(57)【要約】  本発明は生体分子の精製のための新規かつ改良された方法に関する。特に、本発明は、少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を含む又は少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのアニオン基を含む小分子を使用するタンパク質精製方法に関する。
2014527528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の１以上の不溶性不純物から標的生体分子を分離する方法であって、
（ｉ）関心のある標的生体分子および１以上の不溶性不純物を含むサンプルを準備し、
（ｉｉ）１以上の不溶性不純物を含む沈殿物を形成するのに十分な量の、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と、サンプルを接触させ、
（ｉｉｉ）サンプルから沈殿物を除去し、それにより１以上の不溶性不純物から標的分子を分離する工程を含む、サンプル中の１以上の不溶性不純物から標的生体分子を分離する、前記方法。
【請求項２】
無極性基が、芳香族である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
無極性基が、脂肪族である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１以上の不溶性不純物が、全細胞および細胞残屑から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
小分子が、モノアルキルトリメチルアンモニウム塩、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、ヘテロ芳香族アンモニウム塩、多置換第四級アンモニウム塩およびビス−第四級アンモニウム塩からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
モノアルキルトリメチルアンモニウム塩が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリールトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミンクロリド、ヘキサデシルアミンブロミド、ドデシルアミン、ドデシルクロリド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミドおよびセチルジメチルエチルアンモニウムクロリドからなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩が、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドおよび塩化ベンゼトニウムからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ジアルキルジメチルアンモニウム塩が、ドミフェンブロミド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、オクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリドおよびオクチルドデシルジメチルアンモニウムブロミドからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
ヘテロ芳香族アンモニウム塩が、セチルピリジウムクロリド、セチルピリジウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、シス−異性体１−［３−クロロアリル］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミドおよびアルキルジメチルナフチルメチルアンモニウムクロリドからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
多置換第四級アンモニウム塩が、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリナートおよびアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファマートからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
小分子が、塩化ベンゼトニウムである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）において加える小分子の量が、０．０１〜２．０％（重量／容量）の範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉ）において小分子を溶液形態で１〜２００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で加える、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
１以上の不溶性不純物の沈殿を２〜９の範囲のｐＨで行う、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉｉ）における沈殿物の除去が、濾過の使用を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉｉ）における沈殿物の除去が、遠心分離の使用を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
沈殿物の除去の後に標的生体分子を含有するサンプルから残留量の小分子を除去する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
残留量の小分子を除去する工程が、サンプルをポリアニオンと接触させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
残留量の小分子を除去する工程が、サンプルを吸着材と接触させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
残留量の小分子を除去する工程が、サンプルを活性炭と接触させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）標的分子を含む沈殿物を形成するのに十分な量の、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と、サンプルを接触させ、
（ｉｉ）沈殿物を回収し、それにより１以上の可溶性不純物から標的生体分子を分離する工程を含む、１以上の可溶性不純物と共に標的分子を含むサンプルから標的生体分子を精製する方法。
【請求項２２】
無極性基が、芳香族である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
無極性基が、脂肪族である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）の前にサンプルを清澄化工程に付す、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
清澄化工程が、濾過の使用を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
清澄化工程が、遠心分離の使用を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
清澄化工程が、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子とサンプルを接触させることを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
小分子が、プテリン誘導体、エタクリン酸、フェノフィブリン酸、メフェナム酸、ミコフェノール酸、トラネキサム酸、ゾレドロン酸、アセチルサリチル酸、アルサニル酸、セフチオフル酸、メクロフェナム酸、イブプロフィン、ナプロキセン、フシジン酸、ナリジクス酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、チアプロフェン酸、ニフルム酸、トランス−２−ヒドロキシケイ皮酸、３−フェニルプロピオン酸、プロベネシド、クロラゼパート、イコサペント、４−アセトアミド安息香酸、ケトプロフェン、トレチノイン、アデニロコハク酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、タミバロテン、エトドラセトドール酸およびベンジルペニシリン酸からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
プテリン誘導体が、葉酸およびプテロイン酸から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
小分子が、葉酸またはその誘導体である、請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
小分子が、染料分子である、請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
染料分子が、アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）またはニトロレッド（Ｎｉｔｒｏ  ｒｅｄ）である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
小分子を０．００１％〜５．０％の範囲の濃度まで加える、請求項２１記載の方法。
【請求項３４】
小分子の添加の前にサンプルのｐＨを調節する、請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
沈殿を２〜９の範囲のｐＨで行う、請求項２１記載の方法。
【請求項３６】
沈殿物中に存在する標的生体分子の量が、サンプル中の初期標的生体分子量の少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％またはそれ以上である、請求項２１記載の方法。
【請求項３７】
沈殿物における不純物の濃度が、サンプルに存在する初期不純物の濃度の５０％未満または４０％未満または３０％未満または２０％未満または１５％未満または１０％未満または５％未満である、請求項２１記載の方法。
【請求項３８】
標的生体分子を含む沈殿物を、適当なバッファーに溶解する工程を更に含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３９】
バッファーが、４．５〜１０の範囲のｐＨを含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
１以上のクロマトグラフィー工程を更に含む、請求項２１記載の方法。
【請求項４１】
１以上のクロマトグラフィー工程が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
標的生体分子が、組換えタンパク質、抗体またはその機能的フラグメント、ＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質およびイムノアドヘシン分子からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
標的生体分子が、組換えタンパク質、抗体またはその機能的フラグメント、ＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質およびイムノアドヘシン分子からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項４４】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および多重特異性抗体から選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
標的生体分子が、哺乳類細胞における発現により産生される、請求項１記載の方法。
【請求項４６】
標的生体分子が、非哺乳類細胞における発現により産生される、請求項１記載の方法。
【請求項４７】
標的生体分子が、哺乳類細胞における発現により産生される、請求項２１記載の方法。
【請求項４８】
標的生体分子が、非哺乳類細胞における発現により産生される、請求項２１記載の方法。
【請求項４９】
サンプル中の抗体を精製する方法であって、
（ｉ）抗体および１以上の不溶性不純物を含むサンプルを準備し、
（ｉｉ）抗体を含む液相および１以上の不溶性不純物を含む沈殿物を形成するのに十分な量の、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と、サンプルを接触させ、
（ｉｉｉ）液相を少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に付し、それにより抗体を精製する工程を含む、前記方法。
【請求項５０】
１以上のスタティックミキサを使用して小分子をサンプルに加える、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つのクロマトグラフィー工程が、アフィニティクロマトグラフィー工程である、請求項４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子の精製のための新規なかつ改良された方法に関する。特に、本発明は、小分子を使用するタンパク質精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、特に組換え治療用タンパク質のような生体分子の製造のための一般的方法は、２つの主要工程、すなわち、（１）宿主細胞におけるタンパク質の発現、および（２）タンパク質の精製を含む。第１工程は、一般に、関心のあるタンパク質の発現を促進するバイオリアクター内で所望の宿主細胞を増殖させることを含む。タンパク質が所望のレベルで発現されたら、タンパク質を宿主細胞から取り出し、回収する。細胞、細胞断片、脂質および他の不溶物のような懸濁物は、典型的には、濾過または遠心分離によりタンパク質含有流体から除去され、種々の可溶性不純物と共に、関心のあるタンパク質を溶液中に含有する清澄化流体が得られる。
【０００３】
第２工程は、一般に、可溶性不純物を除去するための回収タンパク質の精製を含む。可溶性不純物の例には、宿主細胞タンパク質（一般にＨＣＰと称され、所望の又は標的化タンパク質以外の細胞タンパク質である）、核酸、内毒素、ウイルス、タンパク質、変異体およびタンパク質凝集物が含まれる。
【０００４】
この精製は、典型的に、幾つかのクロマトグラフィー工程を含み、これは、結合および溶出疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；フロースルー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＦＴＨＩＣ）；混合モードクロマトグラフィー技術、例えば、結合および溶出弱カチオンおよびアニオン交換、結合および溶出疎水性およびイオン交換相互作用ならびにフロースロー疎水性およびイオン交換混合モード相互作用（ＦＴＭＭ）（これらは共に、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＣ、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ΡΡＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌのような樹脂を使用しうる）の１以上を含みうる。
【０００５】
近年、タンパク質を精製するための他の代替方法が研究されており、１つのそのような方法は凝集技術を含む。この技術においては、懸濁物および可溶性不純物の一部を捕捉して凝集物を形成させるために、可溶性高分子電解質を未清澄化細胞培養ブロスに加え、ついで該凝集物を濾過または遠心分離によりタンパク質溶液から除去する。
【０００６】
あるいは、可溶性高分子電解質を清澄化細胞培養ブロスに加えて、関心のあるタンパク質を捕捉し、それにより凝集物を形成させ、これを沈殿させ、ついで該溶液の残部から単離することが可能である。典型的には、該凝集物を洗浄して、ゆるく付着した不純物を除去する。ついで溶液のイオン強度の上昇が高分子電解質からの標的タンパク質の解離を招き、ついでタンパク質含有溶液への高分子電解質の可溶化を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この凝集技術の主な欠点は、それにおいて使用される必要のある重合体（高分子）が最終的に標的タンパク質と一緒になる可能性があり、毒性であり、および／または患者の体から容易に消失しない可能性があり、１回使用の適用であるため潜在的に高価であり、しばしば合成を要するため容易には入手できないことである。
【０００８】
本発明は、それほど毒性ではなく、取扱い易く、容易に入手可能である物質を使用する、生体分子の改良された精製方法を提供する。更に、幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、高価な試薬およびクロマトグラフィー工程、例えばプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用する必要がない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、関心のある生体分子、例えば標的分子、例えばモノクローナル抗体に結合（「捕捉」と称されるプロセス）しうる或る小分子の使用方法、および不純物から標的タンパク質を分離または精製するための、生体物質含有流体中の可溶性または不溶性不純物、例えば宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、全細胞、細胞残屑、内毒素などに結合する小分子の使用方法に関する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている方法は、関心のあるタンパク質を含有するサンプルからの不溶性不純物の除去（「清澄化」と称されるプロセス）において特に有用である。
【００１０】
幾つかの実施形態においては、本発明はサンプル中の抗体の精製方法に関する。該方法は、（ｉ）抗体および１以上の不溶性不純物を含むサンプルを準備し、（ｉｉ）抗体を含む液相および１以上の不溶性不純物を含む沈殿物を形成するのに十分な量の、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と、サンプルを接触させ、（ｉｉｉ）液相を少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に付し、それにより標的分子を分離する工程を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程はアフィニティクロマトグラフィー工程である。特定の実施形態においては、アフィニティクロマトグラフィー工程は、プロテインＡに基づくアフィニティリガンドの使用を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態においては、小分子は、芳香族である無極性基を含む。他の実施形態においては、小分子は、脂肪族である無極性基を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態においては、１以上の不溶性不純物は細胞である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子は、モノアルキルトリメチルアンモニウム塩（非限定的な例には、セチルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリールトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミンクロリドまたはブロミド、ドデシルアミンまたはクロリド、およびセチルジメチルエチルアンモニウムブロミドまたはクロリドが含まれる）、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩（非限定的な例には、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドおよび塩化ベンゼトニウムが含まれる）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（非限定的な例には、ドミフェンブロミド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリドまたはブロミドおよびオクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリドまたはブロミドが含まれる）、ヘテロ芳香族アンモニウム塩（非限定的な例には、ハロゲン化セチルピリジウム（塩化物または臭化物塩）およびヘキサデシルピリジニウムブロミドまたはクロリド、シス−異性体１−［３−クロロアリル］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミドおよびアルキルジメチルナフチルメチルアンモニウムクロリドが含まれる）、多置換第四級アンモニウム塩（非限定的な例には、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリナートおよびアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファマートが含まれる）およびビス−第四級アンモニウム塩（非限定的な例には１，１０−ビス（２−メチル−４−アミノキノリニウムクロリド）−デカン、１，６−ビス｛１−メチル−３−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）−プロピルジメチルアンモニウムクロリド｝ヘキサンまたはトリクロビソニウムクロリド、およびＢｕｃｋｍａｎ  ＢｒｏｃｈｕｒｅｓによりＣＤＱと称されているビス−クアット（ｂｉｓ−ｑｕａｔ）が含まれる）からなる群から選択される。
【００１４】
特定の実施形態においては、小分子は塩化ベンゼトニウムである。
【００１５】
本発明の方法の幾つかの実施形態においては、１以上の不溶性不純物を沈殿させるために、０．０１〜２．０％（重量／容量）の小分子をサンプルに加える。幾つかの実施形態においては、タンパク質精製プロセスにおいて用いられる清澄化プロセス工程中に、そのような小分子を使用する。幾つかの実施形態においては、そのようなプロセスは連続的プロセスである。
【００１６】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている１以上の小分子はタンパク質精製プロセスの清澄化工程中に使用され、この場合、そのような小分子は、１以上の不純物を沈殿させるために、細胞培養物を含有するバイオリアクターに直接的に加えられうる。他の実施形態においては、本明細書に記載されている１以上の小分子は、例えば本明細書中の実施例に記載されているとおり、精製プロセスにおける１以上の他のプロセス工程中に使用されうる。
【００１７】
幾つかの実施形態においては、加えられる小分子の量は、溶液形態中で１〜２００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する。
【００１８】
幾つかの実施形態においては、沈殿工程は２〜９の範囲のｐＨで行われる。
【００１９】
幾つかの実施形態においては、沈殿物は濾過（例えば、デプス濾過）によりサンプルから除去される。他の実施形態においては、沈殿物は遠心分離によりサンプルから除去される。
【００２０】
幾つかの実施形態においては、１以上の不溶性不純物から標的生体分子を分離する方法は、残留量の小分子をサンプルから除去する工程を更に含む。幾つかの実施形態においては、そのような工程は、回収された溶液をポリアニオンまたは吸着材と接触させて、残留量の小分子を除去することを含む。特定の実施形態においては、そのような工程は、残留量の小分子を除去するために活性炭を使用する。
【００２１】
また、１以上の可溶性不純物と共に標的分子を含むサンプルから標的生体分子を精製する方法も本発明に含まれ、該方法は、（ｉ）標的分子を含む沈殿物を形成するのに十分な量の、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子とサンプルを接触させ、（ｉｉ）沈殿物を回収し、それにより１以上の可溶性不純物から標的生体分子を分離する工程を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態においては、小分子は、芳香族である無極性基を含む。他の実施形態においては、小分子は、脂肪族である無極性基を含む。
【００２３】
幾つかの実施形態においては、サンプルを清澄化工程に付した後、それを、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と接触させる。典型的な清澄化技術には、濾過および遠心分離が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
幾つかの実施形態においては、清澄化は、前記のとおり、サンプルを、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と接触させることにより達成される。
【００２５】
少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む典型的な小分子には、医薬上適切な化合物、例えばプテリン誘導体（例えば、葉酸、プテロイン酸）、エタクリン酸、フェノフィブリン酸、メフェナム酸、ミコフェノール酸、トラネキサム酸、ゾレドロン酸、アセチルサリチル酸、アルサニル酸、セフチオフル酸、メクロフェナム酸、イブプロフィン、ナプロキセン、フシジン酸、ナリジクス酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、チアプロフェン酸、ニフルム酸、トランス−２−ヒドロキシケイ皮酸、３−フェニルプロピオン酸、プロベネシド、クロラゼパート、イコサペント、４−アセトアミド安息香酸、ケトプロフェン、トレチノイン、アデニロコハク酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、タミバロテン、エトドラセトドール酸（ｅｔｏｄｏｌａｃｅｔｏｄｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびベンジルペニシリン酸が含まれる（例えば、ＤｒｕｇＢａｎｋ  ３．０：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｄｒｕｇｓ．Ｋｎｏｘ  Ｃ，Ｌａｗ  Ｖ，Ｊｅｗｉｓｏｎ  Ｔ，Ｌｉｕ  Ｐ．Ｌｙ  Ｓ．Ｆｒｏｌｋｉｓ  Ａ，Ｐｏｎ  Ａ．Ｂａｎｃｏ  Ｋ．Ｍａｋ  Ｃ，Ｎｅｖｅｕ  Ｖ．Ｄｊｏｕｍｂｏｕ  Ｙ．Ｅｉｓｎｅｒ  Ｒ．Ｇｕｏ  ＡＣ，Ｗｉｓｌｉａｒｔ  ＤＳ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｊａｎ；３９（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ  １０３５−４１．ＰＭＩＤ：２１０５９６８２）を参照されたい）。
【００２６】
特定の実施形態においては、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基（例えば、芳香族基）を含む小分子は葉酸またはその誘導体である。
【００２７】
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子は染料分子である。典型的な染料には、アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）およびニトロレッド（Ｎｉｔｒｏ  ｒｅｄ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
幾つかの実施形態においては、小分子を０．００１％〜５．０％の範囲の濃度まで加える。
【００２９】
幾つかの実施形態においては、小分子の添加の前に、サンプルのｐＨを調節する。
【００３０】
幾つかの実施形態においては、沈殿工程を２〜９の範囲のｐＨで行う。
【００３１】
幾つかの実施形態においては、サンプル中に存在する初期標的生体分子（例えば、標的タンパク質）の量の少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％またはそれ以上を、本発明の方法を用いて沈殿させる。
【００３２】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子を使用する沈殿の後、初期不純物の濃度の５０％未満または４０％未満または３０％未満または２０％未満または１５％未満または１０％未満または５％未満が、関心のある標的生体分子を含む沈殿物中に残存する。しかし、幾つかの場合には、より大きな不純物の濃度が標的生体分子と共に沈殿しうる。
【００３３】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子を使用する標的生体分子の沈殿の後、４．５〜１０の範囲のｐＨを有するバッファーに沈殿物を溶解させる。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、１以上の小分子をサンプルに加えるために、１以上のスタティックミキサを使用する。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、標的生体分子の沈殿の後、標的生体分子を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択されるもう１つのクロマトグラフィー工程に付す。
【００３６】
典型的な標的生体分子には、組換えタンパク質、モノクローナル抗体および機能的フラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、イムノアドヘシン分子およびＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。標的生体分子は、哺乳類発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）または非哺乳類発現系（例えば、細菌、酵母または昆虫細胞）において発現されうる。本明細書に記載されている方法は、哺乳類発現系および非哺乳類発現系を使用して発現されたタンパク質の場合に使用されうる。
【００３７】
本発明は、少なくとも部分的には、関心のある生体分子を精製するためのプロセスにおける或るタイプの小分子の使用の知見に基づくものであり、ここで、該プロセスは１以上の工程を省いており、それにより全体的な実施コストおよび時間を削減する。
【００３８】
更に、本発明は、当技術分野において類似様態で使用される他の試薬と比較して、容易に入手可能であり、治療用分子と最終的に一緒にされる場合に低い毒性である小分子を使用する方法を提供する。また、本明細書に記載されている方法において使用される小分子は高密度供給ストックの加工を可能にし、潜在的に使い捨て可能である。
【００３９】
本開示がより容易に理解されうるように、まず、ある用語を定義する。追加的な定義はこの詳細な説明の全体において記載されている。
【００４０】
Ｉ．定義
本明細書中で用いる「小分子」なる語は、重合体ではない低分子量化合物を意味する。この用語は、約１０，０００ダルトン未満または約９０００ダルトン未満または約８０００ダルトン未満または約７０００ダルトン未満または約６０００ダルトン未満または約５０００ダルトン未満または約４０００ダルトン未満または約３０００ダルトン未満または約２０００ダルトン未満または約１０００ダルトン未満または約９００ダルトン未満または約８００ダルトン未満の分子量を有する分子を含む。小分子には、有機、無機、合成または天然化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載されている種々の実施形態においては、１以上の不純物の沈殿（すなわち、清澄化）または標的生体分子の沈殿（すなわち、捕捉）のために小分子が使用される。幾つかの実施形態においては、本発明の方法において使用される小分子は、不純物（例えば、不溶性不純物）に結合させそれを沈殿させるために使用される。そのような小分子は一般に無極性でありカチオン性である。幾つかの実施形態においては、本発明の方法において使用される小分子は、標的生体分子（例えば、タンパク質産物）に結合させそれを沈殿させるために使用される。そのような小分子は一般に無極性でありアニオン性である。
【００４１】
本明細書中で互換的に用いられる「疎水性」または「無極性」なる語は、水に対するアフィニティをほとんど又は全く有さない化合物または化学基または化学的存在物を意味する。幾つかの実施形態においては、本発明は、本質的に無極性または疎水性である小分子を使用する。幾つかの実施形態においては、無極性化学基または化学的存在物は芳香族である。幾つかの他の実施形態においては、無極性化学基または化学的存在物は脂肪族である。
【００４２】
本明細書中で用いる「アニオン（性）」なる語は、実効負電荷を含有する化合物または化学基または化学的存在物に関するものである。
【００４３】
本明細書中で用いる「カチオン（性）」なる語は、実効正電荷を含有する化合物または化学基または化学的存在物に関するものである。
【００４４】
本明細書中で用いる「芳香族」なる語は、分子の少なくとも一部分が単結合および多重結合の共役系を含有する、そのような分子内の化合物または分子内の化学基または化学的存在物に関するものである。
【００４５】
本明細書中で用いる「脂肪族」なる語は、分子の少なくとも一部分が非環状または環状非芳香族構造を含有する、そのような分子内の化合物または分子内の化学基または化学的存在物に関するものである。
【００４６】
本明細書中で互換的に用いられる「標的生体分子」、「標的タンパク質」、「所望の産物」、「関心のあるタンパク質（対象タンパク質）」または「関心のある産物（対象産物）」なる語は、一般に、関心のあるポリペプチドまたは産物を含有するサンプル中に存在しうる１以上の望ましくない存在物、例えば１以上の可溶性および／または不溶性不純物から精製または分離されることが望まれる、関心のあるポリペプチドまたは産物を意味する。本明細書中で互換的に用いられる「標的生体分子」、「関心のあるタンパク質」、「所望の産物」および「標的タンパク質」は、一般に、本明細書に記載されている方法を用いて精製される抗体（これに限定されるものではない）を含む治療用タンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００４７】
本明細書中で互換的に用いられる「ポリペプチド」または「タンパク質」なる語は、一般に、約１０個を超えるアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を意味する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子は、タンパク質またはポリペプチドと共にサンプル中に存在する１以上の望ましくない存在物から該タンパク質またはポリペプチドを分離するために使用される。幾つかの実施形態においては、そのような１以上の存在物は、精製されるタンパク質またはポリペプチドと共にサンプル中に存在しうる１以上の不純物である。前記のとおり、本明細書に記載されている方法の幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのアニオン基を含む小分子は、標的生体分子を含むサンプル中の１以上の不純物（例えば、不溶性不純物）を沈殿させるために使用される。幾つかの実施形態においては、不溶性不純物は全細胞である。
【００４８】
本明細書に記載されている方法の他の実施形態においては、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子は、標的生体分子および１以上の不純物（例えば、可溶性不純物）を含むサンプルから標的生体分子を沈殿させるために使用される。不純物（可溶性および不溶性）の例には、例えば宿主細胞タンパク質、内毒素、ＤＮＡ、ウイルス、全細胞、細胞残屑および細胞培養添加物などが含まれる。
【００４９】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている方法を用いて精製されるタンパク質またはポリペプチドは哺乳類タンパク質、例えば、治療用タンパク質、または治療において使用されうるタンパク質である。典型的なタンパク質には、例えば以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：レニン；成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子およびホンビルブラント因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム排泄因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲンアクチベータ、例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；主要壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミューレリアン（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ）抑制物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレレキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；Ｄｎアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）または神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子、例えばα−ＦＧＦおよびβ−ＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ、例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦβ４またはＴＧＦ−β５；インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−１（脳ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４およびＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；ウイルス抗原、例えばエイズエンベロープの部分；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；ならびに前記ポリペプチドのいずれかの断片および／または変異体。
【００５０】
更に、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている方法を用いて精製されるタンパク質またはポリペプチドは抗体、その機能性フラグメントまたは変異体である。幾つかの実施形態においては、関心のあるタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含有する組換えタンパク質である。
【００５１】
「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」または「抗体」（本明細書中で互換的に用いられる）なる語は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されている、２本の重鎖と２本の軽鎖とからなる基本的な４本のポリペプチド鎖の構造を有するタンパク質を意味し、これは、抗原に特異的に結合する能力を有する。「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」（本明細書中で互換的に用いられる）なる語は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されている、重鎖と軽鎖とからなる２本のポリペプチド鎖の構造を有するタンパク質を意味し、これは、抗原に特異的に結合する能力を有する。「ドメイン」なる語は、例えばβプリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化された「ペプチドループ」を含む（例えば、３〜４個のペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を意味する。ドメインは更に、本明細書においては、「定常」ドメインの場合の種々のクラスメンバーのドメイン内の配列変異の相対的欠如または「可変」ドメインの場合の種々のクラスメンバーのドメイン内の有意な変異に基づいて、「定常」または「可変」と称される。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、当技術分野においては互換的に、抗体またはポリペプチド「領域」と称される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、互換的に、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、互換的に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、互換的に、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、互換的に、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと称される。
【００５２】
免疫グロブリンまたは抗体はモノクローナル抗体（「ＭＡｂ」と称される）またはポリクローナル抗体であることが可能であり、単量体または多量体形態、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体、および／または単量体、二量体もしくは多量体形態で存在するＩｇＡ抗体として存在しうる。免疫グロブリンまたは抗体はまた、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびそれらの抗体フラグメント（ただし、それらがリガンド特異的結合ドメインを保有する場合、またはリガンド特異的結合ドメインを含むように修飾されている場合に限られる）を含みうる。「フラグメント」なる語は、無傷または完全抗体または抗体鎖より少数のアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分を意味する。フラグメントは無傷または完全抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理により得られうる。フラグメントは組換え手段によっても得られうる。フラグメントは、組換え的に製造される場合、単独で、またはより大きなタンパク質（融合タンパク質と称される）の一部として発現されうる。典型的なフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントが含まれる。典型的な融合タンパク質には、Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。
【００５３】
一般に、免疫グロブリンまたは抗体は、関心のある「抗原」に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与はその哺乳動物における治療利益をもたらしうる。しかし、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５，０９１，１７８号を参照されたい）に対する抗体も想定される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えば、受容体）またはリガンド、例えば増殖因子でありうる。
【００５４】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる考えられうる天然に生じる突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に高特異的である。更に、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要するとは解釈されない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【００５５】
モノクローナル抗体は更に、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同であり、該鎖の残部が、別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、およびそのような抗体のフラグメント（ただし、それらは所望の生物活性を示すものでなければならない）を含みうる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５６】
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基約２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）周辺ならびに重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ここで定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によりレシピエントの超可変領域残基が置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能を更に改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含むであろう。更なる詳細は、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００５８】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子を使用して分離または精製される抗体は治療用抗体である。典型的な治療用抗体には、例えば以下のものが含まれる：トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９：米国特許第５，７２５，８５６号）；抗ＣＤ２０抗体、例えばキメラ抗ＣＤ２０“Ｃ２Ｂ８”米国特許第５，７３６，１３７号）；リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化変異体（米国特許第５，７２１，１０８号；ＷＯ  ０４／０５６３１２）またはトシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＢＥＸＸＡＲ（商標））；抗ＩＬ−８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎら（１９９３）Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２，およびＷＯ  ９５／２３８６５）；抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化および／またはアフィニティ成熟抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｍら（１９９２）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３−６４，ＷＯ  ９６／３００４６，ＷＯ  ９８／４５３３１）；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ  ０１／４０３０９）；抗ＣＤ４０抗体、例えばＳ２Ｃ６およびそのヒト化変異体（ＷＯ  ００／７５３４８）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号；ＷＯ  ９８／２３７６１；Ｓｔｅｐｐｅら（１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３−７；Ｈｏｕｒｍａｎｔら（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７−３８０）；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２；ＷＯ  ９５／１９１８１）；抗ＣＤ１８（米国特許第５．６２２．７００号；ＷＯ  ９７／２６９１２）；抗ＩｇＥ、例えばＥ２５、Ｅ２６およびＥ２７（米国特許第５，７１４，３３８号；米国特許第Ｎｏ．５，０９１，３１３号：ＷＯ  ９３／０４１７３；米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（ＷＯ  ９８／５１７９３）；抗ＴＮＦ−アルファ抗体、例えばｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５（米国特許第５，６７２，３４７号；Ｌｏｒｅｎｚら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３；Ｄｈａｉｎａｕｔら（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９）；抗組織因子（ＴＦ）（ＥＰ  ０  ４２０  ９３７  Ｂ１）；抗ヒトアルファ４ベータ７インテグリン（ＷＯ  ９８／０６２４８）；抗ＥＧＦＲ、キメラ化またはヒト化２２５抗体（ＷＯ  ９６／４０２１０）；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（米国特許第４，５１５，８９３号）；抗ＣＤ２５または抗ｔａｃ抗体、例えばＣＨ１−６２１  ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標）およびＺＥＮＡＰＡＸ（商標）（米国特許第５，６９３，７６２号）；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙら（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２−５６）；抗ＣＤ��２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７）；抗Ｆｃ受容体抗体、例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２に記載されているＦｃガンマＲ１に対するＭ２２抗体；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ−１４（Ｓｈａｒｋｅｙら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６を含む乳上皮細胞に対する抗体（Ｃｅｒｉａｎｉら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ；およびＲｉｃｈｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９ｌ６ｓ−５９２０ｓ）；Ｃ２４２のような結腸癌細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎら（１９９６）Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９）；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ  １３／５（Ｅｌｌｉｓら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７）；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ１９５（Ｊｕｒｃｉｃら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓおよびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｊｕｗｅｉｄら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ）；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（商標））；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）またはｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（商標））；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標））；抗ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標））：抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２：抗肝炎抗体、例えば抗Ｈｅｐ  Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（商標））；抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗アルファｖベータ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ−２５）；ならびに抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ  ＩＤ  １０および抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）。
【００５９】
本明細書中で互換的に用いられる「汚染物」、「不純物」および「残屑」なる語は、いずれかの外来性の又は対処すべき物質、例えば生物学的巨大分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、１以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰまたはＣＨＯＰ）、全細胞、細胞残屑および細胞断片、内毒素、ウイルス、脂質、および１以上の添加物であって、本明細書に記載されている無極性かつ荷電小分子を使用してそのような外来性の又は対処すべき分子の１以上から分離される対象タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体）を含有するサンプル中に存在しうるものを意味する。
【００６０】
本明細書に記載されている方法の幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を含む小分子は、対象タンパク質と共にサンプル中に存在する不溶性不純物（例えば、全細胞）に結合し、それを沈殿させ、それにより、そのような不純物から対象タンパク質を分離する。本明細書に記載されている方法の他の実施形態においては、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子は対象タンパク質またはポリペプチドに結合し、それらを沈殿させて、それを１以上の不純物（例えば、可溶性不純物）から分離する。
【００６１】
本明細書中で用いる「不溶性不純物」なる語は、標的生体分子を含有するサンプル中に存在するいずれかの望ましくない又は対処すべき存在物を意味し、ここで、該存在物は懸濁粒子または固体である。典型的な不溶性不純物には、全細胞、細胞断片および細胞残屑が含まれる。
【００６２】
本明細書中で用いる「可溶性不純物」なる語は、標的生体分子を含有するサンプル中に存在するいずれかの望ましくない又は対処すべき存在物を意味し、ここで、該存在物は不溶性不純物ではない。典型的な可溶性不純物には、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、内毒素、細胞培養、培地成分、脂質などが含まれる。
【００６３】
本明細書中で用いる「組成物」、「溶液」または「サンプル」なる語は、精製される標的生体分子または対象産物と１以上の望ましくない存在物または不純物との混合物を意味する。幾つかの実施形態においては、サンプルは、生物学的物質含有流体、例えば、標的生体分子または所望の産物が分泌される細胞培養培地または供給ストックを含む。幾つかの実施形態においては、サンプルは１以上の可溶性および／または不溶性不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、細胞培養添加物、内毒素、全細胞および細胞残屑）と共に標的生体分子（例えば、治療用タンパク質または抗体）を含む。幾つかの実施形態においては、サンプルは、細胞培養培地内に分泌される標的生体分子を含む。標的生体分子は、１以上の不純物を沈殿させることにより、または標的分子を沈殿させることにより、１以上の望ましくない存在物または不純物から分離されうる。
【００６４】
幾つかの実施形態においては、本発明の小分子は標的生体分子または産物（例えば、標的タンパク質またはポリペプチド）に結合する。この場合、該小分子は少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む。このプロセスは「捕捉」と称されうる。少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む典型的な小分子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：プテリン誘導体（例えば、葉酸、プテロイン酸）、エタクリン酸、フェノフィブリン酸、メフェナム酸、ミコフェノール酸、トラネキサム酸、ゾレドロン酸、アセチルサリチル酸、アルサニル酸、セフチオフル酸、メクロフェナム酸、イブプロフィン、ナプロキセン、フシジン酸、ナリジクス酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、チアプロフェン酸、ニフルム酸、トランス−２−ヒドロキシケイ皮酸、３−フェニルプロピオン酸、プロベネシド、クロラゼパート、イコサペント、４−アセトアミド安息香酸、ケトプロフェン、トレチノイン、アデニロコハク酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、タミバロテン、エトドラセトドール酸（ｅｔｏｄｏｌａｃｅｔｏｄｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびベンジルペニシリン酸。
【００６５】
少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を有する追加的な典型的な小分子には、染料分子、例えばアマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）およびニトロレッド（Ｎｉｔｒｏ  ｒｅｄ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
他の実施形態においては、関心のある生体分子を１以上の不純物から分離するための方法は、そのような１以上の不純物（例えば、不溶性不純物）に結合する小分子を使用する。そのようなプロセスは「清澄化」と称されうる。幾つかの実施形態においては、そのような小分子は少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む。清澄化に使用されうる典型的な小分子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：モノアルキルトリメチルアンモニウム塩（非限定的な例には、セチルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリールトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミンクロリドまたはブロミド、ドデシルアミンまたはクロリド、およびセチルジメチルエチルアンモニウムブロミドまたはクロリドが含まれる）、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩（非限定的な例には、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドおよび塩化ベンゼトニウムが含まれる）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（非限定的な例には、ドミフェンブロミド、ハロゲン化ジデシルジメチルアンモニウム（臭化物および塩化物塩）およびオクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリドまたはブロミドが含まれる）、ヘテロ芳香族アンモニウム塩（非限定的な例には、ハロゲン化セチルピリジウム（塩化物または臭化物塩）およびヘキサデシルピリジニウムブロミドまたはクロリド、シス−異性体１−［３−クロロアリル］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミドおよびアルキルジメチルナフチルメチルアンモニウムクロリドが含まれる）、多置換第四級アンモニウム塩（非限定的な例には、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリナートおよびアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファマートが含まれる）およびビス−第四級アンモニウム塩（非限定的な例には１，１０−ビス（２−メチル−４−アミノキノリニウムクロリド）−デカン、１，６−ビス｛１−メチル−３−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）−プロピルジメチルアンモニウムクロリド｝ヘキサンまたはトリクロビソニウムクロリド、およびＢｕｃｋｍａｎ  ＢｒｏｃｈｕｒｅｓによりＣＤＱと称されているビス−クアット（ｂｉｓ−ｑｕａｔ）が含まれる）。
【００６７】
本明細書中で用いる「沈殿する」、「沈殿させる」または「沈殿」なる語は、結合している（例えば、関心のある生体分子と複合体を形成している）または結合していない小分子が水性および／または可溶性状態から非水性および／または不溶性状態へ変化することを意味する。沈殿（物）は固体または固相をも意味する。
【００６８】
本明細書中で互換的に用いられる「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」および「ＣＨＯＰ」なる語は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養に由来する宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物を意味する。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは一般に、細胞培養培地またはライセート（例えば、関心のあるタンパク質またはポリペプチド（例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体またはイムノアドヘシン）を含有する回収された細胞培養流体）中に可溶性不純物として存在する。一般に、関心のあるタンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は、関心のあるタンパク質の純度の尺度となる。典型的には、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は混合物中の関心のあるタンパク質の量に対するピーピーエムで表される。
【００６９】
宿主細胞が別の哺乳類細胞型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である場合、ＨＣＰは、宿主細胞のライセート中で見出される、標的タンパク質以外のタンパク質を意味すると理解される。
【００７０】
本明細書中で用いる「細胞培養添加物」なる語は、細胞培養または発酵プロセスを促進または改善するために細胞培養プロセスに加えられる分子（例えば、非タンパク質添加物）を意味する。本発明の幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子は１以上の細胞培養添加物に結合し、それらを沈殿させる。典型的な細胞培養添加物には、消泡剤、抗生物質、染料および栄養素が含まれる。
【００７１】
本明細書中で互換的に用いられる「ピーピーエム」または「ｐｐｍ」なる語は、本明細書に記載されている小分子を使用して精製された所望の標的分子（例えば、標的タンパク質または抗体）の純度の尺度を意味する。したがって、この尺度は、精製プロセスの後で存在する標的分子の量を測定するために、または望ましくない存在物の量を測定するために用いられうる。
【００７２】
「単離」、「精製」および「分離」なる語は、本明細書に記載されている小分子を使用して、標的生体分子および１以上の不純物を含む組成物またはサンプルから標的生体分子（例えば、関心のあるポリペプチドまたはタンパク質）を精製する意味において、本明細書中で互換的に用いられる。幾つかの実施形態においては、サンプル中の標的生体分子の純度は、本明細書に記載されている少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を含む小分子を使用してサンプルから１以上の不溶性不純物（例えば、全細胞および細胞残屑）を（完全または部分的に）除去することにより増加する。もう１つの実施形態においては、サンプル中の標的生体分子の純度は、例えば、アニオン基および無極性基を含む小分子を使用することにより、サンプル中の１以上の可溶性不純物から標的生体分子を沈殿させることにより増加する。
【００７３】
幾つかの実施形態においては、精製プロセスは更に、１以上の「クロマトグラフィー工程」を用いる。典型的には、これらの工程は、本明細書に記載されている小分子を使用して１以上の望ましくない存在物から標的生体分子を分離した後、必要に応じて行われうる。
【００７４】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子を使用して対象ポリペプチドまたはタンパク質を単離、分離または精製するための「精製工程」は、「均一」または「純粋」な組成物またはサンプルを与える全体的な精製プロセスの一部でありうる。「均一」または「純粋」なる語は、関心のあるタンパク質を含む組成物中に、１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、あるいは９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満または３ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物またはサンプルを示すために本明細書中で用いられる。
【００７５】
本明細書中で用いる「清澄化」または「清澄化工程」なる語は一般に、生体分子の精製における１以上の初期工程を意味する。清澄化工程は一般に、以下のもののいずれかを単独で又はそれらの種々の組合せで含む１以上の工程を用いる全細胞および／または細胞残屑の除去を含む：例えば、遠心分離およびデプス濾過、沈殿、凝集および沈降。清澄化工程は一般に、１以上の望ましくない存在物の除去を含み、典型的には、所望の標的分子の捕捉を含む工程の前に行われる。清澄化のもう１つの中心的態様は、滅菌フィルターの詰まりを引き起こすサンプル中の不溶性成分の除去であり、これにより、全体的な精製プロセスがより経済的となる。幾つかの実施形態においては、本発明は、一般に用いられる通常の清澄化工程（例えば、デプス濾過および遠心分離）に対する改良を提供する。
【００７６】
本明細書中で用いる「クロマトグラフィー」なる語は、混合物中に存在する他の分子から対象アナライト（例えば、標的生体分子）を分離するいずれかの種類の技術を意味する。通常、関心のあるアナライトは、結合および溶出プロセスにおいて又は移動相の影響下で固定媒体内を混合物の個々の分子が移動する速度の差の結果として、他の分子から分離される。
【００７７】
「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」なる語は本明細書中で互換的に用いられ、混合物中に存在する他の分子から、関心のあるアナライト（例えば、標的生体分子）を分離するいずれかの種類の相（例えば、固定相）を意味する。通常、関心のあるアナライトは、結合および溶出プロセスにおいて又は移動相の影響下で固定媒体内を混合物の個々の分子が移動する速度の差の結果として、他の分子から分離される。種々のタイプのクロマトグラフィー媒体の例には、例えばカチオン交換樹脂、アフィニティ樹脂、アニオン交換樹脂、アニオン交換膜、疎水性相互作用樹脂およびイオン交換モノリスが含まれる。
【００７８】
本明細書中で用いられる「捕捉工程」または「捕捉」なる語は一般に、標的生体分子を沈殿させるのに適した量で及び条件下、標的生体分子を小分子に結合させるために用いられる方法を意味する。典型的には、標的生体分子は次いで、適当なバッファー中への沈殿物の再構成により回収される。本明細書に記載されている方法の幾つかの実施形態においては、芳香族または脂肪族でありうる、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子を使用して、標的生体分子は捕捉される。
【００７９】
本明細書中で互換的に用いられる「プロセス工程」または「単位操作」なる語は、精製プロセスにおける或る結果を達成するための１以上の方法または装置の使用を意味する。精製プロセスにおける１以上のプロセス工程または単位操作は、本発明に含まれる１以上の小分子を含みうる。本明細書に記載されているプロセスにおいて用いられうるプロセス工程または単位操作の例には、清澄化、結合および溶出クロマトグラフィー、ウイルス不活化、フロースルー精製および製剤化が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、プロセス工程または単位操作を行うために使用される１以上の装置は１回使用の装置であり、該プロセスにおけるいずれかの他の装置を交換する必要性も更にはプロセス実施を停止させる必要性も伴うことなく除去および／または交換されうる。幾つかの実施形態においては、１以上の小分子は、精製プロセスの清澄化工程中に１以上の不純物を除去するために使用される。
【００８０】
本明細書中で用いる「サージ（ｓｕｒｇｅ）タンク」なる語は、複数のプロセス工程の間または或る１つのプロセス工程内（例えば、単一プロセス工程が２以上の工程を含む場合）で使用されるいずれかの容器または器または袋を意味し、ここで、１つの工程からの出力はサージタンク内および次工程へ流動する。したがって、サージタンクは或る工程からの出力の全体積を収容または収集することを意図しておらず、その代わりに、サージタンク内へ及びサージタンクから液体が送り出されうるため、サージタンクは１つの工程から次工程への出力の連続的流動を可能にする点で、サージタンクはプールタンクとは異なる。幾つかの実施形態においては、２つのプロセス工程間で又は本明細書に記載されているプロセスもしくは系における或る１つのプロセス工程内で用いられるサージタンクの体積は該プロセス工程からの出力の全体積の２５％以下である。もう１つの実施形態においては、サージタンクの体積はプロセス工程からの出力の全体積の１０％以下である。幾つかの他の実施形態においては、サージタンクの体積は、標的分子が精製されることになる開始物質を構成するバイオリアクター内の細胞培養物の全体積の３５％未満または３０％未満または２５％未満または２０％未満または１５％未満または１０％未満である。
【００８１】
本明細書中で用いる「連続的プロセス」なる語は、２以上のプロセス工程（または単位操作）を含む、標的分子を精製するためのプロセスを意味し、この場合、１つのプロセス工程からの出力は、遮断されることなく該プロセスにおける次のプロセス工程内に直接的に流入し、ここで、２以上のプロセス工程が、それらの持続時間の少なくとも一部にわたって同時に行われうる。言い換えると、本明細書に記載されている連続的プロセスの場合、次のプロセス工程の前にプロセス工程を完了させる必要はなく、それらの複数のプロセス工程にわたってサンプルの一部が常に移動している。「連続的プロセス」なる語はプロセス工程内の工程にも適用され、この場合、複数の工程を含むプロセス工程の実施中、該プロセス工程を行うのに必要な複数の工程にわたってサンプルは連続的に流動する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている小分子は、連続的様態で行われる精製プロセスにおいて使用され、この場合、１つの工程からの出力は、遮断されることなく次の工程内に流入し、ここで、それらの２つの工程は、それらの持続時間の少なくとも一部にわたって同時に行われうる。特定の実施形態においては、小分子は、本明細書に記載されている清澄化のために使用され、該プロセス工程の後、標的分子を含有する出力は次の工程（例えば、アフィニティクロマトグラフィー工程）へ直接的に流動する。幾つかの実施形態においては、清澄化の後およびアフィニティクロマトグラフィーの前に、遠心分離または濾過が用いられうる。
【００８２】
「スタティックミキサ」なる語は、２つの流体物質（典型的には液体）を混合するための装置を意味する。該装置は一般に、円筒状（チューブ）ハウジング内に含有されたミキサ要素からなる。全体的な系の設計は、２つの流体流をスタティックミキサ内へ運搬するための方法を含む。該流体流がミキサー内を移動するにつれて、非移動要素が連続的に物質を混合する。完全な混合は、流体の特性、チューブの内径、ミキサ要素の数およびそれらの設計などを含む多数の変数に左右される。本明細書に記載されている幾つかの実施形態においては、精製プロセスの全体にわたって１以上のスタティックミキサが使用される。特定の実施形態においては、１以上の小分子をサンプル供給流と混合するために、スタティックミキサが使用されうる。したがって、幾つかの実施形態においては、１以上の小分子を、連続的に、例えばスタティックミキサを使用して、サンプル供給流に加える。
【００８３】
ＩＩ．少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を含む典型的な小分子
幾つかの実施形態においては、本発明は、サンプル中の１以上の不溶性不純物から標的生体分子を分離する方法に関するものであり、少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を含む小分子を使用し、これは１以上の不純物（例えば、不溶性不純物）に結合し、それを沈殿させ、それにより、そのような不純物から標的生体分子を分離する。無極性基は芳香族または脂肪族でありうる。
【００８４】
少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を有する小分子の非限定的な例には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：モノアルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリールトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミンクロリド、ヘキサデシルアミンブロミド、ドデシルアミン、ドデシルクロリド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミドおよびセチルジメチルエチルアンモニウムクロリド）、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩（例えば、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドおよび塩化ベンゼトニウム）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（例えば、ドミフェンブロミド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、オクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリドおよびオクチルドデシルジメチルアンモニウムブロミドが含まれる）、ヘテロ芳香族アンモニウム塩（例えば、セチルピリジウムクロリド、セチルピリジウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、シス−異性体１−［３−クロロアリル］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミドおよびアルキルジメチルナフチルメチルアンモニウムクロリド）、多置換第四級アンモニウム塩（例えば、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリナートおよびアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファマート）およびビス−第四級アンモニウム塩（例えば、１，１０−ビス（２−メチル−４−アミノキノリニウムクロリド）−デカン、１，６−ビス｛１−メチル−３−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）−プロピルジメチルアンモニウムクロリド｝ヘキサンまたはトリクロビソニウムクロリド、およびＢｕｃｋｍａｎ  ＢｒｏｃｈｕｒｅｓによりＣＤＱと称されているビス−クアット（ｂｉｓ−ｑｕａｔ））。
【００８５】
特定の実施形態においては、無極性基およびカチオン基を含む小分子は塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ）である。
【００８６】
幾つかの実施形態においては、そのような小分子は精製プロセスの清澄化プロセス工程中に使用される。
【００８７】
ＩＩＩ．少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのアニオン基を含む典型的な小分子
幾つかの実施形態においては、本発明は、１以上の不純物（例えば、可溶性不純物）と共に標的分子を含むサンプルから標的生体分子を精製する方法に関するものであり、該方法は、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子を使用する。無極性基は芳香族または脂肪族でありうる。幾つかの実施形態においては、小分子は、芳香族である無極性基を含む。他の実施形態においては、小分子は、脂肪族である無極性基を含む。
【００８８】
少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む典型的な小分子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：プテリン誘導体（例えば、葉酸、プテロイン酸）、エタクリン酸、フェノフィブリン酸、メフェナム酸、ミコフェノール酸、トラネキサム酸、ゾレドロン酸、アセチルサリチル酸、アルサニル酸、セフチオフル酸、メクロフェナム酸、イブプロフィン、ナプロキセン、フシジン酸、ナリジクス酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、チアプロフェン酸、ニフルム酸、トランス−２−ヒドロキシケイ皮酸、３−フェニルプロピオン酸、プロベネシド、クロラゼパート、イコサペント、４−アセトアミド安息香酸、ケトプロフェン、トレチノイン、アデニロコハク酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、タミバロテン、エトドラセトドール酸（ｅｔｏｄｏｌａｃｅｔｏｄｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびベンジルペニシリン酸。
【００８９】
特定の実施形態においては、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子は葉酸またはその誘導体である。
【００９０】
また、標的生体分子に結合させ、それを沈殿させるために使用されうる或る染料分子も本発明に含まれる。具体例には、アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）およびニトロレッド（Ｎｉｔｒｏ  ｒｅｄ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
ＩＶ．小分子を使用するタンパク質精製方法
本発明に含まれる種々の方法においては、タンパク質精製プロセスの、１以上の段階において、小分子を加え、それにより、１以上の不純物を沈殿させ、または標的生体分子を沈殿させる。
【００９２】
１つのそのような典型的なプロセスは、標的生体分子および１以上の不純物を含有する細胞培養供給物を、少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのカチオン基を含む小分子の適当な量（例えば、０．４重量％のＢＺＣ）と接触させ、それにより、１以上の不純物（例えば、不溶性不純物）を沈殿させることを用いる。サンプル（すなわち、沈殿物を含有するもの）の固相はデプス濾過または遠心分離により除去されうる。ついで、標的生体分子を含有する残りのサンプルは後続の精製工程（例えば、１以上のクロマトグラフィー工程）に付されうる。
【００９３】
本発明のもう１つの典型的なプロセスにおいては、小分子はタンパク質精製プロセスの工程の１以上において加えられ、この場合、小分子は標的生体分子自体に結合し、それを沈殿させる。そのような小分子は少なくとも１つの無極性基および少なくとも１つのアニオン基を含む。
【００９４】
一般に、細胞培養供給物を清澄化工程に付した後、それを、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子と接触させる。清澄化工程は、不溶性不純物を除去することを意図したものである。例えば、本明細書に記載されている典型的な方法においては、標的分子および１以上の可溶性不純物を含有する清澄化細胞培養供給物を、アニオン基および無極性基を含む小分子の適当な量（例えば、葉酸の１：１の質量比）と接触させる。ついで、サンプルをｐＨ条件の変化に付し、それにより標的生体分子の沈殿を促す（例えば、酢酸を使用して、ｐＨをｐＨ５．０まで変化させる）。ついで、標的生体分子を含有する沈殿物を適当なバッファー（例えば、ｐＨ５．０における０．１Ｍ  アルギニン）で洗浄し、ついで、適当なバッファー（ｐＨ７．０における０．１Ｍ  チアミン）を使用して標的生体分子を再可溶化する。ついで、再可溶化標的生体分子を含有する溶液中の残留量の小分子（例えば、葉酸）は、適当な手段（例えば、活性炭）を用いて除去されうる。標的生体分子を含有する溶液は、典型的には、標的生体分子の相当に純粋なサンプルを回収するために、追加的な純化工程に付される。
【００９５】
本発明の幾つかの他の実施形態においては、種々のタイプの小分子（例えば、１以上の不純物に結合するもの、および標的生体分子に結合するもの）が共に、同じタンパク質精製プロセスの種々の工程において使用される。例えば、１以上の不溶性不純物を除去するために、清澄化工程において、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子（例えば、ＢＺＣ）が使用されることが可能であり、ついで、同じサンプル中の標的生体分子は、少なくとも１つのアニオン基および少なくとも１つの無極性基を含む小分子（例えば、葉酸）を使用して沈殿化されうる。
【００９６】
前記のとおり、標的生体分子を含有するサンプル中に残っている残留量の小分子は次いで、例えば活性炭のような適当な物質を使用して除去されうる。サンプルは一般に、所望の産物純度の濃度を得るために追加的なクロマトグラフィーまたは非クロマトグラフィー工程に付される。
【００９７】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている１以上の小分子は、連続形態で行われる精製プロセスにおいて使用される。そのような精製プロセスにおいては、例えば以下のもの（それらに限定されるものではない）を含む幾つかの工程が用いられうる：バイオリアクター内でタンパク質を発現する細胞を培養する；細胞培養を清澄化に付し、この場合、本明細書に記載されている１以上の小分子が使用されることが可能であり、所望により、デプスフィルターが使用されうる；清澄化細胞培養を結合および溶出クロマトグラフィー捕捉工程（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー）に移す；プロテインＡ溶出物をウイルス不活化（例えば、１以上のスタティックミキサおよび／またはサージタンクを使用するもの）に付す；ウイルス不活化からの出力をフロースルー精製プロセスに付し、この場合、活性炭、アニオン交換クロマトグラフィー媒体、カチオン交換クロマトグラフィー媒体およびウイルス濾過媒体から選択される２以上のマトリックスが使用される；ならびにダイアフィルトレーション／濃縮および濾過滅菌を用いて該タンパク質を製剤化する。そのようなプロセスの追加的な詳細は、例えば、本出願と同時に出願された参照番号Ｐ１２／１０７を有する同時係属出願（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されうる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、溶液中のＢＺＣを定量するための検量線を示す。該検量線は、既知量のＢＺＣおよびナトリウムテトラフルオロボラートを混合して沈殿物を形成させる比濁アッセイから導き出された。ｘ軸は溶液中のＢＺＣの開始濃度（ｐｐｍ）を示し、ｙ軸は、既知量のテトラフルオロボラートの添加に際して溶液中に生じた溶液濁度（ＮＴＵ）を示す。このアッセイの検出限界は１００ｍｇ／Ｌまたは１００ｐｐｍ  ＢＺＣ（溶液中）である。
【図２】図２は、溶液中のＢＺＣに結合する活性炭の能力を決定するために用いた静的結合実験の結果を示すグラフを示す。ｘ軸は、加えた活性炭の質量（ｇ）を示し、ｙ軸は、活性炭との１０分間の混合の後に溶液中に残存するＢＺＣの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。示されているとおり、０．１ｇの活性炭は、溶液中のＢＺＣの開始量（２５ｍｇ）を無検出レベル（すなわち、１００ｍｇ／Ｌ未満）に減少させるのに十分である。
【図３】図３は、最適化研究の結果を表すグラフを示し、ここで、標的生体分子（例えば、モノクローナル抗体ＭＡｂ分子）の最大回収および最大不純物消失を達成するためのＢＺＣの最適濃度は４ｇ／Ｌであることが判明した。ｘ軸は、清澄化すべき供給物に加えたＢＺＣの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。ｙ軸は、ＢＺＣを使用する清澄化プロセスの結果として供給物から除去されたＨＣＰの割合（％）を示す（棒グラフ）。第２のｙ軸は、清澄化プロセスの後に供給物中に残存したＭＡｂの割合（％）を示す（菱形で示されている）。
【図４】図４は、葉酸によるＭＡｂの沈殿効率に対する溶液ｐＨの効果を調べるための実験の結果を表すグラフを示す。より塩基性の溶液ｐＨは、溶液中のＭＡｂの９０％以上を沈殿させるのに必要な、ＭＡｂに対する葉酸の、より高い質量比を与える。ｘ軸は、供給物に加えたＭＡｂに対する葉酸の質量比（ｍｇ／ｍｇ）を示す。ｙ軸は、葉酸での沈殿の後に溶液中に残存するＭＡｂの割合（％）を示す。菱形、正方形、三角形および円形は、それぞれ４．５、５．０、５．５および６．０のｐＨにおける結合を示す。点線は誘導線として示されている。
【図５】図５は、溶液中の葉酸を定量するための検量線を示す。該検量線は、既知濃度の葉酸溶液の３５０ｎｍにおける吸光度測定から導き出された。ｘ軸は溶液中の葉酸の開始濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示し、ｙ軸は３５０ｎｍにおける葉酸溶液の吸光度（任意単位）を示す。このアッセイの検出限界は１０ｍｇ／Ｌまたは１０ｐｐｍ  葉酸（溶液中）である。
【図６】図６は、溶液中の葉酸に結合する活性炭の能力を決定するために用いた結合等温実験の結果を示すグラフを示す。ｘ軸は、活性炭との１０分間の混合の後に溶液中に残存する葉酸の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示し、ｙ軸は、１０分間の混合の後に加えた活性炭の質量当たりに結合した葉酸の質量（ｍｇ）を示す。２２５ｍｇの葉酸を除去するには１グラムの活性炭で十分である。
【図７】図７は、４．５の結合ｐＨにおけるニトロレッド（Ｎｉｔｒｏ  ｒｅｄ）染料によるＭＡｂ沈殿効率を調べるための実験の結果を表すグラフを示す。ＭＡｂの沈殿を完了させるためには、少なくとも０．８のニトロレッド／ＭＡｂ比が必要である。ｘ軸は、供給物に加えたＭＡｂに対する葉酸の質量比（ｍｇ／ｍｇ）を示す。ｙ軸は、ニトロレッドでの沈殿の後に溶液中に残存するＭＡｂの割合を示す。
【図８】図８は、ニトロレッドにより沈殿したＭＡｂに関する溶出回収に対する結合ｐＨの効果を示すグラフを示す。より高いｐＨにおける結合は、より良好な溶出回収をもたらした。ｘ軸は、試験したサンプルおよび溶出条件を示す。ＭＡｂは「Ｍａｂ０４」と称され、上清は「Ｓｕｐ」と称され、溶出物は「Ｅｌｕ」と称され、３．９、４．４５および４．９なる数字は、ニトロレッドがＭＡｂに結合しそれを沈殿させた溶液ｐＨを示す。ｙ軸は、沈殿の後の溶液中（すなわち、Ｓｕｐ中）または溶出後（すなわち、Ｅｌｕ中）に残存するＭＡｂの百分率（％）を示す。
【図９】図９は、供給物中の電荷変異体（純粋ＩｇＧと表記されている軌線）、およびアマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）染料分子で処理された供給物からの溶出サンプル（アマランス溶出１および２と表記された軌線）を評価するために用いた弱カチオン交換クロマトグラムを示す。ｘ軸は時間（分単位）を示し、ｙ軸は２８０ｎｍにおける供給物および溶出サンプルの吸光度を示す。アマランス１および２は重複実験からの溶出サンプルである。この実験は、アマランス染料分子を使用する沈殿プロセスの再現性を示すことを意図したものである。
【図１０】図１０は、葉酸を使用して形成した沈殿物の平均粒径に対するせん断の効果を示すグラフを示す。ｘ軸は、中空糸装置内の流速を変化させることにより生じた、せん断速度（秒−１）を示し、ｙ軸は、マルベルン（Ｍａｌｖｅｒｎ）装置により測定した沈殿物の平均粒径（マイクロメートル）を示す。三角形、正方形および菱形の記号は、ニトロレッドがＭＡｂに結合しそれを沈殿させた、それぞれ４．５および５．５の溶液ｐＨを示す。粒子は、より低いｐＨにおいて、より小型であり、せん断に対して、より抵抗性であるようである。
【図１１ａ】図１１ａは、完全リサイクルモードで作動する中空糸ＴＦＦ系の流束（Ｆｌｕｘ）対ＴＭＰを測定するために使用した装置を示す。用いた供給物は、葉酸および清澄化供給物をｐＨ４．５および１：１の質量比で混合して沈殿物を形成させることにより得た。沈殿物を中空糸装置に運搬するために、ポンプを使用した。
【図１１ｂ】図１１ｂは、３つの異なるせん断速度および０．８５ｇ／ＬのＭＡｂ濃度で０．２μｍの膜を使用した場合の葉酸−ＭＡｂ沈殿物に関する流束（Ｆｌｕｘ）対ＴＭＰ曲線を示す。この実験は、ＴＦＦ系を作動させるための最適条件を決定するために行われた。ｘ軸は、用いた流束（ＬＭＨ）を示し、ｙ軸は、測定された膜間圧（Ｐｓｉ）を示す。黒塗りの三角形、菱形および正方形の記号は、それぞれ８５０、１７００および３４００秒−１のせん断速度を示す。中空の記号は、該系がその時点までは定常状態であることを示し、それを超えると、時間経過と共に、膜の詰まりを示すＴＭＰの増加が観察された。流束対ＴＭＰ曲線から、最適せん断および流速が、それぞれ１７００秒−１および１９０  ＬＭＨであると推論することが可能であった。
【図１１ｃ】図１１ｃは、３つの異なるせん断速度および０．８５ｇ／ＬのＭＡｂ濃度で０．２μｍの膜を使用した場合の、葉酸−ＭＡｂ沈殿物に関する１回通過濃縮係数対流束を表すグラフを示す。この実験は、最適作動条件下で達成されうる最大濃縮係数を決定するために行われた。ｘ軸は、用いた流束（ＬＭＨ）を示し、ｙ軸は濃縮係数を示す。黒塗りの三角形、菱形および正方形の記号は、それぞれ８５０、１７００および３４００秒−１のせん断速度を示す。中空の記号は、該系がその時点までは定常状態であることを示し、それを超えると、時間経過と共に、膜の詰まりを示すＴＭＰの増加が観察された。流束対ＣＦ曲線から、それぞれ１７００秒−１および１９０  ＬＭＨである最適せん断および流速において、最大濃縮係数が２．５倍であると推論することが可能であった。
【図１２ａ】図１２ａは、３つの異なるせん断速度および４．３ｇ／ＬのＭＡｂ濃度で０．２μｍの膜を使用した場合の、葉酸−ＭＡｂ沈殿物に関する流束対ＴＭＰ曲線を表すグラフを示す。この実験は、より高い開始沈殿物体積でＴＦＦ系を作動させるための最適条件を決定するために行われた。ｘ軸は、用いた流束（ＬＭＨ）を示し、ｙ軸は、測定された膜間圧（Ｐｓｉ）を示す。黒塗りの三角形、菱形および正方形の記号は、それぞれ８５０、１７００および３４００秒−１のせん断速度を示す。中空の記号は、該系がその時点までは定常状態であることを示し、それを超えると、時間経過と共に、膜の詰まりを示すＴＭＰの増加が観察された。流束対ＴＭＰ曲線から、最適せん断および流速が、それぞれ１７００秒−１および１７０  ＬＭＨであると推論することが可能であった。
【図１２ｂ】図１２ｂは、３つの異なるせん断速度および４．３ｇ／ＬのＭＡｂ濃度で０．２μｍの膜を使用した場合の、葉酸−ＭＡｂ沈殿物に関する１回通過濃縮係数対流束を表すグラフを示す。この実験は、最適作動条件下で達成されうる最大濃縮係数を決定するために行われた。ｘ軸は、用いた流束（ＬＭＨ）を示し、ｙ軸は濃縮係数を示す。黒塗りの三角形、菱形および正方形の記号は、それぞれ８５０、１７００および３４００秒−１のせん断速度を示す。中空の記号は、該系がその時点までは定常状態であることを示し、それを超えると、時間経過と共に、膜の詰まりを示すＴＭＰの増加が観察された。流束対ＣＦ曲線から、それぞれ１７００秒−１および１７０  ＬＭＨである最適せん断および流速において、最大濃縮係数が２．２倍であると推論することが可能であった。
【図１３】図１３は、中空糸モジュールを使用する固体の連続的濃縮および洗浄に使用した装置を示す。結合工程は、沈殿物が〜４倍まで濃縮される２つの段階（すなわち、２つの中空糸モジュール）を含み、洗浄工程は、濃縮沈殿物が向流モードで洗浄される３つの段階（すなわち、３つの中空糸モジュール）を含む。  本発明は以下の実施例により更に詳細に例示されるが、これらの実施例は限定的なものと解釈されるべきではない。本出願および図面の全体において引用されている全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容を参照により本明細書に組み入れることとする。
【実施例】
【００９９】
［実施例１］発現性細胞培養流体（ＣＣＦ）の調製
代表的実験において、モノクローナルＩｇＧ１を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に由来する細胞を１０Ｌのバイオリアクター（ＮＥＷ  ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）内で１３×１０６  細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、５０％未満の生存度において回収した。抗体価は、プロテインＡ  ＨＰＬＣにより、０．８５〜１．８ｍｇ／ｍＬの範囲で決定された。ＥＬＩＳＡ（ＣＹＧＮＵＳ  ＃  Ｆ５５０）を使用して、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度は３５００００〜４２５０００ｎｇ／ｍＬであることが判明した。未清澄化細胞培養のｐＨはｐＨ７．２であった。
【０１００】
［実施例２］発現性清澄化細胞培養流体（ＣＣＦ）の調製
実施例１からの供給物を４０００ｒｐｍで２分間の遠心分離ならびにそれに続く５μｍおよび０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターでの濾過により清澄化した。
【０１０１】
［実施例３］非発現性細胞培養流体（ＣＣＦ）の調製
もう１つの実験においては、非ＩｇＧ発現性チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に由来する細胞を１０Ｌのバイオリアクター（ＮＥＷ  ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）内で１３×１０６  細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、５０％未満の生存度において回収した。ＥＬＩＳＡ（ＣＹＧＮＵＳ  ＃  Ｆ５５０）を使用して、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度は６６０００〜１７７０００ｎｇ／ｍＬであることが判明した。未清澄化細胞培養のｐＨはｐＨ７．２であった。
【０１０２】
［実施例４］非発現性清澄化細胞培養流体（ＣＣＦ）の調製
実施例３からの供給物を４０００ｒｐｍで２分間の遠心分離ならびにそれに続く５μｍおよび０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターでの濾過により清澄化した。
【０１０３】
［実施例５］ＩｇＧ添加を伴う清澄化細胞培養流体（ＣＣＦ）の調製
Ｐｒｏｓｅｐ  ｕｌｔｒａ  ｐｌｕｓ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）プロテインＡ樹脂を使用して精製された純粋なＩｇＧ１を実施例４からの供給物に加えた。プロテインＡ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定されたＩｇＧの最終濃度は〜１ｇ／Ｌであった。
【０１０４】
［実施例６］塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ）溶液の調製
塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ）（＞９７％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１００ｇ／Ｌ  溶液を、室温で３０分間の連続的混合下で１Ｌの脱イオン水中に１００ｇを溶解することにより調製した。
【０１０５】
［実施例７］ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド溶液の調製
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（＞９８％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＨＴＡＢ）の４０ｇ／Ｌ  溶液を、１Ｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に４０ｇを溶解することにより調製した。
【０１０６】
［実施例８］ナトリウムテトラフルオロボラート溶液の調製
ナトリウムテトラフルオロボラート（９８％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の５ｇ／Ｌ  溶液を、室温で３０分間の連続的混合下で１Ｌの脱イオン水中に５ｇを溶解することにより調製した。
【０１０７】
［実施例９］葉酸溶液の調製
葉酸（＞９７％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＦＡ）の８０ｇ／Ｌ  溶液を、室温で６０分間の連続的混合下で１Ｌの０．４Ｍ  水酸化ナトリウム中に８０ｇを溶解することにより調製した。最終溶液ｐＨは約８であった。ついで該溶液を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターで濾過して、残存未溶解固体を除去した。該溶液の色は濃褐色であった。
【０１０８】
［実施例１０］アマランス溶液の調製
アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）（＞９８％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０ｇ／Ｌ  溶液を、室温で３０分間の連続的混合下で１Ｌの２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に５０ｇを溶解することにより調製した。最終溶液ｐＨは約４．５であった。ついで該溶液を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターで濾過して、残存未溶解固体を除去した。該溶液の色は濃赤色であった。
【０１０９】
［実施例１１］ニトロ−レッド溶液の調製
ニトロレッド（Ｎｉｔｒｏ  ｒｅｄ）（４−アミノ−５−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸二ナトリウム塩）（＞９８％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０ｇ／Ｌ  溶液を、室温で３０分間の連続的混合下で１Ｌの２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中に５０ｇを溶解することにより調製した。最終溶液ｐＨは約４．０であった。ついで該溶液を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターで濾過して、残存未溶解固体を除去した。該溶液の色は濃赤色であった。
【０１１０】
［実施例１２］溶液中のＢＺＣの検出のための検量線の作成
本明細書に記載されている代表的な実験においては、溶液中のＢＺＣの量の検出のために使用した検量線を作成するために、比濁アッセイを用いた。
【０１１１】
実施例６に記載されているストック溶液から開始する系列希釈により、７５０、５００、２５０、１００および５０ｍｇ／Ｌの一連のＢＺＣ溶液を脱イオン水中で調製した。該希釈ＢＺＣ溶液のそれぞれの５ｍｌに、実施例８からの溶液の５ｍｌを加え、室温で１０分間にわたって連続的に混合した。ＢＺＣとナトリウムテトラフルオロボラートとの複合体形成により、該溶液は混合に際して濁りを発生した。該溶液の濁度を、２１００ｐ比濁計（ＨＡＣＨ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｌｏ，ＵＳＡ）を使用して測定し、それを用いて、図１に記載されている検量線を作成した。
【０１１２】
このアッセイの検出限界は溶液中で１００ｍｇ／Ｌ  ＢＺＣである。該検量線を用いて、ＢＺＣ清澄化供給物中のＢＺＣの残留量を定量した。
【０１１３】
［実施例１３］溶液からのＢＺＣの除去
本明細書に記載されている代表的な実験において、ある物質（すなわち、活性炭）が溶液からのＢＺＣの除去に有用であることが示された。そのような物質は、ＢＺＣを使用する不溶性不純物の沈殿の後で標的生体分子を含有するサンプル中のＢＺＣを除去するために使用されうる。
【０１１４】
実施例６からの０．２５ｍｌの溶液を４．７５ｍｌの脱イオン水と混合することにより調製された５ｍｌのＢＺＣ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を０．０５、０．１、０．１５および０．２ｇの活性炭（ＮＵＣＨＥＲ  ＳＡ−２０，Ｍｅａｄｗｅｓｔｖａｃｏ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ）と室温で１０分間混合した。ついで該活性炭を遠心分離（４０００ｒｐｍで２分間）により集め、上清を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．から入手可能な５および０．２μ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）フィルターで濾過した。実施例１２に概説されている比濁アッセイを用いて、活性炭での処理の後で溶液中に残ったＢＺＣの量を決定した。
【０１１５】
図２に示されているとおり、０．１ｇの炭素は、溶液中の２５ｍｇのＢＺＣを無検出濃度（１００ｍｇ／Ｌ未満）まで減少させるのに十分である。ＢＺＣ清澄化細胞培養培地からＢＺＣの残留量を除去するのに適した活性炭の量を推定するために、この情報を後に用いた。
【０１１６】
［実施例１４］細胞培養培地の清澄化およびそれに続くＢＺＣを使用するＨＣＰの除去
本明細書に記載されている代表的な実験において、関心のある標的生体分子（これはＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）分子であった）を含有するサンプルから不溶性不純物を除去するために、ＢＺＣを使用した。本明細書に記載されているとおり、清澄化のためのＢＺＣの使用の後、残留量のＢＺＣをサンプルから除去するために活性炭が使用されうる。
【０１１７】
実施例６からの１．６ｍｌのＢＺＣを実施例１からの４０ｍｌの未清澄化供給物（１．８ｇ／Ｌ  ＩｇＧ１）に加え、室温で１０分間混合して、不純物の結合および沈殿を可能にした。ついで遠心分離（４０００ｒｐｍで１分間）により上清を沈殿物から分離した。
【０１１８】
溶液中に残ったＢＺＣの残留量を決定するために、上清の５ｍｌ  サンプルを５ｍｌのナトリウムテトラフルオロボラート溶液（実施例８からのもの）と室温で１０分間混合した。２１００ｐ比濁計（ＨＡＣＨ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｌｏ，ＵＳＡ）で測定された、生じた濁りは、５１２ｍｇ／Ｌの残存ＢＺＣに相当するものであった（実施例１２からの検量線を使用した場合）。
【０１１９】
室温で５分間の連続的混合下で１．２ｇの活性炭（ＮＵＣＨＥＲ  ＳＡ−２０，Ｍｅａｄｗｅｓｔｖａｃｏ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ）を加えることにより、溶液中の残存ＢＺＣを上清の残りの３６ｍｌから除去した。溶液中の残存ＢＺＣの濃度を検出限界未満に減少させるために、実施例１３に従い必要とされたもの（すなわち、０．０７２ｇの活性炭）より過剰量の活性炭を加えた。培地成分も活性炭に結合しうるため、溶液中の残存ＢＺＣに結合するために残された幾らかの能力を活性炭が有するように、活性炭を過剰に加える必要があった。ついで活性炭を遠心分離（４０００ｒｐｍで２分間）により集め、上清を０．２μ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターにより濾過した。
【０１２０】
これらの条件下、元の流体中に存在するＩｇＧの〜９０％が回収され、ＨＣＰの９４％が除去され、溶液中の残存ＢＺＣは検出限界未満であった。
【０１２１】
［実施例１５］ＢＺＣでの清澄化を用いる不純物除去の最適化
本明細書に記載されている代表的な実験において、標的生体分子（例えば、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）分子）の最大回収および最大不純物除去のためのＢＺＣの最適濃度を決定した。
【０１２２】
実施例６からの０．８、１．６、２．４ｍｌのＢＺＣを実施例１からの４０ｍｌの未清澄化供給物（１．８ｇ／Ｌ  ＩｇＧ１）に加え、室温で１０分間混合して、不純物の結合および沈殿を可能にした。ついで沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで１分間）により集め、室温で５分間の連続的混合下で１．２ｇの活性炭（ＮＵＣＨＥＲ  ＳＡ−２０，Ｍｅａｄｗｅｓｔｖａｃｏ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ）を加えることにより過剰な残存ＢＺＣを除去するために、上清を更に精製した。ついで活性炭を遠心分離（４０００ｒｐｍで２分間）により集め、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓから入手可能な５および０．２μ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）フィルターで上清を濾過した。最適ＢＺＣ濃度は〜４ｇ／Ｌ（実施例６からの１．６ｍｌのＢＺＣ）と決定され、これは〜９０％のＨＣＰ除去および〜９４％のＭＡｂ回収をもたらした。
【０１２３】
図３に示されているとおり、ＭＡｂ回収に影響を及ぼすことなく不純物のほとんどを除去するためには〜４ｇ／ＬのＢＺＣが使用可能であろう。
【０１２４】
［実施例１６］ＭＡｂを沈殿させるために必要な葉酸の量の特定
本明細書に記載されている代表的な実験において、効率的なＭＡｂの沈殿（９０％以上）に必要な葉酸の量を決定した。
【０１２５】
実施例２からの４．７５ｍｌの供給物（１．１ｇ／Ｌ  ＩｇＧ１）を種々の体積の実施例９からの葉酸および脱イオン水（表１に示されているとおり）と混合した。３Ｍ  酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、該溶液のｐＨを４．５、５．０、５．５および６．０に調節し、それを室温で１０分間にわたって連続的に混合した。適当な葉酸対ＭＡｂの比に達したら、葉酸とＭＡｂとの複合体形成の結果として、分散固体懸濁液の形態の沈殿が直ちに生成した。ついで沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで１分間）により集め、上清を０．２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターにより濾過した。
【０１２６】
図４に示されているとおり、＞９０％の効率でＩｇＧ１に結合しそれを沈殿させるのに必要な葉酸の量は、溶液ｐＨが上昇するにつれて増加する。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
［実施例１７］葉酸を使用する清澄化細胞培養培地からの所望のＭＡｂ分子の捕捉
本明細書に記載されている代表的な実験において、清澄化ＣＨＯ細胞培養からＭＡｂ分子を捕捉するために葉酸を使用した。
【０１２９】
実施例９からの０．１５２ｍｌの葉酸および０．０９８ｍｌの脱イオン水を実施例２からの４．７５ｍｌの供給物（１．８ｇ／Ｌ  ＩｇＧ１）に加えた。３Ｍ  酢酸を使用して該溶液のｐＨを５．５に調節し、それを室温で１０分間にわたって連続的に混合した。酸添加後、葉酸とＭＡｂとの複合体形成の結果として、分散固体懸濁液の形態の沈殿が直ちに生成した。ついで沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで１分間）により集め、緩く結合した不純物を除去するためにＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＴｒｉｓバッファー（２５ｍＭ，ｐＨ６．０）で洗浄した。室温で１０分間にわたって連続的に混合しながら、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファーを使用して、沈殿物の再可溶化およびＩｇＧの溶出をｐＨ７．５で行った。葉酸を沈殿させる５０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、ついで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．から入手可能な５および０．２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）フィルターで濾過することにより、遊離葉酸の除去を行う。ついで上清流体において精製ＭＡｂ分子を回収する。
【０１３０】
これらの条件下、元の流体中に存在したＭＡｂの＞９５％が葉酸に結合し、ＩｇＧの８８％が溶出の際に回収された。
【０１３１】
［実施例１８］葉酸捕捉ＭＡｂを含有する溶液中のＨＣＰの濃度
実施例１７に記載されているとおり、葉酸を使用してＭＡｂ分子を捕捉した後、ＭＡｂを含有するサンプルにおいてＨＣＰの濃度を測定した。産物（ＩｇＧ）捕捉プロセスの種々の工程における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度を追跡するために、ＥＬＩＳＡアッセイキット（ＣＹＧＮＵＳ  ＃  Ｆ５５０）を使用した。ＨＣＰの濃度は開始細胞培養流体における４２４３０６ｎｇ／ｍｌから溶出サンプルにおける１４６１７８ｎｇ／ｍｌに低下し、それにより、６５％のＨＣＰの濃度低下が示された。
【０１３２】
［実施例１９］溶液中の葉酸の濃度を決定するための検量線の作成
本明細書に記載されている代表的な実験において、溶液中に残った残存葉酸を後に定量するために、検量線を作成した。
【０１３３】
実施例９からの葉酸溶液の系列希釈により、０．０１、０．０２５、０．０５および０．０７５ｍｇ／ｍｌの葉酸の標準溶液を脱イオン水中で調製した。分光光度計を使用して標準溶液の吸光度を３５０ｎｍにおいて測定し、図５に示されているとおりに標準曲線をプロットした。
【０１３４】
［実施例２０］活性炭での葉酸の除去
代表的な実験において、溶液から葉酸を除去するために、例えば活性炭のような或る物質が使用されうることが示された。
【０１３５】
実施例９からの葉酸溶液の系列希釈により、ｐＨ７の０．１Ｍ  塩酸チアミン（Ｓｉｇｍａ）中で０．７５、２．４、４．８５、８．２および１２．９ｍｇ／ｍｌの葉酸溶液を調製した。室温で１０分間の連続的混合下で該溶液を０．５ｇの活性炭（ＮＵＣＨＥＲ  ＳＡ−２０，Ｍｅａｄｗｅｓｔｖａｃｏ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ）と混合した。ついで活性炭を遠心分離（４０００ｒｐｍで２分間）により集め、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．から入手可能な５および０．２μ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）フィルター上清を濾過した。実施例１９に記載されている検量線を使用し、３５０ｎｍの吸光度を測定することにより、溶液中に残った葉酸の濃度を決定した。
【０１３６】
図６に示されているとおり、１グラムの活性炭は、２２５ｍｇの葉酸を除去するのに十分であった。
【０１３７】
［実施例２１］葉酸を使用するＢＺＣ清澄化細胞培養培地からの所望のＭＡｂの捕捉
本明細書に記載されている代表的な実験において、代表的なＢＺＣ清澄化細胞培養培地からＭＡｂ分子を沈殿させるために葉酸を使用した。したがって、清澄化のためにＢＺＣを使用し、捕捉のために葉酸を使用した。
【０１３８】
実施例９からの葉酸を実施例１４からの３０ｍｌの清澄化供給物（１．７ｇ／Ｌ  ＭＡｂ）に加えた。３Ｍ  酢酸を使用して該溶液のｐＨを５．２に調節し、それを室温で１０分間にわたって連続的に混合した。酸添加後、葉酸とＭＡｂとの複合体形成の結果として、分散固体懸濁液の形態の沈殿が直ちに生成した。ついで沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで１分間）により集め、緩く結合した不純物を除去するためにアルギニンバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ５．０）で洗浄した。室温で１０分間にわたって連続的に混合しながら、０．１Ｍ  塩酸チアミンを使用して、沈殿物の再可溶化およびＭＡｂの溶出を３．５ｍｌの体積中でｐＨ６．７５で行った。室温で１０分間の連続的な混合下、０．１５ｇの活性炭（ＮＵＣＨＥＲ  ＳＡ−２０，Ｍｅａｄｗｅｓｔｖａｃｏ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ）を２ｍｌの溶出物に加えることにより、遊離葉酸の除去を行った。ついで活性炭を遠心分離（４０００ｒｐｍで２分間）により集め、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．から入手可能な５および０．２μ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）フィルターで上清を濾過した。ついで上清流体において精製ＩｇＧ分子を回収する。
【０１３９】
これらの条件下、元の流体中に存在したＩｇＧの＞９５％が葉酸に結合し、ＩｇＧの８８％が溶出の際に回収され、葉酸の９９．８％が除去された。
【０１４０】
［実施例２２］葉酸を使用して捕捉された所望の生体分子（ＭＡｂ）を含有するＢＺＣ清澄化溶液におけるＨＣＰの濃度の測定
この実験は、実施例２１に示されているとおりに行った。産物（ＭＡｂ）捕捉プロセスの種々の工程における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度を追跡するために、ＥＬＩＳＡアッセイキット（ＣＹＧＮＵＳ  ＃  Ｆ５５０）を使用した。
【０１４１】
ＨＣＰの濃度は葉酸除去工程後に開始清澄化細胞培養流体における４４２４７ｎｇ／ｍｌから溶出サンプルにおける６５００ｎｇ／ｍｌに低下し、それにより、８５％のＨＣＰの濃度低下が示された。開始供給物体積は３０ｍｌであったが、溶出体積は３．５ｍｌであったことが、溶出における表示ＨＣＰの濃度において考慮される。
【０１４２】
［実施例２３］ＭＡｂを沈殿させるのに必要なニトロレッドの量の推定
代表的な実験において、もう１つの小分子（すなわち、染料であるニトロレッド）をＭＡｂ分子の沈殿に関して評価した。９０％を超える効率でＭＡｂを沈殿させるのに必要なＭＡｂ対ニトロレッドの質量比を決定した。
【０１４３】
３Ｍ  酢酸を使用して、実施例５からの供給物をｐＨ４．５に滴定した。ついで、この溶液の５ｍｌ  アリコートを実施例１１からの種々の体積のニトロレッドと室温で５分間混合して、溶液中の所望のニトロレッド対ＭＡｂの比を得た。この実施例において調べられたニトロレッド対ＭＡｂの比は０、０．２、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０および３．０であった。ついで該混合物を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清をデカントにより除去し、プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いてＩｇＧに関して分析した。
【０１４４】
図７に示されているとおり、ＭＡｂの完全な沈殿のためには０．８のニトロレッド／ＭＡｂ比が必要である。
【０１４５】
［実施例２４］ニトロレッド沈殿ＭＡｂの溶出回収に対する結合ｐＨの依存性
代表的な実験において、溶出後のＭＡｂ回収に対する結合ｐＨの効果を評価した。
【０１４６】
３Ｍ  酢酸を使用して、実施例５からのＭＡｂ添加ＣＣＦをｐＨ３．９、４．５または４．９まで滴下した。ついで該ｐＨ溶液のそれぞれの５ｍｌ  アリコートを実施例１１からのニトロレッドと室温で５分間混合して、１：１の所望のニトロレッド対ＭＡｂ比を得た。該混合物を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清をデカントで除去し、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通過させて、残存ニトロレッドを除去した。ついで、プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いて、該溶液をＭＡｂに関して分析した。３つ全ての場合に、図８に示されているとおり、ＭＡｂは上清中に残らなかった。３つの異なる結合ｐＨからの沈殿物を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で溶出した。溶出液をＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通過させて、残存ニトロレッドを除去し、プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いてＭＡｂに関して分析した。
【０１４７】
図８に示されているとおり、より低い結合ｐＨ（ｐＨ３．９）は５５％の溶出回収を示し、一方、ｐＨ４．５および４．９における結合は〜１００％の収率を示した。
【０１４８】
［実施例２５］アマランス染料で処理された集められた細胞培養物におけるＭＡｂ回収およびＨＣＰ除去
この代表的な実験においては、染料（アマランス染料）である更にもう１つの小分子を使用して、代表的な清澄化細胞培養培地からＭＡｂを沈殿させた。
【０１４９】
３Ｍ  酢酸を使用して、実施例５からのＭＡｂ添加供給物ＣＣＦをｐＨ４．５まで滴定した。ＭＡｂ添加供給物におけるＭＡｂ濃度はプロテインＡ  ＨＰＬＣによる測定で０．９５ｍｇ／ｍｌであった。ＥＬＩＳＡ（ＣＹＧＮＵＳ  ＃  Ｆ５５０）を使用した測定で、宿主細胞タンパク質濃度は１８６，０００ｎｇ／ｍｌであった。５ｍｌの該溶液を実施例１０からの７５μｌの４０ｍｇ／ｍｌ  アマランス染料と室温で５分間混合して、沈殿物を形成させた。該混合物を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清をデカントにより除去し、廃棄した。沈殿物を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で再溶解／溶出した。溶出液を溶出液１ｍｌ当たり４ｍｇの活性炭で処理して、残存アマランスを除去し、溶出液を、プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いてＭＡｂに関して、そしてＥＬＩＳＡを用いてＨＣＰの濃度に関して分析した。
【０１５０】
９６％のＭＡｂ回収が得られ、最終ＨＣＰの濃度は８７，１００ｎｇ／ｍｌであり、それにより、ＨＣＰの濃度における〜５０％の減少が示された。
【０１５１】
［実施例２６］アマランス染料を使用する沈殿後のＭＡｂの電荷変異体の分析
本明細書に記載されている代表的な実験において、アマランス染料でＭＡｂを沈殿させ、沈殿物を洗浄して不純物を除去し、ＭＡｂを溶出した後、サンプル中のＭＡｂの荷電変異体の集団を、弱カチオン交換クロマトグラフィーを用いて分析し、開始供給物中の荷電ＭＡｂ変異体の集団と比較した。この実験の目的は、アマランス染料とＭＡｂとの可溶性複合体が回収ＭＡｂと共に存在するかどうかを決定することであった。そのような存在は非常に望ましくないであろう。
【０１５２】
分析用弱カチオン交換カラム（ＷＣＸ−１０；Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、実施例２５からの溶出物をＭＡｂ電荷変異体に関して分析した。該実施において使用したバッファーは１０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ６．０（バッファーＡ）および１０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ６．０＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ（バッファーＢ）であった。以下の勾配溶出プロファイルを用いた：時間＝０、１０％  バッファーＢ；時間＝４０分、３０％  バッファーＢ；時間＝４５分、９５％  バッファーＢ；時間＝４６分、１００％  バッファーＢ。
【０１５３】
図９に示されているとおり、プロテインＡにより精製されたＭＡｂおよびアマランスにより精製されたＭＡｂに関しては、荷電変異体における認識可能な変化は観察されなかった。
【０１５４】
［実施例２７］粒径分布、および葉酸を使用して形成されるＭＡｂ沈殿に対するせん断の効果
産物の質に影響をほとんど又は全く及ぼすことなく適度な精製およびＭＡｂ回収をもたらす前記のような小分子の使用に加えて、沈殿に基づくプロセスは、生じた沈殿物を取り扱うための工程をも必要とする。バッチおよび連続モードで作動する中空糸タンジェント流濾過（ＴＦＦ）に基づく実用的な技術が本明細書に記載されており、これは、本明細書に記載されている小分子の使用の後の沈殿物の効率的な取扱いを可能にする。
【０１５５】
沈殿物の効率的な取扱いのために使用されうる適当な技術または工程の１つは、濾過に基づく技術であり、これは、加工される固体の特性（例えば、少数ながら例示すると、圧縮性、粒径およびせん断感受性）に基づく。例えば、ある細孔径の膜が、粒径測定に基づくプロセスのために選択された場合、系内のせん断速度の影響下で（例えば、ポンピングまたは他の力学的ストレスにより）粒径が変化しないことを確認することが重要である。一方、予想されたものより小さい粒径は膜を詰まらせる可能性がある。
【０１５６】
以下に記載されているとおり、中空糸タンジェント流濾過装置の場合において、種々の結合ｐＨにおける粒径分布に対するせん断速度の影響を評価した。
【０１５７】
実施例２からの供給物（３０ｍｌ）（０．８５ｇ／Ｌ）を３つの等しい部分に分割し、実施例９からの葉酸と室温で５分間混合した。加えた葉酸対ＭＡｂの比は、該アリコートの２つ（ｐＨ４．０および５．０までの滴定）に関しては１：１であり、該アリコートの１つ（後のｐＨ５．５までの滴定）に関しては１．５：１であった。該葉酸混合供給物のそれぞれ１０ｍｌの３つのアリコートを、３Ｍ  酢酸を使用してｐＨ４．０、５．０または５．５のいずれかまで滴定した。粒径分布を決定するためのマルベルン（Ｍａｌｖｅｒｎ）マスターサイザでの測定のために、適当なバッファー中で沈殿物を〜１０倍（または該装置において十分なシグナルが得られる希釈度まで）希釈した。ｐＨ４．０の沈殿物には２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を使用した。ｐＨ５．０の沈殿物には２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を使用した。ｐＨ５．５の沈殿物には２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を使用した。また、該希釈沈殿物を、Ｍａｌｖｅｒｎ装置の測定室に入れる前に中空糸装置（０．２μｍ  Ｍｉｄｇｅｔフープ，ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）に通過させた。これは、生じた沈殿物の粒径分布に対するせん断の効果を調べるために行った。種々のせん断度を得るために、中空糸を通過する流速を変動させた。全ての測定の前に、５分間の平衡化時間を取った。
【０１５８】
また、より低いｐＨにおける沈殿物（本明細書においては固相とも称される）の総比率は、一般に、より低い（ｐＨ４．０  −  １１％  固体、ｐＨ５．０  −  １４％  固体、およびｐＨ５．５  −  １６％  固体）ことが観察された。スイングバケット遠心機における３０００ｒｐｍで１分間の遠心に基づいて、固体の百分率を計算した。ニュートン流体用パイプにおけるせん断速度（Ｙ）は、式：Ｙ＝４Ｑ／πｒ３（ここで、Ｑは体積流量であり、ｒはパイプの半径である）を用いて評価されうる。
【０１５９】
図１０は、試験された種々のｐＨ条件における平均粒径に対するせん断の影響を示す。粒径は、せん断速度が増加するにつれて減少する。粒子は、より低い結合ｐＨにおいて、より小型であり、せん断に対して、より抵抗性であることに注目することは興味深い。後続の実験では、４．５の結合ｐＨを選択した。
【０１６０】
［実施例２８］葉酸を使用して生じたＭＡｂ沈殿物に関する０．２μｍ中空糸膜を使用する種々のせん断速度における流束対膜間圧（ＴＭＰ）の測定
この代表的な実験は、中空糸タンジェント流濾過（ＴＦＦ）系の安定な実施に要求される最適せん断速度および流速を決定するために行った。該系は、図１１ａに示されている完全リサイクルモード下での設定であった。
【０１６１】
葉酸対ＭＡｂの比が１：１となるように、実施例２からの供給物（２００ｍｌ）（０．８５ｇ／Ｌ）を実施例９からの葉酸と室温で５分間混合した。ついで該混合物のｐＨをｐＨ４．５まで低下させた。与えられた供給流速（せん断速度）に関して、透過流速（透過流束）を段階的な増加により徐々に増加させた。供給物圧力、保持物質圧力および透過物圧力を５分間にわたってモニターした。ＴＭＰ＝（Ｐｆ＋Ｐｒ）／２−Ｐｐを用いて、膜間圧を計算した。ＴＭＰの変化が５分間にわたって観察されなければ、該系は定常状態とみなされた。この研究において使用した膜は、３８ｃｍ２の膜面積を有する０．２μｍ中空糸膜（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）であった。３つの異なる供給流速（せん断速度）に関して、流束対ＴＭＰを図１１ｂに示す。流束の関数としての１回通過に関する濃縮係数（ＣＦ＝１／（１−Ｑｐ／Ｑｆ）と定義される）も示されている（図１１ｃ）。Ｑｐは透過流束であり、Ｑｆは供給流速である。
【０１６２】
図１１ｂにおける流束対ＴＭＰ曲線から、最適せん断および流速が、それぞれ１７００秒−１および１９０  ＬＭＨであると推論することが可能であった。図１１ｃに示されているとおり、これらの条件下、１回通過に関する最大濃縮係数は２．５倍である。
【０１６３】
［実施例２９］４．３ｇ／Ｌ  ＩｇＧ濃度を有する細胞培養供給物からの葉酸を使用して生じたＭＡｂ沈殿物に関する０．２μｍ中空糸膜を使用する種々のせん断速度における流束対膜間圧（ＴＭＰ）の測定
より高いＭＡｂ力価を有する供給物の場合、より多量の沈殿剤（例えば、葉酸）を使用する必要がある。したがって、より高い開始固体体積が処理される必要がある。以下の実験は、実施例２８に記載されているＴＦＦ系の性能に対する、より高い固体含量の効果を決定するために行った。
【０１６４】
実施例２からの供給物（２００ｍｌ）に純粋なＭＡｂを添加して、４．３ｇ／ＬのＭＡｂ濃度を得た。葉酸対ＭＡｂの比が１：１となるように、該ＭＡｂ添加供給物を実施例９からの葉酸と室温で５分間混合した。ついで該混合物のｐＨをｐＨ４．５まで低下させた。該系は、図１１ａに示されている完全リサイクルモード下での設定であった。与えられた供給流速（せん断速度）に関して、透過流速（透過流束）を段階的な増加により徐々に増加させた。供給物圧力、保持物質圧力および透過物圧力を５分間にわたってモニターした。ＴＭＰ＝（Ｐｆ＋Ｐｒ）／２−Ｐｐを用いて、膜間圧を計算した。ＴＭＰの変化が５分間にわたって観察されなければ、該系は定常状態とみなされた。この研究において使用した膜は、３８ｃｍ２の膜面積を有する０．２μｍ中空糸膜（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）であった。３つの異なる供給流速（せん断速度）に関して、流束対ＴＭＰを図１２ａに示す。流束の関数としての１回通過に関する濃縮係数（ＣＦ＝１／（１−Ｑｐ／Ｑｆ）と定義される）も示されている（図１２ｂ）。Ｑｐは透過流束であり、Ｑｆは供給流速である。
【０１６５】
図１２ａにおける流束対ＴＭＰ曲線から、最適せん断および流速が、それぞれ１７００秒−１および１７４  ＬＭＨであると推論することが可能であった。図１２ｂに示されているとおり、これらの条件下、１回通過に関する最大濃縮係数は２．２倍である。これは、１ｇ／ＬのＭＡｂ力価の場合の実施例２８において特定された実施条件に酷似しており、このことは、該系が、固体体積に関連したＭＡｂ力価の変動に対処しうることを示唆している。
【０１６６】
［実施例３０］葉酸で処理され実施例２８に記載のＴＦＦ系を用いて処理された採取細胞培養におけるＭＡｂ回収
葉酸対ＩｇＧの比が１：１となるように、実施例２からの供給物（２５０ｍｌ）（１．８ｇ／Ｌ）を実施例９からの葉酸と室温で５分間混合した。ついで該混合物のｐＨをｐＨ５．０まで低下させた。該沈殿物は約１１％の固体を含有していた。該系は、図１１ａ（実施例２８）に示されている系に類似した設定であった。ただし、この場合には、透過物ラインは供給物へ再循環（リサイクル）されず、ＩｇＧ定量のための別の収集ビーカーへ送られた。透過流速を制御することにより、一定の膜間圧（ＴＭＰは０．４〜０．５ｐｓｉに維持された）で、該沈殿物を６３ｍｌの最終体積まで〜４．０倍濃縮した。濃縮段階中の平均流束は７５ＬＭＨであった。濃縮後、該固体を１２０ｍｌの０．１Ｍ  アルギニン（ｐＨ５．０）で洗浄した。透過流速と同じ流速（７０ＬＭＨ）で洗浄バッファーを供給物ビーカー内に送り出すことにより、洗浄を行った。また、該洗浄からの透過物をＭＡｂ定量のために集めた。ついで、０．１Ｍの最終チアミン濃度となるようにチアミンを加え、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩基（ｐＨ１０）を使用して、ｐＨを７．０に増加させることにより、該固体を再溶解／溶出した。濃縮中または洗浄中のいずれにおいても、透過物中にＭＡｂは認められなかった。全体的なＭＡｂ回収は８７％であり、〜３．０倍の濃縮を達成することが可能であった。
【０１６７】
［実施例３１］スタティックミキサにおける沈殿物形成の速度論
ＴＦＦ系をバッチモードで実施することに加えて、連続モード実施の可能性を評価した。連続的な実施のための１つの前提条件は、ＴＦＦ系への連続供給のためにインラインミキサを使用可能にする速い結合および沈殿速度論である。以下の代表的な実験は、スタティックミキサーを使用した場合の沈殿物形成の速度論を示す。
【０１６８】
葉酸対ＭＡｂの比が１：１となるように、実施例２からの供給物（５０ｍｌ）（０．８５ｇ／Ｌ）を実施例９からの葉酸と室温で５分間混合した。ついで、この溶液を、５ｍｌ未満の無駄容積で、１０ｍｌ／分でヘリカルスタティックミキサ（Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ）を介して送り出した。Ｔ−ジョイントを使用して、スタティックミキサの前に０．２６ｍｌ／分で３Ｍ  酢酸流を導入した。スタティックミキサ内の滞留時間は３０秒未満であった。それぞれ１０ｍｌの体積の５個の画分を集め、ｐＨを測定し、約４．５であることを確認した。これは、スタティックミキサが一定状態の実施を可能にすること、およびｐＨが所望のレベルで一定に維持されうることを示した。ついでサンプルを２５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ついで、プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いて、上清をＭＡｂ濃度に関して分析した。
【０１６９】
上清中にＭＡｂは認められなかった。このことは、ＭＡｂの完全な沈殿が３０秒以内に生じたことを示している。
【０１７０】
［実施例３２］連続向流モードにおいて中空糸ＴＦＦを使用する固体の濃縮および洗浄
図１３に示されているとおり、連続モードで実施するために、中空糸タンジェント流濾過系を設定した。以下の実験は、用いた処理条件および得られたＭＡｂ回収を示す。
【０１７１】
葉酸対ＭＡｂの比が１：１となるように、実施例２からの供給物（２０００ｍｌ）（１．８ｇ／Ｌ）を実施例９からの葉酸と室温で５分間混合した。ついで該混合物のｐＨをｐＨ５．０まで低下させた。該沈殿物は約１１％の固体を含有していた。該沈殿物を１９７ＬＭＨ透過流束で５００ｍｌの最終体積まで２段階で４倍濃縮した。濃縮後、該固体を３１４ｍｌの２５ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄した。洗浄を向流形態で行い、新鮮な洗浄バッファーを、最終中空糸装置に入る供給物内に送り出し、該最終装置からの透過物を前の装置のための洗浄バッファーとして使用し、その透過物を最初の装置のための洗浄バッファーとして使用した。ついで、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩基（ｐＨ１０）を使用し、ついで０．１Ｍの最終チアミン濃度となるようにチアミンを加えて、ｐＨを７．０に増加させることにより、該固体を再溶解／溶出した。全体的なＭＡｂ回収は７４％であった。濃縮工程または洗浄工程のいずれにおいても、透過物におけるＭＡｂの喪失は認められなかった。
【０１７２】
［実施例３３］ＢＺＣでの清澄化工程、葉酸での捕捉工程ならびに活性炭およびアニオン交換膜クロマトグラフィーを使用する純度増加のための１以上の純化工程を用いる完全ＭＡｂ下流精製プロセス
この実験の目的は、清澄化および捕捉工程における沈殿ならびにそれに続くフロースルー工程を用いてモノクローナル抗体の全下流精製が達成されうることを実証することであった。
【０１７３】
実施例２１からの供給物をＴｒｉｓバッファー水溶液（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）で４倍希釈し、最終ｐＨを７．０に調節した。粉末化活性炭をＭｅａｄ  Ｗｅｓｔ  Ｖａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ．ＵＳＡからＮｕｃｈａｒ  ＨＤ等級として入手した。ガラス汎用クロマトグラフィーカラム（Ｇｌａｓｓ  Ｏｍｎｉｆｉｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ）（１００ｍｍ径、１００ｍｍ長）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＨＤ  Ｎｕｃｈａｒ活性炭をローディングして、１ｍＬの充填カラム体積を得た。該カラムをＴｒｉｓバッファー水溶液（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能である、ポリアリルアミンで修飾された０．６５ミクロン等級ポリエチレン膜を、種々のサイズの装置において使用して、０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置を製造した。該膜を２５ｍｍの円盤に切断し、５個の円盤を重ね、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能なＯｐｔｉＳｃａｌｅ  ２５使い捨てカプセルフィルター装置と同じタイプのオーバーモールド（ｏｖｅｒｍｏｌｄｅｄ）ポリプロピレン装置内に密閉した。該装置は、空気閉塞を防ぐための空気抜きを含み、３．５ｃｍ２の有効濾過面積および０．２ｍＬの体積を有する。
【０１７４】
該希釈モノクローナル抗体供給物を０．１ｍｌ／分の一定の流速で活性炭カラムを介して送り出して、２００ｍｌ（２００カラム体積）のフロースループールを得た。このプールの一部を０．２ｍＬ  ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を介して流動させて、８ｍｌ（４０カラム体積）のフロースループールを得た。サンプルの純度を表２に一覧する。
【０１７５】
抗体の最終純度はＨＣＰの約１４ｐｐｍであった。このことは、本明細書に記載されている鋳型が、許容されうる精製およびＭＡｂ回収目標を達成する実施可能な競合的下流精製プロセスであることを示している。
【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
［実施例３４］細胞培養培地の清澄化およびそれに続くＨＴＡＢを使用するＨＣＰの除去
実施例３からの供給物（２００ｍｌ）に純粋なＭＡｂを加えて、４．８ｇ／ＬのＭＡｂ濃度を得た。該供給物中のＨＣＰ濃度は約１７９，０００ｎｇ／ｍｌであった。実施例７からの２ｍｌのＨＴＡＢを３８ｍｌの前記供給物に加え、室温で１０分間混合して、不溶性不純物、例えば細胞および細胞残屑、ならびに可溶性不純物、例えば宿主細胞タンパク質、核酸などの結合および沈殿を可能にした。ついで沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで１分間）により集め、上清を０．２μ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルターで濾過した。これらの条件下、元の流体中に存在したＭＡｂの１００％が回収され、ＨＣＰの９５％が除去された。
【０１７８】
本明細書は、本明細書中に引用されている参考文献（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）の教示を考慮して十分に理解されるものである。本明細書における実施形態は本発明における実施形態の一例であり、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。多数の他の実施形態が本発明に含まれる、と当業者は容易に認識する。全ての刊行物および発明の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。参照により含まれる資料が本明細書と矛盾する又は合致しない場合には、本明細書がいずれのそのような資料にも優先する。本明細書におけるいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明の先行文献であることを認めるものではない。
【０１７９】
特に示されていない限り、特許請求の範囲を含む本明細書において用いられる成分、細胞培養、処理条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」なる語により修飾されていると理解されるべきである。したがって、特に示されていない限り、数的パラメータは近似値であり、本発明により得られることが求められる所望の特性に応じて変動しうる。特に示されていない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる語は、それらの一連の語における各要素に関するものであると理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識し、または単なる通常の実験を用いて確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【０１８０】
当業者に明らかなとおり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多数の修飾および変更が施されうる。本明細書に記載されている具体的な実施形態は単なる例示として示されているに過ぎず、いかなる点においても限定的なものではない。本明細書および実施例は典型例として解釈されるに過ぎず、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示されると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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