(57)【要約】本開示は、細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの活性または発現の修飾物質と接触させることによって、細胞における脂肪酸またはグルコースの代謝を調節する方法を提供する。本開示はまた、被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの活性または発現の阻害剤を投与することによって、被験体において、肥満症、糖尿病、またはメタボリックシンドロームなどのような代謝障害を処置または予防する方法を提供する。被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの活性または発現の阻害剤を投与することによって、被験体におけるミトコンドリア機能および／またはレドックスホメオスタシスを増強または改善する方法もまた、提供される。
2014530222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝障害を処置または予防する必要がある被験体において、代謝障害を処置または予防する方法であって、該被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤を投与することを含み、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性が、投与後に、該被験体の細胞において低下する、方法。
【請求項２】
前記代謝障害が、メタボリックシンドローム、肥満症、真性糖尿病、糖尿病性腎症、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脂質蓄積障害、糖原病、中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症、高コレステロール、または異常なグルコース取込みおよび／もしくは利用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質蓄積障害が、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、ファブリー病、ウォルマン病、およびコレステロールエステル貯蔵病からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの前記阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列に対して、少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号９または配列番号１１に対して、少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖および／またはバックボーンの修飾を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記糖修飾が、ロックド核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記糖修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖修飾が、２’−ハロ修飾である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記２’−ハロ修飾が、２’−フルオロ修飾である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バックボーン修飾が、ホスホロチオエート連結である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約６〜約２２ヌクレオチドである、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に対して、完全に相補的である配列を有する、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３または配列番号４の配列を有する、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０７０７、１０６８０、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、ヒトである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害剤が、前記被験体に対して、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の投与経路によって投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞における脂肪酸またはグルコースの代謝を調節する方法であって、前記細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
前記修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
脂肪酸またはグルコースの代謝が、前記ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤との接触後に、前記阻害剤に対して曝露されない細胞と比較して、前記細胞において増加する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの前記阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列に対して、少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖および／またはバックボーンの修飾を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖修飾が、ロックド核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記糖修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記糖修飾が、２’−ハロ修飾である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記２’−ハロ修飾が、２’−フルオロ修飾である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記バックボーン修飾が、ホスホロチオエート連結である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約６〜約２２ヌクレオチドである、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に対して、完全に相補的である配列を有する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３または配列番号４の配列を有する、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０７０７、１０６８０、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
脂肪酸またはグルコースの代謝が、前記ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとの接触後に、該アゴニストに対して曝露されない細胞と比較して、前記細胞において減少する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アゴニストが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列を含むポリヌクレオチドである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、または肝細胞である、請求項２０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、インビトロまたはインビボにおけるものである、請求項２０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ミトコンドリア機能またはレドックスホメオスタシスを増強する必要がある被験体において、ミトコンドリア機能またはレドックスホメオスタシスを増強する方法であって、該被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含み、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性が、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後に、該被験体の細胞において低下する、方法。
【請求項４２】
前記被験体が、筋力低下、虚弱、サルコペニア、筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、またはミトコンドリア性筋障害と診断されているか、それに罹患しているか、またはその危険性がある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ミトコンドリア性筋障害が、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、カーンズ−セイヤー症候群（ＫＳＳ）、または慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号９または配列番号１１に対して、少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３または配列番号４の配列を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０７０７、１０６８０、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖および／またはバックボーンの修飾を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記糖修飾が、ロックド核酸である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記糖修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記糖修飾が、２’−ハロ修飾である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記２’−ハロ修飾が、２’−フルオロ修飾である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記バックボーン修飾が、ホスホロチオエート連結である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約６〜約２２ヌクレオチドである、請求項４１〜５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約８〜約１６ヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記被験体が、ヒトである、請求項４１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記被験体に対して、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の投与経路によって投与される、請求項４１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
筋萎縮症またはサルコペニアを処置する必要がある被験体において、筋萎縮症またはサルコペニアを処置する方法であって、該被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法。
【請求項５９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号９または配列番号１１に対して、少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３または配列番号４の配列を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０７０７、１０６８０、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物１０１０１、１０６７３、１０６８１、または１０６８３の構造を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖および／またはバックボーンの修飾を含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記糖修飾が、ロックド核酸である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記糖修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記糖修飾が、２’−ハロ修飾である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記２’−ハロ修飾が、２’−フルオロ修飾である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記バックボーン修飾が、ホスホロチオエート連結である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約６〜約２２ヌクレオチドである、請求項５８〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約８〜約１６ヌクレオチドである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験体が、ヒトである、請求項５８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体が、高齢者である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記被験体に対して、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の投与経路によって投与される、請求項５８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年１０月６日に出願した米国仮出願第６１／５４４，１８７号および２０１２年４月２５日に出願した米国仮出願第６１／６３８，３４５の利益を主張する。これらの出願は各々、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援についての記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの助成金番号５Ｒ０１ＨＬ０９３０３９の下での助成金支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または発現を調整する作用物質を投与することによる、代謝障害の処置および予防に関する。特に、本発明は、被験体の細胞におけるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性を阻害することによって、代謝障害を処置または予防するための方法を提供する。そのうえ、本発明は、細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることによって、細胞における脂肪酸代謝を調節するための方法を提供する。本発明はまた、被験体の細胞におけるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性を阻害することによって、ミトコンドリア機能を増強するもしくは上昇させる、燃料代謝を改善する、および／またはレドックスホメオスタシスを維持するための方法をも提供する。
【背景技術】
【０００４】
エネルギーホメオスタシスの維持は、エネルギー摂取およびエネルギー消費の間のバランスを必要とする。西洋社会において、過剰な摂食量は、肥満症の劇的な増加をもたらす、エネルギーバランスの変化（非特許文献１（Ｖａｎら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４、８７５−８８０））、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、高血圧症、高脂血症、および心臓血管系疾患の危険性を高める多臓器障害（非特許文献２（Ｍａｔｈｉｅｕら、（２００８）Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０、８２１−８３６））に至った。エネルギーをもたらす基質の代謝の障害および心筋の脂質蓄積は、肥満でインスリン抵抗性の個人において見つけられる初期の異常である（非特許文献３（Ｈａｒｍａｎｃｅｙら、（２００８）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ５，１８１−１８７））。代謝的に活性な組織（たとえば脂肪、肝臓、および骨格筋）におけるミトコンドリア機能不全は、メタボリックシンドローム（ＭＳ）、インスリン抵抗性（ＩＲ）、およびＴ２Ｄを含む代謝性疾患と一般に関連する（非特許文献４（Ｍｕｏｉｏ  ａｎｄ  Ｎｅｗｇａｒｄ、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００８．９、１９３−２０５））。
【０００５】
したがって、ミトコンドリア機能の増強などによって、肥満症および関連する代謝性疾患を処置するおよび予防するための有効な療法を同定する必要性がますます大きくなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖａｎら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４、８７５−８８０
【非特許文献２】Ｍａｔｈｉｅｕら、（２００８）Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０、８２１−８３６
【非特許文献３】Ｈａｒｍａｎｃｅｙら、（２００８）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ５，１８１−１８７
【非特許文献４】Ｍｕｏｉｏ  ａｎｄ  Ｎｅｗｇａｒｄ、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００８．９、１９３−２０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ｍｉＲ−２０８阻害が、年齢誘発性の体重増加および高脂肪誘発性の体重増加を低下させ、また、糖耐性、燃料代謝、ミトコンドリア機能、およびレドックスホメオスタシスを改善するという驚くべき発見に部分的に基づく。したがって、本発明は、肥満症および糖尿病などのような代謝障害を処置または予防するための方法、および／または細胞（たとえば心および／もしくは骨格筋細胞）におけるｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性を調整することによる肥満症および糖尿病などのような代謝障害を処置または予防するための方法を、その必要がある被験体において提供する。本発明はまた、細胞におけるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性を調整することによって、ミトコンドリア機能、レドックスホメオスタシス、および燃料代謝を増強するための方法をも、その必要がある被験体において提供する。
【０００８】
一実施形態において、本発明の方法が、被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤）を投与することを含み、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性が、投与後に、被験体の細胞において低下する。阻害剤の投与は、その必要がある被験体において、代謝障害を処置または予防するためのものであってもよい。一実施形態において、阻害剤の投与が、その必要がある被験体において、ミトコンドリア機能を増強するためのものである。
【０００９】
処置されることとなる代謝障害は、メタボリックシンドローム、肥満症、真性糖尿病、糖尿病性腎症、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脂質蓄積障害、糖原病、中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症、脂質酸化、高コレステロール、または異常なグルコース取込みおよび／もしくは利用を含むことができる。これらの代謝障害から結果として生じる二次疾患または状態もまた、本発明の方法により予防するまたは処置することができる。たとえば、一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤を投与することによって、睡眠時無呼吸、癌、脳卒中、および変形性関節症などのような、肥満症から結果として生じる二次疾患または障害を予防するまたは処置する方法を提供する。ミトコンドリア機能不全による障害もまた、本明細書において開示される方法によって処置することができる。たとえば、被験体は、筋力低下、虚弱、サルコペニア、筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、またはミトコンドリア性筋障害に罹患し得るまたはその危険性があり得る。
【００１０】
本発明の方法において使用するのに適したｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列に対して、少なくとも部分的に相補的である配列を含む。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ロックド核酸、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’Ｏ−アルキル修飾、およびホスホロチオエート連結などのような、１つ以上の糖または骨格修飾を含む。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’Ｏ−アルキル修飾または２’−フルオロ修飾などのような２’−ハロ修飾を含む。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤が、長さが約６〜約２２ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、細胞における脂肪酸代謝を調節するための方法であって、細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることを含む方法を提供する。修飾物質は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤またはアゴニストとすることができる。ある実施形態において、脂肪酸代謝が、阻害剤に対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤との接触後に、細胞において増加する。他の実施形態において、脂肪酸代謝が、アゴニストに対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとの接触後に、細胞において減少する。細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものであってもよい。いくつかの実施形態において、細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、または膵臓細胞である。
【００１２】
本発明は、エネルギーホメオスタシスに影響を与えるように、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂを含むｍｉＲ−２０８ファミリーｍｉＲＮＡの発現（たとえば存在量）を阻害することができる化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を包含する。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および代謝障害などのような、エネルギーホメオスタシスに関係するまたはそれに影響を与える状態または障害を有する患者を処置するための方法をさらに提供する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、本発明の方法において使用するための、本明細書において記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を含む医薬組成物および製剤を提供する。そのような製剤および組成物は、細胞の送達のための、様々な巨大分子集合体、ミセル、またはリポソーム組成物内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込みを含んでいてもよい。ある実施形態において、組成物が、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内注射または標的組織（たとえば心もしくは骨格筋組織）への直接的な注射に適しているまたはそれ用に製剤される。
【００１４】
本発明の他の態様および実施形態は、本発明についての以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）が、マウスにおける年齢誘発性の体重増加を低下させることを示す図である。１、２、および３日目に３×２５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）および２週間ごとに２５ｍｇ／ｋｇの維持量により処置されたマウスは、コントロール（Ｍ−１０５９１）または食塩水注射動物と比較して、年齢に伴う体重（ＢＷ）増加における低下を示す（Ａ）。グループはすべて、８週齢で、同等の体重でスタートしたが、食塩水およびコントロール注射動物は、年齢誘発性の体重における減少により、有意により低い心臓重量対体重（ＨＷ／ＢＷ）比を示す（Ｂ）。パネルＣおよびＤにおいて、異なるグループの心臓重量（ＨＷ）および心臓重量対全重量（ＨＷ／ＴＬ）もまた、それぞれ示す。
【図２】図２は、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）が、ラットにおける年齢誘発性の体重増加を低下させることを示す図である。１１週間、２週間ごとの、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）、コントロール（Ｍ−１０５９１）、または食塩水の、オス成体ラットへの投薬は、抗ｍｉＲ−２０８ａが、体重における年齢誘発性の増加を低下させることを示す。
【図３】Ａ．抗ｍｉＲ−２０８ａまたはコントロール抗ｍｉＲ（コントロール）により、６週間処置したマウスのノーザンブロット分析。Ｕ６  ＲＮＡは、ローディングコントロールとして検出した。それぞれの処置からの５匹のマウス由来の心臓について分析した。抗ｍｉＲ−２０８ａ処置心臓中にｍｉＲ−２０８ａが存在しないことに注目されたい。Ｂ．６週間の普通の固形飼料（ＮＣ）または高脂肪食（ＨＦ）の抗ｍｉＲ−２０８ａおよびコントロール抗ｍｉＲ処置マウスからの心臓重量（ｎ＝５〜１３）。Ｃ．６週間のＮＣの抗ｍｉＲ−２０８ａおよびコントロール抗ｍｉＲ処置マウスについての短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（ｎ＝５）。Ｄ．６週間のＮＣの抗ｍｉＲ−２０８ａおよびコントロール抗ｍｉＲ処置マウスについての、毎分脈拍における心拍数（ｎ＝５）。
【図４−１】図４は、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスが、食餌誘発性の肥満症に対して抵抗性であることを示す図である。Ａ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する代表的な画像。Ｂ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する成長曲線および体重における増加パーセント。Ｃ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する、ＮＭＲによって測定した体組成。それぞれのバーの白色の部分は、脂肪重量を示す。Ｄ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウス由来の内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）および肩甲下褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量。Ｅ．普通の食餌または高脂肪食のコントロールおよび抗ｍｉＲ−２０８処置マウス由来の内臓ＷＡＴおよび肩甲下ＢＡＴのＨ＆Ｅ染色。スケールバー＝４０μｍ。Ｆ．６週間の高脂肪食の抗ｍｉＲ−２０８ａおよびコントロール抗ｍｉＲ処置マウス由来の内臓ＷＡＴおよび肝臓の写真。Ｇ．内臓ＷＡＴの細胞サイズ（ｎ＝５）。＞５００個の細胞を示すそれぞれのグループにおける７〜８匹のマウス由来の２００ｍｍ間隔の３枚の切片からの画像について、分析した。普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスからの血清トリグリセリドレベル（Ｈ）および血清コレステロールレベル（Ｉ）。
【図４−２】図４は、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスが、食餌誘発性の肥満症に対して抵抗性であることを示す図である。Ａ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する代表的な画像。Ｂ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する成長曲線および体重における増加パーセント。Ｃ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する、ＮＭＲによって測定した体組成。それぞれのバーの白色の部分は、脂肪重量を示す。Ｄ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウス由来の内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）および肩甲下褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量。Ｅ．普通の食餌または高脂肪食のコントロールおよび抗ｍｉＲ−２０８処置マウス由来の内臓ＷＡＴおよび肩甲下ＢＡＴのＨ＆Ｅ染色。スケールバー＝４０μｍ。Ｆ．６週間の高脂肪食の抗ｍｉＲ−２０８ａおよびコントロール抗ｍｉＲ処置マウス由来の内臓ＷＡＴおよび肝臓の写真。Ｇ．内臓ＷＡＴの細胞サイズ（ｎ＝５）。＞５００個の細胞を示すそれぞれのグループにおける７〜８匹のマウス由来の２００ｍｍ間隔の３枚の切片からの画像について、分析した。普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスからの血清トリグリセリドレベル（Ｈ）および血清コレステロールレベル（Ｉ）。
【図４−３】図４は、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスが、食餌誘発性の肥満症に対して抵抗性であることを示す図である。Ａ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する代表的な画像。Ｂ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する成長曲線および体重における増加パーセント。Ｃ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスを比較する、ＮＭＲによって測定した体組成。それぞれのバーの白色の部分は、脂肪重量を示す。Ｄ．普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウス由来の内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）および肩甲下褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量。Ｅ．普通の食餌または高脂肪食のコントロールおよび抗ｍｉＲ−２０８処置マウス由来の内臓ＷＡＴおよび肩甲下ＢＡＴのＨ＆Ｅ染色。スケールバー＝４０μｍ。Ｆ．６週間の高脂肪食の抗ｍｉＲ−２０８ａおよびコントロール抗ｍｉＲ処置マウス由来の内臓ＷＡＴおよび肝臓の写真。Ｇ．内臓ＷＡＴの細胞サイズ（ｎ＝５）。＞５００個の細胞を示すそれぞれのグループにおける７〜８匹のマウス由来の２００ｍｍ間隔の３枚の切片からの画像について、分析した。普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスからの血清トリグリセリドレベル（Ｈ）および血清コレステロールレベル（Ｉ）。
【図５】図５は、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスが、グルコース不耐性に対して抵抗性であることを示す図である。普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール抗ｍｉＲ（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）処置マウスからのブドウ糖負荷試験（Ａ）およびブドウ糖負荷試験についての曲線下面積（Ｂ）。普通の食餌（ＮＣ）および高脂肪食（ＨＦ）の６週間後のコントロール抗ｍｉＲおよび抗ｍｉＲ−２０８ａ処置マウスからの空腹時インスリン（Ｃ）およびレプチン（Ｄ）レベル。
【図６】図６は、普通の食餌（ＲＥＧ）および高脂肪食（ＨＦＤ）の１２週間後の食塩水、コントロール抗ｍｉＲ（Ｍ−１０５９１、Ｍ−１０６４９、Ｍ−１０７０２、Ｍ−１１１８２）、および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０６７３、Ｍ−１０６８１、Ｍ−１０６８３）処置マウスを比較する成長曲線（Ａ）および体重における増加パーセント（Ｂ）を示す図である。
【図７】図７は、ｍｉＲ−２０８ａ阻害が、糖耐性を増強することを示す図である。通常の固形飼料および高脂肪食（ＨＦＤ）の１１週間後のコントロール抗ｍｉＲ（Ｍ−１０５９１）および抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０６７３、Ｍ−１０６８１、Ｍ−１０６８３）処置マウスからのブドウ糖負荷試験。
【図８】図８は、コントロール抗ｍｉＲ（Ｍ−１０５９１）または４つの抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物（Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０６７３、Ｍ−１０６８１、Ｍ−１０６８３）のうちの１つを受ける肥満のマウスについての、ある期間にわたる体重（Ａ）および体重における変化パーセント（Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、代謝障害を処置または予防するための方法を、その必要がある被験体において提供する。ミトコンドリア機能、レドックスホメオスタシス、および／または燃料代謝を増強するための方法もまた、本明細書において提供される。ｍｉＲＮＡは、肥満症、糖尿病、および他の代謝障害を含む、そのような疾患のための処置の開発のための新規な処置標的に相当する。
【００１７】
一実施形態において、方法が、被験体に対して、本明細書において記載されるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤を投与することを含み、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性が、投与後に、被験体の細胞において低下する。本明細書において使用される場合、用語「患者」または「被験体」は、限定を伴うことなく、ヒトおよび他の霊長動物（たとえばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、飼育哺乳動物（たとえばイヌおよびネコ）、家畜（たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、実験動物（たとえばマウス、ラット、およびモルモットなどのようなげっ歯動物）、ならびに鳥（たとえばニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ目の鳥、アヒル、ガチョウ、ならびにその他同種のものなどのような飼育、野生、ならびに猟鳥）を含む、任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態において、被験体が、哺乳動物である。ある実施形態において、被験体が、ヒトである。
【００１８】
ある実施形態において、その必要がある被験体が、代謝状態または障害と診断されている、それに罹患している、および／またはその症状を示している。他の実施形態において、被験体が、代謝状態または障害と診断されていない、それに罹患していない、および／またはその症状を示していない。代謝障害は、メタボリックシンドローム、肥満症、真性糖尿病、糖尿病性腎症、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、異脂肪血症（混合性または糖尿病性異脂肪血症など）、高コレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール、高ＬＤＬコレステロール、高脂血症、高トリグリセリド血症、低血糖症、高血糖症、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧症、高リポタンパク血症、メタボリックシンドローム、症候群Ｘ、血栓障害、跛行、脳卒中および他、腎疾患、ケトアシドーシス、ネフロパチー、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網膜症、脂肪症または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などのような非アルコール性脂肪性肝疾患、脂質蓄積障害（たとえばニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、ファブリー病、ウォルマン病、およびコレステロールエステル貯蔵病）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、高コレステロール、または異常なグルコース取込みおよび／もしくは利用を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明の方法により処置されることとなる代謝障害が、肥満症、高コレステロール血症、２型糖尿病、肝臓脂肪症、または高脂血症である。
【００１９】
他の実施形態において、被験体が、アテローム性動脈硬化症ならびにアンギナ、心臓発作、心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全、および／または心肥大を含むその続発症などのような心臓血管系疾患または障害と診断されていない、それに罹患していない、および／またはその症状を示していない。いくつかの実施形態において、被験体が、心臓血管系疾患または障害と診断されていない、それに罹患していない、および／またはその症状を示していないならびに代謝状態または障害と診断されている、それに罹患している、および／またはその症状を示している。
【００２０】
ある実施形態において、その必要がある被験体が、ミトコンドリア機能不全に関係する状態または障害と診断されている、それに罹患している、および／またはその症状を示している。他の実施形態において、被験体が、ミトコンドリア機能不全に関係する状態または障害と診断されていない、それに罹患していない、および／またはその症状を示していない。障害または状態は、筋力低下、虚弱、サルコペニア、筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、またはミトコンドリア性筋障害を含むことができるが、これらに限定されない。ある実施形態において、その必要がある被験体が、ミトコンドリア機能不全に関係する状態または障害と診断されている、それに罹患している、および／またはその症状を示しているならびに心臓血管系疾患または障害と診断されていない、それに罹患していない、および／またはその症状を示していない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、代謝障害が、糖原病（ＧＳＤ）である。たとえば、本発明の方法は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤をその必要がある被験体に対して投与することによって、被験体において、ＧＳＤの型のいずれか（たとえばＧＳＤ  ０型およびＧＳＤ  Ｉ型〜ＧＳＤ  ＸＩＩＩ型）を処置または予防することを提供する。ＧＳＤは、フォンギールケ病、ポンペ病、コリ病またはフォーブズ病、アンダーセン病、マッカードル病、エール病、垂井病、ファンコニ・ビッケル症候群、および赤血球アルドラーゼ欠損症を含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、代謝障害が、中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）欠損症である。ＭＣＡＤ欠損症を有する個人は、致命的になり得る、脂肪酸酸化における機能障害を示す。本発明の一実施形態において、脂肪酸代謝が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に、ＭＣＡＤ欠損症を有する被験体において増加する。
【００２２】
本発明者らは、驚いたことに、ｍｉＲ−２０８ａ活性の阻害が、肝臓、骨格筋、および心組織において、ミトコンドリア機能の増強をもたらすことを見出した。したがって、本発明はまた、ミトコンドリア機能またはレドックスホメオスタシスを増強するための方法をも、その必要がある被験体において提供する。一実施形態において、方法は、被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含み、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後に、被験体の細胞において低下する。ある実施形態において、ミトコンドリア機能またはレドックスホメオスタシスの増強を必要とする被験体が、筋力低下、虚弱、サルコペニア、筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、またはミトコンドリア性筋障害と診断される、それに罹患する、またはその危険性がある。ミトコンドリア性筋障害は、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、カーンズ−セイヤー症候群（ＫＳＳ）、または慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
関連する実施形態において、本発明は、筋萎縮症またはサルコペニアを処置するための方法を、その必要がある被験体において提供する。サルコペニアは、年齢が進むと共に、遅いが、進行性の筋肉量の損失を示し、運動の緩やかな遅れおよび体力の低下に至る、筋肉の量および質の悪化によって特徴付けられる（Ｒｙａｌｌら、Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ（２００８）９：２１３−２２８）。サルコペニアは、高齢者人口において頻繁に観察される虚弱症候群（ｆｒａｉｌｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の構成要素である。一実施形態において、筋萎縮症またはサルコペニアを処置する必要がある被験体において、筋萎縮症またはサルコペニアを処置するための方法が、被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含み、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後に、被験体の細胞において低下する。いくつかの実施形態において、方法は、筋萎縮症を抑えるための、１つ以上の補足的な療法と組み合わせて、抗ｍｉＲ−２０８ａ／抗ｍｉＲ−２０８ｂオリゴヌクレオチドを投与することをさらに含む。そのような適した補足的な療法は、選択的アンドロゲン受容体修飾物質（たとえばオスタリン、ＢＭＳ−５６４，９２９、およびＬＧＤ−４０３３）、アナボリックステロイド、ヒト成長ホルモン、ならびにデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、筋萎縮症またはサルコペニアのための処置を必要とする被験体が、高齢の患者、好ましくは高齢のヒト患者である。
【００２４】
本発明はまた、本明細書において記載されるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤をその必要がある被験体に対して投与することによって、代謝障害またはミトコンドリア機能不全から結果として生じる二次疾患または状態を予防するまたは処置するための方法をも含む。たとえば、一実施形態において、本発明は、睡眠時無呼吸を予防するまたは処置するための方法であって、その必要がある被験体に対して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤を投与することを含む方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤をその必要がある被験体に対して投与することによって、癌を予防するまたは処置するための方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤をその必要がある被験体に対して投与することによって、変形性関節症を予防するまたは処置するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤をその必要がある被験体に対して投与することによって、脳卒中を予防するまたは処置するための方法を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、あらゆる代謝障害または代謝障害もしくはミトコンドリア機能不全から結果として生じる二次疾患もしくは状態の発症前に、予防的に使用される。これらの実施形態において、予防的処置を必要とする被験体が、代謝障害または二次疾患もしくは状態の家族歴のような因子に基づいて同定されてもよい。
【００２６】
ある実施形態において、代謝障害を処置または予防する必要がある被験体において、代謝障害を処置または予防するための方法が、代謝障害を処置するための１つ以上の通常療法を投与することをさらに含む。したがって、本発明において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物もしくは製剤に加えて、他の治療剤および／または活性成分の同時投与、ならびに他の治療剤および／または活性成分を含有する組成物および医薬を含む実施形態が、本発明の範囲内に含まれる。併用療法と多くの場合呼ばれる、そのような多剤レジメンは、代謝障害の処置および／または予防において使用されてもよい。
【００２７】
本明細書において記載される１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物もしくは製剤と組み合わせて投与されてもよく、別々にまたは同じ医薬組成物中で投与される、通常療法の例は、
（ａ）グリタゾンおよび非グリタゾンの両方を含むＰＰＡＲγアゴニストおよび部分的アゴニスト（たとえばトログリタゾン、ピオグリタゾン、エングリタゾン、ＭＣＣ−５５５、ロシグリタゾン、バラグリタゾン、ネトグリタゾン、Ｔ−１３１、ＬＹ−３００５１２、およびＬＹ−８１８；
（ｂ）メトホルミンおよびフェンホルミンなどのようなビグアナイド；
（ｃ）タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤、
（ｄ）ＭＫ−０４３１およびＬＡＦ−２３７などのようなジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ−ＩＶ）阻害剤；
（ｅ）インスリンまたはインスリンミメティック；
（ｆ）トルブタミドおよびグリピジドなどのようなスルホニル尿素または関連性の物質；
（ｇ）α−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボースなど）；
（ｈ）（ｉ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（ロバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、リバスタチン、イタバスタチン（ｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、ＺＤ−４５２２、および他のスタチン）、（ｉｉ）胆汁酸捕捉剤（コレスチラミン、コレスチポール、および架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体）、（ｉｉｉ）ニコチニルアルコール、ニコチン酸、またはその塩、（ｉｖ）フェノフィブリン酸誘導体（ゲムフィブロジル、クロフィブレート、フェノフィブレート、およびベザフィブレート）などのようなＰＰＡＲαアゴニスト、（ｖ）たとえばエゼチミブなどのようなコレステロール吸収阻害剤、（ｖｉ）アバシミベなどのようなアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、（ｖｉｉ）トルセトラピブなどのようなＣＥＴＰ阻害剤、ならびに（ｖｉｉｉ）プロブコールなどのようなフェノール酸化防止剤などのような、患者の脂質プロファイルを改善する作用物質；
（ｉ）ムラグリタザル（ｍｕｒａｇｌｉｔａｚａｒ）、テサグリタザル、ファルグリタザル、およびＪＴ−５０１などのようなＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト；
（ｊ）国際公開第９７／２８１４９号パンフレットにおいて開示されるものなどのようなＰＰＡＲδアゴニスト；
（ｋ）フェンフルラミン、デクスフェンフルラミン（ｄｅｘｔｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ）、フェンチラミン（ｐｈｅｎｔｉｒａｍｉｎｅ）、スビトラミン（ｓｕｂｉｔｒａｍｉｎｅ）、オーリスタット、神経ペプチドＹ５阻害剤、ＭＣ４Ｒアゴニスト、カンナビノイド受容体１アンタゴニスト／インバースアゴニスト、およびβ３アドレナリン受容体アゴニストなどのような抗肥満化合物；
（ｌ）回腸胆汁酸トランスポーター阻害剤；
（ｍ）アスピリン、非ステロイド性抗炎症薬剤、グルココルチコイド、アザルフィジン、およびシクロオキシゲナーゼ２選択的阻害剤などのような、炎症状態における使用が意図される作用物質；
（ｎ）グルカゴン受容体アンタゴニスト；
（ｏ）ＧＬＰ−１またはエキセンディン、たとえばエキセニチド（ｅｘｅｎｉｔｉｄｅ）などのようなＧＬＰ−１アナログ；
（ｐ）ＧＩＰ−１；ならびに
（ｑ）ヒドロキシステロールデヒドロゲナーゼ−１（ＨＳＤ−１）阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
上記の通常療法のいずれかの１つ以上は、代謝障害を処置または予防するために、その必要がある被験体において、本明細書において記載される１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物もしくは製剤と共に同時投与することができる。併用療法の非限定的な例は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ビグアナイド、スルホニル尿素、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、他のＰＰＡＲアゴニスト、ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤、ＤＰ−ＩＶ阻害剤、および抗肥満症化合物から選択される１つ以上の通常療法との組み合わせを含む。
【００２９】
本明細書において記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物もしくは製剤および通常療法は、同じ投薬形態または別々の投薬形態で投与されてもよい。別々の投薬形態で投与される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常療法と同時にまたは連続的に（つまり、ある間隔で分けて）投与されてもよい。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、通常療法の投与前、それと同時、またはそれに続くものであってもよい。
【００３０】
発明者らは、代謝に対するｍｉＲ−２０８阻害の効果が、心組織においてなどのように、その標的ＭＥＤ１３（別名ＴＨＲＡＰ１）の抑制解除を通して部分的に媒介されることを見出した。マウスにおけるＭＥＤ１３の心特異的過剰発現は、高脂肪食誘発性の肥満症に対する抵抗性を与え、全身的なインスリン感受性および糖耐性を改善するのに対して、心筋細胞においてなどのような、ＭＥＤ１３の遺伝子の欠失は、高脂肪食に応じて肥満症を高め、メタボリックシンドロームを悪化させる（データ示さず）。したがって、本発明はまた、代謝障害を処置または予防する必要がある被験体において、代謝障害を処置または予防するための方法であって、心細胞においてなどのように、ＭＥＤ１３発現を増強することを含む方法を包含する。たとえば、ＭＥＤ１３をコードする発現ベクターなどのようなＭＥＤ１３アゴニストを投与する方法が、本明細書において提供される。ＭＥＤ１３をコードするポリヌクレオチドは、アルファ−ミオシン重鎖などのように、心特異的プロモーターのコントロール下とすることができる。
【００３１】
他の実施形態において、本発明は、グルコース取込みおよび／または利用を増加させる必要がある被験体において、グルコース取込みおよび／または利用を増加させるための方法であって、被験体に対して、本明細書において記載される、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ活性または発現の阻害剤を投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、被験体が、インスリン抵抗性または真性糖尿病と診断される。一実施形態において、被験体の血中グルコースレベルが、阻害剤の投与前の、被験体の血中グルコースレベルと比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に低下する。他の実施形態において、被験体の血中グルコースレベルが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に、経口ブドウ糖負荷試験によって測定されるように、正常なレベルの範囲内まで低下する。たとえば、ある実施形態において、被験体の空腹時血中グルコースレベルが、約１１０ｍｇ／ｄｌ未満である。他の実施形態において、グルコース摂取２時間後の、被験体の血中グルコースレベルが、約１４０ｍｇ／ｄｌ未満である。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、コレステロールを減少させる必要がある被験体において、コレステロールを減少させるための方法であって、被験体に対して、本明細書において記載される、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ活性または発現の阻害剤を投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、被験体が、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、２型糖尿病、および高血圧などのような高コレステロールと関連する疾患と診断される。一実施形態において、阻害剤の投与前の、被験体の総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールレベルと比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に、被験体の総コレステロールレベルが、減少するおよび／またはＨＤＬコレステロールレベルが、増加する。他の実施形態において、被験体のコレステロールレベルが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に、リポタンパク質プロファイル血液検査によって測定されるように、正常なレベルの範囲内まで回復する。たとえば、ある実施形態において、被験体の総コレステロールレベルが、約２００ｍｇ／ｄＬ未満まで低下する。他の実施形態において、被験体のＨＤＬコレステロールレベルが、約４０ｍｇ／ｄＬ以上まで増加する。
【００３３】
他の実施形態において、本発明は、肥満症を処置する必要がある被験体において、肥満症を処置するための方法であって、被験体に対して、本明細書において記載される、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ活性または発現の阻害剤を投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、被験体が、肥満症と診断される。ある実施形態において、処置を必要とする被験体が、２５以上のボディマス指数を有する。他の実施形態において、処置を必要とする被験体が、３０以上のボディマス指数を有する。一実施形態において、被験体のボディマス指数および／またはウエスト周囲が、阻害剤の投与前の、被験体のボディマス指数および／またはウエスト周囲と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に低下する。他の実施形態において、被験体のボディマス指数および／またはウエスト周囲が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の投与後に、被験体の性別および年齢について調整された正常なレベルの範囲内まで低下する。
【００３４】
本発明はまた、細胞における脂肪酸代謝を調節するための方法をも提供する。グリコーゲン合成を調節することによってなどのように、グルコース代謝を調節するための方法もまた、本明細書において提供される。ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤などのような、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質を投与することによって、ミトコンドリア機能を増強するおよびレドックスホメオスタシスを改善するための方法もまた、提供される。
【００３５】
一実施形態において、本明細書において開示される方法は、細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることを含む。本明細書において使用される場合、「修飾物質」は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性を調節する分子である。修飾物質は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂ機能のアゴニストとすることができる（つまり、ｍｉＲ−２０８ａもしくはｍｉＲ−２０８ｂの活性もしくは発現を増強することができる）またはそれらは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂ機能の阻害剤とすることができる（つまり、ｍｉＲ−２０８ａもしくはｍｉＲ−２０８ｂの活性もしくは発現を低下させることができる）。修飾物質は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または小分子を含むことができる。ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質は、本明細書において記載されるようなｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤およびアゴニストを含む。
【００３６】
ある実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤であり、脂肪酸代謝が、阻害剤に対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤との接触後に、細胞において増加する。他の実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストであり、脂肪酸代謝が、アゴニストに対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとの接触後に、細胞において減少する。
【００３７】
ある実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤であり、グルコース代謝が、阻害剤に対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤との接触後に、細胞において増加する。他の実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストであり、グルコース代謝が、アゴニストに対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとの接触後に、細胞において減少する。細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものとすることができる。いくつかの実施形態において、細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、または膵臓細胞であるが、これらに限定されない。
【００３８】
いくつかの実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤であり、ミトコンドリア機能が、阻害剤に対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤との接触後に、細胞において増加する。他の実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストであり、ミトコンドリア機能が、アゴニストに対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとの接触後に、細胞において減少する。細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものとすることができる。いくつかの実施形態において、細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、または膵臓細胞であるが、これらに限定されない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の阻害剤であり、レドックスホメオスタシスが、阻害剤に対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤との接触後に、細胞において改善する。他の実施形態において、修飾物質が、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストであり、レドックスホメオスタシスが、アゴニストに対して曝露されない細胞と比較して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとの接触後に、細胞において損なわれる。細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものとすることができる。いくつかの実施形態において、細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、または膵臓細胞であるが、これらに限定されない。
【００４０】
ある特定の実施形態において、細胞が、心筋細胞である。したがって、本発明はまた、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることによって、心代謝を調節するための方法をも包含する。一実施形態において、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、ストレッサーによって誘発される、酸化的代謝から解糖代謝への代謝変化を予防するまたは低下させる。他の実施形態において、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、心筋細胞において、糖質代謝を低下させる。他の実施形態において、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、心筋細胞において、脂肪酸代謝を増加させる。他の実施形態において、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、心筋細胞において、グルコース代謝を増加させる。一実施形態において、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、心筋細胞において、ミトコンドリア機能を増強する。他の実施形態において、心筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、心筋細胞において、レドックスホメオスタシスを改善する。心筋細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものとすることができる。
【００４１】
他の特定の実施形態において、細胞が、骨格筋細胞である。したがって、本発明はまた、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることによって、骨格筋における代謝を調節するための方法をも包含する。一実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、ストレッサーによって誘発される、酸化的代謝から解糖代謝への代謝変化を予防するまたは低下させる。他の実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞において、糖質代謝を低下させる。他の実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞において、脂肪酸代謝を増加させる。他の実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞において、グルコース代謝を増加させる。一実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞において、ミトコンドリア機能を増強する。他の実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞において、レドックスホメオスタシスを改善する。他の実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞において、ジペプチドのレベルを増加させる。他の実施形態において、骨格筋細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、骨格筋細胞増殖を阻害する。骨格筋細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものとすることができる。
【００４２】
他の特定の実施形態において、細胞が、肝臓細胞または肝細胞である。したがって、本発明はまた、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質と接触させることによって、肝臓細胞における代謝を調節するための方法をも包含する。一実施形態において、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、ストレッサーによって誘発される、酸化的代謝から解糖代謝への代謝変化を予防するまたは低下させる。他の実施形態において、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、肝臓細胞において、糖質代謝を低下させる。他の実施形態において、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、肝臓細胞において、脂肪酸代謝を増加させる。他の実施形態において、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、肝臓細胞において、グルコース代謝を増加させる。一実施形態において、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、肝臓細胞において、ミトコンドリア機能を増強する。他の実施形態において、肝臓細胞を、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤と接触させることが、肝臓細胞において、レドックスホメオスタシスを改善する。肝臓細胞は、インビトロまたはインビボにおけるものとすることができる。
【００４３】
本発明はまた、解糖代謝または脂肪酸代謝における欠損症と関連する障害または疾患を予防するまたは処置するための方法をも提供する。たとえば、一実施形態において、本発明は、本明細書において記載されるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストをその必要がある被験体に対して投与することによって、被験体において、低血糖症または高インスリン症を予防するまたは処置するための方法を提供する。低血糖症または高インスリン症を発症する危険性がある被験体は、インスリンまたはある糖尿病医薬品（たとえばクロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリピジド、もしくはトルブタミド）を過剰服用している糖尿病患者、インスリン分泌腫瘍（インスリノーマ）を有する被験体、高インスリン症を引き起こす肝臓疾患または遺伝子状態と診断された患者を含む。本明細書において記載されるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストにより処置されてもよいまたは予防されてもよい他の障害または状態は、患者が正常な体重を維持するのに苦労しているまたは故意でない体重減少を経験する障害または状態である。たとえば、一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストをその必要がある被験体に対して投与することによって、被験体において、甲状腺機能亢進症（グレーブス病）を処置または予防するための方法を含む。
【００４４】
ｍｉＲ−２０８ａは、その構造およびプロセシングを含めて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０１６９２４号パンフレットにおいて記載される。
【００４５】
ｍｉＲ−２０８ａは、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内にある。詳細なイントロン位置は、特定の種および特有の転写物に依存する。たとえば、ヒトにおいて、ｍｉＲ−２０８ａは、α−ＭＨＣ遺伝子の２８番目のイントロン内にコードされるが、マウスにおいて、それは、２９番目のイントロン内にコードされる。ヒト、マウス、ラット、およびイヌ科の動物についてのｍｉＲ−２０８ａについての配列をコードするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、それぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８として下記に示される。成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列は、配列番号９において提供される。α−ＭＨＣのように、ｍｉＲ−２０８ａは、もっぱら心臓において発現される。
【００４６】
【化１】
2014530222.tif 000003
【００４７】
ゲノムは、イントロン３１のβ−ＭＨＣ遺伝子内にあるｍｉＲ−２０８ｂと呼ばれる、ｍｉＲ−２０８ａに関係する他のマイクロＲＮＡを含有し、β−ＭＨＣのように、ｍｉＲＮＡ  ２０８ｂは、もっぱら心臓および骨格遅筋（ｓｌｏｗ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）（たとえばヒラメ筋）において発現される。ｍｉＲ−２０８ｂによって調節される遺伝子は、たとえばＳｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲｂｅｔａ、ＴＨＲＡＰ１、および骨格速筋（ｆａｓｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）タンパク質遺伝子を含む。このｍｉＲＮＡの配列は、大部分がｍｉＲ−２０８ａとオーバーラップしており、あるｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を決定する領域である「シード領域」において１００％の相同性を有する。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列は、いくつかの哺乳動物種（たとえばヒト、マウス、ラット、およびイヌ科の動物）にわたって保存されている。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列および成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列は、下記に示される：
【００４８】
【化２】
2014530222.tif 000004
【００４９】
ｍｉＲ−２０８ｂの構造およびプロセシングもまた、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０１８４９２号パンフレットにおいて記載される。ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂの様々な形態についての配列は、本発明に従って、相補的な阻害剤を設計するために使用されてもよい。
【００５０】
本明細書において開示されるリボ核酸配列はすべて、配列中のウリジン塩基をチミジン塩基と置換することによって、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書において開示されるデオキシリボ核酸配列はすべて、配列中のチミジン塩基をウリジン塩基と置換することによって、リボ核酸配列に変換することができる。デオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列、および本明細書において開示されるすべての配列のデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの混合物を含有する配列は、本発明に含まれる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法のいずれかにおいて使用するのに適したｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはその組み合わせを含むことができる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾（たとえば糖またはバックボーン修飾）を有する。たとえば、適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の「立体構造的に束縛された」修飾またはＢＳＮを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの相補的なマイクロＲＮＡ標的鎖の間で形成される複合体に対して熱的安定性の増強を与える二環式糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）から構成することができる。たとえば、一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）残基または「ロックドヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」を含有する。ＬＮＡは、たとえば、これらすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６８，４９０号明細書、米国特許第６，３１６，１９８号明細書、米国特許第６，４０３，５６６号明細書、米国特許第６，７７０，７４８号明細書、米国特許第６，９９８，４８４号明細書、米国特許第６，６７０，４６１号明細書、および米国特許第７，０３４，１３３号明細書において記載される。ＬＮＡは、リボース糖成分の２’および４’炭素の間に、「ロックド」立体構造および／または二環式構造をもたらす、追加のブリッジを含有する修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。例示的な実施形態において、ロックドヌクレオチドが、たとえば、構造Ａにおいて示されるように、２’〜４’メチレンブリッジを有する。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシドを含有し（構造Ａ）、リボース糖成分が、「ロックド」立体構造をしている。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンリボヌクレオシドなどのような２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンブリッジ核酸（ＥＮＡ）を含有する。その代わりにまたはそのうえ、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’，４’−Ｃ−ブリッジ２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を含有してもよい。その代わりにまたはそのうえ、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、下記の構造Ｃによって示される構造を有する１つ以上のＬＮＡを含有する。
【化３】
2014530222.tif 000005
ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＣＤＮＡ、およびその他同種のもの）ならびに他の修飾ヌクレオチドならびにリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含有することができる。一実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＣＤＮＡ、およびその他同種のもの）ならびに２’−Ｏ−アルキル修飾および／または２’−フルオロ修飾などのような２’ハロ修飾を含有する。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＣＤＮＡ、およびその他同種のもの）または他の修飾ヌクレオチドならびにリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含有する。一実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＣＤＮＡ、およびその他同種のもの）ならびに２’−Ｏ−アルキル修飾および／または２’−フルオロ修飾などのような２’ハロ修飾の組み合わせを含有する。
【００５２】
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンリボヌクレオシドなどのような２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンブリッジ核酸および２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシドを含む。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンリボヌクレオシドなどのような２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンブリッジ核酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド、ならびに２’−Ｏ−アルキル修飾および／または２’−フルオロ修飾などのような２’−ハロ修飾を含む。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて組み込むことができる他の適したロックドヌクレオチドは、両方とも、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０３，５６６号明細書および米国特許第６，８３３，３６１号明細書において記載されるものを含む。
【００５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全長または切断型ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含んでいてもよい、またはそれから本質的になってもよい、またはそれからなってもよい。本明細書において使用される場合、ｍｉＲＮＡ配列に関しての用語「完全長」は、成熟ｍｉＲＮＡの長さを指す。したがって、本明細書において記載される阻害剤は、切断型または完全長であってもよい、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対してアンチセンスであってもよい、または他のポリヌクレオチド配列と一緒にこれらの配列を含んでいてもよい。ある実施形態において、本明細書において記載される特異的な化学修飾モチーフが、完全長アンチセンスｍｉＲＮＡ（成熟）配列を不必要にする。これらの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが８〜２０ヌクレオチドである、または長さが１０〜１８ヌクレオチドである、または長さが１１〜１６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヌクレオチドである。切断型アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス阻害によって、５’−ＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号７）内のｍｉＲ−２０８ａ配列またはＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号８）内のｍｉＲ−２０８ｂ配列を標的にする配列を有していてもよい。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、成熟ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするように設計されたヌクレオチド配列を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらまたは他の実施形態において、さらにまたはその代わりに、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ形態を標的にするように設計されてもよい。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−２０８配列に比べて、１〜５（たとえば１、２、３、または４）のミスマッチを含有する配列を有するように設計されてもよい。
【００５６】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に対して、完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列を含んでいてもよいまたは５’−ＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号３）または’５−ＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ（配列番号４）を含むまたはそれから本質的になるまたはそれからなる。この文脈において、「から本質的になる」は、補足的なヌクレオチド（複数可）が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ｍｉＲＮＡの阻害に実質的に影響を与えない限り、５’および３’エンドのいずれかまたは両方へのヌクレオチド（たとえば１つまたは２つ）の任意選択の追加を含む。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表１において示される化合物１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０７０７、１０６８０、１０６８１、または１０６８３の構造を有する。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表１において示される化合物１０１０１、１０６７３、１０６８１、または１０６８３の構造を有する。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表１において示される化合物１０１０１または１０６８３の構造を有する。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ、少なくとも５つ、または少なくとも７つのロックドヌクレオチドを含有してもよいが、様々な実施形態において、ロックドヌクレオチドから完全に構成されるわけではない。一般に、ロックドヌクレオチドの数および位置は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、実施例または当業者らに知られている他の方法において記載されるように、インビトロもしくはインビボにおいて決定されるように、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ活性を低下させるような数および位置である。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、４つを超えるまたは３つを超える隣接非ロックドヌクレオチドを有する、ヌクレオチドのストレッチを含有しない。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２つを超える隣接非ロックドヌクレオチドを有する、ヌクレオチドのストレッチを含有しない。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドに、たった１つの隣接非ロックドヌクレオチドが存在してもよい。これらのまたは他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂシード領域に対して相補的な領域が、少なくとも３つまたは少なくとも４つのロックドヌクレオチドを含む。これらの実施形態は、たとえば、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【００５８】
したがって、様々な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも９つのロックドヌクレオチドまたは少なくとも１１個のロックドヌクレオチドを含有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの非ロックドヌクレオチドを含有してもよい。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、９つのロックドヌクレオチドおよび７つの非ロックドヌクレオチドを含有してもよいまたは１１個のロックドヌクレオチドおよび５つの非ロックドヌクレオチドを含有してもよい。
【００５９】
ロックドヌクレオチドのパターンは、少なくとも位置１、６、１０、１３、および１５が、ロックドヌクレオチドであるようなパターンであってもよい。ある実施形態において、位置１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６が、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置が、非ロックドヌクレオチドである。他の実施形態において、位置１、３、４、５、６、８、１０、１３、１５、および１６が、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置が、非ロックドヌクレオチドである。さらに他の実施形態において、位置１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６が、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置が、非ロックドヌクレオチドである。例示的な実施形態において、そのようなパターンが、配列番号３または配列番号４の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドで、使用を見出す。
【００６０】
非ロックドヌクレオチドについては、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに関して２’修飾を含有してもよい。たとえば、２’修飾は、２’デオキシであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける２’修飾ヌクレオチドの組み込みは、ヌクレアーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの抵抗性および相補的なＲＮＡとのそれらの熱的安定性の両方を増加させてもよい。２’位置での様々な修飾は、ＲＮＡ標的または細胞の機構との分子の相互作用を損なうことなく、ヌクレアーゼ感受性の増加をもたらすものから、独立して選択されてもよい。そのような修飾は、インビトロまたはインビボにおけるそれらの効力の増加に基づいて選択されてもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態において、２’修飾が、Ｏ−アルキル（置換されてもよい）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から、独立して選択されてもよい。非ロックドヌクレオチドの実質的にすべてのまたはすべてのヌクレオチド２’位置は、ある実施形態において、たとえば、Ｏ−アルキル（たとえばＯ−メチル）、ハロ（たとえばフルオロ）、およびデオキシ（Ｈ）から独立して選択されるように、修飾されてもよい。たとえば、２’修飾は、それぞれ、Ｏ−メチルおよびフルオロから、独立して選択されてもよい。例示的な実施形態において、プリンヌクレオチドが、それぞれ、２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドが、それぞれ、２’−Ｆを有する。ある実施形態において、１つ〜約５つの２’位置または約１つ〜約３つの２’位置が、未修飾のままとされる（たとえば２’ヒドロキシルとして）。
【００６２】
本発明に従う２’修飾はまた、小さな炭化水素置換基を含む。炭化水素置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルを含み、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニル、およびアルキニルは、置換されてもよいまたは非置換であってもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３などのような、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、またはアルキニルであってもよい。炭化水素置換基は、１つまたは２つまたは３つの非炭素原子を含んでいてもよく、これは、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから、独立して選択されてもよい。２’修飾は、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルのようなアルキル、アルケニル、およびアルキニルをさらに含んでいてもよい。
【００６３】
本発明に従う例示的な２’修飾は、２’−Ｏ−アルキル（２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔなどのようなＣ１〜３アルキル）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換を含む。
【００６４】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードなどのような、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（たとえば２’ヒドロキシルの代わりに）を含有する。いくつかの実施形態において、２’ハロ修飾が、フルオロである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ〜約５つの２’−ハロ修飾（たとえばフルオロ）または１つ〜約３つの２’−ハロ修飾（たとえばフルオロ）を含有してもよい。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、非ロックド位置にすべての２’−フルオロヌクレオチドをまたはすべての非ロックドピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含有する。ある実施形態において、２’−フルオロ基が、独立して、ジメチル化される、トリメチル化される、またはメチル化されない。
【００６５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’−デオキシ修飾（たとえば、２’ヒドロキシルについてＨ）を有してもよく、いくつかの実施形態において、非ロックド位置に２つ〜約１０個の２’−デオキシ修飾を含有するまたはすべての非ロックド位置に２’デオキシを含有する。
【００６６】
例示的な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、非ロックド位置において、２’ＯＭｅとして修飾される２’位置を含有する。その代わりに、非ロックドプリンヌクレオチドは、２’ＯＭｅとして２’位置で修飾され、非ロックドピリミジンヌクレオチドは、２’−フルオロとして２’位置で修飾される。
【００６７】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってもよい。用語「キャップ」または「エンドキャップ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に化学修飾を含み（末端のリボヌクレオチドに関して）、５’エンドの最後の２つのヌクレオチドおよび３’エンドの最後の２つのヌクレオチドの間の連結に修飾を含む。本明細書において記載されるキャップ構造は、ＲＮＡ標的または細胞の機構との分子の相互作用を損なうことなく、エキソヌクレアーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの抵抗性を増加させてもよい。そのような修飾は、インビトロまたはインビボにおけるそれらの効力の増加に基づいて選択されてもよい。キャップは、５’末端（５’キャップ）もしくは３’末端（３’キャップ）に存在することができるまたは両端に存在することができる。ある実施形態において、５’−および／または３’キャップは、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（成分）、ホスホロチオエート連結、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート連結、逆位ヌクレオチドまたは逆位脱塩基成分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、ならびにメチルホスホネート成分から、独立して選択される。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート連結（複数可）は、キャップ構造の一部である場合、５’エンドの２つの末端ヌクレオチドおよび３’エンドの２つの末端ヌクレオチドの間に一般に位置する。
【００６８】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼの作用を阻害することによって、より高い効力を維持してもよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’および／または３’エンドにあってもよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは、以下の構造によって定義され、Ｂが、塩基であり、Ｒが、上記に記載されるような２’修飾であり、
【化４】
2014530222.tif 000006
【００６９】
キャップ構造が、ロックドヌクレオチドの化学的性質を維持することができ、キャップ構造は、本明細書において記載されるようなロックドヌクレオチドを組み込んでもよい。
【００７０】
ホスホロチオエート連結は、いくつかの実施形態において、５’および３’エンド上の最後の２つのヌクレオチドの間などに（たとえばキャップ構造の一部として）またはホスホジエステル結合と交替して存在してもよい。これらのまたは他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’および３’エンドのいずれかまたは両方に、少なくとも１つの末端脱塩基残基を含有してもよい。脱塩基成分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどのような、一般に認識されるプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、そのような脱塩基成分は、ヌクレオチド塩基を欠くまたは１’位置に他の非ヌクレオチド塩基化学基を有する。たとえば、脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基ヌクレオチドであってもよく、たとえば、逆脱塩基ホスホラミダイトが、５’アミダイト（３’アミダイトの代わりに）を介してつながれ、５’−５’リン酸結合がもたらされる。ポリヌクレオチドの５’および３’エンドについての逆脱塩基ヌクレオシドの構造は、下記に示される。
【化５】
2014530222.tif 000007
【００７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエート連結を含有してもよい。ホスホロチオエート連結は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ切断に対してより抵抗性にするために使用されてきた。たとえば、ポリヌクレオチドは、部分的に、ホスホロチオエート連結されてもよく、たとえば、ホスホロチオエート連結は、ホスホジエステル（ｐｈｏｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合と交替されてもよい。ある実施形態において、しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、完全にホスホロチオエート連結される。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ〜５つまたは１つ〜３つのホスフェート連結を有する。
【００７２】
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂを含むｍｉＲ−２０８ファミリーｍｉＲＮＡの発現（たとえば存在量）を阻害するために、化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するための方法を提供する。本発明は、いくつかの実施形態において、心および／または骨格筋組織におけるｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂのそれぞれの発現または存在量を、特異的な方法で阻害するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するための方法を提供する。本発明は、代謝障害などのような、ｍｉＲ−２０８ファミリーｍｉＲＮＡに関するまたはそれを伴う状態または障害を有する患者を処置するための方法をさらに提供する。本発明は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性の修飾物質または阻害剤により、脂肪酸代謝を調節するための方法をさらに提供する。
【００７３】
本発明において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して、少なくとも部分的に相補的である、たとえば、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して、実質的に相補的とすることができる、つまり、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的とすることができる。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して、完全に相補的（つまり１００％相補的）である配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤が、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に対して、少なくとも部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態において、本発明の方法において使用されるｍｉＲ−２０８ａならびに／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤が、ヒトｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂ（または対応するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡもしくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）のヌクレオチド配列に対して、実質的に相補的であり、また、任意選択でホスホロチオエートバックボーンと共に、ロックドおよび非ロックドヌクレオチドの混合物を含有してもよいアンチセンスオリゴヌクレオチドである。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ、少なくとも５つ、または少なくとも７つのロックドヌクレオチドおよび少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドを含有してもよい。実質的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのその標的配列に関して、１つ〜４つのミスマッチ（たとえば１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチ）を有してもよい。例示的な実施形態において、ロックドヌクレオチドが、２’〜４’メチレンブリッジを有してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上のロックドヌクレオチドを有するそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが、完全なホスホロチオエートバックボーンを有する。
【００７５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全長または切断型ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂに対して少なくとも部分的に相補的な配列を含んでいてもよい、またはそれから本質的になってもよい、またはそれからなってもよい。これらの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが約６〜２２ヌクレオチドである、または長さが約１０〜１８ヌクレオチドである、または長さが約１１〜約１６ヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、長さが約１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列を含んでいてもよいまたは５’−ＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号３）または５’−ＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号４）を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる。
【００７６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上のホスホロチオエート連結を含有してもよい。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート連結されてもよい。
【００７７】
本発明の方法において使用される例示的な阻害剤は、下記の表１において列挙される化合物の構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂ活性を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際出願ＵＳ２０１１／０６５１２１号明細書（国際公開第２０１２／０８３００５号パンフレットとして公開されている）において記載される。
【００７８】
【表１−１】
2014530222.tif 000008
【表１−２】
2014530222.tif 000009
【表１−３】
2014530222.tif 000010
【表１−４】
2014530222.tif 000011
【表１−５】
2014530222.tif 000012
【００７９】
【表２】
2014530222.tif 000013
【００８０】
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０７０７、１０６８０、１０６８１、もしくは１０６８３または表１において記載される他のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００８１】
固相合成法による、修飾ポリヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、よく知られており、Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ、Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ  ＪＷ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＥＦ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＭＤ、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ  Ｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．１９８０；（７）：２１５−２３において概説される。
【００８２】
その代わりに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができ、これは、糖リン酸バックボーンではなく、ペプチドベースのバックボーンを含有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する他の修飾糖またはホスホジエステル修飾もまた、企図される。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含有することができる他の化学修飾は、２’−Ｏ−アルキル（たとえば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾などのような糖修飾ならびに１つ以上のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート連結などのようなバックボーン修飾を含むが、これらに限定されない（たとえば、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第６，６９３，１８７号明細書および米国特許第７，０６７，６４１号明細書を参照されたい）。一実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、それぞれの塩基上に２’Ｏ−メチル糖修飾を含有し、ホスホロチオエート連結によって連結される。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、より短い長さのもの（たとえば１５ヌクレオチド未満）は、ＬＮＡ、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’Ｏ−アルキル修飾、およびその他同種のものなどのような、１つ以上の親和性増強修飾を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、適したアンチセンスオリゴヌクレオチドが、中央に少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを有し、５’および３’エンドの両方に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含有する２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」である。これらの「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的の、ＲＮａｓｅ  Ｈ依存性の分解メカニズムを引き起こすことができる。その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第６，８３８，２８３号明細書において記載されるものなどのような、安定性を増強し、かつ効能を改善するアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、当技術分野において知られており、本発明の方法において使用するのに適している。たとえば、インビボにおける送達および安定性を促進するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その３’エンドで、コレステロール成分などのようなステロイド、ビタミン、脂肪酸、糖質もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドに対して連結することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）である。「アンタゴｍｉｒ」は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して、少なくとも部分的に相補的である一本鎖化学修飾リボヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル糖修飾などのような、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉｒが、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴｍｉｒはまた、部分的なまたは完全なホスホロチオエートバックボーンをもたらす、１つ以上のホスホロチオエート連結を含むことができる。インビボにおける送達および安定性を促進するために、アンタゴｍｉｒは、その３’エンドで、コレステロールまたは他の成分に対して連結することができる。ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを阻害するのに適したアンタゴｍｉｒは、長さが約８〜２０ヌクレオチドまたは長さが１０〜１８ヌクレオチドまたは長さが１１〜１６ヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉｒが、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して、実質的に相補的であってもよい、つまり、標的ポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であってもよい。他の実施形態において、アンタゴｍｉｒが、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの配列に対して、１００％相補的である。アンタゴｍｉｒは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂについての前駆物質ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）またはプライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ）配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に対して実質的に相補的な配列を含んでいてもよい。
【００８４】
ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストもまた、本明細書において提供される。ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドとすることができる。たとえば、一実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａアゴニストが、配列番号５〜９などのような、ｍｉＲ−２０８ａ配列を含むポリヌクレオチドである。一実施形態において、アゴニストが、配列番号９などのような成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列を含むポリヌクレオチドである。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａアゴニストが、配列番号５などのような、ｍｉＲ−２０８ａについてのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドとすることができる。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ｂアゴニストが、ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドである。一実施形態において、アゴニストが、配列番号１１などのような成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドである。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ｂアゴニストが、配列番号１０などのような、ｍｉＲ−２０８ｂについてのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドとすることができる。
【００８５】
ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドは、長さが約１８〜約２０００ヌクレオチド、長さが約７０〜約２００ヌクレオチド、長さが約２０〜約５０ヌクレオチド、または長さが約１８〜約２５ヌクレオチドとすることができる。成熟ｍｉＲ−２０８ａ、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ａ、またはｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖とすることができる。ポリヌクレオチドは、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アルキル（たとえば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾などのような糖修飾ならびに１つ以上のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート連結などのようなバックボーン修飾などのような、１つ以上の化学修飾を含有することができる。一実施形態において、ｍｉＲ−２０８配列（たとえば成熟ｍｉＲ−２０８ａ、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ａまたはｐｒ２−ｍｉＲ−２０８ｂ）を含むポリヌクレオチドは、コレステロールなどのようなステロイド、ビタミン、脂肪酸、糖質もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドに対してコンジュゲートされる。
【００８６】
本明細書において記載されるｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤またはアゴニストのいずれかは、細胞に対して、ｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤もしくはアゴニストをコードする発現ベクターを送達することによってまたは阻害剤もしくはアゴニスト自体を標的細胞に対して直接送達することによって、標的細胞（たとえば心臓または骨格筋細胞）に対して送達することができる。「ベクター」は、細胞の内部に、目的の核酸を送達するために使用することができる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含む、ただしこれらに限定されない多数のベクターは、当技術分野において知られている。したがって、用語「ベクター」は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。発現構築物は、生細胞中で複製することができるまたはそれは、合成的に作製することができる。本出願の目的のために、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、および「ベクター」は、一般的で説明的な意味で本発明についての適用を示すために区別なく使用され、本発明を限定するようには意図されない。
【００８７】
一実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤またはアゴニストを発現するための発現ベクターが、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアゴニストオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されたプロモーターを含む。一実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤を発現するための発現ベクターが、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されたプロモーターを含み、発現アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、ｍｉＲ−２０８ａの成熟配列（たとえば配列番号９）またはｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列（配列番号１１）に対して部分的にまたは完全に相補的である。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａ配列を含むポリヌクレオチドを発現するための発現ベクターが、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ａ配列（たとえば配列番号５）を含むポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドを発現するための発現ベクターが、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列（たとえば配列番号１０）を含むポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書において使用される語句「作動可能に連結された」または「転写コントロール下の」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現をコントロールするために、ポリヌクレオチドに関して適正な位置および方向にあることを意味する。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適したプロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、ならびにウイルスプロモーター（たとえばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス末端反復配列）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、プロモーターが、組織特異的プロモーターである。特に該当するのは、筋肉特異的なプロモーター、より詳細には、心特異的プロモーターである。これらは、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｆｒａｎｚら（１９９４）Ｃａｒｄｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．５（４）：２３５−４３；Ｋｅｌｌｙら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２９（２）：３８３−３９６）、アルファアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓら（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１（４９）：３１６８８−３１６９４）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．３５（１）：１１−２３）；Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター（Ｂａｒｎｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２（１７）：１１５１０−１１５１７）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａら（１９９７）Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，Ｖｏｌ．３９（３）：２５７−２６５）、アルファ７インテグリンプロモーター（Ｚｉｏｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１（３７）：２２９１５−２２）、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら（１９９６）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７（３  Ｐｔ  ２）：７１５−２２）、およびアルファＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５（１２）：７０８１−７０９０）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６（１０）：３５０４−３５０８）、ならびにＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６３（１９）：９０７５−９０７８）を含む。一実施形態において、組織特異的プロモーターが、脂肪細胞タンパク質２（ａｐ２）／脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）プロモーターまたはＰＰＡＲγプロモーターなどのような脂肪細胞特異的プロモーターである。
【００８９】
ある実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤をコードするポリヌクレオチドまたはｍｉＲ−２０８ａもしくはｍｉＲ−２０８ｂ配列をコードするポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されるプロモーターが、誘発性プロモーターとすることができる。誘発性プロモーターは、当技術分野において知られており、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘発性マウス乳癌ウイルスＬＴＲを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
細胞に対して、発現構築物および核酸を送達するための方法は、当技術分野において知られており、たとえば、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波処理、高速度微粒子を使用する遺伝子銃、および受容体媒介性トランスフェクションを含むことができる。
【００９１】
本発明はまた、処置後に、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤を回収するまたは取り除くための方法を含む。方法は、心または骨格筋組織において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤に対する結合部位を過剰発現させることを含んでいてもよい。結合部位領域は、好ましくは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂについてのシード領域の配列を含有する。シード領域は、塩基２〜８にわたる、ｍｉＲＮＡの５’部分であり、これは、標的認識にとって重要である。いくつかの実施形態において、結合部位が、甲状腺ホルモン受容体結合タンパク質１（ＴＨＲＡＰｌ、別名ＭＥＤ１３）、Ｓｏｘ６、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲｂｅｔａ、および骨格速筋タンパク質遺伝子などのような、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの１つ以上の標的の３’ＵＴＲ由来の配列を含有してもよい。
【００９２】
本発明の阻害剤（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）またはアゴニストは、様々な巨大分子集合体または組成物内に組み込まれてもよい。送達のためのそのような複合体は、患者に対する送達のために製剤される、様々なリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを含んでいてもよい。複合体は、細胞膜透過を開始するために、１つ以上の融合性または親油性分子を含んでいてもよい。そのような分子は、たとえば、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号明細書および米国特許第７，２０２，２２７号明細書において記載される。その代わりに、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）は、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／１２９６７２号パンフレットにおいて記載されるものなどのような、細胞の送達を支援するための親油性ペンダント基をさらに含んでいてもよい。
【００９３】
組成物または製剤は、本明細書において記載されるものを少なくとも含む、複数の治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてもよい。たとえば、組成物または製剤は、本明細書において記載される、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つのｍｉＲＮＡ阻害剤またはアゴニストを用いてもよい。
【００９４】
本発明の阻害剤（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）またはアゴニストは、様々な医薬組成物として製剤されてもよい。医薬組成物は、意図される適用に適切な形態で調製されるであろう。一般に、これは、ヒトまたは動物に対して有害になり得るパイロジェンおよび他の不純物が本質的にない組成物を調製することを要するであろう。例示的な送達／製剤系は、コロイド分散系、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合性ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。心および骨格筋組織に対して、本発明の核酸を送達するのに適した、市販で入手可能な脂肪エマルションは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似する脂質エマルションを含む。インビボにおいて送達ビヒクルとして使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（つまり人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は、当技術分野においてよく知られている。例示的な製剤はまた、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，９８１，５０５号明細書；米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許第６，７４７，０１４号明細書；および国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにおいても開示される。
【００９５】
医薬組成物および製剤は、送達ビヒクルを安定性にし、かつ標的細胞による取込みを可能にするために、適切な塩およびバッファーを用いてもよい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリヤまたは水性媒体中に溶解されたまたは分散した阻害剤アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアゴニストを含む、有効量の送達ビヒクル（たとえばリポソームまたは他の複合体）を含む。語句「薬学的に許容され得る」または「薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに対して投与された場合に、不利な、アレルギー性の、または他の好ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容され得るキャリヤ」は、ヒトに対する投与に適した医薬品などのような医薬品を製剤する際に使用するのに許容され得る、１つ以上の溶媒、バッファー、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびにその他同種のものを含んでいてもよい。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野においてよく知られている。補足の活性成分もまた、組成物の中に組み込むことができる。
【００９６】
本発明による医薬組成物の投与または送達は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の経路を介してのものであってもよい。たとえば、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内注射によるまたは標的組織（たとえば心もしくは骨格筋組織）への直接的な注射によるものであってもよい。本明細書において開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性および／または効力は、皮下、皮内、および筋肉内を含む、好都合な投与経路を可能にする。ｍｉＲＮＡ阻害剤を含む医薬組成物はまた、心臓に対して治療剤を送達するために、カテーテル系または冠循環を隔離する系によって投与されてもよい。心臓および冠状動脈の血管に対して治療剤を送達するための様々なカテーテル系は、当技術分野において知られている。本発明において使用するのに適した、カテーテルベースの送達方法または冠状動脈の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、すべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４１６，５１０号明細書；米国特許第６，７１６，１９６号明細書；米国特許第６，９５３，４６６号明細書、国際公開第２００５／０８２４４０号パンフレット、国際公開第２００６／０８９３４０号パンフレット、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号明細書、および米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号明細書において開示される。
【００９７】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量または１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量または５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。これらの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物が、筋肉内もしくは皮下注射によってまたは静脈内に投与されてもよい。
【００９８】
組成物または製剤はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与されてもよい。例説として、遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としてのコンジュゲートの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどのような界面活性剤と適切に混合された水において調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物においてならびに油において調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を妨げるために保存剤を含有する。
【００９９】
注射剤の使用またはカテーテル送達に適した医薬形態は、たとえば、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌されており、容易に注射可能（ｅａｓｙ  ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）になる程度まで流動性である。調製物は、製造および保存の条件下で安定性であるべきであり、細菌および真菌などのような微生物の混入作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、ならびにその他同種のもの）、その適した混合物、ならびに植物油を含有してもよい。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および（ａｎ）抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびその他同種のものによってもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、たとえば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用の組成物の長期間の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
【０１００】
滅菌注射用溶液は、所望されるように、任意の他の成分（たとえば上記に列挙されるような）と共に、溶媒の中に、適切な量のコンジュゲートを組み込むことによって、調製されてもよい。一般に、分散液は、塩基性分散媒およびたとえば上記列挙される、所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクルの中に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、活性成分（複数可）およびそのあらかじめ滅菌ろ過された溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１０１】
製剤に際して、溶液は、好ましくは、投薬製剤と適合性の方式でおよび治療上有効である量で投与される。製剤は、注射用溶液、薬剤放出カプセル、およびその他同種のものなどのような、様々な投薬形態で、容易に投与されてもよい。水溶液における非経口投与について、たとえば、溶液は一般に、適切にバッファーされ、液体の希釈剤は、最初に、たとえば十分な食塩水またはグルコースにより等張にされる。そのような水溶液は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与のために使用されてもよい。好ましくは、滅菌水性媒体は、特に、本発明の開示を考慮して、当業者らに知られているように用いられる。例説として、一回の用量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入の液体に追加されてもよく、または注入について提案される部位に注射されてもよい（たとえば”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０を参照されたい）。投薬におけるいくらかの変動は、処置されている被験体の状態に依存して、当然起こるであろう。投与の担当者は、いずれにしても、個々の被験体にとって適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準によって要求されるような滅菌、発熱性、一般的な安全性、および純度基準を満たすべきである。
【０１０２】
本明細書における、あらゆる図面および添付物を含む刊行物、特許、および特許出願はすべて、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照によって組み込まれるように明確にかつ個々に示されたのと同じ程度まで、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１０３】
本発明は、限定として解釈されるべきではない、以下のさらなる実施例によってさらに例証される。当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が、開示される特定の実施形態においてなされ、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解されたい。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：抗ｍｉＲ−２０８は、年齢誘発性の体重増加を阻害する
【０１０５】
マウスにおいて、ｍｉＲ−２０８阻害剤についての、治療効果の可能性を研究するうちに、発明者らは、抗ｍｉＲ−２０８により長期の研究で処置した動物が、マウスが通常示す年齢誘発性の体重増加を示さなかったが、コントロール処置（Ｍ−１０５９１）または食塩水により処置したマウスは、増加を示したことを観察した。処置は、８週齢（２０〜２５グラムの体重）でスタートし、６か月までの間、継続し、この間、マウスは、抗ｍｉＲ−２０８（Ｍ−１０１０１）、非標的コントロール（Ｍ−１０５９１）、または同等量の食塩水を１、２、および３日目に３×２５ｍｇ／ｋｇの負荷投与量でならびに１週間おきに２５ｍｇ／ｋｇで受けた。Ｍ−１０５９１は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）特異的ｍｉＲＮＡを標的にし、以下の配列を有する：ＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＧＡ（配列番号１２）。Ｍ−１０１０１のように、Ｍ−１０５９１もまた、９つのＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含有し、長さが１６ヌクレオチドである。Ｍ−１０１０１により処置したマウスは、コントロール処置または食塩水注射動物と比較して、有意により高い、心臓対身体重量比を示した。この差異は、心臓重量（ＨＷ）における増加によるものではなく、むしろ、研究の過程の間の体重（ＢＷ）の増加がより小さかったことによるものであった（図１）。
【０１０６】
同等の観察は、発明者らが、２週間ごとに、２５ｍｇ／ｋｇのＭ−１０１０１を、長期間、８週齢のオスウィスターラットに投薬した場合になされたが、この効果は、Ｍ−１０５９１処置グループにおいて観察されなかった（図２）。
【０１０７】
実施例２：抗ｍｉＲ−２０８は、高脂肪食誘発性の肥満症に対する抵抗性を与える
【０１０８】
抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドによる長期的な処置の効果を決定するために、６週齢オスＣ５７Ｂｌ６マウスに、食塩水中に溶解したＬＮＡ修飾抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）またはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ特異的ｍｉＲＮＡに対して向けられるコントロールオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０５９１）の１０ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。マウスに、３日間連続して注射し、次いで、実験の全体にわたって毎週の維持注射を与えた。抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）の皮下送達は、ノーザンブロット分析によって検出されるように、心臓においてｍｉＲ−２０８ａレベルを効率的に阻害した（図３Ａ）。抗ｍｉＲ−２０８ａまたはコントロール抗ｍｉＲによる、６週間のマウスの処置は、心臓重量、心筋収縮能、または心拍数に対して効果を有さなかった（図３Ｂ〜Ｄ）。
【０１０９】
体重および代謝を調節する際のｍｉＲ−２０８ａの役割をさらに調査するために、発明者らは、高脂肪（ＨＦ）食に応じた体重増加に対する抗ｍｉＲ−２０８ａの効果について試験した。６週齢オスＣ５７Ｂｌ６マウスに、３日間連続して、抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）またはコントロール抗ｍｉＲ（Ｍ−１０５９１）の１０ｍｇ／体重ｋｇを皮下注射した。３日目に、マウスを、ＨＦ食（６０％ｋｃａｌ／脂肪）または普通の固形飼料（ＮＣ；１０％ｋｃａｌ／脂肪）下に配置した。マウスは、研究の全体にわたって、毎週、重さを量り、１０ｍｇ／ｋｇの維持量を与えた。ＨＦ食の、コントロール抗ｍｉＲにより処置したマウスは、６週間以内にそれらの体重を７５％増加させたのに対して、ＨＦ食の抗ｍｉＲ−２０８ａ処置マウスは、体重が２９％しか増加しなかったことを示し（図４Ａ〜Ｂ）、これは、普通の固形飼料で維持し、コントロール抗ｍｉＲまたは抗ｍｉＲ−２０８ａ（それぞれ、２８％および２５％）により処置したマウスと同等であった。
【０１１０】
ＮＭＲ分光法により、処置グループの間の重量における差異が、図４Ｃのそれぞれのバーにおける白色の部分によって示される脂肪重量における差異によることが明らかにされた。これらの発見と一貫して、内臓白色脂肪ならびに白色および褐色脂肪の両方を含有する肩甲下脂肪組織は、脂肪質量および脂肪細胞サイズに基づいて、コントロール抗ｍｉＲ処置動物と比較して、ＨＦ食およびＮＣの抗ｍｉＲ−２０８ａ処置グループにおいて有意により小さかった（図４Ｄ〜Ｇ）。血清トリグリセリドおよびコレステロールレベルもまた、ＨＦ食の抗ｍｉＲ−２０８ａ処置マウスにおいて、低下した（図４Ｈおよび４Ｉ）。同様に、ＨＦ食餌のコントロール動物において見られた肝臓脂肪症は、抗ｍｉＲ−２０８ａによる処置によって弱められた（図４Ｆ）。
【０１１１】
ＨＦ食誘発性の肥満症は、グルコース不耐性を引き起こす。ＮＣの抗ｍｉＲ−２０８ａ処置マウスは、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）によって測定されるように、正常なグルコース応答を示した（図５Ａ）。ブドウ糖負荷試験は、一晩の絶食後に実行した。ベースライン測定値は、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｐｌｕｓ  ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して得た。続いて、マウスに、１ｍｇ／ｇグルコースを腹腔内注射した。次いで、グルコースレベルを、グルコース注射の１５、３０、６０、および１２０分後に測定した。ＨＦ食で、コントロール抗ｍｉＲ処置肥満マウスは、脂肪質量における増加およびグルコース不耐性を示した（図４Ｄおよび５Ａ）。対照的に、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置マウスは、ＧＴＴおよび計算された曲線下面積によって明らかにされるように、６週間のＨＦ食後に、正常なグルコース応答を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０１１２】
抗ｍｉＲ−２０８ａ処置マウスからの空腹時インスリンレベルは、コントロール抗ｍｉＲ処置マウスのものよりも有意に低かった（図５Ｃ）。同様に、身体の脂質含有量を反映する脂肪細胞（ａｄｉｏｐｏｃｙｔｅ）由来循環ホルモンであるレプチンのレベル（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１：１３１１−１３１４、１９９５）は、ＮＣおよびＨＦ食の動物において、コントロール抗ｍｉＲと比較して、抗ｍｉＲ−２０８ａによって低下した（図５Ｄ）。抗ｍｉＲ−２０８ａは、身体活動性または摂食量に対して効果を有しなかった（データ示さず）。これらの発見は、ｍｉＲ−２０８ａ阻害が、全身のインスリン感受性を改善することを示唆する。ｍｉＲ−２０８ａは、心筋細胞においてのみ発現されるので（Ｃａｌｌｉｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１１９：２７７２−２７８６、２００９；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１６：５７５−５７９、２００７）、抗ｍｉＲ−２０８ａの有益な代謝効果は、全身的な代謝に対する心臓の影響の可能性を示唆する。
【０１１３】
この一連の実験の結果は、抗ｍｉＲの全身的な送達を通しての、心特異的である、ｍｉＲ−２０８ａの薬理的な不活性化が、代謝表現型を増強することを示し、ｍｉＲ−２０８ａ阻害剤が、肥満症、高コレステロール血症、２型糖尿病、肝臓脂肪症、および高脂血症などのような、様々な代謝障害における治療上の有用性を有し得ることを示唆する。
【０１１４】
実施例３：抗ｍｉＲ−２０８化合物は、代謝を調節する
【０１１５】
代謝の調節について効き目のある、ｍｉＲ−２０８ａの他の化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を同定するために、高脂肪食のマウスに、４つの異なる抗ｍｉＲ−２０８阻害剤のうちの１つを受けさせ、これらのうち２つは、以前に、インビボにおいて標的抑制解除を示し（Ｍ−１０１０１およびＭ−１０６８３）、これらのうち２つは、以前に、インビボにおいて標的抑制解除を示さなかった（Ｍ−１０６７３およびＭ−１０６８１）。マウスの他の４つのグループに、４つのコントロールオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０５９１、Ｍ−１０６４９、Ｍ−１０７０２、およびＭ−１１１８２）のうちの１つを受けさせた。６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、６０％高脂肪（ＨＦ）食または通常の固形飼料を与え、毎週、抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドの２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与を受けさせた。処置グループを表３に列挙する：
【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物はすべて、体重の低下に対する効果を有した（図６Ａおよび６Ｂ）。Ｍ−１０１０１およびＭ−１０６８３は、最も効き目があり、また、これらの阻害剤を受けたマウスは、普通の食餌の食塩水処置マウスと同等の体重を示した。Ｍ−１０６７３およびＭ−１０６８１は、体重増加に対して中間の効果を有するように思われた。１１週間の高脂肪食およびすべての抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物による抗ｍｉＲ処置後に実行したブドウ糖負荷試験は、抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物がすべて、糖耐性に対していくらかの効果を有し、Ｍ−１０１０１が最も効き目があったことを示した（図７）。分子分析により、抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物処置グループがすべて、心臓においてｍｉＲ−２０８ａの強い阻害を有することおよび抗ｍｉＲ−２０８ａ処置グループがすべて、検証されたｍｉＲ−２０８ａ標的であるＳｏｘ６の有意な抑制解除を示したことが示された（データ示さず）。
【０１１８】
要約すると、抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物はすべて、ある期間にわたって、高脂肪食誘発性の体重増加を低下させ、Ｍ−１０１０１およびＭ−１０６８３は、試験したｍｉＲ−２０８ａ阻害剤の中で最も効き目があった。これらの同じ２つの化合物は、ラット心組織において、最善の標的抑制解除を示した（データ示さず）。
【０１１９】
次の一連の実験において、抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物が既に肥満であった動物において体重を低下させることができるかどうかを決定するために、逆転研究を実行した。マウスは、マウスが約４５グラムに達するまで、高脂肪食にさらした。この時点で、マウスは、毎週、２５ｍｇ／ｋｇで、４つの抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物（Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０６８３、Ｍ−１０６７３、およびＭ−１０６８１）のうちの１つを皮下に受けさせた。マウスは、実験の間、高脂肪食で維持した。処置グループを表４に列挙する：
【０１２０】
【表４】
2014530222.tif 000015
【０１２１】
毎週の体重測定値は、抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物がすべて、肥満のマウスにおいて体重を低下させたことを明らかにした（図８）。Ｍ−１０１０１は、この化合物による処置が肥満のマウスにおいて体重の約１０パーセント減少をもたらしたので、最も効き目のある化合物であった。この体重減少は、マウスが高脂肪食を継続している間に起こった。反対に、コントロールオリゴ（Ｍ−１０５９１）により処置したマウスは、高脂肪食で体重を増し続けた。３つの他の抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物は、体重減少に対して中間的な効果を示したが、化合物はすべて、体重増加をさらに低下させた。
【０１２２】
この実施例において記載される研究からのデータは、ｍｉＲ−２０８ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤が、代謝を調節する際に重要な役割を果たし、肥満症および関連する代謝障害を予防し、処置するための有効な治療薬として果たすことができることを実証する。
【０１２３】
実施例４：抗ｍｉＲ−２０８は、肝臓のエネルギー代謝およびミトコンドリア機能を促す
【０１２４】
グループ当たり６匹のマウスを、高脂肪食（ＨＦＤ）のみ（コントロール）または抗ｍｉＲ−２０８ａ  Ｍ−１０１０１と組み合わせたＨＦＤにより処置した。サンプルは、最初に、盲検とし、生化学的同定およびデータキュレーション後に、サンプルを、データ分析のために「非盲検」とし、グループ１がＨＦＤ＋抗ｍｉＲ−２０８ａであり、グループ２がＨＦＤのみ（コントロール）であることを明らかにした。
【０１２５】
処置後に、プラスマ、心臓、骨格筋、肝臓、および後腹膜脂肪を、それぞれの動物から収集し、スナップ凍結し、メタボロミック分析のためにＭｅｔａｂｏｌｏｎ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）に送った。合計６０個のサンプルを、この研究において分析した。サンプルは、ある時点（１週間）の２つの別個の処置グループ［ＨＦＤ＋抗ｍｉＲ−２０８ａ（グループ１）対ＨＦＤコントロール（グループ２）］からなり、それぞれのマトリックス（プラスマ、心臓、骨格筋、肝臓、および脂肪）について６回、反復実験した。サンプルは、抽出し、ＧＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳプラットフォーム分析のために等分した。ソフトウェアは、代謝物質同定およびピーク面積統合による代謝物質定量化のために、標準物質の社内ライブラリーに対してイオンをマッチングするために使用した。サンプルについての代謝物質の同定および相対的なの定量化は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎの技術プラットフォームにより行い、これは、プラスマ、心臓、骨格筋、肝臓、および後腹膜脂肪において、それぞれ、合計３２７個、２７５個、２６０個、３１４個、および２３４個の生化学物質を検出した。生化学物質データは、Ｗｅｌｃｈの２標本ｔ検定によって分析した。Ｗｅｌｃｈの２標本ｔ検定は、その相対的レベルが様々な処置グループの間で異なった生化学物質を同定するために使用した。
【０１２６】
品質管理のために、多くの内部標準を、質量分析計へのインジェクション前に、それぞれの実験およびプロセス標準サンプルに対して追加した。プラットフォームのばらつきについての基準は、これらの内部標準についてのメジアン相対標準偏差（ｍｅｄｉａｎ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）（ＲＳＤ）を計算することによって決定した。表５は、内部標準についてのメジアン相対標準偏差（ＲＳＤ）を示す。これらの標準物質は、器機へのインジェクションの直前にサンプルに対して追加するので、この値は、器機の変動を反映する。そのうえ、ＣＭＴＲＸ（それぞれの実験プラスマサンプルの別々の一定分量から生成し、プールした「クライアントマトリックス（Ｃｌｉｅｎｔ  Ｍａｔｒｉｘ）」サンプル。これらのＣＭＴＲＸサンプルは、プラットフォームの実行の全体にわたってインジェクトし、技術的な反復実験として役割を果たした）において一貫して測定した生化学物質についてのメジアン相対標準偏差（ＲＳＤ）は、実際の実験サンプルについてのプロセス内のばらつきの合計およびこれらのサンプル内の内因性代謝物質の定量化におけるばらつきを示す（表５）。ＣＭＴＲＸおよび内部標準についての結果は、プラットフォームがプロセス指定条件を満たしたデータをもたらしたことを示した。
【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
肝臓サンプルについては、同定された３１４個の生化学物質のうちの３６個は、抗ｍｉＲ−２０８ａを受けたＨＦＤマウス対ＨＦＤコントロールの間で、有意な差異を示した。グルコース代謝およびＴＣＡサイクルへのピルビン酸の組み込みに関与する生化学物質については、下流の代謝物質の同時の維持と共に、解糖経路の初期の中間体における増加が、それぞれの代謝物質についての相対的な倍数変化を提供する表６において示されるように見られた。
【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、フルクトース−１，６−リン酸（ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションおよび他の化学的性質に基づいた同定）、ならびにジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）はすべて、コントロールに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａの処置により上昇したことが示された（Ｇ６ＰおよびＦ６Ｐは、有意性の傾向があることを示した、０．０５＜ｐ＜０．１０）。このパターンは、抗ｍｉＲ処置後の肝臓グルコース代謝における増加およびトリカルボン酸（ＴＣＡ、クレブス）サイクルへのピルビン酸供給の効率的な利用と一貫している。解糖最終産物である乳酸において変化がないのは、ＴＣＡサイクルのエネルギー変換に供給するためのグルコース代謝の利用の増加をさらに裏付け、ＨＦＤコントロールに対比して、酸化的グルコース代謝の維持を示す。
【０１３１】
ＴＣＡサイクルのエネルギー変換に向かう、グルコース関連性の代謝物質の使用の増加と一貫して、ＴＣＡサイクル中間体の減少のパターンが、コントロール肝臓サンプルに対比する抗ｍｉＲ−２０８ａ肝臓サンプルにおいて観察された（α−ケトグルタル酸（統計的に有意、ｐ＜０．０５）、スクシニルＣｏＡおよびフマル酸（有意性の傾向がある、０．０５＜ｐ＜０．１０）、ならびにクエン酸およびリンゴ酸を含む）（表７）。
【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
まとめると、大多数のＴＣＡサイクル中間体における減少は、処置なしに対比する、抗ｍｉＲ処置ありのＨＦＤモデルにおける、エネルギー代謝効率の増加を示唆する。そのうえ、ＴＣＡ経路エネルギー代謝は、ミトコンドリアに固有のものであるので、これらの変化は、ＨＦＤマウスモデルにおけるミトコンドリア機能における抗ｍｉＲ媒介性の改善を示す。ＨＦＤマウスモデルにおけるグルコース利用の増加は、特に食餌誘発性の糖代謝異常をより起こしやすいことが知られているＣ５７Ｂｌ／６株において有利であろう（Ｇａｌｌｏｕ−Ｋａｂａｎｉら、（２００７）Ｏｂｅｓｉｔｙ，１５、ｐ．１９９６−２００５）。さらに、補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、α−ケトグルタル酸のスクシニルＣｏＡへのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ媒介性の変換に必要とされ、ＣｏＡ前駆物質パントテン酸における減少を伴うＣｏＡの増加のパターンもまた、ＨＦＤのみに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａにより処置した動物の肝臓において観察された。変化のこのパターンは、ＴＨＲＡＰ１（別名ＭＥＤ１３）の抗ｍｉＲ依存性の解放および甲状腺受容体シグナル伝達に関係するミトコンドリアバイオゲネシスにおける続く増加を反映し得る。
【０１３４】
分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）代謝は、インスリン抵抗性および肥満症の発症において役割を果たすように思われる（Ｎｅｗｇａｒｄら、（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．９、３１１−２６；Ａｌｔｍａｉｅｒら、（２００８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４９、３４７８−８９；Ｓｈｅら、（２００７）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，２９３、Ｅ１５５２−６３）。ＢＣＡＡ、イソロイシン、ロイシン、およびバリンのレベルの上昇は、ＢＣＡＡの代謝に由来する様々な短鎖代謝物質と共に、インスリン抵抗性の状態の間によく観察され、インスリン感受性および／またはＩＲと関連した、特有のパターンの発現を示す（Ｎｅｗｇａｒｄら、Ａｌｔｍａｉｅｒら）。ＢＣＡＡであるロイシンおよびバリンは、コントロールに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置により有意に減少することが示され（ｐ＜０．０５）、イソロイシンは、ＨＦＤモデルにおいて、処置による有意な減少の傾向を示した（０．０５＜ｐ＜０．１０）（表８）。抗ｍｉＲ処置による相対的な減少のこのパターンはまた、いくつかのＢＣＡＡ代謝物質でも観察された。
【０１３５】
【表８】
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【０１３６】
肝臓において観察されたグルコース代謝における増加およびＴＣＡサイクル効率の改善に加えて、この器官における抗糖尿病／肥満の効能のさらなる徴候は、コントロールに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置で明らかであった。グリコーゲン代謝の側面と関連する、マルトース由来の代謝物質における有意な変化は、抗ｍｉＲ−２０８ａによる処置後の、肝臓グリコーゲン沈着の増加の徴候を示した。この事例において、より高次のグルコサッカリド（ｇｌｕｃｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（つまりマルトペンタオースおよびマルトヘキサオース）は、１週間で、ＨＦＤモデルにおいて、処置に応じた、統計的に有意な上昇（ｐ＜０．０５）を示した（表９）。
【０１３７】
【表９】
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【０１３８】
より短いグルコサッカリド前駆物質であるマルトース（有意）およびマルトトリオースにおける同時の減少と組み合わせて、より高次のグルコサッカリドにおいて観察される上昇は、グリコーゲン合成における中間体となり、また、グリコーゲン沈着と関連してそれらが上昇することが仮定される。肝臓グルコース代謝の上昇およびミトコンドリア機能の増強の点からの、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置についての明らかな抗糖尿病／肥満の効能と共に、肝臓グリコーゲン合成の増加は、有利な抗ｍｉＲ−２０８ａ効果と一貫している。肝臓において増加するグリコーゲン沈着は、糖尿病／インスリン抵抗性の管理において、高血糖症を低下させるための有効なメカニズムに相当する。血漿グルコースレベルは、ＨＦＤのみに対比して、ＨＦＤ＋抗ｍｉＲ−２０８ａ後、１週間で、実質的に改変しないが（示さず、コントロールの１．０９倍）、この発見は、ＨＦＤモデルが進むにつれて、抗ｍｉＲが血糖コントロールに影響を与える、可能性のある作用メカニズムに対する洞察をもたらす。
【０１３９】
この実施例は、抗ｍｉＲ−２０８ａにより処置したマウス由来の肝臓が、その好ましいエネルギー源を利用し（たとえば解糖）、過剰な基質をコントロールマウスよりも最適にプロセシングする（たとえばグリコーゲン沈着）ことを実証する。さらに、徴候は、コントロールマウスと比較して、抗ｍｉＲ−２０８ａにより処置したマウスのミトコンドリアが、より最適に機能しているというものである（たとえばＴＣＡサイクル、分岐鎖アミノ酸）。これらの効果はすべて、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）に対する抗ｍｉＲ−２０８ａの効果を通して、可能性として調節され得る甲状腺ホルモンシグナル伝達における改善と一貫し得る。
【０１４０】
実施例５：抗ｍｉＲ−２０８は、骨格筋燃料利用およびミトコンドリア機能の改善を促す
【０１４１】
高脂肪食（ＨＦＤ）のみまたは抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）と組み合わせたＨＦＤにより処置したマウス由来の骨格筋についてのメタボロミック分析を、実施例４において記載されるように実行した。骨格筋代謝における改変は、一般にＩＲ、Ｔ２Ｄ、およびＭＳなどのような代謝性疾患状態と関連する（Ｍｕｏｉｏ  ａｎｄ  Ｎｅｗｇａｒｄ、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９、１９３−２０５；Ｈｕｌｖｅｒら、（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，２８４、Ｅ７４１−７）。
【０１４２】
表１０は、骨格筋グルコース代謝上流中間体が、抗ｍｉＲ処置により上昇するが、下流のトリオースリン酸中間体が、維持されるまたはわずかに減少することを示す。
【０１４３】
【表１０】
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【０１４４】
このパターンは、ＴＣＡサイクルエネルギー代謝経路に効率的に供給されるグルコースの使用の増加となおまた一貫し、ＨＦＤコントロールに対比して、抗ｍｉＲ療法により処置した動物由来の肝臓サンプルにおいて観察されたパターン（実施例４）に顕著に類似するパターンである。これらの差異は、統計的有意性に達しなかったが、パターンが、処置により肝臓において観察される差異を非常に厳密に反映するという事実は、ＨＦＤモデルの設定において代謝の利点をもたらすであろう、肝臓および骨格筋の両方に影響を与える、類似する作用メカニズムを裏付ける。
【０１４５】
さらに、肝臓において観察された抗ｍｉＲ関連性の効果と一貫して、骨格筋サンプルは、ＨＦＤコントロールに比べて、クエン酸（統計的に有意、ｐ＜０．０５）、フマル酸およびリンゴ酸（統計的に有意、ｐ＜０．０５）を含む、複数のＴＣＡサイクル中間体において、減少を示した（表１１）。なおまた、ＴＣＡサイクル中間体における同様の減少は、ＨＦＤコントロールと比較した場合の、抗ｍｉＲ処置によるエネルギー代謝効率における相対的な増加を示唆する。処置およびコントロールグループの間の差異のこのパターンはまた、上記に提唱されるＴＣＡサイクルのエネルギー変換に燃料供給する、グルコース関連性のトリオースリン酸中間体の効率的な使用における高度な増加をも裏付ける。肝臓および骨格筋の両方が、抗ｍｉＲ処置による、グルコース代謝の上昇およびＴＣＡサイクル効率の増加を示すという複合的な観察は、ミトコンドリア機能を改善し得るまたは少なくとも維持し得る薬剤関連性の効果を示し、これは、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）の抗ｍｉＲ媒介性の解放およびミトコンドリアのバイオゲネシスを上昇させる甲状腺受容体シグナル伝達と一貫する。
【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
骨格筋インスリン抵抗性における生物活性脂質の役割は、完全には理解されていないが、肥満症および栄養過多は、インスリン感受性とネガティブに関連する、脂質および脂質代謝物質の筋肉内の蓄積と関連する（Ｍｕｏｉｏ  ａｎｄ  Ｎｅｗｇａｒｄ、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９、１９３−２０５）。グリセロリン脂質（ＧＰＬ）に由来するリゾ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）は、生物活性特性を有し、インスリンシグナル伝達カスケードにおいて複数の部位で相互作用することが知られており、インスリン抵抗性を最終的にもたらす（Ｗｙｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｔｅｒ、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９、１６２−７６；Ｐａｔｔｉ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ、（２００４）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１０、１０４９−５０）。この実施例において、いくつかの脂質種は、表１２において示されるように、ＨＦＤコントロールサンプルと比較した場合、抗ｍｉＲ処置動物由来の骨格筋において減少した。
【０１４８】
【表１２】
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【０１４９】
ＧＰＬ由来リゾ脂質は、特に、コントロールに対比して、抗ｍｉＲ処置により、骨格筋において一様に減少し、エタノールアミンおよびコリンコンジュゲート種の両方は、同様に影響を受けた。ＨＦＤが、おそらく、ＧＰＬ由来リゾ脂質の蓄積を誘発するので、この差異は、抗ｍｉＲ処置が、ＨＦＤモデルにおいて、リゾ脂質における全体的な上昇をブロックすることを示唆する。観察された、減少のパターンはまた、リゾ脂質のｓｎ−１およびｓｎ−２変異体の間でも異なっておらず、抗ｍｉＲ処置が、ホスホリパーゼＡ１にも、Ａ２にも、優先的に影響を与えていないことを示し、生合成の変化に対比する、ＨＦＤモデルにおける、リゾ脂質取込みにおける抗ｍｉＲ誘発性の変化をさらに裏付ける。
【０１５０】
そのうえ、抗ｍｉＲ処置はまた、骨格筋モノおよびジアシルグリセロールならびにスフィンゴ脂質をも減少させ（表１３）、これは、ＨＦＤが、脂質および脂質代謝物質の骨格筋蓄積における全体的な増加と相関するという示唆と一貫している。したがって、グルコース代謝およびＴＣＡサイクル効率（ミトコンドリア機能）の増加に関して、抗ｍｉＲ処置後にリゾ脂質レベルにおいて観察される一様なパターンの変化は、骨格筋インスリン感受性の保護をもたらすための、処置上の効能を示す。
【０１５１】
【表１３】
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【０１５２】
これらの結果は、ＨＦＤと同時の抗ｍｉＲ２０８ａ処置が、骨格筋燃料利用（解糖）およびミトコンドリア機能（ＴＣＡサイクル）の改善をもたらしたことを実証する。そのうえ、骨格筋内の（ｉｎｔｒａ−ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）脂肪沈着における減少があり得る。したがって、抗ｍｉＲ２０８ａの投与は、抗−ｍｉＲ２０８ａにより促進されるＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）発現による甲状腺ホルモン受容体シグナル伝達の増加を通しても媒介され得る骨格筋代謝を改善することができる。
【０１５３】
実施例６：抗ｍｉＲ−２０８は、心代謝を促す
【０１５４】
高脂肪食（ＨＦＤ）のみまたは抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）と組み合わせたＨＦＤにより処置したマウス由来の心臓についてのメタボロミック分析を、実施例４において記載されるように実行した。
【０１５５】
心筋は、複数の燃料基質、主な基質として脂肪酸およびグルコースならびにその好ましい燃料源として脂肪酸を利用する。１週間にわたる食餌投与のスタート時の、抗ｍｉＲ２０８ａによるマウスの同時処置は、ＨＦＤのみと比較した場合、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）の上昇のパターンをもたらし（表１４）、バクセン酸、エイコセン酸、ジホモリノール酸（ｄｉｈｏｍｏｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、およびドコサジエン酸（ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏａｔｅ）の変化は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
【表１４】
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【０１５７】
この差異は、抗ｍｉＲ処置によるその好ましい燃料源の心取込みにおける増加を示唆する。ＦＡ酸化が圧倒されるようになり、ケトン体形成が結果として起こる病的な状態と異なり、抗ｍｉＲ処置による心ＬＣＦＡレベルにおける増加は、コントロールと比較した場合、心ケトン体レベルにおける相対的な減少（ケトン体３−ヒドロキシ酪酸（ＢＨＢＡ）における抗ｍｉＲ依存性の減少）と相関した。これは、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置による心臓における好ましいＦＡ燃料基質のより効率的な使用を反映し得る。
【０１５８】
ほとんどの脂質種における全体的な減少を示した骨格筋と異なり、抗ｍｉＲによる処置は、リゾ脂質、モノおよびジアシルグリセロール、ならびにスフィンゴ脂質を含むＬＣＦＡに加えて、いくつかの心脂質種における全体的な増加に関係した（２−ステアロイル−ＧＰＣおよび２−ステアロイルグリセロールは統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、１−リノレオイル−ＧＰＥは有意性の傾向を示す（０．０５＜ｐ＜０．１））（表１５）。これらのデータは、まとめると、おそらく、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）媒介性のミトコンドリアのバイオゲネシスに伴う、ＨＦＤモデルにおける代謝効率の改善に関係する、心脂質における抗ｍｉＲ−２０８ａ関連性の増加を示唆するであろう。
【０１５９】
【表１５】
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【０１６０】
その好ましい脂質燃料基質の取込みの増加に加えて、抗ｍｉＲ処置動物由来の心臓サンプルはまた、グルコース−６−リン酸、ピルビン酸、および解糖乳酸の最終産物を含む、解糖経路のいくつかの中間体における上昇をも示した（コントロールに対比して統計的に有意）（表１６）。
【０１６１】
【表１６】
2014530222.tif 000027
【０１６２】
このパターンは、乳酸の上昇を示さなかった肝臓および骨格筋で観察されたものとはわずかに異なるが、これらの差異は、心筋、骨格筋、および肝臓の間に存在する好ましい燃料源における差異ならびに心臓における代替の乳酸産生経路を考慮すれば、驚くべきことではない。まとめると、しかしながら、これらのデータは、ＨＦＤコントロールに対比する、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置によるＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）誘発性のミトコンドリアのバイオゲネシスの上昇と関連する、代謝効率の改善にも関係し得る、心臓によって利用される主要な燃料源（脂質およびグルコース）の代謝における増加を裏付ける。
【０１６３】
心グルコース代謝を肝臓と区別した他の生化学的な特色は、ホスホリラーゼ活性を介して産生され、グリコーゲン代謝物質を解糖経路に運ぶグリコーゲン分解産物グルコース−１−リン酸における有意な増加である（Ｓａｌｗａｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｔ  ａ  ｇｌａｎｃｅ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．２００４、Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１２５；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．１９９５、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．１０６４．）。これは、摂食状態において、グリコーゲン合成が、グリコーゲン分解にまさって、優先的に起こるであろうＨＦＤにおいて期待されるものと対照的であり、ＨＦＤモデル心臓における、抗ｍｉＲの独特の代謝の影響を示唆する。全体として、しかしながら、これらのデータは、ＨＦＤモデルの状況における、炭素処理の改善を示唆する、抗ｍｉＲ−２０８ａ効能と関連する、心燃料代謝における増加を示す。
【０１６４】
両方とも、代謝効率の改善と一貫する、ＴＣＡサイクル中間体における差異を示した肝臓および骨格筋と同様に、抗ｍｉＲにより処置した動物由来の心臓もまた、ＨＦＤコントロールに対比して、ＴＣＡサイクル中間体において、変化を示した。驚くほどのことではないが、他の組織に対比して、心燃料代謝において観察される差異は、肝臓または骨格筋において観察されたものに関して、心ＴＣＡサイクルの変化において観察された差異にまで及んだ（表１７）。
【０１６５】
【表１７】
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【０１６６】
クエン酸は、フマル酸のように、コントロールに対比して、抗ｍｉＲ処置動物由来の心臓組織において、有意に上昇した。トリカルボキシレートキャリヤによってミトコンドリアから搬出することができるクエン酸は、続いて、アセチル−およびマロニル−ＣｏＡ中間体を介して脂肪酸合成前駆物質として使用することができる（Ｓａｌｗａｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｔ  ａ  ｇｌａｎｃｅ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．２００４、Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１２５）。脂肪酸取込みは、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置動物の心臓において上昇するように思われ、ＦＡ取込みにおける増加は、ＦＡ合成の必要性を補い得、クエン酸のようなＦＡ前駆物質の蓄積がもたらされる。そのうえ、コハク酸のフマル酸への変換は、電子伝達系におけるＦＡＤＨ２の複合体ＩＩ産生と結び付けられる。コントロールに対比する、抗ｍｉＲにより処置した動物の心臓における、コハク酸における有意な減少（統計的に有意、ｐ＜０．０５）およびフマル酸における調和した有意な増加（統計的に有意、ｐ＜０．０５）は、より効率的な電子伝達および酸化的リン酸化、したがってミトコンドリア機能と相関する、この生化学物質のより効率的な利用を示す。脂肪酸酸化最終産物アセチルＣｏＡおよび補酵素Ａは、両方とも、表１７において示されるように、コントロールと比較して、抗ｍｉＲ−２０８ａにより処置した動物の心臓において増加し、これは、ＦＡ代謝およびミトコンドリア機能の増加と相関する。
【０１６７】
Ｍ−１０１０１によるｍｉＲ−２０８ａの阻害が、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）、したがってＴＲシグナル伝達に対するｍｉＲ−２０８ａの阻害効果を解放するとともに、酸化的リン酸化は、増加し、これは、本明細書において記載される、抗ｍｉＲ−２０８ａ関連性の変化と一貫する。電子伝達系の複合体ＩＩの阻害は、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加およびオートファジー細胞死（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）と関連し、複合体ＩＩの効率の改善が、抗ｍｉＲ−２０８ａにより処置したＨＦＤ動物の心臓におけるレドックスバランスの改善に関係し得ることを示唆する（Ｃｈｅｎら、（２００７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１２０、４１５５−６６）。
【０１６８】
実施例７：プラスマ分析は、抗ｍｉＲ−２０８が、燃料利用、脂質処理、およびミトコンドリア機能の増加を促すことを示す
【０１６９】
高脂肪食（ＨＦＤ）のみまたは抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）と組み合わせたＨＦＤにより処置したマウス由来のプラスマについてのメタボロミック分析を、実施例４において記載されるように実行した。
【０１７０】
プラスマは、血液コンパートメント内の内因性代謝および改変されたまたは宿主の全体にわたって起こるイベントから産生された代謝物質についての生化学的特色を提供する。供給源が複数である代謝物質の検出は、研究されている、定められた処置またはプロセスに関係する全身的なイベントを反映する、非常に有益なデータセットを提供する。プラスマのみにおいて検出された代謝物質の変化は、典型的に、特異的な組織または臓器系において起こっていることを正確には明らかにしないが、それらは、器官特異的な生化学的イベントに関して補足的な裏付けを提供することができる。
【０１７１】
ＨＦＤモデルの抗ｍｉＲ処置から結果として生じる、ＦＡ代謝の増加についての初期のサインと一貫して、両方とも統計的に有意である（ｐ＜０．０５）ヘプタン酸およびウンデカン酸ならびに両方とも有意性の傾向を示す（０．０５＜ｐ＜０．１０）カプリル酸およびペラルゴン酸などのような、いくつかの中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）は、未処置コントロールに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置動物の血清において上昇した（表１８）。
【０１７２】
【表１８】
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【０１７３】
パルミトイルカルニチントランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ−Ｉ）を介しての、ミトコンドリアへのそれらの移行の促進するためのアシルカルニチンコンジュゲーションを典型的に必要とする長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）と異なり、ＭＣＦＡは、このコンジュゲーションステップを伴うことなく、ミトコンドリアに移動することができ、それらを、それらのＬＣＦＡ対応物よりも容易に利用可能な燃料基質にする。プラスマＭＣＦＡの増加は、脂肪分解の最も初期のサインと相関すると考えられる。プラスマＭＣＦＡにおいて観察された変化は、おそらく、マウスＨＦＤモデルにおける抗ｍｉＲ効能に関係する、ＦＡ可動化についての有益な生化学的傾向および代謝の増加を反映する。
【０１７４】
特に高脂肪食物による、プラスマ胆汁酸（ＢＡ）の食後の上昇は、正常な体重の被験体において起こることが知られており、これは、複数の受容体のＢＡ媒介性の活性化を通して、血糖コントロールおよびエネルギー代謝を改善することが示されている（Ｇｌｉｃｋｓｍａｎら、（２０１０）Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，４８２−４）。この実施例において、ＨＦＤと関連するＢＡの変化を識別することは可能ではないが、ＨＦＤのみと比較した場合、１週間、ＨＦＤに抗ｍｉＲを追加すると、検出されたすべての化学種について、プラスマ胆汁酸の一様の減少が引き起こされた（表１９）。
【０１７５】
【表１９】
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【０１７６】
ＢＡ種はすべて、グループ１（つまり抗ｍｉＲ−２０８ａ＋ＨＦＤ）において減少した。この結果は、ＨＦＤモデルにおける抗ｍｉＲ−２０８ａ特異的な効果に対して確信を与える。ＢＡレベルにおける一様な減少は、栄養素のインプットの上昇を処理するための、薬剤を受けている動物の能力の増加（つまり、ミトコンドリアの代謝能力の増加）と相関し、それによって、系からＦＡを排除する手段としての、プラスマＢＡの上昇の必要性を減少させ得る。一方、上記に言及されるように、ＢＡシグナル伝達は、血糖コントロールおよびエネルギー代謝を改善することが知られている（Ｇｌｉｃｋｓｍａｎら、（２０１０）Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，４８２−４）。したがって、グルコース代謝の増加（肝臓、心臓、骨格筋）、肝臓グリコーゲン合成、心ＦＡ代謝の改善、および複数の組織におけるミトコンドリア機能の広範な改善に関して上記に言及される抗ｍｉＲ関連性の観察は、ＢＡシグナル伝達についての必要性の減少を示し、初期のＨＦＤ表現型に関係する、損なわれた代謝の問題（または場合によっては、発症中の問題）を解決するであろう。
【０１７７】
ミトコンドリア機能不全の特徴のうちの１つは、特に、ＦＡ基質の上昇が、ＦＡを代謝的に効率的に処理するためのミトコンドリアの能力を圧倒する、栄養過多に直面した、ＦＡ酸化のアシルカルニチン中間体（ＦＡ−ＡＣ）における上昇である（Ｍｕｏｉｏ  ａｎｄ  Ｎｅｗｇａｒｄ、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９、１９３−２０５）。これまで提起された、いくつかの方面の証拠は、肝臓、骨格筋、および心臓におけるミトコンドリア機能の改善を示す（実施例４〜７）。プラスマＦＡ−ＡＣレベルは、ＨＦＤのみのものと比較した場合、ＨＦＤ中に抗ｍｉＲ処置を受けている動物において減少し（表２０）、ＨＦＤモデルにおけるミトコンドリア機能における薬剤関連性の改善をさらに裏付けた。
【０１７８】
【表２０】
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【０１７９】
ｍｉＲ−２０８ａは、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）をネガティブに調節し、可能性として、ＴＲ媒介性のミトコンドリアバイオゲネシスに対してネガティブな影響を有する。複数の組織のＴＣＡサイクルのエネルギー変換における顕著な変化に加えた、プラスマＦＡ−ＡＣにおける減少の観察は、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）阻害の抗ｍｉＲ関連性の解放およびミトコンドリアバイオゲネシスにおける続く増加の概念を強く裏付け、これは、本明細書において記載される観察と一貫した、改善されたミトコンドリア機能の特色として現れるのであろう。
【０１８０】
したがって、ＨＦＤの設定における、抗ｍｉＲ２０８ａ処置マウス由来のプラスマ内の生化学的改変は、燃料利用、脂質処理、およびミトコンドリア機能が増加していることを示唆する。これはまた、甲状腺ホルモン受容体シグナル伝達における、ＴＨＲＡＰ１（ＭＥＤ１３）媒介性の増加とも一貫し得る。
【０１８１】
実施例８：抗ｍｉＲ−２０８は、レドックスホメオスタシスを促す
【０１８２】
グルタチオン代謝物質についてのメタボロミック分析は、実施例４において記載されるように、高脂肪食（ＨＦＤ）のみまたは抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）と組み合わせたＨＦＤにより処置したマウス由来の肝臓、骨格筋、および心臓について実行した。グルタチオンは、レドックスホメオスタシス、抗酸化防御、タンパク質フォールディング、および薬剤の解毒において重要な役割を果たし、還元グルタチオン（ＧＳＨ）は、レドックスバランスに対して実質的な影響を課する、このトリペプチドの活性形態に相当する。グルタチオンのチオール基は、求電子体と反応して、ＧＳＨ付加生成物を生成することができ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、毒素および薬剤代謝物質とＧＳＨをコンジュゲートし、排泄のために、水溶性産物を形成する。
【０１８３】
抗ｍｉＲにより処置された動物由来の肝臓は、コントロールレベルに対比して、いくつかのグルタチオン代謝物質における上昇に加えて、有意に上昇したＧＳＨレベルを示し、ＨＦＤのみに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置による肝臓レドックスバランスの改善を示した（表２１）。システイン−グルタチオン二硫化物は、包括的なメタボロミック分析において使用される酸化ストレスの一般的なバイオマーカーである。ＨＦＤのみに対する、薬剤誘発性のレドックス改善の考えと一貫して、肝臓システイン−グルタチオン二硫化物は、コントロールと比較した場合、抗ｍｉＲ処置で減少した。ＧＳＨレベルの上昇は、グルタチオン合成の増加を反映し得るが、グルタチオン生合成の上流の中間体は、抗ｍｉＲ処置によって、大部分、影響を与えられなかった（示さず）。この観察は、肝臓ＧＳＨレベルの上昇が、改変されたグルタチオン還元および／またはグルタチオン再利用と相関することを示唆する。
【０１８４】
【表２１】
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【０１８５】
抗ｍｉＲ−２０８ａ処置とポジティブに相関した、グルタチオン代謝経路において観察されたある変化は、Ｓ−ラクトイルグルタチオンの上昇であった（ＨＦＤのみの１．８８倍）。ＧＳＨ再生は、トリオースリン酸中間体の分解経路を介してグルコース代謝に連結される。グルコース代謝の上流の中間体は、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置動物の肝臓において上昇したが、グルコース代謝のトリオースリン酸中間体は、影響を与えられないように思われた。これは、ＴＣＡサイクルのエネルギー変換に向かう、グルコース由来のピルビン酸の効率的な利用に加えて、トリオースリン酸分解が、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置により起こっているかもしれず、これは、Ｓ−ラクトイルグルタチオンからの、グルタチオンのグリオキシラーゼ（ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅ）媒介性の復元を介してのＧＳＨ再生に結びつくことを示唆するであろう。結果的に、グルコース代謝における抗ｍｉＲ媒介性の増加は、少なくとも部分的に、コントロールに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａにより観察されたＧＳＨにおける増加の一因となり得る。
【０１８６】
上記の実施例５において記載されるように、骨格筋は、上流の中間体の上昇およびトリオースリン酸中間体において明らかな変化がないことを含めて、ＨＦＤのみに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａ＋ＨＦＤの状況における肝臓において見出されたものに類似するパターンのグルコース代謝中間体を示した。驚くほどのことではないが、次いで、薬剤により処置された動物由来の骨格筋はまた、コントロールと比較した場合に、ＧＳＨにおける有意な増加をも示し（表２２）、この増加は、Ｓ−ラクトイルグルタチオンにおける増加と相関した（ＨＦＤのみの１．６７倍）。
【０１８７】
【表２２】
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【０１８８】
酸化ストレスマーカーであるシステイン−グルタチオン二硫化物におけるわずかな減少を示した肝臓と異なり、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置動物由来の骨格筋サンプルは、この生化学物質における変化を示さず、可能性として、ＨＦＤモデルに関係する、レドックスバランスの組織特異的な変化における差異を示した。これらのデータは、肝臓および骨格筋におけるＴＣＡサイクルのエネルギー変換の増強およびＧＳＨ再利用の両方と調和する、グルコース代謝に対する抗ｍｉＲ関連性の効果をさらに裏付け、すべて、食餌誘発性の代謝の変化の初期段階における抗ｍｉＲ−２０８ａ効能と一貫した。
【０１８９】
肝臓および骨格筋と異なり、心臓は、ＨＦＤコントロールに対比して、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置により、ＧＳＨレベルにおいてわずかな増加を示し、Ｓ−ラクトイルグルタチオンは、検出されなかった（表２３）。
【０１９０】
【表２３】
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【０１９１】
上記の実施例６において記載されるように、心臓代謝は、肝臓または骨格筋における代謝と異なり、ＦＡ取込み／代謝、グルコース代謝、乳酸産生、およびＴＣＡサイクルのエネルギー変換における差異が、観察された。Ｓ−ラクトイルグルタチオン／グルタチオンのグリオキシラーゼ再生が、トリオースリン酸分解に依存し、これは、肝臓および骨格筋において観察されたので、この経路は、心臓において観察されたＧＳＨの上昇の一因となり得ない。しかしながら、心乳酸における顕著な増加およびピルビン酸における同時の減少もまた、上記に言及され、これは、リンゴ酸／オキサロ酢酸運搬体（ｓｈｕｔｔｌｅ）における増加と関連するように思われ、未処置ＨＦＤコントロールに対比して、薬剤により処置された動物の心臓における、改善された細胞質ゾルレドックスステータスについてのメカニズムの可能性をもたらす。
【０１９２】
心筋は、リンゴ酸−オキサロ酢酸運搬体を含む、他の組織とそれを区別する代謝経路を取り（Ｓｔｒｏｎｇら、（１９７９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２、６２５−３６）、リンゴ酸は、ミトコンドリアから細胞質ゾルに搬出され、オキサロ酢酸へのその変換は、ピルビン酸の乳酸への変換およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのサイクリングに結び付けられる。この運搬体は、リンゴ酸−アスパラギン酸運搬体と関連した細胞質ゾル酸化に可能性として対立することによる、心筋細胞における、レドックスホメオスタシスの調節に対する、可能性のあるメカニズムとして提唱されている（Ｓｔｒｏｎｇら）。抗ｍｉＲ−２０８ａ処置を介してＨＦＤモデルにおいてレドックスバランスを維持するための、この可能性のあるメカニズムは、下記に言及される、処置および未処置サンプルの間でグルタチオン代謝において観察された差異ならびに抗ｍｉＲ−２０８ａ処置により起こる還元グルタチオン（ＧＳＨ）の再構成について、心臓、肝臓、および骨格筋の間で観察された機構的な差異について、少なくとも部分的に要因となり得る。
【０１９３】
実施例４〜７において記載されるような代謝物質の分析は、１週間のＨＦＤのコントロールに比べて、１週間、ＨＦＤと組み合わせた抗ｍｉＲ処置が、限られた数の有意な生化学的変化をもたらし、抗ｍｉＲ投与による、ある程度の有利な代謝の差異を示し得ることを示した。生化学的変化の組織特異的パターンは、ＨＦＤモデルにおける抗ｍｉＲ処置の主要な結果としての、肝臓および筋肉の解糖における上昇ならびに心臓における脂肪酸取込みおよび代謝の上昇に関係する、ミトコンドリア機能の改善を明らかにした。これらの結果はまた、改善されたミトコンドリア機能を示唆するプラスマバイオマーカーにおける差異によっても裏付けされた。そのうえ、抗ｍｉＲ−２０８ａ処置に応じて、肝臓、筋肉、および心臓におけるレドックスホメオスタシスの改善または保護は、肝臓グリコーゲン合成の増加と同様に、明らかであった。有意な変化は、後腹膜脂肪において観察されず、これは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスモデルにおける、短時間のＨＦＤおよび／またはＨＦＤ＋抗ｍｉＲ−２０８ａ処置の組み合わせと一貫している。
【０１９４】
実施例９：抗ｍｉＲ−２０８は、ジペプチド蓄積を促す
【０１９５】
ジペプチドについてのメタボロミック分析は、実施例４において記載されるように、高脂肪食（ＨＦＤ）のみまたは抗ｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）と組み合わせたＨＦＤにより処置したマウス由来の骨格筋について実行した。アミノ酸ジペプチドは、タンパク質合成、したがって筋肉成長のための基本単位として使用することができる。抗ｍｉＲによるＨＦＤ動物の処置は、いくつかの骨格筋ジペプチドレベルにおいて、増加を引き起こした（２０個のうち１５個の増加が同定され、２０個のうちの５つが統計的有意性、ｐ＜０．０５を有し、他の３つが有意性の傾向がある）（表２４）。
【０１９６】
【表２４】
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【０１９７】
骨格筋ジペプチドにおける広範な増加は、おそらく、骨格筋成長の阻害を示し、ジペプチド基本単位の蓄積をもたらす。したがって、抗ｍｉＲ−２０８ａは、骨格筋タンパク質合成を改変し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014530222.tif 000048
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