずれかの検出方法を、好ましくは品質管理段階として含む製造方法によって得られる、組換えＭＩＦ結合タンパク質調製物、好ましくは（ｈ）ＭＩＦ結合ペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはＭＩＦ受容体断片のような（ｈ）ＭＩＦ結合タンパク質の調製物、または抗−（ｈ）ＭＩＦ抗体調製物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法、または請求項１〜４または７のいずれかの検出方法を、好ましくは品質管理段階として含む製造方法によって製造される、組換えＭＩＦ結合タンパク質調製物、好ましくは（ｈ）ＭＩＦ結合ペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはＭＩＦ受容体断片のような（ｈ）ＭＩＦ結合タンパク質の調製物、または抗−（ｈ）ＭＩＦ抗体調製物。
【請求項１８】
本質的にＣＨＯ  ＭＩＦのない、抗−ｈＭＩＦ抗体がＲＡＢ４、ＲＡＢ０、ＲＡＢ９、ＲＡＭ４、ＲＡＭ０および／またはＲＡＭ９の群から選択される、請求項１５〜１７のいずれかの抗−ｈＭＩＦ抗体調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子の同定および特性評価に基づく。これは、特に抗−ＭＩＦ抗体の製造において、ＣＨＯ−ＭＩＦノックアウト細胞の提供を許容し、特定のＣＨＯ−ＭＩＦ複合体の高感度の検出方法の基礎を形成した。本発明はさらに、ＣＨＯ−ＭＩＦ検出方法に使用できる、有利なポリクローナルウサギ抗血清の提供に関する。さらに、ＣＨＯ細胞中の内在性遺伝子をノックアウトすることによって、抗ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦでのいかなる汚染を避けるための方法が示される。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、ツベルクリン過敏性モルモットからの腹腔滲出細胞（マクロファージを含む）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無作為な遊走を阻害する能力に基づいて最初に単離されたサイトカインである（Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６６、１５３、８０−２；Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  １９６６、５６、７２−７）。今日では、ＭＩＦは、活性の多面的スペクトルを発揮する、先天性および後天性の免疫反応の非常に重要な上流調節因子であることが知られている。
【０００３】
ヒトＭＩＦ  ｃＤＮＡは１９８９年にクローニングされ（Ｗｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  １９８９、８６、７５２２−６）、そのゲノムでの局在は、２２番染色体に位置づけられた。ヒトＭＩＦ遺伝子産物は、１１４アミノ酸（Ｎ−末端メチオニンの切断後）で、分子量１２．５ｋＤａのタンパク質である。ＭＩＦは、あらゆる他のタンパク質とも有意な配列相同性を持たない。該タンパク質は、同じサブユニットの三量体として結晶化される。各単量体は、４本鎖βシートに対してパックされる二重逆平行αらせんを含む。該単量体は、隣り合ったサブユニットのβシートと相互作用し、単量体間の接点を形成する、さらなる二本のβ鎖を有する。３つのサブユニットは、分子３回軸に沿ったタンパク質の中心を通り抜ける溶媒が到達可能なチャンネルを含むバレル（ｂａｒｒｅｌ）を形成するよう配置される（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  １９９６、９３、５１９１−５１９６）。
【０００４】
マクロファージからのＭＩＦの分泌は非常に低濃度のグルココルチコイドで誘導されることが報告された（Ｃａｌａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９５、３７７、６８−７１）。しかしながら、ＭＩＦは、グルココルチコイドの作用を逆調節し（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αおよびインターロイキンＩＬ−１βなどの他のサイトカイン、分泌を促す（Ｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００２、３０、Ｓ２７−３５）。また、ＭＩＦは、例えば前−血管由来（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）、前−増殖性（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）および抗アポトーシス性特性を示すために表され、その結果、腫瘍細胞の成長を促進した  （Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｒ．Ａ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，  ２００４．  １６（１）：  ｐ．  １３−１９；  Ｌｕｅ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７．  ２６（３５）：  ｐ．  ５０４６−５９）。それはまた、例えば、リンパ腫、メラノーマ、および結腸癌の成長と直接関連がある（Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  ２０００、２０：７５１−６２）。
【０００５】
ＭＩＦは、多くの病状の介在因子であり、これらに限定されるわけではないが、とりわけ炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、心筋梗塞（ＭＩ）、敗血症、および癌を含む種々の疾患と関連がある。
【０００６】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗−ＭＩＦ抗体は、組換えヒトＭＩＦに対して発現した（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １９９６；３８１、１９９−２０２；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９８６、３９、２２３−２３２；およびＷｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８５、９０、１６７−７８）。
【０００７】
抗ＭＩＦ抗体は、治療的使用が示唆されている。Ｃａｌａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  １９９５．  ４７、３９−５１）は、実験的に誘発したグラム陰性およびグラム陽性敗血症性ショックから動物を保護するための抗−ＭＩＦ抗体の使用について報告した。抗ＭＩＦ抗体は、敗血症性ショックおよび他の炎症性疾患状態におけるサイトカイン産生を調節するための治療手段として示唆された。
【０００８】
ＵＳ６，６４５，４９３は、ＭＩＦの生物活性を中和する、ハイブリドーマ細胞由来のモノクローナル抗ＭＩＦ抗体を開示している。これらマウス由来抗−ＭＩＦ抗体は内毒素性ショックの治療に有益な効果があることが動物モデルにおいて示され得る。
【０００９】
ＵＳ２００３０２３５５８４は、ＭＩＦ遺伝子がホモ接合性にノックアウトされた動物におけるＭＩＦに対する高親和性抗体の製造方法を開示する。
【００１０】
グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）は、Ｇａｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４、２２４、４１７−２１）によって記載されたタンパク質である。ＭＩＦおよびＧＩＦは、現在では同一であると認識されている。Ｗａｔａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ２０００、９７、１３２５１−６）は、Ｔｓ細胞における翻訳後修飾の生化学的性質を同定するための異なるＧＩＦエピトープと結合するポリクローナル抗体について記載した。
【００１１】
したがって、ＭＩＦ／ＧＩＦの明確な生物学的意味の観点において、診断および治療のツールとして、精製抗−ＭＩＦ抗体を提供することが必要であり、非常に望ましいであろう。
【００１２】
明確に、したがって、汚染のない抗−ＭＩＦ抗体の製造のための必要性が存在する。
【００１３】
抗−ＭＩＦ抗体の製造のための様々な方法が、現在利用可能である。１つの主要なアプローチは、宿主細胞が所望の抗−ＭＩＦ抗体製品を発現する、抗−ＭＩＦ抗体の組換産物を使用することである。
【００１４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）の卵巣から得られた細胞株である。それらは治療用タンパク質、例えば、抗体の生物学的および医学的な研究作製において頻繁かつ幅広く使用される。
【００１５】
今日、ＣＨＯ細胞は抗体を含む組換えタンパク治療法の工業的生産のために最も一般的に使用される哺乳類宿主である。
【００１６】
ＣＨＯ細胞はその急速な成長と高いタンパク質産生のために選択される細胞株である。それらは今日の研究およびバイオテクノロジーにおいて、特にタンパク質の長期的で、安定した遺伝子発現および高い収率が必要であるときに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の哺乳類同等物となる。
【００１７】
しかしながら、本発明者らは、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる、抗−ＭＩＦ抗体の可能な好ましい製造および精製工程の調査の際に、ＣＨＯ細胞自体がＭＩＦを生産することを発見した。このことは、例えばハイブリドーマ細胞から、またはポリクローナル抗血清の調製においてＭＩＦを調製するような状況と驚くほど異なっており、そのようなまたは相当する汚染が全くみられない。ＣＨＯ細胞によって生産されるＭＩＦは、チャイニーズハムスターの卵巣細胞からＣＨＯ細胞を得るという事実により、チャイニーズハムスターＭＩＦである。この、「チャイニーズハムスター−ＭＩＦ」（以下および上記においても、「ＣＨＯ−ＭＩＦ」として称される）、ＭＩＦもまた、ＣＨＯ−ＭＩＦおよび他の、例えばヒト、との間の高い相同性により、生産される抗−ＭＩＦ抗体に結合する。したがって、内因性ＣＨＯ−ＭＩＦは、例えばヒトＭＩＦまたはマウスＭＩＦなどの非ＣＨＯ−ＭＩＦを対象とする最終的なＣＨＯ−細胞を基にした調製物（例えば、所望の抗−ＭＩＦ抗体との複合）を汚染し得る。
【００１８】
したがって、ＣＨＯ−ＭＩＦの汚染の可能性を生じない細胞株の提供の必要性；さらにはＣＨＯ−ＭＩＦを生産するＣＨＯ細胞において生産される抗−ＭＩＦ抗体の調製において微量のＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を検出する高感度の方法、およびＣＨＯ−ＭＩＦに汚染されていないそのような抗−ＭＩＦ抗体調製物の製造および精製のための特定の方法の必要性が存在する。本質的にＣＨＯ−ＭＩＦのないＣＨＯ細胞株の提供および潜在的なＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のための高感度な検出法の開発の両方のための前提条件として、上述した問題を解決するための出発点としての、ＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子の同定および特徴付けの必要性が存在する。
【００１９】
野生型ＣＨＯ細胞株と類似の生育および生産特性を提供するそのようなＣＨＯ−ＭＩＦ細胞株の必要性もまた存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の説明
本発明者らは、ＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子を同定し、特徴付けることに成功した。これを基に、彼らはさらに、ＣＨＯ細胞における、本質的にＣＨＯ−ＭＩＦの汚染のない抗−ＭＩＦ抗体調製物の製造および試験を許容するツールおよび方法の提供に成功した。これらのツールおよび方法はさらに、組換えＣＨＯ−ＭＩＦ結合タンパク質を含む、ＣＨＯ細胞において生産される、本質的にＣＨＯ−ＭＩＦの汚染のない、すべての組換体調製物の製造および試験を許容した。組換えＣＨＯ  ＭＩＦ結合タンパク質は、その文脈において、ＣＨＯ  ＭＩＦに結合するタンパク質であり、それゆえ、タンパク質は免疫アッセイ条件下でＣＨＯ  ＭＩＦに結合し、それによって、当業者に周知のとおり、様々な免疫アッセイの形式をこの結合を測定するために使用できる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、そのような反応を測定するために慣用的に使用される；使用できる免疫アッセイ形式および条件の説明のため、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｕｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。
【００２１】
したがって、本発明はＣＨＯ−ＭＩＦをコードする遺伝子座の分析を対象とする。これは本質的にいかなるＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない、組換え抗体または他の産物、好ましくはヒトＭＩＦを対象とする抗体、を生産するＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞の産生を許容する。
【００２２】
本発明はさらにＣＨＯ−ＭＩＦの遺伝子が首尾よくノックアウトされるノックアウト細胞株を対象とする。
【００２３】
本発明はまた、産物、特に抗体およびより好ましくは抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片のＣＨＯ細胞での生産の間に、いくつかの場合に所望の産物に結合したままであることが可能なＣＨＯ−ＭＩＦのｐｐｍレベルでの検出のための高感度な方法を対象とする。好ましい実施形態において、この検出方法は親和性−精製されたポリクローナルウサギ抗体である高特異性抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の生成および精製に基づく。
【００２４】
本発明で記載されるように、非常に少ない量でＣＨＯ−ＭＩＦを検出できる検出方法のみで、最終的な調製物が純粋で、特にＣＨＯ−ＭＩＦのないことを確実にできる。その結果、本発明者らは、ＣＨＯ−ＭＩＦが存在する事象においてＣＨＯ−ＭＩＦに結合できるであろう産物を含む、ＣＨＯ細胞内で生産された、実質的にＣＨＯ−ＭＩＦのない、組換え生産調製物の提供に成功した。好ましくは、ＣＨＯ細胞内で生産された産物は、抗体で有り、より好ましくは抗−ＭＩＦ抗体であり、より好ましくは抗ヒトＭＩＦ抗体である。
【００２５】
これらの抗ヒトＭＩＦ抗体の好ましい実施形態は、以下に記載され、それぞれＲＡＢ４、ＲＡＢ０、ＲＡＢ９、ＲＡＭ４、ＲＡＭ０、およびＲＡＭ９である。
【００２６】
本発明はそれゆえ、特にＣＨＯ−ＭＩＦ汚染が本質的にないことに関する、品質管理上の要求を満たす、上記で規定された組換え調製物を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、ＣＨＯ細胞によって生産される、ＣＨＯ−ＭＩＦをコードするｍＲＮＡの単離も対象とする。本発明によると、このｍＲＮＡの逆転写によって作製されたｃＤＮＡは、原核生物の発現ベクターにクローニングされる。Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現されるＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質は、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）に精製される。組換えＣＨＯ−ＭＩＦは、ＣＨＯ−ＭＩＦに特異的な本発明のポリクローナルウサギ抗体の生成のためにウサギを免疫するために用いられる。
【００２８】
発明の詳細な説明
定義および一般的技術
特記しない限り、本発明に関連して用いる科学用語および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を持つものとする。一般的には、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学の技術およびそれに関連して用いる用語は当該分野でよく知られ、一般に用いられているものである。本発明の方法および技術は、特記しない限り、一般的に、当該分野でよく知られ、本明細書全体に引用され、論じられた種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載された従来の方法に従って行われる。例えば、これらの内容が本明細書の一部を構成する、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、および  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、および  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと。
【００２９】
「ＭＩＦ」または「マクロファージ遊走阻止因子」とは、免疫および炎症反応における非常に重要なメディエーターとして、特にグルココルチコイドの逆調節因子（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として知られるタンパク質をいう。ＭＩＦには、哺乳動物ＭＩＦ、特にヒトＭＩＦ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、一次受託番号：Ｐ１４１７４）が含まれ、ここで、単量体型は、１１５アミノ酸タンパク質としてコードされ、最初のメチオニンの開裂により１１４アミノ酸タンパク質として生成される。「ＭＩＦ」は、また、以前に「ＧＩＦ」（グリコシル化阻害因子）として知られるものも含む。
【００３０】
また知られているものは、例えばＭＩＦの断片または融合タンパク質などの、ＭＩＦの機能的または免疫学的特性を示すＭＩＦ誘導体／断片である。
【００３１】
本発明における「抗体」は、完全抗体または特異的結合に関して完全抗体と競合する抗原結合部分を表す。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．  ７（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．  Ｙ．（１９８９））（この内容は本明細書の一部を構成する）参照のこと。用語「抗体」には、ヒト抗体、哺乳動物抗体、単離抗体および遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体またはヒト化抗体が含まれる。
【００３２】
抗体の、用語「抗原結合部分」は、抗原（例えばＭＩＦ）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上の断片を表す。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術、または完全抗体の酵素的もしくは化学的開裂により製造することができよう。抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、および特異抗原と結合するのに十分な抗体の少なくとも部分を含むポリペプチドが含まれる。成熟軽および重鎖可変ドメインはいずれも、Ｎ末端からＣ末端にむかって、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７、および１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７（１９８７）、または  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。抗体またはその抗原結合部分は、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）と結合するか、誘導体化することができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分は、１またはそれ以上の他の分子構成要素、例えば別の抗体（例えば二特異的抗体またはディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））、検出可能物質、細胞毒性物質、医薬物質、および／または結合分子と機能的に結合することができる。
【００３３】
用語「ヒト抗体」は、可変および定常ドメインがヒト配列であるあらゆる抗体を表す。該用語は、ヒト遺伝子由来の配列を有するが、変化している、例えば、免疫原性が減少しうる、親和性が増加している、望ましくないホールディングなどが生じ得るシステインが除去されている抗体を含む。該用語にはヒト細胞では典型的ではないグリコシル化をもたらすかもしれない非ヒト細胞中で組み換え的に製造した抗体を含む。
【００３４】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト配列を含み、追加の非ヒト配列を含む抗体を表す。
【００３５】
用語「ラクダ化抗体」は、抗体構造または配列がラクダからの抗体により密接に類似するように変更された、またはラクダ抗体として設計された抗体を表す。ラクダ化抗体の設計および生産のための方法は、当業者の一般的な知識の一部である。
【００３６】
用語「キメラ抗体」は、２つ以上の異なる種由来の領域を含む抗体を表す。
【００３７】
用語「単離された抗体」または「単離されたその抗原結合部分」は、抗体供給源、例えばファージ表現ライブラリーまたはＢ細胞レパートリーから選択され、同定され、それから、例えば組換え的に調製された、抗体またはその抗原結合部分を表す。
【００３８】
用語「ポリクローナル抗体」は、精製または部分精製ポリクローナル抗体断片であり得るか、またはそれぞれの抗原、例えば精製ＣＨＯ−ＭＩＦで免疫された動物からの粗血清の形態で使用され得る、ポリクローナル抗体調製物を表す。
【００３９】
用語「ＫＤ」は、各抗原と特定抗体のＦａｂ部分の平衡解離定数を表す。
【００４０】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたは抗体断片と特異的に結合することができるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的活性表面団、例えば露出したアミノ酸、アミノ糖、または他の炭化水素側鎖からなり、通常、特異的３次元構造特性、および特異的荷電特性を有する。
【００４１】
用語「ベクター」は、それが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を表す。ある実施形態において、該ベクターは、プラスミド、すなわち、その中にさらなるＤＮＡ断片を結合（ｌｉｇａｔｅ）することができる環状二本鎖ＤＮＡループである。
【００４２】
用語「宿主細胞」は、発現ベクターを導入した後に組み換えタンパク質を生成することができる細胞株を表す。用語「組換え細胞株」は、その中に組み換え発現ベクターが導入されている細胞株を表す。「組換え細胞株」は、特定の対象細胞株だけでなく、そのような細胞株の子孫も意味すると理解すべきである。突然変異または環境的影響により後の世代にある種の修飾が生じうるので、そのような子孫は、実際に親細胞と同一ではないかもしれないが、まだ、本明細書で用いる用語「組換え細胞株」の範囲内に含まれる。本発明で使用される宿主細胞はＣＨＯ細胞株である。
【００４３】
用語「ウエスタンブロット」は、担体膜上のタンパク質をブロッティングする周知かつ確立された技術を表し、これらのタンパク質は次いで検出できる。膜への転送が、これらに限定されるわけではないが、核酸、毛細管力または電気泳動の適用が例である、周知の方法によって実施される。免疫ブロット法の場合、検出がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用で実施される。本発明の文脈において、「半定量的」ウエスタンブロットは、試料（例えば、いくつかの場合、抗ＭＩＦ抗体との複合体に現れることができるＣＨＯ−ＭＩＦ）からの信号強度が対応する標準（例えば、ＣＨＯ−ＭＩＦ）からの信号強度と比較されるウエスタンブロットを表す。信号は、例えば、例えば電子的に、デジタル画像化システムによって定量化された化学発光信号であることができる。
【００４４】
図面の簡単な説明
本発明は以下の図面によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１はＣＨＯ−ＭＩＦコーディング領域のヌクレオチドとアミノ酸配列について記載する。レーン１は、ＡＴＧを位置＋１として開始されるアミノ酸の数を示す。レーン２はアミノ酸の名前を表す。レーン３は、これらのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のトリプレットを示す。レーン４は塩基対の付番を示す。ＣＨＯ−ＭＩＦの全長は、３４５塩基対から翻訳された１１５のアミノ酸である。
【００４６】
【図２】図２はＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子座の組織を示す。ゲノムＤＮＡ（レーン２：ｇＤＮＡ、配列番号：１４）は、レーン１に示される、２つのイントロンにより分離された、３つのエキソンで組織化される。ｃＤＮＡ（レーン３、配列番号：１５（エキソン１）、１６（エキソン２）および１７（エキソン３））はレーン４（配列番号：１８（エキソン１）、１９（エキソン２）および２０（エキソン３））に示されるＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質配列に翻訳される。ｃＤＮＡの３’非翻訳領域は、翻訳停止コドンＴＧＡの後に、ｐｏｌｙＡテールまでに示される。遺伝子の翻訳された部分は縁どりされる。
【００４７】
【図３】図３はｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を基にしたＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＥＴｃｈｏＭＩＦ７６２−２５の概要図面である。ＣＨＯ−ＭＩＦの完全なｃＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１宿主株の一部として、Ｔ７プロモーターの後ろに挿入され、Ｔ７ポリメラーゼによって転写される。
【００４８】
【図４】図４は異なる下流の工程段階から結果として得られた抗−ＭＩＦ抗体からのＣＨＯ−ＭＩＦ検出のウエスタンブロットである。ブロットは特異的親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体および商業上利用可能なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧによって検出された。レーン１：分子量タンパク質マーカー；レーン２：ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物除去前の、５０μｇ抗ＭＩＦ抗体断片；レーン３−５：異なる下流の工程段階からの各々の５０μｇの抗ＭＩＦ抗体断片；レーン６：  ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物除去後の、５０μｇ抗ＭＩＦ抗体断片；レーン７−１０：組換え型のＣＨＯ−ＭＩＦ参照、４ｎｇ、２ｎｇ、１ｎｇ、および０．５ｎｇ／レーン。  図４ａは、図４に示されるウエスタンブロットから結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質信号の棒グラフである。そのために、ＣＨＯ−ＭＩＦ信号は、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ４０００スキャナソフトウェア（登録商標）を使用するＬＡＳ４０００（富士フイルムライフサイエンス（登録商標））によってスキャンされて、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（登録商標）ソフトウェアによって直接定量化された。レーン７からの４ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ信号が１００％に設定され、直接他のＣＨＯ−ＭＩＦ信号と比較された；１８９％の信号強度は、レーン／棒２に示されているように、下流工程の第段階の後に結果として得られた５０μｇの抗ＭＩＦ抗体におけるＣＨＯ−ＭＩＦ不純物で見いだされた；１２％の信号強度は、レーン／棒３に示されているように、下流工程の第２段階後に結果として得られた５０μｇの抗ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦ不純物で見いだされた；１１％の信号強度は、レーン／棒４に示されているように、下流工程の第３段階後に結果として得られた５０μｇの抗ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦ不純物で見いだされた；５％の信号強度は、レーン／棒５に示されているように、下流工程の第４段階後に結果として得られた５０μｇの抗ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦ不純に関して見いだされた；０％の信号強度は、レーン／棒６に示されているように、下流工程の最終段階の後に結果として得られた５０μｇの抗ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦ不純物で見いだされた；４０％の信号強度は、レーン／棒８に示されているように、２ｎｇ組換え型ＣＨＯ−ＭＩで計算された；２９％の信号強度は、レーン／棒９に示されているように、１ｎｇの組換え型ＣＨＯ−ＭＩＦで計算された；１１％の信号強度は、レーン／棒１０に示されているように、０．５ｎｇ組換え型ＣＨＯ−ＭＩＦで計算された。
【００４９】
【図５】図５は最終的な抗−ＭＩＦ生産ロットにおける、ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物の定量化のためのウエスタンブロットである。ブロットは特異的親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体および商業上利用可能なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧによって検出された。レーン１：分子量タンパク質マーカー；レーン２：ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染物除去後の最終精製抗−ＭＩＦ抗体（５００μｇ抗−ＭＩＦ抗体／レーン）；レーン３：５００μｇの最終精製抗−ＭＩＦ抗体、ただし１ｎｇのＣＨＯ−ＭＩＦでスパイクした；レーン４〜７：組換え型のＣＨＯ−ＭＩＦ参照、４ｎｇ／レーン（５００μｇ抗−ＭＩＦ抗体の８ｐｐｍに相当）、２ｎｇ／レーン（５００μｇ抗−ＭＩＦ抗体の４ｐｐｍに相当）、１ｎｇ／レーン（５００μｇ抗−ＭＩＦ抗体の２ｐｐｍに相当）、および０．５ｎｇ／レーン（５００μｇ抗−ＭＩＦ抗体の１ｐｐｍに相当）。矢印Ａは抗−ＭＩＦ抗体試料の重鎖を示し、矢印Ｂは抗−ＭＩＦ抗体試料の軽鎖を示し、矢印ＣはＣＨＯ−ＭＩＦバンドを示す。  図５ａは、図５に示されるウエスタンブロットから結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質信号の棒グラフである。そのために、ＣＨＯ−ＭＩＦ信号は、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ４０００スキャナソフトウェア（登録商標）を使用するＬＡＳ４０００（富士フイルムライフサイエンス（登録商標））によってスキャンされて、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（登録商標）ソフトウェアによって直接定量化された。レーン４からの４ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ信号が、１００％に設定され、直接他のＣＨＯ−ＭＩＦ信号と比較された。レーン１上に加えられたマーカータンパク質ならびにレーン／棒１および２に示される最終精製抗ＭＩＦ抗体調製物には、全くＣＨＯ−ＭＩＦ信号を示さなかった。１００％の参照信号の４６％は、レーン／棒３において示される、１ｎｇの組換え型ＣＨＯ−ＭＩＦでスパイクされた精製抗ＭＩＦ抗体で見いだされた；１００％の参照信号の８１％は、レーン／棒５において示される、２ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質で見いだされた；１００％の参照信号の４２％は、レーン／棒６において示される、１ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質で見いだされた；１００％の参照信号の１６％は、レーン／棒７で示される、０．５ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質で見いだされた。
【００５０】
【図６】図６は異なるウサギ抗ＭＩＦ抗体から検出されたウエスタンブロット（データ示さず）から結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質の棒グラフである。棒は、ウサギ抗ｈｕＭＩＦおよびウサギ抗ｍｏＭＩＦ抗体と比較して、親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦに対する最も高い感度を示す。そのために、各々のウエスタンブロットに、同じ量のＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質がブロットされ（２ｎｇ／レーン；１ｎｇ／レーン；０．５ｎｇ／レーン）、ＬＡＳ４０００（富士フイルムライフサイエンス（登録商標））によってＣＨＯ−ＭＩＦの結果として得られた信号強度が電子的に比較された。各々のウエスタンブロットは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗−ウサギＩｇＧ（１：６０００）と組み合わせられた各々同じ量のウサギ抗体（３．５μｇ／ｍＬ）で検出された。ウサギ抗ｈｕＭＩＦおよびウサギ抗ｍｏＭＩＦによって検出されたウエスタンブロットは、両方の抗体調製物の機能性を示すために、１０ｎｇ  ｒｈｕＭＩＦまたは１０ｎｇ  ｒｍｏＭＩＦによってさらに制御された（データ示さず）。その後、結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦ信号はＬＡＳ４０００  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ４０００スキャナソフトウェア（登録商標）によってスキャンされ、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（登録商標）ソフトウェアによって直接定量化された。すべてのＣＨＯ−ＭＩＦ信号の直接比較のため、ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体ブロットからの２ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ信号が１００％に設定された。黒い棒：ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体から結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦ信号；暗灰色の棒：ウサギ抗ｈｕＭＩＦ抗体から結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦ信号；明灰色の棒：ウサギ抗ｍｏＭＩＦ抗体から結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦ信号。
【００５１】
【図７】図７は、親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体（３．５μｇ／ｍＬ、ＨＲＰ結合  １：６０００、実施例５の記載と同様の条件）で検出されたＣＨＯ−ＭＩＦの異なる量でのウエスタンブロットを示す。このウエスタンブロットはウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の感度の例である。ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体によって検出されたＣＨＯ−ＭＩＦの最も低い量は０．２５ｎｇ／レーン（５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体調製物の０．５ｐｐｍに相当）であった。レーン１：２ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ（５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体の４ｐｐｍ  ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物に相当）；レーン２：１ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ（５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体の２ｐｐｍ  ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物に相当）；レーン３：０．５ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ（５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体の１ｐｐｍ  ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物に相当）；レーン４：０．２５ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ（５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体の０．５ｐｐｍ  ＣＨＯ−ＭＩＦ不純物に相当）；レーンＭ：分子量タンパク質マーカー。  図７ａは、図７に示されるウエスタンブロットから結果として得られるＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質信号の棒グラフである。そのために、ＣＨＯ−ＭＩＦ信号は、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ４０００スキャナソフトウェア（登録商標）を使用するＬＡＳ４０００（富士フイルムライフサイエンス（登録商標））によってスキャンされて、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（登録商標）ソフトウェアによって直接定量化された。レーン１からの２ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ信号が１００％に設定され、直接他のＣＨＯ−ＭＩＦ信号と比較された。１００％の参照信号の９０％は、レーン／棒２に示されているように、１ｎｇの組換えＣＨＯ−ＭＩＦに見いだされた；１００％の参照信号の７６％は、レーン／棒３に示される、０．５ｎｇの組換えＣＨＯ−ＭＩＦに見いだされた；１００％の参照信号の２６％は、レーン／棒４に示される、０．２５ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質に見いだされた。
【００５２】
【図８】図８は、ＭＩＦ遺伝子座（配列番号：２１）のエキソン１／イントロン１の境界でのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の位置および認識部位を示す模式図である。下部はＭＩＦノックアウトクローンの遺伝特性のための戦略を例証する。エキソン１は太字体で；イントロン１は斜体で示される。５塩基対の切断部位ＧＧＣＣＣが、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼサブユニットの１５ｂｐ認識部位の間にある。ＮａｅＩ制限部位ＧＣＣＧＧＣは下線が引かれる。  翻訳領域外側の位置のＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子座で結合する２つのＰＣＲプライマー、９９８３（配列番号：１１）、および９８７９（配列番号：１２）が、設計された。これらの２つのプライマーを用いて、野生型断片の場合、１２６０ｂｐの断片が、２つのＮａｅＩ部位を含むＰＣＲで増幅できる。ＺＦＮ処理のため、最初のＮａｅＩ部位が破壊されることが予想される。野生型遺伝子座の１２６０ｂｐ断片の場合には、ＮａｅＩ消化が３個の断片をもたらし、ノックアウトの場合には２個の断片のみが発生する。ＤＮＡアガロースゲル上での分離後に予想されるパターンは、ゲルの模式図上に（レーン１ノックアウト、レーン２野生型）示される。ＣＨＯ細胞が２倍体であると予想されるとき、レーン３に示されているヘテロ接合の配置（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）が予想される。
【００５３】
【図９】図９は、ジンクフィンガーヌクレアーゼでの処理後に単離された抗体ＲＡＢ０を産生する個々のＣＨＯ細胞クローンの遺伝分析のアガロースゲルを示す。ＭＩＦの遺伝子座にかかるＰＣＲ断片は、ＮａｅＩで消化され、図８に記載されるように、アガロースゲル上で分離される。５個の細胞株がホモ接合ＭＩＦノックアウトである（レーン２、３；４、５；８、９；１０、１１；１２、１３）。１個の細胞株（レーン６、７）がヘテロ接合である。元の野生型細胞株はレーン１４、１５に示される。  図９ａは、図９の概略図を示す。灰色の強調された円は、図９に示されているように、ＰＣＲ断片の主な信号を示す。
【００５４】
【図１０】図１０はタンパク質レベルで抗体ＲＡＢ０を生産するＣＨＯ−ＭＩＦノックアウト細胞株の特性評価のためのウエスタンブロットの例である。ＣＨＯ−ＭＩＦヘテロ接合（レーン１）、ノックアウト（レーン２〜４）および野生型（レーン５および６）細胞クローンの個々の細胞抽出物を、変性タンパク質ゲル上に分離し、膜に移す。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＣＨＯ−ＭＩＦをゲル上においた（レーン８）。ＭＩＦ特異的抗体を使用することにより、ブロットが染色される。ノックアウト細胞クローン（レーン２、３、４）には、検出可能ないかなるＭＩＦもない。  図１０ａは、図１０の概略図である。濃色の円はウエスタンブロットの陽性ＣＨＯ−ＭＩＦ信号（レーン１、５、６、８）を示す。強調された白抜き円は、図１０のウエスタンブロットに示されるように、ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質の陰性の信号（レーン２、３、４）を示す。
【００５５】
【図１１】図１１はＣＨＯ−ＭＩＦノックアウト細胞株から精製されたヒト抗ＭＩＦ抗体のウエスタンブロット解析の例である。  ＭＩＦ−特異的抗体ＲＡＢ０は、ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株（レーン２）または野生型ＣＨＯ細胞株（レーン３）で生産される。抗体がＭＩＦノックアウト細胞株で生産されるとき、ゲル上にレーン当たり５００μｇまでの精製抗体をローディングした後でも、検出可能なＣＨＯ−ＭＩＦは全くない。Ｅ．ｃｏｌｉで生産された異なる量の精製ＣＨＯ−ＭＩＦは対照として適用された（レーン４〜６）。  図１１ａは、図１１に示されるウエスタンブロットから結果として得られたＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質信号の棒グラフである。そのために、ＣＨＯ−ＭＩＦ信号は、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ４０００スキャナソフトウェア（登録商標）を使用するＬＡＳ４０００（富士フイルムライフサイエンス（登録商標））によってスキャンされて、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（登録商標）ソフトウェアによって直接定量化された。レーン４からの４ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦ信号が、１００％に設定され、直接他のＣＨＯ−ＭＩＦ信号と比較された。ＣＨＯ−ＭＩＦの０％の信号強度は、レーン／棒２に示されるように、ノックアウトＣＨＯ細胞株で生産された精製抗ＭＩＦ抗体で見いだされた；ＣＨＯ−ＭＩＦの膨大な信号（＞＞３００％）は、レーン／棒３に示される野生型ＣＨＯ細胞株から生産された精製抗体で見いだされた；１００％の参照信号の５７％は、レーン／棒５に示されるように、２ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質から見いだされ、２８％の信号強度が、レーン／棒５に示されるように、１ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦで見いだされた。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明者らは、ＣＨＯ−ＭＩＦの遺伝子を同定し、特性評価を行うことに成功した。これを基に、彼らはさらに、本質的にＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない調製物である、ＣＨＯ細胞中の抗−ＭＩＦ抗体調製物の製造および試験を許容するツールおよび方法の提供に成功した。これらのツールおよび方法は、これらの調製物が本質的にＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない場合に、ＣＨＯ−ＭＩＦによって結合できる成分（すなわち、ＣＨＯ  ＭＩＦ結合タンパク質）を含む、ＣＨＯ細胞中で生産される全ての調製物の製造および試験を許容した。
【００５７】
したがって、本発明はＣＨＯ−ＭＩＦをコードする遺伝子座の分析を対象とする。これは、本質的にいかなるＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない、組換え抗体を生産するＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞、またはＣＨＯ−ＭＩＦにより結合できる他の製品、例えば、（ＣＨＯ）ＭＩＦリガンド、（ＣＨＯ）ＭＩＦアゴニストまたはアンタゴニスト、（ＣＨＯ）ＭＩＦ結合ペプチドのような（ＣＨＯ）ＭＩＦ阻害剤、（ＣＨＯ）ＭＩＦ受容体受容体断片、好ましくはヒトＭＩＦに向けられる抗体の産生を許容する。
【００５８】
本出願の文脈において互換的に用いられる、「本質的にいかなるＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない」または「本質的にＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない」は、ＣＨＯ−ＭＩＦの量が０．５ｐｐｍ未満であることを意味する。好ましくは、ＣＨＯ  ＭＩＦの量は０．２ｐｐｍ未満である。
【００５９】
本発明はさらに、ＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子が首尾よくノックアウトされるノックアウト細胞株であって、このノックアウト細胞株が本質的に非経口ＣＨＯ野生型細胞株と同じ特性を示す、ノックアウト細胞株を対象とする。
【００６０】
本発明はまた、ＣＨＯ−ＭＩＦに結合する産物、例えば抗体、好ましくは抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片のＣＨＯ細胞での生産の間に、いくつかの場合に所望の産物に結合したままであることが可能なＣＨＯ−ＭＩＦのｐｐｍレベルでの検出のための高感度な方法を対象とする。好ましい実施形態において、この検出方法は本発明のＣＨＯ−ＭＩＦで免疫されたウサギから得られた親和性精製ポリクローナル抗体である、高特異性抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の産生および精製に基づく。これらの抗体は好ましい実施形態において、組換えＥ．ｃｏｌｉ技術により生産されたＣＨＯ−ＭＩＦでの免疫により生成される。
【００６１】
本発明はさらに、ＣＨＯ細胞によって生産されるＣＨＯ−ＭＩＦをコードするｍＲＮＡの単離を対象とする。このｍＲＮＡの逆転写によって作成されたｃＤＮＡは、原核生物の発現ベクターにクローニングされる。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現したＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質は、均一に精製される。組換体ＣＨＯ−ＭＩＦは、ＣＨＯ−ＭＩＦに特異的な発明のポリクローナルウサギ抗体を生成するためにウサギを免疫するために用いられる。
【００６２】
非常に驚くべきことに、本発明者らによって提供される親和性精製ポリクローナルウサギ抗体（実施例４参照）は、所望の抗ＭＩＦ抗体に結合したＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を非常に高感度に検出でき、これはこれらＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の検出をｐｐｍ範囲で可能にする。
【００６３】
好ましい実施形態において、検出段階がウエスタンブロットで行われる。他の分析的検出方法は、しかしながら、当業者によく知られていて、例えば、（これらに限定されるものではないが）、酵素結合免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫アッセイ、生物発光性および化学発光免疫アッセイ、競合免疫アッセイ、ドットブロット技術および、免疫沈降反応ＨＰＬＣ、質量分析またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳを含む。
【００６４】
ＣＨＯ−ＭＩＦ配列に関する知識に基づいて、本発明はさらにＣＨＯ−ＭＩＦをコードする遺伝子座の分析を対象とする。このことは、ＣＨＯ細胞におけるＭＩＦの存在または不存在について確認して、ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞を製造またはＣＨＯ−ＭＩＦ  ｍＲＮＡを検出することを許容する。本発明者らは、ＣＨＯ  ＭＩＦノックアウト細胞株を首尾良よく提供した。驚くべきことにこの細胞株は安定で、組換えタンパク質、特にＣＨＯ−ＭＩＦに結合できるもの、好ましくは抗体、より好ましくは抗−ＭＩＦ抗体の発現に有用であり、特にＭＩＦそれ自身は、いくらかのかなり重要な細胞過程に関与し、その欠損は、安定な細胞生存がもはや不可能となる程度まで細胞過程を撹乱するはずである。
【００６５】
全く予期しないことに、抗ＭＩＦ抗体の生産性は、ＣＨＯ  ＭＩＦノックアウトなし（野生型細胞）の同じ細胞中で観察されるものと同等であった（データ示さず）。
【００６６】
本発明のＣＨＯ  ＭＩＦノックアウト細胞株で生産される抗体はまた、それらの物理化学的特性において、野生型細胞株において生産されるものに匹敵する（データ示さず）。
【００６７】
本発明は、特に以下の特性によって特徴付けられる：
１．抗−ＭＩＦ抗体調製物を、ＣＨＯ−ＭＩＦに対して親和性精製された、ポリクローナル抗−ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体と接触させる段階を含む、モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体調製物におけるＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を検出するための方法。
２．ＣＨＯ−ＭＩＦが、最終ＣＨＯ細胞産生モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体、その調製物、またはその抗原結合断片の調製物を汚染する、項目１に記載の方法。
３．ＣＨＯ−ＭＩＦが、ＣＨＯ細胞によって産生された内因性ＣＨＯ−ＭＩＦである、項目１および／または２に記載の方法。
４．検出段階が、半定量性ウエスタンブロット分析によって実施される、項目１から３のいずれかに記載の方法。
５．ＣＨＯ−ＭＩＦに対して親和性精製された、ウサギ抗−ＣＨＯ−ＭＩＦポリクローナル抗体の、モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片の製造中またはモノクローナル抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片の最終調製物中のＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の検出のための使用。
６．検出段階が、半定量性ウエスタンブロット分析によって実施される、項目５に記載の使用。
７．ＣＨＯ細胞において抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、該抗体またはその抗原結合断片が本質的にＣＨＯ−ＭＩＦなしであり、請求項１から６のいずれか１項に規定される検出方法が実施される、方法。
８．ＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
９．ＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株であって、該細胞株が、以下の（寄託されたＥ．ｃｏｌｉ中の）プラスミド：ＤＳＭ  ２５１１０、ＤＳＭ  ２５１１２、ＤＳＭ  ２５１１１、ＤＳＭ  ２５１１３、ＤＳＭ  ２５１１４、ＤＳＭ  ２５１１５、ＤＳＭ  ２５８５９、ＤＳＭ  ２５８６０、ＤＳＭ  ２５８６１、ＤＳＭ  ２５８６２、ＤＳＭ  ２５８６３およびＤＳＭ  ２５８６４からの１つ以上を含む、細胞株。
１０．細胞株が、ＤＳＭ  ２５１１０およびＤＳＭ  ２５１１２またはＤＳＭ  ２５８６１およびＤＳＭ  ２５８６２のプラスミドを含む、項目８または９に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
１１．細胞株が、ＤＳＭ  ２５１１１およびＤＳＭ  ２５１１３またはＤＳＭ  ２５８５９およびＤＳＭ  ２５８６０のプラスミドを含む、項目８または９に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
１２．細胞株が、ＤＳＭ  ２５１１４およびＤＳＭ  ２５１１５またはＤＳＭ  ２５８６３およびＤＳＭ  ２５８６４のプラスミドを含む、項目８または９に記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株。
１３．項目８から１２のいずれかのＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株の、モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体またはその結合断片の調製物の製造のための、好ましくは、抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ９、ＲＡＢ４、ＲＡＭ０、ＲＡＭ９またはＲＡＭ４の製造のための、使用。
１４．項目７の方法、または項目８から１２のいずれかのＣＨＯ−ＭＩＦノックアウト細胞株を用いて得られる、本質的にＣＨＯ  ＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体調製物。
１５．項目８から１２のいずれかに記載のＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株を用いることを特徴とする、本質的にＣＨＯ  ＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体調製物の製造のための方法。
１６．ＣＨＯ細胞株中で製造される、本質的にＣＨＯ−ＭＩＦの無いことを特徴とする、組換えＭＩＦ結合タンパク質、好ましくは（ｈ）ＭＩＦ結合ペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはＭＩＦ受容体断片のような（ｈ）ＭＩＦ抗体（ｈ）ＭＩＦ結合タンパク質の調製物、または抗−（ｈ）ＭＩＦ抗体調製物。
１７．項目１５に記載の方法、または項目１〜４または７のいずれかの検出方法を、好ましくは品質管理段階として含む製造方法によって得られる、組換えＭＩＦ結合タンパク質、好ましくは（ｈ）ＭＩＦ結合ペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはＭＩＦ受容体断片のような（ｈ）ＭＩＦ抗体（ｈ）ＭＩＦ結合タンパク質の調製物、または抗−（ｈ）ＭＩＦ抗体調製物。
１８．項目１５に記載の方法、または項目１〜４または７のいずれかの検出方法を、好ましくは品質管理段階として含む製造方法によって製造される、組換えＭＩＦ結合タンパク質、好ましくは（ｈ）ＭＩＦ結合ペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはＭＩＦ受容体断片のような（ｈ）ＭＩＦ抗体（ｈ）ＭＩＦ結合タンパク質の調製物、または抗−（ｈ）ＭＩＦ抗体調製物。
１９．本質的にＣＨＯ  ＭＩＦのない、抗−ｈＭＩＦ抗体がＲＡＢ４、ＲＡＢ０、ＲＡＢ９、ＲＡＭ４、ＲＡＭ０および／またはＲＡＭ９の群から選択される、項目１６〜１８のいずれかの抗−ｈＭＩＦ抗体調製物。
【００６８】
上記の抗−ｈＭＩＦ抗体のために寄託されたプラスミドは、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙのドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）に、ブダペスト条約の下に寄託された際に付与された公式の番号であるそれらのＤＳＭ番号によって特徴付けられる。
【００６９】
ＤＳＭ  ２５１１０番号のプラスミドは、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４の軽鎖配列を含む。
【００７０】
ＤＳＭ  ２５１１２番号のプラスミドは、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４の重鎖（ＩｇＧ４）配列を含む。
【００７１】
適切な宿主細胞、すなわちＣＨＯ細胞、でのプラスミドＤＳＭ  ２５１１０およびＤＳＭ  ２５１１２の共発現は、好ましい抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４の産生をもたらす。
【００７２】
ＤＳＭ  ２５１１１番号のプラスミドは、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９の軽鎖配列を含む。
【００７３】
ＤＳＭ  ２５１１３番号のプラスミドは、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９の重鎖（ＩｇＧ４）配列を含む。
【００７４】
適切な宿主細胞、すなわちＣＨＯ細胞、でのプラスミドＤＳＭ  ２５１１１およびＤＳＭ  ２５１１３の共発現は、好ましい抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９の産生をもたらす。
【００７５】
ＤＳＭ  ２５１１４番号のプラスミドは、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の軽鎖配列を含む。
【００７６】
ＤＳＭ  ２５１１５番号のプラスミドは、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の重鎖（ＩｇＧ４）配列を含む。
【００７７】
適切な宿主細胞、すなわちＣＨＯ細胞、でのプラスミドＤＳＭ  ２５１１４およびＤＳＭ  ２５１１５の共発現は、好ましい抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の産生をもたらす。
【００７８】
また、抗体ＲＡＭ０、ＲＡＭ９およびＲＡＭ４について寄託があり、これらの全てがブダペスト条約に基づき、２０１２年４月１２日に以下の指定でＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  ＧｅｒｍａｎｙのＤＳＺＭに寄託された。
ＲＡＭ９  −  重鎖：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＡ．６６２−０１．ｐＲＡＭ９ｈｃ  −  ＤＳＭ  ２５８６０。
ＲＡＭ４  −  軽鎖：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＡ．９０６−０４．ｐＲＡＭ４ｌｃ  −  ＤＳＭ  ２５８６１。
ＲＡＭ９  −  軽鎖：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＡ．６６１−０１．ｐＲＡＭ９ｌｃ  −  ＤＳＭ  ２５８５９。
ＲＡＭ４  −  重鎖：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＡ．６５７−０２．ｐＲＡＭ４ｈｃ  −  ＤＳＭ  ２５８６２。
ＲＡＭ０  −  軽鎖：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＡ．９０６−０１．ｐＲＡＭ０ｌｃ  −  ＤＳＭ  ２５８６３。
ＲＡＭ０  −  重鎖：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＡ．７８４−０１．ｐＲＡＭ０ｈｃ  −  ＤＳＭ  ２５８６４。
【００７９】
抗−（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の生産もまた、当分野で知られている、該形質転換細胞の培養のためのいかなる方法、例えば、連続またはバッチ方式、および、抗−（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の発現のためのいかなる方法、例えば、構成的または誘導の際、を含み得る。それは抗−（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の生産のさらなる参照のために、ＷＯ２００９／０８６９２０を特に参照する。好ましい実施形態において、本発明によって生産される抗−（ｏｘ）ＭＩＦ抗体は、ｏｘＭＩＦまたはそのエピトープに結合する。本発明による特に好ましい抗体は、抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／または、ＲＡＢ０ならびにＲＡＭ９、ＲＡＭ４および／またはＲＡＭ０である。
【００８０】
これらの抗体の配列はまた、ＷＯ２００９／０８６９２０に一部開示され；さらに、以下の本願の配列リストを参照：
【００８１】
ＲＡＢ９の軽鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２２：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＳＳＱＲＩＭ  ＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＦＶ  ＡＳＨＳＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＲＧＳＧＳＥＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰ  ＥＤＳＡＴＹＹＣＱＱ  ＳＦＷＴＰＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ、
【００８２】
ＲＡＢ４の軽鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２３：ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＧＶＳ  ＳＳＳＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＴＳＳＲＡＴＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＡＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＱ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＧＲＳＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ、
【００８３】
ＲＡＢ０の軽鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２４：ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＧＶＳ  ＳＳＳＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＴＳＳＲＡＴＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＡＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＱ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＧＲＳＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ、
【００８４】
ＲＡＢ２の軽鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２５：ＤＩＱＭＴＱＳＰＶＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲ  ＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＴＰＲＬＬＩＹ  ＧＡＳＮＲＡＴＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＧＮＳＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ、
【００８５】
ＲＡＢ９の重鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２６：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＩＹＳＭＮＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ  ＩＧＳＳＧＧＴＴＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＳＱ  ＷＬＹＧＭＤＶＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴ  ＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹ  ＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰ  ＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬ  ＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭ  ＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶ  ＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥ  ＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶ  ＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ  ＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶ  ＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤ  ＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫ  ＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩ  ＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱ  ＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰ  ＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱ  ＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦ  ＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥ  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ  ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧ  ＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶ  ＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶ  ＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬ  ＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳ  ＬＳＬＧＫ、
【００８６】
ＲＡＢ４の重鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２７：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＩＹＡＭＤＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ  ＩＶＰＳＧＧＦＴＫＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＶＮ  ＶＩＡＶＡＧＴＧＹＹ  ＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧ  ＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴ  ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ  ＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡ  ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ  ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ  ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ  ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ  ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ  ＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣ  ＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ  ＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧ  ＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥ  ＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦ  ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ  ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ  ＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶ  ＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥ  ＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥ  ＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶ  ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ  ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ  ＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥ  ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ  ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰ  ＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶ  ＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹ  ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ  ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ  ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ  ＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤ  ＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦ  ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨ  ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ  ＳＬＧＫ、
【００８７】
ＲＡＢ０の重鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２８：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＷＹＡＭＤＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ  ＩＹＰＳＧＧＲＴＫＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＶＮ  ＶＩＡＶＡＧＴＧＹＹ  ＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧ  ＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴ  ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ  ＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡ  ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ  ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ  ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ  ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ  ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ  ＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣ  ＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ  ＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧ  ＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥ  ＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦ  ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ  ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ  ＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶ  ＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥ  ＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥ  ＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶ  ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ  ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ  ＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥ  ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ  ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰ  ＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶ  ＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹ  ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ  ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ  ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ  ＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤ  ＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦ  ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨ  ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ  ＳＬＧＫ、
【００８８】
ＲＡＢ２の重鎖のアミノ酸配列のための配列番号：２９：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＩＹＡＭＤＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ  ＩＶＰＳＧＧＦＴＫＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＶＮ  ＶＩＡＶＡＧＴＧＹＹ  ＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧ  ＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴ  ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ  ＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡ  ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ  ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ  ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ  ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ  ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ  ＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣ  ＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ  ＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧ  ＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥ  ＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦ  ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ  ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ  ＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶ  ＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥ  ＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥ  ＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶ  ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ  ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ  ＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥ  ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ  ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰ  ＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶ  ＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹ  ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ  ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ  ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ  ＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤ  ＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦ  ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨ  ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ  ＳＬＧＫ。
【００８９】
ＲＡＭ０ｈｃのアミノ酸配列のための配列番号：３０：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＷＹＡＭＤＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ  ＩＹＰＳＧＧＲＴＫＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＶＮ  ＶＩＡＶＡＧＴＧＹＹ  ＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧ  ＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴ  ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ  ＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡ  ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ  ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ  ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ  ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ  ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ  ＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ  ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ  ＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ  ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ  ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ  ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ  ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ  ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＰＧＫ。
【００９０】
ＲＡＭ０ｌｃのアミノ酸配列のための配列番号：３１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＧＶＳ  ＳＳＳＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＴＳＳＲＡＴＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＡＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＱ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＧＲＳＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ。
【００９１】
ＲＡＭ９ｈｃのアミノ酸配列のための配列番号：３２：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＩＹＳＭＮＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ  ＩＧＳＳＧＧＴＴＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＳＱ  ＷＬＹＧＭＤＶＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧＫ。
【００９２】
ＲＡＭ９ｌｃのアミノ酸配列のための配列番号：３３：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＳＳＱＲＩＭ  ＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＦＶ  ＡＳＨＳＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＲＧＳＧＳＥＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰ  ＥＤＳＡＴＹＹＣＱＱ  ＳＦＷＴＰＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ。
【００９３】
ＲＡＭ４ｈｃのアミノ酸配列のための配列番号：３４：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＩＹＡＭＤＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ  ＩＶＰＳＧＧＦＴＫＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＶＮ  ＶＩＡＶＡＧＴＧＹＹ  ＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧ  ＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴ  ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ  ＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡ  ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ  ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ  ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ  ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ  ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ  ＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ  ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ  ＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ  ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ  ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ  ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ  ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ  ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＰＧＫ。
【００９４】
ＲＡＭ４ｌｃのアミノ酸配列のための配列番号：３５：ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＧＶＳ  ＳＳＳＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＴＳＳＲＡＴＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＡＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＱ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＧＲＳＬＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ。
【００９５】
本発明の抗−ＭＩＦ抗体は、好ましくは単離モノクローナル抗体である。抗−ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ分子であり得る。他の実施形態において、抗−ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスである。他の実施形態において、抗体はサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４のどちらかである。他の実施形態において、抗体はサブクラスＩｇＧ４である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４抗体はセリン（Ｋａｂａｔ番号付け体系（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）によるとセリン２２８）をプロリンに変える単一変異を有する。従って、ＩｇＧ４Ｆｃ領域のＣＰＳＣサブ配列は、ＩｇＧ１のサブ配列であるＣＰＰＣになる（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３，  ３０，  １０５−１０８）。
【００９６】
さらに、抗−（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の製造は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーといった抗体の精製のための当分野で知られているいかなる方法を含み得る。一の実施形態において、抗−（ｏｘ）ＭＩＦ抗体は、細胞培養上清からサイズ排除クロマトグラフィーによって精製できる。
【００９７】
用語、ＭＩＦの「中心領域」または「Ｃ−末端領域」は、それぞれ３５〜６８および８６〜１１５アミノ酸を含むヒトＭＩＦ領域、好ましくはヒトＭＩＦのそれぞれ５０〜６８および８６から１０２アミノ酸、を表す。
【００９８】
本発明の特に好ましい抗体は、ヒトＭＩＦの５０〜６８アミノ酸領域か８６〜１０２アミノ酸領域のどちらかに結合する。これはまた、以下のように結合する、好ましい抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ４、ＲＡＢ２およびＲＡＢ９ならびにＲＡＭ４、ＲＡＭ９およびＲＡＭ０の結合で反映される：
ＲＡＢ４およびＲＡＭ４：８６〜１０２アミノ酸
ＲＡＢ９およびＲＡＭ９：５０〜６８アミノ酸
ＲＡＢ０およびＲＡＭ０：８６〜１０２アミノ酸
ＲＡＢ２：８６〜１０２アミノ酸
【００９９】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、通常、露出しているアミノ酸、アミノ糖または他の炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、かつ、通常、特定の三次元構造特徴、ならびに特定の電荷特性を有する。
【０１００】
抗−ＭＩＦ抗体の製造の以下の記載は、精製抗体調製物が汚染ＭＩＦのない状態かどうか試験するための段階、すなわち、ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の検出段階を含む、組換え抗−ＭＩＦ抗体調製物を製造するための方法を例示的に明らかにするものである。
【０１０１】
本発明による抗−ＭＩＦ抗体の製造方法は、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡ増幅、および発現ベクター内へのクローニングといった遺伝子工学によるあらゆる組み換えＤＮＡ製造方法を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、さらなるＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に結合しうるウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、導入された宿主細胞内で自立的に複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他の実施形態において、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入すると宿主細胞のゲノムに統合され、宿主ゲノムと共に複製されることができる。さらに、ある種のベクターは、作動可能なように結合した遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。
【０１０２】
抗ＭＩＦ抗体は、常套的発現ベクター、例えば細菌ベクター（例えば、ｐＢＲ３２２およびその誘導体）、または真核細胞ベクターにより製造することができる。該抗体をコードする該配列には、複製、発現、および／または宿主細胞からの分泌を調節する調節配列を与えることができる。これら調節配列は、例えば、プロモーター（例えばＣＭＶまたはＳＶ４０）およびシグナル配列を含む。発現ベクターは、選択および増幅マーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、およびチミジン−キナーゼを含むこともできる。用いるベクターの構成要素、例えば選択マーカー、レプリコン、エンハンサーは、市販品を入手するか、常套的方法により製造することができる。ベクターは、細胞培養物、すなわちＣＨＯ細胞中で発現させるために構築することができる。
【０１０３】
抗ＭＩＦ抗体軽鎖遺伝子および抗ＭＩＦ抗体重鎖遺伝子を別のベクターに挿入すること、または、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入すること、ができる。該抗体遺伝子は、標準的方法、例えば該抗体遺伝子断片およびベクター上の相補制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーションにより発現ベクター内に挿入される。
【０１０４】
抗ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片の製造には、例えばエレクトロポーレーションまたはマイクロインジェクションを経るトランスフェクションにより、組み換えＤＮＡを真核細胞内に導入するための当該分野で知られたあらゆる方法が含まれ得る。例えば、抗ＭＩＦ抗体の組み換え発現は、抗ＭＩＦ抗体をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドをＣＨＯ細胞株内に、１つ以上の調節配列、例えば強いプロモーターの制御下で、ゲノム内に安定に統合された導入配列を持つ細胞を生じる適切なトランスフェクション法により導入することにより達成することができる。リポフェクション法は、本発明に従って用いることができるトランスフェクション法の例である。
【０１０５】
抗ＭＩＦ抗体の製造には、例えば連続的またはバッチ式で該トランスフェクションした細胞を培養し、抗ＭＩＦ抗体を、例えば構成的にまたは誘導の際に発現させるための当該分野で知られたあらゆる方法も含まれうる。それは抗−ＭＩＦ抗体の製造のさらなる参照のために、ＷＯ２００９／０８６９２０を特に参照する。好ましい実施形態において、本発明によって製造されるＣＨＯ−ＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体調製物の抗体は、ＭＩＦまたはＭＩＦ断片に結合する。本発明により製造される特に好ましい抗体は、ＲＡＢ９、ＲＡＢ４およびＲＡＢ０（Ｅ．ｃｏｌｉ含有プラスミドとして寄託された、それぞれＲＡＢ０についてＤＳＭ  ２５１１４およびＤＳＭ  ２５１１５、ＲＡＢ９についてＤＳＭ  ２５１１１およびＤＳＭ  ２５１１３、およびＲＡＢ４についてＤＳＭ  ２５１１０およびＤＳＭ  ２５１１２）である。
【０１０６】
本明細書に記載される、ＭＩＦの製造のための製造方法において使用される宿主細胞の種類はＣＨＯ細胞である。一の実施形態において、抗−ＭＩＦ抗体は、選択マーカーとしてＧ４１８を付加したＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株、例えばＤＸＢ１１中で発現する。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをＣＨＯ宿主細胞内に導入するとき、該抗体を宿主細胞中で発現させるか、または宿主細胞が増殖する培養液中に抗体を分泌させることを可能にするために十分な時間宿主細胞を培養することにより該抗体を製造する。
【０１０７】
抗−ＭＩＦ抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養液から回収することができる。
【０１０８】
さらに、抗−ＭＩＦ抗体の製造には、抗体を生成するための当該分野で知られたあらゆる方法、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーが含まれうる。ある態様において、該抗−ＭＩＦ抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製することができる。
【０１０９】
本発明は、現在、抗−ＭＩＦ抗体またはその抗原結合断片の製造のための従来技術方法を改良し、最適化することを明確に許容する有利な方法を、提供する。
【０１１０】
特に、本発明者らは、ＣＨＯ細胞によって調製された抗体調製物が、最終的な調製物を製薬または研究目的のための有用性をなくすＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を含み得ることを初めて示した。
【０１１１】
本発明者らはそして、初めてＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子を同定し、特性評価を行った。この知見に基づき、本発明者らはさらに、ｐｐｍ範囲まで、抗−ＭＩＦ抗体に結合したＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の検出を許容する特異的検出方法を提供する。
【０１１２】
非常に驚くべきことに、その結果、本発明は抗−ＭＩＦ抗体のための製造方法、特に精製の過程、が本質的にＣＨＯ−ＭＩＦのない調製物を生成させるために適当であることの確認の可能性を提供する。これは、ＣＨＯ−ＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体の調製のための製造方法を確立するために必須である。特に、この改良はＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を激減させる方法における、抗体調製物の精製において当分野で知られている方法の最適化と組み合わせを許容し、その結果、非常に純粋な、ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない最終Ａｂ−調製物の提供を許容する。さらに、本発明の方法は、非常に純粋な、ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない最終Ａｂ−調製物が製造されることを確実にする、工業生産工程における予防手段としての、該汚染の高感度の検出方法である。好ましくは、この検出はＣＨＯ−ＭＩＦに対する親和性精製で得られたポリクローナルウサギ抗−ＭＩＦ抗体を使用する検出段階で実施される。親和性精製は、当業者によく知られた、例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  Ｆ．  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ  Ｈ．  （１９９８）  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ，  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，  ＩＳＢＮ  ３−８２７４−００４１−４に記載されたように実施される。
【０１１３】
ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染をｐｐｍレベルまで検出でき、特にそれは、デジタル定量的画像化システム（例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００）で化学発光信号によって定量化された一般的なウエスタンブロット技術において高感受性のウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体を使用して、ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染を０．５ｐｐｍ（５００μｇの抗体調製物における、０．２５ｎｇ  ＣＨＯ−ＭＩＦに対応する）まで検出可能である。
【０１１４】
本文脈における「ＣＨＯ−ＭＩＦ汚染」は、組換え技術によって製造される産品、例えば抗−ＭＩＦ抗体、の調製において、組換え技術によって製造される産品、例えば抗−ＭＩＦ抗体、に結合したＣＨＯ−ＭＩＦを意味する。
【０１１５】
本検出方法の高感度は、特に親和性精製で得られるポリクローナルウサギ抗−ＭＩＦ抗体で可能である。
【０１１６】
ＣＨＯ細胞中でＭＩＦのない抗−ＭＩＦ抗体を製造するさらなる代替の実施形態において、本発明はＣＨＯ−ＭＩＦを生産しないノックアウトＣＨＯ細胞株を対象とする。これらのノックアウト細胞株では、本質的にＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のない非常に純粋な抗−ＭＩＦ抗体調製物を提供する製造方法を実施することが、可能である。
【０１１７】
上記の検出方法は、特に最終調整物が本質的にＣＨＯ  ＭＩＦなしであることを確実にするために、ＣＨＯ  ＭＩＦ細胞株中で組換え技術によって生産されたタンパク質、好ましくは抗−ＭＩＦ抗体生産、の品質管理のために使用できる。検出方法はまた、ＣＨＯ  ＭＩＦノックアウト細胞株の品質管理のために使用できる。
【０１１８】
本発明のノックアウト細胞は当分野で知られた方法によって作出でき、その１つの可能性について詳細に以下の実施例で説明するが、本発明がこの実施形態に制限されると解釈するべきではない。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
ＣＨＯ−ＭＩＦをコードするＤＮＡ配列の決定
ＣＨＯ−ＭＩＦのコーディング領域の５’末端および３’末端をアニーリングするオリゴヌクレオチドが、近縁種のＤＮＡ配列を比較することによって設計された。高度に保存された領域が、ＣＨＯ−ＭＩＦ  ＤＮＡにおけるそれらの対応する領域に確実に結合するために、ゆらぎ塩基を含むオリゴヌクレオチド８９５１および８９５４を設計するために選択された。これらのオリゴヌクレオチドをｐｏｌｙＴオリゴと共に使用して、ＣＨＯ細胞から標準のｃＤＮＡクローニング手順で単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡコピーを増幅することが可能であった。得られたＰＣＲ産物はＤＮＡ配列決定に供された。
【０１２０】
ＣＨＯ−ＭＩＦ  ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を知った後、標準的な手順を使用してＣＨＯ細胞から精製されたゲノムＤＮＡからの断片の増幅のための特異的プライマーを設計することが、可能であった。ｃＤＮＡの領域の３個のゲノム断片が、ＰＣＲによって増幅され、以下のＰＣＲ産物が達成された：
−  オリゴ９０６３、９１９６で配列決定された、プライマー９０６３および９１９６をもつＰ２７４６３；
−  ９０６４で配列決定された、プライマー９１９９および９０６４を使用するＰ２７４６５；
−  ９２１６、９２４２で配列決定された、プライマー９２１６および９２４４をもつＰ２８２５４。
【０１２１】
ＡＴＧ開始コドンおよび５’上流領域の周辺の配列を検証するために、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡが、ＢｓｔＨＩで消化され、環状化された。ＢｓｔＨＩは、ｃＤＮＡ配列から、ｃＤＮＡにおけるＡＴＧの１４０ｂｐ下流を切断することが知られていた。環状化ＤＮＡは、ｃＤＮＡの既に知られている部分に結合する２個の特異的オリゴヌクレオチド９２１６（リバースプライマー）および９２４２（ダイレクトプライマー）を使用して逆ＰＣＲによって増幅された。このＰＣＲ産物（Ｐ２７８８３）を使用して、ＡＴＧの数百塩基対上流のゲノムＤＮＡ配列が決定できた。
【０１２２】
ＣＨＯ−ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株のＤＮＡおよび対応するタンパク質配列は、図１および配列番号：１および２に示される。
【０１２３】
ＣＨＯ−ＭＩＦ  ｃＤＮＡを増幅および配列決定するために使用されるオリゴヌクレオチド（プライマー）の配列：
ｐＰＣＲ．ＭＩＦｓｐｅｃ（１）−８９５１：ＡＴＧＴＴＣＲＴＳＧＴＲＡＡＣＡＣＣＡＡＹＧＴ（配列番号：３）
ｐＰＣＲ．ＭＩＦｓｐｅｃ（４）−８９５４：ＧＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＲＹＹＧＴＴＣＣＡＧ（配列番号：４）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ（１）−９０６３：ＴＧＡＣＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＧＡＣ（配列番号：５）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ（２）−９０６４：ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＣＡＧＣＣＡ（配列番号：６）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ−９１９６：ＡＴＴＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧ（配列番号：７）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ−９２１６：ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号：８）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ−９２４２：ＣＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＣＧＣＡＧＴ（配列番号：９）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ−９２４４：ＧＣＴＧＣＡＣＧＣＡＧＣＧＴＴＣＴＧＴＴ（配列番号：１０）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦｇ−９９８３：ＣＧＴＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＡ（配列番号：１１）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦｇ−９８７９：ＧＴＡＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧ（配列番号：１２）
ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦ−９１９９：ＧＣＴＴＣＴＣＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣ（配列番号：１３）。
【０１２４】
実施例２
ＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子座の同定および特性評価
ＣＨＯ−ＭＩＦ  ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列につながる実験戦略は実施例１に記載される。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの分析も同様に実施された。
【０１２５】
遺伝子座の総合的な組織を、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列を並べる（ａｌｉｇｎ）ことによって、決定した。ＣＨＯ−ＭＩＦのコーディング領域は２つの短いイントロンによって中断された３つのエキソン上で断片化される。ＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子座の配列は図２に示される。
【０１２６】
実施例３
組換えＣＨＯ−ＭＩＦの製造および精製
ＣＨＯ−ＭＩＦのｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターの制御下にＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。プラスミドは図３に示される。
【０１２７】
プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｓ（ＤＥ）−ＲＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入された。この株は、ＩＰＴＧ誘導ｌａｃプロモーターの制御下に安定して挿入されたバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのコピーを含む。ＣＨＯ−ＭＩＦタンパク質は、ＩＰＴＧでの誘導の後に高いレベルで発現され、２段階の精製プロトコルを使用することで高度に精製された：最初に、試料は陰イオン交換ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（バッファーＡ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８；バッファーＢ：１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８；組換えＣＨＯ−ＭＩＦ溶出液は、１０％バッファーＢでの直線グラジエントによる）に供された。第２段階では、タンパク質はＳｏｕｒｃｅ  Ｓカラム（バッファーＡ：２０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ５．５；バッファーＢ：１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ５．５；組換えＣＨＯ−ＭＩＦ溶出液は、７〜１０％の間のバッファーＢの直線グラジエントによる）にロードされた。最終的にタンパク質は濃縮され、一般的な脱塩カラム（例えば、ＰＤ−１０カラム）を使用してＰＢＳ中に再バッファリングされた。ＣＨＯ−ＭＩＦの純度は、クマシー染色によるゲル電気泳動手順の後に確認された。
【０１２８】
実施例４
抗−ＭＩＦ抗体調製におけるＣＨＯ−ＭＩＦ汚染のｐｐｍレベルの検出
非常に高感度の半定量的ウエスタンブロット分析は、ＣＨＯ−ＭＩＦのｐｐｍレベルの検出を許す組換え抗−ＭＩＦ抗体調製物においてＣＨＯ−ＭＩＦ汚染をモニタリングするために確立された。
【０１２９】
Ｅ．ｃｏｌｉで発現した精製組換えＣＨＯ−ＭＩＦは、ＣＨＯ−ＭＩＦに対して特異的な抗体を生成させるために、ウサギを免疫するために使用された。特異的ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体は２段階の精製で精製された（以下のａ）およびｂ）を参照）。得られた特異的ウサギの抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体はピコグラム以下の範囲でのＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の検出を許容する、非常に高感度の半定量的ウエスタンブロット法が可能であった。これはＣＨＯ−細胞中で生産されるヒト抗−ＭＩＦ抗体の下流の工程の間に、ＣＨＯ−ＭＩＦ不純をモニタリングすることを許容する。（図４、４ａ、５、および５ａ）。
【０１３０】
ヒト抗−ＭＩＦ抗体中のＣＨＯ−ＭＩＦ不純物の検出限界は、５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体調製物中の０．５ｐｐｍに相当する０．２５ｎｇ／レーンと決定された（図７および７ａに示される）。
【０１３１】
ａ）組換えＣＨＯ−ＭＩＦによるウサギの免疫
ＣＨＯ−ＭＩＦ特異的抗体を生成させるために、以下のプロトコルに従って、１０羽のウサギが免疫された。初期の免疫のために：２５μｇの組換えＣＨＯ−ＭＩＦ（１００μｌのＰＢＳ中）は１００μｌのＣＦＡ（完全フロインドアジュバント）と混合された。動物は、２００μｌ（４ｘ５０μｌ）の混合物を皮下に受けた。２回の追加免疫（ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）が、ＩＦＡ（不完全フロインドアジュバント）を使用して、上述のとおり、２〜３週間の間隔で１動物あたり同じ投与量で実施された。血清は、ＥＬＩＳＡによって試験された。２番目の追加の２週間後に、ウサギはペントバルビタールによる麻酔（ｎａｒｃｏｔｉｚａｔｉｏｎ）の後に放血された。血清は抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の単離のためにプールされた。
【０１３２】
ｂ）ＣＨＯ−ＭＩＦ免疫ウサギからの総ＩｇＧの精製
精製は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのタンパク質ＡＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｅｒｉａｌを用いる親和性クロマトグラフィーによって達成された。典型的に、ＣＨＯ−ＭＩＦ免疫ウサギからの血清はバッファーＡ（＝２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）中に１：２で希釈され、１００ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラムに供された。非結合または非特異的血清材料は、１０カラム容量（ＣＶ）のバッファーＡでの洗浄手順で洗浄され、総ウサギＩｇＧの溶出は、バッファーＢ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．８）への１００％のグラジエントステップを使用する、ｐＨ遷移により行われた。溶出画分は、プールされ、次の親和性精製段階のために２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０で再バッファリングされた。
【０１３３】
ｃ）ＣＨＯ−ＭＩＦ特異的抗体の精製
親和性精製されたウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体は、自作の、組換えＣＨＯ−ＭＩＦと組み合わせられた５ｍｌ  ＮＨＳ−カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって最終的に精製された。典型的に、再バッファリングされた総ウサギＩｇＧの１００ｍｌの画分が５ｍｌのＣＨＯ−ＭＩＦ親和性カラムに供された。洗浄段階（バッファＡを２０ＣＶ）の後に、特異的抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の溶出は、バッファーＢ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．８）への１００％のグラジエントステップを使用する、ｐＨ遷移により達成された。溶出成分はプールされて、ＰＢＳで再バッファリングされて、必要なら濃縮されて、−８０℃で、保管された。精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体の機能性はウエスタンブロットおよびＣＨＯ−ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡによって立証された。
【０１３４】
ｄ）モノクローナル抗−ＭＩＦ抗体調製物中のＣＨＯ−ＭＩＦの検出
試験原理
対象とする抗体の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって分離され、一般的に使用される膜、例えばフッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）またはニトロセルロース、に移した。標的タンパク質ＣＨＯ−ＭＩＦは、特異的ポリクローナルウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体および対応する二次抗体結合体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いる化学発光反応によって同定され、定量化された。
【０１３５】
下流の工程をモニタリングするための試料および対照の調製：
抗−ＭＩＦ抗体の精製の間、汚染ＣＨＯ−ＭＩＦの除去をモニタリングするために、試料は定義された濃度にＳＤＳバッファーで希釈された。全ての試料は、それらがゲル上にロードされる前に、同じ濃度であった。（推奨：３０〜８０μｇの抗−ＭＩＦ抗体／レーン）（図４および４ａ）。
【０１３６】
対照（組換えＣＨＯ−ＭＩＦ）もまた、最終濃度０．５、１、２および４ｎｇ／レーンでＳＤＳゲルにロードされた。
【０１３７】
最終精製抗体を分析するための試料および対照の調製：  
最終精製抗−ＭＩＦ抗体調製物における、潜在的なＣＨＯ−ＭＩＦ汚染の分析のため、５００μｇ／レーンがＳＤＳ  Ｐａｇｅにロードされた。対照（組換えＣＨＯ−ＭＩＦ）はゲルに最終量０．５、１、２および４ｎｇ／レーンで加えられた。（図５および５ａ）
【０１３８】
試験詳細
試料はＳＤＳバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセリン、２００ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ６．８）中で１：１で希釈され、９９℃で５分間（タンパク質減少および変性段階）インキュベートされた。その後、定められた濃度の各々の試料が、４−１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードされ、ゲル電気泳動により分離され、その後適切な膜（例えばＰＶＤＦ）に電気的に移動された。非特異的結合効果の減少のため、膜は、ＴＢＳＴバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ポリソルベート２０、ｐＨ７．５）中に希釈された２％の粉乳によって、２時間ＲＴでブロッキングされた。非結合タンパク質の除去は、ＴＢＳＴでの再度の洗浄段階で達成された。ＣＨＯ−ＭＩＦの検出は、ＴＢＳＴ中に溶解された０．０５％の粉乳で希釈された親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体によって行われた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（例えば、ロバ抗ウサギ／ＨＲＰ）と結合する二次的抗体は、１時間ＲＴで膜でインキュベーションされ、ＴＢＳＴで再度洗浄された。特異的ＣＨＯ−ＭＩＦ信号は、富士フイルム（ＬＡＳ−４０００）からのＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する、化学発光基質（例えば、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ、Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により検出され、定量化された。
【０１３９】
実施例５
親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体によるＣＨＯ−ＭＩＦの高感度の検出
親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦの感度は、ヒトＭＩＦおよびマウスＭＩＦに対する２つの他の親和性精製ポリクローナル抗体と比較された。これらのポリクローナル抗体は、以下を除いて、ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦのために記載されたものと同じ手順で生産された：ウサギ抗ｈｕＭＩＦはｒｈｕＭＩＦに対して親和性精製され、ウサギ抗ｍｏＭＩＦは、ｒｍｏＭＩＦに対して親和性精製された（ウサギ抗ＳＨＯ−ＭＩＦ抗体のために記載されたものと同じ条件で）。
【０１４０】
異なる量のＣＨＯ−ＭＩＦ（２、１、および０．５ｎｇ／レーン）は、ＳＤＳゲルに供され、一般的な電気泳動手順によって分離されて、ＰＶＤＦ膜にブロットされた。各々のポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体のＣＨＯ−ＭＩＦへの感度を比較するために、それらは同じ濃度（それぞれ３．５μｇ／ｍＬ）でウエスタンブロットに適用された。ウサギ抗ヒトおよびマウスＭＩＦ抗体の機能性は、陽性試料（１０ｎｇ  ｈｕＭＩＦおよび１０ｎｇ  ｍｏＭＩＦ）によってさらに、立証された。
【０１４１】
図６に示されるように、ＣＨＯ−ＭＩＦへの最も高い感度は親和性精製ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体で見出された（図６、黒矢印参照）。
【０１４２】
ウサギ抗ＣＨＯ−ＭＩＦ抗体によって検出された最も低いＣＨＯ−ＭＩＦの濃度は、５００μｇヒト抗−ＭＩＦ抗体調製物中の０．５ｐｐｍに相当する０．２５ｎｇ／レーンで決定された（図７参照）。
【０１４３】
実施例６
ＭＩＦノックアウトＣＨＯ細胞株の生成
遺伝子座のエキソン／イントロン接合部を含むゲノム構造の正確な知識は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｓａｎｇａｍｏ−−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の設計のための前提条件である。ＣＨＯ−ＭＩＦ遺伝子座のゲノム組織は実施例２で決定された。ヌクレアーゼは、エキソン１／イントロン１接合部で二本鎖切断を作成するように設計された。（図８）。ＺＦＮ技術の利点は、非常に高い頻度で、一段階で遺伝子の両方の対立遺伝子座をノックアウトできることである。ＭＩＦノックアウト細胞株が生成され、ＭＩＦの不在が遺伝特性評価（図９、９ａ）および実施例４に記載されたＣＨＯ−ＭＩＦ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析（図１０および１０ａ）で示された。この細胞株は、その細胞内標的への結合に関する問題を避ける、抗−ＭＩＦ抗体の発現に使用された。
【０１４４】
ａ）特徴的なＭＩＦノックアウト細胞クローンの生成
安定的に抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０（ＲＡＢ０、ＣＨＯ−Ｓ．３３）を発現するＣＨＯ細胞株が、特異的ＺＦＮの両方のサブユニットを発現する２つのプラスミドでトランスフェクトされた。これらの条件で、機能的なヌクレアーゼは、細胞ゲノムで内因性ＭＩＦ遺伝子座を破壊しながら、発現される。トランスフェクションの２週間後に、細胞プールは半固形培地で希釈された。１週間の増殖の後、特徴的なコロニーが、ＣｌｏｎｅＰｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用する９６ウェルプレートに移され、小さい培養物になるまで増殖された。
【０１４５】
同様の戦略を用いて、ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−ＤＧ４４のような異なるＣＨＯ宿主細胞株で内因性ＭＩＦがノックアウトされた。
【０１４６】
ｂ）ＭＩＦノックアウトＲＡＢ０産生ＣＨＯ−Ｓ細胞株の遺伝的特性
特徴的な細胞クローンの染色体ＤＮＡは、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（５０）を、製造者のプロトコルに従って使用することにより精製された。テンプレートとしてＤＮＡを使用して、特異的断片は、以下のプライマーを使用することによりＰＣＲで増幅された：ｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦｇ９９８３：ＣＧＴＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＡ（配列番号：１１）およびｐＰＣＲ．ｃｈｏＭＩＦｇ９８７９ＧＴＡＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧ（配列番号：１２）。
【０１４７】
野生型（ｗｔ）細胞クローンの場合、予想される断片は１２６０ｂｐ長である（図８）。ノックアウト細胞株の場合には、変異遺伝子の個々の構造によって、長さが異なっている。通常、ヌクレオチドは、ＺＦＮの切断部位で削除されるか、または挿入される。同時に、ＺＦＮ切断部位と重複する制限酵素ＮａｅＩの認識部位は破壊される。
【０１４８】
ＰＣＲ産物はＮａｅＩで切断され、断片は１％アガロースゲル上に分離された。ノックアウト細胞株中の制限部位の欠失により、改変された制限パターンが予想される（図９および９ａ）
【０１４９】
ｃ）ＭＩＦノックアウトＲＡＢ０産生ＣＨＯ−Ｓ細胞株のウエスタンブロット分析
ＭＩＦのＭＩＦタンパク質の減少を立証するため、ノックアウト細胞タンパク質抽出物がウエスタンブロットによって分析された。
細胞抽出物は、市販されている溶解バッファー（＃９８０３「Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」）を使用して調製された。試料をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＵ  Ｐａｇｅ  ４〜１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓゲル  １．５ｍｍ×１５ウェルで分離して、ニトロセルロース膜に移した。
ＣＨＯ−ＭＩＦは、実施例５に記載のポリクローナルウサギ抗−ＭＩＦ抗体を一次抗体として、抗−ウサギＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのホースラディシュペルオキシダーゼを二次抗体として使用して、間接的な免疫蛍光によって検出された。タンパク質パターンはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ＣＢ−ＳＧ−３９を使用して可視化された。（図１０および１０ａ）。
【０１５０】
実施例７
ＣＨＯ−ＭＩＦノックアウト細胞株における抗−ＭＩＦ抗体の製造
抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０は内因性ＣＨＯ−ＭＩＦのノックアウトの後にＣＨＯ細胞株で産生された。対照的に、同じ抗体がＣＨＯ野生型ＭＩＦ細胞株で産生された。抗体は、抗体に結合するＣＨＯ−ＭＩＦを除去するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムで、他のいかなる追加の処理なしで精製された。精製した抗体は、実施例４ｄに記載されるように、ウエスタンブロット分析によって特性評価された。野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞株で産生された同じ抗体と比べて、ノックアウト細胞株ＣＨＯ−ＲＡＢ０  ＭＩＦｋｏ．ｃｐ７５では、検出可能なＣＨＯ−ＭＩＦの残存が全くなかった。（図１１および１１ａ）。
【０１５１】
実施例８
上記された実施例６および７が、それぞれ抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４またはＲＡＢ９の産生をもたらす、各々が抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＭ４または、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９を安定的に発現するＣＨＯ細胞株を使用し、かつそれぞれ抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＭ４、ＲＡＭ９またはＲＡＭ０の産生をもたらす、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４、ＲＡＭ９またはＲＡＭ０を発現するＣＨＯ細胞株を使用して、同じ方法で繰り返される。
【０１５２】
実施例９
振盪フラスコ発酵での、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＭ０を産生するＭＩＦ野生型およびＭＩＦノックアウト細胞株の抗体生産性の比較
ＲＡＭ０ＭＩＦｋｏ．ＣＨＯ−Ｓ．３３ｃｐ７５および親生産細胞株ＲＡＭ０．ＣＨＯ−Ｓ．３３は２８℃で最も高い発現レベルおよび細胞生存を示した。この実験では、両方の細胞株は、振盪フラスコ中で３７℃でおよそ３×１０５の細胞密度に増殖し、１日間、３７℃で培養され、さらに１９日間で、２８℃に移動した。細胞計数と生存性は、ＣＥＤＥＸを使用してモニターされた。ＲＡＭ０の産生はＭＩＦ特異的結合ＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１５３】
実験は以下の結果を示した（データ示さず）：
−  細胞は長期間を通じて、高生存である。
−  細胞は２８℃で増殖が停止する。
−  細胞は連続的に抗体を産生する。
−  ＭＩＦｋｏ細胞株は、非常に驚くべきことに、本質的には親のＭＩＦｗｔ細胞株と同じ特性を示す。
【０１５４】
実施例１０
３リットル規模のバッチ発酵での、抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＭ９を産生するＭＩＦ野生型およびＭＩＦノックアウト細胞株の抗体生産性の比較
抗−ＭＩＦ抗体ＲＡＭ９は、野生型ＭＩＦ遺伝子を含むＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株ＲＡＭ９．ＣＨＯ−ＤＧ４４＃２０、およびノックアウトＭＩＦ遺伝子を含むＲＡＭ９．ＣＨＯ−ＤＧ４４．ＭＩＦｋｏ＃１０で産生された。
【０１５５】
驚くべきことに、両方の細胞株で同様のレベルの細胞増殖および生産性に達することができる（データ示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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