(57)【要約】  セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、その類似株またはそれと機能的に同等な株は、細菌性病原体、特に軟腐病、例えば黒脚病によって引き起こされる植物病害に対する生物的防除剤を提供する。病原体は、ディケヤー属（Dickeya）次亜種３株を含めて、ディケヤー属（Dickeya）、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）およびラルストニア属（Ralstonia）である。寄託された株およびその変異株は、農業上または園芸上許容できる希釈剤、担体、充填材または補助剤中に処方される。寄託した株を含有する植物または植物部分、特にジャガイモ塊茎は、軟腐病または黒脚病を含まない有用な繁殖材料を提供する。
2014507939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、その類似株またはそれと機能的に同等な株。
【請求項２】
代謝的に活性である、請求項１に記載のセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株。
【請求項３】
固形製剤、例えば凍結乾燥製剤の形態である、請求項１に記載のセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株。
【請求項４】
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株、および固形もしくは液体培地、またはその画分を含む生物学的培養物。
【請求項５】
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株、および農業上または園芸上許容できる希釈剤、担体、充填材または補助剤を含む、植物病害を生物的防除するための組成物。
【請求項６】
担体が固形物、場合によって多孔質固形物である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
１つまたは複数のさらなる生物的防除剤、抗生物質、除草剤、農薬、抗真菌剤、植物生長物質、肥料、発根基質、例えば堆肥；土壌、またはバーミキュライトなどの不活性粒子基質をさらに含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、その類似株またはそれと機能的に同等な株を含む、植物の生長基質。
【請求項９】
１つまたは複数の堆肥、砂、土壌または不活性粒子材料であるまたはこれらを含有する、請求項８に記載の生長基質。
【請求項１０】
外生および／または内生セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株を含む植物、植物部分または植物組織。
【請求項１１】
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株に植物、植物部分または植物組織を曝露することを含む、植物の病害を予防または処置する方法。
【請求項１２】
貯蔵するまたは植え付ける前に植物塊茎をセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）株、その変異株、類似株または機能的に同等な株に曝露する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物の苗条または苗条部分を、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）株、その変異株、類似株または機能的に同等な株に曝露する、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物病害の予防または処置に使用する生物的防除剤としての、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株。
【請求項１５】
植物が、
（ｉ）リュウゼツラン科（Agavaceae）、ネギ科（Alliaceae）、サトイモ科（Araceae）、ヤシ科（Arecaceae）、ツルボラン科（Asphodelaceae）、ヒヤシンス科（Hyacinthaceae）、アヤメ科（Iridaceae）、バショウ科（Musaceae）、ラン科（Orchidaceae）、イネ科（Poaceae）、ショウガ科（Zingiberaceae）、パイナップル科（Bromeliaceae）、ヤマノイモ科（Dioscoreaceae）、ユリ科（Liliaceae）、タコノキ科（Pandanaceae）、スズラン科（Ruscaceae）もしくはゴクラクチョウカ科（Strelitziaceae）の単子葉植物のメンバーの種、または
（ｉｉ）セリ科（Apiaceae）、キク科（Asteraceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、サボテン科（Cactaceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、ヒルガオ科（Convolvulaceae）、ベンケイソウ科（Crassulaceae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、マメ科（Fabaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、イワタバコ科（Gesneriaceae）、ヤブコウジ科（Myrsinaceae）、ヒユ科（Amaranthaceae）、ウルシ科（Anacardiaceae）、クスノキ科（Lauraceae）、アオイ科（Malvaceae）、クワ科（Moraceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、バラ科（Rosaceae）もしくはナス科（Solanaceae）の双子葉植物のメンバーの種、
好ましくはナス属（Solanum）の植物、より好ましくはジャガイモ（Solanum tuberosum）である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
植物病害が、細菌性病害病原体によって引き起こされる、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
植物病害が軟腐病、好ましくはジャガイモ黒脚病である、請求項１４から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
細菌性病原体が、ディケヤー属（Dickeya）、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）およびラルストニア属（Ralstonia）、好ましくはディケヤー属（Dickeya）次亜種３株から選択される、請求項１４から１６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業および園芸における生物的防除の分野に関する。詳細には、本発明は細菌性植物病原体、とりわけジャガイモに軟腐病、青枯れ病または黒脚病を引き起こすペクトバクテリウム属（Pectobacterium）、ラルストニア属（Ralstonia）およびディケヤー属（Dickeya）の菌種である病原体の生物的防除に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物は非常に様々な微生物性病原体に感受性であり、そのことによって生産物の莫大な年間損失およびそれに付随する経済的な損害を世界的にもたらす。植物病害から作物を保護するために開発された方法には、抵抗性のための植物育種、栽培の実施、化学薬品の適用および生物的防除がある。
【０００３】
植物病害の生物的防除は、病原体に対して拮抗的活性を呈する１つまたは複数の生物を適用することによって病原体を抑制することとして一般に定義される。拮抗体として機能する生物は通常、生物的防除剤（ＢＣＡ）と命名される。拮抗作用の機序は、ＢＣＡの様々な生物学的特性に基づいている。これらは、抗菌性化合物の産生、病原体の細胞成分の分解を触媒する酵素の発現、空間および栄養分の競合、病原体に寄生する能力ならびに植物防御の誘導を含む。
【０００４】
化学農薬の適用は、今なお植物病害の管理の主流であり、一般に環境およびヒトの健康に対して負の副作用を呈する。加えて、植物病害は比較的速く化学農薬に対して抵抗性になる。このことが、安全で持続的な代替的防除剤である新規なＢＣＡに対する要請を増大させてきた。
【０００５】
多くの異なる拮抗体の有効性が十分に立証されているにもかかわらず、植物病原性微生物を対象として登録された産物のうち、限られた数の株しか実際に使用されていない。市販の生物防除製品において、最も一般的に使用されている拮抗剤は、真菌ではトリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ポリスポラム（Trichoderma polysporum）およびグリオクラディウム・ビレンス（Gliocladium virens）ならびに細菌ではアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）および枯草菌（Bacillus subtilis）である（Agrios G.N.、322〜328頁：Plant Pathology、5th edition、2004、Elsevier、Amsterdamを参照のこと）。それらの製品の例には、Ｆ−Ｓｔｏｐ、ＢＩＮＡＢ（登録商標）Ｔ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標）、ＧｌｉｏＧａｒｄ、Ａｇｒｏｓｉｎ８４、Ｄａｇｇｅｒ  ＧおよびＫｏｄｉａｋがある。
【０００６】
市販されているＢＣＡ産物は、広範な植物病原性微生物を防除すると報告されている。しかし特に、標的病原性生物は、ほぼ例外なく分類界の原生生物および真菌に属している。これらの中で、標的生物は、フハイカビ属（Pythium）、疫病菌属（Phytophthora）、ハイイロカビ属（Botrytis）、フザリウム属（Fusarium）、リゾクトニア属（Rhizoctonia）、アオカビ属（Penicillium）、スクレロティニア属（Sclerotinia）、アカツブタケ属（Nectria）およびウドンコ病菌（powdery mildews）の属の様々な種である。これに反して、ほんのわずかな細菌性病原体しか、生物防除製品の標的にならないことが報告されている。まれな例は、根頭癌腫病の原因となるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（例えばＡｇｒｏｓｉｎ８４により防除される）および果物の火傷病の原因となるエルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）（例えばＢｌｉｇｈｔＢａｎ（登録商標）により防除される）である。
【０００７】
細菌性植物病原体に対する現在市販されている技術は、主に化学農薬（一般に抗生物質）の適用に基づいている。
【０００８】
細菌性植物病原体を効果的に抑制する微生物性拮抗体の差し迫った必要性が、ジャガイモ軟腐病および黒脚病の問題ある管理によって例示されており、それらはペクトバクテリウム属（Pectobacterium）およびディケヤー属（Dickeya）の菌種によって引き起こされる。これらのペクチン分解性細菌は、ジャガイモ植物および塊茎、実質的には貯蔵を含めた塊茎生産の全ての段階に影響を及ぼし、（種）ジャガイモの生産に対する継続的な脅威を世界的に形成している。黒脚病および軟腐病耐性ジャガイモ栽培品種を選抜することにより、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）およびディケヤー属（Dickeya）菌種を含まない種ロットは得られなかった（LapwoodおよびHarris（1982）、Potato Research 25、41〜50、LapwoodおよびRead (1984)、Plant Pathology 33、13〜20を参照のこと)。物理的（例えば熱水処理）および化学的手順は、明らかに表面しか殺菌せず、塊茎の芽茎端で維管束系内部に位置している高密度のペクチン分解性ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）およびディケヤー属（Dickeya）菌種には影響を及ぼさない（Czajkowskiら、(2009)、European Journal of Plant Pathology 125、263〜275を参照のこと）。
【０００９】
ディケヤー属（Dickeya）およびペクトバクテリウム属（Pectobacterium）菌種によって引き起こされる黒脚病および軟腐病は、ヨーロッパにおける種ジャガイモ生産に重大な損害をもたらしている。ジャガイモ黒脚病の発生におけるディケヤー属（Dickeya）の役割は増加しているように思われる。この増加は、ディケヤー属（Dickeya）の新たな遺伝的分岐群の検出と関連しており、その菌種は、Samsonら(2005、IJSEM 55：1415〜1427）によって最近記述された６種のうちの１つに分類できなかった（Tsrorら(2008)、European Journal of Plant Pathology 123(3)：311〜320、Stawiakら、(2009)、European Journal of Plant Pathology 125(2)：245〜261を参照のこと）。この新しい分岐群はおそらく新種を構成しており、暫定的に「Ｄ．ソラニ（Ｄ．ｓｏｌａｎｉ）」と呼ばれている。その発生は、多くのヨーロッパ諸国（すなわちオランダ、フィンランド、ポーランド、ドイツ、ベルギー、フランス、イギリス、スウェーデンおよびスペイン）およびイスラエルのジャガイモで報告された。
【００１０】
ジャガイモにおいて、ディケヤー属（Dickeya）菌種およびペクトバクテリウム属（Pectobacterium）菌種を防除する可能性は限られている（Van der WolfおよびDe Boer (2007)、In: Potato biology and biotechnology, advances and perspectives、595〜617頁、Elsevier、Amsterdamを参照のこと）。防除戦略には、病原体を含まない種の使用、損傷を防ぐ手段、宿主抵抗性を弱める可能性がある塊茎の酸素欠乏を防ぐための土壌の排水、および衛生的な手段がある。しかし、これらの方法では黒脚病病原体を含まない作物の生産は保証されない。
【００１１】
現在のところ、ディケヤー属（Dickeya）およびペクトバクテリウム属（Pectobacterium）菌種の接種原を減らすためのどんな塊茎処理も実際には使用されていない。一般に、物理的な処理および化学的防除剤の使用は、塊茎表面に存在する接種原を減らすことにしか役に立たず、塊茎の発芽に影響を及ぼさずにより深く位置している接種原を除去することはできない。内部の病原体を殺すことができる浸透性殺菌剤は市販されていない。
【００１２】
生物的防除剤としての微生物の適用は、しばしば従来の物理的および化学的処理に対する環境に優しい代替案となる。
【００１３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）によって引き起こされる根頭癌腫（Lopezら(1987)、EPPO Bulletin 17：273〜279を参照のこと）およびエルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）によって引き起こされる火傷病（Stockwellら(1998)、Phytopathology 88：506〜513を参照のこと）など植物のいくつかの細菌性病害に対して細菌性拮抗体を使用する有望な防除が得られるが、畑条件の下でジャガイモ植物のペクチン分解性細菌を防除するためには、限られた研究しか行われてこなかった。生物防除剤またはそれらの混合物に基づく黒脚病および軟腐病に対する製品は、市場に導入されていない。
【００１４】
セラチア属（Serratia）は、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科のグラム陰性、条件的嫌気性、桿菌の属である。最も一般的な種は、霊菌（Serratia marcescens）である。この属のメンバーは、属に特徴的な赤色色素であるプロディジオシンを頻繁に産生する。
【００１５】
霊菌（Serratia marcescens）によって呈される細菌性植物病原体に対する拮抗的活性は、より以前に開示されている。Jafra S.ら（2009、Journal of Applied Microbiology 106：268〜277）は、球根における軟腐病の原因因子であるディケヤー・ゼアエ（Dickeya zeae）によって引き起こされる浸軟を阻害できる霊菌（Serratia marcescens）の菌株について記述している。
【００１６】
植物の真菌病原体を防除するために、別のセラチア属（Serratia）の菌株、すなわちＳ.プリムシカ（S. plymuthica）が頻繁に使用されてきた（Berg, G. (2000) Journal of Applied Microbiology 88：952〜960を参照のこと、Frankowskiら(2001) Archives of Microbiology 176：421〜426も参照のこと）。真菌植物病原体を防除するためのセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）の使用に関する包括的な論評が、De VleesschauwerおよびHoefte（2007、CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Sources 2：1〜12）により提供されている。
【００１７】
ＷＯ０１／４０４４２Ａ１は、雑草および真菌の抑制に対するセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）株およびその代謝物の使用について記述している。この株は、受け入れ番号４０９３８でＮＣＩＭＢに寄託されたＡ１５３であり、その活性代謝物はハテルマライドＡ、Ｂ、ＥおよびＸである。
【００１８】
真菌植物病原体に対するＢＣＡとしてセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）は頻繁に使用されているにもかかわらず、このセラチア属（Serratia）菌種については、細菌性植物病害に対する実質的な拮抗的活性がこれまで全く報告されていない。例えば、真菌病害の生物防除用として市販されているセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）株は、ジャガイモに軟腐病および黒脚病を引き起こすディケヤー属（Dickeya）菌種に対してごくわずかな活性を示した。潜在的な抗菌性ＢＣＡとしてこれまで記述されてきた多くのセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）株のうち、これらのいずれも植物病原性細菌に対していかなる活性も示さないと報告されてきた（De VleesschauwerおよびHoefte（2007）、CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Sources 2：1〜12）。
【発明の概要】
【００１９】
本発明者らは、Ａ３０と称されるＳ．プリムシカ（S. plymuthica）の新規な株を発見した。本発明者らは、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０がＢＣＡであることも見いだした。具体的には、そのＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、ジャガイモ植物において、黒脚病を引き起こす細菌に対するＢＣＡである。新たに発見されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、次亜種３株を含めてペクチン分解性ディケヤー属（Dickeya）に対するＢＣＡであることが見いだされた。
【００２０】
本発明者らは、ＢＣＡであるＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を用いる塊茎処理により、ジャガイモ植物が黒脚病から保護され、塊茎伝播性ディケヤー属（Dickeya）の接種原が根絶されることを見いだした。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は土壌中で生存しており、土壌伝播性の接種原からジャガイモ塊茎、根および幹にコロニー形成することも見いだされた。コロニー形成しているＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が、ジャガイモ植物の内部で持続されていることも見いだされた。
【００２１】
驚くべきことに、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が存在することにより、温室条件下でジャガイモ植物の黒脚病発生率を１００％減少させることが見いだされた。また、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が存在することにより、温室条件下でディケヤー属（Dickeya）による幹のコロニー形成が９７％減少する。
【００２２】
したがって、本発明は、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０（２０１０年１１月１９日に寄託した）、その類似株またはそれと機能的に同等な株を提供する。
【００２３】
ＢＣＣＭ  ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０の寄託者は、バーヘニンゲン大学研究センター、国際植物研究所、私書箱６９、６７００ＡＢバーヘニンゲン、オランダである。正式代表者は、同じ住所のＪａｎ  Ｍ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｏｌｆ博士である。寄託者は、出願人であるＳｔｉｃｈｔｉｎｇ  Ｄｉｅｎｓｔ  Ｌａｎｄｂｏｕｗｋｕｎｄｉｇ  ＯｎｄｅｒｚｏｅｋおよびＳｔｉｃｈｔｉｎｇ  ｖｏｏｒ  ｄｅ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎが本出願において、寄託された生物材料を参照することを承諾し、許可する。
【００２４】
機能的に同等な株とは、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、ＢＣＣＭ寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０に固有の１つまたは複数の特徴を備えている株を含む。
【００２５】
この株は、ディケヤー属（Dickeya）およびペクトバクテリウム属（Pectobacterium）菌種に対する抗生物質を産生し、Ｌ−トリプトファンの補充のある状態およびない状態でオーキシンを産生し、生物系界面活性剤を産生し、運動性であり、ペクチン分解性でなく、ｐＨ１０．０の普通ブロス中、およびジャガイモデキストロース培養液中の嫌気性条件下で増殖する。Ａ３０株は、赤色色素を産生しない。
【００２６】
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株は、この細菌がヒトの手によって一緒にされ共培養されているか、または天然に一緒に存在している細菌が天然に共に存在している他の細菌から部分的に精製されるかを問わず、同じ属または異なる属の他の細菌と共存している可能性があるが、好ましくは分離された形態である。
【００２７】
好ましい実施形態において、Ａ３０株は実質的な純粋培養物であり、純粋培養物とは培養物の複製に干渉するまたは通常の細菌学技術で検出するのに十分な量の他の細菌種を全く含有しない細菌株の培養物を意味している。
【００２８】
本明細書に記載の生物および培養物に関連して使用する場合「分離された」とは、実質的な純粋培養物だけでなく、天然に見いだされるものとは違って増殖または維持されている生物の任意の培養物も意味している。
【００２９】
本発明のS.プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株は代謝的に活性な形態であってよく、すなわち液体培地中および／または固体培地上で増殖している培養物を形成する。代謝活性は、単に細菌細胞の増殖を測定することによって決定でき、あるいは細胞膜の健全性または例えばＤＮａｓｅ、エステラーゼ、リパーゼおよび／もしくはゼラチナーゼなど特定の酵素の活性を測定することによって決定できる。他の細菌性コア代謝酵素の活性を測定して、代謝活性を評価できる。
【００３０】
別法として、本発明のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株は、固形、例えばまたは培養物の乾燥もしくは凍結乾燥製剤であってよい。この形態では、細菌細胞は実質的に代謝的に不活性であると考えられるが、水性環境中に乾燥標本を溶解させると、測定可能な細菌細胞の増殖および代謝と共に細菌細胞活性が回復する。
【００３１】
本発明のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株の変異株、類似株または機能的に同等な株は、生物の遺伝子にコードされている様に、１つまたは複数のタンパク質成分のアミノ酸配列に関して異なっている場合がある。例えば、欠失、付加または置換によってかを問わず、少なくとも１つのタンパク質に対して少なくとも単一のアミノ酸の変化が起こる可能性がある。１、２、３、４、５個またはそれ以上の単一のアミノ酸変化、例えば１、２、３、４、５個またはそれ以上の単一アミノ酸の欠失が、アミノ酸配列の長さに沿って別個に、または１か所で一緒になって起こり得る。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株の中にある複数のタンパク質を上述した方法で変化させて、変異株、類似株または機能的に同等な株を生成できる。
【００３２】
寄託されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株は、同一性パーセンテージ度で測定して、１つまたは複数のタンパク質のアミノ酸配列でその変異株、類似株または機能的に同等な株と異なっている可能性がある。変異株、類似株または機能的に同等な株は、少なくとも１つのタンパク質のアミノ酸配列で、寄託されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株と９５％の同一性、好ましくはＡ３０株と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を共有できる。変異株、類似株または機能的に同等な株中の全タンパク質のアミノ酸配列は、寄託されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株と多数のアミノ酸配列に渡って少なくとも９５％の同一性、好ましくはＡ３０株と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を共有できる。この同一性は、生物中にある実質的に全てのアミノ酸配列に渡って列挙されたパーセンテージ同一性で共有され得る。
【００３３】
本発明のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株の変異株、類似株または機能的に同等な株は、寄託されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株と比較して、そのゲノムの少なくとも一部の核酸配列に関して異なっている可能性がある。遺伝子が構造エレメントか制御エレメントかにかかわらず、１つまたは複数の遺伝子配列が異なっている可能性がある。変異株、類似株または機能的に同等な株は、寄託されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株の核酸配列と少なくとも９５％同一であることができ、好ましくはＡ３０株と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％同一であることができる。
【００３４】
パーセンテージ同一性に対する言及は、寄託された菌株とその変異株、類似株または機能的に同等な株とのパーセンテージ相同性も含み、それを指す。
【００３５】
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）によってリスクグループ１に分類されており、この種にはヒトおよび環境に対するリスクがないと期待されていることを意味している。現在まで、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）に対するヒトまたは動物関連の病原性因子は記述されていない。
【００３６】
本発明は、先に記述した、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０、またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株、および固形もしくは液体培地、またはその画分を含む生物学的培養物も提供する。
【００３７】
本発明の生物学的培養物は、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株から実質的になり、したがって他の生物で実質的に汚染されていない可能性がある。培養物は、細菌細胞の含有量という点で実質的に均質であり、すなわち少なくとも９５％がＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株であり、好ましくは、その均質性は少なくとも：９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の１つから選択される。生物学的培養物は、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株以外の他のコンピテントまたは生存可能な細菌細胞を全く含まない。
【００３８】
したがって、本発明は、実質的に分離されたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株も提供する。
【００３９】
本発明は、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株、および農業上または園芸上許容できる希釈剤、担体、充填材または補助剤を含む、植物病害を生物的防除するための組成物をさらに提供する。
【００４０】
本発明の範囲にある組成物は、当業者に公知であるように、水性懸濁剤、安定化液体懸濁剤、乳剤、カプセル剤、可溶性粉剤または水和剤、水性フロアブル剤、ドライフロアブル剤、顆粒水和剤、顆粒水和分散剤、などで処方できる。
【００４１】
農業上許容できるまたは園芸上許容できる希釈剤の例には、単糖、多糖、糖蜜、ゴム、リグノスルホン酸塩、グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコールおよび水の水溶液ならびに植物油および鉱油がある。担体には、アルギン酸ビーズ、デューラム小麦粉（デンプン）顆粒剤、シリカ、粘土、粘土鉱物（例えばアタパルジャイト、カオリナイト、モンモリロナイト、パイロフィライト、イライト）、ゼラチン、セルロース、セルロース誘導体、塩化カルシウムおよびタルク粉などの固形物があり得る。いくつかの実施形態において、担体は、多孔性固形物、例えば珪藻土、炭（例えば動物性骨炭）、泥炭、バーミキュライト、褐炭、木片およびコーンコブであってよい。
【００４２】
Ａ３０株を、肥料、土壌または葉の添加物に組み込むこともできる。他の適切な処方は、当業者にとって容易に明らかとなる。
【００４３】
好ましくは、病害に対抗して植物、植物組織または植物部分を処理する経路およびタイミングに応じて、組成物は適切な量または濃度のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株も含む。好ましくは、生物防除剤は、病原体接種原より高く適用される。
【００４４】
Ａ３０株の組成物は、機械（噴霧器）または潅漑システムによって植物に手作業で適用できる。塊茎などの植物部分は、水性もしくは液体懸濁液または固体粉末に浸けることができ、または吹き付けることができる。作物サイクルの間に、本発明の組成物を数回適用することは、病原性植物細菌によって引き起こされる病害の発生を予測することができないことを考慮すると、望ましい場合がある。可能であれば、病原体に曝露される前に本発明のＡ３０株を植物に接種することが好ましい。
【００４５】
本発明に従った適用プロトコールは、Ａ３０株の水性懸濁液に植え付ける前にジャガイモ塊茎を浸漬することからなる。Ａ３０株は、１ｍＬにつき１０６〜１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）（ｃｆｕ．ｍＬ−１）の濃度範囲にある。Ａ３０株の好ましい濃度範囲は、１０８〜１０１０ｃｆｕ．ｍＬ−１である。
【００４６】
有機および／または無機肥料をＡ３０と一緒に添加して、葉、根および土壌中にＡ３０集団を形成することを促進できる。肥料は、Ａ３０株が存在していると同時にまたは前後に添加できる。肥料は、植物および／または土壌に添加できる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、畑条件で使用する場合、濃度１０８〜１０１０ｃｆｕ．ｍＬ−１の間のＡ３０株が利用される。より好ましい実施形態において、濃度は、０．５〜９．５×１０９ｃｆｕ．ｍＬ−１の範囲である。畑において、植付けの際に塊茎をわずか約１ｍＬの懸濁液で処理できる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、塊茎を植え付ける前に液体に浸漬することができる。好ましい実施形態において、植付けの際に塊茎に本発明のＡ３０株を含む液体組成物を噴霧する。噴霧は、モンセレンなどの殺真菌剤に関連する公知の方法で実施されてよい。好ましい実施形態において、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）は、発芽および根形成するとすぐに植物にコロニー形成することになる。
【００４９】
本発明の組成物は、１つまたは複数のさらなる成分をさらに含む場合があり、その成分は生物的防除剤、抗生物質、除草剤、農薬、殺真菌剤、植物生長物質、植物の自然防御誘導物質または肥料であってよい。１つまたは複数のさらなる成分は、同時に、別々に、または順次、植物または植物部分に投与されてよい。本発明のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株は、他のさらなる成分の前後に投与されてよい。
【００５０】
もちろん、さらなる物質、例えば農薬を本発明のＡ３０株と一緒に適用することは、それらの潜在的な抗菌活性の理由から、（バイオアッセイで事前に試験していない限り）一般に避けるべきである。農薬を使用しようとする場合、本発明のＡ３０株は、好ましくは農薬を適用した１週間後に再度適用する。
【００５１】
したがって、本発明は、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株の組成物を含有する第１の容器ならびに農業上もしくは園芸上許容できる希釈剤、担体もしくは補助剤を含有する第２の容器を含むキットオブパーツを含む。第２の容器は、生物的防除剤、抗生物質、除草剤、農薬、抗真菌剤、植物生長物質または肥料などのさらなる成分を含むこともできる。
【００５２】
別法として、第２の容器は農業上または園芸上許容できる希釈剤、担体または補助剤を含有し、さらに他の容器が生物的防除剤、抗生物質、除草剤、農薬、抗真菌剤、植物生長物質または肥料などのさらなる成分を含有する。
【００５３】
本発明のキットは、印刷または電子形態で記述された説明書を含むこともできる。
【００５４】
他の生物的防除剤は、真菌、例えばトリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ポリスポラム（Trichoderma polysporum）およびグリオクラディウム・ビレンス（Gliocladium virens）、ならびに／もしくは細菌、例えばアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）および枯草菌（Bacillus subtilis）などの微生物、ならびにまたはバクテリオファージを含むことができる。
【００５５】
追加的な組成物成分として、抗生物質は、例えばストレプトマイシンまたはアクチノマイシンを含むことができる。
【００５６】
追加的な組成物成分として、除草剤は、ジメテナミド、ＥＰＴＣ、グリホスフェート、パラコート、ペンディメタリン、セトキシジム、リムスルフロン、メトラクロールまたはメトリブジンを含むことができる。
【００５７】
追加的な組成物成分として、農薬は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、クロロプロファム、ＤＤＴ、ＤＤＥ、ディルドリン、エンドサルファン、チアベンダゾール、ｃ−フェニルフェノールおよびホレートを含むことができる。
【００５８】
追加的な組成物成分として、抗真菌剤は、メタラキシルおよび／またはカルバメート化合物、シモキサニルならびにマンコゼブを含むことができる。特に、シモキサニルとマンコゼブの相乗的組合せは有用である。
【００５９】
組成物の追加的な成分として、植物生長物質は、オーキシンまたはアブシジン酸（ＡＢＡ）を含むことができる。オーキシンは、１つまたは複数の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、α-ナフタレン酢酸（α-ＮＡＡ）、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸（ジカンバ）、４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸（ｔｏｒｄｏｎまたはピクロラム）またはα−（ｐ−クロロフェノキシ）イソ酪酸（ＰＣＩＢ、抗オーキシン剤）であってよい。
【００６０】
本発明の組成物は、発根基質、例えば堆肥、（天然のまたは人工的な）土壌、砂、および／またはバーミキュライトなど不活性粒子の発根培地をさらに含むことができる。
【００６１】
本発明の組成物を用いて処理した植物、植物組織または植物部分は、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株に外生的および／または内生的に感染する。最適な感染を達成するには２回以上の処理を必要とする場合があるが、１回の処理しか必要でない場合がある。どんな具体的な理論に束縛されるものでもないが、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株の内生および／または外生感染により、存在している可能性もある他のどんな細菌種、特にペクトバクテリウム属（Pectobacterium）および／またはディケヤー属（Dickeya）の増殖も予防されると、本発明者らは考えている。本発明者らは、Ａ３０株が直接の顕在的悪影響を引き起こさずに、植物の生きている内部組織にコロニー形成する微生物である内部寄生菌であることを見いだした。
【００６２】
他の細菌種が植物、植物部分または組織にすでに感染している状況において、本発明の組成物で処理することにより、感染したＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０および／またはその変異株、類似株もしくはそれと機能的に同等な株に、元々の細菌種を最終的に駆逐させることができる。それゆえ、本発明の組成物を使用して、植物の病害、例えば軟腐病または黒脚病を予防または処置できる。
【００６３】
したがって、本発明は、外生および／または内生セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株を含む植物、植物部分または植物組織も含む。本発明のこの態様に従うそのような植物の範囲を、本発明の方法に従った処理に感受性がある植物として以下に列挙する。
【００６４】
本発明は、セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０株、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株に植物、植物部分または植物組織を曝露することを含む、植物の病害を予防または処置する方法をさらに含む。同様に、本発明のそのような方法は、植物、植物部分または組織に本明細書に記載の本発明の組成物を適用して、植物病原性細菌による感染の生物的防除を提供することを含む。Ａ３０株およびその組成物の適用方法、ならびに組成物を混合し、植物、植物部分および植物器官に適用するための装置は、標準的な当業者に周知である。これら方法の対象は、種子、苗、植物、作物、植物部分、花、果実、栄養繁殖植物部分（例えば種芋および切り枝）、土壌および植物材料の培養に使用される人工的な基質系であってよい。Ａ３０株およびその組成物の生物的防除剤株は、収穫前または収穫後に適用できる。
【００６５】
植物が塊茎、球根、球茎または地下茎を持ち、植物が本発明に従って処理される場合、好ましくは塊茎、球根、球茎または地下茎を植え付ける前に本発明の組成物を適用する。種子も、播種する前に本発明に従って処理できる。この処理は、種子を被覆する形態を取ることができ、この形態において本発明のＡ３０株は公知の種子被覆混合物に組み込まれる。被覆された種子は、ペレット形態を取ることができる。
【００６６】
代わりにまたは加えて、植物が塊茎、球根、球茎または地下茎を持っているか否かを問わず、本発明の組成物は、植物の苗条または苗条部分に適用できる。
【００６７】
したがって本発明は、植物病害の予防または処置に使用する生物的防除剤としてＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０株、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０またはその変異株、類似株もしくは機能的に同等な株を含む。
【００６８】
本発明の方法および使用は、好ましくは細菌性病害病原体によって引き起こされる植物病害、特にジャガイモの軟腐病または「黒脚病」を予防または処置するためのものである。処置または予防されるべき細菌性病原体は、好ましくはディケヤー属（Dickeya）および／またはペクトバクテリウム属（Pectobacterium）、好ましくはディケヤー属（Dickeya）次亜種３株である。
【００６９】
広範な植物が、本明細書に記載の本発明の方法および組成物の使用による細菌性病害の予防または処置に感受性である。植物は、単子葉植物または双子葉植物であってよい。
【００７０】
ディケヤー属（Dickeya）による感染に対して感受性がある単子葉植物のうち、その植物は、サトイモ科（Araceae）、ヤシ科（Arecaceae）、ツルボラン科（Asphodelaceae）、パイナップル科（Bromeliaceae）、ヒヤシンス科（Hyacinthaceae）、アヤメ科（Iridaceae）、バショウ科（Musaceae）、ラン科（Orchidaceae）、イネ科（Poaceae）またはショウガ科（Zingiberaceae）のメンバーの種であり得る。
【００７１】
ディケヤー属（Dickeya）による感染に対して感受性がある植物は、アグラオネマ属（Aglaonema）、エクメア属（Aechmea）、ディーフェンバキア属（Dieffenbachia）、フィロデンドロン属（Philodendron）、シンゴニウム属（Syngonium）、アメリカサトイモ属（Xanthosoma）、オランダカイウ属（Zantedeschia）、ナツメヤシ属（Phoenix）、アロエ属（Aloe）、アナナス属（Ananas）、アヤメ属（Iris）、バショウ属（Musa）、コチョウラン属（Phalaenopsis）、ビロードキビ属（Brachiaria）、イネ属（Oryza）、サトウキビ属（Saccharum）、モロコシ属（Sorghum）、トウモロコシ属（Zea）またはエレタリア属（Elettaria）から選択される単子葉植物の属に由来する種であり得る。好ましい種には、アグラオネマ・ピクタム（Aglaonema pictum）、エクメア・ファスキアタ（Aechmea fasciata）、ディーフェンバキア属（Dieffenbachia）、フィロデンドロン・セローム（Philodendron selloum）、シンゴニウム・ポドフィルム（Syngonium podophyllum）、クサントソマ・サギッティフォリア（Xanthosoma sagittifolia）、オランダカイウ（Zantedeschia aethiopica）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、アロエベラ（Aloe vera）、パイナップル（Ananas comosus）、ドイツアヤメ（Iris x germanica）、バナナ（Musa paradisiaca）、コチョウラン属（Phalaenopsis）、ビロードキビ属（Brachiaria）、イネ（Oryza sativa）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ソルガム（Sorghum bicolor）、トウモロコシ（Zea mays）またはカルダモン（Elettaria cardamomum）がある。
【００７２】
双子葉植物のうち、ディケヤー属（Dickeya）による感染に対して感受性がある植物は、セリ科（Apiaceae）、キク科（Asteraceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、ヒルガオ科（Convolvulaceae）、ベンケイソウ科（Crassulaceae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、マメ科（Fabaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、イワタバコ科（Gesneriaceae）、ヤブコウジ科（Myrsinaceae）またはナス科（Solanaceae）からなるメンバーの種であり得る。
【００７３】
ディケヤー（Dickeya）属による感染に対して感受性がある植物は、アラカチャ属（Arracacia）、ニンジン属（Daucus）、キク属（Chrysanthemum）、キクニガナ属（Cichorium）、チョウセンアザミ属（Cynara）、ダリア属（Dahlia）、シュウカイドウ属（Begonia）、ナデシコ属（Dianthus）、サツマイモ属（Ipomoea）、リュウキュウベンケイ属（Kalanchoe）、トウダイグサ属（Euphorbia）、ヒマワリ属（Helianthus）、ウマゴヤシ属（Medicago）、パルテニウム属（Parthenium）、テンジクアオイ属（Pelargonium）、アフリカスミレ属（Saintpaulia）、シクラメン属（Cyclamen）、ナス属（Solanum）またはタバコ属（Nicotiana）から選択される双子葉植物の属に由来する種であり得る。好ましい種には、イモゼリ（Arracacia xanthorrhiza）、ニンジン（Daucus carota）、クリサンセマム・マキシマム（Chrysanthemum maximum）、クリサンセマム・モリフォリウム（Chrysanthemum x morifolium）、チコリー（Cichorium intybus）、カルドン（Cynara cardunculus）、ダリア属（Dahlia）、ベゴニア・ベルティニー（Begonia bertinii）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、ベニベンケイ（Kalanchoe blossfeldiana）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、アルファルファ（Medicago sativa）、ローズゼラニウム（Pelargonium capitatum）、イオナンタ （Saintpaulia ionantha）、シクラメン属（Cyclamen）、トマト（Solanum lycopersicum）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス（Solanum melongena）およびジャガイモ（Solanum tuberosum）がある。
【００７４】
ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）による感染に対して感受性がある単子葉植物のうち、その植物は、リュウゼツラン科（Agavaceae）、ネギ科（Alliaceae）、サトイモ科（Araceae）、ツルボラン科（Asphodelaceae）、パイナップル科（Bromeliaceae）、ヤマノイモ科（Dioscoreaceae）、アヤメ科（Iridaceae）、ユリ科（Liliaceae）、ラン科（Orchidaceae）、タコノキ科（Pandanaceae）、スズラン科（Ruscaceae）またはゴクラクチョウカ科（Strelitziaceae）のメンバーの種であり得る。
【００７５】
ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）による感染に対して感受性がある植物は、リュウゼツラン属（Agave）、ネギ属（Allium）、ディーフェンバキア属（Dieffenbachia）、スキンダプスス属（Scindapsus）、オランダカイウ属（Zantedeschia）、アロエ属（Aloe）、ヤマノイモ属（Dioscorea）、アヤメ属（Iris）、チューリップ属（Tulipa）、カトレヤ属（Cattleya）、シュンラン属（Cymbidium）、コチョウラン属（Phalaenopsis）、タコノキ属（Pandanus）、ドラセナ属（Dracaena）、ゴクラクチョウカ属（Strelitzia）から選択される単子葉植物の属に由来する種であり得る。好ましい種には、テキラリュウゼツ（Agave tequilana）、タマネギ（Allium cepa）、ディーフェンバキア属（Dieffenbachia）、オウゴンカズラ（Scindapsus aureus）、オランダカイウ（Zantedeschia aethiopica）、キバナカイウ（Zantedeschia elliottiana）、モモイロカイウ（Zantedeschia rehmannii）、キダチアロエ（Aloe arborescens）、ヤマノイモ属（Dioscorea）、チューリップ属（Tulipa）、カトレヤ属（Cattleya）、シュンラン属（Cymbidium）、コチョウラン属（Phalaenopsis）、ブアメラ（Pandanus conoideus）、ギンヨウセンネンボク（Dracaena sanderiana）、ゴクラクチョウカ（Strelitzia reginae）がある。
【００７６】
双子葉植物のうち、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）による感染に対して感受性がある植物は、ヒユ科（Amaranthaceae）、ウルシ科（Anacardiaceae）、セリ科（Apiaceae）、キク科（Asteraceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、サボテン科（Cactaceae）、ベンケイソウ科（Crassulaceae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、クスノキ科（Lauraceae）、アオイ科（Malvaceae）、クワ科（Moraceae）、ヤブコウジ科（Myrsinaceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、バラ科（Rosaceae）またはナス科（Solanaceae）のメンバーの種であり得る。
【００７７】
ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）による感染に対して感受性がある植物は、フダンソウ属（Beta）、ホウレンソウ属（Spinacea）、マンゴー属（Mangifera）、オランダミツバ属（Apium）、アラカチャ属（Arracacia）、コエンドロ属（Coriandrum）、ニンジン属（Daucus）、ゴボウ属（Arctium）、キクニガナ属（Cichorium）、ヒマワリ属（Helianthus）、アキノノゲシ属（Lactuca）、パルテニウム属（Parthenium）、コウオウソウ属（Tagetes）、ワサビ属（Eutrema）、アブラナ属（Brassica）、ダイコン属（Raphanus）、アカントケレウス属（Acanthocereus）、カルネギア属（Carnegiea）、フェロカクタス属（Ferocactus）、オプンチア属（Opuntia）、ステノケレウス属（Stenocereus）、リュウキュウベンケイ属（Kalanchoe）から選択される双子葉植物の属に由来する種であり得る。好ましい種には、サトウダイコン（Beta vulgaris）、ホウレンソウ（Spinacea oleracea）、マンゴー（Mangifera indica）、オランダミツバ（Apium graveolens）、イモゼリ（Arracacia xanthorrhiza）、コリアンダー（Coriandrum sativum）、ニンジン（Daucus carota）、アルクチウム・ミヌス（Arctium minus）、チコリー（Cichorium intybus）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、レタス（Lactuca sativa）、グアユールゴムノキ（Parthenium argentatum）、マンジュギク（Tagetes patula）、ワサビ（Eutrema wasabi）、キャベツ（Brassica oleracea）、カブ（Brassica rapa）、ダイコン（Brassica sativus）、ハツカダイコン（Raphanus sativus）、五稜角（Acanthocereus tetragonus）、ベンケイチュウ（Carnegiea giganteum）、金赤竜（Ferocactus wislizenii）、ウチワサボテン（Opuntia ficus-indica）、鱗団扇（Opuntia fulgida）、オプンティア・フェアカンタ（Opuntia phoeacantha）、刺無団扇（Opuntia stricta）、オプンティア・ウィオラケア（Opuntia violacea）、ステノケレウス・トゥルベリ（Stenocereus thurberi）、ベニベンケイ（Kalanchoe blossfeldiana）がある。
【００７８】
好都合にも、本発明は、環境に対する毒物学的影響が低く、病原体による抵抗性の発生に対するリスクが低い生物的防除剤を提供する。Ａ３０株が植物系に定着した後、生物防除効果も比較的耐久性があり／長寿命である。
【００７９】
Ａ３０株の有効性は、比較的広く；例えば、拮抗的なバチルス属（Bacillus）菌種とは対照的に、ジャガイモ塊茎ディスク上のＡ３０株は、ディケヤー属（Dickeya）およびペクトバクテリウム属（Pectobacterium）菌種の両方に対して強い拮抗的活性を有する。
【００８０】
Ａ３０株の別の利点は、この株が例外的に植物の根の強力な内在的および外在的生着菌であり、このことが生物的防除剤としてのこの株の成功の一因になっているということである。Ａ３０株のこれらの利点は、完全に、特に組合せとして予想外であった。
【００８１】
ここで本発明は、詳細にならびに実施例および以下の図面を参照しながら記述される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ディケヤー属（Dickeya）次亜種３によって引き起こされる浸軟に対する、ジャガイモ切片に適用したＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の防護効果を示す図である。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０のＧＦＰタグ付き株が、ディケヤー属（Dickeya）による浸軟からジャガイモ塊茎組織を保護する能力を、ジャガイモ切片アッセイ（potato slice assay）で判断した。Ａ３０およびディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２種を、ＮＢ中で、振盪（２００ｒｐｍ）しながら２８℃で終夜増殖させた。細菌を遠心分離し（５分間、６０００×ｇ）、１／４リンゲル緩衝液を用いて２回洗浄した。滅菌水を用いて、Ａ３０の密度をおよそ１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１に、およびディケヤー属（Dickeya）をおよそ１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１に調整した。塊茎のウェルを、１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１のＡ３０および１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）を含有する懸濁液５０μＬで充填した。１処理につき、３つの異なる塊茎から得られた３枚のジャガイモ切片を使用した。陰性対照用として、細菌懸濁液の代わりに滅菌水５０μＬが、陽性対照用として１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）を含有する５０μＬが使用された。実験を独立して繰り返した。病害を発生させるために、切片を湿った箱の中で、２８℃で７２時間インキュベートした。陽性対照のウェルの周りの腐敗したジャガイモ組織の平均直径と共接種したウェルの周りの腐敗したジャガイモ組織の平均直径とを比較することによってジャガイモ組織に対するＡ３０の保護効果を測定した。
【図２】湿った箱の中で、２８℃で７２時間インキュベートした後に、腐敗している組織の直径（ｍｍ）を測定することによって決定したＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の適用によるディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の浸軟能力の減弱を示す図である。滅菌水（陰性対照）５０μＬ、１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を含有する水中細菌懸濁液（陽性対照）５０μＬ、または１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２と異なる密度（０、１０４、１０５、１０６、１０７および１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１）のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とを含有する水中細菌懸濁液５０μＬを用いてジャガイモ切片のウェルに接種した。１処理につき各３個のウェルを含有し、３つの異なる塊茎から得られた３枚のジャガイモ切片を使用した。実験を独立して１回繰り返し、結果を平均した。
【図３】ジャガイモ切片上におけるＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の集団動態を示す図である。ジャガイモ切片に、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（図３Ａ）、ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２（図３Ｂ）を接種したまたは両方の株を共接種した（図３Ｃ）。横棒は、標準誤差を表す。  ジャガイモ切片上の細菌密度を評価するために、１処理１時点につき３個のランダムに選んだウェルから独立して採取したおよそ２ｇの塊茎組織を、１／４リンゲル緩衝液４ｍＬが入っているユニバーサルビオレババッグ（Universal Bioreba bag）の中でハンマーを使用して破砕した。１００μＬの無希釈、１０００および１０，０００倍希釈した抽出液をＮＡ混釈培養した。  培地に、４０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリンを補充した。プレートを２８℃で２４〜４８時間インキュベートし、落射蛍光実体顕微鏡を使用してＤｓＲｅｄおよび／またはＧＦＰ蛍光細胞の存在についてスクリーニングした。１処理１時点毎のフリーの独立したサンプルの結果を平均した。実験を独立して繰り返した。
【図４Ａ】接種１、７および２８日後にサンプル採取した種芋（図４Ａ）、苗条（図４Ｂ）および根（図４Ｃ）におけるＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の集団動態を示す図である。抽出する前に、植物サンプルを表面殺菌した。  種芋全体および全根を、植物毎に各時点でサンプル採取した。接種の７日後に、全ての苗条を複合サンプルとして植物毎にサンプル採取し、２８日後に、地上より５ｃｍ上で刈り取った茎挿しの複合サンプルを、植物毎に分析した。細菌を抽出する前に、植物サンプルを表面殺菌した。植物抽出物をＮＡ混釈培養し、インキュベートした後に、プレートを緑色および／または赤色の蛍光コロニーについてスクリーニングした。２つの実験の平均値を、１時点につき１０個の植物から示している。統計分析を、１サブサンプル１時点毎に行った（土壌ｎ＝１０、全根ｎ＝１０、幹ｎ＝１０、種芋ｎ＝１０）。同一の記号が続く値は、有意に異なっていない（Ｐ＝０．０５）
【図４Ｂ】接種１、７および２８日後にサンプル採取した種芋（図４Ａ）、苗条（図４Ｂ）および根（図４Ｃ）におけるＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の集団動態を示す図である。抽出する前に、植物サンプルを表面殺菌した。  種芋全体および全根を、植物毎に各時点でサンプル採取した。接種の７日後に、全ての苗条を複合サンプルとして植物毎にサンプル採取し、２８日後に、地上より５ｃｍ上で刈り取った茎挿しの複合サンプルを、植物毎に分析した。細菌を抽出する前に、植物サンプルを表面殺菌した。植物抽出物をＮＡ混釈培養し、インキュベートした後に、プレートを緑色および／または赤色の蛍光コロニーについてスクリーニングした。２つの実験の平均値を、１時点につき１０個の植物から示している。統計分析を、１サブサンプル１時点毎に行った（土壌ｎ＝１０、全根ｎ＝１０、幹ｎ＝１０、種芋ｎ＝１０）。同一の記号が続く値は、有意に異なっていない（Ｐ＝０．０５）
【図４Ｃ】接種１、７および２８日後にサンプル採取した種芋（図４Ａ）、苗条（図４Ｂ）および根（図４Ｃ）におけるＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の集団動態を示す図である。抽出する前に、植物サンプルを表面殺菌した。  種芋全体および全根を、植物毎に各時点でサンプル採取した。接種の７日後に、全ての苗条を複合サンプルとして植物毎にサンプル採取し、２８日後に、地上より５ｃｍ上で刈り取った茎挿しの複合サンプルを、植物毎に分析した。細菌を抽出する前に、植物サンプルを表面殺菌した。植物抽出物をＮＡ混釈培養し、インキュベートした後に、プレートを緑色および／または赤色の蛍光コロニーについてスクリーニングした。２つの実験の平均値を、１時点につき１０個の植物から示している。統計分析を、１サブサンプル１時点毎に行った（土壌ｎ＝１０、全根ｎ＝１０、幹ｎ＝１０、種芋ｎ＝１０）。同一の記号が続く値は、有意に異なっていない（Ｐ＝０．０５）
【図５Ａ】接種７および２８日後に、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（緑色）およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２（赤色）によるジャガイモの根（図５Ａ）および幹（図５Ｂ）内部のコロニー形成を示す図であり、ＮＡ寒天の中に埋め込んだ植物部分を２８℃で１〜２日間インキュベートして細菌を増殖させた後に、共焦点レーザ走査顕微鏡観察で分析した。ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（Ａ３０）を塊茎に接種した植物から、ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）（ＩＰＯ３０１２）を減圧浸潤させた塊茎から生じた植物から、および両方の株を塊茎に順次接種した（共接種）後に、サンプルを採取した。対照用として、ジャガイモ塊茎に滅菌水（水）を減圧浸潤させた。植物細胞を対比染色するために、紫外線を使用した。
【図５Ｂ】接種７および２８日後に、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（緑色）およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２（赤色）によるジャガイモの根（図５Ａ）および幹（図５Ｂ）内部のコロニー形成を示す図であり、ＮＡ寒天の中に埋め込んだ植物部分を２８℃で１〜２日間インキュベートして細菌を増殖させた後に、共焦点レーザ走査顕微鏡観察で分析した。ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（Ａ３０）を塊茎に接種した植物から、ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）（ＩＰＯ３０１２）を減圧浸潤させた塊茎から生じた植物から、および両方の株を塊茎に順次接種した（共接種）後に、サンプルを採取した。対照用として、ジャガイモ塊茎に滅菌水（水）を減圧浸潤させた。植物細胞を対比染色するために、紫外線を使用した。
【図６】土壌感染させた２８日後に、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（緑色の凝集塊）による、新たに採取したジャガイモ根の表面のコロニー形成を示す図である。共焦点レーザ走査顕微鏡観察を用いて、新たに採取した植物サンプルの根を分析した。このために、根を採取し、滅菌水道水で簡単に洗浄して土壌粒子を取り除き、すぐに顕微鏡観察用に加工した。対照として水を接種した植物の根を調製し、同じ方法で加工した。植物細胞を対比染色するために、紫外線を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明者らにより実施された温室実験において、植付けの直前にＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を用いて塊茎を処理することにより、ディケヤー属（Dickeya）および黒脚病症状からジャガイモ塊茎／植物が保護された。塊茎腐敗または典型的な黒脚病症状を発現している植物のパーセンテージは、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を接種した対照植物と比較して著しく減少した。
【００８４】
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を用いた塊茎処理により、ジャガイモ植物に迅速なコロニー形成がもたらされた。土壌に細菌を適用してちょうど７日後に、ジャガイモ植物は組織的および内部的にコロニー形成された。土壌に接種した後に、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、幹に向かってジャガイモ植物の内部を上方に移動できた。細菌は、次いでジャガイモ組織の中で生存していた。細菌の移動は、根および幹の維管束組織内部の木部導管を通って起こった。根および幹内部にある比較的小さいが安定的なＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の集団は、少なくとも２８日間存在した。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、植物にどんな病害症状も引き起こさず、小さな内部集団しか形成しない典型的な内部寄生菌の特徴を共有している。共接種した植物の大多数において、根および幹内部にあるこれら小さなＡ３０の集団は、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２によるコロニー形成および典型的な黒脚病症状の発現からジャガイモ植物を保護するのに十分であった。
【００８５】
本発明者らは、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が根表面にもコロニー形成できることも見いだした。７日後には、細菌は根の維管束組織の内部にすでに存在しており、２８日後には、根の表面に大きなＡ３０集団が観察された。
【００８６】
本発明者らは、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が根内部組織に効果的にコロニー形成できることをさらに観察し、これは細菌が根の発生の間に作られる天然の開口部を通って根に侵入できることを示唆している。
【実施例１】
【００８７】
ディケヤー・ソラニ（Dickeya solani）に拮抗的な細菌の特徴づけ
寒天培地ＴＳＡ、ＮＢ、Ｋｉｎｇ’ｓ  ＢまたはＲ２Ａ上で腐敗したジャガイモ塊茎の抽出物を培養し、形態学的に異なる細菌コロニーを採取することによって、異なる塊茎（栽培品種、アーケイド（Arcade）、コンスル（Konsul）、コンドル（Kondor）、アグリア（Agria））の腐敗したジャガイモ塊茎組織から細菌を分離した。分離した６４９株を、Ｄ．ソラニ（D. solani）に対する抗生作用について、または鉄イオンキレート化タンパク質（シデロホア）の産生についてスクリーニングした。これらのうち、１１２の分離株はシデロホアを産生し、４１株は抗生物質を産生し、４９６株はＤ．ソラニ（D. solani）に対する活性がなかった。
【００８８】
４１株の抗生物質産生株および４１株のシデロホア産生株の選抜を、Ｄ．ソラニ（D. solani）に対する拮抗作用についてジャガイモ切片アッセイで試験した。ジャガイモ塊茎組織の腐敗を、少なくとも対照の５０％に減少させることができた株を選抜した。これらの分離株は、次いで１６ＳｒＲＮＡの配列決定によってバチルス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、セラチア属（Serratia）、オベサムバクテリウム属（Obesumbacterium）またはリシニバチルス属（Lysinibascillus）菌種と特徴づけられた。
【００８９】
これらのうち２３個の分離株（１３株は抗生物質を産生し、１０株はシデロホアを産生する）を、菌体密度感知信号検出、運動性、生物系界面活性剤産生、低（４．０）および高（１０．０）ｐＨにおける増殖、好気性および嫌気性条件における１０℃での増殖ならびにトリプトファン依存的および非依存的オーキシン産生について試験することによってさらに特徴づけた。
【００９０】
上記の分離株のうち１２株を取り出し、温室中で、植物で試験した。ジャガイモ塊茎に各分離株を接種した。
【００９１】
温室実験の結果、４つの拮抗株が見いだされた。
【００９２】
これらの１つは、ブダペスト条約の下でベルギー微生物保存機関（Belgian Co-ordinated collections of Microorganisms）（ＢＣＣＭ）に受け入れ番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０で寄託されたセラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）Ａ３０である。
【００９３】
この株は、ディケヤー属（Dickeya）に対する抗生物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に基づいて選抜された。Ａ３０株は、ディケヤー属（Dickeya）に対する抗生物質を産生し、アシルホモセリンラクトンを分解することができ、生物系界面活性剤を産生する。この株は、運動性であり、好気性および嫌気性条件で増殖できる。Ａ３０株は、植物の生長を刺激するオーキシンも産生する。
【実施例２】
【００９４】
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２による浸軟からジャガイモ塊茎組織を保護する能力の分析
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２による浸軟からジャガイモ塊茎組織を保護する能力を、ジャガイモ切片アッセイで判断した。Ａ３０およびディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２を、ＮＢ中で振盪（２００ｒｐｍ）しながら２８℃で終夜増殖させた。細菌を遠心分離し（５分間、６０００×ｇ）、１／４リンゲル緩衝液で２回洗浄した。滅菌水を用いて、Ａ３０の密度をおよそ１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１に、およびディケヤー属（Dickeya）をおよそ１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１に調整した。塊茎のウェルを、１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１のＡ３０および１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）を含有する懸濁液５０μＬで充填した。１処理につき、３つの異なる塊茎から得られた３枚のジャガイモ切片を使用した。陰性対照用として細菌懸濁液の代わりに滅菌水５０μＬが、陽性対照用として１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）を含有する５０μＬが使用された。実験を独立して繰り返した。病害を発生させるために、切片を湿った箱の中で、２８℃で７２時間インキュベートした。陽性対照のウェルの周りの腐敗したジャガイモ組織の平均直径と共接種したウェルの周りの腐敗したジャガイモ組織の平均直径とを比較することによってジャガイモ組織に対するＡ３０の保護効果を測定した。結果は、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２による浸軟に対するＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の明確で強い防護効果を示した（図１を参照のこと）。
【実施例３】
【００９５】
ＧＦＰまたはＲＦＰタンパク質でタグ付けされたマーカー株の構築
ジャガイモ植物組織内部での相互作用および細菌集団についての理解を評価するために、ならびに植物体中を含めたｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、生存可能な細菌細胞を顕微鏡的に視覚化するために、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）を用いてディケヤー属（Dickeya）次亜種３株を、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いてＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０をそれぞれタグ付けした。ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタンパク質でタグ付けすることにより、両方の細菌種の局在場所および集団動態に関する詳細な顕微鏡観察検討が可能になった。
【００９６】
培養に使用した細菌株および培地
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（寄託受け入れ番号ＬＭＧ  Ｐ−２６１７０）およびディケヤー属（Dickeya）次亜種３型株ＩＰＯ２２２２（Stawiakら（２００９）、European Journal of Plant Pathology 125：245〜261）を、使用する前にトリプティックソイ寒天培地（ＴＳＡ）（Ｏｘｏｉｄ）または普通寒天培地（ＮＡ）（Ｏｘｏｉｄ）上で、２８℃で２４〜４８時間増殖させた。液体培養は、普通ブロス（ＮＢ）（Ｏｘｏｉｄ）および／またはトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）（Ｏｘｏｉｄ）中で撹拌（２００ｒｐｍ）しながら、２８℃で２４時間調製された。ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の株を、４０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリン（シグマ）を補充した同じ培地（ＮＡｔ、ＴＳＡｔ、ＮＢｔ、ＴＳＢｔ）上または中で増殖させた。植物抽出物を分析する場合、増殖培地は、最終濃度２００μｇ  ｍＬ−１になるようにシクロヘキシミド（シグマ）を追加的に補充して、起こり得る真菌の増殖を予防した。
【００９７】
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２株の生成
プラスミドｐＲＺ−Ｔ３−ｇｆｐおよびｐＲＺ−Ｔ３−ｄｓｒｅｄを使用して、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０（Ａ３０ＧＦＰ）およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）次亜種３ＩＰＯ３０１２（親株はディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２）をそれぞれ生成した。以前に記述されているように（Czajkowskiら（2010）、Phytopathology 100：134〜142を参照のこと）、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を担持しているプラスミドを、エレクトロポレーション（CalvinおよびHanawalt（1988）、Journal of Bacteriology 170：2796〜2801を参照のこと）によって細菌細胞に導入した。簡潔には、Ａ３０またはＩＰＯ２２２２のコンピテント細菌細胞の懸濁液およそ５０μＬ（およそ１０１１〜１０１２ｃｆｕ．ｍＬ−１を含有する）を１００ｎｇ  μＬ−１のプラスミドＤＮＡと混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ２００／０．２（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を使用して４℃で、２．５ｋＶで１〜２秒間電気刺激した。エレクトロポレーションした後に、細菌細胞をＮＢ  ５００μＬ中で、２８℃で振盪しながら１時間蘇生させた。形質転換した細胞１００μＬを、４０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリンを含有するＴＳＡ上で平板培養し、２８℃で２４〜４８時間インキュベートして、陽性ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ蛍光形質転換体を選抜した。
【００９８】
ｐＲＺ−Ｔ３−ｇｆｐを用いてＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を、およびｐＲＺ−Ｔ３−ｄｓｒｅｄプラスミドを用いてディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２を形質転換することにより、それぞれ４３個および２９個の形質転換体を得た。高い蛍光を持つコロニーを、各細菌について採取した。形質転換体を選択条件の寒天プレートに繰り返し移すことによって細菌が安定した状態でＧＦＰまたはＤｓＲｅｄを発現していることが明らかになった。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０−ＧＦＰ中のｐＲＺ−Ｔ３−ｇｆｐおよびディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２中のｐＲＺ−Ｔ３−ｄｓｒｅｄの存在を、プラスミドＤＮＡの精製およびアガロースゲル電気泳動によって証明した。
【００９９】
蛍光タンパク質を用いたＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２の標識は、株の健康に影響を及ぼさなかった。形質転換株が、親の野生型株と同様に挙動することから、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタンパク質の発現が、重要な生物学的特徴に著しい影響を及ぼさないことが示された。
【実施例４】
【０１００】
親株の増殖と比較したＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタグ付き細菌株の増殖
好気性条件下でのタグ付き細菌の細菌増殖を親株と比較するために（ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２対ＩＰＯ２２２２およびＡ３０対Ａ３０ＧＦＰ）、ＮＢｔ中に約１０９〜１０１０ｃｆｕ  ｍＬ−１の密度を持つ終夜細菌培養物を、同じ培地で５０倍希釈した。細菌を２００ｒｐｍの振盪速度で、２８℃で増殖させた。最大で２４時間に渡ってＯＤ６００を測定することによって増殖速度を決定した。
【０１０１】
嫌気性条件下でのディケヤー属（Dickeya）株の増殖を、ＰＥＢ中の細菌懸濁液３０ｍＬに液体パラフィン５ｍＬを加えることによって作成した（Perombelon, M., C, MおよびJ . M. Van der Wolf（2002）を参照のこと）。ジャガイモ上のエルウィニア・カロトボーラ亜種アトロセプチカ（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）（ペクトバクテリウム・カロトボラム亜種アトロセプティカム（Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum））の検出および定量方法：実験室マニュアル（Ｓｃｏｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、インキュベーション時間の間に培養物を撹拌しないことを除いて好気性条件下での増殖について記述しているのと同様の方法で決定した。
【０１０２】
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０−ＧＦＰおよびディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２が、液体培地中でそれぞれ親の野生型Ａ３０およびＩＰＯ２２２２株と類似の増殖特性を示したことから、これらの株の増殖がｐＲＺ−Ｔ３プラスミドの存在、または蛍光（ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ）タンパク質の発現の影響を受けていないことが示された。
【実施例５】
【０１０３】
ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）の塊茎組織浸軟能力
細菌懸濁液を、およそ１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１の濃度になるようにリンゲル緩衝液（Ｍｅｒｃｋ）に希釈した。栽培品種Ａｇｒｉａ（Ａｇｒｉｃｏ、オランダ）のジャガイモ塊茎を、水道水の流水ですすぎ、その後７０％エタノールで５分間２回洗浄し、脱塩水で１分間２回洗浄した。塊茎をティッシュペーパーで乾燥させ、０．７ｃｍの横方向のディスク切片に切断した。
【０１０４】
直径５ｍｍの滅菌コルク穿孔器を使用して、深さ５ｍｍのウェルを１切片につき３つ作成した。細菌懸濁液５０μＬでウェルを充填した。１処理につき、３つの異なる塊茎から得られた３枚のジャガイモ切片を使用した。病害を発生させるために、切片を湿った箱の中で、２８℃で７２時間インキュベートした。２８℃で７２時間インキュベートした後に、接種したウェルの周りの腐敗している組織の直径を測定した。この結果を、野生型株および水の対照と比較した。実験を同じ設定で２回繰り返した。
【０１０５】
ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２およびＩＰＯ２２２２がジャガイモ塊茎組織を浸軟させる能力を、ジャガイモ切片試験で比較した。接種した塊茎切片を２８℃で３日間インキュベートした後、腐敗している組織の直径は、野生型ＩＰＯ２２２２株とあまり異ならなかった。
【０１０６】
このジャガイモ切片アッセイにおいて、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を、ディケヤー属（Dickeya）より１００倍高い密度で適用した場合、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２によって引き起こされるジャガイモ組織の浸軟を完全に阻止することができ、ディケヤー属（Dickeya）の密度より１０倍高くまたは等しく適用した場合、塊茎組織の浸軟をかなり減少させることができた。
【実施例６】
【０１０７】
オーバレイプレートアッセイにおいて、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０−ＧＦＰが、ディケヤー属（Dickeya）の増殖を阻害する能力
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２の増殖を阻害する能力を、指示菌としてＩＰＯ２２２２を用いるオーバレイプレートアッセイで試験した。ＮＢ中のディケヤー属（Dickeya）の終夜培養物５０μＬ（およそ１０９ｃｆｕ  ｍＬ−１）を、４５〜５０℃に予熱した柔らかい上層寒天（０．７％の寒天を補充したＮＢ）５ｍＬと混合し、ＴＳＡプレートに流し込んだ。寒天が凝固した後に、ＮＢおよびＮＢｔ中のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０またはＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０それぞれの終夜培養物２．５μＬ（およそ１０９ｃｆｕ  ｍＬ−１）を、寒天プレートの表面にスポットした。プレートを２８℃で２４〜４８時間インキュベートした。コロニーの周りに現れた明らかな「輪」（ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２の増殖阻害を示す）の直径を、測定した。
【０１０８】
共接種した寒天プレートを２８℃で１〜２日間インキュベートした後に、ディケヤー属（Dickeya）の増殖阻害を示すＧＦＰタグ付きＡ３０コロニーの周りの明らかな輪の直径は、野生型Ａ３０コロニーの周りの明らかな輪の直径とあまり異ならなかった。
【実施例７】
【０１０９】
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０-ＧＦＰが、ディケヤー属（Dickeya）による軟腐病から塊茎組織を保護する能力
ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）の塊茎組織浸軟能力を試験した実験について記述したのと同様の方法で、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０がディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２による浸軟からジャガイモ塊茎組織を保護する能力をジャガイモ切片アッセイで判断した。ＧＦＰタグ付きＡ３０および野生型Ａ３０ならびにディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２をそれぞれ、ＮＢｔまたはＮＢ中で振盪（２００ｒｐｍ）しながら２８℃で終夜増殖させた。細菌を遠心分離し（５分間、６０００×ｇ）、１／４リンゲル緩衝液で２回洗浄した。滅菌水を用いて、ＧＦＰタグ付きＡ３０の密度をおよそ１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１に、およびディケヤー属（Dickeya）をおよそ１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１に調整した。塊茎のウェルを、１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１のＧＦＰタグ付きＡ３０および１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を含有する懸濁液５０μＬで充填した。
【０１１０】
１処理につき、３つの異なる塊茎から得られた３枚のジャガイモ切片を使用した。陰性対照用として細菌懸濁液の代わりに滅菌水５０μＬが、陽性対照用として１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）を含有する５０μＬが使用された。実験を独立して繰り返した。病害を発生させるために、切片を湿った箱の中で、２８℃で７２時間インキュベートした。陽性対照のウェルの周りの腐敗したジャガイモ組織の平均直径と共接種したウェルの周りの腐敗したジャガイモ組織の平均直径とを比較することによってジャガイモ組織に対するＡ３０の防護効果を測定した。
【０１１１】
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０がディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２による浸軟からジャガイモ塊茎組織を保護する能力を、ジャガイモ切片試験でＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の野生型株と比較した。ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ２２２２を用いて共接種した塊茎切片を２８℃で７２時間インキュベートした後に、腐敗した組織の直径はあまり異ならなかった。
【実施例８】
【０１１２】
ディケヤー属（Dickeya）による塊茎浸軟に対するＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０−ＧＦＰ密度の効果
ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２によって引き起こされる浸軟からジャガイモ塊茎組織を保護する能力におけるＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の接種原密度の効果を、ジャガイモ切片アッセイで試験した。１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のＩＰＯ３０１２とＡ３０とを１０４〜１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１の密度範囲でジャガイモ切片に共接種した。高圧水銀写真光学ランプ（Ｌｅｉｃａ  Ｈｇ  ５０Ｗ／ＡＣ）ならびにＧＦＰおよびＲＦＰプラスフィルタを備えている落射蛍光実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｗｉｌｄ  Ｍ３２  ＦＬ４）の下で、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタグ付きコロニーを計数した。
【０１１３】
図２は、ディケヤー属（Dickeya）によるジャガイモ組織の浸軟が、最小密度１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１のＡ３０で完全に停止したことを示している。１０７ｃｆｕ  ｍＬ−１および１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１のさらに低い密度では、Ａ３０はジャガイモ組織の浸軟を著しく減少させたが、ジャガイモ切片の腐敗はまだ観察された。１０４ｃｆｕ  ｍＬ−１の密度では、Ａ３０は組織の浸軟を減少させなかった（図２を参照のこと）。
【実施例９】
【０１１４】
ジャガイモ塊茎切片上のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびディケヤー属（Dickeya）の集団動態
ジャガイモ切片を（共）接種した後のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０−ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の集団動態を、混釈平板培養を使用して３日間検討した。
【０１１５】
実験は、実施例７および８に記載したものと同様であった。塊茎ウェルを、１０１０ｃｆｕ  ｍＬ−１のＡ３０および１０８ｃｆｕ  ｍＬ−１のディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を含有する懸濁液５０μＬで充填した。腐敗を発生させるために、調製したジャガイモ切片を湿った箱の中で、２８℃でインキュベートした。実験を独立して繰り返した。ジャガイモ切片上のＡ３０およびＩＰＯ３０１２の密度を評価するために、１処理１時点につき３個のランダムに選んだウェルからおよそ２ｇの塊茎組織を毎日採取し、１／４強度のリンゲル緩衝液４ｍＬが入っているユニバーサルエクストラクションバッグ（Universal Extraction Bag）（ＢＩＯＲＥＢＡ）の中でハンマーを使用して破砕した。１００μＬの無希釈、ならびに１０００倍および１００００倍希釈した塊茎抽出液を、最終濃度４０μｇ  ｍＬ−１になるようにテトラサイクリンを補充し４８℃に予熱したＮＡ（ＮＡｔ）と混合し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに流し込んだ。寒天が凝固した後に、プレートをパラフィルムで覆い、２８℃で２４〜４８時間インキュベートして細菌コロニーを増殖させた。高圧水銀写真光学ランプ（Ｌｅｉｃａ  Ｈｇ  ５０Ｗ／ＡＣ）ならびにＧＦＰおよびＲＦＰプラスフィルタを備えている落射蛍光実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｗｉｌｄ  Ｍ３２  ＦＬ４）の下で、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタグ付きコロニーを計数した。
【０１１６】
図３Ａは、３日間の間に、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の密度が、接種０日後における１０７〜１０８ｃｆｕ  ｇ−１から接種２日後には１０１〜１０２ｃｆｕ  ｇ−１へ、さらに接種３日後には０ｃｆｕ  ｇ−１へと急速に減少したことを示している。３日後に、水対照と同様に塊茎組織にわずかな茶色の変色が見いだされたが、実験の過程でジャガイモ切片の腐敗は観察されなかった。
【０１１７】
図３Ｂは、３日間の間に、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の密度が平均で１０７ｃｆｕ  ｇ−１から１０１１ｃｆｕ  ｇ−１に増加したことを示している。この大きな増加は、ジャガイモ切片の漸進的な腐敗と同時に起こった。
【０１１８】
図３Ｃは、３日間の間に、ジャガイモ塊茎切片にＧＦＰタグ付きＡ３０株とＰＯ３０１２とを共接種することにより、両方の株の密度が同時減少したことを示している。接種３日後には、ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄタグ付き細菌は、接種したジャガイモ切片から全く回収されなかった。
【０１１９】
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２とを共接種したジャガイモ切片における集団動態に関する検討から、生物防除剤は、適用してほんの２日後にジャガイモ切片中のディケヤー属（Dickeya）の集団を大きく減少させ、７２時間後には人工的に接種した塊茎からディケヤー属（Dickeya）を完全に根絶できることが示された。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０によるディケヤー属（Dickeya）次亜種３の防除は、近い距離で、おそらくは細胞間接触によって最も効果的である。
【実施例１０】
【０１２０】
土壌処理を通してディケヤー属（Dickeya）およびＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を処理した塊茎を使用する温室実験
ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２のジャガイモ塊茎への、およびＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の土壌への接種
温室実験は、６月〜７月および９月〜１０月に行った。滅菌脱塩水中にＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の懸濁液を調製して、１０６ｃｆｕ  ｍＬ−１の密度にした。ディケヤー属（Dickeya）を含まないミニチューバ栽培品種コンドル（Ｄｕｔｃｈ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｓｅｅｄｓ  ａｎｄ  ｓｅｅｄ  ｐｏｔａｔｏｅｓ（ＮＡＫ）、Ｅｍｍｅｌｏｏｒｄ、オランダ）を使用した。ミニチューバを、懸濁液に浸漬し、エクシケータ中で、−８００ｍＢａｒで１０分間減圧浸潤させ、続いて大気圧で１０分間インキュベートした。ミニチューバに、滅菌脱塩水だけを浸潤させ陰性対照とした。接種した後に、塊茎をフローキャビネット内で終夜乾燥させ、翌日にバーヘニンゲン（オランダ）のジャガイモ畑から採取した砂質が豊富なジャガイモ土壌（２．９％有機物、０．２％ＣａＣＯ３、ｐＨ６．４）が入った５Ｌプラスチック製ポットに植え付けた。
【０１２１】
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の懸濁液を滅菌脱塩水に調製して、１０１０〜１０１１ｃｆｕ  ｍＬ−１の密度にした。接種の１時間前に植え付けた塊茎に水道水を給水した。埋める前に、陰性対照塊茎またはディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を接種した塊茎に１０１０〜１０１１ｃｆｕ  ｍＬ−１のＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０  ５０ｍＬを接種し、塊茎に直接適用した。処理の２４時間後に、ポットを排水したままにした。塊茎を植え付けた後に、ポットを１６／８時間の光周期、相対湿度７０％、２８℃で４週間（２８日間）温室中に置いた。生長条件のバイアス効果を排除するために、完全にランダムなポットの区画設計が適用された（各処理対して１０ポットを含有する３つの区画−１区画につき合計４０ポット）。各実験において、１処理につき３０個のコンドルミニチューバを使用した。合計で１２０個の植物を使用した：１複製１時点につき、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を接種した１０個の植物（陽性対照）、滅菌水を接種した１０個の植物（陰性対照）、ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２とＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とを共接種した１０個の植物、およびＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を接種した１０個の植物を使用した。
【０１２２】
植付け直後および土壌で塊茎を覆う直前に、ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を事前に浸潤させた塊茎の表面に、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の懸濁液を適用して、畑に植える適用を模倣した。塊茎を処理した後に、株がジャガイモ植物にコロニー形成する可能性を検討して、植物内部組織におけるディケヤー属（Dickeya）の防除に対する拮抗体の潜在性を決定した。
【０１２３】
この検討において、温室実験の条件を、病原体にとって最適であり生物防除剤にとっては最適でないように調整した。本発明者らは、考え得る最悪のシナリオにおいて、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が黒脚病からジャガイモ植物を保護する能力を検討しようと試みた。このために、黒脚病感受性ジャガイモ栽培品種コンドルを使用し、高接種原のディケヤー属（Dickeya）をジャガイモ塊茎に直接適用して、黒脚病の高い発病率を確実にした。ディケヤー属（Dickeya）次亜種３型株は毒性が高く、感染過程を促進するために比較的高い温度および高い湿度条件を必要とするのでこの株を使用した。実験において使用する土壌をジャガイモ畑から採取して、天然の畑の条件を模倣した。それにもかかわらず、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、黒脚病を著しく減少させ、接種した植物中のディケヤー属（Dickeya）密度に影響を及ぼすことができた。
【０１２４】
植物における症状の発症
植物を症状の発症について毎週視覚的に点検した、すなわち、無出芽、葉の萎凋および退緑、茎基部の黒腐れ、気茎の腐敗、茎の乾燥ならびに植物の死について植物を評価した。真空浸潤によって塊茎に順次接種した後の反復温室実験において、Ａ３０株は、ディケヤー属（Dickeya）による症状の発現を１００％、およびディケヤー属（Dickeya）次亜種３による幹のコロニー形成を９７％減少させた。表１は、接種の１、７および２８日後に破壊分析した１０個の植物の３群を累算した結果をそれぞれ示している。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を用いて接種した植物において、第一の症状は接種７日後、苗条がおよそ５〜７ｃｍであり根がおよそ８〜１２ｃｍであるときに現れた。ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２感染は、処理した植物の発芽および発育に強く影響を及ぼした。第一実験においてディケヤー属（Dickeya）に感染した植物の６０％、第二実験における植物の２０％が、接種７日後に出芽前塊茎腐敗、苗条および根の生長悪化ならびに若い苗条において発症し始める第一の典型的な黒脚病症状（すなわち葉の萎凋および退緑、幹表面における水病斑）を示した。接種２８日後には、実験１および２それぞれにおいてディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を接種した植物の６０％および５０％が、幹の基部の近くに典型的な黒化および軟腐化を示した。出芽前腐敗および黒脚病症状の発症は、ＧＦＰタグ付きＡ３０とＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２株とを共接種した植物において著しく減少した。第一実験において、接種７日後には共接種した植物のわずか１０％が出芽前塊茎腐敗および苗条の生長悪化を示したが、接種２８日後には共接種した植物において、病害症状は全く観察されなかった。第二実験では、実験の全経過を通じて共接種した植物のいずれも出芽前塊茎腐敗および黒脚病症状を示さなかった。
【０１２７】
両方の実験の全経過を通じて、水を接種した対照植物はどんな症状も示さなかった（データ不掲載）。
【０１２８】
ＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２およびＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０によるジャガイモ植物のコロニー形成、続いての落射蛍光実体顕微鏡
根および幹の内部コロニー形成に関する理解を評価するために、落射蛍光実体顕微鏡を使用して植物部分もスクリーニングした。このために、接種２８日後に植物サンプルを採取した。全ての接種した植物および水を接種した対照植物から、長さ少なくとも５〜１０ｃｍの８つの根、および６つの苗条（幹）をランダムに切断した。ＮＡｔ混釈平板培養について記述した通り、全てのサンプルを洗浄し、殺菌した後に顕微鏡観察した。各根を２〜３ｃｍ、各幹を０．５ｃｍ長の断片に切断した。断片を、４０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリンおよび２００μｇ  ｍＬ−１シクロヘキシミドを含有し、４８℃まで冷ましたペトリ皿中のＮＡに埋め込んだ。培地が凝固した後に、プレートをパラフィルムで密閉し、２８℃で１〜２日間インキュベートした。緑色および／または赤色蛍光信号を含む植物部分を、高圧水銀写真光学ランプ（Ｌｅｉｃａ  Ｈｇ  ５０Ｗ／ＡＣ）ならびにＧＦＰおよびＲＦＰプラスフィルタを備えている落射蛍光実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｗｉｌｄ  Ｍ３２  ＦＬ４）の下で計数した。典型的な緑色および／または赤色蛍光を示している植物サンプルの数を陽性として記録し、陽性サンプルの画分を各処理について算出した（表２を参照のこと）。共接種によりＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、根および幹中のディケヤー属（Dickeya）コロニー形成発生率を減少させ、または接種した植物から病原体を根絶することさえできた。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
ジャガイモ組織中のＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２およびＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０の混釈平板培養による定量
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の土壌中および植物部分（すなわち塊茎、芽および根）中における集団動態を、ＮＡ混釈平板培養によって異なる時点で検査した。
【０１３１】
接種１、７および２８日後に、植物をサンプル採取した。各時点において、１処理につき１０個の植物をサンプル採取した。サンプルを、各ポットからランダムに採取し、酸化剤として０．０２％ジエチルジチオカルバミン酸（ＤＩＥＣＡ）を補充した１／４リンゲル緩衝液２ｍＬに別々に懸濁した。１００μＬの無希釈、１０および１００倍希釈したサンプルを、最終濃度４０μｇ  ｍＬ−１になるようにテトラサイクリンを補充したＮＡ（ＮＡｔ）と混合し、４８℃に予熱し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに流し込んだ。寒天が凝固した後に、プレートをパラフィルムで包み、２８℃で２４〜４８時間インキュベートして細菌コロニーを発生させた。ジャガイモ切片上でのＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０とディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２との相互作用について落射蛍光実体顕微鏡を使用して行われたのと同じ方法で、プレートをＧＦＰおよび／またはＤｓＲｅｄ陽性コロニーについてスクリーニングした。
【０１３２】
植物毎に種芋を採取し、別々に加工した。塊茎を水道水で洗浄して土壌粒子を取り除き、７０％エタノールで１分間殺菌し、水で１分間３回洗浄し、１％次亜塩素酸ナトリウム（市販の漂白剤）中で４分間インキュベートし、最後に水で４分間３回洗浄した。各塊茎をユニバーサルエクストラクションバッグ（ＢＩＯＲＥＢＡ）の中でハンマーを使用して破砕した。土壌サンプルについて記述した通り、抽出物を希釈し、混釈平板培養した。
【０１３３】
植物毎に、全ての苗条を採取し、複合サンプルとして加工した。植物毎に、根系全体を加工した。幹（苗条）サンプルと根系全体の外側を洗浄および殺菌した後に、種芋について記述したのと同じ方法で、抽出物を調製し混釈平板培養した。
【０１３４】
塊茎中の細菌集団（図４Ａを参照のこと）。
接種１日後に、比較的小さいＡ３０の集団（平均およそ１０１ｃｆｕ  ｇ−１）が、種芋内部に検出された。集団は、７日間で１０２〜１０３ｃｆｕ  ｇ−１に増加し、接種２８日後までこのレベルで安定した。共接種した植物において、接種１日後の塊茎中のＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０集団は、平均して１０３ｃｆｕ  ｇ−１であったが、２８日目には集団は、１０２ｃｆｕ  ｇ−１に減少した。塊茎を真空浸潤した後、接種１日後には１０４ｃｆｕ  ｇ−１の比較的高いディケヤー属（Dickeya）集団が検出された。接種２８日後に、集団は平均して１０３ｃｆｕ  ｇ−１へとわずかに減少した。共接種した植物において、ディケヤー属（Dickeya）集団は、接種１日後における１０４ｃｆｕ  ｇ−１から接種２８日後には平均して１ｃｆｕ  ｇ−１以下へと著しく減少した。
【０１３５】
根の中の細菌集団（図４Ｂを参照のこと）。
接種１日後にはまだ根が形成されていないので、根の中の細菌集団は、接種７および２８日後にだけ分析した。接種７日後には、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、１０２ｃｆｕ  ｇ−１の密度で根の内部に存在していた。接種２８日後には、集団は、１０３〜１０４ｃｆｕ  ｇ−１に増加した。共接種した植物において、Ａ３０の集団動態は、同じ傾向をたどった。ディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２を接種した植物において、接種７日後には、根の内部に小さいディケヤー属（Dickeya）集団（平均１０１ｃｆｕ  ｇ−１未満）が見つかった。接種２８日後には、集団は、１０１〜１０２ｃｆｕ  ｇ−１へとわずか増加した。共接種した植物において、接種７日後にはディケヤー属（Dickeya）は根の中に全く検出されなかった。接種２８日後には、平均して１ｃｆｕ  ｇ−１の非常に小さい集団しか検出されなかった。
【０１３６】
苗条の中の細菌集団（図４Ｃを参照のこと）。
接種１日後にはまだ苗条が形成されていないので、苗条の中の細菌集団は、接種７および２８日後にだけ分析した。接種７日後には、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０は、１０２ｃｆｕ  ｇ−１の密度で苗条の内部にすでに存在していた。接種２８日後には、集団は１０倍増加した。共接種した植物において、Ａ３０の集団動態は、同じ傾向をたどった。共接種した植物において、接種７日後には低密度のディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２が苗条の中に５〜１０ｃｆｕ  ｇ−１で検出された。接種２８日後には、集団は１０２〜１０３の密度に増加した。共接種した植物において、接種７日後には平均して１０ｃｆｕ  ｇ−１未満のディケヤー属（Dickeya）が存在し、接種２８日後には幹の中にディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２は全く検出されなかった。
【０１３７】
細菌コロニー形成を示すための共焦点レーザ走査顕微鏡観察（ＣＬＳＭ）用ジャガイモ植物のサンプル採取
顕微鏡観察用として、植物サンプルを、ＮＡ混釈平板培養と同じ時点、すなわち接種１、７および２８日後に採取した。接種した全ての植物から、長さ少なくとも５〜１０ｃｍの８つの根、および３つの苗条（幹）をランダムに切断した。ＮＡ混釈平板培養について記述した通り、全てのサンプルを洗浄し、殺菌した後に顕微鏡観察した。
【０１３８】
各根を２〜３ｃｍ、各幹を０．５ｃｍ長の断片に切断した。断片を、４０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリンおよび２００μｇ  ｍＬ−１シクロヘキシミドを含有し、４８℃まで冷ましたペトリ皿中のＮＡに埋め込んだ。培地が凝固した後に、プレートをパラフィルムで密閉し、２８℃で１〜２日間インキュベートした。この後に、植物サンプルを寒天プレートから採取し、脱塩滅菌水で簡単に洗浄し、ＣＬＳＭ顕微鏡下で検査した。根表面における細菌集団をモニターするために、１植物につき４つの根を表面殺菌無しにおよび埋め込まずに加工した。
【０１３９】
植物細胞を可視化するために、４０５ｎｍ（励起）紫外レーザおよび４５０ｎｍ発光フィルタを使用した。細菌細胞中のＧＦＰおよびＤｓＲｅｄを励起するために、それぞれ４９５ｎｍおよび５３２ｎｍの青色および緑色レーザを使用した。ＧＦＰ用として５０５ｎｍおよびＤｓＲｅｄ用として６１０ｎｍの発光フィルタを、それぞれ使用した。１０×および６３×水浸対物レンズを使用するＣＬＳＭ顕微鏡と組み合わせたライカデジタルシステム（Ｌｅｉｃａ）を用いて写真撮影した。
【０１４０】
接種７および２８日後に、植物部分を、６４０および１０００倍の倍率でＣＬＳＭを用いて分析した。ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０およびＤｓＲｅｄタグ付きディケヤー属（Dickeya）ＩＰＯ３０１２の局在に関する詳細な検討により、接種７日後には両方の細菌種が、根の維管束組織内部の髄（髄層および皮層中）の中の細胞内および細胞間の両方に存在していることが示された（図５Ａを参照のこと）。幹において、蛍光細菌は、木部導管と原生木部細胞の内部および間にある維管束組織中に見つかった（図５Ｂ）。
【０１４１】
接種２８日後に、ディケヤー属（Dickeya）を接種した植物において、ＤｓＲｅｄタグ付き細菌は、根の髄細胞の内部および間、ならびに幹の木部導管の内部および間に存在していた（図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。
【０１４２】
Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を接種した植物において、ＧＦＰタグ付き細菌は、根の柔組織細胞の内部および間、ならびに幹の木部導管中に存在していた（図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。
【０１４３】
Ａ３０は、種芋、根および幹の内部組織中のディケヤー属（Dickeya）を駆逐すると思われる。接種の７日後に、ディケヤー属（Dickeya）は植物組織中に存在していたが、接種の２８日後には存在しなかった。
【０１４４】
ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０による根表面のコロニー形成、続いてのＣＬＳＭ
接種の２８日後に、Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０を接種した植物からランダムに選択した根を、ＣＬＳＭを使用して分析することにより、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が、ジャガイモ植物の根にコロニー形成する能力を試験した。Ａ３０を接種した塊茎において生長した植物の根の全てが、ＧＦＰタグ付きＳ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０によって表面にコロニー形成されていた（図６を参照のこと）。ＧＦＰタグ付き細菌は、根の縦軸の根表面上に存在する塊または斑点の中に出現し、細菌が存在しないまたは低密度しか存在しない領域によって散らばっていた（図６を参照のこと）。小さいおよび／もしくは大きいならびに／または側根および主根に関しては、表面のコロニー形成に相違は全く観察されなかった（図６を参照のこと）。
【０１４５】
水対照植物のいずれにおいても、根表面にＧＦＰタグ付き細菌は検出されなかった（図６を参照のこと）。
【０１４６】
顕微鏡検査の結果から、Ａ３０株が内部寄生菌ならびに根圏生着菌であることが示された。この株は、接種７日後には、根（図５Ａを参照のこと）と幹（図５Ｂを参照のこと）の両方に見つかった。比較的小さいが、安定したＡ３０集団を形成した。Ｓ．プリムシカ（S. plymuthica）Ａ３０が、芽または傷ついた塊茎周皮を通って入る可能性も排除できないが、細菌は、おそらく根を通って植物組織に入る。本発明者らは、Ａ３０およびディケヤー属（Dickeya）両方の維管束組織中の輸送に注目した。
【０１４７】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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