(57)【要約】  本発明は、分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物の直接検出および／または定量の方法に関し、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子は、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記検出および／または定量される化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記方法はクロマトグラフィーを行うこと、および質量検出器または放射能検出器を用いて、信号の保持時間、および／または該信号の強度を同定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物の直接検出および／または定量の方法であって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記検出および／または定量される化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記直接検出および／または定量のための上記方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが７〜１４になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）質量検出器または放射能検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含む生体マトリックスから上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いて上記ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含むことを特徴とする直接検出および／または定量の方法。
【請求項２】
上記化学複合分子は、２〜６のリン酸基を含む群から選択されるイノシトールポリリン酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記溶媒系は水溶性の極性有機溶媒を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記溶媒系は水を含み、上記水のｐＨはｐＨ変更可能物質によって、７〜１４、好ましくは８〜１３、より好ましくは８．５〜１２に調整され、上記ｐＨ変更可能物質は、アミン、無機塩基、有機酸塩、またはこれらの任意の混合物であることが好ましく、アミンおよび／またはＮＨ３、有機酸塩、または水酸化物であることがより好ましく、トリエチルアミンおよび／またはＮＨ３であることがさらに好ましいことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非極性の固定相の上記微粒子は鎖状アルキル基に共有結合したシリカゲル系であって、鎖状アルキル基は、Ｃ２−Ｃ２０アルキルであることが好ましく、Ｃ８−Ｃ１８アルキルであることがより好ましいことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記化学複合分子の上記溶離（eluation）を検出可能な上記検出器は、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）およびＳＣＡＮ（ネガティブ／ポジティブ）、またはこれらの組み合わせのいずれの動作モードで作動する、質量分析計、タンデム質量分析計（または三連四重極型）、シングル四重極型であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
相変化およびイオン化は、化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）またはサーモスプレーであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記ステップ（ｖ）が、上記試料の前処理のために、トリクロロ酢酸であることが好ましいタンパク質沈殿剤の使用も含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記ステップ（ｖ）が、上記試料の前処理のために、ＥＤＴＡ、その塩、またはそれらの任意の混合物であることが好ましい、キレート剤の試料の使用も含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記生体マトリックスは生体液であり、血液、血漿、血清、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましく、血液および血漿であることが好ましいことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記生体マトリックスは生体組織であり、肺、腎臓、心臓、脳、肝臓、血管、骨、皮膚、筋肉、神経組織、脈管組織、およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましく、心臓組織であることが好ましいことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
分析される上記生体マトリックスは、生物学的等価性試験下に置かれたヒトの単離した試料であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
検量線を作成するために代替マトリックスが用いられ、使用される上記代替マトリックスはウシ血清アルブミンによって生成されることが好ましいことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
代謝プロファイル中の化合物の任意の代謝産物を検出し定量するために用いられる方法であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の分析方法であって、上記ＡＰＩ、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品は分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含み、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記化合物はその関連不純物とともに定量することも可能であり、上記分析方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）上記化学複合分子の溶離（eluation）を検出可能な検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含むＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品から上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記ＡＰＩ、医薬組成物、または機能性食品を全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いて上記ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１６】
不純物プロファイル中の化合物の任意の不純物を検出し定量するために用いられる方法であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む薬、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品用医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品は予め決められた割合の上記化学複合分子を有している必要があり、上記プロセスは、１回分の薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品を取得すること、先行の請求項に記載の方法を含むプロセスによって上記１回分の上記化学複合分子の純度の割合を測定すること、上記のように測定した化学複合分子の割合が、（乾燥含量について）７０重量％より多いことが好ましく、８０重量％より多いことがより好ましいという条件または規定内の場合のみ１回分の上記薬、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品を含有すること、を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１８】
分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記製造方法は、請求項１〜１２に記載のいずれかの方法によって、最初の１回分によって得られた医薬組成物を投与された被験者から採取した、血液または血清試料であることが好ましい生体単離試料を分析した後、算出したＡＵＣおよびＣｍａｘが望ましい条件内にある、および／または参照薬と生物学的等価性があるという条件で、最初の１回分の製造方法と全く同じステップを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１９】
分子量が少なくとも２００の化合物の代謝プロファイルであって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であることを特徴とする代謝プロファイル。
【請求項２０】
分子量が少なくとも２００の化合物の不純物プロファイルであって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記記化合物または複数の化合物はＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の配合組成物中に存在することを特徴とする不純物プロファイル。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、化学複合分子の定量を行うための直接液体クロマトグラフィー法に関し、特に、上記化学複合分子は２〜６のリン酸基を含む群から選択されるイノシトールポリリン酸である。
【０００２】
〔背景技術〕
リン含有化学複合分子の分析定量は、主にその物理化学的性質のため非常に困難である。これらの分子は高帯電分子であり、リン酸塩またはホスホン酸塩等の複合官能基が存在するため、ｐＨによって異なるイオン化度を示す。この問題点は複数のリン含有基を持つ分子に特に関係する。
【０００３】
同様に、これらの化学複合分子の大部分におけるＵＶ−Ｖｉｓスペクトル領域内の吸収帯の欠如は、直接分光光度法による化学複合分子の定量を妨げる。
【０００４】
さらに、生体マトリックス中の化学複合分子の定量はマトリックス効果によってさらなる困難を伴う。そのため、日常的に使用するための新規な生体分析法を開発し、確立しなければならない。
【０００５】
上記マトリックス中の他の構成要素と比較して低い濃度の分析物は、分析物の反応を抑制し得る。こうした効果は、マトリックス試料と標準試料との間に反応の違いを引き起こしかねず、定量分析および化合物の同定を困難なものにしてしまう（Biol Pharm Bull 25, 547-557; 2002）。
【０００６】
例えば、ビスホスホネートは、１つの分子につき、強力なイオン性および増強した極性をもたらす２つのホスホン酸基を与える。さらに、このファミリーの大部分のメンバーは発色団が欠如しており、そのため便利な直接ＵＶ検出ができない（J Pharm Biomed Anal 48, 483-496; 2008）。ビスホスホネートの定量のための別の生体分析法が開発された。ビスホスホネートの定量のために誘導体化ステップやフラグメント化を加えることは直接的な方法ではないが、分子それ自体または該分子の付加物を定量する直接的な方法として理解され、より感度が良く、特異的で、正確かつ確実な方法でありながら、特にルーチン的な分析を行う上でより応用性があり、迅速で信頼性のある方法である（J Chromatogr B 877, 3159-3168; 2009, Int J Mass Spectrom 295, 85-93; 2010, J Mass Spectrom 37, 197-208; 2002）。
【０００７】
リン含有化学複合分子の他の例としてはピロリン酸塩が挙げられる。ピロリン酸塩は、２つのリン原子を結合する炭素原子がある点においてビスホスホネートと異なる（ビスホスホネートの炭素原子（Ｐ−Ｃ−Ｐ）が酸素と置き換わる（Ｐ−Ｏ−Ｐ））。
【０００８】
ヌクレオチドも、（複数のリン酸基の存在によって）高帯電かつ極性性質を有する化学複合分子の一例であり、そのため本発明は、特に複数のリン酸基を有する化学複合分子に関する。
【０００９】
特に生体マトリックス中の（２〜６のリン酸基の）イノシトールポリリン酸に加えて他の関連不純物の選択的定量は、本発明が見出した分析における主な進展のうちの１つである。極端なケースでは、ＩｎｓＰ６またはＩＰ６としても公知のイノシトール六リン酸は、負値〜１０より多い範囲のｐＫａ値を有する１２の解離性タンパク質を示している（Carbohydr Res 46, 159-171; 1976）。
【００１０】
ＩｎｓＰ６定量の数多くの分析方法が文献に記載されている。それにもかかわらず、その多くが単純マトリックス（例えば、食物抽出物または調合薬のための方法に由来するマトリックス）の定量のために開発されており、その場合ＩｎｓＰ６の濃度は生体マトリックス中で予想されるものより高くなる。
【００１１】
複合マトリックス（概して生物由来のもの）の場合、先述した方法は、血漿、尿、他の生体液、組織または細胞の場合のように、定量される濃度が低い場合、ＩｎｓＰ６の定量のための十分な感度および特異性を有していない。
【００１２】
この種のマトリックスのイノシトールポリリン酸の定量のための高感度かつ選択性の高い方法の必要性、ならびにイノシトールポリリン酸の特異な物理化学的性質のために、多くの既存の方法が使用できないものとなっている。
【００１３】
さらに、既存の方法のなかにはイノシトールポリリン酸を検出できるものもあるが、それらは日常的に試料の分析を行わなければならない臨床試験で使用するための十分な再現性および確実性を有していない。
【００１４】
ＷＯ／２００９／１０９６４７は、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳアッセイを利用した試料（尿、血漿）中のイノシトールリン酸（１つのリン酸基のみを有するＩＰ１またはＩｎｓＰ１）の量の定量を開示している。米国特許出願公開第２０１００１３６６００号は、ＬＣ−ＭＳ／ＨＰＬＣ−ＭＳ技術を利用した試料（尿、血漿）中のミオ−イノシトールの定量を開示している。しかし、いずれもＩＰ６の定量方法は開示しておらず、ＩＰ２−ＩＰ６は（リン酸基を有さず、帯電しない）イノシトールまたは（１つのリン酸基のみを有し、限定的に帯電した）ＩＰ１に比べて高帯電分子なので、これらの特許で開示された分析技術も、ＩＰ２−ＩＰ６の定量に対して無効／不適切となることがある。
【００１５】
血漿中のＩｎｓＰ６およびＩｎｓＰ３を定量するための間接的な方法は、従来、ＩＰ６の加水分解、さらにイノシトールまたはリン酸塩の定量を伴うＨＰＬＣクロマトグラフィー分画のガスクロマトグラフィー質量検出分析を利用して開発されたが、これは長時間かかる方法（１つの試料につき３日間）であり、正確性に乏しい結果をもたらした（Life Sci 71, 1535-1546; 2002）。
【００１６】
植物抽出物および生体外の培養細胞における定量のための直接ＨＰＬＣ−ＭＳがすでに記載されている（Mass Spectrom 23, 705-712; 2009）。しかしながら、記載されているＨＰＬＣの条件のために、この方法は他のすべての生体マトリックスでは使用できないものとなってしまう。
【００１７】
サーモスプレーイオン化法を利用したＨＰＬＣ／ＭＳは、イノシトールリン酸の定量を可能にするが、生体への適応の制限として感度の欠如が文献に記載されている（Biomed Environ Mass Spectrom 19, 597-600; 1990）。
【００１８】
フィチン酸の精製抽出物のリンの総計に基づいたヒトの尿中のＩＰ６を分析するためのその他の間接的な方法が記載されている。この場合、尿中のフィチン酸を伴う、リン酸塩またはピロリン酸塩等の他のリン含有化合物からの干渉を避けるために、試料に特定の前処理を行う必要がある（Anal Chem 75, 6374-6378; 2003, Anal Chim Acta 510, 41-43; 2004）。これらの方法の短所の１つは、感度および選択性の問題のために、その利用が尿試料に限定され、組織または血液試料、および関連不純物の定量に適用できないことである。さらに、総リン量を介したＩＰ６の間接的な定量は、すべての定量されたリンがＩＰ６と同定されるために体系的に高値となるため補外法となる。
【００１９】
ヒトの尿中のフィチン酸塩を定量するための別の間接的な方法が記載されている。この方法は、フィチン酸塩の加水分解、および加水分解生成物の１つであるミオ−イノシトールの定量に基づいている（Chromatographia 60, 265 -268; 2004）。この方法は、酸性加水分解の必要があるため、時間がかかる方法（１つの試料につき２日間）である。さらに、加水分解の感度が制限されること、および特異性の欠如によって、他の生体マトリックスおよび関連不純物の共同定量にとって、この方法は無用なものとなってしまう。
【００２０】
生体試料中（主に尿中）のＩＰ６の定量のための先行技術と考えられるその他の文献を下記に挙げる。
【００２１】
２００１年に開示されたＭａｒｃｈ ｅｔ ａｌは、血中のイノシトールリン酸を定量する独特の方法であるが、尿および組織に適応可能である（J Chromatogr B 757, 247-255; 2001）。この方法は、ＩＰ６の酵素加水分解に基づいた時間のかかる間接的な方法（１つの試料につき３日間）であり、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析計を介したイノシトール分子（加水分解物）の定量方法である。この方法は、間接的で、本発明とは異なる原理に基づいた高感度な方法であるが、全てのイノシトールリン酸塩が非特異的（ｉｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）に加水分解され、リン酸塩全体がＩＰ６として定量されるためいずれの場合でも特異性が欠如してしまう。
【００２２】
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは、感度が乏しいため食物および生体試料としては尿にのみ適応可能であるが、ＩＰ６の定量のために広く利用されてきた（Anal Chim Acta 605, 185-191; 2007）。
【００２３】
これらは本明細書に記載した本発明と全く異なる方法であり、いずれの場合も関連不純物を定量することができず、尿と異なる他の生体マトリックスに適用することができない方法である。
【００２４】
〔発明の概要〕
本発明は、化学複合分子の定量のための直接液体クロマトグラフィー法に関し、本発明の範囲において、少なくとも２つのリン含有基を有し、少なくとも分子量が２００である分子が該分子として理解される。これらの複合分子は、数種のイオン化可能基の存在のため高極性かつ高帯電である。さらに、多くの場合、これらの分子はＵＶ可視スペクトル領域の吸収帯が欠如しているため、標準的な技術では不可視である。
【００２５】
目標化合物の同定および定量は直接検出を介して行われる。本発明の範囲において、直接検出は、化合物（またはそのイオンまたはその塩）「そのまま」の性質、または付加物（例えばイオン付加物が挙げられるがこれに限定されない）を生成する化合物、質量検出における主な分析物の分画を含んだ親化合物のフェーズＩＩの代謝産物であることが好ましい代謝産物の性質を用いた分析物の同定／定量として定義される。直接検出によって検出される性質は、限定されるわけではないが、質量検出、伝導性、放射性（つまり分析物が放射標識を付され得る）、ＮＭＲと成り得るが、なかでも質量検出が好ましい。本発明の発明者は、上記化学複合分子の質量が２００未満の場合、移動相および雰囲気からのいくつかの化合物の干渉のために選択性がそれらのレベルに弱まることを発見した。
【００２６】
さらに、本発明の感度を約１ｐｍｏｌとすることが可能であり、これは現在利用可能な方法のなかで高域である。さらに、本発明の感度と特異性／選択性とを組み合わせることで、活性医薬成分、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の品質管理を行う場合に、あらゆる種類の生体マトリックスに加えて、主な分析物ならびに関連不純物の定量に適用可能である。
【００２７】
「生体マトリックス」は温血動物から分離した、または分離していない環境を表している。生体マトリックスの限定されない例としては、液体、組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、培養細胞、尿、排泄物、血液、血清、血漿、唾液、汗、組織液、細胞質、肝細胞、ミクロソーム、Ｓ９分画、筋肉組織、肝組織、心臓組織、腎臓組織等の組織、他の身体環境および／またはヒトであることが好ましい温血動物のマトリックスが挙げられる。生体マトリックスは、溶液中、固体形態またはそれらの混合物中に存在してもよく、生物内または生物の一部として存在してもよいし、または生物から作成した試料のように生物と分離してもよい。本明細書中に開示された方法は、化学複合分子の濃度が、（固体マトリックスの場合）０．００１μｍｏｌ／ｍｇ、または（他の物理的状態の場合）０．００１μｍｏｌ／μｌ未満であることが好ましく、０．０００００１μｍｏｌ／ｍｇ、または０．０００００１μｍｏｌ／μｌ未満であることがより好ましく、０．００００００１μｍｏｌ／ｍｇ、または０．００００００１μｇ／μｌの範囲量であることがさらに好ましい非常に低い値の化学複合分子を含む生体マトリックスを対象とする場合でも優れた結果を提示する。上記生体マトリックスは、限定されるわけではないが、血液、血漿、血清、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液およびそれらの混合物とすることができる生体液でもよく、血液または血漿であることが好ましい。上記生体マトリックスは、限定されるわけではないが、肺、肝臓、腎臓、心臓、血管、脳、骨、皮膚、筋肉、神経組織、脈管組織、およびそれらの混合物とすることができる生体組織でもよく、心臓組織であることが好ましい。
【００２８】
本明細書に開示された方法は、例えば、限定されるわけではないが、ラット、マウス、イヌ、サル、ヒト、ブタ、ミニブタ、ウサギ、モルモット等の異なる種の生体マトリックスに対しても信頼性のある方法である。
【００２９】
本発明の様々な態様について下記に記載する。
【００３０】
したがって、本明細書に開示された方法は、分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物の直接検出および／または定量の方法であって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記検出および／または定量される化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記方法はクロマトグラフィーを行うこと、および質量検出器または放射能検出器を用いて、信号の保持時間、および／または該信号の強度を同定することを含んだ直接検出および／または定量の方法を提供する。
【００３１】
本発明の第１の態様によると、分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物の直接検出および／または定量の方法であって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記検出および／または定量される化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記直接検出および／または定量のための上記方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが７〜１４になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのクロマトカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）質量検出器または放射能検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含む生体マトリックスから上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いて上記ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む直接検出および／または定量の方法を提供する。
【００３２】
本発明の第２の態様によると、ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の分析方法であって、上記ＡＰＩ、上記メディカルフード、上記試薬、上記食品添加物、上記医薬組成物、または上記機能性食品は分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含み、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記化合物はその関連不純物とともに定量することも可能であり、上記分析方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが７〜１４になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのクロマトカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）上記化学複合分子の溶離（eluation）を検出可能な検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含むＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品から上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品を全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いて上記ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む分析方法を提供する。
【００３３】
本発明の第３の態様によると、分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品用医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品は予め決められた割合の上記化学複合分子を有している必要があり、上記プロセスは、１回分の薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品を取得すること、第２の態様に記載の方法を含むプロセスによって上記１回分の上記化学複合分子の純度の割合を測定すること、上記のように測定した化学複合分子の割合が、乾燥含量について、通常の分析で、６０％より多く、７０％より多いことが好ましく、８０％より多いことがより好ましいという条件または予め規定した規定内の場合のみ１回分の上記薬、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品を含有すること、を含む製造方法を提供する。
【００３４】
本発明の第４の態様によると、分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記製造方法は、第１の態様に記載のいずれかの方法によって、最初の１回分によって得られた医薬組成物を投与された被験者から採取した、血液または血清試料であることが好ましい生体単離試料を分析した後、算出したＡＵＣおよびＣｍａｘが望ましい条件内にある、および／または参照薬と生物学的等価性があるという条件で、最初の１回分の製造方法と全く同じステップを含む製造方法を提供する。「ＡＵＣ」は、患者への化合物の投与後の時間の関数として、患者の血漿および血液等の生体液中の該化合物またはその代謝産物の濃度を示す曲線下面積を表している。「Ｃｍａｘ」は、患者への一回分の薬または薬の剤型の投与後の患者の血漿または血液中の該薬の最高濃度である。
【００３５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の様々な実施形態を以下に記載する。
【００３６】
化学複合分子は、ビスホスホネート、ヘキサメタリン酸塩、またはＣ３−Ｃ７シクロアルキルでもよく、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２からなる群からそれぞれ独立して選択されている。「Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル」は、３〜７の炭素原子を有する飽和環状アルキル基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルを含んでいる。好ましい化学複合分子はＣ６シクロアルキルである。上記化学複合分子はシクロアルキル誘導体でもよい。上記化学複合分子がイノシトールポリリン酸であるときに優れた結果が得られた。
【００３７】
上記化学複合分子は放射標識を付されてもよい。
【００３８】
ステップ（ｉｉ）で調製される標準試料は、参照標準、外部標準、内部標準または標準添加でもよく、標準添加法によって調製された標準を意味する標準添加も下記に記載されている。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「参照標準」は、限定されるわけではないが、活性医薬成分とすることができる分析物の定量および定性分析のために利用してもよい化合物を表している。例えば、ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）における上記化合物の保持時間によって相対的な保持時間の設定が可能となり、それによって定性分析が可能になる。ＬＣカラムに注入される前の溶液中の上記化合物の濃度によって、ＬＣクロマトグラムのピーク下面積の比較が可能となり、それによって定量分析が可能になる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、外部標準は公知の濃度の化学複合分子を表している。濃度を分析するために用いられる場合、外部標準を公知の濃度で試験試料に加えることが好ましく、この技術は標準添加として公知である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「内部標準」は、試料に加えられ、その後試料内で検出および定量されるものを表している。内部標準の添加は、試料の収集または処理を行う前、途中、またはその後に行うことが可能である。本発明で考えられるように、内部標準は試料に添加される化合物であり、添加後にこの類似の化合物が本明細書に記載の方法を利用して定量される。
【００４２】
上記溶媒系は極性有機溶媒を含むことが好ましい。特に興味深いのは溶媒系が水溶性の極性有機溶媒を含むことである。溶媒系が、アセトニトリル、メタノール、またはそれらの混合物を含むことが好ましい。上記溶媒系がアセトニトニルを含むことがより好ましい。
【００４３】
さらに、上記溶媒系は水を含んでもよい。最も好ましい溶媒系の１つは、好ましくは、実質的に水とアセトニトリルとからなることを包含している。
【００４４】
上記溶媒系はイソクラティックまたはグラジエントでもよい。ある好ましい実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）で、上記溶媒系の組成を徐々に増加させ、つまりグラジエントとし、移動相の強度を徐々に増加させる。上記試料と上記溶媒系がカラムを通過し始めたときには上記溶媒系は水の含有量が多く、その後、上記化学複合分子が溶離する間に該水の含有量を徐々に減少させることが好ましい。
【００４５】
ステップ（ｉｉｉ）で、上記溶媒系の組成、および結果としての移動相の強度を実質的に変化させずに維持してもよい。
【００４６】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）の間、上記溶媒系は少なくとも１つの溶媒を含み、上記のような溶媒のｐＨは７〜１４になるよう緩衝化され、上記のような溶媒系のｐＨは８〜１３に調整されることが好ましく、８．５〜１２に調整されることがより好ましい。
【００４７】
ｐＨを調整するために当業者が利用するいくつかの技術がある。ｐＨは、ｐＨ変更可能物質を用いて変更することができ、典型的なものとして、酸、塩基、または酸性または塩基性の性質を有する塩が挙げられるが、これに限定されるわけではない。その中でも、ｐＨ変更可能物質は、アミン、無機塩基、有機酸塩、またはそれらの混合物とすることができる。アミン、および特にトリエチルアミンが好ましい。無機塩基は、水酸化物、好ましくは、ＫＯＨであってもよい。無機塩基は、酢酸塩等の有機酸塩として利用可能である。
【００４８】
ある特定の実施形態では、調製済みの試料を対応する装置に注入する前に、さらにｐＨコントロールを行う。ｐＨを移動相と同じｐＨに調整することが好ましい。ｐＨは酸、塩基、または塩で調整することができ、アミン基で調整することが好ましく、該アミンがトリエチルアミンであることがより好ましい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「クロマトカラム」は、吸収性粒子が詰められ、クロマトグラフィーを行うために使用される管を表している。特に興味深いものは、非極性の固定相の微粒子がシリカ系、好ましくはシリカゲル系であるカラムである。非極性の固定相の上記微粒子が、好ましくは鎖状アルキル基に共有結合したシリカゲル系であるときに良い結果が得られる。上記鎖状アルキル基はＣ２−Ｃ２０アルキルでもよく、Ｃ８−Ｃ１８アルキルが好ましい。
【００５０】
非極性の固定相の上記微粒子は、０．５〜２０ミクロンの平均粒子サイズを有してもよく、１．５〜１５ミクロンが好ましく、５〜１０ミクロンがより好ましい。
【００５１】
細孔の大きさは、１０〜１０００オングストロームの範囲であってもよく、６０〜５００オングストロームの範囲が好ましく、１００〜３００オングストロームの範囲がより好ましい。
【００５２】
上記系の再現性およびその他の効果は、ステップ（ｉｉｉ）の間のカラムの温度を実質的に変化させずに維持した場合に向上する。典型的な例として、ステップ（ｉｉｉ）の間のカラムの温度を実質的に変化させずに１０〜７０℃の間で維持する。実質的に変化させずに４５〜５５℃の間で維持することが好ましく、約５０℃で実質的に変化させずに維持することがより好ましい。
【００５３】
「検出器」は、上記化学複合分子を検出可能な任意の装置、機器、機械、構成要素またはシステムを表している。検出器はハードウェアおよびソフトフェアを含んでも良いし、含まなくても良い。質量検出器（質量分析計）において、一般的な検出器は質量分析装置を含むおよび／または質量分析装置に接続される。上記化学複合分子の溶離を検出可能な検出器の例として、質量分析計、タンデム質量分析計（または三連四重極型）、シングル四重極型が挙げられる。これらの質量検出器はいくつかの動作モードで作動することができ、中でも選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）およびＳＣＡＮ（ネガティブ／ポジティブ）、またはこれらのうちのいくつかのモードで作動することができる。放射能検出器も使用可能である。第２の態様では、電気伝導度検出器、光度検出器および／またはＮＭＲ検出器も使用可能である。
【００５４】
質量検出器の利用は概してさらなるステップ、つまり上記化学複合分子が溶離し検出される間の後における相変化およびイオン化という前のステップを含んでいる。上記相変化およびイオン化は、化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）、またはエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）またはサーモスプレーであってもよいが、これに限定されない。エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）は、Ｎ２の温度が２５０〜１０００℃であるなかで行われてもよく、３００〜８００℃が好ましく、４００〜６００℃がより好ましい。
【００５５】
生体試料の前処理のために、ステップ（ｖ）で、該試料に前処理をするためにトリクロロ酢酸であることが好ましいタンパク質沈殿剤を使用する必要があり得る。この追加処理によって、生体マトリックスを単純化することができ、それによってマトリックス効果が減少して選択性が良くなり、感度が上昇する。ステップ（ｖ）では、試料の前処理のためにＥＤＴＡ等のキレート剤を使用することを含んでもよい。これらのキレート剤が生体試料中の遊離カルシウム濃度を下げるので、その結果、回収を低下させ、精度を損なってしまう恐れがあるレイビル化合物が分析物と同時に生成される事態を防ぐ。
【００５６】
上記生体マトリックスは予め濃縮されていてもよく、それによって上記方法の感度が上昇する。
【００５７】
別の特定の実施形態では、少なくとも２つのリン基、そのイオンまたはその塩を含むイノシトールポリリン酸の直接検出および／または定量の方法であって、上記イノシトールポリリン酸は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックス中は、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記直接検出および／または定量のための上記方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される少なくとも２つのリン基を含むイノシトールポリリン酸の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）アミン水溶液からなる溶媒系であり、上記溶媒はｐＨが８〜１３になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）粒子の大きさが１．５〜１５ミクロン、細孔の大きさが６０〜５００オングストロームである逆相固定相である少なくとも１つのカラムに、上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）質量検出器を用いて、上記イノシトールポリリン酸の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量されるイノシトールポリリン酸を含む生体マトリックスから上記イノシトールポリリン酸の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いてステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記イノシトールポリリン酸の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む直接検出および／または定量の方法を提供する。
【００５８】
上記試料の前処理の間、該処理中に現れたあらゆる固体粒子を除去するために、概して遠心分離または濾過である液体−固体分離のためのステップを含んでもよい。このステップでは、上記試料の前処理の間、温度を２〜８℃に管理することが好ましく、約４℃に管理することがより好ましい。
【００５９】
本明細書に開示された上記方法は、化学複合分子の分析に有用である。本明細書に開示された上記方法のある特定の用途は、生物学的等価性試験下に置かれたときのヒトの生体マトリックスの分析である。本明細書に開示された上記方法の他の特定の用途は、特にＩＰ６である上記化学複合分子の関連不純物を同時に定量することである。
【００６０】
本発明の上記方法は、他の分析技術（ＲＭＮ／カール・フィッシャー／ＧＣ／ＩＣＰ／ＴＧ）と組み合わせてもよい。
【００６１】
「代謝プロファイル」は、リン酸化−脱リン酸化代謝経路から主に成る親化合物に由来する１つまたは複数の生体マトリックス中における代謝産物の同定、半定量および／または定量を含んでいる。
【００６２】
「不純物プロファイル」は、ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の配合組成物中における、主に脱リン酸化関連不純物である親化合物に由来する１つまたは複数の不純物の同定、半定量および／または定量を含んでいる。
【００６３】
本発明のさらなる態様／実施形態は下記の各項目に見られる。
【００６４】
項目１．−分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物の直接検出および／または定量の方法であって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記検出および／または定量される化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記直接検出および／または定量のための上記方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが７〜１４になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）質量検出器または放射能検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含む生体マトリックスから上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いてステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む直接検出および／または定量の方法。
【００６５】
項目２．−上記化学複合分子は、ビスホスホネート、ヘキサメタリン酸塩、ヌクレオチド、またはＣ３−Ｃ７シクロアルキルであって、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、少なくとも２つのＲ基で置換される先行する項目に記載の方法。
【００６６】
項目３．−上記化学複合分子は、２〜６のリン酸基を含む群から選択されるイノシトールポリリン酸である先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００６７】
項目４．−ステップ（ｉｉ）で調製した上記標準試料が、参照標準、外部標準、内部標準、または標準添加である先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００６８】
項目５．−上記溶媒系は水溶性の極性有機溶媒を含む先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００６９】
項目６．−ステップ（ｉｉｉ）で、上記溶媒系の組成を徐々に増加させ、つまり、移動相の強度を徐々に増加させる先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００７０】
項目７．−ステップ（ｉｉｉ）で、上記溶媒系の組成、および移動相の強度が実質的に変化されずに維持される項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００７１】
項目８．−上記溶媒系は水を含み、上記水のｐＨはｐＨ変更可能物質によって、７〜１４、好ましくは８〜１３、より好ましくは８．５〜１２に調整され、上記ｐＨ変更可能物質は、アミン、無機塩基、有機酸塩、またはこれらの任意の混合物であることが好ましく、アミンおよび／またはＮＨ３、有機酸塩、または水酸化物であることがより好ましく、トリエチルアミンおよび／またはＮＨ３であることがさらに好ましい先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００７２】
項目９．−装置に注入される前の上記試料の前処理の間であることが好ましい、少なくとも１つの追加のｐＨコントロールをさらに含む先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００７３】
項目１０．−非極性の固定相の上記微粒子は鎖状アルキル基に共有結合したシリカゲル系であって、鎖状アルキル基は、Ｃ２−Ｃ２０アルキルであることが好ましく、Ｃ８−Ｃ１８アルキルであることがより好ましい先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００７４】
項目１１．−上記化学複合分子の上記溶離（eluation）を検出可能な上記検出器は、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）およびＳＣＡＮ（ネガティブ／ポジティブ）、またはこれらの組み合わせのいずれの動作モードで作動する、質量分析計、タンデム質量分析計（または三連四重極型）、シングル四重極型である先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００７５】
項目１２．−上記化学複合分子が溶離し検出される間の相変化およびイオン化という前のステップをさらに含む先行する項目に記載の方法。
【００７６】
項目１３．−相変化およびイオン化は、化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）またはサーモスプレーである先行する項目に記載の方法。
【００７７】
項目１４．−エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）は、Ｎ２の温度が２５０〜１０００℃であるなかで行われ、３００〜８００℃が好ましく、４００〜６００℃がより好ましい先行する項目に記載の方法。
【００７８】
項目１５．−ステップ（ｖ）が、上記試料の前処理のために、トリクロロ酢酸であることが好ましいタンパク質沈殿剤の使用も含む先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００７９】
項目１６．−ステップ（ｖ）が、上記試料の前処理のために、ＥＤＴＡ、その塩、またはそれらの任意の混合物であることが好ましい、キレート剤の試料の使用も含む先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００８０】
項目１７．−上記生体マトリックスが予め濃縮される先行する項目のいずれかに記載の方法。
【００８１】
項目１８．−上記試料の前処理の間、液体−固体分離のためのステップをさらに含む先行する項目のいずれかに記載の方法。
【００８２】
項目１９．−上記生体マトリックスは生体液であり、血液、血漿、血清、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましく、血液および血漿であることが好ましい先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００８３】
項目２０．−上記生体マトリックスは生体組織であり、肺、腎臓、心臓、脳、肝臓、血管、骨、皮膚、筋肉、神経組織、脈管組織、およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましく、心臓組織であることが好ましい項目１〜１８に記載の方法。
【００８４】
項目２１．−分析される上記生体マトリックスは、生物学的等価性試験下に置かれたヒトの単離した試料である先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００８５】
項目２３．−検量線を作成するために代替マトリックスが用いられ、当該用いられるマトリックスはウシ血清アルブミンによって生成されることが好ましい先行する項目のいずれかに記載の方法。
【００８６】
項目２４．−代謝プロファイル中の化合物の任意の代謝産物を検出し定量するために用いられる方法である先行する項目のいずれかに記載の方法。
【００８７】
項目２５．−上記化合物が放射標識を付される先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【００８８】
項目２６．−ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の分析方法であって、上記ＡＰＩ、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品は分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含み、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記化合物はその関連不純物とともに定量することも可能であり、上記分析方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）上記化学複合分子の溶離を検出可能な検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含むＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品から上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記ＡＰＩ、医薬組成物、または機能性食品を全体的または部分的に溶解するステップと、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理するステップを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、ステップ（ｖ）で調製した上記試料を用いてステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む分析方法。
【００８９】
項目２７．−不純物プロファイル中の化合物の任意の不純物を検出し定量するために用いられる方法である先行する項目に記載の方法。
【００９０】
項目２８．−分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む薬、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品用医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品は予め決められた割合の上記化学複合分子を有している必要があり、上記プロセスは、１回分の薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品を取得すること、先行の項目に記載の方法を含むプロセスによって上記１回分の上記化学複合分子の純度の割合を測定すること、上記のように測定した化学複合分子の割合が、（乾燥含量について）７０重量％より多いことが好ましく、８０重量％より多いことがより好ましいという条件または規定内の場合のみ１回分の上記薬、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品を含有すること、を含む製造方法。
【００９１】
項目２９．−分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記製造方法は、項目１〜２２に記載のいずれかの方法によって、最初の１回分によって得られた医薬組成物を投与された被験者から採取した、血液または血清試料であることが好ましい生体単離試料を分析した後、算出したＡＵＣおよびＣｍａｘが望ましい条件内にある、および／または参照薬と生物学的等価性があるという条件で、最初の１回分の製造方法と全く同じステップを含む製造方法。
【００９２】
項目３０．−分子量が少なくとも２００の化合物の代謝プロファイルであって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞である代謝プロファイル。
【００９３】
項目３１．−分子量が少なくとも２００の化合物の不純物プロファイルであって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルであることが好ましく、少なくとも２つのＲ基で置換されており、上記Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルは、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記記化合物または複数の化合物はＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の配合組成物中に存在する不純物プロファイル。
【００９４】
〔図面の説明〕
図１、実施例１のグラジエント溶離逆相クロマトグラフィー後のラットの血漿中のＩＰ６について得られたＵＰＬＣ（登録商標）−ＭＳクロマトグラム。
【００９５】
図２、実施例４のグラジエント溶離逆相クロマトグラフィー後のラットの尿中のＩＰ６について得られたＨＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム。
【００９６】
図３、実施例８（不純物プロファイル）のＡＰＩ試料（該試料の場合の詳細）の典型的なクロマトグラム。図３ａはブランクの場合、図３ｂは試料の場合（Ｐ：リン酸塩、ＩＰ６：イノシトール六リン酸、１、２、３、４：関連不純物）。
【００９７】
図４、ラットの血漿試料についてのＡＴＰの典型的なクロマトグラム（実施例９）。
【００９８】
図５、ラットの血漿試料についてのＩＰ３の典型的なクロマトグラム（実施例１０）。
【００９９】
図６、ヒトの尿中のＩＰ６の典型的なクロマトグラム（実施例１１）。
【０１００】
図７、血漿または血清について、代替マトリックスとしてＰＢＳ中の３０ｍｇＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液を使用したＩＰ６の典型的なクロマトグラム（実施例１２）。
【０１０１】
図８、フィチン酸溶液（ＩＰ５、ＩＰ４、ＩＰ３、およびｍ／ｚ ７７９）中に存在する不純物の典型的なクロマトグラム（実施例１３）。
【０１０２】
図９、ラット肝細胞中のフィチン酸の培養後のｍ／ｚ ７７９、ｍ／ｚ ７４０ｙ、ｍ／ｚ ５７９のフィチン酸代謝産物の典型的なクロマトグラム（実施例１４）。
【０１０３】
図１０、ラット肝細胞中のフィチン酸の培養後のｍ／ｚ ４９９、ｍ／ｚ ４１９、ｍ／ｚ ３３９ｙ、ｍ／ｚ ２５９のフィチン酸代謝産物の典型的なクロマトグラム（実施例１４）。
【０１０４】
図１１、ラット肝細胞中のフィチン酸の培養後のフィチン酸の典型的なクロマトグラム（実施例１４）。
【０１０５】
図１２、ラット血漿中のＩＰ５の典型的なクロマトグラム（実施例１５）。
【０１０６】
図１３、ラット血漿中のフィチン酸代謝産物（代謝プロファイル）の典型的なクロマトグラム（実施例１６）。
【０１０７】
図１４、イヌの血漿中のフィチン酸代謝産物（代謝プロファイル）の典型的なクロマトグラム（実施例１７）。
【０１０８】
図１５、フィチン酸およびその関連不純物（不純物プロファイル）についての対応するピークを示すＡＰＩ試料の典型的なクロマトグラム（実施例１８）。
【０１０９】
下記の実施例は本明細書に開示された本発明を例示するものであるが、本明細書に添付された請求項に記載された本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：ラットの血漿試料中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
血漿試料にキレート剤（ＥＤＴＡ）存在下でＴＣＡを用いたタンパク質沈殿による化合物の精製および抽出を行った。その後、酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）で浮遊物を希釈し、ＵＰＬＣ（登録商標）−ＭＳシステムに２０μＬ注入した。
【０１１１】
フィチン酸のイオン化を、ネガティブエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して評価した。
【０１１２】
選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）の質量分析計によって定量分析を行った。
【０１１３】
移動相として、ＴＥＡＡの水溶液およびアセトニトリルを使用したグラジエント溶離逆相クロマトグラフィーによって上記化合物を分析した。最適なクロマトグラフィー条件下の分析物の保持時間は３．４２分であった（図１のクロマトグラム参照）。
【０１１４】
実施例２：イヌの血漿試料中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
実施例１で実施した生体分析処理を、線形性、真度、および精度のすべてを評価したイヌの血漿試料で再実証した。既知量のＩＰ６を加えたブランク血漿試料を２０μｌ注入して検量線を作成した。中濃度で１０％未満の真度、１５％未満の精度が得られ、結果的に優れた生体分析方法となった。
【０１１５】
実施例３：ヒトの血漿試料中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
実施例１で実施した生体分析処理を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、マトリックス、およびキレート剤の量を倍にしてヒトの血漿試料に適用した。最適なクロマトグラフィー条件下の分析物の保持時間は４．０５分であった。
【０１１６】
実施例４：ラットの尿試料中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
生体分析処理は、キレート剤（ＥＤＴＡ）の存在下でラットの尿を希釈することで化合物を抽出することを含み、沈殿剤は必要としなかった。酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）で浮遊物を希釈し、ＨＰＬＣ−ＭＳシステムに５０μＬ注入した。
【０１１７】
フィチン酸のイオン化を、ネガティブエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して評価した。選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードの質量分析計によって定量分析を行った。
【０１１８】
移動相として、ＴＥＡＡの水溶液およびアセトニトリルを使用したグラジエント溶離逆相クロマトグラフィーによって上記化合物を分析した。最適なクロマトグラフィー条件下の分析物の保持時間は３．９９分であった（図３のクロマトグラム参照）。
【０１１９】
実施例５：配合組成物中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
活性医薬成分の配合組成物（溶液）中でＩＰ６を同定および定量した。この実施例では、関連不純物を同時に定量しなかった。溶液媒体は、水、０．９％のＮａＣｌまたは媒介物として他の水溶液からなっていた。
【０１２０】
検量線域内に適合するように上記配合組成物を希釈すること以外の試料の前処理を行わずに、実施例１と同じ処理を用いてＩＰ６の分析および定量を実施した。
【０１２１】
濾過されていない配合組成物中のＩＰ６の安定性ならびに均等性を評価するために、上記の再実証された分析方法も使用した。この方法は線形性かつ特異性があることが証明された。
【０１２２】
実施例６：肝細胞培養細胞中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
実施例１に記載された方法を肝細胞培養細胞に適応させることに成功した。既知量のＩＰ６を有するいくつかの培養細胞をＨＰＬＣ−ＭＳに注入するこの試験は、この種のマトリックスに対する信頼性のある方法を示した。
【０１２３】
実施例７：ブタの血漿試料中のＩＰ６の定量（ＳＩＭモード）
実施例１で実施した生体分析処理をブタの血漿試料に適用した。既知量のＩＰ６を加えたブランク血漿試料を５０μｌ注入して検量線を作成した。１５％未満の真度および精度が得られ、結果的に優れた生体分析方法となった。
【０１２４】
実施例８：配合組成物中のＩＰ６および関連不純物の定量
活性医薬成分の配合組成物（溶液）中でＩＰ６を同定および定量した。この実施例では、関連不純物を同時に定量し、それによってＡＰＩのクロマトグラフからの純度の計算が可能となった。
【０１２５】
ＩＰ６の分析および定量を、移動相として用いられる水酸化カリウムを用いて実施した。水酸化ナトリウムを代わりに用いてもよく、イソプロパノールを少量添加することが強く勧められる。
【０１２６】
使用されたカラムはアニオン交換ジビニルベンゼンポリマーであった。流速を１ｍＬ／分、温度を３５℃に保った。化学または電気化学イオン抑制を用いたときに、特に不純物に対してより良い感度が得られた。
【０１２７】
フィチン酸の保持時間は２４．６分であった（図４参照）。分析試料におけるメインピークの保持時間が、分析が機能する標準となるように注入された全フィチン酸塩に対応するピークの平均保持時間の±０．５分以内である場合に、ＩＰ６の同定が確立される。この技術によって、１回のクロマトグラムで関連不純物と同時にＡＰＩを定量することができる。
【０１２８】
実施例９：ラットの血漿試料中のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の定量（ＳＩＭモード）
実施例１で実施した生体分析処理を、ＳＩＭモードで検出した質量をＡＴＰの分子量（Ｍ−１）に代えてラットの血漿試料に適用した。既知量のＡＴＰを加えたブランク血漿試料を５０μｌ注入して検量線を作成した。ＡＴＰの保持時間は３．９６分であった。図４はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１２９】
実施例１０：ラットの血漿試料中のＩＰ３（イノシトール三リン酸）の定量（ＳＩＭモード）
実施例１で実施した生体分析処理を、ＳＩＭモードで検出した質量をＩＰ３の分子量（Ｍ−１）に代えてラットの血漿試料に適用した。既知量のＩＰ３を加えたブランク血漿試料を５０μｌ注入して検量線を作成した。ＩＰ３の保持時間は２．６２分であった。図５はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１３０】
実施例１１：ヒト、ラットおよびイヌの血漿中、ヒトおよびラットの尿中のＩＰ６（イノシトール六リン酸）の定量（ＭＲＭモード）
実施例１で実施し、実施例１〜１０で用いた生体分析処理をＵＰＬＣ（登録商標）−ＭＳ／ＭＳシステムのＭＲＭモードに転用した。ＭＲＭモードを用いることによって、結果的に分析感度の上昇に加えて選択性も向上した。
【０１３１】
同様の抽出処理が用いられた。クロマトグラフィーの条件も同様の理論に基づいた。衝突誘起解離後に得られ、ＩＰ６の定量のために用いられた質量のトランジションは、ｍ／ｚ ６５９．０＞ｍ／ｚ ５６０．９であった。図６はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１３２】
実施例１２：代替マトリックス（血清または血漿代替マトリックス）中のＩＰ６の定量
実施例１１で実施した生体分析処理を、代替マトリックスに適用した。特定の状況（例えば、分析物の構造的なレベルがブランクマトリックスにおいて求められる場合）で、検量線を作成し、生体試料のＩＰ６を定量するために代替マトリックスが利用可能であった。
【０１３３】
代替マトリックスと生体マトリックスとの間で類似のマトリックス効果に加えて同一の抽出回収が得られ、結果的にＵＰＬＣ（登録商標）−ＭＳ／ＭＳシステムにおいて同一の挙動に帰結した。血漿または血清の代替マトリックスとして、ＰＢＳ中の３０ｍｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ｍＬ溶液を使用した。代替マトリックスに代えることによって、検量線を作成するために、より高度な感度が得られ、天然生体マトリックスの使用を避けることになる。図７はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１３４】
実施例１３：配合組成物中のＩＰ６および関連不純物の定量（ＳＣＡＮモード）
フィチン酸の定量のために実施したクロマトグラフ法によって、フィチン酸溶液中に存在するいくつかの不純物を定量することが可能となった。検出された全ての不純物（ＩＰ３、ＩＰ４、ＩＰ５、およびｍ／ｚ ７７９）がフィチン酸のピークで溶離したが、これらの不純物はその分子量の違いによって検出された。最も多い不純物はＩＰ５であった。
【０１３５】
図８は本実施例で得られたクロマトグラムを示している。
【０１３６】
実施例１４：ラットの肝細胞中のＩＰ６および関連不純物の定量（ＳＣＡＮモード）
ラットの肝細胞中のフィチン酸の培養後に、フィチン酸およびその代謝産物が検出された。純化ステップでは、ＥＤＴＡを用いた沈殿後にＫＨＢ溶媒を用いた沈殿物の希釈と、最終的にはＴＥＡＡを用いた希釈とを行った。ＩＰ１およびＩＰ２のみがフィチン酸と比較して保持時間に大きな違いを生じて溶離した。
【０１３７】
図９、１０、１１はラットの肝細胞中のフィチン酸培養後のフィチン酸およびその代謝産物の典型的なクロマトグラムを示している。
【０１３８】
実施例１５：イヌおよびラットの血漿試料中のＩＰ５の定量（ＳＩＭモード）
実施例１で実施した生体分析処理を、イヌおよびラットの血漿中のＩＰ５の定量に適用した。
【０１３９】
ＩＰ５の分子量（Ｍ−１）を用いてＳＩＭモードでＩＰ５を検出した。ＩＰ５の保持時間は４．１０分であった。
【０１４０】
図１２はラットの血漿中のＩＰ５について得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１４１】
実施例１６：ラットの血漿試料中のフィチン酸代謝産物の定量（ＳＩＭモード）
フィチン酸の定量のために実施した生体分析処理を、代謝産物の最大量を検出するためにラットの血漿試料に適用した。
【０１４２】
上記代謝産物は、最初にＳＣＡＮモードで検出され、その後ＳＩＭモードで確認および半定量された。基準を作るために対応する代謝産物を得る（つまり合成する）ことで定量測定を行うことができる。図１３はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１４３】
実施例１７：イヌの血漿試料中のフィチン酸の代謝産物の定量（ＳＩＭモード）
フィチン酸の分析のために実施した生体分析処理を、代謝産物の最大量を検出するためにイヌの血漿試料に適用した。上記代謝産物は、最初にＳＣＡＮモードで検出され、その後ＳＩＭモードで確認および半定量された。基準を作るために対応する代謝産物を得る（つまり合成する）ことで定量測定を行うことができる。
【０１４４】
図１４はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
【０１４５】
実施例１８：ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の品質管理のための配合組成物中のフィチン酸および関連不純物の定量（同定、分析）
フィチン酸および関連不純物を水溶液中の配合組成物中で同定および定量した。この方法によってフィチン酸の分析計算およびクロマトグラフィー純度の計算が可能になる。
【０１４６】
フィチン酸の分析および定量は、ＵＶ検出によるポストカラム誘導体化を用いたイオンクロマトグラフィーによって実施された。
【０１４７】
使用されたイオンクロマトグラフィーカラムは２％ジビニルベンゼンポリマーを用いて架橋したポリスチレンであった。流速を１ｍＬ／分に維持し、カラム温度を３５℃に設定した。
【０１４８】
ポストカラム誘導体化およびＵＶ検出によってフィチン酸に関連する化合物についての十分な感度が得られた。
【０１４９】
フィチン酸の保持時間は４８．０６分であった（図１５参照）。分析試料におけるメインピークの保持時間が、分析が機能する標準となるように注入された全フィチン酸に対応するピークの平均保持時間の±０．５分以内である場合に、フィチンの同定が確立される。
【０１５０】
この分析技術によって、ＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の品質管理のために、１回のクロマトグラフィーでフィチン酸と（最大３５の）その関連不純物との同時分析が可能になる。
【０１５１】
本明細書に記載した方法で生成した不純物の相対保持時間との比較による試験的割出しに基づいて生成された主な不純物が表１のリストにあるように同定された。
【０１５２】
【表１】
2014533353.tif 000002
【０１５３】
表１は、分解試料についての不純物の試験的ピーク割出しである。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図１は、実施例１のグラジエント溶離逆相クロマトグラフィー後のラットの血漿中のＩＰ６について得られたＵＰＬＣ（登録商標）−ＭＳクロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例４のグラジエント溶離逆相クロマトグラフィー後のラットの尿中のＩＰ６について得られたＨＰＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。
【図３】図は３、実施例８（不純物プロファイル）のＡＰＩ試料（該試料の場合の詳細）の典型的なクロマトグラムである。図３ａはブランクの場合、図３ｂは試料の場合である（Ｐ：リン酸塩、ＩＰ６：イノシトール六リン酸、１、２、３、４：関連不純物）。
【図４】図４は、ラットの血漿試料についてのＡＴＰの典型的なクロマトグラムである（実施例９）。
【図５】図５は、ラットの血漿試料についてのＩＰ３の典型的なクロマトグラムである（実施例１０）。
【図６】図６は、ヒトの尿中のＩＰ６の典型的なクロマトグラムである（実施例１１）。
【図７】図７は、血漿または血清について、代替マトリックスとしてＰＢＳ中の３０ｍｇＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液を使用したＩＰ６の典型的なクロマトグラムである（実施例１２）。
【図８】図８は、フィチン酸溶液（ＩＰ５、ＩＰ４、ＩＰ３、およびｍ／ｚ ７７９）中に存在する不純物の典型的なクロマトグラムである（実施例１３）。
【図９】図９は、ラット肝細胞中のフィチン酸の培養後のｍ／ｚ ７７９、ｍ／ｚ ７４０ｙ、ｍ／ｚ ５７９のフィチン酸代謝産物の典型的なクロマトグラムである（実施例１４）。
【図１０】図１０は、ラット肝細胞中のフィチン酸の培養後のｍ／ｚ ４９９、ｍ／ｚ ４１９、ｍ／ｚ ３３９ｙ、ｍ／ｚ ２５９のフィチン酸代謝産物の典型的なクロマトグラムである（実施例１４）。
【図１１】図１１は、ラット肝細胞中のフィチン酸の培養後のフィチン酸の典型的なクロマトグラムである（実施例１４）。
【図１２】図１２は、ラット血漿中のＩＰ５の典型的なクロマトグラムである（実施例１５）。
【図１３】図１３は、ラット血漿中のフィチン酸代謝産物（代謝プロファイル）の典型的なクロマトグラムである（実施例１６）。
【図１４】図１４は、イヌの血漿中のフィチン酸代謝産物（代謝プロファイル）の典型的なクロマトグラムである（実施例１７）。
【図１５】図１５は、フィチン酸およびその関連不純物（不純物プロファイル）についての対応するピークを示すＡＰＩ試料の典型的なクロマトグラムである（実施例１８）。
【図１】
2014533353.tif 000003
【図２】
2014533353.tif 000004
【図３】
2014533353.tif 000005
【図４】
2014533353.tif 000006
【図５】
2014533353.tif 000007
【図６】
2014533353.tif 000008
【図７】
2014533353.tif 000009
【図８】
2014533353.tif 000010
【図９】
2014533353.tif 000011
【図１０】
2014533353.tif 000012
【図１１】
2014533353.tif 000013
【図１２】
2014533353.tif 000014
【図１３】
2014533353.tif 000015
【図１４】
2014533353.tif 000016
【図１５】
2014533353.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月10日(2014.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物の直接検出および／または定量の方法であって、上記検出および／または定量される化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子は、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記検出および／または定量される化合物または複数の化合物は生体マトリックス中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、または培養細胞であり、上記直接検出および／または定量のための上記方法は、
ｉ）上記検出および／または定量される化学複合分子の少なくとも１つの標準試料を調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）質量検出器または放射能検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含む生体マトリックスから上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ（ｖ）で調整した上記試料を用いて上記ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記化学複合分子の上記溶離（eluation）を検出可能な上記検出器は、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）およびＳＣＡＮ（ネガティブ／ポジティブ）、またはこれらの組み合わせのいずれの動作モードで作動する、質量分析計、タンデム質量分析計（または三連四重極型）、シングル四重極型であって、上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含むことを特徴とする直接検出および／または定量の方法。
【請求項２】
上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記化学複合分子は、２〜６のリン酸基を含む群から選択されるイノシトールポリリン酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
相変化およびイオン化は、化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）またはサーモスプレーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記生体マトリックスは生体液であり、血液、血漿、血清、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液およびそれらの混合物からなる群から選択され、血液および血漿であることが好ましいことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記生体マトリックスは生体組織であり、肺、腎臓、心臓、脳、肝臓、血管、骨、皮膚、筋肉、神経組織、脈管組織、およびそれらの混合物からなる群から選択され、心臓組織であることが好ましいことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分析される上記生体マトリックスは、生物学的等価性試験下に置かれたヒトの単離した試料であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
代謝プロファイル中の化合物の任意の代謝産物を検出し定量するために用いられる方法であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
活性医薬成分（ＡＰＩ）、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の分析方法であって、上記ＡＰＩ、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品は分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含み、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子は、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記化合物はその関連不純物とともに定量することも可能であり、上記分析方法は、
ｉ）少なくとも１つの標準試料を、調製するステップと、
ｉｉ）極性溶媒または少なくとも１つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、上記溶媒系を生成する少なくとも１つの溶媒はｐＨが緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
ｉｉｉ）固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも１つのカラムに、上記系の圧力を５〜１５００気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
ｉｖ）上記化学複合分子の溶離（eluation）を検出可能な検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および／または該信号の強度を定量するステップと、
ｖ）上記検出および／または定量される化学複合分子を含むＡＰＩ、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品から上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記ＡＰＩ、医薬組成物、または機能性食品を全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
ｖｉ）上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ（ｖ）で調整した上記試料を用いて上記ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｖｉｉ）上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および／または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１０】
上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルからなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
不純物プロファイル中の化合物の任意の不純物を検出し定量するために用いられる方法であることを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む薬、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品用医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子は、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品は予め決められた割合の上記化学複合分子を有している必要があり、上記プロセスは、１回分の薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品を取得すること、先行の請求項に記載の方法を含むプロセスによって上記１回分の上記化学複合分子の純度の割合を測定すること、上記のように測定した化学複合分子の割合が、条件または規定内の場合のみ１回分の上記薬、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品を含有すること、を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１３】
上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
分子量が少なくとも２００の少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物の製造方法であって、上記化合物は化学複合分子であり、上記化学複合分子は、それぞれ独立して−ＯＨ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を意味する少なくとも２つのＲ基で置換されており、ここで少なくとも２つのＲが−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２およびそのイオンとその塩からなる群からそれぞれ独立して選択され、上記製造方法は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって、最初の１回分によって得られた医薬組成物を投与された被験者から採取した生体単離試料を分析した後、算出したＡＵＣおよびＣｍａｘが望ましい条件内にある、および／または参照薬と生物学的等価性があるという条件で、最初の１回分の製造方法と全く同じステップを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
上記化学複合分子はＣ３−Ｃ７シクロアルキルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
2014533353.tif 000018
2014533353.tif 000019