(57)【要約】  本発明は、肝細胞癌細胞及びその他の癌細胞の特異的標的のためのプロトセルに関する。プロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアと、癌細胞死を促進する又はレポーターとしての少なくとも１つの薬剤（従来の小分子、高分子カーゴ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はタンパク質毒素（リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖など））、及び／又はヒストンでパッケージングされてナノ多孔性シリカコア中に配置されたプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡをプロトセル中により効率的にパッケージングするためには好ましくは超らせんである。任意で、プロトセルを癌細胞の核内に局在させることを助ける核局在配列及び癌細胞の治療（アポトーシス／細胞死）に関与するペプチドを発現する能力を助ける核局在配列で任意で修飾される。）と、標的細胞へのプロトセルの結合が特異的かつ増強されるように治療される組織中の癌細胞を標的にするターゲティングペプチドと、プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドとを含む。本発明のプロトセルは、肝細胞組織に選択的に結合する新規の結合ペプチド（ｃ−ＭＥＴペプチド）を用いて癌（特に肝細胞（肝臓）癌を含む）を治療するために、又は癌の診断（癌治療及び創薬を含む）において作用するために用いられることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を標的にする多孔性プロトセルであって、前記プロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性のシリカコア又は金属酸化物コアと、少なくとも１つの更なる成分とを含み、前記少なくとも１つの更なる成分が、
細胞を標的にする化学種と、
プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドと、
二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのカーゴ成分を含むその他のカーゴと、
からなる群から選択され、前記カーゴ成分の１つが任意で更に核局在配列でコンジュゲートされる、プロトセル。
【請求項２】
前記シリカコアが球形であり、直径が約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲である、請求項１に記載のプロトセル。
【請求項３】
前記シリカコアが約１５０ｎｍの平均直径を有する、請求項２に記載のプロトセル。
【請求項４】
前記シリカコアが、単分散又は多分散のサイズ分布である、請求項２又は３に記載のプロトセル。
【請求項５】
前記シリカコアが単分散である、請求項２又は３に記載のプロトセル。
【請求項６】
前記シリカコアが多分散である、請求項２又は３に記載のプロトセル。
【請求項７】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される脂質で構成される、請求項１から６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項８】
前記脂質二重層が、ＤＯＰＣをＤＯＰＥと組み合わせて含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項９】
前記脂質二重層が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＧ、ＤＯＰＣ、又はそれらの混合物を含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１０】
前記脂質二重層がＤＯＰＧ及びＤＯＰＣを含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１１】
前記脂質二重層が更にコレステロールを含む、請求項８から１０のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１２】
前記脂質二重層が、ＤＯＰＣを約５ｗｔ％のＤＯＰＥ、約３０ｗｔ％のコレステロール、及び約１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００ＰＥ（１８：１）と組み合わせて含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１３】
脂質二重層が、約５ｗｔ％のＤＯＰＥ、約５ｗｔ％のＰＥＧ、約３０ｗｔ％のコレステロール、約６０ｗｔ％のＤＯＰＣ及び／又はＤＰＰＣを含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１４】
前記ＰＥＧが前記ＤＯＰＥにコンジュゲートされる、請求項１３に記載のプロトセル。
【請求項１５】
前記細胞を標的にする化学種がターゲティングペプチドである、請求項１から１４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１６】
前記ターゲティングペプチドがＳＰ９４ペプチドである、請求項１５に記載のプロトセル。
【請求項１７】
前記ターゲティングペプチドが配列番号６、配列番号７、又は配列番号８である、請求項１６に記載のプロトセル。
【請求項１８】
前記ターゲティングペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５によるＭＥＴ結合ペプチドである、請求項１５に記載のプロトセル。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、Ｈ５ＷＹＧペプチド（配列番号１３）又はポリアルギニンの８ｍｅｒ（配列番号１４）である、請求項１から１８のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２０】
前記融合ペプチドが配列番号１３である、請求項１９に記載のプロトセル。
【請求項２１】
プラスミドＤＮＡを含み、該プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために任意で修飾される、請求項１から２０に記載のプロトセル。
【請求項２２】
前記プラスミドＤＮＡが、超らせんプラスミドＤＮＡ又はパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項２１に記載のプロトセル。
【請求項２３】
前記ＤＮＡが、超らせん化かつパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項２２に記載のプロトセル。
【請求項２４】
前記プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために修飾される、請求項２０から２３のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２５】
前記ＤＮＡが、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡであって、ヒトのヒストンタンパク質の混合物を含む、請求項２１から２４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２６】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４からなる、請求項２５に記載のプロトセル。
【請求項２７】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４であって１：２：２：２：２の重量比である、請求項２５に記載のプロトセル。
【請求項２８】
前記プラスミドＤＮＡが、ポリペプチド毒素、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現可能である、請求項１から２７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２９】
前記ポリペプチド毒素が、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖からなる群から選択される、請求項２８に記載のプロトセル。
【請求項３０】
前記短鎖ヘアピンＲＮＡ又は前記短鎖干渉ＲＮＡが、細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１又は２８に記載のプロトセル。
【請求項３１】
前記ＤＮＡがレポータータンパク質を発現可能である、請求項１から３０のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３２】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項３１に記載のプロトセル。
【請求項３３】
前記核局在配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２のペプチドである、請求項１から３２のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３４】
前記核局在配列が配列番号９のペプチドである、請求項１から３３のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３５】
前記薬物として抗癌剤を更に含む、請求項１から３４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３６】
前記抗癌剤が、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、��酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、又はそれらの混合物である、請求項３５に記載のプロトセル。
【請求項３７】
前記薬物が抗ウィルス剤を含む、請求項１から３６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３８】
前記抗ウィルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、又は抗ＨＣＶ剤である、請求項３７に記載のプロトセル。
【請求項３９】
担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアと、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＭＥＴ結合ペプチドとを含む、プロトセル。
【請求項４０】
前記ＭＥＴ結合ペプチドが配列番号１のペプチドである、請求項３１に記載のプロトセル。
【請求項４１】
前記ＭＥＴ結合ペプチドが前記脂質二重層にコンジュゲートされる、請求項３９又は４０に記載のプロトセル。
【請求項４２】
前記プロトセルが、プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチド、プラスミドＤＮＡ、二本鎖直鎖ＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの成分を更に含み、前記プラスミドＤＮＡ、前記薬物、前記造影剤、及び／又は前記ＲＮＡが、更に核局在配列とコンジュゲートされる、請求項３９から４１のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４３】
前記薬物が少なくとも１つの抗癌剤を含む、請求項４２に記載のプロトセル。
【請求項４４】
前記抗癌剤が、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、��酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４３に記載のプロトセル。
【請求項４５】
前記薬物が少なくとも１つの抗ウィルス剤を含む、請求項３９から４５のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４６】
前記抗ウィルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物である、請求項４５に記載のプロトセル。
【請求項４７】
前記ＤＮＡが、少なくとも１つのレポーター分子を発現可能である、請求項３９から４６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４８】
プラスミドＤＮＡを含み、前記プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために任意で修飾される、請求項３９から４７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４９】
前記ＤＮＡが、超らせんプラスミドＤＮＡ又はパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項４８に記載のプロトセル。
【請求項５０】
前記ＤＮＡが、超らせん化かつパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項４９に記載のプロトセル。
【請求項５１】
前記プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために修飾される、請求項４８から５１のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５２】
前記ＤＮＡが、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡであって、ヒトのヒストンタンパク質の混合物を含む、請求項４７から５１のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５３】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４からなる、請求項５２に記載のプロトセル。
【請求項５４】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４であって、１：２：２：２：２の重量比である、請求項５３に記載のプロトセル。
【請求項５５】
前記プラスミドＤＮＡが、ポリペプチド毒素、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現可能である、請求項４８から５４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５６】
前記ポリペプチド毒素が、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖からなる群から選択される、請求項５５に記載のプロトセル。
【請求項５７】
前記短鎖ヘアピンＲＮＡ又は前記短鎖干渉ＲＮＡが、細胞のアポトーシスを誘導する、請求項５５に記載のプロトセル。
【請求項５８】
前記プラスミドＤＮＡがレポータータンパク質を発現可能である、請求項４８から５７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５９】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項５８に記載のプロトセル。
【請求項６０】
前記核局在配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２のペプチドである、請求項３９から５９のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項６１】
前記核局在配列が配列番号９のペプチドである、請求項６０に記載のプロトセル。
【請求項６２】
治療効果を達成するための有効な量の請求項１から６１のいずれかに記載の一群のプロトセルを、医薬的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項６３】
プロトセル内にカーゴとして配置されない薬物を更に含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記薬物が、抗癌剤又は抗ウィルス剤である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記抗ウィルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物である、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
非経口剤形である請求項６２から６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６７】
前記剤形が、皮内、筋肉内、骨内、腹腔内、静脈内、皮下、又は髄腔内投与の剤形である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
局所剤形又は経皮剤形である、請求項６２から６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＭＥＴ結合ペプチド。
【請求項７０】
請求項６９に記載の配列番号１のＭＥＴ結合ペプチド。
【請求項７１】
請求項６９又は７０に記載のＭＥＴ結合ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項７２】
抗癌剤、及び抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物と組み合わせて、肝細胞癌の細胞に対してプロトセルが選択的に結合するようにターゲティングペプチドを含む一群のプロトセルを含む、医薬組成物。
【請求項７３】
前記ターゲティングペプチドが、Ｓ９４ペプチド、ＭＥＴ結合ペプチド、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記抗癌剤が、ネクサバール（ソラフェニブ）、スニチニブ、ベバシズマブ、タルセバ（エルロチニブ）、タイカーブ（ラパチニブ）、又はそれらの混合物である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７５】
前記抗ＨＢＶ剤が、ヘプセラ（アデホビルジピボキシル）、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、エムトリシタビン、クレブジン、バルトリシタビン（valtoricitabine）、アムドキソビル、プラデホビル、ラシビル、ＢＡＭ２０５、ニタゾキサニド、ＵＴ２３１−Ｂ、Ｂａｙ４１−４１０９、ΕＨΤ８９９、ザダキシン（チモシンα−１）、又はそれらの混合物である、請求項７２から７４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７６】
前記抗ＨＣＶ剤が、ボセプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ＩＮＸ−１８９、ＦＶ−１００、ＮＭ２８３、ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ＳＣＨ５０３０４、ＴＭＣ４３５、ＶＸ−５００、ＢＸ−８１３、ＳＣＨ５０３０３４、Ｒ１６２６、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ７２２７）、Ｒ７１２８、ＰＦ−８６８５５４、ＴＴ０３３、ＣＧＨ−７５９、ＧＩ５００５、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ａ−８３７０９３、ＧＳ９１９０、ＧＳ９２５６、ＧＳ９４５１、ＧＳ５８８５、ＧＳ６６２０、ＧＳ９６２０、ＧＳ９６６９、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−２９２８、ＧＳＫ６２５４３３、ＴＧ４０４０（ＭＶＡ−ＨＣＶ）、Ａ−８３１、Ｆ３５１、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＡＮＡ５９８、Ａ−６８９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤＸ１０２、ＡＤＸ１８４、ＡＬＳ−２２００、ＡＬＳ−２１５８、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ２０７１２７、ＢＩＴ−２２５、ＢＩＴ−８０２０、ＧＬ５９７２８、ＧＬ６０６６７、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−７８５１、ＳＣＹ−６３５、リバビリン、ＰＥＧ化インターフェロン、ＰＨＸ１７６６、ＳＰ−３０、又はそれらの混合物である、請求項７２から７５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７７】
患者の癌細胞に抗癌剤を送達するように改変された請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群を含む組成物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項７８】
請求項７２から７６のいずれかに記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、肝細胞癌を治療する方法。
【請求項７９】
請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群の有効量を必要とする患者に投与することを含み、前記ＤＮＡプラスミドが超らせんであって抗癌ポリペプチド及び／又は抗癌ＲＮＡを発現するように改変され、任意で前記プロトセル内のカーゴとして処方される更なる抗癌剤の有効量と組み合わされる、癌を治療する方法。
【請求項８０】
前記抗癌ポリペプチドが、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＲＮＡが、癌細胞のアポトーシスを誘導するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項７９又は８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ｓｉＲＮＡが、ｓ５６５、ｓ７８２４、又はｓ１０２３４からなる群から選択される、請求項７９から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記ｓｈＲＮＡが、細胞死を誘導するサイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗癌剤が、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、��酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７９から８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記プロトセル又は前記プロトセルの外側の前記組成物が抗ウィルス剤を更に含む、請求項７９から８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記抗ウィルス剤が抗ＨＢＶ剤又は抗ＨＣＶ剤である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
請求項６２から７６のいずれかに記載の組成物の有効量を必要とする患者に投与することを含む、患者の癌を治療する方法。
【請求項８８】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱、骨、腸、乳房、子宮頸管、結腸（大腸）、食道、頭部、腎臓、肝臓（肝細胞）、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、及び胃の癌腫、白血病、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、悪性のメラノーマ、骨髄増殖性疾患、ユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、末梢性神経上皮腫、滑膜肉腫、グリオーマ、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、神経節神経腫、神経節膠腫、髄芽細胞腫、松果体細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜肉腫、神経線維腫、シュヴァン鞘腫、腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸部癌、子宮癌、非小細胞癌、小細胞肺癌、混合の小細胞癌及び非小細胞肺癌、胸膜中皮腫、精巣癌、甲状腺癌、及び星状細胞腫である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
癌のリスクがある患者の癌を診断する方法であって、前記方法は、請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記プロトセルは、癌細胞に対して選択的に結合して前記プロトセルを前記細胞に送達するように改変されたターゲティングペプチドを含み、前記プロトセルは、レポーター分子を発現するように改変されたプラスミドＤＮＡを含み、任意で更なるレポーター分子を含み、前記癌細胞が存在する場合には、前記患者の癌細胞への前記プロトセルの結合によって前記レポーター分子が前記癌細胞内に放出され、前記レポーター分子がシグナルを引き起こし、前記シグナルを標準と比較して前記患者が癌を有するか否かを判定でき、癌を有する場合には、その程度及び／又は癌性腫瘍のサイズを判定することができる、方法。
【請求項９０】
患者の癌治療を観察する方法であって、請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群を前記患者に投与することを含み、前記プロトセルは、癌細胞に対して選択的に結合して前記プロトセルを前記細胞に送達するように改変されたターゲティングペプチドを含み、前記プロトセルは、レポーター分子を発現するように改変されたプラスミドＤＮＡを含み、任意で更なるレポーター分子を含み、前記患者の癌細胞への前記プロトセルの結合によって前記レポーター分子が前記癌細胞内に放出され、前記レポーター分子がシグナルを引き起こし、前記シグナルを治療開始時及び治療中の様々な間隔で標準と比較して患者が前記治療に反応しているか否かを判定でき、反応している場合には前記治療に対する前記反応の程度を判定できる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願及び政府支援）
本発明は、２０１１年４月２８日出願の米国仮出願第６１／４７９８４７号である発明の名称「ペプチドにより標的を定められたシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）を用いた肝細胞癌の選択的トランスフェクション（The Selective Transfection of Hepatocellular Carcinoma Using Peptide-Targeted Silica Nanoparticle-Supported Lipid Bilayers (Protocells)）」の優先権の利益を主張し、この出願の全内容が参照により援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所の助成金第ＰＨＳ２ＰＮ２ＥＹ０１６５７０Ｂ号、国立癌研究所の１Ｕ０１ＣＡ１５１７９２−０１によって与えられた助成金、空軍科学研究所の助成金第ＦＡ９５５０−０７−１−００５４／９５５０−１０−１−００５４号、ＮＩＥＨＳの１Ｕ１９ＥＳ０１９５２８−０１、国立科学財団のＮＳＦ：ＥＦ−０８２０１１７、及び国立科学財団のＤＧＥ−０５０４２７６による政府支援を受けて行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の実施形態は、特に肝細胞癌細胞及び他の癌細胞を含めた患者体内の細胞の特異的標的のためのプロトセルに関し、このプロトセルは、１）ナノ多孔性のシリカコア又は金属酸化物コア、２）担持された脂質二重層、３）少なくとも１つの薬剤、標的細胞に対するプロトセルの結合を特異的にかつ増強するようにして治療対象の組織中の癌細胞を標的にするターゲティングペプチド、並びにプロトセル及び被包されたカーゴ（ＤＮＡを含む）のエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドを含む。少なくとも１つの薬剤は、癌細胞死を促進する薬剤（従来の小分子、高分子カーゴ（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、他のマイクロＲＮＡ、又はタンパク質毒素（リシン毒素Ａ鎖若しくはジフテリア毒素Ａ鎖など））、及び／又はＤＮＡ（二本鎖又は直鎖のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）などであり、ＤＮＡは超らせん及び／又は例えばヒストンでパッケージングされてナノ多孔性シリカコア中に配置されてもよく（より効率的にＤＮＡをプロトセル中にパッケージングするためには、好ましくは超らせん）、癌細胞の核内にプロトセルを局在させることを助ける核局在配列及び癌細胞の治療法（アポトーシス／細胞死）に関与するペプチドを発現する能力を助ける核局在配列で任意に修飾される。）又はレポーターとしての薬剤である。本発明のプロトセルは、選択的に肝細胞組織に結合する新規の結合ペプチド（ｃ−ＭＥＴペプチド）を用いて癌（特に肝細胞（肝臓）癌を含む）を治療するために、又は癌の診断（癌治療及び創薬を含む）において機能するために用いられることができる。
【背景技術】
【０００４】
ナノ担体中に被包された薬物の標的送達は、従来の「遊離した」薬物が示す多数の問題である貧弱な溶解性、限られた安定性、速やかな除去、及び特に選択性の欠如（これは正常細胞に非特異的な毒性をもたらし、疾患細胞を根絶するのに必要な用量の段階的増大を妨げる）などを改善することが可能である。受動的標的のスキームは、腫瘍血管系の亢進した透過性と腫瘍リンパ管の低下した排出効率とに依存して腫瘍部位へのナノ担体の蓄積を導くものであり（いわゆる血管透過性・滞留性亢進効果又はＥＰＲ効果）、これらの問題の多くを克服するが、ナノ担体の内在化を引き起こすのに必要な細胞特異的相互作用の欠如が治療有効性を低下させ、薬物の排除や多剤耐性の誘発をもたらし得る。
【０００５】
ナノメディシンにおける課題の１つは、例えば薬物などのカーゴを高濃度で効率的に被包し、細胞膜を通過し、所定の期間に渡って標的部位に制御可能に薬物を放出できるナノ構造体及び材料を設計することである。最近になって、ナノメディシンにおける新世代の薬物又は治療法の送達媒体として無機ナノ粒子が現れた。更に最近になって、クマリン、アゾベンゼン、ロタキサン、ポリマー、又はナノ粒子を用いるゲーティング（gating）法が、カーゴを粒子中に封入し、光刺激又は電気化学刺激に従って引き起こされる放出を可能にするために開発された。
【０００６】
リポソームは、その低い免疫原性及び低い毒性により薬物送達に広く用いられて来たが、未だいくつかの点について改善される必要がある。第１に、カーゴの装填はリポソームが調製される状況下でのみ成される。従って、カーゴの濃度や種類が制限される可能性がある。第２に、リポソームの安定性は比較的低い。リポソームの脂質二重層は多くの場合に経時劣化して融合しがちであり、それによってサイズやサイズ分布が変化する。第３に、リポソーム中のカーゴの放出はリポソームのバーストの瞬間に起こるため、それが放出を制御することを困難にしている。
【０００７】
ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合によって形成される多孔性ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）は、癌の治療法や診断法の標的送達に伴う多くの課題に対応する新規種類のナノ担体である。リポソームと同様に、プロトセルは生体適合性、生分解性、及び非免疫原性であるが、そのナノ多孔性シリカコアは、同様のサイズのリポソーム送達剤と比較すると大幅に増強されたカーゴ収容能力及び長期の二重層安定性を提供する。コアの多孔性及び表面の化学的性質を更に調節して、例えば薬物、核酸、及びタンパク質毒素などの多様な治療薬の被包を促進することができる。カーゴ放出の速度は、コアの細孔サイズ、化学組成及びシリカ縮合の全体的な程度によって制御可能であるので、プロトセルはバースト放出又は制御型放出のプロファイルが必要な用途に有用である。最後に、プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）は、選択的送達を促進するためにリガンドで様々に修飾されることができ、更に循環時間を延長するためにＰＥＧで様々に修飾されることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
化学療法薬の活性を改善し、癌治療法を増強する必要性は続いている。プロトセルの使用を、癌を標的とし、癌と結合し、癌への侵入を増強し、そして化学療法薬をその作用部位の近傍に届ける他の方法と組み合わることは、癌治療法の重要な一面である。本発明は、癌治療薬の投与を増強することによって、又は診断における癌の診断及び癌治療観察のための手法を促進するために、癌治療法の技術を向上させること並びに治療結果に影響し得る薬剤の送達を改善することに取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、プロトセル技術、プロトセル自体、そのようなプロトセルを含む医薬組成物について改善を提供すること、及び本発明のプロトセル及び医薬組成物を治療法及び診断法（治療の観察を含む）に用いる方法を提供することに関する。
【００１０】
本発明の実施形態の更なる目的は、本発明のその他の実施形態である新規のＭＥＴ結合ペプチド、医薬組成物及び方法におけるそれらの使用に関する。
【００１１】
本発明のこれらの及び／又はその他の目的は、本明細書で与えられる説明の検討により容易に得られる。
【００１２】
本発明の実施形態は、細胞（特定の態様においては肝細胞の癌細胞及び他の癌細胞）の特異的標的のためのプロトセルに関する。
【００１３】
一部の態様においては、本発明は、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性のシリカコア又は金属酸化物コアと、次のものからなる群から選択される少なくとも１つの更なる成分とを含む、細胞を標的にする多孔性プロトセルに関する。
・細胞を標的にする化学種
・プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチド、並びにその他のカーゴ
その他のカーゴは、
・二本鎖直鎖ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ
・薬物
・造影剤
・短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はそれらの混合物
から選択される少なくとも１つのカーゴ成分を含み、このカーゴ成分の１つは、任意で更に核局在配列でコンジュゲートされる。
【００１４】
一部の実施形態においては、本発明の実施形態のプロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアと、少なくとも１つの治療薬からなるカーゴとを含む。少なくとも１つの治療薬は、選択的に癌細胞死を促進する治療薬であり、例えば従来の小分子、高分子カーゴ（例えばｓｉＲＮＡ（特にＳ５６５、Ｓ７８２４、及び／又はｓ１０２３４など）、ｓｈＲＮＡ、又はタンパク質毒素（リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖など））、及び／又はパッケージングされて（一部の実施形態においてはヒストンでパッケージングされて）ナノ多孔性シリカコア中に配置されるプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡをカーゴ成分としてプロトセル中により効率的にパッケージングするために、好ましくは本明細書に別に記載のように超らせん）であり、ＤＮＡは癌細胞の核内にプラスミドを局在させること／提示することを助ける核局在配列及び治療（例えば癌細胞のアポトーシス／細胞死）に関与するペプチドを発現する能力を助ける核局在配列で任意に修飾される。または、少なくとも１つの治療薬は、診断用途のレポーターとしての薬剤である（特に本明細書に別に記載の蛍光緑色タンパク質、蛍光赤色タンパク質）。本発明のプロトセルは、標的細胞に対するプロトセルの結合を特異的かつ増強するようにして治療される細胞（例えば、治療対象の組織中の癌細胞）を標的にするターゲティングペプチド、並びにプロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドを含む。本発明のプロトセルは、治療法又は診断法に用いられることができ、より具体的には癌及びその他の疾患（ウィルス感染を含み、特に肝細胞（肝臓）癌を含む）を治療するために用いられることができる。本発明の他の態様においては、プロトセルは、癌組織（特に肝細胞、卵巣、及び子宮頸部の癌組織を含む）に選択的に結合する新規の結合ペプチド（本明細書に別に記載のＭＥＴ結合ペプチド）を癌の治療及び／又は診断（癌治療の観察及び創薬を含む）のために用いる。
【００１５】
一態様においては、本発明の実施形態のプロトセルは多孔性ナノ粒子プロトセルを含み、多孔性ナノ粒子プロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアを多くの場合に含む。本発明のこの態様においては、プロトセルはターゲティングペプチドを含み、ターゲティングペプチドは多くの場合に本明細書に別に記載のＭＥＴ受容体結合ペプチドであり、多くの場合にプロトセルの表面の融合ペプチドと組み合わされる。プロトセルは、種々の治療用及び／又は診断用のカーゴ（例えば、小分子（治療用及び／又は診断用、特に抗癌剤及び／又は抗ウィルス剤（ＨＢＶ及び／又はＨＣＶの治療用）を含む）、ポリペプチドやヌクレオチドのような高分子（ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）を含む）、又はプラスミドＤＮＡ（超らせん及びヒストンでパッケージングであって核局在配列を含んでもよい））を装填されて、治療用及び／又は診断用にされることができる（蛍光ペプチド（特に蛍光緑色タンパク質／ＦＧＰ、蛍光赤色タンパク質／ＦＲＰを含む）のようなレポーター分子を含む）。
【００１６】
本発明の実施形態のその他の側面は、医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は一群のプロトセルを含むが、これらは同一であっても異なっていてもよく、医薬的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて製剤される。プロトセルは、治療される疾患や投与経路（本明細書に別に記載）に応じて、単独で処方されても又は別の生物活性剤（例えば更なる抗癌剤又は抗ウィルス剤）と組み合わせて処方されてもよい。これらの組成物は、特定の目的（例えば治療（癌治療など）又は診断法（癌治療の観察など））のために改変されたプロトセルを含む。医薬組成物は、特定の目的及び投与経路に有効な一群のプロトセルを、医薬的に許容される担体、添加剤又は賦形剤と組み合わせて含む。
【００１７】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の新規のプロトセルを利用する方法にも関する。そのため別の実施形態においては、本発明は、本明細書に別に記載の医薬組成物の有効量を、必要とする患者若しくは対象に投与することを含む、疾患及び／又は状態を治療する方法に関する。本発明の医薬組成物は、特に癌、及び癌に続発する又は癌の原因となる病態若しくは状態（特にＨＢＶ及び／又はＨＣＶの感染）を含む多数の病態の治療に特に有用である。
【００１８】
更なる別の態様においては、本発明は、癌を診断する方法に関する。この方法は、診断剤又はレポーター造影剤を癌細胞に選択的に送達して患者の癌を特定するために改変された一群のプロトセルを含む医薬組成物を投与することを含む。この方法では、本発明のプロトセルは、ターゲティングペプチドの的であるポリペプチド（より一般的には表面受容体又は細胞膜成分）を発現する癌細胞に結合する少なくとも１つのターゲティングペプチドの含有によって、癌細胞を標的にするために改変されることができる。または、本発明のプロトセルは、癌細胞を標的としたプロトセルのレポーター成分（造影剤を含む）を含有することで、レポーターのシグナルを標準と比較することによって患者又は対象の癌性組織の存在及びサイズを確認するために用いられてもよい。標準は、例えば健康な患者又は診断の対象となる疾患を有することが分かっている患者の集団から得られる。診断されたら、本発明の医薬組成物を用いた適当な治療法又はその他の治療法が施されることができる。
【００１９】
本発明の更に他の態様では、本発明の組成物は、特定の病態及び／又は状態の治療（本発明の組成物を用いた治療を含む）の進行を観察するために使用されることができる。本発明のこの態様では、病態の治療の進行が観察されるように、癌細胞に特異的に結合しかつレポーター成分を含む一群のプロトセルを含む組成物を治療中の患者又は対象に投与することができる。
【００２０】
本発明のその他の態様は、５つの新規のＭＥＴ結合ペプチド（本明細書に別に記載）に関する。それらは、本発明の一部の実施形態のプロトセルでのターゲティングペプチドとして用いられることができる。あるいは、種々の癌細胞（癌性組織の種々の細胞のうち特に肝細胞、子宮頸部、及び卵巣の細胞を含む）のＭＥＴタンパク質に結合する利点のために医薬組成物中において用いられることができる。本発明の一実施形態は、ＭＥＴ受容体（別名では肝細胞増殖因子受容体であり、ｃ−ＭＥＴ遺伝子によって発現される）に対する新規の結合ペプチドとしての活性を示す５つの異なる７ｍｅｒペプチドに関する。これらの５つの７ｍｅｒペプチドは次の通りである。
ＡＳＶＨＦＰＰ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）  配列番号１
ＴＡＴＦＷＦＱ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ）  配列番号２
ＴＳＰＶＡＬＬ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）  配列番号３
ＩＰＬＫＶＨＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）  配列番号４
ＷＰＲＬＴＮＭ（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ）  配列番号５
【００２１】
これらのペプチドのそれぞれは、単独で用いられても、あるいは上記群のうちの他のＭＥＴ結合ペプチドと組み合わせて用いられても、又は本発明の一実施形態のプロトセルを癌細胞（特に、肝細胞癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、及び子宮頸部癌細胞を含む）に結合させる助けとなり得る一連のその他のターゲティングペプチド（例えば本明細書に記載のＳＰ９４ペプチド）と組み合わせて用いられてもよい。これらの結合ペプチドはまた、癌を治療する又は肝細胞増殖因子結合受容体を阻害するＭＥＴ結合ペプチドとして、単独で医薬化合物に用いられることもできる。これらのペプチドは、意図した結果を提供するために、単独で処方されても又はその他の生物活性剤と組み合わせて処方されてもよい。医薬組成物は、上記５つのＭＥＴ結合ペプチドのうちの少なくとも１つの有効量を医薬的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて含み、任意で更なる生物活性剤、例えば抗癌剤、抗ウィルス剤、又はその他の生物活性剤などと組み合わせて含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】エアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスによって調製される本発明で用いられる一実施形態のナノ粒子が、粒子のサイズ及び分布を制御するために変えられ得ることを示す図である。
【図２】一実施形態において、多くの種類のカーゴに合わせて設計されることができる細孔のサイズ及び骨格と、エアロゾル化した補助成分が容易に取り込まれることとを示す。
【図２Ａ】図２のａ、ｂ、ｃ、及びｅが、ＣＴＡＢ、Ｂ５８、Ｐ１２３、及びＰＳ＋Ｂ５６による鋳型であることを示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、ＣＴＡＰ＋ＮａＣｌ、３ｗｔ％のＰ１２３、３ｗｔ％のＰ１２３＋ポリ（プロピレングリコールアクリレート）、ミクロエマルション、及びＣＴＡＢ（ＮＨ4）2ＳＯ4による鋳型である。
【図３】一実施形態における、同時自己集合又は自己集合後の誘導体化によって細孔表面の化学的性質（即ち電荷及び疎水性）並びに細孔サイズが、有機シランと珪酸との共縮合によって主に制御されることを示す。Linら、Chem. Mater. 15, 4247-56 2003；Liu, J.ら、J. Phys. Chem.,104, 8323-2339, 2000；Fan, H.ら、Nature, 405, 56-60, 2000；Lu, Y.ら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5258-5261, 2000参照。
【図４】ヒストンタンパク質によるＣＢ１プラスミドのパッケージングを示す。（Ａ）は、ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）を超らせん化し、超らせんｐＣＢ１をヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４でパッケージングし、得られたｐＣＢ１−ヒストン複合体を、核膜孔を通る移行を促進する核局在配列（ＮＬＳ）で修飾するために用いられるプロセスを示す概念図である。（Ｂ）及び（Ｄ）は、ＣＢ１プラスミド（Ｂ）及びヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（Ｄ）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。（Ｃ）及び（Ｅ）は、それぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）での赤線に対応する高さプロファイルを示す。
【図５】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填された、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成を示す。（Ａ）は、ＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子のサイズ分布を示す。（Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図Ｓ−４Ａに示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積である。（Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【図６】一実施形態における、メソ多孔性のシリカナノ粒子がヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１について高い収容能力を有し、得られたプロトセルが、エンドソーム環境を模倣する状況下でのみ被包されたＤＮＡを放出することを示す。（Ａ）は、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝−３８．５ｍＶ）又はアミン含有シランのＡＰＴＥＳで修飾されたメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝＋１１．５ｍＶ）中に被包可能な、ｐＣＢ１又はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「複合体」）の濃度を示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（１×１０9個）と共に１×１０6細胞／ｍＬを３７℃で２４時間培養した場合に、ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＣＢ１によりコードされる緑色蛍光タンパク質）に対して陽性となるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。ｘ軸は、プロトセルのコアがＡＰＴＥＳで修飾されたか否か及びｐＣＢ１がヒストンで予めパッケージングされたか否かを示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）でパッケージングされたｐＣＢ１を対照として含む。（Ｃ）及び（Ｄ）は、疑似体液（Ｃ）又はｐＨ５緩衝液（Ｄ）に暴露した際の、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子及び対応するプロトセルからの、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の時間に依存した放出を示す。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、（Ｂ）については、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図７】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をＨＣＣまで送達するプロセスを示す概念図である。［１］種々のＨＣＣ株により過剰発現されるＭｅｔへのターゲティングペプチドの動員によって、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に高親和性で結合する。流動性のＤＯＰＣのＳＬＢはペプチドの流動性を促進し、それにより低いＭＣ４０密度で修飾されたプロトセルがＨｅｐ３Ｂに対して高い特異親和性を保持することを可能にする（図８Ａ参照）。［２］ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、受容体依存性エンドサイトーシスを介してＨｅｐ３Ｂによって内在化される（図８Ｂ及び図１５Ａ参照）。［３］エンドソーム条件はＳＬＢを不安定化し（Nature Materialsの参考文献を挿入）、エンドソーム分解性ペプチドＨ５ＷＹＧのプロトン化を引き起こす。これらは何れも、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質ゾル中に拡散することを可能にする（図１６Ｂ参照）。［４］ｐＣＢ１−ヒストン複合体は、核局在配列（ＮＬＳ）で修飾された場合に、約２４時間以内にＨｅｐ３Ｂ細胞の核内に濃縮される（図１６Ｃ参照）。これによって、分裂中及び非分裂中の癌細胞の両方での効率的なトランスフェクションが可能になる（図１７参照）。
【図８】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルがＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されないことを示す。（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図Ｓ−１１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【図９】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルは、ピコモル濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘導するが、正常肝細胞の生存性に関してはごく小さい影響しか有さないことを示す。ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃でＨｅｐ３Ｂを連続して暴露した際の、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びサイクリンＢ１タンパク質の発現における用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では、細胞を種々のｐＣＢ１濃度に４８時間暴露し、（Ｂ）では、５ｐＭのｐＣＢ１に種々の時間に渡って暴露した。肝細胞でのサイクリンＢ１タンパク質の発現及びＨｅｐ３ＢでのＺｓＧｒｅｅｎの発現が、対照として含まれる。リアルタイムＰＣＲ及び免疫蛍光法を用いて、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びタンパク質それぞれの濃度を測定した。（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した後の、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂの割合を示す。Ｇ2／Ｍ期の肝細胞の割合及びＳ期のＨｅｐ３Ｂの割合を比較のために含む。細胞は、細胞周期分析の前にヘキスト３３３４２で染色された。（Ｄ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。アポトーシスのマーカーに陽性である肝細胞の割合を対照として含む。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶに陽性である細胞は、アポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの両方に陽性である細胞は、アポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、一方及び両方に陽性である細胞の数を加算して求められた。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１０】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルが、対応するリポプレックスよりも２５００倍有効にＨＣＣの選択的なアポトーシスを誘導することを示す。（Ａ）は、ＤＯＰＣプロトセル、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）で修飾されたＤＯＰＣプロトセル、ｐＣＢ１とＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥの混合物（１：１ｗ／ｗ）とからなるリポプレックス、並びに１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスのζ電位の値を示す。全てのζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。（Ｂ、左軸）ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル又はリポプレックスによって送達された５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合である。（Ｂ、右軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞の９０％において３７℃で４８時間以内にアポトーシスを誘導するのに必要な、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル又はリポプレックスの数である。（Ｂ）については、細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色された。一方及び両方に陽性である細胞をアポトーシス性と見なした。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１１】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、肝細胞の生存性には影響を与えることなく、高濃度のタキソール、Ｂｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１をＨＣＣに選択的に送達することを示す。（Ａ）は、１０12個のプロトセル、リポソーム、又はリポプレックスの中に被包可能な、タキソール、Ｂｃｌ−２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びＣＢ１プラスミドの濃度を示す。赤色のバーは、タキソール及びｐＣＢ１の両方がプロトセルに装填された場合に、タキソール及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。青色のバーは、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１のすべてがプロトセルに装填された場合又はｓｉＲＮＡ及びｐＣＢ１がリポプレックスに装填された場合に、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによってＨｅｐ３Ｂまで送達された場合の、オレゴングリーン（登録商標）４８８標識タキソール（緑色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ｓｉＲＮＡ（赤色）、及びＣｙ５標識ｐＤＮＡ（白色）の細胞内分布を示す共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞をＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの１０００倍の過剰量と共に３７℃で２４時間培養した後に固定して、ヘキスト３３３４２で染色した（青色）。スケールバー＝１０μｍ。（Ｃ）は、１０ｎＭのタキソール及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞細胞の割合を示す。割合は、Ｇ2／Ｍでの対数増殖細胞の割合に対して正規化された。（Ｄ）は、１０ｎＭのタキソール、２５０ｐＭのＢｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陽性になるＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞の細胞の割合を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１２】ＣＢ１プラスミドのベクターマップを示す。ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）は、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（クロンテック・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びｐＮＥＢ１９３ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から構築された。ｐＣＢ１は、サイクリンＢ１特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びスナギンチャク種の緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）をコードする。構成的ｓｈＲＮＡ発現は、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ依存性ヒトＵ６プロモーター（ＰU6）によって駆動され、構成的ＺｓＧｒｅｅｎ発現は、サイトメガロウィルスの最初期プロモーター（ＰCMV IE）によって駆動される。ｏｒｉエレメント及びＡｍｐRエレメントは、大腸菌内におけるプラスミドの増殖を可能にする。サイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列に下線を付す。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＩＲＥＮベクターに導入するために用いた制限酵素部位（ＢａｍＨＩは赤色、ＥｃｏＲＩは青色）が横にある。
【図１３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の特徴を示す。（Ａ）は、漸増濃度のヒストン（モル比１：２：２：２：２のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）に暴露されたｐＣＢ１に関する電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ｐＣＢ１：ヒストンのモル比をレーン３〜６に示す。レーン１はＤＮＡラダーを含み、レーン２はｐＣＢ１を含み添加ヒストンを含まない。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（ｐＣＢ１：ヒストンのモル比１：５０）のＴＥＭ画像である。スケールバー＝５０ｎｍ。
【図１４】未装填のメソ多孔性のシリカナノ粒子及びｐＣＢ１が装填されたメソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着分析を示す。（Ａ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着等温線である。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子のブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積である。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１５】ＤＯＰＣプロトセルの小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）データを示す。フィッティングデータは、一定厚さの共形シェルを有する多分散な多孔性シリカ球のモデルを用いて得られたものであり、シリカ粒子の表面に細孔開口部を覆う３６Åの二重層が存在することを示す。厚さ０、２０、６０Åの二重層についてシミュレーションされたＳＡＮＳデータを比較のために含む。測定された二重層の厚さ３６Åは、平坦な担持された脂質二重層について行われた他の中性子研究（３３〜３８Å）と一致しており、これらの対照条件下では、脂質二重層の水素に富む炭化水素コアからの散乱を主に示す。
【図１６】プロトセルが、被包されたＤＮＡをヌクレアーゼ分解から守ることを示す。ＤＮａｓｅＩ処理したｐＣＢ１（レーン３）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン５）、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（レーン７）、カチオン性コアを有するプロトセルに装填されたｐＣＢ１（レーン９）、及びアニオン性コアを有するプロトセルに装填されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１１）のアガロースゲル電気泳動を示す。裸のｐＣＢ１（レーン２）、ヒストンから放出されたｐＣＢ１（レーン４）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスから放出されたｐＣＢ１（レーン６）、カチオン性コアを有するプロトセルから放出されたｐＣＢ１（レーン８）、及びアニオン性コアを有するプロトセルから放出されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１０）を比較のために含む。レーン１はＤＮＡラダーを含む。試料をＤＮａｓｅ１（５０ｎｇのＤＮＡ当たり１ユニット）と共に室温で３０分培養し、ｐＣＢ１放出は１％ＳＤＳを用いて促進された。
【図１７】メソ多孔性のシリカナノ粒子（「未修飾のコア」）、２０％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ中に室温で１２時間浸漬したメソ多孔性のシリカナノ粒子（「ＡＰＴＥＳ修飾コア」）、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「ｐＣＢ１−ヒストン複合体」）、及びＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（「ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックス」）のζ電位（ζ）の値を示す。ζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１８】図６及び２４においてＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性の細胞の割合を求めるのに用いられた、代表的な前方散乱−側方散乱（ＦＳＣ−ＳＳＣ）プロット図及びＦＬ−１ヒストグラムである。（Ａ）〜（Ｄ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ａ及びＣ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＢ及びＤ）であり、（Ａ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｃ）はしていない。ＦＬ−１チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、（Ｂ）及び（Ｄ）に示す。（Ｅ）〜（Ｈ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ｅ及びＧ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＦ及びＨ）であり、（Ｅ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｇ）はしていない。（Ｆ）及び（Ｈ）のゲートは、ＭＦＩ≦２８２、即ちＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞のＭＦＩの１００倍（Ｄ図参照）の細胞の割合に対応する。
【図１９】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの識別を示す。図中に示す概念図は、ＭＣ４０ターゲティングペプチドを選択するのに用いられたプロセスを表す。１×１０11ｐｆｕ／ｍＬのペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された１００ｎＭの組み換えヒトＭｅｔ（ｒｈＭｅｔ）と共に室温で１時間培養した。プロテインＡ又はプロテインＧでコーティングした磁性粒子を用いてＭｅｔ−ファージ複合体を親和性捕捉し、続いてＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回洗浄して未結合のファージを除去した。結合したファージクローンは低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２）で溶出し、溶出物を宿主細菌（大腸菌ＥＲ２７３８）の感染によって増幅した。
【図２０】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの特徴を示す。（Ａ）は、５回目の選択ラウンド後のペプチド配列アラインメントである。主配列ＡＳＶＨＦＰＰは、以前に確認されていたＭｅｔ特異的な１２ｍｅｒのＹＬＦＳＶＨＷＰＰＬＫＡ（配列番号１８、Zhaoら、ClinCancerRes 2007; 13(20 6049-6055)）の下線部分に相似である。標的に無関係のＨＡＩＹＰＲＨペプチド（約１０％）（配列番号１９、Brammerら、Anal.Biochem. 377 (2008) 88-89）を提示するファージクローンは、配列アラインメントから除かれた。（Ｂ）及び（Ｃ）は、親和性選択したファージクローンがｒｈＭｅｔに結合した度合を、酵素結合免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。（Ｂ）に示すＥＬＩＳＡのスキームは、材料及び方法の項で説明する。ＥＬＩＳＡの結果を（Ｃ）に示す。（Ｄ）は、Ｍｅｔに結合しないペプチドを除去した後の配列アラインメントである。図Ｓ−９に示す共通配列は、このアラインメントから決定された。（Ｅ）及び（Ｆ）は、（１）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、無関係なファージクローン（ＴＰＤＷＬＦＰ）（配列番号２０）と、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（青色のドット）、又は（２）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、ＭＣ４０クローンと、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（橙色のドット）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及び肝細胞（Ｆ）についてのフローサイトメトリーの散布図である。未処理細胞（赤色のドット）を用いて、ＦＬ−１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）及びＦＬ−２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６蛍光）のチャンネルについての電圧パラメータを設定した。
【図２１】Ｈｅｐ３Ｂに暴露されたＭＣ４０で標的を定められたプロトセルについての例示の結合曲線である。図５Ａの解離定数を求めるために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞をサイトカラシンＤで前処理してエンドサイトーシスを抑制し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められた種々の濃度のプロトセルと共に３７℃で１時間培養した。フローサイトメトリーを用いて得られた細胞群の平均蛍光強度を測定し、プロトセル濃度に対してプロットして全体の結合曲線を得た。非特異的結合は、飽和濃度の非分類の肝細胞増殖因子の存在下において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められたプロトセルと共に細胞を培養することによって求められた。特異的結合曲線は、非特異的結合曲線を全体の結合曲線から引くことによって得られた。Ｋd値は、特異的結合曲線から計算された。この図に示す実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／粒子）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。対応するＫd値は１０５０±１４２ｐＭである。全てのエラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図２２】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化され、Ｈ５ＷＹＧペプチドの非存在下でリソソームへ誘導されることを示す。（Ａ）は、Ｈｅｐ３Ｂ又は肝細胞の細胞のそれぞれによって１時間以内に３７℃で内在化された、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの平均数である。１×１０6個の細胞を飽和濃度（１００μｇ／ｍＬ）のヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の非存在下（−）又は存在下（＋）において種々の濃度のプロトセルと共に培養し、フローサイトメトリーを用いて各細胞に結合した粒子の平均数を求めた。プロトセルをＮＢＤ及びｐＨｒｏｄｏ（商標）で標識して、表面に結合した粒子を酸性細胞内区画に内在化されたものから区別した（それぞれについて）。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）は、プロトセルと、（１）Ｒａｂ５、（２）Ｒａｂ７、（３）リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）又は（４）Ｒａｂ１１ａとの間のピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０００倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識プロトセルと共に３７℃で１時間培養した後、固定して透過処理し、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、ＬＡＭＰ−１、又はＲａｂ１１ａに対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体と共に培養した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、ＨＣＣ細胞の核内で時間に依存して濃縮されることを示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で１５分（Ａ）、１２時間（Ｂ）、又は２４時間（Ｃ）暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。（Ｂ）については、プロトセルのエンドソーム脱出及びｐＣＢ１の細胞質ゾル内分散は、約２時間後までには明白であった。しかし、ＺｓＧｒｅｅｎ発現は１２〜１６時間まで検出可能でなかった。２４時間の時点で、Ｃｙ５標識ｐＣＢ１は細胞内全体に分布したままであった。一方、（Ｃ）において細胞質ゾルの染色が見えないのは、核内に局在したピクセルの飽和を回避するためにＣｙ５チャンネルのゲインを下げたせいである。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）は、Ｃｙ５で標識したｐＣＢ１及びヘキスト３３３４２で標識したＨｅｐ３Ｂの核についての、時間に対するピアソンの相関係数（ｒ値）である。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０個の細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２４】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、分裂中及び非分裂中のＨＣＣ細胞の両方をほぼ１００％の効率で選択的にトランスフェクションすることを示す。（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で２４時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、（Ａ）では分裂中であり、（Ｃ）及び（Ｅ）では約９５％コンフルエントであった。全ての画像においてｐＣＢ１はヒストンで予めパッケージングされており、（Ｅ）において、ｐＣＢ１−ヒストン複合体はＮＬＳで更に修飾された。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（「ＰＣ」）１×１０9個に３７℃で２４時間連続して暴露された際に、ＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合である。細胞は（Ｂ）では分裂中であり、（Ｄ）及び（Ｆ）では約９５％コンフルエントであった。ｘ軸は、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）及びｐＣＢ１−ヒストン複合体（「複合体」）がＮＬＳで修飾されていたか否かを示す。ｐＣＢ１単独に加えて、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１も対照として用いられた。細胞を２０ｍｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に暴露し、核膜孔複合体を経るＮＬＳ修飾したｐＣＢ１の移行を遮断した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｇ）〜（Ｉ）は、それぞれ（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）で用いた細胞の細胞周期のヒストグラムである。Ｇ0／Ｇ1期の細胞の割合を各ヒストグラムについて示す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２５】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。（Ｂ）の矢印は、有糸分裂細胞を示す。サイクリンＢ１はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識モノクローナル抗体で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２６】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ（白色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色し、それぞれ初期及び後期のアポトーシスを試験した。細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２７】双性イオン性脂質からなるＳＬＢを有するプロトセルが、ごく低い非特異的細胞毒性しか誘導しないことを示す。１×１０9個のＡＰＴＥＳ修飾メソ多孔性のシリカナノ粒子、ＡＰＴＥＳ修飾コアを有するＤＯＰＣプロトセル、スクランブルｓｈＲＮＡ配列をコードするプラスミド（「スクランブルｐＣＢ１」）が装填されたＤＯＰＣプロトセル、又はスクランブルｐＣＢ１が装填されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）リポプレックスに３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂの割合を示す。プロトセル及びリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。正荷電及び負荷電のポリスチレンナノ粒子（それぞれ「アミン−ＰＳ」及び「カルボキシル−ＰＳ」）を正の対照として用い、一方で１０ｍＭの抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）又は１ｐｍｏｌの遊離したｐＣＢ１に暴露されたＨｅｐ３Ｂを負の対照として用いた。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次の用語は、本明細書において本発明を説明するために用いられる。用語が本明細書で特に定義されない場合には、その用語は当業者による使用と一致した方法で用いられるものと理解される。
【００２４】
ある数値の範囲が与えられた場合には、その範囲の上限値と下限値との間にある各値は、文中に別に明記しない限り下限値の単位の１０分の１まで、及びその記載された範囲におけるいずれかの他の記載された値又は介在値は、本発明に包含されるものと理解される。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、そのより狭い範囲に独立して含まれてもよく、同様に本発明に包含され、記載された範囲でのいずれかの具体的に除外された限界値に従う。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合には、それらの限界値の一方又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。ある置換基が１つ以上のマーカッシュ群で可能であるものである場合には、安定な結合を形成する置換基のみが用いられるものと理解される。
【００２５】
別に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者よって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等のいずれかの方法及び材料も本発明の実施又は試験に用いることができるが、ここでは好ましい方法及び材料を説明する。
【００２６】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「ある」（a、an）、及び「その（前記）」（the）には、文脈において明白に別に指示がない限り、複数への言及が包含されることに留意しなければならない。
【００２７】
更に、次の用語は以下に示す定義を有する。
【００２８】
用語「患者」又は「対象」は、本明細書全体にわたって、文脈により動物、通常は哺乳動物（特に家畜及び好ましくはヒトを含む）を記すために用いられ、本発明の化合物又は組成物を用いた治療（予防的治療（予防）を含む）が提供される。ヒト患者などの特定の動物に特異的な感染、状態又は病態の治療については、用語「患者」はその特定の動物を指す。殆どの場合、本発明の患者又は対象は、一方又は両方の性別のヒト患者である。
【００２９】
用語「有効（な）」は、別に示されない限り、その結果が感染及び／又は病態の予防及び／又は治療法に関するか、あるいは本明細書に別に記載の予防及び／又は治療法に関するかを問わず、その使用の文脈において用いられる場合に所期の結果を生じる又はもたらす量の化合物又は成分を記すために用いられる。用語「有効（な）」は、本出願において別に記載される又は使用される全てのその他の有効量又は有効濃度の用語（用語「治療的に有効」を含む）を包含する。
【００３０】
用語「化合物」は、本明細書で開示されるいずれかの特定の化合物又は生物活性剤を記すために用いられ、いずれか及び全ての立体異性体（ジアステレオマーを含む）、個々の光学異性体（エナンチオマー）又はラセミ混合物、医薬的に許容される塩、並びにプロドラッグの形態を含む。用語「化合物」は、本明細書においては安定な化合物を指す。文脈におけるその使用の範囲内で、用語「化合物」は本明細書に別に記載の単一の化合物又は化合物の混合物を指し得る。
【００３１】
用語「生物活性剤」は、本発明の実施形態における使用のために処方可能ないずれかの生理的に活性な化合物又は薬物を指す。生物活性剤の例としては、癌又は癌に続発する病態若しくは状態を治療するために用いられる本発明の化合物を含み、抗ウィルス剤、特に抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、及び／又は抗ＨＣＶ剤（特に肝細胞癌を治療する場合）並びに本明細書に別に記載するその他の化合物又は薬剤が含まれてもよい。
【００３２】
用語「治療する」（treat）、「治療すること」（treating）、及び「治療」（treatment）は、疾患のリスクがある又は疾患に罹患した患者に利益を提供するいずれかの行為を指すために同義的に用いられ、少なくとも１つの症状の緩和、抑制、鎮静又は除去による状態の改善、疾患の進行の遅延、疾患の発症の予防、遅延又はその可能性の抑制などが含まれる。ウィルス感染の場合には、これらの用語はウィルス感染にも適用され、好ましくは一部の特に好ましい実施形態においては感染の病原体であるウィルスの根絶又は除去（診断法の限界によって規定される）を含む。
【００３３】
「治療」は、本明細書で用いる場合、主に癌の予防的及び治癒的な治療の両方を包含するが、その他の病態、例えばウィルス感染、特にＨＢＶ及び／又はＨＣＶも包含する。本発明の化合物は、例えば疾患発生の前に哺乳動物に予防的に投与して、その疾患の可能性を低減することができる。予防的な投与は、哺乳動物での疾患のその後の発生の可能性を低減若しくは減少させ、又はその後に発生する疾患（特に癌の転移を含む）の重症度を減少させる（抑制する）のに有効である。あるいは、本発明の化合物は、例えば既に疾患に罹患している哺乳動物に治療的に投与できる。治療的な投与の一実施形態においては、本発明の化合物の投与は疾患を除去し、及び癌の緩解をもたらし又はその転移の可能性を実質的に除去するのに有効である。本発明の化合物の投与は、癌の場合のように疾患の重症度を減少させるのに又は罹患した哺乳動物の寿命を延ばすのに、あるいはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）及び／又はＣ型肝炎ウィルス感染（ＨＣＶ）の感染の場合のように疾患の病原体を抑制する若しくは場合によっては除去するのに有効である。
【００３４】
用語「医薬的に許容される」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載の治療を達成するために化合物又は組成物が対象（ヒト患者を含む）への投与に適し、疾患の重症度及び治療の必要性に照らして不当に有害な副作用を有さないことを意味する。
【００３５】
用語「抑制（阻害）」は、本明細書で用いる場合、起こり得る結果の部分的又は完全な除去を指す。「抑制（阻害）剤（インヒビター）」は、抑制（阻害）する能力を有する化合物／組成物である。
【００３６】
用語「予防」は、文脈で用いられる場合、本発明の１つ以上の化合物若しくは組成物の単独又は別の薬剤との組み合わせての投与又は同時投与の結果として、「可能性を低減すること」又は疾患、状態若しくは病態が起こることを予防することを意味する。「予防」が１００％有効であることは、ほとんどないことに注意されたい。従って用語「予防」及び「可能性を低減すること」は、患者又は対象の一定の集団において、本発明の化合物の投与が特定の状態若しくは病態（特に癌の増殖若しくは転移のような病態の悪化）又は疾患進行のその他の一般に認められた指標が起こる可能性を低減する、あるいはそれらが起こることを抑制するという事実を示すために用いられる。
【００３７】
用語「プロトセル」は、シリカ、ポリスチレン、アルミナ、チタニア、ジルコニア、又は一般的に金属酸化物、有機金属塩、有機珪酸塩、又はそれらの混合物を含む材料からなる多孔性ナノ粒子を記すために用いられる。多孔性球形シリカナノ粒子は好ましいプロトセルのために用いられ、担持された脂質又はポリマーの二重層又は多分子層によって囲まれる。本発明の種々の実施形態においては、本発明のナノ構造体、ナノ構造体を構築及び使用する方法、並びにプロトセルを提供する方法を提供する。最も基本的な形態であるプロトセルの多くは、当分野で公知である。５ｎｍ未満〜２００ｎｍ若しくは５００ｎｍ以上のサイズ（直径）に渡る種々のサイズ範囲の多孔性シリカ粒子は当分野において容易に入手可能であり、又は当分野で公知の方法を用いて容易に調製できる（実施例の項参照）。あるいはその代わりに、Melorium Technologies（New York, Rochester）、SkySpring Nanomaterials, Inc.（米国, Texas, Houston）又はDiscovery Scientific, Inc.（British Colombia, Vancouver）から購入できる。多様なシリカナノ粒子は、Carollらの手順（Langmuir, 25, 13540-13544 (2009)）を用いて容易に調製できる。プロトセルは、当分野で公知の方法を用いて容易に得られる。本出願の実施例の項では、本発明に有用なプロトセルを得るための特定の方法を提供する。本発明のプロトセルは容易に調製でき、シリカナノ粒子の表面に融合した脂質を含むプロトセルを含む。例えば、Liuら, Chem. Comm., 5100-5102 (2009）、Liuら, J. Amer. Chem. Soc, 131, 7567-7569 (2009)、Luら, Nature, 398, 223-226 (1999)参照。本発明での使用のための好ましいプロトセルは、Ashleyら, Nature Materials, 2011, May; 10 (5): 389-97、Luら, Nature, 398, 223-226 (1999)、Carollら, Langmuir, 25, 13540-13544 (2009)、及び以下の実験の項に別途示す手順に従って調製される。
【００３８】
本発明の一実施形態においては、ナノ構造体は脂質のシェル（好ましくは二重層だが、場合により単分子層又は多分子層）で囲まれた多孔性粒子コアからなるコア−シェル構造を含む（Liuら, JACS, 2009, 前出参照）。多孔性粒子コアは、例えば上記の無機材料及び／又は有機材料からなる多孔性ナノ粒子を含み、脂質二重層によって囲まれることができる。本発明において、これらの脂質二重層に囲まれたナノ構造体は、担持された脂質二重層の膜構造を有するので、「プロトセル」又は「機能上のプロトセル」と呼ばれる。本発明の複数の実施形態においては、プロトセルの多孔性粒子コアには種々の所望の化学種（「カーゴ」）が充填されることができる。化学種は、小分子（例えば、本明細書に別に記載の抗癌剤）、高分子（特に、ＲＮＡ（例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む）若しくはポリペプチド（リシン毒素Ａ鎖のようなポリペプチド毒素又はジフテリア毒素Ａ鎖ＤＴｘのようなその他の毒性ポリペプチドを含む））、レポーターポリペプチド（例えば、特に蛍光緑色タンパク質）、半導体量子ドット、金属系ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又はそれらの組み合わせを含む。本発明のいくつかの好ましい態様においては、プロトセルには超らせんプラスミドＤＮＡが装填され、それはタンパク質（例えば増殖因子受容体、又は細胞（特に癌細胞）の増殖の原因となり若しくはそれを助け、癌細胞の増殖停止及びアポトーシスを誘導するその他の受容体。特に上皮増殖因子／ＥＧＦＲ、血管内皮増殖因子受容体／ＶＥＧＦＲ−２、又は血小板由来増殖因子受容体／ＰＤＧＦＲ−αを含む）の発現を抑制するために使用されることができる治療用若しくは／又は診断用のペプチド、並びに短鎖ヘアピンＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ若しくは短鎖干渉ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを送達するために用いられることができる。
【００３９】
一部の実施形態において、カーゴ成分としては、例えば特定の目的（例えば本明細書に開示の治療用途又は診断用途）用の化学的な小分子（特に抗癌剤及び抗ウィルス剤（抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、及び／又は抗ＨＣＶ剤を含む）、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ、並びに細胞への送達後に１つ以上のポリペプチド又はＲＮＡ分子を発現するプラスミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
一部の実施形態においては、プロトセルの脂質二重層は生体適合性を提供することができ、かつ標的を定めるための化学種（例えばターゲティングペプチド（抗体を含む）、アプタマー、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール））を有するように修飾されることができ、例えばプロトセルの更なる安定性及び／又は生物活性細胞への標的送達が可能である。
【００４１】
本発明のプロトセル粒子のサイズ分布は、用途に応じて単分散又は多分散にすることができる。シリカコアはある程度まで単分散（即ち、特に溶液法を用いて調製される場合、直径が約５％よりもばらつかない一様なサイズの群、例えば２００ｎｍの直径のプロトセルの場合は±１０ｎｍである）にでき、又はある程度まで多分散（即ち、多分散群は平均（又は中央）直径から大きくばらついてよい。例えばエアロゾルによって調製される場合には、最大±２００ｎｍ以上である）にできる（添付の図１参照）。多分散群を大きさで分けて単分散群にすることができる。これらはいずれもプロトセルの生成に好適である。本発明において好ましいプロトセルは、好ましくは直径約５００ｎｍ以下であり、患者又は対象への送達をもたらして所期の治療効果を生ずるためには好ましくは直径約２００ｎｍ以下である。
【００４２】
本発明のプロトセルは、通常は直径約８〜１０ｎｍ超から約５μｍのサイズの範囲であり、好ましくは直径約２０ｎｍ〜３μｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、より好ましくは約２０〜２００ｎｍ（約１５０ｎｍを含み、これを平均直径又は直径の中央値のとすることができる）である。上記のように、プロトセルの群はプロトセルの群の平均直径又は直径の中央値に基づいて単分散又は多分散と見なされる。直径約８ｎｍよりも小さい粒子は腎臓を通して排出され、約２００ｎｍよりも大きい粒子は肝臓及び脾臓によって捕捉されるので、サイズは本発明の治療及び診断の態様にとって非常に重要である。従って本発明の一実施形態は、患者又は対象における薬物送達及び診断のためのより小さいサイズのプロトセルに焦点を合わせる。
【００４３】
本発明のプロトセルは、メソ細孔、好ましくはナノ構造体材料に見られる細孔を含むことを特徴とする。それらの細孔（少なくとも１つだが、多くの場合には多数）は、ナノ粒子の表面と交わっていてもよく（ナノ粒子の表面に現れた細孔の一方又は両方の末端が存在することによって）、又はナノ構造体の内部にあって、少なくとも１つ以上のメソ細孔がナノ粒子の表面のメソ細孔と相互に連結していてもよい。より小さいサイズの相互に連結した細孔は、多くの場合に表面のメソ細孔の内側に見られる。メソ細孔の細孔サイズの全範囲は、直径０．０３〜５０ｎｍにすることができる。メソ細孔の好ましい細孔サイズは約２〜３０ｎｍの範囲であり、単一サイズ、二峰性又は傾斜的であってもよく、規則的又は不規則（本質的にランダムな配置若しくは蠕虫状）であってもよい（添付の図２参照）。
【００４４】
メソ細孔（ＩＵＰＡＣ定義では直径２〜５０ｎｍ）は、鋳型剤（界面活性剤、ブロックコポリマー、分子、高分子、エマルション、ラテックスビーズ、又はナノ粒子など）によって「鋳造」される。更に、プロセスによっては約０．０３ｎｍまで小さいミクロ細孔（ＩＵＰＡＣ定義では直径２ｎｍ未満）をもたらすことができる（例えばエアロゾルプロセスの鋳型成分が用いられない場合）。メソ細孔をマクロ細孔、即ち直径５０ｎｍに拡大することもできる。
【００４５】
ナノ粒子材料の細孔表面の化学的性質は非常に多様であり得る。全ての有機シランは、カチオン性、アニオン性、親水性、疎水性、反応性の基をもたらす。細孔表面の化学的性質、特に電荷及び疎水性は、装填容量に影響する（添付の図３参照）。引力静電相互作用又は疎水性相互作用は装填容量を調節／増強し、放出速度を調節する。より大きい表面積は、それらの引力相互作用を介して薬物／カーゴのより多い装填をもたらし得る（以下参照）。
【００４６】
ナノ粒子の表面積は、Ｎ2−ＢＥＴ法による測定によると、約１００ｍ2／ｇ〜＞約１２００ｍ2／ｇの範囲である。通常は、細孔サイズが大きくなると表面積は小さくなる（図２Ａの表参照）。鋳型剤を除かない場合、又は細孔が０．５ｎｍ未満であり、従って動力学効果のせいで７７ＫにおけるＮ2収着法によって測定可能でない場合、表面積は理論上は本質的に０まで減少し得る。しかしながら、この場合にはＣＯ2又は水の収着によって測定可能であるが、恐らく非多孔性と見なされる。これは鋳型を用いずに調製したシリカコア中に生体分子が直接被包される場合に該当すると考えられ、その場合には粒子（内部のカーゴ）は、細胞への送達後のシリカマトリクスの分解によって放出される。
【００４７】
通常、本発明のプロトセルは、最大約５０ｗｔ％の容量（（カーゴ重量／装填済みのプロトセル重量）×１００として定義される）までカーゴが装填される。カーゴの最適な装填は、多くの場合に約０．０１〜１０％であるが、プロトセル中にカーゴとして組み込まれる薬物又は薬物の組み合わせに依存する。これは通常は１０10個の粒子当たりのμΜとして表され、本発明者は１０10個の粒子当たり２０００〜１００μΜの範囲の値を得ている。本発明の好ましいプロトセルは、ｐＨ約５．５（エンドソームのｐＨ）でカーゴの放出を示すが、生理的ｐＨ７又はより高いｐＨ（７．４）では安定である。
【００４８】
装填用の内部スペースの表面積は、その最適値が約１．１〜０．５立方センチメートル／グラム（ｃｃ／ｇ）の範囲の細孔容積である。ただし、本発明の一実施形態のプロトセルでは、表面積はナノ粒子外部の幾何学的表面積ではなく、主に内部であることに注意されたい。
【００４９】
本発明の一実施形態の多孔性粒子に担持された脂質二重層は、非多孔性支持体に担持された脂質二重層又はリポソームの脂質二重層よりも低い融解転移温度を有する（即ちより流動性である）。二重層の流動性は、側方拡散及び標的細胞表面受容体によるペプチドの動員を可能にするので、これは場合によっては、低ペプチド密度のターゲティングリガンドの高親和性結合を達成するために重要である。一実施形態においてはペプチドにクラスターをもたらし、それは補足的な標的への結合を促進する。
【００５０】
本発明においては、脂質二重層は組成が非常に多様であり得る。通常、リポソームに用いることができるいずれの脂質又はポリマーも、プロトセルに用いることができる。好ましい脂質は本明細書に別に記載する。本発明のプロトセルで使用するための特に好ましい脂質二重層は、脂質の混合物（本明細書に別に記載する）を、重量によって、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、５ｗｔ％のＰＥＧ、３０ｗｔ％のコレステロール、６０ｗｔ％のＤＯＰＣ又はＤＰＰＣの重量比で含む。
【００５１】
ζ電位により測定されるメソ多孔性のシリカＮＰコアの電荷は、アミンシランの２−（アミノエチル）プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）又はその他の有機シランによる修飾によって−５０ｍＶから＋５０ｍＶまで単調に変化させられる。更にこの電荷修飾は、プロトセルのカーゴ中の薬物の装填を変化させる。通常、担持された脂質二重層の融合後にζ電位は約−ｌ０ｍＶと＋５ｍＶとの間まで低下するが、これは血中循環時間を最大化し非特異的相互作用を回避するのに重要である。
【００５２】
どのように界面活性剤鋳型が除去されるか（例えば、高温（５００℃）における焼成、酸性エタノールによる抽出）及びシリカの骨格に含まれるＡＥＰＴＭＳの量に依存して、シリカの分解速度は非常に変わり得る。更にこれによって内部のカーゴの放出速度が調節される。これが起こる理由は、細孔の内部表面積に強く引きつけられた分子が粒子コアからゆっくりと拡散するため、粒子コアの分解によって放出速度が部分的に調節されるためである。
【００５３】
本発明の一実施形態のプロトセルの更なる特徴としては、ｐＨ７において安定である、即ちそのカーゴを漏出させないが、ｐＨ５．５（エンドソームのｐＨ）においては脂質又はポリマーの被覆が不安定化してカーゴ放出を開始する。このｐＨ誘発の放出は、エンドサイトーシスによってプロトセルが細胞中に内在化され、そこでｐＨ誘発の複数の事象がエンドソームへの放出をもたらし、その結果として細胞の細胞質ゾルへの放出をもたらす時点まで、プロトセルの安定性を維持するために重要である。定量的な実験の証拠からは、標的化プロトセルは、高い親和性のＩｇＧに必要なＴ細胞のヘルプを支持しないので、弱い免疫応答しか引き起こさず、好ましい結果が示されている。
【００５４】
本発明のプロトセルは、従来技術のプロトセルから区別される少なくとも１つ又は複数の特徴（実施形態に応じて）を示す。
１）従来技術とは異なり、本発明の一実施形態においては平均サイズ（直径）が約２００ｎｍ未満のナノ粒子を特定する。このサイズは、受容体依存性エンドサイトーシスによる効率的な細胞内取り込みを可能にするように設計されている。
２）本発明の一実施形態においては、生体内分布の制御を可能にするために、単分散及び／又は多分散のサイズを特定する。
３）本発明の一実施形態は、受容体依存性エンドサイトーシスを誘導する標的化されたナノ粒子に関する。
４）本発明の一実施形態は、融合ペプチド又はエンドソーム分解性ペプチドの含有によって細胞質内へのカーゴの分散を誘導する。
５）本発明の一実施形態は、ｐＨで誘発されるカーゴ放出をする粒子を提供する。
６）本発明の一実施形態では、カーゴの制御された時間依存的放出（シリカナノ粒子マトリクスの熱誘起架橋の程度による）を示す。
７）本発明の一実施形態は、時間依存的でｐＨ誘発の放出を示すことができる。
８）本発明の一実施形態は、複合的な複数のカーゴの細胞送達を包含し、提供することができる。
９）本発明の一実施形態は、標的癌細胞の致死を示す。
１０）本発明の一実施形態は、標的癌細胞の診断を示す。
１１）本発明の一実施形態は、標的細胞への選択的移入を示す。
１２）本発明の一実施形態は、標的でない細胞の選択的除外（選択性）を示す。
１３）本発明の一実施形態は、担持された脂質二重層の増強された流動性を示す。
１４）本発明の一実施形態は、標的細胞に対してサブナノモルの制御された結合親和性を示す。
１５）本発明の一実施形態は、従来技術に見られる濃度よりも低いターゲティングリガンド密度でサブナノモルの結合親和性を示す。
１６）本発明の一実施形態は、従来技術では利用できない細部の微細な程度によって、従来技術から更に区別することができる。
【００５５】
用語「脂質」は、本発明で用いられるナノ粒子の表面に脂質二重層を形成するために用いられる成分を表すのに使用される。種々の実施形態では、脂質二重層を担持するナノ粒子から構築されるナノ構造体を提供する。本発明の複数の実施形態においては、ナノ構造体は、好ましくは例えば脂質二重層のシェルに囲まれた多孔性粒子コアを含むコア−シェル構造を含む。ナノ構造体、好ましくは上記の多孔性シリカナノ構造体は、脂質二重層の膜構造を担持する。本発明の複数の実施形態においては、プロトセルの脂質二重層は生体適合性を提供でき、更に例えばプロトセルの更なる安定性及び／又は生物活性の細胞（特に癌細胞）中への標的送達が可能なように、標的を定めるための化学種（例えば、ターゲティングペプチド、融合ペプチド、抗体、アプタマー、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む）を有するように修飾されることができる。ＰＥＧが脂質二重層に含まれる場合、分子量は非常に様々であり得る。ただし約１０〜約１００ユニットのエチレングリコール、約１５〜約５０ユニット、約１５〜約２０ユニット、約１５〜約２５ユニット、約１６〜約１８ユニットなどの範囲のＰＥＧを用いることができ、アミン基を介してリン脂質に通常コンジュゲートされるＰＥＧ成分は、脂質二重層に含まれる脂質のうち、重量で約１％〜約２０％、好ましくは約５ｗｔ％〜約１５ｗｔ％、約１０％を構成する。
【００５６】
リポソーム送達システムに用いられる多くの脂質を用いてナノ粒子上に脂質二重層を形成し、本発明のプロトセルを提供することができる。本発明の一実施形態のプロトセルを生成するために、ナノ粒子を囲む脂質二重層に、リポソームを形成するのに用いられる実質的にいかなる脂質を用いてもよい。本発明での使用のための好ましい脂質としては、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせが挙げられる。コレステロールは専門的には脂質ではないが、コレステロールは本発明の一実施形態のプロトセルの脂質二重層の重要な成分であり得るという事実から、本発明の一実施形態のために脂質として提供される。多くの場合、二重層の構造的完全性を増強するために、コレステロールをプロトセルの脂質二重層に含ませる。これらの脂質は全て、Avanti Polar Lipids, Inc.（米国、Alabama、Alabaster）から市販で容易に入手できる。ＤＯＰＥ及びＤＰＰＥは、ペプチド、ポリペプチド（抗体を含む）、ＲＮＡ、及びＤＮＡをアミン基を介して脂質にコンジュゲートする（適当な架橋剤を介して）のに特に有用である。
【００５７】
用語「レポーター」は、本発明の一実施形態のプロトセルのリン脂質二重層又はカーゴに含まれて測定可能なシグナルを提供する造影剤又は造影成分を記すために用いられる。この成分は蛍光シグナルを提供してもよく、又は特に放射線検出を可能にする放射性同位体であってもよい。プロトセルに用いる例示の蛍光標識（好ましくは脂質二重層又はシリカコアへのコンジュゲート又は吸着によるが、これらの標識はカーゴ成分（プロトセルによって細胞まで送達されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、及び小分子など）に含まれてもよい）としては、ヘキスト３３３４２（３５０／４６１）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３５６／４５１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５カルボン酸スクシンイミジルエステル（４０１／４２１）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）バイオレットＢＭＱＣ（４１５／５１６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）グリーンＣＭＦＤＡ（４９２／５１７）、カルセイン（４９５／５１５）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−アネキシンＶコンジュゲート（４９５／５１９）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４９５／５１９）、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＡＨＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイ（４９５／５１９）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）フィクサブルグリーン死細胞染色キット（４９５／５１９）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン核酸染色（５０４／５２３）、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）レッドミトコンドリア過酸化物指示薬（５１０／５８０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸スクシンイミジルエステル（５３２／５５４）、ｐＨｒｏｄｏ（商標）スクシンイミジルエステル（５５８／５７６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）レッドＣＭＴＰＸ（５７７／６０２）、テキサスレッド（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（テキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ、５８３／６０８）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヒドラジド（６４９／６６６）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル（６５０／６６８）、Ｕｌｙｓｉｓ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７核酸標識キット（６５０／６７０）、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７−アネキシンＶコンジュゲート（６５０／６６５）が挙げられる。蛍光シグナルを増強する又は蛍光の退色を遅らせる成分が含まれてもよく、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールド・アンチフェード試薬（ＤＡＰＩ含有及び非含有）やイメージｉＴ（登録商標）ＦＸシグナル増強剤などである。これらの全ては当分野において周知である。更なるレポーターとしては、プラスミド（例えば、ヒストンでパッケージングされた超らせんＤＮＡプラスミド）によって発現されるポリペプチドレポーターが含まれ、蛍光緑色タンパク質及び蛍光赤色タンパク質のようなポリペプチドレポーターが含まれる。本発明のレポーターは、患者における癌（癌組織）の存在若しくは進行及び／又は患者若しくは対象における治療の進行の診断を含めて、主に診断用途に用いられる。
【００５８】
用語「ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡ」は、「超らせん化」された好ましいプラスミドＤＮＡ（即ち、プロトセル中への効率的なパッケージングのためにより高密度になるように、プラスミド自体を折り畳ませて「超らせん化」させる過飽和塩溶液又はその他のイオン性溶液を用いてそれ自体が折り畳まれたもの）を用いる本発明のプロトセルの好ましい成分を記すために用いられる。プラスミドは、いずれかの数のポリペプチドを発現する、又はＲＮＡ（本明細書に別に記載の短鎖ヘアピンＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ又は短鎖干渉ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを含む）をコードする、実質的にいかなるプラスミドであってよい。超らせん化されたら（高濃度塩溶液又はその他のアニオン性溶液を用いて）、超らせんプラスミドＤＮＡを次にヒストンタンパク質と複合体化して、ヒストンでパッケージングされた「複合体化した」超らせんプラスミドＤＮＡを生じさせる。
【００５９】
「パッケージングされた」ＤＮＡは、本明細書においてはプロトセル中に装填されたＤＮＡ（細孔中に吸着されたもの又はナノ多孔性シリカコア自体の中に直接閉じ込められたもののいずれか）を指す。ＤＮＡを空間的に最小化するために多くの場合はパッケージングされる。これは、周囲の媒体の電荷を調整してＤＮＡと例えば脂質、タンパク質又はその他のナノ粒子（通常は限定ではないがカチオン性）との小型の複合体を作ることで、複数の異なる方法で達成できる。パッケージングされたＤＮＡは、多くの場合にリポプレックス（即ち、ＤＮＡをカチオン性脂質混合物と複合体化すること）によって得られる。更にＤＮＡは、カチオン性タンパク質（ヒストン以外のタンパク質も含む）や金ナノ粒子（例えばナノフレア−ナノ粒子のコアが金である工学的なＤＮＡと金属との複合体）を用いてもパッケージングされる。
【００６０】
いずれかの数のヒストンタンパク質に加えて、ＤＮＡをより小さい体積にパッケージングするその他の手段（例えば通常はカチオン性のナノ粒子、脂質、又はタンパク質）も超らせんプラスミドＤＮＡ「ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡ」をパッケージングするために用いられることができる。しかし、ヒト患者を治療することに関する治療的な態様においては、ヒトのヒストンタンパク質の使用が、好ましくは用いられる。本発明の一部の態様では、ヒトのヒストンタンパク質Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の好ましい比１：２：２：２：２での組み合わせであるが、他のヒストンタンパク質も、当分野で公知のようにその他の類似の比で用いられることができ、又は本発明の教示に従って容易に実施されることができる。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡに代えて二本鎖直鎖ＤＮＡでもよく、任意で超らせん化、及び／又はヒストン若しくはその他のパッケージング成分でパッケージングされてもよい。
【００６１】
本発明のこの態様に用いられることができるその他のヒストンタンパク質は、例えばＨ１Ｆ、Ｈ１Ｆ０、Ｈ１ＦＮＴ、Ｈ１ＦＯＯ、Ｈ１ＦＸ、Ｈ１Ｈ１のＨＩＳＴ１Ｈ１Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｔ；Ｈ２ＡＦ、Ｈ２ＡＦＢ１、Ｈ２ＡＦＢ２、Ｈ２ＡＦＢ３、Ｈ２ＡＦＪ、Ｈ２ＡＦＶ、Ｈ２ＡＦＸ、Ｈ２ＡＦＹ、Ｈ２ＡＦＹ２、Ｈ２ＡＦＺ、Ｈ２Ａ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＭ、Ｈ２Ａ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＣ、Ｈ２ＢＦ、Ｈ２ＢＦＭ、ＨＳＢＦＳ、ＨＳＢＦＷＴ、Ｈ２Ｂ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ１ＨＳＢＢ、ＨＩＳＴ１ＨＳＢＣ、ＨＩＳＴ１ＨＳＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、Ｈ２Ｂ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、Ｈ３Ａ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、Ｈ３Ａ２、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、Ｈ３Ａ３、ＨＩＳＴ３Ｈ３、Ｈ４１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、Ｈ４４、及びＨＩＳＴ４Ｈ４を含む。
【００６２】
用語「核局在配列」は、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡを構成するヒストンタンパク質中に組み込まれた又は架橋されたペプチド配列を指す。一部の実施形態においては、本発明のプロトセルは、ヒストンでパッケージングされたプラスミドが、発現及び最終的には細胞死を促進するために、細胞の核を通過してその内容物をそこに下ろす能力を増強する核局在配列で修飾（架橋）されたプラスミド（多くの場合、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡ）を更に含んでもよい（ただし、ヒストンタンパク質が核局在配列と架橋されても、あるいはプラスミド自体が改変されて核局在配列を発現してもよい。これらのペプチド配列は、ヒストンでパッケージングされたプラスミドＤＮＡ及び会合したヒストンを標的細胞核内に運ぶことを助ける。そこにおいて、治療用及び／又は診断用の分子（ポリペプチド及び／又はヌクレオチド）を標的細胞核内に送達するために、プラスミドは望みのペプチド及び／又はヌクレオチドを発現する。当分野で公知であるいずれかの数の架橋剤を用いて、ヒストンでパッケージングされたプラスミドを細胞核内に導入するのに用いられるヒストンタンパク質に、核局在配列を共有結合することができる（多くの場合、ポリペプチドから突出して露出したアミノ酸側鎖中のリジン基で又は求核性若しくは求電子性の基を有するその他の基の位置で）。あるいは、核局在配列を発現するヌクレオチド配列は、ヒストンタンパク質を発現するヌクレオチド配列の近傍のプラスミドに配置されることができ、それによって核局在配列にコンジュゲートされたヒストンタンパク質の発現が起こって、標的細胞の核内へのプラスミドの運搬を促進する。
【００６３】
タンパク質は、核膜を通って核内に入ることができる。核膜は、複数の同心膜である外膜及び内膜からなる。これらは核への入り口である。この外被は、孔又は巨大な核複合体からなる。ＮＬＳを持つように翻訳されたタンパク質は、インポーチン（別名カリオフェリン）に強く結合して一体となり、この複合体は核膜孔を通って移動する。いずれかの数の核局在配列を用いて、ヒストンでパッケージングされたプラスミドＤＮＡを細胞の核内に導入することができる。好ましい核局在配列には、Ｈ2Ｎ−ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ（配列番号９）、ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０）、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１）、及びＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１２）（ヌクレオプラスミンのＮＬＳであり、約１０アミノ酸のスペーサーによって隔てられた塩基性アミノ酸の２つのクラスターからなる原型的な両方向性シグナル）が含まれる。多数のその他の核局在配列が当分野では周知である。例えば、LaCasseら, Nuclear localization signals overlap DNA- or RNA-binding domains in nucleic acid-binding proteins, Nucl. Acids Res., 23, 1647-1656 1995；Weis, K. Importins and exportins: how to get in and out of the nucleus（Trends Biochem Sci 1998 Jul; 23 (7): 235に訂正記事あり）. TIBS, 23, 185-9 (1998)；Murat Cokol, Raj Nair & Burkhard Rost, "Finding nuclear localization signals", ウェブサイトubic.bioc.columbia.edu/papers/2000 nls/paper.html#tab2参照。
【００６４】
用語「癌」は、無秩序な増殖、分化の欠如、局部組織浸潤、及び／又は転移をもたらす、正常な制御の喪失という独特の特質を有する腫瘍細胞（新生物）の増殖を記すために用いられる。本明細書で用いる場合、「新生物」は限定することなく、同種の組織における正常な増殖と比べての、対象又は宿主の組織中の細胞の形態上の異常、及び対象の組織中の細胞の病的増殖を含む。更に、新生物は、良性腫瘍、及び浸潤性又は非浸潤性の悪性腫瘍（例えば結腸腫瘍）を含む。悪性新生物は、より高度の異形成、又は細胞の分化及び配向の喪失を示し、更に浸潤及び転移の性質を有する点において、良性新生物と区別される。用語「癌」は文脈によって、多剤耐性癌を含めた薬物耐性癌も含む。本発明の標的細胞が生じる新生物又は異常増殖の例は、限定ではないがとりわけ、癌腫（例えば扁平上皮細胞癌、腺癌、肝細胞癌、及び腎細胞癌）、特に膀胱、骨、腸、乳房、子宮頸管、結腸（大腸）、食道、頭部、腎臓、肝臓（肝細胞）、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、及び胃の癌腫；白血病、例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、好中球性白血病、及び肝細胞性白血病；良性及び悪性のリンパ腫、特にバーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫；良性及び悪性のメラノーマ；骨髄増殖性疾患；肉腫、特にユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、末梢性神経上皮腫、及び滑膜肉腫；中枢神経系の腫瘍（例えば、グリオーマ、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、神経節神経腫、神経節膠腫、髄芽細胞腫、松果体細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜肉腫、神経線維腫、及びシュヴァン鞘腫）；生殖系列腫瘍（例えば、腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸部癌、子宮癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、混合の小細胞癌及び非小細胞癌、胸膜中皮腫（転移胸膜中皮腫小細胞肺癌を含む）、及び非小細胞肺癌）、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、食道癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、及びメラノーマ；混合型の新生物、特に癌肉腫及びホジキン病；並びに混合起源の腫瘍、例えばウィルムス腫瘍や奇形癌腫を含む。留意すべきことに、いくつかの腫瘍（特に肝細胞及び子宮頸部癌を含む）は、特に癌細胞上のＭＥＴ受容体の上昇したレベルを示すことが証明されており、プロトセルと複合体化したＭＥＴ結合ペプチドを含む本発明の実施形態の組成物及び治療法についての主な標的である。
【００６５】
用語「共投与する」及び「共投与」は、本発明のプロトセル組成物の少なくとも１つを、少なくとも１つのその他の薬剤（多くの場合、本明細書に具体的に開示される少なくとも１つの更なる抗癌剤（本明細書に別に記載））と組み合わせて、有効量と考えられる量又は濃度で、同時又はほぼ同時に投与することを記すために同義的に用いられる。共投与される組成物／薬剤は同時に投与されることが好ましいが、組成物／薬剤の両方（又はそれ以上）の有効濃度が少なくとも短時間に渡って同時に患者体内に見られるようにして、薬剤が複数の時点で投与されてもよい。あるいは、本発明の一部の態様においては、それぞれの共投与された組成物／薬剤が、癌（特に肝細胞癌又は細胞性癌を含む）の抑制及び治療、並びにその他の病態、状態又は合併症の軽減又は抑制する最終的な成果を伴って、その抑制効果を別々の時点において患者体内で示すようにすることが可能であり得る。当然ながら、複数の病態、感染又はその他の状態が存在する場合には、必要に応じて本発明の化合物をその他の薬剤と組み合わせて、そのような他の感染、疾患又は状態を治療してもよい。
【００６６】
用語「抗癌剤」は、任意でいずれかの種類の癌、とりわけ特に肝細胞又は子宮頸部癌を治療するために、本発明のプロトセルを含む１つ以上の組成物と組み合わせて処方されることができる化合物を記すために用いられる。本発明の化合物と共に処方可能な抗癌化合物は、例えば本発明に用いられ得る例示の抗癌剤を含み、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［��−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物を含む。
【００６７】
用語「抗肝細胞癌剤」は、本明細書において肝細胞癌又はその癌の転移の抑制、治療、その可能性の低減に用いることができる抗癌剤を記すために用いられる。本発明で用いられ得る抗癌剤には、例えばネクサバール（ソラフェニブ）、スニチニブ、ベバシズマブ、タルセバ（エルロチニブ）、タイカーブ（ラパチニブ）、及びそれらの混合物が含まれる。更にその他の抗癌剤が、そのような薬剤が癌、特に肝細胞癌の転移を抑制することが見いだされる場合には本発明で用いられてもよい。
【００６８】
用語「抗ウィルス剤」は、ウィルス（薬物耐性ウィルス株のような変異株も含む）の増殖及び／又は形成を抑制する生物活性剤／薬物を記すために用いられる。好ましい抗ウィルス剤は、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、及び抗ＨＣＶ剤を含む。本発明の一部の態様においては、特に肝細胞癌の治療が治療の目的である場合には、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）及び／又はＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）が多くの場合に肝細胞癌に関する原発性又は続発性の感染又は病態であることを考えると、治療をもたらすために抗Ｃ型肝炎剤又は抗Ｂ型肝炎剤の含有が、その他の従来の抗癌剤と組み合わされることができる。プロトセル中のカーゴ成分として又は一群のプロトセルを含む医薬組成物中の更なる生物活性剤として本発明に用いられる抗ＨＢＶ剤には、ヘプセラ（アデホビルジピボキシル）、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、エムトリシタビン、クレブジン、バルトリシタビン（valtoricitabine）、アムドキソビル、プラデホビル、ラシビル、ＢＡＭ２０５、ニタゾキサニド、ＵＴ２３１−Ｂ、Ｂａｙ４１−４１０９、ΕＨΤ８９９、ザダキシン（チモシンα−１）、及びそれらの混合物のような薬剤が含まれる。本発明での使用のための抗ＨＣＶ剤には、ボセプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ＩＮＸ−１８９、ＦＶ−１００、ＮＭ２８３、ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ＳＣＨ５０３０４、ＴＭＣ４３５、ＶＸ−５００、ＢＸ−８１３、ＳＣＨ５０３０３４、Ｒ１６２６、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ７２２７）、Ｒ７１２８、ＰＦ−８６８５５４、ＴＴ０３３、ＣＧＨ−７５９、ＧＩ５００５、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ａ−８３７０９３、ＧＳ９１９０、ＧＳ９２５６、ＧＳ９４５１、ＧＳ５８８５、ＧＳ６６２０、ＧＳ９６２０、ＧＳ９６６９、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−２９２８、ＧＳＫ６２５４３３、ＴＧ４０４０（ＭＶＡ−ＨＣＶ）、Ａ−８３１、Ｆ３５１、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＡＮＡ５９８、Ａ−６８９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤＸ１０２、ＡＤＸ１８４、ＡＬＳ−２２００、ＡＬＳ−２１５８、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ２０７１２７、ＢＩＴ−２２５、ＢＩＴ−８０２０、ＧＬ５９７２８、ＧＬ６０６６７、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−７８５１、ＳＣＹ−６３５、リバビリン、ＰＥＧ化インターフェロン、ＰＨＸ１７６６、ＳＰ−３０、及びそれらの混合物のような薬剤が含まれる。
【００６９】
用語「抗ＨＩＶ剤」は、ＨＩＶウィルス（Ｉ及び／又はＩＩ）若しくはその変異体の増殖及び／又は形成を抑制する化合物を指す。本発明のプロトセルのカーゴとして含まれることができる本発明での使用のための例示の抗ＨＩＶ剤としては、例えば特にヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、その他の非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（即ち本発明の典型でないもの）、プロテアーゼインヒビター、膜融合阻害剤が含まれる。それらの例示の化合物としては、例えば３ＴＣ（ラミブジン）、ＡＺＴ（ジドブジン）、（−）−ＦＴＣ、ｄｄＩ（ジダノシン）、ｄｄＣ（ザルシタビン）、アバカビル（ＡＢＣ）、テノホビル（ＰＭＰＡ）、Ｄ−Ｄ４ＦＣ（リバーセット（Reverset））、Ｄ４Ｔ（スタブジン）、ラシビル、Ｌ−ＦｄｄＣ、Ｌ−ＦＤ４Ｃ、ＮＶＰ（ネビラピン）、ＤＬＶ（デラビルジン）、ＥＦＶ（エファビレンツ）、ＳＱＶＭ（メシル酸サキナビル）、ＲＴＶ（リトナビル）、ＩＤＶ（インジナビル）、ＳＱＶ（サキナビル）、ＮＦＶ（ネルフィナビル）、ＡＰＶ（アンプレナビル）、ＬＰＶ（ロピナビル）、膜融合阻害剤（特にＴ２０など）、フゼオン（fuseon）、及びそれらの混合物が含まれる。
【００７０】
用語「ターゲティング活性化学種」は、プロトセルが標的細胞の表面に選択的に結合してその内容物を細胞内に下ろすことができるように、標的細胞の表面の成分に結合する、本発明のプロトセルの表面と複合体化又は好ましくは共有結合される化合物又は部分を記すために用いられる。本発明での使用のためのターゲティング活性化学種は、標的細胞に結合する化学種のうち、特に好ましくは本明細書に別に記載のターゲティングペプチド、ポリペプチド（抗体又は抗体断片を含む）、アプタマー、又は炭水化物である。
【００７１】
用語「ターゲティングペプチド」は、好ましいターゲティング活性化学種であって、特定の配列のペプチドであり、癌細胞における受容体又はその他のポリペプチドに結合して、ターゲティングペプチドが結合するペプチド（受容体又はその他の機能性ポリペプチド）を発現する特定の細胞へ、本発明のプロトセルが標的を定めることを可能にするものを記すために用いられる。本発明において、例示のターゲティングペプチドは、例えば遊離したＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬ−ＣＯＯＨ、配列番号６）、架橋剤とのコンジュゲート用にＣ末端システインで修飾されたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号７）、改変されたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＥＥＥＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号８）、又は本明細書に別に記載のＭＥＴ結合ペプチドを含む。その他のターゲティングペプチドも当分野で公知である。ターゲティングペプチドは、脂質二重層と複合体化されても、あるいは好ましくは本明細書に別に記載の架橋剤の使用によって脂質二重層と共有結合されてもよい。
【００７２】
用語「ＭＥＴ結合ペプチド」又は「ＭＥＴ受容体結合ペプチド」は、増強された結合効率で癌細胞表面上のＭＥＴ受容体に結合することが示された５つの７ｍｅｒペプチドについて用いられる。本発明に従って、異なる特異性レベルでＭＥＴ受容体（別名は肝細胞増殖因子受容体であり、ｃ−ＭＥＴ遺伝子により発現される）に結合し、ＭＥＴ受容体シグナル経路を活性化する様々な程度の能力を有する、異なるアミノ酸配列を有する複数の短鎖ペプチドが確認された。７ｍｅｒペプチドは、ファージディスプレイによるバイオパニングを用いて確認された。ＭＥＴ受容体に対し、及びその結果として例えば高レベルのＭＥＴ受容体を発現する癌細胞（例えば肝細胞、卵巣、及び子宮頸部）などの細胞に対し、増強された結合を示す配列の例を下記に示す。バイオパニングのプロセス中に最も頻繁に現れた配列のうちの幾つかの結合性データは、本出願の実施例の項でも示される。これらのペプチドは、細胞特異的治療法用のターゲティングリガンドとして特に有用である。しかし、受容体経路を活性化する能力を有するペプチドは、それ自体又はその他の治療法との組み合わせで、更なる治療有用性を有し得る。ペプチドの多くは、肝細胞癌腫（本来の所期の標的）に結合するだけでなく、広範な種類のその他の癌腫（卵巣及び子宮頸部の癌を含む）にも結合することが見い出された。これらのペプチドは、種々の癌、並びにＭＥＴ及び関連受容体の発現と関連するその他の生理的問題を標的にするための又は治療するための広範囲の適用性を有すると考えられる。
【００７３】
次の５つの７ｍｅｒペプチド配列は、ＭＥＴ受容体に対して実質的な結合を示し、本発明のプロトセルに使用するターゲティングペプチドとして特に有用である。
ＡＳＶＨＦＰＰ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）  配列番号１
ＴＡＴＦＷＦＱ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ）  配列番号２
ＴＳＰＶＡＬＬ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）  配列番号３
ＩＰＬＫＶＨＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）  配列番号４
ＷＰＲＬＴＮＭ（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ）  配列番号５
【００７４】
これらのペプチドのそれぞれは、単独で用いられても、又は上記群のその他のＭＥＴペプチド若しくは本発明のプロトセルを癌細胞（例えば特に肝細胞癌細胞、卵巣癌細胞、及び子宮頸部癌細胞）に結合させる助けとなり得るその他のターゲティングペプチドと組み合わせて用いられてもよい。これらの結合ペプチドは、癌を治療するために又は肝細胞増殖因子の結合を抑制するために、ＭＥＴ結合ペプチドとして医薬化合物中に単独で用いられることもできる。
【００７５】
用語「融合ペプチド」及び「エンドソーム分解性ペプチド」は、本発明のプロトセルの脂質二重層表面のペプチド（任意で好ましくは架橋された）を記すために同義的に用いられる。融合ペプチドは、エンドソーム本体からの脱出を促進し又は助け、標的細胞へのプロトセルの導入を促進して所期の結果（本明細書に別に記載の治療用及び／又は診断用の）をもたらすために、プロトセル上に含まれる。本発明のプロトセルで用いられる代表的で好ましい融合ペプチドは、当分野で公知のもののうち特にＨ５ＷＹＧペプチド、Ｈ2Ｎ−ＧＬＦＨＡＩＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）又は８ｍｅｒのポリアルギニン（Ｈ2Ｎ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１４）を含む。
【００７６】
用語「架橋剤」は、本発明の種々の成分を互いに共有結合するのに使用されることができる、２つの異なる官能基を含む種々の長さの二官能性化合物を記すために用いられる。本発明の架橋剤は２つの求電子性基を含んでもよい（ペプチド（オリゴヌクレオチド）上の求核性基と反応するためには、１個の求電子性基と１個の求核性基又は２個の求核性基）。架橋剤は、連結される成分及び必要な相対的屈曲性に依存しての長さが多様であってよい。架橋剤を用いてターゲティングペプチド及び／又は融合ペプチドをリン脂質二重層上に固定したり、超らせんのプラスミドＤＮＡのパッケージングのために核局在配列をヒストンタンパク質に連結したり、場合によってはプロトセルの脂質二重層中の脂質を架橋したりする。本発明に用いられ得る多数の架橋剤があり、多くは市販されているか又は文献で入手できる。本発明での使用のための好ましい架橋剤には、例えば特に１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、ＮＨＳ−（ＰＥＧ）n−マレイミド、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラコサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）24）、及びスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が含まれる。
【００７７】
詳細に上述したように、本発明の多孔性ナノ粒子コアは少なくとも１つの寸法を有する多孔性ナノ粒子を含んでよい。例えば、幅又は直径約３０００ｎｍ以下、約１０００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下である。好ましくはナノ粒子コアは、約５００ｎｍ以下、より好ましくは約８〜１０ｎｍから約２００ｎｍの好ましい直径を有する球形である。複数の実施形態においては、多孔性粒子コアは、円状、長方形、正方形、又はいずれかのその他の形状などの種々の断面形状を有することができる。一部の実施形態においては、多孔性粒子コアは約２ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の平均細孔サイズの細孔を有することができる。ただし、平均細孔サイズや他の特性（例えば多孔性粒子コアの多孔性）は、本発明の教示の種々の実施形態に従って限定されない。
【００７８】
通常、本発明のプロトセルは生体適合性である。薬物及びその他のカーゴ成分は、多くの場合には粒子コアの細孔の吸着及び／又は毛細管充填によって、最終的なプロトセル（全成分を含む）の最大約５０ｗｔ％まで装填される。本発明の一部の実施形態においては、装填されたカーゴは粒子コア（メソ細孔）の多孔性表面から放出されることができ、その放出プロファイルは、本明細書において概略的に説明されるように、例えば細孔サイズ、多孔性粒子コア表面の化学的性質、システムのｐＨ値、及び／又は多孔性粒子コアと周囲の脂質二重層との相互作用によって決定若しくは調整されることができる。
【００７９】
本発明においては、プロトセルを調製するのに使用される多孔性ナノ粒子コアは、本明細書に別に記載されるように、親水性又は次第により疎水性になるように調整されることができ、より親水性の表面を提供するために更に処理されることができる。例えば、メソ多孔性のシリカ粒子を水酸化アンモニウム及び過酸化水素で更に処理して、より高い親水性を提供することができる。本発明の好ましい態様においては、脂質二重層を多孔性粒子コア上に融合してプロトセルを形成する。本発明のプロトセルは様々な脂質を様々な重量比で含むことができ、好ましくは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−ｌ，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせなどである。
【００８０】
本発明のプロトセルを調製するために用いられる脂質二重層は、例えば約１００ｎｍの細孔サイズを有するフィルターを通した水和した脂質フィルムの押し出しによって、当分野で公知の標準的なプロトコール又は本明細書に別に記載のプロトコールを用いて調製されることができる。フィルターを通された脂質二重層フィルムを、次に例えばピペットで混合することによって、多孔性粒子コアと融合することができる。一部の実施形態においては、プロトセルのコロイド安定性を改善するために、過剰量の脂質二重層又は脂質二重層のフィルムを用いてプロトセルを生成することができる。
【００８１】
一部の診断用の実施形態においては、種々の色素又は蛍光（レポーター）分子がプロトセルのカーゴ（プラスミドＤＮＡとして発現されるもの）に含まれることができ、あるいは診断目的の多孔性粒子コア及び／又は脂質二重層に取り付けられることができる。例えば、多孔性粒子コアはシリカコア又は脂質二重層であってＦＩＴＣ（緑色蛍光）で共有結合的に標識されることができ、一方で脂質二重層又は粒子コアはＦＩＴＣテキサスレッド（赤色蛍光）で共有結合的に標識されることができる。多孔性粒子コア、脂質二重層、及び生成したプロトセルは、例えば診断用途で使用される共焦点蛍光法によって観察できる。更に、プラスミドが例えば診断用途で用いられ得る蛍光緑色タンパク質又は蛍光赤色タンパク質などの１つ以上の蛍光タンパク質を発現できるようにして、本明細書に記載のようにプラスミドＤＮＡを本発明のプロトセル中のカーゴとして用いることができる。
【００８２】
種々の実施形態においては、適宜、脂質二重層融合物又はリポソーム融合物（即ち多孔性粒子コア上）が粒子コアの細孔（メソ細孔）の種々のカーゴ成分と共に装填及び封入される相助作用の方法でプロトセルを用い、それにより脂質二重層の細胞膜を横断する又は多孔性ナノ粒子の分解による、カーゴ送達に有用な装填済みプロトセルを作る。一部の実施形態においては、単一の脂質（例えばリン脂質）二重層を融合することに加えて、反対の電荷を有する複数の二重層を多孔性粒子コア上に続けて融合してカーゴの装填及び／又は封入並びに最終的なプロトセルの放出特性に影響を与えることができる。
【００８３】
融合及び相助作用の装填機構が、カーゴの送達のために含まれることができる。例えば、多孔性粒子へのリポソームの融合によって、カーゴを相助作用的に装填、被包、又は封入できる。カーゴは、例えば小分子薬物（例えば特に抗癌薬物及び／又は抗ウィルス薬物（抗ＨＢＶ薬物若しくは抗ＨＣＶ薬物など）を含む）、ペプチド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ（特にプラスミドＤＮＡであり、好適なヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡ（プロトセル中にカーゴとして含まれるプラスミドＤＮＡによって発現されてもよい）、蛍光色素（プロトセル中に含まれたプラスミドＤＮＡによって発現可能な蛍光色素ペプチドを含む）などである。
【００８４】
本発明の実施形態においては、カーゴを多孔性粒子コアの細孔（メソ細孔）中に装填して装填済みプロトセルを形成することができる。種々の実施形態においては、リポソームを用いた薬物送達、例えばＰＥＧ化を用いる標的送達用に開発されるいずれかの従来技術を移転して本発明のプロトセルに適用することができる。
【００８５】
上記のように、静電的性質及び細孔サイズはカーゴの装填に影響を与え得る。例えば多孔性シリカナノ粒子は負電荷を有することができ、細孔サイズは約２ｎｍから約１０ｎｍ以上まで調整され得る。負荷電ナノ粒子は正荷電分子を吸着する生来の傾向を有することができ、正荷電ナノ粒子は負荷電分子を吸着する生来の傾向を有することができる。種々の実施形態においては、表面湿潤性のようなその他の特性（例えば疎水性）もまた、異なる疎水性を有するカーゴの装填に影響し得る。
【００８６】
種々の実施形態において、カーゴの装填は、脂質組成物を調整することによって相助作用する脂質で補助される装填となり得る。例えば、カーゴ成分が負荷電分子である場合、負荷電シリカ中へのカーゴの装填は脂質で補助された装填によって達成できる。一部の実施形態においては、例えば、融合及び相助作用の装填メカニズムを示すように脂質二重層をシリカ表面に融合する場合、陰性の化学種をカーゴとして負荷電シリカ粒子の細孔中に装填することができる。この方法においては、負荷電のメソ多孔性粒子上への負荷電でない（即ち正荷電又は中性）脂質二重層又はリポソームの融合が、粒子コアに負荷電のカーゴ成分を装填するのに役立つ。装填されるプロトセル中に負荷電のカーゴ成分を濃縮して、溶液中の荷電カーゴ成分と比べて濃度を約１００倍超にすることができる。その他の実施形態においては、メソ多孔性粒子及び脂質二重層の電荷を変えることによって、正荷電カーゴ成分をプロトセル中に容易に装填できる。
【００８７】
製造されたら、装填済みプロトセルは、投与後の望ましい部位へのカーゴ送達のために細胞内取り込まれることができる。例えば、カーゴが装填されたプロトセルが患者又は対象に投与されて、ターゲティングペプチドを含んだプロトセルが標的細胞に結合して標的細胞、例えば対象若しくは患者の癌細胞によって内在化又は取り込まれることができる。標的細胞内でのカーゴが装填されたプロトセルの内在化によって、カーゴ成分は次に標的細胞内に送達され得る。一部の実施形態ではカーゴは小分子であり、治療のために標的細胞内に直接送達されることができる。他の実施形態においては、負荷電のＤＮＡ又はＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含む）（好ましくはヒストンでパッケージングされて好ましくは核局在配列で修飾された超らせんプラスミドＤＮＡとして処方されたＤＮＡプラスミドを特に含む）が直接送達されることができ、標的細胞によって内在化される。そのため、ＤＮＡ又はＲＮＡは先ずプロトセルに装填され、次に装填済みプロトセルの内在化によって標的細胞内に至る。
【００８８】
上記のように、プロトセルに装填されて標的細胞まで送達されるカーゴとしては、小分子又は薬物（特に、抗癌剤又は抗ＨＢＶ剤及び／若しくは抗ＨＣＶ剤）、生物活性高分子（生物活性ポリペプチド（例えばリシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖）又はＲＮＡ分子（例えば本明細書に別に記載のｓｈＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ））、あるいは治療用又は診断用のペプチド又は治療用ＲＮＡ分子（例えばｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）を発現可能なヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡが挙げられる。ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡは、任意で好ましくは、送達されたプラスミドＤＮＡを標的細胞核内に局在させて濃縮できる核局在配列で修飾される。このように装填済みプロトセルは、治療用又は診断用にそのカーゴを標的細胞中に送達っすることができる。
【００８９】
本発明の種々の実施形態において、プロトセル及び／又は装填済みプロトセルは、プロトセル又はカーゴ成分を標的細胞（例えば癌細胞）まで選択的に送達するための標的送達方法を提供できる。例えば、脂質二重層の表面を、標的細胞に対応したターゲティング活性化学種によって修飾できる。ターゲティング活性化学種は、本明細書に別に記載のターゲティングペプチド、ポリペプチド（抗体若しくは抗体断片を含む）、アプタマー、炭水化物、又は標的細胞に結合するその他の成分であり得る。本発明の好ましい態様においては、ターゲティング活性化学種は、本明細書に別に記載のターゲティングペプチドである。一部の実施形態においては、好ましいペプチドのターゲティング化学種は本明細書に別に記載のＭＥＴ結合ペプチドを含む。
【００９０】
例えばターゲティング活性化学種（好ましくはターゲティングペプチド）を装填済みプロトセルの表面に提供することによって、プロトセルは本明細書での教示通りに標的細胞に選択的に結合する。一実施形態においては、癌細胞（癌の肝臓細胞を含む）を標的にする本明細書に別に記載される例示のターゲティングペプチドＳＰ９４若しくは類似体又はＭＥＴ結合ペプチドを脂質二重層にコンジュゲートすることによって、多数のカーゴ装填済みプロトセルが、癌（例えば肝臓）細胞の例示のＳＰ９４又はＭＥＴ結合ペプチドによる特異的標的により、この特定の癌細胞によって認識されて内在化されることができる。殆どの場合、プロトセルがターゲティングペプチドと結合されるなら、プロトセルは癌細胞に選択的に結合し、癌性でない細胞に明らかなほどの結合は起こらないと考えられる。
【００９１】
標的細胞に結合して取り込まれると、装填済みプロトセルは多孔性粒子からカーゴ成分を放出して、放出されたカーゴ成分を標的細胞中に移送することができる。例えば、多孔性粒子コア上のリポソームの融合二重層によってプロトセル中に封入された場合、カーゴ成分は脂質二重層の細孔から放出され、脂質二重層のプロトセル膜を通って移送され、標的細胞内に送達されることができる。本発明の複数の実施形態においては、プロトセル中のカーゴ成分の放出プロファイルは、従来技術で知られているようなリポソームのみを用いる場合と比べてより制御可能であり得る。カーゴの放出は、例えば多孔性コアと脂質二重層との間の相互作用、及び／又はシステムのｐＨ値などのその他のパラメータによって決まり得る。例えば、カーゴの放出は脂質二重層を通してなされ、多孔性シリカの分解によってなされる。一方で、プロトセルからのカーゴの放出はｐＨ依存的であり得る。
【００９２】
一部の実施形態においては、カーゴのｐＨ値は多くの場合に７未満、好ましくは約４．５〜約６．０であるが、約ｐＨ１４以下であってもよい。より低いｐＨでは、高いｐＨと比較してカーゴ成分の放出を大きく促進する傾向がある。より低いｐＨが有利な傾向にあるのは、殆どの細胞内のエンドソーム区画が低ｐＨ（約５．５）であるためだが、細胞でのカーゴの送達速度はカーゴのｐＨによって左右され得る。カーゴとカーゴがプロトセルから放出されるｐＨとに依存して、カーゴの放出は比較的短期（２〜３時間から１日程度）であるか、又は数日から約２０〜３０日以上の期間であり得る。従って、本発明はプロトセルそのものからの即放性及び／又は徐放性の適用を提供し得る。
【００９３】
一部の実施形態においては、界面活性剤の含有を提供して速やかに脂質二重層をバーストさせて、プロトセルの脂質二重層及び標的細胞を通ってカーゴ成分を輸送することができる。一部の実施形態においては、プロトセルのリン脂質二重層を界面活性剤（特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）の添加／放出によってバーストさせて、プロトセルから標的細胞中へのカーゴの速やかな放出を促進することができる。一部の実施形態においては、脂質二重層のバーストが、続いてプロトセルの粒子コアの細孔からのカーゴ成分の即時的で完全な放出を誘導できる。この方法では、本発明のプロトセルプラットフォームは、当分野のその他の送達システムに比べて多用途の送達システムを提供することができる。例えば、ナノ粒子のみを用いる送達システムと比較した場合、本明細書に開示のプロトセルプラットフォームは単純なシステムを提供して、リポソーム又は脂質二重層の低い毒性及び免疫原性と共にそのＰＥＧ化又はコンジュゲートされる能力を利用して、循環時間を延長して標的化を達成することができる。別の例においては、リポソームのみを用いる送達システムと比較して、本発明のプロトセルプラットフォームはより安定なシステムを提供でき、更にメソ多孔性コアを利用して装填及び／又は放出のプロファイルを制御することができる。
【００９４】
更に、脂質二重層及びその多孔性粒子コアとの融合を微調整して装填、放出及び標的化のプロファイルを制御することができ、更に融合ペプチド及び関連ペプチドを含むことで、より大きい治療効果及び／又は診断効果のためにプロトセルの送達を促進することができる。更に、プロトセルの脂質二重層は、リガンド提示及び多価の標的化のために流動性の界面を提供し、これによって流動性脂質の界面上におけるリガンド再編成の能力により、比較的低い表面リガンド密度を用いた特異的標的が可能になる。更に、本明細書に開示のプロトセルは標的細胞中に容易に移入するが、多孔性粒子の支持がない空のリポソームは細胞によって内在化されることができない。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、所期の結果（例えば、治療結果及び／又は診断分析（治療法の観察を含む））を達成するために処方される本明細書に別に記載の有効な一群のプロトセルを含み、医薬的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて製剤される。組成物の群の中のプロトセルは、求められる望ましい結果に依存して同一であっても又は異なってもよい。本発明の医薬組成物は、例えば抗癌剤又は抗ウィルス剤（例えば抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、又は抗ＨＣＶ剤）などの更なる生物活性剤又は薬物を含んでもよい。
【００９６】
通常、上記化合物の投与用量及び投与経路は対象の大きさ及び状態によって決まり、標準的な薬務プラクティスに従って決まる。用いられる用量レベルは非常にさまざまであり、当業者によって容易に決定されることができる。通常、ミリグラム〜グラム量の量が用いられる。組成物は対象に対して種々の経路、例えば特に経口的、経皮的、神経周囲、又は非経口的、即ち静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、髄腔内注射、又は筋肉内注射によって投与されることができ、口腔、直腸、及び経皮の投与が含まれる。本発明の方法の治療が意図される対象には、ヒト、ペット、実験動物などが含まれる。本発明は即放性及び／又は徐放性／制御型放出の組成物を意図し、即放性及び徐放性の処方の両方を含む組成物も含まれる。これは、プロトセルの異なる個体群を医薬組成物に用いる場合又は更なる生物活性剤を本明細書に別に記載のようにプロトセルの１つ以上の個体群と組み合わせて用いる場合に、特に当てはまる。
【００９７】
本発明の化合物を含有する製剤は、液体、固体、半固体、又は凍結乾燥粉末の形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、徐放性製剤、錠剤、カプセル剤、粉末剤、座薬、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾル、パッチ剤などであり、好ましくは正確な用量の簡単な投与に適した単位剤形である。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、通常は従来の医薬用の担体又は賦形剤を含み、更にその他の医薬品、担体、アジュバント、添加剤などを含んでもよい。好ましくは、組成物は、約０．１ｗｔ％〜約８５ｗｔ％、約０．５ｗｔ％〜約７５ｗｔ％が本発明の１つ又は複数の化合物であり、残りは主として適した医薬品賦形剤からなる。
【００９９】
非経口投与（例えば静脈内、筋肉内又は髄腔内）のための注射用組成物は、通常は化合物を好適な静脈用溶剤（例えば無菌生理食塩水）中に含む。組成物は、水性エマルションでの懸濁液として製剤されてもよい。
【０１００】
液体製剤は、プロトセルの一群（約０．５ｗｔ％〜約２０ｗｔ％又はそれ以上）及び任意の医薬用アジュバントを担体（例えば水性生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど）中に溶解又は分散して溶液又は懸濁液を作ることによって調製できる。経口液体製剤での使用については、組成物は溶液、懸濁液、エマルション、又はシロップとして調製されることができ、液体形態又は水若しくは通常生理食塩水での水和に適した乾燥形態で供給されることができる。
【０１０１】
経口投与のためには、そのような賦形剤としては製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。必要に応じて、組成物は少量の無毒の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、又は緩衝剤を含んでもよい。
【０１０２】
組成物を経口投与用の固形製剤の形態で用いる場合、製剤は錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などであってよい。錠剤の場合、組成物は通常は添加剤、例えば賦形剤（糖類又はセルロースの調合剤など）、結合剤（澱粉ペースト又はメチルセルロースなど）、充填剤、崩壊剤、及び医療用製剤の製造に通常用いられるその他の添加剤を用いて製剤される。
【０１０３】
このような剤形を調製する方法は、当業者に公知又は明らかである。例えばレミントンの薬学、第１７版、Mack Pub. Co.、1985年参照）。投与される組成物は、選択した化合物を、生体系（本発明による患者又は対象を含む）の治療での使用のための薬学的有効量で含む。
【０１０４】
特定の病態又は感染（特に、癌及び／又はＨＢＶ、ＨＣＶ、若しくはＨＩＶの感染を含む）について必要とする患者又は対象を治療する方法は、治療用プロトセルと、任意で少なくとも１つの更なる生物活性（例えば抗ウィルス）剤とを含む本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【０１０５】
本発明の診断法は、有効量の一群の診断用プロトセル（例えば、ターゲティング化学種（例えば癌細胞に選択的に結合するターゲティングペプチド）と、癌細胞が存在する場合に癌細胞に対するプロトセルの結合を知らせるレポーター成分とを含むプロトセル）を必要とする患者（癌が疑われる患者）に投与することを含む。レポーター成分（部分）が明示する癌細胞に対するプロトセルの結合によって、患者における癌の存在の診断が可能になる。
【０１０６】
本発明の診断法の代替方法は、患者の癌又はその他の病態の治療を観察するために用いられる。この方法は、有効な一群の診断用プロトセル（例えば、ターゲティング化学種（癌細胞又はその他の標的細胞に対して選択的に結合するターゲティングペプチドなど）と、癌細胞が存在する場合に癌細胞に対するプロトセルの結合を知らせるレポーター成分とを含むプロトセル）を治療前に患者若しくは対象に投与し、この患者での標的細胞に対する診断用プロトセルの結合の程度を治療中及び／又は治療後に測定することを含む。この場合、患者における治療開始前と治療中及び／又は治療後の結合の違いが、患者における治療の有効性（例えば患者が治療を完了したか否か、又は病態が抑制されたか若しくは排除されたか否か（癌の緩解を含む））を明白にする。
【０１０７】
以下の実施例は限定でなく、本発明及びその有利な特性の例示であって、開示又は特許請求の範囲に何ら限定を及ぼすものではない。本出願での実施例及び他の箇所において、全ての割合及び百分率は特に断りがない限り重量に基づく。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例に示すように、多孔性ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）は、ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合によって形成されるものであり、癌の治療法及び診断法の標的送達に関連する種々の課題に対応する新たな種類のナノ担体である。リポソームと同様にプロトセルは生体適合性、生分解性、及び非免疫原性であるが、そのナノ多孔性シリカコアは同様のサイズのリポソーム送達剤と比較して、大幅に増強されたカーゴ収容能力及び長期の二重層安定性を提供する。コアの多孔性及び表面の化学的性質を更に調節して、例えば薬物、核酸、及びタンパク質毒素などの多様な治療薬の被包を促進することができる。カーゴ放出の速度は細孔サイズ及びシリカ縮合の全体的な程度によって制御可能であるので、プロトセルはバースト放出又は制御型放出のプロファイルが必要な用途に有用である。最後に、プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）は、選択的送達を促進するためにリガンドで修飾されることができ、更に循環時間を延長するためにＰＥＧで修飾されることができる。実施例において、本発明者は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドの特異性の高い送達を達成するための、ペプチドで標的を定められたプロトセルの使用を報告する。これにより、トランスフェクションした細胞の増殖停止やアポトーシスがサイクリンＢ１を抑制することによって誘導される。下記の実施例の項で示すように、本発明者は２種類の界面活性剤による手法を用いて、ヒストンでパッケージングされたプラスミドを格納するのに十分大きい細孔を有する合成シリカナノ粒子を調製した。非イオン性界面活性剤（プルロニック（登録商標）Ｆ−１２７）を膨張剤（１，３，５−トリメチルベンゼン）と併用した際には、大型の細孔の鋳型として働いた。一方で、フッ化炭素系界面活性剤（ＦＣ−４）はシリカコアの成長を促進した。得られた粒子は１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の直径を有し、１７．３ｎｍの細孔入口を有する２０ｎｍの細孔の規則的な網状組織を含んでいた。超らせんプラスミドＤＮＡをヒストンでパッケージングし、得られた複合体（直径約１５ｎｍ）を核局在配列（ＮＬＳ）で修飾した後、シリカコアに装填した。ナノ多孔性コアへのリポソームの融合によって、疑似体液に３７℃で暴露した場合にも被包されたＤＮＡの長期保持（＞１ヶ月）が促進された。ファージディスプレイ法を用いて、本発明者は、種々の種類の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）によって過剰発現されることが公知である肝細胞増殖因子受容体ｃ−Ｍｅｔに対してナノモル濃度の親和性を有するターゲティングペプチドを確認した。ＤＮＡ−ヒストン−ＮＬＳ複合体が装填され、“２４０コピーのターゲティングペプチドのそれぞれとプロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドとで修飾されたプロトセルは、分裂中及び非分裂中のＨＣＣの両方をトランスフェクション可能であった。更に、標的化されたプロトセルはＨＣＣのＧＪＭ停止及びアポトーシス（ＬＣ，，＝２５ｎＭ）を有効に誘導したが、癌性でない細胞（肝細胞、内皮細胞、及び免疫細胞（ＰＢＭＣ、Ｂ細胞、及びＴ細胞）を含む）の生存性には影響しなかった。
【０１０９】
＜方法＞
プロトセルのコアを形成するナノ多孔性シリカ粒子を、前述のように1,2（Ashleyら、Nature Materials, 2011, May; 10(5):389-97も参照）水溶性シリカ前駆体と両親媒性界面活性剤との均質混合物から、エアロゾルを使用した蒸発誘起自己組織化（ＥＩＳＡ）又は油中水型エマルション滴中での溶媒抽出による自己組織化を用いて調製した1。溶媒の蒸発又は抽出によってエアロゾル又はエマルション滴が界面活性剤中において濃縮されて周期的な規則構造の形成が誘導され、その周りにシリカが集合して縮合する。界面活性剤を熱焼成によって除去し、良好に定められた均一な細孔サイズ及び形態を有する多孔性ナノ粒子を得る。エアロゾルを使用したＥＩＳＡによって生成された粒子（「単峰分布」の粒子）は、平均直径約１２０ｎｍ（サイズ排除に基づく分離後）、１２００ｍ2／ｇを超えるブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積、細孔容積の割合約５０％、及び単峰分布の細孔直径２．５ｎｍを有する。エマルション滴内に生成した粒子（「多峰分布」の粒子）は、平均直径約１５０ｎｍ（サイズ排除に基づく分離後）、ＢＥＴ表面積＞６００ｍ2／ｇ、細孔容積の割合約６５％、及び表面から利用可能であり６〜１２ｎｍの細孔によって相互に連結した大きな（２０〜３０ｎｍ）細孔からなる多峰分布の細孔形態を有する。エアロゾル又はエマルションの処理（それぞれ）に伴う液−気界面張力又は液−液界面張力によって、ごく小さい表面粗さを有する球形にする。更にどちらの種類の粒子も、窒素収着等温線の解析によって明らかにされるように、十分に利用可能な３次元の細孔の網状組織を有する。
【０１１０】
ナノ多孔性シリカコアの大きい細孔容積、表面積、及び近接性によって高いカーゴ収容能力が得られ、多様な種類の治療剤及び診断剤の速やかな装填が可能になる。単峰分布のナノ多孔性コアは、低分子量の化学療法薬について高い収容能力を有する。一方で多峰分布コアは、ｓｉＲＮＡ、タンパク質毒素、及びその他の高分子量カーゴ（例えばプラスミドＤＮＡ）の被包に必要とされる大きくて表面から利用可能な細孔を有する。カーゴ放出速度は、シリカコアが縮合する度合によって正確に制御できる。ナノ多孔性シリカコアの生成に用いるゾル中に種々の量のＡＥＰＴＭＳ（アミン含有シラン）を含ませることによって、実現可能な縮合の程度が低減され、中性ｐＨ、高イオン強度（即ち細胞質ゾル）の条件下でコアのより速やかな分解が促進される。ＡＥＰＴＭＳを含まない粒子は疑似体液中において２週間掛けて溶解するが、３０ｍｏｌ％のＡＥＰＴＭＳを含む粒子は２４時間以内に溶解する。従って、プロトセルは連続放出又はバースト放出のプロファイルが必要な用途に適合されることができる。
【０１１１】
ナノ多孔性シリカ粒子の生成に用いる前駆体ゾル中にＡＥＰＴＭＳを含ませることによって、細胞質ゾル条件下での粒子分解が加速され、単純な拡散で達成されるよりも速やかな被包されたカーゴの放出が促進される。しかし、ＡＥＰＴＭＳ修飾粒子は、弱塩基性の化学療法剤（例えばドキソルビシン）については低下した収容能力も有する。従って収容能力及び細胞内放出の両方を最大化するために、本発明者はζ電位、カーゴ（例えば、化学療法の薬物（ドキソルビシン／ＤＯＸ））の収容能力、シリカの分解速度、及びカーゴ放出速度をＡＥＰＴＭＳ濃度の関数として明らかにした。上述したように、未修飾の単峰分布粒子（ζ＝−１０４．５±５．６）はカーゴの高い収容能力を有するが（ＤＯＸの場合には１０10粒子当たり約１．８ｍＭ）、被包されたカーゴ（薬物）の２０％を２４時間（即ちＨＣＣの典型的な倍加時間）以内に放出するのみである。反対に、３０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳで修飾された単峰分布粒子（ζ＝８８．９±５．５）は、その被包されたカーゴ（薬物）の全てを６時間以内に放出するが、低下した薬物（ＤＯＸ）収容能力を有する（１０10粒子当たり約０．１５ｍＭ）。１５ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（ζ＝−２１．３±５．１）を含む単峰分布粒子は薬物（ＤＯＸ）の高い収容能力を保持し（１０10粒子当たり約１．１ｍＭ）、疑似体液に暴露されると被包されたカーゴ（薬物）の殆ど全てを２４時間以内に放出する。従って、これらの粒子が、カーゴの送達を含む全ての実験用に選択される。特に留意すべきこととして、単峰分布シリカ粒子のζ電位はＡＥＰＴＭＳ濃度の関数として増大するが、ＡＥＰＴＭＳ修飾粒子の細孔容積の割合（３０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳを含有する粒子では約４５％）は、未修飾の粒子のもの（約５０％）と実質的に異ならない。従って、発明者は、ＡＥＰＴＭＳで修飾された単峰分布粒子の減少したカーゴ収容能力は、減少した細孔容積よりも静電反発力に起因すると考える。カーゴ収容能力及びカーゴ放出の動力学に及ぼす細孔サイズの影響を示すために、多峰分布粒子が対照として含められる。
【０１１２】
＜一般試薬＞
無水エタノール、塩酸（３７％）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、９８％）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、≧９８％）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ、工業等級）、２−シアノエチルトリエトキシシラン（ＣＥＴＥＳ、≧９７．０％）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、≧９９％）、Ｂｒｉｊ（登録商標）−５６、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、≧９８．５％）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ヘキサデカン（≧９９％）、ドキソルビシン塩酸塩（≧９８％）、５−フルオロウラシル（≧９９％）、ｃｉｓ−ジアンミン白金（ＩＩ）二塩化物（シスプラチン、≧９９．９％）、コリネバクテリウムジフテリア由来のジフテリア毒素、トリポクラジウムインフラタム由来のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、≧９５％）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、≧９９％）、ヒト上皮増殖因子、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、チミジン（≧９９％）、ヒポキサンチン（≧９９％）、ウシフィブロネクチン、ウシＩ型コラーゲン、ゼラチン、大豆トリプシンインヒビター（≧９８％）、２−メルカプトエタノール（≧９９．０％）、ＤＬ−ジチオスレイトール（≧９９．５％）、ジメチルスルホキシド（≧９９．９％）、ｐＨ５のクエン酸緩衝液、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ、９９．９９５％））、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、≧９９．５％）、リン酸水素二アンモニウム（≧９９．９９％）、及びセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂは、シグマ・アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン）は、エボニック・インダストリーズ社（ドイツ、エッセン）から購入した。超高純度のＥＭ等級ホルムアルデヒド（１６％、メタノール非含有）は、ポリサイエンシズ社（ペンシルバニア州ウォリントン）から購入した。Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）ＩＩは、ヘルマ社（ドイツ、ミュールハイム）から購入した。
【０１１３】
＜脂質＞
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、及びコレステロールは、アバンティ・ポーラー・リピッズ社（アラバマ州アラバスター）から購入した。
【０１１４】
＜細胞株及び増殖培地＞
ヒトＨｅｐ３Ｂ（ＨＢ−８０６４）、ヒト肝細胞（ＣＲＬ−１１２３３）、ヒト末梢血単核細胞（ＣＲＬ−９８５５）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＣＲＬ−２８７３）、Ｔリンパ球（ＣＲＬ−８２９３）、Ｂリンパ球（ＣＣＬ−１５６）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；バージニア州マナサス）から購入した。ＢＥＧＭ−Ｂｕｌｌｅｔキットは、ロンザグループ社から購入した（クロネティクス；メリーランド州ウォーカーズビル）。フェノールレッド未添加のＤＭＥＭは、シグマ・アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０１１５】
＜蛍光染色試薬及び顕微鏡試薬＞
ヘキスト３３３４２（３５０／４６１）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３５６／４５１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５カルボン酸スクシンイミジルエステル（４０１／４２１）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）バイオレットＢＭＱＣ（４１５／５１６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）グリーンＣＭＦＤＡ（４９２／５１７）、カルセイン（４９５／５１５）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−アネキシンＶコンジュゲート（４９５／５１９）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４９５／５１９）、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＡＨＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイ（４９５／５１９）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）フィクサブルグリーン死細胞染色キット（４９５／５１９）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン核酸染色（５０４／５２３）、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）レッドミトコンドリア過酸化物指示薬（５１０／５８０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸スクシンイミジルエステル（５３２／５５４）、ヨウ化プロピジウム（５３５／６１７）、ｐＨｒｏｄｏ（商標）スクシンイミジルエステル（５５８／５７６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）レッドＣＭＴＰＸ（５７７／６０２）、テキサスレッド（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（テキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ、５８３／６０８）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヒドラジド（６４９／６６６）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸−スクシンイミジルエステル（６５０／６６８）、Ｕｌｙｓｉｓ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７核酸標識キット（６５０／６７０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７−アネキシンＶコンジュゲート（６５０／６６５）、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールド・アンチフェード試薬（ＤＡＰＩ含有及び非含有）、イメージｉＴ（登録商標）ＦＸシグナル増強剤、１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、ウシアルブミン画分Ｖ溶液（ＢＳＡ、７．５％）、及びトランスフェリンは、インビトロジェンライフサイエンシズ社（カリフォリニア州カールスバッド）から購入した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ、５５７／５８５）、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）フルオレセイン活性カスパーゼ−３染色キット（４８５／５３５）、及びＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−８染色キット（５４０／５７０）は、バイオビジョン社（カリフォルニア州マウンテンビュー）から購入した。水溶性ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットＣＺＷＤ６４０（６４０／６６０）は、ＮＮ−Ｌａｂｓ社（アーカンサス州ファイエットビル）から購入した。
【０１１６】
＜架橋剤＞
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラコサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）24）、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、及びスルフヒドリル付加キットは、ピアース・プロテインリサーチプロダクツ社（サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社、イリノイ州ロックフォード）から購入した。
【０１１７】
＜その他のシリカナノ粒子＞
５ｎｍ未満の硅素ナノ粒子は、メロリウムテクノロジーズ社（ニューヨーク州ロチェスター）から購入した。１０〜２０ｎｍの酸化硅素ナノ粒子は、スカイスプリングナノマテリアルズ社（テキサス州ヒューストン）から購入した。３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、及び１０μｍのシリカ粒子は、ディスカバリーサイエンティフィック社（ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー）から購入した。
【０１１８】
＜合成ｓｉＲＮＡ及び合成ペプチド＞
サイレンサーセレクトｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、及びＰＤＧＦＲ−ａについてのｓｉＲＮＡのＩＤは、それぞれｓ５６５、ｓ７８２４、及びｓ１０２３４）は、アンビオン社（テキサス州オースティン）から購入した。５’アミノ修飾剤Ｃ１２を備えた二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＡＣＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣ−３’）は、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）から購入した。「遊離した」ＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬ−ＣＯＯＨ、配列番号６）、コンジュゲート用にＣ末端Ｃｙｓで修飾されたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号７）、及び図２ｄの動員実験に用いたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＥＥＥＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号８）は、ニューイングランドペプチド社（マサチューセッツ州ガードナー）が合成した。Ｈ５ＷＹＧペプチド（Ｈ2Ｎ−ＧＬＦＨＡＩＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＧＧＣ−ＣＯＯＨ）及び核局在配列（Ｈ2Ｎ−ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ）は、バイオペプチド社（カリフォルニア州サンディエゴ）が合成した。ペプチドの下線部分は、元々の配列である。追加のアミノ酸残基は、コンジュゲート又は標識の目的で付加された。全ての抗体（ＣＨＡＬＶ−１、抗Ｒａｂ１１ａ、抗ＬＡＭＰ−１、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ−２、抗ＰＤＧＦＲ−α）は、アブカム社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。
【０１１９】
＜細胞培養条件＞
Ｈｅｐ３Ｂ、肝細胞、ＰＢＭＣ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球はＡＴＣＣから入手し、製品説明書に従って培養した。簡潔に言えば、Ｈｅｐ３Ｂは１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中に維持された。肝細胞は、ＢＳＡ、フィブロネクチン、及びウシＩ型コラーゲンでコーティングされたフラスコ中で培養した。用いた培地は、５ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子、７０ｎｇ／ｍＬホスファチジルエタノールアミン、及び１０％ＦＢＳを備えたＢＥＧＭ（ゲンタマイシン、アンホテリシン、及びエピネフリンは、ＢＥＧＭ−Ｂｕｌｌｅｔキットから除かれた）であった。ＨＵＶＥＣは、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養された。ゼラチンでコーティングしたフラスコを用いて接着を促進した。ＰＢＭＣ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球は、浮遊培養用フラスコ（グライナーバイオワン社、ノースカロライナ州モンロー）中で維持された。ＰＢＭＣは、０．０２ｍＭチミジン、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、及び１０％ＦＢＳが追加されたＩＭＤＭ中で培養された。Ｔリンパ球及びＢリンパ球はそれぞれ、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中及び２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養された。全ての細胞は、湿気のある環境（５％ＣＯ2を補充した空気）において３７℃で維持された。接着細胞は０．０５％トリプシンを用いて継代比率１：３で継代され、一方で非接着細胞は２×１０5細胞／ｍＬの密度で播種され、１〜５×１０6細胞／ｍＬで維持された。
【０１２０】
［ナノ多孔性シリカ粒子の合成及び特徴］
＜単峰分布シリカナノ粒子の合成＞
単峰分布の多孔性を有するナノ多孔性シリカ粒子の調製に用いるエアロゾルを使用した蒸発誘起自己組織化法は、Luら2によって記載されている。簡潔に言えば、シリカ前駆体（ＴＥＯＳ）、構造指向性の界面活性剤（ＣＴＡＢ、最初は臨界ミセル濃度よりもかなり低い濃度、又はＣＭＣ）、及びＨＣｌを含有する、水−エタノール溶液に溶解された均質ゾルを、改良型市販アトマイザー（モデル９３０２Ａ、ＴＳＩ社、ミネソタ州セントポール）を用いてエアロゾル化した。窒素をキャリアガスとして用い、全ての加熱ゾーンを４００℃に維持して溶媒を蒸発させ、有効界面活性剤濃度を増大させた。ピンホールにおける圧力降下は２０ｐｓｉであった。粒子を８０℃に維持したデュラポアメンブレンフィルター（ミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）上に集めた。代表的な反応混合物は、５５．９ｍＬの脱イオン水、４３ｍＬの２００プルーフエタノール、１．１０ｍＬの１．０規定ＨＣ１、４．０ｇのＣＴＡＢ、及び１０．３２ｇのＴＥＯＳを含んだ。細胞内（中性ｐＨ、比較的高塩濃度）条件下でより速やかに溶解するナノ多孔性シリカ粒子を調製するために、様々な量のＴＥＯＳ及びアミン含有シランＡＥＰＴＭＳを前駆体ゾル中に含ませ、系のｐＨを濃塩酸を用いて２．０に調節した。例えば、１５ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳを有する粒子を調製するために、９．３６ｇのＴＥＯＳ及び１．３３ｇのＡＥＰＴＭＳを用いた。
【０１２１】
＜多峰分布シリカナノ粒子の合成＞
多峰分布の多孔性を有するナノ多孔性シリカ粒子を合成するのに用いたエマルションの処理はCarrollら1によって記載されている。簡潔に言えば、１．８２ｇのＣＴＡＢ（水相に可溶）を２０ｇの脱イオン水に加え、溶解するまで４０℃で撹拌し、２５℃まで冷ました。このＣＴＡＢ溶液に０．５７ｇの１．０Ｎ塩酸、５．２ｇのＴＥＯＳ、及び０．２２ｇのＮａＣｌを加え、得られたゾルを１時間撹拌した。３ｗｔ％のＡｂｉｌ−ＥＭ９０（油相中に可溶な非イオン性乳化剤）を含むヘキサデカンからなる油相を調製した。前駆体ゾルを１０００ｍＬの丸底フラスコ中で油相と結合し（ゾル：油の体積比１：３）、２分間激しく撹拌して油中水型エマルションの形成を促進し、ロータリーエバポレーター（Ｒ−２０５、ビュッヒラボラトリーエクイップメント社、スイス）に取り付け、８０℃の水浴中に３０分間置いた。この混合物を次に１２０ｍｂａｒの減圧下で沸騰（３５ｒｐｍ、３時間）させて溶媒を除去した。粒子を３０００ｒｐｍで２０分間遠心し（Ｃｅｎｔｒａ−ＭＰ４Ｒモデル、インターナショナル・エクイップメント・カンパニー社、テネシー州チャタヌーガ）、上清を傾瀉した。最後に粒子を５００℃で５時間焼成して界面活性剤やその他の過剰な有機物質を除去した。Carrollらが記載のように、溶媒除去によって水相にＣＴＡＢ（＞ＣＭＣ）が濃縮され、得られたミセルはシリカ粒子の縮合（水相中での）の際に６〜１２ｎｍの細孔の鋳型となる。更に、水−油界面への２つの界面活性剤（ＣＴＡＢ及びＡｂｉｌ−ＥＭ９０）の吸着によって相助作用で界面張力が減少し、表面から利用可能な大きな細孔の鋳型となる２０〜３０ｎｍのミクロエマルション滴の自発的形成がもたらされる。
【０１２２】
＜シリカナノ粒子の特徴＞
ナノ多孔性シリカ粒子の動的光散乱法は、ゼータサイザーナノ（マルバーン社、英国ウスターシャー州）を用いて行った。サンプルは、４８μＬのシリカ粒子（２５ｍｇ／ｍＬ）を２．４ｍｌの１×Ｄ−ＰＢＳ中で希釈することによって調製した。溶液を解析のために１ｍＬポリスチレンキュベット（ザルスタット社、ドイツ、ニュームブレヒト）に移した。窒素収着は、ＡＳＡＰ−２０２０比表面積・細孔分布測定装置（マイクロメトリックス・インスツルメント社、ジョージア州ノークロス）を用いて行った。ζ電位測定は、ゼータサイザーナノ（マルバーン社、英国ウスターシャー州）を用いて行った。代表的な実験においては、シリカ粒子、リポソーム、又はプロトセルを疑似体液（ｐＨ７．４）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に１：５０で希釈した。これらは何れも１５０ｍＭのＮａＣｌを含むように調節され、解析のために１ｍＬ折り畳みキャピラリーセル（マルバーン社、英国ウスターシャー州）に移された。ＤＬＳ及び窒素収着のデータについては添付の図１、シリカナノ粒子、リポソーム、及びプロトセルのζ電位の値については、添付の図１２を参照。
【０１２３】
［プロトセルの合成、装填、及び表面機能化］
＜ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合＞
プロトセルを合成するのに用いる手順はLiuらによって記載されており25〜27、簡単にのみ言及される。脂質はアバンティ・ポーラー・リピッズ社に注文し、クロロホルム中に予め溶解して−２０℃に保存した。プロトセル合成の直前に、２．５ｍｇの脂質を窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン（モデル１４５０Ｍ、ＶＷＲインターナショナル社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）中に一晩置いて残留溶媒を除去した。脂質を０．５×Ｄ−ＰＢＳ中において濃度２．５ｍｇ／ｍＬで再水和し、Ｍｉｎｉ−エクストルーダーセット（アバンティ・ポーラー・リピッズ社、アラバマ州アラバスター市）を用いて１００ｎｍフィルターを少なくとも１０回通した。ＤＰＰＣ及びＤＳＰＣをそれぞれの転移温度（４１℃及び５５℃）まで予熱した０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に溶解し、押し出しプロセス中は６０℃に維持した。得られたリポソーム（直径約１２０ｎｍ）を４℃で最大１週間保存した。ナノ多孔性シリカコアを０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に溶解し（２５ｍｇ／ｍＬ）、過剰量のリポソーム（脂質：シリカの体積比１：２〜１：４）に室温で３０〜９０分暴露した。プロトセルを過剰な脂質の存在下において４℃で最大３ヶ月間保存した。過剰な脂質を除去するために、プロトセルを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、２回洗浄し、０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１２４】
＜担持された脂質二重層の組成物の最適化＞
対照細胞に対する非特異的結合及び毒性を最少化するために、ＳＬＢの組成を最適化した。用いた種々の脂質の構造については添付の図４参照。表面への結合、内在化、及び送達の実験の全てにおいて用いたプロトセルは、５ｗｔ％ＤＯＰＥ（又はＤＰＰＥ）、３０ｗｔ％コレステロール、及び５ｗｔ％の１８：１（又は１６：０）のＰＥＧ−２０００ＰＥを含むＤＯＰＣ（又はＤＰＰＣ）からなるＳＬＢを有した。必要に応じて、蛍光脂質（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ、１６：０〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ、又はテキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ）をＳＬＢ中に１〜５ｗｔ％含ませた。脂質は、再水和及び押し出しの前にまとめて凍結乾燥した。例えば７５μＬのＤＯＰＣ（２５ｍｇ／ｍＬ）、５μＬのＤＯＰＥ（２５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのコレステロール（７５ｍｇ／ｍＬ）、５μＬの１８：１のＰＥＧ−２０００ＰＥ（２５ｍｇ／ｍＬ）、及び５μＬの１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ（５ｍｇ／ｍＬ）を組み合わせて乾燥し、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、５ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、及び１ｗｔ％のＮＢＤ−ＰＣを含むＤＯＰＣからなるリポソームを生成した。
【０１２５】
＜様々な種類のターゲティングリガンドでの担持された脂質二重層の修飾＞
ＨＣＣに対するプロトセルの特異親和性を、様々な種類のターゲティングリガンドを様々な密度でＳＬＢにコンジュゲートすることによって最適化した。ＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧペプチド（Ｃ末端システイン残基を持つように合成した）を、スルフヒドリル部分及びアミン部分に反応性であって長さを変えて特異親和性を最適化できるＰＥＧスペーサーアームを有するヘテロ二官能性架橋剤のＮＨＳ−（ＰＥＧ）n−マレイミドを介して、ＰＥの頭部基中に存在する１級アミンにコンジュゲートした。殆どの実験においてＳＭ（ＰＥＧ）24を用いた（スペーサーアーム＝９．５２ｎｍ）。トランスフェリン、抗ＥＧＦＲ、及びＣＨＡＬＶ−１中に存在するアミン部分を、スルフヒドリル付加キットを用いて遊離したスルフヒドリルに変換した（製品説明書に従った）。機能化されたトランスフェリン及び抗体を、ＳＭ（ＰＥＧ）24を用いてＳＬＢ中のＰＥにコンジュゲートした。リガンド密度を反応化学量論及び培養時間の両方によって調節した。例えば、プロトセルを１０倍モル過剰のＳＰ９４と共に室温で２時間培養し、ペプチド密度０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／プロトセル）を得た。一方、プロトセルを５０００倍モル過剰のＳＰ９４と共に４℃で一晩培養し、ペプチド密度５．００ｗｔ％（約２０４８ペプチド／プロトセル）を得た。平均リガンド密度は、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧペプチド）又はレムリ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トランスフェリン、抗ＥＧＦＲ、及びＣＨＡＬＶ−１）によって測定された28。簡潔に言えば、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スペーサーアーム＝１．５７ｎｍ）は、１級アミン部分及びスルフヒドリル部分と反応し、還元によって切断可能なヘテロ二官能性架橋剤であり、これを用いてプロトセルを種々のリガンド密度で修飾した。プロトセルを１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）に３０分間暴露し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清は遊離したリガンドを含み、その濃度をＩｍａｇｅＪ画像処理・解析ソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を用いて各サンプルのバンド濃度と標準曲線とを比較することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。２０％ゲル（６％ビスアクリルアミド及び６Ｍ尿素を含む）を用いてＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧのペプチド密度を解析した。１０％ゲルを用いて抗体（抗ＥＧＦＲ及びＣＨＡＬＶ−１）密度を解析し、１５％ゲルを用いてトランスフェリン密度を解析した。
【０１２６】
＜蛍光標識されたナノ多孔性コアの調製＞
１００μＬの粒子（２５ｍｇ／ｍＬ）を０．５×Ｄ−ＰＢＳ中の９００μＬの２０％ＡＰＴＥＳに添加して、ナノ多孔性コアを蛍光標識した。粒子をＡＰＴＥＳ中において室温で一晩培養し、遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分）して未反応のＡＰＴＥＳを除去し、１ｍＬの０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に再懸濁した。アミン反応性フルオロフォア（例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル、１ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）を添加した（粒子の１ｍＬ当たり色素５μＬ）。粒子を室温に２時間保った後、遠心して未反応の色素を除去した。蛍光標識された粒子を４℃で０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に保存した。
【０１２７】
＜単峰分布コア及びリポソームへの化学療法剤の装填＞
リポソームの融合前に、１５ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含むように修飾した単峰分布ナノ多孔性コアを、ドキソルビシン（５ｍＭ）中、又はドキソルビシン、シスプラチン及び５−フルオロウラシル（各薬物５ｍＭ）の混合物中に室温で１時間浸漬した。過剰な薬物を粒子の遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）によって除去した。以前に記載されたリン酸アンモニウム勾配に基づく方法を用いて29、１２０ｎｍリポソームにＤＯＸが装填された。簡潔に言えば、脂質膜を３００ｍＭの（ΝΗ4）ΗΡＯ4で再水和し、リポソーム溶液を１００ｎｍ薄膜に少なくとも１０回通した。リポソームを透析（フロート−Ａ−Ｌｙｚｅｒ−Ｇ２透析ユニット、３．５〜５ｋＤａＭＷＣＯ、スペクトラムラボラトリーズ社、カリフォルニア州ランチョドミンゲス）によって等張緩衝溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で平衡化し、ドキソルビシンＨＣｌ（薬物：脂質のモル比１：３）と共に４℃で一晩培養した。過剰のＤＯＸをサイズ排除クロマトグラフィー（０．７ｃｍ×１０ｃｍセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂカラム）によって除去した。以前に記載されたように30、31、リポソームに５−ＦＵ又はシスプラチンが装填された。
【０１２８】
＜多峰分布コアへの多成分混合物、ｓｉＲＮＡ、及びジフテリア毒素Ａ鎖の装填＞
２０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含むように修飾した多峰分布ナノ多孔性コアを、カルセイン（５ｍＭ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（１００μΜ）、ＲＦＰ（１００μΜ）、及びＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット（１０μΜ）の溶液中に４時間浸漬した。ハイパースペクトル画像のための最善の蛍光強度を得るために、各カーゴの濃度を変化させた。８５０μＬの１×Ｄ−ＰＢＳ中にカルセイン及びＮＬＳをそれぞれ１ｍｇ溶解することによって、カルセインをＮＬＳ（Ｃ末端システイン残基を含むように合成した）で修飾した。１００μＬのＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ、脱イオン水中）及び５０μＬのＢＭＰＨ（１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）を添加し、混合物を室温で２時間培養した。過剰のカルセインを透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒミニ透析ユニット、２ｋＤａＭＷＣＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社、イリノイ州ロックフォード）によって除去した。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをＵｌｙｓｉｓ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７核酸標識キットを用いて標識し（製品説明書に従った）、更に５０μＬのｄｓＤＮＡ（２ｍＭ、脱イオン水中）を５０μＬのＮＬＳ（１ｍＭ、ＤＭＳＯ中）及び１０μＬのＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）と結合することによってＮＬＳで修飾した。混合物を室温で２時間培養し、過剰なＮＬＳを透析（スライド−Ａ−Ｌｙｚｅｒミニ透析ユニット、７ｋＤａ−ＭＷＣＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社、イリノイ州ロックフォード）によって除去した。添付の図１３〜１６に記載の送達実験のために、２０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）で修飾した多峰分布のナノ多孔性コアを、ｓｉＲＮＡ（１００μΜ）又はジフテリア毒素Ａ鎖（１００μΜ）中に４℃で２時間浸漬した。被包されていないカーゴを遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）によって除去し、カーゴ装填済みのコアにリポソームを直ちに融合した。
【０１２９】
＜ヒストンタンパク質によるＣＢ１プラスミドのパッケージング＞
ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）の超らせん化に用いたプロセスを図４に示す。概念図には、高度に飽和した塩溶液を用いてＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）（ＣＢ１プラスミドベクターは以下及び添付の図１２に示される）を超らせん化し、超らせんｐＣＢ１をヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４でパッケージングし、得られたｐＣＢ１−ヒストン複合体をヒストンタンパク質へのコンジュゲートによって核膜孔を通る移行を促進する核局在配列（ＮＬＳ）で修飾するために用いられるプロセスを示す。図４（Ｂ）及び（Ｄ）は、ＣＢ１プラスミド（Ｂ）及びヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（Ｄ）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。（Ｃ）及び（Ｅ）は、それぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）での赤線に対応する高さプロファイルである。
【０１３０】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填された、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成＞
図５に示すように、５（Ａ）はＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。この方法に従って、プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。図５（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。５（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子についてのサイズ分布を示す。（５Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図Ｓ−４Ａに示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積の線図である。（５Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【０１３１】
＜メソ多孔性のシリカナノ粒子はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１について高い収容能力を有し、得られたプロトセルはエンドソーム環境を模倣する条件下でのみ被包されたＤＮＡを放出する＞
図６（Ａ）は、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝−３８．５ｍＶ）又はアミン含有シランのＡＰＴＥＳで修飾されたメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝＋１１．５ｍＶ）の中に被包可能なｐＣＢ１又はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「複合体」）の濃度を示す。図６（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（１×１０9個）と共に１×１０6細胞／ｍＬを３７℃で２４時間培養した場合に、ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＣＢ１によりコードされる緑色蛍光タンパク質）に対して陽性となるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。ｘ軸は、プロトセルのコアがＡＰＴＥＳで修飾されたか否か及びｐＣＢ１がヒストンで予めパッケージングされたか否かを示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）でパッケージングされたｐＣＢ１を対照として含む。図６（Ｃ）及び（Ｄ）は、疑似体液（Ｃ）又はｐＨ５緩衝液（Ｄ）に暴露した際の、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子及び対応するプロトセルからの、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の時間に依存した放出を示す。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、（Ｂ）については、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１３２】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルがヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をＨＣＣまで送達するプロセス＞
添付の図７に示される概念図に表されるように、［１］種々のＨＣＣ株により過剰発現されるＭｅｔへのターゲティングペプチドの動員によって、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に高親和性で結合する。流動性のＤＯＰＣのＳＬＢはペプチドの流動性を促進し、それにより低いＭＣ４０密度で修飾されたプロトセルがＨｅｐ３Ｂに対して高い特異親和性を保持することを可能にする（図８Ａ参照）。［２］ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、受容体依存性エンドサイトーシスを介してＨｅｐ３Ｂによって内在化される（図８Ｂ及び図１５Ａ参照）。［３］エンドソーム条件はＳＬＢを不安定化し（Nature Materialsの参考文献を挿入）、エンドソーム分解性ペプチドＨ５ＷＹＧのプロトン化を引き起こす。これらは何れも、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質ゾル中に拡散することを可能にする（図１６Ｂ参照）。［４］ｐＣＢ１−ヒストン複合体は、核局在配列（ＮＬＳ）で修飾された場合に、約２４時間以内にＨｅｐ３Ｂ細胞の核内に濃縮される（図１６Ｃ参照）。これによって、分裂中及び非分裂中の癌細胞の両方での効率的なトランスフェクションが可能になる（図１７参照）。
【０１３３】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルはＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されない＞
図８（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図Ｓ−１１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。図８（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【０１３４】
＜ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルは、ピコモル濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘導するが、正常肝細胞の生存性に関してはごく小さい影響しか有さない＞
図９（Ａ）及び（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃でＨｅｐ３Ｂを連続して暴露した際の、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びサイクリンＢ１タンパク質の発現における用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では、細胞を種々のｐＣＢ１濃度に４８時間暴露し、（Ｂ）では、５ｐＭのｐＣＢ１に種々の時間に渡って暴露した。肝細胞でのサイクリンＢ１タンパク質の発現及びＨｅｐ３ＢでのＺｓＧｒｅｅｎの発現が、対照として含まれる。リアルタイムＰＣＲ及び免疫蛍光法を用いて、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びタンパク質それぞれの濃度を測定した。図９（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した後の、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂの割合を示す。Ｇ2／Ｍ期の肝細胞の割合及びＳ期のＨｅｐ３Ｂの割合を比較のために含む。細胞は、細胞周期分析の前にヘキスト３３３４２で染色された。図９（Ｄ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。アポトーシスのマーカーに陽性である肝細胞の割合を対照として含む。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶに陽性である細胞は、アポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの両方に陽性である細胞は、アポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、一方及び両方に陽性である細胞の数を加算して求められた。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１３５】
＜ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルが、対応するリポプレックスよりも２５００倍有効にＨＣＣの選択的なアポトーシスを誘導する＞
図１０（Ａ）は、ＤＯＰＣプロトセル、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）で修飾されたＤＯＰＣプロトセル、ｐＣＢ１とＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥの混合物（１：１ｗ／ｗ）とからなるリポプレックス、並びに１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスのζ電位の値を示す。全てのζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。図１０（Ｂ、左軸）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル又はリポプレックスによって送達された５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合を示す。図１０（Ｂ、右軸）は、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞の９０％において３７℃で４８時間以内にアポトーシスを誘導するのに必要な、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル又はリポプレックスの数を示す。（Ｂ）については、細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色された。一方及び両方に陽性である細胞をアポトーシス性と見なした。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１３６】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、肝細胞の生存性には影響を与えることなく、高濃度のタキソール、Ｂｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１をＨＣＣに選択的に送達する＞
図１１（Ａ）は、１０12個のプロトセル、リポソーム、又はリポプレックスの中に被包可能な、タキソール、Ｂｃｌ−２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びＣＢ１プラスミドの濃度を示す。図１１Ａの赤色のバーは、タキソール及びｐＣＢ１の両方がプロトセルに装填された場合に、タキソール及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。青色のバーは、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１のすべてがプロトセルに装填された場合又はｓｉＲＮＡ及びｐＣＢ１がリポプレックスに装填された場合に、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。図１１（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによってＨｅｐ３Ｂまで送達された場合の、オレゴングリーン（登録商標）４８８標識タキソール（緑色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ｓｉＲＮＡ（赤色）、及びＣｙ５標識ｐＤＮＡ（白色）の細胞内分布を示す共焦点蛍光顕微鏡法画像を提供する。細胞をＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの１０００倍の過剰量と共に３７℃で２４時間培養した後に固定して、ヘキスト３３３４２で染色した（青色）。スケールバー＝１０μｍ。図１１（Ｃ）は、１０ｎＭのタキソール及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞細胞の割合を示す。割合は、Ｇ2／Ｍでの対数増殖細胞の割合に対して正規化された。図１１（Ｄ）は、１０ｎＭのタキソール、２５０ｐＭのＢｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陽性になるＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞の細胞の割合を示す。
（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１３７】
＜ＣＢ１プラスミドのベクターマップ＞
ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）は、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（クロンテック・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びｐＮＥＢ１９３ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から構築された。ｐＣＢ１は、サイクリンＢ１特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（Yuanら、Oncogene (2006) 25, 1753-1762）及びスナギンチャク種の緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）をコードする。構成的ｓｈＲＮＡ発現は、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ依存性ヒトＵ６プロモーター（ＰU6）によって駆動され、構成的ＺｓＧｒｅｅｎ発現は、サイトメガロウィルスの最初期プロモーター（ＰCMV IE）によって駆動される。ｏｒｉエレメント及びＡｍｐRエレメントは、大腸菌内におけるプラスミドの増殖を可能にする。サイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列に下線を付す。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＩＲＥＮベクターに導入するために用いた制限酵素部位（ＢａｍＨＩは赤色、ＥｃｏＲＩは青色）が横にある。
【０１３８】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の特徴＞
図１３（Ａ）は、漸増濃度のヒストン（モル比１：２：２：２：２のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）に暴露されたｐＣＢ１に関する電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ｐＣＢ１：ヒストンのモル比をレーン３〜６に示す。レーン１はＤＮＡラダーを含み、レーン２はｐＣＢ１を含み添加ヒストンを含まない。図１３（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（ｐＣＢ１：ヒストンのモル比１：５０）のＴＥＭ画像である。スケールバー＝５０ｎｍ。
【０１３９】
＜未装填のメソ多孔性のシリカナノ粒子及びｐＣＢ１が装填されたメソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着分析＞
図１４（Ａ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着等温線である。図１４（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子のブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積を示す。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１４０】
＜ＤＯＰＣプロトセルの小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）データ＞
図１５は、ＤＯＰＣプロトセルのＳＡＮＳデータを示す。フィッティングデータデータは、一定厚さの共形シェルを有する多分散な多孔性シリカ球のモデルを用いて得られたものであり、シリカ粒子の表面に細孔開口部を覆う３６Åの二重層が存在することを示す。厚さ０、２０、６０Åの二重層についてシミュレーションされたＳＡＮＳデータを比較のために含む。測定された二重層の厚さ３６Åは、平坦な担持された脂質二重層について行われた他の中性子研究（３３〜３８Å）（Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer 5, 161-171 (2005)参照）と一致しており、これらの対照条件下では、脂質二重層の水素に富む炭化水素コアからの散乱を主に示す。実験データは、２９９．２Åの細孔の存在も示しており、２πを０．０３１５Å-1（即ち、細孔からの散乱により生じる実験データでのピークのｑ値）で割ることによって求められた。ＳＡＮＳデータは、１００％Ｄ2Ｏ／ＰＢＳ緩衝液中の５％（ｖ／ｖ）のプロトセル懸濁液を用いて、ＬＡＮＳＣＥ（ロスアラモス国立研究所）でＬＱＤビームラインで得られた。データは、ＮＣＮＲのＳＡＮＳデータ解析パッケージ（ＮＩＳＴ）を用いて適合された。
【０１４１】
＜プロトセルは被包されたＤＮＡをヌクレアーゼ分解から守る＞
図１６に、ＤＮａｓｅＩ処理したｐＣＢ１（レーン３）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン５）、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（レーン７）、カチオン性コアを有するプロトセルに装填されたｐＣＢ１（レーン９）、及びアニオン性コアを有するプロトセルに装填されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１１）のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。裸のｐＣＢ１（レーン２）、ヒストンから放出されたｐＣＢ１（レーン４）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスから放出されたｐＣＢ１（レーン６）、カチオン性コアを有するプロトセルから放出されたｐＣＢ１（レーン８）、及びアニオン性コアを有するプロトセルから放出されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１０）を比較のために含む。レーン１はＤＮＡラダーを含む。試料をＤＮａｓｅ１（５０ｎｇのＤＮＡ当たり１ユニット）と共に室温で３０分培養し、ｐＣＢ１放出は１％ＳＤＳを用いて促進された。
【０１４２】
図１７は、メソ多孔性のシリカナノ粒子（「未修飾のコア」）、２０％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ中に室温で１２時間浸漬したメソ多孔性のシリカナノ粒子（「ＡＰＴＥＳ修飾コア」）、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「ｐＣＢ１−ヒストン複合体」）、及びＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（「ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックス」）のζ電位（ζ）の値を示す。ζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１４３】
＜図６及びＳ−１６（Ａ）〜（Ｄ）においてＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性の細胞の割合を求めるのに用いられた、代表的な前方散乱−側方散乱（ＦＳＣ−ＳＳＣ）プロット図及びＦＬ−１ヒストグラム＞
図１８は、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ａ及びＣ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＢ及びＤ）であり、（Ａ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｃ）はしていない。ＦＬ−１チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、（Ｂ）及び（Ｄ）に示す。（Ｅ）〜（Ｈ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ｅ及びＧ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＦ及びＨ）であり、（Ｅ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｇ）はしていない。（Ｆ）及び（Ｈ）のゲートは、ＭＦＩ≦２８２、即ちＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞のＭＦＩの１００倍（Ｄ図参照）の細胞の割合に対応する。
【０１４４】
＜ＭＣ４０ターゲティングペプチドの確認＞
図１９は、ＭＣ４０ターゲティングペプチドをＰｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイライブラリ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から選択するのに用いたプロセスを示す概念図である。１×１０11ｐｆｕ／ｍＬのペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された１００ｎＭの組み換えヒトＭｅｔ（ｒｈＭｅｔ）と共に室温で１時間培養した。プロテインＡ又はプロテインＧでコーティングした磁性粒子を用いてＭｅｔ−ファージ複合体を親和性捕捉し、続いてＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回洗浄して未結合のファージを除去した。結合したファージクローンは低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２）で溶出し、溶出物を宿主細菌（大腸菌ＥＲ２７３８）の感染によって増幅した。概念図に従って、次第に厳くなる条件を用いて５ラウンドの親和性選択を行った。Ｍｅｔ濃度を１００ｎＭから５０ｎＭに、そして１０ｎＭに減らし、培養時間を１時間から３０分に、そして１５分に縮め、洗浄緩衝液に添加したＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０％（ｖ／ｖ）から０．１％に、そして０．５％に増やした。プロテインＡ及びプロテインＧに特異的なペプチドは、プロテインＡでコーティングした磁性粒子とプロテインＧでコーティングした磁性粒子との間で選択ラウンドを交互に行うことによって回避された。５回の選択ラウンドの後にＤＮＡを４０個の別個のクローンから回収し、Ｐｈ．Ｄ．（商標）−７キットに添付の９６ｇＩＩＩプライマーを用いて配列を決定した。ＭＥＴ受容体に対して最大の結合活性を有する配列は次の通り表される。
ＡＳＶＨＦＰＰ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）  配列番号１
ＴＡＴＦＷＦＱ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ）  配列番号２
ＴＳＰＶＡＬＬ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）  配列番号３
ＩＰＬＫＶＨＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）  配列番号４
ＷＰＲＬＴＮＭ（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ）  配列番号５
【０１４５】
＜ＭＣ４０ターゲティングペプチドの特徴＞
図２０（Ａ）は、５回の選択ラウンド後のペプチド配列アラインメントを示す。主配列ＡＳＶＨＦＰＰは以前に確認されていたＭｅｔ特異的な１２ｍｅｒのＹＬＦＳＶＨＷＰＰＬＫＡ（配列番号１８）の下線部分に相似である。標的に無関係のＨＡＩＹＰＲＨペプチド（約１０％）（配列番号１９）を提示するファージクローンは、配列アラインメントから除かれた。図２０（Ｂ）及び（Ｃ）は、親和性選択したファージクローンがｒｈＭｅｔに結合した度合を示し、酵素結合免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。（Ｂ）に示すＥＬＩＳＡのスキームは、材料及び方法の項で説明する。ＥＬＩＳＡの結果を（Ｃ）に示す。図２０（Ｄ）は、Ｍｅｔに結合しないペプチドを除去した後の配列アラインメントを示す。図２０に示す共通配列はこのアラインメントから決定された。図２０（Ｅ）及び（Ｆ）は、（１）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、無関係なファージクローン（ＴＰＤＷＬＦＰ）（配列番号２０）と、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（青色のドット）、又は（２）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、ＭＣ４０クローンと、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（橙色のドット）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及び肝細胞（Ｆ）についてのフローサイトメトリーの散布図である。未処理細胞（赤色のドット）を用いて、ＦＬ−１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）及びＦＬ−２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６蛍光）のチャンネルについての電圧パラメータを設定した。
【０１４６】
＜Ｈｅｐ３Ｂに暴露されたＭＣ４０で標的を定められたプロトセルについての例示の結合曲線＞
図８Ａの解離定数を求めるために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞をサイトカラシンＤで前処理してエンドサイトーシスを抑制し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められた種々の濃度のプロトセルと共に３７℃で１時間培養した。フローサイトメトリーを用いて得られた細胞群の平均蛍光強度を測定し、プロトセル濃度に対してプロットして全体の結合曲線を得た。非特異的結合は、飽和濃度の非分類の肝細胞増殖因子の存在下において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められたプロトセルと共に細胞を培養することによって求められた。特異的結合曲線は、非特異的結合曲線を全体の結合曲線から引くことによって得られた。Ｋd値は、特異的結合曲線から計算された。図２１に示す実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／粒子）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。対応するＫd値は１０５０±１４２ｐＭである。全てのエラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１４７】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化され、Ｈ５ＷＹＧペプチドの非存在下でリソソームへ誘導される＞
図２２（Ａ）は、Ｈｅｐ３Ｂ又は肝細胞の細胞のそれぞれによって１時間以内に３７℃で内在化された、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの平均数を示す。１×１０6個の細胞を飽和濃度（１００μｇ／ｍＬ）のヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の非存在下（−）又は存在下（＋）において種々の濃度のプロトセルと共に培養し、Ashleyら、Nature Materials, 2011, May;10(5):389-97によって記載されるように、フローサイトメトリーを用いて各細胞に結合した粒子の平均数を求めた。プロトセルをＮＢＤ及びｐＨｒｏｄｏ（商標）で標識して、表面に結合した粒子を酸性細胞内区画に内在化されたものから区別した（それぞれについて）。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）は、プロトセルと、（１）Ｒａｂ５、（２）Ｒａｂ７、（３）リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）又は（４）Ｒａｂ１１ａとの間のピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０００倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識プロトセルと共に３７℃で１時間培養した後、固定して透過処理し、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、ＬＡＭＰ−１、又はＲａｂ１１ａに対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体と共に培養した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【０１４８】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、ＨＣＣ細胞の核内で時間に依存して濃縮される＞
図２３（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で１５分（Ａ）、１２時間（Ｂ）、又は２４時間（Ｃ）暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。（Ｂ）については、プロトセルのエンドソーム脱出及びｐＣＢ１の細胞質ゾル内分散は、約２時間後までには明白であった。しかし、ＺｓＧｒｅｅｎ発現は１２〜１６時間まで検出可能でなかった。２４時間の時点で、Ｃｙ５標識ｐＣＢ１は細胞内全体に分布したままであった。一方、（Ｃ）において細胞質ゾルの染色が見えないのは、核内に局在したピクセルの飽和を回避するためにＣｙ５チャンネルのゲインを下げたせいである。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。図２３（Ｄ）は、Ｃｙ５で標識したｐＣＢ１及びヘキスト３３３４２で標識したＨｅｐ３Ｂの核についての、時間に対するピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０個の細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【０１４９】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１は、ＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、分裂中及び非分裂中のＨＣＣ細胞の両方をほぼ１００％の効率で選択的にトランスフェクションする＞
図２４（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で２４時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、（Ａ）では分裂中であり、（Ｃ）及び（Ｅ）では約９５％コンフルエントであった。全ての画像においてｐＣＢ１はヒストンで予めパッケージングされており、（Ｅ）において、ｐＣＢ１−ヒストン複合体はＮＬＳで更に修飾された。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。図２４（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（「ＰＣ」）１×１０9個に３７℃で２４時間連続して暴露された際に、ＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合を示す。細胞は（Ｂ）では分裂中であり、（Ｄ）及び（Ｆ）では約９５％コンフルエントであった。ｘ軸は、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）及びｐＣＢ１−ヒストン複合体（「複合体」）がＮＬＳで修飾されていたか否かを示す。ｐＣＢ１単独に加えて、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１も対照として用いられた。細胞を２０ｍｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に暴露し、核膜孔複合体を経るＮＬＳ修飾したｐＣＢ１の移行を遮断した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。図２４（Ｇ）〜（Ｉ）は、それぞれ図（Ａ）、（Ｃ）、及び（Ｅ）で用いた細胞の細胞周期のヒストグラムである。Ｇ0／Ｇ1期の細胞の割合を各ヒストグラムについて示す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【０１５０】
図２５は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。（Ｂ）の矢印は、有糸分裂細胞を示す。サイクリンＢ１はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識モノクローナル抗体で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【０１５１】
図２６は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ（白色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色し、それぞれ初期及び後期のアポトーシスを試験した。細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【０１５２】
＜双性イオン性脂質からなるＳＬＢを有するプロトセルは、ごく低い非特異的細胞毒性しか誘導しない＞
添付の図２７は、１×１０9個のＡＰＴＥＳ修飾メソ多孔性のシリカナノ粒子、ＡＰＴＥＳ修飾コアを有するＤＯＰＣプロトセル、スクランブルｓｈＲＮＡ配列をコードするプラスミド（「スクランブルｐＣＢ１」）が装填されたＤＯＰＣプロトセル、又はスクランブルｐＣＢ１が装填されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）リポプレックスに３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂの割合を示す。プロトセル及びリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。正荷電及び負荷電のポリスチレンナノ粒子（それぞれ「アミン−ＰＳ」及び「カルボキシル−ＰＳ」）を正の対照として用い、一方で１０ｍＭの抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）又は１ｐｍｏｌの遊離したｐＣＢ１に暴露されたＨｅｐ３Ｂを負の対照として用いた。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１５３】
本明細書に開示する全参考文献は、適宜引用により援用される。
【０１５４】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４（１）】
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【図４（２）】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【図５（３）】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（１）】
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【図１１（２）】
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【図１１（３）】
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【図１１（４）】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０（１）】
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【図２０（２）】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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