(57)【要約】  システインに特異的な放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、害虫に対する殺虫活性を保持し、飽和可能な様式で昆虫刷子縁膜小胞受容体に結合する。生物学的に活性な放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質は他のＣｒｙ毒素との競合結合アッセイにおいて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ１ＦａホロトキシンおよびＣｒｙ１Ｆａコア毒素からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質はヨウ素の放射性同位体で標識されており、前記標識されたタンパク質は、シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)およびツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)の中腸から調製される刷子縁膜小胞内の受容体に選択的に結合する能力を保持する、タンパク質。
【請求項２】
Ｃｒｙ１Ｆａホロトキシンである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
所与の昆虫種の中腸における受容体に対するＣｒｙ１Ｆａコア毒素の結合活性を決定するための飽和型結合アッセイ方法であって、
ａ）前記昆虫種の中腸から単離した既知の濃度の刷子縁膜小胞を含有する懸濁液を調製する工程と、
ｂ）別の容器において、漸増量の請求項３に記載の標識されたＣｒｙ１Ｆａを、標識されたＣｒｙ１Ｆａが刷子縁膜小胞における受容体に結合できる時間および緩衝液条件下で、一定量の刷子縁膜小胞懸濁液に添加する工程と、
ｃ）刷子縁膜小胞における受容体に結合している標識されたＣｒｙ１Ｆａから未結合の標識されたＣｒｙ１Ｆａを分離する工程と、
ｄ）刷子縁膜小胞に結合している標識されたＣｒｙ１Ｆａから放射される放射性シグナルを計数する工程と
を含む、方法。
【請求項５】
交差反応性を決定するための競合結合アッセイ方法であって、
ａ）昆虫種の中腸から単離した刷子縁膜小胞を含有する懸濁液を調製する工程と、
ｂ）請求項３に記載の標識されたＣｒｙ１Ｆａを、標識されたＣｒｙ１Ｆａおよび標識されていないタンパク質が刷子縁膜小胞における受容体に結合できる時間および緩衝液条件下で、過剰の異なる標識されていないタンパク質および刷子縁膜懸濁液と混合する工程と、
ｃ）結合している刷子縁膜小胞を、未結合の標識されたＣｒｙ１Ｆａおよび未結合の標識されていないタンパク質混合物から単離する工程と、
ｄ）結合している刷子縁膜小胞画分から放射される放射能を、未結合の混合物画分から放射される放射能と比較する工程と
を含む、方法。
【請求項６】
標識されていないタンパク質がＣｒｙタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／４２３，８４４号の利益を主張し、その開示は、全ての図面、表およびアミノ酸または核酸配列を含むその全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
本発明の一般的な分野は、生命科学、特に農業科学および試験方法の領域である。詳細には、本発明の分野は、生化学ならびにバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)結晶（Ｃｒｙ）エンドトキシンの作用機構および昆虫Ｃｒｙ毒素受容体とのそれらの相互作用である。
【背景技術】
【０００３】
Ｃｒｙ殺虫タンパク質は、異なる土壌型において広範に分布して見られるグラム陽性菌である、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)（Ｂｔ）により産生されるエンドトキシンである。種々のクラスのＣｒｙタンパク質は特定の害虫に対して選択的に毒性がある。エンドトキシンは典型的に、細菌の大きな封入体中に位置する結晶タンパク質の形態で見出される。Ｃｒｙ毒素はかなりの配列多様性を有する(Crickmoreら、1998、de Maagdら、2003)が、鱗翅目害虫に対して活性を有する大多数の毒素は、３ドメイン活性コア毒素構造を有する１３０ｋＤａのプロトキシンである(de Maagdら、上記)。
【０００４】
本発明の対象は、３ドメインＣｒｙタンパク質である、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素に関する。この毒素は、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(J. E. Smith)（フォールアーミーワーム(fall armyworm)）およびヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nubilalis)(Hubner)（ヨーロピアンコーンボーラー(European corn borer)）（それらはトウモロコシの最も経済的に重要な害虫のうちの２つである）を含む、種々の鱗翅目昆虫に対して実証されている殺虫活性を有する。Ｃｒｙ１Ｆａは、トウモロコシにおけるイベントＴＣ１５０７（ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標））および綿におけるイベント２８１−２４−２３６（ＷＩＤＥＳＴＲＩＫＥ（登録商標））として知られている、２つのＵＳＤＡにより規制撤廃されているトランスジェニック植物が組み込まれた殺虫剤の毒素成分である。
【０００５】
他の３ドメインＣｒｙ毒素のようなＣｒｙ１Ｆａ完全長ホロトキシンタンパク質は、その殺虫活性を活性化するためにＮ末端およびＣ末端の両方においてタンパク質分解的切断を必要とする。鱗翅目昆虫の中腸は、完全長ホロトキシンを約６８ｋＤａのサイズを有するコア毒素構造に処理する種々のトリプシンおよびキモトリプシン様プロテアーゼを含有する(Christellerら、1992、Gatehouseら、1997、Bernardiら、1996)。処理は、Ｎ末端から約２８アミノ酸およびＣ末端から約５３０アミノ酸（プロトキシン部分）の除去を含み、得られたコア毒素部分は放出され、昆虫の消化管内に位置する特異的受容体に結合する。
【０００６】
昆虫は、Ｃｒｙタンパク質コア毒素に結合する中腸に局在化した受容体の変化を介してＣｒｙタンパク質毒素の活性に対する耐性を発生させることができる(Heckelら、2007、Van Rieら、1990b)。さらに、プロトキシンの減少した活性化、昆虫の中腸のＣｒｙ受容体の数の変化、および昆虫の死の一因となる膜の細孔の形成による毒素に反応する能力の喪失を含む、耐性発生の他の機構が実証されている(GriffittsおよびAroian、2005、ならびにVan Rieら、1990bを参照のこと)。
【０００７】
本発明より前に、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の異なる昆虫受容体への結合を特徴付けるための研究は報告されていなかった。その理由は、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素内のチロシン残基と反応する酸化ヨウ素同位体に関する伝統的な放射性標識法は、シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)およびツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Luoら、1999)の中腸から調製された刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）内の受容体に結合するその能力を喪失した放射性標識されたコア毒素タンパク質を産生したためであった。さらに、伝統的な方法で放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質は、その殺虫活性を喪失し、これらのスポドプテラ属(Spodoptera)種に対して食餌バイオアッセイにおいて不活性化したことが見出された。蛍光標識などのタンパク質標識の他の方法、および等温熱量測定法などのリガンド−受容体結合を測定するための他の方法が試みられているが、いずれも感受性がなさすぎるか、または昆虫ＢＢＭＶの微粒子特性に起因して使用することが非常に困難である光学的方法であると見出されている。
【０００８】
Palmerら(1997)は、システイン残基において特異的なタンパク質の放射性標識の間接的な方法を記載していた。この方法において、中間体化合物であるフルオレセイン−５−マレイミドがまず、放射性ヨウ素と反応し、次いで放射性標識されたフルオレセイン−５−マレイミドが、利用可能なシステイン残基においてタンパク質を化学的に修飾するために使用される。本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素のドメイン１に位置する単一のシステイン残基（Ｃ２０５）を標的化することにより、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を放射性標識するための非常に特異的なPalmerらの方法の使用を記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
最も驚くべきことに、この立体的に扱いにくい放射性標識された５−マレイミドの、この方法によって調製されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質内への導入は、その受容体への結合の喪失を生じない、または毒素不活性化を引き起こさないことが見出された。結果として、この非伝統的な方法で放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素は、その殺虫活性および種々の昆虫由来のＢＢＭＶ調製物内の受容体に特異的に結合するその能力の両方を保持するのに十分なタンパク質の三次構造を維持した。
【００１０】
非伝統的な方法で放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、飽和可能な様式で受容体に結合することが見出され、他のＣｒｙ毒素がその結合と競合するかどうかを決定するために競合結合アッセイにおいて使用された。このアッセイを使用することにより、プエルトリコにおいて収集したツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)の集団において発生したＣｒｙ１Ｆａ毒素に対する圃場抵抗性が、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質に結合するこれらの昆虫のＢＢＭＶ内の受容体の能力の喪失に起因することが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)幼虫に対するトリプシン切断型(trypsin-truncated)のＣｒｙ１Ｆａおよびフルオレセイン−５−マレイミド標識されたトリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａのバイオアッセイである。図は、本発明の方法によって調製したヨウ素化（非放射性）Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を使用してツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)新生幼虫を用いた昆虫食餌バイオアッセイの結果をまとめている。
【図２】ヨーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ）ＢＢＭＶに対する放射性ヨウ素化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の飽和結合曲線を示す。図は、ヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nubilalis)幼虫中腸から調製したＢＢＭＶに対する本発明の方法によって調製した放射性ヨウ素化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の飽和結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列同定の簡単な説明
配列番号１はＣｒｙ１Ｆａホロトキシンをコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００１３】
配列番号２はＣｒｙ１Ｆａホロトキシンである。
【００１４】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の３つの構造ドメインは、さらなるトリプシン消化に耐性がある「トリプシンコア」内に位置する。ドメインＩは、昆虫中腸の膜内に挿入し、細孔様構造を形成すると考えられる７個のα−ヘリックスから構成される(Ballesterら、1999)。ドメインＩＩは３個の逆平行β−シートからなり、ドメインＩＩＩはβ−サンドイッチ構造を形成する(PigottおよびEllar、2007)。ドメインＩＩおよびＩＩＩの露出領域は、昆虫中腸の管腔表面上に位置する特異的受容体と相互作用し、これらの受容体に強く結合すると考えられる(Bravoら、2007、de Maagdら、1996、de Maagdら、1999、Gomezら、2006、Herreroら、2004、Leeら、1999)。受容体に対する毒素の結合は、殺虫活性のための必要条件であり、毒素の特異性および選択性を提供する(PigottおよびEllar、2007、Rausellら、2004)。異なる昆虫種に対する異なるＣｒｙタンパク質の活性の特異性は、異なる昆虫に見出される受容体の相違に部分的に関連することが示されている(Gomezら、2003、Gomezら、2007、Van Rieら、1990a)。
【００１５】
定量的生化学アッセイは、Ｃｒｙ毒素と、昆虫中腸に見出される受容体タンパク質との相互作用を測定するための手段を提供する。飽和型の結合アッセイにおいて、標識されたＣｒｙ毒素タンパク質（リガンド）を、昆虫受容体タンパク質に対するＣｒｙ毒素タンパク質の結合を促進する緩衝液中でインキュベートする。飽和結合アッセイの一実施形態において、一定量の昆虫受容体タンパク質（一般に、昆虫中腸から調製した刷子縁膜小胞）を、ヨウ素化Ｃｒｙ毒素タンパク質の量を増加させながら、（別の管中で）混合し、一定の時間の間、反応させる。未結合のＣｒｙタンパク質（すなわち、昆虫受容体タンパク質に結合していない）を種々の方法のうちの１つによって結合しているタンパク質から分離し、結合しているタンパク質画分の放射能の量は、昆虫受容体に結合しているＣｒｙタンパク質の量の指標を与える。生化学の分野の当業者は、ほとんどまたは全く結合していない放射能の観測が、受容体調製が行われた昆虫種において研究されている特定のＣｒｙ毒素の受容体が欠如していることを示すことを理解するだろう。
【００１６】
結合アッセイの第２の実施形態は競合アッセイである。競合結合アッセイにおいて、放射性Ｃｒｙ毒素タンパク質を過剰の第２の非放射性Ｃｒｙタンパク質と混合し、Ｃｒｙタンパク質を、標準的な条件下で昆虫受容体タンパク質に結合させる。第２の非放射性Ｃｒｙ毒素タンパク質が昆虫受容体に対する結合について放射性Ｃｒｙ毒素タンパク質と競合できる場合、放射性タンパク質は受容体結合部位で置き換えられ、結合状態において放射能はほとんど回収されない。非放射性および放射性Ｃｒｙ毒素タンパク質が異なる昆虫受容体タンパク質に結合する場合、それらは同じ昆虫受容体タンパク質に結合する際に互いに競合しない。この例において、結合しているタンパク質画分中で回収される放射能の量は、非放射性の第２のＣｒｙ毒素タンパク質が結合反応に存在しない場合と同じ、またはほぼ同じである。種々の方法が、結合しているタンパク質画分中の放射能の量を定量化するのに利用可能である。
【００１７】
１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質および非放射性Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質（対照反応）またはＣｒｙ１Ａｂコア毒素タンパク質のいずれかを使用する競合結合アッセイにより、非放射性コアＣｒｙ毒素タンパク質の両方が、ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)由来のＢＢＭＶ内のその受容体部位で、標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素を置き換えることができることが実証された。対照的に、競合結合アッセイにより、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質がＣｒｙ１Ｆａコア毒素結合と競合しないことが実証された。これらの結合アッセイの結果により、プエルトリコで収集したツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)の集団の現地調査において観測されたＣｒｙ１Ｆａ毒素に対する昆虫耐性は、これらの昆虫由来の刷子縁膜小胞内の受容体がＣｒｙ１Ｆａコア毒素に結合できないことにより説明できることが実証される。
【００１８】
本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度でその全体が参照により組み込まれる。
【００１９】
核酸配列は標準的な５’から３’方向に提示され、タンパク質配列は標準的なアミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端方向に提示される。
【００２０】
具体的に示されるか、または示唆されない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、本明細書で使用する場合、「少なくとも１つの」を表す。
【００２１】
以下は本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。全ての割合は重量であり、全ての溶媒混合物の比率は、他に記さない限り、体積である。全ての温度はセ氏温度である。
【実施例１】
【００２２】
Ｃｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質をコードする発現プラスミドの構築および細菌宿主における発現
標準的なクローニング方法（例えば、Sambrookら、(1989)およびAusubelら、(1997)、ならびにそれらの更新情報により提供されている）を、植物に最適化されたコード配列（ＣＤＳ、配列番号１）によりコードされている、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素部分（アミノ酸１〜６０３）およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシン部分（アミノ酸６０４〜１１４８）から構成されるキメラ毒素タンパク質（本明細書においてＣｒｙ１Ｆａ毒素（配列番号２）と称する）を産生するように操作したシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)（Ｐｆ）発現プラスミドである、ｐＤＡＢ１８１７の構築に使用した。
【００２３】
ｐＤＡＢ１８１７はｐＭＹＣ１８０３（米国特許第７３３８７９４号）由来である。基本的なクローニング戦略は、ＳｐｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識部位に隣接し、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素ＣＤＳを含有しているＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素を用いてｐＭＹＣ１８０３ＤＮＡを切断することにより調製した大きな断片のｐＭＹＣ１８０３にライゲーションすることを必要とした。プラスミドｐＭＹＣ１８０３は、ＲＳＦ１０１０ベースのプラスミドｐＴＪＳ２６０（米国特許第５１６９７６０号を参照のこと）由来の中間コピープラスミドであり、調節されたテトラサイクリン耐性マーカーならびにＲＳＦ１０１０プラスミド由来の複製および動員遺伝子座を保有する。このようにして、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素ＣＤＳを、プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）由来のＰｔａｃプロモーターおよびｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下に置いた。発現プラスミドｐＤＡＢ１８１７で、テトラサイクリンに対する耐性についての選択を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．フルオレッセンス(P. fluorescens)株ＭＢ２１７（株ＭＢ１０１の誘導体、Ｐ．フルオレッセンス(P. fluorescens)次亜種Ｉ）を形質転換した。ミニプレッププラスミドＤＮＡの制限酵素消化により組換えコロニーを識別した。
【００２４】
発酵装置内での増殖および発現分析：生化学操作および昆虫バイオアッセイのためのＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質の産生を、発酵槽で増殖させたＰ．フルオレッセンス(P. fluorescens)発現単離株ＤＲ１６４９により達成した。種培養を、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを追加した６００ｍＬのＰｓ２０培地を含有する振盪フラスコ中で３２°にて２０時間増殖させ（最終光学密度６００ｎｍ＝１４にて）、２０Ｌの発酵槽タンク（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢｉｏＦｌｏ４５００、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）中でテトラサイクリンを含む６．６ＬのＤＧＭｐ２．２培地を接種するために使用した。発酵は２００〜１０００ｒｐｍにて攪拌しながら３２°で実施した。Ｐ．フルオレッセンス(P. fluorescens)についての微生物操作の詳細は、本明細書に参照により組み込まれる、Squiresら(2004)、米国特許出願公開第２００６０００８８７７号、米国特許第７６８１７９９号、米国特許出願公開第２００８００５８２６２号、およびHuangら(2007)で得られる。グリセロールを溶存酸素濃度に応じて１０ｇｍ／Ｌにて定期的にバッチ供給した。ＰｔａｃプロモーターによるＣｒｙ１Ｆａ毒素ＣＤＳの発現は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。細胞密度、標的遺伝子発現のレベル、および他のパラメータを決定するために誘導後の発酵時間の全体にわたって培養を監視した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）およびイムノブロット解析のために、全発酵ブロスの０．１ｍＬのアリコートをその後の分析のために凍結した。ＩＰＴＧ誘導から４８時間後の最後の時点（光学密度６００ｎｍ＝２２２にて、最終培養体積＝１３．５Ｌ）で、４Ｌの培養物から細胞を、９０分間、１００００×ｇでの遠心分離により収集した。細胞ペレットをさらなる処理のために−２０°または−８０°にて凍結した。
【００２５】
発酵試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：凍結した発酵槽の細胞ブロス（０．１ｍＬ）を冷水で５倍に希釈し、２０単位の一定出力で１／８インチ直径のマイクロチップを使用したＢｒａｎｓｏｎ  ２５０  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ  ＣＴ）を使用して、２００μＬを氷中で１０分間、超音波処理した。溶解物を２０分間（４°）、１４０００ｒｐｍにて遠心分離し、上清を除去した（可溶性画分）。次いでペレットを２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１１．９ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁した。元の発酵ブロスの２０倍までの等価物の可溶性および不溶性画分の両方のさらなる希釈をＰＢＳ中で実施した。次いでこれらの画分を、５％のβ−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）と１：１で混合し、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）を含む基準の１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に１０μＬ〜２０μＬを負荷する前に５分間沸騰した。製造業者のプロトコールに従ってＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてゲルを染色した。
【００２６】
免疫ブロット法：標準的な生化学的方法（例えば、Sambrookら、(1989)およびAusubelら、(1997)、ならびにそれらの更新情報により提供されている）をタンパク質単離およびイムノブロット解析のために使用した。試料を調製し、電気泳動を変性させるために製造業者の提案したプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＭＥＳランニング緩衝液中でＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いた電気泳動によりタンパク質を分離した。タンパク質をＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液中で８０分間、３０Ｖにてニトロセルロース膜上に移した。ブロットを５％ミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中で室温にて１時間ブロッキングし、次いで一次抗体（Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素部分に対して特異的）を用いて調べ、次いで各抗体の間でＰＢＳＴ中で１５分間すすぎ、ブロッキング溶液中で室温にて各々１時間、二次抗体を用いて調べた。製造業者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従ってＰｉｅｒｃｅのＥＣＬウェスタンブロッティング基質を使用してブロットの展開を行った。
【実施例２】
【００２７】
シュードモナス属(Pseudomonas)により産生された封入体からのＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の精製
封入体調製：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry)）により実証されるように不溶性Ｃｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質を含有するＰ．フルオレッセンス(P. fluorescens)ＤＲ１６４９細胞からタンパク質封入体（ＩＢ）を調製した。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）製のＭＡＬＤＩ−Ｒ（リフレクトロン）質量分析計を、製造業者の指示した方法および推奨に従ってペプチド質量を測定するために使用した。凍結した細胞ペレットを室温の水浴中で解凍した。細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール−使用直前に加えた））中で１０％ｗ／ｖに再懸濁した。２５ｍＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、全ての１００ｇｍの処理した細胞ペーストに対して加えた。１２０００＋ｐｓｉにてＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）にスラリーを２回通過させた。溶解物を１８０００×ｇにて４°で３０分間遠心分離し、上清を保持した。スパチュラまたは機械的ミキサーを使用して（約１０％ｗ／ｖの固体に）穏やかに均質化することによって、細菌の臭いが残らなくなるまで（通常２または３回の洗浄）、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含まない溶解緩衝液中で封入ペレットを洗浄し、記載したように遠心分離した。得られた上清および最終ペレットを保持し、−２０°で保存した。各試料の少しのアリコートを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために微小遠心管中に保存した。次いで封入体調製ペレットを、２日間、周囲棚温度および最大真空吸引にてＶｉｒｔｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機（Ｖｉｏｐｈａｒｍａ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＴＤ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を使用して凍結乾燥した。次いで得られた粉末を分析するまで−２０°で保存した。
【００２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＩＢ調製物の定量：２５ｍｇのＩＢペレットを、１ｍＬのＨＴＳ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＬ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％ｖ／ｖのグリセロール、１０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩、０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に再懸濁し、氷上で１分間、上記のように超音波処理した。次いで再懸濁した試料を、０．２ＭのＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で１：１で希釈した。次いで試料を、ＤＴＴを含まないＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で１０倍および２０倍に希釈し、１×ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を流した基準１８ウェル１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）上に１０μＬを負荷した。１００Ｖにて５分間、次いで２００Ｖにて４５分間、ゲルを流した。ゲルをすすぎ、２０分間、水中で洗浄し、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（商標）で染色した。同じゲルに流した一連のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準試料に対するバンドについての濃度測定値を比較することによって標的バンドの定量を行い、濃度測定標準曲線を生成するために走査した。
【００２９】
Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の切断および精製：精製した封入体を滅菌水で洗浄し、次いで室温にて１時間、タンパク質溶液を振盪することによって、１０ｍＭのＤＴＴを含有する２０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１１（３−（シクロヘキサアミノ）１−プロパンスルホン酸）中で可溶化した。遠心分離（４°にて３０分間、３００００×ｇ）により不溶性物質を除去した後、０．５％（ｗ／ｖ）トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理したトリプシンを上清に添加した。この溶液を、室温にて１時間、混合しながらインキュベートし、濾過し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５で再生したセルロース遠心フィルター装置（３００００  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔｏｆｆ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５倍に濃縮し、次いで２０ｍＭのＣＡＰＳ  ｐＨ１０．５で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ  Ｑ１０１０カラム上に負荷した。２カラム体積の緩衝液で負荷したカラムを洗浄した後、１．０ｍＬ／分の流速にて１５カラム体積の２０ｍＭのＣＡＰＳ  ｐＨ１０．５中の０〜０．５ＭのＮａＣｌの線形勾配を使用して切断毒素タンパク質を溶出した。精製したトリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素を約０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌで溶出した。クマシーブリリアントブルー染色（以下）を使用して可視化してＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を調べた。一部の場合、精製した毒素の合わせた画分を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム（１．６ｃｍ直径、６０ｃｍ長、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に負荷し、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。切断コア毒素（約６８ｋＤａ）の単量体サイズに対応する単一ピークを含む画分を合わせ、濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断して約６８ｋＤａの分子量を有するタンパク質について９５％超均質な調製物を得た。
【００３０】
精製したＣｒｙ１Ｆａコア毒素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：トリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法(Sambrookらによる、上記)により還元および変性条件下で行った。５％のβ−メルカプトエタノールを使用してタンパク質の還元を達成し、２％ＳＤＳの存在下で９０°にて５分間、熱変性を実施した。タンパク質を４％〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに負荷し、２００ボルトで６０分間、分離した。クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１時間、タンパク質バンドを染色し、次いでセルローススポンジの存在下で７％酢酸中の５％メタノールの溶液で脱染した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（商標）画像化ソフトウェアを備えたＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｒｏ−Ｓ  Ｍｕｌｔｉ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）を使用してゲルを画像化し、分析した。タンパク質バンドの相対分子量を、ゲルの１つのウェル中のＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）またはＳｅｅ  Ｂｌｕｅ（商標）で予め染色した分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の試料を含むことによって決定した。
【実施例３】
【００３１】
特異的に放射性ヨウ素化したＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の調製
Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質のヨウ素化：以前の研究により、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質のヨウ素化が、昆虫刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）内のその受容体（複数可）に結合するヨウ素化タンパク質の能力、同様にタンパク質の昆虫毒性を破壊することが実証されている(Luoら、1999)。その研究において、標準的なヨウ素化ビーズ法（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質を放射性ヨウ素化し、結合研究により、タンパク質が、シロイチモジヨトウ(S. exigua)およびツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)由来のＢＢＭＶ内の受容体（複数可）に特異的に結合するその能力の全てを喪失することが明らかにされた。さらに、放射性標識されていないＮａＩを、ヨウ素化ビーズ法を利用してＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質をヨウ素化するために使用した場合、ヨウ素化したＣｒｙ１Ｆａが食餌バイオアッセイにおいてスポドプテラ属(Spodoptera)幼虫に対してその殺虫活性を喪失することが見出された。
【００３２】
ヨウ素化ビーズプロトコールによるタンパク質のヨウ素化は、オルト位においてチロシン上のヒドロキシル基に対して行われ、モノ−またはジ−置換が起こり得る。したがって、ヨウ素化の位置は対象のタンパク質内のチロシン残基の配置に依存し、複数のヨウ素化はタンパク質の構造および／または機能の崩壊の結果を招き得る。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素部分は、ヨウ素化標的として機能し得る２０個のチロシン残基を含むことに留意されたい。
【００３３】
この実施例は、放射性ヨウ素を用いてＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を標識するための代替の方法を教示している。後の実施例は、放射性標識されたコア毒素タンパク質が、昆虫ＢＢＭＶに結合すること、およびヨウ素化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、昆虫食餌バイオアッセイにおいて活性であることを教示している。さらに、これらの実施例は、トリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、フルオレセイン−５−マレイミドを使用してＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質のＣ２０５残基に対応するシステインにおいて特異的に蛍光標識され得ること、および蛍光標識されたタンパク質が生物学的に活性であり、標識されていない、トリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素のものと等しい用量で昆虫死を引き起こすことを教示している。
【００３４】
Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素部分は、９、１４、および２０５位において３つのシステインアミノ酸残基を含有する。トリプシン処理によるタンパク質の切断はＣ９およびＣ１４を除去し、Ｃ２０５残基に対応するシステインを保持するコア毒素部分を与える。Palmerら(1997)は、フルオレセイン−５−マレイミドのフェニル環が放射性ヨウ素化でき、次いでスルフヒドリル基（例えば遊離システイン残基により与えられる）を含有するタンパク質と反応でき、その結果、タンパク質内の遊離システインのアルキル化を生じ、それにより、放射性標識されたタンパク質を与えることを実証した。トリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素はＣ２０５に対応する位置に単一のシステイン残基を含有し、それにより、単一（特異的）部位においてタンパク質のアルキル化および放射性標識のための基質を与える。
【００３５】
Ｆ５−Ｍのモル吸光係数（６８，０００Ｍ−１ｃｍ−１）により決定した、フルオレセイン−５−マレイミド（Ｆ５−Ｍ）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に１０ｍＭで溶解し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で１ｍＭに希釈した。２個のＰｉｅｒｃｅヨウ素化ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＰＢＳの７０μＬ溶液に、０．５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉを鉛遮蔽体の後ろに加えた。（（ヨウ素化され、非放射性の）蛍光標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を調製するために非放射性ＮａＩを使用して同様の手順を実施した。）その溶液を室温にて５分間混合し、次いで１０μＬの１ｍＭのＦ５−Ｍ溶液を加えた。１０分間反応させた後、その溶液をピペット操作によりヨウ素化から除去し、ＰＢＳ中の２μｇの高度に精製されたトリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質をその溶液に加えた。１４ｍＭの最終濃度までβ−メルカプトエタノールを加えることにより反応が終了した場合、タンパク質をヨウ素化Ｆ５−Ｍ溶液と共に４°で４８時間インキュベートした。２０ｍＭのＣＡＰＳ、１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ９中で平衡化したＺｅｂｒａ（商標）スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に反応混合物を加え、タンパク質から未反応のヨウ素化染料を分離するために１５００×ｇで２分間遠心分離した。１２５Ｉ放射性標識したフルオレセイン−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、その特異的放射能を決定するためにガンマカウンタで計数し、入力毒素タンパク質の８０％回収と想定した。
【００３６】
放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の比放射能は約１．１μＣｉ／μｇタンパク質であった。この比放射能は、ヨウ素化ビーズ手順を使用して同様にサイズ合わせされたタンパク質を標識する典型的な予想されるレベルと比較して低かった。これはおそらく、標識している単一部位（Ｃ２０５に対応する）、および（Ｃｒｙ１Ａａタンパク質の比較結晶構造を使用した局在化に基づいて）コア毒素部分のドメインＩ内に深く位置すると推定される、（起こり得る）その部位の相対的な接近不可能性に起因する。
【００３７】
放射性標識されたタンパク質をまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付け、測定した放射能がＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と共有結合していることを検証するために蛍光体イメージング(phosphor-imaging)により可視化した。放射性ヨウ素化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の放射性純度（およびそのＢＢＭＶ受容体に結合したＣｒｙ１Ｆａのその後の検出）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蛍光体イメージングおよびガンマ計数により決定した。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、それらをＭｙｌａｒ（商標）フィルム（１２μｍ厚）中で覆い、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）保存蛍光体スクリーン（３５ｃｍ×４３ｃｍ）下に１時間、それらを曝露することにより画像化した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８２０蛍光体イメージャ(phosphor-imager)を使用してプレートを現像し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを使用して画像を分析した。バンドの真上および真下の領域と共に放射性バンドを、かみそりの刃を使用してゲルから切断し、ガンマカウンタで計数した。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質バンド内およびバンドの下の領域内で放射能を検出した。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質バンドの上のゲル領域において放射能は検出されなかった。一部の放射能は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質バンド（すなわち、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質より小さい断片）の下のゲル領域内で検出可能であった。これらの放射能汚染はＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の分解産物を表している可能性がある。
【００３８】
このように調製した蛍光標識された（非放射性の、ヨウ素化された）Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、昆虫毒性に影響を与えないかを実証するために昆虫食餌供給バイオアッセイにおいて使用し、放射性ヨウ素化された（蛍光標識された）Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、受容体結合活性に影響を与えないかを実証するためにＢＢＭＶ調製物を用いた結合研究において使用した。
【実施例４】
【００３９】
昆虫食餌供給バイオアッセイ
非放射性ヨウ素フルオレセイン−５−マレイミドで標識した、または標識していないいずれかのトリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)（フォールアーミーワーム、ＦＡＷ）の幼虫に対する最大負荷の食餌バイオアッセイにおいてそれらの殺虫活性について個々に試験した。ＦＡＷの幼虫は、商業的な昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）によって維持されたコロニーから得た卵から孵化した。
【００４０】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイのために特別に設計した１２８ウェルプラスチックトレイ（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）で行った。各ウェルは０．５ｍＬの複数種の鱗翅目の食餌（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ、ＡＲ）を含有した。１０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１０．５中で種々の濃度に希釈した精製したＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の４０μＬのアリコート、または４０μＬの対照溶液を、各ウェルの食餌表面（２６．７μＬ／ｃｍ２）上にピペットにより送達した。１つの試料につき１６個のウェルを試験した。陰性対照はタンパク質を含有しないＣＡＰＳ緩衝溶液ブランクであった。陽性対照は完全長のＣｒｙ１Ｆａ毒素の調製物を含んだ。食餌表面上の液体が蒸発または食餌内に吸収されるまで、処理したトレイはドラフト中に保持した。Ｃｒｙ１Ｆ毒素タンパク質の食餌濃度を、ウェル（１．５ｃｍ２）中の表面積の１平方センチメートル当たりのＣｒｙ１Ｆ毒素タンパク質の量（ｎｇ）として算出した。
【００４１】
孵化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダの毛のブラシを用いて取り、１つのウェルごとに処理した食餌上に１匹の幼虫を置いた。次いで寄生されたウェルを、ガス交換を可能にする通気する透明プラスチックの接着シート（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）で密閉した。バイオアッセイトレイを、制御された環境条件（２８°、約４０％相対湿度、１６：８（明：暗））の下に５日間保持し、その時間の後、各タンパク質試料に曝露した昆虫の全数、死んだ昆虫の数、および生存している昆虫の体重を記録した。各処理についての死亡率および増殖阻害率を算出した。増殖阻害（ＧＩ）は以下のように算出した：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
式中、ＴＷＩＴは処理における昆虫の全重量であり、
ＴＮＩＴは処理における昆虫の全数であり、
ＴＷＩＢＣはバックグランドチェック（緩衝液対照）における昆虫の全重量であり、
ＴＮＩＢＣはバックグランドチェック（緩衝液対照）における昆虫の全数である。
ＧＩ５０は、ＧＩ値が５０％である、すなわちＣｒｙ１Ｆａを含有する食餌での昆虫の増殖が、上記で算出した場合、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を有さない食餌での昆虫のものの半分のみである、食餌中のＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質の濃度であると決定した。ＬＣ５０（５０％致死濃度、試験昆虫の５０％が死滅した食餌中のＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質の濃度として算出する）は、５日の実験の期間の間に死がほとんど観測されなかったので、決定しなかった。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して統計的解析（一元配置分散分析(One-way ANOVA)）を行う。
【００４２】
標識された、および標識されていないＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質は、ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)の幼虫の増殖阻害においてほぼ同様の活性であり、３３ｎｇ／ｃｍ２から１００ｎｇ／ｃｍ２の間の濃度にて５０％の増殖阻害を引き起こす（図１）。この結果は、ヨウ素化フルオレセイン−５−マレイミドでのトリプシン切断型のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の標識が殺虫活性の喪失を生じないことを示す。
【実施例５】
【００４３】
刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）の調製
可溶化ＢＢＭＶの調製：ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)およびヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nubilalis)（ヨーロピアンコーンボーラー）の終齢幼虫を、一晩食餌を与えずに保持し、次いで１５分間、氷上で冷却した後に解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に付着している後腸は残しておいた。供給者により推奨されるように希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ−２７１４）を追加した、９倍の体積の氷冷均質化緩衝液（１７ｍＭのＴｒｉｓ塩基、ｐＨ７．５、３００ｍＭのマンニトール、および５ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸））中に中腸を入れた。カクテル成分の最終濃度（μＭ）はＡＥＢＳＦ（５００）、ＥＤＴＡ（２５０）、ベスタチン（３２）、Ｅ−６４（０．３５）、ロイペプチン（０．２５）、およびアプロチニン（０．０７５）であった。１５ストロークのガラス繊維ホモジナイザーを用いて組織を均質化した。Wolfersberger(1993)のＭｇＣｌ２沈殿法によりＢＢＭＶを調製した。簡潔に述べると、等量の２４ｍＭのＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間攪拌し、氷上に２０分間静置した。その溶液を２５００×ｇ、４°にて１５分間、遠心分離した。上清を保存し、ペレットを０．５倍体積の均質化緩衝液内に懸濁し、再び遠心分離した。２つの上清を合わせ、ＢＢＭＶ画分を形成するために２７０００×ｇ、４°にて３０分間、遠心分離した。ペレットを、約３ｍｇ／ｍＬタンパク質の濃度でＢＢＭＶ保存緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、１３０ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール）中に懸濁した。基準物としてＢＳＡを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ法(Bradford、1976)を使用することによってタンパク質濃度を決定した。アミノペプチダーゼＮ決定のためのロイシン−ｐ−ニトロアニリドアッセイを、製造業者の指示書に従ってＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈアッセイキットを使用して試料を凍結する前に行った。ＢＢＭＶ画分中のこのマーカー酵素の比放射能は典型的に、中腸のホモジネート画分に見出されたものと比較して７倍増加した。ＢＢＭＶ調製物を２５０μＬの試料中に分配し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０°で保存した。
【実施例６】
【００４４】
ＢＢＭＶに対するヨウ素化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質結合アッセイ
ＢＢＭＶに対する１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の結合：競合結合アッセイに使用する最適量のＢＢＭＶタンパク質を決定するために、飽和曲線を生成した。１２５Ｉで放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質（０．５ｎＭ）を、結合緩衝液（８ｍＭのＮａＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に０〜５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でヨーロッパアワノメイガ(O. nubilalis)（ＥＣＢ）ＢＢＭＶタンパク質と共に２８°で１時間インキュベートした。全体積は０．５ｍＬであった。結合した１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、３連で１５０μＬの反応混合物をサンプリングし、室温にて８分間、１４０００×ｇで試料を遠心分離することにより未結合の物質から分離した。上清を穏やかに除去し、ペレットを氷冷結合緩衝液で３回洗浄した。ペレットを含有する遠心管の底を切断し、１３×７５−ｍｍガラス培養管内に入れた。各試料をガンマカウンタで１０分間計数した。カウント毎分（ＣＰＭ）−バックグランド（タンパク質を加えていない反応）の値をＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。各結合反応に使用するためのＢＢＭＶタンパク質の最適範囲は１００μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬであると決定した。
【００４５】
結合反応速度：結合反応速度を決定するために、飽和曲線を生成した。簡潔に述べると、１５０μｇ／ｍＬのＥＣＢ  ＢＢＭＶタンパク質を、漸増濃度（０．５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲）の１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と共に２８°で１時間、インキュベートした。３連で１５０μＬの各濃度をサンプリングし、続いて遠心分離し、上記のように計数することによって全ての結合を決定した。３連の値を平均化した。非特異的結合を、１，０００ｎＭの非放射性（競合相手）Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を添加して、同じように決定した。この濃度は、使用した放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の最も高い濃度より少なくとも５０倍高かったので、それは、放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を置き換えながら、全ての利用可能な受容体部位に結合すると予想される。全結合と非特異的結合との間のＣＰＭ（マイナスバックグランド）の差として特異的結合を算出した。１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、ＥＣＢ  ＢＢＭＶタンパク質の１１ｎＭのＫｄおよび３７ｆｍｏｌｅ／ｍｇのＢｍａｘで飽和可能な様式でＥＣＢ  ＢＢＭＶタンパク質に特異的に結合することを決定した（図２）。非特異的結合のレベルは全結合のほぼ７０％であったが、特異的結合のレベルは明らかに飽和し、相互作用が受容体媒介性結合反応であることを示す。
【実施例７】
【００４６】
ＢＢＭＶとの競合結合アッセイ
放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と他の（標識されていない）Ｃｒｙ毒素タンパク質との間の受容体部位への結合に対する競合の量を決定するために「プルダウン」型の受容体アッセイを使用した。このアッセイにおいて、受容体に対する結合リガンドの相対分子サイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離により特徴付け、ＢＢＭＶ受容体に結合した放射性標識されたリガンドの量を、蛍光体イメージングによるゲル内の放射能の検出により測定した。１００μｇ／ｍＬまたは１５０μｇ／ｍＬのＢＢＭＶタンパク質（種々の昆虫源由来）および０．５ｎＭまたは２．５ｎＭの１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を使用して相同および異種競合結合アッセイを行った。競合リガンド（すなわち１０００ｎＭの放射性標識されていないＣｒｙ毒素タンパク質）を、正確な競合結合相互作用を保証するために放射性リガンドと同時に反応混合物に加えた。インキュベーションを２８°にて１時間実施し、そのＢＢＭＶ受容体（複数可）に結合した１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、上記の反応混合物を遠心分離することにより未結合タンパク質から分離した。ペレットを氷冷結合緩衝液で３回洗浄し、次いで５％のβ−メルカプトエタノールを含む２５μＬの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を加えることにより可溶化し、９５°にて１０分間、試料を急速に混合した。その試料を遠心分離し、２連の試料を４％〜２０％のＴｒｉｓグリシンポリアクリルアミドゲル上に負荷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。受容体に結合した１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の量を、ゲルの蛍光体イメージングおよびプレートの３日間曝露後の放射性Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質に対応するバンドの濃度測定により測定した。
【００４７】
対照反応において、０．５ｎＭの１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)（ＦＡＷ）ＢＢＭＶタンパク質と共に１時間インキュベートし、ＢＢＭＶに結合した１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび上記の蛍光体イメージングにより測定した。１０００ｎＭの標識されていないＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を加えた同時実験により、この標識されていないＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の２０００倍の過剰な濃度の添加が、放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質の結合を完全に除去したことが実証された。これらの結果により、このアッセイが、そのＦＡＷ  ＢＢＭＶ受容体（複数可）に対してＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の結合を置き換えるＣｒｙ毒素タンパク質の能力を効果的に測定することが実証された。同様に、１０００ｎＭのＣｒｙ１Ａｂコア毒素タンパク質が、ＦＡＷ  ＢＢＭＶタンパク質に対する１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の結合を完全に除外したことが決定された。この結果は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素タンパク質およびＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質が、類似の受容体結合部位を共有することを示している他の報告(Banksら、2001、HernandezおよびFerre、2005)と一致する。
【００４８】
さらに、１０００ｎＭのＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質と０．５ｎＭの１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質との間のＦＡＷ  ＢＢＭＶ受容体への結合に対する競合が存在しないことが見出され、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆａ受容体（複数可）と異なる受容体に結合することが示される。この結果は、ジアトラエア・サッカラリス(Diatraea saccharalis)（サトウキビ害虫(sugarcane borer)）ＢＢＭＶを用いて行った他の研究と一致し、その研究において、過剰なＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、その受容体（複数可）でビオチン化Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質を置き換えないことが見出された。
【実施例８】
【００４９】
Ｃｒｙ１Ｆａ毒素に耐性があるＦＡＷ昆虫から調製したＢＢＭＶに対するＣｒｙ１Ｆａコア毒素の結合
摂取したＣｒｙ１Ｆａ毒素による中毒に耐性がある昆虫の幼虫から調製したＢＢＭＶを使用してプルダウン競合結合アッセイを実施した。ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)（ｒＦＡＷ））のＣｒｙ１Ｆａ−耐性幼虫を、所有者のコロニー（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から採取した卵から孵化した。ｒＦＡＷ幼虫は、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素の毒性に対して３０倍より多くの耐性がある。ＢＢＭＶは、それらのＣｒｙ１Ｆａ−感受性相対物からと同じようにｒＦＡＷ幼虫から調製した。
【００５０】
上に示したように、野生型（すなわちＣｒｙ１Ｆａ−感受性）ＦＡＷ幼虫由来のＢＢＭＶは１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａに結合し、その結合は、２０００倍の標識されていないＣｒｙ１Ｆａタンパク質の添加により置き換えることができた。対照的に、ｒＦＡＷ幼虫から調製し、２．５ｎＭの１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａを用いて１００μｇ／ｍＬにてプルダウン結合アッセイに使用したＢＢＭＶは、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質のいずれにも結合しなかった。これらの結果により、ｒＦＡＷにおけるＣｒｙ１Ｆａ毒素に対する耐性が、ＢＢＭＶ内のＣｒｙ１Ｆａ受容体（複数可）がＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質に結合できないことに起因し得ることが示される。あるいは、耐性は昆虫由来の受容体が存在しない結果であり得る。いずれの場合でも、これらのｒＦＡＷ幼虫内のＣｒｙ１Ｆａ毒素に対する耐性の機構は受容体に基づいているようである。
【実施例９】
【００５１】
Ｃｒｙ１Ｆａ毒素に耐性があるＥＣＢ昆虫から調製したＢＢＭＶに対するＣｒｙ１Ｆａコア毒素の結合
摂取したＣｒｙ１Ｆａ毒素による中毒に対して耐性がある昆虫の幼虫から調製したＢＢＭＶを使用してプルダウン競合結合アッセイを実施した。ヨーロッパアワノメイガ(O. nubilalis)（ｒＥＣＢ）のＣｒｙ１Ｆａ−耐性幼虫を、所有者のコロニー（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から採取した卵から孵化した。ｒＥＣＢ幼虫はＣｒｙ１Ｆａ毒素の毒性に対して３０倍より多くの耐性がある。ＢＢＭＶは、それらのＣｒｙ１Ｆａ−感受性相対物からと同じようにｒＥＣＢ幼虫から調製した。
【００５２】
野生型ＥＣＢ幼虫（すなわちＣｒｙ１Ｆａ−感受性）およびＣｒｙ１Ｆａ−耐性（ｒＥＣＢ）幼虫から調製した１００μｇ／ｍＬのＢＢＭＶを使用し、および２．５ｎＭの１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を使用してプルダウン実験を行った。放射性ヨウ素化タンパク質はＥＣＢ幼虫由来のＢＢＭＶに結合したが、ＦＡＷ幼虫由来のＢＢＭＶに対する結合について見られたものよりも少ない程度であった。放射性標識されていない（競合相手）Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、ＥＣＢ  ＢＢＭＶに対する１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａの結合と競合したが、その競合はＦＡＷ  ＢＢＭＶを使用した競合実験において測定したものより少なかった。
【００５３】
ｒＥＣＢ  ＢＢＭＶに対する１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａの一部の結合を検出し、結合の量は、ＥＣＢ  ＢＢＭＶを使用して測定したものより低かった。放射性標識されていない（競合相手）Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、ｒＥＣＢ  ＢＢＭＶへの結合に対して１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と完全に競合しなかった。これらのデータにより、ＥＣＢおよびｒＥＣＢ由来のＢＢＭＶを使用して表面プラズモン共鳴により行われた以前のＣｒｙ１Ｆａ結合研究が支持される。それらの研究により、ヨウ素化されていないＣｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質が、ＥＣＢまたはｒＥＣＢ幼虫のいずれかから調製したＢＢＭＶ画分に結合できたが、ＥＣＢ  ＢＢＭＶからの毒素の解離は、ｒＥＣＢ  ＢＢＭＶからのその解離より緩やかであったことが示された。本明細書に記載したプルダウン型アッセイにおいて検出した１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質結合は、結合親和性を測定するのに十分な量ではないが、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素タンパク質はかなりの程度、ｒＥＣＢ  ＢＢＭＶに結合することが示される。したがって、ｒＥＣＢにおけるＣｒｙ１Ｆａ毒素に対する耐性は、影響を受けやすい幼虫の受容体に対する結合と比較して、ｒＥＣＢ  ＢＢＭＶ受容体（複数可）に対するＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の効率の悪い結合に起因し得る。これは、毒素が受容体に残っている時間が、影響を受けやすい昆虫よりも短いので、膜の細孔形成に関する低い有効性として現れ得る。
【００５４】
表１は、種々の昆虫源由来のＢＢＭＶ調製物と共に放射性ヨウ素化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を使用したアッセイの相対結合結果をまとめている。パーセンテージは、非放射性競合リガンドを有する、および有さない、ＢＢＭＶに対する放射性結合の相対量を示す。１００％の値は等しい数を表さず、ＥＣＢ  ＢＢＭＶは、ＦＡＷ  ＢＢＭＶより少ない全Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質に結合する。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
本発明は、驚くべきことに、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を、１２５Ｉ標識されたフルオレセイン−５−マレイミドを使用して放射性標識し、殺虫活性および受容体結合能力を維持しながら特異的にシステイン残基をアルキル化することができることを実証する。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素のトリプシン切断型の形態は、放射性標識部位を含まなければならない単一のシステイン残基（Ｃｒｙ１ＦａのドメインＩ内のＣ２０５に対応する）のみを含有する。この領域は、タンパク質の孔構造の一部を構成し、受容体結合に関与しないと考えられる。タンパク質生化学および構造の分野の当業者は、マレイミド官能基に結合したフェノール環を含有する、フルオレセイン−５−マレイミドと同様の分子が、クロラミン化学によりヨウ素化でき、Ｃｒｙ１Ｆａなどのタンパク質内の特異的システイン残基をヨウ素化するために使用できることを理解するであろう。特に、フルオレセイン−５−マレイミドより小さい類似体は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素の内部により接近可能であり得るので、標識タンパク質のより高い比放射能を生じ得る。
【００５７】
本発明において産生されるシステインアルキル化Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質はＦＡＷ幼虫に対して殺虫活性がある。標識されていないＣｒｙ１Ｃａタンパク質ではなく、標識されていないＣｒｙ１Ｆａタンパク質および標識されていないＣｒｙ１Ａｂタンパク質は、ＦＡＷ  ＢＢＭＶ由来の放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質の結合を置き換えることができる。バイオアッセイデータにより、Ｃｒｙ１Ｃａが、ＦＡＷおよびｒＦＡＷ幼虫の両方に対して活性があるが、Ｃｒｙ１ＡｂはｒＦＡＷ幼虫に対して活性が低いことが実証される。したがって、ＦＡＷおよびｒＦＡＷ幼虫に対するＣｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、およびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の生物活性は、ＢＢＭＶ結合アッセイ結果によって都合良く説明され、予測される。したがって、昆虫管理戦略に有用なＣｒｙタンパク質の組合せが、本発明の方法により放射性標識されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質を利用する競合結合アッセイを使用して予測できることは、本発明の一態様である。
【００５８】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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