(57)【要約】  細胞外マトリックス材料を滅菌及び脱細胞化する方法が開示される。開示される方法を用いて作製される細胞外マトリックス組成物もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を滅菌及び無細胞にするための方法であって、
ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に配置する工程と、
二酸化炭素を超臨界の圧力及び温度条件で前記反応容器の前記内部空間に導入する工程であって、それによって前記ＥＣＭ材料を滅菌する、工程と、
前記反応容器の前記内部空間を少なくとも４００ｐｓｉ／分の減圧速度で急速に減圧する工程であって、それによって前記ＥＣＭ材料を無細胞にする、工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記減圧速度が、４００ｐｓｉ／分ないし２，６００ｐｓｉ／分の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記減圧速度が、７００ｐｓｉ／分ないし１，５００ｐｓｉ／分の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記減圧速度が、１，０００ｐｓｉ／分ないし１，２００ｐｓｉ／分の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、少なくとも１つの二次滅菌剤を前記反応容器の前記内部空間に導入する工程を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１の方法により作製された、滅菌された無細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物。
【請求項７】
前記ＥＣＭ組成物が少なくとも１つの組織を含み、前記少なくとも１つの組織の各組織がそれぞれの組織由来であり、前記少なくとも１つの組織の各組織の前記組織由来が、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心嚢、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、血管が付着する又は付着しない心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織から成る群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物。
【請求項８】
前記ＥＣＭ組成物が、少なくとも９６％脱細胞化されていることを特徴とする請求項６に記載の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物。
【請求項９】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を滅菌及び無細胞にし、並びに該材料に添加物を組み込むための方法であって、
ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に配置する工程と、
二酸化炭素を超臨界の圧力及び温度条件で前記反応容器の前記内部空間に導入する工程であって、それによって前記ＥＣＭ材料を滅菌する、工程と、
前記反応容器の前記内部空間を少なくとも４００ｐｓｉ／分の減圧速度で急速に減圧する工程であって、それによって前記ＥＣＭ材料を無細胞にする、工程と、
前記反応容器の前記内部空間に１つ以上の添加物を導入する工程であって、それによって前記１つ以上の添加物の各々の添加物の少なくとも部分が、前記滅菌され、無細胞にされたＥＣＭ材料に組み込まれる、工程と、
を含む方法。
【請求項１０】
前記減圧速度が、４００ｐｓｉ／分ないし２，６００ｐｓｉ／分の範囲にあることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記減圧速度が、７００ｐｓｉ／分ないし１，５００ｐｓｉ／分の範囲にあることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記減圧速度が、１，０００ｐｓｉ／分ないし１，２００ｐｓｉ／分の範囲にあることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、少なくとも１つの二次滅菌剤を前記反応容器の前記内部空間に導入する工程を含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の添加物が、少なくとも１つの増殖因子を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の添加物が、少なくとも１つのサイトカインを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の添加物が、少なくとも１つのプロテオグリカンを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の添加物が、少なくとも１つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の添加物が、タンパク質、ペプチド及び核酸のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の添加物が、少なくとも１つの薬剤を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の添加物がナノ粒子を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応容器の前記内部空間に前記１つ以上の添加物を導入する前記工程が、前記反応容器の前記内部空間を急速に減圧する前記工程と同時に行われることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項９の方法により作製された、滅菌された無細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物。
【請求項２３】
前記ＥＣＭ組成物が少なくとも１つの組織を含み、前記少なくとも１つの組織の各組織がそれぞれの組織由来であり、前記少なくとも１つの組織の各組織の前記組織由来が、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心嚢、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、血管が付着する又は付着しない心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物。
【請求項２４】
前記ＥＣＭ組成物が、少なくとも９６％脱細胞化されていることを特徴とする請求項２２に記載の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，６９３号、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，８７３号、２０１１年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９１，７２３号及び２０１２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６５０，９１１号の出願日の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、滅菌された無細胞の細胞外マトリックス組成物及びそのような組成物の作製方法に関する。特に、本発明は、細胞外マトリックス組成物を同時に滅菌及び脱細胞化する方法、並びにそのような方法によって得られる滅菌された無細胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
組織組成物を滅菌するための従来技術は、組織組成物の特質をしばしば変化させ、及び／又は増殖因子等の組織組成物の重要な構成要素に損傷を与える。その結果、それら従来の滅菌技術は、組織組成物をそれらの意図された目的にしばしばそぐわなくさせる。例えば、エチレンオキシドは、毒性、変異原性及び発がん性の物質であり、組織組成物を弱らせ、組織組成物の増殖因子の含有量を減少させ、組織組成物内のタンパク質を変性させる場合がある。同様に、従来の蒸気滅菌技術は組織組成物の生体高分子に不適合であり、ガンマ線照射は組織組成物の完全性を著しく減少させる。組織組成物の特質を変化させることなく組織組成物を滅菌するための公知技術も存在するが、抗菌洗浄等のそれらの技術の多くは、組織組成物を完全に滅菌できないことがしばしばあり、及び／又は組織組成物に残存毒性汚染物質をしばしば残す。
【０００４】
さらに、組織組成物が対象の体内に移植するために考案される場合、組織組成物は、別個の時間がかかる脱細胞化プロセスにしばしばさらされなければならない。この脱細胞化プロセスは、組織組成物から細胞を除くことを目的とし、それによって対象の免疫システムが移植された組織組成物を拒絶する、及び／又は著しい炎症反応を引き起こす可能性を減少させることができる。しかしながら従来の脱細胞化技術は組織組成物の部分を脱細胞化するに過ぎず、脱細胞化プロセスの後に天然細胞が組織組成物に残る。
【０００５】
ＮｏｖａＳｔｅｒｉｌｉｓ社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（‘８３２号特許）は、超臨界二酸化炭素を使用することにより様々な材料を滅菌する方法を開示する。しかしながら他の公知の滅菌方法と同様、‘８３２号特許に開示されたプロセスにより滅菌される組織組成物も、上記のように、別個の脱細胞化プロセスにさらされなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、細胞外マトリックス組成物等の組織組成物を滅菌及び脱細胞化する単一の方法についての技術が必要である。より具体的に、（ａ）組織組成物の天然の特質を維持しながら組織組成物を滅菌し、（ｂ）組織組成物が無細胞になるように組織組成物を脱細胞化する単一の方法についての技術が必要である。またさらに、組織組成物の滅菌及び／又は脱細胞化中に添加物を組織組成物に組み入れる方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を滅菌及び脱細胞化する方法が開示される。一つの態様では、本方法は、選択されたＥＣＭ組織を採取し、選択されたＥＣＭ組織を凍結し、選択されたＥＣＭ組織を解凍し、ＥＣＭ材料を単離する工程を含む。単離されたＥＣＭ材料は、インキュベーション及びすすぎを施され、その後超臨界二酸化炭素内で処理され、続いて急速減圧にさらされる。ＥＣＭ材料の急速減圧中又は急速減圧後、生成されるＥＣＭ組成物に望ましい特性を与えるために、一つ以上の添加物がＥＣＭ材料に組み入れられる場合がある。開示される方法により製造される滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物もまた開示される。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態のそれら及び他の特徴は、添付の図面を参照する発明の詳細な説明においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。
【図２】図２は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。
【図３】図３は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図３は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物のｂＦＧＦ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図４】図４は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図４は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物の活性ＴＧＦベータ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図５】図５は、本明細書に記載のように、急速減圧中にｂＦＧＦがＳＩＳ組成物に組み込まれた実験の結果を示す。図５は急速減圧後の各ＳＩＳ組成物についてのｂＦＧＦの含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図６】図６は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、二層のＳＩＳ組成物の引張強度が測定された実験の結果を示す。図６は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物について測定された引張強度を示す。
【図７】図７は、本明細書に記載の滅菌及び脱細胞化方法を含む様々な滅菌及び／又は脱細胞化方法を受けて、ＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図７は、滅菌及び／又は脱細胞化後の各ＳＩＳ組成物についてｂＦＧＦ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図８】図８は、様々な方法で処理された後のＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織は超臨界ＣＯ２  にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図９】図９は、様々な方法で処理された後のＳＩＳからのＤＮＡの除去率を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織は超臨界ＣＯ２  にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１０】図１０は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の活性形質転換増殖因子（ＴＧＦベータ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）界面活性剤のみで処理したものである。次に組織は超臨界ＣＯ２  にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌の処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１１】図１１は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）界面活性剤のみを用いて処理したものである。次に組織は、超臨界ＣＯ２  にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１２】図１２は、急速減圧によるＳＩＳへの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量の追加を示す。ベースライン測定は生又は未処理のＳＩＳである。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲及びそれらの前後の記載を参照することによって、より速やかに理解されるであろう。しかしながら、本装置、システム及び／又は方法が開示され記載される前に、別に特定されない限り、本発明は開示された特定の装置、システム及び／又は方法に限定されるものではなく、従って当然に、様々であり得ることが理解されるべきである。また、本明細書の用語は、具体的な態様を記載する目的でのみ使用され、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００１１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形の「一つの（“a”）」、「一つの（“an”）」及び「その（“the”）」は、文脈が明確に別に指示しない限り、複数形の指示物を含む。従って、例えば、一つの「弁葉」の参照は、文脈が別に示さない限り、二つ以上のそのような弁葉を含む場合がある。
【００１２】
本明細書において、範囲は「約」一つの具体的な値から、及び／又は「約」もう一つの具体的な値までのように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、もう一つの態様では、一つの具体的な値から、及び／又は他の具体的な値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することにより、値が近似値として表現される場合、具体的な値がもう一つの態様を形成することが理解されるであろう。さらに、各々の範囲の端点が、他の端点に関係して、及び他の端点に独立して意義を有することが理解されよう。
【００１３】
本明細書で使用される、用語「任意」又は「任意で」は、続いて記載される事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載は、その事象又は状況が起こる事例と起こらない事例とを含む。
【００１４】
本明細書で使用される用語「又は」は、具体的な一覧の任意の一つの要素を意味し、また、その一覧の要素の任意の組み合わせを含む。
【００１５】
別に明確に記載されない限り、本明細書に説明されるいずれの方法又は態様も、そのステップを特定の順序で行うことを要するものと解釈されることを全く意図するものではない。従って、方法に係る請求項が特許請求の範囲において、または発明の詳細な説明において、ステップが特定の順序に限定されるべきであると特に記載しない場合、いかなる点においても、順序を暗示することを全く意図するものではない。このことは、本明細書に記載された、ステップの配列又は動作フローに関するロジックの事柄、文法的構成や句読点から派生する平易な意味、または、態様の数又はタイプを含む、解釈についての任意のあり得る非明示の原則に適用できる。
【００１６】
排他的な用語等を使用することなく、特許請求の範囲の「含む」という用語は、任意の付加的な要素を含むことを許容する。そのことは、所定の数の要素が特許請求の範囲に列挙されているかどうかに関わらず、また、特徴の追加が特許請求の範囲に説明される要素の本質を変質させると見なされ得るかどうかに関わらない。本明細書において特に画定されるときを除いて、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的な用語は、特許請求の範囲の妥当性を維持しながら、可能な限り広範な一般に理解される意味を与えられるべきである。
【００１７】
本明細書で使用される「対象」は個体であり、以下に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット又は齧歯類）、魚、鳥、爬虫類又は両生類を含む。用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、成体及び新生児の対象、並びに胎児は、男性か女性かに関わらず、網羅されることが意図されている。「患者」は、疾患または疾病に苦しむ対象である。用語「患者」は、ヒトおよび家畜対象を含む。本明細書で使用される、用語「患者」と「対象」は、交互に使用され得る。
【００１８】
本明細書で使用される用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が８０％となるように少なくとも８０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を説明することを意図したものである。本明細書に記載のいくつかの実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９０％となるように少なくとも９０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９５％となるように少なくとも９５％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９６％となるように少なくとも９６％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらに他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９７％となるように少なくとも９７％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９８％となるように少なくとも９８％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたまたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９９％となるように少なくとも９９％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。このように、本明細書で使われる、用語「無細胞」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％及びそれらの値の間に入る任意の割合のレベルに脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。
【００１９】
本明細書で使用される、用語「添加物」は、本明細書に開示される滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物に所定の特質を与えるために、開示されるＥＣＭ材料に選択的に組み入れられ得る材料を指す。そのような添加物は、限定でなく例示的に、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、細胞及び例えば、スタチン系薬剤、副腎皮質ステロイド、抗不整脈薬、非ステロイド性抗炎症薬、他の抗炎症化合物等の薬剤、ナノ粒子及び金属化合物を含む場合がある。
【００２０】
本明細書で使用される、用語「同時に」は、事象が同時に及び／又は重複して起こることを指すとともに、事象が互いに前後約３０分以内に順次的に起こることを指す。従って、第１の事象が起こり、そして第２の事象が第１の事象と同時に起こった場合、または、第１の事象の前後３０分以内に起こった場合、第２の事象が第１の事象と同時に起こったという言う場合がある。例えば、第１の方法のステップが行われる場合、第１の方法のステップの五分後に行われる第２の方法のステップは、第１の方法ステップと「同時に」行われると言う場合がある。同様に、第２の方法ステップが第３の方法ステップを行う１０分前に行われた場合、第２の方法ステップが第３の方法ステップと「同時に」行われたと言う場合がある。
【００２１】
本明細書で使用される、用語「エマルション」は、第１のＥＣＭ材料が第２のＥＣＭ材料に非混和性であり、第２のＥＣＭ材料内に第１のＥＣＭ材料が分散された混合物を指す。本明細書に記載される「エマルション」は、水中油型エマルション又は油中水型エマルションのどちらかを指す場合がある。
【００２２】
本明細書で使用される、用語「懸濁液」は、限定でなく例示的に、微粒子ＥＣＭ等の固体のＥＣＭ材料が、限定でなく例示的に、ＥＣＭゲル又はＥＣＭ液等の流体ＥＣＭ材料内に分散（懸濁）された混合物を指す。
【００２３】
本明細書で使用される、用語「超臨界」は、材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているときの材料の流体状態を指す。材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているとき、典型的に気体及び液体の両方の機能特性を有し、超臨界流体として機能すると言われる。従って、例えば、二酸化炭素がその臨界温度（３１．１℃）及びその臨界圧力（１，０７１ｐｓｉ）以上に保持される場合、それは超臨界二酸化炭素流体としてふるまい、例えば、液体の密度を有しながら気体の拡散特性を示し得る。
【００２４】
滅菌された無細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物及びそのような組成物の作製方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される、開示の細胞外マトリックス組成物は、単離されたＥＣＭ材料を同時に滅菌及び脱細胞化することによって形成される。より具体的に、開示の方法は、単離されたＥＣＭ材料の望ましい滅菌と脱細胞化とを同時に達成し、それによって組織組成物の天然の特性が維持され、ＥＣＭ材料が無菌且つ無細胞にされる。
【００２５】
本明細書にさらに記載されるように、開示の方法は、ＥＣＭ材料が無細胞になるように脱細胞化するために、ＥＣＭ材料の急速減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度に比べて著しく高い減圧速度で生ずる。本明細書に記載されるように、ＥＣＭ材料の脱細胞化に加え、ＥＣＭ材料の急速減圧はまた、ＥＣＭ材料に所望の滅菌剤および添加物を組み入れるために使用され得る。
【００２６】
ＥＣＭ組成物
実施態様において、滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／又は基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含む場合がある。開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。さらに、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ウマ、齧歯類等を含む一つ以上の哺乳動物のＥＣＭ構成要素又は材料由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。従って、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、二つ以上のウシ、二つ以上のブタ、二つ以上のイヌ又は二つ以上のヒツジ等の二つ以上の同種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。さらに、開示の滅菌された、無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、または、ウシとヒツジ等の二つ以上の異種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。またさらに、開示の滅菌された、無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、第１の哺乳動物由来のＳＩＳ等の第１の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料、並びに、限定でなく例示的に、第２の哺乳動物由来のＳＳ等の第２の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。
【００２７】
様々な態様で、開示の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、実質的に平坦なシート、円筒状管、実質的に球状の構造、または多積層構造等を含む任意の適切な形状に作製され得る。開示の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物はまた、限定でなく例示的に、固体、液体、ゲル、微粒子、エマルション又は懸濁液の形態等を含む、任意の適切な形態に作製され得ることが企図される。一つの実施態様で、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、液体、微粒子、エマルション、懸濁液及び／又はゲルのＥＣＭ材料の内層を封入する固体のＥＣＭ材料の外層を含み得ることが企図される。
【００２８】
もう一つの実施態様では、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭゲル内に懸濁されてＥＣＭ懸濁液を形成する一つ以上の型の微粒子ＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。この態様で、開示のＥＣＭ懸濁液内の微粒子は、直径が約５μｍないし約３００μｍの範囲にあり、平均直径が約９０μｍないし約１００μｍの範囲にあることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は、約５％ないし約５０％の範囲にあり、開示のＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は、約５０％ないし約９５％の範囲にあり得ることが企図される。従って、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合が約１０％であるとき、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約９０％であり得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合が約１５％であるとき、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約８５％であり得ることが企図される。より好適に、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約２０％ないし約３０％の範囲にあり、そのとき、開示のＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約７０％ないし約８０％の範囲にあり得る。このように、一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約２０％であり、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約８０％であり得る。もう一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約２５％であり、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約７５％であり得る。追加の実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約３０％であり、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約７０％であり得る。上記範囲は具体的な開始点の値及び終点の値を指すが、開示のＥＣＭ懸濁液は、上記の範囲内の任意のゲルの割合及び微粒子の割合から形成され得ることが企図される。
【００２９】
さらなる態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、滅菌され脱細胞化されたＥＣＭを含み得ることが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、ＥＣＭ加水分解物であり得る。それらの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、約５０％より多く加水分解されたＥＣＭ、より好適に、約７０％より多く加水分解されたＥＣＭ、最も好適に、約９０％より多く加水分解されたＥＣＭを含み得ることが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは約１００％加水分解されたＥＣＭを含み得る。またさらに、懸濁液のＥＣＭ構成要素は、限定でなく例示的に、フィブロネクチン及びラミニン等の糖タンパク質、限定でなく例示的に、ヘパラン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン及び増殖因子のうちの少なくとも一つを含み得ることが企図され、そのことによって天然細胞の構成要素のために追加の生物学的利用能を提供することができる。懸濁液のＥＣＭ構成要素は、開示のＥＣＭ懸濁液を対象内に移植した後、細胞の増殖と幹細胞の誘引を促進する構造的および生化学的微環境を提供し得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、対象の細胞がそれら自身のＥＣＭを作製し始めることができるまで、所望の生化学環境を保つ充填剤として機能し得ることが企図される。
【００３０】
またさらに、ＥＣＭゲルによって保たれる所望の生化学環境は、天然組織における生化学環境に実質的に対応し得ることが企図される。このように、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、対象内の標的部位の弾性率と実質的に等しい弾性率を有し得ることが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルの弾性率は、約５ｋＰａないし約５０ｋＰａの範囲にあり、より好適に、約１０ｋＰａないし約１５ｋＰａの範囲にある。
【００３１】
一つの限定でない実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液が対象の心臓上又は心臓内の標的部位に注入するために構成されているとき、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルの弾性率は、心筋の弾性率である、約１１．５ｋＰａである。本明細書で使用される、用語「心臓上又は心臓内」は、限定でなく例示的に、心嚢、心外膜、心筋、心内膜、心室、心房、大動脈、肺動脈、肺静脈、大静脈等の表面又は内部にある位置を指す。もう一つの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、急性心筋梗塞及び／又は慢性冠動脈性心疾患の後に起こる左室壁のネガティブ・リモデリングを治療的に防止する又は食い止めるために、対象の心臓上又は心臓内の標的部位に注入され得ることがさらに企図される。本明細書で使用される、用語「ネガティブ・リモデリング」は、心筋傷害に反応して起こる心臓の有害な及び／又は好ましくない変化を指し、そのような好ましくない変化は、限定でなく例示的に、筋細胞バイオロジーにおける変化、筋細胞の消失、細胞外マトリックス分解、細胞外マトリックス置換性線維形成、左心室の心室形状の変化、増大する壁応力（後負荷）、後負荷不整合、発作性の心内膜下低灌流、増大する酸素利用率、持続性の血行力学的負荷、補償機構の活動悪化等を含む。開示のＥＣＭ懸濁液はまた、心不全を治療的に処理するために、対象の心臓上又は心臓内の標的部位に注入され得ることがさらに企図される。
【００３２】
一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、限定でなく例示的に、心嚢、心外膜、心筋、心内膜、心室、心房、大動脈等の上又は内部の等の対象の心臓上又は心臓内の標的部位に注入され得ることが企図される。任意に、一つの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、格子状のパターンに注入され得る。この態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、離間した実質的に平行な第１の一連の線及び該離間した実質的に平行な第１の一連の線に実質的に垂直な、離間した実質的に平行な第２の一連の線として注入され、それによって格子状のパターンを画成することが企図される。
【００３３】
もう一つの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、対象の心臓上又は心臓内の標的部位に適用され、約０．１ｍｍないし約１０ｍｍ、より好適に、約１ｍｍないし約５ｍｍ、最も好適に、約２ｍｍないし約４ｍｍの範囲にある厚さを有する、開示のＥＣＭ懸濁液の膜を形成することが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、対象の心臓上又は心臓内の標的部位に適用され、約３ｍｍの厚さを有する、ＥＣＭ懸濁液の膜を作り出す場合があることが企図される。
【００３４】
さらなる実施態様において、開示されたＥＣＭ懸濁液は、対象の心臓の心筋または瘢痕組織内に位置する標的部位に注入される場合があることが企図される。この態様では、開示されたＥＣＭ懸濁液が、心嚢の外表面に関連した所望の深さにおいて、対象の心臓内の心筋または瘢痕組織に注入される場合があることが企図される。開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、約０．５ｍｍないし約５ｍｍの範囲、より好適に、約１ｍｍないし約３ｍｍの範囲、最も好適に、約１．５ｍｍないし約２．５ｍｍの範囲にあることがさらに企図される。一つの実施態様において、開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは約２ｍｍであり得ることが企図される。この態様では、開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、心外膜と心筋の間の接合部に近接した位置に対応し得ることが企図される。開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、虚血性の、及び／又は炎症を起こした、及び／又は損傷した心臓組織に近接した位置に対応し得ることがさらに企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、壊死した、及び／又は梗塞を起こした心筋に近接した位置に対応し得ることが企図される。
【００３５】
実施態様において、開示のＥＣＭ懸濁液が、心筋梗塞が起こった後に対象の心筋内及び／又は一つ以上の心室内の標的部位に注入される場合、ＥＣＭ懸濁液は、二つの可能な期間、すなわち、対象の炎症反応が完全に発症する前、または、対象の炎症反応が減少したあとのうちの一つの期間中に標的部位に注入されるべきであることが企図される。一つの態様において、ＥＣＭ懸濁液が対象の炎症反応が完全に始まる前に標的部位に注入される場合、ＥＣＭ懸濁液は、心筋梗塞の発生後に実質的に直ちに、心臓の治療上の血行再建術（例えば、冠動脈バイパスグラフト又はステントによる）のときまでに標的部位に注入されるべきであることが企図される。もう一つの態様において、ＥＣＭ懸濁液が対象の炎症反応が減少したあとに標的部位に注入される場合、ＥＣＭ懸濁液は、その間にネガティブなリモデリング及び瘢痕組織形成が起こる心筋梗塞の急性期の後に、標的部位に注入されるべきであることが企図される。様々な態様では、開示のＥＣＭ懸濁液を対象の心臓上又は心臓内に注入後、ＥＣＭ懸濁液は分散せずに標的部位に幹細胞を誘引し、これにより心臓の所望のポジティブ・リモデリングを促進することができることが企図される。本明細書で使用される、用語「ポジティブ・リモデリング」は、損傷した心臓組織の有利な再生及び／又は再構築を指し、そのようなポジティブ・リモデリングは、心臓の機能を維持し瘢痕組織の形成を防止しながら、新しい細胞の増殖を促進する。
【００３６】
ＥＣＭ組成物の滅菌及び脱細胞化
任意に、開示の細胞外マトリックス組成物は、限定でなく例示的に、ＮｏｖａＳｔｅｒｉｌｉｓ社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（該特許は参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたシステム等の公知の滅菌システムを使用して滅菌することができることが企図される。従って、いくつかの態様では、開示の方法を実施するために使用されるシステムは、標準の圧縮保存シリンダ及びブースター（例えば、ハスケルブースターＡＧＴ７／３０）と連動して使用される標準のエアコンプレッサを含む場合がある。他の態様では、エアコンプレッサ及びブースターは、単一のコンプレッサに置き替えることができる。実施態様において、圧縮保存シリンダは、二酸化炭素を受け入れるように構成される場合があり、ブースターは、二酸化炭素ブースターであり得る。
【００３７】
システムはさらに入口ポートを含む場合があり、それによってリザーバに収容された一つ以上の添加物を弁及び添加物ラインを通じて反応容器に加えることができる。本明細書で使用される、用語「反応容器」は、本明細書に開示されるように、ＥＣＭ材料を受け入れ、ＥＣＭ材料を一つ以上の滅菌剤及び添加物へ曝露できるように構成された内部空間を有する任意の容器を指す。実施態様において反応容器は、限定されないが、バスケット、バケツ、外筒、箱、パウチ及びその他の公知の容器とすることができる。反応容器は再シール可能であり得ることが企図される。一つの態様では、反応容器は、ＥＣＭ材料が充填される注射器であり得ることが企図される。実施態様において反応容器は、Ｔｙｖｅｋ（商標）の包材（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を含むパウチである場合がある。
【００３８】
限定でなく例示的に、二酸化炭素等の選択された一次滅菌剤が、弁及び供給ラインを介してヘッダーラインから反応容器に導入され得ることが企図される。さらに、限定でなく例示的に、０．５μｍフィルタ等のフィルタが、容器から材料が漏れるのを防ぐために、供給ラインに設けられ得ることが企図される。実施態様では、圧力計が、圧力を視覚的に監視することができるように、ヘッダーラインの遮断弁の下流に設けられる場合がある。逆止弁が、ブースター内への逆方向の流体流れを防ぐために、弁の上流のヘッダーラインに設けられる場合がある。ヘッダーラインに過圧状態が存在することを防止するために、圧力逃がし弁が任意で設けられ得る。
【００３９】
一つの態様では、反応容器の減圧は、出口ライン及び反応容器と連通する弁を用いて達成され得る。この態様において、減圧された流体は、供給ラインを介して容器から出て、フィルタユニットにより濾過され、その後セパレータに案内され、二酸化炭素等の濾過された流体が排出ラインを介して排出され得ることが企図される。さらに、上流の構成要素の流体を単離できるように、弁が装置の様々なラインに組み込まれ得ることが企図される。
【００４０】
一つの実施態様において反応容器は、限定でなく例示的に、３１６ゲージステンレス鋼等のステンレス鋼を含む場合がある。もう一つの実施態様において、反応容器は、実験室規模又は工業規模のいずれかで、滅菌される材料を収容するのに十分な全内部体積を有する場合がある。例えば、反応容器は、約８インチの長さ、約２．５インチの内径及び約６００ｍＬの内部体積を有する場合があることが企図される。追加の態様において、反応容器は、振動器、温度制御ユニット、インペラと磁気駆動部とを含む機械的攪拌システムを含む場合がある。一つの任意の態様では、反応容器は、３１６ゲージのステンレス鋼を含むバスケットを収容し得ることが企図される。この態様では、バスケットは滅菌される材料を保持し、さらにインペラを保護し、所定の方法で一次滅菌剤を案内するように構成される場合があることが企図される。
【００４１】
反応容器は、飛沫や乱流による材料の損失なしに、また、逆拡散を介して圧力ラインを汚染することなしに、一定圧力又は継続的な加圧及び減圧（圧力サイクル）条件下で動作させ得ることが企図される。さらに、システム内の弁は、反応容器をシステムの他の構成要素から容易に分離及び除去することを可能にし得ることが企図される。一つの態様では、反応容器の内部空間へアクセスできるようにするために、減圧時に反応容器の頂部を除去することができる。
【００４２】
任意に、システムは、ユーザが反応容器内の温度を調整可能に制御できるようにする温度制御ユニットを含む場合がある。
【００４３】
使用するとき開示された装置は、本明細書に開示のような滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製する方法に採用される場合がある。しかしながら、開示の装置は単に例示であって、開示の方法のステップを実行することが可能な任意の装置が、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが理解される。従って特許請求の範囲に係る方法は、特定の装置に限定されるものでは全くない。
【００４４】
コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の有意な低減が、開示の方法に従い、一次滅菌剤を使用し滅菌温度及び圧力条件に単離されたＥＣＭ材料をさらすことにより、達成され得ることが企図される。任意に、一次滅菌剤は、所望の滅菌を達成するために、1つ以上の二次滅菌剤と組み合わせることができることが企図される。任意に、さらに、選択された添加物が、得られるＥＣＭ組成物に所望の特性を与えるためにＥＣＭ材料に組み込まれ得ることが企図される。またさらに、開示の方法は、対象の体内に移植するための滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが企図される。
【００４５】
本明細書に記載のように、開示の方法は、ＥＣＭ材料を無細胞にするために、単離されたＥＣＭ材料の急速な減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速な減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度よりも著しく高い減圧速度で起こる。本明細書に記載のようにＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料への所望の滅菌剤及び添加物の組み込みを強化するために使用することができる。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、天然の増殖因子の保持性を向上させながら、ＥＣＭ材料を無細胞にすることができることが企図される。またさらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、ＥＣＭ材料の引張強度の保持性を向上させるために使用することができることが企図される。
【００４６】
開示の方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及び生体栄養特性（bioptric properties）を著しく弱めることがないだけではなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化し、並びに、ＥＣＭ組成物に様々な添加物を組み入れる性能を強化することに、より有効である。従って、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知のＥＣＭ組成物に比べて、より脱細胞化された、並びに、より多くの添加物を組み込み、その後送達するより高い性能を有するＥＣＭ組成物を提供する。さらに、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知である滅菌され脱細胞化されたＥＣＭ組成物に比べて、より多い量及び／又はより高い濃度の保持された天然の増殖因子を有し、より高い引張強度を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【００４７】
実施態様において、一次滅菌剤は、その臨界圧力及び臨界温度条件にある、または、それに近い条件にある二酸化炭素とすることができる。しかしながら、例えば、ＥＣＭ材料の天然の特性を妨げない気体、液体又は粉末の滅菌剤を含む任意の従来の滅菌剤が一次滅菌剤として使用され得ることが企図される。
【００４８】
一つの実施態様において、開示される滅菌プロセスは、一次滅菌剤として二酸化炭素を用いて、約１，０００〜約３，５００ｐｓｉの範囲にある圧力及び約２５℃〜約６０℃の範囲にある温度で実施され得る。より好適に、超臨界二酸化炭素が使用される場合、滅菌プロセスは、１，０７１ｐｓｉ以上の圧力及び３１．１℃以上の温度で一次滅菌剤として二酸化炭素を使用し得ることが企図される。この態様では、滅菌されるＥＣＭ材料は、そのような圧力および温度条件又はそれに近い条件にある二酸化炭素に、約１０分ないし約２４時間、より好ましくは、約１５分ないし約１８時間、最も好ましくは、約２０分ないし約１２時間の間、さらされる場合がある。好適に、開示のシステム及び方法に用いられる二酸化炭素は純粋であるか、または代替的に、二酸化炭素の滅菌特性を損なわない他のガスを微量のみ含むものであり得る。以下のさらなる検討を簡単にするために、用語「超臨界二酸化炭素」が使用されるが、そのような用語は、前述のような圧力及び温度範囲内にある二酸化炭素に限定されず、開示の方法の実施に十分に採用され得ることが理解されよう。開示された圧力及び温度範囲内で、二酸化炭素は気体、液体、流体又はプラズマ形態でＥＣＭ材料に与えられ得ることが企図される。
【００４９】
いくつかの態様で、開示の方法で用いる二次滅菌剤は、限定でなく例示的に、過酸化物及び／又はカルボン酸等の化学滅菌剤を含み得る。好ましいカルボン酸は、アルカンカルボン酸及び／又はアルカン過カルボン酸（alkanepercarboxylic acids）を含み、それらは各々任意に、ハロゲン、酸素、窒素グループ等の1つ以上の電子求引性置換分とα位の炭素で置き換えることができる。開示の方法の実施に使用される化学滅菌剤の実施例の種類は、限定でなく例示的に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、酢酸（ＡｃＡ）、過酢酸（ＰＡＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びそれらの混合物を含む。一つの実施態様において、化学滅菌剤は、酢酸、過酸化水素及び過酢酸を含む混合物であるＳｐｏｒｅｃｌｅｎｚ（商標）滅菌剤を含み得る。
【００５０】
二次滅菌剤は、一次滅菌剤の全体積を基準に、滅菌強化に有効な量の少なくとも約０．００１ｖｏｌ％以上で用いることができることが企図される。さらに、二次滅菌剤の量は、用いられる特定の二次滅菌剤に依存する場合があることが企図される。従って、例えば、過酢酸は約０．００５ｖｏｌ％以上の比較的少量であり、一方で酢酸は、約１．０ｖｏｌ％以上の量で用いられる場合があることが企図される。従って、二次滅菌剤の濃度は、約０．００１ｖｏｌ％ないし約２．０ｖｏｌ％の範囲にあり、典型的に、限定でなく例示的な超臨界二酸化炭素等の開示された一次滅菌剤と組み合わせて、滅菌強化作用を達成するために、本明細書に開示のように使用され得ることが企図される。
【００５１】
一つの態様では、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物の製造方法は、哺乳動物由来の選択された組織を採取する工程と、選択された組織を滅菌生理食塩水又は他の生体適合性の液体（限定でなく例示的に、リンゲル液又は平衡生物学的塩類溶液を含む）中ですすぐ工程を含む場合がある。この態様において、選択された組織は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるもの又はないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織であり得る。もう一つの態様において、本方法は、選択された組織を約１２〜約３６時間、より好ましくは、約１８〜約３０時間、最も好ましくは、約２２〜約２６時間の範囲にある期間、凍結する工程を含む場合がある。例えば、選択された組織がその間凍結される期間は、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間及び前述の値の間に入る時間の任意の他の期間であり得ることが企図される。追加の態様において、本方法は、冷低張トリス緩衝液中で選択された組織を解凍する工程を含む場合がある。任意に、この態様では本方法は、選択された組織を冷やした冷低張トリス緩衝液中で、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて解凍する工程を含む場合がある。実施態様では、選択された組織を凍結及び解凍するステップは、６回まで周期的に繰り返すことができることが企図される。
【００５２】
もう一つの態様において、本方法は、選択された組織由来のＥＣＭ材料を単離する工程を含む場合がある。この態様において、ＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるもの又はないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織等の公知の細胞外マトリックス構成要素を含む任意の材料とすることができる。一つの例示的な限定しない態様において、ＥＣＭ材料を単離するステップは、哺乳動物組織由来からＳＩＳを単離する工程を含む場合がある。この態様では、本方法は、小腸の壁を該小腸の長手方向の軸に実質的に平行な経路に沿って切開する工程と、切開の経路に沿って小腸を開く工程であって、それによって小腸が表面上で平らな状態になる、工程と、滅菌生理食塩水又は他の生体適合性の流体で小腸をすすぐ工程と、粘膜下層及び基底膜層を本質的に残して、ＳＩＳから小腸の周囲の平滑筋層及び漿膜層、並びに粘膜を機械的に取り去る工程とを含み得る。しかしながら、ＥＣＭ材料は、米国特許第４，９０２，５０８号；米国特許第５，２７５，８２６号；米国特許第５，２８１，４２２号；米国特許第５，５５４，３８９号；米国特許第６，５７９，５３８号；米国特許第６，９３３，３２６号；米国特許第７，０３３，６１１号；Ｖｏｙｔｉｋ−Ｈａｒｂｉｎ他、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ” Ｊ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., Ｖｏｌ. ６７, ｐｐ. ４７８−４９１ （１９９７）；Ｈｏｄｄｅ他、“Ｖｉｒｕｓ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ： Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｖｉｒａｌ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ,” Ｂｉｏｔｅｃｈ. ＆ Ｂｉｏｅｎｇ., Ｖｏｌ. ７９, Ｎｏ. ２, ｐｐ. ２１ １−２１６ （２００１）；Ｂａｄｙｌａｋ他、“Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｓ ａ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ,” Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ. １３, ｐｐ. ３７７−３８３ （２００２) ；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、“Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｅｐａｉｒ,” Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ, Ｖｏｌ. １１２, ｐｐ. Ｉ−１３５−Ｉ−１４３ （２００５）；Ｈｏｄｄｅ他、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ａｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ： Ｐａｒｔ Ｉ. Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ,” Ｊ. Ｍａｔｅｒ. Ｓｃｉ.: Ｍａｔｅｒ. Ｍｅｄ., Ｖｏｌ. １８, ｐｐ. ５３７−５４３ （２００７)；並びに、Ｈｏｄｄｅ他、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ａｎ Ｅｘ��ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ: Ｐａｒｔ ＩＩ. Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ,“ Ｊ. Ｍａｔｅｒ. Ｓｃｉ.: Ｍａｔｅｒ. Ｍｅｄ., Ｖｏｌ. １８, ｐｐ. ５４５−５５０ （２００７）（各々が参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載された等のいずれかの従来技術を使用して単離され得ることが企図される。
【００５３】
さらなる態様において、本方法は、単離されたＥＣＭ材料を、０．５〜１％トリトンＸ−１００／０．５〜１％デオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｉｎｃ．）中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて２４時間ないし４８時間インキュベートする工程を含む場合がある。この態様において、胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平らな、またはシート状のＥＣＭ材料は、伸張された形態でインキュベートされ得ることが企図される。さらに、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等のＥＣＭ材料の導管又は他の内腔を有するＥＣＭ材料は、浸漬を通じて、蠕動ポンプを使用することにより様々な開示された溶液を用いて灌流され得る。
【００５４】
さらなる態様では、インキュベーション後に、本方法は、ＥＣＭ材料をＤＰＢＳですすぐ工程を含む場合がある。この態様で、ＥＣＭ材料をすすぐステップは、１回、２回、３回、４回、５回又は６回を含む６回までＥＣＭ材料をすすぐこと（各々のすすぎは約３０分間持続する）を含み得ることが企図される。一つの実施態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎは約３０分持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００５５】
任意で、実施態様において、本方法はさらに、第２のインキュベーション手順を含む場合がある。これらの態様において、第２のインキュベーション手順は、ＥＣＭ材料を、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを含有する等張トリス緩衝液内で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートする工程を含み得る。等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートするステップは、人体の温度に実質的に対応する約３７℃の温度で行われ得ることが企図される。さらに、等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートするステップは、約３０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは約1時間ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは約２時間ないし約１２時間にかけての期間、行われ得ることが企図される。さらなる態様において、第２のインキュベーション手順は、さらに、ＤＰＢＳでＥＣＭ材料をすすぐ工程を含む場合がある。この態様では、ＥＣＭ材料をすすぐステップは、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎが約３０分間持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００５６】
またもう一つの態様では、第２のインキュベーション手順が行われるか否かに関わらず、本方法はＥＣＭ材料を、約１℃〜約１０℃、より好適に約２℃〜約６℃、最も好適に約３℃〜約５℃の範囲にある温度で保存する工程を含む場合がある。実施態様において、ＥＣＭ材料は４℃で保存される場合がある。
【００５７】
さらなる態様において、本方法は、ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に導入する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤が、ＥＣＭ材料とともに反応容器の内部空間に加えられ得る。これらの態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤は、ＥＣＭ材料の前後に、またはＥＣＭ材料と同時に反応容器の内部空間に加えられ得る。さらに、温度制御ユニットが、反応容器の内部空間内に所望の温度を作り出すように選択的に調整され得ることが企図される。さらなる態様において、本方法は、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力を平衡にする工程を含む場合がある。例えば、この態様では、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力が大気圧と実質的に等しい場合があることが企図される。さらに別の態様では、装置内の圧力を平衡にした後に、本方法は、反応容器のインペラを活動化させるために磁気駆動部を動作させる工程を含む場合がある。またさらなる態様では、本方法は、反応容器内が所望の圧力に達するまで、反応容器に保存シリンダから一次滅菌剤を選択的に導入する工程を含む場合がある。この態様では、反応容器に一次滅菌剤を選択的に導入するステップは、反応容器への一次滅菌剤の流れ込みを増大させるために、エアコンプレッサとブースターとを選択的に活動化させることを含み得ることが企図される。実施態様において、エアコンプレッサ及びブースターは、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素を作製するのに必要な圧力及び温度等の超臨界圧力及び温度を、約２０分から約６０分の範囲にある期間の間、ＥＣＭ材料に施すように活動化される場合がある。
【００５８】
さらなる態様において、本方法は、反応容器を急速に減圧する工程を含む場合がある。この態様では、所定量の、限定でなく例示的に超臨界二酸化炭素等の一次滅菌剤が、減圧ラインを通じて反応容器から放出され得る。一次滅菌剤は、反応容器に結合した弁を開くことを通じて反応容器から放出される場合があり、そのことによって反応容器内の圧力を急速に減少させることが企図される。本明細書で使用される、用語「急速減圧」は、４００ｐｓｉ／分以上の速度での反応容器の減圧を指す。例えば、反応容器は、約２．９ＭＰａ／分ないし約１８．０ＭＰａ／分（約４００ｐｓｉ／分ないし約２，６００ｐｓｉ／分）、より好適に、約５．０ＭＰａ／分ないし約１０．０ＭＰａ／分（約７００ｐｓｉ／分ないし約１，５００ｐｓｉ／分）、最も好適に、約７．０ＭＰａ／分ないし約８．０ＭＰａ／分（約１，０００ｐｓｉ／分ないし約１，２００ｐｓｉ／分）の範囲にある減圧速度で減圧され得ることが企図される。従って、これらの急速な減圧は、米国特許第７，１０８，８３２号に開示された３００ｐｓｉ／分の減圧速度よりも著しく大きい。いかなる特定の理論に拘束されることなく、開示の急速な減圧速度は、ＥＣＭ材料で達成される脱細胞化のレベルを増加させると考えられる。例えば、開示のＥＣＭ材料の急速な減圧は、結果として約９６％を超える（９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００．０％等）ＥＣＭ材料の脱細胞化のレベルをもたらす場合がある。
【００５９】
実施態様において、本方法はさらに、ＥＣＭ材料に1つ以上の添加物を組み込むステップを含む場合がある。これらの態様では、1つ以上の添加物は、粉末又は液体の形態のいずれかで提供され得ることが企図される。一つの任意の態様において、1つ以上の添加物を組み込むステップは、反応容器を急速に減圧するステップの間に、反応容器に1つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、1つ以上の添加物の導入は、従来の泡沫プロセスとして位置付けられる場合があることが企図される。別の任意の態様において、1つ以上の添加剤を組み込むステップは、反応容器を急速に減圧するステップの後、反応容器内に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物は、反応容器の急速な減圧がＥＣＭ材料を増大させ、及び／又は伸展させた後にＥＣＭ材料に添加され、それによってＥＣＭ材料への添加物の浸透を向上させるようにすることが企図される。さらに、実施態様において、１つ以上の添加物は、反応容器の急速減圧の後、約３０分以内にＥＣＭ材料に添加され得ることが企図される。さらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込むステップは、反応容器を急速減圧するステップの間、及びそのステップの後の両方で、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物が速い方法及び遅い、拡張された方法の両方で反応容器内に放出され得ることが企図される。またさらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込むステップは、反応容器を急速に減圧するステップの前に、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。
【００６０】
開示の添加物は、結果として得られる滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物に選択された特性を付与するために、ＥＣＭ材料に組み込まれ得る。このように、１つ以上の添加物は、本明細書に記載のように、ＥＣＭ材料の処理中に失われるＥＣＭ材料の構成要素を置換又は補完するように選択され得ることが企図される。例えば、以下に記載されるように、１つ以上の添加物は、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、薬物又は細胞を含む場合がある。さらに、１つ以上の添加物が、ＥＣＭ材料に非天然の構成要素を組み込むように選択され得ることが企図される。例えば、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞を動員するための増殖因子、血管新生サイトカイン及び抗炎症性サイトカインを含む場合がある。またさらに、１つ以上の添加物は、スタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤等の薬剤であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、イリジウムナノ粒子、ロジウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、亜鉛ナノ粒子及びその他金属ナノ粒子等のナノ粒子であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、金属化合物であり得ることが企図される。１つの実施態様において、１つ以上の添加物は、得られるＥＣＭ組成物を対象の体内に移植した後に、対象の免疫反応を薬学的に抑制するように選択され得る。
【００６１】
一つの態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、形質転換増殖因子ベータ−１、−２、−３（ＴＧＦ−β−１、−２、−３）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られる）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む１つ以上の増殖因子を含む場合がある。
【００６２】
他の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、アンフィレグリン、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、トロンボスポンジン３、トロンボスポンジン４、トロンボスポンジン５及びアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を含む１つ以上のサイトカインを含む場合がある。
【００６３】
追加の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ベータグリカン、シンデカン、デコリン、アグリカン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、ルミカン、エピフィカン、パールカン、アグリン、テスティカン、シンデカン、グリピカン、セルグリシン、セレクチン、レクチカン、ベルシカン、ニューロカン及びブレビカンを含む１つ以上のプロテオグリカンを含む場合がある。
【００６４】
さらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）及びコンドロイチン硫酸Ａを含む1つ以上のグリコサミノグリカンを含む場合がある。
【００６５】
またさらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、ベルシカン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリリン１、フィブリリン２、プラスミノーゲン、小ロイシンリッチタンパク質、細胞表面付随性タンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、マトリカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カドヘリン、免疫グロブリン、マルチプレキシン、細胞質領域―４４（ＣＤ−４４）、アミロイド前駆体タンパク質、テネシン、ナイドジェン／エンタクチン、フィビュリンI、フィビュリンII、インテグリン、膜通型分子及びオステオポンチンを含む１つ以上のタンパク質、ペプチド又は核酸を含む場合がある。
【００６６】
さらに別の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチン等のスタチン薬物、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤、抗菌剤、抗生物質等を含む１つ以上の薬剤を含む場合がある。
【００６７】
実施態様において、反応容器中に１つ以上の添加物を導入するステップは、１つ以上添加物が、リザーバから入口ポートに流れるように弁を開けることを含む場合がある。加圧の前に、１つ以上の添加物は、シールに先だって反応容器内に直接導入、及び／又は入口ポートを介して導入され得ることが企図される。
【００６８】
開示される反応容器の急速減圧及び再加圧は、１つ以上の添加物の添加のあるなしに関わらず、任意の所望のサイクル数で繰り返され得ることが企図される。さらに、減圧と再加圧のサイクル、並びに、一次滅菌剤及び／又は二次殺菌剤及び／又は添加物の導入が、システムの様々な弁を選択的に開く及び／又は閉じるように構成された制御器を介して自動的に制御され、所望の圧力条件及びサイクルを達成し得ることが企図される。
【００６９】
いくつかの態様では、開示される方法は、さらに、反応容器の内容物を攪拌するステップを含む場合がある。これらの態様では、反応容器の内容物を攪拌するステップは、振動器を用いて反応容器の内容物を周期的に攪拌することを含み得ることが企図される。さらに、反応容器の攪拌は、断続的、継続的又は連続的であり得ることが企図される。実施態様において、反応容器の内容物を攪拌するステップは、一次滅菌剤を反応容器内に導入するステップ中に起こる場合がある。反応容器の内容物の撹拌は、反応容器内の流体中の空隙を排除してＥＣＭ材料と滅菌剤及び／又は添加物とをより完全に接触させることにより、滅菌剤及び／又は添加物の物質移動を向上させ得ることが企図される。さらに、反応容器の内容物を攪拌するステップは、滅菌時間、温度、加圧／減圧サイクルを最適化するように攪拌の強度および持続時間を選択的に調整することを含み得ることが企図される。
【００７０】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料の滅菌及び脱細胞化が完了した後、本方法はさらに、反応容器を減圧する工程及び攪拌翼（インペラ）の動作を停止するように磁気駆動部を非活動化させる工程を含む場合がある。最後に本方法は、結果として得られる、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を反応容器の上部を通じて取り外すステップを含む場合がある。
【００７１】
開示のステップの持続時間、並びに開示のステップに関連する温度及び圧力は、ＥＣＭ材料の特性の多様性を考慮して選択的に変更され得ることが企図される。例えば、ＥＣＭ材料が多積層構造であり、増大した厚さを有し、または注射器内に配置される場合、開示のステップの持続時間が増加され得ることが企図される。
【００７２】
一つの任意の態様においては、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を微粒子形態に作製するために、本方法は、ＥＣＭ組成物を所望の長さを有する断片に切断する工程を含む場合がある。別の態様において、本方法は任意に、ＥＣＭ組成物の断片を凍結乾燥させる工程を含む場合がある。追加の態様において、本方法は任意に、ＥＣＭ組成物の凍結し水和した断片を粉砕する工程と、次いでＥＣＭ組成物の断片を、所望のサイズのＥＣＭ微粒子が単離されるまで、サイザースクリーンを通過させる工程を含む場合がある。さらなる任意の態様では、本方法は、本明細書に記載されるように、ＥＣＭ懸濁液を形成するために、滅菌生理食塩水または他の無菌の生体適合性流体でＥＣＭ微粒子を再水和させる工程を含む場合がある。
【００７３】
ＥＣＭ材料への添加物の組み込みを強化する方法
実施態様において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料への添加物の組み込みを強化する方法は、反応容器の内部空間にＥＣＭ材料を配置する工程と、反応容器の内部空間に二酸化炭素を超臨界圧力及び超臨界温度条件で導入する工程であって、それによってＥＣＭ材料を滅菌する、工程と、反応容器の内部空間を、ＥＣＭ材料を無細胞にし、かつ添加物を組み込むためのＥＣＭ材料の能力を増大させるのに十分な減圧速度で急速減圧する工程と、１つ以上の添加物を反応容器の内部空間内に導入する工程であって、１つ以上の添加物の各々の添加物の少なくとも部分が滅菌された無細胞ＥＣＭ材料に組み込まれる、工程を含み得る。
【００７４】
減圧速度は、約４００ｐｓｉ／分ないし約２，６００ｐｓｉ／分、より好適に、約７００ｐｓｉ／分ないし約１，５００ｐｓｉ／分、最も好適に、約１，０００ｐｓｉ／分ないし約１，２００ｐｓｉ／分の範囲にあり得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料への添加物の組み込みを強化する方法は、さらに、反応容器の内部空間に少なくとも1つの二次滅菌剤を導入する工程を含む場合があることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、少なくとも１つの増殖因子を含み得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、少なくとも一つのサイトカインを含み得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、少なくとも１つのプロテオグリカンを含み得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、少なくとも１つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含み得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、タンパク質、ペプチド、及び核酸のうちの少なくとも１つを含み得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、少なくとも１つの薬剤を含み得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、ナノ粒子を含み得ることが企図される。
【００７５】
任意に、反応容器の内部空間に１つ以上の添加物を導入するステップは、反応容器の内部空間を急速減圧するステップと同時に行われることが企図される。
【００７６】
さらに、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物は、ＥＣＭ材料への添加物の組み込みを強化する開示の方法を用いて製造され得ることが企図される。実施態様において、滅菌、無細胞ＥＣＭ組成物は、少なくとも１つの組織を含む場合があり、少なくとも１つの組織の各組織は、それぞれの組織由来からであり得る。これらの態様では、少なくとも１つの組織の各組織の組織由来は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心嚢、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着する血管の有無に関わらず心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織から成る群から選択され得ることが企図される。一つの態様において、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、本明細書の説明のように、少なくとも約９６％脱細胞化される場合がある。
【００７７】
実施例
以下の実施例は、当業者に、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのように作製され、評価されるかという完全な開示及び説明を提供するように述べられるものであり、本発明の単に実施例であることが意図され、発明者らが発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、いくらかの誤差や偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃又は雰囲気温度におけるものであり、圧力は大気圧又はその近傍におけるものである。
【００７８】
実施例１
開示された滅菌及び脱細胞化方法の実施例の適用において、選択された組織が採取され滅菌生理食塩水ですすがれた。その後選択された組織は、２４時間凍結された。凍結された組織は５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて冷やした冷低張トリス緩衝液中で解凍された。本明細書に記載されたように、細胞外マトリックス材料が次いで各々の選択された組織から単離された。
【００７９】
単離された細胞外マトリックス材料は、０．５〜１％トリトンＸ−１００／０．５〜１％デオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｉｎｃ．）中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて、２４〜４８時間インキュベートされた。胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平らな細胞外マトリックス材料は、伸張された形態でインキュベートされた。尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等の管状の細胞外マトリックス材料は、浸漬を通じ、蠕動ポンプを用いて溶液で灌流された。
【００８０】
インキュベーション後、各々の細胞外マトリックス材料は、ＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを使用した各々のすすぎは、３０分間持続した。その後いくつかの細胞外マトリックス材料が、２〜１２時間に渡って３７℃で、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを含有する等張トリス緩衝液中で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートされた。該インキュベーションステップの後、細胞外マトリックス材料は、再びＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを用いた各々のすすぎは３０分間持続した。細胞外マトリックス材料は４℃で保存された。
【００８１】
保存の４８時間以内に、細胞外マトリックス材料は、本明細書で開示のように、超臨界二酸化炭素内で２０分から６０分間、３１．１℃以上の温度及び１，０７１ｐｓｉ以上の圧力で処理された。この滅菌ステップの後、細胞外マトリックス材料は、２．７ＭＰａ／１０秒（３９１．６ｐｓｉ／１０秒）の速度で１分１９秒間、急速に減圧された。この間に、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａへ急速に減少した。
【００８２】
細胞外マトリックス材料は、次いで、最終の滅菌を達成するために、３０分から６時間、本明細書に開示のように、超臨界二酸化炭素及び過酢酸（ＰＡＡ）内で処理された。この処理ステップでは、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａに増加した。得られた滅菌無細胞の細胞外マトリックス材料は、その後、流体の漏れを防止するためにプラスチック製のパウチ内にシールされたＴｙｖｅｋ（商標）（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）のパウチに詰められた。
【００８３】
表１は、ブタ尿管、ウシ心嚢及びブタ中皮の滅菌及び脱細胞化をまとめたものである。
【表１】
2014519906.tif 000002
【００８４】
実施例２
ＥＣＭ材料サンプルのＤＮＡ含有量が、様々な滅菌及び脱細胞化技術を用いたそれぞれのＥＣＭ材料サンプルの脱細胞化の指標として測定された。測定されたＤＮＡ含有量は、ピコグリーン（ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ）アッセイで評価され、ＤＮＡは蛍光ラベルでラベルされ、分光光度計で検出された。測定されたＤＮＡ含有量は、サンプルの乾燥重量で正規化された。ＤＮＡ含有量は、以下の、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  による６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたようにＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  による２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳの処理群について測定、評価された。
【００８５】
図１は、乾燥重量で正規化されたそれぞれのサンプルの総ＤＮＡ含有量を示す。図２は、生の、未処理のＳＩＳと比較した、各それぞれのサンプルから除去されたＤＮＡの割合を示す。これらの結果は、非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた６０分間の処理を使用して滅菌することにより、生のＳＩＳに見られるＤＮＡの９６％を超えるものが除去されたことを示し、比較して、ＳＩＳがＥｔＯによって滅菌された場合は９４％のみ、ＳＩＳがいずれの方法でも滅菌されなかった場合は９３％のみであることを示した。
【００８６】
尿管が、強くない界面活性剤（ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡ内の０．５％トリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）を用いて２４時間処理され、次いで、本明細書で開示されたように、ＤＰＢＳ内で三回すすがれた。この前処置の後に、尿管は、本明細書に開示されたように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  での処理とを使用して脱細胞化され滅菌された。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色が、以下の処理の段階、すなわち、（Ａ）天然尿管、（Ｂ）前処理された尿管、（Ｃ）前処理された尿管に、本明細書に開示のように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  での処理を用いたものの１つのサンプル尿管のために調製された。これらの染色は、急速減圧によりＤＮＡ含有量が著しく低減されたことを示した。
【００８７】
実施例４
ＥＣＭ材料サンプルの増殖因子の含有量が測定された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がＥＣＭ材料サンプルに対して実施され、各それぞれのサンプルの、ｂＦＧＦ及び活性型のＴＧＦベータの含有量が定量化された。以下の処理群、すなわち、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のようにＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のようにＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳの処理群が評価された。ｂＦＧＦ含有量及びＴＧＦベータ含有量の測定は、各それぞれのサンプルの乾燥重量で正規化された。それらの結果が図３及び図４に示されている。それらの結果は、ＥｔＯにさらしたことにより、両方の増殖因子の濃度が低下したことを示した。しかしながら、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた滅菌では、増殖因子の濃度に影響はなかった。
【００８８】
実施例５
本明細書に開示された方法により、超臨界ＣＯ２  が、一次滅菌剤として、また、ＳＩＳシート内へｂＦＧＦを添加するための担体として使用された。まず、それぞれのＳＩＳシートは、ｂＦＧＦの様々な量に従ってＴｙｖｅｋ（商標）パウチに入れられた。パウチは９．６ＭＰａで６０分間超臨界ＣＯ２  に曝露された。パウチは、７．２０ＭＰａ／分の速度で急速に減圧された。サンプルは、２０分間、超臨界ＣＯ２  において１６ｍＬのＰＡＡ中で直接処理された。以下の処理群、（１）ｂＦＧＦ無添加、（２）５μＬのｂＦＧＦ添加、（３）１５μＬのｂＦＧＦ添加が評価された。μＬ毎のｂＦＧＦは０．１μｇのｂＦＧＦを含有した。従って、各ＳＩＳシートは約０．５ｇの重量であったため、５μＬ及び１５μＬの群について、ｂＦＧＦの最大濃度はそれぞれ、約４１７０ｐｇ／ｍｇの乾燥重量及び約１２，５００ｐｇ／ｍｇの乾燥重量だった。それぞれのサンプルの乾燥重量に関して測定されたそれらの群のｂＦＧＦの含有量が、図５に示されている。これらの結果は、ｂＦＧＦの測定された濃度が最大の濃度に達しなかったこと、及び１５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプルは、５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプル中のｂＦＧＦの測定された濃度の３倍を超えるｂＦＧＦの測定された濃度を有しないことを示した。
【００８９】
実施例６
二層のＳＩＳサンプルの引張強度が測定された。以下の処理群、（１）ＥｔＯ処理、（２）２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  処理、（３）６０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  処理、及び（４）１２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  処理が評価された。引張強度試験の結果が図６に示されている。これらの結果は、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  で２０分間又は１２０分間処理されたＳＩＳのサンプルは、ＥｔＯで処理されたＳＩＳのサンプルよりも著しく強度が高いことを示すものであった。
【００９０】
実施例７
急速減圧は、表２（下記）に挙げられたＥＣＭ材料を記載の濃度及び記載の期間で、強くない界面活性剤に浸漬又は灌流した後に使用された。組織は採取され、生理食塩水ですすがれた。組織は少なくとも２４時間凍結された。組織は５ｍＭのＥＤＴＡを用いて冷やした冷低張トリス緩衝液中で解凍された。目的のＥＣＭが単離された。平らな組織（例えば、胃粘膜下層、小腸粘膜下層及び膀胱粘膜下層）について、組織は、組織引張装置において伸張され、伸張された形態で、溶液中でインキュベートされた。管状の組織（例えば、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ）について、組織は蠕動ポンプを使用して溶液で灌流され、インキュベーション中に浸漬された。組織は、ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて０．５％のトリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸内で、２〜２４時間インキュベートされた。組織はＤＰＢＳ内で、１回につき１５〜３０分間、３回すすがれた。組織は４℃で保存された。組織の保存の４８時間以内に、組織は超臨界ＣＯ２  内で２０〜１２０分間処理され、続いて急速に減圧（ＲＤＰ）された（圧力の減少は１分１９秒間に９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａ、２．７ＭＰａ／１０秒の減圧に対応）。
【表２】
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【００９１】
結果は、超臨界ＣＯ２  曝露後に続く急速減圧（ＳＣＣＯ２  ＋ＲＤＰ）が、ＥＣＭの増殖因子を維持しながら、細胞の残余物とＤＮＡの除去を確かに補助したことを示すものであった。
【００９２】
実施例８
様々なＥＣＭ組成物の増殖因子の含有量は、代表的な増殖因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて分析された。ｂＦＧＦは、それが天然のＥＣＭ組織によく見られる増殖因子であるため選択された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）が、以下の（１）未処理（生）のＳＩＳ、（２）界面活性剤浸漬（ＴＸ−デオキシ）のみの後のＳＩＳ、（３）ＴＸ−デオキシ及びＲＤＰ（ＳＣＣＯ２  を含む）の後のＳＩＳ、（４）ＴＸ−デオキシ、ＲＤＰ及びＰＡＡ（滅菌のためにＰＡＡとともにＳＣＣＯ２  ）の後のＳＩＳ、（５）ＴＸ−デオキシ及びＰＡＡの後のＳＩＳ、（６）ＥｔＯで滅菌されたＳＩＳ（Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．提供）、及び（７）非滅菌ＳＩＳ（Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．提供）のサンプルのｂＦＧＦ含有量を測定するために使用された。
【００９３】
これらの検討において、ＳＩＳが、ＲＤＰを用いて又は用いないで処理されたＥＣＭ組成物とＣｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．提供のＳＩＳとを比較するために使用された。処理されたＳＩＳのいくつかはまた、脱細胞化の後、記載されたＳＣＣＯ２  ＋ＰＡＡ方法により滅菌された。それぞれのＥＣＭ組成物の測定された増殖因子の含有量が図７に示されている。
【００９４】
それらの結果は、ｂＦＧＦ含有量の維持において、急速減圧プロセスが他の脱細胞化プロセスよりも有効であり、残存するＤＮＡ及び細胞片を除去するための追加のＲＤＰ処理は、ｂＦＧＦの小さい損失しか生じさせないことを示すものであった。比較して、ＰＡＡ滅菌プロセスは、ＲＤＰが行われないときでさえ、ほぼすべての残ったｂＦＧＦを除去するように思われた。さらに、急速減圧プロセスは、Ｃｏｏｋの脱細胞化方法に比べ、天然ＳＩＳ内のｂＦＧＦ含有量をより多く保存した。これらの結果から、増殖因子はすべて同じようにＥＣＭ組成物に結合しているので、ｂＦＧＦ含有量が減少した場合、すべての他の増殖因子の含有量も同様に減少したものと見なされる。
【００９５】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本出願が属する技術水準をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【００９６】
当業者には、本発明の範囲又は思想から逸脱することなく様々な修正及び変形が本発明においてなされ得ることは明らかであろう。本発明の他の実施形態が、本明細書に開示された本発明の詳細な説明及び実施例を考慮することにより、当業者には明らかであろう。発明の詳細な説明及び実施例は単に例示的なものと見なされることが意図され、本発明の正確な範囲および思想は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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