(57)【要約】本発明は、ゲル体を含む微粒子に関し、前記ゲル体は、合成ポリマー及び薬剤を含み、前記微粒子は４０〜１５００μｍの範囲の平均直径を有し、前記ポリマーは、ジスルフィド結合を含む基により架橋され、且つ、ヒドロゲル形態である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル体を含む微粒子であって、前記ゲル体が合成ポリマー及び薬剤を含み、前記微粒子が４０〜１５００μｍの範囲の平均直径を有し、前記ポリマーがジスルフィド結合を含む基によって架橋され、且つ、ヒドロゲルの形態であることを特徴とする、微粒子。
【請求項２】
治療中に前記薬剤が放出されることを特徴とする、塞栓術による治療の方法において使用するための、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３】
前記塞栓術による治療方法において、前記微粒子が低酸素環境にさらされ、そのような環境において前記ジスルフィド結合が切断され、前記薬物の放出を促進することを特徴とする、請求項２に記載の微粒子。
【請求項４】
前記塞栓術による治療方法が腫瘍の治療であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の微粒子。
【請求項５】
前記薬剤が、抗腫瘍薬、抗血管形成薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗細菌薬、抗ヒスタミン薬、抗悪性腫瘍薬、酵素及び抗アレルギー薬から成る群から選択され、好ましくは、アントラサイクリン又はカンプトテシン化合物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項６】
前記微粒子が微小球であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項７】
前記ポリマーがアクリル系ポリマーであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項８】
前記ポリマーがビニルアルコールポリマーであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項９】
４０〜３００μｍの範囲の平均直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１０】
前記ポリマーがアニオン性であり、前記薬剤がカチオン性であり、静電気的に前記ポリマーに関連付けられていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１１】
前記ポリマーを架橋する基が、前記ポリマー上のアニオン荷電に寄与していることを特徴とする、請求項１０に記載の微粒子。
【請求項１２】
前記ポリマーが、生理学的ｐＨで二つのカチオン性又はアニオン性荷電基を含むジスルフィド結合を含む試薬を用いて架橋されており、それらが前記ジスルフィド結合の両側に対称に配置されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１３】
前記二つのカチオン性又はアニオン性荷電基が、前記薬剤に静電気的に関連付けられていることを特徴とする、請求項１２に記載の微粒子。
【請求項１４】
前記ポリマーがＰＶＡマクロマーから形成されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１５】
前記微粒子が生分解性であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の微粒子を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容される液体のビヒクル、好ましくは、生理食塩水及び／又は例えばＸ線などの撮像装置による可視造影剤を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記薬剤が微粒子から放出されることを特徴とする、塞栓術による治療方法で使用するための、塞栓組成物の製造における、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の微粒子の使用。
【請求項１９】
前記治療方法が腫瘍の治療方法であり、好ましくは、前記薬剤が低酸素環境において前記微粒子から放出されることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素状態に応答する新規の薬剤送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
酸素の十分な供給は、すべての多細胞生物／後生動物種の正常な機能に不可欠である。細胞プロセスの大部分についての原則的なエネルギー源は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酸化的リン酸化反応は、それによって細胞がグルコース及び脂肪酸の代謝からＡＴＰを生成するプロセスであり、酸素分子は細胞呼吸のための代謝基質であり、末端電子受容体として作用する。
【０００３】
低酸素症として知られる細胞の低い酸素濃度は、細胞機能の低下を招き、細胞死及び細胞の損傷につながる可能性がある。しかしながら、酸素分子は細胞内の巨大分子へ酸化的損傷を引き起こす可能性があるため、潜在的に毒性である。酸素恒常性の制御は、細胞の維持、従って、生物全体の生存を維持するために不可欠である。
【０００４】
健康なヒトの組織内での生理的酸素分圧は、臓器に応じて異なるが、一般的に２０〜１２０ｍｍＨｇの範囲内にある。異なる組織内の細胞は、異なる酸素分圧を発生する。一組織中の細胞は、最も近い血液供給からの距離（組織を通過する酸素の拡散距離は、１５μｍであると推定される）及び、その血液供給の酸素化状態に依存して、ある範囲の酸素分圧を発生する。例えば、肝臓への血液供給のＯ２圧力は、肝動脈内で９５〜１０５ｍｍＨｇの範囲であり、門脈内で５０〜６５ｍｍＨｇの範囲であり、洞様血管内で３５〜４５ｍｍＨｇの範囲であり、中心静脈内で３０〜４０ｍｍＨｇの範囲である。健康な肝臓中で各細胞が発生する異なる酸素分圧は、全て正常であると認識される。確かに、洞様血管に沿った酸素勾配は、洞様血管内で代謝機能の帯状分布を作る調節因子である。細胞内の酸素濃度を検知し、変更するために応答するための高感度であり、且つ、適応性のあるメカニズムは、酸素の恒常性を維持するために不可欠である。酸素レベル変動への適応は、柔軟且つ、わずかな変化に対応できるようにする必要がある。
【０００５】
通常は、血液中の酸素の低下した分圧（低酸素血症）、又は、血液の酸素運搬能力の低下（貧血）の結果として、酸素の分圧が＜７ｍｍＨｇであるときに、低酸素症が生じる。低酸素症へ対応する分子応答は、低酸素への適応に関与する遺伝子の発現の増加をもたらし、生理的範囲の促進は、細胞を低酸素環境で生存させることができるようにすることに応答及び適応する。これらの標的遺伝子は、血管形成、代謝、細胞増殖及び細胞生存において、重要な役割を果たしている。低酸素に対する対応のマスターレギュレーターは、転写因子低酸素誘導因子（ＨＦ）である。図１は、腫瘍が低酸素にあり従ってサイズが増加するため、腫瘍を提供する酸素レベルが減少するにつれて、その結果として成長因子の存在が増加することを、模式的に示している。
【０００６】
低酸素症を体験した場合に組織内で発生する有害な代謝変化を考えると、これらの変化に対処し得る低酸素環境への対応において、活性化合物の放出を調節する、スマートな薬剤送達システムを開発する機会がある。刺激応答性ポリマーへの、特に、制御された及び自動制御された薬剤送達の分野への関心が、高まってきている。これらのポリマーに基づく送達システムは、密接に疾患状態の通常の生理的過程に類似するように開発され、生理的な必要性に応じた最適な薬剤放出を確保する。ポリマーアーキテクチャは、環境からのマイナー信号への応答におけるそれらの物理化学的挙動における大きな変化を示すように開発されており、医薬的及び生物医学的用途のために、潜在的に有用な物質の製造に使用されてきている。癌と関連する腫瘍のような複雑な病気を治療するために標的化送達システムを設計するように、最も高度な刺激応答性薬物送達システムはまた、新たな戦略が検討されている。
【０００７】
チオール及びジスルフィドの相互変換は、多くのタンパク質の立体構造の整合性に関して重要な生物学的プロセスである。ジスルフィド官能基を含むポリマーは、それらが療法のメカニズムによって可逆変換を受けることになるため、酸化還元及びチオール応答の両方であると考えることができる（Ｍｅｎｇ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ３０，  （２００９），  ２１８０−２１９８を参照）。グルタチオン（ＧＳＨ）は、ほとんどの細胞中で１０ｍＭの濃度で豊富、細胞外のレベルよりも５０００倍高い濃度で存在する、天然に存在する還元剤であり、これは、細胞環境内での応答をトリガするためのメカニズムを提供する。更に、低酸素腫瘍は、還元環境を有することが知られており、これによって、低酸素状態におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存シトクロムＰ４５０及び他のヘムタンパク質は、基質の広い範囲の二電子還元を媒介する。これは、バノキサントロンなどの抗腫瘍活性を有する、それぞれの第三級アミンに変換することができる、低毒性Ｎ−酸化物を含むものなどの、いくつかの生体還元薬剤の基礎である（ＡＱ４→ＡＱ４Ｎ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｈｙｐｏｘｉａ，  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｌ．Ｈ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．  １２，  （１９９３），  １１９−３４）。
【０００８】
Ｏｕｐｉｃｋｙは、ジスルフィド結合を含むポリ−Ｌ−リジンシステムを記載しており、これは細胞内環境において還元可能であり、ＤＮＡ放出を促進するメカニズムを提供し、６０倍トランスフェクション効率を増加させる（Ｏｕｐｉｃｋｙ，  Ｄ．，  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ６０，（２００８）９５７）。
【０００９】
ジスルフィド架橋を含む微小球組成物が記載され、それによって微小球はタンパク質で構成されている。例えば、Ｍａｋらは、いわゆるタンパク質活性化自発的自己集合（ＰＡＳＳ）と呼ばれる、革新的なアプローチで、純粋なタンパク質微粒子を生成するために用いられる、非化学的架橋法を報告する。タンパク質微粒子のこの製造は、微粒子状にタンパク質を組み立てるために、分子リンカーとしてタンパク質分子内で、内部ジスルフィド架橋を使用するという考えに基づいている。組立プロセスは、活性化試薬−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によってトリガされ、これは、得られたタンパク質微粒子中に組み込まれることなく、中間ステップに関与している（Ｍａｋ  Ｗ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０，  （２０１０），  ４１３９−４１４４）。米国特許出願第２００７０２３１４００号明細書（Ｑｕｉｒｋ、Ｓ．）は、架橋試薬と相互連結されている熱的に凝縮されたアミノ酸混合物から成る、プロテイノイド微小球を提供する。プロテイノイド微小球は、物質または化合物をカプセル化し、材料又は化合物の、ゆっくりとした、持続的な又は時機を合わせた放出を提供するために使用することができる。
【００１０】
チオール−ジスルフィド化学に基づく、生分解性ポリマーマイクロカプセルが、記載されてきた。Ｚｅｌｉｋｉｎらは、シリカ粒子上のチオール化ＰＭＡ（ＰＭＡＳＨ）及びポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）の層ごとの蒸着の後、チオールへの架橋ＰＭＡへの酸化及び、水素結合を破壊し、カプセル構造を形成するためにｐＨを変化させることによって、ジスルフィドで架橋されたポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡ）を調製した（Ｚｅｌｉｋｉｎ，  Ａ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃａｐｓｕｌｅｓ：  ｅｎ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｂｉｏｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ７，  （２００６），  ２７−３０）。
【００１１】
他は、イオン性ゲル化することによる、経口チオマー（ｔｈｉｏｍｅｒ）ベースのインスリン用の微粒子送達システムの開発について説明した（Ｇｒｅｉｍｅｌ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌａｔｅｄ  ａｌｇｉｎａｔｅ／ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ５９，  （２００７），  １  １９１  −８）。微粒子マトリックスは、ポリ（アクリル酸）−システイン（ＰＡＡ−システイン）及び、アルギン酸塩−システイン（Ａｌｇ−Ｃｙｓ）又は対応する非修飾ポリマー（ＰＡＡ，Ａｌｇ）から構成されていた。全ての製剤の平均粒子サイズは、４００〜６００ミクロンの範囲であった。
【００１２】
同様に、新規な粘膜付着性微粒子薬物送達システムが報告されている（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １８，  （２００３），  ２９−３８）。微粒子を、ポリマーのグラム当たり、３０８マイクロモルの量のチオール基を含む、４５０ｋＤａの平均分子量のポリ（アクリル酸）−システイン共役体を用いて、溶媒蒸発エマルジョン法により調製した。
【００１３】
Ｙａｎらは、ドキソルビシンを装填し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで大腸癌細胞に薬剤を送達するための、上述の段落０００８で記載した、３ミクロンの直径のＰＭＡＳＨマイクロカプセルの使用を記載している（Ｙａｎ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，  ４，  （２０１０），  ２９２８−３６）。薬剤の酸化還元トリガの放出は全く実証されていないが、しかしながら、論文中では提示されている。
【００１４】
欧州特許ＥＰ１００７１０１Ａ２明細書において、ポリマー微小球は塞栓の治療に有用であり得ることを開示している。塞栓は、その腫瘍の栄養及び酸素を飢餓状態にさせるために、腫瘍へ供給する動脈に塞栓物質の導入を伴う。薬剤溶出ビーズは、デバイスにより誘導される虚血に加えて、化学療法薬の併用容量を、局所的に持続的な方法で腫瘍へ投与し、全身への曝露を減らし、腫瘍中の薬剤レベルを最大化するように、開発されている（例えば、国際公開ＷＯ０４／０７１４９５号明細書参照）。低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）の活性化を介して、生存促進性の多数の経路を順番に開始できる腫瘍内で、塞栓のみが腫瘍内低酸素症を誘発する可能性があり、増加した薬剤耐性及び血管新生応答を含むより悪性の表現型につながる、前臨床腫瘍モデルからの証拠が存在する（Ｌｉａｎｇ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ｗｉｔｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｅｍｂｏｌｉｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ，  ＣＶＩＲ，  ３３，  （２０１０）  ８０６−８１２）。
【００１５】
従来技術は、低酸素環境での薬剤の制御された送達のためにジスルフィド基を含有する、ヒドロゲル微粒子又は微小球の使用を開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の第一の態様によると、ゲル体を含む微粒子が提供され、前記ゲル体は合成ポリマー及び薬剤を含み、前記微粒子は４０〜１５００μｍの範囲の平均直径を有し、前記ポリマーはジスルフィド結合を含む基によって架橋され、ヒドロゲルの形態である。
【００１７】
本発明の第二の態様によると、塞栓術による治療の方法において使用するための微粒子が提供され、前記微粒子はポリマー及び薬剤を含み、前記ポリマーはジスルフィド結合を含む基によって架橋され、治療薬が放出される。
【００１８】
第三の態様によると、ポリマー及び薬剤を含む、４０〜１２００μｍの範囲の平均直径を有する微粒子が提供され、前記ポリマーはジスルフィド結合を含む基によって架橋され、前記ポリマーはビニルアルコールポリマーである。
【００１９】
第四の態様によると、ポリマー及びカチオン荷電した薬剤を含む、４０〜１２００μｍの範囲の平均直径を有する微粒子が提供され、前記ポリマーはジスルフィド結合を含む基によって架橋され、各架橋基は前記ジスルフィド単位について対称的に配置された二つの陰荷電基を含み、前記陰荷電基は静電気的に薬剤に関連付けられている。
【００２０】
第五の態様によると、腫瘍の治療方法において使用するために、ポリマー及び薬剤を含む、４０〜１２０μｍの範囲の平均直径を有する微粒子が提供され、前記ポリマーはジスルフィド結合を含む基によって架橋されている。
【００２１】
本発明は、固形腫瘍の化学療法の塞栓術で有用である、新規の薬剤送達システムを提供する。前記システムは、構造内にジスルフィド架橋を含む、ポリマー微粒子から構成されている。微粒子からの薬物放出速度は腫瘍が低酸素になると変更され、腫瘍の還元的環境内ジスルフィド架橋を切断するように、薬剤の放出増加につながる。本発明は、直接腫瘍内投与又は動脈内経路による腫瘍血管系への送達のいずれかの方法で、腫瘍の局所的なターゲティングのために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、酸化還元環境やチオールの存在に敏感である、即ち、レドックス／チオール反応性である、反応性ポリマーの種類に関係する。他の架橋結合が存在してもよいが、ポリマーは共有結合的に、ジスルフィド結合で架橋されている。
【化１】
2014503580.tif 000002
【００２３】
本発明で使用され得る、いくつかのより一般的なジスルフィド含有架橋結合の化学構造を以下に示す。
【化２】
2014503580.tif 000003
【００２４】
架橋剤は、典型的に以下の一般式を有する：
【数１】
2014503580.tif 000004
式中、Ａ及びＡ’は、ポリマーと共有結合を形成することができる基から独立して選択され；ｎ及びｎ’は、１〜１０の範囲の整数であり、好ましくは２〜４の範囲である。ｎ及びｎ’は、それぞれ最も好ましくは２である。
【００２５】
−（ＣＨ２）ｎ−及び−（ＣＨ２）ｎ’−基は、例えば、静電気的に薬剤と関連付けられ得る他の基と置換されていてもよい。イオン相互作用が好ましい。特に好ましい置換基は、カチオン性薬剤とイオン結合を形成することができるカルボキシル基である。
【００２６】
基Ａ及びＡ’は、ポリマーから求核攻撃を受けやすい基であってもよい。典型的に、求核攻撃を受けやすい基は、−Ｃ（＝Ｏ）ＬＧを含み、式中ＬＧは離脱基であり、ポリマーとの反応において離脱する。あるいは、基はポリマーとの重合を受ける。これを行うには、例えば、
【化３】
2014503580.tif 000005
エチレン性不飽和基を含み得る。
【００２７】
好ましくは、架橋剤は、ジスルフィドユニットについて対称である。特に好ましい架橋剤は、以下の式を有し：
【化４】
2014503580.tif 000006
式中、基Ａ及びＡ’は上述の通りである。
【００２８】
架橋剤は、ポリマー上で架橋剤とエチレン性不飽和ペンダント基とを反応させることによって典型的にポリマーへ組み込まれる。
【００２９】
本発明における有用なポリマーは、アクリル系ポリマー、ビニルアルコール系ポリマー及びアクリレートポリマーを含む。好ましくは、ポリマーは、例えば、ポリアクリルアミド及びその誘導体などのアクリルファミリー、ポリアクリレート及びその誘導体及びポリアリル及びポリビニル化合物からのコポリマーである。ポリマーは、合成、即ち、起源がタンパク質などのように）自然ではないものであり得る。
【００３０】
微粒子は、任意の形状を有することができる。微粒子の直径は、いわゆる「正規分布」を採用する可能性があり、極端な直径を有する非常に少数の粒子及び、平均直径を有する大多数の粒子を含む。本発明の微粒子は、好ましくは微小球である。本発明における微小球は、ポリマーから形成された球形又は実質的に球形のビーズである。実質的に球形は、一群の微小球が約９５％近く、約８０％〜約１００％の範囲内が中心にある球形の測定値を有することを意味する。前記群は、全体として母集団に対して高い球形度の測定値を維持しながら、低い球形度測定値を有するいくつかの個々の微小球を含み得る。微小球の球形度測定値は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標）ＲａｐｉｄＶＵＥ（登録商標）粒子分析システム（Ｈｉａｌｉｅａｈ、Ｆｌａ）を用いて、バルクスケールで製造することができる。
【００３１】
一般的に、微粒子は、微粒子の本体全体にわたって実質的に連続である、つまり、ゲル体、即ち、マイクロカプセルの本体において見つけられるような内部空洞が存在しない、ポリマーマトリックスから形成される。
【００３２】
好ましくは、微粒子は、水膨潤性水不溶性ポリマーのマトリックスから形成される。マトリックス中に、治療剤（薬剤）が吸収される。ポリマーは好ましくは、６〜８の範囲のｐＨで、全体的なアニオン荷電を有する。典型的に、微粒子は、水中で平衡膨潤したときには、４０〜１５００μｍの範囲、好ましくは４０〜１２００μｍの範囲、４０〜１０００μｍの範囲、最も好ましくは４０〜５００μｍの範囲又は４０〜３００μｍの範囲の、粒径（平均直径）を有する。好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の粒子がその範囲内に存在する。粒径分布は、好ましくは単峰性である。
【００３３】
微粒子の平均直径は、画面フィルタリングとも呼ばれる、流動床分離及び篩などの方法により決定することができる。特に有用なのは、所望のサイズの微粒子を含有するサンプルを回収するための、一連の適切な篩である。平均直径は、目盛アイピースを用いた光学顕微鏡イメージングなどの手法によって決定することができる。この方法において、微粒子の平均直径は、例えば、等価円直径の適用によって決定することができる。実質的に球状である微小球について、平均直径は微小球の実質的な直径に関連する。
【００３４】
微粒子は、好ましくは生分解性である。生分解は、物理的特性の変化をもたらす生物の行動による、物質の化学的な破壊である。微粒子は、還元環境の存在下では生分解性であり、微粒子内のジスルフィド結合は、それらのチオール基を切断し、その後に、例えば、可溶化され、微粒子の劣化をもたらすアミノ酸を形成するために、開裂する。
【００３５】
低酸素状態における腫瘍は、スマートな薬剤送達システムのためのターゲットとして使用することができる、高度な還元環境を提供する。特定の実施例において、還元環境の存在下で、ＢＡＬＣ微粒子内のジスルフィド結合は、それらのチオール基へ開裂する。還元されたＢＡＬＣは、その出発成分アミノ酸Ｌ−システインへ開裂されるが、共重合体構造により微粒子内に保持され、従って、送達システムは恒久的な塞栓術の機能を保持する。しかしながら、微粒子内のＢＡＬＣ濃度が増加し、そのコポリマーの濃度が減少するにつれて、より多くのＢＡＬＣがそれ自体と重合する。微粒子が、低酸素腫瘍内で見つかった生物学的因子にさらされている場合には、高レベルの架橋で、ＢＡＬＣは再びアミノ酸を形成するために開裂するが、オリゴマーの形態で、一つ以上の追加のＬ−システイン分子に結合させることができる。アミノ酸オリゴマーは、一旦、微粒子の劣化につながる共重合体構造から切り離されると、可溶化し得る。
【００３６】
本発明におけるポリマーは、好ましくは水膨潤性であるが、水不溶性である。水性液体の存在下では、従って、ポエリマーはヒドロゲルを形成する。ポリマーは、共有結合的に架橋されるが、少なくとも部分的にイオン架橋さるべきポリマーについて適切であり得る。ポリマーは、ジ−又はより高次の官能性架橋ポリマー、アニオン性モノマーを含むエチレン性不飽和モノマーの存在下で、エチレン性不飽和モノマーを重合することによって形成することができる。エタフィルコンＡベースのコンタクトレンズへ使用されるように、エチレングリコールジメタクリレート又はメチレンビスアクリルアミドなどのヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸及び架橋性モノマーの共重合体を使用することができる。これらの架橋性モノマーは、重合反応に加わることが可能であるジスルフィド結合を含む架橋剤に加えて、存在していてもよい。
【００３７】
水膨潤性水不溶性マトリックスを形成するために使用することができる他の種類のポリマーは、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド型架橋剤を使用して、ポリビニルアルコール架橋される。そのような生成物について、例えば、ヒドロキシ基を備えるモノマーを含有する官能性酸性基を反応させることにより、エンダントアニオン基を提供することによって、ポリビニルアルコールを、アニオン性レンダリングしなければならない。適切な試薬の例は、例えば、ジカルボン酸などの二価酸である。
【００３８】
本発明は、ポリマーマトリックスが、酸性モノマーを含むエチレン性不飽和モノマーとの共重合により、分子当たり一つ以上のエチレン性不飽和ペンダント基を有する、ポリビニルアルコールマクロマーから形成されている特定の値の発明である。ＰＶＡマクロマーは、例えば、１０００〜５００，０００Ｄ、好ましくは１０，０００〜１００，０００Ｄなどの範囲の適切な分子量のＰＶＡポリマーを、ペンダントビニル又はアクリル基へ提供することによって、形成することができる。ペンダントアクリル基は、例えば、いくつかのヒドロキシル基を介してエステル結合を形成するために、アクリル又はメタクリル酸をＰＶＡと反応させることによって、提供することができる。ポリビニルアルコールへの重合が可能なビニル基を結合するための方法は、例えば、米国特許第４，９７８，７１３号明細書、好ましくは、米国特許第５，５０８，３１７号明細書及び第５，５８３，１６３号明細書に記載されている。従って、好ましいマクロマーは、環状アセタール結合を介して、（ａｌｋ）アクリルアミノアルキル部分へ結合されている、ポリビニルアルコールの主鎖を含む。国際公開第ＷＯ２００４／０７１４９５号明細書の実施例１は、本発明において有用であるネルフィルコン（ｎｅｌｆｉｌｃｏｎ）Ｂという名称で知られているそのようなマクロマーの例の合成を記載している。好ましくは、ＰＶＡマクロマーは、例えば、５〜１０などの分子当たり約２〜２０のペンダントエチレン基を有する。
【００３９】
ＰＶＡマクロマーが、酸性モノマーを含むエチレン性不飽和モノマーと共重合されている場合、好ましい酸性モノマーは、国際公開ＷＯ０４／０７１４９５号明細書において、一般式Ｉによって表されている。
【００４０】
一つの特に好ましい種類のモノマーは、２−アクリルアミド−２−メチル−２−プロパン−スルホン酸（ＡＭＰＳ）などの（ａｌｋ）アクリルアミドアルカン−スルホン酸である。
【００４１】
例えば、非イオン性モノマーなどが、エチレン性不飽和モノマー希釈モノマー中に含まれていても良い。そのようなモノマーは、ポリマー中の疎水性領域を提供するため、又は、単位不活性希釈剤として作用するために、生成物の親水性又は疎水性を制御するために、酸基のｐＫａを制御するのに有用であり得る。非イオン性希釈剤モノマーの例は、例えば、アルキル（ａｌｋ）アクリレート及び（ａｌｋ）アクリルアミド、特に、炭素数１〜１２のアルキル基、ヒドロキシ及び、ジ−ヒドロキシ置換アルキル（ａｌｋ）アクリレート及び、（ａｌｋ）アクリルアミド、特に炭素数１〜１２のアルキル基を有するそのような化合物、ビニルラクタム類、スチレン及び他の芳香族モノマーである。
【００４２】
エチレン性不飽和モノマーはまた、例えば、粒子の親水性、潤滑性、生体適合性、及び／又は血液適合性を増加させるために、両性イオンモノマーを含み得る。適切な両性イオンモノマーは、我々の以前の刊行物である、国際公開ＷＯ−Ａ−９２０７８８５号明細書、国際公開ＷＯ−Ａ−９４１６７４８号明細書、国際公開ＷＯ−Ａ−９４１６７４９号明細書、及び、国際公開ＷＯ−Ａ−９５２０４０７号明細書に記載されている。好ましくは、両性イオンモノマーは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＭＰＣ）である。
【００４３】
ポリマーマトリックス中で、アニオンレベルは、好ましくは０．１〜１０ｍｅｑｇ−１の範囲、好ましくは少なくとも１．０ｍｅｑｇ−１である。
【００４４】
ＰＶＡマクロマーが他のエチレン性不飽和モノマーと共重合されている場合、他のモノマーに対するＰＶＡマクロマーの重量比は、好ましくは５０：１〜１：５の範囲であり、より好ましくは２０：１〜１：２の範囲である。エチレン性不飽和モノマーにおいて、アニオン性モノマーは、好ましくは１０〜１００モル％の範囲の量で、好ましくは少なくとも２５モル％の量で存在する。
【００４５】
好ましくは、水不溶性水膨潤性ポリマーは、４０〜９９重量％、好ましくは７５〜９５重量％の、重量分析により測定した平衡含水率を有する。
【００４６】
ポリマーを、いくつかの方法で粒子へ形成することができる。例えば、架橋されたポリマーは、例えば、シート状又はブロック状の形態でバルク材料として作ることができ、その後、所望のサイズへ粉砕することができる。あるいは、架橋されたポリマーは、例えば、連続的な非混和性担体中での分散相の液滴中のモノマーの重合により、粒子形態で形成することができる。膨潤されたときに所望のサイズを有する粒子を生成するための適切な油中水型の重合の例が、知られている。例えば、米国特許第ＵＳ４，２２４，４２７号明細書は、懸濁剤の存在下で、連続的な溶媒相中へ水溶性モノマーを分散させることによる、最大直径５ｍｍの均一な球状のビーズを形成するためのプロセスを記載している。安定剤及び界面活性剤は、分散相粒子のサイズの制御を提供するために存在してもよい。重合後、架橋された微粒子は、既知の方法により回収され、洗浄され、必要に応じて滅菌される。好ましくは、粒子、例えば微粒子は、水性液体中で膨潤し、その大きさに従って分類される。
【００４７】
ジスルフィド結合を含む架橋剤は、実施例に記載されているようにポリマー中へ組み込まれる。逆懸濁重合を用いる場合、剤は典型的に水性相へ組み込まれる。架橋剤がエチレン性不飽和基を含む場合、それはポリマーとの重合反応へ加わることが可能である。好ましくは、微粒子製剤は、０．５〜１００重量％の、より典型的には０．５〜８０重量％の架橋剤を含む。
【００４８】
本発明の微粒子中へ組み込むことが可能な任意の薬剤は、本発明において有用性を見出すことができる。薬剤は、例えば、抗腫瘍薬、抗血管形成薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗細菌薬、抗ヒスタミン薬、抗腫瘍薬、酵素及び抗アレルギー剤から成る群から選択され得る。好ましい薬剤は、抗腫瘍薬であり、化学療法特性を有する。これらは、抗腫瘍療法において使用することができる。
【００４９】
薬剤は、細胞毒性剤であってもよい。細胞毒性剤は、細胞に対して直接的に毒性であるものであり、細胞の繁殖や成長を防止する。適切な細胞毒性剤は、例えば、国際公開ＷＯ０４０７１４９５号明細書中に記載のドキソルビシンなどのアントラサイクリン系化合物及び他の化合物、国際公開ＷＯ２００６０２７５６７号明細書に記載のカンプトテシン誘導体、タキサン、５−ＦＵなどの白金系腫瘍性代謝拮抗剤、ＦＵＤＲ、メルカプトプリン、カペシタビン、アクチノマイシンＤなど他の細胞傷害性抗生物質、並びに、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンを含むビンカアルカロイドである。例はまた、シタラビン、ゲムシタビン、シクロホスファミド、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン、ミトキサントロン、レチノイド、アナグレリドなどを含む。トポテカン、イリノテカンなどのカンプトテシン化合物は、それらが荷電されているため、特に好ましい。
【００５０】
他の有用な薬剤は、プラチン類（シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）及びブレオマイシンを含む。
【００５１】
使用することのできる、毒性細胞又は細胞増殖抑制化合物の一つのクラスは、ラパマイシン及びラパマイシン類似体を含み、これはｍＴＯＲを標的とする。そのような化合物は、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、タクロリムス、ピメクロリムス、ゾタロリムス、バイオリムス、及びＡＰ２３５７３を含む。その内容が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ−Ａ−２００３０２２８０７号明細書に記載のラパマイシン類似体の範囲に包含される任意の化合物は、ラパマイシン類似体として使用することができる。
【００５２】
他の適切な薬剤は、ソラフェニブ、スニチニブ、ボスチニブ、ブリバニブ、アキシチニブ、ボルテゾミブ、イマチニブ（ｉｍａｎｔｉｎｉｂ）、カネルチニブ、ダサチニブ、ドビチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、マシチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、サラカチニブ（ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ）、タコシチニブ（ｔａｃｏｃｉｔｉｎｉｂ）、トザセルチブ（ｔｏｚａｓｅｒｔｉｂ）、バンデタニブ及びバタラニブなどであるがそれらに限定されない、マルチキナーゼ阻害剤を含む。
【００５３】
他の適切な薬剤は、エンチノスタット、エンザスタウリン及び、オラパリブなどのＰＡＲＰ阻害剤を含む。
【００５４】
薬剤は、あるいは、ＣＯＸ−阻害剤であってもよい。ＣＯＸ−阻害剤、例えばＮＳＡＩＤ類は、炎症及び鎮痛剤として作用することができ、炎症及び化学塞栓手続きに伴う痛みを標的とする。一例は、イブプロフェンである。
【００５５】
本発明で使用される、治療活性（薬剤）は、好ましくは、アントラサイクリン化合物であり、これは、アミン糖へ結合しているアントラキノン基を含む。糖上のアミノ基は、高レベルの装薬及び、投与後の制御された送達を可能にするために、ポリマーマトリックス内の任意のアニオン性基と関連付けることが考えられている。
【００５６】
好ましい薬剤は、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびアントラセンミトキサントロン等のアントラサイクリンである。
【００５７】
本発明において、薬剤は、一般的に共有結合的に、ポリマーマトリックスへ結合されていない。
【００５８】
薬剤は、イオン性または非イオン性であってもよい。薬剤がカチオンである場合には、架橋剤は、薬剤に結合するのに役立ち得るアニオン性基を有することが好ましい。
【００５９】
好ましくは、二つのアニオン性基が存在し、これらはジスルフィド結合に関して対称に分布している。架橋剤Ｌ−シスチンビスアクリルアミドが特にこの点に関して好ましい。この二つの基は、カチオン性薬剤分子と結合する。理論に束縛されることなく、ジスルフィド結合が低酸素環境で切断される場合、二つのアニオン性基は余儀なく離され、これは薬剤の放出を促進すると、考えられている。
【００６０】
ポリマーがカチオン性である場合、薬剤は、好ましくはアニオン性であり、静電ポリマーに関連付けられている。
【００６１】
それはまたポリマーである可能性もあるか、又は、薬剤は荷電されていない可能性もある。
【００６２】
治療活性（薬剤）は、様々な技術によってポリマーマトリックスへ組み込むことができる。一つの方法において治療活性薬剤は、重合又は架橋前に、ポリマーの前駆体、例えば、モノマー又はマクロマー混合物又は架橋性ポリマー及び架橋剤混合物と混合してもよい。あるいは、治療活性薬剤は、架橋された後にポリマー中へ搭載してもよい。例えば、粒子状の乾燥されたポリマーは、治療活性剤の溶液中、好ましくは、必要に応じて後続の非吸収剤の除去及び／又は溶媒を蒸発した水中で膨潤され得る。アルコールなどの有機溶媒中、又は、より好ましくは水中の活性薬剤の溶液は、粒子の移動床に噴霧してもよく、それによって、同時に溶媒を除去しながら、薬剤を粒子の本体中に吸収させる。最も都合の良いことに、我々は、長期間に渡って水などの連続的な液体ビヒクル中に懸濁された粒子を膨潤させ、薬剤の溶液と接触させることが単に可能であり、それによって薬剤が粒子本体中に吸収されるようになることを見出した。これは、陽イオン交換型プロセスに類似であると考えられる。膨潤ビヒクルはその後除去するか、又は、好都合にも、塞栓剤としてその後使用するために、生成物の一部として粒子を保持することができる。
【００６３】
微粒子を、次に、膨潤ビヒクルから分離し、濾過し、乾燥させる。適切なプロセスの詳細は、国際公開ＷＯ０４／０７１４９５号明細書に記載されている。
【００６４】
例えば、肝細胞癌などの固形腫瘍を有する、塞栓術を必要とする患者へ投与される組成物は、吸収された薬物を含有する膨潤粒子の水性懸濁液である。懸濁液は通常、ゲルタイプの塞栓組成物に使用されるため、従来の放射線不透過性物質などの造影剤の送達前に、混合されることが望ましい。例えば、吸収された薬物を含有する膨潤粒子の水性懸濁液は、従来、例えば、リピオドールなどの塞栓剤とともに使用される、液体放射線不透過性物質の投与の直前に、容積で２：１〜１：２、好ましくは容積で約１：１の範囲の量で、混合することができる。
【００６５】
この更なる詳細は、国際公開ＷＯ０４／０７１４９５号明細書に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、腫瘍が低酸素になり従ってサイズが増加するため、腫瘍に供給する酸素濃度が減少するに連れて、その結果として成長因子の存在が減少することを、概略的に示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１．７％ＢＡＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図３】図３は、４％ＢＡＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図４】図４は、８％ＢＡＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図５】図５は、２％ＢＡＬＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図６】図６は、４％ＢＡＬＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図７】図７は、８％ＢＡＬＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図８】図８は、１５％ＢＡＬＣを含む、ＰＶＡマクロマー微小球のサイズ分布を示す。
【図９】図９は、架橋されたＢＡＬＣ微小球対ドキソルビシン装填の割合を示す。
【図１０】図１０は、ドキソルビシンの洗浄後に装填された微小球の画像を示す。
【図１１】図１１は、経時的なドキソルビシン上のＤＴＴ効果のスキャンを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、３１％ＢＡＬＣ微小球からのドキソルビシンの溶出プロファイルを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、溶離プロファイルの放出割合：還元ＢＡＬＣ対非還元ＢＡＬＣを示す。
【図１３】図１３は、還元ＢＡＬＣ微粒子及び非還元ＢＡＬＣ粒子の割合の差を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、１００％ＢＡＬＣ微粒子の光学顕微鏡画像を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、水中に沈降した１００％ＢＡＬＣ微粒子の画像を示す。
【図１５】図１５は、還元前及び後の、４５％ＢＡＬＣ微粒子のサイズを示す。
【図１６】図１６は、３１％ＢＡＬＣ微粒子（Ｎ＝３）からのイリノテカンの溶離図を示す。
【図１７】図１７は、ラパマイシン装填ＢＡＬＣ微小球を示す。
【図１８】図１８は、ジクロフェナク装填ＢＡＬＣ微小球を示す。
【図１９】図１９は、ドキソルビシンのＢＡＬＣ−ＨＥＭＡ微粒子溶出を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、溶出中、溶出前に装填されたＢＡＬＣ−ＨＥＭＡ微粒子を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、通常環境での溶出中のＢＡＬＣ−ＨＥＭＡ微粒子を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、還元環境での溶出中のＢＡＬＣ−ＨＥＭＡ微粒子を示す。
【図２１】図２１は、ドキソルビシンのＢＡＬＣ−ＡＡ微粒子溶出を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、溶出前に薬剤を装填したＢＡＬＣ−アクリル酸微粒子を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、通常環境での溶出中のＢＡＬＣ−アクリル酸微粒子を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、還元環境での溶出中のＢＡＬＣ−アクリル酸微粒子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
実施例
実施例１：ジスルフィド架橋剤Ｎ，Ｎ−ビス−アクリロイル−（Ｌ）−シスチン（ＢＡＬＣ）の合成のアウトライン方法
【００６８】
ＢＡＬＣ（化学式：Ｃ１２Ｈ１６Ｏ６Ｎ２Ｓ２）という名称のジスルフィド架橋剤を、論文”Ｎｅｗ  ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏ  ａｍｉｎｅ）ｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ．”  （２００５）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｖｏｌ  ４３，  Ｉｓｓｕｅ  ７．  Ｐａｇｅｓ  １４０４−１４１６．に提示された修正された例を用いて調製した。
【００６９】
手順は、シスチン二塩酸塩のアミド化及びジ−アルキル化を含んでいた（スキーム１）。
【化５】
2014503580.tif 000007
【００７０】
真ん中の排出口を介してオーバーヘッドスターラーを備える三つ口の５００ｍＬフラスコ中で、１２．１ｇのシスチン塩酸塩及び１５ｍｇの４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）を、５０ｍＬの水中に溶かした。フラスコを水浴中に配置し、混合物を氷を用いて０〜５℃へ冷却し、温度をガラス温度計で観察した。材料の添加に渡って、オーバーヘッドスターラーを、１５０ｒｐｍへ設定し、温度を０〜５℃に維持した。
【００７１】
二つのガラス滴下漏斗を、スターラーの両側に配置した。ガラス滴下漏斗の内の一つは、１０ｍＬのジクロロメタン及び１０Ｍのアクリロイルの組み合わせを含んでいた。もう一方の滴下漏斗は、６ＭのＮａＯＨを含んでいた。まず、６ＭのＮａＯＨを、ｐＨが８〜１０へ低下するまで液滴し、そのｐＨをＮａＯＨが約５０ｍＬまで蓄積されるように加えられる添加の全ての過程で維持した。ｐＨを修正した後、アクリロイル塩化物溶液を手動で、１時間３０分に渡って液滴して加えた。添加が終わった後、混合物を室温で更に３時間攪拌した。攪拌が完了した後、ｐＨを１〜２へ調整した。
【００７２】
混合物を一晩凍結し、次に、凍結乾燥した。凍結乾燥が終わった後、アセトンを白色粉末へ加え、すべてのＮａＣｌを濾過した。全てのアセトンを除去し、混合物を乾燥させ、次にメタノールを加えた。メタノールを加えた後、溶液をロータリーエバポレーター下に置き、最終的に、この方法で、白色生成物を大量に得られた。
【００７３】
このプロセスにおいて、１０．１５ｇの架橋剤を得、収率は５８％であった。
【００７４】
ＢＡＬＣの構造の分析は、Ｈ２については６．３ｐｐｍで、Ｈ３については６．２４ｐｐｍで、Ｈ１については５．８ｐｐｍ、Ｈ５については４．７ｐｐｍ、Ｈ６については３．３ｐｐｍ、及び、Ｈ７については３．０ｐｐｍでプロトンピークを示す、１Ｈ  ＮＭＲを用いて行った。
【００７５】
ＢＡＬＣの構造の分析は、Ｃ６については１７５ｐｐｍ、Ｃ３については１６８ｐｐｍ、Ｃ２については１２９ｐｐｍ、Ｃ１については１２８ｐｐｍ、Ｃ４については５３ｐｐｍ、及び、Ｃ５については３９ｐｐｍで炭素ピークを示す、１３Ｃ  ＮＭＲを用いて行った。
【００７６】
ＢＡＬＣの構造の分析は、エレクトロスプレー質量分析を用いて行い、分子量が３４８であることを確認した。
【００７７】
実施例２：Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣ）と架橋結合した微小球の合成
【００７８】
本発明の微小球は、オーバーヘッドスターラーを備える、２リットルのジャケット付き容器中で、逆懸濁重合により作られた。
【００７９】
有機相は、６６０ｇのｎ−ブチルアセテート及び、１１．５ｇのセルロースアセテートブチレートから構成されていた。容器を窒素でパージし、４００ｒｐｍの攪拌スピードを利用した。
【００８０】
水相は、広く使われている水溶性ポリマーＰＶＡからの、ＮｅｌｆｉｌｃｏｎＢマクロマー−重合性マクロマーから構成されており、これは、Ｎ−アクリロイルアミノアセトアルデヒドで修飾されている。還元可能なジスルフィド架橋を含有する微小球を生成する、ジスルフィド架橋剤と重く架橋されているのは、官能化されたこのＰＶＡマクロマーである。水相の水含有量は、最大１３０ｇに構成されている。
【００８１】
本実施例で使用したジスルフィド架橋剤は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃから購入した。使用される架橋剤の量は、水相の乾燥重量含有量に基づいて割合を計算することによって事前に決定した。一連の、１．７％、４％及び８％架橋された微小球が生成された。
【００８２】
ビス（アクリロイル）シスタミンの場合、その疎水性の性質のために、架橋剤を水相を構成するために追加される量の水中に溶解する。架橋剤を、加熱するが、架橋剤の融点を絶対に超えないようにすることによって溶解した。水を次に冷却し、溶液をマクロマー中に溶解した。
【００８３】
ＰＶＡマクロマーへの架橋剤の組み込みは、熱開始剤を用いて行った。２時間後、刺激応答性ビーズの合成が完了し、酢酸エチル及びアセトンを用いた洗浄工程によって、容器から除去した。微小球のサイズは、撹拌速度の変化によって所望の大きさにキャリブレーションすることができる。
【００８４】
容器から除去した後、ビーズを全てのアセトン残渣を除去するために、洗浄し清浄した。水和した後、微小球をオーブンを用いて乾燥し、粉砕した。元素分析は、硫黄含有量に基づいて、架橋剤の取り込みを確認するために使用した。
【００８５】
ＰＶＡマクロマーのみの微小球（架橋剤なし）の元素分析
【表１】
2014503580.tif 000008
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００８６】
実施例３：Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）−（Ｌ）―シスチンで架橋した微小球の合成
【００８７】
本発明の微小球を、実施例の場合とほとんど同じ方法で、逆懸濁重合を用いて作った。
【００８８】
本実施例において、ＢＡＬＣをインハウスで合成した。架橋剤は、ＢＡＣとは異なり、親水性であり水中に非常に溶解し；従って、ＢＡＬＣ微小球の合成において、水中に架橋剤を溶解するために加熱は全く必要とされていない。架橋剤の親水性のために、微小球中への組み込みの割合は、０％から実質的に１００％架橋結合されたＢＡＬＣ微小球へと、劇的に増加することが可能であった。
【００８９】
実施例３の微小球の製造のあと、それらを実施例２に記載したように洗浄及び清浄した。再び、微小球中へのジスルフィド架橋剤の組み込みを確認するために、元素分析を、ＢＡＬＣ微小球の異なる製剤設計に関して行った。しかしながら、オーブンでビーズを乾燥しそれらを粉砕する代わりに、ＢＡＣ微小球を用いて実施する、凍結乾燥器を代わりに用いた。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００９０】
実施例４：ＢＡＣ微小球の還元及びサイジング
【００９１】
ＢＡＣ微小球の合成後、更に還元環境における、微小球及びそれらの拡張する潜在的なサイズに焦点を当てた、特性評価試験を行った。
【００９２】
微小球の構造全体に渡ったジスルフィド結合の組み込みのために、還元環境において、ジスルフィド結合は、微小球の直径の増加につながる開裂をするはずである。この直径の増加は、理論上、標的血管のはるかに効率的な塞栓形成につながる。
【００９３】
新規の微小球は、永久塞栓として振舞はずであり、ジスルフィド架橋剤の還元を低減することはない。微小球は、ＰＶＡ骨格によって定位置に保持される。
【００９４】
微小球を、”Ｒｅｄｏｘ−Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｔａｒ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＰＤＭＡＥＭＡ  ｂｙ  ａｒｍ−ｆｉｒｓｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｏｆ  ＡＴＲＰ  ａｓ  ａ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  （２０１０）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ３，  Ｐａｇｅｓ  ５５９−５６９に提示された、修正された実施例を用いて還元した。
【００９５】
１ｍＬの微小球のそれぞれの微小球製剤を、１ｍＬの蒸留水を含む１０ｍＬのバイアルへ入れた。
【００９６】
微小球を次に、光学顕微鏡下での手動でのサイジングのために、ガラス皿へ移した。
【００９７】
同じ微小球を次にガラス瓶へ戻し、ジスルフィド結合を切断するために、１．５ｍＬの４％ＮａＢＨ４をビーズへ加えた。
【００９８】
ビーズを次に水浴中へ３７℃で１時間放置した。
【００９９】
１時間後、経過時点の瓶を水浴から取り除き、全てのＮａＢＨ４が取り除かれるまで蒸留水で洗浄するという、一定の手順を行った。
【０１００】
全ての還元剤が洗い流された後、微小球をガラス皿へ戻し、前述したのと同じ方法を用いて光学顕微鏡下で再分析した。
【０１０１】
全ての微小球をサイジングした後、データを照合し、還元前及び還元後のビーズの二つのグループに分けた（図２Ａ〜図４）。ＰＶＡマクロマーのみの微小球を、サイズ変化が予測されない対照群として使用した。
【０１０２】
実施例５：ＢＡＬＣ微小球の還元及びサイジング
【０１０３】
ＢＡＬＣ微小球の還元及びサイジングを、ＢＡＣ微小球について使用したのと全く同じ方法を使用して行った。結果を図５〜８に示す。
【０１０４】
実施例６：ＢＡＬＣ微小球のドキソルビシンの最大薬物装填量
【０１０５】
ジスルフィド架橋剤ＢＡＬＣの使用により、モノマーに取り付けられた二つのカルボン酸基が存在する。中性ｐＨで、カルボキシル基は脱プロトン化され、正に帯電した薬剤を結合する、二つの負に帯電したカルボキシレート基を放出する。
【０１０６】
ＢＡＬＣ微小球薬剤結合特性及び最大装填量を確認するために、実験を行った。
【０１０７】
二つのカルボキシレート基に起因する、モノマーに対する薬剤の２：１の比に基づいて、理想的な結合能力を仮定した。
【０１０８】
ＢＡＬＣ微小球の各式の１ｍＬの微小球を、それぞれ１０ｍＬのガラス瓶へ入れた。また、１ｍＬのＰＶＡのみの微小球もまた、対照として使用するためにガラス瓶へ入れた。
【０１０９】
理論的な結合能力に基づいて、過剰量のドキソルビシン塩酸塩を、１瓶当たり６０ｍｇ．ｍＬ−１の一定値で、各瓶へ加えた。
【０１１０】
微小球を次に、シェイカー上で一定の攪拌下で、装填させるために一晩放置した。
【０１１１】
シェイカーを次に停止し、瓶中に残っている全ての薬剤をガラスピペットを用いて取り除き、分析のために別の瓶へ入れた。微小球へ、次に、１０ｍＬの蒸留水を加え、振盪するために放置した。後の時点で、１０ｍＬの薬剤汚染された水を除去し、分析のために瓶へ入れ、１０ｍＬの新しい蒸留水を再び微小球へ加えた。
【０１１２】
ドキソルビシン洗浄と呼ばれるこのプロセスを、これ以上薬剤が微小球によって放出されていないこと、及び、水がドキソルビシン薬剤の明らかな赤色から透明になったことが明らかになるまで何度も行った。
【０１１３】
ドキソルビシン洗浄から集めた薬剤サンプルを次に、瓶から取り除かれた正確な量の薬剤を決定するために、ＵＶ−可視分光法を用いて分析し、これは次に、ＢＡＬＣ微小球の結合能力を明らかにする。
【０１１４】
既知のドキソルビシン濃度の標準溶液を、瓶に加えたドキソルビシンの正確な量を確認するために加え、同じ標準溶液を瓶から取り除いた薬剤の正確な量を決定するために使用した。ＢＡＬＣ微小球への薬剤の結合量を決定するために、後の値を、加えられた薬剤の初期量から引いた（図９）。
【表９】
2014503580.tif 000016
【０１１５】
対照微小球は、いかなる薬剤も積極的には取り込まなかった；しかしながら、ドキソルビシンはビーズ及びガラス製品を染めた（図１０参照）。
【０１１６】
装填される薬剤の量を更に増やすための装填結果の分析後、ｎ＝４の装填実験を、より高いＢＡＬＣ含有量を含む製剤を用いて行った（３１％ＢＡＬＣ微小球）。
【０１１７】
再び、同じ方法を他のＢＡＬＣ微小球の装填許容量を決定するために用い、製剤を３１％ＢＡＬＣ微小球の装填許容量を決定するために用いた。
【表１０】
2014503580.tif 000017
【０１１８】
３１％ＢＡＬＣ微小球の平均最大装填許容量＝３８．３ｍｇ／ｍＬ−１
【０１１９】
実施例７：ＢＡＬＣ微小球からの薬剤溶出
【０１２０】
実施例６によるＢＡＬＣ微小球の装填の後、ビーズからの薬剤の放出速度を測定した。
【０１２１】
試験前に定めた帰無仮説は、低酸素（還元）環境におけるものであり、ジスルフィドは、非還元環境におけるものと比較して、微小球からの薬剤の大幅に促進された放出につながる、迅速な化学分解への応答によって、数分から数時間の時間スケールで迅速な切断を受けるであろう。
【０１２２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を、低酸素のｉｎ  ｖｉｖｏ環境において、薬剤が装填されたＢＡＬＣ微小球の可能性のある振る舞いを複製するように設定した。
【０１２３】
まず、六つの１０ｍＬのガラス瓶を、薬剤を装填していない１ｍＬの３１％ＢＡＬＣ微小球で満たした。これらの微小球を次に、平均３８．８ｍｇ．ｍＬ−１である、それらの最大装填許容量まで装填し、また、実施例６における方法を使用して装填した。全てのドキソルビシンが洗い流された後、溶出の開始まで、微小球を蒸留水中のそれぞれ別の瓶中に保持した。
【０１２４】
次に、六つの２２０ｍＬの褐色瓶を取り、２００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＳ）で満たした。これらの瓶を、それぞれの瓶中にマグネチックスターラーを入れて、磁気攪拌プレート上に置いた。
【０１２５】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、周知の軽度のジスルフィド還元剤であり、それらの還元状態においてチオールジスルフィド基を維持するために使用される。ＵＶ／可視分光スキャンは、ＤＤＴが経時的にドキソルビシンの構造を変更しないことを示したため、選ばれた還元剤であった。高濃度のＤＴＴをドキソルビシンへ加え、ＵＶ／可視光計を用いて、１時間ごとの時点でスキャンした。ＤＴＴへ１７時間曝露後、開始から終了まで、ドキソルビシンの吸光度にほとんど変化は無かった（図１）。
【０１２６】
ＢＡＬＣ微小球について還元環境を生成するために、ＤＴＴを５０〜６０ｍＭで褐色瓶の内の三つへ加えた。ＤＴＴは、ジスルフィド架橋に対して、１０モル過剰であると計算された。残りの三つの褐色瓶を、ＰＢＳとして放置し、非還元環境におけるＢＡＬＣ微小球の溶出を示す対照として振舞った。
【０１２７】
０時間の時点で、５ｍＬの溶出溶媒を、瓶からＢＡＬＣ微小球を除去するために使用し、褐色瓶へ加えた。この時点で、溶出が開始した。
【０１２８】
ＢＡＬＣ微小球からのドキソルビシンを含む５ｍＬの溶出媒体の放出の間の特定の時点で、ＵＶ−可視分光法による分析のためにサンプリングした。瓶からの溶出媒体の除去の直後に、５ｍＬの新鮮なＰＢＳの溶出媒体を、非還元環境を含む三つの褐色瓶へ加えた。また、ＤＴＴを含む５ｍＬのＰＢＳを、還元環境を含む三つの褐色瓶へ加えた。これは、還元環境を維持し、チオールを還元状態に保持するのに役立った。
【０１２９】
二つの環境におけるビーズから放出された薬剤の正確な量は、既知のドキソルビシン濃度の標準溶液を用いて計算した。結果を、図１２Ａ及びＢに示す：
【０１３０】
ＤＴＴを用いるｎ＝３溶出の後、類似度係数を用いたモデルに依存しないアプローチを、溶出が著しく異なっていたかどうかを決定するために使用した。
【０１３１】
溶出が大幅に異なるかどうかを決定するための式は、即時放出固体経口剤形の産業溶出試験の文書ガイダンス（ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｏｒａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ）に含まれている。溶出プロファイルの比較について調査したいくつかの方法の中で、ｆ２が最も簡単である。Ｍｏｏｒｅ及びＦｌａｎｎｅｒは、二つの係数、ｆ１及びｆ２を用いて、溶出プロファイルを比較するための、模範的な独立した数学的手法を提案した（１）。
【数２】
2014503580.tif 000018
式中、Ｒｔ及びＴｔは、それぞれ参照及び試験製品の選択されたｎ時点のそれぞれにおける、溶解した累積率である。係数ｆ１は、二つのプロファイル間の平均差に比例し、係数ｆ２は二つのプロファイルの平均二乗差に反比例し、全ての時間点のうち、比較的大きな差に充填を置いた。係数ｆ２は、二つのプロファイル間の密接度を測定する。測定の性質のため、ｆ１は、差異係数として、ｆ２は類似度係数として記載されていた。溶解プロファイルの比較において、特に製品性能の類似性を保証するために、規制の関心は二つの曲線がどの程度類似しているかにあり、任意の特定の時点において大きな差により敏感である測定値を有することを保証する。この理由により、ｆ２の比較は機関のガイダンスにおいて焦点となっている。
【０１３２】
類似していると考えられる曲線について、ｆ１値は０に近く、ｆ２値は１００に近くでなければならないと、ガイドラインは述べている。一般的に、最大１５（０〜１５）の値、及び、５０以上（５０〜１００）のｆ２値は、二つの曲線の同一性又は同等性を保証し、従って、試験（変更後）及び参照（変更前）の製品の性能を保証する。
【０１３３】
ｆ１についての値が１５未満ではなく、ｆ２についての値が５０以上ではない場合、溶出が大幅に異なるというように、理解することができる。
【表１１】
2014503580.tif 000019
【０１３４】
溶出試験は、ｆ２が５０以上である一方、ｆ１が１５未満ではなく、従って二つの溶出は著しく異なっていることを示している。
【０１３５】
同じ薬剤溶出実験を、ＤＴＴの代わりに２−メルカプトエタノールを還元剤として使用して行い、各ＢＡＬＣ微小球製剤について行った。結果はまた、還元されたＢＡＬＣ微小球及び、還元されていないＢＡＬＣ微小球の間に溶出差があったことを示した。３６０分の時点が、互に対して比較した各製剤から溶出した割合を見るために、各ＢＡＬＣ製剤無いにおける溶出の差の割合を比較するために選択した（図１３）。
【０１３６】
結果はまた、還元された溶出及び還元されていない溶出の間の割合のかなりの割合の差を示し、これは前述の結果を裏付けている。グラフはまた、より多いドキソルビシンの装填についての、放出速度の可能性のある傾向を示す。
【０１３７】
微小球は、膨潤ビヒクルから分離し、濾過し、乾燥させることができる。適切なプロセスの詳細は、国際公開ＷＯ０４／０７１４９５号明細書に記載されている。
【０１３８】
例えば、肝細胞癌などの固形腫瘍を有する、塞栓療法を必要とする患者に投与される組成物は、吸収された薬剤を含有する膨潤粒子の水性懸濁液である。懸濁液は、ゲルタイプの塞栓組成物に使用されるため、従来の放射線不透過性物質などの造影剤を用いて送達する前に、混合されることがしばしば望ましい。例えば、吸収された薬物を含有する膨潤粒子の水性懸濁液は、例えば、２：１〜１：２の範囲の量で、好ましくは約１：１の容積で、リピオドールなどの塞栓剤と共に従来使用されていた、液体の放射線不透過性物質の投与の直前に、混合することができる。
【０１３９】
この更なる詳細は、国際公開ＷＯ０４／０７１４９５号明細書に記載されている。
【０１４０】
実施例８：高い架橋割合のＢＡＬＣ微粒子の合成
【０１４１】
ＢＡＬＣは、そのアクリレート基のために反応性が高く、水溶性であるが、ＢＡＬＣの濃度が増加するため、あまりにも速く追加した場合、水への添加が損なわれる可能性がある。大量の水へ加えられた場合、ＢＡＬＣはゲルであり得ることが観察されている。ＢＡＬＣはこの時点で重合し、水中に可溶でなくなったものと想定される。従って、ＢＡＬＣは、所定量の水へ、極めて少量で加える必要がある。完全にＢＡＬＣを溶解した後だけ、更にＢＡＬＣを溶液へ加えることができる。完全に溶解した後、ＢＡＬＣをＰＶＡマクロマー中に分散し、１０分間ローラーミキサー上に配置する。ＢＡＬＣを首尾よく組み込むために、前述したように、より低いＢＡＬＣ製剤へ、より少ない量の熱開始剤を反応へ加える必要がある。元の値の１０分の１へ、合成工程における熱開始剤の量を減らすことによって、微小球内のＢＡＬＣ量を首尾よく増加させることができる。
【０１４２】
既存の技術、及び、開始剤の比較的少ない量に起因して増加した反応時間を用いて、０．５％〜１００％のＢＡＬＣビーズを生成した。有機相中のＢＡＬＣの不溶性のため、架橋剤はそれが重合するために有機相へ分割されないので、生成物の損失を最小限に抑えながら、これらの微小球を製造することが可能である。システムへ導入されたほぼ全てのＢＡＬＣは、ビーズへ組み込まれる。以下の元素分析は、理論的製剤の±１０％以内であり、これは、ポリマー系について典型的であり、４５％ＢＡＬＣ微小球の合成の成功を示している。
【表１２】
2014503580.tif 000020
【０１４３】
更なる実施例が行われ、反応混合物から全てのＰＶＡマクロマーを除去し、ＢＡＬＣによって純粋にお互いに結合された微小球を得た。図１４Ａは、１００％ＢＡＬＣ微粒子の光学顕微鏡画像を示す。図１４Ｂは、水中に沈降した１００％ＢＡＬＣビーズを示す。これらの微粒子は、ＰＶＡを含む以前の製剤と比較して圧縮するのが困難であったが、より脆い製剤は、依然として、イオン交換によって帯電した薬剤を装填することができる。
【０１４４】
実施例９：４５％ＢＡＬＣ微小球の還元及びサイジング
【０１４５】
実施例８における元素分析は、ＢＡＬＣが首尾よくビーズ構造へ組み込まれたことを示唆したが、この仮定をサポートし、また、架橋剤がビーズ構造内にそのまま残存していたかどうかを決定するために、更なる証拠が求められていた。これは、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を用いる視覚的な方法によって行った。
【０１４６】
ＤＴＮＢ（エルマン試薬）は、サンプル内のチオール基の量を定量するために使用することができる化学物質である。この場合、微小球構造内におけるジスルフィド基の存在を認定するために使用される。微粒子が非還元状態に存在する場合、ジスルフィド基はエルマン試薬と反応してはならないが、微粒子が還元される場合、チオール基は、中性及びアルカリ性のｐＨで水中においてＮＴＢ２−へイオン化される２−ニトロ−５−チオベンゾエート（ＮＴＢ−）を得るために、ＤＴＮＢ内のジスルフィド結合を切断するであろう。微粒子上存在するチオール基により、ＤＴＮＢからＮＴＢ２−ジアニオンへ切断されるメカニズムを、以下に示す（スキーム２）。
【化６】
2014503580.tif 000021
ＮＴＢ２−は、ＢＡＬＣの組み込みを確認するために使用することができる、黄色を生成する。従って、色の変化が観察されたかどうかを確認するために、還元されていない微粒子へ、ＤＴＮＢを加えた。色の変化が認められなかったが、これはＢＡＬＣがそのジスルフィド形態にあるか、又は、ＢＡＬＣが全く組み込まれていなかったことを意味する。その後、同じビーズ製剤の別のバッチを採取し、ＮａＢＨ４で還元した。ＤＴＮＢを直接的に還元することによって、還元剤が間違った結果をもたらす可能性があるため、還元後、還元剤を完全に洗い流し、微粒子内に確実に残らないようにした。除去後、ＤＴＮＢを還元した微粒子へ加えた。黄色への迅速な色変化が、すべての製剤について観察された。還元後のみの色変化は、ＢＡＬＣがそのジスルフィド形態で、微粒子中へ組み込まれていることを実証している。これは、微粒子が低酸素腫瘍の環境に対応するための潜在能力を有していることを示している。前の製剤における還元環境に対するこの応答は、直径の増加として見られている。より高度に架橋された製剤を、それらの物理的特性における同様の変化があったかどうかを判断するために、試験した。
【０１４７】
１ｍＬの４５％ＢＡＬＣ微小球を、光学顕微鏡下で測定した。微小球を次に、１ｍＬの４％ＮａＢＨ４を含む瓶中に入れた。サンプルを、水浴中、３７℃で１時間インキュベートした。還元剤を前述のように除去し、ビーズをサイズ変更した。
【０１４８】
図１５に見られる結果は、より高度に架橋されたＢＡＬＣ微小球製剤は、以前のより低度に架橋された製剤と全く同じように振舞うことを実証している。サイジングの結果は、ビーズが低酸素環境へ反応し得ることを示している。全ての以前の比較的低度に架橋された製剤は、２００μｍの平均増加があったが、４５％ＢＡＬＣ微小球は、３００μｍの平均増加を有する。これは、より多くの架橋が壊れて、微小球の膨潤性が増加するため、製剤中にＢＡＬＣの量が増加するに連れて微小球の直径は増加するという、潜在的傾向を表す。
【０１４９】
実施例１０：ＢＡＬＣ微粒子の生分解性
【０１５０】
ＢＡＬＣ微粒子を、標的血管を閉塞し、栄養供給の腫瘍を飢餓状態にする、塞栓としてそれらを使用することを意図して合成した。ＰＶＡマクロマー含有量の減少と連動して製剤内のジスルフィド架橋の数が増加するにつれて、ポリマーネットワークは、架橋の還元に応じてより小さい断片に分割されるため、いくつかの点で製剤は生分解／吸収し得る。０〜４５％のＢＡＬＣ製剤の分析は、ＤＤＴによって誘導される還元剤を含む２００ｍＬのＰＢＳ中に入れることによって行い、ビーズを絶えず磁気攪拌器を用いて攪拌した。実験は７２時間以上行い、その時点で微小球の構造的完全性を目視で調べた。各製剤中のビーズの大部分は、４５％ＢＡＬＣ製剤中の微小球の数が少ないことを除き、この時点では完全な状態で発現しており、これはバラバラになっているように見えた。１００％ＢＡＬＣは、完全に生分解性である。ＢＡＬＣがこの微粒子の唯一の構成要素であるため、還元された場合、それはそのアミノ酸システインへ開裂し得る。そのような低分子量で、ビーズは崩壊し、体内に吸収されるであろう。
【０１５１】
実施例１１：イリノテカン塩酸塩の装填及び溶出
【０１５２】
１ｍＬの３１％ＢＡＬＣ微小球へ、３８ｍｇ．ｍＬ−１のイリノテカン塩酸塩を装填した。前述のように、装填した微小球を２００ｍＬのＰＢＳ中に入れ、一方、別の１ｍＬを、ＤＴＴにより提供された還元環境でＰＢＳ中に入れた。実施例７におけるドキソルビシン溶出についてと同じ方法に従った。結果を図１６に示す。その結果によって、還元環境の存在下で、ジスルフィド結合は、イリノテカンの放出速度の増加につながる開裂をするであろうことを確認する。
【０１５３】
実施例１２：非カチオン荷電薬剤の装填
【０１５４】
塞栓による癌の治療における臨床的有用性を提供することができる他の多くの薬剤がある：しかしながらこれらの薬剤は、正に荷電した基を有していないかもしれず、従って、イオン交換の機構を介して、これらの陰荷電ビーズへ装填されることはない。代替方法を用いて、ラパマイシンをＢＡＬＣ微小球製剤へ装填するために研究を行った。
【０１５５】
ＢＡＬＣ微小球を、一定量の１ｍＬＢＡＬＣ微小球を用いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で洗浄し、１ｍＬのＤＭＳＯで５回洗浄した。製剤内のＢＡＬＣは切断しないが、ＤＭＳＯは微小球を膨潤させる。６０ｍｇ．ｍＬ−１ラパマイシン溶液を膨潤させた後、ＤＭＳＯ中に溶解させ、１ｍＬの体積のビーズへ加えた。薬剤は微小球中へ拡散され、１０分後、過剰量の溶液を排出し、ビーズスラリーを脱イオン水で洗浄した。ＢＡＬＣビーズは、ビーズ内に薬剤が沈殿するため、白色の外観となった。ビーズは、１９ｍｇ．ｍＬ−１装填し、薬剤は水中のビーズ中に保持されるが、ＰＢＳ溶出中に入れられた場合、薬剤は微小球から放出された。図１７は、ＢＡＬＣ微小球へ装填されたラパマイシンを示す。
【０１５６】
ＢＡＬＣ微小球は、ラパマイシンについて記載したものと同様のプロセスを用いて、デキサメタゾン及びジクロフェナクなど、他の非カチオン荷電薬剤で装填されている。図１８は、ＢＡＬＣ微小球に装填しているジクロフェナクを示す。
【０１５７】
実施例１３：ＰＢＡマクロマー以外のコモノマーを用いた、ＢＡＬＣ微粒子の合成
【０１５８】
ＢＡＬＣはまた、代替的なモノマーを用いた共重合体の微粒子を作成するために、使用されている。微粒子は、ＰＶＡマクロマー＋ＢＡＬＣ製剤について記載したのと同様の方法を用いて作られ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）（２１ｇＨＥＭＡ＋２．５ｇＢＡＬＣ）についての一つの研究においてはＰＶＡが置換されており、もう一方の研究では、アクリル酸（ＡＡ）（２１ｇＡＡ＋２．５ｇＢＡＬＣ）。療法の例において、粒状又はビーズ状製品を単離することができる。
【０１５９】
実施例１４：ＢＡＬＣ−ＨＥＭＡ製剤からのドキソルビシンの装填及び溶出
【０１６０】
ＢＡＬＣ−ＨＥＭＡ製剤のサンプルを、微粒子が正に帯電した薬剤を装填することができるか否かを調査するために、低濃度ドキソルビシン溶液中へ入れた。１ｍＬのＢＡＬＣ−ＨＥＭＡは、８．８ｍｇ．ｍＬ−１のドキソルビシンを装填した。微粒子の放出プロファイルを研究するために、次に、装填された微粒子を使用する。実施例７において、ＢＡＬＣ−ＰＶＡ製剤について使用したのと同じ方法を用いた。結果は、図１９に示す。
【０１６１】
放出プロファイルはまた、予測通りに、還元環境における放出の増加を示す。しかしながら、放出は、非還元環境よりも２．６倍多かった。溶出前の微粒子の像（図２０Ａ）、通常環境中における溶出中の像（図２０Ｂ）、及び、還元環境における溶出中の像（図２０Ｃ）を撮影した。図２０Ｂ及び２０Ｃは、６時間の時点で撮影した。
【０１６２】
図２０は明らかに粒子が正常酸素環境で完全に無傷のままであることを示す；しかしながら、薬剤装填した粒子は、還元環境で完全に分解され、薬剤ペイロードの全てを放出する。これは、低分子量成分を含むＢＡＬＣコポリマー製剤は、還元環境においてより迅速に分解することができることを実証している。
【０１６３】
実施例１５：ＢＡＬＣ−ＡＡ製剤からのドキソルビシンの装填及び溶出
【０１６４】
実施例１４と同じ実験を、ＢＡＬＣ−アクリル酸製剤で行った。１ｍＬの微粒子は、加えた１１．６ｍｇ．ｍＬ−１のドキソルビシンの全てを装填した。溶出プロファイルは、図２１に示す。
【０１６５】
最初の６時間以内に、放出のわずかな増加のみが、還元環境において指摘され、この製剤は、非常に遅い放出を有すると考えられる。これは、アクリル酸によって加えられた、過剰な薬剤結合部位が原因であり得、これは、通常環境全体におけるビーズによって示されている。しかしながら、放出プロファイルの２４時間の時点で、還元環境内の薬物放出の急激な増加が再び存在する。視覚的な観察は、異なる環境における微粒子の出現で、明確な違いが再び存在したことを示した。溶出前のビーズの像（図２２Ａ）、通常環境での溶出中の像（図２２Ｂ）、及び、還元環境での溶出中の像（図２２Ｃ）を撮影した。図２２Ｂ及び２２Ｃは、４５時間の時点で撮影した。
【０１６６】
繰り返しになるが、非還元環境におけるビーズは、完全に無傷なままであるが、還元環境における微粒子は、再び分解され、放出の増加につながる。これは再び、ＢＡＬＣとのコポリマーを含む微粒子が、還元環境において分解し、ペイロード全体を放出し得ることを実証している。
【０１６７】
実施例１６：ヒト肝細胞との、非薬物装填されたＢＡＬＣ微粒子の生体適合性
【０１６８】
実験は、微粒子の材料の浸出による細胞死を引き起こし得、従って、それらは体無いで互換性が無いことを示し得るか否かを調査するために行った。ＨＥＰ  Ｇ２細胞系を培養し、１ｍＬのＭＥＭ培地を用いて、２０，０００細胞／ウェルで、２４ウェルプレートへ播種した（ｎ＝６）。播種したあと、１０ｇの４５％ＢＡＬＣ微小球をそれぞれのウェルへ加え、２４〜７２時間の期間に渡って、インキュベートするために放置した。実験は、非薬剤装填微小球の存在下で、インキュベーション期間中に、細胞が生存し複製されることを示した。これは、微小球が生体適合性であり、細胞毒性効果を有していないことを示す。
【図１】
2014503580.tif 000022
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2014503580.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014503580.tif 000029
【図８】
2014503580.tif 000030
【図９】
2014503580.tif 000031
【図１０】
2014503580.tif 000032
【図１１】
2014503580.tif 000033
【図１２Ａ】
2014503580.tif 000034
【図１２Ｂ】
2014503580.tif 000035
【図１３】
2014503580.tif 000036
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
2014503580.tif 000039
【図１６】
2014503580.tif 000040
【図１７】
2014503580.tif 000041
【図１８】
2014503580.tif 000042
【図１９】
2014503580.tif 000043
【図２０Ａ】
2014503580.tif 000044
【図２０Ｂ】
2014503580.tif 000045
【図２０Ｃ】
2014503580.tif 000046
【図２１】
2014503580.tif 000047
【図２２Ａ】
2014503580.tif 000048
【図２２Ｂ】
2014503580.tif 000049
【図２２Ｃ】
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【国際調査報告】
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2014503580.tif 000052
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