(57)【要約】  本発明は、胚体内胚葉へとさらに成熟させるための段階的様式における、多能性幹細胞を原条細胞集団へと分化させるための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
c.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
d.アクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする第2のそれに続くステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記培地が、RPMI-1640である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
CHIRの濃度が、約2,5〜15μMの範囲等、約3,1〜15μMの範囲等または約3,1〜7μMの範囲等または約3,5〜7μMの範囲等または約3,5〜6μMの範囲等または約3,5〜5μM等、少なくとも約2,5μMまたは少なくとも約3,1μMである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
CHIRの濃度が、少なくとも約3,1μMである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
CHIRの濃度が、少なくとも約3,5μMである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
CHIRとの前記インキュベーションが、少なくとも24時間である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アクチビンAとの前記インキュベーションが、少なくとも24時間である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アクチビンAとの前記インキュベーションが、48〜72時間である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞から得られる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内胚葉細胞が、膵臓内胚葉細胞である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか一項に記載の方法により得ることができる膵臓内胚葉細胞。
【請求項１３】
培養培地におけるCHIRの濃度が、約2〜15μMの範囲等、約3〜15μM等、約3,1〜15μM等または約3,1〜7μM等または約3,5〜15uM等または約3,5〜7μM等、少なくとも2μM、少なくとも3μMである、CHIRの使用。
【請求項１４】
胚性幹細胞から原条細胞を誘導するための、培養培地における少なくとも2μMの濃度におけるCHIRの使用。
【請求項１５】
胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3,5〜7μMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚体内胚葉へとさらに成熟させるための段階的様式における、多能性幹細胞を原条細胞集団へと分化させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランゲルハンス島の移植は、1型真性糖尿病の治療を改善する見込みが大いにあるが、利用できるドナー膵島の欠乏は、取り組まねばならない障壁の一つである。多能性幹細胞は、原則的に、移植のために無制限な数のベータ細胞を生じることができるが、十分に機能的なベータ細胞を生じるための信頼できるプロトコールは未だ開発されていない。前腸派生体;膵臓、肺、甲状腺、肝臓、食道および胃は、原腸陥入において形成される三胚葉のうちの一胚葉である、胚体内胚葉(DE)から生じる。DEの誘導は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞等、内胚葉に由来する組織から分化した細胞型の形成に向けた第1の決定的なステップである。多能性胚性幹(ES)細胞からDE細胞の形成は、例えば、国際公開第2005/116073号パンフレット、国際公開第2005/063971号パンフレットおよび米国特許出願公開第2006/0148081号明細書においてマウスとヒトの両方で報告されている。DE細胞から膵臓内胚葉(PE)細胞の作製は、糖尿病の治療のためのインスリン産生ベータ細胞の作製に必要である。
【０００３】
胚におけるDE形成は、中胚葉またはDEのいずれかを形成する潜在能力を有する原条(PS)形成の中間ステップ(中内胚葉中間体)を経ることが知られている。細胞レベルにおいて、全発生過程は最終的に、異なるシグナル伝達経路の協同作用により制御される。そのうち、Wntシグナル伝達は、発生の間中に起こる複雑な細胞挙動の編成に不可欠である。Wntシグナル伝達は、細胞増殖、幹細胞維持および細胞運命決定と共に、組織化された細胞運動および組織極性の樹立を制御する。これはまた、ヒト癌において高頻度に調節解除され、変性疾患に関係付けられてきた。よって、これは、幹細胞生物学および再生医療の分野における治療介入の潜在的な標的として、新たな見込みがある。
【０００４】
DEの誘導は、Wntの組み合わせありまたはなしのアクチビンA/ノーダル(Nodal)の使用により記載されてきた。特に、Wnt受容体リガンドWnt3aは、5日間のAA媒介性DE誘導の1日目(24時間目)においてアクチビンA(AA)と共にインキュベートすると、即ち、従来のD'Amourプロトコール(Kroonら、2008、Nat Biotech、2006)を用いると、効率的なDE形成に寄与することが以前に報告された。
【０００５】
個々のWntタンパク質を、特定の活性を割り当てることのできるクラスへとグループ化するための試みは、「カノニカル」または「非カノニカル」へのWntの下位区分をもたらし、これは、後者(later)ではなく前者のベータ-カテニン/TCFシグナル伝達を誘導する能力に基づく。
【０００６】
CHIRは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3ベータ(Gsk3b)阻害剤であり、多能性状態にマウス胚性幹細胞を維持するための限定組織培養培地の公知の成分である(Yingら、Nature 453、519〜523)。Gsk3bは、複数の標的を有するが、ベータ-カテニンの分解および/または核移行を調節することが主に知られている。ヒト胚性幹細胞(hESC)からPS形成における安定化されたベータ-カテニンの役割は、BIOおよびWnt3a等、他のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3ベータ(Gsk3b)阻害剤を用いて記載されてきた。しかし、CHIRは、現在までに報告された最も選択的なGsk3b阻害剤である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2005/116073号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2005/063971号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第2006/0148081号明細書
【特許文献４】国際公開第03/055992号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2007/042225号パンフレット
【特許文献６】米国特許第6417185号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kroonら、2008、Nat Biotech、2006
【非特許文献２】Yingら、Nature 453、519〜523
【非特許文献３】Novocell、Nature Biotec 2006、2008
【非特許文献４】D'Amour、K.A.ら、(2006)、Nat Biotechnol 24、1392〜401
【非特許文献５】Jiang、J.ら、(2007)、Stem Cells 25、1940〜53
【非特許文献６】Kroon、E.ら、(2008)、Nat Biotechnol 26、443〜452
【非特許文献７】Aoi、T.ら、(2008)、Science 321(no. 5889)、699〜702
【非特許文献８】Takahashi、K.ら、(2007)、Cell 131、861〜72
【非特許文献９】Takahashi、K. and Yamanaka、S.(2006)、Cell 126、663〜76
【非特許文献１０】Wernig、M.ら、(2007)、Nature 448、318〜24
【非特許文献１１】Yuら、(2007)Science 318:5858
【非特許文献１２】Takahashiら、(2007)Cell 131(5):861
【非特許文献１３】Goff、D. Aら、(2002) Inhibitors of glycogen synthase kinase 3
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
AAおよびCHIRのコインキュベーションは、DE形成安定性を低下させ、効率がより低く強固さがより低いプロトコールをもたらす。本発明は、DEを得るための従来の誘導プロトコール(Kroonら、2008に記載されているD'Amourプロトコール)と比較した、AA媒介性胚体内胚葉誘導に先立ち多能性幹細胞を処理するための規定の濃度範囲における、AAなしのCHIRの利用に関する。先ずCHIR、続いてAAのこの連続的曝露は必須であり、逐次的なPS形成(CHIRにより誘導)と続くAAによるより効率的かつ迅速なDE形成を反映する。本発明は、より初期のSOX17発現ピークを有する全体的により効率的で強固なDEプロトコールをもたらす、先ずPS、続いてDEの誘導の別々の逐次的な制御に関する。CHIRのこれらの効果は、Wnt3a処理により再現することはできない。
【００１０】
図面の説明
DO:あらゆる処理の前の未分化細胞 
Ctrl:Chir処理なしD1。薬物刺激期間において細胞をRPMIに維持し、続いてAA D2およびD3以降からAA+血清代替物(serum replacement)(B27)。
D'Am:Chir処理なし、Kroonら、Nat.Biotech.、2008に従ったプロトコール(1日間のアクチビンA 100ng/ml+Wnt 25ng/ml、2日間のアクチビンA 1OOng/ml+0.2%FBS)。
D1:Chir添加後1日目
D2〜4:AA添加後1〜3日目
全遺伝子発現グラフは、Log10値を示す。
【００１１】
図１はCHIR DEプロトコール命名法および概観を示す図である。このプロトコールは、7種の異なる多能性幹細胞株:SA121、SA181、SA461、SA167(ヒトESC)およびchIPS2、chIPS3、chIPS4(ヒトiPSC)において確認されている。
図２は無処理細胞と比較した、hES SA121(図2A)およびchIPS4(図2B)における24時間のCHIR処理後(D1)のPSマーカー、ブラキュリ(Brachyury)(T)、MIXL1、EOMESおよびグースコイド(Goosecoid)(GSC)の転写発現を示す図である。ICCによりTタンパク質レベルも確認した(図2C)。24時間CHIR処理後のT倍数(fold)誘導は、未分化細胞(n>60)と比較して500〜100000の間に及んだ。バーは、未分化細胞DOと相対的なLog10値を示す。
図３はCHIRで前処理していない細胞と比較した、CHIRをアクチビンA(AA)に置き換えた1日後のDEマーカー(SOX17、CXCR4、FOXA2、CER)の遺伝子発現を示す図である。hESC SA121(図3A)およびiPSC chIPS4(図3B)の両方における発現を示す。バーは、未分化細胞DOと相対的なLog10値を示す。
図４は、CHIR(3μM)、BIO(0,5uM)、Wnt3a(200ng/ml)またはAA単独(1OOng/ml)のいずれかにより、2日間AA処理(D3)に先立ち24時間(D1)処理したhESC SA121(4A〜4B)およびiPSC chIPS4(4C)細胞を示す図である。その上、D'Amour(Kroonら、2008に記載されているプロトコール)を解析した。ブラキュリおよびSOX17の発現を解析した。AAまたはBIOで最初の24時間処理したhES細胞は、3日目まで生存しなかった。
図５は、D'Amourと比較したCHIR誘導後のDEマーカーSOX17、FOXA2およびCXCR4(図5A〜図5C)ならびにOCT4(図5E)の遺伝子発現レベルと、chIPS4細胞におけるSOX17/OCT4の定量化したICCタンパク質レベル(図5D、図5F)を示す図である。OCT4およびSOX17(D1〜3)の陽性染色細胞の対応する%もTable 2(表2)に示す。2つのプロトコールのうちいずれかを用いたchIPS/SA121 DE細胞を、以前に発表されたPE分化プロトコール(Ameriら、2010)を用いて膵臓内胚葉(PE)へとさらに分化させた。PDX1タンパク質レベルのICCを用いて、7日間のPE誘導後に細胞を解析した。並行して、細胞からmRNAを収集し、chIPS4細胞(図5G)およびSA121細胞(図5H)両方のリアルタイムPCRによりPDX1発現を解析した。両方の細胞株において実験を2回反復した(図5G、図5H)。
図６は、RPMIのみ、AAおよびWnt3aまたはCHIR D1のいずれかで処理し、続いてAAまたはAAおよびWnt3a D2ならびにAA D3の組み合わせ(図6A)のいずれかにより処理した、hES SA121(図6A)またはchIPS4(図6C)におけるSOX17 D3の遺伝子発現を示す図である。細胞は、CHIR D1とAA D2(「CHIR」)、D'AmourまたはD'Amourに加えたCHIRのいずれかによっても処理し、SOX17発現(図6B)および形態(図6C)を解析した。
図７は1〜7uMの間の濃度においてCHIRを滴定し、24時間後(D1)および2日間のAA処理後(D3)に解析したことを示す図である。CHIR 0,5〜1uMおよびCHIR 7uMは、D3生存しなかった。SA121(図7A)およびchIPS細胞(図7C)において、24時間処理後にブラキュリ発現を解析した。SA121(図7B)およびchIPS細胞(図7D)において、SOX17発現をD3解析した。
図８はmTeSR系におけるCHIR前処理またはD'Amourプロトコール後のSOX17 D3の遺伝子発現を示す(図8) 図である。
図９はMEFフィーダーにおいて培養したときのDO、D2およびD3におけるマーカー、ブラキュリおよびSOX17の遺伝子発現レベルを示す図である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はまた、幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
a.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
b.アクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする第2のそれに続くステップと
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、より速く、より顕著なSOX17発現のピークを有し、より強固な、ヒト多能性幹細胞を分化させて胚体内胚葉を得るための方法に関する。
【００１４】
本発明は、幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、少なくとも2μM CHIRを含む培地において多能性幹細胞をインキュベートするステップと、それに続いて、アクチビンA(AA)を含む培地において該細胞をインキュベートするステップとを含む方法に関する。
【００１５】
本発明者らは、AAのさらなる添加に先立ち24時間CHIRを単独で用いると、この24時間の間にブラキュリ、Mixl1、Eomesおよびグースコイド(GSC)等、PSマーカーの有意で用量依存的な上方調節を誘導したことを見出した。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、DEを誘導するためのそれに続くAAとのインキュベーションにおいて、SOX17発現により測定されるDE誘導が、CHIRプレインキュベーションなしの培養物と比較して、あるいは従来のD'Amourプロトコール(Novocell、Nature Biotec 2006、2008)と比較して、より初期の時点においてより高い倍数変化でピークとなったことを見出した。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法が、DE誘導のための他の公知のプロトコールよりも効率的であり、より速いSox17 mRNA発現誘導を示したことを見出した。
【００１７】
CHIR媒介性効果は、他の培養系(mTeSR培地およびマウス胚性フィーダー(MEF)細胞における従来のES培地)と、異なる細胞株(SA121、SA181、SA461、SA167、chIPS2、chIPS3、chIPS4)の両方で再現され、効果が、細胞株またはDEF培地培養系に依存しないことを示した。ヒト胚性幹細胞は、胚を破壊しない単一の卵割球に由来し得る(Klimanskayaら、2006;Chungら、2008;Geensら、2009)。細胞株chIPS2、chIPS3、chIPS4は、iPS細胞株である。
【００１８】
本発明者らは、CHIRが、AA添加後に高い細胞密度を促進することを見出した。PS誘導におけるCHIRの用量依存性は、AA処理を開始したときの可能な前パターン形成影響の将来的な最適化を可能にするであろう。それに続く順序の添加因子は、並行して活性化されるシグナル伝達経路の量を減少させる。効率に影響を与え得る因子の量の最小化は、強固さおよび再現性を促進する筈である。
【００１９】
本発明者らは、驚くべきことに、CHIR薬物刺激ステップがDE誘導に独特であり、SOX17発現の効率ピークおよび強固さに関して言えば、BIOまたはWnt3aと比較してより優れていたことを見出した。
【００２０】
増やすことができる多能性培養物由来のヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を、基本のRPMI-1640培地においてCHIR(2〜7μM)の24時間処理に付した。AA含有RPMI-1640培地への培地交換後にDE誘導が開始され、SOX17 mRNA発現が2日後にピークとなり、SOX17タンパク質発現が3〜4日後にピークとなった。2μMを下回る濃度のCHIRは、有意により低いレベルへのブラキュリの誘導遅延を引き起こし、それに続くAA刺激に続く72時間後にDEは誘導されなかった。PS形成は、1,5μMより低いCHIR濃度において遅延され、これにより、AAを添加したときにDEへのさらなる進行を無能化した。本発明者らは、驚くべきことに、24時間のCHIRの2μM以上の濃度範囲が、それに続くAAによるDE誘導に重要であることを見出した。
【００２１】
本発明者らは、驚くべきことに、CHIR薬物刺激ステップが、AAによるSOX17の著しく速い誘導をもたらし、ピークが3〜4日後にようやく観察されたAA単独とは対照的に、早くも1日後にはピークとなったことを見出した。CHIRと続くAAによる連続的インキュベーションは、有利なレベルのDE形成に必須である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】CHIR DEプロトコール命名法および概観を示す図である。このプロトコールは、7種の異なる多能性幹細胞株:SA121、SA181、SA461、SA167(ヒトESC)およびchIPS2、chIPS3、chIPS4(ヒトiPSC)において確認されている。
【図２−１】無処理細胞と比較した、hES SA121(図2A)およびchIPS4(図2B)における24時間のCHIR処理後(D1)のPSマーカー、ブラキュリ(Brachyury)(T)、MIXL1、EOMESおよびグースコイド(Goosecoid)(GSC)の転写発現を示す図である。ICCによりTタンパク質レベルも確認した(図2C)。24時間CHIR処理後のT倍数(fold)誘導は、未分化細胞(n>60)と比較して500〜100000の間に及んだ。バーは、未分化細胞DOと相対的なLog10値を示す。
【図２−２】無処理細胞と比較した、hES SA121(図2A)およびchIPS4(図2B)における24時間のCHIR処理後(D1)のPSマーカー、ブラキュリ(Brachyury)(T)、MIXL1、EOMESおよびグースコイド(Goosecoid)(GSC)の転写発現を示す図である。ICCによりTタンパク質レベルも確認した(図2C)。24時間CHIR処理後のT倍数(fold)誘導は、未分化細胞(n>60)と比較して500〜100000の間に及んだ。バーは、未分化細胞DOと相対的なLog10値を示す。
【図３Ａ】CHIRで前処理していない細胞と比較した、CHIRをアクチビンA(AA)に置き換えた1日後のDEマーカー(SOX17、CXCR4、FOXA2、CER)の遺伝子発現を示す図である。hESC SA121(図3A)およびiPSC chIPS4(図3B)の両方における発現を示す。バーは、未分化細胞DOと相対的なLog10値を示す。
【図３Ｂ】CHIRで前処理していない細胞と比較した、CHIRをアクチビンA(AA)に置き換えた1日後のDEマーカー(SOX17、CXCR4、FOXA2、CER)の遺伝子発現を示す図である。hESC SA121(図3A)およびiPSC chIPS4(図3B)の両方における発現を示す。バーは、未分化細胞DOと相対的なLog10値を示す。
【図４】CHIR(3μM)、BIO(0,5uM)、Wnt3a(200ng/ml)またはAA単独(1OOng/ml)のいずれかにより、2日間AA処理(D3)に先立ち24時間(D1)処理したhESC SA121(4A〜4B)およびiPSC chIPS4(4C)細胞を示す図である。その上、D'Amour(Kroonら、2008に記載されているプロトコール)を解析した。ブラキュリおよびSOX17の発現を解析した。AAまたはBIOで最初の24時間処理したhES細胞は、3日目まで生存しなかった。
【図５】D'Amourと比較したCHIR誘導後のDEマーカーSOX17、FOXA2およびCXCR4(図5A〜図5C)ならびにOCT4(図5E)の遺伝子発現レベルと、chIPS4細胞におけるSOX17/OCT4の定量化したICCタンパク質レベル(図5D、図5F)を示す図である。OCT4およびSOX17(D1〜3)の陽性染色細胞の対応する%もTable 2(表2)に示す。2つのプロトコールのうちいずれかを用いたchIPS/SA121 DE細胞を、以前に発表されたPE分化プロトコール(Ameriら、2010)を用いて膵臓内胚葉(PE)へとさらに分化させた。PDX1タンパク質レベルのICCを用いて、7日間のPE誘導後に細胞を解析した。並行して、細胞からmRNAを収集し、chIPS4細胞(図5G)およびSA121細胞(図5H)両方のリアルタイムPCRによりPDX1発現を解析した。両方の細胞株において実験を2回反復した(図5G、図5H)。
【図６−１】RPMIのみ、AAおよびWnt3aまたはCHIR D1のいずれかで処理し、続いてAAまたはAAおよびWnt3a D2ならびにAA D3の組み合わせ(図6A)のいずれかにより処理した、hES SA121(図6A)またはchIPS4(図6C)におけるSOX17 D3の遺伝子発現を示す図である。細胞は、CHIR D1とAA D2(「CHIR」)、D'AmourまたはD'Amourに加えたCHIRのいずれかによっても処理し、SOX17発現(図6B)および形態(図6C)を解析した。
【図６−２】RPMIのみ、AAおよびWnt3aまたはCHIR D1のいずれかで処理し、続いてAAまたはAAおよびWnt3a D2ならびにAA D3の組み合わせ(図6A)のいずれかにより処理した、hES SA121(図6A)またはchIPS4(図6C)におけるSOX17 D3の遺伝子発現を示す図である。細胞は、CHIR D1とAA D2(「CHIR」)、D'AmourまたはD'Amourに加えたCHIRのいずれかによっても処理し、SOX17発現(図6B)および形態(図6C)を解析した。
【図７−１】1〜7uMの間の濃度においてCHIRを滴定し、24時間後(D1)および2日間のAA処理後(D3)に解析したことを示す図である。CHIR 0,5〜1uMおよびCHIR 7uMは、D3生存しなかった。SA121(図7A)およびchIPS細胞(図7C)において、24時間処理後にブラキュリ発現を解析した。SA121(図7B)およびchIPS細胞(図7D)において、SOX17発現をD3解析した。
【図７−２】1〜7uMの間の濃度においてCHIRを滴定し、24時間後(D1)および2日間のAA処理後(D3)に解析したことを示す図である。CHIR 0,5〜1uMおよびCHIR 7uMは、D3生存しなかった。SA121(図7A)およびchIPS細胞(図7C)において、24時間処理後にブラキュリ発現を解析した。SA121(図7B)およびchIPS細胞(図7D)において、SOX17発現をD3解析した
【図８】mTeSR系におけるCHIR前処理またはD'Amourプロトコール後のSOX17 D3の遺伝子発現を示す(図8) 図である。
【図９】MEFフィーダーにおいて培養したときのDO、D2およびD3におけるマーカー、ブラキュリおよびSOX17の遺伝子発現レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施形態:
1. 幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
c.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
d.アクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする第2のそれに続くステップと、
を含む方法。
【００２４】
2.前記培地が、RPMI-1640である、実施形態1に記載の方法。
【００２５】
3.前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、実施形態1または2のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００２６】
4.前記幹細胞が、胚性幹細胞である、実施形態1〜3のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００２７】
5.前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、実施形態3に記載の方法。
【００２８】
6.前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、実施形態3に記載の方法。
【００２９】
7.CHIRの濃度が、約2〜20uMの範囲内等、約3,1〜15μMの範囲等または約3,5〜7μMの範囲等または約3,5〜6μMの範囲等または約3,5〜5μMの範囲等、少なくとも約2,5μMまたは少なくとも3μMである、実施形態1〜6のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００３０】
8.CHIRの濃度が、少なくとも約2μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３１】
9.CHIRの濃度が、少なくとも約2,5μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３２】
10.CHIRの濃度が、少なくとも約3μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３３】
11.CHIRの濃度が、少なくとも約3,1μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３４】
12.CHIRの濃度が、少なくとも約3,2μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３５】
13.CHIRの濃度が、少なくとも約3,3μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３６】
14.CHIRの濃度が、少なくとも約3,4μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３７】
15.CHIRの濃度が、少なくとも約3,5μMである、実施形態7に記載の方法。
【００３８】
16.CHIRの濃度が、約2〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００３９】
17.CHIRの濃度が、約3〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００４０】
18.CHIRの濃度が、約3,1〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００４１】
19.CHIRの濃度が、約3,2〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００４２】
20.CHIRの濃度が、3,3〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００４３】
21.CHIRの濃度が、約3,4〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００４４】
22.CHIRの濃度が、約3,5〜7μMの範囲内である、実施形態7に記載の方法。
【００４５】
23.CHIRの濃度が、2,5μMである、実施形態7に記載の方法。
【００４６】
24.CHIRの濃度が、3μMである、実施形態7に記載の方法。
【００４７】
25.CHIRの濃度が、3,1μMである、実施形態7に記載の方法。
【００４８】
26.CHIRの濃度が、3,2μMである、実施形態7に記載の方法。
【００４９】
27.CHIRの濃度が、3,3μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５０】
28.CHIRの濃度が、3,4μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５１】
29.CHIRの濃度が、3,5μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５２】
30.CHIRの濃度が、3,6μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５３】
31.CHIRの濃度が、3,7μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５４】
32.CHIRの濃度が、3,8μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５５】
33.CHIRの濃度が、3,9μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５６】
34.CHIRの濃度が、約4μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５７】
35.CHIRの濃度が、約4,5μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５８】
36.CHIRの濃度が、約5μMである、実施形態7に記載の方法。
【００５９】
37.CHIRとの前記インキュベーションが、少なくとも12時間である、実施形態1〜36のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００６０】
38.CHIRとの前記インキュベーションが、少なくとも24時間である、実施形態1〜37のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００６１】
39.CHIRとの前記インキュベーションが、少なくとも48時間である、実施形態1〜38のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００６２】
40.CHIRとの前記インキュベーションが、24〜48時間の間である、実施形態37に記載の方法。
【００６３】
41.CHIRとの前記インキュベーションが、24時間である、実施形態37に記載の方法。
【００６４】
42.CHIRとの前記インキュベーションが、48時間である、実施形態37に記載の方法。
【００６５】
43.アクチビンAの濃度が、約1〜5000ng/mlの範囲内等、約1〜1000ng/mlの範囲内等、約10〜500ng/mlの範囲内等または約1〜200ng/mlの範囲内等、少なくとも約100ng/mlである、実施形態1〜42のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００６６】
44.アクチビンAの濃度が、約1〜200ng/mlの範囲内である、実施形態43に記載の方法。
【００６７】
45.アクチビンAの濃度が、約20〜200ng/mlの範囲内である、実施形態43に記載の方法。
【００６８】
46.アクチビンAの濃度が、約30〜200ng/mlの範囲内である、実施形態43に記載の方法。
【００６９】
47.アクチビンAの濃度が、少なくとも25ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７０】
48. アクチビンAの濃度が、約140ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７１】
49.アクチビンAの濃度が、約120ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７２】
50.アクチビンAの濃度が、約100ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７３】
51.アクチビンAの濃度が、約80ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７４】
52.アクチビンAの濃度が、約60ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７５】
53.アクチビンAの濃度が、約40ng/mlである、実施形態43に記載の方法。
【００７６】
54.アクチビンAとの前記インキュベーションが、少なくとも12時間等、少なくとも24時間もしくは少なくとも48時間等または3〜4日間等、12時間から5日間の範囲内である、実施形態1〜53のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００７７】
55.アクチビンAとの前記インキュベーションが、少なくとも12時間である、実施形態54に記載の方法。
【００７８】
56.アクチビンAとの前記インキュベーションが、24時間である、実施形態54に記載の方法。
【００７９】
57.アクチビンAとの前記インキュベーションが、48時間である、実施形態54に記載の方法。
【００８０】
58.アクチビンAとの前記インキュベーションが、72時間である、実施形態54に記載の方法。
【００８１】
59.アクチビンAとの前記インキュベーションが、48〜72時間である、実施形態54に記載の方法。
【００８２】
60.アクチビンAとの前記インキュベーションが、3〜4日間である、実施形態54に記載の方法。
【００８３】
61.内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞から得られる、実施形態1〜60のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００８４】
62.前記内胚葉細胞が、肝臓内胚葉細胞、膵臓内胚葉細胞、腸内胚葉細胞および/または肺内胚葉細胞である、実施形態61に記載の方法。
【００８５】
63.前記内胚葉細胞が、肝臓内胚葉細胞である、実施形態62に記載の方法。
【００８６】
64.前記内胚葉細胞が、膵臓内胚葉細胞である、実施形態62に記載の方法。
【００８７】
65.実施形態1〜64の方法により得ることができる胚体内胚葉細胞。
【００８８】
66.実施形態1〜64の方法により得ることができる内胚葉細胞。
【００８９】
67.実施形態66に記載の肝臓内胚葉細胞、膵臓内胚葉細胞、腸内胚葉細胞および/または肺内胚葉細胞。
【００９０】
68.前記細胞が肝臓内胚葉細胞である、実施形態66に記載の内胚葉細胞。
【００９１】
69.前記細胞が膵臓内胚葉細胞である、実施形態66に記載の内胚葉細胞。
【００９２】
70.ベータ-カテニンが、CHIR誘導性Gsk3b阻害により活性化される、実施形態1〜64に記載の方法。
【００９３】
71.培養培地におけるCHIR濃度が、3,1〜15μMの範囲内等または3,1〜7μM等または3,5〜15uM等、少なくとも2μM CHIRである、CHIRの使用。
【００９４】
72.胚性幹細胞から原条細胞を誘導するための、培養培地における少なくとも3,1uM濃度におけるCHIRの使用。
【００９５】
73.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3,1〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【００９６】
74.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3,5〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【００９７】
75.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3,5uMの濃度におけるCHIRの使用。
【００９８】
76.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、4uMの濃度におけるCHIRの使用。
【００９９】
77.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、4,5uMの濃度におけるCHIRの使用。
【０１００】
78.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、5uMの濃度におけるCHIRの使用。
【０１０１】
79.前記原条が、次のマーカー:ブラキュリまたはMixl1のうち1または複数を発現する、実施形態71〜78に記載の使用。
【０１０２】
80.前記胚体内胚葉が、次のマーカーSox17のうち1または複数を発現する、実施形態71〜78に記載の使用。
【０１０３】
本発明のさらに別の実施形態:
81.幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
a.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
b.少なくとも25ng/mlアクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする第2のそれに続くステップと
を含む方法。
【０１０４】
82.幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
a.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする少なくとも12時間の第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
c.少なくとも25ng/mlアクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする少なくとも12時間の第2のそれに続くステップと
を含む方法。
【０１０５】
83.幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
b.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする少なくとも24時間の第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
d.少なくとも25ng/mlアクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする少なくとも24時間の第2のそれに続くステップと
を含む方法。
【０１０６】
84 幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
a.少なくとも3,1μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
b.少なくとも25ng/mlアクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする第2のそれに続くステップと
を含む方法。
【０１０７】
85.幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
a.少なくとも3,5μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートする第1の薬物刺激ステップであって、アクチビンAが、前記薬物刺激ステップにおいて存在しないステップと、
b.少なくとも25ng/mlアクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートする第2のそれに続くステップと
を含む方法。
【０１０８】
86.前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、実施形態1〜85のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１０９】
87.前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、実施形態86に記載の方法。
【０１１０】
88.前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、実施形態86に記載の方法。
【０１１１】
89.CHIRの濃度が、約3,1〜15μMの範囲内等または約3,5〜7μM等または約3,5〜6μM等または約3,5〜5μM等、少なくとも約2、少なくとも約2,5uM、少なくとも約3uM、少なくとも約3,1μMである、実施形態1〜88のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１２】
90.CHIRの濃度が、少なくとも約3,1μMである、実施形態1〜89のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１３】
91.CHIRの濃度が、少なくとも約3,2μMである、実施形態1〜90のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１４】
92.CHIRの濃度が、少なくとも約3,3μMである、実施形態1〜91のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１５】
93.CHIRの濃度が、少なくとも約3,4μMである、実施形態1〜92のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１６】
94.CHIRの濃度が、少なくとも約3,5μMである、実施形態1〜93のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１７】
95.CHIRの濃度が、約3,1〜7μMの範囲内である、実施形態1〜94のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１８】
96.CHIRの濃度が、約3,2〜7μMの範囲内である、実施形態1〜95のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１１９】
97.CHIRの濃度が、約3,3〜7μMの範囲内である、実施形態1〜96のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２０】
98.CHIRの濃度が、約3,4〜7μMの範囲内である、実施形態1〜97のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２１】
99.CHIRの濃度が、約3,5〜7μMの範囲内である、実施形態1〜98のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２２】
100.CHIRとの前記インキュベーションが、少なくとも24時間である、実施形態1〜99のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２３】
101.CHIRとの前記インキュベーションが、少なくとも48時間である、実施形態1〜100のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２４】
102.CHIRとの前記インキュベーションが、24〜48時間の間である、実施形態1〜101のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２５】
103.CHIRとの前記インキュベーションが、24時間である、実施形態1〜102のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２６】
104.CHIRとの前記インキュベーションが、48時間である、実施形態1〜103のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２７】
105.アクチビンAの濃度が、約25〜200ng/mlの範囲内である、実施形態1〜104のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２８】
106.アクチビンAの濃度が、約30〜200ng/mlの範囲内である、実施形態1〜105のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１２９】
107.アクチビンAの濃度が、約100ng/mlである、実施形態1〜106のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３０】
108.アクチビンAの濃度が、約80ng/mlである、実施形態1〜107のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３１】
109.アクチビンAの濃度が、約60ng/mlである、実施形態1〜108のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３２】
110.アクチビンAの濃度が、約40ng/mlである、実施形態1〜109のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３３】
111.アクチビンAの濃度が、少なくとも約110ng/mlである、実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３４】
112.アクチビンAとの前記インキュベーションが、少なくとも12時間等、少なくとも24時間もしくは少なくとも48時間等または3〜4日間等、12時間から5日間の範囲内である、実施形態1〜111のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３５】
113.アクチビンAとの前記インキュベーションが、少なくとも約24時間である、実施形態1〜112のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３６】
114.アクチビンAとの前記インキュベーションが、約24時間である、実施形態1〜113のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３７】
115.アクチビンAとの前記インキュベーションが、約48時間である、実施形態1〜114のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３８】
116.アクチビンAとの前記インキュベーションが、約72時間である、実施形態1〜115のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１３９】
117.アクチビンAとの前記インキュベーションが、約48〜約72時間である、実施形態1〜116のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１４０】
118.アクチビンAとの前記インキュベーションが、約3〜4日間である、実施形態1〜117のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１４１】
119.内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞から得られる、実施形態1〜118のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０１４２】
120.前記内胚葉細胞が、肝臓内胚葉細胞、膵臓内胚葉細胞、腸内胚葉細胞および/または肺内胚葉細胞である、実施形態119に記載の方法。
【０１４３】
121.前記内胚葉細胞が、肝臓内胚葉細胞である、実施形態120に記載の方法。
【０１４４】
122.前記内胚葉細胞が、膵臓内胚葉細胞である、実施形態120に記載の方法。
【０１４５】
123.実施形態81〜122の方法により得ることができる胚体内胚葉細胞。
【０１４６】
124.実施形態81〜122の方法により得ることができる内胚葉細胞。
【０１４７】
125.実施形態124に記載の肝臓内胚葉細胞、膵臓内胚葉細胞、腸内胚葉細胞および/または肺内胚葉細胞。
【０１４８】
126.肝臓内胚葉細胞である、実施形態124に記載の内胚葉細胞。
【０１４９】
127.膵臓内胚葉細胞である、実施形態124に記載の内胚葉細胞。
【０１５０】
128.ベータ-カテニンが、CHIR誘導性Gsk3b阻害により活性化される、実施形態81〜122に記載の方法。
【０１５１】
129.幹細胞から原条細胞を誘導するための、特異的な濃度におけるCHIRの使用。
【０１５２】
130.幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、特異的な濃度におけるCHIRの使用。
【０１５３】
131.培養培地におけるCHIRの濃度が、少なくとも2μM CHIRである、実施形態129〜130に記載の使用。
【０１５４】
132.培養培地におけるCHIRの濃度が、2〜7μMの範囲内等、3μM等または4μM等、少なくとも2μM CHIRである、実施形態129〜131に記載の使用。
【０１５５】
133.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、2〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【０１５６】
134.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【０１５７】
135.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3,5〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【０１５８】
一実施形態において、本発明に係る方法により得ることができる膵臓内分泌細胞は、インスリン産生細胞であり、これは必要に応じて、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドおよび/またはグレリン産生細胞へと分化した細胞と共にある。本明細書において、「インスリン産生細胞」は、検出可能な量のインスリンを産生および貯蔵、あるいは分泌する細胞を指す。「インスリン産生細胞」は、個々の細胞または細胞コレクションとなり得る。
【０１５９】
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、体細胞集団から得られる。一部の態様において、体細胞集団は、胚様幹(ES、例えば、多能性)細胞へと脱分化するよう誘導された。このような脱分化細胞は、人工多能性幹細胞(IPS)とも称される。
【０１６０】
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胚性幹(ES、例えば、多能性)細胞から得られる。一部の態様において、膵臓細胞を含む細胞集団は、ES様細胞等、多能性細胞である。
【０１６１】
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胚性分化幹(ESまたは多能性)細胞である。分化は、胚様体および/または単層細胞培養物またはこれらの組み合わせにおいて行われる。
【０１６２】
別の一実施形態において、細胞集団は、幹細胞の集団である。一部の態様において、細胞集団は、膵臓内分泌系列に分化した幹細胞の集団である。
【０１６３】
幹細胞は、単細胞レベルにおいて、自己再生するその能力ならびに自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞および終分化細胞を包含する後代細胞を産生する分化を行うその能力の両方により定義される未分化細胞である。幹細胞は、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)由来の様々な細胞系列の機能的細胞へとin vitroで分化すると共に、移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後に全てではないにしても殆どの組織に実質的に寄与するその能力によっても特徴付けられる。
【０１６４】
幹細胞は、その発生上の潜在能力により分類される:(1)あらゆる胚性および胚外細胞型を生じ得ることを意味する全能性;(2)あらゆる胚性細胞型を生じ得ることを意味する多能性;(3)細胞系列のサブセット、但し全て特定の組織、器官または生理系内のサブセットを生じ得ることを意味する複能性(multi-potent)(例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生)、血液細胞に制限された少能性(oligopotent)前駆細胞ならびに血液の正常成分であるあらゆる細胞型および要素(例えば、血小板)を包含する後代を産生することができる);(4)複能性幹細胞よりも制限された細胞系列のサブセットを生じ得ることを意味する少能性;ならびに(5)単一細胞系列を生じ得ることを意味する単能性(例えば、精子形成幹細胞)。
【０１６５】
幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコールは、D'Amour、K.A.ら、(2006)、Nat Biotechnol 24、1392〜401;Jiang、J.ら、(2007)、Stem Cells 25、1940〜53;およびKroon、E.ら、(2008)、Nat Biotechnol 26、443〜452に記載されているプロトコールにより例証されるが、これらに限定されるものではない。
【０１６６】
体細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコールあるいはES様細胞等の多能性細胞へと脱分化するよう誘導された体細胞は、Aoi、T.ら、(2008)、Science 321(no.5889)、699〜702;D'Amour、K.A.ら、(2006)、Nat Biotechnol 24、1392〜401;Jiang、J.ら、(2007)、Stem Cells 25、1940〜53;Kroon、E.ら、(2008)、Nat Biotechnol 26、443〜452;Takahashi、K.ら、(2007)、Cell 131、861〜72;Takahashi、K. and Yamanaka、S.(2006)、Cell 126、663〜76;およびWernig、M.ら、(2007)、Nature 448、318〜24に記載されているプロトコールにより例証されるが、これらに限定されるものではない。
【０１６７】
本明細書において、「分化する」または「分化」は、細胞が、未分化状態から分化状態へと、未成熟状態からそれよりは成熟した状態へと、あるいは未成熟状態から成熟状態へと進行する過程を指す。例えば、初期未分化胚性膵臓細胞は、増殖し、Pdx1、Nkx6.1およびPtf1aのような特徴的なマーカーを発現することができる。成熟または分化した膵臓細胞は、増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌する。例えば、完全に分化したベータ細胞は、グルコースに応答してインスリンを高レベルで分泌する。細胞相互作用の変化および成熟は、細胞が未分化細胞のマーカーを失う、あるいは分化細胞のマーカーを獲得するにつれて起こる。単一マーカーの減少または増加は、細胞が「成熟または完全に分化」したことを示し得る。用語「分化因子」は、膵臓細胞に添加されるとその分化を増強し、インスリン産生ベータ細胞も含有する内分泌細胞を成熟させる化合物を指す。例示的な分化因子として、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、エキセンディン-4、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子-1、神経増殖因子、上皮増殖因子血小板由来増殖因子およびグルカゴン様ペプチド1が挙げられる。一部の態様において、細胞の分化は、1または複数種の分化因子を含む培地における細胞の培養を含む。
【０１６８】
本明細書において、「ヒト多能性幹細胞」(hPS)は、いかなるソースに由来してもよく、適切な条件下において、全3胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)の派生体である異なる細胞型のヒト後代を産生することのできる細胞を指す。hPS細胞は、8〜12週齢のSCIDマウスにおいてテラトーマを形成する能力および/または組織培養において全3胚葉の同定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹(hES)細胞(例えば、Thomsonら、(1998)、Heinsら、(2004)を参照)や人工多能性幹細胞(例えば、Yuら、(2007)Science 318:5858); Takahashiら、(2007)Cell 131(5):861を参照)と多くの場合表される、30報の文献におけるヒト胚盤胞由来の幹(hBS)細胞を包含する様々な種類の胚細胞が包含されている。様々な方法および本明細書に記載されている他の実施形態は、種々のソース由来のhPS細胞を必要とし得るまたは利用し得る。例えば、使用に適したhPS細胞は、発生中の胚から得ることができる。その上またはあるいは、適したhPS細胞は、樹立された細胞株および/またはヒト人工多能性幹(hiPS)細胞から得ることができる。
【０１６９】
本明細書において、「hiPS細胞」は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。
【０１７０】
本明細書において、用語「胚盤胞由来の幹細胞」は、BS細胞と表示され、ヒト型は「hBS細胞」と呼ばれる。文献において、この細胞は、胚性幹細胞、より具体的にはヒト胚性幹細胞(hESC)と多くの場合称される。よって、本発明において用いられる多能性幹細胞は、例えば、国際公開第03/055992号パンフレットおよび国際公開第2007/042225号パンフレットに記載されている胚盤胞から調製される胚性幹細胞であっても、市販のhBS細胞または細胞株であってもよい。しかし、例えば、Yuら、2007、Takahashiら、2007およびYu ら、2009に開示されている通り、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28等、特定の転写因子で成体細胞を処理することにより多能性細胞へと再プログラムされる分化した成体(adult)細胞を包含する、いかなるヒト多能性幹細胞を本発明において用いてもよいことがさらに想定される。
【０１７１】
本明細書において、「フィーダー細胞」は、単独または組み合わせて用いられる支持細胞型を意味するよう企図されている。この細胞型はさらに、ヒトまたは他の種起源のものとなり得る。フィーダー細胞が由来し得る組織は、胚、胎児、新生児、若年期または成体組織を包含し、包皮を包含する皮膚に由来する組織、臍帯(umbilical chord)、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺(glandula)、間質または乳房をさらに包含する。フィーダー細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型に由来し得る。フィーダー細胞を派生させるために用いることのできる特異的な細胞型の例として、胚性線維芽細胞、胚外内胚葉細胞、胚外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および/または線維細胞、胎児筋肉細胞、胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍帯間葉系細胞、胎盤線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤内皮細胞が挙げられる。
【０１７２】
本明細書において、用語「MEF細胞」は、マウス胚性線維芽細胞を意味するよう企図されている。
【０１７３】
本明細書において、「CHIR」、「Chir」または「Chir99021」は、特許、米国特許第6417185号に保護され、Goff、D. Aら、(2002) Inhibitors of glycogen synthase kinase 3により記載されている、特許権取得された市販のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3ベータ(Gsk3b)阻害剤である。
【０１７４】
本発明の実施形態:
136.幹細胞を胚体内胚葉へと分化させるための方法であって、
a.少なくとも2μM CHIRを含む培地において幹細胞をインキュベートするステップと、 
b.それに続いて、アクチビンAを含む培地において幹細胞をインキュベートするステップと
を含む方法。
【０１７５】
137.アクチビンAが、CHIRとの前記インキュベーションにおいて存在しない、実施形態136に記載の方法。
【０１７６】
138.前記培地が、RPMI-1640である、実施形態136〜137に記載の方法。
【０１７７】
139.前記幹細胞が、胚性幹細胞である、実施形態136〜138のいずれかに記載の方法。
【０１７８】
140.CHIRの濃度が、2〜7μMの範囲内等または3μM等または4μM等、少なくとも2μMである、実施形態136〜139のいずれかに記載の方法。
【０１７９】
141.CHIRとの前記インキュベーションが、24時間等、少なくとも12時間である、実施形態136〜140のいずれかに記載の方法。
【０１８０】
142.アクチビンAとの前記インキュベーションが、少なくとも12時間等、少なくとも24時間もしくは少なくとも48時間等または3〜4日間等、12時間から5日間の範囲内である、実施形態136〜141のいずれかに記載の方法。
【０１８１】
143.特異的な内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞から得られる、実施形態136〜142のいずれかに記載の方法。
【０１８２】
144.前記特異的な内胚葉細胞が、膵臓内胚葉細胞である、実施形態143に記載の方法。
【０１８３】
145.実施形態136〜144の方法により得ることができる胚体内胚葉細胞。
【０１８４】
146.実施形態136〜145の方法により得ることができる特異的な内胚葉細胞。
【０１８５】
147.幹細胞から原条細胞を誘導するための、特異的な濃度におけるCHIRの使用。
【０１８６】
148.幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、特異的な濃度におけるCHIRの使用。
【０１８７】
149.培養培地におけるCHIRの濃度が、少なくとも2μM CHIRである、実施形態147〜148に記載の使用。
【０１８８】
150.培養培地におけるCHIRの濃度が、2〜7μMの範囲内等、3μM等または4μM等、少なくとも2μM CHIRである、実施形態147〜148に記載の使用。
【０１８９】
151.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、2〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【０１９０】
152.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【０１９１】
153.胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するための、3,5〜7uMの範囲内の濃度におけるCHIRの使用。
【０１９２】
本明細書に引用されている刊行物、特許出願および特許を包含するあらゆる参考文献は、あたかも各参考文献が、参照により援用されていると個々にそして特に示され、その全体が本明細書に表記されているのと同じ程度まで(法律が許す最大限の程度まで)、これによりその全体を参照により援用する。
【０１９３】
あらゆる見出しおよび小見出しは、本明細書において単に便宜上用いられており、決して本発明を限定するものと解釈するべきではない。
【０１９４】
本明細書に提示されているありとあらゆる具体例または例示的な表現(例えば、「等」)の使用は、単に本発明により良く光を当てるよう企図されており、他に主張されていなければ本発明の範囲に制約を課すものではない。本明細書における表現は、請求されていない要素のいずれも本発明の実施に必須であると示されていると解釈するべきではない。
【０１９５】
本明細書において本発明の特定の特色を説明および記載してきたが、当業者であれば、これにより多くの修正、置き換え、変更および均等物を思いつくであろう。従って、添付の特許請求の範囲が、このような修正および変更の全てを、本発明の真の精神の範囲内に収まるものとして網羅するよう企図されていることを理解されたい。
【０１９６】
略語
AA:アクチビンA
D'Am:D'Amourプロトコール(Kroonら、2008)
DE:胚体内胚葉 
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF2)
Gsk3b:グリコーゲン合成酵素キナーゼ3ベータ
hBSC;ヒト胚盤胞由来の幹細胞
hESC:ヒト胚性幹細胞
hIPSC:ヒト人工多能性細胞
hPSC:ヒト多能性幹細胞
KO-SR:ノックアウト血清代替物
RNA:リボ核酸
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
PS:原条
SOX17:SRY(性決定領域Y)-ボックス17
T:ブラキュリ
【０１９７】
(実施例)
(実施例1)
ヒトES/iPS細胞のin vitro培養
2種の異なるフィーダーフリー(DEF、mTeSR)培養系および1種のフィーダー依存的(MEF-ES)培養系においてDEプロトコールを確認した。
【０１９８】
DEF hESC/iPS培養系
6〜96ウェルプレートにおいて、30ng/ml bFGF(Invitrogen)および10ng/mlノギン(Peprotech)を有するDEF培養培地(Cellartis)におけるヒトフィブロネクチン(Sigma)上でヒト胚性幹(hES)細胞SA121およびchIPS4(Cellartis)を培養した。細胞を、Rock阻害剤Y-27632(Calbiochem)により単細胞継代し、実験のために40000細胞/cm2の密度で播種した。継代後4日目に実験を開始した。
【０１９９】
mTeSR培養系
hES細胞(SA121)を、フィーダー(MEF)からmTeSR1培地(Cell Signaling Techologies)におけるMatrigel(BD Biosciences)へとクラスター継代し、培養系プロトコールに従ってDispase(BD Biosciences)によりさらに継代した。クラスターが互いに触れ始めたらDEを開始した。
【０２００】
MEF-ES
hES細胞(SA121)をhES培地(KO-DMEM、PEST、Glutamax、NEAA、2-メルカプトエタノール、KO血清代替物、10ng/ml bFGF)においてMEFを前播種したゼラチンコートプレートで継代した。80%集密度においてDEを開始した。
【０２０１】
(実施例2)
CHIR DEプロトコール
RPMIにおける0,5〜7μM CHIR99021(Stemgent)による24時間前処理前に、集密的培養物をRPMI1640(Invitrogen)において1回洗浄した。対照細胞は、RPMI中に未処理のまま置き、D'Amour細胞は、実験設定に応じてRPMI中に置くか、あるいは前処理なしでAA(Peprotech)+Wnt3a(R&D Systems)で処理した。
【０２０２】
24時間後、RPMIにおける100ng/ml AAを添加する前に、前処理および対照細胞をRPMIで1回洗浄した。D'Amour細胞も、100ng/ml AAで但しB27の代わりに0,2%FBSを用いて処理した。24時間後に、2%B27(Invitrogen)をAA培地に2〜3日間添加した。対照細胞をB27で処理して細胞死を防止し、発表されたプロトコールに従ってD'Amour細胞を2%FBSで処理した。培地を毎日交換した。
【０２０３】
細胞をさらにPEへと分化させる場合、T75細胞培養フラスコにおいてDEプロトコールを適用し、DE培地において200Kの密度で4日間のDE培養後に再播種した。1日後に、発表されたプロトコール(Ameriら、2010)に従ってPE培地(RPMI1640+12%KOSR+64ng/ml bFGF)を添加する前に細胞を1回洗浄した。
【０２０４】
CHIR胚体内胚葉プロトコールの概観は、図1に見出すことができる。7種の異なる細胞株:SA121、SA181、SA461、SA167(hESC)およびchIPS2、chIPS3、chIPS4(hiPSC)においてプロトコールを確認した。
【０２０５】
【表１】
2014519832.tif 000002
【０２０６】
1日目:分化を開始する前に、予熱した(37℃)RPMIにおいて細胞を慎重に洗浄した。1日目の培地を予め混合し(予熱したRPMI+PESTにおけるCHIR 3μM)、細胞培養物に穏やかに添加した。プレートフォーマットに従って容量を調整した。
【０２０７】
2日目:培地交換前に、予熱した(37℃)RPMIにおいて細胞を慎重に洗浄した。2日目の培地を予め混合し(予熱したRPMI+0,1%PESTにおける100ng/mlアクチビンA)、細胞培養物に穏やかに添加した。
【０２０８】
3日目:3&4日目の培地を予め混合し(予熱したRPMI+0,1%PESTにおける100ng/mlアクチビンAおよび2%B27)、細胞培養物に穏やかに添加した。
【０２０９】
4日目:DEを回収またはさらなる分化のために再播種した。細胞を顕微鏡下で毎日チェックした。
【０２１０】
(実施例3)
RNA抽出および定量的リアルタイムPCR
24時間の前処理後(D1)、1日間のAA処理の後(D2)および1〜2日間のAA+B27処理の後(D3〜4)にRNA試料を収集した。Rneasy Plus Miniキット(Qiagen)により全RNAを抽出し、StepOnePLusシステム(Applied Biosystems)を用いて定量的リアルタイムPCRを行った。
【０２１１】
ICC染色手順
細胞をPBS+/+において洗浄し、4%ホルムアルデヒドにおいて30分間固定した(10%ホルマリン(formaline)、VWR)。次に、細胞を再度PBSにおいて3回洗浄し、染色までPBS(4℃)中に置いた。固定した細胞をPBSで1回洗浄し、次にPBSにおける0,5%Triton X-100で6分間透過処理し、PBSにおいて洗浄し、TNBバッファー(0.1M Tris-HCl pH7.5、0.15M NaCl、0.5%ブロッキング試薬(Perkin Elmer))で30分間ブロッキングした。0,1%TritonX-100+PBSにおいて一次抗体(ヤギ抗SOX17(AF1924、RnD Systems);ヤギ抗ブラキュリ(AF2085、RnD Systems);マウス抗OCT4(sc5279、SantaCruz Biotechnology);ヤギ抗PDX1(AB47383、Abcam))を1時間RTまたは4℃O/Nにて添加した。PBSにおける徹底的な洗浄ステップの後、0,1%Triton X-100+PBSにおいてDAPIと共に二次抗体を45分間RTにて添加し、PBSにおいて徹底的に洗浄し、写真ドキュメンテーション(photodocumentation)までPBS中に置いた。
【０２１２】
(実施例4)
スピードおよび効率
DEF培地における未分化SA121 hESおよびchIPS4 iPS細胞(DO)を、CHIRなしRPMI(Ctrl D1)において、あるいはRPMIにおけるCHIRで24時間処理(CHIR D1)して培養した。次に細胞を洗浄してCHIRの非存在を確実にし、両方の条件を1日間AAで処理した(CtrlおよびCHIR d2)。1日間のCHIR処理の後、ブラキュリ(T)、MIXL1、EOMESおよびGSC等、PSマーカーは、非前処理細胞と比較して高度に上方調節された(図2A〜図2C)。24時間CHIR処理後のT倍数誘導は、未分化細胞(dO)と比較して500〜100000の間に及んだ。ICCによりTタンパク質レベルも確認した(図2C)。
【０２１３】
両方の条件にAAを添加したにもかかわらず、AA添加後1日目に(D2)、SOX17、CXCR4、FOXA2およびCER等、共にDE形成を示すマーカーもまた、非前処理細胞と比較して高度に上方調節された(図3A、図3B)。CHIR前処理後のSox17倍数誘導は、未分化細胞(DO、n>60)と比較して10000〜3500000の間に及んだ。TおよびSOX17両方の効率レベルは、高度に強固であり(n>60)、IHCおよびSOX17定量化により確認された(図2CおよびTable 2(表2))。CHIR前処理ステップは、AA処理後にSOX17の著しく迅速な誘導をもたらした。SOX17発現は、AA誘導前に細胞をCHIRに24時間付した場合、1日間のAA処理後には早くもピークとなった。CHIRで前処理しなかったAA含有培地における細胞(ctrl)は、Sox17誘導において同じスピードまたは効率を示さなかった。
【０２１４】
CHIRは、24時間処理後に(D1)PSマーカーを誘導する直接的な能力を有し、AAが添加されたときにDEを誘導する著しくより高い能力をもたらした(D2)。AAを添加するとブラキュリは大いに抑圧され、高度に段階的な順序で細胞が分化していることを示した。
【０２１５】
【表２】
2014519832.tif 000003
【０２１６】
Table 2(表2)は、D'Amour(Kroonら、2008に記載のプロトコール)に従ったDE誘導のD1〜3およびアクチビンA添加に先立ち3uM CHIR(CHIR D1)で処理した細胞(CHIR D2〜3)を示す。
【０２１７】
(実施例5)
CHIR特異性
CHIR特異性(d1)を示すため、hES SA121およびChIPS4細胞を、AA添加に先立ちCHIR(3μM)、BIO(0,5uM)、Wnt3a(200ng/ml)またはAA単独(100ng/ml)のいずれかで24時間処理した。その上、D'Amour(Kroonら、2008に記載のプロトコール)を並行して検査した。
【０２１８】
CHIR処理は、24時間後にブラキュリ発現を有意に上方調節した(図4A、図4C)。AA添加後に(D2)、ブラキュリは低下し、SOX17は上方調節された(図4B)。AAまたはBIOで処理したhES細胞は、3日目まで生存しなかった。
【０２１９】
データは、PS移行(ブラキュリの上方調節)およびDE誘導(SOX17の上方調節)が共に、加速され、AAおよびWnt3a等の増殖因子による前処理と比較してCHIR処理後にさらにより高かったことを明らかに説明した。別の小分子Gsk3b阻害剤(BIO)による細胞の前処理は同じ効果を誘発せず、細胞はd3まで生存しなかった。CHIRの代わりにWnt3aおよびBIOいずれかによる処理は、CHIR処理と比較してブラキュリ(PS)応答を遅延させた(上方調節D2)(データ図示せず)。さらに、これらの物質は、有意により低い効率でブラキュリおよびSOX17遺伝子発現の両方を誘導し、AAまたはBIOで処理した細胞は、d3まで生存しなかった。このプロトコールはまた、以前に発表されたD'Amourプロトコールよりも非常に優れていた。
【０２２０】
(実施例6)
CHIR対D'Amourプロトコール(DEおよびPE誘導)
未分化ChIPS4細胞(dO)を、CHIR(3uM)で24時間前処理、あるいはKroonら、2008に従ってAA(100ng/ml)およびWnta3a(25ng/ml)に直接的に曝露した。次に細胞を洗浄し、AAを1〜4日間添加した。詳細な設定に関してはTable 1(表1)を参照されたい。
【０２２１】
CHIR処理は、CHIR前処理後のT(mRNA D1)およびSOX17両方の上方調節において(mRNA、ICC D3)、D'Amourと比較してより優れていた(図5およびTable 2(表2))。加えて、プロトコール間の最も顕著な差は、D'Amour処理におけるさらにより高度な細胞死による形態の観点において見られる。結果をさらに強化するため、SOX17タンパク質発現の定量化を行った。CHIRまたはD'Amourプロトコールのいずれかにより処理したchIPS4細胞を固定し、SOX17特異的なabを用いて染色し、SOX17陽性細胞の総量およびパーセンテージに関して画像を定量化した。図6Dに示す通り、CHIR処理細胞の91.5%は、SOX17陽性であることが判明し、一方、D'Amour処理細胞の僅か77,6%が、d3にSOX17陽性染色を示した。加えて、CHIR前処理細胞の総量は、D'Amour処理後に観察された数よりも25%高かった。
【０２２２】
qPCRおよびqICCの両方を用いて、chIPS4細胞におけるOCT4発現の減少も解析した。データは、CHIRプロトコールが、mRNAおよびタンパク質レベルの両方におけるOCT4発現低下においてより十分であることを明らかに示す(図5E、図5F)。
【０２２３】
CHIRおよびD'Amourプロトコール間の効率をさらに比較するため、2つのプロトコールのいずれかを用いてDEへと分化したchIPS4細胞を、以前に発表されたPE分化プロトコール(Ameriら、2010)を用いることにより膵臓内胚葉(PE)へとさらに分化させた。PE分化の誘導後7日目に細胞を固定し、PDX1特異抗体を用いたICCにより解析した。結果は、D'Amour処理細胞においてごく僅かなPDX1染色を示し、一方、染色は、CHIR前処理細胞において明らかであった(データ図示せず)。並行して、細胞からmRNAを収集し、PDX1発現をリアルタイムPCRにより解析した。ICC結果と一致して、PDX1 mRNA発現は、D'Amour処理細胞において殆ど見出されなかったが、CHIR分化細胞において明らかな発現が見られた(図5G)。両方の細胞株において実験を2回反復した(図5G、図5H)。
【０２２４】
(実施例7)
タイミング
AA+/-Wnt3a(25ng/ml)d2およびAA d3の添加に先立ち、RPMI(ctrl)、CHIR 3uM、CHIR 3uM+AA 100ng/mlまたは100ng/ml AA+25ng/ml Wnt3a(D'Amour)のいずれかにより細胞を1日間前処理した(Table 3(表3))。CtrlおよびCHIR d3においてB27を添加し、FBSをD'Amour d2〜3に添加した。
【０２２５】
【表３】
2014519832.tif 000004
【０２２６】
データは、CHIR処理後のWnt3aの非存在が、SOX17誘導に負に影響しないことを示す(図6A、図6C)。しかし、CHIR処理後のAA排除は、ブラキュリ発現を維持し(データ図示せず)、DEへのさらなる進行を制限した。
【０２２７】
前処理におけるCHIRに加えたAAの添加は、相加効果を示さなかったが、しかしプロトコール安定性は、DE誘導の観点から高い実験間変動で負に影響された。細胞生存D1における負の効果も、前処理においてCHIRおよびAAを組み合わせた場合に頻繁に見られた(細胞形態D1、図6Dを参照)。D'Amour D1に加えたCHIRの添加も、CHIRで前処理した細胞と比較してSOX17発現D2低下を示した(図6B)。
【０２２８】
CHIR前処理は、DEへの分化1日目におけるWnt3aおよびAA両方の要件を置き換え、より強固なプロトコールをもたらす安定化効果も有する。
【０２２９】
CHIRおよび外因性AAは、全効率を低下させる相殺効果を有し得る、および/または異なる細胞集団を異なるように標的化し、細胞培養物内により高レベルの不均一性をもたらし、実験間可変性を増加させ得る。これは、培地にAAを添加する前のPS誘導/移行が、プロトコール効率および強固さを増強するための重要な新規ステップであることを示唆する。
【０２３０】
(実施例8)
用量依存性
Chirを1〜7uMの間の濃度で滴定し、24時間Chir処理後(D1)および2日間の続くAA処理後(D3)に解析した。CHIR 0,5〜1uMおよびCHIR 7uMは、d3生存しなかった。
【０２３１】
1.24時間処理後、ブラキュリ誘導は、CHIR 3uMにおいて有意に見られたが、1uMにおいては見られなかった(図7A、図7C)。
【０２３２】
2.AA処理後2日目に、ブラキュリ発現の下方調節は、CHIR 1uMにおいて遅延し(図7A)、一方、Sox17発現は、有意により低かった(図7B、図7D)。
【０２３３】
データは、PS形成が、1uMより低いChir濃度において遅延し、AAが添加されるときにDEへとさらに進行できないことを示す。
【０２３４】
(実施例9)
他の細胞培養系におけるCHIR前処理後のDE誘導
CHIR前処理後のOCT4下方調節およびT/SOX17上方調節D3における効果もまた、mTeSR等、他のhESCフィーダーフリー培養系(図8A、Table 4(表4))およびMEFフィーダーにおいて培養したhESC(図9)において、D'Amourプロトコールよりも優れていた。
【０２３５】
【表４】
2014519832.tif 000005
【０２３６】
[参考文献]
2014519832.tif 000006
2014519832.tif 000007
【図１】
2014519832.tif 000008
【図２−１】
2014519832.tif 000009
【図２−２】
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【図３Ａ】
2014519832.tif 000011
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2014519832.tif 000022
2014519832.tif 000023