(57)【要約】  本発明は、CD40上の特定のエピトープに特異的な抗体、及びCD40に結合し、特定の機能的特徴を有する抗体に関する。本発明は、これらの抗体の断片、移植片拒絶及び移植片対宿主病を軽減又は治療するための抗体の使用、並びに抗体を作出するための方法にも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD40上に存在するエピトープに特異的に結合する単離された抗体、又はその抗原結合性断片であって、前記エピトープが2C10抗体によって認識される、上記単離された抗体、又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
in vitroにおいて、CD154を発現しているジャーカット細胞によるBリンパ球の活性化を遮断する、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
Bリンパ球のCD23、CD80、又はCD86の発現を阻害する、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
前記Bリンパ球がアカゲザルBリンパ球である、請求項2又は3に記載の抗体。
【請求項５】
前記CD40がアカゲザルCD40である、請求項1に記載の抗体。
【請求項６】
前記CD40がヒトCD40である、請求項1に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の定常領域がヒト定常領域である、請求項1に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項1から9のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１１】
2C10抗体である、請求項10に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体の重鎖可変領域が配列番号2のアミノ酸20〜132、又はその抗体結合性部分若しくは断片を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体の軽鎖可変領域が配列番号4の23〜128の配列、又はその抗体結合性部分若しくは断片を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体の重鎖可変領域が配列番号2のアミノ酸20〜132を含み、前記抗体の軽鎖可変配列が配列番号4のアミノ酸23〜128を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗原結合性断片がFc部分を欠く抗体である、又はF(ab')2構造、Fab構造、Fv構造、若しくはscFv構造である、請求項1に記載の抗体結合性断片。
【請求項１６】
請求項1から15のいずれか1項に記載の抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項16に記載のポリヌクレオチドをコードするベクター。
【請求項１８】
請求項17に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
真核細胞である、請求項18に記載の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物細胞である、請求項19に記載の細胞。
【請求項２１】
原核細胞である、請求項19に記載の細胞。
【請求項２２】
対象における免疫系を抑制する方法であって、請求項1から15のいずれか1項に記載の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で前記対象に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項２３】
それを必要とする対象において、移植片拒絶を治療する、若しくは予防的に治療する、又は移植片拒絶が起こるまでの持続時間を増加させる方法であって、請求項1から15のいずれか1項に記載の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で前記対象に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項２４】
前記対象が臓器移植を受けた、又は臓器移植の必要がある、請求項22又は23に記載の方法。
【請求項２５】
前記臓器が、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、腸、及び胸腺、又はその部分からなる群から選択される請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が組織移植を受けた、又は組織移植の必要がある、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織が骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、又は骨髄である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与を、前記移植又は前記グラフトの前に開始する、請求項23から27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与を、前記移植又は前記グラフトの後少なくとも1ヶ月にわたって継続する、請求項23から28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与を、前記グラフトの前記移植の後、少なくとも6ヶ月にわたって継続する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
それを必要とする対象において、移植片対宿主病を治療する、又は予防的に治療する方法であって、請求項1から15のいずれか1項に記載の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で前記対象に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項３２】
それを必要とする対象において、自己免疫障害を治療する、又は予防的に治療する方法であって、請求項1から15のいずれか1項に記載の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で前記対象に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項３３】
前記自己免疫障害が、自己抗体が存在することに関連する、又はそれによって引き起こされる、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記障害が、全身性エリテマトーデス(SLE)、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー症候群、食道蠕動低下、強指症、及び毛細血管拡張症)、眼球クローヌス、炎症性ミオパチー(例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、及び封入体筋炎)、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、小児脂肪便症(例えば、グルテン過敏性腸症)、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー(AMAN)、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質症候群、ヴェグナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、多発性筋炎/強皮症重複症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、全身硬直症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シドナム舞踏病、連鎖球菌属(Streptococcus)に関連する小児自己免疫性精神神経疾患(PANDAS)、脳炎、1型糖尿病、及び視神経脊髄炎からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
前記障害が、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス(例えば、円板状エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、及び新生児エリテマトーデス)、多発性硬化症、及び反応性関節炎からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全症、シュミット症候群、自己免疫性ぶどう膜炎、副腎炎、甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄性疾患、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、成人発症型糖尿病(例えば、2型糖尿病)、男性及び女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織病、結節性多発性動脈炎、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、愛鳥家肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死融解症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サムター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、IgA腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染症、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、寒冷グロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、エプスタイン・バーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エバンス症候群、及び自己免疫性性腺機能不全からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が哺乳動物である、請求項22から36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象がヒトである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与が、非経口的、静脈内、皮下、経口的、局所的、くも膜下腔内、又は局部的である、請求項22から38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、前記抗体の6ヶ月以内に第2の作用剤を投与することをさらに含み、前記第2の作用剤が免疫抑制剤である、請求項22から39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第2の作用剤が、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス、mTor阻害剤、フィンゴリモド、ミリオシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、抗CD4モノクローナル抗体、抗LFA1モノクローナル抗体、抗LFA3モノクローナル抗体、抗CD45抗体、抗CD19抗体、モナバタセプト(monabatacept)、ベラタセプト、インドリル-ASC;アザチオプリン、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン[ウマ]、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ダクリズマブ、バシリキシマブ、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド、FK778、FK779、15-デオキシスパガリン、ブスルファン、フルダラビン、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、15-デオキシスパガリン、LF15-0195、ブレジニン、ブレキナル、及びムロモナブ-CD3からなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記カルシニューリン阻害剤がシクロスポリンA又はシクロスポリンGである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記mTor阻害剤がシロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、又はエベロリムスである、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗CD45抗体が抗CD45RB抗体である、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記第2の作用剤がベラタセプトである、請求項41に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体と前記第2の作用剤を互いから1ヶ月以内に投与する、請求項40から43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体と前記第2の作用剤を互いから1週間以内に投与する、請求項44に記載の方法。
【請求項４８】
抗体を作出する方法であって、
(a)2C10抗体によって認識されるエピトープを含むCD40断片を含むが、全長CD40タンパク質は含まないポリペプチドを、前記断片に対する免疫応答を生じさせるために十分な様式で哺乳動物に投与するステップと、
(b)前記哺乳動物から脾臓細胞を単離するステップと、
(c)前記脾臓細胞と骨髄腫細胞との間でハイブリドーマを形成するステップと、
(d)前記ハイブリドーマによって産生される前記抗体を精製するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、8〜40アミノ酸の長さのCD40断片を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項46又は47に記載の方法。
【請求項５１】
前記哺乳動物がマウス又はウサギである、請求項46に記載の方法。
【請求項５２】
請求項46又は49に記載の方法によって作製される抗体。
【請求項５３】
2C11抗体が結合する、100アミノ酸未満の長さのCD40の断片。
【請求項５４】
50アミノ酸未満の長さである、請求項51に記載の断片。
【請求項５５】
30アミノ酸未満の長さである、請求項52に記載の断片。
【請求項５６】
15アミノ酸未満の長さである、請求項53に記載の断片。
【請求項５７】
10アミノ酸未満の長さである、請求項54に記載の断片。
【請求項５８】
7〜50アミノ酸の長さである、請求項51に記載の断片。
【請求項５９】
8〜10アミノ酸の長さである、請求項56に記載の断片。
【請求項６０】
前記CD40がCD40の細胞外ドメイン由来の断片である、請求項51から57のいずれか1項に記載の断片。
【請求項６１】
ヒトCD40細胞外ドメイン(配列番号6)の断片である、請求項58に記載の断片。
【請求項６２】
アカゲザル(Macacca mulatta)CD40細胞外ドメイン(配列番号5)の断片である、請求項58に記載の断片。
【請求項６３】
(a)請求項51から60までのいずれかに記載の断片と、
(b)異種配列と
を含む融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗CD40抗体、及び、例えば、移植片拒絶の可能性を低下させる、又は移植片拒絶までの持続時間を増加させるため、免疫抑制を誘発するため、又は自己免疫障害を治療するための、そのような抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系、特に体液性免疫系を抑制することは、臓器移植及び自己免疫障害の治療において有益である。臓器移植は、例えば、臓器の損傷を伴う生命にかかわる疾患の多くの形態を治療するための好ましい方法として登場した。細胞又は組織の移植を受けた生物体がその組織に対する望ましくない免疫応答を開始すると、移植拒絶反応が起こる。移植片拒絶は、組織型の一致によって最小限にすることができるが、一致した組織でさえも、一般にはドナーに拒絶される。したがって、組織移植の実質的に全ての場合に免疫抑制療法が必要である。
【０００３】
臨床的移植における結果の改善は、主に、拒絶応答を阻害するますます強力な非特異的免疫抑制薬が開発されることにより実現されてきた。短期的な結果は改善されたが、長期的な転帰は不十分なままである。移植された臓器の慢性の拒絶反応と闘うためには、生涯の免疫抑制剤が必要になる場合があり、これらの作用剤を使用することにより、心臓血管疾患、感染症、及び悪性腫瘍のリスクが劇的に増加する。
【０００４】
移植拒絶反応を軽減するための一つの潜在的標的は、CD40/CD154相互作用である。CD40は、Bリンパ球の表面上で発現され、CD154は、T細胞の表面上で発現される。これらの二種のタンパク質間の相互作用はB細胞の活性化に関連し、それがサイトカインの発現並びにCD23、CD80、及びCD86を含めた細胞表面マーカーの発現のトリガーとなる。抗CD154抗体を使用してこの相互作用を遮断することにより、非ヒト霊長類において、移植された組織の拒絶反応が軽減又は排除されることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
どんな種類の免疫抑制(例えば、移植手順における)についても、有効性と毒性のバランスがその臨床的許容性に関する重要な因子である。したがって、例えば、移植片拒絶及び自己免疫障害に関与する免疫学的経路を特異的に標的とする療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第1の態様では、本発明は、CD40(例えば、アカゲザルCD40、マウスCD40、又はヒトCD40)上に存在する、2C10抗体によって認識されるエピトープ(例えば、前記エピトープは、3A8抗体又はChi220抗体、又はその両方には認識されない)に特異的に結合する単離された抗体、又はその抗原結合性断片(例えば、Fc部分を欠く、又はF(ab')2構造、Fab構造、Fv構造、若しくはscFv構造である抗体)を特徴とする。抗体は、in vitroにおいて、CD154を発現しているジャーカット細胞によるBリンパ球(例えば、アカゲザルBリンパ球又はヒトBリンパ球)の活性化を遮断する能力を有してよい、又は、in vitroにおいてアカゲザルB細胞を阻害する、例えば、CD23、CD80、又はCD86の発現を低下させる能力を有してよい。抗体は2C10抗体であってよい。抗体はヒト定常領域を有してよい。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【０００７】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号2のアミノ酸20〜132によって定義される重鎖可変領域、その抗体結合性部分若しくは断片、又はそのヒト化型を含む。他の実施形態では、抗体の抗体軽鎖可変領域は、配列番号4の23〜128の配列、その抗体結合性部分若しくは断片、又はそのヒト化型を含む。他の実施形態では、抗体の重鎖可変領域は配列番号2のアミノ酸20〜132を含み、抗体の軽鎖可変配列は配列番号4のアミノ酸23〜128を含む。
【０００８】
本発明は、第1の態様の抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのベクターを含む細胞も特徴とする。細胞は、真核細胞(例えば、ヒト、マウス、サル又はウサギの細胞などの哺乳動物細胞)であってよい、又は原核細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞などの細菌細胞)であってよい。
【０００９】
別の態様では、本発明は、対象における免疫系を抑制する方法(例えば、ヒトなどの哺乳動物)を特徴とする。該方法は、第1の態様の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で対象に投与するステップを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象(例えば、ヒトなどの哺乳動物)において移植片拒絶を治療する若しくは予防的に治療する、又は移植片拒絶が起こるまでの持続時間を増加させる方法を特徴とする。該方法は、第1の態様の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で対象に投与するステップを含む。
【００１１】
前の二つの態様のいずれにおいても、対象は、臓器移植(例えば、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、腸、及び胸腺、又はその部分)又は組織移植(例えば、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、又は骨髄)を受けていてよい、又はそれを必要としていてよい。
【００１２】
前の二つの態様のいずれにおいても、投与は、移植又はグラフトの前に開始されてよい。投与は、移植又はグラフトの後少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、7日又は10日;2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、又は12週間;3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、8ヶ月、10ヶ月、12ヶ月、24ヶ月、又は36ヶ月にわたって継続されてよい。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象(例えば、ヒトなどの哺乳動物)において移植片対宿主病を治療する又は予防的に治療する方法を特徴とする。該方法は、第1の態様の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で対象に投与するステップを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象(例えば、ヒトなどの哺乳動物)において自己免疫障害を治療する又は予防的に治療する方法を特徴とする。該方法は、第1の態様の抗体、又はその抗原結合性断片を有効量で対象に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、自己免疫障害は、自己抗体が存在することに関連する、又はそれによって引き起こされる(例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー症候群、食道蠕動低下、強指症、及び毛細血管拡張症)、眼球クローヌス、炎症性ミオパチー(例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、及び封入体筋炎)、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、小児脂肪便症(例えば、グルテン過敏性腸症)、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー(AMAN)、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質症候群、ヴェグナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、多発性筋炎/強皮症重複症候群(scleromyositis)、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、全身硬直症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シドナム舞踏病、連鎖球菌属(Streptococcus)に関連する小児自己免疫性精神神経疾患(PANDAS)、脳炎、1型糖尿病、及び視神経脊髄炎)。他の実施形態では、障害は、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス(例えば、円板状エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、及び新生児エリテマトーデス)、多発性硬化症、及び反応性関節炎からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、障害は、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全症、シュミット症候群、自己免疫性ぶどう膜炎、副腎炎、甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄性疾患、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、成人発症型糖尿病(例えば、2型糖尿病)、男性及び女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織病、結節性多発性動脈炎、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、愛鳥家肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死融解症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サムター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング、心内膜炎、心内膜心��線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎(heterochronic cyclitis)、フックス毛様体炎(Fuch's cyclitis)、IgA腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染症、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群(post vaccination syndrome)、先天性風疹感染症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、寒冷グロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、エプスタイン・バーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エバンス症候群、及び自己免疫性性腺機能不全からなる群から選択される。
【００１５】
前の三つの態様のいずれにおいても、投与は、非経口的、静脈内、皮下、経口的、局所的、くも膜下腔内、局部的、又は本明細書に記載の任意の経路によるものであってよい。
【００１６】
前の四つの態様のいずれにおいても、該方法は、6ヶ月以内(例えば、抗体を投与してから3ヶ月以内、2ヶ月以内、又は1ヶ月以内;4週間以内、3週間以内、2週間以内、又は1週間以内;6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、又は1日以内;又は18時間以内、12時間以内、6時間以内、3時間以内、2時間以内、又は1時間以内)に第2の作用剤を投与することをさらに含んでよく、第2の作用剤は免疫抑制剤である。第2の作用剤は、カルシニューリン阻害剤(例えば、シクロスポリンA又はシクロスポリンG)、タクロリムス、mTor阻害剤(例えば、シロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、又はエベロリムス)、フィンゴリモド、ミリオシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、抗CD4モノクローナル抗体、抗LFA1モノクローナル抗体、抗LFA3モノクローナル抗体、抗CD45抗体(例えば、抗CD45RB抗体)、抗CD19抗体、モナバタセプト(monabatacept)、ベラタセプト、インドリル-ASC;アザチオプリン、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン[ウマ]、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ダクリズマブ、バシリキシマブ、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド、FK778、FK779、15-デオキシスパガリン、ブスルファン、フルダラビン、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、15-デオキシスパガリン、LF15-0195、ブレジニン、ブレキナル、及びムロモナブ-CD3からなる群から選択することができる。ある特定の実施形態では、第2の作用剤はベラタセプトである。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、抗体を作出する方法を特徴とする。該方法は、(a)2C10抗体によって認識されるエピトープを含むが、全長CD40分子は含まないCD40ポリペプチドの断片(例えば、50アミノ酸未満、40アミノ酸未満、30アミノ酸未満、20アミノ酸未満、10アミノ酸未満の長さであるが、6アミノ酸超、8アミノ酸超、又は10アミノ酸超の長さ)を含むポリペプチドを、前記断片に対する免疫応答を生じさせるために十分な様式で哺乳動物(例えば、マウス又はウサギ)に投与するステップと、(b)哺乳動物から脾臓細胞を単離するステップと、(c)脾臓細胞と骨髄腫細胞の間でハイブリドーマを形成するステップと、(d)ハイブリドーマによって産生される抗体を精製するステップとを含む。ポリペプチドは、融合タンパク質(例えば、CD40断片とキーホールリンペットヘモシアニン又はグルタチオンＳ-転移酵素との間の融合タンパク質)であってよい。本発明は、そのような方法によって作製される抗体も特徴とする。
【００１８】
別の態様では、本発明は、2C11抗体が特異的に結合する、150アミノ酸未満(例えば、120アミノ酸未満、100アミノ酸未満、80アミノ酸未満、70アミノ酸未満、60アミノ酸未満、50アミノ酸未満、40アミノ酸未満、30アミノ酸未満、20アミノ酸未満、15アミノ酸未満、12アミノ酸未満、11アミノ酸未満、10アミノ酸未満、9アミノ酸未満、8アミノ酸未満、又は7アミノ酸未満)の長さのCD40の断片を特徴とする。ある特定の実施形態では、断片は、8〜10アミノ酸、8〜12アミノ酸、8〜15アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜30アミノ酸、8〜40アミノ酸、8〜50アミノ酸、8〜60アミノ酸、8〜70アミノ酸、8〜80アミノ酸、又は8〜100アミノ酸の長さである。他の実施形態では、断片は7〜10、7〜12、7〜15、7〜20、7〜30、7〜40、7〜50、7〜60、7〜70、7〜80、又は7〜100の長さである。CD40断片は、CD40の細胞外ドメイン(例えば、配列番号5及び6)由来であってよい。本発明は、本明細書に記載の断片と異種配列とを含む融合タンパク質も特徴とする。
【００１９】
「特異的に結合する」とは、特定のエピトープを認識し、結合するが、試料(例えば、他のポリペプチド、核酸、及び/又は他の生体分子を自然に含む生体試料)中に存在する他の分子は実質的に認識せず、結合しない化合物又は抗体を意味する。一実施例では、2C10抗体によって認識されるCD40エピトープに特異的に結合する抗体は、CD40上に存在する他のエピトープには結合しない。
【００２０】
抗体の「抗原結合性断片」とは、全長抗体の標的抗原に特異的に結合することができる抗体の任意の断片又は部分を意味する。
【００２１】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域(HVR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び/又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)のHVR由来の残基と交換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク(FR)残基(すなわち、超可変領域以外の可変領域内の残基)が対応する非ヒト残基と交換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において又はドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。これらの改変を行って抗体の性能をさらに改良することができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、一般には二つの可変ドメインの実質的に全てを含んでよく、その超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、FRの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列である。ヒト化抗体は、場合によって、免疫グロブリン定常領域(Fc)、一般にはヒト免疫グロブリンの定常領域(Fc)の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、例えば、Jonesら、Nature 321:522-25、1986;Riechmannら、Nature 332:323-29、1988;及びPresta、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-6、1992を参照されたい。例えば、Vaswaniら、Ann. Allergy Asthma & Immunol. 1:105-15、1998;Harris、Biochem. Soc. Transactions 23:1035-8、1995;Hurleら、Curr. Op. Biotech. 5:428-33、1994;及び米国特許第6,982,321号及び同第7,087,409号も参照されたい。
【００２２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体及び/又は本明細書に開示されているヒト抗体を作出するための技法のいずれかを用いて作出された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。このヒト抗体の定義では、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体は明確に排除される。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリーを含めた当技術分野で公知の種々の技法を用いて作製することができる(Hoogenboomら、J. Mol. Biol. 227:381-8、1992;Marksら、J. Mol. Biol、222:581-97、1991)。Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、77頁(1985);Boemerら、J. Immunol. 147:86-95、1991に記載の方法も、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である。Van Dijkら、Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74、2001も参照されたい。ヒト抗体は、抗原を、抗原による攻撃に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内在遺伝子座は無効になっているトランスジェニック動物、例えば、免疫化ゼノマウス(ｘenomice)に投与することによって調製することができる(例えば、XenoMouse(登録商標)技術に関する米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号を参照されたい)。例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62、2006も参照されたい。
【００２３】
対象における疾患、障害、又は状態を「治療すること」とは、対象に治療剤を投与することによって疾患、障害、又は状態の少なくとも一つの症状を軽減することを意味する。
【００２４】
対象における疾患、障害、又は状態を「予防的に治療する」とは、1種以上の疾患症状が現れる前に対象に治療剤を投与することによって疾患、障害又は状態の出現頻度又はその重症度を低下させること(例えば、予防すること)を意味する。
【００２５】
「有効量」という用語は、医学的状態(例えば、移植片拒絶又は移植片対宿主病)の生理作用を有効に治療するために必要な用量を意味する。
【００２６】
「免疫抑制剤」とは、免疫抑制を誘発する化合物又は組成物を意味する、すなわち、免疫抑制剤は、免疫学的応答(例えば、細胞性又は体液性)の発生を低下させる(例えば、予防する)又はそれに干渉する。
【００２７】
「対象」とは、ヒト又は非ヒト動物(例えば、哺乳動物)を意味する。
【００２８】
「融合タンパク質」とは、(a)対象のタンパク質又はその断片と、(b)異種融合パートナーとを含有するポリペプチドを意味する。
【００２９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態、図、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】2C10抗体の重鎖由来の可変領域及び軽鎖由来の可変領域を示す配列である。重鎖について示されているヌクレオチド配列(配列番号1)は、シグナルペプチド(ヌクレオチド1〜57;下線が引かれている)及び重鎖可変配列(ヌクレオチド58〜396)を含む。対応するアミノ酸配列(配列番号2)が下に示されており、アミノ酸1〜19はシグナル配列に対応し(下線が引かれている)、アミノ酸20〜132は、重鎖可変領域に対応する。軽鎖について示されているヌクレオチド配列(配列番号3)は、シグナルペプチド(ヌクレオチド1〜66;下線が引かれている)及び軽鎖可変配列(ヌクレオチド67〜384)を含む。対応するアミノ酸配列(配列番号4)が下に示されており、アミノ酸1〜22はシグナルペプチドに対応し(下線が引かれている)、アミノ酸23〜128は軽鎖可変領域に対応する。
【図２】［図２Ａ］ヒトCD20+B細胞及びアカゲザルCD20+B細胞への2C10の結合が確認されるフローサイトメトリーのデータを示すプロットである。［図２Ｂ］ヤギ抗マウスIgG-HRPを用いて検出されるヒトCD40及びアカゲザルCD40への2C10の結合を確認するために種々の濃度の2C10を用いたELISAアッセイからのCD40吸着データを示すプロットである。
【図３】B細胞への2C10の結合のCD154による用量依存的な阻害を示すグラフである。B細胞を、CD154結合性について、ヒスチジンタグを付けた可溶性CD154と一緒にインキュベートし、ヒスチジンの発現について分析することによって分析した。結果は、実験の多数の反復を表す。
【図４】アカゲザル又はヒトの末梢血単核細胞(PBMC)及びジャーカット細胞を伴うアッセイの原理を示す概略図及びグラフである。
【図５】種々の濃度の3A8抗体、5C8抗体、又は2C10抗体の存在下のアカゲザルPBMCとジャーカット細胞の共培養物から取得したCD20+細胞におけるCD23の発現を示す一連のグラフである。
【図６】種々の濃度の3A8抗体、5C8抗体、又は2C10抗体の存在下でのヒトPBMCとジャーカット細胞の共培養物から取得したCD20+細胞におけるCD86の発現を示す一連のグラフである。
【図７】3A8抗体又は2C10抗体のいずれかの存在下でジャーカット細胞を伴わずに培養したヒトPBMC又はアカゲザルPBMCのいずれか由来のCD20+細胞におけるCD23の発現を示す一連のグラフである。
【図８】アカゲザルのIgG1重鎖定常領域(2C10R1)又はIgG4重鎖定常領域(2C10R4)のいずれかを含有するように工学的に操作したマウス-アカゲザルキメラ型の2C10、及び抗CD40 3A8(3A8R1)又は抗CD40 Chi220(Chi220)のキメラIgG1型で処置したアカゲザルの末梢B細胞数を示すグラフである。全ての動物を、最初の抗体処置後に4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチルとコンジュゲートしたキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を用いて免疫化した。
【図９】2C10R1抗体、2C10R4抗体、又は3A8R1抗体で処置したマカクザルにおけるT細胞依存性抗体応答を示すグラフである。全ての動物を、最初の抗体処置後にKLHを用いて免疫化した。
【図１０】同種異系島移植の標準マカクモデルを示す図である。マカクザルにおいて、ストレプトゾトシンを使用して糖尿病を誘発した。糖尿病のサルに同種異系の島を移植し、バシリキシマブ及びシロリムスを用いて免疫抑制を開始した。移植後0日目及び7日目に、実験動物を2C10R4処置した。
【図１１】［図１１Ａ］島移植し、バックグラウンド免疫抑制し、2C10R4で処置した後の4匹のマカクにおける遊離の血中グルコースレベル(FBG)を示すプロットである。プロット上の実線は血漿中の2C10のレベルを示す。［図１１Ｂ］バックグラウンド免疫抑制のみを受けたマカクにおけるFBGを示すプロットである。
【図１２】2C10を交差遮断(cross-block)する各抗体の能力を評価するための、漸増濃度の2C10抗体、3A8抗体、又はChi220抗体と一緒にインキュベートし、APCとコンジュゲートした2C10を用いて染色したヒトPBMCを使用した競合的遮断アッセイからの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、CD40分子上の特定のエピトープに結合することができる抗CD40抗体及び抗体断片、並びにそのような抗体の使用を伴う方法に関する。このエピトープ特異性により特定の活性プロファイルが付与され、したがって、抗体は一般に、CD40のその結合パートナー(例えば、CD154)と相互作用する能力を、CD40を発現している細胞を活性化することなく遮断する。この活性プロファイルによりこれらの抗体が臓器又は組織移植に付随する合併症を低下させるために特に有用なものになることが理解される。
【００３２】
CD40抗体の作製及び同定
マウス(AJ系統)を、マルトース結合性タンパク質と融合したアカゲザル(M. mulatta)CD40の細胞外ドメイン(アミノ酸配列:EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCV;配列番号5)からなる融合タンパク質(CD40-MBP)を用いて免疫化した。アカゲザルCD40タンパク質のこの領域内のアミノ酸配列は、ヒトCD40タンパク質とは五つのアミノ酸位で異なる(ヒトアミノ酸配列:EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETD TICTCEEGWHCTSEACESCV;配列番号6)。CD40-MBPを完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントと一緒にマウスに多数回投与した。免疫化マウス由来の脾細胞をマウス骨髄腫細胞株P2/0と融合し、標準のハイブリドーマ技術を用いてハイブリッドを選択した。
【００３３】
抗体を、グルタミン合成酵素と融合した同じアカゲザルCD40ドメインからなる第2の融合タンパク質(CD40-GST)に対する反応性について選択した。ELISAによりCD40-GSTに対して反応性であった抗体を、アカゲザル血液B細胞、ヒト血液B細胞及びアカゲザルB-リンパ芽球様細胞株上で発現しているネイティブなCD40に対する反応性についてフローサイトメトリーによってさらに試験した。最終レベルの選択として、抗体をin vitroアッセイにおいて、CD154を発現しているジャーカットD1.1細胞と共培養した後に、ヒトB細胞又はアカゲザルB細胞の活性化を阻害するそれらの能力について試験した。抗CD40抗体2C10の安定なサブクローンを限界希釈によって得た。抗体は、マウスIgG1-カッパである。
【００３４】
抗体のクローニング
モノクローナル抗体の可変領域を当技術分野で公知の任意の方法を用いてクローニングすることができる。ハイブリドーマ細胞の抗体可変領域配列を得るためのPCRに基づく方法は、例えば、Larrickら、Nat. Biotechnol. 7:934-8、1989及びOrlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-7、1989に記載されている。これらの技法又は同様の技法を使用して、モノクローナル抗体の可変領域をクローニングし、さらなる操作に供することができる。
【００３５】
本発明の場合、2C10抗体の重鎖及び軽鎖由来の可変配列をクローニングし、配列決定した。2C10ハイブリドーマ由来の免疫グロブリン重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を表しているDNAを、5'RACE PCRを以下のDNAプライマーを使用して用い、クローニングした:
マウスカッパリバース:5'-CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTTGAC(配列番号7);
マウスカッパフォワード:5'-GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC-3'(配列番号8)
マウスIgG1リバース:5'-GGC AAC GTT GCA GGT CTC GC-3'(配列番号9)
マウスIgG1フォワード:5'-CTG GAT CTG CTG CCC AAA CTA ACT CC-3'(配列番号10)
PCR産物を、市販のクローニングベクターにクローニングし、標準の配列決定技法を用いて配列決定した。生じた配列が図1に提供されている。
【００３６】
免疫グロブリン可変領域遺伝子を、抗CD40抗体クローン2C10を分泌するハイブリドーマから、及び抗ヒトCD40クローン3A8 (Kwekkeboomら、Immunology 79:439-44、1993)(American Type Culture Collection、ATCC、Vienna、VAから入手した)から、cDNA末端の5'急速増幅ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニングした。免疫グロブリン重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、アカゲザルIgG1重鎖定常領域配列又はアカゲザルIgG4重鎖定常領域配列及びアカゲザルカッパ軽鎖定常領域配列を含有する発現ベクターにサブクローニングした。
【００３７】
組換え型の重鎖及び軽鎖を、発現ベクターにサブクローニングし、レトロウイルスベクターにパッケージングし、GPEx(商標)発現技術(Catalent Pharma Solutions、Middleton、WI)を用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞に形質導入するために使用した。形質導入された細胞のプールを無血清培地で成長させ、分泌された抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製されたキメラアカゲザルのIgG1(2C10R1、3A8R1)抗体及びIgG4(2C10R4)抗体を、リン酸緩衝液でダイアフィルトレーションした。内毒素レベルは、1内毒素単位/mg未満であることが確認された。
【００３８】
抗体の特徴付け
2C10はCD40に結合し、CD154の結合を妨げる
アカゲザルCD40及びヒトCD40のどちらにも結合する2C10の能力を評価するために、組換えによって発現させたヒトCD40又はアカゲザルCD40をELISAプレートに吸着させ、種々の濃度の2C10と反応させた。CD40への2C10の結合を、ELISAでヤギ抗マウスIgG-HRPを使用して検出した。図2Bの結果により、2C10がアカゲザルCD40及びヒトCD40に対して同様の結合親和性を有することが示されており、これは、2C10を臨床的に解釈するために重要である。2C10の、その同族リガンドであるCD154の結合を遮断する能力を確認するために、アカゲザルB細胞及びヒトB細胞を、濃度を段階的に増加させた2C10又はアイソタイプ対照と一緒にインキュベートし、次いで、ヒスチジンタグを付けた可溶性CD154(R&D Systems、Minneapolis、MN)と一緒にインキュベートし、ヒスチジンの発現について分析した。2C10によりCD154の結合が用量依存的に遮断され(図3)、これにより、2C10が、B細胞及び抗原提示細胞上のT細胞と結合したCD154とCD40の相互作用を有効に遮断することができることが示されている。
【００３９】
2C10により、アカゲザル末梢血単核細胞及びヒト末梢血単核細胞におけるB細胞の活性化が遮断される
アカゲザル末梢血単核細胞(PBMC)及びヒト末梢血単核細胞(PBMC)を使用して、CD40抗体2C10をB細胞の活性化に影響を及ぼすその能力に関して特徴付けた。CD20の発現をB細胞の指標として選択し、CD23、CD80、及びCD86の発現をB細胞の活性化と関連づける。まず、2C10をCD20に結合するその能力について評価した。アカゲザルPBMC又はヒトPBMCを、蛍光色素とコンジュゲートした2C10及び抗CD20抗体と一緒にインキュベートした。フローサイトメトリー分析を用いてヒトCD20+B細胞及びアカゲザルCD20+B細胞への2C10の結合を確認した(図2A)。実験の別のセットでは、アカゲザル又はヒトいずれか由来のPBMCを、不死化Tリンパ球細胞株であるCD154+ジャーカットD1.1細胞の存在下又は不在下で培養した。B細胞の活性化を、PBMCに存在するCD20+細胞における三つのマーカー(CD23、CD80、及びCD86)の発現を測定することによって決定した。このアッセイの一般的なスキームが図4に示されている。図4に示されている通り、PBMCをジャーカット細胞の存在下で培養することにより、三つのマーカー全ての発現が増加し、これは、B細胞がCD154+ジャーカット細胞によって活性化されることを示している。
【００４０】
B細胞の活性化を遮断する抗体の能力を試験するために、PBMCとジャーカット細胞を、三つの抗体:3A8、5C8、及び2C10のうちの一つの存在下又は不在下で共培養した。3A8抗体はマウス抗ヒトCD40抗体(ATCC寄託番号HB-12024)であり、5C8は抗CD154抗体(ATCC寄託番号CRL-10915)である。それぞれを陽性対照として使用した。5桁の抗体濃度の範囲(0.001μg〜10μg)にわたって共培養を行った。図5に示されている通り、3A8は、CD23の発現によって測定された通りアカゲザルPBMCにおけるB細胞の活性化を遮断しなかったが、2C10及び5C8はどちらも同様の効率で活性化を遮断することができた。CD80の発現及びCD86の発現を用いても対応する変化が観察された。これらの結果により、2C10が3A8とは異なるCD40のエピトープに結合することが示されている。これらの結果により、3A8は弱い刺激潜在力を伴う部分的なアゴニストとしての機能を果たすことが示されているのとは対照的に、2C10は主にCD40アンタゴニストとして作用することも示されている(Adamsら、J. Immunol. 174:542-50、2005、Badellら、Am. J. Transplant. 2011年出版予定)。同様の実験を、アカゲザルPBMCではなくヒトPBMCを使用して実施したところ、2C10及び5C8のどちらによっても、CD86の発現によって測定された通り、B細胞の活性化が同様の効率で遮断されることが再度観察された。この場合、アカゲザルPBMCとは異なり、3A8抗体によりB細胞の活性化が遮断された(図6)。
【００４１】
2C10抗体及び3A8抗体を、ジャーカット細胞の不在下でB細胞を活性化するそれらの能力についても、アカゲザルPBMC又はヒトPBMCを使用して試験した。この場合、PBMCを2C10又は3A8のいずれかの存在下又は不在下で培養した。次いで、CD20+細胞におけるCD23、CD80、及びCD86の発現を測定した。図7に示されている通り、アカゲザル細胞におけるCD23の発現は、3A8抗体の存在下では増加したが、2C10抗体の存在下では増加しなかった。対照的に、3A8及び2C10のいずれによっても、ヒトB細胞は活性化されなかった。3A8抗体と2C10抗体の間で観察された活性の差異により、2C10抗体が、3A8抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合することが示されている。
【００４２】
2C10により、T細胞依存性抗体応答が妨げられる
2C10がCD40上の独特のエピトープに結合し、抗CD154抗体と同様にB細胞の活性化を阻害し、アゴニストの性質を欠くことが確立されたので、次いで、in vivoにおける2C10の効果を特徴付けた。組換えマウス-アカゲザルキメラ型2C10を、アカゲザルIgG1(2C10R1)重鎖定常領域配列又はIgG4(2C10R4)重鎖定常領域配列及びアカゲザルカッパ軽鎖定常領域配列を使用して生成した。キメラアカゲザルIgG1型3A8(3A8R1)も、対照として使用するために生成した。
【００４３】
アカゲザルを、0日目に4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチルとコンジュゲートしたキーホールリンペットヘモシアニン(KLH、10mg IM)抗原(Biosearch Technologies、Novato、CA)を用いて1回免疫化した。免疫化する前、及び1週間の時点で、動物3匹のコホートに、2C10R1、2C10R4、3A8R1、又は生理食塩水の静脈内用量(50mg/kg)を与えた。全ての動物を70日間観察し、フローサイトメトリーを週に1回実施した。組換え2C10アイソタイプのいずれを用いた処置によっても、以前報告された、3A8R1(Badellら、Am. J. Transplant. 10:214、2010)又はChi220(Adamsら、J. Immunol. 174:542-50、2005)のいずれかを受けた動物において起こった有意かつ持続性の末梢B細胞の枯渇と比較して、末梢B細胞数にそれほど大きくない変化がもたらされた(図8)。
【００４４】
KLH-NPに対するT細胞依存性抗体応答をELISAによって試験した。プレートを、KLH(0.01 mg/ml、Sigma、St. Louis、MO)でコーティングし、Super Block(Thermo Scientific、Woodstock、GA)を用いてブロッキングした。処置前及び処置後の血漿試料を段階的に希釈し、1時間プレーティングし、リン酸緩衝食塩水/0.05%Tweenで洗浄した。抗KLH抗体を、モノクローナル抗アカゲザルIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(クローン1B3、NHP Reagent Resource、Boston、MA)と一緒に1時間インキュベートすることによって検出した。次いでプレートを、ペルオキシダーゼ基質溶液(KPL)と一緒にインキュベートした。次いで停止液(KPL)を加え、ELISAプレートリーダーで、450nmにおける光学濃度を読み取った。所与の希釈度の試料を、処置後の血漿の光学濃度の読み取りが、同じ希釈度において処置前の血漿の光学濃度の2倍になった場合に陽性とみなした。KLH免疫化の後、対照の動物において力価の高いKLH特異的IgGが発生した(図9)。3A8R1を受けた動物でも抗KLH応答が発生したが、B細胞が有意に枯渇していたにもかかわらず力価は対照のおよそ10分の1であった。対照的に、IgG抗KLH抗体の生成は、2C10R1又は2C10R4のいずれかを受けた全ての動物において、56日目を通してほぼ完全に遮断された。
【００４５】
同種異系島移植のマカクモデルにおいて、2C10により島同種移植片の生存が有意に延長される
CD4精製キメラアカゲザルIgG4抗体である2C10R4について、非ヒト霊長類同種間島移植モデルにおいてさらに試験した(図10)。体重10〜20kgのアカゲザルに、移植の1日前に正中線開腹術によってドナー膵切除術を行った。動物を放血死させた(terminally exsanguinated)後、膵臓を単離し、氷上に置いた。島の単離を、コラゲナーゼ/中性プロテアーゼ(それぞれ950 Wunsch単位及び63単位;Serva、Heidelberg、Germany)を使用して実施した。消化した膵臓を4層、不連続なEuroficoll勾配(Mediatech、Manassas、VA)及びCobe 2991血液細胞プロセッサ(CaridianBCT、Lakewood、CO)で精製した。最終的な島調製物の試料を計数し、島当量(islet equivalent)(IEQ)として表した。単離した島を一晩培養し、計数し、移植培地(Mediatech)に懸濁させた。
【００４６】
体重3〜5kgのアカゲザルを、移植の4週間前にストレプトゾトシン(1250 mg/m2 IV;Zanosar、Teva Parenteral Medicines、Irvine、CA)を使用して糖尿病にした。ブドウ糖500mg/kgのボーラスを用いた静脈内耐糖能検査(IVGTT)及び霊長類C-ペプチドの測定によって糖尿病を確認した。グルコースレベルをモニターし、C-ペプチドをベースライン及びブドウ糖を注射した後10、30、60及び90において測定した。検出可能な血清C-ペプチドの不在下での血中グルコースレベルの上昇を測定することによって糖尿病を確認した。糖尿病のレシピエントに、MHC不一致島同種移植を行った。平均15,745(±4,063)IEQを、小正中線開腹術及び腸間膜静脈へのカニューレ挿入によって注入した。
【００４７】
血中グルコースレベルを1日2回、綿棒によって測定した;NPH(Novolin;Novo Nordisk、Princeton、NJ)及びグラルギン(Lantus;Sanofi-Aventis、Bridgewater、NJ)インスリンを投与して、移植前及び移植片拒絶後の空腹時血中グルコース(FBG)を300mg/dL未満に維持した。移植後、IVGTTを定期的に実施して、グラフトの機能をモニターした。移植レシピエントについて週に1回フローサイトメトリー分析を行って、T細胞集団(CD3 V450、CD4 PerCP-Cy5.5、CD8 PerCp;BD Bioscience)及びB細胞集団(CD20 PE、BD Bioscience)をモニターした。島の生着後拒絶反応を、二日連続でFBGが130mg/dLを超えることと定義した。主要評価項目は、拒絶反応のない島グラフト生存であった。これらの実験に用いた全ての動物は、Emory University IACUC及びGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsガイドに従って処置した。
【００４８】
移植レシピエントは、2C10R4、バシリキシマブ(Simulect、Novartis、Basel、Switzerland)及びシロリムス、又はバシリキシマブとシロリムスのみのいずれかを受けた。2C10R4(50mg/kg)は手術後(POD)0日目及び7日目に静脈内に投与した。バシリキシマブ(0.3mg/kg)はPOD0及びPOD3に静脈内に投与した。シロリムスは毎日筋肉内に投与して、POD120まで5〜15ng/mlのレベルを実現した。バシリキシマブ及びシロリムスを単独で受けた3匹の動物は全て歴史的対照である(Badellら、J. Clin. Invest. 120:4520-312、2010)。これらの歴史的対照の二つ(RQz6及びRIb7)には、膵切除術によって糖尿病を誘発し、経口的にシロリムスを与えた。
【００４９】
上記のレジメンを用いた処置により、バシリキシマブ誘発及びシロリムス維持療法のみを受けた対照(図11B)と比較して有意に持続性の島グラフト生存がもたらされた(図11A)。2C10R4を受けた動物についての無拒絶反応グラフト生存時間の中央値は280日であり、それと比較して対照の動物では8日であった(p=0.010、表1)。薬物動態データにより、血漿2C10R4レベルがPOD100まで1μg/ml未満であることが予測される。POD120でシロリムスを中止したので、生存が最長であったレシピエント(304日)は、拒絶反応の前におよそ24週間にわたって免疫抑制を受けなかった。2C10R4で処置した動物で臨床的に関連性のある感染性合併症又は体重減少を発生した動物はいなかった。これらの結果は、2C10のIgG4アイソタイプを受けた動物を反映する。2C10(2C10R1)のIgG1アイソタイプをバシリキシマブ及びシロリムスと組み合わせて受けた追加的な動物2匹では、220日及び162日の同様に持続性のグラフト生存が実現された(データは示していない)。誘発療法として使用した2C10での陽性の結果を考慮すると、次のステップは、2C10を維持療法として投与することによって、グラフト生存に対する効果を評価することである。
【表１】
2014509855.tif 000002
【００５０】
CD28/B7経路と併せたCD40/CD154経路の遮断
CD40/CD154経路を遮断することは、他の同時刺激遮断作用剤と併せて有用であることを証明することができる。CD28/b7共刺激経路を遮断するために設計された高親和性バージョンのCTLA4-Igであるベラタセプトは、腎移植及び島移植の非ヒト霊長類モデル及び腎移植の第II相及び第III相臨床試験において有効であることが示されている(Larsenら、Transplantation 90:1528-35、2010、vincentiら、Am. J. Transplant. 10:535-46、2010、Adamsら、J. Immunol. 174:542-50、2005、Adamsら、Diabetes 51:265-70、2002、Larsenら、Am. J. Transplant. 5:443-53、2005、Vincentiら、N. Engl. J. Med. 358:770-81、2005)。BENEFIT試験により、ベラタセプトで処置した患者において優れた腎機能が明らかになったが、これらの患者では生検により診断された急性拒絶反応の発生率が高く、その悪性度がより重度であった(Larsenら、Transplantation 90:1528-35、2010、Vincentiら、Am. J. Transplant. 10:535-46、2010)。この急性拒絶反応の率の上昇及びCD40とB7遮断の間の相乗作用(Larsenら、Nature 381:434-8、1996)を考慮すると、次の目的は、非ヒト霊長類腎移植における2C10とベラタセプトの併用療法の有効性を試験することである。
【００５１】
エピトープのマッピング
抗体が結合する特定のエピトープを同定するための方法は当業者に公知である。標準の技法としては、抗体が結合する全長タンパク質に由来するオーバーラップしている短いペプチド(例えば、10〜30アミノ酸、例えば、20の長さ)を個別に、抗体に結合するそれらの能力について試験するペプチドスキャニング(peptide scanning)が挙げられる。そのような実験から、次に、抗体が結合するタンパク質の領域を決定することができる。
【００５２】
部位特異的突然変異誘発も、特定のタンパク質の抗原性領域(複数可)を同定するために用いることができる。この手法では、標的ポリペプチドに点突然変異を系統的に導入し、さまざまな位置に突然変異を有するペプチドに結合する抗体の能力を用いて、そのタンパク質の特定の領域が、抗体が結合するエピトープを含有するかどうかを決定する。
【００５３】
抗体エピトープは、標的タンパク質内に多数の突然変異を生成するために用いることができるショットガン突然変異誘発(Integral Molecular、Inc.、Philadelphia、Pa.)などのハイスループットな突然変異誘発技法を用いて同定することもできる。そのような方法体系により、タンパク質内のエピトープを効率的に同定することが可能になる。
【００５４】
CD40に対する種々の抗体が同様のエピトープに結合するかどうかを決定するために、in vitro競合的遮断アッセイを実施した。抗体2C10、3A8及びChi220、キメラIgG1 CD40特異的抗体をアッセイに使用した。Lightning Link抗体標識キット(Novus Biologics、Littleton、CO)を使用して2C10をアロフィコシアニン(APC)とコンジュゲートした。ヒトPBMCを、濃度を段階的に増加させた2C10、3A8、又はChi220と一緒にインキュベートし、次いで、APTとコンジュゲートした2C10を用いて染色して、2C10を交差遮断する各抗体の能力を評価した。図12に示されている通り、APCとコンジュゲートした2C10の結合は、漸増濃度の2C10では減少したが、Chi220又は3A8では減少しなかった。この結果により、2C10は、Chi220又は3A8のいずれとも異なる独特のエピトープに結合することが示されている。
【００５５】
追加的な抗体の生成
2C10によって認識されるCD40エピトープに対する追加的な抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、又は単一特異性抗体)を、例えば、当技術分野で公知の抗体を作出するための多数の方法のいずれかを用いて作出することができる。一実施例では、2C10抗体によって認識されるエピトープのコード配列を、グルタチオンＳ-転移酵素(GST)とのC末端融合物として発現させる(Smithら、Gene 67:31-40、1988)。融合タンパク質をグルタチオン-セファロースビーズで精製し、グルタチオンを用いて溶出し、トロンビンを用いて切断し(工学的に作製した切断部位において)、ウサギを免疫化するために精製する。一次免疫化を、フロイント完全アジュバントを使用して行い、その後の免疫化を、フロイント不完全アジュバントを使用して行う。抗体価を、GST融合タンパク質をトロンビンで切断したタンパク質断片を使用したウエスタンブロット及び免疫沈降分析を用いてモニターする。CNBr-セファロースとカップリングしたタンパク質を使用して免疫血清をアフィニティ精製する。抗血清特異性を、無関係のGSTタンパク質のパネルを使用して決定することができる。
【００５６】
GST融合タンパク質の代替の又は補助的な免疫原として、本発明のポリペプチドの比較的独特の免疫原性領域に対応するペプチドを生成し、導入したC末端リシンを通じてキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)とカップリングすることができる。これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清を同様にBSAとコンジュゲートしたペプチドでアフィニティ精製し、ペプチドコンジュゲートを使用したELISA若しくはウエスタンブロット分析によって、又はGST融合タンパク質として発現させたポリペプチドを使用したウエスタンブロット若しくは免疫沈降によって特異性を試験する。
【００５７】
あるいは、2C10抗体に認識されるCD40エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、標準のハイブリドーマ技術を用いて調製することができる(例えば、Kohlerら、Nature 256:495-7、1975;Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6:511-9、1976;Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6:292-5、1976;Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas、Elsevier、NY、1981を参照されたい)。モノクローナル抗体を作製したら、それを、ウエスタンブロット又は免疫沈降分析によって特異的な認識について試験することができる。あるいは、モノクローナル抗体は、上記の本発明のポリペプチド及びファージディスプレイライブラリーを使用して調製することができる(Vaughanら、Nat. Biotechnol. 14:309-14、1996)。
【００５８】
エピトープ断片は、標準の技法によって、例えば、PCR及び断片をpGEX発現ベクターにクローニングすることを用いて生成することができる。融合タンパク質を大腸菌(E.coli)において発現させ、グルタチオンアガロースアフィニティマトリックスを使用して精製する。抗血清の親和性又は特異性が低いことに関する潜在的な問題を最小限にするために、各タンパク質についてそのような融合物を二つ又は三つ生成し、各融合物を少なくとも二匹のウサギに注射する。連続的であり、例えば、少なくとも3回の追加免疫注射を伴ってよい注射によって抗血清を生じさせる。
【００５９】
大規模かつ低費用でポリクローナル抗体を生成するために、適切な動物種を選択することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化したウシの乳又は初乳から単離することができる。ウシの初乳は、IgGを1リットル当たり28g含有し、一方ウシの乳は、IgGを1リットル当たり1.5 g含有する(Ontsoukaら、J. Dairy Sci. 86:2005-11、2003)。ポリクローナル抗体は、免疫化したニワトリの卵黄から単離することもできる(Sarkerら、J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 32:19-25、2001)。
【００６０】
乳牛に使用するための多数のアジュバントが認可されている。本発明において有用なアジュバントとしては、これらだけに限定されないが、水中油型乳化アジュバントであるEmulsigen(登録商標)、DDA免疫賦活薬を伴う水中油型乳化アジュバントであるEmulsigen(登録商標)-D、共重合体免疫賦活薬を伴う水中油型乳化アジュバントであるEmulsigen(登録商標)-P、ブロック共重合体免疫賦活薬を伴う水中油型乳化アジュバントであるEmulsigen(登録商標)-BCL、カルボマーベースのCarbigen(商標)、及び共重合体ベースのPolygen(商標)が挙げられる。列挙されているアジュバントは全て、MVP Laboratories in Omaha、Nebrから市販されている。
【００６１】
有用な抗体は、いくつかの異なるスクリーニングアッセイで同定することができる。まず、抗体をELISAによってアッセイして、これらが免疫化抗原(すなわち、本明細書に記載のCD40エピトープ)に特異的であるかどうかを決定する。標準の技法を使用して、ELISAプレートを免疫原でコーティングし、抗体をプレートに加え、洗浄し、結合した抗体の存在を、抗体が生成された種のIgに特異的な第2の抗体を使用することによって検出する。
【００６２】
機能的in vitroアッセイ、例えば、単球由来樹状細胞に基づく中和アッセイ(neutralizing assay)を用いて、抗体をスクリーニングすることができる。
【００６３】
ヒト対象において回腸液中のウシ免疫グロブリンを直接測定することにより、著しい量の生存する免疫グロブリンが胃及び小腸を通って移行することが示された(Warnyら、Gut 44:212-7、1999)。トリ免疫グロブリン(IgY)をGI送達するために製剤化するための方法も記載されている(Kovacs-Nolanら、Immunol. Methods 296:199-209、2005)。
【００６４】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から1以上のアミノ酸残基が導入されていてよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と称され、これは、一般には、「移入」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的に、Winter及び共同研究者の方法(Jonesら、Nature 321:522-5、1986;Riechmannら、Nature 332:323-7、1988;Verhoeyenら、Science 239:1534-6、1988)の後に、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、対応する非ヒト種由来の配列で置換されたインタクトなヒト可変ドメインが実質的により少ない。実際には、ヒト化抗体は、一般には、ヒト抗体の少なくともいくつかの超可変領域残基並びに他の可変領域残基がげっ歯類抗体の類似の部位由来の残基で置換されたものである。
【００６５】
ヒト化抗体を作出するために使用する軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択が、抗原性を低下させるために重要であり得る。いわゆる「最良適合」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変性ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。そこで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして許容される。例えば、Simsら、J. Immunol. 151:2296-308、1993;Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-17、1987を参照されたい。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用することができる。例えば、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-9、1992;Prestaら、J. Immunol. 151:2623-32、1993を参照されたい。
【００６６】
さらに、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されていることが一般に望ましい。この目標を実現するために、一つの方法に従って、ヒト化抗体を、親の配列及び種々の概念的なヒト化産物を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して分析するプロセスによって調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元コンフォメーション構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンの、その抗原結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することが可能になる。このように、標的抗原(複数可)に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が実現されるようにFR残基をレシピエントから選択し、組み合わせ、配列を移入することができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合性への影響に直接かつほぼ実質的に関与する。
【００６７】
ヒト抗体
本発明のヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列(複数可)と公知のヒト定常ドメイン配列(複数可)を組み合わせることによって構築することができる(Hoogenboomら、J. Mol. Biol. 227:381-8、1992;Marksら、J. Mol. Biol. 222:581-97、1991)。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作出することができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス-ヒト異種骨髄腫(heteromyeloma)細胞株が、例えば、Kozbor、J. Immunol. 133:3001-5、1984;Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁(Marcel Dekker、Inc.、New York、1987);及びBoernerら、J. Immunol. 147:86-95、1991に記載されている。
【００６８】
現在、免疫化すると、内在性の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失により、内在性の抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような生殖細胞系突然変異体マウスに移行することにより、抗原による攻撃でヒト抗体が産生される。例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-5、1993;Jakobovitsら、Nature 362:255-8、1993;Bruggemannら、Year Immunol. 7:33-40、1993を参照されたい。
【００６９】
非ヒト、例えば、げっ歯類抗体からヒト抗体を得るために遺伝子シャッフリングも用いることができ、ヒト抗体は出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。「エピトープ刷り込み」とも称されるこの方法に従って、本明細書に記載のファージディスプレイ技法によって得られる非ヒト抗体断片の重鎖可変性領域又は軽鎖可変性領域のいずれかをヒトVドメイン遺伝子のレパートリーと交換し、これにより、非ヒト鎖/ヒト鎖scFv又はFabのキメラの集団が創出される。抗原を用いて選択することにより非ヒト鎖/ヒト鎖キメラscFv又はFabが単離され、ここで、ヒト鎖には一次ファージディスプレイクローンにおいては対応する非ヒト鎖を除去する際に破壊された抗原結合部位が復元されている、すなわち、エピトープによりヒト鎖パートナーの選択が支配される(刷り込まれる)。このプロセスを繰り返して残りの非ヒト鎖を交換すると、ヒト抗体が得られる(PCT公開第WO93/06213号を参照されたい)。従来の、CDRグラフトによる非ヒト抗体のヒト化とは異なり、この技法により、非ヒト起源のFR残基又はCDR残基を有さない完全なヒト抗体がもたらされる。
【００７０】
抗体断片
本発明は、インタクトな抗体の一部を含む、好ましくはその抗原結合領域を含む抗体断片も特徴とする。抗体断片の例としては、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、及びFv断片;二重特異性抗体(diabody);直鎖抗体;単鎖抗体分子;並びに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００７１】
抗体をパパインで消化することにより、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と称される二つの同一の抗原結合性断片、及び、容易に結晶化することができることがその名称に反映されている残りの「Fc」断片が生じる。ペプシン処理により、二つの抗原の組み合わせ部位を有し、なお抗原を架橋することができるF(ab')2断片がもたらされる。
【００７２】
Fvは、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態では、二鎖Fv種は、一つの重鎖可変ドメイン及び一つの軽鎖可変ドメインが密接に非共有結合的に会合した二量体からなる。単鎖Fv(scFv)種では、一つの重鎖可変ドメイン及び一つの軽鎖可変ドメインを、軽鎖及び重鎖が二鎖Fv種と類似した「二量体」構造で会合することができるように可動性のペプチドリンカーによって共有結合的に連結することができる。この立体配置では、各可変ドメインの三つの超可変領域(HVR)が相互作用して、それによりVH-VL二量体の表面上の抗原結合部位が規定される。集合的に、六つのHVRにより、抗体に抗原結合特異性が付与される。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的なHVRを三つのみ含むFvの半分)であっても、抗原を認識し、それに結合することができるが、結合部位全体よりも親和性が低い。
【００７３】
Fab断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含有する。Fab'断片は、Fab断片とは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の1以上のシステインを含めた数個の残基が付加されていることによって異なる。Fab'-SHは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基(複数可)に遊離のチオール基を担持するFab'に対する名称である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として最初に作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【００７４】
単鎖Fv又はscFv抗体断片は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりscFvが、抗原と結合するための所望の構造を形成することが可能になる。scFvに関する概説については、例えば、Pluckthun、in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、vol. 113、Rosenburg及びMoore編、(Springer-Verlag、New York、1994)、269〜315頁を参照されたい。
【００７５】
二重特異性抗体は、二つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、断片は、同じポリペプチド鎖としてつながった重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖可変ドメイン(VL)を有する(VH-VL)。同じ鎖上の二つのドメイン間の対合を可能にするには短いリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対合することになり、二つの抗原結合部位が創出される。二重特異性抗体は、二価又は二重特異性であってよい。二重特異性抗体については、例えば、欧州特許第404,097号;PCT公開第WO1993/01161号;Hudsonら、Nat. Med. 9:129-34、2003;及びHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8、1993においてより詳細に記載されている。三重特異性抗体(triabody)及び四重特異性抗体(tetrabody)についてもHudsonら、Nat. Med. 9:129-34、2003に記載されている。
【００７６】
抗体断片は、酵素による消化によって、又は組換え技法によってなど、従来の手段によって生成することができる。ある特定の状況では、全抗体よりも抗体断片を使用することが有利である。断片のサイズがより小いほど、急速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍への接近が改善される可能性がある。特定の抗体断片の概説については、Hudsonら  Nat. Med. 9:129-134、2003を参照されたい。
【００７７】
抗体断片を作製するために、種々の技法が開発されてきた。伝統的に、これらの断片は、インタクトな抗体をタンパク質消化することによって得られていた(例えば、Morimotoら、J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17、1992;及びBrennanら、Science 229:81-3、1985を参照されたい)。しかし、現在では、これらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Fab抗体断片、Fv抗体断片、及びScFv抗体断片は全て、大腸菌(E.coli)において発現させ、大腸菌(E.coli)に分泌させることができ、したがって、大量のこれらの断片を容易に作製することができる。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片を大腸菌(E.coli)から直接回収し、化学的にカップリングしてF(ab')2断片を形成することができる(Carterら、Bio/Technology 10:163-7、1992)。別の手法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離する。サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含むin vivo半減期を増加させたFab断片及びF(ab')2断片が米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片を作製するための他の技法は当業者には明らかであろう。
【００７８】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体、又はその抗原結合性部分(複数可)を含有し、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化した組成物、例えば、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、併用療法において、すなわち、他の作用剤(例えば、免疫抑制剤)と組み合わせて投与することもできる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理的に適合する任意のかつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤(isotonic agent)及び吸収遅延剤などを包含する。担体は、静脈内投与、くも膜下腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は表皮投与(例えば、注射又は注入による)のために適していることが好ましい。投与経路に応じて、本発明の抗体を、化合物を不活化する可能性がある酸の作用及び他の天然の条件から化合物を保護するための材料でコーティングすることができる。
【００７９】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路及び/又は形式は、所望の結果に応じて変動する。投与は、非経口的、静脈内、くも膜下腔内、皮下、経口的、局所的、又は局部的、例えば、脳脊髄液への直接注射によるものであってよい。本発明の治療用抗体を投与するための一つの典型的な方法は連続的な注入による静脈内送達である。治療用化合物は、溶液、懸濁剤、乳剤、注入デバイス、又は埋め込み用の送達デバイスの形態であってよく、使用する前に水又は別の適切なビヒクルを用いて再構成するための乾燥粉末としてもたらされてもよい。組成物は、経口投与するための丸薬、錠剤、カプセル剤、液剤、若しくは持続的放出錠剤;又は静脈内投与、くも膜下腔内投与、皮下投与若しくは非経口投与するための液剤;又は局部投与するためのポリマー若しくは他の持続的放出ビヒクルの形態であってよい。
【００８０】
製剤を作出するための当技術分野で周知の方法は、例えば、「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」(第20版、A.R. Gennaro AR.編、2000、Lippincott Williams & Wilkins、Philadelphia、PA)に見いだされる。非経口投与するための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、又は水素化ナフタレンを含有してよい。生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド/グリコリド共重合体、又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体を使用して、化合物の放出を制御することができる。ナノ粒子製剤(例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム)を使用して、化合物の体内分布を制御することができる。他の潜在的に有用な送達系としては、エチレン-酢酸ビニル共重合体粒子、浸透性ポンプ、くも膜下腔内ポンプ、埋め込み型注入系、及びリポソームが挙げられる。製剤中の化合物の濃度は、投与される薬物の投与量及び投与経路を含めたいくつもの因子に応じて変動する。
【００８１】
本発明の化合物を特定の投与経路で投与するためには、化合物が不活性化することを予防するための材料で化合物をコーティングすること、又はそれと化合物を同時投与することが必要な場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えば、リポソーム、又は希釈剤に入れて対象に投与することができる。薬学的に許容される希釈剤としては、生理食塩水及び緩衝水溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型CGF乳剤並びに従来のリポソームが挙げられる(Strejanら、J. Neuroimmunol. 7:27-41、1984)。薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散剤を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。薬剤的に活性な物質へのそのような媒体及び作用剤の使用は当技術分野で公知であり、従来の媒体又は作用剤のいずれかが活性化合物と適合しない場合以外は本発明に包含される。補充の活性化合物も組成物に組み入れることができる。
【００８２】
治療用組成物は、一般には、製造及び貯蔵の条件下で滅菌されており、かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、及び適切なそれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、組成物に、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００８３】
滅菌注射用溶液は、活性化合物を、上に列挙されている成分の一つ、又は成分の組み合わせを伴う適切な溶媒中に必要量で組み入れ、必要に応じて、その後に滅菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上に列挙されている成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から活性成分と任意の追加的な所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥(freeze-drying)(凍結乾燥(lyophilization))である。最適な所望の応答(例えば、治療反応)をもたらすために投薬レジメンを調整する。例えば、治療状況の緊急性によって示される通り、単回のボーラスを投与することができ、いくつかの分割した用量を徐々に投与することができ、又は用量を比例的に低下又は増加させることができる。例えば、本発明の抗体を週に1回又は2回、皮下注射によって投与することができ、月に1回又は2回、皮下注射によって投与することもできる。
【００８４】
非経口用組成物は、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするために単位剤形で製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすために算出された所定の分量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の独特の特性及び実現されるべき特定の治療効果、並びに(b)個体における感受性を治療するためのそのような活性化合物の配合の技術分野における固有の制限によって規定され、それに直接左右される。
【００８５】
「非経口投与」及び「非経口的に投与する」という句は、本明細書で使用される場合、経腸投与及び局所投与以外の投与形式、通常注射による投与形式を意味し、これらとしては、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。本発明の医薬組成物に利用することができる適切な水性担体及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及び適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【００８６】
本発明の組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有してよい。微生物の存在の予防は、滅菌手順によって、及びさまざまな抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤も組成物に含めることが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の持続的な吸収を、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる作用剤を含めることによってもたらすことができる。
【００８７】
本発明の化合物を医薬品としてヒト及び動物に投与する場合、これらは単独で、又は、例えば、0.001〜90%(より好ましくは、0.005〜70%、例えば、0.01〜30%など)の活性成分を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物として与えることができる。
【００８８】
静脈内又はくも膜下腔内に送達又は直接注射するためには、シリンジによって送達することができる組成物である限りでは、組成物は滅菌されており、且つ流体でなければならない。水に加えて、担体は、等張緩衝生理食塩水溶液、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、及び適切なそれらの混合物であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性物質を使用することによって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール又はソルビトールなど、及び塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【００８９】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和物の形態で使用することができる本発明の化合物、及び/又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して有毒になることなく、特定の患者、組成物、及び投与形式に対して所望の治療反応を実現するために有効な量の活性成分を得るために変動してよい。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、他の薬物、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び/又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び以前の病歴、医学の分野で周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に左右される。当技術分野における通常の技術を有する医師又は獣医師は、有効量の必要な医薬組成物を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、医薬組成物中に使用される本発明の化合物の用量を所望の治療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が実現されるまで徐々に投与量を増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適切な1日用量は、治療効果をもたらすために有効な最低用量である化合物の量になる。そのような有効量は、一般に、上記の因子に左右される。所望であれば、治療用組成物の有効な1日用量を、1日を通して適切な間隔で、場合によって、単位剤形で別々に投与される二つ、三つ、四つ、五つ、六つ以上の副用量(sub-dose)として投与することができる。本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、化合物を医薬製剤(組成物)として投与することが好ましい。
【００９０】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医学的なデバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知の埋め込み、送達系、及びモジュールの例は当業者に公知である。
【００９１】
状態及び障害
本明細書に記載の抗体及び抗体断片は、免疫抑制が望まれる任意の状況(例えば、移植片拒絶又は自己免疫障害)において使用することができる。これらの抗体は、移植片拒絶を治療するため、例えば、特定の移植片が宿主に拒絶される可能性を低下させるため、又は拒絶反応が起こるまでの時間を増加させるために特に有用である。本明細書に記載の抗体は、移植に適した任意の臓器又は任意の組織の移植と併せて使用することができる。例示的な臓器としては、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、腸、及び胸腺が挙げられ、例示的な組織としては、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、及び骨髄が挙げられる。
【００９２】
抗体及び抗体断片は、自己抗体が疾患の発病に関係づけられる特定の障害である自己免疫障害を治療するためにも用いることができる。自己抗体の産生と関連する、又はそれと関連する可能性がある自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス(SLE)、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー症候群、食道蠕動低下、強指症、及び毛細血管拡張症)、眼球クローヌス、炎症性ミオパチー(例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、及び封入体筋炎)、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、小児脂肪便症(例えば、グルテン過敏性腸症)、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー(AMAN)、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質症候群、ヴェグナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、多発性筋炎/強皮症重複症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、全身硬直症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シドナム舞踏病、連鎖球菌属(Streptococcus)に関連する小児自己免疫性精神神経疾患(PANDAS)、脳炎、1型糖尿病、及び視神経脊髄炎が挙げられる。
【００９３】
他の自己免疫障害としては、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス(例えば、円板状エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、及び新生児エリテマトーデス)、多発性硬化症、及び反応性関節炎が挙げられる。
【００９４】
本発明の方法を用いて治療することができる追加的な障害としては、例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全症、シュミット症候群、自己免疫性ぶどう膜炎、副腎炎、甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄性疾患、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、成人発症型糖尿病(例えば、2型糖尿病)、男性及び女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織病、結節性多発性動脈炎、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、愛鳥家肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死融解症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サムター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、IgA腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染症、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、寒冷グロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、エプスタイン・バーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エバンス症候群、及び自己免疫性性腺機能不全が挙げられる。
【００９５】
免疫抑制剤
本明細書に記載の抗体及び抗体断片は、免疫抑制剤と組み合わせて製剤化又は投与することができる。免疫抑制剤の例としては、これらだけに限定されないが、カルシニューリン阻害剤(例えば、シクロスポリンA(Sandimmune(登録商標))、シクロスポリンGタクロリムス(Prograf(登録商標)、Protopic(登録商標)))、mTOR阻害剤(例えば、シロリムス(Rapamune(登録商標)、Neoral(登録商標))、テムシロリムス(Torisel(登録商標))、ゾタロリムス、及びエベロリムス(Certican(登録商標)))、フィンゴリモド(Gilenya(商標))、ミリオシン、アレムツズマブ(Campath(登録商標)、MabCampath(登録商標)、Campath-1H(登録商標))、リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、MabThera(登録商標))、抗CD4モノクローナル抗体(例えば、HuMax-CD4)、抗LFA1モノクローナル抗体(例えば、CD11a)、抗LFA3モノクローナル抗体、抗CD45抗体(例えば、抗CD45RB抗体)、抗CD19抗体(例えば、米国特許公報第2006/0280738号を参照されたい)、モナバタセプト(monabatacept)(Orencia(登録商標))、ベラタセプト、インドリル-ASC(タクロリムス及びアスコマイシンの32-インドールエーテル誘発体)、アザチオプリン(Azasan(登録商標)、Imuran(登録商標))、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン[ウマ](Atgam(登録商標))、ミコフェノール酸モフェチル(Cellcept(登録商標))、ミコフェノール酸ナトリウム(myfortic(登録商標))、ダクリズマブ(Zenapax(登録商標))、バシリキシマブ(Simulect(登録商標))、シクロホスファミド(Endoxan(登録商標)、Cytoxan(登録商標)、Neosar(商標)、Procytox(商標)、Revimmune(商標))、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド(Arava(登録商標))、FK778、FK779、15-デオキシスパガリン(DSG)、ブスルファン(Myleran(登録商標)、Busulfex(登録商標))、フルダラビン(Fludara(登録商標))、メトトレキサート(Rheumatrex(登録商標)、Trexall(登録商標))、6-メルカプトプリン(Purinethol(登録商標))、15-デオキシスパガリン(グスペリムス)、LF15-0195、ブレジニン、ブレキナル、及びムロモナブ-CD3(Orthoclone(登録商標))が挙げられる。
【００９６】
作用剤の免疫抑制活性を評価するための方法は当技術分野で公知である。例えば、薬理学的介入を伴う場合と伴わない場合の、移植された臓器のin vivoにおける生存時間の長さが、免疫応答の抑制についての定量的尺度としての機能を果たす。in vitroアッセイ、例えば、混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(例えば、Fathmanら、J. Immunol. 118:1232-8、1977を参照されたい);CD3アッセイ(抗CD3抗体(例えば、OKT3)による免疫細胞の特異的活性化)(例えば、Khannaら、Transplantation 67:882-9、1999;Khannaら(1999)Transplantation 67:S58を参照されたい);IL-2Rアッセイ(外因的に添加したサイトカインIL-2を用いた免疫細胞の特異的活性化)(例えば、Farrarら、J. Immunol. 126:1120-5、1981を参照されたい)も用いることができる。
【００９７】
シクロスポリンA(CsA;CAS番号59865-13-3;米国特許第3,737,433号)及びその類似体を免疫抑制剤として使用することができる。免疫抑制活性を示すいくつもの他のシクロスポリン及びそれらの誘発体及び類似体が公知である。シクロスポリン及びそれらの製剤は、例えば、2004 Physicians' Desk Reference(登録商標)(2003)Thomson Healthcare、第58版、及び米国特許第5,766,629号;同第5,827,822号;同第4,220,641号;同第4,639,434号;同第4,289,851号;同第4,384,996号;同第5,047,396号;同第4,388,307号;同第4,970,076号;同第4,990,337号;同第4,822,618号;同第4,576,284号;同第5,120,710号;及び同第4,894,235号に記載されている。
【００９８】
タクロリムス(FK506)は、その分子作用様式及びその臨床的有効性のどちらに関してもCsAと非常に類似した効果を発揮するマクロライドである(Liu、Immunol. Today 14:290-5、1993;Schreiberら、Immunol. Today、13:136-42、1992);しかし、これらの効果は、CsAの20〜100分の1の用量で示される(Petersら、Drugs 46:746-94、1993)。タクロリムス及びその製剤は、例えば、2004 Physicians' Desk Reference(登録商標)(2003)Thomson Healthcare、第58版、及び米国特許第4,894,366号;同第4,929,611号;及び同第5,164,495号に記載されている。
【００９９】
シロリムス(ラパマイシン)は、例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)に産生させることができる免疫抑制性のラクタム系マクロライドである。シロリムス及び類似体の多数の誘発体及びそれらの製剤は公知であり、例えば、2004 Physicians' Desk Reference(登録商標)(2003)Thomson Healthcare、第58版、欧州特許第EP0467606号;PCT公開第WO94/02136号、同第WO94/09010号、同第WO92/05179号、同第WO93/11130号、同第WO94/02385号、同第WO95/14023号、及び同第WO94/02136号、並びに米国特許第5,023,262号;同第5,120,725号;同第5,120,727号;同第5,177,203号;同第5,258,389号;同第5,118,677号;同第5,118,678号;同第5,100,883号;同第5,151,413号;同第5,120,842号;及び同第5,256,790号に記載されている。
【０１００】
CD40断片
本発明は、2C10抗体が特異的に結合するエピトープを含むCD40の断片も特徴とする。2C10抗体は、CD40ポリペプチドの細胞外部分に対して生じた。したがって、この抗体は、この配列(配列番号5及び6)の一部と反応すると考えられる。
【０１０１】
したがって、本発明は、2C10抗体が特異的に結合するCD40断片(例えば、150未満、120未満、100未満、80未満、70未満、60未満、50未満、40未満、30未満、20未満、18未満、15未満、12未満、11未満、10未満、9未満、8未満、又は7未満のアミノ酸長)を特徴とする。ある特定の実施形態では、断片は、8〜10アミノ酸、8〜12アミノ酸、8〜15アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜30アミノ酸、8〜40アミノ酸、8〜50アミノ酸、8〜60アミノ酸、8〜70アミノ酸、8〜80アミノ酸、又は8〜100アミノ酸の長さである。他の実施形態では、断片は7〜10、7〜12、7〜15、7〜20、7〜30、7〜40、7〜50、7〜60、7〜70、7〜80、又は7〜100の長さである。
【０１０２】
融合タンパク質
本発明は、本明細書に記載の断片と異種配列とを含む融合タンパク質も特徴とする。ある特定の実施形態では、融合パートナーのうちの一つはFcタンパク質(例えば、マウスFc又はヒトFc)である。融合物は、抗体産生のために有用な配列、例えば、マルトース結合性タンパク質又はGSTであってもよい。他の実施形態では、融合タンパク質は、精製又は検出タグ、例えば、直接的に、又は間接的に検出することができるタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤血球凝集素、又はアルカリホスファターゼ)、DNA結合ドメイン(例えば、GAL4又はLexA)、遺伝子活性化ドメイン(例えば、GAL4又はVP16)、精製タグ、又は分泌シグナルペプチド(例えば、プレプロトリプシン(preprotyrypsin)シグナル配列)などである。他の実施形態では、融合パートナーは、c-myc、ポリヒスチジン、又はFLAGなどのタグであってよい。各融合パートナーは、1以上のドメイン、例えば、プレプロトリプシン(preprotrypsin)シグナル配列及びFLAGタグを含有してよい。
【０１０３】
CD40断片及び融合タンパク質の作製
本明細書に記載のCD40断片及び融合タンパク質は、適切な宿主細胞を、適切な発現ビヒクル中の、ポリペプチド断片又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を用いて形質転換することによって作製することができる。
【０１０４】
分子生物学の分野の当業者には、多種多様な発現系を用いることができること、及び厳密な系又は使用する宿主細胞は本発明に対して重大ではないことが理解されよう。例示的な発現系としては、原核生物宿主(例えば、大腸菌(E.coli))及び真核生物宿主(例えば、出芽酵母(S.cerevisiae)、昆虫細胞、例えば、Sf21細胞、又は哺乳動物の細胞、例えば、NIH 3T3細胞、HeLa細胞、又は好ましくはCOS細胞)が挙げられる。そのような細胞は、広範な供給源(例えば、American Type Culture Collection、Manassas、VA)から入手可能である。形質転換又はトランスフェクション及び発現ビヒクル選択の方法は、選択される宿主系に左右される。形質転換及びトランスフェクションの方法は、例えば、Kucherlapatiら(CRC crit. Rev. Biochem. 16:349-379、1982)及びDNA Transfer to Cultured Cells(Ravid及びFreshney編、Wiley-liss、1998)に記載されており、発現ビヒクルは、例えば、Vectors:Expression Systems:Essential Techniques(Jones編、Wiley & Sons Ltd.、1998)において提供されるものから選択することができる。
【０１０５】
組換えCD40ポリペプチド断片又は融合タンパク質が発現したら、それを、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて単離することができる。一実施例では、断片又は融合タンパク質に対して生じた抗体(例えば、2C10抗体)を、カラムに付着させ、ポリペプチド断片又は融合タンパク質を単離するために使用することができる。アフィニティークロマトグラフィーの前の、断片を有する細胞又は融合タンパク質を有する細胞の溶解及び分画は標準の方法によって実施することができる(例えば、Methods in Enzymology、182巻、Abelson、Simon、及びDeutscher編、Elsevier、1990を参照されたい)。
【０１０６】
CD40ポリペプチド断片又は融合タンパク質を単離したら、それを、所望であれば、例えば、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製することができる(例えば、Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Work及びBurdon編、Elsevier、1980;及びScopes、Protein Purification:Principles and Practice、第3版、Cantor編、Springer、1994を参照されたい)。
【０１０７】
CD40ポリペプチド断片又は融合タンパク質は、化学合成によって作製することもできる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、1984、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL;及びSolid-Phase Synthesis:A Practical Guide、Kates及びAlbericio編、Marcel Dekker Inc.、2000に記載の方法によって)。
【０１０８】
他の実施形態
本明細書において言及されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、独立した特許、特許出願、又は刊行物のそれぞれが具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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