(57)【要約】  アグリンのヒトＣ４４断片に特異的に結合することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の製造方法であって、アグリンのＣ４４ｙ≧４断片の免疫化量を野生型マウスに投与するステップと、免疫化されたマウスから抗体産生細胞を単離するステップと、それらをミエローマ細胞系と融合させるステップと、選択培地中で融合させた細胞を増殖させるステップと、アグリンのＣ４４断片への結合に関してハイブリドーマ細胞の上清中の抗体をスクリーニングするステップと、および前記所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離するステップとを含む、方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグリンのヒトＣ４４断片に特異的に結合することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の製造方法であって、アグリンのＣ４４ｙ≧４断片の免疫化量を野生型マウスに投与するステップと、免疫化されたマウスから抗体産生細胞を単離するステップと、それらをミエローマ細胞系と融合させるステップと、選択培地中で融合させた細胞を増殖させるステップと、アグリンのＣ４４断片への結合に関してハイブリドーマ細胞の上清中の抗体をスクリーニングするステップと、前記所望のモノクローナル抗体を産生する前記ハイブリドーマ細胞を単離するステップとを含む、方法。
【請求項２】
免疫化のために用いられる前記断片がＣ４４−ｙ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫化のために用いられる前記断片がＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
免疫化のために用いられる前記断片がＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法により得られるハイブリドーマ細胞系。
【請求項６】
ＤＳＭＡＣＣ３１０１、ＤＳＭＡＣＣ３１０２、ＤＳＭＡＣＣ３１０３、ＤＳＭＡＣＣ３１０４、ＤＳＭＡＣＣ３１０５、ＤＳＭＡＣＣ３１０６、ＤＳＭＡＣＣ３１０７またはＤＳＭＡＣＣ３１０８の下で寄託された請求項５に記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項７】
アグリンのＣ４４断片に特異的に結合することができる抗体の製造方法であって、請求項５に記載のハイブリドーマ細胞系を培養するステップと、上清からモノクローナル抗体を単離するステップとを含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により得られるモノクローナル抗体。
【請求項９】
アグリンのＣＡＦ部分を認識することができる、請求項８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
Ｃ４４断片中に存在する挿入を認識することができる、請求項８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ＣＡＦ部分中に存在するｚ８挿入を認識することができる、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
生物材料からＣＡＦを除く方法であって、インビトロで前記材料を請求項８に記載のモノクローナル抗体で処理するステップと、場合により形成されるＣＡＦ−抗体複合体を前記生物材料から除去するステップとを含む、方法。
【請求項１３】
前記抗体を不溶性担体に結合させるステップと、
血液などの体液を、結合した前記抗体に曝露するステップと、
濃い塩溶液および／または低いｐＨ値に曝露することにより、前記結合した抗体を再生するステップと
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトの生物材料中の神経性起源のＣＡＦの検出のための免疫学的検出方法であって、請求項１１に記載の抗体で前記材料の試料をインビトロで処理するステップと、ＣＡＦ−抗体複合体を検出するステップとを含む、方法。
【請求項１５】
アグリンまたはアグリン切断が関与する疾患の治療用薬剤の製造のための、請求項８に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１６】
臨床試験におけるマーカーもしくはサロゲートマーカーとして、または個別化医療におけるマーカーとしての、アグリンまたはアグリン断片の検出のための、請求項８に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグリンのＣ末端断片に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の製造方法、前記細胞系により産生される抗体、前記抗体を含有する医薬組成物、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アグリンは、発達中の神経筋接合部（ＮＭＪ）のシナプス後装置（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）の形成および維持を補助することから、シナプス形成プロセスにおいて中枢的な役割を果たす重要なタンパク質である（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。例えば、アグリン欠損のマウスは呼吸不全のため誕生時に死ぬことが示され得る。これは、アグリンが筋線維の適切な神経支配にとって厳密に必要とされ、これらのマウスが適切なＮＭＪを構築することができないという事実により引き起こされる。
【０００３】
アグリンは、神経組織またはニューロン組織中に存在するだけでなく、肺および腎臓などの末梢組織にも認められており、これはアグリンがこれらの器官においても役割を果たすことを示している。
【０００４】
アグリンは、４００〜６００ｋＤａの分子量を有する大きいヘパランプロテオグリカンである（データベースアクセッション（受託）番号ＮＰ＿９４０９７８）。このタンパク質のコアは約２０００のアミノ酸からなり、その質量は約２２５ｋＤａである。それは９個のＫ（Ｋｕｎｉｔｚ型）ドメイン、２個のＬＥ（ラミニン−ＥＧＦ様）ドメイン、１個のＳＥＡ（精子タンパク質、エンテロキナーゼおよびアグリン）ドメイン、４個のＥＧ（表皮増殖因子様）ドメインおよび３個のＬＧ（ラミニン球状）ドメインから構成されるマルチドメインタンパク質である（図１）。
【０００５】
アグリンはいくつかのスプライス変異体で存在し、Ｎ末端ＮｔＡ（Ｎ末端アグリン）ドメインを含有する分泌タンパク質として発現され得る。Ｎ末端ＮｔＡは、アグリンの最も豊富な形態であり、運動ニューロン中で発現される主要な形態である。それはニューロンの細胞体中で産生され、軸索に沿って輸送され、運動神経の軸索末端からＮＭＪのシナプス間隙中に放出される。ここで、それはＬＲＰ４（低密度リポタンパク質受容体関連のタンパク質４）のアゴニストとして作用し、基底膜の成分にもなり得る。ＣＮＳ（中枢神経系）においては、多くのアグリンは、Ｎ末端ＮｔＡドメインを欠く、Ｎ末端での選択的スプライシングによってＩＩ型膜貫通タンパク質として発現される（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。
【０００６】
ヒトアグリンのＣ末端部分には、２つの選択的スプライス部位ｙおよびｚがある。ｙ部位には、０、４、１７または２１（４＋１７）個のアミノ酸の挿入があり得、ｚ部位には、０、８、１１または１９（８＋１１）個のアミノ酸の挿入があり得る。ｙ部位中の４個の挿入されたアミノ酸の機能は、ヘパリン結合部位を作ることである。運動ニューロンは、主にｙ４アグリンを発現する。ＮＭＪ成熟に関するアグリンの最も重要なスプライス部位はｚ部位であり、アセチルコリン受容体のクラスタリング剤として活性となる能力をアグリンに与える。スプライス部位ｙに４個のアミノ酸の挿入の存在下で、ｚ部位に８個のアミノ酸の挿入を含有している、完全長のアグリン（ｙ４ｚ８）が、培養筋管クラスタリングアッセイ（分析）において３５ｐＭの最大半量のＡＣｈＲクラスタリング活性を有するアグリン変異体を生成することは周知である。１１個のアミノ酸の挿入は５ｎＭの最大半量のＡＣｈＲクラスタリング活性を生じるが、１９個のアミノ酸の挿入は１１０ｐＭの最大半量のＡＣｈＲクラスタリング活性をもたらす。この部位での挿入を含まないアグリンは、インビトロでの培養筋管上でアセチルコリン受容体をクラスタ化する活性がない（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。このように、クラスタリングアッセイにおけるアグリンの最も活性の高い形態はｙ４ｚ８変異体であり、運動ニューロンにより発現される。
【０００７】
ＬＧ２、ＥＧＦ４およびＬＧ３ドメインを含有するアグリン（ｙ４ｚ８）の約４５ｋＤａのＣ末端断片は、ＡＣｈＲクラスタリングにおいて活性であり、ＡｃｈＲクラスタリング活性において１３０ｐＭのＥＣ５０を有するが、より短い断片はより低い活性しか有さないことがわかっている。ｚ８挿入を有するＣ末端ＬＧ３ドメインは、４５ｋＤａの断片よりも１００倍低い係数である、わずかに１３ｎＭの最大半量のＡＣｈＲクラスタリング活性を示す（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。
【０００８】
国際公開第９７／２１８１１号において、筋肉に作用する疾患の治療方法においてアグリンまたはアグリン断片を使用することが提唱されている。しかしながら、そのような試みは、現在まで成功が示されていない。
【０００９】
本出願人の調査により、アグリン断片のインビボでの活性がＬＧ２およびＬＧ３ドメインの両方が一緒に存在することに主に依存することを確認した。国際公開第９７／２１８１１号においては、ＬＧ３のみに関するＡＣｈＲクラスタリングのインビトロでの活性を示したが、ＬＧ３のインビボでの活性は示し得なかった。ＬＲＰ４のみの活性化では、インビボでの活性を完全に達成するには不十分であると考えられる。
【００１０】
アグリンは、アグリンの活性を制御するのに重要な役割を果たすニューロトリプシンと呼ばれる酵素により切断される。現在、アグリンはニューロトリプシンの唯一の既知の標的である。ニューロトリプシン（Ｓｔｅｐｈａｎ  Ａら、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  ２００８；２２：１８６１〜１８７３頁）は、α部位およびβ部位と呼ばれる２つの異なる部位でアグリンを切断する（図１）。α部位は、ＳＥＡドメインからＮ末端側に位置し、β部位はアグリンのＬＧ３ドメインの前に位置する。α部位での切断は、４〜１２％のビストリスＳＤＳゲル中で約１３０ｋＤａに泳動する約１１０ｋＤａのＣ末端アグリン断片を生成する。β部位での切断は、前記ゲル中で約２２ｋＤａに泳動するＣ末端ＬＧ３ドメインを遊離する（Ｍｏｌｉｎａｒｉ、Ｒｉｏら、２００２；Ｒｅｉｆ、Ｓａｌｅｓら、２００７）。β部位での切断は、ＬＧ３ドメインからのＬＧ２ドメインの分離を誘導する。
【００１１】
ニューロトリプシン（ＮＴ）を過剰に発現させるマウス、いわゆるサルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ、Ｍ４９１Ｓ）（Ｓｔｅｐｈａｎ、Ｍａｔｅｏｓら、２００８）は、サルコペニアの早期発現、加齢に伴う骨格筋の質量および強度の変性喪失を示すことがわかった。
【００１２】
全てのＣ末端断片は、マウスの脳抽出物および脊髄抽出物中で検出され得た（Ｓｔｅｐｈａｎ、Ｍａｔｅｏｓら、２００８）。ニューロトリプシンノックアウトマウスにおいては、いずれの断片も検出され得なかった。結果として、ニューロトリプシンは、２つの切断部位で有意な量のアグリンを切断する唯一のプロテアーゼであると考えられる。ニューロトリプシンによるアグリンの切断は、原則として５つの異なるアグリン断片を生成し、そのうちの３つは血液中で検出することができる。これらの３つのアグリン断片は、ＣＡＦ、Ｃ９０およびＣ１１０である。これらの断片は、ｙおよびｚ位置での特異的挿入の存在にも応じて異なる機能を有し得る。本特許で用いられる様々な天然および人工のアグリン断片を含む一覧を以下の表１に記載する。
【表１】
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【００１３】
合計で２４の、天然のニューロトリプシン由来のＣ末端アグリン断片が存在し得る。これらの断片は、様々な器官、組織中で異なる機能を有し得る。正確な診断のためには、これらの様々なアグリン断片間を識別することが非常に重要であることは明らかである。
【００１４】
本出願と同一の出願人による欧州特許第１９９０４２０号において、ニューロトリプシンのインビボでの活性に関するバイオマーカーとしての、ならびにニューロトリプシンに関連したかく乱の診断およびモニタリングでの、アグリンのＣ末端の２２ｋＤａのアグリン断片（ＣＡＦ）の使用が記載されている。本出願人は、β部位でのアグリンの切断後に遊離されて血清などの体液中で測定することができる、この断片の存在および量の上昇が、例えばサルコペニアなどの特定のかく乱と相関することを見出した。
【００１５】
上昇したＣＡＦレベルの存在はまた、腎臓および肺の機能障害に罹患しているか、または自閉症もしくは精神遅滞などの脳の疾患に罹患している患者においても示され得る。軽度の認知機能障害、初期の認知症またはアルツハイマー病に罹患している患者は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＣＡＦレベルが上昇し得る。
【００１６】
あるいは、神経因性疼痛に罹患している患者においては、正常である健康な人と比較して、ＣＡＦレベルは低下し得る。末梢神経損傷は、接触性アロディニアを示すラットの同側の脊髄後角中でのアグリン発現を減少させることがわかった。アグリンは、ＧＡＢＡニューロン中でのＮＲ１リン酸化反応を通じて神経因性疼痛を調節する。ＮＲ１はＮＭＤＡ受容体の一部であり、ＮＭＤＡ受容体は２個のＮＲ１および２個のＮＲ２サブユニットの間でヘテロ四量体を形成する。ＮＭＤＡ受容体であるグルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡＲ機能の調節が存在する疾患、例えば、虚血、発作、パーキンソン病、ハンチントン病、疼痛、糖尿病（末梢ＮＭＤＡＲが関与する）、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、アルツハイマー病および他の認知症または認知機能障害における主要因子であり、シナプス可塑性および記憶機能を制御するための分子デバイスである。
【００１７】
アグリンの減少、およびその後のＣＡＦレベルの減少はまた、神経因性疼痛だけでなく、てんかん、振戦、および痙性の検出のための新しい手法を開くことができる（ＣｕｉおよびＢａｚａｎ、２０１０）。
【００１８】
報告された通り、ＣＡＦは、それぞれ観察される機能障害または疾患における共通の誘発因子となり得るＮａＫ−ＡＴＰａｓｅのα３サブユニットを阻害する。
【００１９】
まとめると、アグリンは、発達中の神経筋接合部でのアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の蓄積を媒介するが、中枢神経系（ＣＮＳ）シナプスの調節因子としても関与してきた（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｍｉｙａｉ、Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋａら、２００９）。天然のニューロトリプシン切断産物であるアグリンのＣ２２構築物が、良好にフォールディングされた安定したドメインを構成することは示されている。さらに、アグリンのＣ末端領域は、ＣＮＳニューロン中でナトリウム−カリウムＡＴＰａｓｅ（ＮＫＡ）のα３サブユニットに結合することが示されており、これはα３ＮＫＡがニューロンのアグリン受容体であることを示している。
【００２０】
上記のことから、特にＣＡＦだけでなく、様々な組織中で検出することが可能な、様々な病的状態および非病的状態と相関させることができる、アグリンの他のＣ末端断片も、患者の治療において用いることができる重要なマーカーであるだけでなく、重要な標的でもあると考えられる。
【００２１】
しかしながら、標的として例えばＣＡＦを用いる有望な医学的適用は、
ヒトＣＡＦ（特異的ニューロトリプシン切断により誘導される）と他のヒトアグリン断片との間の識別を可能にし、
高い特異性および親和性でヒトＣＡＦに結合することができ、
ニューロトリプシンによるアグリンの切断が起こる組織に対してヒトＣＡＦを識別する
抗体を必要とする。
【００２２】
様々なアグリン断片に対する抗体は利用可能であるが、それらはヒト由来のＣＡＦを検出せず、または不十分にしか機能しない。ヒトＣＡＦを検出することができるモノクローナル抗体は、現在のところ利用可能ではない。
【００２３】
２０１０年１１月１７日にＶｒｉｊｂｌｏｅｄらによって提示されたポスター「Ａｇｒｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ」において、また、上記で引用した欧州特許第１９９０４２０号においても、出願人によって実験室において、２２ｋＤａの断片（ＣＡＦ）の検出のために、アグリンの９０ｋＤａおよび２２ｋＤａの断片に対して作製した、特異的なアフィニティー精製されたポリクローナル抗体の使用が記載されている。これらのポリクローナル抗体Ｇ９２（ヤギ）およびＲ１３９（ウサギ）（Ｓｔｅｐｈａｎら、参照）は、ヤギおよびウサギから誘導されたものであり、特殊な最適化された実験室条件下では非ヒトアグリン断片を認識したが、モノクローナル抗体は、はるかにより良い特異性および再現可能な特性を有し、診断適用にとってはポリクローナル抗体よりも明らかに優れている。例えば、ポリクローナル抗体は大規模で、および一貫した品質で製造することができない。そのため、それらが標準的な適用において機能することが疑われ、それらは上記要件を明確に満たさなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の課題は、ヒトＣＡＦおよびアグリン断片を含むヒトＣＡＦに対する改良された抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本出願人は、そのような改良された抗体を、アグリンの特殊なＣ４４断片、すなわち、断片Ｃ４４ｙ≧４が免疫化のために用いられる、請求項１に記載の方法によって製造された、ハイブリドーマ細胞系から取得することができることを見出した。
【００２６】
Ｃ４４断片という用語は、ロイシン１６３７からプロリン２０４５にまで及ぶヒトアグリンのＣ末端部分の全ての異なる変異体を包含し、前記プロリンの正確な位置は、ｙおよび／またはｚ位置における挿入の長さおよび存在に依存する。
【００２７】
Ｃ４４ｙ≧４断片という用語は、少なくとも４個のアミノ酸のｙ挿入を有するＣ４４断片の全ての異なる変異体を包含する。原則として、天然のＣ４４ｙ４、１７、２１挿入を用いることができる。しかしながら、異なる挿入を有する合成断片も想定される。本出願で用いられる場合、接尾語Ｋ／Ａは、課題のアグリン断片がニューロトリプシン耐性であることを意味する。
【００２８】
驚くべきことに、少なくとも４個のアミノ酸のｙ挿入を有するＣ４４断片が、この挿入を欠く他のＣ４４断片と比較してより高い免疫作用を示すことがわかった。本出願人の観察によれば、ｙ挿入を有する断片は凝集体を形成する傾向があり、これはこの挿入を欠く他のＣ４４断片には当てはまらず、おそらく、改善された免疫作用の理由である。
【００２９】
免疫化にとって特に好ましいＣ４４ｙ≧４断片は、後に詳述する断片Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８である。この断片を用いることによる免疫化は、非常に特異的で有効な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を誘導することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８断片の模式図である。
【図２】Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８断片の配列を示す図である。抗体の結合部位を太字の斜体で表し、エピトープ配列が位置する配列の部分を必要に応じて数回記載する（それぞれの抗体につき１回）。
【図３】マウス血清における様々なアグリン変異体の免疫原性を示すＥＬＩＳＡ試験の結果を示す図である。
【図４】エピトープマッピング後に試験されたそれぞれの抗体について得られたｐｅｐｓｐｏｔ膜および対応するスキームを示す図である。
【図５】ラット血清中で急増したＣＡＦを検出する異なる抗体の能力を示すウェスタンブロットの図である。
【図６】抗体１３Ｅ８によるＣＡＦ−ｚ８およびＣＡＦ−ｚ０の染色を示すウェスタンブロットの図である。
【図７】ＣＡＦ−ｚ８およびＣＡＦ−ｚ０への抗体２８Ｈ７Ｇ３および１３Ｅ８の異なる結合を示すドットブロットの図である。
【図８】抗体１４Ｃ５Ｇ４および１２Ａ１１Ｄ１１のＥＬＩＳＡ試験の結果を示す図である。
【図９】ＣＡＦ−ｚ０およびＣＡＦ−ｚ８への抗体２Ｄ７Ｄ９および２８Ｈ７Ｇ３の結合を示すウェスタンブロットの図である。
【図１０】ｚ８特異的抗体のＥＬＩＳＡ試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明による方法において好ましく用いられるアグリンのＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８断片を、図１に概略的に図示する。これは実施例１に記載のように取得することができる。
【００３２】
この配列（配列番号１）を図２に示し、本発明に従って得られる抗体の結合部位を太字の斜体で表す。
【００３３】
Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８断片は、ヒトアグリン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｏ００４６８−１、但しプロリン１７５１とバリン１７５２の間にｙ４挿入のＫＳＲＫ（配列番号２）およびセリン１８８４とグルタミン酸１８８５の間にｚ挿入のＥＬＡＮＥＩＰＶ（配列番号３）を有する）のロイシン１６３７からプロリン２０４５にまで及び、ＬＧドメインＬＧ２およびＬＧ３を含む。ニューロトリプシンのβ切断部位は、アラニン（Ａ：図１で太字で示される）によって切断部位中のリシン（Ｋ）を置換することにより欠失されている。しかしながら、本発明は、この特殊なＣ４４断片に限定されることなく、Ｃ４４ｙ断片の全ての異なる変異体を包含する。また、配列ＶＬＳＡＳＨＰＬＴＶＳＧＡＳＴＰＲ（配列番号４）を有するｙ１７挿入を含む天然のＣ４４ｙ１７断片、または配列ＫＳＲＫＶＬＳＡＳＨＰＬＴＶＳＧＡＳＴＰＲ（配列番号５）を有するｙ２１挿入を含むＣ４４ｙ２１断片を用いることも想定される。同じことがｚ挿入にも適用可能である。ｚ−８挿入を含む好ましく用いられるＣ４４断片とは別に、ｚ挿入を有さない、配列ＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ  ＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（配列番号６）のｚ１１挿入または配列ＥＬＡＮＥＩＰＶＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（配列番号７）のｚ１９挿入を有する、Ｃ４４断片を用いることもできる。
【００３４】
本出願人は、本発明による方法を用いることにより、２８Ｈ７Ｇ３、２６４Ｅ１２Ｂ８、２８Ａ６Ｈ１１、１４Ｃ５Ｇ４、１２Ａ１１Ｄ１１、２８Ｆ７Ａ６、１４Ｂ７Ｂ８、２６４Ｂ１２Ａ８および１３Ｅ８と命名されたモノクローナル抗体を産生するいくつかの異なるハイブリドーマ細胞系を含有する抗体プラットフォームを調製した。この方法は、実施例２および実施例３で詳細に考察される。
【００３５】
抗体１３Ｅ８（以下に記載される）を産生するハイブリドーマ細胞系とは別に、全てのハイブリドーマ細胞系が２０１１年１月１１日にブダペスト条約の下で本出願人によってＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  ＧＥＲＭＡＮＹに寄託されている。この細胞系は、以下の受託番号を与えられている。
２８Ｈ７Ｇ３＝ＤＳＭＡＣＣ３１０１；２６４Ｅ１２Ｂ８＝ＤＳＭＡＣＣ３１０２
２８Ａ６Ｈ１１＝ＤＳＭＡＣＣ３１０３；１４Ｃ５Ｇ４＝ＤＳＭＡＣＣ３１０４
１２Ａ１１Ｄ１１＝ＤＳＭＡＣＣ３１０５；２８Ｆ７Ａ６＝ＤＳＭＡＣＣ３１０６
１４Ｂ７Ｂ８＝ＤＳＭＡＣＣ３１０７；２６４Ｂ１２Ａ８＝ＤＳＭＡＣＣ３１０８
【００３６】
図１において、記載されたアグリンのＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８断片上の抗体の結合部位を概略的に図示する。抗体のエピトープ配列は、ペプチドマッピング（実施例５）により決定されたものであり、以下の通りである。
抗体２８Ｈ７Ｇ３（配列番号８）、配列：ＴＦＶＥＹ
抗体１４Ｂ７Ｂ８（配列番号９）、配列：ＦＶＥＹＬ
抗体２８Ａ６Ｈ１１（配列番号１０）、配列：ＴＦＶＥ
抗体２６４Ｅ１２Ｂ８（配列番号１１）、配列：ＷＬＧＧＬＰＥＬＰ
抗体２６４Ｂ１２Ａ８、配列：ＬＰＥ
抗体２８Ｆ７Ａ６（配列番号１２）、配列：ＬＰＥＬＰ
【００３７】
上記のエピトープは、今までのところ記載されていないものである。また、このエピトープに関する知識が、好ましい適用を誘導し得ることも想定される。例えば、療法または予防的適用において用いることができる１または複数のエピトープ配列を含む合成ペプチドを作製することが想定される。さらに、本発明は、上記の特定の抗体に限定されることはなく、課題のエピトープに結合する他の抗体も包含する。
【００３８】
また、抗体１４Ｃ５Ｇ４および１２Ａ１１Ｄ１１ならびに上記の抗体１３Ｅ８は、本発明による方法を用いて得られたものである。これらの抗体について、エピトープ配列は決定されなかった。
【００３９】
しかしながら、抗体１３Ｅ８はＣＡＦ  ｚ−８断片に特異的に結合することが示され得た（実施例７）。これはそのエピトープ配列がＥＬＡＮＥＩＰＶ（配列番号３）またはその一部にちがいないことを示している。当業者にとって、本発明の方法を用いることにより、ｙ４、ｙ１７もしくはｙ２１またはｚ１１もしくはｚ１９挿入などのＣ４４断片中におそらく存在する他の挿入に特異的に結合する、本出願には記載されていないさらなる抗体を得ることもできることが明らかである。
【００４０】
抗体１４Ｃ５Ｇ４および１２Ａ１１Ｄ１１は、Ｃ４４の非ＣＡＦ  Ｎ末端部分に結合することが示された（実施例８）。
【００４１】
図１は、上記抗体の異なる結合部位をまとめたものである。図１に見られる通り、抗体２８Ｈ７Ｇ３、１４Ｂ７Ｂ８、２８Ａ６Ｈ１１、２６４Ｅ１２Ｂ８、２６４Ｂ１２Ａ８、２８Ｆ７Ａ６および１３Ｅ８は、ＣＡＦ部分に位置する部位に結合し、抗体１３Ｅ８はＣＡＦ断片中におそらく存在するｚ８挿入に特異的に結合する。抗体１４Ｃ５Ｇ４および１２Ａ１１Ｄ１１は、Ｃ４４の他のＮ末端部分に位置する部位に結合する。
【００４２】
結果として、本発明により得られる抗体を用いることにより、ＣＡＦ断片を他の断片から識別することができ、さらに後に考察するように、検出されたＣＡＦ断片の起源を決定することもできる。
【００４３】
例えば、試験システムにおいて抗体２８Ｈ７Ｇ３および抗体１４Ｃ５Ｇ４を用いることにより、試料中で検出されたアグリン断片がＣＡＦ断片であるか、またはＣＡＦ部分を含むより大きい断片、例えば、そのα切断部位でのアグリンの切断により生成される１１０ｋＤａの断片であるかどうかを決定することができる。両方の抗体が前記断片に結合する場合、これはＣＡＦ断片を含むより大きいアグリン断片を示唆する。一方の抗体だけが結合する場合、これはＣＡＦ（２８Ｈ７Ｇ３）またはＣＡＦを欠くアグリン断片（１４Ｃ５Ｇ４）のいずれかを示唆する。
【００４４】
興味深いことに、１４Ｂ７Ｂ８はＣＡＦのみを認識し、より長いＣ末端アグリン断片、例えばヒトＣ４４またはヒトＣ１１０を認識しないが、２８Ｈ７Ｇ３はヒトＣＡＦ、Ｃ４４およびＣ１１０に対する全てのＣＡＦ含有変異体を検出する。両抗体は同じエピトープに結合すると考えられるが、それらの抗体は明確に異なる結合特性を有する。つまり、１４Ｂ７Ｂ８の使用により、他のアグリン断片と干渉せずにヒトＣＡＦを特異的に検出することができるが、２８Ｈ７Ｇ３は全てのＣＡＦ含有断片を同時に検出することができる。
【００４５】
本発明に従って得られた記載の抗体の特定の組合せの使用により、濃度および同一性に関して様々なＣ末端アグリン断片を識別するＥＬＩＳＡシステムの確立が可能になる。
【００４６】
上述の抗体１３Ｅ８に関して、この抗体はＣＡＦ断片中におそらく存在するｚ８挿入に特異的に結合する。このｚ８挿入は神経組織を起源とするＣＡＦ断片中にのみ存在するので、この抗体の使用により検出された断片が神経組織または他の組織中で遊離されたかどうかの決定が可能になる。
【００４７】
本発明の方法により得られる抗体は、診断だけでなく、ＣＡＦに関連するかく乱の治療においてもいくつかの異なる適用を可能にすることが明らかである。
【００４８】
上述の通り、ＣＡＦ断片はＮａ、Ｋ、−ＡＴＰａｓｅのα３ユニットを阻害するため、毒性タンパク質断片となり得る。これは、細胞内または細胞外に毒性ナトリウム、カリウムまたはカルシウム濃度をもたらし得る。従って、本発明の方法に従って生成された抗体の１つの重要な適用としては、人工腎臓において腎臓病に罹患している患者の血液を浄化するためのそれらの使用があり得る。この浄化は、抗体をセファロース（架橋デキストラン）などの不溶性担体材料または他の生体適合性材料に結合させ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）などの他のタンパク質の除去について記載されたもの（Ｂｏｒｂｅｒｇ、Ｇａｃｚｋｏｗｓｋｉら、１９９０）と同様のアフェレーシス処置（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、方法）において、患者の血液を前記抗体に曝露することによって達成することができる。好ましくは、血液は抗凝固化され、抗体との接触の前に細胞が除去される。結合した抗体を、濃い塩溶液および／または低いｐＨ値への曝露により再生することができる。
【００４９】
また、患者における、静脈内または皮内注射または点滴によるＣＡＦの直接的中和のために、本発明の方法に従って得ることができる１または複数の抗体を用いて薬剤を製造することも想定される。
【００５０】
本発明の１つの主な態様は、医薬製剤における抗体の使用またはそのような製剤の製造におけるこれらの抗体の使用に関して想定されるいくつかのさらなる適用である。これは、抗体の形成によるアレルギー反応またはその中和を防止するための抗体のヒト化処置を含んでもよい。
【００５１】
そのような製剤は、血液中の上昇したＣＡＦレベルに対するものであったり、例えば、サルコペニア、腎臓病、肺疾患、およびアルツハイマー病、パーキンソン病などの精神遅滞を特徴とする疾患において用いることができるものであったりする。
【００５２】
また、臨床試験におけるマーカーもしくはサロゲートマーカーとして、または個別化医療におけるマーカーとして、アグリンまたはアグリン断片の検出のための抗体を使用することも想定される。ＣＡＦ含有薬剤を用いる臨床試験においては、ｍＡＢを用いて、体内、例えば、血液または尿中の薬剤の量を検出することができる。
【００５３】
１つのそのような薬剤は、例えば、アグリンのニューロトリプシン耐性Ｃ４４断片（特許出願ＥＰ０９０１１３６７．１に記載されている）である。臨床試験中の患者またはこのニューロトリプシン耐性アグリン断片を摂取する任意の他の患者における、この断片の濃度の決定のためにｍＡＢを用いることができる。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、それを限定するものではない。これらの実施例を読む当業者であれば、他の関連する状態を適用することができ、これらのものも本発明の範囲内にある。
【００５５】
（実施例１）
［Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８のクローニング、発現および精製］
［ａ）アグリンのニューロトリプシン耐性ヒト  ４４ｋｄ  Ｃ末端断片のクローニング］
最初に、Ｎ末端ＮｔＡドメインを欠く完全長のヒトアグリンｙ０ｚ０（ヒトアグリンｙ０ｚ０  ｄｅｌｔａＮＴＡは、受託番号ＮＰ＿９４０９７８のタンパク質配列中で位置Ｋ１５６から始まる）を、好適な限定部位およびプライマーを介して、ヒトカルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）−１の分泌シグナルのコード配列を含有するｐＥＡＫ８ベクター（Ｒｅｉｆ、Ｓａｌｅｓら、２００７）中に、ＰＣＲによりクローニングした。ヒトアグリンのための鋳型として、ベクターｐＣＭＶ−ＸＬ５−アグリン（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＵＳＡから購入）を用いた。
【００５６】
その後の２つのステップにおいて、ｙ４ｚ８挿入にとって必要な対応するコドンを、標準的な技術の部位特異的突然変異誘発により導入し、完全長のヒトアグリンｙ４ｚ８  ｄｅｌｔａＮｔＡを含有するｐＥＡＫ８ベクターを得た。
【００５７】
このベクターを鋳型として用いて、ヒトアグリンの４４ｋｄ  Ｃ末端断片をコードする遺伝子を増幅し、変換（転移）されるタンパク質のＮ末端にＨｉｓ８タグおよびＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位のコード領域を導入した。
【００５８】
ニューロトリプシン耐性型のヒトアグリンＣ４４Ｋ／Ａを、アグリンの切断部位-□中のリシンのコドンの位置にアラニンのコドンを導入するプライマーを用いたクイックチェンジ突然変異誘発ステップにおいて作製した。
【００５９】
このプラスミドは、トランスフェクト細胞の培養上清中で配列番号１の配列と共に、Ｈｉｓ８タグおよびＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ切断部位を含有するさらなるＮ末端アミノ酸配列「ＡＲＶＮＨＨＨＨＨＨＨＨＬＥＶＬＦＱＧＰ」（配列番号１３）を含む、タンパク質（シグナル配列を含まない）を生成する。
【００６０】
［ｂ）ヒトアグリンＣ４４およびニューロトリプシン耐性Ｃ４４Ｋ／Ａの発現および精製］
１×１０６細胞／ｍｌの密度までＥｘｃｅｌｌ２９３培地中で増殖させた５００ｍｌのＨＥＫ２９３細胞を、１００×ｇで、３０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心分離機中で遠心分離してペレット化した。細胞を、３７℃に予め温めた５００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。ニューロトリプシン耐性ヒトアグリンＣ４４  ｙ４ｚ８の発現に起因する挿入を含有する１．２５ｍｇのｐＥＡＫ８を、２５ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中に希釈した。３．７５ｍｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、２５ｋＤａを、２５ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中に希釈した。両溶液をプールし、室温で１０分間インキュベートした。その後、この溶液を細胞懸濁液に添加し、これを１０００ｍｌのスピナーフラスコに移した。細胞懸濁液を、加湿雰囲気中の５％のＣＯ２および３７℃のインキュベータ中に置かれた撹拌プラットフォーム上で、７５ｒｐｍで７日間インキュベートした。
【００６１】
７日後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心分離機による５０００ｒｐｍでの遠心分離により、培養上清を分取した。０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ滅菌濾過装置を通す濾過により、残留する粒子を除去した。濾過した培養上清を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＰＬＣＧＣ  １０ｋＤａ  カットオフ接線流カートリッジを用いて１０倍に濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、４００ｍＭのＮａＣｌに対して少なくとも１：１０００で透析した。透析液を、Ｎｉ２＋で標識化した１０ｍｌのベンチトップＨｉｓ  Ｓｅｌｅｃｔカラムを用いたＨｉｓ８タグを活用する固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にかけた。濃縮および透析された細胞培養上清をロードした後、カラムを１００ｍｌの透析バッファー（緩衝材）で洗浄し、結合したタンパク質を、５００ｍＭのイミダゾールを含有する１０ｍｌの透析バッファーで５回溶出させた。精製を達成した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。陽性画分をプールし、Ｓｉｇｍａ  ４Ｋ１５遠心分離機中、３０００×ｇでＡＭＩＣＯＮ  ３０ｋＤａ  カットオフ濾過装置を用いて１０倍に濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌに対して１：１００００で透析した。０．７２５ｃｍ２／ｍｇの吸光係数を用いるＵＶ分光法により、精製したＣ４４Ｋ／Ａの濃度を決定した。
【００６２】
［ｃ）Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断によるＨｉｓ８タグの除去］
Ｈｉｓ８タグを除去すべき場合、０．５ｍｌのタンパク質溶液のバッファーを、そのバッファーで予め平衡化させたＮＡＰ−５カラムを用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡに交換した。タンパク質溶液を１ｍｌの同じバッファー中に溶出させた。１μｌの１ＭのＤＴＴをタンパク質溶液に添加し、チューブを数回軽くはじくことにより混合した。２０μｌのＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（１Ｕ／μｌ）を添加し、チューブを数回軽くはじくことによりそれを混合した。反応を４℃で一晩行った。０．５ｍｌの重力流グルタチオンセファロースカラムを、１ｍＭのＤＴＴを添加した５ｍｌのＰＢＳで平衡化させた。消化されたタンパク質溶液をロードし、流出液を回収した。カラムを、１ｍＭのＤＴＴを添加した１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、流出液を前の流出液画分と同じチューブ中に回収した。回収した流出液画分を、５ｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、４００ｍＭのＮａＣｌに対して２時間、２回透析して、ＤＴＴおよびＥＤＴＡを除去した。
【００６３】
切断されたＨｉｓ８タグを除去するために、２回目のＩＭＡＣを実施した。Ｎｉ２＋イオンで予め標識化された１ｍｌのキレート化セファロースＦＦカラムを、５ｍｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、４００ｍＭのＮａＣｌで平衡化させた。透析したタンパク質溶液をカラム上に適用し、流出液を回収した。カラムを１ｍｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、４００ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄し、流出液を同じチューブ中に回収した。プールした画分を、ＡＭＩＣＯＮ  ３０ｋＤａ  カットオフ濃縮装置を用いて０．５ｍｌに濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌで予め平衡化させたＮＡＰ−５カラムを用いてバッファーを交換した。０．７６１ｃｍ２／ｍｇの吸光係数を用いるＵＶ分光法により、濃度を決定した。タンパク質を、さらなる実験のために新たに用いるか、または使用まで−８０℃で保存した。対応するタンパク質のタンパク質配列は、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ切断の結果として、さらなるＮ末端アミノ酸配列「ＧＰ」を含む、配列番号１の一部に対応する。
【００６４】
（実施例２）
［Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８を用いたマウスの免疫化］
３匹の６〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中の９０〜１５０マイクログラムのＣ４４Ｋ／Ａで免疫化した。２８日後、Ｃ４４Ｋ／Ａを不完全フロイントアジュバント中で投与した。このステップを５６日後に繰り返した。８７日後、Ｃ４４Ｋ／ＡをＰＢＳ中で投与し、これを９０日目に繰り返した。１日後、膝のリンパ節に由来する細胞を調製し、得られたＢ細胞を、ＰＥＧ４０００の存在下でＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８のマウスのミエローマ細胞と融合させた。
【００６５】
細胞融合の完了後、細胞を２４ウェルプレート上に塗布したところ、５〜１０個のクローンからなる３６０個のオリゴクローンが得られた。融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択する選択用Ｏｐｔｉｍｅｍ培地（ＧＩＢＣＯ）中で１０日間、細胞を培養した。
【００６６】
陽性検査として、ＥＬＩＳＡにより上清をスクリーニングした。２倍の限界希釈により、単一のクローンが生成された。クローンの陽性を、Ｃ４４Ｋ／Ａを用いるＥＬＩＳＡにより検査した。
【００６７】
（実施例３）
［モノクローナル抗体の発現および精製］
ハイブリドーマ細胞を無血清ＩＳＦ−１培地（ＢＩＯＣＨＲＯＭＥ  ＡＧ）に適応させ、５〜７日間増殖させた。約１００ｍｌの馴化（条件）培地を、プロテインＧセファロースクロマトグラフィーにかけた。
【００６８】
簡単に述べると、馴化された上清を、１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で１ｍｌのプロテインＧまたはプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ−ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）上にロードした。３０倍のカラム容量（ＣＶ）のＰＢＳ／０．５Ｍのグリシン、ｐＨ７．４で洗浄した後、結合した抗体を１００ｍＭのクエン酸バッファー、ｐＨ２．６で溶出させた。陽性画分をプールし、好適な量の２ＭのＴｒｉｓにより中和した。
【００６９】
精製した抗体を、ＰＢＳに対して透析し、それをさらに使用するまで４℃で保存した。
【００７０】
（実施例４）
［ＣＡＦ−ｚ８およびＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８を用いる免疫化ならびにこれらの免疫原を用いて得られた抗体の比較］
それぞれの抗原、Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８またはＣＡＦ−ｚ８について、３匹のマウスを用いた。５ｍｇ／ｋｇの対応するアグリン変異体を、１日１回、２４日間にわたって皮下注射した。この後、マウスを犠牲にし、標準的な血清チューブを用いて血清を調製した。
【００７１】
［ＥＬＩＳＡプレートの被覆］
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏプレート９６ウェル（平底、ポリスチレン）を、１００ｎｇ／ウェルのＣＡＦ−ｚ８で被覆した。被覆は、１×Ｃａｎｄｏｒ社製の被覆バッファー（Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．６の存在下、４℃で一晩（すなわち、１５ｈ）行った。
【００７２】
被覆バッファーの吸引後、プレートを４００μｌのＮａ−ＰＢＳ−ＣＡＳ、ｐＨ７．２（追加の０．２ｍｏｌのＮａＣｌ（「Ｎａ」）および０．０５％のカゼイン（「ＣＡＳ」）を添加したＰＢＳ）で７回洗浄した。洗浄は、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄装置（Ｗｉｔｅｃ  ＡＧ）を用いて行った。ウェルあたり１８０μｌのＣａｎｄｏｒ社製のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加することにより、洗浄されたプレートのウェルをブロッキングした。次いで、プレートを室温で３ｈインキュベートした。ブロッキング溶液を除去した後、プレートを４００μｌのＮａ−ＰＢＳ−ＣＡＳ、ｐＨ７．２で７回洗浄した。続いて、プレートをＥＬＩＳＡ実験に用いた。
【００７３】
［アグリン変異体の免疫原性の検査］
ＰＢＳに、カゼインおよびＴｗｅｅｎ２０を、０．０５％の最終濃度まで添加した（ＰＢＳＴ−ＣＡＳバッファー）。血清をＰＢＳで１０００倍に希釈した。バックグラウンド対照を、未処理のマウスから調製した。各試料のうち、ウェルあたり１００μｌを、対応するアグリン種で被覆したＥＬＩＳＡプレートに移した。室温（ＲＴ：２０〜２１℃；密閉フィルムで密閉）で２ｈ、プレートをインキュベートした後、これらをＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄装置（Ｗｉｔｅｃ  ＡＧ）を用いて４００μｌのＰＢＳＴ−ＣＡＳで７回洗浄した。続いて、１００μｌ／ウェルのヤギ抗マウス、ペルオキシダーゼ標識（ＫＰＬ、０７４−１８０６）を添加し、ＰＢＳＴ−ＣＡＳで１００００倍に希釈した。その後、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした後、４００μｌのＰＢＳＴ−ＣＡＳで７回洗浄した。基質を添加し（ウェルあたり１００μｌ；「ＴＭＢ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ」基質；ＢｉｏＦＸ；ＴＭＢＳ−１０００−０１）、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌの４５０ｎｍ  停止試薬（Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ＢｉｏＦＸ；＃ＳＴＰＲ−１０００−０１）を添加することにより、発色を停止させた。続いて、４５０ｎｍでの吸光度を、Ｔｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００プレートリーダーを用いて測定した。測定の結果を図３にまとめる。ＣＡＦ−ｚ８マウスに由来する血清中では良好な免疫応答は検出されなかった。応答はバックグラウンド（ｂｃｋｇ）を超えてちょうど検出可能であり、その平均は０．０７ＯＤ単位であった。驚くべきことに、抗原としてＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８で処理したマウスにおいては、非常に高い免疫応答が認められた。バックグラウンド（ｂｃｋｇ）を超える平均の増加は１．６ＯＤ単位であった。ＣＡＦ−ｚ８の良好な免疫応答が存在しないことの理由は、完全には理解されないが、天然のニューロトリプシン切断産物であるアグリンＣ２２構築物は良好にフォールディングされた安定なドメイン（ｔｙｄｏｒ）を構成することが示された。対照的に、Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８は、凝集する傾向があるタンパク質である（データは示さない）。この凝集は、マウスにおける強力な免疫応答の理由となり得る。マウスにおけるＣＡＦの良好な免疫応答の欠如は、ヒトＣＡＦに対する良好なモノクローナル抗体が未だ市販されていない理由の１つであり得る。しかしながら、抗原としてＣ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８を用いた場合、強力な免疫応答が観察され、多種多様のモノクローナル抗体が得られた。
【００７４】
（実施例５）
［抗ＣＡＦ抗体のエピトープマッピング］
ＣＡＦに対する抗体のエピトープマッピングのために、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＰｅｐｓｐｏｔ膜を用いた：ヒトアグリンのニューロトリプシン切断部位βのＰ１’残基で始まるＬＧ３ドメインの配列（ＣＡＦ−ｚ０）を、１４個のアミノ酸の重複を含む１５個のアミノ酸長のペプチドに分割した。これにより、全配列を包含する１５個のアミノ酸長の１７２個のペプチドが得られた。ペプチドをＮ−アセチル化し、そのＣ末端を介してセルロース−□□アラニン膜に共有結合させた。
【００７５】
０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２時間、０．１〜２マイクログラム／ｍｌの濃度で抗体と共に、膜をインキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間の洗浄ステップを３回行った後、ＨＲＰで標識化されたヤギ抗マウスの二次抗体を添加し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）化学発光ＨＲＰ基質（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を添加し、Ｓｔｅｌｌａ画像化システム（ＲＡＹＴＥＳＴ）上で１分間、膜に転写（ｒｅｃｏｒｄｅｄ）した。陽性スポットを対応するペプチドスポットに割り当て、エピトープを一致させた。
【００７６】
陽性スポットを、膜上にスポットされたペプチド配列に割り当てた。抗体の結合に寄与する必須アミノ酸を、タンパク質配列のＮ末端側でシグナルを与える最初のアミノ酸と、Ｃ末端側でシグナルを与える最後のアミノ酸との決定により位置づけた。
【００７７】
ペプチドマッピングの結果を図４に示し、得られるエピトープを以下の表２に示す。
【表２】
2014507942.tif 000004
【００７８】
（実施例６）
［ラット血清中で急増したＣＡＦのウェスタンブロッティング］
生物試料中のＣＡＦを検出する抗体の能力を証明するために、ヒトＣＡＦ−ｚ０をラット血清中で急増させ、ＰＢＳで１：２５０に希釈し、０．２ｎｇ／μｌの濃度を得た。２ｎｇのＣＡＦ−ｚ０に対応する１０μｌを、４〜１２％のビストリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢＩＯＲＡＤ）上にロードし、セミドライブロッティング装置（ＢＩＯＲＡＤ）を用いてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）上にブロットした。
【００７９】
ＰＢＳＴ  ｏ／Ｎ中の１０％ｒｏｃｈｅブロッキング試薬中の１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体と共に、ブロットをインキュベートした。比較のために、ＣＡＦに対する市販の抗体、ＡＢＣＡＭ社製のａｂ２４７を用いた。
【００８０】
洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした後、化学発光基質（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）とのＨＲＰ反応から誘導された化学発光シグナルを、Ｓｔｅｌｌａ画像化システム（ＲＡＹＴＥＳＴ）中で１分間転写した。
【００８１】
その結果を図５に示す。レーン１＝抗体２８Ｈ７Ｇ３；レーン２＝抗体１４Ｂ７Ｂ８；レーン３＝抗体２８Ａ６Ｈ１１；レーン４＝２６４Ｅ１２Ｂ８；レーン５＝抗体２６４Ｂ１２Ａ８；レーン６＝２８Ｆ７Ａ６；７＝Ａｂｃａｍ抗体、［Ａｇｒ  ２４７］ａｂ１２３６４−１００；ロット：５７７０８７およびレーン８＝ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｓｏｃｏｃｈｉｍ  ＳＡ、０７４−１８０６。
【００８２】
番号および説明は、用いた一次抗体に対応する。ラット血清中に天然に存在する抗体の重鎖および軽鎖のバンド（それぞれ、５５ｋＤａおよび２５ｋＤａの一本線の矢印で示される）が二次抗マウス抗体により検出されることに留意されたい。これらのバンドは、ローディング対照およびウェスタンブロットの機能性対照として役立つ。
【００８３】
２２ｋＤａの二本線の矢印で示されるＣＡＦシグナルは、レーン１〜６においてのみ、すなわち、本発明に従って得られた抗体についてのみ検出することができた。
【００８４】
（実施例７）
［ｚスプライス部位に対して特異的なモノクローナル抗体１３Ｅ８］
アグリンＣＡＦ−ｚ８特異的抗体１３Ｅ８を、限界希釈を行わずに、実施例１の記載と同じ免疫化から誘導した。このクローンの選択のために、以下の方法を選択した。
【００８５】
ＥＬＩＳＡプレートの被覆：Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏプレート９６ウェル（平底、ポリスチレン）を、１００ｎｇ／ウェル（１２５μｌ／ウェル）のヒトＣＡＦ−ｚ８またはヒトＣＡＦ−ｚ０で被覆した。被覆は、１×Ｃａｎｄｏｒ被覆バッファー、ｐＨ９．６の存在下、４℃で一晩（すなわち、１５ｈ）行った。
【００８６】
被覆バッファーの吸引後、４００μｌのＮａ−ＰＢＳ−ＣＡＳ、ｐＨ７．２（追加の０．２ｍｏｌのＮａＣｌおよび０．０５％のカゼインを添加したＰＢＳ）で、プレートを７回洗浄した。洗浄は、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄装置（Ｗｉｔｅｃ  ＡＧ）を用いて行った。洗浄されたプレートのウェルを、室温で３ｈ、ウェルあたり１８０μｌのＣａｎｄｏｒブロッキング溶液を添加することによりブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、プレートを４００μｌのＮａ−ＰＢＳ−ＣＡＳ、ｐＨ７．２で７回洗浄した。続いて、プレートをＥＬIＳＡ実験のために用いた。
【００８７】
推定される抗アグリン抗体を含有するハイブリドーマ上清を検査するために、洗浄バッファー（０．０５％のカゼインおよびＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）を新たに調製した。細胞培養上清をＰＢＳで３０倍に希釈した。細胞培養培地のみで、陰性対照を調製した。各試料のうち、１００μｌを、様々なアグリン種で被覆したＥＬＩＳＡプレートのウェルに移した。
【００８８】
室温（ＲＴ：２０〜２１℃；密閉フィルムで密閉）で２ｈ、プレートをインキュベートした後、それらを、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄装置（Ｗｉｔｅｃ  ＡＧ）を用いて４００μｌのＰＢＳＴ−ＣＡＳで７回洗浄した。続いて、１００μｌ／ウェルの１００００倍に希釈したヤギ抗マウス、ペルオキシダーゼ標識（ＫＰＬ、０７４−１８０６）を添加した後、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。
【００８９】
プレートを４００μｌのＰＢＳＴ−ＣＡＳで７回洗浄し、基質を添加した（ウェルあたり１００μｌ；「ＴＭＢ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ」基質；ＢｉｏＦＸ；ＴＭＢＳ−１０００−０１）。ＴＭＢ基質を添加した後、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌの４５０ｎｍ  停止試薬（ＢｉｏＦＸ；ＳＴＰＲ−１０００−０１）を添加することにより、発色を停止させた。続いて、４５０ｎｍでの吸光度を、Ｔｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００プレートリーダーを用いて測定した。クローン１３Ｅ８に関する測定の結果を図６にまとめる。１３Ｅ８はＣＡＦ−ｚ０ではなく、ＣＡＦ−ｚ８にのみ高い特異性で結合することが明らかであり、これはこの抗体がＣＡＦ中のｚ挿入に特異的であることを意味する。
【００９０】
さらなる実験において、抗体１３Ｅ８および２８Ｈ７Ｇ３を、ＣＡＦ−ｚ０およびＣＡＦ−ｚ８のそれらの結合に関して比較した。２ｎｇのＣＡＦ−ｚ０およびＣＡＦ−ｚ８を、４〜１２％のビストリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢＩＯＲＡＤ）上にロードした。分離後、２４Ｖで６０分間、ＴｒａｎｓブロットＳＤセル（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて標準的なトランスファーバッファーでのセミドライブロッティングによってＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）上にタンパク質をブロットした。
【００９１】
ブロットされたタンパク質の検出のために、１μｇ／ｍｌの濃度の精製した抗体（１３Ｅ８および２８Ｈ７Ｇ３）または細胞培養上清（１：２で希釈されたもの）をＰＢＳＴ中で用いた。
【００９２】
ＰＢＳＴ中のＲｏｃｈｅブロッキング溶液（１０％）を用いて１ｈ、ブロットをブロッキングした。その後、必要な量の抗体を添加し、２ｈインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体溶液（標準的なヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート）を、ＰＢＳＴ＋１０％Ｒｏｃｈｅブロッキング溶液中で好適な濃度で添加した。３０分間インキュベートした後、ブロットをＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｓｔｅｌｌａ化学発光画像化装置を用いて化学発光基質にブロットを曝露した。その結果を図７に示し、レーン１および２は抗体２８Ｈ７Ｇ３に関する結果を示し（レーン１：ＣＡＦ−ｚ０；レーン２：ＣＡＦ−ｚ８）、レーン２およびレーン３は１３Ｅ８に関する結果を示す（レーン３：ＣＡＦ−ｚ０；レーン４：ＣＡＦ−ｚ８）。
【００９３】
これらの結果はまた、抗体１３Ｅ８はＣＡＦ−ｚ８を特異的に認識するが、２８Ｈ７Ｇ３は両方の変異体を認識することを示している。
【００９４】
（実施例８）
［Ｃ４４のＮ末端（非ＣＡＦ）部分に対する抗体］
Ｃ４４ｙ４ｚ８のＮ末端部分に対する抗体に関して試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するためのタンパク質としてＣ４４ｙ４ｚ８およびＣＡＦ−ｚ８を用いて、実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡ試験を行った。上記の２つの抗体、１４Ｃ５Ｇ４および１２Ａ１１Ｄ１１を試験した。その結果を図８に示す。試験した抗体は両方とも、ＣＡＦ−ｚ８ではなく、Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８に結合し、これは、これらの抗体がＣ４４のＮ末端非ＣＡＦ部分に結合することを意味する。
【００９５】
（実施例９）
［ｚ８スプライス部位の特異的抗体を達成するためのマウスの免疫化］
神経性のアグリンは、非神経性のアグリンとは異なる生物学的機能を有し得る（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。例えば、神経性のアグリンは、発達中の神経筋接合部でのアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の蓄積を媒介するが、非神経性のアグリンはこの活性を有さない。血液、血清、尿または脳脊髄液中のＣＡＦ−ｚ８の存在は、神経性のアグリンの分解を示す。それゆえ、ＣＡＦ−ｚ８を特異的に検出することができ、このようにして神経性のアグリンと非神経性のアグリンとを区別することができる、モノクローナル抗体は非常に重要である。そのような抗体を得るために、ヒトアグリンのｚ８挿入中に存在するアミノ酸を含有するペプチドＮＨ２−ＥＬＡＮＥＩＰＶ（配列番号３）−ＣＯＯＨを、マウスオボアルブミンにコンジュゲートさせて、免疫原として用いた。アミノ酸合成、コンジュゲーション、免疫化および細胞融合ならびにモノクローナル抗体の精製は、当業者には公知の標準的な技術に従って行った。簡単に述べると、オボアルブミンにコンジュゲートさせたペプチドを抗原として用いて、４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。２０〜３０□ｇ＋ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）の注射をＴ０（開始日）に行い、１０〜１５□ｇ＋ＩＦＡ（不完全ＦＡ）の注射をＴ２１、Ｔ２８（日）に皮下に行った。さらなる注射をＴ４２、４７、５９、６１、７２で行った。Ｔ７５日目に、脾臓摘出を行った後、脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合させたペプチドに対するＥＬＩＳＡ試験によって母ハイブリドーマ（ｍｏｔｈｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）クローンをスクリーニングした。陽性クローンを、限界希釈によりサブクローニングし、ＩＳＦ−１培地中で無血清条件に適応させた。培養上清中に分泌された抗体を、プロテインＧセファロースクロマトグラフィーにより精製した。最良のモノクローナル抗体（ｍＡＢ）は、ＩｇＭ（２Ｄ７Ｄ９）サブクローンであり、ＩｇＧクローンは得られなかった。
【００９６】
［ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡの結果］
対照抗体として２８Ｈ７Ｇ３を用いる２Ｄ７Ｄ９でのウェスタンブロットを、セミドライブロッティング技術を用いてＰＶＤＦ膜上にブロットされた１００ｎｇのＣＡＦ−ｚ０（レーンｚ０）およびＣＡＦ−ｚ８（レーンｚ８）を用いて実施した。この膜を、１０％Ｒｏｃｈｅブロッキング溶液を添加したＰＢＳＴ中で１時間ブロッキングした。その後、１３ｎｇ／ｍｌのビオチン化２８Ｈ７Ｇ３または１μｇ／ｍｌのビオチン化２Ｄ７Ｄ９を添加し、さらに２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ポリ−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ、０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１０％Ｒｏｃｈｅブロッキング溶液を添加したＰＢＳＴ中で１：３００００に希釈した。ＰＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄した後、膜を化学発光基質に曝露し、Ｓｔｅｌｌａ画像化システム中で画像化した。２８Ｈ７Ｇ３を含むパネルは１秒曝露したが、２Ｄ７Ｄ９を含むパネルは３００秒曝露した。第１抗体として用いた２８Ｈ７Ｇ３と比較して２Ｄ７Ｄ９のアクセスはおおよそ１００倍であり、２Ｄ７Ｄ９のシグナルを受け取るまでの曝露時間が３００倍長いことを考慮すると、２８Ｈ７Ｇ３が２Ｄ７Ｄ９よりも少なくとも３００００倍感受性が高いと結論付けることができる。ＣＡＦ−ｚ０およびＣＡＦ−ｚ８は、グリコシル化タンパク質の画分に起因して二重のバンドとして出現する（図９）。
【００９７】
受容された抗体は、ウェスタンブロットにおいて非常に弱いシグナルしか示さず、ＣＡＦ−ｚ０とＣＡＦ−ｚ８とを良好に識別しない。ＥＬＩＳＡにおいては、前記抗体は、弱いシグナルしか与えず、ＣＡＦ−ｚ０とＣＡＦ−ｚ８との識別はわずかである（図１０）。
【００９８】
［２Ｄ７Ｄ９を用いるＥＬＩＳＡ］
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏプレート）を、３０ｎｇ／ウェルのＣＡＦ−ｚ０またはＣＡＦ−ｚ８で被覆した。プレートを、室温で４ｈ、ウェルあたり１８０□ｌのＣａｎｄｏｒブロッキングバッファーでブロッキングした。３００ｎｇ／ｍｌの２Ｄ７Ｄ９または１３Ｅ８−２Ｃ５を添加し、ＲＴで２ｈインキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および０．０５％のカゼインを添加した４００μｌのＰＢＳＴで７回洗浄した。検出抗体として、それぞれヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰまたはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを、１：１００００の希釈率で用いた。洗浄後、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００  ９６ウェルリーダー中、ウェルあたり１００□ｌのＢｉｏＦＸ社製の「４５０ｎｍ  Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」でブロッキングされたＴＭＢ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＰＲ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ基質を用いて、結合した抗体を検出した。得られたシグナルは非常に弱く、ＣＡＦ変異体の識別は弱い。この免疫化方法では、高親和性の特異的ｍＡＢの生成に成功しなかった。Ｃ４４Ｋ／Ａ−ｙ４ｚ８の免疫化により得られたｍＡＢ  １３Ｅ８−１Ｃ５（以下を参照）は、ＣＡＦ−ｚ８に対して高く、特異的なシグナルを示した。
【００９９】
［文献リスト］
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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