(57)【要約】  本発明は、血液凝固因子ＶＩＩ誘導体、血液凝固因子ＶＩＩａ誘導体、前記誘導体に血中半減期を延長させる重合体が結合されたＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａ結合体、前記結合体にキャリアを結合させたＦａｃＶＩＩ及びＶＩＩａ複合体、前記ＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａの誘導体をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体、前記形質転換体を用いて前記ＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａの誘導体を製造する方法、前記ＦａｃＶＩＩａ結合体及び複合体を製造する方法、前記方法で製造されたＦａｃＶＩＩａ複合体、前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血友病予防又は治療用医薬組成物、並びに前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血液凝固用医薬組成物に関する。また、本発明は、前記組成物を治療学的に有効な量で対象体に投与することを含む、血友病を予防もしくは治療する方法、又は血液の凝固を促進する方法に関する。  本発明のＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａの誘導体は、活性を保持しつつ、血中半減期を向上させることのできるキャリアに結合されるので、より効果的な血友病予防又は治療剤の開発に広く活用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固因子ＶＩＩ(第ＶＩＩ因子又はＦａｃＶＩＩ)のアミノ酸配列(配列番号４)を含み、そのＣ末端にペプチドリンカーが連結されたＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの誘導体。
【請求項２】
前記ペプチドリンカーのＣ末端アミノ酸残基が、システインである請求項１に記載の誘導体。
【請求項３】
前記ペプチドリンカーが、ＳＯＤ１(スーパーオキシドジスムターゼ)の部分配列である請求項１に記載の誘導体。
【請求項４】
前記ＳＯＤ１の部分配列が、配列内のＶＬＫＧ(バリン-ロイシン-リシン-グリシン)が自己切断部位アミノ酸配列であるＩＰＲＩ(イソロイシン-プロリン-アルギニン-イソロイシンで置換されることにより変異したものである請求項３に記載の誘導体。
【請求項５】
配列番号９、１３、１４、２０、２４及び２７からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成される請求項１に記載の誘導体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号８、１２、１５、２１、２５及び２８からなる群から選択される塩基配列で構成される請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣ、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩ、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−２５ＩＰＲＩ、及びｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−９０ ＩＰＲＩからなる群から選択される請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
寄託番号ＫＣＴＣ１２０２２ＢＰで特定される請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
ＦａｃＶＩＩ誘導体の製造方法であって、以下の工程、
(ｉ)請求項１０の形質転換体を培養して培養液を得る工程と、
(ｉｉ)前記培養液からＦａｃＶＩＩ誘導体を回収する工程と、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記回収したＦａｃＶＩＩ誘導体を活性化する工程をさらに含む請求項１２に記載のＦａｃＶＩＩ誘導体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ誘導体又はその活性型ＦａｃＶＩＩａのペプチドリンカーに、血中半減期を延長させることのできる非ペプチド性重合体が結合されているＦａｃＶＩＩ結合体又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの結合体。
【請求項１５】
前記非ペプチド性重合体が、ＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの誘導体のＣ末端に結合されている請求項１４に記載の結合体。
【請求項１６】
前記非ペプチド性重合体が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される１個以上の反応基を有するものである請求項１４に記載の結合体。
【請求項１７】
前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル又はスクシンイミジルカーボネートである請求項１４に記載の結合体。
【請求項１８】
前記非ペプチド性重合体が、２個又は３個の反応末端を有する請求項１４に記載の結合体。
【請求項１９】
前記非ペプチド性重合体が、両末端にそれぞれマレイミド反応基又はアルデヒド反応基を有する請求項１４に記載の 結合体。
【請求項２０】
前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール非ペプチジル共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質非ペプチド性重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１４に記載の結合体。
【請求項２１】
非ペプチド性重合体を介して、免疫グロブリンＦｃ領域に連結された、請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体からなる、ＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの複合体。
【請求項２２】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記非ペプチド性重合体は、１個、２個又は３個の反応末端を有する請求項２１に記載の複合体。
【請求項２４】
前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれマレイミド反応基又はアルデヒド反応基を有する請求項２１に記載の複合体。
【請求項２５】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１個〜４個のドメインからなる請求項２１に記載の複合体。
【請求項２６】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む請求項２１に記載の複合体。
【請求項２７】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する請求項２１に記載の複合体。
【請求項２８】
免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４Ｆｃ領域である請求項２１に記載の複合体。
【請求項２９】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４Ｆｃ領域である請求項２１に記載の複合体。
【請求項３０】
ＦａｃＶＩＩａ複合体の製造方法であって、以下の工程、
(ｉ)一方の末端にスクシンイミド誘導体又はアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０において、免疫グロブリンＦｃのアミン基と共有結合で連結する工程と、
(ｉｉ)前記(ｉ)の反応混合物から、前記アミン基において非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む結合体を回収する工程と、
(ｉｉｉ)回収した結合体の非ペプチド性重合体の他方の末端に、請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端チオール基を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の末端のそれぞれにおいて免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃＶＩＩ誘導体に結合されたＦａｃＶＩＩ複合体を生成する工程と、
(ｉｖ)前記(ｉｉｉ)で生成したＦａｃＶＩＩ複合体を活性化することにより、非ペプチド性重合体を介して、ＦａｃＶＩＩａ及び免疫グロブリンＦｃ領域を有するＦａｃＶＩＩａ複合体を生成する工程と、
を含む方法。
【請求項３１】
ＦａｃＶＩＩａ複合体の製造方法であって、以下の工程、
(ｉ)一方の末端にスクシンイミド誘導体又はアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０において、免疫グロブリンＦｃのアミン基と共有結合で連結する工程と、
(ｉｉ)前記(ｉ)の反応混合物から、前記アミン基において、非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む結合体を回収する工程と、
(ｉｉｉ)回収した結合体の非ペプチド性重合体の他方の末端に、請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端チオール基を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の末端のそれぞれにおいて、免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃＶＩＩａ誘導体を有するＦａｃＶＩＩａ複合体を生成する工程と、
を含む 方法。
【請求項３２】
ＦａｃＶＩＩａ結合体の製造方法であって、以下の工程、
(ｉ)請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端チオール基に、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する非ペプチド性重合体を共有結合させる工程と、
(ｉｉ)前記ＦａｃＶＩＩ誘導体に非ペプチド性重合体が共有結合により連結されることにより調製されたＦａｃＶＩＩ結合体を回収する工程と、
(ｉｉｉ)前記回収したＦａｃＶＩＩ結合体を活性化することにより、ＦａｃＶＩＩａ領域が非ペプチド性重合体と連結されたＦａｃＶＩＩａ結合体を生成する工程と、
を含む方法。
【請求項３３】
ＦａｃＶＩＩａ結合体の製造方法であって、以下の工程、
(ｉ)請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端チオール基に、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する非ペプチド性重合体を共有結合させる工程と、
(ｉｉ)前記ＦａｃＶＩＩａ誘導体に非ペプチド性重合体が共有結合により連結されることにより調製されたＦａｃＶＩＩａ結合体を回収する工程と、
を含むＦａｃＶＩＩａ結合体の製造方法。
【請求項３４】
請求項３２又は３３に記載の方法で回収したＦａｃＶＩＩａ結合体の非ペプチド性重合体の他方の末端に連結された免疫グロブリンＦｃ領域からなるＦａｃＶＩＩａ複合体。
【請求項３５】
前記ＦａｃＶＩＩ誘導体、ＦａｃＶＩＩ結合体又はＦａｃＶＩＩ複合体の活性化が、オンカラム(on-column)活性化又はインソリューション(in-solution)活性化により行われるものである請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールである請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法で製造されたＦａｃＶＩＩａ結合体又はＦａｃＶＩＩａ複合体。
【請求項３８】
ＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体とキャリアが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性重合体を介して連結されたＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの複合体。
【請求項３９】
前記ＦａｃＶＩＩ結合体又はＦａｃＶＩＩａ結合体を構成する非ペプチド性重合体の一方の末端が、抗体、アルブミン及びトランスフェリンからなる群から選択されるキャリアに結合されている請求項１４に記載の複合体。
【請求項４０】
前記キャリアが、抗体、アルブミン及びトランスフェリンからなる群から選択される請求項３８に記載の複合体。
【請求項４１】
前記非ペプチド性重合体が、１個、２個又は３個の反応末端を有する請求項３８に記載の複合体。
【請求項４２】
前記非ペプチド性重合体が、両末端にそれぞれマレイミド反応基又はアルデヒド反応基を有する請求項３８に記載の複合体。
【請求項４３】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体、請求項１４〜２０のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ結合体又はＦａｃＶＩＩａ結合体、請求項２１〜２９のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ複合体又はＦａｃＶＩＩａ複合体、又は請求項３７に記載のＦａｃＶＩＩａ結合体又はＦａｃＶＩＩａ複合体を有効成分として含む血友病予防又は治療用の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体、請求項１４〜２０のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ結合体又はＦａｃＶＩＩａ結合体、請求項２１〜２９のいずれかに記載のＦａｃＶＩＩ複合体又はＦａｃＶＩＩａ複合体、又は請求項３７に記載のＦａｃＶＩＩａ結合体又はＦａｃＶＩＩａ複合体を有効成分として含む血液凝固用の医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４３に記載の血友病予防又は治療用の医薬組成物を治療学的に有効な量で対象体に投与することを含む、血友病を予防又は治療する方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の血液凝固用の医薬組成物を治療学的に有効な量で被験体に投与することを含む、血液凝固を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固因子ＶＩＩ誘導体、血液凝固因子ＶＩＩａ誘導体、前記誘導体に血中半減期を延長させうる重合体が結合されたＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａ結合体、前記結合体にキャリアを結合させたＦａｃＶＩＩ及びＶＩＩａ複合体、前記ＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａ誘導体をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体、前記形質転換体を用いて前記ＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａ誘導体を製造する方法、前記ＦａｃＶＩＩａ結合体及び複合体を製造する方法、前記方法で製造されたＦａｃＶＩＩａ複合体、前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血友病予防又は治療用医薬組成物、並びに前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血液凝固用医薬組成物に関する。また、本発明は、前記組成物を治療学的に有効な量で被験体に投与することを含む、血友病を予防もしくは治療する方法、又は血液の凝固を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界の血友病患者は１４万人と推定されており、毎年２０％の増加傾向を示している。遺伝的に１万人に１人の割合で血友病が発生しているが、患者全体の約２５％しか診断や治療を受けていない。前記血友病は、発病原因により大きく２つに分けられるが、一方は血液凝固因子ＶＩＩ(ＦａｃｔｏｒＶＩＩ, ＦａｃＶＩＩ)の欠乏により発病するＡ型血友病であり、全血友病患者の８０％を占め、他方は血液凝固因子ＸＩ(ＦａｃｔｏｒＸＩ)の欠乏により発病するＢ型血友病であり、全血友病患者の２０％を占める。このような血友病を治療する方法として外部から血液因子を投与する方法が用いられているが、この方法を用いると、Ａ型血友病患者の１０〜１５％において投与された血液因子に対する抗体が生成され、またＢ型血友病患者の１〜３％で投与された血液因子に対する抗体が生成されるという問題が報告されている。
【０００３】
一方、血友病患者の半分以上を占めるＡ型血友病の原因であるＦａｃＶＩＩは、主に肝臓で産生される４０６個のアミノ酸で構成された酵素であり、１０位のアミノ酸であるグルタミン酸がγ−カルボキシル化され、１４５位及び３２２位のアミノ酸であるアスパラギンがＮ−グリコシル化され、５２位及び６０位のアミノ酸であるセリンがＯ−グリコシル化されている。また、ＦａｃＶＩＩは、２つのＥＧＦ様ドメインと、１つのセリンプロテアーゼドメインとを有し、１５２位のアルギニンと１５３位のイソロイシンの間が切断されて重鎖の活性部位が露出し、それにより１つのアミノ酸配列で構成されたＦａｃＶＩＩが２つのアミノ酸配列(軽鎖及び重鎖)で構成された二量体のＦａｃＶＩＩａの形態に活性化される。活性化されたＦａｃＶＩＩａは、他の血液凝固因子とは異なる補助的な血液凝固機序で作用するので、高用量で投与しても抗体が生成されない。よって、Ａ型血友病患者だけでなく、従来の治療方法によりＦａｃＶＩＩに対する抗体が形成されている患者を治療するのに用いることができ、上記問題を解決する手段として知られている。
【０００４】
しかし、前記ＦａｃＶＩＩａは抗体が形成されないものの、血中での半減期が短いという別の問題があるので、頻繁に過剰量の薬物を投与しなければならないという欠点がある。短い半減期のため、ＦａｃＶＩＩａは、血友病患者の治療に１日２〜３回以上投与しなければならず、このような頻繁な投与が血友病予防の深刻な障害となっている。血中半減期が短いという問題を解決するために、周知のマイクロカプセル化、リポソーム封入、及び様々な化学的修飾方法の研究が提示されてが、未だその成果は報告されていない。特に、化学的修飾方法として、ＦａｃＶＩＩａの表面に位置するリジン残基又はＮ末端を化学的に修飾する方法や、ポリエチレングリコール、アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン断片などの血中半減期を延長させるキャリアを結合する方法や、ＦａｃＶＩＩａの活性に直接影響を及ぼさない領域にシステイン残基を挿入して他のキャリアとの結合を促進する方法が研究されている。しかし、ＦａｃＶＩＩａの表面に位置するリジン残基又はＮ末端を修飾するとＦａｃＶＩＩａが血小板膜に結合する能力が低下し、他のキャリアを結合するとキャリアが酵素の活性に干渉し、システイン残基を挿入すると非特異的なジスルフィド結合が形成されるので、結果的に酵素の活性が低下するという結果を招く。このように、ＦａｃＶＩＩａの活性を低下させることなく、その血中半減期を延長させた誘導体を開発する努力が続けられているが、未だその成果は報告されていない。
【０００５】
ＦａｃＶＩＩａのＣ末端にアルブミンを融合したｒＶＩＩａ−ＦＰ(CSL Behring)は、前臨床段階にあり、ラットにおいては血中半減期が天然型ＦａｃＶＩＩａに比べて６．７倍増加したが、依然として４．３８ｈと非常に短く、血友病治療及び予防への使用には適さない。ペグ化リポソーム製剤を用いたＰＥＧＬｉｐ−ＦＶＩＩａ(Omri)も前臨床段階にあるが、血中半減期が天然型ＦａｃＶＩＩａに比べてわずか２倍増加したに過ぎない。
【０００６】
ＦａｃＶＩＩａのＧｌａドメイン変異及びハイパーグリコシル化により血中半減期を延長させたＭＡＸＹ−ＶＩＩ(Bayer/Maxygen)、４０ ｋ ＰＥＧグリコシル化を用いて血中半減期を延長させたＮＮ７１２８(Novo/Neose)の２つの製品が臨床で用いられているが、天然型ＦａｃＶＩＩａに比べて血中半減期が５倍増と依然として血友病治療及び予防への使用には適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１０−００６２８６０号
【特許文献２】韓国登録特許第０８８０５０９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Urlaub et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 12, 555-566, 1986
【発明の概要】
【０００９】
こうした背景の下、本発明者らはＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａの最大活性を保持しつつ、その血中半減期を延長させた誘導体を開発するために鋭意研究努力した。その結果、本発明者らはＦａｃＶＩＩのＣ末端にＳＯＤ１(Superoxide Dismutase 1)の一部配列が融合された形態の誘導体が、ＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩａの活性を低下させることなく、ポリエチレングリコール、アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン断片のような血中半減期を延長させるキャリアと容易に結合できることを確認し、特に免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体、及びＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩａ誘導体が共有結合により部位特異的に互いに連結し、活性減少を最小限に抑えることができ、結合体の血中半減期を画期的に増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の一つの目的は、血液凝固因子ＶＩＩ(ＦａｃｔｏｒＶＩＩ, ＦａｃＶＩＩ)又はその活性型である血液凝固因子ＶＩＩａ(Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ，ＦａｃＶＩＩａ)のアミノ酸配列を含み、そのＣ末端にペプチドリンカーが連結されたＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａ誘導体を提供することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、前記ＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａ誘導体をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１２】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。
【００１３】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記形質転換体を用いて前記ＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの誘導体を製造する方法を提供することである。
【００１５】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記誘導体のペプチドリンカーに血中半減期を延長させる重合体が結合されたＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの結合体を提供することである。
【００１６】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記結合体の一方の末端に血中半減期を延長させるキャリアが結合されたＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの複合体を提供することである。
【００１７】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記ＦａｃＶＩＩ複合体を活性化する工程を含むＦａｃＶＩＩａ複合体の製造方法を提供することである。
【００１８】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記方法で製造されたＦａｃＶＩＩａ複合体を提供することである。
【００１９】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血友病予防又は治療用の医薬組成物を提供することである。
【００２０】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血液凝固用の医薬組成物を提供することである。
【００２１】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記血友病予防又は治療用医薬組成物を治療学的に有効な量で対象体に投与することを含む、血友病を予防又は治療する方法を提供することである。
【００２２】
さらに、本発明のもう一つの目的は、前記血液凝固用の医薬組成物を治療学的に有効な量で対象体に投与することを含む、血液の凝固を促進する方法を提供することである。
【００２３】
本発明のＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａ誘導体は、ＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａの活性を最大化しつつ、血中半減期を向上させることのできるキャリアに結合されるので、より効果的な血友病予防又は治療剤の開発に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ａ】２９３Ｆ細胞株を用いて発現させたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣのウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【図１ｂ】２９３Ｆ細胞株を用いて発現させた対照群とＦａｃＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣのウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【図１ｃ】２９３Ｆ細胞株を用いて発現させたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとＦａｃＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９の分子量の違いを示すウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【図２】精製されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを示す電気泳動写真である。
【図３】製造されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとＰＥＧが結合した結合体を示す電気泳動写真である。
【図４ａ】製造されたＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を示す電気泳動写真である。
【図４ｂ】製造されたＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を示すウェスタブロット分析の写真である。
【図５】ＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの in vitro 活性を示す濃度の吸光度のグラフである。
【００２５】
上記目的を達成するための一実施態様において、本発明は血液凝固因子ＶＩＩ(ＦａｃｔｏｒＶＩＩ, ＦａｃＶＩＩ)のアミノ酸配列(配列番号４)を含み、そのＣ末端にペプチドリンカーが連結されたＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの誘導体を提供する。
【００２６】
本発明において使用される用語「血液凝固因子ＶＩＩ(ＦａｃｔｏｒＶＩＩ, ＦａｃＶＩＩ)」とは、プロコンバーチン(proconvertin)とも言われ、血液凝固反応に関与する因子の一つであり、４８ ｋＤａのサイズを有し、１２．８ｋｂのサイズの遺伝子によりコードされ、主に肝臓で生成され、ビタミンＫ依存性を示す血漿タンパク質の一種を意味する。前記ＦａｃＶＩＩは、セリンプロテアーゼ前駆体タンパク質、平滑筋細胞などの血管外組織、腫瘍組織、活性化白血球などの表面にある組織因子(血液凝固第ＩＩＩ因子)に結合し、血液凝固第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を活性化することにより、外因系血液凝固反応を開始させることが知られている。本発明において、前記ＦａｃＶＩＩは、天然型ＦａｃＶＩＩだけでなく、その活性を正常に示しつつ化学的に修飾されたＦａｃＶＩＩ誘導体や、その活性を正常に示しつつ天然型ＦａｃＶＩＩと８０％以上のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列で構成された修飾体であってもよいが、好ましくは、８５％、９０％、９５％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列で構成された修飾体であってもよく、より好ましくは、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列で構成された修飾体であってもよい。ただし、天然型ＦａｃＶＩＩの活性を示すものであれば配列相同性は限定されない。
【００２７】
本発明において使用される用語「血液凝固因子ＶＩＩａ(Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ，ＦａｃＶＩＩａ)」とは、前記血液凝固因子ＶＩＩ(ＦａｃｔｏｒＶＩＩ, ＦａｃＶＩＩ)の活性化された形態を意味するが、ＦａｃＶＩＩの１５２位のアルギニンと１５３位のイソロイシンの間が切断されて重鎖の活性部位が露出し、それにより１つのアミノ酸配列により構成されたＦａｃＶＩＩが２つのアミノ酸配列(軽鎖及び重鎖)で構成された二量体のＦａｃＶＩＩａの形態に活性化される。活性化されたＦａｃＶＩＩａは、他の血液凝固因子とは異なる補助的な血液凝固機序で作用するので、高用量で投与しても抗体が生成されないことが知られている。本発明において、前記ＦａｃＶＩＩａは、天然型ＦａｃＶＩＩａだけでなく、その活性を正常に示しつつ化学的に修飾されたＦａｃＶＩＩａ誘導体や、その活性を正常に示しつつ天然型ＦａｃＶＩＩａと８０％以上のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列で構成された修飾体であってもよいが、好ましくは、８５％、９０％、９５％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列で構成された修飾体であってもよく、より好ましくは、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列で構成された修飾体であってもよい。ただし、天然型ＦａｃＶＩＩの活性を示すものであれば配列相同性が限定されない。
【００２８】
本発明において使用される用語「リンカー」とは、基本的には２つの異なる融合パートナー(例えば、生物学的高分子など)を水素結合、静電気的相互作用、ファンデルワールス力、ジスルフィド結合、塩架橋、疎水性相互作用、共有結合などを用いて連結することのできる連結体を意味するが、生理学的条件又は他の標準的なペプチド条件(例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存条件)下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与し得る少なくとも１つのシステインを有することができる。このシステインは、ジスルフィド結合だけでなく、融合パートナーを連結する反応基として用いることができる。また、リンカーは、単にそれぞれの融合パートナーを連結する役割以外に、キャリア間に所定のサイズの間隔を与える役割を果たすこともでき、融合体に柔軟性又は剛直性を提供するヒンジの役割を果たすこともできる。本発明において、前記リンカーは、特にこれらに限定されるものではないが、ＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩａのＣ末端に結合して血中半減期を延長させるキャリアを連結できるペプチド性リンカーであり、好ましくは、Ｃ末端がシステインであるペプチドリンカーであってもよい。また、好ましくは、ＳＯＤ１の一部配列(配列番号３０)であってもよく、より好ましくは、前記ＳＯＤ１の１位〜１４９位の配列から選択される一部配列(配列番号３１)であってもよく、さらに好ましくは、前記ＳＯＤ１の１位〜９０位の配列(配列番号３２)、さらにより好ましくは、前記ＳＯＤ１の１位〜２５位の配列(配列番号３３)であってもよく 、最も好ましくは前記ＳＯＤ１の１位〜６位の配列(ＡＴＫＡＶＣ，配列番号５)であってもよい。
【００２９】
本発明において使用される用語「ＳＯＤ１」とは、生体内で活性酸素である超酸化物をイオンを酸素と過酸化水素に分解する不均等化反応を触媒する酵素を意味し、酸素に露出するほとんど全ての細胞において主な抗酸化防御機構を果たすことが知られている。本発明において、前記ＳＯＤ１は、ＦａｃＶＩＩと血中半減期を延長させるキャリアを連結するペプチド性リンカーとして用いられるが、前記リンカーとして生体内で多く見出されるタンパク質の一種であるＳＯＤ１を用いることにより、リンカーの免疫原性を低下させることができる。前記ペプチドリンカーとして用いられるＳＯＤ１配列内のＶＬＫＧ(バリン-ロイシン-リシン-グリシン)は、ＦａｃＶＩＩａ誘導体に認識されて切断される自己切断部位アミノ酸配列であるＩＰＲＩ(イソロイシン-プロリン-アルギニン-イソロイシン)に置換することができる。このような自己切断配列への置換によりＦａｃＶＩＩａ誘導体が活性化されると、活性に不要なリンカー部位が除去される。
【００３０】
本発明において使用される用語「自己切断部位」とは、ポリペプチドが自己配列内に有する特定配列を認識して当該部位を切断する場合に当該特定配列を含む部位を意味する。
【００３１】
本発明において使用される用語「ＦａｃＶＩＩ誘導体」とは、前記ＦａｃＶＩＩのＣ末端に前記ペプチドリンカーが結合されたアミノ酸配列で構成された、修飾されたＦａｃＶＩＩを意味する。本発明のＦａｃＶＩＩ誘導体は活性化される前の形態を意味し、特定方法により活性化されるとＦａｃＶＩＩａ誘導体となる。本発明において、ＦａｃＶＩＩ誘導体とＦａｃＶＩＩａ誘導体は、特定工程、例えば結合体の製造過程などを除いて、同じ意味で用いられる。本発明において、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体は、特にこれらに限定されるものではないが、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列であるＡＴＫＡＶＣ(配列番号５)が結合されたポリペプチド(配列番号９)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＧＧＧＧＳＣ(配列番号１０)が結合されたポリペプチド(配列番号１３)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号１４)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号３４)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号３５)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号２０)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号２７)、又はＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号２４)などである。
【００３２】
本発明において使用される用語「ＦａｃＶＩＩａ誘導体」とは、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体と同じアミノ酸配列を有するが、その１５２位のアミノ酸と１５３位のアミノ酸の間が切断されて活性化された形態を意味する。本発明において、前記ＦａｃＶＩＩａ誘導体は、特にこれらに限定されるものではないが、ＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列であるＡＴＫＡＶＣ(配列番号５)が結合されたポリペプチド(配列番号９)、ＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端にＧＧＧＧＳＣ(配列番号１０)が結合されたポリペプチド(配列番号１３)、ＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号１４)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号３４)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号３５)、ＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号２０)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号２７)、又はＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸配列が結合されたポリペプチド(配列番号２４)などである。
【００３３】
本発明者らは、ＦａｃＶＩＩの活性化に関する特性を考察し、ＦａｃＶＩＩａの活性を低下させることなく、その血中半減期を延長させた誘導体の開発を試みた。活性化されていないＦａｃＶＩＩは、軽鎖と重鎖が結びついた単鎖構造であり、軽鎖のＮ末端のみが露出しているが、ＦａｃＶＩＩａの形態になると、ＦａｃＶＩＩの１５２位のアルギニンと１５３位のイソロイシンの間が切断されて重鎖の活性部位が露出し、ここで露出する１５３位のイソロイシンが重鎖のＮ末端になる。前記軽鎖と重鎖のＮ末端は、ＦａｃＶＩＩａの活性に重要な役割を果たす部分であるので、Ｎ末端に結合体を形成すると、ＦａｃＶＩＩの活性が天然型ＦａｃＶＩＩに比べて減少する。
【００３４】
よって、本発明は、前記ＳＯＤ１のペプチド配列に含まれるアミノ酸のうち、構造的に外部に表れることなく内部に埋もれていることからジスルフィド結合に関与しないシステインを含むペプチド断片をリンカーとして連結したＦａｃＶＩＩ誘導体を提供する。また、リンカーとして連結したペプチド断片には、ＦａｃＶＩＩａ誘導体に認識されて切断される自己切断部位アミノ酸配列が挿入されているので、活性化に不要なリンカーを除去することができる。本発明は、ＳＯＤ１ペプチドの遊離システインを含む断片をＣ末端に有するＦａｃＶＩＩ誘導体を提供し、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体は、培養中に二量体形態が最も低いレベルで形成され、血中半減期を延長させるキャリアと容易に結合体を形成することができるので、天然型ＦａｃＶＩＩ及びＦａｃＶＩＩａにシステインを単に挿入しただけの誘導体の欠点を補完できることを見出した。
【００３５】
よって、本発明のＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端に、血中半減期を大幅に延長させ、血液凝固機能を保持し、服薬コンプライアンスを著しく向上さことのできる物質を結合させて結合体を製造することで、従来の製品より血液凝固効果、血友病予防又は治療効果が改善されたより優れた製品を製造することができる。
【００３６】
本発明の他の一実施態様は、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入されて前記ＦａｃＶＩＩ誘導体を発現する形質転換体、及び前記形質転換体を用いてＦａｃＶＩＩ誘導体を製造する方法を提供する。
【００３７】
本発明において提供される前記ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドは、特にこれらに限定されるものではないが、ＦａｃＶＩＩをコードする部分と前記ペプチドリンカーをコードする部分が連結された形態のポリヌクレオチドであり、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列であるＡＴＫＡＶＣ(配列番号５)が結合されたポリペプチド(配列番号９)をコードするポリヌクレオチド(配列番号８)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＧＧＧＧＳＣ(配列番号１０)が結合されたポリペプチド(配列番号１３)をコードするポリヌクレオチド(配列番号１２)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端にＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸が結合されたポリペプチド(配列番号１４)をコードするポリヌクレオチド(配列番号１５)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸が結合されたポリペプチド(配列番号２０)をコードするポリヌクレオチド(配列番号２１)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸が結合されたポリペプチド(配列番号２７)をコードするポリヌクレオチド(配列番号２８)、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸が結合されたポリペプチド(配列番号２４)をコードするポリヌクレオチド(配列番号２５)などが好ましい。
【００３８】
本発明において提供される前記ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、哺乳類細胞(例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など)、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又はバクテリア細胞(例えば、大腸菌など)を含む真核もしくは原核細胞において前記ポリヌクレオチドを複製及び／又は発現するベクターであるが、好ましくは、宿主細胞において前記ポリヌクレオチドが発現されるように適切なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターであり、より好ましくは、ァージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、レトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態である。最もこのましくは、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列であるＡＴＫＡＶＣ(配列番号５)をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＧＧＧＧＳＣ(配列番号１０)をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣ、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸(配列番号１４)をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチド(配列番号２１)を含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩ、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチド(配列番号２８)を含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−９０ ＩＰＲＩ、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端に変異型ＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチド(配列番号２５)を含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−２５ ＩＰＲＩなどである。
【００３９】
本発明において提供される前記発現ベクターが導入された形質転換体は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された、大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラティフィムリウムのようなバクテリア細胞；ピキアパストリス(Pichiapastoris)のような酵母細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、ボウメラノーマ細胞のような動物細胞；又は植物細胞である。好ましくは、２９３Ｆ細胞株又はＣＨＯ細胞株に導入された形質転換体であってもよく、最も好ましくは、発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣがＣＨＯ細胞株に導入されたＨＭＦ７０９であってもよい。
【００４０】
本発明において提供されるＦａｃＶＩＩ誘導体を製造する方法は、(ｉ)前記形質転換体を培養して培養液を得る工程と、(ｉｉ)前記培養物からＦａｃＶＩＩ誘導体を回収する工程とを含む。
【００４１】
前記方法は、回収したＦａｃＶＩＩ誘導体を活性化する工程をさらに含み、製造されたＦａｃＶＩＩ誘導体からＦａｃＶＩＩａ誘導体を製造することができる。活性化する方法は前述した通りである。
【００４２】
本発明者らは、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列であるＡＴＫＡＶＣ(配列番号５)をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを製造し(実施例２−１)、前記発現ベクターを２９３Ｆ細胞株(実施例３−１)又はＣＨＯ細胞株(実施例３−２)に導入することにより形質転換体を得た。次に、前記形質転換体からＦａｃＶＩＩ誘導体を発現させ、前記発現したＦａｃＶＩＩ誘導体を精製し(実施例４及び図２)、精製したＦａｃＶＩＩ誘導体を活性化することによりＦａｃＶＩＩａ誘導体を製造し、天然型ＦａｃＶＩＩａとその活性を比較した(実施例６及び図４)。その結果、本発明のＦａｃＶＩＩ誘導体から製造されたＦａｃＶＩＩａ誘導体は、天然型ＦａｃＶＩＩａと同レベルの活性を示すことが分かった。よって、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣがＣＨＯ細胞に導入された形質転換体のうち、ＦａｃＶＩＩ誘導体の発現量が最も多いクローンを選択し、それを「ＨＭＦ７０９」と命名し、大韓民国大田市儒城区科学路１１１韓国生命工学研究院所在の生物資源センター(Korean Collection for Type Culture)に「ＫＣＴＣ１２０２２ＢＰ」として寄託した。
【００４３】
本発明のさらに他の一実施態様は、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端に血中半減期を延長させる重合体が結合されたＦａｃＶＩＩ結合体又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの結合体を提供する。
【００４４】
本発明の重合体は、血中半減期を延長させるポリエチレングリコールのような高分子重合体であり、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、抗体及びアルブミンのようなタンパク質キャリアから選択される。
【００４５】
本発明は、ＦａｃＶＩＩ誘導体とタンパク質キャリアが、遺伝子組換え方法を用いることなく、 in vitro で非ペプチド性重合体をリンカーとして用いて製造された結合体を提供する。
【００４６】
本発明において使用される用語「非ペプチド性重合体」とは、血液又は血漿内に存在する様々な酵素や免疫分子によって分解されないように構成された非ペプチド性重合体を意味するが、前記非ペプチド性重合体は、特にこれらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子(ＰＬＡ(ポリ乳酸)及びＰＬＧＡ(ポリ乳酸−グリコール酸)、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、それらの組み合わせなどであり、これらの非ペプチド性重合体は、ペプチド結合でない任意の共有結合により互いに連結されうる。さらに、当該分野で周知のこれらの誘導体や、当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体なども本発明の範囲に含まれる。本発明において、前記非ペプチド性重合体は、ＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体に存在する前記ペプチドリンカーにより結合される。好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、ＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体に存在するペプチドリンカーのＣ末端に結合されてもよい。
【００４７】
前記非ペプチド性重合体は、反応基を含んでもよく、前記反応基は、特にこれらに限定されるものではないが、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィド、チオール、スクシンイミド誘導体(スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカーボネートなど)などである。また、前記非ペプチド性重合体は、１つ又は複数の反応基を含んでもよく、二個以上の場合は、一方の反応基は前記ＦａｃＶＩＩ誘導体のリンカーと連結され、他方の反応基は抗体、免疫グロブリン断片、アルブミン、トランスフェリンなどの他のキャリアに結合される。例えば、前記非ペプチド性重合体が一方の末端に反応アルデヒド基、他方の末端にマレイミド、オルトピリジルジスルフィド、チオールなどの反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端でＦａｃＶＩＩ誘導体又はＦａｃＶＩＩａ誘導体及びキャリアとそれぞれ選択的に結合するのに効果的であり、アルデヒド結合による還元性アルキル化により生成された最終産物は、アミド結合により連結したものよりはるかに安定している。また、アルデヒド反応基は、低いｐＨでは前記キャリアのアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基と共有結合を形成することができる。
【００４８】
本発明のさらに他の一実施態様は、ＦａｃＶＩＩ誘導体又はその活性型ＦａｃＶＩＩａ誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体により結合されたＦａｃＶＩＩ複合体又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの複合体を提供する。
【００４９】
非ペプチド性重合体により、抗体、免疫グロブリン断片、アルブミン、トランスフェリンなどのキャリア、特に免疫グロブリンＦｃに結合されたＦａｃＶＩＩ複合体は、(１)一方の末端にアルデヒド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体を用いて免疫グロブリンＦｃのアミン基に共有結合で連結する工程と、(２)前記(１)の反応混合物からアミン基に非ペプチド性重合体が共有結合された免疫グロブリンＦｃ領域を含む結合体を回収する工程と、(３)回収した結合体のマレイミド、オルトピリジルジスルフィド、チオール反応基を有する非ペプチド性重合体の他方の末端にＦａｃＶＩＩ誘導体を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃＶＩＩ誘導体に結合されたＦａｃＶＩＩ複合体を生成する工程と、(４)前記(３)で生成したＦａｃＶＩＩ結合体を活性化することにより、ＦａｃＶＩＩａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体で連結されたＦａｃＶＩＩａ複合体を生成する工程とにより製造することができる。
【００５０】
また、(１)一方の末端にマレイミド、オルトピリジルジスルフィド、チオール反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端チオール基に共有結合で連結する工程と、(２)前記(１)の反応混合物から非ペプチド性重合体が共有結合されたＦａｃＶＩＩ誘導体を含む結合体を回収する工程と、(３)回収した結合体のアルデヒド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃＶＩＩ誘導体に結合されたＦａｃＶＩＩ複合体を製造する工程と、(４)前記(３)で製造したＦａｃＶＩＩ結合体を活性化することにより、ＦａｃＶＩＩａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体で連結されたＦａｃＶＩＩａ複合体を生成する工程とにより製造することができる。
【００５１】
また、(１)一方の末端にマレイミド、オルトピリジルジスルフィド、チオール反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端チオール基に共有結合で連結する工程と、(２)前記(１)の反応混合物から非ペプチド性重合体が共有結合されたＦａｃＶＩＩａ誘導体を含む結合体を回収する工程と、(３)回収した結合体のアルデヒド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合で連結することにより、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃＶＩＩａ誘導体に結合されたＦａｃＶＩＩａ複合体を製造する工程とにより製造することができる。
【００５２】
一方、前記非ペプチド性重合体は、両末端又は三末端の反応基を含んでもよく、前記両末端又は三末端の反応基は、同じものでもよく、異なるものでもよい。例えば、一方の末端にはマレイミド基を有し、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有する。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリ(エチレングリコール)を非ペプチド性重合体として用いる場合は、公知の化学反応により前記ヒドロキシル基を前記様々な反応基として活性化することもでき、商業的に入手可能な修飾された反応基を有するポリ(エチレングリコール)を用いて本発明のＦａｃＶＩＩ結合体及び複合体を製造することもできる。
【００５３】
よって、本発明のＦａｃＶＩＩ結合体又は複合体に含まれる非ペプチド性重合体は、好ましくは、一方の末端にメチル基を有し、他方の末端にマレイミド、オルトピリジルジスルフィド又はチオール反応基を有する非ペプチド性重合体であってもよく、より好ましくは、一方の末端にマレイミド、オルトピリジルジスルフィド又はチオール反応基を有し、他方の末端にアルデヒド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体であってもよく、最も好ましくは、両末端にそれぞれマレイミドとアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体であってもよい。
【００５４】
本発明のＦａｃＶＩＩ誘導体を用いた結合体又は複合体の製造に用いられるＦａｃＶＩＩ誘導体は不活性化された形態であり、活性化されたＦａｃＶＩＩａ誘導体でもよいが、ＦａｃＶＩＩａ誘導体を結合体製造に用いると、結合体製造過程中に活性化されたＦａｃＶＩＩａによる分解が生じるので、これを防止するためにＦａｃＶＩＩを用いることが好ましい。
【００５５】
前記キャリアのうち有用な免疫グロブリンＦｃは、ヒト免疫グロブリンＦｃ、それに密接に関連する類似体の配列を有するもの、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよい。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭに由来するもの、又はそれらの組み合わせもしくはハイブリッドによるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭに由来するものであってもよく、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧに由来するものであっていもよい。免疫グロブリンＦｃは、天然ＩｇＧを特定のタンパク質分解酵素で処理することにより製造することができ、組換え技術を用いて形質転換された細胞からも製造することができる。大腸菌から製造した組換えヒト免疫グロブリンＦｃであることが好ましい。一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、これらの組み合わせ又はハイブリッド化も可能である。好ましくは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであってもよく、最も好ましくは、補体依存性細胞傷害(CDC, Complementdependent cytotoxicity)のようなエフェクター機能のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよい。
【００５６】
すなわち、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化Ｆｃ領域である。ヒト生体で抗原として作用し、それに対する新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こしうる非ヒト由来のＦｃ領域に比べて、ヒト由来のＦｃ領域が好ましい。
【００５７】
従来のインフレーム融合(inframe fusion)方法でキャリアに結合させる際に用いられていたペプチド性重合体の欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断されるので、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果を期待したほど得られないということである。しかし、発明においては、タンパク質分解酵素に抵抗性のある非ペプチド性重合体を用いて、免疫グロブリンＦｃ領域などのキャリアと複合体を形成する場合、免疫グロブリンＦｃ領域などのキャリアと類似したＦａｃＶＩＩａ血中半減期を維持することができる。よって、本発明において用いられる非ペプチド性重合体は、このような役割を果たすもの、すなわち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある非ペプチド性重合体であれば限定されることなく用いられる。非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ ｋＤａの範囲であり、好ましくは１〜４０ ｋＤａの範囲である。また、本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の非ペプチド性重合体だけでなく、異なる種類の非ペプチド性重合体の組み合わせが用いられてもよい。
【００５８】
また、本発明の一実施例においては、前記ＦａｃＶＩＩ結合体の in vitro 活性を測定した。本発明は、部位特異的にＦａｃＶＩＩと非ペプチド性重合体を連結することにより、活性減少を最小限に抑えることを目的とし、天然型ＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−４０ ｋＤａ ＰＥＧを対照群としてＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ及びＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの活性が確認された(実施例７)。その結果、Ｎ末端ペグ化ＦａｃＶＩＩ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの in vitro 活性はＦａｃＶＩＩに比べて約１１％の活性を有し、Ｃ末端ペグ化ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの in vitro 活性はＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣに比べて約２９％の活性を有することが確認された。これは、Ｎ末端がペグ化されたＦａｃＶＩＩ−４０ ｋＤａ ＰＥＧのＥＣ50と比べて、Ｃ末端がペグ化されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧは、約２．５倍高い相対活性を保持し、ＡＴＫＡＶＣを用いた部位特異的結合(site specific conjugation)方法がＦａｃＶＩＩの活性をやや高く保持することが分かる(表２)。
【００５９】
本発明の一実施例においては、前記ＦａｃＶＩＩ結合体とそれに非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を結合した複合体の in vitro 活性を測定した(実施例８)。その結果、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃの in vitro 活性は、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣに比べて約４５％の活性を保持していた(表３)。これは、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を結合した複合体がＦａｃＶＩＩ活性を保持しつつ、血中半減期を向上させることのできるキャリアに結合されるので、より効果的な血友病予防又は治療剤の開発に広く活用できることを示すものである。
【００６０】
本発明のさらに他の一実施態様は、前記ＦａｃＶＩＩ結合体を活性化する工程を含むＦａｃＶＩＩａ結合体の製造方法、及び前記方法により製造されたＦａｃＶＩＩａ結合体を提供する。具体的には、前記ＦａｃＶＩＩａ結合体の製造方法は、(ｉ)前記ＦａｃＶＩＩ誘導体に血中半減期を延長させる非ペプチド性重合体を加え、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ末端チオール基に前記非ペプチド性重合体の反応基を共有結合させる工程と、(ｉｉ)前記ＦａｃＶＩＩ誘導体に非ペプチド性重合体が共有結合されたＦａｃＶＩＩ結合体を回収する工程と、(ｉｉｉ)前記回収したＦａｃＶＩＩ結合体を活性化することにより、ＦａｃＶＩＩａ領域が非ペプチド性重合体と連結されたＦａｃＶＩＩａ結合体を生成する工程とにより製造することができる。
【００６１】
また、(ｉ)前記ＦａｃＶＩＩａ誘導体に血中半減期を延長させる非ペプチド性重合体を加え、前記ＦａｃＶＩＩａ誘導体のＣ末端チオール基に前記非ペプチド性重合体の反応基を共有結合させる工程と、(ｉｉ)前記ＦａｃＶＩＩａ誘導体に非ペプチド性重合体が共有結合されたＦａｃＶＩＩａ結合体を回収する工程により、ＦａｃＶＩＩａ領域が非ペプチド性重合体と連結されたＦａｃＶＩＩａ結合体を生成する工程とを含む。
【００６２】
前記方法で用いられた血中半減期を延長させる非ペプチド性重合体は前述した通りであり、前記ＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩ結合体を活性化する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩ結合体を陰イオン交換カラムに吸着させて活性化するオンカラム活性化方法(autoactivation)、又は溶液状態で反応させて活性化するインソリューション(in solution)活性化方法を用いることができる。特に、前記オンカラム活性化方法は、固相(solid-Phase)活性化方法ともいうが、別途の構成要素を付加することなく、陰イオン交換カラムにＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩ結合体を結合させ、「自己活性化(autoactivation)」することにより行われる。これに対して、前記インソリューション(in solution)活性化方法は、ＦａｃＶＩＩの活性化に必要な様々な要素、例えばカルシウムイオンの濃度、ｐＨ、温度、ＦａｃＶＩＩの濃度などを全て考慮してＦａｃＶＩＩの活性化を誘導する方法である。
【００６３】
本発明者らは、天然型ＦａｃＶＩＩに非ペプチド性リンカーを用いて前記免疫グロブリン断片を連結した結合体の血中半減期が、免疫グロブリン断片を連結していない天然型ＦａｃＶＩＩに比べて、約２００倍以上増加することを確認した(特許文献１)。このように半減期が増加する理由は、ＦａｃＶＩＩによるものではなく、非ペプチド性リンカーとそれに連結された免疫グロブリン断片によるものであることは周知の事実である。したがって、前記のように製造されたＦａｃＶＩＩ誘導体を用いた結合体も、血中半減期が増加するものと予想される。
【００６４】
本発明のさらに他の一実施態様は、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体、又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの、ＦａｃＶＩＩ結合体、又はその活性型ＦａｃＶＩＩａ、ＦａｃＶＩＩ複合体又はその活性型ＦａｃＶＩＩａを有効成分として含む、血友病予防もしくは治療用医薬組成物、又は血液凝固用の医薬組成物を提供する。
【００６５】
また、前記医薬組成物を治療学的に有効な量で被験体に投与することを含む、血友病の予防もしくは治療方法、又は血液の凝固を促進する方法を提供する。
【００６６】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による前記医薬組成物の投与により血友病の発病を抑制又は遅延全ての行為を意味する。本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による前記組成物の投与により血友病の症状を好転又は有利に変更される全ての行為をいう。
【００６７】
本発明において、血液の凝固を促進する方法は、半減期が短い血液凝固因子ＦａｃＶＩＩ又はその活性型ＦａｃＶＩＩａの誘導体、結合体又は複合体を製造して血中半減期を画期的に増加させる方法により、血液凝固因子としての作用を促進するものであってもよい。
【００６８】
本発明の血友病予防もしくは治療用医薬組成物、又は血液凝固用医薬組成物は、医薬組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な担体は、経口投与の場合は、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与の場合は、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。本発明の医薬組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容可能な担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【００６９】
一方、製剤化に適する担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などを用いることができる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
【００７０】
本発明のさらに他の一実施態様は、前記誘導体、結合体又は複合体を有効成分として含む血友病予防又は治療用医薬組成物を薬学的に有効な量で血友病が発病した被験体に投与する工程を含む、血友病を治療する方法を提供する。ここで、前記医薬組成物は、単独又は他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次又は同時に投与することができる。
【実施例】
【００７１】
実施例１：ＦａｃＶＩＩ遺伝子を含む発現ベクターの製造
まず、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)法を用いてシグナル配列を含むヒトのＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ遺伝子を取得した。Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ(ＦａｃＶＩＩ)遺伝子増幅のために、ヒト胎児の肝臓(fetal liver)ｃＤＮＡライブラリー(TAKARA BIO USA)を鋳型とし、配列番号１及び２の正方向及び逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行った(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で３０秒間，６０℃で３０秒間，６８℃で９０秒間)；６８℃で５分間)。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号１のプライマーには制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を挿入し、配列番号２のプライマーには制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を挿入した。次に、前記ＰＣＲにより得られた約１．３ｋｂのＰＣＲ産物の塩基配列(配列番号３及び４)を確認した。
【００７２】
ＶＩＩＢＨＩＳＳ Ｆ：５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｔｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃ−３’(配列番号１)
ＶＩＩＸｈｏＩＡＳ Ｒ：５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｃｔａｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇ−３’(配列番号２)
【００７３】
前記得られたＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーターの調節下で発現させるために、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターにクローニングした。前記ｐＸ０ＧＣベクターは、少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣ反復配列が除去されたＤＨＦＲプロモーターの塩基配列、及びそれに作動可能に連結されたＤＨＦＲをコードする塩基配列を含む発現ベクター(特許文献２)である。具体的には、前記ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キット(Qiagen，USA)を用いて切断されたＤＮＡ断片を得て、これを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理されたｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、ＦａｃＶＩＩ遺伝子を含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ)を製造した。
【００７４】
実施例２：様々な組換えＦａｃＶＩＩ誘導体の発現のための発現ベクターの製造
実施例１で製造したＦａｃＶＩＩ遺伝子を含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ)を用い、ＦａｃＶＩＩのＣ末端にＳＯＤ１(Superoxide Dismutase 1，配列番号３０)の一部配列が結合された形態のＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを得て、前記誘導体を発現させることのできる発現ベクターを製造した。
【００７５】
実施例２−１：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの製造
実施例１で製造された発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩに含まれるＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列(ＡＴＫＡＶＣ，配列番号５)をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチドを含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを製造した。具体的には、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩを鋳型とし、下記の配列番号６及び７の正方向及び逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行った(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で６０秒間，６０℃で６０秒間，６８℃で９０秒間)；６８℃で５分間)。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号６のプライマーには制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を挿入し、配列番号７のプライマーには制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を挿入した。次に、前記ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂのＰＣＲ産物の塩基配列(配列番号８)を確認した。
【００７６】
ＦＶＩＩＥｃｏＲＩＳＳ Ｆ(配列番号６)：５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃａｔｇｇｃｃａａｃｇｃｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｇｇｇｃ−３’
ＦＶＩＩ＃１ＸｈｏＩＡＳ Ｒ(配列番号７)：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｃａｃａｃｇｇｃｃｔｔｃｇｔｃｇｃｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｃ−３’
【００７７】
前記得られたＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーターの調節下で発現させるために、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターにクローニングした。具体的には、前記ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キットを用いて切断されたＤＮＡ断片を得て、これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理されたｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜６位の配列であるＡＴＫＡＶＣ(配列番号５)をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ)を製造した。
【００７８】
実施例２−２：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣの製造
実施例１で製造された発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩに含まれるＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端に６個のアミノ酸(ＧＧＧＧＳＣ，配列番号１０)をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチドを含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣを製造した。そのために、配列番号６及び１１の正方向及び逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行うことを除いて、実施例２−１と同様の方法を行うことにより、約１．４ｋｂのＰＣＲ産物の塩基配列(配列番号１２)を確認した。次に、前記ＰＣＲ産物を用いることを除いて、実施例２−１と同様の方法を行うことにより、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＧＧＧＧＳＣ(配列番号１０)をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣ)を製造した。
【００７９】
ＦＶＩＩ＃２ＸｈｏＩＡＳ Ｒ(配列番号１１)：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｃ−３’
【００８０】
実施例２−３：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９の製造
実施例１で製造された発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩに含まれるＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチド(配列番号１５)を含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９を製造した。
【００８１】
まず、前記ＦａｃＶＩＩＤＮＡ配列(配列番号３)を鋳型とし、ＦａｃＶＩＩ正方向プライマー(配列番号１６)とＦａｃＶＩＩ逆方向プライマー(配列番号１７)を用いてＰＣＲを行った(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で６０秒間，６０℃で６０秒間，６８℃で９０秒間)；６８℃で５分間)。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号１６のプライマーには制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を挿入し、配列番号１７のプライマーにはＳＯＤ１の５’末端部位を一部含ませた。その結果、最初のＰＣＲ断片が得られた。
【００８２】
ＦＶＩＩＥｃｏＲＩＳＳ Ｆ：５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃａｔｇｇｔｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃ−３’(配列番号１６)
ＦＶＩＩＳＯＤＩｎｆＡＳ Ｒ：５’−ｃｇｇｃｃｔｔｃｇｔｃｇｃｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇａｇ−３’(配列番号１７)
【００８３】
次に、ＳＯＤ１ ｃＤＮＡ(RC200725, OriGene, USA)を鋳型とし、ＳＯＤ１正方向プライマー(配列番号１８)とＳＯＤ１逆方向プライマー(配列番号１９)を用いてＰＣＲを行った(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で６０秒間，６０℃で６０秒間，６８℃で４０秒間)；６８℃で５分間)。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号１８のプライマーにはＦａｃＶＩＩの３’末端部位を一部含ませ、配列番号１９のプライマーにはＸｈｏＩ制限酵素切断部位を挿入した。その結果、２番目のＰＣＲ断片が得られた。
【００８４】
ＦＶＩＩＳＯＤＩｎｆＳＳ Ｆ：５’−ｇａｇｃｃｃｃａｔｔｔｃｃｃｇｃｇａｃｇａａｇｇｃｃｇｔｇｔｇｃｇｔ−３’(配列番号１８)
ＳＯＤＸｈｏＩＡＳ Ｒ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａａａｔｔａｃａｃｃａｃａａｇｃｃａａａｃｇａ−３’(配列番号１９)
【００８５】
前記得られた最初のＰＣＲ断片と２番目のＰＣＲ断片を鋳型とし、前記ＦａｃＶＩＩ正方向プライマー(配列番号１６)とＳＯＤ１逆方向プライマー(配列番号１９)を用いた２次ＰＣＲを行うことにより、３番目のＰＣＲ断片を得た(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で６０秒間，６０℃で６０秒間，６８℃で１２０秒間)；６８℃で５分間)。
【００８６】
前述したように得られた３番目のＰＣＲ断片をＣＭＶプロモーターの調節下で発現させるために、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターにクローニングした。具体的には、前記３番目のＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キットを用いて切断されたＤＮＡ断片を得て、これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理されたｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが結合された、ＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９)を製造した。
【００８７】
実施例２−４：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩの製造
実施例２−３で製造された発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９に含まれるＳＯＤ１遺伝子領域内にＦａｃＶＩＩの自己切断部位を挿入することを試みた。これを達成するために、前記ＦａｃＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９(配列番号１４)の４５１位〜４５４位のアミノ酸であるＳＯＤ１の７位〜１０位のアミノ酸ＶＬＫＧがＩＰＲＩで置換されるように、変異型ＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸がＦａｃＶＩＩのＣ末端に結合された形態のアミノ酸配列(配列番号２０)をコードするポリヌクレオチド(配列番号２１)を含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩを製造した。
【００８８】
具体的には、実施例２−３で得られた３番目のＰＣＲ断片を鋳型とし、正方向及び逆方向プライマー(配列番号２２及び２３)を用いたＰＣＲを行うことにより、４番目のＰＣＲ産物を得た(９５℃で３０秒間の変性，１８サイクル。前記４番目のＰＣＲ産物は約９ｋｂのサイズを有するものであり、その塩基配列(配列番号２１)を確認した。
【００８９】
ＶＩＩＳＯＤ１ｍｕｔＳＳ Ｆ：(配列番号２２)５’−ｃｃｃｇｃｇａｃｇａａｇｇｃｃｇｔｇｔｇｃａｔｔｃｃｇａｇｇａｔｃｇａｃｇｇｃｃｃａｇｔｇｃａｇｇｇｃａｔｃ−３’
ＦＶＩＩＳＯＤ１ｍｕｔＡＳ Ｒ：(配列番号２３)５’−ｇａｔｇｃｃｃｔｇｃａｃｔｇｇｇｃｃｇｔｃｇａｔｃｃｔｃｇｇａａｔｇｃａｃａｃｇｇｃｃｔｔｃｇｔｃｇｃｇｇｇ−３’
【００９０】
次に、前記４番目のＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩにより３７℃で１時間反応させて変異していない配列を切断し、大腸菌に形質転換させてクローニングすることにより、ＦａｃＶＩＩのＣ末端に前記変異型ＳＯＤ１の１位〜１４９位のアミノ酸配列が結合されたＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩ)を製造した。
【００９１】
実施例２−５：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−２５ ＩＰＲＩの製造
前記ＳＯＤ１の７位〜１０位のアミノ酸であるＶＬＫＧがＩＰＲＩで置換されるように、変異型ＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸がＦａｃＶＩＩのＣ末端に結合された形態のアミノ酸配列(配列番号２４)をコードするポリヌクレオチド(配列番号２５)を含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−２５ ＩＰＲＩを製造した。
【００９２】
具体的には、実施例２−４で製造した発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩを鋳型とし、正方向及び逆方向プライマー(配列番号１６及び２６)を用いてＰＣＲを行うことにより(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で６０秒間，６０℃で６０秒間，６８℃で９０秒間)；６８℃で５分間)、５番目のＰＣＲ産物を得た。
【００９３】
ＳＯＤ１−２５ＸｈｏＩＡＳ Ｒ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａａｃｔｔｔｃｃｔｔｃｔｇｃｔｃｇａａａｔｔｇ−３’(配列番号２６)
【００９４】
次に、前記５番目のＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キットを用いて切断されたＤＮＡ断片を得て、これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理されたｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、ＦａｃＶＩＩのＣ末端に前記変異型ＳＯＤ１の１位〜２５位のアミノ酸配列が結合されたＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−２５ ＩＰＲＩ)を製造した。
【００９５】
実施例２−６：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−９０ ＩＰＲＩの製造
前記ＳＯＤ１の７位〜１０位のアミノ酸であるＶＬＫＧがＩＰＲＩに置換されるように、変異型ＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸がＦａｃＶＩＩのＣ末端に結合された形態のアミノ酸配列(配列番号２７)をコードするポリヌクレオチド(配列番号２８)を含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−９０ ＩＰＲＩを製造した。
【００９６】
具体的には、実施例２−４で製造した発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ ＩＰＲＩを鋳型とし、正方向及び逆方向プライマー(配列番号１６及び２９)を用いてＰＣＲ(９５℃で１分間の変性，３０サイクル(９５℃で６０秒間，６０℃で６０秒間，６８℃で１００秒間)，６８℃で５分間)を行うことにより、５番目のＰＣＲ産物を得た。
【００９７】
ＳＯＤ１−９０ＸｈｏＩＡＳ Ｒ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｃａｇｃａｇｔｃａｃａｔｔｇｃｃｃａａｇ−３’(配列番号２９)
【００９８】
次に、前記５番目のＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キットを用いて切断されたＤＮＡ断片を得て、これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理されたｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、ＦａｃＶＩＩのＣ末端に前記変異型ＳＯＤ１の１位〜９０位のアミノ酸配列が結合されたＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−９０ ＩＰＲＩ)を製造した。
【００９９】
実施例３：ＦａｃＶＩＩ誘導体の発現
実施例２で製造した各発現ベクターを用いて様々なＦａｃＶＩＩ誘導体を発現させた。
【０１００】
実施例３−１：２９３Ｆ細胞株を用いたＦａｃＶＩＩ誘導体の発現
ＦａｃＶＩＩのＣ末端に何も結合していない発現ベクター(対照群)と、ＦａｃＶＩＩのＣ末端にＳＯＤ１ １−１４９配列、変異型ＳＯＤ１ １−２５配列、変異型ＳＯＤ１ １−９０配列、ＳＯＤ１ １−６配列、又はＧＧＧＧＳＣ配列を融合したポリヌクレオチドを含む発現ベクター(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−２５ ＩＰＲＩ、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−９０ ＩＰＲＩ、ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ、又はｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣ)をｆｒｅｅｓｔｙｌｅTM２９３Ｆ細胞株(Invitrogen社, cat. no. R79007)に導入して各形質転換体を製造し、前記各形質転換体からそれぞれの様々なＦａｃＶＩＩ誘導体を発現させた。
【０１０１】
これを達成するために、前記２９３Ｆ細胞株を３７℃、８％ＣＯ2の条件下で１２０ｒｐｍ以上の速度で攪拌し、２日に１回継代培養した。前記培養した細胞の濃度が１０×１０5細胞／ｍｌ、生存率が８５％以上になったら、実施例２で製造した各発現ベクターを導入することにより形質転換体を得た。具体的には、前記細胞の濃度が１０×１０5細胞／ｍｌのｆｒｅｅｓｔｙｌｅTM２９３発現培地(Invitrogen社, cat. no. 12338-018)５００ｍｌ当たりｆｒｅｅｓｔｙｌｅTM ｍａｘ ｒｅａｇｅｎｔ５００μｌ、各発現ベクター５００μｇ、及びｏｐｔｉｐｒｏTMＳＦＭ(Invitrogen社, cat. no. 12309-050)１０ｍｌを加えて混合し、常温で１０分間静置し、２９３Ｆ細胞株に各発現ベクターを導入した。その後、ＦａｃＶＩＩの活性化に必須であるビタミンＫを５０μｇ加え、３７℃、８％ＣＯ2の条件下で１２０ｒｐｍ以上の速度で３日間攪拌しながら培養した。培養終了後に、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培養上清を得て、前記培養上清に含まれる各ＦａｃＶＩＩ誘導体を回収して精製した。次に、抗ＦａｃＶＩＩ抗体を用いたウェスタンブロット分析を行うことにより、発現された各ＦａｃＶＩＩ誘導体を確認した(図１ａ〜図１ｃ)。
【０１０２】
図１ａは２９３Ｆ細胞株を用いて発現させたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣのウェスタンブロット分析結果を示す写真であり、Ｍはサイズマーカー(Prestained protein ladder, fermentas)、レーン１は還元条件でのＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣのウェスタンブロット分析結果、レーン２は非還元条件でのＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣのウェスタンブロット分析結果を示す。図１ａに示すように、非還元条件では約２０〜３０％の二量体の形態が確認され、還元条件では二量体が確認されなかった。
【０１０３】
また、図１ｂは２９３Ｆ細胞株を用いて発現させた対照群とＦａｃＶＩＩ−ＧＧＧＧＳＣのウェスタンブロット分析結果を示す写真であり、図１ｃは２９３Ｆ細胞株を用いて発現させたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとＦａｃＶＩＩ−ＳＯＤ１ １−１４９の分子量の違いを示すウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【０１０４】
図１ｂ及び図１ｃに示すように、２９３Ｆ細胞株を用いて様々なＦａｃＶＩＩ誘導体が正常に生産されることが確認された。
【０１０５】
実施例３−２：ＣＨＯ細胞株を用いたＦａｃＶＩＩ誘導体(ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ)の発現
実施例２−１で製造した発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣをＤＨＦＲ遺伝子の破壊により核酸生合成過程が不完全なＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株(ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−)(非特許文献１)に導入して形質転換体を得て、前記形質転換体からＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ誘導体を発現させた。
【０１０６】
具体的には、前記ＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株を培養容器の底の約８０〜９０％を覆う程度に培養し、次いで前記細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Gibco社, cat. No. 51985034)で３回洗浄した。
【０１０７】
一方、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと５μｇの発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの混合物と、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと２０μｇのリポフェクタミン(Gibco社, cat. no. 18324-012)の混合物とをそれぞれ常温で３０分間静置した。次に、前記各混合物を混合して前記培養したＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株に加え、次いで３７℃、５％ＣＯ2の条件で約１８時間培養することにより、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣをＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株に導入した。次に、前記培養した細胞を１０％ＦＢＳが含まれるＤＭＥＭ−Ｆ１２(Gibco社, cat. no. 11330)培地で３回洗浄し、次いで前記培地を加えて４８時間再培養した。培養した細胞にトリプシンを加えて培養した細胞をそれぞれ分離し、それらを、選択培地(ＨＴサプリメント(Hypoxanthine-Thymidine)を含まず、１０％ＦＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８(Cellgro社, cat. no. 61-234-RG)を含むＭＥＭ−α培地(WELGENE社, cat. no. LM008-02)に接種した。形質転換された細胞のみ生存してコロニーを形成するまで、前記選択培地を２日又は３日毎に交換して培養することにより、前記分離した細胞から形質転換された細胞を選択した。ここで、前述したように選択した形質転換された細胞におけるＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ誘導体の発現レベルを向上させるために、１０ｎＭ ＭＴＸ(Sigma社, cat. no. M8407)を選択培地に加え、濃度を徐々に上げて２〜３週間後には３０ｎＭまでＭＴＸの含有量を増加させた。
【０１０８】
また、前記形質転換された細胞の異種性を減少させるために、限界希釈法(limiting dilution method)を行うことにより単一クローンを得た。具体的には、９６ウェルプレートに１ウェル当たりの細胞数の割合が０．７となるように希釈した前記形質転換された細胞をそれぞれ分注し、２〜３週間培養して単一クローンが観察されるか否かを確認した。単一クローンがクラスターを形成するウェルが観察されると、前記単一クローンを２４ウェルプレートに移し、各クローンの細胞増殖率とＦａｃＶＩＩ誘導体の発現量をＥＬＩＳＡ方法で分析し、ＦａｃＶＩＩ誘導体の発現量が最も高レベルのクローンを選択した。これを「ＨＭＦ７０９」と命名し、大韓民国大田市儒城区科学路１１１韓国生命工学研究院所在の生物資源センターに２０１１年９月２３日付けで寄託番号「ＫＣＴＣ１２０２２ＢＰ」として寄託した。
【０１０９】
実施例４：ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの精製
実施例３−２で製造した形質転換体を培養してＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを発現させ、培養物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより培養上清を得た。
【０１１０】
前記培養上清を０．２μｍの精密濾過膜で濾過し、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを加え、次いでＢｕｔｙｌ ＨＰカラムにかけ、０．６〜０Ｍ硫酸アンモニウムを含む濃度勾配緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５)で溶出することによりＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを含む活性分画を得た。
【０１１１】
前記得られた活性分画の緩衝液条件を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)に交換し、Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラムにかけ、次いで０〜１．０Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配緩衝液(１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０)で溶出することによりＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを含む活性分画を得た。
【０１１２】
前記活性分画を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにかけ、次いで１５０ｍＭ ＮａＣｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)緩衝液で溶出することによりＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを含む活性分画を得た。前述したように得られた活性分画の緩衝液条件を２ｍＭベンズアミジン２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)緩衝液に交換し、Ｑ ＦＦカラムにかけ、次いで洗浄(２ｍＭベンズアミジン ０．２Ｍ ＮａＣｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液)、再平衡化(２ｍＭベンズアミジン ０．１Ｍ ＮａＣｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液)、及び濃度勾配溶出(２ｍＭベンズアミジン ２５ｍＭ ＮａＣｌ ３５ｍＭ ＣａＣｌ2，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液)を行うことによりＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを精製した。
【０１１３】
前述したように精製したＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの純度は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより確認した(図２)。図２は精製されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを示す電気泳動写真であり、Ｍはサイズマーカー、レーン１は還元条件でのＦａｃＶＩＩI、レーン２は還元条件でのＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ、レーン３は非還元条件でのＦａｃＶＩＩ、レーン４は非還元条件でのＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣである。
【０１１４】
実施例５：ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとＰＥＧが結合した結合体の製造
実施例４で精製したＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを様々な分子量のＰＥＧに結合させて結合体を製造した。
【０１１５】
実施例５−１：ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧ結合体の製造
４０ ｋＤａ ｍＰＥＧ−マレイミド(NOF, 日本)をＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣのＣ末端に結合させる(PEGylation)ために、１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ５．５)の条件下でＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ(１ｍｇ／ｍｌ)と４０ ｋＤａ ｍＰＥＧ−マレイミドを１：２０のモル比で混合し、還元剤である２ｍＭトリアリルホスフィンを加えて２５℃で２時間反応させた。その結果、モノペグ化されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ(ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋ ＰＥＧ結合体)が製造された(図３)。図３は製造されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとＰＥＧが結合した結合体を示す電気泳動写真であり、Ｍはサイズマーカー、レーン１は非還元条件でのＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧ結合体、及びレーン２は非還元条件でのＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−５ ｋＤａ ＰＥＧ結合体である。
【０１１６】
実施例５−２：ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−５ ｋＤａ ＰＥＧ結合体の製造
アルデヒド−５ ｋＤａ ＰＥＧ−マレイミド(NOF, 日本)をＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣのＣ末端に結合させるために、４０ ｋＤａ ｍＰＥＧ−マレイミドの代わりにアルデヒド−５ ｋＤａ ＰＥＧ−マレイミドを用いたことを除いて、実施例５−１と同様の方法を行うことにより、ペグ化されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ(ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−５ ｋＤａ ＰＥＧ結合体)を製造した(図３)。
【０１１７】
実施例５−３：ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃ複合体の製造
マレイミド−１０ ｋＤａ ＰＥＧ−アルデヒド(NOF, 日本)のアルデヒド反応基と免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端とを結合させるために、１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６．０)の条件下で免疫グロブリンＦｃ断片とマレイミド−１０ ｋＤａ ＰＥＧ−アルデヒドを１：１のモル比で混合し、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌの条件下で還元剤である２０ｍＭ Ｎａ−ＣＮＢＨ３を加え、低温(４〜８℃)で２時間反応させた。モノペグ化された免疫グロブリンＦｃ断片(マレイミド−１０ ｋＤａ ＰＥＧ−Ｆｃ)を得るために、陽イオンクロマトグラフィーであるＳｏｕｒｃｅ１５Ｑを用いて、２０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ７．５)の条件下で塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出した。
【０１１８】
一方、ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣは、１０ｍＭグリシルグリシン緩衝液(ｐＨ５．５)の条件下で還元剤である０．５〜２ｍＭトリフェニルホスフィン(トリフェニルホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸三ナトリウム塩水和物)を加え、常温で２時間反応させてＣ末端を還元した。
【０１１９】
Ｃ末端が還元されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとモノペグ化された免疫グロブリンＦｃ断片(マレイミド−１０ ｋＤａ ＰＥＧ−Ｆｃ)とを１：４〜１：２０のモル比で混合し、総タンパク質濃度１〜２ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ７．５)の条件下で２時間常温で反応させた。まず、陽イオンクロマトグラフィーであるＳｏｕｒｃｅ１５Ｑを行い、２０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ７．５)の条件下で塩化ナトリウムの濃度勾配でＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−１０ ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ複合体を溶出した。
【０１２０】
ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃ複合体のＦａｃＶＩＩを活性化するために、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．０)、ＦａｃＶＩＩ基準約４ｍｇ／ｍｌの条件下で１８時間低温(４〜８℃)で溶液反応を行った。
【０１２１】
１０ｍＭグリシルグリシン緩衝液(ｐＨ５．５)でサイズ排除クロマトグラフィーであるＳｕｄｐｅｒｄｅｘ２００を行うことにより、最終ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃを精製した。
【０１２２】
前記精製されたＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃの純度は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット分析により確認した(図４)。図４ａは精製されたＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃを示す電気泳動写真であり、Ｍはサイズマーカー、レーン１は還元条件でのＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃ、レーン２は非還元条件でのＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃである。図４ｂは精製されたＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃを示すウェスタンプロット分析の写真であり、レーン１は還元条件でのＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃ、レーン２は非還元条件でのＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃである。
【０１２３】
実施例６：ＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの in vitro 活性測定(ＥＣ50)
ＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの in vitro 活性を測定するために、商用キット(Chromogenix, COASET)を用いてｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙを行った。活性測定試験は、欧州薬局方「２．７．１０．ＡＳＳＡＹ ＯＦ ＨＵＭＡＮ ＣＯＡＧＵＬＡＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ」の内容に基づいて行った。
【０１２４】
各濃度に希釈されたＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣは、 トロンボプラスチン(ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ)、Ｃａ2+イオンにより活性化される。活性化したＦａｃＶＩＩａとＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣはＦＸをＦＸａに活性化し、活性化したＦＸａにより基質に添加されるＳ−２７６５(Ｎ−ａ−Ｃｂｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ)が加水分解されてペプチドと発色団(ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ ｇｒｏｕｐ)のｐＮＡが解離し、解離したｐＮＡが４０５ｎｍで吸光する性質を用いて、ＦａｃＶＩＩａとＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣの in vitro 活性を測定した。
【０１２５】
ＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの処理濃度による吸光度値の変化はＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ４．０ ｐｒｏｇｒａｍの４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌを用いてｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎし、そこから得られたＥＣ50値を用いて両物質の活性を比較した。
【０１２６】
試験の結果(図５及び表１)、ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの in vitro 活性は天然型ＦａｃＶＩＩに比べて同等以上の力価を示した。
【０１２７】
【表１】
2014530018.tif 000003
【０１２８】
表１及び図５に示すように、ＦａｃＶＩＩとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣは同レベルの in vitro 活性を示すことが分かった。これらの結果は、本発明のＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩ誘導体が天然型と同等の活性を有するので、ペプチドリンカーがＣ末端に添加されてもその活性には影響を及ぼさないことを意味する。
【０１２９】
実施例７：ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣとＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの in vitro 活性測定(ＥＣ50)
部位特異的結合(site-specific conjugation)による活性を確認するために、ＦａｃＶＩＩ−４０ ｋＤａ ＰＥＧ、ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ、Ｃ末端ペグ化ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの in vitro 活性を測定した。商用キット(Chromogenix, COASET)を用いてｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙを行い、実施例６と同様の試験方法を用いた。テストサンプルの処理濃度による吸光度値の変化はＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ４．０ ｐｒｏｇｒａｍの４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌを用いて確認し、そこから得られたＥＣ50値を用いてペグ化後の相対力価(relative activity)を確認した。
【０１３０】
試験の結果(表２)、Ｎ末端ペグ化ＦａｃＶＩＩ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの in vitro 活性はＦａｃＶＩＩに比べて約１１％の力価を示し、Ｃ末端ペグ化ＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧの in vitro 活性はＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣに比べて約２９％の力価を示すことが確認された。
【０１３１】
【表２】
2014530018.tif 000004
【０１３２】
本発明のＦａｃＶＩＩ誘導体にＰＥＧが結合した結合体の活性はＦａｃＶＩＩ誘導体に比べて約２９％の力価を示すことが確認された。それに対して、ＦａｃＶＩＩにＰＥＧが結合した結合体の活性はＦａｃＶＩＩに比べて約１１％の力価を示した。よって、Ｎ末端がペグ化されたＦａｃＶＩＩ−４０ ｋＤａ ＰＥＧのＥＣ50に比べて、Ｃ末端がペグ化されたＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ−４０ ｋＤａ ＰＥＧのほうが約２．５倍高い相対活性を保持するので、ＡＴＫＡＶＣを用いた部位特異的結合(site specific conjugation)方法のほうがＦａｃＶＩＩの活性をより高く保持することが分かる。
【０１３３】
実施例８：ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃの in vitro 活性測定
ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃの in vitro 活性を測定するために、商用キット(StaclotVIIa-rTF, Stago)を用い、標準物質としては国際標準品であるＮＩＢＳＣ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ(６５６ＩＵ／ｖｉａｌ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．０７／２２８)を用いた。この試験法は、ｒｓＴＦ(recombinant soluble tissue factor)がＦａｃｔｏｒ ＶＩＩａと特異的に反応して凝固が起こる原理に基づくものである。３つの濃度のＮＩＢＳＣ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃは、ＦａｃＶＩＩ欠乏ヒト血漿(human plasma)と１：１の割合でそれぞれ希釈し、その後ｒｓＴＦとリン脂質(phospholipid)の混合物と約１８０秒間反応させる。その後、２５ｍＭ ＣａＣｌ2を加えて凝固が起こる時間を測定する。Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａの量が多いほど凝固時間は短くなる。
【０１３４】
ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣとＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃの比活性度(specific activity, ＩＵ／ｍｇ)を計算するために、まずＮＩＢＳＣ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａのｐｏｔｅｎｃｙ(ＩＵ／ｍＬ)と比較して、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣとＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃのｐｏｔｅｎｃｙ(ＩＵ／ｍＬ)をＰＬＡ２．０で分析する。その後、計算されたｐｏｔｅｎｃｙ(ＩＵ／ｍＬ)をタンパク質濃度(ｍｇ／ｍＬ)で割って比活性度を計算する。
【０１３５】
試験の結果(表３)、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣ−ＰＥＧ−Ｆｃの in vitro 活性は約２０６３２ＩＵ／ｍｇであった。これは、ＦａｃＶＩＩａ−ＡＴＫＡＶＣに比べて約４５％の活性を保持するものである。
【０１３６】
【表３】
2014530018.tif 000005
【０１３７】
2014530018.tif 000006
【図５】
2014530018.tif 000007
【図１ａ】
2014530018.tif 000008
【図１ｂ】
2014530018.tif 000009
【図１ｃ】
2014530018.tif 000010
【図２】
2014530018.tif 000011
【図３】
2014530018.tif 000012
【図４ａ】
2014530018.tif 000013
【図４ｂ】
2014530018.tif 000014
【配列表】
2014530018000001.app
【国際調査報告】
2014530018.tif 000015
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