(57)【要約】  本発明は、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を使用することにより、医薬品有効成分（ＡＰＩ）またはこの中間体を調製するための工程、特に、例えばスタチンの調製において有用な中間体の合成における特定の段階を開示する。本発明はさらに、前記酵素を有効に翻訳する発現系を提供する。加えて、本発明は、ＡＰＩまたはこの中間体を調製するための、特にスタチンまたはこの中間体を調製するためのこのような酵素の特定の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014501524.tif 000030
［式中、
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＣＨ２−Ｒ５、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）のいずれかを表すか；または
Ｒ１とＲ２は、一緒になって＝Ｏ、＝ＣＨ−Ｒ５を表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３によって置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｒ５は、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である。］
の化合物、または医薬的として許容されるこの塩もしくはエステルもしくは立体異性体を調製するための工程であって、式（ＩＩ）：
【化２】
2014501524.tif 000031
［式中、Ｒ１およびＲ２は上記のように定義される。］
の化合物を、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させること、および場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解することを含む工程。
【請求項２】
Ｒ５が、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）：
【化３】
2014501524.tif 000032
から選択される部分を表す、請求項１に記載の工程。
【請求項３】
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３またはＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表すか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｏを表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３で置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である、
請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物を調製するための工程。
【請求項４】
酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、アルドースデヒドロゲナーゼである、請求項１から３のいずれか一項に記載の工程。
【請求項５】
酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）依存性デヒドロゲナーゼである、請求項１から４のいずれか一項に記載の工程。
【請求項６】
アルドースデヒドロゲナーゼ酵素が、ＹｌｉｌアルドースデヒドロゲナーゼまたはｍＧＤＨグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の工程。
【請求項７】
酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、配列番号：０１、０３、０５、０７、０９、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９および６１のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるデヒドロゲナーゼコード遺伝子によってコードされるデヒドロゲナーゼ、または配列番号：０２、０４、０６、０８、１０、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２の中に含まれるもしくはこれらによって構成されるアミノ酸配列のいずれか１つによって定義されるデヒドロゲナーゼ、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がデヒドロゲナーゼ活性を維持する、任意のデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の工程。
【請求項８】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）酵素を、式（ＩＩ）の化合物を調製するために使用する、請求項１から７のいずれか一項に記載の工程。
【請求項９】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ酵素を、式（ＩＩ）の化合物を酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させる前に、または少なくとも重複する期間同時に、合成段階のために使用する、請求項８に記載の工程。
【請求項１０】
酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、場合により独立してＤＥＲＡ酵素も、生存全細胞、不活性化全細胞、ホモジナイズされた全細胞もしくは無細胞抽出物中に含まれる、または精製され、固定化されているおよび／または細胞外で発現されるタンパク質の形態である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の工程。
【請求項１１】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を含む反応系であって、式（ＩＸ）：
【化４】
2014501524.tif 000033
［式中、Ｒは、式（Ｉ）：
【化５】
2014501524.tif 000034
［式中、Ｒ１およびＲ２は上記で定義されたとおりである。］
のＲ１−ＣＨ−Ｒ２部分を表し、Ｒ１およびＲ２は請求項１−４のいずれか一項で定義されたとおりである。］
の化合物をアセトアルデヒドで式（Ｉ）の化合物に変換することができるまたは変換するように設計されている、反応系。
【請求項１２】
前記酵素、即ちＤＥＲＡおよび酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の両方が１以上の細胞によって発現され、細胞の種類が、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞から成る群より選択される、請求項８に記載の工程または請求項１１に記載の反応系。
【請求項１３】
ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）の存在をさらに提供する、請求項８に記載の工程または請求項１１に記載の反応系。
【請求項１４】
ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）の存在を提供することが、
（ｉ）ＰＱＱを外部から添加する；
（ｉｉ）デヒドロゲナーゼ活性の存在を提供することのほかに、内因性ＰＱＱ生合成能をさらに有する宿主生物を使用する；および
（ｉｉｉ）ＰＱＱの内因性生合成能は有さないが、ＰＱＱ合成関連遺伝子クラスターを発現するように遺伝子操作されている微生物を使用する
ことから成る群より選択される手段によって達成される、請求項１３に記載の工程または反応系。
【請求項１５】
手段（ｉｉｉ）に従って使用される微生物が、配列番号：１１、１７、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるＰＱＱ合成コード遺伝子の発現、または配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列のいずれか１つをコードするＰＱＱ合成遺伝子の発現を提供するように遺伝子操作されている、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がＰＱＱを産生する活性を維持する、ＰＱＱ合成コード遺伝子の発現を提供するように遺伝子操作されている、請求項１４に記載の工程または反応系。
【請求項１６】
前記化合物（Ｉ）を、スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩を調製するのに十分な条件に供すること、場合によりスタチン生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の工程。
【請求項１７】
スタチンが、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンおよびダルバスタチン、ならびに医薬的として許容されるこれらの塩から選択される、請求項１６に記載の工程。
【請求項１８】
医薬組成物を調製するための工程であって、請求項１６または１７に記載の工程に従って工程を実施すること、および前記スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩を少なくとも１つの医薬的として許容される賦形剤と共に製剤して前記医薬組成物を得ることを含む工程。
【請求項１９】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を翻訳することができ、ならびに前記翻訳のために必要な遺伝子の両方を過剰発現することができる発現系。
【請求項２０】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を翻訳することができる発現系であって、前記翻訳が１以上の細胞型において設計されており、それぞれの細胞型が、細胞型全体でおよび好ましくは同じ細胞型内で、前記２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる前記酵素の両方を発現するように遺伝子操作されている、発現系。
【請求項２１】
酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、配列番号：０１、０３、０５、０７、０９、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９および６１のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるデヒドロゲナーゼコード遺伝子によってコードされるデヒドロゲナーゼ、または配列番号：０２、０４、０６、０８、１０、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２の中に含まれるもしくはこれらによって構成されるアミノ酸配列のいずれか１つによって定義されるデヒドロゲナーゼ、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がデヒドロゲナーゼ活性を維持する、任意のデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、請求項１９または２０に記載の発現系。
【請求項２２】
配列番号：１１、１７、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるＰＱＱ合成コード遺伝子の発現、または配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列のいずれか１つをコードするＰＱＱ合成遺伝子の発現、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がＰＱＱを産生する活性を維持する、ＰＱＱ合成コード遺伝子の発現をさらに提供する、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項２３】
それぞれ、請求項１から３のいずれか一項で定義されるとおりである、式（Ｉ）の化合物を調製するため、および場合によりスタチンまたは医薬的として許容されるこの塩のさらなる調製のための、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の発現系または請求項１９から２２のいずれか一項に記載の発現系の使用。
【請求項２４】
合成ＡＰＩまたはこの中間体を調製するための、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の使用であって、基質化合物を、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素による酸化に供することを含み、基質化合物が、置換または非置換ジデオキシアルドース糖、合成非天然アルコール、さらにヒドロキシル化されたエステルおよびさらにヒドロキシル化されたラクトールから成る群より選択される非天然化合物である、使用。
【請求項２５】
スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩を調製するためのアルドースデヒドロゲナーゼ酵素の使用。
【請求項２６】
式（Ｉ）：
【化６】
2014501524.tif 000035
［式中、
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＣＨ２−Ｒ５、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２はどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）のいずれかを表すか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｏ、＝ＣＨ−Ｒ５を表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３によって置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｒ５は、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である。］
の化合物、または医薬的として許容されるこの塩もしくはエステルもしくは立体異性体を調製するための、場合によりスタチンを調製するための式（Ｉ）の化合物のさらなる処理を伴う、微生物の使用であって、微生物が、
（ｉ）プロテオバクテリア属（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノミセタール属（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ミクソバクテリア属（ｍｉｘｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌起源から選択される；または
（ｉｉ）ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）を提供するための遺伝子クラスターの遺伝子を発現することができるように遺伝子操作されているもしくは外因性ＰＱＱの添加によって補完されているエシェリキア・コリ（大腸菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、化学技術の分野、特に酵素を使用することによって医薬品有効成分（ＡＰＩ）またはこの中間体を調製するための工程に関する。特に、本発明は、スタチンとしても知られる、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の調製に関し、合成における特定の段階を触媒するためのある特定の酵素が提供される。ある実施形態では、本発明は、前記酵素を提供することによって中間体を調製するための工程に関する。本発明はさらに、前記酵素を有効に翻訳する発現系に関する。加えて、本発明は、ＡＰＩまたはこれの中間体を調製するための、特にスタチンまたはこの中間体を調製するためのこのような酵素の特定の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成経路は、通常、インビトロで化学反応を行うことによって実行される。化学は複雑になることがあり、おそらく低い立体選択性による低い収率で、高価な試薬、多数の長い段階を必要とし得る。特定の場合には、出発物質を所望化合物に変換する生化学的経路における基質として、この出発物質を使用することができる微生物または微生物の部分を用いることが可能である。微生物または、例えば酵素のような、これらの部分を、場合により合成工程段階と共に用いて、ＡＰＩまたはこの中間体を調製するための完全な合成経路を構築することは可能であり得るが、これは困難な作業である。
【０００３】
例えば、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４，７７８−７８４（１９９２）は、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼを使用することによるまたは化合物を酸化する微生物による、キラルラクトールおよびラクトンに対応する７−オキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジメタノールの立体選択的微生物／酵素的酸化を述べている。さらに、Ｍｏｒｅｎｏ−Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｖｏｌ．４９，２４−２７（２００７）は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）を生体触媒として使用する、γ−ラクトールを介した１，４−アルカンジオールのγ−ラクトンへの酸化を述べている。
【０００４】
複雑な合成経路の特定の例は、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ）の阻害剤の合成であり、前記阻害剤は、アテローム性動脈硬化症が引き起こす病的過程および疾患における重大な心臓血管事象による死亡率を低下させるために、脂質およびコレステロールの血中濃度を低下させる優れたツールであることが認められた。ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の中で、天然ロバスタチンが公知であるが、これは、半合成のプラバスタチン、シンバスタチンおよび後には完全合成のアトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンおよびダルバスタチンに取って代わられた。臨床的に有効なＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、スタチンとしても知られる（−スタチンで終わるＩＮＮ名を特徴とする。）。
【０００５】
すべてのスタチンは、それぞれスタチン骨格に連結されたヘプタン酸またはヘプタン酸部分（遊離酸、塩またはラクトン）から成る特徴的な側鎖を共有する（スキーム１）。スタチンの生物学的活性はこの構造およびこの立体化学に関係する。通常は、ヘプタン酸またはヘプタン酸部分を調製するには多数の化学的段階が必要である。この側鎖の構築は化学者にとってまだ難しい課題である。
【０００６】
【化１】
2014501524.tif 000002
【０００７】
ラクトールを介して側鎖、従ってスタチンを調製する最初の試みは米国特許第７４１４１１９号に開示された。ＷＯ２００６／１３４４８２は、ラクトールの合成のためのアルドラーゼ（特に２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ；ＤＥＲＡ；ＥＣクラスＥＣ  ４．１．２．４）の適用を開示し、これはアトルバスタチンを得るための直接カップリングを可能にした。
【０００８】
さらなる使用および最終的にスタチン化合物を生成するためには、ラクトールを酸化しなければならない。Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１９９４），ｐ．８４２２−８４２３およびＷＯ２００８／１１９８１０では、精製ラクトールをＢｒ２／ＢａＣＯ３によってラクトンに酸化した。ＷＯ２００６／１３４４８２は、同じ目的のための接触脱水素反応（例えばＰｔ／Ｃ、Ｐｄ／Ｃ）の使用を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７４１４１１９号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／１３４４８２号
【特許文献３】国際公開第２００８／１１９８１０号
【特許文献４】国際公開第２００６／１３４４８２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４，７７８−７８４（１９９２）
【非特許文献２】Ｍｏｒｅｎｏ−Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｖｏｌ．４９，２４−２７（２００７）
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１９９４），ｐ．８４２２−８４２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般に、少ない数の工程段階で、より短い時間、高い収率および改善されたより経済的で簡便な方法でＡＰＩまたはこの中間体を調製する際の酸化または脱水素反応を可能にする新しい工程を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本発明は請求項１に記載の工程を提供する。好ましい実施形態を従属請求項に示す。本発明はさらに、請求項９に記載の反応系、請求項１３に記載の医薬組成物を調製するための工程、請求項１４および１５に記載の発現系ならびに請求項１８から２１に記載の使用を提供する。
【００１３】
意外にも、スタチン型化合物の合成に典型的な特定のラクトールからラクトン部分への酸化が特定の酵素を使用して可能であることが見出された。留意すべきは、化学試薬でラクトールを酸化するには最初にラクトールを単離する必要があり、これは極めて面倒で、多量の有機溶媒を消費することである。加えて、４−ヒドロキシ−ラクトールは最初にヒドロキシル保護基で保護しなければならず、これが、多数の反応段階とＡＰＩの最終的な不純物プロフィールを追加する。他方で、本発明による上記で定義された酵素触媒で実施された式（ＩＩ）の化合物の酸化または脱水素反応は、先行技術のＢｒ２／ＢａＣＯ３での化学的酸化または化学的接触脱水素反応（例えばＰｔ／Ｃ、Ｐｄ／Ｃ）に比べて極めて有利である。化学的酸化剤は特異的でなく、従ってラクトールの事前の精製を必要とし、さもなければ副産物または試薬、さらには溶媒の酸化において過剰の試薬が消費される。ラクトールの精製は難しく、抽出のために実質的な量の溶媒を必要とし、これは、ラクトールが通常親水性であり、例えば酢酸エチルなどの有機溶媒にはほとんど抽出されないという事実に関連する。また、抽出において使用された溶媒を蒸発させる必要があり、これは工業規模で作業する場合には望ましくないことにも留意すべきである。化学的酸化の上記欠陥のすべてが本発明の工程によって解決される。酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を使用することによって精製と蒸発の段階を回避することは、式（Ｉ）の化合物を調製する工程を有意に短縮する。
【００１４】
化合物（ＩＩ）のようなラクトールは非天然型化合物であるが、これらは、意外にも、本明細書で開示される酵素のための有効な基質として働くことが見出された。この所見に基づき、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の使用は、一般に合成ＡＰＩまたはこの合成中間体を調製するための貴重なツールを提供する。一般に、非天然の合成ＡＰＩまたはこの中間体を調製するための本発明の使用の範囲内の基質は、従って、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の天然のものとは異なり、これにより例えばエタノール、メタノール、アセトアルデヒド、酢酸、天然の糖もしくはアミノ酸、またはグルコン酸などのカルボン酸基を有する単糖類を含む、糖から誘導される糖酸から選択される天然基質を除外する。
【００１５】
それぞれ単独でまたは組合せとして、以下の項目で要約される本発明の態様、有利な特徴および好ましい実施形態は、本発明の課題を解決することに寄与する。
【００１６】
（１）式（Ｉ）：
【００１７】
【化２】
2014501524.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＣＨ２−Ｒ５、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）のいずれかを表すか；または
Ｒ１とＲ２は、一緒になって＝Ｏ、＝ＣＨ−Ｒ５を表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３によって置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｒ５は、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である。］
の化合物、または医薬的として許容されるこの塩もしくはエステルもしくは立体異性体を調製するための工程であって、式（ＩＩ）：
【００１８】
【化３】
2014501524.tif 000004
［式中、Ｒ１およびＲ２は上記のように定義される。］
の化合物を、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させること、および場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解することを含む工程。
【００１９】
（２）Ｒ５が、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）：
【００２０】
【化４】
2014501524.tif 000005
から選択される部分を表す、項目１に記載の工程。
【００２１】
（３）Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３またはＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表すか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｏを表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３で置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である、
項目１または２に記載の式（Ｉ）の化合物を調製するための工程。
【００２２】
（４）Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３またはＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈもしくは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表すか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を表し、前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である、
前記項目のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を調製するための工程。
【００２３】
（５）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼである、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００２４】
（６）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、アルドース脱水素反応を触媒することができる、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００２５】
（７）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素がアルドースデヒドロゲナーゼである、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００２６】
（８）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、ラクトールのヒドロキシ基の酸化に特異的である、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００２７】
（９）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、アルドース１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．５．２）である、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００２８】
（１０）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）依存性デヒドロゲナーゼの群から選択される、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００２９】
（１１）酵素が水溶性または膜結合型である、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３０】
（１２）酵素が、配列番号：０１、０３、０５、０７、０９、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９および６１のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるデヒドロゲナーゼコード遺伝子によってコードされるデヒドロゲナーゼ、または配列番号：０２、０４、０６、０８、１０、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２の中に含まれるもしくはこれらによって構成されるアミノ酸配列のいずれか１つによって定義されるデヒドロゲナーゼ、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がデヒドロゲナーゼ活性を維持する、任意のデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３１】
（１３）酵素が、ＹｌｉｌアルドースデヒドロゲナーゼまたはＧｃｄ膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３２】
（１４）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）酵素を、式（ＩＩ）の化合物を調製するために使用する、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３３】
（１５）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）酵素を、式（ＩＩ）の化合物を酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させる前に、または少なくとも重複する期間同時に、合成段階のために使用する、項目１４に記載の工程。
【００３４】
（１６）式（ＩＩ）の化合物を、式（ＩＩ）の化合物の事前の単離または精製を行わずに酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させる、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３５】
（１７）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、場合により独立してＤＥＲＡ酵素も、生存全細胞、不活性化全細胞、ホモジナイズされた全細胞もしくは無細胞抽出物中に含まれる、または精製され、固定化されているおよび／または細胞外で発現されるタンパク質の形態であり、好ましくは生存全細胞、不活性化全細胞またはホモジナイズされた全細胞中に存在し、より好ましくは生存全細胞または不活性化全細胞中に存在し、特に生存全細胞中に含まれる、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３６】
（１８）式（Ｉ）の化合物が、式（ＩＩ）の化合物の調製と少なくとも部分的には同時に調製される、項目１４から１７のいずれか一項に記載の工程。
【００３７】
項目１４から１７で定義される好ましい実施形態では、化合物（ＩＩ）が２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素を使用することによって調製され、生成物が酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素によるその後の酸化反応と共に使用される、好ましくは少なくとも重複する期間同時に使用されるようにする設計は、工程の効率および工程に必要な時間の短縮という観点から特に好都合である。工程が少なくとも部分的に同時に進行する場合、調製された式（ＩＩ）の化合物は、その後の酸化反応において直ちに基質として消費されることができ、これは最初の反応の定常状態平衡を生成物の方向にシフトさせる。
【００３８】
（１９）電子受容体が工程に含まれるまたは酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素に添加される、好ましくは酸素が使用または添加される；ならびに／または機能性となるための酵素の補因子、例えばＦＡＤ、ＮＡＤ（Ｐ）＋および／もしくはＰＱＱの群から選択される補因子、ならびに場合により本明細書で開示されるさらなる添加剤および助剤が工程に含まれるまたは添加される、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００３９】
このさらなる好ましい実施形態に従って、酸素が、酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素に添加されるか、または工程が、例えば曝気条件下のような、酸素の存在下で実施される場合、好ましくは空気が、脱水素酵素または酸化酵素によって触媒される脱水素反応または酸化反応に通気される場合、反応は不可逆的となり、これは得られた生成物を保護し、式（ＩＩ）と（Ｉ）の化合物が同時に調製される場合、最初の反応の定常状態平衡のシフトをさらに増強する。酸素の存在、特に５％を上回る溶解酸素（１００％の溶解酸素は所与の工程条件で酸素の飽和溶液と理解される。）の存在は、やはり収率を高め、反応時間を短縮する好ましい工程パラメータである。加えて、酸素を存在させることは、特定の場合、使用される微生物の増殖を促進し得る。同様の説明は、補因子の使用およびそれぞれの酵素に有用な選択的なさらなる添加剤および助剤の使用にもあてはまる。
【００４０】
（２０）式（Ｉ）：
【００４１】
【化５】
2014501524.tif 000006
［式中、Ｒ１およびＲ２は項目１から４のいずれか一項で定義されたとおりである。］
の化合物、または医薬的として許容されるこの塩もしくはエステルもしくは立体異性体を調製するための反応系またはワンポット工程であって、反応系が、式（Ｘ）：
【００４２】
【化６】
2014501524.tif 000007
［式中、Ｒは式（Ｉ）のＲ１−ＣＨ−Ｒ２部分を表し、Ｒ１およびＲ２は項目１から４のいずれか一項で定義されたとおりである。］
の化合物を、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の存在下でアセトアルデヒドと反応させる、ならびに場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解することができるもしくはこのように設計されている、またはワンポット工程が前記段階を含む、反応系またはワンポット工程。
【００４３】
ここでは、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素は、好ましくは項目５から１３のいずれか一項で定義される酵素によって代表され得る。
【００４４】
「反応系」という用語は、技術的な系、例えばインビトロ系、反応器または培養容器または発酵槽を意味する。
【００４５】
「ができる」または「ように設計されている」という用語は、反応系が適切であること、または条件および形状が、定義された反応が起こり得るように用意されていることを意味する。
【００４６】
（２１）項目１で定義された式（ＩＩ）の化合物が、単離されていない中間体として生成される、項目２０に記載の系または工程。
【００４７】
（２２）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、場合により独立してＤＥＲＡ酵素も、生存全細胞、不活性化全細胞、ホモジナイズされた全細胞もしくは無細胞抽出物中に含まれるか、または精製され、固定化されているおよび／または細胞外で発現されるタンパク質の形態であり、好ましくは生存全細胞、不活性化全細胞またはホモジナイズされた全細胞中に存在し、より好ましくは生存全細胞または不活性化全細胞中に存在し、特に生存全細胞中に含まれる、項目２０または２１のいずれか一項に記載の系または工程。
【００４８】
（２３）前記酵素、即ちＤＥＲＡおよび酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の両方が同じ細胞によって発現される、項目２０から２２のいずれかに記載の系または工程。
【００４９】
（２４）細胞が、細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり、好ましくは細菌または酵母であり、より好ましくは細菌である、項目１７に記載の工程または項目２２もしくは２３に記載の系もしくは工程。
【００５０】
（２５）細菌が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）から成る属の群より選択される、項目２４に記載の系または工程。より詳細には、微生物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（緑膿菌）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）から選択され得、最も好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）およびクルイベラ・インテルメディウム（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）から選択され得、特にエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００５１】
（２６）酵母が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）から成る属の群より選択され、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である、項目２４に記載の系または工程。
【００５２】
（２７）哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞または肝細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目２４に記載の系または工程。
【００５３】
（２８）前記化合物（Ｉ）を、スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩、好ましくはロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンまたはダルバスタチンまたは医薬的として許容されるこれらの塩、より好ましくはアトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチンまたは医薬的として許容されるこれらの塩、特にロスバスタチンまたは医薬的として許容されるこの塩を調製するのに十分な条件に供することをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の工程。
【００５４】
（２９）スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩、エステルもしくは立体異性体を調製するための工程であって、
（ｉ）式（ＩＩ）：
【００５５】
【化７】
2014501524.tif 000008
［式中、Ｒ１およびＲ２は、項目１から４のいずれか一項におけるように定義される。］
の化合物を、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させて、項目１から４のいずれか一項で定義される式（Ｉ）の化合物を調製する段階、および
（ｉｉ）前記化合物（Ｉ）を、スタチンを調製するのに十分な条件に供する段階；
（ｉｉｉ）場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解する段階
を含む工程。
【００５６】
（３０）式（ＩＩ）の化合物が、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）酵素によって調製される、前記項目に記載の工程。
【００５７】
（３１）式（ＩＩ）の化合物と式（Ｉ）の化合物が少なくとも部分的に同時に調製される、前記項目に記載の工程。
【００５８】
（３２）スタチンが、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンまたはダルバスタチンであり、より好ましくはアトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチン、特にロスバスタチンである、項目２９から３１のいずれか一項に記載の工程。
【００５９】
（３３）項目５から１９または２０から２７のいずれか一項で定義されるさらなる特別な条件を、単独または組合せのいずれかで、さらに満たす、項目２９から３２のいずれか一項に記載の工程。
【００６０】
（３４）前記スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩、好ましくはロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンまたはダルバスタチンまたは医薬的として許容されるこれらの塩、より好ましくはアトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチンまたは医薬的として許容されるこれらの塩、特にロスバスタチンまたは医薬的として許容されるこの塩を医薬製剤に製剤することをさらに含む、項目２９から３３のいずれか一項に記載の工程。
【００６１】
（３５）それぞれの細胞型が、細胞型全体で、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の両方を発現するように遺伝子操作されている、１以上の細胞型を含む発現系。
【００６２】
（３６）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を翻訳することができ、ならびに前記翻訳のために必要な遺伝子の両方を過剰発現することができる発現系。
【００６３】
（３７）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼである、項目３５または３６に記載の発現系。
【００６４】
（３８）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、アルドース脱水素反応を触媒することができる、項目３５から３７のいずれか一項に記載の発現系。
【００６５】
（３９）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素がアルドースデヒドロゲナーゼである、項目３５から３８のいずれか一項に記載の発現系。
【００６６】
（４０）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、広域スペクトルの糖デヒドロゲナーゼから選択される、項目３５から３８のいずれか一項に記載の発現系。
【００６７】
（４１）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、Ｃ１位での酸化に特異的である、項目３５から４０のいずれか一項に記載の発現系。
【００６８】
（４２）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素がアルドース１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．５．２）である、項目３５から４１のいずれか一項に記載の発現系。
【００６９】
（４３）ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）を提供するための遺伝子のクラスターをさらに発現することができる、項目３５から４２のいずれか一項に記載の発現系。
【００７０】
（４４）前記発現系が、細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり、好ましくは細菌または酵母であり、より好ましくは細菌である、項目３５から４３のいずれか一項に記載の発現系。
【００７１】
（４５）細菌が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）から成る属の群より選択される、項目２４に記載の系または工程。より詳細な意味では、微生物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）から選択され得、最も好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）およびクルイベラ・インテルメディウム（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）から選択され得、特にエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００７２】
（４６）酵母が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）から成る属の群より選択され、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である、項目４４に記載の発現系。
【００７３】
（４７）哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞または肝細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目４４に記載の発現系。
【００７４】
（４８）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素、ＤＥＲＡ（デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ）、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼおよびＰＱＱ生合成経路遺伝子を同時に発現するように設計されている、項目３５から４７のいずれか一項に記載の発現系。
【００７５】
（４９）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素が、配列番号：０１、０３、０５、０７、０９、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９および６１のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるデヒドロゲナーゼコード遺伝子によってコードされるデヒドロゲナーゼ、または配列番号：０２、０４、０６、０８、１０、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２の中に含まれるもしくはこれらによって構成されるアミノ酸配列のいずれか１つによって定義されるデヒドロゲナーゼ、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がデヒドロゲナーゼ活性を維持する、任意のデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、項目３５から４８のいずれか一項に記載の発現系。
【００７６】
（５０）ＰＱＱが、配列番号：１１、１７、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０のヌクレオチド配列のいずれか１つの中に含まれるもしくはいずれか１つによって構成されるＰＱＱ合成コード遺伝子の発現によって、または配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列のいずれか１つをコードするＰＱＱ合成遺伝子の発現によって、または前記配列にそれぞれ少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％のヌクレオチド配列同一性もしくはアミノ酸配列同一性を有し、ただし生じる配列変異体がＰＱＱを産生する活性を維持するＰＱＱ合成コード遺伝子の発現によって提供される、項目３５から４９のいずれか一項に記載の発現系。
【００７７】
（５１）ＰＱＱ遺伝子クラスターを提供する、項目５０に記載の発現系。
【００７８】
（５２）合成ＡＰＩまたはこの中間体を調製するための、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の使用。
【００７９】
（５３）合成ＡＰＩまたはこの中間体が、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素に対する基質化合物であり、前記化合物が、置換または非置換ジデオキシアルドース糖、合成非天然アルコール、さらにヒドロキシル化されたエステルおよびさらにヒドロキシル化されたラクトールから成る群より選択される非天然化合物であり、好ましくは前記非天然化合物がラクトール構造部分を含む、項目５２に記載の使用。
【００８０】
この実施形態によれば、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素、より具体的には項目５から１３のいずれか一項で定義される酵素は、対応するラクトール構造部分を含む前駆体化合物に作用することができる。
【００８１】
（５４）ＤＥＲＡ酵素と同時のまたはＤＥＲＡ酵素に続く、項目５２または５３に記載の酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の使用。
【００８２】
（５５）酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素によるエタノール、単糖またはアセトアルデヒドの変換が除外される、項目５２から５４のいずれか一項に記載の使用。
【００８３】
（５６）式（Ｉ）が項目１から４のいずれか一項で定義されたとおりである、式（Ｉ）の化合物を調製するためのアルドースデヒドロゲナーゼ酵素の使用。
【００８４】
（５７）前記酵素を項目１で定義された式（ＩＩ）の化合物と接触させる、項目５６に記載のアルドースデヒドロゲナーゼ酵素の使用。
【００８５】
（５８）項目２から５１の条件のいずれか１つを、単独または組合せのいずれかで、さらに満たす、項目５２から５７のいずれか一項に記載の使用。
【００８６】
（５９）スタチンまたは医薬的として許容されるこの塩、好ましくはロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンまたはダルバスタチンまたは医薬的として許容されるこれらの塩、より好ましくはアトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチンまたは医薬的として許容されるこれらの塩、特にロスバスタチンまたは医薬的として許容されるこの塩を調製するためのアルドースデヒドロゲナーゼ酵素の使用。
【００８７】
（６０）式（Ｉ）が項目１から４のいずれか一項で定義されたとおりである、式（Ｉ）の化合物を調製するための項目３５から５１のいずれか一項に記載の発現系の使用。
【００８８】
（６１）項目２から３４の条件のいずれか１つを、単独または組合せのいずれかで、さらに満たす、項目６０に記載の発現系の使用。
【００８９】
（６２）ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンまたはダルバスタチン、より好ましくはアトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチン、特にロスバスタチンを調製するための、項目３５から５１のいずれか一項に記載の発現系の使用。
【００９０】
（６３）項目２から３４の条件のいずれか１つを、単独または組合せのいずれかで、さらに満たす、項目６２に記載の発現系の使用。
【００９１】
（６４）式（Ｉ）：
【００９２】
【化８】
2014501524.tif 000009
［式中、
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＣＨ２−Ｒ５、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２はどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）のいずれかを表すか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｏ、＝ＣＨ−Ｒ５を表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３によって置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｒ５は、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である。］
の化合物、または医薬的として許容されるこの塩もしくはエステルもしくは立体異性体を調製するための、場合によりスタチンを調製するための式（Ｉ）の化合物のさらなる処理を伴う、微生物の使用であって、微生物が、
（ｉ）クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌起源から選択され、より詳細にはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）の特定微生物の群から選択され、好ましくはグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）およびクルイベラ・インテルメディウム（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）から成る群より選択されるか、または
（ｉｉ）ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）を提供するための遺伝子クラスターの遺伝子を発現することができるように遺伝子操作されているもしくは外因性ＰＱＱの添加によって補完されているエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、
微生物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】加えて、ＤＥＲＡおよびアルドースデヒドロゲナーゼＹｌｉＩの両方を含む構築物ならびにグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ６２１Ｈ）からのＰＱＱ生合成クラスターを連結した。手順は上記手順と同様に実施したが、ベクターｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩ（実施例６で述べた。）を出発点として使用した。生じたプラスミドをｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅ（図１）と称した。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
意外にも、本発明者らは、式（Ｉ）：
【００９５】
【化９】
2014501524.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＣＨ２−Ｒ５、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３もしくはアリールを表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）のいずれかを表すか；または
Ｒ１とＲ２は、一緒になって＝Ｏ、＝ＣＨ−Ｒ５を表すか、もしくは一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を形成し、前記式中、
上記に示されるＣＨ２もしくはＣＨ３基のいずれか一方は、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、アリール、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３によって場合によりさらに置換されていてもよく；または
炭素原子を連結する各々のＣＨ２は、Ｏ、ＳもしくはＮＲ３によって置換されていてもよく；前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｒ５は、場合により置換された単環式または二環式アリール、複素環式または脂環式基を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である。］
の化合物、または医薬的として許容されるこの塩、エステルもしくは立体異性体を調製するための工程であって、式（ＩＩ）：
【００９６】
【化１０】
2014501524.tif 000011
［式中、Ｒ１およびＲ２は上記のように定義される。］
の化合物を、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と単に接触させることができ、および場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解する、
工程を見出した。
【００９７】
本明細書で使用される「単環式または二環式アリール基」という用語は、任意の単環式または二環式、５員、６員または７員芳香環または複素芳香環、例えばピロリル、フラニル、チオフェニル、フェニル、イミダゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリニル、フタルイミニルおよびベンズイミダゾリルを指す。
【００９８】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、特定の実施形態に関して特に明記されない場合、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の環炭素原子を含む芳香環系への言及を包含する。アリールはフェニルであり得るが、２以上の環を有し、このうちの少なくとも１つが芳香族である多環式環系であってもよい。この用語は、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、インデニル、アントリル等を包含する。
【００９９】
本明細書で使用される「単環式または二環式複素環式基」という用語は、任意の単環式または二環式、５員、６員または７員飽和または不飽和環であって、環中の少なくとも１個の炭素が酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される原子によって置換されている、前記環を指す。単環式または二環式複素環式基の非限定的な例は、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアオゾリル、モルホリニルである。
【０１００】
本明細書で使用される「複素環」という用語は、特定の実施形態に関して特に明記されない場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の環原子を有し、このうち少なくとも１つが窒素および酸素から選択される、飽和（例えばヘテロシクロアルキル）または不飽和（例えばヘテロアリール）複素環部分を包含する。特に、ヘテロシクリルは、飽和または不飽和であってよい、３員から１０員環または環系、より詳細には５員または６員または７員環を包含する；この例には、オキシラニル、アジリニル、１，２−オキサチオラニル、イミダゾリル、チエニル、フリル、テトラヒドロフリル、ピラニル、チオピラニル、チアントレニル、イソベンゾフラニル、ベンゾフラニル、クロメニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリジニル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピラゾリジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ジチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピペリジル、ピペラジニル、ピリダジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、特にチオモルホリノ、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、クマリル、インダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、オクタヒドロイソキノリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ジベンゾチオフェニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フラザニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、クロメニル、イソクロマニル、クロマニル等が含まれる。
【０１０１】
より具体的には、飽和複素環部分は、３、４、５、６または７個の環炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１、２、３、４または５個の環ヘテロ原子を有してよい。該基は多環式環系であってもよいが、より頻繁には単環式であり、例えばアゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、オキシラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、インドリジジニル、ピペラジニル、チアゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、キノリニジニル等が含まれる。さらに、「ヘテロアリール」は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の環原子を有し、このうち少なくとも１つは窒素および酸素から選択される、芳香族複素環系を包含し得る。該基は、２以上の環を有し、このうち少なくとも１つは芳香族である、多環式環系であってもよいが、より頻繁には単環式である。この用語は、ピリミジニル、フラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピロリジニル、ピリジニル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ピラジニル、プリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、フェノチアジニル、トリアジニル、フタラジニル、２Ｈ−クロメニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、プテリジニル等を包含する。
【０１０２】
本明細書で使用される「単環式または二環式脂環式基」という用語は、任意の単環式または二環式、５員、６員または７員脂環式環を指す。
【０１０３】
本明細書で使用される、場合により置換されていてもよい、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、ＡＰＩまたはスタチンとの関連において「塩化された」または「医薬的として許容される塩」という用語は、実質上生理的にも耐容される、塩の形態、例えばカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、塩酸塩、臭化水素酸塩等の形態の該化合物またはスタチンを指す。式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、ＡＰＩまたはスタチンは、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、ＡＰＩまたはスタチンまたはこの中間体を、場合により水性または有機溶媒中の、酸または塩基またはこれらの混合物と混合することによって塩化するまたは塩の形態にすることができる。好ましくは、溶媒はその後除去される。
【０１０４】
本明細書で使用される、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、ＡＰＩまたはスタチンとの関連において「エステル化すること」または「エステル」という用語は、これらの構造中に少なくとも１つのエステル結合を有する、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはスタチンを指す。このようなエステル結合または化合物をエステル化することは、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、ＡＰＩまたはスタチンまたはこの中間体を、化合物またはスタチンがヒドロキシル基を含む場合は、カルボン酸またはリン酸基含有化合物とカップリングすることによって達成され得る。式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、ＡＰＩまたはスタチンまたはこの中間体がカルボン酸基またはリン酸基を含む場合は、別の化合物のヒドロキシル基とカップリングすることによって達成され得る。
【０１０５】
「立体選択的に分解された」という用語は、立体異性体の混合物の分離、立体特異的化合物の準備化学、または分析の分野の当業者に公知の任意の方法を指すために本明細書で使用される。立体異性体は、例えば立体選択的カラムを使用するＨＰＬＣによって得ることができる。立体選択的カラムは当分野において公知である。
【０１０６】
酵素、生物
本明細書で使用される「酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素」という用語は、酸化または脱水素反応を触媒する任意の酵素を指す。酵素は、例えば式（ＩＩ）の化合物を基質として認識し、利用する。酵素の組合せ、異なる単位が場合により異なる反応を触媒する、マルチユニット酵素、縮合もしくは結合酵素、または別の構造もしくは非触媒化合物、単位、サブユニットもしくは部分も、酸化または脱水素反応を触媒することができるという要件を満たす限り本発明において企図される。酵素は、例えば原核もしくは真核細胞の電子伝達鎖において、または真核もしくは原核細胞におけるアルコール、アルデヒドもしくは糖の生化学的経路において認められる酵素であってよい。通常天然基質に作用する酵素は、意外にも、かなり複雑な合成化合物を認識し、酸化すること、特にラクトールをラクトンにまたはおそらくエステルに変換することが認められた。酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素のために使用されることを意図された反応は、通常は自然には起こらず、これは、例えばエタノール、メタノール、アセトアルデヒド、酢酸、天然の糖もしくは天然のアミノ酸、または例えばグルコン酸のような糖から得られる酸を使用することを免除されるように、基質が天然のものとは異なるからであることは、本発明の重要な態様である。しかし、驚くべきことに、本明細書で開示される合成基質は、かなり構造的に複雑である場合でも、最終的にＡＰＩ、特にスタチンまたは、例えば式（Ｉ）のラクトン化合物を含むこの中間体を得るために、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を使用することによってまだ容易に処理され得ることが見出された。一般に、酵素はオキシドレダクターゼから選択され得る。
【０１０７】
酵素命名法によれば、本発明に適用できる酵素は、主としてＥＣ  １．１（主に供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼ）、より具体的にはＥＣ  １．１．１（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を受容体とする。）、ＥＣ  １．１．２（シトクロムを受容体とする。）、ＥＣ  １．１．３（酸素を受容体とする。）、ＥＣ  １．１．５（キニンまたはフラビンまたは類似の化合物を受容体とする。）のサブクラスに属するが、これらに限定されない。当分野で公知の任意のオキシドレダクターゼを、これらの配列同一性にかかわりなく反応のために使用し得る。
【０１０８】
以下では、原則として本発明に適用できる酵素をさらに詳細に説明し、説明に役立つ実験的な実施例を後ほど述べ、必要に応じて適切なスクリーニングおよび／または実証試験も本明細書で提供する。特定の酵素の一部が本発明に先立って記述され、場合により使用されているが、明らかに本発明とは別の状況または分野においてである。開示が参照により本明細書に組み込まれる、参考文献を、以下で引用し、列挙する。
【０１０９】
糖の酸化／脱水素反応の活性を有する酵素は工業界で広く使用されている。酸化発酵の典型的な例は、Ｄ−グルコナート（グルコン酸）、Ｌ−ソルボースその他の伝統的な生産である。これらの工程は、原因となる酵素の分子機構が解明される前に一部の微生物の経験的に認められた特性に基づく実際的な工業として開発された［Ａｄａｃｈｉ，２００７］。
【０１１０】
糖酸化酵素は、食品加工において添加剤として、食品保存のために乳製品およびラクトペルオキシダーゼ系において、製パンにおいて、乾燥卵粉末を生産するために、抗酸化剤／防腐剤（脱酸素剤）として、ワインのアルコールを減じるため、グルコースアッセイおよび燃料電池として使用されてきた［Ｗｏｎｇ，２００８］。糖酸化酵素はまた、例えば血中のグルコース濃度を測定するため［Ｉｇａｒａｓｈｉ，２００４］、重金属の検出のため［Ｌａｐｅｎａｉｔｅ，２００３］、空気中のホルムアルデヒドの検出のため［Ａｃｍａｎｎ，２００８］、フローインジェクション分析におけるフェノール化合物の検出のため［Ｒｏｓｅ，２００１］、アドレナリンについての超高感度二酵素センサーとして［Ｓｚｅｐｏｎｉｋ，１９９７］、キシロース濃度の測定のため［Ｓｍｏｌａｎｄｅｒ，１９９２］等に、電流測定バイオセンサーとしても使用されてきた。
【０１１１】
６員糖を酸化することができる周知の酵素はグルコースオキシダーゼ、Ｇｏｘ（ＥＣ  １．１．３．４）であり、この酵素はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からの抽出物としてＳｉｇｍａから市販されている。この酵素は非常に限られた基質特異性を有する［Ｋｅｉｌｉｎ，１９５２］。一部の真菌および昆虫において天然に生産され、この酵素の触媒産物である過酸化水素は抗菌剤および抗真菌剤として働く。Ｇｏｘは一般に安全とみなされており、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）からのＧｏｘは多くの工業適用の基礎である［Ｗｏｎｇ，２００８］。Ｇｏｘが触媒する反応はまた、パン焼き、乾燥卵粉末の生産、ワインの生産、グルコン酸の生産等においても使用されている。電気化学的活性により、この酵素は、特に糖尿病患者において、グルコースセンサーの重要な成分となっており、これはＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼに関しておよび潜在的に燃料電池適用においてもあてはまる。グルコースオキシダーゼは単糖類、ニトロアルカンおよびヒドロキシル化合物を酸化することができる［Ｗｉｌｓｏｎ，１９９２］。グルコースの反応速度を基準（１００％）として使用すると、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２０−３０％）、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース（１５％）および６−デオキシ−Ｄ−グルコース（１０％）だけが有意の速度でＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）からのグルコースオキシダーゼによって酸化される［Ｐａｚｕｒ，１９６４；Ｌｅｓｋｏｖａｃ，２００５］。他の基質に対するグルコースオキシダーゼの活性は、典型的には低く、反応速度はグルコースの２％未満である［Ｋｅｉｌｉｎ，１９４８；Ｐａｚｕｒ，１９６４；Ｌｅｓｋｏｖａｃ，２００５］。
【０１１２】
好ましい実施形態では、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素はデヒドロゲナーゼである。特に、この酵素は糖の脱水素反応、より詳細にはアルドース脱水素反応を触媒することができる。好ましくは、酵素は糖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１）である。特定の実施形態では、酵素はアルドースデヒドロゲナーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼである。このような酵素を表す現在の技術分野の用語は本発明によって提供されるものとは異なり得るが、酵素の基質特異性および化合物（ＩＩ）または本明細書で企図される他の化合物の酸化／脱水素反応を触媒する酵素の能力は、現在の技術分野で見出される用語とは無関係であることが理解される。見出され得る一例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＹｌｉＩ、Ａｄｈ、Ａｓｄ）で認められる酵素についての用語であり、この酵素は、一部の著者によって「可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ」と称され、また別の著者では「アルドース糖デヒドロゲナーゼ」または「可溶性アルドースデヒドロゲナーゼ」と称される。別の例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｍＧＤＨ、ＧＣＤ、ＰＱＱＭＧＤＨ）で認められる膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼについての用語であり、一部の著者では「ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ」と称され、また別の著者によっては「膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼ」またはＧＣＤと称される。
【０１１３】
糖デヒドロゲナーゼ（アルドースデヒドロゲナーゼ）に対する天然基質は、酸化される様々な糖である。アルドースデヒドロゲナーゼが作用し得る広範囲の糖は、五炭糖、六炭糖、二糖および三糖を包含する。好ましくは、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素は、Ｃ１位での酸化に特異的である。アルドース１−デヒドロゲナーゼの場合、酵素はアルデヒドまたは環状ヘミアセタールをラクトンに酸化する。
【０１１４】
上記糖に一致して、オキシドレダクターゼは電子受容体に従って（一部の場合には、これらは、機能性となるためにこれらの酵素が利用する補因子、即ちＦＡＤ、ＮＡＤ（Ｐ）＋またはＰＱＱである。）クラスに分類される。糖オキシドレダクターゼのサブクラス間で大きく異なり得る、基質特異性の見地から、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．５）の使用が本発明に従って好ましい。
【０１１５】
ＦＡＤ（フラボタンパク質デヒドロゲナーゼ）およびＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼ（キノプロテインデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ  １．１．５は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）補因子をそれぞれ利用し、活性部位を細胞周辺腔に向けて、細菌の細胞質膜の外表面に位置する。これらはしばしば膜糖デヒドロゲナーゼと称される。または、特にＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼ群において、多くの酵素が可溶性形態で認められ、細胞周辺腔内に位置する。溶解度に関して、使用される糖デヒドロゲナーゼの性質に本発明による限定はないが、クローニング、発現手順および利用可能な分子ツールに関連して、可溶性ペリプラズム糖デヒドロゲナーゼ、即ち水溶性のものが選択されることが好ましいと考えられる。このような酵素の効率的なペリプラズム発現のための発現株の構築は技術的により容易であり、従って好ましい。他方で、膜結合型糖デヒドロゲナーゼは効率的な発現がより困難であり得るが、ＰＱＱからユビキノンプールへの電子の移動を介した、呼吸鎖とのこれらのより密接な結びつきのために好ましいと考えられる。本発明の過程で、例えば工業的に有用な収率で化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換するために天然の膜結合型糖デヒドロゲナーゼならびに過剰発現される膜結合型糖デヒドロゲナーゼを使用する例が提供される。
【０１１６】
呼吸鎖；電子受容体
酸化過程によって生成される電子は、ユビキノンを宿主生物の呼吸鎖におけるメディエータとして、酵素補因子（電子伝達体）を介して基質から末端ユビキノールオキシダーゼに伝達される。電子の最終的な受容体は酸素であり、酸素は呼吸鎖の酸化還元酵素によって水に還元される。
【０１１７】
呼吸鎖は、精密に調整される段階的な反応のカスケードにおいて還元分子からの電子を伝達する能力を有する一連の酸化還元酵素であり、段階的な反応は酸素の還元で終了する。各々の段階は、有用な作業、例えば細胞質膜を横切るプロトンの移動、他の分子の還元等のために酸化還元電位の差を利用する。電子伝達体は、呼吸鎖ならびに全体的な細胞の酸化還元過程において主要な役割を担う。
【０１１８】
電子は様々なレベルで呼吸鎖に入ることができる。ユビキノンプールへの電子の伝達および細胞外空間へのプロトンの放出を伴ってＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（細胞内の様々な酸化還元過程によって得られる。）を酸化する、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのレベルで。または、酸化還元酵素は、酵素結合補因子（ＦＡＤ、ＰＱＱ）を介して電子を直接ユビキノンに伝達することができる。ユビキノールは末端酸化還元酵素、例えばシトクロム、硝酸レダクターゼ等によってさらに酸化され、これにより電子は細胞内プロトンと結合して酸素を還元し（水を形成する。）、ユビキノール結合プロトンが細胞外空間に放出される。酸化還元電位を利用してプロトンを転移することができる任意の系は、しばしばプロトンポンプとして知られる。膜透過プロトン電位がこれによって確立され、ＡＴＰシンターゼの機能のための駆動力となる。これらのレベルは逐次的により高い正の酸化還元電位を有し、即ち逐次的に減少する最終電子受容体に対する電位差を有する。個々の細菌はしばしば複数の電子伝達鎖を同時に利用する。細菌は多くの異なる電子供与体、多くの異なるデヒドロゲナーゼ、異なるオキシダーゼおよびレダクターゼならびに異なる電子受容体を利用することができ、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（グルコースをエネルギー源として好気的に増殖している場合）は、２つの異なるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび２つの異なるキノールオキシダーゼを、同時に作動する合計４つの異なる電子伝達鎖のために利用する。
【０１１９】
従って、酸化還元酵素（例えば糖デヒドロゲナーゼ）は電子受容体が提供される場合にのみ機能性であり得ることは明らかである。天然の系の場合、これは呼吸鎖によって提供され、または基質／酵素／補因子カスケードと比較して適切な酸化還元電位を有する人工電子受容体を使用することができる。後者の選択肢において不利な点は、人工電子受容体がかなり多量に、言い換えると通常は酸化される基質と等モル量で提供されねばならないことである。
【０１２０】
この態様では、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素によって生成される電子の受容体は、電子の流れおよび化合物（ＩＩ）の酸化または脱水素反応を促進するために反応混合物中で提供され得る。受容体は、ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム（ＰＦ）、フェリシュウ酸カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、デュロキノン、シリコモリブダート、ビタミンＫ３、ジアミノデュレン（ＤＡＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＤＰ）から選択され得るが、これらに限定されない。電子受容体は酸素であってもよい。当業者は、例えば人工電子受容体として働き、還元された場合色が変化する染料である、ヒル試薬として列挙される化合物を認識し、これらを使用することができ、文献から多くのさらなる候補受容体を見出すことができる。
【０１２１】
ＰＱＱデヒドロゲナーゼ
ＰＱＱは溶液中の二価カチオンと錯体を形成する能力を有することが示されており、この能力は細菌キノプロテインデヒドロゲナーゼの触媒活性にとっての必須条件である［Ｍｕｔｚｅｌ，１９９１；Ｉｔｏｈ，１９９８；Ｉｔｏｈ，２０００］。細菌キノプロテインデヒドロゲナーゼ（起源にかかわりなく）を活性にするには、ホロ形態の酵素の再構成を達成するためにＰＱＱに加えて二価イオン（例えばＭｇ２＋、Ｃａ２＋）が存在しなければならない［Ｊａｍｅｓ，２００３］。錯体形成した二価イオンは、これらの構造上の役割以外に、ＰＱＱの活性な立体配置を維持するうえでも役割を果たす。［Ａｎｔｈｏｎｙ，２００１］。
【０１２２】
ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼをスクリーニングした後、本発明者らは、驚くべきことに、試験したすべての酵素（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＹｌｉＩアルドースデヒドロゲナーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＧｃｄ膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）からのＧＤＨ（可溶性または膜結合形態）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）からのＧＤＨ、クルイベラ・インテルメディウム（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）からのＧＤＨ）が、受容体が合成分子であるかまたは微生物の呼吸鎖であるかにかかわらず、電子受容体の存在下で化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）−（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｏ−ＣＯ−ＣＨ３）に酸化できることを認めた。実際に、ＰＱＱ依存性酸化還元酵素を含む試験したすべての生物が、我々の実験において（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに成功裏に酸化することが認められた。幾つかを、以下に例示する他の化合物（ＩＩ）分子に関しても試験し、成功を収めた。
【０１２３】
この意味で、本発明の好ましい態様は、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼ（キノプロテイン、ＥＣ  １．１．５）、より具体的にはＰＱＱ依存性糖１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．５．２）を対象とする。
【０１２４】
例えばＹｌｉＩは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアルドース糖デヒドロゲナーゼであり、活性のためにはＰＱＱを必要とする［Ｓｏｕｔｈａｌｌ，２００６］。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）はＰＱＱ自体を合成する能力を持たないが［Ｈｏｍｍｅｓ，１９８４；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，１９９７］、環境で認められる、ＰＱＱに対する正の走化性作用を示し［ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，１９９８］、外部から供給された補因子を利用することができる［Ｓｏｕｔｈａｌｌ，２００６］。ＹｌｉＩアルドース糖デヒドロゲナーゼは、細胞質膜を通ってペリプラズムに転移するために必要なＮ末端シグナル配列を含む、可溶性のペリプラズムタンパク質である。ＹｌｉＩアルドース糖デヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）のフォールドは、６枚の４本鎖逆平行βシートと、浅い、溶媒に曝露されたクレフト中のタンパク質の表面に位置するＰＱＱ結合部位を含む。ＹｌｉＩタンパク質は、各々が２個のカルシウムイオンに結合している単量体であり、これらの一方はＰＱＱ結合ポケットに位置し、他方はプロペラフォールドを構成する６本の鎖の２本の間に押し込まれている［Ｓｏｕｔｈａｌｌ，２００６］。
【０１２５】
Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リクソース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、キシリトール、ミオイノシトール、Ｌ−ソルボース、マンニトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース１−リン酸、グルコース６−リン酸、マルトース、α−ラクトース、Ｄ−スクロース、Ｄ−セロビオース、メリビオースおよびマルトトリオースが、ＹｌｉＩアルドース１−デヒドロゲナーゼの受容される天然基質であることが示されている［Ｓｏｕｔｈａｌｌ，２００６］。化合物（ＩＩ）に類似した、Ｃ３位に立体化学を有する天然の糖、例えばＤ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロースまたはＤ−イドースは、いずれもＳｕｔｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．によって試験されなかった。
【０１２６】
ＹｌｉＩアルドース糖デヒドロゲナーゼに加えて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ｍＧＤＨ）も含み、これもまたアルコールおよび糖のペリプラズム酸化における呼吸鎖に含まれるキノプロテインである［Ｙａｍａｄａ，２００３］。ＧＣＤまたはｍＧＤＨまたはＰＱＱＧＤＨとも称されるこの酵素は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が酵素の補欠分子族であるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を合成する能力を持たないので、ＹｌｉＩのようにアポ酵素の形態で生じる。ｍＧＤＨは膜結合型キノプロテインであり［Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，１９９３；Ａｎｔｈｏｎｙ，１９９６；Ｇｏｏｄｗｉｎ，１９９８］、細胞周辺腔に伸びるＣ末端ドメイン上でＤ−グルコースのＤ−グルコナートへの酸化を触媒する。ＰＱＱによって媒介される電子伝達は、Ｎ末端の膜結合ドメインによってさらに駆動される；呼吸鎖への電子の流れは、ユビキノンプールを通ってユビキノールオキシダーゼに向かう［Ｖａｎ  Ｓｃｈｉｅ，１９８５；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，１９８７；Ｙａｍａｄａ，１９９３］。活性ホロ形態のｍＧＤＨ酵素は、ＰＱＱおよびＭｇ２＋またはＣａ２＋または他の二価金属イオンの添加によって得られる。ＧＣＤは、内膜にまたがるＮ末端疎水性ドメイン［Ｙａｍａｄａ，１９９３］ならびにＰＱＱおよびＭｇ２＋またはＣａ２＋のための結合部位を含む、細胞周辺腔に位置する大きなＣ末端ドメインを有する単量体タンパク質である［Ｙａｍａｄａ，１９９３；Ｃｏｚｉｅｒ，１９９９］。
【０１２７】
驚くべきことに、ｍＧＤＨ酵素はまた、人工基質である式（ＩＩ）の化合物の酸化も触媒することができる。Ｃｏｚｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．は、試験した化合物（ＩＩ）のものに類似するＣ−３原子上の立体化学を有する唯一の天然アルドヘキソースである、Ｄ−アロースに対するこの酵素の活性を試験し、Ｄ−グルコースと比較して類似の活性を示した。Ｄ−アロースはＣ−２およびＣ−４上の２個の付加的なＯＨ基が化合物（ＩＩ）と異なり、このことが化合物（ＩＩ）に対する活性を等しく意外で予期せぬものにしていることは注目すべきである。
【０１２８】
ＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼのさらに別の例は、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）のＧＤＨである。アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来の少なくとも２つの異なるキノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼが公知である：膜結合形態（ｍＧＤＨ）および可溶性形態（ｓＧＤＨ）であり、細胞質膜を通ってペリプラズムに転移するために必要な２４アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含む。２つの形態は、すべての特徴において、例えば基質特異性、分子サイズ、動態、最適ｐＨ、免疫反応性において異なる。
【０１２９】
ｓＧＤＨの基質特異性はｍＧＤＨのものと異なる。ｓＧＤＨは、好ましくはＤ−グルコース、マルトースおよびラクトースを酸化し、Ｄ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトースはそれほど成功裏には酸化せず、一方ｍＧＤＨは二糖との反応性がより低い；ｍＧＤＨは、好ましくはＤ−グルコース、６−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−アロース、Ｄ−フコース、２−アミノ−Ｄ−グルコース（グルコサミン）、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−リクソースおよびＤ−リボースを酸化し、やはりマルトースおよびラクトースはそれほど成功裏には酸化しない［Ｃｏｚｉｅｒ，１９９９；Ａｄａｃｈｉ，２００７］。
【０１３０】
ｓＧＤＨについての２つの可能性のある反応機構は次のとおりである：（Ａ）付加−脱離機構は、一般塩基が触媒するプロトン引き抜きとこれに続く基質の共有結合的付加およびその後の生成物の脱離を含む；（Ｂ）基質からＰＱＱへの直接の水素化物移動と呼応した、一般塩基が触媒するプロトン引き抜きおよびＰＱＱＨ２への互変異性化を含む機構［Ｏｕｂｒｉｅ，１９９９］。同様の機構は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｌｉＩアルドースデヒドロゲナーゼ酵素にもあてはまると推測される。これまでに記述されたＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼと同様に、ｓＧＤＨおよびｍＧＤＨのいずれもが二量体化および機能のためにカルシウムまたはマグネシウムを必要とする［Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ，１９９７］。この構造は、単量体につき３つのカルシウム結合部位が存在することを確認する［Ｏｕｂｒｉｅ，  １９９９］。
【０１３１】
本発明によって例示されるように、構造特性、局在化、補因子結合および電子伝達の機構等の意味でのこれらの酵素の多様性は、化合物（ＩＩ）の化合物（Ｉ）への酸化を触媒するうえでの前記多様な酵素の効果には影響を及ぼさない。
【０１３２】
ＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼの現在の工業適用には、古典的発酵工程におけるＤ−グルコナート生産（グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ））ならびに様々な天然糖の生産が含まれる。グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）生物は、生物工学適用における使用のために天然の炭素基質、例えばＤ−ソルビトール（ビタミンＣ合成のためにＬ−ソルボースを生産する。）、グリセロール（ジヒドロキシアセトンを生産する。）、Ｄ−フルクトースおよびＤ−グルコース（グルコン酸、５−ケト、２−ケトおよび２，５−ジケトグルコン酸を生産する。）を不完全に酸化するこの重要な能力のゆえに周知である［Ｇｕｐｔａ，２００１］。
【０１３３】
上記説明から導かれるように、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼは、食用酢の製造において使用される工業的微生物、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）中に認められる。
【０１３４】
ＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼに対する最近の注目は、種々の電流測定バイオセンサー、例えば血中のグルコース濃度を測定するため［Ｄ’Ｃｏｓｔａ，１９８６；Ｉｇａｒａｓｈｉ，２００４；Ｈｅｌｌｅｒ，２００８］、重金属の検出のため［Ｌａｐｅｎａｉｔｅ，２００３］、空気中のホルムアルデヒドの検出のため［Ａｃｍａｎｎ，２００８］、フローインジェクション分析におけるフェノール化合物の検出のため［Ｒｏｓｅ，２００１］、アドレナリンについての超高感度二酵素センサーとして［Ｓｚｅｐｏｎｉｋ，１９９７］、キシロース濃度の測定のため［Ｓｍｏｌａｎｄｅｒ，１９９２］等の、電流測定バイオセンサーの開発に向けられている。ＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼはバイオ燃料電池としてナノテクノロジーにおいても使用され得る［Ｇａｏ，２０１０］。可溶性ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースオキシダーゼと異なり、酸素の存在とは無関係であるので［Ｈｅｌｌｅｒ，２００８］、血糖の自己測定のためのバイオセンサーシステムにおいて使用される酵素の主要な群となっている。
【０１３５】
現在の技術分野では、特に活性医薬化合物またはこれらの中間体に関連して、非天然化合物の生産のためにＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼを使用する工程は存在しないかまたは企図されていないが、本発明によって開示され、提供されるように、このような酵素は、有用な非天然化合物のための有効で容易な合成原理を提供するために実現可能および達成可能となった。従って本発明は、特に合成ＡＰＩおよびこれらの中間体化合物のクラスに属する非天然化合物の合成を目的として使用される、さらなる酸化還元反応におけるこれらの酵素の使用のために新しい分野を開く。
【０１３６】
本発明のために特に有用な酵素の選択
本明細書で提供される情報および実験指針により、当業者は、例えば基質特異性または不特定性、使用可能なｐＨ、温度およびイオン強度ウィンドウ、付加的なイオンまたは補因子の必要性等に基づいて式（ＩＩ）の化合物を式（Ｉ）の化合物に変換するために、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を認識し、酵素をどのようにして選択するかを導き出す。基質および反応条件は、通常、酵素の最適活性を与えるように選択される。しかし、酵素を保有する細胞に最小の阻害作用を与えるまたは生成物の安定性を低下させる基質および条件を、最適活性が達成される基質および条件に対して活用することができる。原則として、酵素の高い活性、好ましくは最良の活性を可能にする基質が好ましく、またはこの逆も同様で、所望化合物基質に対して高い、好ましくは最良の特異性を有する酵素が好ましい。反応条件には、１つの態様では、温度、ｐＨ、溶媒組成物、撹拌および反応の長さが所望生成物の蓄積を可能にすることが含まれることは当業者に直ちに明らかである。酵素活性を満たすことに加えて、当業者は、本明細書で提供される開示により、生成物、例えばラクトンまたはエステルが劣化するのを防ぐ適切なｐＨ、温度および反応時間を適用するという見地から条件を適合させることを理解する。必要な場合は、特定の補因子、補助基質および／または塩を、酵素の活性を可能にするまたは改善するために酵素に添加することができる。補因子は塩または化学的化合物である。しばしば、前記種は、特に酵素が生存全細胞、不活性化全細胞、ホモジナイズされた全細胞または無細胞抽出物中に含まれる場合、溶媒混合物中に既に含まれている。これにもかかわらず、補因子、補助基質および／または塩を酵素、溶媒または反応混合物にさらに添加することができる。酵素に依存して、第二銅、第二鉄、ニッケル、セレン、亜鉛、マグネシウム、カルシウム、モリブデンもしくはマンガンイオン、またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、リポアミド、アスコルビン酸、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、補酵素Ｑ、補酵素Ｆ４２０、ピロロキノリンキニン、補酵素Ｂ、グルタチオン、ヘム、テトラヒドロビオプテリン等を、酵素、溶媒または媒質または酵素を含む反応混合物に添加することができる。例えば、アルドース１−デヒドロゲナーゼまたは、好ましくはＹｌｉｌもしくはＧｃｄに関しては、カルシウムイオンまたはマグネシウムイオンおよびピロロキノリンキニンまたは類似の電子受容体を反応混合物、酵素または溶媒または媒質に添加する。具体的には、適切な条件を以下の実施例において例示する。
【０１３７】
本発明における使用のためのデヒドロゲナーゼは、特に上記基質（ＩＩ）に対して酸化活性を有する任意の酵素の中から選択され得る。一般に当分野で公知の任意の糖１−デヒドロゲナーゼを、以下で列挙する酵素、特にデヒドロゲナーゼとのこれらの配列同一性にかかわりなく使用することができる。上述したように、Ｃ１位で特異的に酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を選択することが有益である。アルドース１−デヒドロゲナーゼの場合、この酵素はアルデヒドまたは環状ヘミアセタールをラクトンに酸化する。
【０１３８】
例えば耐熱性微生物株において認められる酵素のような、特殊な変異体の酵素も本発明において企図される。同じことが天然の酵素の修飾または改善された変種にもあてはまり、これらのアミノ酸配列または構造は、より良好な基質特異性、より高い活性、より広い温度またはｐＨ範囲にわたる活性、有機溶媒の存在または溶媒の高いイオン強度に対する耐性等を達成するように変更されている。
【０１３９】
本発明者らは、驚くべきことに、分類上多様な微生物に由来し、２１．８％だけのアミノ酸配列同一性を有する２つの異なる糖デヒドロゲナーゼが、我々の実験において等しく成功を収めることを認めた。具体的には、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＧＤＨ  ０１アルドース糖デヒドロゲナーゼＹｌｉＩのアミノ酸配列である配列番号：０２と、Ａ．カルコアセチカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）からのＧＤＨ  ０２グルコースデヒドロゲナーゼＧｄｈＢのアミノ酸配列である配列番号：０６との間で比較を実施した。配列比較アルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムをデフォルト設定で用いる、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１．０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構成要素であるＡｌｉｇｎＸモジュールにおいてデフォルト設定で行った。
【０１４０】
加えて、構造的に大きく異なる酵素、例えばアミノ酸配列、配列番号：０２を有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの可溶性アルドース１−デヒドロゲナーゼおよびアミノ酸配列、配列番号：０４を有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼでさえも、わずかに異なる反応条件ではあるが、我々の実験において等しく成功を収めることが認められた。
【０１４１】
この驚くべき所見により、化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換するかまたは同様の反応を行うことができるタンパク質は、アミノ酸配列が有意に異なり得ると予想することは今や妥当である。反応の収率は、しかし、各々の糖デヒドロゲナーゼ酵素の基質特異性に依存し得る。
【０１４２】
適切なデヒドロゲナーゼ酵素の例には配列表中の酵素が含まれるが、これらに限定されず、これらは、これらのヌクレオチド配列またはそれぞれのコドン最適化ヌクレオチド配列または配列表に示すアミノ酸配列によって同定される。
【０１４３】
ＧＤＨ  ０１は、配列番号：０１のヌクレオチド配列または配列番号：０２のアミノ酸配列に含まれる遺伝子をコードするデヒドロゲナーゼである。
【０１４４】
ＧＤＨ  ０２は、配列番号：０３のヌクレオチド配列または配列番号：０４のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１４５】
ＧＤＨ  ０３は、配列番号：０５のヌクレオチド配列または配列番号：０６のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１４６】
ＧＤＨ  ０４は、配列番号：０７のヌクレオチド配列または配列番号：０８のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１４７】
ＧＤＨ  ０５は、配列番号：０９のヌクレオチド配列または配列番号：１０のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１４８】
ＧＤＨ  ０６は、配列番号：２３のヌクレオチド配列または配列番号：２４のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１４９】
ＧＤＨ  ０７は、配列番号：２５のヌクレオチド配列または配列番号：２６のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５０】
ＧＤＨ  ０８は、配列番号：２７のヌクレオチド配列または配列番号：２８のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５１】
ＧＤＨ  ０９は、配列番号：２９のヌクレオチド配列または配列番号：３０のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５２】
ＧＤＨ  １０は、配列番号：３１のヌクレオチド配列または配列番号：３２のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５３】
ＧＤＨ  １１は、配列番号：３３のヌクレオチド配列または配列番号：３４のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５４】
ＧＤＨ  １２は、配列番号：３５のヌクレオチド配列または配列番号：３６のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５５】
ＧＤＨ  １３は、配列番号：３７のヌクレオチド配列または配列番号：３８のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５６】
ＧＤＨ  １４は、配列番号：３９のヌクレオチド配列または配列番号：４０のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５７】
ＧＤＨ  １５は、配列番号：４１のヌクレオチド配列または配列番号：４２のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５８】
ＧＤＨ  １６は、配列番号：４３のヌクレオチド配列または配列番号：４４のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１５９】
ＧＤＨ  １７は、配列番号：４５のヌクレオチド配列または配列番号：４６のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６０】
ＧＤＨ  １８は、配列番号：４７のヌクレオチド配列または配列番号：４８のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６１】
ＧＤＨ  １９は、配列番号：４９のヌクレオチド配列または配列番号：５０のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６２】
ＧＤＨ  ２０は、配列番号：５１のヌクレオチド配列または配列番号：５２のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６３】
ＧＤＨ  ２１は、配列番号：５３のヌクレオチド配列または配列番号：５４のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６４】
ＧＤＨ  ２２は、配列番号：５５のヌクレオチド配列または配列番号：５６のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６５】
ＧＤＨ  ２３は、配列番号：５７のヌクレオチド配列または配列番号：５８のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６６】
ＧＤＨ  ２４は、配列番号：５９のヌクレオチド配列または配列番号：６０のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６７】
ＧＤＨ  ２５は、配列番号：６１のヌクレオチド配列または配列番号：６２のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼである。
【０１６８】
従って、本発明における使用のための糖デヒドロゲナーゼは、化合物（ＩＩ）に対して糖１−デヒドロゲナーゼ活性を有する任意の化合物であってよい。本発明の１つの実施形態では、糖１−デヒドロゲナーゼはＰＱＱ依存性糖１−デヒドロゲナーゼである。適切なＰＱＱ依存性糖１−デヒドロゲナーゼの例には、ＧＤＨ  ０１、ＧＤＨ  ０２、ＧＤＨ  ０３、ＧＤＨ  ０４、ＧＤＨ  ０５、ＧＤＨ  ０６、ＧＤＨ  ０７、ＧＤＨ  ０８、ＧＤＨ  ０９、ＧＤＨ  １０、ＧＤＨ  １１、ＧＤＨ  １２、ＧＤＨ  １３、ＧＤＨ  １４、ＧＤＨ  １５、ＧＤＨ  １６、ＧＤＨ  １７、ＧＤＨ  １８、ＧＤＨ  １９、ＧＤＨ  ２０、ＧＤＨ  ２１、ＧＤＨ  ２２、ＧＤＨ  ２３、ＧＤＨ  ２４およびＧＤＨ  ２５が含まれるが、これらに限定されず、各々の酵素は、上記配列表に示す対応するヌクレオチド配列またはそれぞれのコドン最適化ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列によって同定される。
【０１６９】
本発明は、ＧＤＨ  ０１、ＧＤＨ  ０２、ＧＤＨ  ０３、ＧＤＨ  ０４、ＧＤＨ  ０５、ＧＤＨ  ０６、ＧＤＨ  ０７、ＧＤＨ  ０８、ＧＤＨ  ０９、ＧＤＨ  １０、ＧＤＨ  １１、ＧＤＨ  １２、ＧＤＨ  １３、ＧＤＨ  １４、ＧＤＨ  １５、ＧＤＨ  １６、ＧＤＨ  １７、ＧＤＨ  １８、ＧＤＨ  １９、ＧＤＨ  ２０、ＧＤＨ  ２１、ＧＤＨ  ２２、ＧＤＨ  ２３、ＧＤＨ  ２４およびＧＤＨ  ２５から選択されるデヒドロゲナーゼのいずれかに少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する糖デヒドロゲナーゼを提供する。アミノ酸配列の同一性は、配列比較アルゴリズムでの解析によってまたは目視検査によって決定される。１つの態様では、配列比較は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムをデフォルト設定で用いる、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１．０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構成要素であるＡｌｉｇｎＸモジュールにおいてデフォルト設定で行う。
【０１７０】
本発明によって提供される好ましい糖１−デヒドロゲナーゼは、上記配列表においてＧＤＨ０１と同定される、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来し、対応するヌクレオチド配列、配列番号：０１および配列番号：０２のアミノ酸配列を有する糖デヒドロゲナーゼであり得る。
【０１７１】
本発明によって提供される同様に好ましい糖１−デヒドロゲナーゼは、上記配列表においてＧＤＨ０２と同定される、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来し、対応するヌクレオチド配列、配列番号：０３および配列番号：０４のアミノ酸配列を有する糖デヒドロゲナーゼであり得る。
【０１７２】
本発明によって提供される別の好ましい糖１−デヒドロゲナーゼは、上記配列表においてＧＤＨ０３と同定される、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）に由来し、対応するヌクレオチド配列、配列番号：０５および配列番号：０６のアミノ酸配列を有する糖デヒドロゲナーゼから選択され得る。
【０１７３】
本発明によって提供されるさらに別の好ましい糖１−デヒドロゲナーゼは、上記配列表においてＧＤＨ０４と同定される、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）に由来し、対応するヌクレオチド配列、配列番号：０７および配列番号：０８のアミノ酸配列を有する修飾された糖デヒドロゲナーゼから選択され得る。
【０１７４】
本発明によって提供される最も好ましい糖１−デヒドロゲナーゼは、上記配列表においてＧＤＨ０２と同定される、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来し、対応するヌクレオチド配列、配列番号：０３および配列番号：０４のアミノ酸配列を有する糖デヒドロゲナーゼであり得る。前記糖１−デヒドロゲナーゼは、当分野においておよび本発明の中でＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼ、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼ、アルドースデヒドロゲナーゼ、アルドースデヒドロゲナーゼキノプロテインまたはグルコースデヒドロゲナーゼキノプロテインとも表される。この特定の酵素は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において天然に生じるｇｃｄ遺伝子によってコードされ、Ｇｃｄ、ｍＧＤＨまたはＰＱＱＧＤＨと称されるタンパク質をコードする。
【０１７５】
本発明は、アミノ酸配列、配列番号：０２と少なくとも２１．８％、好ましくは少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する糖デヒドロゲナーゼを説明のために使用する。
【０１７６】
本発明において、式（ＩＩ）のラクトールまたは、生成物としての所望の合成ＡＰＩもしくはこの前駆体化合物に依存して、別の非天然基質を酸化することができる酵素／生物をスクリーニングすることが可能である。本発明の１つの態様では、当業者は、文献から付加的な候補酵素を見出し、これを所望のタイプの酵素変換に適用することができる。
【０１７７】
化合物（ＩＩ）に対する酸化／脱水素活性を種々の微生物および／または酵素においてスクリーニングし得る。本明細書で使用される「分析された物質」という用語は、天然であるかまたは遺伝的に改変された微生物であるかにかかわらず、任意の微生物の本発明によって提供される生存全細胞触媒、休止全細胞触媒、無細胞溶解物、部分精製もしくは精製酵素、固定化酵素または任意の他の形態の触媒として化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換することができる微生物および／または酵素をスクリーニングし、同定するスクリーニング方法において使用できる任意の微生物および／または酵素を指す。実際的な目的のために、以下では、「分析された物質」という用語は上述した候補触媒のすべての調製物を包含すると理解される。化合物（ＩＩ）に対する酸化／脱水素活性のスクリーニングおよび同定を可能にする、従って本発明を実施するのに有用な生物および／または酵素をスクリーニングし、同定するための幾つかの方法が本開示において提供される。
【０１７８】
前記スクリーニング方法を成功裏に実施するために、「分析された物質」を、物質の培養特性を考慮して入手し得る。培養は、栄養素要求を満たす増殖培地において「分析された物質」のバイオマスを得るために実施し得る。培養は液体培地中または固体培地上で実施し得る。増殖培地および培養の条件は、Ｄｉｆｃｏ  ＆  ＢＢＬ  Ｍａｎｕａｌ，２０１０および当業者に周知の他のプロトコールから選択され得るが、これらに限定されない。培養された微生物は、本発明によって提供される種々の形態の触媒として調製され得る。特に、「分析された物質」を、化合物（Ｉ）の形成および蓄積を可能にする条件下で化合物（ＩＩ）と接触させる。これらの条件には、１つの態様では「分析された物質」が、酸化／脱水素反応を実施することができる十分な投入量で提供されること、別の態様では基質および電子受容体が、触媒の活性の最小限の阻害を示す量で反応中に存在すること、別の態様では温度、ｐＨ、溶媒組成物、撹拌および反応の長さが所望生成物の蓄積を可能にすること、別の態様では前記条件が生成物の安定性に有害な作用を及ぼさないことが含まれる。具体的には、このような条件は、実施例で開示される値または条件によって指示されるように、または前記値もしくは条件から修正もしくは変更されるように定義され得る。「分析された物質」は、化合物（Ｉ）（ＰＱＱと命名する。）に対する活性のために必要なすべての補因子を内因的に提供することできるか、または「分析された物質」は、本発明で述べるようにＰＱＱが外部から提供された場合、化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換する能力を有する。本明細書で提供されるすべてのスクリーニング方法においてＰＱＱは、好ましくは記述され、例示される濃度で添加され得る。ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２などの塩の形態で提供される、カルシウムまたはマグネシウムイオンなどの二価金属イオンは、活性形態のアルドースデヒドロゲナーゼを生じさせるＰＷＷのアポ酵素への再構成を促進する。これらは、好ましくは記述され、例示される濃度で酵素に添加され得る。
【０１７９】
ＰＱＱの存在の定量化が上記方法によっておよび本明細書の別の部分で述べるように測定できることは当業者に明らかになる。この場合、この方法のために使用される物質は、ＰＱＱが枯渇しているまたは本質的に既にＰＱＱ不含でなければならない。
【０１８０】
候補触媒をスクリーニングし、同定するためのこのような方法の１つは、「分析された物質」を化合物（ＩＩ）と接触させることである。化合物（ＩＩ）の化合物（Ｉ）への変換は、上述したような最適反応条件で実施されるべきである。「分析された物質」の存在下で生成物に変換する基質の検出は、当分野で周知のクロマトグラフィ法のいずれかによって達成できる。非限定的な例には、液体ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＴＬＣ分析等が含まれる。化合物（Ｉ）および対応する化合物（ＩＩ）を観測するための、例示的であるが非限定的な方法は、ガスクロマトグラフィ分析である（クロマトグラフィカラム：ＤＢ−１  １００％ジメチルポリシロキサン；温度プログラム：初期温度：５０℃、初期時間：５分、温度速度：１０℃／分、最終温度：２１５℃、最終時間：１０分；注入器：スプリット／スプリットレスインジェクタ；キャリヤガス：ヘリウム、初期流量：１０ｍＬ／分；検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、検出器温度：２３０℃）。このような方法を実施するための前提条件は、反応混合物中の電子受容体が存在することである。天然の電子受容体が存在する「分析された物質」（例えば呼吸鎖）に関しては、付加的な成分（空気中の酸素を別として）を必要とせずに、前記クロマトグラフィ法を用いることによって化合物（ＩＩ）からの化合物（Ｉ）の形成を観察することができる。自らの電子対のＰＱＱを放出することができる電子受容体が利用可能でない場合（例えば無細胞溶解物または細胞膜画分におけるように）、ＤＣＰＩＰなどの人工電子受容体が必要である。しかし、記述されている方法は分析手順であり、ごく少量の人工電子受容体しか必要としないので、任意の種類の「分析された物質」に関してスクリーニング方法を実施する好ましい方法は、人工電子受容体の存在下においてである。上記方法を実施するための例示的な好ましい条件は、実施例で開示される値および条件によって定義される。
【０１８１】
本発明によって提供される別のスクリーニング方法は、使用できる基質／酵素／補因子カスケードと比較して適切な酸化還元電位を有する選択的な人工電子受容体の存在下で実施される方法である。この意味で、本発明は、還元された場合光学的に測定可能な単数または複数の特性（例えば色、吸光度スペクトル等）を変化させる人工電子受容体を使用するスクリーニング方法を提供する。このような人工電子は、電子の流れを促進するために反応混合物（色素結合系）中で提供され得、従って化合物（ＩＩ）の酸化または脱水素反応を指示する。受容体／インジケータは、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム（ＰＦ）、フェリシュウ酸カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、デュロキノン、シリコモリブダート、ビタミンＫ３、ジアミノデュレン（ＤＡＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＤＰ）から選択され得るが、これらに限定されない。当業者は、人工電子受容体として働き、還元された場合色が変化する染料である、ヒル試薬として列挙される化合物を認識し、文献から多くのさらなる候補受容体／インジケータを見出す。好ましくは、フェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）と組み合わせた２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を使用し得る。例示的なスクリーニング方法は、反応混合物中に以下の成分を含む：人工電子受容体としてＰＭＳと組み合わせたＤＣＰＩＰ、「分析された物質」および化合物（ＩＩ）。化合物（ＩＩ）についての「分析された物質」の酸化／脱水素活性はＤＣＰＩＰの吸光度の減少として分光光度法で追跡され、ＤＣＰＩＰは、酸化された場合は青色であり、還元された場合は無色になる。「分析された物質」が化合物（ＩＩ）に対して酸化／脱水素活性を示すことができる場合、電子は人工電子受容体に移動して、人工電子受容体は還元され、従って反応混合物は色が青色から無色に変化する。
【０１８２】
前記方法を実施する一例は、以下の手順に従うことである：ＤＣＰＩＰおよびＰＭＳを、両方の前記人工電子受容体について約０．０１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で、特に約０．０５ｍＭから約５ｍＭ  ＤＣＰＩＰを０．０１ｍＭから約２ｍＭ  ＤＣＰＩＰと組み合わせて使用する。好ましくは、スクリーニング方法におけるＤＣＰＩＰの量は、０．０５ｍＭから約０．５ｍＭの濃度のＰＭＳと組み合わせて０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で提供される。最も好ましくは、ＰＭＳと組み合わせたＤＣＰＩＰは、分光光度法で追跡できる時系列で吸光度の減少を観察することができる量で提供される。化合物（ＩＩ）を適切な水溶液に溶解し、約０．５ｍＭから約１Ｍ、好ましくは約１０ｍＭから約５００ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭから２００ｍＭの濃度でスクリーニング方法において使用し得る。化合物（ＩＩ）は、蒸留水または適切な緩衝液に溶解し得る。ｐＨ値を調整するための適切な緩衝剤は、酸、塩基、塩またはこれらの混合物で作製され、特にリン酸および水酸化ナトリウムを使用し得る。スクリーニング方法が実施される水性懸濁液は、ｐＨ５．５から９．０、好ましくは６．０から８．５、より好ましくは６．０から８．０に緩衝し得る。「分析された物質」を、場合により緩衝液中で（特にリン酸緩衝液ｐＨ６．０から８．５中で）、前記水性懸濁液中の（特に約０．０５ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌの濃度範囲で）反応混合物に添加する。化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換することができる触媒のスクリーニングおよび同定は、経時的に吸光度の減少を追跡して分光光度法で観察することができ、３８０ｎｍから７５０ｎｍの間の波長、好ましくは４５０ｎｍから６５０ｎｍの間の波長、より好ましくは５５０ｎｍから６５０ｎｍの間の波長においてあり得る。
【０１８３】
本発明はまた、アルドースデヒドロゲナーゼ活性単位を提供する。アルドースデヒドロゲナーゼ活性単位は、任意の「分析された物質」の調製物について使用される培養微生物の湿重量につき１分当たりの吸光度単位の低下の絶対値（ａｂｓ［ｍＡＵ／分／ｍｇ］）と定義される。比較試験のために、試験微生物の細胞密度を試料ｍＬ当たりのｍｇでの湿重量、タンパク質濃度および／または当業者に周知の定量化のための他の間接的もしくは直接的方法として定量し得る。
【０１８４】
化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換することができる生物の同定のためのさらに別のスクリーニング方法は、当分野で公知の任意の酸素消費測定法の使用である。本発明によって提供される非限定的な例は、化合物（ＩＩ）の添加後の試験生物の培養物中での溶解酸素の測定の使用である。より詳細には、実験設定は、試験生物の液体培養ブロスを含む撹拌通気容器および溶解酸素センサーで構成され得る。化合物（ＩＩ）の添加後、溶解酸素値の低下によって示される酸素消費の増大を観察することができる。標準化された条件下での溶解酸素値の低下がより速くより深いほど、化合物（ＩＩ）のより高い酸化速度が試験生物によって促進される。
【０１８５】
ＰＱＱ
ピロロキノリンキニン（４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸：ＰＱＱ）は、キノプロテインを使用する場合、機能するために必要とされる分子である。酸化還元補因子であるＰＱＱは、水溶性および熱安定性であり、生物学的酸化還元においてニコチンアミドおよびフラビンに次ぐ３番目の種類の補酵素とみなされ、Ｈａｕｇｅ，１９６４によって発見された。この時点まで未知の酸化還元補因子も、アルコールデヒドロゲナーゼ中でＡｎｔｈｏｎｙ  ａｎｄ  Ｚａｔｍａｎによって見出され、彼らによりメトキサンチンと命名された［Ａｎｔｈｏｎｙ，１９６７］。その後、ＰＱＱは、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドラターゼおよびデカルボキシラーゼにおいて生じることが報告された。これらのキノプロテインの役割は、非リン酸化基質、例えばアルコール、アルデヒドまたはアルドースの一次酸化段階を触媒することである。
【０１８６】
ＰＱＱは、原核生物（例えばクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）および真核生物（例えばポリポラス・ベルシカラー（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ラス・ベルニシフェラ（Ｒｈｕｓ  ｖｅｒｎｉｃｉｆｅｒａ））の両方で認められている［Ｇｏｏｄｗｉｎ，１９９８；Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，２００６；Ｙａｎｇ，２０１０］。
【０１８７】
ＰＱＱの一般に認められている構造は：
【０１８８】
【化１１】
2014501524.tif 000012
［式中、ＰＱＱｏｘは酸化形態の補因子であり、ＰＱＱｒｅｄは還元形態の補因子である。］
である。
【０１８９】
ＰＱＱの生合成に関与する遺伝子の数は種間で異なるが、一般に、生合成のためには、通常ｐｑｑＡＢＣＤＥまたはｐｑｑＡＢＣＤＥＦオペロンにクラスター化した、少なくとも５または６個の遺伝子が必要であることが公知である。遺伝子の数および組織化は、以下の実施例で見られるように可変的である。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では、ＰＱＱ生合成遺伝子はｐｑｑＡＢＣＤＥＦオペロンにクラスター化し、一方シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ではｐｑｑＦがｐｑｑＡＢＣＤＥオペロンから分離されている。アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）では、ｐｑｑＡＢＣＤＥは存在するがｐｑｑＦ遺伝子は知られていない。条件的メチロトローフであるメチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１は、ｐｑｑＣ遺伝子とｐｑｑＤ遺伝子が融合しているｐｑｑＡＢＣ／ＤＥオペロンを含み、一方ｐｑｑＦＧ遺伝子は３個の他の遺伝子とオペロンを形成する。
【０１９０】
ＰＱＱを補因子として利用する酵素については多くのことが公知であるが、ＰＱＱの生合成については相対的にほとんど知られていない。しかし、ＰＱＱの骨格はグルタマートおよびチロシンから構築される。おそらくこれらのアミノ酸は前駆体ペプチドＰｑｑＡ中にコードされている。低分子ペプチドの長さは種々の生物間で異なり（それぞれＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）での２３アミノ酸からＰ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の３９アミノ酸まで）、すべての変異体においてＰｑｑＡペプチドの中央にＧｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒモチーフが保存されている。ＰｑｑＢタンパク質は、ＰＱＱのペリプラズムへの輸送に関与すると考えられ、従ってＰＱＱの生合成に直接必要ではない。ＰｑｑＣタンパク質の残基は種々の細菌からのＰｑｑＣタンパク質内で高度に保存されており、このタンパク質はＰＱＱ形成における最終段階を触媒することに関与する。種々の生物からのＰｑｑＤタンパク質のタンパク質配列のアラインメントは厳密に保存された残基を示すが、ＰｑｑＤの機能は十分には解明されていない。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において、ＰｑｑＥは、Ｃ９およびＣ９ａを連結するＰｑｑＡを認識することが示されており、その後連結されたアミノ酸を切断するＰｑｑＦによって受容される。前記生物において、その次の反応（シッフ塩基）は、二原子酸素添加後、自発的であることが示された。最後の環化および酸化段階はＰｑｑＣによって触媒される［Ｐｕｅｈｒｕｎｇｅｒ，２００８］。
【０１９１】
タンパク質データベース内でクレブシエラ・シュードモナス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来するＰｑｑＦおよびＰｑｑＧタンパク質の比較を実施した場合、前記タンパク質は、低分子ペプチドを切断する二価カチオン含有エンドペプチダーゼのファミリーと類似性を共有することが示された［Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，１９９２］。メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）のＰｑｑＦおよびＰｑｑＧタンパク質は、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼの２つのサブユニットに多少の類似性を示すが［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９６］、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰｑｑＦは、ｔｌｄＤ遺伝子によってコードされるエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ペプチダーゼ、ピトリリシンに最も密接に関連する［Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，１９９２］。ｐｑｑＡＢＣＤＥ遺伝子だけを含み、ｐｑｑＦを欠くＰＱＱ遺伝子クラスターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において適格なＰＱＱ生合成機構を提供するために使用し得ることが提案され、実験的に示されている（Ｋｉｍ  Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｙａｎｇ  Ｘ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ピトリリシンプロテアーゼ（ｔｌｄＤ遺伝子によってコードされる。）は、見掛け上、一部の微生物において認められるｐｑｑＦ遺伝子の活性を補完している。
【０１９２】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）はＰＱＱ自体を合成する能力を持たないが［Ｈｏｍｍｅｓ，１９８４；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，１９９７］、環境で認められる、ＰＱＱに対する正の走化性作用を示し［ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，１９９８］、外部から供給された補因子を利用することができる［Ｓｏｕｔｈａｌｌ，２００６］。従ってＰＱＱ生合成遺伝子はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換え発現することができ、これは本発明で述べる態様の１つである。
【０１９３】
上記に関して、一般に、ＰＱＱをＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼにインサイチューで提供する少なくとも３つの方法がある。
【０１９４】
第一に、ＰＱＱを、アルドースデヒドロゲナーゼ酵素を含む生存もしくは休止細胞または無細胞溶解物または精製アルドースデヒドロゲナーゼ酵素に添加することができる。ホロ酵素形態の活性アポ酵素への再構成はほとんど瞬時であり、これは本発明の１つの態様で示された。ＰＱＱと酵素のカップリングを促進するためにカルシウム、マグネシウムまたは他の二価金属イオンを混合物に添加する。これは、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２などの塩を酵素混合物に添加することによって達成され得る。さらに、ＰＱＱの添加のさらに別の可能性があり、ＰＱＱは必ずしも補助食品、酵母抽出物などの培地成分等の形態に精製される必要はない。キノプロテインがＰＱＱに対して非常に高い親和性を有する［ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，１９９８］という事実は、キノプロテインと等モル量を使用することを可能にする。実際には、これはナノモルからマイクロモルレベルの濃度を意味する。工程のコストを低減するためにアルドースデヒドロゲナーゼ酵素の最適活性に必要なＰＱＱの量を最適化することが容易に実施されることは当業者に明らかになる。非限定的な例として、漸増量（０．１ｎＭから出発する。）のＰＱＱをアルドースデヒドロゲナーゼ触媒に添加し、さらなるＰＱＱを提供しても前記触媒の活性がもはや増大しない場合、添加された量が最適である。
【０１９５】
この意味で、本発明は、アルドースデヒドロゲナーゼに、より具体的には生存全細胞触媒、休止もしくは不活性化全細胞触媒、無細胞溶解物もしくは抽出物または本明細書によって提供される任意の他の形態の触媒に、ＰＱＱを約０．１ｎＭから約５ｍＭの濃度で供給する方法を提供する。特に約１ｎＭから約１００μＭのＰＱＱが提供され得る。より好ましくは、ＰＱＱは約１００ｎＭから約５μＭの濃度で提供される。最も好ましくは、ＰＱＱは、前記触媒の最大活性を可能にする最少量で提供される。ＰＱＱは任意の供給源から得ることができ、固形物またはＰＱＱの保存溶液として触媒に提供される。ＰＱＱによるアルドースデヒドロゲナーゼの再構成を促進するため、カルシウムまたはマグネシウムイオン、好ましくはＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２を約０．１ｍＭから約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭから約２０ｍＭの濃度で酵素に提供する。ＭｇＣｌ２は好ましい選択肢であるが、異なる酵素は特定の二価イオンに対する選択性が異なり得る。第二に、適切なデヒドロゲナーゼの生産のための宿主生物が内因性ＰＱＱ生合成能を有する、言い換えるとこの遺伝物質中に既に組み込まれたＰＱＱ生合成についての機能的遺伝子を含むという選択肢がある。非限定的な例は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）その他である。
【０１９６】
このような微生物を同種または異種アルドースデヒドロゲナーゼの発現のための宿主として使用する場合、発現された酵素をＰＱＱと結合して、これらの活性形態を形成する。前記微生物の一部には、ＰＱＱ生産能に加えて、活性ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼが存在し、これは化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換することができる。本発明の幾つかの態様において、このアプローチは以下で例示するように極めて有効でうまくいくことが証明された。
【０１９７】
この態様では、本発明は、ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼの相同または非相同発現のための宿主として使用できるＰＱＱを生産する生来の能力を有する微生物を提供する。前記微生物は、好ましくは細菌の中から、より好ましくは工業的に培養可能な細菌、特にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）から選択される。最も好ましい実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）を使用し得る。
【０１９８】
同様であるが異なる実施形態では、本発明は、化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換する天然の能力を有する微生物を提供する。所望の酸化を実施することができる触媒を得るために、提供される生物に関して遺伝的修飾は必要ない。従って本発明は、細菌起源から、より詳細にはクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）から選択される、本明細書で開示される目的および使用のための微生物を提供する。より詳細には、微生物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）から、最も好ましくはグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）およびクルイベラ・インテルメディウム（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）から選択され得る。
【０１９９】
上記で述べたのは、本発明を実施するための所望特性を有する微生物の非限定的な例である。さらに、このような微生物のスクリーニングおよび同定を可能にする方法を開示し、提供する。
【０２００】
３番目の選択肢は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のようなＰＱＱの生合成の内因性能力を有さない微生物に特に適用できる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの一部の微生物および大部分の高等生物は、これらのゲノム中にコードされたＰＱＱ依存性酵素を有し、特定の条件で発現するが、ＰＱＱの生合成を欠くことは当分野で周知である［Ｍａｔｓｈｕｓｈｉｔａ，１９９７］。このような微生物がＰＱＱを必須栄養素として、または言い換えるとビタミンとして得ることが当分野で企図されている。本発明のために使用されるこのような微生物においてＰＱＱの生合成を確立する方法は当業者に明らかである。このような生物にＰＱＱの生合成を提供するアプローチは記述されている（例えばＧｏｏｓｅｎ，１９８８；Ｙｏｓｈｉｄａ，２００１；Ｋｉｍ，２００３；Ｋｈａｉｒｎａｒ，２００３；Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，２００６；Ｙａｎｇ，２０１０参照）。同じく本発明によって提供されるように、これは、ＰＱＱ生合成機構を有する微生物からのＰＱＱ生合成遺伝子クラスターをプラスミドベクターまたは細菌染色体にクローニングし、次に宿主生物においてこのような遺伝子を発現させることによって確立され得る。この目的に適する微生物の非限定的な例には、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）その他が含まれる。「ＰＱＱ遺伝子クラスターの異種発現」という用語は、上記手順を表す広く確立された用語として、当業者には直ちに理解される。
【０２０１】
本発明における使用のために、前記遺伝子クラスターが上述した機能的タンパク質をコードし、単独でまたは宿主生物の酵素と協力してＰＱＱを生合成する能力を有することを条件として、任意のＰＱＱ遺伝子クラスターを使用し得る。
【０２０２】
本発明の１つの実施形態では、ＰＱＱ遺伝子クラスターは、ＰＱＱを産生する任意の生存生物から得ることができる。本発明のより特定の実施形態では、ＰＱＱ遺伝子クラスターは、細菌の中から、より詳細にはクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）から選択される任意の微生物から得ることができる。より詳細には、微生物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）から、最も好ましくはグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）およびクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）から選択され得る。
【０２０３】
適切なＰＱＱ遺伝子クラスターの例には、クラスターのヌクレオチド配列または配列表に含まれる遺伝子が含まれるが、これらに限定されず、これらは、配列表に示すこれらのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列によって同定される。一般に、当分野で公知の機能的遺伝子を提供するＰＱＱクラスターのいずれかを、列挙されるＰＱＱクラスター、この中に含まれる遺伝子および前記遺伝子によってコードされるタンパク質とのこれらの配列同一性にかかわらず、反応のために使用し得る。
【０２０４】
ＰＱＱ  ０１は、配列番号：６８のヌクレオチド配列に含まれるグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）６２１ＨからのＰＱＱコード遺伝子クラスターであり、それぞれアミノ酸配列、配列番号：１２、１３、１４、１５、１６を有するタンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤおよびＰｑｑＥをコードする遺伝子ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤおよびｐｑｑＥの発現を可能にする。
【０２０５】
ＰＱＱ  ０２は、配列番号：６９のヌクレオチド配列に含まれるクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）からのＰＱＱコード遺伝子クラスターであり、それぞれアミノ酸配列、配列番号：１８、１９、２０、２１、２２を有するタンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤおよびＰｑｑＥをコードする遺伝子ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤおよびｐｑｑＥの発現を可能にする。
【０２０６】
ＰＱＱ  ０３は、配列番号：６３のヌクレオチド配列を有するクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３２４からの遺伝子クラスターｐｑｑＡＢＣＤＥＦであり、タンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤ、ＰｑｑＥおよびＰｑｑＦをコードする遺伝子ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤ、ｐｑｑＥおよびｐｑｑＦの発現を可能にする。上記配列は、２６０２８４６と２５９９７０６の間の位置にある、ＮＣＢＩゲノムデータベースでアクセッション番号ＣＰ０００９６４を有するゲノム配列の一部として入手可能である。
【０２０７】
ＰＱＱ  ０４は、それぞれ配列番号：６４および配列番号：６５のヌクレオチド配列を有するメチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１からの遺伝子クラスターｐｑｑＡＢＣ／ＤＥおよびｐｑｑＦＧであり、タンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤ、ＰｑｑＥおよびＰｑｑＦをコードする遺伝子ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤ、ｐｑｑＥおよびｐｑｑＦの発現を可能にする。上記配列は、１８２５２３５と１８２１７６３の間（ｐｑｑＡＢＣ／ＤＥ）、２４０１０５５と２４０３７９２の間（ｐｑｑＥＦ）の位置にある、ＮＣＢＩゲノムデータベースでアクセッション番号ＣＰ００１５１０を有するゲノム配列の一部として入手可能である。
【０２０８】
ＰＱＱ  ０５は、それぞれ配列番号：６６および配列番号：６７のヌクレオチド配列を有するシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ７からの遺伝子クラスターｐｑｑＡＢＣＤＥおよびｐｑｑＦであり、タンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤ、ＰｑｑＥおよびＰｑｑＦをコードする遺伝子ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤ、ｐｑｑＥおよびｐｑｑＦの発現を可能にする。上記配列は、３４２０３８５と３４２３５７８の間（ｐｑｑＡＢＣＤＥ）、３４３９５１２と３４３７２２１の間（ｐｑｑＦ）の位置にある、ＮＣＢＩゲノムデータベースでアクセッション番号ＣＰ０００７４４を有するゲノム配列の一部として入手可能である。
【０２０９】
ＰＱＱ  ０６は、配列番号：７０のヌクレオチド配列を有するエルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）ＡＴＣＣ  ４９９４６からの遺伝子クラスターｐｑｑＡＢＣＤＥＦであり、タンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤ、ＰｑｑＥおよびＰｑｑＦをコードする遺伝子ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤ、ｐｑｑＥおよびｐｑｑＦの発現を可能にする。上記配列は、５９７６０４と６００８５０の間の位置にある、ＮＣＢＩゲノムデータベースでアクセッション番号ＦＮ６６６５７５を有するゲノム配列の一部として入手可能である。
【０２１０】
当業者はまた、広く確立されたデータマイニングツールを使用して公的に利用可能なデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ、ＲＣＳＢ  ＰＤＢ、ＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、ＭｅｔａＣｙｃ）において、ＰＱＱ合成を提供する付加的な候補遺伝子クラスターを認識する。
【０２１１】
本発明によって提供されるＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼの活性を測定する方法は、本明細書で本発明によって例示されるように、生物の起源（天然または遺伝的に改変されている。）にかかわりなく、ＰＱＱを産生することができる生物をスクリーニングし、同定するために使用することができ、加えて、所望する場合は、産生されたＰＱＱの量を推定する半定量的方法を可能にする。好ましくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（またはＰＱＱを産生することができない任意の他の微生物）において発現される、任意の形態のＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼを活性ホロ酵素の再構成のために使用することができる。様々な量のＰＱＱを添加した、前記ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼの活性を測定することによって得られる検量線を、分析された試料を添加した前記ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼの活性と比較する。この方法の直線範囲内で、より多くのＰＱＱが分析試料中に存在するほど、より高い活性が認められる。
【０２１２】
本発明の特定の実施形態では、ＰＱＱ遺伝子クラスター（またはこの部分）は、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）またはグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）に由来する。特に、配列番号：６８のヌクレオチド配列に含まれるグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）６２１Ｈからの遺伝子クラスターを使用し得る。または、本発明の特定の実施形態は、配列番号：６９のヌクレオチド配列に含まれるクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）からの遺伝子クラスターの使用を提供する。前述した遺伝子クラスターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における前記クラスター内にコードされた遺伝子の発現を可能にするために、当分野で公知の方法によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１に記載されている方法によって改変することができる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の数多くの株のいずれかを使用することができる：例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、例えばＪＭ１０９、ＤＨ５、ＤＨ１０、ＨＢ１０１、ＭＧ４１００等またＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ株、例えばＢＬ２１、Ｒｏｓｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ等が使用できる。遺伝子は、当分野で公知の任意の遺伝学的方法によって、例えばトランスフェクション、形質転換、電気穿孔、接合伝達その他によって前記宿主株に導入することができる。前記遺伝子クラスターは、当分野で公知の任意の形態で、例えば自律複製プラスミド中にコードされてまたは宿主のゲノムに組み込まれて、前記宿主微生物中に維持され得る。前記遺伝子クラスター中にコードされる遺伝子の発現は、前記遺伝子の発現を制御する天然プロモーターの活性を利用することによってまたはプロモーターを、前記宿主微生物における発現により適し得るプロモーターに置き換えることによって得ることができる。このような改変を行うための方法は当分野において周知である。
【０２１３】
１つの態様では、本発明は、配列番号：６８のヌクレオチド配列に含まれるグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）６２１Ｈからの遺伝子クラスターを提供し、これは、宿主Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に含まれる自律複製プラスミド上で実施される。この特定の態様では、クラスター上にコードされる遺伝子は、これらの対応する天然プロモーターの制御下で発現される。
【０２１４】
１つの態様では、本発明は、配列番号：６９のヌクレオチド配列に含まれるクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）からの遺伝子クラスターを提供し、これは、宿主Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に含まれる自律複製プラスミド上で実施される。この特定の態様では、クラスター上にコードされる遺伝子は、これらの対応する天然プロモーターの制御下で発現される。同じ特定の態様において、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＱＱ合成を提供するために使用される遺伝子はｐｑｑＡＢＣＤＥであり、ｐｑｑＦの機能はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内因性活性によって提供される。
【０２１５】
本発明者らの所見によれば、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼの異種発現の間にＰＱＱが利用可能であることは、これらの正しい折りたたみ、輸送、リーダー配列の切断および他の翻訳後修飾にほとんど影響を及ぼさない。これは、ＰＱＱがいつデヒドロゲナーゼに提供されるか、即ちＰＱＱがデヒドロゲナーゼに提供される時点または期間、例えば培養および発現の誘導の間または後であるかにかかわらず、デヒドロゲナーゼ活性にはほとんど差がないことを意味する。他のパラメータ、即ち細胞周辺腔または細胞膜において高い、さらには最大のＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼ活性がいつ確立されるか、細胞の天然電子受容体（呼吸鎖）への最適結合がどこで可能となるかは、より意味がある。これらのパラメータの１つは、タンパク質をペリプラズムまたは膜へと向かわせる、適切なリーダー配列の存在である。別のこのようなパラメータは、培養の温度、選択される転写プロモーター、ＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼコード遺伝子におけるコドン使用頻度、発現誘導物質の量等によって制御され得る発現強度である。さらに別のこのようなパラメータは、選択されるＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼの固有特性、例えば異種宿主における正しい折りたたみの能力、異種宿主に対する毒性、宿主の分解酵素に対する耐性等である。このようなパラメータはすべて、活性の増強および最適化ならびにこれらを行う方法のために有用であり、当業者に明らかになる。
【０２１６】
本発明のさらに例示され、改変されたまたは選択的な実施形態
本発明の実施するための様々なさらなる実施形態、改変および代替手段が上記説明から明らかになる。
【０２１７】
さらに例示される、本発明は、例えば基質（ＩＩ）をデヒドロゲナーゼ触媒酸化条件下で反応させて対応するラクトン（Ｉ）を形成する段階を含む特定の工程を提供し、この工程でデヒドロゲナーゼは、第一の実施形態では、ＧＤＨ  ０１もしくはＧＤＨ  ０２もしくはＧＤＨ  ０３もしくはＧＤＨ  ０４もしくはＧＤＨ  ０５、またはこれらと少なくとも７０％、より好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有する任意のデヒドロゲナーゼから選択される。別の実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＧＤＨ  ０６もしくはＧＤＨ  ０７もしくはＧＤＨ  ０８もしくはＧＤＨ  ０９もしくはＧＤＨ  １０、またはこれらと少なくとも７０％、より好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有する任意のデヒドロゲナーゼから選択される。
【０２１８】
別の態様では、本発明は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が宿主微生物として例示される、適切な合成生物学的経路を構築し、提供する方法に関し、この場合ＤＥＲＡ（デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ）、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼおよび、場合によりＰＱＱ生合成経路遺伝子が同時に発現される。宿主生物の呼吸鎖も確立され、提供される。
【０２１９】
Ｇｃｄアルドースデヒドロゲナーゼはすべての好ましい特徴を満たし、従って使用される最も好ましい酵素である。Ｇｃｄは、本明細書で述べるＧｃｄの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％にアミノ酸配列同一性を有する任意のアルドースデヒドロゲナーゼを包含する。アミノ酸配列同一性は、配列比較アルゴリズムでの解析によってまたは目視検査によって決定される。１つの態様では、配列比較アルゴリズムは、デフォルトに設定したＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ９．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ）のＡｌｉｇｎＸアルゴリズムで行う。
【０２２０】
さらなる特別な態様では、本発明は、上述した酵素を用いた化合物（ＩＩ）の酸化または脱水素反応の工程であって、生存全細胞触媒、休止全細胞触媒、無細胞溶解物、部分精製もしくは精製酵素、固定化酵素または任意の他の形態の触媒として使用される微生物または微生物由来物質を提供することを含む工程に関し、上述した酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素は、前記微生物において天然に発現される、即ち前記酵素は微生物の天然の特性である。前記態様では、培養され、前記反応において触媒として使用される場合このような生物は、前記微生物の付加的な遺伝的修飾を必要とせずに化合物（ＩＩ）を対応するラクトンに変換することができる。前記微生物は、以下で例示するような極めて多様な細菌から選択することができる。記述された特性を有する生物は、細菌、より詳細にはプロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノミセタール（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ミクソバクテリアセアエ（ｍｉｘｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）から選択することができる。より詳細には、前記微生物はガンマプロテオバクテリアセアエ科（Ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）から選択され得る。この意味で最も好ましい生物は、エンテロバクテリアセアエ科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）およびアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の群から選択される。
【０２２１】
本明細書で提供される開示を考慮して、化合物（ＩＩ）の酸化または脱水素の能力を有する生物を探索する方法は当業者に明らかである。１つのこのような方法は、一定量の化合物（ＩＩ）を試験微生物の培養物に提供し、活性を調べることである。
【０２２２】
さらなる特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物の定義、従ってまた式（Ｉ）の化合物の定義も、Ｒ５が式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）：
【０２２３】
【化１２】
2014501524.tif 000013
から選択される部分を表すものに限定され得る。
【０２２４】
さらに別の特定の実施形態では、式（ＩＩ）の定義、従ってまた式（Ｉ）の定義も、以下の定義：
Ｒ１は、Ｒ２とは独立して、Ｈ、Ｘ、Ｎ３、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３またはＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表し；ならびに
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、Ｈもしくは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか；または
Ｒ１およびＲ２のどちらも、Ｘ、ＯＨもしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表すか；または
Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−を表し、前記式中、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立してもしくは一緒になってＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３を表すか、または一緒になって環−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＨ２）ｓ−、−（ＣＯ）ｒ−（１，２−アリーレン）−（ＣＯ）ｓ−を形成し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し；
ｎは０から１０の整数であり；
ｍは０から３の整数であり；
ｐは２から６の整数であり；ならびに
ｒおよびｓの少なくとも一方は１である
に特定され得る。
【０２２５】
本発明の工程によって得られる式（Ｉ）の化合物は、スタチンを調製するための中間体として使用することができる。当業者は、スタチン合成に関連して本発明による前記化合物を得る工程段階をどのように実施するかを理解する。原則として、スタチンに到達する２つの基本的な方法がある。第一の経路によれば、ラクトンをラクトールから調製し、次にスタチン骨格に連結する。または、最初にアルデヒド側鎖を含むスタチン骨格を調製し、その後これを、例えば２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素を使用することによってラクトールに変換し、次にラクトンに酸化する。アトルバスタチンの特定の場合については、一例として、ＷＯ２００６１３４４８２のスキーム２から４を参照することができる。
【０２２６】
特定の実施形態では、酵素２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）を、式（ＩＩ）の化合物を調製するために使用し、その後これを、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素によってラクトンに変換する。ＤＥＲＡ酵素の多数の野生型、変異体または突然変異型が当分野で公知であり、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１９９４），ｐ．８４２２−８４２３、ＷＯ２００５／１１８７９４またはＷＯ２００６／１３４４８２が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ酵素を、式（ＩＩ）の化合物を酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させる段階の直前に合成段階のために使用する。
【０２２７】
別の好ましい実施形態では、ＤＥＲＡを使用して、式（ＩＩ）の化合物を、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素による前記化合物の式（Ｉ）の化合物への変換と少なくとも部分的に同時に調製する。式（ＩＩ）の化合物を調製する反応および前記化合物を式（Ｉ）に酸化する反応を触媒するのに必要な酵素は、同時にまたは続いて、一度に、断続的にもしくは継続的に、混合物中で使用することができるかまたは反応混合物に添加することができる。ＤＥＲＡによって調製される、式（ＩＩ）の化合物、および従って酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素との反応のための出発物質を有する実施形態は、この設計が良好に適合性であり、先行する段階で水性溶媒を使用することを可能にし、従って式（ＩＩ）の化合物を、ラクトンへの変換のために酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素に提供する前に精製することを不要にするので、好都合である。好ましい実施形態は、従って、前記化合物の事前の単離または精製を伴わずに式（ＩＩ）の化合物を酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させることである。この場合、先行段階の完全な反応混合物をその後の反応のために使用することができ、これは工程段階の数を低減し、工程を単純化する。精製段階を取り除くことにより、収率も上昇する。加えて、化学的酸化剤に比べてより良好な酵素特異性のために、ほとんど（ＩＩ）の化合物だけがラクトンに酸化され、存在する残りの化合物は変化せず、このため不純物生成の傾向が低減し、従ってその後の作業または精製手順を改善する。本発明による任意の酵素反応における基質はすべて、一度に反応に添加することができるか、またはより長期間にわたって継続的にまたは１つのバッチもしくは断続的なバッチで添加することができる。
【０２２８】
式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物を調製するのと少なくとも部分的に同時に調製した場合、有意の改善を達成することができる。同時に、ＤＥＲＡ酵素との反応を個別に使用することの多くの欠点を解決する。例えば、ＤＥＲＡ酵素を使用することによって式（ＩＩ）の化合物を調製する場合に出発物質として使用されるアルデヒドは、反応の経過中にＤＥＲＡ酵素を不活性化する傾向があり、従って酵素の活性を低下させる。加えて、反応混合物中で形成される式（ＩＩ）のラクトールは生存微生物に対して毒性である。このため、ＤＥＲＡとの反応段階を短縮し、出発アルデヒドおよび／またはラクトールをできるだけ早く消費することが極めて望ましく、これは両方の酵素反応段階を少なくとも部分的に同時に実施する場合に達成される。即ち、両方の反応段階を少なくとも部分的に同時に、好ましくは完全に同時に実施した場合、毒性ラクトールは直ちに、結果として起こる反応に入り、非毒性のラクトンに変換される。さらに、２番目の反応段階は、以下の実施例で確認されるように、典型的には律速段階ではなく、ＤＥＲＡとの最初の段階よりも速く進行するので、最初の反応の定常状態平衡は生成物の方向にシフトする。これは、第一段階の完了のための時間短縮をもたらし、従ってＤＥＲＡを不活性化から保護する。同時に生細胞を高濃度のラクトールによる破壊から保護する。
【０２２９】
本発明の重要な態様は、（ＩＩ）の酸化／脱水素反応によって生成される電子を、この呼吸鎖を介して酸素（最終電子受容体）に伝達する微生物の内因性能力を対象とする。これは、全細胞系において酵素が触媒する化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素の反応を駆動する。電子溜めとして働く能力が、本発明において本明細書によって説明される全細胞系の重要で有益な特性であることは直ちに明らかである。
【０２３０】
全細胞の使用は、従って、上述したＤＣＩＰその他のような付加的な電子受容体の使用を回避する。全細胞工程を使用することのさらなる恩恵は、記述された合成生物学的経路のすべての態様、即ちＤＥＲＡ酵素、ＰＱＱおよびＰＱＱ依存性糖デヒドロゲナーゼを１つの生物において提供できることである。このような工程の生産性および収率は以下で例示するように工業的に適切であるので、全細胞の使用は、コストを他のアプローチ、例えば無酵素工程、固定化酵素、無細胞溶解物等と比較して有意に低いレベルに抑えることができるため好ましい。また、ＤＥＲＡおよび酸化／脱水素反応段階の両方を、ワンポット設計を用いて完全にまたは部分的に同時に実施する可能性は、工業規模で使用される場合、有意のコスト削減を導く。
【０２３１】
全細胞系を電子溜めとして利用するという意味で、酸素の存在下で工程を実施することも、特に酸素が所与の工程条件で溶解酸素の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１５％となる量で提供される場合、好都合であり、１００％溶解酸素は所与の工程条件で酸素の飽和溶液と理解され、０％は無酸素液体と理解され、酸素濃度と溶解酸素パーセントとの間の相関は、所与の工程条件で０％から１００％まで線形である。この態様では、工程条件は液体組成物、温度、ｐＨ、圧と理解され、動的過程における測定は均質な固体／液体／気体多相系において実施されると理解される。
【０２３２】
酸化または脱水素反応を不可逆的にする量の酸素の存在は、得られたラクトンを保護し、第一反応の定常状態平衡が生成物の方向にシフトすることをさらに増強する。この好ましい実施形態は、従って、収率を高め、工程に必要な時間を短縮する。
【０２３３】
酸素もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素および／またはＤＥＲＡ酵素は、即ちそれぞれ単独でまたは組み合わせておよび場合により独立して、単一または複数の生存全細胞、不活性化全細胞、ホモジナイズされた全細胞もしくは無細胞抽出物中に含まれ得るか、またはそれぞれ精製され、固定化されているおよび／または細胞外で発現されるタンパク質の形態である。好ましくは、２つの酵素の一方は、さらにより好ましくは両方の酵素は、同じ生存全細胞、同じ不活性化全細胞または同じホモジナイズされた全細胞に含まれ、より好ましくは同じ生存全細胞または同じ不活性化全細胞に含まれ、特に同じ生存全細胞に含まれ、なぜならば、一般的な全細胞または少なくとも一般的な不活性化全細胞中に酵素を有することは、工程中で使用する前に酵素の取扱いをあまり必要とせず、コストを低減するからである。さらに、酵素が生存全細胞中に含まれることは、ろ過による酵素の簡単な除去を可能にし、工業規模での最終的な精製段階を軽減する。加えて、生細胞に含まれる酵素をその後のバッチで再利用することを可能にする。
【０２３４】
全細胞または少なくとも不活性化全細胞中で酵素を使用することの別の利点は、上記で詳述したようにＰＱＱ補因子を内因的に提供できることである。
【０２３５】
好都合な選択肢として、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を翻訳することができる全細胞系を、前記翻訳のために必要な遺伝子の両方を過剰発現するように設計することができる。過剰発現のための手段は当業者に公知であり、時に本明細書の別の部分で言及される。
【０２３６】
本発明のさらなる態様によれば、１以上の細胞型を含む発現系であって、それぞれの細胞型が、細胞型全体で、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の両方を発現するように遺伝子操作されている発現系が提供される。
【０２３７】
発現系は、適切な生物または細胞および場合によりさらなる因子および添加剤で構成され得、本明細書で提供される開示が参照される。
【０２３８】
１つの態様では、本発明は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が宿主微生物として例示される、本発明における使用のための合成生物学的経路を構築するまたは提供する方法を提供し、この場合ＤＥＲＡ（デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ）、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼおよび、場合によりＰＱＱ生合成経路遺伝子が同時に発現される。宿主生物の呼吸鎖を提供するので、前記合成生物学的経路は、以下に示す化合物（Ｘ）およびアセトアルデヒドなどの簡単な分子から化合物（Ｉ）の生成を実施する能力を有する。このアプローチは、化合物（ＩＩ）の生成、化合物（ＩＩ）の精製および化合物（ＩＩ）の化合物（Ｉ）への酸化という別々の段階をあらかじめ結合するので、好都合である。加えて、前記合成生物学的経路を担持する生物の培養は、化合物（ＩＸ）などの分子とアセトアルデヒドを式（Ｉ）の化合物に変換することができる物質を直ちに提供する、１つの工業的発酵工程で実施される。
【０２３９】
本発明の別の実施形態は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の存在下でＤＥＲＡ酵素反応のための出発物質を反応させ、ならびに場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解することにより、式（Ｉ）の化合物またはこの塩、エステルもしくは立体異性体をワンポット工程で得ることである。この実施形態は、式（Ｘ）：
【０２４０】
【化１３】
2014501524.tif 000014
［式中、Ｒは式（Ｉ）のＲ１−ＣＨ−Ｒ２部分を表し、Ｒ１およびＲ２は上記で定義されたとおりである。］
の化合物から出発して、前記化合物（Ｘ）を２つの酵素、即ちアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素の存在下でアセトアルデヒドとの反応に供することを企図する。この設定は、比較的簡単な出発物質、例えばアセトアルデヒドから出発する単一工程段階で式（Ｉ）の化合物を得ることを可能にする。反応は数時間以内に完了に至るので、工業的に適切である。この反応は中間精製段階を不要にする。加えて、好ましくは同じ生存全細胞、不活性化全細胞、ホモジナイズされた全細胞もしくは無細胞抽出物に含まれる、または精製され、固定化されているおよび／または細胞外で発現されるタンパク質の形態である、好ましくは同じ生存全細胞、不活性化全細胞またはホモジナイズされた全細胞に含まれ、より好ましくは同じ生存全細胞または不活性化全細胞に含まれ、特に同じ生存全細胞に含まれる、両方の酵素を一緒に添加する、即ち第一酵素反応の生成物が第二酵素反応の基質を形成する、可能性を提供する。
【０２４１】
これは、本明細書で述べるものを含むがこれらに限定されない、組み合わせた酵素反応の有利な作用すべてを利用する。１つの態様では、混合物に添加する基質の総量は、添加する基質（Ｘ）の総量が反応混合物１リットルにつき約２０ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約２ｍｏｌ、特に反応混合物１リットルにつき約１００ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約１．５ｍｍｏｌ、より詳細には反応混合物１リットルにつき約２００ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約７００ｍｍｏｌとなる量である。アセトアルデヒドは幾つかの手段によって添加し得る。１つの態様では、アセトアルデヒドを１つのバッチでまたはより多くのバッチでまたは連続的に反応混合物に添加する。アセトアルデヒドを式（Ｘ）の基質と予混合して、反応混合物に添加し得る。反応混合物に添加するアセトアルデヒドの総量は、受容体基質の総量に対して約０．１から約４モル当量、特に約２から約２．５モル当量である。本発明の１つの態様では、反応に使用されるｐＨ値は約４から約１１である。１つの実施形態では、反応に使用されるｐＨは約５から約１０である。別の実施形態では、反応に使用されるｐＨ値は約５から約８である。具体的には、ｐＨ値は適切な緩衝液によって５．２から７．５の範囲内に維持される。または、上記で挙げたｐＨ値は、当業者に明らかであるように必要に応じて酸または塩基の添加を制御することによって、しかしこれに限定されることなく、管理され得る。
【０２４２】
１つの態様では、本発明によって説明される反応に使用されるｐＨは、最適な酵素活性と最適な基質および／または生成物安定性との間で互譲が得られるように最適化され得る。本明細書で述べる種々の酵素についての最適酵素活性が基質／生成物安定性についての最適条件と同一でない場合があることは本明細書で理解される。当業者は、基質および／または生成物安定性を適合させて最適な生成物収率を得られるように条件を調整することにより、ある程度酵素活性を犠牲にすることが有益である（または逆もまた同様である。）と判断し得る。
【０２４３】
具体的には、アルドラーゼ酵素を、場合により少なくとも一部は酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と共に、水溶液中で（特に各々０．１ｇ／Ｌから３ｇ／Ｌの濃度で）、場合により塩（特に５０から５００ｍＭの濃度のＮａＣｌ）の存在下に、場合によりＰＱＱ（特に２５０ｎＭから５μＭの濃度で）およびＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２または選択的なカルシウムもしくはマグネシウム塩）を特に０．１から２０ｍＭの濃度で添加して調製する。水溶液は水と混和性の有機溶媒（特に２から１５％Ｖ／Ｖの濃度のジメチルスルホキシド）を含んでもよく、ｐＨ４から１１に緩衝され得る。一部の一般的に使用される緩衝液は、アルドラーゼ縮合中間体、特に第一縮合反応の産物が緩衝液との化学反応を受けることがあるので、これらの利用可能性を制限することによってアセトアルデヒドから出発する前記反応の収率を低下させ得る。例えば、ビス−トリスプロパンは、前記中間体（（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４，４−ジメトキシブタナール）と反応して（Ｓ，Ｚ）−２−（３−（（１，３−ジヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）（３−ヒドロキシ−４，４−ジメトキシブト−１−エニル）アミノ）プロピルアミノ）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールを与える。同様に反応し得る他の緩衝液は、ビス−トリス、トリシン、トリス、ビシンまたは第一級、第二級もしくは第三級アミノ基を有する任意の他の緩衝液である。従ってｐＨを調整するための適切な緩衝液は、この調整が必要である場合、酸、塩基、塩またはこれらの混合物、特にリン酸および水酸化ナトリウムで作製される。特に好ましい実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液である。特に、リン酸緩衝液を１０から５００ｍＭの濃度で使用することができる。水溶液はまた、アルドラーゼ酵素を、場合により少なくとも一部は酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と共に水に添加して、無機酸、塩基、塩またはこれらの混合物の自動添加を用いて反応の間ｐＨ値を維持することによっても調製できる。
【０２４４】
本発明による１つの態様では、アセトアルデヒドから出発する反応に使用される温度は約１０から約７０℃である。１つの実施形態では、反応に使用される温度は約２０から約５０℃である。別の実施形態では、反応に使用される温度は約２５から約４０℃である。
【０２４５】
１つの態様では、本発明によって説明される反応に使用される温度は、最適な酵素活性と最適な基質および／または生成物安定性との間で互譲が得られるように最適化され得る。本明細書で述べる種々の酵素についての最適酵素活性が基質／生成物安定性についての最適条件と同一でない場合があることは本明細書で理解される。当業者は、基質および／または生成物安定性を適合させて最適な生成物収率を得られるように条件を調整することにより、ある程度酵素活性を犠牲にすることが有益である（または逆もまた同様である）と判断し得る。
【０２４６】
反応の完了後、どちらの酵素も、例えば１容の反応混合物に対して少なくとも約１容のアセトニトリルを添加することによって、反応混合物から除去することができる。または、当分野で公知の任意の塩析法によって酵素を除去することができる。１つの実施形態では、塩析は、少なくとも５％ｍ／Ｖの硫酸アンモニウムを添加して実施される。酵素が生存または不活性化細胞に含まれる実施形態では、反応混合物をろ過するまたは遠心分離することによって酵素を除去し得る。
【０２４７】
別の実施形態では、生成物は、多くの水不混和性または難混和性溶媒のいずれかへの液／液抽出によって除去される。溶媒は、塩化メチレン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、酢酸プロピオニル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ニトロメタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ベンゼン、トルエン、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、石油エーテル、トリエチルアミンから選択され得るが、これらに限定されない。選択された有機溶媒での液／液抽出の前に、生成物の水溶液のｐＨを１から１２の間、好ましくは２から８の間、より好ましくは３から５の間の値に調整し得る。抽出完了後の有機相中の残留水分の乾燥は、列挙される塩：硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム（一水和物）、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸銅を添加することによって実施され得るが、これに限定されない。
【０２４８】
一般に、使用されるアルドラーゼ酵素および／または酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素は、当分野で公知の任意の手段によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに記載されているタンパク質発現の方法によって調製することができる。アルドラーゼ酵素および／または酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素をコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、酵素を適切な発現宿主において発現させることができる。改変された型の公知のアルドラーゼ酵素または酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素は、クローニング条件に依存して必要であり得るかまたは生じてもよく、本発明に包含される。
【０２４９】
細胞および生物
本発明の１つの態様は、天然に発現される酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を有する、本明細書で述べる任意の形態の微生物を使用した、化合物（ＩＩ）または本明細書で列挙する他の化合物の酸化または脱水素の工程を提供する。前記態様では、培養され、触媒として使用された場合このような生物は、前記微生物の付加的な遺伝的修飾を必要とせずに化合物（ＩＩ）を対応するラクトンに変換することができる。このような生物を同定する方法が本発明において例示される。このような生物の非限定的な例は、極めて多様な細菌から、より詳細にはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）から選択され得る。
【０２５０】
関連実施形態では、および本発明の実施形態を最良の配置で実施するために、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）酵素および酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素を翻訳することができ、ならびに前記翻訳のために必要な遺伝子の両方を過剰発現することができる特に適合された発現系が提供される。本明細書で使用される「過剰発現する」という用語は、強力なプロモーターの制御下での発現、または遺伝子が高レベルで発現され（野生型発現制御と比較して）、細胞内もしくは細胞外に蓄積される発現を指す。このような改変された発現を得る方法は当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに記載されているクローニング方法が使用できる。酵素についての遺伝子を、例えば同じまたは異なるベクター上にクローニングし、細胞に形質転換することができる。選択的に、発現系は別々の細胞を含み、第一細胞はアルドラーゼ酵素についての遺伝子を過剰発現し、第二細胞は酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素についての遺伝子を過剰発現する。本明細書は例証的に、一般的な知識に課せられる限定を伴わずに、このような発現系を作製する例を提供する。発現系は、スタチンまたはこの中間体を調製するのに特に適する。
【０２５１】
当業者は、ＤＥＲＡ酵素または酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素のいずれかを、単独でまたは組み合わせて、および場合により互いから独立して調製するまたは受け入れるためのすべての可能な細胞系を認識する。一般に、細胞系は原核または真核細胞系である。特定の実施形態では、酵素は合成的に調製することができる。酵素のいずれかを調製するまたは受け入れるための細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞であり得る。細菌または酵母細胞はより容易に培養され、増殖されるので、好ましくは、細胞は細菌または酵母であり、より好ましくは細菌である。細菌は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から成る属の群から、好ましくはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から、より好ましくはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）から選択され得、特にエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。酵母の場合、細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）から成る属の群から、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され得る。哺乳動物細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞または肝細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【０２５２】
本発明の別の実施形態は、化合物（Ｉ）の調製のための工程、特に工業的発酵工程であって、化合物（ＩＩ）を酸化することができる微生物の培養の段階を含み、前記微生物を化合物（ＩＩ）と接触させる工程である。
【０２５３】
本発明のさらに別の実施形態は、化合物（Ｉ）の調製のための工程、特に工業的発酵工程であって、化合物（ＩＩ）を酸化することができる微生物の培養の段階を含み、前記微生物を、特にＤＥＲＡの触媒作用によって、（ＩＩ）の酵素的生成の能力を有する別の微生物と接触させ、化合物（ＩＩ）の生成を可能にする基質を反応混合物に提供する工程である。
【０２５４】
本発明の好ましい実施形態は、化合物（Ｉ）の調製のための工程、特に工業的発酵工程であって、化合物（ＩＩ）の生成ならびに酸化／脱水素の両方の能力を有する微生物の培養の段階を含み、化合物（ＩＩ）の生成を可能にする基質を反応混合物に提供する工程である。
【０２５５】
特定の実施形態では、本発明による工程は以下の段階を含む：
段階ａ１）既に公知ではないかまたは提供されていない場合、本明細書の別の部分で開示されるように、この段階は、化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素の能力を有する微生物の同定および／または本明細書で述べるように化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素の能力を得るための微生物の遺伝的に改変された株の生成を含む。特に糖１−デヒドロゲナーゼ活性を有する生物が好ましい。
【０２５６】
段階ａ２）既に公知ではないかまたは提供されていない場合、本明細書の別の部分で開示されるように、この段階は、化合物（ＩＩ）の生成の能力を有する微生物の同定および／または本明細書で述べるようにもしくは当分野で公知のように化合物（ＩＩ）の生成の能力を得るための微生物の遺伝的に改変された株の生成を含む。特にアルドラーゼ触媒活性を有する生物が好ましい。
【０２５７】
段階ａ１）および段階ａ２）で述べた両方の特性を得るために微生物が同定されるおよび／または遺伝的に改変されることが特に好ましい。この意味で本発明は、具体的には微生物の遺伝的に改変された株に関し、株の遺伝物質はアルドール縮合を触媒して化合物（ＩＩ）を形成することができる酵素をコードする少なくとも１つの過剰発現される遺伝子、より具体的にはＤＥＲＡ酵素をコードする遺伝子を含む。
【０２５８】
段階ａ１）および段階ａ２）で述べた微生物を同定するおよび／または遺伝的に改変された微生物を生成する手順を本発明において詳細に例示するが、当業者は、前記微生物の同じ所望特性を導き得る選択的手順を直ちに見出す。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに記載されているクローニング方法が使用できる。酵素についての遺伝子を、例えば同じまたは異なるベクター上にクローニングし、細胞に形質転換することができる。選択的に、発現系は別々の細胞を含み、第一細胞はアルドラーゼ酵素についての遺伝子を過剰発現し、第二細胞は酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素についての遺伝子を過剰発現する。本明細書は例証的に、限定を伴わずおよび一般的な知識を考慮に入れずに、このような改変された微生物を作製する例を提供する。微生物は、スタチンまたはこの中間体を調製するのに特に適する。
【０２５９】
当業者は、ＤＥＲＡ酵素または酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素または、場合により、ＰＱＱ生合成遺伝子のいずれかを、単独でまたは組み合わせて、および場合により互いから独立して調製するまたは受け入れるためのすべての可能な細胞系を認識する。一般に、細胞系は原核または真核細胞系である。特定の実施形態では、酵素は合成的に調製することができる。酵素のいずれかを調製するまたは受け入れるための細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞であり得る。細菌または酵母細胞はより容易に培養され、増殖されるので、好ましくは、細胞は細菌または酵母であり、より好ましくは細菌である。
【０２６０】
細菌は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）およびデイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）から成る属の群より選択され得る。より詳細には、微生物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）から、最も好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）およびクルイベラ・インテルメディウム（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）から選択され得る。酵母の場合、細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）から成る属の群から、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）から選択され得る。
【０２６１】
段階ａ１）および段階ａ２）で述べた両方の特性を得るために微生物が同定されるおよび／または遺伝的に改変されることが特に好ましい。この意味で本発明は、具体的には微生物の遺伝的に改変された株に関し、株の遺伝物質はアルドール縮合を触媒して化合物（ＩＩ）を形成することができる酵素をコードする少なくとも１つの過剰発現される遺伝子、より具体的にはＤＥＲＡアルドラーゼ酵素をコードする遺伝子を含む。
【０２６２】
従って、本発明は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が宿主微生物として例示される、合成生物学的経路を構築する例示的な方法を提供し、この場合ＤＥＲＡ（デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ）、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼおよび、場合によりＰＱＱ生合成経路遺伝子が同時に発現される。宿主生物の呼吸鎖が提供されるので、前記合成生物学的経路は、化合物（Ｘ）およびアセトアルデヒドなどの簡単な分子から化合物（Ｉ）の生成を実施する能力を有する。
【０２６３】
本発明で述べる１つの態様は、段階ａ１）およびａ２）で述べた微生物を同時にまたは独立して培養することである。
【０２６４】
段階ｂ）種培地の調製
本明細書で述べる微生物の培養は、当業者に公知の方法によって実施することができる。様々な微生物の培養方法は、例えば「Ｄｉｆｃｏ  ＆  ＢＢＬ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ」（Ｚｉｍｂｒｏ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＩＳＢＮ  ０−９７２７２０７−１−５）ハンドブックに記載されている。好ましくは、（Ｉ）の生成のための主発酵工程で使用できる種微生物の生産は、前記微生物のコロニーから出発する。これに関して本出願による工程は、記述された微生物の保存株の調製を含む。この凍結ストックの調製は当分野で公知の方法を用いて、例えば液体増殖培地を使用して実施し得る。好ましくは、微生物のこの凍結保存株を使用して栄養培地に接種することにより、栄養種培地を作製する。
【０２６５】
種培地は無菌的にバイオリアクターに移し得る。原則として種微生物の培養は主発酵工程（段階ｃ）で述べる。）におけるような条件（例えばｐＨおよび温度）下で実施することができる。
【０２６６】
段階ｃ）主発酵工程
好ましくは、本出願で述べる微生物を使用した主発酵工程は、バイオリアクターにおいて特に撹拌および／または通気下で実施される。好ましくは、本出願で述べる化合物（Ｉ）の生成のための工程に使用される微生物の培養は、同化炭素、窒素、リン酸塩および無機物の供給源を含む、水性栄養培地（生産培地）での液中好気条件下で実施される。適切な酵素活性を得るために付加的な化合物を培養工程の間または培養工程後に生産培地に添加してもよい。これらには、発現誘導物質、補因子の供給源および／または遺伝要素の維持を可能にする化合物（抗生物質など）が含まれ得る。
【０２６７】
好ましくは、主発酵工程は、特に反応器に無菌的に移すことにより、段階ｂ）で得られた種微生物を生産培地に接種することを含む。接種には栄養型の微生物を用いることが好ましい。主発酵工程における栄養培地（生産培地）の反応器への添加は、１回以上のバッチ式でまたは連続的に実施することができる。栄養培地（生産培地）の添加は発酵工程の前および／または発酵工程の間に実施できる。
【０２６８】
栄養培地中の炭素の好ましい供給源は、以下に例示するようにデキストリン、グルコース、可溶性デンプン、グリセロール、乳酸、マルトース、フルクトース、糖蜜およびスクロースから選択することができる。
【０２６９】
栄養培地中の窒素の好ましい供給源は、アンモニア溶液、酵母抽出物、大豆ペプトン、  大豆ミール、細菌ペプトン、カゼイン加水分解物、Ｌ−リシン、硫酸アンモニウム、コーンスティープリカーその他である。
【０２７０】
無機塩、例えば炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛、鉄その他の塩も培地に添加し得る。
【０２７１】
発酵工程のためのさらなる公知の添加剤は、特に主発酵工程において添加し得る。培地の過剰な発泡を防ぐために消泡剤、例えばシリコーン油、脂肪油、植物油等を添加することができる。特にシリコーンに基づく消泡剤は、培地の過剰な発泡を防ぐために発酵工程の間に添加し得る。発現誘導物質、例えばイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、アラビノース、テトラサイクリン、インドールアクリレート等を培地に添加してもよい。加えて、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）、ＮＡＤ（Ｐ）、ＦＡＤなどの補因子を、関与する酵素の活性を改善するために添加してもよい。特定の態様では、ＩＰＴＧおよびＰＱＱを使用し得る。
【０２７２】
発酵工程は、生産培地を撹拌および通気しながら好気条件下で実施し得る。培養混合物の撹拌および通気は様々な方法で達成し得る。生産培地の撹拌は、プロペラまたは同様の機械装置によって提供され得、発酵の条件および規模によって様々な程度にわたり得る。通気速度は、バイオリアクターの作業体積に対して０．５から２．５ＶＶＭ（１分当たりの液体体積単位当たりのガス体積流量（体積／体積／分））の範囲内で変化させ得る。
【０２７３】
本発明の方法による主発酵工程は、約６．３から８．５の範囲内のｐＨおよび１８から３７℃の範囲内の温度で実施される。好ましくは、ｐＨは約６．５から８．３の範囲内であり、温度は約２１から３１℃の範囲内である。好ましくは、培養物を１６から約３００時間、より好ましくは約３０から７０時間インキュベートする。
【０２７４】
異なる微生物は異なる増殖条件を要求し得ることおよび特定の生物の増殖のための最適条件をどのようにして決定できるかが当分野で広く記述されていることは当業者に明らかである。また、異なる増殖条件が、提供される工程に関与する酵素の活性に大きな影響を及ぼし得ることも当業者に明らかである。本発明は、前記酵素の最大活性および反応速度を得るために増殖条件を最適化するのに使用できる方法の詳細な例を提供する。
【０２７５】
本発明の別の実施形態は、段階ａ）で述べた微生物を同時にまたは独立して培養することを包含する。同様に、化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）の調製のための反応を別々にまたは同時に、連続的にまたはワンポット法で実施することも可能である。
【０２７６】
具体的には、デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ酵素を、水溶液中（特に０．１ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌの濃度範囲で）、場合により塩（特に５０から５００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ）の存在下で、塩を前記濃度範囲に希釈または濃縮して、段階ｃ）の後に調製する。新鮮培地または生物の生存を可能にする培地の成分を添加した場合は、生存全細胞触媒が得られる。緩衝水溶液中または使用済み培地中で調製した場合は、休止全細胞触媒が得られる。水溶液は、ｐＨ４．０から１１、好ましくはｐＨ５．０から１０．０、より好ましくはｐＨ５．０から８．０に緩衝し得る。最も好ましくは溶液を約ｐＨ５．２から約ｐＨ７．５に緩衝する。適切な緩衝液は、酸、塩基、塩またはこれらの混合物、および第一級、第二級もしくは第三級アミノ基を有するものを除く当分野で公知の任意の他の緩衝系から調製できる。特に、リン酸緩衝液を１０から５００ｍＭの濃度で使用し得る。水溶液は、前記デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ酵素を水に添加し、無機または有機酸、塩基、塩またはこれらの混合物の自動添加を用いて反応の間ｐＨを維持することによって調製できる。
【０２７７】
段階ｄ）酵素反応
本発明を実施するための幾つかの選択肢を提供する。化合物（ＩＩ）および化合物（Ｉ）の調製のための反応を別々にまたは同時に、連続的にまたはワンポット法で実施することが可能である。１つの実施形態では、これらの変法は次のとおりである：
１．化合物（ＩＩ）を、化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素能力を有する微生物の培養物に添加する。
主発酵工程で化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素能力を有する微生物を培養する前段階の完了後、化合物（ＩＩ）を前記微生物と接触させる。前記微生物がすべての必要な補因子を内因性に含んでもよくまたは外部からのＰＱＱ添加を用いてもよい。ＰＱＱは約０．１ｎＭから約５ｍＭの濃度で添加し得る。特に約１ｎＭから約１００μＭのＰＱＱが提供され得る。より好ましくは、ＰＱＱは１００ｎＭから約１０μＭの濃度で提供される。最も好ましくは、ＰＱＱは、前記触媒の最大活性を可能にする最少量で提供される。実際には、これはＰＱＱの２５０ｎＭから５μＭの最終濃度の範囲内である。外部から提供されたＰＱＱによる、酸化／脱水素能力を有する酵素の再構成を促進するため、マグネシウムまたはカルシウムイオンを添加してもよい。好ましくは、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２を約０．１ｍＭから約５０ｍＭ、特に約１ｍＭから約２０ｍＭの濃度で、最も好ましくは約２ｍＭから約２０ｍＭの濃度で添加する。場合により人工電子受容体を、本発明で述べるように等モル濃度で化合物（ＩＩ）に添加する。好ましくは、この工程は、脱水素／酸化反応の間に形成された電子を自らの内因性呼吸鎖に受け取る微生物の能力を利用することによって実施される。化合物（ＩＩ）は、アルドラーゼが触媒するアルドール縮合条件下でＤＥＲＡアルドラーゼを含む前反応の混合物からまたは他の供給源（有機合成）から得られる部分的または完全に単離された化合物（ＩＩ）として提供され得る。化合物（ＩＩ）は、本発明で述べる任意の手段および速度によって約２０ｍＭから約１Ｍ、好ましくは約５０ｍＭから約７００ｍＭの濃度で添加され得、最も好ましい濃度は１００ｍＭから５００ｍＭである。化合物（ＩＩ）の脱水素／酸化の工程の間に、微生物の生存能を支持するために付加的な栄養素を段階ｃ）で述べたのと同様の方法で添加してもよい。実際には、場合により窒素源とは独立してまたは窒素源に加えて、本発明で述べるように前記反応混合物に付加的な炭素源を提供することが有益であり得る。この特定の態様において化合物（ＩＩ）の脱水素／酸化を可能にする一般的な反応条件は、本発明によって提供される「アルドース脱水素／酸化条件」と定義される。
【０２７８】
化合物（ＩＩ）を得るためのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼについての基質としての化合物（ＩＩ）は、１以上のバッチで反応混合物に添加し得る。１つの態様では、混合物に添加する基質の総量は、添加する化合物（ＩＩ）の総量が反応混合物１リットルにつき約２０ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約１．５ｍｏｌ、より詳細には反応混合物１リットルにつき約１００ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約７００ｍｍｏｌとなる量である。好ましい実施形態では、基質は、反応の任意の特定時点でプログラム可能なポンプを用いて特定の流量で反応混合物に連続的に添加する。最適には、流量は、基質が反応混合物中に蓄積していかない最大流量として決定される。特に、これは望ましくない生成物の濃度を最小にする。別の実施形態では、正しい添加方法を用いて基質の阻害作用をさらに最小限に抑えることができる。
【０２７９】
２．ＤＥＲＡアルドラーゼおよび酸化／脱水素酵素を用いた逐次反応
本発明のこの態様はｄ１）で述べた変異体を提供するが、この場合化合物（ＩＩ）は、当分野で公知の方法によりＤＥＲＡアルドラーゼを化合物（Ｘ）およびアセトアルデヒドと反応させることによって得られる反応混合物の形態で、直接インサイチューで提供される。好ましくは、このアプローチは、ワンポット反応を実施することの利点を利用し、従って組み合わせた工程の簡単さに有意の影響を及ぼす。「アルドラーゼが触媒するアルドール縮合条件」に従って前段階でＤＥＲＡアルドラーゼを含む全細胞触媒を使用することは好都合である。
【０２８０】
３．２つの別々の触媒中でＤＥＲＡアルドラーゼおよび酸化／脱水素酵素を使用する同時反応
両方の触媒を発酵工程によって同時にまたは独立して得（段階ｃ）で述べたように）、次に触媒を、好ましくは触媒を得るために使用した同じ発酵槽に連結されたまたは発酵槽中に残された、適切な容器または反応器に移す。この工程の別であるが類似の態様では、両方の酵素活性が、好ましくは段階ｃ）で述べたように得られる単一微生物中に存在する。特定の実施形態では、ＤＥＲＡアルドラーゼおよび酸化／脱水素能力を有する酵素を使用すること、従って化合物（Ｉ）を提供することを含む同時工程。より好ましくは、化合物（ＩＩ）を得るためのＤＥＲＡアルドラーゼについての基質としてのアセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）を、反応混合物に連続的に添加してもよく、またはアセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）を１以上のバッチで反応混合物に添加する。１つの態様では、混合物に添加する基質の総量は、添加するアセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）の総量が反応混合物１リットルにつき約２０ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約１．５ｍｏｌ、より詳細には反応混合物１リットルにつき約１００ｍｍｏｌから反応混合物１リットルにつき約７００ｍｍｏｌとなる量である。アセトアルデヒドは幾つかの手段によって添加し得る。１つの態様では、アセトアルデヒドを１以上のバッチでまたは連続的に反応混合物に添加する。アセトアルデヒドをアセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）と予混合して、反応混合物に添加してもよい。反応混合物に添加するアセトアルデヒドの総量は、受容体基質、アセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）の総量に対して約０．１から約４モル当量、特に約１から約３モル当量、より好ましくは約２から約２．５モル当量である。特に、これは望ましくない生成物の濃度を最小にする。場合によりＰＱＱを約０．０５μＭから約１０ｍＭ、より好ましくは０．１μＭから約１００μＭの濃度で反応混合物に添加する。外部から提供されたＰＱＱによる、酸化／脱水素能力を有する酵素の再構成を促進するため、マグネシウムまたはカルシウムイオンを添加してもよい。好ましくは、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２を約０．１ｍＭから約５０ｍＭ、特に約１ｍＭから約２０ｍＭの濃度で、最も好ましくは約２ｍＭから約２０ｍＭの濃度で添加する。好ましい実施形態では、基質は、反応の任意の特定時点でプログラム可能なポンプを用いて特定の流量で反応混合物に連続的に添加する。流量は、基質が反応混合物中に蓄積していかない最大流量として決定される。特に、これは望ましくない生成物の濃度を最小にする。別の実施形態では、正しい添加方法を用いて基質の阻害作用をさらに最小限に抑えることができる。１つの態様では、デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ触媒反応に使用する温度は約１０℃から約７０℃である。１つの実施形態では、デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ反応に使用する温度は約２０℃から約５０℃である。１つの実施形態では、デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ反応に使用する温度は約２５℃から約４０℃である。反応は数時間以内に完了まで進行するので、この反応は工業的に適切である。
【０２８１】
本明細書で使用される「アルドース脱水素／酸化条件」という用語は、本明細書で述べるような、任意のデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ酵素によって触媒され得る、当分野で公知の任意の脱水素／酸化条件を指す。特にデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ条件は、所望生成物の形成および蓄積を可能にする条件である。これらの条件は、１つの態様では、デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼが、脱水素／酸化を実施することができる十分な充填量で提供される活性な酵素であることを包含する。別の態様では、基質としての化合物（ＩＩ）が、アルドラーゼの活性の最小阻害を示す量で反応混合物中に存在することである。好ましくは、温度、ｐＨ、溶媒組成物、撹拌および反応の長さが所望生成物の蓄積を可能にする、従って化合物（ＩＩ）から対応する化合物（Ｉ）を形成することを可能にすることであり、別の態様では、前記条件が安定性に有害な作用を及ぼさないことである。具体的には、これらの条件は実施例で開示する値によって定義される。本明細書における使用のためのデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼは、化合物（ＩＩ）に対してデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ活性を有する任意の酵素であり得る。好ましい実施形態では、デヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ酵素には、ＧＤＨ  ０１、ＧＤＨ  ０２、ＧＤＨ  ０３、ＧＤＨ  ０４、ＧＤＨ  ０５、ＧＤＨ  ０６、ＧＤＨ  ０７、ＧＤＨ  ０８、ＧＤＨ  ０９、ＧＤＨ  １０、ＧＤＨ  １１、ＧＤＨ  １２、ＧＤＨ  １３、ＧＤＨ  １４、ＧＤＨ  １５、ＧＤＨ  １６、ＧＤＨ  １７、ＧＤＨ  １８、ＧＤＨ  １９、ＧＤＨ  ２０、ＧＤＨ  ２１、ＧＤＨ  ２２、ＧＤＨ  ２３、ＧＤＨ  ２４およびＧＤＨ  ２５が含まれるが、これらに限定されず、各々の酵素は、上記配列表に示す対応するヌクレオチド配列またはそれぞれのコドン最適化ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列によって同定される。本明細書で述べるデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ触媒は、本発明で提供される任意の生物学的に活性な形態で使用することができる。一般に、化合物（ＩＩ）を得ることができる触媒は適切な容器または反応器中で提供され、化合物（ＩＩ）はバッチ式でもしくは連続的に添加されるかまたは、少なくとも一部は、好ましくは「アルドラーゼが触媒するアルドール縮合条件」下に同じ容器中で、化合物（ＩＩ）の同時生成によって提供される。
【０２８２】
本明細書で使用される「アルドラーゼが触媒するアルドール縮合条件」という用語は、例えばＷＯ２００８／１１９８１０Ａ２に記載されているように、任意のアルドラーゼによって触媒され得る当分野で公知の任意のアルドール縮合条件を指す。特にアルドラーゼが触媒するアルドール縮合条件は、所望生成物の形成および蓄積を可能にする条件、より好ましくは基質としての置換されたアセトアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ、より詳細にはアセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）およびアセトアルデヒドが、アルドラーゼの活性の最小阻害を示す量で反応混合物中に存在する条件であり、別の態様では、温度、ｐＨ、溶媒組成物、撹拌および反応の長さが所望生成物の蓄積を可能にする、従って対応するラクトール（化合物（ＩＩ））を形成することを可能にする条件である。本明細書で述べるＤＥＲＡアルドラーゼは、前記発明において提供される任意の生物学的に活性な形態で使用することができる。ＤＥＲＡアルドラーゼについての基質、式（Ｘ）の化合物は、対応する化合物（ＩＩ）に応じて選択される。マスクされたアルデヒド基を有するこれらの生成物は、スタチン、特にアルデヒド基を有する生成物を生じる基質の調製においてさらなる段階を可能にする、ＷＯ２００８／１１９８１０Ａ２およびＷＯ２００９／０９２７０２Ａ２における重要な中間体である。化合物（Ｘ）は、特にアセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）であり得る。
【０２８３】
選択的段階ｅ）：化合物（Ｉ）の分離および／または精製
前記培地から主発酵工程で生成された化合物（Ｉ）の単離および／または精製をさらなる分離段階で実施し得る。
【０２８４】
単離の第一段階では、反応混合物中に存在する全細胞触媒を任意の公知の種類のろ過／凝集／沈降／遠心分離手順によって除去し得るか、または全細胞を含有する反応混合物に関してさらなる単離段階を実施する。好ましくは、反応混合物から固体粒子を分離する段階を省き、以下でさらに述べるように反応の完了直後に直接抽出段階を実施することが本発明の目的である。
【０２８５】
本発明の１つの実施形態では、化合物（Ｉ）の単離は、有意のレベルで化合物（Ｉ）に結合することができる吸着剤への吸着、および溶出条件後に、例えば培地をより非極性の化合物に置き換えた後に化合物（Ｉ）を放出することによって実施し得る。吸着剤は、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＸＡＤ（商標）吸着樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＦＰイオン交換樹脂等から選択され得るが、これらに限定されない。
【０２８６】
または、アセトニトリルまたはメタノールなどの水混和性溶媒を使用して、いわゆる「塩析」抽出手順において混合物に高濃度の塩、場合により塩化ナトリウムを添加して液−液抽出を実施し得る。この工程では相の分離が認められ、化合物（Ｉ）は溶媒リッチ相に選択的に分配される。
【０２８７】
好ましい実施形態では、液／液抽出のための抽出溶媒は、多くの水不混和性または難混和性溶媒から選択される。溶媒は、塩化メチレン、ジエチルエーテル、酢酸プロピオニル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ニトロメタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ベンゼン、トルエン、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、石油エーテル、トリエチルアミンから選択され得るが、これらに限定されない。選択された有機溶媒での液／液抽出の前に、生成物の水溶液のｐＨを１から９の間、好ましくは２から８の間、より好ましくは２から５の間の値に調整し得る。加えて、好ましい実施形態では、水相のイオン強度を液／液抽出の前に無機／有機酸、塩または塩基のいずれかの添加によって増大させる。このような酸、塩または塩基の非限定的な例は、リン酸およびこの塩、硫酸およびこの塩、クエン酸およびこの塩、塩酸およびこの塩等である。水相のイオン強度の増大は、水相と有機相との間の化合物（ＩＩ）の分配係数を上昇させ、従って抽出工程の有効性を高める。
【０２８８】
抽出完了後の有機相中の残留水分の乾燥は、列挙される塩：硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム（一水和物）、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸銅を添加することによって実施され得るが、これに限定されない。
【０２８９】
精製工程の最も好ましい実施形態では、反応混合物のｐＨを最初に約１から９、好ましくは約２から８の間、より好ましくは約３から６の値に修正する。最も好ましくは、リン酸、硫酸または塩酸等のような酸化合物を使用してｐＨを約５に修正する。硫酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム等を５０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、最も好ましくは１００ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌの濃度で添加する。酢酸エチルを、１容の反応混合物への少なくとも１容の酢酸エチルの添加によって少なくとも１回、好ましくは１容の反応混合物への１容の酢酸エチルの添加によって少なくとも３回、添加する。最も好ましくは、酢酸エチルを添加し、抽出物を分離する段階を、５％以下の化合物（Ｉ）が水相に存在するまで実施する。酢酸エチル画分を収集し、当分野で公知の乾燥塩のいずれか、好ましくはＣａＣｌ２もしくはＭｇＳＯ４または当分野で公知の水除去の他の方法で乾燥させる。１つの態様では、得られた酢酸エチル抽出物を蒸発させて、室温で黄色からコハク色の形態の単離された化合物（Ｉ）を生成することができるかまたは医薬的に有用な化合物、好ましくはスタチンを生成するためにさらなる段階に進むことができる。
【０２９０】
選択的段階ｆ）：さらなる処理
式（Ｉ）の化合物を得た後、式（Ｉ）の化合物をＡＰＩ、好ましくはスタチンを調製するのに十分な条件に供することにより、式（Ｉ）の化合物をＡＰＩ、好ましくはスタチンまたは医薬的として許容されるこの塩にさらに変換することができる。従って、１つの実施形態では、スタチンまたはこの塩、エステルもしくは立体異性体は、（ｉ）上記で定義した式（ＩＩ）の化合物を酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素と接触させて、上記で定義した式（Ｉ）の化合物を調製すること、（ｉｉ）前記化合物（Ｉ）を、スタチンを調製するのに十分な条件に供すること、および（ｉｉｉ）場合により生成物を塩化する、エステル化するまたは立体選択的に分解することによって調製される。再び、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）酵素を使用することによって式（ＩＩ）の化合物を調製することができる。反応の設定は、両方の酵素を実質的に同時にまたは続いて、一度にまたは連続的に、１バッチでまたは断続的なバッチで導入するように設計することができる。好ましくは、式（ＩＩ）および（Ｉ）の化合物は、少なくとも部分的に同時に、より好ましくは実質的に同時に調製される。式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の化合物を調製するために酵素を使用することは好都合であり、というのは、酵素の場合は、生成物が直ちに置換基の正しい空間的配向を含み、さらなる精製または分離を必要としないからである。他の立体異性体が必要である場合は、工程を当業者に公知の立体特異的化学の方法と組み合わせることができる。好ましい実施形態では、調製されるスタチンは、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチンまたはダルバスタチンであり、より好ましくはアトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチン、特にロスバスタチンである。
【０２９１】
本明細書で使用される「ＡＰＩ、好ましくはスタチンを生成するのに十分な条件」という用語は、式（Ｉ）の化合物をさらにＡＰＩ、好ましくはスタチンに変換するための本明細書で述べる手段を含む、当分野で記述されている手段を指す。特定の実施形態では、スタチンを調製する場合、当業者は、適切なＲ１およびＲ２、またはＲを選択することによって化学的経路を選択する。Ｒ１、Ｒ２およびＲがスタチン骨格を示すように選択される場合、式（Ｉ）の化合物は既にスタチン分子であるかまたはこれの「進んだ」中間体である。これにもかかわらず、例えばラクトン環を開くこと、塩もしくはエステルを形成することまたは立体異性体の混合物から所望の立体異性体を分割することなどによってスタチンを改変することも可能である。選択的に、スタチンを、最初にラクトンを提供し、次にこれをスタチン骨格に結合することによって調製しようとする場合、反応スキーム２に従うことができる。式（Ｉ）の化合物を得た後、これの４位のヒドロキシル基を保護基Ｐ（式（ＸＩ））で保護することができ、保護基Ｐは任意の慣例的に使用される保護基であり得、特にシリル保護基である。その後、化合物をアルデヒドまたはこれの水和物（それぞれ式（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ））の形態にすることができる。
【０２９２】
【化１４】
2014501524.tif 000015
Ｉから得た式（ＸＩＩ）の化合物またはこの水和物（ＸＩＩＩ）をさらに使用して、式（ＸＩＩ）の化合物またはこの水和物（ＸＩＩＩ）をウィッティヒカップリングの条件下で複素環式または脂環式誘導体（スタチン骨格）と反応させ、次いで必要な場合は水素化することによってスタチンを調製することができる。ロスバスタチンを調製することに関連する特定の実施形態では、その後の反応段階で、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（Ｐ−オキシ）−６−オキソ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボアルデヒド（ＸＩＩ）をウィッティヒカップリングの条件下で（塩基の存在下に）（（４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチルメチルスルホンアミド）ピリミジン−５−イル）メチル）トリフェニル−ホスホニウムハライドもしくは任意の他の（（４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチルメチルスルホンアミド）ピリミジン−５−イル）メチル）ホスホニウム塩またはジ−ｉ−プロピル（｛４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］−５−ピリミジニル｝メチルホスホナートもしくは任意の他の（｛４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］−５−ピリミジニル｝メチルホスホナートエステルと反応させて、Ｎ−（５−（（Ｅ）−２−（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（Ｐ−オキシ）−６−オキソ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ビニル）−４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピルピリミジン−２−イル）−Ｎ−メチルメタンスルホンアミドを得ることができる。塩基として、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＬｉＨＭＤＳ）、カリウムヘキサメチルジシラザン（ＫＨＭＤＳ）、ナトリウムヘキサメチルジシラザン（ＮａＨＭＤＳ）、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、水素化ナトリウム、ブチルリチウムまたはグリニャール試薬、好ましくはナトリウムヘキサメチルジシラザンを使用し得る。供給源が水和物形態ＸＩＩＩであるかまたはＸＩＩとこの水和物形態ＸＩＩＩとの混合物である場合、これは、ＴＨＦ、Ｅｔ２Ｏ、ｉ−Ｐｒ２Ｏ、ｔＢｕＭｅＯから選択されるエーテル；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ヘプタンから選択される炭化水素；トルエンもしくはこの塩素化誘導体から選択される芳香族炭化水素；クロロホルムおよびジクロロメタンから選択される塩素化炭化水素、またはこれらの溶媒の混合物に溶解するので、形成されるイリド溶液への添加の前に水和物から放出される水を除去すべきである。反応のための好ましい溶媒は、無水トルエンおよびジクロロメタンである。反応は、−８０℃から９０℃、好ましくは０℃から９０℃、より好ましくは８０℃から９０℃の温度で実施できる。反応は１から１２時間で完了する。抽出による粗生成物の単離は、ＡｃＯＥｔ、エーテルまたはアルカン、好ましくはｔＢｕＭｅＯで実施できる。保護基は除去してもよく、ラクトンを開環してロスバスタチン遊離酸またはこの塩、場合によりアミンを生成し、これをヘミカルシウム塩に変換してもよい。脱保護は、０℃から８０℃の温度、好ましくは２０または４０℃で、適切な溶媒中、好ましくはアルコール、酢酸、ＴＨＦ、アセトニトリル、メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ＣＨ２Ｃｌ２から選択される溶媒中、より好ましくはアルコールおよびＴＨＦ／ＡｃＯＨの混合物中で実施することができる。通常の脱保護試薬、例えばテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、アンモニウムフルオリド、ＡｃＣｌ、ＦｅＣｌ３、ＴＭＳＣｌ／ＨＦ・２Ｈ２Ｏ、クロロエチルクロロホルマート（ＣＥＣ）、Ｐｈ３ＰＣＨ２ＣＯＭｅＢｒを使用し得る。ラクトンの開環は、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏの４：１から２：１混合物中ならびに純粋なＴＨＦ中、２０℃から６０℃の温度で、適切なアルカリ、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、アンモニアまたはアミンを用いて起こる。加水分解は３０分（６０℃）から２時間（２０℃）で達成される。加水分解段階後、ＴＨＦの蒸発を減圧下に１０℃から５０℃の温度で実施することができ、好ましくはＣａ（ＯＡｃ）２．×Ｈ２Ｏの添加（一度にまたは５から６０分間滴下して添加することができる。）による、カルシウム塩への変換は、０℃から４０℃の温度で実施できる。Ｃａ（ＯＡｃ）２．×Ｈ２Ｏの添加後、生じた懸濁液を０℃から４０℃の温度で３０分から２時間撹拌することができる。このような反応の詳細は、ＷＯ２００８／１１９８１０を含むがこれに限定されない、当分野において公知である。
【０２９３】
前記実施形態のいずれかによって得られるＡＰＩ、好ましくはスタチンは、医薬製剤に製剤化することができる。ＡＰＩ、好ましくはスタチンで医薬製剤を調製するための方法は当業者に公知である。一般に、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル、坐剤、溶液、軟膏、懸濁液、泡、パッチ、輸液、注射用溶液等のような製剤を調製することから選択できる。製剤は、例えば放出、安定性、効果または安定性のようなＡＰＩの特定の態様を改変するために変化させることができる。ＡＰＩに依存して、当業者は前記ＡＰＩのための適切な投与経路をどのようにして選択するかを理解する。これに基づき、当業者は適切な製剤を選択することができる。次に、当業者は、医薬製剤を製剤化するために必要な賦形剤を選択することができる。ＡＰＩ（場合により少なくとも１つの別のＡＰＩと組み合わせることができる。）に加えて、当業者は、医薬製剤を製剤化するための賦形剤および添加剤を選択することができる。適切な賦形剤は、例えば結合剤、希釈剤、潤滑剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、溶媒、ｐＨ調整剤、イオン強度調整剤、界面活性剤、緩衝剤、抗酸化剤、着色剤、安定剤、可塑剤、乳化剤、防腐剤、粘度調整剤、緩和剤、着香剤であり得るが、これらに限定されず、これらは単独でまたは組み合わせて使用することができる。方法は、選択される製剤に依存して、混合、粉砕、湿式造粒、乾式造粒、成形、溶解、凍結乾燥、カプセルへの充填を含み得るが、これらに限定されない。
【０２９４】
ＡＰＩおよびこの中間体への適用
本発明のさらなる態様では、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素は、一般に、本明細書で開示される酵素系と適合性であるＡＰＩまたはこの中間体を調製するために使用することができる。
【０２９５】
本発明のこの態様は、好ましくは、可能な基質としての置換または非置換ジデオキシアルドース糖、ラクトール（場合により複数のヒドロキシル基を含む。）および合成非天然アルコール、ならびに可能な生成物としての（場合によりさらにヒドロキシル化された）ラクトンまたはエステルとしてそれぞれ分類可能な合成ＡＰＩまたはこの中間体に関する。本発明の開示およびこの技術的特徴から、天然に生じるまたは糖の生化学的経路（例えば解糖、ペントースリン酸経路、グリコーゲン新生）、脂肪酸もしくは細胞呼吸鎖の生化学的経路において生じる化合物は、本発明による酸化もしくは脱水素反応を触媒することができる酵素またはＡＰＩもしくはこの中間体についての基質とみなされることから免除されることが理解される。同じように、天然のアミノ酸、ビタミンまたは補因子も、本発明によるＡＰＩまたはこの中間体の定義から免除される。自然界におけるこのような経路の基質または生成物には、メタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、メタン酸、酢酸、単糖、二糖、三糖、グルクロン酸、特にメタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、メタン酸、酢酸、単糖、グルクロン酸、中でもエタノール、酢酸および単糖が含まれる。好ましい実施形態では、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素は、式（Ｉ）の化合物を調製するために使用され、式（Ｉ）は上記で定義されたとおりである。この態様では、式（ＩＩ）の化合物に作用する酵素を使用することが最も効率的であり、式（ＩＩ）は上記で定義されたとおりである。使用の特定の選択肢は、上記で開示された本発明の他の実施形態、態様または好ましい特徴を考慮した場合、当業者に直ちに明らかである。
【０２９６】
説明に役立つさらなる例を提供するため、適切なＡＰＩまたはこの中間体の調製のために有用な基質、従って出発化合物の可能で有用なさらなる定義を以下の式ＸＩＶによって与え、ゆえに式ＸＶによって定義される対応する生成物化合物をもたらす：
【０２９７】
【化１５】
2014501524.tif 000016
［式中、Ｑは、例えば上記で定義されたＲ１、Ｒ２およびＲ５の群から選択される、任意の所望構造部分であり、場合によりＲ１、Ｒ２またはＲ５とラクトール／ラクトン環との間に中間リンカー分子を有する。］。構造式に示すように、酸化されていない非ラクトールヒドロキシル基は、ラクトール／ラクトン環の任意の位置に存在し得る。
【０２９８】
好ましい実施形態では、酸化または脱水素反応を触媒することができる酵素は、ＤＥＲＡ酵素と同時にまたはこれに続いてＡＰＩまたはこの中間体を調製するために使用される。
【実施例】
【０２９９】
以下の実施例は単に本発明の説明に役立つ例にすぎず、これらの実施例およびこれらの他の等価物が本開示および付属の特許請求の範囲を考慮して当業者に明らかになるので、これらはいかなる意味においても本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
【０３００】
［実施例１］
全細胞中に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼの調製
幾つかのアルドースデヒドロゲナーゼを以下の実施例で述べるように調製した：
最初に、ｇｃｄ遺伝子（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．ＪＷ０１２０、遺伝子座タグｂ０１２４）によってコードされる、膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、ピロロキノンキノン（ＰＱＱ）依存性デヒドロゲナーゼを調製した。
【０３０１】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αからのゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して単離した。ゲノムＤＮＡの単離は、ＬＢ培地にて３７℃で増殖させたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養物を使用して行った。遺伝子ｇｃｄの増幅を、オリゴヌクレオチドプライマーＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＧおよびＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＧを使用してＰＣＲによって実施した。増幅は、Ｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって以下のように実施した：９４℃、１０分間の初期変性、次いで９４℃、４５秒、５２℃、４５秒および６８℃、１５０秒の３０サイクル。最終伸長は６８℃で４２０秒間実施した。ｇｃｄを含む２．４ｋｂのＤＮＡフラグメント（配列番号：０３）をアガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。生成物をＴ４リガーゼ反応においてプラスミドｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に連結した。プラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢｌｐＩで切断し、生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離して、ｇｃｄを含む２．４ｋｂフラグメントを精製した。発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、精製した。ｇｃｄ遺伝子を含む２．４ｋｂフラグメントを、Ｔ４リガーゼ反応において切断した発現ベクターと連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／Ｇｃｄと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。細胞膜への組み込みのために必要なシグナルを含む配列（配列番号：０４）を有するタンパク質の発現を可能にするため、クローニング手順を実施した。膜結合型グルコースデヒドロゲナーゼを発現する生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３０２】
第二に、遺伝子ｙｌｉＩ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．ＥＣＫ０８２７、遺伝子座タグｂ０８３７）によってコードされる、水溶性アルドースデヒドロゲナーゼ、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性デヒドロゲナーゼを調製した。
【０３０３】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αからのゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して単離した。ゲノムＤＮＡの単離は、ＬＢ培地にて３７℃で増殖させたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養物を使用して行った。遺伝子ｙｌｉＩの増幅を、オリゴヌクレオチドプライマーＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴＴおよびＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧを使用してＰＣＲによって実施した。増幅は、Ｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって以下のように実施した：９４℃、１０分間の初期変性、次いで９４℃、４５秒、５２℃、４５秒および６８℃、１５０秒の３０サイクル。最終伸長は６８℃で４２０秒間実施した。ｙｌｉＩを含む１．２ｋｂのＤＮＡフラグメント（配列番号：０１）をアガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。生成物をＴ４リガーゼ反応においてプラスミドｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に連結した。プラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断し、生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離して、ｙｌｉＩを含む１．２ｋｂフラグメントを精製した。発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、精製した。ｙｌｉＩ遺伝子を含む１．２ｋｂフラグメントを、Ｔ４リガーゼ反応において切断した発現ベクターと連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／ＹｌｉＩと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。ペリプラズムへのＹｌｉＩ転移のためのリーダー配列を含む配列（配列番号：０２）を有するタンパク質の発現を可能にするため、クローニング手順を実施した。アルドースデヒドロゲナーゼを発現する生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３０４】
アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）において認められる、別の水溶性アルドースデヒドロゲナーゼを選択的な酸化試験のために使用した。遺伝子およびペリプラズムへの転移のためのリーダー配列をコードするヌクレオチド配列（ＰＱＱ  ＧｄｈＢ、Ａ．カルコアセチカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ１５８７１）をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化し、ＤＮＡを化学合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（配列番号：０５）。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を、ヌクレオチド配列ｇｄｈＢを担持する人工プラスミドで形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離し、構築物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して、生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、１．５ｋｂフラグメントを精製した（配列番号：０５）。発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、精製した。ｇｄｈＢ遺伝子を含む１．５ｋｂフラグメントを、Ｔ４リガーゼ反応において切断した発現ベクターに連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／ＧｄｈＢと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。配列番号：０６の配列を有するタンパク質の発現を可能にする標的に関してクローニング手順を実施した。Ａ．カルコアセチカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）からのアルドースデヒドロゲナーゼを発現する生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３０５】
変化した配列を有する、従って熱安定性特性が増大している、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（ＰＱＱ  ＧｄｈＢ、Ａ．カルコアセチカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ１５８７１）において認められるさらに別の水溶性アルドースデヒドロゲナーゼを使用した［Ｉｇａｒａｓｈｉ，２００３］。遺伝子およびペリプラズムへの輸送のためのリーダー配列をコードするヌクレオチド配列（ＰＱＱ  ＧｄｈＢ、Ａ．カルコアセチカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ１５８７１）をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化し、ＤＮＡを化学合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（配列番号：０７）。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を、ヌクレオチド配列ｇｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍを担持する人工プラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離し、構築物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して、生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、１．５ｋｂフラグメントを精製した（配列番号：０７）。発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、精製した。ｇｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍ遺伝子を含む１．５ｋｂフラグメントを、Ｔ４リガーゼ反応において切断した発現ベクターに連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を、得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。選択的なアルドースデヒドロゲナーゼ発現生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製した。配列番号：０８の配列を有するタンパク質の発現を可能にする標的に関してクローニング手順を実施した。配列番号：０６と比較した配列番号：０８は、２３１位のＳｅｒ残基をコードする配列がＬｙｓ残基に変化した配列を有する。
【０３０６】
明記される場合は、発現プラスミドベクターｐＥＴ３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を陰性対照として使用した。対照細胞は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。
【０３０７】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において様々な酵素を発現する手順を、手順１Ａで述べるように実施した。発現後、細胞を採取し、手順１Ｂで述べるように全細胞触媒を得た。休止全細胞触媒を得るため、手順１Ｃを実施した。
【０３０８】
手順１Ａ：
カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を添加したＶＤ培地（３０ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整した。）に、新たに画線培養したＶＤ寒天プレートからの単一コロニー、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ（３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ（３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩまたはＢＬ２１  ＤＥ（３）ｐＥＴ３０／ＧｄｈＢまたはＢＬ２１  ＤＥ（３）ｐＥＴ３０／ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍを接種し、対数増殖期後期まで前培養した（３７℃、２５０ｒｐｍ、８時間）。前培養細胞（接種物サイズ１０％、ｖ／ｖ）を、次に、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を添加した新鮮ＶＤ培地（１００ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整した。）に移した。タンパク質発現の誘導のため、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙにより購入）を添加した。細胞を回転振とう機において２５℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。
【０３０９】
手順１Ｂ：
発現後（手順１Ａで述べたように）、細胞を遠心分離（１００００ｇ、５分間、４℃）によって採取した。遠心分離後に上清を廃棄し、ペレットを新鮮ＶＤ培地（１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝６．０に調整した。）に再懸濁した。細胞を初期培養容量の１０分の１で再懸濁した。
【０３１０】
手順１Ｃ：
上清を廃棄した後（手順１Ａに関して）、ペレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に再懸濁した。細胞を初期培養容量の１０分の１で再懸濁した。
【０３１１】
［実施例２］
無細胞溶解物に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼの調製
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｄｈＢ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｃｄまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍの発現後に（実施例１で述べたように、より詳細には手順１Ａを実施した後に）無細胞溶解物を得るため、細胞を遠心分離（１００００ｇ、５分間、４℃）によって採取した。遠心分離後に上清を廃棄し、ペレットを初期容量の１０分の１でリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。細胞に１ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を添加した。３７℃で１時間溶解を実施した。溶解後、細胞デブリを沈降（１０分間、２００００ｇ、４℃）によって除去し、透明な水溶液を得た。このようにして無細胞抽出物に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼを得た。
【０３１２】
または、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ）１Ｌにつきペレット２００ｇを使用して、ペレットを前記緩衝液に再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎデジタルソニファイアーを用いて細胞を超音波処理し（３×１５秒）、細胞デブリを沈降（１０分間、２００００ｇ、４℃）によって除去して、透明な水溶液を得た。このようにして無細胞抽出物に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼを得た。
【０３１３】
上記と同じ方法で、無細胞溶解物を全細胞クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）およびグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）から調製した（全細胞触媒の培養および調製は、それぞれ実施例９および実施例１０で述べる。）。
【０３１４】
陰性対照として使用した、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０の培養物を同じ手順によって処理した。
【０３１５】
［実施例３］
アルドースデヒドロゲナーゼを含むペリプラズム細胞画分の調製
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｇｃｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｄｈＢまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍの発現後に（実施例１で述べたように、より詳細には手順１Ａを実施した後に）ペリプラズムタンパク質の特異的放出を得るため、以下の手順を用いた。新鮮発現された培養物からの細胞を遠心分離によってペレット化し、増殖培地を完全に除去した。細胞ペレットを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で３回洗浄した。次に細胞ペレットを遠心分離（１００００ｇ、５分間、４℃）した後、初期培養容量の１０分の１の、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％スクロースおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む高張液に再懸濁した。遠心分離後（１０分間、１２０００ｇ、４℃）、細胞ペレットを、高張液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）と同じ容量で、ピペットで分注することによって高張液に静かに再懸濁した。細胞を氷上でさらに１０分間インキュベートした。細胞を遠心分離（１０分間、２００００ｇ、４℃）によってペレット化し、上清を取り出して、ペリプラズム画分とみなした。
【０３１６】
陰性対照として使用した、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０の培養物を同じ手順によって処理した。
【０３１７】
［実施例４］
アルドースデヒドロゲナーゼを含む膜細胞画分の調製
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｇｃｄの発現後に（実施例１で述べたように、より詳細には手順１Ａを実施した後に）膜結合タンパク質の特異的放出を得るため、以下の手順を用いた。新鮮発現された培養物からの細胞を遠心分離によってペレット化し、増殖培地を完全に除去した。細胞ペレットを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に初期容量まで再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞デブリを遠心分離（３０分間、２００００ｇ、４℃）によって除去し、上清を分離して、膜画分と表示した。
【０３１８】
陰性対照として使用した、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０の培養物を同じ手順によって処理した。
【０３１９】
［実施例５］
全細胞に含まれるデオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ酵素（ＤＥＲＡ）の調製
全細胞触媒に含まれるアルドラーゼ遺伝子ｄｅｏＣ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．ＥＧ１０２２１、遺伝子座タグｂ４３８１）は、多くの手順によって、例えばＷＯ２００９／０９２７０２に記載されているように得ることができる。これにもかかわらず、本発明者らは、全細胞に含まれるアルドラーゼ酵素（ＤＥＲＡ）の調製の非限定的な例を提供する。
【０３２０】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αからのゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して単離した。ゲノムＤＮＡの単離は、ＬＢ培地にて３７℃で増殖させたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養物を使用して行った。遺伝子ｄｅｏＣの増幅を、オリゴヌクレオチドプライマーＣＣＧＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧおよびＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＣを使用してＰＣＲによって実施した。増幅は、Ｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって以下のように実施した：９５℃、１０分間の初期変性、次いで９４℃、４５秒、６０℃、４５秒および６８℃、６０秒の３０サイクル。最終伸長は６８℃で４２０秒間実施した。生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。ｄｅｏＣを含む０．９ｋｂのＤＮＡフラグメント（配列番号：０９）をアガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。生成物をＴ４リガーゼ反応においてプラスミドｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に連結した。このようにして得たプラスミド構築物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢｌｐＩで切断し、生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離して、ｄｅｏＣを含む０．９ｋｂフラグメントを精製した。発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、精製した。ｄｅｏＣ遺伝子を含む０．９ｋｂフラグメントを、Ｔ４リガーゼ反応において切断した発現ベクターと連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養した。その後プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／ＤｅｏＣと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。配列番号：１０の配列を有するタンパク質の発現を可能にする標的に関してクローニング手順を実施した。ＤＥＲＡアルドラーゼを発現する生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３２１】
ｄｅｏＣの発現：カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を添加したＶＤ培地（５０ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝７．０）に、新たに画線培養したプレートからの単一コロニー、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ（３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを接種し、一晩培養した（３７℃、２５０ｒｐｍ）。
【０３２２】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｅｏＣの発現の手順は、手順１Ａで述べたとおりに実施したが、唯一の相違はＩＰＴＧ誘導物質の濃度が０．５ｍＭであった点である。発現後、細胞を採取し、全細胞触媒を手順１Ｂで述べたように得て、生存全細胞触媒を入手した。休止全細胞触媒を得るため、手順１Ｃを実施した。
【０３２３】
［実施例６］
単一微生物の全細胞培養物に含まれるアルドラーゼ酵素（ＤＥＲＡ）およびキノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼの調製
アルドラーゼ活性（ＤＥＲＡ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する遺伝的に改変された生物の２つの例を構築した。
【０３２４】
１番目の場合は、付加的なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する遺伝子ｙｌｉＩを構築物ｐＥｔ／ＤｅｏＣに付加した。生じた構築物は、単一オペロンに組織化された、ＩＰＴＧ誘導的プロモーターの転写制御下にある２つの異なるコード配列（一方はＤＥＲＡをコードし、他方はＹｌｉＩをコードする。）を担持する。
【０３２５】
具体的には、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９  ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩからのプラスミドＤＮＡ（構築は実施例１に述べられている。）を、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して単離した。プラスミドＤＮＡの単離は、ＬＢ培地にて３７℃で増殖させたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養物を使用して行った。
【０３２６】
単離したプラスミドｐＥＴ３０／ＹｌｉＩをＰＣＲ反応における鋳型として使用して、遺伝子ｙｌｉＩおよびコード領域の上流の発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）に由来するＲＢＳを含む配列を増幅した。ＰＣＲ反応を、オリゴヌクレオチドプライマーＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧおよびＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＴＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧを使用して実施した。このフラグメントの増幅を、Ｐｆｕ  ＵＬＴＲＡ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  ２００ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＰＣＲによって以下のように実施した：９８℃、３分間の初期変性、次いで９８℃、２０秒、５５℃、２０秒および７２℃、９０秒の３０サイクル。最終伸長は７２℃で１８０秒間実施した。生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、ｙｌｉＩおよびＲＢＳ部位を含む１．２ｋｂフラグメントを精製した。生成物をプラスミドｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に導入し、ｐＧＥＭ／ＲＢＳ＿ｙｌｉＩと称した。構築物を制限エンドヌクレアーゼＢｌｐＩで切断し、次に生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離して、ｙｌｉＩおよびＲＢＳ部位を含む１．２ｋｂフラグメントを精製した。構築物ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣ（構築は実施例５に述べられている。）を、前記制限エンドヌクレアーゼ（ＢｌｐＩ）を使用して切断し、精製した。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡにより購入）を製造者の指示に従って使用して、切断したｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの５’リン酸化末端を脱リン酸化した。このようにしてｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの自己連結を防止した。フラグメントをＴ４リガーゼ反応において連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養して、プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。ＤＥＲＡアルドラーゼおよびキノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼを発現する生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前述したプラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３２７】
２番目の場合は、付加的なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）だけでなく付加的なＴ７プロモーター配列も有する遺伝子ｇｃｄを構築物ｐＥｔ／ＤｅｏＣに付加した。生じたベクターは、ＩＰＴＧ誘導的プロモーターの転写制御下にある２つの異なるコード配列（一方はＤＥＲＡをコードし、他方はＧｃｄをコードする。）を担持する。
【０３２８】
具体的には、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９  ｐＥＴ３０／ＧｃｄからのプラスミドＤＮＡ（構築は実施例１に述べられている。）を、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して単離した。プラスミドＤＮＡの単離は、ＬＢ培地にて３７℃で増殖させたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養物を使用して行った。
【０３２９】
単離したプラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応における鋳型として使用して、遺伝子ｇｃｄおよびコード領域の上流の発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）に由来するＲＢＳ配列を含む配列を増幅した。ＰＣＲ反応を、オリゴヌクレオチドプライマーＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡおよびＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＧを使用して実施した。このフラグメントの増幅を、Ｐｆｕ  ＵＬＴＲＡ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  ２００ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＰＣＲによって以下のように実施した：９８℃、３分間の初期変性、次いで９８℃、２０秒、５５℃、２０秒および７２℃、９０秒の３０サイクル。最終伸長は７２℃で１８０秒間実施した。生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、ｇｃｄおよびＲＢＳ部位を含む１．２ｋｂフラグメントを精製した。生成物をプラスミドｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に導入し、ｐＧＥＭ／Ｔ７ｐ＿ＲＢＳ＿ｇｃｄと称した。構築物を制限エンドヌクレアーゼＢｌｐＩで切断し、次に生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離して、ｇｃｄ、ＲＢＳおよびＴ７プロモーター配列部位を含む２．４ｋｂフラグメントを精製した。
【０３３０】
構築物ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣ（構築は実施例５に述べられている。）を、同じ前記制限エンドヌクレアーゼ（ＢｌｐＩ）を使用して切断し、精製した。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡにより購入）を製造者の指示に従って使用して、切断したｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの５’リン酸化末端を脱リン酸化した。このようにしてｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの自己連結を防止した。フラグメントをＴ４リガーゼ反応において連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養して、プラスミドＤＮＡを単離した。生じた構築物をｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿Ｔ７ｐ＿ＲＢＳ＿Ｇｃｄと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。ＤＥＲＡアルドラーゼおよびキノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼを発現する生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前述したプラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３３１】
特に明記されない限り、上記手順によって得られた株によってコードされる酵素の発現は、手順１Ａで述べたように実施した。
【０３３２】
［実施例７］
ピロロキノンキノン（ＰＱＱ）を合成することができるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の調製
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）生合成に関与する、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ６２１Ｈ）遺伝子クラスターｐｑｑＡＢＣＤＥ（ｐｑｑＡ、ｐｑｑＢ、ｐｑｑＣ、ｐｑｑＤ、ｐｑｑＥ、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＰ０００００９、ゲノム内のおよその位置１０８０９７８…１０８４１６４）をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた。
【０３３３】
グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ６２１Ｈ）からのゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して単離した。ゲノムＤＮＡの単離は、マンニトール培地（１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、３ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌマンニトール、ｐＨ７．０）にて２６℃で４８時間増殖させたＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の培養物を使用して行った。前記単離ゲノムを遺伝子クラスターｐｑｑＡＢＣＤＥおよびこれ自体のプロモーターの増幅のための鋳型として使用した。増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＣＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＧＧＴＧＴＴＣ（配列番号：８０）およびＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＡ（配列番号：８１）を使用し、Ｐｆｕ  ＵＬＴＲＡ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  ２００ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲによって以下のように実施した：９５℃、２分間の初期変性、次いで９５℃、２０秒、６５℃、２０秒および７２℃、１２０秒の３０サイクル。最終伸長は７２℃で１８０秒間実施した。ｐｑｑＡＢＣＤＥオペロンおよびこの上流および下流配列を担持するＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の３．４ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。３．４ｋｂの生成物（配列番号：１１）をプラスミドｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを培養して、プラスミドＤＮＡを単離した。生じたプラスミド構築物をｐＧＥＭｐｑｑＡ−Ｅと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。天然プロモーターの制御下での遺伝子の発現、従ってＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）由来のタンパク質ＰｑｑＡ、ＰｑｑＢ、ＰｑｑＣ、ＰｑｑＤおよびＰｑｑＥ（それぞれ配列番号：１２、１３、１４、１５、１６）の生産を可能にする標的に関してクローニング手順を実施した。
【０３３４】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＱＱの合成（手順７Ａ）：アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地（３０ｍＬ；２０ｇ／ＬバクトＬＢブロス）に、新たに画線培養したプレートからの単一コロニー、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９  ｐＧＥＭ／ｐｑｑＡ−Ｅを接種し、対数増殖期後期まで前培養した（３７℃、２５０ｒｐｍ、８時間）。前培養細胞を遠心分離（１００００ｇ、１０分間）によってペレット化し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。前培養細胞を、元の前培養物と同じ容量で同じ前記緩衝液に再懸濁した。次に懸濁液（接種物サイズ５％、ｖ／ｖ）をグルコース最少培地（１００ｍＬ；５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、１０ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０）に移した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍで４８時間増殖させた。細胞培養物に１ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を添加した。溶解を３７℃で１時間実施した。溶解後、細胞デブリを沈降（１０分間、２００００ｇ、４℃）によって除去し、透明な水溶液を得た。このようにして無細胞抽出物に含まれるＰＱＱを得た。
【０３３５】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＱＱ産生を確認するための方法は実施例１３で述べる。
【０３３６】
［実施例８］
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を合成することができる単一微生物の全細胞培養物に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼ酵素の調製
遺伝子ｙｌｉＩおよび遺伝子クラスターｐｑｑＡ−Ｅを担持する発現プラスミドを構築した。
【０３３７】
構築物ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ（調製は実施例１に述べられている。）を制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩで消化した。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡにより購入）を製造者の指示に従って使用して、切断したｐＥＴ３０ａ／ＹｌｉＩの５’リン酸化末端を脱リン酸化した。このようにしてｐＥＴ３０ａ／ＹｌｉＩの自己連結を防止した。二重の制限認識部位ＳｐｈＩおよび制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩについての認識部位を含む二本鎖リンカーＧＣＧＣＡＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＡＣＴＡ（配列番号：８２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡで作製）を、ＳｐｈＩでの切断後、消化した構築物ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ上のＳｐｈＩ部位に導入した。
【０３３８】
切断したリンカーと切断した構築物をＴ４リガーゼ反応において連結した。リンカーの導入は、プラスミドに付加的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を挿入する。構築物ｐＧＥＭｐｑｑＡ−Ｅ（実施例７による。）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断し、次に生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離して、遺伝子オペロンｐｑｑＡＢＣＤＥを含む３．４ｋｂフラグメントを精製した。リンカーを有する構築物ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩを、前記制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、精製した。フラグメント（それぞれリンカーを有する切断したｐＥＴ３０／ＹｌｉＩおよびｐｑｑＡ−Ｅ）をＴ４リガーゼ反応において連結した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を得られた連結反応物で形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを培養して、プラスミドＤＮＡを単離した。生じたプラスミド構築物をｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅと称し、遺伝子配列の確認のために配列決定した。
【０３３９】
アルドースデヒドロゲナーゼを発現することができ、一方でピロロキノリンキノンを合成することができる生物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を前記プラスミドで形質転換することによって作製した。
【０３４０】
ＰＱＱを産生することができる単一微生物の全細胞培養物に含まれるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｌｉＩの発現を手順１Ａで述べたように実施した。手順１Ｂおよび１Ｃに対応して、生存全細胞触媒および休止全細胞触媒をそれぞれ調製した。無細胞溶解物を実施例２で述べた手順に従って調製した。
【０３４１】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の酸化能力およびＰＱＱ産生を確認するための方法は実施例１３で述べる。
【０３４２】
加えて、ＤＥＲＡおよびアルドースデヒドロゲナーゼＹｌｉＩの両方を含む構築物ならびにグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ６２１Ｈ）からのＰＱＱ生合成クラスターを連結した。手順は上記手順と同様に実施したが、ベクターｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩ（実施例６で述べた。）を出発点として使用した。生じたプラスミドをｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅ（図１）と称した。
【０３４３】
［実施例９］
クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）全細胞触媒の調製
クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＡＴＣＣ  ３３４２１、以前のエンテロバクター・インテルメディウム（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ））の培養：ＶＤ培地（３０ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整した。）に、新たに画線培養したＶＤ寒天プレートからのクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）の単一コロニーを接種し、対数増殖期後期まで前培養した（３０℃、２５０ｒｐｍ、８時間）。
【０３４４】
前培養細胞（接種物サイズ１０％、ｖ／ｖ）を、次に、新鮮ＶＤ培地（１００ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整した。）に移した。細胞を３０℃、２５０ｒｐｍで１６時間維持した。
【０３４５】
全細胞触媒の調製（手順１Ｂ）：培養後、細胞を遠心分離（１００００ｇ、５分間、４℃）によって採取した。遠心分離後に上清を廃棄し、ペレットを新鮮ＶＤ培地（１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝６．０に調整した。）に再懸濁した。細胞を初期培養容量の１０分の１で再懸濁した。生存全細胞に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼをこのようにして新鮮培地中で得た。
【０３４６】
または（手順１Ｃ）、遠心分離後に上清を廃棄した後、ペレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に再懸濁した。細胞を初期培養容量の１０分の１で再懸濁した。休止全細胞培養物に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼをこのようにして得た。
【０３４７】
無細胞溶解物を実施例２で述べた手順に従って調製した。
【０３４８】
［実施例１０］
グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）全細胞触媒の調製
グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６２１Ｈ）の培養：マンニトール培地（１００ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、３ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌマンニトール、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整した。）に、新たに画線培養したマンニトール寒天プレートからの単一コロニー、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）を接種し、培養した。細胞を２６℃、２５０ｒｐｍで４８時間維持した。
【０３４９】
全細胞触媒の調製（手順１Ｂ）：培養後、細胞を遠心分離（１００００ｇ、５分間、４℃）によって採取した。遠心分離後に上清を廃棄し、ペレットを新鮮ＶＤ培地（１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ＝６．０に調整した。）に再懸濁した。細胞を初期培養容量の１０分の１で再懸濁した。生存全細胞に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼをこのようにして新鮮培地中で得た。
【０３５０】
または（手順１Ｃ）、遠心分離後に上清を廃棄した後、ペレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に再懸濁した。細胞を初期培養容量の１０分の１で再懸濁した。休止全細胞培養物に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼをこのようにして得た。
【０３５１】
無細胞溶解物を実施例２で述べた手順に従って調製した。
【０３５２】
［実施例１１］
ＤＣＰＩＰを電子受容体として使用する、化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素活性の測定のための方法
この方法はアルドースデヒドロゲナーゼ活性（または他のデヒドロゲナーゼおよび／もしくはオキシダーゼの活性）を測定するために有用である。従って同じ方法が、化合物（Ｉ）を生じさせる化合物（ＩＩ）の酸化／脱水素反応を実施することができる酵素および／または生物をスクリーニングし、同定するために用いられる。
【０３５３】
化合物（ＩＩ）に対する酸化／脱水素活性は、天然であるかまたは遺伝的に改変された微生物であるかにかかわらず、任意の微生物の生存全細胞触媒（手順１Ｂに関して）、休止全細胞触媒（手順１Ｃに関して）、溶解物（調製は実施例２に述べられている。）、ペリプラズム画分（実施例３）または膜画分（実施例４）を使用して測定することができる。実際的には、以下では「分析された物質」という用語は、これまでの実施例で述べた触媒のすべての調製物を包含すると理解される。種々の調製物を使用して得られた結果を以下で提供する表において別々に示す。
【０３５４】
比較試験のために、試験した微生物の細胞密度を試料１ｍＬ当たりのｍｇ湿重量として定量化した。試料中の細胞を遠心分離（１００００ｇ、１０分間）によってブロスから分離し、湿潤ペレットを計量した。溶解物、ペリプラズム画分または膜画分を試験分画として使用した場合は、これらの画分が由来する全細胞の湿潤細胞重量のデータを考慮に入れた。
【０３５５】
「分析された物質」１ｍＬに５μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、室温で１０分間インキュベートした。測定の前に「分析された物質」のｐＨ値を１Ｍ  ＮａＯＨで８．０に調整した。特に明記される場合（記号「＊」は例外を示す。）、測定の相違はｐＨ値であり、より詳細にはｐＨ６．０であった。明記される場合、内因性のものを除き、付加的なＰＱＱを反応混合物に添加しなかった。
【０３５６】
フェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）と組み合わせた人工電子受容体２，６−ジクロロベンゼノン−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の存在下で（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに変換するために有用な「分析された物質」をスクリーニングし、同定するために、スクリーニング方法を９６穴マイクロプレートにおいて実施した。
【０３５７】
反応混合物（総容量は２００μＬであった。）は、リン酸緩衝液ｐＨ８．０（または、明記される場合はリン酸緩衝液ｐＨ６．０）、１００ｍＭ基質（（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート）、１ｍＭ  ＤＣＰＩＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．４ｍＭ  ＰＭＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだ。「分析された物質」（５０μＬ）を反応混合物に添加した。必要な場合は（反応の迅速な完了による）、「分析された物質」をリン酸緩衝液ｐＨ８．０または、明記される場合はリン酸緩衝液ｐＨ６．０に希釈した。試験したすべての「分析された物質」を３組作製した。アッセイが線形である有用な範囲は、１０から４００ｍＡＵ／秒であることが認められた。
【０３５８】
方法は、分光光度計Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｒｏ  Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）で実施した。６００ｎｍでの吸光度を１５秒ごとに１５分間、２８℃で測定した。結果を収集し、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。
【０３５９】
「分析された物質」の活性、従って化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）に変換する、具体的には（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに変換する反応を実施する能力は、反応混合物中に存在する、手順１Ｃ、２、３または４による任意の「分析された物質」の調製のために使用される培養細胞の湿重量当たりの１分当たりの吸光度単位の低下の絶対値と定義された（ａｂｓ［ｍＡＵ／分／ｍｇ］）。データは３つの並行する測定の平均値であり、以下の表に示されている。
【０３６０】
【表１】
2014501524.tif 000017
【０３６１】
陰性対照については、反応混合物の少なくとも１つの成分（電子受容体である、ＰＭＳと組み合わせたＤＣＰＩＰを除く）を、リン酸緩衝液ｐＨ８．０または、適切な場合はｐＨ６．０で置き換えた。長期的なインキュベーション後でも、すべての陰性対照ウェルにおいて変色は認められなかった。アルドースデヒドロゲナーゼの透明な水溶液をリン酸緩衝液で置き換えた場合、変色は認められなかった。基質（（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート、グルコース、ガラクトースまたはグリセロール）のいずれかをリン酸緩衝液で置き換えた場合、変色は認められなかった。ＰＱＱを本発明で述べる何らかの手段によって反応混合物に提供しなかった場合（ＰＱＱが内因的に提供される混合物９、１０および１１を除く。）、変色は認められなかった。
【０３６２】
［実施例１２］
ＤＣＰＩＰの存在下でのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に含まれるアルドースデヒドロゲナーゼの特性の測定
ａ）他の基質および種々の濃度に関するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｌｉＩアルドースデヒドロゲナーゼの活性の測定のために、付加的な実験を実施した。
【０３６３】
「分析された物質」（より詳細には５μＬ  ＰＱＱおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で再構成し、手順１Ｂを実施したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ）５０μＬ、１ｍＭ  ＤＣＰＩＰ、０．４ｍＭ  ＰＭＳを、種々の濃度（２．５から１０ｇ／Ｌ）の基質（（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート、Ｄ−グルコースおよびＤ−ガラクトース）と共に９６穴マイクロタイタープレートに入れた。反応混合物の最終容量は２００μＬであり、すべての成分をリン酸緩衝液ｐＨ８．０に溶解した。
【０３６４】
ＤＣＰＩＰの変色がこれらのウェルで認められた。変色速度は、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを基質とした場合、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースを基質として含む対照ウェルよりも約２倍速かった。
【０３６５】
変色は、１０ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを基質として使用した場合、２．５ｇ／Ｌの前記基質に比べてより速かった。反応速度に対するわずかな基質阻害が、反応混合物中の（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの濃度が４０ｇ／Ｌより上になった場合にのみ認められた。
【０３６６】
生成物（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの反応速度への影響の可能性を評価するため、反応の開始前に様々な量の前記生成物を反応混合物に添加した。１０ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに加えて３５ｇ／Ｌ以上の（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを添加した場合にのみ、反応速度のわずかな低下が認められた。
【０３６７】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｌｉＩアルドースデヒドロゲナーゼの基質特異性および最適ｐＨを調べるため、以下の実験を実施した：
１つの反応混合物（総容量は２００μＬであった。）は、リン酸緩衝液ｐＨ８．０、５０ｍＭ基質（（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート、Ｄ−グルコースまたはグリセロール）、１ｍＭ  ＤＣＰＩＰ、０．４ｍＭ  ＰＭＳを含んだ。５μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した、「分析された物質」（以下でさらに詳述する。）５０μＬを混合物に添加した。触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ培養物を休止全細胞触媒（手順１Ｃを実施して得た。）または溶解物（実施例２で述べたように）のいずれかとして得た。反応混合物の初期ｐＨ値は８．０であった。すべての試験溶液を３組作製した。
【０３６８】
２番目の反応混合物は、上記と同じように調製したが、唯一の相違は、作製した混合物のｐＨ値が６．０であった点である（反応混合物のすべての化合物をリン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解し、反応混合物の初期ｐＨ値は、従って６．０であった。）。すべての試験溶液を３組作製した。
【０３６９】
アルドースデヒドロゲナーゼの区別、従って前記反応物中の種々の最適値での基質の変換を分光光度計Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｒｏ  Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）で測定した。６００ｎｍでの吸光度を１５秒ごとに１５分間、２８℃で測定した。結果を収集し、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。実験は実施例１１で述べたように実施した。以下の表に「分析された物質」の活性を示す（ａｂｓ［ｍＡＵ／分／ｍｇ］）。
【０３７０】
【表２】
2014501524.tif 000018
【０３７１】
ｂ）さらに、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの構造的に異なる膜結合型グルコース、Ｇｃｄの特徴を、ＤＣＰＩＰ法を用いて評価した。
【０３７２】
「分析された物質」（より詳細には５μＬ  ＰＱＱおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で再構成し、手順１Ｂを実施したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ）５０μＬ、１ｍＭ  ＤＣＰＩＰ、０．４ｍＭ  ＰＭＳを、種々の濃度（２．５から１０ｇ／Ｌ）の基質（（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート、Ｄ−グルコースおよびＤ−ガラクトース）と共に９６穴マイクロタイタープレートに入れた。反応混合物の最終容量は２００μＬであり、すべての成分をリン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解した。
【０３７３】
ＤＣＰＩＰの変色がこれらのウェルで認められた。変色速度は、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを基質とした場合、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースを基質として含む対照ウェルよりも約２倍速かった。
【０３７４】
変色は、１０ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを基質として使用した場合、２．５ｇ／Ｌの前記基質に比べてより速かった。反応速度に対するわずかな基質阻害が、反応混合物中の（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの濃度が６０ｇ／Ｌより上になった場合にのみ認められた。
【０３７５】
生成物（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの反応速度への影響の可能性を評価するため、反応の開始前に様々な量の前記生成物を反応混合物に添加した。１０ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに加えて５５ｇ／Ｌ以上の（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを添加した場合にのみ、反応速度のわずかな低下が認められた。
【０３７６】
前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）膜アルドースデヒドロゲナーゼの基質特異性および最適ｐＨを調べるため、上述した実験を触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ｐＥＴ３０／Ｇｃｄに関して実施した。
【０３７７】
結果は、膜中の過剰発現されたＧｃｄキノプロテインデヒドロゲナーゼは、基質が（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートである場合、ｐＨ６．０でより良好に機能することを示す。（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに対する活性は、グルコースを基質として使用した場合の活性よりもわずかに弱い。
【０３７８】
【表３】
2014501524.tif 000019
【０３７９】
結果は、同じ生物（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））に由来する場合でも、異なるキノプロテインデヒドロゲナーゼは完全に異なる活性最適値および他の特性を有し得ることを明らかに示し、各々個別の酵素についての個別の特徴づけおよび反応条件の最適化の必要性を指摘する。
【０３８０】
［実施例１３］
ｐＯ２センサーを使用したバイオリアクターにおける全細胞の触媒作用能力の測定
最大容量２Ｌの実験室バイオリアクターＩｎｆｏｒｓ  ＩＳＦ１００を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルドースデヒドロゲナーゼの全細胞触媒作用能力の測定のために使用した。以下で述べるように反応器を撹拌し、通気して、温度およびｐＨを制御した。ホロアルドースデヒドロゲナーゼを担持する全細胞触媒を様々な基質に曝露した場合、Ｏ２の異常な消費が出現した。Ｏ２センサーＨａｍｉｌｔｏｎ  ＯＸＹＦＥＲＭ  ＦＤＡ  ２２５  ＰＮ  ２３７４５２を使用して、基質を提供した後の時間的なｐＯ２低下（酸素消費）の割合は全細胞触媒作用能力の割合と相関することが認められた。
【０３８１】
全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ（実施例１、手順１Ａおよびさらに実施例２５で述べた調製の手順）を使用して実験を実施した。
【０３８２】
全細胞触媒をバイオリアクターにおいてリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２）に溶解し、最終容量（１Ｌ）に対して５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌおよび２０ｇ／Ｌの濃度にした。
【０３８３】
基質を添加する前の初期工程パラメータは次のとおりであった：３７℃、空気流量１．０Ｌ／分（１．０ＶＶＭ）、撹拌器速度１０００ｒｐｍ、ｐＨ６．２および溶解酸素濃度は飽和の８０％以上に保持した。５μＭ  ＰＱＱおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２をバイオリアクターブロスに供給した。供給溶液は、持続的に供給した１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液およびシリコーン消泡性化合物であるシンペロニック消泡剤（Ｓｉｇｍａ，Ａ−５５５１）であった。
【０３８４】
基質（Ｄ−グルコースおよび（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート）を０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌおよび１ｇ／Ｌの濃度で一気に添加した。基質をブロス中で提供した場合は、酸素消費を時間的に追跡した。
【０３８５】
上述したシステムは、経時的な溶解酸素レベルの数学的記述に関して非常に複雑である。一方では、これらはｋＬａ（容器特性、撹拌、通気、培地、温度等）に依存し、他方でアルドースデヒドロゲナーゼの酵素動態に依存する。加えて、酸素プローブの遅延動態が重要な役割を果たす。本発明者らは、これゆえ、この動的システムにおいて基質のパルス供給後、溶解酸素の最少量までの期の酸素消費が二次方程式に最もよく相関することを経験的に見出した。試験した生体触媒の活性能の良好なインジケータは、特定の時間値（例えばｔ＝１５秒）で測定した、この二次方程式の勾配である。勾配は、二次方程式の一次導関数から計算した。この計算手順は、良好な再現性ならびに方法の線形性を示した。
【０３８６】
【表４】
2014501524.tif 000020
【０３８７】
［実施例１４］
様々な供給源からのＰＱＱによるホロ酵素アルドースデヒドロゲナーゼの再構成および電子受容体としてのＤＣＰＩＰに関するアッセイ
ＰＱＱならびにＭｇ２＋およびＣａ２＋などの適切な二価カチオンをＰＱＱ依存性アルドースデヒドロゲナーゼにインサイチューで提供すること、従って活性アルドースデヒドロゲナーゼを得ることによるホロ酵素の構築の種々の可能性がある。測定のために、本発明者らは、実施例１１で述べたように人工電子受容体（ＰＭＳと組み合わせたＤＣＰＩＰ）による方法を使用した。
【０３８８】
手順１Ｂまたは１Ｃに従って調製した全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０または全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｄｈＢ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩおよびｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿Ｔ７ｐ＿ＲＢＳ＿Ｇｃｄに、ＰＱＱを次のように供給することができる：
−手順１４Ａ：５μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびリン酸緩衝液ｐＨ６．０（５ｍＬ）を生存全細胞触媒または休止全細胞触媒（５ｍＬ）に添加し、室温で１０分間インキュベートした。
【０３８９】
−手順１４Ｂ：培養したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９  ｐＧＥＭ／ｐｑｑＡ−Ｅ（溶解物は手順７Ｄで述べたように得た。）の上清５ｍＬを１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で全細胞触媒または休止細胞触媒（５ｍＬ）に添加し、室温で１０分間インキュベートした。
【０３９０】
−手順１４Ｃ：培養したクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）またはグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（培養は、それぞれ実施例１０および実施例１１で述べた。）の上清５ｍＬを全細胞触媒または休止細胞触媒（５ｍＬ）に添加した。培養物の遠心分離（１００００ｇ、５分間、４℃）後に上清を得て、懸濁液中１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下に室温で１０分間インキュベートした。
【０３９１】
手順１Ｂまたは１Ｃを実施した生存全細胞触媒または休止全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅ（５ｍＬ）にリン酸緩衝液ｐＨ＝６．０および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を同じ容量比で添加し、室温で１０分間インキュベートした。
【０３９２】
すべての反応混合物を、９６穴マイクロプレートにおいて、実施例１１で述べた手順を実施して人工電子受容体ＤＣＰＩＰの存在下で（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートに変換する能力に関して試験した。
【０３９３】
【表５】
2014501524.tif 000021
【０３９４】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞におけるプラスミドｐＥＴ３０、ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ、ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ、ｐＥＴ３０／ＧｄｈＢ、ｐＥＴ３０ａ／ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍの発現の誘導時点での５μＭ  ＰＱＱおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の添加（手順１Ａに従って）は、反応の直前の添加と同様の結果を明らかにした。
【０３９５】
［実施例１５］
生存全細胞触媒に含まれる様々なアルドースデヒドロゲナーゼによるラクトール（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの酸化
アルドースデヒドロゲナーゼを有する様々な生存全細胞触媒（これらの種類は、それぞれ実施例１、７、８、９および１０に述べられている。）を、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートへの生物変換に関して試験した。
【０３９６】
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／Ｇｃｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＧｄｈＢ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＧｄｈＢ＿ｔｈｅｒｍ（調製は実施例１に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。上記生存全細胞触媒の試料９ｍＬを１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移し、ここで反応を実施した。反応混合物に１μＭ  ＰＱＱ（ＰＱＱの１ｍＭ予調製保存溶液１０μＬ、Ｓｉｇｍａ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＭｇＣｌ２の４Ｍ予調製保存溶液２．５μＬ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。
【０３９７】
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅ（調製は実施例７に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。上記細胞の試料９ｍＬを１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移し、ここで反応を実施した。
【０３９８】
生存全細胞触媒クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（実施例１０）およびグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（実施例１１）を手順１Ｂで述べたように調製した。上記細胞の試料９ｍＬを１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移し、ここで反応を実施した。
【０３９９】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートをリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に溶解して２ｍｏｌ／Ｌの濃度にした。濃縮生存全細胞触媒のすべての試料に２ｍｏｌ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート１ｍＬを添加した。反応を回転振とう機において３７℃、２５０ｒｐｍで６時間実施した。０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分および３６０分の時点で試料を採取した。各々の試料をＧＣ−ＭＳ分析のためにアセトニトリルで５０倍に希釈した。０分、１８０分および３６０分の時点の結果を以下の表に示す。
【０４００】
反応の主要生成物は、当分野で記述されている化学的酸化によって得られる（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートと同じ保持時間およびイオン分布を有していた。
【０４０１】
３６０分後、反応混合物を等容量の酢酸エチルで５回抽出し、すべての有機画分を収集して、回転蒸発器で乾燥させた。最終的に黄色の油を得た。
【０４０２】
生じた生成物の構造をＮＭＲによって確認したところ、当分野で報告されているものと同じである。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ４．８８（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．３８（ｈｅｘ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．２３（ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ）、２．６８（ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．５ＨＺ，１Ｈ）、２．５１（ｄｄｄｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ，１Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、１．９１（ｍ，２Ｈ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ１７０．８、１６９．７、７４．２、６６．５、６２．７、３９．１、３２．３、２０．６。
【０４０３】
【表６】
2014501524.tif 000022
【０４０４】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０を陰性対照として使用した。反応は上述したのと同じ条件で実施し、反応の終了時に少量の（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認めた。しかし、提供した（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートはすべて影響を受けないままであった。変換の理由は、ＰＱＱとＭｇＣｌ２が提供された場合にホロ酵素を形成する、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に存在する内因性キノプロテインデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩおよびＧｃｄ）の活性化である。
【０４０５】
［実施例１６］
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩまたはＧｃｄ）を使用した逐次反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを、手順１Ｂに従って実施例５で述べたように調製した。生存全細胞触媒５ｍＬを１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した。
【０４０６】
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの保存溶液を調製した。アセチルオキシアセトアルデヒド（前記化合物の化学合成は本発明者らの研究室において実施し、８５％の純度を示した。）６００．５ｍｇおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）４６７．２ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量１０ｍＬにした。
【０４０７】
０分の時点でアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液０．１ｍＬを反応混合物に添加した。反応を回転振とう機において３７℃、２５０ｒｐｍで３時間実施した。
【０４０８】
１μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ（調製は手順１Ｂに従って実施例１に述べられている。）５ｍＬを、３時間後に同じエルレンマイヤーフラスコに添加した。酸化反応を回転振とう機において３７℃、２５０ｒｐｍでさらに３時間進行させた。
【０４０９】
０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分および３６０分の時点で試料を採取した。各々の試料をＧＣ−ＭＳ分析のためにアセトニトリルで５０倍に希釈した。反応の主要生成物は、当分野で記述されている化学的酸化によって得られる（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートと同じ保持時間およびイオン分布を有していた。３６０分後に１２．３ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認め、これは６４％モル収率である。
【０４１０】
上述したのと同じ手順を、生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ（調製は手順１Ｂに従って実施例１に述べられている。）を使用して実施した。生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ  ５ｍｌをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを有する反応混合物に添加した３６０分後に、１４．４５ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認め、これは７５％モル収率である。
【０４１１】
［実施例１７］
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（Ｇｃｄ）を使用した同時反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ（調製はそれぞれ実施例１および５に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。両方の生存全細胞触媒を同じ容量比（５ｍＬ）で１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した。
【０４１２】
両方の生存全細胞触媒が存在する２つの異なる反応を設定した。１番目の反応混合物には５μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、２番目の反応混合物はアポアルドースデヒドロゲナーゼ酵素だけが存在する対照として使用した。
【０４１３】
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの保存溶液を調製した。アセチルオキシアセトアルデヒド（前記化合物の化学合成は本発明者らの研究室において実施し、８５％の純度を示した。）１．２０１ｇおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）９３４．４ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量１０ｍＬにした。
【０４１４】
０分の時点でアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した。アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの最終濃度はそれぞれ１００ｍＭおよび２１０ｍＭであった。反応を３７℃、２５０ｒｐｍで６時間実施した。
【０４１５】
０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分および３６０分の時点で試料を採取した。各々の試料をＧＣ−ＭＳ分析のためにアセトニトリルで５０倍に希釈した。反応の主要生成物は、当分野で記述されている化学的酸化によって得られる（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートと同じ保持時間およびイオン分布を有していた。
【０４１６】
ホロデヒドロゲナーゼが存在する１番目の反応混合物では、３６０分後に１３．６ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認め、これは７１％モル収率である。３６０分後にごく少量のラクトール（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認めたが、基質（アセトアルデヒドおよびアセチルオキシアセトアルデヒド）ならびに中間体（（Ｓ）−（４−ヒドロキシオキセタン−２−イル）メチルアセタート）がこの時点でまだ存在した。
【０４１７】
同時に、アポデヒドロゲナーゼだけが存在する、従って反応において活性なＤＥＲＡアルドラーゼだけを有する２番目の反応混合物では、９．５５ｇ／Ｌのラクトール（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートだけが生成された。
【０４１８】
これらの指標は、アルドースデヒドロゲナーゼ（Ｇｃｄ）による反応段階がアルドラーゼ酵素（ＤＥＲＡ）によって触媒される段階よりも速いことおよびアルドースデヒドロゲナーゼの存在がＤＥＲＡ反応段階の定常状態平衡を生成物の方にシフトさせることを示し、アルドースデヒドロゲナーゼ（Ｇｃｄ）との同時反応は、実際にラクトン（化合物Ｉ）に向かう全体的な割合を改善する。
【０４１９】
［実施例１８］
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの生成のための単一微生物の生存全細胞触媒中にＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩまたはＧｃｄ）を含む同時反応
以下の実施例は、簡単で安価な分子：アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドから極めて鏡像異性的に純粋な（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを生成することができる、生存微生物中で提供される合成生物学的経路を提供する。
【０４２０】
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿Ｔ７ｐ＿ＲＢＳ＿Ｇｃｄ（調製は実施例６に述べられている。）を手順１Ａで述べたように調製した。前記全細胞触媒を遠心分離（５０００ｇ、１０分間）によって別々に濃縮し、ペレットを同じ上清の初期容量の１０分の１で再懸濁した。過剰の上清を廃棄した。前記濃縮生存全細胞触媒１０ｍＬを１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した。細胞ブロスに５μＭ  ＰＱＱおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加し、ブロスのｐＨ値をアンモニウム溶液で６．０に調整した。
【０４２１】
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドから成る保存溶液を調製した。アセチルオキシアセトアルデヒド（前記化合物の化学合成は本発明者らの研究室において実施し、８５％の純度を示した。）１．２０１ｇおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）９３４．４ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量１０ｍＬにした。
【０４２２】
０分の時点でアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した。反応混合物中のアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの最終濃度はそれぞれ１００ｍＭおよび２１０ｍＭであった。反応を３７℃、２５０ｒｐｍで６時間実施した。
【０４２３】
０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分および３６０分の時点で試料を採取した。各々の試料をＧＣ−ＭＳ分析のためにアセトニトリルで５０倍に希釈した。反応の主要生成物は、当分野で記述されている化学的酸化によって得られる（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートと同じ保持時間およびイオン分布を有していた。
【０４２４】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿ＲＢＳ＿ＹｌｉＩが触媒として存在した場合は、３６０分後に７．８０ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認め、これは４１％モル収率である。同時に、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿Ｔ７ｐ＿ＲＢＳ＿Ｇｃｄの存在下で反応を実施した場合は、３６０分後に１３．１２ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認め、これは６９％モル収率である。
【０４２５】
［実施例１９］
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよび生存全細胞触媒クルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）を含む同時反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣおよびクルイベラ・インテルメディア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（調製はそれぞれ実施例１および１１に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。両方の生存全細胞触媒を同じ容量比（５ｍＬ）で１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した。
【０４２６】
アセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの保存溶液を調製した。アセチルオキシアセトアルデヒド（前記化合物の化学合成は本発明者らの研究室において実施し、８５％の純度を示した。）１．２０１ｇおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）９３４．４ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量１０ｍＬにした。
【０４２７】
０分の時点でアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した。反応混合物中のアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの最終濃度はそれぞれ１００ｍＭおよび２１０ｍＭであった。反応を３７℃、２５０ｒｐｍで６時間実施した。
【０４２８】
０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分および３６０分の時点で試料を採取した。各々の試料をＧＣ−ＭＳ分析のためにアセトニトリルで５０倍に希釈した。反応の主要生成物は、当分野で記述されている化学的酸化によって得られる（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートと同じ保持時間およびイオン分布を有していた。
【０４２９】
３６０分後、１０．４０ｇ／Ｌの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを認め、これは５４％モル収率である。
【０４３０】
［実施例２０］
（４Ｒ，６Ｓ）−６−（クロロメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩまたはＧｃｄ）を使用した同時反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ（調製はそれぞれ実施例１および５に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ  ６ｍＬおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ  ３ｍＬを５０ｍＬポリスチレン円錐チューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，（登録商標）ＵＳＡ）に移した。反応混合物に１μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。
【０４３１】
クロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの保存溶液を調製した。クロロアセトアルデヒド溶液（Ｈ２Ｏ中５０重量％、Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡにより購入）８１７μＬおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）５００．６ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量５ｍＬにした。
【０４３２】
０分の時点でクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した−従って総反応容量は１０ｍＬであり、反応混合物中のクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの出発濃度はそれぞれ１００ｍＭおよび２２５ｍＭであった。反応を、水浴中２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２時間実施した。
【０４３３】
反応の進行をガスクロマトグラフィで観測した。１２０分後、反応混合物を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、すべての有機画分を収集して、回転蒸発器で乾燥させた。乾燥生成物（４Ｒ，６Ｓ）−６−（クロロメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン６６ｍｇ（３６．２％収率）が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後に残り、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後には乾燥生成物７２ｍｇ（３９％収率）が残った。生成物をＮＭＲで分析した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．０１（ｍ，１Ｈ）、４．４７（ｍ，１Ｈ）、３．８０（ｍ，１Ｈ）、３．６８（ｍ，１Ｈ）、２．６９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．０９（ｍ，１Ｈ）、１．９７（ｍ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．２、７４．８、６２．５、４６．６、３８．５、３２．８。
【０４３４】
［実施例２１］
（４Ｒ，６Ｓ）−６−（ジメトキシメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩまたはＧｃｄ）を使用した同時反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ（調製はそれぞれ実施例１および５に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ  ６ｍＬおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ  ３ｍＬを５０ｍＬポリスチレン円錐チューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に移した。反応混合物に１μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。
【０４３５】
ジメトキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの保存溶液を調製した。ジメトキシアセトアルデヒド溶液（Ｈ２Ｏ中６０重量％、Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）８６８μＬおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）５００．６ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量５ｍＬにした。
【０４３６】
０分の時点でジメトキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した−従って総反応容量は１０ｍＬであり、反応混合物中のジメトキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの出発濃度はそれぞれ１００ｍＭおよび２２５ｍＭであった。反応を、水浴中２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２時間実施した。
【０４３７】
反応の進行をガスクロマトグラフィで観測した。１２０分後、反応混合物を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、すべての有機画分を収集して、回転蒸発器で乾燥させた。乾燥生成物（４Ｒ，６Ｓ）−６−（ジメトキシメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン５３ｍｇ（２５．３％収率）が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後に残り、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後には乾燥生成物６７ｍｇ（３１．９％収率）が残った。生成物をＮＭＲで分析した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．７４（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．４３（ｍ，２Ｈ）、３．４９（ｓ，３Ｈ）、３．４７（ｓ，３Ｈ）、３．１０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、２．７２（ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｊ＝１７．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．６２（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｍ，２Ｈ）。
【０４３８】
［実施例２２］
（４Ｒ，６Ｓ）−６−（ベンジルオキシメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩまたはＧｃｄ）を使用した同時反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ（調製はそれぞれ実施例１および５に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ  ６ｍＬおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ  ３ｍＬを５０ｍＬポリスチレン円錐チューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に移した。反応混合物に１μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。
【０４３９】
ベンジルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの保存溶液を調製した。ベンジルオキシアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）７７４．１ｍｇおよびアセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）５００．６ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量５ｍＬにした。
【０４４０】
０分の時点でベンジルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した−従って総反応容量は１０ｍＬであり、反応混合物中のベンジルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの出発濃度はそれぞれ１００ｍＭおよび２２５ｍＭであった。反応を、水浴中２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２時間実施した。
【０４４１】
反応の進行をガスクロマトグラフィで観測した。１２０分後、反応混合物を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、すべての有機画分を収集して、回転蒸発器で乾燥させた。乾燥生成物（４Ｒ，６Ｓ）−６−（ベンジルオキシメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン５１ｍｇ（１９．６％収率）が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後に残り、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後には乾燥生成物５６ｍｇ（２１．５％収率）が残った。粗生成物をジクロロメタンに溶解し、ＴＢＤＭＳＣｌおよびイミダゾールと２４時間反応させた。溶液を濃縮し、クロマトグラフィによって精製して、ＴＢＤＭＳＣｌで保護された化合物（（４Ｒ，６Ｓ）−６−（ベンジルオキシメチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン）を得、これをＮＭＲで分析した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３６（ｍ，５Ｈ）、５．１７（ｓ，２Ｈ）、４．９３（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．３８（ｄｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．３５（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．２７（ｄｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．５８（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．８５（ｍ，２Ｈ）、０．８８（ｓ，９Ｈ）、０．０９（ｓ，３Ｈ）、０．０８（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５４．８、１３４．８、１２８．７、１２８．６、１２８．４、７３．２、７０．０、６８．８、６３．２、３９．０、３２．２、２５．６、１７．８、−５．０。
【０４４２】
［実施例２３］
（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの生成のためのＤＥＲＡアルドラーゼおよびアルドースデヒドロゲナーゼ（ＹｌｉＩまたはＧｃｄ）を使用した同時反応
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ（調製はそれぞれ実施例１および５に述べられている。）を手順１Ｂで述べたように調製した。生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ  ６ｍＬおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄ  ３ｍＬを５０ｍＬポリスチレン円錐チューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に移した。反応混合物に１μＭ  ＰＱＱ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。
【０４４３】
アセトアルデヒドの保存溶液を調製した。アセトアルデヒド（Ｆｌｕｋａ，ＵＳＡにより購入）４４５ｍｇを氷冷リン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解して、最終容量５ｍＬにした。
【０４４４】
０分の時点でアセトアルデヒドの前記保存溶液１ｍＬを反応混合物に添加した−従って総反応容量は１０ｍＬであり、反応混合物中の最終濃度はそれぞれ２００ｍＭであった。反応を、水浴中２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２時間実施した。
【０４４５】
反応の進行をガスクロマトグラフィで観測した。１２０分後、反応混合物を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、すべての有機画分を収集して、回転蒸発器で乾燥させた。乾燥生成物（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン９９ｍｇ（３４．１％収率）が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後に残り、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣを組み合わせた反応後には乾燥生成物１１０ｍｇ（３７．９％収率）が残った。生成物をＮＭＲで分析した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ４．７６（ｄｑ，Ｊｄ＝１１．２Ｈｚ，Ｊｑ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．４１−４．１５（ｍ，２Ｈ）、２．６３（ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．４６（ｄｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，１Ｈ）、１．９２（ｍ，１Ｈ）、１．７１（ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，１Ｈ）、１．２９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ１７０．６、７２．７、６３．１、３９．１、３８．２、２１．８。
【０４４６】
［実施例２４］
生存全細胞触媒の高細胞密度生産ならびにアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートのワンポット連続生成
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−ＥおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣ（調製はそれぞれ実施例７および実施例４に述べられている。）の高細胞密度培養物を、最大容量２Ｌの実験室バイオリアクターＩｎｆｏｒｓ  ＩＳＦ１００を使用して「フェドバッチ」バイオプロセスで調製した。以下で述べるように反応器を撹拌し、通気して、温度およびｐＨを制御した。培地に提供した初期基質の消費後、アンモニアおよびグルコースをそれぞれ窒素源および炭素源として連続的に工程に供給する。
【０４４７】
培地の組成物および調製は次のとおりであった：
１３．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／Ｌクエン酸、６０ｍｇ／Ｌクエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、４０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、８ｍｇ／Ｌ  Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２  ２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．７ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏおよび１０ｍＬ／Ｌ鉱液。
【０４４８】
鉱液を次のように予調製した：  
１．５ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２  ４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｇ／Ｌ  ＮａＭｏＯ４  ２Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＰＯ４  ２Ｈ２Ｏ。
【０４４９】
沈殿を防ぐため、特別なプロトコールに従って初期培地を調製した：ＫＨ２ＰＯ、クエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、鉱液、Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２  ２Ｈ２Ｏおよび（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を溶液として最終容量の約半分まで連続して添加した。加圧滅菌（１２１℃で２０分間）した後、グルコース、ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏおよびカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）の滅菌溶液を、事前に１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液でｐＨを６．８に調整した後、添加した。滅菌蒸留水を添加してバイオリアクター中で最終容量（１Ｌ）を調整した。上記溶液をろ過（０．２μｍ）によって別々に滅菌した。
【０４５０】
供給溶液は、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液、シリコーン消泡性化合物であるシンペロニック消泡剤（Ｓｉｇｍａ，Ａ−５５５１）および５０％（ｗ／ｖ）グルコースであった。
【０４５１】
両方の培養物についての接種材料を対数増殖期の振とうフラスコ培養物５０ｍＬとして提供した。ＶＤ培地（５０ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨで７．０に調整した。）に、新たに画線培養したＶＤ寒天プレートからの前記全細胞触媒の単一コロニーを接種し、対数増殖期後期まで前培養した（３７℃、２５０ｒｐｍ、８時間）。
【０４５２】
接種時の初期工程パラメータは次のとおりであった：２５℃、空気流量１．５Ｌ／分（１．５ＶＶＭ）、撹拌器速度８００ｒｐｍ、ｐＨ６．８。培養の間、溶解酸素濃度をｐＯ２／撹拌速度制御ループおよびｐＯ２／空気流量制御ループによって飽和の２０％以上に保持し、バイオプロセスの終わりごろに０％に近づけ、バイオリアクター能力を最大にした（撹拌器速度２０００ｒｐｍ、通気３Ｌ／分）。
【０４５３】
ｐＨは、ｐＨが６．８より下になった場合は常にアンモニア溶液のパルスをバイオリアクターに供給する、ｐＨセンサー制御された外部ポンプを使用して全工程の間６．８に保持した。
【０４５４】
初期培地中に存在するグルコースの枯渇後、ｐＯ２およびｐＨレベルの特徴的な上昇が認められる（工程に入って約１０から１２時間）。この時点で５０％（ｗ／ｖ）グルコースの供給を開始し、できるだけ指数曲線に近づけるように手操作で調節した（供給は０．１ｍＬ／分で開始し、２４時間後に０．６ｍＬ／分で終了した。）。工程は基質供給によって制御することができる；グルコース濃度を動的なゼロに保持する場合、グルコース溶液流量が培養物の呼吸速度を制御する。酸素供給および熱伝達に関する技術的な制約はこのようにして成功裏に克服することができる。
【０４５５】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅの培養物中のタンパク質ＹｉｌＩの発現の誘導を、供給段階の開始の６時間後に０．０５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって実施した。
【０４５６】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの培養物中のタンパク質ＤｅｏＣの発現の誘導を、供給段階の開始の６時間後に０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって実施した。
【０４５７】
工程の全体的な長さは３４から４２時間であり、２００から２４０ｇ／Ｌのレベルの湿重量のバイオマスが得られる。
【０４５８】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅの高密度培養物を１５℃に冷却し、反応に使用するまで、光誘導し、通気（４００ｒｐｍ、０．５Ｌ／分）しながら反応器中に保持した（５時間）。
【０４５９】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの高密度培養物をバイオリアクターに保持し、８００ｒｐｍで撹拌した。温度を３７℃に上昇させ、アセチルオキシアセトアルデヒド５６．６ｇおよび水に希釈したアセトアルデヒド（４５．４ｇ）１２０ｍＬをプログラム可能なポンプで反応混合物に添加した。アセチルオキシアセトアルデヒドの全量を一定の流量にて３０分間で添加した。アセトアルデヒドは、以下の表に示すように連続的に３時間で添加した。
【０４６０】
【表７】
2014501524.tif 000023
【０４６１】
反応の間、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液およびバイオリアクターのセンサー依存性ｐＨ補正機能を用いてｐＨを５．８に保持した。反応の３時間後、反応混合物の一部を反応器から取り出し、８００ｒｐｍ、３７℃で撹拌しながら反応混合物１Ｌを残した。あらかじめ３７℃に加熱したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＹｌｉＩ＋ｐｑｑＡ−Ｅの高密度培養物０．５Ｌを反応混合物に添加し、通気（１Ｌ／分）を行った。反応混合物を６時間放置し、この時間中に０．１ｍＬ／分のグリセロールを混合物に添加して、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨを５．８に維持した。
【０４６２】
６時間後に反応を停止させ、５Ｍ  ＨＣｌ溶液を用いてｐＨを５に低下させて、反応混合物の全容量を簡単なガラス容器に移し、酢酸エチル１．５Ｌと混合して「全ブロス」抽出工程を実施した。有機相を収集し、別の１．５Ｌの酢酸エチルを水相に添加した。手順全体を５回反復した。収集した有機相画分を合わせて、無水硫酸ナトリウム２００ｇを添加し（酢酸エチル溶解水に結合するため）、ろ過して除去した。次に低圧蒸発によって３７℃で溶媒を除去した。残存する物質（８２．６ｇ）は黄色からコハク色の油であり、室温で蜂蜜の粘稠度を有していた。１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳを用いたその後の分析は（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの構造を確認し、クロマトグラフィ純度は５２％であった。反応の全体的なモル収率は４２．５％と推定された。
【０４６３】
［実施例２５］
生存全細胞触媒の高細胞密度生産ならびにアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートのワンポット連続生成
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＧｃｄおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣ（構築はそれぞれ実施例１および実施例５に述べられている。）の高細胞密度培養物を、最大容量２Ｌの実験室バイオリアクターＩｎｆｏｒｓ  ＩＳＦ１００を使用して「フェドバッチ」バイオプロセスで調製した。以下で述べるように反応器を撹拌し、通気して、温度およびｐＨを制御した。培地に提供した初期基質の消費後、アンモニアおよびグルコースを、それぞれ窒素源および炭素源として工程に連続的に供給する。
【０４６４】
培地の組成物および調製は次のとおりであった：
１３．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／Ｌクエン酸、６０ｍｇ／Ｌクエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、４０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、８ｍｇ／Ｌ  Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．７ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１０ｍＬ／Ｌ鉱液。
【０４６５】
鉱液を次のように予調製した：
１．５ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｇ／Ｌ  ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ。
【０４６６】
沈殿を防ぐため、特別なプロトコールに従って初期培地を調製した：ＫＨ２ＰＯ４、クエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、鉱液、Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏおよび（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を溶液として最終容量の約半分まで連続して添加した。加圧滅菌（１２１℃で２０分間）した後、グルコース、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよびカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）の滅菌溶液を、事前に１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液でｐＨを６．８に調整した後添加した。滅菌蒸留水を添加してバイオリアクター中で最終容量（１Ｌ）を調整した。上記溶液をろ過（０．２μｍ）によって別々に滅菌した。
【０４６７】
供給溶液は、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液、シリコーン消泡性化合物であるシンペロニック消泡剤（Ｓｉｇｍａ，Ａ−５５５１）および５０％（ｗ／ｖ）グルコースであった。
【０４６８】
両方の培養物についての接種材料を対数増殖期の振とうフラスコ培養物５０ｍＬとして提供した。ＶＤ培地（５０ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨで７．０に調整した。）に、新たに画線培養したＶＤ寒天プレートからの前記全細胞触媒の単一コロニーを接種し、対数増殖期後期まで前培養した（３７℃、２５０ｒｐｍ、８時間）。
【０４６９】
接種時の初期工程パラメータは次のとおりであった：２５℃、空気流量１．５Ｌ／分（１．５ＶＶＭ）、撹拌器速度８００ｒｐｍ、ｐＨ６．８。培養の間、溶解酸素濃度をｐＯ２／撹拌速度制御ループおよびｐＯ２／空気流量制御ループによって飽和の２０％以上に保持し、バイオプロセスの終わりごろに０％に近づけ、バイオリアクター能力を最大にした（撹拌器速度２０００ｒｐｍ、通気３Ｌ／分）。
【０４７０】
ｐＨは、ｐＨが６．８より下になった場合は常にアンモニア溶液のパルスをバイオリアクターに供給する、ｐＨセンサー制御された外部ポンプを使用して全工程の間６．８に保持した。
【０４７１】
初期培地中に存在するグルコースの枯渇後、ｐＯ２およびｐＨレベルの特徴的な上昇が認められる（工程に入って約１０から１２時間）。この時点で５０％（ｗ／ｖ）グルコースの供給を開始し、できるだけ指数曲線に近づけるように手操作で調節した（供給は０．１ｍＬ／分で開始し、２４時間後に０．６ｍＬ／分で終了した。）。工程は基質供給によって制御することができる；グルコース濃度を動的なゼロに保持する場合、グルコース溶液流量が培養物の呼吸速度を制御する。酸素供給および熱伝達に関する技術的な制約はこのようにして成功裏に克服することができる。
【０４７２】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄの培養物中のタンパク質Ｇｃｄの発現の誘導を、供給段階の開始の６時間後に０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって実施した。
【０４７３】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの培養物中のタンパク質ＤｅｏＣの発現の誘導を、供給段階の開始の６時間後に０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって実施した。
【０４７４】
工程の全体的な長さは３４から４２時間であり、１５０から２００ｇ／Ｌのレベルの湿重量のバイオマスが得られる。
【０４７５】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄの高密度培養物を１５℃に冷却し、反応に使用するまで、光誘導し、通気（４００ｒｐｍ、０．５Ｌ／分）しながら反応器中に保持した（５時間）。
【０４７６】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの高密度培養物５９２ｍＬをバイオリアクターに保持し、１３００ｒｐｍで撹拌した。温度を３７℃に上昇させ、アセチルオキシアセトアルデヒド３９．３０ｇおよび水に希釈したアセトアルデヒド（４８．４６ｇ）１００ｍＬを調製した。アセチルオキシアセトアルデヒドの全量を一定の流量にて２７分間で添加した。アセトアルデヒド溶液は、プログラム可能なポンプを用いて以下の表に示すように９０分間で反応混合物に連続的に添加した。
【０４７７】
【表８】
2014501524.tif 000024
【０４７８】
反応の間、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液およびバイオリアクターのセンサー依存性ｐＨ補正機能を用いてｐＨを６．２に保持した。反応の３０分後、さらに７０ｍＬのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣの高密度培養物を添加した。反応の２時間後、残存する反応混合物７３５ｍＬを１４００ｒｐｍ、３７℃で撹拌した。ＧＣ−ＦＩＤ分析は、反応の終了時に（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートが７５．６／Ｌの濃度で存在することを示した。
【０４７９】
あらかじめ３７℃に加熱したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／Ｇｃｄの高密度培養物１８３ｍＬを反応混合物に添加し、通気（１．４Ｌ／分）を行った。ＭｇＣｌ２およびＰＱＱを添加してそれぞれ最終濃度１０ｍＭおよび２μＭにし、ＰＱＱによるＧｃｄ酵素の完全な再構成を達成するため、反応混合物を撹拌しながら１０分間放置した。反応混合物を３時間放置し、この時間中、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨを６．２に維持した。２番目の段階の反応開始から６５分後、撹拌速度を１２００ｒｐｍ、空気流量を１．２Ｌ／分に低下させた。再び、２番目の段階の反応開始から１３７分後、撹拌速度を１０００ｒｐｍ、空気流量を１．０Ｌ／分に低下させた。ＧＣ−ＦＩＤ分析は、反応の終了時に（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートが５８．６ｇ／Ｌの濃度で存在することを示した。ＧＣ−ＦＩＤ結果から計算した、この段階での（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートへの変換の収率は９５％より高かった。
【０４８０】
３時間後に反応を停止させ、５Ｍリン酸溶液を用いてｐＨを４．０に低下させて、反応混合物の全容量を簡単なガラス容器に移し、ガラス容器に２００ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４を添加して、５Ｍリン酸でｐＨを再び４．０に補正し、酢酸エチル９２０ｍＬと混合して（１：１）、「全ブロス」抽出工程を実施した。有機相を収集し、別の９２０ｍＬの酢酸エチルを水相に添加した。手順全体を５回反復した。収集した有機相画分を合わせて、無水硫酸マグネシウム約１５０ｇを添加し（酢酸エチル相から水を除去するため）、ろ過して除去した。次に低圧蒸発によって４０℃で溶媒を除去した。残存する物質（５１．１ｇ）、室温で蜂蜜の粘稠度を有する黄色からコハク色の油を、１Ｈ  ＮＭＲを用いて分析し、ＧＣ−ＭＳによって（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの構造を確認し、クロマトグラフィ純度（ＧＣ−ＦＩＤ）は７８．６％であった。２つの連続的な酵素反応の全体的なモル収率は８１．６％と計算された。
【０４８１】
［実施例２６］
生存全細胞触媒の高細胞密度生産ならびにアセチルオキシアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドからの（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートのワンポット同時生成
生存全細胞触媒Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＿Ｔ７ｐ＿ＲＢＳ＿Ｇｃｄ（調製は実施例６に述べられている。）の高細胞密度培養物を、最大容量２Ｌの実験室バイオリアクターＩｎｆｏｒｓ  ＩＳＦ１００を使用して「フェドバッチ」バイオプロセスで調製した。以下で述べるように反応器を撹拌し、通気して、温度およびｐＨを制御した。培地に提供した初期基質の消費後、アンモニアおよびグルコースを、それぞれ窒素源および炭素源として工程に連続的に供給する。
【０４８２】
培地の組成物および調製は次のとおりであった：
１３．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／Ｌクエン酸、６０ｍｇ／Ｌクエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、４０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、８ｍｇ／Ｌ  Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．７ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび１０ｍＬ／Ｌ鉱液。
【０４８３】
鉱液を次のように予調製した：
１．５ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｇ／Ｌ  ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ。
【０４８４】
沈殿を防ぐため、特別なプロトコールに従って初期培地を調製した：ＫＨ２ＰＯ４、クエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、鉱液、Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏおよび（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を溶液として最終容量の約半分まで連続して添加した。加圧滅菌（１２１℃で２０分間）した後、グルコース、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよびカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）の滅菌溶液を、事前に１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液でｐＨを６．８に調整した後、添加した。滅菌蒸留水を添加してバイオリアクター中で最終容量（１Ｌ）を調整した。上記溶液をろ過（０．２μｍ）によって別々に滅菌した。
【０４８５】
供給溶液は、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液、シリコーン消泡性化合物であるシンペロニック消泡剤（Ｓｉｇｍａ，Ａ−５５５１）および５０％（ｗ／ｖ）グルコースであった。
【０４８６】
両方の培養物についての接種材料を対数増殖期の振とうフラスコ培養物５０ｍＬとして提供した。ＶＤ培地（５０ｍＬ；１０ｇ／Ｌバクトイーストエクストラクト、５ｇ／Ｌグリセロール、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨで７．０に調整した。）に、新たに画線培養したＶＤ寒天プレートからの前記全細胞触媒の単一コロニーを接種し、対数増殖期後期まで前培養した（３７℃、２５０ｒｐｍ、８時間）。
【０４８７】
接種時の初期工程パラメータは次のとおりであった：２５℃、空気流量１．５Ｌ／分（１．５ＶＶＭ）、撹拌器速度８００ｒｐｍ、ｐＨ６．８。培養の間、溶解酸素濃度をｐＯ２／撹拌速度制御ループおよびｐＯ２／空気流量制御ループによって飽和の２０％以上に保持し、バイオプロセスの終わりごろに０％に近づけ、バイオリアクター能力を最大にした（撹拌器速度２０００ｒｐｍ、通気３Ｌ／分）。
【０４８８】
ｐＨは、ｐＨが６．８より下になった場合は常にアンモニア溶液のパルスをバイオリアクターに供給する、ｐＨセンサー制御された外部ポンプを使用して全工程の間６．８に保持した。
【０４８９】
初期培地中に存在するグルコースの枯渇後、ｐＯ２およびｐＨレベルの特徴的な上昇が認められる（工程に入って約１０から１２時間）。この時点で５０％（ｗ／ｖ）グルコースの供給を開始し、できるだけ指数曲線に近づけるように手操作で調節した（供給は０．１ｍＬ／分で開始し、２４時間後に０．６ｍＬ／分で終了した。）。工程は基質供給によって制御することができる；グルコース濃度を動的なゼロに保持する場合、グルコース溶液流量が培養物の呼吸速度を制御する。酸素供給および熱伝達に関する技術的な制約はこのようにして成功裏に克服することができる。
【０４９０】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０／ＤｅｏＣ＋Ｇｃｄの培養物中のタンパク質ＤＥＲＡおよびＧｃｄの発現の誘導を、供給段階の開始の６時間後に０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって実施した。
【０４９１】
工程の全体的な長さは３４から４２時間であり、１５０から２００ｇ／Ｌのレベルの湿重量のバイオマスが得られる。
【０４９２】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３０ａ／ＤｅｏＣ＋Ｇｃｄの高密度培養物６９０ｍＬをバイオリアクター中に保持し、１３００ｒｐｍで撹拌した。温度を３７℃に上昇させ、通気（１．０Ｌ／分）を行って、アセチルオキシアセトアルデヒド３２．６７ｇおよび水に希釈したアセトアルデヒド（３７．００ｇ）１００ｍＬを調製した。ＭｇＣｌ２およびＰＱＱを添加して、それぞれ最終濃度１０ｍＭおよび５μＭにし、ＰＱＱによるＧｃｄ酵素の完全な再構成を達成するため、反応混合物を撹拌しながら１０分間放置した。アセチルオキシアセトアルデヒドの全量を一定の流量にて３５分間で添加した。アセトアルデヒド溶液は、プログラム可能なポンプを用いて以下の表に示すように６０分間で反応混合物に連続的に添加した。
【０４９３】
【表９】
2014501524.tif 000025
【０４９４】
反応の間、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液およびバイオリアクターのセンサー依存性ｐＨ補正機能を用いてｐＨを６．２に保持した。反応混合物を３時間半放置し、この時間中、１２．５％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム溶液を使用してｐＨを６．２に維持した。ＧＣ−ＦＩＤ分析は、反応の終了時に（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートが４６．１ｇ／Ｌの濃度で存在することを示した。
【０４９５】
３時間半後に反応を停止させ、５Ｍリン酸溶液を用いてｐＨを４．０に低下させて、反応混合物の全容量を簡単なガラス容器に移し、ガラス容器に２００ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４を添加して、５Ｍリン酸でｐＨを再び４．０に補正し、酢酸エチル８００ｍＬと混合して（１：１）、「全ブロス」抽出工程を実施した。有機相を収集し、別の８００ｍＬの酢酸エチルを水相に添加した。手順全体を５回反復した。収集した有機相画分を合わせて、無水硫酸マグネシウム約１５０ｇを添加し（酢酸エチル相から水を除去するため）、ろ過して除去した。次に低圧蒸発によって４０℃で溶媒を除去した。残存する物質（３４．２ｇ）、室温で蜂蜜の粘稠度を有する黄色からコハク色の油を、１Ｈ  ＮＭＲを用いて分析し、ＧＣ−ＭＳによって（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートの構造を確認し、クロマトグラフィ純度（ＧＣ−ＦＩＤ）は７６．３％であった。２つの同時酵素反応の全体的なモル収率は５９．９％と計算された。
【０４９６】
【表１０】
2014501524.tif 000026
2014501524.tif 000027
2014501524.tif 000028
2014501524.tif 000029
【図１】
2014501524.tif 000036
【配列表】
2014501524000001.app
【国際調査報告】
2014501524.tif 000037
2014501524.tif 000038
2014501524.tif 000039
2014501524.tif 000040
2014501524.tif 000041
2014501524.tif 000042
2014501524.tif 000043
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