(57)【要約】   本発明は、発酵により、主要な炭素源としてのグルコースからメチオニンを生産するための修飾およびグルコース取り込みを向上させるための修飾、ここで、該 グルコース取り込みはｐｔｓＧ 、ｓｇｒＴ 、ｓｇｒＳ およびｄｇｓＡ から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される）を含んでなる、メチオニン生産の向上のための組換え微生物に関する。本発明はまた、上記の組換え微生物を、グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養する工程、およびその培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程を含む、メチオニンまたはメチオニン誘導体の発酵生産のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニン生産の向上のための組換え微生物であって、
ａ）発酵により、主要な炭素源としてのグルコースからメチオニンを生産するための修飾、および
ｂ）グルコース取り込みを向上させるための修飾、ここで、該グルコース取り込みはｐｔｓＧ、ｓｇｒＴ、ｓｇｒＳ、またはｄｇｓＡから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される、
を含んでなる、組換え微生物。
【請求項２】
遺伝子ｐｔｓＧの発現が増大された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
遺伝子ｐｔｓＧが、誘導プロモーターまたは構成プロモーターの制御下で過剰発現される、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
遺伝子ｐｔｓＧが低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位の配列を含まない、請求項２または３に記載の微生物。
【請求項５】
遺伝子ｓｇｒＳおよび／またはｓｇｒＴおよび／またはｄｇｓＡの発現が減弱された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
遺伝子ｓｇｒＳおよび／またはｓｇｒＴおよび／またはｄｇｓＡが欠失された、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
以下の遺伝子：ｐｙｃ、ｐｎｔＡＢ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｔｈｒＡ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／もしくはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）、またはトレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の少なくとも一つの発現が増大された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
少なくとも一つの遺伝子が誘導プロモーターの制御下にある、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
以下の遺伝子：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、ｙｎｃＡ、またはｕｄｈＡの少なくとも一つの発現が減弱された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
ｄ）遺伝子ｐｓｔＧが過剰発現され、および／またはｓＲＮＡ  ｓｇｒＳ結合部位を含まず、および／または遺伝子ｓｇｒＳが欠失され、および／または遺伝子ｓｇｒＴが欠失され、および／または遺伝子ｄｇｓＡが欠失され、
ｅ）遺伝子ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｔｈｒＡ＊、およびｐｙｃの発現が増大され、かつ
ｆ）遺伝子ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、およびｙｎｃＡの発現が減弱された、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
前記微生物が腸内細菌科またはコリネバクテリウム科細菌由来のものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
前記微生物が大腸菌である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
メチオニンまたはメチオニン誘導体の発酵生産のための方法であって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物を、グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養する工程、および
ｂ）前記培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
メチオニンまたはメチオニン誘導体の発酵生産のための方法であって、
ａ）グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で、
ｉ．発酵により、主要な炭素源としてのグルコースからメチオニンを生産するための修飾、および
ｉｉ．グルコース取り込みを向上させるための修飾、ここで、該グルコース取り込みはｐｔｓＧ、ｓｇｒＴ、ｓｇｒＳ、またはｄｇｓＡから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される、
を含んでなる組換え微生物を培養する工程、および
ｂ）該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、メチオニンの生産のために改良された微生物およびメチオニンの調製のための方法に関する。特に、本発明は、ｐｔｓＧ、ｓｇｒＳ、ｓｇｒＴ、またはｄｇｓＡから選択される少なくとも一つの遺伝子の修飾された発現を含んでなる、グルコース取り込みが向上されたメチオニン生産用微生物に関する。
【０００２】
背景技術
システイン、ホモシステイン、メチオニン、またはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような障害の治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
【０００３】
ＢＳＥおよび鳥インフルエンザの結果として動物由来タンパク質の使用が減少するに伴い、純粋なメチオニンに対する需要が高まっている。通常、Ｄ，Ｌ−メチオニンは、アクロレイン、メチルメルカプタン、およびシアン化水素から化学的に生産される。しかしながら、ラセミ混合物は、純粋なＬ−メチオニンほど良好には機能しない（Saunderson, C.L., 1985）。また、純粋なＬ−メチオニンは、ラセミ体メチオニンから、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって生産することができるが、これにより生産コストは劇的に増加する。従って、環境問題に関連して純粋なＬ−メチオニンに対する需要が高まりつつあることから、微生物によるメチオニンの生産は魅力的な展望を持つ。
【０００４】
微生物からの化学製品の生産の最適化には、一般に、生合成経路に関与するタンパク質の過剰発現、生合成経路の抑制に関与するタンパク質の減弱、または望ましくない副産物の産生に関与するタンパク質の減弱が必要である。微生物におけるＬ−メチオニン生産の最適化に向けたこれら総てのアプローチはこれまでに記載されている（例えば、米国特許第７，７９０，４２４号、米国特許第７，６１１，８７３号、特許出願ＷＯ２００２／１０２０９号、ＷＯ２００６／００８０９７号、およびＷＯ２００５／０５９０９３号を参照）、しかしながら、微生物からのＬ−メチオニンの工業生産にはさらなる改善が必要である。
【０００５】
一般に、Ｌ−メチオニンは、発酵プロセスにより主要な炭素源としてのグルコースで増殖された微生物により生産されている。細菌では、外部のグルコースが細胞内に輸送され、ホスホエノールピルビン酸によりリン酸化される：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）（Meadow et al. 1990; Rohwer et al. 1996; Tchieu et al. 2001）。ＰＴＳは二つの共通細胞質タンパク質である酵素ＩおよびＨＰｒ、ならびに一連の糖特異的酵素ＩＩ複合体（ＥＩＩ）からなる。大腸菌(E.coli)においてｐｔｓＧによりコードされるＰＴＳ酵素ＩＩＣＢＧｌｃは、グルコースを輸送すると同時にリン酸化してグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）とする。Ｇ６Ｐはグルコース代謝において不可欠な中間体であるが、その細胞内蓄積により、「リン糖ストレス(phosphosugar stress)」とも呼ばれる糖−リン酸毒性(sugar-phosphate toxicity)という現象が起こる。実際に、グルコースの蓄積は細菌に対して高い毒性を示し、糖化、ＤＮＡ突然変異誘発および増殖阻害をもたらすことが報告されている（Lee and Cerami, 1987; Kadner et al. 1992）。
【０００６】
最近の研究により、大腸菌ではＩＩＣＢＧｌｃをコードするｐｔｓＧ遺伝子は、生理学的状態に応じて、転写レベルおよび転写後レベルの両方で、極めて興味深い方法で高度に調節されることが示された（Plumbridge, 1998; Kimata et al. 1998; Plumbridge et al. 2002； Morita and Aiba, 2007; Gorke and Vogel, 2008）。具体的には、いくつかのレベルでの調節が確認されている：
・多くの異なるレギュレーター（ＡｒｃＡ、Ｆｉｓ、Ｃｒｐ）によるｐｔｓＧ遺伝子の発現の調節、特に、最初にＭｌｃ(Making larger colonies)と呼ばれた転写レギュレーターであるＤｇｓＡによる抑制、
・アンチセンス機構での低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳ(Sugar transport-related sRNA)によるｐｔｓＧ  ｍＲＮＡの不安定化、
・未知の機構での低分子ポリペプチドＳｇｒＴによるＰｔｓＧ活性の制御、および
・転写レギュレーターＳｇｒＲによるｓｇｒＳ／ｓｇｒＴの発現の調節。
【０００７】
微生物におけるグルコース輸送系の操作は、Ｇ６Ｐの毒性およびその系の高度に調節される複雑な性質から非常に難しい。今日まで、ｐｔｓＧまたはｄｇｓＡ遺伝子を操作することによりグルコース取り込みを増加させることで、アミノ酸生産、特に、トレオニン生産を向上させるいくつかの試みが行われてきた（DegussaのＷＯ０３００４６７５号およびＷＯ０３００４６７０号、AjinomotoのＵＳ２００４２２９３２０ならびにDegussaのＷＯ０２８１７２１号）。それにもかかわらず、細菌のグルコース取り込みを増加させることによりメチオニンの生産を向上させた例はない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の発明者らは、上述の問題を克服し、グルコース取り込みの増加を通じて微生物によるＬ−メチオニン生産を向上させた。従って、第１の側面では、本発明は、メチオニン生産の向上のための組換え微生物を提供し、その組換え微生物は、ａ）発酵により、主要な炭素源としてのグルコースからメチオニンを生産するための修飾（modification）、およびｂ）グルコース取り込みを向上させるための修飾、ここで、該グルコース取り込みはｐｔｓＧ、ｓｇｒＴ、ｓｇｒＳ、またはｄｇｓＡ（ｍｌｃ）から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される、を含んでなる。
【０００９】
本発明者らは、グルコースの取り込みに関与する遺伝子の発現を修飾することにより、微生物へのグルコース取り込みが向上し、その微生物によるメチオニンの生産が増加することを示す。さらに、本発明者らは、グルコースの取り込みに関与する遺伝子の発現を修飾することで、副産物であるケトメチルバレラート（ＫＭＶ）およびホモランチオニン（ＨＬＡ）の産生が減少し、その結果、産物であるメチオニンの純度が向上することも見出した。一実施形態では、ＩＩＣＢＧｌｃをコードする遺伝子ｐｔｓＧの発現が増大される。ｐｔｓＧの発現は当技術分野で公知の任意の手段によって増大され得るが、一実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧは誘導プロモーターまたは構成プロモーター（inducible or constitutive promoter）の制御下で過剰発現される。別の実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧは低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位の配列を含まない。
【００１０】
他の実施形態では、遺伝子ｓｇｒＳ、ｓｇｒＴ、またはｄｇｓＡの発現が減弱される。遺伝子発現を減弱させる方法は当業者によく知られている。一実施形態では、遺伝子ｓｇｒＳが欠失される。別の実施形態では、遺伝子ｓｇｒＴが欠失される。本発明のさらなる実施形態では、遺伝子ｄｇｓＡが欠失される。
【００１１】
さらに、グルコース取り込みは、上述の修飾の組合せによっても向上され得る。一実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧの発現が増大され、かつ、遺伝子ｓｇｒＳの発現が減弱される。別の実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧの発現が増大され、かつ、遺伝子ｓｇｒＴの発現が減弱される。さらなる実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧの発現が増大され、かつ、遺伝子ｓｇｒＳおよびｓｇｒＴの発現が減弱される。また別の実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧの発現が増大され、かつ、遺伝子ｄｇｓＡの発現が減弱される。
【００１２】
本発明の微生物は、メチオニンを生産するように修飾される。本発明の微生物は、微生物におけるメチオニン生産を促進するための、当技術分野で公知の任意の修飾を含んでもよいと理解されるが、一実施形態では、以下の遺伝子の少なくとも一つの発現が増大される：ｐｙｃ、ｐｎｔＡＢ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｔｈｒＡ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）、またはトレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）。一実施形態では、少なくとも一つの遺伝子が誘導プロモーターの制御下にある。別の実施形態では、以下の遺伝子の少なくとも一つの発現が減弱される：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、ｙｎｃＡ、またはｕｄｈＡ。
【００１３】
特に好ましい実施形態では、遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱される。別の実施形態では、遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、かつ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大される。さらなる実施形態では、遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、かつ、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大される。さらに別の実施形態では、遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大され、かつ、遺伝子ｃｙｓＥの発現が増大される。さらなる実施形態では、遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大され、遺伝子ｃｙｓＥの発現が増大され、かつ、遺伝子ｍｅｔＦおよび／またはｍｅｔＨの発現が増大される。特定の実施形態では、本発明は微生物を含んでなり、その微生物では、ａ）遺伝子ｐｓｔＧが過剰発現され、および／またはｓＲＮＡ  ｓｇｒＳ結合部位を含まず、および／または遺伝子ｓｇｒＳが欠失され、および／または遺伝子ｓｇｒＴが欠失され、および／または遺伝子ｄｇｓＡが欠失され、ｂ）遺伝子ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｔｈｒＡ＊、およびｐｙｃの発現が増大され、かつｃ）遺伝子ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、およびｙｎｃＡの発現が減弱される。
【００１４】
本発明の微生物は、ケトメチルバレラート（ＫＭＶ）およびホモランチオニン（ＨＬＡ）の産生が少なく、従って、純度の向上したメチオニンを生産する。一実施形態では、生産されたメチオニンは高い純度を有する。一実施形態では、高い純度のメチオニンの発酵生産のための方法が提供され、その方法は、ａ）上記の組換え微生物を、グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養する工程、およびｂ）該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程を含んでなる。
【００１５】
第２の側面では、本発明は、高い純度のメチオニンの発酵生産のための方法を提供し、その方法は、ａ）グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で、ｉ）発酵により、主要な炭素源としてのグルコースからメチオニンを生産するための修飾、およびｉｉ）グルコース取り込みを向上させるための修飾、ここで、該グルコース取り込みはｐｔｓＧ、ｓｇｒＴ、ｓｇｒＳまたはｄｇｓＡから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される、を含んでなる組換え微生物を培養する工程、およびｂ）該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程を含んでなる。
【００１６】
本発明はまた、メチオニンまたはメチオニン誘導体を生産する方法に関すると認識される。一実施形態では、メチオニンまたはメチオニン誘導体の発酵生産のための方法が提供され、その方法は、ａ）上記の組換え微生物を、グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養する工程、およびｂ）該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程を含んでなる。
【００１７】
第３の側面では、本発明は、メチオニンまたはメチオニン誘導体の発酵生産のための方法を提供し、その方法は、ａ）グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で、ｉ）発酵により、主要な炭素源としてのグルコースからメチオニンを生産するための修飾、およびｉｉ）グルコース取り込みを向上させるための修飾、ここで、該グルコース取り込みはｐｔｓＧ、ｓｇｒＴ、ｓｇｒＳまたはｄｇｓＡから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される）を含んでなる組換え微生物を培養する工程、およびｂ）該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収する工程を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】株１および株２の培養中の残留グルコース濃度（ｇ／Ｌ）。（◆）：参照株と呼ばれる株１、（▲）：２０／２０のＩＰＴＧ濃度条件での株２および（●）：２０／８０のＩＰＴＧ濃度条件での株２。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特に例示した方法に限定されず、当然のことながら、変更し得るものと理解されるべきである。また、本明細書において用いられる用語は単に本発明の特定の実施形態を記載することを目的とするにすぎず、限定されるものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものと理解されるべきである。
【００２０】
本明細書において引用される総ての刊行物、特許および特許出願は、前掲または後掲を問わず、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。しかしながら、本明細書において記述される刊行物は、それらの刊行物の中で報告されておりかつ本発明に関連して使用される可能性があるプロトコール、試薬およびベクターの記載および開示を目的として引用される。本明細書中のいかなる記載も、本発明が先行発明に基づいてかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきでない。
【００２１】
さらに、本発明の実施には、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内である通常の微生物学的技術および分子生物学的技術を用いる。そのような技術は当業者によく知られており、文献において十分に説明されている。例えば、Prescott et al. (1999); およびSambrook et al., (1989) (2001)参照。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」という単数形は、特に明示されていない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「一微生物」という場合には、そのような微生物の複数が包含され、「一酵素」という場合には、１以上の酵素を表すなどである。特に定義されない限り、本明細書において用いられる総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用して、本発明の実施または試験を行うことができるが、好ましい材料および方法を次に記載する。
【００２３】
本明細書においては、以下の用語が特許請求の範囲および明細書の解釈のために用いられ得る。
【００２４】
以下の特許請求の範囲および本発明の前述の記載では、明示された言語または必然的な関連性から文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含んでなる」という用語または変化形（comprisesもしくはcomprising)は、包含の意味で、すなわち、述べられた特徴の存在を具体的に示すだけでなく、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除しないように用いられる。
【００２５】
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
【００２６】
ＰＦＡＭ(アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models)、 http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を表示することができる。
【００２７】
ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、３８の主要な系統発生系を示す６６の完全配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義され、先に保存されているドメインを同定することができる。
【００２８】
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次に、得られた配列を、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://multalin.toulouse.intra.fr/multalin/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。
【００２９】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、コンセンサス配列を使用して行われ、このコンセンサス配列は、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989)に記載されている。
【００３０】
本発明は、メチオニン生産のための組換え微生物に関する。具体的には、本発明は、グルコース取り込みを増加させることによる微生物におけるメチオニン生産の向上に関する。
【００３１】
「メチオニン生産の向上」という用語は、メチオニン生産性の増大および／またはメチオニン力価の増大および／またはメチオニン／炭素源収率の増大および／またはメチオニン純度の上昇を意味する。「メチオニン／炭素源収率の増加」という用語は、発酵中に得られたメチオニンの量を消費されたグルコースの量で割ったものを定義する。それはメチオニンｇ数／グルコースｇ数またはメチオニンｍｏｌ数／グルコースｍｏｌ数のパーセントで表すことができる。これに関して「増加」という用語は、明記された修飾を受けていない微生物と比べての測定可能な増加を表す。好ましい実施形態では、その増加は少なくとも約７％、好適には、少なくとも約１５％、好適には、少なくとも約２５％、最も好適には、少なくとも約３０％の増加である。全メチオニン／グルコース収率は、好適には、少なくとも約７％ｇ／ｇ、好適には、少なくとも約１５％ｇ／ｇ、好適には、少なくとも約２０％ｇ／ｇ、最も好適には、少なくとも約２４％ｇ／ｇである。
【００３２】
グルコースの消費量およびメチオニン生産量を決定するための方法は当業者によく知られており、本明細書の他所で論じている。
【００３３】
「メチオニン純度の上昇」または「上昇した純度のメチオニン」という用語は、メチオニン生産量に対する、発酵中に得られたケトメチルバレラート（ＫＭＶ）および／またはホモランチオニン（ＨＬＡ）の量に関する用語である。これに関して、メチオニンの量に対するＫＭＶおよびＨＬＡの量の割合が、本発明の微生物において改善される。この割合は、ＫＬＶおよびＨＬＡの生産量を減少させることによるか、またはＫＭＶおよびＨＬＡの濃度は一定のままメチオニンの生産量を向上させることによるか、あるいはその両方によって改善され得る。また、有利には、それは、メチオニン生産量に対する、培養終了時に発酵培養液中に残留するグルコースの量を意味する。本発明においては、生産されたメチオニンの量に対する、発酵培養液中に残留するグルコースの割合が、本発明の微生物において減少される。この割合は、発酵培養液中に残留するグルコースの量を減少させることによるか、または発酵槽に注入されるグルコースの総量は一定のままメチオニンの生産量を向上させることによるか、あるいはその両方によって改善され得る。
【００３４】
培地中に含まれるメチオニン、ＮＡＭ、ＫＭＶ、ＨＬＡおよびグルコースの量を決定するための方法は当業者によく知られている。例えば、Ｌ＿メチオニン(L_methionine)の量は、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより、標準としてＬ−メチオニン（Fluka、参照番号６４３１９）を用いて測定し得る。
【００３５】
上述のように、外部のグルコースが細菌細胞内に輸送され、ホスホエノールピルビン酸によりリン酸化される：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）（Meadow et al. 1990、 Rohwer et al. 1996、 Tchieu et al. 2001）。リン酸化グルコースは高濃度では細胞に対して毒性があり、従って、ＰＴＳ系は高度に調節される。このことが、その系が複雑であるという事実と関連して、その系の操作を非常に困難なものにしている。しかしながら、下記のように、本発明者らはグルコース取り込みが向上された組換え微生物を作出した。
【００３６】
本明細書において「組換え微生物」という用語は、自然界には見られない、自然界に見られる同等の微生物と遺伝的に異なる細菌、酵母または真菌を意味する。本発明によれば、「修飾」という用語は、微生物において導入または誘導された任意の遺伝子変化を表す。微生物は、新たな遺伝エレメントの導入または欠失のいずれかにより修飾され得る。さらに、微生物は、指定突然変異誘発と特定の選択圧下での進化の組合せによって新規代謝経路の発生および進化を促すことにより修飾され得る（例えば、ＷＯ２００４／０７６６５９号参照）。好適には、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトマイセス科(Streptomycetaceae)、コリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)およびサッカロミセス科(Saccharomyceteceae)を含んでなる群から選択される。より好適には、微生物は腸内細菌科またはコリネバクテリウム科またはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)種である。一実施形態では、微生物は大腸菌（Escherichia coli）である。
【００３７】
特に、例では修飾大腸菌株を示しているが、これらの修飾は同じ科の他の微生物でも容易に行うことができる。
【００３８】
大腸菌は、腸内細菌科に属し、この科には、芽胞形成しない、典型的には長さ１〜５μｍのグラム陰性桿菌のメンバーが含まれる。ほとんどのメンバーは鞭毛を有し、鞭毛を用いて動き回るが、いくつかの属は非運動性である。この科の多くのメンバーが、ヒトおよび他の動物の腸内で見られる腸管菌叢の正常な部分であるが、水または土壌中で見られるものや、様々な異なる動植物に寄生するものもある。大腸菌は最も重要なモデル生物の一つであるが、腸内細菌科の他の重要なメンバーとして、クレブシェラ属(Klebsiella)、特に、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、およびサルモネラ菌属(Salmonella)も挙げられる。
【００３９】
本明細書において「グルコース取り込みを向上させる」、「グルコース取り込みが向上された」という用語、およびその文法的同義語は、グルコース摂取率の増加を意味する。「グルコース摂取率の増加」という用語は、発酵中に消費されたグルコースの量をバイオマス濃度で割ったものを指す。具体的には、グルコース摂取率は下記載のように定義することができる：
【数１】
2014522642.tif 000002
（式中、ｒｓはグルコース摂取率であり、Ｘはバイオマス濃度である）。
【００４０】
グルコース摂取率は以下のように記載することができる：
【数２】
2014522642.tif 000003
（式中、Ｓはｔ時点におけるグルコース消費量である）。流加発酵の場合、培養中に消費されたグルコースの量は、バッチ培養物中に存在するグルコースと、接種材料に加えられたグルコースと、流加段階中に注入されたグルコースとの合計から、実験終了時の残留グルコースを引いた値に相当する。他の技術を使用することもでき、それらは文献に記載されている：
・グルコース摂取率を測定するための蛍光グルコース類似体（２−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコースまたは２−ＮＢＤＧ）の使用（Natarajan A. and Srienc F. (1999) metabolic engineering, vol 1, issue 4, 320-333）、
・ＰｔｓＧ活性の測定（Kornberg H. L. and Reeves R. E. Biochem. J (1972) 128, 1339-1344、 Rungrassamee et al., Erch Microbiol (2008) 190:41-49）、
・ｐｔｓＧ  ｍＲＮＡのような特異的標的を定量し、対応する遺伝子の発現の増大を確認するために使用されるｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）プロファイリング。
【００４１】
これに関して「増加」という用語は、明記された修飾を受けていない微生物と比べての測定可能な増加を表す。
【００４２】
本発明によれば、グルコース取り込みは、ｐｔｓＧ、ｓｇｒＴ、ｓｇｒＳ、またはｄｇｓＡから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾することにより向上される。さらに、微生物におけるｐｔｓＧの過剰発現によるまたはＰｔｓＧの活性増加を介したグルコース取り込みの向上は当業者に知られている異なる技術によって測定することができる。
【００４３】
本明細書において「発現を修飾する」という用語は、遺伝子の発現が遺伝エレメントの導入または欠失を通じて増大または低減されることを示す。一般には、遺伝子の発現は、修飾されていない同等の微生物、すなわち、グルコース輸送を向上させるための遺伝エレメントの導入または欠失を含まない微生物と比べて増大または低減される。遺伝子の発現が基準に対して増大されるか低減されるかを判定する方法は当技術分野で周知であり、下記に述べる。
【００４４】
グルコース取り込みは本発明によれば遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させることにより向上される。このｐｔｓＧ遺伝子は、大腸菌においてＰＴＳ酵素ＩＩＣＢＧｌｃ（別名−ＥＣ２．７．１．６９、タンパク質−Ｎ（ｐｉ）−ホスホヒスチジン−糖ホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ系の酵素ＩＩ、ＰＥＰ−糖ホスホトランスフェラーゼ酵素ＩＩ、ＰＴＳパーミアーゼ）をコードする。ｐｔｓＧ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１８に示される。
【００４５】
本明細書において「増大」という用語、およびその文法的同義語は、修飾されていない同等の微生物と比べて遺伝子の発現を増大させるまたはアップレギュレートする修飾を意味する。「発現の増大」、「発現の増加」または「過剰発現」という用語は、本書において互換的に用いられ、同様の意味を有する。
【００４６】
微生物において遺伝子の発現を増大させる様々な手段は当業者に知られており、例えば、メッセンジャーＲＮＡの安定性の増大、遺伝子のコピー数の増加、より強力なプロモーターの使用、調節エレメントの除去または活性が高められた対立遺伝子の使用、あるいはおそらくはこれらの手段の組合せによるものが挙げられる。さらに、遺伝子の発現は染色体または染色体外の手段によっても増大させることができる。例えば、数コピーの遺伝子を組換え法により微生物のゲノムに導入し得る。あるいは、遺伝子を、それらの複製起点と、従って細胞内でのそれらのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドによって運ばせることもできる。遺伝子は、厳密な複製を行う低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）に対応して、１〜５コピー、約２０コピーまたは最大５００コピーで存在し得る。調節エレメントは遺伝子の発現の制御に重要である。例えば、遺伝子は、異なる強度のプロモーターを用いて発現させることができ、さらに、これらのプロモーターは誘導性であってもよい。これらのプロモーターは同種または異種であってよい。適当なプロモーターを選択することは十分に当業者の能力の範囲内であるが、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、またはλプロモーターｃＩが広く用いられている。一実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧの発現はその遺伝子を誘導プロモーターまたは構成プロモーターの制御下に置くことにより増大される。
【００４７】
別の実施形態では、遺伝子ｐｔｓＧの発現は低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位をコードする配列を除去することにより増大される。
【００４８】
「低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位をコードする配列を除去する」とは、低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位（配列番号１９）が完全にまたは部分的に欠失され、遺伝子ｐｔｓＧにおける低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合が妨げられるということを意味する。
【００４９】
グルコース取り込みはまた、遺伝子ｓｇｒＳおよび／または遺伝子ｓｇｒＴおよび／または遺伝子ｄｇｓＡの発現を減弱させることによっても向上される。ｓｇｒＳ遺伝子は大腸菌において低分子ＲＮＡであるSugar transport-related sRNAをコードする。ｓｇｒＳ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２０で示される。ｓｇｒＴ遺伝子は大腸菌において低分子ポリペプチドＳｇｒＴをコードする。ｓｇｒＴ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２１に示される。ｄｇｓＡ遺伝子はいくつかの遺伝子、特に、ｐｔｓＧ遺伝子および大腸菌由来ｐｔｓＨＩｃｒｒオペロンの転写レプレッサーとして作用するグローバルレギュレーターをコードする。ｄｇｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２２に示される。
【００５０】
本明細書において「減弱」という用語は、遺伝子の発現の部分的または完全な抑制を意味する。この発現抑制は、遺伝子の発現の阻害、遺伝子の発現に必要なプロモーター領域の総てまたは一部の欠失、遺伝子のコード領域における欠失、および／あるいは野生型プロモーターとより弱い天然または合成プロモーターの交換のいずれかであり得る。好適には、遺伝子の減弱は本質的にはその遺伝子の完全な欠失であり、その遺伝子は本発明による株の同定、単離および精製を容易にする選択マーカー遺伝子で置き換えることができる。例えば、遺伝子発現の抑制は相同組換え技術により達成され得る（Datsenko & Wanner, 2000）。一実施形態では、グルコース取り込みは、遺伝子ｓｇｒＳの欠失により向上される。別の実施形態では、グルコース取り込みは、遺伝子ｓｇｒＴの欠失により向上される。別の実施形態では、グルコース取り込みは、遺伝子ｄｇｓＡの欠失により向上される。
【００５１】
さらなる実施形態では、グルコース取り込みは、上述の修飾の組合せによって向上される。例えば、本発明の微生物では、グルコース取り込みは以下により向上され得る：
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｓｇｒＳの発現を減弱させること、
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｓｇｒＴの発現を減弱させること、
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｄｇｓＡの発現を減弱させること、
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｓｇｒＳおよび遺伝子ｓｇｒＴの発現を減弱させること、
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｄｇｓＡおよび遺伝子ｓｇｒＳの発現を減弱させること、
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｄｇｓＡおよび遺伝子ｓｇｒＴの発現を減弱させること、
・遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｄｇｓＡならびに遺伝子ｓｇｒＴおよびｓｇｒＳの発現を減弱させること、
・遺伝子ｄｇｓＡの発現を減弱させ、かつ、遺伝子ｓｇｒＳおよび／またはｓｇｒＴの発現を減弱させること。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、グルコース取り込みは、遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｓｇｒＳおよび遺伝子ｓｇｒＴの発現を減弱させることにより向上される。
【００５３】
本発明の別の好ましい実施形態では、グルコース取り込みは、遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｄｇｓＡの発現を減弱させることにより向上される。
【００５４】
より好ましくは、グルコース取り込みは、遺伝子ｐｔｓＧの発現を増大させ、かつ、遺伝子ｄｇｓＡならびに遺伝子ｓｇｒＴおよびｓｇｒＳの発現を減弱させることにより向上される。
【００５５】
メチオニン生産を向上させるためにグルコース輸送を向上させるための修飾は単独ではなされないが、微生物による主要な炭素源としてのグルコースからのメチオニンの発酵生産を促進する修飾と組み合わせて行われる。微生物におけるメチオニンの生産を促進する修飾は当業者によく知られている。一実施形態では、以下の遺伝子の少なくとも一つの発現が増大される：ｐｙｃ、ｐｎｔＡＢ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｔｈｒＡ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）、またはトレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）。本発明の特定の実施形態では、これらの遺伝子の少なくとも一つは誘導プロモーターの制御下にあり得る。本発明の好ましい実施形態では、遺伝子ｔｈｒＡ＊が誘導プロモーターの制御下で発現される。
【００５６】
別の実施形態では、以下の遺伝子の少なくとも一つの発現が減弱される：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＪ、ｙｎｃＡ、またはｕｄｈＡ。微生物における遺伝子の発現を修飾する方法は当業者によく知られており、上記および下記で述べる。
【００５７】
加えて、微生物による主要な炭素源としてのグルコースからのメチオニンの発酵生産は、上述の修飾の組合せによって達成され得る、例えば：
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、かつ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大される、
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、かつ、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大される、
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大され、かつ、遺伝子ｃｙｓＥの発現が増大される、
・遺伝子ｍｅｔＪの発現が減弱され、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ＭｅｔＡ＊）の発現が増大され、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減された酵素をコードするｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）の発現が増大され、遺伝子ｃｙｓＥの発現が増大され、かつ、遺伝子ｍｅｔＦおよび／またはｍｅｔＨの発現が増大される。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、組換え微生物は以下の遺伝子修飾を含んでなる：
ａ）遺伝子ｐｓｔＧが過剰発現され、および／またはｓＲＮＡ  ｓｇｒＳ結合部位を含まず、および／または遺伝子ｓｇｒＳが欠失され、および／または遺伝子ｓｇｒＴが欠失され、および／または遺伝子ｄｇｓＡが欠失され、
ｂ）遺伝子ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｃｙｓＥ、ｔｈｒＡ＊、およびｐｙｃの発現が増大され、かつ、
ｃ）遺伝子ｍｅｔＪ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、およびｙｎｃＡの発現が減弱される。
【００５９】
本発明はまた、メチオニンまたはメチオニン誘導体を生産する方法に関し、その方法は、上記の微生物を、グルコースを含有する発酵性炭素源と、硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で培養すること、および該培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収することを含んでなる。
【００６０】
当業者ならば、本発明による微生物の培養条件を定義することができる。好ましくは、その微生物は２０℃〜５５℃の間、好適には、２５℃〜４０℃の間、より具体的には、大腸菌では約３７℃の温度で発酵させる。
【００６１】
発酵は一般に、少なくとも一つの単純炭素源を、必要な場合には、代謝産物の生産に必要な補助基質とともに含有する、使用する微生物に適合した既知の定義された組成の無機培養培地の入った発酵槽で行われる。特に、大腸菌用の無機培養培地は、Ｍ９培地（Anderson, 1946）、Ｍ６３培地（Miller, 1992）またはSchaefer et al. （1999, Anal. Biochem. 270: 88-96）により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成のものであってよい。
【００６２】
「発酵性炭素源」という用語は、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味し、この場合、その基質は少なくとも一つの炭素原子を含む。本発明の特定の実施形態では、その炭素源は再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短時間で、目的産物へのその変換を可能とするのに十分な量で再生され得る、特定の工業プロセスに必要な原料として定義される。
【００６３】
本発明によれば、その炭素源はグルコースを含む。
【００６４】
発酵後に、それからのメチオニンまたはメチオニン誘導体は培養培地から回収され、必要な場合には、精製され得る。培養培地からメチオニンおよびメチオニン誘導体などの化合物を回収し、精製する方法は当業者によく知られている。
【００６５】
メチオニン誘導体はメチオニンの変換経路および／または分解経路から生じる。特に、これらの産物はＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）およびＮ−アセチルメチオニン（ＮＡＭ）である。特に、ＮＡＭは、容易に再生可能なメチオニン誘導体であり、単離され、脱アシル化によりメチオニンへと変換され得る。従って、「培養培地からメチオニンまたはメチオニン誘導体を回収すること」との句は、メチオニン、ＳＡＭ、ＮＡＭ、および有用であり得る他の総ての誘導体を回収する行為を意味する。
【実施例】
【００６６】
プロトコール
下記の実施例に記載するメチオニン生産株を構築するために、いくつかのプロトコールを用いた。
【００６７】
プロトコール１：相同組換えによる染色体修飾および組換え体の選択（Datsenko & Wanner, (2000)。
【００６８】
特定の染色体遺伝子座における対立遺伝子置換または遺伝子破壊は、Datsenko & Wanner (2000)により記載されているように、相同組換えによって行った。Ｆｌｐ認識部位が隣接した、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性ｃａｔまたはカナマイシン（Ｋｍ）耐性ｋａｎを、ＰＣＲにより、鋳型としてそれぞれｐＫＤ３またはｐＫＤ４プラスミドを用いることで増幅した。得られたＰＣＲ産物を用いて、λＲｅｄ（γ、β、ｅｘｏ）リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を保持するレシピエント大腸菌株を形質転換した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、突然変異遺伝子座の染色体構造を、下表１に記載の適当なプライマーを用いたＰＣＲ解析により確認した。
【００６９】
ｃａｔ耐性遺伝子は、Datsenko & Wanner (2000)により記載されているように、Ｆｌｐリコンビナーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドｐＣＰ２０と、ｋａｎ遺伝子を有するプラスミドｐＫＤ４を用いることで、ｋａｎ耐性遺伝子により置き換えることができる。ｐＣＰ２０およびｐＫＤ４プラスミドを目的の株に導入し、ｆｌｐ遺伝子を発現させる目的で、形質転換体を、カナマイシン(kanamycine)を添加したＬＢ上で３７℃で培養した後、増殖するクローンを、表１に記載のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより確認した。
【００７０】
耐性遺伝子を、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されているように、プラスミドｐＣＰ２０を用いることにより除去した。簡単に述べると、ｐＣＰ２０プラスミドを保持するクローンをＬＢ上で３７℃で培養した後、３０℃で抗生物質耐性の欠如について調べた。次に、抗生物質感受性クローンを、表１に記載のプライマーを用いたＰＣＲにより確認した。
【００７１】
プロトコール２：ファージＰ１の形質導入
染色体修飾をＰ１形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に移入した。このプロトコールは、（ｉ）耐性関連の染色体修飾を含むドナー株におけるファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の感染との２段階から構成される。
【００７２】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌまたはＫｍ  ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭ中に、目的の染色体修飾を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナー株ＭＧ１６５５で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌを添加する（約１×１０９ファージ／ｍｌ）。
・細胞が完全に溶解するまで３７℃で３時間振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残屑を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を４℃で保存する。
【００７３】
形質導入
・ＬＢ培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに細胞ペレットを懸濁する。
・１００μｌの細胞に、染色体に修飾を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ（供試試験管）を感染させ、対照試験管として、Ｐ１ファージを含まない細胞１００μｌと、細胞を含まないＰ１ファージ１００μｌとを感染させる。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・７０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
・ＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌまたはＫｍ  ５０μｇ／ｍｌに播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００７４】
【表１】
2014522642.tif 000004
2014522642.tif 000005
【００７５】
実施例１：株２の構築
１．メチオニン生産株１、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）は特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２９３７に記載されており、これは引用することにより本願の開示の一部とされる。
【００７６】
２．株２の構築
細胞へのグルコース取り込みを増加させるために、ＰｔｓＧ（ＩＩＣＧｌｃ）、すなわち、グルコースホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的ＰＴＳパーミアーゼを、細菌人工染色体と、人工誘導ｔｒｃプロモーターの使用により過剰生産させた。
【００７７】
プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７は、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７（下記）から誘導され、従って、細菌人工染色体ｐＣＣ１ＢＡＣ（Epicentre）に由来するものである。
【００７８】
プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７の構築のために、ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７断片をオーバーラッピングＰＣＲにより得た。まず、ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２領域を、以下のオリゴヌクレオチド、Ｏｍｅ２０７０−ＥｃｏＲＩ−ＰｌａｃＩｑ−ＦおよびＯｍｅ２０７１−ＮｈｅＩ−ＴＴ０２−ｌａｃＩｑ−Ｒを用い、ＰＣＲにより、プラスミドｐＴＲＣ９９Ａ(Stratagene)から増幅し、Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７領域を、以下のオリゴヌクレオチド、Ｏｍｅ２０７２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＲＢＳ０１＊２−ＡｖｒＩＩ−ＯＰ０１−Ｐｔｒｃ０１−ＮｈｅＩ−ＴＴ０２−ＦおよびＯｍｅ２０７３−ＥｃｏＲＩ−ＳｆｉＩ−ＰａｃＩ−ＴＴ０７−Ｒを用い、ＰＣＲにより、プラスミドｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰｌａｍｂｄａＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７（Geneartにより合成、下記）から増幅した。次に、鋳型として、オーバーラッピング領域を有するＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２およびＰｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７のＰＣＲ産物と、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２０７０−ＥｃｏＲＩ−ＰｌａｃＩｑ−ＦおよびＯｍｅ２０７３−ＥｃｏＲＩ−ＳｆｉＩ−ＰａｃＩ−ＴＴ０７−Ｒを用いることにより、オーバーラッピングＰＣＲを行った。最終ＰＣＲ産物ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７をＥｃｏＲＩおよびＳｆｉＩ制限酵素により消化し、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターのＥｃｏＲＩ／ＳｆｉＩ部位にクローニングした。組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７プラスミドを得た。
Ｏｍｅ２０７０−ＥｃｏＲＩ−ＰｌａｃＩｑ−Ｆ（配列番号１）
【化１】
2014522642.tif 000006
この配列において
・小文字の配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位および余分な塩基に関する配列であり、
・大文字の配列は、ｐＴＲＣ９９Ａベクターに含まれる、ｌａｃＩ遺伝子のＰｌａｃＩｑ修飾型プロモーター（２９６７〜２９９１、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22744.1上に参照配列）と相同な配列である。
【００７９】
Ｏｍｅ２０７１−ＮｈｅＩ−ＴＴ０２−ｌａｃＩｑ−Ｒ（配列番号２）
【化２】
2014522642.tif 000007
この配列において
・太字の大文字の配列は、人工ｔｒｃプロモーター、Ｐｔｒｃ０１（Meynial-Salles et al. 2005）と相同な配列であり、
・小文字の配列は、ＮｈｅＩ制限部位および余分な塩基に関する配列であり、
・斜体の大文字の配列は、ＴＴ０２と呼称される、大腸菌ｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１（Orosz et al. 1991）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）に関する配列であり、
・大文字の配列は、ｌａｃＩ遺伝子（４１１８〜４１３７、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22744.1上に参照配列、または３６５６５２〜３６５６７１、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・下線を施した配列は、オーバーラッピングＰＣＲステップに必要なオーバーラッピング領域を示す。
【００８０】
Ｏｍｅ２０７２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＲＢＳ０１＊２−ＡｖｒＩＩ−ＯＰ０１−Ｐｔｒｃ０１−ＮｈｅＩ−ＴＴ０２−Ｆ（配列番号３）
【化３】
2014522642.tif 000008
この配列において
・斜体の大文字の配列は、ＴＴ０２と呼称される、大腸菌ｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１（Orosz et al. 1991）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）に関する配列であり、
・小文字の配列は、ＮｈｅＩまたはＡｖｒＩＩ制限部位および余分な塩基に関する配列であり、
・太字の大文字の配列は、人工ｔｒｃプロモーター、Ｐｔｒｃ０１およびオペレーター、ＯＰ０１（Meynial-Salles et al. 2005）と相同な配列であり、
・太字斜体の小文字の配列は、ＲＢＳ０１＊２と呼称される、リボソーム結合部位配列であり、
・大文字の配列は、ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔと呼称される、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて最適化された、修飾型ｇｆｐ遺伝子と相同な配列であり、
・下線を施した配列は、オーバーラッピングＰＣＲステップに必要なオーバーラッピング領域を示す。
【００８１】
Ｏｍｅ２０７３−ＥｃｏＲＩ−ＳｆｉＩ−ＰａｃＩ−ＴＴ０７−Ｒ（配列番号４）
【化４】
2014522642.tif 000009
この配列において
・小文字の配列は、ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＰａｃＩ制限部位および余分な塩基に関する配列であり、
・斜体の大文字の配列は、ＴＴ０７と呼称される、転写ターミネーター配列Ｔ７Ｔｅ（Harrington et al. 2001）である。
【００８２】
ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７領域は、Geneart Companyによって合成された、ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰｌａｍｂｄａＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７プラスミド中に存在する（配列番号１７）：
【化５】
2014522642.tif 000010
この配列において
・太字斜体の小文字の配列は、ＲＢＳ０１＊２と呼称される、リボソーム結合部位に関する配列であり、
・小文字の配列は、ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔと呼称される、大腸菌用に最適化されたＧｆｐＴｕｒｂｏ遺伝子（Evrogene）と相同な配列であり、
・大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位に関する配列であり、
・下線を施した文字の配列は、ＴＴ０７と呼称される、転写ターミネーター配列Ｔ７Ｔｅ（Harrington et al. 2001）である。
【００８３】
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７ベクターにおいて、ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ遺伝子をｐｔｓＧ遺伝子により置き換えて、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７を得るために、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７をまず、ＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素により部分的に消化した。次に、ｐｔｓＧ領域を、以下のオリゴヌクレオチド、Ｏｍｅ２１１５−ＡｖｒＩＩ−ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＦおよびＯｍｅ２１１６−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ｐｔｓＧ−Ｒを用い、ＰＣＲにより、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡから増幅し、得られたＰＣＲ産物をＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素により消化し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ＧｆｐＴｕｒｂｏＯｐｔ−ＴＴ０７ベクターのＡｖｒＩＩ／ＢｓｔＺ１７Ｉ部位にクローニングした。組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７プラスミドを得た。
【００８４】
Ｏｍｅ２１１５−ＡｖｒＩＩ−ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−Ｆ（配列番号５）
【化６】
2014522642.tif 000011
この配列において
・小文字の配列は、ＮｏｔＩ、ＡｖｒＩＩ制限部位および余分な塩基に関する配列であり、
・太字の大文字の配列は、ＲＢＳ０１＊２と呼称される、リボソーム結合部位配列であり、
・大文字の配列は、ｐｔｓＧ遺伝子（１１５７０９２〜１１５７１１６、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列である。
【００８５】
Ｏｍｅ２１１６−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ｐｔｓＧ−Ｒ（配列番号６）
【化７】
2014522642.tif 000012
この配列において
・小文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基に関する配列であり、
・大文字の配列は、ｐｔｓＧ遺伝子（１１５８５０２〜１１５８５２５、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列である。
【００８６】
最後に、得られたプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７を株１に導入し、ＭＧ１６５５株２、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７）を作出した。
【００８７】
この構築物ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７では、天然プロモーターならびに低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位は強力な人工プロモーターで置き換えられている。その結果として、ｐｔｓＧは過剰発現されるが、そのｍＲＮＡはもはや調節されることなく、ｓｇｒＳによる分解は起こらない。
【００８８】
誘導条件（培養物にＩＰＴＧ添加）下で増殖させた株におけるｐｔｓＧ過剰発現をｑＰＣＲにより確認した。
【００８９】
実施例２：株４の構築
１．メチオニン生産株３、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ ΔｕｄｈＡ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）は特許出願ＷＯ２０１２／０５５７９８号に記載されており、これは引用することにより本願の開示の一部とされる。
【００９０】
２．株４の構築
ＮＡＤＰＨ産生経路（トランスヒドロゲナーゼＵｄｈＡおよびＰｎｔＡＢ）に関して修飾されたメチオニン生産株においてＰｔｓＧを過剰生産するために、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７（実施例１に記載）の抗生物質耐性カセットを修飾する必要があった。ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７のクロラムフェニコール耐性遺伝子をゲンタマイシン耐性遺伝子により置き換え、ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７プラスミドを得る。
【００９１】
この抗生物質耐性遺伝子置換を進めるために、ｐＫＤ４６ベクターに含まれるＲｅｄ系に基づいた手法（Genebridges）を用いた。この目的で、二つのオリゴヌクレオチドを用いた：
Ｏｍｅ２１２７−ＲＨａｍｏｎｔ−ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｇｔ−Ｆ（配列番号７）
【化８】
2014522642.tif 000013
（この配列において
・下線を施した大文字の配列は、クロラムフェニコール耐性遺伝子の３’側にあるｐＣＣ１ＢＡＣベクターの領域と相同な配列であり、
・大文字の配列は、ｐ３４Ｓ−Ｇｍベクターに含まれるゲンタマイシン耐性遺伝子（Dennis & Zyltra, 1998）（７３５〜８０５、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF062079.1上に参照配列）と相同な配列である）
および
Ｏｍｅ２１２８−ＲＨａｖａｌ−ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｇｔ−Ｒ（配列番号８）
【化９】
2014522642.tif 000014
（この配列において
・下線を施した大文字の配列は、クロラムフェニコール耐性遺伝子の５’側にあるｐＣＣ１ＢＡＣベクターの領域と相同な配列であり、
・大文字は、ｐ３４Ｓ−Ｇｍベクターに含まれるゲンタマイシン耐性遺伝子（Dennis & Zyltra, 1998）（２７２〜３４４、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF062079.1上に参照配列）と相同な配列である。）
オリゴヌクレオチドＯｍｅ２１２７−ＲＨａｍｏｎｔ−ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｇｔ−ＦおよびＯｍｅ２１２８−ＲＨａｖａｌ−ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｇｔ−Ｒを用いて、プラスミドｐ３４Ｓ−Ｇｍからゲンタマイシン耐性カセット（Dennis & Zyltra, 1998）を増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションにより株ＤＨ５α（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７）（ｐＫＤ４６）に導入した（この株では、Ｒｅｄリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能にする）。次に、ゲンタマイシン耐性・クロラムフェニコール感受性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を制限プロフィール解析(restriction profile analysis)により確認した。
【００９２】
最後に、組換えプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７をＤＮＡ配列決定法により確認し、そのプラスミドを株３に導入し、ＭＧ１６５５株４、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：Ｔ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ  ΔｕｄｈＡ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０１）（ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７）を得た。
【００９３】
この構築物ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７では、天然プロモーターならびに低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位は強力な人工プロモーターで置き換えられている。その結果として、ｐｔｓＧは過剰発現されるが、そのｍＲＮＡはもはや調節されることなく、ｓｇｒＳによる分解は起こらない。
【００９４】
誘導条件（培養物にＩＰＴＧ添加）下で増殖させた株におけるｐｔｓＧ過剰発現をｑＰＣＲにより確認した。
【００９５】
実施例３：株５の構築
ｐｔｓＧ転写物およびＰｔｓＧタンパク質に対するいずれの調節も回避するために、ＰｔｓＧ活性を調節する低分子ペプチドをコードする遺伝子ｓｇｒＴと、ｐｔｓＧのｍＲＮＡに干渉するｓｇｒＳ低分子ＲＮＡをコードするｓｇｒＳ遺伝子の一部を欠失させた。
【００９６】
遺伝子ｓｇｒＳ／ＴはｓｇｒＳ／Ｔ−ｓｅｔＡオペロンの第１遺伝子である。下流遺伝子ｓｅｔＡの発現を消失させずにｓｇｒＳ／Ｔ遺伝子を欠失させるために、ｓｇｒＳ／Ｔを欠失させるとともに、ｓｅｔＡ遺伝子をオペロンのプロモーターの下流に移動させた。この目的で、プロトコール１に記載した相同組換え法を用いた。Ｋｅｉｏ変異株コレクション(Keio mutant collection)の大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｓｅｔＡ：：Ｋｍ（ｐＫＤ４６）株（Baba et al., 2006）を用い、ｓｇｒＳ／Ｔ遺伝子を欠失させるとともにクロラムフェニコール耐性カセットを挿入し、オペロンプロモーターの下流にｓｅｔＡ遺伝子を再配置した。
【００９７】
具体的には、ｓｇｒＳ／Ｔ遺伝子を欠失させるのに必要な断片「ｓｇｒＲ−ＰｓｇｒＲ−ＰｓｇｒＳ−ＲＢＳｓｅｔＡ−ｓｅｔＡ−ＦＲＴ−Ｃｍ−ＦＲＴ−ｌｅｕＤ」（断片４）をオーバーラッピングＰＣＲにより増幅した。まず、最終オーバーラッピングＰＣＲの鋳型となる断片１、断片２および断片３を増幅した。これらの断片は各々、３’末端と５’末端の間に少なくとも４８ヌクレオチド長の相同領域を有し、この相同領域がオーバーラッピングＰＣＲステップを可能にする。断片１、「ｓｇｒＲ−ＰｓｇｒＲ−ＰｓｇｒＳ−ＲＢＳｓｅｔＡ−ｓｅｔＡ」は、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７１−ＤｓｇｒＳ−Ｆ１およびＯｍｅ２３７２−ＤｓｇｒＳ−Ｒ１を用い、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅し、断片２、「ＰｓｇｒＲ−ＰｓｇｒＳ−ＲＢＳｓｅｔＡ−ｓｅｔＡ」は、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７３−ＤｓｇｒＳ−Ｆ２およびＯｍｅ２３７４−ＤｓｇｒＳ−Ｒ２を用い、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅し、断片３、「ＦＲＴ−Ｃｍ−ＦＲＴ−ｌｅｕＤ」は、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７５−ＤｓｇｒＳ−Ｆ３およびＯｍｅ２３７６−ＤｓｇｒＳ−Ｒ３を用い、プラスミドｐＫＤ３からＰＣＲ増幅した。最後に、断片４を、鋳型として用いられる断片１、断片２および断片３の混合物から、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７１−ＤｓｇｒＳ−Ｆ１およびＯｍｅ２３７６−ＤｓｇｒＳ−Ｒ３を用いることによりＰＣＲ増幅した。
【００９８】
Ｏｍｅ２３７１−ＤｓｇｒＳ−Ｆ１（配列番号９）
【化１０】
2014522642.tif 000015
この配列は、ｓｇｒＲ遺伝子（７６７４３〜７６７６５、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【００９９】
Ｏｍｅ２３７２−ＤｓｇｒＳ−Ｒ１（配列番号１０）
【化１１】
2014522642.tif 000016
この配列において
・大文字の配列は、ｓｇｒＲおよびｓｇｒＳプロモーター領域（７７３７９〜７７３９８、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・太字の大文字は、ｓｅｔＡ領域（７７６３７〜７７６０７、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・下線を施した文字の配列は、オーバーラッピングＰＣＲステップに必要なオーバーラッピング領域を示す。
【０１００】
Ｏｍｅ２３７３−ＤｓｇｒＳ−Ｆ２（配列番号１１）
【化１２】
2014522642.tif 000017
この配列において
・大文字の配列は、ｓｇｒＲおよびｓｇｒＳプロモーター領域（７７３７０〜７７３９８、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・太字の大文字の配列は、ｓｅｔＡ領域（７７６３７〜７７６０７、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・下線を施した文字の配列は、オーバーラッピングＰＣＲステップに必要なオーバーラッピング領域を示す。
【０１０１】
Ｏｍｅ２３７４−ＤｓｇｒＳ−Ｒ２（配列番号１２）
【化１３】
2014522642.tif 000018
この配列において
・斜体の大文字の配列は、クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する配列（Datsenko & Wanner, 2000に参照配列）であり、
・太字の大文字の配列は、ｓｅｔＡ領域（７８７９９〜７８７７７、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・下線を施した文字の配列は、オーバーラッピングＰＣＲステップに必要なオーバーラッピング領域を示す。
【０１０２】
Ｏｍｅ２３７５−ＤｓｇｒＳ−Ｆ３（配列番号１３）
【化１４】
2014522642.tif 000019
この配列において
・太字の大文字の配列は、ｓｅｔＡ領域（７８７６４〜７８７９９、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・斜体の大文字の配列は、クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する配列（Datsenko & Wanner, 2000に参照配列）であり、
・下線を施した文字の配列は、オーバーラッピングＰＣＲステップに必要なオーバーラッピング領域を示す。
【０１０３】
Ｏｍｅ２３７６−ＤｓｇｒＳ−Ｒ３（配列番号１４）
【化１５】
2014522642.tif 000020
この配列において
・大文字の配列は、ｓｅｔＡ−ｌｅｕＤ領域（７８９１９〜７８８００、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な配列であり、
・斜体の大文字の配列は、クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する配列（Datsenko & Wanner, 2000に参照配列）である。
【０１０４】
次に、得られたＰＣＲ産物（断片４に相当する）をエレクトロポレーションにより株ＢＷ２５１１３  ΔｓｅｔＡ：：Ｋｍ（ｐＫＤ４６）に導入した（この株では、Ｒｅｄリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能にした）。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されるオリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７８−ＤｓｇｒＳ−ＦｓｅｑおよびＯｍｅ２３７７−ＤｓｇｒＳ−Ｒｓｅｑを用いたＰＣＲ解析により確認し、ＤＮＡ配列決定法により確認した。選択株をＢＷ２５１１３  ΔｓｇｒＳ：：Ｃｍと呼称した。
【０１０５】
ｓｇｒＴオープンリーディングフレームは低分子ＲＮＡをコードするｓｇｒＳ配列とオーバーラップするため、ｓｇｒＳの欠失によりｓｇｒＴが欠失することになる。従って、ｓｇｒＳ／Ｔ欠失をΔｓｇｒＳと呼称した。
【０１０６】
Ｏｍｅ２３７８−ＤｓｇｒＳ−Ｆｓｅｑ（配列番号１５）
【化１６】
2014522642.tif 000021
この配列は、ｓｇｒＲ遺伝子（７６５０２〜７６５２１、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１０７】
Ｏｍｅ２３７７−ＤｓｇｒＳ−Ｒｓｅｑ（配列番号１６）
【化１７】
2014522642.tif 000022
この配列は、ｌｅｕＤ遺伝子（７９１４３〜７９１２０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１０８】
ｓｇｒＳ／Ｔ欠失をＰ１ファージ形質導入によりＢＷ２５１１３  ΔｓｇｒＳ：：Ｃｍ株から株１へと移入した。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７８−ＤｓｇｒＳ−ＦｓｅｑおよびＯｍｅ２３７７−ＤｓｇｒＳ−Ｒｓｅｑを用いたＰＣＲ解析により確認した。得られた株を株５、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｓｇｒＳ：：Ｃｍ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）と呼称した。
【０１０９】
実施例４：株６の構築
ＮＡＤＰＨ産生経路（トランスヒドロゲナーゼＵｄｈＡおよびＰｎｔＡＢ）に関して修飾されたメチオニン株においてＰｔｓＧ調節を克服するために、株３についてｓｇｒＳ／Ｔ遺伝子を欠失させた。
【０１１０】
この目的で、ΔｓｇｒＳ：：Ｃｍ欠失のクロラムフェニコール耐性カセットを、まず、カナマイシン耐性カセットによって置き換えた。このために、ｐＣＰ２０およびｐＫＤ４プラスミドをＢＷ２５１１３  ΔｓｇｒＳ：：Ｃｍ株に導入し、形質転換体を、カナマイシンを補給したＬＢ上で３７℃で培養した後、増殖するクローンを、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７８−ＤｓｇｒＳ−ＦｓｅｑおよびＯｍｅ２３７７−ＤｓｇｒＳ−Ｒｓｅｑを用いたＰＣＲにより確認した。次に、ΔｓｇｒＳ：：Ｋｍ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入によりＢＷ２５１１３  ΔｓｇｒＳ：：Ｋｍ株から株３へと移入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７８−ＤｓｇｒＳ−ＦｓｅｑおよびＯｍｅ２３７７−ＤｓｇｒＳ−Ｒｓｅｑを用いたＰＣＲ解析により確認した。得られた株を株６、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  Ｐｔｒｃ３０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ  ＡｕｄｈＡ  ΔｓｇｒＳ：：Ｋｍ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）と呼称した。
【０１１１】
実施例５：株７の構築
ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７からｐｔｓＧをすでに過剰発現する株２においてグルコース取り込みを大幅に増加させるために、その株においてｓｇｒＳ／Ｔ遺伝子を欠失させた。
【０１１２】
この目的で、ΔｓｇｒＳ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入によりＢＷ２５１１３  ΔｓｇｒＳ：：Ｋｍ株から株２へと移入した。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＯｍｅ２３７８−ＤｓｇｒＳ−ＦｓｅｑおよびＯｍｅ２３７７−ＤｓｇｒＳ−Ｒｓｅｑを用いたＰＣＲ解析により確認した。得られた株を株７、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−Ｐλ＊（−３５）−ＰＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｓｇｒＳ：：Ｃｍ（ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７）と呼称した。
【０１１３】
誘導条件（培養物にＩＰＴＧ添加）下で増殖させた株におけるｐｔｓＧ過剰発現をｑＰＣＲにより確認した。
【０１１４】
実施例６：株１５の構築
１．株８
メチオニン生産株８は特許出願ＷＯ２０１２／０５５７９８号に記載されており、これは引用することにより本願の開示の一部とされる。株８の遺伝子型は以下である、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊  １１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ。
【０１１５】
２．株９、株１０、株１１および株１２の構築
ｐｙｃｒｅと呼称される、インゲン根粒菌(Rhizobium etli)のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるために、この遺伝子１コピーを染色体上のｍｅｌＢおよびｐｕｒＵ遺伝子座に２回組み込んだ。ｍｅｌＢ遺伝子座では、ｐｙｃｒｅ遺伝子は、ｐｙｃｒｅ遺伝子の翻訳開始部位の上流に組み込まれた、合成Ｐｔｒｃプロモーター配列、ｍＲＮＡ安定化配列および最適リボソーム結合部位の付加により発現された。この構築物はΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７と注釈付けされた。ｐｕｒＵ遺伝子座では、ｐｙｃｒｅ遺伝子は、ｐｙｃｒｅ遺伝子の翻訳開始部位の上流に組み込まれた、ＰＬ１＊１（ファージλのＰλＬ１プロモーターの−１０ボックスに突然変異）および最適リボソーム結合部位の付加により発現された。この構築物はΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７と注釈付けされた。
【０１１６】
下に示す染色体上の異なる遺伝子座での遺伝子組み込みについての総ての記載は同じ方法に従って構成される、１）目的の遺伝子座の上流および下流の相同配列、ＤＮＡ断片ならびに耐性カセットを含む複製ベクターの構築、２）相同組換えによる最小株（ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６）への目的の修飾の組み込み、および３）複合株（いくつかの修飾をすでに含むＭＧ１６５５）への目的の修飾の形質導入。
【０１１７】
２．１．株９および株１０の構築
ｍｅｌＢ遺伝子を欠失させ、それをＰｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７領域により置き換えるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットだけでなく追加のＤＮＡを挿入することを可能とする。この目的で、以下のプラスミドを構築した、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ。このｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドは、ｐＵＣ１８ベクター（Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106）から誘導され、Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７断片と連結されたカナマイシン耐性カセットを保持し、それらはどちらもｍｅｌＢの上流領域と下流領域の間にクローニングされている。
【０１１８】
ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍの構築のために、まず、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドを構築した。このプラスミドは、ｍｅｌＢの上流領域と下流領域を有し、これらの領域の間には、転写ターミネーター（大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子のＴ１、ＴＴ０２と呼称される）および多重クローニング部位（ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ制限部位からなり、ＳＭＣと呼称される）がある。この最後の領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
ｍｅｌＢｕｐ−Ｆ（配列番号２３）
【化１８】
2014522642.tif 000023
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｍｅｌＢ領域の配列（４３４０４８９〜４３４０５１３）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１１９】
ｍｅｌＢｕｐ−Ｒ（配列番号２４）
【化１９】
2014522642.tif 000024
この配列において
・領域（小文字）は、多重クローニング部位のＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位とＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の一部に関する領域であり、
・領域（太字の大文字）は、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１（Orosz et al. 1991）に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｍｅｌＢ領域の配列（４３４１３７７〜４３４１４０６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１２０】
ｍｅｌＢｄｏｗｎ−Ｆ（配列番号２５）
【化２０】
2014522642.tif 000025
この配列において
・領域（太字の大文字）は、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１（Orosz et al. 1991）の一部に関する領域であり、
・領域（小文字）は、多重クローニング部位全体に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｍｅｌＢ領域の配列（４３４２７９３〜４３４２８１８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１２１】
ｍｅｌＢｄｏｗｎ−Ｒ（配列番号２６）
【化２１】
2014522642.tif 000026
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｍｅｌＢ領域の配列（４３４３６９４〜４３４３７１９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１２２】
第一に、「ｕｐＭｅｌＢ」および「ｄｏｗｎＭｅｌＢ」断片を、それぞれ、ｍｅｌＢｕｐ−Ｆ／ｍｅｌＢｕｐ−ＲおよびｍｅｌＢｄｏｗｎ−Ｆ／ｍｅｌＢｄｏｗｎ−Ｒオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。第二に、「ｕｐＭｅｌＢ−ｄｏｗｎＭｅｌＢ」断片を、ｍｅｌＢｕｐ−Ｆ／ｍｅｌＢｄｏｗｎ−Ｒオリゴヌクレオチドを用いて、「ｕｐＭｅｌＢ」および「ｄｏｗｎＭｅｌＢ」ＰＣＲ断片（これらの断片は大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１の一部および多重クローニング部位の一部からなるオーバーラッピング領域を有する）から増幅した。「ｕｐＭｅｌＢ−ｄｏｗｎＭｅｌＢ」ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｆｏＩで切断し、ｐＵＣ１８ベクターの平滑末端化したＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドを得た。
【０１２３】
次に、カナマイシン耐性カセットを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＫＤ４ベクターからＰＣＲ増幅した：
【０１２４】
Ｋｍ−Ｆ（配列番号２７）
【化２２】
2014522642.tif 000027
この配列において
・領域（小文字）は、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（（Datsenko & Wanner (2000)に参照配列）であり、
・領域（大文字）は、ＳｍａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基に関する領域である。
【０１２５】
Ｋｍ−Ｒ（配列番号２８）
【化２３】
2014522642.tif 000028
この配列において
・領域（小文字）は、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（Datsenko & Wanner (2000)に参照配列）であり、
・領域（大文字）は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および余分な塩基に関する領域である。
【０１２６】
ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｋｍプラスミドを得た。
【０１２７】
最後に、Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７断片を、プライマーＰｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−Ｆおよびｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７−Ｒを用いて、特許出願ＷＯ２０１２／０５５７９８号に記載されているプラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を制限酵素ＡｖｒＩＩおよびＰａｃＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：ＫｍプラスミドのＡｖｒＩＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドを得た。
【０１２８】
組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１２９】
Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−Ｆ（配列番号２９）
【化２４】
2014522642.tif 000029
この配列において
・領域（小文字）は、ＰａｃＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（太字の大文字）は、人工誘導性ｔｒｃプロモーターと相同な領域であり、
・領域（下線を施した大文字）は、ｍＲＮＡを安定化させた配列（Meynial-Salles et al. 2005）と相同な領域であり、
・領域（斜体の大文字）は、最適リボソーム結合部位と相同な領域であり、
・領域（大文字）は、インゲン根粒菌のｐｙｃ遺伝子の開始点（１〜３２）と相同な領域である。
【０１３０】
ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７−Ｒ（配列番号３０）
【化２５】
2014522642.tif 000030
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｍａＩ、ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（太字の大文字）は、ＴＴ０７と呼称される、Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列（Harrington et al. 2001）に関する領域であり、
・領域（大文字）は、インゲン根粒菌のｐｙｃ遺伝子の終了点（３４４１〜３４６５）と相同な領域である。
【０１３１】
第二に、ｐＵＣ１８−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：ＫｍプラスミドをＫｐｎＩ制限酵素で切断することによりΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片を得、その断片を、プロトコール１に従って、エレクトロポレーションによりＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片の挿入を、オリゴヌクレオチドｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−ＦおよびｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−Ｒを用いたＰＣＲ解析により確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍと呼称した。
【０１３２】
ｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−Ｆ（配列番号３１）
【化２６】
2014522642.tif 000031
この配列は、ｍｅｌＢ領域の配列（４３４０１６８〜４３４０１８７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１３３】
ｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−Ｒ（配列番号３２）
【化２７】
2014522642.tif 000032
この配列は、ｍｅｌＢ領域の配列（４３４４０４４〜４３４４０６５）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１３４】
第３に、ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾を、プロトコール２に従って、上記のＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ株のＰ１ファージ溶解液を用いて、株８に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾の存在を、プライマーｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−ＦおよびｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−Ｒを用いたＰＣＲにより確認した。得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｚＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＫＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍを株９と呼称した。
【０１３５】
次に、カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するリコンビナーゼＦＬＰを有するｐＣＰ２０プラスミドを株９に導入した。３７℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド、ｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−Ｆ／ｍｅｌＢ−ｐｙｃｒｅ−Ｒを用いたＰＣＲ解析により確認した。得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を株１０と呼称した。
【０１３６】
２．２．株１１および株１２の構築
ｐｕｒＵ遺伝子を欠失させ、それをＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７領域により置き換えるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この目的で、以下のプラスミドを構築した、ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ。このｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドは、ｐＵＣ１８ベクター（Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106）から誘導され、ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７断片と連結されたカナマイシン耐性カセットを保持し、それらはどちらもｐｕｒＵの上流領域と下流領域の間にクローニングされている。
【０１３７】
ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍの構築のために、まず、ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドを構築した。このプラスミドはｐｕｒＵの上流領域と下流領域を有し、これらの領域の間には、転写ターミネーター（大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子のＴ１、ＴＴ０２と呼称される）および多重クローニング部位（ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ制限部位からなり、ＳＭＣと呼称される）がある。この最後の領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
ｐｕｒＵｕｐ−Ｆ（配列番号３３）
【化２８】
2014522642.tif 000033
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｔｕＩおよびＮｓｉＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｐｕｒＵ領域の配列（１２８８４２４〜１２８８４４７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１３８】
ｐｕｒＵｕｐ−Ｒ（配列番号３４）
【化２９】
2014522642.tif 000034
この配列において
・領域（小文字）は、多重クローニング部位のＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の一部に関する領域であり、
・領域（太字の大文字）は、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１（Orosz et al. 1991）に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｐｕｒＵ領域の配列（１２８７８４９〜１２８７８７７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１３９】
ｐｕｒＵｄｏｗｎ−Ｆ（配列番号３５）
【化３０】
2014522642.tif 000035
この配列において
・領域（太字の大文字）は、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１（Orosz et al. 1991）の一部に関する領域であり、
・領域（小文字）は、多重クローニング部位全体に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｐｕｒＵ領域の配列（１２８７０００〜１２８７０２８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１４０】
ｐｕｒＵｄｏｗｎ−Ｒ（配列番号３６）
【化３１】
2014522642.tif 000036
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｔｕＩおよびＮｓｉＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（大文字）は、ｐｕｒＵ領域の配列（１２８６４２９〜１２８６４５２）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域である。
【０１４１】
第一に、「ｕｐＰｕｒＵ」および「ｄｏｗｎＰｕｒＵ」断片を、それぞれ、ｐｕｒＵｕｐ−Ｆ／ｐｕｒＵｕｐ−ＲおよびｐｕｒＵｄｏｗｎ−Ｆ／ｐｕｒＵｄｏｗｎ−Ｒオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。第二に、「ｕｐＰｕｒＵ−ｄｏｗｎＰｕｒＵ」断片を、ｐｕｒＵｕｐ−Ｆ／ｐｕｒＵｄｏｗｎ−Ｒオリゴヌクレオチドを用いて、「ｕｐＰｕｒＵ」および「ｄｏｗｎＰｕｒＵ」ＰＣＲ断片（これらの断片は大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１の一部および多重クローニング部位の一部からなるオーバーラッピング領域を有する）から増幅した。「ｕｐＰｕｒＵ−ｄｏｗｎＰｕｒＵ」ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｔｕＩで切断し、ｐＵＣ１８ベクターの平滑末端化したＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：ＴＴ０２−ＳＭＣを得た。
【０１４２】
次に、カナマイシン耐性カセットを、オリゴヌクレオチドＫｍ−ＦおよびＫｍ−Ｒ（上記）を用いて、ｐＫＤ４ベクターからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＳＭＣプラスミドのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｋｍを得た。
【０１４３】
最後に、ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片を、プライマーＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−Ｆおよびｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７−Ｒ２を用いて、特許出願ＷＯ２０１２／０５５７９８号に記載されているプラスミドｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＳｍａＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：ＫｍプラスミドのＡｖｒＩＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドを得た。組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１４４】
ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−Ｆ（配列番号３７）
【化３２】
2014522642.tif 000037
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｐｅＩ、ＳａｌＩ、ＨｐａＩおよびＭｌｕＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（太字の大文字）は、λバクテリオファージＰＬプロモーターの短鎖型（ＰＬ１  Giladi et al. 1995）と相同な、Kincade & deHaseth (1991)に記載されている−１０ボックスに突然変異（Ｇ１２Ｔ、下線を施した太字の文字）を保持する領域であり（このプロモーターをＰＬ１＊１と呼称する）、
・領域（斜体の大文字）は、最適リボソーム結合部位と相同な領域であり、
・領域（大文字）は、インゲン根粒菌のｐｙｃ遺伝子の５’開始点（１〜３２）と相同な領域である。
【０１４５】
ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７−Ｒ２（配列番号３８）
【化３３】
2014522642.tif 000038
この配列において
・領域（小文字）は、ＳｍａＩ、ＰａｃＩ、ＳｃａＩ、ＳｎａＢＩ制限部位および余分な塩基に関する領域であり、
・領域（太字の大文字）は、Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列（Harrington et al. 2001）に関する領域であり、
・領域（大文字）は、インゲン根粒菌のｐｙｃ遺伝子の５’末端（３４４５〜３４６５）と相同な領域である。
【０１４６】
第二に、ｐＵＣ１８−ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：ＫｍプラスミドをＮｓｉＩ制限酵素で切断することによりΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片を得、その断片を、プロトコール１に従って、エレクトロポレーションによりＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｐｕｒＵ：：ＴＴ０２−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片の挿入を、オリゴヌクレオチドｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−ＦおよびｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−Ｒを用いたＰＣＲ解析により確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：Ｋｍと呼称した。
【０１４７】
ｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−Ｆ（配列番号３９）
【化３４】
2014522642.tif 000039
この配列は、ｐｕｒＵ領域の配列（１２８８５８９〜１２８８６０８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１４８】
ｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−Ｒ（配列番号４０）
【化３５】
2014522642.tif 000040
この配列は、ｐｕｒＵ領域の配列（１２８５８６８〜１２８５８８７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１４９】
第３に、ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾を、プロトコール２に従って、上記のＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：Ｋｍ株のＰ１ファージ溶解液を用いて、株１０に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：Ｋｍ染色体修飾の存在を、プライマーｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−ＦおよびｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−Ｒを用いたＰＣＲにより確認した。得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７：：Ｋｍを株１１と呼称した。
【０１５０】
次に、カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するリコンビナーゼＦＬＰを有するｐＣＰ２０プラスミドを株１１に導入した。３７℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド、ｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−Ｆ／ｐｕｒＵ−ｐｙｃｒｅ−Ｒを用いたＰＣＲ解析により確認した。得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊ｌ／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７を株１２と呼称した。
【０１５１】
３．株１３および株１４の構築
細胞内へのメチレンテトラヒドロ葉酸プールを増加させるために、ｇｃｖＴＨＰオペロンによってコードされるグリシン開裂複合体を、このオペロンの１コピーをｙｊｂＩ遺伝子座において染色体上に付加することにより過剰生産させた。ｇｃｖＴＨＰのこの付加的コピーを、人工誘導性ｔｒｃプロモーターおよび最適リボソーム結合部位を用いて発現させ、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１２／０５１３６１号に記載されているΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体組み込みを得た。
【０１５２】
ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾を、プロトコール２に従って、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１２／０５１３６１に記載されているＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ株のＰ１ファージ溶解液を用いて、株１２に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍ染色体修飾の存在を、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１２／０５１３６１に記載されているプライマーｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−ＦおよびｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｒを用いたＰＣＲにより確認した。得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７：：Ｋｍを株１３と呼称した。
【０１５３】
次に、カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するリコンビナーゼＦＬＰを有するｐＣＰ２０プラスミドを株１３に導入した。３７℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド、ｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−ＦおよびｙｊｂＩ−ｇｃｖＴＨＰ−Ｒを用いたＰＣＲ解析により確認した。得られた株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Δｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７を株１４と呼称した。
【０１５４】
４．株１５の構築
セリン経路への流れを増加させるために、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１２／０５１３６１に記載されているプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａを株１４に導入し、以下の株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）を得、株１５と呼称した。
【０１５５】
実施例７：株１６および株１７の構築
１．株１６の構築
細胞へのグルコース取り込みを増加させるために、大腸菌ＰＥＰ依存性糖ホスホトランスフェラーゼ（ＰＴＳ）系の酵素をコードする複数の遺伝子の発現を制御する転写デュアルレギュレーター(a transcriptional dual regulator)をコードする遺伝子ｄｇｓＡ（またはｍｌｃ）を欠失させた。
【０１５６】
ｄｇｓＡ遺伝子を欠失させるために、Ｋｅｉｏ変異株コレクションの大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍ株（Baba et al., 2006）を用いた。ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍ欠失をＰ１ファージ形質導入により（プロトコール２に従って）、ＢＷ２５１１３  ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍ株から株１４へと移入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍ染色体欠失の存在を、下に定義するプライマーｄｇｓＡ−ＦおよびｄｇｓＡ−Ｒを用いたＰＣＲにより確認した。
【０１５７】
確保した株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０  ７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７  ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍを株１６と呼称した。
【０１５８】
ｄｇｓＡ−Ｆ（配列番号４１）
【化３６】
2014522642.tif 000041
この配列は、ｄｇｓＡ領域の配列（１６６７０６７〜１６６７０８６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１５９】
ｄｇｓＡ−Ｒ（配列番号４２）
【化３７】
2014522642.tif 000042
この配列は、ｄｇｓＡ領域の配列（１６６４８５３〜１６６４８７２）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１６０】
２．株１７の構築
細胞へのグルコース取り込みを増加させるもう一つの方法は、グルコースリン酸転移系の膜透過パートナーであるＰｔｓＧ（ＩＩＣＧｌｃ）を過剰生産することにある。株１５のバックグラウンドにおいてｐｔｓＧを過剰発現させるために、以下のプラスミドを構築した、ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ。
【０１６１】
プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａは、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７（実施例１の株２の構築において上記）および、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１２／０５１３６１に記載されているプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａから誘導される。プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａから、制限酵素ＳｎａＢＩおよびＡｖｒＩＩを用いてＰｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ断片を切断し、その断片をｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７プラスミドの平滑末端化したＰａｃＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａを得た。
【０１６２】
次に、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａを株１６に導入し、以下の株、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７  ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍ（ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）を得、株１７と呼称した。
【０１６３】
このプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７では、ｐｔｓＧ遺伝子の天然プロモーターならびに低分子ＲＮＡ  ｓｇｒＳの結合部位は強力な人工プロモーターで置き換えられている（上の実施例１で記載した構築）。その結果として、ｐｔｓＧは過剰発現されるが、そのｍＲＮＡはもはや調節されることなく、ｓｇｒＳによる分解は起こらない。
【０１６４】
誘導条件（培養物にＩＰＴＧ添加）下で増殖させた株１７におけるｐｔｓＧ遺伝子の過剰発現をｑＰＣＲにより確認した。
【０１６５】
実施例８：株１８の構築
株１８は、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ（特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１２／０５１３６１に記載）の修飾型を保持する株であり、すなわち、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａのクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ゲンタマイシン耐性遺伝子により置き換え、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａとしたものである。
【０１６６】
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａプラスミドの抗生物質耐性遺伝子を置き換えるために、ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＰｌａｃＩｑ−ｌａｃＩ−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｔｓＧ−ＴＴ０７プラスミドの構築について上に記載したものと同じ手順を用いた。
【０１６７】
次に、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａを株１６に導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：Ｔａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ΔｍｅｌＢ：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＡＲＮ０１／ＫＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｐｕｒＵ：：ＲＮ／ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｐｙｃｒｅ−ＴＴ０７  ΔｙｊｂＩ：：ＲＮ／Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１−ｇｃｖＴＨＰ−ＴＴ０７  ΔｄｇｓＡ：：Ｋｍ（ｐＣＣ１ＢＡＣＶＢ０１−ＴＴ０２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＣ−ＴＴ０７＊２−Ｐｔｒｃ３０／ＲＢＳ０１−ｓｅｒＡ−ＴＴａｄｃｃａ）株を得、株１８と呼称した。
【０１６８】
実施例９：振盪フラスコでの発酵によるＬ−メチオニンの生産
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を、混合培地（２．５ｇ．Ｌ−１グルコースおよび９０％最少培地ＰＣ１を含む１０％ＬＢ培地（Sigma  ２５％））中で３０℃で２１時間増殖させた。それを用いて、ＯＤ６００ｎｍが０．２となるようにＰＣ１培地（表２）の培養物５０ｍＬに植菌した。必要な場合には、抗生物質を、スペクチノマイシンは５０ｍｇ．Ｌ−１の濃度で、クロラムフェニコールは３０ｍｇ．Ｌ−１の濃度で、ゲンタマイシンは１０ｍｇ．Ｌ−１の濃度で加えた。ＩＰＴＧを、各実施例で示した異なる濃度で培養物に加えた。培養温度は３７℃であった。培養物のＯＤ６００が５〜７に達したときに、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連代謝産物を、屈折率検出によるＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。各株について数回の反復を行った。
【０１６９】
メチオニン収率は次のように表した：
【数３】
2014522642.tif 000043
【０１７０】
【表２】
2014522642.tif 000044
【０１７１】
異なる株におけるｐｔｓＧ過剰発現のメチオニン生産に対する影響
【表３】
2014522642.tif 000045
【０１７２】
表３で分かるように、メチオニン生産収率はｐｔｓＧの過剰発現により大幅に増加する。２０μΜのＩＰＴＧの場合に最大のｐｔｓＧ誘導が得られ（ｑＰＣＲにより確認。データは示していない）、そのような条件下でメチオニンの最大生産も得られる。さらに、ｐｔｓＧ過剰発現は培養物中のケトメチルバレラート蓄積の減少も可能にする。
【０１７３】
情報として、フラスコ内で培養した対照株１は、ＩＰＴＧを添加しないで株２で得られた収率と同等のメチオニン生産収率を与える。
【０１７４】
【表４】
2014522642.tif 000046
【０１７５】
トランスヒドロゲナーゼ発現を修飾した株４（ｐｎｔＡＢの過剰発現およびｕｄｈＡの欠失）におけるｐｔｓＧの過剰発現はホモランチオニンおよびケトメチルバレラートの産生の減少を可能にする。そのようなバックグラウンドでは、ｐｔｓＧの過剰発現は、メチオニン生産収率を増大させないが最終産物の純度を明らかに向上させる。
【０１７６】
これは、メチオニン生産株におけるグルコース取り込み増加効果の予測が容易ではなかったことを示す。
【０１７７】
ｓｇｒＳおよびｓｇｒＴ欠失のメチオニン生産に対する影響
【表５】
2014522642.tif 000047
上の表５で分かるように、メチオニン収率は遺伝子ｓｇｒＳおよびｓｇｒＴの欠失により大幅に増加する。
【０１７８】
ＳｇｒＳはｐｔｓＧ  ｍＲＮＡの翻訳を直接的にも間接的にも阻害する。ＳｇｒＳの５’末端は、ＰｔｓＧの活性を調節する、４３個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム、ｓｇｒＴを含む。株５では、ｓｇｒＳおよびｓｇｒＴの両遺伝子が欠失しており、メチオニン生産に対する影響はプラス方向であり、ｐｔｓＧの過剰発現の場合に得られた影響と同様である（表３を参照）。
【０１７９】
実施例１０：株１および株２を用いたバイオリアクターにおける発酵によるＬ−メチオニンの生産
続いて、フラスコ内で十分な量の目的代謝産物を生産した株を、流加法を用い、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)において生産条件下で試験した。
【０１８０】
２．５ｇ．Ｌ−１グルコースを添加したＬＢ培地１０ｍＬで増殖させた２４時間培養物を用いて、最少培地（Ｂ１ａ）に２４時間前培養物を植菌した。これらのインキュベーションは、５０ｍＬの最少培地（Ｂ１ａ）の入った５００ｍＬバッフル付フラスコで、回転式振盪培養機（２００ＲＰＭ）に入れて行った。１回目の前培養は３０℃の温度で培養し、２回目の前培養は３４℃の温度で培養した。
【０１８１】
３回目の前培養工程はバイオリアクター(Sixfors)で行い、バイオリアクターには２００ｍＬの最少培地（Ｂ１ｂ）を充填し、濃縮前培養物５ｍＬをバイオマス濃度１．２ｇ．Ｌ−１に植菌した。前培養温度は３４℃で一定に保ち、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて６．８の値に自動調整した。溶存酸素濃度は、空気供給および／または撹拌により大気分圧飽和の３０％の値に連続的に調整した。バッチ培地のグルコース枯渇後、流加を初期流速０．７ｍＬ．ｈ−１で開始し、増殖速度０．１３ｈ−１で２４時間、指数関数的に増加させ、最終細胞濃度約２０ｇ．Ｌ−１を得た。
【０１８２】
【表６】
2014522642.tif 000048
【０１８３】
【表７】
2014522642.tif 000049
【０１８４】
【表８】
2014522642.tif 000050
【０１８５】
【表９】
2014522642.tif 000051
【０１８６】
続いて、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)に６００ｍＬの最少培地（Ｂ２）を充填し、５５〜７０ｍＬの間の範囲の前培養物量をバイオマス濃度２．１ｇ．Ｌ−１に植菌した。
【０１８７】
培養温度は３７℃で一定に保ち、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液の自動添加（ＮＨ４ＯＨ  １０％を９時間、そして、培養終了まで２８％）により作業値（６．８）に維持した。バッチ段階中、初期撹拌速度は２００ＲＰＭに設定し、流加段階中は１０００ＲＰＭまで速めた。バッチ段階中、初期気流速度は４０ＮＬ．ｈ−１に設定し、流加段階開始時に１００ＮＬ．ｈ−１まで速めた。溶存酸素濃度は撹拌回数を増やすことにより２０〜４０％の間の値、好適には、３０％飽和に維持した。
【０１８８】
細胞塊が５ｇ．Ｌ−１に近い濃度に達したら、流加を初期流速５ｍＬ．ｈ−１で開始した。供給溶液は、流速が上昇し２６時間後には２７ｍＬ．ｈ−１に達するＳ字状プロフィールで１４時間注入した。正確な供給条件は下式：
【数４】
2014522642.tif 000052
（式中、Ｑ（ｔ）はバッチ容量６００ｍＬの場合の供給流速（ｍＬ．ｈ−１）である）
により算出した。
【０１８９】
１４時間の間、パラメーターはｐ１＝１．８０、ｐ２＝２２．４０、ｐ３＝０．２７、ｐ４＝６．５０であり、その後、１４時間から２６時間まで、パラメーターはｐ１＝２．００、ｐ２＝２５．００、ｐ３＝０．４０、ｐ４＝９．００であった。
【０１９０】
２６時間の流加後、供給溶液ポンプを止め、グルコース枯渇後に培養を停止した。
【０１９１】
細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連代謝産物を、屈折率検出によるＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０１９２】
【表１０】
2014522642.tif 000053
【０１９３】
表１０で分かるように、株２の培養中に適用されたＩＰＴＧ濃度に関係なく、ｐｔｓＧ過剰発現はメチオニン生産を大幅に向上させる。株２におけるｐｔｓＧ遺伝子の構成的過剰発現（誘導条件：バッチ培地中２０μΜ  ＩＰＴＧ−流加培地中２０μΜ  ＩＰＴＧ）はメチオニン収率を増大させるための最良の条件である。
【０１９４】
ｐｔｓＧの発現の誘導はｑＰＣＲにより調べた。ｐｔｓＧ  ｍＲＮＡのレベルはＩＰＴＧを用いた株２および株３において対照株１よりもずっと高かった。図１の結果を参照。
【０１９５】
ｐｔｓＧ過剰発現により、株２は培養中でもその終了時点でもグルコースを蓄積しない。それに比べて、野生型グルコース取り込みを行う株１は２５時間の増殖後に強いグルコース蓄積を示す。残留グルコース濃度は、株１の場合には１０ｇ／Ｌを上回り、株２の場合には３ｇ／Ｌ未満である。
【０１９６】
グルコース取り込みの向上は、メチオニン生産を向上させるだけでなく、産物の純度も向上させる。
【０１９７】
リアクター容量は、初期容量に、ｐＨ調節および培養物供給のために加える溶液の量を加算し、サンプリングに用いる容量と蒸発により損失する容量を減算することにより算出した。
【０１９８】
流加容量は、供給ストックを秤量することにより連続的に追跡した。次に、注入重量、溶液の密度およびＢｒｉｘ法により決定されたグルコース濃度（［グルコース］）に基づいて、グルコース注入量を計算した。メチオニン収率は次のように表した。
【数５】
2014522642.tif 000054
【０１９９】
各株について培養中に得られた最大収率を本明細書に示した。
【０２００】
この場合、メチオニン０およびメチオニンｔはそれぞれ、初期メチオニン濃度および最終メチオニン濃度であり、Ｖ０およびＶｔは初期容量およびｔ時点における容量である。
【０２０１】
消費グルコースは次のように計算した：
【数６】
2014522642.tif 000055
注入グルコースｔ＝流加容量ｔ＊［グルコース］
消費グルコースｔ＝［グルコース］０＊Ｖ０＋注入グルコース−［グルコース］residual＊Ｖｔ
この場合、［グルコース］０、［グルコース］、［グルコース］residualはそれぞれ、初期グルコース濃度、流加グルコース濃度および残留グルコース濃度である。
【０２０２】
実施例１１
株１５、株１７および株１８を用いたバイオリアクターにおける発酵によるＬ−メチオニンの生産
前培養条件は上に記載した（実施例１０）。
【０２０３】
続いて、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)に６００ｍＬの最少培地（Ｂ２）を充填し、５５〜７０ｍＬの間の範囲の前培養物量をバイオマス濃度２．１ｇ．Ｌ−１に植菌した。バッチ培地Ｂ２の最終リン酸濃度は０〜２０ｍＭの間に含まれる値に調整した。
【０２０４】
培養温度は３７℃で一定に保ち、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液の自動添加（ＮＨ４ＯＨ  １０％を９時間、そして、培養終了まで２８％）により作業値（６．８）に維持した。バッチ段階中、初期撹拌速度は２００ＲＰＭに設定し、流加段階中は１０００ＲＰＭまで速めた。バッチ段階中、初期気流速度は４０ＮＬ．ｈ−１に設定し、流加段階開始時に１００ＮＬ．ｈ−１まで速めた。溶存酸素濃度は撹拌回数を増やすことにより２０〜４０％の間の値、好適には、３０％飽和に維持した。必要な場合には、バッチ培地および流加培地にＩＰＴＧを終濃度２０μΜで加えた。必要な場合には、抗生物質を、カナマイシンは濃度５０ｍｇ．Ｌ−１で、クロラムフェニコールは３０ｍｇ．Ｌ−１で、ゲンタマイシンは１０ｍｇ．Ｌ−１で加えた。
【０２０５】
細胞塊が５ｇ．Ｌ−１に近い濃度に達したら、流加を初期流速５ｍＬ．ｈ−１で開始した。Ｆ２培地の最終リン酸濃度は５〜３０ｍＭの間に含まれる値に調整し、培養中にリン酸制限に達した。供給溶液は、流速が上昇し２６時間後には２７ｍＬ．ｈ−１に達するＳ字状プロフィールで注入した。正確な供給条件は下式：
【数７】
2014522642.tif 000056
（式中、Ｑ（ｔ）はバッチ容量６００ｍＬの場合の供給流速（ｍＬ．ｈ−１）であり、ｐ１＝１．８０、ｐ２＝２２．４０、ｐ３＝０．２７、ｐ４＝６．５０である）
により算出した。この流速は、１０〜５０％、好適には、全培養期間を通じて３０％速められた。
【０２０６】
２６時間の流加後、供給溶液ポンプを止め、グルコース枯渇後に培養を停止した。
【０２０７】
細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連代謝産物を、屈折率検出によるＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０２０８】
【表１１】
2014522642.tif 000057
【０２０９】
比グルコース消費速度（ｑｓ）は、ｐｔｓＧの過剰発現に関連しているかどうかに関係なくｄｇｓＡ遺伝子の欠失により増加した。さらに、メチオニンの生産収率（最大収率および最終収率の両方）がこれらの遺伝子修飾により上昇した。
【０２１０】
メチオニン収率の定義については上の実施例１０を参照。
【０２１１】
比グルコース消費速度（ｑｓ）は次のように計算した。
【数８】
2014522642.tif 000058
（式中、［Ｘ］はｔ時点における細胞濃度である）。
【０２１２】
参照文献：
2014522642.tif 000059
【図１】
2014522642.tif 000060
【配列表】
2014522642000001.app
【国際調査報告】
2014522642.tif 000061
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