(57)【要約】本発明は、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１１１７として中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された新規ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）株に関する。また、本発明は、新規ＰＣＶ２株を含有する免疫原性組成物、ＰＣＶ２試験キット、および新規ＰＣＶ２株の応用に関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のゲノム配列を含むことを特徴とするブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス。
【請求項２】
中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１１１７として寄託されていることを特徴とする請求項１に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス。
【請求項３】
ＰＫ−１５細胞系またはその派生細胞系に細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こすことができることを特徴とする請求項１に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス。
【請求項４】
請求項１に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルスを含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される媒体を更に含むことを特徴とする請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記薬学的に許容される媒体はアジュバントであることを特徴とする請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ＰＣＶ２ウイルスは不活化プロセスで処理されていることを特徴とする請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ＰＣＶ２ウイルスは弱毒化されているか、または請求項１に記載のＰＣＶ２に由来および産生されるサブユニット構築体、ＤＮＡ構築体、もしくは他の形態であることを特徴とする請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）の抗原、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の抗原、マイコプラズマの抗原、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の抗原、丹毒の抗原、および仮性狂犬病ウイルスの抗原からなる群から選択される少なくとも１つの病原体抗原を更に含むことを特徴とする請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ブタサーコウイルス２型感染からブタを防御する方法であって、請求項４に記載の免疫原性組成物を前記ブタに接種して当該ブタのＰＣＶ２に対する免疫力を増加させるステップを含むことを特徴とするブタサーコウイルス２型感染からブタを防御する方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＰＣＶ２ウイルスに由来する抗ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および遺伝子操作抗体の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１１に記載の抗ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載のＰＣＶ２ウイルスのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、および配列番号７の配列の少なくとも１つを有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、および配列番号６の配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）試験キットであって、請求項１に記載のウイルスのウイルス抗原、請求項１に記載のウイルスに由来する抗体、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、および配列番号１の配列を検出する核酸断片からなる群から選択される１以上の検出ユニットを含むことを特徴とする試験キット。
【請求項１６】
前記ウイルス抗原はプレートに堆積されていることを特徴とする請求項１５に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）試験キット。
【請求項１７】
前記ウイルス抗原は不活化プロセスで処理されていることを特徴とする請求項１６に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）試験キット。
【請求項１８】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および遺伝子操作抗体の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１５に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）試験キット。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、および配列番号６の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１５に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）試験キット。
【請求項２０】
前記核酸断片は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１５に記載のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物医療の分野に関し、特に新規ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）株、上記ウイルス株を含有する免疫原性組成物、ＰＣＶ２試験キット、および上記ウイルス株の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、ブタ腎臓細胞系（ＰＫ−１５、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３３）で初めて発見された。ブタサーコウイルスは、ＰＫ−１５細胞を汚染し続けることができるが、汚染したＰＫ−１５細胞に細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こさない。加えて、ＰＫ−１５に由来するＰＣＶは、非病原性であるとみなされている。
ブタサーコウイルスは、ブタに感染することはできても、感染したブタに病変を引き起こさない。ブタサーコウイルスは、１，７５９塩基対（ｂｐ）の環状ゲノムを有する、正２０面体状の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＰＫ−１５に由来するＰＣＶは、１９９５年にサーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類された。
【０００３】
１９９１年、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）が、カナダにおいてブタで最初に記録に残された。ＰＭＷＳは、５〜１２週齢の子ブタに発症する。ＰＭＷＳは、進行性体重減少、呼吸困難、蒼白、および黄疸が時折見られること等の症状を臨床的な特徴とする。その特徴的な顕微鏡的病変には、リンパ器官内の組織球浸潤を伴うリンパ系枯渇、肺炎、肉芽腫性炎症、肝炎、および腎炎が含まれる。
１９９１年にカナダで大流行して以来、ＰＭＷＳは、北アメリカ、ヨーロッパ、およびアジアの多くの国々で報告されている。その後、新たなサーコウイルスが、ＰＭＷＳを有するブタから単離された。ＰＭＷＳ由来ブタサーコウイルスの形態は、ＰＫ−１５由来ＰＣＶの形態とよく似ているが、この２つのブタサーコウイルスは、ゲノム配列では６８〜７６％の相同性を共有しているに過ぎない。更に、非病原性ＰＫ−１５由来ＰＣＶおよび病原性ＰＭＷＳ由来ＰＣＶは、それぞれブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）およびブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）として識別された。
【０００４】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）も、サーコウイルス科に属する。ＰＣＶ２は、直径が１７ｎｍの非エンベロープ正２０面体状一本鎖環状ＤＮＡウイルスであり、最も小型の動物ウイルスの１つであることが知られている。ＰＣＶ２環状ゲノムは、ステムループ構造を有する複製開始点を含有しており、これは、サーコウイルスの共通した特徴である。
ＰＣＶ２ゲノムは、１，７６７個または１，７６８個のヌクレオチドを含み、１１個の潜在的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有すると考えられている。１１個のＯＲＦの中で、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２は、最も重要な遺伝子である可能性が高く、それらは、それぞれ複製（ＲｅｐおよびＲｅｐ’）タンパク質およびカプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードする。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子によりコードされるカプシド（Ｃａｐ）タンパク質は、中和抗体の産生を誘導する抗原である可能性が最も高いだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＣＶ２感染は、世界中のほとんどの養豚場に蔓延している。ＰＣＶ２は、感染したブタの生存率および飼料効率（ＦＣＲ）の低下を引き起こし、養豚に大きな経済的損失をもたらすことが判明している。したがって、ＰＣＶ２試験キットおよびＰＣＶ２に対するワクチンを開発することは重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）の臨床症状を示すブタから単離され、更に分析されて、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）であると確認されたＰＣＶ２株に関する。新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）のゲノムのプラス（＋）鎖は、配列番号１のＤＮＡ塩基配列を有する。新規ＰＣＶ２株は、２０１１年１１月５日に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１１１７として中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ、Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された。
【０００７】
本発明の第２の態様は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）を含有する免疫原性組成物に関する。１つの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）の非活化ウイルスまたは弱毒化ウイルスおよび薬学的に許容される媒体を含むワクチンである。
しかしながら、ワクチンのタイプには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：不活化ワクチン、生（弱毒化）ワクチン（ウイルスの弱毒化による）、サブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、および新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）または新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）のＤＮＡもしくはアミノ酸配列に由来または生成される他のワクチン。
【０００８】
本発明の不活化プロセスには、これらに限定されないが、不活化試薬による処理、熱処理、および当業者に公知の他の処理が含まれる。不活化試薬には、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ、ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、または本発明に好適な他の不活化試薬が含まれる。
【０００９】
薬学的に許容される媒体には、これらに限定されないが、溶媒、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈液、ゲル化剤、保存剤、潤滑剤、界面活性剤、アジュバント、または他の好適な媒体が含まれる。
【００１０】
アジュバントには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：油性アジュバント（鉱油、植物油、動物油、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント等）、水性アジュバント（水酸化アルミニウム等）、２相性乳化アジュバント（水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型乳剤アジュバント等）、生物学的アジュバント（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびトキソイド等）等。２相性乳化アジュバントは、界面活性剤および油性物質を含む。
界面活性剤は、以下のものからなる群から選択される１つまたは複数である：ソルビトール脂肪酸エステル；ソルビトール脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド（またはプロピレンオキシド）の濃縮物；マンニトール脂肪酸エステル：マンニトール脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド（またはプロピレンオキシド）の濃縮物；カルボン酸、アミン、アミド、アルコール、ポリオール、エーテル、およびオキシドからなる群から選択される１つまたは複数である親水基を有する修飾マンニトール脂肪酸エステル；アンヒドロマンニトール脂肪酸エステル；カルボン酸、アミン、アミド、アルコール、ポリオール、エーテル、およびオキシドからなる群から選択される１つまたは複数である親水基を有する修飾アンヒドロマンニトール脂肪酸エステル；サッカロース脂肪酸エステル；サッカロース脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド（またはプロピレンオキシド）の濃縮物；グリセロール脂肪酸エステル；グリセロール脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド（またはプロピレンオキシド）の濃縮物；脂肪酸およびエチレンオキシド（またはプロピレンオキシド）の濃縮物；脂肪アルコールおよびエチレンオキシド（またはプロピレンオキシド）の濃縮物；およびグリセロリン脂質。油性物質は、鉱油、植物油、および動物油からなる群から選択される１つまたは複数である。
【００１１】
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つの病原体抗原を更に含む。病原体抗原には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）の抗原、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の抗原、マイコプラズマの抗原、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の抗原、丹毒の抗原、および仮性狂犬病（オーエスキー病）ウイルスの抗原。
病原体抗原のタイプには、これらに限定されないが、組換えタンパク質、サブユニットタンパク質、遺伝子欠陥を有する病原体、不活化病原体抗原等が含まれる。
【００１２】
本発明の第３の態様は、ブタをＰＣＶ２感染から防御する方法であって、免疫学的有効用量の前記ＰＣＶ２免疫原性組成物をブタに投与して、ＰＣＶ２感染に対するその免疫を増強し、ウイルス血症および臨床症状の重症度を低下させ、生存率および体重を増加させることを含む方法に関する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）に由来する抗ＰＣＶ２抗体に関する。抗体には、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および遺伝子操作抗体が含まれる。１つの好ましい実施形態では、抗体は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）を動物に注射することにより得られるポリクローナル抗体である。別の好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナルハイブリドーマライブラリーのスクリーニングにより得られるモノクローナル抗体である。
【００１４】
本発明の第５の態様は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）のＤＮＡ断片に関する。ＤＮＡ断片は、配列番号１、２、４、および６のヌクレオチド配列を有する。ＤＮＡ断片の応用には、これらに限定されないが、ＤＮＡワクチンおよびサブユニットワクチンの製造、および試料中のＰＣＶ２ウイルスを検出するためのプライマーまたはプローブの設計が含まれる。
１つの好ましい実施形態では、ＤＮＡ断片は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）の全長ゲノム配列（配列番号１）である。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ断片は、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：
配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列を有するオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）、
配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号４のヌクレオチド配列を有するオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）、および
配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号６のヌクレオチド配列を有するオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）。
【００１５】
本発明の第６の態様は、ＰＣＶ２の試験キットに関する。試験キットは、検査試料中のＰＣＶ２ウイルスまたは抗ＰＣＶ２抗体を検出するために使用される。
試験キットには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：（１）１つの好ましい実施形態では、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）の抗原であり、上記抗原は、抗原プレートに配置されており、不活化試薬で不活化されている；（２）新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）に由来するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；（３）新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）の全長ゲノム配列（配列番号１）またはヌクレオチド断片（配列番号２、４、および６）に由来する遺伝子操作抗原または抗体；および（４）新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）の全長ゲノム配列（配列番号１）またはヌクレオチド断片（配列番号２、４、および６）に由来するポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、プライマーおよびプローブが含まれる。１つの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）を検出するために使用でき、配列番号８〜１１のヌクレオチド配列を有するプライマーである。
【００１６】
試験キットのタイプには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：酵素結合免疫吸着測定キット（ＥＬＩＳＡ）、マイクロチップキット、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）キット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キット、および新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）に由来する他の試験キット。１つの好ましい実施形態では、試験キットは、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）を含む少なくとも１枚の抗原プレートを含み、試験キットを使用して、検査試料中の抗ＰＣＶ２抗体を検出できる。
【００１７】
本発明の新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）は、サブカルチャーされた継代培養、および新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）と同様のウイルス特徴、ゲノム、または病原性を有する変異体を全て含む。
【００１８】
本発明での用語「ＤＮＡ（核酸）」および「ポリヌクレオチド」は、天然、単離、組換え、または合成状態で存在し得る。
【００１９】
本発明での用語「アミノ酸」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、天然、単離、組換え、または合成状態で存在し得る。
【００２０】
用語「予防する」、「防御する」、および「に対する」は、開示された免疫原性組成物によるワクチン接種を受けない動物と比較して、開示された免疫原性組成物によるワクチン接種を受けた動物が、ＰＣＶ２感染およびＰＣＶ２感染に起因する関連疾患に対する能力の増強を示すことができるという観察に関する。
【００２１】
本明細書に記載の技術用語および科学用語の意味は、当業者であれば明白に理解できる。
【００２２】
本発明は、以下の例示的な例において、より詳細に説明される。これらの例は、本発明の単なる選択された実施形態を表し得るものの、以下の例は例示であり限定ではないことが理解されるべきである。
本発明は、以下の詳細な説明および添付の図面を用いるとより容易に理解可能になるが、それらは例示目的で示されているに過ぎず、したがって本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】４日間培養した未感染ＰＫ−１５細胞（倍率（１００×））
【図１Ｂ】４日間培養した、ＰＣＶ２  Ｈ株に感染したＰＫ−１５細胞（倍率（１００×））。
【図２】ＰＣＶ２  Ｈ株ゲノム配列の系統発生解析。
【図３】ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２アミノ酸配列（配列番号５）と、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにある、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２アミノ酸配列に最も高い配列類似性を示す３つの他のアミノ酸配列とのアラインメント。
【図４】ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２アミノ酸配列と、ＰＣＶ２  ２ｄのプロトタイプ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＺＪ０９５５ｂ）のＯＲＦ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＤＤ２５７７２）とのアラインメント。
【図５】ＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンをワクチン接種したマウスから、様々な時点で採取した血清試料のＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡの結果。
【図６】ＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンをワクチン接種した子ブタから、様々な時点で採取した血清試料のＰＣＶ２  ＩＦＡの結果。
【図７】ＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンをワクチン接種した子ブタの体重。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、以下の例により説明されることになるが、本発明は、それらに限定されることはない。
【００２５】
実施例１：ＰＣＶ２ウイルスの単離および特定
１．種ウイルスの供給源および単離：
組織試料は、Ｈｓｉｎ−Ｃｈｕ（台湾）の養豚場の子ブタの肺およびリンパ節から採取した。これら子ブタは８週齢であり、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＷＭＳ）の臨床症状を示していた。肺およびリンパ節試料を採取し、−７０℃で凍結した。
【００２６】
ウイルスを単離するために、組織試料をホモジナイズし、０．２ｍｌの各ホモジネートを、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ブタアデノウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、マイコプラズマ、および細菌に感染していないＰＫ−１５単層細胞またはその派生細胞系に播種した。
細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした後、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ2にて４時間、２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地でインキュベートした。
その後、ＭＥＭ培地を廃棄し、細胞を、３００ｍＭ  Ｄ−グルコサミンと共に３０分間インキュベートした。その後、細胞を無菌ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2にて７２時間、８％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地でインキュベートした。最後に、細胞培養を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）でＰＣＶ２について試験した。
【００２７】
ＩＦＡのプロトコールは、以下のように記述される。最初に、試料細胞を、無菌ＰＢＳで３回、毎回５分間洗浄し、７５μｌの８０％アセトンで４℃にて３０分間固定した。その後、アセトンを廃棄し、細胞を、無菌ＰＢＳで３回、毎回５分間洗浄した。その後、細胞を、７５μｌのブタサーコウイルス抗ウイルスポリクローナル抗血清（ＶＭＲＤ（登録商標））（一次抗体、ＰＢＳで１：１５００希釈）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。
その後、抗血清を廃棄し、細胞を、無菌ＰＢＳで３回、毎回５分間洗浄した。その後、細胞を、７５μｌのウサギ抗ブタＩｇＧ−ＦＩＴＣ（分子全体）（Ｓｉｇａｍａ社、Ｆ１６３８）（二次抗体、ＰＢＳで１：１０００希釈）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、抗体を廃棄し、細胞を、無菌ＰＢＳで３回、毎回５分間洗浄した。最後に、９６ウエル培養皿中の細胞試料の各々を、蛍光顕微鏡検査用に２００μｌのＰＢＳ中にマウントした。
【００２８】
細胞に感染し、ＩＦＡの結果が最も陽性だったウイルスを、種ウイルスとして選択した。その後、配列番号１に示されているように、種ウイルスのゲノム配列を決定した。配列をアラインし、分析し、最終的にＰＣＶ２の新株であることを確認した（配列アラインメントの分析および結果は、下記に記載されている）。この新規ＰＣＶ２株を、ＰＣＶ２  Ｈ株と命名する。
【００２９】
２．種ウイルスのサブカルチャー
新しく調製したＰＫ−１５細胞またはその派生細胞系に、新規ＰＣＶ２株（ＰＣＶ２  Ｈ株）を播種した。播種細胞から回収したウイルスは、ＰＣＶ２  Ｈ株の継代１（Ｐ1）だった。ＰＣＶ２  Ｈ株のＰ1を含有する細胞培養上清を収集し、希釈（１：２）し、新しく調製したＰＫ−１５細胞またはその派生細胞系に播種した。
播種細胞を３日間インキュベートした後、ＰＣＶ２  Ｈ株の継代２（Ｐ2）を含有する細胞培養上清を収集し、希釈（１：２）し、新しく調製したＰＫ−１５細胞またはその派生細胞系に播種した。播種細胞を３日間インキュベートし、次に、ＰＣＶ２  Ｈ株の継代３（Ｐ3）を含有する細胞培養上清を収集した。このプロセスを、更に３回繰り返して、ＰＣＶ２  Ｈ株の継代６（Ｐ6）を得た。
【００３０】
図１Ｂに示されるように、ＰＣＶ２  Ｈ株を播種したＰＫ−１５細胞またはその派生細胞系の培養過程中、播種細胞に細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された。加えて、図１Ａには、培養４日後の非播種ＰＫ−１５細胞の形態および増殖（１００×）が示されており、図１Ｂには、ＰＣＶ２  Ｈ株を播種したＰＫ−１５細胞の培養４日後の形態および増殖（１００×）が示されている。同様に、ＰＣＶ２  Ｈ株を播種したＰＫ−１５由来細胞系で観察されたＣＰＥは、図１Ｂを参照すれば参考にできる。
【００３１】
３．種ウイルスの特定：
本発明で単離されたＰＣＶ２  Ｈ株のゲノムは、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。配列番号１のヌクレオチド配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列と比較した。
比較の結果は、ＰＣＶ２  Ｈ株が、幾つかのＰＣＶ２配列（表１）と９９％相同性であったことを示したが、データベースには、ＰＣＶ２  Ｈ株のゲノム配列（配列番号１）と同一（１００％相同性）である配列は存在しない。したがって、アラインメントの結果に基づくと、本発明で単離されたウイルス、ＰＣＶ２  Ｈ株は、ＰＣＶ２ファミリーに属し、新しい株であることが示されている。
図２に示されているＰＣＶ２  Ｈ株のゲノム配列の系統発生解析に基づくと、ＰＣＶ２  Ｈ株は、ＰＣＶ２  ２ｄサブグループのメンバーであることが示されている。
【００３２】
【表１】
2014507124.tif 000003
【００３３】
解析により、本発明のＰＣＶ２  Ｈ株が、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１、２、および３を有することが示されている。ＯＲＦ１は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列を有する。ＯＲＦ２は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号４のヌクレオチド配列を有する。ＯＲＦ３は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号６のヌクレオチド配列を有する。
【００３４】
ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質は、中和抗体の産生を誘導する抗原である可能性が最も高いと考えられるため、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２のヌクレオチド配列（配列番号４）およびアミノ酸配列（配列番号５）を、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列と比較した。
比較の結果は、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２のヌクレオチド配列（配列番号４）またはアミノ酸配列（配列番号５）と同一（１００％相同性）の配列が、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースには存在しないことを示している。ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号５）とＧｅｎｂａｎｋデータベース配列との最も高い相同性は、９８％であった。
図３には、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号５）と最も高い相同性を示す上位３つの配列とのアラインメントが示されており、このアラインメントによると、配列番号５の６つのアミノ酸が、上位３つの配列と異なっていることが示されている。ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号５）を、ＰＣＶ２  ２ｄサブグループプロトタイプ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＺＪ０９５５ｂ）のＯＲＦ２のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＤＤ２５７７２）と更に比較した。
図４に示されている結果は、この２配列間では７つのアミノ酸が異なっており、この２配列は、９７％相同性を共有していることを示す。
【００３５】
加えて、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ１およびＯＲＦ３のヌクレオチド配列（配列番号２および６）およびアミノ酸配列（配列番号３および７）を、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列と比較した。比較の結果は、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ１またはＯＲＦ３のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列と同一（１００％相同性）の配列が、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースには存在しないことを示している。
【００３６】
この解析により、本発明のＰＣＶ２  Ｈ株は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の新規株であることが示されている。新規ＰＣＶ２株は、２０１１年１１月５日に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１１１７として中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された。
【００３７】
実施例２：ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンの調製
１．ウイルス培養
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ブタアデノウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、マイコプラズマ、および細菌に感染していないＰＫ−１５細胞を、３７℃、５％ＣＯ2にて細胞培養増殖培地（５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地（ｐＨ７．２±０．２））で培養した。
ＰＫ−１５細胞の単層が形成された後、ＰＫ−１５細胞を、０．２％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、細胞計数用の細胞培養維持培地（２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地（ｐＨ７．４±０．２））に懸濁した。その後、細胞を、細胞培養増殖培地で３．０×１０5細胞／ｍｌの終濃度に希釈し、ローラーボトルに配分し、３７℃にて３〜４日間培養してコンフルエント単層に到達させた。その後、ローラーボトル内部の細胞培養培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで洗浄した。
ＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス原液を、細胞培養維持培地で１０4.0ＴＣＩＤ50／ｍｌの終濃度に希釈し、ローラーボトルのＰＫ−１５細胞単層に播種した。ウイルスを増殖させるため、感染細胞を、３７℃で４８〜９６時間インキュベートした。ＰＣＶ２  Ｈ株のウィルス力価を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によりモニターした。その後、ＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス溶液を収集するため、ウイルス力価が１０6.0ＴＣＩＤ50／ｍｌ以上に達したか、または細胞変性効果（ＣＰＥ）が７０〜８０％に達した時点で、細胞培養の上清を回収した。
【００３８】
２．不活化プロセス
３７パーセント（３７重量％）のホルムアルデヒドを、前述のステップで収集したＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス溶液に添加して、終濃度を０．２％（ｗ／ｖ）にし、その後ウイルスを、３７℃にて少なくとも２４時間、好ましくは４８時間、ホルムアルデヒドと共に連続振とうすることにより不活化した。ウイルスを完全に不活化した後、ホルムアルデヒドを含有するＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス溶液を遠心分離して、ホルムアルデヒドを除去した。その後、遠心分離したウイルス溶液を、蒸留水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝溶液に懸濁し、懸濁ウイルス溶液を、ＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンの不活化抗原原液とし、後の使用のために４℃で保管した。
【００３９】
３．ＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンの調製
水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）乳剤用のＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ  ２０６油性ワクチンアジュバント等の無菌２相性乳化アジュバントを、混合および乳化するために、乳剤タンク内のＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンの不活化抗原原液に添加して、終濃度５０％（ｖ／ｖ）にした。乳化産物は、油性アジュバントを有するＰＣＶ２  Ｈ株不活化ワクチンである。
【００４０】
本発明のＰＣＶ２不活化ワクチンに好適な、当業者に知られている他のアジュバントも、本発明においてアジュバントとして使用できる。
この例で使用される２相性乳化アジュバント（水中油中水型乳剤アジュバント等）は、これらに限定されないが、以下のものに置き換えることができる：油性アジュバント（鉱油、植物油、動物油、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント等）、水性アジュバント（水酸化アルミニウム等）、生物学的アジュバント（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびトキソイド等）。
【００４１】
実施例３：ＰＣＶ２試験キットの調製−１
この例におけるＰＣＶ２試験キットは、ＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス抗原を含有する抗原プレートである。最初に、ＰＫ−１５細胞またはその単クローン細胞系を培養し、トリプシン処理し、２×１０5細胞／ｍｌの終濃度で細胞培養培地に再懸濁した。５０マイクロリットル（μｌ）のＰＫ−１５細胞および５０μｌのＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス原液（１×１０3ＴＣＩＤ50／ｍｌ）を、９６ウエル細胞培養プレート（平底）の各ウエルに添加し、３７℃、５％ＣＯ2にて７２時間インキュベートした。
ＰＣＶ２  Ｈ株に感染した細胞を、無菌ＰＢＳで２回洗浄し、室温にて１５分間８０％アセトンで固定した。その後、アセトンを廃棄し、細胞を、無菌ＰＢＳで３回洗浄した。その後、プレートを逆さまにし、次いで３７℃のインキュベータで乾燥させた。乾燥させたプレートは、ＰＣＶ２  Ｈ株のウイルス抗原を含有する抗原プレートであり、ＥＬＩＳＡ試験に使用して、血清試料中のＰＣＶ２に対する抗体量を検出できる。その後、プレートを、後の使用のために−２０℃で保管した（Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。
【００４２】
実施例４：ＰＣＶ２試験キットの調製−２
この例におけるＰＣＶ２試験キットは、ＰＣＶ２  Ｈ株の組換えカプシドタンパク質を含有する抗原プレートである。組換えカプシドタンパク質は、抗原プレートの抗原である。カプシドタンパク質は、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２遺伝子によりコードされており、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
最初に、ＰＣＶ２  Ｈ株のＯＲＦ２ヌクレオチド配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＶ２  Ｈ株のウィルスＤＮＡを、ＰＣＲ反応のテンプレートＤＮＡとして使用した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、ＯＲＦ２ヌクレオチド配列を増幅するように設計した。この例における順方向プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を有しており、この例における逆方向プライマーは、ＸｈｏＩ切断部位を有する。当業者であれば、本発明のＯＲＦ２ヌクレオチド配列（配列番号４）に従って、プライマーを設計できる。
ＰＣＲ反応には、８μｌのテンプレートＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（ＭＤＢｉｏ社）、８μｌのｄＮＴＰ（各１．２５ｍＭ）、１μｌの各プライマー（各５０μＭ）、および０．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＤＢｉｏ社）を含有ししており、最終容積が５０μｌであるＰＣＲ混合液を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００反応装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に設置した。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ混合液を９５℃で５分間予熱する初期ステップから開始し、ＤＮＡ増幅は、以下のパラメーターのサイクルを２５回繰り返すことにより実施した：９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長。ＰＣＲ反応は、７２℃で５分間の最終伸張ステップで終了した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ−Ｍクリーンアップキット（Ｖｉｏｇｅｎｅ社）で精製した。
【００４４】
精製した後、ＰＣＲ産物を、ｐＥＴ２４ａ発現ベクターに構築した。精製したＰＣＲ産物およびｐＥＴ２４ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、２つの制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで、３７℃にて８時間それぞれ消化した。
制限酵素切断反応の後、消化したＰＣＲ産物およびｐＥＴ２４ａ発現ベクターを、ＰＣＲ−Ｍクリーンアップキット（Ｖｉｏｇｅｎｅ社）を用いてそれぞれ精製した。精製したＰＣＲ産物を、精製したｐＥＴ２４ａ発現ベクターにライゲーションし、ライゲーション産物を宿主細胞（大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入した。形質転換体を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定法により正確な配列を有するクローンを特定し、ｐＥＴ２４ａ−ＯＲＦ２と命名した。
【００４５】
ｐＥＴ２４ａ−ＯＲＦ２を有する細菌を、２ｍｌのＬＢ培地中で１６〜１８時間３７℃にて培養し、その後培養物を、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する新しいＬＢ培地に１：５０の比率で添加し、３７℃、２００ｒｐｍにて培養した。波長６００ｎｍにおける培養物の光学密度（ＯＤ６００）が０．６に達したら、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの終濃度になるように培養に添加し、培養物を、３７℃、２００ｒｐｍにて更に６時間インキュベートした。
１ミリリットルの培養物を遠心分離し（１０，０００×ｇ）、次いで、Ｂ−ＰＥＲＴＭ細菌タンパク質エクストラクション（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ社）を用いて、組換えタンパク質が、可溶性タンパク質かまたは封入体かを決定した。４０マイクロリットル（μｌ）の試薬を、遠心分離した細菌に添加し、１分間ボルテックスミキサーで振とうした。その後、混合物を１０，０００×ｇで遠心分離した。
上清に懸濁されていたタンパク質は、可溶性タンパク質であり、下部（ペレット）のタンパク質は封入体だった。可溶性タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の１×試料緩衝液に溶解し、封入体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の２×試料緩衝液と混合した。試料は両方とも、２０分間沸騰させ、その後遠心分離した。両試料の上清中のタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＣＶ２  Ｈ株の組換えカプシドタンパク質の発現を分析した。分析後、ＰＣＶ２  Ｈ株の組換えカプシドタンパク質を使用して、抗原プレートを製作した。
【００４６】
ＰＣＶ２  Ｈ株の組換えカプシドタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ９．６）で希釈して、終濃度を１０μｇ／ｍｌにした。希釈した組換えタンパク質を、３７℃で２時間、その後４℃で一晩、９６ウエル細胞培養プレート（平底）にコーティングした（１００μＬ／ウエル）。その後、プレートの各ウエルをＰＢＳで３回３〜５分間洗浄し、２００μｌの０．１５％ＢＳＡブロッキング溶液を添加し、組換えタンパク質を３７℃で２時間ブロッキングした。プレートの各ウエルをＰＢＳで洗浄した後、後の使用のためプレートを４℃で保管した。
【００４７】
実施例５：抗ＰＣＶ２  Ｈ株抗体の調製
１．抗ＰＣＶ２  Ｈ株ポリクローナル抗体
十分なウィルス力価を有する不活化ＰＣＶ２  Ｈ株を、フロインド完全アジュバント等の好適なアジュバントと混合した。混合物を、マウス、ブタ、ヤギ、およびウサギ等の動物に一次接種した。必要に応じて、適切な期間をおいて（２〜３週間等）二次免疫を実施してもよい。
更に適切な期間をおいて（２〜３週間等）、接種した動物の血清を、抗ＰＣＶ２  Ｈ株ポリクローナル抗体として採取した。
【００４８】
抗ＰＣＶ２  Ｈ株ポリクローナル抗体は、必要に応じて、発色リポーターまたは蛍光体と結合させることができる。
【００４９】
必要に応じて、一次または二次免疫後、接種した動物に更にワクチン接種を行って抗体価を増加させることができる。
【００５０】
抗ＰＣＶ２  Ｈ株ポリクローナル抗体を産生するために接種できる動物には、これらに限定されないが、マウス、ウサギ、トリ（卵）、ブタ、ヤギ、ウシ、および水生動物が含まれる。
【００５１】
２．抗ＰＣＶ２  Ｈ株モノクローナル抗体
十分なウイルス力価を有する不活化ＰＣＶ２  Ｈ株またはＰＣＶ２  Ｈ株の特異的抗原断片（ＯＲＦ２等）を、動物（マウス等）に一次接種した。必要に応じて、非活化ウイルスまたは抗原断片を、フロインド完全アジュバント等の好適なアジュバントと混合できる。また、必要に応じて、適切な期間をおいて（２〜３週間等）二次免疫を実施してもよい。
更に適切な期間をおいて（２〜３週間等）、接種した動物の血清を採取して、動物の脾臓細胞が、抗ＰＣＶ２  Ｈ株モノクローナル抗体の産生に好適か否かを評価した。接種した動物から採取した好適な脾臓細胞およびミエローマ細胞（ＦＯ細胞系およびＮＳ細胞系等）の細胞融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００等のＰＥＧ）を使用して達成した。適切な特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを融合細胞から選択し、次いで、抗ＰＣＶ２  Ｈ株モノクローナル抗体を産生するのに好適なハイブリドーマにサブクローニングした。
【００５２】
抗ＰＣＶ２  Ｈ株モノクローナル抗体は、試験キット、治療、または動物の免疫を増強する食品もしくは飼料サプリメントに使用できる。
【００５３】
実施例６：不活化ＰＣＶ２ワクチンの効力試験−１
１．ワクチン接種プロトコールおよび試料採取
５〜６週齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）Ｂａｌｂ／ｃマウスを、無作為に各群１５匹マウスの４群に分割した。ＥＬＩＳＡ試験は、６０匹のマウス全てが、抗ＰＣＶ２抗体に陰性だったことを示した。３ワクチン接種群（第１群〜第３群）のマウスに、３つのロット違いの０．２ｍｌ不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンをそれぞれ筋肉内注射した。一次免疫（ｐ．ｉ．）の２週間後に、３ワクチン接種群のマウスを、同じ用量の３つのロット違いのワクチンで追加免疫した。第４群のマウスにはワクチン接種をせず、陰性対照とした。一次免疫（ｐ．ｉ．）の２、３、４、および５週間後に、各群から５匹のマウスを無作為に選択し、血清試料を採取した。血清試料は全てＥＬＩＳＡにより試験した。
【００５４】
２．ＥＬＩＳＡによる抗ＰＣＶ２抗体の検出
実施例３または４で調製した抗原プレートは、この例ではＥＬＩＳＡプレートとして使用できる。ＥＬＩＳＡプレートを、５００μｌ／ＬのＴｗｅｅｎ−２０を含有する５０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）（つまり、ＰＢＳＴ）で、３回、毎回３〜５分間洗浄した。
ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングするために、２００μＬの０．１５％ＢＳＡブロッキング溶液を、ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、その後、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで洗浄した。マウス血清試料を、ＰＢＳで５０倍（１：５０）希釈し、その後、２倍連続希釈を行った。希釈した血清試料を、ＥＬＩＳＡプレートのウエルに添加し（１００μｌ／ウエル）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ウサギ抗マウス二次抗体等）を、ウエルに添加した。
３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで洗浄した。結果を視覚化するため、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウエルに添加した。インキュベーションした後、２ｍＭ  Ｈ2ＳＯ4を添加することにより反応を停止させた。結果は、陽性対陰性（Ｐ／Ｎ）比として報告した。Ｐ／Ｎ比は、所与の試験試料の４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ450）を、標準陰性対照のＯＤ450で除算することにより算出した。Ｐ／Ｎ比≧２．１を、陽性とみなした。Ｐ／Ｎ比≧２．１の最大希釈を、血清試料のＥＬＩＳＡ抗体価とみなした。
【００５５】
ＨＲＰおよびＴＭＢに加えて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の同じ機能を有する他の発色リポーターまたは蛍光体も、この例で使用できる。
【００５６】
３．結果
一次免疫（ｐ．ｉ．）の２週間後に、抗ＰＣＶ２  Ｈ株抗体が全てのワクチン接種マウスで検出された。二次免疫後、ワクチン接種マウスのＥＬＩＳＡ抗体価は、一次免疫後日数（ｄ．ｐ．ｉ．）３５日で１８００〜２０００に達した（図５）。したがって、これらの結果は、本発明の不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンが、マウスの免疫応答を効果的に誘導できたことを示した。
【００５７】
実施例７：不活化ＰＣＶ２ワクチンの効力試験−２
１．ワクチン接種プロトコールおよび試料採取
５〜６週齢の２匹の健常子ブタに、１ｍｌの不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンをそれぞれ筋肉内注入した。一次免疫（ｐ．ｉ．）の３週間後に、同じ用量のワクチンで子ブタを追加免疫した。血清試料を、一次免疫前（５〜６週齢）、二次免疫前（８〜９週齢）、および二次免疫の２週間後（１０〜１１週齢）に両子ブタから採取した。血清採取と同じ時点で、両子ブタを計量した。血清試料は全てＥＬＩＳＡにより試験した。
【００５８】
２．ＥＬＩＳＡによる抗ＰＣＶ２抗体の検出
実施例３または４で調製した抗原プレートは、この例ではＥＬＩＳＡプレートとして使用できる。ＥＬＩＳＡプレートを、５００μｌ／ＬのＴｗｅｅｎ−２０を含有する５０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）（つまり、ＰＢＳＴ）で、３回、毎回３〜５分間洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングするために、２００μＬの０．１５％ＢＳＡブロッキング溶液を、ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、その後、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで洗浄した。
ブタ血清試料を、ＰＢＳで５０倍（１：５０）希釈し、その後、２倍連続希釈を行った。希釈した血清試料を、ＥＬＩＳＡプレートのウエルに添加し（１００μｌ／ウェル）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ヤギ抗ブタ二次抗体等）を、ウエルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで洗浄した。結果を視覚化するために、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウエルに添加した。インキュベーション後、２ｍＭ  Ｈ2ＳＯ4を添加することにより反応を停止させた。
結果は、陽性対陰性（Ｐ／Ｎ）比として報告した。Ｐ／Ｎ比は、所与の試験試料の４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ450）を、標準陰性対照のＯＤ450で除算することにより算出した。Ｐ／Ｎ比≧２．１を、陽性とみなした。Ｐ／Ｎ比≧２．１の最大希釈を、血清試料のＥＬＩＳＡ抗体価とみなした。
【００５９】
３．結果
一次免疫（ｐ．ｉ．）の３週間後に、抗ＰＣＶ２  Ｈ株抗体が両ワクチン接種子ブタで検出された。二次免疫の２週後、ワクチン接種した子ブタのＥＬＩＳＡ抗体価は、１１，０００を超えていた（表２）。したがって、これらの結果は、本発明の不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンが、ブタの免疫応答を効果的に誘導できたことを示した。
【００６０】
【表２】
2014507124.tif 000004
【００６１】
実施例８：不活化ＰＣＶ２ワクチンの効力試験−３
１．ワクチン接種プロトコールおよび試料採取
２週齢の４０匹の健常子ブタを、各群１０匹子ブタの４群に無作為に分割した。３週齢時に、３ワクチン接種群（第１群〜第３群）の子ブタに、３つのロット違いの１ｍｌ不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンをそれぞれ筋肉内注射した。一次免疫（ｐ．ｉ．）の３週間後に、同じ用量のワクチンで子ブタを追加免疫した。第４群の子ブタにはワクチン接種をせず、陰性対照とした。血清試料を、一次免疫の１週間前（２週齢）、ならびに一次免疫の１、２、３、および５週間後（それぞれ、４週齢、５週齢、６週齢、および８週齢）に、全ての子ブタから採取した。子ブタは全て、３、４、５、６、および８週齢時に計量した。血清試料は全てＥＬＩＳＡにより試験した。
【００６２】
【表３】
2014507124.tif 000005
【００６３】
２．ＩＦＡによる抗ＰＣＶ２抗体の検出
実施例３で調製した抗原プレートを、この例で使用した。抗原プレートを、−２０℃から取り出し、３７℃で解凍および乾燥した。ブタ血清試料を、ＰＢＳで５０倍（１：５０）希釈し、その後２倍連続希釈を行った。希釈した血清試料を、抗原プレートのウエルに添加し（５０μｌ／ウエル）、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、未結合抗体を除去した。その後、５０マイクロリットル（５０μｌ）のＦＩＴＣ結合ウサギ抗ブタＩｇＧ（１：１００、Ｓｉｇｍａ社）を、ウエルに添加した。暗所で３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で検査して、抗ＰＣＶ２  Ｈ株抗体の力価を算出した。（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ａｒｒｉｏｊａら、２０００年）
【００６４】
３．結果
３．１  抗体価
一次免疫（ｐ．ｉ．）の２週間後、ワクチン接種子ブタ（５週齢）に由来する血清試料は、約６００のＩＦＡ力価を示したが、対照群に由来する血清試料は、約２００のＩＦＡ力価を示した（表４および図６）。二次免疫後、ワクチン接種子ブタ（６週齢）のＩＦＡ力価は劇的に増加した（ＩＦＡ力価は、１３，０００を超えている）。８週齢では、ワクチン接種子ブタは、４６，０００を超えるＩＦＡ力価を示したが、非ワクチン接種子ブタは、約１７０の非常に低いＩＦＡ力価を示した。
【００６５】
【表４】
2014507124.tif 000006
【００６６】
３．２  体重増加
ワクチン接種子ブタは、対照群の非ワクチン接種子ブタよりも高い体重増加を示した（表５および図７）。８週齢では、ワクチン接種子ブタは、非ワクチン接種子ブタよりも体重が約２ｋｇ重かった。
【００６７】
【表５】
2014507124.tif 000007
【００６８】
したがって、これらの結果は、本発明の不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンが、ブタの免疫応答を効果的に誘導し、ブタの免疫を増強し、その後ブタの体重を増加させることができたことを示した。
【００６９】
実施例９：不活化ＰＣＶ２ワクチンの効力試験−４
１．ワクチン接種プロトコールおよびＰＣＶ２感染
１４〜１６日齢の子ブタを、各群５匹子ブタの４群に無作為に分割した。２０匹の子ブタは全て、抗ＰＣＶ２抗体に陰性だった。３ワクチン接種群（第１群〜第３群）の子ブタに、３つのロット違いの１ｍｌ不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンをそれぞれ筋肉内注射した。
一次免疫（ｐ．ｉ．）の２週間後、同じ用量のワクチンで子ブタを追加免疫した。第４群の子ブタにはワクチン接種をせず、陰性対照とした。一次免疫の５週間後に、全ての子ブタを、１ｍｌ当たり１０6.0の５０％組織培養感染用量（１０6.0ＴＣＩＤ50／ｍｌ）のＰＣＶ２  Ｈ株（毒性株）ウイルス原液で負荷した。各子ブタを、１ｍｌのウイルス原液で鼻腔内に、および２ｍｌのウイルス原液で筋肉内に負荷した。血清および鼻腔スワブ試料を、負荷の７、１１、１９、および２５日後に採取して、ＰＣＲによりＰＣＶ２ウイルス血症を検出した。
【００７０】
２．ＰＣＲによるＰＣＶ２ウイルス血症の検出
ＰＣＲを使用して、ＰＣＶ２負荷後に採取したブタ血清試料中のウィルスＤＮＡレベルを決定した。ウィルスＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ（登録商標）試薬で抽出した。最初に、４００μｌのＤＮＡｚｏｌ（登録商標）試薬を、２００μｌの血清に添加し、混合物を１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を２倍容積の無水エタノールと混合して、ＤＮＡを沈殿させた。混合物を、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上清を廃棄した。ＤＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してエタノールを除去し、最終的に８ｍＭ  ＮａＯＨに溶解した。
【００７１】
ＰＣＶ２ウイルス血症を検出するために使用されるＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する。
ＰＣＶ２−Ｆ１：５’ＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＴＧＣＣ３’  （配列番号８）
ＰＣＶ２−Ｒ１：５’ＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣ３’  （配列番号９）
ＰＣＶ２−Ｆ１（順方向）およびＰＣＶ２−Ｒ１（逆方向）プライマーを使用して、ＰＣＶ２のＯＲＦ１に由来する２８４ｂｐ断片を増幅した。最終容積を２５μｌとしたＰＣＲ混合物は、１μｌの順方向プライマー、１μｌの逆方向プライマー、１．５μｌの２５ｍＭ  Ｍｇ2+、２．０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５μｌの１０×無Ｍｇ2+緩衝液、０．２μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１１．８μｌの蒸留水、および５μｌのテンプレートＤＮＡを含有していた。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ混合液を９５℃で５分間予熱する初期ステップから開始し、ＤＮＡ増幅は、以下のパラメーターのサイクルを３８回繰り返すことにより実施した：９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長。ＰＣＲ反応は、７２℃で５分間の最終伸長ステップで終了し、その後４℃で維持した。次に、ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで分析し、臭化エチジウム染色により視覚化した。
【００７２】
加えて、ＰＣＶ２ウイルス血症を検出するために使用した別の対のＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する。
ＰＣＶ２−Ｆ２：５’ＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＴＧ’３  （配列番号１０）
ＰＣＶ２−Ｒ２：５’ＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＴ’３  （配列番号１１）
ＰＣＶ２−Ｆ２（順方向）およびＰＣＶ２−Ｒ２（逆方向）プライマーを使用して、ＰＣＶ２に由来する６７６ｂｐ断片を増幅した。
【００７３】
３．解剖学的構造および病理学的分析
負荷の２５日後、子ブタを犠牲にして解剖し、器官の病理学的異常を観察し、リンパ節および肺を採取した。組織試料を、４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、その後薄片にした。組織切片をヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡で観察した。
【００７４】
４．結果
４．１  ウイルス血症の評価
ＰＣＲの結果は、負荷の２５日後に、ワクチン接種子ブタ（第１群〜第３群）におけるウイルス血症の発症率が、非ワクチン接種子ブタ（第４群）における発症率より、４０〜６０％低かったことを示した（表６）。これらの結果は、本発明の不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンが、ブタの免疫を誘導し、ブタのウイルス血症の重症度および持続期間を低減し、ＰＣＶ２感染からブタを防御できたことを示した。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
４．２  病理組織検査
負荷の２５日後に子ブタを犠牲にして解剖した。鼠径部、縦隔、および腸間膜リンパ節の肥大が、２匹の非ワクチン接種子ブタに見られ、リンパ節の切片は蒼白だった。別の非ワクチン接種子ブタは、虚脱していない弾力性のある肺、肺水腫、および白斑腎（ｗｈｉｔｅ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｋｉｄｎｅｙ）を有していた。ワクチン接種子ブタは全て、肉眼でわかる病理学的異常を示さなかった（表７及び表８）。
【００７７】
【表７】
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【００７８】
表８には、組織切片の顕微鏡病理組織検査の結果、およびＰＣＲによるＰＣＶ２ウイルス血症の評価結果が示されている。リンパ球枯渇およびマクロファージ浸潤等のリンパ節の組織病理学的病変が、ほとんど全ての非ワクチン接種子ブタ（第４群）で観察され、非ワクチン接種子ブタから試料採取したリンパ節は全て、ＰＣＶ２ウイルス血症に陽性だった。
加えて、炎症性細胞浸潤等の肺の組織病理学的病変が、３匹の非ワクチン接種子ブタに観察され、非ワクチン接種子ブタから試料採取した肺組織のうちの２つが、ＰＣＶ２ウイルス血症に陽性だった。非ワクチン接種子ブタと比較して、ワクチン接種子ブタは、組織病理学的病変およびＰＣＶ２ウイルス血症の著しい低減を示した。リンパ節の組織病理学的病変は、ワクチン接種子ブタ１５匹（第１群〜第３群）中１匹（ブタ番号Ａ４）でしか観察されず、ワクチン接種子ブタ（ブタ番号Ａ４）から試料採取したリンパ節が、ＰＣＶ２ウイルス血症陽性の唯一のリンパ節だった。これらの結果は、本発明の不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンが、ＰＣＶ２伝染からブタを防御できたことを示した。防御比率は、８０％から１００％だった。
【００７９】
【表８】
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【００８０】
これらの結果全てに基づき、本発明の不活化ＰＣＶ２  Ｈ株ワクチンは、ブタの免疫を効果的に誘導し、ワクチン接種ブタをＰＣＶ２感染から防御し、ブタのウイルス血症の重症度および持続期間を低減し、臨床症状を最小限に抑え、体重増加量を増加させた。
【００８１】
無論、本発明の前述した実施形態の多くの変更および改変は、その範囲から逸脱せずに実施できる。このように、本発明は、科学および有用な技術の発展を促進するために開示されるものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図されている。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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