(57)【要約】ＴＯＰＫ由来の単離されたエピトープペプチドおよびその免疫原性断片は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を有しており、したがって、がん免疫療法における使用のために好適であり、より具体的にはがんワクチンとして好適である。本発明のペプチドは、ＴＯＰＫ由来のアミノ酸配列を含むペプチドと、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているその改変体がＣＴＬ誘導能を有するならば、そのような改変体との両方を包含する。上記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、ならびに、上記ペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む薬学的組成物がさらに提供される。本発明のペプチド、ポリヌクレオチドおよび薬学的組成物は、がんおよび腫瘍の治療および予防のいずれか一方または両方において特に有用性が見出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ｉ）および（ｉｉ）からなる群より選択される単離されたペプチド：
（ｉ）下記の（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、
（ｂ）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導能を有する、単離されたペプチド、
（ｉｉ）下記の（ｃ）または（ｄ）の単離されたペプチド：
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、
（ｄ）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導能を有する、単離されたペプチド。
【請求項２】
以下の特徴の一方または両方を有する、請求項１記載の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている、ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている。
【請求項３】
以下の特徴の一方または両方を有する、請求項１記載の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている、ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている。
【請求項４】
ＨＬＡ抗原に結合する能力を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である、請求項４記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の単離されたペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
ＣＴＬを誘導するための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチドまたは請求項７記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、
（ｂ）請求項７記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチド、
（ｃ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のＡＰＣ、
（ｄ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のエキソソーム、または
（ｅ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識することができる１種もしくは複数種のＣＴＬ
を、薬学的に許容される担体との組合せで含む薬学的組成物であって、
がんの治療および／もしくは予防、術後のその再発の予防、ならびに／または、がんに対する免疫応答の誘導のために製剤化される、薬学的組成物。
【請求項１０】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項９記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを、請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドと、インビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、および
（ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドによって形成されるＴＣＲがＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体に細胞表面上で結合することができる、該ＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法によって誘導される、請求項１３記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法によって誘導される、請求項１５記載のＣＴＬ。
【請求項１７】
がんに対する免疫応答を対象において誘導する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、請求項７記載のポリヌクレオチド、または請求項１８記載の抗体を含む、診断キット。
【請求項２２】
ＴＯＰＫ由来の断片を提示する細胞に対する特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する能力を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択される元のアミノ酸配列に対して１個、２個、または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列からなる候補配列を提供する段階、
（ｉｉ）ＴＯＰＫ以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも実質的に有意な相同性を有さない候補配列を選択する段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において選択される前記候補配列からなるペプチドを抗原提示細胞と接触させる段階、
（ｉｖ）段階（ｃ）の前記抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させる段階、ならびに
（ｖ）ＣＴＬ誘導能が、前記元のアミノ酸配列からなるペプチドと同じであるかまたはそれよりも高い前記ペプチドを特定する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん療法の分野に関する。特に、本発明は、がんワクチンとして有効な新規ペプチド、ならびに、腫瘍の治療および予防のどちらかまたは両方のための薬物に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２０１１年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／５５２，８１７号の恩典を主張し、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーがＴＡＡの最初の例として発見されて以来、多くの他のＴＡＡが免疫学的アプローチによって発見されており（非特許文献１、非特許文献２）、これらのＴＡＡのいくつかが目下、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
好ましいＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡである。そのようなＴＡＡを免疫療法の標的として使用することによって、療法により生じる免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、突然変異および／または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳述されているリスクが最小限に抑えられる場合がある。したがって、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる新しいＴＡＡを特定することにより、さらなる開発が保証される。したがって、様々なタイプのがんにおいてペプチドワクチン接種戦略の臨床適用が進行中である（非特許文献３〜非特許文献１０）。現在までに、これらのＴＡＡ由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながら、今までのところ、これらのがんワクチン治験は低い客観的奏効率しか示していない（非特許文献１１〜非特許文献１３）。したがって、免疫療法の標的として使用するために好適である新規ＴＡＡが、当技術分野では依然として必要とされている。
【０００５】
ＴＯＰＫ（Ｔ−ＬＡＫ細胞起源プロテインキナーゼ、Ｔ−ＬＡＫ  ｃｅｌｌ−ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）は、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）３／６に関連したＭＡＰＫＫファミリーのメンバーであるセリン／トレオニンキナーゼである。このキナーゼは、ｐ３８  ＭＡＰＫをリン酸化し、細胞周期チェックポイントの調節に関与している（非特許文献１４、非特許文献１５）。臨床試料を使用したＴＯＰＫの遺伝子発現分析では、ＴＯＰＫがいくつかの悪性がん、例えば、乳癌、胆管癌、肝細胞癌、白血病、結腸直腸癌および黒色腫などにおいて過剰発現されることが示された（非特許文献１６〜非特許文献１９）。キナーゼ活性が乳癌発生において重要な役割を果たすことを示す近年の研究によって、ＴＯＰＫなどのがん関連キナーゼに対する研究的関心が復活した。これを受けて、ノーザンブロット分析によって、ＴＯＰＫ転写物が乳癌細胞において高発現しているが、精巣を除く正常なヒト組織ではほとんど検出できないことが明らかにされている。加えて、乳癌細胞株におけるｓｉＲＮＡによる内在性ＴＯＰＫの発現のノックダウンは、がん細胞の細胞質分裂を減弱し、アポトーシスを引き起こすことを示している（非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｏｏｎ  Ｔ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９３  Ｍａｙ  ８，５４（２）：１７７−８０
【非特許文献２】Ｂｏｏｎ  Ｔ＆ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６  Ｍａｒ  １，１８３（３）：７２５−９
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ  ＣＣ，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １６，８８（２０）：１４４２−５５
【非特許文献４】Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ＬＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｊｕｌ  １，５９（１３）：３１３４−４２
【非特許文献５】Ｖｉｓｓｅｒｓ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｎｏｖ  １，５９（２１）：５５５４−９
【非特許文献６】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６  Ｍａｙ  １，１５６（９）：３３０８−１４
【非特許文献７】Ｔａｎａｋａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｏｃｔ  １５，５７（２０）：４４６５−８
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｊａｎ  １８，８０（２）：１６９−７２
【非特許文献９】Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｍａｙ  ５，８１（３）：４５９−６６
【非特許文献１０】Ｏｉｓｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｍａｙ  ５，８１（３）：３８７−９４
【非特許文献１１】Ｂｅｌｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２  Ｏｃｔ  １５，２０（２０）：４１６９−８０
【非特許文献１２】Ｃｏｕｌｉｅ  ＰＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２００２  Ｏｃｔ，１８８：３３−４２
【非特許文献１３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４  Ｓｅｐ，１０（９）：９０９−１５
【非特許文献１４】Ａｂｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｊｕｌｙ  １４：２１５２５−２１５３１
【非特許文献１５】Ａｙｌｌｏｎ  Ｖ  ａｎｄ  Ｏ'ｃｏｎｎｏｒ  Ｒ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００７  Ｍａｙ  ２４；２６（２４）：３４５１−６１
【非特許文献１６】Ｈｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０  Ｍａｒ；４１（３）：４１５−２４
【非特許文献１７】Ｌｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００６  Ｓｅｐ；８５（９）：５８３−９０
【非特許文献１８】Ｍｉｎｏｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０  Ｓｅｐ；３７（３）：７０７−１８
【非特許文献１９】Ｚｙｋｏｖａ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｄｅｃ  １；１２（２３）：６８８４−９３
【非特許文献２０】Ｐａｒｋ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｓｅｐ  １５；６６（１８）：９１８６−９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、免疫療法の適切な標的として役立つ可能性のある新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは一般に免疫系によって「自己」として認識され、そのため多くの場合は自然免疫原性を有さないため、適切な標的の発見は極めて重要である。本発明を通して、ＴＯＰＫ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８４９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）の遺伝子によってコードされるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）が、がん細胞において、特に、限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および軟部組織腫瘍において特異的に過剰発現されることが明らかにされる。したがって、本発明は、がん／腫瘍免疫療法の適切な候補標的としてＴＯＰＫに着目する。
【０００８】
その目的のために、本発明は、ＴＯＰＫの遺伝子産物の中で、ＴＯＰＫに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を有する、特異的なエピトープペプチドの同定に少なくとも一部向けられている。以下にさらに詳述するように、健常ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＴＯＰＫに由来するＨＬＡ（ヒト白血球抗原）−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを使用して刺激した。その後、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株を樹立した。本明細書における結果は、これらのペプチドが、ＴＯＰＫを発現する細胞に対する強力かつ特異的な免疫応答を誘導することができるＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープペプチドであることを実証している。これらの結果はさらに、ＴＯＰＫは免疫原性が強く、かつ、そのエピトープが腫瘍免疫療法の有効な標的であることを示している。
【０００９】
したがって、ＨＬＡ抗原と結合する能力を有し、かつ、ＴＯＰＫ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）またはその免疫原性活性断片を含む、単離されたペプチドを提供することが、本発明の１つの目的である。これらのペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有することが予測され、したがって、インビトロ、エクスビボまたはインビボにおいてＣＴＬを誘導するために使用することができ、あるいは、がんに対する免疫応答をインビボにおいて誘導するために対象に対して直接投与するために使用することができ、この場合、そのようながんの例には、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
好ましいペプチドがノナペプチドおよびデカペプチドであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列を有するノナペプチドおよびデカペプチドである。これらのうち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６の中より選択されるアミノ配列を有するペプチドが最も好ましい。
【００１１】
本発明はまた、得られる改変ペプチドが元の未改変ペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列を有する改変ペプチドも企図する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のペプチドのいずれか１種をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導または調製するために使用することができる。上記の本発明のペプチドと同様に、そのようなＡＰＣを、がんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１３】
対象に投与された場合、本発明のペプチドは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、好ましくはＡＰＣの表面上に提示される。したがって、本発明の１つの目的は、ＣＴＬを誘導する剤または組成物であって、本発明の１種もしくは複数種のペプチドまたはそのようなペプチドをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む組成物または剤を提供することである。そのような剤または組成物は、原発性がん、その転移、または術後のその再発の治療および／または予防のために用いることができる。本発明によって企図される、標的とされるがんの例には、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明はさらに、上記の原発性がん、転移または術後再発がんの治療および／または予防のために製剤化される、本発明の１種もしくは複数種のペプチドまたは１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む薬学的な組成物または剤を企図する。本発明の薬学的な剤または組成物は、有効成分として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、あるいは、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドに加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣおよび／またはエキソソームを含み得る。
【００１５】
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるか、または、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を表面上に提示するＡＰＣを誘導するために用いられ得る。そのようなＡＰＣは、標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、がん免疫療法に有用である。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびに該方法によって得られるＡＰＣを包含する。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、ＣＴＬを誘導するための方法であって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、あるいは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドによって形成されるＴＣＲが本発明のペプチドに結合することができる、該ＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを導入する段階を含む、方法を提供することである。そのような方法によって得られるＣＴＬは、がんの治療および／または予防において使用が見出され、より具体的には、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍の治療および／または予防において使用が見出される。したがって、本発明は、ＣＴＬを誘導するための方法、ならびに、該方法によって得られるＣＴＬを包含する。ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明はさらに、本発明のペプチドを標的とする単離されたＣＴＬを提供する。これらのＡＰＣおよびＣＴＬは、がん免疫療法に使用することができる。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための方法であって、本発明のペプチド、そのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなペプチドを提示するエキソソームまたはＡＰＣ、および、そのようなペプチドを自身の表面上に提示する細胞を認識することができるＣＴＬの中より選択される少なくとも１つの成分を含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法を提供することである。
【００１８】
本発明の適用性は、ＴＯＰＫの過剰発現に関連するか、または、ＴＯＰＫの過剰発現から生じる多数の疾患のいずれにも及び、例えば、ＴＯＰＫを発現するがんなどに及び、この場合、そのようながんの例には、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の目的および特徴が、下記の詳細な説明を、添付の図面および実施例と併せて読んだとき、より十分に明らかになるであろう。前述の発明の概要および下記の詳細な説明はともに例示的な態様についてであり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されなければならない。
【００１９】
特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の様々な局面および適用が、下記の図面の簡単な説明ならびに本発明およびその好ましい態様の詳細な説明を考慮することで、当業者には明らかになるであろう。
【００２１】
【図１】図１は、ＴＯＰＫ由来のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬに対するインターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｅ）から構成される。ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）により誘導されるウェル番号＃８（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）により誘導されるウェル番号＃３（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）により誘導されるウェル番号＃３（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）により誘導されるウェル番号＃２（ｄ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）により誘導されるウェル番号＃４（ｅ）におけるＣＴＬは、対照と比較して、強力なＩＦＮ−γ産生をそれぞれ示した。これらの写真のウェルにおける四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データとして、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）により刺激されたＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｆ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【００２２】
【図２−１】図２は、ＴＯＰＫ由来のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬに対するインターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｏ）から構成される。ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）により誘導されるウェル番号＃７（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）により誘導されるウェル番号＃４（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）により誘導されるウェル番号＃２（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）により誘導されるウェル番号＃８（ｄ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）により誘導されるウェル番号＃４（ｅ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）により誘導されるウェル番号＃３（ｆ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）により誘導されるウェル番号＃３（ｇ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）により誘導されるウェル番号＃５（ｈ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）により誘導されるウェル番号＃３（ｉ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）により誘導されるウェル番号＃８（ｊ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）により誘導されるウェル番号＃１（ｋ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）により誘導されるウェル番号＃１（ｌ）におけるＣＴＬは、対照と比較して、強力なＩＦＮ−γ産生をそれぞれ示した。これらの写真のウェルにおける四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データとして、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）により刺激されたＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｏ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【００２３】
【図２−２】図２は、ＴＯＰＫ由来のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬに対するインターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｏ）から構成される。ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）により誘導されるウェル番号＃４（ｍ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）により誘導されるウェル番号＃４（ｎ）におけるＣＴＬは、対照と比較して、強力なＩＦＮ−γ産生をそれぞれ示した。これらの写真のウェルにおける四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データとして、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）により刺激されたＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｏ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【００２４】
【図３】図３は、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）（ｄ）およびＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）（ｅ）により刺激されたＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｅ）から構成される。ＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量をＩＦＮ−γの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比率を示す。
【００２５】
【図４】図４は、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）（ｂ）およびＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）（ｃ）により刺激されたＣＴＬ株から限界希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｃ）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は応答細胞（ＣＴＬクローン）および刺激細胞の数の比率を示す。
【００２６】
【図５−１】図５−１は、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）（ｄ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）（ｅ）およびＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）（ｆ）により刺激されたＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｆ）から構成される。ＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量をＩＦＮ−γの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比率を示す。
【００２７】
【図５−２】図５−２は、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）（ｇ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）（ｈ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）（ｉ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）（ｊ）およびＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）（ｋ）により刺激されたＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ｇ）〜（ｋ）から構成される。ＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量をＩＦＮ−γの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比率を示す。
【００２８】
【図６】図６は、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）（ａ）およびＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）（ｂ）により刺激されたＣＴＬ株から限界希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す一対の折れ線グラフ（ａ）および（ｂ）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は応答細胞（ＣＴＬクローン）および刺激細胞の数の比率を示す。
【００２９】
【図７】図７は、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を発現する標的細胞に対するＣＴＬクローンの特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２または全長ＴＯＰＫ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（菱形）に対する特異的ＣＴＬ活性を示した。一方で、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（三角）またはＴＯＰＫ（丸）のどちらか一方を発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【００３０】
【図８】図８は、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対するＣＴＬ株の特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＴＯＰＫ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（菱形）に対する特異的ＣＴＬ活性を示した。一方で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角）またはＴＯＰＫ（丸）のどちらか一方を発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
態様の説明
上記概要に加え、以下のものを提供することは、本発明の目的である：
［１］ＣＴＬ誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＴＯＰＫのアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド。
［２］ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［１］に記載の単離されたペプチド。
［３］下記の（ｉ）および（ｉｉ）からなる群より選択される単離されたペプチド：
（ｉ）下記の（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、
（ｂ）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導能を有する、単離されたペプチド、
（ｉｉ）下記の（ｃ）または（ｄ）の単離されたペプチド：
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、
（ｄ）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導能を有する、単離されたペプチド。
［４］以下の特徴の一方または両方を有する、［３］に記載の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている、ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている。
［５］以下の特徴の一方または両方を有する、［３］に記載の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている、ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択されるアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるように置換されている。
［６］ＨＬＡ抗原に結合する能力を有する、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド。
［７］前記ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である、［６］に記載の単離されたペプチド。
［８］ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド。
［９］［１］〜［８］のいずれか１つに記載の単離されたペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［１０］ＣＴＬを誘導するための組成物であって、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の１種もしくは複数種のペプチドまたは［９］に記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
［１１］
（ａ）［１］〜［８］のいずれか１つに記載の１種もしくは複数種のペプチド、
（ｂ）［９］に記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチド、
（ｃ）［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のＡＰＣ、
（ｄ）［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する１種もしくは複数種のエキソソーム、または
（ｅ）［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識することができる１種もしくは複数種のＣＴＬ
を、薬学的に許容される担体との組合せで含む薬学的組成物であって、
がんの治療および／もしくは予防、術後のその再発の予防、ならびに／または、がんに対する免疫応答の誘導のために製剤化される、薬学的組成物。
［１２］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、［１１］に記載の薬学的組成物。
［１３］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを、［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドと、インビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
［１４］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、および
（ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドによって形成されるＴＣＲがＨＬＡ抗原と［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体に細胞表面上で結合することができる、該ＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
［１５］ＨＬＡ抗原と［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
［１６］［１３］に記載の方法によって誘導される、［１５］に記載のＡＰＣ。
［１７］［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
［１８］［１４］に記載の方法によって誘導される、［１７］に記載のＣＴＬ。
［１９］がんに対する免疫応答を対象において誘導する方法であって、［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
［２０］［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
［２１］［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
［２２］［２１］に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
［２３］［１］〜［８］のいずれか１つに記載のペプチド、［９］に記載のポリヌクレオチド、または［２０］に記載の抗体を含む、診断キット。
［２４］ＴＯＰＫ由来の断片を提示する細胞に対する特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する能力を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む、方法。
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択される元のアミノ酸配列に対して１個、２個、または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列からなる候補配列を提供する段階、
（ｉｉ）ＴＯＰＫ以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも実質的に有意な相同性を有さない候補配列を選択する段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において選択される前記候補配列からなるペプチドを抗原提示細胞と接触させる段階、
（ｉｖ）段階（ｃ）の前記抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させる段階、ならびに
（ｖ）ＣＴＬ誘導能が、前記元のアミノ酸配列からなるペプチドと同じであるかまたはそれよりも高い前記ペプチドを特定する段階。
【００３２】
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、これらの記載が説明のためのものにすぎず、限定することは意図していないことが理解されるべきである。本発明は、本明細書に記載される特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコールなどに限定されないこともまた理解されなければならない。これは、これらが慣例的な実験法および最適化に従って変更可能であるからである。さらに、本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００３３】
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例証であり、限定することは意図していない。
【００３４】
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも１つ」を意味する。
物質（例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチドなど）に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、該物質が、そうでなければその天然源中に含まれ得る少なくとも１種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離されたペプチドまたは精製されたペプチドは、該ペプチドが由来する細胞源または組織源からの例えば、炭水化物、脂質または他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないペプチド、あるいは、化学合成された場合には化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないペプチドを示す。
【００３５】
「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ペプチドが、それが単離された細胞または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されている、ペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞材料を実質的に含まないペプチドは、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量ベースで）の異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物を含む。ペプチドを組換え産生する場合、ペプチドは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、培養培地をペプチド調製物の容量の約２０％、１０％、または５％未満で有するペプチドの調製物を含む。ペプチドを化学合成によって生成する場合、ペプチドは、好ましくは、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、ペプチドの合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容量の約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾燥重量ベースで）で有するペプチドの調製物を含む。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含有することは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色などの後の単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離または精製されている。
【００３６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が１個もしくは複数個の修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書において時として用いられる「オリゴペプチド」という用語は、長さが２０アミノ酸残基またはそれ未満であり、典型的には１５アミノ酸残基またはそれ未満であるペプチドを指すために使用され、典型的には約８個〜約１１個のアミノ酸残基から構成され、多くの場合には９個または１０個のアミノ酸残基から構成される。後者は本明細書において「ノナペプチド」および「デカペプチド」とそれぞれ称される。
【００３７】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸はＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれかであり得る。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記によって参照されてもよい。
【００３８】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって示される。
「剤」および「組成物」という用語は本明細書では互換的に用いられ、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに、特定量の特定成分の組合せから直接的または間接的に生じる任意の生成物を指す。そのような用語は、（「薬学的な剤」および「薬学的組成物」の場合のように）「薬学的（な）」という修飾語に関連して使用されるとき、有効成分と、担体を構成する不活性成分とを含む生成物、ならびに、任意の２つもしくはそれ以上の成分の組合せ、複合体化または凝集から、あるいは、１つもしくは複数の成分の解離から、あるいは、１つもしくは複数の成分の他の種類の反応または相互作用から直接的または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的な剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と、薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の生成物を指す。
【００３９】
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的活性または生理的活性のある、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物との関連において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す成分物質を指す。例えば、がんの治療または予防において使用するための薬学的な剤または組成物の場合、そのような剤または組成物における有効成分は、がん細胞および／またはがん組織に対する少なくとも１つの生物学的作用または生理学的作用を直接的または間接的にもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖の低下または阻害、がん細胞および／または組織の損傷または殺傷などが含まれ得る。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識または殺傷するＣＴＬの誘導である。製剤化される前には、「有効成分」は「バルク」、「原薬」、または「原体」と称することもできる。
【００４０】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
いくつかの本発明の薬学的な剤または組成物は、特にワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を改善、増強および／または誘導する機能を有する剤または組成物を指す。
【００４１】
別段の定めのない限り、「がん」という用語は、ＴＯＰＫ遺伝子を過剰発現するがんまたは腫瘍を指し、その例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
【００４３】
別段の定めのない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊２４０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊２４０３、ＨＬＡ−Ａ＊２４０４、ＨＬＡ−Ａ＊２４０７、ＨＬＡ−Ａ＊２４０８、ＨＬＡ−Ａ＊２４２０、ＨＬＡ−Ａ＊２４２５およびＨＬＡ−Ａ＊２４８８が含まれるが、これらに限定されないサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指す。
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的にはサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、ＨＬＡ−Ａ＊０２０５、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２１１、ＨＬＡ−Ａ＊０２１３、ＨＬＡ−Ａ＊０２１６、ＨＬＡ−Ａ＊０２１８、ＨＬＡ−Ａ＊０２１９、ＨＬＡ−Ａ＊０２２８およびＨＬＡ−Ａ＊０２５０が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「キット」という用語は、試薬と他の物質との組合せに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカーなどを含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組合せに限定することを意図しない。
【００４５】
対象または患者との関連において、本明細書で用いる「対象（または患者）のＨＬＡ抗原がＨＬＡ  Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である」という語句は、対象または患者がＨＬＡ−Ａ２４抗原遺伝子またはＨＬＡ−Ａ２抗原遺伝子をＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩ分子としてホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、ＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原がＨＬＡ抗原として対象または患者の細胞において発現していることを指す。
【００４６】
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用性がある限り、治療が、ＴＯＰＫ遺伝子の発現の低下、対象におけるがんの大きさ、広がりもしくは転移能の減少、がんの進行の遅延、がんの臨床症状の緩和、生存期間の延長、術後再発の抑制などの臨床的利点をもたらすならば、その治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００４７】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
【００４８】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００４９】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を示す。
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同一の意味を有する。
【００５０】
ＩＩ．ペプチド
下記において詳しく記載される本発明のペプチドは「ＴＯＰＫペプチド」または「ＴＯＰＫポリペプチド」と称される場合がある。
ＴＯＰＫ由来のペプチドが、ＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＴＯＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）に由来するペプチドを解析して、それらが、一般に見られるＨＬＡアレルであるＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Ｄａｔｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７：９３−１０１，１９９６；Ｋｏｎｄｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５：４３０７−１２，１９９５；Ｋｕｂｏ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：３９１３−２４，１９９４）。
【００５１】
ＨＬＡ−Ａ２４に対するそれらの結合親和性に基づいて同定されたＴＯＰＫ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドの候補には、下記のものが含まれる：
ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−７３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−８１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−７３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）およびＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）。
【００５２】
上記のうち、下記のペプチドにより、これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激の後、ＣＴＬの樹立に成功した：
ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）。
【００５３】
ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定されたＴＯＰＫ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドの候補には、下記のものが含まれる：
ＴＯＰＫ−Ａ２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−８１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−２２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−３１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−２４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１３８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ＴＯＰＫ−Ａ２−９−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−１９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−８１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−３１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−１１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−１７３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−１４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）、ＴＯＰＫ−Ａ２−１０−２９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）およびＴＯＰＫ−Ａ２−１０−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）。
【００５４】
上記のうち、下記のペプチドにより、これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激の後、ＣＴＬの樹立に成功した：
ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）およびＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）。
【００５５】
上記の樹立されたＣＴＬは、それぞれのペプチドでパルスされた標的細胞に対する強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果は、ＴＯＰＫが、ＣＴＬによって認識される抗原であること、および、これらのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のＴＯＰＫのエピトープペプチドであることを明らかにする；したがって、そのようなペプチドは、ＣＴＬによる細胞傷害性のための標的抗原として有効であり得る。
【００５６】
ＴＯＰＫ遺伝子が、例えばＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍を含む、がん細胞およびがん組織において過剰発現され、ほとんどの正常な器官では発現されないため、ＴＯＰＫ遺伝子は免疫療法のための優れた標的である。したがって、本発明は、ＣＴＬにより認識されるＴＯＰＫ由来のエピトープに対応するノナペプチド（９個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）およびデカペプチド（１０個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）を提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列を有するそのようなペプチドが含まれる。
【００５７】
一般に、例えば、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えば、Ｐａｒｋｅｒ  ＫＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４，１５２（１）：１６３−７５および、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２００３；１２：１００７−１７に記載されるソフトウェアプログラムなどを用いて、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間における結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性を、例えば、Ｐａｒｋｅｒ  ＫＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４，１５２（１）：１６３−７５，Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００１，９８（６）：１８７２−８１，Ｌａｒｓｅｎ  ＭＶ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００７；８：４２４，Ｂｕｕｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．，６２：３７８−８４，２００３，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２００３；１２：１００７−１７およびＮｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２００７；２：ｅ７９６に記載されるように測定することができ、これらは、例えば、Ｌａｆｕｅｎｔｅ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，２００９，１５，３２０９−３２２０に要約されている。結合親和性を求めるための方法が、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９５，１８５：１８１−１９０）、および、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００，９：１８３８−１８４６）に記載される。したがって、ＨＬＡ抗原との高い結合親和性を有するＴＯＰＫ由来のそのような断片を、そのようなソフトウェアプログラムを使用して選択するために、そのようなソフトウェアプログラムを容易に利用することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原と結合することが決定されるであろう、ＴＯＰＫ由来の任意の断片から構成されるペプチドを包含する。さらに、そのようなペプチドには、全長のＴＯＰＫ配列から構成されるペプチドが含まれ得る。
【００５８】
本発明のペプチド、特に本発明のノナペプチドおよびデカペプチドは、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。具体的な付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するペプチド、特にＴＯＰＫ由来のペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２または７６のアミノ酸配列を含むペプチド）を包含する。そのようなペプチドは、例えば、約４０アミノ酸未満であり、多くの場合は約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００５９】
一般に、あるペプチドにおける１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、また、場合によっては元のタンパク質の所望される機能を増強することさえあることが知られている。実際に、改変ペプチド（すなわち、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が元の参照配列と比較して改変された（すなわち、置換、付加、欠失および／または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）が、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４，８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８２，１０：６４８７−５００；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，７９：６４０９−１３）。したがって、１つの態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ、１個、２個、またはさらにそれより多くのアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列を有する。別の言い方をすれば、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持するという条件で、１個、２個、または数個のアミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列において置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を有する。
【００６０】
当業者は、単一のアミノ酸またはアミノ酸配列全体のわずかな割合を変更する、アミノ酸配列に対する個々の改変（すなわち、欠失、挿入、付加および／または置換）が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。そのため、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変更により、元のタンパク質と類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存することが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに、以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４を参照されたい）。
【００６１】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元の未改変ペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＴＯＰＫの多型変異体、種間相同体およびアレルに由来するＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除すべきではない。
【００６２】
より高い結合親和性を達成するために、アミノ酸残基が本発明のペプチドに対して挿入、置換および／または付加される場合があり、あるいは、アミノ酸残基が本発明のペプチドから欠失される場合がある。必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、好ましくは少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸のみを改変（すなわち、欠失、挿入、付加および／または置換）する。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個、３個、またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は好ましくは２０％もしくはそれ未満であり、より好ましくは１５％もしくはそれ未満であり、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満であり、例えば、１〜５％である。
【００６３】
免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するだけでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を保有するペプチドを選択することが好ましい。その目的のために、ペプチドをアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原に対する結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既に公知であるので（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４，１５２：３９１３；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９５，４１：１７８；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４，１５５：４３０７）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
【００６４】
例えば、高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を保有するペプチドは、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンで置換されたＮ末端から２番目のアミノ酸を有する傾向がある。同様に、Ｃ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンで置換されたペプチドが、高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を保有する傾向がある。したがって、ＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を高めるために、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンもしくはトリプトファンで置換すること、および／または、Ｃ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンで置換することが望ましい場合がある。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンもしくはトリプトファンで置換されている、および／または、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンで置換されているペプチドが、本発明によって包含される。また、本発明は、１個、２個、または数個のアミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列において置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、以下の特徴の一方または両方を有するそのようなペプチドを包含する：（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである；および（ｂ）Ｃ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。好ましい態様において、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンもしくはトリプトファンで置換されている、および／または、Ｃ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンで置換されているアミノ酸配列を含む。
【００６５】
同様に、高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を示すペプチドは、ロイシンもしくはメチオニンで置換されたＮ末端から２番目のアミノ酸および／またはバリンもしくはロイシンで置換されたＣ末端のアミノ酸を有する傾向がある。あるいは、ＨＬＡ−Ａ２結合親和性を高めるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンもしくはメチオニンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をバリンもしくはロイシンで置換することが望ましい。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／または、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されているペプチドが、本発明によって包含される。また、本発明は、１個、２個、または数個のアミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列において置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、以下の特徴の一方または両方を有するそのようなペプチドも包含する：（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである；および（ｂ）Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンである。好ましい態様において、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／または、Ｃ末端アミノ酸がバリンもしくはロイシンで置換されているアミノ酸配列を含む。
【００６６】
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、アミノ酸置換を有するペプチドが、例えば、ＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）またはｇｐ１００（２０９−２１７）などでは、元のペプチドと同等もしくはそれより優れたものであり得ることを実証している（Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，４５７０−４５７７，１９９７，Ｔ．Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）；１６８（３）：１３３８−４７．，Ｓ．Ｏ．Ｄｉｏｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００３）５２：１９９−２０６およびＳ．Ｏ．Ｄｉｏｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２００４）５３，３０７−３１４）。
【００６７】
本発明はまた、１個、２個、または数個のアミノ酸を本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に加えることもできる付加も企図する。ＣＴＬ誘導能を有するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００６８】
例えば、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、長さが、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸未満の単離されたペプチドを提供する：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２４および４２〜６０の中より選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）１個、２個、または数個のアミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２４および４２〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列において改変されているアミノ酸配列であって、ペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）ＨＬＡ−Ａ２４との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ａ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている、および
（ｂ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｉｖ）ＨＬＡ−Ａ２との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ｃ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている；および
（ｄ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている。
【００６９】
さらに、本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、長さが、１５、１４、１３、１２、または１１アミノ酸未満の単離されたペプチドも提供する：
（ｉ'）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５〜４０および６１〜８４の中より選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ'）１個、２個、または数個のアミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５〜４０および６１〜８４からなる群より選択されるアミノ酸配列において改変されているアミノ酸配列であって、ペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ'）ＨＬＡ−Ａ２４との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉ'）のアミノ酸配列：
（ａ'）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｂ'）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている。
【００７０】
（ｉｉｉ'）ＨＬＡ−Ａ２との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉ'）のアミノ酸配列：
（ｃ'）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている；ならびに
（ｄ'）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または、そのようなアミノ酸であるように改変されている。
【００７１】
これらのペプチドは、それらのペプチドをＡＰＣと接触させた場合、ＡＰＣ上でＨＬＡ抗原と結合して、ＨＬＡ抗原との複合体としてＡＰＣ上に提示される。あるいは、それらのペプチドは、それらのペプチドをＡＰＣと接触させた場合、ＡＰＣの中に取り入れられ、ＡＰＣにおいて（ｉ）〜（ｉｖ）および（ｉ'）〜（ｉｖ'）の中より選択されるアミノ酸配列を有する断片にプロセッシングされて、ＨＬＡ抗原との複合体としてＡＰＣ上に提示される。結果的に、そのようなペプチドに特異的なＣＴＬが誘導される。
【００７２】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性タンパク質または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、負の副作用、例えば、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などが誘発されることがある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて最初に相同性検索を行うことが好ましい場合がある。目的ペプチドと同一であるか、あるいは、目的ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドが自然界に存在しないことが相同性検索から明らかになった場合、該目的ペプチドは、そのような副作用の危険性を何ら伴うことなく、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるために、および／または、そのＣＴＬ誘導能を増大させるために改変することができる。
【００７３】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００７４】
ＣＴＬ誘導能の確認が、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ））、または、より具体的にはヒト末梢血単核白血球に由来するＤＣを誘導し、ＡＰＣを試験ペプチドで刺激した後、ＡＰＣをＣＤ８陽性Ｔ細胞と混合してＣＴＬを誘導し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することによって達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ，Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ，Ａｕｇｅ  Ｃ，Ｌｏｗ  Ｌ，Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ，Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００，６１（８）：７６４−７９，Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｂｏｏｋｓ，Ｌｉｎｋｏｕｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ＨＬＡ  Ａ＊０２０１／ＤＲ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ（Ｈ）  ｒｅｓｐｏｎｓｅに記載されるトランスジェニック動物）を使用することができる。あるいは、標的細胞を５１Ｃｒなどで放射標識することができ、標的細胞から放出された放射能からＣＴＬの細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００７５】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６によって示されるアミノ酸配列の中より選択されるノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性と同様に、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが発見された。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例示される。
【００７６】
さらに、相同性解析結果から、そのようなペプチドが、他のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも有意な相同性を有していないことが実証された。そのため、免疫療法に用いた場合に未知のまたは望ましくない免疫応答が生じる可能性は低くなっている。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドは、がん患者においてＴＯＰＫに対する免疫を誘発させるために有用である。したがって、本発明のペプチドの好ましい例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに、それらの改変ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
上述のように、本発明のペプチドは、ＴＯＰＫに特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４を介してＴＯＰＫ由来のペプチドを提示する細胞（例えば、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞）に対する特異的な細胞傷害活性を示すことができるＣＴＬを誘導する能力を有する。そのような細胞の例には、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん細胞が含まれる。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２を介してＴＯＰＫ由来のペプチドを提示する細胞（例えば、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞）に対する特異的な細胞傷害活性を示すことができるＣＴＬを誘導する能力を有する。そのような細胞の例には、ＨＬＡ−Ａ２陽性のがん細胞が含まれる。
【００７８】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドはまた、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、より好ましくは、必要なＨＬＡ結合能もまた保持する限り、他のペプチドに連結することができる。好適な「他の」ペプチドの例には、本発明のペプチド、または、他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。本発明のペプチドは、リンカーを介して直接的または間接的に「他の」ペプチドに連結させることができる。好適なペプチド間リンカーは当技術分野では周知であり、これらには、例えば、ＡＡＹ（Ｐ．Ｍ．Ｄａｆｔａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ２００７，５：２６）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１６５：７３０８−７３１５）またはＫ（Ｓ．Ｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｒｅｓ．６２，１４７１−１４７６，Ｋ．Ｓ．Ｋａｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，１６８：５７０９−５７１５）が含まれる。
【００７９】
例えば、ＴＯＰＫ以外の腫瘍関連抗原ペプチドもまた、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、続いて、または同時に使用することができる。がん細胞が２種類以上の腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは、十分に確立されている。したがって、当業者が、特定の対象がさらなる腫瘍関連遺伝子を発現するかどうかを判定すること、そして、その後、そのような遺伝子産物に由来するＨＬＡクラスＩ結合ペプチドおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを本発明の薬学的組成物またはワクチンに含めることは、慣例的な実験法の範囲内である。
【００８０】
ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの一部が当業者には公知であり（例えば、Ｃｏｕｌｉｅ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １３：３９３−４０３，１９９５を参照されたい）、本明細書に開示される様式と同様の様式で本発明において用いることができる。したがって、当業者は、１種もしくは複数種のＴＯＰＫペプチドおよび１種もしくは複数種の非ＴＯＰＫペプチドを含むポリペプチド、または、そのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準的な手順を用いて容易に調製することができる。
【００８１】
上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で一緒に連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の刺激、増強、および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
【００８２】
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用によって連結して、ポリトープを形成することができ、ポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２（１３）：５８４５−５８４９，１９９５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（１２）：１２８０−１２８４，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（２）：８２２−８２６，１９９６；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１（１）：２９９−３０６，１９９０を参照されたい）。様々な数および組合せのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
【００８３】
本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが、元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。好適な物質の例には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然ポリマーおよび合成ポリマーなどが含まれる。ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾は、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与するために、またはペプチドを安定化するために実施し得る。
【００８４】
例えば、ペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のペプチドに対して適合することもできる。ペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼならびに様々な生物学的媒質、例えばヒトの血漿および血清を使用して、安定性を試験することができる（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ  １９８６，１１：２９１−３０２を参照されたい）。
【００８５】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、挿入または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的方法は以下の段階を含む：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を改変する（すなわち、置換、欠失、挿入または付加する）段階、
ｂ：ペプチドの活性を測定する段階、
ｃ：元のペプチドと比較して同じ活性またはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
【００８６】
好ましい態様において、本発明は、ＴＯＰＫ由来の断片を提示する細胞に対する特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する能力を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む、方法を提供する：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７、２８、４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６からなる群より選択される元のアミノ酸配列に対して１個、２個、または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列からなる候補配列を提供する段階、
（ｉｉ）ＴＯＰＫ以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも実質的に有意な相同性（または配列同一性）を有さない候補配列を選択する段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において選択される前記候補配列からなるペプチドを抗原提示細胞と接触させる段階、
（ｉｖ）段階（ｃ）の前記抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させる段階、ならびに
（ｖ）ＣＴＬ誘導能が、前記元のアミノ酸配列からなるペプチドと同じであるかまたはそれよりも高い前記ペプチドを特定する段階。
本明細書において、アッセイされる活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。好ましくは、アッセイされるペプチドの活性はＣＴＬ誘導能である。
【００８７】
ＩＩＩ．ＴＯＰＫペプチドの調製：
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００８８】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば、ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる１種もしくは複数種のＤ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。
【００８９】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に採用され得る従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；
（ｉｉ）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；
（ｉｉｉ）ペプチド合成（日本語），丸善，１９７５；
（ｉｖ）ペプチド合成の基礎と実験（日本語），丸善，１９８５；
（ｖ）医薬品の開発（日本語），続第１４巻（ペプチド合成），広川書店，１９９１；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Ｂａｒａｎｙ  Ｇ．＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｂ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  第２巻，「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０，１００−１１８。
【００９０】
あるいは、本発明のペプチドは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合化して得ることができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｊ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９７７，１３２：３４９−５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．編）１９８３，１０１：３４７−６２）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を採用して、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００９１】
ＩＶ．ポリヌクレオチド：
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然のＴＯＰＫ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８４９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５））に由来するポリヌクレオチド、同様にまた、その保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。当技術分野において周知の通り、ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれ得ることを認識する。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってもよく、またはマーカー遺伝子などを有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００９３】
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ポリヌクレオチドを、ＰＣＲ技法または適切な宿主における発現を用いて増幅することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。あるいは、ポリヌクレオチドを、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ＆Ｉｙｅｒ  ＲＰ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８：２２２３−３１１；Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９８４，３：８０１−５に記載されるような固相技法を用いて合成することができる。
【００９４】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成される複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００９５】
複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊２４０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が広く一般的であり、したがってこれは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＨＬＡ−Ａ２４型の使用が、有効な結果を得るために好ましく、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプもまた使用される。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを得るために、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加を、天然のＴＯＰＫ部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて行うことができる。
【００９６】
本発明のエキソソームがＨＬＡ−Ａ２４型を抗原として有する場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが特に有用である。
あるいは、本発明のエキソソームがＨＬＡ−Ａ２型を抗原として有する場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが特に有用である。
【００９７】
いくつかの態様において、本発明のエキソソームは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体を自身の表面上に提示するエキソソームである。典型的な態様において、本発明のエキソソームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７または２８のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）とＨＬＡ−Ａ２４との複合体を自身の表面上に提示する。他の態様において、本発明のエキソソームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２または７６のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）とＨＬＡ−Ａ２との複合体を自身の表面上に提示する。
【００９８】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）：
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を自身の表面上に提示する単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してもよく、かつ、単独で、または、本発明のペプチド、エキソソームもしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００９９】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されない。ＡＰＣの例には、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、好ましくは、ＤＣを本発明のＡＰＣとして使用することができる。
【０１００】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（本発明のペプチドで刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。本明細書において、「ＡＰＣを誘導する」という語句は、抗原提示細胞を本発明のペプチドと接触させること（本発明のペプチドで刺激すること）、または、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入して、ＡＰＣに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示させることを含む。例えば、本発明のＡＰＣは、本発明の１種もしくは複数種のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることができる。
【０１０１】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【０１０２】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られるＡＰＣは、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍などのがんを治療および／または予防するためのワクチンとして製剤化し、投与することができる。
【０１０３】
本発明との関連において、本発明の１種もしくは複数種のペプチドが、抗原提示細胞を誘導するための薬学的組成物を製造するために利用される場合がある。抗原提示細胞を誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程が本明細書において提供され、該方法または工程は好ましくは、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む。
【０１０４】
本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドの使用を提供する。
本発明の一局面によれば、本発明のＡＰＣはＣＴＬ誘導能を有する。ＡＰＣとの関連において、「ＣＴＬ誘導能」という語句は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させたときにＣＴＬを誘導するＡＰＣの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」には、ＣＴＬ活性化を誘導するＡＰＣの能力、ＣＴＬ増殖を誘導するＡＰＣの能力、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進するＡＰＣの能力、および、ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増加させるＡＰＣの能力が含まれる。特に、本発明のＡＰＣは、ＴＯＰＫに特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する。
【０１０５】
ＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であることが可能である。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、当技術分野において従来実施されている様々な方法が含まれ、それらを使用することができる。より具体的には、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６，５６：５６７２−７；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８，１６１：５６０７−１３；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６，１８４：４６５−７２；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。本発明のペプチドをコードする遺伝子をＡＰＣに移入することによって、遺伝子は細胞内で転写、翻訳などを受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされ、提示経路を経て、本発明のペプチドが提示される。あるいは、本発明のＡＰＣは、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階を誘導する方法によって調製することができる。
【０１０６】
いくつかの態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣである。典型的な態様において、本発明のＡＰＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７または２８のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）とＨＬＡ−Ａ２４との複合体を自身の表面上に提示する。他の態様において、本発明のＡＰＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２または７６のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）とＨＬＡ−Ａ２との複合体を自身の表面上に提示する。
【０１０７】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）：
本発明のペプチドのいずれか１種に対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドのいずれか１種によって特異的に誘導または活性化される単離されたＣＴＬを提供する。
【０１０８】
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、（２）対象由来ＡＰＣおよびＣＤ８陽性Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させること、（３）ＣＤ８陽性Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または、（４）細胞表面上でＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を形成することができるＴＣＲサブユニットをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを導入することによって得ることができる。（３）の方法のためのそのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができる。（４）の方法の詳細が、以下の「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の節で説明される。
【０１０９】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、効果を調節するという目的のために、単独で、または、上記のペプチド、ＡＰＣ、もしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、例えばがん細胞のように、ＴＯＰＫを内因的に発現する細胞、または、ＴＯＰＫ遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、また、本発明のペプチドによる刺激に起因して該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞はまた、活性化されたＣＴＬ攻撃の標的として役立ち得る。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識することができる。ＣＴＬとの関連において、「細胞を認識する」という語句は、細胞表面上でＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体にそのＴＣＲを介して結合すること、および該細胞に対する特異的な細胞傷害活性を示すことを指す。本明細書において、「特異的な細胞傷害活性」は、ＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示する細胞に対して細胞傷害活性を示すが、他の細胞に対しては示さないことを指す。したがって、本発明のペプチドを提示する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を示すＣＴＬが本発明に含まれる。
【０１１１】
典型的な態様において、本発明のＣＴＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７または２８のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）を、ＨＬＡ−Ａ２４を介して提示する細胞を認識することができる。好ましい態様において、本発明のそのようなＣＴＬは、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞（例えば、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん細胞）を認識することができる。
他の態様において、本発明のＣＴＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２または７６のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）を、ＨＬＡ−Ａ２を介して提示する細胞を認識することができる。好ましい態様において、本発明のそのようなＣＴＬは、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞（例えば、ＨＬＡ−Ａ２陽性のがん細胞）を認識することができる。
【０１１２】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）：
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができるポリペプチドをコードする１種または複数種のポリヌクレオチドを含む組成物、および、それを使用する方法を提供する。そのようなＴＣＲサブユニットは、ＴＯＰＫを発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を使用することによって、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、および、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，３２８８（２００３））。例えば、ＴＣＲを解析するためにはＰＣＲ法が好ましい。解析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとして、５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）、および３'側プライマーとしてＴＣＲのα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）、ＴＣＲのβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）、または、ＴＣＲのβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＴＯＰＫペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、場合により、本発明のＴＯＰＫペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロにおいて媒介し得る。
【０１１３】
ＴＣＲサブユニットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（すなわち、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、または、ＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチド）を、適切なベクターに、例えば、レトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該ポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチドを有用に含むベクターを、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）に、例えば、患者由来のＴ細胞に移入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変によって、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に利用可能な組成物を提供する。
【０１１４】
本発明のペプチドに対する特異的なＴＣＲは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に発現される場合、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を特異的に認識して、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する標的細胞に対する特異的な活性をＴ細胞に与えることができるだろう。そのようなＴＣＲのサブユニットをコードするポリペプチドを導入することによって調製されたＣＴＬがそのような標的細胞を特異的に認識することができる任意の公知の方法によって、必要な活性を確認することができる。そのような方法の好ましい例には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを使用するテトラマー解析、ならびに、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、上記のような方法により調製されたＣＴＬが標的細胞を特異的に認識し得ること、および、そのような認識によって生じたシグナルが細胞内に伝達され得ることを確認することができる。さらに、上記方法によって調製されたＣＴＬが標的細胞に対する特異的な細胞傷害活性を有することを公知の方法によって確認することができる。そのような方法の例には、例えば、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２の両方を発現する細胞を使用するクロム遊離アッセイが含まれる。
【０１１５】
１つの局面において、本発明は、ＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリペプチド（すなわち、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、または、ＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチド）による形質導入によって調製されるＣＴＬを提供し、ここで、そのようなＴＣＲサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０の中より選択されるアミノ酸配列を有するＴＯＰＫペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体に結合することができるか、または、細胞表面上で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列を有するＴＯＰＫペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体に結合することができる。
【０１１６】
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４５２−３４６１（１９８９））。本発明のＣＴＬは、療法または防御を必要としている患者におけるがんの治療および予防のどちらかまたは両方において有用な免疫原性組成物を形成するために使用し得る（ＷＯ２００６／０３１２２１を参照されたい。その内容は参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１１７】
ＩＸ．薬学的な剤または組成物：
ＴＯＰＫの発現が、正常な組織と比較して、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍がその例として含まれるが、これらに必ずしも限定されないがんにおいて特異的に上昇しているので、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、がんに対する免疫応答を誘導するために使用される場合があり、したがって、がんの治療および／もしくは予防のために、ならびに／または、その転移もしくは術後再発の予防のために役立つ場合がある。したがって、本発明は、がんの治療および／もしくは予防のために、ならびに／または、術後のその再発予防のために製剤化される薬学的な組成物または剤であって、本発明の１種もしくは複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを１種または複数種の有効成分として含む組成物または剤を提供する。あるいは、本発明のペプチドは、薬学的な組成物または剤として用いるために、前述のエキソソームまたは細胞（例えば、ＡＰＣなど）のいずれかの表面に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれか１種を標的とする前述のＣＴＬはまた、本発明の薬学的な組成物または剤の有効成分として用いることができる。
【０１１８】
したがって、本発明は、下記の中より選択される少なくとも１種の有効成分を含む剤または組成物を提供する：
（ａ）本発明の１種または複数種のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードする１種または複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明の１種または複数種のＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の１種または複数種のＣＴＬ。
【０１１９】
本発明の薬学的な組成物または剤はまた、ワクチンとしての使用が見出される。本発明との関連において、「ワクチン」（これは「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫性を改善、増強および／または誘導する機能を有する剤または組成物を指す。換言すると、本発明は、対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための薬学的な剤または組成物を提供する。
【０１２０】
本発明の薬学的な組成物または剤は、対象または患者において、がんの治療および／もしくは予防のために、ならびに／または、術後のその再発もしくは転移再発の予防のために使用することができる。そのような対象の例には、ヒト、ならびに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、サル、ヒヒおよびチンパンジーが含まれるが、これらに限定されない他の哺乳動物、特に、商業的に重要な動物または飼育動物が含まれる。いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化することができる。
【０１２１】
別の態様において、本発明はまた、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するための、ならびに／または、術後のその再発を予防するための薬学的な組成物または剤を製造することにおける、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（ｅ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１２２】
あるいは、本発明はさらに、がんもしくは腫瘍の治療および予防のどちらかまたは両方、ならびに／または、術後のその再発の予防において使用するための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（ｅ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１２３】
あるいは、本発明はさらに、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するための、ならびに／または、術後のその再発を予防するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分とともに、薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（ｅ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１２４】
別の態様において、本発明はまた、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するための、ならびに／または、術後のその再発を予防するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（ｅ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１２５】
別の態様において、本発明はまた、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するための、ならびに／または、術後のその再発を予防するための方法であって、以下の中より選択される少なくとも１種の有効成分を対象に投与する段階を含む方法を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（ｅ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１２６】
本発明によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドであり得る。これらのペプチドの中で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４およびＴＯＰＫを発現するがんに対する強力かつ特異的な免疫応答を対象において効果的に誘導することができる。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであり得る。これらのペプチドの中で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２およびＴＯＰＫを発現するがんに対する強力かつ特異的な免疫応答を対象において効果的に誘導することができる。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドおよびそれらの改変ペプチドのいずれかを含む薬学的な組成物または剤が、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である対象への投与のために特に適している。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドおよびそれらの改変ペプチドのいずれかを含む薬学的な組成物または剤は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含有する薬学的な組成物または剤にも当てはまる。
【０１２７】
本発明の薬学的な組成物または剤によって治療されるがんには、ＴＯＰＫが関与するすべての種類のがんが含まれ、これらには、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明の薬学的な組成物または剤は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、そのような他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、そのような他のペプチドを提示する他の細胞などを含有することができる。がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するそのような「他の」ペプチドの例には、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）が含まれるが、これに限定されない。
【０１２９】
必要ならば、本発明の薬学的な組成物または剤は、他の治療物質が有効成分（例えば、本発明のペプチドのいずれか）の抗腫瘍効果を阻害しない限り、付加的な有効成分としてそのような他の治療物質を任意に含むことができる。例えば、製剤は、抗炎症性物質、鎮痛剤、化学療法薬などを含むことができる。他の治療物質を医薬自体に含めることに加えて、本発明の医薬はまた、１つまたは複数の他の薬理学的組成物と連続してまたは同時に投与することができる。医薬および薬理学的組成物の量は、例えば、使用する薬理学的組成物の種類、治療する疾患、ならびに、投与スケジュールおよび投与経路に依存する。
【０１３０】
当業者は、本明細書において特に言及された成分に加えて、本発明の薬学的な組成物または剤が、対象となる製剤の種類を考慮して当技術分野において慣用的である他の物質（例えば、増量剤、結合剤、希釈剤、賦形剤など）を含み得ることを認識するであろう。
【０１３１】
本発明の１つの態様において、本発明の薬学的な組成物または剤を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な組成物または剤のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、組成物または剤が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与などに関する指示も示し得る。
【０１３２】
本発明の薬学的な組成物または剤を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
薬学的な組成物または剤は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置に詰めることができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【０１３３】
（１）有効成分としてペプチドを含有する薬学的な剤または組成物：
本発明のペプチドは、薬学的な組成物または剤として直接に投与することができ、あるいは、必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化される場合がある。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤などが特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬学的な組成物または剤は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤などを含有し得る。本発明の薬学的な組成物または剤は、抗がん目的に用いることができる。
【０１３４】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２つまたはそれ以上から構成される組合せとして調製することができる。ペプチドの組合せはカクテルの形態をとってもよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組合せにおけるペプチドは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象から取り出し、その後、本発明のペプチドによって刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再投与し、対象においてＣＴＬを誘導させ、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増加させることができる。
【０１３５】
有効成分として本発明のいずれかのペプチドを含有する、がんの治療および／または予防のための薬学的な組成物または剤は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な組成物または剤は、他の有効成分と共に投与してもよく、または顆粒内に製剤化することによって投与してもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書において企図されるアジュバントには、文献（Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９４，７：２７７−８９）に記載されるアジュバントが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗ型エマルションなどが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に使用してもよい。
【０１３６】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、および、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩が含まれる。本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という語句は、その化合物の生物学的な有効性および特性を保持し、かつ、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られるそのような塩を指す。
【０１３７】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な組成物または剤はさらに、ＣＴＬを抗原刺激（ｐｒｉｍｅ）する成分を含む場合がある。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを抗原刺激することができる物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリシン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合し、次いで本発明のペプチドに連結することができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による抗原刺激の別の一例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリポタンパク質、例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などを、適切なペプチドに共有結合させたときにはＣＴＬを抗原刺激するために使用することができる（例えば、Ｄｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２：５６１−４を参照されたい）。
【０１３８】
適切な投与方法の例には、経口、皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹膜および静脈内注射など、ならびに、全身投与または標的部位近傍への局所投与（すなわち、直接注射）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療されるべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに応じて適宜調整することができ、これは通常、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば、０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切かつ最適な投薬量を容易に決定することができる。
【０１３９】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含有する薬学的な剤または組成物：
本発明の薬学的な組成物または剤はまた、本発明のペプチドを発現可能な形態でコードする核酸も含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現のために必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように、必要なものを備えることができる（相同組換えカセットベクターの説明については、例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ＫＲ＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ，Ｃｅｌｌ  １９８７，５１：５０３−１２を参照されたい）。例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，２４７：１４６５−８；米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１４０】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５１：４５６−６０に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなどが明らかである。例えば、Ｓｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ２０００，６：６６−７１；Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０００，６８：７９３−８０６；Ｈｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２０００，１４：５７１−８５を参照されたい。
【０１４１】
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１４２】
遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １９９３，３３：５７３−９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６０：９２６−３２；Ｍｏｒｇａｎ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３，６２：１９１−２１７；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９３，１１（５）：１５５−２１５を参照されたい。本発明に適用可能である組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．によって、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９３）に記載されており、また、Ｋｒｉｅｇｅｒによって、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）に記載されている。
【０１４３】
ペプチドの投与と同様に、ポリヌクレオチドの投与が、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内および／または腹膜注射などによって行われる場合があり、また、全身投与または標的部位近傍への局所投与は使用が見出される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体におけるポリヌクレオチドの用量、または、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞におけるポリヌクレオチドの用量は、治療されるべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに応じて適宜調整することができ、これは通常、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば、０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日毎に１回から数ヶ月毎に１回までで投与することができる。当業者は、適切かつ最適な投薬量を容易に決定することができる。
【０１４４】
Ｘ．ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、ＡＰＣおよびＣＴＬを使用する方法：
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導するために使用することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣはまた、ＣＴＬを調製または誘導するために使用することができる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、ＣＴＬ誘導能を他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な組成物または剤のいずれかを用いて、ＣＴＬを調製または誘導することができる。それらに加えて、前記ペプチドまたはポリヌクレオチドを含むものもまた、以下で議論されるように、ＡＰＣを調製または誘導するために使用することができる。
【０１４５】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣをエクスビボで誘導する方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：ＡＰＣを対象から回収する段階；および
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階。
【０１４６】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されない。ＡＰＣの例には、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている、ＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有することから、好ましくはＤＣを用いることができる。本発明のペプチドのいずれか１種を単独で、または、本発明の他のペプチドもしくはＴＯＰＫ以外のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドと組み合わせて用いることができる。
【０１４７】
一方で、本発明のペプチドが対象に投与される場合、ＡＰＣが該ペプチドとインビボで接触し、その結果、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明の方法は、本発明のペプチドを対象に投与して、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを対象の体内で誘導する段階を含んでもよい。同様に、本発明のポリヌクレオチドが発現可能な形態で対象に投与される場合、本発明のペプチドがインビボで発現し、ＡＰＣと接触し、その結果、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与して、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを対象の体内で誘導する段階を含んでもよい。「発現可能な形態」という語句は、上記において、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物、（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含有する薬学的な剤または組成物」の節で記載された。
【０１４８】
あるいは、本発明の方法は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入して、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する段階を含んでもよい。例えば、本方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：ＡＰＣを対象から回収する段階；および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを段階ａのＡＰＣに導入する段階。
段階ｂは、上記において「ＶＩ．抗原提示細胞」の節で記載されるように実施することができる。
【０１４９】
あるいは、本発明の方法は、以下の段階のうちの１つにより、ＴＯＰＫに対するＣＴＬ活性を特異的に誘導することができる抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する段階を含んでもよい：
（ａ）ＡＰＣを、本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１５０】
あるいは、本発明の方法は、以下の段階の中より選択される段階を含み、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために役立つ場合がある：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１５１】
好ましい態様において、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導または調製する方法であって、以下の段階の１つを含む方法を提供する：
（ａ）ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＡＰＣを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドと、インビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣに導入する段階。
上記方法によって誘導されるＡＰＣは、そのようなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を介して自身の表面上に提示し、ＨＬＡ−Ａ２４およびＴＯＰＫを発現する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導することができる。
【０１５２】
別の態様において、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導または調製する方法であって、以下の段階の１つを含む方法を提供する：
（ａ）ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドと、インビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８４（とりわけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６）の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣに導入する段階。
上記方法によって誘導されるＡＰＣは、そのようなペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２を介して自身の表面上に提示し、ＨＬＡ−Ａ２およびＴＯＰＫを発現する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導することができる。
【０１５３】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用するＡＰＣは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原を発現するＡＰＣであってよい。そのようなＡＰＣは、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から当技術分野において周知の方法によって調製することができる。本発明の方法によって誘導したＡＰＣは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原）との複合体を自身の表面に提示するＡＰＣであり得る。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために本発明の方法によって誘導されたＡＰＣを対象に投与する場合、対象は、好ましくは、ＡＰＣが由来する同一の対象である。しかし、対象は、対象がＡＰＣドナーと同一のＨＬＡ型を有する限り、ＡＰＣドナーと異なる対象であってもよい。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用するための剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の１種または複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、ＡＰＣの誘導のために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
あるいは本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用される本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリペプチドをさらに提供する。
【０１５５】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソームまたはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を形成し得るポリペプチド（すなわち、ＴＣＲサブユニット）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを使用してＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導する方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞と接触させる段階；
ｂ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと接触させる段階；および
ｃ：本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識することができるＴＣＲを形成し得るポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
【０１５６】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたはエキソソームが対象に投与される場合、ＣＴＬが該対象の体内で誘導され、ＴＯＰＫを発現するがん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって、前述の段階に代えて、本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたはエキソソームを対象に投与する段階を含んでもよい。
【０１５７】
あるいは、ＣＴＬはまた、それらをエクスビボまたはインビボで用いて誘導することができ、ＣＴＬ誘導後、活性化されたＣＴＬが対象に戻される。例えば、本方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：ＡＰＣを対象から回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性Ｔ細胞と共培養する段階。
【０１５８】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性Ｔ細胞と共培養されるためのＡＰＣはまた、上記において「ＶＩ．抗原提示細胞」の節で記載されるように、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに移入することによって調製することができるが、本発明はこれに限定されず、したがって、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【０１５９】
上述のＡＰＣの代わりに、任意で、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを利用してもよい。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の節に上述した方法によって調製することができる。本発明の方法のための好適なＡＰＣおよびエキソソームは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２との複合体を自身の表面上に提示する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、２７および２８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）との複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソームを好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４およびＴＯＰＫを発現する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導するために利用することができる。同様に、ＨＬＡ−Ａ２と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４５、４７、５０、５１、５３、５４、６２、６３、６４、６６、７１、７２および７６の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）との複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソームを好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２およびＴＯＰＫを発現する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導するために利用することができる。
【０１６０】
さらに、本発明のＣＴＬは、ＴＣＲサブユニットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することによって誘導することができ、ここで、そのようなＴＣＲサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上で、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体に結合することができる。そのような形質導入は、上記において「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の節で記載されるように実施することができる。
【０１６１】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。ＣＴＬの誘導のために使用されるＣＤ８陽性Ｔ細胞は、対象から得られるＰＢＭＣから当技術分野において周知の方法によって調製することができる。好ましい態様において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のためのドナーは、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象であってよい。本発明の方法によって誘導したＣＴＬは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識し得るＣＴＬであってよい。そのようなＣＴＬは、本発明のペプチドを自身の表面上に提示する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を示すことができ、したがって、ＴＯＰＫを発現する細胞（例えば、がん細胞）に対する特異的な細胞傷害活性を示すことができる。本発明の方法によって誘導されるＣＴＬが、対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために該対象に投与される場合、該対象は好ましくは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が由来する同一の対象である。しかし、対象がＣＤ８陽性Ｔ細胞ドナーと同一のＨＬＡ型を有する限り、該対象はＣＤ８陽性Ｔ細胞ドナーと異なる対象でよい。
【０１６２】
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【０１６３】
別の態様において、本発明は、ＣＴＬを誘導するための剤または組成物であって、本発明の１種もしくは複数種のペプチド、１種もしくは複数種のポリヌクレオチドまたは１種もしくは複数種のＡＰＣもしくはエキソソームを含む剤または組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬの誘導のために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはＡＰＣもしくはエキソソームの使用を提供する。
あるいは本発明は、ＣＴＬの誘導に使用される本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはＡＰＣもしくはエキソソームをさらに提供する。
【０１６４】
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに、本発明は、ＴＯＰＫに関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。企図される疾患にはがんが含まれ、その例として、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
本発明の方法は、本発明のペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含有する剤または組成物を投与する段階を含み得る。あるいは、本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣを投与する段階を含み得る。詳細については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物」の項目、特に、ワクチンとしての本発明の薬学的組成物の使用を記載する部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に用いることができるエキソソームおよびＡＰＣが、上記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに、「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣおよびＣＴＬを使用する方法」の（１）および（２）の項目において詳述されている。
【０１６６】
本発明はまた、がんに対する免疫応答を誘導する薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程を提供し、該方法は本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含み得る。
【０１６７】
あるいは、本発明の方法は、以下を含む本発明のワクチンまたは薬学的な組成物もしくは剤を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；または
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１６８】
本発明との関連において、ＴＯＰＫを過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。したがって、上記有効成分を含むワクチンまたは薬学的な組成物もしくは剤を投与する前に、治療すべき対象におけるＴＯＰＫの発現レベルが増強しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＴＯＰＫを（過剰）発現するがんの治療を、それを必要とする患者において行なうための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られた生物学的試料におけるＴＯＰＫの発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＴＯＰＫの発現レベルを正常な対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）の中より選択される少なくとも１つの成分を、正常な対照と比較してＴＯＰＫを過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１６９】
あるいは、本発明は、ＴＯＰＫを過剰発現するがんを有する対象に投与するための、上記の（ａ）〜（ｄ）の中より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＴＯＰＫポリペプチドで治療すべき対象を同定するための方法であって、対象由来の生物学的試料におけるＴＯＰＫの発現レベルを決定する段階を含み、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して増強していることにより、該対象が、本発明のＴＯＰＫポリペプチドで治療され得るがんを有し得ることが示される方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下に、より詳細に説明する。
【０１７０】
目的とするＴＯＰＫの転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織を、ＴＯＰＫの発現を決定するために使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製し、次いでこれを対象由来試料として使用してよい。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
本発明によれば、対象から得られた生物学的試料におけるＴＯＰＫの発現レベルが決定され得る。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＴＯＰＫのｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量し得る。検出は、チップまたはアレイにおいて行うことができる。アレイの使用は、ＴＯＰＫの発現レベルを検出するために好ましい。当業者は、そのようなプローブを、ＴＯＰＫの配列情報を利用して調製することができる。例えば、ＴＯＰＫのｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、適切な標識、例えば色素、蛍光物質および同位体で標識してよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、ＴＯＰＫの転写産物を、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを用いて定量し得る。そのようなプライマーは、該遺伝子の利用可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【０１７２】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または、低ストリンジェントな条件下でＴＯＰＫのｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によって達成してもよい。
【０１７３】
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは典型的には、ストリンジェントな条件のもとで、少なくとも約２０００、１０００、５００、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０もしくは２５の連続する、ＴＯＰＫ配列を含む核酸のセンス鎖ヌクレオチド配列、または、ＴＯＰＫ配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列に、または、これらの配列の天然の変異体にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。特に、例えば、好ましい態様において、５〜５０の長さを有するオリゴヌクレオチドを、検出すべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして用いることができる。より好ましくは、ＴＯＰＫ遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、特定のサイズ、一般に長さが１５ｂ〜３０ｂのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーにより検出することができる。サイズは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドの範囲であってよく、プローブおよびプライマーのサイズは５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドの範囲にわたってよい。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは、１５〜２５から選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって遺伝子を検出するためのアッセイ手順、装置または試薬は、周知のものである（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーはタグまたはリンカー配列も含み得る。さらに、プローブまたはプライマーは、検出可能な標識または捕捉される親和性リガンドで修飾することができる。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づく検出手順において、数百（例えば、約１００〜２００）塩基から数千（例えば、約１０００〜２０００）塩基長を有するポリヌクレオチドもまた、プローブに使用することができる（例えば、ノーザンブロッティングアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）。
【０１７４】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＴＯＰＫタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）またはその免疫学的断片の量が測定され得る。翻訳産物としてタンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＴＯＰＫタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物を（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなどを）検出に用いることができる。本発明のペプチドに対するそのような抗体およびその断片も本発明によって提供される。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１７５】
ＴＯＰＫ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＴＯＰＫタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により染色の強度を測定してもよい。すなわち、この測定では、強い染色により、該タンパク質の増大した存在／レベルが示され、それと同時に、ＴＯＰＫ遺伝子の高い発現レベルが示される。
【０１７６】
がん細胞における、標的遺伝子、例えば、ＴＯＰＫ遺伝子のがん細胞における発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常な細胞におけるレベル）から、例えば、１０％、２５％もしくは５０％上昇するか、または、１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超もしくはそれ以上に上昇する場合には上昇していると判定され得る。
【０１７７】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料におけるＴＯＰＫ遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて統計学的方法によって決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の１つの局面によれば、生物学的試料におけるＴＯＰＫ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＴＯＰＫ遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【０１７８】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
ＴＯＰＫ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、または、がん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は、治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１７９】
本発明はまた、（ｉ）治療すべきがんを有する疑いのある対象を診断する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、該方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた生物学的試料におけるＴＯＰＫの発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＴＯＰＫの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＴＯＰＫの発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、該対象を、治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１８０】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた生物学的試料におけるＴＯＰＫの発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＴＯＰＫの発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＴＯＰＫの発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合、該対象を、治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１８１】
本発明はまた、本発明のＴＯＰＫポリペプチドにより治療され得るがんに罹患している、もしくは罹患していることが疑われるか、または、本発明のＴＯＰＫポリペプチドにより治療され得るがんを発症する危険性がある、もしくはそのような危険性があることが疑われる対象を、診断または判定するための診断キットを提供し、該キットはまた、がん免疫療法の効果または適用性の評価およびモニターの一方または両方において有用であり得る。好ましくは、そのようながんには、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは好ましくは、対象由来の細胞におけるＴＯＰＫ遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、そのような試薬は以下の群より選択される場合がある：
（ａ）ＴＯＰＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＴＯＰＫタンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＴＯＰＫタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１８２】
ＴＯＰＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出するために適した試薬の例には、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、または、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれ得る。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡを検出するための試薬は固体マトリックス上に固定化され得る。さらに、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬がキットに含まれる場合がある。
【０１８３】
一方で、ＴＯＰＫタンパク質またはその免疫学的断片を検出するために適した試薬の例には、ＴＯＰＫタンパク質またはその免疫学的断片に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＴＯＰＫタンパク質またはその免疫学的断片への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物を（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなどを）試薬として用い得る。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＴＯＰＫタンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１８４】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。キットはさらに、ＴＯＰＫ遺伝子に対するプローブまたはＴＯＰＫペプチドに対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびに、ＴＯＰＫペプチドに対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんを有さない対象、またはがんに罹患している対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬などは、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１８５】
本発明の１つの態様において、試薬が、ＴＯＰＫ  ｍＲＮＡに対するプローブである場合、該試薬を、固体マトリックス（例えば、多孔性ストリップなど）に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料が添加されると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＴＯＰＫ  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１８６】
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはＴＯＰＫ標準試料を含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＴＯＰＫ陽性試料を回収し、次にそれらのＴＯＰＫレベルをアッセイすることによって調製され得る。あるいは、精製されたＴＯＰＫタンパク質またはＴＯＰＫポリヌクレオチドを、ＴＯＰＫを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＴＯＰＫ標準試料を形成してもよい。本発明において、精製されたＴＯＰＫは組換えタンパク質である場合がある。陽性対照試料のＴＯＰＫレベルは、例えば、カットオフ値よりも高い。
【０１８７】
一つの態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片によって特異的に認識されるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
本発明のタンパク質の部分ペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における少なくとも８個、好ましくは１５個、より好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質およびペプチドを調製するための方法は、上記の通りである。
【０１８８】
本発明のがん診断方法は、抗ＴＯＰＫ抗体の量と、上記のような対応する対照試料における抗ＴＯＰＫ抗体の量との差を測定することによって実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＴＯＰＫ）に対する抗体を含み、抗ＴＯＰＫ抗体の量が、正常対照中の抗ＴＯＰＫ抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合、該対象は、がんに罹患していることが疑われる。
【０１８９】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合するＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出するための方法が既に確立されている（例えば、Ａｌｔｍａｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６，２７４（５２８４）：９４−６）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを用いることができる。
【０１９０】
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Ａｌｔｍａｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６，２７４（５２８４）：９４−６を参照されたい）、放射標識されたＨＬＡ分子と本発明のペプチドとのオリゴマー複合体（例えば、四量体など）を調製することができる。この複合体を使用して、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを定量することによって、診断を行うことができる。
【０１９１】
本発明はさらに、本明細書に記載されるようなペプチドエピトープを使用することによって、対象の免疫学的応答を評価するための方法および診断用の剤を提供する。本発明の１つの態様において、本明細書に記載されるようなＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いられる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導される。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から選択し得る。そのような免疫担当細胞を回収または単離するための方法は当技術分野において周知である。いくつかの態様においては、ペプチドエピトープを認識して結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の剤を、試薬として用いてもよい。ペプチド試薬を免疫原として使用しなくてもよい。そのような解析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１９２】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接に可視化し（例えば、Ｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０３−２１０６，１９９８；およびＡｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７４：９４−９６，１９９６を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１９３】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシル末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような解析を、診断または予後予測目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１９４】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３−５１３，１９９７およびＰｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５６５−１５７０、１９９１を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体から得られる患者ＰＢＭＣ試料が、特異的ペプチドを使用して抗原特異的ＣＴＬの存在について解析される。ＰＢＭＣを培養し、該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について解析することができる。
【０１９５】
ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて解析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、その患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。
【０１９６】
本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい）、この抗体は、がんを診断またはモニターするための試薬として有用であり得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１９７】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＴＯＰＫ免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出するための方法を提供する。これらの方法は、生物学的試料においてＴＯＰＫ  ＨＬＡ結合ペプチド、または、ＴＯＰＫ  ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定することを伴う。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体である。腫瘍生検などの生物学的試料におけるＴＯＰＫの発現はまた、ＴＯＰＫプライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することができる。腫瘍発現の一例が本明細書に示されており、ＴＯＰＫ増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示をＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１９８】
好ましくは、診断法は、対象から単離された生物学的試料を、ＴＯＰＫ  ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な剤と接触させて、該生物学的試料におけるＴＯＰＫ  ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出することを伴う。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と、生物学的試料に存在するＴＯＰＫ  ＨＬＡ結合ペプチドとの間における特異的相互作用が可能となるように、生物学的試料を、例えば、濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で該剤の十分な近傍に置くことを意味する。一般に、剤と生物学的試料を接触させるための条件は、分子と生物学的試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間における特異的相互作用を促進させるための最適な条件が、Ｌｏｗらに発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載される。
【０１９９】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生物学的試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生物学的試料はインビボの組織であってよく、ＴＯＰＫ免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生物学的試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生物学的試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療すべき対象から回収された腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０２００】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法によって診断を行うことができる（例えば、Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０３３０）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイもまた提供されている。四量体染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイはすべてが、より慣例的なアッセイより少なくとも１０倍高感度であるようである（Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１７７；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９；Ｄｕｎｂａｒ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３）。五量体（例えば、ＵＳ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ０２／０７２６３１）およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６．６３１−６３７（２００２））を使用することもできる。
【０２０１】
例えば、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＴＯＰＫペプチドの少なくとも１つが投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法を提供し、該方法は以下の段階を含む：
（ａ）免疫原を、該免疫原に対して特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）で誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または決定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答をＣＴＬ誘導レベルと相関させる段階。
【０２０２】
本発明との関連において、免疫原は好ましくは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４のアミノ酸配列の中より選択されるＴＯＰＫペプチド、そのようなアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに、そのようなアミノ酸配列が、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸置換により改変されたペプチド、のうち少なくとも1つを含む。一方、免疫原特異的ＣＴＬの誘導に適した条件は当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞を、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために免疫原の存在下でインビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導する目的で、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してもよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
【０２０３】
いくつかの態様において、ペプチドがん療法によって治療される対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療中、および／または治療後に行うことができる。一般に、がん療法プロトコール中、免疫原性ペプチドは、治療される対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドを３〜１０週間にわたって毎週投与してもよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコール中に評価またはモニターされ得る。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階が、療法プロトコールの完了時であってよい。
【０２０４】
本発明によれば、免疫原特異的ＣＴＬの誘導が対照と比較して増強されていることにより、評価または診断される対象が、投与された免疫原に対して免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するための適した対照には、例えば、免疫担当細胞をペプチドと接触させていない場合、または、いかなるＴＯＰＫペプチドとも異なるアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドと接触させている場合のＣＴＬ誘導レベルが含まれ得る。一つの好ましい態様において、対象に投与された各免疫原間で免疫学的応答を比較することにより、対象の免疫学的応答を配列特異的な様式で評価する。特に、いくつかの種類のＴＯＰＫペプチドの混合物を対象に投与する場合であっても、免疫学的応答はペプチドに依存して異なる可能性がある。その場合には、各ペプチド間で免疫学的応答を比較することによって、対象がより強い応答を示すペプチドを同定することができる。
【０２０５】
ＸＩＩ．抗体：
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない（または、弱く結合する）。あるいは、抗体は、本発明のペプチド、ならびにその相同体に結合し得る。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後アッセイ、ならびに、画像化方法論において使用が見出され得る。同様に、そのような抗体は、ＴＯＰＫががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断および／または予後において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）が、ＴＯＰＫの発現が関与するがんの治療において治療的使用が見出されることがあり、そのようながんの例には、ＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０６】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ＴＯＰＫタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）またはその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、必要に応じてＴＯＰＫタンパク質またはその断片を認識し、それと結合することができる１種または複数種の抗ＴＯＰＫ抗体を含み得る。本発明との関連において、ＴＯＰＫポリペプチドに結合する抗ＴＯＰＫ抗体は、好ましくは他のペプチドを除外して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは認識する。抗体の結合特異性を阻害試験によって確認することができる。すなわち、解析される抗体と全長のＴＯＰＫポリペプチドとの間における結合が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４のアミノ酸配列を有するいずれかの断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体は該断片と特異的に結合するとみなされる。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイは、様々な種類の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０２０７】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイもまた含まれ得る。加えて、本発明は、ＴＯＰＫを発現するがんを検出することができる免疫学的画像化法を企図し、この場合、そのような方法の例には、本発明の標識された抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイは、ＴＯＰＫを発現するがんの検出、モニタリングおよび予後において臨床的な使用が見いだされ、そのようながんの例にはＡＭＬ、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟部組織腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として任意の形態で用いることができ、これには、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体がさらに含まれ得る。
【０２０９】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、タンパク質の完全なペプチドおよび部分ペプチドが免疫化抗原として機能し得る。好適な部分ペプチドの例には、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片が含まれ得る。
【０２１０】
本明細書において、抗体は、ＴＯＰＫペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義される。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４０および４２〜８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＴＯＰＫの断片ペプチドを認識することができる。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明との関連において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合するための方法もまた、当技術分野において周知である。
【０２１１】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
【０２１２】
任意の哺乳動物を抗原により免疫することができるが、細胞融合のために使用される親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０２１３】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水などで希釈し、懸濁させ得る。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０２１４】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０２１５】
本発明との関連における使用のためのモノクローナル抗体を調製するためには、免疫細胞を、抗原で免疫した哺乳動物から回収し、上記のように血清中の所望の抗体の増大したレベルについて調べ、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合すべき他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ他の方法（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ７３：３−４６（１９８１））に従って、上記の免疫細胞および骨髄腫細胞を融合させることができる。
【０２１６】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地において培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０２１７】
ハイブリドーマを調製するために、非ヒト動物が抗原で免疫される上記方法に加えて、ＥＢウイルスを感染させたヒトリンパ球などのヒトリンパ球が、ペプチド、ペプチド発現細胞またはそれらの溶解物によりインビトロにおいて免疫される場合がある。次いで、免疫化されたリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂することができるヒト由来の骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０２１８】
得られたハイブリドーマは続いてマウスの腹腔内に移植され、腹水が取り出される。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけではなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
あるいは、免疫したリンパ球などの抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に使用することができる。
【０２１９】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＬＴＤ（１９９０）により英国で刊行された、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製される組換え抗体を提供する。
【０２２０】
本発明の抗体は、本発明のペプチドの１種または複数種に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、または、Ｈ鎖およびＬ鎖に由来するＦｖ断片が適切なリンカーによって連結される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３（１９８８））。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：２９６８−７６（１９９４）；Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７８：４７６−９６（１９８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６５２−６３（１９８６）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６６３−９（１９８６）；Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１３２−７（１９９１）を参照されたい）。
【０２２１】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０２２２】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０２２３】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１））。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０２２４】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択および組み合わせることによって、抗体を分離および単離することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。使用すべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳおよび、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２２５】
適切なクロマトグラフィー法の例には、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．編者：Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。クロマトグラフィー手順は、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣおよびＦＰＬＣによって実施することができる。
【０２２６】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含有する試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してよい。
【０２２７】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含有すると考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することによって、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明のペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０２２８】
ＸＩＩＩ．ベクターおよび宿主細胞：
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、本発明のペプチドを発現させるための、または、遺伝子治療のために本発明のヌクレオチドを投与するための、宿主細胞における本発明のヌクレオチドのキャリア、とりわけ、ＤＮＡのキャリアとしての有用性が見出される。
【０２２９】
大腸菌が宿主細胞として選択され、かつ、ベクターが大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）において増幅され、また、大量に生成される場合、ベクターは、大腸菌内における増幅のために適する「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するために適したマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールなどの薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどを用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１  Ｂｌｕｅなど）が宿主細胞として使用される場合、ベクターは、所望の遺伝子を大腸菌において効率的に発現させることができるプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−６（１９８９）；ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ６：２４２２−７（１９９２））、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−３（１９８８））またはＴ７プロモーターなどを有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：４３７９（１９８７））である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２３０】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８（１７）：５３２２（１９９０））、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドを産生させるために使用することができる。
【０２３１】
ベクターを動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞など）において発現させるために、ベクターは、そのような細胞における発現のために必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８（１９７９））、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：５３２２（１９９０））、ＣＭＶプロモーターなど、および、好ましくは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶおよびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２３２】
本明細書中下記において、本発明が、実施例を参照して、より詳細に記載される。しかしながら、下記の材料、方法および実施例は、本発明の特定の態様を行い、または使用することにおいて当業者を助けるために役立ち得るが、本発明の態様を例示することが意図されるだけであり、したがって、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。当業者が容易に認識するように、本明細書に記載される方法および材料と類似するか、または同等である方法および材料を、本発明を実施することまたは試験することにおいて使用することができる。
【実施例】
【０２３３】
材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴＩＳＩを、ＩＨＷＧ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴ２、およびアフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
【０２３４】
ＴＯＰＫ由来ペプチドの候補選択
ＴＯＰＫ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８４９２；例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）に由来する９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドで、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子のどちらかまたは両方に結合するものを、「ＮｅｔＭＨＣ３．０」結合予測サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）（Ｂｕｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２００３  Ｎｏｖ，６２（５）：３７８−８４；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００３  Ｍａｙ，１２（５）：１００７−１７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４  Ｊｕｎ  １２：２０（９）：１３８８−９７）を用いて予測した。これらのペプチドは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）により、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０２３５】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。ＤＣを、他所に記載されているように、インビトロで作製した（Ｎａｋａｈａｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３  Ｊｕｌ  １５，６３（１４）：４１１２−８）。具体的には、健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって単離された末梢血単核細胞を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）によって不活化し、ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴＩＳＩ細胞またはＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Ｔａｎａｋａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ｊａｎ  ５，８４（１）：９４−９；Ｕｍａｎｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ａｐｒ  ２０，８４（８）：１０５２−７；Ｕｃｈｉｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４  Ｄｅｃ  １５，１０（２４）：８５７７−８６；Ｓｕｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００６  Ｍａｙ，９７（５）：４１１−９；Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００５  Ａｕｇ，９６（８）：４９８−５０６）。
【０２３６】
ＣＴＬ増殖手順
Ｒｉｄｄｅｌｌら（Ｗａｌｔｅｒ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９５  Ｏｃｔ  １９，３３３（１６）：１０３８−４４；Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９６  Ｆｅｂ，２（２）：２１６−２３）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化された２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Ｔａｎａｋａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ｊａｎ  ５，８４（１）：９４−９；Ｕｍａｎｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ａｐｒ  ２０，８４（８）：１０５２−７；Ｕｃｈｉｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４  Ｄｅｃ  １５，１０（２４）：８５７７−８６；Ｓｕｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００６  Ｍａｙ，９７（５）：４１１−９；Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００５  Ａｕｇ，９６（８）：４９８−５０６）。
【０２３７】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同一の方法を用いて、ＣＴＬクローンを増殖させた。（Ｕｃｈｉｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４  Ｄｅｃ  １５，１０（２４）：８５７７−８６；Ｓｕｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００６  Ｍａｙ，９７（５）：４１１−９；Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００５  Ａｕｇ，９６（８）：４９８−５０６）。
【０２３８】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡを行った。ペプチドパルスしたＴＩＳＩ細胞またはＴ２細胞（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェルプレート中の培養細胞、ＣＴＬ株、およびＣＴＬクローンを応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡを製造業者の手順に従って実施した。
【０２３９】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２の、いずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の手順に従って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、標的遺伝子欠損、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１欠損、かつＨＬＡ−Ａ＊２４０２欠損の細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトされた細胞を、ベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための刺激細胞として使用した（５×１０４細胞／ウェル）。
【０２４０】
ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現した標的細胞株を認識するＣＴＬの能力
ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現する標的細胞を認識するＣＴＬクローンの能力について調べた。樹立されたＣＴＬクローンを２晩にわたって標的細胞株（５×１０４個／ウェル）と共に培養した。インキュベーション後、培養培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって測定した。製造業者の手順に従って、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡを実施した。
【０２４１】
結果
がんにおけるＴＯＰＫ発現の上昇
ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して様々ながんから得られた包括的遺伝子発現プロファイルデータにより、ＴＯＰＫ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８４９２；例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）の発現が、対応する正常組織と比較してがん組織において特異的に上昇していることが明らかにされた。ＴＯＰＫの発現が、１５例中１例のＡＭＬ、１８例中１５例の膀胱癌、４０例中３６例の乳癌、６例中２例の子宮頸癌、６例中６例の胆管細胞癌、６例中２例の結腸直腸癌、１例中１例のびまん性胃癌、５例中５例のＮＳＣＬＣ、２例中１例のリンパ腫、１１例中７例の骨肉腫、１９例中１２例の前立腺癌、１２例中３例の腎癌、１４例中１４例のＳＣＬＣ、および２９例中１５例の軟部組織腫瘍において確かに上昇していた（表１）。
【０２４２】
【表１】
2014533095.tif 000002
【０２４３】
ＴＯＰＫ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの予測
表２ａおよび表２ｂは、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＴＯＰＫの９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを結合親和性の高い順に示す。ＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する可能性のある合計４０個のペプチドを、エピトープペプチドを決定するために選択し、調べた。
【０２４４】
【表２ａ】
2014533095.tif 000003
【０２４５】
【表２ｂ】
2014533095.tif 000004
【０２４６】
ＴＯＰＫ由来のＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表３ａおよび表３ｂは、ＨＬＡ−Ａ０２結合性のＴＯＰＫの９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドをそれぞれ結合親和性の高い順に示す。ＨＬＡ−Ａ０２結合能を有する可能性のある合計４４個のペプチドを、エピトープペプチドを決定するために選択し、調べた。
【０２４７】
【表３ａ】
2014533095.tif 000005
【０２４８】
【表３ｂ】
2014533095.tif 000006
【０２４９】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性のＴＯＰＫ由来予測ペプチドによるＣＴＬ誘導
ＴＯＰＫ由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載されるプロトコールに従って作製した。ペプチド特異的なＣＴＬ活性をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（図１）。ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いたウェル番号＃８（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いたウェル番号＃３（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いたウェル番号＃３（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を用いたウェル番号＃２（ｄ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を用いたウェル番号＃４（ｅ）は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を実証した。一方で、表２ａおよび表２ｂに示される他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドによる刺激では、特異的なＣＴＬ活性が検出されなかった。典型的な陰性データとして、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）により刺激されたＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＴＯＰＫ由来の５個の選択されたペプチドが強力なＣＴＬを誘導できたことを示唆する。
【０２５０】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＴＯＰＫ由来予測ペプチドによるＣＴＬ誘導
ペプチド特異的なＣＴＬ活性をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（図２）。ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を用いたウェル番号＃７（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を用いたウェル番号＃４（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）を用いたウェル番号＃２（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）を用いたウェル番号＃８（ｄ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）を用いたウェル番号＃４（ｅ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）を用いたウェル番号＃３（ｆ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）を用いたウェル番号＃３（ｇ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）を用いたウェル番号＃５（ｈ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）を用いたウェル番号＃３（ｉ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）を用いたウェル番号＃８（ｊ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）を用いたウェル番号＃１（ｋ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）を用いたウェル番号＃１（ｌ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）を用いたウェル番号＃４（ｍ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を用いたウェル番号＃４（ｎ）は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を実証した。一方で、表３ａおよび表３ｂに示される他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドによる刺激では、特異的なＣＴＬ活性が検出されなかった。典型的な陰性データとして、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）により刺激されたＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｏ）。まとめると、これらの結果は、ＴＯＰＫ由来の１４個の選択されたペプチドが強力なＣＴＬを誘導できたことを示唆する。
【０２５１】
ＴＯＰＫ由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的なＣＴＬ活性を示した、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いたウェル番号＃８（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いたウェル番号＃３（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いたウェル番号＃３（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を用いたウェル番号＃２（ｄ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を用いたウェル番号＃４（ｅ）における細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した（図３）。ＣＴＬ株は、ペプチドパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を実証した。さらに、「材料および方法」に記載されるように、ＣＴＬクローンをＣＴＬ株から限界希釈によって樹立し、対応するペプチドをパルスしたＴＩＳＩ細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した。強力なＩＦＮ−γ産生が、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）（ｂ）、およびＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）（ｃ）により刺激されたＣＴＬクローンから認められた（図４）。
【０２５２】
ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的なＣＴＬ活性を示した、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を用いたウェル番号＃７（ａ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を用いたウェル番号＃４（ｂ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）を用いたウェル番号＃８（ｃ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）を用いたウェル番号＃４（ｄ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）を用いたウェル番号＃３（ｅ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）を用いたウェル番号＃３（ｆ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）を用いたウェル番号＃５（ｇ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）を用いたウェル番号＃３（ｈ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）を用いたウェル番号＃８（ｉ）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）を用いたウェル番号＃１（ｊ）、および、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）を用いたウェル番号＃４（ｋ）における細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した（図５）。ＣＴＬ株は、ペプチドパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を実証した。さらに、「材料および方法」に記載されるように、ＣＴＬクローンをＣＴＬ株から限界希釈によって樹立し、対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した。強力なＩＦＮ−γ産生が、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）（ａ）およびＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）（ｂ）により刺激されたＣＴＬクローンから認められた（図６）。
【０２５３】
ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬクローンを、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長のＴＯＰＫとＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を発現する標的細胞のための特異的モデル）を刺激細胞として調製し、全長のＴＯＰＫまたはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のどちらか一方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として使用した。図７において、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）により刺激されたＣＴＬクローンは、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータは、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）ペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子とともに標的細胞上に提示され、ＣＴＬによって認識されることを明確に実証する。ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長のＴＯＰＫとＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を発現する標的細胞のための特異的モデル）を刺激細胞として調製し、全長のＴＯＰＫまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のどちらか一方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として使用した。図８において、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）により刺激されたＣＴＬ株は、ＴＯＰＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータは、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）ペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子とともに標的細胞上に提示され、ＣＴＬによって認識されることを明確に実証する。これらの結果は、ＴＯＰＫ由来のこれらのペプチドが、ＴＯＰＫを発現する腫瘍を有する患者にがんワクチンを適用するために利用可能であり得ることを示している。
【０２５４】
抗原ペプチドの相同性解析
ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）またはＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）により刺激されたＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、これらの配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドに対して相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列について相同性解析を行い、これにより、有意な相同性を有する配列が認められないことが明らかにされた。相同性解析の結果は、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−１３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−９−２３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ＴＯＰＫ−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−２８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−９−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−２７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）およびＴＯＰＫ−Ａ０２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）の配列は、固有のものであることを示し、したがって、本発明���らが知る限り、これらの分子が、いくつかの非関連分子に対する意図されない免疫学的応答を引き起こす可能性がほとんどないことを示している。結論として、本明細書において同定されるＴＯＰＫ由来の新規なＨＬＡ−Ａ２４エピトープペプチドまたはＨＬＡ−Ａ０２エピトープペプチドは、がん免疫療法の分野において有用性が見出され得る。
【産業上の利用可能性】
【０２５５】
本発明は、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、したがって、幅広い様々ながんタイプに対する適用性を有する可能性がある新規ＴＡＡ、特に、ＴＯＰＫ由来の新規ＴＡＡを提供する。そのようなＴＡＡは、ＴＯＰＫに関連する疾患、例えば、がん、より具体的には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、びまん性胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および軟部組織腫瘍に対するペプチドワクチンとしての使用が見出され得る。
【０２５６】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明しているが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境界および限界が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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