(57)【要約】本発明は、改善されたプライマー設計を含む新規の技術を提供する。これらのプライマー対は、幅広い用途を有し、高い感度と高い選択性を提供する。本発明は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせを提供し、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドへのＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記標的ポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドへのＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有し、Ｐａがｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｐ１３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ｐ５３、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、ならびにＡＫＴからなる群から選択される遺伝子座の配列に、特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドの前記二次構造が、Ｆの不在下で、前記標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を阻害する、請求項１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３】
前記Ｐおよび／またはＦが、修飾核酸をさらに含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
Ｐおよび／またはＦが、修飾核酸をさらに含み、Ｐａがｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｐ１３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ｐ５３、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、ならびにＡＫＴからなる群から選択される遺伝子座の配列に、特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項５】
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記ブロッカーポリヌクレオチドが、第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｔ３が、Ｔ１およびＴ２の５’側に位置し、Ｐａがｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｐ１３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ｐ５３、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、ならびにＡＫＴからなる群から選択される遺伝子座の配列に、特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項６】
Ｐの３’末端のヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端が重複する、請求項５に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項７】
前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｐａの全長にわたってＰａと重複する配列を有する、請求項６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項８】
Ｐの３’末端の前記ヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドとが異なる、請求項６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項９】
Ｐ、Ｆ、および／または前記ブロッカーポリヌクレオチドが修飾核酸を含む、請求項５、６、または８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１０】
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、プローブポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチドが、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記プローブポリヌクレオチドが、第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ４）に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｔ４が、Ｔ１およびＴ２の５’側に位置し、Ｐａがｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｐ１３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ｐ５３、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、ならびにＡＫＴからなる群から選択される遺伝子座の配列に、特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１１】
前記プローブポリヌクレオチドが、標識とクエンチャーとを含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１２】
Ｐ、Ｆ、および／または前記プローブポリヌクレオチドが、修飾核酸を含む、請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１３】
ブロッカーポリヌクレオチドをさらに含み、前記ブロッカーポリヌクレオチドが、第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｔ３が、Ｔ１およびＴ２の５’側かつＴ４の３’側に存在する、請求項１０、１１、または１２に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１４】
前記ブロッカーが修飾核酸を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１５】
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）と、その５’末端の標識とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、２つのポリヌクレオチド配列、Ｐｃの５’ポリヌクレオチド配列とＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃの５’配列に対して十分に相補的な５’ポリヌクレオチド配列、およびＦｄの３’ポリヌクレオチド配列と前記ユニバーサルクエンチャーが適切な条件下でハイブリダイズするように前記ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドに対して十分に相補的な３’ポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドが、クエンチャーと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとＦｄの３’ポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズできようにＦｄの３’ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的なヌクレオチド配列とを含み、Ｐａがｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｐ１３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ｐ５３、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、ならびにＡＫＴからなる群から選択される遺伝子座の配列に、特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１６】
Ｐ、Ｆ、および／または前記ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドが、修飾核酸を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１７】
逆方向プライマーであって、Ｔ１にハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に対して相補的なポリヌクレオチド配列を含む逆方向プライマーをさらに含む、前述の請求項のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１８】
Ｐが修飾核酸を含む、請求項３、４、９、１２、１４、または１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項１９】
Ｆが修飾核酸をさらに含む、請求項３、４、９、１２、１４、または１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２０】
前記修飾核酸がＰａ中にある、請求項１８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２１】
前記修飾核酸がＦｂ中にある、請求項１９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２２】
Ｐが、Ｐａ中に複数の修飾核酸を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２３】
Ｆが、Ｆｂ中に複数の修飾核酸を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２４】
前記修飾核酸が、Ｐの３’末端のヌクレオチドである、請求項２１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２５】
Ｆｄが、Ｐｃに対して少なくとも７０％相補的である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２６】
Ｐｃが、Ｆｄに対して少なくとも７０％相補的である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２７】
ＰｃとＦｄが鋳型ポリヌクレオチドの不在下で互いにハイブリダイズする、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２８】
Ｐが、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項２９】
Ｆが、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３０】
ＤＮＡポリメラーゼからの伸長をブロックする、Ｆにその３’末端で結合したブロック基をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３１】
前記ブロック基が、３’リン酸基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、および逆位デオキシチミジン（ｄＴ）からなる群から選択される、請求項３０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３２】
Ｐａが、約５塩基長〜約３０塩基長、約５塩基長〜約２０塩基長、約５塩基長〜約１５塩基長、約５塩基長〜約１０塩基長、約５塩基長〜約８塩基長である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３３】
Ｐｃが、約５塩基長〜約２００塩基長、約５塩基長〜約１５０塩基長、約５塩基長〜約１００塩基長、約５塩基長〜約５０塩基長、約５塩基長〜約４５塩基長、約５塩基長〜約４０塩基長、約５塩基長〜約３５塩基長、約５塩基〜３０塩基長、約５塩基長〜約２５塩基長、約５塩基長〜約２０塩基長、約５塩基長〜約１５塩基長、約１０塩基長〜約５０塩基長、約１０塩基長〜約４５塩基長、約１０塩基長〜約４０塩基長、約１０塩基長〜約３５塩基長、約１０塩基長〜約３０塩基長、約１０塩基長〜約２５塩基長、約１０塩基長〜約２０塩基長、または約１０塩基長〜約１５塩基長である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３４】
Ｆｂが、約１０塩基長〜約５０００塩基長、約１０塩基長〜約４０００塩基長、約１０塩基長〜約３０００塩基長、約１０塩基長〜約２０００塩基長、約１０塩基長〜約１０００塩基長、約１０塩基長〜約５００塩基長、約１０塩基長〜約２５０塩基長、約１０塩基長〜約２００塩基長、約１０塩基長〜約１５０塩基長、約１０塩基長〜約１００塩基長、約１０塩基長〜約９５塩基長、約１０塩基長〜約９０塩基長、約１０塩基長〜約８５塩基長、約１０塩基長〜約８０塩基長、約１０塩基長〜約７５塩基長、約１０塩基長〜約７０塩基長、約１０塩基長〜約６５塩基長、約１０塩基長〜約６０塩基長、約１０塩基長〜約５５塩基長、約１０塩基〜５０塩基長、約１０塩基長〜約４５塩基長、約１０塩基長〜約４０塩基長、約１０塩基長〜約３５塩基長、約１０塩基長〜約３０塩基長、または約１０塩基長〜約１００塩基長である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３５】
Ｆｄが、約５塩基長〜約２００塩基長、約５塩基長〜約１５０塩基長、約５塩基長〜約１００塩基長、約５塩基長〜約５０塩基長、約５塩基長〜約４５塩基長、約５塩基長〜約４０塩基長、約５塩基長〜約３５塩基長、約５塩基〜３０塩基長、約５塩基長〜約２５塩基長、約５塩基長〜約２０塩基長、約５塩基長〜約１５塩基長、約１０塩基長〜約５０塩基長、約１０塩基長〜約４５塩基長、約１０塩基長〜約４０塩基長、約１０塩基長〜約３５塩基長、約１０塩基長〜約３０塩基長、約１０塩基長〜約２５塩基長、約１０塩基長〜約２０塩基長、または約１０塩基長〜約１５塩基長である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３６】
Ｐが標識を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３７】
前記標識が、Ｐの５’末端に存在する、請求項３６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３８】
前記標識が消光可能である、請求項３６または３７に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項３９】
Ｆがクエンチャーを含む、請求項３６、３７、または３８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４０】
前記クエンチャーが、Ｆの３’末端に存在する、請求項３９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４１】
前記クエンチャーが、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、およびＤａｂｃｙｌ．Ｇ塩基からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４２】
前記ブロッカーポリヌクレオチド中の前記修飾核酸が、前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドである、請求項９、１４、および１８〜４１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４３】
前記修飾核酸が、Ｐの３’末端のヌクレオチドである、請求項３、４、９、１２、１３、１６、または１７〜４２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４４】
前記修飾核酸が、ロックド核酸である、請求項３、４、９、１２、１４、１６、１８〜２４、４２、または４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４５】
前記プライマーの組み合わせが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ／Ｋからなる群から選択される変異を特異的に認識する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４６】
前記標的ポリヌクレオチドが、宿主中のゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、小型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、遊離循環核酸、および外因性病原体ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４７】
前記ＲＮＡが徴候特異的ＲＮＡである、請求項４６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４８】
前記徴候特異的ＲＮＡが、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＮＯＴＣＨ１、ＴＷＩＳＴ１、マンマグロビン（ＭＧＢ１）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、カリクレイン２／３（ＫＬＫ２／３）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、小型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および病原体特異的ＲＮＡからなる群から選択される、請求項４７に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項４９】
前記ＤＮＡが徴候特異的ＤＮＡである、請求項４６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項５０】
前記徴候特異的ＤＮＡが、種特異的ＤＮＡ、株特異的ＤＮＡ、病原体特異的ＤＮＡ、徴候特異的ＤＮＡメチル化状態、および個人識別特異的ＤＮＡからなる群から選択される、請求項４９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
【請求項５１】
ＰがＴ１に対して完全に相補的な第１のドメインを含み、Ｐａが試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のプライマーの組み合わせを使用して、前記試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記試料中に存在するときに、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、前記試料を前記プライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、
Ｐａから伸長した前記配列を検出するステップと、
を含み、検出が前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、方法。
【請求項５２】
前記方法が、標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較して、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出に変化を与える、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
プライマーの組み合わせを使用して試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記試料中に存在するときに、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、前記試料を前記プライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸長した前記配列を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項５４】
前記方法が、標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較して、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出に変化を与える、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記検出ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記プライマーの組み合わせのＰと逆方向プライマーとを使用し、前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸長した配列に対して相補的な配列を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記Ｐａから伸長した配列に対して相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする前記標的ポリヌクレオチドの鎖に対して相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
検出がリアルタイムで実施される、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
プライマーの組み合わせを使用して試料中の標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を開始させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記試料が、（ｉ）前記Ｐａ中の配列に対して完全に相補的な配列（Ｔ１）を第１の領域に有する、標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全には相補的でない配列（Ｔ１＊）を第１の領域に有する、非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
前記方法が、ＰａがＴ１に接触したときに、Ｐａからの配列であって、前記標的ポリヌクレオチド鎖に対して相補的な配列の伸長を可能にする条件下で、前記試料を前記プライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップを含む、方法。
【請求項６０】
前記標的ポリヌクレオチド中の前記第１の領域の配列（Ｔ１）が、前記非標的ポリヌクレオチド中の前記第１の領域の配列（Ｔ１＊）と１つの塩基で異なる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｐａから伸長した配列を検出する前記ステップをさらに含み、検出が、前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
Ｐが第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない、請求項１〜５０のいずれか１項に記載されるプライマーの組み合わせを使用して、前記試料中の標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を開始させる方法であって、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記試料中に存在するときに、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、前記試料を前記プライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップを含む、方法。
【請求項６３】
前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、前記Ｐａから伸長した配列を検出するステップをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記プライマーの組み合わせのＰと逆方向プライマーとを使用し、前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸長した配列に対して相補的な配列を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記Ｐａから伸長した配列に対して相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする前記標的ポリヌクレオチドの鎖に対して相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
検出がリアルタイムで実施される、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを使用して試料中の標的ポリヌクレオチドを増幅する方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記試料が、（ｉ）前記Ｐａ中の配列に対して完全に相補的な配列を第１の領域（Ｔ１）に有する、標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全には相補的でない１つまたは複数の非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
前記方法が、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記試料中に存在するときに、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、前記試料を前記プライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドのＰａから伸長した前記配列を変性させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で前記Ｐａから伸長した配列中の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下でステップ（ａ）を繰り返して、前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるステップと、を含み、
前記標的ポリヌクレオチドの伸長および増幅は、Ｐａが前記Ｐａ中の配列に対して完全に相補的である場合に生じるが、前記標的ポリヌクレオチド中の前記第１の領域が前記Ｐａ中の配列に対して完全には相補的でない場合には、あまり効率的ではないか、または生じない、方法。
【請求項６９】
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない、請求項１〜５０のいずれか１項に記載されるポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを使用して、前記試料中の標的ポリヌクレオチドを増幅する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記試料中に存在するときに、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、前記試料を前記プライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドのＰａから伸長した前記配列を変性させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で前記Ｐａから伸長した配列中の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下でステップ（ａ）を繰り返して、前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるステップと、を含み、
前記標的ポリヌクレオチドの伸長および増幅は、Ｔ１が前記Ｐａ中の配列に対して完全に相補的である場合に生じるが、前記標的ポリヌクレオチド中の前記第１の領域が前記Ｐａ中の配列に対して完全には相補的でない場合には、あまり効率的ではないか、または生じない、方法。
【請求項７０】
前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸長した配列中の領域に対して完全に相補的な配列を有する、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記逆方向プライマーが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせである、請求項６８または６９に記載の方法であって、
前記第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）は、ステップ（ａ）で前記Ｐａから伸長した配列中の第１の領域（ＴＴ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）は、ステップ（ａ）で前記Ｐａから伸長した配列中の第２の領域（ＴＴ２）に対して相補的な第１のドメイン（ＦＦｂ）と、ＰＰｃとＦＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む、方法。
【請求項７２】
前記逆方向プライマーが、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のプライマーの組み合わせである、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法で増幅された産物を検出するステップをさらに含む、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
検出がポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
検出がリアルタイムで実施される、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的ポリヌクレオチドが変異を含む、請求項５１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記変異が、塩基置換、挿入／欠失（インデル）、増幅、再構成、体細胞変異、生殖細胞系変異、内因性変異、外因性変異、および非コード変異からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的ポリヌクレオチドが、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｐ１３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ｐ５３、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、およびＡＫＴからなる群から選択される変異を遺伝子座に含む、請求項５１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ、およびＧ１２Ａからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＢＲＡＦ変異がＶ６００Ｅ／Ｋである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的ポリヌクレオチドが、宿主中のゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、小型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、遊離循環核酸、および外因性病原体ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項５１〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＲＮＡが徴候特異的ＲＮＡである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記徴候特異的ＲＮＡが、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＮＯＴＣＨ１、ＴＷＩＳＴ１、マンマグロビン（ＭＧＢ１）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、カリクレイン２／３（ＫＬＫ２／３）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、小型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および病原体特異的ＲＮＡからなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＤＮＡが徴候特異的ＤＮＡである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記徴候特異的ＤＮＡが、種特異的ＤＮＡ、株特異的ＤＮＡ、病原体特異的ＤＮＡ、徴候特異的ＤＮＡメチル化状態、および個人識別特異的ＤＮＡからなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記試料が、身体組織、腫瘍試料（新鮮、凍結、または固定のいずれか）、生検試料、リンパ節試料、骨髄試料、全血試料、血清または血漿試料、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）試料、循環タンパク質試料、循環無細胞核酸試料、尿試料、喀痰試料、口腔スワブ、環境スワブ、商品／農産物試料、および唾液試料からなる群から選択される、請求項５１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４４２，７２９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、該出願は、参照により全体が本明細書に援用される。
（技術分野）
【０００２】
本発明は、ポリヌクレオチドの組み合わせおよびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の検出および増幅は、遺伝子解析、分子診断法、および創薬において重要な役割を果たしている。そのような用途の多くは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、遺伝子発現、ポリヌクレオチド全体のうちのわずかな部分に存在するＤＮＡ変異またはＤＮＡメチル化の特異的で高感度かつ安価な定量的検出を必要とする。現在の方法の多くは、臨床試料から非常に少量のＤＮＡまたはＲＮＡを検出および定量化するために、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲ、また具体的にはリアルタイムＰＣＲ（定量的、すなわちｑＰＣＲ）を用いる。
【０００４】
現在のＰＣＲアッセイの性能は絶えず改善されてはいるが、その感度、特異性、およびコストは、広く受け入れられる診断試験となるには未だほど遠い。実際に、当技術分野で現在用いられている多くのＰＣＲ法には技術的な限界があり、そのためこれらの方法は実用的応用の多くに不適切である。例えば、標的分子が、片方または両方のプライマーの標的との結合を阻害または完全に阻止する二次構造を有する場合には、増幅が減少されるかまたは完全に排除されることがあり、それにより、例えば診断的見地からすると、高感度であるはずの結合特性を有する高度に特異的なプライマーを使用しても偽陰性を引き起こす可能性がある。他の課題としては、何千もの非変異ＤＮＡ分子を混合した状況で単一塩基変異を有する希少なＤＮＡ分子を検出および識別する際の現在のリアルタイムＰＣＲアッセイの感度の低さ、また複数の変異検出アッセイを組み合わせて１つの複合診断アッセイにする能力が挙げられる。
【０００５】
したがって、次世代の配列決定プラットフォームを用いた診断用のＰＣＲの新規の用途を含む、当技術分野で認識されている技術的問題を克服する能力を保持する、高い結合特異性と低い合成コストとを同時に実現する増幅プライマーの開発が、当技術分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本開示は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを提供し、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドへのＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する。一態様では、標的ポリヌクレオチドの二次構造は、Ｆの不在下で、標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を阻害する。本開示は、さらに、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせのＰおよび／またはＦが修飾核酸をさらに含む態様も想定している。
【０００７】
本開示は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、Ｐおよび／またはＦが修飾核酸をさらに含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせをさらに提供する。
【０００８】
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせも提供され、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、ブロッカーポリヌクレオチドは、第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｔ３は、Ｔ１およびＴ２の５’側に位置する。プライマーの組み合わせの一態様では、Ｐの３’末端のヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドが重複する。別の態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、Ｐａの全長にわたってＰａと重複する配列を有する。さらに別の態様では、Ｐの３’末端のヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドとは異なる。これらの各態様では、Ｐ、Ｆ、および／またはブロッカーポリヌクレオチドが修飾核酸を含む実施形態が想定されている。
【０００９】
本開示は、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、プローブポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、第１のポリヌクレオチドが、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、プローブポリヌクレオチドが、第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ４）に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｔ４が、Ｔ１およびＴ２の５’側に位置する、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせをさらに提供する。特定の態様では、プローブポリヌクレオチドは、標識およびクエンチャーを含む。他の態様では、Ｐ、Ｆ、および／またはプローブポリヌクレオチドは、修飾核酸を含む。ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせが、ブロッカーポリヌクレオチドをさらに含み、このブロッカーポリヌクレオチドが、第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｔ３が、Ｔ１およびＴ２の５’側かつＴ４の３’側に存在する、実施形態も提供される。一態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、修飾核酸を含む。
【００１０】
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して相補的な第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）と、その５’末端の標識とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、２つのポリヌクレオチド配列、Ｐｃの５’ポリヌクレオチド配列とＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃの５’配列に対して十分に相補的な５’ポリヌクレオチド配列、およびＦｄの３’ポリヌクレオチド配列とユニバーサルクエンチャーが適切な条件下でハイブリダイズするように該ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドに対して十分に相補的な３’ポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドが、クエンチャーと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとＦｄの３’ポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズするように３’ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的なヌクレオチド配列とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせも提供される。１つの態様では、Ｐ、Ｆ、および／またはユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、修飾核酸を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせは逆方向プライマーをさらに含み、逆方向プライマーは、Ｔ１にハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に対して相補的なポリヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本明細書において提供されるプライマーの組み合わせのいずれかの種々の態様において、Ｐは修飾核酸を含む。他の態様では、Ｆが修飾核酸をさらに含み、これらの態様の一部では、修飾核酸はＰａ中に存在し、および／または修飾核酸はＦｂ中に存在する。
【００１２】
本開示のそれぞれのポリヌクレオチドプライマーの組み合わせにおいて、Ｐが複数の修飾核酸をＰａ中に含み、および／またはＦが複数の修飾核酸をＦｂ中に含む態様が提供される。Ｐが修飾核酸を含む場合、修飾核酸がＰの３’末端のヌクレオチドである態様が提供される。
【００１３】
開示されるそれぞれのプライマーの組み合わせでは、ＦｄがＰｃに対して少なくとも７０％相補的であり、ＰｃがＦｄに対して少なくとも７０％相補的であり、ＰｃとＦｄが鋳型ポリヌクレオチドの不在下で互いにハイブリダイズし、ＰがＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはそれらの組み合わせであり、および／またはＦがＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはそれらの組み合わせである態様が提供される。
【００１４】
それぞれのプライマー対の組み合わせでは、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせが、ＤＮＡポリメラーゼからの伸長を遮断する、Ｆにその３’末端で結合したブロック基をさらに含む態様が提供される。本態様では、ブロック基が３’リン酸塩基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、および逆位デオキシチミジン（ｄＴ）からなる群から選択される実施形態が提供される。
【００１５】
それぞれのプライマー対の組み合わせの別の態様では、Ｐａが、約５塩基長〜約３０塩基長、約５塩基長〜約２０塩基長、約５塩基長〜約１５塩基長、約５塩基長〜約１０塩基長、約５塩基長〜約８塩基長である、特定の実施形態が提供される。他の態様では、Ｐｃは、約５塩基長〜約２００塩基長、約５塩基長〜約１５０塩基長、約５塩基長〜約１００塩基長、約５塩基長〜約５０塩基長、約５塩基長〜約４５塩基長、約５塩基長〜約４０塩基長、約５塩基長〜約３５塩基長、約５塩基長〜約３０塩基長、約５塩基長〜約２５塩基長、約５塩基長〜約２０塩基長、約５塩基長〜約１５塩基長、約１０塩基長〜約５０塩基長、約１０塩基長〜約４５塩基長、約１０塩基長〜約４０塩基長、約１０塩基長〜約３５塩基長、約１０塩基長〜約３０塩基長、約１０塩基長〜約２５塩基長、約１０塩基長〜約２０塩基長、または約１０塩基長〜約１５塩基長である。また他の態様では、Ｆｂは、約１０塩基長〜約５０００塩基長、約１０塩基長〜約４０００塩基長、約１０塩基長〜約３０００塩基長、約１０塩基長〜約２０００塩基長、約１０塩基長〜約１０００塩基長、約１０塩基長〜約５００塩基長、約１０塩基長〜約２５０塩基長、約１０塩基長〜約２００塩基長、約１０塩基長〜約１５０塩基長、約１０塩基長〜約１００塩基長、約１０塩基長〜約９５塩基長、約１０塩基長〜約９０塩基長、約１０塩基長〜約８５塩基長、約１０塩基長〜約８０塩基長、約１０塩基長〜約７５塩基長、約１０塩基長〜約７０塩基長、約１０塩基長〜約６５塩基長、約１０塩基長〜約６０塩基長、約１０塩基長〜約５５塩基長、約１０塩基長〜約５０塩基長、約１０塩基長〜約４５塩基長、約１０塩基長〜約４０塩基長、約１０塩基長〜約３５塩基長、約１０塩基長〜約３０塩基長、または約１０塩基長〜約１００塩基長である。また他の態様では、Ｆｄは、約５塩基長〜約２００塩基長、約５塩基長〜約１５０塩基長、約５塩基長〜約１００塩基長、約５塩基長〜約５０塩基長、約５塩基長〜約４５塩基長、約５塩基長〜約４０塩基長、約５塩基長〜約３５塩基長、約５塩基長〜約３０塩基長、約５塩基長〜約２５塩基長、約５塩基長〜約２０塩基長、約５塩基長〜約１５塩基長、約１０塩基長〜約５０塩基長、約１０塩基長〜約４５塩基長、約１０塩基長〜約４０塩基長、約１０塩基長〜約３５塩基長、約１０塩基長〜約３０塩基長、約１０塩基長〜約２５塩基長、約１０塩基長〜約２０塩基長、または約１０塩基長〜約１５塩基長である。
【００１６】
提供されるプライマー対の組み合わせのそれぞれの態様では、実施形態には、Ｐが標識を含むものがある。一部の態様では、標識はＰの５’末端に位置し、および／または標識は消光可能である。これらの実施形態の一部の態様では、Ｆはクエンチャーを含み、および／またはクエンチャーはＦの３’末端に位置する。具体的な実施形態では、クエンチャーは、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、およびＤａｂｃｙｌ．Ｇ塩基からなる群から選択される。
【００１７】
修飾核酸を含む特定のプライマー対の組み合わせでは、ブロッカーポリヌクレオチド中の修飾核酸は、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドであり、修飾核酸は、Ｐの３’末端のヌクレオチドであり、および／または修飾核酸は、ロックド核酸である。
【００１８】
本開示は、プライマーの組み合わせを使用して試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法をさらに提供し、プライマーの組み合わせは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａは、試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない配列を有し、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、この方法は、標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するときに、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、試料をプライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸長した配列を検出するステップとを含む。特定の態様では、方法は、標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較して、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出に変化を与える。
【００１９】
また、ＰがＴ１に対して完全に相補的な第１のドメインを含み、Ｐａが試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない、本明細書において開示されるプライマーの組み合わせを使用して、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法も提供され、この方法は、標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するときに、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、試料をプライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、Ｐａから伸長した配列を検出するステップとを含み、このとき検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。一部の態様では、方法は、標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較して、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出に変化を与える。
【００２０】
これらの方法のそれぞれにおいて、検出ステップがポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される実施形態が提供される。これらの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応が、プライマーの組み合わせのＰと、Ｐａから伸長する配列に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーとを使用する態様、および／またはポリメラーゼ連鎖反応が、Ｐａから伸長する配列に対して相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチド鎖に対して相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する態様が提供される。
【００２１】
これらの方法の別の態様では、検出はリアルタイムで実施される。
【００２２】
本開示は、プライマーの組み合わせを使用して試料の標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を開始させる方法をさらに提供し、プライマーの組み合わせは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａは、試料中の非標的ポリヌクレオチドと完全には相補的でない配列を有し、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、試料は、（ｉ）Ｐａ中の配列に対して完全に相補的な配列（Ｔ１）を第１の領域に有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全には相補的でない配列（Ｔ１＊）を第１の領域に有する、非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、この方法は、ＰａがＴ１と接触したときに、Ｐａからの配列であって、標的ポリヌクレオチド鎖に対して相補的な配列の伸長を可能にする条件下で、試料をプライマーの組み合わせおよびポリメラーゼに接触させるステップを含む。本方法の特定の態様では、標的ポリヌクレオチドの第１の領域（Ｔ１）中の配列は、非標的ポリヌクレオチドの第１の領域（Ｔ１＊）中の配列と、１つの塩基で異なる。他の態様では、方法は、Ｐａから伸長する配列を検出するステップをさらに含み、検出は試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。
【００２３】
また、本開示は、Ｐが第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない、本明細書において開示されるプライマーの組み合わせを使用して、試料中の標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を開始させる方法も提供し、この方法は、標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するときに、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、試料をプライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップを含む。一部の態様では、方法は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸長した配列を検出するステップをさらに含む。種々の実施形態において、検出ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施され、この実施形態の特定の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応は、プライマーの組み合わせのＰと、Ｐａから伸長した配列に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーとを使用し、および／またはポリメラーゼ連鎖反応は、Ｐａから伸長した配列に対して相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチド鎖に対して相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する。方法のそれぞれの実施形態では、検出がリアルタイムで実施される態様が提供されている。
【００２４】
また、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを使用して、試料中の標的ポリヌクレオチドを増幅する方法も提供され、プライマーの組み合わせは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａは、試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない配列を有し、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に対して相補的な第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、試料は、（ｉ）Ｐａ中の配列に対して完全に相補的な配列を第１の領域（Ｔ１）に有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全には相補的でない１つまたは複数の非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、この方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するときに、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、試料をプライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、（ｂ）標的ポリヌクレオチドのＰａから伸長した配列を変性させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）でＰａから伸長した配列中の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下でステップ（ａ）を繰り返して、標的ポリヌクレオチドを増幅させるステップと、を含み、標的ポリヌクレオチドの伸長および増幅は、ＰａがＰａ中の配列に対して完全に相補的である場合に生じるが、標的ポリヌクレオチド中の第１の領域がＰａ中の配列に対して完全には相補的でない場合には、あまり効率的ではないか、または生じない。
【００２５】
また、本開示は、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的な第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが試料中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的でない、本明細書において開示されるポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを使用して、試料中の標的ポリヌクレオチドを増幅する方法も提供し、この方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するときに、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なＰａからの配列の伸長を可能にする条件下で、試料をプライマーの組み合わせおよびポリメラーゼと接触させるステップと、（ｂ）標的ポリヌクレオチドのＰａから伸長した配列を変性させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）でＰａから伸長した配列中の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下でステップ（ａ）を繰り返して、標的ポリヌクレオチドを増幅させるステップと、を含み、標的ポリヌクレオチドの伸長および増幅は、Ｔ１がＰａ中の配列に対して完全に相補的である場合に生じるが、標的ポリヌクレオチド中の第１の領域がＰａ中の配列に対して完全には相補的でない場合には、あまり効率的ではないか、または生じない。この方法の一部の態様では、逆方向プライマーは、Ｐａから伸長した配列中の領域に対して完全に相補的な配列を有する。他の態様では、逆方向プライマーは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせであり、第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）は、ステップ（ａ）でＰａから伸長した配列中の第１の領域（ＴＴ１）に対して完全に相補的な配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）は、ステップ（ａ）でＰａから伸長した配列中の第２の領域（ＴＴ２）に対して相補的な第１のドメイン（ＦＦｂ）と、ＰＰｃとＦＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む。特定の態様では、方法は、本方法で増幅された産物を検出するステップをさらに含み、検出は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施され、および／または検出はリアルタイムで実施される。
【００２６】
本開示のそれぞれの方法では、逆方向プライマーが本明細書において開示されるプライマーの組み合わせである態様が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本明細書で開示される基本ポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド）の構造的関係を示す。
【図２】３つの標的結合ドメインａ、ｇ、およびｂを含む２つの３方向接合部を有するプライマーの組み合わせを示す。
【図３】２つの標的結合ドメインを含む安定な４方向接合部（Ａ）および５方向接合部（Ｂ）を有するポリヌクレオチドの組み合わせを示す。
【図４】ブロッカーポリヌクレオチドを有するプライマーの組み合わせを示す。図４Ａに示すように、ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基と重複し、かつ第１のポリヌクレオチドの３’側塩基とは異なる。ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、標的ポリヌクレオチドに対して相補的ではなく、ポリメラーゼによる第１のポリヌクレオチドの伸長時に置換される。図４Ｂに示すように、ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基と重複し、かつ第１のポリヌクレオチドの３’側塩基とは異なる。ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、非標的ポリヌクレオチドに対して１００％相補的であるが、一方、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基は、非標的ポリヌクレオチドに対して相補的でない。この構造では、ブロッカーポリヌクレオチドは、ポリメラーゼによる第１のポリヌクレオチドの伸長を遮断する。
【図５】プローブポリヌクレオチドを有するプライマーの組み合わせを示す。図５Ａに示すように、プローブポリヌクレオチドは、その５’末端に標識を含み、その３’末端にクエンチャーを含む。図５Ｂは、第１／第２のポリヌクレオチド対と組み合わせたプローブポリヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの構造的関係を示す。
【図６】基本ポリヌクレオチドの組み合わせとユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとの構造的関係を示す。図示するように、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して相補的であり、その３’末端にクエンチャーを含み、一方第１のポリヌクレオチドは、その５’末端に標識を含む。
【図７Ａ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するポリヌクレオチドの組み合わせを示すスキームである。
【図７Ｂ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するポリヌクレオチドの組み合わせを示すスキームである。
【図７Ｃ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するポリヌクレオチドの組み合わせを示すスキームである。
【図７Ｄ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するポリヌクレオチドの組み合わせを示すスキームである。
【図７Ｅ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するポリヌクレオチドの組み合わせを示すスキームである。
【図７Ｆ】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するポリヌクレオチドの組み合わせを示すスキームである。
【図８Ａ】基本ポリヌクレオチドの組み合わせと逆方向プライマーとの構造的関係を示す。図８Ａでは、逆方向プライマーは、単一のポリヌクレオチドである。
【図８Ｂ】基本ポリヌクレオチドの組み合わせと逆方向プライマーとの構造的関係を示す。図８Ｂでは、逆方向プライマーは、第１および第２のポリヌクレオチドの第２の組である。
【図９Ａ】非特異的ＲＮＡリンカーを有する蛍光体−クエンチャーで標識した第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）、および典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。
【図９Ｂ】図９Ａに示す組み合わせのＰＣＲにおける使用を図示している。プライマーＡの逆鎖が生成されるとき、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの切断によって、蛍光体（またはクエンチャー）が放出され、蛍光シグナルが検出される。
【図９Ｃ】部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを有する蛍光体−クエンチャーで標識した第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）、および第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。
【図９Ｄ】図９Ｃで示す組み合わせのＰＣＲにおける使用を図示している。プライマーＡを含むＰＣＲ産物が変性されたとき、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーＡの下流領域にハイブリダイズして、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを切断して蛍光体を放出し、配列特異的蛍光シグナルが検出される。
【図１０】リアルタイムＰＣＲで使用するための３方向または４方向接合部を有するプライマーの組み合わせを示す。３方向接合プライマーでは、プライマーポリヌクレオチド（すなわち、第１のポリヌクレオチド）はその５’末端が蛍光体で標識され、フィクサーポリヌクレオチド（すなわち、第２のポリヌクレオチド）はその３’末端がクエンチャーで標識される。４方向接合プライマーでは、プライマーポリヌクレオチドはその５’末端が蛍光体で標識され、ステープルはその３’末端がクエンチャーで標識される。フィクサーポリヌクレオチドは非標識である。プライマーおよびフィクサーの両ポリヌクレオチドの第２のドメイン領域は固有であるため、ステープルポリヌクレオチドを「ユニバーサル」クエンチャーポリヌクレオチドとして使用できる。
【図１１】（スキーム１１）非共有結合したアンチプライマー（ＡＰ）を有する基本プライマーおよびフィクサーポリヌクレオチドを使用する３つの例を示している。
【図１２】基本プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ０」）および修飾フィクサーポリヌクレオチド構造体（「Ｆ１〜Ｆ４」）を用いて構築されたポリヌクレオチドを示す。ステムループ構造を有する修飾ポリヌクレオチドの組み合わせ（スキーム１２の１〜４）を使用して、鋳型ポリヌクレオチドへの結合時の特異性のレベルを高めることもできる。
【図１３Ａ】修飾プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ１」）および基本フィクサーポリヌクレオチド（「Ｆ」）（スキーム１３）を用いて構築されたポリヌクレオチドの組み合わせを示す。スキーム１３において、修飾プライマーポリヌクレオチドを左に示し、完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（修飾プライマーポリヌクレオチドおよび基本フィクサーポリヌクレオチド）を右に示す。
【図１３Ｂ】修飾プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ１」）および基本フィクサーポリヌクレオチド（「Ｆ」）（スキーム１３）を用いて構築されたポリヌクレオチドの組み合わせを示す。
【図１３Ｃ】修飾プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ１」）および基本フィクサーポリヌクレオチド（「Ｆ」）（スキーム１３）を用いて構築されたポリヌクレオチドの組み合わせを示す。
【図１４】（スキーム１６）本明細書で開示される基本ポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド）を用いて点変異を検出する２つのシナリオを示す。上のシナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインが、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して１００％相補的であり、伸長が発生し、産物を生じる。下のシナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインが、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してミスマッチを含有し、プライマーポリヌクレオチドの短い第１のドメインにおける不安定性により伸長がブロックされる。この不安定性の結果、ＰＣＲが非常に低効率となり、検出可能な産物はわずかに生じるか、または全く生じない。
【図１５】次世代配列決定（ＮＧＳ）を実行するためのポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド）の使用を示す。
【図１６】本明細書で開示される基本ポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド）を用いた、染色色素ＳＹＴＯ  ９の存在下での定量ＰＣＲの結果を示す。
【図１７】蛍光体標識プローブプライマー（すなわち、第１のポリヌクレオチド）とクエンチャー標識フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）を用いた定量ＰＣＲの結果を示す。
【図１８】蛍光体標識プローブプライマー（すなわち、第１のポリヌクレオチド）およびユニバーサルクエンチャーを用いたｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図１９Ａ】第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、およびＳＹＢＲ緑色色素での染色を用いた、混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図１９Ｂ】第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、およびＳＹＢＲ緑色色素での染色を用いた、混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２０】第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、およびＳＹＢＲ緑色色素での染色を用いた、ホルムアルデヒド固定試料中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２１】第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、およびプローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）を用いた、混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２２】第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２３】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２４Ａ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／反応のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（統計的に決定）を含む混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２４Ｂ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／反応のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（統計的に決定）を含む混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２４Ｃ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／反応のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（統計的に決定）を含む混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２４Ｄ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／反応のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（統計的に決定）を含む混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２４Ｅ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡのコピーを有さない混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。９４％の野生型ＤＮＡ試料（１６試料中１５試料）がシグナルを示さず、改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｑＰＣＲ変異アッセイによる単一変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆した。
【図２４Ｆ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡのコピーを有さない混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。９４％の野生型ＤＮＡ試料（１６試料中１５試料）がシグナルを示さず、改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｑＰＣＲ変異アッセイによる単一変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆した。
【図２４Ｇ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡのコピーを有さない混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。９４％の野生型ＤＮＡ試料（１６試料中１５試料）がシグナルを示さず、改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｑＰＣＲ変異アッセイによる単一変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆した。
【図２４Ｈ】３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡのコピーを有さない混合物中の変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。９４％の野生型ＤＮＡ試料（１６試料中１５試料）がシグナルを示さず、改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｑＰＣＲ変異アッセイによる単一変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、とりわけ標的ポリヌクレオチドに対する増幅プライマーのハイブリダイゼーションにおいて直面する問題を克服する、不連続的ポリヌクレオチド設計の発見に基づく。これらの問題には、限定するものではないが、標的ポリヌクレオチド中の困難な二次構造の克服と、標的ポリヌクレオチド中の単一塩基変化に対する低い特異性とが挙げられる。
【００２９】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの組み合わせは、効果的に増幅することが困難なポリヌクレオチド鋳型を使用するときに、標準ＰＣＲプライマーと長いＰＣＲプライマーの双方に優る利点を提供する。例えばこのような鋳型としては、例えば、相補配列に対するハイブリダイゼーションの妨害、効率低下の引き起こし、または阻害につながるループ、ヘアピンなどを生じさせる内部自己ハイブリダイゼーションによって形成されるある程度の二次構造を含有するものが挙げられる。鋳型の二次構造は、内部ハイブリダイゼーションを不安定化することができず、したがってプライマー相補体にハイブリダイズできない標準的ＰＣＲプライマーによるプライミングを阻止する可能性がある。本発明のポリヌクレオチドの組み合わせを用いることで、鋳型の二次構造が脱ハイブリダイズ（または融解）されて、適切な条件下で相補的鋳型領域とのハイブリダイゼーションが生じる。本明細書で使用する際、「標準ＰＣＲプライマー」の長さは、約１０〜約１００塩基であり得る。
【００３０】
長いＰＣＲプライマーは、標的ポリヌクレオチドの二次構造を分解することができるが、プライマーの３’（プライミング）末端近傍に特異性または感度のいずれかを同時に提供することはできない。これは、長いＰＣＲプライマーの場合、大きな部分が標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、プライマーの３’末端近傍の標的ポリヌクレオチドに対するミスマッチが、プライミング効率を低下させるのに十分ではないためである。結果として、ミスマッチ（１つまたは複数）があるにもかかわらず、ＰＣＲ産物が合成されることになる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせは、他の利点も提供する。例えば、短いＰＣＲプライマーは単独で、標的ポリヌクレオチドに対する正確な配列のハイブリダイゼーションに有用であるが、ＰＣＲにとって望ましい高い特異性の標的ポリヌクレオチドに対するプライマー結合を達成するためには、可能な限り高いアニーリング温度が通常は選択される。このアニーリング温度は、所定のプライマーの融解温度に基づいて選択されて、短いプライマーの場合、そのアニーリング温度は比較的低くなる。しかしながら、低いアニーリング温度は、標的ポリヌクレオチドに対する短いプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを許容するという不利点を有し、その結果、非特異的なＰＣＲ産物の形成をもたらす。短いＰＣＲプライマーがその標的ポリヌクレオチドにアニーリングできるようにするために使用しなければならない比較的低いアニーリング温度に基づいて、短いプライマーは標的ポリヌクレオチドと二重鎖を形成するが、これは標的ポリヌクレオチド領域に対して１００％相補的である場合でも通常は不安定である。さらに、プライマーが１００％を下回って相補的である（すなわち、プライマーと標的ポリヌクレオチドとの間に少なくとも１つのミスマッチがある）場合は、これらの二重鎖はよりいっそう不安定である。本発明のポリヌクレオチドの組み合わせは、短いＰＣＲプライマーの使用に関連する不安定性の問題克服に役立ち、所望の標的への高度に特異的な結合を可能にする。例えば、本開示の組み合わせは、わずかに単一塩基が異なる標的配列を区別することが可能である。
【００３２】
例えば、不連続的ポリヌクレオチドの組み合わせ設計（図１を参照）は、鋳型ポリヌクレオチドに対するフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）の第１のドメイン［Ｆａ］のハイブリダイゼーション、およびフィクサーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｆｄ］に対するプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）の第２のドメイン［Ｐｃ］のハイブリダイゼーションによって、短いＰＣＲプライマー領域［Ｐａ］の使用を可能にし、それによって明白に「より長い」プライマー配列の有効な結果が得られる。このより長くかつ不連続なハイブリダイゼーションは、プライマーポリヌクレオチドの第１の領域［Ｐａ］間の結合を、これが８塩基程度の小さい領域であったとしても、事実上安定化させて、それによってＰＣＲの効率を向上させる。
【００３３】
別の実施形態では、プライマーポリヌクレオチドおよびフィクサーポリヌクレオチドの第１のドメインに対して相補的な鋳型ポリヌクレオチドの領域は、直接隣接する必要はない。本発明は、相補領域が最大１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離され（すなわち不連続的）、鋳型ポリヌクレオチドへのフィクサーハイブリダイゼーション時に、介在配列をループアウトして増幅すべき標的鋳型領域をプライマーポリヌクレオチドに近付ける実施形態を想定している。本態様では、次いで、プライマーの組み合わせが、場合によってループアウト構造の内部自己ハイブリダイゼーションを伴って、または伴わずに、鋳型ポリヌクレオチド中の二次構造を実際に誘導する。
Ｉ．  ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ
【００３４】
一実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドの組み合わせが提供され、第１のポリヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的な第１のドメイン［Ｐａ］と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン［Ｐｃ］とを含み、第２のポリヌクレオチドは、第２の標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的な第１のドメイン［Ｆｂ］と、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインが適切な条件下でハイブリダイズするように第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン［Ｆｄ］とを含む。基本ポリヌクレオチドの組み合わせの構造的関係を図１に示す。
Ａ．  ３方向接合
【００３５】
３方向接合ポリヌクレオチドの組み合わせでは、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドとが、第１のポリヌクレオチドの第２のドメイン（スキーム１中のＰｃ）と第２のポリヌクレオチドの第２のドメイン（スキーム１中のＦｄ）との相互作用によって結合し、プライマーオリゴヌクレオチドの第１のドメイン（図１中のＰａ）およびフィクサーポリヌクレオチドの第１のドメイン（図１中のＦｂ）は、図２（スキーム２Ａ）に示すように、標的ポリヌクレオチド中のそれぞれの相補領域にハイブリダイズする。
Ｂ．  ３方向を超える接合
【００３６】
本発明は、プライマーの組み合わせが２つの３方向接合部を含む代替的実施形態も想定している（図２、スキーム２Ｂを参照）。これらの実施形態の一部では、ドメイン「ｅ」がドメイン［Ｐｃ］に対して相補的であり、ドメイン「ｆ」がドメイン［Ｆｄ］に対して相補的であり、ならびにドメイン「ｇ」が第３の標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である。
【００３７】
本発明は、さらに、４方向接合部を含むポリヌクレオチドの組み合わせも想定している。４方向接合ポリヌクレオチドの組み合わせでは、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドが、「ステープル」ポリヌクレオチドを介して結合している（スキーム３Ａ、下）。ステープルポリヌクレオチドは、プライマーポリヌクレオチドおよびフィクサーポリヌクレオチドの双方の第２のドメインとハイブリダイすることが可能である。ステープルポリヌクレオチドの構造は、適切な条件下でそれらの領域がハイブリダイズするようにプライマーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｐｃ］に対して十分に相補的な第１のドメイン［ｅ］と、適切な条件下でそれらの領域がハイブリダイズするようにフィクサーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｆｄ］に対して十分に相補的な第２のドメイン［ｆ］とを含む。本実施形態の一部の態様では、典型的な条件下でＰｃドメインとＦｄドメインとの間のハイブリダイゼーションを可能にするようにプライマーポリヌクレオチドの第２のドメインＰｃがフィクサーポリヌクレオチドの第２のドメインＦｄに対して十分に相補的である必要はない。本態様では、ステープル中の第１のドメイン［ｅ］が、プライマーポリヌクレオチドの第２のドメインＰｃに対して十分に相補的であり、ステープルの第２のドメイン［ｆ］がフィクサードメインの第２のドメイン［Ｆｄ］に対して十分に相補的であることで、図３（スキーム３Ａ）に示す安定な４方向接合部の形成が可能となる。
【００３８】
本明細書に記載するように、ポリヌクレオチドの組み合わせ中の付加的な「ステープル」ポリヌクレオチドも想定されており、それによってポリヌクレオチドの組み合わせ中のステープルポリヌクレオチドの数に応じて、多方向接合部を生成する。スキーム３Ｂは、５方向接合部を示しているが、当業者は、５方向を超える接合部をどのように構築するかを容易に理解するであろう。
【００３９】
さらに、「ステープル」ポリヌクレオチドは、本明細書に記載するような修飾ヌクレオチドを含んでもよい。さらなる態様では、「ステープル」ポリヌクレオチドは、標識および／またはクエンチャーを含んでもよい。これらの態様では、標識またはクエンチャーは、「ステープル」ポリヌクレオチドの５’末端は３’末端のいずれかにあってよい。
Ｃ．  ブロッカーポリヌクレオチドを含むプライマーの組み合わせ
【００４０】
本発明は、ブロッカーポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの組み合わせとともに含まれる実施形態も想定している。ブロッカーポリヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチド領域のすぐ５’側に位置する標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的な配列を有する。これは図４に図示される。一部の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと重複する。言い換えると、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）およびブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）は、標的ポリヌクレオチドの同一のヌクレオチド（１つまたは複数）に対して相補的となる。種々の実施形態において、第１のポリヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの重複は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０クレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、または１５ヌクレオチドである。関連する実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）とブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）とは異なる。これらの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）は、それらが適切な位置の標的ポリヌクレオチドに対して相補的である場合に、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることになり、したがって適切な条件下で、第１のポリヌクレオチドの伸長を可能にする（図４Ａを参照）。関連する実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）は、それらが適切な位置の非標的ポリヌクレオチドに対して相補的である場合に、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることになり、それによって第１のポリヌクレオチドの伸長を遮断する（図４Ｂを参照）。種々の実施形態において、ブロッカーポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように修飾されている。
【００４１】
一部の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドと第１のポリヌクレオチド（Ｐａ）の第１のドメインとの重複する配列は、少なくとも２塩基、少なくとも３塩基、少なくとも４塩基、少なくとも５塩基、少なくとも６塩基、少なくとも７塩基、少なくとも８塩基、少なくとも９塩基、または少なくとも１０塩基異なる。この異なる塩基は、重複部分のいかなる位置にあってもよい。
Ｄ．  プローブポリヌクレオチドを含むプライマーの組み合わせ
【００４２】
本発明は、上記のポリヌクレオチドの組み合わせとともにプローブポリヌクレオチドが含まれる実施形態も想定されている。プローブポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチド領域の５’側に位置する標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的な配列を有する（図５Ａを参照）。他の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの伸長産物に対して相補的な配列を有する（図５Ｂを参照）。明らかなように、このプローブポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対して相補的となる。ブロッカーポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドとともにプライマーの組み合わせに含まれる実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、ブロッカーポリヌクレオチドに対して相補的な標的ポリヌクレオチド領域の５’側に位置する標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である。種々の実施形態において、プローブポリヌクレオチドは、その５’末端に標識を含む。関連する実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、その３’末端にクエンチャーをさらに含む。またさらなる実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、限定するものではないが、例えばＺｅｎクエンチャーなどの内部クエンチャーをさらに含む。
Ｅ．  ユニバーサルクエンチャーを含むプライマーの組み合わせ
【００４３】
種々の実施形態において、プライマーポリヌクレオチドの組み合わせは、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドを含む。ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、それが第２のポリヌクレオチドの第２のドメインにハイブリダイズするように、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して相補的である。これらの実施形態では、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインがハイブリダイズする領域の３’側に位置する第２のポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズする（図６を参照）。ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、その３’末端がクエンチャーで標識されている。
Ｆ．  逆方向プライマーを含むプライマーの組み合わせ
【００４４】
本発明は、逆方向プライマーポリヌクレオチドが、上記のポリヌクレオチドの組み合わせとともに含まれる実施形態も想定している。逆方向プライマーは、第１のポリヌクレオチドの伸長によって作成されるポリヌクレオチド中の領域に対して相補的である（図８Ａを参照）。明らかなように、一部の実施形態では、逆方向プライマーは、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖である場合、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対しても相補的である。一部の実施形態では、逆方向プライマーは、上述のような第１のポリヌクレオチド／第２のポリヌクレオチドの組み合わせである（図８Ｂを参照）。
ＩＩ．  ポリヌクレオチド
【００４５】
本明細書で使用する際、ブロッカーポリヌクレオチドおよびプローブを含むポリヌクレオチド対の組み合わせの要素として、または標的分子としての「ポリヌクレオチド」という用語は、「オリゴヌクレオチド」という用語と互換的に使用される。
【００４６】
本明細書で使用する「ヌクレオチド」という用語、またはその複数形は、本明細書で説明するような、あるいは当分野で既知のような修飾形態と互換的である。場合によっては、当分野は、天然に存在するヌクレオチドの他に重合可能なヌクレオチドの修飾形態も含む「ヌクレオ塩基」という用語を使用する。
【００４７】
既定の配列を有するポリヌクレオチドの作製方法は、当分野で周知である。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの双方に好適である（ＤＮＡを合成する周知の方法は、ＲＮＡを合成するためにも有用である）。オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。
【００４８】
種々の態様では、提供される方法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはこれらの２種の組み合わせであるポリヌクレオチドの使用を含む。また、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合を有するものを含むオリゴヌクレオチドの修飾形態も想定されている。修飾ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、本明細書において下記に詳細に記載する。
ＩＩＩ．  修飾ポリヌクレオチド
【００４９】
オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、修飾骨格を含有するオリゴヌクレオチド、または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格中にリン原子を保有するオリゴヌクレオチド、および骨格中にリン原子を有さないオリゴヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味に含まれると考えられる。具体的な実施形態では、第１のポリヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含む。
【００５０】
リン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびにボラノホスフェートであって、通常の３’−５’結合、それらの２’−５’結合類似体、また１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’結合、５’−５’結合、または２’−２’結合である、逆の極性を有するものを含む。また、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち、脱塩基性（ヌクレオチドが欠けているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）であってもよい単一の逆ヌクレオシド残基を含む、逆の極性を有するオリゴヌクレオチドも想定されている。塩、混合塩、および遊離酸の形態も想定される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、および第５，６２５，０５０号があり、これらの開示内容は参照により本明細書に援用される。
【００５１】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分部分を有する他の骨格が挙げられる。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号、および第５，６７７，４３９号（これらの開示内容は、参照により全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【００５２】
また他の実施形態では、オリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の１つまたは複数の糖および／または１つまたは複数のヌクレオチド間結合の双方が「非天然」基で置換されている。一態様では、本実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を想定している。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格で置換されている。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００５３】
また他の実施形態では、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格を備え、およびオリゴヌクレオシドはヘテロ原子骨格を備え、これには米国特許第５，４８９，６７７号および第５，６０２，２４０号に記載される、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−が含まれる。また、米国特許第５，０３４，５０６号に記載のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも想定される。
【００５４】
種々の形態において、オリゴ中の２つの連続するモノマー間の結合は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される２〜４個、望ましくは３個の基／原子からなり、式中、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。そのような結合の実例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続モノマーとの結合として使用される場合、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続モノマーとの結合として使用される場合、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続モノマーとの結合として使用される場合、Ｒ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ  Ｈ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）２−Ｏ−があり、その中でも、ＲＨが水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”がＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ  Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−が想定されている。さらなる実例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  ２５：ｐｐ４４２９−４４４３に示される。
【００５５】
また他のオリゴヌクレオチドの修飾形態は、その開示内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されている。
【００５６】
また、修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖部分を含んでもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを２’位に含み、このときアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。他の実施形態には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２があり、式中ｎおよびｍは１〜約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の基のうちの１つを２’位に含む。一態様では、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基がある。他の修飾としては、本明細書の以下の実施例に記載に記載される、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、別名２’−ＤＭＡＯＥ、および本明細書の以下の実施例にも記載される、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当分野において、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【００５７】
また他の修飾として、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−修飾は、アラビノ（上）位であっても、リボ（下）位であってもよい。一態様では、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に行ってもよい。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号（これらの開示内容全体は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００５８】
種々の態様では、糖の修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合され、それによって二環式糖部分が形成される、ロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。特定の態様における結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基（式中、ｎは、１または２である）である。ＬＮＡおよびその調製は、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号に記載されており、これらの開示内容全体は、参照により本明細書に援用される。種々の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、１つのロックド核酸を含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドが、複数のロックド核酸を含む。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが、複数のロックド核酸を含む。より具体的な実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドが、ロックド核酸を含む。種々の実施形態において、ブロッカーポリヌクレオチドは、１つのロックド核酸を含む。他の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドが、複数のロックド核酸を含む。具体的な実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドが、ロックド核酸を含む。
【００５９】
また、ポリヌクレオチドは塩基修飾または塩基置換を含んでもよい。本明細書で使用する際、「非修飾」または「天然」塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基としては、他の合成塩基および天然塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾塩基は、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環で置換された修飾塩基、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンなどの修飾塩基を含んでもよい。さらなる塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９���３に開示されているものがある。これらの塩基の一部は、結合親和性を増加させるために有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含み、これらには２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており、特定の態様では、これは２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号、および第５，６８１，９４１号（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００６０】
「修飾塩基」または他の同様の用語は、天然塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／またはチミン）と対合できる、および／または非天然塩基と対合できる組成物を指す。一部の態様では、修飾塩基は、１５℃、１２℃、１０℃、８℃、６℃、４℃、または２℃、あるいはそれ未満のＴｍ差をもたらす。例示的修飾塩基は、欧州特許第１  ０７２  ６７９号および国際公開第９７／１２８９６号に記載されている。
【００６１】
「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびに天然に存在しない核酸塩基、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、疑似イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号、およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載されている「天然に存在しない」核酸塩基を意味する。したがって、「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、その複素環式類似体および互変異性体も含む。さらなる天然に存在する核酸塩基および天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｂｙ  Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に、第６２２〜第６２３ページを参照）およびＣｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１，６，５８５−６０７に開示されているものがあり、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」という用語は、さらに、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基としての機能を果たす特定の「ユニバーサル塩基」を含む、核酸塩基のような機能を果たし得る複素環式化合物などの化合物を包含することも意図している。特にユニバーサル塩基として挙げられるものは、３−ニトロピロール、場合により置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および場合により置換されたヒポキサンチンである。他の望ましいユニバーサル塩基としては、当分野で既知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を包含する。
ＩＶ．  ポリヌクレオチド構造−長さ
【００６２】
一態様では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインは、標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的な５個のヌクレオチドである。種々の態様では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインは、標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的な少なくとも６個のヌクレオチド、少なくとも７個のヌクレオチド、少なくとも８個のヌクレオチド、少なくとも９個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１１個のヌクレオチド、少なくとも１２個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチド、少なくとも１４個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも１６個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも２１個のヌクレオチド、少なくとも２２個のヌクレオチド、少なくとも２３個のヌクレオチド、少なくとも２４個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチド、少なくとも２６個のヌクレオチド、少なくとも２７個のヌクレオチド、少なくとも２８個のヌクレオチド、少なくとも２９個のヌクレオチド、少なくとも３０個のヌクレオチド、またはそれ以上である。関連する態様では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的であって、適切な条件下でのこれらの２つの相補配列間のハイブリダイゼーションを可能にする固有のＤＮＡ配列に、１０個以上のヌクレオチドを含む。種々の態様において、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、適切な条件下でのこれらの２つの相補配列間のハイブリダイゼーションを可能にするように、十分に相補的な固有のＤＮＡ配列の少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２２０個、少なくとも約２４０個、少なくとも約２６０個、少なくとも約２８０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３２０個、少なくとも約３４０個、少なくとも約３６０個、少なくとも約３８０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４２０個、少なくとも約４４０個、少なくとも約４６０個、少なくとも約４８０個、少なくとも約５００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。
【００６３】
別の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、約１０個のヌクレオチドを含む第１のドメインを含み、この第２のポリヌクレオチドの第１のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインによって認識される標的領域とは異なる標的ＤＮＡ領域に対して相補的である。種々の態様において、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４５０個、少なくとも約５００個、少なくとも約５５０個、少なくとも約６００個、少なくとも約６５０個、少なくとも約７００個、少なくとも約７５０個、少なくとも約８００個、少なくとも約８５０個、少なくとも約９００個、少なくとも約９５０個、少なくとも約１０００個、少なくとも約１１００個、少なくとも約１２００個、少なくとも約１３００個、少なくとも約１４００個、少なくとも約１５００個、少なくとも約１６００個、少なくとも約１７００個、少なくとも約１８００個、少なくとも約１９００個、少なくとも約２０００個、少なくとも約２１００個、少なくとも約２２００個、少なくとも約２３００個、少なくとも約２４００個、少なくとも約２５００個、少なくとも約２６００個、少なくとも約２７００個、少なくとも約２８００個、少なくとも約２９００個、少なくとも約３０００個、少なくとも約３１００個、少なくとも約３２００個、少なくとも約３３００個、少なくとも約３４００個、少なくとも約３５００個、少なくとも約３６００個、少なくとも約３７００個、少なくとも約３８００個、少なくとも約３９００個、少なくとも約４０００個、少なくとも約４１００個、少なくとも約４２００個、少なくとも約４３００個、少なくとも約４４００個、少なくとも約４５００個、少なくとも約４６００個、少なくとも約４７００個、少なくとも約４８００個、少なくとも約４９００個、少なくとも約５０００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む第１のドメインを含み、この第２のポリヌクレオチドの第１のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインによって認識される標的領域とは異なる標的ＤＮＡ領域を認識してそれに対して結合するように、相補的または十分に相補的である。
【００６４】
関連する態様では、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、適切な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするように、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的な固有のＤＮＡ配列の１０個のヌクレオチドを含む。種々の態様において、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、適切な条件下でのこれらの２つの十分に相補的な配列間のハイブリダイゼーションを可能にするように、十分に相補的である固有のＤＮＡ配列の少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２２０個、少なくとも約２４０個、少なくとも約２６０個、少なくとも約２８０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３２０個、少なくとも約３４０個、少なくとも約３６０個、少なくとも約３８０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４２０個、少なくとも約４４０個、少なくとも約４６０個、少なくとも約４８０個、少なくとも約５００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、第１および第２のポリヌクレオチドについて上述した特徴を備える第２のポリヌクレオチドの組を含む。一部の実施形態では、複数の組が想定されている。これらの付加的な第１および第２のポリヌクレオチドの組は、第１および第２のポリヌクレオチドについて記載した特徴のいずれを有し得る。
【００６６】
図３（スキーム３Ａおよび３Ｂ）に示す「ステープル」ポリヌクレオチドは、一態様では、少なくとも２０個のヌクレオチドを含むことが想定されている。他の態様では、「ステープル」ポリヌクレオチドは、少なくとも２１個のヌクレオチド、または少なくとも２２個のヌクレオチド、または少なくとも２３個のヌクレオチド、または少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも２６個のヌクレオチド、または少なくとも２７個のヌクレオチド、または少なくとも２８個のヌクレオチド、または少なくとも２９個のヌクレオチド、または少なくとも３０個のヌクレオチド、または少なくとも約３５個のヌクレオチド、または少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約４５個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチド、または少なくとも約５５個のヌクレオチド、または少なくとも約６０個のヌクレオチド、または少なくとも約６５個のヌクレオチド、または少なくとも約７０個のヌクレオチド、または少なくとも約７５個のヌクレオチド、または少なくとも約８０個のヌクレオチド、または少なくとも約８５個のヌクレオチド、または少なくとも約９０個のヌクレオチド、または少なくとも約９５個のヌクレオチド、または少なくとも約１００個のヌクレオチド、または少なくとも約１５０個のヌクレオチド、または少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約２５０個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチド、または少なくとも約３５０個のヌクレオチド、または少なくとも約４００個のヌクレオチド、または少なくとも約４５０個のヌクレオチド、または少なくとも５００個のヌクレオチド、あるいはそれ以上を含み得る。
【００６７】
一部の実施形態では、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長〜約１００塩基長である。種々の態様において、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、適切な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするように、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的である固有のＤＮＡ配列の少なくとも５個のヌクレオチド、または少なくとも６個のヌクレオチド、または少なくとも７個のヌクレオチド、または少なくとも８個のヌクレオチド、または少なくとも９個のヌクレオチド、または少なくとも１０個のヌクレオチド、または少なくとも１１個のヌクレオチド、または少なくとも１２個のヌクレオチド、または少なくとも１３個のヌクレオチド、または少なくとも１４個のヌクレオチド、または少なくとも１５個のヌクレオチド、または少なくとも１６個のヌクレオチド、または少なくとも１７個のヌクレオチド、または少なくとも１８個のヌクレオチド、または少なくとも１９個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチド、または少なくとも２１個のヌクレオチド、または少なくとも２２個のヌクレオチド、または少なくとも２３個のヌクレオチド、または少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも２６個のヌクレオチド、または少なくとも２７個のヌクレオチド、または少なくとも２８個のヌクレオチド、または少なくとも２９個のヌクレオチド、または少なくとも３０個のヌクレオチド、または少なくとも約３５個のヌクレオチド、または少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約４５個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチド、または少なくとも約５５個のヌクレオチド、または少なくとも約６０個のヌクレオチド、または少なくとも約６５個のヌクレオチド、または少なくとも約７０個のヌクレオチド、または少なくとも約７５個のヌクレオチド、または少なくとも約８０個のヌクレオチド、または少なくとも約８５個のヌクレオチド、または少なくとも約９０個のヌクレオチド、または少なくとも約９５個のヌクレオチド、または少なくとも約１００個のヌクレオチドを含む。
【００６８】
一部の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長〜約１００塩基長である。種々の態様において、プローブポリヌクレオチドは、適切な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするように、標的ポリヌクレオチド領域に対して十分に相補的であるＤＮＡ配列の少なくとも５個のヌクレオチド、または少なくとも６個のヌクレオチド、または少なくとも７個のヌクレオチド、または少なくとも８個のヌクレオチド、または少なくとも９個のヌクレオチド、または少なくとも１０個のヌクレオチド、または少なくとも１１個のヌクレオチド、または少なくとも１２個のヌクレオチド、または少なくとも１３個のヌクレオチド、または少なくとも１４個のヌクレオチド、または少なくとも１５個のヌクレオチド、または少なくとも１６個のヌクレオチド、または少なくとも１７個のヌクレオチド、または少なくとも１８個のヌクレオチド、または少なくとも１９個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチド、または少なくとも２１個のヌクレオチド、または少なくとも２２個のヌクレオチド、または少なくとも２３個のヌクレオチド、または少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも２６個のヌクレオチド、または少なくとも２７個のヌクレオチド、または少なくとも２８個のヌクレオチド、または少なくとも２９個のヌクレオチド、または少なくとも３０個のヌクレオチド、または少なくとも３１個のヌクレオチド、または少なくとも３２個のヌクレオチド、または少なくとも３３個のヌクレオチド、または少なくとも３４個のヌクレオチド、または少なくとも３５個のヌクレオチド、または少なくとも３６個のヌクレオチド、または少なくとも３７個のヌクレオチド、または少なくとも３８個のヌクレオチド、または少なくとも３９個のヌクレオチド、または少なくとも４０個のヌクレオチド、または少なくとも約４５個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチド、または少なくとも約５５個のヌクレオチド、または少なくとも約６０個のヌクレオチド、または少なくとも約６５個のヌクレオチド、または少なくとも約７０個のヌクレオチド、または少なくとも約７５個のヌクレオチド、または少なくとも約８０個のヌクレオチド、または少なくとも約８５個のヌクレオチド、または少なくとも約９０個のヌクレオチド、または少なくとも約９５個のヌクレオチド、または少なくとも約１００個のヌクレオチドを含む。
【００６９】
一部の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長〜約１００塩基長である。種々の態様において、ブロッカーポリヌクレオチドは、適切な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするように、標的ポリヌクレオチド領域に対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列の少なくとも５個のヌクレオチド、または少なくとも６個のヌクレオチド、または少なくとも７個のヌクレオチド、または少なくとも８個のヌクレオチド、または少なくとも９個のヌクレオチド、または少なくとも１０個のヌクレオチド、または少なくとも１１個のヌクレオチド、または少なくとも１２個のヌクレオチド、または少なくとも１３個のヌクレオチド、または少なくとも１４個のヌクレオチド、または少なくとも１５個のヌクレオチド、または少なくとも１６個のヌクレオチド、または少なくとも１７個のヌクレオチド、または少なくとも１８個のヌクレオチド、または少なくとも１９個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチド、または少なくとも２１個のヌクレオチド、または少なくとも２２個のヌクレオチド、または少なくとも２３個のヌクレオチド、または少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも２６個のヌクレオチド、または少なくとも２７個のヌクレオチド、または少なくとも２８個のヌクレオチド、または少なくとも２９個のヌクレオチド、または少なくとも３０個のヌクレオチド、または少なくとも３１個のヌクレオチド、または少なくとも３２個のヌクレオチド、または少なくとも３３個のヌクレオチド、または少なくとも３４個のヌクレオチド、または少なくとも３５個のヌクレオチド、または少なくとも３６個のヌクレオチド、または少なくとも３７個のヌクレオチド、または少なくとも３８個のヌクレオチド、または少なくとも３９個のヌクレオチド、または少なくとも４０個のヌクレオチド、または少なくとも約４５個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチド、または少なくとも約５５個のヌクレオチド、または少なくとも約６０個のヌクレオチド、または少なくとも約６５個のヌクレオチド、または少なくとも約７０個のヌクレオチド、または少なくとも約７５個のヌクレオチド、または少なくとも約８０個のヌクレオチド、または少なくとも約８５個のヌクレオチド、または少なくとも約９０個のヌクレオチド、または少なくとも約９５個のヌクレオチド、または少なくとも約１００個のヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、ブロッカーポリヌクレオチドは、その５’末端のヌクレオチドとして修飾核酸をさらに含む。種々の実施形態において、修飾核酸はロックド核酸である。一部の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸長を阻止するために、ブロック基を３’末端にさらに含む。
【００７０】
一部の実施形態では、逆方向プライマーポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長〜約１００塩基長である。種々の態様において、逆方向プライマーポリヌクレオチドは、適切な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするように、ポリメラーゼ伸長された第１のポリヌクレオチドの領域に対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列の少なくとも５個のヌクレオチド、または少なくとも６個のヌクレオチド、または少なくとも７個のヌクレオチド、または少なくとも８個のヌクレオチド、または少なくとも９個のヌクレオチド、または少なくとも１０個のヌクレオチド、または少なくとも１１個のヌクレオチド、または少なくとも１２個のヌクレオチド、または少なくとも１３個のヌクレオチド、または少なくとも１４個のヌクレオチド、または少なくとも１５個のヌクレオチド、または少なくとも１６個のヌクレオチド、または少なくとも１７個のヌクレオチド、または少なくとも１８個のヌクレオチド、または少なくとも１９個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチド、または少なくとも２１個のヌクレオチド、または少なくとも２２個のヌクレオチド、または少なくとも２３個のヌクレオチド、または少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも２６個のヌクレオチド、または少なくとも２７個のヌクレオチド、または少なくとも２８個のヌクレオチド、または少なくとも２９個のヌクレオチド、または少なくとも３０個のヌクレオチド、または少なくとも３１個のヌクレオチド、または少なくとも３２個のヌクレオチド、または少なくとも３３個のヌクレオチド、または少なくとも３４個のヌクレオチド、または少なくとも３５個のヌクレオチド、または少なくとも３６個のヌクレオチド、または少なくとも３７個のヌクレオチド、または少なくとも３８個のヌクレオチド、または少なくとも３９個のヌクレオチド、または少なくとも４０個のヌクレオチド、または少なくとも約４５個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチド、または少なくとも約５５個のヌクレオチド、または少なくとも約６０個のヌクレオチド、または少なくとも約６５個のヌクレオチド、または少なくとも約７０個のヌクレオチド、または少なくとも約７５個のヌクレオチド、または少なくとも約８０個のヌクレオチド、または少なくとも約８５個のヌクレオチド、または少なくとも約９０個のヌクレオチド、または少なくとも約９５個のヌクレオチド、または少なくとも約１００個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドである場合、逆方向プライマーは、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対して相補的である。一部の実施形態では、逆方向プライマーは、本明細書で定義した第１および第２のポリヌクレオチドの組み合わせである。
Ｖ．  ポリヌクレオチド塩基構造
【００７１】
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらの組み合わせからなる。他の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらの組み合わせからなる。
ＶＩ．  ポリヌクレオチド構造−ブロック基
【００７２】
ポリヌクレオチドの３’領域からのポリメラーゼ伸長が望ましくない場合、ブロック基が必要に応じて組み込まれる。例えば、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、別の態様では、核酸を合成することができる酵素による伸長を阻止するために、第２のドメインの３’末端にブロック基（図１中の「Ｒ」）をさらに含む。付加的な態様では、ユニバーサルクエンチャーが、その３’末端にブロック基を含む。さらなる態様では、ブロッカーポリヌクレオチドが、その３’末端にブロック基を含む。方法の実施において有用なブロック基には、３’リン酸基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、炭素６個のグリコールスペーサー（また一態様では、この炭素６個のグリコールスペーサーは、ヘキサンジオールである）、および逆位デオキシチミジン（ｄＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
ＶＩＩ．  ポリヌクレオチド構造−相補性
【００７３】
一部の態様では、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して少なくとも約７０％相補的である。関連する態様では、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補的である。
【００７４】
一態様では、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第４のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、少なくとも約７０％相補的である。関連する態様では、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第４のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または約１００％相補的である。
【００７５】
別の態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補的であり、さらに別の態様では、プローブポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補的である。
ＶＩＩＩ．  ハイブリダイゼーション条件
【００７６】
一部の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドの不在下、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドの不在下、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」とは、通常の技能を有する当業者が経験的に決定することができ、例えば、プライマーの長さ、プライマーの相補性、プライマーの濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液中の塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーションを実施する温度、ハイブリダイゼーションを実施する時間の長さ、およびポリヌクレオチドの表面電荷に影響を及ぼす因子の存在に基づいて変化することになる。一般的に、ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドが、標的上の他のいずれの領域に対するよりも高い親和性で、その相補配列に優先的に結合することができる条件である。２０塩基を有するポリヌクレオチド配列のその相補体に対するハイブリダイゼーションの例示的なストリンジェントな条件には、限定するものではないが、Ｇ＋Ｃ含有量約５０％、塩（Ｎａ＋）５０ｍＭ、およびアニーリング温度６０℃が含まれる。より長い配列の場合、特異的ハイブリダイゼーションは、より高い温度で達成される。一般的に、ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドの融解温度より約５℃低い温度でアニーリングが実施されるようなものである。「融解温度」は、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドの５０％が、一定のイオン強度、ｐＨ、およびポリヌクレオチド濃度で平衡状態にある温度である。
ＩＸ．  使用方法
Ａ．  ＰＣＲ
【００７７】
本明細書に記載の標的ポリヌクレオチド増幅法において、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドの組み合わせと組み合わせた使用が想定され、第３のポリヌクレオチドは、第１の標的相補体ポリヌクレオチド領域における標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対して［第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが相補的である鎖に対して］相補的な第１のドメイン［Ｐａ］と、固有のポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン［Ｐｃ］とを含み、第４のポリヌクレオチドは、第２の相補体標的ポリヌクレオチド領域における標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対して［第２のポリヌクレオチドが相補的である鎖に対して］相補的な第１のドメイン［Ｆｂ］と、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインと第４のポリヌクレオチドの第２のドメインが適切な条件下でハイブリダイズするように第３のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン［Ｆｄ］とを含む。これらの態様の一部では、方法は、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと標的ポリヌクレオチドの第１の標的ポリヌクレオチド領域、第２のポリヌクレオチドの第１のドメインと標的ポリヌクレオチドの第２の標的ポリヌクレオチド領域、第３のポリヌクレオチドの第１のドメインと標的ポリヌクレオチドの相補鎖の第１の標的ドメイン、および第４のポリヌクレオチドの第１のドメインと第２の相補体標的ポリヌクレオチド領域のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、標的ポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドの相補体を第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチド、および第４のポリヌクレオチドと接触させることと、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの伸長を可能にする条件下で、第１および第４のポリヌクレオチドの第１のドメイン（すなわち、プライミングドメイン）を伸長させることとをさらに含む。
【００７８】
一部の態様では、本明細書において上述したブロック基は、第２のポリヌクレオチドおよび／または第４のポリヌクレオチドにそれらの３’末端で結合しており、これが核酸を合成できる酵素による伸長を遮断する。方法の実施において有用なブロック基には、３’リン酸基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、および逆位デオキシチミジン（ｄＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
種々の実施形態において、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドの相補体、またはそれら両方は、第２のポリヌクレオチドの第１のドメインおよび／または第４のポリヌクレオチドの第１のドメインの標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって変性された二次構造を有する。
【００８０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、図７Ａ〜Ｆ（スキーム４〜９）に図示するようなＰＣＲにおける使用が想定されている。スキーム４では、プライマーＡ（すなわち、本明細書に記載の第１のポリヌクレオチド）およびＢ（すなわち、本明細書に記載の第３のポリヌクレオチド）は、Ｗ（ワトソン）鎖およびＣ（クリック）鎖として示される標的ポリヌクレオチドの逆鎖上に使用される。図７Ｆ（スキーム９）に示すように、ステップ１２のあとは、プライマーＡおよびＢのみが、標的ポリヌクレオチドの増幅に必要とされる。
【００８１】
当業者は、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせを所定のＰＣＲアンプリコンの一端または両端のいずれかのプライミングに使用できることを理解するであろう。本明細書で使用する際、「アンプリコン」とは、増幅技法を用いて合成されたポリヌクレオチドの一部を意味するものと理解される。プライマーのうちの少なくとも１つが本明細書に記載のポリヌクレオチドの組み合わせであれば、２以上のポリヌクレオチドの組み合わせを含む本発明のいずれの方法も、標準プライマーとポリヌクレオチドの組み合わせのいかなる組み合わせを用いてもよいと想定される。
Ｂ．  簡易な第２の鎖の合成
【００８２】
別の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドを用いて標的ポリヌクレオチドを増幅する方法が提供され、この方法は、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと標的ポリヌクレオチドの第１の標的ポリヌクレオチド領域、および第２のポリヌクレオチドの第１のドメインと標的ポリヌクレオチドの第２の標的ポリヌクレオチド領域のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、標的ポリヌクレオチドを本明細書において開示される第１および第２のポリヌクレオチドと接触させることと、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインの伸長を可能にする条件下で、第１のポリヌクレオチドの第１のドメイン（すなわち、プライミングドメイン）を伸長させることとを含む。一部の態様では、第１のポリヌクレオチド（そこから伸長された関連するポリヌクレオチド産物を有する）および第２のポリヌクレオチドが、次いで標的ポリヌクレオチドから変性されて、第１および第２のポリヌクレオチドの別の組が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能になる。
【００８３】
一態様では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが標的ポリヌクレオチドに順次ハイブリダイズする。別の態様では、第２のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前に、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的にハイブリダイズする。さらに別の態様では、第１のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前に、第２のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。別の態様では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと第２のポリヌクレオチドの第１のドメインとが、標的ポリヌクレオチドに同時にハイブリダイズする。
【００８４】
種々の実施形態において、標的ポリヌクレオチドには、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ポリヌクレオチド、一本鎖ポリヌクレオチド、または二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。一態様では、標的が二本鎖ポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと第２のポリヌクレオチドの第１のドメインとが、二本鎖標的ポリヌクレオチドの同一の鎖にハイブリダイズする。別の態様では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインとは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションの前にハイブリダイズする。
【００８５】
一実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが、標的ポリヌクレオチドに同時にハイブリダイズし、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとが、標的ポリヌクレオチドの相補体に同時にハイブリダイズし、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドは、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするのと同時に、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００８６】
別の実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチド、および第４のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドの相補体に同時にはハイブリダイズしない。
【００８７】
さらに別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインとは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前にハイブリダイズする。別の実施形態では、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインと第４のポリヌクレオチドの第２のドメインとは、標的ポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする前にハイブリダイズする。
【００８８】
一実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインとは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前にハイブリダイズし、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインと第４のポリヌクレオチドの第２のドメインとは、標的ポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする前にハイブリダイズする。
【００８９】
別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域に変異を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域において、完全に相補的である。一部の実施形態では、非標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが非標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域において、完全には相補的でない。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第３のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域に変異を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第３のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域において、完全に相補的である。一部の実施形態では、非標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第３のドメインが非標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域において、完全には相補的でない。一部の態様では、変異は不安定化変異である。関連する態様では、不安定化変異は、第１のポリヌクレオチド、または第３のポリヌクレオチド、またはそれら両方の伸長を阻止する。
Ｃ．  マルチプレックス化
【００９０】
一実施形態では、核酸を合成できる酵素による伸長はマルチプレックス伸長であり、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインは、標的ポリヌクレオチド中の２以上の領域にハイブリダイズする特性を有する。関連する実施形態では、核酸を合成できる酵素による伸長はマルチプレックス伸長であり、第３のポリヌクレオチドの第１のドメインは、標的ポリヌクレオチド中の２以上の遺伝子座にハイブリダイズする特性を有する。
【００９１】
関連する実施形態では、マルチプレックスＰＣＲは、２以上のポリヌクレオチド産物を増幅するために、少なくとも２つのポリヌクレオチドプライマーを用いて実施される。これらの実施形態の一部の態様では、マルチプレックスＰＣＲに使用される各ポリヌクレオチドプライマーは、本明細書において開示されるポリヌクレオチドの組み合わせである。他の態様では、マルチプレックスＰＣＲに使用される少なくとも１つのポリヌクレオチドプライマーは、本明細書において開示されるポリヌクレオチドの組み合わせである。
【００９２】
別の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲは、複数のフィクサーポリヌクレオチドを用いて実施され、これらはゲノム反復配列に向けられる。別の実施形態では、フィクサーポリヌクレオチドはランダム配列からなる。これらの態様の一部では、複数のフィクサーポリヌクレオチドとは、約１０個のポリヌクレオチド配列を指す。他の態様では、複数のフィクサーポリヌクレオチドとは、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１０００個、またはそれ以上のポリヌクレオチド配列を指す。これらのフィクサーポリヌクレオチド配列は、次いで多数のプライマーポリヌクレオチドが結合できる、多数の「固定された」位置をゲノム中に提供することになり、本明細書に記載のようなプライマーポリヌクレオチドおよびフィクサーポリヌクレオチドの双方中に存在する固有の相補的ポリヌクレオチド配列を利用する。
Ｄ．  リアルタイムＰＣＲ
【００９３】
標準的３方向接合部を有するプライマーの組み合わせは、リアルタイムＰＣＲに有用である。希少な転写産物の分析および定量化、病原体の検出、変異を有する希少な癌細胞または癌患者における低レベルの遺伝子メチル化異常の診断は、標的増幅の高い感度および特異性、標的検出の高い特異性、数千の正常ＤＮＡコピー存在下で小数の癌特異的変異対立遺伝子または異常メチル化プロモーターを選択的に増幅および検出する能力、低コピー数ＲＮＡ転写産物の分析および定量化、蛍光微量検出、現在のリアルタイムサーマルサイクラーの能力を最大限に利用するために１つのアッセイで４〜５種の異なる標的をマルチプレックス化する能力を兼ね備えた改善されたリアルタイムＰＣＲアッセイによって解決できる問題である。蛍光体はプライマーポリヌクレオチドの５’末端に配置され、クエンチャーはフィクサーポリヌクレオチドの３’末端に配置される。この配置では、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドがハイブリダイズするときに、蛍光は検出されない（蛍光体がクエンチャーに隣接して配置されているため）。しかしながら、ＰＣＲにおけるプライマーポリヌクレオチドの伸長後、ＰＣＲの変性段階においてプライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドとが分離され、それによって蛍光体とクエンチャーとの間に距離ができ、検出可能な蛍光シグナルがもたらされる。
【００９４】
また、４方向接合部を有するプライマーの組み合わせをリアルタイムＰＣＲに使用することもできる。プライマーポリヌクレオチドは、その５’末端が蛍光体で標識され、ステープルは、その３’末端がクエンチャーで標識されている。フィクサーポリヌクレオチドは非標識である。プライマーおよびフィクサーポリヌクレオチド双方の第２のドメイン領域が固有であることから、ステープルポリヌクレオチドを「ユニバーサル」ポリヌクレオチドとして使用することができる（図１０、スキーム１０）。
【００９５】
また、２方向接合部を有するプライマーの組み合わせおよびプローブポリヌクレオチドをリアルタイムＰＣＲに使用することもできる。プローブポリヌクレオチドは、その５’末端が蛍光体で標識され、その３’末端がクエンチャーで標識され、一部の実施形態では、付加的な内部クエンチャーで標識される。Ｔａｑポリメラーゼなどの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて第１のポリヌクレオチドを伸長する場合、標識が切断されて、もはや消光されず、標識からのシグナルの増加をもたらす。一部の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは分子指標プローブである。要するに、分子指標プローブは、相補的であり、かつ標的ポリヌクレオチドの不在下でヘアピン構造を形成する塩基をその５’末端および３’末端に有するヌクレオチド配列からなる。また、分子指標プローブは、その３’末端（または５’末端）にクエンチャーを含み、その５’末端（または３’末端）に蛍光標識を含んで、標的ポリヌクレオチドが存在しないときに標識からの検出可能なシグナルが存在しないようにする。また、分子指標プローブは、標的ポリヌクレオチドに対して相補的な配列を含んで、標的の存在下で、プローブの標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションが、ヘアピン構造の分離および消光の喪失を引き起こすようにし、検出可能な蛍光シグナルをもたらす。
【００９６】
また、２方向接合部を有するプライマーの組み合わせとブロッカーポリヌクレオチドとを組み合わせて、リアルタイムＰＣＲに使用することもできる。プライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）は、その５’末端が蛍光体で標識され、フィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）は、その３’末端がクエンチャーで標識される。ブロッカーポリヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチドの領域のすぐ５’側に位置する標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である（図４に図示）。一部の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと重複する。言い換えると、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）およびブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）は、標的ポリヌクレオチドの同一のヌクレオチド（１つまたは複数）に対して相補的となる。関連する実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）と、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）とは異なる。これらの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド（１つまたは複数）は、適切な位置（１つまたは複数）で標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるときに、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることになり、それによって適切な条件下での第１のポリヌクレオチドの伸長が可能になる（図４Ａを参照）。ＰＣＲにおけるプライマーポリヌクレオチドの伸長後、ＰＣＲの変性段階においてプライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドとが分離され、それによって蛍光体とクエンチャーとの間に距離ができ、検出可能な蛍光シグナルがもたらされる。関連する実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドは、それが適切な位置の非標的ポリヌクレオチドに対して相補的である場合に、非標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることになり、それによって第１のポリヌクレオチドの伸長を遮断する（図４Ｂを参照）。この配置では、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドがハイブリダイズするときに、蛍光は検出されない（蛍光体がクエンチャーに隣接して配置されているため）。種々の実施形態において、ブロッカーポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように修飾されている。この系は、例えば単一ヌクレオチド多型の優れた感度および特異性での検出を可能にする。
【００９７】
また、２方向接合部を有するプライマーの組み合わせ、ブロッカーポリヌクレオチド、およびプローブポリヌクレオチドが組み合わされて、リアルタイムＰＣＲに使用される。関連する実施形態では、この組み合わせに使用する第１のポリヌクレオチドは、その３’末端のヌクレオチドとして修飾核酸を含み、ブロッカーポリヌクレオチドは、その５’末端のヌクレオチドとして修飾核酸を含む。一部の実施形態では、修飾核酸はロックド核酸である。
【００９８】
一部の態様では、上記の実施形態は、逆方向プライマーポリヌクレオチドをさらに含む。逆方向プライマーは、第１のポリヌクレオチドの伸長によって作成されたポリヌクレオチド中の領域に対して相補的である。図８を参照されたい。明らかなように、一部の実施形態では、逆方向プライマーは、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖である場合、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対しても相補的である。逆方向プライマーの含有は、標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする。種々の態様において、逆方向プライマーの配列が、プライマーの全長にわたって標的配列にハイブリダイズするように、その全長にわたって十分に相補的となるよう設計された逆方向プライマーは、「単純」なプライマーである。この種の単純なプライマーは、一態様では、標的配列に対して１００％相補的であるが、特定の状況および条件下では、１００％未満の相補性を有する単純なプライマーが有用であることは理解されるであろう。
【００９９】
他の態様では、逆方向プライマーは、第１の反応で用いられたプライマー対の組み合わせ中の第１のポリヌクレオチドの第１のドメインからポリヌクレオチドの伸長によって産生された配列中の領域に特異的に結合する、別個のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせである。
【０１００】
種々の態様において、本明細書に記載の方法は、標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較して、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出に変化を与える。一部の態様では、この変化は、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較した、試料中の標的ポリヌクレオチドの検出の増加である。一部の態様では、この変化は、非標的ポリヌクレオチドを含む試料からの配列検出と比較した、試料中の標的ポリヌクレオチドの検出の減少である。
【０１０１】
本明細書に記載のポリヌクレオチドの特異性の向上により、ＳＹＢＲ緑色染料の存在下リアルタイムＰＣＲを実施して、ＴａｑＭａｎ、分子指標プローブ、またはスコーピオンプライマーを用いて達成されるのと同等の特異性を大幅に低いコストで達成することができる。
【０１０２】
一実施形態では、５’末端が蛍光分子で標識されたプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）と、３’末端がクエンチャーで標識された第２の消光ポリヌクレオチド（すなわち、「ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチド」）との双方は、ＤＮＡポリメラーゼからの伸長を阻止するために３’末端にブロック基を含むフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）の第２のドメインにハイブリダイズされる。この複合体は、この状態では蛍光を有さないが、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーポリヌクレオチドの伸長後に、複合体が置換（変性）されたときに、蛍光を発することになる。
【０１０３】
別の実施形態では、５’末端に蛍光体を含むプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）は、３’末端にクエンチャーを含むフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）にハイブリダイズされる。この複合体は、ハイブリダイズされるときには蛍光を有さないが、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーポリヌクレオチドの伸長後に、複合体が置換（変性）されたときに、蛍光を発することになる。この方法の別の態様では、２組のポリヌクレオチドの組み合わせを用いてマルチプレックスリアルタイムＰＣＲが実施され、プライマーの各組中の１つのポリヌクレオチドは蛍光体で標識され、これらの２つの蛍光体は互いに区別できる。
【０１０４】
別の実施形態では、プライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）は、蛍光体と、３’末端のクエンチャーとを含み、これらの２つの標識は、一続きのＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、「プローブポリヌクレオチド」）によって分離されている（図９を参照）。一部の態様では、プローブポリヌクレオチドは、内部Ｚｅｎクエンチャーをさらに含む。一部の態様では、熱安定性ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの生成および分解時、ならびに遊離蛍光体（すなわちクエンチャー）の溶液中への放出時に、蛍光シグナルが生成される。
【０１０５】
図９Ａは、非特異的ＲＮＡリンカーを含む蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）、および典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示している。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’標識、次にＲＮＡ配列、次いでクエンチャー、次いで本明細書に記載の第１のポリヌクレオチド（Ｐ）に特有の配列を含む。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’クエンチャー、次にＲＮＡ配列、次いで標識、次いで本明細書に記載の第１のポリヌクレオチド（Ｐ）に特有の配列を含む。図９Ｂは、図９Ａに示す組み合わせのＰＣＲでの使用を図解している。Ｐの逆鎖が生成されるとき、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの切断が蛍光体（すなわちクエンチャー）を放出し、蛍光シグナルが検出される。
【０１０６】
図９Ｃは、部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを有する蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）、および典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’標識、次いでＰの下流の配列に対して相補的なＲＮＡ配列、次いでクエンチャー、次いで本明細書に記載の第１のポリヌクレオチド（Ｐ）に特有の配列を含む。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’クエンチャー、次いでＰの下流の配列に対して相補的なＲＮＡ配列、次いで標識、次いで本明細書に記載の第１のポリヌクレオチド（Ｐ）に特有の配列を含む。図９Ｄは、図９Ｃに示す組み合わせのＰＣＲにおける使用を図解している。プライマーＡを含むＰＣＲ産物が変性されるとき、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーＡの下流の領域にハイブリダイズし、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを切断し、蛍光体を放出し、蛍光シグナルが検出される。
【０１０７】
一部の実施形態では、１個のフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）を２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）と組み合わせて、１つのリアルタイムＰＣＲアッセイでのいくつかの変異の同時マルチプレックス検出に使用してもよい。
【０１０８】
別の実施形態では、例えば、添付文書、４つの蛍光標識ユニバーサルポリヌクレオチド分子、３’末端にクエンチャーを含むユニバーサルポリヌクレオチド分子、ならびにＤＮＡリガーゼおよび蛍光標識プライマーポリヌクレオチドの組立てのための適切な緩衝液を含むキットが提供される。このキットは、場合により、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび適切な緩衝液をさらに含む。
【０１０９】
このキットは、ライゲーションによってポリヌクレオチドを蛍光標識するために使用される。一実施形態では、プライマーポリヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化され、その後フィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。５’末端に蛍光体を含む第３のポリヌクレオチド（すなわち、蛍光標識ユニバーサルポリヌクレオチド、上記を参照）も同様にフィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。第３のポリヌクレオチドの３’末端は、次いでプライマーポリヌクレオチドのリン酸化された５’末端にライゲーションされ、蛍光標識プライマーポリヌクレオチドが作成される。最後に、３’末端にクエンチャーを含むユニバーサルポリヌクレオチドが、フィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズされて、その結果、蛍光を有さず、例えばリアルタイムＰＣＲ分析で使用可能な状態のポリヌクレオチド複合体が得られる。
Ｅ．  プライマー伸長
【０１１０】
本明細書において開示されるプライマー組成物は、プライマー伸長を必要とする、または利用するいかなる方法で使用してもよい。例えば、プライマー伸長は、既知の遺伝子のＲＮＡ転写開始部位を決定するために用いることができる。この技術は、当該遺伝子の３’末端付近の領域に対して相補的な、本明細書に記載される標識されたプライマーポリヌクレオチドの組み合わせ（通常は、２０〜５０ヌクレオチド長）を必要とする。このポリヌクレオチドの組み合わせは、ＲＮＡにアニールすることができ、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡの５’末端に到達するまでＲＮＡに対する相補型（ｃＤＮＡ）を合成する。ポリアクリルアミドゲル上で産物を分析することによって、ゲル上の配列の長さが開始部位から標識されたプライマーまでの距離を表すため、転写開始部位を決定することが可能である。
【０１１１】
本明細書に記載する高度なポリヌクレオチド技術は、ＲＮＡにおいて直面する潜在的な二次構造を克服および解決することになる。
Ｆ．  等温ＤＮＡ増幅
【０１１２】
等温ＤＮＡ増幅は、本明細書に記載する高度なポリヌクレオチド技術を用いて、米国特許第７，５７９，１５３号において教示されるように実施することができる。簡潔に述べると、等温ＤＮＡ増幅は、（ｉ）一方の末端にヘアピンを他方の末端にポリヌクレオチドを有し、その間にプロモーター配列であって、このプロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼによる合成がヘアピンの方向に進むように配向されたプロモーター配列が配置された二本鎖ＤＮＡを提供するステップと、（ｉｉ）プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを転写し、プロモーター配列およびポリヌクレオチドのコピーを含むＲＮＡ転写産物を形成するステップと、（ｉｉｉ）ＲＮＡ転写産物から相補ＤＮＡを生成するステップと、（ｉｖ）ヘアピンが再構成されるように、相補ＤＮＡからＲＮＡ転写産物の５’末端を除去するステップと、（ｖ）ヘアピンを伸長させて、再構成されたプロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメラーゼが再構成されたプロモーター配列を認識し、ＲＮＡ転写産物を合成するステップとを含む。好ましい実施形態では、該生成ステップは、該相補ＤＮＡおよび該ＲＮＡ転写産物のヘテロ二重鎖を形成することを含み、該除去ステップは、このヘテロ二重鎖をヘリカーゼで処理することを含む。
Ｇ．  蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
【０１１３】
また、本明細書に記載の高度なポリヌクレオチド技術は、ＦＩＳＨを実施するためにも使用することができる。ＦＩＳＨは、染色体上の特異的ＤＮＡ配列の存在または不在を検出および特定するために使用される細胞遺伝学的手法である。ＦＩＳＨは、高度な配列類似性を示す染色体の部分のみと結合する蛍光プローブを使用する。蛍光顕微鏡を用いて、蛍光プローブが染色体に結合した位置を解明することもできる。ＦＩＳＨは、遺伝相談、薬剤、および種同定で使用するためのＤＮＡ中の特異的な特徴を発見するためにしばしば用いられる。ＦＩＳＨは、組織試料内の特異的ｍＲＮＡを検出および特定するためにも使用することができる。これに関連して、細胞および組織内の遺伝子発現の時空間的パターンを明らかにするためにも役立つ。
Ｈ．  ライゲーションプローブ
【０１１４】
また、本明細書に記載の高度なポリヌクレオチド技術は、ライゲーションプローブを用いたマルチプレックスＰＣＲを実施するためにも使用することができる。ライゲーションプローブ法は当業者に既知である。簡潔に述べると、ライゲーションプローブは、２つの別個のオリゴヌクレオチドからなり、これらはそれぞれＰＣＲプライマー配列を含有する。これらの２つの片側プローブ（ｈｅｍｉ  ｐｒｏｂｅ）の両方がそれらの隣接する標的にハイブリダイズする場合にのみ、それらをライゲーションすることができる。ライゲーションされたプローブのみが、ＰＣＲで指数関数的に増幅されることになる。したがって、プローブライゲーション産物の数は、試料中の標的配列の数に依存する。
【０１１５】
一部の実施形態では、２つのライゲーションプローブは、約１個〜約５００個のヌクレオチドによって分離され、ライゲーションの前に、鎖置換活性を有さないＤＮＡ熱安定性ポリメラーゼによって第１のプローブが伸長される。鎖置換活性を有さないＤＮＡ熱安定性ポリメラーゼには、Ｐｆｕポリメラーゼが含まれるが、これに限定されない。伸長された鎖が第２のライゲーションプローブの５’−リン酸基に達したときに重合が停止し、ニックが作成される。このニックは、反応混合物中に存在する熱安定性リガーゼで閉じることができ、これにより全反応が単一反応形態で起きることを可能にする。
Ｉ．  次世代配列決定（ＮＧＳ）
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせは、ＮＧＳの用途でも使用できる。ＤＮＡプローブの連続ライゲーションによって配列決定する代わりに、図１５に図示するように、ライゲーションを伴わない連続ハイブリダイゼーションに、本明細書において開示されるプライマーの組み合わせを使用することができる。ＮＧＳ技術の概説については、Ｍｏｒｏｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９２（５）：２５５−６４，２００８（参照により全体が本明細書に援用される）を参照されたい。ＮＧＳは、当業者により容易に理解および実施され、下記の実施例２に記載される一実施形態に例示される。
Ｊ．  特異的配列検出
【０１１７】
また、本明細書において開示されるポリヌクレオチドの組み合わせは、変異および癌を含むがこれらに限定されない様々な病態を検出、評価、および管理するためにも使用される。種々の実施形態において、対象中の１つまたは複数の遺伝子座における変異を検出するための方法が提供される。本開示のポリヌクレオチドの組み合わせを用いて検出可能な変異の種類には、塩基置換、挿入／欠失（インデル）、増幅、再構成（逆位／転座）、体細胞、生殖細胞、内因性、外因性（宿主試料（ウイルス、細菌、真菌、原虫、昆虫）における病原体特異的なものおよび／または母体試料における胎児特異的なものを含むが、これらに限定されない）、非コード（調節配列、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーを含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
対象遺伝子座には、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ＫＲＡＳコドン１２、ＫＲＡＳコドン１３、ＮＲＡＳ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＫＩＴ、血小板由来成長因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、カテニン（カドヘリン結合タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）、ＡＬＫ、およびＡＫＴが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本開示のポリヌクレオチドの組み合わせを用いて検出可能な特定のＫＲＡＳ変異には、限定するものではないが、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ、およびＧ１２Ａが含まれる。本開示のポリヌクレオチドの組み合わせを用いて検出可能な特定のＢＲＡＦ変異には、限定するものではないが、Ｖ６００Ｅ／Ｋが含まれる。
【０１２０】
本開示のポリヌクレオチドの組み合わせは、宿主中のゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｍＲＮＡ、小型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、遊離循環核酸、および外因性ＲＮＡまたはＤＮＡを含むがこれらに限定されない一連の鋳型を用いた、変異検出アッセイにおいて有用である。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの組み合わせは、徴候特異的ＲＮＡを検出するために使用される。そのようなＲＮＡの例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＮＯＴＣＨ１、ＴＷＩＳＴ１、マンマグロビン（ＭＧＢ１）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、カリクレイン２／３（ＫＬＫ２／３）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、小型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および病原体特異的ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
さらなる実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの組み合わせは、徴候特異的ＤＮＡを検出するために使用される。そのようなＤＮＡの例には、種特異的、株特異的、病原体特異的、および個人識別特異的なものが含まれるが、これらに限定されない。別の態様では、本開示のポリヌクレオチドの組み合わせは、徴候特異的ＤＮＡメチル化状態を検出するために使用され、これは一部の態様では、非メチル−ＣからＴへの重亜硫酸塩変換によって測定される。
【０１２３】
本来研究志向または臨床診断用のアッセイは、対象から採取した生物試料を用いて実施されることが想定されている。使用に好適な生物試料には、限定するものではないが、身体組織（新鮮、凍結、または固定）、腫瘍、生検試料、リンパ節試料、骨髄試料、全血試料（新鮮または保存／乾燥）、血清または血漿試料（新鮮または保存／乾燥）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）試料、循環タンパク質試料、循環無細胞核酸試料、尿試料、喀痰試料、口腔スワブ、環境スワブ、商品／農産物試料、および唾液試料が含まれる。
Ｘ．  酵素
【０１２４】
本方法のうちのいずれかの一部の態様では、核酸を合成できる酵素によって行われる伸長は、リアルタイムで定量化される。本発明の実施において有用な酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい）、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素が含まれるが、これらに限定されない。本発明を実施するために使用可能な酵素の非限定的な例には、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ（商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと標準Ｔａｑ（Ｍｇ非含有）緩衝液、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと標準Ｔａｑ緩衝液、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  ＩＩ（Ｍｇ非含有）緩衝液、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼと（Ｍｇ非含有）緩衝液、Ｐｈｉｒｅ（商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ（商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＡＭＶファーストストランドｃＤＮＡ合成キット、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｍ−ＭｕＬＶ  ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（全長）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージ断片）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼと（Ｍｇ非含有）緩衝液、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ���ＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ホットスタート高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブスＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージ断片）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージ（クレノウ）断片）、クレノウ断片（３’→５’エキソ−）、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（非修飾）、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
ＸＩ．  標識
【０１２５】
一部の態様では、第１のポリヌクレオチドは標識を含む。他の態様では、本明細書に記載の方法で使用される任意のポリヌクレオチドは標識を含む。これらの態様の一部では、標識は蛍光性である。オリゴヌクレオチドを蛍光分子で標識し、蛍光を測定する方法は、当分野で周知である。本発明の実施において有用な蛍光標識には、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および−６）−カルボキシ−２’、７’−ジクロロフルオレセイン（ｐＨ９．０）、５−ＦＡＭ（ｐＨ９．０）、５６−ＦＡＭ、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ（ｐＨ７．０）、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ（ｐＨ７．０）、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６  ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（ｐＨ９．０）、６−カルボキシローダミン６Ｇ（ｐＨ７．０）、６−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、６−ＨＥＸ，ＳＥ（ｐＨ９．０）、６−ＴＥＴ，ＳＥ（ｐＨ９．０）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ｐＨ７．０）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（ｐＨ９．０）、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４０５、Ａｌｅｘａ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５５５、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６４７、Ａｌｅｘａ  ６６０、Ａｌｅｘａ  ６８０、Ａｌｅｘａ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヒドラジド−水、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０  Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジン（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジン（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、アロフィコシアニン（ｐＨ７．５）、ＡＭＣＡコンジュゲート、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ  ６４７、ＢＣＥＣＦ（ｐＨ５．５）、ＢＣＥＣＦ（ｐＨ９．０）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−Ｘ（ＭｅＯＨ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬコンジュゲート、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（ＭｅＯＨ）、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ（ＭｅＯＨ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘ  コンジュゲート、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ（ＭｅＯＨ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ，ＳＥ、Ｂ���ＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘファラシジン（ｐＨ７．０）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ（ＭｅＯＨ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ，ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセイン（ｐＨ９．０）、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセイン（ｐＨ１０．０）、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡ（ｐＨ７．０）、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ（ｐＨ２．５）、ＣＩ−ＮＥＲＦ（ｐＨ６．０）、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン（ＭｅＯＨ）、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、Ｄａｐｏｘｙｌ（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ（ｐＨ９．０）、ジ−８  ＡＮＥＰＰＳ、ジ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ（ｐＨ４．０）、ＤＭ−ＮＥＲＦ（ｐＨ７．０）、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、エリトロシン−５−イソチオシアネート（ｐＨ９．０）、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー、エチジウムホモダイマー−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、ＦｌＡｓＨ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３  Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏｒ−ルビー、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ  ＮａＯＨ、フルオレセイン抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、フルオレセインデキストラン（ｐＨ８．０）、フルオレセイン（ｐＨ９．０）、フルオロエメラルド、ＦＭ  １−４３、ＦＭ  １−４３脂質、ＦＭ  ４−６４、ＦＭ  ４−６４、２％  ＣＨＡＰＳ、Ｆｕｒａレッド  Ｃａ２＋、Ｆｕｒａレッド（高Ｃａ）、Ｆｕｒａレッド（低Ｃａ）、Ｆｕｒａ−２  Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２（高Ｃａ）、Ｆｕｒａ−２（Ｃａなし）、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＨｃＲｅｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８−ＤＮＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｉｎｄｏ−１  Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１（Ｃａ非含有）、Ｉｎｄｏ−１（Ｃａ飽和）、ＪＣ−１、ＪＣ−１（ｐＨ８．２）、リサミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、ルシフェルイエロー、ＣＨ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒブルー、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒブルー（ｐＨ５．０）、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒグリーン、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒグリーン（ｐＨ５．０）、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒイエロー（ｐＨ３．０）、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒイエロー（ｐＨ９．０）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒブルー、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒグリーン、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒレッド、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンＭｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーン、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンＦＭ（Ｍｅ��Ｈ）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒオレンジ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒオレンジ（ＭｅＯＨ）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒレッド、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒレッド（ＭｅＯＨ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ（ＭｅＯＨ）、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ  ５００／５２５、緑色蛍光ニッスル染色−ＲＮＡ、ナイルブルー（ＥｔＯＨ）、ナイルレッド、ナイルレッド−脂質、ニッスル、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン４８８抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、オレゴングリーン５１４、オレゴングリーン５１４抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、フィコエリトリン、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリン（ｐＨ７．５）、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィン（ｐＨ９．０）、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２  Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０（ｐＨ７．０）、ローダミン１２３（ＭｅＯＨ）、ローダミングリーン、ローダミンファロイジン（ｐＨ７．０）、ローダミンレッド−Ｘ抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、ローダミングリーン（ｐＨ７．０）、Ｒｈｏｄｏｌグリーン抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーン  Ｎａ＋、スルホローダミン１０１、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ  １３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ  ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸ  ブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体コンジュゲート（ｐＨ８．０）、テトラメチルローダミンデキストラン（ｐＨ７．０）、テキサスレッド−Ｘ抗体コンジュゲート（ｐＨ７．２）、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１  Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、およびＹＯＹＯ−３−ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
蛍光分子以外の標識、例えばハイブリダイゼーション時に検出可能なシグナルを生じる、または検出可能なシグナルを変化させる化学発光分子、および放射性分子なども使用可能である。
【０１２７】
一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、標識の蛍光シグナルを減衰させるクエンチャーを含む。他の実施形態では、第４のポリヌクレオチドが、標識の蛍光シグナルを減衰させるクエンチャーを含む。本発明の方法を実施する際の使用に想定されているクエンチャーには、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、Ｚｅｎ  クエンチャーおよびＤａｂｃｙｌ．Ｇ塩基が含まれるが、これらに限定されない。
ＸＩＩ．  修飾ポリヌクレオチドの組み合わせ
【０１２８】
改変された特性を有する部分二本鎖プライマーの組み合わせは、（１）基本プライマーポリヌクレオチドと基本フィクサーポリヌクレオチドなどの２個のポリヌクレオチドによって、（２）修飾プライマーポリヌクレオチドと基本フィクサーポリヌクレオチドなどの２個のポリヌクレオチドによって、（３）修飾プライマーポリヌクレオチドと修飾フィクサーポリヌクレオチドなどの２個のポリヌクレオチドによって、（４）基本プライマーポリヌクレオチドと、基本フィクサーポリヌクレオチドと、アンチプライマーポリヌクレオチドなどの３個のポリヌクレオチドによって、および（５）修飾プライマーポリヌクレオチドと、基本フィクサーポリヌクレオチドと、アンチプライマーポリヌクレオチドなどの３個のポリヌクレオチドによって、形成することができる。
【０１２９】
部分二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの線状部分内またはループ領域内に位置してもよいその一本鎖領域によってのみ、ゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを開始させることができる。
【０１３０】
ポリヌクレオチドの一本鎖領域内の不完全な配列相補性（単一のヌクレオチドミスマッチを含む）は、ハイブリダイゼーションの開始を減速させることにより、ハイブリダイゼーションの効率を著しく減少させる。
【０１３１】
ポリヌクレオチドの二本鎖領域内の不完全な配列相補性は、鎖置換ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドの鋳型ポリヌクレオチドとの結合を妨げるはずである。
【０１３２】
基本ポリヌクレオチドよりも鋳型ポリヌクレオチド配列の変化に対する感度が高い修飾ポリヌクレオチドは、より特異的なＰＣＲベースの診断アッセイの開発のため、および例えば癌組織中の希少なＤＮＡ変異のより高感度のＰＣＲ検出のために使用することができる。
【０１３３】
図１１（スキーム１１）は、基本プライマーおよびフィクサーポリヌクレオチドを非共有結合アンチプライマー（ＡＰ）とともに用いた３例を示している。
【０１３４】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、基本プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ０」）および修飾フィクサーポリヌクレオチド構造体（「Ｆ１〜Ｆ４」）で構築されていてもよい（図１２、スキーム１２を参照）。修飾フィクサーを左側に示し、完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（基本プライマーおよび修飾フィクサーポリヌクレオチド）を右側に示す。
【０１３５】
ステムループ構造を含む修飾ポリヌクレオチドの組み合わせ（スキーム１２の１〜４）を使用して、鋳型ポリヌクレオチドに結合するときの特異性のレベルの向上をもたらすこともできる。これらの態様では、一本鎖領域（例えば、ループ構造内）が、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションは、配列が１００％相補的である場合、フィクサーポリヌクレオチドの完全に相補的なステム部分に効果的に置換する。関連する態様では、プライマーポリヌクレオチドは、完全にハイブリダイズしたフィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。修飾フィクサーポリヌクレオチドの一本鎖ループ領域または二本鎖ステム領域内のいかなる変異も、そのハイブリダイゼーション効率を低下させ、結果として、ポリヌクレオチドの組み合わせのプライミング効率も低下させることになる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、修飾プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ１」）と基本フィクサーポリヌクレオチド（「Ｆ」）とで構築されていてもよい（スキーム１３の図１３Ａを参照）。スキーム１３において、修飾プライマーポリヌクレオチドは左側に示し、完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（修飾プライマーポリヌクレオチドおよび基本フィクサーポリヌクレオチド）は右側に示す。この実施形態では、一本鎖ＤＮＡリンカー（例えば、ポリｄＴからなる）は、プライマー１の５’セグメントがその３’セグメントにハイブリダイズできるように、十分な長さであるべきである。
【０１３６】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、修飾プライマーポリヌクレオチド（プライマー１、Ｐ１）と修飾フィクサーポリヌクレオチド（スキーム１４を参照）とで構成されていてもよい。２つのそのような例は、図１２（スキーム１２）の修飾フィクサーポリヌクレオチドＦ１およびＦ４とともに図１３Ｂ（スキーム１４）に示す。
【０１３７】
別の実施形態では、修飾プライマー構造を有するポリヌクレオチドの組み合わせは、非共有結合したアンチプライマーをさらに含む。１つの態様では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、修飾プライマーポリヌクレオチド、基本フィクサーポリヌクレオチド、およびアンチプライマーを含むように形成してもよい。種々の態様において、アンチプライマーは、ポリヌクレオチドの組み合わせの様々な領域にハイブリダイズしてもよい（図１３Ｃ、スキーム１５を参照）。
【０１３８】
アンチプライマーポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドへのフィクサーポリヌクレオチドの第１のドメインの結合の特異性をさらに向上させる役目を果たす。このとき、１００％相補的な鋳型ポリヌクレオチド領域のみが、アンチプライマーの範囲外の短いポリヌクレオチド領域に対して効果的にハイブリダイズすることになる。フィクサーポリヌクレオチドの第１のドメインは、鋳型ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするため、鋳型領域がフィクサーポリヌクレオチドに対して１００％相補的である場合には、アンチプライマーを置換することになる。このことが、フィクサーポリヌクレオチド単独の場合に比べて非常に高いレベルの特異性を提供する。
【０１３９】
本明細書全体で引用される参考文献は、本明細書に記載されるものの補足となる例示的手順または他の詳細を提示する限り、参照により全てが具体的に本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４０】
当業者は、プライマーまたはプライマーの組み合わせが「順方向」または「逆方向」であると表現される場合、これらの表示は、ＰＣＲ反応、およびプライマーと鋳型との構造的関係を説明する際に使用される任意の慣習であることを理解するであろう。したがって、当業者には明らかなように、ＰＣＲスキームを１８０°反転させて配向し直すことにより、「順方向」プライマーは「逆方向」プライマーとなり、「逆方向」プライマーは「順方向」プライマーとなり、したがって、例えば、１つのプライマーの組み合わせの順方向プライマーまたは逆方向プライマーとしての表示は、その特定のプライマーの組み合わせの構造または使用を限定するものではない。
（実施例１）
【０１４１】
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせを用いる基本的な単一塩基変異検出ＰＣＲ。その最も基本的な形態の１つでは、２つのポリヌクレオチドの組み合わせを用いてＰＣＲが実施される。１つのポリヌクレオチドの組み合わせは「順方向」複合体であり、他方は「逆方向」複合体である。それぞれのポリヌクレオチドの組み合わせは、２つのポリヌクレオチドであるプライマーおよびフィクサーからなる。プライマーおよびフィクサーポリヌクレオチドは、スキーム２（図２）に示すように、互いに、そして鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【０１４２】
変異検出の場合には、順方向および／または逆方向プライマーポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡポリヌクレオチド中の変異体と野生型配列とを識別することができる配列を含む。プライマーポリヌクレオチド配列が野生型配列に向けられている場合、プライマーポリヌクレオチドは、野生型鋳型にのみ効果的に結合し、逆もまた同様である。この結果は、変異配列が１つのみの塩基位置で野生型配列と異なることになるためであり、本明細書に記載のポリヌクレオチドの組み合わせの一態様は、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーポリヌクレオチドの第１のドメインが短い（５〜３０個のヌクレオチド）ものである。ミスマッチがある場合にはプライマーオリゴヌクレオチド結合が不安定になり、結果的にＤＮＡ合成をプライミングできないため、この長さは変異配列と野生型配列との区別を可能にする。
【０１４３】
第１のステップは、反応容器内での試薬の構築である。この試薬は、順方向および逆方向のポリヌクレオチドの組み合わせ複合体と、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドと、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、デオキシヌクレオチド基質と、好適な緩衝液とを含む。ＰＣＲは、当業者により容易に決定される最適条件を用いて、当分野で周知の方法に従って実施する。
【０１４４】
プライマーポリヌクレオチドがどのように設計されたか（すなわち、それらが変異対立遺伝子または野生型対立遺伝子のいずれの検出のために設計されたのか）に応じて、得られるＰＣＲ産物は、試料が変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子のいずれを（または両方を）含むかについての情報を提供する。
【０１４５】
図１４（スキーム１６）は、２つのシナリオを示している。上のシナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインは、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して１００％相補的であり、伸長が発生し、産物を生じる。
【０１４６】
下のシナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインは、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対するミスマッチを含有し、プライマーポリヌクレオチドの短い第１のドメインにおける不安定性により伸長が遮断される。この不安定性は、極めて低いＰＣＲ効率をもたらすことになり、検出可能な産物を極めて少量生じるか、または全く生じないことになる。
（実施例２）
【０１４７】
次世代配列決定。次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施するためのポリヌクレオチドの組み合わせの使用は、プローブライゲーションまたはポリメラーゼ伸長のいずれの使用も伴わずに実施される（図１５、スキーム１７）。
【０１４８】
まず、第１のフィクサーポリヌクレオチドと４種の蛍光標識ポリヌクレオチドの混合物とをポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズさせる。ポリヌクレオチドが結合した鋳型を次いで洗浄し、シグナルを読み取る。
【０１４９】
次に、蛍光標識を切断し、混合物を再び洗浄する。次に４種の蛍光標識ポリヌクレオチドの混合物を鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、混合物を洗浄し、シグナルを再び読み取る。
【０１５０】
鋳型の末端に到達するまで、最初の２ステップを繰り返す。次に、第１のフィクサーポリヌクレオチドおよびハイブリダイズされた全てのポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドから取り除く。このステップのあと、第１のフィクサーポリヌクレオチドから上流の単一の塩基にハイブリダイズする第２のフィクサーポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う。
【０１５１】
前述と同様に、４種の蛍光標識ポリヌクレオチドの混合物を鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、混合物を洗浄し、シグナルを読み取る。次いで、蛍光標識を切断し、混合物を洗浄し、４種の蛍光標識ポリヌクレオチドを再びハイブリダイズさせる。混合物を次いで洗浄し、シグナルを読み取る。
【０１５２】
この場合も鋳型ポリヌクレオチドの末端に到達するまで、これらのステップを繰り返す。このようにして、ＤＮＡポリメラーゼを使用せずにＤＮＡ配列が得られる。
（実施例３）
染色色素ＳＹＴＯ  ９の存在下での定量ＰＣＲ
材料
【０１５３】
基質：λＤＮＡ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｎ３０１１Ｓ
【０１５４】
Ｐ１０−３５（配列番号４）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）
【０１５５】
Ｆ１０−２３（配列番号３）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）
【０１５６】
順方向プライマー１０−１５（配列番号１）
【０１５７】
逆方向プライマー１０−１７（配列番号２）
【０１５８】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０３２０Ｌ
【０１５９】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３、２５℃
【０１６０】
ｄＮＴＰ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１０２９７０１８
【０１６１】
ＳＹＴＯ（登録商標）９  緑色蛍光核酸染色Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｓ３４８５４
方法  
【０１６２】
増幅は、２５μＬ容量の一定分量で３回実施した。
【０１６３】
通常の増幅反応は、１２．５μＬの２×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭの従来型順方向プライマー１０−１５（配列番号１）、従来型逆方向プライマー１０−１７（配列番号２）、２００μＭのｄＮＴＰ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、０．１ｎｇのλＤＮＡ、および２ｕＭのＳＹＴＯ（登録商標）９から構成された。ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムシステムで、以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を実施した：９４℃で２分間を１サイクル、続いて９４℃で１５秒間および６６℃で１分２０秒間を５０サイクル。
【０１６４】
プライマーの組み合わせＰ１０−３５およびＦ１０−２３の増幅ミックスは、１２．５μＬの２×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭの従来型順方向プライマー１０−１５（配列番号１）、２００ｎＭのＰ１０−３５（配列番号４）、４００μＭのＦ１０−２３（配列番号３）、２００μＭのｄＮＴＰ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、０．１ｎｇのλＤＮＡ、および２ｕＭのＳＹＴＯ（登録商標）９から構成された。増幅パラメータは、通常のプライマー増幅のものと同様とした。
結果
【０１６５】
２種の従来型プライマーである１０−１５（配列番号１）および１０−１７（配列番号２）を用いた反応、ならびに従来型順方向プライマー１０−１５（配列番号１）、Ｐ１０−３５（配列番号４）、およびＦ１０−２３（配列番号３）を用いた反応の平均増幅曲線を図１６に示す。結果は、Ｐ１０−３５／Ｆ１０−２３対を含むアッセイが従来型プライマーを含むアッセイと同様に良好に実施されたことを示唆している。
（実施例４）
蛍光体標識プライマーの組み合わせおよびクエンチャー標識フィクサーを使用した定量ＰＣＲアッセイ
材料
【０１６６】
基質：λＤＮＡ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｎ３０１１Ｓ
【０１６７】
５’−フルオレセイン標識Ｐ１０−７４（配列番号１０）（すなわち、「標識を含む第１のポリヌクレオチド」）
【０１６８】
３’−Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー標識Ｆ１０−７３（配列番号９）（すなわち、「クエンチャーを含む第２のポリヌクレオチド」）
【０１６９】
順方向プライマー１０−１５（配列番号１）
【０１７０】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０３２０Ｌ
【０１７１】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３、２５℃
【０１７２】
Ｖｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０２５７Ｌ
【０１７３】
ｄＮＴＰ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１０２９７０１８
方法
【０１７４】
Ｐ１０−７４を用いた増幅反応は、１２．５μＬの２×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭの従来型順方向プライマー１０−１５（配列番号１）、２００ｎＭのＰ１０−７４（配列番号１０）、および４００ｎＭのＦ１０−７３（配列番号９）、２００μＭのｄＮＴＰ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および０．１ｎｇのλＤＮＡを含んだ。ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムシステムで、以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を実施した：９４℃で２分間を１サイクル、続いて９４℃で１５秒間および６６℃で１分２０秒間を５０サイクル、および６０℃で１０秒間の「読み取り」サイクル。一部の反応には、０．２単位のＶｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼも補充した。
結果
【０１７５】
増幅リアルタイムＰＣＲ曲線を図１７に示す。蛍光体標識Ｐ１０−７４を用いたアッセイは、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼを加えることでやや向上した適度に強いシグナルを生成した。
結論
【０１７６】
標識およびクエンチャーを含むＰ１０−７４／Ｆ１０−７３対を用いたｑＰＣＲアッセイは、それぞれ診断用途の新規の手段となる。
（実施例５）
蛍光体標識プライマーの組み合わせおよびユバーサルクエンチャーを用いたｑＰＣＲアッセイ
材料
【０１７７】
基質：λＤＮＡ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｎ３０１１Ｓ
【０１７８】
３’蛍光体標識および保護された結合を含むＰ１０−１０４（配列番号１３）（すなわち、「標識を含む第１のポリヌクレオチド」）、
【０１７９】
Ｆ１０−７９（配列番号１１）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
【０１８０】
クエンチャーオリゴヌクレオチド１０−８０（配列番号１２）（すなわち、「ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチド」）、
【０１８１】
順方向プライマー１０−１５（配列番号１）、
【０１８２】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０３２０Ｌ
【０１８３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３、２５℃
【０１８４】
Ｖｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０２５７Ｌ
【０１８５】
ｄＮＴＰ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１０２９７０１８
方法
【０１８６】
増幅は、１２．５μＬの２×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭの従来型順方向プライマー１０−１５（配列番号１）、２００ｎＭのＰ１０−１０４（配列番号１３）、４００ｎＭのＦ１０−７９（配列番号１１）、６００ｎＭのクエンチャー１０−８０（配列番号１２）、２００μＭのｄＮＴＰ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および０．１ｎｇのλＤＮＡを含む２５μＬ容量の一定分量で３回実施した。ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムシステムで、以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を実施した：９４℃で２分間を１サイクル、続いて９４℃で１５秒間および６６℃で１分２０秒間を５０サイクル、および６０℃で１０秒間の「読み取り」サイクル。一部の反応には、０．２単位のＶｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼも補充した。
結果  
【０１８７】
平均増幅リアルタイムＰＣＲ曲線を図１８に示す。蛍光体標識Ｐ１０−１０４およびユニバーサルクエンチャーオリゴヌクレオチド１０−８０を用いたアッセイは、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼを加えることで著しく向上した強いシグナルを生成した。
結論
【０１８８】
蛍光体標識Ｐ１０−１０４およびユニバーサルクエンチャーを用いたｑＰＣＲアッセイは、診断用途の新規のｑＰＣＲ手段となる。これは、ユニバーサルクエンチャー分子を使用するため、実施例４に記載の方法よりも多重アッセイの設計が安価である。
（実施例６）
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ染料を用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異アッセイ
材料
【０１８９】
０．１×ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０
【０１９０】
ゲノムＤＮＡ単離キット：Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  ＃６９５０４
【０１９１】
野生型ヒトゲノムＤＮＡ鋳型：プロメガヒトゲノムＤＮＡ  ＃Ｇ１４７１
【０１９２】
変異鋳型：採取したばかりのＳＷ４８０結腸直腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２８）から単離した（Ｇ１２Ｖ）ゲノムＤＮＡ
【０１９３】
オリゴヌクレオチド：
【０１９４】
ｋｒａｓ  従来型順方向プライマー１０−５３（配列番号６）、
【０１９５】
ｋｒａｓ  Ｇ１２Ｖ従来型逆方向プライマー１０−４８（配列番号５），
【０１９６】
ｋｒａｓ  Ｐ１０−５６（配列番号８）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）、
【０１９７】
ｋｒａｓ  Ｆ１０−５４（配列番号７）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
【０１９８】
リアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲミックス：ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＃１７０−８８８２
方法
【０１９９】
ゲノムＤＮＡ単離：製造業者の手順に従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いて、Ｋｒａｓ  Ｇ１２ＶヒトゲノムＤＮＡを採取したばかりのＳＷ４８０細胞から単離し、０．１×ＴＥ緩衝液に濃度１００ｎｇ／μＬで再懸濁させ、一定分量に分け、−２０℃で使用まで保管した。
【０２００】
鋳型調製：リアルタイムＰＣＲ反応用のゲノムＤＮＡ鋳型を生成するために、変異体ｋｒａｓのコピー数が５０ｎｇの全ＤＮＡ当たり１〜１４，０００コピーで変化するように、プロメガ野生型ゲノムＤＮＡに指定量のｋｒａｓ  Ｇ１２ＶゲノムＤＮＡを添加し、次いで鋳型ＤＮＡを一定分量に分け、使用まで−２０℃で保存した。
【０２０１】
リアルタイム増幅反応：増幅は、１２．５μＬの２×ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの順方向プライマー１０−５３（配列番号６）、２００ｎＭの従来のＰＣＲ反応用の従来型逆方向プライマー１０−４８（配列番号５）または２００ｎＭのｋｒａｓ  Ｐ１０−５６（配列番号８）、およびプライマーの組み合わせを用いる増幅反応用の４００ｎＭのｋｒａｓ  Ｆ１０−５４（配列番号７）、ならびに５０ｎｇの鋳型ＤＮＡからなる２５μＬの一定分量で、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して３回実施した。以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を行った：９４℃で３分間を１サイクル、続いて９４℃で１５秒間および６６℃で１分２０秒間を６０サイクル。
結果
【０２０２】
５０％（変異ＤＮＡコピー７，０００個）、１０％（変異ＤＮＡコピー１，４００個）、１％（変異ＤＮＡコピー１４０個）、０．１％（変異ＤＮＡコピー１４個）、０．０１％（変異ＤＮＡコピー１個）、および０％の変異対立遺伝子Ｇ１２Ｖを含む５０ｎｇの正常ＤＮＡ試料のプライマーの組み合わせを用いた平均ｑＰＣＲ曲線を図１９Ａに示す。図１９Ｂは、従来型プライマーを用いた、同じＤＮＡ試料の分析を示す。いずれの場合も、プライマーは、ｋｒａｓ  Ｐ１０−５６または従来型プライマーの３’末端に位置する塩基によるミスマッチを識別するように設計した。
結論
【０２０３】
プライマーの組み合わせを用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異アッセイは、１４，０００個の正常ＤＮＡ配列の混合物中に存在する単一コピー変異対立遺伝子を検出できたが（０．０１％）、従来型プライマーを用いたアッセイは、１４０コピーの変異ＤＮＡの検出（１％）に限定された。プライマーの組み合わせを希少変異の検出に用いた場合、従来型プライマーと比較して、感度が１００倍改善された。単一変異対立遺伝子に由来するシグナルをバックグラウンドから識別することができる（２〜３サイクル差）。
（実施例７）
固定試料を用いた、プライマーの組み合わせおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎを使用する変異の検出
材料
【０２０４】
野生型ｋｒａｓ  ＨＴ２９結腸直腸腺癌細胞ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−３８
【０２０５】
採取したばかりのＳＷ４８０  結腸直腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２８）からＧ１２ＶゲノムＤＮＡを単離した。
方法  
【０２０６】
細胞固定：ＨＴ２９細胞（ｋｒａｓ野生型ＤＮＡの供給源）またはＳＷ４８０細胞（ｋｒａｓ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡの供給源）をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルムアルデヒドを用いて１０分間室温で固定し、ＰＢＳでさらに４回洗浄した。最終洗浄後、実施例５に記載の手順に従って、細胞ペレットを使用してＤＮＡを単離した。
【０２０７】
鋳型調製およびＤＮＡ増幅：実施例５の記載と同様。
結果  
【０２０８】
１００％（変異ＤＮＡコピー１４，０００個）、５０％（変異ＤＮＡコピー７，０００個）、１０％（変異ＤＮＡコピー１，４００個）、１％（変異ＤＮＡコピー１４０個）、０．１％（変異ＤＮＡコピー１４個）、０．０１％（変異ＤＮＡコピー１個）、および０％の変異対立遺伝子Ｇ１２Ｖを含む固定ＤＮＡ試料のプライマーの組み合わせを用いた平均ｑＰＣＲ曲線を図２０に示す。非固定試料での結果と同様に、検出限界は０．０１％すなわち１変異ＤＮＡ分子であった。
結論
【０２０９】
プライマーの組み合わせを用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異ｑＰＣＲアッセイの感度および選択性は、細胞固定の影響を受けず、実際の臨床試料でのこのアッセイの有用性を示唆した。単一変異対立遺伝子に由来するシグナルをバックグラウンドから識別することができる（３サイクル差）。
（実施例８）
プライマーの組み合わせおよびプローブポリヌクレオチドを用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアッセイ
材料
【０２１０】
鋳型ＤＮＡ：
【０２１１】
プロメガ＃Ｇ１４７１の野生型ヒトゲノムＤＮＡ、ＳＷ４８０細胞から単離した変異Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（実施例６を参照）。
【０２１２】
オリゴ：
【０２１３】
ｋｒａｓ従来型順方向プライマー１０−１７８（配列番号１６）、
【０２１４】
ｋｒａｓ  Ｇ１２Ｖ  Ｐ１０−１７１（配列番号１４）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）、
【０２１５】
ｋｒａｓ  Ｆ１０−１７４（配列番号１５）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
【０２１６】
ｋｒａｓ特異的Ｚｅｎ二重消光プローブ１０−１８５（配列番号１９）（すなわち、「標識とクエンチャーとを含むプローブポリヌクレオチド」）。
【０２１７】
リアルタイムｑＰＣＲ混合物：ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＃１７０−８８６２。
方法
【０２１８】
リアルタイム増幅反応：増幅は、１２．５μＬの２×ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの順方向プライマー１０−１７８（配列番号１６）、２００ｎＭのｋｒａｓ  Ｇ１２Ｖ  Ｐ１０−１７１（配列番号１４）、４００ｎＭのｋｒａｓ  Ｆ１０−１７４（配列番号１５）、２５０ｎＭのプローブ１０−１８５（配列番号１９）、および５０ｎｇの鋳型ＤＮＡからなる２５μＬの一定分量で、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して３回実施した。以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を行った：９４℃で３分間を１サイクル、続いて９４℃で１０秒間および６６．５℃で１分２０秒間を６０サイクル。
結果
【０２１９】
１００％（変異ＤＮＡコピー１４，０００個）、５０％（変異ＤＮＡコピー７，０００個）、１０％（変異ＤＮＡコピー１，４００個）、１％（変異ＤＮＡコピー１４０個）、０．１％（変異ＤＮＡコピー１４個）、０．０１％（変異ＤＮＡコピー１個）、および０％の変異対立遺伝子Ｇ１２Ｖを含むＤＮＡ試料のプライマーの組み合わせを用いた平均ｑＰＣＲ曲線を図２１に示す。実施例６および７に記載した結果と同様に、プローブポリヌクレオチドを用いた検出限界は０．０１％、すなわち１変異ＤＮＡ分子であった。シグナル強度は、少量の変異ＤＮＡ（０．１％および０．０１％）で減少した。
結論
【０２２０】
プライマーの組み合わせを用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異ｑＰＣＲアッセイの感度は、プローブポリヌクレオチドの使用から著しくは改善しなかった。単一変異対立遺伝子に由来するシグナルをバックグラウンドから識別することができ（６５サイクルまで平坦線）、プローブポリヌクレオチドを含むアッセイで感度がより良好なことを示した。
（実施例９）
プライマーの組み合わせ、プローブポリヌクレオチド、およびブロッカーポリヌクレオチドを用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアッセイ
材料
【０２２１】
鋳型ＤＮＡ：
【０２２２】
プロメガ＃Ｇ１４７１の野生型ヒトゲノムＤＮＡ、ＳＷ４８０細胞から単離した変異Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（実施例６を参照）。
【０２２３】
オリゴ：
【０２２４】
ｋｒａｓ  Ｐ１０−１８４（配列番号１８）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）、
【０２２５】
ｋｒａｓ  Ｆ１０−１８２（配列番号１７）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
【０２２６】
ｋｒａｓ特異的Ｚｅｎ二重消光プローブ１０−２１０（配列番号２１）（すなわち、「プローブポリヌクレオチド」）、
【０２２７】
ｋｒａｓ従来型逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）、（すなわち、「逆方向プライマー」）
【０２２８】
ブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）（すなわち、「ブロッカーポリヌクレオチド」）
【０２２９】
リアルタイムｑＰＣＲミックス：ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＃１７０−８８６２
方法
【０２３０】
リアルタイム増幅反応：増幅は、１２．５μＬの２×ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２００ｎＭのｋｒａｓ  Ｐ１０−１８４（配列番号１８）、５０ｎＭのｋｒａｓ  Ｆ１０−１８２（配列番号１７）、２００ｎＭの逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）、２５０ｎＭのプローブポリヌクレオチド１０−２１０（配列番号２１）、２０００ｎＭのブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）、および５０ｎｇの鋳型ＤＮＡからなる２５μＬの一定分量で、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して３回実施した。以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を行った：９４℃で３分間を１サイクル、続いて９４℃で１０秒間および６５℃で１分間を６０サイクル。
結果
【０２３１】
１００％（変異ＤＮＡコピー１４，０００個）、５０％（変異ＤＮＡコピー７，０００個）、１０％（変異ＤＮＡコピー１，４００個）、１％（変異ＤＮＡコピー１４０個）、０．１％（変異ＤＮＡコピー１４個）、０．０１％（変異ＤＮＡコピー１個）、および０％の変異対立遺伝子Ｇ１２Ｖを含むＤＮＡ試料のプライマーの組み合わせを用いた平均ｑＰＣＲ曲線を図２２に示す。
結論
【０２３２】
ブロッカーオリゴヌクレオチド１０−２１３（配列番号２２）（プローブポリヌクレオチドとの組み合わせで）の添加は、アッセイの特性を著しく改善した。実施例４、５、および６に記載の結果と同様に、ＴａｑＭａｎプローブおよびブロッカーを用いた検出限界は０．０１％、すなわち１変異ＤＮＡ分子であったが、単一変異対立遺伝子の検出感度が実施例６に記載のアッセイよりも約１００〜１０００倍改善された（単一変異コピーと１４，０００個の正常ＤＮＡ分子に由来するバックグラウンドとは５〜７サイクル差）。
（実施例１０）
プローブポリヌクレオチド、ブロッカーポリヌクレオチド、および３’側塩基ＬＮＡ修飾を含むプライマーの組み合わせを用いたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアッセイ
材料
【０２３３】
鋳型ＤＮＡ：
【０２３４】
プロメガ＃Ｇ１４７１の野生型ヒトゲノムＤＮＡ、ＳＷ４８０細胞から単離した変異Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ（実施例６を参照）。
【０２３５】
オリゴ：
【０２３６】
３’ＬＮＡを含むｋｒａｓ  Ｐ１０−２３６（配列番号２３）（すなわち、「３’末端にロックド核酸を含む第１のポリヌクレオチド」）、
【０２３７】
ｋｒａｓ  Ｆ１０−１８２（配列番号１７）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
【０２３８】
ｋｒａｓ特異的Ｚｅｎ二重消光プローブ１０−２１０（配列番号２１）（すなわち、「プローブポリヌクレオチド」）、
【０２３９】
ｋｒａｓ従来型逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）（すなわち、「逆方向プライマー」）、
【０２４０】
ブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）（すなわち、「ブロッカーポリヌクレオチド」）
【０２４１】
リアルタイムｑＰＣＲ混合物：ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＃１７０−８８６２
方法
【０２４２】
リアルタイム増幅反応：増幅は、１２．５μＬの２×ＢｉｏＲａｄ  ＩＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２００ｎＭのｋｒａｓ  Ｐ１０−２３６（配列番号２３）、５０ｎＭのｋｒａｓ  Ｆ１０−１８２（配列番号１７）、２００ｎＭの逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）、２５０ｎＭのプローブポリヌクレオチド１０−２１０（配列番号２１）、２０００ｎＭのブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）、および５０ｎｇの鋳型ＤＮＡからなる２５μＬ容量で、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して３回実施した。以下の熱サイクルプロファイルを用いて増幅を行った：９４℃で３分間を１サイクル、続いて９４℃で１０秒間および６５℃で１分間を６０サイクル。
結果
【０２４３】
１％（変異ＤＮＡコピー１４０個）および０％の変異対立遺伝子Ｇ１２Ｖを含むＤＮＡ試料のプライマーの組み合わせを用いた平均ｑＰＣＲ曲線を図２３に示す。
結論
【０２４４】
プローブポリヌクレオチド、ブロッカーポリヌクレオチド、およびＰ１０−２３６の３’側塩基ＬＮＡ修飾を含むプライマーの組み合わせを用いたＫＲＡＳ  ｇ１２Ｖアッセイは、先述の実施例と比較して、最良の感度（単一変異対立遺伝子）および最良の選択性（１４，０００個の野生型ＤＮＡ分子からのシグナルなし）を示した。
（実施例１１）
改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアッセイを用いた、野生型ＤＮＡ１４，０００コピー当たりＧ１２Ｖ  ＤＮＡ０．５コピーでの単一変異検出：１６試料の分析
材料
【０２４５】
実施例１０と同じ。
方法
【０２４６】
鋳型調製：
【０２４７】
０．５コピーのＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ鋳型を生成するために、あらかじめ単離したＳＷ４８０ゲノムＤＮＡを１０ｎｇ／μＬのプロメガヒトゲノムＤＮＡで希釈して、最終濃度を野生型ＤＮＡ１０μＬ当たりＳＷ４８０  ＤＮＡ分子１個とした。
【０２４８】
リアルタイム増幅反応：
【０２４９】
増幅は、実施例１０に記載の増幅混合組成物および手順を用いて、５μＬの０．５コピーのＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＤＮＡ鋳型または野生型ＤＮＡを含む一定分量で１６回実施した。
結果
【０２５０】
実施例１０の改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｑＰＣＲ変異アッセイ、および１４，０００コピーの野生型ＤＮＡ当たり０．５コピーのＧ１２Ｖ  ＤＮＡを（統計的に）含む試料を用いた１６回の反復実験を図２４Ａ〜Ｄに示す。スパイクおよび希釈したＤＮＡ試料の５０〜６０％（１６試料中８〜１０試料）は単一変異ＤＮＡの存在を示し、スパイクおよび希釈したＤＮＡ試料の４０〜５０％（１６試料中６〜８試料）は、統計的予想と一致してシグナルを示さなかった。
【０２５１】
実施例１０の改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｑＰＣＲ変異アッセイ、および１４，０００コピーの野生型ＤＮＡを含む試料（変異ＤＮＡは付加せず）を用いた１６回の反復実験を図２４Ｅ〜Ｈに示す。野生型ＤＮＡ試料の９４％（１６試料中１５試料）はシグナルを示さず、改善されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖプライマーの組み合わせを用いたｑＰＣＲ変異アッセイによる単一変異ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆した。
結論
【０２５２】
プローブポリヌクレオチド、ブロッカー、および３’側修飾ＬＮＡ塩基を含むプライマーの組み合わせを用いたＧ１２Ｖアッセイは、１０，０００個を上回る非変異ＤＮＡ分子中の単一変異対立遺伝子中の検出で、感度１００％および選択性９４〜１００％を有した。Ｇ１２Ｖアッセイのこのようなパラメータは、診断アッセイの最も要求の厳しい特性を満たす。このアッセイは、ＣＲＣおよびＮＳＣＬＣ患者の有効かつ非侵襲的な管理のための、血液中を循環する希少な癌細胞の検出に理想的に適している。
【０２５３】
１４，０００コピーの野生型ＤＮＡとの混合物中に１４０コピーの変異ＤＮＡ構築物を含む鋳型混合物を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子座の７個の変異（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、およびＧ１２Ｖ）それぞれに、個別にさらなるアッセイを実施した。各ＫＲＡＳ反応に使用したプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入したもので、これらを下記の表１に示す。
【表１】
2014507149.tif 000002
【０２５４】
表１の各プライマーの配列を下記の表２に示す。
【表２】
2014507149.tif 000003
【０２５５】
結果は、プライマーの組み合わせが、いずれの場合にも高度な感度で変異ＤＮＡを検出することができたことを示し、また野生型ＤＮＡと比較して、顕著かつ特異的な変異ＤＮＡの増幅を実証した。さらに、変異ＤＮＡの増幅は、野生型ＤＮＡと比較して、より少ない回数の増幅後に検出可能であった。場合によっては、変異ＤＮＡの最大増幅は、サイクル４５またはその前後に生じたが、野生型ＤＮＡの最大増幅は、あるとすればサイクル５５またはその前後に生じた。
【０２５６】
ＢＲＡＦ遺伝子座に同様のアッセイを実施した。ｑＰＣＲおよび本明細書において開示されるプライマーの組み合わせを用いたＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ／Ｋ変異ＤＮＡの検出を実施したが、結果はＫＲＡＳ遺伝子座について得られた結果と類似していた。このＢＲＡＦ  ｑＰＣＲアッセイで使用したプライマー配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入したもので、これらを下記の表３に示す。
【表３】
2014507149.tif 000004
【０２５７】
ＢＲＡＦにおける癌変異を単一変異コピー感度および高特異性で検出した。鋳型として単離した変異ＤＮＡおよび野生型ＤＮＡを用いた実験の結果は、本明細書において開示されるプライマーの組み合わせを用いて、わずか１個のＤＮＡの変異コピーを検出できることを示唆したが、同じ反応混合物中で１４，０００コピーの野生型ＤＮＡからはシグナルは得られなかった。固定（ホルマリンで固定しパラフィンで包埋した（ＦＦＰＥ））メラノーマ試料中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ／Ｋ変異の検出時にも同様の結果が得られた。
【図１】
2014507149.tif 000005
【図２】
2014507149.tif 000006
【図３】
2014507149.tif 000007
【図４】
2014507149.tif 000008
【図５】
2014507149.tif 000009
【図６】
2014507149.tif 000010
【図７Ａ】
2014507149.tif 000011
【図７Ｂ】
2014507149.tif 000012
【図７Ｃ】
2014507149.tif 000013
【図７Ｄ】
2014507149.tif 000014
【図７Ｅ】
2014507149.tif 000015
【図７Ｆ】
2014507149.tif 000016
【図８Ａ】
2014507149.tif 000017
【図８Ｂ】
2014507149.tif 000018
【図９Ａ】
2014507149.tif 000019
【図９Ｂ】
2014507149.tif 000020
【図９Ｃ】
2014507149.tif 000021
【図９Ｄ】
2014507149.tif 000022
【図１０】
2014507149.tif 000023
【図１１】
2014507149.tif 000024
【図１２】
2014507149.tif 000025
【図１３Ａ】
2014507149.tif 000026
【図１３Ｂ】
2014507149.tif 000027
【図１３Ｃ】
2014507149.tif 000028
【図１４】
2014507149.tif 000029
【図１５】
2014507149.tif 000030
【図１６】
2014507149.tif 000031
【図１７】
2014507149.tif 000032
【図１８】
2014507149.tif 000033
【図１９Ａ】
2014507149.tif 000034
【図１９Ｂ】
2014507149.tif 000035
【図２０】
2014507149.tif 000036
【図２１】
2014507149.tif 000037
【図２２】
2014507149.tif 000038
【図２３】
2014507149.tif 000039
【図２４Ａ】
2014507149.tif 000040
【図２４Ｂ】
2014507149.tif 000041
【図２４Ｃ】
2014507149.tif 000042
【図２４Ｄ】
2014507149.tif 000043
【図２４Ｅ】
2014507149.tif 000044
【図２４Ｆ】
2014507149.tif 000045
【図２４Ｇ】
2014507149.tif 000046
【図２４Ｈ】
2014507149.tif 000047
【配列表】
2014507149000001.app
【国際調査報告】
2014507149.tif 000048
2014507149.tif 000049