(57)【要約】  本発明は、ワクチン接種による、細胞内生物感染の防止および治療、腫瘍の治療、ならびに感染性およびアレルギー性疾患の防止のための方法および化合物を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＴ細胞を活性化可能な人工配列を含むペプチドまたはポリペプチドを得るための方法であって：
（ａ）ＮＫＴ細胞を活性化しないペプチドまたはポリペプチドの同定；
（ｂ）アミノ酸付加、置換および／または欠失による、少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフの導入
の工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ＣＤ１ｄ結合モチーフが［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＨＹ］である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＮＫＴ細胞を活性化しない前記ペプチドまたはポリペプチドが、［ＦＷＨＹ］−Ｒ−［ＩＬＭＶ］および／または［ＩＬＭＶ］−Ｒ−［ＦＷＨＹ］、の中から選択される少なくとも１つの推定上のＣＤ１ｄ結合モチーフ（式中、Ｒはアミノ酸またはアミノ酸配列を示す）を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記の少なくとも１つの推定上のＣＤ１ｄ結合モチーフが、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］、［ＩＬＭＶ］−Ｘ２Ｘ３−［ＦＷＨＹ］、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３Ｘ４−［ＩＬＭＶ］、［ＩＬＭＶ］−Ｘ２Ｘ３Ｘ４−［ＦＷＨＹ］、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２−［ＩＬＭＶ］、［ＩＬＭＶ］−Ｘ２−［ＦＷＨＹ］アミノ酸配列またはそれらの任意の組み合わせ、の中から選択される（式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、任意のアミノ酸を示す）、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ１ｄ結合モチーフが、細胞内病原体、腫瘍関連抗原、感染性病原体またはアレルゲン由来の抗原であって、前記細胞内病原体がｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡウイルスであり、例としてはヘルペスウイルス科、フラビウイルス科およびピコルナウイルス科、インフルエンザ、麻疹および免疫不全ウイルスがあり、前記細菌およびマイコバクテリアが、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ヒトまたは動物に対して病原性である他のマイコバクテリア、エルシニア症、ブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ）であり、寄生虫が、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｓ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｓ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）であり、前記腫瘍が癌遺伝子、癌原遺伝子、ウイルス由来タンパク質、生存因子またはクローン形質決定因子であり、前記感染性病原体がウイルス、細菌または寄生虫であり、前記アレルゲンが風媒性アレルゲン、接触アレルゲン、全身性アレルゲンまたは食物アレルゲンである、請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのさらなるＣＤ１ｄ結合モチーフが、化学合成によって、または組換え発現によって得られることで特徴付けられる、請求項１〜５のいずれかにしたがって得られうるペプチドまたはポリペプチド。
【請求項７】
前記ＣＤ１ｄ結合モチーフの隣接配列内に大きなアミノ酸残基をさらに含む、請求項１〜５の方法のいずれかにしたがって得られうるペプチドまたはポリペプチド。
【請求項８】
前記ＣＤ１ｄ結合モチーフの隣接配列内に、少なくとも１つのクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをさらに含む、請求項１〜５のいずれかにしたがって得られうるペプチドまたはポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜５の方法にしたがって得られうるペプチドまたはポリペプチドを含むタンパク質。
【請求項１０】
薬剤としての、請求項１〜５にしたがって得られうる少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドの使用。
【請求項１１】
被験体において、細胞内病原体感染を防止するかまたは治療するための、腫瘍を治療するための、感染を防止するかまたは治療するための、アレルギー性疾患を防止するかまたは治療するための薬剤としての、請求項１０記載の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドの使用。
【請求項１２】
哺乳動物においてＮＫＴ細胞を活性化するための薬剤としての、請求項１０〜１１記載の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドの使用。
【請求項１３】
ペプチドまたはポリペプチドを核酸配列の形で哺乳動物に投与する、請求項１０〜１２のいずれか記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫＴ細胞を補充（recruit）し、そして活性化する能力を持つペプチドまたはポリペプチド、ならびに細胞内生物感染または腫瘍の治療、およびワクチン接種戦略による疾患の防止におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内病原体による慢性感染性疾患は治療が困難であり、これは、通常、免疫系が感染細胞を特異的に認識するのを可能にするであろういくつかの分子の表面発現を、前記感染細胞が減少させるためである。感染細胞が主要組織適合（ＭＨＣ）複合体分子の発現を阻害し、それによって、ＣＤ８系譜のＴリンパ球による（ＭＨＣクラスＩ認識を通じた）、そしてＣＤ４系譜のリンパ球による（クラスＩＩ  ＭＨＣ認識を通じた）認識を防止する例は、マイコバクテリウム感染である。実際、多くの細菌およびウイルスが、感染細胞の認識を回避する方法を精巧に作り上げてきている。
【０００３】
ある程度まで、同じ機構によって腫瘍が検出を回避することが可能になる。こうした腫瘍のいくつかは、少なくとも炎症条件下で、ＭＨＣクラスＩＩ決定因子を発現する。最近の実験によって、例えばワクチン接種により、ＭＨＣクラスＩが提示する腫瘍由来ペプチドのＣＤ８認識が増加した際であっても、腫瘍増殖に対する全体の効果は限定されたままであることが示されてきている。
【０００４】
細胞内病原体での慢性感染および腫瘍の両方において、それぞれ感染細胞または腫瘍細胞を認識し、そして排除する新規方法を精巧に作り上げることが緊急に必要である。
【０００５】
感染性疾患に対するワクチン接種が現在、行われている。しかし、かなりの数の状態において、病原体に対する特定の抗体の優先的な誘導によって、そして感染細胞を認識する免疫細胞がまったくまたはほとんど誘発されないことによって、ワクチン接種の有効性が限定される。したがって、ワクチン接種によるウイルスおよび細菌疾患の防止は、しばしば、有効性が限定される。少なくとも世界のいくつかの地域で、ウイルス疾患、例えばインフルエンザウイルス、ロタウイルスまたはさらにポリオウイルスに対するいくつかのワクチンが有効である例が見出されるであろう。いくつかの例において、ワクチン接種に関して考慮される抗原は、弱い免疫原であり、そしてＭＨＣ決定因子が非常に多様であるため、被験体間で有効性の有意な相違が観察される。
【０００６】
アレルギー性疾患に関するワクチン接種はまた、アレルゲンの免疫原性が弱いこと、または正確にアレルギー症状を伴って反応する傾向がある被験体にアレルゲンを投与することに関連するリスクの管理が欠如していることのいずれかに関連する限界も有する。
【０００７】
感染性病原体に対するおよびアレルゲンに対するワクチン接種どちらにおいても、より効率的でそしてより安全な方法に関する必要性がある。
【０００８】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、非古典的ＭＨＣ複合体分子ＣＤ１ｄによって提示される抗原を認識する非慣用的Ｔリンパ球の別個の系譜を構成する。ＮＫＴ細胞の２つのサブセットが現在記載されている。１型ＮＫＴ細胞はまた、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）とも呼ばれ、最も豊富である。これらは、マウスにおいてはＶアルファ１４であり、そしてヒトにおいてはＶアルファ２４である、インバリアント・アルファ鎖で作製されるアルファ−ベータＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって特徴付けられる。このアルファ鎖は、可変であるが限定された数のベータ鎖と会合する。２型ＮＫＴ細胞は、アルファ−ベータＴＣＲを有するが、多型アルファ鎖を伴う。しかし、ＮＫＴ細胞の他のサブセットが存在し、その表現型はなお定義が不完全であるが、これらはＣＤ１ｄ分子の状況（context）で提示される糖脂質によって活性化される特性を共有することが明らかである。
【０００９】
ＮＫＴ細胞は、典型的には、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫ１．１を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体の組み合わせを発現する。ＮＫＴ細胞は、自然免疫系の一部であり、これらが完全なエフェクター能を獲得する前に拡大を必要としないという事実によって、適応免疫系とは区別可能である。ＮＫＴ細胞の活性化は、多様な影響を生じる。こうした細胞は、非常に多数のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２１およびＩＦＮ−アルファを含む）を含むあらかじめ形成された仲介因子を放出し、これらは抗体産生に関してＢ細胞に対する補助を提供し、そしてサイトカインの放出はまた、ＣＤ４＋  Ｔ細胞にも影響を及ぼしうることが示唆されてきている（Ｂｕｒｒｏｗｓら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９，  １０：  ６６９−６７１）。本発明の状況において、Ｂ細胞活性化増加および主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化は有益であろう。
【００１０】
ＮＫＴ細胞の認識ユニット、ＣＤ１ｄ分子は、ベータ−２ミクログロブリンの存在を含めて、ＭＨＣクラスＩ分子のものとよく似た構造を有する。２つのアルファ鎖によって境界づけられ、そして脂質鎖を受け入れる非常に疎水性の残基を含有する深い間隙によって特徴付けられる。間隙は両端が開放されており、より長い鎖に適合可能である。ＣＤ１ｄの古典的リガンドは、合成アルファ・ガラクトシルセラミド（アルファＧａｌＣｅｒ）である。しかし、多くの天然代替リガンドが記載されてきており、これには、糖脂質およびリン脂質、ミエリン中に見出される天然脂質スルファチド、微生物ホスホイノシトールマンノシドならびにアルファ−グルクロノシルセラミドが含まれる。現在のコンセンサス（概説に関しては、例えばＭａｔｓｕｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２０：３５８−３６８、およびＧｏｄｆｒｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １１：  １９７−２０６を参照されたい）は、ＣＤ１ｄは、脂質鎖を含有するリガンド、または一般的にＣＤ１ｄ内部に埋め込まれる脂質テールおよびＣＤ１ｄの外側に突き出る糖残基頭基で作製される共通の構造にのみ結合するというものである。
【００１１】
ペプチドは、ＣＤ１ｄによる提示を通じてＮＫＴ細胞を活性化可能ではないようである。しかし、大きなアミノ酸残基を含有する長い疎水性ペプチドはＣＤ１ｄに結合可能であることが示唆された（Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６）。定義された生理学的関連を持たないランダム配列ペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを用いて行った観察によって、理論的なコンセンサスモチーフを確立することが可能になった（Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６、および以下を参照されたい）。
【００１２】
実際、Ｃａｓｔａｎｏらは、活性化される細胞がＣＤ８＋  Ｔ細胞、すなわちＭＨＣクラスＩ拘束細胞であって、そしてＮＫＴ細胞ではないことを示す。これらの知見は、当業者に、疎水性ペプチドがＣＤ１ｄ分子によって提示される証拠がないことを示す。Ｃａｓｔａｎｏらによって行われる請求の生理学的関連性は、慣用的な免疫プロトコル下でＮＫＴ細胞を誘発できないために、さらに疑問視された（Ｍａｔｓｕｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２０：３５８−３６８、およびＢｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  １７７：  ７６９−７７５）。ＣＤ１ｄを過剰発現するようにトランスフェクションされ、そしてオボアルブミン由来ペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで装填された細胞での免疫などの人工的な系は、ＮＫＴ細胞を誘発可能であった。同様に、プラスミドＤＮＡとともにネズミＣＤ１ｄおよび共刺激分子で皮内免疫すると、細胞溶解性ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞が誘導される（Ｌｅｅら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８，  １８７：  ４３３−４３８）。Ｐ１およびＰ７位の芳香族残基、ならびにＰ４位の脂肪族鎖で作製される構造モチーフを含有する疎水性ペプチドが、Ｃａｓｔａｎｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：  ２２３，  １９９５）によって、ＣＤ１ｄ結合エピトープのコアモチーフを含有すると請求された。上記のように、Ｃａｔａｎｏらによって導かれた結論は、データに裏付けられていない。
【００１３】
本発明者らは、疎水性アミノ酸配列を含むペプチドが、実際にＮＫＴ細胞の活性化を誘発可能であるという予期されない発見をした。
【００１４】
さらに、ＮＫＴ細胞の活性化は、Ｂ細胞およびクラスＩＩ拘束Ｔ細胞活性化（Ｂｕｒｒｏｗｓら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９，  １０：  ６６９−６７１）、そしてそれによって抗体産生を誘発するのを補助する、ＮＫＴ細胞によって分泌される多量のサイトカインによって、感染性疾患に対する、そしてアレルゲンに対するワクチンの効率を増加させる方法を提供する。
【００１５】
タンパク質由来のエピトープがＣＤ１ｄに結合可能であるならば、タンパク質へのＣＤ１ｄ結合モチーフの付加は、ＮＫＴ細胞の活性化を増加可能であり、これによって、細胞内病原体感染または腫瘍の治療に適切であろうように、抗原提示細胞殺傷の誘導を生じることが可能であるか、あるいは感染性疾患またはアレルギーに関するワクチン接種戦略に適切であろうように、抗原の免疫原性を増加させることが可能である。
【００１６】
細胞内病原体感染の例には、マイコバクテリウム感染、細胞内細菌感染、ウイルス疾患および寄生虫感染が含まれる。腫瘍の例は、ＣＤ１ｄを発現する任意の腫瘍である。ワクチン接種に用いられる抗原の例は、インフルエンザワクチン接種、経口ロタウイルスまたは経口ポリオウイルスワクチン接種、およびアレルゲンワクチン接種に用いられるウイルスタンパク質である。
【００１７】
より具体的には、ＣＤ１ｄ結合モチーフの付加は、抗原提示細胞に向かうＮＫＴ細胞の殺傷活性を増加させるか、またはＮＫＴ細胞によって作製されるサイトカインの産生を増加させ、そしてそれによって免疫原性を増加させることが望ましい場合に有用であろう。
【００１８】
ＮＫＴ細胞を補充し、そして活性化するための、ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内での新規ＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）の生成、あるいはこうしたペプチドまたはポリペプチドへのＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）の付加は、本発明の基礎を形成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｕｒｒｏｗｓら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００９，  １０：  ６６９−６７１
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２０：３５８−３６８
【非特許文献３】Ｇｏｄｆｒｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １１：  １９７−２０６
【非特許文献４】Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６
【非特許文献５】Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  １７７：  ７６９−７７５
【非特許文献６】Ｌｅｅら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８，  １８７：  ４３３−４３８
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、細胞内病原体を所持する細胞の排除を増加させることによる、被験体におけるこうした病原体の感染を治療するためのペプチドまたはポリペプチドの使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、腫瘍細胞の認識および殺傷を増加させることによる、被験体における腫瘍の療法のためのペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２２】
本発明はまた、感染性病原体またはアレルゲン由来の抗原を用いた被験体におけるワクチン接種目的のためのペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２３】
本発明者らは、ペプチドがＣＤ１ｄ分子によって提示可能であり、そしてＮＫＴ細胞を活性化可能であるという予期せぬ観察を行った。こうした細胞の活性化は、ＣＤ１ｄに結合したペプチドを提示する細胞に対する細胞溶解特性の獲得、およびサイトカインの放出を生じる。
【００２４】
本発明は、１つの側面において、細胞内病原体由来の少なくとも１つの単離免疫原性ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記細胞内病原体感染を被験体において治療するための薬剤として、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するか、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドに少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加することによって修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用に関する。
【００２５】
本発明はまた、腫瘍由来の少なくとも１つの単離免疫原性ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記腫瘍を被験体において治療するための薬剤として、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するか、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドに少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加することによって修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２６】
本発明はまた、１つの側面において、細胞外感染性病原体由来の少なくとも１つの単離免疫原性ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、前記感染を被験体において防止するための薬剤として、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するか、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドに少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加することによって修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２７】
本発明はまた、１つの側面において、アレルゲン由来の少なくとも１つの単離免疫原性ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、アレルギー反応を被験体において防止するための薬剤として、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するか、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドに少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加することによって修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００２８】
当業者には、上に列挙した適応症いずれにおいても、ＣＤ１ｄ結合モチーフの生成が、前記モチーフが抗原提示細胞によって発現されるＣＤ１ｄ分子によって提示された際に、ＮＫＴ細胞によって認識され、そして前記ＮＫＴ細胞を活性化することを意味することが明らかであるはずである。
【００２９】
さらなる側面において、本発明はまた、細胞内病原体、腫瘍、感染性病原体またはアレルゲン由来の少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用であって、被験体における細胞溶解活性および前記被験体におけるＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞によるサイトカイン産生を活性化するための薬剤として、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するか、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドに少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加して、ＮＫＴ細胞を補充し、そして活性化することによって修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの使用もまた含む。
【００３０】
上記使用のいずれにおいても、細胞内病原体由来の前記ペプチドまたはポリペプチドは、細胞内生活環を持つウイルス、細菌、マイコバクテリアまたは寄生虫由来の任意のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。ウイルスには、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれ、例としてはヘルペスウイルス科、フラビウイルス科およびピコルナウイルス科、インフルエンザ、麻疹および免疫不全ウイルスがある。細菌およびマイコバクテリアには、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ヒトまたは動物に対して病原性である他のマイコバクテリア、エルシニア症、ブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ）が含まれる。寄生虫には、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｓ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｓ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）が含まれる。
【００３１】
上記使用のいずれにおいても、腫瘍由来の前記ペプチドまたはポリペプチドは：（１）癌遺伝子、例えばいくつかのメラノーマにおいて同定されるＭＡＧＥ；（２）癌原遺伝子、例えば腎臓または副甲状腺のものなどの軟部組織癌上で、ならびに多発性骨髄腫において発現されるサイクリンＤ１；（３）ウイルス由来タンパク質、例えばいくつかの癌腫におけるおよびいくつかのホジキン型リンパ腫におけるエプスタインバーウイルス由来のもの；（４）抗アポトーシス因子である生存因子、例えばサバイビンまたはｂｃｌ２；（５）クローン形質決定因子、例えば濾胞性リンパ腫または多発性骨髄腫におけるＢ細胞受容体由来のイディオタイプ決定因子、あるいはＴ細胞悪性腫瘍におけるＴ細胞受容体決定因子由来のペプチドまたはポリペプチドのいずれであってもよい。
【００３２】
上記使用のいずれにおいても、前記ペプチドまたはポリペプチドは、ウイルス、細菌および寄生虫を含む感染性病原体由来である。
【００３３】
上記使用のいずれにおいても、アレルゲン由来の前記ペプチドまたはポリペプチドは、
−ピーナッツ、魚、例えばタラ（ｃｏｄｆｉｓｈ）、卵白、甲殻類（ｃｒｕｓｔａｃｅａ）、例えばエビ（ｓｈｒｉｍｐ）、ミルク、例えば牛乳、小麦、シリアル、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａ）の果物（リンゴ、プラム、イチゴ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）およびセリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）の野菜、ナッツ（ｔｒｅｅ  ｎｕｔｓ）、ゴマ、ピーナッツ、大豆（ｓｏｙｂｅａｎ）および他のマメ科植物アレルゲン、香辛料、メロン、アボカド、マンゴー、イチジク、バナナ・・・に存在する食物アレルゲン、
−ヒョウヒダニ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）種またはヤケヒョウヒダニ（Ｄ．  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、コナヒョウヒダニ（Ｄ．  ｆａｒｉｎａｅ）およびＤ．ミクロセラス（Ｄ．  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）またはブロミア属（Ｂｌｏｍｉａ）種から得られるチリダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）アレルゲン、
−ゴキブリ（ｃｏｃｋｒｏａｃｈ）またはハチ類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）に存在する昆虫由来のアレルゲン、
−花粉由来、特に樹木、草および雑草の花粉由来のアレルゲン、
−動物由来、特にネコ、イヌ、ウマおよびげっ歯類におけるアレルゲン、
−真菌由来、特にアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）またはクラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）由来のアレルゲン、ならびに
−ラテックスまたはアミラーゼなどの製品に存在する職業性アレルゲン
由来のペプチドまたはポリペプチドのいずれであってもよい。
【００３４】
本発明はさらに、細胞内病原体由来、腫瘍由来、感染性病原体由来またはアレルゲン由来の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドであって、少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフが前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に生成されているか、あるいは少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフが付加されている、前記ペプチドまたはポリペプチドを含むことで特徴付けられる、単離ウイルスベクターを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
用語「ペプチド」は、本明細書において、ペプチド結合によって連結された２〜２００アミノ酸の間のアミノ酸配列を含む分子を指すが、特定の態様においては、非アミノ酸構造（連結有機化合物のようなもの）を含むことも可能である。本発明にしたがったペプチドは、慣用的な２０アミノ酸またはその修飾型のいずれを含有することも可能であるし、あるいは化学ペプチド合成によって、または化学もしくは酵素修飾によって取り込まれる非天然存在アミノ酸を含有することも可能である。用語「ポリペプチド」は、本明細書において、一般的に、より長いペプチドまたはタンパク質を指す。
【００３６】
用語「エピトープ」は、本明細書において、抗体またはその一部（Ｆａｂ’またはＦａｂ２’等）、あるいはＢまたはＴ細胞リンパ球の細胞表面に提示される受容体によって特異的に認識され、そして結合され、そして前記結合によって免疫反応を誘導可能である、タンパク質の１またはいくつかの部分（コンホメーションエピトープと定義可能）を指す。
【００３７】
用語「抗原」は、本明細書において、１またはそれより多いハプテンを含み、そして／または１またはそれより多いＴ細胞エピトープを含む、巨大分子構造を指す。典型的には、前記巨大分子は、タンパク質またはペプチド（多糖を含むまたは含まない）であるか、あるいはタンパク質性組成物で作製され、そして１またはそれより多いエピトープを含む；前記巨大分子は、本明細書において、別に、「抗原性タンパク質」または「抗原性ペプチド」と称されることも可能である。
【００３８】
用語「アレルゲン」は、素因がある個体において、ＩｇＥアイソタイプの抗体を誘発する能力によって特徴付けられる抗原の特定のサブセットを指す。
【００３９】
用語「Ｔ細胞エピトープ」または「Ｔ−細胞エピトープ」は、本発明の状況において、優位の、順優位の、または微量なＴ細胞エピトープ、すなわちＴリンパ球の細胞表面の受容体によって特異的に認識されそして結合される抗原性タンパク質の部分を指す。エピトープが優位、順優位、または微量であるかどうかは、エピトープに対して誘発される免疫反応に依存する。優位性は、タンパク質のすべてのありうるＴ細胞エピトープの中で、こうしたエピトープがＴ細胞によって認識され、そしてこれらを活性化可能である頻度に応じる。特に、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子によって結合されるエピトープである。
【００４０】
用語「ＮＫＴ細胞エピトープ」は、Ｔリンパ球の細胞表面で受容体によって特異的に認識され、そして結合される抗原性タンパク質の部分を指す。特に、ＮＫＴ細胞エピトープは、ＣＤ１ｄ分子によって結合されるエピトープである。
【００４１】
用語「ＣＤ４＋エフェクター細胞」は、その機能が他の細胞、例えばＢ細胞に対する補助を提供することである、Ｔ細胞のＣＤ４陽性サブセットに属する細胞を指す。これらのエフェクター細胞は、Ｔｈ細胞（Ｔヘルパー細胞）として慣用的に報告され、異なるサブセット、例えばＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞を含む。
【００４２】
用語「ＮＫＴ細胞」は、ＮＫ１．１およびＮＫＧ２Ｄなどの受容体を所持し、そしてＣＤ１ｄ分子によって提示されるエピトープを認識するという事実によって特徴付けられる、自然免疫系の細胞を指す。本発明の状況において、ＮＫＴ細胞は、１型（インバリアント）または２型サブセットのいずれに属してもよい。
【００４３】
「ＣＤ１ｄ分子」は、両側が開放された深い疎水性の溝になるように配置された、３つのアルファ鎖およびベータ鎖の逆平行セットで作製され、そしてＮＫＴ細胞に、脂質、糖脂質または疎水性ペプチドを提示可能な、非ＭＨＣ由来分子を指す。
【００４４】
用語「ＣＤ１ｄ結合モチーフ」は、一般的なアミノ酸モチーフ、［ＦＷ］−ＸＸ−［ＩＬＭＶ］−ＸＸ−［ＦＷ］に対応するアミノ酸配列を指し、ここで、Ｆはフェニルアラニン、Ｗはトリプトファン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、そしてＶはバリンを指す。Ｘは任意のアミノ酸に対応する。いくつかの場合、７位の［ＦＷ］はＴ（スレオニン）またはＨ（ヒスチジン）によって置換される。
【００４５】
用語「推定上のＣＤ１ｄ結合モチーフ」は、本明細書において、一般アミノ酸モチーフ［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｘ２Ｘ３−［ＦＷＨＹ］、式中、Ｙはチロシンを表す、に対応するアミノ酸配列を指す。いくつかの場合、推定上のモチーフは、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｘ２−［ＦＷＨＹ］または［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３Ｘ４−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｘ２Ｘ３Ｘ４−［ＦＷＨＹ］であってもよい。
【００４６】
用語「免疫障害」または「免疫疾患」は、免疫系の反応が、生物における機能不全または非生理学的状況の原因となるか、またはこれを維持する、疾患を指す。本発明の状況における免疫障害は、感染性病原体および腫瘍監視によって誘導される病理を指す。
【００４７】
用語「被験体」は、霊長類および非霊長類を含む哺乳動物を指す。
【００４８】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体において、細胞内病原体感染または腫瘍を抑制するかまたは排除する、あるいはワクチン接種戦略に用いられるいくつかの感染性病原体およびアレルゲンなどの抗原の免疫原性を増加させる方法を提供する。
【００４９】
特に、本発明は、ＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞の拡大および機能活性を増加させる方法を提供する。こうした細胞は、通常、２つの別個のサブセット、すなわちインバリアントＴＣＲアルファ鎖（マウスにおいてはＶアルファ１４、ヒトにおいてはＶアルファ２４）を所持するＮＫＴ細胞１型、または多様なアルファ鎖レパートリーを伴って提示する２型ＮＫＴ細胞に分類される。しかし、最近の証拠によれば、１型または２型カテゴリーには適合しないＮＫＴ細胞の別のサブセットが示唆されてきている。本発明の目的は、これらがＣＤ４共受容体を所持するならば、これらの非慣用的ＮＫＴ細胞を含めることである。ＣＤ１ｄに結合した抗原の提示に際して、ＮＫＴ細胞は迅速に活性化され、細胞溶解特性を獲得し、そして自然および適応免疫系の両方由来の他の細胞に影響を及ぼす決定因子であると考えられる、多くのサイトカインを分泌する。
【００５０】
本発明の状況において、本発明者らは、ペプチドがＣＤ１ｄ分子によって提示されることが可能であり、そしてＣＤ１ｄおよびペプチド間で作製される複合体を認識するＮＫＴ細胞を活性化することが可能であるという、予期されぬ観察を行った。ＣＤ１ｄ分子の特徴は、２つの逆平行ベータ鎖で作製されるプラットホームの上に位置する間隙を形成する２つの逆平行アルファ鎖で作製されることである。間隙は狭くそして深く、そして古典的には脂質のみと見なされる、疎水性残基のみを受け入れる。
【００５１】
間隙は、１位（Ｐ１）および７位の疎水性残基、およびＰ４の脂肪族残基と特徴付けられる７アミノ酸の配列に適合しうる。Ｐ１は、強制的に疎水性残基、例えばＦ、Ｗ、ＨまたはＹである。しかし、Ｐ７は許可的であり、そして極性でなければ別の残基を含有してもよい。Ｐ４の残基は、好ましくは脂肪族であるが、これは場合による。ＣＤ１ｄ結合モチーフの一般配列は、したがって、［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］である。しかし、当業者には、モチーフが対称的であり、そしてＰ７がＰ１と見なされることが可能であり、そしてＰ１がＰ７と見なされることが可能であることが明らかであるはずである。ＣＤ１ｄ結合モチーフの一般配列は、限定するいかなる意図も伴わずに、一般的な表示として、本明細書に提供される。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ＣＤ１ｄ分子内での提示によって、ＮＫＴ細胞を活性化する能力にしたがって定義される。
【００５２】
多くのペプチドまたはポリペプチドは、天然にはＣＤ１ｄ結合モチーフを所持しない。しかし、本発明はまた、その天然配列中に少なくとも１つのＣＤ１ｄモチーフをすでに所持するペプチドまたはポリペプチドも含み、これは、前記モチーフの数を増加させて、細胞内病原体感染または腫瘍細胞の抑制を増加させるか、あるいは感染性病原体由来のまたはアレルゲン由来の抗原に対する免疫原性を増加させることが好適であると見出される可能性もあるためである。
【００５３】
本発明は、ペプチドまたはポリペプチドであって、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成することによって、あるいはこれらがこうしたモチーフをすでに所持するかどうかに関わらず、前記ペプチドまたはポリペプチドに少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加することによって、修飾されている、前記ペプチドまたはポリペプチドの産生に関する。
【００５４】
さらなる側面において、本発明はまた、被験体において、細胞内病原体に感染した細胞または腫瘍細胞の排除を増加させるための、あるいは前記被験体において、ワクチン接種に用いられる感染性病原体またはアレルゲンの免疫原性を増加させるための、一般式［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］配列モチーフによって示される少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを含む、少なくとも１つの単離疎水性ペプチドまたはポリペプチドの使用も含む。
【００５５】
さらにさらなる側面において、本発明はまた、被験体においてＮＫＴ細胞を活性化するため、［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］配列によって示される少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフが、前記ペプチドまたはポリペプチドの天然配列内に生成されているか、あるいは前記天然配列に付加されている、少なくとも１つの単離ペプチドまたはポリペプチドの使用も含む。
【００５６】
さらにさらなる側面において、本発明はまた、被験体において、細胞内病原体感染または腫瘍細胞を抑制するための薬剤としての、あるいはワクチン接種のための感染性病原体由来のまたはアレルゲン由来の抗原の効率を増加させるための、［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］配列によって示される少なくとも１つの新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを含む、少なくとも１つの単離疎水性ペプチドまたはポリペプチドの使用も含む。
【００５７】
本発明のさらなる利点は、ペプチドまたはポリペプチドにおいて、芳香族アミノ酸残基を付加すると、前記モチーフがすべてのまたは非常に多数の被験体のＣＤ１ｄ分子に結合可能であるという意味で手当たり次第である（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）、ＣＤ１ｄ結合モチーフが生成される点である。これは、ＣＤ１ｄ分子自体が非常に限定された度合いの多型を提示するという事実のためである。さらに、ＮＫＴ細胞抗原性受容体の多型が非常に制限されているため、当業者には、同じ芳香族アミノ酸付加が、本発明の適用に関して考慮されるすべての対象にも適用可能であることが明らかであるはずである。
【００５８】
これは、主要組織適合クラスＩＩ分子に結合するペプチドまたはポリペプチドモチーフとは非常に対照的であり、この場合は、適切な配列を含有する多数のペプチドが示されうる。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドに課されるのは最小限の制約であるためであり、そしてクラスＩＩ分子の多型が大きいためである。
【００５９】
本発明の目的であるペプチドおよびポリペプチドは、以下のように得られる：
（１）ペプチドまたはポリペプチドは、場合によって、ＮＫＴ細胞を活性化する能力に関して評価される。これは、ＣＤ１ｄ分子を発現する細胞株と前記ペプチドまたはポリペプチドをインキュベーションすることによって行われる。こうした細胞株の例は、当該技術分野に知られる（例えばＪＡＷＳ２細胞）。好ましい態様において、細胞株はＭＨＣクラスＩＩ分子を提示せず、そしてＣＤ１ｄのＤＮＡ配列を含有するウイルスベクターまたは細胞において遺伝子を導入することが当該技術分野に知られる任意の他の手段を用いたＣＤ１ｄの過剰発現のため形質導入される。細胞形質導入のための方法は、当該技術分野に知られる。細胞株は、培養において、ペプチドまたはポリペプチドを装填される。次いで、ＮＫＴ細胞の活性化を測定することによって、ＣＤ１ｄ分子によるペプチドまたはポリペプチドの効率的な提示を評価する。こうした細胞は、例えば磁気分取によって末梢血から得られ、そしてサイトカイン、例えばＩＬ−２およびＩＬ−１５またはＩＬ−７の存在下で、アルファ−ｇａｌ−セラミドなどの刺激剤で培養中に維持されうる。これらの方法は、当該技術分野に記載される（例えばＢｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  １７７：  ７６９−７７５を参照されたい）。サイトカイン産生の評価などの方法を用いて、ＮＫＴ細胞の活性化を評価する。ＮＫＴ細胞の活性化をまったく示さないかまたは限定的にしか示さないペプチドまたはポリペプチドを選択する。
【００６０】
（２）次いで、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／などの当該技術分野に周知のアルゴリズムを用いて、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｘ２Ｘ３−［ＦＷＨＹ］配列（推定上のＣＤ１ｄ結合モチーフ）に対応する少なくとも１つのモチーフの存在に関して評価する。より具体的には、前記アルゴリズムは、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＨＹ］配列に対応し、そしてそれによって、ＣＤ１ｄ分子の間隙内に適合する潜在的可能性を有する、１またはそれより多い長さ７アミノ酸の、ペプチドまたはポリペプチド内での予測を可能にする。より具体的には、前記アルゴリズムは、［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｘ２Ｘ３−［ＦＷ］に対応するアミノ酸配列の予測を可能にする。
【００６１】
（３）前記アルゴリズムによって同定されるアミノ酸配列を調べ、そしてＣＤ１ｄに結合する潜在能力を増加させるアミノ酸置換によって修飾する。これには、本質的に、Ｐ１位のアミノ酸の、疎水性残基、例えばＦ、Ｗ、ＨまたはＹによる置換、および／または必要な場合、Ｐ７位のアミノ酸の、Ｆ、Ｗ、ＨまたはＹによる置換が含まれる。
【００６２】
（４）場合によって、［ＦＷＨＹ］−Ｘ２−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｘ２−［ＦＷＨＹ］、あるいは［ＦＷＨＹ］−Ｘ２Ｘ３Ｘ４−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−  Ｘ２Ｘ３Ｘ４−［ＦＷＨＹ］に対応する、推定上のＣＤ１ｄ結合モチーフが同定される。こうした場合、それぞれ、Ｘ３の付加またはＸ４の欠失は、Ｐ４位に脂肪族アミノ酸残基を含むＣＤ１ｄ結合モチーフを再構成するのに好適であることが見出される。より一般的には、推定上のＣＤ１ｄ結合モチーフは、一般式［ＦＷＨＹ］−Ｒ−［ＩＬＭＶ］または［ＩＬＭＶ］−Ｒ−［ＦＷＨＹ］、式中、Ｒはアミノ酸またはアミノ酸配列に相当する、に対応しうる。
【００６３】
（５）場合によって、ＣＤ１ｄモチーフを、配列のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれか、あるいはペプチドまたはポリペプチド天然配列内の任意の場所で、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に付加してもよい。
【００６４】
（６）場合によって、少なくとも１つのＣＤ１ｄモチーフを生成することによって、そして少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフを付加することによって、本発明のペプチドまたはポリペプチドを修飾することも可能である。
【００６５】
（７）場合によって、（１）に記載するようにＣＤ１ｄ分子を発現する細胞株を用いて、ＣＤ１ｄ結合モチーフを含有する配列を含む合成ペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。
【００６６】
（８）場合によって、上記のようにアミノ酸の置換、付加または欠失によって修飾されたペプチドまたはポリペプチドがＣＤ１ｄに結合する能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＤ１ｄ分子の四量体を用い、こうしたペプチドに特異的なＮＫＴ細胞を検出して試験する。１つの可能性は、蛍光標識四量体および蛍光活性化細胞分取（ｆａｃｓ）を用いた検出を使用することである。
【００６７】
当業者には、Ｄ−アミノ酸または有機化合物などの非生理学的アミノ酸残基を用いて、アミノ酸残基の置換または付加、あるいはＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）の付加を行ってもよいことが明らかであるはずである。
【００６８】
次いで、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞などの発現系を用いた組換えタンパク質産生のため、当該技術分野に知られる方法を用いて、アミノ酸置換、付加または欠失を含有するペプチドまたはポリペプチドを産生する。
【００６９】
本発明にしたがって、細胞内病原体による疾患の治療のための薬剤が想定される。前記細胞内病原体の例には、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、細菌およびマイコバクテリア、ならびに寄生虫が含まれる。
【００７０】
腫瘍治療のための薬剤もまた想定される。
【００７１】
さらに、主に細胞外生活環を持つ感染性病原体に向かう、そしてアレルゲンに向かう、ワクチン接種戦略のための薬剤もまた想定される。
【００７２】
本発明の状況において想定されるペプチドまたはポリペプチドのいずれを、遺伝子組み換えのための遺伝子の形で投与してもよく、これは、ウイルスベクター、または当業者に知られる他の手段を用いて実行可能であることを理解すべきである。こうした場合、ＣＤ１ｄ結合モチーフを付加して、それによって導入遺伝子の発現を増加させることによって、ウイルスベクター自体のアミノ酸配列を改変することが好適であると見出される可能性もある。
【００７３】
好ましい態様において、ペプチドは、［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］配列を含むＣＤ１ｄ結合モチーフで構成されうる。さらにより好ましい態様において、前記ペプチドはまた、前記ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、あるいは両端で、アミノ酸隣接残基を含有する。さらに好ましい態様において、前記ペプチドは、隣接残基において、大きなアミノ酸残基を含有する。さらに別の態様において、前記ペプチドは、少なくとも１つのクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを所持する。さらに別の態様において、前記ペプチドは、ペプチドが由来する天然配列の部分であるアミノ酸隣接残基を含有する。
【００７４】
本発明の薬剤は、必ずしもではないが、通常、活性成分として、本発明のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つ、あるいは前記ペプチドまたはポリペプチドを発現可能な遺伝子療法ベクターを含む、（薬学的）配合物である。活性成分（単数または複数）のほかに、こうした配合物は、少なくとも１つの（薬学的に許容されうる）希釈剤を含むであろう。
【００７５】
一般的に、本発明のペプチドまたはポリペプチドは、自然免疫系の活性化、より具体的にはＮＫＴ細胞の活性化、より具体的には、ＮＫＴ細胞活性化に関連するサイトカイン産生、より具体的には、ＮＫＴ細胞の細胞溶解特性を増加させる。
【００７６】
本発明のペプチドまたはポリペプチドのための投与経路は、適応症および／またはペプチドまたはポリペプチドの性質にしたがって、多様でありうる。例は、感染性疾患のための、そしてアレルゲンのための、または腫瘍のためのワクチンの皮下または筋内注射、あるいは細胞内病原体感染のための経口、鼻または気管内投与である。本発明は、鼻内、舌下、経皮、筋内、直腸内または膣内などの他のすべてのありうる投与経路を含むことを意図する。
【００７７】
さらに詳細に説明するように、本発明のペプチドまたはポリペプチドを化学合成によって作製することも可能であり、これによって非天然アミノ酸の取り込みが可能になる。
【００７８】
本発明の別の側面は、ＮＫＴ細胞を活性化可能な人工配列を含むペプチドまたはポリペプチドを得るための方法であって：
（ａ）ＮＫＴ細胞を活性化しないか、または限定された度合いまでしか活性化しないペプチドまたはポリペプチドの同定；
（ｂ）アミノ酸付加、置換および／または欠失による、少なくとも１つのＣＤ１ｄ結合モチーフの導入
の工程を含む、前記方法に関する。
【００７９】
こうした方法には、アミノ酸置換、付加または欠失によって、ＣＤ１ｄ結合モチーフを所持するように修飾可能なエピトープの同定が含まれる。推定上のＮＫＴ細胞エピトープをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定するための方法は、当該技術分野において十分に知られ、そしていくつかの側面を以後、詳細に述べる。例えば、前記の推定上のＮＫＴ細胞エピトープが同定されたら、前記配列を含む合成ペプチドを産生する。アミノ酸配列がＣＤ１ｄに結合する能力を増加させるのに適切であると判断されるアミノ酸置換、付加または欠失を含む別のペプチドもまた合成する。ＣＤ１ｄを発現する抗原提示細胞を装填することによって、天然配列を含むペプチド、およびアミノ酸置換（単数または複数）、付加、欠失またはこれらの組み合わせを含むペプチドを、ＣＤ１ｄ四量体に結合する能力および／またはＮＫＴ細胞を活性化する能力に関して、試験する。
【００８０】
例えば、合成および／または化学カップリングによって可溶性ＣＤ１ｄ分子を得て、そして四量体を作製する。アフィニティクロマトグラフィーによってＣＤ１ｄ分子を精製する。可溶性ＣＤ１ｄ分子を、前記ＣＤ１ｄ分子に対する強い結合アフィニティにしたがって産生されたビオチン標識参照ペプチドとインキュベーションする。次いで、ＣＤ１ｄ結合に関して評価しようとするペプチドを、異なる濃度でインキュベーションし、そしてニュートラアビジンを添加することによって、ＣＤ１ｄ結合から参照ペプチドを置換する能力を計算する。方法は、主要組織適合クラスＩＩ分子によって提示されるペプチドに関して、例えば、Ｔｅｘｉｅｒら，  （２０００）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４，  ３１７７−３１８４に見出されうるが、該方法は、ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞エピトープに容易に適用可能である。
【００８１】
場合によって、ＮＫＴ細胞とのインキュベーションおよび蛍光活性化細胞分取（ｆａｃｓ）分析によって、ＣＤ１ｄ四量体への本発明のペプチドの結合を評価してもよい。これらの方法は当該技術分野に周知である。
【００８２】
あるいは、ＣＤ１ｄを発現するが、主要組織適合クラスＩＩ複合体を発現しないＪＡＷＳ２細胞などの抗原提示細胞に、本発明のペプチドまたはポリペプチドを装填し、そしてトリチウム標識したチミジンの取り込みによって評価されるようなＮＫＴ細胞の増殖によって、ＮＫＴ細胞を活性化する能力を評価する。これらの方法は、当業者に周知である。本発明のペプチドまたはポリペプチドは、２より大きいかまたは２に等しい平均ＮＫＴ細胞刺激指数を有する。２より大きいかまたは２に等しいＮＫＴ細胞刺激指数を有するペプチドは、本発明を実施する候補として有用であると見なされる。
【００８３】
本発明に適していると同定されるアミノ酸置換（単数または複数）、前記アミノ酸の付加または欠失を、次いで、本発明を実施するための全長ペプチドまたはポリペプチド内に導入する。
【００８４】
例えば細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、酵母細胞（例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種）、昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来）、植物細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ細胞）における組換え発現によって、本発明のペプチドまたはポリペプチドを産生することも可能である。その結果、必要とされる適切な発現ベクターの構築は（プロモーターおよび終結配列などのさらなる情報を含めて）、その間の標準的な組換えＤＮＡ技術を伴う。本発明の組換え的に産生されるペプチドまたはポリペプチドは、例えばペプチドまたはポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端に隣接して挿入された酵素切断部位の酵素的切断、その後の適切な精製を通じた、より大きい前駆体タンパク質由来であってもよい。
【００８５】
限定された長さのいくつかの本発明のペプチドまたはポリペプチドに関しては、互いに異なるアミノ酸をカップリングすることによってペプチドが調製される、化学ペプチド合成によって調製可能である。化学合成は、例えばＤ−アミノ酸、非天然存在側鎖を持つアミノ酸またはメチル化システインなどの修飾側鎖を持つ天然アミノ酸の包含に特に適切である。化学ペプチド合成法は、よく記載され、そしてペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他の会社などの会社から注文することも可能である。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）として、または反溶液相（ｃｏｎｔｒａｒｙ  ｔｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）ペプチド合成としてのいずれかで、ペプチド合成を行ってもよい。最もよく知られるＳＰＰＳ法はｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相化学反応であり、これは当業者に十分に知られる。さらに、Ｋｅｎｔ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ＆  Ｋｅｎｔ  （１９９２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４０，  １８０−１９３）によって元来記載され、そして例えばＴａｍら（２００１）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６０，  １９４−２０５に概説されるような連結戦略（２つの保護されないペプチド断片の化学選択カップリング）を用いて、ペプチドを互いに連結して、より長いペプチドを形成してもよい。これは、ＳＰＰＳの範囲を超えたタンパク質合成を達成する潜在的可能性を提供する。１００〜３００残基のサイズを含む多くのタンパク質が、この方法によって成功裡に合成されてきている。
【００８６】
関心対象のペプチドまたはポリペプチドの物理的および化学的特性（例えば溶解度、安定性）を調べて、ペプチドが療法組成物で使用するのに適しているかどうか／適しているであろうかどうかを決定する。典型的にはこれは、ペプチド配列を調整することによって最適化される。場合によって、当該技術分野に知られる技術を用いて、合成後にペプチドを修飾してもよい（例えば官能基を付加する／欠失させる化学修飾）。
【００８７】
遺伝子改変ペプチドまたはポリペプチドの産生は、クローニング、部位特異的突然変異誘発および増殖を含む、当業者に周知の方法に頼る。
【００８８】
本発明はまた、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列、および例えば組換え発現のためのまたは遺伝子療法におけるその使用のための方法にも関する。特に、前記核酸配列は、本発明のペプチドを発現可能である。
【００８９】
遺伝子療法において、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする組換え核酸分子を、裸のＤＮＡとして、あるいはリポソーム中で、またはターゲット細胞への送達のための他の脂質系中で用いてもよい。細胞内へのプラスミドＤＮＡの直接トランスファーのための他の方法が、ヒト遺伝子療法における使用のため、当業者には周知であり、そしてプラスミドＤＮＡをタンパク質に複合体化することによる、細胞上の受容体へのＤＮＡのターゲティングを伴う。最も単純な形において、マイクロインジェクションのプロセスを通じて、細胞の核内に微量のＤＮＡを単に注入することによって、遺伝子トランスファーを実行してもよい。ひとたび、組換え遺伝子が細胞内に導入されたら、これらは、転写および翻訳のための細胞の正常な機構によって認識されることが可能であり、そして遺伝子産物が発現されるであろう。より多数の細胞内にＤＮＡを導入するための他の方法もまた試みられてきている。これらの方法には：ＤＮＡをリン酸カルシウムで沈殿させ、そして飲作用によって細胞内に取り込ませる、トランスフェクション；細胞を大きな電圧パルスに曝露して、膜内に穴を導入する、エレクトロポレーション；ＤＮＡを親油性小胞内にパッキングし、これをターゲット細胞と融合させる、リポフェクション／リポソーム融合；ならびに小さい発射物に結合させたＤＮＡを用いる微粒子銃が含まれる。細胞内にＤＮＡを導入するための別の方法は、化学的に修飾されたタンパク質にＤＮＡをカップリングすることである。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを脱安定化して、そして細胞内へのＤＮＡの取り込みを増進することが可能である。ＤＮＡ複合体を含有する溶液にアデノウイルスを混合するか、またはタンパク質架橋剤を用いて、アデノウイルスに共有結合させたポリリジンにＤＮＡを結合させることによって、組換え遺伝子の取り込みおよび発現が実質的に改善される。アデノ随伴ウイルスベクターもまた、血管細胞内への遺伝子送達に使用可能である。本明細書において、「遺伝子トランスファー」は、外来核酸分子を細胞内に導入するプロセスを意味し、これは一般的に、遺伝子によってコードされる特定の産物の発現を可能にするために行われる。前記産物には、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは酵素的に活性であるＲＮＡが含まれてもよい。遺伝子トランスファーを培養細胞において行ってもよいし、または哺乳動物への直接投与によって行ってもよい。別の態様において、本発明記載のペプチドをコードする核酸分子配列を含むベクターを提供する。特定の態様において、核酸分子配列が特定の組織においてのみ発現されるように、ベクターを生成する。例えば、本発明の免疫原性ペプチドをコードする配列を、１またはそれより多い組織（単数または複数）または臓器（単数または複数）において、特異的にペプチドの発現を指示するプロモーターの調節下に配置することによって、組織特異的遺伝子発現を達成する方法が当該技術分野に周知である。本発明記載のペプチド、その相同体または誘導体をコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を、ターゲットとする組織または細胞集団内に送達するために、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＲＮＡウイルスまたはウシ・パピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを用いてもよい。当業者に周知の方法を用いて、こうしたコード配列を含有する組換えウイルスベクターを構築してもよい。あるいは、本発明記載のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子を含有する、操作された細胞を、遺伝子療法に用いてもよい。
【００９０】
本発明の薬剤は、必ずしもではないが、通常、本発明のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つ、前記ペプチドまたはポリペプチドを発現可能な遺伝子療法ベクターを活性成分として含む（薬学的）配合物である。活性成分（単数または複数）の他に、こうした配合物は、（薬学的に許容されうる）希釈剤の少なくとも１つを含むであろう。典型的には、薬学的に許容されうる化合物は、例えば薬局方ハンドブック（例えば米国、欧州または国際薬局方）に見出されうる。本発明の薬剤または薬学的組成物は、通常、（予防的にまたは療法的に）有効な量の活性成分（単数または複数）を含み、ここで有効性は、防止するかまたは治療しようとする状態または障害に対するものである。
【００９１】
本発明の薬剤または薬学的組成物は、前記薬剤または組成物の多数回の投与を含む、予防的または療法的措置の一部として、必要とする被験体に投与されることを必要としうる。前記多数回の投与は、通常、連続して起こり、そして２つの投与間の時間間隔は、多様であることも可能であり、そして活性成分の性質および防止するかまたは治療しようとする状態の性質に合わせて調節されるであろう。単回投与を必要とする被験体に投与される活性成分の量もまた多様であることも可能であり、そして被験体の身体状態（例えば体重および年齢）、防止するかまたは治療しようとする状態の状況、および治療する医師、内科医または看護師の経験などの要因に応じるであろう。
【００９２】
用語「希釈剤」は、例えば生理学的生理食塩水溶液を指す。用語「薬学的に許容されうるキャリアー」は、例えば前記組成物を溶解し、分散し、または拡散させることによって、治療しようとする部位への適用または散在を容易にするために、そして／またはその有効性を損なうことなく、その貯蔵、輸送または取り扱いを容易にするために、活性成分とともに配合される任意の材料または物質を意味する。これらには、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤（例えばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張性剤（例えば糖または塩化ナトリウム）等が含まれる。組成物中の活性成分の作用期間を調節するため、さらなる成分が含まれてもよい。薬学的に許容されうるキャリアーは、固形または液体または液体を形成するように圧縮されている気体であってもよく、すなわち本発明の組成物は、濃縮物、エマルジョン、溶液、顆粒、粉塵、スプレー、エアロゾル、懸濁物、軟膏、クリーム、錠剤、ペレットまたは粉末として、適切に用いられうる。
【００９３】
前記薬学的組成物およびその配合物において使用するのに適した薬学的キャリアーは、当業者に周知であり、そして本発明内で、その選択に対する特定の制限はない。これらにはまた、薬学的実施と一致する、すなわち哺乳動物に永続的な損傷を生じないキャリアーおよび添加剤であれば、湿潤剤、分散剤、粘着剤（ｓｔｉｃｋｅｒ）、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤（例えばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張性剤（例えば糖または塩化ナトリウム）等が含まれうる。本発明の薬学的組成物を、任意の既知の方式で、例えば１工程または多工程法において、活性成分を、選択されたキャリアー材料と、そして適切な場合、他の添加剤、例えば表面活性剤と、均質に混合し、これらでコーティングし、そして／またはこれらとともに粉砕することによって、調製することも可能である。また、微粒子化によって、例えば約１〜１０μｍの直径を通常有する微小球体の形で得ることを視野に入れて、すなわち活性成分の徐放または持続放出のためのマイクロカプセルの製造のため、これらを調製してもよい。
【００９４】
本発明記載のペプチドまたはポリペプチド、その相同体または誘導体（および用語「活性成分」にすべて含まれる、その生理学的に許容されうる塩または薬学的組成物）を、防止するかまたは治療しようとする状態に適した、そして化合物、ここでは、投与しようとするペプチドまたはポリペプチドに適した、任意の経路によって投与してもよい。可能な経路には、局所、全身性、経口（固形または吸入）、直腸、鼻、局部（目、頬および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、動脈内、クモ膜下腔内および硬膜外を含む）が含まれる。投与の好ましい経路は、例えば、レシピエントの状態に応じて、あるいは防止するかまたは治療しようとする状態に応じて多様でありうる。
【００９５】
配合物を単位投薬型で好適に提示してもよいし、そして薬学業に周知の方法のいずれによって調製してもよい。経口投与に適した本発明の配合物を、あらかじめ決定された量の活性成分を各々含有するカプセル、カシェーまたは錠剤などの別個の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁物として；あるいは水中油液体エマルジョンまたは油中水液体エマルジョンとして、提示してもよい。活性成分をまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして提示してもよい。錠剤は、圧縮またはモールディングによって、場合によって１またはそれより多い附属成分とともに作製してもよい。自由流動型、例えば粉末または顆粒を、場合によって、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械の中で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適切な機械の中でモールディングすることによって、モールディングされた錠剤を作製してもよい。錠剤を、場合によって、コーティングするかまたはスコアリングしてもよく、そして中の活性成分の緩慢放出または徐放を提供するように配合してもよい。
【００９６】
本発明はここで、以下の実施例によって例示され、該実施例は限定の意図を伴わずに提供される。さらに、本明細書記載のすべての参考文献は、本明細書に明確に援用される。
【実施例】
【００９７】
実施例１  マイコバクテリア
結核菌は、毎年数千の死亡の原因となる。唯一入手可能なワクチン接種、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）に基づくカルメット−ゲラン・ワクチン（ＢＣＧ）は効率的でない。ワクチン接種を改善するための１つの候補は、ヒトおよびマウスなどの動物の両方によって認識される主な抗原の１つである、結核菌によって産生される６ｋＤａ初期分泌抗原ターゲット（ＥＳＡＴ−６）である。
【００９８】
［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］配列に対応するＣＤ１ｄ結合モチーフを同定するコンピュータアルゴリズムを用いて、ＥＳＡＴ−６（配列番号１）の配列を分析した。こうしたモチーフはまったく見出されなかった。標準的突然変異誘発法によって、それぞれ、１４位および２０位で、ＮＫＴ細胞を活性化する感受性を持つＣＤ１ｄ結合モチーフを生成する、ＡからＦおよびＧからＦの突然変異を導入した（突然変異ＥＳＡＴ−６；配列番号２）。
【００９９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ミョウバンなどのアジュバントとともにＥＳＡＴ−６（配列番号１）または配列番号２の突然変異ＥＳＡＴ−６で免疫する。５０μｇのペプチドの４回の注射を、二晩間隔で行う。最後の免疫の２週後、マウスを屠殺し、そして密度勾配遠心分離および抗体コーティング磁気ビーズ上での選択の組み合わせによって、脾臓からＣＤ４＋  Ｔリンパ球を調製する。
【０１００】
次いで、配列番号２の突然変異ＥＳＡＴ−６を装填した抗原提示細胞としてのＪＡＷＳ２細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を活性化し、そして拡大する。ＪＡＷＳ２細胞は、主要組織適合クラスＩＩ決定基を発現せず、それによって、クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化を防止するが、ＪＡＷＳ２細胞はＣＤ１ｄを発現し、そしてしたがって、ＮＫＴ細胞を活性化するペプチドの能力をアッセイするために使用可能である。突然変異ＥＳＡＴ−６（配列番号２）で免疫したマウスから得たＮＫＴ細胞のみが、装填されたＪＡＷＳ２細胞によって活性化され、一方、ＥＳＡＴ−６（配列番号１）で免疫したマウス由来のＮＫＴ細胞は活性化されない。
【０１０１】
配列番号２の突然変異ＥＳＡＴ−６によって活性化されたＣＤ４＋  ＮＫＴ細胞の細胞溶解特性を評価するため、ＮＫＴ細胞との１８時間のインキュベーション後、アポトーシス誘導に関して、ＪＡＷＳ２細胞を分析した。したがって、蛍光標識アネキシンＶの添加によって、アポトーシス細胞表面へのアネキシンＶ結合を検出する。結果によって、突然変異ＥＳＡＴ−６（配列番号２）で免疫したマウスから得たＮＫＴ細胞とインキュベーションされたＪＡＷＳ２細胞は、アポトーシスへと誘導されることが示される。
【０１０２】
これらの結果は、したがって、ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成する単一のアミノ酸置換が、ＮＫＴ細胞の活性化および抗原提示細胞のアポトーシスを誘発するのに十分であることを示す。
【０１０３】
実施例２  ＥＧ７腫瘍
ＥＧ７腫瘍細胞（Ｈ−２ｂ）は、オボアルブミン（ｏｖａ）含有構築物で形質導入された胸腺腫由来である。ＣＤ１ｄ拘束ｏｖａエピトープが、こうした細胞によって提示されるが、これは、ＮＫＴ活性化および腫瘍細胞殺傷を誘発するには不十分であることが知られる（Ｃａｓｔａｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  ２６９：  ２２３−２２６）。
【０１０４】
新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するアミノ酸置換によって改変可能である代替エピトープを同定するため、コンピュータアルゴリズムを用いて検索を行った。１６〜２２位（ＦＫＥＬＫＶＨ）および１８１〜１８７位（ＦＫＧＬＷＥＫ）に２つの配列が同定された。ｏｖａ配列中、Ｈ２２およびＫ１８７をＦに突然変異させ、それによって配列番号４のタンパク質を生成した。
【０１０５】
１０日間の間隔で分離された４回で、ミョウバン中の５０μｇのｏｖａを皮下投与して、配列番号４のｏｖａでのマウスの免疫を行った。対照群を、天然配列のｏｖａ（配列番号３）で免疫した。次いですべてのマウスの脇腹に、１０６  ＥＧ７腫瘍細胞を注射して移植し、そして腫瘍の増殖を長期に渡って追跡した。配列番号４のｏｖａであらかじめ免疫されたマウスは腫瘍を拒絶した一方、天然配列番号３のｏｖａであらかじめ免疫された対照マウスは拒絶しなかった。
【０１０６】
磁気ビーズ分取を用いて、脾臓から調製したＮＫＴ細胞を用いて、ＥＧ７細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷を評価した。ＮＫＴ細胞をまず、配列番号４のｏｖａを装填した抗原提示細胞で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４時間刺激した。１μＭ  ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの３，３’−ジオクタデシルシクロオキサカルボシアニン過塩素酸塩）を用いて、膜レベルでＥＧ７細胞を標識した。次いで、１／１〜１／５（ＥＧ７細胞対ＮＫＴ細胞）の比を用いて、２つのマウス群の各１つから得たＮＫＴ細胞の存在下で、ＥＧ７細胞（ウェルあたり１ｘ１０５）を３７℃で１８時間培養した。１８時間後、細胞を採取し、そして製造者の指示にしたがって、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤに関して染色し（アポトーシス検出キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、そしてＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。結果は、配列番号４のｏｖａで免疫したマウスから得たＮＫＴ細胞とインキュベーションしたＥＧ７細胞がアポトーシスへと誘導される一方、配列番号３のｏｖａで免疫した対照マウスから得たＮＫＴ細胞は、有意な度合いの腫瘍細胞アポトーシスを誘導しなかったことを示す。
【０１０７】
実施例３  インフルエンザ
インフルエンザウイルス赤血球凝集素は、ワクチン接種目的のために用いられる主な抗原である。しかし、ワクチン接種の有効性は、赤血球凝集素の免疫原性が比較的弱いことによって限定される。
【０１０８】
赤血球凝集素の配列（配列番号５）は、［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］形式のＣＤ１ｄ結合モチーフをコードするアミノ酸配列を得るために突然変異に適した３つの配列を含有する。赤血球凝集素のｃＤＮＡを得て、そしてＣＤ１ｄ結合モチーフの７位のアミノ酸をＦ（フェニルアラニン）に置換する標準的突然変異誘発法によって３つの突然変異を導入した。これらの突然変異は、Ｖ３１４Ｆ、Ａ３４８ＦおよびＫ４５９Ｆに対応し、この中で、それぞれ、３１４位、３４８位および４５９位のバリン、アラニンおよびリジンをフェニルアラニンに突然変異させた。配列番号６の突然変異赤血球凝集素を、組換え技術によって産生した。
【０１０９】
１週間間隔、皮下経路によって、配列番号５または配列番号６の赤血球凝集素いずれかで４回、マウスを免疫した。最後の免疫の７日後、マウスを屠殺し、そして磁気ビーズ分取を用いて、脾臓からＣＤ４＋  Ｔ細胞を調製した。室温で１８時間インキュベーションすることによって、ＪＡＷＳ２細胞に配列番号６の突然変異赤血球凝集素を装填した。次いで、細胞を洗浄し、そして配列番号５の赤血球凝集素または配列番号６の赤血球凝集素のいずれかで免疫したマウスから得たＣＤ４＋  Ｔ細胞の存在下でインキュベーションした。配列番号６の赤血球凝集素で免疫したマウスから得た場合には、有意な割合のＮＫＴ細胞が活性化されるが、配列番号５の赤血球凝集素では活性化されないことが観察され、配列番号６の赤血球凝集素での免疫が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫＴ細胞の拡大を誘導したことが立証される。
【０１１０】
さらに、配列番号６の突然変異赤血球凝集素を、ワクチン接種のために用いる。配列番号６の赤血球凝集素で免疫されたマウスが、赤血球凝集素特異的抗体をより高い濃度で産生することが観察される。
【０１１１】
実施例４  アレルゲン
アレルギー性疾患のワクチン接種は、現在、アレルゲンの免疫原性が比較的弱いために限定される。アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の増加した産生が得られうる方法が非常に望ましい。
【０１１２】
Ｄｅｒ  ｐ  ２は、世界中で、アレルギー性鼻炎および喘息に関連する、チリダニであるヤケヒョウヒダニ由来の主なアレルゲンの１つである。コンピュータアルゴリズムを用いたＤｅｒ  ｐ  ２の配列内の検索は、ＣＤ１ｄ結合モチーフを所持する配列をまったく同定しなかった。７アミノ酸（ＦＡＡＬＡＡＦ）で作製されたモチーフを、Ｄｅｒ  ｐ  ２の配列のカルボキシ末端で付加した。こうした配列は、配列［ＦＷ］−Ｘ２Ｘ３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ５Ｘ６−［ＦＷＴＨＹ］に対応するＣＤ１ｄ結合モチーフをコードする。
【０１１３】
注目すべき点として、主要組織適合クラスＩＩ複合体によって提示される主要Ｔ細胞エピトープは、成熟Ｄｅｒ  ｐ  ２分子の２４〜３５位に位置することが知られる。
【０１１４】
１０日間隔で４回、ミョウバン中の５０μｇのタンパク質を皮下注射して、天然Ｄｅｒ  ｐ  ２（配列番号７）またはＣＤ１ｄ結合モチーフを付加した天然Ｄｅｒ  ｐ  ２（配列番号８）でＣＤ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）の２つの群を免疫した。次いで、マウスから出血させ、そして直接結合ＥＬＩＳＡによって、特異的抗Ｄｅｒ  ｐ  ２抗体の濃度を試験した。配列番号８のＤｅｒ  ｐ  ２で免疫したマウスの群において、抗体濃度が１０倍高いことが観察される。
【０１１５】
さらに、磁気ビーズ分取を用いて、２群由来の各マウスの脾臓から、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を調製した。こうした細胞（１０６細胞／ウェル）を、同系ＣＤ１ｄ  ＫＯマウスから調製した樹状細胞とともに培養した。こうした細胞は、クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞のみを活性化可能である。配列番号８のＤｅｒ  ｐ  ２で免疫したマウスから得た細胞が、天然Ｄｅｒ  ｐ  ２（配列番号７）で免疫したマウスから得た細胞よりも４倍高い刺激指数で増殖することが観察される。
【０１１６】
したがって、ＣＤ１ｄ結合モチーフの存在は、特異的抗体の産生およびクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を増加させると結論づけられる。
【０１１７】
本明細書に提供する実施例は、包括的ではなく、そして新規ＣＤ１ｄ結合モチーフを生成するための多様な数のアミノ酸置換または欠失を含有するか、あるいは多様な数の付加されたＣＤ１ｄ結合モチーフを含有するタンパク質またはペプチドの組み合わせが、本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。
【０１１８】
配列表
【０１１９】
【化１−１】
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【０１２０】
【化１−２】
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【０１２１】
【化１−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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