(57)【要約】  サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母細胞であって、そのゲノムに少なくとも１つのｘｙｌＡ遺伝子と、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子の各々の少なくとも１つとを導入した、且つグルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖混合物の消費能を有する酵母細胞において、グルコース及びアラビノースを同時消費し、適応進化の間に獲得された遺伝的変異を有し、且つグルコースの存在下で０．２５ｇキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭ以上のキシロース比消費速度を有する細胞。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母細胞であって、そのゲノムに少なくとも１つのｘｙｌＡ遺伝子と、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子の各々の少なくとも１つとを導入した、且つグルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖混合物の消費能を有する酵母細胞であって、グルコース及びアラビノースを同時消費し、適応進化の間に獲得された遺伝的変異を有し、且つグルコースの存在下で０．２５ｇキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭ以上のキシロース比消費速度を有する細胞。
【請求項２】
前記酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記グルコースの存在下におけるキシロース比消費速度が０．３５ｇキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭ以上である、請求項１又は２に記載の酵母細胞。
【請求項４】
グルコースの存在下におけるキシロース比消費速度が０．２５〜０．６０ｇキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５】
前記ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子のコピー数が、それぞれ３又は４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
前記ｘｙｌＡのコピー数が約９又は１０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項７】
ＳＳＹ１遺伝子におけるＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子におけるＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子におけるＡ１１８６Ｇ、ＧＡＬ８０遺伝子におけるＡ４３６Ｃ及びＰＭＲ１遺伝子におけるＡ１１３Ｇの突然変異からなる群から選択される単一ヌクレオチド多型の１つ以上を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項８】
ＧＡＬ８０遺伝子における単一多型Ａ４３６Ｃを有する、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項９】
ＣＥＰ３遺伝子における単一ヌクレオチド多型Ａ１１８６Ｇも有する、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
ＰＭＲ１遺伝子における単一ヌクレオチド多型Ａ１１３Ｇを有する、請求項６又は７に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
前記酵母細胞が、０．４０ｇエタノール／ｇ糖類以上又は約０．４２ｇのエタノール／ｇ糖類の収率を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記酵母細胞が、発酵開始後０〜２４時間の間隔で計測して１．２０ｇ  ＥｔＯＨ／ｌ，ｈ以上又は約１．６９ｇ  ＥｔＯＨ／ｌ，ｈの生産性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
配列番号８の配列を有するポリペプチド及び他の位置の１つ以上に、ＳＰＣＡファミリーの既存の保存アミノ酸であるアミノ酸による前記アミノ酸の突然変異を有し得る、その変異ポリペプチド。
【請求項１４】
グルコース、ガラクトース、アラビノース及びキシロースを含む糖組成物から１つ以上の発酵生成物を生成する方法であって、前記糖組成物が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母細胞により発酵される、方法。
【請求項１５】
前記糖組成物が、
ａ）１つ以上のリグノセルロース系材料を前処理することによる前処理されたリグノセルロース系材料の生成；
ｂ）前記前処理されたリグノセルロース系材料を酵素処理することによる前記糖組成物の生成
によってリグノセルロース系材料から生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵が嫌気的に行われる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記発酵生成物が、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、及びアスパラギン酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物用飼料添加剤、特殊化学品、化学供給原料、プラスチック、溶媒、バイオ燃料及びバイオガスを含む燃料又は有機ポリマー、及び工業用酵素、例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ又はキシラナーゼからなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、アラビノース及びキシロースを含む糖類の変換能を有する酵母細胞に関する。本発明はさらに、かかる細胞がエタノールなどの発酵生成物の生成に用いられる方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ここ数十年における従来の化石燃料（石油系燃料）の大量消費は、高レベルの汚染の一因となっている。これにより、世界の化石燃料資源には限りがあるという認識及び高まりつつある環境意識と相まって、エタノールなどの代替燃料の実現可能性を調査する新たな試みが活発化している。エタノールは、粒子状物質を生じない燃焼の燃料供給源であり、毎リットル基準で無鉛ガソリンと比べて放出するＣＯ２が少ない。バイオマス由来のエタノールは、多くの異なる供給源から得られるヘキソース糖類の発酵により製造し得るが、燃料アルコールを商業規模で製造するために典型的に用いられる基質は、甘蔗糖及びコーンスターチなど、高価である。従って燃料エタノールの増産には、より低価な供給原料の使用が必要となり得る。現在、現行のエタノール製造に用いられる作物の代替とするのに十分な量で利用可能であるのは、植物バイオマス由来のリグノセルロース系供給原料のみである。ほとんどのリグノセルロース系材料には、Ｃ６糖の次に、アラビノース及びキシロースを含めた多量のＣ５糖類も含まれる。従って、経済的に見合う燃料生産プロセスとするには、ヘキソース及びペントースの双方の糖類を発酵させてエタノールを形成しなければならない。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はロバストで、エタノール製造によく適合しているものの、アラビノース及びキシロースを変換する能力がない。また、キシロース又はアラビノースを高いエタノール収率並びに高いエタノール生産性でエタノールに発酵することのできる天然に存在する生物は、知られていない。従って、リグノセルロース系供給原料からの商業的に実行可能なエタノール製造が可能となるように、これらの特性を有する生物が必要とされている。本願（欧州特許第１０１６０６４７．３号明細書及びその優先権を主張するＰＣＴ出願）の出願日現在において未公開の同時係属中の特許出願に、株ＢＩＥ２５２が記載される。この株は、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、及びマンノースを含む混合糖組成物を発酵する能力、及び発酵生成物を生成する能力がある。株ＢＩＥ２５２はこれらのいずれの糖類も変換する能力があるが、しかしほとんどの場合、グルコースが初めに消費され、他の糖類は後に消費される。グルコースと、アラビノース及びキシロースを含むＣ５糖類とを同時消費するならば、ひいては発酵時間の短縮が可能になると予想され得るため、望ましいといえる。
【０００３】
［発明の概要］
本発明の目的は、グルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖組成物の変換能を有する細胞、特に酵母細胞を提供することである。別の目的は、グルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖組成物を高収率で変換するかかる細胞を提供することである。別の目的は、Ｃ５糖とＣ６糖とを同時消費する能力があるかかる細胞を提供することである。別の目的は、高い生産性を有するかかる細胞を提供することである。さらなる目的は、遺伝的に安定なかかる細胞を提供することである。これらの目的の１つ以上が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母細胞であって、そのゲノムに少なくとも１つのｘｙｌＡ遺伝子と、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子の各々の少なくとも１つとを導入した、且つグルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖混合物の消費能を有する酵母細胞を提供する本発明によって達成され、ここでこの細胞は、グルコース及びアラビノースを同時消費し、適応進化の間に獲得された遺伝的変異を有し、且つグルコースの存在下で０．２５ｇキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭ以上のキシロース比消費速度を有する。
【０００４】
本発明の酵母細胞は、グルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖組成物の高収率での変換能を有する。さらにこの酵母細胞は、以下に定義するとおりの高い生産性を有する。これにより発酵時間の短縮が可能となる。加えて、この酵母細胞は遺伝的に安定である。このことは、酵母を工業プロセスで使用する場合に有利である。
【０００５】
ある実施形態では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、株Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ２５２の改良培養物のＳＢＲ培養系における各サイクル後の、アラビノース及びキシロースでの成長速度を示す。
【図２】図２は、ＢＡＭシステムにおける、合成培地上での株ＢＩＥ２５２の糖変換及び生成物形成を示す。ＣＯ２生成を常時計測した。培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。前培養物は２％グルコースで成長させた。
【図３】図３は、ＢＡＭシステムにおける、合成培地上での株ＢＩＥ２７２の糖変換及び生成物形成を示す。ＣＯ２生成を常時計測した。培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。前培養物は２％グルコースで成長させた。
【図４】図４は、１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳの実際の加水分解物での、ＡＦＭ発酵における株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２によるキシロース消費を示す。
【図５】図５は、１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳの実際の加水分解物での、ＡＦＭ発酵における株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２によるアラビノース消費を示す。
【図６】図６は、１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳの実際の加水分解物でＡＦＭ発酵において株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２により生成されたエタノールを示す。
【図７】図７は、１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳの実際の加水分解物でＡＦＭ発酵において株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２により生成されたＣＯ２を示す。
【図８】図８は、２０％乾燥物質の前処理した加水分解トウモロコシ茎葉における株ＢＩＥ２７２のパフォーマンスを示す。エタノール生成及び糖変換を示す。
【図９】図９は、株ＢＩＥ２７２のパフォーマンス安定性を示す。株ＢＩＥ２７２のグリセロールストックから直接単離した２つのコロニー、及び１０、１９、２８、３７及び４６世代にわたりＹＥＰ  ２％グルコースで培養した後の６つのコロニーを、２％キシロースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地上で成長するそれらの能力について試験した。バーの灰色の部分は、基準株ＢＩＥ２７２より良好か又はそれと同等のキシロース成長を示すコロニーの数を表す。バーの黒色の部分は、遅れているコロニーの数を示す。実験はデュプリケートで行った。左側のパネルは振盪フラスコ１の結果を表し、右側のパネルは振盪フラスコ２の結果を表す。
【図１０】図１０は、臭化エチジウムで染色したＣＨＥＦゲルを示す。染色体は、そのサイズに基づきＣＨＥＦ技法を用いて分離した。分析した株は、ＢＩＥ１０４；ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の別名）；ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ；株ＢＩＥ２０１；ＢＩＥ２０１Ｘ９；ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２である。染色体のシフトが観察される（本文参照）。株ＹＮＮ２９５は、染色体サイズの基準として用いたマーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。
【図１１】図１１は、膜にブロットしてＰＮＣ１プローブとハイブリダイズした、ＣＨＥＦゲルのオートラジオグラムを示す。分析した株は、ＢＩＥ１０４；ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の別名）；ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ；株ＢＩＥ２０１；ＢＩＥ２０１Ｘ９；ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２である。染色体のシフトが観察される（本文参照）。
【図１２】図１２は、膜にブロットしてＡＣＴ１プローブ（左側のパネル、ａ）及びｘｙｌＡプローブ（右側のパネル、ｂ）とハイブリダイズした、ＣＨＥＦゲルのオートラジオグラムを示す。分析した株は、ＢＩＥ１０４；ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の別名）；ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ；株ＢＩＥ２０１；ＢＩＥ２０１Ｘ９；ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２である。染色体のシフトが観察される（本文参照）。
【図１３】図１３は、株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ２０１、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のＣＯ２生成速度（毎分のｍｌ  ＣＯ２単位）を示す。
【図１４】図１４は、株ＢＩＥ１０４及びＢＩＥ２０１のＣＯ２生成速度（毎分のｍｌ  ＣＯ２単位）を示す。
【図１５】図１５は、株ＢＩＥ２０１及びＢＩＥ２５２のＣＯ２生成速度（毎分のｍｌ  ＣＯ２単位）を示す。
【図１６】図１６は、株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のＣＯ２生成速度（毎分のｍｌ  ＣＯ２単位）を示す。
【図１７】図１７は、ＢＡＭシステムにおける、合成培地上での株ＢＩＥ１０４の糖変換及び生成物形成を示す。ＣＯ２生成を常時計測した。培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。
【図１８】図１８は、ＢＡＭシステムにおける、合成培地上での株ＢＩＥ２０１の糖変換及び生成物形成を示す。ＣＯ２生成を常時計測した。培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。
【図１９】図１９は、ＢＡＭシステムにおける、合成培地上での株ＢＩＥ２５２の糖変換及び生成物形成を示す。ＣＯ２生成を常時計測した。培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。
【図２０】図２０は、ＢＡＭシステムにおける、合成培地上での株ＢＩＥ２７２の糖変換及び生成物形成を示す。ＣＯ２生成を常時計測した。培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。
【図２１】図２１は、ＰＭＡ１遺伝子の正規化した読みの深さ（又はカバレッジ）を示す。
【図２２】図２２は、ｘｙｌＡ遺伝子の正規化した読みの深さ（又はカバレッジ）を示す。
【０００７】
［配列表の簡単な説明］
配列番号１：  合成ＤＮＡ、フォワードプライマーｘｙｌＡ、ＣＡＣＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＧＣ
配列番号２  合成ＤＮＡ、リバースプライマーｘｙｌＡ、ＣＡＣＴＴＴＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＴＴＧＧＣ
配列番号３  合成ＤＮＡ、フォワードプライマーＡＣＴ１、ＧＴＴＡＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧ
配列番号４  合成ＤＮＡ、リバースプライマーＡＣＴ１、ＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＡＴＧＧ
配列番号５  合成ＤＮＡ、フォワードプライマーＰＮＣ１、ＧＡＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＴＧ
配列番号６  合成ＤＮＡ、リバースプライマーＰＮＣ１、ＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＣ
配列番号７  野生型ＰＭＲ１タンパク質配列
配列番号８  酵母株ＢＩＥ２７２のＰＭＲ１タンパク質配列
【０００８】
［本発明の詳細な説明］
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」並びに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「〜を包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変化形は、包含的に解釈されるべきである。すなわちこれらの語句には、文脈上許容される場合に、具体的に記載されない他の要素又は完全体を包含する可能性があることを知らせる意図がある。
【０００９】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１つの又は１つより多い（すなわち１つ又は少なくとも１つの）その冠詞の文法的対象を指して使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味し得る。
【００１０】
単数又は複数の酵母細胞は、本明細書では酵母株とも称され得る。
【００１１】
本明細書に記載される本発明の様々な実施形態は、互いに組み合わされてもよい。
【００１２】
本発明は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母細胞であって、そのゲノムに少なくとも１つのｘｙｌＡ遺伝子と、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子の各々の少なくとも１つとを導入した、且つグルコース、キシロース及びアラビノースを含む混合糖混合物の消費能を有する酵母細胞に関し、ここで細胞はグルコース及びアラビノースを同時消費し、グルコースの存在下におけるキシロース比消費速度は０．２５ｇキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭ以上である。本明細書においてＤＭは、乾燥酵母バイオマスである。
【００１３】
ある実施形態では、グルコースの存在下におけるキシロース比消費速度は、０．２５ｇ以上、０．３０ｇ以上、０．３５ｇ以上、０．４０ｇ以上、又は約０．４１ｇのキシロース／ｈ，ｇ  ＤＭである。ある実施形態では、グルコースの存在下におけるキシロース比消費速度は、０．２５〜０．６０ｇアラビノース／ｈ／ｇ  ＤＭである。ある実施形態では、酵母細胞は、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子のコピー数が各々３又は４である。別の実施形態では、酵母細胞のｘｙｌＡコピー数は約９又は１０である。
【００１４】
別の実施形態では、酵母細胞は、ＳＳＹ１遺伝子におけるＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子におけるＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子におけるＡ１１８６Ｇ、ＧＡＬ８０遺伝子におけるＡ４３６Ｃ及びＰＭＲ１遺伝子におけるＡ１１３Ｇの突然変異からなる群から選択される単一ヌクレオチド多型の１つ以上を有する。
【００１５】
ある実施形態では、酵母細胞は、ＧＡＬ８０遺伝子における単一多型Ａ４３６Ｃを有する。場合により酵母細胞は、ＣＥＰ３遺伝子における単一ヌクレオチド多型Ａ１１８６Ｇ又はＰＭＲ１遺伝子における単一ヌクレオチド多型Ａ１１３Ｇも有する。
【００１６】
ある実施形態では、酵母細胞は、０．４０ｇ以上又は約０．４２ｇのエタノール／ｇ糖の収率を有する。別の実施形態では、酵母細胞は、１．２０ｇ以上のＥｔＯＨ／ｌ，ｈの生産性を有する。ある実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｔ）では酵母細胞は、１．２５ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．３５ｇ以上、１．４０ｇ以上、１．４５ｇ以上、１．５０ｇ以上、１．５５ｇ以上、１．６０ｇ以上又は１．６５ｇ以上のＥｔＯＨ／ｌ，ｈの生産性を有する。ある実施形態では酵母細胞は、約１．６９ｇ  ＥｔＯＨ／ｌ，ｈの生産性を有する。生産性は、本明細書では、発酵開始後０〜２４時間の間隔で計測される。また他の時間間隔でも、酵母細胞の生産性は高い。表１１を参照のこと。
【００１７】
本発明はさらに、ＰＭＲ１に置換Ｔｙｒ３８Ｃｙｓを有する配列番号７のアミノ酸配列であって、その結果配列番号８となるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び他の位置の１つ以上に、ＳＰＣＡ（分泌経路カルシウムＡＴＰアーゼ）ファミリーにおける既存の保存アミノ酸であるアミノ酸による当該アミノ酸の突然変異を有し得る、その変異ポリペプチドに関する。本発明はさらに、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース及びマンノースを含む糖組成物からの１つ以上の発酵生成物の生成方法に関し、ここで糖組成物は、本発明に係る酵母細胞により発酵される。この方法のある実施形態では、糖組成物はリグノセルロース系材料から、以下によって生成される：１つ以上のリグノセルロース系材料を前処理することによる前処理されたリグノセルロース系材料の生成；前処理されたリグノセルロース系材料を酵素処理することによる糖組成物の生成。
【００１８】
別の実施形態では、この方法において発酵は嫌気的に行われる。発酵生成物は、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、及びアスパラギン酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物用飼料添加剤、特殊化学品、化学供給原料、プラスチック、溶媒、バイオ燃料及びバイオガスを含む燃料又は有機ポリマー、及び工業用酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ又はキシラナーゼからなる群から選択され得る。
【００１９】
ある実施形態では、酵母細胞は、宿主株と比較して増幅された染色体を有し、ここで増幅された染色体は、宿主株においてａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子が導入された染色体と同じ番号を有する。ある実施形態では、増幅された染色体は７番染色体である。ある実施形態では、７番染色体の、セントロメアを取り囲む酵母細胞部分において、増幅される（宿主株と比較したとき）。ある実施形態では、７番染色体の右腕の一部が２回増幅されたとともに、隣接する一部が３回増幅された。
【００２０】
３回増幅された、７番染色体の右腕の一部は、アラビノース発現カセット、すなわち強力な構成的プロモーターの制御下にある遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤを含む。
【００２１】
本発明はさらに、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子を有する酵母細胞に関し、ここで７番染色体のサイズは、電気泳動法により以下に記載するとおり計測して決定するとき、１３００〜１４００ｋｂ、又は１３７５ｋｂである。
【００２２】
ある実施形態では、酵母細胞において、ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子のコピー数は、各々、２〜１０、ある実施形態では２〜８又は３〜５である。ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子のコピー数は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であってもよい。コピー数は、当業者に公知の方法により決定することができ、好適な方法は本例に例示され、及び結果が、例えば図５に示される。
【００２３】
ある実施形態では、酵母細胞  ＳＳＹ１遺伝子におけるＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子におけるＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子におけるＡ１１８６Ｇ、ＧＡＬ８０遺伝子におけるＡ４３６Ｃ及びＰＭＲ１におけるＡ１１３Ｇの突然変異からなる群から選択される単一ヌクレオチド多型の１つ以上。ある実施形態では、酵母細胞は、ＧＡＬ８０遺伝子における単一多型Ａ４３６Ｃを有する。ある実施形態では、酵母細胞は、ＣＥＰ３遺伝子における単一多型Ａ１１８６Ｇを有する。ある実施形態では、酵母細胞は、ＰＭＲ１における単一多型Ａ１１３Ｇを有する。
【００２４】
［適応］
適応は、個体群がその１つ又は複数の生息地に対してより好適となる（適応する）進化過程である。この過程は数世代乃至多数の世代にわたって起こり、生物学の基本的現象の一つである。
【００２５】
適応という用語はまた、生物の生存にとって特に重要な特徴も指す。かかる適応は、変異する個体群において、自然選択により、繁殖成功を高めるのにより好適な形態によって生じる。
【００２６】
環境条件の変化により自然選択の結果が変わり、新しい条件下における生物の適応度を向上させる続く適応の選択的利益に影響が及ぶ。極度の環境変化があった場合、有益な適応の出現及び固定化が生存に必須であり得る。数多くの異なる要因、例えば栄養素利用性、温度、酸素利用性等が、適応進化を推進し得る。
【００２７】
例えば、アラビノース（全てまとめてＡＲＡと表す）の発酵に必須の、又はその発酵能力を増強する遺伝子で形質転換された半数体酵母株は、適応進化と呼ばれる過程によって増強された。適応進化プロセスの間に、ｍｕｔ１、ｍｕｔ２及びｍｕｔ３と命名される３つの突然変異がゲノムに導入されている。かかる酵母株の遺伝子型は、ｍｕｔ１  ｍｕｔ２  ｍｕｔ３  ＡＲＡと書くことができる。
【００２８】
［適応度］
適応性（生物が所与の生息地で生存及び繁殖することが可能な程度）と適応度との間には、明らかな関係がある。適応度は、自然選択率の推定量及び予測因子である。自然選択の適用により、時間が経つと代替表現型の相対頻度は、それらの表現型が遺伝性である場合には、変化し得る。
【００２９】
［遺伝的変化／変異］
自然選択が個体群の遺伝的変異性に作用する場合、遺伝的変化が、基礎にある機序である。これによって個体群はその環境に遺伝的に適応する。遺伝的変化は、目に見える構造をもたらすこともあり、又は生物の生理学的活性を生息地の変化に適合する形で調整することもある。
【００３０】
生息地の頻繁な変化が起こり得る。従って適応の過程はいつになっても完了しないということになる。時間が経つと、環境の変化が漸進的になり、種がその外界にますます良好に適合していくことも起こり得る。他方で、環境の変化が比較的急激に起こり、ひいては種が次第に適応しなくなることも起こり得る。適応は遺伝的過程であり、ある程度は常に、また個体群が生息地又は環境を変えないときにも進行している。
【００３１】
ＤＮＡ配列における単一のヌクレオチドを変更し（置換）、除去し（欠失）又は付加する（挿入）ことができる。挿入又は欠失ＳＮＰ（インデル）では、翻訳フレームがシフトし得る。
【００３２】
単一ヌクレオチド多型は、遺伝子のコード配列（オープンリーディングフレーム又はＯＲＦ）の範囲内、遺伝子の非コード領域（プロモーター配列、ターミネーター配列などのような）の範囲内、又は遺伝子の間の遺伝子間領域にあり得る。コード配列の範囲内のＳＮＰは、遺伝子コードの縮重に起因して、転写及び翻訳後に生じる対応するタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させるものではない。両方の形態が同じポリペプチド配列に至るＳＮＰは、同義的（サイレント突然変異）と称される。異なるポリペプチド配列が生じる場合、それらは非同義的である。非同義変化はミスセンス又はナンセンスのいずれかであり得る。ミスセンス変化は対応するポリペプチドに異なるアミノ酸をもたらし、一方ナンセンス変化は中途での終止コドンをもたらし、ときにトランケート型タンパク質の形成に至る。
【００３３】
タンパク質コード領域にないＳＮＰもなお、例えば転写因子結合又は対応するｍＲＮＡの安定性の変化により、遺伝子発現に影響を及ぼし得る。
【００３４】
ＤＮＡで起こり得る変化は、必ずしも単一ヌクレオチドの変化（置換、欠失又は挿入）に限られず、２つ以上のヌクレオチドの変化（小さい核変異（Ｓｍａｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ））もまた含み得る。
【００３５】
加えて、染色体転座が起こり得る。染色体転座は、非相同染色体間の一部の再配列によって引き起こされる染色体異常である。
【００３６】
特に、本発明に係る細胞においては、ＳＮＰが以下のリーディングフレームに作られる：ＳＳＹ１、ＣＥＰ３、ＧＡＬ８０及びＰＭＲ１。
【００３７】
ＳＳＹ１は、本明細書ではＳＰＳ細胞膜アミノ酸感知系（Ｓｓｙ１ｐ−Ｐｔｒ３ｐ−Ｓｓｙ５ｐ）の一成分である。この感知系は外部のアミノ酸濃度を感知して細胞内シグナルを伝達するもので、アミノ酸透過酵素遺伝子の発現の調節をもたらす。
【００３８】
ＣＥＰ３は、本明細書では、セントロメアのＣＤＥＩＩＩ領域に結合するＣＢＦ３複合体の成分である必須動原体タンパク質であり；Ｎ末端Ｚｎ２Ｃｙｓ６型ジンクフィンガードメイン、Ｃ末端酸性ドメイン、及び推定コイルドコイル二量化ドメインを含む。
【００３９】
ＧＡＬ８０は、本明細書では、ガラクトースの非存在下におけるＧＡＬ遺伝子の抑制に関与する転写調節因子である。典型的には、ＧＡＬ８０はＧａｌ４ｐによる転写活性化を阻害し、阻害はＧａｌ３ｐ又はＧａｌ１ｐ結合により軽減される。
【００４０】
ＰＭＲ１（系統名ＹＧＬ１６７ｃ）は、本明細書では、ゴルジへのＣａ２＋及びＭｎ２＋輸送に必要な高親和性Ｃａ２＋／Ｍｎ２＋  Ｐ型ＡＴＰアーゼである；Ｃａ２＋依存性タンパク質の選別及びプロセシングに関与する。Ｐｍｒ１ｐは、メンバーが真菌、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及び哺乳類に見出されるＳＰＣＡ（分泌経路Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ）として知られる輸送体ファミリーのプロトタイプである。
【００４１】
本発明によれば、遺伝子ＳＳＹ１、ＣＥＰ３、ＧＡＬ８０及びＰＭＲ１におけるＳＮＰは、細胞が混合糖組成物を発酵可能であるために重要であることが示されている。
【００４２】
これらの遺伝子に見られるＳＮＰのＢＬＡＳＴ検索を実施した。
【００４３】
同定されたＳＮＰの概要を表１に提供する：
【００４４】
【表１】
2014512818.tif 000002
【００４５】
ＳＮＰを含む遺伝子のｂｌａｓｔ検索により、以下のデータが得られた：
【００４６】
［Ｓｓｙ１ｐ（ＡＡトランススーパーファミリーのメンバー）］
ＳＰＳ細胞膜アミノ酸感知系（Ｓｓｙ１ｐ−Ｐｔｒ３ｐ−Ｓｓｙ５ｐ）の成分、この感知系は外部アミノ酸濃度を感知して細胞内シグナルを伝達するもので、アミノ酸透過酵素遺伝子の発現の調節をもたらす［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］
【００４７】
【表２】
2014512818.tif 000003
【００４８】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ２０１に見られるより短いタンパク質が、ユニークな特徴である。
【００４９】
［ＹＪＲ１５４ｗ（ＰｈｙＨスーパーファミリーのメンバー）］
未知の機能の推定タンパク質；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質が細胞質に局在する［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］
【００５０】
【表３】
2014512818.tif 000004
【００５１】
これらのタンパク質全てにおいて、１７１位のＤ残基（又はＢＬＡＳＴ結果に基づく等価な位置）は保存されている。
【００５２】
［ＣＥＰ３（ＧＡＬ４様Ｚｎ２Ｃｙｓ６二核クラスターＤＮＡ結合ドメイン；ＧＡＬ４などの転写調節因子に見られる）］
セントロメアＤＮＡ結合タンパク質複合体ＣＢＦ３サブユニットＢ
【００５３】
【表４】
2014512818.tif 000005
【００５４】
これらのタンパク質全てにおいて、３９６位のＳ残基（又はＢＬＡＳＴ結果に基づく等価な位置）は保存されている。
【００５５】
［ＧＡＬ８０（ＮＡＤＢロスマンスーパーファミリーのメンバー）］
ガラクトース／ラクトース代謝調節タンパク質ＧＡＬ８０
【００５６】
【表５】
2014512818.tif 000006
【００５７】
これらのタンパク質全てにおいて、１４６位のＴ残基（又はＢＬＡＳＴ結果に基づく等価な位置）は保存されている。
【００５８】
［株ＢＩＥ２７２（ファミリーＳＰＣＡ（分泌経路Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ）のメンバー由来のＰＭＲ１］
【００５９】
【表６】
2014512818.tif 000007
【００６０】
［構造変異］
構造変異（またゲノム構造変異）は、１つの種のゲノムにおける多くの種類の変異からなり、通常、欠失、重複、コピー数変異、挿入、逆位及び転座などの顕微鏡的及び超顕微鏡的なタイプが含まれる。
【００６１】
［読みの深さ］
読みの深さ（又はカバレッジ）は、次世代シーケンシング構築のある部分に寄与する（平均）ヌクレオチド数に相当する。読みの深さは、各塩基が読まれた回数を表す。読みの深さはゲノム領域によって異なる。読みの深さの平均もまた、ストリンジェンシー及び読みの質などのマッピング基準によって異なり得る。
【００６２】
ゲノム領域の平均シーケンシング深さが配列間で比較される。これにより、過剰又は過少に出現する領域の検出が可能となる。
【００６３】
［コピー数変異］
コピー数変異（ＣＮＶ）は、挿入、欠失及び重複を含む、構造変異の大分類である。
【００６４】
［単一ヌクレオチド多型］
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ゲノム（又は他の共通配列）の単一のヌクレオチド−Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ−が、生物学的種のメンバー間又は個々の細胞の対になった染色体間で異なるときに起こるＤＮＡ配列変異である。
【００６５】
単一ヌクレオチド多型は、遺伝子のコード配列、遺伝子非コード領域の範囲内、又は遺伝子の間の遺伝子間領域にあり得る。コード配列の範囲内のＳＮＰは、遺伝子コードの縮重に起因して、必ずしも産生されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものではない。
【００６６】
［インデル又はＤＩＰ］
進化研究では、インデルは挿入又は欠失を意味して用いられる。インデルは、挿入、欠失の双方、及びそれらの組み合わせを含む突然変異クラスを指す。
【００６７】
［パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）］
ＰＦＧＥは、方向が周期的に変化する電場をゲルマトリックスに印加することによる大型のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の分離に用いられる技法である。ＰＦＧＥは、様々な代替システム、例えば、横断交替パルスフィールド電気泳動（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＴＡＦＥ）、直交電場交替ゲル電気泳動（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｆｉｅｌｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＯＦＡＧＥ）、電場反転ゲル電気泳動（Ｆｉｅｌｄ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＦＩＧＥ）及びコンタークランプ均一電場（Ｃｏｎｔｏｕｒ−ｃｌａｍｐｅｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄ：ＣＨＥＦ）ゲル電気泳動を用いて実施することができる。Ｂａｓｉｍ  ａｎｄ  Ｂａｓｉｍ（Ｔｕｒｋ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  ２５（２００１）４０５−４１８）及びその中の参考文献により概説されるとおり、各方法には、使い易さ、電気泳動法の実施にかかる時間、及び染色体の分解能に関して、その利点と欠点がある。
【００６８】
ＣＨＥＦゲル電気泳動は、１つのゲル上でサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母株の染色体１００〜２５００ｋｂの実質的な染色体分離を生じさせることができるが、それより大きいサイズの染色体及びサイズが類似した染色体については、全てを分解するわけではない（Ｓｈｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，Ｖｏｌ．９７，１６３−１６７）。
【００６９】
［混合糖組成物］
本発明に係る糖組成物は、グルコース、アラビノース及びキシロースを含む。そのような基準を満たす任意の糖組成物を本発明において使用することができる。糖組成物における任意選択の糖類は、ガラクトース及びマンノース、及びラムノースである。好ましい実施形態において、糖組成物は、１つ以上のリグノセルロース系材料の加水分解物である。本明細書におけるリグノセルロースには、ヘミセルロース及びバイオマスのヘミセルロース部分が含まれる。また、リグノセルロースには、バイオマスのリグノセルロース系画分も含まれる。好適なリグノセルロース系材料は、以下のリストに見出すことができる：果樹園の剪定材（ｐｒｉｍｉｎｇｓ）、シャパラル、製粉廃棄物、都市木材廃棄物、都市廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐材、短期輪作木質作物、産業廃棄物、小麦わら、えん麦わら、稲わら、大麦わら、ライ麦わら、亜麻わら、大豆皮、もみ殻、トウモロコシグルテン飼料、えん麦殻、サトウキビ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ稈、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮、スイッチグラス、茅、スイートソルガム、カノーラの茎、大豆の茎、プレーリー草、ガマグラス（ｇａｍａｇｒａｓｓ）、エノコログサ；テンサイパルプ、柑橘類パルプ、種子殻、セルロース系家畜糞尿、刈り取った芝生、綿、海草、樹木、針葉樹、広葉樹、ポプラ、マツ、低木、草類、小麦、小麦わら、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシカーネル、カーネル由来の繊維、穀粒の湿式又は乾式製粉からの生成物及び副生成物、都市固形廃棄物、古紙、庭ごみ、草本材料、農業残渣、林業残渣、パルプ、製紙残渣、枝、低木、トウ、エネルギー作物、森林、果実、花、穀粒、草、草本作物、葉、樹皮、針葉、荒材、根、若木、灌木、スイッチグラス、樹木、野菜、果皮、つる、テンサイパルプ、小麦ミドリング粉（ｍｉｄｌｉｎｇｓ）、農業プロセスから生じる有機廃棄材料、林業の木材廃棄物、又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせ。ある実施形態では、リグノセルロース系材料は、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、コメ又は草、例えばトウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、トウモロコシ穂軸、小麦わら、もみ殻、サトウキビバガス又は種々の草類又は他のエネルギー作物由来である。
【００７０】
リグノセルロースに由来するいくつかの好適な糖組成物及びそれらの加水分解物の糖組成の概要を、表２に提供する。掲載されるリグノセルロースには、以下が含まれる：トウモロコシ穂軸、トウモロコシ繊維、もみ殻、メロンの皮、テンサイパルプ、小麦わら、サトウキビバガス、木材、草及びオリーブ圧搾物。
【００７１】
【表７】
2014512818.tif 000008
【００７２】
表２から、これらのリグノセルロースには、グルコース、キシロース、アラビノース及びガラクトースの形態で多量の糖が存在することが明らかである。従って、グルコース、キシロース、アラビノース及びガラクトースからの発酵生成物への変換は、経済的に極めて重要である。また一部のリグノセルロース材料には、先述の糖類と比べて量が少ないとはいえ、マンノース及びラムノースも存在する。従って有利には、マンノース及びラムノースもまた混合糖細胞により変換される。
【００７３】
［前処理及び酵素加水分解］
本発明により発酵され得る糖類をリグノセルロース系（ヘミセルロース系を含む）材料から遊離させるには、前処理及び酵素加水分解が必要となり得る。これらのステップは、従来の方法によって行われ得る。
【００７４】
［混合糖細胞］
以下に定義するとおりの混合糖（ｍｉｘｅｄ  ｓｕｇｅｒ）細胞ゲノムに組み込まれた遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤを含む混合糖細胞。これは、グルコース、アラビノース、キシロース、ガラクトース及びマンノースを発酵する能力がある。本発明の一実施形態において、混合糖細胞は、１つ以上のさらなる糖、好ましくはＣ５糖及び／又はＣ６糖を発酵する能力がある。本発明のある実施形態において、混合糖細胞は以下の１つ以上を含む：混合糖細胞によるキシロースの発酵を可能にするｘｙｌＡ遺伝子及び／又はＸＫＳ１遺伝子；アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞のペントースリン酸パスウェイ（ｐａｓｓ−ｗａｙ）を通る流束の増加を可能にするＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１及びＲＫＩ１の過剰発現。
【００７５】
［混合糖株の構築］
宿主細胞への以下の導入：
ａ）強力なプロモーターの制御下にある、ＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１及びＲＫＩ１からなるクラスター；
ｂ）双方とも構成的プロモーターの制御下にあるｘｙｌＡ遺伝子及びＸＫＳ１遺伝子からなるクラスター、
ｃ）遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤからなるクラスター及び／又はｘｙｌＡ遺伝子及び／又はＸＫＳ１遺伝子のクラスター；
及び
ｄ）アルドースレダクターゼ遺伝子の欠失
並びに適応進化により混合糖細胞に遺伝子を導入して混合糖細胞を作製し得る。上記の細胞は、組換え発現技術を用いて構築されてもよい。
ｅ）単一コロニー単離物をサンプリングする
ｆ）単一コロニー単離物を連続バッチ反応器において適応進化に供する
ｇ）単一コロニー単離物をサンプリングする
ｈ）単一コロニー単離物をそれらの糖消費特性について特徴付ける。
【００７６】
これらのステップについて以下に詳細に記載する。
【００７７】
［組換え発現］
本発明の細胞は組換え細胞である。すなわち、本発明の細胞は、当該の細胞に天然に存在しないヌクレオチド配列を含むか、又はそれで形質転換されるか、又はそれで遺伝子修飾される。
【００７８】
細胞における酵素の組換え発現技術、並びに本発明の細胞のさらなる遺伝子修飾技術は、当業者に公知である。典型的にはかかる技術には、関連する配列を含む核酸コンストラクトによる細胞の形質転換が関わる。かかる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、又はＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）などの標準的なハンドブックから公知である。菌類宿主細胞の形質転換及び遺伝子修飾方法は、例えば欧州特許出願公開第Ａ−０６３５  ５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書及び米国特許第６，２６５，１８６号明細書から公知である。
【００７９】
典型的には、核酸コンストラクトはプラスミド、例えば低コピープラスミド又は高コピープラスミドであってよい。本発明に係る細胞は、例えばヌクレオチドコンストラクトの複数のコピーによるか、又は酵素配列の複数のコピーを有するコンストラクトの使用により、酵素をコードするヌクレオチド配列の単一の又は複数のコピーを含み得る。
【００８０】
核酸コンストラクトはエピソームに保持され、従って常染色体複製配列の配列などの自己複製配列を含み得る。好適なエピソーム性核酸コンストラクトは、例えば、酵母２μプラスミド又はｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）、又はＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）に基づき得る。或いは、各核酸コンストラクトは、１つ以上のコピーで細胞のゲノムに組み込まれてもよい。細胞のゲノムへの組み込みは、非相同組換えによりランダムに行われてもよく、しかし好ましくは、核酸コンストラクトは、当該技術分野において公知のとおり相同組換えによって細胞のゲノムに組み込まれ得る（例えば国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５  ５７４号明細書及び米国特許第６，２６５，１８６号明細書を参照のこと）。
【００８１】
多くのエピソームプラスミド又は２μプラスミドは比較的不安定であり、世代を経る毎に約１０−２以上の細胞において失われる。選択的成長の条件下であっても、細胞の６０％〜９５％がエピソームプラスミドを維持するに過ぎない。多くのエピソームプラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主の細胞あたり１０〜４０の範囲である。しかしながら、これらのプラスミドは細胞間に均等に分布するわけではなく、個体群における細胞あたりのコピー数には大きいばらつきがある。組込みプラスミドで形質転換された株は、選択圧がなくても極めて安定している。しかしながらプラスミド損失は、縦列反復ＤＮＡ間の相同組換えにより約１０−３〜１０−４の頻度で起こり、ベクター配列からループアウトすることになり得る。従って、好ましくは、安定に組み込む場合のベクター設計は、選択マーカー遺伝子の喪失時に（これもまた分子内相同組換えにより起こる）、組み込まれたコンストラクトのそうしたループアウトがもはや不可能なものである。このように好ましくは遺伝子は安定に組み込まれる。安定な組み込みは、本明細書では、組み込まれたコンストラクトのループアウトがもはや不可能な場合のゲノムへの組み込みとして定義される。好ましくは選択マーカーは存在しない。典型的には、酵素コード配列は、酵素配列の転写及び／又は翻訳を提供又は促進することが可能な１つ以上の核酸配列に作動可能に連結され得る。
【００８２】
用語「作動可能に連結された」は、記載される構成要素が、それらの構成要素のその意図された形での働きを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサーはコード配列に作動可能に連結され、前記プロモーター又はエンハンサーはコード配列の転写に影響を与える。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する１つ以上の遺伝子の転写を調節するように機能する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位及び当業者に周知されている任意の他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、多くの環境及び発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境及び発生調節下で活性なプロモーターである。
【００８４】
本発明に係る酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を実現するために用いることのできるプロモーターは、その発現させる酵素をコードするヌクレオチド配列にとって天然でなくてもよく、すなわちそのプロモーターが作動可能に連結されるヌクレオチド配列（コード配列）にとって異種のプロモーターであってもよい。しかしながら、プロモーターは宿主細胞にとって同種、すなわち内因性であってもよい。
【００８５】
プロモーターは広く入手可能であり、当業者に周知されている。かかるプロモーターの好適な例としては、例えば、酵母又は糸状菌類由来のホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３又はＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどの、解糖系遺伝子由来のプロモーターが挙げられる；酵母由来のかかるプロモーターに関するさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見出すことができる。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質コード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨＩ、ＡＤＨ４など）、及びエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。構成的及び誘導性の双方の他のプロモーター、及びエンハンサー又は上流活性化配列が、当業者に周知されている。本発明の宿主細胞に用いられるプロモーターは、必要であれば、その調節特性に影響を与えるように修飾してもよい。これに関連して好適なプロモーターには、構成的及び誘導性の双方の天然のプロモーター、並びに操作されたプロモーターが含まれ、それらは当業者に周知されている。真核生物宿主細胞において好適なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、又はＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ１、ＴＰＩ１、及びＡＯＸ１であり得る。他の好適なプロモーターには、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、及びＴＤＨ３が含まれる。
【００８６】
本発明の細胞において、酵素をコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は、好ましくは転写ターミネーター配列に作動可能に連結される。好ましくはターミネーター配列は、選択の宿主細胞、例えば選択の酵母種において作動可能である。いずれの場合にもターミネーターの選択は、決定的に重要なものではない；それは、例えば任意の酵母遺伝子由来であってよく、しかしながらターミネーターは、非酵母の真核生物遺伝子由来の場合、ときに機能し得る。通常、酵素をコードするヌクレオチド配列はターミネーターを含む。好ましくは、かかるターミネーターは、本発明の宿主細胞におけるナンセンス媒介性ｍＲＮＡ分解を阻止する突然変異と組み合わされる（例えば、Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２を参照のこと）。
【００８７】
転写終結配列は、さらに好ましくはポリアデニル化シグナルを含む。
【００８８】
場合により、本発明での使用に好適な核酸コンストラクトには、選択可能なマーカーが存在し得る。本明細書で使用されるとき、用語「マーカー」は、そのマーカーを含む宿主細胞の選択、又はそのスクリーニングを可能にする形質又は表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であってもよく、それにより適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞の中から形質転換された細胞を選択することができる。好適な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシン及びＧ４１８耐性）が挙げられる。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換に最も好都合であり得るが、栄養要求マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰＩ、ＬＥＵ２）又はＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ  Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ  ４０：１２５−１３０により記載される）などの非抗生物質耐性マーカーもまた用いられ得る。好ましい実施形態において、核酸コンストラクトで形質転換された宿主細胞は、マーカー遺伝子を含まない。マーカー遺伝子を含まない組換え微生物宿主細胞の構築方法は、欧州特許出願公開第Ａ−Ｏ  ６３５  ５７４号明細書に開示され、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子又は酵母ＵＲＡ３及びＬＹＳ２遺伝子などの双方向性マーカーの使用に基づく。或いは、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーを本発明の核酸コンストラクトに取り込み、形質転換細胞の選別を可能にしてもよい。
【００８９】
本発明での使用に好適な、核酸コンストラクトに存在してもよい任意選択のさらなるエレメントとしては、限定はされないが、１つ以上のリーダー配列、エンハンサー、組込み因子、及び／又はレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア及び／又はマトリックス結合（ＭＡＲ）配列が挙げられる。本発明の核酸コンストラクトは、ＡＲＳ配列などの自己複製配列をさらに含み得る。
【００９０】
このように組換えプロセスは、公知の組換え技法で実行されてもよい。本発明の細胞における酵素の発現及び過剰発現に対して、様々な手段が当業者に公知である。特に、宿主細胞におけるその酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、例えば、遺伝子のさらなるコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによるか、エピソーム多コピー発現ベクターから遺伝子を発現させることによるか、又は遺伝子の複数のコピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することにより、酵素を過剰発現させてもよい。
【００９１】
或いは、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現させるその酵素をコードする配列にとって天然でないプロモーター、すなわちそれが作動可能に連結されるコード配列にとって異種のプロモーターを用いて実現してもよい。プロモーターは好ましくは、それが作動可能に連結されるコード配列にとって異種であるが、プロモーターが宿主細胞にとって同種である、すなわち内因性であることもまた好ましい。好ましくは異種プロモーターは、コード配列にとって天然のプロモーターと比べて、コード配列を含む転写物のより高い定常状態レベルを生じさせる能力を有する（又は単位時間あたりにより多い転写物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を産生する能力を有する）。これに関連して好適なプロモーターには、構成的及び誘導性の双方の天然プロモーター並びに操作されたプロモーターが含まれる。
【００９２】
上述の酵素の過剰発現に用いられるコード配列は、好ましくは本発明の宿主細胞にとって同種であり得る。しかしながら、本発明の宿主細胞にとって異種のコード配列が用いられてもよい。
【００９３】
酵素の過剰発現とは、遺伝子修飾された細胞における酵素の産生に関連するとき、同じ条件下の非修飾宿主細胞と比較したとき、その酵素がより高い比酵素活性レベルで産生されることを意味する。通常これは、同じ条件下の非修飾宿主細胞と比較したとき、その酵素的に活性なタンパク質（又はマルチサブユニット酵素の場合、複数のタンパク質）がより多量に産生される、又はむしろより高い定常状態レベルで産生されることを意味する。同様にこれは、通常、同じ条件下の非修飾宿主細胞と比較したとき、酵素的に活性なタンパク質をコードするｍＲＮＡがより多量に産生される、又はここでもむしろより高い定常状態レベルで産生されることを意味する。好ましくは本発明の宿主細胞において、過剰発現させる酵素は、過剰発現を生じさせる遺伝子修飾を除いては遺伝的に同一の株と比較したとき、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍又は約２０倍過剰発現する。これらの過剰発現レベルは、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベル並びに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用され得ることが理解されるべきである。
【００９４】
［適応進化］
混合糖細胞は、その調製において適応進化に供される。本発明の細胞は、所望の糖上での好ましくはそれを単一炭素源とした、及びより好ましくは嫌気性条件下での成長について、自発的なものであれ、或いは誘導（例えば放射線又は化学物質により）されたものであれ、突然変異体を選択することにより、糖利用に適応され得る。突然変異体の選択は、例えばＫｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）により記載される培養物の連続継代を含む技法によるか、又は選択圧下におけるケモスタット培養での培養により実施されてもよい。例えば本発明の好ましい宿主細胞では、突然変異体の選択により得られる修飾を含めた、上記に記載される遺伝子修飾の少なくとも１つが、キシロース上でそれを炭素源として、好ましくは単一炭素源として、及び好ましくは嫌気性条件下で成長する能力を宿主細胞に付与する。好ましくは細胞は、本質的にキシリトールを生成しない、例えば生成されるキシリトールは検出限界未満、又は例えばモル基準で消費炭素の約５、約２、約１、約０．５、又は約０．３％未満である。
【００９５】
適応進化については、Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  Ｈ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｇ．２００７，ｐ．４８８１−４８９１にも記載される。
【００９６】
適応進化の一実施形態では、異なる培地、例えば組成が異なる３つの培地（グルコース、キシロース、及びアラビノース；キシロース及びアラビノースにおける反復的な連続成長サイクルによる反復バッチ培養からなるレジメンが適用される。Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００９，ｐ．９０７−９１４を参照のこと。
【００９７】
一実施形態では、ＳＢＲ環境で酵母細胞ＢＩＥ２５２を適応させた。以下の培地を使用した：（１）混合糖類培地：１０ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌキシロース、７ｇ／ｌアラビノース、２ｇ／ｌガラクトース及び１ｇ／ｌマンノース；（２）アラビノース培地：２７ｇ／ｌアラビノース及び３ｇ／ｌキシロース及び（３）キシロース培地：２７ｇ／ｌキシロース及び３ｇ／ｌアラビノース。培地（１）でのバッチ成長の完了後、培地（２）及び（３）を交互に切り換え、培地（２）及び（３）におけるこの一連の培養を６サイクル繰り返した。サイクル３の後に培地（１）での成長を再び行い、培養物がなおＣ６糖類をＳＢＲ培養の開始時と同じ速さで利用可能であることを確認した。ラン毎に、指数増殖期におけるＣＯ２プロファイルから最大比成長速度（μｍａｘ）を推定した。
【００９８】
［宿主細胞］
宿主細胞は、有用な生成物の生成に好適な任意の宿主細胞であってよい。本発明の細胞は、細菌などの原核細胞、又は真核細胞など、任意の好適な細胞であってよい。典型的には、細胞は真核細胞、例えば酵母又は糸状菌類であり得る。
【００９９】
酵母は、本明細書では真核微生物として定義され、主に単細胞形態で成長するユーミコチナ亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の全ての種（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）が含まれる。
【０１００】
酵母は、単細胞葉状体の出芽により成長し得るか、或いは生物の分裂により成長し得る。本発明の細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属し得る。好ましくは酵母は、嫌気的発酵能を有するもの、より好ましくは嫌気的アルコール発酵能を有するものである。
【０１０１】
糸状菌類は、本明細書では、全ての糸状形態のユーミコチナ亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）を含む真核微生物として定義される。これらの菌類は、キチン、セルロース、及び他の複合多糖類から構成される栄養菌糸により特徴付けられる。本発明の細胞としての使用に好適な糸状菌類は、酵母とは形態学的、生理学的、及び遺伝的に異なる。多くの糸状菌類が繁殖に無菌条件を必要とせず、且つバクテリオファージ感染に対して非感受性であるため、糸状菌細胞は有利に用いられ得る。糸状菌類による栄養成長は菌糸伸長により、ほとんどの糸状菌類の炭素異化が偏性好気性である。本発明の宿主細胞として好ましい糸状菌類は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウラ属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｒｒａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属し得る。より好ましくは、糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、又はリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であってもよい。
【０１０２】
一実施形態において、宿主細胞は酵母であってよい。
【０１０３】
好ましくは宿主は、工業用宿主、より好ましくは工業用酵母である。工業用宿主及び工業用酵母細胞は、以下のとおり定義され得る。工業プロセスにおける酵母細胞の生存環境は、実験室での生存環境とは大きく異なる。工業用酵母細胞は、プロセス中に変化し得る複数の環境条件下で良好に機能しなければならない。かかる変動には、栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度等の変化が含まれ、これらが一体となって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞成長及びエタノール生成に潜在的に影響を及ぼす。不利な工業条件下において、環境耐性株はロバストな成長及び生成が可能でなければならない。概して工業用酵母株は、製パン工業、醸造工業、ワイン製造及びエタノール工業などにおける、それらが用いられる適用において生じ得るこうした環境条件の変化に対し、ロバスト性が高い。工業用酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）及びＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【０１０４】
ある実施形態では、宿主は阻害薬耐性を有する。阻害薬耐性宿主細胞は、Ｋａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８に例示されるように、阻害薬含有材料上での成長について株をスクリーニングすることにより選択されてもよく、ここでは阻害薬耐性Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ  ２６６０２が選択された。
【０１０５】
好ましくは宿主細胞は、工業用且つ阻害薬耐性である。
【０１０６】
［ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子］
本発明の細胞は、アラビノースを使用する能力を有する。従って本発明の細胞は、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロース及び／又はキシルロース５−リン酸に、及び／又は所望の発酵生成物、例えば本明細書で言及されるうちの一つに変換する能力を有する。
【０１０７】
Ｌ−アラビノースからエタノールを生成する能力がある生物、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、好適な供給源由来のａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）及びａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入する細胞を修飾することにより生成されてもよい。かかる遺伝子は、本発明の細胞に、それがアラビノースを使用する能力を有するようにするため導入され得る。かかる手法は、国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに提供され、記載される。ラクトバチルス・プランタナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｎｕｍ）由来のａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子を使用してもよく、国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットに開示されている。バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｒａＡ遺伝子及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のａｒａＢ及びａｒａＤ遺伝子を使用してもよく、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示されている。
【０１０８】
［ＰＰＰ遺伝子］
本発明の細胞は、ペントースリン酸経路の流束を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。特に、このような１つ又は複数の遺伝子修飾は、非酸化的部分ペントースリン酸経路の流束増加をもたらし得る。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束増加を生じさせる遺伝子修飾とは、本明細書では、流束の増加を生じさせる遺伝子修飾を除き遺伝学的に同一の株における流束と比較したとき、流束を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍又は約２０倍に増加させる修飾を意味するものと理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、キシロースを単一炭素源として修飾宿主を成長させ、キシロース比消費速度を決定し、且つ任意のキシリトールが生成される場合、キシリトール比生産速度をキシロース比消費速度から減じることにより計測され得る。しかしながら、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、キシロースを単一炭素源とした成長速度、好ましくはキシロースを単一炭素源とした嫌気的成長速度に比例する。キシロースを単一炭素源とした成長速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束との間には、直線関係がある。糖上でのバイオマス収率は一定であるため、キシロース比消費速度（Ｑｓ）は、成長速度（μ）を糖上でのバイオマス収率（ＹＸＳ）で除したものに等しい（所与の条件：嫌気性、成長培地、ｐＨ、株の遺伝的背景等の下で；すなわちＱｓ＝μ／ＹＸＳ）。従ってペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束増加は、輸送の場合を除き（取り込みが限定的である）これらの条件下における最大成長速度の増加から推定されてもよい。
【０１０９】
ペントースリン酸経路の流束を増加させる１つ以上の遺伝子修飾は、様々な方法で宿主細胞に導入され得る。そうした方法には、例えばキシルロースキナーゼ及び／又は非酸化的部分ペントースリン酸経路の酵素のうちの１つ以上の定常状態活性レベルの上昇、及び／又は非特異的アルドースレダクターゼ活性の定常状態レベルの低下を達成することが含まれる。定常状態活性レベルのこれらの変化は、突然変異体（自発的なもの、又は化学物質若しくは放射線により誘導されたもの）の選択によるか、及び／又は組換えＤＮＡ技術により、例えば酵素をコードする遺伝子又はそれらの遺伝子を調節する因子のそれぞれ過剰発現又は不活性化によってもたらすことができる。
【０１１０】
好ましい宿主細胞において、遺伝子修飾は、（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組み合わせを過剰発現させてもよい。例えば過剰発現させる酵素は、少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びリブロース−５−リン酸エピメラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びトランスケトラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ及びトランスケトラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、及びトランスアルドラーゼ；又は少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、及びトランスケトラーゼであってもよい。本発明の一実施形態において酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの各々は、宿主細胞において過剰発現させる。より好ましくは、遺伝子修飾が少なくとも酵素トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの両方の過剰発現を含み、従って宿主細胞が既にキシロースでの嫌気的成長能を有する宿主細胞である。実際、一部の条件下では、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞は、これらの酵素の４つ全て、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同じキシロースにおける嫌気的成長速度を既に有する。さらに、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びリブロース−５−リン酸エピメラーゼの両方を過剰発現する宿主細胞は、イソメラーゼのみ又はエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞と比べると、これらの酵素の一方のみの過剰発現は代謝不均衡を生じ得るため、好ましい。
【０１１１】
酵素「リブロース−５−リン酸エピメラーゼ」（ＥＣ５．１．３．１）は、本明細書では、Ｄ−キシルロース５−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸への、及びその逆のエピマー化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリトロース−４−リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース３−エピメラーゼ；キシルロースリン酸３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースリン酸−３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；ペントース−５−リン酸３−エピメラーゼ；又はＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸エピメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にリブロース５−リン酸エピメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにリブロース５−リン酸エピメラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。リブロース５−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＲＰＥ１と命名される。
【０１１２】
酵素「リブロース５−リン酸イソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．６）は、本明細書では、Ｄ−リボース５−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸への、及びその逆の直接の異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホペントースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｎｔｏｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース５−リン酸イソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼ；又はＤ−リボース−５−リン酸アルドースケトースイソメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸イソメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にリブロース５−リン酸イソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにリブロース５−リン酸イソメラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。リブロース５−リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＲＰＩ１と命名される。
【０１１３】
酵素「トランスケトラーゼ」（ＥＣ２．２．１．１）は、本明細書では、反応：Ｄ−リボース５−リン酸＋Ｄ−キシルロース５−リン酸＜−＞セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸、及びその逆を触媒する酵素として定義される。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼ又はセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしても知られる。トランスケトラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にトランスケトラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにトランスケトラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＴＫＬ１と命名される。
【０１１４】
酵素「トランスアルドラーゼ」（ＥＣ２．２．１．２）は、本明細書では、反応：セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸＜−＞Ｄ−エリトロース４−リン酸＋Ｄ−フルクトース６−リン酸、及びその逆を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；又はセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとしても知られる。トランスアルドラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にトランスアルドラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにトランスアルドラーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではＴＡＬ１と命名される。
【０１１５】
［キシロースイソメラーゼ遺伝子］
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の存在は、細胞に対し、キシロースをキシルロースに異性化する能力を付与する。本発明によれば、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５コピーが宿主細胞に導入される。
【０１１６】
一実施形態では、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５コピーが宿主細胞に導入される。
【０１１７】
「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、本明細書では、Ｄ−キシロースからＤ−キシルロースへの、及び／又はその逆の直接の異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。本明細書におけるキシロースイソメラーゼはまた、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの間の変換の触媒能も有し得る（従ってそれゆえグルコースイソメラーゼと称されてもよい）。本明細書におけるキシロースイソメラーゼは、マグネシウム、マンガン又はコバルトなどの二価カチオンを補因子として必要とし得る。
【０１１８】
従って、本発明の細胞は、キシロースからキシルロースへの異性化能を有する。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、宿主細胞に対し、定義されたキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換することにより付与される。本発明の細胞は、キシロースからキシルロースへの直接の異性化によってキシロースをキシルロースに異性化する。これは、キシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼによってそれぞれ触媒されるとおりの、キシリトール中間体を介したキシロースからキシルロースへの二段階変換とは対照的に、キシロースイソメラーゼによって触媒される単一の反応でキシロースがキシルロースに異性化されることを意味するものと理解される。
【０１１９】
キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、本明細書では、Ｋｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６９−７８）により記載されるとおりの条件下で毎分１ｎｍｏｌのキシルロースを生成する酵素の量として定義され得る。キシロースイソメリゼ（Ｘｙｌｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒｉｓｅ）遺伝子は、例えば国際公開第２００６／００９４３４号パンフレットに開示されるとおりのピロミセス・エスピー（Ｐｙｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）など、様々な起源を有し得る。他の好適な起源は、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／５２６２３号明細書に記載されるとおりバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、特にバクテロイデス・ユニフォミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｍｉｓ）、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２５号明細書に記載されるとおりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特にバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２１号明細書に記載されるとおりサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、特にサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、及びＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２０号明細書に記載されるとおりクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、特にクロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）である。
【０１２０】
［ＸＫＳ１遺伝子］
本発明の細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。好ましくは１つ又は複数の遺伝子修飾は、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現により、キシルロースキナーゼの過剰発現を生じさせる。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞にとって内因性であってもよく、又は宿主細胞にとって異種のキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現に用いられるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【０１２１】
酵素「キシルロースキナーゼ」（ＥＣ２．７．１．１７）は、本明細書では、反応ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５−リン酸を触媒する酵素として定義される。この酵素は、リン酸化キシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼ又はＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとしても知られる。本発明のキシルロースキナーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にキシルロースキナーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにキシルロースキナーゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。
【０１２２】
本発明の細胞では、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ又は複数の遺伝子修飾が、上記に記載したとおりのペントースリン酸経路の流束を増加させる修飾のいずれかと組み合わされてもよい。しかしながら、これは必須ではない。
【０１２３】
従って、本発明の宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ又は複数の遺伝子修飾のみを含み得る。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現を実現及び分析する当該技術分野において利用可能な様々な手段は、上記にペントースリン酸経路の酵素について記載したものと同じである。好ましくは本発明の宿主細胞において、過剰発現させるキシルロースキナーゼは、過剰発現をもたらす１つ又は複数の遺伝子修飾を除いては遺伝的に同一である株と比較したとき、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍又は約２０倍過剰発現する。これらの過剰発現レベルは、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベル並びに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用され得ることが理解されるべきである。
【０１２４】
［アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子欠失］
本発明の細胞は、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼ活性は宿主細胞において、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるか、又はそれを不活性化する１つ以上の遺伝子修飾によって低下する。好ましくは、１つ又は複数の遺伝子修飾は、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の各内因性コピーの発現を低下させ、又は不活性化する（本明細書ではＧＲＥ３欠失と呼ばれる）。宿主細胞は、二倍性、多倍数性又は異数性の結果として、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含むことができ、及び／又は宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、且つ各々が異なる遺伝子によりコードされる、アルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含み得る。また、かかる例では、好ましくは非特異的アルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現を低下させ、又は不活性化する。好ましくはその遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によるか、又は遺伝子の破壊により不活性化され、ここでこれに関連して用語の遺伝子には、コード配列の上流又は下流の任意の非コード配列も含まれ、その（部分的）欠失又は不活性化により、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性の発現の低下が得られる。
【０１２５】
本発明の宿主細胞においてその活性を低下させるべきアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【０１２６】
従って、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる１つ又は複数の遺伝子修飾のみを含む本発明の宿主細胞は、明確に本発明に包含される。
【０１２７】
酵素「アルドースレダクターゼ」（ＥＣ１．１．１．２１）は、本明細書では、キシロース又はキシルロースからキシリトールへの還元能を有する任意の酵素として定義される。本発明の文脈では、アルドースレダクターゼは、本発明の宿主細胞にとって天然の（内因性の）、且つキシロース又はキシルロースからキシリトールへの還元能を有する任意の非特異的アルドースレダクターゼであってもよい。非特異的アルドースレダクターゼは以下の反応を触媒する：
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋⇔アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【０１２８】
この酵素は広い特異性を有し、アルドースレダクターゼ；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ；アルジトール：ＮＡＤＰ＋  １−オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰＨ−アルドペントースレダクターゼ；又はＮＡＤＰＨ−アルドースレダクターゼとしても知られる。
【０１２９】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にとって内因性であり、且つＧＲＥ３遺伝子によりコードされるかかる非特異的アルドースレダクターゼの詳細な例（Ｔｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。従って、本発明のアルドースレダクターゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義され得る。同様にアルドースレダクターゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によっても、並びにアルドースレダクターゼをコードする基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても定義され得る。
【０１３０】
［バイオ生成物の生成］
長年にわたり、作物砂糖からバイオエタノールを生産するための様々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら実際には、主要なバイオエタノール生産プロセスは全て、エタノール産生株としてサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母を使用し続けている。これは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種に、工業プロセスに魅力的な多くの特徴、すなわち、強酸耐性、エタノール耐性及び浸透圧耐性、嫌気的成長能、及び当然ながらその高いアルコール発酵能があるためである。宿主細胞として好ましい酵母種には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）又はＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。
【０１３１】
本発明の細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フルコース（ｆｒｕｃｏｓｅ）、マルトース、マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎｅ）、リボース、リブロース、又はデンプン、デンプン誘導体、スクロース、ラクトース及びグリセロールを、例えば発酵性糖類に変換する能力があってよい。従って、本発明の細胞は、セルロースからグルコース単量体への、及びヘミセルロースからキシロース及びアラビノース単量体への変換に必須のセルラーゼ（エンドセルラーゼ又はエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンド又はエキソキシラナーゼ又はアラビナーゼ）、ペクチンからグルクロン酸及びガラクツロン酸への変換能力があるペクチナーゼ、又はデンプンをグルコース単量体に変換するアミラーゼなどの１つ以上の酵素を発現し得る。
【０１３２】
細胞は、さらに好ましくは、ピルビン酸塩を所望の発酵生成物、例えば、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質又はセファロスポリンへの変換に必要な酵素活性を含む。
【０１３３】
本発明の好ましい細胞は、アルコール発酵能、好ましくは嫌気的アルコール発酵能を天然で有する細胞である。本発明の細胞は、好ましくは高いエタノール耐性、高い低ｐＨ耐性（すなわち約５、約４、約３、又は約２．５より低いｐＨでの成長能）並びに乳酸、酢酸又はギ酸などの有機酸及び／又はフルフラール及びヒドロキシメチルフルフラールなどの糖分解産物に対する耐性、及び／又は高い高温耐性を有する。
【０１３４】
本発明の細胞の上記特性又は活性のいずれも、細胞に天然に存在してもよく、又は遺伝子修飾によって導入若しくは修飾されてもよい。
【０１３５】
本発明の細胞は、エタノールの生成に好適な細胞であり得る。しかしながら、本発明の細胞は、エタノール以外の発酵生成物の生成に好適であってもよい。かかる非エタノール発酵生成物には、原則的に、酵母又は糸状菌類などの真核微生物によって生成可能な任意のバルク化学品又はファインケミカルが含まれる。
【０１３６】
かかる発酵生成物は、例えば、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質又はセファロスポリンであってもよい。非エタノール発酵生成物の生成に好ましい本発明の細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらす遺伝子修飾を含む宿主細胞である。
【０１３７】
さらなる態様において、本発明は、キシロースなどの、キシロース供給源を含む炭素源の発酵に本発明の細胞が用いられる発酵プロセスに関する。キシロース供給源に加えて、発酵培地中の炭素源はまた、グルコース供給源も含み得る。キシロース又はグルコースの供給源はキシロース又はグルコースそれ自体であってもよく、或いはキシロース又はグルコース単位を含む任意の炭水化物オリゴポリマー又はポリマー、例えばリグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプンなどであってもよい。かかる炭水化物からキシロース又はグルコース単位を遊離させるには、適切なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）を発酵培地に添加してもよく、又は細胞によって産生されてもよい。後者の場合、細胞は、かかるカルボヒドラーゼを産生して分泌するように遺伝子操作されてもよい。オリゴポリマー又はポリマーのグルコース供給源を使用するさらなる利点は、例えば律速量のカルボヒドラーゼを使用することにより、発酵中における遊離グルコースの低い（より低い）濃度の維持が可能になることである。これによりひいては、キシロースなどの非グルコース糖類の代謝及び輸送に必要な系の抑制が回避され得る。
【０１３８】
好ましいプロセスでは、細胞はキシロース及びグルコースの双方を、好ましくは同時に発酵し、同時に発酵する場合には好ましくは、ジオーキシー成長が回避されるように、グルコース抑制に対して非感受性の細胞が用いられる。炭素源としてのキシロース（及びグルコース）の供給源に加えて、発酵培地は、細胞の成長に必要とされる適切な成分をさらに含み得る。酵母などの微生物を成長させる発酵培地の組成は、当該技術分野において周知されている。発酵プロセスとは、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質、例えばペニシリンＧ又はペニシリンＶ及びそれらの発酵性誘導体、並びにセファロスポリンなどの発酵生成物の生成プロセスである。
【０１３９】
［バイオ生成物の生成］
長年にわたり、作物砂糖からバイオエタノールを生産するための様々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら実際には、主要なバイオエタノール生産プロセスは全て、エタノール産生株としてサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母を使用し続けている。これは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種に、工業プロセスに魅力的な多くの特徴、すなわち、強酸耐性、エタノール耐性及び浸透圧耐性、嫌気的成長能、及び当然ながらその高いアルコール発酵能があるためである。宿主細胞として好ましい酵母種には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）又はＫ．フラギリス（Ｋ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。
【０１４０】
混合糖細胞は、エタノールの生成に好適な細胞であり得る。しかしながら、混合糖細胞は、エタノール以外の発酵生成物の生成に好適であってもよい。かかる非エタノール発酵生成物には、原則的に、酵母又は糸状菌類などの真核微生物によって生成可能な任意のバルク化学品又はファインケミカルが含まれる。
【０１４１】
非エタノール発酵生成物の生成に用いられ得る混合糖細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらす遺伝子修飾を含む宿主細胞である。
【０１４２】
ある実施形態では、混合糖細胞は、リグノセルロースに由来する糖類をエタノールに変換するプロセスで用いられてもよい。
【０１４３】
［リグノセルロース］
潜在的な再生可能原料と考えられ得るリグノセルロースは、概して、多糖類セルロース（グルカン）及びヘミセルロース（キシラン、ヘテロキシラン及びキシログルカン）を含む。加えて一部のヘミセルロースは、例えば木材由来の供給原料において、グルコマンナンとして存在し得る。これらの多糖類から、単量体及び多量体の双方を含めた可溶性糖類、例えばグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルコロン酸（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）並びに他のヘキソース及びペントースへの酵素加水分解は、協調して作用する種々の酵素の作用下に起こる。
【０１４４】
加えて、ペクチン及びその他のペクチン質、例えばアラビナンは、非木本植物組織からの典型的に細胞壁である乾燥質量の大きい割合を占め得る（乾燥質量の約４分の１乃至半分がペクチンであり得る）。
【０１４５】
［前処理］
酵素処理の前に、リグノセルロース系材料は前処理され得る。前処理は、リグノセルロース系材料を、酸、塩基、溶媒、熱、過酸化物、オゾン、機械的破砕、粉砕、磨砕又は急速減圧、又はこれらのいずれか２つ以上の組み合わせに曝露することを含み得る。この化学的前処理は、多くの場合に熱的前処理（例えば１５０〜２２０℃で１〜３０分間）と組み合わされる。
【０１４６】
［酵素加水分解］
前処理された材料は、一般的には酵素加水分解に供され、本発明により発酵され得る糖類が遊離される。これは、従来の方法、例えば、セルラーゼ、例えば１つ又は複数のセロビオヒドロラーゼ、１つ又は複数のエンドグルカナーゼ、１つ又は複数のβ−グルコシダーゼ及び場合により他の酵素との接触によって実施されてもよい。セルラーゼによる変換は、周囲温度又はそれより高温で、十分な量の１つ又は複数の糖を遊離させる反応時間で実施されてもよい。酵素加水分解の結果は、Ｃ５／Ｃ６糖類を含む加水分解物であり、本明細書では糖組成物と呼ばれる。
【０１４７】
［発酵］
発酵プロセスは、好気的又は嫌気的発酵プロセスであってよい。嫌気的発酵プロセスは、本明細書では、酸素の非存在下で実行される発酵プロセス、又は実質的に酸素が消費されない、好ましくは約５、約２．５又は約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費される（すなわち酸素消費が検出不能である）発酵プロセスとして定義され、ここでは有機分子が電子供与体及び電子受容体の双方として働く。酸素の非存在下では、解糖及びバイオマス形成において生じるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によっては酸化されることができない。この問題を解決するため、多くの微生物がピルビン酸塩又はその誘導体のうちの一つを電子及び水素受容体として使用し、それによりＮＡＤ＋を再生する。
【０１４８】
従って、好ましい嫌気的発酵プロセスでは、ピルビン酸塩が電子（及び水素受容体）として使用され、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンなどの発酵生成物に還元される。
【０１４９】
発酵プロセスは、好ましくは細胞に最適な温度で実行される。従って、ほとんどの酵母又は菌類宿主細胞は、発酵プロセスが約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度で実施される。酵母又は糸状菌宿主細胞は、好ましくは発酵プロセスが約３５、約３３、約３０又は約２８℃未満の温度、且つ約２０、約２２、又は約２５℃より高い温度で実施される。
【０１５０】
このプロセスにおけるキシロース及び／又はグルコースでのエタノール収率は、好ましくは少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５又は約９８％である。エタノール収率は、本明細書では、理論最大収率に対する割合として定義される。
【０１５１】
本発明はまた、発酵生成物の生成方法にも関する。
【０１５２】
発酵プロセスは、バッチ式、流加式又は連続式で行われ得る。個別加水分解発酵（ＳＨＦ）プロセス又は同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスもまた、適用することができる。最適な生産性のため、これらの発酵プロセス様式の組み合わせもまた可能であり得る。
【０１５３】
本発明に係る発酵プロセスは、好気性及び嫌気性条件下で実行され得る。好ましくは、このプロセスは、微好気性条件下又は酸素制限条件下で行われる。
【０１５４】
嫌気的発酵プロセスは、本明細書では、酸素の非存在下で実行される発酵プロセス、又は実質的に酸素が消費されない、好ましくは約５、約２．５又は約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満の発酵プロセスとして定義され、ここでは有機分子が電子供与体及び電子受容体の双方として働く。
【０１５５】
酸素制限発酵プロセスは、気体から液体への酸素移動により酸素消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入ガスフローの量及び組成並びに使用される発酵機器の実際の混合／物質移動特性により決定される。好ましくは、酸素制限条件下のプロセスにおいて、酸素消費速度は少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、例えば少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。本発明のプロセスは、発酵生成物の回復を含む。
【０１５６】
［発酵生成物］
本発明の発酵生成物は、任意の有用な生成物であってよい。一実施形態においてそれは、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、及びアスパラギン酸など、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物用飼料添加剤、特殊化学品、化学供給原料、プラスチック、溶媒、バイオ燃料及びバイオガスを含む燃料又は有機ポリマー、及び工業用酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ又はキシラナーゼからなる群から選択される生成物である。例えば発酵生成物は、本発明に係る細胞により、追加的に先行技術の細胞調製方法及び発酵プロセスに従い（但しそれらの例が本明細書において限定するものとして解釈されてはならない）生成されてもよい。例えば、ｎ−ブタノールは、国際公開第２００８１２１７０１号パンフレット又は国際公開第２００８０８６１２４号パンフレットに記載されるとおりの細胞；米国特許出願公開第２０１１０５３２３１号明細書又は米国特許出願公開第２０１０１３７５５１号明細書に記載されるとおりの乳酸；国際公開第２０１００１０２９１号パンフレットに記載されるとおりの３−ヒドロキシプロピオン酸；国際公開第２００９１５３０４７号パンフレットに記載されるとおりのアクリル酸によって生成されてもよい。あらゆる種類の発酵生成物の概要、及び酵母においてそれらをどのように調製することができるかについては、Ｒｏｍａｎｏｓ，ＭＡ，ｅｔ  ａｌ，“外来遺伝子発現：レビュー（Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ：ａ  Ｒｅｖｉｅｗ）”，ｙｅａｓｔ  ｖｏｌ．８：４２３−４８８（１９９２）に提供されており、例えば表７を参照のこと。グリセロール、１，３プロパンジオール、有機酸、及びビタミンＣの生成（表２）が、Ｎｅｖｏｉｇｔ，Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７２（３）３７９−４１２（２００８）に記載されている。Ｇｉｄｄｉｊａｌａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（２９）（２００８）は、酵母におけるβ−ラクタムの生成について記載している。
【０１５７】
［発酵生成物の回収］
発酵（ｆｅｒｍｅｎａｔｉｏｎ）生成物の回収には、既存の技法が用いられる。異なる発酵生成物には異なる回収プロセスが適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に分画及び吸着技法を用いる。例えば、ビール蒸留器を使用して、水性混合物中にエタノールを含有する発酵した生成物を処理し、それにより濃縮エタノール含有混合物を生成することができ、次にそれが分画（例えば、分留又は他の同様の技法）に供される。次に、最も高濃度のエタノールを含有する画分を吸着装置に通過させることで、全てではないにしろ、ほとんどの残留する水を、エタノールから除去することができる。
【０１５８】
以下の例は、本発明を例示する：
【０１５９】
［実施例］
特に指示がない限り、ここに記載する方法は標準的な生化学的技法である。好適な一般的手法のテキストブックの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。
【０１６０】
［培地組成］
成長実験：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、以下の組成を有する培地で成長させる：０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素原基礎培地又は合成培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）及びグルコース、アラビノース、マンノース、ガラクトース又はキシロース、又はこれらの物質の組み合わせ、濃度は様々（具体的な詳細については例を参照；％重量対体積（ｗ／ｖ）単位の濃度）。寒天プレートは、培地に２％（ｗ／ｖ）細菌学用寒天を補足する。
【０１６１】
［エタノール生成］
１００ｍｌ振盪フラスコにおいて２％グルコースを補足した２５ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）に、凍結ストック培養物又は寒天プレートからの単一コロニーを接種することにより、前培養物を調製した。オービタルシェーカー（２８０ｒｐｍ）において３０℃で約２４時間インキュベートした後、培養物を収集し、ＣＯ２進化の決定及びエタノール生成実験に使用した。
【０１６２】
エタノール生成用の培養を、ＢＡＭ（生物活性モニタ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）、Ｈａｌｏｔｅｃ，オランダ）において１００ｍｌの合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトース及び０．５％マンノースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２））中、３０℃で実施した。培地のｐＨは、滅菌前に２Ｍ  ＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４で４．２に調整した。嫌気的培養用の合成培地には、エタノール中に溶解した０．０１ｇ  ｌ−１エルゴステロール及び０．４２ｇ  ｌ−１Ｔｗｅｅｎ  ８０を補足した（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６，１９５３；及びＡｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１，１９５４）。培地を約２の初期ＯＤ６００で接種した。培養物はマグネチックスターラで撹拌した。培養物は曝気しなかったため、発酵中、急激に嫌気性条件が生じた。ＣＯ２生成を常時モニタした。糖変換及び生成物形成（エタノール、グリセロール）はＮＭＲにより分析した。ＬＫＢ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  Ｋ分光光度計において、６００ｎｍで培養物の光学濃度を追跡して成長をモニタした。
【０１６３】
［Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換］
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換は、Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（２００２；ＬｉＡｃ／ＳＳ担体ＤＮＡ／ＰＥＧ法による酵母の形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：８７−９６）により記載されるとおり行った。
【０１６４】
［コロニーＰＣＲ］
プラスチック製トゥースピックで単一コロニー単離物を取り、５０μｌのミリＱ水に再懸濁した。試料を９９℃で１０分間インキュベートした。５μｌのインキュベートした試料を、供給業者により提供される指示に従いＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用したＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【０１６５】
【表８】
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【０１６６】
［染色体ＤＮＡ単離］
ロータリーシェーカーにおいて（一晩、３０℃及び２８０ｒｐｍ）、２％グルコースを含有するＹＥＰ培地で酵母細胞を成長させた。これらの培養物の１．５ｍｌをエッペンドルフ試験管に移し、最高速度で１分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを、２００μｌのＹＣＰＳ（１０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．５中０．１％ＳＢ３−１４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，オランダ）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び１μｌ  ＲＮアーゼ（ウシ膵臓由来の２０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡ、Ｓｉｇｍａ，オランダ）に再懸濁した。細胞懸濁液を６５℃で１０分間インキュベートした。懸濁液を、エッペンドルフ遠心機において７０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を廃棄した。ペレットを、２００μｌ  ＣＬＳ（２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）及び１μｌ  ＲＮアーゼＡに慎重に溶解した。６５℃で１０分間インキュベートした後、懸濁液を氷冷した。７０μｌ  ＰＰＳ（１０Ｍ酢酸アンモニウム）を添加した後、ボルテックスミキサーで溶液を完全に混合した。遠心後（エッペンドルフ遠心機において最高速度で５分間）、上清を２００μｌの氷冷イソプロパノールと混合した。ＤＮＡが直ちに沈殿し、それを遠心（５分、最高速度）によりペレット化した。ペレットを４００μｌの氷冷７０％エタノールで洗浄した。ペレットを室温で乾燥させて、５０μｌ  ＴＥ（１０ｍＭトリス  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。
【０１６７】
［実際の加水分解物に対する酵母適用試験］
希酸で前処理したトウモロコシ茎葉試料を、実験用広域スペクトルセルラーゼ調製物を６０℃で３日間（７２時間）用いて酵素加水分解した。加水分解開始時のｐＨは５．０であった。加水分解開始時の乾燥物質含量は１０及び２０％ｗ／ｗであった。加水分解後（７２時間後）、試料を室温に放冷した。１０％ＮａＯＨを使用してｐＨを５．５に調整した。続いて、１ミリリットルの２００グラム毎リットル（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１ミリリットルの１００グラム毎リットルＫＨ２ＰＯ４を添加した。最後に、１０又は２０％ｗ／ｗの加水分解物１キログラムあたりそれぞれ１又は２グラム酵母の酵母乾燥物質含量に相当する酵母試料を添加した。ＡＦＭ（アルコール発酵モニタ（Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）；ＨａｌｏｔｅＣ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＢＶ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，オランダ）を使用して、ＣＯ２進化を経時的に追跡した。実験は少なくともトリプリケートで、３３℃で７２時間実施した。エタノール形成及び残留糖濃度を分析可能にするため、これらのうちの一つを一定の間隔でサンプリングする。これらのデータを使用して発酵収率を計算することができる。他の２つの実験のブロスはサンプリングしない。代わりに発酵の終了時に、Ｂｕｃｈｉ  Ｋ−３５５蒸留ユニットを使用して、４５％蒸気で１５分間ブロスを蒸留する。生成されるアルコールは、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＤＭＡ  ５０００密度計（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  ＢＶＢＡ，Ｄｏｎｇｅｎ，オランダ）を使用して決定される。
【０１６８】
［実施例１］
［連続バッチ反応器（ＳＢＲ）培養におけるキシロース及びアラビノースでの成長速度の改善］
Ｃ５糖類での成長速度を改善するため、国際公開第２００９／１１２４７２号パンフレットに記載される改良プロトコルに従う連続バッチ反応器培養システムで株Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ２５２を成長させた。嫌気的培養は、実働容積が２Ｌの５Ｌ実験室用発酵槽において３２℃で実行した。ｐＨは、２Ｍ  ＫＯＨの自動添加により４．０に維持した。培養物を１００ｒｐｍで撹拌して０．０１ｖｖｍの送気でスパージした一方、ＭＳ排ガス計測のため、ヘッドスペースにおいてキャリアガスとして２ｎＬ／分のＮ２を用いた。培養は、種々のＣ６糖類及びＣ５糖類組成を含む培地で実施した。ＣＯ２レベルによって示されるときＣ源が完全に枯渇したところで、培養物の約９５〜９９％を、適切なＣ源を含む新鮮な合成培地と交換することにより、新しいバッチ培養サイクルを開始した。以下の培地を使用した：（１）混合糖類培地：１０ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌキシロース、７ｇ／ｌアラビノース、２ｇ／ｌガラクトース及び１ｇ／ｌマンノース；（２）アラビノース培地：２７ｇ／ｌアラビノース及び３ｇ／ｌキシロース及び（３）キシロース培地：２７ｇ／ｌキシロース及び３ｇ／ｌアラビノース。培地（１）でのバッチ成長の完了後、培地（２）及び（３）を交互に切り換え、培地（２）及び（３）におけるこの一連の培養を６サイクル繰り返した。サイクル３の後に培地（１）での成長を再び行い、培養物がなおＣ６糖類をＳＢＲ培養の開始時と同じ速さで利用可能であることを確認した。ラン毎に、指数増殖期におけるＣＯ２プロファイルから最大比成長速度（μｍａｘ）を推定した。６サイクル（９０〜１００世代）のＳＢＲ培養後、キシロース及びアラビノースでの株Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ２５２のいずれの成長速度も、図１に示すとおり、ほぼ倍増した。キシロースでの成長速度は０．１ｈ−１から０．１９ｈ−１に増加し、一方アラビノースでの成長速度は０．０６６ｈ−１から０．１２ｈ−１に増加した。ＳＢＲ系における進化操作の最後のサイクル後、単一コロニー単離用の試料を採取した。
【０１６９】
［実施例２］
［単一コロニー単離］
Ｃ６糖類（グルコース及びガラクトース）の利用能を失うことなくキシロース及びアラビノースを単一炭素源とする成長の改善が得られた株を選択するため、以下の手法を実施した。初めに、ＳＢＲ培養系における進化操作の最後のサイクル後、発酵槽から試料を採取した。ブロス試料（ＳＢＲ培養物）をＹＥＰＤ寒天上にストリークし、３０℃で４８時間インキュベートした。ＳＢＲ培養物の９つの単一コロニー単離物をＹＥＰＤ寒天上に再ストリークし、３０℃で４８時間インキュベートした。続いて、各単一コロニーについて、２％グルコースを補足したＹＥＰ液体培地で前培養を行った。９つの培養物を３０℃及び２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。ＢＡＭ（生物活性モニタ）システム（Ｈａｌｏｔｅｃ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，オランダ）において、９つ全ての培養物をそのパフォーマンスについて試験した。
【０１７０】
［実施例３］
［ＢＡＭにおけるパフォーマンス試験］
９つの単一コロニー単離物のパフォーマンスを試験するため、２％グルコースを補足したＶｅｒｄｕｙｎ培地に株を接種した。対照として、ＳＢＲ培養系における適応進化前の元の株である株Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ２５２を含めた。ロータリーシェーカーにおいて３０℃及び２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした後、細胞を遠心により収集し、ＣＯ２生成用の培養を、ＢＡＭで、５０ｇ／ｌグルコース、５０ｇ／ｌキシロース、３５ｇ／ｌアラビノース、１０ｇ／ｌガラクトース及び５ｇ／ｌマンノースを補足した１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地において３３℃及びｐＨ４．２で実施した。ＣＯ２生成を所定の間隔で常時モニタし、分析用の試料を採取した（分光光度計を使用した６００ｎｍの光学濃度；ＮＭＲによりエタノール、グリセロール及び残留糖類）。９つの単一コロニー単離物のうち、株ＢＩＥ２７２と命名されるコロニー５番は、株ＢＩＥ２５２と比べて著しく良好なパフォーマンスを示した。株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のＢＡＭ実験の結果は、それぞれ図２及び図３に示す。株ＢＩＥ２５２のパフォーマンスは、グルコースが発酵実験の開始後直ちに消費されたことを示す（図２）。続いて、ガラクトース、マンノース、アラビノース及びキシロースが同時発酵された。約３０時間後にガラクトース及びマンノースが消費され、一方、約７２時間後にアラビノース及びキシロースもまた完全に消費された。アラビノース及びキシロースの双方とも、ＣＯ２及びエタノールの形成に大きく寄与した。しかしながら、アラビノース及びキシロース消費、従ってエタノール及びＣＯ２生成は、ガラクトース及びマンノースが枯渇すると減速した。株ＢＩＥ２７２は、概して大幅に良好なパフォーマンスを示した（図３）。グルコースが１０時間以内に枯渇した直後、ガラクトース、マンノース、アラビノース及びキシロースが迅速且つ効率的に同時発酵された。Ｃ５糖類利用速度はＢＩＥ２５２より高かった。ガラクトース及びマンノースが枯渇した後であっても、双方のペントース（アラビノース及びキシロース）とも迅速に発酵され、いずれもＣＯ２生成及びエタノール形成に寄与した。株ＢＩＥ２７２の場合、約４８時間後に全ての糖類の発酵が完了した。これにより、株ＢＩＥ２５２と比較して株ＢＩＥ２７２のより高い累積ＣＯ２及びエタノール生成並びにより高い生産性（ｇエタノール／Ｌ／ｈ）が得られた。
【０１７１】
［実施例４］
［実際の加水分解物におけるパフォーマンス試験］
２％グルコースを補足したＹＥＰ培地が入った振盪フラスコで一晩培養した株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２を使用して、実際の加水分解物におけるパフォーマンス試験を実施した。細胞を遠心により収集し、５０グラム乾燥物質毎リットルの濃度で再懸濁した。１０％及び２０％乾燥物質の前処理したトウモロコシ茎葉（ｐＣＳ）を供給原料として使用した。加水分解及び発酵を、材料及び方法セクションに記載するとおり実施した。結果を図４（１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳでのＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のキシロース消費）、図５（１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳでのＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のアラビノース消費）、図６（１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳでのＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のエタノール生成）及び図７（１０％及び２０％乾燥物質ｐＣＳでのＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のＣＯ２生成）に提供する。いずれの株も、グルコースが発酵開始後直ちに消費され、消費プロファイルは同様であった。グルコースは、１０％乾燥物質ｐＣＳで約１２時間後に、及び２０％乾燥物質ｐＣＳで２４時間後に、完全に消費された（データは示さず）。株ＢＩＥ２５２は１０％乾燥物質ｐＣＳでキシロースを９６時間で完全に消費し、一方、２０％乾燥物質ｐＣＳでは、１６８時間後になお約９ｇ／ｌキシロースが残っていた。株ＢＩＥ２７２の場合、キシロースは１０％乾燥物質ｐＣＳでは７２時間で完全に消費され、一方、２０％乾燥物質ｐＣＳでは１６８時間後に、株ＢＩＥ２５２と比べてより少ないキシロースが残った（５ｇ／ｌ）（図４）。いずれの株の場合にも、１０％及び２０％乾燥物質の双方でアラビノースは完全には消費されなかった。しかしながら株ＢＩＥ２７２の場合、ＢＩＥ２５２と比較して、１６８時間後に計測された残留アラビノースがより少なかった（図５）。エタノール力価及び累積ＣＯ２生成は、試験した１０％及び２０％乾燥物質の双方の加水分解物で株ＢＩＥ２７２の場合においてより高かった（図６及び図７）。２０％乾燥物質ｐＣＳでの株ＢＩＥ２７２の全体的なパフォーマンスを図８に提供する。以下の表では、加水分解の終了時に遊離した糖類及び発酵の終了時に生成されたエタノールの量に基づき、発酵の収率を計算している。
【０１７２】
【表９】
2014512818.tif 000010
【０１７３】
［実施例５］
［株ＢＩＥ２７２の安定性試験］
［５．１  接種手順］
株ＢＩＥ２７２の安定性を試験するため、株ＢＩＥ２７２の２５μｌグリセロールストックを使用して、デュプリケートフラスコで２５ｍｌのＹＥＰ  ２％グルコースに接種した。培養物の光学濃度を６００ｎｍで計測した。培養物を３０℃及びロータリーシェーカーにおいて２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【０１７４】
一晩インキュベートした後、光学濃度を測定した。インキュベーション前後のＯＤ６００値に基づき、インキュベートする間に作製された世代数を計算した。２５μｌの一晩培養物を使用して、２５ｍｌの新鮮培地が入ったフラスコを接種した。
【０１７５】
培養物を上記と同じ条件下で再びインキュベートした。細胞が約５０世代にわたり成長した培養物が得られるまで、この手順を繰り返した。
【０１７６】
これらの条件下では、アラビノース及びキシロースの変換に必要な、株ＢＩＥ２７２に導入された遺伝子及び構造変異の維持のために選択圧は加えないため、２％グルコースを補足したＹＥＰ培地を選択した。
【０１７７】
［５．２  ９〜１０世代成長する毎の単一コロニーの単離］
上記に記載する接種手順に加え、以下を適用した。
【０１７８】
株ＢＩＥ２７２のグリセロールストックから、一白金耳量の細胞をＹＥＰＤ寒天プレートにストリークした。このプレートを３０℃で２日間インキュベートした。２日間インキュベートした後、単一のコロニーを目視することができた。
【０１７９】
単一コロニー単離物を作成するため、セクション５．１の全ての一晩培養物（すなわち１０、１９、２８、３７又は４６世代後）から、一白金耳量の細胞をＹＥＰＤ寒天プレートにストリークした。６つのかかるコロニーのパフォーマンスを成長実験で評価した。このため、２４ウェルマイクロプレートにおいて２％キシロースを含有するＶｅｒｄｕｙｎ培地にコロニーを接種した。プレートを３０℃及びＩｎｆｏｒｓマイクロプレートシェーカーにおいて５５０ｒｐｍで、６日間インキュベートした。所定間隔で光学濃度を読み取り、グリセロールストックから直接ストリークした最初の単一コロニー単離物と比較した。
【０１８０】
４８時間の成長後、ある場合に、基準株ＢＩＥ２７２と１０、１９、２８、３７又は４６世代後に生じたＢＩＥ２７２の単一コロニー単離物との間には、キシロースでの成長に差があった。基準株と比較したとき７５％以下の光学濃度によって示されるとおり、後者のコロニーの成長が遅れていた場合、成長をそのようなものとして特徴付けた。インキュベーション４８時間目の成長の結果を図９に提供する。
【０１８１】
これらの結果は、約４６世代後、１２個全てのコロニー（デュプリケートで６個のコロニー）が、グリセロールストックから直接単離した基準株ＢＩＥ２７２のコロニーと同じ成長表現型を示すことを示している。
【０１８２】
長時間の成長（すなわち４８時間超、最長６日、上記参照）の後には、全てのコロニーがコンフルエントに成長し、すなわち最大光学濃度が得られた。
【０１８３】
ＹＥＰＤ寒天プレート上での世代数は考慮に入れなかった。振盪フラスコでインキュベートして寒天プレートにストリークした後、単細胞の成長は、３０℃で２日以内にＹＥＰＤ寒天プレート上のコロニーに成長し得る。酵母コロニーは、典型的には約３．１０５〜１０６細胞を有する（Ｒｕｎｇｅ，Ｋ．Ｗ．（２００６）酵母モデル系におけるテロメアと老化（Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）．１９１〜２０６頁  所収：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｇｅｉｎｇ．Ｐ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｏｎｎ．編  ＩＳＢＮ  １３：９７８−０−１２−３６９３９１−４）。そのため、１つの細胞から出発してコロニーが完全に成長するまでには、約１８〜２０分裂を要し、従って振盪フラスコでの培養が行われた後にさらに１８〜２０世代を要する。
【０１８４】
これらの結果から、培養が５０世代を超えると、全てのコロニーが当初のグリセロールストックの株ＢＩＥ２７２と同じ成長表現型を示したことを結論付け得る。従って、この株は表現型が安定している。
【０１８５】
［５．３  キシロースイソメラーゼ遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析］
セクション５．２に記載する表現型分析に加え、培養実験前の株ＢＩＥ２７２に存在する、並びに一晩成長させた後の培養物からの、キシロースイソメラーゼ遺伝子のコピー数を評価するため、定量的ＰＣＲ実験（Ｑ−ＰＣＲ）を行った。
【０１８６】
一晩成長させた後、培養物の少量のアリコートを使用して新鮮な培地を接種し、又は単一コロニーを単離した（セクション５．１及び５．２を参照）。残りの培養物は、Ｑ−ＰＣＲを目的とした染色体ＤＮＡの単離に使用した。
【０１８７】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱシステムを用いてＱ−ＰＣＲ分析を実施した。ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。実験は、供給者のマニュアルに提案されるとおりセットアップした。
【０１８８】
キシロースイソメラーゼをコードするｘｙｌＡ遺伝子のコピー数を決定することにより、株ＢＩＥ２７２の安定性を評価した。基準シングルコピー遺伝子として、ＡＣＴ１遺伝子を選択した。
【０１８９】
遺伝子ｘｙｌＡ及びＡＣＴ１の検出用プライマーを以下の表に要約する。
【０１９０】
【表１０】
2014512818.tif 000011
【０１９１】
Ｑ−ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：
１）９５℃で３分間
４０サイクル（ｃｙｃｌｉ）にわたり、ステップ２〜４
２）９５℃で１０秒間
３）５８℃で４５秒間
４）７２℃で４５秒間
５）６５℃で１０秒間
６）０，５℃／１０秒で温度を９５℃に上昇させる
【０１９２】
６５℃で１０秒間蛍光を計測し始めることにより、融解曲線を作成する。温度は９５℃の温度に達するまで、１０秒毎に０．５℃上昇させる。読み取り値から、目的の遺伝子のコピー数を計算及び／又は推定する。結果を以下の表に提供する。
【０１９３】
【表１１】
2014512818.tif 000012
【０１９４】
ＡＣＴ１遺伝子に対するｘｙｌＡ遺伝子コピー数の値は、フラスコ間で小さい偏差を示すが、デュプリケートフラスコを考慮すると、極めて再現性が高い。
【０１９５】
これらの結果から、ＢＩＥ２７２におけるｘｙｌＡ遺伝子のコピー数が、Ｋｌｅｉｎ（Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．（２００２）ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．８  Ｎｏ．６，２５７−２６０）により過去に開示されたとおりの定量的ＰＣＲ分析の制約を考慮すれば、２％グルコースを補足したＹＥＰ培地での約５０世代の培養の前と後とで本質的に同じであることが示された。ｘｙｌＡ遺伝子の７〜１３コピーが検出され、平均約９コピーであった。
【０１９６】
まとめると、本実施例の結果は、この株が表現型的に且つ遺伝的に安定であることを示している。
【０１９７】
［実施例６］
［選択株の再配列決定及びペントース発酵に関与する構造変異（ＳＶ）の同定］
上記に記載される実施例では、ペントースのアラビノース及びキシロースでの成長を増進するための適応進化後、前記選択戦略を適用して改良株を選択し得ることが示された。株ＢＩＥ２７２は、エタノール収率及び生産性に関して、単一コロニー単離物から選択された最良の株であるように思われた。さらに、この株は、ミネラル培地に添加されたか、或いはリグノセルロース系加水分解物に存在するかいずれかの、ヘキソース及びペントース糖類混合物の優れた変換を示し、現在までに知られるペントース発酵株のパフォーマンスを上回った。
【０１９８】
加えて、選択株が遺伝的及び表現型的に安定であることが示された（実施例５）。非選択培地で約５０世代にわたり培養した後、培養前及び培養後に得られる単一コロニー単離物は、同じ関連性のある表現型及び遺伝子型を示す。
【０１９９】
株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のゲノムにおけるどの遺伝的変異、例えばＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、ＤＩＰ（欠失／挿入多型）、欠失、増幅及び再配列が観察された表現型（混合糖基質におけるエタノール収率及び生産性の向上）に寄与したのかを調べるため、本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ゲノム解析機を使用して、当該技術分野で知られるＳｏｌｅｘａ（登録商標）技術を用いてこれらの形質転換体のゲノムＤＮＡの再配列決定を行った。
【０２００】
このために、予め２８０ｒｐｍ及び３０℃で一晩成長させたＹＥＰ  ２％グルコース培養物の株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２から、染色体ＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、ＢＩＥ２５２の場合はＳｅｒｖｉｃｅＸＳ（Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）に送り、及びＢＩＥ２７２の場合はＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）に送り、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ゲノム解析機（それぞれ５０ｂｐ及び７５ｂｐリード、いずれの場合もペアドエンドシーケンシング）を使用して再配列決定を行った。
【０２０１】
主として当該技術の開発水準に関連した配列解析において、種々の配列収率（すなわちリード数）が得られた。全ての株において、数百万の配列リードが得られ、例えばＢＩＥ２７２については、７５ヌクレオチド長さの２千５百万のリードが得られ、１８億ヌクレオチドとなった。
【０２０２】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩマシーンから配列リードを得て、（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアに基づき品質フィルタリングを適用した。加えて、残るリードから、低品質及び多義性のヌクレオチドをトリミングした。
【０２０３】
ＮｅｘｔＧｅｎｅ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ  ＬＬＣ，Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ  １６８０３，ＵＳＡ）及びＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ワークベンチ  ｖ４．５（ＣＬＣｂｉｏ，Ａａｒｈｕｓ，デンマーク）などのソフトウェアを使用して、シーケンシングリードを、株ＢＩＥ２５２の場合にはＳ２８８ｃを鋳型としてアラインメントした。ＢＩＥ２７２の場合、Ｓ２８８ｃの鋳型に対してＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓワークベンチｖ４．５を使用してアラインメントを行い、２回目の分析において、先に得た株ＢＩＥ１０４のシーケンシングデータの集約物を、参照鋳型として使用した。
【０２０４】
リードを鋳型にマッピングした後に得られた塩基あたりの平均読みの深さ：
ＢＩＥ２５２：１２１の読みの深さ
ＢＩＥ２７２：１３５の読みの深さ
【０２０５】
突然変異（単一ヌクレオチド多型及び挿入／欠失、最大３０ｂｐ）を検出し、突然変異レポートに要約した。異なる株にコールされる突然変異を互いに比較し、株間でユニークな変異を同定した。
【０２０６】
突然変異レポートの全エントリーを手動で調べることにより、配列リードのミスアラインメントの可能性、又はシーケンシングエラーに起因する突然変異コール若しくは配列カバレッジが極めて低かったコールを除外した。誤判定の突然変異を突然変異レポートから取り除いた。
【０２０７】
表７は、観察されたＳＮＰの概要を提供する。
【０２０８】
【表１２】
2014512818.tif 000013
【０２０９】
加えて、ゲノムの単一ヌクレオチド位置毎の読みの深さを示すカバレッジプロットを使用して、ゲノムにおいて過剰又は過少に出現する範囲の検索を行った。かかる構造変異は、欠失、重複、コピー数変異、挿入、逆位及び転座を含む。
【０２１０】
図２１は、ＰＭＡ１ターミネーター領域のカバレッジ増加の例を示す。このターミネーターは、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤ（プラスミドｐＰＷＴ０１８にある（ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６２４２号明細書を参照）、並びにｘｙｌＡ遺伝子（欧州特許第１０１６０６４７．３号明細書を参照））の過剰発現用のいくつかのコンストラクトで用いられている。結果として、ＰＭＡ１ターミネーターの複数のコピーが株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のゲノムに存在し、ＰＭＡ１ターミネーターの周囲のゲノム領域と比較したときの読みの深さの増加をもたらす。
【０２１１】
図２２は、この場合キシロースイソメラーゼをコードするｘｙｌＡ遺伝子の、カバレッジ分析の別の例を示す。ｘｙｌＡ遺伝子からなる領域の正規化した読みの深さは９〜１０の値に対応し、これはＱ−ＰＣＲにより決定したときのコピー数（実施例５を参照）と一致する一方、周囲のゲノム領域の読みの深さは約１である。
【０２１２】
この方法を用いて、株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２において過剰又は過少に出現した領域を同定した。株ＢＩＥ２０１において以前観察された増幅（ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６２４２号明細書を参照）は、現在利用可能な情報に基づけば、７番染色体の左腕に位置し、且つこの左腕は株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２においてもはや増幅されないことが分かった。遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ及びａｒａＤを含むＢＩＥ２０１において７番染色体の右腕に観察された増幅は、株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２において保存されている。正規化した読みの深さに基づき、ＢＩＥ２７２におけるアラビノース遺伝子のコピー数を３コピーと決定した。
【０２１３】
［実施例７］
［形質転換体の染色体構造の分析］
再配列決定データから（実施例６を参照）、適応進化後、ゲノムにゲノム変化が起こったと推論することができる。これらのゲノム変化には、単一核多型（ＳＮＰ）、欠失−挿入多型（ＤＩＰ）と、増幅及び転座などのイベントに起因する、染色体構造のより大きい変化とが含まれる。後者を裏付けるため、ＣＨＥＦゲル電気泳動を用いた。
【０２１４】
コンタークランプ均一電場（ＣＨＥＦ）ゲル電気泳動法を用いて、形質転換されていない株ＢＩＥ１０４から、糖混合物のペントース及びヘキソースを迅速に発酵する能力のある株である株ＢＩＥ２７２に至るまでの、ある範囲のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母株の核型を調べた。
【０２１５】
［７．１  ＣＨＥＦ電気泳動法］
染色体の数及びサイズが変化したかどうか、又は特定の主要遺伝子に関する組成を決定するため、ＣＨＥＦ電気泳動法（クランプ均一電場電気泳動法；ＣＨＥＦ−ＤＲ（登録商標）ＩＩＩ可変角度システム；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７，ＵＳＡ）を適用した。供給業者の指示に従いＣＨＥＦ酵母ゲノムＤＮＡプラグキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、酵母株のアガロースプラグ（下記参照）を調製した。供給業者の指示に従い、０．５×ＴＢＥ（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）に１％アガロースゲル（パルスフィールドアガロース、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を調製した。以下の設定に従いゲルを泳動させた：
ブロック１      初期時間  ６０秒
最終時間  ８０秒
比１
実行時間  １５時間
ブロック２      初期時間  ９０秒
最終時間  １２０秒
比１
実行時間 ９時間
【０２１６】
この実験では、染色体のサイズ決定用マーカーとして、株ＹＮＮ２９５のアガロースプラグ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含めた。
【０２１７】
電気泳動後、終濃度７０μｇ毎リットルの臭化エチジウムを使用して、３０分間、ゲルを染色した。図１０に、染色したゲルの例を示す。
【０２１８】
株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ、ＢＩＥ２０１及びＢＩＥ２０１Ｘ９では、７番染色体のサイズが増加した。そのサイズは、約１５００〜１５５０ｋｂの、４番染色体のサイズに近いサイズまで増加した。
【０２１９】
しかしながら株ＢＩＥ２５２では、ＢＩＥ２０１と比較して大きいサイズの７番染色体が減少し、しかし７番染色体の元のサイズ（株ＢＩＥ１０４にあるとおり、非形質転換酵母株）と比べると、なお大きかった。２つの染色体が出現し、それぞれ約１３７５及び１４５０ｋｂのサイズを有した。この結果は、株ＢＩＥ２０１で増幅された７番染色体の左腕が株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２でもはや増幅されないという、再配列決定データ（実施例６）からの観察を裏付けている。７番染色体の右腕の増幅は、ＢＩＥ２０１に存在するのと同様、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２になお存在するため、７番染色体のサイズは、７番染色体の元のサイズ（ＢＩＥ１０４に現れるとおり）と比べるとなお大きい。
【０２２０】
株ＢＩＥ２７２では、状況は一層複雑であるように見える。４番染色体に相当する１６００ｋｂバンドはもはや見えない。４番染色体上には、任意の他の染色体上と同じく、いくつかの必須の（ｉｎｄｉｓｐｅｎｓｉｂｌｅ）遺伝子が存在するため、断片化（すなわち２つのより小さい部分に分かれる）又はサイズの増加（例えば増幅による）のいずれかにより染色体サイズが変化したものと推測される。
【０２２１】
加えて、約１４５０ｋｂのサイズの染色体が消失した。約１３７５ｋｂのサイズの染色体もまた、ＢＩＥ２７２には存在する。
【０２２２】
部分の増幅、転座及び／又は断片化のいずれかにより、染色体がどのように再配列されたかを同定する一方法は、ゲルのＤＮＡをブロッティングによりトランスファーした後、続いて特定の染色体の代表である特異的プローブでハイブリダイズすることである。
【０２２３】
［７．２  特異的プローブによるハイブリダイゼーション］
染色後、ゲルをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｉｅｇｅｍ，ベルギー）にブロットした。
【０２２４】
染色体のサイズ変化の性質を同定できるようにするため、ブロットした膜とのハイブリダイゼーション用プローブを作製した。供給業者の指示に従いＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ，Ａｌｍｅｒｅ，オランダ）を使用して、プローブ（以下の表を参照）を調製した。
【０２２５】
以下のプローブを調製した。
【０２２６】
【表１３】
2014512818.tif 000014
【０２２７】
ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）において、供給業者の指示に従い膜を予備ハイブリダイズした。プローブを９９℃で５分間変性させ、５分間氷冷し、予備ハイブリダイズした膜に添加した。ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩行った。
【０２２８】
供給業者の指示に従いＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して膜を洗浄し、膜のブロックを行った後、ハイブリダイズしたプローブを検出した。検出は、ＡＰ標識抗ジオキシゲニンＦａｂフラグメント（ａｎｔｉ−ｄｉｏｘｙｇｅｎｉｎ−ＡＰ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）（Ｒｏｃｈｅ）とインキュベートし、続いてＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出試薬を添加することにより行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ＋システムを使用して、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ機器により提供される適切な設定を用いて化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）シグナルの検出を実施した。
【０２２９】
結果を図１１（ＰＮＣ１）、図１２ａ（ＡＣＴ１）及び図１２ｂ（ｘｙｌＡ）に示す。
【０２３０】
ＰＮＣ１は７番染色体の左腕に位置し、従ってこの染色体に特異的なプローブと考えられる。非形質転換株の株ＢＩＥ１０４の場合には、ハイブリダイゼーションにより予想されたサイズのバンドが生じた。株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１では（図１１においてＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａと命名される）、同じバンドが観察される。加えて、第２の、それより不鮮明で短いバンドが観察される。臭化エチジウム染色ゲルには、対応するバンドは存在しない（図１０）。従って、このシグナルは電気泳動（トラッピング）及び／又はハイブリダイゼーションのアーチファクトであると推測される。
【０２３１】
株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ、ＢＩＥ２０１及びＢＩＥ２０１Ｘ９では、臭化エチジウム染色ゲルで見られたのと同様に、７番染色体のサイズの増加が観察される（図１０）。そのサイズは、約１５００〜１５５０ｋｂの、４番染色体のサイズに近いサイズまで増加した。
【０２３２】
株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２では、より小さいサイズのバンドがハイブリダイズした。サイズは約１３７５ｋｂである。ＢＩＥ２５２では、第２の、それより大きいもののより薄いバンドが観察され、これはＢＩＥ２７２には存在しない。このバンドは、電気泳動（トラッピング）及び／又はハイブリダイゼーションのアーチファクトの結果であり得る。或いはこのバンドは、より大型の同じ染色体である。アガロースプラグは精製した単一コロニー単離物から調製したため、この可能性は低い。
【０２３３】
強度比較に基づけば、これらの結果は、株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２において７番染色体（ｃｈｒｏｍｏｍｅ  ＶＩＩ）の左腕がもはや増幅されないという上記に記載される観察を裏付けている。バンドの強度から、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ、ＢＩＥ２０１及びＢＩＥ２０１Ｘ９においては、ＢＩＥ１０４及びＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１（ａ）と比べてＰＮＣ１遺伝子のコピー数が増加し、しかし株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２ではまた減少すると推定することができる。
【０２３４】
ＡＣＴ１遺伝子は６番染色体に位置し、増幅しないものと予想される。従って、このプローブは対照として機能する。代わりに、試験した全ての株で、ハイブリダイゼーション後に単一のバンドが観察された（図１２、パネルａを参照のこと）。
【０２３５】
ｘｙｌＡ遺伝子を、株ＢＩＥ２０１Ｘ９の５番染色体にシングルコピー遺伝子として組み込んだ。株ＢＩＥ２５２では、株ＢＩＥ２０１Ｘ９のＴｙ１遺伝子座にさらなるコピーを導入し、続いて適応進化させ、最後に株ＢＩＥ２７２を得た。
【０２３６】
予想どおり、株ＢＩＥ２０１Ｘ９では、１つの単一染色体がｘｙｌＡプローブとハイブリダイズした。オートラジオグラムで観察されたバンドは約６００ｋｂのサイズを有し、これは正しいサイズである。この遺伝的背景では、５番染色体と８番染色体との間の分解能は、マーカー株ＹＮＮ２９５の場合と同様に、それほど顕著でないことに留意されたい（図１０を参照のこと）。
【０２３７】
株ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２では同じバンドが観察される。
【０２３８】
株ＢＩＥ２５２では、少なくとも１つのさらなるバンドが観察され、これは高分子量を有する。このバンドは約２Ｍｂであり、最大の染色体である７番染色体でｘｙｌＡ遺伝子のさらなるコピーの組み込みが起こったことが示唆される。このバンドの強度は、５番染色体上の組み込まれたｘｙｌＡ遺伝子に対応するバンドの強度と比較して高い。双方のバンドの強度比から、コピー数を推測し得る。７番染色体においてｘｙｌＡ遺伝子の複数のコピーが組み込まれたと結論付け得る。コピー数を正確に決定するには、さらに精緻な作業、例えば、適用種々のＤＮＡ濃度、及びいくつかの露光時間によるオートラジオグラムのデンシトメトリーの適用（写真上の銀粒子の密度を計測することによるＤＮＡの定量化）、それによる得られた読み取り値がフィルムの直線範囲内であることの確定が必要である。加えて、シグナル強度の増加は特定の遺伝子のコピー数の増加を示唆し得るが、ゲルに加えたＤＮＡの量、ブロッティング効率、検出飽和など、他の要因もまたシグナル強度に影響を及ぼし得る。
【０２３９】
株ＢＩＥ２５２では２つのさらなるより不鮮明なバンドが観察され、最も濃いバンドと比べて一つは僅かに長く、一つは僅かに短かった。推定では、これらのバンドは、ＤＮＡのトラッピングにより引き起こされる電気泳動のアーチファクトである。
【０２４０】
株ＢＩＥ２７２では、最も強くハイブリダイズするバンドのサイズについて、株ＢＩＥ２５２と比較したときサイズが減少したことから、７番染色体の構造変異が示唆される（図１２ｂ）。これはまた、臭化エチジウム染色ゲルでも観察される（図１０）。また株ＢＩＥ２７２の場合、「シャドーバンド」も生じ、これは電気泳動中の染色体のトラッピングに起因する可能性が最も高い。７番染色体に対応するバンドの強度は、５番染色体に対応するバンドの強度と比べて数倍高く、株ＢＩＥ２７２には、株ＢＩＥ２５２について観察されたのと同様に、ｘｙｌＡ遺伝子の複数のコピーがなお存在することが示唆される。Ｑ−ＰＣＲ実験から、株ＢＩＥ２７２には約９コピーのｘｙｌＡ遺伝子が存在すると結論付けた（実施例５、セクション５．３）。
【０２４１】
染色したゲル（図１０）において、株ＢＩＥ２７２に４番染色体に対応するバンドはもはや見られず、４番染色体が関与する組換えイベントが示唆される。
【０２４２】
結論として、実施例７の結果は、染色体サイズのシフトをもたらす構造変異が起こったことを明らかに示している。どの染色体（の部分）がこれらの過程に関与したのかを結論付けるには、さらに精緻な研究を要し得る。
【０２４３】
［実施例８］
［株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ２０１、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２のパフォーマンス試験］
株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ２０１、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２は、その遺伝子構成及び糖加水分解物におけるそのパフォーマンスに関して異なる特性を有する。以下の表は、これらの株が互いにどのように関係し合うかを示す。
【０２４４】
【表１４】
2014512818.tif 000015
【０２４５】
株ＢＩＥ２７２の開発中に実現した糖混合物の変換に関する改良を例示するため、ＡＦＭ（Ｈａｌｏｔｅｃ，Ｖｅｎｎｅｎｄａａｌ，オランダ）においてパフォーマンス試験を実施した。このために、２％グルコースを炭素源とする１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地において、株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ２０１、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２の単一コロニー単離物を３０℃及び２８０ｒｐｍで２４時間培養した。
【０２４６】
細胞を遠心により収集し、ＡＦＭにおいて５０ｇ／ｌグルコース、５０ｇ／ｌキシロース、３５ｇ／ｌアラビノース、１０ｇ／ｌガラクトース及び５ｇ／ｌマンノースを補足した２００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地中、３３℃及びｐＨ４．２でＣＯ２生成用の培養を実施した（温度３３℃、撹拌速度２５０ｒｐｍ、発酵時間最低７２時間）。ＣＯ２生成を所定の間隔で常時モニタし、分析用の試料を採取した（分光光度計を使用して６００ｎｍの光学濃度で；ＮＭＲによりエタノール、グリセロール及び残留糖類）。
【０２４７】
ＣＯ２進化プロファイルを、図１３、図１４、図１５及び図１６に示す。７１時間と２５分継続した実験中に生成されたＣＯ２の総量を、表１０に示す。
【０２４８】
【表１５】
2014512818.tif 000016
【０２４９】
図１３では、４株全てを１つのグラフに示す。図１４、図１５及び図１６では、その時点における２つの株のペアワイズ比較を行う。
【０２５０】
図１４では、株ＢＩＥ１０４をＢＩＥ２０１と比較する。この糖混合物から、株ＢＩＥ１０４はグルコース及びマンノースのみを発酵することができ、一方、株ＢＩＥ２０１はグルコース、マンノース、ガラクトース及びアラビノースを発酵する。このことによって異なるＣＯ２生成速度プロファイルが生じ（図１４）、生成されたＣＯ２の総量が７０％増加した。
【０２５１】
図１５では、株ＢＩＥ２０１及びＢＩＥ２５２を比較した。ＢＩＥ２０１と比べて株ＢＩＥ２５２において新しい、アラビノース及びヘキソースに次いで、キシロースを変換する能力により、より高いＣＯ２生成速度（図１５）、及びより高い総ＣＯ２生成（ＢＩＥ１０４と比べて＋１０６％及びＢＩＥ２０１と比べて＋２１％）が得られた。
【０２５２】
図１６では、株ＢＩＥ２７２が糖類からエタノール及び二酸化炭素へのより高い変換率を示したことが示される。実験の終了時（７１時間と２５分）、株ＢＩＥ２７２はＣＯ２をＢＩＥ１０４と比べて１４５％多く生成し、及び株ＢＩＥ２５２と比べて１９％多く生成した。
【０２５３】
図１７、図１８、図１９及び図２０には、それぞれ株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ２０１、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２についての糖消費及びエタノール形成を示す。
【０２５４】
株ＢＩＥ１０４（図１７）はグルコース及びマンノースのみを消費する。この株は非形質転換株であるため、これはペントースのキシロース及びアラビノースの変換能を有しない。また、発酵条件下であるため、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｌｉｍｉｔｓ  ｔｏ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ（代謝柔軟性のエネルギー限界：グルコース−ガラクトース転移に対するサッカロミセス・セレビシエの応答）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５５（Ｐｔ  ４）：１３４０−５０）により記載されるとおり、おそらくガラクトース利用のためのルロワールタンパク質の合成を可能にするにはエネルギーチャージが低過ぎ、ガラクトースも変換されない。投与した糖類に対する収率は、７２時間で糖１グラムあたり０．１４グラムのエタノールに達する。
【０２５５】
株ＢＩＥ２０１（図１８）は、グルコース、マンノース、アラビノース及びガラクトースの変換能を有する。この株にキシロース発酵経路は導入しなかったため、キシロースは発酵されない。この実験において、７２時間後にはアラビノースはほぼ完全に発酵されるが、ガラクトースを含めたヘキソースは、実験開始後３６時間経たず完全に変換された。投与した糖類に対する収率は、７２時間で糖１グラムあたり０．２５グラムのエタノールに達する。
【０２５６】
株ＢＩＥ２５２（図１９）は、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース及びガラクトースの発酵能を有する。この実験において、７２時間後にはキシロース及びアラビノースはほぼ完全に発酵されるが、ヘキソースのグルコース、マンノース及びガラクトースは、実験開始後３６時間経たずにほぼ枯渇した。投与した糖類に対する収率は、７２時間で糖１グラムあたり０．３６グラムのエタノールに達する。
【０２５７】
株ＢＩＥ２７２（図２０）は、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース及びガラクトースの発酵能を有する。７２時間後には全ての糖類が迅速且つ完全に発酵され、但しアラビノースは例外で、これはほぼ完全に発酵された。投与した糖類に対する収率は、７２時間で糖１グラムあたり０．４２グラムのエタノールに達する。
【０２５８】
株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ２０１、ＢＩＥ２５２及びＢＩＥ２７２の発酵特性を以下の表に要約する。
【０２５９】
【表１６】
2014512818.tif 000017
【０２６０】
表１１から明らかなとおり、株ＢＩＥ２７２の場合、プロセス全体で収率が増加したのみならず、いくつかの時間間隔における生産性も増加した。最初の２４時間の発酵で、株ＢＩＥ２７２の場合に、株ＢＩＥ２５２と比較したとき生産性は５０％増加した。
【０２６１】
試験した他の株に対する株ＢＩＥ２７２の収率及び生産性の増加に加えて、グルコースの存在下におけるキシロース及びアラビノースの消費速度も同様に増加した。
【０２６２】
６．２時間の時点で、株ＢＩＥ２５２の培養物は１９．８ｇグルコース毎リットル（１１０ｍＭ）を含んだ。２３．３時間の時点で、グルコース濃度は７．１ｇ／ｌ（３９ｍＭ）であった。いずれの濃度も抑制濃度（グルコース又はカタボライト抑制）であり、その濃度ではグルコース以外の炭素源の使用が能動的に回避される。意外にも、この期間中、アラビノース濃度は３０．８ｇ／ｌから２４．３ｇ／ｌに低下し、キシロース濃度は４２．８ｇ／ｌから３２．９ｇ／ｌに低下した。そのため、これらの条件下でグルコース、キシロース及びアラビノースの同時消費が起こった。
【０２６３】
株ＢＩＥ２７２の場合、６．２時間の時点から２３．３時間までに以下の低下が観察された：グルコース  ２２．４ｇ／ｌから４．８ｇ／ｌ（１２４ｍＭから２７ｍＭ）、アラビノース  ３３．７ｇ／ｌから２２．４ｇ／ｌ、及びキシロース  ４６．２ｇ／ｌから２２．６ｇ／ｌ。この株でもまた、キシロース、アラビノース及びグルコースの同時消費が起こった。
【０２６４】
グルコースの存在下におけるアラビノース及びキシロースの消費速度は、乾燥酵母バイオマス１グラムあたりに毎時消費されるペントースのグラム数として計算した。これらの値を表１２に提供する。
【０２６５】
【表１７】
2014512818.tif 000018
【０２６６】
抑制性のグルコース濃度の存在下でペントースのアラビノース及びキシロースを消費する能力は、株ＢＩＥ２７２においてさらに改善された。
【図１】
2014512818.tif 000019
【図２】
2014512818.tif 000020
【図３】
2014512818.tif 000021
【図４】
2014512818.tif 000022
【図５】
2014512818.tif 000023
【図６】
2014512818.tif 000024
【図７】
2014512818.tif 000025
【図８】
2014512818.tif 000026
【図９】
2014512818.tif 000027
【図１０】
2014512818.tif 000028
【図１１】
2014512818.tif 000029
【図１２】
2014512818.tif 000030
【図１３】
2014512818.tif 000031
【図１４】
2014512818.tif 000032
【図１５】
2014512818.tif 000033
【図１６】
2014512818.tif 000034
【図１７】
2014512818.tif 000035
【図１８】
2014512818.tif 000036
【図１９】
2014512818.tif 000037
【図２０】
2014512818.tif 000038
【図２１】
2014512818.tif 000039
【図２２】
2014512818.tif 000040
【配列表】
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【国際調査報告】
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