(57)【要約】  本発明は、疾患及び障害の医療的治療だけでなく、生体工学分野に関するものである。本発明の実施形態は、組織または臓器内に深く内蔵された腫瘍を治療するか、臓器を脱細胞化させて既存の脈管構造を損なわずに既存の動物組織からスキャフォールドを生成するための器官の脈管構造を通じた不可逆的電気穿孔（Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＲＥ）の輸送に関するものである。特に、脈管組織及び臓器に位置する腫瘍を治療するための生体内の非熱的不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）の投与方法を提供する。さらに、本発明の実施形態は、細胞破片を除去し、再細胞化の可能性を最大化させ、異物性免疫反応を最小化するために生体外ＩＲＥを用いて製造される天然の源からのスキャフォールドと組織を提供する。このような操作された組織は、組織代替または増大が必要な被験者を治療する方法に用いられ得る。
2014501574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む、組織または臓器から細胞を除去する方法：
臓器または組織の脈管構造内に一つ以上の電極を挿入し；
前記脈管構造を通じて灌流液で前記組織または臓器を機械的に灌流させ；及び
標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造内に電場を与える。
【請求項２】
下記を含む組織または臓器から細胞を除去する方法：
臓器または組織内に、臓器または組織上に、または臓器又は組織の近くに一つ以上の電極を置き；
灌流液で前記組織または臓器を機械的に灌流させ；及び
標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記組織または臓器内に電場を与える。
【請求項３】
電気化学療法（ＥＣＴ）、電気遺伝子療法（ＥＧＴ）、ナノ秒パルス電場（ｎｓＰＥＦ）、高周波不可逆的電気穿孔（Ｈ−ＦＩＲＥ）、高周波アブレーション、または急性温熱療法から選択された療法である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的細胞の壊死を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造内にエネルギーを与えることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
第１電極が前記臓器の動脈内に挿入され、第２電極が前記臓器の静脈内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２電極が前記臓器の他の血管内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２電極が前記臓器の流体管（ｆｌｕｉｄ  ｄｕｃｔ）内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２電極が前記臓器の他の血管内に挿入され、前記第１血管及び第２血管の間に前記臓器の治療領域が位置し、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２外部グラウンディングパッド、プレート電極または前記臓器外部の伝導性ゲルが第２電極として用いられ、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、電気パルスが標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために与えられることにより、前記標的領域内で発生する疾患を治療するための治療的な遺伝子構成物の導入を可能とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、電気パルスが標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために与えられることにより、全身疾患を治療するために細胞を交替するための治療的な遺伝子構成物の導入を可能とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、電気パルスが標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために与えられることにより、前記標的領域内または全身疾患内の疾患を治療するために治療的な巨大分子の導入を可能とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、前記脈管構造を通じて交差電場を与えることが、臓器の標的領域または全部の熱焼灼を生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記電気穿孔が、標的細胞の非熱的不可逆的電気穿孔を含むものである、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
機械的灌流、生理学的灌流、物理的、化学的または酵素的技術、またはこれらのいずれかの組合せにより前記組織または臓器から細胞破片を除去することをさらに含む、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
電気測定を通じて観察することにより、電気穿孔を感知し、観察することをさらに含む、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織の灌流の間、前記標的細胞に不可逆的電気穿孔を与えることにより、天然の組織源から標的細胞を除去することにより形成された組織スキャフォールド。
【請求項１８】
前記電気穿孔が前記組織の脈管構造を通じて与えられるものである、請求項１７に記載のスキャフォールド。
【請求項１９】
天然の組織源の細胞外マトリックス及び血管構造を含む、請求項１７または１８に記載のスキャフォールド。
【請求項２０】
前記組織スキャフォールドが、約１〜１０ｃｍの少なくとも一つの大きさの厚みを有するものである、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
【請求項２１】
組織スキャフォールドを得るために、前記組織の灌流の間、前記標的細胞に不可逆的電気穿孔を与え、前記スキャフォールド内または前記スキャフォールド上に生存している細胞の成長を許容する条件下で前記細胞を前記スキャフォールドに再接種することにより、天然の組織源から前記標的細胞を除去することにより構築された、人工組織。
【請求項２２】
前記電気穿孔が前記天然組織の脈管構造内に与えられるものである、請求項２１に記載の人工組織。
【請求項２３】
前記組織スキャフォールドが動物を由来とするものであり、前記生存している細胞がヒトを由来とするものである、請求項２１または２２に記載の人工組織のスキャフォールド。
【請求項２４】
前記組織スキャフォールドが、天然の組織源の細胞外マトリックス及び血管構造を含むものである、請求項２１乃至２３のいずれか一項に記載の人工組織のスキャフォールド。
【請求項２５】
前記作製された組織スキャフォールドが、約５〜１０ｃｍの少なくとも一つの大きさの厚みを有するものである、請求項２１乃至２４のいずれか一項に記載の人工組織のスキャフォールド。
【請求項２６】
心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、消化管、膀胱、前立腺、卵巣、脳、耳、目または肌またはその一部である、請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の人工組織のスキャフォールド。
【請求項２７】
下記を含む、組織または臓器の標的細胞を除去するための装置：
前記組織または臓器脈管構造の動脈から静脈まで灌流液を輸送するに適した灌流システム；
前記組織または臓器脈管構造の前記動脈及び前記静脈内に各々挿入されるに適した第１電極及び第２電極；及び
前記第１電極及び第２電極間における標的細胞の電気穿孔を実行するに十分な時間の間、十分な電圧で灌流の間前記第１電極及び第２電極間に電圧を印加するために前記電極との疎通を作動させる電圧源。
【請求項２８】
前記電気穿孔が、標的細胞の非熱的不可逆的電気穿孔を含むものである、請求項２７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月２４日付で提出されたＵ．Ｓ．特許仮出願番号第６１／０７５，２１６号；２００８年４月２９日付で提出されたＵ．Ｓ．特許仮出願番号第６１／１２５，８４０号；２００９年４月２２日付で提出されたＵ．Ｓ．特許仮出願番号第６１／１７１，５６４号；及び２００９年４月９日付で提出されたＵ．Ｓ．特許仮出願番号第６１／１６７，９９７号の提出日の利点に依存して請求する、２００９年６月２４日付で提出されたＵ．Ｓ．特許出願番号第１２／４９１，１５１号の一部継続出願（ＣＩＰ）であり、本出願は、また２００８年４月２９日付で提出されたＵ．Ｓ．特許仮出願番号第６１／１２５，８４０号の提出日の利点に依存して請求する、２００９年４月２９日付で提出されたＵ．Ｓ．特許出願番号第１２／４３２，２９５号のＣＩＰ出願であり；本出願は、２０１０年１１月２３日付で提出されたＵ．Ｓ．特許仮出願番号第６１／４１６，５３４号の提出日の利点に依存して請求するものである。このような全ての出願の全体記載は、参考文献として本願に取り込まれた。
【０００２】
本発明は、疾患及び障害の医療分野だけでなく、生体工学分野に関するものである。本発明の具現例は、組織または臓器内に深く内蔵された腫瘍を治療するか、臓器を脱細胞化させて既存の脈管構造を損なわずにヒト組織のような既存の動物組織からスキャフォールドを生成するための器官の前記脈管構造を通じた不可逆的電気穿孔（Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＲＥ）の輸送についてのものである。さらに、本発明の具現例は、可逆的電気穿孔を容易にすることにより、治療剤または遺伝子構成物の強化された投与を通じて悪性疾患及び良性疾患の治療に用いられ得る。また、血管の電気導管が、既存の脈管構造を損なわずに身体または器官組織の標的領域への電気エネルギーの輸送に依存する他の療法を行うのに用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
不必要な軟部組織の除去は、外科的摘出、過量の電離放射線（ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）または他の形態のエネルギー（過度な加熱及び冷却）の適用、細胞毒性のある化学物質への暴露、またはこのような手段の組合せを含む多くの手段によりなされる。新生物を破壊するためにこのような手段が一般的に用いられている。本分野における公知の処置には、異常な細胞集団の物理的除去のための外科的処置、異常な細胞集団の細胞を殺すための放射線、毒性化学物質への暴露（即ち、化学療法）、またはこのような技術の組合せを含む。各治療様式は、様々な細胞増殖性疾患にかなり効果的ではあるが、細胞増殖性疾患及び障害の全ての類型を治療するのに非常に効果的な技術は一つもない。
【０００４】
外科的処置は、物理的にアプローチ可能であり、持続的な物理的損傷を可能とするか、再生が可能な組織及び臓器上の固形腫瘍の除去に効果的であるが、外科的処置は、アプローチが容易でない腫瘍または再生されない腫瘍に実行することは難しい。このような場合において、外科的処置は、しばしば長い回復時間及び後続治療が要求され、患者に相当な物理的損傷が伴われることがある。またある時は、大規模に成長した前記新生物の除去を防止するが、これは、このような除去の試みにより患者が死亡する可能性もあるからである。同様に、放射線治療は、前記腫瘍周囲の組織に付随的な損傷を引き起こすことがあり、患者の寿命の質を低下させる、長期持続する副作用を引き起こすことがある。化学療法治療は、患者に全身損傷を引き起こすことがあり、長い回復期間を要求する相当な副作用を引き起こしたり、組織及び臓器に永久的な損傷を生じたりすることがある。
【０００５】
本発明者等による最近の研究は、不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）と命名された技術を用いて、過量の電気エネルギーの適用による望まない軟部組織（悪性腫瘍）の除去に焦点を合わせている。軟部組織肉腫及び悪性神経膠腫の成功的な調節及び／又は除去が達成された。不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）は、標的領域内または近くに電極を位置させて一連の低いエネルギーであるマイクロ秒電気パルスを輸送することを含む。このようなパルスは、標的組織（例えば、腫瘍）の細胞膜を永久的に不安定にして、細胞を殺すことができる。正確に適用されたとき、ＩＲＥは、周囲組織に有意な損傷を発生させず、主要血管に損傷を与えず、薬物の使用を要求することなく調節可能な方式で新生細胞を非熱的に殺す。
【０００６】
疾患を治療するための他の方法は、疾患にかかった組織または臓器を交替することを含む。去る２０年間、臓器移植は、肝硬変、腎不全等のような末期疾患を有することが診断された患者に対する標準的なケアとなった。１年及び５年後に、それぞれ９０％及び７５％の生存率を示す、肝移植の驚くべき成功は、移植を待つ患者の数を増加させ続けた。Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ａ  ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  ｒｉｇｈｔ  ｌｉｖｅｒ  ａｄｕｌｔ−ｔｏ−ａｄｕｌｔ  ｌｉｖｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−Ｔｈｅ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｍｉｄ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２４８，４１  １−４１８，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＳＬＡ．０ｂ０１３ｅ３１８１８５８４ｅ６（２００８）（“Ｃｈａｎ  ２００８”）。
【０００７】
ユナイテッド・ネットワーク・オブ・オーガン・シェアリング（ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ，ＵＮＯＳ）によれば、米国だけで、現在、腎臓、肝臓、心臓、肺等を含む臓器移植を待っている１０８，０００名以上の候補者がいる。それらの候補者のうち、肝移植が直ぐに（１年）必要な１６，０００名以上の候補者と、臓器移植によって効果が得られる進行した肝疾患を持っている少なくとも１００，０００名の更なる患者がいる。２００９年には、生きているか死亡した提供者からの７，０００回未満の肝移植があった。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｏｓ．ｏｒｇ＞（２０１０）。
【０００８】
米国における標準的な肝移植は、通常、脳死（脳幹死）と判定された提供者から除去された臓器に基づいて行われる。Ｋｏｏｔｓｔｒａ，Ｇ．，Ｄａｅｍｅｎ，Ｊ．Ｈ．Ｃ．＆  Ｏｏｍｅｎ，Ａ．Ｐ．Ａ．Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｈｅａｒｔ−Ｂｅａｔｉｎｇ  Ｄｏｎｏｒｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２７，２８９３−２８９４（１９９５）；Ｒｉｇｏｔｔｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−Ｈｅａｒｔ−ｂｅａｔｉｎｇ  Ｄｏｎｏｒｓ−Ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｉｎ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２３，２５７９−２５８０（１９９１）；及びＢａｌｕｐｕｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒｏｕｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｋｉｄｎｅｙｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｏｎ  ｈｅａｒｔ−ｂｅａｔｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ：Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｎｔｅｒ  １０−ｙｅａｒ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９，８４２−８４６（２０００）を参照してほしい。
【０００９】
移植手術及び一般医学の改善にもかかわらず、臓器移植を待っている患者の数は増加し続けているが、臓器の供給はそうでない。臓器の供給と臨床的な需要との間での差の増加は、人口年齢の増加、肝移植が要求される疾患の増加（肝癌及び肝炎ウイルスへの感染）、提供後の急激な臓器低下（数時間）、組織適合性及びその他の免疫的現象により発生する不一致、臓器と潜在的レシピエント（小児科患者を含む）との間の大きさの不一致を含む種々の因子に起因したものであり、移植は、末期肝疾患（Ｍｕｒｒａｙ，Ｋ．Ｆ．＆  Ｃａｒｉｔｈｅｒｓ，Ｒ．Ｌ．ＡＡＳＬＤ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１，１４０７−１４３２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２０７０４（２００５））；非アルコール脂肪肝疾患の増加した発生（Ａｍａｒａｐｕｒｋａｒ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｗ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｓ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｓｉａ−Ｐａｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｔｈｅｒｅ  ｌｏｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ？  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２２，７８８−７９３，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．ｌ４４０−１７４６．２００７．０５０４２．ｘ（２００７））；及び、新陳代謝または先天性疾患を持っている患者に対する移植の適合性（Ｍｉｒｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｌａｇｕｎｏ，Ｍ．，Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．，Ｒｉｍｏｌａ，Ａ．＆  Ｈｏｓｐ  Ｃｌｉｎ，Ｏ．Ｌ．Ｔ．Ｈ．Ｉ．Ｖ．Ｗ．Ｇ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄ  ｓｔａｇｅ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＥＳＬＤ）：Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＯＬＴ）？  Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４４，Ｓ１４０−Ｓ１４５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２００５．１１．０２８（２００６））を有する患者に対してのみ実施可能な治療である。
【００１０】
臓器供給は、取得が遅れる障害により遅延する。例えば、脳死（脳幹死）と一致する臓器の除去のための必要条件は、人工生命維持装置で維持する手段を有する病院の使用を必要とする。結果として、集中治療手段が酷使された場合、臓器提供に問題が生じ得る。Ｆａｂｒｅ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｐａｒｔｙ  ｏｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ．（１９９５）．潜在的臓器提供の保護のための生命維持装置の使用は、倫理的に論争を起こし（Ｆｅｅｓｔ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｏｒｇａｎ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｅａｔｈｓ  ｉｎ  ａ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３３５，１１３３−１１３５（１９９０）；及びＲｉａｄ，Ｈ．＆  Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ａ．，Ａｎ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｄｅｂａｔｅ  Ｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  Ｄｏｎｏｒｓ，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．３１０，７１４−７１５（１９９５）参照）、社会的、文化的及び宗教的な圧迫が臓器調達を制限する地域での提供拒否は一般的である。
【００１１】
臓器提供と患者への供給との間の増加する差は、代替臓器源に対する関心を増加させた。Ｐｅｒｅｒａ，Ｍ．，Ｍｉｒｚａ，Ｄ．Ｆ．＆  Ｅｌｉａｓ，Ｅ．Ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ２０  ｙｅａｒｓ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２４，Ｓ１２４−Ｓ１３１，ｄｏｉ：１０．１  １  １  １／ｊ．１４４０−１７４６．２００９．０６０８１．ｘ（２００９）．臓器の構造及び機能を複製するための人工物質の開発は、制限された成功を収めた。大容量の低調に組織された細胞及び組織は、酸素、栄養素及び老廃物の初期制限された拡散により移植され得ない。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｓｅｌｆ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  ３  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３８（１９７３）；ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｌ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｒ．＆  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８，１０７１６−１０７２１（２００１）．
【００１２】
それにも拘わらず、研究者は、部分的臓器再生に対する一部の進展を示した。例えば、脱細胞化されたコラーゲンマトリックスで成長して無胸腺マウス（ａｔｈｙｍｉｃ  ｍｉｃｅ）内に移植された、マウス腎臓細胞は、８週間後、ネフロン類似構造に発達した。Ａｔａｌａ，Ａ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｒｇａｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，５７５−５９２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｐｂｉｏ．２００９．１０．００３（２００９）（“Ａｔａｌａ  ２００９”）．さらに、マウス内に移植された後、肝細胞が注入された、５ｍｍ厚さの多孔性ポリビニル−アルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ−ａｌｃｏｈｏｌ、ＰＶＡ）構造が、１年の経過の間、肝類似形態に発達した。Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３１，１９２８−１９２９（１９９９）（“Ｋａｕｆｍａｎｎ  １９９９”）．このようなそれぞれの構造における細胞の生存及び増殖は、栄養源から数ｍｍに制限される。
【００１３】
ヒト移植に適した完全な臓器の開発及び分化のために、微細血管構造を提供する構造は、組織のあらゆるところに栄養素を輸送することが要求され、細胞構成のための物理的半硬質マトリックス及び定着具が開発されなければならない。Ａｔａｌａ  ２００９；Ｋａｕｆｍａｎｎ  １９９９；及びＡｔａｌａ，Ａ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｕｒｅｔｈｒａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２９，４８５−＋（２００２）を参照してほしい。伝統的な下向式製造技術は、現在、ヒト臓器において、４桁以上にわたる範囲である、数ｃｍの大きさ（例えば、大静脈）から小さくはわずか数μｍ（ほとんどの毛細管）の大きさの範囲で階層的血管構造を生産することができない。微細加工技術は、哺乳動物微細脈管構造の複雑な構造のいくつかの特徴を複製することができるが、現在の工程は、マイクロスケールへの拡張には失敗した。複数の長さの範囲にわたり特徴を持つ構造は、現在、生物学的メカニズムを通じてのみ製造され、相対的に新規な分野の生物学的製造術がこのような工程を使用し、調節することを目的として開発されている。
【００１４】
生体工学によって作られた組織は、細胞及び支持マトリックスが同時に蒸着されて複合ネットワークを形成する、直接プリンティング及びバイオスプレイング（ｂｉｏｓｐｒａｙｉｎｇ）を含む多くの計画を通じて製造された。Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ：Ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ａｓ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０，２１６４−２１７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８．１２．０８４（２００９）；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｉｎｋｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１，１６５８−１６６６（２００５）；及びＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｇ．＆  Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｉｄ  ｏｆ  ｉｎｋｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｅｒｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７，１１２３−１１２７，ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．７．８．１１２３（２００７）を参照してほしい。管状構造が密集して内蔵された細胞ネットワークを持つ架橋されたヒドロゲルを生成するために遠心力が用いられた。Ｋａｓｙａｎｏｖ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｂｙ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｃａｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｗｉｔｈ  ｌａｓｅｒ−ｍａｃｈｉｎｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｅｓ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．−Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．２０，３２９−３３７，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓｌ０８５６−００８−３５９０−３（２００９）．誘電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）（Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｓａｈ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｂｈａｔｉａ，Ｓ．Ｎ．Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｂｙ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８７，２１３１−２１４７，ｄｏｉ：１０．１５２９／ｂｉｏｐｈｙｓｊ．１０４．０３９５１１（２００４））及び磁場（Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ｖ．，Ｋａｓｙａｎｏｖ，Ｖ．＆  Ｍａｒｋｗａｌｄ，Ｒ．Ｒ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｆｒｏｍ  ｎａｎｏｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｒａｐｉｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，３３８−３４４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２００８．０３．００１（２００８））が合成マトリックス内の細胞の配置を導くために用いられ、バイオ−ポリマー内に内蔵された細胞は、組織構造内に電気紡糸された（Ｓｔａｎｋｕｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．＆  Ｗａｇｎｅｒ，Ｗ．Ｒ．Ｍｉｃｒｏ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ，ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ  ｆｉｂｅｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７，７３５−７４４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５．０６．０２０（２００６））。このような技術は、内蔵された細胞が最適な構造内へ再構成することから外れて、適した合成−製造されたネットワーク内で細胞を分布させることを試みるものである。
【００１５】
既存組織の脱細胞化は、身体の天然プログラミングの利点を取り機能的血管ネットワークを含む完璧な組職を生成する生物学的な製造のコンセプトを拡張する。ラットの肝細胞外のマトリックス構造は、化学的な脱細胞化及び再接種を用いて生成された。Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｂｉｏｓｃａｆｆｏｌｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｗｈｏｌｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｈａｒｖａｒｄ−ＭＩＴ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｉｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００９）．複数の細胞タイプで再接種された脱細胞化されたラットの心臓は収縮可能で、ポンピング圧力を生成する能力を持つ。Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｍａｔｒｉｘ：ｕｓｉｎｇ  ｎａｔｕｒｅ’ｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ａ  ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｈｅａｒｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４，２１３−２２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｌ６８４（２００８）．化学的な脱細胞化技術に対する挑戦は、ＥＣＭ成分を損傷する洗浄剤に対する可能性、毒性を生成して蒸着させる可能性、及び小さなラットの臓器から大きな臓器へのこのような技術の規模拡大の内在した難しさを含む。このような挑戦は、脱細胞化された臓器が臨床セッティングで成功的に移植され得る前に克服されなければならない。
【００１６】
異種臓器移植、または動物臓器の移植は、未来の臓器不足に対する一つの潜在的な解決策である。Ｋｅｅｆｆｅ，Ｅ．Ｂ．Ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２０，７４９−７６２，ｄｏｉ：１０．１０５３／ｇａｓｔ．２００１．２２５８３（２００１）．豚異種移植体は、相当な可能性を示すが、広く承認され、使用されるには至らなかった。豚膵島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ）の移植は、最近、一時的逆糖尿病（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）を示し（Ｃａｒｄｏｎａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，３０４−３０６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｌ３７５（２００６）；及びＨｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ  ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，３０１−３０３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｌ３６９（２００６）参照）、Ｔ−細胞耐性プロトコルの使用は、非ヒト霊長類において長期間の腎臓移植の可能性を証明した。Ｙａｍａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｍａｒｋｅｄ  ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｎａｌ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｂａｂｏｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  １，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｄｏｎｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ｔｈｙｍｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１，３２−３４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｌｌ７２（２００５）．
【００１７】
さらに、豚の肝臓が、アンモニアを除去したヒト血漿の短期間の灌流下にある間、凝固を復旧させる能力があることが証明された。Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｅｆ  Ｒｅｐｏｒｔ−Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｅｘ−ｖｉｖｏ  Ｐｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１，２３４−２３７（１９９４）；及びＭａｋｏｗｋａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｚｅｎｏｇｒａｆｔ  ｆｏｒ  Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｆａｉｌｕｒｅ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５９，１６５４−１６５９（１９９５）．残念ながら、このような移植での移植片の損失及び拒絶のメカニズムは、依然としてよく知られておらず、免疫拒絶は、移植の成功のための最も大きな障害として残っている。Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｇ．＆  Ｓｙｋｅｓ，Ｍ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ａ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，５１９−５３１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ２０９９（２００７）。
【００１８】
人工組織は、今日の最も破壊的な疾患のうち一部を治療するために最も有望視されるものである。人工組織及び臓器代替は実験室で開発され得るので、複数の疾患の段階で潜在的に大規模に輸送され得、この治療法では、患者の待機時間を顕著に減少させる。選択的な細胞移植を用いる人工組織のコンセプトは、膀胱再構成のための人工膀胱組織、膀胱尿管逆流（ｖｅｓｉｃｏｕｒｅｔｅｒａｌ  ｒｅｆｌｕｘ）及び尿失禁治療用の注入可能な人工の軟骨細胞及び血管移植片の成功的な使用を含む、様々な障害に実験的かつ臨床的に適用された。ヒト用臨床使用のために、前記工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの接種及びスキャフォールド上へのヒト細胞の付着を含む。接種されると、前記細胞は増殖してスキャフォールド内に移動し、関連のある特定組織に対して適切な細胞タイプで分化されるが、細胞外マトリックス成分を分泌することは、前記組織を形成することを必要とする。前記スキャフォールドの三次元構造、及び特に前記スキャフォールドの多孔の大きさ及び密度は、重要な組織を生成するために接種された細胞の成功的な増殖及び移動において重要である。それゆえ、スキャフォールドの選択は、所望の形態及び大きさの組織及び臓器を生成するために細胞が必要とされる方式で実行できるように決定する。
【００１９】
これまで、人工組織用スキャフォールディング（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）は、一般に、天然及び合成ポリマーで構成された。ポリマーから人工組織用スキャフォールドを形成するための本分野で公知になった方法は、溶媒−キャスティング、粒子−浸出、ポリマー等のガスフォーミング（ｇａｓ  ｆｏａｍｉｎｇ）、相分離、及び溶液キャスティングを含む。電気紡糸は、人工組織及び臓器のためのスキャフォールドを生成するための他の人気のある方法であるが、広く用いられる技術は、これまでその臨床移植を防止する根本的な製造上の制約を持っている。このような制約は、細胞の成長及び機能を十分に促進するナノ−、マイクロ−、及びミリメートルの大きさの電気紡糸構造を生成できる工程等の確実な不足により引き起こされたものである。
【００２０】
ほとんどの人工組織のスキャフォールドに対する根本的な重要性は、ガス及び栄養素の交換である。本来は、これは組織に酸素及び栄養素を提供し、毛細管水準で老廃物を除去する微細循環により果たされる。しかし、ほとんどの人工スキャフォールドにおけるガス交換は、一般に、分散（一般に１ｍｍ未満の距離にわたって）により受動的になされるか、特定類型の物質繊維から酸素の溶出により能動的になされる。微細循環は操作しにくいが、これは、特に毛細管の断面寸法がわずか５〜１０マイクロメータ（μｍ；ミクロン）の直径であるためである。未だに、組織スキャフォールドを操作するための製造工程が開発されておらず、血管のネットワークを生成することができない。現在、ガス交換のための構造で設計された循環を有する人工組織のスキャフォールドは公知になっていない。結果として、組織及び臓器のための前記スキャフォールドは、大きさ及び形態が制限される。
【００２１】
ガス交換以外に、人工組織のスキャフォールドは、交替しようとする本来の組織と類似した機械的特性を示さなければならない。これは、本来の組織に存在する前記細胞が組織の成長及び機能を調節するように作用することができる生理学的気質を感知するため、事実である。ほとんどの天然の硬質組織及び軟質組織は、弾性があるか粘弾性があり、一般の作用条件下で、これらが従属する前記気質を可逆的に回復できる。従って、本来の組織の成熟した細胞外マトリックスとして同様の機械的特性を有する人工組織構造を宿主内に移植する時点で、特に、骨、軟骨または血管のような構造を支持するのに好適である。
【００２２】
天然の組織からスキャフォールドを製造するための本分野で公知になった多くの物理的、化学的、及び酵素的方式がある。スキャフォールドを製造するための最も一般的な物理的方法は、スナップ冷却（ｓｎａｐ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）、機械的な力（例えば、直接圧迫）、及び機械的な攪拌（例えば、超音波処理）である。スキャフォールドを製造するための最も一般的な化学的方法は、アルカリまたは塩基処理、非イオン性、イオン性、または両性イオン性洗浄剤の使用、低張性（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ）または高張性（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ）溶液の使用、及びキレート剤の使用である。スキャフォールドを製造するための一般的な酵素的方法は、トリプシン、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼの使用を含む。現在、スキャフォールドを製造するために組織を十分に脱細胞化するために、二つ以上の前記の言及された方式及び特に他の一般分類（即ち、物理的、化学的、酵素的）からの二つ以上の方式が用いられなければならないことが本分野において認識された。残念ながら、用いられた前記方法は、組織上では相対的に強力で細胞形質成分が完全に除去されることがある。前記の強力な処理は、結果的に生成されたスキャフォールドを不可逆的に分解して脈管構造及び神経構造を破壊する。
【００２３】
動物予備−臨床実験及びヒト臨床適用のいずれにおいても用いられたほとんどの成功的なスキャフォールドは生物学的（天然）であり、大きな動物（例えば、豚）の臓器を脱細胞化して作られた。一般に、スキャフォールドの製造のための組織または臓器からの細胞の除去は、前記細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）を構成する構造的及び機能的タンパク質の複合混合物を残さなければならない。ＥＣＭが得られる前記組織、起源の前記種（ｓｐｅｃｉｅｓ）、前記脱細胞化方法及びこのような生物学的スキャフォールドに対する末期殺菌方法は非常に多様である。しかし、本願において言及されたように、前記脱細胞化方法は相対的に強力で、前記細胞外スキャフォールドの相当な破壊または分解を引き起こす。前記スキャフォールドが製造されると、ヒト細胞を接種して増殖し、移動し、特定の組織内に分化され得る。ほとんどの脱細胞化工程の目標は、スキャフォールドに起こる崩壊を最小化して前記組織の本来の機械的特性及び生物学的特性を維持することである。しかし、現在までこのような目標は達成されていない。スナップ冷却が、腱組織、靭帯組織及び神経組織の脱細胞化によく利用された。組織の急激な冷却により、細胞内の氷結晶が細胞膜を破壊し、細胞溶解を起こした。ＥＣＭの破壊から氷形成を防止するために、温度変化の速度が注意して調節されなければならない。冷却が細胞溶解の効果的な方法ではあるが、前記組織から細胞形質成分を除去する後続工程が引き続かれなければならない。
【００２４】
細胞は、組織に直接圧力を加えて溶離され得るが、この方法は、密接に組織化されたＥＣＭ（例えば、肝臓、肺）で特徴付けられる組織または臓器に対してのみ効果的である。機械的な力は、また、小腸及び膀胱のような天然切開平面（ｎａｔｕｒａｌ  ｐｌａｎｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｓ）により特徴付けられる臓器から組織の層を層間分離するのに用いられた。このような方法は効果的であり、このような組織内で前記ＥＣＭの三次元構造に対する最小崩壊をもたらす。さらに、機械的攪拌及び超音波処理を化学的処理と同時に用いて細胞溶離及び細胞破片の除去を補助することができる。機械的攪拌は、磁性攪拌プレート、オービタルシェーカー、または低プロファイルローラを用いて適用され得る。細胞の崩壊のための超音波の最適な規模または振動数を決定するための研究はなかったが、標準超音波クリーナーが効果的であると見られた。前記言及した通り、現在用いられる物理学的処理は、完全な脱細胞化を達成するには一般的に不十分であり、二次処理、通常、化学的処理と併行しなければならない。トリプシンのような酵素処理、及びイオン性溶液及び洗浄剤のような化学的処理は、細胞膜と細胞内及び細胞外の連結を可能とする結合を崩壊させる。それゆえ、これらは、機械的手段による全般的な崩壊後に脱細胞化での二次ステップとしてしばしば用いられる。
【００２５】
最近、ＩＲＥ分野での改善がなされ、ＩＲＥでの腫瘍の処理概念が成立したが、本発明者等は、ＩＲＥを用いて疾患にかかった組織を除去するための改善された装置及び方法に対する本分野の要求が依然として存在するということを認知した。さらに具体的には、本発明者等は、生理学的電極（“生理学的血管電極（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）”または“ＰＶＥ”）として組織の血管床（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｅｄ）を用いて軟質組織から細胞を選択的に除去した。望まない細胞の除去のためのこの技術の生体外及び生体内適用は、積極的であり、浸透性で限局性の新生物の治療に有用であるだけでなく、組織工学、組織再生、及び生物学的に由来した組織構造を用いた臓器移植においても広く多様に適用され得る。
【発明の概要】
【００２６】
本発明は、パルス輸送のための導管として組織内の既存の脈管構造の使用を通じて不可逆的及び可逆的電気穿孔の新規な適用を提供する。このような方法論は、細胞及び組織の非熱焼灼を誘導するのに必須のエネルギーを減少させて脈管化組織構造の開発のための細胞外マトリックスの保存を劇的に改善する、わずか数ミクロンの“電極”の分離を引き起こす。また、電気穿孔の可逆的領域を活用することを含む、生体内の固形腫瘍等の治療及び他の生体内への適用における臨床的影響を与え、ここで、前記電場は、細胞を殺さずに前記細胞の透過性を臨時的に増加させて外因性物質の細胞内輸送を可能とする。
【００２７】
組織を脱細胞化させるためのＩＲＥの使用は、組織または器官の細胞を破壊するための制御された正確な方法を提供し、原組織の血管新生及びその他の全体的な形態学的特性を含む根本的な細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）の損傷はないものとした。このような前記脱細胞化されたスキャフォールドは、適切な生物の細胞を接種するに適する。
【００２８】
前記工程が細胞外で実行されると、前記接種された組織が交替組織として生物の体内に移植されるに適する。スキャフォールドを製造する方法以外に、前記発明は、また、脱細胞化されたスキャフォールド自体だけでなく、このようなスキャフォールドから作られた人工組織及び臓器を製造する方法を提供する。さらに、本発明は、前記人工スキャフォールド用途及びこのようなスキャフォールドから作られた前記人工組織及び臓器を提供する。
【００２９】
さらに具体的には、ＩＲＥは、微細脈管構造を損傷なしに残し、任意に電場のための経路として臓器脈管構造を用いるＩＲＥ投与と併用される、臓器の能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を用いて組織を中心的に除去するのに用いることができる。ＩＲＥパルス輸送のための経路として脈管構造を用いるこのような画期的な方法論は、組織内に深く内蔵された腫瘍を治療するための（例えば、インサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）から治療）または完全な臓器スキャフォールド発生のための有望な解決策である。
【００３０】
プレート電極及び針状電極が組織及び臓器を治療するためにＩＲＥを輸送するのに用いられ得る。しかし、いくつかの場合において、プレート電極は、腫瘍を除去するか臓器内の深い臓器を治療するのに好ましい解決策ではないことがある。例えば、プレート電極は、一般的に前記臓器の外部表面上に位置し、腫瘍及び前記臓器の外部表面間に位置した健康な組織に望まない損傷を引き起こす可能性がある。針電極は、実行可能な方法であって、これは、針が前記臓器内に挿入されて前記臓器のさらに内部の部分を治療するためである。輸送治療において最も効果的であると見られる前記針電極は、前記臓器に穴をあけなければならない。さらに、低い熱投与量の必要条件が治療のそれぞれのセッティングのための最大処理領域を制限し、全体臓器を治療するために多数の針穴を一般的に必要とするはずである。しかも、このような穴は、流体のための代案的な経路を提供するため下流の臓器セクションの灌流がまともになされない可能性がある。プレート電極は、このような問題のうち一部を緩和するのに用いられ得るが、これら自体の制約を導入することができる。大きなプレート電極を一つの治療において肝臓の相当する部分の治療に用いることができる。しかし、適用される治療の距離比率に対する電圧が組織の深さの変化に起因するため治療される領域にわたってかなり多様である。このような輸送システムに関連したプロトコルは、一般に、前記臓器の不十分な治療を引き起こすリスクがある。
【００３１】
プレート及び針状電極の代案として、本発明者等は、バルク組織（例えば、肝組織）での非熱的な細胞の死滅を誘導するために機械的に灌流される臓器の脈管構造を通じて電気パルスを輸送する装置、システム、及び方法を提供する。
【００３２】
臓器の脈管構造内にＩＲＥを直接投与する代表的な装置を、本発明に係るＩＲＥ−機械的灌流連結装置の実施形態の概略図である図１に示した。前記脈管構造及び前記灌流システムへの連結は、ルアーロック（Ｌｕｅｒ  ｌｏｃｋ）の連結管の使用を通じて行われる。前記装置内部の一方向弁が逆流を予防し、機械的摸倣心臓拍動の間で前記臓器を電気的に分離するのに用いられ得る。従って、このような電気穿孔システムは、血管及び伝導構造（例えば、肝静脈、肝動脈、肝門脈、及び／又は肝臓の胆管）に内部的に連結され、持続的な機械的灌流が遅れないようにすることができる。このような好ましい中心除去システムにおいて、前記プロトコルは、小葉（ｌｏｂｕｌｅ）単位の細胞外基底膜を保存しながら細胞の９５％の細胞死滅を誘導することができる。
【００３３】
生体外及び生体内組織の血管床を通じる電気エネルギーの適用は、疾患の治療及び有用な生物由来の組織構造の生成のための手段として望まない細胞を除去するのに用いられ得る。さらに、このような技術は、臓器の全体（または特定領域）に電気または熱エネルギーを輸送し、他の現象を可能とするのに用いられ得る。前記脈管構造を通じてまた適用され得る他の治療としては、電気−化学療法、及び電気−遺伝子−療法、高周波アブレーション（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｂｌａｔｉｏｎ）、ＲＦ誘導温熱及びパルスナノ秒電場（ｐｕｌｓｅｄ  ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ）のための可逆的電気穿孔を含む。実際に、エネルギーを輸送するための伝導性経路を必要とする全ての療法は、この明細書において記載された発明的原理を適用することにより調整できる。
【００３４】
本発明の実施形態は、様々な量のエネルギーの適用（可逆的及び不可逆的電気穿孔のいずれも）（例えば、伝導性経路として臓器の脈管構造を使用）が一般及び新生物細胞の選択的除去を含む広範囲な所望する組織の除去に効果を有するように調節され得る方法を提供する。
【００３５】
伝導性経路として前記臓器の前記脈管構造を用いて様々な量のエネルギーを適用することは、他の治療様式（例えば、電気化学療法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏ  ｔｈｅｒａｐｙ，ＥＣＴ）、電気遺伝子療法（ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，ＥＧＴ）、ナノ秒パルス磁場（ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ，ｎｓＰＥＦ）、高周波不可逆的電気穿孔（Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈ−ＦＩＲＥ）、高周波アブレーション（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｂｌａｔｉｏｎ）、または急性温熱療法（ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ））に対して用いられ得、所望の治療効果を達成することができる。
【００３６】
本発明によれば、エネルギー適用（例えば、伝導性経路として臓器の前記脈管構造を使用）の効果は、エネルギーのパルス形態、電圧、アンペア数、期間、繰返し率及び周波数を多様化し／多様化するか、エネルギーシステムの設計及び位置決めにより制御され、調節され得る。
【００３７】
本発明の他の側面は、精巧で正確に調節される血管灌流システムの設計及び使用を通じてエネルギー適用（例えば、伝導性経路として臓器の前記脈管構造を使用）の効果を調節し、制御することを含む。
【００３８】
本発明に係る、例えば、パルス電場を通じるエネルギー適用の効果を調節する方法は、精巧で正確に調節される血管灌流システムの生理学的模倣特性を多様化することを含むことができる。
【００３９】
しかも、例えば、パルス電場を通じるエネルギー適用の効果は、灌流の条件及び生体外臓器及び組織の保存条件を多様化して調節することができる。
【００４０】
例えば、パルス電場を通じるＩＲＥを用いるエネルギー適用及びその結果として現れる効果は、本発明の実施形態による生体内臓器及び組織の灌流及び保存条件を多様化して調節され得る。
【００４１】
本発明は、また、エネルギー適用システム及びプロトコルの拡張として部分的にまたは全体的に機能する血管内流体の組成を変更して、例えば、伝導性経路として前記臓器の前記脈管構造を用いるエネルギー適用の効果を調節する方法を含む。
【００４２】
さらに具体的には、本発明の実施形態の側面は、下記側面またはその組合せを含む。第１側面において、下記を含む細胞を除去する方法を含む：臓器または組織内、上、または近くに一つ以上の電極を位置させ；灌流液で前記組織または器官を機械的に灌流させ；及び標的細胞の電気穿孔を起こすのに十分な時間の間、十分な電力で前記組織または器官内に電場を投与する。第２側面において、このような方法は、下記を含むことができる：臓器または組織の脈管構造内に前記電極を挿入し；前記脈管構造を通じて灌流液で前記組織または臓器を機械的に灌流させ；及び標的細胞の電気穿孔を起こすのに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造内に電場を投与する。
【００４３】
第３側面において、このような方法は、前記臓器の動脈内に第１電極を挿入し、前記臓器の静脈内に第２電極を挿入して、前記臓器の脈管構造を通じて前記電極間に組織または細胞を電気穿孔させることを含むことができる。さらに、または代案的に、輸尿管または一般胆管のような他の生理学的経路がエネルギー適用のために用いられ得る。このような方法は、標的細胞の非熱的不可逆的電気穿孔を含むことができる。
【００４４】
第５側面は、第１側面乃至第４側面のいずれかを含み、機械的灌流、生理学的灌流、または物理的、化学的、または酵素的技術、またはこれらのある組合せにより前記組織または臓器から細胞破片を除去することをさらに含む。
【００４５】
第６側面において、前記組織の灌流の間に標的細胞に不可逆的電気穿孔を投与することにより天然の組織源から前記標的細胞を除去して形成された組織スキャフォールドが、本発明の実施形態によって提供される。第７側面において、第６側面のこのようなスキャフォールドは、前記組織の脈管構造を通じて投与される電気穿孔を含むことができる。第８側面において、第６側面または第７側面のスキャフォールドは、天然の組織源の細胞外マトリックス及び血管構造を含むことができる。第９側面において、第６側面乃至第８側面のいずれかの前記スキャフォールドは、約１〜８ｃｍ、または５〜１０ｃｍの少なくとも一つの大きさの厚さを有する前記組織スキャフォールドをもたらすことができる。
【００４６】
第１０側面は、組織の灌流の間、標的細胞に不可逆的電気穿孔を投与して組織スキャフォールドを収得し、前記スキャフォールド上または内に生きている細胞が成長するようにする条件下で、前記生きている細胞を前記スキャフォールドに再接種することにより、天然の組織源から前記標的細胞を除去して形成された人工組織を含む。
【００４７】
第１１側面において、第１０側面の前記人工組織は、前記の天然の組織の脈管構造内に投与された電気穿孔を含むことができる。第１２側面において、第１０側面または第１１側面の前記人工組織のスキャフォールドは、動物（ヒトを含むあらゆる動物）からの組織スキャフォールド及びヒト由来の生きている細胞を含むことができる。第１３側面は、第１０側面乃至第１２側面のいずれかの前記人工スキャフォールドを含み、ここで、前記組織スキャフォールドは、天然の組織源の細胞外マトリックス及び血管構造を含むことができる。第１４側面は、第１０側面乃至第１３側面のいずれかの前記人工組織のスキャフォールドを含み、ここで、前記人工組織のスキャフォールドは、約１〜１０ｃｍの少なくとも一つの大きさの厚さを有する。第１５側面は、第１０側面乃至第１４側面のいずれかの前記人工組織のスキャフォールドを含むことができ、これは、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、消化管、膀胱、前立腺、卵巣、脳、耳、目または肌またはその一部、または他の全ての臓器またはその一部である。
【００４８】
本発明の第１６側面において、下記を含む組織または臓器の標的細胞を除去するための装置を含む：前記組織または器官脈管構造の動脈から静脈に灌流液を輸送するに適した灌流システム；前記組織または臓器脈管構造の前記動脈及び前記静脈内に各々挿入されるに適した第１電極及び第２電極；及び前記第１及び第２電極間に位置した標的細胞の電気穿孔を行うに十分な時間の間、十分な電圧で灌流の間前記第１及び第２電極間の電圧を適用するために前記電極との疎通を作動させる電圧源。本発明の第１７側面において、第１６側面の前記装置は、非熱的不可逆的電気穿孔である電気穿孔を含むことができる。本発明の第１８側面において、第１６側面または第１７側面の前記装置は、灌流液（患者の血液内の生体内または合成灌流液内の細胞外のうち一つ）内のアジュバント巨大分子と共に電気穿孔を含んで、前記電気穿孔された細胞の二次効果を促すことができる。
【００４９】
第１９側面において、前記電極は、第３側面において記載されたように、生きている組織内に挿入され得、ここで、前記標的領域を通じて適用された前記電気エネルギーパラメータは、前記組織の温和な温熱または熱的破壊（高周波アブレーション）のように輸送を誘導する温度での増加を意図的に誘導するように設定される。
【００５０】
本発明の第２０側面において、本発明のある側面は、電気パルスが標的細胞に電気穿孔を起こすに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために投与され、前記標的領域内で発生する疾患を治療するための治療的な遺伝子構成物の導入が可能となるように、機械的灌流下で生きている動物または臓器で実行されるように調整され得る。このような療法は、例えば、インスリンの生産に拍車を掛けるためのＩ型糖尿病での膵島（ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｓ）に対する遺伝子療法を投与することにより役立つだろう（疾患にかかった組織、非がん性）。
【００５１】
本発明の第２１側面において、本発明のある側面は、全身性疾患を治療するために標的細胞を交替するための遺伝子構成物の導入を可能とするために、標的細胞に電気穿孔を起こすに十分な時間の間、十分な電力で電気パルスが前記脈管構造を通じて電場を誘導するために投与されるように、機械的灌流下で生きている動物または臓器で実行されるように調整され得る。このような療法は、筋肉のような組織内に遺伝子を導入させて所望の抗体（療法において血管として用いられる健康な組織）を生産する免疫調整の脈絡で適用可能である。
【００５２】
本発明の第２２側面において、本発明のある側面は、標的領域内または全身性疾患のいずれか一つでの疾患を治療するために、巨大分子の導入を可能とするために、標的細胞に電気穿孔を起こすに十分な時間の間、十分な電力で電気パルスが前記脈管構造を通じて電場を誘導するために投与されるように、機械的灌流下で生きている動物または臓器で実行されるように調整され得る。このような療法は、ある範囲の疾患を治療するための薬物流入を増加させるのに有用であり、がん細胞のみを殺すだけでなく、非がん性疾患を治療することのできる全ての他の薬物も可能である。このような側面は、第２０側面及び第２１側面と類似しているが、遺伝子の代わりに薬物を用いる。
【００５３】
本発明の第２３側面において、本発明のある側面は、前記脈管構造を通じる交差電場の投与が、標的領域または臓器全体の熱焼灼をもたらすように、機械的灌流下で生きている動物または臓器で実行を調整することができる。
【００５４】
第２４側面において、第１側面乃至第２３側面の方法のいずれかは、電気化学療法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ＥＣＴ）、電気遺伝子療法（ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，ＥＧＴ）、ナノ秒パルス電場（ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ，ｎｓＰＥＦ）、高周波不可逆的電気穿孔（Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈ−ＦＩＲＥ）、高周波アブレーション（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｂｌａｔｉｏｎ）、または急性温熱療法（ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）から選択された療法を含むことができる。
【００５５】
第２５側面は、標的細胞の死滅を起こすに十分な電力で十分な時間の間、前記脈管構造内にエネルギーを投与することを含むかさらに含む、本願に言及されたその他の側面の方法を含む。
【００５６】
第２６側面は、第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２電極が前記臓器の他の血管内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の脈管構造を通じて前記電極間に投与される、本願に言及されたその他の側面の方法である。
【００５７】
同様に、第２７側面は、第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２電極が前記臓器の流体導管内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の脈管構造を通じて前記電極間に投与される、本願に言及されたその他の側面の方法である。
【００５８】
また、本発明の第２８側面は、第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、第２電極が前記臓器の他の血管内に挿入され、前記臓器の治療領域は第１及び第２血管間に位置し、電気穿孔が前記臓器の脈管構造を通じて前記電極間に投与される、本願に言及されたその他の側面の方法である。
【００５９】
第２９側面は、第１電極が前記臓器の血管内に挿入され、前記臓器外部の第２外部接地パッド、プレート電極または伝導性ゲルが第２電極として用いられ、電気穿孔が前記臓器の脈管構造を通じて前記電極間に投与される、本願に言及されたその他の側面の方法を含む。
【００６０】
本発明の側面は、標的細胞の非熱的不可逆的電気穿孔を誘導するために、電気穿孔を含むことができる。本発明のある側面は、機械的灌流、生理学的灌流、または物理的、化学的、または酵素的技術、またはそのある組合せにより前記組織または臓器から細胞破片を除去することを含むように調整され得る。また、本発明のある側面は、電気穿孔を感知するか観察するための電気的測定を通じて観察することをさらに含むために調整され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
添付の図面は、本発明の実施形態の一部の明らかな側面を示したものであり、本発明を制限するか規定するために用いられてはならない。記載の叙述と共に図面は、本発明の明確な原理を説明するために提供されたものである。
【００６２】
図１は、本発明に係るＩＲＥ−機械的灌流連結装置の一実施形態の概略図である。
【００６３】
図２は、従来の実験の数値的表現で表された電位及び電場等高線を示したグラフである。
【００６４】
図３Ａ及び図３Ｂは、小葉水準詳細物（モデル２）での二つの異なるシミュレーションの数値結果を示すグラフである：（図３Ａ）外部電極が１５００Ｖ（上部）または接地で設定（下部）のうち一つで充電され、（図３Ｂ）各小葉の中央細静脈は１５００Ｖで充電され、外部電極は接地された。
【００６５】
図４Ａは、５０Ｖ  １００マイクロ秒パルスが胆管に投与され、中央細静脈及び門細動脈（ｐｏｒｔａｌ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅ）が接地されたとき、単一小葉を伴う模擬電場分布を示した図である。
【００６６】
図４Ｂは、血管の機能的ユニットの複合血管ネットワークを示す肝小葉を図式的に表現したものである（Ｓｌｉｅｍａｎ，Ｔ．Ａ．Ｔｈｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｈｔｔｐ：／／ｔｏｎｙｓｌｉｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｐｈｇｙ＿２３０＿ｌｅｃｔｕｒｅ＿ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ．ｈｔｍ参照）。
【００６７】
図５Ａ乃至図５Ｂは、（図５Ａ）能動的に灌流された肝組織上の電極の位置及び、（図５Ｂ）９９、１００μｓ、１５００Ｖ／ｃｍパルスで処理及び４時間の灌流後、結果的に生成された病変を示した写真であり、前記電極の近似値の領域は、黒色輪郭である。
【００６８】
図６Ａ乃至図６Ｃは、治療マージン内で３７９±１４２Ｖ／ｃｍの電場を描写する数値結果を伴う、治療電場の閾値を決定するために用いられた数値モデルの概略図である。
【００６９】
図７Ａ乃至図７Ｂは、パルスが１Ｈｚで適用された後に発生した病変が、０．２５及び４Ｈｚの割合で発生する病変よりも統計学的にさらに大きい（α＝０．１）ことを示すグラフである。
【００７０】
図８Ａ乃至図８Ｂは、結合組織及び血管の保存を示す軽いＩＲＥ処理を受けた領域に対する処理されていない肝組織の組織学的比較を示す顕微鏡写真である。
【００７１】
図９Ａ乃至図９Ｃは顕微鏡写真であり、（図９Ａ）２４時間の灌流後、処理されていない肝臓の部分を示している。２４時間灌流後、針電極を用いて４Ｈｚで９０個の、１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓパルスで処理された同一の肝臓の部分（図９Ｂ）１０ｘの倍率及び（図９Ｃ）２０ｘの倍率を示している。
【００７２】
図１０Ａ乃至図１０Ｂは顕微鏡写真であり、（図１０Ａ）２４時間の灌流後、処理されていない肝臓の部分及び、（図１０Ｂ）２０ｘの倍率で２４時間灌流後、針電極を用いて１Ｈｚで１００個の、１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓパルスで処理された同一の肝臓を示している。
【００７３】
図１１は、本発明に係る灌流電極の写真である。
【００７４】
図１２は、原型電極及び腎臓静脈及び動脈による灌流システムを同時に取り付けられた腎臓を示す写真である。
【００７５】
図１３は、相当な電気抵抗及び静電容量を示す、パルシング前の腎臓からのインピーダンス測定を示すグラフである。
【００７６】
図１４は、１０００Ｖの振幅を有する５０マイクロ秒パルスから結果的に生成された波形を示すモニターの写真である。
【００７７】
図１５は、１００及び２０００Ｖ間の振幅で輸送されるパルスに対する消滅時間及び輸送される最大電流を示すグラフである。
【００７８】
図１６は、パルシング後、３０分の腎臓部分を示す写真であって、赤色部分は生きている組織を示したものであり、白色部分はＩＲＥパルスにより除去された領域を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
参考は、本発明の様々な例示的実施形態を詳細にするために現在作られるだろう。例示的実施形態の下記議論は、本発明を制限しようとする意図ではないことが理解されるだろう。むしろ、下記議論は、読者が本発明の明確な側面及び特徴をさらに詳細に理解するように提供される。
【００８０】
本発明の実施形態によれば、生存可能な脱細胞化された組織スキャフォールドは、持続的な灌流下で臓器上に非熱的不可逆的電気穿孔（ｎｏｎ−ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎ−ＴＩＲＥ）を用いることで達成できる。電気穿孔（可逆及び／又は不可逆）は、プレート電極または針電極を含む公知の技術を用いて、または、さらには臓器または組織の脈管構造を通じて電気的電荷を輸送することで組織及び器官に輸送され得る。
【００８１】
さらに具体的には、電気穿孔は、多くの医学症状を治療するための療法として用いられ得る。非熱的ＩＲＥを含む不可逆的電気穿孔は、ＥＣＭ血管、及び神経を保存しながら組織内で電場を用いて望まない細胞を殺す方法である。細胞を横切って適用されたとき、ある電場は、“電気穿孔”と命名される過程を通じて細胞膜を脱細胞化させる能力を有する。電場が細胞は生存させて細胞膜を一時的に透過するとき、前記工程は“不可逆的電気穿孔”であると知られた。可逆的電気穿孔は、生命工学及び医学で重要な道具となってきた。他の電場は、細胞膜が透過された後、細胞が死ぬことを引き起こすことがある。このような壊死工程は“不可逆的電気穿孔”として知られた。非熱的不可逆的電気穿孔は、望まない組織、例えば、腫瘍組織を除去する新規で最小限に侵襲的な手術技術である。前記技術は、適用しやすく、観察して調節でき、局所血流により影響を受けず、アジュバント薬物を必要としない。最小限に侵襲的な過程は、細胞死亡を促進する細胞膜での構造的変化を引き起こす短く集中的な一連のパルスを輸送するために標的領域内にまたは周囲に針状電極を位置させることを含む。前記電圧は、主要血管及びＥＣＭをかなり損なう相当なジュール（Ｊｏｕｌｅ）加熱を誘導せず組織を電気穿孔させるために適用される。特定組織型及びパルス条件の設定において、不可逆的に電気穿孔された容積を決定するための一次パラメータは、組織内における電場分布である。最近、ＩＲＥ動物実験は、細胞外マトリックス、主要血管、及びミエリン鞘のような主要構造の保存、瘢痕非形成だけでなく、有益な免疫反応の促進のような非熱的細胞除去の特定モードからもたらされた有益な多くの効果が証明された。
【００８２】
電気穿孔は、恐らく脂質二重層のナノ規模ポアの形成を通じて、細胞の透過度の増加を導くパルス電場が適用される非線形生物理学的工程である。Ｗｅａｖｅｒ，Ｊ．Ｃ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏ  ｎａｎｏ  ｓｃａｌｅｓ，ＩＥＥＥ  Ｔｒｎｓ．Ｄｉｅｌｅｃｔｒ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｉｎｓｕｌ．１０，７５４−７６８（２００３）．前記パルスの長さ及び強度がある基準を超えなければ、このような透過度は可逆的であり、細胞の健康及び機能は維持される。決定的な電場強度閾値を超えると（パルスパラメータの通常のセッティングでおよそ５００〜７００Ｖ／ｃｍ）、細胞膜は回復が不可能であり、細胞死が生じることとなる。Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｎｏｎｔｈｅｒｍａｌ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ  ２３６，１２７−１３６（２０１０）；Ｓｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｆｉｎｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｅｅｅ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５２，８１６−８２７，ｄｏｉ：１０．１１０９／ｔｂｍｅ．２００５．８４５２１２（２００５）；ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ａｂｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｃｒｅａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ：Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２５５，４２６−４３３，ｄｏｉ：１０．１１４８／ｒａｄｉｏｌ．１００９０３３７（２０１０）（“Ｌｅｅ  ２０１０”）を参照してほしい。
【００８３】
サブミリメートル解像度を持つ正確で調節可能な方式で壊死を誘導する、細胞の膜を永久的に不安定にするパルスの適用（Ｅｄｄ，Ｊ．Ｆ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｌ．，Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．，Ｍｉｒ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｂ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｆｏｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｉｅｅｅ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５３，１４０９−１４１５，ｄｏｉ：１０．１１０９／ｔｍｂｅ．２００６．８７３７４５（２００６））は、非熱的不可逆電気穿孔（ｎｏｎ−ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎ−ＴＩＲＥ）でも言及される工程である（Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．，Ｍｉｒ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｂ．Ｔｉｓｓｕｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３３，２２３−２３１，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ  １０４３９−００５−８９８１−８（２００５）（“Ｄａｖａｌｏｓ  ２００５”））。前記技術は、熱メカニズム（Ｄａｖａｌｏｓ  ２００５）に依存せず、下にある細胞外マトリックスの構造を保存するものと見られる。研究は、神経導管及び胆管が除去領域内で損傷を受けないことを示す。Ｍａｏｒ，Ｅ．，Ｉｖｏｒｒａ，Ａ．，Ｌｅｏｒ，Ｊ．＆  Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｂ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６，３０７−３１２（２００７）。さらに、生体内の肝切開領域は、小血管で最小限の損傷及び最小限の脈管炎を示した（Ｌｅｅ  ２０１０）。
【００８４】
低温酸素化灌流（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ  ｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ＨＯＰＥ）は、生理学的な温度以下で全体臓器に酸素化された、栄養素が豊富な血液代替物を機械的に輸送する全体臓器保存方法である。Ｄｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．，ｄｅ  Ｒｏｕｇｅｍｏｎｔ，Ｏ．＆  Ｃｌａｖｉｅｎ，Ｐ．Ａ．Ｍａｃｈｉｎｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ‘Ｍａｒｇｉｎａｌ’ｌｉｖｅｒ  ｇｒａｆｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．８，９１７−９２４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１６００−６１４３．２００８．０２１６５．ｘ（２００８）；及びＭｏｎｂａｌｉｕ，Ｄ．＆  Ｂｒａｓｓｉｌ，Ｊ．Ｍａｃｈｉｎｅ  ｐ
ｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌ．１５，１６０−１６６，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＭＯＴ．０ｂ０１３ｅ３２８３３７３４２ｂ（２０１０）を参照してほしい。この方法は、７２時間の保存時間に達するために行われた研究（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．７２−Ｈｏｕｒ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ  ｂｙ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＵＷ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｃｏｌｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１，２８８−２９２（１９９１）であり、温虚血（ｗａｒｍ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）を持って腎臓の保存質及び移植成功率を改善することが成功的に証明された｛Ｏｌｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｏｎｏｒ  ｌｉｖｅｒｓ．Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，３３７−３４３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｒｙｏｂｉｏｌ．２０１０．０３．００５（２０１０）；及びＳｔｅｇｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｈｉｒｎｅｒ，Ａ．，Ｒａｕｅｎ，Ｕ．＆  Ｍｉｎｏｒ，Ｔ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＴＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｇｒａｆｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６０，１５５−１６２，ｄｏｉ：：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｓ．２００８．１０．０２１（２０１０）参照｝。Ｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｒｏｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．は、灌流流体が生理学的な温度またはその近くで維持される正常温度の灌流を用いて臓器質を延ばす能力を証明した。Ｓｃｈｏｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｏｒｇａｎ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｒｍｏｔｈｅｒｍｉｃ  ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２３３，１１４−１２３（２００１）；及びＢｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｒｍｏｔｈｅｒｍｉｃ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ａ  Ｎｅｗ  Ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２５０，１−６，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＳＬＡ．０ｂ０１３ｅ３１８１ａ６３ｃｌ０（２００９）を参照してほしい。
【００８５】
このような臓器保存方法は、死後（ｐｏｓｔ  ｍｏｒｔｅｍ）組織の生体内及び自然分解で観察される免疫反応からＮ−ＴＩＲＥ組織除去効果を分離するのに用いられ得る。最近は、細胞外マトリックスを破壊せずに細胞を破壊するＮ−ＴＩＲＥの能力を活用して（Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｒｅａｔｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ（２００９）；及びＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．，Ｍａｏｒ，Ｅ．＆  Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｂ．Ｎｏｎ−Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ，ｄｏｉ：１０．１１１５／１．４００１８８２（２０１０））Ｎ−ＴＩＲＥを臓器脱細胞化によるスキャフォールド形成のための実行可能な手段にすることが変形実験室モデルの使用を通じて決定された。
【００８６】
Ｎ−ＴＩＲＥ処理の結果は、臨床的に意味があり、組織工学に広く用いられ得る、多くのモデリング組織除去／脱細胞化を通じて予想され得る。Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．＆  Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｂ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｔ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ５１，５６１７−５６２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｊｈｅａｔｍａｓｓｔｒａｎｓｆｅｒ．２００８．０４．０４６（２００８）；Ｅｄｄ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｌａｎｎｉｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６，２７５−２８６（２００７）；及びＮｅａｌ，Ｒ．Ｅ．，ＩＩ  ＆  Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．，Ｔｈｅ  Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３７，ｄｏｉ：：１０．１００７／ｓｌ０４３９−００９−９７９６−９（２００９）を参照してほしい。
【００８７】
人工スキャフォールドはレシピエントの細胞で再接種され、機能的臓器構造をもたらす。このような臓器再生方法は、移植用臓器の供給不足を減少させるのに用いられるだろう。
【００８８】
本発明の実施形態は、臓器の脈管構造を通じる不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）の輸送方法、システム及び装置に関するものである。生体外または生体内にこのような方法で投与されるＩＲＥは、血管化された臓器内に深く内在した腫瘍を治療するのに用いられ得る。本発明の実施形態の適用は、また、臓器を脱細胞化し、細胞外マトリックスを損なわずに細胞破片は除去された既存の組織からスキャフォールドを生成するために、組織及び臓器の脈管構造を通じてＩＲＥを用いることを含む。
【００８９】
一般に、除去過程は、標的組織に一連の低エネルギー（集中的であるが短い）電気パルスを輸送することを含む。このようなパルスは、前記標的組織の細胞膜を回復できないくらい不安定にして、電場により影響を受ける細胞を殺す。前記治療は非熱的であり、本質的に前記標的組織の前記細胞膜にのみ影響を及ぼし、治療された組織内で神経または血管には影響を及ぼさない。
【００９０】
本発明は、非熱的−不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）を用いて形成され得る脱細胞化されたスキャフォールドを提供する。前記臓器または組織は、医学分野において一般的な技術である前記過程中に及び／又は後に灌流され得る。
【００９１】
スキャフォールドを製造した後、組織工学は、スキャフォールドへのヒト細胞の生体外接種及び付着を含むことができる。これまで、組織工学用に最も成功的なスキャフォールドは天然のものであり、大きな動物（例えば、豚）の臓器を化学的及び／又は機械的脱細胞化して作られた。
【００９２】
本発明の実施形態は、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する方法を提供する。一般に、細胞及びその下のスキャフォールドを含む組織は、前記組織の細胞を殺すに十分な期間の間、電力の電場で生体内または生体外で処理され得る。前記電場は、前記臓器の前記脈管構造内に直接的に投与される。前記電場は、血管システムの壁により前記臓器の脈管構造を通じて誘導される。好ましくは、前記電気パルスは、下にあるスキャフォールド及び前記臓器または組織の脈管構造に崩壊を避ける方式で投与される。
【００９３】
前記方法は、人工組織で用いるための組織スキャフォールドを製造するに適している。組織の源は制限されないが、例示的な実施形態において、前記組織は、豚、牛、馬、猿、または類人猿のような、相対的に大きな動物または（重要な組織において）ヒトと類似した解剖学構造を有するものと認知される動物に由来する。実施形態において、前記組織の源はヒトであり、これは、前記スキャフォールドに基づく人工組織の拒絶の可能性を減少させるための用途である。
【００９４】
好ましい実施形態において、前記方法は、毛細管のような血管構造を損傷しない。実施形態において、前記方法は、前記電場で処理する前に、前記組織内に存在する神経管を損傷しない。本願において用いられたように、用語“損なわれていない”は、要素が相当な規模でその本来の機能を行えるようにする状態を意味する。それゆえ、例えば、損なわれていない毛細管は、血液を運搬可能な毛細管であり、損なわれていない神経管は、ニューロンを収容可能な神経管である。実施形態において、血管系及び神経系だけでなく胆管または乳管のような例を含む他の腺状構造の細胞は、損なわれずに残っている。このような実施形態において、前記細胞は、前記スキャフォールド及び人工組織の一部として残ることがあるか、または適切な処理技術またはスキャフォールド上に接種された細胞または前記人工組織を収容する身体の細胞により除去され得る。
【００９５】
本発明の実施形態によれば、組織は、前記組織の細胞の壊死を引き起こすには時間及び電力で十分な、しかし、細胞が存在するスキャフォールドを有意に破壊するには不十分な電場に露出する。しかも、好ましい実施形態において、前記電場は、前記組織の加熱の結果として不可逆的組織損傷を発生させない。このような電場を提供する様々な方式が可能である。典型的な実施形態において、一つ以上の電気パルスが適用されて電気の結果として細胞膜破壊を発生させ、熱の結果としてはほとんど発生させない。二つ以上のパルスが用いられると、前記パルスは、他のものの中で、前記組織が冷却されるようにする時間の期間により分離されて、熱損傷が相当な規模で起こらないようにした。例えば、一つ以上の電気パルスは、約５マイクロ秒（μｓ）から約２００秒の範囲の間、関連する組織に適用され得、パルスは、１〜２４時間の間の期間にわたってさらに低い繰返し率で適用され得る。便宜上、短期間の処理が望まれる。このように、好ましい実施形態において、約１〜１００００μｓの期間の間、電気パルスが適用される。また、組織に輸送されるパルスの数に対する制限はないが、好ましい実施形態において、約１〜約１００個のパルスが前記組織に適用される。例えば、例示的な実施形態において、期間内にそれぞれ１００μｓの約１０〜１０００個のパルスが細胞性の除去のために前記組織に適用される。
【００９６】
しかる後、臓器は、細胞破片を除去するために灌流パラメータを調節することで脱細胞化スキャフォールドを形成するために処理され得る。細胞破片の機械的浄化は、前記破片の除去の所望の結果を達成するために必須なある程度の時間の間、例えば、４、１２、２４、４８、または７２時間の期間にわたって実行され得る。心臓収縮圧力、心臓拡張圧力、及び温度を含む灌流パラメータは、細胞破片の除去効率を改善するために調節され得る。また、細胞破片の除去を増加させるか促進させることが必須な場合、マイルドな洗浄剤が加えられ得る。好ましい実施形態は、９９％の細胞破片及びＤＮＡ構造の除去をもたらす灌流プロトコルを提供する。
【００９７】
本発明の実施形態は、エネルギー量を変更して適用（可逆及び不可逆的電気穿孔のいずれも）することは、一般細胞及び新生物細胞の選択的な除去を含む広範囲な好ましい組織除去効果を生成するために調節され得る方法を提供する。
【００９８】
本発明によれば、エネルギー適用の前記効果は、例えば、下記を含む多数のパラメータを変更して調節され、調整され得る：エネルギーの電圧、アンペア数、期間及び周波数；エネルギー供給システムの設計及び位置調整；精巧で、精密に調節された血管灌流システムの設計及び使用；精巧で、精密に調節された血管灌流システムの生理学的模倣特性；生体外臓器及び組織の灌流及び保存条件；生体内臓器及び組織の灌流及び保存条件；及び／又は前記エネルギー適用システム及びプロトコルの拡張として部分的にまたは全体的に作用する血管内流体の組成。
【００９９】
このような努力で、組織スキャフォールドの製造、または生体内または生体外腫瘍の治療、または疾患にかかったか他の方式で標的化された組織内での適した巨大分子の生体輸送の保障のために非熱的ＩＲＥの使用で観察されるか調節され得る種々のパラメータがある。例えば、本発明の実施形態は、インスリン生成を刺激するＩ型糖尿病での膵島の遺伝子療法、即ち、非がん性疾患組織がある状況で用いられ得る。本発明は、また、所望の抗体を生成するために筋肉のような組織内に遺伝子を導入させ、即ち、療法のための導管として健康な組織を用いて、免疫調節にも適用され得る。特定適用のために変更され得るパラメータは、電圧勾配を含む。実施形態において、前記パルスは、約１０ｖｏｌｔ／ｃｍ〜約１０，０００ｖｏｌｔ／ｃｍの範囲で電圧勾配を生成する。電圧勾配（磁場）は、組織サンプル、組織特性及びその他の因子に依存して変更される、電極及び電極幾何学の間の距離の関数である。いくつかの実施形態において、二つの電極が用いられ、この電極を約５ｍｍ〜１０ｃｍの間隔で位置させた。典型的な電極直径は、０．２５〜１．５ｍｍの範囲であり、通常、２個または４個の電極が用いられる。実施形態において、一つの双極電極が用いられる。また、前記“電極”は、絶縁される部分（非伝導性被覆の使用を含む）及び伝導性部分（例えば、端部）を含むことができ、電気電流の適した適用を保障し、前記組織の一部における過度な熱の生成を最小化することができる。
【０１００】
適した電場及び露出期間は、腫瘍の除去のための医学治療に適したものとして文献で報告されたものである。例示的な露出パラメータは、次を含む：１Ｈｚまたは４Ｈｚの周波数での１．５ｋＶ／ｃｍで９０個の９０マイクロ秒（μｓ）パルス；１Ｈｚまたは４Ｈｚの周波数での２．５ｋＶ／ｃｍで８０個の１００μｓパルス；４００Ｖ／ｃｍで１個の２００ミリ秒パルス；１秒当たり１０個のパルスの周波数で３８００Ｖ／ｃｍでの１０個の１００μｓパルス；約１Ｈｚまたは４Ｈｚの周波数で１０００〜１６６７Ｖ／ｃｍの範囲の９０個の１００μｓパルス；及び１Ｈｚまたは４Ｈｚで１０００〜３０００Ｖ／ｃｍの範囲の８０個の１００μｓのパルス。一般に、パルシングの前記周波数は、パルス幅の半分程度に低くてもよく、かなり遠い間隔であってもよい。前記組織に相当な熱損傷なしに電気穿孔を可能とする、ある適した周波数も許容可能である。電流は、ＤＣまたはＡＣのいずれかに適用され得る。実際に、特定の所望の結果を達成するために適用可能なこのようなパラメータを調整することは、本分野の技術に属する。ある数のパルス、例えば１〜１０００個のパルスが投与され得る。前記パルスは、１マイクロ秒〜１秒のような、ある時間量の期間を有することができる。前記電圧は、所望の効果によって可逆または不可逆的電気穿孔を達成するためのある量となることができ、例えば５００Ｖ／ｃｍ〜５０００Ｖ／ｃｍ、例えば１５００Ｖ／ｃｍを含むことができる。実際に、毛細管床でＩＲＥを達成するために、遥かに少ない電圧、例えば、約１Ｖ／ｃｍから約１０００Ｖ／ｃｍまでの順序で要求され得る。
【０１０１】
前記電極の形態及び大きさは、本発明の実施において重要でない。本分野の当業者は、前記組織内に所望の電場を伝送するに適した如何なる形態及び大きさでも選択できる。例えば、前記電極は、プレート型、ワイヤ型、または針型であってもよく、円形、楕円形、四角形、矩形、ダイヤモンド形、六角形、八角形等の形態であってもよい。ワイヤ型電極において、前記電極が脈管構造を閉塞しないようにするために、ワイヤが挿入される脈管構造よりも小さい直径が好ましい。いくつかの設計及び兆候において、臓器または組織の循環の一部の分離を提供する閉塞装置の一部である電極の使用が好ましい。同様に、前記電極の表面領域は、本発明の実施において重要でない。それゆえ、例えば、前記表面領域は、約０．５ｃｍ2、約１ｃｍ2またはそれ以上であってもよい。臓器または組織の脈管構造に直接挿入される電極において、好ましくは、前記電極は、前記脈管構造内で適した距離の電極を提供するために十分な長さの長いワイヤ型電極である。前記ワイヤ型電極の直径は、また、好ましくは、前記電極と前記脈管構造の内壁との接触を避けるか最小化させ得るように、臓器脈管構造の様々な類型内に挿入するために調整され得る。いくつかの実施形態において、前記電極及び前記脈管構造の壁の間が少なくとも一部分離されている。ワイヤ型電極において、前記電極間の標的領域の境界（ｂｏｕｎｄｓ）を越えて移動する結合されたエネルギー損失及び電流の電位を減少させるために前記標的領域の血管の“アップストリーム”及び“ダウンストリーム”を一時的に閉塞させることが可能である。生体内で実行されるこのような実施形態は、標的領域及びある“ダウンストリーム”領域に許容されない虚血効果を誘導しない時間期間内で前記パルスを輸送するだろう。さらに具体的には、このような技術は、前記標的臓器または組織の上下の前記血管をクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）して、前記血管の残りが電流を伝導しないようにする（絶縁された血管壁を有するクランピングは、回路を“開放”するだろう）。これは、細胞を殺すことを目的としない遺伝子または薬物輸送の適用にさらに適切で、前記組織の損傷なしにこれを行うことができる適したウィンドウが存在しなければならない。本発明のこのような方法は、例えば、プラークの除去に用いられ得、例えば、約１０分間頸動脈を閉塞させて頸動脈からプラークを除去する。
【０１０２】
いくつかの状況において電場に組織を露出させると熱が発生する。熱による組織の損傷を避けるために、前記組織に移送されるエネルギーの量を単位時間当たり閾値水準未満にセッティングした。時間及び温度パラメータは、ＩＲＥに対して本分野において公知になっており、如何なる適切な組合せも用いられ得る。例えば、前記組織の温度は、除去のための処理の間観察され得、電気パルスは、１００℃以下、例えば、６０℃以下、または体温に前記温度が維持されるように調節する。実施形態において、前記温度は、特定臓器または被検者に正常な生理学的温度に維持され得る。いくつかの実施形態において、前記温度は５０℃以下に維持される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記組織の生物細胞にわたって平均の不可逆的電気穿孔を得るために適用された電圧、パルスの長さ、及び／又はパルスの数を調節して、非標的組織での損傷を最小化する水準で前記組織内の前記生物細胞の不可逆的電気穿孔を達成することを含む。プロトコルは、電気電荷の投与を通じて同一または変更されたパラメータを含むことができる。同様に、いくつかの実施形態において、前記適用される電圧の期間は、確認された標的細胞の不可逆的電気穿孔を達成するために、電圧に対する電流の割合によって調節され、これによって、細胞膜が細胞死滅を引き起こす方式で崩壊される。さらなる例示パラメータを下記に記載した。
【０１０４】
実施例１−マルチフィジックス・モデリング
【０１０５】
電気パルスの輸送のための経路として血管系を用いることの実現可能性を確立するために、予備マルチフィジックス・モデリングが実施された。細胞膜における多孔（可逆的または不可逆的）の発達のための主要因子である電場分布は、有限要素法（ｆｉｎｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてモデリングされた。３つの肝組織モデルが細部の異なるレベルで肝臓構造を示すように開発された。コムソル・マルチフィジックス（Ｃｏｍｓｏｌ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ）がラプラスの方程式に従い、電気電位（Φ）を計算するために用いられた：
【０１０６】
2014501574.tif 000003
【０１０７】
ここで、σは、電気伝導度である。
【０１０８】
モデル１：先ず、前記組織の側面のうち一つに１ｃｍ直径のプレート電極を有する２ｃｍ厚さの均質構造を、前記肝臓をモデルとして形成した。このようなモデルを電場強度に対して実験的病変を関連させるために用いた。単一１０マイクロ秒１５００Ｖ／ｃｍパルスを上部電極に輸送し、下部電極は接地された。図２に示されたように、このモデルの結果は、用いられた電気パラメータに対して、約４００Ｖ／ｃｍのシミュレーションされた電場強度が実験結果と同程度の幅の病変を生成するために要求されることを示した。
【０１０９】
【表１】
2014501574.tif 000004
【０１１０】
モデル２：肝臓は、脈管構造、リンパ及び胆管の多くのセットが存在する複合的な器官である。肝臓の門静脈（ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）及び肝臓の動脈の分枝は、血液をろ過し、バクテリアを除去し、胆汁を生成するために構造的に機能する、基本機能単位である小葉に血液を輸送する。小葉を通じて輸送された血液は、結局、肝静脈内に流れて循環系に血液を戻す大きな中央細静脈に届く。灌流下において、灌流液は、前記脈管構造を通じて移送される流体として血液を代替する。しかし、胆汁の生産が２４時間まで持続することが見出されたことが言及された。二つの異なる様相の電圧適用が用いられたとき、前記の複合的な脈管構造がどのように電場分布に影響を及ぼすかを理解するために秒（ｓｅｃｏｎｄ）多重−規模モデルを製造した。第一の様相は、前記組織の外部に位置した典型的な電極を用い、第二の様相は、電圧源として中央細静脈を用い、接地として外部電極を用いた。小葉を、豚組織学と一致するように、５ミクロンの結合組織層及び２００ミクロン直径の中央細静脈で囲まれた１ｍｍの等価半径を持つ六角形のモデルに形成した。単一１０マイクロ秒１５００Ｖ／ｃｍパルスで再び刺激した。
【０１１１】
前記組織内の前記電場分布は、外部電極が用いられたとき、前記小葉の上皮層により発生するさらなる不均質性に有意に変化しなかった。ほとんどの有意な変化は、さらに高い伝導性の中央細静脈に近接して現れた。各小葉の前記中央細静脈は１５００Ｖで充電され、かなり異なった電場分布が形成された。不可逆的に電気穿孔されるに十分な電場に達した組織領域は、前記組織内にわずかにおよそ０．５ｃｍ広がった。電場適用のこのような様相は全体の脱細胞化に十分ではないが、高度に血管化された臓器の表面に近い腫瘍を治療するには効果的な手段となり得る。図３Ａに示したモデルは、１５００Ｖ（上部）または接地設定（下部）のいずれか一つで充電された外部電極を示すものであり、このような様相を用いる前記電場分布が添加された不均質性とともに有意に変化しないことを立証した。図３Ｂに示されたモデルは、１５００Ｖで充電された各小葉の中央細静脈を示し、外部電極は接地された。図３Ａ−Ｂに示したモデルは、流体が前記小葉を通じて門細動脈（ｐｏｒｔａｌ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅｓ）及び門細静脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｎｕｌｅｓ）から前記中央細静脈に容易に流れるので、完全に生理学的に精密でないことが言及された。
【０１１２】
モデル３：モデル３は、単一小葉の頂点に門細動脈、門細静脈、及び胆管を含む。中央静脈は、バルク肝組織により囲まれている。適用された１０マイクロ秒パルスの規模は、バルク肝組織で見られる範囲で電場分布が発達するまで変更された。
【０１１３】
このようなシミュレーションからの結果を図４Ａに示した。このようなシミュレーションからの結果は、単一小葉内で電場を誘導するＩＲＥの発達が、前記臓器の脈管構造を用いて可能なものであることを示す。さらに、５０ＶパルスがＩＲＥ誘導水準に対して前記電場を増加させるに非常に十分であることが見出された。これは、電場が全体組織構造にわたって適用されたとき、ＩＲＥを誘導するために必須な１５００Ｖパルスよりもかなり少ない。前記中央静脈から門細動脈及び細静脈に接触する複合的な微細脈管構造ネットワークがあることが、図４Ｂ及び組織学的試料から見られる。．前記脈管構造の間に胆管に胆汁を分泌する肝細胞がある。モデル１及び２は、このような微細脈管構造ネットワークが電流の流れに対して相当な抵抗を示し、前記小葉の内部構造が不均質組織としてモデリングされ得ることを推定する。これは、赤血球（生体内）または上皮細胞が電場により損なわれた場合に、どこで血管閉塞が生じ得るかの適当な推定である。
【０１１４】
【表２】
2014501574.tif 000005
【０１１５】
脈管構造及び微細脈管構造の抵抗（Ｒ）の近似値は、関係式を解いて前記流体伝導度（ρ）が知られた場合、容易に得られる：
【０１１６】
2014501574.tif 000006
【０１１７】
ここで、Ｌ及びＡは、それぞれ前記血管の長さ及び前記血管の断面積である。表２で表される結果は、血管がリン酸塩緩衝溶液で満たされたとき、直径が１０μｍ直径及び長さが１００μｍの血管は、抵抗が９０ｋΩと同じくらい高くなり得る。非常に著しいが、この抵抗は、微細脈管構造を通じる電流の流れを防止するほど十分に高くはない。さらに、前記臓器のあらゆるところで平行に連結された多大な数の微細血管は、全体電気抵抗を急激に減少させるだろう。
【０１１８】
本発明の一実施形態は、前記臓器または組織の能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の間にＩＲＥを投与することにより、スキャフォールドを調整することである。電極は、標的領域を通じて前記細胞の不可逆的（または可逆的）電気穿孔を発生させる電気パルスの適用を伴う前記組織の近傍内にまたは近くに位置できる。前記電気パルスを投与する一つの方式は、前記臓器自体の前記脈管構造を通じるものである。前記電極の位置は、処理される領域を規定する；それゆえ、前記治療される領域は、開始物質として用いられる全体組織または器官の単に一部分であってよい。前記電気パルスは、治療される細胞の膜を不可逆的にまたは可逆的に通過して（不可逆的な場合）細胞死滅を起こす。前記電気パルスの時間の長さ、適用された前記電圧、及び結果的に生成された膜透過性は、規定された範囲内で全て調節される。細胞死滅を引き起こす電気パルスの適用は、前記臓器、好ましくは、微細循環（ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）及びマクロ循環（ｍａｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）に関連した臓器の脈管構造の一部または全部を依然として保護することができる。いくつかの実施形態において、微細循環構造は、部分的または全体的に損なわれ得るが、さらに大きい構造は維持された。
【０１１９】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの実施例において、細胞内物質を除去するための二次技術が用いられ得る。例えば、公知の全ての物理的、化学的または酵素的技術を、前記不可逆的に透過された細胞から細胞破片を除去するのに用いることができる。同様に、前記人工組織は、前記人工組織を通じて液状組成物（例えば、洗浄剤含有液状組成物）をポンピングできる人工灌流システムに付着され得、前記スキャフォールドから細胞破片を除去できる。このような二次処理が細胞破片の除去を可能とするが、前記スキャフォールディング構造（血管及び神経構造を含む）の残留も可能とする相対的に穏やかな条件下で適用され得ることが重要である。非熱的ＩＲＥの使用は、このような穏やかな工程を可能とし、非熱的ＩＲＥに依存しない工程に比べて、最終的に製造されるスキャフォールドを改善する。
【０１２０】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実施例の方法において、前記不可逆的透過された細胞から残っている前記破片は、ｉｎ  ｓｉｔｕで残っていることがあり、身体の自体循環及び免疫システムのような自然的な工程を通じて除去され得る。
【０１２１】
組織を脱細胞化させる不可逆的電気穿孔の概念は、本分野において用いられる他の形態の脱細胞化と異なる。不可逆的電気穿孔は細胞を死滅するために電気を用いるため、化学的及び物理的方法または浸透圧不均衡を用いる細胞溶解と異なる。不可逆的電気穿孔は、前記標的された組織内の細胞の細胞膜だけを破壊し、その下にある細胞外マトリックス（ＥＣＭ）には損傷を与えないため、より穏やかな方法である。逆に、化学的及び物理的方法は、ＥＣＭ、血管、及び神経のような必須構造を損なうことがある。本願において記述されるタイプＩＲＥは、特定の手段、即ち、細胞膜の致命的な崩壊により細胞死滅を誘導するための有効手段として提供するために電気パルスを用いる。
【０１２２】
不可逆的電気穿孔は、前記ＥＣＭに実質的に影響を与えないか、影響を及ぼさない最小限に侵襲的な過程で組織を脱細胞化するのに用いられ得る。脱細胞化の非選択的モードは、組織工学分野において許容可能であり、浸透圧不均衡、冷却、または化学的脱細胞化を誘導するいくつかの方式は、超音波処理に相当するという結果を提供する。
【０１２３】
本発明の例示的な一実施形態は、前記臓器または組織の能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の間、非常に正確に決定された長さのパルス及び電圧を適用することにより組織の細胞が不可逆的に電気穿孔される方法を含む。これは、熱損傷なしに不可逆細胞損傷を得るためにリアルタイムで電気的インピーダンスでの変化を測定及び／又は観察し、電気穿孔の開始で減少に注目し、リアルタイムで電流を調節して実施され得る。そのため、前記方法は、電気処理の効果を観察するためのコンピュータ装置及びセンサを含むことができる。電圧が適用される実施形態において、前記インピーダンスの観察は、使用者に多孔の存在及び欠如に対する情報を提供する。このような測定により、多孔形成の進展を示し、細胞の死滅を導く不可逆的多孔形成が発生したかが示される。
【０１２４】
他の実施形態は、組織中の細胞の電気穿孔の開始及び規模が、前記組織の電気インピーダンス（本願においては、電流に対する電圧を意味するために用いられた）での変化に相互に関連し得る方法を提供する。与えられた地点で、前記電気穿孔が不可逆的となる。生物細胞のグループの耐性での減少は、前記細胞の膜が多孔形成により透過性となったときに生じる。組織中の生物細胞のインピーダンスを観察して、細胞の多孔形成が発生する平均的な時間だけでなく、前記多孔形成に起因した細胞膜透過性の相対的な程度を検出できる。与えられた組織内で電圧を段階的に増加させて細胞を試験することにより、不可逆的電気穿孔が生じる地点を決定できる。しかる後、このような情報を前記組織の前記細胞に不可逆的電気穿孔が経たことの確立に用いることができる。このような情報は、また、前記電圧の大きさの選択を決定することにより前記電気穿孔の工程を調節するために用いることができる。他のイメージ技術を、領域がどれだけ処理されたかを観察するために用いることができる（例えば、超音波、ＭＲＩ、ＣＴ等）。
【０１２５】
本発明は、電気穿孔の実際発生の直接誘導及び多数の細胞で平均程度の電気穿孔の誘導を提供する多数の細胞に同時に起こる不可逆的電気穿孔を提供する。このような発見は、同様の理由から、生物組織（隣接する膜を有する生物細胞の塊）の不可逆的電気穿孔において同様に有用である。このような工程の利点は、電気穿孔の開始点に対する高水準の統制を含む。
【０１２６】
本発明の実施形態の一特性は、前記組織の電気穿孔の間、電流の大きさが電気穿孔の程度に依存するようになるにつれ電流及びパルス長さが所定の範囲に調節されて、細胞及び組織周囲の細胞損傷を最小化する前記組織の標的細胞の不可逆的電気穿孔を得ることである。本発明の実施形態の他の特性は、パルスの長さ及び電流が、細胞の死滅を引き起こす細胞内の電気調節よりもさらに高く、そして、周辺組織に熱的損傷をもたらし得るものよりも低いる範囲内で正確に調節されることである。本発明の実施形態の他の特性は、回路を通じて電流（リアルタイム）を測定することが、前記組織中の前記細胞が達成する電気穿孔の平均的な全体としての程度の測定値を与えることである。
【０１２７】
実施形態のまた他の特徴は、前記組織の正確な電気抵抗が、プローブ電極への交差時間の電圧測定及び電気穿孔の電極に付着された回路を用いた交差電流の測定から計算され得ることを含む；前記組織の正確な電気抵抗が、プローブ電極への交差時間の電圧測定及び電気穿孔の電極に付着された回路を用いた交差電流の測定から計算されることを含む；前記組織の電気測定は、前記組織の電気穿孔分布をマッピングするのに用いられ得る。不可逆的電気穿孔において、実際に不可逆的であることを立証するために、前記電気穿孔後に実質的な時間（数分またはそれ以上）で電流またはＥＩＴの測定を実行することが可能であるか、ひいては好ましい。
【０１２８】
前記方法の実施形態において、非熱的ＩＲＥへの一次細胞破壊後に脱細胞化されたスキャフォールディングから細胞破片を除去することが好ましい。このような実施形態において、公知の全ての物理的、化学的、及び／又は酵素的方法を含む、このようにするための全ての公知技術が用いられ得る。例示的な一実施形態において、細胞物質の除去は、残っている無償の脈管構造を通じる一般的な拡散、移送またはこの両方の混合を用いて、適切な剤（例えば、水、ｐＨ調節された水、一つ以上のキレート剤の水溶液等）と共に組織スキャフォールディングの灌流を通じて少なくとも部分的になされ得る。
【０１２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法において、前記スキャフォールドを殺菌することが好ましく、特に宿主内に移植するために処理された組織及び臓器を製造するためにスキャフォールドを用いる場合、殺菌することが好ましい。患者の拒絶リスク（例えば、ＤＮＡ断片に起因する）を低下するために、脱細胞化後の殺菌及び／又は破片の除去が、移植物として用いられるスキャフォールドに対して一般的になされる。スキャフォールドがいくつかのタイプの殺菌を必要とするとき、スキャフォールドの殺菌のために、文献において公開された方法を用いることができる。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法において、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する前記方法は、その自然環境から単離された脱細胞化された組織スキャフォールドをもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏの方法において、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する前記方法は、通常の細胞形質成分のない組織スキャフォールドをもたらす。そのため、本発明の側面において、前記人工組織のスキャフォールドが提供される。前記処理された組織スキャフォールドは、その自然環境から除去されたか／細胞形質成分が除去された天然のスキャフォールドを含む。本発明の前記人工組織のスキャフォールドは、その天然状態における前記組織内に存在する前記血管構造（即ち、動脈、静脈、毛細管）及び伝導性の構造（即ち、導管）の少なくとも一部、好ましくはほとんど、及びさらに好ましくは実質的に全部または全部を含む。実施形態において、前記組織スキャフォールドは、その天然状態において前記組織に存在する神経構造の少なくとも一部、好ましくはほとんど、及びさらに好ましくは実質的に全部または全部を含む。実施形態において、前記スキャフォールドは、このような血管構造及び／又はこのような神経構造を構成する前記細胞をさらに含む。好ましくは、前記人工組織のスキャフォールドは、前記スキャフォールドに自然的に存在する減少した数の前記細胞を含む。起源となる細胞のほとんど、さらに好ましくは、前記起源となる細胞の実質的に全部、及び最も好ましくは、前記起源となる細胞の全部は、前記人工スキャフォールドに見られない。実施形態において、残っている細胞は、血管または神経構造を含む細胞である。
好ましい実施形態において、前記細胞からの一部、ほとんど、または全部の細胞破片は、前記人工組織のスキャフォールドに見られない。同様に、実施形態において、前記組織スキャフォールドは、前記組織中に元から存在するニューロンの一部または全体を含む。しかし、実施形態において、前記ニューロンは破壊されるが、前記ニューロンが存在する神経管は損なわれずに残っている。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、前記人工スキャフォールドは、前記スキャフォールドに元から（即ち、自然的に）存在する細胞からの細胞破片を含む。前記議論されたように、このような実施形態において、前記細胞破片は、公知の手段を利用して除去され得る。あるいは、前記細胞破片の一部または全部が前記スキャフォールド内及び上に残ってもよい。細胞破片が前記スキャフォールド上に残っている実施形態において、前記スキャフォールド上に接種される新たな細胞の作用によって、及び／又は新たな細胞の接種、浸透、及び成長工程の間に後ほど除去され得る。例えば、新たな細胞が細胞破片を含むスキャフォールド上に接種されると、前記新たな細胞の浸透及び成長の活動のみで、または前記の新たな細胞の付与及び支持のための灌流手段との組合せで前記細胞破片の除去をもたらし得る。
【０１３２】
本発明は、前記スキャフォールド上及び内で細胞が成長するための栄養素及びガスを提供する機能を果たす血管構造を含む人工組織のスキャフォールドを提供する。前記人工スキャフォールドを生成するための非熱的ＩＲＥの使用は、このような重要な構造の維持を許容し、医学、獣医学及び研究活動での使用のための改善されたスキャフォールドを提供する。そのため、本発明は、相対的に大きな寸法を有し得る人工スキャフォールドを提供する。即ち、独創的なスキャフォールド内で成長する再接種した細胞が栄養素及びガスを得るために外部表面に近接（即ち、１ｍｍ以内）する必要がないため、前記人工スキャフォールドは、本分野において既に公知のスキャフォールドよりもさらに厚いことがある。人工スキャフォールドは、脱細胞化をもたらすために十分な電場を生成する能力があることを唯一の制限として、どのような望ましい範囲の厚さをも有し得る。しかし、このような制限は、有意な物理学的制限ではなく、これは、ＩＲＥに影響を及ぼす電極の位置が本発明の実行者の要求によって容易に調節され、調整されるためである。
【０１３３】
本発明の人工スキャフォールドは、これらが由来とする前記組織及び臓器の厚さに近接するか類似した厚さを有してもよい。例示的な厚さは、相対的に薄い（即ち、１ｍｍ以下）厚さから中間の厚さ（即ち、約５ｍｍ〜１ｃｍ）及び相対的に厚い厚さ（即ち、５ｃｍ以上、例えば、１０〜２０ｃｍ以上）の範囲である。
【０１３４】
本発明の前記方法による能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の間、組織のＩＲＥから人工スキャフォールドを提供する実施例を下記に提供した。理想的にｅｘ  ｖｉｖｏで実行されたＩＲＥが行われなければならないが、これは、前記組織がバイオリアクター内で灌流されるためである。バイオリアクター内の組織の灌流は文献に公開されており、前記文献に記載されたパラメータは、一般的に本文脈内で適用され得る。ＩＲＥは、主要血管、結合組織、神経、及び周囲の組織に損傷を与えずに、前記標的領域で前記細胞を殺すことができるため、スキャフォールドを製造するために完全に適した細胞除去のための特定モードである。通常、穏やかな酵素または化学物質（非イオン性洗浄剤、両性洗浄剤、キレート剤、酵素方法）が、脱細胞化後のＤＮＡ断片の除去を可能とするために用いられ得る（ｉｎ  ｖｉｖｏのＩＲＥにおいて、細胞の前記除去は、身体の自然なシステムにより達成され得る）。
【０１３５】
バイオリアクター灌流システムでｅｘ  ｖｉｖｏのＩＲＥを実行する一つのアプローチは、下記を含む：（ａ）新鮮な切断した臓器をバイオリアクター灌流システムに取り付け、生理学的環境を維持するか特定の結果をなすために他の温度条件下で維持し；（ｂ）前記臓器の前記脈管構造内のような標的領域内に電極を挿入し；（ｃ）前記臓器を生理食塩水または他の適切な灌流液で灌流させ；及び（ｄ）一つ以上の電極を通じて電気的パルスを投与し、前記脈管構造を通じて可逆的または不可逆的電気穿孔を投与する。一旦望まない細胞が除去されたら、化学的（例えば、非イオン性洗浄剤）または物理的技術を用いて細胞破片を除去し、細胞成分／破片（特に、細胞外の場合）を除去する。しかる後、前記スキャフォールドは、前記標的とされた／処理された領域内に接種細胞を接種できる。前記臓器のさらなる灌流は、前記接種された細胞に栄養素及び／又は成長培地を投与し得て（ＩＲＥの間の灌流の実施、Ｅｄｄ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、前記バイオリアクター灌流システムは、細胞成長のための最適な条件（３７℃）で維持され得る。一つ以上のこのような方法のあるステップを実行することができ、好ましい容積の人工組織を得るためにも実行できる。例えば、臓器の多数の領域を処理するか臓器の全体を処理するために、電気穿孔が臓器のさらに小さい多数の領域に繰り返され、前記臓器から細胞破片を洗い流せるようにする実質的な間欠的休止期またはＩＲＥなしに一定期間の灌流をＩＲＥ実行後に実施することができる。同様に、プレートまたは針状電極を用いる場合、前記電極を位置させるか挿入する前に灌流を実施することができ、前記脈管構造内に位置したワイヤ型電極を持って、適切に前記電極を位置させた後、能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を開始することが好ましい。実際、一つ以上のこのようなあるステップは、省略されるか、変更されるか、他のステップと再編成されるか、または適切に他のステップに交替され得る。
【０１３６】
実施例ＩＩ−能動的な灌流の間のＩＲＥ
【０１３７】
交雑種の飼育された子豚にバルビツール酸塩を過多投与してと殺した。肝臓を採って死亡後１５分以内に氷上に位置させた。灌流システムを伴う血管吻合装置（ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）を門静脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）、肝動脈及び主要肝静脈内にルアーロック式注射器の連結管を挿入して形成し、ジップタイ（ｚｉｐ  ｔｉｅｓ）で固定した。前記灌流システム上に置く前に、前記肝臓を乳酸リンゲル液（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＬＲＳ）で洗い流して血液／凝固物を除去した。
【０１３８】
ＶａｓｏＷａｖｅ（登録商標）  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｍａｒｔ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＮＣ）を用いて肝臓を４時間及び２４時間の間灌流させた。このシステムは、心臓摸倣パルス波を生じて前記臓器内で生理学的心臓収縮及び心臓拡張圧力及び流速を発生させた。このシステムは、生理学的な標準以上及び未満に前記灌流液の酸素含量を調節できる。変形されたＬＲＳで構成された灌流液は、門静脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）及び肝動脈に輸送され、肝静脈を通じてシステムに戻り再使用された。全ての肝臓を死後１時間以内に能動的に機械灌流させた。
【０１３９】
灌流下で、ＥＣＭ  ８３０  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて前記肝組織に低エネルギーパルスを輸送した。２ｃｍ直径の二つの金属プレート電極を、ベルクロを用いる一対のラチェッティング・バイス・グリップ（ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ  ｖｉｃｅ  ｇｒｉｐｓ）（３８ｍｍ、Ｉｒｗｉｎ  Ｑｕｉｃｋ−Ｇｒｉｐｓ）に取り付けた。ＢＴＸユニットに前記電極を連結するのに高電圧ワイヤを用いた。前記電極を前記肝臓に静かにクランプで固定し、前記電極の中心間距離（ｃｅｎｔｅｒ−ｔｏ−  ｃｅｎｔｅｒ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を測定した。ＢＴＸユニットでの前記電圧出力を、近似値の適用電場が１０００Ｖ／ｃｍとなるように調整した。
【０１４０】
９９個の個別１００μｓスクエアパルスを０．２５、０．５、１．０及び４．０Ｈｚの繰返し率で投与した。繰返し率の試験は、任意に実行され、最小３回繰り返した。如何なるパルスも輸送せず、前記組織上に前記電極を位置させる虚偽対照を実施した。２回の追加試験を１Ｈｚ及び４Ｈｚの割合で１５００Ｖ／ｃｍの電圧対距離の割合を用いて０．５ｃｍの間隔で位置された針電極を用いて実施した。このようなプロトコルのための設定は、図５Ａから見られる。全てのＮ−ＴＩＲＥ処理を死後２時間以内に完了した。各処理部位で発生する表面病変を２４時間の灌流期間の末期に測定した。
【０１４１】
Ｎ−ＴＩＲＥ処理及び機械灌流後に、肝臓をＶａｓｏＷａｖｅ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍから分離し、病変を保存するために区画化し、組織を１０％の天然緩衝ホルマリン溶液内に含浸させて固定した。固定後、組織を手入れし、通常のパラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）で処理した後、４マイクロメータで区画化し、ヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）及びトリクロム着色剤（ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｓｔａｉｎｓ）で染色した。前記Ｎ−ＴＩＲＥ処理パラメータについて知らない獣医病理学者が組織区画を評価した。
【０１４２】
電場分布を予想して、組織での前記Ｎ−ＴＩＲＥ処理領域に対する洞察を提供するために数値モデリングを用いることができる。Ｅｄｄ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｌａｎｎｉｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６，２７５−２８６（２００７）（“Ｅｄｄ  ２００７”）。これは、前記肝臓で発生する病変に対する効果的な電場閾値を有する病変容積に関連性がある方法として選択されたものである。Ｎ−ＴＩＲＥ領域を予想するための方法は、Ｅｄｄ及びＤａｖａｌｏｓの文献（Ｅｄｄ  ２００７）により記載されたものと類似している。前記肝臓内にＮ−ＴＩＲＥを誘導するための効果的な電場閾値を理解するために、有限要素シミュレーション（ｆｉｎｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）を、Ｃｏｍｓｏｌ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  ３．５ａ（Ｃｏｍｓｏｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて実施した。前記数値モデルを、前記組織の上及び下に位置されたそれぞれ１ｍｍの厚さの２ｃｍの直径のプレートを用いて構成した。前記モデルをＧａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｎｏｎｔｈｅｒｍａｌ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ  ２３６，１２７−１３６（２０１０））により規定されたように解いた。前記電場分布は、ラプラスの方程式（Ｌａｐｌａｃｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を解いて得られた。
【０１４３】
2014501574.tif 000007
【０１４４】
ここで、σは、前記組織の電気伝導度であり、ψは電位である。
【０１４５】
前記エネルギー化された電極と接触した前記組織による前記電気的境界（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｂｏｕｎｄａｒｙ）条件は、ψ＝Ｖoである。他の電極の接点での電気的境界条件は、ψ＝０である。分析された領域が電極と接触していない前記境界は、電気絶縁として処理されたものである。前記エネルギー化された電極と接触した前記組織による前記電気的境界（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｂｏｕｎｄａｒｙ）条件は、ψ＝Ｖoである。他の電極の接点での電気的境界条件は、ψ＝０である。分析された領域が電極と接触していない前記境界は、電気的に絶縁されるように処理されたものである。
【０１４６】
電気穿孔及び温度に起因した伝導率変化は、下記式によって動的伝導度を計算してモデリングされた：
【０１４７】
2014501574.tif 000008
（Ｂｏｏｎｅ，Ｋ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｄ．＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．Ｒｅｖｉｅｗ−Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２１，２０１−２３２（１９９７）；Ｓｅｌ，Ｄ．，Ｌｅｂａｒ，Ａ．Ｍ．＆  Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｄ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｓｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ５４，７７３−７８１（２００７）；Ｓｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｆｉｎｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ５２，８１６−８２７，ｄｏｉ：１０．１  １０９／ＴＢＭＥ．２００５．８４５２１２（２００５）；及びＰａｖｓｅｌｊ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｏｎ  ａ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ａｎｉｍａｌｓ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ５２，１３７３−１３８１（２００５）参照）。
【０１４８】
前記組織が露出された電場のシミュレーションを得るために、前記肝臓に用いられた前記パルスパラメータに対して、このような数値モデルを計算した。しかる後、前記Ｎ−ＴＩＲＥ電場閾値を、病変の面積を測定し、前記モデルでのこのような領域における電場数値を決定して見出した。
【０１４９】
処理を始めてから３０分以内の灌流の間に表面病変が現れた。プレート電極により生成された前記肝表面の病変の領域は、針電極からの領域よりもさらに大きかったが、同一のタイプであった。図５Ｂにおいて、処理４時間後に収得され、１５００Ｖの適用電圧から生成された３．３ｃｍの表面病変が見られる。数値的にモデリングされたこのような病変の大きさは、３７９±１４２Ｖ／ｃｍまたはそれ以上の電場が適用された組織の領域内で生成されたものである。このような試験に対する数値モデルの結果は、図６Ａ〜６Ｃから見られる。
【０１５０】
周波数試験において、プレート間の距離に対する適用電圧の平均は、９６２Ｖ／ｃｍであった。このような試験からの病変は、死後２２時間にわたって発生し、平均的に２．５ｃｍの直径を有していた（１２５％の電極直径）；これは、０．２５Ｈｚ及び９３６Ｖ／ｃｍで発生した２ｃｍの最小病変、及び１．０Ｈｚ及び９５０Ｖ／ｃｍで発生した３．２ｃｍの最大病変を有する。著しく重要ではないが、前記結果は、病変の大きさが１Ｈｚで最も大きな平均であり、周波数が増加するか減少するにつれて減少することを提案する。０．２５及び４Ｈｚで適用される処理後に発生した病変は、１Ｈｚで適用された処理に対して発生した病変よりも統計的に小さい（α＝０．１）（図７Ａ〜７Ｂ）。
【０１５１】
前記の処理された組織の分析は、前記組織を通じて円筒状に延びる均一な処理領域を示す。これは、０．６２８ｃｍ及び０．７９２ｃｍの相応する組織厚さに対する１．９７ｃｍ3及び６．３７ｃｍ3間の計算された処理容積を算出した。
【０１５２】
処理後２４時間からの組織学的実験において、前記の処理された領域は、対照（図８Ａ）に比べて細胞の死滅（図８Ｂ）を示している。さらに具体的には、図８Ａ〜８Ｂは、穏やかにＩＲＥ処理した領域における結合組織及び血管の維持に対し、非処理の肝組織の領域における組織学的な比較を示している。非処理の試料をＨ＆Ｅで染色したもの（図８Ａ）及び１０ｘの倍率で、２４時間の心臓摸倣灌流のプレート電極を用いて９９個の１００μｓ、１０００Ｖ／ｃｍパルスを投与した試料をＨ＆Ｅで染色したもの（図８Ｂ）である。
【０１５３】
豚での肝小葉（Ｈｅｐａｔｉｃ  ａｃｉｎｉ）は、血管及び胆汁構造を含む結合組織によりさらに広くなり、肝細静脈で終結する重要なコード構造（ｃｏｒｄ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有する。エネルギー輸送に隣接した領域において、肝細胞コードは、若干の液胞が形成された肝細胞（２４時間のｅｘ  ｖｉｖｏの機械灌流サイクルで予想された発見）を伴い、よく保存された。非処理領域での類洞構造（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は開放され、肝動脈／門静脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）及び肝静脈間の灌流液の流れを反映する。Ｎ−ＴＩＲＥ処理は、肝細胞索（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｏｒｄｓ）を崩壊させ、細胞分解を誘導する（図８Ｂ）。さらに広い結合組織及び血管を含む主要肝小葉の保存が見られる。Ｎ−ＴＩＲＥ処理の領域において、細胞コードは明確でなく、類洞内膜は、程度を多様化して分画された。
【０１５４】
ヒトと同様に、豚も門脈三管（ｐｏｒｔａｌ  ｔｒｉａｄｓ）間につながる繊維状の結合組織の薄いバンドにより肝小葉が実質的に分離される。このような微細構造は、電気穿孔により誘導される病変の分布に影響を及ぼす。病変は、前記電気穿孔フィールドの縁で病変を持つ小葉か、通常であるか、ほとんど通常の小葉である構造的小葉内に局限される。そのため、電気穿孔で中心肝病変を処理するか、それに続く組織の処理のために損なわれていない結合組織／導管／血管マトリックスを発達させる工程を考慮するとき、結合組織のバンドが電気パルシングのための絶縁体として作用することは重要な発見である。
【０１５５】
図９Ａ〜図９Ｃは顕微鏡写真であり、（図９Ａ）２４時間の灌流後、処理されていない肝臓の部分を示している。２４時間灌流後、針電極を用いて４Ｈｚで９０個の、１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓパルスで処理された同一の肝臓の部分（図９Ｂ）１０ｘの倍率及び（図９Ｃ）２０ｘの倍率を示している。
【０１５６】
図９Ａは、門脈管（ｐｏｒｔａｌ  ｔｒａｃｔｓ）から中央静脈まで整列した一般的な類洞細胞コードを有する非処理の豚の肝臓の部分を示す。細胞の形態はよく保存されている。赤血球細胞を有するいくつかの血管充血が見られ、また、軽微な小葉中心性の胆汁うっ滞（ｃｅｎｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｓｔａｓｉｓ）もある。若干損なわれた豚小葉がプレート電気穿孔をした領域で観察された（図９Ｂ）。前記小葉の中心は、コード構造の崩壊及び一部の細胞の変質及び群集が現れる。
この領域のさらに高い解像度の写真は図９Ｃから見られ、細胞性変化がさらに容易にわかる。このような処理領域は、肝細胞コード分布及びコード基底板から層間分離される細胞で構成される軽微な病変を示す。軽微な胆汁うっ滞が見られる（暗い色素）。
【０１５７】
針電極またはプレート電極のいずれか一つを有するＮ−ＴＩＲＥ処理の投与は、区別されるいくつかの肝小葉での病変を生成した。各小葉内の病変の深刻度は、軽微な程度から適当に深刻な程度までの範囲である。軽微な病変は、基底膜から分離された肝細胞の小さな群集からなる。このような細胞は、微細細胞内構造の組織及び細胞質／細胞器官の群集の損失を示す（図９Ａ〜９Ｃ）。
【０１５８】
適度に深刻な病変は容易に把握される（図１０Ａ〜１０Ｂ）。Ｎ−ＴＩＲＥ処理により影響を受けた細胞は、様々な程度の細胞膨張及び核融解を示す（図１０Ｂ）。個別の小葉内において、ほとんどの細胞が影響を受ける。いくつかの小葉において、基底膜から分離される高色素細胞（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ）の小さな群集を伴うフランク核濃縮症（ｆｒａｎｋ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｙｋｎｏｓｉｓ）及び細胞変質が見られる。一部の小葉において、末梢類洞空間で胆汁色素の凝集を伴う小葉中心性胆汁うっ滞が見られる。全ての場合において、言及されたように、結合組織の架橋バンドが、無傷の胆管及び血管構造で観察され、相当なＮ−ＴＩＲＥによって誘導された組織の損傷を有する小葉がさらに広がって現れた。
【０１５９】
この試験は、臓器移植用の脱細胞化された組織スキャフォールドの作製において、この使用のために能動的に灌流された臓器における非熱的不可逆的電気穿孔の効果を報告する。本願において報告された前記結果は、単一のＮ−ＴＩＲＥ処理において６．３７ｃｍ3まで組織の容積を局限させた。これは、部分及び全体の肝移植に対する脱細胞化構造を生成する目標で多重処理を行うことによりさらに大きな容積に容易に拡大することができる。２４時間灌流後に、前記組織構造内に多量の細胞破片が一般的に残っている。このような破片の除去は、レシピエントの免疫反応を最小化するのに必須であり、さらに長くさらに効果的な灌流プロトコルを通じて及び／又は身体自体のメカニズムによる灌流を利用して、細胞成分の除去を最大化することで達成され得る。
【０１６０】
脱細胞化された組織スキャフォールドの製造以外に、このような方法は、パルス長さ、繰返し率、及び全体臓器構造でのフィールド強度のようなパルスパラメータの効果を研究するための理想的な足場を提供する。さらに、前記灌流液の電気特性に対する直接的な調節があるので、独特な電気的または物理的特性を持つ疾患にかかった臓器または癌にかかった臓器でのＮ−ＴＩＲＥの効果を試験するためのモデルとして提供され得る。本発明の方法を、疾患にかかった組織または臓器の部分を治療するか、不必要であるか疾患にかかった組織を除去するのに適用することができ、しかる後、前記臓器または組織の再接種が行われ得る。例えば、脈管構造を通じて肝臓の損なわれた領域だけを対象とし、身体が脱細胞化させることができ、再接種されるようにして肝疾患を持つ患者を治療することができる。
【０１６１】
灌流を伴うＮ−ＴＩＲＥから結果的に生成されたスキャフォールドは、非血管構造で存在する栄養素の分散制限よりも遥かに大きい構造内への灌流のために必須な脈管構造を維持する。用いられた灌流液の温度が４℃だけ低いことがあるので、ジュール加熱に関連した熱的側面は、無視してもよい程である。これは、熱損傷の効果から分離された電場の細胞及び組織での効果を評価するための理想的な足場を提供する。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏの適用に比べて前記臓器の低い温度は熱損傷を誘導せず、さらに厚い構造を脱細胞化するための適切な電場を獲得するためにさらに高い電圧を適用することを可能とする。これは、ヒトの肝臓の厚さが一部の領域で１０ｃｍを超えることがあるので重要である。
【０１６２】
本願において示されて記述されているように、能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を実行した組織及び臓器を脱細胞化しようとする計画であるとき、脱細胞化された組織の処理領域は、数値モデリングを通じて予想され得る。本願において用いられた病変の大きさ及び数値モデルから、移植可能なスキャフォールドに対して全体臓器を脱細胞化するとき、前記プロトコルは、３７９±１４２Ｖ／ｃｍの電場に前記組織の全体を露出するはずである。これは、所望の細胞をスキャフォールドに包括的に再接種してレシピエントの拒絶効果を最小化させることを可能とする、完全な細胞の死滅を保障するだろう。本願において見出された前記閾値は、従来の研究における閾値よりももう少し低く、これは、灌流下にあるときに用いられた独特なパルスパラメータまたは前記パルスに対する前記細胞の固有の感受性が増加した結果であり得ることが言及された。
【０１６３】
前記脱細胞化工程における持続的で能動的な機械灌流は、また、再細胞化（ｒｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）にも有用である。前記脱細胞化工程が完了すると、前記灌流システムから新たに生成されたスキャフォールドの除去を伴う損傷のリスクなしに前記スキャフォールドを再接種することが可能である。前記動脈及び静脈供給を個別的に扱うことができるため、複数の細胞タイプを前記臓器の他の領域に同時に輸送できる。同様に、前記胆汁システムを通じた逆行する灌流が、前記再接種工程で肝細胞を輸送する理想的な経路となり得る。
【０１６４】
微視的に見られる病変は、電気穿孔を用いる細胞ストリッピング（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）のためのメカニズム及び形態学を明らかに示す。さらには２４時間で、本願に記載の前記電気穿孔パラメータを用いたとき、小葉構造の普通程度の損失だけがあるということは非常に興味深い。エネルギー輸送のさらに厳しい条件がこれを変えられると予想されるが、重要な結合組織及び血管構造に損傷を誘導する。前記灌流流体内にアジュバント細胞毒性製剤、酵素、及び洗浄剤を添加することで、また、細胞ストリッピングの厳格性及び臨時的な性質を調節し得る。論理的に、細胞及び基質を急速に除去するよりは、組織工学的な目標のために重要な構造を保存する、穏やかな条件を立てることがさらに良い。心臓摸倣システムを伴う灌流期間及び灌流条件を処理する能力が、肝臓の脱細胞化及び究極的な再細胞化に対するこのような段階的かつ漸進的なアプローチに有用なことが明らかである。
【０１６５】
実施例ＩＩＩ−能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を伴う脈管構造が管理するＩＲＥ
【０１６６】
死後の豚から正常腎臓を標準的で印加された方式を通じて得た。収得したとき、前記腎臓の腎臓動脈及び静脈を分離し、心臓血管摸倣システム（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，ＣＶＥＳ）（ＶａｓｏＷａｖｅ  ２．３TM，Ｓｍａｒｔ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ＬＬＣ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＮＣ）への吻合（ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）が可能となるように適するように連結させた。前記臓器をＣＶＥＳに連結させ、前記腎臓を１．５リットルのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｌｅｉｔ／グルタチオン生理溶液で５分間洗浄した。
【０１６７】
その後、前記腎臓をＣＶＥＳへの前記動脈及び血管コネクタに吻合させて灌流を始めた（１分当たり６０回の拍動で輸送される生理学的パルス列（ｐｕｌｓｅ  ｔｒａｉｎ）を有する、動脈の心臓収縮圧力：１１０ｍｍＨｇ、心臓拡張圧力６０ｍｍＨｇ）。灌流を２５℃で行った。前記腎臓静脈を連結させずに残すが、管組織の端は低い背圧（これは、およそ１ｍｍＨｇである）を生成するために高くした。灌流を１５分間隔で安定化させた。前記Ｋｒｅｂｓ溶液伝導度を０．７２Ｓ／ｍで測定した。
【０１６８】
図１１から見られるように、注文製作されるエネルギー適用電極が特定適用のために製造され得る。この実施例において、中央点近くの折り畳み可能な配管の小さな分画を貫通して穴を通じて露出された端部（例えば、露出された端部を有するむき出しのワイヤまたはエナメルコーティングワイヤの一部分）を有する絶縁ワイヤを挿入して接着し、サイトを封止することにより電極を生成した。前記ワイヤの末端のエナメルは、前記配管内で電気的な連結を生成するために除去され、外部的に安全のために前記ワイヤのほとんどを絶縁コーティングした。さらに、縮められた包装された配管がさらなる電気絶縁のために前記配管の長さによって適用された。しかる後、ルアーロックの連結管を前記配管の末端内に挿入し、灌流システムへの連結を可能とした。このような電極は、パルス生成システム及び灌流流体間の１ｏｈｍ未満の電気抵抗を示す。図１１から見られるように、小径のワイヤは配管内に位置し、外部からアプローチ可能であり、灌流と同時にパルスが輸送されることを許容する。
【０１６９】
図１２は、腎臓静脈及び動脈により原型の電極及び灌流システムに同時に取り付けられる腎臓を示すグラフである。一つの電極がＣＶＥＳからの動脈供給及び前記腎臓血管コネクタ間に一直線で位置した。静脈電極の一末端を腎臓静脈血管コネクタに連結し、電極配管の他の末端を注射器で支えて前記背圧を形成した。これは、また、前記ＣＶＥＳを通じた前記灌流液の逆流を通じた最小の抵抗の経路を発見すること、または前記システム及び前記腎臓を通じて部分的に電流を送ることにより前記電気的電流を防止した。
【０１７０】
前記血管ネットワークの前記抵抗及び静電容量をＬＣＲメータで測定した。低い周波数（１００Ｈｚ）において前記抵抗及び静電容量の数値は、それぞれ３７２．６ｋ  Ｏｈｍｓ及び０．２４８ｎａｎｏ−Ｆａｒａｄｓであった。これは、９２．４マイクロ秒のＲＣ時間定数及びおよそ４６２マイクロ秒の完全な消滅時間（５＊ＲＣ）を算出する。
【０１７１】
パルシング前に前記腎臓からのインピーダンス測定を提供する図１３から示されるように、前記臓器は、相当な電気抵抗及び静電容量を示した。１００及び１０，０００Ｈｚ間で観察される動向（図１３）は、大きな直流ＤＣ成分を有する矩形波パルス（ｓｑｕａｒｅ  ｗａｖｅ  ｐｕｌｓｅｓ）を示し、前記ＲＣ時間定数はさらに大きいはずであった。単一５０マイクロ秒パルスをＢＴＸパルス再生機（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、１００、５００、７５０、１０００、１５００、及び２０００Ｖの電圧で前記脈管構造を通じて輸送した。輸送された電流及び前記パルスの消滅時間を記録した。全ての場合において、前記消滅時間は、予想されたものより少なかった。
【０１７２】
結果的に生成された波形を図１４に示した。さらに具体的には、図１４は、１０００Ｖの振幅を有する５０マイクロ秒パルスから結果的に生成された波形を提供する。パルスの消滅は、抵抗及び静電容量成分を両方とも有する組織の特性である。代表的なパルス電圧及び電流プロットが図１４から見られる。前記消滅時間は、１００Ｖ及び５００Ｖ間でかなり減少し、５００及び２０００Ｖ間の電圧で相対的に一定に維持された。全ての場合において、前記輸送された電流は、循環を根拠として予想されたものよりさらに大きかった（２３〜５３％）。
【０１７３】
図１５は、輸送される最大電流及び１００及び２０００Ｖ間の振幅で輸送されるパルスに対する消滅時間を示したグラフである。動向は、５００Ｖ及びそれ以上のパルスに対して、前記組織の前記抵抗が電気穿孔に起因して減少することを示す。その後、前記臓器に毎秒ごとに一つのパルスの繰返し率を有する、１０００Ｖでの２００個のパルスを適用させた。
【０１７４】
ＴＴＣ着色剤（Ｋｒｅｂｓ溶液の２％）をパルシングが完了した後、１５分間灌流により投与し、前記臓器をさらに３０分間前記灌流システム上に維持した。前記ＴＴＣ着色剤は、組織デヒドロゲナーゼの活性を通じて発色した反応産物（レッド・ホルマザン）の形成により生存組織及び非生存組織を示すのに用いられる。酸素呼吸が可能な生存組織を赤色で染色し；非生存組織または虚血性組織は、比較したとき、薄い色である。図１６から見られるように、パルシング後３０分で腎臓分画は生きている組織は赤色領域で、ＩＲＥパルスにより除去された領域は白色領域で示される。分画された臓器を固定及び組織学的検査のためにホルマリン内に固定した。腎臓の大容積に不可逆的電気穿孔が適用されたことがこの図面から明白である。脈管構造内の血栓は、電気穿孔の適用から全体臓器を保護することができる。このような問題は、手術摘出後に直ちに前記臓器の脈管構造を洗浄することによって解決できる。
【０１７５】
前記臓器の前記脈管構造及び微小脈管構造を、短いが強い電気パルスをバルク組織に輸送するのに用いて、その下の細胞外マトリックスの構造と機能は維持する非熱的な細胞の死滅を引き起こすことができる。組織学的染色を前記組織の全体的な健康状態（Ｈ＆Ｅ）、内皮細胞の損傷及び除去（ｖＷＦ）、及び前記細胞外マトリックスの構造（トリクロム）及びこのような予備実験の結果として生成された脱細胞化を評価するために用いることができる。４時間の総灌流プロトコルを、脱細胞化プロトコルのためのベースラインとして用いることができ、血管新生された臓器の内部に深く内在する固形腫瘍を治療するなど、組織の構築を超えて拡張される。
【０１７６】
人工スキャフォールドが製造されれば、前記スキャフォールドをさらに生体内で再生するように構築するか、生体内への移植に適した組織及び臓器に構築できる。人工組織を製造する方法は、下記を含むことができる：重要な細胞を本発明に係る人工スキャフォールドに接種し、及び接種されたスキャフォールドを、接種された細胞が前記スキャフォールドマトリックスに浸透して成長できる条件に露出させる。前記スキャフォールドの接種は、本分野において公知の全ての技術によりなされ得る。同様に、前記接種されたスキャフォールドを、接種された細胞が前記スキャフォールドに浸透して成長できる条件に露出させることは、前記結果を達成するために本分野において公知の全ての技術を用いてなされ得る。例えば、市販の成長培地内で前記接種されたスキャフォールドを約３７℃の市販のインキュベータ内でｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件で恒温することを含むことができ、必要であれば、前記成長培地に適した成長因子、抗生剤等を補充することができる。本分野の当業者は、本願の詳細な記載なしにも適切な接種及び増殖技術及びパラメータを適宜選別できる。言い換えれば、細胞の接種及び成長に関して、本発明の前記スキャフォールドは本分野において公知の他の天然スキャフォールドと同様に一般的に挙動する。本発明のスキャフォールドは他のスキャフォールドが有しない有益な特徴を有しているが、このような特徴は、細胞の接種及び成長には有意な影響を及ぼさない。
【０１７７】
人工組織は、傷ついたか、疾患にかかったか、他の方式で欠陥のある組織に対する交替物として開発された。組織工学の分野の重要な目標は、ヒトの健康における医学／治療学的用途を発達させることである。スキャフォールドの源としてヒト組織を使用することを取り巻く難しさ及び倫理的問題の観点から、大動物からの組織が天然スキャフォールドのための源として通常用いられる。しかる後、ヒトでのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために異種型（ｘｅｎｏｔｙｐｉｃ）スキャフォールドにヒト細胞を接種する。現在記載の人工組織は動物スキャフォールドを基礎とするヒト組織に制限されているが、人工組織の一次構成を形成することが構想されている。そのため、実施形態において、本発明の前記人工組織は、ヒト組織以外の動物組織に由来したスキャフォールド上及び内にヒト細胞を含む組織である。
【０１７８】
特定のｉｎ  ｖｉｖｏでの用途のために、動物組織を非熱的ＩＲＥに生体内適用させ、前記処理組織は、宿主動物の身体により細胞破片が除去された。そのため、特定のｉｎ  ｖｉｖｏでの実施形態において、宿主動物の身体自体でこのような除去（このようなコンセプトは、同様にヒトにおいてスキャフォールドのｉｎ  ｖｉｖｏでの構築に適用される）が可能であるので、二次細胞破片除去ステップは不要である。その後、処理組織を、例えばヒト細胞で生体内接種し、前記接種された細胞が前記スキャフォールドを浸透して成長するようにする。適切な浸透及び成長によって、再生された組織を除去し、好ましくは、可能な汚染宿主細胞を洗浄し、受容動物、例えば、ヒトに移植する。このような状況において、前記宿主動物は、外部細胞として前記接種された細胞を認識できないか、よく認識できない損なわれた免疫システムを有することが好ましい。例えば、損なわれた免疫システムを有する遺伝学的に変異した動物が宿主動物として用いられ得る。代案的として、例えば、前記宿主動物に免疫抑制剤を与えて、前記接種された細胞に対する前記動物の免疫反応を減少させるか除去できる。
【０１７９】
レシピエントまたは宿主動物は、ヒト、コンパニオン・アニマル（即ち、犬または猫のようなペット）、家畜（例えば、牛、豚、羊）、またはスポーツ用動物（例えば、馬）を含むあらゆる動物であってよい。そのため、本発明は、ヒト及び動物の健康管理及び研究分野のいずれにも適用可能である。
【０１８０】
体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において接種する細胞の選択が実施者に残っている。多くの細胞タイプが収得され得、組織工学分野の熟練者であれば、組織の接種のために用いる細胞のタイプを容易に決定することができる。例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、または肝細胞を用いることができる。実施形態において、胚性幹細胞、生体幹細胞のような間葉幹細胞が前記スキャフォールドに接種するための細胞として用いられる。接種された細胞の源は、特に制限されない。そのため、前記接種された細胞は、自家組織、同類（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）または同質（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）であってよい。本発明の特徴は、免疫原性が低減した（本分野において現在公知のスキャフォールド及び組織と比較して）スキャフォールド及び組織を生成することであるため、前記接種された細胞が自家組織（前記人工組織のレシピエントと関連する）であることが好ましい。
特定の実施形態においては、前記接種された細胞が、幹細胞または重要な組織から適切な細胞タイプに分化できる他の細胞であることが好ましい。
【０１８１】
またはさらに、スキャフォールドを生成するｉｎ  ｖｉｖｏの方法及び人工組織を生成するｉｎ  ｖｉｖｏの方法は、不可逆的電気穿孔を伴う非熱的ＩＲＥによる処理細胞の近くで組織を処理することを含むことができる。前記不可逆的電気穿孔の一部として、一つ以上の遺伝要素、タンパク質または他の物質（例えば、薬物）が前記処理された細胞に挿入され得る。前記遺伝要素は、コーディング領域、または、いつ発現するか、前記接種された細胞と前記細胞の相互作用を減少させるか、他の方法で抗炎症あるいは他の抗炎症物質を製造するかに対するその他の情報を含むことができる。このような遺伝要素の短期間の発現は、損傷または拒絶なしにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて人工組織を成長させる能力を増強することができる。タンパク質及びその他の物質は、不可逆的に電気穿孔された細胞内に、または電気穿孔後に前記細胞から分泌された産物として直接的に影響を与えることができる。
【０１８２】
本発明の特定の実施形態は、ヒトの人工組織の製造に用いるためのヒトスキャフォールドの用途に関するものである。他の人工組織と共に、このような人工組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、または部分的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び部分的にｉｎ  ｖｉｖｏで構築することができる。例えば、組織提供者は、非熱的ＩＲＥが適用された組織の一部または全部を有し、レシピエントの細胞の移植のための組織工学用スキャフォールドを構築した後、これらの細胞を成長させることができる。前記移植された細胞の浸透及び成長によって、前記組織を除去し、その必要に応じてレシピエントに移植することができる。もちろん、倫理的な懸念として、前記提供者の組織は、提供者の生命及び健康に致命的でない組織でなければならない。例えば、前記組織は、肝臓の一部であってよい。前記人工組織は、前記宿主からの除去及び前記レシピエントでの移植によって、完全に機能する肝臓に再生でき、宿主の肝臓に残っている部分は、除去された部分を再生することができる。
【０１８３】
このような点によって、本発明は、人工組織のスキャフォールド、人工組織、及びこれらを製造する方法について記載された。同様に、本発明が、人工臓器及びこれらを製造する方法を含むことが言及されたことが重要である。これは、一般に、臓器が前記動物の別個の機能または機能のセットを実行する多細胞動物の部分を意味するものと見なされる。これは、また、一般に臓器が組織で作られ、複数のタイプの組織で作られるものと見なされる。本発明は一般に組織及び臓器のいずれにも適用され得るものであり、前記両方の区分が本発明の実施を理解するのに決定的なものではないので、前記用語の“組織”及び“臓器”は、本願において互いに交替可能に使われ、両方を区別しようとする意図はない。
【０１８４】
本発明に含まれる多くの概念は、人工組織に関連した種々の例示的な概念で作られて言及され得る。例えば、人工臓器の構築において、初期の臓器は、再接種前に不可逆電気穿孔を用いて細胞が完全に除去され得る（これは、特に１ｍｍ未満の少なくとも一つの大きさを有する臓器に係る）；前記臓器は、分画において不可逆的に電気穿孔され、再接種されて、ヒト細胞が一度に小さな分画を浸透することができる；前記臓器は、ステップにおいて前記細胞を誘導する増加スライス（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｓｌｉｃｅｓ）で不可逆的に電気穿孔して生存ヒト細胞が、置換する生存動物細胞と接触しないようにする；前記臓器を全体でまたは分画で不可逆的に電気穿孔し、前記ヒト細胞を前記臓器内の標的位置内に注入できる；前記全体臓器を不可逆的に電気穿孔して、動物細胞を殺した後、ヒト細胞が前記臓器の上部に移植されて前記スキャフォールドに浸透し、他の細胞と交替することができる（前記動物細胞が死ぬことで、前記ヒト細胞が内部を満たし、置換して新たな臓器を生成する）。
【０１８５】
提供された分離された人工組織及び臓器により、これらを用いる方法を提供することができる。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれの設定においても前記人工組織の用途を考慮する。そのため、本発明は、研究目的及び治療または医学／獣医学的目的のための前記人工組織の用途を提供する。研究的な設定において、多大な数の実用化技術が存在する。このような適用の一例は、研究室において様々な除去技術（例えば、放射線処理、化学療法処理、または組合せを含む）の効能を試験し、病気の患者の使用を避けて治療方法を最適化するためのものである、ｅｘ  ｖｉｖｏの癌モデルにおける前記人工組織の使用である。例えば、最近除去された肝臓（例えば、豚の肝臓）をバイオリアクターまたはスキャフォールドに付着し、組織を除去して肝臓を治療することができる。さらに、相当数の免疫細胞の欠如によって、自発的手段（発癌物質）または前記組織内への腫瘍形成細胞株の導入のいずれか一つにより、前記除去された器官に腫瘍を成長させることができる。その後、このような腫瘍をの知識を得るために増加させ、生理学的に関連する同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）設定での治療技術の最適化を促進するために治療することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のその他の例は、人工組織のためのものである。
【０１８６】
本発明の前記人工組織は、ｉｎ  ｖｉｖｏの用途を有する。様々な用途のうち、被検者（本願においては“患者”を互いに交替可能な用語として使用し、ヒト及び動物をいずれも含む）のｉｎ  ｖｉｖｏの治療の方法が言及され得る。特定の実施形態に対して、一般に、被検者を治療する方法は、被検者の表面内部または上に本発明に係る人工組織を移植することを含み、前記組織の移植は、前記被検者の検出可能な変化を引き起こす。前記検出可能な変化は、自然的な感覚または人工の装置を用いて検出可能なあらゆる変化であってよい。どのタイプの治療でも本発明により構想され（疾患または障害、皮膚の傷の美容治療等）、多くの実施形態において、前記治療は、疾患、障害または被検者の他の苦痛の治療学的治療であるだろう。そのため、検出可能な変化は、変化、例えば、被検者が影響を受けている疾患または障害の少なくとも一つの臨床症状での改善の検出であってよい。例示的なｉｎ  ｖｉｖｏの治療方法は、腫瘍治療後の臓器の再生、医療装備の移植のための手術部位の準備、皮膚移植、及び疾患または障害により損傷または破壊されたような組職または臓器（例えば、肝臓）の一部または全部の交替を含む。例示的な臓器または組織は、下記を含む：心臓、肺、肝臓、腎臓、膀胱、脾臓、膵臓、卵巣、脳、耳、目、または肌。被検者がヒトまたは動物であるという事実を勘案して、本発明は、医学及び獣医学の適用のいずれであってもよい。
【０１８７】
例えば、前記治療方法は、被検者の疾患に係る機能不全した組織を再生する方法であってよい。前記方法は、非熱的ＩＲＥに組織を暴露させて処理された組織の細胞を殺し、組織スキャフォールドを生成することができる。前記方法は、前記組織スキャフォールドに前記被検者の外部からの細胞を接種し、前記接種された細胞が前記組織スキャフォールド内及び上で増殖するようにすることをさらに含むことができる。前記細胞の増殖は、健康で機能的な細胞を含む再生された組織を産生する。このような方法は、前記被検者から前記組織スキャフォールドの除去を必要としない。むしろ、前記スキャフォールドは、元来の組織から構築され、健康で機能的な細胞を再接種されたものである。スキャフォールドの生成、人工組織の生成及び被検者の治療の全体工程は、接種される細胞の拡張をできる限り除いてｉｎ  ｖｉｖｏで実施され、仮に必要であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行され得る。
【０１８８】
また他の例示的な実施形態において、組織スキャフォールドを、非熱的ＩＲＥを用いてドナー動物での組織を除去することで構築した。前記人工組織は、提供者の身体内に残り、前記組織スキャフォールドから細胞破片がないようにする。適当な時間後に、前記人工組織を提供者の身体から除去してレシピエントの身体内に移植する。移植されたスキャフォールドは、外部細胞で再接種されない。むしろ、前記スキャフォールドは、レシピエントの身体により自然に再接種されて機能的組織を生成する。
【０１８９】
本発明のまた他の実施形態において、前記ワイヤ電極を、パルス電場または持続的な電場を可能とするのに用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれか一つに標的領域に不可逆電気穿孔または熱損傷を誘導することができる。不可逆的電気穿孔が、能動的な灌流（ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）が適用される前記臓器のほとんどに可能なことがこのような例において示される場合、前記組織に電気パルスを輸送するに十分な電気導管として組織／臓器の天然の脈管構造を提供することが証明された。不可逆的電気穿孔が、不可逆的電気穿孔よりも低いエネルギーパルスパラメータを示す現象である場合、前記脈管構造を通じて不可逆的な電気穿孔がまた可能なことが明白である。このような技術は、実施者が標的領域は除去しないが、前記標的領域に遺伝子または薬物のような治療的な巨大分子を導入することを希望する場合、非常に有用である。用いられた前記巨大分子及び希望する治療的効果は、前記実施者に一任される。さらに、高周波アブレーションは、連続的な交差磁場を用いて組織を加熱する一般に用いられる熱を中心とする熱アブレーションであって、医学での使用が増加し、本発明において記載された血管電極技術を導入することにより浸湿性が減少する。
【０１９０】
本発明は、移植によって現在発生するほとんどの問題のうち一部を解消する。提供者の臓器から残っている唯一の細胞が血管及び神経を形成するのに関連した細胞であるため、本願に記載の方法は、拒絶のリスクを低減させる（伝統的な臓器移植に比べて）。同時に、血管、神経、及び腺構造が維持される。本発明は、実質的に天然の構造及び機能を有し、低い免疫原性を有する人工組織を生産するための相対的に早く、効果的で簡単な方式を提供する。そのため、本発明の前記人工組織が相対的に低い拒絶の可能性を有しており、治療的及び美容的な用途に非常に適している。ヒト臓器がスキャフォールドの源として用いられる（例えば、生体提供者または死体から）実施形態においては、拒絶のリスクが非常に少ない。
【０１９１】
要約すれば、本発明者は、細胞、組織及び臓器を含む望まない軟質組織の高度で選択的な除去に用いられ得る、新たに製造された道具（電極及び灌流システム）を用いる、新規なプロセスを確立した。特別な実施形態は、管組織、または血管床内で含まれる流体内にパルス電気エネルギーの適用、灌流流体の含量及び流れパラメータの調節、パルスエネルギー輸送のスキーム、及び治療学的効果を局限させて規定するための他の調整の使用を含む。損傷を受けていない組織からの細胞除去が可能で、様々な用途のための新規な組織マトリックスの生成に有用であることがさらに確認された。本願に示されたこのような結果は、ｅｘ  ｖｉｖｏで実行される実験に基づいたものである。しかし、灌流される流体は、組成及び伝導度が血液と類似している。これは、このような実験結果がｉｎ  ｖｉｖｏで見られる反応を示すものであることを示す。
【０１９２】
例えば、器官の脈管構造を通じて直接輸送する、本明細書において記載のエネルギー輸送方法は、また他の治療学的反応を誘導するのに用いられ得る。致死量に近い電気パルス（不可逆的電気穿孔）は、遺伝子または薬物を特定臓器または臓器の領域内に導入して局所疾患を治療するのに用いられ得る。同様に、高周波アブレーション技術は、前記脈管構造を用いて無線周波数エネルギーを輸送し、急性温熱療法を通じて疾患にかかった組織または腫瘍を破壊することができる。このような方法は、このような効果を増加させるために他の電気特性と共に生理学的に許容可能な流体（共同−灌流により）を輸送して改善され得る。
【０１９３】
このエネルギーは、前記脈管構造を通じて適用されるため、調節可能な大規模な治療容積を達成することができる。前記エネルギーが針電極により輸送されず、臓器に穴が不要であるので、臓器の全体構造が破壊されない。さらに、理論的に予想され、実験的に証明されたように、前記輸送されたエネルギーは、バルク組織を横切るよりは前記血管床または毛細管床を直接的に横切って消滅する。針またはプレート電極を用いる通常の治療は、同様の電圧を用いて、１Ａｍｐを超える電流を輸送し、少ない容積にのみ影響を及ぼす。これとは逆に、腎臓の血管ネットワークを用いるエネルギー輸送は、およそ５０ｍＡ（２００倍未満の電力）の電流を引き起こし、さらに一層大きな容積を治療することができる。
【０１９４】
本発明は、様々な特徴を有する特定の実施形態を参照として記載された。本発明の範囲及び精神から外れずに本発明の実施において様々な変更及び変異が行われることは本分野の当業者に自明であるだろう。本分野の当業者は、与えられた適用または設計の必要条件及び明細書に基づいて、単独でまたはある組合せでこのような特徴が用いられ得ることを認識するだろう。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書及び実施を考慮して本分野の当業者に自明になるだろう。数値範囲が本明細書に提供された場合、この範囲の上限及び下限間の各数値は、また特定に記載された。このようなさらに小さな範囲の上限及び下限は、同様に独立して前記範囲に含まれたか、排除された。本明細書において言及されたように、単数形である“一つ（ａ、ａｎ）”及び“前記（ｔｈｅ）”は、他に明確に描写されない限り、複数の対象を含む。そのため、例えば、“一つのパルス（ａ  ｐｕｌｓｅ）”の言及は、このようなパルスの複数を含み、“前記試料（ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ）”の言及は、一つ以上の試料及び本分野の当業者に公知のその等価物を含む。本明細書及び実施例は、事実上、例示として見なされるものを意図し、本発明の本質から外れない変形は、本分野の範囲内に含まれるものと意図される。また、本記載において言及された参考文献は、全体が本願に参考文献として取り込まれたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月29日(2013.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む、組織の標的細胞を除去するための装置：
組織の標的細胞に関連する血管内に挿入されるのに適し、及び血管内部の流体と接触するのに適した第一電極；
及び血管内部の流体を電気導管として使用する組織の標的細胞に除去エネルギー（アブレーションエナジー）を輸送するために、該第一電極に複数の電気パルスを印加するのに適した電圧源。
【請求項２】
前記電圧源が不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）によって組織の標的細胞を除去するのに十分な
量の複数の電気パルスを発生するのに適した電圧源である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記電圧源が組織の標的細胞の熱的な除去に十分な量の複数の高周波（ＲＦ）パルスを発
生するのに適した電圧源である請求項１に記載の装置。
【請求項４】
第一電極が血管内部の液体に接触するのに適した露出された部分を有するワイヤ電極であ
る請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
組織の標的細胞に関連する血管の外側に配置するのに適した外部電極をさらに含み、第一
電極と外部電極の間に電気パルスが印加される請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
組織の標的細胞に関連する血管内に挿入されるのに適し、及び血管内部の流体と接触する
のに適した第二電極をさらに含み、第一電極と第二電極がそれぞれ動脈と静脈への挿入に
適し、これによって第一電極及び第二電極の間に電気パルスが印加される請求項１〜４の
いずれかに記載の装置。
【請求項７】
胆管（biliary tract）に挿入されるのに適した第二電極をさらに含み、これによって第
一電極及び第二電極の間に電気パルスが印加される請求項１〜４のいずれかに記載の装置
。
【請求項８】
第一電極が、血管壁との接触を避けるために血管の壁から離れることに適した第一電極で
ある請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
組織の標的細胞に関連する血管を通って潅流液を輸送するために適した潅流システムをさ
らに含む請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
身体の他の部位から組織の標的細胞を単離するために血管を閉塞させるための閉塞手段を
さらに含む請求項１〜９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
電気パルスが第一電極と第二電極の間に印加されることによる、第二電極をさらに含む請
求項１に記載の装置：
不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）によって組織の標的細胞を除去するのに十分な量の複数の電
気パルスを発生するのに適した電圧源；及び
それぞれ動脈と静脈への挿入に適した第一電極及び第二電極。
【請求項１２】
血管内に挿入されるのに適した連結装置をさらに含み、該連結装置が心拍の間に組織の標
的細胞を電気的に単離するのに適した一方向弁を有する請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
身体の他の部位から組織の標的細胞を単離するために血管を閉塞させるための閉塞手段を
さらに含む請求項１１または１２に記載の装置。
【請求項１４】
第一電極が血管内部の液体に接触するのに適した露出された部分を有するワイヤ電極であ
る請求項１１〜１３のいずれかに記載の装置。
【請求項１５】
閉塞手段が組織の標的細胞に関連する血管の上流及び下流を閉塞するための手段を含む請
求項１０に記載の装置。
【国際調査報告】
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