(57)【要約】  皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物、および皮膚の不完全性を改善するための方法であって、注射用組成物が、皮膚の不完全な領域で皮下投与され、ａ）皮膚の不完全な領域を特定するステップと、ｂ）安全かつ美容的に有効な量の組成物を、皮膚の不完全な領域に皮下投与するステップとを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物。
【請求項２】
エイコサノイド、特にΔ（デルタ）１２−プロスタグランジンＪ２および１５−デオキシ−Δ（デルタ）１２−プロスタグランジンＪ２などのプロスタグランジン、ロシグリタゾン、シグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾンおよびピオグリタゾンなどのチアゾリデン誘導体、非ステロイド系抗炎症薬、不飽和脂肪酸、α−リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ビフェニル誘導体、Ｎ−（フェニルオキサゾール−４−イル−メトキシメチル）−シクロヘキシル−コハク酸アミド誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、前記ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの少なくとも１つのアゴニストを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
レチノイン酸、レチノール、レチナールおよび／またはレチノイドＸ受容体を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γが、前記組成物の総重量に基づいて、約０．００００１重量％から約５重量％の範囲にある濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの前記アゴニストが、前記組成物の総重量に基づいて、約０．００００１重量％から約５重量％の範囲にある濃度を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
レチノイン酸、レチノール、レチナールまたはレチノイドＸ受容体が、前記組成物の総重量に基づいて、約０．００００１重量％から約５重量％の範囲にある濃度を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
コラーゲン、架橋コラーゲン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、ポリ乳酸、カルシウムヒドロキシルアパタイト、コンドロイチン硫酸、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリメタクリレート、ポリウレタン、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリグリコライド、リジンおよび乳酸のコポリマー、リジン−ＲＧＤおよび乳酸のコポリマー、キトサン、アルギネート、ペクチン、ゼラチン、ゲラン、カラギーナン（carrageenan）、細胞、幹細胞、成体幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性細胞、前駆細胞、切り刻まれた組織、自家移植細胞、脂肪または組織、およびそれらの混合物からなる群から選択される真皮充填材料をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
皮下注射剤である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
皮膚の不完全性を改善するための、顔または身体充填剤として、顔または体形の輪郭付けにおいて、フェイシャルまたはボディーシェイピングにおいて使用するための、または大領域体積欠損の治療のための、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記皮膚の不完全性が、しわの寄った皮膚、深いしわのある皮膚、折り重なった皮膚、たるんだ皮膚、目尻のしわ、瘢痕のある皮膚、および皮膚におけるくぼみからなる群から選択される、皮膚の状態または欠陥である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物であって、ａ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γと、ｂ）薬学的に許容される担体と、任意選択でｃ）真皮充填材料とを含む組成物。
【請求項１２】
皮膚の不完全性を改善するための、顔または身体充填剤として、顔または体形の輪郭付けにおいて、フェイシャルまたはボディーシェイピングにおいて使用するための、または大領域体積欠損の治療のための、前記請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
真皮充填剤としての、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
皮膚の不完全性を改善するための方法であって、前記請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物が、皮膚の不完全な領域で皮下投与され、ａ）皮膚の不完全な領域を特定するステップと、ｂ）安全かつ美容的に有効な量の前記組成物を、前記皮膚の不完全な領域に皮下または真皮投与するステップとを含む方法。
【請求項１５】
前記組成物が、皮内および／または真皮下注射によって、皮下または真皮投与される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物に関する。本発明は、皮膚の不完全性を改善するための組成物の使用にも関する。さらに、本発明は、皮膚の不完全性を改善するための方法であって、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物が、皮膚の不完全な領域で皮下投与され、ａ）皮膚の不完全な領域を特定するステップと、ｂ）安全かつ美容的に有効な量の組成物を、皮膚の不完全な領域に皮下投与するステップとを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、一般に３つの主要な層、表皮、真皮、および真皮の下の皮下組織に分けられる複合組織である。皮膚のこの最も深い層は、脂肪細胞を含有し、皮下脂肪層としても知られている。皮膚は、環境に対する解剖学的なバリアであり、種々の目的を遂行し、その１つが体温を制御することである。皮膚は、年齢とともに変化する。皮下脂肪層は、遮断および当て物を提供するのだが、薄くなり、脂肪を失う。これは、皮膚損傷のリスクを増加させ、体温を維持する能力を減少させる。特に顔および首において、脂肪組織における脂肪の量が、年齢とともに減少する。この結果として、皮膚は、かなりまずく当て物をされており、これは、目に見える皮膚のしわ、笑いおよびほほ笑み皺、やせこけた頬、ならびに特に筋肉の動きが生じる領域上の顔のみぞの形成と関連している。年齢にともなう内臓の局所的な脂肪再配置に加えて、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などのウイルス感染と関連する、実質的な局所的なリポジストロフィーがあり得る。
【０００３】
皮膚の変化は、加齢の最も目に見える兆候の１つである。皮膚の最も顕著な変化は、しわの出現およびたるんだ皮膚である。しかしながら、ますます多くの人々が、今なお若いと感じ、老けて見えたくない。クリームおよびローションなどの多くの製品が、しわを減少させると主張しているが、しばしばマーケティング上の議論としてのみであり、実証された効果を有さない。皮膚のしわを治療するための代替物は、標的領域中への充填剤の注射を含む。真皮充填剤は、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギネート、およびまた細胞、例えばヒト真皮線維芽細胞、切り刻まれた脂肪組織、または自家移植細胞もしくは組織を含む。
【０００４】
かかる充填剤は、体積欠損に取り組み、注射後、数ヶ月から最大数年、炎症性小結節、肉芽腫につながり得る異物反応をいつも引き起こす。一般に、充填剤は、移動に関するリスクも有する。真皮充填剤は、それらの効果において、非永続の充填剤であり、したがって吸収性であるか、または永続であり、非吸収性であるかのいずれかである。しかしながら、合成または動物由来の充填剤材料は、過敏症反応を引き起こし得る。患者の脂肪をある位置から採取し、それを同じ患者において別の位置に移植する自家脂肪注射は、かなりの休止期間と関連がある今なお非常に複雑、高価かつ侵襲的な治療であり、すなわち、患者にとって都合が良くない。
【０００５】
したがって、皮膚の不完全性を改善することにおける改善への継続的な需要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、脂肪組織を再生することにおいて良い効率を示す注射用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
驚いたことに、皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物が、本発明の目的を満たすことが発見された。
【０００８】
したがって、一態様において、本発明は、皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物を提供する。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの皮下投与は、例えば加齢またはウイルス感染による、皮膚不完全性の改善をもたらす。注射用組成物は、化粧品組成物または医薬組成物であり得る。
【０００９】
本発明は、皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物であって、ａ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γと、ｂ）薬学的に許容される担体と、任意選択でｃ）真皮充填材料とを含む組成物にも関する。注射用組成物は、化粧品組成物または医薬組成物であり得る。
【００１０】
本発明は、皮膚の不完全性を改善するための、顔または身体充填剤として、顔または体形の輪郭付けにおいて、フェイシャルまたはボディーシェイピングにおいて使用するための、または大領域体積欠損の治療、および真皮充填剤としての使用のための、皮下投与のための本発明による注射用組成物の使用にも関する。使用する注射用組成物は、化粧品組成物または医薬組成物であり得る。したがって、本発明は、注射用組成物の非治療的または治療的使用に関し得る。
【００１１】
本発明はさらに、皮膚の不完全性を改善するための方法であって、本発明による注射用組成物が、皮膚の不完全な領域で皮下投与され、ａ）皮膚の不完全な領域を特定するステップと、ｂ）安全かつ美容的に有効な量の組成物を、皮膚の不完全な領域に皮下または真皮投与するステップとを含む方法に関する。注射用組成物は、化粧品組成物または医薬組成物であり得る。したがって、本発明は、非治療的または治療的方法に関し得る。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む組成物の皮下投与は、皮膚不完全性の特定された領域の周りの皮膚不完全性の出現の減少をもたらす。
【００１２】
本発明の注射用組成物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの少なくとも１つのアゴニストをさらに含むことができる。本発明の注射用組成物は、レチノイン酸、レチノール、レチナールおよび／またはレチノイドＸ受容体をさらに含むことができる。
【００１３】
本発明の注射用組成物は、コラーゲン、架橋コラーゲン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、ポリ乳酸、カルシウムヒドロキシルアパタイト、コンドロイチン硫酸、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリメタクリレート、ポリウレタン、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリグリコライド、リジンおよび乳酸のコポリマー、リジン−ＲＧＤおよび乳酸のコポリマー、キトサン、アルギネート、ペクチン、ゼラチン、ゲラン、カラギーナン（carrageenan）、細胞、幹細胞、成体幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性細胞、前駆細胞、切り刻まれた組織、自家移植細胞、脂肪または組織、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、真皮充填材料をさらに含むことができる。
【００１４】
本発明の他の特色および利点は、本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明によれば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物が、皮下投与のために提供される。本発明の組成物は、良いバイオアベイラビリティを示し、いかなる強い侵襲的技法もなしに、持続可能な天然脂肪の（再）生成を誘発することが発見された。それは別として、それは、既知の充填剤と比較して、副作用を減少させることができる。さらに、それは、自然な外見につながり得る。本発明の組成物は、充填剤または体形を輪郭付けるものとして使用することができる。さらに、一貫した忍容性および安全性が、合成または動物由来の充填剤材料と対照的に、天然化合物が使用されるという事実によって達成される。したがって、過敏症反応はありそうにない。さらに、患者に都合が良くかつより原因的な治療を提供することができる。
【００１６】
有利な効果が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γが、脂肪細胞と相互作用する能力により得られると考えられる。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）は、転写因子の核内ホルモン受容体サブファミリーに属しており、脂肪細胞組織を上方制御すると考えられる。脂肪細胞組織を上方制御するこの能力を使用して、皮下脂肪組織における脂肪の量を改善することができる。局所送達と対照的に、皮下投与は、作用部位に効果的な送達を提供することができる。さらに、本発明の組成物は、身体自体の真皮下脂肪が、再生のために誘発されるので、大領域体積欠損の治療においてさえも、長期効果をもたらすことができる。
【００１７】
本明細書では、「注射用」という用語は、本発明の組成物を、針、極微針、シリンジなどを含むが、これらに限定されない、任意の注射手段を使用して、哺乳動物などの生体の身体の標的領域中に注射することができることを意味する。組成物は、最低限の侵襲的注射によって、投与することができる。最低限の侵襲的注射による投与は、いかなる強い侵襲的技法もなしに、天然脂肪の持続可能な（再）生成を誘発することができる。
【００１８】
「皮下投与」という用語は、皮膚においてまたは皮膚の下に、または皮下脂肪層において直接的に沈積させることを意味する。使用可能な適用手段は、針、極微針、マルチ針アレイ、シリンジ、または同様のデバイス、例えば注射ジェットである。
【００１９】
「皮下脂肪組織」という用語は、皮下組織とも呼ばれる、脊椎動物の皮膚の真皮の下にある層における組織を表す。
【００２０】
「不完全性」という用語は、完全性の喪失または欠如を表す。より明確には、「皮膚の不完全性」は、外観を傷つける皮膚における状態、欠陥または不具合、例えば加齢またはウイルス感染によって駆動されるリポジストロフィーを表す。「皮膚の不完全性」の例は、しわ、たるんだ眼瞼、目尻のしわ、鼻唇のしわ、瘢痕のあるまたは深いしわのある皮膚、たるんだ皮膚および皮膚のへこみである。皮膚の顔面不完全性は、額の皺、眉間の皺、鼻唇溝、前頭しわ、怒りしわ、心配しわ、目尻のしわまたは眼窩周囲の皺、ほほ笑み皺、垂直方向のまたは口周囲の皺、マリオネット皺または口部の合わせ目、座瘡瘢痕、頬のくぼみ、顔の瘢痕、唇などを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
「皮膚欠陥」という用語は、しわの寄った皮膚、瘢痕のあるまたは深いしわのある皮膚、折り重なった皮膚、たるんだ皮膚を含むが、これらに限定されない。さらに、皮膚の状態または欠陥は、加齢した皮膚に限定されず、座瘡、または皮膚の他の不規則さ、セルライトまたは他の皮膚領域の脂肪吸引後の皮膚のへこみ、皮膚移植または他の外科的に誘発された不規則さへの二次的影響などの審美的欠損の出現を示す状態を含む。
【００２２】
「輪郭付け」という用語は、容貌をより若々しい、ふっくらした、健康な外見に調節すること、形づくること、再編成することまたは変えること、皮膚欠陥の出現を回復させることを意味する。これは、より若い対象、例えば上腕、胸部、臀部における若返りまたは美化のために取り組む身体全体にわたる体積欠損を含む。皮膚不完全性という用語は、手、デコルタージュ（decolletage）などにおける大領域体積欠損も表す。
【００２３】
「薬学的に許容される」という用語は、それぞれの化合物または担体が、過度の毒性、不適合性、不安定性、炎症、アレルギー反応などがなく、皮下投与に適していることを意味する。この用語は、それが、医薬として記載する化合物または生成物の使用を限定することを意図せず、対象への適合性を示すことを意図している。
【００２４】
「美容的に有効な量」という用語は、皮膚不完全性の治療または顔の輪郭付けに十分であるが、重大な副作用を避けるのに十分低い化合物または組成物の量を意味する。
【００２５】
他に定義されなければ、本明細書で使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通例理解されるのと同じ意味を有する。
【００２６】
一実施形態において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、組成物の総重量に基づいて、約０．００００１重量％から約５重量％の範囲にある濃度を有する。別の実施形態において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、組成物の総重量に基づいて、約０．００１重量％から約１重量％の範囲にある濃度を有する。さらなる実施形態において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、組成物の総重量に基づいて、約０．０１重量％から約０．１重量％の範囲にある濃度を有する。
【００２７】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、生物工学的な方法、例えばエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・メガテリウム、バシラス・ズブチリス、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの既知の宿主における発現によって、組換え体を生成することができる。また、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランスおよびピキア・パストリスなどの真菌の宿主を使用することができる。タンパク質は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。代わりに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、化学合成によって生成することができる。さらに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γは、市販されている。
【００２８】
本発明の実施形態によれば、組成物は、エイコサノイド、特にΔ（デルタ）１２−プロスタグランジンＪ２および１５−デオキシ−Δ（デルタ）１２−プロスタグランジンＪ２などのプロスタグランジン、ロシグリタゾン、シグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾンおよびピオグリタゾンなどのチアゾリデン誘導体、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、不飽和脂肪酸、α−リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ビフェニル誘導体、Ｎ−（フェニルオキサゾール−４−イル−メトキシメチル）−シクロヘキシル−コハク酸アミド誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの少なくとも１つのアゴニストを含むことができる。
【００２９】
本明細書では、「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γのアゴニスト」という用語は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γタンパク質と直接的に相互作用し、レチノイドＸ受容体および／またはその標的遺伝子とのその相互作用を刺激して、生理学的効果を生じる化合物を表す。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γとの相互作用によって、アゴニストは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む組成物の効果を増強および／または延長することができる。
【００３０】
本発明の実施形態において、チアゾリデン誘導体は、ロシグリタゾン、（ＲＳ）−５−（（４−（２−（メチル−２−ピリジニルアミノ）エトキシ）フェニル）メチル）−２，４−チアゾリジンジオンである。本発明による組成物に含まれ得るチアゾリデン誘導体のさらなる例は、トログリタゾン、（ＲＳ）−５−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル−メトキシ）ベンジル）−２，４−チアゾリジンジオン）である。本発明のさらなる実施形態において、チアゾリデン誘導体は、ピオグリタゾン、（ＲＳ）−５−｛ｐ−［２−（５−エチル−２−ピリジル）エトキシ］ベンジル｝−２，４−チアゾリジンジオンである。
【００３１】
一実施形態において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γのアゴニストは、組成物の総重量に基づいて、約０．００００１重量％から約５重量％の範囲にある濃度を有する。別の実施形態において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γのアゴニストは、組成物の総重量に基づいて、約０．００１重量％から約１重量％の範囲にある濃度を有する。さらなる実施形態において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γのアゴニストは、組成物の総重量に基づいて、約０．０１重量％から約０．１重量％の範囲にある濃度を有する。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、組成物は、レチノイン酸、レチノール、レチナールおよび／またはレチノイドＸ受容体を含むことができる。レチノイドＸ受容体は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γとヘテロ二量体を形成する。レチノイドＸ受容体との相互作用によって、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む組成物の効果は、増強され得る。一実施形態において、レチノイン酸、レチノール、レチナールまたはレチノイドＸ受容体は、組成物の総重量に基づいて、約０．００００１重量％から約５重量％の範囲にある濃度を有する。別の実施形態において、レチノイン酸、レチノール、レチナールまたはレチノイドＸ受容体は、組成物の総重量に基づいて、約０．００１重量％から約１重量％の範囲にある濃度を有する。さらなる実施形態において、レチノイン酸、レチノール、レチナールまたはレチノイドＸ受容体は、組成物の総重量に基づいて、約０．０１重量％から約０．１重量％の範囲にある濃度を有する。
【００３３】
本発明の実施形態によれば、組成物は、コラーゲン、架橋コラーゲン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、ポリ乳酸、カルシウムヒドロキシルアパタイト、コンドロイチン硫酸、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリメタクリレート、ポリウレタン、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリグリコライド、リジンおよび乳酸のコポリマー、リジン−ＲＧＤおよび乳酸のコポリマー、キトサン、アルギネート、ペクチン、ゼラチン、ゲラン、カラギーナン（carrageenan）、細胞、幹細胞、成体幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性細胞、前駆細胞、切り刻まれた組織、自家移植細胞、脂肪または組織、およびそれらの混合物からなる群から選択される真皮充填材料をさらに含む。
【００３４】
本明細書では、「真皮充填材料」という用語は、体積欠損に取り組むための化粧用および審美的必要性に使用される材料を表す。一実施形態において、真皮充填材料は、コラーゲンであり得る。別の実施形態において、真皮充填材料は、コラーゲンが、１つまたは複数の糖と架橋している、架橋コラーゲンであり得る。代替の実施形態において、真皮充填材料は、アルギネートである。「アルギネート」という用語は、海洋褐藻類から単離される天然の陰イオンの非分岐多糖を表す。それは、２つの酸のヘテロポリマーの領域によって分離された、−Ｄ−マンヌロン酸および−Ｌ−グルロン酸のホモポリマーの群から構築される。本発明の実施形態に従って使用可能である高純度のアルギネートは、均質な藻類の原料および標準化されたプロセスを使用することによって、単離することができる。生体適合性必要条件は、それによって満たされる。さらなる実施形態において、真皮充填材料は、架橋アルギネート、例えばバリウム−架橋アルギネートである。バリウムと架橋したアルギネートは、安定なヒドロゲルを形成する。さらなる実施形態において、真皮充填材料は、細胞、例えばヒト真皮線維芽細胞であり得る。
【００３５】
一実施形態において、真皮充填材料は、ヒアルロン酸である。真皮充填材料としてのヒアルロン酸は、最終組成物の約０．００１重量％から約８重量％を構成することができる。別の実施形態において、真皮充填材料ヒアルロン酸は、最終組成物の約１重量％から約４重量％を構成することができる。代替の実施形態において、真皮充填材料ヒアルロン酸は、最終組成物の約２重量％から約２．５重量％を構成することができる。
【００３６】
本発明の実施形態によれば、組成物は、皮下注射剤である。皮下注射剤に関する例は、水溶液、懸濁剤、油性溶液、エマルション、マイクロエマルション、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子および移植片を含む。皮下注射剤の利点は、作用の急速な開始、および効果が標的組織に制限されることである。さらに、皮下組織からの薬物吸収が緩徐であるために、化合物の全身アベイラビリティ（systemic availability）が、経時的に減少する。
【００３７】
本発明によれば、組成物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γが懸濁している培地を含むことができる。前記培地は、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、等張生理食塩水（０．９％）、トロメタモール、クエン酸（citrate）、カーボネート、アセテート、ホウ酸（borate）、アミノ酸、ジエチルアミン、グルコノδ（デルタ）ラクトン、グリシン、乳酸（lactate）、マレイン酸、メタンスルホン酸、モノエタノールアミン、最適な酒石酸（tartrate）緩衝液またはそれらの任意の組合せでよい。
【００３８】
本発明は、抗酸化剤、緩衝液、等張化剤、水和剤、粘度エンハンサーおよび／または粘度調整剤、界面活性剤、錯体ビルダー、消泡剤、防腐剤またはそれらの混合物から選択される１つまたは複数の付形剤（excipients）をさらに含むことができる。錯体ビルダー、消泡剤、および／または防腐剤などのかかる添加物質に関する例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クレゾールおよびその誘導体、安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸エステル、および／またはソルビン酸である。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベートなどの非イオン性界面活性剤、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、デオキシコレート、またはそれらの混合物を含む。
【００３９】
抗酸化剤は、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、補酵素Ｑ、リスベラトロール、ケルセチン、亜硫酸水素ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール／トルエン、システイネート、亜ジチオン酸ナトリウム、ゲンチシン酸、グルタメート、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、フラボノイド、カタラーゼ、リコピン（lycopene）、カロチン（carotenes）、ルテイン、スーパーオキシドジスムターゼおよびペルオキシダーゼ、亜鉛またはそれらの混合物でよいが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明において特許請求した組成物は、麻酔剤、鎮痛薬、抗菌剤、抗炎症薬、増殖因子、ホルモン、薬用化粧品、ビタミン、栄養剤、刺激薬、ステロイド、血管収縮薬、抗血栓剤、抗凝固薬、トランキライザー、筋弛緩薬、抗真菌薬、脂肪分解剤および生体若返り剤の群から選択される１つまたは複数の有効医薬用成分をさらに含むことができる。
【００４１】
「有効医薬用成分」という用語は、薬学的に有効であり、したがって、哺乳動物における薬理効果をもたらす、すべての構造およびそれらのすべての既知の化学形態を表す。例は、コンジュゲート、異性体、エステル、誘導体、代謝産物、残基、塩またはそれらのプロドラッグであるが、これらに限定されない。
【００４２】
麻酔剤は、プロカイン、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、ラロカイン、プロポキシカイン、プロパラカイン、テトラカイン、リドカイン、アルチカイン、ブピバカイン、カルチカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、およびトリメカインなどの局所麻酔剤でよいが、これらに限定されない。麻酔剤に関する適した濃度は、組成物の総重量に基づいて、約０．０１重量％から約６重量％である。
【００４３】
鎮痛薬は、パラセタモール、イブプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、アスピリン、セレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ニメスリド、ピロキシカム、イソキシカム、トネキシカム、スドキシカム、およびＣＰ−１４、３０４などのオキシカム、サリチル酸、アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリリセート、サファプリン、ソルピリン、ジフルニサル、およびフェンドサルなどのサリチレート、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラクト、クリダナク、オキセピナク、およびフェルビナクなどの酢酸誘導体、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、およびトルフェナム酸などのフェナム酸、イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェン酸などのプロピオン酸誘導体、ならびにフェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾンなどのピラゾールでよいが、これらに限定されない。
【００４４】
抗菌剤は、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、カナマイシン、メロペネム、イミペネムまたはセファクロールなどの抗生物質、アバカビル、アシクロビル、アマンタジン、ボセプレビル、シドホビル、ダルナビル、エドクスジン、ファムシクロビル、ガンシクロビル、イムノビル、イノシン、インターフェロン、ラミブジン、ネキサビル、オセルタミビル、ペンシクロビル、リバビリン、リマンタジン、ビラミジンおよびジドブジンなどの抗ウイルス薬、ならびにミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、アバファンギン、ナフチフィン、カスポファンギン、ミカファンギン、安息香酸、およびグリセオフルビンなどの抗真菌薬でよいが、これらに限定されない。
【００４５】
抗炎症薬は、ヒアルロン酸などの多糖酸の亜鉛塩を含めた、亜鉛塩でよいが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の組成物は、溶液、ゲル、エマルション、懸濁剤、マイクロエマルション、ナノエマルション、液滴、リポソーム、徐放性の材料、ポリマーまたはモノマーおよび重合剤などを含むが、これらに限定されない、標的組織に投与する注射薬に適した多種多様の生成物型にすることができる。本発明において有用な組成物は、溶液として製剤化することができる。本発明の組成物の製剤は、例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γが、水においてヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシ−メチル−セルロース、グリセリンなどの生理学的に許容される塩および／または増粘剤と混合されるようなものであり得る。かかる組成物は、有機溶媒をさらに含むことができる。組成物は、水性混合物の製剤の任意の既知の形態によって提示することができる。
【００４７】
本発明の実施形態によれば、組成物を、皮膚の不完全性を改善するために、顔または身体充填剤として、顔または体形の輪郭付けにおいて、フェイシャルまたはボディーシェイピングにおいて使用するために、または大領域体積欠損の治療のために使用することができる。
【００４８】
「大領域体積欠損」という用語は、単一のしわとしてより大きくあり得る皮膚の領域の欠陥、例えばやせこけた頬としての顔の領域またはデコルテ（decollete）、胸部、臀部、上腕などとしての身体の領域を表す。
【００４９】
本発明の実施形態によれば、皮膚の不完全性は、しわの寄った皮膚、深いしわのある皮膚、折り重なった皮膚、たるんだ皮膚、目尻のしわ、瘢痕のある皮膚、および皮膚におけるくぼみからなる群から選択される、皮膚の状態または欠陥である。皮膚の不完全性は、例えば加齢、環境の影響、体重減少、妊娠、外科的介入および座瘡によって引き起こされる欠損であり得る。皮膚の不完全性は、特に加齢した皮膚の状態または欠陥である。組成物は、例えば、皮膚のひだの深さを減少させるため、しわを減少させるため、組織の欠陥を充填するため、および瘢痕の可視性を減少させるために使用可能である。組成物は、特に、しわ、例えば前頭のしわ、怒りしわ、心配しわ、額の皺、鼻唇溝などの中間の深さのしわ、眉間の皺、明白な軽度から中程度の鼻の深いしわおよび頬のしわ、口周囲のしわ、たるんだ眼瞼、目尻のしわ、および座瘡瘢痕の治療に適している。組成物は、唇の下注射（under-injection）に、また手の部分、デコルテ（decollete）におけるしわ、および皮膚のへこみの治療にも適している。
【００５０】
本発明は、皮下投与のためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む注射用組成物であって、ａ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γと、ｂ）薬学的に許容される担体と、任意選択でｃ）真皮充填材料とを含む組成物も提供する。
【００５１】
本発明の本態様による組成物において、１つまたは複数の薬学的に許容される担体が存在することができる。適した担体は、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、等張生理食塩水（０．９％）、トロメタモール、クエン酸（citrate）、カーボネート、アセテート、ホウ酸（borate）、アミノ酸、ジエチルアミン、グルコノδ（デルタ）ラクトン、グリシン、乳酸（lactate）、マレイン酸、メタンスルホン酸、モノエタノールアミン、最適な酒石酸（tartrate）緩衝液またはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
任意選択で、組成物は、真皮充填材料をさらに含む。真皮充填材料は、コラーゲン、架橋コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、カルシウムヒドロキシルアパタイト、コンドロイチン硫酸、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリメタクリレート、ポリウレタン、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリグリコライド、リジンおよび乳酸のコポリマー、リジン−ＲＧＤおよび乳酸のコポリマー、キトサン、アルギネート、ペクチン、ゼラチン、ゲラン、カラギーナン（carrageenan）、細胞、幹細胞、成体幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性細胞、前駆細胞、切り刻まれた組織、自家移植細胞、脂肪または組織、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、最初に真皮充填材料と組み合わせて投与し、その後、維持として、真皮充填材料なしに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを含む本発明の組成物の投与を続けることができる。
【００５３】
一実施形態において、真皮充填材料は、コラーゲンであり得る。別の実施形態において、真皮充填材料は、コラーゲンが、１つまたは複数の糖と架橋している、架橋コラーゲンであり得る。代替の実施形態において、真皮充填材料は、アルギネートである。さらなる実施形態において、真皮充填材料は、架橋アルギネート、例えばバリウム−架橋アルギネートである。さらなる実施形態において、真皮充填材料は、細胞、例えばヒト真皮線維芽細胞であり得る。一実施形態において、真皮充填材料は、ヒアルロン酸である。真皮充填材料としてのヒアルロン酸は、最終組成物の約０．００１重量％から約８重量％を構成することができる。別の実施形態において、真皮充填材料ヒアルロン酸は、最終組成物の約１重量％から約４重量％を構成することができる。代替の実施形態において、真皮充填材料ヒアルロン酸は、最終組成物の約２重量％から約２．５重量％を構成することができる。
【００５４】
本発明は、皮膚の不完全性を改善するための、顔または身体充填剤として、顔または体形の輪郭付けにおいて、フェイシャルまたはボディーシェイピングにおいて使用するための、または大領域体積欠損の治療のための本発明による組成物の使用にも関する。
【００５５】
本発明の実施形態によれば、皮膚の不完全性は、瘢痕のある皮膚、しわの寄った皮膚、深いしわのある皮膚、折り重なった皮膚、たるんだ皮膚、目尻のしわおよび皮膚におけるくぼみからなる群から選択される、皮膚の状態または欠陥である。皮膚の不完全性は、特に加齢した皮膚の状態または欠陥である。本発明による組成物を使用して、しわを減少させる、皮膚のひだの深さを減少させる、組織の欠陥を充填する、または瘢痕の可視性を減少させることができる。組成物は、特に、しわ、例えば前頭のしわ、怒りしわ、心配しわ、額の皺、鼻唇溝などの中間の深さのしわ、眉間の皺、明白な軽度から中程度の鼻の深いしわおよび頬のしわ、口周囲のしわ、たるんだ眼瞼、目尻のしわ、および座瘡瘢痕の治療に使用することができる。組成物は、唇の下注射（under-injection）に、および手の部分、デコルテ（decollete）におけるしわ、および皮膚のへこみの治療にも適している。
【００５６】
本発明の実施形態によれば、本発明の組成物は、真皮充填剤として使用することができる。本発明の組成物は、例えば、皮膚のひだの深さを減少させるための、しわを減少させるための、組織の欠陥を充填するための、または瘢痕の可視性を減少させるための注射用充填剤として使用することができる。実施形態によれば、本発明の組成物は、しわの審美治療のための天然の注射用充填剤として使用することができる。
【００５７】
本発明は、皮膚の不完全性を改善するための方法であって、本発明による注射用組成物が、皮膚の不完全な領域で皮下投与され、ａ）皮膚の不完全な領域を特定するステップと、ｂ）安全かつ美容的に有効な量の組成物を、皮膚の不完全な領域に皮下または真皮投与するステップとを含む方法にも関する。
【００５８】
一実施形態において、本発明の組成物は、皮下注射によって投与される。別の実施形態によれば、組成物は、皮内および／または真皮下注射によって皮下または真皮投与される。
【００５９】
実施形態において、組成物は、針または他の適した技法を通して、注射される。注射は、影響された皮膚の領域中への多数または数倍の注射のいずれかによって行うことができる。代わりに、注射は、１から数回行うことができる。実施形態において、１回の注射ショットは、組成物の約０．１５ｍｌから約５ｍｌのサイズである。別の実施形態において、１回の注射ショットは、組成物の約０．５ｍｌから約２ｍｌのサイズである。
【００６０】
本明細書で記載した本発明は、例えば加齢、環境の影響、体重減少、妊娠、外科的介入および座瘡によって引き起こされた皮膚不完全性に適している。皮膚の不完全性は、特に加齢した皮膚の状態または欠陥である。本発明の実施形態によれば、皮膚の不完全性は、しわの寄った皮膚、深いしわのある皮膚、折り重なった皮膚、たるんだ皮膚、目尻のしわ、瘢痕のある皮膚、および皮膚におけるくぼみからなる群から選択される皮膚の状態または欠陥である。組成物は、特に、しわ、例えば前頭のしわ、怒りしわ、心配しわ、額の皺、鼻唇溝などの中間の深さのしわ、眉間の皺、明白な軽度から中程度の鼻の深いしわおよび頬のしわ、口周囲のしわ、たるんだ眼瞼、目尻のしわ、および座瘡瘢痕の治療に適している。組成物は、唇の下注射に、手の部分およびデコルテ（decollete）におけるしわまたは体積欠損およびセルライトまたは他の皮膚領域の脂肪吸引後の皮膚のへこみの治療にも適している。方法は、例えば、皮膚のひだの深さを減少させるため、しわを減少させるため、組織の欠陥を充填するため、および瘢痕の可視性を減少させるためにまたは大領域体積喪失を改善するために使用可能である。方法は、顔の皮膚の前記領域の周りの顔の輪郭を改善することができる。
【００６１】
本発明を、本明細書で以下に示す例によって、より詳細に説明する。少なくとも１つの例示的な実施形態が提示されるが、膨大な数の変形形態が存在することが認識されるべきである。例示的な実施形態が、単に例であり、範囲、適用性、または構成を限定することが決して意図されていないことも認識されるべきである。むしろ、先の説明は、当業者に、少なくとも１つの例示的な実施形態を実行するための、本発明の本質的な特徴を提供することになり、添付の特許請求の範囲において示す範囲から逸脱することなしに、様々な変更を行うことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＰＰＡＲγの種々の濃度（ＯＤ×１０-3）で６日間インキュベートした、脂肪由来幹細胞のＭＴＴアッセイの光度測定値を示す図である。バー１から１０は、ＮＭにおいてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＮＭにおいて、ＦＣＳを有さないＤＭＥＭでインキュベートした負の対照（１）、標準培地ＮＭでインキュベートした対照（２）、ＤＭＳＯを含有するＮＭでインキュベートした溶媒対照（３）、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（４）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（５）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（６）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（７）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（８）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（９）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１０）を示す。バー１１から１８は、ＡＭ−においてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＡＭ−において、ＡＭ−でインキュベートした対照（１１）、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１２）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１３）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１４）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１５）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（１６）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１７）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１８）を示す。
【図２】ＰＰＡＲγの種々の濃度で２週間インキュベートした脂肪由来幹細胞の細胞培養物の光度測定値を示す図である。バー１から８は、ＮＭにおいてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＮＭにおいて、標準培地ＮＭでインキュベートした対照（１）、およびＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（２）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（３）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（４）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（５）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（６）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（７）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（８）を示す。バー９から１６は、ＡＭ−においてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＡＭ−において、ＡＭ−でインキュベートした対照（９）、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１０）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１１）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１２）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１３）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（１４）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１５）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１６）を示す。
【図３】標準培地（ＮＭ）においてＰＰＡＲγの種々の濃度でインキュベートした脂肪由来幹細胞のＯｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色を示す図である（６３０×の拡大率）。図３ａ）は、対照細胞を示し、図３ｂ）、３ｃ）、３ｄ）、および３ｅ）は、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌで培養した細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
実施例
実施例１  ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γタンパク質の調製
バチルス・メガテリウムにおけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γタンパク質の発現のために、手順を、バーグ・エイチ（Barg, H.），マルテン・エム（Malten, M.），およびヤーン・ディー（Jahn, D.）（2005年）「バチルス・メガテリウムにおけるタンパク質およびビタミン生成（Protein and vitamin production in Bacillus megaterium）」，バイオテクノロジーにおける方法−微生物生成物および生体内変換（Methods in Biotechnology-Microbial Products and Biotransformations）（バレード・ジェイ・エル（Barredo, J.-L）, ed.）と同じように行った。真菌の生成株として、ピキア・パストリス（例えばＧＳ１１５およびＫＭ７１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）およびアスペルギルス・ニデュランス（例えばＲＭＳ０１１（ストリンガー・エムエー（Stringer, M A），ディーン・アールエー（Dean, R A），シューワル・ティーシー（Sewall, T C），ティンバーレーク・ダブリューイー（Timberlake, W E）（1991年）「ロッドレットレス、直接的な遺伝子活性化によって誘発される新規なアスペルギルス発生変異体（Rodletless， a new Aspergillus developmental mutant induced by direct gene activation)」, Genes Dev 5:1161-1171）およびＳＲＦ２００（カロス・エム（Karos, M），フィッシャー・アール（Fischer, R）（1999年）「ＨｙｍＡの分子特徴付け、進化的に高度に保存され高度に発現されたアスペルギルス・ニデュランスのタンパク質（Molecular characterization of HymA, an evolutionarily highly conserved and highly expressed protein of Aspergillus nidulans）」，Mol Genet Genomics 260:510-521）など）を使用することができる。さらに、発現のために、例えば、アスペルギルス・ニガーなどの、他の真菌の生成宿主を使用することも可能である。代わりに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γタンパク質は、例えばｐＱＥ３０などのベクター系を使用して、エシェリキア・コリにおいて組換え生成することができる。精製は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばＨｉｓ−Ｔａｇ）によって、達成することができる。
【００６４】
実施例２  ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γによる脂肪細胞分化の誘発
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γが、脂肪細胞の分化を誘発する能力を、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）において試験した。ヒト脂肪由来幹細胞を、脂肪吸引によって入手し、公開された手順（クランダルら（Crandall et al）, Endocrinology 140:154-8, 1999年）に従って培養した。簡潔に述べると、脂肪組織を、クレブス−リンゲル−重炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）において２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼで消化した。前脂肪細胞画分を、増殖培地に再懸濁し、培養びんに移し、インキュベーターにおいて３７℃、および５％ＣＯ２で維持した。１６〜２０ｈの間細胞を接着させ、その後、付着しなかった細胞を除去した。
【００６５】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）を、細胞を播種した２４時間後、０．０００１％、０．０１％および１重量％のそれぞれの最終濃度まで培地に加えた。培地を、３日毎に交換し、新鮮なペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを補充した。細胞を、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γで５日間インキュベートした。その後、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを、除去し、細胞を、分化する能力を示す、脂質液滴形成の観察のために、さらに９日間、培養液において保持した。対照を、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γを有さない培地において行った。脂質液滴の形成を、中性トリグリセリドの染色に使用される脂溶性の色素のオイルレッドＯ染色によって、チャンバースライドでは顕微鏡により、９６ウェル平底マイクロプレートでは分光光度法（５４０ｎｍ）により検証した。増加したオイルレッドＯ染色は、より多くの脂質生成、したがってより高い分化のレベルと相関があった。結果を、以下の表１において示す。
【００６６】
【表１】
2014509324.tif 000002
- 分化なし
+ 最小の分化
++ 中程度の分化
+++ 高い分化
【００６７】
表１は、脂肪細胞が、対照と比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γでの処置において増加した分化を示すことを示す。本実施例は、インビボでのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γでの脂肪細胞の処置が、皮膚の不完全性を改善することになることを示唆している。
【００６８】
実施例３  ヒト脂肪由来幹細胞の単離
ヒト脂肪由来成熟間葉系幹細胞（ＡＳＣ）を、美容脂肪吸引を受けた患者由来の脂肪吸引物から単離した。脂肪吸引の吸引物を、形成外科的手順を受けた患者から入手した。吸引した組織を、３７℃で０．０７５％コラゲナーゼＩ（２３０Ｕ／ｍｇ、ＣｅｌｌＳｙｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で消化し、４５分間、連続的に撹拌した。ストローマ血管画分を、３００ｇでの遠心分離によって、残りの線維性の材料および浮遊している脂肪細胞から分離した。沈降した細胞を、ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｒｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄し、１００μｍポアフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してろ過した。赤血球での高度なコンタミネーションは、細胞接着および増殖を著しく低下させることが発見されているので、赤血球コンタミネーションを、Ｂｉｏｃｏｌｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での密度勾配遠心分離によって減少させた。最後に、細胞を、最初の細胞培養のために蒔き、多湿な空気において５％ＣＯ2の雰囲気において３７℃で培養した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＰＡＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１００ｍｇ／ｄｌの生理学的なグルコース濃度を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、培地として使用した。培地を、３日毎に交換した。サブコンフルエントな細胞を、トリプシン処理によって、継代した。
【００６９】
実施例４  脂肪由来幹細胞の細胞増殖に及ぼすＰＰＡＲγの効果の決定
細胞増殖を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用して、測光アッセイによって決定した。簡潔に述べると、ヒト脂肪由来幹細胞を、実施例３による５人の異なるドナーから単離し、細胞１．５×１０4個を、９６ウェルプレートに播種した。細胞試料を、各実験において四つ組で使用した。ヒト脂肪由来幹細胞を、ＰＰＡＲγを含有する培地または対照培地の２つの異なる培地において、６日間培養した。組換えＰＰＡＲγ（ｒｅｃＰＰＡＲγ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｒｃｅ、ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｈｕｍａｎ）を、２７０ｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、原液として使用した。希釈標準溶液を、２．７μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：１００の倍率、１μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：２７０の倍率、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：５４０の倍率、および０．１μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：２７００の倍率を使用して、希釈によって調製した。
【００７０】
細胞試料を、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌを含有する、「ＮＭ」と表示された標準培地である、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＰＡＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１００ｍｇ／ｄｌの生理学的なグルコース濃度を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において培養した。さらなる試料を、５μΜピオグリタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγ、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＮＭにおいて培養した。対照細胞を、ＮＭにおいて培養した。ＦＣＳを有さないＤＭＥＭでインキュベートした細胞試料を、負の対照として使用した。溶媒対照を、ＤＭＳＯを含有するＮＭでインキュベートした。他の細胞試料を、「ＡＭ−」と表示された、４５００ｍｇ／ｌグルコース（高グルコース）および１０μΜインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、１μΜデキサメタゾン（Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）、および１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭにおいて培養した。細胞試料を、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌ、または５μΜピオグリタゾン、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγ、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＡＭ−において培養した。対照細胞を、ＡＭ−において培養した。
【００７１】
培養の６日後、細胞を、ＭＴＴを含有するＰＢＳにおいて、３７℃で４時間、インキュベートした。その後、培地を除去し、０．０４Ｎ  ＨＣｌを加え、吸光度を、マイクロプレートリーダーにおいて、５５０ｎｍ対６５０ｎｍで測定した。
【００７２】
図１は、細胞増殖に及ぼすＰＰＡＲγの効果を例示しており、細胞試料の光度測定（ＯＤ×１０-3）を示す。図１において、バー１から１０は、ＮＭにおいてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＮＭにおいて、ＦＣＳを有さないＤＭＥＭでインキュベートした負の対照（１）、標準培地ＮＭでインキュベートした対照（２）、ＤＭＳＯを含有するＮＭでインキュベートした溶媒対照（３）、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（４）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（５）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（６）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（７）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（８）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（９）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１０）を示す。バー１１から１８は、ＡＭ−においてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＡＭ−において、ＡＭ−でインキュベートした対照（１１）、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１２）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１３）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１４）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１５）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（１６）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１７）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１８）を示す。
【００７３】
図１から解釈できるように、ＭＴＴアッセイの結果は、ＰＰＡＲγが、両方の培地において用量依存的に、脂肪由来幹細胞の増殖を刺激したことを例示した。ピオグリタゾン単独では、ＮＭ標準培地における細胞増殖に及ぼす効果がなかった。
【００７４】
実施例５  ＰＰＡＲγによって誘発された、脂肪由来幹細胞における脂質生成の分化の光度測定
組換えＰＰＡＲγによる脂質生成の分化の誘発を、実施例３において記載したように単離した４人の異なるドナー由来のヒト脂肪由来幹細胞において試験した。細胞を、２週間培養し、培地を、５〜６日毎に交換した。細胞試料を、細胞１．５×１０4個で、９６ウェルプレートに播種した。組換えＰＰＡＲγ（ｒｅｃＰＰＡＲγ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｒｃｅ、ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｈｕｍａｎ）を、２７０ｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、原液として使用した。希釈標準溶液を、２．７μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：１００の倍率、１μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：２７０の倍率、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：５４０の倍率、および０．１μｇ／ｍｌの最終濃度に関して１：２７００の倍率を使用して、希釈によって調製した。
【００７５】
細胞を、「ＮＭ」、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＰＡＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１００ｍｇ／ｄｌの生理学的なグルコース濃度を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の標準培地において、または４５００ｍｇ／ｌグルコース（高グルコース）および１０μΜインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、１μΜデキサメタゾン（Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）、および１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭからなる「ＡＭ−」においてのいずれかの、２つの異なる培地において培養した。細胞試料を、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌを含有するＮＭにおいて培養した。さらなる試料を、５μΜピオグリタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγ、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＮＭにおいて培養した。対照細胞を、ＮＭにおいて培養した。さらなる細胞試料を、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌ、または５μΜピオグリタゾン、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγ、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＡＭ−において培養した。対照細胞を、ＡＭ−において培養した。培養の２週間後、光学濃度を、マイクロプレートリーダーにおいて測定した。
【００７６】
図２は、培養の２週間後の細胞試料の光学濃度（ＯＤ×１０-3）を示す。図２において、バー１から８は、ＮＭにおいてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＮＭにおいて、標準培地ＮＭでインキュベートした対照（１）、およびＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（２）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（３）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（４）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（５）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（６）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（７）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（８）を示す。バー９から１６は、ＡＭ−においてインキュベートした脂肪由来幹細胞を表し、ＡＭ−において、ＡＭ−でインキュベートした対照（９）、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１０）、ＰＰＡＲγの１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１１）、ＰＰＡＲγの０．５μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１２）、またはＰＰＡＲγの０．１μｇ／ｍｌでインキュベートした細胞（１３）、５μΜピオグリタゾンでインキュベートした細胞（１４）、５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１５）、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγでインキュベートした細胞（１６）を示す。
【００７７】
図２から解釈できるように、光学濃度の測定は、ＰＰＡＲγでのインキュベーションが、細胞数を減少させなかったことを例示した。これは、ＰＰＡＲγが、細胞に及ぼす細胞毒性の効果を有さなかったことを示した。さらに、光学濃度における増加は、ＰＰＡＲγでのインキュベーションが、両方の培地における脂肪由来幹細胞の分化および増殖を刺激したことを示している。
【００７８】
実施例６  組換えＰＰＡＲγによる、脂肪由来幹細胞の分化の誘発
組換えＰＰＡＲγによる脂質生成の分化の誘発を、脂肪空胞のＯｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色によって検証した。４人の異なるドナー由来のヒト脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を、実施例３において記載したように単離した。細胞を、「ＮＭ」、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＰＡＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１００ｍｇ／ｄｌの生理学的なグルコース濃度を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の標準培地において２週間培養し、培地を、５〜６日毎に交換した。細胞を、それぞれ、ＰＰＡＲγ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｒｃｅ、ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｈｕｍａｎ）の２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌ、または５μΜピオグリタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγ、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＮＭにおいて培養した。対照を、ＮＭにおいて培養した。
【００７９】
培養における２週間後、分化する能力を示す、脂質液滴の形成を、Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色によって検証した。Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄは、中性のトリグリセリドの染色に使用する脂溶性の色素である。Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色は、脂質生成の分化を示す、細胞内の空胞における脂質液滴の蓄積を明らかにする。４％パラホルムアルデヒドでの２０分間の固定後、細胞を、イソプロパノール／グリセリンにおける、０．５％Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）溶液での１時間の染色時間の間、インキュベートした。Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色を、顕微鏡的に評価した。
【００８０】
図３は、培養の２週間後、脂肪由来幹細胞の分化に及ぼすＰＰＡＲγの効果を示す。図３ａ）は、ＮＭにおいて培養した未分化対照細胞の顕微鏡写真（拡大率６３０×）を示す。図３ｂ）、３ｃ）、３ｄ）、および３ｅ）は、２週間、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌで培養した細胞の顕微鏡写真を示す。図３ｂ）、３ｃ）、３ｄ）、および３ｅ）から解釈できるように、Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色は、ＰＰＡＲγが、脂肪空胞の形成、したがって脂肪由来幹細胞の脂質生成の分化を誘発することができたことを示した。さらに、図は、ＰＰＡＲγによる脂肪空胞の形成の誘発が、濃度依存的効果であったことを示す。
【００８１】
さらなる細胞を、５μΜピオグリタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγ、または５μΜピオグリタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＮＭにおいて培養した。ＰＰＡＲγおよびピオグリタゾンの組合せが、純粋なＮＭ培地と比較して、脂肪空胞の発生をさらに増加させたことが認められた。
【００８２】
さらなる細胞試料を、４５００ｍｇ／ｌグルコース、１０μΜインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、１μΜデキサメタゾン（Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）、１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭからなる「ＡＭ−」において培養した。細胞試料を、それぞれ、ＰＰＡＲγの２．７μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌ、または５μΜピオグリタゾン、または５μΜピオグリタゾンおよび２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγを含有するＡＭ−において培養した。負の対照細胞を、ＡＭ−において培養した。４５００ｍｇ／ｌグルコース、１０μΜインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、１μΜデキサメタゾン（Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）、１０％ＦＣＳおよび１ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）および２００μΜインドメタシン（Ｆｌｕｋａ）を有するＤＭＥＭでインキュベートした細胞を、正の誘発対照として使用した。ＡＭ−培地においても、ＰＰＡＲγは、濃度依存的に、脂肪空胞の形成、したがって脂肪由来幹細胞の脂質生成の分化を誘発することができたことが認められた。
【００８３】
上記のような異なるＰＰＡＲγ濃度を含有するＮＭおよびＡＭ−における細胞の培養を、３週間のインキュベーション期間で繰り返した。Ｏｉｌ−Ｏ−Ｒｅｄ染色は、ＮＭにおけるインキュベーションの３週間後、ＰＰＡＲγが、脂質生成の分化を大いに誘発したことを明らかにした。５μΜピオグリタゾンの追加が、分化をわずかにのみ誘発した一方で、２．７μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＲγおよび５μΜピオグリタゾンの組合せは、脂肪空胞の発生を大量に誘発した。さらに、ＡＭ−培地において３週間培養した細胞においても、ＰＰＡＲγは、濃度依存的に、脂肪空胞の形成および脂肪由来幹細胞の脂質生成の分化を誘発したことが認められた。
【００８４】
これらの実験は、ＰＰＡＲγが、脂肪由来幹細胞における脂質生成の分化を誘発することができることを示しており、インビボでのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γでの脂肪細胞の治療が、皮膚の不完全性を改善することになることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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