(57)【要約】  本発明は、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７を含む大腸菌の様々なバイオタイプおよびクロストリジウム・ディフィシル、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種およびクレブシエラ種を含むクロストリジウム菌の様々なバイオタイプの増殖を阻害／低減する活性を有する乳酸菌および／またはビフィズス菌の株に関する。さらに、本発明は、所望によりアセチルシステインおよび／またはマイクロカプセル化された胃保護されたリゾチームおよび／またはアセチルシステインとマイクロカプセル化された胃保護されたリゾチームと組み合わせて、少なくとも１つの該細菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌種(species E. coli)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、エンテロコッカス種(Enterococcus sp.)およびクレブシエラ種(Klebsiella sp.)に属する病原体と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができるラクトバチルス・デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)およびビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)を含むか、あるいはそれらからなる群から選択される１つ以上の種に属する少なくとも１つの細菌株を含むか、あるいはそれらからなる、医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品(supplement)または医療デバイス。
【請求項２】
該細菌株が、病原体大腸菌に対する活性を有し、該病原体が、好ましくは、血清型大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７および大腸菌  Ｏ１０４：Ｈ４中から；または大腸菌  ＡＴＣＣ  ８７３９、大腸菌  ＡＴＣＣ  １０５３６、大腸菌  ＡＴＣＣ  ３５２１８および大腸菌  ＡＴＣＣ  ２５９２２を含む群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該細菌株が、病原体リステリア・モノサイトゲネス株  ＡＴＣＣ  １９１１２に対する活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該細菌株が、
−ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＢＲ０３  ＤＳＭ  １６６０４
−ビフィドバクテリウム・ブレーベ  Ｂ６３２  ＤＳＭ  ２４７０６
−ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５
−ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０６  ＤＳＭ  ２１９８１
−ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１
−ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０２  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２０
−ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０３  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２２
−ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０４  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２３
−ラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０
−ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・デルブリッキー  ＬＤＤ０１  ＤＳＭ  ２２１０６
−ラクトバチルス・ロイテリ  ＬＲＥ０１  ＤＳＭ  ２３８７７
−ラクトバチルス・ロイテリ  ＬＲＥ０３  ＤＳＭ  ２３８７９
を含むか、あるいはそれらからなる群から選択され、
好ましくは、該組成物が、１つ以上の種に属する２または３または４または５または６つの株を含むか、あるいは、それらからなる、
請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該細菌株が、
−ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＢＲ０３  ＤＳＭ  １６６０４
−ビフィドバクテリウム・ブレーベ  Ｂ６３２  ＤＳＭ  ２４７０６
−ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５
−ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０６  ＤＳＭ  ２１９８１
−ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１
−ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０２  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２０
−ラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０
−ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・デルブリッキー  ＬＤＤ０１  ＤＳＭ  ２２１０６；
を含むか、あるいはそれらからなる群から選択され、
好ましくは、該組成物が、１つ以上の種に属する２または３または４または５または６つの株を含むか、あるいは、それらからなる、
請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
該細菌株が、大腸菌種血清型  Ｏ１５７：Ｈ７または大腸菌  Ｏ１０４：Ｈ４に属する病原体と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、株ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５およびラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０を含むか、あるいは、それらからなる群から選択され、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
細菌株が、種リステリア・モノサイトゲネスに属する病原体と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
該組成物が、アセチルシステインをさらに含む、請求項１−７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
該組成物が、リゾチームをさらに含む、請求項１−８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
該組成物が、３０℃から８０℃；好ましくは４０℃から７０℃；よりさらに好ましくは５０℃から６０℃に含まれる融点を有する、好ましくは天然起源の、脂質マトリックスにマイクロカプセル化されたリゾチームをさらに含む、請求項１−９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
該組成物が、脂質マトリックス、３０℃から８０℃；好ましくは４０℃から７０℃；よりさらに好ましくは５０℃から６０℃に含まれる融点を有する、好ましくは天然起源の、脂質マトリックスにマイクロカプセル化されたアセチルシステインおよびリゾチームをさらに含む、請求項１−１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
該組成物が、ビフィズス菌作用を有する少なくとも１つのプレバイオティクス食物繊維および／または炭水化物をさらに含む、請求項１−１１のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
記述
本発明は、大腸菌(E.coli)  Ｏ１５７：Ｈ７およびＯ１０４：Ｈ４を含む大腸菌の様々なバイオタイプ（グラム陰性）、および腐敗および重症腸内感染に関与するクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）のファミリーに属する様々な細菌種（嫌気性、グラム陽性桿菌(Gram positive rods)）（クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)）の増殖を阻害／低減する作用を有する乳酸菌(lactic bacteria)およびビフィズス菌(bifidobacteria)の株に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)（グラム陽性）、エンテロコッカス種(Enterococcus sp.)およびクレブシエラ種(Klebsiella sp.)（グラム陰性）に対する特異的抗菌活性を有する乳酸菌株に関する。さらに、本発明は、所望によりアセチルシステインおよび／またはリゾチームと組み合わせて、少なくとも１つの該乳酸菌および／またはビフィズス菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品(supplement)または医療デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌(E.coli)と省略される大腸菌(Escherichia coli)は、エシェリキア(Escherichia)属の最も知られた種であり、その中で、少なくとも１７１個の血清型が、抗原Ｏ、Ｈ、Ｋ、Ｆの様々な組合せにより区別され、特徴付けられることが知られている。それは、温血動物（鳥類およびヒトを含む哺乳類）の腸下部に生息し、食物の適切な消化のために必要である主要細菌種の１つである。水域におけるその存在は、汚染(faecalisation)状態の存在を示す（それは、腸球菌と共に、糞便汚染の主要指標である）。
【０００４】
例えばエンテロバクター(Enterobacter)、クレブシエラ(Klebsiella)、シトロバクター(Citrobacter)およびセラチア(Serratia)のような他の属と共に、エシェリキア属は、よく知られた大腸菌の下でグループ化される。技術的には、「大腸菌群」は、非胞子形成好気性および嫌気性細菌を含む。
【０００５】
それは、腸の一般的な生息者であり、消化プロセスにおいて基本的な役割を有するけれども、大腸菌がヒトおよび動物において病気を引き起こし得る状況がある。いくつかの大腸菌株は、尿路の感染、髄膜炎、腹膜炎、敗血症および肺炎のような、腸および腸管外疾患の原因物質である。いくつかの大腸菌株は毒素産生性である。すなわち、それらは、とりわけ下痢の原因であり得る毒素を生産する。大腸菌により引き起こされる赤痢は、主に汚染食品から病気にかかるため、一般的な消化管毒性感染である。汚染は、不十分に加熱された感染肉から、未低温殺菌ミルクおよびそれから作られたチーズから、ならびに糞便により汚染された他の食品から生じ得る。大腸菌は、熱処理に対するそれらの様々な感受性により熱不安定性および熱安定性に、ならびにそれらの毒素産生作用により区別される４つの型の毒素を生産する（志賀毒素および溶血性毒素、ＨｌｙＡ）。
【０００６】
ＬＴと称される熱不安定性の毒素は、構造および機能においてコレラ毒素と非常に類似している。それは、ホロトキシンにおいて１つの「Ａ」サブユニットおよび５つの「Ｂ」サブユニットを含む。Ｂサブユニットは、宿主の腸細胞への付着および毒素の侵入に寄与し、Ａサブユニットは該細胞を刺激し、下痢を引き起こす水を放出させる。
【０００７】
大腸菌の「株」は、様々な種類の動物を区別することができる方法と同様に、他の大腸菌株と見分け可能にする特定の特性を有する一軍である。異なる大腸菌株が異なる動物種において生息し、その結果、水中の糞便物質が、例えばヒト由来かまたは鳥類由来かを立証することができる。
【０００８】
大腸菌の新規株は、突然変異の自然生物学的プロセスから継続的に生じ、これらの株のいくつかは、宿主動物に有害であり得る特性を有する。大多数の成人において、病原体株は大抵、下痢のほかは何も引き起こさず、何ら症状を生じないが、幼い子供または病人または最近の病気により弱体化された人または特定の処置を受けている人において、新規株は重度の病気およびさらには死を引き起こし得る。特に大腸菌毒性株の１つの例は大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７である。腸管出血性大腸菌株は、先進国において病気に関与する主要なものである。これらの病気に関与する血清型は主に、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７である。
【０００９】
大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）は、食物により伝染する疾患の原因である細菌大腸菌の腸管出血性株である。感染は、とりわけ若者、子供および高齢者において、出血性下痢および、時折、腎不全、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）をしばしば引き起こす。
【００１０】
伝染は糞口経路により起こり、病気の大多数の症例は、土壌もしくは汚染水により汚染された生もしくは加熱不十分な食物の食事消費、またはかかる水により汚染された野菜の消費と関連する。反芻動物において、それは、腸において共生生物として生息するが、該細菌により生産される毒素に対する受容体の不足のため、病変を引き起こさない。クロストリジウム属に関しては、多数の食物が食物自体の分解プロセスに関与するこれらの細菌を含むこと、および、それらが食事とともに摂取され、腸に到達すると、それらは微生物叢組成を修飾し、腐敗を開始することができることが知られている。
【００１１】
これらの食物(alimentary)毒性感染(toxinfection)に一般的に関与する食物は、悪臭物質、例えば、インドール、アンモニアおよびメルカプタンを形成する糖を加水分解することができる特にクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・スポロゲネス(C. sporogenes)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス(C. bifermentans)などにより汚染された新鮮な肉である。
【００１２】
他方、魚類は、低い温度（４℃）でさえ、毒素を発生および生産することができるクロストリジウムの別の種であるクロストリジウム・ボツリヌス(C. botulinum)により攻撃され得る。クロストリジウム菌の中で、ヒトに対して最も危険なものは、穿孔、敗血症および死のような重度な合併症を有する出血性下痢、偽膜性大腸炎の症例に関与するエンテロトキシンを生産することができるクロストリジウム・ディフィシルである。該細菌は、熱耐性を示す芽胞を形成し、糞口経路を介して人から人へ伝染される。
【００１３】
一般的に、クロストリジウム・ディフィシルにより引き起こされる病因は、発酵作用を有する細菌を損失するほどの、腸管微生物叢における顕著な不均衡を引き起こし、プトレファシエンス(putrefacient)種のまん延を引き起こす、抗生物質の使用と関連する。
【００１４】
クロストリジウム・ディフィシルは、特に病院環境に遍在し、健常個体の数パーセント（約５％）の腸にコロニー化することができる。抗生物質の使用は、その過剰な開発、および大多数の抗生物質に対する耐性に起因するその重度の病理学的兆候と関連する。摂取された芽胞は、いったん胃の障壁を乗り越えると、結腸に定着し、そこで、発芽し、栄養型に発展し、２分裂増殖により、高齢者において特に重度である多数の病理学的形態に関与する、非常に多くの集団を生じる。
【００１５】
現在、該生物体が、米国における病院において処置された３０％以上の患者に感染していると概算される。加えて、リステリア・モノサイトゲネスは、消化管起源の潜在的に致死的な感染であるリステリア症の原因となるヒトにおける遍在的な病原体である。
【００１６】
プロバイオティック細菌（乳酸菌およびビフィズス菌）は、宿主の健康の利益となる微生物であり、この理由のため、プロバイオティック細菌を含む食品、発酵乳製品、ヨーグルトおよび栄養補助食品を選択する増え続ける数の人々により一般的に消費されている。
【００１７】
したがって、腸にコロニーを形成し、宿主に有益な効果をもたらすことができるプロバイオティック細菌を利用可能にする必要性が依然としてある。特に、健康上の利益を結果として伴う、病原性種よりも優勢になることができるプロバイオティック細菌を利用可能にする必要性が依然としてある。よりさらに特に、病原体細菌（グラム陽性およびグラム陰性）と関連がある感染および／または病状を予防および／または処置することができるプロバイオティック細菌を利用可能にする必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【００１８】
徹底的な研究活動後、出願人は、驚くべきことに、選択された細菌が、上記必要性に対して適当な応答を与えることができることを見出した。
【００１９】
出願人は、さらに、驚くべきことに、病原体細菌による自己防衛において通常生産される細菌生物膜を溶解する特性を有するＮ−アセチルシステインを使用することにより、選択されたプロバイオティック株のバクテリオシン作用がはるかに有効であることを見出した。
【００２０】
さらに、驚くべきことに、リゾチームに胃保護を与える、好ましくは植物性(vegetable nature)の、脂質マトリックスにおけるマイクロカプセル化の特定の技術を使用することにより、リゾチーム(latter)は、無傷で胃十二指腸管を通り、大腸レベルで活性化され、全てのクロストリジウム菌種の芽胞に対する溶解作用を発現することが可能であることを見出した。クロストリジウム属およびクロストリジウム・ディフィシルの芽胞に対する加水分解作用の結果として（特に、それらの発芽の時に）、病原体集団における増加および毒素の形成に関与する増殖性(vegetative)細胞の形成は起こらない。
【００２１】
クロストリジウム菌を含むプトレファシエンス種に対する発酵活性および障壁効果を有するプロバイオティック株と、実際にクロストリジウム菌芽胞の発芽を防止するリゾチームの直接的作用との組合せ作用は、病原体の危険なグループに対する並はずれた革新的な戦略を構成する。
【００２２】
全組合せ（バクテリオシンを生産する本発明のプロバイオティック細菌、および／または、細菌生物膜を溶解するＮ−アセチルシステイン、および／または、好ましくは脂質マトリックス中でマイクロカプセル化された形態において、芽胞の発芽をブロックするリゾチーム）は、現在までに、対抗する有効な戦略がなかった多くの病原体株に有効であり得る革新的なツールを構成する。
【００２３】
本発明の対象は、所望により、Ｎ−アセチルシステインおよび／またはリゾチームと組み合わせて使用してもよい、種々の病原体、例えば、大腸菌および特に大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７およびＯ１０４：Ｈ４；および／またはクロストリジウム科ファミリーに属するプトレファシエンス細菌、クロストリジウム・ディフィシル；および／または病原体リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種、クレブシエラ種、これらの細菌と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができる乳酸菌および／またはビフィズス菌株の選択により形成される。リゾチームは、脂質マトリックス中にマイクロカプセル化され胃保護され得る。好ましい態様において、脂質マトリックスは、３０℃から８０℃、好ましくは４０℃から７０℃、よりさらに好ましくは５０℃から６０℃に含まれる融点を有する植物起源のものである。
【００２４】
本発明の別の対象は、大腸菌病原体、例えば、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７；および／またはクロストリジウム科ファミリーに属するプトレファシエンス細菌、例えば、クロストリジウム・ディフィシル；および／または病原体リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種、クレブシエラ種と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、少なくとも１つの上記細菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスにより形成される。
【００２５】
本発明の別の対象は、Ｎ−アセチルシステインと組み合わせて、少なくとも１つの上記細菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスにより形成される。
【００２６】
本発明の別の対象は、リゾチームと組み合わせて、少なくとも１つの上記細菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスにより形成される。好ましい態様において、リゾチームはマイクロカプセル化されている。
【００２７】
本発明の別の対象は、Ｎ−アセチルシステインおよびリゾチームと組み合わせて、少なくとも１つの該細菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスにより形成される。好ましい態様において、リゾチームは、脂質マトリックスでマイクロカプセル化されている。好ましい態様において、脂質マトリックスは、３０℃から８０℃、好ましくは４０℃から７０℃、よりさらに好ましくは５０℃から６０℃に含まれる融点を有する不活性起源のものである。
【００２８】
本発明の他の好ましい態様は、記述の続きに記載されており、特許請求の範囲において請求されている。
【００２９】
表および図面のリスト
表１は、大腸菌の４個のバイオタイプに対して試験された１４個の乳酸菌株、４個のビフィズス菌株および２個の連鎖球菌株のリストを示す。
【００３０】
表２−５は、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産し、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７を含む大腸菌種に属する病原体細菌の増殖に抵抗する、該増殖を阻害する、または該増殖を低減することができる株を記載する。
【００３１】
表６および７は、乳酸菌属の株を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明の対象である株を試験するために使用される技術を示す。
【図２】図２は、大腸菌（ＡＴＣＣ  ８７３９  ＡＴＣＣ  １０５３６  ＡＴＣＣ  ３５２１８  ＡＴＣＣ  ２５９２２）および血清型  Ｏ１５７：Ｈ７  （ＣＱ  ９４８５）に対する、表４の株により形成された阻害ハロー(inhibition halo)を示す。
【図３】図３は、表６および７において示されるデータを示す。
【図４】図４は、大腸菌に対するプロバイオティック細菌株のインビトロ阻害活性を示す。
【図５】図５は、他の病原性細菌に対するプロバイオティック細菌株のインビトロ阻害活性を示す。
【図６】図６は、他の病原性細菌に対するプロバイオティック細菌株のインビトロ阻害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
出願人は、非常に広範囲のグループの細菌株から出発して、徹底的な研究およびスクリーニング作業を行った。該作業の最後に、出願人は、ラクトバチルス・デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)およびビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)を含むか、あるいは、これらからなる群から選択される１つの種またはいくつかの種に属する細菌株のグループを見出し、選択した。選択された株は、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができ、これらの物質は、有効に病原体細菌に抵抗する、該細菌を阻害する、または該細菌を低減することができる。これらの株は、グラム陰性および／またはグラム陽性病原体細菌と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置において効果的な用途を有する。
【００３４】
病原体細菌は、大腸菌およびクロストリジウム菌を含む群から選択される。大腸菌は、エンテロバクターファミリーに属する細菌のグループである。特に、大腸菌は、３５−３７℃で４８時間で、ガスおよび酸の生産と共に、ラクトースを発酵させ、酵素ベータ−ガラクトシダーゼを有する、桿菌様、グラム陰性、胞子非形成性、好気性および嫌気性通性細菌である。それらは遍在的な生物である。糞便物質中に存在するものもあり、したがって水および食物の両方の汚染の指標として使用され、水性または大地性(telluric)起源のものもある。該グループは、５０以上の属からなり、なかでも、シトロバクター、エンテロバクター、好ましくはエンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア属、好ましくは大腸菌、ハフニア(Hafnia)、クレブシエラ、好ましくはクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、セラチアおよびエルシニア(Yersinia)を含む。本発明の文脈において興味ある他の病原体は常に、クロストリジウム・ディフィシルに特に関連して、クロストリジウム科ファミリーに属する。拮抗作用はまた、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteriditis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejunii)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種およびクレブシエラ種を含む群から選択される種に対して発揮される。
【００３５】
本発明の対象は、病原体、例えば、大腸菌、クロストリジウム・ディフィシル、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種およびクレブシエラ種と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができるラクトバチルス・デルブリッキー、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・デルブリッキー、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)およびビフィドバクテリウム・ブレーベを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される１つの種またはいくつかの種に属する少なくとも１つの細菌株を含む、医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスにより形成される。
【００３６】
１つの態様において、医薬または食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスは、病原体、例えば、大腸菌、クロストリジウム・ディフィシル、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種およびクレブシエラ種と関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のためのバクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができるラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサスおよびラクトバチルス・ペントーサスを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される１つの種またはいくつかの種に属する少なくとも１つの細菌株を含む。
【００３７】
該目的のために選択された株および／または上記株（以下の表１−５も参照）の種々の可能な組合せは、単独で、またはＮ−アセチルシステインと組み合わせて；またはマイクロカプセル化されたリゾチームと組み合わせて；またはＮ−アセチルシステインおよびマイクロカプセル化されたリゾチームと組み合わせて使用され得る。
【００３８】
１つの態様において、病原体大腸菌は、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７および大腸菌  Ｏ１０４：Ｈ４中から選択される。
【００３９】
表１は、大腸菌の４個のバイオタイプに対して試験された１４個の乳酸菌株、４個のビフィズス菌株および２個の連鎖球菌株のリストを示す。値は、阻害ハロー（ｍｍ）として示される。
【表１】
2014526242.tif 000002
【００４０】
表１において試験された細菌は、単一で、または互いに組み合わせて、本発明の文脈において有効な適用を有する。
【００４１】
１つの態様において、細菌株は、表２に記載されているものを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される。
【表２】
2014526242.tif 000003
【００４２】
表２の株は、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができ、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７を含む大腸菌種に属する病原体細菌の増殖に抵抗する、該増殖を阻害する、または該増殖を低減することができる。
【００４３】
表２の株は、表１において右の４つの欄において記載されているとおり、拮抗する（１つ以上の有害または病原体微生物種／属の増殖を阻害する、または該数を低減する）能力を同定する目的のために個々に試験された。
【００４４】
本特許出願において記載および／または請求されている全ての株は、ブダペスト条約にしたがって寄託されており、管轄の寄託当局への請求により公衆に利用可能にされる。
【００４５】
他の態様において、細菌株は、表３に記載されているものを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される。
【表３】
2014526242.tif 000004
【００４６】
さらなる態様において、細菌株は、表４に記載されているものを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される。
【表４】
2014526242.tif 000005
【００４７】
本発明の組成物は、さらに、病原体大腸菌、ヘリコバクター・ピロリおよびクロストリジウム・ディフィシルと関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための有効な適用も有する。
【００４８】
１つの態様において、本発明の組成物は、表４に記載されているものを含むか、あるいは、表４に記載されているものからなる群から選択される１から８つの株を含むか、あるいは、該株からなる。
【００４９】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、表４に記載されている株を含むか、あるいは、該株からなる群から選択される１から６つの株、好ましくは２から５つの株、よりさらに好ましくは３または４つの株を含むか、あるいは、該株からなる。
【００５０】
好ましい態様において、該組成物は、表５に記載されている６つの株を含むか、あるいは、該株からなるか；または、表５の４つの乳酸菌を含むか、あるいは、該株からなる。
【表５】
2014526242.tif 000006
【００５１】
出願人は、ラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０、ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１、ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０２  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２０およびラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５を含むか、あるいは、該株からなる群から選択される細菌株が、大腸菌の４つの株に対して阻害活性を発揮することができる；特に株ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５およびラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０が、血清型Ｏ１５７：Ｈ７に対しても、より良い活性を示すことを見出した。
【００５２】
さらに、出願人は、株ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１が、全ての病原性細菌に対して、特にリステリア・モノサイトゲネスに対して阻害能力を示すことを見出した。
【００５３】
本発明の対象は、病原体、例えば、大腸菌、例えば、血清型  Ｏ１５７：Ｈ７、およびリステリア・モノサイトゲネスと関連がある感染および／または病状の予防的および／または治癒的処置における使用のための、バクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水を生産することができるラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサスおよびラクトバチルス・ペントーサスを含むか、あるいは、これらからなる群から選択される１つの種またはいくつかの種に属する少なくとも１つの細菌株を含む医薬もしくは食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスにより形成される。
【００５４】
１つの態様において、該医薬または食品組成物または栄養補助食品または医療デバイスは、ラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０、ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１、ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０２  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２０およびラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５を含むか、あるいはそれらからなる群から選択される少なくとも１つの細菌株を含む。有利には、それは、株  ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４  ＤＳＭ  １６６０５およびラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１  ＤＳＭ  ２１９８０を含むか、またはそれらからなる。または、それは、株  ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１  ＬＭＧ  Ｐ−２１０２１を含むか、またはそれからなる。
【００５５】
本発明の組成物において、細菌株の混合物は、組成物の総重量と比較して、０．５％から２０重量％、好ましくは２．５％から１０％の量で存在する。好ましい態様において、組成物は、ビフィズス菌作用を有する少なくとも１つのプレバイオティクス食物繊維および／または炭水化物をさらに含み得る。
【００５６】
本発明の組成物において適用されるプレバイオティクス食物繊維は、拮抗することが意図される病原体によってではなく、組成物中に存在する細菌株により使用されなければならない食物繊維である。
【００５７】
さらに、組成物はまた、組成物の総重量と比較して、活性成分の型およびもしあればその推奨される１日用量にいつも依存して、一般的に０．００１％から２０重量％、好ましくは０．０１％から５重量％の量で、他の活性成分および／または成分、例えば、ビタミン、ミネラル、生物活性ペプチド、抗酸化、コレステロール低下、血糖降下および抗炎症性作用を有する物質および抗甘味剤を含み得る。
【００５８】
本発明の対象である食事組成物、例えば共生組成物、または栄養補助食品または医薬組成物または医療デバイスは、当業者に知られた技術および装置にしたがって調製される。
【００５９】
好ましい態様において、組成物は、１ｘ１０６から１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ混合物、好ましくは１ｘ１０８から１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ混合物の濃度において細菌を含む。
【００６０】
好ましい態様において、組成物は、１ｘ１０６から１ｘ１０１１ＣＦＵ／用量、好ましくは１ｘ１０８から１ｘ１０１０ＣＦＵ／用量の濃度において細菌を含む。
【００６１】
用量は、０．２から１０ｇからなることができ、例えば、それは、０．２５ｇ、１ｇ、３ｇ、５ｇまたは７ｇである。
【００６２】
本発明において使用されるプロバイオティック細菌は、固体形態、特に粉末、乾燥粉末または凍結乾燥粉末形態であり得る。
【００６３】
本発明のすべての組成物は、当業者に知られた技術にしたがって、および既知の装置の使用により調製される。
【００６４】
好ましい態様において、本発明の対象である組成物は、アミノ酸システインのＮ−アセチル化誘導体であるアセチルシステイン（またはＮ−アセチルシステイン）、および、上記のとおり、好ましくは脂質マトリックス中でマイクロカプセル化され胃保護された、リゾチームをさらに含む。
【００６５】
出願人は、表１−５または上記種々の好ましい態様に記載されている１または２つの細菌株と関連したアセチルシステインの使用が、病原体細菌自体により生産され、該病原体により防護として使用される細菌生物膜を溶解することができることを見出した。実際、病原体細菌がその細胞のまわりに保護コーティング（生物膜）を形成することができることが分かった。生物膜は、病原体細胞を攻撃することをより困難にし、より強固に保護する。アセチルシステインは、細胞の生物膜に浸透し、それを溶解することができ、その結果、本発明の対象である細菌の株により生産されるバクテリオシンおよび／または代謝産物および／または過酸化水素水の手段による、病原性細胞に対する攻撃を促進する。
【００６６】
本発明の対象である、投与される組成物中に存在するアセチルシステインの量は、１０から１，０００ｍｇ／日で含まれ、好ましくは、それは、２００から６００ｍｇ／日で含まれる。好ましくは固体形態において、アセチルシステインは、当業者に知られた技術および装置を使用して、好ましくは固体形態または凍結乾燥形態において、プロバイオティック細菌と混合される。
【００６７】
本発明の対象である、投与される組成物中に存在する、好ましくはマイクロカプセル化された、リゾチームの量は、１０から２．０００ｍｇ／日で含まれ、好ましくは、それは、４００から１．０００ｍｇ／日で含まれる。（好ましくはマイクロカプセル化された）リゾチームは、好ましくは固体形態においてであり、当業者に知られた技術および装置を使用して、好ましくは固体形態または凍結乾燥形態において、プロバイオティック細菌と混合される。
【００６８】
本発明の対象である、投与される組成物中に存在するアセチルシステインおよびマイクロカプセル化されたリゾチームの量はそれぞれ、１０から１，０００ｍｇ／日、好ましくは２００から６００ｍｇ／日で含まれ、一方、マイクロカプセル化されたリゾチームは、１０から２，０００ｍｇ／日、好ましくは４００から１，０００ｍｇ／日で含まれる。それらは、当業者に知られた技術および装置を使用して、固体形態において、好ましくは固体形態または凍結乾燥形態において、プロバイオティック細菌と混合される。本発明の対象である組成物中に存在するＮ−アセチルシステインの量は、１０から１，０００ｍｇ／日、好ましくは５０から２００ｍｇ／日、よりさらに好ましくは６０から１５０ｍｇ／日で含まれる。Ｎ−アセチルシステインは、薬学的に許容される形態において、好ましくは固体形態において市場に出ており、当業者に知られた技術および装置を使用して、好ましくは固体形態または凍結乾燥形態において、プロバイオティック細菌と混合し、均一組成物を得る。
【００６９】
本発明の対象である組成物中に存在する、好ましくはマイクロカプセル化され胃保護された、リゾチームの量は、１０から２，０００ｍｇ／日で含まれ、好ましくは、それは、好ましくは固体形態において、４００から１，０００ｍｇ／日、よりさらに好ましくは５００から８００ｍｇ／日で含まれる。それは、当業者に知られた技術および装置を使用して、好ましくは固体形態または凍結乾燥形態においてプロバイオティック細菌と混合し、均一組成物を得る。リゾチームは、薬学的に許容される形態において市場に出ている。
【００７０】
実験の部
１４株の乳酸菌、４株のビフィズス菌および２株の連鎖球菌(streptococci)の抗菌活性を、大腸菌の４個のバイオタイプ、ＡＴＣＣ  ８７３９、ＡＴＣＣ  １０５３６、ＡＴＣＣ  ３５２１８およびＡＴＣＣ  ２５９２２に対して試験した。これらは公に入手可能である。値は阻害ハロー（ｍｍ）として示される。データは表１に示される。
【００７１】
抗菌活性を決定するために、株を、Santiniら(2010) Characterization of probiotic strains：カンピロバクター・ジェジュニに対する家禽における飼料添加物としての適用、Int J Food Microbiol. 2010 Jul 31;141 Suppl 1:S98-108. Epub 2010 Apr 8におけるプロトコールにしたがって試験した。
【００７２】
表１に記載されている細菌株を、嫌気性雰囲気を産生するためのシステム（ＧａｓＰａｃｋ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、３７℃で１８時間ＭＲＳブロスで培養した。様々な大腸菌のバイオタイプを、トリプシンソイブロス(Tryptic Soy Broth)（ＴＢＳ）中で活性化し、３７℃で１８時間好気的にインキュベートした。実験前に、株を少なくとも３回継代培養した。スポット寒天試験(spot agar test)（当業者に知られた試験）のために、以下の処理を行った。実際には、３７℃で一晩培養された（培養ブロス＋培地）上記乳酸菌株の１０マイクロリットルの培養物を、（寒天ＴＢＳ培地を含む）寒天プレートの表面上に置いた（スポット化した）。該プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、株（スポット）を発達させた。大腸菌のバイオタイプ（０．１％）をトリプシンダイズ軟寒天(Tryptic Soy soft agar)中でインキュベートし、上記プレートにおいてスポット上に配置した。上層寒天(top agar)を固体化して、プレートを反転させ、３７℃で２４時間好気状態下でインキュベートした。それぞれの試験を２回繰り返した。２４時間後、プレートを視覚的に検査し、阻害地域を観察および決定した。乳酸菌のスポットの周り２ｍｍ以上の阻害地域の存在を、陽性結果と考えた（使用される方法の要約のために図１参照）。
【００７３】
乳酸菌と同じ技術をビフィズス菌に対して使用した。
【００７４】
上層寒天技術：
寒天Ｐｅｔｒｉプレート（ＭｃＣｏｎｋｅｉ寒天培地）上に筋状にされた(streaked)大腸菌株を、２４時間好気状態下でインキュベートした。１または２つのコロニーを回収し、ＭｃＦａｒｌａｎｄスケール（参照表に引用される既知のスケール）において０．５の濁度値に達するまで、１ｍｌの滅菌水中に溶解した。
【００７５】
１００μｌの該懸濁液を、液体を維持するように、約４５℃の温度で５０ｍｌの軟寒天培地（０．７％寒天を有するＬＡＰＴｇ）に接種した。
【００７６】
３ｍｌの軟寒天を、培養した乳酸菌で以前に調製されたプレートの表面上に注ぐ。
【００７７】
１８−２０時間、好気状態下で３７℃で乾燥およびインキュベートする。
【００７８】
結果は、阻害ハローを測定することにより読んだ。
【００７９】
結果
Ａ．大腸菌のバイオタイプに対する本発明の株のインビトロスクリーニング
大腸菌の増殖を阻害する活性を、表１に記載されている株の生存細菌培養物を使用して決定した。陽性結果を、表２に記載されている全ての株について得た。特に、表３−５に記載されている株は、全ての試験された大腸菌のバイオタイプの増殖に対する強い阻害／低減効果により区別された。
【００８０】
Ｂ．毒素原性大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７に対する阻害活性を有する本発明の株の選択
表１に記載されている株をまた、大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７に対して試験した。大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７の増殖に対する阻害活性を、表１に記載されている株の生存細菌培養物を使用して決定した。
【００８１】
図２に示されるとおり、試験された５つの株のみが、腸管出血性大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７（ＣＱ９４８５）を含む試験された大腸菌のバイオタイプの増殖を阻害／低減する能力を示した。図２において、結果は、３つの別個の試験にて計算され、阻害ハローの標準偏差（ＳＤ）として示され、２ｍｍのカットオフを与える。
【００８２】
上記実験データから、６つの乳酸菌および２つのビフィズス菌（表４）が、アミノ酸の脱カルボキシル化により、例えば、メルカプタン、ヒスタミン、カダベリン、プトレシンおよびチラミンのような、多種多様の生体アミンの生産に関与する４つの大腸菌株（ＡＴＣＣ  ８７３９  ＡＴＣＣ  １０５３６  ＡＴＣＣ  ３５２１８  ＡＴＣＣ  ２５９２２）の増殖に対するインビトロ阻害／低減活性を示すと推測することができる。これらの生体アミンは、危険な全身性中毒に関与すると考えられる。さらに、亜硝酸化合物および硝酸化合物の存在は、いくつかの型の癌を引き起こし得る強い変異原活性を示すＮ−ニトロソアミンを形成し得る。最後に、上記実験データは、試験される５つの細菌株が、ヒトの健康に対して非常に毒性であり、死に至りさえする１つ以上の志賀毒素を生産することができる大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７（ＣＱ９４８５）の病原体株に対して、活性であることを示す。
【００８３】
実験の部
材料および方法：微生物および培養条件
本試験において、乳酸菌属に属するプロバイオティック細菌の４つの異なる種を使用した（表６および７）。全ての細菌を、嫌気状態下で（GasPak, Becton Dickinson, Milan, Italy）、３７℃で１８時間、Ｍａｎ, Ｒｏｇｏｓａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地中で培養した（Becton Dickinson, Milan, Italy社により販売される）。以下の４つの大腸菌バイオタイプを標的株として使用した：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC, Rockville, Maryland, USA）から購入される大腸菌  ＡＴＣＣ  ８７３９、大腸菌  ＡＴＣＣ  １０５３６、大腸菌  ＡＴＣＣ  ３５２１８および大腸菌  ＡＴＣＣ  ２５９２２。腸管出血性大腸菌株  Ｏ１５７：Ｈ７（ＣＱ  ９４８５）は、Gastroenterology Department, Ospedale Maggiore della Carita, Novara, Italyにより提供された。リステリア・モノサイトゲネス  ＡＴＣＣ  １９１１２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した；エンテロコッカス種およびクレブシエラ種は、コリックを患った新生児の糞便サンプルから単離された（University of Bologna, Italy）。全ての大腸菌のバイオタイプ、エンテロコッカス種およびクレブシエラ種を、トリプトンダイズブロス（ＴＳＢ）培地（Biotest, Rockaway, NJ, USA）で培養し、３７℃で１８時間好気的にインキュベートした。リステリア・モノサイトゲネスを、Ｆｒａｓｅｒ培地（Oxoid, Hampshire, United Kingdom）で培養し、３７℃で１８時間好気的にインキュベートした。全ての細菌株を、阻害実験に使用する前に、少なくとも３回移植した(transplanted)。
【００８４】
ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬを使用する発酵プロフィール
乳酸菌属に属するプロバイオティック細菌種を、３７℃で１８時間培養し、滅菌水で２回洗浄し、６０００ｒｐｍで５分間遠心した。水で再懸濁後、５ｍｌの水を含む試験チューブ中で、サンプルの量を、ＭｃＦａｒｌａｎｄスケールにおいて不透明度値２に達するように加えた。以前に使用された量の２倍のサンプルの量を、１０ｍｌのＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ培地（API systems, BioMerieux）に加えた。２００μｌの懸濁液を、ＡＰＩ  ５０  ＣＨギャラリー(gallery)のそれぞれのウェルに移した。全てのウェルをパラフィン油で再び覆い、嫌気状態を保証した。ギャラリーを湿らせ、３７℃でインキュベートした。出発色（紫色）の変化を、インキュベーションの１および２日後に確認した。
【００８５】
プライマーおよび種特異的ＰＣＲアッセイ
乳酸菌のそれぞれの株のゲノムＤＮＡを、Ｍｉｃｒｏ溶解ＴＭキット（Labogen, Rho, Italy）で抽出する。具体的には、２μｌのそれぞれの細菌培養物を溶解バッファーに加え、溶解を製造業者の指示にしたがって、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーマルサイクラー（Perkin-Elmer, Monza, Italy）で行う。
【００８６】
ラクトバチルス・プランタラムないしラクトバチルス・ペントーサスの株について、ＰＣＲ反応のために使用されるプライマーをｒｅｃＡ遺伝子に対して設計し、ラクトバチルス・ラムノサス株について、１６Ｓから２３ＳのリボソームＲＮＡに含まれる遺伝子間領域（表６）を使用した。全てのプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社により合成された。
【００８７】
増幅のために、混合物（２５μｌ）を、２ｘ  ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌの溶解ＤＮＡおよび種特異的プライマーセット（０．３０ｍＭ）で作り出した。ＰＣＲサイクルを、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーマルサイクラーで行った。増幅プログラムは、表６に示されている。
【００８８】
ＰＦＧＥ
乳酸菌株を、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学濃度が０．８に達するまで、ＭＲＳ培地で培養する。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２のバッファー溶液中で洗浄後、細胞を３００μｌの同じバッファー溶液に再懸濁する。３００μｌのアガロース  ２％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の添加後、サンプルをモールド(mould)に注いだ。
【００８９】
プラグ(plug)を、２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）および４Ｕ／ｍｌのムタノリシン（Ｓｉｇｍａ）を添加した溶解バッファー溶液（６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  サルコシル、０．２％  デオキシコール酸塩、ｐＨ７．６）中で３７℃で１８時間インキュベートする。プロテイナーゼ  Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ）での処理を、５０℃で２４時間ｐＨ８．０で、バッファー溶液  １００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  サルコシル、０．２％  デオキシコール酸塩中で行った。プラグをバッファー溶液  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓで４回洗浄し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ａｔ  ｐＨ８．０、最初の２回の洗浄は１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｓｉｇｍａ）を加える。制限酵素での消化前に、プラグをＴＥバッファーで２回洗浄し、次に、適当な制限酵素バッファーで１時間を平衡にする。制限酵素での消化は、１８時間、ＮｏｔＩに対して３７℃でおよびＳｆｉＩで５０℃で行う。電気泳動サイクルは、０．５Ｍ  ＴＢＥバッファー中１％  アガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＣＨＥＦ  ＤＲ  ＩＩＩ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行う。
【００９０】
サイクルは、以下のパラメーターをセットする：ＮｏｔＩ（スイッチ時間：１−１１秒、電圧  ６Ｖ／ｃｍ、バッファー温度  １４℃、サイクル時間  ２７時間）；ＳｆｉＩ（スイッチ時間：１−１５秒、電圧  ５Ｖ／ｃｍ、バッファー温度  １４℃、サイクル時間  ２２時間）。アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５ｍｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ光の手段により視覚化する。
【００９１】
インビトロ阻害活性の評価
大腸菌に対する抗菌活性は、Ｓａｎｔｉｎｉ  Ｃら２６により記載されたプロトコールを使用して評価した。簡潔には、６００ｎｍで約１．０の光学濃度を有する１０μｌのそれぞれのＬＡＢ培養物を、ＬＡＰＴｇ培地で寒天Ｐｅｔｒｉプレートの表面上に注ぎ（滴下し）、３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートし、細菌増殖（スポット）させる。標的大腸菌株（０．１％）を、トリプシンダイズ軟寒天培地に接種させ、スポットを含むプレート上に注ぐ。凝固後、プレートを反転させ、３７℃で２４時間好気状態下でインキュベートする。
【００９２】
それぞれの実験は、デュプリケートで行った。試験下での病原体の増殖が認められないハローの存在（阻害ハロー）を、陽性結果とみなした。
【００９３】
種々の大腸菌株に関してプロバイオティックの阻害活性の定量化を、Ｂｉｏｌａｂ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＭｏｆｉｎＡｌｃｅ  Ｇｒｏｕｐ社の研究および開発課の研究室において行い、腸管出血性大腸菌株  Ｏ１５７：Ｈ７に関する定量化を、民間クリニック「Ｉ  Ｃｅｄｒｉ」、Ｆａｒａ  Ｎｏｖａｒｅｓｅ、Ｉｔａｌｙの専門家スタッフにより行った。
【００９４】
リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコッカス種およびクレブシエラ種に対する抗菌活性を、ディスク拡散方法を使用して評価した。簡潔には、ＬＡＢを３７℃で２４時間ＭＲＳ培地で培養し、次に、新鮮な培地で洗浄し、再懸濁した。病原体を、試験下で病原性種に対して特異的な寒天培地を含むＰｅｔｒｉプレートの表面上に一様に播種する。種々のペーパーディスクを病原体を有するプレートの表面上に置き、次に、１００μｌのＬＡＢをそれぞれのディスク上に吸収させる。プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。試験下での病原体の増殖が認められないハローの存在（阻害ハロー）を、陽性結果とみなした。結果は阻害ハロー（ｍｍ）として示される。結果の有意性を決定するための閾値は２ｍｍである。
【００９５】
結果
病原体細菌に対するプロバイオティック株のインビトロ阻害活性
病原体細菌に対するいくつかの乳酸菌株の抗菌活性は、多元的(multi-factorial)であり、過酸化水素、乳酸、既知の分子、例えば、バクテリオシンおよび熱安定性の未知の分子の生産を含む。
【００９６】
図４に示されるとおり、寒天および生細胞におけるスポット方法により得られた結果は、試験された全ての細菌が４つの大腸菌株に関して阻害活性を示すという事実を強調した。最も良い阻害活性を示すプロバイオティック株は、ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４およびラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１である。標的として腸管出血性大腸菌株  血清型  Ｏ１５７：Ｈ７を使用して得られたデータもまた、ラクトバチルス・ラムノサス  ＬＲ０４およびラクトバチルス・ペントーサス  ＬＰＳ０１の存在下で最も良い阻害活性を示した（図４）。
【００９７】
試験下のプロバイオティック株をさらに特徴付けるために、分析を、ディスク拡散方法を使用して、ヒト胃腸管を襲う他の病原性種に拡大した。ラクトバチルス・プランタラム  ＬＰ０１株は、試験された全ての病原性細菌に対して、特にリステリア・モノサイトゲネスに対して、最も良い阻害能力を予想外に示した。
【表６】
2014526242.tif 000007
【表７】
2014526242.tif 000008
【図１】
2014526242.tif 000009
【図２】
2014526242.tif 000010
【図３】
2014526242.tif 000011
【図４】
2014526242.tif 000012
【図５−１】
2014526242.tif 000013
【図５−２】
2014526242.tif 000014
【図６】
2014526242.tif 000015
【国際調査報告】
2014526242.tif 000016
2014526242.tif 000017
2014526242.tif 000018
2014526242.tif 000019
2014526242.tif 000020