(57)【要約】  サンプル中に含まれる対象の三次元撮像システムであって、画像センサと、サンプルを保持するように構成され画像センサの近傍に配置されているサンプルホルダと、部分コヒーレント光を具える照明源と、を具えるシステム。照明源は、照明源とサンプルホルダとの間に介在させた、開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも１つを通してサンプルを照明するように構成されており、照明源は、複数の異なる角度を通じてサンプルを照明する。【選択図】図１Ａ
2014507645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル内に含まれる対象の三次元撮像システムにおいて：
画像センサと；  
前記サンプルを保持するように構成され、前記画像センサ近傍に配置されたサンプルホルダと；
部分コヒーレント光又はコヒーレント光を具える照明源であって、前記光源と前記サンプルホルダの間に配置された、開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路の少なくとも１つを通して前記サンプルを照明するように構成された照明源と、を具え、
前記照明源が複数の異なる角度で前記サンプルを照明するように構成されていることを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記照明源が静止しているサンプルホルダに対して移動可能であることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダが静止している照明源に対して移動可能であることを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダがマイクロ流体フローセルを具えることを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項４に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダが前記画像センサに対して角度を成していることを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記複数の異なる角度が、約−８９°乃至＋８９°の範囲に亘ることを特徴とするシステム。
【請求項７】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記複数の異なる角度が、ほぼ直交する軸に沿った角度を含むことを特徴とするシステム。
【請求項８】
請求項１に記載のシステムが更に、前記サンプルの三次元画像を、前記複数の異なる角度における照明から取得した画像に基づいて再構築するように構成された少なくとも一のデジタルプロセッサを具えることを特徴とするシステム。
【請求項９】
請求項１に記載のシステムが更に、前記開口、光ファイバケーブル又は光導波路のうちの少なくとも１つを、前記撮像面とほぼ平行な平面において移動させる手段を具えることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記移動させる手段が、ステップモータ、移動可能なステージ、圧電素子、及びソレノイドのうちの少なくとも１つを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１１】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記複数の角度が、三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１２】
請求項１１に記載のシステムにおいて、前記形状が球形又は楕円形であることを特徴とするシステム。
【請求項１３】
サンプルに含まれる対象の三次元画像を取得する方法において：
第１の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光を出射する光源と共にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを照明するステップであって、前記サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルのうちの少なくとも１つを光が通過するステップと；
前記サンプルホルダを異なる角度で前記照明源を用いて照明するステップであって、前記サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルを光が通過するステップと；
各角度において、前記サンプルホルダの反対側に配置した画像センサから複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップと；
各角度における前記サブピクセル画像フレームを、各角度について単一のより解像度が高いホログラムにデジタル的に変換するステップと；
前記より高い解像度のホログラムから各角度についての投影画像をデジタル的に再構築するステップと；
前記サンプル中の対象の三次元断層写真画像をデジタル的に逆投影するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、各角度において画像センサからの複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップが更に、前記照明源、開口、又は光ファイバケーブルの少なくとも１つを、前記画像センサにほぼ平行な平面において横方向に移動させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法において、前記複数の角度が単一平面における複数の角度を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法において、前記複数の角度が互いにほぼ直交する２つの平面における複数の角度を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法において、前記複数の角度が三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記形状が球形又は楕円形を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法において、前記各角度においてサブピクセル画像フレームを各角度についての単一の解像度が高いホログラムにデジタル的に変換するステップ；各角度についてより解像度が高いホログラムから投影画像をデジタル的に再構築するステップ；及び前記サンプル中の対象の三次元断層写真画像をデジタル的に逆投影するステップ；が、少なくとも一のプロセッサで実行されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
サンプル中に含まれる対象の三次元撮像を行う方法において：
画像センサ近傍に配置したフローセルを通してサンプルを流すステップと；
第１の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光を出射する照明源で前記サンプルを照明するステップであって、前記光が、前記サンプルを照明する前に、開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも１つを通過するステップと；
前記画像センサを用いて前記第１の角度で、移動するサンプル中にある前記対象の複数の画像フレームを取得するステップと；
前記照明源で前記サンプルを一又はそれ以上の異なる角度で照明するステップであって、前記光が、前記サンプルを照明する前に、開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも１つを通過するステップと；
前記画像センサを用いて前記一又はそれ以上の異なる角度で、移動するサンプル中にある前記対象の複数の画像フレームを取得するステップと；
前記第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した前記複数の画像フレームから前記対象の超解像投影ホログラムをデジタル的に再構築するステップと；
前記第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した前記超解像投影ホログラムに基づいて、前記サンプル内の対象の複合投影画像をデジタル的に再構築するステップと；
前記複合投影画像を前記サンプル中の対象の三次元断層写真にデジタル的に再構築するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記複合投影画像が、前記複合投影画像のフィルタ逆投影を介して三次元断層写真にデジタル的に再構築されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、前記フローセルが前記撮像センサアレイに対して角度を成していることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法において、前記第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度が、約−８９°乃至＋８９°の間の範囲内にあることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法において、前記第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度が前記フローの方向に対して若干角度を成しているアークに沿って成されており、約−８９°乃至＋８９°の間の範囲内にあることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法において、前記第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度が前記フローの方向に対して垂直なアークに沿って成されており、約−８９°乃至＋８９°の間の範囲内にことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法において、前記一又はそれ以上の異なる角度が、三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記形状が球形又は楕円形を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
携帯型断層写真撮像装置において：
中にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを具えるハウジングと；
前記サンプルの第１側部に対して変化する角度で前記ハウジング内に配置された複数の部分コヒーレント光源又はコヒーレント光源であって、当該複数の光源の各々が、それぞれ導波路に接続されている光源と；
前記複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、個々の光源を個別に作動させるように構成されているマイクロコントローラと；
ほぼ直交する方向に前記導波路を移動させるように構成された電磁アクチュエータと；
前記サンプルの第２の側部の前記ハウジング内に配置した画像センサと；
を具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項２９】
請求項２８に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記導波路と前記サンプルとの間にカラーフィルタを介在させたことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項３０】
請求項２８に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記ハウジング内に一又はそれ以上のバッテリを配置したことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項３１】
請求項２８に記載の携帯型断層写真撮像装置において、前記複数の部分コヒーレント光源がＬＥＤ又はレーザダイオードを具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項３２】
携帯型断層写真撮像装置において：
中にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを具えるハウジングと；
前記サンプルの第１側部に対して変化する角度で前記ハウジング内に配置された複数の部分コヒーレント光源又はコヒーレント光源であって、当該複数の光源の各々が、それぞれ空間開口に接続されている光源と；
前記複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、個々の光源を選択的に個別に作動させるように構成されているマイクロコントローラと；
ほぼ直交する方向に前記空間開口を移動させるように構成された電磁アクチュエータと；
前記サンプルの第２の側部の前記ハウジング内に配置した画像センサと；
を具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項３３】
請求項３２に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記空間開口と前記サンプルとの間にカラーフィルタを介在させたことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項３４】
請求項３２に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記ハウジング内に一又はそれ以上のバッテリを配置したことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【請求項３５】
請求項３２に記載の携帯型断層写真撮像装置において、前記複数の部分コヒーレント光源がＬＥＤ又はレーザダイオードを具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１月６日に出願された米国暫定特許出願第６１／４３０，４６５号と、２０１１年５月１６日に出願された米国暫定特許出願第６１／４８６，６８５号の優先権を主張する。優先権は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて主張されている。上述の特許出願は、ここに完全に記載されているように、引用によって組み込まれている。
【０００２】
技術分野
本発明の属する技術分野は、一般的に細胞などの微細構造の撮影方法及び装置に関する。特に、本発明の属する技術分野は、静止サンプル又はマイクロ流体環境内のフロー中の、細胞、細胞小器官、細胞粒子などの断層撮影システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
光学顕微鏡検査は、数世紀にわたって生命工学における欠くことができないツールであった。それにもかかわらず、そのデザインは基本的に初めから変わっていない。すなわち、視覚化のために目又はデジタルセンサアレイによって検出する前に、レンズ及びその他の光学部品のシステムを介して検体の画像を拡大するというものである。より小さな特徴をより良好な解像度で解像するという追及が、サイズが大きくなり複雑さが増すという代償を払って光学顕微鏡の性能を改良してきた。一方で、非常に小型化されたアーキテクチュア内で生物サンプルを迅速かつ効率良く操作し処理するマイクロ流体システム及びラボオンチップシステムなどの新しい技術が頭角を現してきた。しかしながら、検体の光学的検査は、未だに従来の光学顕微鏡によって行われており、これはマイクロ流体システムのスケールに比べて、通常桁違いのサイズ不整合がある。この結果、小型のラボオンチッププラットフォームと一体化することができる代替の小型の顕微鏡モダリティが明らかに必要とされている。
【０００４】
新しい光学顕微鏡モダリティの要求は、小型化と微小流体の一体化の必要性によってのみ拍車がかけられたのではない。大きな視野（ＦＯＶ）の低減という代償を払って高解像度が達成されるという事実は、レンズベースでの撮像のもう１つの基本的な制限である。希少細胞の撮像又はモデル器官の光学的表現型検査といった、スループットが高い顕微鏡が非常に望まれるいくつかの重要な問題について、従来の光学顕微鏡の比較的小さな視野がそのアプリケーションに更なる課題をもたらしている。
【０００５】
上述したこれらの要求を補完する解決策を提供するために、代替的に無レンズ顕微鏡プラットフォームが開発されている。これは、小型のオンチップ撮像アーキテクチュアにおいて高い解像度と大きな視野を組み合わせたものである。このモダリティでは、微小な対象物のデジタルインラインホログラムが、単位フリンジ倍率の部分コヒーレント照明を用いてセンサアレイ上に記録され、センサの活性領域全体が撮像ＦＯＶとして作用する。センサのピクセルサイズによる解像度の制限を克服するためには、サンプルの複数サブピクセルをシフトさせたホログラムが必要であり、ピクセル超解像技術を適用して、大きなＦＯＶと矛盾することなくサブミクロンの方位分解能を達成する。この結果、開口数（ＮＡ）が〜０．５の顕微鏡対物レンズと比較できる横方向の撮像性能が、２４ｍｍ２のＦＯＶについて達成された。これは同じ解像度の対物レンズより２桁以上大きい倍率である。Ｂｉｓｈａｒａ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｎｓｆｒｅｅ  ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｖｅｒ  ａ  ｗｉｄｅ  ｆｉｅｌｄ−ｏｆ−ｖｉｅｗ  ｕｓｉｎｇ  ｐｉｘｅｌ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １８：１１１８１：−１１１９１（２０１０） 参照。
【０００６】
部分コヒーレント無レンズインラインホログラフィにおけるピクセル超解像技術が、大きな視野に亘るサブミクロン方位分解能での撮像を可能にする一方で、デジタルインラインホログラフィの焦点深度が本質的に長いため、残念ながら距離分解能は有意に低い（例えば、＞４０乃至５０μｍ）。したがって、ホログラフィな再構築が計算上異なる深度で合焦するにもかかわらず、〜５０μｍより近い平面をセクションにわけることは、開口数の検出に関係なく、無レンズ広視野ホログラフィック顕微鏡では実現できなかった。この基本的な制限に取り組む必要がある。
【０００７】
同じように、この数年間、断撮像可能な光学顕微鏡モダリティに興味が広がってきた。一例として、光投射型断層撮影（ＯＰＴ）が提案され、ここでは、屈折率マッチングゲル中に沈めた光学的に透明にした検体を、従来のレンズベースの顕微鏡の固定光路に対して回転させ、最大〜１ｃｍ３の撮像ボリューム内で３つの寸法すべてにおいて〜１０μｍの等方性分解能を提供している。Ｓｈａｒｐｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ３Ｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５４１−５４５（２００２） 参照。
【０００８】
近年、開口数が大きい対物レンズを用いたＯＰＴの変形バージョンも実装されて、例えば、＜０．０００５ｍｍ３といった有意に低減されたボリュームにわたるサブミクロン細胞撮像が実現されている。Ｆａｕｖｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｉ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １３：４２１０−４２２３（２００５）参照。
【０００９】
光学回析トモグラフィ（ＯＤＴ）はもう１つのパワフルな技術であり、ここでは、デジタルホログラフィを用いて、照明方向を変え、対象を回転させ、あるいは、異なる波長で複数の画像を捕捉することによって、検体の３Ｄ屈折率分布を再構築している。これらの断層撮影システムでは、定期的に細胞を撮像することができ、三次元すべてにおけるサブミクロン解像度を潜在的に実現している。しかしながら、従来の顕微鏡と同様に、これらのシステムには解像度と撮影ボリュームのトレードオフが生じ、使用する対物レンズによって、例えば、０．０４乃至０．２ｍｍ２より小さい非常に低減された撮像ＦＯＶと、１０乃至２０μｍより小さい被写界深度（ＤＯＦ）という犠牲を払って、高解像度を達成している。
【００１０】
同じ目的で、もう１つの撮像モダリティ、すなわち、選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）も導入されている。これは、筒状レンズによって発生する光シートを用いて蛍光サンプル内の選択的平面を連続的に照明し、方位分解能を強化した３Ｄ画像を生成する。Ｈｕｉｓｋｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  Ｄｅｅｐ  Ｉｎｓｉｄｅ  Ｌｉｖｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  ｂｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｌａｎｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１００７−１００９（２００４）参照。ＳＰＩＭは、蛍光撮像法のみに限定されており、最大数ミリメートルの厚いサンプルで、使用する対物レンズの開口数あるいは光−電子センサアレイの活性領域のいずれかによって決まる、０．０４乃至２ｍｍ２の範囲のＦＯＶ上での〜６μｍの方位分解能を達成する。一般的に、これらの既存の光学断層撮像プラットフォームは、上述したように、すべて小型化してマイクロ流体システムと一体化するよう取り組んでいる、比較的複雑で嵩の大きい光学組織に依存している。したがって、コンパクトな具体例における分解能が高く、撮像ボリュームが大きい代替の断層撮影顕微鏡プラットフォームは、細胞及び発生生物学、神経科学、及び創薬を含む様々な分野において、重要な撮像ツールセットを提供できる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の一態様において、無レンズ光学断層撮影システム及び方法が提供されており、これは、〜１４ｍｍ２のＦＯＶ上で〜２．５乃至３μｍの距離分解能と、１μｍより小さい方位分解能、並びに〜４ｍｍの拡張ＤＯＦを達成して、〜１５ｍｍ３のオンチップ撮影ボリュームを達成する。この無レンズ光学断層撮影プラットフォームは、非常に大きい撮影ボリュームを持つ三次元（３Ｄ）の高い分解能と、既存の光学コンピュータ断層撮影モダリティには適合しない３Ｄ空間−バンド帯域積を提供する。
【００１２】
１つのアプローチでは、〜１０ｎｍのスペクトルバンド幅を有する部分コヒーレント光源を回転させて、複数角度（空気中で±５０°にわたる）から検体ボリュームを照明することによって無レンズ断層撮影が達成され、ここでは、各照明角度において、レンズや、レーザ、あるいはその他の嵩のある光学部品を使用することなくいくつかの物体のサブピクセルシフト投影ホログラムが記録される。次いで、このサブピクセル画像は、デジタル処理が行われ、各角度投影について、単一の高い分解能（例えば、ピクセル超解像度）のホログラムを生成する。次いで、この高分解能ホログラムをデジタル的に再構築して、位相及び振幅情報を取得し、次いで逆投影して、サンプルのＸ線断層写真を計算する。
【００１３】
このホログラム記録ジオメトリの制限付空間的時間的コヒーレンスは、スペックル及び複数の反射干渉ノイズタームの低減といった、重要な利点を再構築画像にもたらす。更に、このジオメトリにおける単位フリンジ倍率によって、例えば＞４０°の斜照明角度でも対象物のインラインホログラムを記録することができる。これは、フリンジ倍率を用いた従来のコヒーレントインラインホログラム撮影スキームでは、通常、実現不可能である。
【００１４】
斜照明の制限された角度レンジによる欠陥を最小限に抑えるため、二軸断層撮影スキームを適用することができる。ここでは、二本のほぼ直交する軸に沿って光源が回転する。断層撮像性能は、様々な寸法のマイクロビーズを用いて、また野生型Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓによって定量化される。良好な３Ｄ空間分解能を用いて大容量をプローブして、この無レンズ光学断層撮影プラットフォームは、例えば、細胞及び発生生物学において、高スループットの撮像アプリケーション用のパワフルなツールを提供する。
【００１５】
一の実施例では、サンプル中に含まれている対象物の三次元撮像システムが、画像センサと；サンプルを保持するように構成されたサンプルホルダであって、画像センサに隣接して配置されたサンプルホルダと；部分コヒーレント光又はコヒーレント光を具える照明源であって、照明源とサンプルホルダの間に介在させた開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路のうちの少なくとも１つを通ってサンプルを照明するように構成された照明源と；を具え、この照明源が複数の異なる角度からサンプルを照明するように構成されている。
【００１６】
別の実施例では、サンプル中に含まれている対象物の三次元画像を取得する方法が開示されており、これは、第１の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光であって、サンプルを照明する前に開口か、光ファイバケーブルを通過する光を発する照明源を用いてサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを照明するステップと；サンプルホルダを異なる角度で照明源を用いて照明するステップであって、サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルのうちの少なくとも１つを光が通過するステップと；各角度で、サンプルホルダの反対側に配置した画像センサから複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップと；この各角度におけるサブピクセル画像フレームを、各角度について単一のより分解能が高いホログラムにデジタル的に変換するステップと；このより分解能が高いホログラムから各角度について投影画像をデジタル的に再構築するステップと；サンプル中の対象物の三次元断層画像をデジタル的に逆投影するステップと；を具える。
【００１７】
さらに別の実施例では、サンプル中に含まれている対象物の三次元撮像を実行する方法が開示されており、これは、画像センサに隣接して配置したフローセルを通してサンプルを流すステップと；第１の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光であって、サンプルを照明する前に開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも１つを通過する光を発する照明源を用いて、サンプルを照明するステップと；画像センサを用いて第１の角度で移動するサンプル中の対象物の複数の画像フレームを取得するステップと；この照明源を用いて少なくとも一又はそれ以上の異なる角度でサンプルを照明するステップであって、サンプルを照明する前に開口か、光ファイバケーブルか、光導波路のうちの少なくとも１つを光が通過するステップと；画像センサを用いて一又はそれ以上の異なる角度で移動するサンプル中の対象物の複数の画像フレームを取得するステップと；第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した複数の画像フレームから対象物の超解像投影ホログラムをデジタル的に再構築するステップと；第１の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した超解像投影ホログラムに基づいてサンプル中の対象物の複合投影画像をデジタル的に再構築するステップと；この複雑な投影画像のフィルタをかけた逆投影を行ってサンプル中の対象物の三次元Ｘ線断層写真をデジタル的に再構築するステップと；を具える。
【００１８】
さらに別の実施例では、携帯型断層撮像装置が開示されており、これは、内部にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを収容するハウジングと；サンプルの第１の側に対して変化する角度でハウジング内に配置した複数の部分コヒーレント又はコヒーレント光源であって、複数の光源の各々がそれぞれ導波路に接続されている光源と；複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、各々の光源を選択的に作動させるように構成されたマイクロコントローラと；ほぼ直交する方向に導波路を移動させるように構成された電磁アクチュエータと；サンプルの第２の対向する側にあるハウジング中に配置した画像センサと；を具える。
【００１９】
別の実施例では携帯型断層撮像装置が開示されており、これは、内部にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを収容するハウジングと；サンプルの第１の側に対して変化する角度でハウジング内に配置した複数の部分コヒーレント又はコヒーレント光源であって、複数の光源の各々がそれぞれの空間開口に接続されている光源と；複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、各々の光源を選択的に作動させるように構成されたマイクロコントローラと；ほぼ直交する方向に空間開口を移動させるように構成された電磁アクチュエータと；サンプルの第２の対向する側にあるハウジング中に配置した画像センサと；を具える。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、サンプル中の一又はそれ以上の対象物を断層撮影する一実施例によるシステムを示す。図１Ｂは、ここに配置した対象物を有するサンプルを収容するサンプルホルダを示す。図１Ｃは、照明源と対象物を含有するサンプルとの間に光学的に介在させることができる開口を具える空間フィルタの方向を示す。
【図２】図２は、サンプル中の対象物の三次元断層画像をシステムがどのように取得するのかを示すトップレベルフローチャートである。
【図３】図３は、サンプル中の一又はそれ以上の対象物の断層撮像を行う別の実施例によるシステムを示す。この実施例では、サンプルがフローセル内を流れている。
【図４】図４は、サンプル中の一又はそれ以上の対象物の断層画像を行う別の実施例によるシステムを示す。この実施例では、システムがコンパクトな、又は携帯型撮像装置を具える。
【図５】図５Ａは、＋５０°、０°、及び−５０°の３つの角度のそれぞれについてホログラフィック記録状態を示す線図である。光源、投影画像面、及びホログラム面が、各状態について示されている。図５Ｂは、＋５０°、０°、及び−５０°の３つの角度にそれぞれ対応する角度で測定した５μｍのビーズの対応する超解像（分解能が高い）ホログラムからのクロップ画像（ｂ１、ｂ２、ｂ３）を示す。図５Ｃは、図５Ｂの対応するホログラム（それぞれの画像ｂ１、ｂ２、ｂ３）を用いて、デジタル的に再構築した無レンズ投影画像（ｃ１、ｃ２、ｃ３）を示す。再構築は、＋５０°、０°、及び−５０°の３つの角度でそれぞれ行った。
【図６】図６Ａは、光学接着剤（屈折率〜１．５２、Ｎｏｒｌａｎｄ  ＮＯＡ６５）で埋めた厚さ〜５０μｍのチャンバ内にランダムに配置した５μｍのメラミンビーズ（屈折率〜１．６８、Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）についての二軸断層画像を再構築した結果を示す。チャンバ容積中の様々なパネルが記載されている（ａ１：１４μｍ；ａ２：０μｍ；ａ３：６μｍ；ａ４：１４μｍ；ａ５：２５μｍ）。図６Ｂは、図６Ａに示す対応する断層写真における同じ平面の顕微鏡画像（×４０、０．６５ＮＡ）を示す。図６Ｃは、図６Ａ（画像ａ３乃至ａ５）の破線で示す円で強調した拡大対象領域（画像ａ６乃至ａ８）を示す図であり、ここで２つのランダムビーズが、ｚ方向において、中心から中心へ〜２０μｍ離れて軸方向に重なっている。これらの画像は、対応する顕微鏡画像（画像ｂ６乃至ｂ８）の横に表示されている。
【図７】図７Ａは、ｘ−ｙ面におけるｚ＝−３μｍの位置でビーズの再構築した断面（ビーズの中心を通って切った）を示す。図７Ｂは、ｙ−ｚ面におけるｚ＝−３μｍの位置のビーズの再構築した断面（ビーズの中心を通って切った）を示す。図７Ｃは、ｘ−ｚ面におけるｚ＝−３μｍの位置でビーズの再構築した断面（ビーズの中心を通って切った）を示す。
【図８】図８Ａは、異なる深度に位置する３つの個別ビーズの、ｘ−ｙ断面に沿った断面ラインプロファイルを示す。図８Ｂは、異なる深度に位置する３つの個別ビーズの、ｙ−ｚ断面に沿った断面ラインプロファイルを示す。図８Ｃは、異なる深度に位置する３つの個別ビーズの、ｘ−ｚ断面に沿った断面ラインプロファイルを示す。
【図９】図９Ａは、０°の角度でホログラフィックに記録した投影画像（１０μｍビーズのピクセル超解像ホログラム）を示す。このビーズは、厚い多重層サンプル内の異なる層に分散されている。図９Ａにおけるサイズの異なる矢印は、多重層チャンバ内の異なる層に位置するビーズを示している。図９Ｂ乃至Ｅは、このチャンバ内の異なる深度での断層写真である（図９Ｂ：ｚ＝３．９７ｍｍ；図９Ｃ：ｚ＝１．７４０ｍｍ；  図９Ｄ：ｚ＝７３０μｍ；図９Ｅ：ｚ＝７４２μｍ）。断層写真は、２軸撮像によって取得した。
【図１０】図１０Ａは、全体の厚さが〜３．３ｍｍの４層チャンバに分散させた１０μｍビーズの測定ホログラムを示す。図１０Ｂは、所望しない深度で測定したホログラムを再構築するとともに、ホログラム場全体からその寄与分を除去することによってデジタル的に抽出した、所定の層（ｚ〜０．７ｍｍの層１）のみにあるビーズのホログラムを示す図である。図１０Ｃは、デジタル的に取得した単層ホログラム（図１０Ｂ）を測定多層ホログラム（図１０Ａ）から差し引くことによって取得した差ホログラムを示す。図１０Ｃは、疑似的詳細は示しておらず、デジタル抽出プロセスがデータ測定のためのアーティファクトを導入していないことを示す。
【図１１】図１１Ａは、ｚ＝３μｍの平面に対応するＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層写真を示す。図１１Ｂは、ｚ＝２μｍの平面（ｂ１）；ｚ＝８μｍの平面（ｂ２）；ｚ＝１３μｍの平面（ｂ３）に対応するＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層写真を示す。図１１Ｃは、顕微鏡画像（比較用×４０，０．６５ＮＡ）を示す。図１１Ｄは、ｚ＝−６μｍの平面（ｃ１）；ｚ＝０μｍの平面（ｃ２）；ｚ＝＋６μｍの平面（ｃ３）に対応するＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの中央部分断層写真を示す。図１１Ｅは、比較用の蠕虫の中央部分の顕微鏡画像（比較用×４０，０．６５ＮＡ）を示す。図１１Ｆは、図示された異なる３つの角度（θ＝０°、３４°、及び−３４°）におけるＣ．Ｅｌｅｇａｎｓのサンプルの無レンズ未加工の断層写真を示す。図１１Ｇは、図１１Ｆに示す３つの角度の３つの再構築した超解像ホログラムを示す。
【図１２】図１２Ａは、蠕虫の縦断面に対応する４０倍の対物レンズ顕微鏡画像である。図１２Ｂは、−３４°の角度で撮像した虫の振幅及び位相再構築画像を示す。図１２Ｃは、０°の角度で撮像した虫の振幅及び位相構築画像を示す。図１２Ｄは、＋３４°の角度で撮像した虫の振幅及び位相再構築画像を示す。
【図１３】図１３Ａは、−６μｍの深度でスライスしたＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層流体工学画像を示す。バー・スケールは長さ５０μｍである。図１３Ｂは、−３μｍの深度でスライスしたＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層流体工学画像を示す。バー・スケールは長さ５０μｍである。図１３Ｃは、０μｍの深度でスライスしたＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層流体工学画像を示す。バー・スケールは長さ５０μｍである。図１３Ｄは、＋３μｍの深度でスライスしたＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層流体工学画像を示す。バー・スケールは長さ５０μｍである。図１３Ｅは、＋６μｍの深度でスライスしたＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの断層流体工学画像を示す。バー・スケールは長さ５０μｍである。図１３Ｆは、比較用のＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの１０倍顕微鏡画像を示す。
【図１４】図１４Ａは、−４４°、０°、及び＋４４°の３つの角度についての、ホログラフィック記録状態をそれぞれ示す図である。光源、投影画像面、及びホログラム面を各状態について示す。図１４Ｂは、−４４°、０°、及び＋４４°の３つの角度に対応する角度でそれぞれ測定したマイクロビーズの、対応する超解像（高解像）ホログラムからクロップした画像（ｂ１、ｂ２、ｂ３）を示す。図１４Ｃは、図１４Ｂ（画像ｂ１、ｂ２、ｂ３）に対応するホログラムを用いて、デジタル的に再構築した無レンズ投影画像（ｃ１、ｃ２、ｃ３）を示す。
【図１５】図１５Ａは、直径２μｍのマイクロ粒子の低解像度（ＬＲ）垂直投影ホログラムである。図１５Ｂは、同じ粒子のデジタル的に合成したピクセル超解像（ＳＲ）ホログラムであり、通常、図１５Ａでアンダーサンプリングされ、より高い周波数のホログラムフリンジが観察される。図１５Ｃは、図１５Ａに示すＬＲホログラムを用いた、同じマイクロ粒子のｘ−ｙ面における再構築画像である。図１５Ｄは、図１５Ｂに示すＳＲホログラムを用いた、マイクロ粒子のｘ−ｙ面における再構築画像である。図１５Ｅは、図１５ＡのＬＲホログラムを再構築することによって取得した、マイクロ粒子のｙ−ｚ及びｘ−ｚ断面を示す図である。図１５Ｆは、図１５ＢのＳＲホログラムを再構築することによって取得した、同じマイクロ粒子のｙ−ｚ及びｘ−ｚ断面を示す図である。
【図１６】図１６Ａ乃至１６Ｃは、ｙ−ｚ、ｘ−ｚ、及びｘ−ｙのそれぞれの面におけるマイクロ粒子の中心を通る断面図（断層画像）である。
【図１７】図１７Ａは、深度−７μｍで、ランダムに配置した直径５μｍのマイクロビーズを満たしたチャンバの無レンズコンピュータ断層写真を示す。各画像の矢印は、所定の深度で合焦しているビーズを示す。図１７Ｂは、深度０μｍで、直径５μｍのランダムに配置したマイクロビーズを満たしたチャンバの無レンズコンピュータ断層写真を示す。各画像の矢印は、所定の深度で合焦しているビーズを示す。図１７Ｃは、深度＋７μｍで、直径５μｍのランダムに配置したマイクロビーズを満たしたチャンバの無レンズコンピュータ断層写真を示す。各画像の矢印は、所定の深度で合焦しているビーズを示す。図１７Ｄは、深度１６μｍで、直径５μｍのランダムに配置したマイクロビーズで満たしたチャンバの無レンズコンピュータ断層写真を示す。各画像の矢印は、所定の深度において合焦しているビーズを示す。図１７Ｄの破線長方形で囲んだ差し込み図は、２つの軸方向に重なったマイクロビーズの断面を示し、図１７Ｆ及び１７Ｅの破線円で示す図は、両方とも、無レンズ断層写真と、従来の顕微鏡写真（４０×、０．６５ＮＡ）である。図１７Ｆ乃至１７Ｊは、図１７Ａ乃至１７Ｅの画像に対応する深度の顕微鏡画像（４０×、０．６５ＮＡ）を示す。
【図１８】図１８Ａは、任意のビーズの中心を通る拡大した断層写真であり、ｘ及びｙ軸に沿ったラインプロファイルと共に示す。図１８Ｂは、図１８Ａに示す同じビーズの軸上ラインプロファイルとその派生物を示す図であり、〜６μｍの距離分解能を示唆している。
【図１９】図１９Ａは、携帯型撮像装置を用いて、総厚さ〜３．５ｍｍの４層に懸濁したた１０μｍのビーズの多層チャンバ（センサ上に０．７ｍｍの間隔で装填されている）について記録した断層写真（０°の角度）を示す図である。様々な深度でビーズの断層画像（センサチップからの距離に応じてサイズを変化させた）を見ることができる。図１９Ｂは、深度７１９μｍのコンピュータ断層画像を示す。図１９Ｃは、深度７５０μｍのコンピュータ断層画像を示す。図１９Ｄは、深度１８４０μｍのコンピュータ断層画像を示す。図１９Ｅは、深度１８５１μｍのコンピュータ断層画像を示す。図１９Ｆは、深度４２２５μｍのコンピュータ断層画像を示す。図１９Ｇは、図１９Ａのものをデジタル的に鮮明にしたホログラムを示しており、選択された層（ｚ〜．７５ｍｍ）における対象物のみが示されている。図１９Ｈは、図１９Ａのデジタル的に鮮明にしたホログラムを示しており、選択された層（ｚ〜１．８ｍｍ）における対象物のみが示されている。図１９Ｉは、図１９Ａのデジタル的に鮮明にしたホログラムを示しており、選択された層（ｚ〜４．２ｍｍ）における対象物のみが示されている。
【図２０】図２０Ａは、携帯型装置を用いて取得した様々な深度のＨ．Ｎａｎａの卵のコンピュータ断層画像を示す。深度は、−８μｍ（ａ１）；０μｍ（ａ２）；及び＋６μｍ（ａ３）である。図２０Ｂは、図２０Ａに示す同じ深度におけるＨ．Ｎａｎａの卵の４０倍の顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１Ａは、サンプル１４中の対象１２（図１Ｂに最もよく見られる）の断層撮像を行うシステム１０を示す。対象１２は、細胞又は生物学的要素又は構造（例えば、細胞器官又は細胞構造）を含むものでもよい。対象１２は、むしろ、多細胞生物又は同様のものを含んでいてもよい。代替的に、対象１２は、粒子物体又はその他の物体であってもよい。図１Ａは、画像センサ１６の上方に若干の距離を置いて配置された撮像対象１２を示す。いくつかの実施例では、一又はそれ以上の対象１２を含むサンプル１４が、光学的に透明なカバーの上にあるいは画像センサ１６の表面上（例えば、ガラスカバー）に直接配置されている。代替的に、一又はそれ以上の対象１２を含むサンプル１４は、ガラス又はプラスチックのスライド、カバースリップ、又は図１Ｂに見らえるような同様のものといった、光学的に透明なサンプルホルダ１８上に配置されている。
【００２２】
とにかく、画像センサ１６の表面はサンプル１４に接していてもよく、近接していてもよい。一般的に、サンプル１４中の対象１２は、画像センサ１６の活性表面内数ミリメートルにある。画像センサ１６は、例えば、電荷接合素子（ＣＣＤ）あるいは相補型ＭＯＳ（ＣＭＯＳ）素子を具えていてもよい。画像センサ１６は、モノクロセンサであっても、カラーセンサであってもよい。画像センサ１６は、一般的に、９．０μｍより小さい、具体的には５．０μｍより小さい（例えば、２．２μｍ又はそれより小さい）小ピクセルサイズである。一般的に、ピクセルサイズが小さい画像センサ１６は、高分解能である。本明細書に記載した撮像方法の１つの利点は、ピクセルサイズより良好な空間解像度が得られることである。
【００２３】
図１Ａをさらに参照すると、システム１０は、サンプルホルダ１８の第１の側部（図１Ａで見られる上側）を照明するように構成した照明源２０を具える。照明源２０は、好ましくは空間コヒーレント光源あるいは部分コヒーレント光源である。発光ダイオード（ＬＥＤ）が、照明源２０の一例である。ＬＥＤは比較的安価であり、耐久性があり、一般的に所要電力が少ない。もちろん、フィルタ付キセノンランプなどのその他の光源を使用してもよい。電球も光源２０の１つの選択である。レーザ光などのコヒーレント光線（例えば、レーザダイオード）も使用することができる。光源２０は、好ましくは、約０．１乃至約１００ｎｍの間のスペクトル帯域を有しているが、このスペクトル帯域はより小さくても大きくてもよい。更に、照明源２０は、約０．１乃至１０，０００μｍの空間コヒーレント径を有する部分コヒーレント光を具えていてもよい。
【００２４】
図１Ｃを参照すると、選択的に空間フィルタ２２を、照明源２０と、対象１２を含むサンプル１４の間に配置している。空間フィルタ２２はフィルタに含まれる照明経路（空間開口又はピンホール）を形成する開口２４を有する不透明面を具える。開口２４は、通常５０μｍ乃至約１００μｍの範囲にある径（Ｄ）を有する。代替的に、空間フィルタ２２は、図１Ａに示すように照明源２０の遠位端に一体的に形成することもできる。例えば、照明源２０は、図１Ａに示すような光ファイバ、あるいはその他の光導波路に連結することができる。光ファイバに関しては、ファイバは、外側表面より屈折率が高い内側コアを具えており、光が内側コア内部に案内される。この実施例では、開口２４を有する別の不透明面は不要である。代わりに、光ファイバ自体が空間フィルタ２２として作用する。この実施例では、光学ファイバのコアは、本明細書に記載した開口２４と同じ範囲の径を有している。図１Ａに見られるように、光ファイバケーブル照明源２０の遠位端（空間フィルタ２２）は、サンプルホルダ１８（又はサンプル１４）から距離ｚ１のところに配置されている。画像センサ１６の結像面は、サンプルホルダ１８（又はサンプル１４）から距離ｚ２のところに配置されている。本明細書に記載したシステム１０では、ｚ２＜＜ｚ１である。例えば、距離ｚ１は、約１ｃｍ乃至約１０ｃｍのあたりにある。別の実施例では、この範囲がより小さく、例えば、約５ｃｍ乃至約１０ｃｍのあたりにある。距離ｚ２は、約０．０５ｍｍ乃至２ｃｍのあたりにあるが、別の実施例では、この距離ｚ２が約１ｍｍ乃至２ｍｍのあたりである。システム１０では、伝達距離ｚ１によって、空間を対象１２の平面で展開させ、対象１２によって散乱した光がバックグラウンド光と干渉して、画像センサ１６の上に無レンズインラインホログラムを形成する。
【００２５】
図１Ａを更に参照すると、システム１０は、ラップトップ、デスクトップ、又はシステム１０に操作可能に接続された同様のものといったコンピュータ３０を具えており、解像度の低い画像（例えば、解像度の低いあるいは生の画像フレーム）を画像センサ１６からコンピュータ３０に転送してデータを取得し、画像を処理する。コンピュータ３０は、以下により詳細に説明するように、一又はそれ以上のプロセッサ３２を具えており、ある角度で撮影した複数のサブピクセル（低解像度）画像をとって対象１２の単一で解像度が高い投影ホログラム画像を生成するソフトウエアを稼働又は実行する。このソフトウエアは、振幅及び位相情報の両方を含む対象１２の複合投影画像をデジタル的に再構築することもできる。同じ画像のホログラム振幅と回復した位相を有しており、ソフトウエアは、複雑な投影画像のフィルタにかけた誤差逆伝搬を通して、デジタル的に対象１２の三次元断層画像を再構築する。再構築した断層画像は、例えば、ディスプレイ３４等の上でユーザに表示することができる。ユーザは、例えば、キーボードやマウスといった入力デバイス３６を介してコンピュータ３０とインターフェースを取って、様々な断層画像面を選択することができる。
【００２６】
図１Ａは、互いにほぼ直交している第１及び第２のアーク４０、４２を示す。第１及び第２のアーク４０、４２は、照明源２０がサンプル１４中に含まれる対象１２を照明する異なる角度を表している。異なる撮像位置（破線で示す）が第１及び第２のアーク４０、４２に沿って示されている。一般的に、照明源２０は、０°位置を表す画像センサ１６上方に上死点（図１Ａに示す）を有する−８９°乃至＋８９°の範囲の角度で、移動する。一実施例では、照明源２０はアーク４０、４２の一方に沿って、静止撮像センサ１６に対して移動する。代替的に、照明源２０を静止させて、撮像センサ１６が移動して、同じ角度の照明を行うようにしてもよい。さらに別の代替例では、照明源２０と画像センサ１６の両方が互いに移動してもよい。一般的に、サンプル１４内に含まれる対象１２を画像センサが妨害する傾向にあるので、照明源２０をその中にサンプル１４を有する画像センサ１６と逆に移動させることが好ましい。照明源２０及び／又は画像センサ１６は、照明源２０を画像センサ１６に対して様々な角度で動かす機械的ステージ、アーム、スライド、等の機械的アクチュエータによって移動する。このアクチュエータの数はいくつでもよい。
【００２７】
図１Ａを更に参照すると、照明源２０は、結像面とほぼ平行の面内でアーク４０、４２に沿った各角度で移動する能力も有する。図１Ａの挿入図は、蛇行ラインパターンにおける照明源２０の二次元（例えば、ｘ及びｙ変位）の移動を示す。このようにして、照明源２０は比較的小さい変位湾曲部（例えば７０μｍより小さい）を作ることができる。以下に説明するように、画像センサ１６に平行な小さい個別シフトを用いて、単一の高解像度（例えば、ピクセル超解像度）画像を作る。例えば、３×３グリッドを用いて、ｘ−ｙ面において、アーク４０、４２の各角度位置に、９つの異なる低分解能（ＬＲ）画像を得ることができる。図１Ｃを参照すると、照明源２０を移動させる代わりに、固定照明源２０に対して開口２４を移動させるようにしてもよい。例えば、ステップモータ、移動可能ステージ、圧電素子、あるいはソレノイドを含めて、任意数の機械的アクチュエータを使用することができる。
【００２８】
図１Ａは、互いにほぼ直交するように配置したアーク４０、４２を示す。別の実施例では、照明源２０を球形又は楕円形などの三次元表面上の異なる角度に配置することができる。対象１２は、一般的に、その形状で規定される三次元表面の中心（例えば、重心）近くに配置される。この実施例では、照明源２０は、２つの直交するアークに対向する三次元表面部分をトレースすることができる。
【００２９】
図２は、システム１０がサンプル１４中の対象１２の三次元断層画像をどのようにして取得するかについてのトップレベルフローチャートを示す。サンプル１４をサンプルホルダ１８に装填した後、照明源２０が操作１０００に見られるように第１の角度に移動する。照明源１０は、サンプル１４を照明し、操作１１００に見られるように複数のサブピクセル（ＬＲ）ホログラム画像を取得する。このステップにおいて、一の実施例によれば、複数のサブピクセル画像は、照明源１０を、画像センサ１６にほぼ平行な面（例えばｘ及びｙ面）において移動させることによって取得する。この移動は、照明源１０が第１の角度位置にいる間に生じる。例えば、３×３アレイで取られた９つの画像を第１の角度位置で得ることができる。次いで、操作１２００に見られるように、照明源１０を別の角度位置に移動させる。この異なる角度位置では、照明源１０がサンプル１４を照明し、操作１３００に見られるように、複数のサブピクセルホログラム画像を取得する。このステップでも複数のサブピクセル画像は、同様に、画像センサ１６にほぼ平行な面（例えばｘ及びｙ面）において照明源１０を移動させることによって得られる。照明源２０は、次いで、操作１２５０に見られるように別の角度位置に移動して複数のサブピクセルホログラムを取得する。このプロセスを任意の回数繰り返して、複数の異なる角度で画像を得る。複数のサブピクセルホログラム画像は、例えばアーク４０、４２に沿って撮像される。
【００３０】
操作１４００では、各角度における複数のサブピクセル画像を、ピクセル超解像技術を用いて、単一の高解像度ホログラム（ＳＲホログラム）にデジタル的に変換する。その詳細は引用によって組み込まれている、Ｂｉｓｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｓｆｒｅｅ  ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｖｅｒ  ａ  ｗｉｄｅ  ｆｉｅｌｄ−ｏｆ−ｖｉｅｗ  ｕｓｉｎｇ  ｐｉｘｅｌ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １８：１１１８１−１１１９１（２０１０）に開示されている。最初に、これらのホログラム間のシフトを、局所勾配反復アルゴリズムを用いて推定する。このシフトを推定すると、測定したシフトホログラムと相補的な、高分解能グリッドが反復計算される。これらの反復において、最小限に抑える費用関数が、高解像ホログラムのダウンサンプルバージョンと、対応するサブピクセルシフト生ホログラムとの間の平均平方誤差として選択される。
【００３１】
次いで、操作１５００で、各角度において、複合投影画像をデジタル的に再構築する。デジタル的に合成された超解像ホログラフィック画像を再構築して、様々な照明角度における対象の無レンズ投影画像を取得する。斜めの照明角度で記録されたホログラムが、散乱した物体波の同軸伝搬と、センサアレイに対する非摂動基準波によって、インラインホログラムである旨は、強調すべきである。結果的に、デジタル的に再構築した画像は、検出面における複合視野の位相が記録プロセスにおいて失われるという兆候である、二重像アーティファクトによって品質が落ちる。忠実な投影画像を得るために、サイズを制限した反復位相回復アルゴリズムが用いられ、センサによって検出された複合視野の位相を回復することができる。位相回復アルゴリズムに関する詳細は、完全にここに記載されているかのように引用によって組み込まれている、Ｍｕｄａｎｙａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｃｔ，Ｌｉｇｈｔ−ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｌｅｎｓｌｅｓｓ  Ｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｌｅｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １０：１４１７−１４２８（２０１０）に見ることができる。
【００３２】
従来の縦型照明ケースと同様に、斜めの照明角度で記録されたホログラムは、ホログラムを記録するのに使用した基準波のデジタル的なレプリカである基準波と重なって、センサに対して垂直に傾いた平面基準波を使用することになる。サンプルホルダ中の光の屈折により、この再構築波の傾斜角度は、照明ビームの傾斜と同じではない。実際、投影ホログラム用のデジタル再構築角度は、Δｄ／ｚ２の比率の逆タンジェントを計算することによって決まる。ここで、Δｄは縦方向の投影画像における位置に対する対象のホログラムの横方向のシフトを意味し、ｚ２は、実験的にわかるか、あるいは縦方向のホログラムのデジタル再構築距離によって反復決定される。
【００３３】
反復位相復元のために、平行な画像検出面と対象面との間で複合視野をデジタル的に前後に伝達する。照明に垂直な面における投影画像を得るために、回復した視野をグリッド上に挿入する。傾斜方向に沿ったこのグリッドの寸法は、ｃｏｓ（θ）で再計測する。ここで、θはデジタル的な再構築角度である。加えて、断層写真をコンピュータ計算する前に、投影画像を共通の回転中心に対して整列させる必要がある。これを行うために、画像登録アルゴリズムに基づいて、自動化した２段階相互相関を実装した。連続的な照明角度（例えば５０°及び４８°）で得た投影画像は、互いに非常に似ており、隣接する角度において取得した投影画像を相互相関させることによって、画像登録の第１ステップが行われる。ほとんどの場合、特に、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓなど、対象が大きな連結された構造である場合、このステップで、連続的に登録された投影セットが生じる。しかし、ＦＯＶがビーズなど分散型の小さな対象を含む場合、隣接する角度についても各々の変化に起因する投影画像における若干の相違が登録精度を悪化させることがある。この場合、投影画像の中央にあるビーズは、回転中心にあると仮定され、投影画像の中心を離れて、質の悪い画像登録を表す。したがって、第１のステップに続いて、登録の第２ステップが用いられ、縦型投影画像の中心にあるビーズを全体的基準として使用し、その他のすべての投影画像が、特定のビーズに対して自動的に整列する。基準ビーズは第１ステップにおいて、すでに大まかに整列しているので、第２の相関ステップは、クロップした投影画像をクロップした全体、すなわち縦型の、投影画像と相関させることによって、基準ビーズの上でのみ実行される。
【００３４】
この無レンズ記録スキームにおける大きなｚ１／ｚ２比によって、媒体の屈折率に近い検出ＮＡが得られる。このシステムの特徴は、傾斜照明ビームを用いてホログラムを記録するのに最も重要であるが、光電子センサアレイの設計によって、使用できる最大角度が制限される。一般的に、光電子センサアレイはレンズベースの撮像システムとして設計されており、入射光の角度は通常２０°乃至３０°を超えない。この結果、±５０°より大きい照明角度で記録されたホログラムはアーティファクトを示し始める。このため、２つの異なる回転軸に沿って、−５０°乃至＋５０°の制限された角度範囲内で実験的な投影ホログラムを取得した。しかしながら、角度範囲は、例えば、−８９°と＋８９°の間に跨る角度より大きい、あるいは、いくつかの場合−８９°と＋８９°の間に跨る角度であると理解すべきである。
【００３５】
無レンズ投影画像（位相と振幅の両方）は、操作１６００に見られるように、フィルタ逆投影アルゴリズムにかけて、三次元画像を生成する。フーリエ射影定理によって、異なる方向に沿った対象の２Ｄ投影画像から、対象の３Ｄ伝達機能を再構築することができる。逆投影法に関する詳細は、引用によりここに組み込まれている、Ｍ．，Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｂａｃｋ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２ｎｄ  ｅｄ．）ｐｐ．２４５−２７３（２００６）に見ることができる。もちろん、当業者に公知であるその他の断層画像再構築方法も同様に使用することができる。
【００３６】
したがって、各照明角度についての１つのピクセル超解像（ＳＲ）ホログラムが、複数のサブピクセル（ＬＲ）シフトホログラムを用いてデジタル的に合成され、次いで、すべての高解像ホログラムのホログラフィック再構築により無レンズ投影画像が生成される。次いで、操作１６００において、これらの再構築した無レンズ投影画像（位相と振幅）を用いて、フィルタ逆投影アルゴリズムを用いてマイクロ対象の３Ｄ断層画像をコンピュータで計算する。この技術の基本的要件は、一般的な投影仮定（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ）と呼ばれており、投影画像が対象の所定の特徴の線形和を表すものであり、このための断層画像をコンピュータで計算することができる。Ｘ線コンピュータ断層画像においてこの条件に満足することは、電磁スペクトルのその部分におけるわずかな回析によってより容易であるが、光学レジメにおけるコンピュータ断層画像は弱い分散対象を必要とする。同様に、この無レンズ光学断層モダリティも、大多数の光子が、最大でも断層写真の各スタック量を超える単一の分散事象を経験する必要がある。弱い分散対象については、システムの長い焦点深度とともに、複雑な分散電位が照明方向に沿って付加的になる。この結果、フィルタ逆投影アルゴリズムを適用することによって、対象の複雑な分散電位の断層写真を計算することができる。この入力は、各照明角度におけるピクセル超解像無レンズホログラムのホログラフィック再構築によって計算した合成投影画像である。
【００３７】
ホログラムは、±５０°といった制限された角度範囲で記録されるため、対象のフーリエ空間に、欠損ウエッジとして知られている欠けた領域がある。この欠損ウエッジの主な意味合いは、低い距離分解能であり、ラテラルより大きな値に距離分解能を制限する。更に、ラテラル平面では、リンギングアーティファクトが観察されるとともに、照明の回転方向に沿って点広がり関数（ＰＳＦ）を狭くして、ｘ−ｙ面におけるＰＳＦが楕円形になる。
【００３８】
これらの撮像アーティファクトを最小限にするために、二軸断層撮像スキームを使用する。各傾斜方向に沿って得られた投影画像は、別々に逆投影されて、２セットの合成Ｘ線断層写真を計算する。これらのＸ線断層写真をフーリエ空間で合わせて、Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ  Ｄ．Ｎ．，Ｄｕａｌ−Ａｘｉｓ  Ｔｍｏｇｒａｐｈｙ：Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｗｉｔｈ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２０：３４３−３５２（１９７７） にあるシーケンスを行う。この文献は、ここに完全に記載されているように引例として組み込まれている。したがって、両方のＸ線断層写真セットがデータを有する領域が平均され、一方、フーリエ空間において一セットのみが有益なデータを有する領域は、対応するＸ線断層写真のデータで満たされる。この結果、欠損ウエッジが欠損ピラミッドまで最小になり、上述した制限された角度のＸ線写真アーティファクトが有意に低減する。更に、対象の支持部外のアーティファクトを低減するために、縦型投影ホログラムのデジタル再構築に用いられるマスクをすべてのＸ線断層写真にあてる。欠損ウエッジを繰り返しデータで満たして、解像度を良くするとともに、対象の３Ｄサポート又は伝達関数の推測的情報に基づいて、反復制限アルゴリズムを装填することによるアーティファクトを低減することができる。
【００３９】
図３は、サンプル１４中の対象１２の断層写真撮像用システム５０の別の実施例を示す図である。この実施例では、対象が、例えばＣ．Ｅｌｅｇａｎｓなどの蠕虫のように見えるが、サンプル１４は、流れるサンプルボリュームである。システム５０は、フローセル５２を具えており、このセルはキャリア流体の流れの中を移動する対象１２を搬送するように構成されている。一の態様では、移動する対象１２は、細胞又はその他の生物学的要素を含む。移動する対象１２は、また、非生物学的粒子又はそのようなものを含むものでもよい。キャリア流体は、通常、移動する対象がその中に存在する流体である。キャリア流体は、また、ある状況では気体であってもよい。移動する対象１２が細胞である場合、キャリア流体は通常、生理学的に適用可能な緩衝溶液又はそのようなものである（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）。フローセル４２は、ほぼまっすぐであり、光学的にほぼ透明（少なくとも、ここにより詳細に述べた照明源に対して）な三次元導管である。フローセル５２は、ガラス、プラスチック、あるいはマイクロ流体デバイスに通常使用されるその他の材料でできている。フローセル５２の導管は、正方形あるいは長方形といった形状の規則的な断面積を有する。移動する対象１２を含むフローセル５２の内部寸法はさまざまである。例えば、フローセル５２は、ミリメートルスケールの高さ／幅を有していてもよい。代替的に、フローセル５２は、マイクロメートルスケールの高さ／幅を有していてもよい。この点に関して、フローセル５２は、マイクロチャネル又はそのようなものを具えていてもよい。
【００４０】
移動する対象１２は、一又はそれ以上のポンピング技術を用いて、フローセル５２を移動する又は流れる。例えば、圧力勾配が生じて、フローセル５２内に対象１２を含む流体を送り込む。代替的に、移動対象１２は、使用しているセル５２の対向する端部の電極による導電運動を用いて、フローセル５２を通って移動する。この点に関しては、何らかの特別なポンプモダリティを用いて、フローセル５２中で対象１２を移動させることができる。例としては、シリンジポンプ、誘電得移動現象ベースの電極、電磁流体力学電極、などのポンプの使用が含まれる。
【００４１】
図３を更に参照すると、システム５０は照明源５４を具えており、この照明源はフローセル５２の第１の側部（図３に見る上側）を照明するように構成されている。照明源５４は、好ましくは、空間的にコヒーレントな、あるいは部分的にコヒーレントな光源である。発光ダイオード（ＬＥＤ）は、照明源５４の一例である。ＬＥＤは、比較的安価であり、耐久性があり、一般的に所要電力が少ない。もちろん、フィルタ付キセノンランプなどのその他の光源を使用することもできる。レーザや電球も照明源５４の選択肢である。照明源５４は、好ましくは、約０．１乃至約１００ｎｍの間のスペクトル帯域を有するが、このスペクトル帯域はこれより小さくても、大きくてもよい。更に、照明源５４は、約０．１乃至１００００μｍの空間コヒーレント径を有する少なくとも部分的なコヒーレント光を含むものであってもよい。
【００４２】
空間フィルタ５６は、図３に示すように照明源５４の遠位端に一体化することができる。例えば、照明源５４は図３に見られる光ファイバあるいは別の光導波路に接続することができる。光ファイバに関しては、ファイバは外側面より屈折率の高い内側コアを具えているため、光が内部に案内される。代替的に、空間フィルタ５６は、図１Ｃに示すような開口２４を有する不透明面を具えていてもよい。空間フィルタ５６は、光をよりコヒーレントにするように作用する。
【００４３】
図３に示すように、画像センサ５８は、フローセル５２と反対の第２の側に配置されており、フローセル５２が照明源５４と画像センサ５８との間に挿入される。画像センサ５８は、フローセル５２の後側近傍に配置されている。画像センサ５８の表面は、フローセル５２の近位側あるいは後側に接触しているか、これに近接していてもよい。例えば、フローセル５２は、画像センサ５８を通常覆っているガラス又はその他の光学的に透明な層の上に直接配置してもよい。画像センサ５８は、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補型金属−酸化物半導体（ＣＭＯＳ）素子を具えている。画像センサ５８は、モノクロでもよく、カラーでもよい。画像センサ５８は、一般的に、サイズが９．０μｍより小さい、特に、サイズが５，０μｍより小さい（例えば、２．２μｍ又はそれより小さい）小サイズピクセルを有している。一般的に、より小さいピクセルサイズの画像センサ５８は、解像度が高い。
【００４４】
図３をさらに参照すると、照明源５４は、フローセル５２から距離ｚ１に配置されている。画像センサ５８の撮像面は、フローセル５２から距離ｚ２に配置されている。ここに記載したシステム５０では、ｚ２＜＜ｚ１である。例えば、距離ｚ１は約１ｃｍ乃至約１０ｃｍのオーダである。別の実施例では、この範囲はより小さくてもよく、例えば、約５ｃｍ乃至約１０ｃｍである。距離ｚ２は、約０．０５ｍｍ乃至２ｃｍのオーダであるが、別の実施例では、この距離ｚ２は約１ｍｍ乃至２ｍｍである。システム５０では、伝搬距離ｚ１は、移動する対象１２の面において空間コヒーレンスが発達する距離であり、移動する対象１２によって散乱する光が、バックグラウンド光と干渉して画像センサ５８上に無レンズインラインホログラムを形成する。
【００４５】
図３に見られるように、移動する対象１２は、矢印Ａで示す方向にフローセル５２内を流れる。矢印Ａは、フローセル５２の縦軸とほぼ平行である。矢印Ａの方向（したがって、フローセル５２の方向）は、画像センサ５８に対して若干角度がついている。この角度の正確な値は、臨界的なものではなく、事前に知られている必要はない。これは、単純に、フローセル５２に沿って移動する対象１２の流れが、画像センサ２２の両方の軸方向であるｘ及びｙ方向においてシフト要素を確実に作るようにする。この角度は、通常、非ゼロ角度４５°より小さい角度の間にある。図１Ａに示す従来技術の実施例のように、照明源５４は異なる角度でフローセル５２を照明するために移動可能である。
【００４６】
図３をさらに参照すると、システム５０は、システム５０に動作可能に接続されたラップトップ、デスクトップなどのコンピュータ３０あるいは同様のものを具えており、低解像度画像（例えば、低解像度フレーム又は生画像フレーム）を画像センサ５８からコンピュータ３０に送ってデータ取得と画像処理を行うようにしている。コンピュータ３０は、ここにより詳細に説明する一又はそれ以上のプロセッサ３２を具えており、このプロセッサは、ホログラフィックな振幅又は強度を具える移動対象物１２の画像を取得するソフトウエアを稼働あるいは実行する。コンピュータ３０においてこのソフトウエアが、画像の失われた位相を回復する。同じ画像に関するホログラフィックな振幅と回復した位相の両方で、このソフトウエアは移動する対象物１２のより解像度が高い画像を再構築する。再構築された画像は、例えば、ディスプレイ３４あるいは同様のものの上でユーザに表示することができる。ソフトウエアは、ホログラフィック署名に基づいて対象となる特定の細胞を同定し表示することもできる。
【００４７】
フローセル５２を通って流れる移動対象物１２は、画像センサ５８を用いて撮像される。特に、角度的にオフセットした画像センサ５８を用いて複数の解像度の低いホログラフィック画像フレームを取得する。システム撮像ジオメトリの単位フリンジ倍率のため、画像センサ５８のピクセルサイズによって、取得したホログラムがアンダーサンプリングとなることがある。一方、この流れの間に、各無レンズ対象ホログラムが、時間を関数にして様々なサブピクセルシフトでサンプリングされるため、ピクセル超解像アルゴリズムを用いて、例えば、≦０．５μｍの有効ピクセルサイズを有する高解像ホログラムをデジタル的に合成する。このサイズは、センサの物理的ピクセルサイズより有意に小さい（例えば＞２μｍ）。したがって、システム５０は、フローセル５２内の移動対象１２の流れを用いて、ホログラムサンプリング用のより小さいピクセルを作る。このような超解像デジタルインラインホログラムは、ツイン画像アーティファクトを削除した後、移動対象１２の高解像無レンズ撮像を可能にする。
【００４８】
図３は、アーク５９を示しており、これに沿って照明源５４が移動して、フローセル５２を異なる角度から撮像する。様々な撮像位置（破線で示す）が、アーク５９に沿って示されている。一般的に、照明源５４は、−８９°乃至＋８９°の範囲の角度で移動し、画像センサ５８の上方には０°位置を表す上死点がある（図３に見られる）。システム５０は、更に、従来の実施例にあるような画像の処理と分析を行うソフトウエアを実行する、少なくとも１つのプロセッサ３２を有するコンピュータ３０を具えている。モニタ３４と入力デバイス３６は、コンピュータ３０に接続して結果を表示し、コンピュータ３０とインターフェースをとる。
【００４９】
図３に示す実施例は、図２に示すものと同様に作用する。操作１１００における差異は、画像センサ５８に平行な面のｘ−ｙ方向において照明源５４を移動させる必要がないことである。この動作は、移動対象１２が対象１２のホログラムにシフトを提供するため不要である。
【００５０】
図４は、サンプル１４内の対象１２の断層画像を撮像するシステム６０の別の実施例を示す図である。この実施例では、システム６０がハウジング６４を具える、携帯型あるいは持ち運び可能な撮像器６２を具える。ハウジング６４は、粗プラスチックあるいは金属材料から作ることができ、持ち運び可能な撮像器６２の様々な部品を含むあるいは収納している。ハウジング６４は、その中に照明源６６を具えており、この照明源は複数のＬＥＤを具える。２４個のＬＥＤが図４に見られるが、これより多くても少なくてもよい。図４に見られるように、ＬＥＤ照明源６６の各々は、ハウジング６４のアーチ型内面に沿って配置されている。各ＬＥＤは、光ファイバ６８に突合せ結合されている。
【００５１】
各光ファイバ６８は、導波路として作用し、光ファイバ６８のアレイは、図４に示すようにアークに沿って設けられている。このスキームにおいて、各光ファイバコアの径が〜０．１ｍｍであるため、焦点レンズあるいは、各ＬＥＤの対応する光ファイバ端部への突合せ結合を単純かつ機械的に強固なものとするその他の光結合ツールが不要である。照明源６６の一時的なコヒーレンスを上げるために、光緩衝ベースのカラーフィルタ７０を用いてＬＥＤのスペクトルを〜１０ｎｍ（〜６４０ｎｍに中心がある）まで狭くすることができる。各光ファイバ６８の対応する端部（ＬＥＤに突合せ結合されていない端部）が、共通のアーク型ブリッジ７２に装着されている。したがって、各光ファイバ６８は、アーク型ブリッジ７２に沿って異なる角度からサンプルを照明することができる。従来の実施例と異なり、照明源を異なる角度に移動させる必要がない。ここでは、以下に説明するように、個々のＬＥＤがオンになり、サンプルを異なる角度から照明する。プラスチックで作ることができるアーク形状ブリッジは、両端にマグネット７４を装着している。マグネット７４は、ネオジム磁石などの希土類磁石を具えていてもよい。撮像器６２は、各マグネット近傍に装着したコイル７６を具えている。コイル７６は、ＤＣ電流源に接続され、起動すると、ブリッジ７２を移動させ、ファイバ６８の全端部を同時に移動させる電磁力を生成する。この点に関して、磁石７４と関連するコイル７６が付いたアーク型ブリッジ７２は、電磁アクチュエータとして作用する。コイル７６及び／又は磁石７４は、対応するコイル７６が起動すると、直交する変位が生じるように配置されている。したがって、ファイバ６８の端部の変位は、ｘ及びｙ方向の両方において生じる。コイル７６は、筒状軸が磁石の磁化ベクトルに整列するように配置されている。
【００５２】
バッテリ（図示せず）は、撮像器６２への電力供給に使用できる。例えば、標準的なアルカリバッテリ（容量が、例えば３０００ｍＡｈのもの）を用いて、断層写真顕微鏡を少なくとも数日間連続使用するための配置を必要とすることなく、ファイバを起動することができる。代替的に、撮像器６２は、外部電源から電力供給してもよい。
【００５３】
撮像器６２は更に、ハウジング６４内にマイクロコントローラ７８を具えている。マイクロコントローラ７８を用いて、照明源６６を構成しているＬＥＤの点火を制御する。例えば、マイクロコントローラ７８は、個々のＬＥＤを適時に起動あるいはトリガする。一例として、ＬＥＤは、ブリッジ７２に沿って順番に起動させてもよい。マイクロコントローラ７８は、コイル７６の起動を制御するのに使用することもできる。
【００５４】
図４を参照すると、撮像器６２は、ハウジング６４内及び外に移動可能な、サンプル充填機８０を具えている。一又はそれ以上の対象１２を含むサンプル１４（図１Ｂ参照）が、サンプルホルダ１８に装填され、サンプル充填機８０内に配置される。サンプル充填器８０は、次いで、デバイスを押し入れ、照明器６６の光路にサンプル１４が配置される。撮像器６２も、画像センサ８２を具えている。画像センサ８２は、従来の実施例のコンテキストで述べたように、ＣＭＯＳ又はＣＣＤを具えている。
【００５５】
システム６０は、更に、少なくとも一のプロセッサ３２を有するコンピュータ３０を具えており、従来の実施例にあるように画像の処理及び分析を行うソフトウエアを実行する。モニタ３４と入力デバイス３６がコンピュータ３０に接続されており、結果を表示するとともに、コンピュータ３０とインターフェースを取る。コンピュータ３０、モニタ３４、入力デバイス３６は、従来の実施例と同じ又は同様の態様で動作する。
【００５６】
実験１−第１実施例
図１Ａに示す実施例を無レンズ断層写真撮影に使用して、〜１４ｍｍ２の大ＦＯＶと、〜４ｍｍの拡大されたＤＯＦを超える、＜１μｍの方位分解能と、〜２．５乃至３μｍの軸上分解能を達成し、〜１５ｍｍ３のオンチップ撮像ボリュームを可能にした。この無レンズ光断層写真プラットフォームは、有意に大きい撮像ボリュームを有する３Ｄ高解像度と合体させ、既存の光コンピュータ断層画像モダリティによってはマッチングしない、３Ｄ空間帯域積を提供している。
【００５７】
無レンズ断層写真撮像は、〜１０ｎｍのスペクトル帯域を有する部分コヒーレント光源を回転させて、複数角度（空気中の±５０°に亘る）からサンプルボリュームを照明することで実行される。ここでは、各照明角度において、チップ上の対象の複数サブピクセルシフトインライン投影ホログラムが、レンズ、レーザ、あるいはその他の嵩のある光学部品を用いることなく記録される。ホログラム記録ジオメトリの制限付き空間及び時間的コヒーレンスによって、スペックルと、複数の反射干渉ノイズタームの低減といった再構築画像への重要な利点がもたらされる。更に、このジオメトリにおける単位フリンジ倍率によって、フリンジ倍率を用いる従来のコヒーレントインラインホログラム撮像スキームでは通常実現できない、例えば＞４０°といった斜めの照明角度においても、対象のインラインホログラムを記録することができる。
【００５８】
断層写真の制限された角度アーティファクトに対向するために、二軸断層写真スキームを使用して、図１Ａに示すように、２つの直交する方向に照明源を連続的に回転させる。ピクセル超解像を実行し、したがって、各投影画像についてサブミクロンの方位分解能を達成するには、互いに対してサブピクセルシフト（ｘ−ｙ面において）複数の無レンズインラインホログラムを、各照明角度で取得する（図１Ａの挿入図参照）。一旦、高解像度（ＳＲ）投影ホログラム（各照明角度につき１つ）セットが、ピクセル超解像アル
ゴリズムを用いてデジタル的に合成されると、ハイブリッドフィルタ逆投影法を用いて、対象の最終断層写真を作る。したがって、超解像投影がまずデジタル的に再構築され、次いで、逆投影を行って、サンプルの散乱ポテンシャルの体積画像を得る。
【００５９】
これらの結果は、（１）光学断層写真撮像が無レンズオンチップ撮像に拡大され；（２）２軸断層写真を電磁スペクトルの光学部分に適用し；（３）ピクセル超解像技術を光学断層写真撮像に適用した、最初のものである。レンズあるいはレーザなどのコヒーレント光源を用いることなく、ここに提供されている無レンズ断層写真撮像スキームは、二軸断層写真スキームを用いて〜１５ｍｍ３の大きな撮像体積を超える、＜１μｍ×＜１μｍ×〜２．５乃至３μｍの空間解像度を実現する。短軸投影データを用いたならば、方位分解能で〜１５％の低減という代償を払って、撮像体積は、〜３０ｍｍ３に増える。大きな撮像体積を超えて良好な空間解像度を提供し、無レンズ光学断層写真は、一般的に、例えば、細胞及び発生生物学における高スループットの撮像アプリケーション用に非常に便利である。
【００６０】
この実験で使用した無レンズ断層写真撮像構成においては、センサから約ｚ１＝７０ｍｍ離れたところに位置する光源（Ａｐｔｉｎａ  ＭＴ９Ｐ０３１ＳＴＣ，５  Ｍｅｇａｐｉｘｅｌｓ，２．２μｍ  ｐｉｘｅｌ  ｓｉｚｅ）が、部分コヒーレント照明を提供し、チャンバの高さによってセンサまでの距離が例えば、ｚ２＝０．５乃至４ｍｍの間で、対象のインラインホログラムを記録する。実験のフレキシビリティのために、単色光分光器を用いて、約５００ｎｍを中心に〜１０ｎｍ帯域を有する調整可能な広域帯照明を提供する。径０．０５乃至０．１ｍｍの開口を通してフィルタをかけ、ｚ１＝７０ｍｍの距離を伝達した後、＜０．５乃至１ｍｍの空間コヒーレンス径の照明ビームを取得する。このビームによって、個々の対象のインラインホログラムを記録することができる。モータ駆動ステージを用いて光源を回転させ、原点がセンサアレイの中心であるアークに沿って多角照明を行うことができる。ｚ１／ｚ２比が大きいため、このアラインメントは精度が高くなく、構成のロバスト性が維持される。
【００６１】
各照明角度において、一連のサブピクセルシフトホログラムが記録されて、ピクセル超解像を実装する（図２の操作１４００）。これは、モータ駆動リニアステージを使用して光源を直線的に移動させ、〜７０μｍのステップサイズを用いて、センサ表面に平行な面における３×３グリッド内の位置に分散させる（トータル９個の画像）。ｚ１／ｚ２比が大きいため、光源面における大きなシフトがホログラム面におけるサブピクセルシフトに対応する。この正確なサブピクセルシフト量は重要ではなく、実際この値は、照明角度に応じて生ホログラムが経験する横方向のシフト量からデジタル的に推察される。
【００６２】
ほとんどのデジタルセンサアレイは、センサ面の法線から測定した入射光線の角度が２０乃至３０°を超えないレンズベースの撮像システムで動作するように設計されているので、ｋ−ベクトルが大きい入射波はアーティファクトが増えて、ＳＮＲが低減した状態でサンプリングされる。したがって、システムのＮＡ検出がｚ２が短いことによって媒体の屈折率に届く場合でも、±５０°を超える角度についての再構築した投影画像はアーティファクトを示し、断層写真の再構築用の投影像を含むことで、最終画像品質を改善するのではなく悪化させ得ることが観察された。この結果、投影画像は、±５０°の傾斜範囲のみにおいて、２°の角度インクリメントで取得される。
【００６３】
角度を制限した断層写真のアーティファクトを低減するために、２軸断層写真スキームを用いた。したがって、１軸に沿った投影画像の記録が完了した後、コンピュータで制御した回転ステージを用いてサンプルを装着したセンサを９０°回転させて、直交する方向に沿って第２の投影画像セットを記録する。カスタムメイドの発達したＬａｂＶｉｅｗインターフェースを用いて、データ取得プロセスを自動化するとともに、トータルで９１８の広いＦＯＶ無レンズホログラムを記録する。１軸に沿った４５９の投影画像セットの取得には、〜４ｆｐｓのフレームレートで〜５分かかるが、より早いフレームレートセンサを用いることにより、有意に改善することができる。
【００６４】
図５Ａは、＋５０°、０°、及び−５０°の３つのそれぞれの角度についての、ホログラフィック記録状態を示す図である。光源、投影画像面、及びホログラム面が、各状態について示されている。図５Ｂは、＋５０°、０°、及び−５０°の３つの角度に対応する角度で測定した、５μｍのビーズの対応する超解像（分解能がより高い）ホログラムからクロップした画像（ｂ１、ｂ２、ｂ３）を示す。検出面がビームの伝達に対して法線方向ではないため、個々のビーズのホログラムは、予想通り楕円形をしている。図５Ｃは、図５Ｂの対応するホログラム（画像ｂ１乃至ｂ３）を用いてデジタル的に再構築した無レンズ投影画像を示す。遠近補正を行った後、再構築した円形ビーズに見られるように楕円性を除去する。再構築された投影画像は、回転中心であると仮定される画像中心のビーズに対して登録される。
【００６５】
無レンズ断層写真システムを特徴づけるべく、寸法の異なるマイクロビーズを用いて一連の実験を行った。図６Ａは、光学接着剤（屈折率〜１．５２、Ｎｏｒｌａｎｄ  ＮＯＡ６５）を満たした厚さ〜５０μｍのチャンバ内にランダムに分配した５μｍメラミンビーズ（屈折率〜１．６８、Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）についての２軸断層写真再構築の結果を示す。コンピュータ断層写真は、−１４μｍから２５μｍの範囲の様々な面で計算する。顕微鏡比較画像（図６Ｂ）を得るために使用した対物レンズ（４０×、０．６５−ＮＡ）のＦＯＶに合致させるために、〜１４ｍｍ２の画像のより大きなＦＯＶからクロップした対象の小領域についてのみ、＜３ｍｉｎ内に、グラフィックス処理単位（ＮＶｉｄｉａ，Ｇｅｆｏｒｃｅ  ＧＴＸ４８０）を用いて断層写真を計算した。図６Ａ及び６Ｂの矢印は、ビーズを指しており、このビーズは所定の層において、合焦している。図６Ａ（画像ａ１乃至ａ５）は、図６Ｂ（画像ｂ１乃至ｂ５）に提供されている対応する顕微鏡比較写真とともに、合焦していないビーズが断層写真において順次はじかれており、合焦しているビーズのみが再構築画像に現れていることを示している。断層写真の画像性能を更に示すために、図６Ｃ（画像ａ６乃至ａ８）は、対象となるズーム領域を示しており、図６Ａ（画像ａ３乃至ａ５）において破線の円で強調されている。ここでは、２つのランダムビーズが、ｚ方向における〜２０μｍの中心間距離をもって軸方向に重なっている。これらの画像は、対応する顕微鏡画像（画像ｂ６乃至ｂ８）に沿って表示されている。これらの再構築結果から、重なり合ったビーズが、相当の深度で、互いから最小焦点外コンタミネーションで順次解像されることが明らかであり、図６Ｃ（画像ａ７）に示す中間スライスは無視できる誤った詳細を有しており、この軸方向に重なっている領域の順次の切断面を表示している。図６Ｂ（画像ｂ１乃至ｂ５）と図６Ｃ（画像ｂ６乃至ｂ８）に示す対応する顕微鏡画像によって認証されるので、照明源の開口数又はコヒーレント特性に関係なく、これらの結果は、定期的なインラインホログラフスキームへの到達を超える、断面画像能力を示す。
【００６６】
図６Ａ乃至６Ｃの結果が比較的小さいＦＯＶの上で示されているが、全体の撮像体積の断層写真は、同じ生ホログラフィックデータセットから計算できるＦＯＶ内の異なる領域についてのいくつかの断層写真をデジタル的に組み合わせることによって取得することができる。なお、センサエッジに近い対象のホログラムは、大きな照明角度において活性領域外に来るので、有効ＦＯＶは〜２４ｍｍ２から１４ｍｍ２に（ＣＭＯＳセンサチップの活性領域にある）下がる。
【００６７】
断層写真顕微鏡の撮像特性をさらに調べるために、光学接着剤に分散させた直径２μｍのビーズを撮像した。図７Ａ乃至７Ｃは、ｘ−ｙ、ｙ−ｚ、及びｘ−ｚ面における再構築断面をそれぞれ示す図であり、各々、ビーズの中心を通って切断されている。図７Ａに示す再構築したビーズの円形によって明らかな通り、２軸断層写真スキームが、ｘ−ｙ面における延長アーティファクトをなくしている。これは、通常、角度を制限した１軸断層写真に見られる。一方で、同じビーズの再構築版は、センサ面の法線に対して±５０°を超える角度での投影がないため、軸上の伸長が見られる。図８Ａ乃至８Ｃは、異なる深度に位置する３つの個別のビーズについて、ｘ、ｙ、及びｚ軸に沿った断面ラインプロファイルを示す。ｚ＝−３μｍにあるビーズにおいては、中心を通るラインプロファイルのＦＷＨＭ値が、ｘ、ｙ、及びｚ寸法に沿って、それぞれ、２．３μｍ、２．２μｍ、及び５．５μｍである。深度ｚ＝−９μｍとｚ＝４μｍにあるその他のビーズでも同様の結果が得られた。このことは、深度が異なる視覚化ボリュームで同じ撮像パフォーマンスが維持されることを示す。
【００６８】
広角ＦＯＶ上で対象の３Ｄ撮像を可能にするのに加えて、無レンズ単位拡大ジオメトリによって、このプラットフォームにも、従来の顕微鏡対物レンズを用いた撮像システムに比べて優位に延長したＤＯＦがある。この大きなＤＯＦを示すために、〜１ｍｍ幅（例えば、トータルで厚さ３．３ｍｍ）で重ねた４つの層を有する１０μｍのビーズでできた多層チャンバを撮像した。次いで、このチャンバをセンサの活性領域の上に持ち上げて、最も遠い層を、センサチップから〜４ｍｍ離れたところに位置させた。空中で±５０°に亘る照明角度で、１４ｍｍ２×３．３ｍｍの体積に対応する全体の断層写真データを、２軸スキャニングを用いて〜１０分以上かけて取得した。一旦、この生データを取得すると（各照明角度における９つのサブピクセルシフトホログラムを具える）、各深度の層について個別に断層写真がコンピュータ処理される。次いで、これらの断層写真を、ここでは、ＤＯＦ〜４ｍｍの単一ボリューム画像にデジタル的に組み合わせる。ホログラフィックに記録した投影画像セットは、これらの１つを図９Ａに示すが、厚いサンプルの全３Ｄボリューム情報を具えており、図９Ａに示すサイズが異なる矢印は、多層チャンバ内の異なる層に配置したビーズを示している。図９Ｂ乃至９Ｅは、チャンバ内の様々な深度についての断層写真を示す（図９Ｂ：ｚ＝３．９７ｍｍ；図９Ｃ：ｚ＝１．７４０ｍｍ；図９Ｄ：ｚ＝７３０μｍ；図９Ｅ：ｚ＝７４２μｍ）。
【００６９】
このような大きなＤＯＦの断層撮影再構築についての１つの重要な試みは、各照明角度におけるピクセル超解像の実装である。比較的離れた深度に位置する粒子／対象の生ホログラムは、異なるシフトを作るため、そのホログラムが検出面で重なり合う場合に、ピクセル超解像のブラインドリアライゼーションによって、重なり合う粒子ホログラムの少なくともいくつかについてエラーが生じるであろう。この試みを軽減するべく、異なる層の生ホログラムを互いにフィルタにかけて、ピクセル超解像を、異なる深度の層の無レンズホログラムに個別に適用した。厚いサンプル中の軸方向に重なり合う対象についての超解像ホログラフィック投影を計算するには、＞２００乃至３００μｍ、軸上で離れている対象のホログラムがセンサチップの上を、有意に様々な量シフトするため、追加のデジタル処理が必要である。この結果、光源をシフトさせることによって得られた生ホログラムは、同じ２Ｄ生ホログラムの変位バーションというよりはむしろ、実質的に異なる二次元関数であり、第４ピクセルの超解像技術に合致することが求められる。結果的に、所定の照明角度における単一超解像投影ホログラムは、サンプル深度全体について計算することができない。代わりに、個別超解像ホログラムを各深度の層について計算する。これを行うために、例えば、図１０Ａの測定したホログラムなどの測定したホログラフィック投影画像は、削除されるべき各深度についてデジタル的に再構築され、再構築した対象を、対象のサポートの内側が０で外側が１のバイナリマスクと重畳させることによってホログラムフィールドから除去する。大ボリューム中の削除すべきすべての層についてこの操作を連続して行い、図１０Ｂに示すように、対象となる層のみのデジタルホログラムを取得する。不要な層にのみマスク操作を行っているので、図１０Ｃに示すように、対象になる層の元々のホログラムとデジタル的に取り出したホログラムとの間の差異を示す対象となる層のホログラムにアーティファクトが導入されない。深度の短い範囲（＜２００乃至３００μｍ）のシフトしたホログラムをデジタル的に取得すると、前述したように対象となる層の深度について、超解像ホログラムを特に計算することができる。
【００７０】
生命科学の応用に関する無レンズ断層写真顕微鏡の性能を示すために、野生種Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓの蠕虫を、脱イオン水中のＬ４ステージ（長さ〜６５０μｍ）で撮像した。この蠕虫は、４ｍＭのレバミソール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ９７５６）溶液で一時的に固定して、撮像処理中の好ましくない動きを防止した。蠕虫は、データ取得中にｙ−軸に平行に整列するので、ｘ−軸に沿った傾斜によって得られる投影のみを用いて、蠕虫の断層写真をコンピュータ計算した。この計算は、単一ＧＰＵを用いて〜４分間かかった。図１１Ａは、ｚ＝３μｍ面に対応する蠕虫全体のスライスを示す。蠕虫は、センサ面に対して若干傾斜した面外に観察され、前方が〜８μｍほど上がっていた。この結果、蠕虫全体の単一スライスは、同等の鮮明度でこの動物に亘る詳細を明らかにしていない。図１１Ｂ（画像ｂ１乃至ｂ３）は、ｚ＝２μｍ、ｚ＝８μｍ、ｚ＝１３μｍ、のそれぞれにおける蠕虫の前方領域を通る再構築した深度断面を示している。図１１Ｃの画像ｂ４は、比較のための顕微鏡画像（×４０、０．６５ＮＡ）を示す。これらの図に示すように、外径＜５μｍの長い筒状構造をしている蠕虫の咽頭管を、ｚ＝８μｍの面ではっきりと見ることができる（画像ｂ２）が、これは、咽頭の中心から離れた深度で急速に消失している。図１１Ｄ（画像ｃ１乃至ｃ３）も、同じ蠕虫の中心及び前側領域を通る異なる深度における断層写真を示す。図１１Ｅ（画像ｃ４）は、比較のための顕微鏡画像を示す。これらのすべての結果において、異なる部位におけるはっきり区別できる詳細の状況を明確に観察することができる。これは、検出開口数あるいはコヒーレント特性にかかわらず、規則的なインラインホログラフィック再構築ではなしえない、有意に改善された切断能力を示している。大撮像量とともに、これらの結果は、高スループット撮像が最も大事なＣ．Ｅｌｅｇａｎｓやｚｅｂｒａｆｉｓｈ等の光学的にアクセス可能なモデル生命体のオンチップ撮像とスクリーニング用の無レンズ断層写真プラットフォームの可能性を顕在化するものである。
【００７１】
無レンズ断層撮像システムは、＜１μｍの方位分解能と〜２．５乃至３μｍの軸分解能で、〜１４ｍｍ２の広いＦＯＶと〜４ｍｍの長いＤＯＦを照明できる独自の顕微鏡モダリティを提供している。これらの結果は、標準的な２０倍の対物レンズ（ＮＡ〜０．４、ＦＯＶ＜１ｍｍ２）と比較して、＞１０４倍を超える大撮像量の分解能を提示している。このことは、特に、３Ｄのモデルアニマル撮像といった、高スループットの撮像及びスクリーニングアプリケーションに適したプラットフォームを作りうる。また、撮像量は、短軸データセットで必要な投影を用いることで、〜３乃至３．５μｍの低軸上解像度という代償を払って、〜３０ｍｍ３まで増やすことができる。
【００７２】
このような広いＦＯＶと拡大したＤＯＦで、オンチップ断層撮像を行うことができる、無レンズインコヒーレントホログラフィスキームには、いくつもの独自の態様がある。例えば、〜２０乃至１００という大きなｚ１／ｚ２比を選択することで、画像モダリティに大ＦＯＶをもたらす単位倍率でのホログラフィック撮像ができる。センサーチップにおけるこの単位倍率とピクセルサイズによって決まる制限されたホログラム解像度は、撮像ＦＯＶのトレードオフがない状態で、ピクセル超解像アプローチによってバランスされ、方位開口数を０．４乃至０．５上げる。同じく大きいｚ１／ｚ２比は、非常に大きい照明開口（例えば、＞５０μｍ）を使用することもでき、光結合部品、感度の高いアラインメント、あるいは達成可能な解像度においてトレードオフを必要とすることなく、照明端を非常に簡易なものにする。この結果、構成を不必要に複雑にし、サンプルを摂動させるであろう対象物を回転させるのではなく、光源を傾けることによって投影画像を容易に取得できる。更に、光学部品の簡素化と無レンズ構成のアラインメントが不要な構造によって、二軸断層写真の簡単な実装が可能となる。なぜなら、光源又はセンサ（その上にサンプルを装着した）の傾斜軸が９０°回転して、二本の直交する方向に沿って投影画像を取得できるからである。
【００７３】
無レンズ断層写真スキームのもう１つの独自の態様は、部分コヒーレント光の一時的かつ空間的な使用である。照明のスペクトル幅は〜１０ｎｍであり、中心波長が〜５００ｎｍであり、コヒーレント長を＜１０μｍに制限する。この比較的短いコヒーレント長は、この技術に関していかなる制限もなさず、実際のところ、２つの主たるノイズ源、すなわち、スペックル及び複数反射干渉ノイズ項を低減する。複数反射干渉ノイズ項は、斜角でのレーザ照明では、特に邪魔である。更に、制限されたコヒーレンス長も、互いに対する異なる深度のクロストークを部分的になくす。このようなクロス干渉項は望ましくなく、実際、ホログラフィック再構築スキームにおいては完全に無視される。同じクロス干渉が所定の深度層内でも生じる。換言すると、サンプルボリューム中の分散中心が、実際、検出面において互いに干渉する。これは、ホログラフィック再構築（例えば、対の画像の削除）に関する限り、アーティファクト源でもある。この制限された空間コヒーレンスも、対象物の個々のホログラムを記録するのに十分大きいが、ＦＯＶを全体的に撮像するより有意に小さい空間コヒーレンス径（例えば、＜０．５乃至１ｍｍ）を選択することによって、この問題を低減するのに役立つ。この空間コヒーレンス径は、照明の開口（例えば、０．０５乃至０．１ｍｍ）を変えること、及び、ソース開口とサンプルボリューム間の幅を変えることによって、このジオメトリのエンジニアにはむしろ簡単である。
【００７４】
実験２−第２実施例
この実験では、図３に示す実施例を光流体断層写真顕微鏡として試験した。この顕微鏡は、マイクロ流体チャネル内を流れる検体の３Ｄ撮像を行うことができる。この光流体無レンズ撮像モダリティでは、センサから〜５０ｍｍ離して配置した空間的非干渉性光源（〜１０ｎｍの特定帯域で中心周波数６００ｎｍ、直径〜０．０５乃至０．１ｍｍの開口でフィルタにかけた）を用いて、サンプルのデジタルインラインホログラムを、光電センサアレイ（Ａｐｔｉｎａ  ＭＴ９Ｐ０３１ＳＴＣ，５  Ｍｅｇａｐｉｘｅｌｓ，２．２μｍピクセルサイズ）で記録した。ホログラムが取得されている一方で、図３に見られるように、ｘ−ｙ面において少し傾いたセンサ上に直接配置したマイクロチャネルに沿って対象を電気運動流で駆動する。この傾斜角度の正確な値は重要ではなく、事前に知る必要はない。これは、単に、マイクロチャネルに沿った対象の流れが、ｘ及びｙの両方においてシフト成分を生じることを確認して、ピクセル超解像を通じてより高い解像度のホログラムのデジタル合成を可能にしている。単位フリンジ倍率を有する独自のホログラム記録ジオメトリによって、ホログラフィック光流体顕微鏡プラットフォームで、図３に示すように、光学的計算断層写真を実行するカギである複数の照明角度を用いて流れる対象を撮像することができる。
【００７５】
断層写真撮像用の多角照明は、従来の光流体顕微鏡のアーキテクチュアで実行できない。なぜなら、対象と開口／センサ面との間の距離と屈折率が増えることによって、より大きい照明角度で、同じ対象の異なる断面の投影画像が失われ始めるからである。この光流体断層写真プラットフォームでは、各照明角度（例えば、θ＝−５０°：＋５０°に亘る）で、サンプルがセンサアレイ上をしっかり流れる間にいくつかの投影ホログラム（例えば、１５フレーム）が記録される。これらの低解像度（ＬＲ）無レンズホログラムは、次いで、ピクセル超解像技術を用いて、単一の超解像（ＳＲ）ホログラムにデジタル的に合成され、所定の照明方向に対応する各投影ホログラムについて＜１μｍの方位分解能を達成する。これらのＳＲ投影ホログラムがデジタル的に再構築され、同じ対象の複合投影画像を得る。これは、フィルタ逆投影アルゴリズムを用いて逆投影で対象の断層写真を計算できる。
【００７６】
野生種のＣ．Ｅｌｅｇａｎｓの蠕虫を、マイクロ流体チャネル内を流れる間に、θ＝−５０°：＋５０°にわたって、２°の分散インクリメントの様々な照明角度で、順次撮像する実験を行った。これらの実験で、実験に使用したＣＭＯＳセンサチップの設計が、有効最大照明角度を最終的に制限している。ほとんどのデジタルセンサが、レンズベースの撮像システムで作動するように設計されており、したがって、±５０°より大きい照明角度で記録したホログラムはアーティファクトを示している。このため、角度レンジを±５０°に制限した。各照明角度について、〜１５のホログラフィックフレームが流れる対象（＜３秒で）について捕捉され、その結果電気運動流体条件の下、トータルで〜２．５分の撮像時間となった。これらの撮像角度は、光源を保持しているコンピュータ制御された回転ステージによって自動的に作られ、ｘ−ｙ面に配置されている検出器アレイに対してｘ−ｚ面内で光源の回転を規定している。この設定で記録したいくつかの例示的ＬＲホログラムを図１１Ｆに示す。予想通りに、傾斜した照明（θ＝±３４°）について、ｘに沿ったホログラムの延長部分が、θ＝０°の場合に比べて広い。マイクロチャネル内を流れる間の蠕虫のサブピクセルシフトを用いることによって、図１１Ｇに示すように、各照明角度におけるサンプルの超解像ホログラムが合成される。すなわち、複数のサブピクセル画像を用いて、図２の操作１４００に見られるように、単一のより高度な解像画像が作られる。これらのＳＲホログラムは、生ホログラムでサンプリングしたより詳細なフリンジを示す。
【００７７】
デジタルホログラフィック再構築を介してサンプルの複雑な投影画像を得るには、合成したＳＲホログラムを傾斜した基準波とデジタル的に重ね合わせる。マイクロ流体チャンバ内で光が反射するので、この再構築波の傾斜角度は、光源の傾斜と同じではない。代わりに、投影ホログラム用のデジタル再構築角度（θ）は、比Δｄ／ｚ２の逆タンジェントを計算することによって決まる。ここで、Δｄは対象のホログラム縦型投影画像における位置に対する横方向のシフトを表し、ｚ２は、実験的に得ることもできるし、縦型投影ホログラムのデジタル再構築距離によってもわかる。なお、傾斜照明角度を使用する場合と異なり、基準波と対象波が同軸で伝わるため、記録したホログラムはインラインホログラムである。結果的に、対象−サポート制約に基づく反復位相回復アルゴリズムを用いて、対象を透過した複合フィールドを再構築する。これらの反復を通じて、光場が、平行なホログラムと対象面との間で前後して伝搬する。この反復が収束すると、傾斜方向に沿った寸法をｃｏｓ（θ）でスケーリングし直した寸法のグリッド上に回復した場を挿入することによって、照明角度の垂直な面に複合場の投影が得られる。θ±３４°及び０°に関して、例示的な再構築が図１２Ａ乃至１２Ｄに示されている。これは、ホログラフィック光流体顕微鏡プラットフォームの多重角度超解像撮像パフォーマンスを示す。ＳＲホログラムを計算して、〜１５反復における画像の繰り返して行われる再構築の全プロセスは、Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（ＧＰＵ−ＮＶｉｄｉａ  Ｇｅｆｏｒｃｅ  ＧＴＸ４８０）平行ＣＵＤＡベースの実装を用いて、０．２５秒以下で行われる。
【００７８】
弱い分散対象については、デジタルホログラフィック再構築を介して得た複合場（図１２Ａ乃至１２Ｄに示す）が、照明方向に沿った対象の複合伝達関数（位相、吸収、又は分散している電位）の投影を表す。したがって、対象の３Ｄ伝達関数は、逆フィルタ投影アルゴリズムを用いて断層写真の形で計算することができる。ここで、すべての複合投影画像（すなわち、θ＝−５０°：２°：５０°についての５１の超解像画像）が入力として使用されている。図１３Ａ乃至１３Ｅは、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓサンプルの無レンズ光流体断層写真を示す図であり、ここでは、いくつかの深度における蠕虫の断面が提供されている。図１３Ｆは、１０倍の顕微鏡画像を示す。このような断層写真撮像スキームは、特に、ホログラフィック再構築モダリティに内在する良く知られた焦点深度の問題を軽減し、有意に改良した軸方向解像度で光流体断層撮像を可能にする。この断層写真再構築プロセスは（ＳＲホログラムと逆フィルタ投影とを合成するステップを含む）、単一のＧＰＵを用いて３．５分以上はかからない。これは、いくつかのＧＰＵを並行して使用することによって、有意に改良できる。これらの断層写真再構築の結果に基づいて、蠕虫の移動の振幅についての軸方向ラインプロファイルの半値全幅（ＦＷＨＭ）は、〜３０μｍと測定された。これは、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓサンプルの典型的な厚さに匹敵する。断層写真を計算することなく、単一の超解像縦方向無レンズホログラム（θ＝０°）を用いた同じ軸方向ＦＷＨＭは〜１ｍｍであり、これは、複数投影を用いて焦点深度が改良されることを明らかにしている。無レンズホログラムに固有の長い焦点深度は、実際、延長された被写界深度として近い投影を満足するよう補助しており、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓなどの弱く散乱したサンプルの断層写真撮像ができる。
【００７９】
記録しうるホログラムの制限された角度範囲によって、対象のフーリエ空間に、一般に「欠落ウエッジ」と呼ばれる欠落した領域がある。欠落ウエッジの最も重要な効果は、軸方向におけるＰＳＦの延長である。これが、軸方向の解像度を、この場合〜３μｍと考えられるラテラルより大きな値に制限する。このようなアーティファクトの減少は、対象の３Ｄサポートに基づく、あるいは対象の伝達機能に関する事前情報を用いた、反復制限アルゴリズムを実装することによって達成される。これによって、対象関数の３Ｄフーリエ空間における欠落領域を繰り返し埋めることができる。
【００８０】
実験３−第３実施例
実施例３は、チップ上に対象の深度断面を切り取ることができる携帯型無レンズ断層写真顕微鏡に関する。この小型無レンズ光学断層写真顕微鏡は、重さ〜１１０ｇであり、部分コヒーレントデジタルインラインホログラフィに基づいており、〜２０ｍｍ２の大きなＦＯＶにわたる＜７μｍの軸上解像度と、〜１ｍｍの焦点深度（ＤＯＦ）を達成することができ、チップ上の〜２０ｍｍ３の大きなサンプルボリュームを調べることができる。ＤＯＦを〜４ｍｍに延長することによって、空間解像度の低減を犠牲にして、撮像ボリュームも〜８０ｍｍ３に増える。
【００８１】
この携帯型無レンズ断層写真プラットフォームでは、３Ｄ空間解像度を有意に強くできる主な要因は：（ｉ）対象の複数デジタルインラインホログラムを断層写真撮像用の変化する照明角度で記録することと；（ｉｉ）ピクセル超解像度を実装して、各視野角度における無レンズホログラムの方位分解能を有意にあげること；である。このオンチップ顕微鏡断層写真の実装に、２４個の発光ダイオード（ＬＥＤ−各々のコストは＜０．３ＵＳＤ）が使用される。このＬＥＤは、個別であるが、図４に示すように、アークに沿って傾斜した光ファイバ導波路にバット・カップリングされている。各ファイバは、コア径が〜０．１ｍｍ、長さが〜１４ｍｍである。このファイバは、アークに沿って装着されており、〜４．１°のインクリメントで±５０°の範囲内で様々な角度からサンプルを照明している。このスキームでは、各ファイバコアの径が〜０．１ｍｍなので、焦点レンズあるいは、各ＬＥＤの対応するファイバ端へのバット・カップリングをむしろシンプルにし、機械的ロバストにするその他の光結合ツールは不要である。照明源の一時的コヒーレンスを増やすために、ＬＥＤのスペクトルは、区分アーク上に装着した光ファイバアレイのジオメトリ（〜１０ｍｍ×５ｍｍ）に合致する６ピースの干渉ベースのカラーフィルタ（総額＜５０ＵＳＤ、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて、〜１０ｎｍ（中心〜６４０ｎｍ）まで狭める。このことによって、これらのカラーフィルタ上にほぼ垂直な入射光が入る。このスペクトルフィルタリングを行った後、照明ビームのコヒーレンス長は〜３０μｍまで増え、これによって、〜０．３乃至０．４の開口数（ＮＡ）、センサチップ表面からの最大対象高さ〜１ｍｍのホログラムを得ることができる。
【００８２】
複数角度から無レンズ投影ホログラムを記録するためには、低価格マイクロコントローラ（Ａｔｍｅｌ  ＡＴｍｅｇａ８５１５、単価〜３ＵＳＤ）で順次、ＬＥＤを自動的にオン・オフ切り替えをする。デジタルセンサアレイ（Ａｐｔｉｎａ  ＭＴ９Ｐ０３１ＳＴＣ，５  Ｍｅｇａｐｉｘｅｌｓ，２．２μｍ ピクセルサイズ）が、ファイバ端からｚ１＝〜６０ｍｍ離れて配置されており、無レンズ顕微鏡の一方の側から挿入されたサンプルトレイを介して装填された（センサチップの活性領域への距離、ｚ２＜５ｍｍ）対象の無レンズ投影ホログラムを記録する（図４参照）。各照明角度において、デジタルピクセル超解像を実装するためにサブピクセルシフトした一連のホログラムが記録される。この目的で、両端にネオジム磁石を有する共通のアーク形状部理事にすべてのファイバが装着されている。これらの磁石に装着されているコイルを直流電流で駆動することによって、電磁力が生じ、プラスチックのブリッジを始動させて、すべてのファイバ端を同時に移動させる。これらのファイバは、〜５００μｍ×〜５００μｍのグリッド内で１０乃至１５の異なる位置にシフトして、各位置について、新しい〜２０乃至２４個のホログラフィック投影セットが得られる。すなわち、ソース面におけるここのような大きなシフトは、ｚ１／ｚ２比が大きいので、ホログラム面におけるより小さなシフトに対応している。より重要なことは、すべてのランダムシフトは、ピクセル超解像度を達成するのに同様の価値があるため、これらのシフトは正確である必要がなく、繰り返し可能なことである。更に、この情報は、取得した無レンズホログラムのシーケンスを処理することによって正確に得られるので、これらのシフトを事前に知る必要がない。ＬａｂＶｉｅｗ(Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)をベースにした自動露出ソフトウエアを用いて、２４画像セットを、４フレーム／秒で、〜６秒で取得することができる。これは、例えば、＞１５乃至２０ｆｐｓの高いフレームレートのセンサを使用して、非常にスピードアップすることができる。
【００８３】
ホログラム記録ジオメトリにおける大きなｚ１／ｚ２比が、±９０°に近い角度でホログラムを記録できるにもかかわらず、デジタルセンサアレイの設計自体は、断層写真顕微鏡で使用できる照明角度の実際の範囲を制限している。ほとんどのデジタルセンサアレイは、撮像エレメントとしてレンズを使用する撮像システム用に設計されており、その結果、センサ表面法線から測定した入射光線の角度は、通常２０°乃至３０°より小さい。したがって、これらの光電センサの感度は、設計によっては、５０°より大きい入射角と、収差が有意になるために急速に落ちる。したがって、ホログラム記録ジオメトリは、より大きな角度（例えば、７０°乃至８０°）の使用が可能であっても、この特別な断層写真顕微鏡構成のために、照明の角度範囲を±５０°に制限している。
【００８４】
上述した通り、多角照明に使用する光ファイバは、電磁力で始動されるとすべてのファイバーと共に動く共通のアーク形軽量ブリッジ（〜１．７グラム）に接続されている。これらの光ファイバケーブルの他端は、機械的に固定されており、ここにアドレスされたＬＥＤにバット・カップリングされている。したがって、全体の構造は、ばね質量系として成形することができ、すべてのファイバが集合的にばねとして作動し、ブリッジ片は質量負荷となる。
【００８５】
この構造の設計に考慮する必要があるいくつかの重要なスペックがある。すなわち、（１）機器の形状要因を小さく保つために、アクチュエータの全体アーキテクチュアを可能な限りコンパクトにするべきである；（２）この構造は、自体で硬いままに保つのに十分な剛性があって、小さな外部の動きが画像取得の間、ファイバーチップをランダムに動かさないようにしなければならない、さもなければ、記録したホログラムがぼやけてしまう；（３）この構造の最小振動モードの自然な機械共振周波数はできる限り高く、外部の振動とカップリングしたことによって構造が動かないようにしなければならない、これは、長期にわたってファイバ端を搖動することなく迅速に安定した状態で変位させるのに役立つ；及び（４）現場で使用するには、標準的な電池で供給できる適宜の電流と電圧値で十分な始動が行われなくてはならない。（１）、（２）、及び（３）は、ファイバーを短く保つことによって、構造をコンパクトかつ剛性にして（共鳴周波数も上げて）達成することができるが、これは残念なことに、必要な電磁力を大幅に上げることになり、多くの電力を消費する結果になるであろう。
【００８６】
この機械系をより分析するために、各光ファイバ導波路が、筒状断面を有する片持ち梁として作用する単純なモデルを考えると、構造の剛性（ｋ）は次のようになる：
2014507645.tif 000003
【００８７】
ここで、Ｅはシリカファイバのヤング係数であり（Ｅ＝７２ＧＰａ）、ｒはファイバの半径であり（ｒ＝〜６２．５μｍ）、Ｌはファイバ長である。この無レンズ断層写真顕微鏡の設計では、ファイバ長Ｌ＝１４ｍｍが選択されており、これはプラスチックブリッジとファイバの固定端との間の距離である。これらのファイバが、Ｎ＝２４ファイバの集中型システムを形成する平行ばねとして作用すると仮定すると、構造の機械的周波数を以下の式で計算できる。
2014507645.tif 000004
【００８８】
式（２）は、測定した質量ｍ＝１．７ｇがプラスチックブリッジと２つの磁石に使用される場合、ｆ０〜２４Ｈｚの期待値となる。この計算式によれば、力が加わってファイバが安定−安定した変位に達するまでの時間は、例えば、〜４５の線質係数として、〜３００ｍｓと推測することができる。これらの計算を考慮すると実際のファイバの安定する時間は短い。更に、実験の間、外部の動揺に起因するファイバアレイの望ましくない搖動は観察されなかったし、構造全体は極めてロバスト性があり、頑丈で、現場使用に適している。
【００８９】
照明ファイバの電磁始動を達成するために、２つのネオジム磁石をプラスチックブリッジの各端部に装着した。これらの磁石の一方は、その上に〜１乃至２ｍｍの距離で装着されているコイルに直流電流が流れると電磁力がアークの方向に沿ってファイバを移動させるように整列している。もう一方の磁石は、対応するコイルが作動すると直交する方向に変位するように配置されている。したがって、ファイバ端のｘ及びｙ方向における変位がなされて、サンプルの超解像投影ホログラムが生成される。これらのコイルは、そのシリンダ軸が磁石の磁化ベクトルに整列するように配置されている。この構成では、磁石に発生する力（Ｆｍａｇ）は、以下の式で計算できる。
2014507645.tif 000005
【００９０】
ここで、Ｓは磁石の円筒断面積（単位ｍ２）であり、Ｍは磁化（テスラ）であり、Ｈｚ１及びＨｚ２（Ａ／ｍ）は磁石の上下それぞれにおける磁場強度の軸方向成分である。式（３）は、発生した力が磁石の２つの端部に生じる磁場の差ΔＨ２に正比例しており、これを用いて流れた電流の極性に応じて円筒軸に沿って磁石を押したり引いたりすることを提示している。
【００９１】
図４に示すように、撮像するサンプルは、携帯用断層写真顕微鏡の一方の側部から挿入したサンプルトレイを用いてセンサアレイの上に配置した標準的なカバーグラスの上に置くことができる。サンプルは、光源までの距離（〜６０ｍｍ）に比べてセンサアレイの活性領域へより近い（＜４乃至５ｍｍ）ので、対象の無レンズホログラムは、例えば〜２４ｍｍ２といった広いＦＯＶに記録できる。これは、例えば、典型的な１０倍の対物レンズのＦＯＶより、＞２０倍大きい。次いで、低価格マイクロコントローラを用いて、ＬＥＤを自動的に、（１つずつ）順次オンにして、±５０°の角度範囲内でサンプルの無レンズ投影ホログラムを記録する。
【００９２】
各照明角度において空間解像度を上げるピクセル超解像（ＳＲ）を行うために、光ファイバ導波路端部を、電磁作動を介して少量（＜５００μｍ）ずつ機械的に変位させる。このスキームにおいては、ファイバを、両端に取り付けた低価格ネオジム磁石を用いて、共通ブリッジ（半径３．１ｍｍ、長さ６．２ｍｍ）に連結する。電磁的に磁石を作動させるのに使用する小型の円形電気コイル（半径５ｍｍ、高さ５ｍｍ）をプラスチックハウジング内部に装着し、ｘ及びｙ両方向に沿ってすべてのファイバを同時にシフトさせる。
【００９３】
これらのファイバ端部の正確な変位量は事前に知る必要はなく、繰り返しあるいは正確に制御する必要もない。実際、各ファイバ端の個々の変位は、取得した無レンズホログラムシーケンスを用いてデジタル的に計算することができる。直流電流でコイルを駆動することでファイバが新しい位置にシフトされると、新しい無レンズ投影ホログラムセットが記録され、各ホログラムがセンサアレイに対して二次元的に若干シフトされる。電気コイル（５０Ω）に〜４Ｖの電圧をかけて、ファイバ変位を最大（すなわち、＜５００μｍ）にするためには、８０ｍＡの最大電流が必要である。標準的なアルカリ電池（例えば、３０００ｍＡｈの容量）を使用してファイバを作動させ、電池を交換する必要なく、少なくとも数日間、断層写真顕微鏡を連続的に使用することができる。
【００９４】
上述の設定で、１０乃至１５の投影ホログラムを各照明角度で記録して、所定の照明角度について一のＳＲホログラムをデジタル的に合成する。図１４Ａは、３つの異なる角度（−４４°、０°、及び＋４４°）についてのホログラム記録ジオメトリを示す。図１４Ｂは、図１４Ａの各対応する角度で取得した、対応するピクセル超解像（ＳＲ）投影ホログラムを示す。これらの無レンズＳＲホログラムは、デジタル的に再構築して、図１４Ｃに見られるサンプルの投影画像を取得し、次いで、逆フィルタ投影アルゴリズムを用いて合成し、センサチップ上に配置した対象の断層写真を計算する。
【００９５】
各照明角度で記録したシフトしたホログラムをデジタル的に処理して、より空間解像度の高い投影ホログラムを合成する。これは、図２の操作１４００に記載されている。これらのデジタル的に合成した超解像ホログラムは、次いで、迅速に再構築されて、対象の無レンズ投影画像を取得する。斜めの照明角度を使用したにもかかわらず、物体波と非摂動基準が同軸で伝達し、各無レンズホログラムはインラインホログラムとなる。二重像アーティファクトをなくし、記録した光場強度の位相を回復するには、ホログラム場が、対象サポートをこれらの反復機関における制約として用いて検出器と対象面との間で前後に伝わる反復位相回復アルゴリズムを用いる。従来のホログラム再構築と同様に、記録したホログラムは、ホログラムを記録するのに使用した基準波のデジタル的レプリカである再構築波とデジタル的に乗算される。したがって、反復位相回復ステップの前に、まず、ホログラムを角度θｒｅｃ傾いている平面波と乗算する。サンプルチャンバ内の光の屈折によって、この再構築波の傾斜角度、θｒｅｃが、照明ファイバの物理的な傾きと同じではないことも重要である。実際、θｒｅｃは、Δｄ／ｚ２の逆タンジェントを計算することで決まる。ここで、Δｄは、縦型投影ホログラムにおける生ホログラムの位置に対する横方向のシフトであり、ｚ２は実験的に得るか、あるいは縦型ホログラム画像のデジタル再構築距離によって決まる。集束は、通常１０乃至２０回の反復で達成され、その後、検出器に平行な物体面の光場が得られる。それにもかかわらず、照明方向に垂直である投影画像を得るには、この光場を回転させる必要がある。これを達成するには、回復した場を、照明の傾斜方向に沿ってｃｏｓ（θｒｅｃ）分、リスケールした新しいグリッドに挿間する。これは、回復した場を効果的に絞り込み、対応する角度についての投影画像を提供する。
【００９６】
各照明角度における投影画像を計算すると、この画像を断層写真を計算する前に共通の回転中心に対して記録する必要がある（例えば、３つの投影画像が中心のビーズに対して整列している、図１４Ｃ（画像ｃ１乃至ｃ３）参照）。これは、自動化した２段階相互相関アルゴリズムを実装することによって達成される。第１の段階では、隣接する角度についての投影画像を、これらの隣接する投影の対象となる領域全体を相互相関させることによって、互いに整列させる（例えば、４２°と４６°；４６°と５０°）。連続する角度についての投影画像は互いによく似ているので、この操作は近似初期アラインメントを提供する。しかしながら、視野角に応じたシーンの若干の変化により、記録は完全ではない。第２の微調整段階では、投影画像の１つをグローバル基準画像として選択して、すべての投影画像をこの基準画像に対して記録するが、今回は投影画像中の対象となる小さな領域を利用する。この第２段階は、マイクロビーズなどの分散した小さな対象の画像を整列させる場合に、特に必要である。
【００９７】
逆フィルタ投影アルゴリズム（ここに参照により組み込まれているＲａｄｅｒｍａｃｈｅｒ  Ｍ．公報により詳細に記載されている）を用いて、無レンズ投影画像から対象の断層写真を計算する。このアプローチの妥当性についての基本的条件は、断層写真を計算する投影画像が対象の特性の線的総和を表すことである（例えば、位相、吸収、分散強度、他）。これは、一般的に、入射光子の大部分が対象の容量を超えて最大で単会分散事象を経験する場合である弱い分散対象によって満たされる。
【００９８】
弱い分散対象が、｜ｓ（ｘθ、ｙθ、ｚθ）｜≪１を満足する複雑な分散関数ｓ（ｘθ、ｙθ、ｚθ）によって表されると仮定する。ここで、（ｘθ、ｙθ、ｚθ）は、ｚ軸が特定の投影角度における照明角度に整列してる座標軸を規定する。この場合、相互干渉期間のホログラムに対する寄与は、実際のホログラフィック周波数変換機関に比較して、無視することができるであろう。この過程はさらに、システムの低空間コヒーレンス（横方向分離がコヒーレンス径より大きい対象間のクロストークを最小限に抑える）と一時的低コヒーレンス（分離がコヒーレンス長より長い異なる層間のクロストークを最小限に抑える）によって確認され、３Ｄコヒーレンスフィルタとして作用する。この結果、単一の断層写真容量（例えば、Δｚ〜±２５μｍに亘る）内の各投影画像について、ホログラフィックに再構築した画像コントラストが、∫｜ｓ（ｘθ、ｙθ、ｚθ）｜・ｄｚθで表される分散強度関数の線的和を生む。この結果は更に、検出開口数にかかわらず、デジタルインラインホログラフィスキームが一般的に、非常に長い焦点深度を有しており、その結果、所定のｚθ方向に沿った分散係数を概算して、適宜の二重画像削除ステップの後に線的に加算することによって証明される。その結果、対象の分散強度の断層画像を、入力が、様々な照明角度において取得したピクセル超解像無レンズホログラムのホログラフィック再構築によって計算した投影画像である、フィルタをかけた逆投影アルゴリズムを適用することによって計算することができる。
【００９９】
携帯型無レンズ断層写真顕微鏡の性能を評価するために、寸法の異なるマイクロビーズを、伝染性の寄生性扁形動物であるＨｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  Ｎａｎａの卵と共に撮像した。レンズ、レーザ、又はその他のコストのかかる光学機械部品を用いることなく、ここに述べた無レンズ断層写真顕微鏡が＜７μｍの軸方向解像度の断層像を提供し、一方で、〜２０ｍｍ３の大撮像容量に各投影画像のＮＡを最大〜０．３乃至０．４上げ得るピクセル超解像を実装した。更に、この容量は、空間解像度を低減して、最大〜８０ｍｍ３（〜４ｍｍのＤＯＦに対応する）まで拡大することができる。このように大きな撮像容量を超える良好な空間解像度を提供しつつ、この小型で、軽量（〜１１０ｇ）で、対費用効果の高い無レンズ断層写真顕微鏡は、遠隔治療及び遠隔位置における高スループット撮像アプリケーション用の有益なツールを提供することができる。
【０１００】
図１５Ｂは、直径２μｍのマイクロ粒子のデジタル的に合成したピクセル超解像（ＳＲ）ホログラムを示す。ここで、空間周波数がより高いホログラフィックフリンジを、図１５Ａに示す生の低解像度（ＬＲ）ホログラムと比較して観察することができる。この開口数（ＮＡ）が大きくなった結果、ＳＲホログラムを用いた再構築画像が、図１５Ｃと１５Ｄの視覚的な比較でわかるように、より高い方位解像度を示している。ここでは（ＳＲで）、２μｍのビーズを実際のサイズより近くで撮像している。
【０１０１】
次いで、図１５Ａ及び１５Ｂにそれぞれ示すＬＲ及びＳＲホログラムに対応して、再構築した深度プロファイルを考察した。図１５ＡのＬＲ無レンズホログラムをいくつかの異なる深度（ｚ）でデジタル的に再構築することによって、同じ２μｍの粒子に対応する図１５Ｅに示すｙ−ｚ及びｘ−ｚプロファイル（画像ａ１及びａ２）を得ることができる。この結果、ｚ方向に沿った拡大は深度断面に向けての単一ＬＲホログラムの制限を示している。この制限は、図１５Ｆ（画像ｂ１及びｂ２）に示すようにＳＲ無レンズホログラムを用いて部分的に改善される。一方、ＳＲでの開口数の改良にもかかわらず、例えば、〜４５μｍあるいはより良好な軸上解像度で対象の断面撮像をすることができない。
【０１０２】
この基本的な軸上解像度の制限を軽減するために、±５０°の範囲にわたる〜２０の照明角度について合成した無レンズＳＲホログラムを用いて、図１６Ａ乃至１６Ｃに示す同じマイクロ粒子の断層写真を作成した。図１６Ａ乃至１６Ｃに示すこの結果は、ビーズ画像の短い焦点深度で観察される携帯型無レンズ断層写真顕微鏡が軸上解像度を有意に改善することを表している。携帯型断層写真顕微鏡は、単一ＬＲホログラムと単一ＳＲホログラムでそれぞれ達成できる要因に比較して、＞１３×及び〜６乃至７×の要因で軸上解像度を改善する。
【０１０３】
携帯型無レンズ断層写真顕微鏡の深度セクショニング能力を更に示すために、光学接着剤（屈折率〜１．５２、Ｎｏｒｌａｎｄ  ＮＯＡ６５）を満たした厚さ〜５０μｍのチャンバ内にランダムに分散させた直径５μｍの球形マイクロビーズ（屈折率〜１．６８、Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）を撮像した。図１７Ａ乃至１７Ｅは、比較目的で使用した４０倍の対物レンズ（ＮＡ：０．６５）のＦＯＶに合致させるためにより大きい画像領域からデジタル的にクロップした対象小領域についての断層写真再構築結果を示す（図１７Ｆ乃至１７Ｊ）。チャンバの全深度についての無レンズ断層写真を、Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ (ＮＶｉｄｉａ，Ｇｅｆｏｒｃｅ  ＧＴＸ  ４８０)を用いて＜１分以内に計算した。図１７Ａ乃至１７Ｅの矢印は、画像の対応する層深度でフォーカスしているマイクロビーズを示しており、これは、図１７Ｆ乃至１７Ｊに示す、同じ深度で得られた標準的な顕微鏡の画像を用いて交差評価することができる。断層写真撮像性能を更に数量化するために、図１８Ａでは同じＦＯＶ内に位置する任意のマイクロビーズのｘ及びｙラインプロファイルを示す。ここでは、粒子の半値全幅（ＦＷＨＭ）をｘ及びｙ方向に沿ってそれぞれ、〜５μｍ及び〜５．５μｍとして計算することができ、これはその径（５μｍ）に良く合致している。同じビーズの断層写真（ｚ方向に沿った）の軸上ラインプロファイルは、図１８Ｂに見られるように、〜１２．９μｍのＦＷＨＭを有する。多角照明と断層写真デジタル再構築を使用せずに、単一のＳＲホログラムのみを使用すると、同じマイクロ粒子のコンピュータ画像は＞７５μｍの軸上ＦＷＨＭを有するであろう。これは、その焦点深度が長いため、インラインホログラフィック撮像プラットフォームでは予期されることである。図１８Ｂに示す軸上ラインプロファイルの一次元空間導関数（すなわち、そのラインプロファイル）を取ることによって、ｚ方向に沿った断層写真顕微鏡の点広がり関数のＦＷＨＭは〜６μｍになると予測できる（図１８Ｂの導関数曲線参照）。
【０１０４】
図４に示す無レンズホログラム記録ジオメトリは、特に、高スループットの撮像が必要な場合にいくつかの利点があり、長い焦点深度（例えば〜１．４ｍｍ）や、広い視野（例えば〜２０ｍｍ２）の両方を達成する。特に、無レンズホログラフィック投影は、対象となるどの深度でも再構築することができ、したがって、断層写真は特別な収差を導入することなくその深度領域付近で計算できる。このアプローチにより、長い被写界深度内の対象となる任意の領域の３Ｄ撮像が可能となり、したがって、撮像容量が大きくなる。
【０１０５】
この能力を特に示すために、多層チャンバ（間に〜１ｍｍの距離を置いて互いに重ねた、トータル厚さ〜３．５ｍｍの４層）を撮像した。この層は、光学接着剤に埋め込んだ１０μｍのビーズでできている。この厚い対象は、センサチップの活性領域から〜０．７ｍｍ離して配置されており、最も遠い層は、センサ面からｚ〜４．２ｍｍの位置にある。図１９Ａは、角度０°における多層チャンバの記録されたホログラムを示す図である。図１９Ｂ乃至１９Ｆは、この厚い対象の中の異なる層のコンピュータ断層写真を示す図であり、長いＤＯＦ内での無レンズ断層写真アプローチの光学的セクショニング能力を示している。異なる層において計算したこのような分離した断層写真をデジタル的に合成することによって、全ＤＯＦの断層写真と対象の体積を得ることができる。最も遠い層（センサから〜４．２ｍｍ離れている）における対象の無レンズホログラムは、センサの活性領域から上は４０°及び下は−４０°の照明角度に対してシフトしており、その結果、角度範囲は最上層に対してのみ±４０°に制限されている。厚い又は多層のチャンバの断層写真撮像用のピクセル超解像スキームのデジタル的実装には、追加の信号処理が必要である。なぜなら、有意に異なる深度に位置する対象は、センサ面における対応するホログラムの横方向のシフトに大きな変化があるためである。この問題に対処するために、反復アルゴリズムを用いて超解像ホログラムを所定の深度の層（すなわち、その他の層から独立して）について特別に計算できるようにした。図１９Ｇ乃至１９Ｉは、様々な深度についてのＳＲホログラムを示す（図１９Ｇ：ｚ＝〜０．７５ｍｍ；図１９Ｈ：ｚ＝〜１．８ｍｍ；図１９Ｉ：ｚ＝〜４．２ｍｍ）。
【０１０６】
上述した通り、例えば＜２００乃至３００μｍの高さに対象が分散されているチャンバについて、すべての対象のホログラムは所定のソースシフトとほぼ同じようにシフトする。したがって、すべてのサブピクセルシフトホログラムで測定したデータを満足する単一のＳＲホログラムを合成することができる。しかしながら、厚い又は多層のチャンバについては、＞２００乃至３００μｍ軸方向に離れている対象の無レンズホログラムは、有意に異なる量シフトし、異なるソースシフトについて記録したホログラムは異なって見える。この結果、シフトしたすべてのホログラムを満足する単一のＳＲホログラムを計算することはできない。この問題を解決するために、ホログラム強度から望ましくない層をデジタル的に消去することによって、所望の層についてのみの情報を持つ新しいホログラムを取得することができる。これを行うために、図１９Ａに示すような厚い（あるいは多層の）チャンバについての無レンズホログラムを、望ましくない層で再構築して、これらの層でフォーカスされた対象を、二値マスク操作を用いてホログラム場から除去するようにする。所望の層以外のすべての層を続けて消去することで、新しいデジタル的にクリーンなホログラムができる。このホログラムは、特に、対象の層深度について測定したデータに忠実である。センサにより近い層を消去することで、クリーンになったホログラムの残り部分を残すが、これらの残り部分は非常に弱いのでこのことは問題にならない。また、所望の層のホログラムは、もともと測定した生のホログラムデータに合致して完全な状態で残る。最終的に、様々なサブピクセルシフトがあるこれらの新しいホログラムが対象となる所定の層について得られると、その層深度のＳＲホログラムを順次計算することができる。図１９Ｇ乃至１９Ｉは、異なる深度におけるデジタル的にクリーンなＳＲホログラムを示している。
【０１０７】
バイオ医薬における潜在的なアプリケーションについての携帯型無レンズ断層写真顕微鏡の性能を評価するために、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  Ｎａｎａ（Ｈ．Ｎａｎａ）の卵を撮像した。Ｈ．Ｎａｎａの卵は、直径〜４０μｍのほぼ球形構造を持つヒトの伝染性寄生型扁虫である。無レンズインラインホログラフィの長い被写界深度によって、この卵の光学的切断は、所定の照明角度で記録したホログラムを再構築するだけではできない。しかしながら、図２０Ａに示すように、この寄生型卵の個別の深度セクション（画像ａ１、ａ２、ａ３）を、携帯型断層写真顕微鏡（図４に示す）を用いて作ることができ、各深度層における個々の詳細／特徴を示すことができる。比較の目的で、図２０Ａに見られるものと同じ深度位置での４０倍の顕微鏡画像を図２０Ｂに示す。
【０１０８】
実施例を示して説明したが、ここに開示した本発明の概念範囲から外れることなく様々な変形を行うことができる。したがって、本発明は特許請求の範囲とその均等物以外によっては制限を受けるべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月6日(2013.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル内に含まれる対象の三次元撮像システムにおいて：
画像センサと；  
前記サンプルを保持するように構成され、前記画像センサ近傍に配置されたサンプルホルダと；
部分コヒーレント光又はコヒーレント光を具える照明源であって、前記光源と前記サンプルホルダの間に配置された、開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路の少なくとも一つを通して前記サンプルを照明するように構成された照明源であって、複数の異なる角度で前記サンプルを照明するように構成されている照明源と；
撮像平面とほぼ平行な面において、前記開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路の少なくとも一つを搖動させる手段と；
を具えることを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記照明源と静止しているサンプルホルダのうちの少なくとも一つが、互いに対して移動可能であることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダがマイクロ流体フローセルを具えることを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項３に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダが前記画像センサに対して角度を成していることを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記複数の異なる角度が、約−８９°乃至＋８９°の範囲に亘ることを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムが更に、前記サンプルの三次元画像を、前記複数の異なる角度における照明から取得した画像に基づいて再構築するように構成された少なくとも一のデジタルプロセッサを具えることを特徴とするシステム。
【請求項７】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記搖動させる手段が、ステップモータ、移動可能なステージ、圧電素子、電磁アクチュエータ、及びソレノイドのうちの少なくとも一つを具えることを特徴とするシステム。
【請求項８】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記複数の角度が、三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とするシステム。
【請求項９】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記照明源が個々の照明源を選択的に作動させるように構成されたマイクロコントローラに動作可能に接続された複数の個別照明源を具えることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
サンプルに含まれる対象の三次元画像を取得する方法において：
第１の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光を出射する光源と共にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを照明するステップであって、前記サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルのうちの少なくとも一つを光が通過するステップと；
前記サンプルホルダを異なる角度で前記照明源を用いて照明するステップであって、前記サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルを光が通過するステップと；
各角度において、前記サンプルホルダの反対側に配置した画像センサから複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップであって、前記サブピクセル画像フレームの各々が、画像センサとほぼ平行な面において、前記開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路の少なくとも一つを搖動させることによって取得されるステップと；
各角度における前記サブピクセル画像フレームを、各角度について単一のより解像度が高いホログラムにデジタル的に変換するステップと；
前記より高い解像度のホログラムから各角度についての投影画像をデジタル的に再構築するステップと；
前記サンプル中の対象の三次元断層写真画像をデジタル的に逆投影するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記複数の角度が単一平面又は複数平面における複数の角度を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記複数の角度が三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法において、前記開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路の少なくとも一つを搖動させるステップが、電磁アクチュエータによって行われることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法が更に、
画像センサ近傍に配置したフローセルを通してサンプルを流すステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記フローセルが前記撮像センサアレイに対して角度を成していることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法において、前記第１の角度及び一またはそれ以上の異なる角度が前記フローの方向に対して若干角度を成しているアークに沿って成されており、約−８９°乃至＋８９°の間の範囲内にあることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2014507645.tif 000033
2014507645.tif 000034