(57)【要約】本発明は、コンパニオン動物および家畜において、病原性の細菌および抗生物質耐性の細菌を含めた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株を含めたグラム陽性細菌、ならびに関連する状態を予防的および治療的に改善および処置するための方法を提供する。本発明の方法は、ＰｌｙＳｓ２溶菌酵素および／またはＰｌｙＳｓ１溶菌酵素、ならびにこれらの切断型を含めたこれらの改変体を使用する。コンパニオン動物および家畜を処置するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパニオン動物または家畜において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有する前記コンパニオン動物または前記家畜へと、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、前記コンパニオン動物または前記家畜におけるグラム陽性細菌の数を低減し、前記感染をコントロールする、方法。
【請求項２】
前記組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コンパニオン動物または家畜において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有する前記コンパニオン動物または前記家畜へと、少なくとも２つの単離リシンポリペプチドの組合せを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、第１の前記単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、第２の前記単離リシンポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、これにより、前記コンパニオン動物または前記家畜におけるグラム陽性細菌の数を低減し、前記感染をコントロールする、方法。
【請求項４】
コンパニオン動物または家畜において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有する前記コンパニオン動物または前記家畜へと、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、前記コンパニオン動物または前記家畜におけるグラム陽性細菌の数を低減し、前記感染をコントロールする、方法。
【請求項５】
前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属  ＧＥＳ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）から選択される、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
病原性グラム陽性細菌に曝露されたか、またはこれへの曝露の危険性があるコンパニオン動物被験体または家畜被験体を処置するための方法であって、前記コンパニオン動物被験体または前記家畜被験体へと、少なくとも２つの単離リシンポリペプチドの組合せを含む組成物を投与するステップを含み、第１の前記単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、第２の前記単離リシンポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、方法。
【請求項７】
病原性グラム陽性細菌に曝露されたか、またはこれへの曝露の危険性があるコンパニオン動物被験体または家畜被験体を処置するための方法であって、前記コンパニオン動物被験体または前記家畜被験体へと、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、前記単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、方法。
【請求項８】
前記被験体が、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌（ＧＢＳ）に曝露されているか、またはその危険性がある、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
コンパニオン動物または家畜において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌による感染または汚染を軽減またはコントロールするための方法であって、前記コンパニオン動物または前記家畜の外表面、皮膚、または外被を、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物と接触させるステップを含み、これにより、前記コンパニオン動物または前記家畜におけるグラム陽性細菌の数を低減し、前記感染をコントロールする、方法。
【請求項１０】
投与される前記組成物が、局所適用もしくは皮膚適用、またはコンパニオン動物もしくは家畜の皮膚、外被もしくは外表面への投与に適する組成物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、担体をさらに含む、請求項１、３、４、６、７、または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、前記ポリペプチドの感染部位への送達に適するビヒクルをさらに含む、請求項１、３、４、６、７、または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、１または複数の抗生物質をさらに含む、請求項１、３、４、６、７、または９に記載の方法。
【請求項１４】
前記グラム陽性細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓである、請求項１、３、４、６、７、または９に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンパニオン動物または前記家畜が、仔ブタまたは仔ウシを含めたブタまたはウシである、請求項１、３、４、６、７、または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、コンパニオン動物および家畜における、病原性の細菌および抗生物質耐性の細菌を含め、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株を含めた、グラム陽性細菌、ならびに関連する状態を予防的および治療的に改善および処置するための方法に関する。本発明の方法は、ＰｌｙＳｓ２溶菌酵素および／またはＰｌｙＳｓ１溶菌酵素、ならびにこれらの切断型を含めたこれらの改変体を利用する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な疾病および他の状態に対してより多くの抗生物質が用いられるときに、薬物耐性細菌の発生が、医療における大きな問題となっている。院内感染は、米国で８番目に多い死因であり、大部分が薬物耐性および新興病原体に起因する。例えば、米国では、毎年５００，０００例を超えるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ症例が認められ、株のうちの６５％超が多剤耐性（ＭＲＳＡ）である。より多量の抗生物質の使用と、耐性を示す細菌の数とは、より長い処置期間を促している。さらに、それらの一部が患者に対して有害作用を及ぼしている広域で非特異的な抗生物質が、今や、いっそう頻繁に用いられている。この使用の増大と関連する問題は、粘膜内層を容易には透過しない抗生物質が多いことである。加えて、抗生物質に対してアレルギーである人々の数も増大していると考えられる。したがって、新たな抗菌法、とりわけ、病原性細菌を死滅させるのに新たなモダリティーを介して作用するか、または病原性細菌を死滅させるための新たな手段をもたらす抗菌法に対する商業上の必要性が存在する。
【０００３】
グラム陽性細菌は、ポリペプチドおよび多糖を含有する細胞壁により取り囲まれている。グラム陽性細菌細胞壁は、厚さが２０〜８０ｎｍであり、ペプチドグリカンによる多数の相互接合層からなる、広く厚い壁部として現れる。グラム陽性細菌細胞壁のうちの６０％〜９０％の間は、ペプチドグリカンであり、細胞の形状、堅い構造、浸透圧ショックに対する耐性を与える。細胞壁は、グラム染色のクリスタルバイオレットを排除せず、細胞が紫色に、したがって、「グラム陽性」に染色されることを可能とする。グラム陽性細菌には、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属が含まれるがこれらに限定されない。医学的に関与性である種には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが含まれる。芽胞形成性であるＢａｃｉｌｌｕｓ属種は、炭疽病および胃腸炎を引き起こす。芽胞形成性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種は、ボツリヌス中毒症、破傷風、ガス壊疽、および偽膜性腸炎の一因となる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種は、ジフテリアを引き起こし、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種は、髄膜炎を引き起こす。
【０００４】
ペニシリンおよびセファロスポリンなど、細胞壁の合成を阻害する抗菌剤は、ペプチドグリカンのインターペプチドの連結に干渉し、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌いずれの細胞壁も脆弱化させる。グラム陽性細菌のペプチドグリカンが露出しているために、これらの抗生物質に対するグラム陽性細菌の感受性は大きい。真核細胞が、細胞壁を欠き、これらの薬物または他の細胞壁用薬剤に対して感受性でないことは有利である。
【０００５】
バクテリオファージを用いることにより細菌性疾患を処置する試みがなされている。しかし、疾患を防止するかまたはこれに対処するための、バクテリオファージの動物への直接的な導入には、特有の欠点がある。とりわけ、ファージが付着するには、細菌およびファージの両方が、適正で同期した増殖サイクルになければならない。加えて、細菌に付着するのに適正な数のファージを存在させなければならない；ファージが多すぎたり少なすぎたりすれば、付着も溶菌酵素の産生も生じないであろう。ファージはまた、十分に活性でなければならない。ファージはまた、ファージが攻撃しようとする生物に由来する細菌破砕物を含めた多くのものによっても阻害される。さらに、バクテリオファージの、細菌感染を処置するための直接的な使用を困難とするのは、ファージを非機能性とする免疫反応の可能性である。
【０００６】
新規の抗微生物療法には、バクテリオファージリシンなど、酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティクス」）が含まれる。ファージは、これらのリシンを用いて、それらの細菌宿主の細胞壁を消化し、低張性溶菌を介して子孫ウイルスを放出する。精製された組換えリシンを、グラム陽性細菌へと外部から添加するときにも、類似の帰結が結果として生じる。リシンの、グラム陽性病原体に対する致死性の高い活性は、それらを、治療剤として開発するための魅力的な候補物質とする。バクテリオファージリシンはまず、病原性連鎖球菌の鼻咽頭保菌を根絶するために提起された（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．ら（２００１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４巻：２１７０〜２１７２頁；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．ら（２００１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８巻：４１０７〜４１１２頁）。リシンとは、宿主の溶菌をウイルスアセンブリーの完遂と協調させるために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ファージにより用いられる溶菌機構の一部である（Ｗａｎｇ，  Ｉ．  Ｎ．ら（２０００年）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４巻：７９９〜８２５頁）。ファージは、細菌膜に小孔を開けるホリンと、細菌壁における結合を切断する、リシンと呼ばれるペプチドグリカンヒドロラーゼとの両方をコードする［６］。感染の後期に、リシンは、細胞壁マトリックスへと移行し、そこで、ペプチドグリカンの完全性に不可欠な共有結合を急速に加水分解し、細菌の溶菌および同時的な子孫ファージの放出を引き起こす。
【０００７】
リシンのファミリーメンバーは、触媒ドメインを特異性ドメインまたは結合ドメインへと融合させたモジュールデザインを呈示する（Ｌｏｐｅｚ，  Ｒ．ら（１９９７年）、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ、３巻：１９９〜２１１頁）。リシンは、細菌ゲノム内のウイルスプロファージ配列からクローニングし、処置に用いることができる（Ｂｅｒｅｓ，  Ｓ．Ｂ．ら（２００７年）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２巻（８号）：１〜１４頁）。外部から添加する場合、リシンは、グラム陽性細菌細胞壁の結合に到達することが可能である（図１）（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．（２００８年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１巻：３９３〜４００頁）。リシンは、多数のグラム陽性病原体（とりわけ、それらがそこからクローニングされる細菌）に対する致死性の高い活性を顕示することが示されており、それらの治療剤としての開発の可能性を提起している（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．（２００８年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１巻：３９３〜４００頁；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．Ｌ．ら（２００１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８巻：４１０７〜４１１２頁）。
【０００８】
バクテリオファージの溶菌酵素は、多様な投与経路を介する、被験体における多様な種類の感染に対する評価および特異的処置において有用な酵素として確立されている。例えば、特許文献１（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら）は、臨床検体における、半精製のＣ群連鎖球菌ファージ関連リシン酵素による酵素的消化を介するＡ群連鎖球菌の迅速な検出に関する。この酵素についての研究は、さらなる研究の基礎となり、疾患を処置する方法をもたらしている。ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓによる特許（特許文献２、特許文献３、および特許文献４）は、Ｃ１バクテリオファージに感染したＣ群連鎖球菌により産生されるリシン酵素の使用について開示している。米国特許第６，２４８，３２４号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、皮膚組織への局所適用に適する担体における溶菌酵素の使用を介する、皮膚感染のための組成物について開示している。米国特許第６，２５４，８６６号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、消化管の細菌感染を処置するための方法であって、感染細菌に特異的な溶菌酵素を投与するステップを含む方法について開示している。少なくとも１つの溶菌酵素を消化管へと送達するための担体は、坐剤、浣腸、シロップ、または腸内用にコーティングされた丸薬からなる群から選択される。米国特許第６，２６４，９４５号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、その細菌に特異的なバクテリオファージを感染させた細菌により産生される、少なくとも１つの溶菌酵素、ならびにこの溶菌酵素を患者へと送達するのに適する担体の非経口（筋内、皮下、または静脈内）導入により細菌感染を処置するための方法および組成物について開示している。
【０００９】
ファージ関連溶菌酵素は、各々が特異的菌株を死滅させるのに有効であると示されている多様なバクテリオファージから同定およびクローニングされている。米国特許第７，４０２，３０９号、同第７，６３８，６００号、およびＰＣＴ出願公報第ＷＯ２００８／０１８８５４号は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を処置または軽減するための抗菌剤として有用な異なるファージ関連溶菌酵素を提供している。米国特許第７，５６９，２２３号は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのための溶菌酵素について記載している。米国特許第７，５８２２９１号では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属（バンコマイシン耐性株を含めたＥ．  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．  ｆａｅｃｉｕｍ）に有用なリシンについて記載されている。ＵＳ２００８／０２２１０３５は、Ｂ群連鎖球菌を死滅させるのに高度に有効な変異体であるＰｌｙ  ＧＢＳリシンについて記載している。ＷＯ２０１０／００２９５９では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めた、ブドウ球菌に対する活性を伴うＣｌｙＳと称するキメラリシンについて詳述されている。
【００１０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓとは、世界中でブタに感染するグラム陽性病原体である。ブタからヒトへの人畜共通の伝染についての報告が増大している（Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎ  Ｓ．ら（２００６年）、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻（５号）：５８５〜５６７頁）。Ｓ．ｓｕｉｓは、今後数年間においてヒト集団内で恒常的な存在となる可能性がある。ヒトおよびブタは、ペニシリンまたはゲンタマイシンで処置されてきたが、これらの抗生物質に対して耐性であるＳ．ｓｕｉｓ分離株が存在する（Ｃａｎｔｉｎ，  Ｍ．ら（１９９２年）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、４巻：１７０〜１７４頁）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，６０４，１０９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２７１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０１７，５２８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０５６，９５５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現行の従来の抗菌剤と関連する欠点および問題から、当技術分野では、さらなる特異的抗菌剤（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）が依然として必要とされており、また、特に、獲得耐性の危険性が高くない、スペクトルがより広域な薬剤も必要とされていることが明らかである。注目すべきことに、現在のところ、リシンが、病原性の細菌および臨床的に関与性の細菌のうちの複数の異なる種に対して広域の溶菌活性を顕示することは示されていない。
【００１３】
本明細書における参考文献の引用は、この参考文献が本発明に対する先行技術であることの容認としてはみなされないものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は一般に、コンパニオン動物および家畜におけるグラム陽性細菌ならびにコンパニオン動物および家畜のグラム陽性細菌感染の処置法を提供する。本発明の方法において用いられるリシンポリペプチドは、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を含めたグラム陽性細菌に対する広域の死滅活性を顕示する点で固有である。本明細書ではとりわけ、動物による方法で用いられる２つの例示的な異なる固有のリシン、特に、その活性切断型を含めたＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２が例示される。
【００１５】
本発明のある態様では、コンパニオン動物および家畜におけるグラム陽性細菌を死滅させる方法であって、細菌を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、ＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、コンパニオン動物または家畜におけるグラム陽性細菌を死滅させる方法であって、細菌を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、ＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の付加的な態様では、コンパニオン動物または家畜におけるグラム陽性細菌を死滅させる方法であって、細菌を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、リシンポリペプチド、特に、ＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチドおよびＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体の組合せを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の方法はまた、コンパニオン動物または家畜において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有するコンパニオン動物または家畜へと、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、もしくは９５％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、コンパニオン動物または家畜におけるグラム陽性細菌の数を低減し、感染をコントロールする方法も包含する。
【００１９】
上記の方法において用いられる組成物は、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、もしくは９５％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体のうちの１または複数を、代替的にまたはさらに含みうる。
【００２０】
本発明は、コンパニオン動物または家畜において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有するコンパニオン動物または家畜へと、少なくとも２つの単離リシンポリペプチドの組合せを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、第１の単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、第２の単離リシンポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、これにより、コンパニオン動物または家畜におけるグラム陽性細菌の数を低減し、感染をコントロールする方法を提供する。
【００２１】
本発明は、病原性グラム陽性細菌に曝露されたか、またはこれへの曝露の危険性があるコンパニオン動物または家畜を処置するための方法であって、コンパニオン動物または家畜へと、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、もしくは９５％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法も加えて包含する。この方法の特定の態様では、コンパニオン動物または家畜が、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌（ＧＢＳ）に曝露されているか、またはその危険性がある。被験体は、コンパニオン動物または家畜の乳仔（ｉｎｆａｎｔ）または胎仔（ｆｅｔｕｓ）でありうる。
【００２２】
本発明は、病原性グラム陽性細菌に曝露されたか、またはこれへの曝露の危険性があるコンパニオン動物または家畜を処置するための方法であって、コンパニオン動物被験体または家畜被験体へと、少なくとも２つの単離リシンポリペプチドの組合せを含む組成物を投与するステップを含み、第１の単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、第２の単離リシンポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法をさらに包含する。
【００２３】
さらなる態様では、コンパニオン動物または家畜において、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓを含めたグラム陽性細菌による汚染またはグラム陽性細菌の感染を軽減またはコントロールする方法であって、コンパニオン動物または家畜を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、リシンポリペプチド、特に、ＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチドおよびＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体の組合せを含む方法が提供される。特定の態様では、コンパニオン動物または家畜における皮膚または他の外表面などの外表面を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させ、単離リシンポリペプチドが、リシンポリペプチド、特に、ＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチドおよびＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチド、またはコンパニオン動物または家畜におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓなどのグラム陽性細菌による汚染または感染を処置、軽減、またはコントロールするための、グラム陽性細菌、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓを死滅させるのに有効なその改変体の組合せを含む。
【００２４】
本発明の方法において用いられるリシンポリペプチドの改変体は、配列番号１、２、または３を含めて、本明細書で例示されるリシンポリペプチド（複数可）のうちの１または複数と実質的に同一でありうる。本発明の組成物および方法において用いられるリシンポリペプチドの改変体は、アミノ酸配列における、配列番号１、２、または３を含めて、本明細書で例示されるリシンポリペプチド（複数可）と比較した、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【００２５】
任意のこのような、上記の１または複数の方法では、感受性であるか、死滅させるか、または処置される細菌を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＥＳ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）から選択することができる。
【００２６】
上記のコンパニオン動物または家畜の本発明の方法のうちのいずれかによれば、感受性細菌または処置もしくは脱コロニー化される細菌は、抗生物質耐性細菌でありうる。細菌は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、またはバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）でありうる。感受性細菌は、特に、コンパニオン動物または家畜に対して、臨床的に関与性の細菌の場合もあり、病原性の細菌の場合もある。方法（複数可）のある態様では、リシンポリペプチド（複数可）が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を死滅させるのに有効である。
【００２７】
コンパニオン動物または家畜の本発明の方法のうちのいずれかによれば、その組成物は、薬学的に許容される担体、添加剤、または希釈剤を含めた担体をさらに含みうる。コンパニオン動物または家畜の本発明の方法のうちのいずれかによれば、その組成物は、ポリペプチドの感染部位への送達に適するビヒクルをさらに含みうる。コンパニオン動物または家畜の本発明の方法のうちのいずれかによれば、その組成物は、１または複数の抗生物質をさらに含みうる。
【００２８】
本発明のコンパニオン動物または家畜のための方法のある態様では、グラム陽性細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓである。
【００２９】
本発明のコンパニオン動物または家畜のための方法のさらなる態様では、コンパニオン動物または家畜は、仔ブタまたは仔ウシを含めたブタまたはウシである。本発明のコンパニオン動物または家畜のための方法の特定のさらなる態様では、コンパニオン動物または家畜はブタである。
【００３０】
以下の例示的な図面を参照しながら進められる以下の記載を概観することにより、当業者には、他の目的および利点が明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、溶菌サイクルをリシンによる処理と対比させて示す図である。組換えにより発現させ精製したリシンは、ファージがその宿主内から発現させるリシンと全く同様に細菌を溶解させることが可能である。
【図２】図２は、ＰｌｙＳｓ２ドメインを示す図である。触媒ドメインは、残基８〜１４６に対応する。１６残基のリンカーが存在する。結合ドメインは、残基１６２〜２２８に対応する。
【図３−１】図３Ａおよび３Ｂは、リシンＰｌｙＳｓ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のほか、タンパク質ドメイン解析を提示する図である。全長ＰｌｙＳｓ１（配列番号１）および切断型ＰｌｙＳｓ１（配列番号２）のアミノ酸配列が提示される。
【図３−２】図３Ａおよび３Ｂは、リシンＰｌｙＳｓ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のほか、タンパク質ドメイン解析を提示する図である。全長ＰｌｙＳｓ１（配列番号１）および切断型ＰｌｙＳｓ１（配列番号２）のアミノ酸配列が提示される。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、リシンＰｌｙＳｓ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のほか、タンパク質ドメイン解析を提示する図である。ＰｌｙＳｓ２のアミノ酸配列は、配列番号３に対応する。
【図５】図５は、ｐＤＡＤ２４ベクターを示す図である。配列は、Ｔ７ポリメラーゼのためのｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーターで始まり、ＰｌｙＳｓ２で終わる。アンピシリンは、細胞を増殖させるときにプラスミドの保持を確保するための選択マーカーとして用いられる。
【図６】図６は、ＰｌｙＳｓ２の精製を示す。全ての試料を、４〜１２％のビス−トリスゲル上、２００Ｖで約４０分間にわたり泳動させ、クーマシー染色した。Ａ．約２６ｋＤａのＰｌｙＳｓ２を含有するＤＥＡＥカラムのフロースルーを示す図である。Ｂ．１０Ｌの調製物から精製したＰｌｙＳｓ２の６つの代表的な画分を示す図である。Ｃ．全ての画分を併せてプールした後のＰｌｙＳｓ２の純度を示す、約２６ｋＤａにおける単一のバンドを示す図である。
【図７Ａ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。ブタの外鼻孔中の唾液のｐＨは約８．５なので、このことは重要である。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図７Ｂ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。ブタの外鼻孔中の唾液のｐＨは約８．５なので、このことは重要である。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図７Ｃ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。ブタの外鼻孔中の唾液のｐＨは約８．５なので、このことは重要である。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図７Ｄ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。ブタの外鼻孔中の唾液のｐＨは約８．５なので、このことは重要である。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図８】図８は、高ｐＨレベルまでのビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）緩衝液中のＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対して決定された、ＰｌｙＳｓ２の最適なｐＨを示す図である。
【図９】図９は、緩衝液中、３７℃で最長４８時間にわたる保管後における７９９７株に対する死滅の有効性を評価することにより、精製ＰｌｙＳＳ２の安定性を決定したことを示す図である。
【図１０】図１０は、緩衝液中、−８０℃で最長７カ月間にわたるリシンの保管後においてＰｌｙＳｓ２リシンにより処理したときの、ＯＤ６００による増殖で評価される７９９７株の死滅の有効性を示す図である。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ΔＰｌｙＳｓ１のｐＨ依存性を示す図である。（Ａ）７７１１株宿主細胞を、４．６〜８．０のｐＨ値の範囲でリン酸クエン酸緩衝液（４０／２０ｍＭの）中に懸濁させたことを示す図である。ΔＰｌｙＳｓ１を添加し（１１０μｇ／ｍｌ）、ＯＤ６００を３７℃で６０分間にわたり測定した（水平軸）。垂直軸は、各時点における、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００の比を表す。各ｐＨ値について、曲線は、３回の独立した実験の試行の平均を示す。全体として、活性は、緩衝範囲の上端において最大であった。（Ｂ）この図では、ビス−トリス−プロパン（４０ｍＭの）を、ｐＨ範囲が７．０〜９．７の緩衝剤として使用したことが示される。ここでもまた、ΔＰｌｙＳｓ１を１１０μｇ／ｍｌまで添加した。各曲線は、３回の実験の試行の平均を示す。定量的なＯＤ減衰度は一般に、リン酸−クエン酸中より小さかったが、最大の活性は、ｐＨ＝９．０で観察された。
【図１２】図１２は、ΔＰＬｙＳＳ１のＮａＣｌ依存性を示す図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７７１１細胞を、ｐＨ＝７．８のリン酸−クエン酸緩衝液中に懸濁させた（４０／２０ｍＭの）。ＮａＣｌを上記の濃度まで添加した後、ΔＰｌｙＳｓ１を１１０μｇ／ｍｌで添加した。６００ｎｍにおける光学密度を、３７℃で６０分間にわたり観察した。この図では、垂直軸が、各ＮａＣｌ濃度について、３回の独立した実験にわたり平均された、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００の比を表す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ΔＰｌｙＳｓ１のＤＴＴ感受性およびＥＤＴＡ感受性についての評価を提示する図である。（Ａ）ΔＰｌｙＳｓ１を、７７１１細胞への添加前に、５ｍＭのＤＴＴ（大幅なモル濃度過剰）と共に１時間にわたりプレインキュベートしたところ、活性が変化しなかったことを示す図である。（Ｂ）ここでは、ΔＰｌｙＳｓ１の添加（１１０μｇ／ｍｌ  リシン）前に、緩衝化された細胞懸濁液中に多様な濃度のＥＤＴＡを含めたことを示す図である。いずれの画像についても、垂直軸は、各条件について、３回の独立した実験にわたり平均された、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００の比を表す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ΔＰｌｙＳｓ１の温度安定性を示す図である。（Ａ）ΔＰｌｙＳｓ１原液を、上記の温度の各々で３０分間にわたり保持した後、７７１１細胞へと添加した（２７０μｇ／ｍｌの最終酵素濃度、最終温度＝３７℃、理想的な緩衝条件）ことを示す図である。この画像中の曲線は、３回にわたる個別の実験の試行の平均を表す。各場合では、完全な活性の喪失が、４５℃〜５０℃の間の試料において観察された。３つの最高温度の試料は、変性時におけるΔＰｌｙＳｓ１のフロキュレーションに起因して、処理されていない対照より若干高値のＯＤ６００の読取りを示す。（Ｂ）上記の実験を繰り返したが、アッセイ前に６時間にわたる熱処理を伴ったことを示す図である。この長いインキュベーション時間において、４５℃の試料は、ある程度の活性の喪失を示したが、完全な活性の喪失ではなかった。４０℃の試料は、本質的に天然の活性を維持した。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、（Ａ）ＰｌｙＳｓ２が、８ｕｇ／ｍＬ以上において、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対する急性の溶菌活性を有することを示す図であり、（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて評価される、Ｓ．ｓｕｉｓ  Ｓ７３５株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、複数の種、血清型、および菌株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。各場合において、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００を、棒グラフで示した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株のバーは赤色で着色され、Ｓ．ｓｕｉｓ株に対応するバーは橙色である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌および他の目的の細菌のバーは、紫色で示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、複数の種、血清型、および菌株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。各場合において、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００を、棒グラフで示した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株のバーは赤色で着色され、Ｓ．ｓｕｉｓ株に対応するバーは橙色である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌および他の目的の細菌のバーは、紫色で示す。
【図１８】図１８は、ＰｌｙＳＳ２を、そのブドウ球菌株を死滅させる能力について、標準的なＭＩＣ解析により調べたことを示す図である。バンコマイシン耐性（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性（ＶＩＳＡ）、およびメチシリン耐性（ＭＲＳＡ）のブドウ球菌など、耐性ブドウ球菌が試験に組み入れられた。試験された３つのＶＲＳＡ株は、公知の分離株全てのうちの半分を表す。
【図１９】図１９は、ΔＰｌｙＳｓ１による溶菌活性を提示する図である。この例では、３つのＳ．ｓｕｉｓ株：ＰｌｙＳｓ１が元来そこからクローニングされた血清型７株である７７１１株（すなわち、宿主株）；種の標準菌株である血清型２分離株であるＳ７３５株；および毒性の高い血清型９株である７９９７株についてのＯＤ低下曲線が示される。細菌は、２０ｍＭのｐＨ７．８リン酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ（最適状態として規定される）中に懸濁させた。ΔＰｌｙＳｓ１は、ある濃度範囲（挿入図により示す）で細胞へと添加した。各試料について、３７℃で１時間にわたり（水平軸）、６００ｎｍにおける光学密度（垂直軸）を測定した。この画像では、全ての曲線が、３または４回の独立した実験の試行の平均を表す。
【図２０】図２０は、ΔＰｌｙＳｓ１によるＳ．ｓｕｉｓ  ７７１１の増殖の阻害を示す図である。ΔＰｌｙＳｓ１を上記の最終濃度で、ＢＨＩブロス中のＳ．ｓｕｉｓ  ７７１１株の希釈懸濁液へと添加した。各試料の光学密度は、９６ウェルプレートフォーマットで一晩にわたり継続的に測定した。全体として、細菌の増殖は、用量依存的な様式で遅延した。しかし、ここでは、緩衝液中で溶菌を誘導するのに十分な酵素濃度（１３０および５０μｇ／ｍｌ）の場合、効果はごくわずかであった。さらに、上記のΔＰｌｙＳｓ１濃度のうちのいずれも、増殖を完全には阻害しなかった（よって、ＭＩＣを割り当てることはできないであろう）。処理された試料の全てについて、最終光学密度は、実際に、未処理試料の最終光学密度より高値であることが注目されるであろう。これは、溶菌酵素の存在下で生じた、凝集した細菌破砕物の蓄積によるアーチファクトである。
【図２１】図２１は、ΔＰｌｙＳｓ１についての菌株パネルを提示する図である。図１９ならびに表３および４に提示される情報を、１３０μｇ／ｍｌおよび３２．５μｇ／ｍｌという２つのＰｌｙＳｓ１濃度について、グラフにまとめる。画像中、Ｓ．ｓｕｉｓ株は、２つの赤色星印で示され、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の連鎖球菌は、単一の黒色星印で示される。１時間後における光学密度応答（未処理の場合のＯＤ６００と比べた、処理された場合のＯＤ６００の比）が示される。Ｓ．ｓｕｉｓ株の血清型の定義については、表３を参照されたい。
【図２２】図２２は、ＰｌｙＳｓ２の、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株およびＳ．ｓｕｉｓ  Ｓ７３５株に対する溶菌活性についての、ＣＦＵ死滅アッセイの結果を提示する図である。
【図２３】図２３は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる、ＰｌｙＳＳ２に対する、抗生物質であるムピロシンと比較した耐性アッセイの結果を示す図である。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、ＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２により研究された相乗作用についての結果を提示する図である。
【図２５】図２５は、接種、リシン処置またはプラセボ処置、およびサンプリングのための、サンプリングスキームを示す図である。
【図２６】図２６は、実験ＩでＳ．  ｓｕｉｓ陽性試料が初めて見られる時点（接種後の日数による）についての度数分布を示す図である。
【図２７】図２７は、実験ＩＩでＳ．  ｓｕｉｓ陽性試料が初めて見られる時点（接種後の日数による）についての度数分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明によれば、当技術分野の技量の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法が使用されうる。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」巻Ｉ〜ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．編（１９９４年）］；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」巻Ｉ〜ＩＩＩ［Ｊ．  Ｅ．  Ｃｅｌｉｓ編（１９９４年））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」巻Ｉ〜ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．編（１９９４年）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）］；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）を参照されたい。
【００３３】
したがって、本明細書に現れる場合、以下の用語は、以下および本節で提起され示される定義を有するものとする。
【００３４】
本明細書では、「Ｓ．ｓｕｉｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ１リシン」、「ＰｌｙＳｓ１」、「全ＰｌｙＳｓ１」、「切断型ＰｌｙＳｓ１」、「ΔＰｌｙＳｓ１」、「ＰｌｙＳｓ２リシン」、「ＰｌｙＳｓ２」という用語、および具体的に列挙されているわけではない任意の変形を互換的に用いることができ、本出願および特許請求の範囲全体にわたって用いられる通り、単一または複数のタンパク質を含めたタンパク質性物質にも言及し、本明細書で記載され、図３および図４に示されるアミノ酸配列データ（配列番号１、２および／または３）、ならびに本明細書および特許請求の範囲に示される活性プロファイルを有するタンパク質にも及ぶ。したがって、実質的に同等な活性または活性の変化を提示するタンパク質も同様に想定される。これらの修飾は、例えば、部位指向変異誘発を介して得られる修飾など、意図的な場合もあり、複合体またはその記名サブユニットの産生細胞である宿主における変異を介して得られる修飾など、偶発的な場合もある。「Ｓ．ｓｕｉｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ１リシン」、「ＰｌｙＳｓ１」、「全ＰｌｙＳｓ１」、「切断型ＰｌｙＳｓ１」、「ΔＰｌｙＳｓ１」、「ＰｌｙＳｓ２リシン」、「ＰｌｙＳｓ２」という用語はまた、具体的に本明細書で列挙されるタンパク質のほか、全ての実質的に相同な類似体、断片、または切断型、および対立遺伝子変異をそれらの範囲内に包含することも意図する。
【００３５】
本明細書で用いられる「（１または複数の）コンパニオン動物」とは、ペット、または親交および娯楽のために飼われる動物であって、イヌ、ネコ、または飼い主に健康上の利益または情緒的な利益をもたらす他のペットが含まれるがこれらに限定されないペットまたは動物を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる「家畜」とは、市販用に飼われる動物、食品用もしくは他の製品用に飼育される動物、または、特に、食肉牛および乳牛、ブタ、および家禽などの農場動物を含めた、使用のために飼われる動物を指す。
【００３７】
ポリペプチドおよび溶菌酵素
「溶菌酵素」は、適切な条件下で相応な時間にわたり、１または複数の細菌を死滅させる任意の細菌の細胞壁溶解酵素を包含する。限定なしに述べると、溶菌酵素の例には、多様なアミダーゼである細胞壁溶解酵素が含まれる。
【００３８】
「Ｓ．ｓｕｉｓ溶菌酵素」は、適切な条件下で、相応な時間にわたり、少なくとも１つまたは複数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌を死滅させることが可能な溶菌酵素を包含する。
【００３９】
「バクテリオファージの溶菌酵素」とは、バクテリオファージから抽出もしくは単離された溶菌酵素、または溶菌酵素の機能性を維持する類似のタンパク質構造を有する合成された溶菌酵素を指す。
【００４０】
溶菌酵素は、具体的には、細菌細胞のペプチドグリカンに存在する結合を切断して、細菌の細胞壁を破壊することが可能である。今日ではまた、細菌細胞壁のペプチドグリカンは、大半の細菌間で高度に保存されており、少数の結合を切断するだけで細菌の細胞壁を破壊しうることも前提とされている。バクテリオファージの溶菌酵素は、アミダーゼでありうるが、他の種類の酵素も可能である。これらの結合を切断する溶菌酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼ、またはＮ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼなど、多様なアミダーゼである。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４年）は、Ｃ１連鎖球菌のファージリシン酵素が、アミダーゼであることについて報告した。Ｇａｒｃｉａら（１９８７年、１９９０年）は、Ｃｐ−１ファージに由来する、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＣｐ１リシンが、リゾチームであることについて報告した。ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２年）は、ｐｈｉ  ６Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージに由来する溶菌酵素が、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸（ｍｅｌｏ−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびＤ−アラニンにより形成されるペプチド架橋を分割するエンドペプチダーゼであることについて報告した。Ｅ．  ｃｏｌｉのＴ１ファージおよびＴ６ファージの溶菌酵素も、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属のファージ（ｐｌｙ）に由来する溶菌酵素と同様に、アミダーゼである（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６年）。当技術分野ではまた、細菌の細胞壁を切断することが可能な他の溶菌酵素も公知である。
【００４１】
「バクテリオファージにより遺伝的にコードされる溶菌酵素」は、例えば、宿主細菌に対して少なくとも何らかの細胞壁溶解活性を有することにより宿主細菌を死滅させることが可能なポリペプチドを包含する。ポリペプチドは、天然配列の溶菌酵素およびその改変体を包含する配列を有しうる。ポリペプチドは、バクテリオファージ（「ファージ」）など、多様な供給源から単離することもでき、Ｇａｒｃｉａらにより記載されており、また、本明細書でも提示される組換え法または合成法などの組換え法または合成法により調製することもできる。このポリペプチドは、カルボキシル末端側においてコリン結合部分を含むことが可能であり、アミノ末端側における細胞壁ペプチドグリカンを切断することが可能な酵素活性（ペプチドグリカン中のアミド結合に対して作用するアミダーゼ活性など）によって特徴付けられうる。ＰｌｙＧＢＳリシンなど、複数の酵素活性、例えば、２つの酵素ドメインを包含する溶菌酵素が記載されている。一般的に述べれば、溶菌酵素は、分子量が２５，０００〜３５，０００ドルトンの間にある可能性があり、単一のポリペプチド鎖を含む可能性があるが、これは、酵素鎖に応じて変化しうる。分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム変性ゲルによる電気泳動および分子量マーカーとの比較に基づくアッセイを介して、最も便利に決定することができる。
【００４２】
「天然配列のファージ関連溶菌酵素」は、細菌に由来する酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。このような天然配列の酵素は、単離することもでき、組換え手段または合成手段により作製することもできる。
【００４３】
「天然配列の酵素」という用語は、酵素の天然に存在する形態（例えば、代替的なスプライシング形態または変化形態）および天然に存在する改変体を包含する。本発明の一実施形態では、天然配列の酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージに由来する遺伝子により遺伝的にコードされる成熟ポリペプチドまたは全長ポリペプチドである。Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、３巻：１９９〜２１１頁（１９９７年）；Ｇａｒｃｉａら、Ｇｅｎｅ、８６巻：８１〜８８頁（１９９０年）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：９１４〜９１８頁（１９８８年）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：９１４〜９１８頁（１９８８年）；Ｇａｒｃｉａら、「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｊ．  Ｊ．  ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＣｕｒｔｉｓ編、１９８７年）；Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、１００巻：４３９〜４４８頁（１９９２年）；Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻：５０６４〜５０７０頁（１９９０年）；Ｒｏｎｄａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６４巻：６２１〜６２４頁（１９８７年）；ならびにＳａｎｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅ、６１巻：１３〜１９頁（１９８７年）などの刊行物で認知されている通り、当然ながら、多数の改変体が可能および公知である。これらの参考文献の各々の内容、特に、配列表、および配列相同性についての言明を含めた、配列を比較する関連の説明文は、具体的に、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【００４４】
「改変体配列による溶菌酵素」は、溶菌酵素のポリペプチド配列とは異なるが、機能的活性を保持するポリペプチド配列によって特徴付けられる溶菌酵素を包含する。一部の実施形態では、溶菌酵素が、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される本明細書の溶菌酵素配列（複数可）と特定のアミノ酸配列の同一性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージにより遺伝的にコードされうる。例えば、一部の実施形態では、機能的に活性な溶菌酵素が、細菌の細胞壁を破壊することにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌、ならびに表１および図９および１０において示される他の感受性細菌を含め、本明細書で提示される他の感受性細菌を死滅させうる。活性の溶菌酵素は、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される、本明細書の溶菌酵素配列（複数可）と、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、または９９．５％のアミノ酸配列の同一性を有しうる。このようなファージ関連溶菌酵素の改変体には、例えば、溶菌酵素ポリペプチドであって、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される、本明細書の溶菌酵素配列（複数可）の配列のＮ末端またはＣ末端において１または複数のアミノ酸残基を付加するか、または欠失させた溶菌酵素ポリペプチドが含まれる。特定の態様では、ファージ関連溶菌酵素が、天然のファージ関連溶菌酵素配列と少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列の同一性、特に、少なくとも約９０％（例えば、９０％）のアミノ酸配列の同一性を有するであろう。最も具体的には、ファージ関連溶菌酵素の改変体が、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される、天然のファージに関連する本明細書の溶菌酵素配列（複数可）と少なくとも約９５％（例えば、９５％）のアミノ酸配列の同一性を有するであろう。
【００４５】
本明細書では、同定されたファージ関連溶菌酵素配列に関する「アミノ酸配列の同一性パーセント」を、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、同じリーディングフレーム内で配列を整列させ、必要な場合は、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後における、ファージ関連溶菌酵素配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と定義する。
【００４６】
本明細書では、同定されたファージ関連溶菌酵素配列に関する「核酸配列の同一性パーセント」を、配列を整列させ、必要な場合は、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後における、ファージ関連溶菌酵素配列中のヌクレオチドと同一な候補配列中のヌクレオチドの百分率と定義する。
【００４７】
２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を、最適な比較を目的として整列させる（例えば、第１のヌクレオチド配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するヌクレオチド位置またはアミノ酸位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸により占められる場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間における同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／全ての位置の数×１００）。
【００４８】
２つの配列間における同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁（１９９３年）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、本発明のヌクレオチド配列と所望の同一性を有する配列を同定するのに用いうる、ＮＢＬＡＳＴプログラムへと組み込まれている。比較を目的としてギャップを施したアライメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）において記載される通りに使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、各々のプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いることができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより提供されているプログラムを参照されたい。一実施形態では、配列比較のためのパラメータを、Ｗ＝１２に設定することができる。パラメータはまた、変化させることもできる（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。値「Ｗ」は、２つの配列を、同一性の領域を含有する配列として同定するプログラムのためには、どのくらい多くの連続ヌクレオチドが同一でなければならないのかを決定する。
【００４９】
「ポリペプチド」は、直鎖状に接合された複数のアミノ酸を含むポリマー分子を包含する。一部の実施形態では、ポリペプチドが、天然に存在するポリヌクレオチド配列によりコードされる分子に対応しうる。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸が類似の特性を有するアミノ酸で置きかえられる保存的置換であって、ポリペプチドの機能を変化させない保存的置換を包含しうる（例えば、Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ  Ｖ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１章、９〜１３頁、１９９４年を参照されたい）。
【００５０】
「改変溶菌酵素」という用語は、シャフリングされた溶菌酵素および／またはキメラ溶菌酵素を包含する。
【００５１】
特異的ファージを感染させた細菌に特異的なファージ溶菌酵素は、問題となる細菌の細胞壁を有効かつ効率的に分解することが見出されている。溶菌酵素は、タンパク質分解性の酵素活性を欠くと考えられ、したがって、細菌細胞壁の消化時に存在するときも、哺乳動物のタンパク質および組織に対しては非破壊的である。参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、「Ｒａｐｉｄ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４巻：２１７０〜２１７２頁（２００１年１２月７日）、およびＳｃｉｅｎｃｅ誌によりオンラインで公表されているこの文献に対する補遺資料により示される通り、Ｐａｌなど、精製された肺炎球菌のバクテリオファージの溶菌酵素は、多様な肺炎球菌を死滅させることが可能である。Ｌｏｅｆｆｌｅｒらは、これらの実験を介して、接触後数秒間以内に、溶菌酵素であるＰａｌが、最も高頻度で単離される血清群およびペニシリン耐性株（ｓｔａｉｎ）を含めたＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１５の臨床株（ｓｔａｉｎ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて死滅させうることを示している。Ｐａｌによるマウスの処置はまた、血清型１４の鼻腔内保菌を、用量依存的な様式で消失させるかまたは著明に低減することも可能であった。さらに、Ｐａｌの作用は、他のファージ溶菌酵素と同様であるが、抗生物質とは異なり、むしろ標的の病原体に特異的であることが見出されているために、正常微生物叢は本質的に無傷に保持される可能性が高い（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．  Ｊ．  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｇ．  Ｗｅｎｄｌｉｎｇｅｒ、Ｓ．  Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６巻、１２３１〜４１頁（１９９５年））。これに対し、本発明のリシンポリペプチドは、顕著に広範で臨床的に有意な殺菌プロファイルを有する。本明細書で裏付けられる通り、例えば、単離されたＳ．ｓｕｉｓリシンであるＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓを死滅させるのに有効であり、また、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（ＧＢＳ）を含めた他の多様なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属株、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属も死滅させるのに有効である。
【００５２】
本発明の溶菌酵素またはポリペプチドは、特定のバクテリオファージに感染させた後の細菌生物に、感染の症状を有する他の患者へと曝露されている患者を発病から防御するための予防的処置として産生させる場合もあり、感染から病気に既に罹患している患者のための治療的処置として産生させる場合もある。本明細書では、リシンポリペプチド配列およびリシンポリペプチドをコードする核酸が提供されるので、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、本明細書で例示される方法を含めた当技術分野の標準的な方法を用いて、ファージゲノムから単離された溶菌酵素の遺伝子を介し、この遺伝子を遺伝子導入ベクターへと挿入し、前記遺伝子導入ベクターを発現系へとクローニングして作製することが好ましい場合がある。溶菌酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、切断型の場合もあり、キメラの場合もあり、シャフリングされている場合もあり、「天然」の場合もあり、組み合わせることが可能である。本明細書には、関与性の米国特許第５，６０４，１０９号が参照によりその全体において組み込まれる。「改変」溶菌酵素は、多数の方式で作製することができる。好ましい実施形態では、ファージゲノムに由来する、改変溶菌酵素の遺伝子を、遺伝子導入用ベクターまたは可動性ベクター、好ましくは、プラスミドへと挿入し、このプラスミドを、発現ベクターまたは発現系へとクローニングする。本発明のリシンポリペプチドまたはリシン酵素を作製するための発現ベクターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、または他の多数の適切な細菌に適しうる。ベクター系はまた、無細胞の発現系でもありうる。当技術分野では、遺伝子または遺伝子のセットを発現させるこれらの方法の全てが公知である。溶菌酵素はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージを感染させることにより創出することもでき、この場合、前記少なくとも１つの溶菌酵素は、前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの細胞壁をもっぱら溶解させ、他の、例えば、存在する天然細菌叢または片利共生細菌叢に及ぼす影響はせいぜい最小限である。
【００５３】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドへと作動可能に連結した本発明のポリペプチドの全部または（好ましくは生物学的に活性な）一部を含む。キメラタンパク質またはキメラペプチドは、例えば、２つ以上の活性部位を有する２つ以上のタンパク質を組み合わせることにより作製する。キメラタンパク質およびキメラペプチドは、同じ分子において独立に作用する場合もあり、異なる分子において作用する場合もあり、よって、２つ以上の異なる細菌感染を同時に処置する可能性を有する。キメラタンパク質およびキメラペプチドはまた、細胞壁を１つより多い場所で開裂させることにより、したがって、単一のリシン分子またはリシンキメラペプチドによる、より急速または有効な（または相乗作用的）死滅を潜在的にもたらすことにより、細菌感染を処置するのに用いることもできる。
【００５４】
ＤＮＡ構築物またはペプチド構築物の「異種」領域とは、天然における大型分子と会合しては見出されない、大型のＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントまたは大型のペプチド分子内の同定可能なペプチドセグメントである。したがって、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、この遺伝子には通常、供給源生物ゲノム内では哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡが隣接する。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、ゲノムのコード配列が、イントロン、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成的配列を含有するｃＤＮＡ）である。対立遺伝子変異または天然に存在する変異イベントは、本明細書で規定されるＤＮＡまたはペプチドの異種領域をもたらさない。
【００５５】
「作動可能に連結する」という用語は、本開示のポリペプチドと異種ポリペプチドとを、インフレームで融合させることを意味する。異種ポリペプチドは、本開示のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合させることができる。キメラタンパク質は、化学的合成により酵素的に作製されるか、組換えＤＮＡ法により作製される。多数のキメラ溶菌酵素が作製および研究されている。バクテリオファージｐｈｉ  Ｘ１７４およびＭＳ２のそれぞれの溶菌タンパク質であるＥおよびＬから構築されたキメラ溶菌遺伝子である遺伝子Ｅ−Ｌを内部欠失にかけて、溶菌特性または死滅特性を変化させた、新たな一連のＥ−Ｌクローンを創出した。この研究では、親遺伝子であるＥ、Ｌ、Ｅ−Ｌ、およびＥ−Ｌの内部切断形態の溶菌活性を探索し、異なる膜貫通ドメインの構築の差違に基づき、異なる溶菌機構を特徴付けた。電子顕微鏡検査法、ならびに細胞質空間およびペリプラズム空間へのマーカー酵素の放出により、２つの異なる溶菌機構は、これらの溶菌タンパク質の、Ｅ．  ｃｏｌｉの内膜または内膜および外膜に対する透過に応じて識別しうることが明らかとなった（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．（１９９８年）、１６４巻（１号）：１５９〜６７頁（参照により本明細書に組み込まれる））。有用な融合タンパク質の一例は、本開示のポリペプチドをＧＳＴ配列のＣ末端へと融合させたＧＳＴ融合タンパク質である。このようなキメラタンパク質は、本開示の組換えポリペプチドの精製を容易としうる。
【００５６】
別の実施形態では、キメラタンパク質またはキメラペプチドが、そのＮ末端において異種シグナル配列を含有する。例えば、本開示のポリペプチドの天然のシグナル配列を除去して、別のタンパク質に由来するシグナル配列で置きかえることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列を、異種シグナル配列として用いることができる（参照により本明細書に組み込まれる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年）。真核生物の異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）の分泌配列が含まれる。さらに別の例では、有用な原核生物の異種シグナル配列に、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が含まれる。
【００５７】
融合タンパク質により、リシンポリペプチドを、異なる能力を有するタンパク質またはポリペプチドと組み合わせることもでき、このリシンポリペプチドにさらなる能力または付加的な特徴を与えることもできる。融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの全部または一部を、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列へと融合させた、免疫グロブリン融合タンパク質でありうる。免疫グロブリンは、抗体、例えば、感受性細菌または標的の細菌の表面タンパク質またはエピトープを指向する抗体でありうる。免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物へと組み込み、被験体へと投与して、リガンド（可溶性リガンドまたは膜結合リガンド）と細胞の表面におけるタンパク質（受容体）との間の相互作用を阻害し、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるシグナル伝達を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドのコグネイトリガンドのバイオアベイラビリティーを改変しうる。リガンド／受容体間相互作用の阻害は、細菌と関連する疾患および障害を処置するため、かつ、細胞の生存を調節する（すなわち、促進または阻害する）ために治療的に有用でありうる。さらに、本開示の免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドに対して方向付けられた抗体を被験体において産生させ、リガンドを精製し、スクリーニングアッセイにおいて受容体のリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原としても用いることができる。本開示のキメラタンパク質およびキメラペプチドならびに融合タンパク質および融合ペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法により作製することができる。
【００５８】
融合遺伝子は、自動式ＤＮＡ合成器を含めた従来の技法により合成することができる。代替的に、ＰＣＲによる遺伝子断片の増幅は、２つの連続遺伝子断片間の相補的な突出をもたらし、その後、これをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を発生させうる、アンカープライマーを用いて実行することもできる（すなわち、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）。さらに、融合部分（すなわち、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分を、インフレームで本発明のポリペプチドへと連結するように、このような発現ベクターへとクローニングすることができる。
【００５９】
本明細書で用いられる、シャフリングされたタンパク質もしくはペプチド、シャフリングされた遺伝子産物、または複数の関連するファージタンパク質もしくはタンパク質のペプチド断片についてシャフリングされたペプチドは、ランダムに切断され、より活性のタンパク質またはより特異的なタンパク質へと再組立てされる。シャフリングされたオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはペプチド断片分子を選択またはスクリーニングして、所望の機能特性を有する分子を同定する。この方法は、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、米国特許第６，１３２，９７０号（「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）；Ｋａｕｆｆｍａｎ、米国特許第５，９７６，８６２号（「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｃｏｎｄｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」）、およびＨｕｓｅ、米国特許第５，８０８，０２２号（「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｄｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」）において記載されている。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。シャフリングを用いて、活性の大きな、例えば、活性が鋳型タンパク質の最大で１０〜１００倍であるタンパク質を創出することができる。鋳型タンパク質は、多種多様なリシンタンパク質の間で選択される。シャフリングされたタンパク質またはペプチドは、例えば、１または複数の結合ドメインおよび１または複数の触媒ドメインを構成する。各結合ドメインまたは触媒ドメインは、同じファージもしくは異なるファージ、または同じファージタンパク質もしくは異なるファージタンパク質に由来する。シャフリングされたドメインは、単独でまたは他の遺伝子もしくは遺伝子産物と組み合わせてペプチド断片へと翻訳可能な、遺伝子または遺伝子産物としてのオリゴヌクレオチドベースの分子であるか、あるいはペプチドベースの分子である。遺伝子断片には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＥＳＴ、ＳＮＩＰ、および単独でまたは他の分子と組み合わせてペプチドへの翻訳が可能であるかまたは不可能なオリゴヌクレオチド分子を生成させる他のオリゴヌクレオチドベースの分子のうちのいずれの分子も含まれる。
【００６０】
本明細書で開示されるタンパク質またはペプチドおよびペプチド断片の修飾形態または改変形態は、化学合成されるか、もしくは組換えＤＮＡ法により調製されるか、またはこれらの両方によるタンパク質またはペプチドおよびペプチド断片を包含する。これらの技法には、例えば、キメラ化およびシャフリングが含まれる。タンパク質またはペプチドを化学的合成により作製する場合、このタンパク質またはペプチドは、実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含まないことが好ましい、すなわち、このタンパク質またはペプチドは、このタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されていることが好ましい。したがってこのようなタンパク質調製物が有する目的のポリペプチド以外の化学的前駆体または化合物は、約３０％、２０％、１０％、５％の（乾燥重量で）未満である。
【００６１】
ポリペプチドのシグナル配列は、本開示のタンパク質およびペプチドならびにペプチド断片の粘膜への膜貫通移動および粘膜からの膜貫通移動を容易としうるほか、目的の分泌タンパク質または他のタンパク質の分泌および単離も容易としうる。シグナル配列は、１または複数の切断イベントによる分泌において成熟タンパク質から一般に切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられることが典型的である。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を経るときに、シグナル配列の成熟タンパク質からの切断を可能とする、プロセシング部位を含有する。したがって、本開示は、シグナル配列を有する、記載されたポリペプチドのほか、シグナル配列自体、およびシグナル配列の不在下におけるポリペプチド（すなわち、切断産物）にも関連する。本開示のシグナル配列をコードする核酸配列は、発現ベクター内で、通常は分泌されないか、または他の形で単離することが困難なタンパク質など、目的のタンパク質へと作動可能に連結することができる。シグナル配列が、発現ベクターが形質転換された真核生物宿主などからのタンパク質の分泌を方向付けると、このシグナル配列は、続いてまたは同時に切断される。次いで、タンパク質は、当技術分野で認識される方法により細胞外培地から容易に精製することができる。代替的に、シグナル配列は、ＧＳＴドメインなどによる精製を容易とする配列を用いて、目的のタンパク質へと連結することができる。
【００６２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの他の改変体にも関連する。このような改変体は、アゴニスト（模倣体）として、またはアンタゴニストとして機能しうる改変アミノ酸配列を有しうる。改変体は、変異誘発、すなわち、個別の点変異または切断により発生させることができる。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性、またはこれらの生物学的活性のサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の活性のうちの１または複数を、例えば、細胞内のシグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーであって、目的のタンパク質を包含するメンバーに競合的に結合することにより阻害しうる。したがって、機能の限定された改変体で処置することにより、特異的な生物学的効果を誘発することができる。被験体を、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体で処置することにより、被験体における副作用を、タンパク質の天然に存在する形態による処置と比べて低減することができる。アゴニスト（模倣体）として、またはアンタゴニストとして機能する本開示のタンパク質の改変体は、本開示のタンパク質の変異体、すなわち、切断型変異体の組合せライブラリーを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。一実施形態では、多様化させた改変体のライブラリーを、核酸レベルにおける組合せ変異誘発により発生させ、多様化させた遺伝子ライブラリーによりコードさせる。多様化させた改変体のライブラリーは、例えば、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが、個別のポリペプチドとして発現可能であるか、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（すなわち、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列へと酵素的にライゲーションすることにより作製することができる。本開示のポリペプチドの潜在的な改変体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するのに用いられうる多様な方法が存在する。当技術分野では、縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法が公知である（すなわち、全てが参照により本明細書に組み込まれるＮａｒａｎｇ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁を参照されたい）。
【００６３】
加えて、本開示のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを用いて、改変体、活性断片、または切断型のスクリーニングおよびその後の選択のための多様化させたポリペプチド集団を発生させることができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、目的の二本鎖のＰＣＲ用コード配列の断片を、ニッキングが分子１個当たり約１回だけ生じる条件下において、ヌクレアーゼで処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物に由来するセンス／アンチセンス対を包含しうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理を介して改質された二重鎖から一本鎖部分を除去し、結果として得られる断片ライブラリーを発現ベクターへとライゲーションすることにより発生させることができる。この方法により、サイズが多様な目的のタンパク質のＮ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを導出することができる。当技術分野では、点変異または切断により作製される組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための複数の技法が公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技法であって、ハイスループット解析に適する技法は、遺伝子ライブラリーを、複製可能な発現ベクターへとクローニングするステップと、適切な細胞を、結果として得られるベクターライブラリーで形質転換するステップと、所望の活性の検出によりその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件下で、組合せ遺伝子を発現させるステップとを包含することが典型的である。ライブラリー内の機能的変異体の頻度を増大させる技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、本開示のタンパク質の改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。タンパク質またはペプチド断片の免疫学的活性部分は、ファージ酵素を認識する抗体に結合する領域を包含する。この文脈では、実施形態によるタンパク質の最小の部分（またはこのタンパク質をコードする核酸）が、リシンタンパク質をもたらすファージに特異的なエピトープとして認識可能なエピトープである。したがって、抗体への結合を予測することが可能であり、一部の実施形態に有用な最小のポリペプチド（およびこのポリペプチドをコードする関連する核酸）は、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５、または１００アミノ酸の長さでありうる。わずか、８、９、１０、１１、１２、または１５アミノ酸の長さの小型の配列も、エピトープとして作用するのに十分な構造を確実に含むが、５、６、または７アミノ酸の長さのより短い配列も、条件によってはエピトープ構造を呈示し、ある実施形態では価値を有する。したがって、本明細書の図３および４、ならびに配列��号１、２、および／または３に示される場合を含めた、本明細書で提供されるタンパク質（複数可）またはリシンポリペプチドの最小の部分は、わずか、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、または１６アミノ酸の長さのポリペプチドを包含する。
【００６４】
本明細書で記載される実施形態によるタンパク質またはペプチド断片の生物学的活性部分は、ファージタンパク質の全長タンパク質より少数のアミノ酸を包含し、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を呈示する本開示のファージタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。生物学的活性部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を伴うドメインまたはモチーフを含むことが典型的である。本開示のタンパク質またはタンパク質断片の生物学的活性部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００アミノ酸未満であるポリペプチドの場合もあり、１０、２５、５０、１００アミノ酸より長いポリペプチドの場合もある。さらに、タンパク質の他の領域が欠失しているかまたは付加されている他の生物学的活性部分も、組換え法により調製し、本明細書における実施形態のポリペプチドの天然形態の機能的活性のうちの１または複数について評価することができる。
【００６５】
当業者により察知される通り、このような小型のタンパク質および／または核酸（または大型分子のタンパク質領域および／もしくは核酸領域）と機能性を共有する相同タンパク質および相同核酸を調製することができる。相同でありうるこのような小型の分子および大型分子の短い領域は、とりわけ実施形態として意図される。このような有益な領域の相同性は、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、および／または３に示されるリシンポリペプチドを含めた、本明細書で提供されるリシンポリペプチドと比較して、少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、８５％であることが好ましく、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または少なくとも９９％であることが好ましい。これらの相同性パーセント値は、保存的アミノ酸置換に起因する改変を包含しない。
【００６６】
アミノ酸残基のうちの少なくとも約７０％（好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、および好ましくは、少なくとも約９０、または９５％）が同一であるか、または保存的置換を表す場合、２つのアミノ酸配列は、「実質的に相同」である。リシンポリペプチドのアミノ酸のうちの１もしくは複数の、またはいくつかの、または最大１０％、または最大１５％、または最大２０％が、類似のアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換で置換されており、同等なリシンが、本明細書で開示されるＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１リシンなどのリシンの活性プロファイル、抗菌効果、および／または細菌特異性を有する場合、同等なＰｌｙＳｓ２リシン、または同等なＰｌｙＳｓ１リシンなど、同等なリシンの配列は、実質的に相同である。
【００６７】
本明細書で記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性体形態にある残基は、そのポリペプチドにより免疫グロブリン結合の所望の機能的特性が保持される限りにおいて、任意のＬ−アミノ酸残基を置換することができる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指し、ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。以下の対応表では、アミノ酸残基の略記法を、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２４３巻：３５５２〜５９頁（１９６９年）における標準的なポリペプチドの用語法に準拠して示す。
【００６８】
【化１】
2014519485.tif 000002
本明細書では、全てのアミノ酸残基配列が、その左向きおよび右向きが従来のアミノ末端からカルボキシ末端への方向である慣例法により表されることに注意されたい。さらに、アミノ酸残基配列の始端部または末端部におけるダッシュが、１または複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対するペプチド結合を示すことに注意されたい。上記の表は、本明細書では代替的に出現しうる、三文字表記と一文字表記とを相互関連させるために示す。
【００６９】
本明細書のアミノ酸配列、あるいは本明細書のポリペプチド、および図３もしくは図４に示されるリシン配列、またはこれらの活性断片もしくは切断型を含めた本明細書のリシンをコードする核酸配列には、特定のコドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンへと変化させるか、アミノ酸を別のアミノ酸に置換するか、または１もしくは複数のアミノ酸を欠失させるように、変異を施すことができる。一般に、可能な限り少数のアミノ酸変化またはヌクレオチド変化を施すことにより、このような変異を施すことができる。この種の置換変異を施して、結果として得られるタンパク質におけるアミノ酸を、非保存的様式で（例えば、コドンを、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群分けに属するアミノ酸から、別の群分けに属するアミノ酸へと変化させることにより）変化させることもでき、保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群分けに属するアミノ酸に由来するコドンを、同じ群分けに属するアミノ酸へと変化させることにより）変化させることもできる。このような保存的変化は一般に、結果として得られるタンパク質の構造および機能にもたらす変化が小さい。非保存的変化は、結果として得られるタンパク質の構造、活性、または機能を改変する可能性が大きい。本発明は、結果として得られるタンパク質の活性または結合特徴をそれほど改変しない保存的変化を含有する配列を包含すると考えられるものとする。
【００７０】
以下は、アミノ酸の多様な群分けの一例である：
非極性のＲ基を伴うアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性のＲ基を伴うアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性のＲ基を伴うアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）  。
【００７１】
別の群分けは、フェニル基を伴うアミノ酸でありうる：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン  。
【００７２】
別の群分けは、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）による：
【００７３】
【化２】
2014519485.tif 000003
特に、好ましい置換は、
・正の電荷を維持しうるようなＡｒｇのＬｙｓへの置換であって、この逆も成り立つ置換；
・負の電荷を維持しうるようなＡｓｐのＧｌｕへの置換であって、この逆も成り立つ置換；
・遊離−ＯＨを維持しうるようなＴｈｒのＳｅｒへの置換；および
・遊離ＮＨ２を維持しうるようなＡｓｎのＧｌｎへの置換である。
【００７４】
例示的で好ましい保存的アミノ酸置換は、グルタミン酸（Ｅ）のグルタミン（Ｑ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；バリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；トレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；グルタミン（Ｑ）のリシン（Ｋ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；メチオニン（Ｍ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；グルタミン酸（Ｅ）のリシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；セリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；フェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；イソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；アルギニン（Ｒ）のリシン（Ｋ）への置換であって、この逆も成り立つ置換のうちのいずれかを包含する。
【００７５】
アミノ酸置換はまた、特に、好ましい特性を伴うアミノ酸を置換するためにも導入することができる。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在性部位として導入することができる。Ｈｉｓは、特に、「触媒」部位（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用する可能性があり、生化学的触媒において最も一般的なアミノ酸である）として導入することができる。Ｐｒｏは、タンパク質構造においてβ−ターンを誘導する、その特に平面的な構造のために導入することができる。
【００７６】
本明細書で記載されるポリペプチドまたはエピトープは、抗体を生成させるのに用いることができ、また、リシンまたはリシンタンパク質を認識する分子への結合を検出するのにも用いることができる。別の実施形態は、通常の免疫化またはファージディスプレイ法などによるエピトープの使用であって、エピトープを用いて潜在的な結合剤のライブラリーをスクリーニングしうる使用を介して創出しうる抗体または他の特異的な結合剤などの分子である。このような分子は、リシンタンパク質の１もしくは複数のエピトープまたはリシンタンパク質をコードする核酸を認識する。エピトープを認識する抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ヒト化抗体の場合もあり、抗体タンパク質の部分の場合もある。エピトープを認識する分子は、そのエピトープに対して、その分子が血清アルブミンに対して示す結合の少なくとも１０倍強い特異的結合を示すことが所望される。特異的結合は、アフィニティー（Ｋｍ）として測定することができる。特異的結合は、同じ条件下における血清アルブミンに対する結合の少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８倍、なおまたはこれを超えて強いことがより所望される。
【００７７】
所望される実施形態では、抗体または抗体断片が、リシンタンパク質の存在を検出するか、または、代替的に、リシンタンパク質に対して感受性の細菌の存在を検出するのに有用な形態にある。さらなる実施形態では、抗体が、例えば、キメラタンパク質または融合タンパク質中の本発明のリシンポリペプチドに付着するか、またはこれと他の形で会合することが可能であり、リシンを、目的または標的の細菌細胞または株へと方向付けるのに用いられうる。代替的に、リシンポリペプチドは、抗体が、とりわけ、細菌上または細菌内の表面または表面下でそのエピトープに結合しうるように、例えば、細菌の細胞壁を完全にまたは部分的に溶解させるときに、抗体を方向付けるか、または抗体と共に作用するようにも用いられうる。例えば、本発明のリシンを抗連鎖球菌抗体に接合させ、この抗体をそのエピトープへと方向付けることができる。
【００７８】
当業者により察知される通り、抗体合成のための多様な形態および方法は公知である。抗体は、光学シグナルを創出する酵素であるＦｌｕｏｒ、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｐｈｏｒｅ、微小粒子、または放射性原子などのレポーター分子またはレポーター原子とコンジュゲートする（共有結合的に複合体化する）ことができる。抗体または抗体断片は、動物を免疫化した後でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて合成させることができ、例えば、抗体または抗体断片は、遺伝子組換え後に細胞培養を介して合成させることができる。抗体または抗体断片は、細胞合成と化学修飾との組合せにより調製することができる。
【００７９】
「抗体」とは、特異的エピトープに結合する、抗体およびその断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を包含し、最後に言及された抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号においてさらに詳細に記載されている。「抗体」という用語は、天然の場合であれ、部分的または完全に合成により作製される場合であれ、免疫グロブリンについて記載するものである。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、またはこれと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も網羅する。この用語により、ＣＤＲ移植抗体もまた想定される。「抗体」とは、抗体および特異的エピトープに結合するその断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を包含し、最後に言及された抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号においてさらに詳細に記載されている。「抗体（複数可）」という用語は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つの全長ポリペプチド鎖を一般に含む野生型の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはその同等のＩｇ相同体（例えば、重鎖だけを含むラクダ科動物のナノボディー）を包含し、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持する機能的な全長変異体、改変体、またはその誘導体も包含し、二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、多重特異性抗体、および二重可変ドメイン抗体も包含する；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）でありうる。「抗体」という用語の意味の中にはまた、任意の「抗体断片」も包含される。
【００８０】
「抗体断片」とは、（ｉ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン、および定常重鎖（ＣＨ１）ドメイン１からなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ（Ｆｄ）断片の重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる可変断片（Ｆｖ）、（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ，  Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年））；（ｖｉ）ラクダ科動物の抗体；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインが会合して、抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーにより連結された単鎖Ｆｖ断片（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁、１９８８年）；（ｉｘ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖において発現させた二価の二特異性抗体であるが、同じ鎖における２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを用い、これにより、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創出したダイアボディー（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．  Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、（１９９３年））；ならびに（ｘ）相補性の軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む直鎖状抗体；（ｘｉ）多価抗体断片（ｓｃＦｖの二量体、三量体および／または四量体（ＰｏｗｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４２巻：１９３〜２０４頁（２０００年））；ならびに（ｘｉｉ）単独もしくは任意の組合せにおける、重鎖および／もしくは軽鎖の他の非全長部分、またはその変異体、改変体、もしくは誘導体を含めた、全長ではない、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【００８１】
抗体は、多数の方式で改変しうるので、「抗体」という用語は、要求される特異性を伴う結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を網羅するものとして理解されたい。したがって、この用語は、天然であれ、完全にまたは部分的に合成であれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた、抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等物、および相同体を網羅する。したがって、別のポリペプチドへと融合させた免疫グロブリンの結合ドメイン、または同等物を含むキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、ならびに米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号において記載されている。
【００８２】
「抗体接合部位」とは、とりわけ、抗原に結合する軽鎖または重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
【００８３】
その多様な文法的形態において本明細書で用いられる「抗体分子」という語句は、無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の両方を想定する。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の部分であって、当技術分野ではＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として公知の部分を含めたパラトープを含有する部分であり、本明細書で記載される治療法において用いられることが好ましい部分である。
【００８４】
その多様な文法的形態における「モノクローナル抗体」という語句は、特定の抗原と免疫反応することが可能な、唯一の種類の抗原接合部位を有する抗体を指す。したがって、モノクローナル抗体は、それが免疫反応する任意の抗原に対する単一の結合アフィニティーを提示することが典型的である。したがって、モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対して免疫特異的な複数の抗原接合部位を有する抗体分子、例えば、二特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含有しうる。
【００８５】
「特異的」という用語は、特異的結合対のうちの一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子への結合を著明には示さない状況を指すのに用いることができる。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により保有される特定のエピトープに特異的である場合であって、抗原結合ドメインを保有する特異的結合メンバーが、このエピトープを保有する多様な抗原に結合しうる場合にも適用可能である。
【００８６】
「〜を含む」という用語は一般に「〜を包含する」の意味で用いられ、すなわち１または複数の特徴または成分の存在を許容する。
【００８７】
「〜から本質的になる」という用語は、大型の産物へと共有結合的に接合されない規定された数の残基の産物、特に、ペプチド配列を指す。しかし、本明細書における本発明のペプチドの場合、当業者は、末端の、保護基などを付加する化学的修飾、例えば、Ｃ末端のアミド化など、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する微細な修飾が想定されうることを察知するであろう。
【００８８】
「単離された」という用語は、本発明のリシンポリペプチド（複数可）、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸が、本発明に従う状態を指す。ポリペプチドおよび核酸は、それらがそれらの天然の環境、またはそのような調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施される組換えＤＮＡ法を介する場合、それらが調製される環境（例えば、細胞培養物）において共に見出される他のポリペプチドまたは核酸など、それらが自然に会合する物質を含まないかまたは実質的に含まない。ポリペプチドおよび核酸は、希釈剤または補助剤と調合し、やはり、実際的な目的のために、単離することができる（例えば、ポリペプチドは通常、ポリマーもしくは粘膜接着剤または他の担体と混合するか、または診断もしくは治療において用いられる場合は、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合する）。
【００８９】
核酸
本明細書では、本発明のＳ．ｓｕｉｓリシンポリペプチド（複数可）をコードすることが可能な核酸が提供され、本発明の態様を構成する。この文脈において代表的な核酸配列は、図３および４のうちのいずれかのポリペプチド、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のポリペプチド、ならびにストリンジェントな条件下で図３または４のＤＮＡ配列（複数可）の相補的な配列とハイブリダイズする配列をコードするポリヌクレオチド配列である。また、得ることが可能な天然の改変体を含め、これらの配列およびこれらの図中に示されている核酸配列とハイブリダイズする核酸配列のさらなる改変体も、本開示による溶菌酵素を作製するための使用に想定される。ファージ関連溶菌酵素をコードする多種多様な単離核酸配列または単離ｃＤＮＡ配列、およびこのような遺伝子配列とハイブリダイズする部分的な配列は、本発明のリシン酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）を組換えにより作製するために有用である。
【００９０】
「レプリコン」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する任意の遺伝子エレメント、すなわち、それ自身の制御下で複製が可能な任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００９１】
「ベクター」とは、付着したセグメントの複製をもたらすように、プラスミド、ファージ、またはコスミドなど、別のＤＮＡセグメントを付着させうるレプリコンである。
【００９２】
「ＤＮＡ分子」とは、その一本鎖形態または二本鎖へリックスにおけるポリマー形態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）を指す。この用語は、ＤＮＡ分子の一次構造および二次構造だけを指し、これを任意の特定の三次形態へと限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。本明細書では、特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じるとき、配列を、転写されていないＤＮＡ鎖に沿って、５’〜３’方向の配列（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）だけを与える通常の慣例により記載することができる。
【００９３】
「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
【００９４】
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて転写されて、ポリペプチドへと翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン、および３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンにより決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびまた、合成ＤＮＡ配列が含まれうるがこれらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列に対して３’側に位置する。
【００９５】
転写制御配列および翻訳制御配列とは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど、宿主細胞内のコード配列の発現をもたらすＤＮＡ調節配列である。
【００９６】
「プロモーター配列」とは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡの調節領域である。本発明を規定する目的では、プロモーター配列が、転写開始部位によりその３’末端で境界づけられ、上流（５’方向）に及び、バックグラウンドを上回って検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを包含する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより規定するのが好都合である）のほか、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。真核生物のプロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多いであろうが、常にそうであるわけではない。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５のコンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含有する。
【００９７】
「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡへと転写し、次いで、これがコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されるとき、細胞内の転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００９８】
「シグナル配列」は、コード配列の前に包含されうる。この配列は、ポリペプチドに対してＮ末端側のシグナルペプチドであって、このポリペプチドを細胞表面へと方向付けるか、またはこのポリペプチドを培地へと分泌するように宿主細胞とコミュニケーションするシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドが宿主細胞により切り離されると、タンパク質が細胞から放出される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然の多様なタンパク質と会合して見出されうる。
【００９９】
本発明のプローブに言及して本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確なサイズは、多くの因子に依存するであろうし、これらの因子は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する。
【０１００】
本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、精製された制限消化物におけるように天然に存在する場合であれ、合成により作製される場合であれ、ある核酸鎖と相補的なプライマーによる伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、適切な温度およびｐＨにおいて、合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成をプライミングするのに十分な程度に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および用いられる方法を含めた多くの因子に依存するであろう。例えば、診断的適用のためには、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、１５〜２５以上のヌクレオチドを含有することが典型的であるが、少数のヌクレオチドを含有する場合もある。
【０１０１】
本明細書では、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖と「実質的に」相補的となるようにプライマーを選択する。これは、プライマーが、それらの各々の鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列が、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片を、プライマーの５’端へ、プライマー配列の残りが鎖と相補的な状態で付着することができる。代替的に、プライマー配列が、鎖の配列との、これとハイブリダイズするのに十分な相補性を有することを前提とすれば、非相補的な塩基または長い配列をプライマー内に散在させ、これにより、伸長産物を合成するための鋳型を形成することもできる。
【０１０２】
本明細書で用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、それらの各々が、特異的ヌクレオチド配列において、またはこの近傍で、二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。
【０１０３】
外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを細胞内に導入した場合、この細胞はこのようなＤＮＡにより「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡへ組み込まれる（共有結合的に連結される）場合もあり、そうでない場合もある。原核細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡが、プラスミドなどのエピソームエレメントにおいて維持される場合もある。真核細胞に関して述べると、安定的に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが、染色体の複製を介して娘細胞により受け継がれるように、これが染色体へと組み込まれた細胞である。この安定性は、真核生物の細胞が、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む細胞系またはクローンを樹立する能力により裏付けられる。「クローン」とは、有糸分裂を介して単一の細胞または共通の祖先から派生する細胞集団である。「細胞系」とは、幾世代にもわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける安定的な増殖が可能な初代細胞のクローンである。
【０１０４】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドのうちの少なくとも約７５％（好ましくは、少なくとも約８０％であり、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％である）が、規定される長さのＤＮＡ配列にわたりマッチするとき、「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することにより同定することもでき、例えば、その特定の系について規定されるストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験により同定することもできる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当技術分野の範囲内にある。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、ＩおよびＩＩ巻、前出；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、前出を参照されたい。
【０１０５】
本明細書で想定される改変体ＤＮＡ分子の多くは、Ｍ１３プライマーによる変異誘発など、標準的なＤＮＡ変異誘発法により創出される改変体ＤＮＡ分子を包含する。これらの技法の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書に組み込まれる）において提示されている。このような技法を用いることにより、開示される改変体とは微細な形で異なる改変体を創出することができる。本開示では、リシンポリペプチド（複数可）の機能的特徴を保有するタンパク質をやはりコードしながらも、とりわけ、本明細書で開示されるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列の誘導体であり、開示されるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列とは、ヌクレオチドの欠失、付加、または置換により異なるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列が想定される。また、開示されるＤＮＡ分子に由来する小型のＤＮＡ分子も包含される。このような小型のＤＮＡ分子には、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとしての使用に適するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの小型のＤＮＡ分子はそれら自体、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのバクテリオファージにより遺伝的にコードされる溶菌酵素のうちの少なくとも１つのセグメントを含み、ＰＣＲの目的では、遺伝子のうちの少なくとも１０〜１５ヌクレオチドの配列を含み、より好ましくは、１５〜３０ヌクレオチドの配列を含むであろう。また、上記の通りに開示されるＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列も、ストリンジェントな条件下で開示されるＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列またはその断片として規定することができる。
【０１０６】
特定のストリンジェンシーの程度に対応するハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質、ならびに用いられるハイブリダイズ用ＤＮＡの組成および長さに応じて変化する。一般に、ハイブリダイゼーション緩衝液のハイブリダイゼーション温度およびイオン強度（とりわけ、ナトリウムイオン濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するであろう。特定のストリンジェンシーの程度を達成するのに要求されるハイブリダイゼーション条件についての計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、９および１１章（参照により本明細書に組み込まれる）により論じられている。
【０１０７】
このような計算の例は、以下の通りである。ハイブリダイゼーション実験は、ＤＮＡ分子（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージにより遺伝的にコードされる溶菌酵素の天然の変異）の、標的のＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションにより実施することができる。標的のＤＮＡとは、例えば、アガロースゲル内で電気泳動させ、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている技法であるサザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、９８巻：５０３頁）によりニトロセルロース膜へと転写した、対応するｃＤＮＡでありうる。同位体Ｐ３２標識ｄＣＴＰで標識した標的プローブとのハイブリダイゼーションを、融解温度であるＴｍ（以下で記載される）を摂氏２０〜２５度下回る温度での６倍濃度ＳＳＣなど、イオン強度の大きな溶液中で実行する。サザンブロット上における標的のＤＮＡ分子が１０ｎｇ以上のＤＮＡを含有するようなサザンハイブリダイゼーション実験では、ハイブリダイゼーションを、１〜２ｎｇ／ｍｌの放射性標識したプローブ（比放射能が１０９ＣＰＭ／ｍｕｇ以上である）を用いて、６〜８時間にわたり実行する。ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロースフィルターを洗浄して、バックグラウンドハイブリダイゼーションを除去する。洗浄条件は、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを保持しながらバックグラウンドハイブリダイゼーションを除去するため、可能な限りストリンジェントなものとする。「Ｔｍ」という用語は、それを上回ったイオンが優勢な条件下では、放射性標識したプローブ分子が、その標的のＤＮＡ分子とハイブリダイズしない温度を表す。このようなハイブリッド分子のＴｍは、以下の式：Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ナトリウムイオン濃度のｌｏｇ１０）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−０．６３（ホルムアミドの％）−（６００／ｌ）［式中、ｌ＝塩基対内のハイブリッドの長さ］から推定することができる。この式は、０．０１Ｍ〜０．４Ｍの範囲にあるナトリウムイオン濃度については有効であり、ナトリウムイオン濃度が大きな溶液中におけるＴｍを計算するにはそれほど正確でない（ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、４８巻：１３９０頁）（参照により本明細書に組み込まれる）。この式はまた、Ｇ＋Ｃ含量が３０％〜７５％以内であるＤＮＡについても有効であり、また、１００ヌクレオチドを超える長さのハイブリッドにも適用される。オリゴヌクレオチドプローブの挙動は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書に組み込まれる）の１１章において詳細に記載されている。この文献において記載されている好ましい例示的な条件は、特に、溶菌遺伝子の変異を選択するのに用いることが想定される。
【０１０８】
本開示の好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件を、その下では配列の変異が２５％を超えるＤＮＡ分子（また、「ミスマッチ」とも称する）はハイブリダイズしない条件として定義することができる。より好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件が、その下ではミスマッチが１５％を超えるＤＮＡ分子はハイブリダイズしない条件であり、なおより好ましくは、ストリンジェントな条件が、その下ではミスマッチが１０％を超えるＤＮＡ配列はハイブリダイズしない条件である。好ましくは、ストリンジェントな条件が、その下ではミスマッチが６％を超えるＤＮＡ配列はハイブリダイズしない条件である。
【０１０９】
遺伝コードの縮重は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を維持しながら、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列における大きな変異を可能とするので、実施形態の範囲をさらに広げる。例えば、代表的なアミノ酸残基は、アラニンである。ｃＤＮＡにおいて、アラニンは、ヌクレオチドのコドントリプレットであるＧＣＴによりコードされうる。遺伝コードの縮重のために、他の３つのヌクレオチドのコドントリプレット（ＧＣＴ、ＧＣＣ、およびＧＣＡ）もまた、アラニンをコードする。したがって、遺伝子のヌクレオチド配列を、この位置において、コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはこのタンパク質の特徴に影響を及ぼさずに、これらの３つのコドンのうちのいずれかへと変化させうるであろう。当業者には、特定のアミノ酸についての遺伝コードおよびヌクレオチドコドンの変異が周知である。遺伝コードの縮重に基づき、上記の通りの標準的なＤＮＡ変異誘発法を用いて、またはＤＮＡ配列の合成により、改変体のＤＮＡ分子を、本明細書で開示されるｃＤＮＡ分子から派生させることができる。本開示では、遺伝コードの縮重に基づく配列の変異により開示される、ｃＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下ではハイブリダイズしないＤＮＡ配列も、本明細書に包含する。
【０１１０】
したがって、その配列が、図３もしくは４、または配列番号１、２、もしくは３に提示される同じアミノ酸配列を有するが、これらと縮重しているかまたは図３もしくは４に提示される例示的な核酸配列と縮重しているポリペプチドをコードするＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＳｓ１を含め、本発明のリシンをコードするＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲内にあることを察知されたい。「〜と縮重である」とは、異なる３文字コドンを用いて、特定のアミノ酸を指定することを意味する。当技術分野では、以下のコドンを互換的に用いて、各特定のアミノ酸をコードしうることが周知である。
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）  ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）  ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）  ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）  ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ）  ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ）  ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ）  ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）  ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ）  ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ）  ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）  ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）  ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）  ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ）  ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）  ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）  ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ）  ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）  ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ）  ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）  ＵＧＧ
終止コドン  ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）  。
【０１１１】
上記で指定されたコドンは、ＲＮＡ配列のためのコドンであることを理解されたい。対応するＤＮＡのためのコドンは、ＵがＴに置換されている。
【０１１２】
当業者は、本明細書で記載され、当技術分野でも公知のＤＮＡ変異誘発法により、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのバクテリオファージリシンをコードし、さらに、本明細書で記載および提供される溶菌ポリペプチドの本質的な特徴も維持する、多種多様なＤＮＡ分子を作製しうることを認識するであろう。以下でより完全に記載される通り、新たに派生させたタンパク質はまた、溶菌ポリペプチド（複数可）に特徴的な変異を得るためにも選択することができる。このような派生体には、微細な欠失、付加、および置換を含めた、アミノ酸配列における変異を伴う派生体が含まれる。
【０１１３】
アミノ酸配列の変異を導入するための部位は所定であるが、変異自体が所定である必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を最適化するために、標的のコドンまたは領域においてランダム変異誘発を施し、発現させたタンパク質の改変体を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。上記の公知の配列を有するＤＮＡ内の所定の部位において置換変異を施すための技法が周知である。
【０１１４】
アミノ酸置換は、典型的に単一の残基の置換であり；挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基の程度であり；欠失は約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、単一の形態でありうるが、隣接する対、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入で施すことが好ましい。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せを組み合わせて最終構築物に達することができる。明らかに、タンパク質をコードするＤＮＡ中に施される変異は、配列をリーディングフレームの外側に位置付けてはならず、ｍＲＮＡの二次構造をもたらしうる相補的領域を創出しないことが好ましい（ＥＰ７５，４４４Ａ）。
【０１１５】
置換改変体とは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入される改変体である。このような置換は、タンパク質の特徴に対して著明な影響を及ぼさないように施すこともでき、タンパク質の特徴を細かく調節することが所望である場合に施すこともできる。タンパク質中で元のアミノ酸を置換することが可能であり、保存的置換とみなされるアミノ酸は、上記のアミノ酸であり、当業者により認知されているアミノ酸であろう。
【０１１６】
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、それほど保存的ではない置換を選択することにより、例えば、以下を維持することに対するそれらの効果がいっそう著明に異なる残基を選択することにより施すことができる：（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートコンフォメーションもしくはへリックスコンフォメーションとしての構造；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖のバルク。タンパク質特性における最大の変化をもたらすことが一般に予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルで、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（またはこれらにより置換する）置換；（ｂ）システインもしくはプロリンで、他の任意の残基を置換する（またはこれらにより置換する）置換；（ｃ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジル（ｈｉｓｔａｄｙｌ）で、陰電性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルを置換する（またはこれらにより置換する）置換；または（ｄ）巨大側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンで、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンを置換する（またはこれらにより置換する）置換であろう。
【０１１７】
これらのアミノ酸の置換または欠失または付加の効果は、誘導体タンパク質または改変体タンパク質が、感受性細菌を溶解させるかもしくは死滅させる能力、または感染させた細菌宿主内のファージにより呈示されるＤＮＡ架橋剤に対する感受性を補完する能力を解析することにより、溶菌ポリペプチド（複数可）の誘導体または改変体について評価することができる。これらのアッセイは、誘導体タンパク質または改変体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、上記の細菌へとトランスフェクトすることにより実施することもでき、細菌を、誘導体タンパク質または改変体タンパク質をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた宿主から発現させたタンパク質と共にインキュベートすることにより実施することもできる。
【０１１８】
アミノ酸配列の変異を導入するための部位は所定でありうるが、変異自体が所定である必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を最適化するために、標的のコドンまたは領域においてランダム変異誘発を施し、発現させたタンパク質の改変体を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。上記の公知の配列を有するＤＮＡ内の所定の部位において置換変異を施すための技法が周知である。
【０１１９】
本発明の別の特徴は、本明細書で開示されるＤＮＡ配列の発現である。当技術分野では周知の通り、ＤＮＡ配列は、それらを適切な発現ベクター内の発現制御配列へと作動可能に連結し、この発現ベクターを使用して、適切な単細胞宿主を形質転換することにより発現させることができる。本発明のＤＮＡ配列の、発現制御配列への、このような作動的連結は、既にＤＮＡ配列の一部ではなくても、当然ながら、ＤＮＡ配列の上流にある適正なリーディングフレーム内への開始コドンであるＡＴＧの提供を包含する。多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを、本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることが可能である。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、ならびに公知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉプラスミドであるｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、および線維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドなどの酵母プラスミドまたはその誘導体；昆虫細胞内または哺乳動物細胞内で有用なベクターなど、真核細胞内で有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドなど、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターなどが含まれる。
【０１２０】
多種多様な発現制御配列（それへと作動可能に連結されるＤＮＡ配列の発現を制御する配列）のうちのいずれかをこれらのベクターにおいて用いて、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、またはアデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの大型のオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母接合因子のプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの多様な組合せが含まれる。
【０１２１】
また、多種多様な単細胞の宿主細胞も本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これらの宿主は、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の株、酵母などの真菌、および組織培養物中のＣＨＯ細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、およびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、およびヒト細胞などの動物細胞、ならびに植物細胞など、周知の真核生物宿主および原核生物宿主を包含しうる。
【０１２２】
全てのベクター、発現制御配列、および宿主が、本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに同等に良好に機能するわけではないことが理解されるであろう。また、全ての宿主が、同じ発現系で同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、所望の発現を達成するのに不要な実験なしに、適正なベクター、発現制御配列、および宿主を選択することが可能である。
【０１２３】
ポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを用いて、改変体のスクリーニングおよびその後の選択のための多様化させたポリペプチド集団を発生させることができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、目的の二本鎖のＰＣＲ用コード配列の断片を、ニッキングが分子１個当たり約１回だけ生じる条件下において、ヌクレアーゼで処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物に由来するセンス／アンチセンス対を包含しうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処置を介して改質された二重鎖から一本鎖部分を除去し、結果として得られる断片ライブラリーを発現ベクターへとライゲーションすることにより発生させることができる。この方法により、多様なサイズの目的のタンパク質のＮ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを導出することができる。
【０１２４】
当技術分野では、点変異または切断により作製される組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための複数の技法が公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技法であって、ハイスループット解析に適する技法は、遺伝子ライブラリーを、複製可能な発現ベクターへとクローニングするステップと、適切な細胞を、結果として得られるベクターライブラリーで形質転換するステップと、所望の活性の検出により、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件下で、組合せ遺伝子を発現させるステップとを包含することが典型的である。ライブラリー内の機能的変異体の頻度を増大させる技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、タンパク質の改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。
【０１２５】
組成物
本発明によれば、本発明の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物または医薬組成物のほか、関連する使用法および製造法も提供される。治療用組成物または医薬組成物は、１または複数の溶菌ポリペプチドを含むことが可能であり、場合によって、天然溶菌酵素、切断型溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、またはシャフリングされた溶菌酵素を、場合によって、担体、ビヒクル、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ホリンタンパク質（複数可）、１もしくは複数の抗生物質、または適切な賦形剤、担体、もしくはビヒクルなど、他の成分と組み合わせて包含しうる。本発明は、細菌感染または関連する状態を含めたグラム陽性細菌の死滅、緩和、コロニー除去、予防、または処置において用いられるＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１（特に、ΔＰｌｙＳｓ１）を含めた本発明のリシンによる治療用組成物または医薬組成物を提供する。本発明は、特に、皮膚または外被などの外表面のまたはそれを介する汚染または感染を含めた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓを含めたグラム陽性細菌による汚染および／または感染を処置、軽減、またはコントロールするのに用いられるＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１（特に、ΔＰｌｙＳｓ１）を含めた、本発明のリシンによる治療用組成物または医薬組成物を提供する。これにより、局所適用または皮膚適用および、コンパニオン動物または家畜の皮膚、外被または他の外表面を含めた外部への一般的な投与のための組成物が想定および提供される。本明細書では、特に、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属および抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属による細菌感染または関連する状態を含めた、グラム陽性細菌の死滅、緩和、コロニー除去、予防、または処置において用いられる、その切断型または改変体を含めたＰｌｙＳｓ２リシンまたはＰｌｙＳｓ１リシンを含む組成物が提供される。
【０１２６】
治療用組成物中に包含される酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、未改変ファージ関連溶菌酵素（複数可）、切断型溶菌ポリペプチド、改変体溶菌ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラ溶菌酵素および／またはシャフリングされた溶菌酵素のうちの１もしくは複数またはこれらの任意の組合せでありうる。加えて、異なるファージにより遺伝的にコードされる異なる溶菌ポリペプチド（複数可）を、同じ細菌を処置するのに用いることもできる。これらの溶菌酵素はまた、「未改変」溶菌酵素または溶菌ポリペプチド、切断型溶菌ポリペプチド（複数可）、改変体溶菌ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラ溶菌酵素およびシャフリングされた溶菌酵素の任意の組合せでもありうる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属を含めたグラム陽性細菌のための治療用組成物中または医薬組成物中の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、単独で用いることもでき、標的とされる他の細菌に特異的な他のファージ関連溶菌酵素と組み合わせて処置される他の侵襲性細菌生物が存在する場合は、抗生物質と組み合わせて用いることもできる。溶菌酵素、切断型酵素、改変体酵素、キメラ酵素、および／またはシャフリングされた溶菌酵素は、ホリンタンパク質と共に用いることができる。また、ホリンタンパク質の量も変化させることができる。場合によって、多様な抗生物質を、酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）と共に、かつ、リソスタフィンの存在を伴うかまたは伴わずに治療用組成物中に組み入れることもできる。複数の溶菌酵素または溶菌ポリペプチドを、治療用組成物中に組み入れることができる。
【０１２７】
医薬組成物はまた、化学的合成法またはＤＮＡ組換え法により作製されるそのアイソザイム、類似体、または改変体を含めた、１または複数の改変溶菌酵素も包含しうる。特に、改変溶菌タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、切断、キメラ化、シャフリング、またはこれらの組合せにより作製することができる。医薬組成物は、１または複数の天然の溶菌タンパク質と、１または複数の切断型溶菌タンパク質、改変体溶菌タンパク質、キメラ溶菌タンパク質、またはシャフリングされた溶菌タンパク質との組合せを含有しうる。医薬組成物はまた、１または複数の補完的薬剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤の任意選択の添加を伴う、同じ細菌種または異なる細菌種に由来する少なくとも１つの溶菌タンパク質のペプチド、またはペプチド断片も含有しうる。
【０１２８】
本発明は、殺菌活性を有するＰｌｙＳｓリシンポリペプチド改変体を含む細菌のリシンを提供する。本発明は、唯一の触媒ドメインまたは酵素ドメインを含有し、グラム陽性抗菌活性を保持するＰｌｙＳｓリシンの切断型変異体に関する。本発明は、例えば、予測されるアラニン−アミダーゼドメインおよび予測されるグルコサミニダーゼドメインから選択される唯一のドメインを含有する例示的なＰｌｙＳｓリシンの切断型変異体に関する。ＰＬｙＳＳ１の切断型変異体では、切断型リシンが、Ｎ末端の酵素ドメインおよび細胞壁結合ドメインを含み、含有するように、例えば、Ｃ末端のグルコサミニダーゼドメインを欠失させる。ΔＰｌｙＳＳ１切断型がＮ末端の２５４アミノ酸を有するのに対し、全長ＰｌｙＳｓ１リシンは４５２アミノ酸を有する。したがって、本発明は、本明細書で提示され、裏付けられる通り、唯一の触媒ドメインを含有し、Ｓ．ｓｕｉｓおよび他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のほか、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、および他の細菌を含めた他の多数の菌株に対する死滅活性を保持する切断型変異体である、Ｓ  ｓｕｉｓのリシン変異体、特に、ＰｌｙＳｓ１リシンの変異体を提供する。本明細書では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓを含めたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細胞に対して、全長ＰｌｙＳｓ１リシンタンパク質を含めた全長ＰｌｙＳｓリシンタンパク質と比較して同等であるかまたはこれを超える死滅活性を有するＰｌｙＳＳ１変異体リシンを含めたＰｌｙＳｓ変異体リシンであって、ａ）ＰｌｙＳｓ変異体が、エンドペプチダーゼドメインおよびグルコサミニダーゼドメインからなる群から選択される唯一の触媒ドメインを含有する切断型変異体リシンである修飾；ｂ）ＰｌｙＳｓ変異体が、Ｃ末端の酵素ドメインを伴わない切断型変異体リシンである修飾；ｃ）ＰｌｙＳｓ変異体が、単一の触媒ドメインおよび細胞壁結合ドメインを有する修飾；ならびにｄ）ＰｌｙＳｓ変異体が、配列番号２または１もしくは複数の保存的置換を有するその改変体アミノ酸に対応する修飾からなる群から選択される修飾を伴う、配列番号１のアミノ酸配列によるポリペプチド改変体を有するＰｌｙＳｓ変異体リシンを含む組成物が提供される。
【０１２９】
治療用組成物はまた、ホリンタンパク質も含みうる。ホリンタンパク質（または「ホリン」）とは、細胞膜に小孔をもたらすタンパク質である。ホリンタンパク質は、細菌における細胞呼吸を停止させる致死性の膜病変を形成しうる。溶菌タンパク質と同様に、ホリンタンパク質は、ファージによりコードされ、保有される。実際に、ホリンタンパク質の遺伝コードが、ファージ溶菌タンパク質のコードに隣接するか、なおまたはこのコード内に存在することは極めて一般的である。大半のホリンタンパク質配列は短く、全体としては疎水性の性状であるが、高度に親水性のカルボキシ末端ドメインを伴う。多くの場合には、推定ホリンタンパク質が、ファージの酵素的活性ドメイン内の異なるリーディングフレームにおいてコードされる。他の場合には、ホリンタンパク質が、細胞壁の溶菌タンパク質をコードするＤＮＡに隣接または近接するＤＮＡにおいてコードされる。ホリンタンパク質は、ファージ感染の後期において高頻度で合成され、それらが膜病変を引き起こす細胞質膜において見出される。ホリンは、一次構造の解析に基づき、２つの一般的なクラスへと群分けすることができる。クラスＩのホリンは、通常は９５残基以上の長さであり、３つの潜在的な膜貫通ドメインを有しうる。クラスＩＩのホリンは、通常は小型で、約６５〜９５残基であり、荷電しかつ疎水性の残基の分布は、２つのＴＭドメインを示す（Ｙｏｕｎｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、８巻、４号、２０００年３月）。しかし、少なくとも、グラム陽性宿主のファージにとって、二成分の溶菌系は普遍的ではない。複数のファージについて、ホリンの存在が示されているかまたは示唆されているが、全てのファージについて、推定ホリンをコードする遺伝子が既に見出されているわけではない。ホリンは、例えば、乳酸球菌のバクテリオファージであるＴｕｃ２００９、乳酸球菌のＮＬＣ３、肺炎球菌のバクテリオファージであるＥＪ−１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉのバクテリオファージであるＮａｄｈ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバクテリオファージであるＴｗｏｒｔ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのバクテリオファージ、肺炎球菌のファージであるＣｐ−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓファージであるＭ２９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｋｉのバクテリオファージであるＬＬ−Ｈリシン、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバクテリオファージであるＮ  １１を含めた、複数の細菌において存在することが示されている（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９９年８月、４４５２〜４４６０頁）。
【０１３０】
例えば、ホリンタンパク質は、溶菌酵素と共に用いて、細菌を死滅させる速度および効率を加速化させることができる。ホリンタンパク質はまた、キメラ酵素および／またはシャフリングされた酵素の形態にある可能性もある。一部の実施形態によれば、ホリンタンパク質はまた、細菌感染を処置するのに単独で用いることもできる。
【０１３１】
医薬組成物は、１または複数の抗微生物剤および／または１または複数の従来の抗生物質を含めた補完的薬剤を含有しうる。感染の処置を加速化させるために、治療剤は、また、溶菌酵素の殺菌活性も強化しうる、少なくとも１つの補完的薬剤をさらに包含しうる。抗微生物剤は主に、タンパク質およびＤＮＡの合成を含め、細胞壁の合成の阻害、細胞膜の機能の阻害、および／または代謝機能の阻害を介して、細菌細胞の構造または機能に干渉することにより作用する。抗生物質は、細胞壁のペプチドグリカンの生合成に影響を及ぼす抗生物質と、グラム陽性細菌におけるＤＮＡまたはタンパク質の合成に影響を及ぼす抗生物質とに広く細分することができる。ペニシリンおよびペニシリンと同様の抗生物質を含めた細胞壁合成阻害剤は、比較的支持の弱い細胞が膨潤し、最終的には破壊されるように、外側の硬質な細胞壁を破壊する。細胞壁のペプチドグリカンの生合成に影響を及ぼす抗生物質には、Ｎ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）のペプチドサブユニットの、ペプチドグリカンマトリックスへの組込みを防止することによりペプチドグリカンの合成を阻害する糖ペプチドが含まれる。入手可能な糖ペプチドには、バンコマイシンおよびテイコプラニン、ペプチドグリカン架橋の形成を阻害することにより作用するペニシリンが含まれる。ペニシリンの官能基であるβ−ラクタム部分は、細菌中のペプチドグリカン分子を連結するＤＤ−トランスペプチダーゼに結合し、これを阻害する。加水分解酵素は、細胞壁を持続的に分解し、浸透圧に起因する細胞溶解または細胞死滅を引き起こす。一般的なペニシリンには、オキサシリン、アンピシリン、およびクロキサシリン；ならびに形質膜の外側におけるペプチドグリカンの構成要素を保有する分子であるＣ５５−イソプレニルピロリン酸の脱リン酸化に干渉するポリペプチドが含まれる。細胞壁に影響を及ぼすポリペプチドは、バシトラシンである。
【０１３２】
補完的薬剤は、溶菌酵素の治療的効果を相乗作用的に増強するのに有効な量におけるエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、マクロリドファミリーの他のメンバー、ペニシリン、セファロスポリン、およびこれらの任意の組合せなどの抗生物質でありうる。他の事実上任意の抗生物質も、改変溶菌酵素および／または未改変溶菌酵素と共に用いることができる。同様に、他の溶菌酵素を、担体中に含ませて、他の細菌感染を処置することもできる。抗生物質の追加補充は、異なる疾患を処置する場合の、酵素の事実上全ての使用において用いることができる。医薬組成物はまた、少なくとも１つの溶菌タンパク質のペプチドもしくはペプチド断片、１つのホリンタンパク質、または溶菌タンパク質およびホリンタンパク質の各々が同じ細菌種もしくは異なる細菌種に由来し、補完的薬剤および適切な担体もしくは希釈剤の任意選択の添加を伴う、少なくとも１つのホリンタンパク質および１つの溶菌タンパク質も含有しうる。
【０１３３】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、有効量の溶菌ポリペプチド（複数可）、または溶菌ポリペプチド（複数可）のペプチド断片を発現させることが可能な、単独の、または他の核酸分子と組み合わせた核酸分子を含有する組成物も提供される。また、これらの核酸分子、ポリヌクレオチド、およびこれらの分子を保有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現させるベクターを含有する細胞培養物も提供される。
【０１３４】
治療用組成物または医薬組成物は、感受性のグラム陽性細菌により引き起こされる疾病を処置するための、多様な担体と組み合わされた溶菌ポリペプチド（複数可）を含みうる。担体は、等張性および化学的安定性を増強する物質など、微量の添加剤を含有することが適切である。このような物質は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸、もしくはこれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、例えば、ポリアルギニンもしくはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、もしくはアルギニンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、もしくはデキストリンを含めた他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性の界面活性剤；および／または中性の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２などを包含する。グリセリンまたはグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）は、医薬用に市販されている。グリセリンまたはグリセロールは、注射用滅菌水中で希釈することもでき、塩化ナトリウム注射液中で希釈することもでき、他の薬学的に許容される水性注射用流体中で希釈することもでき、０．１〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．０〜５０％、より好ましくは約２０％の濃度で用いることができる。ＤＭＳＯとは、局所適用される多くの薬物の透過を増強する顕著な能力を伴う非プロトン性溶媒である。ＤＭＳＯは、注射用滅菌水中で希釈することもでき、塩化ナトリウム注射液中で希釈することもでき、他の薬学的に許容される水性注射用流体中で希釈することもでき、０．１〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で用いることができる。担体ビヒクルにはまた、特に、静脈内用溶液を調製する場合には、リンゲル液、緩衝化された溶液、およびデキストロース液も含まれうる。
【０１３５】
溶菌ポリペプチド（複数可）のための担体のうちのいずれも、従来の手段で製造することができる。しかし、いずれの口内洗浄液または類似する種類の製品も、ポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）／酵素の変性を防止するため、アルコールを含有しないことが好ましい。同様に、製造工程において、溶菌ポリペプチド（複数可）を風邪用ドロップ（ｃｏｕｇｈ  ｄｒｏｐ）、ガム、キャンディー、またはロゼンジに配置する場合、このような配置は、ロゼンジまたはキャンディーが硬化する前に行うべきであるが、酵素の熱変性を回避するためには、風邪用ドロップまたはキャンディーをある程度冷却した後で行うべきである。
【０１３６】
溶菌ポリペプチド（複数可）は、液体形態または凍結乾燥状態にあるこれらの物質へと添加することができ、凍結乾燥状態の場合、溶菌ポリペプチド（複数可）は、唾液などの体液と接触するときに可溶化しうるであろう。ポリペプチド（複数可）／酵素はまた、ミセル中またはリポソーム中に入れることもできる。
【０１３７】
改変溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）または未改変溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の、感染を処置するのに有効な投与速度または投与量は、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）が治療的に用いられるのか、予防的に用いられるのか、コンパニオン動物または家畜のレシピエントの感染性細菌への曝露の持続期間、個体のサイズおよび体重などに部分的に依存するであろう。酵素／ポリペプチド（複数可）を含有する組成物を使用するための持続期間はまた、この使用が予防的目的の使用であって、短期間にわたり１時間ごと、毎日、または毎週の使用であるのかどうか、またはこの使用が治療的目的の使用であって、使用量が、数時間、数日間、数週間にわたり、かつ／もしくは毎日のベースで、または１日のうちの一定の時間間隔で持久しうるように、組成物の使用についてのより集約的なレジメンが必要とされうる使用であるのかどうかにも依存する。使用される任意の剤形は、最小限の時間の長さにわたる、最小限の単位数をもたらすものとする。酵素の有効量または有効用量をもたらすと考えられる酵素の活性単位の濃度は、鼻腔および口腔の湿潤環境内または湿った環境内の体液１ｍｌ当たり約１００単位〜約５００，０００単位の範囲であることが可能であり、おそらく、１ｍｌ当たり約１００単位〜約５０，０００単位の範囲でありうる。より具体的に述べると、活性酵素単位／ポリペプチド（複数可）単位への曝露時間は、１ｍｌ当たりの活性酵素単位の所望の濃度に影響を及ぼしうる。「長時間」放出担体または「緩徐」放出担体として分類される担体（例えば、特定の鼻腔内スプレーまたはロゼンジなど）であれば、１ｍｌ当たりで低濃度の活性（酵素）単位を、しかし、より長時間にわたり保有するかまたはもたらすことが可能であるのに対し、「短時間」放出担体または「急速」放出担体（例えば、含そう薬など）であれば、１ｍｌ当たりで高濃度の活性（酵素）単位を、しかし、より短時間にわたり保有するかまたはもたらすことが可能であろう。１ｍｌ当たりの活性単位量および曝露の持続時間は、感染の性質、処置が予防的であるのか、治療的であるのか、および他の変数に依存する。用量１ｍｌ当たりではるかに高値の単位を有することが必要でありうるか、または用量１ｍｌ当たりではるかに低値の単位を有することが必要でありうる状況が存在する。
【０１３８】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）は、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の活性を可能とするｐＨを有する環境にあるべきである。例えば、あるコンパニオン動物個体または家畜個体が、細菌性上気道障害を伴う別のコンパニオン動物または家畜へと曝露されている場合、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）が粘膜内層中に常在し、感染細菌の任意のコロニーの形成を防止するであろう。改変溶菌酵素を担体系または経口送達方式へと投入する時点より前において、またはこの時点において、酵素は、約４．０〜約９．０の間、より好ましくは約５．５〜約７．５の間のｐＨ範囲を維持するために、安定化緩衝液環境内にあることが好ましい。
【０１３９】
安定化緩衝液は、リシン酵素／ポリペプチド（複数可）の最適な活性を可能としうる。安定化緩衝液は、ジチオトレイトールなどの還元剤を含有しうる。安定化緩衝液はまた、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩など、金属キレート化剤であるかまたは金属キレート化剤を包含する場合もあり、また、リン酸緩衝液もしくはクエン酸リン酸緩衝液、または他の任意の緩衝液を含有する場合もある。これらのファージおよび他のファージのＤＮＡコード化を改変して、組換え酵素が、１つの細胞壁を、２つを超える場所で攻撃することを可能とするか、組換え酵素が複数の細菌種の細胞壁を切断することを可能とするか、組換え酵素が他の細菌を攻撃することを可能とするか、またはこれらの任意の組合せを可能とすることができる。組換えバクテリオファージにより産生される酵素に対する改変の種類および数は、無数である。
【０１４０】
低刺激性の界面活性剤を、治療用組成物または医薬組成物に、この組成物において用いられる溶菌酵素の／ポリペプチド（複数可）の治療的効果を強化するのに有効な量で含めることができる。適切な低刺激性の界面活性剤には、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタンおよび脂肪酸のエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、および生体由来の界面活性剤、例えば、脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコール酸、およびデオキシコール酸のエステルが含まれる。
【０１４１】
本発明ではまた、防腐剤も用いることができ、全組成物の重量で約０．０５％〜０．５％を構成することが好ましい。防腐剤の使用は、製品が微生物で汚染された場合、処方物により微生物の増殖を防止または減殺することを確保するであろう。本発明において有用な一部の防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭ  ヒダントイン、３−ヨード−２−プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１４２】
本発明の全ての実施形態において用いられる医薬には、抗微生物剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、局所麻酔剤、コルチコステロイド、破壊療法剤（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇｅｎｔ）、抗真菌剤、および抗アンドロゲン剤が含まれる。にきびの処置において用いられうる活性医薬には、抗微生物剤、とりわけ、ダプソン、エリスロマイシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、および他の抗微生物剤など、抗炎症特性を有する抗微生物剤が含まれる。抗微生物剤に好ましい重量百分率は、０．５％〜１０％である。
【０１４３】
局所麻酔剤には、テトラカイン、テトラカイン塩酸塩、リドカイン、リドカイン塩酸塩、ジクロニン、ジクロニン塩酸塩、ジメチソキン塩酸塩、ジブカイン、ジブカイン塩酸塩、ブタンベンピクリン酸塩、およびプラモキシン塩酸塩が含まれる。局所麻酔剤に好ましい濃度は、全組成物の重量で約０．０２５％〜５％である。また、ベンゾカインなどの麻酔剤も、重量で約２％〜２５％の好ましい濃度により用いることができる。
【０１４４】
用いられうるコルチコステロイドには、ベタメタゾンジプロピオン酸塩、フルオシノロンアクチニド、ベタメタゾン吉草酸塩、トリアムシノロンアクチニド、クロベタゾールプロピオン酸塩、デソキシメタゾン、ジフロラゾン二酢酸塩、アムシノニド、フルランドレノリド、ヒドロコルチゾン吉草酸塩、ヒドロコルチゾン酪酸塩およびデソニドが含まれ、重量で約０．０１％〜１．０％の濃度が推奨される。ヒドロコルチゾンまたはメチルプレドニゾロン酢酸塩など、コルチコステロイドに好ましい濃度は、重量で約０．２％〜約５．０％である。
【０１４５】
加えて、治療用組成物は、感受性のグラム陽性細菌と共に存在する任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌を処置するための酵素であるリソスタフィンなど、他の酵素もさらに含みうる。リソスタフィンなどの粘液溶解性ペプチドは、ヒトのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置するのに有効であることが示唆されている（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  ＆  Ｍｅｄ．、３９巻：２３０頁（１９６７年）。リソスタフィンとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓの遺伝子産物であり、細胞壁のポリグリシン架橋を酵素的に分解することによりＳ．ａｕｒｅｕｓに対して静菌効果および殺菌効果を及ぼす（Ｂｒｏｗｄｅｒら、Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．、１９巻：３９３〜４００頁（１９６５年））。米国特許第３，２７８，３７８号は、リソスタフィンを、後にＳ．  ｓｉｍｕｌａｎｓと命名し直されるＳ．  ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓの培養培地から作製するための発酵法について記載している。他のリソスタフィンを作製するための方法も、米国特許第３，３９８，０５６号および同第３，５９４，２８４号においてさらに記載されている。その後、リソスタフィンの遺伝子がクローニングおよび配列決定された（Ｒｅｃｓｅｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻：１１２７〜１１３１頁（１９８７年））。ｒ−リソスタフィンなどの組換え粘液溶解性殺菌タンパク質は、その標的化特異性、低毒性、および生物学的に活性な残留物を低減する可能性のために、現行の抗生物質療法と関連する問題を潜在的に回避しうる。さらに、リソスタフィンが、非分裂細胞に対してもまた活性であるのに対し、大半の抗生物質は、活発な分裂細胞がそれらの効果を媒介することを要求する（Ｄｉｘｏｎら、Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４１巻：６２〜６８頁（１９６８年））。改変溶菌酵素と組み合わせたリソスタフィンは、抗生物質の存在下で用いることもでき、抗生物質の非存在下で用いることもできる。リソスタフィンおよびリシン酵素の両方を同じ治療剤中で用いることには、ある程度の重要性が付加される。コンパニオン動物または家畜が細菌感染を有する場合、１つの細菌属による感染は、コンパニオン動物または家畜の身体を弱めるか、または身体の細菌叢を変えることから、他の潜在的な病原性細菌のその身体への感染を許すことが多い。場合によって、身体に共感染する細菌のうちの１つは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの多くの株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、および他のグラム陽性細菌の株が標準的な抗生物質により死滅しないように、ペニシリナーゼを産生させる。結果として、おそらく抗生物質と組み合わせたリシンおよびリソスタフィンの使用は、細菌感染の最も急速かつ有効な処置として用いられうる。治療用組成物はまた、ムタノリシンおよびリゾチームも包含しうる。
【０１４６】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物の適用手段には、直接的、間接的な担体および特殊な手段、または手段の任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の直接的な適用は、ポリペプチドを、鼻腔内領域（例えば、鼻腔内スプレー）、皮膚（ｄｅｒｍａｌまたはｓｋｉｎ）適用（例えば、局所用軟膏または局所用処方物）、坐剤、タンポン適用など、感染部位または細菌コロニー形成部位と直接的に接触させるのに適する任意の手段を介しうる。鼻腔内適用には、例えば、鼻腔内スプレー、点鼻液、鼻腔用軟膏、鼻腔内洗浄液、鼻腔内注射、鼻腔内パッキング、気管支内スプレーおよび吸入器、またはロゼンジ、もしくは口腔洗浄液の使用を介する間接的な適用、または鼻孔もしくは顔面へと適用される軟膏の使用を介する適用、あるいはこれらの適用法および類似の適用法の任意の組合せが含まれる。溶菌酵素が投与されうる形態には、ロゼンジ、トローチ、注射液、錠剤、粉末、スプレー、液体、軟膏、およびエアゾールが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４７】
天然の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）、および／または改変溶菌酵素（複数可）／改変ポリペプチド（複数可）を、スプレー、液滴、軟膏、洗浄液、注射、パッキング、および吸入器を用いて直接的に導入する場合、酵素は、担体として作用する液体と共に液体環境またはゲル環境にあることが好ましい。吸入器および気管支内スプレーにより改変酵素の乾燥させた無水形も投与しうるが、液体形態の送達が好ましい。
【０１４８】
局所感染または局所汚染を処置するための組成物は、本発明によるＰｌｙＳＳ１および／またはＰｌｙＳｓ１を含めた有効量の少なくとも１つの溶菌酵素、および少なくとも１つの溶菌酵素を、コンパニオン動物または家畜動物の、感染するかまたは汚染された皮膚、外被、または外表面へと送達するための担体を含む。溶菌酵素を適用するための方式は、多数の異なる種類の担体および担体の組合せを包含し、これらには、水性の液体、アルコールベースの液体、水溶性のゲル、ローション、軟膏、非水性の液体ベース、鉱油ベース、鉱油とペトロラタムとのブレンド、ラノリン、リポソーム、血清アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質担体、粉末化セルロース、カルメロース（ｃａｒｍｅｌ）、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。治療剤を含有する担体の送達方式には、塗抹、スプレー、長時間放出パッチ、液体吸収ワイプ（ｌｉｑｕｉｄ  ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｗｉｐｅ）、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。溶菌酵素は、包帯へと直接的に適用することもでき、他の担体のうちの１つにより適用することもできる。包帯は、湿潤させて市販することもでき、乾燥させて市販することもでき、この場合酵素は包帯上で凍結乾燥形態にある。この適用法は、感染した皮膚を処置するために極めて有効である。局所用組成物の担体は、ポリマー増粘剤、水、防腐剤、活性の界面活性剤または乳化剤、抗酸化剤、日焼け止め、および溶媒または混合溶媒系を包含する半固体のビヒクルおよびゲル様ビヒクルを含みうる。米国特許第５，８６３，５６０号（Ｏｓｂｏｒｎｅ）は、皮膚を医薬へと曝露する一助となりうる多数の異なる担体の組合せについて論じている。用いられうるポリマー増粘剤には、化粧品業界および医薬品業界でしばしば用いられる親水性ゲル化剤および含水アルコール性ゲル化剤など、当業者に公知の増粘剤が含まれる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）とは、多数の架橋アクリル酸ポリマーのうちの１つであり、カルボマーという一般名が与えられている。これらのポリマーは、水中で溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、または他のアミン塩基などの腐食物質で中和させると、透明であるかまたは若干濁ったゲルを形成する。ＫＬＵＣＥＬ（登録商標）とは、水中で分散させ、完全に水和させると、均一なゲルを形成するセルロースポリマーである。他の好ましいゲル化ポリマーには、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、ＭＶＥ／ＭＡデカジエン架橋ポリマー、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１４９】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を含む組成物は、上気道病と関連する細菌感染を防止または処置するためのロゼンジ、トローチ、錠剤、粉末、エアゾール、液体、液体スプレー、または歯磨き粉の形態で投与することができる。その中に溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を添加するロゼンジ、錠剤は、糖、コーンシロップ、多様な色素、糖以外の甘味剤、香料、任意の結合剤、またはこれらの組合せを含有しうる。同様に、任意のガムベースの製品は、アカシア、カルナウバロウ、クエン酸、トウモロコシデンプン、食品着色剤、香料、糖以外の甘味剤、ゼラチン、グルコース、グリセリン、ガムベース、セラック、ナトリウムサッカリン、糖、水、白色蝋、セルロース、他の結合剤、およびこれらの組合せを含有しうる。ロゼンジは、スクロース、トウモロコシデンプン、アカシア、トラガントガム、アネトール、アマニ、オレオレジン、鉱油、およびセルロース、他の結合剤、ならびにこれらの組合せをさらに含有しうる。また、糖置換体も、デキストロース、スクロース、または他の糖の代わりに用いることができる。
【０１５０】
溶菌酵素またはそれらのペプチド断片を含む組成物は、常在すると、コロニー形成する疾患細菌を死滅させる粘膜内層を指向しうる。本明細書で開示されて記載される粘膜内層には、例えば、上気道および下気道、眼、口腔、鼻、直腸、膣、歯周ポケット、腸および結腸が含まれる。粘膜組織の天然の消失機構または浄化機構に起因して、従来の剤形は、いかなる有意な長さの時間にわたっても適用部位に保持されることがない。
【０１５１】
粘膜組織への接着を呈示する物質であって、１または複数のファージ酵素および他の補完的薬剤と共にある期間にわたり投与される物質を有することが有利でありうる。制御放出能を有する物質が特に所望であり、持続放出型粘膜接着剤の使用が大きな関心の的となっている。Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６１５，６９７号）は、経粘膜薬物送達において用いられる多様な制御放出型ポリマー組成物についての優れた総説を提示している。この特許は、生体接着剤と有効量の処置用薬剤とを包含する制御放出型処置用組成物について記載している。生体接着剤とは、水膨潤性であるが、水に不溶性で繊維性の、架橋されたカルボキシ官能基によるポリマーであって、（ａ）そのうちの少なくとも約８０パーセントが少なくとも１つのカルボキシル官能基を含有する複数の反復単位、および（ｂ）ポリアルケニルポリエーテルを実質的に含まない約０．０５〜約１．５パーセントの架橋剤を含有するポリマーである。Ｒｏｂｉｎｓｏｎによるポリマーは、水膨潤性であるが不溶性である一方、架橋されており、熱可塑性ではなく、活性薬剤と調合し、多様な剤形へと調合することが本出願のコポリマー系ほど容易ではない。また、ミセルおよび多層状ミセルも、酵素の放出を制御するのに用いることができる。
【０１５２】
親水性物質と疎水性物質との組合せである粘膜接着剤を伴う他の手法も公知である。Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ＆  Ｃｏ製のＯｒａｈｅｓｉｖｅ（登録商標）は、口腔粘膜へと接着させるための粘着性の炭化水素ポリマー中におけるペクチン、ゼラチン、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムの組合せである接着剤である。しかし、このような親水性成分と疎水性成分との物理的な混合物は、最終的に解離する。これに対し、本出願における親水性ドメインと疎水性ドメインとは、不溶性のコポリマーを生成させる。これもまた参照により組み込まれる米国特許第４，９４８，５８０号は、生体接着性の経口薬物送達系について記載している。この組成物は、凍結乾燥させたポリマー混合物であって、ポリ（メチルビニルエーテル／無水マレイン酸）コポリマーとゼラチンとから形成され、分散ポリエチレンを含有する鉱油など、軟膏ベース中に分散させたポリマー混合物を包含する。米国特許第５，４１３，７９２号（参照により本明細書に組み込まれる）は、（Ａ）好ましくは３：６〜６：３の重量比で存在する、ポリ有機シロキサンおよび水溶性のポリマー材料を含むペースト様ベースと、（Ｂ）有効成分とを含むペースト様調製物について開示している。米国特許第５，５５４，３８０号は、少なくとも２つの相を有する油中水系を含有する、固体または半固体で生体接着性の経口摂取可能な薬物送達系を特許請求している。一方の相は、容量で約２５％〜約７５％の内部親水性相を含み、他の相は、容量で約２３％〜約７５％の外部疎水性相であって、３つの成分：（ａ）乳化剤、（ｂ）グリセリドエステル、および（ｃ）蝋材料からなる外部疎水性相を含む。参照により組み込まれる米国特許第５，９４２，２４３号は、抗菌剤を投与するために有用な一部の代表的な放出用材料について記載している。
【０１５３】
治療用組成物または医薬組成物はまた、生物学的に活性な薬剤を制御放出するための、親水性の主鎖および疎水性のグラフト鎖を含むグラフトコポリマーを含めたポリマー粘膜接着剤も含有しうる。グラフトコポリマーとは、（１）エチレン性不飽和官能基を有するポリスチレンのマクロモノマーと、（２）エチレン性不飽和官能基を有する少なくとも１つの親水性の酸性単量体との反応生成物である。グラフト鎖は、ポリスチレンと、親水性の単量体部分によるポリマー主鎖であって、その一部が酸性の官能基を有するポリマー主鎖とから本質的になる。グラフトコポリマー中のポリスチレンのマクロモノマーの重量パーセントは、約１〜約２０％の間であり、グラフトコポリマー中の全親水性単量体の重量パーセントは、８０〜９９％の間であり、ここで、前記全親水性単量体のうちの少なくとも１０％は酸性であり、前記グラフトコポリマーは、完全に水和すると、平衡における少なくとも９０％の水分含量を有する。コポリマーを含有する組成物は、適用部位において組織液を収着することにより徐々に水和して、極めて軟質のゼリー様の塊であって、粘膜表面への接着を呈示する塊をもたらす。組成物は、粘膜表面へと接着する時間において、粘膜組織により吸収される薬理学的に活性な薬剤の持続放出をもたらす。
【０１５４】
本出願の組成物は、場合によって、ポリ（アクリル酸）可塑剤、ポリ（ビニルピロリドン）可塑剤、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム可塑剤など、他のポリマー材料、ならびに他の薬学的に許容される賦形剤を、組成物の粘膜接着性に対して有害作用を引き起こさない量において含有することも可能である。
【０１５５】
本発明の組成物の剤形は、従来の方法で調製することができる。筋内注射が選択される投与方式である場合には、等張性の処方物を用いることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれうる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定化剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。処方物には血管収縮剤を添加することができる。本出願による医薬調製物は、無菌かつ発熱物質非含有で提供される。
【０１５６】
本発明の溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）はまた、非経口的に投与され得る。例えば、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を、筋内投与、髄腔内投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、または静脈内投与して、グラム陽性細菌による感染を処置することができる。非経口注射が選択された投与方式である場合には、等張性処方物を用いることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれうる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを包含する。血管収縮剤を、処方物へと添加することができる。本出願による医薬調製物は、無菌および発熱物質非含有で提供される。
【０１５７】
任意の化合物について、まず細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はイヌ、もしくはブタにおいて、治療有効用量を推定することができる。また、所望の濃度範囲および投与経路を達成するためにも、動物モデルが用いられる。次いで、このような情報を用いて、コンパニオン動物または家畜における投与に有用な投与量および経路を決定することができる。正確な投与量は、処置される患者を考慮して個別の医師により選択される。投与量および投与を調整して、十分な活性部分レベルを供給し、または所望の効果を維持する。考慮されうるさらなる因子には、患者の病状の重症度、年齢、体重、および性別；食餌、所望される処置の持続期間、投与方法、時間、および投与頻度、薬物の組合せ（複数可）、反応感受性、および治療に対する耐容性／応答が含まれる。長時間作用型の医薬組成物であれば、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日間おき、毎週、または隔週１回投与しうるであろう。
【０１５８】
非経口投与される溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の有効な投与速度または量、および処置の持続期間は、感染の重篤度、処置されるコンパニオン動物または家畜の体重、レシピエントの感染性細菌への曝露の持続期間、感染する皮膚または組織の平方センチメートル数、感染の深さ、感染の重篤度、および他の多様な多数の変数に部分的に依存するであろう。組成物は、毎日１回〜複数回のいずれかで適用することができ、短期間または長期間にわたり適用することができる。使用は、数日間または数週間にわたり続く場合もある。使用される任意の剤形は、最小限の長さの時間にわたり最小限の単位数を供給すべきである。有効量または有効投与量の酵素を供給すると考えられる酵素の活性単位の濃度を、適宜選択することができる。１ｍｌ当たりの活性単位量および曝露の持続時間は、感染の性質、および担体が、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）に有することを可能とする接触量に依存する。
【０１５９】
方法およびアッセイ
本発明のリシンポリペプチド（複数可）により呈示される殺菌能、および実際の著明に広範な殺菌により、本発明のポリペプチド（複数可）の抗菌有効性に基づくコンパニオン動物または家畜を処置するための多様な方法が提供される。したがって、本発明は、グラム陽性細菌を死滅させるための方法、グラム陽性細菌の集団を低減するための方法、細菌感染を処置または緩和するための方法、病原性細菌に曝露されたコンパニオン動物被験体または家畜被験体を処置するための方法、およびこのような曝露への危険性があるコンパニオン動物被験体または家畜被験体を処置するための方法を含めた抗菌法を想定する。本明細書では、感受性細菌に、本発明のファージ酵素（複数可）が元来それに由来する細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのほか、他の多様な連鎖球菌の菌株、ブドウ球菌の菌株、腸球菌の菌株、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株が含まれることが裏付けられる。また、連鎖球菌の感染、ブドウ球菌の感染、腸球菌の感染、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染に対する予防的処置法、連鎖球菌の感染、ブドウ球菌の感染、腸球菌の感染、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染に対する処置法、連鎖球菌の集団もしくは保菌、ブドウ球菌の集団もしくは保菌、腸球菌の集団もしくは保菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の集団もしくは保菌を低減する方法、下気道感染を処置する方法、耳感染を処置する方法、中耳炎（ｏｔｔｉｓ  ｍｅｄｉａ）を処置する方法、心内膜炎を処置する方法、および他の局所性感染もしくは局所性状態または全身性感染もしくは全身性状態を処置または防止する方法を含め、多様な状態を処置する方法も提供される。
【０１６０】
本発明はまた、特に、コンパニオン動物または家畜における敗血症を処置するのにも用いることができる。例えば、肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または細菌性髄膜炎など、敗血性感染を処置するには、静脈内において、治療剤を血流へと連続的に流入させるものとする。敗血症を処置するための酵素の濃度は、血中の細菌カウントおよび血液容量に依存する。
【０１６１】
また、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染、保菌、またはコンパニオン動物または家畜の集団を処置するための方法であって、感染を、有効量の、少なくとも１つの、本発明の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）、特に、ＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１、特に、ＰｌｙＳｓ２を含む治療剤で処置するステップを含む方法も提供される。より具体的に述べると、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株の細胞壁を溶解させることが可能な溶菌酵素／ポリペプチドを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージに由来する遺伝子物質から作製する。本発明の方法では、ＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１を含めた本発明のリシンポリペプチド（複数可）、特に、ＰｌｙＳｓ２が、グラム陽性細菌、特に、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染または細菌のコロニー形成に対して方向付けられた予防法および処置法において有用および有効である。本発明の方法における標的として感受性および関与性の菌株には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＥＳ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが含まれ、これらから選択することができる。
【０１６２】
本発明は、特に、ＭＲＳＡを含めた抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む、Ｂ群連鎖球菌および／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに関連する感染もしくは状態を処置または緩和する方法であって、細菌、あるいは特定の細菌に感染しているかもしくはこれに曝露されているか、または曝露されていることが疑われるかもしくはその危険性があるコンパニオン動物被験体または家畜被験体を、特定の細菌を死滅させるのに有効な量の、本発明の単離リシンポリペプチド（複数可）と接触させるかまたはこれを投与する方法を包含する。したがって、関与性の細菌を死滅させるか、または細菌感染を他の形で緩和もしくは処置するのに有効であるように、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、または３において提示されるこのようなポリペプチドを含め、その切断型または改変体を含めたＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１のうちの１または複数を、接触させるかまたは投与する。
【０１６３】
「薬剤」という用語は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化合物、および小型の分子を含めた任意の分子を意味する。特に、薬剤という用語は、被験化合物、添加されるさらなる化合物（複数可）、またはリシン酵素化合物など、化合物を包含する。
【０１６４】
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で、リガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを指す。
【０１６５】
「アッセイ」という用語は、化合物の特定の特性を測定するのに用いられる任意の工程を意味する。「スクリーニングアッセイ」とは、化合物のコレクションに由来する化合物を、それらの活性に基づき特徴付けるかまたは選択するのに用いられる工程を意味する。
【０１６６】
「〜を防止する」または「防止」という用語は、疾患を引き起こす薬剤に曝露されているか、または疾患に対する素因がある可能性のあるコンパニオン動物被験体または家畜被験体における、疾患または障害を獲得するかまたは発症する危険性の、疾患の発生に先立つ低減（すなわち、疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つを発症させないこと）を指す。
【０１６７】
「予防」という用語は、「防止」という用語と関連し、これに包含され、その目的が、疾患を処置するかまたは治癒させるよりもこれを防止することである手段または手順を指す。
【０１６８】
「治療有効量」とは、薬物、化合物、抗微生物剤、抗体、ポリペプチド、または薬剤の量であって、獣医師または他の臨床医により探索されているコンパニオン動物被験体または家畜被験体の生物学的応答または医学的応答を誘発する量を意味する。特に、グラム陽性細菌感染およびグラム陽性細菌の増殖に関する「有効量」という用語は、殺菌効果および／または静菌効果を有することを含め、グラム陽性細菌の量または感染の程度の生物学的に有意義な減少をもたらす、有効量の化合物または薬剤を包含することを意図する。本明細書では、「治療有効量」という語句を、感染性細菌の増殖もしくは量、または、例えば、その存在および活性に伴いうる高熱または白血球カウントなど、病態の他の特徴において臨床的に有意な変化である、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント防止し、好ましくは低減するのに十分な量を意味するのに用いる。
【０１６９】
一実施形態では、任意の疾患もしくは感染「を処置する」または任意の疾患もしくは感染の「処置」という用語が、疾患または感染を改善すること（すなわち、疾患または感染性因子もしくは細菌の増殖を停止させること、あるいはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発現、程度、または重症度を低減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処置する」または「処置」が、被験体により識別可能とならない可能性がある少なくとも１つの物理的パラメータを改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置する」または「処置」が、物理的に、（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に、（例えば、身体パラメータの安定化）、または両方に、疾患または感染を調節することを指す。さらなる実施形態では、「〜を処置する」または「処置」が、疾患の進行を緩徐化するか、または感染を低減することに関する。
【０１７０】
「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に耐容可能であり、コンパニオン動物または家畜へと投与するときに、アレルギー反応、または胃腸の不調、めまい感など、類似の有害反応をもたらさないことが典型的な分子実体および組成物を指す。
【０１７１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実行される処置法、または本出願および特許請求の範囲に従う処置法の文脈では、被験体、患者、または個体という用語が、コンパニオン動物または家畜を指すことを意図することが注意される。
【０１７２】
「被験体」または「個体」または「患者」という用語は、コンパニオン動物または家畜を指すのに互換的に用いられる。被験体、個体、または患者という用語は、とりわけ、ヒトを除外する。
【０１７３】
本明細書では、「グラム陽性細菌」、「グラム陽性細菌」、「グラム陽性」という用語、および具体的に列挙されているわけではない任意の変形を互換的に用いることができ、本出願および特許請求の範囲の全体で用いられる通り、これらの用語は、公知であり、かつ／あるいは特定の細胞壁および／もしくは細胞膜の特徴の存在により同定することもでき、かつ／またはグラム染色で染色することにより同定することもできるグラム陽性細菌を指す。グラム陽性細菌は公知であり、容易に同定することができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属から選択しうるがこれらに限定されず、これらの任意および全ての認識された種もしくは株、または認知されていない種または株が含まれる。
【０１７４】
「殺菌性の」という用語は、細菌細胞を死滅させることが可能なことを指す。
【０１７５】
「静菌性の」という用語は、増殖する細菌細胞の阻害を含め、細菌の増殖を阻害することが可能なことを指す。
【０１７６】
「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に耐容可能であり、コンパニオン動物または家畜へと投与するときに、アレルギー反応、または胃腸の不調、めまい感など、類似の有害反応をもたらさないことが典型的な分子実体および組成物を指す。
【０１７７】
本明細書では、「治療有効量」という語句を、標的細胞塊のＳ相活性を防止し、好ましくは、臨床的に有意な変化である、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント低減するか、または、例えば、その存在および活性に伴いうる高血圧、高熱、または白血球カウントの増大など、病態の他の特徴を防止し、好ましくは、これらを上記と同程度に低減するのに十分な量を意味するのに用いる。
【０１７８】
コンパニオン動物または家畜におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌により引き起こされる全身性細菌感染または組織細菌感染を処置するための一方法は、感染を、有効量の１または複数の本発明のリシンポリペプチド、特に、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、または３において提示されるこのようなポリペプチドを含め、その切断型または改変体を含めたＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１ならびに適切な担体を含む治療剤で非経口的に処置するステップを含む。他の多数の異なる方法を用いて、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を導入することができる。これらの方法は、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を静脈内、筋内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、髄腔内、および皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）を介して導入するステップを包含する。当業者（特に動物医療従事者または獣医師）は、細菌性状態の性格および程度、ならびに関与するかまたは疑われる細菌の株または種類を踏まえ、最も適切な投与方式または投与手段を評価および認識することが可能であろう。
【０１７９】
感染はまた、コンパニオン動物または家畜の患者の感染組織へと、適切な溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）およびこれらの酵素のための担体を含む治療剤を注射することによっても処置することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清、またはこれらの任意の組合せを含みうる。より具体的に述べると、注入用または注射用の溶液は、従来の様式で、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩などの防腐剤またはエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩などの安定化剤の添加により調製することができ、次いで、これを、注入容器、注射用バイアル、またはアンプルへと移すことができる。代替的に、注射用化合物は、他の成分を伴うかまたは伴わずに凍結乾燥させ、使用時において必要に応じて、緩衝液または蒸留水中に可溶化させることもできる。本明細書ではまた、固定油、リポソーム、およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルも有用である。他のファージ関連溶菌酵素も、ホリンタンパク質と共に、組成物中に含ませることができる。
【０１８０】
本明細書で例示されるＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＳＳ１など、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を、感受性細菌の保菌を消失させるかまたは低減し、感染の症状を有する他のコンパニオン動物または家畜へと曝露されたコンパニオン動物または家畜が発病することを防止するための予防的処置として、または感染に由来して既に発病しているコンパニオン動物または家畜のための治療的処置として用いる多様な処置法が提供される。同様に、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を用いて、特に、酵素の気管支内スプレーまたは静脈内投与を用いることにより、例えば、下気道病を処置することができる。ｐＨ範囲は、他の溶菌酵素の場合と同じ範囲にあるものとするが、最適なｐＨは、本明細書で裏付けられ、かつ、提示される範囲にあろう。同様にまた、他の溶菌酵素にも、上記の種類の緩衝液が用いられるものとする。点眼液において用いられるのに適する他の抗生物質も、酵素を含有する組成物へと添加することができる。また、殺菌剤および静菌化合物も添加することができる。溶液中の酵素（複数可）の濃度は、約１００単位／ｍｌ〜約５００，０００単位／ｍｌの範囲であることが可能であり、約１００〜約５，０００単位／ｍｌ、および約１００〜約５０，０００単位／ｍｌの範囲がより好ましい。濃度は、提示される範囲より高濃度の場合もあり、低濃度の場合もある。
【０１８１】
本発明のリシンポリペプチド（複数可）の認識および単離によりもたらされる診断的可能性および診断的適用、予防的可能性および予防的適用、ならびに治療的可能性および治療的適用は、本発明のポリペプチドが、感受性細菌内で直接的効果および特異的効果（例えば、死滅）を引き起こすという事実から導出される。したがって、本発明のポリペプチドを用いて、関与性の細菌および感受性細菌を消失させることもでき、特徴付けることもでき、同定することもできる。
【０１８２】
したがって、本発明の診断法は、細胞の試料または培地を、それが感受性細菌を含有するのかどうか、または試料もしくは培地中の細菌が感受性であるのかどうかを決定することを目的として、有効量の１もしくは複数のリシンポリペプチド、および試料中の１もしくは複数の細胞を特徴付けるための手段、または細胞溶解が生じたのかどうか、もしくは細胞溶解が生じつつあるのかどうかを決定するための手段を含めたアッセイにより検討するステップを含みうる。この方法から利益を得ることが可能な患者は、未決定の感染、認識された細菌感染に罹患するか、または特定の細菌に曝露されているかもしくはこれを保有することが疑われる患者を包含する。被験体または患者と接触する流体、食物、医療デバイス、組成物、または他のこのような試料を、感受性細菌について検討することもでき、これらから関与性の細菌を消失させることもできる。このような一態様では、体液、食物、医療デバイス、組成物、または他のこのような試料を、１または複数の本発明の溶菌性ポリペプチドとのインキュベーションにより、またはこれらへの曝露により、任意の潜在的な関与性の細菌を消失させるか、または除去するために、滅菌するか、または他の形で処置することができる。
【０１８３】
当業者は手順およびそれらの適用全てに精通しており、したがって、本発明の範囲内で使用することができる。一例では、本発明の溶菌性ポリペプチド（複数可）が、試料中の関与性または感受性の細菌と複合体化するか、またはこれらに他の形で結合するか、またはこれらと会合し、複合体の１つのメンバーが、検出可能な標識で標識される。複合体が形成されたという事実、および、所望の場合はその量を、標識の検出に適用可能な公知の方法により決定することができる。これらの研究のために最も一般に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外光に曝露されると蛍光発光する化学物質などである。多数の蛍光物質が公知であり、標識として使用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＭＣＡ  ｂｌｕｅ、およびＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗが含まれる。放射性標識は、現在のところ入手可能な計数手順のうちのいずれかにより検出することができる。好ましいアイソトープは、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択することができる。酵素標識も同様に有用であり、現在使用されている比色分析法、分光光度分析法、蛍光分光光度分析法、電流測定法、または気体定量法のうちのいずれかにより検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアン酸塩、グルタルアルデヒドなど、架橋分子との反応により、選択された粒子へとコンジュゲートする。これらの手順において用いられうる多くの酵素が公知であり、これらを使用することができる。好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号；同第３，８５０，７５２号；および同第４，０１６，０４３号は、それらにおける代替的な標識化材料および標識化法の開示についての例を目的として参照される。
【実施例】
【０１８４】
本発明は、本発明を例示するものとして提示される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解することができる。以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示されるものであり、本発明の広範な範囲を限定するものとしては決してみなされないものとする。
【０１８５】
（実施例１）
Ｓ．ｓｕｉｓに由来するファージリシンのクローニングおよび特徴付け
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓとは、世界中でブタに感染するグラム陽性病原体である。ブタからヒトへの人畜共通の伝染についての報告が増大している（Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎ  Ｓ．ら（２００６年）、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻（５号）：５８５〜５６７頁）。Ｓ．ｓｕｉｓは、今後数年間においてヒト集団内で恒常的な存在となる可能性がある。ヒトおよびブタは、ペニシリンまたはゲンタマイシンで処置されてきたが、これらの抗生物質に対して耐性であるＳ．ｓｕｉｓ分離株が存在する（Ｃａｎｔｉｎ，  Ｍ．ら（１９９２年）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、４巻：１７０〜１７４頁）。
【０１８６】
本発明者らは、Ｓ．ｓｕｉｓ株に由来する２つのファージリシン（ＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２）を精製および特徴付けし、それらの多様なＳ．ｓｕｉｓ株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性を確認した。加えて、Ｓ．ｓｕｉｓリシン、特に、ＰｌｙＳｓ２リシンは、Ｂ群連鎖球菌を含め、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の他の多様な株および異なる株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて死滅させることも示された。ＰｌｙＳｓ２リシンはまた、他の病原性および臨床的に有意な細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、また、ＭＲＳＡなどの抗生物質耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含めたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを含めたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属を含め、他の多数の細菌を死滅させるのにも有効である。
【０１８７】
結果
Ｓ．ｓｕｉｓプロファージゲノムＤＮＡを用いる機能的なゲノムスクリーンを介してＰｌｙＳｓ１を単離およびクローニングし、Ｓ．ｓｕｉｓプロファージゲノム配列を配列解析することにより、ＰｌｙＳｓ２を同定し、次いで、単離およびクローニングした。ＰｌｙＳｓ１リシンは、Ｓ．ｓｕｉｓの血清型７株である７７１１のゲノムの機能的ショットガンスクリーニングを介してクローニングした。マイクログラム量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、短時間にわたりＴｓｐ５０９Ｉ（ＮＥＢ）による制限消化にかけた。アガロースゲル電気泳動を介して１．５〜４ｋｂの長さの断片を単離し、ＥｃｏＲＩで直鎖化されたｐＢＡＤ２４プラスミドへとライゲーションした。このプラスミドは、アンピシリン耐性を付与し、アラビノースによる組換え挿入の誘導を可能とする。リシンをコードするクローンを同定するために、ライブラリーを、隣接してコードされるホリンタンパク質の毒性に依拠する新規のスクリーニング法（Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｊ．Ｅ．ら（２０１０年）、Ａｄｖ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７６巻（２１号）：７１８１〜７１８７頁）にかけた。略述すると、Ｅ．  ｃｏｌｉのＴＯＰ１０形質転換体を、アンピシリンおよびヒツジの血液を補充したＬＢ寒天上へと播種した。肉眼で見えるコロニーまで増殖させた後、プレートを、アラビノースのミストへと曝露して、組換え転写を誘導した。毒性クローンは、周囲の溶血帯域の発生により明らかとなった。これらのコロニーを同定し、再増殖させ、それらを熱殺菌された細菌と重ね合せる二次スクリーンにかけた（溶菌酵素の産生へと方向付けられたアッセイにかけた）。ＰｌｙＳｓ１リシンをもたらしたＳ．ｓｕｉｓ株（７７１１）については、約３，５００個のクローンを元の溶血スクリーンにかけ、これらのうちの１００個のクローンを二次スクリーンのために選択し、これらのうちの２個のクローンに溶菌酵素をコードさせた。理論的な翻訳タンパク質については、Ｐｆａｍ解析（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）により、推定酵素および推定結合ドメインの割当てを行った。この情報に基づき、Ｃ末端のグルコサミニダーゼドメインの上流に挿入される終止コドンを伴って構築される切断型（以下ではＰｌｙＳｓ１と称する）を合成するためのプライマーをデザインした。全長ＰｌｙＳｓ１リシンの核酸配列およびアミノ酸配列、ならびに切断型酵素のアミノ酸配列を、図３に提示する。
【０１８８】
ＰｌｙＳｓ２を同定およびクローニングするには、Ｓ．ｓｕｉｓの配列決定された８つの分離株のゲノムを、リシンをコードする遺伝子の、組み込まれたプロファージ内の存在について精査した。これらの株は、０５ＺＹＨ３３（ＮＣＢＩゲノムプロジェクト＃１７１５３）；９８ＨＡＨ３３（＃１７１５５）；ＢＭ４０７（＃３２２３７）；ＧＺ１（＃１８７３７）；Ｐ１／７（＃３５２）；ＳＣ８４（＃３２２３９）；０５ＨＡＳ６８  ０５ＨＡＨ３３（＃１７１５７）；および８９／１５９１（＃１２４１７）であった。各ゲノムにつき、注記のなされたＯＲＦの、位相幾何学的に配置されたリストを、潜在性プロファージ領域について、手作業で精査した。あるプロファージが疑われる場合は、その領域における各ＯＲＦを理論的翻訳にかけ、予測される酵素ドメインと結合ドメインとの組合せに基づき、推定リシン状態を割り当てた。この様式で同定されるリシン遺伝子（８９／１５９１株に由来するＰｌｙＳｓ２）だけを、ゲノムＤＮＡからＰＣＲクローニングし、これを、ｐＢａｄ２４  Ｅ．  ｃｏｌｉ発現プラスミドへとクローニングした（以下を参照されたい）。ＰｌｙＳｓ２リシンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図４に提示する。
【０１８９】
上記の通りに、２つのＳ．ｓｕｉｓリシンを、公表されているＳ．ｓｕｉｓゲノムについての機能的組換えスクリーニングとコンピュータ解析との組合せを介して同定およびクローニングした。これらのリシンをクローニングし、ＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２と命名した。他のリシンと同様に、Ｓ．ｓｕｉｓリシン、特に、ＰｌｙＳｓ２は、Ｎ末端の触媒ドメインおよびＣ末端の細胞結合ドメイン（ＰｌｙＳｓ２におけるＳＨ−３  ５型結合ドメイン）を有する（図２）。実のところ、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７７１１株からクローニングされたＰｌｙＳｓ１の天然の構造は、結合ドメインの下流においてさらなる二次触媒ドメインを含有した（非典型的なリシン配置）が、このドメインは、組換えにより消失させて（上記の通りに）、標準的な構築に適合させた。
【０１９０】
リシンをコードする遺伝子ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２  ８９／１５９１株（ＮＣＢＩゲノムプロジェクト＃１２４１７、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＺＰ＿０３６２５５２９）（Ｌｕｃａｓ，Ｓ．ら、ＵＳ  ＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、直接寄託）の配列決定されたゲノムに沿って組み込まれたプロファージゲノム内に見出された。ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓ内のプロファージゲノムから、ｐＢＡＤ２４ベクターへとクローニングし（ｐＢＡＤ２４＿ＰｌｙＳｓ２；図５）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０細胞へと形質転換した。ｐＢＡＤ２４は、β−ラクタマーゼをコードし、転写の緊密な制御を可能とし、廉価なアラビノースにより誘導される。ベクターで形質転換したＥ．  ｃｏｌｉは、軟質寒天中に懸濁させたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のペプチドグリカンハローを含有する不透明プレート上で増殖させた。透明帯が、Ｅ．  ｃｏｌｉコロニーの周囲に現れたことから、軟質寒天中のペプチドグリカンを加水分解する活性ＰｌｙＳｓ２の発現が示された。
【０１９１】
リシンタンパク質の作製
ｐＢＡＤ２４＿ＰｌｙＳｓ２プラスミドを含有するＥ．  ｃｏｌｉを、１０ＬのＬＢ  ＡＭＰ１００中、３７℃で増殖させ、約０．８のＯＤ６００で、一晩の発現にわたり０．２％アラビノースにより誘導した。培養物を、１０，７２２ｒｃｆで２０分間にわたりスピニングした。ペレットを、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．４  １００ｍＬ中に再懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠と混合した。この混合物をホモジナイズし、ホモジネートを、１，７２３ｒｃｆで２０分間にわたり遠心分離した。上清を、３０，０００ｒｐｍで１時間にわたり超遠心分離した。十分な１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０を、上清へと添加し、ｐＨを７．４とした。
【０１９２】
タンパク質に、ＰｌｙＳｓ２を結合させないアニオン性のＨｉＴｒａｐ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＤＥＡＥカラム（１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４（ＰＢ）、ｐＨ７．４）を流過（ｒｕｎ  ｏｖｅｒ）させた（図６Ａ）。硫酸アンモニウムを、４０％の濃度までフロースルーへと添加した。沈殿物を遠心分離し、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．７  ２００ｍＬ中に再懸濁させた。タンパク質を、２０μｍの管により、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．７中で一晩にわたり透析した。透析物に、カチオン性のＨｉＴｒａｐ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＣＭカラムを流過させたところ、ＰｌｙＳｓ２は、フロースルーのショルダーのほか、７０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．７で明確に溶出した（図６Ｂ）。純粋なＰｌｙＳｓ２を示す全ての画分をプールした（図６Ｃ）。ＰｌｙＳｓ２の上流には、３つの開始コドンがインフレームで存在する「ＡＴＧＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡ・・・」（「ＭＭＲＧＫＥＫＰＭＴ  ＴＶＮＥＡＬ・・・」に対応する）ことは注目に値する。純粋なタンパク質試料を、タンパク質の配列決定にかけ、開始が「ＭＴＴＶＮＥＡＬ・・・」であることを確認した。
【０１９３】
ＰｌｙＳｓ１を発現させるために、クローンを、Ｐｏｗｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋ＬＢ−Ｂｏｏｓｔｅｒ（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）中でＯＤ６００≒１．０まで増殖させ、０．２％アラビノースで誘導した。培養物を３７℃で４時間にわたり振とうした（より長い時間では封入体が形成される）。発現細胞をペレット化し、１５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．２中に再懸濁させ、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ−５ホモジナイザーを３回にわたり通過させることにより溶解させた。残留破砕物を遠心分離（１時間、３５，０００×Ｇ）により除去し、硫酸アンモニウムを２２５ｇ／Ｌ（４０％の飽和）で添加した。沈殿したタンパク質は、ペレット化し、１５ｍＭのリン酸塩ｐＨ７．４中で再可溶化させ、この緩衝液に対して一晩にわたり透析した。次に、透析物に、同じ緩衝液に対して平衡化させたＤＥＡＥアニオン交換カラムを流過させた（Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）。予測されるｐＩを７．７とすれば、ＰｌｙＳｓ１は、ｐＨ＝７．４でＤＥＡＥへと弱く結合するか、またはおそらく、ＤＥＡＥをそのままフロースルーすることが期待される。しかし、そうではなくて、一過性の相互作用であって、ＰｌｙＳｓ１が樹脂にまず結合するが、次いで、過剰な緩衝液Ａがカラムを流下するにつれてゆっくりと溶出する相互作用が認められた。この現象により、単回のクロマトグラフィーステップだけで高純度のリシン調製物がもたらされた。元のＥ．  ｃｏｌｉ培養物１リットルごとに、５０〜１００ｍｇの最終ＰｌｙＳｓ１を得ることができるであろう。
【０１９４】
ＰｌｙＳｓ２の生化学的特徴付け
最適なｐＨ、最適な塩分、温度安定性、およびＥＤＴＡの効果を決定するため、Ｓ．ｓｕｉｓリシンをさらに特徴付けし、試験にかけた。略述すると、５ｍＬのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）によるＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７の一晩にわたる培養物を、４５ｍＬのＢＨＩへと接種し、３７℃で２時間にわたり増殖させた。５０ｍＬの培養物を、１，７８９ｒｃｆで１０分間にわたりスピニングした。５０ｍＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７培養物を遠心分離した。ペレットを、ｐＨ試験のためには、５０ｍＬの２回蒸留Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）で洗浄するか、または他の試験のためには、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０  ２５ｍＬで洗浄し、再度遠心分離した。次いで、ペレットを、十分なｄｄ  Ｈ２Ｏまたは１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に再懸濁させ、各試験条件について、最終ＯＤ６００を約１．０とした。全ての対照では、ＰｌｙＳｓ２をＰＢで置きかえた。各試料の分光光度分析の読取りは、ＯＤ６００で、１時間にわたり１分間ごとに行った。最適なｐＨ、最適な塩分、温度安定性、およびＥＤＴＡの効果についての全体的な結果を図７Ａ〜７Ｄに示す。
【０１９５】
最適なｐＨを決定するため、多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液中のＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対するＰｌｙＳｓ２活性を調べた（図７Ａ）。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０において最も強力な活性を有した。同様に、今度は、高ｐＨレベルまでの評価を可能とするビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）緩衝液を用いて、Ｓ  ｓｕｉｓ  ７９９７株に最適なｐＨも決定した（図８）。ＰｌｙＳｓ２は、９．７のｐＨまで急性の活性を有することが示された。このことは、Ｓ．ｓｕｉｓ宿主動物（ブタ）の外鼻孔中の唾液のｐＨが約８．５であることから関連深く、また重要である。
【０１９６】
最適な塩濃度を決定するため、１９５μｌの細胞中で、５μｌのリシンを、５０μｌの多様なＮａＣｌ濃度へと添加した（図７Ｂ）。ＰｌｙＳｓ２は、０ｍＭのＮａＣｌ中で最大の活性を有した。細胞は、より低張性の溶液中で、溶菌に対してより感受性である。
【０１９７】
リシンの温度安定性を決定するため、リシンを、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μｌの細胞へと添加した（図７Ｃ）。
【０１９８】
リシンを、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加して、リシンが補因子を要求するかどうかを決定した。対照では、全ての試験について、ｄｄ  Ｈ２Ｏでリシン（ＰｌｙＳｓ２）を置きかえた。ＰｌｙＳｓ２活性は、極めて低濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）により減衰した（図７Ｄ）。これは、ＰｌｙＳｓ２が、補因子または他の何らかの修飾剤を要求することを意味する。リシン（ＰｌｙＳｓ２）を、極めて低濃度のＥＤＴＡと共に試験にかけて、いかなるレベルにより、ある程度の残留活性が可能となるのかを決定した。このレベル（４ｕＭ〜２００ｕＭの間のＥＤＴＡ）では、低（５〜５０ｕＭ）量の異なる二価カチオン（Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋）を添加して、補因子を決定する。
【０１９９】
図９において示される通り、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対する死滅の有効性を定期的に決定した。ＰｌｙＳｓ２リシンは、２４時間まで、＞９０％が安定的であり、４８時間後において少なくとも５０％の活性を維持する。
【０２００】
ＰｌｙＳＳ２リシンの安定性を、−８０℃の冷凍庫における保管について評価した。ＰｌｙＳｓ２リシンは、緩衝液中の保管で、−８０℃で少なくとも７カ月間までにわたり、本質的に１００％の活性を保持する（図１０）。
【０２０１】
ＰｌｙＳｓ２リシンによって触媒される結合を決定するための探索を企図した。ＰｌｙＳｓ２を、リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）および炭水化物をはく奪した精製Ｓ．ｓｕｉｓペプチドグリカンと共に、３７℃で一晩にわたりインキュベートし、生成物を質量分析にかけた。データは、切断が、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼであることを示唆する。
【０２０２】
ＰｌｙＳｓ１の生化学的特徴付け
プロファージ溶菌酵素を、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ１に由来する血清型７分離株であるＳ．ｓｕｉｓ  ７７１１株の機能的ゲノムスクリーンからクローニングした。完全なＰｌｙＳｓ１リシン遺伝子は、４５２残基のタンパク質をコードする：Ｐｆａｍ解析は、Ｎ末端における５型アラニン−アミダーゼドメイン（ＰＦ０５８３２）に続き、中央領域における二重ＣＰＬ−７細胞壁結合ドメイン（ＰＦ０８２３０）、およびＣ末端における二次グルコサミニダーゼドメイン（ＰＦ０１８３２）を予測する。構築的に述べると、クローニングされたリシンのドメイン配置は、高度に非典型的である。グラム陽性リシンは、Ｎ末端の酵素ドメインとＣ末端の結合ドメインとからなることが典型的である。場合によって、リシンは、Ｎ末端の２つの溶菌性ドメインを伴って見られるが、第２の酵素ドメインが、結合ドメインの後で機能的にコードされることは稀である。一例は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのＬａｍｂｄａＳａ２リシンである（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ＤＧら（２００７年）、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７３巻（２２号）：７１５０〜７１５４頁）。ＬａｍｂｄａＳａ２について研究する中で、ＤｏｎｏｖａｎおよびＦｏｓｔｅｒ−Ｆｒｅｙは、驚くべきことに、Ｃ末端のグルコサミニダーゼドメインを除去した後で、酵素活性が増大することを観察した（Ｄｏｎｏｖａｎ  ＤＭおよびＦｏｓｔｅｒ−Ｆｒｅｙ  Ｊ（２００８年）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、２８７巻（１号）：２２〜３３頁）。これを動機として、本発明者らは、Ｎ末端の酵素および中央の結合ドメインだけを伴う、クローニングされたリシンの切断型構築物を創出した。この切断型構築物をその後の機能的解析のために発現させ、精製した；本明細書で記載される活性および特徴付けの研究は、本明細書では切断型ＰｌｙＳｓ１またはΔＰｌｙＳｓ１と称する、切断型ＰｌｙＳＳ１に基づく。上記で言及した通り、全長ＰｌｙＳｓ１リシンおよび切断型ＰｌｙＳｓ１リシンの構造およびアミノ酸配列を、図３に示す。
【０２０３】
Ｓ．ｓｕｉｓ株（７７１１）の生細胞に対するＰｌｙＳｓ１に最適な生化学的条件を決定した。これらの実験では、リシンを添加した後における水性細菌懸濁液の濁度（ＯＤ６００）の低減の程度を介して活性を測った。まず、ｐＨ範囲が隣接する２つの緩衝液セット：クエン酸／リン酸緩衝液：４．６〜８．０；ビス−トリス−プロパン（ＢＴＰ）緩衝液：７．０〜９．７を用いて、酵素のｐＨ依存性に取り組んだ。５．４〜９．４の広域溶菌スペクトルが観察された（図１１Ａ）。ＢＴＰでは、溶菌が８．２〜９．０で最大となったが、同等のｐＨ値では、クエン酸／リン酸におけるＯＤ低下の大きさが若干顕著となった（図１１Ｂ）。
【０２０４】
塩濃度の役割も同様に考慮したが、塩濃度は、ＰｌｙＳｓ１に誘導される溶菌にそれほど大きな影響を及ぼさなかった。酵素濃度を一定としたとき、溶菌は、０〜１０００ｍＭのＮａＣｌにおいてほとんど変化せず、最も低張性の条件下におけるわずかな数値の増大だけを伴った（図１２）。ＰｌｙＳｓ１の、過剰量のＤＴＴまたはＥＤＴＡへの曝露が、活性に負の影響を及ぼさなかったことから、酵素は、分子内のジスルフィド架橋または補因子としてのキレート化可能なカチオンに依拠しないことが示される（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ＰｌｙＳｓ１の熱安定性は、酵素を、使用前に多様な高温でインキュベートすることにより検討した（ＯＤ低下実験自体は、常に３７℃で行った）。３５℃〜６０℃で３０分間にわたり保持した場合、リシン活性は、５０℃までは事実上影響を受けなかったが、５０℃で、リシン活性は完全に消失した（図１４Ａ）。６時間にわたるインキュベーションでは、４５℃で部分的な活性の減少が観察される一方、４０℃の試料は影響を受けなかった（図１４Ｂ）。後者は、典型的なブタの体温に対応する。
【０２０５】
ＰｌｙＳｓ１の酵素ドメインの結合特異性を決定するため、精製されたＳ．ｓｕｉｓ細胞壁（Ｓ７３５型株に由来する）を、ＨＥＷＬ（ムラミダーゼ）およびＰｌｙＳｓ１による二重消化にかけた。２つの主要ピークは、ｍ／ｚ＝７１８およびｍ／ｚ＝７３４であった。これは、ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−ＬＡｌａ−Ｄ−Ｇｌｎの［Ｎａ−Ｍ］＋付加物および［Ｋ−Ｍ］＋付加物の予測質量に正確に対応する。これは、ＰｌｙＳｓ１が、γ−Ｄ−グルタミニル−Ｌ−リシンエンドペプチダーゼに特徴的な、Ｄ−ＧｌｎとＬ−Ｌｙｓとの間のペプチドグリカンステムを切断するガンマ−エンドペプチダーゼ活性を保有することを示唆する。未消化の細胞壁についての質量スペクトルを採取したところ、上記の２つのピークは見られなかった。
【０２０６】
（実施例２）
リシン比活性についてのＩｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ＰｌｙＳｓ２活性
異なる細胞型に対するＰｌｙＳｓ２リシン活性を決定するため、１．６μｇ／μＬ（８μｇ）のＰｌｙＳｓ２  ５μＬを、マイクロタイターウェル内の２４５μＬの細胞（１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた）へと添加した。対照としての対応するウェルには、５μＬのｄｄ  Ｈ２Ｏを、２４５μＬの細胞へと添加した。１分間ごと１時間にわたり、分光光度計により各ウェルについて読取り（ＯＤ６００）を行った。ＯＤ密度とは、マイクロタイターウェル内の細菌細胞増殖の量を示す。
【０２０７】
この活性試験をまず、病原性Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株について、多様なＰｌｙＳｓ２濃度により決定した（図１５Ａ）。また、精製ＰｌｙＳｓ２リシンの比活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｓ．ｓｕｉｓ  Ｓ７３５株に対しても評価した（図１５Ｂ）。次いで、この試験を、３２ｕｇ／ｍＬ（溶菌アッセイに基づき、他の生物に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける死滅研究にもこれが良好な濃度であることが見出された）のＰｌｙＳｓ２を用いて実施して、他の細菌種に対するＰｌｙＳｓ２活性を決定した（図１６Ａ〜１６Ｄ）。さらなる株の死滅結果を図１７Ａおよび１７Ｂに示す。さらなる結果は、以下の表１に表にして示す。
【０２０８】
上記の結果で裏付けられ、示される通り、ＰｌｙＳｓ２リシン酵素は、Ｓ．ｓｕｉｓに対してだけでなく、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、およびＢ群連鎖球菌を含めた他の病原体に対しても広範な死滅活性を有する。示された結果は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株（ＭＲＳＡ）の増殖の低減および死滅を裏付ける。同等なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、ＰｌｙＳｓ２は、加えて、かつ、同様に、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）株に対しても有効である（図１８）。
【０２０９】
このＳ．ｓｕｉｓリシンは、病原性細菌を早急に死滅させるその能力において、既に同定されて特徴付けされたリシンと類似している。しかし、このＳ．ｓｕｉｓリシンは、主要な病原体に対するその広範な活性において稀であり、注目に値する。また、上記で示した通り、このリシンが、容易に作製し、精製することが可能であり、多様な関与性の温度、ｐＨ、および塩分において安定的であることから、魅力的な治療的酵素の候補となっていることも注目に値する。
【０２１０】
【表１】
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ＰｌｙＳｓ１の活性
切断型ＰｌｙＳｓ１（ΔＰｌｙＳｓ１）リシン活性を、異なる細胞型に対して決定した。上記の実験を踏まえ、ΔＰｌｙＳｓ１による全てのさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために、以下の最適な緩衝条件：２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．８、２ｍＭのＥＤＴＡを使用した。６．５〜１３０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のリシンを、この緩衝液中のＳ．ｓｕｉｓの生細胞へと導入した。３つの株：ＰｌｙＳｓ１をコードする血清型７株である７７１１株；基準の血清型２株であるＳ７３５株；および毒性の高い血清型９株である７９９７株を、特に、関与性であると考えた。これらの株の各々について、多様なＰｌｙＳｓ１用量における時間依存的なＯＤ６００応答を図１９に示す。細菌の生存率については、最高のＰｌｙＳｓ１濃度（１３０μｇ／ｍｌ）だけが、１時間の処理後において、７７１１、Ｓ７３５、および７９９７について、ＣＦＵの＞９０％の減少をもたらした（表２）。そのリシンはまた、培養液中の活発な分裂細胞（７７１１株）に対しても調べた（図２０）。ΔＰｌｙＳｓ１リシンは、細菌の増殖を用量依存的な様式で遅延させたが、これらの効果は一般に軽微であり、Ｓ．ｓｕｉｓの増殖を完全に阻害することはできなかった。
【０２１１】
【表２】
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１時間の処理（最適な緩衝条件）後において、２つのΔＰｌｙＳｓ１濃度（１３０および１３μｇ／ｍｌ）について、Ｓ．ｓｕｉｓのＳ７３５株、７９９７株、および７７１１株に対するＣＦＵ解析を行った。各実験では、未処理試料と対比した処理試料について、ＣＦＵの百分率による減少を決定した。各株について観察される（３回の独立した実験にわたり）値の範囲を報告する。各株の血清型をカッコ内に示す。
【０２１２】
ΔＰｌｙＳｓ１を、様々な血清型の他の１９のＳ．ｓｕｉｓ株のパネルのほか、他のグラム陽性細菌種に対してもさらに調べた。上記と同じリシン濃度を用いた。各用量について、１時間後において観察される溶菌値を、表３および表４に列挙し、情報を図２１のグラフにまとめる。
【０２１３】
【表３】
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【０２１４】
【表４】
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全てのＳ．ｓｕｉｓ株は、ある程度の感受性を裏付けた。興味深いことに、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の連鎖球菌の多く（およびなお一部の非連鎖球菌）もまた、同等の酵素濃度で溶解した。上記の結果で裏付けられ、かつ、示される通り、ＰｌｙＳｓ１リシン酵素は、Ｓ．ｓｕｉｓに対するだけでなく、Ｂ群連鎖球菌を含めた多数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属株にも対し、加えて、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属を含めた他の病原体にも対する、広範かつ同等の死滅活性を有する。古典的に、ファージリシンは、その宿主種内から宿主種外へと移行するとき、顕著な活性の減少を顕示している。しかし、この例では、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の細菌間で広範囲にわたる感受性が見られ、一部の細菌は、Ｓ．ｓｕｉｓ自体と同一の溶菌を裏付けた。
【０２１５】
（実施例３）
ＣＦＵ死滅アッセイ
１５ｍＭのＰＢ、ｐＨ８．０中３２ｕｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２へと６０分間にわたり曝露したときの、Ｓ．ｓｕｉｓのＳ７３５および７９９７の特異的死滅、ならびにこれらのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の低下を決定した（図２２）。
【０２１６】
（実施例４）
耐性の評価
感受性細菌内のＳ．ｓｕｉｓリシンに対する耐性の発生について調べるために、ブドウ球菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓのＭＷ２株および８３２５株の各々を、濃度を段階的に増大させるＰｌｙＳｓ２へと曝露した。いずれのＳ．ａｕｒｅｕｓ株も、研究期間中において耐性を発生させなかった（図２３）。ムピロシン耐性株を発生させるために確立されたプロトコール（Ｐａｓｔａｇｉａ  Ｍら（２０１１年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、５５巻（２号）：７３８〜４４頁）に従い、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭＷ２株および８３２５株を、ＰｌｙＳｓ２の存在下で増殖させた。ＰｌｙＳｓ２の濃度は、各株に対するＰｌｙＳｓ２の最低阻害濃度（ＭＩＣ）の３２分の１の濃度から、各株に対するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣの４倍の濃度まで、８日間にわたり毎日倍増させた。各株の別個の培養物を、陽性対照と同じ様式でムピロシンの存在下で増殖させた。
【０２１７】
この実験では、丸型のポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅ）製プレートウェルの底部におけるペレットの形成を検出することにより、ＭＩＣを決定した。各日、各培養物に由来する１．０μＬずつの試料を、各培養物が曝露されるＭＩＣの各薬物を含有する選択プレート上に広げた。毎日培養物１つ当たり４つずつのコロニーについて、ＰｌｙＳｓ２またはムピロシンのＭＩＣを調べて、耐性（ＭＩＣの４倍の増大として規定される）クローンが出現したかどうかを決定した。ムピロシンおよび陽性対照としての各株により手順を繰り返した。
【０２１８】
（実施例５）
ＰｌｙＳｓ１とＰｌｙＳｓ２との相乗作用
ＰｌｙＳｓ２を、ΔＰｌｙＳｓ１との相乗作用について調べたところ、ＰｌｙＳｓ２とΔＰｌｙＳｓ１とは、非競合的な相乗作用的効果を提示することが決定された。ＰｌｙＳｓ２のΔＰｌｙＳｓ１との組合せは、これらのリシンによる相加的な増殖の低減より大幅な細胞増殖の低減（光学密度（ＯＤ）により決定される）を顕示する。ΔＰｌｙＳｓ１とＰｌｙＳＳ２との相乗効果について調べるために、５０ｍＬのブドウ球菌培養物を１〜４時間にわたり増殖させた。細菌細胞ペレットを１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０で洗浄し、ＯＤ６００≒１．０まで再懸濁させた。次いで、９６ウェルプレート内で、１７０μｌの細胞を、合計８０μｌのリシン（１または複数の）または緩衝液と以下の通りに組み合わせた：
８０μＬの緩衝液（対照）
８０μＬのＰｌｙＳｓ１
８０μＬのＰｌｙＳｓ２
４０μＬのＰｌｙＳｓ１＋４０μＬのＰｌｙＳｓ２
４０μＬのＰｌｙＳｓ１＋４０μＬの緩衝液
４０μＬのＰｌｙＳｓ２＋４０μＬの緩衝液  。
【０２１９】
分光光度計の読取りをＯＤ６００において行い、細胞増殖を評価した。結果を、リシン濃度を変化させたときの相乗作用的効果が示される図２４Ａおよび２４Ｂに示す。例えば、図２４Ａは、２μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２が、細胞培養物のＯＤを、８μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ１とほぼ同程度に低減することを示す。２μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２と８μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ１との組合せは、リシンのうちの１つの量を２倍に増大させた場合より大幅にＯＤを低減する（すなわち、４μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２よりはるかに大幅なＯＤの低減）。
【０２２０】
（実施例６）
口腔内微生物叢研究
ラットでの口腔内微生物叢研究を用いて、Ｓ．ｓｕｉｓリシンの天然の微生物叢に対する効果を評価した。血液寒天プレートに、２匹のラットの口腔に由来するスワブで画線した。２サイクルの継代培養を介して培養物を各プレートから単離し、ＢＨＩブロス中で一晩にわたり増殖させた。翌日、１ｍＬの各培養物を乾燥させたＢＨＩ寒天プレートへと播種し、結果として、寒天上にこれらの培養物のローンがもたらされた。それらを乾燥させた後で、１０μＬのＰｌｙＳｓ２を、対照としての中央の１０μＬのｄｄ  Ｈ２Ｏ液滴の両側に堆積させた。６つの培養物のうち、ＰｌｙＳｓ２の液滴周囲に透明帯が現れたのは、１つの培養物だけであった（データは示さない）。この培養物を送付し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓと確認した。Ｈａｒｌａｎ製のラット３匹、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ製の４匹、およびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ製の別個のラット２匹の各々の口腔をスワブで擦過した。各ラットに由来するスワブで画線した各マンニトール塩プレート上では、黄色のコロニーが増殖したことから、それら全てが口腔内においてＳ．ａｕｒｅｕｓを含有したことが示される（データは示さない）。
【０２２１】
（実施例７）
ブタにおけるＳ．  ｓｕｉｓ血清型９に対するＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２についてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２を、天然のＳ．  ｓｕｉｓ宿主であるブタにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで調べた。Ｓ．  ｓｕｉｓを含まないブタを得るために、ＣＤＣＤ仔ブタ（帝王切開由来、初乳無摂取）を捕獲し、衛生的な条件下で飼育した。バクテリオファージリシンであるＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２を、Ｓ．  ｓｕｉｓ血清型９  ７９９７株をチャレンジ株として実行される２つの動物実験（実験Ｉおよび実験ＩＩ）で評価した。両方の実験の一般的な設定は同一であった。
【０２２２】
材料および方法
動物および収容
仔ブタは、帝王切開により得た。仔ブタを無菌条件下で捕獲し、アイソレーターへと速やかに移した。動物は、初乳無摂取とし、人工乳ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ属およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ属を添加したスラリーを摂取させて、（限定的）消化管菌叢を確立した。全ての仔ブタを、生後最初の３週間にわたり（０〜２１日齢）アイソレーター内に収容した（アイソレーター１つ当たり、仔ブタ４〜５匹）。次いで、仔ブタを大型ユニットへと移動させ、２６日齢まで、地上の囲い内の１つの群に収容した。
【０２２３】
実験デザイン
リシンによる処置を評価するために、伝染実験を実施した。各群の動物のうちの半数に接種し、他の半数は、接種動物へと接触曝露した。伝染実験の各々は、２つの群からなった。一方の群は、非処置対照群（プラセボ）であり、他方の群は、処置群（リシンであるＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２）であった。各群は、１１匹の仔ブタからなった。Ｄｅ  ＪｏｎｇおよびＫｉｍｍａｎ（１９９４年）ならびにＶｅｌｔｈｕｉｓら（２００７年）は、この設定を、用いられる動物の数を低減するために、小規模の実験において伝染率（Ｒまたはベータ）に対する介入の効果を調べるのに適するものとして記載した。
【０２２４】
さらに、この設定では、リシン処置などの介入法の、臨床徴候に対する防御への有効性も評価することができる。このようにして、直接的、人工的に接種したブタだけでなく、より重要なことであるが、また、感染動物へと接触曝露することにより、より自然な様式で感染させたブタにおいても臨床防御の有効性を評価することができる。
【０２２５】
接種されるブタの群を、接触感染動物としての役割を果たす群から隔離して収容した。接種は、２６日目に、５ｍｌのＳ．  ｓｕｉｓ血清型９  ７９９７株懸濁液を、鎮静下で鼻腔内接種することにより実施した（３０分間）。接種されたｃｆｕの合計は、１０９であった。接種ブタは、感染させる仔ブタからさらに４８時間にわたり隔離して飼った。接種動物の群を、２つの群に無作為に分け、これらの動物を接触動物と再統合させた。
【０２２６】
処置
対照群
対照群には、接触曝露仔ブタでは、再統合の２日間前に始め、接種動物では、再統合日に始めて、リン酸緩衝液だけを施した（プラセボ群）。緩衝液は、図２５に示されるスキームに従い毎日２回（早朝、夕方）、鼻腔内（３ｍＬ）および口腔内（３ｍＬ）に適用した。
【０２２７】
処置群
リシン（リン酸緩衝液中のＰｌｙＳｓ１とＰｌｙＳｓ２との混合物）を、鼻腔内（３ｍＬ）および口腔内（３ｍＬ）の両方に適用した。接触曝露ブタの処置を再統合の２日間前に始める一方で、接種動物は再統合日に処置を始めた（接種の２日後に、コロニー形成の成功を確認した）。さらに３日間にわたり処置を継続し、そこで２つの群を併せて収容した。実験の最後の週に、コロニー形成の低減を主に評価するために、接触仔ブタを含めた全ての仔ブタをさらに２日間にわたり処置した。第２の実験では、用量を大幅に  増大させた。投与レジメンを、以下の表４に示す。
【０２２８】
【表５】
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サンプリングおよび臨床的モニタリング
唾液試料は、接種の前日に始めて、接種の２週間後まで毎日採取した（図２５）。全てのブタからサンプリングした。これらの試料において、細菌の培養を実施した。感染した接触ブタの数およびこれらの接触ブタに感染する速度から、伝染パラメータを計算し、リシン処置群およびプラセボ群の両方について比較できるであろう。接種の７日間前において、扁桃腺払拭試料を全てのブタから採取してＳ．  ｓｕｉｓの非存在を確認した。サンプリングと処置とを同日に実施する場合は、サンプリングを、処置の３〜４時間後に行った。
【０２２９】
臨床観察および直腸内温度を、処置およびサンプリングの前に毎日記録した。
【０２３０】
結果
伝染
接触曝露ブタがＳ．ｓｕｉｓ陽性であると見出される場合の接種後の時間（日単位）で表現される、両方の処置群におけるＳ．ｓｕｉｓの伝染速度を、図２６（実験Ｉ）および図２７（実験ＩＩ）に表す。
【０２３１】
臨床徴候および死亡
Ｓ．ｓｕｉｓ感染に帰せられうる臨床徴候を、両方の実験について、それぞれ、表６および７に示す。死亡に関するデータは、表８および９に示す。
【０２３２】
【表６】
2014519485.tif 000009
【０２３３】
【表７】
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【０２３４】
【表８】
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【０２３５】
【表９】
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結論
実験Ｉから、リシン処置群では、接種ブタから接触曝露ブタへの伝染が若干低減すると結論することができる。加えて、リシン処置群では、死亡の低減も明確に認められる。発熱および跛行などの（軽度の）臨床徴候の頻度は、死亡に起因する観察日数の不足について補正した場合でも、プラセボ群においてよりしばしば観察される。接触感染させてリシンで処置したブタの唾液試料中の細菌カウントは、サンプリング日数の大半において、プラセボで処置したブタと比較して若干減少する（本明細書ではデータを示さない）。
【０２３６】
実験ＩＩから、リシン処置群では、接種ブタから接触曝露ブタへの伝染が低減されないと結論することができる。両方の処置群間において、死亡の明確な差違は観察されなかった。リシン処置群における接触ブタは、プラセボ群と比較して跛行の影響を受ける程度が低かった（Ｓ．ｓｕｉｓに帰せられうる徴候）。接種ブタのサブグループのリシン処置群で観察される跛行および発熱（Ｓ．  ｓｕｉｓに帰せられうる臨床徴候）は、プラセボ処置群の場合より低頻度であった。唾液中の平均細菌カウントからは、プラセボ群とリシン群とを比較しても差違が観察されなかった。非常に高い投与量のリシン処置が、感染をより良好にコントロールするとは考えられない。
【０２３７】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける鼻腔内ＭＲＳＡコロニーの除去
Ｓ．ｓｕｉｓリシンが、ブタ鼻腔内粘膜のＭＲＳＡコロニー形成を低減する能力を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、約２×１０７個のＭＲＳＡの自発性ストレプトマイシン耐性株（１９１−ＳＭＲ）を鼻腔内接種する。感染の２４時間後、マウスに１時間ごと３回にわたり、リン酸緩衝生理食塩水（対照）またはＰｌｙＳｓリシン（１ｍｇずつ）を鼻道へと投与する。最終回の処置の１時間後に、マウスを屠殺し、細菌コロニーを、Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＲＳＡ寒天（ＭＲＳＡの鼻腔内コロニー形成を診断的に検出するために開発された選択性の発色性培地）およびＣｏｌｕｍｂｉａ血液寒天上で数え上げる。３回の独立した実験を実施して、各処置群につき、少なくとも１０匹ずつのマウスを評価する。Ｓ．ｓｕｉｓリシンにより処置したときの鼻腔内粘膜における平均ＣＦＵの著明な低減を決定する。
【０２３８】
参考文献
【０２３９】
【化３】
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本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱しない限りにおいて、他の形態で実施することもでき、他の方式で実行することもできる。したがって、本開示は、全ての態様において、例示的なものであり、制限的なものではなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲により示されると考えられたい。同等性の意味および範囲内に収まる全ての変化をその中に包含することを意図する。
【０２４０】
本明細書の全体では、多様な参考文献が引用され、それらの各々は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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