(57)【要約】改善された熱的安定性をＤＡＲＰｉｎに付与する設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）のための改善されたＮ末端キャッピングモジュール、ならびに、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインが、アミノ酸配列ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、配列番号１４又は配列番号１５の位置２４のアミノ酸残基Ｌは、場合により、Ｖ、Ｉ、又はＡにより置換され；
位置２４以外の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸が、場合により、任意のアミノ酸により交換され；及び、
ここで、配列番号１４又は配列番号１５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損している、結合タンパク質。
【請求項２】
Ｎ末端キャッピングモジュールが、配列番号１４又は配列番号１５の位置２４に対応するアミノ酸残基が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡの代わりにＭであるという例外を有するＮ末端キャッピングモジュールの同一のアミノ酸配列を有するアンキリンリピートドメインと比較した場合、ＰＢＳ中でのより高いＴｍ値を、該アンキリンリピートドメインに付与する、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号１４又は配列番号１５の位置２６のアミノ酸残基Ａが、Ｈ、Ｙ、Ｋ、又はＲにより置換されていない又は置換されている、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号１４又は配列番号１５の位置２１のアミノ酸残基Ｒが、Ｅにより置換されていない又は置換されている、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項５】
配列番号１４の位置２２のアミノ酸残基Ｉ又は配列番号１５の位置２２のアミノ酸残基Ｅが、Ｖにより置換されていない又は置換されている、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項６】
配列番号１４又は配列番号１５の位置２５のアミノ酸残基Ｋが、Ａ又はＥにより置換されていない又は置換されている、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１４の位置２１〜２６のアミノ酸残基ＲＩＬＬＫＡ又は配列番号１５の位置２１〜２６のアミノ酸残基ＲＥＬＬＫＡが、置換されていない、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項８】
Ｎ末端キャッピングモジュールが、配列ＧＳＸ１ＬＸ２ＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  Ｘ３Ｘ４ＬＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号５）を含み、ここで、配列番号５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；
Ｘ１はアミノ酸残基Ｇ、Ａ、又はＤを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ｇ又はＤを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ｒ又はＥを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ、Ｅ、又はＶを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ａ、Ｋ、又はＥを表し；及び、
Ｘ７はアミノ酸残基Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項９】
Ｎ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列が、ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）であり、ここで、配列番号１４及び配列番号１５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損している、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインが、ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）と少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有し、そしてＮ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列中の位置２４におけるアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡであるという条件を有するアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール；
及び、位置１及び／又は２におけるアミノ酸が欠損している、そのようなＮ末端キャッピング分子、
を含む、結合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端キャッピングモジュールが、該Ｎ末端キャッピングモジュールの位置２４に対応するアミノ酸残基が、Ｍであるという例外を有する同一のアミノ酸配列を有するアンキリンリピートドメインと比較した場合、ＰＢＳ中でのより高いＴｍ値を、該アンキリンリピートドメインに付与する、請求項１０記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
Ｎ末端キャッピングモジュールの位置２６のアミノ酸残基が、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、又はＲである、請求項１１記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
Ｎ末端キャッピングモジュールの位置２１のアミノ酸残基が、Ｒ又はＥである、請求項１１記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインが、アミノ酸配列Ｘ１ＤＫＸ２ＧＫＴＸ３Ｘ４Ｄ  Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８ＧＸ９ＥＤＸ１０  ＡＥＸ１１ＬＱＫＡＡ（配列番号６）を有するＣ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ａ又はＦを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
Ｘ７はアミノ酸残基Ｉ又はＡを表し；
Ｘ８はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；
Ｘ９はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
Ｘ１０はアミノ酸残基Ｌ又はＩを表し；
Ｘ１１はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表し；
Ｘ４がＦを表し、Ｘ７がＩを表し、Ｘ８がＮ又はＥが表す場合、Ｘ２はＦを表さない、結合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の結合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の結合タンパク質又は請求項１５記載の核酸、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む、医薬的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、改善された熱的安定性をＤＡＲＰｉｎに付与する設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）のための改善されたＮ末端キャッピングモジュール、ならびに、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
抗体の他、標的分子に特異的に結合させるために使用することができる新規の結合タンパク質又は結合ドメインがある（例、Binz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol.23, 1257-1268, 2005）。結合タンパク質又は結合ドメインの１つのそのような新規のクラスは、設計リピートタンパク質又は設計リピートドメインに基づく（WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004；Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008）。WO 2002/020565には、リピートタンパク質の大きなライブラリーをどのように構築することができるのか、及びそれらの一般的な適用が記載されている。これらの設計リピートドメインは、リピートタンパク質のモジュラー性質を活用し、ドメインの疎水性コアを遮蔽することにより、設計リピートドメインを凝集から防止するためのＮ末端及びＣ末端キャッピングモジュールを持つ（Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. and Pluckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003）。これらのキャッピングモジュールは、天然グアニン−アデニン結合タンパク質（ＧＡ結合タンパク質）のキャッピングリピートに基づいた。これらの設計アンキリンリピートドメインの熱的及び熱力学的安定性は、ＧＡ結合タンパク質に由来するＣ末端キャッピングリピートを改善することによりさらに増加されうることが示された（Interlandi, G., Wetzel, S.K, Settanni, G., Pluckthun, A. and Caflisch, A., J. Mol. Biol. 375, 837-854, 2008；Kramer, M.A, Wetzel, S.K., Pluckthun, A., Mittl, P.R.E, and Grutter, M.G., J. Mol. Biol. 404, 381-391, 2010）。著者らは、このキャッピングモジュール中に合計８つの変異を導入し、３つの異なるアミノ酸を加えることにより、そのＣ末端ヘリックスを伸張させた。それにもかかわらず、Ｃ末端キャッピングモジュールにおけるこれらの改変の導入は、この変異Ｃ末端キャッピングモジュールを保有する設計リピートドメインの不要な二量体化の傾向をもたらした。このように、設計アンキリンリピートドメインのＣもしくはＮ末端キャッピングモジュール又はＣもしくはＮ末端キャッピングリピートを改善させることによる、さらなる最適化されたリピートタンパク質の生成についての必要性がある。
【０００３】
全体的に、癌及び他の病理学的状態を処置するための改善された安定性を有する標的特異的アンキリンリピートタンパク質についての必要性が存在する。
【０００４】
本発明の基礎となる技術的問題は、癌及び他の病理学的状態の改善された処置のための改善された安定性を有する新規アンキリンリピートタンパク質を同定することである。この技術的問題への解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施態様を提供することにより達成される。
【０００５】
発明の概要
本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し
、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アミノ酸配列ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、配列番号１４又は配列番号１５の位置２４のアミノ酸残基Ｌは、場合により、Ｖ、Ｉ、又はＡにより置換され；
位置２４以外の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸が、場合により、任意のアミノ酸により交換され；及び、
ここで、配列番号１４又は配列番号１５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損している。
【０００６】
特に、本発明は、結合タンパク質に関し、ここで、前記Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列ＧＳＸ１ＬＸ２ＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  Ｘ３Ｘ４ＬＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号５）を含み、ここで、配列番号５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；
Ｘ１はアミノ酸残基Ｇ、Ａ、又はＤを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ｇ又はＤを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ｒ又はＥを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ、Ｅ、又はＶを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ａ、Ｋ、又はＥを表し；及び、
Ｘ７はアミノ酸残基Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
【０００７】
別の実施態様において、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）と少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール（前記Ｎ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列中の位置２４におけるアミノ酸残基が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡであるという条件を有する）；
ならびに、位置１及び／又は２におけるアミノ酸が欠損している、そのようなＮ末端キャッピング分子を含む。
【０００８】
そのような結合タンパク質は、Ｎ末端キャッピングモジュールにおいてだけ異なる同じ結合タンパク質と比較した場合、例えば、最先端のＮ末端キャッピングモジュール、例えば、位置２４においてアミノ酸Ｍ（メチオニン）を有するアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュールなど（例、位置２４のＬがＭにより置換されている配列番号１４又は配列番号１５）を有する結合タンパク質と比較した場合、改善された熱的安定性を示す。
【０００９】
本発明は、さらに、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アミノ酸配列Ｘ１ＤＫＸ２ＧＫＴＸ３Ｘ４ＤＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８ＧＸ９ＥＤＸ１０ＡＥＸ１１ＬＱＫＡＡ（配列番号６）を有するＣ末端キャッピングモジュールを含む。
【００１０】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質をコードする核酸分子、及び上で言及する結合タンパク質又は核酸分子を含む医薬的組成物に関する。
【００１１】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質を使用した病理学的状態の処置の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１．ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７及びＤＡＲＰｉｎ  ＃１８の熱的安定性。ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７及びＤＡＲＰｉｎ  ＃１８の熱変性からのトレースを示す。熱変性は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に存在する色素ＳＹＰＲＯオレンジの蛍光強度の増加で追う。ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７及びＤＡＲＰｉｎ  ＃１８についてのＴｍ値を、それぞれ６４．５℃及び７１．０℃と推定した。Ｆ、相対蛍光単位（ＲＦＵ）、５１５〜５３５nmでの励起、５６０〜５８０nmでの検出；Ｔ、℃での温度；ＤＡＲＰｉｎの定義、下を参照のこと。
【図２】図２．ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２０の熱的安定性。ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２０の熱変性からのトレースを示す。熱変性は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２２２nmでのＣＤシグナルで追う。ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２０についてのＴｍ値を、それぞれ７２．３℃及び７４．８℃と推定した。ＦＵ、アンフォールド（unfold）した画分；Ｔ、℃での温度；ＤＡＲＰｉｎの定義、下を参照のこと。
【図３】図３．ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３の熱的安定性。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３の熱変性からのトレースを示す。熱変性は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２２２nmでのＣＤシグナルで追う。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３についてのＴｍ値を、それぞれ５６．５℃及び６３．５℃と推定した。ＦＵ、アンフォールドした画分；Ｔ、℃での温度；ＤＡＲＰｉｎの定義、下を参照のこと。
【図４】図４．ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６の熱的安定性。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６の熱変性からのトレースを示す。熱変性は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２２２nmでのＣＤシグナルで追う。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６についてのＴｍ値を、それぞれ８３℃及び８９℃と推定した。ＲＥ、２０℃測定されたシグナルに対して標準化された、２２２nmでの相対ＣＤシグナル；Ｔ、℃での温度；ＤＡＲＰｉｎの定義、下を参照のこと。
【００１３】
発明の詳細な説明
用語「タンパク質」はポリペプチドを指し、ここで、ポリペプチドの少なくとも部分は、そのポリペプチド鎖内及び／又は間の二次、三次、又は四次構造を形成することにより、所定の三次元配置を有する、又は、得ることができる。タンパク質が２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む場合、個々のポリペプチド鎖は非共有結合的又は共有結合的に、例えば、２つのポリペプチドの間のジスルフィド結合により連結されうる。タンパク質の部分は、二次又は三次構造を形成することにより所定の三次元配置を個々に有する、又は、得ることができ、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは当業者に周知である。
【００１４】
用語「組換え」は、組換えタンパク質、組換えタンパク質ドメイン、組換え結合タンパク質などで使用される通り、前記ポリペプチドが、当業者により周知である組換えＤＮＡ技術の使用により産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例、遺伝子合成により産生される）を、細菌発現プラスミド（例、ｐＱＥ３０、Qiagen）、酵母発現プラスミド、又は哺乳動物発現プラスミド中にクローン化することができる。例えば、そのような構築された組換え細菌発現プラスミドは、適切な細菌（例、大腸菌）中に挿入される場合、この細菌は、この組換えＤＮＡによりコードされるポリペプチドを産生することができる。対応して産生されたポリペプチドは、組換えポリペプチドと呼ばれる。
【００１５】
本発明に関連して、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数、即ち、２つ又はそれ以上のアミノ酸の１つ又は複数の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結された８を上回るアミノ酸からなる。
【００１６】
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に付着したアミノ酸配列を指し、ここで、前記アミノ酸配列は、前記ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、又は標的化のために有用であり、あるいは、ここで、前記アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、あるいは、ここで、前記アミノ酸配列はエフェクター機能を持つ。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグ、部分、及び／又はドメインを、互いに直接的に又はポリペプチドリンカーを介して接続してもよい。これらのポリペプチドタグは、全て、当技術分野において周知であり、当業者に完全に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小さなポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ（例、配列番号１６のＨｉｓタグ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、もしくはＳｔｒｅｐタグ又は部分、例えば酵素など（例えば、アルカリホスファターゼなどの酵素）であり、それらは前記ポリペプチド／タンパク質の検出を許し、あるいは、標的化のため（例えば免疫グロブリン又はそのフラグメントなど）及び／又はエフェクター分子として使用することができる部分である。
【００１７】
用語「ポリペプチドリンカー」はアミノ酸配列を指し、それは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非ポリペプチド部分（例えばポリエチレングルコールなど）、又は２つの配列タグを連結することができる。そのような追加ドメイン、タグ、非ポリペプチド部分、及びリンカーは、当業者に公知である。例のリストを、特許出願WO 2002/020565の説明に提供する。そのようなリンカーの特定の例は、可変長のグリシン−セリンリンカー及びプロリン−スレオニンリンカーである；好ましくは、前記リンカーは２〜２４の間のアミノ酸の長さを有する；より好ましくは、前記リンカーは、２〜１６の間のアミノ酸の長さを有する。
【００１８】
用語「結合タンパク質」は、下でさらに説明する通り、１つ又は複数の結合ドメイン、１つ又は複数の生物活性化合物、及び１つ又は複数のポリマー部分を含むタンパク質を指す。好ましくは、前記の結合タンパク質は、４つまでの結合ドメインを含む。より好ましくは、前記の結合タンパク質は、２つまでの結合ドメインを含む。最も好ましくは、前記の結合タンパク質は、１つだけの結合ドメインを含む。さらに、任意のそのような結合タンパク質は、結合ドメインではない追加のタンパク質ドメイン、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、及び／又は単一のＣｙｓ残基を含みうる。多量体化部分の例は、ペアになり、機能的な免疫グロブリンＦｃドメインを提供する免疫グロブリン重鎖定常領域、及びロイシンジッパー又は遊離チオールを含むポリペプチド（２つのそのようなポリペプチド間に分子間ジスルフィド結合を形成する）である。単一のＣｙｓ残基は、例えば、当業者に周知のマレイミド化学を使用することにより、他の部分をポリペプチドに共役するために使用してもよい。好ましくは、前記結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。また、好ましくは、結合タンパク質の結合ドメインは、異なる標的特異性を持つ。
【００１９】
用語「結合ドメイン」は、下に定義する通り、所定の特性を有するアンキリンリピートドメインを意味する。そのような結合ドメインは、合理的な、又は最も一般的な、当技術分野において公知の技術である、コンビナトリアルタンパク質操作技術により得てもよい（Binz et al., 2005、前掲文献）。例えば、所定の特性を有する結合ドメインは、以下の工程を含む方法により得ることができる：（ａ）リピートドメインの多様なコレクションを提供すること；ならびに（ｂ）前記の多様なコレクションをスクリーニングこと及び／又は前記の所定の特性を有する少なくとも１つのリピートドメインを得るために前記の多様なコレクションから選択すること。リピートドメインの多様なコレクションは、使用されるスクリーニング及び／又は選択システムに従ったいくつかの方法により提供され、当業者に周知の方法（例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイなど）の使用を含みうる。好ましくは、前記の結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
【００２０】
用語「所定の特性」は、特性、例えば標的への結合、標的の遮断、標的媒介反応の活性化、酵素活性、及び関連するさらなる特性などを指す。所望の特性の型に依存して、当業者は、所望の特性を有する結合ドメインのスクリーニング及び／又は選択を実施するためのフォーマット及び必要な工程を同定することができる。好ましくは、前記の所定の特性は、標的への結合である。
【００２１】
好ましい結合タンパク質は、少なくとも１つのリピートドメインを含む。
【００２２】
用語「標的についての結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、ＰＢＳ中で、無関係のタンパク質（例えば大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）など）よりも低い解離定数と供に、標的に結合することを意味する。好ましくは、標的についてのＰＢＳ中での解離定数は、ＭＢＰについての対応する解離定数よりも、少なくとも１０、より好ましくは１０２、さらにより好ましくは１０３、又は最も好ましくは１０４倍低い。
【００２３】
タンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を決定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの技術（例、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量計（ＩＴＣ）などが、当業者に周知である。特定のタンパク質−タンパク質相互作用の測定Ｋｄ値は、異なる条件（例、塩濃度、ｐＨ）下で測定した場合、変動しうる。このように、Ｋｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及び標準化緩衝液（例えばＰＢＳなど）を用いて行われる。
【００２４】
用語「標的」は、個々の分子、例えば核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然分子（そのような個々の分子の任意の部分、あるいは、そのような分子の２つ又はそれ以上の複合体を含む）などを指す。標的は、全細胞又は組織サンプルでよく、又は、それは任意の非天然分子もしくは部分でよい。好ましくは、標的は、天然もしくは非天然ポリペプチド又は化学的修飾（例えば、天然もしくは非天然のリン酸化、アセチル化、又はメチル化により修飾される）を含むポリペプチドである。
【００２５】
リピートタンパク質についての以下の定義は、特許出願WO 02/20565中のものに基づく。特許出願WO 2002/020565は、さらに、リピートタンパク質の特性、技術、及び適用の一般的な記載を含む。
【００２６】
用語「リピートタンパク質」は、１つ又は複数のリピートドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、４つまでのリピートドメインを含む。より好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、２つまでのリピートドメインを含む。最も好ましくは、リピートタンパク質の各々は、１つだけのリピートドメインを含む。さらに、前記リピートタンパク質は、追加の非リピートタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はポリペプチドリンカーを含みうる。
【００２７】
用語「リピートドメイン」は、構造単位として２つ又はそれ以上の連続リピート単位（モジュール）を含むタンパク質ドメインを指し、ここで、前記構造単位は同じフォールディングを有し、そして堅固に積み重なり、例えば、結合疎水性コアを有する超らせん構造を作製する。好ましくは、リピートドメインは、さらに、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）を含む。さらにより好ましくは、前記Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）は、キャッピングリピートである。
【００２８】
用語「設計リピートタンパク質」及び「設計リピートドメイン」は、特許出願WO 2002/020565に説明される、本発明の手順の結果として得られる、リピートタンパク質又はリピートドメインをそれぞれ指す。「設計リピートタンパク質」及び「設計リピートドメイン」は、合成であり、天然からではない。それらは、それぞれ、対応して設計された核酸の発現により得られる、人工タンパク質又はドメインである。好ましくは、発現は、真核細胞もしくは原核細胞（例えば細菌細胞など）中で、又は、無細胞インビトロ発現系を使用することにより行われる。したがって、設計アンキリンリピートタンパク質（即ち、ＤＡＲＰｉｎ）は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む、本発明の結合タンパク質に対応する。
【００２９】
用語「構造単位」は、ポリペプチドの局所的に順序付けられた部分を指し、ポリペプチド鎖に沿って互いに近い二次構造の２つ又はそれ以上のセグメントの間の三次元相互作用により形成される。そのような構造単位は、構造モチーフを示す。用語「構造モチーフ」は、少なくとも１つの構造単位中に存在する二次構造エレメントの三次元配置を指す。構造モチーフは、当業者に周知である。構造単位単独では、所定の三次元配置を得ることはできない；しかし、例えば、リピートドメイン中でのリピートモジュールとしてのそれらの連続配置は、隣接単位の相互安定化に導き、超らせん構造をもたらす。
【００３０】
用語「リピート単位」は、１つ又は複数の天然リピートタンパク質のリピート配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、ここで、前記「リピート単位」は複数のコピーにおいて見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての前記モチーフに共通する所定のフォールディングトポロジーを示す。そのようなリピート単位は、リピートタンパク質の「リピート構造単位（リピート）」（Forrer et al., 2003、前掲文献により記載される）又はリピートタンパク質の「連続相同構造単位（リピート）」（Binz et al, 2004、前掲文献により記載される）に対応する。そのようなリピート単位は、フレームワーク残基及び相互作用残基を含む。そのようなリピート単位の例は、アルマジロリピート単位、ロイシンリッチリピート単位、アンキリンリピート単位、テトラトリコペプチドリピート単位、ＨＥＡＴリピート単位、及びロイシンリッチ変異体リピート単位である。２つ又はそれ以上のそのようなリピート単位を含む天然タンパク質は、「天然リピートタンパク質」として言及される。リピートタンパク質の個々のリピート単位のアミノ酸配列は、互いに比較された場合、有意な数の変異、置換、付加、及び／又は欠失を有しうるが、リピート単位の一般的なパターン、又はモチーフを依然として実質的に保持する。
【００３１】
用語「アンキリンリピート単位」は、アンキリンリピート（例えば、Forrer et al., 2003、前掲文献により記載される）であるリピート単位を意味するものとする。アンキリンリピートは、当業者に周知である。
【００３２】
用語「フレームワーク残基」は、リピート単位のアミノ酸残基、又はリピートモジュールの対応するアミノ酸残基に関し、それは、フォールディングトポロジーに寄与し、即ち、それは、前記リピート単位（又はモジュール）のフォールディングに寄与する、又は、隣接単位（又はモジュール）との相互作用に寄与する。そのような寄与は、リピート単位（又はモジュール）における他の残基との相互作用、あるいはαヘリックスもしくはβシート中に見出されるポリペプチド骨格の立体構造、又は直線状ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸ストレッチに対する影響でありうる。
【００３３】
用語「標的相互作用残基」は、リピート単位のアミノ酸残基、又はリピートモジュールの対応するアミノ酸残基を指し、標的物質との相互作用に寄与する。そのような寄与は、標的物質との直接的な相互作用、又は他の直接的に相互作用する残基に対する影響（例、リピート単位（又はモジュール）のポリペプチドの立体構造を安定化し、前記標的と直接的に相互作用する残基の相互作用を許す又は増強することによる）でありうる。そのようなフレームワーク残基及び標的相互作用残基は、物理化学的方法（例えばＸ線結晶解析、ＮＭＲ、及び／又はＣＤ分光法など）により得られる構造データの解析により、あるいは、構造生物学及び／又は生物情報学における当業者に周知である公知の及び関連する構造情報との比較により同定してよい。
【００３４】
好ましくは、リピート配列モチーフの推定のために使用されるリピート単位は、相同なリピート単位であり、ここで、リピート単位は同じ構造モチーフを含み、ここで、前記リピート単位のフレームワーク残基の７０%超が互いに相同である。好ましくは、前記リピート単位のフレームワーク残基の８０%超が相同である。最も好ましくは、前記リピート単位のフレームワーク残基の９０%超が相同である。ポリペプチドの間の相同性のパーセントを決定するためのコンピュータプログラム（例えばFasta、Blast、又はGapなど）は、当業者に公知である。さらに好ましくは、リピート配列モチーフの推定のために使用されるリピート単位は、標的上で選択されたリピートドメインから得られ、同じ標的特異性を有する、相同なリピート単位である。
【００３５】
用語「リピート配列モチーフ」は、アミノ酸配列を指し、それは１つ又は複数のリピート単位又はリピートモジュールから推定される。好ましくは、前記のリピート単位又はリピートモジュールは、同じ標的についての結合特異性を有するリピートドメインからである。そのようなリピート配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。前記フレームワーク残基位置は、リピート単位（又はモジュール）のフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、前記の標的相互作用残基位置は、リピート単位（又はモジュール）の標的相互作用残基の位置に対応する。リピート配列モチーフは、固定化された位置及び無作為化された位置を含む。用語「固定化された位置」は、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、ここで、前記位置は特定のアミノ酸に設定される。ほとんどの場合、そのような固定化された位置は、フレームワーク残基の位置及び／又は特定の標的について特異的である標的相互作用残基の位置に対応する。用語「無作為化された位置」は、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、ここで、２つ又はそれ以上のアミノ酸がアミノ酸位置で許され、例えば、ここで、通常の２０の天然アミノ酸のいずれかが許され、あるいは、ここで、２０の天然アミノ酸の大半が許され、例えばシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などである。ほとんどの場合、そのような無作為化された位置は、標的相互作用残基の位置に対応する。しかし、フレームワーク残基の一部の位置も無作為化してよい。
【００３６】
用語「フォールディングトポロジー」は、前記のリピート単位又はリピートモジュールの三次構造を指す。フォールディングトポロジーは、αヘリックス又はβシートの少なくとも一部を形成するアミノ酸のストレッチ、あるいは直線状ポリペプチド又はループを形成するアミノ酸ストレッチ、あるいはαヘリックス、βシート、及び／又は直線状ポリペプチド／ループの任意の組み合わせにより決定される。
【００３７】
用語「連続」は配置を指し、ここで、リピート単位又はリピートモジュールがタンデムに配置される。設計リピートタンパク質中に、少なくとも２つ、通常は約２〜６、特に少なくとも約６、高頻度には２０又はそれ以上のリピート単位（又はモジュール）がある。大半の場合において、リピートドメインのリピート単位（又はモジュール）は、高度の配列同一性（対応する位置での同じアミノ酸残基）又は配列類似性（アミノ酸残基は異なるが、しかし、類似の物理化学的特性を有する）を示し、アミノ酸残基の一部は、強く保存されている重要残基でありうる。しかし、アミノ酸の挿入及び／又は欠失、ならびに／あるいはリピートドメインの異なるリピート単位（又はモジュール）の間での置換による高度な配列変動性は、リピート単位（又はモジュール）の共通のフォールディングトポロジーが維持される限り可能でありうる。
【００３８】
物理化学的手段（例えばＸ線結晶学、ＮＭＲ、又はＣＤ分光法など）によりリピートタンパク質のフォールディングトポロジーを直接的に決定するための方法が、当業者に周知である。リピート単位又はリピート配列モチーフを同定及び決定するための、又は、そのようなリピート単位又はモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定するための方法、例えばホモロジー検索（ＢＬＡＳＴなど）などは、生物情報学の分野において十分に確立されており、当業者に周知である。初期リピート配列モチーフを改良する工程は、反復プロセスを含みうる。
【００３９】
用語「リピートモジュール」は、設計リピートドメインの繰り返しアミノ酸配列を指し、それらは、本来は、天然リピートタンパク質のリピート単位に由来する。リピートドメイン中に含まれる各々のリピートモジュールは、天然のリピートタンパク質のファミリー又はサブファミリー（例、アルマジロリピートタンパク質又はアンキリンリピートタンパク質のファミリー）の１つ又は複数のリピート単位に由来する。
【００４０】
「リピートモジュール」は、対応するリピートモジュールの全てのコピー中に存在するアミノ酸残基を有する位置（「固定化された位置」）及び異なる又は「無作為化された」アミノ酸残基を有する位置（「無作為化された位置」）を含みうる。
【００４１】
用語「キャッピングモジュール」は、リピートドメインのＮ又はＣ末端リピートモジュールに融合されたポリペプチドを指し、ここで、前記キャッピングモジュールは、前記リピートモジュールと強固な三次相互作用（即ち、三次元構造相互作用）を形成し、それにより、連続リピートモジュールと接触しない側で、溶媒から前記リピートモジュールの疎水性コアを遮蔽するキャップを提供する。前記Ｎ及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位又はリピート単位に隣接する天然リピートタンパク質中で見出される他の構造単位でありうる、又は、それに由来しうる。用語「キャッピング単位」は、天然の折り畳まれたポリペプチドを指し、ここで、前記ポリペプチドは、リピート単位のＮ又はＣ末端に融合された特定の構造単位を定義し、ここで、前記ポリペプチドは、前記リピート単位と強固な三次相互作用を形成し、それにより、一方の側の前記リピート単位の疎水性コアを、溶媒から遮蔽するキャップを提供する。好ましくは、キャッピングモジュール又はキャッピング単位は、キャッピングリピートである。用語「キャッピングリピート」は、前記の隣接リピート単位（又はモジュール）と類似の又は同じフォールディング及び／又は前記の隣接リピート単位（又はモジュール）との配列類似性を有するキャッピングモジュール又はキャッピング単位を指す。キャッピングモジュール及びキャッピングリピートは、WO 2002/020565において、及び、Interlandi et al., 2008（前掲文献）により記載される。例えば、WO 2002/020565には、アミノ酸配列ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡ（配列番号１）を有するＮ末端キャッピングモジュール（即ち、キャッピングリピート）及びアミノ酸配列ＱＤＫＦＧＫＴＡＦＤＩＳＩＤＮＧＮＥＤＬＡＥＩＬＱＫＬＮ（配列番号２）を有するＣ末端キャッピングモジュール（即ち、キャッピングリピート）が記載される。
Interlandi et al., 2008（前掲文献）には、アミノ酸配列ＱＤＫＦＧＫＴＰＦＤＬＡＩＲＥＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡ（配列番号３）及びＱＤＫＦＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡ（配列番号４）を有するＣ末端キャッピングモジュールが記載される。
【００４２】
例えば、配列番号１７のＮ末端キャッピングモジュールは、位置１〜３２のアミノ酸によりコードされ、配列番号１７のＣ末端キャッピングモジュールは、位置９９〜１２６のアミノ酸によりコードされる。
【００４３】
本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アミノ酸配列ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、配列番号１４又は配列番号１５の位置２４のアミノ酸残基Ｌは、場合により、Ｖ、Ｉ、又はＡにより置換され；
位置２４より他の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸が、場合により、任意のアミノ酸により交換され；及び、
ここで、配列番号１４又は配列番号１５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損している。
【００４４】
Ｎ末端キャッピングモジュール中の位置２４は、メチオニン（Ｍ）であるべきではないことが見出されている。配列、配列番号１４及び配列番号１５において、位置２４はロイシン（Ｌ）である。この位置におけるアミノ酸は、同様に、Ｖ、Ｉ、又はＡでありうる。好ましいのは、位置２４におけるＬ、又はＡによる置換である。最も好ましいのは、位置２４におけるＬである。
【００４５】
位置２４におけるメチオニンの置換の原理は、種々の他のＮ末端キャッピングモジュールに適用することができる。その結果として、本発明の被験体は、また、位置２４より他の位置において９つまでのアミノ酸の置換により、アミノ酸配列、配列番号１４及び配列番号１５とは異なる全てのそれらのＮ末端キャッピングモジュールを含む。より好ましくは、そのようなＮ末端キャッピングモジュールは、８つのアミノ酸、より好ましくは７つのアミノ酸、より好ましくは６つのアミノ酸、より好ましくは５つのアミノ酸、さらにより好ましくは４つのアミノ酸、より好ましくは３つのアミノ酸、より好ましくは２つのアミノ酸、最も好ましくは１つのアミノ酸の置換により異なる。
【００４６】
アミノ酸の置換は、２０の、ほとんどの場合、天然のアミノ酸のいずれかによりうる、好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より；より好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸によりうる。また、好ましくは、アミノ酸の置換は、同族のアミノ酸による；即ち、アミノ酸は、同様の生物物理学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸により置換される。例えば、負荷電アミノ酸Ｄを、負荷電アミノ酸Ｅにより置換してもよく、又は、疎水性アミノ酸（例えばＬなど）を、Ａ、Ｉ、又はＶにより置換してもよい。同族のアミノ酸によるアミノ酸の置換は、当業者に周知である。
【００４７】
配列番号１４又は配列番号１５の位置１のアミノ酸Ｇ及び／又は位置２のＳを、特性に対する任意の見かけ上の影響を伴わずに、Ｎ末端キャッピングモジュールから除去することができる。これらの２つのアミノ酸は、アンキリンリピートドメインを、さらなるアミノ酸及びタンパク質に接続するためのリンカーとしての役割を果たす。本発明は、また、位置１のＧ及び／又は位置２のＳが除去されている、そのようなＮ末端キャッピングモジュールを含む。したがって、本明細書に定義する「位置２４」に適応すると、１つのアミノ酸が欠損している場合には位置２３を、又は、２つのアミノ酸が欠損している場合には位置２２をそれぞれもたらすことが理解される。
【００４８】
Ｎ末端キャッピングモジュール中の位置２４のメチオニンの置換は、Ｎ末端キャッピングモジュール（配列番号１４又は配列番号１５の位置２４に対応するそのＮ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡの代わりにＭであるという例外を有する）を含む同一のアミノ酸配列を有するアンキリンリピートドメインと比較した場合、ＰＢＳ中でのより高い熱的安定性、即ち、より高いＴｍ値を、アンキリンリピートドメインに付与する。アンキリンリピートドメイン（位置２４のＭに対して位置２４のＬ、Ｖ、Ｉ、又はＡ）及び結合タンパク質のそのようなペアの例ならびにそれらのＴｍ値を、実施例に記載し、図に示す。好ましいのは、Ｎ末端キャッピングモジュールであって、ここで、別のアミノ酸による、位置２４のＭの交換が、そのようなＮ末端キャッピングモジュールを保有するアンキリンリピートドメインにおいて、少なくとも１℃、好ましくは少なくとも２℃、より好ましくは少なくとも３℃、又は最も好ましくは少なくとも４℃だけＴｍの増加に導く。
【００４９】
タンパク質の、特にアンキリンリピートドメインの熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて解析した（Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221, 2007）。それにより、タンパク質がアンフォールディングする温度を、タンパク質の疎水性部分（タンパク質がアンフォールディングする時に露出される）に対して親和性を有する色素の蛍光における増加により測定する。次に、それにより得られた蛍光遷移の中間点（より低い蛍光強度からより高い蛍光強度まで）での温度は、解析したタンパク質の中間点変性温度（Ｔｍ）に対応する。あるいは、タンパク質の熱的安定性を、ＣＤ分光法により、即ち、その熱変性、続く当業者に周知の技術による２２２nmでのその円偏光二色性（ＣＤ）シグナルの測定により解析した。
【００５０】
一実施態様において、位置２４より他の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸を、場合により、他のアミノ酸により交換し、好ましくは、配列番号１４又は配列番号１５の位置２６のアミノ酸残基Ａを、Ｈ、Ｙ、Ｋ、又はＲにより置換する。より好ましくは、しかし、位置２６のアミノ酸残基Ａは置換しない。
【００５１】
さらなる実施態様において、位置２４より他の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸を、場合により、他のアミノ酸により交換し、好ましくは、配列番号１４又は配列番号１５の位置２１のアミノ酸残基Ｒを、Ｅにより置換する。より好ましくは、しかし、位置２６のアミノ酸残基Ｒは置換しない。
【００５２】
さらなる実施態様において、位置２４より他の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸を、場合により、他のアミノ酸により交換し、好ましくは、配列番号１４の位置２２のアミノ酸残基Ｉ又は配列番号１５の位置２２のアミノ酸残基Ｅを、Ｖにより置換する。より好ましくは、しかし、位置２２のアミノ酸残基Ｉ又はＥは、それぞれ、置換しない；例えば、図２に示す化合物のペアを参照のこと。
【００５３】
さらなる実施態様において、位置２４より他の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸を、場合により、他のアミノ酸により交換し、好ましくは、配列番号１４又は配列番号１５の位置２５のアミノ酸残基Ｋを、Ａ又はＥにより置換する。より好ましくは、しかし、位置２５のアミノ酸残基Ｋは置換しない、又は、図１に示す化合物のペアにより実証される通り、Ａにより置換される。
【００５４】
さらなる実施態様において、位置２４より他の位置における配列番号１４又は配列番号１５の９つまでのアミノ酸を、場合により、他のアミノ酸により交換し、好ましくは、配列番号１４の位置２１〜２６のアミノ酸残基ＲＩＬＬＫＡ又は配列番号１５の位置２１〜２６のアミノ酸残基ＲＥＬＬＫＡは置換しない。
【００５５】
さらに好ましいＮ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフＧＳＸ１ＬＸ２ＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  Ｘ３Ｘ４ＬＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号５）を含み、ここで、配列番号５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；
Ｘ１はアミノ酸残基Ｇ、Ａ、又はＤ；好ましくは、Ａ又はＤを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ｇ又はＤを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ｒ又はＥを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ、Ｅ、又はＶ；好ましくは、Ｉ又はＥを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡ；好ましくは、Ｌ又はＡを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ａ、Ｋ、又はＥ；好ましくは、Ａ又はＫを表し；及び、
Ｘ７は、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基；好ましくは、Ａ又はＨを表す。
【００５６】
別の実施態様において、Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列Ｘ１ＬＸ２ＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＸ３ＡＸ４ＧＡＤＶＮＡ（配列番号１３）を含み、
ここで、Ｘ１はアミノ酸残基Ｇ、Ａ、又はＤを表し；
ここで、Ｘ２はアミノ酸残基Ｇ又はＤを表し；
ここで、Ｘ３はアミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡ；好ましくは、Ｌを表し；及び、
ここで、Ｘ４はアミノ酸残基Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表す。
【００５７】
最も好ましいのは、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、前記アンキリンリピートドメインが、アミノ酸配列ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、配列番号１４及び配列番号１５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損している。
【００５８】
別の実施態様において、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１４）又はＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥ  ＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶ  ＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶ  ＮＡ（配列番号１５）と少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール（前記Ｎ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列中の位置２４におけるアミノ酸残基が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡであるという条件を有する）；ならびに、位置１及び／又は２におけるアミノ酸が欠損している、そのようなＮ末端キャッピング分子を含む。
【００５９】
好ましくは、対応するＮ末端キャッピングモジュールは、配列番号１４又は配列番号１５と少なくとも７５%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは８０%のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは８５%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは９０%のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは９５%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を、常に、前記Ｎ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列における位置２４のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡ、より好ましくはＬ又はＡ、最も好ましくはＬである条件下で有する。
【００６０】
特定の実施態様において、Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号１４又は配列番号１５と、示すパーセントのアミノ酸配列同一性、ならびに、位置２６のアミノ酸残基Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、又はＲ、ならびに／あるいは、位置２１のアミノ酸残基Ｒ又はＥを、常に、前記Ｎ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列における位置２４のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、又はＡである条件下で有する。
【００６１】
さらに好ましいのは、Ｎ末端キャッピングリピートを含む任意のそのようなＮ末端キャッピングモジュールであって、ここで、前記キャッピングリピート中のアミノ酸残基の１つ又は複数が、対応するキャッピング単位又はリピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により置換される。
【００６２】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む本発明の結合タンパク質であって、ここで、前記アンキリンリピートドメインが、本明細書に定義するＮ末端キャッピングモジュールを含み、前記アンキリンリピートドメインが、さらに、以下の好ましいＣ末端キャッピングモジュールの１つを含みうる。好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフＸ１ＤＫＸ２ＧＫＴＸ３Ｘ４Ｄ  Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８ＧＸ９ＥＤＸ１０  ＡＥＸ１１ＬＱＫＡＡ（配列番号６）を含み、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦ；好ましくは、Ｓ又はＦを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ａ又はＦを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
Ｘ７はアミノ酸残基Ｉ又はＡを表し；
Ｘ８はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表し；
Ｘ９はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
Ｘ１０はアミノ酸残基Ｌ又はＩを表し；
Ｘ１１はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表し；
Ｘ４がＦを表し、Ｘ７がＩを表し、Ｘ８がＮ又はＥが表す場合、Ｘ２はＦを表さない。
【００６３】
さらなる好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフＸ１ＤＫＸ２ＧＫＴＸ３ＡＤ  Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＸ７ＧＸ８ＥＤＸ９  ＡＥＸ１０ＬＱＫＡＡ（配列番号７）を含み、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦ；好ましくは、Ｓ又はＦを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ｉ又はＡを表し；
Ｘ７はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表し；
Ｘ８はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
Ｘ９はアミノ酸残基Ｌ又はＩを表し；及び、
Ｘ１０はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表す。
【００６４】
さらなる好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフＸ１ＤＫＸ２ＧＫＴＸ３ＡＤ  Ｘ４Ｘ５ＡＤＸ６ＧＸ７ＥＤＸ８  ＡＥＸ９ＬＱＫＡＡ（配列番号８）を含み、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦ；好ましくは、Ｓ又はＦを表し；
Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
Ｘ５はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
Ｘ６はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表し；
Ｘ７はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
Ｘ８はアミノ酸残基Ｌ又はＩを表し；及び、
Ｘ９はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表す。
【００６５】
好ましくは、配列番号６、７、又は８の配列モチーフを含む、そのようなＣ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸残基Ａ、Ｉ、又はＫ；好ましくは、Ｉ又はＫを；前記配列モチーフの位置３に対応する位置に有する。
【００６６】
また、好ましくは、配列番号６、７、又は８の配列モチーフを含む、そのようなＣ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸残基Ｒ又はＤを、前記配列モチーフの位置１４に対応する位置に有する。
【００６７】
好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列ＱＤＫＳＧＫＴＰＡＤＬＡＡＤＡＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡ（配列番号９）を有するＣ末端キャッピングモジュールである。
【００６８】
本発明は、さらに、少なくとも１つのアンキリンリピートドメイン含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、上に定義する、アミノ酸配列、配列番号６、７、又は８を有するＣ末端キャッピングモジュールを含む。
【００６９】
本発明のアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール（即ち、配列番号１４のＮ末端キャッピングリピート）、それに続く、１つ又は複数のリピートモジュール（即ち、配列番号１７の位置３３〜９８までのアミノ酸残基を含むリピートモジュール）、及びＣ末端キャッピングモジュール（即ち、配列番号９のＣ末端キャッピングリピート）を、遺伝子合成の手段により組み立てることにより遺伝的に構築することができる。遺伝的に組み立てられたリピートドメイン遺伝子を、次に、上に記載する通りに、大腸菌において発現させることができる。
【００７０】
さらに好ましいのは、結合タンパク質、リピートドメイン、アミノ酸Ｃ、Ｍ、又はＮを欠くアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングモジュールである。
【００７１】
さらに好ましいのは、結合タンパク質、リピートドメイン、アミノ酸Ｎ、それに続くＧを欠くアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングモジュールである。
【００７２】
さらに好ましいのは、非天然キャッピングモジュール、リピートモジュール、結合タンパク質、又は結合ドメインである。
【００７３】
用語「非天然」は、合成であること又は天然からではないことを意味し、より具体的には、この用語は、ヒトの手で作られたことを意味する。用語「非天然結合タンパク質」又は「非天然結合ドメイン」は、前記結合タンパク質又は前記結合ドメインが、合成（即ち、アミノ酸からの化学的合成により産生される）又は組換えであり、天然からではないことを意味する。「非天然結合タンパク質」又は「非天然結合ドメイン」は、それぞれヒトが作ったタンパク質又はドメインであり、対応する設計核酸の発現により得られる。好ましくは、この発現は、真核細胞もしくは細菌細胞中で、又は、無細胞インビトロ発現系を使用することにより行われる。さらに、この用語は、前記結合タンパク質又は前記結合ドメインの配列が、配列データベース中、例えば、GenBank、EMBL-Bank、又はSwiss-Prot中の非人工配列エントリーとして存在しないことを意味する。これらのデータベース及び他の類似の配列データベースは、当業者に周知である。
【００７４】
用語「ＰＢＳ」は、１３７mM  ＮａＣｌ、１０mMリン酸、及び２．７mM  ＫＣｌを含み、ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝水溶液を意味する。
【００７５】
１つの特定の実施態様において、本発明は、本発明に従ったＮ末端キャッピングモジュールを含むアンキリンリピートドメインを含み、生物活性化合物を含む結合タンパク質に関する。
【００７６】
用語「生物活性化合物」は、前記疾患を有する哺乳動物に適用された場合に、疾患修飾性である化合物を指す。生物活性化合物は、アンタゴニスト特性又はアゴニスト特性を有しうるが、タンパク質性の生物活性化合物又は非タンパク質性の生物活性化合物でありうる。
【００７７】
そのようなタンパク質性の生物活性化合物は、例えば、本発明のアンキリンリピートに、標準的なＤＮＡクローニング技術、それに続く、それらの標準的な発現及び精製を使用した遺伝子融合ポリペプチドの生成により、共有結合的に付着させることができる。
【００７８】
そのような非タンパク質性の生物活性化合物を、例えば、本発明のアンキリンリピートドメインに、化学的手段により、例えば、マレイミドリンカーを介したシステインチオールへの結合により、共有結合的に付着することができ、システインは、本明細書に記載する通りに、ペプチドリンカーを介して、結合ドメインのＮ又はＣ末端に結合されている。
【００７９】
タンパク質性の生物活性化合物の例は、異なる標的特異性を有する（例、それに結合することにより成長因子を中和する）結合ドメイン、サイトカイン（例、インターロイキン）、成長因子（例、ヒト成長ホルモン）、抗体及びそれらのフラグメント、ホルモン（例、ＧＬＰ−１）、及び任意の可能なタンパク質性薬物である。
【００８０】
非タンパク質性の生物活性化合物の例は、毒素（例、ImmunoGenからのＤＭ１）、ＧＰＣＲを標的とする小分子、抗生物質、及び任意の可能な非タンパク質性薬物である。
【００８１】
別の好ましい実施態様は、結合ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、ここで、前記結合ドメインは、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインである。そのようなアンキリンリピートドメインは、標的への結合に関与する１つ、２つ、３つ、又それ以上の内部リピートモジュールを含みうる。そのようなアンキリンリピートドメインは、本発明により定義するＮ末端キャッピングモジュール、２〜４の内部リピートモジュール、及びＣ末端キャッピングモジュールを含む。好ましくは、前記結合ドメインは、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインである。
【００８２】
好ましいのは、上に定義する結合タンパク質であって、ここで、前記アンキリンリピートドメイン又は前記設計アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフＸ１ＤＸ２Ｘ３ＧＸ４ＴＰＬＨＬＡＡＸ５Ｘ６ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ７ＧＡＤＶＮＡ（配列番号１０）を有するリピートモジュールを含み、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及びＸ７は、互いに非依存的に、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；好ましくは、
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、及びＫ；より好ましくは、Ｋ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；及び、
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｈ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基；より好ましくは、Ｙ又はＨを表す。
【００８３】
さらなる実施態様において、本明細書に記載する結合タンパク質又はドメインのいずれかを、１つ又は複数の追加の部分、例えば、異なる標的に結合し、二重特異的結合薬剤を作る部分、生物活性化合物、標識部分（例、蛍光標識、例えばフルオレセイン、又は放射活性トレーサーなど）、タンパク質精製を促進する部分（例、小ペプチドタグ、例えばＨｉｓタグ又はｓｔｒｅｐタグなど）、改善された治療的効力のためにエフェクター機能を提供する部分（例、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性を提供する抗体のＦｃ部分、毒性タンパク質部分、例えば緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ）など、又は小分子毒性薬剤、例えばメイタンシノイド又はＤＮＡアルキル化薬剤など）、又は改善された薬物動態を提供する部分などに共有結合的に結合させてもよい。改善された薬物動態は、認知された治療的な必要性に従って評価されうる。しばしば、恐らくは、タンパク質が、投与後に、血清中で利用可能なままである時間を増加させることにより、バイオアベイラビリティを増加させること及び／又は投与間の時間を増加させることが望ましい。一部の例において、経時的なタンパク質の血清濃度の連続性を改善させる（例、投与後短時間での濃度と次の投与前短時間での濃度の間のタンパク質の血清濃度における差を減少させる）ことが望ましい。
【００８４】
さらなる実施態様において、本発明は、特定の結合タンパク質、特定のアンキリンリピートドメイン、及び特定のＮ末端キャッピングモジュールをコードする核酸分子に関する。さらに、前記核酸分子を含むベクターを考える。
【００８５】
さらに、上で言及したアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質、又は特定の結合タンパク質をコードする核酸分子の１つ又は複数、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む医薬的組成物を考える。医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤は、当業者に公知であり、下でより詳細に説明する。さらに、上で言及した結合タンパク質、特に、アンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質の１つ又は複数を含む診断用組成物を考える。
【００８６】
医薬的組成物は、上に記載する結合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤を含む（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980]に記載される通り）。当業者に公知の適した担体、賦形剤、又は安定剤は、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の５%デキストロース、等張性及び化学的安定性を増強させる物質、緩衝液、ならびに保存剤である。他の適した担体は、それ自体が、組成物（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、及びアミノ酸共重合体など）を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体を含む。医薬的組成物は、また、追加の活性薬剤（例えば抗癌剤又は抗血管形成剤など）を含む組み合わせ製剤でありうる。
【００８７】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌又は滅菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通したろ過により容易に達成される。
【００８８】
医薬的組成物は、当業者の知識内の任意の適した方法により投与されうる。好ましい投与の経路は、非経口的である。非経口投与において、本発明の医薬は、上に定義する医薬的に許容可能な賦形剤との関連において、単位投与量の注射可能な形態（例えば、溶液、懸濁液、又は乳濁液など）において製剤化される。投与量及び投与の様式は、処置される個人及び特定の疾患に依存する。一般的に、医薬的組成物は、本発明の結合タンパク質が、１μg/kg〜２０mg/kgの間、より好ましくは１０μg/kg〜５mg/kgの間、最も好ましくは０．１〜２mg/kgの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、それはボーラス用量として与えられる。連続注入も使用してもよく、浸透圧ミニポンプを介した連続的な皮下送達を含む。そのような場合、医薬的組成物は、５〜２０μg/kg/分の間、より好ましくは７〜１５μg/kg/分の間の用量で注入されうる。
【００８９】
さらに、上で言及する医薬的組成物のいずれかが、障害の処置のために考えられる。本発明は、さらに、処置の方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、本発明の結合タンパク質の治療的に効果的な量を投与することを含む。
【００９０】
さらに、それを必要とする患者に、上で言及する医薬的組成物の効果的な量を投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物において病理学的状態を処置する方法が考えられる。
【００９１】
本発明に従った結合タンパク質は、いくつかの方法、例えばバクテリオファージ（WO 1990/002809、WO 2007/006665）又は細菌細胞（WO 1993/010214）の表面上でのディスプレイ、リボソームディスプレイ（WO 1998/048008）、プラスミド上でのディスプレイ（WO 1993/008278）、又は共有結合的ＲＮＡリピートタンパク質ハイブリッド構築物を使用することにより（WO 2000/032823）、又は細胞内発現及び選択／スクリーニング、例えばタンパク質相補性アッセイ（WO 1998/341120）などにより得られうる及び／又はさらに進化されうる。そのような方法は、当業者に公知である。
【００９２】
本発明に従った結合タンパク質の選択／スクリーニングのために使用されるアンキリンリピートタンパク質のライブラリーは、当業者に公知のプロトコールに従って得てもよい（WO 2002/020565, Binz, H.K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003、及びBinz et al., 2004、前掲文献）。本発明のリピートドメインは、本発明に従ったリピートモジュール及び適切なキャッピングモジュール又はキャッピングリピート（Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003）から、標準的な組換えＤＮＡ技術（例、WO 2002/020565, Binz et al., 2003、前掲文献、及びBinz et al., 2004、前掲文献）を使用して、モジュール組み立てされうる。
【００９３】
本発明は、実施例に記載される特定の実施態様に制限されない。他の供給源を、下に記載する概要に従って使用及び加工してよい。
【００９４】
実施例
下に開示する出発材料及び試薬の全てが、当業者に公知であり、商業的に利用可能である、又は、周知の技術を使用して調製することができる。
【００９５】
材料
化学薬品はFluka（Switzerland）から購入した。オリゴヌクレオチドはMicrosynth（Switzerland）からであった。特記なき場合、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、New England Biolabs（ＵＳＡ）又はFermentas（Lithuania）からであった。クローニング及びタンパク質産生株は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Stratagene、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Novagen、ＵＳＡ）であった。
【００９６】
分子生物学
特記なき場合、方法は、記載されるプロトコールに従って実施する（Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory 1989, New York）。
【００９７】
実施例において使用されるＤＡＲＰｉｎ
ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号１７）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃１８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号１８）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号１９）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２０）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２１）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２２）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２３）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２４）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２５）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２６）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２７）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２８）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２９）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号３０）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号３１）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号３２）。
【００９８】
設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリー
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーが記載されている（WO 2002/020565; Binz et al. 2003、前掲文献；Binz et al. 2004、前掲文献）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ中の桁は、Ｎ末端とＣ末端キャッピングモジュールの間に存在する無作為化リピートモジュールの数を記載する。リピート単位及びモジュール内部の位置を定義するために使用される命名法は、Binz et al. 2004、前掲文献に基づき、アンキリンリピートモジュール及びアンキリンリピート単位の境界が、１つのアミノ酸位置だけシフトしているという改変を有する。例えば、Binz et al. 2004（前掲文献）のアンキリンリピートモジュールの位置１は、本開示のアンキリンリピートモジュールの位置２に対応する。結果的に、Binz et al. 2004（前掲文献）のアンキリンリピートモジュールの位置３３は、以下の本開示のアンキリンリピートモジュールの位置１に対応する。
【００９９】
全てのＤＮＡ配列をシークエンシングにより確認し、全ての記載されたタンパク質の算出された分子量を質量分析により確認した。
【０１００】
実施例１：ＤＡＲＰｉｎの構築、発現、及び精製
所定のアミノ酸配列を有するＤＡＲＰｉｎは、対応する逆翻訳された核酸配列の遺伝子合成、発現系（例、大腸菌発現系）の適切な発現ベクター中へのサブクローニング、タンパク質の発現及び精製により産生することができる。そのような方法は、当業者に公知である。
【０１０１】
キャッピングモジュール／リピートの交換
アンキリンリピートドメインのＮ又はＣ末端キャッピングリピートを、本発明のＮ又はＣ末端キャッピングリピートにより、当業者に公知の技術（例えばアミノ酸配列のアラインメント、変異誘発、及び遺伝子合成など）を組み合わせることにより、それぞれ交換することができる。
【０１０２】
例えば、配列番号１７のＮ末端キャッピングリピートを、配列番号１４のＮ末端キャッピングリピートにより、置換することができる：（ｉ）配列番号１４を有する配列アラインメントによる、配列番号１７のＮ末端キャッピングリピート（即ち、配列位置１〜３２）の決定、（ｉｉ）配列番号１７の決定されたＣ末端キャッピングリピートの配列を、配列番号１４の配列を用いて置換し、配列番号１８をもたらすこと（ｉｉｉ）交換されたＣ末端キャッピングリピートをコードするリピートドメインをコードする遺伝子（即ち、配列番号１８）の生成、（ｉｖ）大腸菌の細胞質中での改変リピートドメインの発現、及び（ｖ）標準的な手段による改変リピートドメインの精製による。
【０１０３】
さらなる例として、配列番号１７のＣ末端キャッピングリピートを、配列番号９のＣ末端キャッピングリピートにより、置換することができる：（ｉ）配列番号９を有する配列アラインメントによる、配列番号１７のＣ末端キャッピングリピート（即ち、配列位置９９〜１２６）の決定、（ｉｉ）配列番号１７の決定されたＣ末端キャッピングリピートの配列を、配列番号９の配列を用いて置換すること、（ｉｉｉ）交換されたＣ末端キャッピングモジュールをコードするリピートドメインをコードする遺伝子の生成、（ｉｖ）大腸菌の細胞質中での改変リピートドメインの発現、及び（ｖ）標準的な手段による改変リピートドメインの精製による。
【０１０４】
ＤＡＲＰｉｎの高レベル及び可溶性発現
ＤＡＲＰｉｎを、大腸菌ＢＬ２１又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中で発現させ、標準的プロトコールを使用し、それらのＨｉｓタグを使用して精製した。２５mlの一晩静置培養物（ＬＢ、１%グルコース、１００mg/Lアンピシリン；３７°Ｃ）を使用し、１Lの培養物（同じ培地）に接種した。６００nmでの吸光度約１で、培養物を、０．５mM  ＩＰＴＧを用いて誘導し、３７℃で４時間にわたりインキュベートした。培養物を遠心し、結果として得られたペレットを、４０mlのＴＢＳ５００（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、超音波処理した。ライセートを再遠心し、グリセロール（１０%（ｖ／ｖ）最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭ最終濃度）を、結果として得られた上清に加えた。タンパク質を、製造業者（QIAgen、Germany）の指示に従い、Ｎｉニトリロ三酢酸カラム（２．５mlカラム容積）上で精製した。あるいは、６ｘＨｉｓタグを欠くＤＡＲＰｉｎ又はアンキリンリピートドメインを、陰イオン交換クロマトグラフィー、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより、標準的な樹脂及び当業者に公知のプロトコールに従って精製した。ＳＤＳ−１５%  ＰＡＧＥから推定して、純度＞９５%を有する高度に可溶性のＤＡＲＰｉｎの２００mgまでを、１リットルの大腸菌培養物から精製することができる。そのような精製ＤＡＲＰｉｎを、さらなる特徴付けのために使用する。
【０１０５】
実施例２：改善されたＮ末端キャッピングモジュールを有するＤＡＲＰｉｎのより高い熱的安定性
精製ＤＡＲＰｉｎ（実施例１に従う）の熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて解析した（Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221, 2007）。それにより、タンパク質（即ち、そのようなＤＡＲＰｉｎ）がアンフォールディングする温度を、タンパク質の疎水性部分（タンパク質がアンフォールディングする時に露出される）に対して親和性を有する色素（例、SYPROオレンジ；Invitrogen、カタログ番号Ｓ６６５０）の蛍光における増加により測定する。次に、それにより得られた蛍光遷移の中間点（より低い蛍光強度からより高い蛍光強度まで）での温度は、解析したタンパク質の中間点変性温度（Ｔｍ）に対応する。あるいは、そのような精製ＤＡＲＰｉｎの熱的安定性を、ＣＤ分光法により、即ち、その熱変性、続く当業者に周知の技術による２２２nmでのその円偏光二色性（ＣＤ）シグナルの測定により解析した。
【０１０６】
蛍光ベースの熱的安定性アッセイ
ＳＹＰＲＯオレンジを蛍光色素として使用したＤＡＲＰｉｎの熱変性を、リアルタイムＰＣＲ機器（即ち、CFX96光学システム（BioRad）との組み合わせにおけるＣ１０００サーマルサイクラー（BioRad））を使用して測定した。ＤＡＲＰｉｎを、５０μM濃度で、１×SYPRO Orange（５,０００×SYPRO Orange原液、Invitrogenから希釈）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）又はＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）（２５０mM（２−Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ｐＨ  ５．５）、１５０mM  ＮａＣｌを、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）と１対４（ｖ／ｖ）で混合し、ｐＨを５．８に調整した）のいずれかにおいて調製し、５０μlのそのようなタンパク質溶液又は緩衝液だけを、白色９６ウェルＰＣＲプレート（Bio-Rad）中に加えた。プレートを、Microseal 'B' Adhesive Seals（Bio-Rad）を用いてシールし、リアルタイムＰＣＲ機器において２０℃から９５℃まで、０．５℃の増加（各々の温度増加後の２５秒の保持段階を含む）で加熱した。ＤＡＲＰｉｎの熱変性の後に、各々の温度増加でのサンプルの相対蛍光単位を測定した。プレートのウェル中の相対蛍光単位を、リアルタイムＰＣＲ機器のチャネル２（即ち、励起は５１５〜５３５nmであり、検出は５６０〜５８０nmであった）を使用して測定した。緩衝液だけについて得られた、対応する値を減算した。それにより得られた熱的変性転移の中間点から、解析されたＤＡＲＰｉｎについてのＴｍ値を決定することができる。
【０１０７】
ＣＤ分光法ベースの熱的安定性アッセイ
ＤＡＲＰｉｎのＣＤシグナルを、１℃又は２℃／分の温度勾配を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で濃度０．０２mMのタンパク質を２０℃から９５℃までゆっくり加熱しながら、Jasco J-715機器（Jasco, Japan）において２２２nmで記録した。これは、ＤＡＲＰｉｎの変性を追跡するための効果的な手段である。なぜなら、それらは、主に、アンフォールディング時に、２２２nmでのそれらのＣＤシグナルにおける強い変化を示すアルファヘリックスからなるからである。ＤＡＲＰｉｎについてのそのような測定されたＣＤシグナルトレースの観察された転移の中間点は、そのＴｍ値に対応する。
【０１０８】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＤＡＲＰｉｎの熱変性、それに続く、SYPRO Orangeの蛍光強度における増加、又は、それに続く、ＣＤ分光法の結果を、図及び表１に示す。
【０１０９】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７の熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１８の熱的安定性と比較した（表１、図１）。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＮ末端キャッピングモジュール中の単一アミノ酸を除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃１８（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＮ末端キャッピングモジュールを含み；即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１８のＮ末端キャッピングモジュールは、そのＮ末端キャッピングモジュールの位置２４にロイシン（Ｌ）残基を含むのに対し、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１７は、この位置にメチオニン（Ｍ）を含む。驚くべきことに、単一アミノ酸のこの変化は、約６．５℃の  Ｔｍ値の増加をもたらした。
【０１１０】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９の熱的安定性を、蛍光ベースの及びＣＤベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２０の熱的安定性と比較した（表１、図２）。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＮ末端キャッピングモジュール中の単一アミノ酸を除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２０（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＮ末端キャッピングモジュールを含み；即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２０のＮ末端キャッピングモジュールは、そのＮ末端キャッピングモジュールの位置２４にＬ残基を含むのに対し、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１９は、この位置にＭを含む。驚くべきことに、単一アミノ酸のこの変化は、約２．５℃のＴｍ値の増加をもたらした。このように、既に非常に安定したＤＡＲＰｉｎの熱的安定性は、本発明の改善されたＮ末端キャッピングモジュールを適用することにより、さらに増加されることができた。
【０１１１】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１の熱的安定性を、ＣＤベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３の熱的安定性と比較した（表１、図３）。これらの３つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＮ末端キャッピングモジュール中の２又は３のアミノ酸を除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＮ末端キャッピングモジュールを含み；  即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３のＮ末端キャッピングモジュールは、位置２４にＬ残基（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１が、この位置にＭを含むのに対し）及び位置２６にＡ残基を含み（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１が、この位置にＮを含むのに対し）；  また、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２３のＮ末端キャッピングモジュールは、位置２５にＫ残基を含む（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２２が、この位置にＡを含むのに対し）。このように、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２３は、本明細書に記載される通り、位置２１〜２６までにアミノ酸配列ＲＩＬＬＫＡ（配列番号１１）を含む、改善されたＮ末端キャッピングモジュールを含む。驚くべきことに、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３のＮ末端キャッピングモジュールにおけるこれらの小さな変化は、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１と比較して、それぞれ約８．５℃又は７℃のＴｍ値の増加をもたらした。さらに、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２３は、ほとんど同一の熱的安定性を持ち、それらのアミノ酸配列は、それらのリピートドメインのＮ末端キャッピングモジュールにおける単一アミノ酸において異なる；即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２のＮ末端キャッピングモジュールは、そのＮ末端キャッピングモジュールの位置２５にＡ残基を含むのに対し、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２３は、この位置にＫを含む。このように、そのようなＮ末端キャッピングモジュールの位置２５の単一アミノ酸のこの変化は、十分に許容され、熱的安定性に対して効果を有さないように見える。
【０１１２】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４の熱的安定性を、蛍光ベースの及びＣＤベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６の熱的安定性と比較した（表１、図４）。これらの３つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＮ末端キャッピングモジュールにおける３つ又は４つのアミノ酸を除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＮ末端キャッピングモジュールを含み；即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６のＮ末端キャッピングモジュールは、位置２４にＬ残基を含み（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４が、この位置にＭを含むのに対し）、位置２５にＫ残基（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４が、この位置にＡを含むのに対し）及び位置２６にＡ残基を含み（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４が、この位置にＮを含むのに対し）；また、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２６のＮ末端キャッピングモジュールは、位置２２にＥ残基を含む（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２５が、この位置にＩを含むのに対し）。このように、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６は、本明細書に記載される通り、位置２１〜２６までにアミノ酸配列ＲＩＬＬＫＡ（配列番号１１）及びＲＥＬＬＫＡ（配列番号１２）をそれぞれ含む、改善されたＮ末端キャッピングモジュールを含む。驚くべきことに、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６のＮ末端キャッピングモジュールにおけるこれらの小さな変化は、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４と比較して、それぞれ約５℃又は６℃のＴｍ値の増加をもたらした。さらに、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２６は、ほとんど同一の熱的安定性を持ち、それらのアミノ酸配列は、それらのリピートドメインのＮ末端キャッピングモジュールにおける単一アミノ酸において異なる；即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５のＮ末端キャッピングモジュールは、そのＮ末端キャッピングモジュールの位置２２にＩ残基を含むのに対し、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２６は、この位置にＥを含む。このように、そのようなＮ末端キャッピングモジュールの位置２２の単一アミノ酸のこの変化は、十分に許容され、熱的安定性に対して有意な効果を有さないように見える。
【０１１３】
全体的に、種々のＤＡＲＰｉｎの熱的安定性は、本明細書に記載する通り、それらのＮ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列の小さな変化により、有意に改善させることができる。
【０１１４】
【表１】
2014501510.tif 000002
【０１１５】
実施例３：改善されたＣ末端キャッピングモジュールを有するＤＡＲＰｉｎのより高い熱的安定性
ＤＡＲＰｉｎの熱的安定性を、実施例２に記載する通り、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて、又はＣＤ分光法により解析した。
【０１１６】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２７）の熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２８）の熱的安定性と比較した。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールを除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２８（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２７ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＣ末端キャッピングモジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２７及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２８について決定されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＴｍ値は、それぞれ約６３℃及び約７３℃であった。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２７及びＤＡＲＰｉｎ  ＃２８について決定されたＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）中のＴｍ値は、それぞれ約５４．５℃及び約６６℃であった。
【０１１７】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号２９）の熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃３０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１６）を有する配列番号３０）の熱的安定性と比較した。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールを除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃３０（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２９ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＣ末端キャッピングモジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ  ＃２９及びＤＡＲＰｉｎ  ＃３０について決定されたＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）中のＴｍ値は、それぞれ約５１℃及び約５５℃であった。
【０１１８】
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３１（配列番号３１）の熱的安定性を、ＣＤ分光法を使用して、ＤＡＲＰｉｎ  ＃３２（配列番号３２）の熱的安定性と比較した。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールを除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ  ＃３２（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃３１ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＣ末端キャッピングモジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ  ＃３１及びＤＡＲＰｉｎ  ＃３２について決定されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＴｍ値は、それぞれ約５９．５℃及び約７３℃であった。
【図１】
2014501510.tif 000003
【図２】
2014501510.tif 000004
【図３】
2014501510.tif 000005
【図４】
2014501510.tif 000006
【配列表】
2014501510000001.app
【国際調査報告】
2014501510.tif 000007
2014501510.tif 000008
2014501510.tif 000009
2014501510.tif 000010
2014501510.tif 000011