(57)【要約】  本発明はゲノム変異検出分野に関し、特に細胞染色体DNA断片コピー数変異（Copy number variation、CNV）の検出に関する。本発明は、更に細胞染色体DNA断片コピー数変異に関連する病気の検出に関する。【選択図】図１
2014530629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）被検測サンプル及び正常サンプルから得られたゲノムDNA分子をぞれぞれ無作為に切断してDNA断片を得て、前記DNA断片の配列決定を行い配列決定のリードを獲得するステップ、
b）ステップaで測定したDNA配列とサンプルの種のゲノム参考配列を対比して測定したDNA配列を参考配列上に定位し、参考配列上に唯一の位置を有するリードのみを選出して解析を行うステップ、
c）参考配列において以下の条件に満足する断点、即ち被検測サンプルの対比結果と正常サンプルの対比結果を比べ、サイト両側にコピー数変異比率が異なるサイトを探すステップ、具体の手順は以下の通りである：
i）参考配列上の各々サイトbに対して、強引にその左右両側の局部窓口にw条正常リードを包含させ、即ちN(xL,b)=N(b,xR)=wを満たし、式中に、N(xL,xR)は正常サンプルの窓口(xL,xR)中に落ちた対比本数であり、wは1を超える整数であり、
ii）これらの位置において、
【数１】
2014530629.tif 000026
に符合するサイトを選別し、Di(xL,xR)=0、b-w<i<b+wに符合するサイトを除去し、検定統計量D(xL,xR)に対して正規分布の両側有意性検定を行うことで、各々サイトのp(|D(xL,xR)|)は得られ、式中に、D(xL,xR)=log(R(xL,x))-log(R(x,xR))、
【数２】
2014530629.tif 000027
、また、正常サンプルリードと被検測サンプルリード中唯一に参考配列上に対比したリード本数はそれぞれaN及びaTであり、窓口(xL,xR)中に落ちた参考配列の唯一対比したリード本数はそれぞれN(xL,xR)及びT(xL,xR)であり、
iii）pbkpを設定し、p(|D(xL,xR)|)>pbkpに符合するすべてのサイトを得るまで上記のステップを繰り返し、得られた候補サイト集合はBc、Bc={b1,b2,...,bN}であり、
d）ステップcで得られた参考配列上の候補サイト集合Bc、Bc={b1,b2,...,bN}にある各サイトkの両側に窓口(bk-1,bk-1)及び(bk,bk+1)が存在し、両側窓口の間のコピー数変異比率の差異が比較的に小さいサイトを除去し、即ち毎回に
【数４】
2014530629.tif 000028
最大のサイトkを削除し、また区間(bk-1,bk+1)のp値を更新・合併し、pmergeを設定することで、すべてのサイトは
【数５】
2014530629.tif 000029
に満たすまで当該ステップを繰り返して染色体コピー数変異が発生する断点を得るステップ、
を含む染色体コピー数変異の検出方法。
【請求項２】
前記wは100〜1000の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
pbkpは侯補サイトが10、100、1000又は10000である時最小のp(|D(xL,xR)|)であるか、或いは、以下のように選択されるものである：正常サンプルを被検測サンプルとして、前記ステップa）からc）のii）まで執行し、すべてのp(|D(xL,xR)|)について偽発見率制御（FDR）で濾過し、濾過したサイト中の最後にFDR閾値を突破するp(|D(xL,xR)|)をpbkpとすし、その偽発見率制御を行うステップは、被検定データ集合を有意性（P値）で小さいから大きいまで排列し、これらのランク（r）を得て、上から下に
【数３】
2014530629.tif 000030
（Pkは第k個位置のP値であり、rkは第k個位置のランクであり、Nは総サイト個数であり、αは有意性レベル、例えば0.01である）に満たす最後のサイトkまで検定し、k及びその前のすべてのサイトを保留し、その後の偽陽性サイトを除去するステップである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
pmergeは、残りのサイト数はもと侯補サイト数の1/2、1/10、1/100又は1/1000である時の最大のp(|D(xL,xR)|)であるか、或いは、以下のように選択されるものであり、即ち、正常サンプルを被検測サンプルとして、合併した候補サイト数を最初サイト数の1/2、1/10、1/100又は1/1000になるように、上記のステップa）〜d）を執行し、最大のp(|D(xL,xR)|)はpmergeとして選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
染色体コピー数変異が発生したサイトを得た後、 
e）ステップdで得られた断点に基づきCNV解析を行い、正常サンプルに対する被検測サンプルのCNV比率は微細欠失検出閾値以下であるサイトを微細欠失サイトとして選択し、正常サンプルに対する被検測サンプルのCNV比率は微細重複検出閾値以上であるサイトを微細重複サイトとして選択するステップ及び、
f）前記微細欠失サイト及び/又は微細重複サイトを既存のCNV及び病気データベースに対照して遺伝子注釈と機能解析を行い、染色体の微細欠失及び／または微細重複症候群病気のタイプを注釈するステップ、
を更に含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微細欠失検出閾値は0.75であり、微細重複検出閾値は1.25である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは細胞、血液、又は組織から由来のものである、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
サンプルゲノムDNA分子無作為に切断し的ステップは、化学又は物理断裂方式で行い、前記化学又は物理断裂方式は酵素切断破壊、霧化、超音又はHydroShear法破壊を含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記DNA断片配列決定ステップはハイスループット配列決定技術を利用して行ない、前記ハイスループット配列決定技術はIllumina/Solexa、ABI/SOLiD又はRoche/454配列決定技術を含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記DNA断片配列決定ステップに採取される配列決定深度範囲は1〜30×である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
コピー数変異比率値により染色体数字核型図を製作するステップを更に含む、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム変異検出分野に関し、特に細胞染色体DNA断片コピー数変異（Copy number variation、CNV）の検出に関する。本発明は、更に染色体DNA断片コピー数変異に関連する病気の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体微細欠失/微細重複とは、染色体上に、長さは1.5kb-10Mbである欠失又は重複が現れることを意味する。人染色体微細欠失/微細重複症候群(microdeletion/microduplication syndromes)は、人染色体上に微小断片欠失又は重複（即ちDNA断片コピー数変異）が出現することに起因する複雑表型病気であり、周産期子供及び新生児に発病率が比較的に高く、先天性心臓病又は心臓畸形、厳重な成長発育緩慢、外貌又は肢体奇形などの酷い病気及び異常をもたらす。また、微細欠失症候群は、唐氏症候群と脆弱X染色体症候群に加え、知力発育緩慢の主要な原因の一つである。（Knight SJL (ed): Genetics of Mental Retardation. Monogr Hum Genet. Basel, Karger, 2010, vol 18, 101-113）。近年、国内外の主要出生欠陥発病率統計中、前列に立つのは染色体微細欠失/微細重複に関連する先天性心臓病、知力低下、脳性麻痺及び先天性耳不自由である。常見の微細欠失症候群は、22q11微細欠失症候群、ネコ鳴き症候群、Angelman症候群、AZF欠失などを含む。
【０００３】
22q11微細欠失症候群を例として、この症候群は人染色体22q11.21 - 22q11.23区域ヘテロ接合性の消失を原因とする臨床症候群の一種であり、DiGeorge症候群、口蓋心臓顔面症候群、円錐動脈幹異常顔貌症候群、Cayler心臓顔症候群及びOpitz症候群などの同じ遺伝学基礎を有する多数の臨床症候群を含み、この病気の最も常見な臨床表現には心臓畸形、異常顔貌、胸腺発育不良、口蓋裂及び低カルシウム血症を含み、また、この症候群の患者には体格及び知力発育緩慢、学習及び認知困難、精神異常などの表現が現れ、人類に最も常見な微細欠失症候群である。その発生率は1: 4000（生産児）であり、男女発病率に明らかな差異がない。（Drew LJ, et al. The 22q11.2 microdeletion: Fifteen years of insights into the genetic and neural complexity of psychiatric disorders. Int J Dev Neurosci. 2010 Oct 8.）。
【０００４】
毎種の微細欠失症候群の発病率低く（https://decipher.sanger.ac.uk/syndromes）、そのうち、常見の22q11微細欠失症候群、ネコ鳴き症候群、Angelman症候群、Miller-Dieker症候群などの発生率はそれぞれ1: 4000（生産児）、1: 50000、1: 10000、1: 12000であるけれど、臨床検出技術の制限で、多量の微細欠失症候群患者は産前スクリーニング及び産前診断中に検出することができなく、ひいては子どもが生まれた数ヶ月後更に数年後に典型的な臨床表徴が現れた場合、その原因を遡って探す時にも、検出技術の制限で病因を確診することができない。一部分のタイプの微細欠失症候群は根治することができないので、生まれた数月又は数年内に死亡し、社会及び家庭に重い精神及び経済の負担をもたらす。不完全な統計により、全世界で“アンジェルマン症候群”（即ちAngelman症候群）患者は1.5万名に達する。他のタイプの染色体微細欠失症候群患者の数量も年々増える傾向がある。従って、妊娠前に臨床擬似患者及び関連不良妊娠歴を有する両親に対して染色体微細欠失/微細重複の検出を行うことは、遺伝諮問の提供及び臨床策略根拠の提供に有利である。妊娠期間に早期産前診断を行うことは、患児出生を効果的に防止する又は患児に出産後の治療方法を提供するに根拠を提供することができる（Bretelle F, et al..Prenatal and postnatal diagnosis of 22q11.2 deletion syndrome. Eur J Med Genet. 2010 Nov-Dec; 53(6): 367-370）。
【０００５】
しかしながら、この種の病気は、染色体レベルの微小変異なので、染色体核型解析方法などの通常の臨床方法（解像度は10M以上）で検出することができない（Malcolm S. Microdeletion and microduplication syndromes. Prenat Diagn. 1996 Dec; 16(13): 1213 - 9）。現在、微細欠失/微細重複症候群に対する診断方法には、主として、高解像度染色体核型解析、FISH（蛍光in situ ハイブリダイゼーション）、Array CGH（比較ゲノムハイブリダイゼーション）、MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）及びPCR方法などの方法があり、これらの方法を利用して、染色体的微細欠失/微細重複を検出することができる。
【０００６】
高解像度染色体核型解析は、20世紀80年代後に出現する高解像度分染技術（high resolution banding technique）であり、細胞同期化の方法により、多量の優質の有糸分裂後期又は前中期の分染核型を獲得し、一セットの染色体のバンドの数量を数百本以上に増加させることで、染色体微細構造変化を区別する能力を高めることができるが、その解像度はただ約3-5Mしかない。この方法の解像度は通常染色体核型解析より高いが、より小さい染色体レベルの微細欠失/微細重複変異の検出には足りない（Jorge J. Yunis, Jeffrey R. Sawyer and David W. Ball. The characterization of high-resolution G-banded chromosomes of man. Chromosoma. 67(4), 293 - 307）。
【０００７】
FISH（fluorescence in situ hybridization）は、20世紀80年代末に発展してきた非放射性分子細胞遺伝技術であり、当該方法は微細欠失/微細重複検出の黄金標準であり、当該方法は多くの染色体欠失を効果的に検出することができる。その基本原理は、下記のようです：検出される染色体又はDNA繊維切片上の標的DNAは用いられる核酸プローブと相同及び相補的であれば、両者は変性-アニール-復性を経て、標的DNAと核酸プローブのハイブリダイゼーション体を形成することができ、核酸プローブのある一種のヌクレオチドにビオチン、ジゴキシンといった報告分子を標記し、この報告分子とフルオレセイン標記の特異アビジンの間の免疫化学反応を利用して、蛍光検出システムで鏡下被検測DNAに対して定性、定量又は相対定位解析を行う。その優点は、実験周期短い、結果を早く得ること、特異性優良、定位精確である。中期染色体FISHの解像度は1〜2Mに達し、間期染色体FISH解像度は50Kに達するが、この技術は、欠失サイトを知っている条件下にプローブを設計して検証を行う必要があり、新しい染色体レベルの微細欠失又は重複異常の発見に適しなく、且つ費用も高く、操作人員の技術熟練程度への要求が高い（Fluorescence in situ hybridization. Nature Methods, 2237〜2238, 2005）。
【０００８】
Array CGH（Array comparative genomic hybridization）は、近年、臨床細胞遺伝学分野に応用されている一つの技術であり、特異DNA断片を標的プローブとして担体に固化してマイクロアレイを形成し、フルオレセインを標記した被検測DNA及び参考DNAとマイクロアレイとをハイブリダイゼーションすることでDNAコピー数変異を検出することである。Array CGHの解像度は設計するプローブのタイプ、大きさ及びそのゲノム上の距離により、理論的に5乃至10kb更により小さいDNA配列を検出できるが、当該方法の価格が高く、また、一般的に全ゲノムの全部のサイトを覆うことではない。目前、染色体微細欠失症候群に用いられる診断は文献によく見られる（ACOG Committee Opinion No. 446: array comparative genomic hybridization in prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology, 2009）。
【０００９】
MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）は、近年発展してきた、被検測DNA配列を定性及び半定量解析する新しい技術である。MLPA技術は、目前、臨床実験室でY染色体微細欠失、22q11.2染色体微細欠失などの検出に応用される。該技術の長所は効率高く、特異、高速、便利にあり、欠点はサンプルを汚染されやすく、未知の点変異タイプの検出に適しなく、染色体の平衡転座を検出できないことにある（王科ら、MLPA技術検出22q11.2染色体微細欠失.《第七回全国唇裂口蓋裂学術会議論文集》, 2009）。
【００１０】
PCR方法は常にY染色体微細欠失方面の検出に用いられ、例えばY染色体の男性生殖関連のAZF遺伝子（AZFa、AZFb、AZFc）などの欠失はPCRの方法にて検出することが多い。既知の染色体微細欠失サイトの検証には、PCR方法も用いられる。当該方法は簡単、実施しやすいが、欠点は既知サイトのみに対して検出ができ、また、毎回、一つのサイトしか検出することができない。確実の検出方法は、検出目的に達するために多数のサイトのPCR反応を組み合わせる必要がある（Cong-yi YU、et al. Multiplex PCR Screening of Y Chromosome Microdeletions in Azoospermic Patients. JOURNAL OF REPRODUCTION AND CONTRACEPTION. 2004, 15(4)）。
【００１１】
上記の内容により分かるように、目前、染色体微細欠失/微細重複の検出方法に存在する限制要因は、主に、解像度低く、全ゲノムを覆うことができなく、ロースループット及び高コストにある。これらの限制因素を克服する検出染色体微細欠失/微細重複の新しい方法を開発するのは切実な要求されるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ハイスループット（HIGH-THROUGHPUT）配列決定技術の継続的な発展と配列決定コストの継続的な降下に伴い、ハイスループット配列決定による染色体異常の検出解析がますます広く活用されてきている。現在の検出染色体微細欠失/微細重複方法の解像度高くないなどの欠陥を解決するために、本発明はハイスループット配列決定技術によるDNAコピー数変異を検出してさらに染色体微細欠失/微細重複を検出する方法を設計する。当該方法は、先行技術の常用のいくつかの方法における解像度低い、全ゲノムを覆うことができず、ロースループット及び高コストとの欠点を克服し、全ゲノムのレベル上に染色体微細欠失/微細重複の検出を行い、病気の既知サイトを探す及び検証することができるだけではなく、未知のサイトを探索する及び発見することもでき、ハイスループット、特異性高い、定位精確である。染色体微細欠失/微細重複を検出することで、染色体微細欠失/微細重複症候群の検出を図る。
【００１３】
本発明は細胞染色体DNA断片コピー数変異（Copy number variation、CNV）を検出する方法に関し、この方法は以下のステップを含む。
a）被検測サンプル及び正常サンプルから得られたゲノムDNA分子をぞれぞれ無作為に切断してDNA断片を得て、前記DNA断片の配列決定を行い配列決定のリード（read）を獲得する；
b）ステップaで測定したDNA配列とサンプルの種のゲノム参考配列を対比して測定したDNA配列を参考配列上に定位し、参考配列上に唯一の位置を有するリードのみを選出して解析を行う；
c）参考配列上において、以下の条件に満足するサイトを探す。即ち、正常サンプルの対比結果と比べ、サイト両側にコピー数変異比率は差異があるサイトである。具体の手順は以下のようになる。
i）参考配列上の各々のサイトbに対して、強引にその左右両側の局部窓口にw条正常リードを包含させ、即ちN(xL,b)=N(b,xR)=wを満たし、式中に、N(xL,xR)は窓口(xL,xR)中に落ちた正常サンプルの対比本数である；
ii）これらの位置において、
【数１】
2014530629.tif 000003
に符合するサイトを選別し、Di(xL,xR)=0、b-w<i<b+wに符合するサイトを除去し、検定統計量D(xL,xR)に対して正規分布の両側有意性検定を行うことで、各々サイトのp(|D(xL,xR)|)は得られ、式中に、D(xL,xR)=log(R(xL,x))-log(R(x,xR))、
【数２】
2014530629.tif 000004
、また、正常サンプルリードと被検測サンプルリード中唯一に参考配列上に対比したリード本数はそれぞれaN及びaTであり、窓口(xL,xR)中に落ちた参考配列の唯一対比したリード本数はそれぞれN(xL,xR)及びT(xL,xR)である；
iii）pbkpを設定し、p(|D(xL,xR)|)>pbkpに符合するすべてのサイトを得るまで上記のステップを繰り返し、得られた候補サイト集合BcはBc={b1,b2,...,bN}に満たす；
そのうち、pbkpを設定してよく、例えば対照サンプルデータにより最初の候補サイトが10、100、1000又は10000である時最小のp(|D(xL,xR)|)をpbkpと設定する。以下の方式でpbkpを選択してもよい。正常サンプルを被検測サンプルとして、前記ステップa）〜c）のii）を執行し、すべてのp(|D(xL,xR)|)について偽発見率制御（False discovery rate control、FDR control）で濾過し、濾過したサイト中の最後にFDR閾値を突破するp(|D(xL,xR)|)をpbkpとする。偽発見率制御を行うステップは以下のようになる。
被検定データ集を有意性（P値）で小さいから大きいまで排列し、これらのランク（r）を得る。
上から下に
【数３】
2014530629.tif 000005
に満たす最後のサイトkまで検定し、式中に、Pkは第k個位置のP値であり、rkは第k個位置のランクであり、Nは総サイト個数であり、αは有意性レベル、例えば0.01である。
k及びその前のすべてのサイトを保留し、その後の偽陽性サイトを除去する。
d）ステップcで得られた参考配列上の候補サイト集合Bc、Bc={b1,b2,...,bN}にある各サイトkの両側に窓口(bk-1,bk-1)及び(bk,bk+1)が存在する。両側窓口の間のコピー数変異比率差異比較的に小さいサイトを除去し、即ち毎回
【数４】
2014530629.tif 000006
最大のサイトkを削除し、また区間(bk-1,bk+1)のp値を更新・合併し、ｈを設定することで、すべてのサイトは
【数５】
2014530629.tif 000007
に満たすまで当該ステップを繰り返して、残りのサイトはCNVを探すに必要な要求を満たすサイトであり、即ち染色体コピー数変異が発生するサイトを得る。
そのうち、pmergeは、設定してよく、例えば残りのサイトの規模はもとの1/2、1/10、1/100又は1/1000である時の最大のp(|D(xL,xR)|)をpmergeとして設定する。以下の形態でpmergeを選択してよい。合併した候補サイトの数量を最初サイトの数量の1/2、1/10、1/100又は1/1000にするように、正常サンプルを被検測サンプルとして、上記のステップa）〜d）を執行し、そのうち、最大のp(|D(xL,xR)|)はpmergeとして選ばれる。
【００１４】
本発明は更に、細胞染色体DNA断片コピー数変異（Copy number variation、CNV）による複雑な臨床表型効果の病気解析方法に関する。前記方法は、上記のステップa）〜d）以外、更に以下のステップを含む。
e）ステップdで得られた断点に基づきCNV解析を行い、正常サンプルに対する被検測サンプルのCNV比率は微細欠失検出閾値以下であるサイトを微細欠失サイトとして選択し、正常サンプルに対する被検測サンプルのCNV比率は微細重複検出閾値以上であるサイトを微細重複サイトとして選択し、
微細欠失検出閾値及び微細重複検出閾値は、当業者が経験により選択してよく、例えば微細欠失検出閾値は0.75であり、微細重複検出閾値は1.25である。
f）前記微細欠失サイト及び/又は微細重複サイトを既存のCNV及び病気データベースに対比して、基本の遺伝子のアノテーション及び欠失部分に関する遺伝子機能解析を行い、微細欠失症候群病気のタイプを注釈する。
【００１５】
本発明の実施形態の具体的な技術流れは図1に示す。
【００１６】
本発明の効果
目前の染色体微細欠失/微細重複を検出する常用方法（如高解像度染色体核型解析、FISH、Array CGH及びPCRの方法）と比べ、本発明の優越性は主に以下の点である。
１）  高解像度。本発明は、染色体CNVを解析する精度が100kbに達し、染色体微細欠失/微細重複を効果的に検出することができる。
２）  より広いデータ解析に適用し、メモリー設備の利用率を高める。算法を新たに編訳し、データ処理の方法を改善し、元のSegSeqソフトウェアは1〜4×低深度配列決定データ解析のみに適したが、改良したSegSeqは1〜30×異なる配列決定深度のデータ解析に適用することができる。
３）  全ゲノムを覆う。第二世代の配列決定技術に基づき、本発明は全ゲノム範囲に対して染色体CNV解析を行い、既知のプローブを依頼すること及びプローブを設計することなく、新しい染色体異常を発見することができる。
４）  ハイスループット。ハイスループット配列決定技術に基づき、本発明はハイスループットで染色体CNV解析を行い、サンプル一個あたりに異なるラベル配列を加えることで、多量のサンプルに対して一括に解析することができる。
５）  低コスト。配列決定技術の不断の発展及び配列決定コストの継続的に降下に従い、本発明の染色体CNV解析のコストもますます低下してくる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は本発明の染色体CNV解析の概要流れ図である。
【図２】図2はSeqSeq算法流れ模式図である。
【図３】図3A-Cはサンプル1-サンプル3の染色体数字核型図であり、染色体上の重複、欠失及び正常区域はそれぞれ図中に示し、相応位置及び詳細な情報は表2に示す。
【図４】図4A-Cはサンプル4-サンプル6の染色体数字核型図であり、染色体上の重複、欠失及び正常区域はそれぞれ図中にしめし、相応位置及び詳細な情報は表4に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の明細書及び特許請求の範囲において、リード（reads）とは、配列決定で得られた配列断片である。
【００１９】
本発明の明細書及び特許請求の範囲において、断点（breakpoint）とは、染色体上にコピー数変異が発生する分界点。
【００２０】
本発明において、サンプルから由来のゲノムDNAは、サンプルの血液、組織又は細胞から得られる。前記の血液は、両親の末梢血又は胎児の臍帯血から得られる。前記の組織は、胎盤組織又は絨毛膜組織であって良い。前記の細胞は、未培養又は培養した羊水細胞、絨毛組織細胞であって良い。
【００２１】
本発明において、ゲノムDNAの採集は、塩析法、カラムクロマトグラフィー 法、磁珠法、SDS法などの通常DNA抽出方法を用いって良く、磁珠法を用いることは好ましい。いわゆる磁珠法とは、血液、組織又は細胞は、細胞溶解物及びプロティナーゼKの作用を経て、暴露されたDNA分子を得て、特異性の磁珠を利用してDNA分子に可逆性の親和付着を行い、洗浄液で洗浄し、蛋白質、脂質などの不純物を除去した後、精製液でDNA分子を磁珠から洗脱剃る方法である。磁珠法は、メーカーから提供の方案に従って行わればよい。
【００２２】
本発明において、DNA分子の無作為切断処理は、酵素切断、霧化、超音、或いはHydroShear法を用いて行うことができる。好ましくは、超音法を用いて、例えば、Covaris社のS-seriesは、AFA技術に基づき、センサーから放出した音声エネルギー/機械エネルギーがDNAサンプルを通る時、溶解気体が気泡に形成する。エネルギーを取り除いた後、気泡が崩壊してDNA分子を断裂する能力を産生する。一定のエネルギー強度及び時間間隔などの条件（破壊パラメーターとして以下の例を挙げられる。Duty cycle 20%、Intensity 10、cycles/Burst 1000、Time 60s、Mode：power tracking）を設定することで、DNA分子を一定範囲の大きさ（例えば、200bp - 800bpまちまちである）まで破壊することができる。具体的な原理及び方法はメーカーから提供の説明書を参照し、DNA分子を比較的に集中した一定の大きさの断片に破壊すればよい。在本発明の一つの実施形態において、DNA分子は約500bp程度に破壊される。
【００２３】
本発明において、採用される配列決定方法は、ハイスループット配列決定方法Illumina/Solexa、ABI/SOLiD、Roche/454であって良い。配列決定タイプはsingle-end（単一方向）配列決定及びPair-end（両方向）配列決定であって良く、配列決定長さは50bp、90bp、又は100bpであって良い。本発明の一つの形態において、配列決定プラットフォームはIllumina/Solexaであり、配列決定タイプはPair-end配列決定であり、両方向位置関係を有する100bp程度のDNA配列分子を得る。
【００２４】
本発明において、配列決定深度は1〜30×であってよく、即ち総データ量はヒトゲノム長さの1-30倍であり、例えば本発明の一つの形態において、配列決定深度は2×であり、即ち2倍（6×109bp）である。具体的な配列決定深度は、検出した染色体変異断片の大きさにより確定してよく、配列決定深度は高いほど検出した欠失及び重複の断片は小さくなる。
【００２５】
被検測のDNA分子は多数の被験サンプルから由来する場合、配列決定過程中にサンプルの区別を行うように、サンプル一個あたりに異なるラベル配列を加えてよく、（Micah Hamady, Jeffrey J Walker, J Kirk Harris et al. Error-correcting barcoded primers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex. Nature Methods, 2008, 5(3)）、同時に多数のサンプルの配列決定を実現する。
【００２６】
本発明において、ゲノム参考配列は、公共データベースから由来するものであって良い。例えば、ヒトゲノム配列は、NCBIデータベースでのヒトゲノム参考配列であって良い。本発明の一つの形態において、前記ヒトゲノム配列はNCBIデータベースでの36版（hg18；NCBI Build 36）のヒトゲノム参考配列である。
【００２７】
配列対比は、いずれか一種の配列対比プログラム、例えば当業者にとって得られる短いオリゴヌクレオチド解析パッケージ（Short Oligonucleotide Analysis Package , SOAP）及びBWA対比（Burrows-Wheeler Aligner）にて行い、リードと参考ゲノム配列を対比し、リードの参考ゲノム上の位置を得る。配列対比は、プログラムで提供された黙認パラメーターで行い、或いは当業者に必要に応じてパラメーターを選択される。本発明の一つの形態において、採用される対比ソフトウェアはSOAPaligner/soap2である。
【００２８】
本発明において、SOAPといったソフトウェアによりリードを染色体配列データ上に対比される。ゲノムコピー数変異（copy number variation, CNV）のソフトウェア算法は、Broad研究院に開発されたMatlab脚本（群）であり、Segseqソフトウェア算法と呼ばれる。図2に示す。これは、新世代の配列決定技術で産生されたデータにより、癌化サンプルと正常サンプルを比較することで、コピー断片の断点（breakpoint）及びコピー数変異比率（tumor‐normal copy ratio）を算出し、同時に相応のP‐valueなどの統計データを推算し、低配列決定深度（10M PE: 32,36リード）の場合に50K程度のCNV断片を検出することができる。
【００２９】
本発明において、被検測サンプルに対してCNV解析の断点を探すとは、改良されたSegseqソフトウェア算法を利用して、正常サンプルを陰性対照として、参考ゲノム配列において、被検測サンプルと正常サンプルちの両側コピー数変異比率差異は一定の要求に満たす候補サイト、即ち断点を探すこと指す。前記断点を探すことには二つのステップを含む。即ち、（1）初期化。その目的は、候補点の選出にある。（2）隣接の断片の合併を繰り返す。その目的は、偽陽性率を低下することにある。
【００３０】
具体的な原理及数学模型は、配列決定で得られたリードはゲノムDNA中の随机断片から由来するものである前提下、対比後一つの区域に落ちるリード数量はポアソン分布に従うべき。全ゲノム中の対比可能な区域長さをA（A=2.2×109）とし、正常サンプル及び被検測サンプルの参考配列に対比可能なリード本数をそれぞれaN及びaTとし、窓口(xL,xR)中に落ちたリード本数をそれぞれN(xL,xR)及びT(xL,xR)とし、窓口大きさL=xR-xL+1、そしてN及びTはそれぞれパラメーターは
【数６】
2014530629.tif 000008
及び
【数７】
2014530629.tif 000009
であるポアソン分布に従い、かつλT=r×a×λN、a=aT/aNがある。コピー数変異比率は
【数２】
2014530629.tif 000010
と定義され、サンプリングが大きいである条件下、R(xL,xR)は対数正規分布に近いである。D(xL,xR)=log(R(xL,x))-log(R(x,xR))、xL<x<xR、と定義する。そして、R(xL,xR)は対数正規分布に近いから、D(xL,xR)は正規分布に従うことにより、両側P-value（p(|D(xL,xR)|>d）を用いてあるサイト両側のコピー数変異比率差異は有意かどうかことを検定することができる。
【００３１】
断点を探すステップ（1）中の初期化とは、候補点を予選する流れを指す。具体的には、参考配列上の位置ｂに対し、強引にその左右両側の局部窓口にｗ条正常リードを包含させ、即ちN(xL,b)=N(b,xR)=wを満たす。これらの位置において、
【数１】
2014530629.tif 000011
を満たすものを候補配列に加入し、Di(xL,xR)=0、b-w<i<b+wを満たすものを除去し、候補点に列入しない。適宜なpbkpを設定することで、p(|D(xL,xR)|)>pbkpに符合するすべてのサイトを得るまで上記のステップを繰り返し、適宜な数量の候補点を得る。
【００３２】
本発明において、ｗは1を超える任意の整数で良い、例えば5 - 5000、好ましくは10 - 2000、更に好ましくは100〜1000であり、例えば300である。
【００３３】
断点を探すステップ（2）に隣接の断片の合併を繰り返すとは、最尤処理により、その間のコピー数変異比率差異が比較的に小さい隣接の断片を合併させることで、偽陽性率を低下する。具体的に、ステップ（1）で得られた参考配列上の候補点集合をBc、Bc={b1,b2,...,bN}とし、候補点kの左右両側窓口をそれぞれ(bk-1,bk-1)及び(bk,bk+1)とし、両側窓口の間のコピー数変異比率差異比較的に小さいサイトを除去する。即ち、毎度、
【数４】
2014530629.tif 000012
最大のサイトkを削除し、合併区間(bk-1, bk+1)のｐ値を更新し、pmergeを設定し、すべてのサイトは
【数５】
2014530629.tif 000013
に満たすまで当該ステップを繰り返すと、残りのサイトはCNVを探すに必要な要求を満たすサイトである。
【００３４】
本発明において、候補点を探してからCNV解析を行うとは、当該分野群体データ解析の経験値により被検測サンプルの正常サンプルに対するCNV比率≦0.75及び≧1.25をそれぞれ染色体コピー数変異の検出閾値とし、CNV比率≦0.75は染色体欠失であり、CNV比率≧1.25は染色体重複である。解析で得られた微細欠失/微細重複結果により染色体数字核型図を製作する。
【００３５】
染色体数字核型はゲノム上のDNAコピー数変異を量化する技術であり、全ゲノム上の特定サイトのDNA短配列を単離して挙げる。例えば、人染色体において、染色体核型図を製作するのは、通常、一つの細胞中の染色体を最大（第1号染色体）から最小（第22号染色体）まで排列、性染色体（X及び/又はY）を最後に示す。これは本分野中に常用されている表示方法であり、本分野普通技術人員の能力範囲内にある。例えば、文章（Tian-Li Wang et al. Digital karyotyping. PNAS, 2002, vol. 99, no. 25, 16156-16161.）、（Henry Wood et al. Using next-generation sequencing for high resolution multiplex analysis of copy number variation from nanogram quantities of DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. Nucleic Acids Research, 2010, 38(14), doi: 10.1093/nar/gkq510.）或いは本発明実施例を参照して行って良い。
【００３６】
本発明において、そのうち、pbkpは設定されてよく、例えば対照サンプルデータにより最初の候補サイトが10、100、1000又は10000である時最小のp(|D(xL,xR)|)をpbkpと設定する。以下の形態でpbkpを選択してよい。正常サンプルを被検測サンプルとして、本発明のステップを執行してp(|D(xL,xR)|)を計算し、すべてのp(|D(xL,xR)|)を偽発見率制御（False discovery rate control、FDR control）を行い、最後にFDR閾値を突破するp(|D(xL,xR)|)をpbkpとする。例えば、実施例において、癌症サンプルと異なり、群体研究中に黙認の対照サンプル（例えば、癌旁）が存在していないので、炎黄群体のデータ（45名南方漢民族+45名北方漢民族）の深度配列決定データを利用してこれによる不足を補う。混合正常サンプル（ここで、炎黄一号以外の炎黄群体データのみを与える）を被検測サンプルとし、それぞれ本発明方法ステップa）〜c）のii）を執行し、すべてのp(|D(xL,xR)|)を偽発見率制御（False discovery rate control、FDR control）を行い、さいごにFDR閾値を突破するp(|D(xL,xR)|)をpbkpとする。
【００３７】
本発明において、pmergeを設定してよく、例えば残りのサイトの規模がもとの1/2、1/10、1/100又は1/1000である時最大のp(|D(xL,xR)|)をpmergeと設定する。以下の方法でpbkpを選択してよい。正常サンプルを被検測サンプルとして、本発明方法ステップa）〜d）を執行し、合併した候補サイトの数量を最初サイトの数量の1/2、1/10、1/100又は1/1000にし、そのうち、最大のp(|D(xL,xR)|)はpmergeとして選択される。例えば、実施例において、黙認対照サンプル（例えば癌旁）が足りないので、黙認対照を合併する方法で閾値を選定することができない。混合正常サンプル（ここで、炎黄一号以外の炎黄群体データのみを与える）に対して、候補点集合中の候補点数量は最初の1/100になるまでに、合併ステップまで本発明の方法を執行し、そのうち、最大のp(|D(xL,xR)|)はpmergeとして選出され、その後の解析に用いられる。
【００３８】
本発明において、正規分布有意性検定P値の計算方法は、本分野中公知の方法を用いてよく、既存の多量のソフトウェア算法にて計算してもよい。これらの算法は本分野普通技術人員が得られるものである。
【００３９】
本発明において、既存のCNVと病気データベースとは、既存のコピー数変異と病気関連情報のデータベースを指す。本発明の一つの形態において、使用されるデータベース値DECIPHER (https://decipher.sanger.ac.uk/syndromes)、該データベースに挙げられた58種の微細欠失/微細重複症候群はいずれも欠失重複断片と病気関係明確の内容である。
【００４０】
本発明の一つの形態において、絨毛組織に対して染色体CNV解析を行う具体的な方法は、以下のステップを含む。
1、DNA抽出及び配列決定：磁珠法ゲノムDNA抽出キット（例えばTiangen DP329）操作ハンドブックに従って絨毛組織DNAを抽出した後、Illumina/Solexa標準ライブラリ構築工程に従ってライブラリを構築する。この過程中、絨毛組織DNAは超音法で500bp程度に集中したDNA分子に無作為に切断され、両端に配列決定用ジョイントを加え、サンプル一個あたりに異なるラベル配列（index）を加えることで、一回配列決定で得られたデータ中に多数のサンプルのデータを区別することができる。
2、対比及び統計：第二世代の配列決定方法Illumina/Solexaを利用して配列決定（他の配列決定方法、例えばABI/SOLiDを用いて相同又は相似の効果を得る）を行い、サンプル一個あたりに一定大きさの断片のDNA配列、即ちリードを得る。それとNCBIデータベース中の標準ヒトゲノム参考配列とをSOAP対比し、測定されるDNA配列がゲノム相応位置に定位する情報を得る。重複配列のCNV解析への妨害を避けるために、ヒトゲノム参考配列と唯一対比したリード（Unique reads）のみを選択し、後続CNV解析の有效データとし、その数目aTを統計する。
3、データ解析：既知正常サンプルを陰性サンプルとし、SegSeq算法によるCNV解析で、CNV解析に必要な断点を探し、及び被検測サンプルの正常サンプルに対するコピー数変異比率を計算し、一定の検出閾値を設定することで、被検測サンプルの染色体断片微細欠失/微細重複状態を判断し、かつ染色体数字核型図を製作し、及び対応の遺伝子のアノテーションを行う。具体的な過程は以下のようになる。
1）初期化。同じ一本の染色体上に対し、一つの位置bに対し、その左右両側の局部窓口に300条正常リードを含むように、パラメーターwを設定し、即ちN(xL,b)=N(b,xR)=w=300。被検測サンプルのリード位置に、
【数１】
2014530629.tif 000014
を満たす物を候補配列に加入し、Di(xL,xR)=0、b-w<i<b+wを満たすものを除去する。pbkp関連のパラメーターを1000とし、当該初期化流れに1000個候補点を輸出させる。すべてのp(|D(xL,xR)|)>pbkpまで、上記の除去及び加入候補配列のステップを繰り返し、染色体c上の候補点集合Bc、Bc={b1,b2,...,bN}を輸出する。
2）隣接の断片の合併を繰り返す。初期化して候補点集合をえて、候補点kの左右両側窓口をそれぞれ(bk-1,bk-1)及び(bk,bk+1)とし、pmerge関連のパラメーターを10とし、当該反復分割流れにせいぜい10個偽陽性断片結果を輸出させる。すべての
【数５】
2014530629.tif 000015
まで、その間のコピー数変異比率差異比較的に小さい隣接の断片の合併を繰り返す、最終の解析CNVに必要な有效候補点、即ち断点を得る。
3）CNV解析。上記の最終断点を統計し、ある二つの断点の間の窓口を(xL,xR)とし、被検測サンプルの正常サンプルに対するCNV比率
【数２】
2014530629.tif 000016
を計算する。前記CNV比率≦0.75及び≧1.25をそれぞれ染色体断片欠失及び重複の検出閾値とし、解析して微細欠失/微細重複結果を得てから染色体数字核型図を製作し、かつ遺伝子のアノテーションを行う。
【００４１】
本発明の方法は動物に対して、好ましいのは哺乳動物に対して、特に人に対して染色体CNV解析を行うことに適用する。
例えば、本発明は、適用人群染色体に対してCNV解析を行い、遺伝諮問の提供及び臨床策略根拠の提供に有利であり、植入前診断又は産前診断を行い、患児の出生を効果的に防止することができる。本発明の適用人群は、通常染色体核型解析に異常がないが、以下の臨床表現がある人群であって良い。
１）  胚胎発育停止又は自然流産を何回もした女性及びその配偶；
２）  畸形胎児を出産したことがある女性及びその配偶；
３）  男性無精子、貧精子、不育症患者；
４）  原因不明の男性不育症患者；
上記の適用人群の例は本発明を説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明の実施形態を詳細に説明する。しかし、当業者は、以下の実施例は本発明を説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではないと理解できる。実施例において、具体的な条件を明記していないのは、通常条件又はメーカーの提案の条件で行う。用いられる試薬又は機器には、その生産メーカーを明記していないのはいずれも市場から入手可能な通常製品である。以下、括弧内はそれぞれの試薬又はキットのメーカーの製品番号である。使用される配列決定用ジョイント及びラベル配列はIllumina社のMultiplexing Sample Preparation Oligonutide Kitから由来する。
【００４３】
実施例一、3例の組織に対して染色体CNV解析を行う
１．DNA抽出と配列決定
磁珠法ゲノムDNA抽出キット（TiangenDP329）操作流れに従って、妊婦自身は平衡転座保因者であって以前に一例の異常胎児を妊娠したことある妊婦に、産前スクリーン高危険（危険値1/9）で絨毛膜穿刺術の３例の胎児組織サンプル（以下、サンプル1、サンプル2及びサンプル3と略称し、合計2例絨毛及び1例胎盤組織サンプル）のDNAを抽出し、Qubit（Invitrogen、the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit）で定量し、抽出したDNA総量は約500ngである。
【００４４】
抽出した組織DNAは、完全のゲノムDNAであり、Illumina/Solexa標準ライブラリ構築流れに従ってライブラリを構築する。要するに、500bpに集中するように破壊されたDNA分子の両端に配列決定所用ジョイントを加え、サンプル一個あたりに異なるラベル配列（index）を加え、その後、芯片（flowcell）表面相補ジョイントと雑交し、一定の条件下核酸分子をクラスタ成長させ、その後Illumina Hiseq 2000に双末端配列決定により、位置関係を有する対の長さは100bpであるDNA断片配列を得る。
【００４５】
その後、上記の組織から得られる約500ngのDNAを、Covaris S-seriesを用いて500bp断片に無作為に切断してから、修正後のIllumina/Solexa標準ライブラリ構築を行い、具体的な流れは先行技術（http://www.illumina.com/に提供されるIllumina/Solexa標準ライブラリ構築説明書を参照）を参照する。2100 Bioanalyzer (Agilent)でDNAライブラリの大きさ及び挿入した断片の大きさを確定し、QPCR精確定量してから、機械で配列決定することができる。サンプルごとに、最後得られたデータ総量は6×109bpである。
【００４６】
本実施例中、上記の3例組織から得られるDNAサンプルに対して、Illumina/Solexa官方に公布されたCluster Station及びHiseq 2000（PE sequencing）説明書に従って操作を行う。
【００４７】
２．対比と統計
ステップ1のように配列決定を行った後、サンプルごとに、前記ラベル配列により区別されて約500bpの一定大きさ断片のDNA配列、即ちリードを得る。対比ソフトウェアSOAPaligner/soap2を利用して、配列決定で得られたリードとNCBIデータベース中の36版（hg18；NCBI Build 36）のヒトゲノム参考配列を対比し、測定されるDNA配列がゲノム相応位置に定位する情報を得る。ヒトゲノム参考配列と唯一対比する唯一リードを選択し、後続CNV解析の有效データとし、その数目aTを統計する。
【００４８】
本実施例中、知られた正常サンプルの炎黄ゲノムDNAサンプルを選択して陰性サンプル対照とする（Jun Wang、et al. The diploid genome sequence of an Asian individual. Nature. 2008 Nov 6; 456(7218): 60 - 65）
【００４９】
被検測サンプルと同じのデータ量を取り、標準化した後、その有效リード数目
2014530629.tif 000017
を統計し、aN=68750810。上記のサンプル1、サンプル2及びサンプル3の有效リード数目aTを統計し、それぞれは25934245、34164361及び32085646である。
【００５０】
３．データ解析
１）初期化。SegSeq算法を運行し、一本染色体上の位置bに対して、位置b左右両側の局部窓口に300条正常リードを包含させるように、パラメーターw=300を設定し、即ちN(xL,b)=N(b,xR)=w=300。被検測サンプルのリード位置に、
【数１】
2014530629.tif 000018
を満たすものを候補配列に加入し、Di(xL,xR)=0、b-w<i<b+wを満たすものを除去する。pbkp関連のパラメーターを1000とし、当該初期化流れに1000個候補点を出させる。すべてのp(|D(xL,xR)|)>pbkpまで、上記の除去及び加入候補配列のステップを繰り返し、染色体
2014530629.tif 000019
上の候補点集合Bc、Bc={b1,b2,...,bN}を輸出する。
２）  隣接の断片の合併を繰り返す。初期化して候補点集合を得て、候補点kの左右両側窓口をそれぞれ(bk-1,bk-1)及び(bk,bk+1)とし、pmerge関連のパラメーターを10とし、当該反復合併流れにせいぜい10個偽陽性断片結果を輸出させる。すべての
【数５】
2014530629.tif 000020
まで、両側窓口の間のコピー数変異比率差異比較的に小さいサイトを除去し、最終の解析CNVに必要な有效断点を得る。
３）  CNV解析。上記の最終断点を統計し、ある二つの断点の間の窓口を(xL,xR)とし、被検測サンプルの正常サンプルに対するCNV比率
【数２】
2014530629.tif 000021
を計算する。前記CNV比率≦0.75及び≧1.25をそれぞれ染色体断片欠失及び重複の検出閾値とし、解析して微細欠失/微細重複結果を得てから、染色体数字核型図を製作し、arrayCGH（The Fetal DNA Chip, http://www.fetalmedicine.hk/en/Fetal_DNA_Chip.asp ）と比較する。DECIPHERデータベースにより病気分類を行って遺伝子のアノテーションを行う。
４）  CNV解析結果を出して数字核型図を製作する。
陰性対照結果コピー数はいずれも正常であり、3例サンプルのCNV結果及び検出結果検証並び主要遺伝子それぞれは下表2と3に示す。
【００５１】
【表２】
2014530629.tif 000022
【表３】
2014530629.tif 000023
【００５２】
上記の結果により分かられるように、ハイスループット配列決定で検出された染色体微細欠失及び微細重複区域と既存のarrayCGH（The Fetal DNA Chip, http://www.fetalmedicine.hk/en/Fetal_DNA_Chip.asp ）の結果は一致し、具体的な数字核型図は図3A、3B及び3Cに示す。
【００５３】
実施例二、別の3例絨毛組織に対して染色体CNV解析を行う
3例の絨毛組織（以下、サンプル4、サンプル5及びサンプル6と略称する）は、実施例一と同様な処理方法及び配列決定過程を経てから、算法に入力データを得た。その結果を高解像度核型解析結果と比較する。
【００５４】
本実施例のデータ解析過程中、実施例一と同様に、既知正常サンプルの炎黄ゲノムDNAサンプルを陰性サンプル対照として選択し、被検測サンプルに近いデータ量を取り、標準化してからその有效リード数目aNを統計し、aN=68750810。上記のサンプル4、サンプル5及びサンプル6の有效リード数目aTを統計し、それぞれは44797212、44086450及び45374254である。他のデータ解析の流れ及び関連パラメーターの設定は、いずれも実施例一と同じであり、最後、解析して微細欠失/微細重複結果を得てから、染色体数字核型図を製作して遺伝子のアノテーションを行う。
【００５５】
陰性対照結果コピー数はいずれも正常であり、3例サンプルのCNV結果及び検出結果検証及び主要遺伝子はそれぞれ下表4と5に示す。
【００５６】
【表４】
2014530629.tif 000024
【００５７】
上記の結果により分かられるように、3例絨毛膜組織は、ハイスループット配列決定で検出された染色体微細欠失及び微細重複区域と既存のarrayCGH（The Fetal DNA Chip, http://www.fetalmedicine.hk/en/Fetal_DNA_Chip.asp ）の結果が一致し、具体的な数字核型図は図4A-Cに示す。
【００５８】
【表５】
2014530629.tif 000025
【００５９】
上記の結果により分かられるように、3例絨毛膜組織は、ハイスループット配列決定で検出された染色体微細欠失及び微細重複区域と既存の高解像度核型解析の結果は一致する。
【００６０】
本発明の具体的な実施形態はすでに詳細な説明されたものの、当業者は公開されたすべての示唆により、その細節を修正及び変更できると理解することができる。これらの変更はいずれも本発明の保護範囲内のものである。本発明の全部範囲は権利要求及びその任何等同物に与えられる。
【図１】
2014530629.tif 000031
【図２】
2014530629.tif 000032
【図３Ａ】
2014530629.tif 000033
【図３Ｂ】
2014530629.tif 000034
【図３Ｃ】
2014530629.tif 000035
【図４Ａ】
2014530629.tif 000036
【図４Ｂ】
2014530629.tif 000037
【図４Ｃ】
2014530629.tif 000038
【国際調査報告】
2014530629.tif 000039
2014530629.tif 000040