(57)【要約】【解決手段】タンパク質の検出装置及び検出方法。装置は、レール分子又はレール分子の極性に応じた方向にレール分子上を移動する生体分子モータのいずれか一方が付着するメインチャネルを有する。サブチャネルは、タウタンパク質を含む検体を受け取るためにメインチャネルと交差する。方法は、検体を装置に供給すること、及び、レール分子上の生体分子モータの移動状態又は生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動状態に基づいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子と、該レール分子上を移動する生体分子モータとの相対的な移動状態に基づいて行うタンパク質の検出方法であって、
（ａ）安定剤によってレール分子を安定化し、
（ｂ）該レール分子又は前記生体分子モータのいずれか一方を基材上に付着させ、
（ｃ）タウタンパク質を含む検体を前記レール分子に供給し、
（ｄ）該レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態又は前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動状態に基づいて、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出することを特徴とするタンパク質の検出方法。
【請求項２】
安定剤によって安定化されたレール分子上の生体分子モータの運動は、前記検体に含まれる正常なタウタンパク質によって阻害され、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質によっては阻害されないことに基づいて、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出する請求項１に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項３】
前記安定剤はパクリタキセル又はドセタキセルである請求項１に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項４】
前記移動状態は、前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動速度、移動距離又は密度若しくは数、又は、前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動速度、移動距離又は密度若しくは数である請求項２に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項５】
基材上に付着させたレール分子に、生体分子モータが接合された微小球体を供給し、該微小球体の移動状態に基づいて前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態を判断する請求項４に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項６】
基材上に付着させた生体分子モータに、蛍光性を備えるレール分子を供給し、該レール分子の移動状態に基づいて前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動状態を判断する請求項４に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項７】
極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子と、該レール分子上を移動する生体分子モータとの相対的な移動状態に基づいて行うタンパク質の検出方法に使用される検出装置であって、
（ａ）安定剤によって安定化されたレール分子を付着させる基材の表面を底面とするメインチャネルと、
（ｂ）該メインチャネルと交差する方向に延在し、タウタンパク質を含む検体が供給されるサブチャネルとを有し、
（ｃ）前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態を観察可能であることを特徴とする検出装置。
【請求項８】
前記サブチャネルは複数であり、複数の検体に含まれるタウタンパク質による前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態への影響を同時に観察可能である請求項７に記載の検出装置。
【請求項９】
前記メインチャネルには生体分子モータが接合された微小球体が供給され、該微小球体の移動状態に基づいて前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態が判断される請求項７に記載の検出装置。
【請求項１０】
極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子と、該レール分子上を移動する生体分子モータとの相対的な移動状態に基づいて行うタンパク質の検出方法に使用される検出装置であって、
（ａ）前記生体分子モータを付着させる基材の表面を底面とする複数のナノチャネルを含むナノチャネル部と、
（ｂ）該ナノチャネル部の一端に接続され、安定剤によって安定化されたレール分子が供給されるインレット部と、
（ｃ）前記ナノチャネル部の他端に接続されたアウトレット部であって、前記インレット部に供給され、前記ナノチャネル部を通過して排出されたレール分子を観察可能なアウトレット部とを有することを特徴とする検出装置。
【請求項１１】
前記インレット部に供給されるレール分子は蛍光性を備え、前記アウトレット部は蛍光強度を検出可能である請求項１０に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の検出方法及び該方法に使用される検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体分子モータの一種であるキネシン（Ｋｉｎｅｓｉｎ）は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の加水分解に伴い、レール分子の一種である微小管（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の上を移動することが知られている（例えば、特許文献１参照。）。この場合、微小管は、モノマーであるチューブリン（Ｔｕｂｕｌｉｎ）を重合することによって得られる直径約２５〔ｎｍ〕、長さ数十〔μｍ〕の円筒状構造を備えるフィラメントであって、極性を有しており、キネシンは微小管のマイナス端側からプラス端側に向けて移動する。
【０００３】
なお、生体内における微小管にはＭＡＰ（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：微小管結合タンパク質）が存在し、特に脳神経細胞の微小管にはタウタンパク質（Ｔａｕ−Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれるＭＡＰが付着する。正常なタウタンパク質（Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｔａｕ）は、チューブリンの重合及び微小管の安定に寄与し、細胞内物質輸送を支える（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、過剰リン酸化したタウタンパク質や局在化したタウタンパク質のような異常なタウタンパク質（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｔａｕ）（又は、変質したタウタンパク質（Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｔａｕ））は、生体内における生体分子モータの運動を阻害する。
【０００４】
そして、脳科学、神経病理学等の分野では、変質したタウタンパク質が脳の嗅内野に凝集体（Ｔａｎｇｌｅｄ  Ｔａｕ、すなわち、Ｔａｎｇｌｅｓ）を形成することによって、神経機能の低下や、それに起因する記憶障害のような、アルツハイマー病に代表されるタウタンパク質異常疾患（Ｔａｕｏｐａｔｈｙ：タウオパシー）が生じることが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。そこで、タウタンパク質の存在をオンチップで検出する技術として、表面プラズモンを用いる方法やイムノアッセイによる方法が提案されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−３１２２１１号公報
【非特許文献１】P. Tolnay,“Tau protein pathology in Alzheimer's disease and related disorders”, Neuropathology and applied neurobiology, vol. 25(3), pp. 171-187(1999)
【非特許文献２】T. Kimura et al., EMBO J., 26, 5143-5152, 2007
【非特許文献３】M. Vestergaard et al., Talanta, 74, 1038-1042, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の技術は、タウタンパク質の存在のみを検出するのであって、過剰リン酸化したタウタンパク質や局在化したタウタンパク質のような変質したタウタンパク質の存在を検出することができない。タウタンパク質異常疾患は、変質したタウタンパク質の割合が低い段階で診断を下すことができれば、例えば、リン酸化酵素阻害剤等を利用して通常のタウタンパク質としての機能を回復させることによって、早期治療が可能であると考えられる。
【０００７】
本発明は、前記従来の問題点を解決して、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）によって安定化されたレール分子に対する生体分子モータの相対的な移動状態を観察することにより、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を、容易に、確実に検出することができるタンパク質の検出方法及び検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そのために、本発明のタンパク質の検出方法においては、極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子と、該レール分子上を移動する生体分子モータとの相対的な移動状態に基づいて行うタンパク質の検出方法であって、安定剤によってレール分子を安定化し、該レール分子又は前記生体分子モータのいずれか一方を基材上に付着させ、タウタンパク質を含む検体を前記レール分子に供給し、該レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態又は前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動状態に基づいて、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出する。
【０００９】
本発明の他のタンパク質の検出方法においては、さらに、安定剤によって安定化されたレール分子上の生体分子モータの運動は、前記検体に含まれる正常なタウタンパク質によって阻害され、変質したタウタンパク質によっては阻害されないことに基づいて、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出する。
【００１０】
本発明の更に他のタンパク質の検出方法においては、さらに、前記安定剤はパクリタキセル又はドセタキセルである。
【００１１】
本発明の更に他のタンパク質の検出方法においては、さらに、前記移動状態は、前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動速度、移動距離又は密度若しくは数、又は、前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動速度、移動距離又は密度若しくは数である。
【００１２】
本発明の更に他のタンパク質の検出方法においては、さらに、基材上に付着させたレール分子に、生体分子モータが接合された微小球体を供給し、該微小球体の移動状態に基づいて前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態を判断する。
【００１３】
本発明の更に他のタンパク質の検出方法においては、さらに、基材上に付着させた生体分子モータに、蛍光性を備えるレール分子を供給し、該レール分子の移動状態に基づいて前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動状態を判断する。
【００１４】
本発明の検出装置においては、極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子と、該レール分子上を移動する生体分子モータとの相対的な移動状態に基づいて行うタンパク質の検出方法に使用される検出装置であって、安定剤によって安定化されたレール分子を付着させる基材の表面を底面とするメインチャネルと、該メインチャネルと交差する方向に延在し、タウタンパク質を含む検体が供給されるサブチャネルとを有し、前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態を観察可能である。
【００１５】
本発明の他の検出装置においては、さらに、前記サブチャネルは複数であり、複数の検体に含まれるタウタンパク質による前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態への影響を同時に観察可能である。
【００１６】
本発明の更に他の検出装置においては、さらに、前記メインチャネルには生体分子モータが接合された微小球体が供給され、該微小球体の移動状態に基づいて前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態が判断される。
【００１７】
本発明の更に他の検出装置においては、極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子と、該レール分子上を移動する生体分子モータとの相対的な移動状態に基づいて行うタンパク質の検出方法に使用される検出装置であって、前記生体分子モータを付着させる基材の表面を底面とする複数のナノチャネルを含むナノチャネル部と、該ナノチャネル部の一端に接続され、安定剤によって安定化されたレール分子が供給されるインレット部と、前記ナノチャネル部の他端に接続されたアウトレット部であって、前記インレット部に供給され、前記ナノチャネル部を通過して排出されたレール分子を観察可能なアウトレット部とを有する。
【００１８】
本発明の更に他の検出装置においては、さらに、前記インレット部に供給されるレール分子は蛍光性を備え、前記アウトレット部は蛍光強度を検出可能である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、タンパク質の検出方法においては、安定剤によってレール分子を安定化し、該レール分子又は生体分子モータのいずれか一方を基材上に付着させ、タウタンパク質を含む検体を前記レール分子に供給し、該レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態又は前記生体分子モータによって移動させられるレール分子の移動状態に基づいて、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出する。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を、容易に、確実に検出することができる。
【００２０】
また、検出装置においては、安定剤によって安定化されたレール分子を付着させる基材の表面を底面とするメインチャネルと、該メインチャネルと交差する方向に延在し、タウタンパク質を含む検体が供給されるサブチャネルとを有し、前記レール分子上を移動する生体分子モータの移動状態を観察可能である。これにより、簡単な構成でありながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を、容易に、確実に検出することができる。
【００２１】
さらに、検出装置においては、生体分子モータを付着させる基材の表面を底面とする複数のナノチャネルを含むナノチャネル部と、該ナノチャネル部の一端に接続され、パクリタキセルによって安定化されたレール分子が供給されるインレット部と、前記ナノチャネル部の他端に接続されたアウトレット部であって、前記インレット部に供給され、前記ナノチャネル部を通過して排出されたレール分子を観察可能なアウトレット部とを有する。これにより、簡単な構成でありながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を、容易に、確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１の実施の形態における第１の検出装置を用いて変質したタウタンパク質を検出する方法を説明する図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態における微小管及びキネシンを示す模式図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態における生体内での微小管とタウタンパク質との関係を示す模式図である。
【図４】本発明の第１の実施の形態におけるビーズアッセイの概念図である。
【図５】本発明の第１の実施の形態における変質したタウタンパク質を検出する方法の概念図である。
【図６】本発明の第１の実施の形態におけるビーズを撮影した顕微鏡写真である。
【図７】本発明の第１の実施の形態における実験で使用したデバイスを説明する図である。
【図８】本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の影響を示す図である。
【図９】本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の密度の影響を示す図である。
【図１０】本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすインキュベート時間の影響を示す図である。
【図１１】本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの分子の数に及ぼすインキュベート時間の影響を示す図である。
【図１２】本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼす微小管の状態の影響を示す図である。
【図１３】本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の密度の影響を示す第２の図である。
【図１４】本発明の第２の実施の形態におけるグライディングアッセイの概念図である。
【図１５】本発明の第２の実施の形態における変質したタウタンパク質を検出する方法の概念図である。
【図１６】本発明の第２の実施の形態における微小管を撮影した顕微鏡写真である。
【図１７】本発明の第２の実施の形態における実験で使用したデバイスを説明する図である。
【図１８】本発明の第２の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の影響を示す図である。
【図１９】本発明の第２の実施の形態におけるキネシンの動きを第１の実施の形態と比較した図である。
【図２０】本発明の第２の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすインキュベート時間の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２４】
図２は本発明の第１の実施の形態における微小管及びキネシンを示す模式図、図３は本発明の第１の実施の形態における生体内での微小管とタウタンパク質との関係を示す模式図である。なお、図２において、（ａ）は微小管及びキネシンのみを示す図、（ｂ）は神経細胞内での微小管及びキネシンを示す図であり、図３において、（ａ）は安定した微小管を示す図、（ｂ）は分解した微小管を示す図である。
【００２５】
図において、３１は生体内におけるレール分子の一種である微小管であり、３２は生体内における神経細胞５１のような細胞内において細胞小器官等の被輸送物質３６を輸送する生体分子モータの一種であるキネシンである。
【００２６】
生体分子モータは、モータタンパク質（モータプロテイン：Ｍｏｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称されるものであり、極性を有する細胞骨格繊維に結合し、該細胞骨格繊維沿いに一定方向に移動する。そして、細胞内には数十種類の生体分子モータが存在し、本実施の形態における生体分子モータは、いかなる種類のものであってもよく、例えば、ミオシン（Ｍｙｏｓｉｎ）、ダイニン（Ｄｙｎｅｉｎ）等であってもよいが、本発明の発明者は、生体分子モータとしてキネシン３２を使用して実験を行ったので、ここでは、生体分子モータがキネシン３２である場合について説明する。
【００２７】
また、生体分子モータが移動するためのレール分子は、細胞内においては、前述のように細胞骨格繊維であり、例えば、アクチンフィラメント（Ａｃｔｉｎ  Ｆｉｌａｍｅｎｔ）であってもよいが、本発明の発明者はレール分子として微小管３１を使用して実験を行ったので、ここでは、レール分子が微小管３１である場合について説明する。
【００２８】
なお、微小管３１は、３種類存在する細胞骨格繊維の１つであり、モノマーであるチューブリンを重合することによって得られる直径約２５〔ｎｍ〕、長さ数十〔μｍ〕の円筒状構造を備えるフィラメント、すなわち、繊維である。なお、チューブリンは、α−チューブリン及びβ−チューブリンという２個の球状ポリペプチドが、非共有結合によって固く結合したヘテロ二量体である。
【００２９】
また、微小管３１は極性を有し、一方の端（図２における右端）がプラス端であり、他方の端（図２における左端）がマイナス端である。プラス端とマイナス端とは、微小管３１を構成するサブユニットであるチューブリンが重合する速度によって識別され、重合する速度が高く、速く伸長する端がプラス端と呼ばれ、重合する速度が低く、ゆっくりと伸長する端がマイナス端と呼ばれる。
【００３０】
一方、キネシン３２は、ヘッド（頭）部が１０〔ｎｍ〕、全長が８０〔ｎｍ〕程度のタンパク分子である。そして、２個の球形のヘッド部と細長いより合わせコイル部とを有し、ヘッド部が微小管３１への付着と解離とを交互に繰り返すことによって、両手で繊維を手繰るように、１歩ずつ前進する。この場合、キネシン３２の運動は、８〔ｎｍ〕のステップから成り、最大速度が８００〔ｎｍ／ｓｅｃ〕程度であり、図２において矢印で示されるように、微小管３１上をマイナス端側からプラス端側に向けて移動する。また、キネシン３２の発生力は５〜８〔ｐＮ〕である。
【００３１】
生体内における微小管３１、特に脳神経細胞の微小管３１にはタウタンパク質と呼ばれるＭＡＰが付着する。図３（ａ）に示されるように、正常なタウタンパク質、すなわち、正常なタウは、チューブリンの重合及び微小管３１の安定に寄与する。しかし、図３（ｂ）に示されるように、変質したタウタンパク質、すなわち、変質したタウは、凝集体を形成して微小管３１から離脱するので、微小管３１が分解してしまう。
【００３２】
なお、ここでは、タウタンパク質（ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と正常なタウ（ｈｅａｌｔｈｙ  ｔａｕ）とは同義であり、異常なタウタンパク質（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｔａｕ）と凝集体を形成したタウタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔａｎｇｌｅｓ（ＮＦＴｓ））、及び、部分的に消化された又は機能不全となったタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｏｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎ  ａｎｙ  ｗａｙ）とは同義であり、変質したタウ（ｍｕｔａｔｅｄ  ｔａｕ）と変質したタウタンパク質（ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）とは同義であり、高リン酸化したタウ（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｔａｕ）は、過剰にリン酸化されてＭＴに結合不能なタウタンパク質（ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｅｘｃｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｔ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＴｓ）と同義であり、局在化したタウ（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｔａｕ）は、所定位置にいるタウタンパク質（ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｎｏｗｎ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）と同義であり、凝集したタウ（ｔａｎｇｌｅｄ  ｔａｕ）は、凝集体を形成したタウ（ｔａｕ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｉｎ  ｔａｎｇｌｅｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  ＮＦＴｓ）と同義であるものとする。
【００３３】
次に、本実施の形態における変質したタウタンパク質を検出する方法について説明する。
【００３４】
図１は本発明の第１の実施の形態における第１の検出装置を用いて変質したタウタンパク質を検出する方法を説明する図、図４は本発明の第１の実施の形態におけるビーズアッセイの概念図、図５は本発明の第１の実施の形態における変質したタウタンパク質を検出する方法の概念図、図６は本発明の第１の実施の形態におけるビーズを撮影した顕微鏡写真である。なお、図１において、（ａ）〜（ｄ）は各工程を示す図、（ｃ−１）、（ｃ−２）、（ｄ−１）及び（ｄ−２）は（ｃ）及び（ｄ）の要部拡大図であり、図５において、（ａ）はキネシンの運動が阻害された状態を示す図、（ｂ）はキネシンの運動が正常な状態を示す図である。
【００３５】
本発明の発明者は、生体外、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてタンパク質を検出する検出装置として、後述される第１及び第２の検出装置と、これら第１及び第２の検出装置を使用する第１及び第２のタンパク質の検出方法とを発明した。
【００３６】
本実施の形態においては、第１のタンパク質の検出方法について説明する。ここでは、第１のタンパク質の検出方法として、変質したタウタンパク質を検出する方法についてのみ説明する。具体的には、図４に示されるような「ビーズアッセイ」（Ｂｅａｄ  Ａｓｓａｙ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｂｅａｄ  Ａｓｓａｙ）と称されるタンパク質に付着したビーズ３６ａを観察することによってタンパク質を検出する方法であって、ビーズ３６ａが付着したキネシン３２の、ガラス板等から成る基材２２上に固定された微小管３１に沿った移動状態を観察することによって、検体に含まれる変質したタウタンパク質の存在や割合を判断する方法である。
【００３７】
この場合、微小管３１としては、安定剤によって安定化されたものを使用する。安定剤としては、タキサン（Ｔａｘａｎｅ）系の化合物であるパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）やドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）を使用することができるが、ここでは、パクリタキセルを使用した例について説明する。すなわち、パクリタキセルによって安定化された微小管（Ｔａｘｏｌ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）３１を使用した例について説明する。このような微小管３１は、パクリタキセルによってチューブリンの重合状態が安定的に維持されており、タウタンパク質のようなＭＡＰを含んでいない。具体的には、豚の脳から採取したチューブリンをＭｇＳＯ4 （１〔ｍＭ〕）及びＧＴＰ（１〔ｍＭ〕）を含むＢＲＢ８０緩衝液（８０〔ｍＭ〕  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ＝６．８、１〔ｍＭ〕  ＭｇＣｌ2   １〔ｍＭ〕  ＥＧＴＡ）内で重合させて微小管３１を生成した。そして、３７〔℃〕で３０分間インキュベートした後、微小管３１は、パクリタキセル（４０〔μＭ〕）で安定化させられ、パクリタキセル（２０〔μＭ〕）を含むＢＲＢ８０緩衝液内で１００倍に希釈された。なお、実験に応じて、微小管３１は、タウタンパク質及びパクリタキセルの両方を含むＢＲＢ８０緩衝液内で希釈される。
【００３８】
本実施の形態においては、「特許文献１」に記載された発明と同様に、所定波長の光を照射することによってキネシン３２を失活させることにより、微小管３１をキネシン３２によって固定する方法を採用した。該方法においては、まず、基材２２の表面に多数のキネシン３２の分子を固定する。ここに微小管３１を導入して、ＡＴＰを与えるとキネシン３２の生体分子モータとしての作用によって、微小管３１が動き出す。すなわち、基材２２の表面に固定されたキネシン３２の分子が微小管３１上を移動するので、微小管３１が基材２２の表面を移動することになる。そして、前記微小管３１が所望の位置に到達すると、キネシン３２に所定波長の光を照射する。これにより、キネシン３２は、失活し、該キネシン３２のヘッド部に微小管３１が付着した状態で、動きを停止する。そのため、微小管３１が停止する。この場合、キネシン３２のヘッド部が微小管３１に付着した状態を維持するので、微小管３１が固定される。
【００３９】
そして、キネシン３２の移動状態を観察するために、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを被輸送物質３６として使用する。具体的には、ビオチン化されたキネシン（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｋｉｎｅｓｉｎ）（ビオチン−カルボキシル−キャリア−タンパク質（ＢＣＣＰ）と呼ばれるビオチン依存酵素（Ｂｉｏｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ）を有するＧＳＴ−４１０−ＢＣＣＰキネシン）が実験に使用された。ビオチン化されたキネシンは、大腸菌から採取したものである。培養及び精製の後、ビオチン化されたキネシンの濃度は、０．０７〔ｍｇ／ｍｌ〕である。
【００４０】
また、ビーズ３６ａは、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）がコートされた市販の微小球体（ＣＰ０１Ｎ／６９０５、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）であって、直径が０．４９〔μｍ〕である。キネシン３２の分子をビーズ３６ａに付着させるために、特定のアビジン−ビオチンバインディング（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）を使用する。
【００４１】
さらに、２種類の組み換え型タウタンパク質（Ｔａｕ−４４１  ｈｕｍａｎ  ２Ｎ４Ｒ）を使用する。１つは正常なタウタンパク質（Ｔ０５７６、Ｓｉｇｍａ）であり、もう１つは変質したタウタンパク質（Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｔａｕ）（Ｐ３０１Ｌ、ｒＰｅｐｔｉｄｅ）である。
【００４２】
パクリタキセルによって安定化された微小管３１は、前述のように、ＭＡＰを含んでいない。そのため、パクリタキセルによって安定化された微小管３１にタウタンパク質を付着させると、図５（ａ）に示されるように、キネシン３２の分子は、その動作が阻害され、動作が遅くなったり、微小管３１から離脱したりしてしまうと考えられる。しかし、パクリタキセルによって安定化された微小管３１にタウタンパク質を付着させない場合には、図５（ｂ）に示されるように、キネシン３２は、その動作が阻害されることがないので、動作が正常であり、微小管３１から離脱しにくいと考えられる。つまり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、パクリタキセルによって安定化された微小管３１にタウタンパク質が付着しているか否かによって、微小管３１上を移動するキネシン３２の分子の移動速度及び移動距離、並びに、微小管３１上に存在するキネシン３２の分子の密度（又は数）に差異が生じる、と考えられる。
【００４３】
一方、タウタンパク質は、正常なものである場合には、パクリタキセルによって安定化された微小管３１に付着するであろうが、変質して凝集体を形成している場合には、パクリタキセルによって安定化された微小管３１に付着しないであろう、と考えられる。つまり、パクリタキセルによって安定化された微小管３１にタウタンパク質を供給すると、当該タウタンパク質が正常なものである場合には、図５（ａ）に示される場合と同様に、キネシン３２の分子の移動状態、すなわち、移動速度、移動距離及び密度（又は数）に影響を及ぼすが、当該タウタンパク質が変質したものである場合には、図５（ｂ）に示される場合と同様に、キネシン３２の移動状態に影響を及ぼすことがない、と考えられる。
【００４４】
したがって、被験者から採取したタウタンパク質を含む検体をパクリタキセルによって安定化された微小管３１に供給し、キネシン３２の移動状態を観察すれば、該移動状態に基づいて検体に含まれるタウタンパク質が正常なものであるか変質したものであるかを判断することができ、さらに、変質したタウタンパク質の割合をも検出することが可能となる。
【００４５】
本発明の発明者は、このような知見に基づいて、異常な、すなわち、変質したタウタンパク質を検出する方法を発明した。この場合、図１に示されるような検出装置を用いて変質したタウタンパク質を検出することができる。
【００４６】
図１において、２１はＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）フィルムであり、該ＰＤＭＳフィルム２１には、直線状に延在する１本のメインチャネル２６と、該メインチャネル２６と交差する方向に延在する（図示される例においては、直交するように延在する）２本のサブチャネル２９が形成されている。そして、該サブチャネル２９の一方を第１サブチャネル２９ａと称し、他方を第２サブチャネル２９ｂと称することとする。なお、前記ＰＤＭＳフィルム２１の下面にはガラススライドである基材２２が付着しており、該基材２２の表面がメインチャネル２６及びサブチャネル２９の底面として機能する。
【００４７】
そして、図１（ｂ）に示されるように、メインチャネル２６の底面に微小管３１を固定する。なお、該微小管３１はパクリタキセルによって安定化されたものである。続いて、サブチャネル２９内にタウタンパク質の溶液を注入する。この場合、図１（ｃ）に示されるように、第１サブチャネル２９ａには、正常なタウタンパク質の溶液を注入し、第２サブチャネル２９ｂには、変質したタウタンパク質の溶液を注入する。すると、図１（ｃ−１）に示されるように、正常なタウタンパク質は微小管３１に付着するが、図１（ｃ−２）に示されるように、変質したタウタンパク質は微小管３１に付着しない。
【００４８】
続いて、図１（ｄ）に示されるように、メインチャネル２６内にキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを供給し、キネシン３２を活性化する。すると、該キネシン３２は、ビーズ３６ａとともに、微小管３１上を移動するが、図１（ｄ−１）に示されるように、正常なタウタンパク質が付着している箇所では、その動作が阻害され、動作が遅くなったり、微小管３１から離脱したりしてしまう。これに対し、図１（ｄ−２）に示されるように、タウタンパク質が付着していない箇所では、その動作が阻害されることがないので、キネシン３２は、ビーズ３６ａとともに、スムーズに移動し、かつ、微小管３１から離脱してしまうこともない。
【００４９】
なお、図６には、本発明の発明者が撮影したキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの顕微鏡写真が示されている。
【００５０】
このようにして、正常なタウタンパク質が供給された箇所と変質したタウタンパク質が供給された箇所とにおける微小管３１上のキネシン３２の移動状態をあらかじめ観察して記録しておき、被験者から採取したタウタンパク質を含む検体を供給した箇所におけるキネシン３２の移動状態を記録結果と比較することによって、前記検体に変質したタウタンパク質が含まれるか否かを判断することが可能となり、さらに、前記検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を判断することも可能となる。
【００５１】
次に、本実施の形態において、本発明の発明者が行った実験の方法、及び、実験で使用したデバイスの構造について説明する。
【００５２】
図７は本発明の第１の実施の形態における実験で使用したデバイスを説明する図である。なお、図において、（ａ）はフローセルを示す図、（ｂ）は第１の検出装置の模式図である。
【００５３】
本発明の発明者は、図７（ａ）に示されるようなフローセル１０を使用して基礎実験を行った。前記フローセル１０は、ガラス板等から成る透明な板材としての一対のカバースリップ１２と、該カバースリップ１２同士の間隔を保持する一対の間隔保持部材１３とを備える。該間隔保持部材１３は、例えば、グリースを含浸させた板紙から成る。前記一対のカバースリップ１２と一対の間隔保持部材１３とによって周囲を画定した空間内に微小管３１及びキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを供給して、微小管３１上のキネシン３２の移動状態を観察する。
【００５４】
また、検体に変質したタウタンパク質が含まれるか否かを判断したり、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を判断したりするために使用する最終的な第１の検出装置は、図７（ｂ）に示されるような微小フルイディックスチップ（Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｈｉｐ）としての第１のチップ２０である。該第１のチップ２０は、ガラススライドである基材２２と、該基材２２の表面に付着するＰＤＭＳフィルム２１とを有し、該ＰＤＭＳフィルム２１には、前述のように、直線状に延在する１本のメインチャネル２６と、該メインチャネル２６に直交するように延在する２本のサブチャネル２９とが形成されている。そして、該サブチャネル２９の一方を第１サブチャネル２９ａと称し、他方を第２サブチャネル２９ｂと称することとする。なお、前記ＰＤＭＳフィルム２１の下面には基材２２が付着しているので、該基材２２の表面がメインチャネル２６及びサブチャネル２９の底面として機能する。
【００５５】
前記ＰＤＭＳフィルム２１は、「特許文献１」に記載された発明と同様に、フォトリソグラフィー技術を利用して作成される。例えば、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ社から市販されているレジストであるＳＵ−８  ５０を使用して、図示されないシリコンウェハの表面に、前記メインチャネル２６及びサブチャネル２９に対応する形状の高さ５０〔μｍ〕程度の凸パターンを形成する。次に、前記シリコンウェハの表面に、例えば、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社から市販されているＳｉｌｇａｒｄ  １８４等のＰＤＭＳのプレポリマを塗布し、該プレポリマを硬化させた後、剥（はく）離させる。これにより、図７（ｂ）に示されるようなＰＤＭＳフィルム２１を得ることができる。
【００５６】
最後に、前記ＰＤＭＳフィルム２１を、酸素プラズマに曝（さら）した（５０〔ｓｃｃｍ〕、２０〔Ｐａ〕、６５〔Ｗ〕、８〔ｓｅｃ〕）後に、基材２２の表面に密着するように接合する。
【００５７】
なお、本発明の発明者が作成した第１のチップ２０において、メインチャネル２６の深さ、幅及び長さは、それぞれ、５０〔μｍ〕、２００〔μｍ〕及び２０〔ｍｍ〕であり、各サブチャネル２９の深さ、幅及び長さは、それぞれ、５０〔μｍ〕、１００〔μｍ〕及び１５〔ｍｍ〕である。
【００５８】
さらに、本発明の発明者は、ＤＩＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ：微分干渉コントラスト）セットアップを備える倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社  ＩＸ−７１）を実験の観察のために使用した。そして、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ社製のカメラ（Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２II）を使用して画像を実験データとして記録し、記録された実験データをソフトウェアであるＭｅｔａＭｏｒｐｈ及びＣｏｓｍｏｓを使用して処理した。
【００５９】
そして、フローセル１０は、倒立顕微鏡のステージに直接保持されるようにした。また、図７（ｂ）に示されるように、第１のチップ２０には、Ｋｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のシリンジポンプ４１を２つ接続した。各シリンジポンプ４１は、接続管４２を介して、メインチャネル２６の出口２６ｏｕｔ及びサブチャネル２９の出口２９ｏｕｔに、それぞれ、接続され、メインチャネル２６及びサブチャネル２９内の液体を吸い出すために使用される。なお、図７（ｂ）において、２６ｉｎ及び２９ｉｎは、メインチャネル２６及びサブチャネル２９の入口である。
【００６０】
キネシン３２の活動を検出するために、微小管３１に沿ったキネシン３２の動作を観察する必要がある。そこで、前述のように、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを使用することによって、ＤＩＣセットアップを用いて固定された微小管３１に沿ったキネシン３２の移動状態、典型的には、平均移動速度を計測することが可能となる。
【００６１】
実験では、負帯電したタンパク質に結合可能なポリカチオン（Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）であるＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ：ポリエルリジン）をコーティングしたガラス板から成るカバースリップ１２及び基材２２を微小管３１の固定に使用した。なお、タウタンパク質の付着した微小管３１を用意するためには、２つの方法がある。
【００６２】
第１の方法は、タウタンパク質の付着した微小管３１（ＴＭＴ：正常なタウタンパク質が供給された微小管３１、又は、ＭｕＴＭＴ：変質したタウタンパク質が供給された微小管３１）を別々に用意する方法である。この場合、正常なタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液又は変質したタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液で１００倍に希釈された微小管３１を、チューブ内において３７〔℃〕で３０分間インキュベートする。そして、タウタンパク質の付着した微小管３１をＰＬＬでコーティングしたフローセル１０内に注入し、３分間インキュベートする。キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを流した後、１〔ｍＭ〕のＡＴＰ溶液を流し込んでキネシン３２を活性化する。
【００６３】
また、第２の方法は、現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で付着させるものである。この場合、ＢＲＢ８０緩衝液内で１００倍に希釈された微小管３１を、まず、ＰＬＬでコーティングしたフローセル１０内で不動化するために３分間インキュベートする。そして、タウタンパク質を微小管３１に付着させるために、タウタンパク質の溶液を注入する。続いて、後述されるように相違する時間だけ、タウタンパク質を微小管３１に付着させるためのインキュベートを行う。これによって得られたタウタンパク質の付着した微小管３１（ＴＭＴ）を、１〔ｍＭ〕のＡＴＰ溶液の存在下でのキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの動作を観察するために使用する。
【００６４】
第２の方法、すなわち、現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で付着させる方法では、図１に示されるような第１の検出装置も使用した。メインチャネル２６は、まず、ＰＬＬでコーティングされ、そして、微小管３１がメインチャネル２６内に固定される。タウタンパク質の溶液が一方のサブチャネル２９に注入され、対照実験として、ＢＲＢ８０緩衝液が他方のサブチャネル２９に注入される。２５分間インキュベートした後、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａをメインチャネル２６内に流し込む。最後に、１〔ｍＭ〕のＡＴＰ溶液を加えて、ビーズ３６ａに付着したキネシン３２を活性化する。
【００６５】
次に、本発明の発明者が行った実験の内容及び結果について説明する。
【００６６】
図８は本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の影響を示す図、図９は本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の密度の影響を示す図、図１０は本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすインキュベート時間の影響を示す図、図１１は本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの分子の数に及ぼすインキュベート時間の影響を示す図、図１２は本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼす微小管の状態の影響を示す図、図１３は本発明の第１の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の密度の影響を示す第２の図である。
【００６７】
本発明の発明者は、相違する３つの条件で実験を行った。
【００６８】
第１の条件は、前述の第１の方法に対応し、フローセル１０内に微小管３１を固定する前に、タウタンパク質をあらかじめ微小管３１に付着させておくものである。チューブリンモノマー：タウタンパク質分子の比が４０：１となるようにし、正常なタウタンパク質又は変質したタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液で１００倍に希釈された微小管３１を、３７〔℃〕で２０分間インキュベートした。また、対照実験として、通常の微小管３１をＢＲＢ８０緩衝液内で１００倍に希釈し、３７〔℃〕で２０分間インキュベートした。前述の所定の実験手順を行った後、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを観察し、各ケースにおける平均移動速度を計測した。
【００６９】
通常の微小管３１であるＭＴに沿ったビーズ３６ａの平均移動速度、及び、変質したタウタンパク質を付着させた微小管３１であるＭｕＴＭＴに沿ったビーズ３６ａの平均移動速度の計測値は、それぞれ、０．２２±０．０６〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝４５）、及び、０．２２±０．０４〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝４４）であった。なお、ｎは、観察したビーズ３６ａの数である。また、正常なタウタンパク質を付着させた微小管３１であるＴＭＴに沿ったビーズ３６ａの平均移動速度の計測値は、０．１９±０．０５〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝４５）であった。
【００７０】
図８に示されるように、得られた結果を対照実験と比較することによって、その意味が明らかとなる。図８は、フローセル１０内におけるキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの正規化された平均移動速度を、通常の微小管３１に沿って移動する場合と相違する種類のタウタンパク質を付着させた微小管３１に沿って移動する場合とを比較して、示している。図８において、ＭＴは通常の微小管３１、ＭｕＴＭＴは変質したタウタンパク質が供給された微小管３１、及び、ＴＭＴは正常なタウタンパク質が供給された微小管３１を意味する。また、エラーバーは、標準偏差に対応する。
【００７１】
なお、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔテスト（例えば、非特許文献４参照。）の結果では、変質したタウタンパク質を付着させたケース、及び、正常なタウタンパク質を付着させたケースの値は、それぞれ、ｐ＝０．８６及びｐ＜０．０１である。
【００７２】
【非特許文献４】S.M. Dunn, A. Constantinides, P.V. Moghe, “Numerical Methods in Biomedical Engineering ”,Elsevier Academic Press, 2006
【００７３】
また、本発明の発明者は、ビーズ３６ａの平均移動速度に対するタウタンパク質の密度の影響についても実験を行った。図９は、微小管３１とタウタンパク質との比を変化させた場合におけるフローセル１０内におけるキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの正規化された平均移動速度の変化を示している。図９に示されるように、微小管３１の数とタウタンパク質の数との比を変化させた場合における微小管３１に沿ったビーズ３６ａの正規化された平均移動速度は、微小管モノマーの数とタウタンパク質の分子の数との比が８：１、８０：１、８００：１、及び、タウタンパク質の数が０の場合、それぞれ、０．１１±０．０２〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝３２）、０．１２±０．０３〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝４４）、０．１３±０．０２〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝２４）、及び、０．１４±０．０２〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝４５）であった。このように、微小管３１に付着するタウタンパク質が多くなるほど、ビーズ３６ａの平均移動速度が低下する、という結果が得られた。
【００７４】
第２の条件は、前述の第２の方法に対応し、フローセル１０内における微小管３１に、タウタンパク質を現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で付着させるものである。この実験では、微小管３１を固定した後に、１〔μｇ／ｍｌ〕のタウタンパク質の溶液をフローセル１０に注入した。そして、相違するインキュベート時間（０分、５分、２０分、６０分及び１２０分）毎に、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度を計測した。
【００７５】
図１０に示されるように、インキュベート時間の増加とともに、ビーズ３６ａの平均移動速度が低下するという結果が得られた。図１０は、フローセル１０内における微小管３１にタウタンパク質を現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で付着させた場合におけるキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの正規化された平均移動速度を、相違するインキュベート時間毎に示している。なお、観察したビーズ３６ａの数ｎは、それぞれ、ｎ＝６５、４４、２５、２０及び８であった。また、図１０において、エラーバーは、標準偏差に対応し、Ｘ軸の目盛は一定の割合で付与されてはいない。
【００７６】
さらに、図１１は、観察された移動するビーズ３６ａの平均個数を示している。これにより、フローセル１０内に固定された微小管３１に、タウタンパク質を現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で付着させる場合の影響が分かる。また、図１１において、エラーバーは、標準偏差に対応し、Ｘ軸の目盛は一定の割合で付与されてはいない。
【００７７】
なお、対照実験（インキュベート時間＝０分）において観察された移動するビーズ３６ａの数は、１回の観察当たり１７個以上であった。しかし、インキュベート時間が長くなるにつれて移動するビーズ３６ａの数は減少し、最長のインキュベート時間（インキュベート時間＝１２０分）においては１回の観察当たり２個であった。各インキュベート時間毎に、４回の観察を行った。
【００７８】
第３の条件は、前述の第２の方法に対応し、図１に示されるような第１の検出装置内における微小管３１に、タウタンパク質を現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で付着させるものである。前述のように、メインチャネル２６は、ＰＬＬでコーティングされ、微小管３１が固定された。そして、１〔μｇ／ｍｌ〕のタウタンパク質の溶液を一方のサブチャネル２９に注入し、２５分間インキュベートした。また、対照実験として、ＢＲＢ８０緩衝液を他方のサブチャネル２９に注入した。図１２には、予備実験結果が示されている。通常の微小管３１上のキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度の計測値は、０．３２±０．０８〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝１５）であり、正常なタウタンパク質が付着した微小管３１上のキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度の計測値は、０．２４±０．０３〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝９）であった。
【００７９】
図１２は、メインチャネル２６と相違するサブチャネル２９との交差箇所におけるキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの正規化された平均移動速度の比較を示している。なお、観察したビーズ３６ａの数ｎは、それぞれ、ｎ＝１５及び９であった。ＢＲＢ８０緩衝液のみが注入されたサブチャネル２９との交差箇所と比較すると、タウタンパク質の溶液が注入されたサブチャネル２９との交差箇所では、平均移動速度が大きく低下した。なお、図１２におけるエラーバーは、標準偏差に対応する。
【００８０】
タウタンパク質が微小管３１の安定化に重要な役割を果たすことは知られているが、これらの実験結果は、タウタンパク質がキネシン３２の動きにネガティブな影響を及ぼすことを示している。これは、微小管３１の安定化がパクリタキセルによって達成されているためである。このことから、タウタンパク質は、微小管３１の安定化には有益でないが、キネシン３２の抵抗として作用することが分かった。この知見は、図８に示される実験結果に合致する。
【００８１】
正常なタウタンパク質が微小管３１に付着する。これに対して、変質したタウタンパク質は、互いに結合して凝集体を形成する傾向がある。そして、このような凝集体になると、微小管３１への結合能力が低下する（例えば、非特許文献１参照。）。このことから、正常なタウタンパク質が供給された微小管３１であるＴＭＴを使用すると、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度が低下する、と予想することができる。さらに、微小管３１にタウタンパク質が付着しないので、変質したタウタンパク質が供給された微小管３１であるＭｕＴＭＴを使用した場合と通常の微小管３１であるＭＴを使用した場合とでは、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度に差が生じない、と予想することができる。
【００８２】
分子検出器として、前述のようなデバイスを使用することは、タウタンパク質の付着レベルについての情報を提供する能力を必要とする。図１０は、インキュベート時間が増加すると、微小管３１に付着するタウタンパク質の量が増加し、その結果、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度が低下する、ことを示している。さらに、タウタンパク質の付着量が増加すると、キネシン３２の動作が（及び、キネシン３２の微小管３１への付着力も、同様に）阻害されるので、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａが微小管３１から容易に離脱してしまう。そして、図１１に示されるように、正常なタウタンパク質が供給された微小管３１であるＴＭＴに沿って移動するキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの数が、インキュベート時間の増加とともに、減少する。
【００８３】
また、本発明の発明者は、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度に対する変質したタウタンパク質の密度の影響についても実験を行った。図１３は、正常なタウタンパク質の密度と変質して凝集体となったタウタンパク質の密度とを変化させた場合におけるフローセル１０内におけるキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの正規化された平均移動速度の変化を示している。図１３に示される例において、ケースＡ〜Ｅでは、微小管３１の数に対する正常なタウタンパク質の数、微小管３１の数に対する凝集体となったタウタンパク質の数、及び、ｎの値は、それぞれ、｛１０倍、１倍、ｎ＝２４｝、｛１０倍、０、ｎ＝３３｝、｛１１倍、０、ｎ＝２０｝、｛１０倍、１０倍、ｎ＝３５｝、及び、｛０、１０倍、ｎ＝２７｝であった。このように、変質したタウタンパク質が供給された微小管３１であるＭｕＴＭＴを使用した場合には、正常なタウタンパク質が供給された微小管３１であるＴＭＴを使用した場合よりも、キネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａの平均移動速度が高い、という結果が得られた。
【００８４】
図７（ｂ）に示されるような第１のチップ２０を使用することは、相違する条件で研究することができるので、実験構成に起因するエラーをできるだけ抑制するために重要である。フローセル１０を使用する場合には、個々の実験に応じて、相違する装置を用意する必要がある。これに対して、第１のチップ２０は、正確に同一の条件で実験を行うことができるので、優れた実験装置である。これは、メインチャネル２６の相違する箇所において、同一の微小管３１の相違する部分にタウタンパク質の分子を付着させることができるからである。さらに、同一のキネシン３２がコーティングされたビーズ３６ａを、相違するケースのために、メインチャネル２６内を移動させることができる。相違するケースを比較するために同一の条件を提供することができるということは、安定した結果を得るために、実験装置にとっては重要な利点である。
【００８５】
このように、本実施の形態においては、パクリタキセルによって微小管３１を安定化し、微小管３１を基材２２上に付着させ、タウタンパク質を含む検体を微小管３１に供給し、微小管３１上を移動するキネシン３２の移動状態に基づいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出するようになっている。
【００８６】
また、第１のチップ２０は、パクリタキセルによって安定化された微小管３１を付着させる基材２２の表面を底面とするメインチャネル２６と、メインチャネル２６と交差する方向に延在し、タウタンパク質を含む検体が供給されるサブチャネル２９とを有し、微小管３１上を移動するキネシン３２の移動状態を観察可能である。
【００８７】
これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を、容易に、確実に検出することができる。したがって、アルツハイマー病に代表されるタウタンパク質異常疾患について、変質したタウタンパク質の割合が低い段階で診断を下すことができ、例えば、リン酸化酵素阻害剤等を利用して通常のタウタンパク質としての機能を回復させることによって、早期治療が可能となる。
【００８８】
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、前記第１の実施の形態と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
【００８９】
図１４は本発明の第２の実施の形態におけるグライディングアッセイの概念図、図１５は本発明の第２の実施の形態における変質したタウタンパク質を検出する方法の概念図、図１６は本発明の第２の実施の形態における微小管を撮影した顕微鏡写真である。なお、図１５において、（ａ）はキネシンの運動が阻害された状態を示す図、（ｂ）はキネシンの運動が正常な状態を示す図である。
【００９０】
本実施の形態においては、第２のタンパク質の検出方法について説明する。なお、前記第１の実施の形態と同様の事項については、その説明を省略する。
【００９１】
ここでは、第２のタンパク質の検出方法として、変質したタウタンパク質を検出する方法についてのみ説明する。具体的には、図１４に示されるようなグライディングアッセイ（Ｇｌｉｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｇｌｉｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ）と称される微小管３１を観察することによってタンパク質を検出する方法であって、微小管３１として蛍光性を備える蛍光微小管を使用し、該蛍光微小管の、キネシン３２がコーティングされたガラス板等から成る基材２２の表面に沿った移動状態を観察することによって、検体に含まれる変質したタウタンパク質の存在や割合を判断する方法である。なお、蛍光微小管は、「特許文献１」に記載された発明と同様に、蛍光色素によってラベリングされた蛍光チューブリンと、蛍光色素によってラベリングされていない蛍光チューブリンとを適切な比で混合することによって得ることができる。
【００９２】
また、前記微小管３１は、前記第１の実施の形態と同様に、パクリタキセルによって安定化されたものである。そのため、微小管３１にタウタンパク質を付着させると、図１５（ａ）に示されるように、キネシン３２は、その動作がタウタンパク質によって阻害され、動作が遅くなったり、キネシン３２が微小管３１から離脱したりしてしまうと考えられる。しかし、前記微小管３１にタウタンパク質を付着させない場合には、図１５（ｂ）に示されるように、キネシン３２は、その動作がタウタンパク質によって阻害されることがないので、動作が正常であり、キネシン３２が基材２２の表面から離脱しにくいと考えられる。つまり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、パクリタキセルによって安定化された微小管３１にタウタンパク質が付着しているか否かによって、キネシン３２がコーティングされた基材２２上を移動する微小管３１の移動速度及び移動距離、並びに、基材２２上に存在する微小管３１の密度（又は数）に差異が生じる、と考えられる。
【００９３】
したがって、被験者から採取したタウタンパク質を含む検体をパクリタキセルによって安定化された前記微小管３１に供給し、該微小管３１の移動状態を観察すれば、該移動状態に基づいて検体に含まれるタウタンパク質が正常なものであるか変質したものであるかを判断することができ、さらに、変質したタウタンパク質の割合をも検出することが可能となる。
【００９４】
次に、本実施の形態において、本発明の発明者が行った実験の方法、及び、実験で使用したデバイスの構造について説明する。
【００９５】
図１７は本発明の第２の実施の形態における実験で使用したデバイスを説明する図である。なお、図において、（ａ）は第１の検出装置の模式図、（ｂ）はナノチャネルに微小管が進入する様子を示す写真、（ｃ）は作成したナノチャネルを示す写真である。
【００９６】
図において、３０は、第２の検出装置として本発明の発明者が作成した微小フルイディックスチップである第２のチップである。該第２のチップ３０は、ナノチャネル部３５と、該ナノチャネル部３５の両端に接続されたインレット部３７、及び、アウトレット部としての蛍光検出部３８とを備える。
【００９７】
前記ナノチャネル部３５は、「特許文献１」に記載された発明におけるナノチャネルと同様に、フォトリソグラフィー技術を利用して作成されたものであり、ガラス板と該ガラス板に接合されたＰＤＭＳフィルムとを備え、図１７（ｃ）に示されるようなＰＤＭＳフィルムに形成された複数本の互いに平行な細長い溝、すなわち、ナノチャネルを有する。したがって、該ナノチャネルの底面はガラス板の表面によって形成されている。なお、ガラス板の表面は、キネシン３２によってコーティングされている。
【００９８】
そして、前記インレット部３７は、ナノチャネル部３５の一端に接続された空間であり、ＢＲＢ８０緩衝液内で希釈された微小管３１が供給される部分である。前記インレット部３７に供給された微小管３１は、ガラス板の上面に固定されたキネシン３２によって搬送され、図１７（ｂ）に示されるように、確率的にナノチャネル内に進入する。そして、キネシン３２が微小管３１上をマイナス端側からプラス端側に向けて移動するので、微小管３１は矢印の示す方向に移動する。
【００９９】
また、前記蛍光検出部３８は、ナノチャネル部３５の一端に接続された空間であり、ナノチャネル部３５から搬出された微小管３１を観察する部分である。前述のように、パクリタキセルによって安定化された微小管３１にタウタンパク質が付着しているか否かにより、キネシン３２によって搬送される微小管３１の移動速度及び移動距離、並びに、密度（又は数）に差異が生じるのであるから、ナノチャネル部３５の長さ、及び、インレット部３７に供給される微小管３１の密度（又は数）が所与条件として与えられれば、微小管３１がインレット部３７に供給されてから、一定の時間が経過した後に、蛍光検出部３８に存在する微小管３１の数をカウントすることによって、キネシン３２により搬送される微小管３１の移動速度及び移動距離、並びに、密度（又は数）を計測することができる。なお、蛍光検出部３８における蛍光強度は、そこに存在する微小管３１の数に比例すると考えられるので、蛍光検出部３８における蛍光強度を検出することによって、微小管３１の移動速度及び移動距離、並びに、密度（又は数）を計測してもよい。
【０１００】
次に、本発明の発明者が行った実験の内容及び結果について説明する。
【０１０１】
図１８は本発明の第２の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすタウタンパク質の影響を示す図、図１９は本発明の第２の実施の形態におけるキネシンの動きを第１の実施の形態と比較した図、図２０は本発明の第２の実施の形態におけるキネシンの動きに及ぼすインキュベート時間の影響を示す図である。
【０１０２】
図１８は、第２のチップ３０のナノチャネル部３５を通過する微小管３１の平均移動速度を、通常の微小管３１の場合と相違する種類のタウタンパク質を付着させた微小管３１の場合とを比較して、示している。図１８において、ＭＴは、通常の微小管３１であって、ＢＲＢ８０緩衝液内において３７〔℃〕で２０分間インキュベートしたもの、ＭｕＴＭＴは、変質したタウタンパク質を付着させた微小管３１であって、変質したタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液内において３７〔℃〕で２０分間インキュベートしたもの、ＴＭＴは、正常なタウタンパク質を付着させた微小管３１であって、正常なタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液内において３７〔℃〕で２０分間インキュベートしたもの、並びに、ＭｕＴＴＭＴは、正常なタウタンパク質及び変質したタウタンパク質を付着させた微小管３１であって、正常なタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液内において３７〔℃〕で２０分間及び変質したタウタンパク質を含むＢＲＢ８０緩衝液内において３７〔℃〕で２０分間インキュベートしたものである。
【０１０３】
キネシン３２によって搬送される微小管３１の平均移動速度の計測値は、ＭＴ、ＭｕＴＭＴ、ＴＭＴ及びＭｕＴＴＭＴの場合、それぞれ、０．２８９±０．０３６〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝６０）、０．２７２±０．０２６〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝６０）、０．２３０±０．０３４〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝６０）、及び、０．１８４±０．０２３〔μｍ／ｓｅｃ〕（ｎ＝６０）であった。なお、ｎは、観察した微小管３１の数である。
【０１０４】
本実施の形態において説明したようなグライディングアッセイと称される方法によって得られた微小管３１の平均移動速度を正規化した値を、前記第１の実施の形態において説明したようなビーズアッセイと称される方法によって得られたビーズ３６ａの平均移動速度を正規化した値と比較すると、図１９に示されるようになる。なお、図１９において、□はグライディングアッセイの場合の値を示し、◆はビーズアッセイの場合の値を示している。
【０１０５】
また、図１９に示される例において、微小管３１の数とタウタンパク質の数との比は、８０：１である。さらに、ＭＴ、ＭｕＴＭＴ、ＴＭＴ及びＭｕＴＴＭＴの比は、グライディングアッセイ及びビーズアッセイの場合、それぞれ、１：０．９４：０．８０：０．６４、及び、１：０．９９：０．７５：０．６４である。
【０１０６】
そして、図２０は、インキュベート時間と微小管３１の平均移動速度との関係を示している。なお、□は微小管３１がＭＴの場合の値を示し、◆は微小管３１がＴＭＴの場合の値を示している。微小管３１がＴＭＴである場合には、インキュベート時間が増加するほど、微小管３１の平均移動速度が低下することが分かる。
【０１０７】
このように、本実施の形態においては、パクリタキセルによって微小管３１を安定化し、キネシン３２の分子を基材２２上に付着させ、タウタンパク質を含む検体を微小管３１に供給し、キネシン３２によって移動させられる微小管３１の移動状態に基づいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を検出するようになっている。
【０１０８】
また、第２のチップ３０は、キネシン３２を付着させる基材２２の表面を底面とする複数のナノチャネルを含むナノチャネル部３５と、ナノチャネル部３５の一端に接続され、パクリタキセルによって安定化された微小管３１が供給されるインレット部３７と、ナノチャネル部３５の他端に接続された蛍光検出部３８であって、インレット部３７に供給され、ナノチャネル部３５を通過して排出された微小管３１を観察可能な蛍光検出部３８とを有する。
【０１０９】
これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、検体に含まれる変質したタウタンパク質の割合を、容易に、確実に検出することができる。したがって、アルツハイマー病に代表されるタウタンパク質異常疾患について、変質したタウタンパク質の割合が低い段階で診断を下すことができ、例えば、リン酸化酵素阻害剤等を利用して通常のタウタンパク質としての機能を回復させることによって、早期治療が可能となる。
【０１１０】
なお、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々変形させることが可能であり、それらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明は、タンパク質の検出方法及び検出装置に利用することができる。
【符号の説明】
【０１１２】
２２    基材
２６    メインチャネル
２９ａ    第１サブチャネル
２９ｂ    第２サブチャネル
３５    ナノチャネル部
３６ａ    ビーズ
３７    インレット部
３８    蛍光検出部
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２】
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【図３】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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