(57)【要約】  本開示は、ＥＲＧの過剰発現、遺伝子再構成の早期の検出、及び／又は併用ＥＲＧ ＩＨＣ−ＦＩＳＨアッセイを用いた前立腺癌の予後のための方法に関する。典型的な方法は、被験者からの試料を提供し；核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、ゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することによりアンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分及びＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合の試料の有無を決定し、免疫組織化学アッセイを用いてＥＲＧタンパク質の過剰発現を検出することを含み、被験者の低悪性度前立腺上皮細胞内腫瘍（ＬＧ−ＰＩＮ）の存在を決定することを含む、前記被験者における前立腺癌の早期診断のための方法に関し、ここで遺伝子融合とＥＲＧの過剰発現の両方の試料の存在が、癌の存在に関連する被験者における低悪性度のＰＩＮを示し、又は癌を予測し、及び前記被験者が前立腺癌に対して陰性であると以前に決定されている。
2014507163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における前立腺癌の早期診断のための方法であって、前記被験者における低悪性度前立腺上皮細胞内腫瘍（ＬＧ−ＰＩＮ）の存在を決定することを含み、
（ａ）前立腺癌に対して陰性であると以前に決定されている被験者からの試料を提供し；
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、ゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することによりアンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分及びＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合の試料の有無を決定し、
（ｃ）免疫組織化学アッセイを用いてＥＲＧの過剰発現を検出することを含み、
工程（ｂ）において決定された遺伝子融合と工程（ｃ）におけるＥＲＧの過剰発現の両方の試料の存在が、被験者における低悪性度のＰＩＮを示す方法。
【請求項２】
アンドロゲン調節遺伝子が、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＤＲＧ１、ＳＬＣ４５Ａ３、及びＰＳＡを含む群から選択され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）が、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイ及びサザンブロットからなる群から選択される核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分とＥＲＧからの３’部分とを有するキメラｍＲＮＡを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インサイツハイブリダイゼーションが、ＲＰ１１−９５Ｉ２１及びＣＴＤ−２５０６Ｊ１３から開発され染色体２１ｑ２２．３上に位置している５ｐプローブ、及びＲＰ１１−４７６Ｄ１７及びＲＰ１１−２４Ａ１１から開発され、染色体２１ｑ２２．３上に位置しているＥＲＧ ３ｐプローブからなる群から選択されるプローブを利用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域のＥＲＧ遺伝子への融合に起因するアミノ末端切断ＥＲＧのタンパク質を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）が、アンドロゲン調節遺伝子の転写制御領域によりコードされるアミノ末端部分、及びＥＲＧ遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラ部分を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料が、組織、血液、尿、精液、前立腺分泌物及び前立腺細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子融合が、ＡＲＧ遺伝子とＥＲＧ遺伝子の融合であり、方法が、遺伝子融合におけるゲノムの欠失の有無に基づいて、前立腺細胞を特徴付けるする工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子再構成は、染色体２１におけるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子及びＥＲＧ遺伝子の間のゲノムＤＮＡの欠失である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記欠失がＥＲＧ遺伝子のエクソン１の欠失を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記欠失がＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のエクソン３の欠失を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ゲノムＤＮＡの２．８から２．８５メガベースの間が欠失している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記欠失が、ＲＰ１１−９５Ｉ２１、ＣＴＤ−２５０６Ｊ１３、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７及びＲＰ１１−２４Ａ１１からなる群から選択される少なくとも一の蛍光標識化プローブを用いるＦＩＳＨアッセイを用いて検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験者において、欠失の存在が転移性前立腺癌を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
正常な隣接細胞に比較して、目視可能な核小体が無く核の大きさが拡大した異型管腔細胞の存在を決定するために、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて前記前立腺細胞を染色することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料中の前立腺細胞中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の存在を決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者が、針生検により決定される場合に前立腺癌に対して陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＬＧ−ＰＩＮを有する被験者において、前立腺癌の進行を予知することを更に含む、請求項１から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
ＬＧーＰＩＮの存在に対する前立腺癌細胞をアッセイするための方法であって、ａ）被験者からの前立腺細胞の検査試料を得る；ｂ）免疫組織化学アッセイを用いるＥＲＧの発現を決定するために前立腺細胞の試料を分析する；ｃ）工程ｂ）で決定された発現レベルと対照試料におけるレベルとを比較する；ｄ）アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する試料中で遺伝子融合の有無を決定するためにＦＩＳＨアッセイを実施する、及びｅ）前記検査試料中の前立腺細胞におけるＥＲＧの発現のレベルが対照試料のそれよりも高く、そして工程ｅ）で決定されるように、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分とＥＲＧ遺伝子からの３’部分との遺伝子融合が存在する場合に、前記被験者において、前記前立腺細胞が癌化するか又は試料の遺伝子座に隣接した癌細胞の指標となることを決定する、ことを含む方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法に従って、低悪性度ＰＩＮの有無を決定することを含む、被験者における前立腺癌の攻撃性を予知する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年２月２４日に提出された、米国仮特許出願第６１／４４６，３００号の利益を主張して提出される。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本開示は、以前に癌病変として検出可能とされている生物学的試料中の前立腺癌細胞の早期検出のための方法に関する。より具体的には、本開示は、癌に関連する可能性が大きく従って癌を予測する可能性が大きい低悪性度ＰＩＮ（前立腺上皮細胞内腫瘍）の同定につながる，ＥＲＧ ＦＩＳＨアッセイを伴った併用抗ＥＲＧ免疫組織化学アッセイを開示する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌の早期検出は、癌患者の治療における重要な特徴である。男性においては、前立腺癌は全ての人種において癌の最も高頻度に見られる形態である。毎年、米国だけで毎年３０万人以上の男性が前立腺癌と診断されているが、現在利用可能な検査は、悪名高いほど不正確かつ主観的である。その結果、前立腺癌の多くの発生率は、病気が転移を含む後期にまで進行するまで診断未確定である。前立腺癌の発生率とそれに関連する死亡率の両方が過去１０年間で増加している。前立腺癌の５０−６５％程度が局在し、９〜１７％は前立腺近傍に広がっており、２０−２５％は身体の他の部分に転移していると推定される。
【０００４】
前立腺癌のスクリーニングは、主として、ＰＳＡ（前立腺特異抗原に対する血液検査）とＤＲＥ（直腸診）を検査することによる。癌の確証は、針生検に由来する組織試料の検査によって行われる。これらの方法論では、良性疾患と癌を識別することはできない。識別できないと、例えば、良性疾患の患者を、不要な、副作用（例えば、インポテンス及び失禁）がある処置に対して曝露することを結果的にもたらす可能性がある。更に、ＰＳＡ検査は癌に罹患した全患者の２０％−３０％を見逃すと推定される。より優れた感度および特異性を有する診断のための明確な必要性が存在する。
【０００５】
前立腺癌の発生率の増加及びこの障害が転移する高い割合に伴い、非常に早い段階でのこの疾患の検出のため、そして潜在的に転移性である前立腺癌細胞を標的とすることができる治療法についての重要な必要性がある。理想的には、これらのタイプの治療は、初期段階の限定された前立腺癌並びに転移性疾患の治療においての両方に対して適用されるであろう。
【０００６】
低悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＬＧ−ＰＩＮ）を検出するために使用することができる特異的な検出方法があった場合、男性の健康に大きく利益をもたらすであろう１つの領域がある。ＬＧ−ＰＩＮは、最も一般的に辺縁部で見つかる、前立腺細胞における前癌性の増殖である。ＰＩＮは、経直腸的超音波ガイド付き前立腺生検を受けた男性の最大１６％において同定されるであろう。ＰＩＮにおいて、細胞の配置は、間質の侵入が欠けている一方、ＰＩＮのグレードが増加している基底細胞層の進行性の破壊を伴う導管及び腺の構築物の保存を示している。報告されている他の組織学的または生物学的変化には以下が含まれる：神経内分泌及び分泌性分化の消失、核及び核小体の異常、新生血管、増殖能の増加、ＤＮＡ含有量の変化に伴う遺伝的不安定性。ＰＩＮの程度の増大に伴い、核異常の程度の増加が基底細胞破壊の増加と共に見られる。癌（ＰＣ）は、基底細胞層を欠いているのに対し、ＰＩＮは、インタクトな又は断片化した基底細胞層を有している。サイトケラチンに対する基底細胞特異的免疫染色は、ＰＩＮには存在しているが、ＰＣの領域では存在しない。
【０００７】
ＰＩＮはほとんど変化が無い最低グレード（グレードＩ）から、最も深刻な変化を持つ最高グレード（グレードＩＩＩ）へと類別される。大半の医学論文ではＰＩＮを高悪性度（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ）又は低悪性度（ｌｏｗ ｇｒａｄｅ）の何れかとして分類している。高悪性度のＰＩＮとグレードＩＩＩのＰＩＮは同意語として使用される。ＰＣは低悪性度よりは高悪性度のＰＩＮにより関係する。ＰＩＮはＰＣの出現よりも５年以上遡るように見える。高悪性度のＰＩＮの所見とその後の生検における前立腺癌の診断との間に有意な相関関係がある。ＨＧ−ＰＩＮは、様々な研究の症例の３３〜１００％において、そのような後の診断に相関している。一研究において、ＰＩＮは合計６６人の男性に検出され：２１人は低悪性度のＰＩＮで４５人が高悪性度のＰＩＮであった。反復生検では、低悪性度群のうち５／２１又は２４％で、高悪性度群の２６／４５又は５８％でＰＣを明らかにした。
【０００８】
従って、癌の増悪へと導くであろう高悪性度のＰＩＮに比較して疾患の進行サイクルにおいてなお早期である低悪性度のＰＩＮの検出の方法が、前立腺癌の早期段階の検出と診断のために用いられ、前立腺癌の優れた治療レジメンをもたらすことが可能であろう。
【発明の概要】
【０００９】
発明の簡潔な概要
本開示は前立腺癌の診断のための改良された方法を提供する。例えば、本発明は、被験者からの試料を提供し；核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、ゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することによりアンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分及びＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合の試料の有無を決定し、免疫組織化学アッセイを用いてＥＲＧタンパク質の過剰発現を検出することを含み、被験者の低悪性度前立腺上皮細胞内腫瘍（ＬＧ−ＰＩＮ）の存在を決定することを含む、前記被験者における前立腺癌の早期診断のための方法に関し、ここで遺伝子融合とＥＲＧの過剰発現の両方の試料の存在が、癌の存在に関連する被験者における低悪性度のＰＩＮを示し、又は癌を予測し、及び前記被験者が前立腺癌に対して陰性であると以前に決定されている。
【００１０】
好ましい実施態様では、アンドロゲン調節遺伝子は、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＤＲＧ１、ＳＬＣ４５Ａ３、及びＰＳＡを含む群から選択することができる。別の実施態様において、試料中の遺伝子融合の有無の検出は、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイ及びサザンブロットからなる群から選択される核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することを含む。
【００１１】
ある実施態様において、そのような検出は、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分とＥＲＧからの３’部分を有するキメラｍＲＮＡを検出することを含む。
【００１２】
本発明の診断方法において、インサイツハイブリダイゼーションは、ＲＰ１１−９５Ｉ２１及びＣＴＤ−２５０６Ｊ１３から開発され染色体２１ｑ２２．３上に位置している５ｐプローブ、及びＲＰ１１−４７６Ｄ１７及びＲＰ１１−２４Ａ１１から開発され、染色体２１ｑ２２．３上に位置しているＥＲＧ ３ｐプローブからなる群から選択されるプローブを利用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。
【００１３】
典型的な方法において、ＥＲＧタンパク質の過剰発現の検出は、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域のＥＲＧ遺伝子への融合に起因するアミノ末端切断ＥＲＧのタンパク質を検出することを含む。更に別の実施態様において、過剰発現の検出は、アンドロゲン調節遺伝子の転写制御領域によりコードされるアミノ末端部分、及びＥＲＧ遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラ部分を検出することを含む。
【００１４】
本発明の診断方法は、前立腺癌を決定するためにスクリーニングされる任意の試料において行われ得る。例えば、試料は、組織、血液、尿、精液、前立腺分泌物及び前立腺細胞からなる群から選択され得る。
【００１５】
特定の実施態様において、遺伝子融合はＡＲＧ（限定されないがＴＭＰＲＳＳ２を含む）遺伝子とＥＲＧ遺伝子の融合であり、本方法は、遺伝子融合におけるゲノムの欠失の有無に基づいて、前立腺細胞を特徴付けるする工程を更に含む。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの再構成は、当業者に知られている。典型的な実施態様において、そのような遺伝子再構成は、染色体２１におけるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子及びＥＲＧ遺伝子の間のゲノムＤＮＡの欠失である。より具体的には、欠失は、ＥＲＧ遺伝子のエクソン１の欠失を含む、又はＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のエクソン３の欠失を含む。例えば、欠失はゲノムＤＮＡの２．８から２．８５メガベースの間が欠失している欠失を含む。
【００１６】
欠失は、ＲＰ１１−９５Ｉ２１、ＣＴＤ−２５０６Ｊ１３、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７及びＲＰ１１−２４Ａ１１からなる群から選択される少なくとも一の蛍光標識化プローブを用いるＦＩＳＨアッセイを用いて検出され得る。典型的な実施態様において、欠失は被験者における転移性前立腺癌を示す。
【００１７】
本発明の診断方法は、正常な隣接細胞に比較して目視可能な核小体が無い核の大きさが拡大した異型管腔細胞の存在を決定するために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いた前記前立腺細胞を染色することを更に含み得る。あるいは、又は更に、診断方法は、前記前立腺細胞における前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の存在を決定することをさらに含んでもよい。
【００１８】
述べたように、本発明の診断方法は、別の方法では、試料を前立腺癌に対して陰性と示した、前立腺癌の早期の同定を有利に与える。例えば、開示された方法は、針生検によって決定される場合および／またはＨ＆Ｅ染色によって決定される場合に、前立腺癌に対して最初は陰性と検査された被験者に実施される。
【００１９】
また熟考されるのは、ＬＧーＰＩＮの存在に対する前立腺癌細胞のアッセイであり、ａ）前立腺細胞の検査試料を得る；ｂ）免疫組織化学アッセイを用いるＥＲＧの発現を決定するために前立腺細胞の試料を分析する；ｃ）工程ｂ）で決定された発現レベルと対照試料におけるレベルとを比較する；ｄ）アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する試料中で遺伝子融合の有無を決定するためにＦＩＳＨアッセイを実施する、及びｅ）前記検査試料中の前立腺細胞におけるＥＲＧの発現のレベルが対照試料のそれよりも高く、そして工程ｅ）で決定されるように、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分とＥＲＧ遺伝子からの３’部分との遺伝子融合が存在する場合に、前記被験者において、前記前立腺細胞が癌を発症するか又は近接［又は隣接］癌細胞の指標となることを決定する、ことを含む。
【００２０】
更に熟考されるのは、本明細書に記載される方法に従って低悪性度ＰＩＮの存在を決定すること、および前立腺癌を治療する薬剤を前記被験者に投与することを含む、被験者の前立腺癌を治療するための方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
複数の図面の簡単な説明
【図１】図１：２つの症例における低悪性度のＰＩＮ、（１Ａ）症例１のＨ＆Ｅ染色、及び（１Ｂ）症例１の連続切断スライド切片のＩＨＣによるＥＲＧ過剰発現；（１Ｃ）症例２のＨ＆Ｅ染色、及び（１Ｄ）症例２の連続切断スライド切片のＩＨＣによるＥＲＧ過剰発現。記：ＬＧーＰＩＮは、正常な隣接細胞に比較して目視可能な核小体が無い核の大きさが拡大した異型管腔細胞によりＨ＆Ｅで診断される。
【図２】図２：前立腺ブレークアパート（ｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔ）アッセイにおけるＥＲＧ再構成。
【図３】図３：Ｈ＆Ｅ及びＥＲＧ ＩＨＣにより評価された前立腺癌に隣接する低悪性度ＰＩＮ。
【００２２】
発明の詳細な説明
現在、病理学のコミュニティは、低悪性度ＰＩＮに関して報告しない。Ｈ＆Ｅ染色による診断は十分には特徴付けられておらず、大きく主観的であり、よってＬＧーＰＩＮと前立腺癌への進行との間に直接的関連があるかどうかは未知のままである。本開示は、ＥＴＳ遺伝子再構成が前立腺癌に存在するという発見に拡張する。本開示された方法は、低悪性度のＰＩＮにおいて、ＥＲＧ遺伝子の再構成及び関連するＥＲＧタンパク質の過剰発現に関する証拠を提供する。本開示は、前立腺癌に関連する又は前立腺癌に進行する可能性が高い低悪性度ＰＩＮの新規サブセットを同定する潜在能力があることを示す。これらの知見は、針生検では見逃されている可能性がある前立腺癌の男性のリスクを予知する方法を提供し、従って、前立腺癌を有するか、または発症する可能性についてより高感度かつ正確な予測を提供するため、臨床現場で有用である場合がある。
【００２３】
前立腺癌を評価するための現在の治療は、低悪性度ＰＩＮについて報告しないことである。実際、患者のこのカテゴリは、癌の決定的な証拠が発見されるまで必要とされる、ＰＳＡのモニタリング、反復されるＤＲＥ及び複数の再生検を用いた再スクリーニングに付される。
【００２４】
本開示の有利な点は、生検単独と比較して向上した癌の予測方法を提供し、それにより不要な生検の必要性を減らし、前立腺癌の早期診断を与えることである。
【００２５】
前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子再構成と疾患増悪とのその関連の発見は、治療的および診断的意義の両方を有する。前腫瘍性ＰＩＮ病変から前立腺癌への進行のリスクが増大する男性の同定は、針生検標本とＰＳＡスクリーニングの実践に直接影響を与える可能性がある未だ対処されていない医学的必要性である。先の研究では、高悪性度のＰＩＮのおよそ１５％にＥＲＧ再構成の存在を同定している。更に、ＥＲＧが再構成されたＨＧ ＰＩＮ病変は、前立腺切除標本における隣接腫瘍病巣の遺伝子再構成に非常に関連付けられている。本開示において、診断方法は、癌の相関としてのＬＧ−ＰＩＮにおいて、ＥＲＧ遺伝子再構成とタンパク質過剰発現の両方の存在を決定することに焦点を当て、より迅速に前立腺癌を発症するリスクにさらされている男性を同定するために、同一物を使用する。
【００２６】
そのような診断目的のために、前立腺組織試料を個体から採取し、ＥＲＧ融合の存在およびＥＲＧの過剰発現について試験され得る。組織試料は、腺上皮を覆う細胞の単一細胞層を除外することができ、又は層の内側および外側の両方の細胞を含むことができる。非限定的な例として、試料は、組織（例えば、前立腺生検試料または前立腺切除術により得られた組織試料）、血液、尿、精液、前立腺分泌物又はその画分（例えば、血漿、血清、尿の上清、尿細胞ペレット又は前立腺細胞）であり得る。尿試料は、好ましくは、前立腺からの前立腺細胞を尿に流させる注意深い直腸診（ＤＲＥ）の直後に採取される。ある実施態様において、前立腺組織試料は、生検方法の結果であり得る。前立腺組織試料は、複数の隣接する細胞及び／又は前立腺からの一以上の別個の細胞であってもよい。
【００２７】
開示された診断／予後徴候の検査法は、ＰＳＡ試験及び／又はＤＲＥと組み合わせてもよい。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検査は、当該技術分野において周知である。上述の通り、前立腺癌を検出するためのＰＳＡのスクリーニングは、実際に前立腺癌を有する検査される個体の有意な割合を見逃す（すなわち、偽陰性）と推定される。本発明の利点は、前立腺癌のスクリーニングする本方法は、癌を有するが、ＰＳＡの検査で陰性の結果である個体における前立腺癌を検出することができ得るということである。本方法は、単独又はＰＳＡの検査と組み合わせて用いることができる。
【００２８】
治療目的のために、診断された又は前立腺機能障害を呈する患者が良性前立腺疾患または前立腺癌を有するかどうかを決定できることが望ましい。良性前立腺疾患には、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）が含まれる。有利な点として、開示された方法において、ＬＧ−ＰＩＮの検出は前立腺癌と相関しており、それによって当業者が、前立腺機能障害と診断された又は呈する患者において、良性前立腺疾患と区別することを可能にしている。本明細書に説明される、併用ＥＲＧ ＩＨＣ−ＦＩＳＨアッセイにより決定されるＬＧ−ＰＩＮの存在は、前立腺癌と関連し、逆に、ＬＧ−ＰＩＮの欠損は、良性前立腺疾患の指標である。前立腺機能障害と診断された又は呈している患者はＰＳＡについての検査で検査され、結果は陰性であり得る。ＰＳＡ検査と本明細書に記載されるＥＲＧ ＩＨＣ−ＦＩＳＨアッセイの併用により、前立腺癌の感度の高い初期の検出を与えることが可能である。
【００２９】
前立腺癌の指標となる再発性遺伝子融合は現在、数年の間、特徴付けがなされてきた。遺伝子融合はアンドロゲン調節遺伝子（ＡＲＧ）及び、例えばＥＲＧ癌原遺伝子を含む、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の染色体再構築の結果である。それらの再発にもかかわらず、ＡＲＧがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子に融合する接合は変化する。遺伝子融合は、典型的には、ＡＲＧの転写調節領域からの５’部分及びＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を含む。再発性遺伝子融合は、診断及び／又は予後徴候マーカー及び前立腺癌に対する臨床標的としての用途を有する。
【００３０】
ＡＲＧはアンドロゲンホルモンによって調節されており、ヒト前立腺の正常な生理学的機能のために極めて重要である。それらはまた前立腺癌の発症と進行に寄与している。認識されたＡＲＧは、限定されないが、ＭＰＲＳＳ２；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＫＬＫ２；ＳＮＲＫ；Ｓｅｌａｄｉｎ−１；及びＦＫＢＰ５１を含む（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４：３０９（１９９７）；Ｖｅｌａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４５（８）：３９１３（２００４）)。特に、ＴＭＰＲＳＳ２（ＮＭ．ｓｕｂ．−−００５６５６）は、前立腺上皮において、他の正常ヒト組織に比べて、高度に発現されていることが実証されている(Lin et al., Cancer Research 59: 4180 (1999))。ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子は、染色体２１上に位置している。この遺伝子は、ｐｔｅｒから４１，７５０，７９７−４１，８０１，９４８塩基対に位置している（５１，１５１全塩基対；マイナス鎖配向）。
【００３１】
ＡＲＧの転写調節領域は、プロモーター領域を含み、ＡＲＧのコード領域又は非コード領域を含み得る。
【００３２】
転写因子のＥＴＳファミリーは、細胞内シグナル伝達調節遺伝子の発現を調節する。下流のエフェクターとして、それらは特定の標的遺伝子を活性化又は抑制する。上流のエフェクターとして、それらは、多くの成長因子受容体の空間的及び時間的発現に関与している。このファミリーのメンバーのほぼ３０が同定され、生理学的および病理学的プロセスの広範囲に関与している。これらは、限定されないが、ＥＲＧ；ＥＴＶ１（ＥＲ８１）；ＦＬＩ１；ＥＴＳ１；ＥＴＳ２；ＥＬＫ１；ＥＴＶ６（ＴＥＬ１）；ＥＴＶ７（ＴＥＬ２）；ＧＡＢＰ．アルファ．；ＥＬＦ１；ＥＴＶ４（Ｅ１ＡＦ；ＰＥＡ３）；ＥＴＶ５（ＥＲＭ）；ＥＲＦ；ＰＥＡ３／Ｅ１ＡＦ；ＰＵ．１；ＥＳＥ１／ＥＳＸ；ＳＡＰ１（ＥＬＫ４）；ＥＴＶ３（ＭＥＴＳ）；ＥＷＳ／ＦＬＩ１；ＥＳＥ１；ＥＳＥ２（ＥＬＦ５）；ＥＳＥ３；ＰＤＥＦ；ＮＥＴ（ＥＬＫ３；ＳＡＰ２）；ＮＥＲＦ（ＥＬＦ２）；及びＦＥＶを含む。
【００３３】
ＡＲＧのＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質として検出可能である。最初に、遺伝子融合は、ＡＲＧの転写調節領域からの５’部分、及びＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再構築として検出可能である。いったん転写されると、遺伝子融合は、ＡＲＧの転写調節領域からの５’部分、及びＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有するキメラｍＲＮＡとして検出可能である。ひとたび翻訳されると、ＡＲＧの転写調節領域のＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合から生じた、アミノ末端が切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質；ＡＲＧの転写調節領域からのアミノ末端部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質；又は上方制御された、別の方法では区別できない、天然型ＥＴＳファミリーメンバータンパク質として検出可能である。切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質及びキメラタンパク質は、それら各々の天然型タンパク質と、アミノ酸配列、翻訳後プロセシング及び／又は二次、三次又は四次構造において異なり得る。そのような違いは、もし存在すれば、遺伝子融合の存在を同定するために用いることができる。好ましい実施態様において、ＦＩＳＨが遺伝子融合の存在を検出するために用いられる。
【００３４】
ＥＲＧ免疫組織化学アッセイ
ＥＲＧタンパク質発現のＩＨＣによる評価は、手動及び自動化方法を用いて達成することができる。以下の方法が、ＥＲＧ ＩＨＣ及びＦＩＳＨの間の相関を示す、影響力の大きい出版物で参照されている（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１２巻 Ｎｕｍｂｅｒ ７ Ｊｕｌｙ ２０１０ 頁５９０−５９８より）。この参照は、ＥＲＧ ＩＨＣを行う一例として引用されるだけである。代替的な自動化されたプラットフォーム、及び手動の方法は、同様の結果を生み出すかもしれないが、まだ、文献では実証されていない。
【００３５】
パラフィン包埋ホルマリン固定腫瘍組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓからの自動化されたＤｉｓｃｏｖｅｒｙＸＴ染色プラットフォームを用いて行った。一次ウサギモノクローナル抗体は、商業的供給源から入手した。抗原回復は、熱回復（ｈｅａｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）及びＣＣ１スタンダード、高ｐＨのトリス／ホウ酸／ＥＤＴＡバッファー（ＶＭＳＩ，カタログ番号９５０−１２４）を用いて行った。スライドは室温で１時間、ＥＲＧ一次抗体の１：１００でインキュベートした。一次抗体は、ＣｈｒｏｍｏＭａｐ ＤＡＢ検出キット（ＶＭＳＩ，カタログ番号７６０−１５９）及びＵｌｔｒａＭａｐ抗Ｒｂ ＨＲＰ（ＶＭＳＩ，カタログ番号７６０−４３１５）を用いて検出した。抗Ｒｂ ＨＲＰ二次抗体を室温で１６分間アプライした。スライドをヘマトキシリンＩＩ（ＶＭＳＩ，カタログ番号７９０−２２０８）で８分間対比染色し、続いてＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ，カタログ番号７６０−２０３７）で３７℃で４分間対比染色した。
【００３６】
ＥＲＧ融合の検出のためのＦＩＳＨアッセイ
二色間期ＦＩＳＨを用いた遺伝子再構成状態の評価は、手動又は自動化方法を用いて行われうる。以下の方法が、ＥＲＧ ＩＨＣ及びＦＩＳＨの間の相関を示す、影響力の大きい出版物で参照されている（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１２巻 Ｎｕｍｂｅｒ ７ Ｊｕｌｙ ２０１０ 頁５９０−５９８より）。この参照は、ＥＲＧ ＦＩＳＨを行う一例として引用されるだけである。自動化されたプラットフォーム、および手動の方法は同様の結果をもたらし得る。四マイクロメートル厚のＴＭＡ切片を間期ＦＩＳＨ分析のために使用した。再構成状態は、以前に説明されたデュアルカラーブレークアパート（ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ ｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔ）間期ＦＩＳＨアッセイを用いて決定された［Ｔｏｍｌｉｎｓ ＳＡ， Ｒｈｏｄｅｓ ＤＲ， Ｐｅｒｎｅｒ Ｓ， Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ ＳＭ， Ｍｅｈｒａ Ｒ， Ｓｕｎ ＸＷ， Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ Ｓ， Ｃａｏ Ｘ， Ｔｃｈｉｎｄａ Ｊ， Ｋｕｅｆｅｒ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２００５）。前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２及びＥＴＳ転写因子遺伝子の再発性融合。Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０（５７４８），６４４−６４８．及びＰｅｒｎｅｒ Ｓ， Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉｓ Ｆ， Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ Ｒ， Ｓｃｈｍｉｄｔ ＦＨ， Ｍｏｓｑｕｅｒａ ＪＭ， Ｓｅｔｌｕｒ Ｓ， Ｔｃｈｉｎｄａ Ｊ， Ｔｏｍｌｉｎｓ ＳＡ， Ｈｏｆｅｒ ＭＤ， Ｐｉｅｎｔａ ＫＧ， ｅｔ ａｌ．（２００６）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合に関連した欠失は、前立腺癌の異質性を知る上での手掛かりとなる。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６（１７），８３３７−８３４１］。
【００３７】
更に、ＥＲＧ ３ｐプローブと５ｐ ＦＩＳＨプローブ及び量子ドット５６５と６５５を用いる自動化ＦＩＳＨアッセイは、遺伝子再構成の検出用のＥＲＧ ＩＨＣアッセイと類似の高い相関を生じた。量子ドット検出を用いる方法の概要は以下に再現されるチャートで報告される：
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【００３８】
再構成を示さないプローブ（すなわち、方の対立遺伝子は「正常」である）は、共局在化したままであろうし、一対の黄色のシグナルとして、又は非常に密接に並置べられた緑／赤のシグナルとしての何れかで視覚化される。ＥＲＧの再構成は、図２に示すように、蛍光プローブの「挿入」を生じるであろう、ブレークアパート（Ｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔ）事象は、ＥＲＧの５ｐ領域における「挿入」の結果として視覚化され得、５ｐ ＥＲＧ（緑）シグナルの「欠損」、並びに３ｐ ＥＲＧ遺伝子の重複が伴う場合がある。
【実施例】
【００３９】
本研究の目的は、前立腺のＰＩＮ病変におけるＥＲＧの再構成の範囲を特定することであった。発明者は、ＦＩＳＨアッセイにより検出された特異的遺伝子再構成と組み合わせて、免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＥＲＧ過剰発現を検出するための自動化染色手順を開発した。この目的に対して、３’及び５’ＥＲＧを含むＥＲＧ遺伝子再構成に特異的なプローブが量子ドット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＯＲ）バイオコンジュゲートで検出された。一般的に針生検の保存に使用される固定液並びに固定時間についても評価した。特異的ＦＩＳＨシグナルを、干渉計と分光イメージングソフトウェアを使用してデコンボリューションした。
【００４０】
量子ドットによる、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織におけるスペクトルＦＩＳＨを行うための具体的な方法は文献に記載されている。簡潔には、各ピクセルで高分解能の波長強度情報を含むスペクトル画像キューブが、改良型ＳｐｅｃｔｒａＶｉｅｗ（ＡＳＩ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｓｒａｅｌ）捕捉及び解析システムを用いて捕獲された。改良型システムは、コンピュータワークステーション、蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ６１）、干渉光学ヘッドからソニーＩＣＸ２８５デジタルＣＣＤ．２０−２３へのスペクトルを出力する、光のガイドが結合した、安定化されたメタルハライド励起源（Ｅｘｆｏ Ｅｘａｃｔｅ， Ｅｘｆｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含む。スペクトルイメージング用の励起／発光フィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ， ＵＳＡ）は以下のとおりであった：励起用の５０ｎｍのバンド幅を持つ３７７ｎｍ中心波長；４１０ｎｍ未満に反射バンドを持つ二色性ビームスプリッター、及び４０９ｎｍで深いブロッキングトランジションを持つ長いパスフィルター。全てのスペクトル画像キューブは４０×ｐｌａｎ−ｆｌｕｏｒ対物（開口数０．７５）及び１×ｃマウントで捕捉された。データは、スペクトル処理のための干渉法による画像キューブを構築するために、一連の１００ミリ秒の暴露を通じて収集された。これらの条件下で捕捉された画像キューブにより表される波長の範囲は、１０ｎｍ波長サンプリング分解能で４１０から９００ｎｍ間の可視波長を網羅した。組織の自発蛍光、ＤＡＰＩ、量子ドット５６５，及び量子ドット６５５に対応するシグナルを分離するためのスペクトル不混合化が、適切な参照スペクトル及びＳｐｅｃｔｒａＶｉｅｗスペクトルデータ解析ソフトウエアに実装された線形非混合化アルゴリズムを用いて行われた。
【００４１】
特徴的な狭いガウス波長分布とＱＤ発光スペクトルの離散ピーク位置が、個々のプローブシグナルの信頼性の高い分離を可能にした。個々のモノクロのＤＡＰＩ及びＦＩＳＨシグナル強度の層は色付けされ、相対的なプローブ局在化の可視化のための重ね合わせ画像を提供するためにマージされた。
【００４２】
結果は、異種移植モデルＶｃａｐは、Ｈ６６０およびＬＮＣａＰにおいて、並びに前立腺針生検及び前立腺全摘除術からの試料において、この検査法による遺伝子再構成の感受性で特異的な検出を示した。前立腺組織標本のコホートにおいて、ＥＲＧ ＩＨＣは、Ｈ＆Ｅ染色による初期の調査で見逃された低悪性度ＰＩＮを診断した（ｎ＝４／１０又はＬＧ−ＰＩＮ標本の４０％；表１）。ＬＧ−ＰＩＮの癌との会合は比較的少なかったが（わずか１０％又は６０のうち６つの標本が癌の近傍にＬＧ−ＰＩＮを有することが観察された）、ＥＲＧが再構成されるときの癌の近傍のＬＧ−ＰＩＮの頻度は７５％である（つまり、４のうち３つのＥＲＧ陽性であったＬＧ−ＰＩＮ標本が癌の近傍にあって、わずか１つのＬＧ−ＰＩＮ／ＥＲＧ陽性標本は癌の直ぐ近傍にはなかった（表１）。
ＨＧ−ＰＩＮにおいて同様に、癌との会合の頻度は２５％（６０のうち１５）で比較的低くかったが；ＥＲＧがＨＧ−ＰＩＮに発現されると、癌の近傍は１００％（４の症例のうち４）であり；つまり、全ての症例のＥＲＧ陽性ＨＧ−ＰＩＮが近接する癌に会合していた（表１）。
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【００４３】
ＥＲＧの過剰発現は、ＥＲＧ遺伝子の５’領域における挿入及び欠失を含み、いかなる特定の型の遺伝子再構成とも有意に関連していなかった。ＥＲＧ ＦＩＳＨ検査が評価した再構成は、再構成無し（正常）、挿入を介した転座、及び欠失を介した転座を含んでいる。
下の表２は、前立腺組織試料の選択されたコホートにおけるＥＲＧの過剰発現と遺伝子再構成を示す。
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【００４４】
簡潔にいうと、データは、ＥＲＧ 量子ドットＦＩＳＨと組み合わせた抗ＥＲＧ免疫組織化学アッセイは、ＰＩＮ病変において臨床的に意義のあるバイオマーカーを検出することにおいて、最初のＨ＆Ｅ染色の後で、有用性を持ち得る、感受性のある特異的な反射試験形式を提供することを示している。低悪性度ＰＩＮにおける遺伝子再構成及びＥＲＧタンパク質過剰発現の同定は、新規クラスのより高悪性度の前立腺疾患の定義付けに役にたつ。この検査形式は、例えば、再生検、活動性ＰＳＡスクリーニング、ＤＲＥ及びＭＲＩ検査を通じて、より積極的なモニタリングを考慮されるべき男性を同定するにの役にたつ場合がある。研究は、この検査戦略は、選択された前立腺癌及び生検のコホートにおけるＬＧ−ＰＩＮの発生率と関連した前立腺癌の進行の評価において診断的価値を与える。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における前立腺癌の早期診断のための方法であって、前記被験者における低悪性度前立腺上皮細胞内腫瘍（ＬＧ−ＰＩＮ）の存在を決定することを含み、
（ａ）前立腺癌に対して陰性であると以前に判断されている被験者からの試料を提供し；
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、ゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することによりアンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分及びＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合の試料の有無を決定し、
（ｃ）免疫組織化学アッセイを用いてＥＲＧタンパク質の発現レベルを検出することを含み、
工程（ｂ）において検出される遺伝子融合と工程（ｃ）において検出されるＥＲＧの過剰発現の両方の該試料における存在が、被験者における低悪性度のＰＩＮを示す方法。
【請求項２】
サンプルが前立腺細胞のサンプルであり、工程（ｂ）においてインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイが実行され、
該方法が更に
（ｄ）工程（ｃ）において検出されるＥＲＧタンパク質の発現レベルを対照試料におけるＥＲＧタンパク質の発現レベルと比較し、
（ｅ）前記検査試料中の前立腺細胞におけるＥＲＧの発現のレベルが対照試料のそれよりも高く、工程（ｂ）で決定されるように、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分とＥＲＧ遺伝子からの３’部分の遺伝子融合が存在する場合に、前記被験者において、前記前立腺細胞が癌化するか又は試料の遺伝子座に隣接した癌細胞の指標となることを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンドロゲン調節遺伝子が、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＤＲＧ１、ＳＬＣ４５Ａ３、及びＰＳＡを含む群から選択され得る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）がインサイツハイブリダイゼーション、マイクロアレイ及びサザンブロットからなる群から選択される核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することを含み、又は工程（ｂ）がアンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分とＥＲＧからの３’部分を有するキメラｍＲＮＡを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インサイツハイブリダイゼーションが、ＲＰ１１−９５Ｉ２１及びＣＴＤ−２５０６Ｊ１３から開発され、染色体２１ｑ２２．３上に位置している５ｐプローブ、及びＲＰ１１−４７６Ｄ１７及びＲＰ１１−２４Ａ１１から開発され、染色体２１ｑ２２．３上に位置しているＥＲＧ ３ｐプローブからなる群から選択されるプローブを利用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域のＥＲＧ遺伝子への融合に起因するアミノ末端切断ＥＲＧのタンパク質を検出することを含み、又は工程（ｃ）が、アンドロゲン調節遺伝子の転写制御領域によりコードされるアミノ末端部分とＥＲＧ遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子融合が、アンドロゲン調節遺伝子とＥＲＧ遺伝子の融合であり、方法が、遺伝子融合におけるゲノムの欠失の有無に基づいて、前立腺細胞を特徴付けるする工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノムの欠失が、染色体２１におけるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子及びＥＲＧ遺伝子の間のゲノムＤＮＡの欠失である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記欠失が、ＥＲＧ遺伝子のエクソン１の欠失を含む、又は前記欠失がＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のエクソン３の欠失を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記欠失が、ゲノムＤＮＡの２．８から２．８５メガベースの間の欠失である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記欠失が、ＲＰ１１−９５Ｉ２１、ＣＴＤ−２５０６Ｊ１３、ＲＰ１１−４７６Ｄ１７及びＲＰ１１−２４Ａ１１からなる群から選択される少なくとも一の蛍光標識化プローブを用いるＦＩＳＨアッセイを用いて検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験者において、欠失の存在が転移性前立腺癌を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
正常な隣接細胞に比較して目視可能な核小体が無い核の大きさが拡大した異型管腔細胞の存在を決定するために、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いた前記試料中の前立腺細胞を染色することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料中の前立腺細胞中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の存在を決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が、針生検により決定される場合に前立腺癌に対して陰性である、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
発明の簡潔な概要
本開示は前立腺癌の診断のための改良された方法を提供する。例えば、本発明は、被験者からの試料を提供し；核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、ゲノムＤＮＡの染色体再構築を検出することによりアンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域からの５’部分及びＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合の試料の有無を決定し、免疫組織化学アッセイを用いてＥＲＧタンパク質の過剰発現を検出することを含み、被験者の低悪性度前立腺上皮細胞内腫瘍（ＬＧ−ＰＩＮ）の存在を決定することを含む、前記被験者における前立腺癌の早期診断のための方法に関し、ここで遺伝子融合とＥＲＧの過剰発現の両方の該試料における存在が、癌の存在に関連する被験者における低悪性度のＰＩＮを示し、又は癌を予測し、及び前記被験者が前立腺癌に対して陰性であると以前に決定されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
典型的な方法において、ＥＲＧタンパク質の過剰発現の検出は、アンドロゲン調節遺伝子の転写調節領域のＥＲＧ遺伝子への融合に起因するアミノ末端切断ＥＲＧのタンパク質を検出することを含む。更に別の実施態様において、過剰発現の検出は、アンドロゲン調節遺伝子の転写制御領域によりコードされるアミノ末端部分とＥＲＧ遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質を検出することを含む。
【国際調査報告】
2014507163.tif 000012