(57)【要約】本発明は、概して、抗体分子のように安定性及び溶解性を示すポリペプチドに関連する。本発明は、特に、還元環境又は細胞内環境で溶解性発現及びフォールディングを示す一対のＶL及びＶH領域を含むポリペプチドに関連する。本発明は、このようなポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにも関連し、このようなポリペプチド又はポリヌクレオチドのライブラリーにも関連し、このようなポリペプチドの検査器具、治療器具及び診断器具での使用方法にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なるポリペプチドを含むポリペプチドライブラリーであって、
前記ポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
前記ＶH及び前記ＶLは、抗体結合を形成することができ、
前記ポリペプチドの２以上は、前記ＶH可変領域及び／又は前記ＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域に存在するアミノ酸配列が互いに異なる、ポリペプチドライブラリー。
【請求項２】
前記ＶH可変領域及び／又は前記ＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域のアミノ酸配列は、ランダム又はセミランダムであるか、又はヒト抗体に由来する、請求項１のライブラリー。
【請求項３】
ポリペプチドライブラリーを構成する方法であって、
前記方法は、複数の異なるポリペプチドを準備する工程を含み、
前記複数の異なるポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
前記ＶH及び前記ＶLは、抗体結合を形成することができ、
前記ポリペプチドの２以上は、前記ＶH可変領域及び／又は前記ＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域に存在するアミノ酸配列が互いに異なる、ポリペプチドライブラリーを構成する方法。
【請求項４】
複数の異なるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、
各ポリヌクレオチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含むポリペプチドをコード化するものであり、
前記ポリヌクレオチドの２以上は、前記ＶH可変領域及び／又は前記ＶL可変領域中の１以上の異なる相補性決定領域を含むポリペプチドをコード化することによって互いに異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、前記ＶH可変領域及び／又は前記ＶL可変領域の１以上の相補性決定領域のアミノ酸配列をコード化し、
前記アミノ酸配列は、ランダム又はセミランダムであるか、又はヒト抗体に由来する、請求項４のライブラリー。
【請求項６】
ポリヌクレオチドライブラリーを構成する方法であって、
前記方法は、ポリペプチドをコード化する複数の異なるポリヌクレオチドを準備する工程を含み、
前記ポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
前記ＶH及び前記ＶLは、抗体結合を形成することができ、
前記ポリヌクレオチドの２以上は、前記ＶH可変領域及び／又は前記ＶL可変領域中の１以上の異なる相補性決定領域を含むポリペプチドをコード化することによって互いに異なる、ポリペプチドライブラリーを構成する方法。
【請求項７】
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
前記ＶH及び前記ＶLは、抗体結合を形成することができる、単離及び／又は組換ポリペプチド。
【請求項８】
前記ＶLは、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む、請求項７のポリペプチド。
【請求項９】
可変のフラグメント（Ｆｖ）である、請求項７又は８のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、scFv、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、又はより高次のポリペプチド複合体である、請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、scFvであり、前記ＶH及び前記ＶLは、リンカーペプチドを通じて互いに結合している、請求項１０のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＶH可変領域及び前記ＶL可変領域の骨格領域は、与えられたいずれかの配列の骨格領域に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上一致する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
還元条件下で溶解性である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
還元条件下で作製されたときに、溶解性であり、かつ抗体結合部を安定して形成することができる、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
化合物に接合している、請求項７〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記化合物は、放射性同位体、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象物中のポリペプチドの半減期を増加させる化合物、及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１５のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチドをコード化する単離及び／又は外因性ポリヌクレオチド、又は、それらの重鎖可変領域又は軽鎖可変領域。
【請求項１８】
請求項１７のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】
請求項７〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７のポリヌクレオチド、又は請求項１８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
標的分子に結合するポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
前記方法は、請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチド又は請求項１、２、４及び５のいずれか一項のライブラリーを標的分子に接触させる工程と、
請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチドが、標的分子に結合するかどうかを決定する工程と、を含む、標的分子に結合するポリペプチドをスクリーニングする方法。
【請求項２１】
請求項７〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、宿主細胞中で発現されるか、又は、請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチドを作製するための無細胞発現系中で発現される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、宿主細胞の細胞質及び／又はペリプラズム中で発現される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳類細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞は、細菌細胞であり、
前記方法は、
ａ）ポリペプチドが作製されるように、請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）細菌細胞を透過化する工程であって、前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドが、透過化した細菌細胞内に保持される工程と、
ｃ）標的分子が透過化した細菌細胞内で拡散するように、透過化した細菌細胞を標的分子に接触させる工程と、
ｄ）請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチドが標的分子に結合するかどうかを決定する工程と、を含む請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記無細胞発現系は、リボソームディスプレイシステム、ｍＲＮＡディスプレイシステム、又はシスディスプレイシステムを含む、請求項２１の方法。
【請求項２６】
複数の宿主細胞を含む宿主細胞ライブラリーであって、
前記複数の宿主細胞は、請求項７〜１６のいずれか一項記載のポリペプチドを含み、
１以上の宿主細胞は、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域に存在するアミノ酸配列のライブラリーにおいて、別の宿主細胞に存在するポリペプチドと異なるポリペプチドを含む、複数の宿主細胞を含む宿主細胞ライブラリー。
【請求項２７】
請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチド、請求項１７のポリヌクレオチド、及び／又は請求項１８のベクター、並びに、薬学的に許容されるキャリア。
【請求項２８】
請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチド、請求項１７のポリヌクレオチド、及び／又は、請求項１８のベクター、並びに、細菌細胞を透過処理することができる薬剤を含むキット。
【請求項２９】
治療器具又は診断器具における、請求項７〜１６のいずれか一項のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い安定性及び溶解性を示す、抗体分子のようなポリペプチドに関する。本発明は、特に、還元環境又は細胞内環境で溶解性発現及び折りたたみを示す一対のＶL及びＶH領域を含むポリペプチドに関する。本発明は、このようなポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにも関し、このようなポリペプチド又はポリヌクレオチドのライブラリーにも関し、このようなポリペプチドの検査器具、治療器具及び診断器具での使用方法にも関する。例えば、ポリペプチドは、特定の標的分子に結合するポリヌクレオチドを特定するためのスクリーニング方法で用いられることもある。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脊椎動物抗体のレパートリーは、免疫グロブリン（Ig）フォールドのヘテロダイマーの先祖遺伝子の重複及び多様性によって形成された。免疫システムによって産まれる多様性は、Ｉｇ遺伝子の生殖細胞系列の遺伝子ファミリーに依存するだけでなく、Ｉｇタンパク質の表面が露出したループで生じるエクソン境界での追加の多様性とともに、多くの独特な系統を形成するＢ細胞及びＴ細胞の成長中に、生体内でサブドメインエクソンの組換えにも依存している。この組換えのプロセスは、抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれのＮ末端抗体結合領域を形成するために再結合する２つの軽鎖可変エクソン（ＶL）と重鎖可変エクソン（ＶH）に因んで、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれている。しかしながら、祖先型ペアから枝分かれした複製遺伝子のように、突然変異の蓄積は、可変領域のヘテロダイマーユニット間の不完全な界面接合をもたらす。淘汰圧は、いずれか１つの遺伝子に適用されるのではなく、全体としてのファミリーに適用される。このため、免疫システムにとって良いものである最大多様性は、個々のファミリーのメンバーに理想とは言えない折りたたみ安定性をもたらすこともある。さらに、結合領域それ自体は、異なる折りたたみ安定性を有するかもしれない。たくさんの枝分かれしたサブユニットから機能的ヘテロダイマーを形成する要件は、領域のβシートの間に一定のジスルフィド結合があることによって補われる。しかしながら、接合部分は、ＥＲでの折りたたみのチェックポイントを必要とする安定な接合ではないかもしれない。
【０００３】
抗体可変領域によって適合されたタンパク質接合への「一致した」アプローチの結果として、いくつかのペアは、折りたたみ安定性が低く、細菌／哺乳類の宿主での発現が乏しい傾向があり、かつ凝集する傾向がある。さらに、ほぼ全ての場合、ＶL及びＶH領域内で形成されるインターシートのジスルフィド結合に全体の必要性がある。これは、大腸菌のような細菌宿主中の抗体ライブラリー発現のために、細胞のペリプラズム中、ジスルフィドシャペロンを有する酸化スペース中、並びに溶解としてＶL及びＶH領域（単鎖抗体；scFv）の間に、抗体を発現することを必要とする。しかしながら、ペリプラズムへの輸送は、抗体の高発現のための所望の水準で飽和した内膜を通じた排出を必要とし、細胞質の発現よりもずっと低い収率になる。
【０００４】
大腸菌細胞質中のscFv抗体をより安価に産出する利点に加えて、還元環境でフォールドする能力がある抗体スカフォールドは、哺乳類の細胞質中の親和性試薬として用いることもできるだろう。これは、細胞質内での科学試薬として、又はタンパク質の機能をイメージング又はブロッキングするための核として、治療用及び診断用でも同様に、抗体の使用を延長できるようになるだろう。
【０００５】
ほとんど全ての哺乳類の抗体は、細胞質内で不溶性であるので、さらなる多様性を構築するためのスカフォールドとして使用するために、いくつかのグループは、安定したヘテロダイマーを形成してフォールドする遺伝子の希少な組合せを探索している。細胞質性の可溶性抗体を見出すために取られるアプローチは、抗体クローンが、細胞内抗体（「イントラボディ」）スカフォールドの基礎を形成することができる細胞質(Tavladoraki et al., 1999; Vaccaro et al., 2006)で安定して発現されることを偶然観察するか、又は、体内 (Martineau et al., 1998; Visintin et al., 1999; Auf der Maur et al., 2002; Fisher and DeLisa, 2009) 若しくは体外(Contreras-Martinez and Delisa, 2007; Jermutus L., et al. 2001)のどちらかでscFv遺伝子の安定性を進化させる進化的アプローチをとる。さらに、単一ドメイン抗体は、単一で対になっていない可変ドメインが標的抗原に結合しており、細胞質内に可溶で安定することがわかっている。細胞質で発現した時にフォールドされていて可溶な２つのラクダの単一ドメイン抗体を報告している(Kirchhofer Al., et al, 2010; Saerens et al., 2005)。
【０００６】
細菌の細胞質ゾル内で細胞内抗体を生成するもう一つの方法は、還元から酸化まで細胞質内でタンパク質の酸化還元状態を変化する突然変異を持つ大腸菌変異体を使用することである。これは大腸菌細胞質内で折りたたみ構造を持ち、部分的に及び/又は全体的に酸化されたscFvsを生成する(He et al, 1995; Jurado P., et al., 2002)
【０００７】
scFvライブラリーから抗原に結合するscFvに対する生体内スクリーンとして酵母ツーハイブリッド(Ｙ2Ｈ)システムを使用した２つのグループが可溶クローンに対する配列を作成した。最初のグループ(Tse et al., 2002)は、ＶH３クレードがＶLκ１と４クレードと対になっていることを発見した。多数の可溶なscFvを整列させることによって、彼らはVLとＶH遺伝子に対してＶH３とVLκ1ファミリーにおけるMorphosys HuCA（登録商標）ライブラリー(Knappik et al., 2000)に対して得られたファミリーのコンセンサスとほぼ正確に一致するというコンセンサスを得た。Y2Hを使用した２番目のグループは、可溶scFvは、VLκ1又はVLλ1又はVLλ3クレードと最も密接に関係している配列と結合した、VH3若しくはVH1a又はVH1bのメンバーと最も密接に関係しているいずれかの配列であることをWO 03/097697で報告した。彼らの最適な配置はVH1bと対になっているVLλ3であった。しかし、ここで言及すべき重要な点は、報告された配列のいずれにおいても、最も近い同種の免疫グロブリン遺伝子の生殖細胞系列の配列の翻訳に厳密に一致するものはなく、配列を通して多数の突然変異を伴った点である。これは恐らく両グループ共に酵母形質転換の律速段階前にクローンに結合した抗体用に濃縮したプレスクリーンしたファージライブラリーを使用したためである。しかし、これは各遺伝子で１つかそれ以上の突然変異が細胞質のscFvのフォールドに安定化効果をもたらす可能性を示唆している。
【０００８】
今まで、ＶLとＶH遺伝子に対応する人間の生殖細胞系列アミノ酸配列と厳密に同一な細胞内抗体は公表されていない。そのような抗体は多様化に対しての有利な骨格となるだろう。なぜなら、それは細胞質の発現から高収率を得ることを可能にし、酸化型における安定性をより高め、ループ多様性のより大きな耐性を保証する構造的な安定性をより高め、そして完全な抗体の生成物から低耐性拒絶をもたらす完全に天然の配列を含むからである。
【０００９】
本発明者らは、本明細書に、WO2011/075761で前に述べたタンパク質ディスプレイ方法の、ヒトのscFvライブラリーのスクリーニング、及び、生殖細胞系列の配列と同一のフレームワーク領域を有する溶解性scFv遺伝子の単離への適用を報告する。さらに、我々は、scFvスカフォールドへのCDR3グラフトの、顕著な耐熱性及び許容範囲を開示する。
【発明の開示】
【００１０】
ある側面において、本発明は、複数の異なるポリペプチドを含むポリペプチドライブラリーを提供するものであり、そのポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
ＶH及びＶLは、抗体結合を形成することができ、
ポリペプチドの２以上は、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域に存在するアミノ酸配列が互いに異なる。
【００１１】
好ましくは、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域のアミノ酸配列は、ランダム又はセミランダムであるか、又はヒト抗体に由来する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、ポリペプチドライブラリーを構成する方法を提供するものであり、その方法は、複数の異なるポリペプチドを準備する工程を含み、
複数の異なるポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
ＶH及びＶLは、抗体結合を形成することができ、ポリペプチドの２以上は、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域に存在するアミノ酸配列が互いに異なる。
【００１３】
別の側面において、本発明は、複数の異なるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを提供するものであり、各ポリヌクレオチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、
を含むポリペプチドをコード化するものであり、
ポリヌクレオチドの２以上は、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の異なる相補性決定領域を含むポリペプチドをコード化することによって互いに異なる。
【００１４】
好ましくは、ポリヌクレオチドが、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域の１以上の相補性決定領域のアミノ酸配列をコード化し、アミノ酸配列は、ランダム又はセミランダムであるか、又はヒト抗体に由来する。
【００１５】
別の側面において、本発明は、ポリヌクレオチドライブラリーを構成する方法を提供するものであり、その方法は、ポリペプチドをコード化する複数の異なるポリヌクレオチドを準備する工程を含み、そのポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
ＶH及びＶLは、抗体結合を形成することができ、
ポリヌクレオチドの２以上は、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の異なる相補性決定領域を含むポリペプチドをコード化することによって互いに異なる。
【００１６】
別の側面において、本発明は、単離及び／又は組換ポリペプチドを提供するものであり、その単離及び／又は組換ポリペプチドは、
ｉ）SEQ ID NO:３に記載のIGLV３−２３の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む重鎖抗体可変領域（ＶH）、及び、
ｉｉ）SEQ ID NO:１８に記載のIGLV１−４０、SEQ ID NO:２１に記載のIGLV１−４４、SEQ ID NO:２４に記載のIGLV１−４７、SEQ ID NO:１５に記載のIGLV１−５１、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１、SEQ ID NO:２７に記載のIGLV３−１９、SEQ ID NO:９に記載のIGLV３−２１、SEQ ID NO:１２に記載のIGLV６−５７、のいずれか１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む軽鎖抗体可変領域（ＶL）、を含み、
ＶH及びＶLは、抗体結合を形成することができる。
【００１７】
ＶLは、好ましくは、SEQ ID NO:６に記載のIGLV３−１の骨格領域に９０％以上一致する骨格領域を含む。
【００１８】
好ましくは、上記ポリペプチドは、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)フラグメント、scFv、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、又はより高次のポリペプチド複合体のような可変のフラグメント（Fv）である。ポリペプチドは、scFvであり、ＶH及びＶLは、リンカーペプチドを通じて互いに結合している。
【００１９】
好ましくは、本発明のポリペプチド中のＶH可変領域及びＶL可変領域の骨格領域は、与えられたいずれかの配列の骨格領域に９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上一致する。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、好ましくは還元条件下で溶解性である。さらに、本発明のポリペプチドは、好ましくは、還元条件下で作製されたときに、溶解性であり、かつ抗体結合部を安定して形成することができる。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、化合物に接合している。当該化合物は、放射性同位体、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象物中のポリペプチドの半減期を増加させる化合物、及びそれらの混合物からなる群より選択されてもよい。
【００２２】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコード化する単離及び／又は外因性ポリヌクレオチド、又は、それらの重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域を提供する。
【００２３】
別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２４】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２５】
さらなる側面において、本発明は、標的分子に結合するポリペプチドをスクリーニングする方法を提供するものであり、その方法は、本発明のポリペプチド又は本発明のライブラリーを標的分子に接触させる工程と、本発明のポリペプチドが、標的分子に結合するかどうかを決定する工程と、を含む。かかる方法において、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、宿主細胞中で発現されるか、又は、ポリペプチドを作製するための無細胞発現系中で発現されることが好ましい。細胞内でポリペプチドを発現するとき、この発現は、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳類細胞のような、宿主細胞の細胞質及び／又はペリプラズム中で起こってもよい。
【００２６】
好ましい実施形態において、宿主細胞は細菌細胞であって、その方法は、
ａ）ポリペプチドが作製されるように、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）細菌細胞を透過化する工程であって、前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドが、透過化した細菌細胞内に保持される工程と、
ｃ）標的分子が透過化した細菌細胞内で拡散するように、透過化した細菌細胞を標的分子に接触させる工程と、
ｄ）本発明のポリペプチドが標的分子に結合するかどうかを決定する工程と、を含む。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法は、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかを用いて実行され得る。好ましくは、本発明のスクリーニング方法は、本発明のライブラリーをスクリーニングすることを含む。このため、スクリーニング方法は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドライブラリーを発現する工程と、ターゲット分子に結合するライブラリー内のポリペプチドを特定する工程とを含んでいてもよい。好ましくは、このようなスクリーニングの方法は、還元環境下で実行される。例えば、このような方法は、宿主細胞で実行され得る。好ましい実施形態において、このような方法は、宿主細胞の宿主細胞の細胞質で実行される。好ましくは、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞のような細菌細胞である。好ましい実施形態において、細菌細胞は大腸菌細胞である。
【００２８】
別の側面において、本発明は、複数の宿主細胞を含む宿主細胞ライブラリーを提供するものであり、当該複数の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを含み、１以上の宿主細胞は、ＶH可変領域及び／又はＶL可変領域中の１以上の相補性決定領域に存在するアミノ酸配列のライブラリーにおいて、別の宿主細胞に存在するポリペプチドと異なるポリペプチドを含む。本発明の宿主細胞ライブラリー中の１以上の宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコード化する１以上のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、宿主細胞ライブラリー中の宿主細胞は、ＶHをコード化する１つのポリヌクレオチドと、ＶLをコード化する別の１つのポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。
【００２９】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び／又は、ベクターを含む組成物、並びに、薬学的に許容されるキャリアを提供する。
【００３０】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、及び／又は、本発明、並びに、細菌細胞を透過処理することができる薬剤を含むキットを提供する。
【００３１】
さらなる側面において、本発明は、治療器具又は診断器具における、本発明のポリペプチドの使用を提供する。
【００３２】
本発明の１つの形態の好ましい特徴及び特性は、本発明の多くの他の形態に、変更すべきところは変更して、適用可能であることが明らかとなるであろう。
【００３３】
本明細書全体を通して、「comprise（含み）」という用語、又は「comprises（含む）」若しくは「comprising（含んでいる）」などの変形は、記載の、要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の組合せを包含するが、任意の他の要素、整数若しく工程、又は要素、整数若しくは工程の組合せを除外しないことを意味するものと理解される。
【００３４】
添付の図面を参照して、以下の非限定的例により本発明を以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】十分に発現した可溶のscFvクローン1A及び挿入図)と十分発現しているが不溶のscFvクローン(1B及び挿入図)の典型的外観を示す。
【図２】VL遺伝子IGLV3-1、IGLV3-21、IGLV6-57と高い類似性を有する又は完全に同一の選択した可溶クローンの多重アラインメントを示す。
【図３】２つのクローン、つまり１つのIGLV3-1と１つのIGLV3-21の温度上昇における発現の挙動を示す。
【図４】２５℃の大腸菌細胞質ゾルで発現した時のIGLV3-1クローンの可溶性を示す。scFv:I27:FLAG融合タンパク質は完全に可溶性画分(S)にある。
【図５】ラムダＪ領域がＪ１又はＪ２に置換されたオリジナルクローン(#8.93)の熱安定性挙動を示す。
【図６Ａ】多様化したIGLV3-1 CDR3を持つ４つの独立クローンの可溶性と高発現を示す。
【図６Ｂ】多様化したIGHV3-23 CDR3を持つクローン全母集団のサンプルを示す。
【図７】本発明で好ましい可変領域における典型的CDRを(太字及び／又は下線で)示す。
【図８】可変CDR3領域を持つIGLV3-1::IGHV3-23骨格をコード化するポリヌクレオチド配列と、それに対応する翻訳アミノ酸配列の一例を示す。CDRは下線及び太字で示し、ペプチドリンカー配列はイタリックで示す。
【図９】可溶ライブラリーメンバーが高頻度であることが明らかであるＳＮＡＰ配位子標識したIGLV3-1::IGHV3-23 scFvライブラリーを示す。
【図１０】REDスクリーンからのmAG結合scFvの単離を示す。クローン34はmAG結合に対して陽性であり、クローン25は陰性であった。
【図１１】C末端 His6 FLAG融合タンパク質が可溶性画分(S)に存在し、不溶性画分(P)にタンパク質が存在しないようにクローン化されたREDスクリーンから単離されたα-mAG scFv全体を伴うIGLV3-1::IGHV3-23 scFv骨格の可溶性を示す。
【図１２】IMAC Ni-sepharoseに結合したα-mAG scFv His6 FLAG融合によるmAGの結合を示す。
【図１３】大腸菌溶解物からの未浄化mAGの"破壊"によりmAGに対するα-mAG scFv相互作用の特性を示す。α-mAG scFv His6 FLAGは全大腸菌細胞溶解物(レーン6と7)中でmAGの付加を伴ってIMAC Ni-セファロース樹脂に結合し、mAGの期待サイズのタンパク質の結合となった(〜26kD)。
【図１４】gpD::α-mAG scFv融合タンパク質を示すカプセル化した溶解不全バクテリオファージを使用した"ドープ化"mAGライブラリースクリーンのFACS段階からのスクリーングラブ(Top)を示す。カプセル化ファージを含むmAG陽性細胞は右門にある。FACSスクリーンから回収したバクテリオファージは、バクテリオファージの複製とgpD::α-mAG発現に誘導し、RED法を用いてmAGでラベルした(Bottom)。
【００３６】
配列表の凡例
SEQ ID NO:１−IGHV3-23をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Ref. NT_026437.12)
SEQ ID NO:２−イントロンを排除する、IGHV3-23をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:３−IGHV3-23のアミノ酸配列
SEQ ID NO:４−IGLV3-1をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Ref. NT_011520.12)
SEQ ID NO:５−イントロンを排除する、IGLV3-1をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:６−IGLV3-1のアミノ酸配列
SEQ ID NO:７−IGLV3-21をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Ref. NT_011520.12)
SEQ ID NO:８−イントロンを排除する、IGLV3-21をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:９−IGLV3-21のアミノ酸配列
SEQ ID NO:１０−IGLV6-57をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Reference: NW_001838745.1)
SEQ ID NO:１１−イントロンを排除する、IGLV6-57をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:１２−IGLV6-57のアミノ酸配列
SEQ ID NO:１３−IGLV1-51をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Reference Sequence: NT_011520.12)
SEQ ID NO:１４−イントロンを排除する、IGLV1-51をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:１５−IGLV1-51のアミノ酸配列
SEQ ID NO:１６−IGLV1-40をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Reference Sequence: NT_011520.12)
SEQ ID NO:１７−イントロンを排除する、IGLV1-40をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:１８−IGLV1-40のアミノ酸配列
SEQ ID NO:１９−IGLV1-44をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Reference Sequence: NT_011520.12)
SEQ ID NO:２０−イントロンを排除する、IGLV1-44をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:２１−IGLV1-44のアミノ酸配列
SEQ ID NO:２２−IGLV1-47をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Reference Sequence: NT_011520.12)
SEQ ID NO:２３−イントロンを排除する、IGLV1-47をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:２４−IGLV1-47のアミノ酸配列
SEQ ID NO:２５−IGLV3-19をコード化するポリヌクレオチド配列(NCBI Reference Sequence: NT_011520.12)
SEQ ID NO:２６−イントロンを排除する、IGLV3-19をコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:２７−IGLV3-19のアミノ酸配列
SEQ ID NO:２８−好ましいペプチドリンカー
SEQ ID NO:２９−ＣＤＲ変異体配列
SEQ ID NO:３０−選択的ＣＤＲ変異体配列
SEQ ID NO:３１−プライマーHVK1 F1
SEQ ID NO:３２−プライマーHVK1 F2
SEQ ID NO:３３−プライマーHVK2 F
SEQ ID NO:３４−プライマーHVK3 F
SEQ ID NO:３５−プライマーHVK4 F
SEQ ID NO:３６−プライマーHVK5 F
SEQ ID NO:３７−プライマーHVK6 F
SEQ ID NO:３８−プライマーHVKCL R
SEQ ID NO:３９−プライマーHVL1 F1
SEQ ID NO:４０−プライマーHVL1 F2
SEQ ID NO:４１−プライマーHVL2 F
SEQ ID NO:４２−プライマーHVL3 F1
SEQ ID NO:４３−プライマーHVL3 F2
SEQ ID NO:４４−プライマーHVL4 F1
SEQ ID NO:４５−プライマーHVL4 F2
SEQ ID NO:４６−プライマーHVL5 F
SEQ ID NO:４７−プライマーHVL6 F
SEQ ID NO:４８−プライマーHVL7/8 F
SEQ ID NO:４９−プライマーHVL9/10 F
SEQ ID NO:５０−プライマー01115 HVLCL R
SEQ ID NO:５１−プライマー01116 HVLCL R2
SEQ ID NO:５２−プライマーHVK1 2F1
SEQ ID NO:５３−プライマーHVK1 2F2
SEQ ID NO:５４−プライマーHVK2 2F
SEQ ID NO:５５−プライマーHVK3 2F
SEQ ID NO:５６−プライマーHVK4 2F
SEQ ID NO:５７−プライマーHVK5 2F
SEQ ID NO:５８−プライマーHVK6 2F
SEQ ID NO:５９−プライマーHVKCL 2R
SEQ ID NO:６０−プライマーHVL1 2F1
SEQ ID NO:６１−プライマーHVL1 2F2
SEQ ID NO:６２−プライマーHVL2 2F
SEQ ID NO:６３−プライマーHVL3 2F1
SEQ ID NO:６４−プライマーHVL3 2F2
SEQ ID NO:６５−プライマーHVL4 2F1
SEQ ID NO:６６−プライマーHVL4 2F2
SEQ ID NO:６７−プライマーHVL5 2F
SEQ ID NO:６８−プライマーHVL6 2F
SEQ ID NO:６９−プライマーHVL7/8 2F
SEQ ID NO:７０−プライマーHVL9/10 2F
SEQ ID NO:７１−プライマーHVLCL 2R
SEQ ID NO:７２−ラムダＪ領域Ｊ１
SEQ ID NO:７３−ラムダＪ領域Ｊ２
SEQ ID NO:７４−ラムダＪ領域Ｊ３
SEQ ID NO:７５−ラムダＪ領域Ｊ４
SEQ ID NO:７６−ラムダＪ領域Ｊ５
SEQ ID NO:７７−ラムダＪ領域Ｊ６
SEQ ID NO:７８−ラムダＪ領域Ｊ７
SEQ ID NO:７９−ハイブリッドＪ領域配列
SEQ ID NO:８０−ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:８１−転換配列
SEQ ID NO:８２−ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:８３−転換配列
SEQ ID NO:８４−可変CDR3領域とIGLV3-1:IGHV3-23スカフォールドをコード化するポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:８５−SEQ ID NO:８４のポリヌクレオチドによってコード化されたアミノ酸配列
SEQ ID NO:８６−転換CDR3配列
SEQ ID NO:８７−選択的転換CDR3配列
SEQ ID NO:８８−IGLV3-1のフレームワーク配列及びIGHV3-23のＪ領域
SEQ ID NO:８９−介在配列
SEQ ID NO:９０−縮重プライマー１
SEQ ID NO:９１−縮重プライマー２
SEQ ID NO:９２−CDR3ループＬ１
SEQ ID NO:９３−CDR3ループＨ１
SEQ ID NO:９４−CDR3ループＬ２
SEQ ID NO:９５−CDR3ループＨ２
SEQ ID NO:９６−CDR3ループＬ３
SEQ ID NO:９７−CDR3ループＨ３
SEQ ID NO:９８−CDR3ループＬ４
SEQ ID NO:９９−CDR3ループＨ４
SEQ ID NO:１００−CDR3ループＬ５
SEQ ID NO:１０１−CDR3ループＨ５
SEQ ID NO:１０２−CDR3ループＬ６
SEQ ID NO:１０３−CDR3ループＨ６
SEQ ID NO:１０４−CDR3ループＬ８
SEQ ID NO:１０５−CDR3ループＨ８
SEQ ID NO:１０６−CDR3ループＬ９
SEQ ID NO:１０７−CDR3ループＨ９
SEQ ID NO:１０８−CDR3ループＬ１０
SEQ ID NO:１０９−CDR3ループＨ１０
SEQ ID NO:１１０−mAG-BioHis6タンパク質
SEQ ID NO:１１１−Anti-mAG-BioHis6 scFv配列
SEQ ID NO:１１２−gpD:α-mAG scFv 融合構造ポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO:１１３−gpD::α-mAG scFv 融合タンパク質配列
SEQ ID NO:１１４−野生型ヒトIGLV 3-1
SEQ ID NO:１１５−可溶性クローン8.93
SEQ ID NO:１１６−可溶性クローン8.184
SEQ ID NO:１１７−可溶性クローン8.174
SEQ ID NO:１１８−可溶性ヒトIGLV 3-21クローン8.186
SEQ ID NO:１１９−可溶性ヒトIGLV 3-21クローン8.39
SEQ ID NO:１２０−野生型ヒトIGLV 3-21
SEQ ID NO:１２１−可溶性ヒトIGLV 3-21クローン9.19
SEQ ID NO:１２２−野生型ヒトIGLV 6-57
SEQ ID NO:１２３−可溶性クローン16.26
SEQ ID NO:１２４−可溶性クローン16.1
SEQ ID NO:１２５−可溶性クローン16.121
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一般的技術及び一般的定義
別段の明確に定義されない限り、本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、（例えば、タンパク質化学、生化学、細胞培養、分子遺伝学、微生物学及び免疫学における）当業者により通常理解されるのと同じ意味を有すると解される。
【００３８】
他に示されない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫方法は、当業者に公知の標準的手順である。かかる技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)、R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994)、T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、及びF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、及びJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)等の出典の文献に記載及び説明されている。
【００３９】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」の用語は、本明細書中では通常相互交換できるように用いている。「外因性ポリペプチド」の用語は、本明細書中においては、外因性ポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドを指す。「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中においては、それが導入される細胞と異なるポリヌクレオチド、又はポリペプチドが通常見いだされない宿主細胞核酸内のある場所以外に導入される細胞における配列と配列が相同性であることを意味する。
【００４０】
本発明で用いる「抗体」「抗体群」「抗体分子」「抗体分子群」の用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、多特異性抗体、ヘテロ結合抗体、キメラ抗体、例えばインタクト分子、及びそのフラグメント、例えばFab、F(ab’)2、Fv及びscFv並びに他の抗体様分子が挙げられる。当業者は、抗体が一般的に多数のポリペプチド鎖からなる可変領域、例えば軽鎖可変領域(ＶL)と重鎖可変領域(ＶH)を含むタンパク質であると考えることがわかる。抗体はまた定常ドメインを含み、それは定常領域、定常フラグメント又は結晶化可能フラグメント(Fc)に配置され得る。抗体は特に１つ又は２〜３の近縁抗原に結合できる。完全長抗体は、一般的に共有結合した２つの重鎖(〜50-70kD)と２つの軽鎖(それぞれ、〜23kD)を含む。軽鎖は、一般に１つの可変領域と１つの定常ドメインを含み、哺乳類は、κ軽鎖若しくはλ軽鎖のいずれかである。重鎖は一般的に１つの可変領域と、付加的な定常ドメインとヒンジ領域で結合した１又は２の定常ドメインを含む。哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ、μのタイプのうちの１つからなる。その重鎖の１つに、それぞれの軽鎖もまた共有結合している。例えば、２つの重鎖と、重鎖と軽鎖は、鎖間のジスルフィド結合及び/又は非共有相互作用によって結合していてもよい。（もし存在するなら）鎖間ジスルフィド結合の数は抗体のタイプによって異なっていてもよい。それぞれの鎖はN末端可変領域(ＶH又はＶL、それぞれ〜110アミノ酸の長さ)と、C末端に１つ以上の定常ドメインを持つ。軽鎖の定常ドメイン(ＣL、〜110アミノ酸の長さ)はしばしば一直線になり、重鎖の最初の定常ドメイン(ＣH、〜330-440アミノ酸の長さ)とジスルフィド結合する。軽鎖可変領域はしばしば重鎖の可変領域と並ぶ。抗体重鎖は２つ以上の付加的CHドメイン(例えばＣH２、ＣH３等)を含み、ＣH１とＣｍの定常ドメイン間で確認できるヒンジ領域を含み得る。抗体は、タイプ(IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgY)、クラス(IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1、IgA2)であり、サブクラスはどの可能性もある。可能であれば、抗体はネズミ科（マウス若しくはラット）の抗体、又は霊長類（できればヒト）の抗体が望ましい。「抗体」という用語はまた、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体を含む。
【００４１】
本発明において、「可変領域」という用語は、本発明で定義したようにCDR、すなわちCDR1とCDR2とCDR3のアミノ酸配列とフレームワーク領域(FR)を含む抗体の軽鎖と重鎖の一部を指す。ＶHは重鎖の可変領域を指す。ＶLは軽鎖の可変領域を指す。
【００４２】
本発明において、「骨格領域」という用語は、CDR残基以外の全ての可変領域残基を指す。
【００４３】
本発明において、「フレームワーク領域(FR)」という用語は、CDR残基以外の可変領域残基に隣接する配列を意味する。したがって、全てのFRが一緒に「骨格領域」を作り上げる。天然抗体の各可変領域は通常、FR1、FR2、FR3及びFR4と同定されている４つのFRを持つ。もしCDRがKabatに従って定義されると、典型的な軽鎖FR(LCFR)残基は、残基1-23(LCFRl)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)及び98-107(LCFR4)の辺りに位置する。残基10はλLCFR1には含まれず、κLCFR1に含まれることに着目する。典型的な重鎖FR(HCFR)残基は、残基1-30(HCFRl)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)及び103-113(HCFR4)のあたりに位置する。
【００４４】
本発明において、「相補性決定領域(complementarity determining regions)」(CDR、すなわちCDR1、CDR2及びCDR3、又は超可変領域)という用語は、その存在が抗体の結合に必要な免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。各可変領域は通常、CDR1、CDR2又はCDR3と同定される３つのCDR領域を有する。各CDRは、Kabat(1987及び／又は1991)により定義された「相補性決定領域」からのアミノ酸残基を含む。例えば、重鎖では可変領域CDRH1は残基31-35の間にあり、CDRH2は残基50-65の間にあり、CDRH3は残基95-102の間にある。軽鎖ではCDRL1は残基24-34の間にあり、CDRL2は残基50-56の間にあり、CDRL3は残基89-97の間にある。これらのCDRはまた、Kabat(1987 and/or 1991)による報告にあるように多数の挿入を含み得る。
【００４５】
「定常領域(constant region)」(CR又は結晶化可能フラグメント又はFc)という用語は本発明において、１以上の定常ドメインを含む抗体の一部を指し、(必ずではないが)一般的にグリコシル化されており、(例えば、エフェクター機能をもたらす)補体カスケードの１つ以上の受容体及び/又は成分と結合している。重鎖定常領域は５つのアイソタイプα、δ、ε、γ、μのいずれかから選択され得る。さらに、(重鎖のIgGサブクラスのような)さまざまなサブクラスの重鎖は、異なるエフェクター機能の原因となり、したがって、望ましい重鎖定常領域を選ぶことにより、望ましいエフェクター機能を有するタンパク質を作成できる。好ましい重鎖定常領域は、ガンマ1(IgG1)、ガンマ2(IgG2)、ガンマ3(IgG3)である。
【００４６】
「定常ドメイン」は、抗体中のドメインで、その配列は同じタイプの抗体中のものと高い類似性がある。例えば、IgG又はIgM又はIgEなど。抗体の定常領域は一般的に多数の定常ドメインを含む。例えば、γ、α、δ重鎖の定常領域は３つの定常ドメインを含み、γ、α、δ重鎖のFcは２つの定常ドメインを含む。μとε重鎖の定常領域は４つの定常ドメインを含み、Fc領域は２つの定常ドメインを含む。
【００４７】
本発明において、「Fv」という用語は、任意のタンパク質を意味するものとする。そのタンパク質のポリペプチドは複数でも単数でもよい。またそのタンパク質中では、ＶLとＶHが結び付いて特異的に抗原に結合できる抗原結合部を持つ複合体を形成する。抗原結合部を形成するＶLとＶHは、単一のポリペプチド鎖に存在する可能性もあるし、異なるポリペプチド鎖に存在する可能性もある。さらに本発明のFvは(本発明のあらゆるポリペプチドと同様に)、同じ抗原に結合するかどうかは分からない複数の抗原結合部を持っていてもよい。「Fv」という用語は、組み換え法を用いて作成したフラグメントに対応するタンパク質と同様に、直接抗原から得たフラグメントを含むこととする。好ましい実施形態は、ＶHが重鎖定常ドメイン(ＣH)1に結合していない、及び/又は、ＶLが軽鎖定常ドメイン(CL)に結合していない。ポリペプチド又はタンパク質を含む典型的なFvは、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')フラグメント、scFv、二量体、三量体、四量体若しくはそれ以上の高次の複合体、又はその定常領域若しくはドメイン、例えばＣH２又はＣH３ドメインに結合する前述のいずれかを含む。「Fabフラグメント」は、抗体の一価の抗原結合フラグメントからなり、例えば、酵素パパインで抗体全体を消化することによって作成でき、無傷の軽鎖と重鎖の一部から成るフラグメントを得ることができる。又は組み換え法を用いて作成できる。抗体の「Fab'フラグメント」は、例えば、ペプシンで免疫グロブリン全体を処理することで得られ、還元した後、無傷の軽鎖と重鎖の一部から成る分子を得ることができる。この方法で処理すると１つの抗体につき、２つのFab'フラグメントが得られる。Fab'フラグメントはまた、組み換え法によっても得られる。抗体の「F(ab')2フラグメント」は、２つのジスルフィド結合によって結合した２つのFab'フラグメントの二量体から成り、酵素ペプシンで抗体分子全体を処理した後、還元せずに得られる。「Fab2」フラグメントは、例えばロイシンジッパーやＣH３ドメインを使用して結合した２つのFabフラグメントを含む組み換えフラグメントである。
【００４８】
「単鎖Fv」又は「scFv」は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が適切で柔軟なポリペプチドリンカーによって共有結合している免疫グロブリンの可変領域フラグメント(Fv)を含む組み換え分子である。この用語の範囲内のポリペプチドを含む典型的なFvの詳細な説明については本明細書で後述する。
【００４９】
本発明において、「抗原結合部」という用語は、特異的に抗原に結合することが可能なポリペプチドによって形成される構造を意味するものとする。抗原結合部は、単一ポリペプチド鎖中で、一連の隣接アミノ酸どころかアミノ酸さえ必要としない。例えば、２つの異なるポリペプチド鎖から作成したFv中で、抗原結合部は、抗原と相互作用するＶLとＶHの一連の領域から成り、一般的に、しかし常にではないが、各可変領域の１つ以上のCDR中に存在する。
【００５０】
本発明でCDR及びFRに割り当てられた任意のアミノ酸の位置は、Kabat(1987 and 1991)により定義される。当業者は、容易に本発明の実行において他のナンバリングシステムを使用することができるだろう。例えば、ChothiaとLesk(1987 and/or 1989)、及び/又は、Al-Lazikaniら(1997)の超可変ループナンバリングシステムなど。
【００５１】
当業者は、「ジスルフィド結合」はチオール基のカップリングによって形成された共有結合であることを理解する。その結合はまた、ＳＳ結合やジスルフィド架橋とも呼ばれる。ポリペプチドにおいて、ジスルフィド結合は一般的に２つのシステイン残基のチオール基の間で起こる。
【００５２】
当業者はまた、「非還元条件」という用語は、タンパク質中のスルフヒドリル(-SH)基の酸化に対して十分な条件を含み、例えば、ジスルフィド結合を形成することができることを理解する。その結果、「還元条件」という用語は、タンパク質中のスルフヒドリル(-SH)基の酸化に対して不十分な条件を含み、例えば、ジスルフィド結合を形成することはできない。
【００５３】
本発明において、「抗原」という用語は、抗体反応が引き起こされうる任意の組成物を意味することとする。典型的な抗原は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、リン酸基、リン-ペプチド又はポリペプチド、グリコシル化ペプチド又はペプチドなどを含む。
【００５４】
本発明における可変領域とその部分、免疫グロブリン、抗体とそのフラグメントの記述と定義は、Kabat(1987 and/or 1991)、Borkら(1994)、及び/又はChothiaとLesk(1987 and 1989)、又はAl-Lazikaniら(1997)の議論を参照すればさらに明確になるだろう。
【００５５】
本発明において、「接合する」、「接合した」という用語、又はその変化形は、本研究で明らかにする方法で有用な化合物と別の試薬との間で共有結合的又は非共有結合的な会合の任意の形態を言及するのに広く用いられる。
【００５６】
「及び／又は」の用語、つまり、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ」又は「Ｙ」を意味するものとして理解され、その両方の意味又はいずれか一方の意味を明らかに裏付けるものとして解されるべきである。
【００５７】
本明細書中で用いる「約」の用語は、特定した値の±５％の範囲を指す。
【００５８】
以下の記述から明らかなように、本発明者は、タンパク質ディスプレイ法をポリペプチド(例えば、抗体)の同定に適用した。それは細胞質内を可溶形で発現でき、驚くべきレベルの可溶性、熱安定性、及びCDR多様性に対する耐性を示す。本発明者はさらに抗体可変ドメインのフレームワーク領域の生殖細胞系配列のみを使用して、ヒト免疫グロブリンレパートリーが細胞質可溶性と安定性に対する潜在力を有することを示している。
【００５９】
保有カプセル化ディスプレイ(RED):
本発明者らは、保有カプセル化ディスプレイ(Retained Encapsulated Display, RED)を使用して、細胞質内を可溶形で発現し、驚くべきレベルの可溶性、熱安定性、CDR多様性に対する耐性を示すポリペプチドを同定した。REDは、WO2011/075761(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)で報告されたグラム陰性菌に対するタンパク質ディスプレイプラットフォームである。REDでは、ディスプレイされるタンパク質は、細胞のペリプラズムか細胞質のいずれかで発現する。細胞壁が無傷で残っている間に、細胞膜を洗剤又は有機溶媒で透過処理する。ディスプレイタンパク質は、細胞壁の空隙限界を超えて自身の分子径を増すタンパク質への融合(例えば、四量体モノマーへの融合)、又は、DNA若しくは細胞壁自身のいずれか一方若しくはその両方と結合するタンパク質ドメインへの融合のいずれかを通して細胞壁に保持される。ディスプレイシステムに必要な表現型と遺伝子型の連鎖は、透過処理細胞の細胞壁内のプラスミドとゲノムDNAの共同保持を通して供給される。
【００６０】
ポリペプチド：
ヒト抗体レパートリーは、機能的可変領域と偽遺伝子可変領域を含む(Lefranc, 2000)。抗体の発現に利用できる遺伝子構造物の準備のために、これらは非免疫系統のゲノムDNA、又はV(D)J組み換えを経た免疫細胞起源のmRNAのいずれかからのエクソンとしてクローン化される。その過程の間、軽鎖と重鎖の可変領域は、モノマーscFvとして、又は二価かそれ以上の価数を形成する配列でクローン化される。定常領域もまた、可変ドメインの下流でクローン化され、Fab又は完全長抗体を作る。
【００６１】
あらゆる形態において、正しいフォールドを達成し、抗体の作製中に安定性と可溶性を保つため、抗体をコード化する遺伝子構造物はほとんど常にドメイン内ジスルフィド結合がβシート間で形成するような条件下（つまり、非還元条件下）で発現されなければならない。このため、哺乳類の細胞において、抗体は、分泌又は膜内挿入のために小胞体(ER)とゴルジに挿入される。仮に大腸菌のような細菌ホストで発現すると、ジスルフィド結合シャペロンDsbA、B、Cが存在するペリプラズム腔に導かれるはずである。もし抗体が非酸化環境で発現すると、(例えば細胞質内であれば)ジスルフィド結合の安定化の欠如により誤ったフォールドや分解される結果となり、もし大腸菌細胞質内で高レベルに発現すると、細胞内封入体として凝集する結果となる。
【００６２】
本発明者は、抗体可変領域骨格を含むポリペプチドを同定した。抗体可変領域骨格はポリペプチドが非酸化(還元)環境で発現したときでさえ、抗原結合部を形成する能力を有する。
【００６３】
したがって、本発明者は、免疫グロブリン可変ドメインのＶLλ1、3又は6ファミリーの抗体軽鎖可変領域(ＶL)にペプチドリンカーを介して結合した免疫グロブリン可変ドメインのＶH３ファミリーの抗体重鎖可変領域(ＶH)を含む単離及び/又は組み換えのポリペプチドであって、ＶHとＶLが抗体結合部を形成する能力を有するものを提供する。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、抗体又は抗体フラグメントの形として任意の既知の形で提供してもよい。このため、本発明のポリペプチドは、(i)抗体、(ii)単一ドメイン抗体、(iii)単鎖Fv(scFv)、(iv)二量体、三量体又は四量体、(v)(ii)-(iv)のいずれかと抗体のFcドメインを含む融合タンパク質又はそのドメイン、(vi)(ii)-(iv)の任意の１つと免疫エフェクター細胞に結合できるタンパク質を含む融合タンパク質、又は他のすべての既知の抗体の形である。
【００６５】
好ましくは、本発明のポリペプチドはFvである。例えば、本発明のポリペプチドとして、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')フラグメント、scFv、二量体、三量体、四量体又はそれ以上の高次のポリペプチド複合体であることが好ましい。
【００６６】
最も好ましい本発明のポリペプチドはscFvである。scFvは、単一のポリペプチド鎖の中にＶHとＶL領域を含む。ポリペプチド鎖はさらにscFvが抗原結合に対して(すなわち、互いに連携して抗原結合部を形成する単一のポリペプチド鎖のＶHとＶLに対して)望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶHとＶLの間に含むことが好ましい。これは、本発明の二量体又はそれ以上の高次の多量体とは異なる。それらでは異なるポリペプチド鎖の可変領域が互いに連携又は結合する。ペプチドリンカーは12以上のアミノ酸残基を含んでもよい。例えば、ペプチドリンカーは12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30のアミノ酸かそれ以上を含んでもよい。好ましくは、ペプチドリンカーはscFvに対するより好適なリンカーの一つである(Gly4Ser)3(すなわち、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28))を有し１２を上回るアミノ酸残基を含むことが好ましい。他の適したポリペプチドリンカーは当技術分野で公知である。本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン可変のＶH３のＶHの骨格領域、及び/又は、免疫グロブリン可変ドメインのＶLλ1、3又は6ファミリーのＶLの骨格領域を含むことが好ましい。このため、本発明のポリペプチドは、CDR残基を除いて本発明で明らかにした任意の可変領域のアミノ酸残基の全てを含むことが好ましい。CDR残基は、当技術分野の当業者であればKabat(1987 and/or 1991)、Borkら(1994)及び/又はChothiaとLesk(1987 and 1989)若しくはAl-Lazikaniら(1997)の考察を参照して容易に同定できる。したがって、本発明のポリペプチドは、本発明で明らかにした任意の可変領域のFRの全てを含み得る。ポリペプチドはさらに、本発明で明らかにした可変領域のCDRを１つ以上含んでいてもよい。ポリペプチドはまた、本発明で明らかにした可変領域に存在しないCDRを１つ以上含んでいてもよい。したがって、１つ以上の異なる起源のCDRが本発明で明らかにした可変領域の骨格領域に挿入され得る。そのような可能性のさらなる考察は本明細書に後述する。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明のscFvは、ペプチドリンカーを通して免疫グロブリン可変ドメインのＶLλ1、3又は6ファミリーのＶLの骨格領域に結合した免疫グロブリン可変ドメインのＶH3のＶHの骨格領域を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のscFvは、IGHV3-23の骨格領域と、IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21、IGLV6-57の中の任意の１つの骨格領域を含む。最も好ましいのは、本発明のscFvはIGHV3-23の骨格領域とIGLV3-1の骨格領域を含む。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、参照配列に対する割合同一性の点で定義できる。この割合同一性は、当技術分野で公知の任意の適した方法で計算できる。アラインした配列を比較するいくつかのアルゴリズムが公知であり、本発明のポリペプチドの参照配列に対する割合同一性を決定するのに使用できる。例えば、アミノ酸とポリヌクレオチドの配列は手作業、又は、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschulら, 1993; www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/を参照)、アラインメントのClustal法(HigginsとSharp, 1989)やその他のアルゴリズムを用いたコンピュータによる配列比較同定ツールを使用することによって比較できる。そこでのそれぞれの特定の配列の比較に対する適切なパラメータの選択は、当該技術分野の当業者であれば理解できる。
【００６９】
本発明のポリペプチドは単離された、及び/又は、組み換えのポリペプチドが好ましい。本発明で用いられる「単離」又は「精製」という用語は、一般に、核酸、他のポリペプチドとペプチド、そして天然の状態で結びついていた混入分子から分離されたポリペプチドを意味する。単離ポリペプチドは、自然に結びついている他の成分から、６０％以上遊離していることが好ましく、７５％以上遊離していることがより好ましく、９０％以上遊離していることがさらに好ましい。
【００７０】
ポリペプチドの文脈での「組み換え」という用語は、細胞によって若しくは無細胞発現システムにおいて、天然の状態と比較して変化した量、又は、変化した速度で生成される時のポリペプチドのことを指す。一実施形態において、細胞は、ポリペプチドを自然に生成することのない細胞である。しかし、細胞は、変化した、好ましくは増加したペプチドの量を生成する原因となる非内因性遺伝子を含む細胞の可能性がある。本発明で述べる組み換えポリペプチドは、他の遺伝子組み換え細胞又は無細胞の発現システムで生成され、それらの成分から分離されていないポリペプチドと、そのような細胞又は無細胞のシステムで生成され、その後少なくとも何らかの他の成分から精製されたポリペプチドを含む。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、ネズミ科(マウス又はラット)の抗体又は霊長類(好ましくはヒト)の抗体に由来するアミノ酸配列を含むことが好ましい。したがって、本発明のポリペプチドに含まれる可変領域及び/又は骨格領域は、ネズミ科(マウス又はラット)の、又は霊長類(好ましくはヒト)の可変領域及び/又は骨格領域である。
【００７２】
本発明のポリペプチドは可溶であることが好ましい。ポリペプチドの可溶性を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、J. Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)により述べられている。ポリペプチドは、例えばもし溶解した、及び/又は透過処理した細胞フラクションから物理的な分離(例えば、遠心分離)によって分離できないなら、可溶であると決定される。加えて、本発明のポリペプチドが細胞質内で封入体を形成しないなら、可溶であると決定される。従って、ポリペプチドは、もしホスト細胞で発現する時に、任意の適した機械的方法、洗浄法及び/又は酵素法によって、ホスト細胞の溶解後に生成される可溶フラクションに保持されるなら、可溶であると見なす。適した機械的方法は、例えば超音波処理の使用を含む。適した洗浄法は、例えばn-オクチル-β-D-チオグリコキシド(8TGP)の使用を含む。適した酵素法は、例えばリゾチームの使用を含む。本発明のポリペプチドは、５０％以上、７５％以上、９０％以上又は９５％以上のように、２５％以上のレベルで細胞溶解物の可溶フラクションに保持され得ることが好ましい。
【００７３】
本発明のポリペプチドは安定して抗原結合部を形成できることが好ましい。従って、ポリペプチドは、ポリペプチド-抗原複合体を検出するのに十分なレベルで標的抗原に結合できることが好ましい。そのような検出は、５℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３５℃以上、４０℃以上、４５℃以上又は５０℃以上のような、任意の適した実験条件下で行なってもよい。
【００７４】
複合体
本発明のポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適した方法を使用し、１以上の成分に接合している。ポリペプチドが接合できる成分の例は、放射性同位体からなる検出可能ラベル、治療成分、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、被験体とその混合物中のタンパク質の半減期を増やす成分のグループから選ばれる。典型的な治療薬は、血管新生阻害剤に限られず、血管新生阻害や他の血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤、又は治療核酸を含む。
【００７５】
毒素は、細胞に有害な(例えば細胞を殺すような)任意の試薬を含む。当技術分野で公知の薬物のクラスと、作用のメカニズムの内容については、Goodman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990、を参照。免疫グロブリン-抗毒素複合体の調製に関しての追加の技術は、例えばVietta(1993)とUS5,194,594に示されている。典型的な毒素は、ジステリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A鎖(Pseudomonas aeruginosa起源)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(PAPI、PAPII、PAP-S)、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(saponaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセンを含む。例えばWO93/21232参照。
【００７６】
本発明のポリペプチドを含む免疫複合体を形成するために適した化学療法薬は、オーリスタチンとメイタンシン、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、そしてピューロマイシン、代謝抵抗物質(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチンと他の白金誘導体、例えばカルボプラチン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン(AMC))、を含む。
【００７７】
適切な血管新生抑制剤（血管新生阻害薬）の例としては、ウロキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、マリマスタット、ネオバスタット、BAY 12-9566、AG3340、BMS-275291及び類似の薬剤）、内皮細胞遊走と増殖の阻害剤（例えば、TNP-470、スクアラミン、2-メトキシエストラジオール、コンブレタスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ペニシラミン、SCH66336 （Schering-Plough Corp, Madison, NJ）、R115777 （Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ）及び類似の薬剤）、血管新生促進因子の拮抗剤（例えば、ZD6474、SU6668のような血管新生剤に対する抗体及び/又はその受容体（例えば、VEGF、bFGF及びアンジオポイエチン1等）、サリドマイド、サリドマイド類似体（例えば、CC-5013等）、スージェン5416、SU5402、抗血管新生リボザイム（例えば、angiozyme等）、インターフェロンα（例えば、インターフェロンα2a等）、スラミン及び類似の薬剤）、VEGF-Rキナーゼ阻害剤及び他の抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、SU011248等）、内皮特異的インテグリン/生存シグナル伝達の阻害剤（例えば、vitaxin及び類似の薬剤）、銅拮抗薬/キレート剤（例えば、テトラチオモリブデート、カプトプリル及び類似の薬剤）、カルボキシアミドトリアゾール（CAI）、ABT-627、CM101、インターロイキン12（IL-12）、IM862、PNU145156E、並びに血管新生を阻害するヌクレオチド分子(例えば、アンチセンス-VEGF-cDNA、アンギオスタチンをコードするcDNA、p53をコードするcDNA及び欠損したVEGF受容体2をコードするcDNAなど)、並びに類似の薬剤が挙げられるが、それらに限定されない。血管形成、血管新生、及び/又は他の血管新生阻害剤のその他の例としては、抗血管新生ヘパリン誘導体及び関連分子(例えば、ヘパリナーゼIII)、テモゾロミド、NK4、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、低酸素誘導因子1の阻害剤、抗血管新生大豆イソフラボン、オルチプラズ、フマギリン及びその類似体、ソマトスタチン類似体、ペントサンポリ硫酸、テコガランナトリウム、ダルテパリン、タムスタチン、トロンボスポンジン、NM-3、コンブレスタチン、カンスタチン、アバスチン、他の関連する標的に対する抗体(例えば、抗アルファv/ベータ3インテグリン及び抗キニノスタチンmAbs等)及び類似の薬剤がある。
【００７８】
一の実施例においては、任意の実施形態による本発明に記載のポリペプチドは、例えば、本発明に記載されているような、免疫グロブリン又はそれに由来するポリペプチドのような、本発明の別のポリペプチド又は免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを含む、別のポリペプチドに接合又は連結している。他のタンパク質を排除されない。追加のタンパク質は、当業者には明らかであり、例えば、免疫調節剤又は半減期延長タンパク質又はとりわけ、血清アルブミンに結合するペプチド又は他のタンパク質が挙げられる。
【００７９】
典型的な免疫調節剤としては、サイトカインやケモカインが挙げられる。「サイトカイン」という用語は、細胞間仲介物質として別の細胞に作用する一つの細胞集団によって放出されるタンパク質又はペプチドの総称である。サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、成長因子及び従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)及び黄体形成ホルモン(LH)等の糖タンパク質ホルモン、肝成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、OBタンパク質、腫瘍壊死因子-α及び-β、ミュラー管抑制物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン(TPO)、NGF-B等の神経成長因子、血小板増殖因子、TGF-α及びTGF-β等の形質転換成長因子(TGFs)、インスリン様増殖因子-I又は-II、エリスロポエチン(EPO)、骨誘導因子、インターフェロン-α、-β又は-γ等のインターフェロン、マクロファージ-CSF(M-CSF)、顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、及び顆粒球-CSF(G-CSF)等のコロニー刺激因子(CSFs)、IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21及びLIF等のインターロイキン(ILs)は、サイトカイン中に含まれる。
【００８０】
ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を補充するように化学誘引物質として機能する。ケモカインには、RANTES、MCAF、MIPl-alpha又はMIPl-Betaが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインもまた、化学誘引効果を有することが公知であり、ケモカインという用語に分類できることもを認識される。
【００８１】
典型的な血清アルブミン結合ペプチド又はタンパク質は、US20060228364又はUS20080260757に記載されている。
【００８２】
様々な放射性核種は、放射性物質抱合タンパク質の作製に利用可能である。例としては、例えば、13Ｃ、15Ｎ、2Ｈ、125Ｉ、123Ｉ、99Ｔｃ、43Ｋ、52Ｆｅ、67Ｇａ、68Ｇａ、111Ｉｎ等の低エネルギー放射性核(例えば、診断目的に適している)が挙げられるが、これらに限定されない。放射性核種は、投与とイメージング部位への局在化の間の経過時間の後の活動及び検出を可能にするのに適した半減期を持つガンマ線、光子、又は陽電子放出核種であることが好ましい。本発明はまた、例えば、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、111Ｉｎ、105Ｒｈ、153Ｓｍ、67Ｃｕ、67Ｇａ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、186Ｒｅ及び188Ｒｅ等の高エネルギー放射性核(例えば、治療目的のため)を含む。これらの同位体は、典型的に、短い経路長を有する高エネルギーα-又はβ-粒子を生成する。そのような放射性核種は、それらが近接している細胞、例えば、その複合体が付着している又は入り込んでいる腫瘍細胞を死滅させる。それらは、非局在化細胞にほとんど又は全く効果が無く、本質的に非免疫原性である。あるいは、高エネルギー同位元素は、例えばホウ素中性子捕捉療法(Guanら、1998)のように、他の安定同位体の熱照射によって生成してもよい。
【００８３】
別の実施形態において、ポリペプチドは、患者に複合体が投与される事前の標的細胞で利用するために、「受容体」（例えば、ストレプトアビジン等）に接合している。その後、除去剤を用いて循環から未結合の複合体を取り除いてから治療薬（例えば、放射性ヌクレオチド）に接合した「配位子」(例えば、アビジン)を投与する。
【００８４】
本発明のタンパク質は、当該技術分野で公知であり、容易に利用可能な追加の非タンパク質性部分を含むように修正してもよい。タンパク質の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーであることが好ましい。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、エチレングリコール/プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモ重合体又はランダム共重合体のいずれか)、及びデキストラン又はポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（PPG）ホモ重合体、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール； POG)、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定なため、製造することに利点がある。
【００８５】
ポリマー分子は、約２から約１０００、又は約２から約３００の繰り返し単位を有することを典型的な特徴とする。
【００８６】
例えば水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリオキシエチレン(ＰＯＥ)、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、デキストランに限らず、共通してタンパク質に接合し、そのタンパク質の安定性や大きさを増す。
【００８７】
ＰＥＧ、ＰＥＯ又はＰＯＥは、エチレンオキシドのオリゴマー又はポリマーを指す。PEGの場合、これらのオリゴマー又はポリマーは、例えばエポキシド環への水酸化物イオンの求核攻撃により開始されるエチレンオキシドのアニオン開環重合によって生成される。タンパク質修飾のためのＰＥＧの有用な形式の１つは、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である。
【００８８】
本発明のポリペプチドへの接合に対する特に好ましい成分を表１に示す。
【００８９】
表１：接合に好適な化合物
【表１】
2014527408.tif 000002
【００９０】
本発明の一例では、スペーサー部分は、接合される成分とポリペプチドの間に含まれる。本発明のスペーサー部分は開裂できてもよいし、開裂できなくてもよい。例えば、開裂可能なスペーサー部分は、酸化還元開裂可能スペーサー部分であり、そのようなスペーサー部分は、より低い酸化還元電位の環境において開裂可能であり、遊離スルフヒドリル基を持つ分子の濃度がより高い細胞質や他の領域などのことである。酸化還元電位の変化によって開裂するスペーサー部分の例としては、ジスルフィドを含むスペーサー部分がある。開裂の刺激は、細胞質のより低い酸化還元電位がスペーサー部分の開裂を促進する複合タンパク質が細胞内に取り込まれることで提供される。
【００９１】
さらに別の例において、pHの低下はスペーサーの開裂を引き起こし、それにより成分が標的細胞に放出される。pHの低下は、多くの生理学的かつ病理学的過程、例えばエンドソーム輸送、腫瘍増殖、炎症、心筋虚血などに関与している。pHは、生理的な7.4からエンドソームで5-6又はリソソームで4-5まで低下する。ガン細胞のリソソーム又はエンドソームを標的にするのに使用される酸感受性スペーサー部分の例としては、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヒドラゾン、トリチル、シス‐アコニチル、チオカルバモイルに見られるような酸開裂性結合を有するものが挙げられる(例として、US Pat. Nos. 4,569,789、4,631,190、5,306,809、5,665,358を参照)。他の典型的な酸開裂性スペーサー部分は、ジペプチド配列Phe-LysとVal-Lysを含む。
【００９２】
開裂性スペーサー部分は、特定の標的細胞、例えばリソソームや腫瘍関連酵素に結びつく生物学的に供給された開裂試薬に対して感受性がある。酵素的に開裂されるリンク部分の例としては、ペプチドとエステルが挙げられるが。これらに限られない。典型的なリンク部分開裂酵素としては、カテプシンBやプラスミンのような腫瘍関連プロテアーゼに対して感受性のある酵素が挙げられる。カテプシンB開裂部はジペプチド配列バリン-シトルリン、フェニルアラニン-リシン及び/又はバリン-アラニンを含む。
【００９３】
タンパク質複合体
本発明のポリペプチドは、好ましくは、ポロペプチドを本明細書で言及するＲＥＤ分析の使用に特に適した１以上の化合物に接合する。例えば、ポリペプチドをジスルフィド架橋などの共有結合、又は非共有結合により、第２ポリペプチド（以下において、「第２ポリペプチド」と言う）と結合させ得る。「非共有結合」とは、原子間結合が関与しない分子相互作用を指す。例えば、非共有相互作用は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用及びファンデルワールス力が関与する。非共有結合力を用いて、別個のポリペプチド鎖をタンパク質又はタンパク質複合体中に一緒に保持することができる。このため、ポリペプチド及び第２ポリペプチドを同じか若しくは異なるベクターのいずれかから別のポリペプチドとして発現することができるか、又はポリペプチドの一方若しくは両方を、細菌細胞ゲノム中に組み入れられたポリペプチドをコード化するＤＮＡから発現することができる。
【００９４】
また、タンパク質複合体と結合するポリペプチド及び第２ポリペプチドは融合タンパク質であってもよい。本明細書中で用いられる「融合タンパク質」とは、２つのポリペプチドのそれぞれの少なくとも一部をコード化するポリヌクレオチドの発現から生じる２以上のポリペプチド、又はそれらのフラグメントからなるハイブリッドタンパク質を指す。
【００９５】
分子サイズにより透過処理された細菌細胞中に保持されるタンパク質複合体
第２ポリペプチドは、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドで形成された複合体の少なくともいくつかが、透過処理された細菌細胞から拡散することができないような十分な分子サイズ（すなわち十分な分子量又は十分な分子半径）の任意のポリペプチドであり得る。このため、タンパク質複合体は、細胞の透過処理後に細菌細胞内に保持される。分子量及び球状又は桿状（糸状）タンパク質であるかどうかを含む第２ポリペプチドの性質が、細菌細胞壁を通過するタンパク質複合体の拡散を防止又は阻害する第２ポリペプチドの能力を決めることを当業者は理解するだろう。一実施形態において、第２ポリペプチドの分子量は、少なくとも約３０ｋＤａ、又は約４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０ｋＤａ以上若しくはそれ以上である。一実施形態において、第２ポリペプチドは約１２０ｋＤａ以上である。
【００９６】
一実施形態において、第２ポリペプチドは、透過処理された細菌細胞の孔排除サイズよりも大きな分子サイズを有するマルチマーを形成する。本明細書中で用いる「マルチマー」という用語及びその文法的変形は、２以上の異なる分子間のマルチマー複合体の構造を指す。マルチマーは、例えば、同じタンパク質の２以上の分子（すなわち、ホモマルチマー）又は２以上の異なるか、若しくは非同一タンパク質（すなわち、ヘテロマルチマー）の混合物を含み得る。本発明の方法における使用に好適なマルチマーを形成するタンパク質としては、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、及び７以上のサブユニットを含むさらに高次のマルチマーが挙げられる。
【００９７】
マルチマータンパク質は、ホモダイマー（例えばＰＤＧＦ受容体α及びβイソ型、エリスロポエチン受容体、ＭＰＬ、並びに−ＣＳＦ受容体）、サブユニットがリガンド結合及びエフェクター領域をそれぞれ有するヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソ型）、並びに異なる機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体）を含む。本発明の方法で用いてもよい他のマルチマータンパク質の非限定的例としては、ＤＮＡの合成又は複製に関与する因子、例えばＴＦＩＩＤ及びＴＦＩＩＨ等のｍＲＮＡの産生に関与するＤＮＡポリメラーゼタンパク質；細胞、核及び他の膜関連タンパク質、例えばホルモン及び他のシグナル伝達受容体、能動輸送タンパク質及びイオンチャンネル、ヘモグロビン、フィブリノゲン及びフォンウィルブランド因子を含む血液中のマルチマータンパク質；細胞内の構造を形成するタンパク質、例えばアクチン、ミオシン及びチューブリン並びに他の細胞骨格タンパク質；細胞外環境で構造を形成するタンパク質、例えばコラーゲン、エラスチン及びフィブロネクチン；細胞内外の輸送に関与するタンパク質、例えばキネシン及びダイニン、タンパク質のＳＮＡＲＥファミリー（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体）及びクラスリン；クロマチン構造の調節に役立つタンパク質、例えばヒストン及びプロタミン、Ｓｗｉ３ｐ、Ｒｓｃ８ｐ及びモイラ；マルチマー転写因子、例えばＦｏｓ、Ｊｕｎ及びＣＢＴＦ（ＣＣＡＡＴボックス転写因子）；マルチマー酵素、例えばアセチルコリンエステラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ；シャペロンタンパク質、例えばＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ（シャペロニン６０）及びＧｒｏＥＳ（シャペロニン１０）；抗毒素、例えばヘビ毒、ボツリヌス毒素、ストレプトコッカス超抗原；リシン（バクテリオファージ及びウイルス由来の酵素）；並びにほとんどのアロステリックタンパク質が挙げられる。一実施形態において、マルチマータンパク質は大腸菌タンパク質である。マルチマーを形成する大腸菌タンパク質の非限定的例としては、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ（ＲｈｎＡ；例えばＮＣＢＩ受入ＣＡＡ４３００２）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ；例えばＮＣＢＩ受入ＹＰ００１４６１５２０）、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｅｔＢ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＡＡ２３５０６）、グルタメート−５−キナーゼ（Ｇ５Ｋ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＡＢ０８６６２）、グルタチオンシンターゼ（ＧｓｈＢ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＰ＿００３５０４）、及び中鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＰ＿００２０６７）が挙げられる。
【００９８】
一実施形態において、ポリペプチドは、細菌細胞壁内にポリペプチドを保持するために十分な分子サイズを有する。このため、当業者は、透過処理された細菌細胞内にポリペプチドを保持するために、そのようなポリペプチドを第２ポリペプチドと必ずしも結合させる必要はないことを理解するであろう。
【００９９】
ＤＮＡ結合タンパク質
本発明者らは、透過処理後の細菌細胞内にＤＮＡが保持されることを見出した。このため、一実施形態において、ポリペプチドをＤＮＡ結合タンパク質と結合させて、ＤＮＡと結合するタンパク質複合体を形成し、それは細菌細胞の内部に保持される。本明細書中で用いる「ＤＮＡ結合タンパク質」は、２本鎖又は１本鎖ＤＮＡを認識する１以上のモチーフを含むＤＮＡ結合領域を含む任意のタンパク質を意味する。ＤＮＡ結合領域は、当業者に公知であるように、ヘリックス・ターン・ヘリックス、亜鉛フィンガー、ロイシンジッパー、翼状ヘリックス、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、ＤＮＡを認識する免疫グロブリンフォールド、又はＢ３ドメインが挙げられる。ＤＮＡ結合タンパク質とポリペプチドを結合により、本発明のスクリーニング法においてポリペプチドをコード化するプラスミド等のＤＮＡの回収が有意に増大する。
【０１００】
ＤＮＡ結合タンパク質の具体例としては、細菌コンピテンスタンパク質、例えば大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質、淋菌ＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣｏｍＥ、アデノウイルスＥ２タンパク質、ＡｒａＣ転写因子、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ブチラート反応因子、セントロメアタンパク質Ｂ、ＣＯＵＰ転写因子、初期増殖応答転写因子、Ｇボックス結合因子、ＧＡＴＡ転写因子、ＨＭＧＡタンパク質、ホメオドメインタンパク質、Ｉ−カッパＢタンパク質、組込宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン−刺激遺伝子因子３、Ｋｒｕｐｐｅｌ様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着ドメイン結合タンパク質、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質、ＭｕｔＳホモログ２タンパク質、骨髄性−リンパ性白血病タンパク質、ＮＦ−カッパＢ、ＮＦ１転写因子、核呼吸因子、ガン遺伝子タンパク質ｐ５５、起点認識複合体、対合ボックス転写因子、ＰＯＵドメイン因子、プロトオンコジーン因子、ラッド５１リコンビナーゼ、Ｒａｄ５２ＤＮＡ修復及び組換えタンパク質、複製タンパク質Ａ、複製タンパク質Ｃ、網膜芽細胞種タンパク質、Ｓｍａｄタンパク質、ＳＯＸ転写因子、Ｔボックスドメインタンパク質、ＴＣＦ転写因子、テロメア結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体９、トランス活性化因子、及び翼状ヘリックス転写因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質である。別の実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は淋菌タンパク質、例えばＣｏｍＥである。
【０１０１】
細胞壁結合タンパク質
細菌細胞壁結合タンパク質とポリペプチドを結合させてもよい。異なる細菌は異なる細胞壁組成を有するので、当業者は、細胞壁結合タンパク質の選択が宿主細胞種に依存することを理解するであろう。細菌は、ペプチドグリカン（ＰＧ）から構成される細胞壁を有するが、種間の化学修飾は、異種間結合に影響を及ぼし得る。当業者は、特定の細菌種における使用に適した細胞壁結合タンパク質を容易に決定することができる。
【０１０２】
細菌細胞壁結合タンパク質は、ドメイン構造を有することが知られているタンパク質を含み、そのドメイン構造によって天然の構造中のポリペプチド鎖の部分が細菌細胞壁上の特定の分子又は分子構造を認識し、結合する。それ故、「細菌細胞壁結合タンパク質」の用語は、細菌細胞壁に特異的に結合するタンパク質の部分であるタンパク質ドメインを含む。細菌細胞壁結合タンパク質の例としては、バクテリオファージによりコードされるような細胞壁ヒドロラーゼ、細菌細胞壁ヒドロラーゼ及び異なる自己溶菌酵素が挙げられる。さらに、バクテリオファージ及び他のウイルスのＤＮＡによりコードされる受容体分子も含まれる。細菌細胞壁結合タンパク質が、細菌に特異的に結合できるバクテリオファージ複製起点の加水分解酵素に由来する場合、細胞壁結合タンパク質はそれらの結合能力を保持するが、顕著な加水分解性は有さないことが好ましい。
【０１０３】
一実施形態において、細胞壁結合タンパク質は大腸菌の細胞壁に非共有結合する。例えば、大腸菌宿主細胞に対して、ＰＡＬ、ＯｍｐＡ、ＹｉａＤ、ＹｆｉＢ、及びＭｏｔＢに存在する、約１００の保存されたアミノ酸ＰＧ結合ドメインを有する内因性ＰＧ結合タンパク質がある（Parsons et al., 2006）。しかしながら、例えばシュードモナス属φＫＺファージ（ＫｚＰＧ）由来の約７０のアミノ酸ＰＧ結合ドメイン等の他の生物由来のタンパク質は、大腸菌で十分に発現され、高親和性で細胞壁に結合することが示されている（Briers et al., 2009）。したがって、本発明の方法において、ＰＧと結合するタンパク質由来のＰＧ結合ドメインを細菌細胞壁結合タンパク質として用いてもよい。
【０１０４】
典型的な実施形態において、細菌細胞のサイトゾルで発現される本発明のポリペプチドに、ＰＧ結合ドメインを融合させてもよい。膜透過処理により、ＰＧ結合ドメインは細胞壁に結合し、その結果、透過処理細胞内で関心対象のポリペプチドが保持される。細胞内の関心対象のポリペプチドの保持を潜在的にさらに増強するために、当業者は、ポリペプチドが細菌細胞壁結合タンパク質に加えてＤＮＡ結合タンパク質と結合できることを理解するであろう。
【０１０５】
あるいは、ポリペプチドは、細菌細胞壁に共有結合することができるタンパク質と結合することができる。好ましくは、タンパク質は周辺質を標的とするシグナルを含む。このため、ポリペプチドは細菌細胞のサイトゾル中で発現されるが、膜透過処理前に細胞壁に結合する周辺質を標的とする。
【０１０６】
非限定的な具体例として、細胞壁と共有結合する細菌細胞壁結合タンパク質は、細胞壁と結合することができ、外膜付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如したリポタンパク質であり得る。例えば、リポタンパク質は大腸菌ＬＰＰであり得る。ＬＰＰは、トリマーコイルドコイルを形成する多量の大腸菌タンパク質である。その天然の形態において、一端は脂質化により外膜に結合し、多端はＣ−末端リシンにより細胞壁に共有結合する。リポタンパク質は、リポタンパク質に周辺質を標的とさせる配列、例えばＯｍｐＦ周辺質ターゲティング配列をさらに含んでもよい。一実施形態において、リポタンパク質は、外膜への付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如した大腸菌リポタンパク質である。
【０１０７】
本明細書の教示を考慮すれば、当業者は、本発明の方法の使用に好適なタンパク質であって、細菌細胞壁と共有結合するタンパク質を同定又は設計し得る。
【０１０８】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＫｚＰＧドメイン並びにスペーサー、ＳＮＡＰ及び／又はＤＢＰから選択される１以上の他のドメインを含む融合ポリペプチドである。特定の一実施形態において、融合ポリペプチドは、１以上スペーサー並びにＫｚＰＧ、ＳＮＡＰ及びＤＢＰドメインを含む。
【０１０９】
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを提供するものでもある。好ましくは、ポリヌクレオチドは、単離及び／又は組換ポリヌクレオチドである。
【０１１０】
「単離ポリペプチド」の用語は、通常、自然の状態で結合又は関連するポリヌクレオチド配列から離れているポリヌクレオチドを意味することを意図している。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、自然に結合する他の成分から６０％以上遊離しており、より好ましくは７５％以上遊離し、さらに好ましくは９０％以上遊離している。さらに、「ポリヌクレオチド」の用語は、本明細書においては「核酸分子」「遺伝子」及び「ｍＲＮＡ」の用語と相互交換可能で用いられる。
【０１１１】
ポリヌクレオチドの文脈において「組み換え」という用語は、細胞中に、若しくは無細胞発現システム中に、又は天然の状態と比較して変化した量で存在する時のポリヌクレオチドのことを示す。一実施形態において、細胞は、天然ではポリヌクレオチドを含まない細胞である。しかし、細胞は、コード化されたポリヌクレオチドの生成量を変化させ、好ましくは増加させる非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞でもよい。本発明の組み換えポリヌクレオチドは、自身が存在する遺伝子組み換え細胞、又は無細胞発現システムの他の成分から分離されていないポリヌクレオチドと、そのような細胞又は無細胞システムで生成され、後に少なくともいくらかの他の成分から精製されるポリヌクレオチドを含む。
【０１１２】
「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの任意のフラグメントを示す。それはゲノム、合成起源のDNA又はRNAであり、二本鎖又は一本鎖であり、そして炭水化物、脂質、タンパク質、又は他の物質と結合して本明細書で定義する特定の活性を示す。
【０１１３】
可変領域を含むポリペプチドをコード化するDNAは、当該技術分野における標準的な方法を用いて単離することができる。例えば、プライマーは、関心領域の側面に位置する可変領域内で保存された領域にアニールするように設計できる。そしてそれらのプライマーは介在核酸を、例えばPCRによって増幅するのに使用できる。適した方法及び/又はプライマーは、当技術分野で公知であり、例えばBorrebaeck (ed), 1995及び/又はFroyenら, 1995に説明されている。そのような増幅方法に対する適した鋳型DNA源は、例えばハイブリドーマ、トランスファクトーマ、及び/又は例えば本明細書で記述する可変領域を含むタンパク質を発現する細胞から抽出できる。
【０１１４】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド全体をコード化できる。あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの単一の重鎖又は軽鎖をコード化できる。従って、それぞれ重鎖又は軽鎖の１つをコード化する２つのポリペプチドが、本発明のポリペプチドを生成するために単一の細胞内で生成し、発現され得る。
【０１１５】
ポリヌクレオチドは、可変領域の骨格領域、そして１以上のCDRをもコード化することが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、可変領域の骨格領域と３つのCDR全てをコード化することがより好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、CDRのアミノ酸配列に、そしておそらく骨格領域のアミノ酸配列にも多様性をもたらすために突然変異してもよい。当業者であれば、この目的に対する適した方法を理解するだろう。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本明細書で述べられるように、本発明のポリヌクレオチドに接合するタンパク質複合体、又は接合可能なタンパク質複合体をコード化し得る。
【０１１７】
ポリペプチド生成物
本明細書で開示されるポリペプチドは、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、組み換えポリペプチドの生成及び回収、そしてポリペプチドの化学合成等によって合成することができる。したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法をも提供する。
【０１１８】
本発明のポリペプチドは、還元又は非還元条件で生成されてもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、還元条件下、例えばホスト細胞の細胞質中、で生成される。
【０１１９】
組み換えポリペプチドの場合、同一のものをコード化する核酸は、１以上の発現ベクターに配置されることが望ましい。そしてそれは次にホスト細胞、例えば大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は別に免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞に導入され、組み換えホスト細胞中でタンパク質が合成される。Skerraら (1993)とPluckthun(1992)の免疫グロブリンをコード化するDNAの細菌における組み換え発現の論文を参照されたい。これらの目的を達成する分子クローニング技術は、当技術分野で公知であり、例えばAusubelやSambrookで論じられている。組み換え核酸の構築に対する適したクローニングと生体外増強の方法は多種にわたっている。組み換え免疫グロブリンの作製方法もまた、当技術分野で公知である。US4,816,567、US5225539、US6054297、US7566771、US5585089を参照されたい。
【０１２０】
単離した後、本発明のポリペプチドをコード化する核酸は、さらなるクローニング(DNAの増強)のため、又は無細胞系若しくは細胞における発現のために発現構築物又は複製可能ベクターに挿入されることが望ましい。核酸は操作可能なようにプロモーターに結合していることが望ましい。
【０１２１】
本発明において、「プロモーター」という用語は、その最も広い内容で解釈されるべきであり、核酸の発現を変化させる付加的な調節要素（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部、エンハンサー及びサイレンサー等）の有無にかかわらず、例えば、発生刺激及び/又は外部刺激に反応して、又は組織特異的に、正確な転写開始に必要とされるTATAボックス又は開始要素を含むゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。本明細書中の「プロモーター」はまた、組み換え核酸、合成核酸、若しくは融合核酸、又は操作可能に結合している核酸の発現をもたらすか、活性するか、又は増進する誘導体を述べることにも使われる。好ましいプロモーターは、さらなる発現の増進する、及び/又は、前述の核酸の空間的な発現及び/又は時間的発現を変化させる、付加的な１つ以上の特定の調節要素のコピーを含む。
【０１２２】
本発明において、「操作可能に結合する」という用語は、核酸の発現がプロモーターによって制御されるように、プロモーターを核酸に対して配置することを意味する。
【０１２３】
本発明は、無細胞発現系についても考慮している。例えば、本発明のポリペプチドをコード化する核酸は、適したプロモーター、例えば、T7プロモーター、そして転写及び翻訳に十分な条件に適用して得られる発現構築物に対し、操作可能に結合している。上述した生体外発現又は無細胞発現に対する典型的な発現ベクターは、TNT T7とTNT T3システム(Promega)、pEXP1-DESTとpEXP2-DESTベクター(Invitrogen)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
細胞での発現に対して多数のベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般的に次のもの：つまり、シグナル配列、本発明のタンパク質をコード化する配列(例えば、本発明で提供した情報から得られるもの)、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列のうちの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、タンパク質の発現に対する適した配列を理解するだろう。例えば、典型的なシグナル配列は、原核生物の分泌シグナル（例えば、pelB、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、熱安定性エンテロトキシンIIなど）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、酸性ホスファターゼリーダー等）、又は哺乳類の分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスgDシグナル）等が挙げられる。
【０１２５】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、特に本発明で述べたREDシステムにおける発現に適したベクターに挿入される。従って、ベクターは、特に細菌細胞内での発現に適していてもよい。例えば、ベクターは、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入する部位、及び透過化細菌細胞の細胞壁の内部に保持できる、又は細胞壁に付着できるタンパク質複合体を形成するために本発明のポリペプチドと配位する第二のポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。好適なベクターは、ＷＯ２０１１／０７５７６１に述べられている。
【０１２６】
好ましくは、ベクターは、ホストのゲノムとは独立して細菌細胞内で複製できることである。好適なベクターは、大腸菌の線形ファージN15、及び／又は細菌細胞ゲノムとは独立して複製する染色体外DNA等の直鎖DNA要素と同様に、プラスミド、ウイルス、コスミドが挙げられる。
【０１２７】
当業者は、本発明の方法でポリペプチドを発現するのに適した細菌の菌株を容易に決定できる。当業者であれば、例えばサルモネラ、大腸菌、赤痢菌、カンピロバクター、フゾバクテリウム、ボルデテラ、パスツレラ、アクチ、ヘモフィルス及びヒストフィラスを含むグラム陰性菌が本発明の方法に使用するのに適していることを理解する。
【０１２８】
本発明のベクターに含まれていてもよい典型的なプロモーターは、原核生物で活性のあるもの（例えば、phoAプロモーター、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びtacプロモーター等のハイブリッドプロモーター）が挙げられる。これらのプロモーターは、枯草菌及びB.リケニホルミスのようなバシラス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、並びにストレプトマイセス属と同様に、グラム陰性又はグラム陽性生物等、例えば、エシェリキア属、例えば大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、例えばセラチア菌、及び赤痢菌属等の腸内細菌、のような真正細菌を含む原核生物での発現に有用である。ホストとしては大腸菌が好ましい。好ましい大腸菌クローニングホストの１つは、E. coli 294 (ATCC 31,446)である。とはいえ、E. coli B、E. coli X 1776 (ATCC 31,537)、及びE. coli W3110 (ATCC 27,325)、DH5α又はDH10B等の他の菌株も好適である。
【０１２９】
哺乳類細胞で活性のある典型的なプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター(CMV-IE)、ヒト伸長因子1-aプロモーター(EF1)、小核RNAプロモーター(U1a及びU1b)、a-ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)、アデノウイルス主要後期プロモーター、β-アクチンプロモーター、つまりCMVエンハンサーを含むハイブリッド調節要素、β-アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター若しくはその活性フラグメントが挙げられる。有用な哺乳類ホスト細胞株の例としては、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた293細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10)、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)が挙げられる。
【０１３０】
例えば、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ及びS.ポンベを含む群から選択される酵母細胞のような酵母細胞での発現に適した典型的なプロモーターは、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、nmtプロモーター、RPR1プロモーター、又はTEF1プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
昆虫細胞での発現に適した典型的なプロモーターには、OPEI2プロモーター、カイコガ(Bombyx muri)から単離した昆虫アクチンプロモーター、ショウジョウバエ種(Drosophila sp.)のdshプロモーター(Marshら、2000)及び誘導性メタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。組み換えタンパク質の発現に対する好ましい昆虫細胞には、BT1-TN-5B1-4細胞、及びヨトウガ細胞（例えば、SF19細胞、Sf21細胞）を含む群から選択される昆虫細胞が挙げられる。核酸フラグメントの発現に適した昆虫には、ショウジョウバエ種が挙げられるが、これらに限定されない。ヨトウガの使用もまた考慮される。
【０１３２】
単離された核酸分子又は発現のために細胞内に同じものを含む遺伝子構築物を誘導するための手段は、当業者に公知である。所定の細胞に使用される技術は、既知の成功した技術に依存する。細胞に組み換えDNAを導入するための手段には、マイクロインジェクション、DEAE-デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン(Gibco, MD, USA)及び／又はセルフェクチン(Gibco, MD, USA)を使用するようなリポソームによって媒介されるトランスフェクション、PEG媒介DNA取り込み、例えばとりわけDNA被覆タングステン又は金粒子を用いた電気穿孔法及び微粒子銃法が挙げられる。
【０１３３】
本発明のタンパク質を生成するために使用されるホスト細胞は、使用される細胞型に依存して、種々の培地で培養することができる。例えばHam's Fl0 (Sigma)、Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma)、RPMl-1640 (Sigma)及びDulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)等の市販の培地は、哺乳類細胞の培養に適している。本明細書で述べた他の細胞型の培養に対する培地は当技術分野で公知である。
【０１３４】
骨格配列
これまで、細胞内抗体（細胞質内で生産的にフォールドされるようなより高い安全性のために操作又は進化してきた配列を持つ抗体分子）の構造領域の配列、つまり非CDR配列は、同族生殖細胞系列のゲノム配列とは大きく異なる。本明細書で明らかにしたように、本発明者は、同族生殖細胞系列のゲノム配列と同一であるか、又は密接に関連した、そして非酸化環境においての発現時に正確にフォールドし、安定性が増すヒト抗体可変領域の配列をスクリーニングして決定した。本発明での使用に対する好ましい配列は、下記に記載する。本発明に記載した任意の可変領域配列に対して、当業者がCDR（例えば、その多くはNCBIデータベースで同定される）と残りの骨格領域を同定できることが理解される。本発明に記載した各可変領域のCDRの特定の例は図７に示す。
【０１３５】
IGHV3-23
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン可変ドメインのＶH３ファミリーの重鎖可変領域(ＶH)を含む。ＶHは、IGHV3-23(SEQ ID NO: 3)であることが好ましい。
【０１３６】
IGHV3-23は、DP-47としても知られ、ヒトIg可変ドメインのＶH３ファミリーに属する。ＶH３ファミリーは、ＶH遺伝子の機能的メンバーの43%(22/51)を占め、IGHV3-23はＶHレパートリーの中で最も高発現の遺伝子として挙げられている(Stewartら、1993)。IGHV3-23はまた、B細胞における生産的Ig再配列に高頻度で見られる(Brezinschekら、1997)。IGHV3-23は天然Igレパートリーにおいて高頻度のため、頻繁にヒトV領域のファージディスプレイライブラリーから単離される(Griffithsら、1994)。IGHV3-23はまた、合成ライブラリーにおける骨格パートナーとしても使用される(Jirholtら、1998; Piniら、1998; Soderlindら、2000、Geら、2010)。IGHV3-23は、安定した可溶の抗体領域骨格を同定するために本発明において重鎖可変領域パートナーとして選択した。
【０１３７】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、９０％以上はSEQ ID NO: 3に記載のIGHV3-23の骨格領域と同一である骨格領域を含む抗体重鎖可変領域(ＶH)を含む。例えば、骨格領域は、SEQ ID NO: 3に記載のIGHV3-23の骨格領域と、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％同一であってもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、９６％以上、SEQ ID NO: 3に記載のIGHV3-23の骨格領域と同一である骨格領域を含む抗体重鎖可変領域(ＶH)を含む。骨格領域は、CDR残基を除く全ての可変領域残基を含む。従って、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸1-25、33-51、60-98を含む骨格領域（又は、これらのアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％同一のアミノ酸配列を持つ骨格領域）を含んでもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸1-25と33-98を含む骨格領域（又は、これらのアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％同一であるアミノ酸配列を持つ骨格領域）を含んでもよい。あるいは、それとは別に、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸1-51と60-98を含む骨格領域(又は、これらのアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％同一であるアミノ酸配列を持つ骨格領域)を含んでもよい。
【０１３８】
本発明のポリペプチドは、任意のCDR配列を含んでいてもよい。従って、本発明のポリペプチドは、IGHV3-23のCDR配列(すなわち、SEQ ID NO: 3のアミノ酸26-32、52-59)を含んでいてもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、任意の他のCDR配列を含んでいてもよい。従って、ＶH３可変ドメインの骨格領域は、任意の所定のCDR配列を挿入できる鋳型として機能してもよい。CDR配列は、ランダムに生成されていてもよい。あるいは、さらに、CDR配列は、（全ての可能なアミノ酸のサブセット（そのサブセットはCDRの所定のアミノ酸位置で必要又は特に有利と知られている）から選択したアミノ酸残基をCDRの各特定のアミノ酸位置にランダムに割り当てることによって）準ランダムに生成されていてもよい。
【０１３９】
あるいは、CDR配列は、別の抗体に由来する可能性もある。従って、例えばヒト抗体由来のCDRは、ＶH３可変ドメイン骨格に移植できる。当業者は、本明細書で規定した骨格領域は、ヒト抗体から採取した１以上のCDR配列を含むことを保証するために多種の方法が使用できることを理解するだろう。好ましくは、そのような方法としては、本発明で下記で詳細に記述するように、１以上のCDRコード化配列を本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにクローニングすることが挙げられる。CDRコード化配列は、さらに、複数の異なるCDR配列を含む複数のポリペプチドを供給するために、標的とした又はランダムの突然変異発生によって変化させられてもよい。そのような方法は、CDR1、CDR2、CDR3のいずれか１つ又はこれらの組み合わせに適用できる。
【０１４０】
CDR1、CDR2、CDR3のCDRのいずれか１以上の配列は、任意の組み合わせで本発明に記載の可変ドメイン骨格に導入されてもよい。好ましくは、少なくともCDR3の配列が本発明に記載のＶH３可変ドメイン骨格に導入される。
【０１４１】
加えて、本明細書に記載のＶH３可変ドメイン骨格に導入されたCDR配列の長さは可変である。例えば、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1アミノ酸のCDR3配列を骨格に挿入できる。本発明者は、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1のような12未満の短くしたCDR3配列、そして最も好ましくは7アミノ酸の長さのCDR3配列が、安定性を増大させることを見出した。
【０１４２】
IGHV3-23に対するIGKとIGL軽鎖パートナー
本発明者は、scFv融合がREDプラットフォームに可溶であるという基準のみを適用することにより、（生体内で抗体標的への抗体の結合が必要で、従ってそれぞれの生殖系列配列から十分に突然変異した抗体を、以前に実施した機能的スクリーニングとは対照的にスクリーニングした）V領域内で突然変異したナイーブ軽鎖をスクリーニングすることができた。従って、IGHV3-23 scFv融合に安定性をもたらす生殖細胞系列配列を同定することができた。これは、ＶLとＶHドメインで構築された人工的な骨格ライブラリーが豊富なヒト抗体タンパク質の配列において同一であることを保証し、それにより任意の誘導体に長期間さらすことで免疫認識及び拒絶を最小化するという大きな利点を有する。
【０１４３】
従って、本発明のポリペプチドは、ヒト生殖細胞系列IGHV3-23配列と結合した免疫グロブリン可変ドメインのＶLλ1、3又は6ファミリーの抗体軽鎖可変領域(ＶL)を含むことが好ましい。好ましいＶLλ1、3又は6ファミリーのメンバーとしては、IGLV1-40(SEQ ID NO: 18に記載)、IGLV1-44(SEQ ID NO: 21に記載)、IGLV1-47(SEQ ID NO: 24に記載)、IGLV1-51(SEQ ID NO: 15に記載)、IGLV3-1(SEQ ID NO: 6に記載)、IGLV3-19(SEQ ID NO: 27に記載)、IGLV3-21(SEQ ID NO: 9に記載)及びIGLV6-57(SEQ ID NO: 12に記載)が挙げられる。従って、本発明のポリペプチドは、IGLV1-40(SEQ ID NO: 18に記載)、IGLV1-44(SEQ ID NO: 21に記載)、IGLV1-47(SEQ ID NO: 24に記載)、IGLV1-51(SEQ ID NO: 15に記載)、IGLV3-1(SEQ ID NO: 6に記載)、IGLV3-19(SEQ ID NO: 27に記載)、IGLV3-21(SEQ ID NO: 9に記載)及びIGLV6-57(SEQ ID NO: 12に記載)のうち任意の骨格領域と９０％以上同一である骨格領域を含む抗体軽鎖可変領域(ＶL)を含むことが好ましい。例えば、骨格領域は、IGLV1-40(SEQ ID NO: 18に記載)、IGLV1-44(SEQ ID NO: 21に記載)、IGLV1-47(SEQ ID NO: 24に記載)、IGLV1-51(SEQ ID NO: 15に記載)、IGLV3-1(SEQ ID NO: 6に記載)、IGLV3-19(SEQ ID NO: 27に記載)、IGLV3-21(SEQ ID NO: 9に記載)及びIGLV6-57(SEQ ID NO: 12に記載)のうち任意の１つの骨格領域と、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％同一であってもよい。
【０１４４】
IGHV3-23のＶLパートナーはIGLV3-1(SEQ ID NO: 6に記載)であることが最も好ましい。従って、本発明のポリペプチドは、IGLV3-1(SEQ ID NO: 6に記載)の骨格領域と９０％以上同一である骨格領域を含む抗体軽鎖可変領域(ＶL)を含むことが好ましい。例えば、骨格領域は、IGLV3-1(SEQ ID NO: 6に記載)の骨格領域と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％同一であってもよい。IGLV3-1の骨格領域は、SEQ ID NO: 6のアミノ酸1-23、32-48、56-89を含んでいてもよい。従って、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: 6のアミノ酸1-23、32-48、56-89を含む骨格領域(又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％同一であるアミノ酸配列を持つ骨格領域)を含む抗体軽鎖可変領域(ＶL)を含んでいてもよい。
【０１４５】
好ましい可変CDR3領域を持つIGLV3-1::IGHV3-23骨格をコード化するポリヌクレオチド配列、及びそれに対応する翻訳されたアミノ酸配列を図８に示す。
【０１４６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ＶL可変ドメインの骨格領域を含む(例えば、本発明のポリペプチドはIGHV3-1の骨格領域、例えばSEQ ID NO: 6のアミノ酸1-23、32-48、56-89を含んでもよい)。さらに、本発明のポリペプチドは、任意のCDR配列を含んでいてもよい。従って、本発明のポリペプチドは、IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21及び/又はIGLV6-57のうちの任意のCDR配列を含んでいてもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、任意の他のCDR配列を含んでいてもよい。従って、ＶL可変ドメインの骨格領域は、ＶH３可変ドメイン骨格について上述したように任意の所定のCDR配列が挿入され得る鋳型として機能する。従って、CDR配列はランダムに生成されてもよい。あるいは、又は加えて、CDR配列は、(全ての可能なアミノ酸のサブセットから選択したアミノ酸残基をCDRの各特定のアミノ酸位置にランダムに割り当てることによって、ただし、そのサブセットはCDRの所定のアミノ酸位置で必要又は特に有利だと知られている)準ランダムに生成されてもよい。
【０１４７】
あるいは、CDR配列は、別の抗体に由来してもよい。従って、例えばヒト抗体由来のCDRは、ＶL可変ドメイン骨格に移植できる。当業者は本発明で定義した骨格領域がヒト抗体から採取した１以上のCDR配列を含むことを保証するために多種の方法が使用できることを理解するだろう。さらに、ヒト抗体のCDR配列は、本発明に記載のＶL可変ドメイン骨格への挿入の前に突然変異を起こしてもよい。
【０１４８】
任意の１以上のCDR1、CDR2及びCDR3の配列は、任意の組み合わせで本発明に記載のＶL可変ドメイン骨格に挿入されていてもよい。好ましくは、少なくともCDR3の配列が本発明に記載のＶL可変ドメイン骨格に挿入されることである。
【０１４９】
加えて、本発明に記載のＶL可変ドメイン骨格に挿入されたCDR配列の長さは可変である。例えば、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1アミノ酸のCDR3配列が骨格に挿入できる。本発明者は、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1のような12未満の短縮したCDR3配列、及び最も好ましくは7アミノ酸の長さのCDR3配列が安定性を増大させることを見出した。
【０１５０】
合成ポリペプチドライブラリー
ポリペプチド配列のライブラリーは、所望の標的に対する親和性タンパク質のために選択できる様々なタンパク質ディスプレイプラットフォームでクローン化してもよいし、発現してもよい。従って、本発明は、本発明の複数のポリペプチドを含むライブラリーを提供する。好ましい実施形態において、ライブラリーは、"親(parent)"ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド配列を同定し、そしてライブラリーを形成するための複数の可変配列を作り出すためにその配列を改変させることによって作成することができる。改変は、任意の適した手段、例えば、部位特異的変異誘発又はランダム突然変異誘発によって行うことができる。ライブラリー構築の適する方法は、当技術分野で公知である。
【０１５１】
上記のように、可変ドメインは、V(D)J組み換えによって形成される際、構造配列とCDRの両方が存在するように、生物学的起源から直接クローン化することができる。あるいは、抗体ライブラリーは、部分的又は完全に、新たに組み立てられたCDRと構造的領域を持つ合成物であってもよい。例えば、一般に発現される、又は特に安定な、抗体遺伝子の対合を表す単一の人工骨格は、ホスト生物中で最適化された発現のために再コード化されてもよい。全体の骨格及びCDRは、Geら(2010)により報じられたような重複オリゴヌクレオチドを用いて単一の反応で組み立てられる可能性さえある。
【０１５２】
抗原結合CDRの多様性を構築するための方法は、完全に従来技術で報告されている。それらには、mRNAから、ナイーブ又は事前に免疫化した免疫細胞からのCDRの調達; 照合された抗体配列の分析によるCDRの設計及び合成；照合された抗体配列に基づく加重アミノ酸分布によるCDRの設計及び合成；ランダム化、非偏向のCDR領域の採用、が挙げられる。
【０１５３】
Igドメイン、ＶL及びＶHはそれぞれ、３つのCDR領域、CDR1、CDR2及びCDR3を有し、それらは様々な長さであり、異なる頻度で抗原と界面接触する。ＶL及びＶHの両方の生体内で最も変異したCDRは、CDR3であり、そのループはV-Jドメイン(ＶL)又はV-D-Jドメイン(ＶH)のエクソン接合間の組み換えによって形成される。これは、ナイーブ免疫系の典型である。しかし、B細胞は拡張の刺激を受けると、その後、体細胞の超変異はしばしばCDR1及び2を多様化するように機能する。
【０１５４】
しかしながら、単一又はいくつかのＶL及びＶH骨格に組み込まれた可変ドメインのクローン化したscFvライブラリーに対しては、CDR多様性は、アミノ酸組成及びループ長変異が標的結合を占め、CDR3に限定されることが一般的である。
【０１５５】
本発明で記載した安定ポリペプチドの場合、これは、自然に変化するCDR3ループ領域以外のscfvの全体が同族抗体遺伝子の生殖系列配列と同一、又はそれに近いことを可能にする。これは、ヒトナイーブ抗体レパートリーに酷似する親和性タンパク質をスクリーニングし、それにより患者免疫認識を引き起こしてもよい人工骨格の配列多様性を最小化することを可能にする。従って、本発明では、ポリペプチドライブラリーは、CDR3配列にのみ互いに異なるポリペプチドを含んでもよい。
【０１５６】
人工抗体ライブラリーは、単一の骨格を利用して構築してもよく、又は複数の骨格によって構成してもよい。従って、本発明のライブラリーは、本明細書で明らかにした重鎖及び軽鎖可変領域骨格の特定の組み合わせを有する１つ以上のポリペプチド、並びに本発明で明らかにした重鎖及び軽鎖可変領域骨格のもう１つ別の組み合わせを持つ１つ以上のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１５７】
例えば、ライブラリーは以下のものを含んでもよい。
- SEQ ID NO: 3に記載のIGHV3-23の骨格領域と９０％以上同一の骨格領域を含む抗体重鎖可変領域(ＶH)、及び(SEQ ID NO: 6に記載の)IGLV3-1の骨格領域と９０％以上同一の骨格領域を含む抗体軽鎖可変領域(ＶL)を含む１以上のポリペプチドであって、ＶH及びＶLは抗原結合部位を形成することができるもの。及び
- SEQ ID NO: 3に記載のIGHV3-23の骨格領域と９０％以上同一の骨格領域を含む抗体重鎖可変領域(ＶH)、及び(SEQ ID NO: 18に記載の)IGLV1-40、(SEQ ID NO: 21に記載の)IGLV1-44、(SEQ ID NO: 24に記載の)IGLV1-47、(SEQ ID NO: 15に記載の)IGLV1-51、(SEQ ID NO: 27に記載の)IGLV3-19、(SEQ ID NO: 9に記載の)IGLV3-21、又は(SEQ ID NO: 12に記載の)IGLV6-57の骨格領域と９０％以上同一の骨格領域を含む抗体軽鎖可変領域(ＶL)を含む１以上のポリペプチドであって、ＶH及びＶLは抗原結合部位を形成することができるもの。
このため、本発明のライブラリーは、本発明で明らかにした重鎖及び軽鎖可変領域骨格の任意の組み合わせを有する１以上のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１５８】
複数の骨格は、ヒトIg遺伝子の２つの広いクラス、すなわち、κ及びλラムダ軽鎖クラスとともに重鎖対合を表すかもしれないか、若しくはそれらは複数の重鎖を持つ単一の軽鎖骨格の混合物、又は軽鎖骨格及び単一重鎖の混合物であってもよい。複数の骨格はまた、最も安定な異なるサブクラスの代表である単一のメンバーから引き出されるか、又は任意のクラスに属する最も安定な骨格のみの組み合わせである可能性も考えられる。
【０１５９】
本発明の例では、ポリペプチドライブラリーは、好ましくはヒトIGHV3-23遺伝子の骨格領域と同一、又はほぼ同一（例えば、９０以上、９５以上、９６以上、９７以上、９８以上又は９９％以上同一）の骨格領域から構成され、IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21若しくはIGLV6-53のヒト遺伝子の骨格領域と同一、又はほぼ同一（例えば、９０以上、９５以上、９６以上、９７以上、９８以上又は９９％以上同一）である配列に操作可能なように連結されている。ライブラリーは、認識された形式(例えば、scFv)で重鎖及び軽鎖遺伝子の単一の骨格対合を構成してもよい、又は１以上の前述の軽鎖遺伝子を有するIGHV3-23遺伝子の骨格対合であってもよい。これらの骨格から構築されたライブラリーは、大腸菌細胞質中で優れ、かつ望ましい安定性及び可溶性特性を有することが発明者によって示される。実際には、同族生殖系列遺伝子に対する理想的な配列相同性からの変動がCDRループ領域にのみ存在する優れた細胞内抗体ライブラリーである。
【０１６０】
ＶH遺伝子、IGHV3-23に対するＶLパートナーを持つ細胞質の可溶ポリペプチドに対するスクリーニングの方法はまた、ＶL又はＶHのいずれかの他の可変領域の可溶性パートナーに対するスクリーニングに適用され得ることが当業者に認識されるだろう。さらに、細胞質の可溶性ポリペプチドに対するスクリーニングの方法は、安定性と可溶性を増大させる突然変異を見つけるために単一骨格の変異体の使用を反復することができる。例えば、
同定されている任意の骨格のペア(IGHV3-23と、IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21又はIGLV6-57)は、親の骨格の可溶性が乏しいことを示すであろう温度での細胞質スクリーニングを行なう目的で単一骨格上の変異体のさらなるライブラリーの鋳型として使用できる。
【０１６１】
当技術分野で経験が豊富な技術者によって、ポリペプチドライブラリーは、１００％未満の存在量での前述のポリペプチドの存在によってもまた構成され得ることもまた理解されるだろう。本発明に記載の５０％ポリペプチド、又は本発明に記載の２５％ポリペプチド、又は本発明に記載の１０％ポリペプチドで構成されるライブラリーは、依然として所望の安定性特性の親和性タンパク質を得るために機能するだろう。従って、本発明のポリペプチドライブラリーは本発明のもの以外のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１６２】
さらに、本発明者は、驚くべきことに、ＶHとＶLドメインのヒト生殖細胞系列遺伝子と同一又はほぼ同一の配列であるscFv骨格は、大腸菌細胞質内で優れ、かつ望ましい安定性及び可溶性特性を有することを発見したが、当技術分野で経験豊富な技術者には、これらの配列は報告されているものよりも多形であることが得られ、それでも臨んだ安定性特性をもつ親和性タンパク質として機能する可能性があることが理解されるであろう。従って、本発明は、１０％又は５％まで本発明で明らかにした骨格領域配列から分岐し、依然として所望の可溶性及び／又は安定性特性を有する親和性タンパク質を得るために機能する配列を持つ骨格領域を提供する。従って、本発明のポリペプチドは、本発明で明らかにした任意の骨格領域配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一の骨格領域配列を含み得る。
【０１６３】
本発明は、ポリペプチドライブラリー及びポリヌクレオチドライブラリー(例えば、DNAライブラリー)の両方を提供する。DNAライブラリーは、ポリペプチドをコード化するDNAインサート(DNAフラグメント)を含む組み換えベクターの集合である。DNAインサートの起源は、ゲノム、cDNA、合成又は準合成があり得る。
【０１６４】
本発明のポリペプチドをコード化するDNAライブラリーのクローニングと構築は、当技術分野で公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、LutzとPatrick(2004)は、ライブラリーの変動性を生み出す方法及びタンパク質工学で使用するための遺伝子組み換えの戦略を検討した。表示されたポリペプチド変異体のスクリーニングのために、表面表示されたライブラリーで使用される戦略を本発明の方法に採用及び適用することができる(Beckerら, 2004; Kenrickら, 2007; Millerら, 2006; Daughertyら, 2000)。
【０１６５】
核酸のライブラリーは、各細菌細胞におけるライブラリーのメンバーの発現をもたらす複数の細菌細胞に導入することができる。発現に加えて、ポリペプチドはそれらの機能若しくは特性を評価するために、透過化細菌細胞内に保持されるか、又は細胞壁に結合する。ポリペプチドの核酸ライブラリーは、例えば、点突然変異、欠失及び挿入のような突然変異の導入による方法、又は組み換え現象による方法を含め、様々な方法で生成できる。変異体のライブラリーを生成するための方法は、当技術分野で公知であり、エラープローンPCR、DNA修復不全細菌におけるDNA合成及びDNAの化学修飾を含む。組み換えによるライブラリー生成のための方法は、当技術分野で公知であり、遺伝子シャッフリング、高度に組み換えされた細菌におけるDNAの組み立て、合成核酸ライブラリー組み立て等、又はそれらの任意の組み合わせを含む。このようにポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのライブラリーは、各細菌細胞でライブラリーの１以上のメンバーの発現をもたらす複数の細菌細胞に導入できる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、各変異体がアミノ酸配列、例えばCDR配列においてわずかに変化した固有のポリペプチドを含む２以上のポリヌクレオチドの変異体を含む。ライブラリーは２以上、５以上、１０以上、５０以上、１００以上、１０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、１，０００，０００以上、１０7以上又はそれ以上のメンバーを持つことができる。
【０１６７】
スクリーニング法
本発明で明らかにしたポリペプチド(又は抗体)ライブラリーは、標的分子に結合したポリペプチドをスクリーニングするために使用することができる。ポリペプチドは、それぞれが異なるポリペプチド又はポリペプチド変異体を発現する細胞のライブラリーに関連して、又は単一ポリペプチドを発現する単一タイプの細胞に関連して、スクリーニング又は選択されるということが理解されるだろう。"標的分子(target molecule)"という用語は、ポリペプチドに結合した、及び/又はポリペプチドで修飾された分子を指し、例えば、抗原、酵素、抗体、受容体などである。従って、"標的分子(target molecule)"は、結合に対して評価される酵素基質のような基質又は分子(例えば、配位子、エピトープ、抗原、ホモ若しくはヘテロ二量体パートナーのような多量体化パートナーなど、又はそれらの任意の組み合わせ)を表示することにも使用できる。
【０１６８】
従って、本発明は、標的ポリペプチドに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法、及び本発明のポリペプチドを標的ポリペプチドに接触させ、本発明のポリペプチドが標的ポリペプチドに結合しているかどうか決定することを含む方法を提供する。複数の本発明のポリペプチドがそのような方法で用いられることが好ましい。
【０１６９】
多数の適するスクリーニング法が当技術分野で公知であり、本発明に従って使用できる。
【０１７０】
例えば、その方法はタンパク質ディスプレイ法を含んでもよい。タンパク質ディスプレイの最も早い方法は、ファージディスプレイ(Smith、1985)である。その方法では、目的のタンパク質は、タンパク質の野生型コピーと共に存在できるファージの外被タンパク質の１つと融合する。例えば、pIIIタンパク質との融合を用いるM13繊維状ファージに基づくディスプレイプラットフォームを使用できる。
【０１７１】
他の適するディスプレイ方法には、細胞の翻訳抽出物を用いてポリペプチドを発現させ、物理的結合によって(例えばリボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ)、又はmRNA及びタンパク質の両方に対する微粒子(磁気又はセファロース)捕獲システムも含み得るミセル懸濁液内でmRNAが翻訳される‘生体外’区画化(IVC)などによる、共通の骨格への連結又は膜内でのカプセル化によってポリペプチドとコードする核酸の間のカップリングを達成させる‘生体外’ディスプレイ方法が挙げられる。
【０１７２】
別の好適なポリヌクレオチドディスプレイの方法は、発現されるポリペプチドの標的位置をグラム陰性、グラム陽性真正細菌又は酵母のいずれかの微生物細胞の外側にする微生物表面ディスプレイである。ポリペプチドは、細胞表面にそれらを付着させるアンカードメインと融合する。アンカードメインは、脂質化又は細胞壁への共有結合を決定づけるモチーフを有してもよい、又は、それらは露出ループ領域内の内在性膜タンパク質に融合してもよい。
【０１７３】
本明細書は、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドが無細胞発現系を含むスクリーニング手法で使用される時に特に有効であることを示している。そのような発現系における本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用は、標的ポリペプチドに対する高発現、高可溶性及び高親和性を示すポリペプチドのスクリーニング過程を大幅に促進する。特に還元条件下において、本発明のポリペプチドによって示される高い可溶性、安定性及び発現に利点がある。
【０１７４】
従って、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、本発明で記載した無細胞又は生体外発現系及び当技術分野で周知の他の系のいずれかを含むスクリーニング法で使用するのに特に適している。例えば、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、cisディスプレイ(そこでは発現したポリペプチドは、コード化するポリヌクレオチド配列に結合したままになっている)、又は他のそのような当技術分野で周知の手法を含むスクリーニング法で使用するのに特に適している。
【０１７５】
加えて、本出願は、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドはタンパク質ディスプレイ法に基づくスクリーニング法で用いられる時に特に有効であることを示している。例えば、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ファージディスプレイ(例えば、溶菌ラムダファージ、M13繊維状ファージ、溶菌欠損ファージ、及び当技術分野で周知の他のもの)を含むスクリーニング法で使用される時に特に有効である。１つの実施例では、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドはラムダファージを含むスクリーニング法で使用する時に驚くほど有効である。
【０１７６】
加えて、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、本明細書及びWO 2011/075761に記載されたREDシステムとの組み合わせによって、溶菌欠損ファージに基づくスクリーニング法(例えば、国際特許出願No. PCT/AU2012/000761に記載のような、その内容は参照によりその全体が援用される)で使用できる。
【０１７７】
キット
本発明の方法の実施に必要な成分は、キットの形態で好適に提供することができる。当業者に理解されるように、キット中の種々の成分は、個々の容器中若しくはアリコートで供給することができるか、又は溶液成分を異なる組み合わせ、異なる濃度で組み合わせて、本発明の方法の最適な実施を達成することができる。使用するまで成分が安定な形態で維持されるように、キットのどの成分を組み合わせることができるかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。
【０１７８】
本発明のキットは、典型的には、最低でも本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクター中に挿入するための部位、及び第１ポリペプチドと結合して、透過処理された細菌細胞の細胞壁の内部に保持されるか又は細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームを含むベクターを含む。キットは、細菌細胞を透過処理するための薬剤も含むことが好ましい。一実施形態において、キットは、細菌細胞、好ましくはグラム陰性細菌細胞をさらに含む。他のさらなる成分がキットとともに含まれていてもよいか、又は所望により他の成分を最終使用者が提供してもよい。
【０１７９】
使用
本発明のポリペプチドは、研究、診断及び治療への応用を含む、様々な用途で有用である。ポリペプチドが結合する抗原に応じて、それは、例えば、細胞を殺す又は成長を阻害するために及び/又はイメージング及び/又は生体外試験のために、細胞に化合物を送るのに有用であってもよい。１つの実施例では、ポリペプチドは、イメージング及び細胞毒性薬の細胞への送達の両方に有用である。すなわち、それは検出可能ラベル及び細胞毒性薬に結合する。あるいは、組成物は、いくつかが細胞毒性薬に結合し、いくつかが検出可能ラベルに結合したタンパク質の混合物を含む。
【０１８０】
本発明に記載のポリペプチドはまた、(a)(例えば、配位子、阻害剤の)受容体への結合、(b)受容体シグナル伝達機能、及び/又は、(c)刺激昨機能を抑制する(減少させる又は妨げることができる)阻害剤として働くことができる。受容体機能の阻害剤として働くポリペプチドは、直接的又は間接的に(例えば、立体配座の変化を引き起こすことによって)配位子結合を阻止することができる。本発明で記載のポリペプチドは、本明細書に記載の好ましいポリペプチドの安定性及び大きさを与えられる時、ホスト細胞内で起こる結合相互作用を伴う用途に特に適していてもよい。
【０１８１】
医薬組成物及び治療法
本発明のポリペプチド（同義語、有効成分）は、予防的又は治療的処置のための非経口、局所、経口、若しくは局所投与、エアロゾル投与、又は経皮投与に有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位の投薬形態で投与できる。例えば、経口投与に適する単位投薬形態としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル剤及びトローチ剤が挙げられる。又は非経口投与による。本発明の医薬組成物は、経口投与される時、消化から保護されるべきであると認識されている。これは、酸加水分解及び酵素加水分解に対する耐性を得るためにタンパク質と組成物と複合体を作るか、又はリポソームのような適切な耐性キャリアに化合物を詰め込むことのどちらかによって一般的に達成される。消化からタンパク質を保護する手段は当技術分野で公知である。
【０１８２】
一般的に、治療有効量のポリペプチドが被験者に投与する組成物に処方される。"治療上有効量"という用語は、被験者の治療又は他の治療効果を促進、誘導、及び/又は増強するのに十分な量を意味する。明らかなように、これらの製剤における本明細書のタンパク質の濃度は、広く変化させることができ、選択した特定の投与様式及び患者の必要性に従い、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、例えば、１回以上の分割投与によるか、又は持続注入によるかどうかで、治療上有効量は、分子重量当たり約1μg/kgから15 mg/kgまで(例えば、0.1-20 mg/kg)になってもよい。典型的な１日の投与量は、約1μg/kgから100mg/kg以上の範囲である。患者に投与されるべき模範的なタンパク質の投与量は、患者の体重当たり約0.1から約10mg/kgの範囲である。数日間以上にわたる繰り返し投与では、条件に応じて、所望の疾患の症状の抑制が起こるまで治療が続けられる。模範的な投与計画には、約4mg/kgの初期負荷用量の後、１週間毎に約2mg/kgの維持用量のタンパク質を投与することが含まれる。他の投与計画が有用であってもよい。この治療の進行は、従来の技術及び試験によって容易に監視される。
【０１８３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、濃縮された用量で処方され、被験者への投与の前に治療有効量に希釈される。
【０１８４】
本発明の医薬組成物は、蠕動投与及び腫瘍又は疾患の部位への直接点滴注入(腔内投与)を含む非経口投与に特に有用であり、例えば静脈内、筋肉内、皮下、経皮又は他のそのような経路を介する注入用に処方される。投与のための組成物は、一般的に本発明のタンパク質を薬学的に受容可能なキャリア、好ましくは水性のキャリアに溶解した溶液を含む。様々な水性キャリア、例えば緩衝食塩水等を使用できる。他の模範的なキャリアとしては、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチルのような非水性溶媒も使用されてもよい。リポソームもまたキャリアとして使用されてもよい。溶媒は、等張性及び化学的安定性を増大させる少量の添加剤、例えば、緩衝剤及び防腐剤を含んでもよい。組成物は、pH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質を含んでもよい。
【０１８５】
医薬組成物を調製するための技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980で実証されているように、一般的に当技術分野で公知である。
【０１８６】
WO2002/080967は、例えばぜんそくの治療のためのタンパク質を含むエアロゾル化した組成物の投与のための組成物及び手法を記載している。またそれらは本発明のタンパク質の投与にも好適である。
【０１８７】
本発明の化合物の適切な投与量は、特定のタンパク質、診断/治療/予防の条件及び/又は治療の被験者に応じて変化する。熟練した医師の能力の範囲内で、例えば、準最適投与量で開始し、最適又は有用な投与量を決定するために徐々に投与量を修正することによって、適切な投与量を決定する。あるいは、治療/予防のための適切な投与量を決定するために、細胞培養試験又は動物実験のデータが用いられ、そこでの適切な用量は、毒性がほとんど又は全く無い活性化合物のED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投薬形態及び用いる投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。治療的/予防的有効用量は、細胞培養試験から最初に推定できる。用量は、細胞培養で決定したようなIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方されてもよい。そのような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するのに使用できる。血漿中のレベルは、おそらく、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定される。
【０１８８】
本発明のタンパク質は、医薬併用製剤、又は併用療法としての投与計画において、第二の化合部と組み合わせられてもよい。医薬併用製剤又は投与計画の第二の化合物は、互いに悪影響を及ぼさないように、組み合わせのタンパク質に相補活性を有することが好ましい。
【０１８９】
第二の化合物は、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長抑制剤、抗ホルモン剤、及び/又は心臓保護剤であってもよい。そのような分子は、意図した目的に対して有効な量の組み合わせで適切に存在する。本発明のタンパク質を含む医薬組成物はまた、チューブリン形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又はDNA結合剤のような化学療法剤の治療上有効量を有してもよい。薬学的な"徐放性(slow release)"カプセル又は組成物も使用してよい。徐放性製剤は、一般的に、長期間にわたって一定の薬物レベルを与えるように設計されており、本発明の化合物を送達するのに用いられてもよい。
【０１９０】
本発明はまた、被験者の病気を治療又は予防する手法も提供する。その方法は、本発明のタンパク質の治療有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【０１９１】
本明細書において、病気を予防するという文脈における、"予防の(preventing)"、"予防する(prevent)"又は"予防(prevention)"という用語は、特定の疾患又は病気の少なくとも１つの症状の発症を停止又は妨害するのに十分な本発明に記載のタンパク質の量を投与することを含む。
【０１９２】
本発明において、“治療の(treating)”、“治療する(treat)”又は“治療(treatment)”という用語は、特定の疾患又は病気の少なくとも１つの症状を低減若しくは排除するのに十分な本発明に記載の阻害剤及び/又は薬剤の治療有効量を投与することを含む。
【０１９３】
本発明において、"被験者"という用語は、ヒトを含む任意の動物、好ましくは哺乳類を意味するものとする。模範的な被験者は、ヒト、霊長類、家畜(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター)、捕獲野生動物(例えば、キツネ、シカ)が挙げられる。好ましくは、哺乳類はヒト若しくは霊長類であるが、これらに限定されない。より好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０１９４】
本発明において、"病気"は、正常な機能の崩壊又は阻害であり、任意の特定の病気に限られるものではなく、疾患又は障害を含む。例としては、病気は癌又は免疫病理学的障害である。
【０１９５】
模範的な癌としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、扁平上皮細胞癌(例えば、上皮扁平細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌、すい臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌が挙げられる。
【０１９６】
免疫病理学は、免疫学的な原因を持つ疾患についての研究であり、免疫学的疾患は、抗原に対する免疫グロブリンの反応によって引き起こされる任意の状態である。従って、"免疫病理学的障害"は、抗原に対する被験者の免疫系の反応に起因する障害として定義することができる。免疫病理学的障害としては、自己免疫疾患及び過敏症反応(例えば、I型：アナフィラキシー、蕁麻疹、食物アレルギー、喘息；II型：自己免疫性溶血性貧血、輸血反応；タイプIII：血清病、壊死性血管炎、糸球体腎炎、関節リウマチ、狼瘡；IV型：接触性皮膚炎、移植片拒絶)が挙げられる。自己免疫疾患としては、リウマチ性疾患(例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、SLE及びループス腎炎のような狼瘡、多発性筋炎/皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎など)、変形性関節症、自己免疫性胃腸及び肝臓疾患(例えば、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病)、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病など)、血管炎(例えば、チャーグ・ストラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、及び多発性動脈炎を含むANCA関連血管炎など)、自己免疫性神経疾患(例えば、多発性硬化症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、及び自己免疫性多発性神経炎など)、腎障害(例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルジェ病など)、自己免疫皮膚疾患(例えば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデスなど)、血液疾患(例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血など)、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患(例えば、内耳疾患及び聴力損失など)、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫性内分泌疾患(例えば、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、アジソン病、及び自己免疫性甲状腺疾患(例えば、グレーブス病及び甲状腺炎)のような糖尿病関連の自己免疫疾患など)が挙げられる。より好ましいそのような疾患としては、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ANCA関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、IDDM、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が挙げられる。
【０１９７】
別の実施形態において、障害は炎症性疾患である。炎症は刺激や傷害に対する体組織の防御反応であり、急性又は慢性の可能性がある。従って、炎症性障害は、サイトカイン放出、ヒスタミン放出、酸化バースト、食作用、他の顆粒酵素及び走化性の放出が起こる好中球、単球、マスト細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージが関与する疾患を含む。(免疫病理学的障害で上記に定義した)過敏性反応はまた、しばしば好中球、肥満細胞、好塩基球などの様々な白血球の補体活性化及び動員/浸潤を伴うことから、(急性又は慢性の)炎症性疾患とみなすことができる。
【０１９８】
本発明の組成物は、投与製剤に適合する方法で、かつ治療的/予防的に有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、容易に様々な方法、例えば、摂取又は注射若しくは吸入によって投与される。
【０１９９】
他の治療計画は、本発明のポリペプチドの投与と併用されてもよい。併用療法は、同時又は逐次の投与計画として投与されてもよい。逐次投与する場合、併用は、2回以上の投与で投与されてもよい。併用投与は、別々の製剤又は単一の医薬製剤を用いた同時投与、及びいずれかの順序での連続投与を含む。そこでは両方(又は全て)の活性剤が同時にその生物学的活性を発揮する期間が存在することが好ましい。
【０２００】
本発明は、これより以下の非限定的な例を参照してさらに記述される。
【実施例】
【０２０１】
実施例１：ヒトＶＬサブライブラリーのIGHV3-23ディスプレイベクターへのクローニング
大腸菌細胞質において十分に発現し可溶性のあるIGHV3-23のヒト軽鎖パートナーをスクリーンするために、本発明者は１０λと５κの機能的な軽鎖ファミリー全てを、IGHV3-23へのscFv融合としてクローン化した。scFvライブラリーは、アラビノースによって誘導され、かつ細胞壁結合（ペプチドグリカン（PG）結合ドメイン）、発現レポータードメイン（SNAP、ニューイングランドバイオラボ）、DNA結合ドメイン（DBP）をこの順番で与える下流ドメインにさらに溶解される発現構造物へとクローン化された。これらの下流ドメインは、外部及び内部の細菌宿主の細胞膜が、融合タンパク質をDNAと細胞壁の両方に固定することで、洗浄剤又は有機溶剤によって透過処理されるとき、scFv部分の保持を可能にする。
【０２０２】
λ軽鎖族とκ軽鎖族は、ヒトの末梢血単核細胞(PBMCs）から準備されたcDNAから増幅された。λ軽鎖族とκ軽鎖族はそれぞれ7及び11のPCR反応において増幅された。各々のサブライブラリーは、溶解性のあるメンバーを含んでいるらしく見えるライブラリーのパーセンテージをおおまかに特徴づけるために、はじめは別々にスクリーンした。溶解性のあるメンバーの評価可能なパーセンテージ（>１％）を含むサブライブラリーは、次に個体のクローンとしてスクリーンした。
【０２０３】
オリゴヌクレオチドプライマーは、BsmBIによるクローニングの終端への修飾を伴った、HustとDubel(2010)によって記述された配列に基づいていた。それ以上の変化は、もとは軽鎖のC1定常ドメインに対して設計された逆方向プライマーの配列のためになされた。これは不必要な配列を含むために考えられ、縮重プライマーは軽鎖のＪ領域に対して設計された。軽鎖領域の増幅のためのオリゴヌクレオチド配列は表２にリスト化している。
【０２０４】
表２：軽鎖領域の増幅のためのオリゴヌクレオチド配列
【表２−１】
2014527408.tif 000003
【０２０５】
【表２−２】
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【０２０６】
【表２−３】
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【０２０７】
【表２−４】
2014527408.tif 000006
【０２０８】
λ軽鎖サブライブラリーとκ軽鎖サブライブラリーのVL遺伝子は、VentDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用するPCRの２ラウンドにおいて増幅された。各々のサブライブラリーは、BsmBI(New England Biolabs)を使用するREDディスプレイベクターへと、別々にクローン化した。各々のライブラリーはおおよそ20-40,000のコロニーを産出すると予測された。
【０２０９】
実施例２：保有カプセル化ディスプレイ(RED)を使用するヒトscFv融合のスクリーニング
可溶性の最初のスクリーンのように、各々のライブラリープレートは10mLのLB/グリセロール(10%)の中で破砕され懸濁された。懸濁液の小片(~50uL)は、1時間37℃の1mLのLB媒質(1リットルにつき10gのトリプトン、5gの酵母エキス、10gのNaCl)の中で成長し、次に0.2%のアラビノースによって誘導され、さらに25℃2時間で成長した。この時点で細胞は、10分間25℃のLB媒質における0.5%のn-オクチル-β-チオグリコシド(8TGP)において、細菌ペレットの再懸濁によって透過処理された。透過処理された細胞はLB媒質におけるペレット形成と再懸濁によって一度洗浄され、その後、誘導されたscFv融合タンパク質は、SNAPサーフェス488試薬(S9124S、New England Biolabs)を加えることによって、また20分25℃の培養によってラベルされた。ラベルされた細胞は次にペレット形成とPBSにおける再懸濁によって再び洗浄され、その後、サンプルが蛍光顕微鏡検査によって検視するために固定された。
【０２１０】
顕微鏡検査が示したのは、全てのライブラリーは十分に発現し可溶性のあるように見えるいくつかの細胞を各々の視野の内に有するが、Vλ1クレード、Vλ3クレード及びVλ6クレードを表すサブライブラリーは、可溶の組織をもつ細胞を１％より多くもっていることが発見された、ということである。したがって、Vλ1、Vλ3、Vλ6を除く全てのサブライブラリーは十分に高い頻度の可溶クローンを有するとは考えられず、さらにスクリーンされなかった。
【０２１１】
サブライブラリーVλ1、Vλ3及びVλ6を、単一クローンを産出し可溶性を個別的にスクリーンする希釈液でメッキした。こうして、Vλ1、Vλ3及びVλ6サブライブラリーは単一コロニーの清浄なピックを可能にする希釈液でメッキされ、それらは次に発現へと誘導され、また上記のように、顕微鏡検査のために準備された。
【０２１２】
図１は、十分に発現した可溶のscFvクローン(1A及び挿入図)の典型的概観と、十分に発現してはいるが不溶のscFvクローン(1B及び挿入図)を示す。当該細胞は、上記のように透過処理の後にSNAP蛍光体でラベルされる。不溶のクローンに特徴的な凝集は、可溶のクローンのより拡散的で周辺的な局在化と対照をなす。
【０２１３】
可溶の発現を表示するscFvクローンは、次に100μg/mLのアンピシリン選択下で、37℃で一晩中成長し、標準的な方法（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)を使用することでプラスミド調剤薬を機能させた。また当該DNAは、発現構造物の上流プロモーター領域におけるプライマーと配列された。配列ファイルは次に、NCBI BLASTアルゴリズムを使用するヒトゲノムジェンバンクのデータベースを比較して分析された。
【０２１４】
図２は、VL遺伝子IGLV3-1、IGLV3-21及びIGLV6-57と高い類似性を有する又は完全に同一の選択した可溶クローンの多重アラインメントを示している。CLUSTALXを使って多重アラインメントを準備した。アラインメントの上の可溶クローンの画像（分離番号によってリスト化されている）は、下記の並んだ配列に対応している。
クローンは単離と配列決定によって調べられた。
【０２１５】
可溶個体の779サブライブラリーメンバーのスクリーンは、11のIGLV1-40（SEQ ID NO:18）クローン、2のIGLV1-44（SEQ ID NO:21）クローン、3のIGLV1-47（SEQ ID NO:24）クローン、3のIGLV1-51（SEQ ID NO:15）クローン、25のIGLV3-1（SEQ ID NO:6）クローン、2のIGLV3-19（SEQ ID NO:27）クローン、4のIGLV3-21（SEQ ID NO:9）クローン、18のIGLV6-57（SEQ ID NO:12）クローンを産出した。可溶scFvクローンの配列を分析することで、B細胞の準備中に生体内で選択された又は成熟した親和力ではなかったIGLV1-40、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19メンバーの単純な配列があるらしい、ということが示された。さらに、一定のIGLV6-57クローンには、生殖細胞系列の翻訳からの、1つ（2クローン）だけの、又は2つ（1クローン）のアミノ酸変化との高い可溶性があり、それぞれ99％の完全な同一性と98％の完全な同一性を示した。
【０２１６】
それゆえ、以前Tseその他(2002）が、酵母の細胞質における可溶で安定したヒト抗体をスクリーニングし、ＶH3ドメインを含む可溶の抗体がVLΚ1パートナー及びVLΚ4パートナーとペアになっていることを発見したが、そのような結果とは対照的に、本発明者が発見したのは、ＶLΚサブファミリーは種類としては見かけ上の可溶性が乏しく、99％より多くのVLΚサブライブラリークローンが、大腸菌において発現が乏しいかあるいはミスフォールドの徴候を示すかしているIGHC3-23ドメインと、明確にペアになっているということである。Tissotその他（WO 03/097697）もまた可溶のヒトscFvのスクリーンを行い、この可溶scFvは、VLK1又はVLλ1又はVLλ3クレードのメンバーと最も密接に関係している配列と結合した、VH1a又はVH1b又はVH3クレードのメンバーに最も密接に関係している配列であると報告した。しかしながら、これらの中で最適の構成は、VH1bとペアになったVLλ3であった。
【０２１７】
しかしながら、Tse et al.(2002)とTIssot(WO 03/097697)は機能的なスクリーン（すなわち、抗体を生体内の抗原標的に結合すること）を、1)可溶性と2)標的結合との両方に要求される陽性のY2Hシグナルをもち、それゆえ必然的に生殖細胞系列の配列から十分に変異したアウトプット抗体の可溶性のためにさらに要求されるものとして、用いていた。
【０２１８】
IGHV3-23ドメインへの可溶融合のスクリーンにおいて単離されたVLメンバーの大部分は、DPL23としても知られているIGLV3-1である。いくつかのクローンは多数の変異体をもっていたが、しかしかなりの数がIGLV3-1生殖細胞系列V配列（SEQ ID NO:4）と同一であった。このことが表すのは、生殖細胞系列の配列は、IGHV3-23とパートナーであるとき、細胞質において本質的に安定し可溶的である、ということである。
【０２１９】
IGLV3-1はヒトの免疫体系において適度に高い発現をもち、15％のλ軽鎖を示す(Knappik et al., 2000)が、しかし最も多量に発現したλメンバー(DPL11)ではない。それは公表された文献において特徴づけられておらず、どのような明確な言及もなく、また高い同一性を有した構造体も報告されていない。IGHV3-23を使用している人工のscFvスカフォールドライブラリーが以前作られたが、VLパートナーは、主に生体内での相対的な発現量に、すなわち高度に発現したDPK22(Pini et al., 1998; Geet et al., 2010)、DPL(aka.IGLV1-47)(Kobayashi et al., 1997。Soderlind et al., 2000)、DPL16(aka.IGLV3-19)(Viti et al., 2000)に基づいて選択された。
【０２２０】
ヒトの可変ドメインレパートリーの熱安定性を包括的に分析しているただ一つの公表された報告が、Ewert et al.(2003)によってMorphosys HuCALTMライブラリーで行われた。「ヒト抗体可変ドメインの生物物理学的特性」と題された彼らの論文において、著者は個体ドメインの安定性と、大腸菌周辺質において発現したときのドメイン対合（ＶL::ＶH）の安定性との両方を吟味した。
【０２２１】
ＶΚ3コンセンサスは軽鎖可変領域の最も安定したものであるのに対し、IGHV3-23が関係づけられたVH3コンセンサスは、重鎖可変領域の熱力学的な安定性と可溶性にとって最も安定したものであると発表された。
【０２２２】
最も安定した対合を産出するＶH::ＶL化合物は、H3::Κ3、H5::Κ3及びH3::Κ1の間で形成される化合物であった。注目すべきなのは、ＶL３ファミリーを含む最も安定した対合がないということである。さらに、ＶH３パートナー(IGHV3-23)を使用する私たちのscFvライブラリーを構成することは、たいていのサブライブラリーにおけるクローンの大多数がミスフォールドしたか発現が乏しかったため、大腸菌細胞質で発現したときに融合タンパク質に対して安定性を与えるのにそれ自体において十分なものではなかった。
【０２２３】
要約すると、既存の技術に基づいてドメインIGHV3-23及びIGKV3-1をscFv融合として使用した化合物は、大腸菌細胞質のような還元環境において発現したとき、高められた安定性と可溶性とを所有すると予測することはできなかった。
【０２２４】
実施例３：scFvクローンの熱安定性試験
25℃での誘導と発現を伴ったVLサブライブラリーの初めのスクリーンの後で、scFvクローンはクローンとファミリーとを熱安定性に応じて等級付けするためにさらなるスクリーンを受けた。
【０２２５】
各々のクローンは26℃ 28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃で90分間誘導された後で、実施例2で記述されたように透過処理しSNAPでラベリングした。実施例2で記述されたように、クローンは蛍光顕微鏡検査を使用することによって、可溶性に応じてスコア化された。
【０２２６】
図３が表示するのは、上昇していく温度での発現を伴った、二つのクローン、つまり一つのIGLV3-1と一つのIGLV3-21の挙動である。IGLV3-21クローンは32℃と34℃の間でミスフォールドの徴候を示すが、scFv融合タンパク質は、IGLV3-1クローンが少なくとも36℃になるまでは可溶であり続ける。
【０２２７】
この発現温度の勾配は、IGLV3-1及びIGLV6-57に関係したあるいはそれと同一のscFvクローンが、種類として最も優れた可溶性をもつものと判断されたということを示したが、その一方でまた、他のλ遺伝子の個体クローンは変化する可溶性の度合いを表示した。図4が表示するのは、スクリーンから単離されたVLドメインの各々の種類に代表的なクローンの可溶性である。
【０２２８】
顕微鏡検査によるscFvsの見かけの可溶性が人為的なものではなかったという事実は、ヒトのチチンに由来する下流I27ドメインに加えてscFvのフラグメントを、C末端FLAGエピトープを伴う発現構築物へとサブクローニングすることによって確かめられた。scFv::I27::FLAG融合タンパク質は、26℃から38℃にわたる温度でアラビノースにより誘導され、大腸菌細胞は超音波処理を使用することで溶解した。可溶のタンパク質は、遠心分離(14K 1分)によって不溶のデブリとタンパク質集合とから単離された。
【０２２９】
図4が表示するのは、25℃の大腸菌細胞質基質において発現したとき、IGLV3-1クローンがもつ卓越した可溶性である。scFv::I27::FLAG融合タンパク質は、完全に可溶のフラクションの中にある。それが表示するのは、全プロテインの中の小さいフラクションがもついくつかのN末端の開裂であるが、これが取り除かれるのは、当該タンパク質が、それが8TGP洗浄剤による透過処理によって放出された周辺質プロテアーゼの相互作用によって引き起こされたことを示唆する変性条件のもとで抽出されるときである。
【０２３０】
こうして、大腸菌における可溶性スクリーンからのIGLV3-1の回収が高頻度であった結果、それは、37℃に近い温度の細胞質における可溶scFvライブラリー‐安定性の典型的なスカフォールドと、多様化したCDR3ループへの耐性とに必要な特徴のために、さらに特徴づけられた。IGLV3-1は28℃から38℃にわたる温度の大腸菌細胞質において熱安定性が試験された。それは、PBMC cDNAのPCRの間、変性オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することで形成される軽鎖J1及びJ2領域、またJ領域と結合したとき、36℃まで高い可溶性があることが発見された。36℃以上では、それはある程度のミスフォールディングを示した。このことは免疫蛍光法によって、またFLAGタグのscFvをウェスタンブロッティングすることによって、確かめられた。
【０２３１】
実施例４：IGLV3-1 J ドメイン交換
表2でリスト化されている、VLドメインを増幅するために使用された変性オリゴヌクレオチドの配列は、ヒトゲノム（表3）における7の異なるλJ領域を下塗りしなければならなかった。したがって、スクリーンから単離されたクローンは、フォールディングの安定性を低減させていたであろう非カノニカル配列を表すハイブリッドλJ領域をもっていた。
【０２３２】
表３：ヒトλＪ領域
【表３】
2014527408.tif 000007
【０２３３】
フレームワーク領域の生殖細胞系列の配列を有したIGLV3-1クローンの中で最も安定したもののJ領域を比較することで、J領域1及び2/3との最大の類似性が示された。それゆえ、ハイブリッドJ領域（“VFGTGTKLIIS”（SEQ ID NO:79））は、IGLV3-1スカフォールドの熱安定性がさらに改善されるかどうかを試験するため、生殖細胞系列λJ1あるいはJ2/3配列（表3）に置換された。その変形は30℃、32℃、34℃、36℃、38度の間の温度で試験された。試験を受けた当該クローンのJ2/3又はオリジナルハイブリッドJ領域よりも、λJ1はわずかに優れたフォールディングと可溶性を提供すると主観的に感じられた。
【０２３４】
図５は、λJ領域がJ1あるいはJ2に置換されたオリジナルクローンの熱安定性挙動を表す。
【０２３５】
実施例5： CDR多様化に対するIGLV3-1とIGHV3023の耐性
scFvが親和性ライブライーのフレームワークとして役に立つためには、CDR3領域における交換に対して耐性がある必要がある。このことは特に、安定化内部ドメインのジスルフィド結合を欠いた、大腸菌細胞質基質のような還元環境において発現するscFvに当てはまる。
【０２３６】
好ましいscFvスカフォールド、IGLV3-1::IGHV3-23の安定性を試験するために、各々のドメインのCDR3領域を別々に多様化した。したがって、IGLV3-1遺伝子とIGHV3-23遺伝子の両方がCDR3多様化への耐性を試験された。図２は、すでに提出された多様化と、両配列のCDR3の周囲の領域を示す。2のアミノ酸のIGLV3-1 CDR3は、“- NNNGGNNN -“（SEQ ID NO:29）領域（ここで‘N’はTrp、Gln、Lys、Glu、Met以外のアミノ酸である）に置換された。同様に、12のアミノ酸のIGHV3-23 CDR3は“-NNNGNNN-“（SEQ ID NO:29）領域に置換された。各々の領域は、貯められたクローンライブラリーとして可溶性と発現が別々に試験された。加えて、ランダムに選ばれた個体クローンもまた、予測された多様性を確かめるために試験されて配列された。
【０２３７】
IGLV3-1 CDR3は、（逆）オリゴヌクレオチド配列を使用したPCRによってIGLV3-1ドメインを変化させることによって、残基91から置換された。
GATCAGGGTCTGAGACGAGACCGTCACTTTCGTACCGGTGCCGAACACCACAGTANNANNANNTCCGCCANNANNANNGTCCCACGCCTGACAGTAATAGTCAGC (SEQ ID NO: 80)
【０２３８】
この配列の（逆／順）翻訳が与える（ここで“N”はTrp, Gln, Lys, Glu, Met以外のすべてのアミノ酸である）のは、
…ADYYCQAWD(91) NNNGGNNN TVVFGTGTKVTVSS (SEQ ID NO: 81)
【０２３９】
IGLV3-1 CDR3置換は優れた成功を示した。３０℃のタンパク質誘導による母集団の外観は、優れた発現を有した非常に可溶性の高いクローンであった。40のクローンが個別的に分析され、36が可溶性と発現の点で卓越したものとしてランク付けされた。4の失敗したクローンと、優れた可溶性と発現を有したその他の16のクローンが、VLドメインの至るところで配列された。4の失敗したクローンは、遺伝子を増幅するために使用された長いオリゴヌクレオチドプライマーにおけるフレームシフトのため、失敗したことが確かめられた。正確なリーディングフレームを有する他のすべての調査されたクローンはランダムなアミノ酸混合を有しており、生殖細胞系列IGLV3-1フレームワークはCDR3多様化に対して非常に高い耐性をもっているということを示している。
【０２４０】
したがって、IGLV3-1に対する、大腸菌細胞質基質において３０℃で発現したときの多様化CDR3ライブラリーの可溶性は、驚くほどに高かった。おおよそ９０％のクローンは高発現で可溶性があった。低発現の、又は発現のない１０％のクローンは、ミスフォールドになったか、又は配列されて、主として必然的に〜１００塩基という長さの逆プライマーの領域においてフレームシフトされたことが示された。塩基欠失は、長いオリゴヌクレオチドとその他の基を使用する合成ライブラリーの構築が、インフレームの対立遺伝子を豊富にするために抗生物質選択に基づいたプレスクリーニング法を発展させた（例えばGeその他、2010）ときによく起こるエラーである。
【０２４１】
ＶHドメインのCDR3領域、IGHV3-23は、逆オリゴヌクレオチドを使用して上記の方法に似た仕方で残基98から置換された。つまり、（逆）オリゴヌクレオチド配列を使用したPCRによってIGHV3-23ドメインを変化させることによってである。
GATCAGGGTCTGAGACCCGCTGCTCACGGTAACCATGGTACCTTGACCCCAAATATCAAACGCANNANNANNGCCANNANNANNTTTCGCACAGTAGTAAACAGC (SEQ ID NO: 82)
この配列の（逆／順）翻訳（ここで“N”はTrp, Gln, Lys, Glu, Met以外のアミノ酸全てである）は、NNNGNNN AFDIWGQGTMVT (SEQ ID NO: 83)を与える。
【０２４２】
IGLV3-1ドメインとまさに同程度にCDR3多様化に対して強いということが証明されたIGHV3-23は、可溶性と高発現とを示す試験された８０％のクローンと、低発現であった２０％のクローンとを有するが、このIGHV3-23は、フレームワークにおける不適正塩基対が保存されていることから結果する配列決定によって、又はより一般に、長いオリゴヌクレオチドプライマーの領域における単一の塩基対欠失から結果する配列決定によって、したがってタンパク質翻訳のフレームを変化させることによって、説明することができた。
【０２４３】
したがって、IGHV3-23に対する、大腸菌細胞質基質において３０℃で発現したときの多様化CDRの可溶性は、再び驚くほどに高かった(〜８０％)。再び、融合タンパク質をフレームシフトすることは多くの陰性の原因となった。CDR3ループによって12から7へとアミノ酸を短縮することによって、このライブラリーの可溶性は親クローンに比べて改善された。
【０２４４】
図６Ａは、多様化したIGLV3-1 CDR3を持つ4つの独立クローンの可溶性と高発現を表す。図６Ｂは、多様化したIGHV3-23 CDR3を持ったクローンの全母集団のサンプルを表す。それゆえ、要約すると、IGLV3-1::IGHV3-23フレームワークは、親和性ライブラリーを構成する典型的なスカフォールドであり、これはヒト生殖細胞系列の配列と同一で、多様化した配列をもつCDR3ループの置換に強い可溶性を持ち続ける。さらに、当該スカフォールドを大腸菌細胞質基質においてREDタンパク質ディスプレイ法と組み合わせることで、親和性タンパク質の安定性と発現との両方を同時にスクリーニングし、標的分子に結合することが可能になる。当該スカフォールドは大腸菌細胞質基質という還元環境において高い安定性と可溶性を持つが、この還元環境において、ほとんど全ての他のscFvタンパク質のフォールディングと安定性に必須の要件である、安定化ドメイン内ジスルフィド結合を欠いている。このスカフォールドによって、大腸菌細胞質基質における親和性試薬の低コストでの生産ができるようになるだろうが、それは研究、治療用あるいは診断用の使用のためであり、また内因性タンパク質を標的にするための哺乳類の細胞の細胞質基質におけるその試薬の使用のためでもある。
【０２４５】
実施例６：多様化したIGLV3-1::IGHV3-23scFvライブラリーの構成
IGLV3-1::IGHV3-23スカフォールドは、実施例５で記述された、アミノ酸配列‘NNNGGNNN’（SEQ ID NO:86）と‘NNNGNNN’（SEQ ID NO:87）を、それぞれＶLとＶHのCDR3領域に導入するという方法を使用することで多様化された。
【０２４６】
多様性は、次のようなIGLV3-1のフレームワーク配列とIGHV3-23のJ領域からなるベーススカフォールドを初めに作ることによって導入された。
フレームワーク配列；
ATG GGA GAC GGT CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCG TGG GAC  tgagacctagacggtctct  gcg TTT GAT ATT TGG GGT CAA GGT ACC ATG GTT ACC GTG AGC AGC TCG TCT CaG ACC (SEQ ID NO: 88).  
【０２４７】
このフレームワークは、フランキングBsmBI部位によるドメイン要素を結合するPGとDNAを有する、RED細胞質の発現ベクターへとクローン化された。介在性配列（ＶLJ領域とIGHV3-23フレームワーク）（SEQ ID NO:89）は、それぞれ5及び3の末端にあるＶL領域とＶH領域両方のCDR3多様性を含んだ変性プライマー（SEQ ID NO:90、91）を使用したPCR鋳型として役立つ、単離されたプラスミドにコード化された。これらのプライマー配列は、PCRの産物を、スカフォールドにおける適切に方向づけられたBsaI部位へと継ぎ目なくクローンニングすることを可能とする、末端のBsaI制限部位を有していた。
【０２４８】
介在性配列：
ACT GTG GTG TTC GGC acc ggt acg aaa gtg acT gtc TCA TCT CAG ACC
GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAAGTCCAACTGCTGGAGTCCGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCATCCGGTTTTACTTTCAGCAGCTACGCGATGTCGTGGGTGCGCCAGGCACCGGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCGCCATCAGCGGTAGCGGCGGTTCTACGTATTATGCGGACAGCGTCAAGGGCCGTTTCACCATCAGCCGTGACAATTCCAAAAACACCCTGTACTTGCAGATGAACAGCTTGCGTGCGGAAGATACGGCTGTTTACTACTGTGCGAAA (SEQ ID NO: 89)
【０２４９】
縮重プライマー１：
gatcag ggtctca ggac NNT NNT NNT ggc gga NNT NNT NNT ACT GTG GTG TTC GGC acc ggt acg aaa gtg (SEQ ID NO: 90)
縮重プライマー２：
GATCAGGGTCTCAACGCANNANNANNGCCANNANNANNTTTCGCACAGTAGTAAACAGCCGTATCTTC (SEQ ID NO: 91)
【０２５０】
10μgの塩基スカフォールドベクターはBsaIで切断された。切断ベクターはSureclean(Bioline)を使用することによって沈殿した。CDR3多様性領域を含む挿入は、SEQ ID NO:90と91のプライマーを使用したテンプレートとしてのコアフレームによって生じたPCRであった。2μgの挿入PCRは、BsaIによる消化の前にゲル精製された。PCR消化は、Surecleanを使用することによって沈殿した。消化されたベクターとPCR挿入の等モル量は、T4DNAリガーゼを使用することで連結した。この連結は加熱死し、連続的に銀大腸菌細胞(Alchemy Bio)へと電気穿孔された。電気穿孔された細胞は、15cmのLB+カルベニシリン(４０μg/mL)+グルコース(０．１％)の寒天培地へと分散した。全ライブラリーのサイズは、>１×１０8の独立クローンであった。
【０２５１】
多様化したscFvの発現によってライブラリー建造の質を評価した。上記で指摘したように、可溶若しくは部分的に可溶、又は非可溶の融合パートナーの発現は、ペプチドグリカン(PG) 結合ドメインと、SNAP（New England Biolabs）のような色素生成発現レポーターとを使用した、REDディスプレイシステムにおけるscFvの外観によって直接評価することができる。一度膜が透過処理されてしまえば（例えば図１Ａ）、細胞壁を拡散しそこに自由に結合できるのと同じく、可溶の融合タンパク質は著しく均等に細胞の周囲に分布する。比較すると、不溶の融合タンパク質は、細胞壁へと遊走することのない高密度に染色する集合（例えば図１Ｂ）を形成する。部分的に可溶の融合は、各々のいくつかの特徴をもっている。私たちは以前に、上記のような融合タンパク質と、図４における可溶性scFvのようなウェスタンブロットにおける可溶／不溶のフラクションに現われる量との間の、卓越した相互関係を発見した。
【０２５２】
この経験的な基準によって、私たちの多様化されたscFvライブラリーは〜９０％の可溶で十分に発現したメンバーから構成されたが、これは、IGLV3-1::IGHV3-23スカフォールドの、挿入されたCDR3多様性に対する耐性を表す。図９は、発現したライブラリーのサンプルのラベルされたSNAP画像である。
【０２５３】
当該ライブラリーがランダム化されたＶLとＶH CDR3領域から構成されていることをさらに確かめるために、10の独立クローンを配列した。配列決定は、（表４で示された）CDR3ループの構成が、縮重すなわち終止コドンの不在のために使用される‘NNT’ヌクレオチドのトリプレットと、アミノ酸W、Q、M、K及びＥとによって作られたコドン多様性を予期する構成である、ということを示した。
【０２５４】
表４：任意抽出したライブラリーでのサンプルCDR3ループ配列
【表４】
2014527408.tif 000008
【０２５５】
実施例７：mAG1標的に結合するIGVL3-1::IGVH3-23ライブラリーのスクリーニング
標的タンパク質mAGに結合するクローンのために多様化したライブラリーをスクリーンした。アザミグリーン(AG)は、Aequorea victoria緑色蛍光体タンパク質(GFP)の遠位オーソログである。配列の同一性が低い(5％)にもかかわらず、それは同様に、492nmの吸収ピークと510nmの放出ピークを有する緑色蛍光である。モノマー体型が(mAG)Karasawa et al.(2003)に報告され、DNA2.0(USA)に大腸菌における最適の発現のために再コード化された。C末端の大腸菌BirAビオチン化モチーフと6xHisタグは、精製とmAGマトリックス付着における支援に含められた。mAG-BioHis6タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:110のようにリスト化される。
【０２５６】
mAG BioHis6タンパク質配列：
MVSVIKPEMKIKLCMRGTVNGHNFVIEGEGKGNPYEGTQILDLNVTEGAPLPFAYDILTTVFQYGNRAFTKYPADIQDYFKQTFPEGYHWERSMTYEDQGICTATSNISMRGDCFFYDIRFDGTNFPPNGPVMQKKTLKWEPSTEKMYVEDGVLKGDVNMRLLLEGGGHYRCDFKTTYKAKKEVRLPDAHKIDHRIEILKHDKDYNKVKLYENAVARYSMLPSQAKSGGLNDIFEAQKIEWHEDTGGSHHHHHH (SEQ ID NO: 110)
【０２５７】
〜１００フォールドの余剰を表す、多様化したライブラリーの１０10の細胞は、実施例２とWO2011/075761で記述されたようなREDディスプレイへと誘導した。透過処理した細胞は50mLのPBSで懸濁され、MACSストレプトアビジンと結合したミクロビーズ(130-048-102, Miltenyi Biotec)に事前結合された、精製されたmAGでラベルされた。4℃で一晩中、細胞とミクロビーズを穏やかに攪拌した。次にそれらは、磁気支持体に固定された3xLSカラム(130-042-401, Miltenyi Biotec)にロードした。各々のカラムは、５０ｍＬのPBSで洗浄した。細胞は、１０ｍＬのPBSにおいて溶出し、貯留して、ペレット化した。アルカリ溶解によって細胞ペレットから、REDディスプレイベクターをコード化するプラスミドDNAを単離した。次に、プラスミドを電気穿孔して銀細胞へと戻し、誘導、結合とカラム精製を繰り返した。親和性スクリーンを４度繰り返した後で、低含量の透過処理したRED細胞がmAGタンパク質に結合していることが、蛍光顕微鏡検査によって観察された。５度の繰り返すことにより、FACSによって透過処理した細胞をmAG結合に分類した。細胞は、融合タンパク質の発現を正常化するためのSNAP配位子とmAGを使用したFACSでラベルした。4428のmAG-陽性事象を２.４６×１０8の全事象から収集している間の細胞母集団のFACSは、１０5の細胞にほぼ１の結合事象という量を示した。FACSのアウトプットであるmAG陽性に由来するscFvは、scFv配列に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したPCRによって回収され、産出物が再クローン化されてREDディスプレイベクターへと戻された。mAG結合に対して陽性である細胞の最後のスクリーンアウトプットを分析することで、〜４０％(23/60)のクローンがmAG1陽性であったことが示された。したがって、FACS段階は、ライブラリーバックグラウンドに由来する陽性細胞の〜１０5フォールドの濃縮が可能である。
【０２５８】
図１０は、mAG結合に対して陰性（クローン25）であり陽性（クローン34）であるクローンのための、REDの透過処理された細胞へのmAGの結合を示す。
【０２５９】
２０のmAG陽性クローンが配列され、この２０mAG陽性クローンの全てが同一であるということが見出された。mAG結合IGLV3-1::IGHV3-23クローンのタンパク質配列はSEQ ID NO:111（太字の大きい文字で記されたCDR3配列と、下線を引いたペプチドリンカーを有する）で下記にリスト化している。VL CDR3は、設計された多様性に合致する‘FNLGGCGD’とＶH CDR3‘HIDGPVA’であることを発見した。
【０２６０】
反mAG結合scFv：
MGDGQSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRP SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDFNLGGCGDTVVFGTGTKVTVSSQ TGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHID GPVAAFDIWGQGTMVTVSSSSQTSILVA (SEQ ID NO: 111)
【０２６１】
α-mAG scFvの特性を規定するために、遺伝子はＣ末端6xHisとFLAGエピトープタグをもつ発現ベクターへとクローン化された。アラビノースと、０．５％の8TGPで透過処理された細胞とによってscFv発現を誘導し、可溶scFvを上澄みへと放出した。不溶の細胞物質をペレット化して、両抽出物のサンプルをSDS-PAGEローディング染料で煮沸し、１５％のSDS-PAGEゲルの上で電気泳動した。溶解したタンパク質は、ニトロセルロース膜へと移植され、α-FLAGマウスモノクローナル抗体で探索した。図１１は、α-mAG scFvがほとんど可溶フラクションの内にだけ存在したことを示す。
【０２６２】
α-mAG scFvは、mAGタンパク質に特有のものであって、単に「扱いにくい」抗体ではないということを示すために、α-mAG scFvの透過処理された細胞は、構造的及び機能的にmAGに関係するタンパク質、EGFPでラベルされた。これらの細胞は、mAGは結合するが、EGFPは結合しない（データが示されなかった）。α-mAG scFvの特有性をさらに評価するために、α-mAG scFv His6-FLAGタンパク質は、IMAC Niセファロース樹脂に結合した。「清潔な」mAGタンパク質（除去されたHis6 and FLAGタグを有する）の未加工の細胞溶解質を樹脂で混合した。結合されていないタンパク質を任意に洗浄した。図１２における蛍光顕微鏡検査の画像は、付着したα-mAG scFvをもつ樹脂ビーズはmAGを結合したが、コントローズビーズは結合しなかったことを示している。結合されたタンパク質はイミダゾールで溶出し、SDS-PAGEゲルの上で電気泳動した。ゲルのクーマシー染色（図１３）は、明白なmAG細胞溶解質に特有のいかなる他の帯域ももたないmAGタンパク質であるために適切なサイズのα-mAG scFvのサンプルにおける帯域を示している。
【０２６３】
したがって、本発明は、ランダム化されたCDR3ループを含むscFvポリペプチドのライブラリーを発生させるために首尾よく使用することができ、また特有の結合活動を示すscFvを見分けるようにスクリーンすることができる。
【０２６４】
実施例8：α-mAG IGLV3-1::IGHV3-23 scFvを使用したラムダファージのディスプレイ
細胞質という還元環境における強化された安定性と生産的なフォールディングを示すスカフォールドの有用性を表すために、ラムダバクテリオファージgpDカプシドタンパク質へのC末端融合として、α-mAG IGLV3-1::IGHV3-23 scFvをクローン化した。ラムダバクテリオファージは繊維状ファージに対して多くの長所を持つため、それはタンパク質ディスプレイの典型的な伝達手段であるとこれまで報告されていた。ラムダカプシドタンパク質、gpDは、ファージ頭部につき〜４００のコピーにおいて提示され、またそれは頑丈で耐性のあるディスプレイパートナーであるが、これはカプシドによってロードされた>８０％のgpDが組み換え融合タンパク質であることを可能にする一方、伝染の実行可能性を維持する(Vaccaro et al., 2006)。さらにそれは、N末端又はC末端への融合に対して耐性を有する。
【０２６５】
それゆえ、ラムダバクテリオファージ又はそれと同等にパッケージされたベクターは、繊維状ファージの名目上は単一分子のディスプレイと比べられる、ライブラリータンパク質の多価ディスプレイを有する。この多価ディスプレイは、結合溶液に由来するファージの驚異的な捕捉効率を持たせることができ―ほぼ１００％の捕捉にまで至る(Mikawa et al.,1996)。加えて、ラムダのパッケージの高効率（２×１０9pfu/μgにまで至る）を可能にするキットが商業的に入手しやすいことによってラムダバクテリオファージライブラリーの収集を促進する。
【０２６６】
しかしながら、ラムダバクテリオファージは、次のような特異な事実、すなわち、ラムダファージ及びP2/P4、P22、T7、及びT4のような関連ファージは、細胞質におけるそれらの集合に起因する溶解性の生活様式を有する事実のために、抗体ディスプレイのための繊維状ファージ使用の流行の恩恵を受けなかった。抗体スカフォールの大部分は、酸化型領域間のジスフィルド架橋がなければ生産的にフォールドされないので、これは抗体ディスプレイへのためのラムダバクテリオファージの使用を大いに妨げてきた。
【０２６７】
細胞質によって安定するscFvスカフォールドを形成するIGHV3-23ドメインに対するIGLVパートナーの数を見極めることによって、私たちは抗体スクリーニングに対するラムダディスプレイの典型的な適用を示すことができるようになった。アラビノース誘導のaraBADプロモーターとaraCレギュレーターの制御下にある融合タンパク質の発現を有するラムダgpDカプシドタンパク質へのC末端融合として、α-mAG scFvをクローン化した。このユニットは、他のラムダディスプレイプラットフォーム(Mikawa et al., 1996; Sternberg and Hoess, 1995; Minenkova et al., 2003)と同様に、ラムダバクテリオファージゲノムへとクローン化されたが、使用されたラムダゲノムが遺伝的にcI857 gpD+ RSであるという注目すべき例外を伴った。細胞溶解に必要なラムダエンドリシン(R)とポリン(S)遺伝子を構成するRS遺伝子が欠失していることは、ラムダ状ディスプレイにおける溶解性に欠陥のあるバクテリオファージの使用に関する、International Patent Application No. PCT/AU2012/000761に記述された。ラムダ状ディスプレイのために使用される溶解性に欠陥のあるファージベクターによって、細胞質内の伝染性バクテリオファージの粒子のパッケージングが可能になる。この粒子は、その高濃度のサーフェスに繋ぎ留められたカプシド融合タンパク質とともに細胞内に蓄積し続け、細胞質のREDディスプレイの宿主細菌細胞を処理する研究者によって停止されるまで成長する。したがって結果として生じる標本は、FACSによる融合タンパク質抗原結合のためにスクリーンされる。抗原結合のためにFACSによって陽性的に分類された、透過処理済の細胞内にカプセル化されたバクテリオファージの粒子を放出するには、ただリゾチームの追加が必要とされるにすぎない。高活性のリゾチームの標本は、このタスク（例えばEpicentreのReady-Lyse）のために商業的に購入されるだろう。親和性で選択されたクローンの回収を完全なものにするために、伝染性バクテリオファージの粒子は宿主大腸菌細胞へと伝染し、溶原菌として育てられる。したがって、細胞質によって安定したヒト抗体スカフォールドと結合した、溶解性に欠陥のあるファージを使用することによって、FACSによって行われる最後のスクリーンを伴う、遊離バクテリオファージのフォーマットにおける多価ライブラリークローンの高捕捉頻度が可能になるということは、この分野の従事者によって評価されるべきである。重要なことに、スクリーニングフォーマットにおけるこの変化は、ライブラリー発現の構成の再フォーマットのためのいかなる必要条件もなしに生じる。したがってこれは、クローン選択性の低い高次に相似したスクリーニング（遊離バクテリオファージパニング）とクローン選択性は高いが処理能力は低いスクリーン（カプセル化バクテリオファージのFACS）という二重の能力を有するスクリーニングシステムである。
【０２６８】
当発明のポリペプチドを使用したラムダファージディスプレイの便益を示すために、モデルとなるα-mAG scFv融合（当発明のポリペプチドの多くの適切な実施例の中の一つとして）を、ラムダカプシドgpD遺伝子へのC末端融合としてクローン化した。
【０２６９】
使用されたgpD::α-mAG scFv融合構築のDNA配列は、
ATGACGAGCAAAGAAACCTTTACCCATTACCAGCCGCAGGGCAACAGTGACCCGGCTCATACCGCAACCGCGCCCGGCGGATTGAGTGCGAAAGCGCCTGCAATGACCCCGCTGATGCTGGACACCTCCAGCCGTAAGCTGGTTGCGTGGGATGGCACCACCGACGGTGCTGCCGTTGGCATTCTTGCGGTTGCTGCTGACCAGACCAGCACCACGCTGACGTTCTACAAGTCCGGCACGTTCCGTTATGAGGATGTGCTCTGGCCGGAGGCTGCCAGCGACGAGACGAAAAAACGGACCGCGTTTGCCGGAACGGCAATCAGCATCGTTGGAGGTAGCGGCGGATCGGATGACGACGATAAGTCTAGAAATGGCGGAGACGGTCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACTTTAATCTTGGCGGATGTGGTGATACTGTGGTGTTCGGCACCGGTACGAAAGTGACTGTCTCATCTCAGACCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAAGTCCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCATCCGGTTTTACTTTCAGCAGCTACGCGATGTCGTGGGTGCGCCAGGCACCGGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCGCCATCAGCGGTAGCGGCGGTTCTACGTATTATGCGGACAGCGTCAAGGGCCGTTTCACCATCAGCCGTGACAATTCCAAAAACACCCTGTACTTGCAGATGAACAGCTTGCGTGCGGAAGATACGGCTGTTTACTACTGTGCGAAACATATTGATGGCCCTGTTGCTGCGTTTGATATTTGGGGTCAAGGTACCATGGTTACCGTGAGCAACTCGAGCGATTACAAGGACGATGATGACAAATAA (SEQ ID NO: 112)
【０２７０】
使用されたgpD::α-mAG scFv融合タンパク質のタンパク質配列は：
MTSKETFTHYQPQGNSDPAHTATAPGGLSAKAPAMTPLMLDTSSRKLVAWDGTTDGAAVG ILAVAADQTSTTLTFYKSGTFRYEDVLWPEAASDETKKRTAFAGTAISIVGGSGGSDDDD KSRNGGDGQSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSK RPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDFNLGGCGDTVVFGTGTKVTVS SQTGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQ APGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKH IDGPVAAFDIWGQGTMVTVSNSSDYKDDDDK* (SEQ ID NO: 113)
【０２７１】
次にgpD::α-mAG scFv融合を、araBADプロモーターの制御下でラムダディスプレイベクターへとクローン化した。溶原菌クローンを４２℃で１５分熱することによって、ラムダパッケージングのために宿主細胞を誘導した（ラムダ遺伝子のバックグラウンドは温度感知cIリプレッサーを持つcI857 gpD+ RSであった）。熱誘導に直接続く０．２％のアラビノースで融合タンパク質を誘導した。さらに７５分間３２℃でエアレーションによって培養菌を生育した。当該細胞は、LB媒質+０．５％の8TGPの1/3rd培養菌容積においてペレット化され、再懸濁され、またスクリーンのためのRED法によって当該細胞を透過処理するために、25℃で10分培養した。ファージを放出するために、Ready-Lyse (Epicentre) リゾチームの1/10,000th培養容積を懸濁液に加えた。残存する全ての細胞を非活性化するためにクロロホルムの一滴を加え、ユニット(cfu/mL)を形成する溶原菌のために放出されたバクテリオファージの粒子を滴定した。二つのバクテリオファージの群体が作られた―その一つはクローン化されたgpD::α-mAG scFv融合を有する構成を有し、もう一つは空虚な構成を有する。極少数の陽性クローンの開始時のscFvライブラリー濃度を追跡するために、空虚な構成の１０9のうちの１クローンにまでgpD::α-mAG scFv融合を希釈した。次にこの「ドープされた」ライブラリーは、ストレプトアビジンビーズ支持体に結合した、ビオチン化されたmAGに対してパンされた。パニングは、この分野の当業者に公知のファージのパニングに一般に使用される方法に従って行なわれた。溶原菌としての宿主大腸菌の菌株へと回収された最後の繰り返しでニ回のパニングの繰り返しを行なった。FACSによってスクリーニングの三回目の繰り返しを行なった。gpD::α-mAG scFv融合のアラビノース誘導に加えて、バクテリオファージの熱誘導のために上で記されたように溶原菌細胞を扱った。しかしながら、透過処理された細胞は、リゾチーム処理でバクテリオファージの粒子を放出するのではなく、代わりにmAGタンパク質で培養された。透過処理された細胞は一度洗浄し、TBS+10mMMgSO4において懸濁されて、次にFACSによってmAG結合（すなわちmAG陽性細胞はグリーンにラベルされるだろう）に応じて分類された。図１４(TOP)は、mAG陽性細胞の発生を表す、現行のFACS分類のスクリーングラブを示している。蛍光顕微鏡検査によって査定される（図１４、BOTTOM）FACS後のmAG陽性細胞の最後の発生は、20％であった。
【０２７２】
こうして、ラムダカプシドディスプレイは、それが当発明の安定した可溶のscFvスカフォールドと結合しているとき、開始時の比較的高い希釈液（１０9に1）から結合クローンを強力に単離することができることが示されてきた。さらに、溶解性に欠陥のあるバクテリオファージと化合し、またREDに教示された方法で扱われるとき、有益な特性のさらなる拡大が、ライブラリーメンバーの再クローニングなしにFACSスクリーニングをする能力を含めることが可能となる。 
【０２７３】
こうした方法を組み合わせることで、理想的な特性（高発現、高可溶性、高親和性）を持った抗体クローンのスクリーニングプロセスが大いに速められる。
【０２７４】
広く記述された本発明の範囲を逸脱することなく、特定の態様において示したように、多くの変化形及び／又は改良が可能であることを当業者は理解するであろう。本実施態様は、したがって、いかなる点においても説明のためであって、制限を課すものと考えてはならない。
【０２７５】
本明細書において、議論され、及び／又は参照された公刊物は、その全体を参照のため本明細書に組み入れる。
【０２７６】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等々に関するいかなる議論もひとえに本発明の状況を提供することを目的としている。これらの事項のいずれか、又は全てが、当出願の各請求項の優先日より以前に存在していたことを理由として、それが先行技術の基盤の一部を形成すること、あるいは本発明に関連する分野において普通の一般的な知識であったことを是認するとして取られるべきでない。
【０２７７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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