(57)【要約】  本発明は、疾患、特に自己免疫障害および/もしくは炎症性障害または感染性障害の治療のための、インターフェロン誘導タンパク質16の循環細胞外型(細胞外IFI16)の阻害に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、インターフェロン誘導タンパク質16の循環細胞外型(細胞外IFI16)の阻害剤。
【請求項２】
自己免疫疾患および/または炎症性疾患の予防、治療および/または軽減のための、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記疾患が、全身性硬化症(SSc)、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群(SjS)および関節リウマチから選択される、請求項1または2に記載の阻害剤。
【請求項４】
自己免疫障害および/または炎症性障害に関与する皮膚の病変の予防、治療および/または軽減のための、請求項1から3のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項５】
感染症の予防、治療および/または軽減のための、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記疾患が、HCV感染症である、請求項1または5に記載の阻害剤。
【請求項７】
IFI16に特異的な抗体もしくはその抗原結合断片、IFI16に対するアプタマー、またはIFI16の変異型から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項８】
細胞外IFI16に特異的な抗体またはその抗原結合断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体またはその断片から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項９】
抗体またはその抗原結合断片が、哺乳類の細胞外IFI16、特にヒト細胞外IFI16に特異的に結合する、請求項1から8のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
少なくとも1つの別の治療活性薬剤、例えば抗自己免疫剤、抗炎症薬および/または抗病原体剤、好ましくは抗ウイルス薬と組み合わせた、請求項1から9のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
自己免疫疾患、炎症性疾患および/または感染症に罹っている対象を治療する方法であって、請求項1から10のいずれか一項に記載の阻害剤の薬学的有効量を、それを必要としている対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
活性薬剤として、請求項1から10のいずれか一項に記載の少なくとも1つの阻害剤を、薬学的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントと一緒に含む、医薬組成物またはキット。
【請求項１３】
少なくとも1つの阻害剤が、少なくとも1つの別の治療活性薬剤、例えば抗自己免疫剤、抗炎症薬および/または抗病原体剤、好ましくは抗ウイルス薬と組み合わせられている、請求項12に記載の組成物またはキット。
【請求項１４】
医学において使用するための、請求項12または13に記載の組成物またはキット。
【請求項１５】
抗自己免疫剤、抗炎症薬および/または抗病原体剤を求めてスクリーニングする方法であって、試験化合物が、細胞外IFI16の生物活性のモジュレーター、好ましくは阻害剤であるかどうかを決定する工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項15に記載のスクリーニング方法であって、
(a)細胞外IFI16を提供する工程と、
(b)化合物を(a)の細胞外IFI16と接触させる工程と、
(c)細胞外IFI16の量および/または活性を決定する工程と、
(d)細胞外IFI16タンパク質の生物活性を調節する、好ましくは阻害する化合物を選択する工程と
を含む方法。
【請求項１７】
細胞スクリーニングアッセイまたは/および分子スクリーニングアッセイを含む、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
細胞外IFI16が、細胞外IFI16を発現かつ/または放出する能力がある、細胞または/および非ヒト生物によって提供される、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞外IFI16が、単離された形で提供される、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患、特に自己免疫障害および/もしくは炎症性障害または感染性障害の治療のための、インターフェロン誘導タンパク質16の循環細胞外型(circulating extracellular form)(細胞外IFI16)の阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン(IFN)は、ウイルス複製、細胞増殖、免疫調節および炎症の重要な制御因子である(1、2)。さらに、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身性硬化症(SSc)、自己免疫性甲状腺疾患および1型糖尿病を含めた、特定の自己免疫疾患の発病および永続化において、IFNが重要な役割を果たすことは、現在十分に認められている(3)。
【０００３】
IFNによって誘導される多くの遺伝子産物の中に、インターフェロン誘導p200タンパク質ファミリー(マウスのIfi200、ヒトのHIN200)がある(4〜6)。最近、Pyrin、ASC、およびゼブラフィッシュカスパーゼなどの細胞死関連タンパク質の中で一般にみられる、PAAD/DAPINドメインとも称されるPyrinドメイン(7、8)が、大部分のIfi200/HIN200タンパク質のN末端においてみられ、これは、炎症およびアポトーシスにおいてこれらのタンパク質がある役割を果たしていることを示唆している(9、10)。
【０００４】
HIN200ファミリーのメンバーであるインターフェロン誘導16(IFI16)遺伝子(PYHIN2、IFNGIP1、MGC9466としても知られる)(4〜6)は、もともとはインターフェロン(IFN-α/βおよび-γ)の標的として同定された。しかしながら、最近、酸化ストレス、細胞密度、および様々な炎症促進性サイトカインも、IFI16の発現を誘発することが明らかになった(11、12)。IFI16の発現は、造血細胞に加えて、血管およびリンパ管由来の血管内皮細胞にみられ、これは、血管形成および炎症との関連の可能性を示唆している(13、14)。
【０００５】
HIN-200ファミリーの他のメンバーであるIFI16タンパク質は、そのN末端にPyrinドメインを示し、これは、このタンパク質が、細胞死への運命決定に関与する核におけるいくつかの転写因子の活性を制御することによりアポトーシス経路においてある役割を果たしていることを示唆している(15)。例えば、IFI16は、核レベルでp53に直接結合し、そのDNA結合活性を強化する。
【０００６】
IFI16を過剰発現しているヒト血管内皮細胞の遺伝子アレイ分析は、免疫系の制御に関与する遺伝子の発現の増加を明らかにした(16)。IFI16は、細胞間接着分子-1(ICAM-1)ならびにE-セレクチンまたはIL-8および単球走化性タンパク質-1(MCP-1)などのケモカインなどの、接着分子の発現を誘発した。IFI16を標的とする低分子ヘアピン型RNAでの細胞の処置は、IFN-γによるICAM-1誘発を著しく阻害し、これは、IFI16がIFN-γによる炎症促進性遺伝子の刺激に関与することを実証している。さらに、ICAM-1プロモーターの機能解析は、NF-kBが、IFI16駆動遺伝子誘発の主要なメディエーターであることを実証した(16)。
【０００７】
さらに、IFI16は、自己抗体の標的であることが実証された。抗IFI16自己抗体力価は、対照と比較した場合、全身性硬化症(SSc)、全身性エリテマトーデス(SLE)、およびシェーグレン症候群(SjS)などの自己免疫疾患を有する患者において著しく上昇する(17)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】PCT/EP2009/067128
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Youinou、Immunobiology 210 (2005、789〜797頁)
【非特許文献２】Abraham他、Rheumatology 2009、48:iii3〜iii7頁
【非特許文献３】Liang CC他、Nat. Protoc. 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それにもかかわらず、文献で報告されたIFI16の全ての生物活性およびIFI16の生物活性のヒトの病態との関連の可能性は、IFI16についての前述のユニークな局在性である、細胞内(特に核)タンパク質に割り当てられた(制限された)。実に、全てのin vitroでの研究は、異種細胞モデルにおけるIFI16の過剰発現または下方制御によって行われ、IFI16の調節は、常に細胞内でモニターされた(すなわち細胞抽出を行うことによって、または例えば免疫蛍光技法により細胞内のIFI16の存在を直接分析することによって)。
【００１１】
PCT/EP2009/067128は、病態、特に、自己免疫疾患、炎症性疾患および/または感染症に冒された患者の血清における検出可能な量のIFI16の細胞外型の存在を記載している。IFI16サンドウィッチELISA法によって、SSc、SLE、SjSおよび関節リウマチに冒された患者、ならびにC型肝炎ウイルス(HCV)感染症に罹っている患者において、対照としての健康な患者と比較した場合、著しく高いレベルの循環IFI16がみられた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明者らは、IFI16の細胞外型が治療標的であり、特に、細胞外IFI16タンパク質活性の調節、特に、阻害が、特に自己免疫疾患、炎症性疾患および/または感染症と関連している病態の予防、抑圧および/または軽減につながることを発見した。
【００１３】
本発明において、細胞外IFI16が、生物学的効果を発揮することができることが初めて示された。特に、著者らは、細胞外IFI16をヒト初代細胞に投与することによる実験を行い、培養細胞の生物学的パラメーターが影響されるかどうかを評価した。
【００１４】
細胞外IFI16の投与は、生接着ヒト初代細胞の数に影響することが示された。細胞外IFI16に曝露された上皮細胞および内皮細胞培養物は、対照細胞と比較した場合、生接着細胞の数の減少を示した(実施例2.1ならびに図2a、2bおよび2c)。さらに、細胞外IFI16は、標的細胞の細胞移動を妨げることが示された。細胞(例えば、初代ヒトケラチノサイト(KER)およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC))の細胞外タンパク質での処置は、移動能力の制限/低減を示した(実施例2.2ならびに図3a、3b、3cならびに4aおよび4b)。さらに、本発明の著者らは、血管発生(血管形成)に及ぼす細胞外IFI16の効果を立証することができ、それによって、特定のアッセイにおいて、HUVECによる管形成は、細胞が細胞外IFI16に曝露された場合、大幅に制限されることが示される(実施例2.4ならびに図6aおよび6b)。
【００１５】
血管内皮細胞損傷は、様々な自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデスおよび全身性硬化症ならびに感染症においてしばしばみられる病態である(Youinou、Immunobiology 210 (2005、789〜797頁)。自己免疫障害における別の重要な標的は、皮膚によって代表される(Abraham他、Rheumatology 2009、48:iii3〜iii7頁)。実に、内皮細胞および上皮細胞の両方は、自己免疫または感染症によって誘発される発病プロセスにしばしば関与する。
【００１６】
上述の報告された実験結果とともに、病態における細胞外IFI16の相当量の存在は、細胞外IFI16タンパク質を、治療介入の標的とすることができることを実証する。したがって、細胞外IFI16タンパク質の阻害は、医学、特に自己免疫疾患、炎症性疾患および/または感染症の治療における新規な治療手法と見なすことができる。より詳細には、IFI16の細胞外型の阻害は、自己免疫疾患および/または炎症性疾患および/または感染症に関与する皮膚の病変の予防、治療および/または軽減に適したものであり得る。
【００１７】
したがって、本発明の第1の態様は、医薬としての使用のための、インターフェロン誘導タンパク質16の循環細胞外型(細胞外IFI16)の阻害剤に関する。特に、阻害剤は、自己免疫疾患および/または炎症性疾患の予防、治療および/または軽減に使用することができる。より詳細には、細胞外IFI16阻害剤は、全身性硬化症(SSc)、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群(SjS)および関節リウマチ(RA)から選択される障害の治療に使用することができる。さらに、自己免疫疾患および/または炎症性疾患の別の例には、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、抗リン脂質症候群、自己免疫性甲状腺疾患および1型糖尿病が含まれる。本発明の非常に好ましい実施形態において、阻害剤は、例えば上述のような、自己免疫疾患および/または炎症性疾患に関与する皮膚の病変の予防、治療および/または軽減に使用することができる。
【００１８】
細胞外IFI16の阻害剤は、感染症の予防、治療および/または軽減にも使用することができる。感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症および/または寄生虫感染症から選択することができる。特に、感染症は、例えばC型肝炎ウイルス(HCV)によるウイルス感染症である。感染症の別の例には、B型肝炎ウイルス(HBV)またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)によるウイルス感染症が含まれる。
【００１９】
本発明の阻害剤は、IFI16の循環細胞外型の阻害剤から選択される。したがって、本発明の阻害剤は、好ましくは、循環細胞外IFI16に結合することによってタンパク質レベルに対して作用し、それによってタンパク質活性に影響する、例えばタンパク質活性を低減する。好ましい実施形態において、阻害剤は、細胞外環境においてIFI16に結合する。本発明の阻害剤は、好ましくは、哺乳類の循環細胞外IFI16、例えばウシ、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、マウス、ハムスター、ラットおよび/またはブタ、非常に好ましくはマウスおよび/またはヒト細胞外IFI16の生物活性を調節する、すなわち低減する。本発明で開示された治療標的としてのヒトIFI16は、IFI16の少なくとも1つの自然発生型アイソフォーム、特にアイソフォームa(UniProtKB受託番号Q16666-1)、アイソフォームb(UniProtKB受託番号Q16666-2)およびアイソフォームc(UniProtKB受託番号Q16666-3)、その断片または変異体を含む。ヒトIFI16アイソフォームは、特に配列番号1(アイソフォームa)、配列番号2(アイソフォームb)および配列番号3(アイソフォームc)の配列を有することができる。
【００２０】
例えば、阻害剤は、IFI16に特異的な抗体もしくはその抗原結合断片、IFI16に対するアプタマーまたはIFI16の変異型から選択することができる。
【００２１】
好ましくは、IFI16阻害剤は、細胞外IFI16に特異的な抗体またはその抗原結合断片である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体またはその抗原結合断片から選択することができる。
【００２２】
抗体の産生のために、宿主動物、例えばマウスまたはウサギを、任意選択で免疫応答を増加させるためのアジュバントと一緒に、IFI16抗原で免疫することができる。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技法を含むがこれに限定されない、既知の技法を使用することによって調製することができる。キメラ抗体は、非ヒト定常部を適切なヒト定常部で置換することによってモノクローナル抗体から得ることができる。ヒト化抗体は、可変抗体ドメインにおける非ヒトフレームワーク領域を適切なヒト配列で置換することによって得ることができる。ヒト抗体は、異種ヒト免疫系を含む宿主動物、例えばマウスから得ることができる。組換え抗体は、所与の抗体配列のファージディスプレイおよび親和性成熟によって得ることができる。組換え抗体は、単鎖の抗体、二重特異性抗体などとすることができる。
【００２３】
細胞外IFI16に関する少なくとも1つの結合部位を含有する抗体断片は、Fab断片、Fab'-断片、F(ab')2断片または単鎖Fv断片から選択することができる。
【００２４】
本発明の非常に好ましい実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、IFI16アイソフォームa、IFI16アイソフォームbおよび/またはIFI16アイソフォームcを含めて、哺乳類の循環細胞外IFI16、特にヒト細胞外IFI16に特異的に結合する。好ましい抗IFI16抗体の特定の実施形態は、IFI16のbアイソフォームのアミノ酸478〜729に相当するIFI16断片に対して作られた抗体である。
【００２５】
本好ましい実施形態において、本発明者らは、抗IFI16抗体を、細胞外IFI16の効果を取り消すための阻害剤として使用することができることを発見した。特に、抗IFI16抗体は、接着HUVECの生存率における細胞外IFI16の活性を阻害するために使用された(実施例3.1および3.3ならびに図7および9)。さらに、抗IFI16抗体は、細胞外IFI16によって制限された創傷治癒能力を回復することが示された(実施例3.2)。実に、in vitroでの創傷治癒アッセイにおいて、抗IFI16の使用により、細胞外IFI16で処置したKERの創傷閉鎖能力が回復した(図8)。
【００２６】
細胞外IFI16に対するアプタマーは、既知のプロトコールに従って、核酸配列および/またはペプチド配列の親和性選択によって得ることができる。
【００２７】
IFI16の変異型は、変異、例えばアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加によって改変されているIFI16分子から選択することができる。好ましい変異IFI16分子は、本発明の実施例において示されるように、少なくとも1つのIFI16活性に及ぼす部分的または完全な阻害効果を示す。かかる変異IFI16分子の例は、例えば上述のような、例えば自然発生型IFI16分子の少なくとも20個、50個または100個のアミノ酸の欠失を含む、IFI16の切断型である。
【００２８】
細胞外IFI16の阻害剤は、単剤治療薬としてもしくは追加の治療薬と組み合わせて、または少なくとも1つの別の追加の治療活性薬剤、例えば抗自己免疫剤(anti-autoimmune agent)および/もしくは抗炎症薬とともに投与することができる。別の自己免疫剤(autoimmune agent)の例は、例えばアバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アザチオプリン、クロロキン、シクロホスファミド、シクロスポリン、D-ペニシラミン、エタネルセプト、ゴリムマブ、オーラノフィン、インフリキシマブ、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、リツキシマブ、スルファサラジン、トシリズマブ、グルココルチコイドまたは非ステロイド性の抗炎症薬(パラセタモールおよびイブプロフェンなどのNSAID)を含むことができる。別の抗炎症薬の例は、例えばプロスタグランジン、グルココルチコイドまたはNSAIDを含むことができる。
【００２９】
感染症の治療のために、細胞外IFI16の阻害剤を、単独でまたは感染病原体に対する追加の治療薬と組み合わせて、特に、少なくとも1つの別の抗病原体剤(antipathogenic agent)、好ましくは別の抗ウイルス薬とともに投与することができる。別の抗ウイルス薬は、プロテアーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、侵入阻害剤、構築/分泌阻害剤(assembly/secretion inhibitor)、翻訳阻害剤、免疫賦活薬またはその任意の組合せから選択することができる。
【００３０】
本発明の別の態様は、上述のような活性薬剤としての、少なくとも1つの細胞外IFI16の阻害剤を薬学的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物である。医薬組成物は、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。治療する特定の障害に応じて、組成物は、全身的または局所的に投与することができる。適した経路は、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、静脈内もしくは腹腔内注射または注入を含めた、例えば経口、直腸、経粘膜、腸、鼻腔内、眼内もしくは肺投与または非経口の送達を含むことができる。
【００３１】
医薬組成物は、その意図された目的を達成するのに十分な有効量で活性薬剤を含む。当業者は、有効量の決定を行うことができる。例えば、有効量は、細胞培養アッセイからおよび/または動物モデルにおいて推定することができる。ヒトの医学における投与に関する常用量は、例えば0.01〜2000mg/日、一般に0.1〜1000mg/日、典型的には1〜500mg/日の範囲であってよい。
【００３２】
本発明の別の態様は、少なくとも1つの別の抗自己免疫剤および/もしくは少なくとも1つの別の抗炎症薬と組み合わせて、ならびに/または上述のような少なくとも1つの別の抗ウイルス薬とともに、上述のような少なくとも1つの阻害剤を含む、医薬組成物またはキットを対象とする。
【００３３】
医薬組成物は、好ましくは、医学において、例えばヒトの医学または獣医学において使用するためのものである。したがって、自己免疫疾患および/もしくは炎症性疾患ならびに/または感染症に罹っている対象を治療するための方法であって、細胞外IFI16の阻害剤または活性成分として少なくとも1つの細胞外IFI16の阻害剤を含む医薬組成物の薬学的有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む方法が提供される。自己免疫疾患および/または炎症性疾患は、好ましくは、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群および関節リウマチから選択される。感染症は、好ましくは、HCV感染症である。
【００３４】
最後に、本発明はさらに、抗自己免疫剤および/または抗炎症薬または抗病原体剤(anti-pathogen agent)、例えば抗ウイルス薬を求めてスクリーニングする方法であって、試験化合物が、細胞外IFI16の生物活性を調節する、好ましくは阻害する能力があるかどうかを決定する工程を含む方法に関する。スクリーニング方法は、例えば、
(a)細胞外IFI16を提供する工程と、
(b)試験化合物を(a)の前記細胞外IFI16と接触させる工程と、
(c)試験化合物の細胞外IFI16への結合を通して、IFI16の量を決定し、かつ/または、例えば試験化合物の非存在下での対照と比較して、試験化合物の存在下で細胞外IFI16の活性を決定する工程と、最後に
(d)細胞外IFI16タンパク質の生物活性を調節する、好ましくは阻害する化合物を選択する工程と
を含むことができる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法は、細胞スクリーニングアッセイまたは/および分子スクリーニングアッセイを含むことができる。したがって、スクリーニングは、無細胞系または細胞系で行うことができる。細胞スクリーニング方法に関して、細胞外IFI16を発現かつ/または放出する能力がある、組換え細胞または非ヒト生物の使用が好ましい。本発明のスクリーニング方法において、細胞外IFI16は、例えばIFI16タンパク質の本質的に純粋かつ未精製の調製物または製剤を含めた、単離された形で提供することもできる。
【００３６】
試験化合物は、ポリペプチド、例えば抗体もしくは抗体断片、アプタマー、ペプチド化合物または非ペプチド低分子量有機分子(例えば最大2000Daの分子量を有する)から選択することができる。上述のスクリーニング方法において細胞外IFI16タンパク質の阻害剤として同定された試験化合物は、自己免疫疾患および/もしくは炎症性疾患ならびに/または感染症の治療のための適した候補薬剤とすることができる。
【００３７】
さらに、本発明を、以下の図および実施例によってさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】IFI16 ELISA法を使用して、自己免疫患者および健康な対象における循環IFI16を測定したグラフである。  全身性硬化症(SSc、n=50)、全身性エリテマトーデス(SLE、n=50)、シェーグレン症候群(SjS n=51)、RA(50)、抗リン脂質症候群(pAPS、80)に罹っている患者およびC型肝炎ウイルス感染を有する患者(HCV、82)ならびに健康な対象(CTRL、50)において、血清中の循環IFI16濃度をELISA法によって決定した。  ELISAマイクロタイタープレートを、ポリクローナルウサギ抗IFI16抗体でコーティングした。その後、プレートを洗浄し、遊離結合部位を室温で1時間、PBS/0.05%Tween-20/3%BSA(PBS-TB)で飽和させた。洗浄後、100μlのPBS/0.05%Tween-20/1%BSA(PBS-TB)の最終体積において、5μlの異なる血清試料を用いて、インキュベーションを行った(室温で1時間)。PBS-TB中の5%FBSで希釈した、精製した6His-IFI16タンパク質を標準物質として使用した。BSAを負の対照とした。試料を洗浄し、いずれの場合にも、モノクローナルマウス抗IFI16抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、PBS-TBで希釈したHRPコンジュゲート抗マウス抗体とともにインキュベーションを行った(室温で1時間)。洗浄後、IFI16タンパク質/抗体複合体を、テトラメチルベンジジン(TMB)とともにインキュベーションを行うことによって可視化し、停止液で反応を停止した。マイクロプレートリーダーにおいて450nmで吸光度を測定した。濃度の決定を、精製した6His-IFI16の濃度を増加させながら使用した、検量線を使用して行った。測定値の直線性は、血清において20から640ng/ml IFI16の範囲であった。直線性範囲外の濃度(<20ng/mlまたは>640ng/ml)を有する血清を、それぞれ0.1ng/mlまたは640ng/mlを有するとしてプロットする。赤の横線(1つの灰色の横線)は、各患者群に関する平均IFI16濃度を表す。  IFI16陽性に関するカットオフ値は、対照集団の95°パーセンタイル(117ng/ml)で設定した。これを緑の横線(薄い灰色の実線)によって表している。X軸の下方の数は、各群におけるカットオフレベルより高いIFI16血清濃度を有する患者のパーセンテージを表す。IFI16血清タンパク質は、SSc、SLE、SjS、RAおよびHCV患者血清の画分において、カットオフより高いレベルで検出可能であり、健康な対象においてはわずか6%である一方で、20%から80%までの範囲であった。pAPSに罹っている患者の1%のみが、循環IFI16について陽性であった。
【図２ａ】IFI16で処置した接着ヒト上皮細胞および接着ヒト内皮細胞の生存率分析を示すグラフである。  細胞外IFI16は、生接着ヒト上皮細胞(A)および生接着ヒト内皮細胞(B)の量に影響を与える。  パネルA:ヒト初代ケラチノサイト(KER)を、増殖因子を含有する無血清培地(Epilife, Cascade Biologics, USA)で培養した。5000個〜10000個の細胞を、96ウェル培養プレートに播種し、24時間後、ヒトIFI16の全長bアイソフォームをコードする大腸菌(E. coli)中で産生された、組換えIFI16タンパク質(IFI16)の異なる用量(10または25μg/ml)で処置し、次いで3つの連続したクロマトグラフィーのステップによって精製し、高純度のエンドトキシンフリーのタンパク質を得た。負の対照として、細胞を各IFI16用量に使用したビヒクルの同じ体積で処置した(Mock)、または処置しなかった(NT)。48時間後、37℃で3時間、細胞を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で処置し、次いで培地を吸引し、MTT結晶をDMSOで溶解した。生接着細胞の量に比例する吸光度を、570nmで読み取った。*p<0.01、一元配置ANOVAおよびBonferroniのポストテストによる。  パネルB:初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、2%FBSを含有する完全内皮増殖培地(complete endothelial growth medium)(EGM-2, Clonetics, USA)で培養した。3000個の細胞を、96ウェル培養プレートに播種し、次いでパネルAにおけるように処理した。p<0.01、一元配置ANOVAおよびBonferroniのポストテストによる。
【図２ｂ】48時間、組換えIFI16タンパク質の異なる用量で処置した接着ヒト上皮細胞、Mockで処置した接着ヒト上皮細胞または処置していない接着ヒト上皮細胞の生存率分析を示すグラフである。値は、7つの独立した実験の平均±SEMを表す(*p<0.05、一元配置ANOVAに続いてBonferroni's Multiple Comparison Test)。  初代ヒトケラチノサイト(KER)を、増殖因子を含有する無血清培地(Epilife, Cascade Biologics, USA)において培養した。1×104個の細胞を、96ウェル培養プレートに播種し、24時間後、組換えIFI16タンパク質(IFI16)(Notopharm srlによって作製された)の異なる用量(10または25μg/ml)で処置した。負の対照として、細胞を、各IFI16用量に使用した賦形剤(Notopharm srlによって作製された)の同じ体積で処置した(Mock)、または処置しなかった(NT)。48時間のインキュベーション後、37℃で3時間、細胞を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で処置し、次いで培地を廃棄し、MTT結晶をDMSOで溶解した。生接着細胞の量に比例する吸光度を、分光光度計を用いて570nmで読み取った。
【図２ｃ】48時間、組換えIFI16タンパク質の異なる用量で処置したHUVEC細胞、Mockで処置したHUVEC細胞、または処置していないHUVEC細胞の生存率分析を示すグラフである。値は、4つの独立した実験の平均±SEMを表す(**P<0.01、***P<0.001、一元配置ANOVAに続いてBonferroni's Multiple Comparison Test)。  3×103個のHUVEC細胞を、96ウェル培養プレートに播種し、24時間後、組換えIFI16タンパク質(IFI16)(Notopharm srlによって作製された)の異なる用量(10または25μg/ml)で処置した。負の対照として、細胞を、賦形剤(Notopharm srlによって作製された)の同じ体積で処置した(Mock)、または処置しなかった(NT)。48時間のインキュベーション後、37℃で2時間、細胞を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で処置し、次いで培地を廃棄し、MTT結晶をDMSOで溶解した。生接着細胞の量に比例する吸光度を、分光光度計を用いて570nmで読み取った。
【図３ａ】IFI16で処置した接着ヒト上皮細胞のin vitroスクラッチアッセイ分析を示す画像である。  細胞外IFI16は、ヒトケラチノサイトの移動を妨げる。細胞を、6ウェル培養プレートに5×105個の密度で播種し、24時間、コンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄した。3つの人工的な創傷(1つは縦、2つは横)を、ピペットチップを使用して注意深く作り、コンフルエントな細胞単層をスクラッチして細胞を含まない領域を作製した。細胞を、PBSで2回洗浄してスクラッチされた細胞片を除去し、Leica倒立顕微鏡を使用してプレートを撮影した(0時間)。次いで、10μg/mlのIFI16を含有するまたは含有しないEpilife完全培地を加え、細胞を48時間インキュベートし、それから同じ領域の写真を撮った。
【図３ｂ】ヒト上皮ケラチノサイトにおけるin vitroスクラッチアッセイを示す画像である。  48時間、組換えIFI16タンパク質で処置した細胞、Mockで処置した細胞、または処置していない細胞の代表的な画像。
【図３ｃ】ヒト上皮ケラチノサイトにおけるin vitroスクラッチアッセイを示すグラフである。  48時間、組換えIFI16タンパク質で処置した細胞、Mockで処置した細胞、または処置していない細胞の創傷閉鎖データの分析。値は、4つの独立した実験の平均±SEMを表す(*p=0.0062、対応のあるt検定)。  初代ヒトケラチノサイト(KER)を、12ウェル培養プレートに2.5×105個の密度で播種し、24時間、コンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄した。3つのスクラッチ(1つは垂直、2つは水平)を、ピペットチップを使用して注意深く作り、コンフルエントな細胞単層をこすって細胞を含まない領域を作製した。細胞を、PBSで2回洗浄してスクラッチされた細胞片を除去し、Leica倒立顕微鏡を使用して撮影した(t=0)(図3b)。次いで、10μg/mlの組換えIFI16タンパク質を含有するEpilife完全培地を加え、細胞を48時間インキュベートし、それから同じ領域の写真を撮った(図3b)。創傷した領域を、Microsoft Power Pointを使用して測定し、データを%創傷閉鎖としてグラフで表した(図3c)。負の対照として、細胞を賦形剤の同じ体積を含有する培地で処置した(Mock)、または処置しなかった(NT)。
【図４ａ】IFI16で処置した接着ヒト内皮細胞のトランスウェル移動アッセイ分析を示すグラフである。  細胞外IFI16は、HUVEC移動を損傷する。本試験を、ゼラチン(0.2%)の薄層でコーティングされた8μmポアサイズを有する24ウェルトランスウェルインサート(Corning)において行った。HUVECを、48時間、IFI16の異なる用量(10または25μg/ml)で処置した、または処置せず、次いで、EBM-2、0.1%BSA中に再懸濁した。Boydenチャンバーの下のコンパートメントを、化学誘引物質としてVEGFおよびbFGF、2%FBSならびにIFI16を含有する600μlのEGM2で満たした(上のチャンバーと同量)。0.1%BSAを補った、化学誘引物質がないEBM-2を、負の対照として使用した。HUVEC(400000個の細胞/200μl)を、上のコンパートメントに置き、適切な場合には、IFI16を培地に添加した。チャンバーを、5%CO2を含有する加湿した雰囲気で、37℃で5時間インキュベートした。インキュベーション後、フィルターの上側にある細胞を取り出した。フィルターの下側に移動した細胞を、PBSで2回洗浄し、室温で20分間、2.5%グルタルアルデヒドで固定し、0.5mlのクリスタルバイオレット(20%メチルアルコール溶液中で0.1%)で染色した。洗浄後、10%酢酸中で発色させ、マイクロプレートリーダー(Victor 3; Perkin-Elmer, Boston, MA)上540nmで二連で読み取った。
【図４ｂ】48時間、組換えIFI16タンパク質の異なる用量で処置したHUVEC細胞、Mockで処置したHUVEC細胞または処置していないHUVEC細胞の移動分析を示すグラフである。値は、3つの独立した実験の平均±SEMを表し、処置していないHUVECと比較した場合の、移動した細胞のパーセンテージとして報告する(**P<0.01、***P<0.001、一元配置ANOVAに続いてBonferroni's Multiple Comparison Test)。  8μmポアサイズを有する24ウェルトランスウェルインサート(Corning)を、ゼラチン(0.2%)の薄層でコーティングした。2%FBSを有するEGM-2で培養し、かつ48時間、IFI16組換えタンパク質もしくはMockの異なる濃度で前処置したHUVECまたは処置していないHUVECを、PBSで2回洗浄し、トリプシン処理し、上のチャンバー中に播種し(400,000個の細胞)、200μlのEBM-2、0.1%BSAプラスIFI16組換えタンパク質またはmock(48時間の前処置と同量)中で再懸濁した。チャンバーの下のコンパートメントを、化学誘引物質としてVEGFおよびbFGF、2%FBSを含有する600μlのEGM2で満たした。チャンバーを、5%CO2を含有する加湿した雰囲気で、37℃で5時間インキュベートした。インキュベーション後、フィルターの上側にある細胞を取り出した。フィルターの下側に移動した細胞を、PBSで2回洗浄し、室温で20分間2.5%グルタルアルデヒドで固定し、0.5mlのクリスタルバイオレット(20%メチルアルコール溶液中で0.1%)で染色した。洗浄後、10%酢酸中で発色させ、マイクロプレートリーダー(Victor 3; Perkin-Elmer, Boston, MA)上540nmで二連で読み取った。
【図５】表皮ラフト培養物に及ぼすIFI16の効果を示す画像である。  予備実験は、細胞外IFI16が表皮ラフト培養物の形態形成を損傷することを示唆している。グリセロール保存された皮膚(Euro Skin Bank, Beverwijk, Holland)を洗浄し、表皮が真皮から剥離するまで、37℃で、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンサルフェートおよびアムホテリシンBを含有するDPBS中でインキュベートした。表皮の剥がれた真皮を、2cmの正方形に切り、表皮真皮接合部を下にして培養プレートに置いた。ガラスリングを、真皮の上に置き、5×105個のヒト初代繊維芽細胞を、真皮表面上で培養した。24時間のインキュベーションの後、真皮等価物の表皮‐真皮表面を上向きにしてからリングを交換し、5×105個のKERを、インサート上に播種した。インキュベーションの2日後、真皮を同じ向きで気相液相界面に上げた。ラフト培養物を、加湿した5%CO2中で37℃で、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンB溶液の存在下で、FAD培地[熱失活した10%FBS(F12/DMEM/10%FBS)、インスリン(0.4mg/ml)、上皮増殖因子(EGF、10ng/ml)、コレラ毒素(8.4ng/ml)、ヒドロコルチゾン(0.4μg/ml)、アポトランスフェリン(5μg/ml)、3,3',5'-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩(13ng/ml)およびアスコルビン酸(50μg/ml)の存在下で(1部分がHam's F12および3部分がDMEM)]中で維持した。1週間後、10μg/mlのIFI16を、FAD培地に添加した、または培養物を処置しなかった。  さらに1週間後、ラフト培養物を10%緩衝ホルマリン固定によって採取し、パラフィンに埋め込み、5μmの切片に切り、組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。
【図６ａ】IFI16で処置した接着ヒト内皮細胞のMatrigelアッセイ分析を示す画像である。  初代ヒト内皮細胞の管形成は、細胞外IFI16によって影響される。-20℃で事前に冷却した24マイクロウェルプレートを、250μl/ウェルのMatrigel Basement Membrane(5mg/ml; Becton and Dickinson)でコーティングし、次いで凝固するまで37℃で30分間インキュベーターに置いた。48時間、25μg/mlのIFI16で事前に処置した、または処置していない、完全培地における8×104個の細胞/(500μlウェル)HUVECを、マトリックスに播種し、5%CO2環境で37℃でインキュベートした。プレートを、Leica倒立顕微鏡を使用して、6時間(播種後)で撮影した。
【図６ｂ】48時間、組換えIFI16タンパク質で処置したHUVEC細胞、Mockで処置したHUVEC細胞、または処置していないHUVEC細胞の毛細血管様管形成アッセイ(Matrigelアッセイ)を示す画像である。3つの独立した実験の代表的な画像を報告する。  0.2%ゼラチンでコーティングされた60mmの培養皿中の完全培地に播種したHUVEC細胞を、48時間、組換えIFI16タンパク質(IFI16)(Notopharm srlによって作製された)の異なる用量(10または25μg/ml)で処置した。負の対照として、細胞を各IFI16用量に使用した賦形剤(Notopharm srlによって作製された)の同じ体積で処置した(Mock)、または処置しなかった(NT)。-20℃で事前に冷却した24マイクロウェルプレートを、250μl/ウェルのMatrigel Basement Membrane (5mg/ml; Becton and Dickinson, Milan, Italy)でコーティングし、次いで凝固するまで37℃で30分間インキュベートした。HUVEC細胞(ウェルにつき8×104個の細胞/500μl)を、マトリックスに播種し、37℃および5%CO2で、インキュベートしておいた。6時間後、プレートを、Leica倒立顕微鏡を使用して撮影した。
【図７】IFI16および/または抗IFI16抗体で処置した接着ヒト内皮細胞の生存率分析を示すグラフである。  生接着HUVECの量に及ぼすIFI16の効果は、抗IFI16抗体によって制限された。初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、2%FBSを含有する完全内皮増殖培地(EGM-2, Clonetics, USA)で培養した。10μg/mlのIFI16および等モル量の抗IFI16抗体を、37℃で1時間、プレインキュベートした。3000個の細胞を96ウェル培養プレートに播種し、24時間後、IFI16、抗IFI16もしくはIFI16+抗IFI16で処置した、または処置しなかった。48時間後、細胞を、37℃で3時間、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で処置し、次いで培地を吸引し、MTT結晶をDMSOで溶解した。生接着細胞の量に比例する吸光度を、570nmで読み取った。
【図８】IFI16および/または抗IFI16抗体で処置した接着ヒト上皮細胞のin vitroスクラッチアッセイ分析を示す画像である。  抗IFI16抗体は、IFI16処置初代ヒトケラチノサイトの創傷治癒能力を回復する。細胞を、6ウェル培養プレートに5×105個の密度で播種し、24時間、コンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄した。3つの人工的な創傷(1つは垂直、2つは水平)を、ピペットチップを使用して注意深く作り、コンフルエントな細胞単層をスクラッチして細胞を含まない領域を作製した。Leica倒立顕微鏡を使用してプレートを撮影した(0時間)。細胞を、PBSで2回洗浄してスクラッチされた細胞片を取り出した。次いで、IFI16(10μg/ml)、抗IFI16(等モル量)もしくはIFI16+抗IFI16(等モル量)を含有するEpilife完全培地または処置していないEpilife完全培地を添加し、細胞を48時間インキュベートし、それから同じ領域の写真を撮った。
【図９】48時間、組換えIFI16タンパク質(IFI16)単独もしくはIFI16に対する抗体と組み合わせた組換えIFI16タンパク質で処置したHUVEC細胞、Mockで処置したHUVEC細胞、または処置していない(NT)HUVEC細胞の生存率分析を示すグラフである。値は、2つの独立した実験の平均±SEMを表す。  3×103個のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)細胞を、96ウェル培養プレートに播種し、24時間後、IFI16に対するポリクローナル抗体の等モル量でプレインキュベートした、またはしていない、10μg/mlの組換えIFI16タンパク質(IFI16)(Notopharm srlによって作製された)で処置した。負の対照として、細胞を賦形剤(Notopharm srlによって作製された)および/または抗IFI16抗体の同じ体積で処置した(Mock)、または処置しなかった(NT)。48時間のインキュベーション後、37℃で2時間、細胞を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で処置し、次いで培地を廃棄し、MTT結晶をDMSOで溶解した。生接着細胞の量に比例する吸光度を、分光光度計を用いて570nmで読み取った。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
(実施例)
(実施例1)
細胞外IFI16は、自己免疫疾患、炎症性疾患および感染症に罹っている患者の血清において認められる。
全身性硬化症(SSc、n=50)、全身性エリテマトーデス(SLE、n=50)、シェーグレン症候群(SjS、n=51)、関節リウマチ(RA、n=50)、抗リン脂質症候群(pAPS、n=80)に罹っている患者およびC型肝炎ウイルス感染症を有する患者(HCV、n=82)ならびに健康な対象(CTRL、50)において、血清中の循環IFI16濃度をELISA法によって決定した。細胞外IFI16は、最大80%の陽性で、SSc、SLE、SjS、RAおよびHCV患者の血清において、対照群における濃度より有意に高い濃度で認められた(図1)。
【００４０】
(実施例2)
細胞外IFI16は、初代ヒト細胞において生物活性を発揮する
2.1 細胞外IFI16は、生接着ヒト上皮細胞および生接着ヒト内皮細胞の量に影響を与える。
外来性IFI16の投与により、処置していない対照細胞と比較した場合、MTTアッセイによって測定すると生接着細胞の量が低下する。実に、細胞を、異なる濃度で培地に添加した組換えIFI16で48時間処置した場合、生接着初代ヒト上皮細胞(KER)の用量依存的な減少(最大50%)が観察された(図2a、パネルA)。さらに一貫した低減が、細胞外IFI16で処置した初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において観察された(図2a、パネルB)。対照的に、対照賦形剤の培地への添加は、細胞生存率に有意に影響を与えなかった。おそらく培地増殖因子の希釈が原因で、最も高いIFI16用量に使用した体積に相当する賦形剤の体積の場合に、わずかな低減のみが観察された。
【００４１】
別の実験では、外来性IFI16の投与により、Mock処置細胞と比較した場合、MTTアッセイによって測定すると生接着細胞の量が低下することが確認された。実に、生接着初代ヒト上皮細胞(ケラチノサイト)の減少(両方のIFI16濃度について、19%)が観察された(図2b)。
【００４２】
さらに別の実験を行い、Mock処置細胞と比較した場合、MTTアッセイによって測定すると外来性IFI16の投与は生接着細胞の量を低下させることが示された。IFI16またはmock処置後、生接着HUVECの量を、MTTアッセイによって分析した。剥離した細胞を、MTTアッセイ分析に先立って洗い流した。細胞外IFI16で処置した場合、生接着HUVEC細胞の有意な減少(最大45%)が観察された(図2c)。
【００４３】
2.2 細胞外IFI16は、ヒト初代内皮細胞およびヒト初代上皮細胞の移動を損傷する
細胞外IFI16のヒト上皮細胞の移動における関与を評価するために、in vivoでの創傷治癒の間の細胞移動を模倣するために使用されるin vitroスクラッチアッセイ(Liang CC他、Nat. Protoc. 2007)にヒトケラチノサイト(KER)を供した。図3aにおいて観察されるように、細胞外IFI16の培地への添加は、対照細胞と比較して、創傷修復の大幅な減少をもたらした。実に、処置していない細胞は、スクラッチが作製された48時間後、創傷をほぼ完全に閉じた一方で、IFI16で処置したわずかな細胞のみが、スクラッチされた領域において移動することができた。
【００４４】
細胞外IFI16のヒト上皮細胞の移動における関与を評価するために、創傷治癒の間の細胞移動を模倣するために使用されるin vitroスクラッチアッセイ(Liang CC他, Nat. Protoc. 2007)にケラチノサイトを供して、別のデータを入手した。細胞外IFI16の培地への添加は、mock処置細胞と比較した場合、創傷修復能力の有意な減少(平均=24%)をもたらした(図3bおよび3c)。
【００４５】
IFI16の存在下または非存在下でのHUVECの移動速度を、トランスウェル移動アッセイによって分析した。細胞外IFI16で事前に処置した、または処置していない内皮細胞を、修正Boydenチャンバーの上部で培養し、次いで、5時間放置し、細胞の通過を可能にするのに十分大きいポア(8μm)を含有する膜を横断して移動させた。図4aに示すように、細胞外IFI16で処置した場合、有意に少ないHUVECが膜を横断することができ、細胞外IFI16は用量依存的に作用した。
【００４６】
これらのデータは、外来性IFI16の投与が、走化性因子に応答してHUVEC細胞の移動を減少させることを示す別の実験によって確認された。トランスウェル移動アッセイは、血管新生誘導因子または血管新生阻害剤に対する内皮細胞の移動応答を研究するために通常使用される試験である。図4bに示すように、外来性IFI16の投与は、mock処置細胞または処置していない細胞と比較した場合、HUVEC細胞が走化性因子(VEGFおよびbFGF)に応答する能力を低減する。
【００４７】
2.3 細胞外IFI16は、表皮ラフト培養物の形態形成を損傷する
皮膚形態形成に及ぼす細胞外IFI16の潜在的な効果を評価するために、初代ヒトケラチノサイトを、脱表皮化されたヒト真皮(保存された皮膚から採取した)上で培養し、気相液相界面で2週間分化させておいた。1週間、IFI16をラフト培養物の培地に添加した場合、上皮形態形成は激しく影響され、処置していない培養物と比較した場合、より薄い上皮をもたらした(図5の代表写真参照)。図5におけるH/E染色によって実証されるように、ケラチノサイト分化の結果としての、多層形成(pluristratification)は損傷され、層は、IFI16処置皮膚等価物において識別できなかった。これらのデータは、予備試験によって得られた結果である。
【００４８】
2.4 初代ヒト内皮細胞の管形成は、細胞外IFI16によって影響される
管形成(分岐した管状の構造の形態形成)は、血管発生における必須のプロセスである。BD Matrigel(商標)Basement Membrane Matrixは、多くの組織においてみられる、複雑な細胞外環境に似たゼラチンの混合物である。Matrigelを、初代内皮細胞を使用してin vitro血管形成アッセイに使用する:内皮細胞をMatrigel上で培養した場合、細胞は増殖を停止し、高い運動性および細胞間コミュニケーションを示す。予期された通り、Matrigelマトリックス上で培養した場合、処置していない初代HUVECは、6時間以内に毛細血管様構造を形成した(図6a、左のパネル)。対照的に、細胞を、Matrigelに播種する前に、48時間、IFI16を培地に添加することによって事前に処置した場合、細管を形成する細胞の能力が激しく影響され、わずかな分岐しか有さないより短い細管構造をもたらした(図6a、右のパネル)。したがって、細胞外IFI16は、初代ヒト内皮細胞による管形成の阻害において役割を果たしている。
【００４９】
別の実験を行い、細胞外IFI16の投与がHUVEC細胞における血管新生活性を減少させることを確認した。Matrigelアッセイは、天然のヒト臍帯静脈由来の内皮細胞が液体ラミニン/コラーゲンゲル(Matrigel)に懸濁する、ヒト血管形成を模倣するin vitroアッセイである。図6bに示すように、外来性IFI16の投与は、HUVEC細胞の血管形成を阻害する。実に、細胞外IFI16の培地への添加は、mock処置細胞または処置していない細胞と比較した場合、内皮細胞(HUVEC)がMatrigelにおいて微小管を形成する能力の著しい減少をもたらした。
【００５０】
(実施例3)
細胞外IFI16の効果は、抗IFI16抗体によって阻害することができる
3.1 生接着HUVECの量に及ぼすIFI16の効果は、抗IFI16抗体によって制限される
細胞外IFI16の生物学的効果を阻害することができるかどうかを評価するために、IFI16に対する抗体(抗IFI16)の等モル量を、IFI16溶液に添加した後に、IFI16溶液を培地へ添加した。細胞外IFI16単独で処置した細胞のほぼ50%の低減とは対照的に、抗IFI16+IFI16で処置した培養物において、接着細胞生存率のわずかな低減のみが観察された(図7)。予期された通り、抗IFI16の単独での投与は、細胞生存率に影響を与えなかった。
【００５１】
3.2 抗IFI16抗体は、IFI16処置初代ヒトケラチノサイトの創傷治癒能力を回復する
スクラッチされたケラチノサイトを培地へ添加する前に、抗IFI16抗体の等モル量でIFI16をプレインキュベートすると、スクラッチされた領域において移動するケラチノサイトの能力の著しい回復をもたらした。実に、図8に示すように、創傷閉鎖は、IFI16単独で処置した細胞と比較して、細胞を抗IFI16+IFI16で処置した場合、著しく強化された。したがって、抗IFI16抗体は、細胞外IFI16活性の阻害剤として働く。
【００５２】
3.3 IFI16誘導細胞毒性に及ぼす抗IFI16抗体の効果
細胞外IFI16の生物学的効果を阻害することができるかどうかを評価するために、IFI16に対する抗体(Ab)の等モル量を、IFI16溶液に添加した後に、IFI16溶液を培地に添加した。細胞外IFI16単独で処置した細胞のほぼ50%の低減とは対照的に、Ab+IFI16で処置した培養物において、接着細胞生存率のわずかな低減のみが観察された(図9)。予期された通り、抗IFI16単独での投与は、細胞生存率に影響を与えなかった。したがって、抗IFI16抗体は、細胞外IFI16の生物活性を阻害することができる。
（参考文献）
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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