(57)【要約】  本発明は、一般に、工業微生物学の分野、およびリグノセルロース加水分解物などの五炭糖源からのブタノールの生産に関する。より具体的には、本発明は、キシルロースまたはキシルロース−５−リン酸産生酵素および微好気性または嫌気性条件を使用して、このような糖からのブタノールの生産と、その場生成物回収方法による前記ブタノールの回収とを増大させることに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）ブタノールを産生可能な微生物と、（ｉｉ）五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせと、を含む組成物を提供するステップと；
（ｂ）該組成物を、混合糖を含む炭素基質と接触させるステップと；
（ｃ）酸素利用が制限された条件下で、前記微生物を培養するステップと；
を含むブタノールの生産方法。
【請求項２】
ブタノールがイソブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が酵母である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、組成物中の微生物によって組換えで発現される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、ブタノールを産生可能な微生物によって組換えで発現される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、ブタノールを産生可能な微生物によって産生されない、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、組成物中の微生物によって産生されない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、（ｉ）キシロースイソメラーゼ、（ｉｉ）キシロースレダクターゼ、（ｉｉｉ）キシリトールデヒドロゲナーゼ、（ｉｖ）アラビノースイソメラーゼ、（ｖ）リブロキナーゼ、（ｖｉ）リブロース−リン酸−５−エピメラーゼ、（ｖｉｉ）アラビノースレダクターゼ、（ｖｉｉｉ）アラビトールデヒドロゲナーゼ、（ｉｘ）キシルロースレダクターゼ、（ｘ）キシルロキナーゼ、（ｘｉ）アルドースレダクターゼ、および（ｘｉｉ）これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
キシロースイソメラーゼが酵素番号ＥＣ５．３．１．５を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キシロースレダクターゼが酵素番号ＥＣ１．１．１．９またはＥＣ１．１．１．１０を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
アラビノースイソメラーゼが酵素番号ＥＣ５．３．１．４を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
リブロキナーゼが酵素番号ＥＣ２．７．１．１６を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
リブロース−リン酸−５−エピメラーゼが酵素番号ＥＣ５．１．３．４を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
アラビトールデヒドロゲナーゼが酵素番号ＥＣ１．１．１．１２を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
キシルロキナーゼが酵素番号ＥＣ２．７．１．１７を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
アルドースレダクターゼが酵素番号ＥＣ１．１．１．２１を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
五炭糖源がキシロース源である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
五炭糖源がアラビノース源である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
五炭糖がブタノールへ変換される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
五炭糖源が六炭糖源でもある、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記組成物を六炭糖源と接触させるステップを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
五炭素および六炭糖が少なくとも約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの比率で累積的に消費される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
五炭糖および六炭糖がブタノールへ変換される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
発酵性炭素が少なくとも約２ｇ／ｇｄｃｗ／ｈの比率で累積的に消費される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
五炭糖および六炭糖が消費され、五炭糖の消費率が六炭糖の消費率の少なくとも約１％である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
五炭糖源がリグノセルロース系バイオマスである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記リグノセルロース系バイオマスが、スイッチグラス、古紙、製紙からの汚泥、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、木くず、草、小麦、小麦わら、干し草、大麦、大麦わら、稲わら、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、ならびにこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
リグノセルロース系バイオマスがアンモニアによって前処理される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
五炭糖源が少なくとも約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
五炭糖源が少なくとも約５０ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
五炭糖源が少なくとも約７５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ブタノールを産生可能な微生物が、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ブタノールを産生可能な微生物が、アセト乳酸シンターゼ、ケト酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ブタノールを産生可能な微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ブタノールを産生可能な微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ブタノールを産生可能な微生物がＰＮＹ１５０４である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
培養するステップが、発酵槽内で行われる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
組成物に呼吸抑制剤が添加される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
抑制剤がアンチマイシンＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
組成物および／または五炭糖源が、ブタノールを産生不能な微生物をさらに含み、ブタノールを産生可能な前記微生物が少なくとも１ｇ／ｌに等しい濃度で存在する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ブタノールを産生可能な微生物が、ブタノールを産生不能な微生物の濃度を超える濃度で存在する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ブタノールの比生産量が少なくとも約０．４ｇ／ｇ／ｈである、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
組成物を適切な抽出剤と接触させ、それによりブタノールを回収することができるステップをさらに含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
培養物からブタノールを精製するステップをさらに含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
培養物からのブタノールの精製がオレイルアルコール中での抽出を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法によって得られるブタノール組成物。
【請求項４８】
請求項２〜４７のいずれか一項に記載の方法によって得られるイソブタノール組成物。
【請求項４９】
（ａ）ブタノールを産生可能な微生物と、
（ｂ）五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせと、
（ｃ）五炭糖源と、
（ｄ）発酵培地と
を含む、ブタノールを生産するための組成物。
【請求項５０】
ブタノールがイソブタノールである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
微生物が酵母である、請求項４９または５０に記載の組成物。
【請求項５２】
五炭糖源が六炭糖源でもある、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
六炭糖源をさらに含む、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
五炭糖源が少なくとも約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
五炭糖源が少なくとも約５０ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
五炭糖源が少なくとも約７５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
ブタノールを産生可能な微生物が、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
ブタノールを産生可能な微生物が、アセト乳酸シンターゼ、ケト酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
ブタノールを産生可能な微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む、請求項４９〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
ブタノールを産生可能な微生物がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
呼吸抑制剤をさらに含む、請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
ブタノールを産生しない微生物をさらに含む、請求項４９〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
ブタノールを産生可能な微生物が、少なくとも、ブタノールを産生しない微生物の濃度と等しい濃度で存在する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
組成物がブタノールおよびエタノールを生産することができる、請求項４９〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
組成物が、少なくとも約０．４ｇ／ｇ％の理論収率でブタノールを生産することができる、請求項４９〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
酸素利用が制限された条件下で、請求項４９〜６７のいずれか一項に記載の組成物を培養することによって得られるブタノール組成物。
【請求項６８】
酸素利用が制限された条件下で、請求項４９〜６７のいずれか一項に記載の組成物を培養することによって得られるイソブタノール組成物。
【請求項６９】
リグノセルロース系材料においてブタノール産生微生物を増殖させる方法であって、
（ａ）リグノセルロース系材料を含有する組成物を提供するステップと、
（ｂ）該組成物を、（ｉ）ブタノールを産生可能な微生物、および（ｉｉ）五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせと、接触させるステップと、
（ｃ）酸素利用が制限された条件下で該組成物を維持するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項７０】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、ブタノールを産生可能な微生物によって組換えで発現される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法によって得られるブタノール組成物。
【請求項７２】
請求項７０に記載の方法によって得られるイソブタノール組成物。
【請求項７３】
リグノセルロース系材料を含む組成物において、ブタノールを産生しない微生物の増殖を抑制する方法であって、
（ａ）リグノセルロース系材料を含有する組成物を提供するステップと、
（ｂ）該組成物を、（ｉ）ブタノールを産生可能な微生物、および（ｉｉ）五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせと、接触させるステップと、
（ｃ）酸素利用が制限された条件下で該組成物を維持するステップと、
を含む方法。
【請求項７４】
五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせが、ブタノールを産生可能な微生物によって組換えで発現される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項７３または７４に記載の方法によって得られるブタノール組成物。
【請求項７６】
請求項７３または７４に記載の方法によって得られるイソブタノール組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表への参照
本出願と共に出願されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２０１２０６１５＿ＣＬ５１９４ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、サイズ：１，１６４，８５４バイト、および作成日：２０１２年６月１４日）において電子的に提出された配列表の内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、一般に、工業微生物学の分野およびブタノールの生産に関する。より具体的には、本発明は、五炭糖（リグノセルロース系バイオマスの加水分解物中の五炭糖を含む）をブタノールへ変換するための微生物の使用と、混合糖の存在下での発酵からブタノールを回収するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック工業における原料化学物質として、そして食品および香料産業における食品グレードの抽出剤としての使用を含む、様々な用途を有する重要な工業用化学物質である。従って、ブタノール、および効率的で環境に優しい生産方法に対して高い需要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
微生物による発酵を利用するブタノールの生産は、このような環境に優しい生産方法の１つである。いくつかの原料をこのような発酵産物のために使用することができる。これらの中には、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、バガス、および木くずを含むリグノセルロース系バイオマスの加水分解物が含まれる。しかしながら、リグノセルロース加水分解物は、その発酵のために使用される微生物の増殖および代謝を抑制する化合物、特に、ブタノールを産生することができる微生物の増殖および代謝を抑制する化合物も含有する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、リグノセルロース加水分解物から得ることができる五炭糖をブタノールへ効率的に変換するための方法と、混合糖の存在下での発酵からブタノールを回収するための方法とを提供することによって、このようなリグノセルロース加水分解物からのブタノールの生産を改善する現在の必要性を満足させる。
【０００６】
本発明は、一般に、リグノセルロース加水分解物などの五炭糖および六炭糖の混合源からのブタノールの生産のための方法および組成物と、その場生成物回収方法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）による前記糖からのブタノールの生産の改善とに関する。より具体的には、本発明は、キシルロースまたはキシルロース−５−リン酸産生酵素および微好気性または嫌気性条件を使用して、ブタノールの生産を増大させることに関する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ブタノールを生産するための方法は、（ａ）（ｉ）ブタノールを産生可能な微生物と、（ｉｉ）五炭糖をキシルロースまたはキシルロース−５−リン酸へ変換することができる酵素または酵素の組み合わせとを含む組成物を提供するステップと、（ｂ）組成物を、混合糖を含む炭素基質と接触させるステップと、（ｃ）酸素利用が制限された条件下で微生物を培養するステップとを含み、それによりブタノールが生産される。
【０００８】
本発明の種々の実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列記述（本出願の一部を形成する）からより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】トウモロコシ穂軸加水分解物における増殖。増殖は、製造業者（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用説明書に従ってＰＣＶ管を用い、充填細胞容積（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）によってモニターした。３通りのフラスコの結果が示される。イソブタノロゲン（ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）（ＰＮＹ１５０４、点線）を０．５×ＬＣＨにおいて増殖させた。エタノロゲン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）（実線）を１×ＬＣＨにおいて増殖させた。
【図２】ＰＮＹ１５０４によるグルコースの消費ならびにイソブタノールおよびグリセロールの産生。結果を１４８時間にわたって測定し、ＨＰＬＣを用いて代謝産物を決定した。
【図３】ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄによるグルコースの消費ならびにエタノールおよびグリセロールの産生。結果を１４８時間にわたって測定し、ＨＰＬＣを用いて代謝産物を決定した。
【図４】ＰＮＹ１５０４によるグルコースのイソブタノールへの発酵。アンチマイシンＡの存在（＋ＡＡ、実線）または非存在（−ＡＡ、点線）下における、グルコース消費（Ｇｌｃ）、増殖（バイオマス、充填細胞容積による）、およびイソブタノールの産生（Ｉｓｏ）のプロファイルが示される。
【図５】キシロースイソメラーゼの存在下、ＰＮＹ１５０４によるキシロースのイソブタノールへの発酵。アンチマイシンＡの存在（＋ＡＡ、実線）または非存在（−ＡＡ、点線）下における、キシロース（Ｘｙｌ）およびキシルロース（Ｘｌｓ）の濃度、増殖（バイオマス、充填細胞容積による）、ならびにイソブタノールの産生（Ｉｓｏ）のプロファイルが示される。
【図６】イソブタノールへの発酵中のリグノセルロース加水分解物におけるグルコースおよびキシロースのプロファイル。培養物はアンチマイシンＡにより処理される（実線）か、あるいは未処理（点線）の何れかであり、キシロースイソメラーゼを供給（黒塗り記号）または供給しなかった（白抜き記号）。
【図７】リグノセルロース加水分解物の発酵中に産生されるイソブタノールの有効力価。培養物はアンチマイシンＡにより処理される（実線）か、あるいは未処理（点線）の何れかであり、キシロースイソメラーゼを供給（黒塗り記号）または供給しなかった（白抜き記号）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。
【００１１】
本明細書に開示されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に開示される。材料、方法および実施例は単に例示的であって、限定的であることは意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１２】
本発明をさらに定義するために、以下の用語、略語および定義が提供される。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはこれらの他のあらゆる変化形は、非排他的または非制約的であることが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素だけに限定されるのではなく、明白に記載されていないか、あるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含み得る。さらに、反対する明確な記載がない限り、「または（ｏｒ）」は包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または存在する）。
【００１４】
また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その要素または成分の例、すなわち発生の数に関して非限定的であることが意図される。そのため、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは少なくとも１つを含むように読み取られるべきであり、要素または成分の単数形の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
【００１５】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書で使用される場合、非限定的な用語であり、どれか１つの特定の本発明の実施形態を指すことは意図されず、本出願で開示される全ての可能性のある実施形態を包含する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、使用される原料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物の製造または溶液の使用のために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における不注意な誤差によって、組成物の製造または方法の実行のために使用される原料の製造、供給源、または純度の差異によって、そして同様のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好ましくは、報告される数値の５％以内を意味する。
【００１７】
「バイオマス」は、本明細書で使用される場合、発酵性糖を提供する加水分解性多糖類または炭水化物を含有する天然産物を指し、任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料、ならびにセルロースを含み、そして場合によりさらにヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖、二糖、および／または単糖を含む材料が含まれる。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの付加的な成分を含むこともできる。バイオマスは単一のソースに由来することもできるし、あるいはバイオマスは２つ以上のソースに由来する混合物を含むこともできる。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草茎および葉の混合物を含むことができる。バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材、および林業廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、農作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、ライ麦、小麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、都市廃棄物、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
「ブタノール」は、本明細書で使用される場合特に、ブタノール異性体の１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、イソブタノール（ｉＢｕＯＨ）、および／またはｔｅｒｔ−ブタノール（ｔ−ＢｕＯＨ）を、個々にあるいはこれらの混合物として指す。
【００１９】
「発酵性炭素源」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示される微生物によって代謝されることが可能なバイオマスからの炭素基質を意味する。適切な発酵性炭素源には、単糖（グルコースまたはフルクトース、キシロースおよびアラビノースなど）、二糖（マルトース、ラクトースまたはスクロースなど）、オリゴ糖、多糖類（デンプンまたはセルロースなど）、一炭素基質、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
「原料」は、本明細書で使用される場合、発酵性炭素源を含有する産物を意味する。適切な原料には、ライ麦、小麦、トウモロコシ、茎（ｃａｎｅ）、かいば（ｓｔｏｖｅｒ）、スイッチグラス、バガスおよびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
「発酵ブロス」は、本明細書で使用される場合、水、糖（発酵性炭素源）、溶解固形物、アルコールを産生する微生物、産物アルコール、および発酵容器内に保持される材料の全ての他の成分の混合物を意味し、ここで、産物アルコールは、存在する微生物による糖からアルコール、水および二酸化炭素（ＣＯ２）への反応によって作られている。時々、本明細書で使用されるように、「発酵培地」および「発酵混合物」という用語は、「発酵ブロス」と同義に使用することができる。
【００２２】
「炭素基質」という用語は、本明細書において開示される微生物および細胞によって代謝されることが可能なバイオマスからの炭素源を指す。炭素基質の非限定的な例は本明細書で提供されており、単糖、オリゴ糖、多糖類、エタノール、ラクテート、スクシネート、グリセロール、二酸化炭素、メタノール、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、アラビノース、デキストロース、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
「有効力価」という用語は、本明細書で使用される場合、発酵培地１リットルあたり、発酵によって生産される特定のアルコール（例えば、ブタノール）の総量を指す。
【００２４】
「分離」という用語は、本明細書で使用される場合、「回収」と同義であり、初期混合物から化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度または濃度よりも高純度または高濃度で化合物を得ることを指す。
【００２５】
「水相」という用語は、本明細書で使用される場合、発酵ブロスを水と非混和性の有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。従って、本明細書に記載される発酵抽出を含む方法の実施形態において、「発酵ブロス」という用語は特に、二相発酵抽出の水相を指す。
【００２６】
「有機相」という用語は、本明細書で使用される場合、発酵ブロスを水と非混和性の有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」という用語は単一の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、全長ｃＤＮＡ配列、またはその断片（非翻訳５’および３’配列ならびにコード配列を含む）のヌクレオチド配列を含有することができる。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができ、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでも修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより一般的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００２８】
ポリヌクレオチド配列は、「単離された」（その天然環境から取り出されている）とみなされることもある。例えば、ベクター中に含有される酵素活性（例えば、基質をキシルロースへ変換する能力）を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の純粋な（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。本発明に従う単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成的に生成されるような分子を含む。ＤＮＡのポリマー形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成されてもよい。
【００２９】
「遺伝子」という用語は、特異的タンパク質として発現されることが可能な核酸断片を指し、任意選択的に、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の制御配列が含まれる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「コード領域」という用語は、特異的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は単一の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に結合されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、任意のアミノ酸の鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはアミノ酸の鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用することができる。ポリペプチドは天然の生物学的ソースに由来してもよいし、あるいは組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定される核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。
【００３２】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体、または誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現される組換えで産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドなので、本発明の目的では単離されていると考えられる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「天然」は、存在する場合にはそれ自体の制御配列を有する、天然に見出されるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物または生物のゲノム中のその天然位置にあるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を指す。「内因性ポリヌクレオチド」は、生物のゲノム中のその天然位置にある天然ポリヌクレオチドを含む。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を含む。「内因性ポリペプチド」は、生物中のその天然位置にある天然ポリペプチドを含む。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「異種」は、通常は宿主生物中に見出されないが、宿主生物中に導入されたポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。「異種ポリヌクレオチド」は、対応する天然ポリヌクレオチドとは異なる形態でソース生物中に再導入された天然コード領域またはその一部を含む。「異種遺伝子」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態でソース生物中に再導入された天然コード領域またはその一部を含む。例えば、異種遺伝子は、天然宿主中に再導入された非天然制御領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード領域を含むことができる。「異種ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドとは異なる形態でソース生物中に再導入された天然ポリペプチドを含む。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性の変更をもたらす本明細書に開示されるポリヌクレオチドの変化と、ポリペプチドの活性の変更をもたらす本明細書に開示されるポリペプチドの変化とを指す。このような変化は当該技術分野において周知の方法によって行うことができ、欠失、突然変異（例えば、自然変異誘発、ランダム変異誘発、変異誘発遺伝子によって生じる変異誘発、またはトランスポゾン変異誘発）、置換、挿入、細胞位置の改変、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの状態の改変（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン化）、補因子の除去、化学修飾、共有結合修飾、ＵＶまたはＸ線による照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換法、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾可能であるかの決定におけるガイダンスは、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、酵母または細菌）の配列とを比較し、相同性の高い領域（保存領域）またはコンセンサス配列において成される修飾の数を最大にすることによって見出すことができる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、例えば、変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を用いて作製された、アミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および置換によって、特に列挙される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が対象となる活性を消滅させることなく置換、付加、または欠失され得るかを決定するためのガイドラインは、特定のポリペプチドと、相同ポリペプチド（例えば、酵母または細菌）との配列を比較し、相同性の高い領域（保存領域）において成されるアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることによって、あるいはコンセンサス配列によりアミノ酸を置換することによって見出すことができる。
【００３８】
あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体は、遺伝コードの「冗長性」を用いることによって、合成または選択され得る。種々の制限部位を生じるサイレント変化などの種々のコドン置換を導入して、発現のためのプラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異はポリペプチドまたはポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映され、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾することができる。
【００３９】
アミノ酸「置換」は、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってもよいし、異なる構造および／または化学特性を有するアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、正帯電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み、そして負帯電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における差異を選択することによって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質により構造的または機能的に許容される変異の範囲内であり得る。可能とされる変異は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチド分子においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって、実験的に決定することができる。
【００４０】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの転写を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよいし、さらに、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる宿主細胞型において、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは当業者によって理解される。ほとんどの時点でほとんどの細胞型で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【００４１】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一の核酸断片における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現をもたらすことができる場合、そのコード配列と作動可能に連結される（すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。
【００４２】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００４３】
「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞中の核酸またはタンパク質のレベルの増大を指す。従って、過剰発現は、宿主細胞における内因性配列の転写または翻訳のレベルの増大によって起こり得るか、あるいは宿主細胞への異種配列の導入によって起こり得る。また過剰発現は、核酸またはタンパク質配列の安定性の増大によっても起こり得る。
【００４４】
酵素などの内因性タンパク質の「低減された活性および／または発現」という用語は、タンパク質の低減された比触媒活性（例えば、低減された活性）および／または細胞中のタンパク質の低下された濃度（例えば、低減された発現）のいずれかを意味することができ、酵素などの内因性タンパク質の「削除された活性および／または発現」は、全くないか無視できる程度の酵素の比触媒活性（例えば、削除された活性）および／または全くないか無視できる程度の細胞中の酵素の濃度（例えば、削除された発現）のいずれかを意味することができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、核酸断片の宿主生物への転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【００４６】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意のソースに由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）を含んでもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびコード領域を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。そのために、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【００４８】
種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための遺伝子または核酸分子のコード領域におけるコドンの改変を指す。このような最適化は、その生物の遺伝子中で使用されることがより多い１つまたは複数の同義的なコドンによる、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなりの数のコドンの置換を含む。コドン最適化コード領域は、「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）などのソフトウェアパッケージを含む、当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。
【００４９】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定されるので、６４個の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在し、そのうち６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは翻訳を終了させるシグナルをコードする）。「遺伝コード」は、表１のように本明細書においてどのアミノ酸が再現されるかをどのコドンがコードするかを示す。結果として、多数のアミノ酸が２つ以上のコドンによって設計される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは６つによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ１つのトリプレットによってコードされる。この縮重によって、ＤＮＡ塩基組成は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく広範囲にわたって変化することができる。
【００５０】
【表１】
2014522634.tif 000002
【００５１】
様々な種類の動物、植物および微生物種に対して多数の遺伝子配列が利用可能であれば、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日訪問）で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２８．０［２００２年２月１５日］から計算される酵母のためのコドン使用表は、以下の表のように再現される。この表はｍＲＮＡ命名法を使用するので、ＤＮＡ中に見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、この表では、ＲＮＡ中に見出されるウラシル（Ｕ）が使用される。表２は、頻度が６４個の全てのコドンに対してではなく各アミノ酸に対して計算されるように適合されている。
【００５２】
【表２】
2014522634.tif 000003
【００５３】
【表３】
2014522634.tif 000004
【００５４】
この表または類似の表を用いることによって、当業者は任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが所与の種にとって最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を生じることができる。
【００５５】
コドンを最適化頻度でランダムに割り当てて所与のポリペプチド配列をコード化することは、各アミノ酸のコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって手作業で行うことができる。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムは、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅにおける「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅの折り返し翻訳（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅにおける「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能である。さらに、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日訪問）における「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」機能、およびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（２００２年７月９日訪問）において利用可能な「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能など、種々の資源がコドン最適化コード領域配列にとって公的に入手可能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。
【００５６】
コドン最適化コード領域は、「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）などのソフトウェアパッケージを含む当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。
【００５７】
ポリヌクレオチドまたは核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で核酸断片の一本鎖形態が他の核酸断片にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（参照によって本明細書中に完全に援用される）において例示されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した断片（遠縁の生物からの相同配列など）から、高度に類似した断片（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間の洗浄から始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、そして次に０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましいストリンジェント条件セットはより高温を用い、最終の０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。別の好ましい高ストリンジェント条件セットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃における最終の２回の洗浄を用いる。付加的なストリンジェント条件セットには、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃におけるハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄と、その後の０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が含まれる。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の９．５０〜９．５１を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の１１．７〜１１．８を参照）。一実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【００５９】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０以上の近接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイツハイブリダイゼーション）において、２０〜３０の近接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されてもよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告されるような配列の利益を得て、開示される配列の全てまたは実質的な部分を当業者に既知の目的のためにこれから使用することができる。従って、本発明は、本明細書において提供されるような完全な配列、ならびに上記で定義したこれらの配列の実質的な部分を含む。
【００６０】
「相補的」という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を表すために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。
【００６１】
「同一性パーセント」という用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）、２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）、３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  ＧｒｉｆＦｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）、および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）において開示される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。
【００６２】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムを用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されるアライメント法に相当する「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）によって開示される）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムにおいて見出される「Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法」を用いて実施される。多重アライメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるペアワイズアライメントおよびタンパク質配列の同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法」も利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されるアライメント法に相当し（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ  ｖ６．１プログラムにおいて見出される。多重アライメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００６３】
他の種からのポリペプチドの同定において多数の配列同一性レベルが有用であることは、当業者によって十分に理解されており、このようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する。同一性パーセントの有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５５％〜１００％の任意の整数の百分率が本発明の説明において有用であり得る。適切な核酸断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドもコードする。
【００６４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、１．）ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた任意の値またはパラメータのセットを意味するであろう。
【００６５】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称する）によって、そしてＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）によって、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版）（１９８７）によって記載されている。本明細書で使用される付加的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にある。
【００６６】
本明細書に開示される細胞の遺伝子操作は、標準的な遺伝子技術およびスクリーニングを用いて実施することができ、遺伝子操作に適した任意の細胞において行うことができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）。
【００６７】
五炭糖源
リグノセルロース系バイオマスの加水分解物は、五炭糖および六炭糖の両方を提供するバイオ燃料の生産のために価値のある原料である。しかしながら、これらの加水分解物は、五炭糖を発酵させるために使用される微生物の増殖および代謝に対して抑制的である化合物を含有し得る。従って、五炭糖は、抑制剤活性を改善するために特定の遺伝子修飾およびいくらかの処理を行わなければ容易に使用することができないので、リグノセルロース加水分解物から生産することができるブタノールの量は限られている。しかしながら、本明細書に記載される方法は、ブタノール産生微生物の増殖および代謝と、五炭糖の発酵とを可能にすることによって、このようなリグノセルロース加水分解物からのブタノールの収量を増大させる方法を提供する。
【００６８】
バイオマスは任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含み、そして場合により、さらにヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖を含む材料が含まれる。またバイオマスは、タンパク質および／または脂質などの付加的な成分を含むこともできる。バイオマスは単一のソースに由来することもできるし、あるいはバイオマスは２つ以上のソースに由来する混合物を含むこともでき、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草および葉の混合物を含むことができる。バイオマスは、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物を含むが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、リュウゼツラン（ａｇａｖｅ）、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
発酵性糖は、例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許第７，７８１，１９１号明細書に記載されるように、前処理および糖化のプロセスを通して、このようなセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスから得ることができる。例として、バイオマスの乾燥重量に対して低濃度のアンモニアで比較的高濃度のバイオマスを前処理することができる。前処理の後、バイオマスは糖化酵素コンソーシアムにより処理されて、発酵性糖を生成することができる。従って、前処理は、ａ）バイオマスを、アンモニアを含む水溶液と接触させて、バイオマス−アンモニア水混合物を形成する（ここで、アンモニアは少なくとも、バイオマス−アンモニア水混合物のアルカリ性ｐＨを維持するのに十分な濃度で存在するが、前記アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約１２重量パーセント未満で存在し、そしてさらに、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−アンモニア水混合物の重量に対して少なくとも約１５重量パーセントの高固形物濃度である）ステップと、ｂ）ステップ（ａ）の生成物を適切な条件下で糖化酵素コンソーシアムと接触させて、発酵性糖を生成するステップとを含むことができる。
【００７０】
リグノセルロース加水分解物および他の五炭糖源は五炭糖を提供することができ、そして六炭糖または発酵に適した他の炭素基質と組み合わせて五炭糖を提供することができる。いくつかの実施形態では、五炭糖はキシロースである。いくつかの実施形態では、五炭糖はアラビノースである。いくつかの実施形態では、五炭糖は、キシロースおよびアラビノースの両方を含む。また五炭糖源は、他の炭素基質、例えば、単糖、多糖類、一炭素基質、二炭素基質、および他の炭素基質を含むこともできる。従って、本発明において用いられる炭素源は、五炭糖に加えて炭素基をいくらでも包含可能であると考えられる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、リグノセルロース加水分解物は、特定の濃度で発酵のための組成物中に存在する。例えば、いくつかの実施形では、リグノセルロース加水分解物は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、または２００ｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、リグノセルロース加水分解物は、約５〜５００ｇ／Ｌ、約５〜４００ｇ／Ｌ、約５〜３００ｇ／Ｌ、約５〜２００ｇ／Ｌ、または約５〜１５０ｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、リグノセルロース加水分解物は、約２５〜５００ｇ／Ｌ、約２５〜４００ｇ／Ｌ、約２５〜３００ｇ／Ｌ、約２５〜２００ｇ／Ｌ、または約２５〜１５０ｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、リグノセルロース加水分解物は、約５０〜５００ｇ／Ｌ、約５０〜４００ｇ／Ｌ、約５０〜３００ｇ／Ｌ、約５０〜２００ｇ／Ｌ、または約５０〜１５０ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００７２】
さらに、いくつかの実施形では、リグノセルロース加水分解物は、特定の速度で消費される。従って、いくつかの実施形では、トウモロコシの場合のように６ｇ／ｌの細胞質量、およびわらの場合の２０％のＴＳレベルを仮定すると、０．４４ｇ／ｌ・ｈまたは１時間に細胞１ｇ当たり０．０７ｇのＣ５の比速度で、Ｃ５の消費が得られる。
【００７３】
特に、五炭糖は、特定の速度でリグノセルロース加水分解物から消費され得る。
【００７４】
五炭糖源からのキシルロースの生産
本明細書に記載される方法に従って使用することができる微生物は、ペントースリン酸経路によりキシルロースを発酵させることができる。しかしながら、リグノセルロース加水分解物などの多くの五炭糖源は、微生物が直接発酵することができないキシルロース以外の五炭糖を含有し得る。従って、本明細書に記載される方法は、他の五炭糖をＤ−キシルロースおよび／またはＤ−キシルロース−５−Ｐへ変換することができる酵素を提供する。例えば、キシロースまたはアラビノースをキシルロースへ変換することができる酵素は当業者に知られている。例として、キシロースイソメラーゼはキシロースをＤ−キシルロースへ変換することができ、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼはキシロースをＤ−キシルロースへ変換することができ、アラビノースレダクターゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースレダクターゼ、およびキシリトールデヒドロゲナーゼはアラビノースをＤ−キシルロースへ変換することができ、アラビノースイソメラーゼ、リブロキナーゼ、およびリブロース−リン酸−５−エピメラーゼはアラビノースをＤ−キシルロース−５−Ｐへ変換することができる。加えて、アルジトールをアルドースへ変換することができるアルドースレダクターゼは、アラビノースおよびキシロースからＤ−キシルロース５−Ｐへの変換において有用である。
【００７５】
他の五炭糖をキシルロースへ変換することができる酵素（単数または複数）は、外因性ソースから提供することもできるし、あるいは発酵組成物中の組換え微生物によって産生させることもできる。
【００７６】
例えば、キシルロース産生酵素は、当業者に既知の任意の手段（自然産生、組換え産生および化学合成を含む）によって生産することができ、キシルロース産生酵素を含む組成物は、五炭糖を発酵させるためにブタノール産生微生物に添加することができる。キシロースイソメラーゼなどのキシルロース産生酵素は商業的な供給源から購入することができ、例えば「Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ」はＮｏｖｏｚｙｍｅによって生産される。
【００７７】
付加的に、および／または代替的に、キシルロース産生および／またはキシルロース−５−Ｐ産生酵素を発現する細胞および／または微生物は、五炭糖を発酵させるためにブタノール産生生物に添加することができる。細胞および／または微生物は、内因的に五炭糖をキシルロースおよび／またはキシルロース−５−Ｐへ変換する細胞および／または微生物であってもよいし、キシルロース産生および／またはキシルロース−５−Ｐ産生酵素を組換えで産生するように操作された細胞および／または微生物であってもよい。付加的に、および／または代替的に、ブタノール産生微生物は、キシルロース産生および／またはＤ−キシルロース−５−Ｐ産生酵素を組換えで産生するように操作することもできる。さらに、本発明の宿主細胞において、非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低減する遺伝子修飾と組み合わせられたＬ−アラビノースの利用を提供するａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素の発現は、ペントース−リン酸経路（ＰＰＰ）におけるＬ−アラビノースの効率的な利用を提供する。例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許第７，３５４，７５５号明細書を参照されたい。非特異的なアルドースレダクターゼ活性の低減をもたらす遺伝子修飾は、ペントースリン酸経路のフラックスを増大させる修飾のいずれか、および／または本明細書に記載される宿主細胞中の特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる修飾のいずれかと組み合わせられてもよい。従って、非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低減する付加的な遺伝子修飾を含むａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを発現する宿主細胞は特に本発明に包含される。ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現する遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来し得る。宿主細胞が酵母株である場合、特定の実施形態では、酵母株は、ＧＡＬ２、ＫｍＬＡＴ１およびＰｇＬＡＴ２からなる群から選択される少なくとも１つのアラビノーストランスポーター遺伝子を含む。高い親和性を有するＬ−アラビノーストランスポーターはそれぞれ、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）（カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）としても知られている）から供給され得る。クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）は両方とも、Ｌ−アラビノースの効率的な利用者であると考えることができ、それにより、これらはＬ−アラビノーストランスポーター遺伝子をクローニングするためのソースであるとされる。特定の実施形態では、酵母株はさらに、ＧＡＬ２にコードされたガラクトースパーミアーゼを過剰発現し得る。また、参照によって本明細書中に援用される米国特許第５，５１４，５８３号明細書も参照されたい。その他のキシロース利用菌株には、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６，５６６，１０７号明細書��、８ｂ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書、Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）が含まれ、これらは、キシロースおよびグルコースを含む混合糖からのブタノール生産のために修飾され得る。
【００７８】
従って、ブタノールの生産を改善するために、キシルロースおよび／またはキシルロース−５−Ｐを産生することができる酵素を発現するように微生物を操作することができる。宿主細胞中のキシルロース−および／またはキシルロース−５−Ｐ産生酵素の全体的な活性は、異種核酸および／またはタンパク質配列の導入によって、あるいは内因性核酸および／またはタンパク質配列の突然変異によって増大させることができる。異種キシルロース産生および／またはキシルロース−５−Ｐ産生酵素遺伝子またはタンパク質が宿主細胞内に導入される場合、宿主細胞の酵素活性は、異種核酸またはタンパク質が存在しない場合の酵素活性と比べて増大される。内因性核酸またはタンパク質が宿主細胞内で突然変異される場合、宿主細胞内の酵素活性は、突然変異が存在しない場合の酵素活性と比べて増大される。いくつかの実施形態では、細胞内のキシルロースおよび／またはキシルロース−５−Ｐの産生速度は、野生型酵母株と比べて増大される。
【００７９】
キシルロース−および／またはＤ−キシルロース−５−Ｐ産生酵素は、宿主株において個々にあるいは組み合わせて過剰発現され得る。いくつかの実施形態では、キシロースイソメラーゼが過剰発現される。いくつかの実施形態では、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼが過剰発現される。いくつかの実施形態では、アラビノースからキシルロースおよび／またはキシルロース−５−Ｐを産生する酵素が過剰発現される。いくつかの実施形態では、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、およびキシリトールデヒドロゲナーゼが過剰発現される。いくつかの実施形態では、キシロースをキシルロースへ変換する酵素と、アラビノースをキシルロースおよび／またはキシルロース−５−Ｐへ変換する酵素との両方が過剰発現される。
【００８０】
キシルロース産生および／またはキシルロース−５−Ｐ産生酵素の組換え宿主細胞への導入は、ブタノールの生産を増大させることができる。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、所望の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術を用いて細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、例えば、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、またはキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入は、改善されたイソブタノール濃度と、増大されたイソブタノールの比生産速度とをもたらす。
【００８１】
キシルロース産生酵素を発現する微生物の製造方法は当該技術分野において知られている。例えば、参照によってその全体が本明細書に援用される国際公開第２００９／１０９６３０号パンフレットには、キシロースイソメラーゼを発現するペントース−糖発酵細胞の生産が示される。本明細書に開示される宿主細胞において発現され得るキシルロース産生および／またはキシルロース−５−Ｐ産生酵素遺伝子およびポリペプチドの付加的な例としては、以下の表３に示されるものが挙げられるがこれらに限定されず、参照によって本明細書中に援用される添付の表において配列が提供される。キシロースイソメラーゼ酵素およびこのようなポリペプチドのソース生物の例は、米国特許出願公開第２０１１０３１８８０１Ａ１号明細書において開示されている。キシロースイソメラーゼおよびソース生物の例としては、以下の表４および５に示されるもの（例えば、配列番号８９〜３９４）、ならびに配列番号７４、７５、および３９５〜３９９が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
【表４】
2014522634.tif 000005
【００８３】
【表５】
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【００８４】
【表６】
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【００８５】
【表７】
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【００８６】
【表８】
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【００８７】
【表９】
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【００８８】
【表１０】
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【００８９】
【表１１】
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【００９０】
【表１２】
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【００９１】
【表１３】
2014522634.tif 000014
【００９２】
【表１４】
2014522634.tif 000015
【００９３】
【表１５】
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【００９４】
【表１６】
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【００９５】
【表１７】
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【００９６】
【表１８】
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【００９７】
【表１９】
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【００９８】
【表２０】
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【００９９】
【表２１】
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【０１００】
【表２２】
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【０１０１】
【表２３】
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【０１０２】
【表２４】
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【０１０３】
【表２５】
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【０１０４】
【表２６】
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【０１０５】
【表２７】
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【０１０６】
【表２８】
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【０１０７】
【表２９】
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【０１０８】
【表３０】
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【０１０９】
【表３１】
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【０１１０】
【表３２】
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【０１１１】
【表３３】
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【０１１２】
配列番号３９５は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のためにコドン最適化されたアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｎｅｓｉｓ）キシロースイソメラーゼのコード領域である。
【０１１３】
配列番号３９６は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のためにコドン最適化されたラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）キシロースイソメラーゼのコード領域である。
【０１１４】
配列番号３９７は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ためにコドン最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのコード領域である。
【０１１５】
配列番号３９８は、ゲオデルマトフィラス・オブスキュラス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｂｓｃｕｒｕｓ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コード領域のヌクレオチド配列である。
【０１１６】
配列番号３９９は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コード領域のヌクレオチド配列である。
【０１１７】
配列番号７４は、サリニスポラ・アレニコーラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コード領域のヌクレオチド配列である。
【０１１８】
配列番号７５は、キシラニモナス・セルロシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コード領域のヌクレオチド配列である。
【０１１９】
本明細書において使用可能なポリヌクレオチドおよびポリペプチドのその他の例には、表３、４または５の配列のいずれか１つに対して少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（ここで、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子は酵素活性をコードする、あるいはこのようなポリペプチドは酵素活性を有する）が含まれるが、これらに限定されない。記載される異性化および発酵方法において使用可能なポリヌクレオチドおよびポリペプチドのさらにその他の例には、表３、４、または５の配列のいずれか１つの活性な変異体、断片または誘導体（ここで、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子は酵素活性をコードする、あるいはこのようなポリペプチドは酵素活性を有する）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
実施形態において、その他のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの配列は、本明細書中で開示され、当該技術分野において利用可能な配列を用いて、文献において、そして当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。例えば、このような配列は、既知の酵素をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を用いて公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定することができる。このような方法では、同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくことができる。
【０１２１】
さらに、本明細書に開示されるかあるいは当該技術分野において既知のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、天然の他の相同体を同定するために使用することができる。例えば、本明細書に開示される核酸およびその断片のそれぞれは、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用することができる。配列依存性プロトコールを用いる相同遺伝子の単離は当該技術分野においてよく知られている。配列依存性プロトコールの例としては、（１）核酸ハイブリダイゼーション法、（２）核酸増幅技術の種々の使用により例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，６８３，２０２号明細書、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５）、またはストランド置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］、および（３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
組換え宿主細胞（酵母細胞を含むが、これに限定されない）における遺伝子発現のための方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照）。エピソームプラスミドおよび組込まれたポリヌクレオチドによる遺伝子発現のための方法はいずれも本明細書に記載される方法に適合する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、発現される酵素のコード領域は、当業者によく知られているように、標的宿主細胞のためにコドン最適化され得る、組換え宿主細胞（酵母細胞を含むが、これに限定されない）における遺伝子の発現は、対象のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写ターミネーターを必要とし得る。遺伝子のための発現カセットの構築においていくつかのプロモーターを使用することができ、酵母中での使用に適した以下の構成的プロモーター：ＦＢＡ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、およびＧＰＭ１、ならびに酵母中での使用に適した以下の誘導性プロモーター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＣＵＰ１が含まれるが、これらに限定されない。発現のためのキメラ遺伝子構築物において使用可能な適切な転写ターミネーターには、ＦＢＡ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、およびＡＤＨ１ｔが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
組換えポリヌクレオチドは、通常、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび終結調節領域を含む、形質転換のために使用されるキメラ遺伝子の一部としてのコード配列を用いて、発現のためにクローン化される。コード領域は形質転換のための宿主細胞に由来し、タンパク質をコードする天然遺伝子に対して天然ではない制御配列と結合され得る。あるいは、コード領域は別の宿主細胞に由来し得る。
【０１２５】
様々な宿主細胞の形質転換に有用なベクターは一般的であり、文献に記載されている。通常、ベクターは、所望の宿主における自己複製または染色体の組込みを可能にする選択可能なマーカーおよび配列を含有する。さらに、適切なベクターは、転写開始調節および転写終結調節領域（これらの間に、コード領域ＤＮＡ断片が挿入され得る）を有するプロモーター領域を含み、挿入されたコード領域の発現を提供することができる。調節領域は両方とも形質転換宿主細胞に相同の遺伝子に由来することができるが、このような調節領域が、産生宿主として選択される特定の種に天然でない遺伝子に由来することもできることは理解されるべきである。
【０１２６】
実施形態において、適切なプロモーター、転写ターミネーター、および酵素コード領域は大腸菌−酵母シャトルベクターにクローン化され、酵母細胞に形質転換され得る。このようなベクターは、大腸菌および酵母菌株の両方における株の伝播を可能にし、所望の宿主における自己複製または染色体の組込みを可能にする選択可能なマーカーおよび配列を含有することができる。酵母において通常使用されるプラスミドには、大腸菌複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２ミクロン複製開始点、および栄養選択のためのマーカーを含有するシャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）が含まれるがこれらに限定されない。これらの４つのベクターのための選択マーカーは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。
【０１２７】
実施形態において、記載される酵素をコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、酵母におけるギャップ修復組換え方法によって実施することができる。ギャップ修復クローニングアプローチは、酵母における高効率の相同組換え系を利用する。実施形態において、酵母ベクターＤＮＡは消化され（例えば、その多重クローニング部位において）、その配列内に「ギャップ」を形成する。５’端部および３’端部の両方に約２１ｂｐの配列を含有する、対象となる多数の挿入ＤＮＡが生成され、互いに、そしてベクターＤＮＡの５’末端および３’末端と順次オーバーラップされる。例えば、「遺伝子Ｘ」の酵母発現ベクターを構築するために、酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターが発現カセットのために選択される。プロモーターおよびターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、遺伝子Ｘはそのソース生物からＰＣＲ増幅されるか、あるいは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られる。直線化ベクターの５’端部とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、およびターミネーターと直線化ベクターの３’端部との間には、少なくとも、２１ｂｐのオーバーラップ配列が存在する。次に「ギャップ化」ベクターおよび挿入ＤＮＡは酵母菌株に同時形質転換され、プラスミドにおける栄養選択マーカーの相補性を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。正しい挿入の組み合わせの存在は、選択された細胞から作製されるプラスミドＤＮＡを用いるＰＣＲマッピングによって確認することができる。次に、酵母から単離されるプラスミドＤＮＡ（通常は低濃度）は大腸菌株、例えばＴＯＰ１０に形質転換された後、プラスミド構築物をさらに検証するためにミニプレップおよび制限マッピングが行われる。最後に、構築物はＤＮＡ配列分析によって検証され得る。
【０１２８】
ギャップ修復技術のように、酵母ゲノムへの組込みも酵母における相同組換えシステムを利用する。実施形態において、コード領域プラス調節要素（プロモーターおよびターミネーター）ならびに栄養要求性マーカーを含有するカセットは、カセットとハイブリッド形成すると共に、挿入が所望されるゲノム区域の遺伝子座５’および３’に対して４０〜７０塩基対の配列相同性を含有するプライマーを用いて、高忠実度のＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ増幅される。次に、ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター構築物は、プラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ  ＰＣＲによって、あるいは一般的な制限消化およびクローニングによって、独立栄養マーカー（ＵＲＡ３など）に結合される。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含有する全カセットは、酵母染色体上の位置「Ｙ」の領域５’および３’に対して４０〜７０ｂｐの相同性を含有するプライマー配列によりＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシル欠乏増殖培地において選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲまたは染色体ＤＮＡの直接配列決定のいずれによって検証され得る。
【０１２９】
本明細書に開示される組換え宿主細胞におけるキシルロース産生酵素活性（例えば、キシロースイソメラーゼ、キシルロースキナーゼなど）の存在は、当該技術分野において既知の方法を用いて確認することができる。非限定的な例において、形質転換体は、酵素のためのプライマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングすることができる。別の非限定的な例では、酵素活性は、内因的に酵素活性が欠けている本明細書に開示される組換え宿主細胞においてアッセイすることができる。例えば、酵素活性を有するポリペプチドは、キシロースまたはアラビノースをキシルロースへ変換することができる。別の非限定的な例では、酵素活性は、例えばイソブタノール産生を含む、酵素活性を必要とする経路において下流の産物をアッセイするなどのより間接的な方法によって確認することができる。
【０１３０】
代謝工学によるキシルロースの生産の改善は、外因性酵素の非存在下での発酵によるイソブタノールの生産を可能にするであろう。従って、五炭糖からブタノールへの発酵は、外因性酵素の添加によって、酵素の組換え発現によって、またはその両方によって改善することができる。キシルロースの生産が改善されると、五炭糖からイソブタノールを生産する効力が増大される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、基質をキシルロースへ変換する酵素の使用は、特定のキシロース：キシルロース平衡をもたらす。例えば、いくつかの実施形では、平衡は、約５キシロース：１キシルロースである。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、酵素は、少なくとも約０．１ｇ／時間、少なくとも約０．２５ｇ／時間、少なくとも約０．５ｇ／時間、または少なくとも約１ｇ／時間の速度で、基質をキシルロースへ変換するために十分な量で存在する。
【０１３３】
基質をキシルロースへ変換する酵素の使用は、ブタノールの生産の増大を可能にする。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、このようは酵素の使用は五炭糖の消費の増大をもたらす。五炭糖の消費速度は、当該技術分野において既知の任意の手段を用いて測定することができる。六炭糖も消費される特定の実施形態では、五炭糖の消費速度は、六炭糖の消費速度の少なくとも約０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％であり得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ブタノールを産生可能な微生物は遺伝的に安定している。染色体異常およびプラスミド損失は、遺伝的に安定した微生物では最小限にされる。いくつかの実施形態では、ブタノールを産生可能な微生物は、工業的に関連している培地において増殖される場合に遺伝的に安定している。いくつかの実施形態では、ブタノールを産生可能な微生物は、ミネラル培地において増殖される場合に遺伝的に安定している。いくつかの実施形態では、ブタノールを産生可能な微生物は、限定培地において増殖される場合に遺伝的に安定している。いくつかの実施形態では、ブタノールを産生可能な微生物は、長期間の連続培養にわたって遺伝的に安定している。
【０１３６】
異性化および発酵
ブタノール産生微生物は、ブタノール産生を可能にする任意の条件下で培養することができる。特に、エアレーションの存在下での微生物の増殖と、その後の呼吸の非存在下における発酵により、ブタノール産生（嫌気性または微好気性発酵）が増大されることが観察された。
【０１３７】
呼吸は、当該技術において既知の任意の手段を用いて測定することができる。例として、呼吸は、ＡＴＰ産生、二酸化炭素産生、および／または酸素使用によってアッセイすることができる。呼吸は、当該技術において既知の任意の手段によって抑制することができる。例えば、呼吸抑制剤を発酵組成物に添加することができる。適切な呼吸抑制剤は、例として、アンチマイシンＡ、シアニド、アジド、オリゴマイシン、およびロテノンを含む。
【０１３８】
抑制剤は、呼吸を減少または制限する任意の濃度で存在することができる。いくつかの実施形態では、抑制剤は約０．１〜約１０μＭの濃度で存在する。例えば、抑制剤の濃度は、約０．１〜約５μＭ、約０．１〜約４μＭ、約０．１〜約３μＭ、約０．１〜約２μＭ、約０．１〜約１．５μＭ、または約０．１〜約１μＭであり得る。また抑制剤の濃度は、約０．５〜約１０μＭ、約０．５〜約５μＭ、約０．５〜約３μＭ、約０．５〜約２μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．５〜約１μＭであり得る。また抑制剤の濃度は約１μＭであり得る。
【０１３９】
抑制剤は、抑制剤が存在しない同一条件下での呼吸レベルの約１％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、または７５％以下であるレベルまで呼吸を低下させるのに十分な濃度で存在することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、呼吸抑制剤はアンチマイシンＡである。いくつかの実施形態では、アンチマイシンＡは、約０．１〜約１０μＭの濃度で存在する。例えば、アンチマイシンＡの濃度は、約０．１〜約５μＭ、約０．１〜約４μＭ、約０．１〜約３μＭ、約０．１〜約２μＭ、約０．１〜約１．５μＭ、または約０．１〜約１μＭであり得る。またアンチマイシンＡの濃度は、約０．５〜約１０μＭ、約０．５〜約５μＭ、約０．５〜約３μＭ、約０．５〜約２μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．５〜約１μＭであり得る。またアンチマイシンＡの濃度は約１μＭであり得る。
【０１４１】
アンチマイシンＡは、アンチマイシンＡが存在しない同一条件下での呼吸レベルの約１％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、または７５％以下であるレベルまで呼吸を低下させるのに十分な濃度で存在することができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、培養条件は、抑制剤の非存在下で呼吸がなくても発酵が生じるようなものである。例えば、微好気性または嫌気性条件下、発酵槽内で細胞を培養することができる。
【０１４３】
ブタノールの生産を最大にするその他の条件も提供され得る。
【０１４４】
通常、微生物は約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で増殖される。五炭糖からキシルロースへの変換（異性化）および発酵は、同じまたは異なる温度で実施することができる。例えば、五炭糖からキシルロースへの変換のために約４０℃の温度を使用することができ、キシルロースからブタノールへの発酵のために約３０℃の温度を使用することができる。さらに、五炭糖からキシルロースへの変換およびキシルロースからブタノールへの発酵の両方のために、約３０℃〜約４０℃、約３１℃〜約３９℃、約３２℃〜約３８℃、約３２℃〜約３７℃、約３３℃〜約３６℃、または約３３℃〜約３５℃の温度を使用することができる。さらに、五炭糖からキシルロースへの変換およびキシルロースからブタノールへの発酵の両方のために約３２℃〜約３６℃、約３２℃〜約３５℃、約３２℃〜約３４℃、約３３℃〜約３６℃、約３３℃〜約３５℃、または約３３℃〜約３４℃の温度を使用することができる。さらに、五炭糖からキシルロースへの変換およびキシルロースからブタノールへの発酵の両方のために、約３２℃〜約３６℃、約３３℃〜約３６℃、約３４℃〜約３６℃、約３３℃〜約３５℃、約３３℃〜約３５℃、または約３４℃〜約３５℃の温度を使用することができる。いくつかの実施形態では、五炭糖をキシルロースへ変換し、キシルロースをブタノールへ発酵させるために、約３３℃〜約３５℃の温度または約３４℃の温度が使用される。
【０１４５】
微生物のために適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０である。五炭糖からキシルロースへの変換（異性化）および発酵は、同じまたは異なるｐＨで実施することができる。いくつかの実施形態では、異性化は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、または約７．０のｐＨで生じる。いくつかの実施形態では、発酵は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ６．０、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ５．０のｐＨで生じる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、異性化および発酵は、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、または約ｐＨ６．０のｐＨで生じる。いくつかの実施形態では、異性化および発酵は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０、または約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０のｐＨで生じる。いくつかの実施形態では、異性化および発酵は、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ６．０であるｐＨで生じる。いくつかの実施形態では、異性化および発酵は、約ｐＨ６．０であるｐＨで生じる。
【０１４７】
加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ならびに培養物の増殖および本明細書に記載される酵素経路の促進のために適切な当業者に知られている他の成分を含有しなければならない。使用可能な培地の非限定的な例としては、酵母抽出物−ペプトン、限定ミネラル培地、酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、合成完全（ＳＣ）、Ｍ１２２Ｃ、ＭＯＰＳ、ＳＯＢ、ＴＳＹ、ＹＭＧ、ＹＰＤ、２ＸＹＴ、ＬＢ、Ｍ１７、またはＭ９最小培地が挙げられる。使用可能な培地のその他の例としては、リン酸カリウムおよび／またはリン酸ナトリウムを含有する溶液が挙げられる。適切な培地には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが補充され得る。本発明におけるその他の適切な増殖培地は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス、または酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、およびデキストロース（炭素／エネルギー源として）を含むブロス、またはほとんどのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンドであるＹＰＤ培地などの、一般的な商業的に調製される培地である。その他の限定または合成培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のために適切な培地は、微生物学または発酵科学分野における当業者によって分かるであろう。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、発酵培地は酵母抽出物を含有しない。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、抗生物質が含まれる。例えば、キシルロース産生酵素の外因性ソースを使用する方法では、細菌汚染物質が導入され得る。例えば、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧまたはペニシリンＶ）、テトラサイクリン、またはセファロスポリン（例えば、セファロスポリンＣ）、ヴァージニアマイシン、およびクロラムフェニコールなどの抗生物質を使用することができる。いくつかの実施形態では、抗生物質は、細菌の増殖を抑制するために十分な量で存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質は、酵母の増殖に影響を与えない量で存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０μｇ／Ｌの濃度で存在する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１４０時間、少なくとも約１６０時間、少なくとも約１８０時間、または少なくとも約２００時間培養される。
【０１５１】
イソブタノール、または他の産物の生産はバッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、任意の既知の発酵モードが適切であり得ると考えられる。さらに、細胞は全細胞触媒として基質上またはマトリックス中に固定化されて、イソブタノールの生産のための発酵条件にさらされ得ると考えられる。
【０１５２】
イソブタノールの生産
五炭糖を用いるブタノールの生産のための方法が本明細書において記載されている。いくつかの実施形態では、ブタノールはイソブタノールである。
【０１５３】
例えば、ブタノールは、（ａ）ブタノールを産生可能な微生物と、基質をキシルロースへ変換することができる酵素または酵素の組み合わせとを含む組成物を提供するステップと、（ｂ）組成物を五炭糖源と接触させるステップと、（ｃ）酵母呼吸を制限する条件下で酵母を培養するステップとによって、五炭糖から生産することができる。
【０１５４】
従って、五炭糖からブタノールを生産するための組成物も提供される。組成物は、（ａ）ブタノールを産生可能な酵母と、（ｂ）五炭糖をキシルロースへ変換することができる酵素または酵素の組み合わせと、（ｃ）五炭糖源と、（ｄ）発酵培地とを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ブタノールまたはイソブタノールは、特定の収率または速度で生産される。
【０１５６】
従って、イソブタノールの比生産速度は、少なくとも約０．１０ｇ／ｇ／ｈ（１時間につき乾燥細胞重量１グラムあたりのイソブタノールのグラム数）、少なくとも約０．１１ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１２ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１３ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１４ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１５ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１６ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１７ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１８ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．１９ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．２０ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．２５ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．３０ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．３５ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．４０ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．４５ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．５０ｇ／ｇ／ｈ、少なくとも約０．７５ｇ／ｇ／ｈｒ、または少なくとも約１．０ｇ／ｇ／ｈｒであり得る。またイソブタノールの比生産速度は、約０．０５ｇ／ｇ／ｈ〜約１．０ｇ／ｇ／ｈ、約０．０５ｇ／ｇ／ｈ〜約０．７５ｇ／ｇ／ｈ、または約０．０５ｇ／ｇ／ｈ〜約０．５０ｇ／ｇ／ｈであり得る。またイソブタノールの比生産速度は、約０．１０ｇ／ｇ／ｈ〜約１．０ｇ／ｇ／ｈ、約０．１０ｇ／ｇ／ｈ〜約０．７５ｇ／ｇ／ｈ、または約０．１０〜約０．５０ｇ／ｇ／ｈであり得る。またイソブタノールの比生産速度は、約０．１５ｇ／ｇ／ｈ〜約１．０ｇ／ｇ／ｈ、約０．１５ｇ／ｇ／ｈ〜約０．７５ｇ／ｇ／ｈ、または約０．１５ｇ／ｇ／ｈ〜約０．５ｇ／ｇ／ｈであり得る。
【０１５７】
特定の実施形態では、生産は、理論値の約１０％を超える収率、理論値の約２０％を超える収率、理論値の約２５％を超える収率、理論値の約３０％を超える収率、理論値の約４０％を超える収率、理論値の約５０％を超える収率、理論値の約６０％を超える収率、理論値の約７０％を超える収率、理論値の約７５％を超える収率、理論値の約８０％を超える収率、理論値の約８５％を超える収率、理論値の約９０％を超える収率、理論値の約９５％を超える収率、理論値の約９６％を超える収率、理論値の約９７％を超える収率、理論値の約９８％を超える収率、理論値の約９９％を超える収率、または理論値の約１００％の収率を提供する。
【０１５８】
イソブタノールおよびエタノールの両方が生産される特定の実施形態では、イソブタノールの生産速度はである可能性があり、イソブタノールの速度はエタノール生産の存在下では低下するであろう。
【０１５９】
微生物
本明細書に記載される方法によると、ブタノールを産生可能な微生物はどれも使用することができる。例えば、いくつかの実施形では、微生物は、ブタノールを産生可能な酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属の一員である。さらに別の態様では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【０１６０】
微生物は、ブタノールを産生できるように遺伝的に改変することができる。イソブタノールの生産のための使用され得る生合成経路には、参照によって本明細書中に援用される米国特許第７，９９３，８８９号明細書に記載されるものが含まれる。例えば、ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、または（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、ケト酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６１】
ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、（ｅ）バリンからイソブチルアミンへの変換、（ｆ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換、（ｇ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、（ｅ）バリンからイソブチルアミンへの変換、（ｆ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換、（ｇ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼ、オメガトランスアミナーゼ、および／または分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６２】
ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｅ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｅ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、アセリル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および／または分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６３】
ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｂ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｃ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｂ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、および（ｃ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、参照によって本明細書中に援用される米国特許第７，９９３，８８９号明細書からの図１のステップｋ、ｅ、およびｇに記載されるように、微生物は、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、アセリル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および／または分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６４】
１−ブタノールの生産のための使用され得る生合成経路には、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書に記載されるものが含まれる。ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換、（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換、および（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換、（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換、（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換、および（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６５】
２−ブタノールの生産のための使用され得る生合成経路には、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが含まれる。ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換、（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸への変換、（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへの変換、および（ｆ）２−ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換、（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸への変換、（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへの変換、および（ｆ）２−ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニン（ａｃｅｔｏｎｉｎ）アミナーゼ、アミノブタノールキナーゼ、アミノブタノールリン酸ホスホリラーゼ、および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６６】
ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換、および（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換、および（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジアール（ｄｉａｌ）デヒドラターゼ、および／またはブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６７】
２−ブタノンの生産のための使用され得る生合成経路には、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが含まれる。ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換、（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸への変換、および（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換、（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸への変換、および（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトニン（ａｃｅｔｏｎｉｎ）アミナーゼ、アミノブタノールキナーゼ、および／またはアミノブタノールリン酸ホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６８】
ブタノールを産生可能な微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、および（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物は、（ａ）ピルベートからアルファ−アセトラクテートへの変換、（ｂ）アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換、（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、および（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物は、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、および／またはジアール（ｄｉａｌ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６９】
加えて、いくつかの実施形では、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、例として、Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない。グルコース抑制を低減する効果を有する遺伝子修飾（ここで、酵母産生宿主細胞はｐｄｃ−である）は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載されている。
【０１７０】
本明細書において提供されるブタノール生合成経路を含む微生物がさらに、１つまたは複数の付加的な修飾を含み得ることは認識されるであろう。米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）には、サイトゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現およびピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的な除去のために酵母を操作することによる、ピルベートからアセトラクテートへの変換の増大が開示される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための修飾、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を調節する制御要素をコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路による炭素フラックスの増大または当量バランスの低下を提供する宿主細胞への修飾を含む。その他の修飾には、ピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みが含まれる。その他の修飾には、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換が含まれる。実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃまたはその相同体である。付加的な修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換が含まれる。実施形態において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＬＤ６またはその相同体である。いくつかの実施形態では、微生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸からグリセレート１，３，ビスリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの欠失または下方制御を含有する。いくつかの実施形態では、この反応を触媒する酵素はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、酵母株はＰＮＹ１５０４である。ＰＮＹ１５０４はＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、以下の遺伝子：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２の欠失を含有する。この菌株をプラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換させて、菌株ＰＮＹ１５０４（ＢＰ１０８３、ＮＧＣＩ−０７０）を形成した。プラスミドｐＹＺ０９０およびｐＬＨ４６８は、参照によってその全体が本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／２４６８４４号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、微生物は、ペントースリン酸経路において機能する１つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、ポリペプチドは、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−リン酸３−エピメラーゼ、および／またはリボース−５−リン酸イソメラーゼであり得る。例示的なペントースリン酸経路タンパク質の配列は、以下の表６において見出される。
【０１７２】
【表３４】
2014522634.tif 000035
【０１７３】
【表３５】
2014522634.tif 000036
【０１７４】
【表３６】
2014522634.tif 000037
【０１７５】
加えて、微生物は、ペントースリン酸経路において機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本明細書において使用される組成物は、ブタノールを産生することができる微生物と、ブタノールを産生することができない微生物との両方を含む。リグノセルロース加水分解物はブタノール産生微生物の増殖を抑制し、非ブタノール産生微生物の増殖を抑制するよりも大きい程度まで抑制し得る。本明細書に記載される方法は、ブタノール産生微生物の増殖および収量を最大にする。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ブタノール産生微生物は、少なくとも、ブタノールを産生不能な微生物の濃度と等しい濃度で組成物（例えば、発酵組成物）中に存在する。さらに、ブタノールを産生可能な微生物は、ブタノールを産生不能な微生物の濃度よりも高い濃度で存在し得る。ブタノールを産生可能な微生物は、ブタノールを産生不能な微生物の濃度の少なくとも２倍の濃度で存在し得る。
【０１７８】
発酵培地からのイソブタノールの単離方法
本明細書に記載される方法によると、ブタノールは、（ａ）ブタノールを産生可能な微生物と、五炭糖をキシルロースへ変換することができる酵素（単数または複数）とを含む組成物を提供するステップと、（ｂ）組成物を五炭糖源と接触させるステップと、（ｃ）呼吸を制限する条件下で微生物を培養するステップと、（ｄ）培養物からイソブタノールを精製するステップとを含む方法によって、五炭糖から得ることができる。
【０１７９】
本明細書に記載される方法は、当該技術分野において既知の方法と併せて使用することができる。本明細書において開示される方法と併せて使用することができる方法は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書、ならびに２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号明細書、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号明細書、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号明細書、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号明細書、２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号明細書、および２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，０３４号明細書において開示されており、これらの内容全体は参照によって全て本明細書中に援用される。
【０１８０】
バイオ生成されたイソブタノールは、アセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去することができる。次に、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離させることができる。
【０１８１】
イソブタノールが低沸点の水との共沸混合物を形成するため、蒸留は、混合物をその共沸組成に至るまで分離するために使用することができる。蒸留は、共沸混合物付近の分離を得るために、別の分離方法と組み合わせて使用することができる。ブタノールを単離および精製するために蒸留と組み合わせて使用することができる方法には、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜ベースの技術が含まれるがこれらに限定されない。さらに、ブタノールは、共沸剤を用いた共沸蒸留を用いて単離され得る（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照）。
【０１８２】
ブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するので、イソブタノールを単離および精製するために、デカンテーションと組み合わせて蒸留を使用することができる。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスは、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物は濃縮され、デカンテーションによって発酵培地からイソブタノールが分離される。デカントされた水相は、還流として第１の蒸留塔に戻すことができる。デカントされたイソブタノールが豊富な有機相は、第２の蒸留塔において、蒸留によりさらに精製することができる。
【０１８３】
またイソブタノールは、蒸留と組み合わせて液液抽出を用いて発酵培地から単離することもできる。この方法では、イソブタノールは、適切な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次に、イソブタノール含有有機相は、ブタノールを溶媒から分離するために蒸留される。
【０１８４】
吸着と組み合わせた蒸留を使用して、発酵培地からイソブタノールを単離することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、モレキュラーシーブなどの吸着剤の使用により残りの水が除去される（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０１８５】
さらに、パーベーパレイションと組み合わせた蒸留を用いて、発酵培地からイソブタノールを単離および精製することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性膜を通るパーベーパレイションによって残りの水が除去される（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。
【０１８６】
その場生成物除去（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｍｏｖａｌ）（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも呼ばれる）は、ブタノール（または他の発酵アルコール）を、産生されたときに発酵容器から除去するために使用することができ、それにより、微生物はブタノールを高収率で産生することが可能になる。当該技術分野で記載されている発酵アルコールを除去するためのＩＳＰＲの１つの方法は液液抽出である。通常、例えばブタノール発酵に関して、微生物を含む発酵培地は、ブタノール濃度が毒性レベルに達するよりも前の時点で有機抽出剤と接触される。有機抽出剤および発酵培地は二相混合物を形成する。ブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物を含有する水相中の濃度を低下させ、それにより抑制性ブタノールに対する微生物の暴露が制限される。
【０１８７】
液液抽出は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書（その開示は本明細書にその全体が援用される）に記載される方法に従って実施することができる。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを生産および回収するための方法が記載されており、この方法は、発酵ブロスを水と非混和性の抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む２相混合物を形成するステップを含む。通常、抽出剤は、飽和、一価不飽和、多価不飽和（およびこれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、およびこれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。ＩＳＰＲのための抽出剤は、非アルコール抽出剤であり得る。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリン酸アルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびこれらの混合物などの外因性有機抽出剤であり得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、有機酸（例えば、脂肪酸）および有機酸によりアルコールをエステル化することができる触媒（例えば、リパーゼ）と、発酵培地中のアルコールを接触させることによって、アルコールをエステル化することができる。このような実施形態では、有機酸は、アルコールエステルが分配されるＩＳＰＲ抽出剤としての役割を果たすことができる。有機酸は発酵容器に供給されることができ、そして／あるいは発酵容器に送給される発酵性炭素を供給するバイオマスから得ることもできる。原料中に存在する脂質は、触媒作用により有機酸に加水分解することができ、同じ触媒（例えば、酵素）がアルコールにより有機酸をエステル化することができる。触媒は発酵よりも前に原料に供給されてもよいし、あるいは原料の供給よりも前または供給と同時に発酵容器に供給されてもよい。触媒が発酵容器に供給される場合、アルコールエステルは、脂質の有機酸への加水分解と、発酵容器内に存在するブタノールによる実質的に同時的な有機酸のエステル化とによって得ることができる。原料に由来しない有機酸および／または天然油を発酵容器に送給することもでき、天然油は有機酸に加水分解される。アルコールによりエステル化されない有機酸はどれもＩＳＰＲ抽出剤の一部としての役割を果たすことができる。アルコールエステルを含有する抽出剤は発酵培地から分離することができ、アルコールは抽出剤から回収することができる。抽出剤は、発酵容器へリサイクルすることができる。従って、ブタノールの生産の場合、例えば、ブタノールからエステルへの変換は発酵培地中の遊離ブタノール濃度を低下させ、ブタノール濃度の増大の毒性効果から微生物を保護する。加えて、脂質は触媒作用により有機酸に加水分解され、それによりＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の蓄積速度を低下させることができるので、分画されていない粒子を、その中の脂質を分離することなく原料として使用することができる。
【０１８９】
その場生成物除去はバッチモードまたは連続モードで実行することができる。その場生成物除去の連続モードでは、生成物は反応器から連続的に除去される。その場生成物除去のバッチモードでは、大量の有機抽出剤が発酵容器に添加され、プロセスの間、抽出剤は除去されない。その場生成物除去のために、有機抽出剤は発酵の開始時に発酵培地と接触して、二相発酵培地を形成することができる。あるいは、有機抽出剤は、微生物が所望の量の増殖（培養物の光学濃度の測定により決定することができる）を達成した後に発酵培地と接触することができる。さらに、有機抽出剤は、発酵培地中の生成物アルコールレベルが予め選択されたレベルに達した時点で発酵培地と接触することができる。本発明のいくつかの実施形態に従うブタノールの生産の場合、有機酸抽出剤は、有機酸によりブタノールをエステル化してブタノールエステルを生成し、その結果発酵容器中のブタノールの濃度を低減するように、ブタノール濃度が毒性レベルに達するよりも前の時点で発酵培地と接触することができる。次に、エステル含有有機相は、ブタノールエステルの所望の有効力価が達成された後で、発酵容器から除去する（そして、水相を構成する発酵ブロスから分離する）ことができる。いくつかの実施形態では、エステル含有有機相は、発酵容器内の利用可能な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後で水相から分離される。
【実施例】
【０１９０】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例が、本発明の実施形態を示すが、実例として提供されるだけであることは理解されるべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確かめることができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適合させるために本発明の種々の変化および修飾を行うことができる。
【０１９１】
雑誌論文もしくは要約、公開もしくは対応する米国もしくは外国特許出願、発行済みもしくは外国特許、または他のあらゆる文献を含む、本明細書において引用される全ての文献は、それぞれ参照によって、その引用文献中で提示される全てのデータ、表、図面、および本文を含む全体が本明細書中に援用される。
【０１９２】
実施例１
リグノセルロース加水分解物中の発酵性炭素からイソブタノールへの変換
方法
参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に全て記載されるように、希アンモニアおよび熱加工による前処理をしてから、市販用セルラーゼおよびヘミセルラーゼ酵素調製物の混合物を前処理済トウモロコシ穂軸固形分の２５％で用いて、ｐＨ５．３および４８℃で９６時間酵素的に加水分解した粉砕トウモロコシ穂軸から、リグノセルロース加水分解物（ＬＣＨ）を生成した。得られた加水分解物中の主要な糖およびアセテート濃度は、グルコース７５ｇ／Ｌ、キシロース５４ｇ／Ｌ、アラビノース６ｇ／Ｌ、およびアセテート５ｇ／Ｌであった。
【０１９３】
２つの酵母株を使用した。第１のＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄは、野生型エタノール生成株である。Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：７０６−７１４（２０００）。第２の株ＰＮＹ１５０４は、イソブタノール生成株である。この菌株は、プラスミドｐＹＺ０９０（ａｌｓＳ−Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫＡＲＩ）およびｐＬＨ４６８（ＩｌｖＤ−ｈＡＤＨ−ＫｉｖＤｙ）による形質転換によって、ＰＮＹ１５０３（ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ）から作成した。
【０１９４】
合成完全−ＧＥ培地は、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ドロップアウトミックス−Ｈｉｓ−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ（１．４ｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｙ２００１）＋トリプトファン（２０ｍｇ／Ｌ）およびロイシン（６０ｍｇ／Ｌ）（Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：３−４１（２００２））、ならびに３ｇ／Ｌのグルコース＋３ｍｌ／Ｌの１９０プルーフエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｅ７０２３）で構成した。０．１ＭのＭＥＳ−ＫＯＨを用いて液体培地をｐＨ５．５に緩衝させた。２０ｇ寒天／Ｌを用いてペトリ皿用の固体培地を形成した。
【０１９５】
２ｍｌのＳＣ−ＧＥ培地を含有する試験管にプレートから播種し、振とうさせながら３０℃で６時間インキュベートした。次に、この前培養物を用いて、３０℃、２５０ｒｐｍにおける一晩のインキュベーションのために２５０ｍｌのフラスコ内の５０ｍｌのＳＣ−ＧＥに播種した。遠心分離によって細胞を回収し、５０ｍｌのフラスコ内の１０ｍｌの産生培地へ移した。培養物を３０℃で１５０時間増殖させ、ＨＰＬＣによる残留糖および産生アルコールの分析のために定期的にサンプリングした。試験した産生培地は、ＬＣＨまたは水で１：１に希釈したＬＣＨのいずれかであった。
【０１９６】
分析の前に、１３，０００ｒｐｍに設定したＭｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて３〜５分間、発酵サンプルにＮａｎｏｓｅｐ  ＭＦ  ０．２ミクロン遠心ろ過機（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を通過させた。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムによるＨＰＬＣによって、発酵ブロス中のグルコース、キシロース、酢酸、グリセロール、エタノール、およびイソブタノールを測定した。使用したカラムは、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（＃１２５−０１２９、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を付けたＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＩＯＮ−３００カラム（＃ＩＣＥ−９９−９８５０、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｏｈｍａｈａ，ＮＥ）であった。カラムは、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を溶媒として用いて、７５℃および０．４ｍＬ／分の流速で流した。外部標準較正曲線を用いて屈折率検出器により出発糖および産物の濃度を決定した。
【０１９７】
結果
イソブタノロゲンのＰＮＹ１５０４は１×トウモロコシ穂軸加水分解物において増殖することができなかった。図１において分かるように、ＰＮＹ１５０４は、希釈した加水分解物において、非希釈ＬＣＨにおける野生型基準株に匹敵する速度で増殖し、野生型基準株の最終バイオマス濃度の約２／３に達した。図２は、ＰＮＹ１５０４によるグルコースの消費およびイソブタノールの産生のプロファイルを示す。グルコースは、２４時間以内に約４０ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌの残留濃度になるまで消費された。その同じ期間に、イソブタノールが産生され、最終力価は３ｇ／Ｌであり、０．１２ｇ．ｇ−１の収量が得られた。比較して、図３において、エタノール生成株は、４８時間よりも長い期間にわたって、約７５ｇ／Ｌの初期濃度から５ｇ／Ｌ未満になるまでグルコースをほとんど完全に消費することが観察された。エタノール生成株は、約０．３７ｇ．ｇ−１の収量に対して約２８ｇ／Ｌのエタノールを産生した。
【０１９８】
実施例２
限定培地におけるＣ−５糖からＣ−４アルコールへの変換
方法
培地をｐＨ６に緩衝させたことを除いて上記のように限定培地ＳＣ−ＧＥにおいて菌株ＰＮＹ１５０４を前培養した。産生培養は、グルコースまたはキシロースのいずれかを３５ｇ／Ｌの最終濃度まで添加し、ペニシリンＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３０３２）を２５μｇ／ｍｌで添加したことを除いて同じＳＣ培地を使用した。
【０１９９】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、キシロースを発酵させるように遺伝子操作されなければキシロースを発酵させることはできないが、キシルロースを発酵させることはできる。キシロースがイソブタノールへの発酵のために利用可能であるかどうかを試験するために、Ｌａｓｔｉｃｋ  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：５７４−５７９（１９８９）、Ｗａｎｇ  Ｐ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２：２７３−２７８（１９８０）、およびＣｈａｎｄｒａｋａｎｔ  Ｐ  ＆  Ｂｉｓａｒｉａ  ＶＳ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５３：３０１−３０９（２０００）において本質的に記載されるように、キシロースイソメラーゼ（１０ｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｇ４１６６）によってその場でキシルロースへ変換した。
【０２００】
キシルロースは酵母により吸収され、ペントースリン酸経路を通って代謝されることが可能である。酵母はキシロースにおいて増殖させると主に代謝の呼吸モードを表し、高いバイオマス収量および低い発酵産物の収量をもたらすことが示されている。Ｓｏｕｔｏ−Ｍａｉｏｒ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４３：１１９−２３（２００９）。従って、発酵産物へ向かうフラックスを増大させるために、培養物を呼吸抑制剤アンチマイシンＡ（１μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａ８６７４）で処理した。
【０２０１】
結果
図４に示されるように、イソブタノロゲンはグルコースをイソブタノールへ発酵させた。ヘキソースはアンチマイシンＡ処理に関係なく２４時間以内に消費された。アンチマイシンＡ処理した培養物は、約０．０８ｇ．ｇ−１の収量に対して、いくらか高い約３．３ｇ／Ｌのイソブタノール力価を達成した。高い初期バイオマス濃度を使用して産生培養物を播種したので、低レベルの増殖が観察された。
【０２０２】
図５は、キシロースイソメラーゼと共に単独の炭素源としてキシロースが提供されたときの発酵プロファイルを示す。キシルロースへのキシロースの変換およびその後のその利用は、グルコース消費よりも遅い。７８時間までに、１０ｇ／Ｌのキシロースが消費されたに過ぎない（間接的に、キシロースイソメラーゼの存在のために平衡状態にあるキシルロースとして）。この消費プロファイルはアンチマイシンＡの有無によって有意な影響を受けなかった。しかしながら、呼吸抑制剤はバイオマスの蓄積をわずかに低下させ、著しく増大されたイソブタノールの産生が観察された（７８時間においてそれぞれ０．５対０．１ｇ／Ｌ）。イソブタノールの収量は、アンチマイシンＡの存在下で０．０４ｇ．ｇ−１であり、薬物の非存在下で０．０１ｇ．ｇ−１であった。
【０２０３】
実施例３
リグノセルロース加水分解物中のキシロースのイソブタノールへの変換
方法
この実験はキシロースイソメラーゼを使用して、リグノセルロース加水分解物（ＬＣＨ）中に存在するキシロースをキシルロースへ変換した。キシルロースは次に、イソブタノール生成酵母株によるイソブタノールへの発酵のために利用可能である。ＰＮＹ１５０４を上記のように前増殖させ、培養のために２５ｍｇ／ＬのペニシリンＧを含有する０．５×ＬＣＨに移した。図面の凡例に記載されるようにキシロースイソメラーゼ（１０ｇ／Ｌ）および／またはアンチマイシンＡ（１μＭ）を添加した。１７０時間の途中で分析のためにサンプルを定期的に抜き取った。
【０２０４】
結果
図６は、発酵の間のグルコース、キシロース、およびキシルロースの濃度を示す。キシロースイソメラーゼの非存在下でアンチマイシンＡを添加した場合を除いて、グルコースは４８時間以内に消費された。キシロースの消費およびキシルロースの形成（図示せず）は、予想通りに、キシロースイソメラーゼの添加を必要とした。
【０２０５】
発酵中の有効なイソブタノール力価は図７に示される。４つの培養物は全て、最初の４８時間でグルコースからイソブタノールを作り、力価は約４〜６ｇ／Ｌの範囲であった。続いて、原料からグルコースが使い果たされた後の期間には、キシロースイソメラーゼおよびアンチマイシンＡの両方で処理した培養物が１００時間の間に最大量のイソブタノールを作った。その後、恐らくアルコールの蒸発のために濃度は低下した。キシロースイソメラーゼを含まない培養物は、恐らく酢酸などの加水分解物中の不良炭素源のゆっくりとした同化作用のために、実験全体を通してイソブタノールを徐々に蓄積し続けた。
【０２０６】
実施例３
イソブタノールの回収
前述の実施例で生産されたイソブタノールは、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書の方法に従うその場生成物回収方法によって回収され得る。そこに記載されるその場生成物回収（ＩＳＰＲ）方法は、発酵前および発酵中の抑制剤の除去によってブタノールの生産の改善を提供する。ＩＳＰＲ技術を用いる組換えの生物による混合糖の利用は、糖利用の増大、抑制剤プロファイルの低下およびアルコール産物のトレランスの増大の１つまたは複数によりブタノールの生産の改善を提供し得る。
【０２０７】
実施例４
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０８３（「ＮＧＣＩ−０７０」、ＰＮＹ１５０４）の構築
菌株ＢＰ１０６４はＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、以下の遺伝子：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２の欠失を含有する。ＢＰ１０６４をプラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１、米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換し、菌株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３、ＰＮＹ１５０４）を作成した。
【０２０８】
標的遺伝子の上流および下流の相同性領域と、形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかとを含有するＰＣＲ断片による相同組換えによって、コード配列全体を完全に除去した欠失を作成した。Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、ｌｏｘＰ部位により隣接されるＧ４１８耐性マーカーを除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去して痕跡のない（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作成するか、あるいはｌｏｘＰ部位に隣接される場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。
【０２０９】
痕跡のない欠失の手順は、Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９−４０５，２００６）から適合させた。一般に、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−ＣをオーバーラップＰＣＲにより結合させることによって、痕跡のない欠失のそれぞれに対するＰＣＲカセットを作った。ＰＣＲカセットは、選択可能／対抗選択可能なマーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）と共に含有した。断片ＡおよびＣ（それぞれ、長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ上流５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’の５００ｂｐ（断片Ｃ）に相当した。断片ＡおよびＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、カセットの染色体への組込みの際に断片Ｂに相当する配列の直接反復が作成されるように、相同組換えによる染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除のために使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、まずＵＲＡ３マーカーを組込み、次に相同組換えにより染色体から切除した。最初の組込みにより、３’の５００ｂｐを除く遺伝子が欠失された。切除の際、遺伝子の３’の５００ｂｐ領域も欠失させた。この方法を用いる遺伝子の組込みのために、組み込むべき遺伝子は、断片ＡとＢの間でＰＣＲカセットに包含させた。
【０２１０】
ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４テンプレートＤＮＡ（配列番号３）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、ｌｏｘＰ部位によって隣接されて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えおよびマーカーの除去を可能にする。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号４および５）を用いて行った。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄに形質転換し、Ｇ４１８（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＹＰＤにおいて３０℃で形質転換体を選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号６および７）を用いるＰＣＲによって正確な組込みを検証し、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸと命名した。
【０２１１】
ＨＩＳ３の欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ，キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、痕跡のないＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）と、ＨＩＳ３断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１５）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ａを増幅した。ＨＩＳ３断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１６）と、ＨＩＳ３断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１７）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｂを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）と、ＨＩＳ３断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１９）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｕを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号２０）と、プライマーｏＢＰ４５９（配列番号２１）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５５（配列番号１７）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３断片ＡＢを作成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。
【０２１２】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ＨＩＳ３ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正確な形質転換体を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸΔｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
【０２１３】
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカーの除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカーの除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸΔｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）で形質転換し、２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングすることによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。１％のガラクトースが補充されたＹＰにおいて３０℃で約６時間、形質転換体を増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカーの切除を誘発させ、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートにプレーティングした。分離株をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（５−ＦＯＡ、０．１％）を含有する合成完全培地に３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のために、５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＤにおいて増殖およびプレーティングした。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシルを欠いた合成完全培地プレート、およびヒスチジンを欠いた合成完全培地プレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を検査した。Ｇ４１８に対して感受性があり、ウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性である正確な分離株を、菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７と命名した。欠失およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３のためのプライマーｏＢＰ４５０（配列番号２４）およびｏＢＰ４５１（配列番号２５）、ならびにΔｈｉｓ３のためのプライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
【０２１４】
ＰＤＣ６の欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、痕跡のないＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）と、ＰＤＣ６断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４１（配列番号２７）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ａを増幅した。ＰＤＣ６断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４２（配列番号２８）と、ＰＤＣ６断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４３（配列番号２９）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）と、ＰＤＣ６断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４５（配列番号３１）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４６（配列番号３２）と、プライマーｏＢＰ４４７（配列番号３３）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４３（配列番号２９）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６断片ＡＢを作成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。
【０２１５】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ＰＤＣ６ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびｏＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正確な形質転換体を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
【０２１６】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。欠失およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびｏＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。分離株からのＰＤＣ６遺伝子の欠損は、ＰＤＣ６のコード配列、ｏＢＰ５５４（配列番号３６）およびｏＢＰ５５５（配列番号３７）に特異的なプライマーを用いて、陰性ＰＣＲ結果によって実証した。正確な分離株を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１と命名した。
【０２１７】
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍの組込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６１０からのｉｌｖＤコード領域で置換した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＮＹＬＡ８３ゲノムＤＮＡとを用いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みのためのＰＣＲカセットのＡ断片とその後のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード領域を増幅した。ＮＹＬＡ８３は、参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されるＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みを有する菌株（参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書に記載される構成）である。プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）と、ＰＤＣ１断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１５（配列番号３９）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号６９）を増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１６（配列番号４０）と、ＰＤＣ１断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１７（配列番号４１）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）と、ＰＤＣ１断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１９（配列番号４３）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５２０（配列番号４４）と、プライマーｏＢＰ５２１（配列番号４５）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡにより精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５１７（配列番号４１）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを作成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号７０）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。
【０２１８】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組込みを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲによってスクリーニングした。分離株からのＰＤＣ１遺伝子の欠損は、ＰＤＣ１のコード配列、ｏＢＰ５５０（配列番号４８）およびｏＢＰ５５１（配列番号４９）に特異的なプライマーを用いて、陰性ＰＣＲ結果によって実証した。正確な形質転換体を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
【０２１９】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組込み、およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１（配列番号４７）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正確な分離株を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７と命名した。
【０２２０】
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのｓａｄＢコード領域で置換した。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組込みのためのＰＣＲカセットのセグメントをまずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２２１】
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳはｐＵＣ１９に基づき、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に位置するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコン、およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における複製および選択のためにベータ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のコード配列に加えて、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のためにこの遺伝子の上流および下流からの配列が含まれる。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。
【０２２２】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからのＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐおよび下流１５０ｂｐと共にＵＲＡ３コード領域を包含するＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１２）と、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１３）とにより増幅した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号７２）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後にＴ４ＤＮＡリガーゼと連結させ、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。ベクターは、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０）およびｏＢＰ２６５（配列番号１１）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
【０２２３】
ｓａｄＢのコード配列およびＰＤＣ５断片ＢをｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化して、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を作成した。ｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号６７）をテンプレートとして用いて、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）と、ＰＤＣ５断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５３１（配列番号５１）とによりｓａｄＢのコード配列を増幅した。ｓａｄＢの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５３２（配列番号５２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号５３）とを用いて、ＰＤＣ５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）およびｏＢＰ５３３（配列番号５３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）と、ＰＤＣ５断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するｏＢＰ５４６（配列番号５５）とを用いるｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のために、得られたプラスミドをテンプレートとして使用した。ＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４７（配列番号５６）と、プライマーｏＢＰ５３９（配列番号５７）とを用いて、ＰＤＣ５断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。天然ＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０個のヌクレオチドに対する相同性を有する５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４２（配列番号５８）と、ｏＢＰ５３９（配列番号５７）とを用いてＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号７１）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。
【０２２４】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地（グルコースなし）において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組込みを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。分離株からのＰＤＣ５遺伝子の欠損は、ＰＤＣ５のコード配列、ｏＢＰ５５２（配列番号６１）およびｏＢＰ５５３（配列番号６２）に特異的なプライマーを用いて、陰性ＰＣＲ結果によって実証した。正確な形質転換体を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
【０２２５】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３をＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノール（グルコースなし）が補充された、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組込み、およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３と命名した。
【０２２６】
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号６８）をテンプレートＤＮＡとして用いて、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号７３）をＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位に隣接される（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号８および９）を用いてＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地（グルコースなし）において選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（配列番号６３および６４）を用いるＰＣＲによって正確な組込みを検証した。
【０２２７】
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６）による形質転換と、１％のエタノールが補充された、ヒスチジンを欠いた合成完全培地における３０℃でのプレーティングとによって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。１％のエタノールが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地上に形質転換体を画線し、３０℃でインキュベートして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去は、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号６３）およびｏＢＰ５９１（配列番号６５）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢΔｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）と命名した。
【０２２８】
ＢＰ１０６４をプラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、菌株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３、ＰＮＹ１５０４）を作成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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