(57)【要約】  Ｘ列およびＹ行を用いて走査される、多焦点レーザ走査顕微鏡の走査フィールドのサイズを変化させる方法が提供される。走査フィールド内にはｎ個のレーザ・スポットが、それぞれ互いの間隔ｄを空けて、試料平面上に低速の走査軸に沿って配置されており、試料平面上の走査される行の間隔が、Ｋ∈Ｎとして、ａ＝ｄ／Ｋであり、Ｋを変化させることによって走査フィールドのサイズを変化させ、Ｋ行の走査後に、少なくともＹ行の走査が完了するまで、例えば走査方向に（ｎ−１）×Ｋ＋１行分、または走査方向とは逆方向に（ｎ＋１）×Ｋ−１行分の飛び越しにより、縦方向の飛び越しを行う。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ列およびＹ行を用いて走査される、多焦点レーザ走査顕微鏡の走査フィールドのサイズを変化させる方法であって、
該走査フィールド内にｎ個のレーザ・スポットが、それぞれ互いの間隔ｄを空けて、試料平面上に低速の走査軸に沿って配置され、
該試料平面上の走査される行の間隔が、Ｋ∈Ｎとして、ａ＝ｄ／Ｋであり、
Ｋを変化させることによって該走査フィールドのサイズを変化させ、Ｋ行の走査後に、少なくともＹ行の走査が完了するまで、例えば走査方向に（ｎ−１）×Ｋ＋１行分、または走査方向とは逆方向に（ｎ＋１）×Ｋ−１行分の飛び越しにより、縦方向の飛び越しを行う、方法。
【請求項２】
対物レンズ焦点に互いの間隔ｄを空けて一列に配置された、Ｎが１より大きい、Ｓ１〜ＳＮの数の照射スポットを用いた、
試料の走査による、
好適には請求項１に記載の、レーザ走査顕微鏡の走査フィールドのサイズを変化させる方法であって、
走査線状に照射される画像ポイントの画像ポイント毎の検出を行い、
該試料の走査を、Ｓ１〜ＳＮによって第１の方向Ｘに行毎に行い、その際、第１の段間隔ｋのＫ＝１／ｄ段で第２の方向に段毎にさらなる行を走査し、それにより、個々のスポットを割り当てて、少なくとも部分毎に検出される走査線領域を生成する方法において、
ｋよりも小さい第２の段間隔Ｌで第２の方向に行毎に走査を行い、該第２の方向にＮ倍の間隔ｄ分をずらすために、少なくとも１つの該照射スポットについて、少なくとも部分毎にその走査線領域の走査を繰り返すことによって、好適には走査される画像ポイントの総数を保持しながら、前記走査フィールドを拡大すること、および
ｋよりも大きい第３の段間隔ｐで該第２の方向に行毎に走査を行い、少なくとも１つの該照射スポットについて、その走査線領域の少なくとも一部の照射の遮断および検出される画像ポイントの遮断（減衰）のうちの少なくとも一方を行うことによって、走査フィールドを縮小すること
のうちの少なくとも一方を行う、方法。
【請求項３】
前記走査フィールドの拡大を、Ｋ＜Ｙ／Ｎを選択することによって行う、請求項１または２に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項４】
前記走査フィールドの縮小を、Ｋ＞Ｙ／Ｎを選択することによって行う、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項５】
好適にはＡＯＭ、ＥＯＭ、またはＡＯＤのような光スイッチ、またはスキャナによって、個々のスポットを個別に遮断または調節する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項６】
前記多焦点レーザ走査顕微鏡の様々な位置で、有利には既にマルチ・スポットの生成時に遮断を行うことができる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項７】
前記レーザ・スポットの間隔を、例えば光学的ズームまたはスポット生成に介入することによって変化させる、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項８】
前記レーザ・スポットの数を変化させる、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項９】
走査される部分画像を互いに接続する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項１０】
前記走査される部分画像が、好適には整数の行数に対応する、重複領域を備えている、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項１１】
前記重複領域において、少なくとも照射される画像のポイントの一部について、その照射強度を低減させる、請求項１０に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【請求項１２】
前記重複領域において、異なるレーザ・スポットによって照射される画像情報を画像解析によってカバーする、請求項１０または１１に記載の走査フィールドのサイズを変化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
従来のレーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ）では、照射光線がポイント毎に試料上に導かれることによって、試料の２次元の画像が撮影される。通常、光線の偏向は可動の走査ミラーを用いて行われる。これに関しては、例えば非特許文献１を参照されたい。
【０００２】
所望の画像サイズ、分解能、およびサンプリング法に応じて、画像の画素数を調節することができる。一般的な画像フォーマットは、例えば５１２×５１２画素である。
走査ミラーの最大走査角度を変化させることにより、画素数を変化させずに、走査される試料領域のサイズを変化させることができる。このような撮像倍率の変更は、事実上無段階に行うことができ、ズームと呼ばれる。
【０００３】
マルチ・スポット励起を用いるＬＳＭでは、試料が複数の光線で同時に走査される。これにより、シングル・ポイント励起を用いた撮影と比べて、試料をより高速に走査することができる。
【０００４】
図６には、例として、マルチ・スポット照射のための配置が示されている。
以下の符号は以下の意味で用いられる。
Ｆ：ファイバー
ＫＯ：ファイバー・コリメータ・レンズ
Ｈｆｔ．：顕微鏡の主カラー・スプリッタ
ＬＡ  １…ｎ＞：ｎ個の単レンズから成るレンズ・アレイ
Ｌ：マルチ・スポット・レンズ
ＳＣ：スキャナ
ＳＣＯ：走査対物レンズ
ＺＢ：中間像
Ｏ：顕微鏡対物レンズ
ＤＥ：検出光線路
ＰＨＯ：ピンホール対物レンズ
ＰＨ：単ピンホール
ＺＢ１、ＺＢ２：中間像面
ＤＥ１…ｎ：ｎ個の単検出器から成る検出器アレイ
ＰＨＡ：ピンホール・アレイ
ＭＬＡＰＨ：ピンホール・レンズ・顕微レンズ・アレイ
部分１ａ）には試料への方向である照射方向が示され、部分１ｂ）には検出される試料光の検出方向が示され、部分１ｃ）には検出器前の光線路が示されている。
【０００５】
照射光はファイバーＦから発散出射し、コリメータＫＯを介して平行化され、顕微鏡の主カラー・スプリッタＨＦＴによって試料の方向へ反射されて、レンズ・アレイＬＡに到達する。
【０００６】
中間像ＺＢ１においてＬＡによって生成される照射スポットは、マルチ・スポット・レンズＬを介して平行化され、光軸へ向けて分解され、テレセントリック照明によってスキャナＳＣが配置されたＬの後側の焦点で集光する。
【０００７】
中間像ＺＢ２において走査対物レンズＳＣＯの後方で生成される焦点は、さらに不図示の顕微鏡対物レンズＯを介して試料上に撮像され、それにより、照射ポイントが少なくとも１次元のスキャナによって試料上を移動される。
【０００８】
試料から到来する光は、同じ要素を介して検出部ＤＥの方向に、ピンホール対物レンズおよびピンホールを介して単検出器ＤＥ１〜ＤＥｎに到達する。
ＬＡを通過した後に平行化される単光線は、ピンホール対物レンズによってピンホールの平面上で集束される。つまり、ここでは１つのピンホールのみが必要となる。
【０００９】
ＰＨＯの２倍の焦点距離には、試料上に生成される蛍光分布を検出するための、照射される個々の試料ポイントに対応する検出器ＤＥ１…ｎが位置している。
単ピンホールＰＨの代わりに、検出部においてここでは不図示の単レンズのアレイによって、この場合も検出器アレイＤＥ１…ｎが後置された、ピンホール・アレイに焦点を合わせてもよい。
【００１０】
ＨＦＴによって送信される照射光が試料の方向に到達し、ＨＦＴが試料光を検出部の方向に反射するように、ＨＦＴへの照射光線路および検出光線路を入れ替えることもできる。
【００１１】
通常、スポットは、各スポットが画像の部分領域を走査するように配置されており、試料平面上のスポット間隔は所定の値に固定されている。図１には、例として、４つのスポットによって走査された３２×３２画素のフィールドが示されている。各スポットが画像フィールドの４分の１を走査し、４つの部分画像が１つの全体画像に合成される。画像の行数が所与である場合、試料平面上の幾何学的な行間隔は、隣接するスポットの部分画像を走査過程の終了後に互いに直接接続しなければならないという条件によって決まる。各スポットがサイズの等しい１つの部分フィールドを走査することにより、フィールド全体がＮ個の部分フィールドから（Ｎスポットで）合成される場合のフィールドは、最大倍率のフィールドと呼ばれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７３８５１６５号明細書
【特許文献２】米国特許第６０２８３０６号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ジェイ  ポウリー（Ｊ．  Ｐａｗｌｅｙ），“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ここで、従来の方法で、最大走査角度を変化させることによってズームしようとすると、フィールド・サイズは高速の走査軸の方向に変化するが、スポット間隔は変化しないので、全スポットの部分画像のサイズが等しく、これらの部分画像が互いに隣接するような、フィールドの均等な走査は、ある特定のフィールド・サイズの場合にしか行うことができない。特に、画像の画素数（例えば５１２×５１２画素）が所与である場合のズームが困難になる。
【００１５】
特許文献１に記載されている技術では、少数の非常に大まかな段階でしかズームを行うことができない。
そのサイズが最大倍率でフィールド・サイズの整数の倍数であり、加えて、この整数の倍数が、Ｌ＞１として、２つの自然数の累乗ＬＫで表されるフィールドが走査される。走査されるフィールドをＬＫ倍に拡大すると、スポットおよび部分画像当たりの行数が同様にＬＫ倍に減少する。この影響により、選択可能なズーム段階の数が著しく制限されてしまう。スポットによって生成される蛍光信号が検出器上で互いにクロストークしないように、スポットが最小間隔を下回ってはならず、また各顕微鏡が最大フィールドしか記録することができないという限界条件があるので、Ｌ＝２について、最大倍率に対して、１、２、４、８、１６の倍数の５段階のズーム段階のみが利用可能である。Ｌ＞２の場合には、特許文献１に記載された方法の制限が一層明らかになる。加えて、いわゆる「最大倍率」を前提としているこの方法によれば、より低い倍率への変更しか行うことができない。
【００１６】
特許文献２では、光アレイの走査スポット周囲の狭い領域内を光アレイが移動される。これにより、このスキャナを介して実現されるべきズーム機能が阻害される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
以下の概念を一義的に用いることができるように、これらを以下により詳細に定義する。
スポットまたは光スポットＳ１〜ＳＮ：焦点を合わされたＮ本のレーザ光線またはＮ本の部分に分割されたレーザ光線によって同時に生成される試料上の照射ポイントである。
【００１８】
スポット間隔ｄ：試料上の隣接する照射スポット間の間隔。
画素または画像画素Ｐ１〜Ｍ、Ｐ１〜Ｍ１：検出ユニットによって画像ポイントに割り当てられる検出値である。
【００１９】
これらは走査線状に記録される。つまり、ポイント状の試料領域に対応する値が走査線状に検出されるように、連続的な走査動作で、計時された検出が行われる。
画素間隔：通例、２つの検出される画素の中央の間隔である。
【００２０】
走査フィールドＦ：光学的に走査動作によって走査される、記録対象の試料の画像に対応する。
走査フィールドまたは画像フィールドは、使用される顕微鏡光学系によってその広がりが限定される。
【００２１】
走査線領域：照射スポットの１つによって走査される走査フィールドの部分領域である。走査される画像ポイントは検出および保存することができる。
【発明の効果】
【００２２】
上記の解決法では、マルチ・スポットＬＳＭにおいて、所与の走査フィールド・サイズでズーム機能を細かく段階付けできることを可能にする方法について述べる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】４つのスポットによって走査された３２×３２画素のフィールドを示す。
【図１ａ】図１の左側の部分が切り取られて拡大図を示す。
【図２】Ｆと比べてより小さいフィールドＦ１を、本発明により３２×３２画素で走査する説明図を示す。
【図３】図１のＦに比べてより大きいフィールドＦ２を、３２×３２画素で走査する説明図を示す。
【図４】横方向の走査動作の開始ポイントＰ１〜ＰＭ間の走査動作の説明図を示す。
【図５−１】５１２×５１２画素および４つの単スポットにおけるフィールド・サイズの段階付け表を示す。
【図５−２】図５−１の続きの５１２×５１２画素および４つの単スポットにおけるフィールド・サイズの段階付け表を示す。
【図６】マルチ・スポット照射のための配置図を示す。
【図７】本発明の別の実施形態の説明図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、所与の画素分解能で実現可能なズーム段階をより細かく段階付けすることを可能にするものである。典型的な画素走査線（例えば５１２×５１２画素）の場合には、ほぼ連続的なズームが可能となろう。
【００２５】
その他、本発明は、より大きいフィールドへのズームだけでなくより小さいフィールドへのズームをも可能にすることを課題とする。
以下では本発明を、概略図を用いてより詳細に説明する。
【００２６】
本発明による解決法は、Ｓ１からＳＮまでのＮ個のスポットを有するマルチ・スポットＬＳＭを用いて行われる。これらのスポットは、例えばＹ方向に位置しており、好適には互いからの間隔ｄが等しい。試料の高速走査は、例えばＸ方向に行われる。
【００２７】
所与の画素数、図１では例えば３２×３２＝１０２４、を含む図１のような走査フィールドＦが与えられている。
ここで、（顕微鏡の配置によって）与えられた試料上のスポット間隔ｄをｋ（整数）個の等しい部分に分割し、ＸおよびＹ方向の走査がこの走査線で、つまり１からｋまでの段で行われると、Ｙ方向のｋ行の走査後には、Ｍ＝Ｎ×ｋ行である、Ｙ方向のポイントＰＭまでの領域の走査が完了している。Ｘ方向にもポイントＰｍ１までのＭ１ポイントを走査すると、Ｍ×ｍ１画素の走査領域が得られる。各単スポットがｍ１×Ｋ画素の領域の走査を完了してから、Ｎ個の単画像を合成することにより、Ｍ×ｍ１画素のフィールド全体が得られる。
【００２８】
ここで、図３と同じ画素数、Ｍ×ｍ１で走査されるフィールドＦ２を拡大するには、ここではＬ＜ＫおよびＬ＞＝１として、スポット間隔（整数）をＬ個の部分に分割することによってこれを行うことができる。
【００２９】
Ｌ行の走査後には、Ｎ（スポット数）×Ｌ（スポット間隔の分割）行の領域の走査が完了している。
その場合、行Ｍまであと（Ｋ−Ｌ）×Ｎ行が不足している。
【００３０】
これらの行は、行走査をＬ×（Ｎ−１）＋１行分ずらして継続することによって有利に走査される（図３）。この手順は、全Ｍ行の走査が終わるまで繰り返される。その際、最後の領域ではもはや全てのスポットが必要というわけではなくなるかもしれない。これは、検出されるポイント走査線を用いて、照射中にまたは検出側で遮断することにより修正することができる。
【００３１】
この手順の結果、やはりＭ×ｍ１画素を有する画像が得られるが、この画像は有利にはＫ／Ｌ倍大きい。
同様に、Ｐ＞Ｋとして、スポット間隔をＰ（整数）個の部分に分割することによって、同じ画素数Ｍ×ｍ１で走査されるフィールドを縮小することができる（図２）。Ｐ行の走査後には、所望のＭ行の領域より（Ｐ−Ｋ）×Ｎ行分大きい領域の走査が既に完了している。そのため、上述のように、全てのスポットの全てのデータが画像描写に使用されるわけではない。
【００３２】
この手順の結果、Ｍ×ｍ１画素を有する画像が得られるが、この画像はＰ／Ｋ倍小さい。
走査フィールド内にｎ個のレーザ・スポットが、それぞれ互いへの間隔ｄを空けて、試料平面上に低速の走査軸に沿って配置されており、試料平面上の走査される行の間隔が、Ｋ∈Ｎとして、ａ＝ｄ／Ｋである場合、有利にはＫを変化させることによって走査フィールドのサイズを変化させ、Ｋ行の走査後には、本発明によれば、走査される部分画像が互いに接続するように、少なくともＹ行の走査が完了するまで、好適には、走査方向に（ｎ−１）×Ｋ＋１行分、または走査方向とは逆方向に（ｎ＋１）×Ｋ−１行分の飛び越しにより、縦方向の飛び越しを行う。
【００３３】
本発明の解決法は、以下の例によっても説明されよう。
図１には、ここでは４つのスポットＳ１〜Ｓ４を用いて走査された、３２×３２画素の走査フィールドＦが示されている。各スポットの画素は、分かりやすくするために、それぞれ互いに異なるように塗りつぶされた円（暗い円および明るい円）として示されている。
【００３４】
横方向の走査動作の開始ポイントＰ１〜ＰＭ間の走査動作が、図４に概略的に動作線で示されている。図１では、例えば２つの隣接する画素の間隔がスポット間隔の８分の１となるように走査が行われる。そうすれば、８行の走査後には、全体の画像フィールドの走査が完了している。各スポットが８×３２画素のフィールドの走査を完了してから、フィールド全体を４つの走査線領域から合成することにより、１０２４画素の分解能を有する画像フィールドＦの撮影が行われる。
【００３５】
図１ａには、図１の左側の部分が切り取られて拡大図で示されている。
縦方向にＸ行ずらした場合の、Ｙ方向のスポットＳ１のそれぞれの開始ポイントはＰ１〜Ｐｋであり、開始ポイントの各間隔はｄ／ｋである。
【００３６】
これと類似して、スポットＳ２〜Ｓ４は、開始ポイントＰ２〜Ｐ２ｋ、Ｐ３〜Ｐ３ｋ、Ｐ４〜Ｐ４ｋを有しており、開始ポイントの各間隔がｄ／ｋである。
図３には、図１のＦに比べてより大きいフィールドＦ２を、同様に３２×３２画素で走査できる様子が示されている。画素間隔は、ここでは例えばスポット間隔の５分の１である。したがって、５行の走査後には、Ｓ１〜Ｓ４によって２０行の走査が完了している。ここで、Ｓ１〜Ｓ３について、Ｙ方向に１５画素分、行Ｓ１．１、Ｓ２．１、Ｓ３．１の開始位置への飛び越しを行わなければならない。続いて、残りの行を走査する。このために、もう一度５行を走査する必要があるが、全ての単スポットのデータがフィールドの描写に必要となるわけではない。第１および第２のスポットからは全ての行が必要であり、第３のスポットからは最初の２行が必要であり、最後のスポットのデータは全く必要ではない。単フィールドを合成することによって、再びフィールド全体が得られる。このフィールドは図１に示されたものより１．６倍大きい。
【００３７】
その際、単スポットを個別に遮断することができれば有利である。これにより、この対象領域の不要な露光を避けることが可能になる。
図２には、Ｆと比べてより小さいフィールドＦ１を、本発明により同様に３２×３２画素で走査できる様子が示されている。画素間隔はここではスポット間隔の１０分の１である。１０行の走査後には、４０行、つまり、必要な行数より既に８行多い走査が完了している。部分領域はやはり全体領域に合成されるが、第４の単スポットからは最初の２行のみが必要である。３行目以降は、第４の単スポットを遮断してもよい。得られるフィールド・サイズは、図１のフィールドより０．８倍小さい。
【００３８】
フィールド・サイズおよびスポット数に応じて、上記の方法で、有利にはフィールド・サイズ、およびそれとともに倍率の様々な細かい段階付けを実現することができる。
図５−１および図５−２の表には、５１２×５１２画素および４つの単スポットの例における、フィールド・サイズの段階付けが示されている。
【００３９】
画素間隔をスポット間隔の１／１２８として選定すると、１２８行の走査後にはフィールド全体の走査が完了している。各単スポットは、１２８×５１２画素の部分領域の走査を完了する。全ての他のフィールド・サイズがこのフィールド・サイズを参照している。つまり、このサイズは１００％である。フィールド全体の走査は、全ての４つの単スポットの走査を終えることによって行うことができる。
【００４０】
表には、いくつかの可能な行間隔について、５１２×５１２画素を有するフィールド全体を走査するために必要となる走査領域の数が示されている。３行目には、フィールド・サイズが相対的に変化する様子が示されている。
【００４１】
非常に小さいフィールドの領域では、走査が３つまたは２つの単スポットのみを用いて行われる。５１２行以上の領域では、１つの単スポット走査のみが行われる。
通常のズーム領域では、拡大段階のほぼ連続的な細分化、つまり事実上途切れの無いズームが実現される。
【００４２】
このことは、さらにＬＳＭの照射光線路において光学的ズームを変化させることによって、または照射走査線のスポット間隔を（調節可能または交換可能に）変化させることによって、順応性の向上が補われ得ることが有利である。
【００４３】
本発明の別の有利な実施形態が図７に示されている。
図７は、図３およびこれに付属する記述（Ｆ２はＦより大きい）に基づいている。ただし、ここでは線によって囲まれた（例として）２行の重複領域ＯＬが設けられており、この領域は第４のスポット（Ｓ４）だけでなく、続いて第１のスポット（Ｓ１．１）によっても走査される。この重複領域は整数の行で構成されているのが有利だが、整数の行で構成されている必要はない。
【００４４】
領域ＯＬでの不必要に高い試料負荷を避けるために、重複領域では、例えばＡＯＴＦ（Acousto-Optical Tunable Filter）のような相応しい手段によって、該当するポイントの照射強度を、適切には例えばそれぞれ５０％に低減させることにより、全体の試料負荷が一定に保たれる。
【００４５】
図示のように、ここでは走査領域Ｓ３．１が、図３とは違って４行で構成されているので、画像当たり走査される画素の総数が有利には一定であり、ここでもやはり１０２４画像ポイントである。
【００４６】
図示の重複領域ＯＬの目的は、個々のスポット（ここではＳ１〜Ｓ４）によって走査される領域の画像を完全にカバーし、全体画像を確保することである。
重複領域ＯＬでは、この目的のために、例えば関与する両方のスポットについて、撮影された試料特徴（コントラスト・エッジ等）の構造解析が行われ、画像加工および相関解析の既知の手段を用いて、個々のスポットによって撮影された画像部分の「継目の無い」全体画像への正確な合成が行われる。
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2014530381.tif 000013
2014530381.tif 000014
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