(57)【要約】本発明は、抗ＩＦＮα抗体をin vivoで誘導し得る担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物、およびＩＦＮα関連症状を処置するためのその使用に関する。【選択図】図２
2014510126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象におけるＩＦＮα関連症状の処置に使用するための担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物であって、前記対象に投与される治療有効量の免疫原性生成物が投与当たり３０ｍｃｇより多い免疫原性生成物。
【請求項２】
治療有効量の免疫原性生成物の投与が、ＩＦＮαの過剰産生に関連する疾患の症候の発生を予防する請求項１記載の免疫原性生成物。
【請求項３】
治療有効量の免疫原性生成物の投与が、ＩＦＮαの過剰産生に関連する疾患の拡大を予防する請求項１記載の免疫原性生成物。
【請求項４】
ＩＦＮα関連症状が、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎、ＨＩＶ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎および筋炎を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項５】
対象に投与される治療有効量の免疫原性生成物が、投与当たり３５ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇの免疫原性生成物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項６】
１ヶ月に少なくとも２回、対象に投与される請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項７】
さらに、３ヶ月毎に少なくとも１回、対象に投与される請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項８】
さらに、対象から得られた血清内に抗ＩＦＮα抗体の量が検出されない場合、対象に投与される請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項９】
免疫原性生成物が強力に不活性化され、これは、前記生成物がＴＥＳＴ  Ｂの症状における抗ウイルス活性の５％未満を示す、ということを意味する請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項１０】
ＴＥＳＴ  Ｃの症状におけるＩＦＮαの抗ウイルス活性を中和可能である請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項１１】
ＩＦＮαの少なくとも１つの亜型を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項１２】
ＩＦＮαの亜型がＩＦＮα  ２ｂであり、担体タンパク質分子がＫＬＨである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項１３】
免疫原性生成物がワクチンであり、好ましくは乳濁液の形態のワクチンである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性生成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く含む単位剤形。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く含む医療用具。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の担体タンパク質と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く含有する少なくとも１つのバイアルと、
アジュバントを含有する少なくとも１つのバイアルと、
前記免疫原性生成物をアジュバントと接触させるための、およびアジュバントとの混合物を乳化するための手段と、を包含するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性ワクチン、およびＩＦＮα関連症状、例えば全身性紅斑性狼瘡を処置するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＦＮ  Ｉ型ファミリーとしては、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮδ、ＩＦＮ１、ＩＦＮκ、ＩＦＮτおよびＩＦＮωが挙げられる。その主な形態は、ＩＦＮα（このうち１３の密接に関連するタンパク質がヒトにおいて記述されている）および単一ＩＦＮβである。異なるＩＦＮ  Ｉ型形態は異なる生物学的応答を促進し得るという事実にもかかわらず、すべてのＩＦＮ  Ｉ型が構造的に関連しており（それらの遺伝子はイントロンを欠き、第９染色体の短腕上に位置する）、同一受容体サブユニットを介してシグナル伝達する（Van Boxel-Dezaire et al., Immunity 2006; 25: 361-372）。
【０００３】
近年、ＩＦＮ  Ｉ型の誘導の徴候、いわゆるインターフェロン・シグネチャーが、異なる自己免疫疾患に罹患している患者で報告されている（Baccala et al., Immunol Rev 2005; 204: 9-26）ため、ＩＦＮ  Ｉ型と自己免疫障害との間の関係に対する関心が、今日、増大しつつある。実際、ＩＦＮ  Ｉ型は、その免疫調節作用のため、種々の自己免疫症状のいくつかの病原性経路に関与すると思われる。
【０００４】
自己免疫性におけるＩＦＮ  Ｉ型病原性関連性の範例は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）である。ＳＬＥは、自己抗原に向けられる自己抗体により引き起こされる臓器の自己矛盾的損害のため、多臓器障害により特性化される慢性疾患である。ＳＬＥの病因は複雑で、遺伝的および環境的因子の両方を包含する。ＳＬＥにおけるＩＦＮαの血清レベルは、疾患の重症度と相関することが示されている（Dall’era et al. Ann Rheum Dis 2005; 64: 1692-7）。
【０００５】
シェーグレン症候群（ＳＳ）（乾燥症候群としても知られている）は、外分泌腺、特に唾液腺および涙腺に影響を及ぼす慢性全身性自己免疫症状である。ＩＦＮα活性上昇も、この疾患に罹患している患者の血清中で観察されている。最後に、他の症状、例えば糖尿病、関節リウマチ、強皮症、血管炎および自己免疫性甲状腺炎も、高レベルのＩＦＮαに関連することが示されている。
【０００６】
また、近年、Sedaghatらは、長寿命メモリーＴ細胞の代わりに短寿命細胞であるＴｈ１エフェクターの方に平衡を移すことにより、１型ＩＦＮが正常ＣＤ４＋Ｔ細胞動力学の定常状態に影響を及ぼすということを示したように、１型ＩＮＦはＨＩＶ＋患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇において一役を果たし得るということを示唆した（Sedaghat et al. J. Virol. 2008, 82(4): 1870-1883）。これは、Mandlら（Mandl et al. Nat. Med. 2008）で検証された（ここでは、病理学的免疫活性化を改善するために、形質細胞様樹状細胞によるＩＦＮα産生を減少させることが示唆されている）。
【０００７】
さらに、ＩＦＮαの投与は、乾癬、自己免疫性甲状腺炎および多発性硬化症を有する患者における根元的疾患を悪化させ、自己免疫疾患の病歴を有さない患者においてＳＬＥ様症候を誘導することが報告されている。
【０００８】
したがって、ＩＦＮα活性を抑制する作用物質が必要とされている。
【０００９】
モノクローナル中和抗体による受動的免疫化は、一般に、ＳＬＥの処置のためにロンタリズマブおよびシファリムマブを用いて臨床試験で試験されている。しかしながら、上記の療法は、ＩＦＮαに関する１３のうちの１つのサブセットのみをターゲッティングするという欠点を示し、受動的に投与されるモノクローナル抗体の使用は、抗薬剤抗体の誘導により制限され得る。上記の抗薬剤抗体は、薬剤の臨床的作用を中和するか、そうでなければ弱め得るし、さらにまた自己タンパク質との交差反応性に関連した重篤な悪事象と関連づけられ得る（De Groot et al. Trends. Immunol. 2007, 28(11)）。
【００１０】
したがって、本発明は、免疫学的Ｂ細胞耐容性を遮断し、ＩＦＮαに対する高力価のポリクローナル中和抗体を生成し得る能動的免疫化を可能にする治療有効量の免疫原性生成物を投与することにより、in vivoでＩＦＮａ活性を抑制するための方法、ならびにＩＦＮα関連症状を処置するためのその使用を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一目的は、それを必要とする対象におけるＩＦＮα関連症状を予防または処置するのに用いるための担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物であって、対象に投与される治療有効量の免疫原性生成物が投与当たり３０ｍｃｇより多い、好ましくは少なくとも６０ｍｃｇの免疫原性生成物である。
【００１２】
本発明の一実施形態では、治療有効量の免疫原性生成物の投与は、ＩＦＮαの過剰産生に関連する疾患の症候の発生を予防する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、治療有効量の免疫原性生成物の投与は、ＩＦＮαの過剰産生に関連する疾患の拡大を予防する。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、ＩＦＮα関連症状は、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎、ＨＩＶ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎および筋炎を含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、対象に投与される治療有効量の免疫原性生成物は、投与当たり３５ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇ、好ましくは６０ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇの免疫原性生成物である。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、１ヶ月に少なくとも２回、対象に投与される。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、さらに、３ヶ月毎に少なくとも１回、対象に投与される。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、さらに、対象から得られた血清中で、抗ＩＦＮα抗体の量が検出されない場合、対象に投与される。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は強力に不活性化され、これは、生成物がＴＥＳＴ  Ｂの症状における抗ウイルス活性の５％未満を示す、ということを意味する。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、ＴＥＳＴ  Ｃの症状におけるＩＦＮαの抗ウイルス活性を中和可能である。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、ＩＦＮαの少なくとも１つの亜型を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、ＩＦＮαの亜型はＩＦＮα  ２ｂであり、担体タンパク質分子はＫＬＨである。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は好ましくは乳濁液の形態のワクチンである。
【００２４】
本発明の別の目的は、上記のような担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く含む単位剤形である。
【００２５】
本発明の別の目的は、上記のような担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く含む医療用具である。
【００２６】
本発明の別の目的は、上記のような担体タンパク質と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く、好ましくは少なくとも６０ｍｃｇ含有する少なくとも１つのバイアル、アジュバントを含有する少なくとも１つのバイアル、ならびに上記免疫原性生成物をアジュバントと接触させるための、およびアジュバントと水溶液の混合物を乳化するための手段を包含するキットである。
【００２７】
一実施形態では、本発明のキットは、
−  本発明による担体タンパク質と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く、好ましくは少なくとも６０ｍｃｇ含有する少なくとも１つのバイアルと、
−  本発明による担体タンパク質と結合されるＩＦＮαを含む免疫原性生成物を３０ｍｃｇより多く、好ましくは少なくとも６０ｍｃｇ含む溶液、好ましくは水溶液を含有する少なくとも１つのバイアルと、
−  アジュバントを含有する少なくとも１つのバイアル、ならびに上記溶液をアジュバントと接触させるための、およびアジュバントと水溶液の混合物を乳化するための手段と、
を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】暫定報告中のＩＦＮα中和活性を示す免疫化患者血清試料のパーセンテージを示す。
【図２】処置患者対プラセボ患者におけるＩＦＮ誘導遺伝子の差分進化を示す。基線でのＩＦＮ誘導遺伝子発現のレベル増大を示す患者１１名のうち、８名を免疫原性生成物で処置し、３名にはプラセボ注射を施した。ＳＬＥ患者における最高レベルの過剰発現を示す２５０のＩＦＮ誘導遺伝子のレベルを、高密度マイクロアレイを用いて評価した。結果を、平均ｌｏｇ２（Ｖ１での発現のレベル）−ｌｏｇ２（Ｖ６での発現のレベル）として示す。
【図３】基線での陽性または陰性ＩＦＮシグネチャーを有する処置患者対プラセボ摂取患者におけるＩＦＮ結合抗体の力価であり、星印は、ｐ値＜０．０５を示す。
【図４】Ｖ１０〜Ｖ０またはＶ１１〜Ｖ０の間の、基線での陽性または陰性ＩＦＮシグネチャーを有する処置患者対プラセボ患者におけるＩＦＮ誘導遺伝子の差分進化。結果を、平均デルタＬｏｇ（遺伝子発現）として示す。星印は、ｐ値＜０．０５を示す。
【図５】基線での陽性ＩＦＮシグネチャーを有する処置患者における、ならびにプラセボ摂取患者における、血清Ｃ３値の評価であり、星印は、ｐ値＜０．０４を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
本明細書中で用いる場合、「インターフェロンα」または「ＩＦＮα」という用語は、ＩＦＮアルファ１と７５％以上の配列同一性を有するインターフェロンアルファ遺伝子座の機能遺伝子によりコードされるＩＦＮアルファタンパク質を指す（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０７６９１８、またはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０２４０１３によりコードされるタンパク質）。ヒトＩＦＮアルファ亜型としては、ＩＦＮアルファ１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＮＰ＿０７６９１８）、アルファ２ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＩＴＦ＿Ａ）、アルファ２ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＡＡＰ２００９９）、アルファ４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＮＰ＿０６６５４６）、アルファ５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｐ０１５６９）、アルファ６（Ｐ０５０１３）、アルファ７（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｐ０１５６７）、アルファ８（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｐ３２８８１）、アルファ１０（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｐ０１５６６）、アルファ１４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｐ０１５７０）、アルファ１６（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＮＰ＿００２１６４）、アルファ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｐ０１５７１）およびアルファ２１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＮＰ＿００２１６６）が挙げられる。非ヒト哺乳動物ＩＦＮａ亜型の例は、当業者に周知であるようにＧｅｎｂａｎｋで見出され得る（再検討のためには、Pestka et al Immunological reviews 2004、202:8-32を参照）。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、ならびに上記の細胞または肝臓により産生される高分子物質（例えば、抗体、サイトカインおよび補体）の作用を指す。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、ＩＦＮαの「生物学的活性を抑制する」または「生物学的活性を中和する」抗体は、例えば、実施例に記載されるものと同様の機能性アッセイを用いることにより、抗体の非存在下でのサイトカインの活性レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％またはそれ以上、サイトカインの活性を抑制する抗体を指すよう意図される。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「担体タンパク質分子」という用語は、ヘテロ複合体を形成するためにＩＦＮα分子と部分的に共有結合される場合、ＩＦＮαの多数の抗原をＢリンパ球に提示させる少なくとも１５アミノ酸長のタンパク質またはペプチドを指す。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ等を包含する。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、「患者」という用語は、ＩＦＮα関連症状に冒されている対象を指す。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の臨床的結果（例えば、臨床症状の改善）を生じるのに十分な量を指す。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「処置」または「処置すること」という用語は、処置される対象または患者の疾患の自然経過を変更するための試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床的病態の経過中に実施され得る。望ましい効果としては、疾患の発生または再発を予防すること、症候を軽減すること、疾患の任意の直接的または間接的病理学的結果を抑制し、縮小し、または阻止すること、疾患進行速度を低下させること、疾患状態を改良するかまたは一時的に緩和して寛解を生じ、寛解状態または改良された予後を保持することが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
ＩＦＮαの調節因子は身体中に自然に生じるが、しかし例えばＳＬＥおよびＳＳのような疾患におけるサイトカインレベルを調節するそれらの能力は、不十分であると思われる。本発明の抗ＩＦＮα治療的免疫化の目標は、サイトカインに対して抗体レベルを上げる一方で、それらの親和性および中和活性を増強して、過剰量のサイトカインの低減を生じて、他の代謝的および生理学的過程を妨げることなく、その病原作用を抑制することである。
【００３８】
本発明の一目的は、それを必要とする対象におけるＩＦＮα関連症状を処置するための方法であって、担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含む治療有効量の免疫原性生成物を対象に投与することを包含する方法であるが、この場合、上記治療有効量は、投与当たり３０ｍｃｇより多い。
【００３９】
本発明の一実施形態では、上記の治療有効量は、投与当たりの免疫原性生成物が少なくとも６０ｍｃｇ（μｇ）である。
【００４０】
本発明の一実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く１０００ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く７５０ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く５００ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く４５０ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く４００ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く３５０ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く３００ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く２５０ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く２００ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く１５０ｍｃｇまでである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３０ｍｃｇより多く、好ましくは６０ｍｃｇより多く１００ｍｃｇまでである。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜７５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜５００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜４５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜４００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜３５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜３００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜２５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜２００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜１５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、３５ｍｃｇ〜１００ｍｃｇである。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜７５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜５００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜４５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜４００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜３５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜３００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２４０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１２０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１００ｍｃｇである。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０ｍｃｇから、４００ｍｃｇまでである。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２４０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、１２０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、２４０ｍｃｇである。
【００４５】
一実施形態では、治療有効量は、当該技術分野で周知のようなブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて決定される総タンパク質の量に対応する。
【００４６】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、少なくとも月２回投与される。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、月２回投与される。この実施形態では、対象は、０日目に１回投与され、第２回目は７日目〜２８日目の間である。別の実施形態では、対象は、０日目に１回投与され、２回目は７日目〜２１日目の間である。一実施形態では、対象は、０日目に１回投与され、２回目は２８日目に投与される。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、月に３回投与される。この実施形態では、処置される対象は、０日目に１回投与され、２回目は７日目〜１４日目の間であり、３回目は２１日目と２８日目の間である。一実施形態では、対象は、０日目に１回投与され、２回目は７日目で、３回目は２８日目に投与される。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、３ヶ月に４回投与される。この実施形態では、処置される対象は、０日目に１回投与され、２回目は７日目〜１４日目の間であり、３回目は２１日目と２８日目の間であり、４回目は７７日目と８４日目の間である。一実施形態では、対象は、０日目に１回投与され、２回目は７日目で、３回目は２８日目、４回目は８４日目に投与される。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、さらに、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、３ヶ月毎に１回投与され得る。
【００５１】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように月３回投与され、次いで、さらに３ヶ月毎に１回投与される。
【００５２】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように３ヶ月に４回投与され、次いで、さらに３ヶ月毎に１回投与される。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、６ヶ月毎に１回投与される。
【００５４】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように月３回または３ヶ月に４回投与され、次いで、さらに６ヶ月毎に１回投与される。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、年１回さらに投与される。
【００５６】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように月３回または３ヶ月に４回３ヶ月に４回投与され、次いで、さらに毎年１回投与される。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、５年毎に１回さらに投与される。
【００５８】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように月３回または３ヶ月に４回投与され、次いで、さらに５年毎に１回投与される。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、１０年毎に１回さらに投与される。
【００６０】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように月３回または３ヶ月に４回投与され、次いで、さらに１０年毎に１回投与される。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、ＩＦＮαに対する抗体の量が対象から得られる血清試料中で非検出可能である場合、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物をさらに投与され得る。
【００６２】
本発明の一実施形態では、ＩＦＮαに対する抗体の量が対象から得られる血清試料中で非検出可能である場合、処置される対象は、本明細書中に上記したような治療有効量の免疫原性生成物を、上記のように月３回または３ヶ月に４回投与され、次いで、さらに投与され得る。
【００６３】
血清試料中のＩＦＮαに対する抗体の量の定量は、当該技術分野で既知の慣用的方法により、例えばＥＬＩＳＡ抗ＩＦＮにより実行され得る。
【００６４】
このような方法の実行の一例を、以下に示す。
−  ＩＦＮα−２ｂのような免疫原性生成物を調製するために用いられるＩＦＮαの亜型  １００ｎｇで９６ウェルプレートを被覆し、２℃〜８℃で一晩、プレートをインキュベートする。
−  ３７℃で９０分間、遮断緩衝液でプレートを遮断する。
−  ３７℃で９０分間、血清試料およびナイーブ試料のプールとともにプレートをインクとする（血清試料は、典型的には、２００倍希釈から出発して、２倍希釈シリーズで、少なくとも８回希釈まで、希釈される）。
−  ＨＲＰと共役されるヤギ抗ヒト免疫グロブリンのような標識化二次抗体とともにプレートをインキュベートする。
−  ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液で複合体を発色させる。酵素反応停止後、結果的に生じた色の強度を、４９２ｎｍで分光測光的方法により決定する。
【００６５】
各試料に関する抗ＩＦＮ力価は、平均ＯＤ値が、以下のカットオフ値より高い最小希釈として表される。
カットオフ値＝ナイーブ血清のプールの平均ＯＤ×２．０８
（ここで、カットオフ値  Ｎは２．０８と等しい）。
【００６６】
次に、各試料に関する抗ＩＦＮ力価は、平均ＯＤ値がカットオフ値より高い最小希釈として表される。初回希釈は２００であり、１／２００でのそのＯＤがカットオフ値より低い場合、患者は陰性であるとみなされる（Mire-Slius et al. 2004 J. Immunol Meth. 289: 1-16）。
【００６７】
本発明の一実施形態では、処置される対象は、ＩＦＮα関連症状を患っている。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、処置される対象は、血清中の非検出可能量の抗ＩＦＮα抗体を示す。
作用機序
【００６９】
本発明は、上記の免疫原性生成物が投与される哺乳動物における免疫応答、例えば体液性免疫応答（この場合、抗体は、内因性サイトカインＩＦＮαの免疫抑制的、アポトーシス的または血管原性特性を中和する）を誘導するために有用である免疫原性生成物にも関する。
【００７０】
本発明は、それを必要とする哺乳動物において免疫応答を誘導するための方法であって、上記の哺乳動物に本明細書中で上記したような免疫原性生成物を投与することを包含する方法にも関する。一実施形態では、上記免疫応答は、内因性サイトカインの免疫抑制的、アポトーシス的または血管原性特性を中和する抗体が誘導される体液性免疫応答を包含する。
【００７１】
本発明の一実施形態では、免疫原性生成物は、例えばＫＬＨなどのＴヘルパー刺激外来担体タンパク質と化学的に結合されるＩＦＮαの、不活性化されているが免疫原性のサイトカイン誘導体である。上記の免疫原性生成物は、ＩＦＮαに対するＢ細胞耐容性を崩壊するが、しかしＴ細胞耐容性を崩壊しない能力を有する。自己に対するヘルパーＴ細胞耐容性は、ＩＦＮαを外来担体タンパク質と連結することにより阻止される。
【００７２】
ＩＦＮαに特異的なＢ細胞は、抗原結合後に活性化され、免疫原性生成物を貪食して、担体特異的ペプチドが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して提示される。この活性化シグナルは、Ｔ依存性抗原の場合にはＢ細胞分化を誘導するには十分ではないが、しかし、Ｂ細胞は、自己および担体抗原をプロセシングするため、Ｔ細胞ヘルプが、自己または担体タンパク質に特異的なＴ細胞により与えられ得る。Ｔ細胞選択は非常に癌密であるため、自己抗原に関する特異的Ｔ細胞活性化は認められない。
【００７３】
樹状細胞（ＤＣ）も、自己抗原および担体分子を取込み、それらのＭＨＣクラスＩＩ分子を介して担体特異的ペプチドを提示する。ヘルパー細胞は、順次、自己抗原に特異的なＢ細胞に担体特異的Ｔヘルパー細胞を提供し、それらのＭＨＣクラスＩＩ分子上に担体ペプチドを提示することができる。
【００７４】
担体に特異的なヘルパー細胞は、自己抗原に特異的なＢ細胞と相互作用して、自己抗原に対する正常抗体応答を引き出す。
【００７５】
免疫原性生成物は主に、ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患を処置するためにワクチン組成物中に用いられる。
【００７６】
さらに具体的には、本発明は、ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患を処置するための方法であって、治療有効量の本発明の免疫原性生成物を対象に投与するステップを包含する方法に関する。
【００７７】
本発明は、ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患を処置するための方法であって、治療有効量の免疫原性生成物を投与し、免疫原性生成物の投与が疾患の症候の発声を予防することを包含する方法にも関する。
【００７８】
本発明は、ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患を処置するための方法であって、治療有効量の免疫原性生成物を投与し、免疫原性生成物の投与が疾患の拡大を予防することを包含する方法にも関する。
【００７９】
本発明は、ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患を処置するための方法であって、治療有効量の免疫原性生成物を投与し、免疫原性生成物の投与が内因性ＩＦＮαの活性を中和する抗体の産生を誘導することを包含する方法にも関する。
【００８０】
本発明は、ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患を処置するための方法であって、治療有効量の免疫原性生成物を投与し、免疫原性生成物の投与が内因性ＩＦＮαの活性の中和を誘導することを包含する方法にも関する。
【００８１】
ＩＦＮαの過剰産生と結び付けられる疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎、ＨＩＶ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎および筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明のさらなる目的は、対象における内因性ＩＦＮαの活性を中和する抗体の産生を誘導するための方法であって、治療有効量の免疫原性生成物を上記非検体に投与するステップを包含する方法からなる。
免疫原性生成物
【００８３】
本発明で用いられるような免疫原性生成物は、ＫＬＨのような担体タンパク質分子と結合されるＩＦＮαを含むが、この場合、免疫原性生成物は不活性化される。
【００８４】
本明細書中で用いられるような免疫原性生成物は、少なくとも１つの組換えＩＦＮα亜型と、少なくとも１つの担体タンパク質分子、例えばＫＬＨ（グルタルアルデヒドと共役され、その後、ホルムアルデヒドデ不活性化される）との間の複合体である。
【００８５】
本発明の一実施形態では、担体タンパク質分子は、免疫学で慣用的に用いられる任意の担体分子、例えばＫＬＨ（カギアナカサガイヘモシアニン）、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風類毒素、コレラ毒素Ｂ、突然変異体非毒性ジフテリア毒素（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質（外膜小胞中）、非類別可能インフルエンザ菌外膜タンパク質、緑膿菌毒素Ａ、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等であり得る。好ましい一実施形態では、上記の担体は、ＫＬＨである。好ましくは、ＫＬＨ出発物質は、海洋性腹足類軟体動物メガスラ・クレヌラタのリンパから抽出される高度精製ＫＬＨからなる。天然に産生されるＫＬＨは、一般的に、２０サブユニットの非共有的管状集合体である二重十量体構造からなる。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、組換えＩＦＮα亜型は、ＩＦＮアルファ１、アルファ２ａ、アルファ２ｂ、アルファ４、アルファ５、アルファ６、アルファ７、アルファ８、アルファ１０、アルファ１４、アルファ１６、アルファ１７およびアルファ２１の中の任意の亜型であり得る。
【００８７】
組換えＩＦＮα亜型は、上記のようなＧｅｎＢａｎｋからの配列を用いて、当該技術分野で既知の慣用的方法により獲得され得る。例えば、組換えＩＦＮα亜型の賛成は、ＩＦＮアルファ亜型の遺伝子を含む発現ベクターを含有する細胞を培養し、次いで封入体を収穫し、最後にＩＦＮα亜型を精製することにより実行され得る。
【００８８】
本発明の一実施形態では、組換えＩＦＮα亜型は、ＩＦＮα  ２ｂ亜型である。
【００８９】
本発明の一実施形態では、免疫原性生成物は少なくともＩＦＮα  ２ｂ亜型を含む。
【００９０】
本発明の一実施形態では、組換えＩＦＮα亜型は、液体溶液、好ましくは３．５から好ましくは６〜７．８までの範囲のｐＨを有する緩衝溶液中にある。
【００９１】
一実施形態では、処置される対象がヒトである場合、用いられる組換えＩＦＮαはヒトである。
【００９２】
本発明の一実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含み、この場合、上記免疫原性生成物は抗ＩＦＮα抗体により認識される。
【００９３】
抗ＩＦＮα抗体による免疫原性生成物の認識は、当該技術分野で既知の慣用的方法、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ抗ＩＦＮα／担体タンパク質により実行され得る。ＥＬＩＳＡ（試験Ｄ）は、当該技術分野で既知の任意の比色手段により、例えばビオチンで標識される検出抗体、ポリストレプトアビジンＨＲＰ増幅系およびｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を用いて、開発される。
【００９４】
上記の方法の一例を以下に示す。
−  捕捉抗体、例えばウサギポリクローナル抗ＫＬＨ抗体でプレートを被覆する。
−  ３７℃で９０分間、遮断緩衝液（例えば、ＰＢＳ中の２％カゼイン）でプレートを遮断する。
−  ３７℃で９０分間、２５０ｎｇ／ｍｌから８回の２倍希釈までの免疫原性生成物の希釈シリーズとともに、あるいは陰性対照、例えばＫＬＨおよびＩＦＮαとともに、プレートをインキュベートする。
−  ３７℃で９０分間、検出抗体、例えばビオチニル化抗ＩＦＮα抗体とともに、プレートをインキュベートする。
−  ３７℃で３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰとともにプレートをインキュベートし、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液で３０分間、複合体を発色させる。酵素反応停止後、結果的に生じた色の強度を、４９０ｎｍで分光測光的方法により決定する。
【００９５】
免疫原性生成物を含有するウェルの光学密度が、陰性対照を含有するウェルの光学密度より少なくとも１０倍高い場合、免疫原性生成物は抗ＩＦＮα抗体により認識され、免疫原性生成物中のＩＦＮαはＫＬＨと結合される、と当業者は考える。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含むが、この場合、上記免疫原性生成物は強免疫原性であり、これは、当該生成物が、本明細書下で試験される試験Ａの条件でin vivoで抗体抗ＩＦＮαを誘導し得る、ということを意味する。
【００９７】
試験Ａは、以下の方法により実行される。
免疫原性生成物の総タンパク質０．３〜１０μｇ（ブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定される）を、３０日で２回、好ましくは０日目および２１日目に、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに注射する。血清試料は、免疫化前（前免疫血清試料）および３０日目〜４０日目（試験血清試料）、好ましくは３１日目に採取する。ＥＬＩＳＡ抗ＩＦＮαを、本明細書に上記したように実行する。
【００９８】
簡潔に記載すると、免疫原性生成物を調製するために用いられるＩＦＮαの亜型、例えばＩＦＮα−２Ｂ  １００ｎｇで９６ウェルプレートを被覆し、２℃〜８℃で一晩インキュベートする。次に、３７℃で９０分間、遮断緩衝液でプレートを遮断する。１／２５００希釈の前免疫試料  １００μｌ、ならびに血清試料（前免疫および試験）の１／２５００から８回の２倍希釈までの希釈シリーズを、ウェルに付加する。最後に、抗マウス免疫グロブリン標識化二次抗体、例えばＨＲＰ共役抗体をウェルに付加し、当該技術分野で既知の任意の比色法、例えばｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を用いて、ＥＬＩＳＡを発色させる。
【００９９】
試験血清試料を含有するウェルの光学密度が、前免疫血清試料を含有するウェルの光学密度より少なくとも２倍高い場合、免疫原性生成物は免疫原性であると当業者はみなすが、これは、in vivoでそれが抗ＩＦＮα抗体を誘導していたことを意味する。
【０１００】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含み、この場合、ＩＦＮαは強力に不活性化されるが、これは、当該生成物が、下記で言及される試験Ｂの条件でのＩＦＮαの抗ウイルス活性の５％未満、好ましくは１％未満の抗ウイルス活性を示す、ということを意味する。一実施形態では、本発明の免疫原性生成物は、５００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で、試験Ｂの条件で５００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度でのＩＦＮαの抗ウイルス活性の５％未満、好ましくは１％未満の抗ウイルス活性を示す。
【０１０１】
このアッセイは、メイディン・ダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞に及ぼす水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞壊死作用（ＣＰＥ）に及ぼすＩＦＮαの防御効果を基礎にしている。このアッセイは、Ｈｅｐ−２ＣまたはＡ５４９ヒト細胞およびＥＭＣＶウイルスを用いても実行され得る。試験Ｂは、以下の方法により実行される。
免疫原性生成物および免疫原性生成物を調製するために用いられる組換えＩＦＮα亜型（陽性対照）を、基本培地（２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中に、それぞれ少なくとも５００ｎｇ／ｍｌおよび少なくとも１０００Ｕ／ｍｌで希釈する。５０μｌの免疫原性生成物および陽性対照を９６ウェルプレート中でプレート化して、基本培地中で２倍希釈のシリーズに希釈する。５０μｌの細胞培地（４％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中の各ウェル中に、２×１０４ＭＤＢＫ細胞を付加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、プレートをインキュベートする。次に、ウイルスを基本培地中で少なくとも１０  ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量  ５０：感染細胞の５０％を殺害するために１０回希釈）に希釈する。プレートを空にして、１００μｌの希釈ウイルスを付加する。次いで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、プレートをインキュベートする。
【０１０２】
培養の終了時に、当該技術分野で周知の方法を用いて、ＭＤＢＫ細胞の生存度を評価する。上記の方法の一例を、以下に示す。ＭＴＳ／ＰＭＳ（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ；Promega  Ｇ５４３０）の溶液２０μｌ／ウェルをウェルに付加し、プレートをさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。次に、プレートを、分光光度計で４９０ｎｍで読み取る。
【０１０３】
抗ウイルス活性のパーセンテージは、以下のように算定される。
抗ウイルス活性（％）＝［（ＯＤ生成物−ＯＤウイルス）／平均ＯＤ細胞−ＯＤウイルス］×１００
（式中、ＯＤ生成物は、免疫原性生成物を有するかまたは陽性対照（ＩＦＮα亜型）を有するウェルの光学密度を意味し、
ＯＤウイルスは、ウイルスのみを有する対照ウェルの光学密度を意味し、
ＯＤ細胞は、ＩＦＮαおよびウイルスを有する対照ウェルの光学密度を意味する）。
【０１０４】
ＥＣ５０値（ウイルス媒介性死亡率の５０％抑制を生じる免疫原性生成物の量に対応する）は、生存度／濃度グラフ上のｘ軸上にＥＣ５０値を挿入することにより決定される。
【０１０５】
免疫原性生成物のＥＣ５０と陽性対照（免疫原性生成物を調製するために用いられる組換えＩＦＮα亜型）のＥＣ５０を比較することにより、免疫原性生成物が、５％未満、好ましくは１％未満の活性を示すか否かが決定される。
【０１０６】
不活性化因子ＥＣ５０生成物／ＥＣ５０ＩＦＮαが算定され得る。免疫原性生成物が５％未満、好ましくは１％未満の抗ウイルス活性を示す場合、不活性化因子は、２０より大きい、好ましくは１００より大きい。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含み、この場合、免疫原性生成物は、下記で言及される試験Ｃの条件でＩＦＮαの抗ウイルス活性を中和可能である。本発明によれば、このアッセイは、免疫原性生成物で免疫化されるマウスから得られる血清の中和能力を評価するために実施される。中和能力は、ＭＤＢＫ細胞中で複製する水疱性口内炎ウイルスの存在下で細胞生存度を評価することにより評価され得る。このアッセイは、Ｈｅｐ−２Ｃヒト細胞およびＥＭＣＶウイルスを用いても実行され得る。
【０１０８】
試験Ｃは、以下の方法により実行される。
免疫原性生成物の総タンパク質０．３〜１０μｇ（ブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定される）を、３０日で２回、好ましくは０日目および２１日目に、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに注射する。血清試料は、免疫化前（前免疫血清試料）および３０日目〜４０日目（試験血清試料）、好ましくは３１日目に採取する。
【０１０９】
２５μｌの前免疫および試験血清試料を、１／２００の希釈、１／２００から８回の希釈までの希釈で、９６ウェルプレート中でプレート化する。陽性対照（ポリクローナル抗ＩＦＮα；PBL, Piscataway, NJ, ref.31100-1）は、典型的には、基本培地（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中で３１２５ＵＩ／ウェルから１００ＵＩ／ウェルに、ＩＦＮα活性を中和可能であるよう希釈され、２５μｌは、さらにプレート中でプレート化された。
【０１１０】
基本培地２５μｌ中の２５Ｕ／ウェル（最終濃度）のＩＦＮαを、各ウェルに付加し、プレートを、室温で６０分間インキュベートする。
【０１１１】
アッセイ培地（４％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中の２００００個のＭＤＢＫ細胞を各ウェルに付加し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートする。
【０１１２】
ウイルスを、ウイルス培地（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中で少なくとも１０  ＴＣＩＤ（感染細胞の５０％を殺害する希釈の１０倍）に希釈する。プレートを空にして、１００μｌのウイルスを各ウェルに付加した後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、インキュベートする。
【０１１３】
培養の終了時に、当該技術分野で周知の方法を用いて、ＭＤＢＫ細胞の生存度を評価する。上記の方法の一例を、以下に示す。ＭＴＳ／ＰＭＳ（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ；Promega  Ｇ５４３０）の溶液２０μｌ／ウェルをウェルに付加し、プレートをさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。次に、プレートを、分光光度計で４９０ｎｍで読み取る。
【０１１４】
相対細胞生存度は、以下のように算定される。
％＝［（ＯＤ試料−ＯＤウイルス）／ＯＤＩＦＮ＋ウイルス］×１００
（式中、ＯＤ試料は、免疫原性生成物で、または陽性対照（ポリクローナル抗ＩＦＮ抗体）で免疫化されたマウスから得られる血清を有するウェルの光学密度を意味し、
ＯＤウイルスは、ウイルスのみを有する対照ウェルの光学密度を意味し、
ＯＤＩＦＮ＋ウイルスは、ＩＦＮαおよびウイルスを有する対照ウェルの光学密度を意味する）。
【０１１５】
ＮＣ５０値（希釈因子または中和単位／ｍｌとして表されるウイルス媒介性死亡率の５０％中和を生じる血清の希釈に対応する）は、生存度／濃度グラフ上のｘ軸上にＮＣ５０値を挿入することにより決定される。
【０１１６】
試験Ｃにおいて、免疫原性生成物で免疫化されたマウスから得られる血清がＭＢＤＫ細胞を死から護るわけではないことを示す結果は、その抗ウイルス活性を中和するＩＦＮαに対して向けられる抗体を誘導する能力を免疫原性生成物が有している、ということを意味する。
【０１１７】
一実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含み、この場合、免疫原性生成物は、試験Ｃの条件でＩＦＮαの抗ウイルス活性の少なくとも５０％を中和可能である。上記の実施形態において、ＮＣ５０が算定され得る。血清の希釈が試験Ｃの条件でＩＦＮαの抗ウイルス活性の少なくとも５０％を中和し得ない場合、当該生成物のＮＣ５０は算定され得ない。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含むが、この場合、ＩＦＮα／担体の重量比は０．０６〜０．６の範囲である。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含むが、この場合、ＩＦＮα／担体の比は０．１〜０．５である。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含むが、この場合、ＩＦＮα／担体の比は０．３である。
【０１２１】
本発明の別の実施形態では、免疫原性生成物は、担体タンパク質分子、例えばＫＬＨと結合されるＩＦＮαを含むが、この場合、ＩＦＮα／担体の比は０．０５、０．１、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．５である。
【０１２２】
上記の比は、実施例１０で記載されるように、ＵＶおよび蛍光検出（試験Ｅ）に基づいた方法により算定され得る。
免疫原性生成物を得るための方法
【０１２３】
本発明の一実施形態では、ＩＦＮα  キノイド（kinoid）は、以下の方法により得られる。
ａ）少なくとも１つの組換えヒトＩＦＮα亜型および少なくとも１つの担体タンパク質分子をグルタルアルデヒドと混合し、（ｉ）還元剤および（ｉｉ）リシンおよびグリシンならびにその混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択されるクエンチング化合物を付加することにより反応を遮断する。
ｂ）１０ｋＤａ未満の、または８ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する。
ｃ）ホルムアルデヒドを付加する。
ｄ）（ｉ）還元剤および（ｉｉ）リシンおよびグリシンならびにその混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択されるクエンチング化合物を付加することによりホルムアルデヒドとの反応を遮断する。
ｅ）上記免疫原性生成物を収集する。
【０１２４】
ステップａ)の一実施形態では、ＩＦＮαおよび担体タンパク質分子、例えばＫＬＨが先ず、適切な量で混合された後、グルタルアルデヒドを付加する。
【０１２５】
一実施形態では、ＩＦＮαおよびＫＬＨは、１０：１〜４０：１の範囲のＩＦＮα：サブユニットＫＬＨモル比で、ステップａ)で混合される。別の実施形態では、ＩＦＮαおよびＫＬＨは、１５：１〜２５：１の範囲のＩＦＮα：サブユニットＫＬＨモル比で、ステップａ)で混合される。別の実施形態では、ＩＦＮαおよびＫＬＨは、２０：１〜２５：１の範囲のＩＦＮα：サブユニットＫＬＨモル比で、ステップａ)で混合される。
【０１２６】
ステップａ)の一実施形態では、グルタルアルデヒドは、１ｍＭ〜２５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜３０ｍＭ、さらに好ましくは２２．５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲の反応混合物中の最終濃度で用いられる。ステップａ)の一実施形態では、グルタルアルデヒドは、ＩＦＮαおよびＫＬＨとともに、１５分〜１２０分の範囲の時間、好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０分間、インキュベートされる。一実施形態では、グルタルアルデヒドは、約４５分間、２２．５ｍＭで付加される。有益には、グルタルアルデヒドを伴うインキュベーションのステップａ）は、１８℃〜３７℃、好ましくは１８℃〜２７℃の範囲の温度で実施される。
【０１２７】
一実施形態によれば、グルタルアルデヒドとの反応（ステップａ）は、クエンチング化合物、好ましくは（ｉ）還元剤および（ｉｉ）リシンおよびグリシンならびにその混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択されるクエンチング化合物を付加することにより、１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する（ステップｂ）前に、停止される。
【０１２８】
還元剤は、それらの還元特性のために、アルデヒド処理中に生成される残存するイミン群を還元する能力を有する当該技術分野で既知の還元剤のいずれか１つで構成され得る。還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択され得る。
【０１２９】
一実施形態によれば、上記のクエンチング化合物がアミノ酸である実施形態では、上記のアミノ酸はグリシンからなる。グルタルアルデヒドとの反応を遮断するためにグリシンおよび／またはリシンが用いられるステップｂ)のいくつかの実施形態では、選択アミノ酸は、本明細書中の実施例で示されるように、０．０１Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜０．５Ｍ、最も好ましくは０．０８Ｍ〜０．２Ｍの範囲の、例えば０．１Ｍの反応混合物中の最終濃度で用いられる。一実施形態では、クエンチング化合物を伴うインキュベーションは、本明細書中の実施例で示されるように、１分〜１２０分、好ましくは５分〜６０分の範囲の時間、例えば３０分間、実施される。別の実施形態ではこのステップは、１８℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２５℃の範囲の温度で実施される。
【０１３０】
ステップｂ)では、反応混合物中に存在する１０ｋＤａ未満の小化合物は除去される。これらの小化合物は、ＩＦＮαまたはＫＬＨと反応していない余分量のグルタルアルデヒドおよび余分量のクエンチング化合物分子を主に包含する。ステップｂ）は、１０ｋＤａ未満の化合物の除去を可能にする任意の既知の技法に従って実施され得るが、この技法は、１０ｋＤａのカットオフを有する透析膜を伴う透析、または１０ｋＤａのカットオフを有する濾過膜を用いる濾過を包含する。例証的には、ステップｂ)は、本明細書中の実施例で示されるように、１０ｋＤａのカットオフを有する濾過膜を用いる接線流濾過のステップで構成され得る。望ましくない小化合物を有さない濾過副産物は、ステップｂ)の終了時に収集される。所望により、ステップｂ）は、ステップｂ)の終了時に得られる反応混合物中に存在する終局的化合物集合体を取り出すという予備的ステップを含み得る。上記の予備ステップは、液体溶液中の懸濁液中に最終的に存在する集合体を取り出すための関与的濾過ステップ、例えば適切な濾過膜、例えば０．２μｍの孔サイズを有する濾過膜を用いる濾過ステップで構成され得る。
【０１３１】
当該方法のステップｃ)の一実施形態では、ホルムアルデヒドが、６ｍＭ〜６５０ｍＭ、好ましくは２５ｍＭ〜２５０ｍＭの最終濃度で付加される。当該方法のステップｃ)の一実施形態では、ホルムアルデヒドは、１時間〜３３６時間、好ましくは１時間〜１４４時間の間付加される。一実施形態では、ホルムアルデヒドは、５０〜１００ｍＭ、好ましくは６６ｍＭの最終濃度で、２０〜５０時間、好ましくは４０時間、適用される。
【０１３２】
ステップｃ）では、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションは、本明細書中の実施例で示されるように、好ましくは３０℃〜４０℃の範囲の温度で、例えば３７℃で実施される。
【０１３３】
当該方法のステップｄ）では、ホルムアルデヒド戸の反応は、クエンチング化合物、好ましくは、（ｉ）還元剤および（ｉｉ）リシンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸から選択されるクエンチング化合物を付加することにより、停止される。
【０１３４】
還元剤は、それらの還元特性のために、アルデヒド処理中に生成される残存するイミン群を還元する当該技術分野で既知の還元剤のいずれか１つで構成され得る。還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択され得る。一実施形態によれば、上記のクエンチング化合物がアミノ酸である実施形態では、上記のアミノ酸はグリシンからなる。ホルムアルデヒドとの反応を遮断するためにグリシンおよび／またはリシンが用いられるステップｂ)のいくつかの実施形態では、選択アミノ酸は、本明細書中の実施例で示されるように、０．０１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜１Ｍ、最も好ましくは０．１Ｍ〜０．２Ｍの範囲の、例えば０．１Ｍの反応混合物中の最終濃度で用いられる。一実施形態では、クエンチング化合物を伴うインキュベーションは、本明細書中の実施例で示されるように、５分〜１２０分、好ましくは１０分〜６０分の範囲の時間、例えば３０分間、実施される。別の実施形態ではこのステップは、１８℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２５℃の範囲の温度で実施される。
【０１３５】
当該方法の一実施形態によれば、ステップｅ)での収集の直前に、１００ｋＤａ未満の分子量を有する物質の取り出しが、液体溶液中から１００ｋＤａより大きい分子量を有する物質を除去するために、当該技術分野で既知の任意の技法により、当業者によって実施される。第一の実施形態では、用いられる技法は、少なくとも１００ｋＤａのカットオフ値を有する濾過膜を用いることにより実施される濾過ステップであり、これは、限外濾過ステップまたは接線濾過ステップを包含する。第二の実施形態では、用いられる技法は、少なくとも１００ｋＤａのカットオフ値を有する濾過膜を用いる接線濾過ステップからなる。別の実施形態では、ステップｅ)での収集の直前に、３００ｋＤａ未満の分子量を有する物質の取り出しが、少なくとも３００ｋＤａのカットオフ値を有する濾過膜を用いることにより実施され得る。
組成物、乳濁液およびこのような乳濁液を含有するワクチン
【０１３６】
本発明は、本明細書中に上記したような免疫原性生成物を含む組成物に関する。本発明は、当該生成物が乳濁得に内に存在する本発明の生成物の処方物にも関する。有益には、本発明のワクチン組成物は、上記の乳濁液を含むかまたはそれで構成される。このような乳濁液は、本発明の免疫原性生成物、油および界面活性剤、または少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤の混合物を含む。好ましくは、油または混合物油／界面活性剤は、製薬上許容可能な賦形剤である。さらに好ましくは、油および界面活性剤の混合物は、アジュバント、さらに好ましくは免疫アジュバントである。好ましいアジュバントは、ＩＳＡ５１である。用いられ得る免疫アジュバントの別の例は、ＳＷＥ（スクアレンベースの水中油型乳濁液）である。用いられ得る免疫アジュバントの別の例は、ＳＷＥ−ａ（スクアランベースの水中油型乳濁液）である。本発明の乳濁液は、油中水型乳濁液または水中油型乳濁液であり得る。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明による免疫原性生成物の量は、上記の乳濁液の総重量の０．０１％（ｗ／ｗ）より多くかつ１％（ｗ／ｗ）未満である。
アジュバント
【０１３８】
本発明の乳濁液またはワクチン組成物は、アジュバント、特に免疫アジュバントを含み得る。一実施形態では、アジュバントの量は、ワクチン組成物の総重量の０．００００１％（ｗ／ｗ）〜１％、好ましくは０．０００１〜０．１％、さらに好ましくは０．００１〜０．０１％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【０１３９】
当業者に既知の任意の適切なアジュバント、例えば油ベースのアジュバント、例えばフロイントの不完全アジュバント、ミコール酸塩ベースのアジュバント（例えば、トレハロース二ミコール酸塩）、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチドまたは糖タンパク質、例えばＮ−Ｏｐａｃａ、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］またはＭＤＰ類似体）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌から抽出される）、連鎖球菌調製物（例えば、ＯＫ４３２）、Ｂｉｏｓｔｉｍ．ＴＭ．（例えば、０１  Ｋ２）、ＥＰ  １０９９４２、ＥＰ１８０５６４およびＥＰ２３１０３９の「Ｉｓｃｏｍｓ」、水酸化アルミニウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、中性油（例えば、ミグリオール）、植物油（例えば、落花生油）、リポソーム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．ポリオール、Ｒｉｂｉアジュバント系（例えばＧＢ−Ａ−２１８９１４１参照）、またはインターロイキン、特に細胞媒介性免疫を刺激するものが、上記のワクチン組成物中に用いられ得る。放線菌目の細菌属であるアミコラトゥムの抽出物からなる代替的アジュバントは、米国特許第４，８７７，６１２号に記載されている。代替的には、ＳＷＥ（クエン酸塩緩衝液中、スクアレン  ３．９％、スパン  ０．４７％、トゥイーン８０  ０．４７％）およびＳＷＥ−ａ（クエン酸塩緩衝液中、スクアラン  ３．９％、スパン  ０．４７％、トゥイーン８０  ０．４７％）も、用いられ得る。付加的には、所有権保持アジュバント混合物が市販されている。用いられるアジュバントは、一部は、レシピエント生物体によって決まる。投与するためのアジュバントの量は、動物の種類および大きさによって決まる。最適投与量は、通例の方法により容易に決定され得る。
【０１４０】
油中水型乳濁液中に用いるのに適した油アジュバントとしては、鉱油および／または代謝可能な油が挙げられる。鉱油は、バイオール（登録商標）、マルコール（登録商標）およびドラケオール、例えばドラケオール（登録商標）６ＶＲ（SEPPIC, France）から選択され得る。代謝可能な油は、ＳＰ油（後記）、エマルシゲン（MPV Laboratories, Ralston, NZ）、モンタニド  ２６４、２６６、２６（Seppic SA, Paris, France）、ならびに植物油、例えば落花生油およびダイズ油、動物油、例えば魚油スクアランおよびスクアレン、ならびにトコフェロールおよびその誘導体から選択され得る。
【０１４１】
さらに、アジュバントは、アジュバントの約０．１〜２５容積％、さらに好ましくは約１〜１０容積％、さらに好ましくは約１〜３容積％の量で、１つ以上の湿潤剤または分散剤を含み得る。湿潤剤または分散剤として特に好ましいのは、非イオン性界面活性剤である。有用な非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、特に、商標プルロニック（登録商標）下で市販され、BASF Corporation（Mt. Olive, N.J.）から入手可能なものが挙げられる。その他の有用な非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン８０（登録商標）の商標下で入手可能）またはマンニドモノオレエートが挙げられる。１つ以上の、例えば少なくとも２つの湿潤剤または分散剤を、本発明のワクチン組成物の一部として、アジュバント中に含むことが望ましい。
【０１４２】
適切なアジュバントとしては、当業者に既知の界面活性剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシル−グリセロールおよびプルロニックポリオール；ピラン、デキストラン、スルフェート、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポールなどのポリアニオン、；ムラミルジペプチド、アイメチルグリシン、ツフトシンなどのペプチド、油乳濁液、ミョウバンおよびその混合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。その他の考え得るアジュバントとしては、大腸菌熱不安定性毒素の、またはコレラ毒素のＢペプチドサブユニットが挙げられる（McGhee, J.R., et al., “On
vaccine development,” Sem. Hematol., 30:
3-15 (1993)）。
さらなる界面活性剤
【０１４３】
乳濁液を含む本発明によるワクチン組成物の実施形態では、ワクチン組成物は、好ましくは、免疫原性生成物および１つ以上の油性免疫アジュバント物質のほかに、１つ以上の界面活性剤も含有する。界面活性剤の例示的実施形態は、マンニドモノオレエート、例えばモンタニド（登録商標）８０（Arlacel（SEPPIC, France）により市販されている）を含む。
【０１４４】
一実施形態では、界面活性剤の量は、ワクチン組成物の総重量の０．００００１％（ｗ／ｗ）〜１％、好ましくは０．０００１〜０．１％、さらに好ましくは０．００１〜０．０１％（ｗ／ｗ）の範囲である。
凍結乾燥生成物
【０１４５】
一実施形態によれば、かつ貯蔵目的のために、本発明の生成物またはワクチン組成物は、凍結乾燥され得る。したがって、ワクチン組成物は、フリーズドライ（凍結乾燥）形態で提示され得る。上記の実施形態では、本発明による免疫原性生成物は、１つ以上の凍結乾燥補助物質と組み合わされる。種々の凍結乾燥補助物質は、当業者により周知である。補助物質の凍結乾燥は、ラクトースおよびマンニトールのような糖を包含する。
【０１４６】
ワクチン組成物が、界面活性剤を含む液体乳濁液として用いるための凍結乾燥組成物からなるこのような実施形態では、ワクチン組成物は、好ましくは、上記ワクチン組成物の総重量の０．１％（ｗ／ｗ）より多く、１０％（ｗ／ｗ）未満の本発明による免疫原性生成物の量を含む。
安定化剤
【０１４７】
いくつかの実施形態では、例えば、分解しがちなタンパク質が分解するのを防いで、ワクチンの保存寿命を増大するために、あるいはフリーズドライ効率を改良するために、ワクチンは安定化剤と混合され得る。有用な安定化剤は、ＳＰＧＡ（Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)）では、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインまたはその分解産物、アミノ酸、例えばリシンまたはグリシンの混合物、ならびに緩衝剤、例えばアルカリ金属リン酸塩である。
投与経路
【０１４８】
本発明によるワクチン組成物は、任意の慣用的方法により、例えば注射、例えば皮内、筋肉内、腹腔内または皮下注射により、あるいは、例えば経皮送達により、免疫化される対象に局所的に投与され得る。処置は、単回用量投与、または長期間に亘る複数回の用量投与で構成され得る。
剤形
【０１４９】
注射可能な使用に適した形態は、滅菌溶液または分散液、ならびに滅菌注射用溶液または分散液の必要に応じた調製のための滅菌粉末を含み得る。微生物による汚染に対する防御は、防腐剤、例えば種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等をワクチン組成物中に付加することにより、行うことができる。多くの場合、注射中の疼痛を低減するために、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンの使用により行うことができる。
【０１５０】
一実施形態によれば、本発明の凍結乾燥ワクチン組成物は、注射のために水中に溶解され、静かに混合される。次いで、免疫アジュバント、好ましくはＩＳＡ  ５１が付加される。混合物が、乳化のために静かに混合されて、適切な注射器に入れられる。したがって、本発明は、医療用具、例えば本発明のワクチン組成物を充填されるかまたは予備充填される注射器にも関する。乳濁液は、理想的には、必要に応じて調製される。しかしながら、乳濁液を含有する注射器は、２〜８℃で１０時間未満、保存され得る。この場合、乳濁液は、両手で擦り合わせることにより、注射前に温められる必要がある。
単位投与量範囲
【０１５１】
本発明の別の目的は、３０ｍｃｇより多く１０００ｍｃｇまでの範囲の免疫原性生成物の量を含む投与量単位である。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜７５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜５００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜４５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜４００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜３５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜３００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、３５ｍｃｇ〜２５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜７５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜５００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜４５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜４００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜３５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜３００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２４０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１２０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１００ｍｃｇである。別の実施形態では、投与量単位は、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０ｍｃｇから、４００ｍｃｇまでの範囲の免疫原性生成物の量を含む。
【０１５２】
別の実施形態では、投与量単位は、６０ｍｃｇ〜２４０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、６０ｍｃｇ〜１２０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。
【０１５３】
別の実施形態では、投与量単位は、６０ｍｃｇの免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、１２０ｍｃｇの免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、投与量単位は、２４０ｍｃｇの免疫原性生成物の量を含む。
キットおよび医療用具
【０１５４】
本発明は、
−  典型的には３ｍＬの本発明の免疫原性生成物を含有する１つのバイアル（第１バイアル）と、
−  アジュバント、好ましくはＩＳＡ５１を含有する１つのバイアル（第２バイアル）であって、このバイアルは、３ｍＬのアジュバントを含有することが可能であり、８ｍＬの容器であり得る１つのバイアルと、
−  １つの注射器、典型的には、１ｍＬのＢｒａｕｎ  Ｉｎｊｅｋｔ−Ｆ（登録商標）と、
−  乳濁液調製のための１つの針（第１針）であって、この針は、好ましくは２０Ｇ針である１つの針と、
−  注射用の、好ましくは筋肉内注射用の１つの針（第２針）であって、この針は、好ましくは２３Ｇ針である１つの針と、を包含するキットにも関する。
【０１５５】
本発明は、キットからワクチンを調製するための方法であって、
（１）第２バイアルから０．４ｍｌのアジュバントを吸い上げ、この注射器内容物を、０．４ｍｌの免疫原性生成物を含有する第１バイアル中に放出することと、
（４）内容物を乳化するために、十分な回数、典型的には３０回、全バイアル内容物を吸い上げたり吸い出したりして、最後に、全乳濁液を吸い上げることと、
を包含する方法にも関する。
【０１５６】
注射前に、第１針は、好ましくは、第２針に切り替えられて、空気が注射器から除去される。
【０１５７】
一実施形態では、上記のキットは、
−  ０．４ｍｌの本発明の免疫原性生成物を含有する１つのバイアル（第１バイアル）と、
−  アジュバント、好ましくはＩＳＡ５１を含有する１つのバイアル（第２バイアル）と、
−  １つの注射器、典型的には、１ｍＬのＢｒａｕｎ  Ｉｎｊｅｋｔ−Ｆ（登録商標）と、
−  乳濁液調製のための（第１針）であって、この針は、好ましくは２０Ｇ針である１つの針と、
−  注射用の、好ましくは筋肉内注射用の１つの針（第２針）であって、この針は、好ましくは２３Ｇ針である１つの針と、
を含有する。
【０１５８】
別の実施形態では、免疫原性生成物は凍結乾燥形態である。したがって、キットは、
−  典型的には３ｍＬの本発明の凍結乾燥生成物を含有する１つのバイアル（第１バイアル）と、
−  典型的には２ｍＬの注射用の水を含有する１つのバイアル（第２バイアル）と、
−  アジュバント、好ましくはＩＳＡ５１を含有する１つのバイアル（第３バイアル）であって、このバイアルは、３ｍＬのアジュバントを含有することが可能であり、８ｍＬの容器であり得る１つのバイアルと、
−  １つの注射器、典型的には、１ｍＬのＢｒａｕｎ  Ｉｎｊｅｋｔ−Ｆ（登録商標）と、
−  乳濁液調製のための１つの針（第１針）であって、この針は、好ましくは２０Ｇ針である１つの針と、
−  注射用の、好ましくは筋肉内注射用の１つの針（第２針）であって、この針は、好ましくは２３Ｇ針である１つの針と、
を備える。
【０１５９】
本発明は、キットからワクチンを調製するための方法であって、
（１）第１針に連結された注射器を用いることにより、第２バイアルから第１バイアルに注射のための水を注入することと、
（２）調製物が完全に可溶化するまで、１〜５分間、第１バイアルを静かに回転させることと、
（３）同一の注射器および針を用いて、第３バイアルからアジュバントを吸い上げこの注射器の内容物を第１バイアル中に放出することと、
（４）内容物を乳化するために、十分な回数、典型的には３０回、全バイアル内容物を吸い上げたり吸い出したりして、最後に、全乳濁液を吸い上げることと、
を包含する方法にも関する。
【０１６０】
本発明は、本発明の組成物、乳濁液またはワクチンで充填されるかまたは予備充填される注射器である医療用具にも関する。
【０１６１】
一実施形態では、上記注射器は二重チェンバー注射器であって、この場合、一方のチェンバーは本発明の免疫原性生成物を有する溶液を含み、他方のチェンバーはアジュバントを含む。
【０１６２】
本発明は、本発明の当該生成物を、または本発明のワクチン組成物を予備充填されたバイアルまたはカープルを含む医療用具にも関する。
【０１６３】
一実施形態では、医療用具は、３０ｍｃｇより多く１０００ｍｃｇまでの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜７５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜５００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜４５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜４００ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜３５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜３６０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、３５ｍｃｇ〜２５０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜７５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜５００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜４５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜４００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜３５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜３００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２４０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜２００ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１５０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１２０ｍｃｇである。本発明の別の実施形態では、投与当たりの免疫原性生成物の治療有効量は、６０ｍｃｇ〜１００ｍｃｇである。別の実施形態では、投与量単位は、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０ｍｃｇから、４００ｍｃｇまでの範囲の免疫原性生成物の量を含む。
【０１６４】
別の実施形態では、医療用具は、６０ｍｃｇ〜２４０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、６０ｍｃｇ〜１２０ｍｃｇの範囲の免疫原性生成物の量を含む。
【０１６５】
別の実施形態では、医療用具は、６０ｍｃｇの免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、１２０ｍｃｇの免疫原性生成物の量を含む。別の実施形態では、医療用具は、２４０ｍｃｇの免疫原性生成物の量を含む。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：免疫原性生成物の調製
カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を、海洋性腹足類軟体動物メガスラ・クレヌラタのリンパから抽出し、次いで、ＧＭＰ条件下で精製した。２〜８℃の温度での貯蔵条件で実施した安定性アッセイからの結果は、精製ＫＬＨの保存寿命が２〜８℃で３６ヶ月である、ということを示した。ＧＭＰ条件下で、大腸菌中で組換えヒトＩＦＮα  ２ｂが産生された。以下で開発された製法を用いて、３５０ｍｇ  ＩＦＮα規模で、本発明の生成物のバッチが産生された。
ａ）グルタルアルデヒドを用いた共役
【０１６７】
濾過ＫＬＨを、ＩＦＮα  ２ｂ溶液（７０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．８中のＩＦＮα）に、ＵＶ濃度を基礎にして、２０：１のＩＦＮα：ＫＬＨ比（ＫＬＨの１サブユニットに対して２０単量体のＩＦＮαのモル比に対応する）で付加する。グルタルアルデヒド（反応培地中の最終濃度２２．５ｍＭを達成するために付加）およびホウ酸塩、ｐＨ９（反応培地中２８．５ｍＭの最終濃度を達成するために付加）を用いて共役を実行して、ｐＨを８．５とする。次に、ｐＨ８．５でのこの溶液を、２３±２℃で４５分間混合する。
ｂ）グリシンを用いたクエンチング
【０１６８】
３０分間、グリシン０．１Ｍを用いて、反応をクエンチする。
ｃ）一次接線流濾過（ＴＦＦ１）
【０１６９】
Ｐａｌｌ  Ｍｉｎｉｍ  ＩＩ  ＴＦＦ系、ならびに０．５ＭのＮａＯＨで衛生化され、作業緩衝液（７０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．８）で平衡される１０ｋＤａの分子量カットオフを有する０．０２ｍ２のポリエーテルスルホン膜を用いて、一次ＴＦＦを実施する。
【０１７０】
次に、クエンチ化溶液を、０．２２μｍ濾過により清澄にする。中間体を作業緩衝液で２回希釈し、次いで、接線流濾過（ＴＦＦ）および１２容積の作業緩衝液により分離濾過する。副産物を収穫し、２０時間未満の間保存する。
ｄ)ホルムアルデヒドを用いた不活性化
【０１７１】
蠕動ポンプを用いてホルムアルデヒドを当該副産物に付加して、最終濃度を６６．６ｍＭとする。３７±２℃に設定したインキュベーター中で４０時間、不活性化反応を実施して、磁気撹拌器で溶液を毎日混合する。
ｅ)グリシンを用いたクエンチング
【０１７２】
３０分間、グリシン０．１Ｍを用いて、反応をクエンチする。
ｆ）二次接線流濾過（ＴＦＦ２）
【０１７３】
Ｐａｌｌ  Ｍｉｎｉｍ  ＩＩ  ＴＦＦ系、ならびに０．５ＭのＮａＯＨで衛生化され、作業緩衝液（７０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．８）で平衡される１００ｋＤａの分子量カットオフを有する０．０２ｍ２のポリエーテルスルホン膜を用いて、二次ＴＦＦを実施する。
【０１７４】
クエンチ化溶液を、０．２μｍ濾過により清澄にする。≒９００ｍＬの出発接線容積を有するよう中間体を濃縮し、次いで、１２容積の処方緩衝液（７０ｍＭリン酸塩緩衝液）を用いたＴＦＦにより濾過して、ＩＦＮαの低分子量ホモポリマーおよび非反応試薬を除去する。副産物を収穫し、次いで、ブラッドフォードタンパク質アッセイによる濃度決定に基づいた３００μｇ／ｍＬの理論濃度に希釈して、次に、０．２μｍ濾過して、本発明の免疫原性生成物を得る。
実施例２：生成物の抗原性
【０１７５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ抗ＩＦＮα／ＫＬＨを、以下のように実行した。簡潔に記載すると、９６ウェルプレートを捕捉抗体：ウサギポリクローナル抗ＫＬＨ抗体で被覆して、３７℃で９０分間、遮断緩衝液（例えば、ＰＢＳ中カゼイン２％）で遮断した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、２５０ｎｇ／ｍｌから８回の２倍希釈までの免疫原性生成物の希釈シリーズとともに、あるいは陰性対照、例えばＫＬＨおよびＩＦＮαとともに、プレートをインキュベートした。次に、検出抗体、例えばビオチニル化抗ＩＦＮα抗体を、９０分間付加した。最後に、３７℃で３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰとともにプレートをインキュベートし、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液で３０分間、複合体を発色させた。酵素反応停止後、結果的に生じた色の強度を、４９０ｎｍで分光測光的方法により決定した。
【０１７６】
この試験は、抗原性である、すなわち抗ＩＦＮα抗体により認識されるＩＦＮαを当該生成物が含むということ、および上記ＩＦＮαがＫＬＨと結合されるということを検証した。
実施例３：生成物の免疫原性（試験Ａ）
【０１７７】
ブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定されるような生成物の総タンパク質４μｇを、０日目および２１日目に、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス７匹に注射した。
【０１７８】
３１日目に、マウスから血を抜取り、血清を採取した。
【０１７９】
以下のように、抗ＩＦＮαＥＬＩＳＡを免疫前に実行して、以下のように血清を採取した。
−  ９６ウェルプレートを１００ｎｇのＩＦＮα−２ｂで被覆して、２℃〜８℃で一晩インキュベートした。
−  ３７℃で９０分間、遮断緩衝液を付加した。
−  １／２５００の希釈から少なくとも８回の２倍希釈までの希釈で免疫原性生成物を付加し、プレートを、３７℃で９０分間、インキュベートした。
−  ３７℃で９０分間、抗マウス免疫グロブリン標識化抗体、例えばＨＲＰ共役抗体とともに、プレートをインキュベートした。
−  ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液でＥＬＩＳＡを発色させた。酵素反応停止後、結果的に生じた色の強度を、４９０ｎｍで分光測光的方法により決定した。
この試験は、マウス７匹において、免疫原性生成物による免疫化は抗ＩＦＮα抗体力価を存在させる、ということを示した。
実施例４：生成物の残存活性（試験Ｂ）
【０１８０】
このアッセイは、メイディン・ダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞に及ぼす水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞壊死作用（ＣＰＥ）に及ぼすＩＦＮαの防御効果を基礎にしていた。免疫原性生成物および免疫原性生成物を調製するために用いられる組換えＩＦＮα亜型（陽性対照）を、基本培地（２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中に、それぞれ少なくとも５００ｎｇ／ｍｌおよび少なくとも１０００Ｕ／ｍｌで希釈した。５０μｌの免疫原性生成物および陽性対照を９６ウェルプレート中でプレート化して、基本培地中で２倍希釈のシリーズに希釈する。５０μｌの細胞培地（４％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中の各ウェル中に、２×１０４ＭＤＢＫ細胞を付加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、プレートをインキュベートした。次に、ウイルスを基本培地中で少なくとも１０  ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量  ５０：感染細胞の５０％を殺害するために１０回希釈）に希釈した。プレートを空にして、１００μｌの希釈ウイルスを付加した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、プレートをインキュベートした。培養の終了時に、ＭＴＳ／ＰＭＳ（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ；Promega  Ｇ５４３０）の溶液２０μｌ／ウェルをウェルに付加し、プレートをさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次に、プレートを、分光光度計で４９０ｎｍで読み取った。
【０１８１】
免疫原性生成物の抗ウイルス活性のパーセンテージを算定した。試験した生成物の２つのバッチに関して、抗ウイルス活性は、ＩＦＮαの抗ウイルス活性の１％未満であった。
実施例５：生成物の中和能力（試験Ｃ）
【０１８２】
ＭＤＢＫ細胞中で複製する水疱性口内炎ウイルスの存在下での細胞生存度を評価することにより、当該生成物の中和能力を評価した。
【０１８３】
免疫原性生成物の総タンパク質４μｇ（ブラッドフォードタンパク質アッセイにより決定）を、０日目および２１日目に、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。免疫化前（前免疫血清試料）および３１日目（試験血清試料）に、血清試料を得た。
【０１８４】
２５μｌの前免疫および試験血清試料を、１／２００の希釈、１／２００から８回の希釈までの希釈で、９６ウェルプレート中でプレート化した。陽性対照（ポリクローナル抗ＩＦＮα；PBL, Piscataway, NJ, ref.31100-1）を、基本培地（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中で３１２５ＵＩ／ウェルから１００ＵＩ／ウェルに希釈し、２５μｌを、さらにプレート中でプレート化した。
【０１８５】
基本培地２５μｌ中の２５Ｕ／ウェル（最終濃度）のＩＦＮαを、各ウェルに付加し、プレートを、室温で６０分間インキュベートする。
【０１８６】
アッセイ培地（４％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中の２００００個のＭＤＢＫ細胞を各ウェルに付加し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。
【０１８７】
ウイルスを、ウイルス培地（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中で少なくとも１０  ＴＣＩＤ（感染細胞の５０％を殺害する希釈の１０倍）に希釈する。プレートを空にして、１００μｌのウイルスを各ウェルに付加した後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。
【０１８８】
培養の終了時に、ＭＴＳ／ＰＭＳ（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ；Promega  Ｇ５４３０）の溶液２０μｌ／ウェルをウェルに付加し、プレートをさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次に、プレートを、分光光度計で４９０ｎｍで読み取った。
【０１８９】
７つの試験試料すべてに関して、ＮＣを算定した：平均ＮＣ＝２５３７８９  ＩＵ／ｍｌ（ＳＥＭ＝１７２５２６）。これは、すべての血清が、ＩＦＮαの抗ウイルス活性を中和可能である抗体抗ＩＦＮαを含む、ということを示した。
実施例６：免疫原性生成物を含む組成物およびワクチンの例
【０１９０】
免疫原性生成物を含む一例示的組成物を、表１に示す。
【表１】
2014510126.tif 000003
【０１９１】
免疫原性生成物を含む一例示的ワクチン組成物を、表２に示す。
【表２】
2014510126.tif 000004
実施例７：臨床試験
【０１９２】
表２に記載したようなワクチン組成物を用いて、臨床試験を実行した。
試験計画：
【０１９３】
ＳＬＥを蒙った成体において、０日目、７日目および２８日目に、または０日目、７日目、２８日目および８４日目に、当該生成物の３または４回投与を実施した。当該生成物の以下の用量を試験した：３０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、１２０ｍｃｇおよび２４０ｍｃｇ。
試験集団：
【０１９４】
処置を受けているにもかかわらず、活動性疾患である軽度〜中等度のＳＬＥ（ＳＬＥＤＡＩ  ４〜１０）を有する１８〜５０歳の男性または女性２８名。正常対照インターフェロン遺伝子シグネチャーを、４８名の健常志願者で確立した。高密度アレイ上のインターフェロン・シグネチャーを同定するために、４８名の健常志願者のうちの１８名のＰＢＭＣを、Ｉ型インターフェロンでin vitroで刺激した。基線での健常志願者とＳＬＥ患者との間のシグネチャーを比較することにより、ＳＬＥシグネチャーを確立した。
【０１９５】
最初の３つの群に登録された患者、すなわち３０、６０または１２０ｍｃｇ用量またはプラセボを摂取した患者において、暫定分析を実施した。
【表３】
2014510126.tif 000005
【表４】
2014510126.tif 000006
結果
ワクチンの安全性および耐容性
【０１９６】
２つの狼瘡拡大は、関連ＳＡＥと報告されている。最初のものは、プラセボ群であった。他方は、注射の２日後に彼女のコルチコステロイド治療を自発的に中止していた患者において、ＩＦＮ−Ｋ  ２４０ｍｃｇの最初の注射後に起きた。これは、拡大の発生に関与すると思われるコルチコステロイド処置の中止を中断する。定期的暫定安全分析は、独立安全委員会により実施された。実験室パラメーターにおける臨床的に有意の変化は、検出されていない（血液学、生化学、尿）。
ワクチンの免疫原性
【０１９７】
患者から採取した血清試料から、ＥＬＩＳＡにより、抗ＩＦＮα抗体力価を測定した。
【０１９８】
抗ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡを、本明細書に上記したように実行した。
【０１９９】
結果は、２８日目に出発して免疫原性生成物で処置した全群において、抗ＩＦＮα抗体力価が検出された、ということを示している。
ワクチンの中和活性
【０２００】
以下の方法を用いて、in
vitroで中和活性を評価した。
患者から得た血清試料５０μｌを、１／２００の希釈、１／２００から８回の希釈までの希釈で、９６ウェルプレート中でプレート化した。
陽性対照（ポリクローナル抗ＩＦＮ；PBL, Piscataway, NJ, ref.31100-1）を、１００ｎｇ／ウェルから３．１２５ｎｇ／ウェルに希釈し、５０μｌをプレートに付加した。希釈は、基本培地（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中で実行した。
１０Ｕ／ウェル（最終濃度）のＩＦＮα  ２ｂを各ウェルに付加し、プレートを、室温で６０分間インキュベートした。
アッセイ培地（４％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中の３００００個のＭＤＢＫ細胞を各ウェルに付加し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。
ウイルスを、ウイルス培地（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭのｈｅｐｅｓを補足したＲＰＭＩ）中で少なくとも１０  ＴＣＩＤ（感染細胞の５０％を殺害する希釈の１０倍）に希釈した。プレートを空にして、１００μｌのウイルスを各ウェルに付加した後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。
培養の終了時に、ＭＴＳ／ＰＭＳ（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ；Promega  Ｇ５４３０）の溶液２０μｌ／ウェルをウェルに付加し、プレートをさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次に、プレートを、分光光度計で４９０ｎｍで読み取った。
【０２０１】
３０ｍｃｇの免疫原性生成物で処置した患者からの血清で、免疫化後１６８日目に中和能力を有する抗ＩＦＮα抗体を提示する血清はなかったが、一方、６０ｍｃｇの免疫原性生成物で処置した患者からの血清は、１６８日目に中和能力を有する抗ＩＦＮα抗体を提示する、ということを暫定報告の結果は示した（図１）。
【０２０２】
さらに、６０μｇまたは１２０μｇの免疫原性生成物で処置した対象の５０％、および２４０μｇの免疫原性生成物で処置した対象の８０％において、中和活性が検出された、ということを最終報告の結果は示した（表５）。
【表５】
2014510126.tif 000007
【０２０３】
これらの結果は、ＩＦＮαのin
vivo中和を有するためには３０ｍｃｇの免疫原性生成物での処置が必要である、ということを示した。
実施例８：トランスクリプトーム解析
【０２０４】
免疫原性生成物の注射の前後のいくつかの時点で、ＰＢＭＣを採取した。この暫定分析のために、標準Affymetrixプロトコールに従って標識されたＶ１（０日目）およびＶ６（初回注射後３８日目）試料で総ＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  ＨＧＵ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイ上でハイブリダイズした。試料のＲＭＡ（Robust Microarray Analysis（強固なマイクロアレイ解析））正規化後、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇで統計学的解析を実施した。
【０２０５】
目的変数なしのクラスタリングアルゴリズムを基線試料で実施して、患者を、Ｉ型インターフェロンにより誘導される遺伝子の自発的過剰発現を有する者（ｎ＝１１）と、有さない者（ｎ＝７）との２つの部類に群分けした基線での（ＩＦＮ誘導遺伝子は、ＩＦＮ刺激対照ＰＢＭＣのマイクロアレイを基礎にして、実験的に同定された）。ｄｓＤＮＡ力価が、シグネチャーを有する患者（平均＋／−ＳＥＭ：１３１．１＋／−５０．１  ＵＩ／ｍｌ）では、シグネチャーを有さない患者（平均＋／−ＳＥＭ：４４．７＋／−３３．３、ｐ＝０．００６；マン・ホイットニー試験による）と比較して有意に高かった、ということは意外ではない。免疫原性生成物を摂取した、基線においてＩＦＮシグネチャーを有する患者８名の８つの追跡調査試料において測定可能な抗ＩＦＮα抗体が見出されたが、一方、これは、免疫原性生成物で処置したＩＦＮシグネチャーを有さない患者６名のうち２名でのみ見出され、４名のプラセボ処置個体では誰からも見出されなかった（ｐ＝０．００２；カイ自乗アッセイ）。基線ＩＦＮシグネチャーを有する患者１１名のうち、２名が３０ｍｃｇ用量を摂取し、１名が６０ｍｃｇ用量を摂取し、５名が１２０ｍｃｇ用量を摂取し、３名がプラセボ注射で処置された。Ｖ１およびＶ６間のＩＦＮ誘導遺伝子の発現で観察された変化は、プラセボで処置された患者と比較して、免疫原性生成物で処置された患者においては有意に異なった（図２）。
【０２０６】
この結果は、免疫原性生成物がin
vivoでＩＦＮ誘導遺伝子の発現に影響を及ぼす、ということを示唆している。
実施例９：ＩＦＮシグネチャーおよび免疫原性生成物処置に対する応答
【０２０７】
実施例７の軽度〜中等度のＳＬＥを有する患者２８名において、基線での「インターフェロン・シグネチャー」を測定した。インターフェロン・シグネチャー（ＩＦＮシグネチャー）は、２１のＩＦＮ誘導遺伝子を用いて算定されるスコアと対応し、Yao et al., Arthritis & Rheumatism, 2009, 60(6): 1785-1796に記載されている。実施例８に記載したように、インターフェロン・シグネチャーの測定を実行した。
【０２０８】
実施例７のＳＬＥ患者２８名のうち、基線において、１９名が陽性インターフェロン・シグネチャーを示し、９名が陰性インターフェロン・シグネチャーを示した。
インターフェロン・シグネチャーおよびＳＬＥ疾患活性
【０２０９】
ｄｓＤＮＡ抗体力価およびＣ３の血清レベルを、両群の患者における疾患活性の指数として測定した。
【０２１０】
ＤＰＣ抗ＤＮＡキット（ＰＩＫＡＤＤ−４：Diagnostic Products Corporation）を用いて、ｄｓＤＮＡ抗体力価を決定した。
【０２１１】
補体Ｃ３キット（キット＃４４６４５０；Beckman Coulter）を用いて、Ｃ３血清レベルを決定した。
【表６】
2014510126.tif 000008
【０２１２】
上記表６に示すように、基線においてインターフェロン・シグネチャーが陽性であるＳＬＥの患者は高い生物学的な疾患活性の指数を示した。
インターフェロン・シグネチャーおよび本発明の免疫原性生成物による処置に対する応答
【０２１３】
実施例７で記載したような本発明の免疫原性生成物による処置の作用を、基線においてＩＮＦシグネチャーが陽性のＳＬＥ患者と陰性のＳＬＥ患者とで比較した。
抗ＩＦＮ−アルファ応答
【０２１４】
Ｖ６（免疫化後３８日目）、Ｖ１０（１１２日目）およびＶ１１（１６８日目）で、実施例７に記載したように、ＩＦＮ結合抗体力価を測定した。
【０２１５】
陽性インターフェロン・シグネチャーを有するＳＬＥ患者は、基線でのインターフェロン・シグネチャーが陰性であるＳＬＥ患者より、本発明の免疫原性生成物に応答して１０以上のＩＦＮ結合抗体を産生する、ということがこの結果により示された（図３）。
ＩＦＮ誘導遺伝子
【０２１６】
Ｖ０およびＶ１０またはＶ１１間のＩＦＮ誘導遺伝子の発現の進化を、基線において陽性または陰性ＩＦＮシグネチャーを有する処置患者において、ならびにプラセボ処置患者において測定した。
【０２１７】
プラセボおよびＩＦＮシグネチャーが陰性の患者と比較して、ＩＦＮシグネチャーが陽性のＳＬＥ患者では、ＩＦＮ誘導遺伝子に及ぼす本発明の免疫原性生成物による処置の作用は、Ｖ１０およびＶ１１で、強力且つ有意に異なる、ということがこの結果により示された（図４）。
補体Ｃ３
【０２１８】
本明細書で上記したようにＶ−１（免疫化の３０日前）、Ｖ０（免疫化当日）、Ｖ７（免疫化後５６日目）、Ｖ１０（１１２日目）およびＶ１１（１３８日目）で、処置患者およびプラセボ摂取患者において、血清Ｃ３値を測定した。
【０２１９】
処置患者対プラセボ患者において、Ｃ３レベルに有意の増大が認められる、ということがこの結果により示された。さらに、本発明の免疫原性生成物で処置したＩＦＮシグネチャー陽性ＳＬＥ患者において、Ｃ３レベルの有意の増大が認められる（図５）。
実施例１０：本発明の生成物中のＩＦＮα／ＫＬＨ比の決定
【０２２０】
本発明の生成物中のＩＦＮαおよびＫＬＨの量を評価するために、ＵＶおよび蛍光検出に基づいた定量方法を開発した。ＩＦＮαまたはＫＬＨに各々特異的である２つの蛍光標識を用いて、本発明の生成物を製造した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析後、２２０ｎｍでのＵＶシグナルおよびＩＦＮα標識またはＫＬＨ標識に特異的な蛍光シグナル（ＦＬＤ）の積分により、ＩＦＮαおよびＫＬＨの量を決定した。この方法は、ＩＦＮα／ＫＬＨの重量比の算定を可能にする。
ａ）原料標識化：
【０２２１】
生成物製造中に用いられるアミノ基を保存するために、蛍光タグをスルフヒドリル基上に結合させた。
【０２２２】
室温で３時間、７０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で、標識化を実行した。ＫＬＨを２００モル当量のＡｔｔｏ５６５−マレイミド（１８５０７、Sigma）で、ＩＦＮαを１００モル当量のフルオレセインマレイミド（４６１３０、Pierce）でそれぞれ標識した。次に、非反応タグを排除するために、７０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）で状態調節したＺｅｂａカラム上で、標識化タンパク質（ＫＬＨ−ａｔｔｏ５６５およびＩＦＮ−フルオレセイン）を濾過した。
ｂ）生成物製造：
【０２２３】
次に、標識化原料を用いて、実施例１と同じ製法であるが接線流濾過の代わりに透析濾過を用いて、標識化生成物を製造した。
ｃ)ＫＬＨおよびＩＦＮαホモポリマー標準製造
【０２２４】
定量分析方法のために、ホモポリマー標準を製造した。実施例１と同じ製法であるがＫＬＨの代わりに７０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）を、接線流濾過の代わりに透析濾過をそれぞれ用いて、標識化ＩＦＮαホモポリマー標準を製造した。
【０２２５】
実施例１と同じ製法であるがＩＦＮαの代わりに７０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）を、接線流濾過の代わりに透析濾過をそれぞれ用いて、標識化ＫＬＨホモポリマー標準を製造した。
ｄ）サイズ排除クロマトグラフィーによる分析方法
【０２２６】
次に、ＵＶおよび特異的蛍光検出を用いたＳＥＣにより、バッチを分析した。順次接続した（Agilent,
５１９０−２５３６、５１９０−２５１１）カラムＳＥＣ５（１０００Å）ＳＥＣ３（３００Å）上に、試料６０μＬを注入し、２２０ｎｍでのＵＶ検出、ならびに表７に記載するような特異的蛍光検出（ＩＦＮα−フルオレセインまたはＫＬＨ−Ａｔｔｏ５６５に関して）により、３５分間、ＰＢＳを用いて溶離を実施した。
【表７】
2014510126.tif 000009
【０２２７】
０〜２０分間のクロマトグラムピーク下面積を積分することにより、ＵＶおよび蛍光（ＦＬＤ）シグナルを算定した。
【０２２８】
この方法を検証するために、予備実験を実行して、以下を示した。
−  蛍光シグナル特異性（２つの標識化タンパク質間でシグナル重複は観察されなかった）。
−  各製造バッチ（本発明の生成物、ＫＬＨおよびＩＦＮαの標識化ホモポリマー）に関して、ＳＥ−ＨＰＬＣによる類似のＵＶプロフィールが観察された。
−  製造のための蛍光シグナルの消光は観察されなかった。
−  ＦＬＤシグナルは線形で、ＵＶシグナルに比例する。
【０２２９】
製造された標識化キノイド（kinoid）における標識化ＩＦＮα  ＵＶ関与を、標識化ＩＦＮαホモポリマー標準のＦＬＤＩＦＮα−フルオレセイン＝ｆ（ＵＶによる面積）による曲線面積に従って測定した。
【０２３０】
製造された標識化キノイド（kinoid）における標識化ＫＬＨ  ＵＶ関与を、標識化ＫＬＨホモポリマー標準のＦＬＤＫＬＨ−Ａｔｔｏ５６５＝ｆ（ＵＶによる面積）による曲線面積に従って測定した。
【０２３１】
ＵＶ面積がタンパク質濃度の線形関数であると確認される場合、この方法は、総製造標識化キノイド（kinoid）における標識化ＩＦＮαの重量パーセンテージの評価を可能にする。
ｅ）バッチ解析
【０２３２】
標識化キノイド（kinoid）の３つのバッチを製造し、この方法により解析した。ＵＶシグナルおよび濃度の、ならびにＦＬＤおよびＵＶシグナルの比率性に基づいて、ＩＦＮαおよびＫＬＨの量の間の比（ｍＩＦＮα／ｍＫＬＨ）を、３つのバッチに関して算定した（表８）。
【表８】
2014510126.tif 000010
【０２３３】
０．２８という平均比  ｍＩＦＮα／ｍＫＬＨは、＜１５％の相対標準偏差を有することが判明した。
実施例１１：生成される抗ｍＩＦＮα抗体力価ならびに本発明の免疫原性生成物がＳＷＥまたはＳＷＥ−ａを有する乳濁液として注入される場合の中和能力
ｍｕＩＦＮ−Ｋの製造：
【０２３４】
簡潔に記載すると、ネズミＩＦＮαＡ（PBL Biomedical Laboratories）およびネイティブＫＬＨ（Sigma）を５０：１比で混合し、２．５ｍＭグルタルアルデヒドデ４５分間処理した。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析して、余分量のグルタルアルデヒドを除去し、溶液を、３７℃で４８時間、６６ｍＭホルムアルデヒドとともにインキュベートした。グリシン（最終濃度０．１Ｍ）でクエンチングした後、１０ｋＤａカットオフ膜を用いてＰＢＳに対して透析し、調製物を０．２２μｍ膜を用いてフィルター滅菌して、４℃で保存した。
免疫化プロトコール：
【０２３５】
ｍＩＦＮ−Ｋ（１０μｇ／注射）をＳＥまたはＳＥ−アジュバント（最終容積１００μｌ）との１：１乳濁液として、０日目および２１日目に２回、筋肉内免疫化した。
ＥＬＩＳＡによる抗ｍｕＩＦＮαおよび抗ＫＬＨ抗体力価の決定
【０２３６】
ＥＬＩＳＡにより、ｍｕＩＦＮαまたはＫＬＨに対する抗体に関して、血清を分析した。簡潔に記載すると、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc）を１００ｎｇ／ウェルのｍｕＩＦＮαＡ（PBL Biomedical
Laboratories）で被覆して、抗ＫＬＨ抗体を検出した。
【０２３７】
２倍連続血清試料希釈液（１：１００〜１：５１，２００）を、ウェルに付加した。ブランクウェルには、希釈緩衝液１００μＬを入れた。３７℃で１．５時間後、１００μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびＯ−フェニレンジアミン、ホースラディッシュペルオキシダーゼのための比色基質で、抗体を検出した。ｍｕＩＦＮ−Ｋ免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウスからの血清のプールを、陽性対照として用いた。４９０ｎｍの波長で、光学密度（ＯＤ）を記録した。ＥＬＩＳＡアッセイを、二重反復実験で実施した。各プレートにおいて、２つのウェルをブランクのために残しておき、その平均値を全ウェルから差し引いた。
【０２３８】
最大ＯＤ（ＯＤｍａｘ）／２をｘ軸上に内挿することにより、抗体力価を算定した。用いた方程式は、ＯＤｍａｘ／２の周囲の２つの点を通る直線に関して、ｙ＝ａｘ＋ｂであった。
ＩＦＮ−Ｋ免疫化後に誘導される抗ｍｕＩＦＮα抗体の中和能力の決定
【０２３９】
古典的抗ウイルス細胞変性アッセイ（ＥＭＣＶ／Ｌ９２９）を用いて、中和能力を決定した。このアッセイでは、ネズミＬ−９２９細胞（ＡＴＣＣ）に及ぼす脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の致死作用を抑制するその能力に関して、ｍｕＩＦＮαの抗ウイルス活性力価を決定した。
【０２４０】
簡潔に記載すると、２５μＬの希釈血清試料（または対照抗体）を、２倍連続希釈液（１：２００〜１：６４００）中の９６ウェル培養プレートに付加した。市販のウサギポリクローナル抗体抗ｍｕＩＦＮα（    PBL, ref:３２１００−１）を、陽性対照として用いた。２５  ＩＵ／ウェルのｍｕＩＦＮαとともに室温で１時間インキュベートした後、ウェル当たり２０×１０３  Ｌ−９２９細胞を植えつけ、３７℃でインキュベートした。一晩培養後、プレートをＰＢＳで洗浄して、１００μＬ／ウェルのＥＭＣＶ溶液（細胞の５０％を殺害するために必要とされる用量の１００倍）を各ウェルに付加した。プレートを、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、２０μＬ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩／フェナジンメトスルフェート）溶液（Promega）を付加し、プレートを、加湿インキュベーター（遮光）中で、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、インキュベートした。次いで、４９０ｎｍでのＯＤを各ウェルに関して測定した。ブランク（１００μＬの培地単独を有するウェル）のＯＤを、試料ＯＤから差し引いた。
【０２４１】
各試料の中和能力を、以下のように算定した。
中和能力（％）＝１００×［（ＯＤ試験−ＯＤウイルス）／（ＯＤ細胞）］
（式中、ＯＤ試験は、試験試料（細胞＋ＩＦＮα＋血清＋ウイルス）に関するＯＤ
ＯＤウイルスは、ウイルス対照（細胞＋ウイルス）に関するＯＤ
ＯＤ細胞は、２０，０００個の細胞／ウェル（細胞＋ＩＦＮα＋ウイルス）に関するＯＤ）
【０２４２】
中和能力を、血清希釈の一関数としてプロットした。ＩＦＮα活性値の５０％を中和する力価（血清希釈数）を、曲線の線形部分上の内挿により決定した。
【０２４３】
ＳＷＥまたはＳＷＥ−ａ中に乳濁されたｍｕＩＦＮ−Ｋの初回注射後３１日目に収集したマウス血清中に、抗ｍｕＩＦＮα力価および抗ＫＬＨ力価が存在するということ、ならびに抗ｍｕＩＦＮα抗体は中和能力を有する（ＮＣ５０＞２０）、ということがこの結果により示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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