(57)【要約】  ＩＬ４／ＩＬ１３結合タンパク質は、ＩＬ４／ＩＬ１３がＩＬ４Ｒα及び共通γ鎖複合体（１型）に結合するのを阻害し、ＩＬ４がＩＬ４Ｒα及びＩＬ１３Ｒα１複合体（２型）に結合するのを阻害し、かつＩＬ１３がＩＬ１３Ｒα１及び／又はＩＬ１３Ｒα２に結合するのを阻害する結合ドメインを含み、癌、炎症状態、及び他の病態、例えば、アレルギー性若しくは線維性疾患、特に肺疾患の治療に有用である。
2014519808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合ドメインを含む、結合タンパク質であって、前記結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、ヒトＩＬ４に結合し、インビトロ又はインビボでヒトＩＬ４がＩＬ４Ｒαに結合するのを阻害し、前記アンキリン反復ドメインが、少なくとも１つのアンキリン反復モジュールを含む、結合タンパク質。
【請求項２】
前記アンキリン反復ドメインが、２つ以上のアンキリン反復モジュールを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号２、１７１、及び１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記アンキリン反復ドメインに対してＮ末端に位置付けられるアミノ末端キャップ（Ｎキャップ）モジュールと、配列番号３、１０３、１７２、及び１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記アンキリン反復ドメインに対してＣ末端に位置付けられるカルボキシ末端キャップ（Ｃキャップ）モジュールと、を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
前記アンキリン反復モジュールが、配列番号１、３１〜４０、及び４２〜９０からなる群から選択される、アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
前記アンキリン反復モジュールが、ＡＲ１モジュール、ＡＲ２モジュール、及びＡＲ３モジュールを縦一列に含み、前記ＡＲ１モジュールが、配列番号１、３１〜４０、４２〜４６、８２、８５、及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＡＲ２モジュールが、配列番号１、４７〜６１、８３、８６、及び８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＡＲ３モジュールが、配列番号１、６２〜７８、８４、８７、及び９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
ＡＲ４モジュールを縦一列に更に含み、前記ＡＲ４モジュールが、配列番号１及び７９〜８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号９１〜９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＬ４結合タンパク質。
【請求項８】
アンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合タンパク質とヒトＩＬ４への結合について競合する、結合タンパク質。
【請求項９】
結合ドメインを含む結合タンパク質であって、前記結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、インビトロ又はインビボでヒトＩＬ１３に結合し、ヒトＩＬ１３がヒトＩＬ１３Ｒα１及びヒトＩＬ１３Ｒα２のうちの少なくとも１つに結合するのを阻害し、前記アンキリン反復ドメインが、少なくとも１つのアンキリン反復モジュールを含む、結合タンパク質。
【請求項１０】
前記アンキリン反復ドメインが、２つ以上のアンキリン反復モジュールを含む、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記結合ドメインが、ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ変異型に結合し、ヒトＩＬ１３Ｒα１及びヒトＩＬ１３Ｒα２のうちの少なくとも１つへのＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ変異型の結合を阻害する、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記アンキリン反復ドメインが、縦一列に配置されたアンキリン反復モジュールＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号２、１７１、及び１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する前記アンキリン反復ドメインに対してＮ末端に位置付けられる、Ｎキャップモジュールと、配列番号３、１０３、１７２、及び１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する前記アンキリン反復ドメインに対してＣ末端に位置付けられる、Ｃキャップモジュールと、を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前記アンキリン反復モジュールが、配列番号１、１０８〜１６１、及び１６８〜１７０からなる群から選択される、アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
前記アンキリン反復ドメインが、ＡＲ１モジュール、ＡＲ２モジュール、及びＡＲ３モジュールを縦一列に含み、前記ＡＲ１モジュールが、配列番号１、１０８〜１２５、１５６、１５７、及び１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＡＲ２が、配列番号１、１２６〜１４３、１５８、１５９、及び１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＡＲ３モジュールが、配列番号１、１４４〜１５５、１６０、１６１、及び１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号９４、１６２〜１６７、及び１７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＬ１３結合タンパク質。
【請求項１７】
結合ドメインを含む結合タンパク質であって、前記結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、インビトロ又はインビボでヒトＩＬ１３に結合し、ヒトＩＬ１３がヒトＩＬ１３Ｒα１及びヒトＩＬ１３Ｒα２のうちの少なくとも１つに結合するのを阻害し、前記アンキリン反復ドメインが、２つ以上のアンキリン反復モジュールを含み、前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１０１の残基６、９、１０、１３、１７、２０、９６、９９、１０３、１０４、１０６〜１０９、１１１、及び１１２のうちの１つ以上において、ヒトＩＬ１３に結合する、結合タンパク質。
【請求項１８】
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１０１の残基１０６、１０７、及び１１２のうちの１つ以上において、ヒトＩＬ１３に結合する、請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
アンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質とヒトＩＬ１３への結合について競合する、結合タンパク質。
【請求項２０】
第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む結合タンパク質であって、前記第１の結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、ヒトＩＬ４に結合し、インビトロ又はインビボでヒトＩＬ４がヒトＩＬ４Ｒαに結合するのを阻害し、前記第２の結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、インビトロ又はインビボでヒトＩＬ１３に結合し、ヒトＩＬ１３がヒトＩＬ１３Ｒα１及びヒトＩＬ１３Ｒα２のうちの少なくとも１つに結合するのを阻害し、前記アンキリン反復ドメインが、少なくとも１つのアンキリン反復モジュールを含む、結合タンパク質。
【請求項２１】
第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む結合タンパク質であって、前記第１の結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、ヒトＩＬ４に結合し、インビトロ又はインビボでヒトＩＬ４がヒトＩＬ４Ｒαに結合するのを阻害し、前記第２の結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ変異型に結合し、ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ変異型がヒトＩＬ１３Ｒα１及びヒトＩＬ１３Ｒα２のうちの少なくとも１つに結合するのを阻害し、前記アンキリン反復ドメインが、少なくとも１つのアンキリン反復モジュールを含む、結合タンパク質。
【請求項２２】
前記結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴により決定される、２ｎＭ未満のＫD値でＩＬ４又はＩＬ１３に結合する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
ＩＬ４に結合するアンキリン反復ドメイン及びＩＬ１３に結合するアンキリン反復ドメインを含む、結合タンパク質。
【請求項２４】
前記アンキリン反復ドメインが、ＩＬ４に結合するアンキリン反復モジュールと、前記ＩＬ４に結合するアンキリン反復モジュールに対してＮ末端に位置付けられるＮキャップモジュールと、前記ＩＬ４に結合するアンキリン反復モジュールに対してＣ末端に位置付けられるＣキャップモジュールと、ＩＬ４に結合するアンキリン反復モジュールと、前記ＩＬ１３に結合するアンキリン反復モジュールに対してＮ末端に位置付けられるＮキャップモジュールと、前記ＩＬ１３に結合するアンキリン反復モジュールに対してＣ末端に位置付けられるＣキャップモジュールと、リンカーと、を含み、前記リンカーが、前記ＩＬ４に結合するアンキリン反復モジュールの前記Ｃキャップモジュールと前記ＩＬ１３に結合するアンキリン反復モジュールの前記Ｎキャップモジュールとを接続するか、又は前記ＩＬ４に結合するアンキリン反復モジュールの前記Ｎキャップモジュールと前記ＩＬ１３に結合するアンキリン反復モジュールの前記Ｃキャップモジュールとを接続する、請求項２３に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記リンカーがＧＳリンカーである、請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
配列番号４１、１０４、１７７、及び１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。
【請求項２７】
配列番号９１の前記アミノ酸配列を有するＩＬ４に結合するアンキリン反復ドメインと、配列番号９４の前記アミノ酸配列を有するＩＬ１３に結合するアンキリン反復ドメインと、リンカーと、を含む、結合タンパク質。
【請求項２８】
請求項１〜７、９〜１８、及び２０〜２７のいずれか一項に記載の前記結合タンパク質と、製薬上許容できる担体及び／又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、呼吸器疾患の治療に好適である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記呼吸器系疾患が、ぜんそく及び肺線維症のうちの少なくとも１つである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、心臓血管病変、癌、皮膚病変、及び線維性病変の治療に好適である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、ネブライザを使用して送達するために処方される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、乾燥粉末デバイスを使用して送達するために、乾燥粉末処方を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
投与経路が、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺臓内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮からなる群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物を投与する方法。
【請求項３５】
請求項１〜７、９〜１８、及び２０〜２７のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３６】
請求項３５に記載の核酸分子を含む、単離された核酸ベクター。
【請求項３７】
宿主細胞が原核又は真核である、請求項３５に記載の単離された核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、大腸菌、酵母、バキュロウイルス、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２，６５３、ＳＰ２／０，２９３、ＨｅＬａ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、及びＳＰ２／０−Ａｇ１４、骨髄腫、並びにリンパ腫細胞から選択されるもののうちの少なくとも１つである、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記結合タンパク質が発現及び回復されるような条件下で、請求項３７に記載の単離された宿主細胞を培養する工程を含む、結合タンパク質を生成するための方法。
【請求項４０】
前記結合ドメインが、アンキリン反復ドメインであり、前記結合タンパク質が、配列番号４の前記アミノ酸配列、及び／又は配列番号１０１の前記アミノ酸配列を有する前記ＩＬ１３タンパク質を有する前記ＩＬ４タンパク質に結合するために、請求項１〜７、９〜１８、及び２０〜２７のいずれか一項に記載の結合タンパク質と競合する、結合ドメインを含む結合タンパク質。
【請求項４１】
配列番号１７６の前記ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。
【請求項４２】
配列番号１７６のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４３】
請求項４２に記載の核酸分子を含む、単離された核酸ベクター。
【請求項４４】
前記宿主細胞が原核又は真核である、請求項４２に記載の単離された核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞が、大腸菌、酵母、バキュロウイルス、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２，６５３、ＳＰ２／０，２９３、ＨｅＬａ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、及びＳＰ２／０−Ａｇ１４、骨髄腫、並びにリンパ腫細胞から選択されるもののうちの少なくとも１つである、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記結合タンパク質が発現及び回復されるような条件下で、請求項４４に記載の単離された宿主細胞を培養する工程を含む、結合タンパク質を生成するための方法。
【請求項４７】
心臓血管病変、呼吸器系病変、癌、皮膚病変、及び線維性病変を治療するための薬剤の製造のための、請求項１〜７、９〜１８、２０〜２７、及び４１のいずれか一項に記載の結合ドメインの使用。
【請求項４８】
ぜんそく及び肺線維症のうちの少なくとも１つを治療するための、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、設計されたモジュール反復単位を含み、ＩＬ４及びＩＬ１３がそれらの同種受容体に結合するのを阻害する能力のために選択され、それにより有用かつ安定した治療用タンパク質を代表する、反復タンパク質である、結合ドメインを含む組み換え結合タンパク質に関する。より具体的に、本発明は、アンキリン反復モジュールを含む二重特異性ＩＬ４／ＩＬ１３結合タンパク質を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン４（ヒトＩＬ４、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０５１１２）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、並びに単球、内皮細胞、及び線維芽細胞を含む非リンパ系細胞を含む多くの細胞型に対して複数の生物学的効果を有する、Ｔ細胞及びマスト細胞に由来する１２９のアミノ酸のサイトカインである。ＩＬ４は、多面発現性サイトカインであり、ＩｇＥ生成を含むぜんそく、炎症、気道過敏症、及び杯細胞過形成と関連付けられる細胞応答の多くに関与している（Ｐｅｒｋｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１８：４１０〜９，２００６、Ｐｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：６８８０〜４，１９８８）。Ｔ細胞及びマスト細胞の両方によるその生成は、Ｔｈ２媒介性応答を持続する多様な仲介物資及びサイトカインにより調節される。ＩＬ４シグナル伝達は、２つの受容体複合体、Ｉ型受容体複合体、及びＩＩ型受容体複合体を介して媒介される。１つのＩＬ−４Ｒα及び１つのＩＬ１３Ｒα１鎖で構成される、ＩＩ型受容体複合体によるシグナルで伝達は、ＩＬ４及びＩＬ１３の共有生物学的効果に大きく関与し、ＩＬ４及びＩＬ１３の両方は、複合体の構成要素に接触し得る。ＩＬ−４Ｒα及び共通γ鎖で構成されるＩ型受容体複合体は、ＩＬ４にのみ応答し、ＩＬ１３αＲ１を発現しないＴ細胞中のＩＬ４応答を媒介する（Ｉｄｚｅｒｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７１：８６１〜７３，１９９０、Ｎｅｌｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：７０１〜３８，１９９９）。
【０００３】
抗体を使用するか、又はＩＬ４欠乏マウスの応答によって実証されるように、ＩＬ４の効果を中和することは、ＴＨ２炎症のマウスモデルにおいて、アレルゲン特異的ＩｇＥを阻害し、好酸球増多（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ，Ｂｌｏｏｄ  １１２：１５５７〜６９，２００８）、並びに気道過敏症（ＡＨＲ）（Ｈｅａｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：１４２〜９，２００５）を低減する。同様に、可溶性ＩＬ４受容体は、ＩＬ４シグナル伝達を阻害するために使用され、アレルゲン誘発性ＡＨＲ並びにＶＣＡＭ−１発現、粘液生成、及びマウスの肺への好酸球動員を低減することが示された（ＭｃＫｉｎｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１：４０８９〜９７，２００８）。ヒト細胞において、ＩＬ４は、未感作Ｔヘルパー（Ｔｈ０）リンパ球のＴＨ２リンパ球への分化を駆動することが示された（Ｂｒｅｅｋｖｅｌｄｔ−Ｐｏｓｔｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ  ２４：９７５〜８３，２００８、Ｗｒａｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  ７：１３３〜９，２００２）。ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３を分泌することが示されたが、ＩＦＮγを生成せず、炎症促進性ＴＨ２サイトカインの不均衡に寄与する（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７：１８３〜４，２００６）。受容体結合を阻害する抗体を用いるＩＬ４の中和は、Ｔ細胞分化を妨げる（（Ｉｄｚｅｒｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７１：８６１〜７３，１９９０、Ｎｅｌｍｓ，Ｋｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：７０１〜３８，１９９９））。ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、及びＩＬ１３をコードする遺伝子内の多型は、ぜんそくと関連付けられ、実際、ＩＬ４及びＩＬ４Ｒａ多型の両方は、重症のぜんそく及びぜんそく増悪と関連付けられる（Ｓａｎｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０６：１３５〜４０，２０００、Ｗｅｎｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７５：５７０〜６，２００７）。ぜんそくにおけるＩＬ４の認識されている中心的役割に基づいて、ＩＬ４の活性を阻害する生物学的治療薬は、ぜんそく及び他のＴｈ２関連病理の治療のための有益な手段となることが期待された。しかしながら、可溶性ＩＬ４受容体を使用する臨床研究の結果は期待外れであり、プラシーボ群と治療群との間で、ぜんそく増悪の発生率において最小の差を示した（Ｂｏｒｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７：９６３〜７０，２００１）。
【０００４】
ＩＬ４と同様に、インターロイキン１３（ＩＬ１３）は、活性化されたヒトＴリンパ球から同定されたサイトカインである。過去１０年にわたって、様々な報告が、ＩｇＥ生成、炎症、気道過敏症、粘液生成、及び肺線維症を含む、ぜんそくと関連付けられた細胞応答の多くにおけるＩＬ１３の役割を実証した（Ｋａｓａｉａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７６：１４７〜５５，２００８）。その生成は、Ｔｈ２媒介性免疫応答を持続するように、正のフィードバックループにおいて相互作用する様々な媒介物質及びサイトカインにより調節される。ＩＬ１３シグナル伝達は、２型受容体、ＩＬ１３α１、及びＩＬ−４Ｒα複合体を介して主に媒介される。２型複合体もまた、存在する場合、ＩＬ４に結合することにより活性化される（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０２：１７５〜９０，２００４、ＬａＰｏｒｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３２：２５９〜７２，２００８）。ＩＬ１３Ｒα２は、ＩＬ１３の高い親和性結合が可能な受容体であり、ＩＬ１３及びＩＬ４の作用の減衰によるか、又はＴＧＦ−βの誘発及び肺線維症の発症を介するかのいずれかで、より機能的な役割を果たし得る。
【０００５】
様々なインビボデータは、ぜんそくの病因におけるＩＬ１３の役割を支持する。アレルギー性呼吸器疾患のカニクイザルモデルにおいて、ＩＬ１３の作用を妨げる抗体は、肺の炎症を低減することが示された（Ｋａｓａｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３２５：８８２〜９２，２００８）。ヒトにおいて、増加したＩＬ１３レベルは、ぜんそく患者からの気管支組織、鼻洗浄液、及び誘発喀痰中で測定され得る。ぜんそくと関連付けられる一般的な多型は、ＩＬ１３遺伝子座において同定された（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９：５４９〜５９，２０００）。加えて、ＩＬ１３は、皮膚線維症及びアトピー性皮膚炎を含む他のアトピー性疾患において重要な役割を果たすと考えられる。ＩＬ１３の活性を阻害する抗体又は他のタンパク質分子は、ぜんそく及び他のアトピー性疾患の治療に有益な治療薬であり得る（Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４０：４２〜９）。
【０００６】
まとめると、ＩＬ１３及びＩＬ４に関するインビボ及びインビトロデータは、両方のサイトカインの作用を阻害することができる治療薬は、ぜんそくの治療に有効な薬剤であり得ることを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある技術的問題は、ＩＬ４、ＩＬ−１３、又はＩＬ４及びＩＬ１３中和分子の局所送達を提供するように、炎症性疾患、癌、アトピー性疾患、及びアレルギー性若しくはアトピー性応答と関連付けられ、肺機能が影響を受ける他の病態、例えば、ぜんそく、好酸球増多、及び線維性疾患の治療を改善するために単独又は混合で使用され得る、新規のＩＬ−４及びＩＬ−１３拮抗薬（例えば、中和結合剤）を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＩＬ４及びＩＬ１３に結合することができ、ＩＬ４及びＩＬ１３の生物活性を阻害する、ＩＬ４／ＩＬ１３に結合するアンキリン反復（ＡＲ）タンパク質を含む、結合タンパク質構成体に関する。本明細書に例示されるＩＬ４及びＩＬ１３を阻害する構成体は、ＩＬ１３に結合するＡＲ反復ドメインに連結されたＩＬ４に結合するＡＲ反復ドメインで構成される。かかる二重特異性ＡＲタンパク質は、ぜんそく並びにＩＬ４及びＩＬ１３の存在又は生物活性と関連付けられる他のアトピー性疾患を含む、様々なＴｈ２媒介性疾患の生物治療薬としての適用を有する。
【０００９】
また本発明は、ＩＬ４又はＩＬ１３に結合することができ、ＩＬ４又はＩＬ１３の生物活性を阻害する、ＩＬ４又はＩＬ１３に結合するアンキリン反復（ＡＲ）タンパク質を含む、結合タンパク質構成体に関する。本明細書に例示されるＩＬ４又はＩＬ１３を阻害する構成体は、ＩＬ４に結合するＡＲ反復ドメイン又はＩＬ１３に結合するＡＲ反復ドメインで構成される。かかる二重特異性ＡＲタンパク質は、ぜんそく及びＩＬ４又はＩＬ１３の存在又は生物活性と関連付けられる他のアトピー性疾患を含む、様々なＴｈ２媒介性疾患の生物治療薬としての適用を有する。
【００１０】
本発明は更に、本発明の組み換え結合タンパク質をコードする核酸分子、及び結合タンパク質又は核酸分子のうちの１つ以上を含む医薬組成物に関する。
【００１１】
本発明は更に、本発明の結合タンパク質を使用して、炎症性疾患、癌、アトピー性疾患、及び他の病態、特にぜんそく及び肺線維症に至る状態等の肺疾患を治療する方法に関する。特定の実施形態において、単独又は混合でＩＬ４又はＩＬ１３に結合することができる結合タンパク質は、ＩＬ４及び／又はＩＬ１３媒介性疾患の症状若しくは病態生理学を予防、改善、低減、又は排除するために、予防的又は治療的処置の方法において使用され得る。特定の治療方法は、本発明のＩＬ−４結合タンパク質及び／又はＩＬ−１３結合タンパク質の局所送達による。治療方法の一実施形態において、ＩＬ４結合タンパク質及び／又はＩＬ−１３結合タンパク質は、エアゾール化処方として投与される。局所送達の一方法において、ＩＬ４結合タンパク質及び／又はＩＬ１−１３結合タンパク質を含むエアゾール化処方は、治療を必要とする対象の肺区画に投与される。この治療方法は、対象が、ぜんそく、炎症性疾患、癌、アトピー性疾患、又はアレルギー性若しくはアトピー性応答と関連付けられた他の病態、例えば、好酸球増多、及び線維性疾患等の状態を有すると診断されるか、又は疑われる場合、並びに特に肺機能が影響される場合、ＩＬ４結合タンパク質及び／又はＩＬ−１３結合タンパク質を含む予防的又は治療的処置として、対象に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】Ｎキャップ及びＣキャップを示す結合タンパク質、並びに複数のＡＲを含む結合ドメインの概略リボン図である。
【図１Ｂ】Ｎキャップ、２つのアンキリン反復モジュール、及びＣキャップを含む完全なアンキリン反復ドメインを示す、結合タンパク質の概略リボン図である。
【図２Ａ】３０分間の噴霧の前後に、ＩＬ１３及びＩＬ４に依存する活性の中和を表すグラフである。エアゾール化されたＡＲタンパク質又はカップ内に保持されたＡＲタンパク質の濃度は、Ａ２８０により評価し、活性は、ＩＬ１３  ＳＴＡＴ６活性アッセイを使用して、噴霧化前ＡＲタンパク質（正方形で示される）、エアゾール化ＡＲタンパク質（三角形で示される）、及び保持されたＡＲタンパク質（菱形で示される）について測定した。
【図２Ｂ】３０分間の噴霧の前後に、ＩＬ１３及びＩＬ４に依存する活性の中和を表すグラフである。エアゾール化されたＡＲタンパク質又はカップ内に保持されたＡＲタンパク質の濃度は、Ａ２８０により評価し、活性は、ＩＬ４に依存するＨＴ２増殖アッセイを使用して、噴霧化前ＡＲタンパク質（正方形で示される）、エアゾール化ＡＲタンパク質（三角形で示される）、及び保持されたＡＲタンパク質（菱形で示される）について測定した。
【図３】ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬで調製されたＡＲタンパク質１１Ｇ１１−２１Ｈ２の溶液を使用して、カスケードインパクションにより評価されるように、ＡＲタンパク質１１Ｇ１１−２１Ｈ２の粒径分布を示す。ＭＭＡＤは２．８４μｍであり、ＧＳＤは１．６６μｍである。
【図４】様々な時点で屠殺されたマウスの気管内注入群（ｎ＝５）を介して投与した後の経時的な１１Ｇ１１−２１Ｈ２血清、肺組織、又は気管支洗浄液（ＢＡＬ）濃度に関するデータのプロットを示す。
【図５】急性ＯＶＡ感作及び惹起モデルにおいて、メタコリンへのＯＶＡ誘発性気道過敏症に対する、気管内点滴を介して投与された反復タンパク質１１Ｇ１１又は反復タンパク質１１Ｇ１１−２１Ｈ２の効果を示す。非感作溶媒惹起された（ＮＳＶ）動物（塗りつぶした正方形で示される）、対照ＡＲタンパク質（塗りつぶした菱形で示される）、１１Ｇ１１  ２０ｍｇ／ｋｇ（正方形で示される）、２１Ｈ２  ２０ｍｇ／ｋｇ（塗りつぶした円で示される）、１１Ｇ１１−２１Ｈ２  ＡＲタンパク質、４０ｍｇ／ｋｇ（塗りつぶした三角形で示される）。
【図６】急性ＯＶＡ感作及び惹起モデルにおいて、バルブ／Ｃマウスの肺へのオボアルブミン誘発性好酸球動員に対する様々なＡＲ構成体の効果を示す、棒グラフである。１１Ｇ１１−２１Ｈ２タンパク質（ｍＣＮＴＸ４１３と標識される）の効果は、単一特異性ＡＲタンパク質２１Ｈ２又は１１Ｇ１１のいずれか単独とは著しく異なる。
【図７】肺へのＯＶＡ誘発性好酸球動員に対する様々なＡＲ構成体（ｍＣＮＴＸ４１３と標識される１１Ｇ１１−２１Ｈ２）の効果を示す。
【図８】結合タンパク質６Ｇ９（上）とＩＬ１３（下）との間にある複合体のリボン表示である。矢印は、ＩＬ１３結合時のＩＬ１３結合タンパク質の「開放」を示す。
【図９】ＩＬ１３結合タンパク質ループでの相互作用を示す。図８に関する背面図を示す。
【図１０】ＩＬ１３結合タンパク質溝での相互作用を示す。図８に関する平面図を示す。
【図１１】ＩＬ１３結合タンパク質６Ｇ９（配列番号１６２）のアミノ酸配列及びアンキリン反復の整合を示す。ＩＬ１３の結合に関与する残基には下線が引かれている。Ｅ１１４（イタリック体）も関与し得る。二次構造要素は、文字「ｔ」（β回転）及び「ｈ」（らせん）によって示される。
【図１２】ヒト及びｃｙｎｏ  ＩＬ１３の配列整合を示す。６Ｇ９エピトープ残基には下線が引かれている。
【図１３】結合タンパク質６Ｇ９及び３つの異なるＩＬ１３抗体との複合体から得たＩＬ１３構造の重畳を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
略語
ＣＣＬ１７＝ケモカイン（ＣＣモチーフ）リガンド１７、ＥＣＤ＝細胞外ドメイン、ＩＬ＝インターロイキン、ＴＡＲＣ＝胸腺及び活性化調節ケモカイン、ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＡＲ＝アンキリン反復、ＭＥＭ＝最小必須培地、ＮＥＡＡ＝非必須アミノ酸、ＳＰＲ＝表面プラズモン共鳴。
【００１４】
定義
用語「タンパク質」は、定義された三次元配置を有するか、又はポリペプチドを指し、ポリペプチドの少なくとも一部が、そのポリペプチド鎖（複数可）内及び／若しくはそれらの間に二次、三次、又は四次構造を形成することにより、定義された三次元配置を取得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチドを含む場合、個別のポリペプチド鎖は、例えば、２つのポリペプチドの間のジスルフィド結合によって、非共有結合又は共有結合され得る。定義された三次元配置を有するか、又は二次若しくは三次構造を形成することによって、定義された三次元配置を取得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。かかるタンパク質ドメインは、当該技術分野において熟練した施術者によく知られている。
【００１５】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、複数の、すなわち、ペプチド結合を介して連結された２つ以上のアミノ酸からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結された８個を超えるアミノ酸からなる。
【００１６】
用語「結合タンパク質」は、１つ以上の結合ドメインを含むタンパク質を指す。本発明の様々な実施形態において、結合タンパク質は、２つ、３つ、又は４つの結合ドメインを含む。更に、任意のかかる結合タンパク質は、結合ドメインではない追加のタンパク質ドメイン、多重体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、及び／又は単一のＣｙｓ残基を含んでよい。多重体化部分の例は、一対で機能的免疫グロブリンＦｃドメインを提供する重鎖一定領域、及び２つのかかるポリペプチドの間に分子間ジスルフィド結合を形成する、遊離チオールを含むロイシンジッパー又はポリペプチドである。例えば、Ｃｙｓ残基上に存在する遊離チオールは、例えば、当業者によく知られるマレイミド化学反応を使用することによって、他の部分をポリペプチドに共役させるために使用され得る。好ましくは、該結合タンパク質は、組み換え結合タンパク質である。また好ましくは、本発明の結合タンパク質の結合ドメインは、異なる標的特異性を有する。金属等の非タンパク質性原子、活性剤、及び非タンパク質性材料は、有用な組成物中で本発明の結合タンパク質に付着するか、又は関連付けられ得る。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」は、タンパク質骨格と同一又は実質的に同一の「折り畳み」（三次元配置）を呈し、特定の特性を有する、例えば、標的分子を結合する、タンパク質ドメインを意味する。タンパク質骨格は、アミノ酸の挿入、置換、又は削除に高度に許容できる露出面領域を有し、結合ドメインに選択、特定、又は決定された特性を提供するように修飾されてもよい。結合ドメインの他の特定の特性としては、標的への結合、標的結合又は標的活性の遮断、標的媒介性反応の活性化、酵素活性、及び関連した更なる特性が挙げられ得る。所望の特性の種類に応じて、当業者は、所望の特性を有する結合ドメインをスクリーニング及び／又は選択するために必要なステップを同定及び実行することができる。かかる結合ドメインは、合理的又は最も一般的には、組み合わせタンパク質工学技術、当該技術分野において既知の手技により得られてもよい（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．１３，１６７〜１８７，２０００、Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２５７〜１２６８，２００５）。例えば、選択された特性を有する結合ドメインは、（ａ）以下で更に定義されるように、タンパク質骨格と同一の折り畳みを呈するタンパク質ドメインの多様なコレクションを提供するステップと、（ｂ）該多様なコレクションをスクリーニングし、及び／又は該多様なコレクションから選択して、該特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを得るステップと、を含む方法によって得ることができる。タンパク質ドメインの多様なコレクションは、使用されるスクリーニング及び／又は選択システムに従っていくつかの方法により提供されてよく、ファージ提示又はリボソーム提示ライブラリ等の当業者によく知られている方法の使用を含んでよい。
【００１８】
本明細書に記載されるように、結合ドメインは、「反復ドメイン」又は「設計された反復ドメイン」である。かかる反復ドメインは、標的又は他の特定された特性への結合に関与する、１、２、３つ以上の内部反復モジュールを含み得る。好ましくは、かかる反復ドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール、２〜４つの内部反復モジュール、及びＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。好ましくは、該結合ドメインは、アンキリン反復ドメイン若しくは設計されたアンキリン反復ドメインであり、反復モジュール配列は、天然のタンパク質（反復単位）に由来するか、又は天然の反復単位のコンセンサス配列（反復モジュール）に由来する。したがって、反復ドメインは天然に存在し得るか、又は特許公報第ＷＯ  ０２／２０５６５号に説明される発明の手順の結果として得られるもの等のように形成され得る。
【００１９】
本発明による結合タンパク質は、「反復タンパク質」又は「設計された反復タンパク質」であってよく、それぞれが同一の折り畳みを有する構造単位であり、強固に積層して接合疎水性コアを有する構造を形成する、２つ以上の連続する反復単位又はモジュールを含むタンパク質を指す（図１Ａ及び１Ｂ）。独立して、安定したタンパク質ドメインを形成するか、又は特定の機能的活性を有する能力を欠失する、反復タンパク質の反復単位の積層された配置は、２〜２５個以上の反復単位（モジュール）の縦一列の配列内で組み立てられ、タンパク質−タンパク質相互作用が可能な超らせん構造を有する反復ドメインを形成する。用語「折り畳みトポロジー」又は「折り畳み」は、反復タンパク質内の反復単位の三次構造を意味する。反復モジュール又は反復単位は、典型的に、２０〜４０アミノ酸残基長の比較的短い配列モチーフである。大部分の場合、反復単位は、高度の配列同一性（対応する位置での同一のアミノ酸残基）、又は配列相同性（異なるが、類似の物理化学的特性を有するアミノ酸残基）を呈し、アミノ酸残基の一部は、天然に存在するタンパク質において見出される異なる反復単位内で良好に保存される主要残基であり得る。しかしながら、アミノ酸の挿入及び／又は欠失、並びに／又は異なる単位間の置換による高度の配列変化は、共通の折り畳みトポロジーが維持される限り可能である。
【００２０】
用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在する反復タンパク質の反復配列モチーフを含む、アミノ酸配列を意味し、該「反復単位」は、複数の複製内で見出され、タンパク質の折り畳みを決定する全ての該モチーフに共通の定義された折り畳みトポロジーを呈する。かかる反復単位は、フレームワーク残基と、相互作用残基とを含む。かかる反復単位の例は、アルマジロ反復単位、ロイシンに富んだ反復単位、アンキリン反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富んだ変異反復単位である。２つ以上のかかる反復単位を含有する天然に存在するタンパク質は、「天然に存在する反復タンパク質」と称される。反復タンパク質の個別の反復単位のアミノ酸配列は、互いに比較されるとき、多数の突然変異、置換、付加、及び／又は欠失を有し得るが、依然として実質的に、反復単位の一般的なパターン、又はモチーフを保持する。
【００２１】
用語「反復モジュール」は、設計された反復タンパク質又はドメインの反復アミノ酸配列と称される。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質の一族の１つ以上の反復単位に由来し、該基のメンバーは、類似の反復単位を含む。かかる「反復モジュール」は、その反復モジュールの全ての複製内に存在するアミノ酸残基を有する位置（「固定位置」）と、異なるアミノ酸残基又は「ランダム化」アミノ酸残基（「ランダム化位置」）を有する位置とを含み得る。かかる反復モジュールの例は、アルマジロ反復モジュール、ロイシンに富んだ反復モジュール、アンキリン反復モジュール、テトラトリコペプチド反復モジュール、ＨＥＡＴ反復モジュール、及びロイシンに富んだ変異型反復モジュールである。反復タンパク質の個別の反復単位／反復モジュールのアミノ酸配列は、互いに比較されるとき、多数の突然変異、置換、付加、及び／又は欠失を有し得るが、依然として実質的に、反復単位／反復モジュールの一般的なパターン、又はモチーフを保持する。
【００２２】
用語「一連の反復モジュール」は、反復ドメイン内に存在する反復モジュールの総数を意味する。反復ドメイン内に存在する、かかる「一連の反復モジュール」は、２つ以上の連続した反復モジュールを含み、２つ以上の複製内に１種類のみの反復モジュールを含み得るか、又はそれぞれ１つ以上の複製内に存在する２つ以上の異なる種類のモジュールを含み得る。一連の反復モジュールにおいて、モジュールの順序は、反復ドメインの組成物を決定し、結合ドメイン等の反復ドメインは、特定の活性、反復ドメインの生物学的機能のために選択された。反復ドメイン内の反復単位／モジュールは、本明細書において、ポリペプチドのＮ末端からポリペプチドのＣ末端へ連続して付番される。
【００２３】
用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復単位又は反復モジュールから推定される、アミノ酸配列を意味する。かかる反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置と、標的相互作用残基位置とを含む。該フレームワーク残基位置は、反復単位（又はモジュール）のフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、該標的相互作用残基位置は、反復単位（又はモジュール）の標的相互作用残基の位置に対応する。標的相互作用残基は、概して、反復ドメインの一面に沿って位置付けられる。かかる反復配列モチーフの一例は、例えば、配列番号１において示される、アンキリン反復配列モチーフである。
【００２４】
用語「フレームワーク残基」は、反復単位のアミノ酸残基、又は反復モジュールの対応するアミノ酸残基に関し、それらは折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、該反復単位（若しくはモジュール）の折り畳みに寄与するか、又は隣接する単位（若しくはモジュール）との相互作用に寄与する。かかる寄与は、反復単位（モジュール）内の他の残基との相互作用であり得るか、又はαらせん若しくはβシート、あるいは線状ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸伸長において認められるようなポリペプチド骨格構造に対する影響であり得る。
【００２５】
用語「標的相互作用残基」は、反復単位のアミノ酸残基、又は反復モジュールの対応するアミノ酸残基を意味し、反復単位（若しくはモジュール）の標的物質との相互作用に寄与し得る。かかる寄与は、標的物質との直接相互作用であり得るか、又は例えば、反復単位（若しくはモジュール）のポリペプチドの構造を安定させて、該標的と直接相互作用する残基の相互作用を可能にするか、又は強化することにより、他の直接相互作用する残基に対する影響であり得る。かかるフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、及び／若しくはＣＤ分光法等の物理化学的方法によって、又は構造生物学及び／若しくは生物情報工学における実践者によく知られている既知及び関連の構造情報と比較することによって得られる構造データの分析により同定され得る。
【００２６】
好ましくは、反復配列モチーフの推定に使用される反復単位／モジュールは、相同性反復単位であり、反復単位は、同一の構造モチーフを含み、該反復単位のフレームワーク残基の７０％超は、互いに同一である。好ましくは、該反復単位のフレームワーク残基の８０％超は同一である。最も好ましくは、該反復単位のフレームワーク残基の９０％超は同一である。Ｆａｓｔａ、Ｂｌａｓｔ、又はＧａｐ等のポリペプチド間の同一性率を決定するためのコンピュータプログラムは、当業者に知られている。より好ましくは、反復配列モチーフの推定に使用される反復単位は、例えば、実施例１に記載される標的上で選択され、同一の標的特異性を有する反復ドメインから得られる、相同反復単位である。
【００２７】
反復配列モチーフは、固定位置及びランダム化位置を含む。用語「ランダム化位置」は、反復配列モチーフ内のアミノ酸位置を意味し、２つ以上のアミノ酸が、該アミノ酸位置で許可され、例えば、通常２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可されるか、又は２０個の天然に存在するアミノ酸の大部分、例えば、システイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸が許可される。これらのアミノ酸は、当該技術分野において既知のように修飾された形態であってよい。最も多くの場合、かかるランダム化位置は、標的相互作用残基の位置に対応する。しかしながら、フレームワーク残基のいくつかの位置がランダム化されてもよい。
【００２８】
「キャッピングモジュール」、「キャッピング単位」又は「Ｎキャップ」（Ｎ末端キャッピングモジュールの場合）、若しくは「Ｃキャップ」（Ｃ末端キャッピングモジュールの場合）は、反復ドメインのＮ若しくはＣ末端反復モジュールに融合されたポリペプチドを指し、該キャッピングモジュールは、隣接した反復単位との堅密な三次相互作用を形成し、それにより連続反復モジュールと接触していない側方で該反復モジュールの疎水性コアを溶媒から保護するキャップを提供する。該Ｎ及び／若しくはＣ末端キャッピングモジュールは、反復単位に隣接した天然に存在する反復タンパク質内で見出されるキャピング単位若しくは他のドメインであり得るか、又はそれに由来し得る。Ｎ又はＣキャップは、隣接した反復単位との堅密な三次相互作用を形成する。かかるキャッピング単位は、反復配列モチーフに対する配列類似性を有し得る。キャッピングモジュール及びキャッピング反復は、国際公開第ＷＯ  ０２／０２０５６５号に記載され、本明細書において例示される。
【００２９】
用語「標的」は、分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、２つ以上の分子の複合体を指し、単離された形態で存在し得るか、又は生物学的形態で、例えば、細胞若しくは組織試料上若しくはその中に存在し得、例えば、天然に存在するか、若しくは天然に存在しない化学修飾で存在し得る、例えば、リン酸化反応、アセチル化、若しくはメチル化により修飾された複数の形態で存在し得るか、又は例えば、天然若しくは非天然プロセスによって生じる電離放射線若しくは活性酸素種との反応時に発生し得る、損傷若しくは架橋残基を呈する。本発明の特定の出願において、標的は、サイトカインである可溶性タンパク質である。
【００３０】
ＩＬ４、ＩＬ−４、又はｈＩＬ４は、小サイトカイン、ヒトインターロイキン４（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０５１１２、配列番号４）、又はその種相同体を意味する。具体的に述べると、種相同体配列、例えば、カニクイザルＩＬ４、ｃｙｎｏ  ＩＬ４、又はｃＩＬ４（配列番号５）が特定される。このタンパク質は、特に、Ｂ細胞刺激因子１、Ｂ細胞成長因子、ＢＣＧＦ１、ＢＣＧＦ−１、ＢＳＦ１、ＢＳＦ−１、及びリンパ球刺激因子１としても知られる。ヒト成熟タンパク質は、単一のＮ結合グリコシル化部位において、２４アミノ酸シグナルペプチドを有する１５３のアミノ酸のポリペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０５１１２）として発現され、分裂して３つの鎖間結合ジスルフィド結合を有する１２９のアミノ酸の成熟タンパク質（配列番号１）を生成する。２種類のＩＬ４受容体、１型及び２型が存在する。１型は、ＩＬ４  Ｒ−α（ＩＬ４  ＲＡ、ＣＤ１２４、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２４３９４、配列番号６はそのＥＣＤを表す）及び共通受容体サブユニットγ、ＣＤ１３２（ＩＬ２ＲＧ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ３１７８５、配列番号７）からなるヘテロ二量体である。２型受容体は、ＩＬ４  Ｒ−α及びＩＬ１３Ｒ−α１（ＩＬ１３ＲＡ１、ＣＤ２１３ａ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ７８５５２、配列番号８）からなるヘテロ二量体である。ＩＬ４ではなくＩＬ１３（配列番号１０１）が、ＩＬ１３ＲＡタンパク質を結合することにより２型受容体に結合する。更に、ＩＬ１３はＩＬ１３ＲＡ２（配列番号１０２）に結合する。
【００３１】
「コンセンサスアミノ酸残基」は、複数の反復単位の構造的及び／又は配列整合により同定される配列内のある位置で最も頻繁に見出されるアミノ酸である。２つ以上、例えば、３、４、又は５つのアミノ酸が、該２つ以上の反復単位内で類似の確率で見出される場合、コンセンサスアミノ酸は、最も頻繁に見出されるアミノ酸のうちの１つ、又は該２つ以上のアミノ酸残基の組合せであってよい。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、２つの分子間の結合の「親和性」という用語は、相互作用の強度の生物物理学的測定値を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「Ｋdis」又は「ＫD」若しくは「Ｋd」は、特定の組成物−標的相互作用の解離速度を意味するよう意図されている。「ＫD」は、解離速度（ｋ2）（「オフ速度（ｋoff）」若しくは「ｋd」と、結合速度（ｋ1）（又は「オン速度（ｋon）若しくは「ｋa」）との比である。よってＫDはｋ2／ｋ1又はｋoff／ｋon若しくはｋd／ｋaに等しく、モル濃度（Ｍ）として表現される。結果として、ＫDが小さくなるほど、結合は強くなる。よってＫDの１０-6Ｍ（又は１μＭ）は、１０-9Ｍ（又は１ｎＭ）と比較して弱い結合を示す。ＫDは、当業者によって実践されるように、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法により決定され得る。特定のタンパク質−タンパク質相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なる場合がある。よって親和性の測定（例えば、ＫD、ｋon、ｋoff）は、好ましくは、タンパク質の標準液、及び標準緩衝液を用いて行われる。
【００３３】
他のタンパク質又はペプチドとの相互作用から生じるそれらの生物活性のために選択される、本発明の反復タンパク質は、ポリペプチドタグ、放射性同位体、キレート化剤、及び多量体化ドメイン等のタンパク質若しくは非タンパク質性質であり得る分子に追加の生物物理的若しくは生物学的特性を強化又は付与するように更に修飾され得る。例えば、体内で持続する能力は、ある生理学的に相溶性のポリマーの付加又は免疫グロブリンタンパク質定常ドメイン配列のタンパク質への融合により強化され得る。非タンパク質ポリマー分子の例は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンである。タンパク質がクリアランスの減少又は再取り込みの増加を通じて体内で持続する能力を強化する修飾は、「半減期延長」修飾と称される。
【００３４】
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に付着したアミノ酸配列を意味し、該アミノ酸配列は、該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、又は標的に有用であるか、又は該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的動作を改善するか、又は該アミノ酸配列は、エフェクター機能を有する。結合タンパク質の個別のポリペプチドタグ、部分、及び／又はドメインは、互いに直接接続され得るか、又はポリペプチドリンカーを介して接続され得る。これらのポリペプチドタグは、全て当該技術分野において周知であり、当業者に完全に入手可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、又はＳｔｒｅｐタグ若しくは部分、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ等の酵素）であり、標的に使用され得る（例えば、免疫グロブリン若しくはその断片）、及び／又はエフェクター分子として使用され得る、該ポリペプチド／タンパク質、又は部分の検出を可能にする。
【００３５】
多重体化部分の例は、一対で機能的免疫グロブリンＦｃドメインを提供する重鎖一定領域、及び２つのかかるポリペプチドの間に分子間ジスルフィド結合を形成する、遊離チオールを含むロイシンジッパー又はポリペプチドである。
【００３６】
用語「ポリペプチドリンカー」は、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非ポリペプチド部分、例えば、ポリエチレングリコール又は２つの配列タグを結合することができる、アミノ酸配列を意味する。かかる追加のドメイン、タグ、非ポリペプチド部分、及びリンカーは、関連技術分野における熟練者に既知である。ポリペプチドリンカー又は反復モジュール間の任意の介在配列は、トポロジー又はモジュールの折り畳み、又はモジュールが積層する能力を干渉しない、任意の配列であり得る。かかるリンカーの特定の例は、可変長の可撓性グリセリン−セリン−リンカーであり、好ましくは、該リンカーは、２〜１６アミノ酸長、及びプロリン−トレオニンリンカーを有する。
【００３７】
概論
新しいＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質は、様々な潜在的相互作用残基（システイン、グリシン、又はプロリンを除く任意のアミノ酸）を含有するコンセンサス３３アミノ酸アンキリン反復モジュールを含む、反復タンパク質のライブラリを使用して同定された。本明細書に記載されるように、積層された反復モジュール内のランダム化位置でのアミノ酸は、多様な標的に高い親和性で結合することができる、相互作用表面を形成する（図１Ａ及び１Ｂ）。結合剤は、特定の残基位置で様々なアミノ酸を有する２〜４個のＡＲモジュールを包含する、潜在的結合ドメインのライブラリから選択され、反復ドメインは、Ｎ末端及びＣ末端モジュールが両側に配置される。本発明の好ましい結合ドメインは、好ましくは、国際公開第ＷＯ  ０２／２０５６５号（Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）に記載される、反復ドメイン又は設計された反復ドメインである。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＲ配列モチーフ
Ｘ1ＤＸ3Ｘ4ＧＸ6ＴＰＬＨＬＡＡＸ14Ｘ15ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ27ＧＡＤＶＮＡ（配列番号１）を有する１つ以上の反復モジュールを含む、反復タンパク質のライブラリから選択される、ＩＬ４に対して特異性を有する結合ドメインを含む、組み換えＩＬ４結合タンパク質に関し、
式中、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ14、及びＸ15は互いに独立して、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸残基を表す。Ｘ27は、Ａ、Ｈ、Ｎ、又はＹを表し、
Ｎ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列：
ＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡ（配列番号２）を有し、
Ｃ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列：
ＱＤＫＦＧＫＴＡＦＤＩＳＩＤＮＧＮＥＤＬＡＥＩＬＱＫＬＮ（配列番号３）を有する。
【００３９】
用語「ＡＲ」は、アンキリン反復モジュールを意味し、「ＡＲ１」は、アンキリン反復ドメインの第１のタンデムＡＲを意味し、用語「ＡＲ２」は、アンキリン反復ドメインの第２のＡＲを意味し、用語「ＡＲ３」は、アンキリン反復ドメインの第３のＡＲを意味し、用語「ＡＲ４」は、アンキリン反復ドメインの第４のＡＲを意味する。縦一列に配置されるとき、ＡＲ配置が、ＡＲ１−ＡＲ２−ＡＲ３−ＡＲ４であるように、ＡＲ１モジュールは、ＡＲ２モジュールのＮ末端であり、ＡＲ２モジュールは、ＡＲ３モジュールのＮ末端であり、場合に応じて、ＡＲ３モジュールは、ＡＲ４モジュールのＮ末端である。ＡＲは、Ｎキャップ又はＣキャップ配列を含まず、好ましくは、各ＡＲがＮキャップ及びＣキャップモジュールを有する。当然のことながら、配列番号２は、Ｎキャップ配列の一例であり、配列番号３は、Ｃキャップ配列の一例であり、これらの配列は、必要に応じて修飾され得る。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＲ配列モチーフ
Ｘ1ＤＸ2Ｘ3ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡＸ5Ｘ6ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡ（配列番号１）を有する１つ以上の反復モジュールを含む、反復タンパク質のライブラリから選択される、ＩＬ１３に対して特異性を有する結合ドメインを含む、組み換えＩＬ１３結合タンパク質に関し、
式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、及びＸ6は互いに独立して、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸残基を表す。Ｘ7は、Ａ、Ｈ、Ｎ、及びＹを表し、
Ｎ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列（括弧の付いた配列は、その位置の代替アミノ酸を意味する）：
ＤＬ［Ｄ，Ｇ］ＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡ（配列番号１７４）を有し、
Ｃ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列：
ＱＤＫＦＧＫＴ［Ａ，Ｐ］［Ａ，Ｆ］ＤＩ［Ａ，Ｓ］［Ａ，Ｉ］ＤＮＧ［Ｈ，Ｎ］ＥＤ［Ｉ，Ｌ］ＡＥ［Ｉ，Ｖ］ＬＱＫ［Ａ，Ｌ］［Ａ，Ｎ］（配列番号１７５）を有する。
【００４１】
式Ｎキャップ−［ＡＲ］n−Ｃキャップに基づくライブラリの形成において多様化する位置での残基の置換に加えて、一般的な結合タンパク質突然変異は、同定された結合タンパク質構造により包含される。一般的な突然変異は、本発明の任意の結合タンパク質に適用され得、そこでこれらの突然変異は、結合ドメインの上で参照されるライブラリの全ての結合タンパク質に共通する配列の位置内で発生する。本発明の結合ドメインの特定の残基に対する共通の一般的変化は、以下にまとめられるとおりである。
【００４２】
【表１】
2014519808.tif 000003
【００４３】
Ｎキャップの位置１は、ＡｓｐからＧｌｙ又はＡｌａに変異し、大腸菌における発現のためのＮ末端メチオニン残基の処理を支援する（Ｈｉｒｅｌ  ｅｔ．ａｌ．ＰＮＡＳ  ８６：８２４７〜８２５１  １９８９）。Ｎキャップの位置３は、ＧｌｙからＡｓｐに変異し、この変異は、国際公開第ＷＯ２０１０／０６０７４８号に記載されるように、反復タンパク質コンセンサス配列を安定させることが分かった。フレームワークのＡＲ配列モチーフ（配列番号１）位置２８がＧｌｙであるとき、配列Ａｓｎ27−Ｇｌｙ28からなるＡＲタンパク質を単離する可能性がある。Ａｓｎ−Ｇｌｙジペプチドは、脱アミド化反応を起こしやすく（Ｇｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：７８５〜７９４，１９８７）、よって単離されたＡｓｎ−Ｇｌｙ配列の位置２７は、潜在的脱アミド化を回避するために、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、又はＡｌａに変異され得る。いくつかの例では、位置２７での残基はＡｌａに変更され、タンパク質の領域の潜在的免疫原性を低減する。最後に、リボソームにより選択される標的結合ＡＲタンパク質は、Ｃキャップにアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｓｎを有する末端を表示する。この配列は、スクリーニングのための発現ベクターにサブクローニングするための制限部位に対応するために、ＡＲタンパク質の上に追加される。これらの位置の好ましいアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ａｌａである。
【００４４】
本発明は、結合ドメインを含む結合タンパク質に関し、該結合ドメインは、ＩＬ１３Ｒα１若しくはＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ１３、又はＩＬ４ＲＡに結合するＩＬ４を阻害し、該結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、熱変性時に４０℃以上の中心点変性温度（Ｔｍ）を有し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１日間、３７℃で培養されるとき、最高１０ｇ／Ｌの濃度で５％（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集体を形成する。特定の実施形態において、ＩＬ１３結合タンパク質は、配列番号２又は１７４等のＮ末端キャッピングモジュールが先行し、配列番号３又は１７５等のＣ末端キャッピングモジュールが続く、配列番号１により表される２つ又は３つの反復モジュールで構成される。
【００４５】
本発明は、結合ドメインを含む結合タンパク質に関し、該結合ドメインは、ＩＬ４ＲＡに結合するＩＬ４を阻害する。好ましくは、結合ドメインのＩＬ４との相互作用のためのＫDは、１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下であるか、又はある実施形態では、１０-10Ｍである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術等のタンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を決定する方法は、当業者によく知られている。
【００４６】
本発明は、結合ドメインを含む結合タンパク質に関し、該結合ドメインは、ＩＬ１３Ｒα１及び／又はＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ１３を阻害する。好ましくは、結合ドメインのＩＬ１３との相互作用のためのＫDは、１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下であるか、又はある実施形態では、１０-10Ｍである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術等のタンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を決定する方法は、当業者によく知られている。
【００４７】
好ましくは、結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、熱変性時に、４５℃以上、より好ましくは５０℃以上、より好ましくは５５℃以上、及び最も好ましくは６０℃以上の中心点変性温度（Ｔｍ）を有する。本発明の結合ドメインの結合タンパク質は、生理学的条件下で、定義された二次及び三次構造を有する。かかるポリペプチドの熱変性は、その三次及び二次構造の喪失をもたらし、その後に、例えば、円偏光二色性（ＣＤ）の測定が続き得る。熱変性時の結合タンパク質又は結合ドメインの中心点変性温度は、温度を１０℃から約１００℃に徐々に高めることによって、該タンパク質又はドメインの熱変性時に、生理学的緩衝液中の共同転移の中心点での温度に対応する。熱変性時の中心点変性温度の決定は、当業者によく知られている。熱変性時の結合タンパク質又は結合ドメインのこの中心点変性温度は、該ポリペプチドの熱安定性を示す。
【００４８】
水溶液中３７℃で５日以上、好ましくは１０日以上、より好ましくは２０日以上、より好ましくは４０日以上、及び最も好ましくは１００日以上の間培養されるとき、最高２０ｇ／Ｌ、好ましくは最高４０ｇ／Ｌ，より好ましくは最高６０ｇ／Ｌ、更により好ましくは最高８０ｇ／Ｌ、及び最も好ましくは最高１００ｇ／Ｌの濃度で５％（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集体を形成する結合タンパク質及び／又は結合ドメインも好ましい。不溶性凝集体の形成は、不溶性凝集体の形成時に著しく増加する目に見える沈殿物、ゲル濾過、又は動的光散乱の出現によって検出され得る。不溶性凝集体は、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってタンパク質試料から除去され得る。好ましくは、結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、ＰＢＳ中３７℃の前述の培養条件下で、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、又は０．０５％（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集体を形成する。不溶性凝集体の割合は、可溶性タンパク質からの不溶性凝集体の分離に続いて、標準定量法による可溶性及び不溶性分留中のタンパク質量の決定により決定され得る。
【００４９】
生物活性
ＥＣ50値は、特定の一連の条件下で、完全又は既定の最大効果の５０％をもたらすために必要とされる、結合タンパク質又は結合ドメイン等の物質の濃度である。効果が活性を遮断又は阻害しているとき、値は、その効果の５０％低減をもたらす阻害濃度と呼ばれる（ＩＣ50）。ＩＣ50値は、細胞、組織、器官から、又は対象若しくは動物の体内で検出可能な量の病理学的マーカー若しくはバイオマーカーの放出等の実験的に決定したパラメーターのインビトロ阻害に適用され得る。かかる測定値は、タンパク質組成物の活性の直接的尺度であり得るか、又は修飾される生物活性の代理若しくは下流マーカーであり得る。
【００５０】
ＩＬ４は、ＩＬ１３といくつかの生物活性を共有する。例えば、ＩＬ４又はＩＬ１３のいずれかは、Ｂ細胞中でＩｇＥアイソタイプの切り替えをもたらし得る（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２〜５８００）。加えて、細胞表面ＣＤ２３及び血清ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）のレベルの増加は、ぜんそく患者において報告された（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｕｅｒｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４９：５８７〜９２；ＤｉＬｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２０．１１９〜２５）。加えて、ＩＬ４又はＩＬ１３のいずれかは、Ｂ細胞及び単球上のＭＨＣクラスＩＩ及び低親和性ＩｇＥ受容体（ＣＤ２３）の発現を上方制御することができ、抗原提示の強化及びマクロファージ機能の調節をもたらす（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。重要なことに、ＩＬ４又はＩＬ１３のいずれかは、内皮細胞上のＶＣＡＭ−１の発現を増加させることができ、好酸球（及びＴ細胞）の気道組織への選好動員を促進する（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。ＩＬ４又はＩＬ１３のいずれかは、気道の反応性を増悪させ得る、気道粘液分泌も増加させ得る（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。ＩＬ１３のそれとは異なるシグナル伝達経路を遮断するように作用することにより、ＩＬ４阻害剤／拮抗薬を使用して、未感作Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化を阻害することができる。
【００５１】
本発明は、これらに限定されないが、ＩｇＥ生成；Ｂ細胞若しくは単球上のＣＤ２３上方調節；内皮細胞上のＶＣＡＭ−Ｉ、好酸球動員、ＴＧＦβ導入、増加した粘液分泌の上方調節；線維芽細胞増殖、コラーゲン増殖、及び細胞外マトリックスのリモデリング（Ｗｙｎｎ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４：５８３〜９４）、又はＴＧＦβの刺激により生じる線維症；及びロイコトリエンの放出による１５−リポキシゲナーゼ活性の刺激（例えば、ＬＴＡ４、ＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、及び／若しくはＬＴＦ４）を含む、ＩＬ４及びＩＬ１３媒介性の生物活性を阻害するために、記載されるＩＬ４及びＩＬ１３中和活性の両方を有する結合タンパク質を使用するための方法に更に関する。したがって、ＩｇＥ生成、血液単球からのＬＴＡ４及びＬＴＢ４の放出、好酸球動員、ＴＧＦβ放出、強化されたコラーゲン合成、及び細胞外マトリックスリモデリングは、本明細書に記載されるＩＬ４若しくはＩＬ１３結合タンパク質の効果の生物活性の測定値として使用され得る。
【００５２】
ＩＬ１３バイオアッセイは、ＴＦ−１赤白血病細胞等の癌細胞型又は前癌細胞型の増殖も含む。ＩＬ１３中和は、ＩＬ１３結合タンパク質がＩＬ１３Ｒ−α１又はＩＬ１３Ｒ−α２に結合するＩＬ１３を低減する能力として、特異的に測定され得る。
【００５３】
本発明のＩＬ１３結合組成物は、本発明のＩＬ１３とＩＬ１３Ｒα２若しくはＩＬ１３Ｒα２の間の明らかな解離定数（Ｋd）が、又は本発明のＩＬ４結合組成物は、ＩＬ４とＩＬ４ＲＡとの間の明らかな解離定数（Ｋd）が、１０2倍超、好ましくは１０3倍超、より好ましくは１０4倍超、より好ましくは１０5倍超、及び最も好ましくは１０6倍超増加する方法でＩＬ１３結合又はＩＬ４結合を阻害し得る。ＩＬ１３結合には、ＩＣ50値が１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、及び最も好ましくは１．０ｎＭ以下の特定されたインビトロ条件下で、ＩＬ１３Ｒα２に結合する、ＩＬ１３若しくはヒトＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑタンパク質変異型（ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ−Ｖｌａｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．「ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ，ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ａｓｔｈｍａ，ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５（３）：７４７〜７５４）を阻害する、結合タンパク質及び／又は結合ドメインである。
【００５４】
ＩＬ４中和は、ＩＬ４結合タンパク質がＩＬ４  ＲＡに結合するＩＬ４を低減する能力として、特異的に測定され得る。本発明のＩＬ４結合タンパク質は、ＳＴＡＴ６−ｂｌａレポーターを発現する組み換えＨＥＫ細胞株等の２型ＩＬ４受容体複合体を発現する細胞内で、ＳＴＡＴ６のＩＬ４依存性リン酸化反応を阻害する能力を特徴とする。ＩＬ４結合タンパク質は、１型ＩＬ４受容体複合体を有する細胞内でシグナル伝達を遮断又は低減することができる追加の特性を有することを更に特徴とし、例えば、未感作Ｔ細胞分化のＴｈ２表現型への阻害によって実証される。ＩＬ４結合タンパク質は、６７ｐＭ  ＩＬ４の存在下で、Ａ５４９細胞等の細胞からのＩＬ４依存性ＴＡＲＣ生成の刺激を遮断又は低減し得る。本発明のＩＬ４結合タンパク質は、ヒト及びマカクサルＩＬ４相同タンパク質に結合する。
【００５５】
本発明のＩＬ４結合タンパク質がＩＬ１３結合タンパク質に連結されるとき、組成物は、ＩＬ１３とＩＬ１３Ｒα１又はＩＬ１３Ｒα２との間の明らかな解離定数（Ｋd）が、１０2倍超、好ましくは１０3倍超、より好ましくは１０4倍超、より好ましくは１０5倍超、及び最も好ましくは１０6倍超増加する方法でＩＬ１３結合を阻害し得る。ＩＣ50値が１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、及びより好ましくは１．０ｎＭ以下の特定されたインビトロ条件下で、ＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ１３又はヒトＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑタンパク質変異型（ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ，Ｖｌａｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５（３）：７４７〜７５４）を阻害する結合タンパク質及び／又は結合ドメインが好ましい。
【００５６】
本発明の一実施形態は、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ４  ＲＡタンパク質を表示する、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞内のＳＴＡＴ６リン酸化反応のヒトＩＬ４又はＩＬ４及びＩＬ１３活性を遮断することができる反復モジュールを含む、結合タンパク質であり、ＩＬ４又はＩＬ１３により活性化されるとき、物質を発色団に変換することができる活性酵素アルカリホスファターゼである、レポータータンパク質の分泌を誘発する。本発明の結合タンパク質は、インビトロアッセイにおいて、１ｎＭ以下、好ましくは１００ｐＭ以下、及びより好ましくは１０ｐＭ以下のＩＣ50で、ＳＴＡＴ６のＩＬ４又はＩＬ４及びＩＬ１３活性を阻害する。加えて、本発明の結合タンパク質は、ｃｙｎｏ  ＩＬ４又はＩＬ１３がＩＣ50が５ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下である同一細胞に結合することを阻害し、ヒトＩＬ４又はＩＬ１３のＩＣ50とカニクイザル相同体ＩＬ４又はＩＬ１３のＩＣ50との間の工学的ＨＥＫ青色細胞におけるＳＴＡＴ６阻害の比率は、インビトロアッセイにおいて１０以下である。代表的なアッセイは、当業者に既知であるとして本明細書に記載される。
【００５７】
胸腺及び活性調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）は、ＩＬ１３（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：８１〜８８）により上方調節され、ＴＨ２細胞の移行を誘発し（Ｈｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｌｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１１３（２）：３３４〜４０）、ぜんそく患者の気道内で上方調節されるが（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｌｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１１４（１）：１９９〜２０２）、本発明の結合タンパク質及び／又は結合ドメインの一実施形態は、６７ｐＭ  ＩＬ４の存在下で、ＩＣ50値が５００ｐＭ以下、好ましくは１００ｐＭ以下、及びより好ましくは５０ｐＭ以下のＡ５４９細胞によるＴＡＲＣ生成を阻害する。
【００５８】
組成物
本発明のＩＬ４結合ＡＲ組成物は、結合タンパク質の式（Ｎキャップ−［ＡＲ］n−Ｃキャップ（Ｉ））に準拠し、ＫDが１０-6Ｍ以下、ＫDが１０-7Ｍ以下、ＫDが１０-8Ｍ以下、又はＫDが１０-9Ｍ以下として測定されるＩＬ１３に結合するための親和性を有する、２つ又は３つの反復モジュールを有し、結合タンパク質分子は、配列番号１の反復モジュールで構成される。ＩＬ４結合タンパク質の一実施形態において、ＡＲドメインは、配列番号３１〜８１のいずれかから選択される配列を有する反復モジュールを含む。
【００５９】
本発明、ＩＬ４結合タンパク質の特定の実施形態において、ＡＲ１配列は、配列番号３１〜４６からなる群から選択され、配列番号４７〜８１からなる群から選択される第２の設計されたアンキリン反復ドメイン（ＡＲ２）が続き、任意でこの第２の設計されたアンキリン反復単位には、配列番号６２〜７８からなる群から選択される第３の設計されたアンキリン反復（ＡＲ３）単位が続き、任意でこのＡＲ３反復単位には、配列番号７９〜８１からなる群から選択されるＡＲ４が続く。
【００６０】
特定の実施形態において、ＩＬ４結合タンパク質は、配列番号５３のアンキリン反復配列を有するアンキリン反復モジュールを含み、該反復モジュールは、配列番号３６のアンキリン反復配列モチーフを有する反復モジュールが先行し、及び／又は配列番号６８のアンキリン反復配列モチーフを有する反復モジュールが後に続く。
【００６１】
特定の実施形態において、ＩＬ４結合タンパク質は、配列番号５６のアンキリン反復配列を有するアンキリン反復モジュールを含み、該反復モジュールは、配列番号３９のアンキリン反復配列モチーフを有する反復モジュールが先行し、及び／又は配列番号７１のアンキリン反復配列モチーフを有する反復モジュールが後に続く。
【００６２】
特定の実施形態において、ＩＬ４結合タンパク質は、配列番号５９の配列を有するＡＲ単位を含み、該反復モジュールは、配列番号４３のＡＲ配列モチーフを有する反復モジュールが先行し、及び／又は配列番号７４のＡＲ配列モチーフを有する反復モジュールが後に続く。
【００６３】
本明細書に例示された更なる実施形態において、ＡＲ単位タンデム配置は、結合タンパク質内の特定位置でのＡＲ配列モチーフに対応する指定された配列番号によって表３に特定されるとおりである。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、ＩＬ４結合タンパク質であり、配列番号３１〜８１から選択される１つのＡＲ単位は、配列番号２及びその変異型を含むＮキャップが先行する。この変異型は、配列番号１と、ＩＬ４タンパク質に結合する配列番号３１〜８１の分子のいずれかに対して７５％以上の同一性を有する分子とを含む。別の実施形態において、本発明は、ＩＬ４結合タンパク質であり、配列番号３１〜８１から選択される１つのＡＲ単位は、配列番号３及びその変異型を含むＣキャップが後に続く。
【００６５】
配列番号３１〜８１から選択されるＡＲ単位配列を含むＩＬ４に対して結合特異性を持つ結合ドメインを有するＩＬ４結合タンパク質は、宿主細胞内での発現を向上させ、１つ以上の残基が酸化を経る可能性を低減し、残基が化学的アミド分解を経る可能性を低減し、結合タンパク質が投与される宿主が免疫応答を実装する可能性を低減する目的で、その配列を修飾してよく、及び／又は１つ以上の残基が、ＩＬ１３結合タンパク質を別のタンパク質若しくは部分と結合する目的で付加又は修飾される。結合タンパク質は、水溶液中の結合特異性、親和性、及び溶解度の生物物理学的特徴、並びに自己凝集する傾向の欠如を保持し、４５℃を超える融解温度を有する。
【００６６】
より具体的に、本発明は、コンセンサス配列（モチーフ）に由来するか、又は反復単位の多配列整合から得られる様々な位置で特定のアミノ酸の同定が頻繁に観察される、ＩＬ４結合タンパク質を包含する。例えば、ＩＬ４結合タンパク質は、配列番号１の配列モチーフを有する縦一列に配置されるアンキリン反復モジュールＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３を含んでよく、ＡＲ１モジュールは、式（括弧の付いた配列は、その位置の代替アミノ酸を意味する）：
Ｘ1Ｄ−［ＤＷ］−ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＴＤ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡに従うアミノ酸を有し、式中、Ｘ1は、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、及びＹから選択され、Ｘ4は、Ｄ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｙ、及びＴから選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、及びＹ（配列番号８２）から選択される。
ＡＲ２は、式：
Ｘ1Ｄ−Ｘ2Ｘ3−Ｇ  Ｘ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［Ｘ5Ｘ6］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｓ、Ｉ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、及びＶから選択され、Ｘ2Ｘ3は、ＡＭ、ＲＭ、ＡＩ、ＡＳ、ＮＦ、ＮＩ、ＮＬ、ＭＮ、ＷＮ、ＳＱ、ＤＤ、ＤＴ、ＥＴ、及びＬＦから選択され、Ｘ4は、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｗ、及びＹから選択され、Ｘ5Ｘ6は、ＶＹ、ＶＥ、ＦＦ、ＦＶ、ＡＤ、ＡＴ、ＤＦ、ＦＤ、ＶＤ、ＬＹ、ＹＹ、及びＷＴから選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、及びＹから選択される（配列番号８３）。
ＡＲ３モジュールは、式：
Ｘ1Ｄ−Ｘ2Ｘ3−Ｇ  Ｆ−ＴＰＬＨＬＡＡ−Ｘ5Ｘ6−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｍ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、及びＹから選択され、Ｘ2Ｘ3は、ＦＳ、ＱＴ、ＬＡ、ＨＨ、ＳＨ、ＩＬ、ＩＳ、ＮＬ、ＭＩ、ＳＮ、ＲＴ、及びＬＨから選択され、Ｘ5Ｘ6は、ＦＹ、ＦＳ、ＮＦ、ＶＤ、ＥＦ、ＦＡ、ＦＦ、ＦＷ、ＳＹ、ＹＮ、及びＹＹから選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、及びＹ（配列番号８４）から選択される。
【００６７】
別の実施形態において、ＩＬ４結合タンパク質は、配列番号１の配列モチーフを有する、縦一列に配置されるアンキリン反復モジュールＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３を含んでよく、ＡＲ１モジュールは、式：
ＴＤ−［ＤＷ］−ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＴＤ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡに従うアミノ酸を有し、式中、Ｘ4は、Ｄ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ｙ、及びＴから選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、及びＹから選択される（ＡＲ１−Ｆ、配列番号８５）。
ＡＲ２モジュールは、式：
Ｘ1Ｄ−［ＡＭ］−ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＶＹ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｓ、Ｉ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、及びＶから選択され、Ｘ4は、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、Ｉ、及びＹから選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、及びＹから選択される（ＡＲ２−Ｆ、配列番号８６）。
ＡＲ３モジュールは、式：
Ｘ1Ｄ−［Ｘ2Ｘ3］−Ｇ−Ｆ−ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＦＹ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＦＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｍ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、及びＹから選択され、Ｘ2Ｘ3は、ＦＳ、ＱＴ、ＬＡ、ＨＨ、ＳＨ、ＩＬ、ＩＳ、ＮＬ、ＭＩ、ＳＮ、ＲＴ、ＬＨ、及びＶＨから選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、及びＹから選択される（ＡＲ３−Ｆ、配列番号８７）。
【００６８】
最適化された活性ＩＬ４結合タンパク質配列に基づいて、本発明のＩＬ４結合タンパク質は、配列番号１の配列モチーフを有する、縦一列に配置されたアンキリン反復モジュールＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３を含んでよく、ＡＲ１モジュールは、式：
［Ａ，Ｌ，Ｔ］−ＤＤ−［Ｓ，Ｗ］−Ｇ−［Ｄ，Ｉ，Ｙ］−ＴＰＬＨＬＡＡ−［Ｅ，Ｔ］−ＤＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ａ，Ｈ］−ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ１−Ｏ）（配列番号８８）に従うアミノ酸を有し、式：
［Ａ，Ｎ，Ｑ］−Ｄ−［ＮＬ，ＲＬ，ＡＩ］−ＧＤＴＰＬＨＬＡＡ−［ＷＴ，ＦＶ，ＬＹ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ａ，Ｙ］−ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ２−Ｏ）（配列番号８９）に従うＡＲ２モジュールが後に続き、式：
［Ｔ，Ｖ，Ｙ］−Ｄ−［ＩＳ，ＬＡ，ＬＨ］−Ｇ−［Ｆ，Ｉ，Ｖ］−ＴＰＬＨＬＡＡＦ−［Ｗ，Ｙ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ａ，Ｈ］−ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ３−Ｏ）（配列番号９０）に従うＡＲ３モジュールが後に続き、括弧の付いたエントリは、代替アミノ酸残基又は残基対を表す。
【００６９】
好ましい実施形態において、ＩＬ４結合タンパク質の結合ドメインは、本明細書に記載及び例示されるように、Ｎキャッピングモジュール及びＣキャッピングモジュールを含む。
【００７０】
本発明のＩＬ１３結合ＡＲ組成物は、結合タンパク質の式（Ｎキャップ−［ＡＲ］n−Ｃキャップ（Ｉ））に準拠し、ＫDが１０-6Ｍ以下、ＫDが１０-7Ｍ以下、ＫDが１０-8Ｍ以下、又はＫDが１０-9Ｍ以下として測定されるＩＬ１３に結合するための親和性を有する、２つ又は３つの反復モジュールを有し、結合タンパク質分子は、配列番号１の反復モジュールで構成される。ＩＬ４結合タンパク質の一実施形態において、ＡＲドメインは、配列番号１０８〜１５５のいずれかから選択される配列を有する反復モジュールを含む。
【００７１】
本発明、ＩＬ１３結合タンパク質の特定の実施形態において、ＡＲ１反復配列は、配列番号１０８〜１２５からなる群から選択され、配列番号１０９〜１４３からなる群から選択される第２の設計されたアンキリン反復ドメイン（ＡＲ２）が続き、任意でこの第２の設計されたアンキリン反復単位には、配列番号１４４〜１５５からなる群から選択される第３の設計されたアンキリン反復ドメイン（ＡＲ３）が続く。
【００７２】
より具体的に、本発明は、コンセンサス配列（モチーフ）に由来するか、又は反復単位の多配列整合から得られる様々な位置で特定のアミノ酸の同定が頻繁に観察される、ＩＬ１３結合タンパク質を包含する。例えば、ＩＬ１３結合タンパク質は、配列番号１の配列モチーフを有する、縦一列に配置されるアンキリン反復モジュールＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３を含んでよく、ＡＲ１モジュールは、式：
Ｘ1ＤＸ2−Ｘ3−ＧＳＴＰＬＨＬＡＡ−ＲＨ−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ｗから選択され、Ｘ2は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、及びＶから選択され、Ｘ3は、Ｆ又はＹであり、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（式ＡＲ１−Ｃ、配列番号１５６）。
ＡＲ２モジュールは、式：
Ｘ1ＤＦＩＧＤＴＰＬＨＬＡＡＹ−Ｘ4−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｅ、Ｈ、Ｍ、及びＦから選択され、Ｘ4は、Ｈ又はＲであってよく、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（式ＡＲ２−Ｃ、配列番号１５８）。
ＡＲ３モジュールは、式：
Ｘ1Ｄ−Ｘ2ＴＧＥＴＰＬＨＬＡＡ−Ｘ5Ｘ6−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ1は、Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｅ、及びＭから選択され、Ｘ2は、Ａ、Ｉ、Ｔ、及びＶから選択されるか、又は不在であり、Ｘ5Ｘ6は、ＳＭ、ＨＬ、ＹＨから選択される一対の残基であり、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであってよく（式ＡＲ３−Ｃ、配列番号１６０）、括弧内に現れる残基は、代替で使用される。
【００７３】
ＩＬ１３結合タンパク質の一実施形態において、ＡＲドメインは、配列番号１０８〜１５５のいずれかから選択される配列を有する反復モジュールを含む。別の実施形態において、ＡＲドメイン、Ｎキャップ、及びＣキャップモジュールを有する結合タンパク質は、Ｎキャップ−［ＡＲ１−Ｃ：ＡＲ２−Ｃ：ＡＲ３−Ｃ］−Ｃキャップ（反復モジュールが配列番号１５６、１５８、及び１６０により特定される）、又はＮキャップ［ＡＲ１−Ｆ：ＡＲ２−Ｆ：ＡＲ３−Ｆ］−Ｃキャップ（反復モジュールが配列番号１５７、１５９、及び１６１により特定される）、あるいはＮキャップ−［ＡＲ１−Ｏ：ＡＲ２−Ｏ：ＡＲ３−Ｏ］−Ｃキャップ（反復モジュールが配列番号１６８、１６９、及び１７０により特定される）等のタンデム反復モジュールについて、本明細書に提供される式を使用して構成されてよく、Ｎキャップ及びＣキャップは、それぞれ配列番号２若しくは１７１、並びに配列番号３及び１７２によって、又は本明細書に記載される修飾若しくは更なる化学的連結、生物学的処理等に必要な修飾によって特定される。
【００７４】
配列番号１０８〜１５５から選択される反復単位配列を含むＩＬ１３に対して結合特異性を持つ少なくとも１つの反復ドメインを含むＩＬ１３結合タンパク質は、宿主細胞内での発現を向上させ、１つ以上の残基が酸化を経る可能性を低減し、残基が化学的アミド分解を経る可能性を低減し、結合タンパク質が投与される宿主が免疫応答を実装する可能性を低減する目的で、その配列を修飾してよく、及び／又は１つ以上の残基が、ＩＬ１３結合タンパク質を別のタンパク質若しくは部分と結合する目的で付加又は修飾される。結合タンパク質は、水溶液中の結合特異性、親和性、及び溶解度の生物物理学的特徴、並びに自己凝集する傾向の欠如を保持し、４５℃を超える融解温度を有する。
【００７５】
一実施形態において、本発明はＩＬ１３結合タンパク質であり、配列番号１０８〜１５５から選択される１つのアンキリン反復モジュールは、配列番号２及びその変異型を含むＮキャップが先行する。この変異型は、配列番号１と、ＩＬ１３タンパク質及び／又はＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑに結合する配列番号１６２〜１６７の分子のいずれかに対して７５％以上の同一性を有する分子とを含む。別の実施形態において、本発明はＩＬ１３結合タンパク質であり、配列番号１６２〜１６７から選択される１つのアンキリン反復ドメインは、配列番号３及びその変異型を含むＣキャップが後に続く。本明細書に例示された更なる実施形態において、ＡＲ単位タンデム配置は、結合タンパク質内の特定位置でのＡＲ配列モチーフに対応する指定された配列番号によって表４に特定されるとおりである。
【００７６】
一実施形態において、本発明はＩＬ１３結合タンパク質であり、配列番号１０８〜１５５から選択される１つのＡＲ単位は、配列番号２及びその変異型を含むＮキャップが先行する。この変異型は、配列番号１と、ＩＬ１３タンパク質に結合する配列番号１０８〜１５５の分子のいずれかに対して７５％以上の同一性を有する分子とを含む。別の実施形態において、本発明はＩＬ１３結合タンパク質であり、配列番号１０８〜１５５から選択される１つのＡＲ単位は、配列番号３及びその変異型を含むＣキャップが後に続く。
【００７７】
選択された反復ドメインとＩＬ１３への結合のためにＩＬ１３Ｒα２と競合する結合タンパク質は、競合酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の当業者に良く知られている方法によって同定され得る。更に、１つ以上の修飾された反復単位配列を有する修飾された結合タンパク質は、ＩＬ１３に結合するためにＩＬ１３Ｒα２と競合することが知られている結合タンパク質とＩＬ１３への競合結合を使用して、活性について試験され得る。
【００７８】
機能特性
選択された反復ドメインとＩＬ１３への結合のためにＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２と競合するＩＬ４又はＩＬ１３結合タンパク質に結合するためにＩＬ４ＲＡと競合するＩＬ４結合タンパク質は、競合酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の当業者に良く知られている方法によって同定され得る。更に、１つ以上の修飾された反復単位配列を有する修飾されたＩＬ４又はＩＬ１３中和結合タンパク質が生成されることが望ましい場合、修飾された結合タンパク質の活性は、修飾されていないタンパク質と修飾された結合タンパク質との競合結合を使用して、活性について試験され得る。修飾されたＩＬ４結合タンパク質は、ＩＬ４に結合するために既知のＩＬ４結合タンパク質との教護において試験され得、修飾されたＩＬ１３結合タンパク質は、ＩＬ１３に結合するためにＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２と競合することが知られているＩＬ１３結合タンパク質との競合において試験され得る。
【００７９】
修飾された結合タンパク質の一実施形態において、該反復ドメインの反復モジュールのアミノ酸残基の１つ以上は、反復単位の整合上で対応する位置で見出されるアミノ酸残基と交換される。一態様において、アミノ酸残基の最高３０％が交換され、より多くの場合、最高２０％、及び更により頻繁にアミノ酸残基の最高１０％が交換される。最も好ましくは、交感された残基のソースは、天然に存在する反復単位である反復単位である。更に別の特定の実施形態において、アミノ酸残基は、反復単位の対応する位置で見出されないアミノ酸と交換される。
【００８０】
更なる実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ４及び／又はＩＬ１３結合タンパク質若しくはドメインは、１つ以上の追加の部分に共有結合され得、例えば、血液循環中の持続を改善するか、又は体内からの脱離を減少させる（すなわち、薬物動態を改善する）部分、標識部分（例えば、フルオレセイン等の蛍光標識、又は放射性トレーサー）、タンパク質精製を促進する部分（例えば、Ｈｉｓタグ若しくはｓｔｒｅｐタグ等の小ペプチドタグ）、エフェクター機能に改善された治療的有効性を提供する部分（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を提供する抗体のＦｃ部分）、緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ）等の毒性タンパク質部分、又はメイタンシノイド、カリケアミシン、若しくはプラチナ含有ＤＮＡアルキル化剤等の小分子毒性剤を含む。改善された薬物動態は、認識される治療的必要性により評価され得る。多くの場合、生物学的利用能を増加させること、及び／又は恐らくタンパク質が投与後の血清中で依然として入手可能である時間を増加させることによって、投与間の時間を増加させることが望ましい。場合によっては、経時的なタンパク質の血清濃度の継続を改善する（例えば、投与直後と次の投与の直前とのタンパク質の血清濃度の差を減少させる）ことが望ましい。血液からのタンパク質のクリアランスを遅延させる部分としては、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖（例えば、シアル酸）、良好な耐容性を示すタンパク質部分（例えば、Ｆｃ断片又は血清アルブミン）、及び豊富な血清蛋白質に対して特異性及び親和性を持つ結合ドメイン又はペプチド、例えば、血清アルブミンに結合することができるものが挙げられる。
【００８１】
核酸及び使用
更なる実施形態において、本発明は、特定のＩＬ４及び／又はＩＬ１３結合タンパク質をコードする核酸分子、及び更には核酸分子を含むベクターに関する。広くは、細菌発現ベクターは、（１）通常はウイルスプロモーター又はエンハンサー配列の形態であり、広い宿主及び組織範囲を特徴とする調節要素と、（２）ベクター内のＤＮＡ断片の挿入を促進する配列と、（３）最終タンパク質をコードする配列とを含有する。ベクターは、同様に（４）多くの場合、抗生物質（例えば、アンピシリン）に対する耐性を付与し、初期の正の形質転換体の選択を許可する、選択可能なマーカー遺伝子（複数可）（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子）、及び（５）細菌及び哺乳類宿主細胞におけるベクターの複製を促進する配列、又は宿主のゲノムへの安定した挿入を促進する配列も含有する。プラスミド複製起点は、大腸菌等の細菌内での発現構成体の増殖のために含まれており、ＳＶ４０複製起点は、Ｃｏｓ細胞内の一過性発現のために、発現プラスミド中に含まれている。加えて、上述の特性を有する好適な哺乳類細胞株が使用され得る。
【００８２】
したがって、本発明は、ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質反復ドメイン及びタンパク質の組み換え発現において使用される宿主細胞、並びに宿主細胞がかかるタンパク質をコードする核酸を含む、ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質を含むより複雑な構成体を検討する。ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質は、かかる宿主細胞が当該技術分野において既知の方法によって、バッチ又は連続培養として維持される培養物から生成され得る。単離されたタンパク質は、精製を促進し、その意図される用途でタンパク質の最終処方及び包装前に後次的に除去され得る、タグ等の付随部分と共に発現され得る。
【００８３】
ＩＬ４及びＩＬ１３結合反復タンパク質の処方及び使用
本発明の医薬組成物は、上述の結合タンパク質、特に、反復ドメインを含む結合タンパク質のうちの１つ以上、又は特定の結合タンパク質をコードする核酸分子、並びに任意で薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、当業者に既知であり、以下で更に詳細に説明される。なおも更に、本発明は、上述の結合タンパク質、特に、反復ドメインを含む結合タンパク質のうちの１つ以上を含む診断的組成物を含む。ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質をコードする核酸の送達が行われる場合、治療ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中にベクターを含み得るか、又はベクターが組み込まれる徐放マトリックスを含み得る。あるいは、完全なベクターを組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからインタクトに生成できる場合、医薬品は核酸送達系を生成する１つ以上の細胞を含むことができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質を含む安定した処方であり、水性リン酸緩衝生理食塩水又は混合塩溶液、あるいは、保存溶液及び処方、薬学的に許容される処方中の医薬的又は動物への使用に適した多用途保存処方であり得る。他のタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含む、好適なビヒクル及びそれらの処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１st  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。インビボ投与に使用される処方は、無菌又は滅菌であり得る。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって（熱、ガス、又は化学滅菌等の他の方法が適用されてもよい）、又は処方の成分の一部又は全てに電離放射線を使用することによって、容易に達成される。
【００８５】
医薬組成物は、熟練した施術者の知識の範囲内で任意の好適な方法により投与されてよく、この投与は、別の者によって行われ得るか、又は自己投与され得る。投与経路は、これらに限定されないが、静脈内（Ｉ．Ｖ．）；筋肉内（Ｉ．Ｍ．）；皮下（Ｓ．Ｃ．）；経皮；肺；経粘膜（経口、鼻孔内、膣内、直腸）；錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子状の処方を使用する、シリンジ、埋め込まれたデバイス、浸透性ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；又は当該技術分野においてよく知られるように、熟練者により評価されている他の手段を含む、様々な送達方法から選択され得る。
【００８６】
例えば、部位特異的投与は、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段などの身体区画また腔に対するものであり得る。
【００８７】
ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質は、ジェットネブライザ又は超音波ネブライザ等のネブライザにより気道に直接投与され得る。典型的には、ジェットネブライザ中では、オリフィスを通して高速の空気ジェットを作り出すのに圧縮空気供給源を使用する。ガスがノズルを超えて膨脹する際に低圧領域が作り出され、それが液体リザーバに接続された毛細管を通してタンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流は、それが管を出る際に不安定な糸状体及び液滴に剪断されてエアゾールを作り出す。ある範囲の構成、流量及びバッフル型を、所定のジェットネブライザから所望の性能の特徴を達成するのに使用し得る。超音波ネブライザにおいては、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電変換器を使用して、振動性の機械的エネルギーを作り出す。このエネルギーが、直接又はカップリング液を通じてタンパク質の処方に伝播されて、タンパク質を含むエアゾールを作り出す。有利には、ネブライザにより送達されるタンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの範囲の粒径を有する。
【００８８】
適応症
本発明は更に、ＩＬ４及びＩＬ１３媒介性疾患及び病変、特にぜんそく及び肺線維症等の呼吸器系病変、心臓血管病変、癌、皮膚病変、及び線維性病変の治療の新規方法を提供する。本発明は、高親和性ＩＬ４／ＩＬ１３二重特異性結合タンパク質、及びそれらをコードし、ＩＬ４の生物活性をインビトロ、インビボ、又はその場で遮断することができる、これらに限定されないが、ＩＬ−４ＲＡ又はその断片に結合するヒトＩＬ４の野生型又は天然変異型を阻害することができる、ＩＬ４の存在下で、細胞上のＩＬ４  ＲＡ複合体がシグナル伝達するのを阻害することができる、及び未感作Ｔ細胞のＴｈ２細胞へのＩＬ４依存性分化を防止又は抑制することができる、核酸を提供する。
【００８９】
ＩＬ１３を結合及び中和することができる結合タンパク質は、ＩＬ１３のヒトＩＬ１３受容体α１（ＩＬ１３Ｒα１）（ＵｎｉＰｒｏｔ．Ｐ７８５５２）若しくはその断片の結合を阻害すること、ヒトＩＬ１３若しくはヒトＩＬ１３の天然変異型のヒトＩＬ１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）（ＵｎｉＰｒｏｔ．Ｑ１４６２７）若しくはその断片への結合を阻害すること、ヒト腫瘍細胞のヒトＩＬ１３依存性増殖を防止又は抑制すること、ヒトＩＬ１３依存性ＩｇＥ生成を阻害すること、組織の好酸球浸潤を低減すること、から選択される１つ以上の特性を有し、これらのタンパク質は、ヒトＩＬ１３上の特定の結合部位を有する。
【００９０】
一態様において、アレルギー性ぜんそく、重度のぜんそく、困難なぜんそく、脆性ぜんそく、夜間のぜんそく、月経前ぜんそく、ステロイド耐性ぜんそく、ステロイド依存性ぜんそく、アスピリン誘発性ぜんそく、成人発症ぜんそく、小児ぜんそく、若しくは運動誘発性ぜんそくと命名され得るぜんそくの形態、アトピー性皮膚炎等のアトピー性疾患、アレルギー性鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、全身性進行性硬化症、肝線維症、放射線誘発性線維症、化学療法誘発性線維症等の線維性疾患又は障害、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキンス病等の細胞周期調節の疾患、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病からなる群から選択した疾患又は障害に罹患したヒト患者を治療する方法は、治療上有効な量のＩＬ４／ＩＬ１３結合タンパク質を投与する工程を含む。
【００９１】
ＩＬ４／ＩＬ１３関連障害又は病変の例としては、これらに限定されないが、ＩｇＥ関連障害（これに限定されないが、例えば、ＩＬ４／ＩＬ１３に対する感受性の増加に起因するアトピー性障害（例えば、アトピー性皮膚炎、じんま疹、湿疹、並びにアレルギー性鼻炎及びアレルギー性胃腸炎等のアレルギー性病変）を含む）；呼吸器障害、例えば、ぜんそく（例えば、アレルギー性及び非アレルギー性ぜんそく（例えば、低年齢の小児における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）等の感染に起因するぜんそく））、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び気道炎症、好酸球増多、線維症、及び過剰な粘膜生成を伴う他の病変、例えば、嚢胞性線維症及び肺線維症、全身性硬化症（ＳＳｃ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）及びサルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、呼吸器細気管支炎関連間質性肺疾患、器質化肺炎を伴う突発性閉塞性細気管支炎；リンパ球性間質性肺炎；ランゲルハンス細胞肉芽腫症；特発性肺ヘモジデリン沈着症；急性気管支炎；肺胞タンパク症；気管支拡張症；無気肺；嚢胞性線維症；炎症性及び／又は自己免疫性障害若しくは病変、胃腸障害若しくは病変（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び好酸球性食道炎（ＥＥ）、並びに好酸球媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、及び／又はクローン病）、肝臓障害若しくは病変（例えば、肝硬変、肝細胞癌）、及び強皮症；腫瘍若しくは癌（例えば、軟組織若しくは固形腫瘍）、例えば、白血病、グリア芽細胞腫、及びリンパ腫（例えば、ホジキンスリンパ腫）；ウイルス感染（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉから）；他の器官の線維症、例えば、肝臓の線維症（例えば、Ｂ型及び／若しくはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる線維症）；及び保護的１型免疫応答の発現の抑制（例えば、ワクチン接種中）のうちの１つ以上から選択される障害が挙げられる。
【００９２】
対象を治療する方法は、障害又は病変の１つ以上の症状を低減するために有効な量（例えば、対象における呼吸器症状（例えば、気管支収縮）、ＩｇＥレベル、ヒスタミン若しくはロイコトリエンの放出レベル、又はエオタキシンレベルのうちの１つ以上を低減するために有効な量）の高親和性ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質を投与する工程を含む。予防的使用の場合（例えば、障害若しくは病変の１つ以上の症状の発症又は再発を防止、低減、又は遅延させるため）、対象は、その障害又は病変の１つ以上の症状を有していてもいなくてもよい。
【００９３】
一実施形態において、高親和性ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ４又はＩＬ１３関連障害の早期段階と関連付けられる１つ以上の症状、例えば、「早期ぜんそく反応」又は「ＥＡＲ」を阻害又は低減する。例えば、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＥＡＲと関連付けられる１つ以上の症状を、侵襲（例えば、アレルゲン曝露）後約０．２５〜３時間の時点で、侵襲（例えば、アレルゲン曝露）後約３時間まで低減する。ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質の不在下での対象における症状のレベル又は程度と比較して、ＥＡＲの１つ以上の症状を減少又は防止することができる。あるいは、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、例えば、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質の不在下での対象における症状のレベル又は程度と比較して、症状の増加を防止することができ、これらに限定されないが、例えば、気道肥満細胞若しくは好塩基性細胞からのロイコトリエン及び／又はヒスタミン等の少なくとも１つのアレルギー性媒介物質の放出；ロイコトリエン及び／又はヒスタミン等の少なくとも１つのアレルギー性媒介物質のレベルの増加；気管支収縮；及び／又は気道浮腫を含む。
【００９４】
他の実施形態において、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ４又はＩＬ１３関連障害の後期段階と関連付けられる１つ以上の症状、例えば、「後期ぜんそく反応」若しくは「ＬＡＲ」を阻害又は低減する。例えば、ＩＬ１３結合タンパク質は、ＬＡＲと関連付けられる１つ以上の症状を、例えば、侵襲（例えば、アレルゲン曝露）後約３時間〜最長約２４時間の時点で低減する。例えば、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＬＡＲの１つ以上の症状（例えば、結合タンパク質の不在下での対象における症状のレベル又は程度と比較して）、例えば、気道反応性及び／又はリンパ球、好酸球、及び／若しくはマクロファージ等の炎症細胞の、例えば、気道及び／若しくは気管粘膜における流入及び／若しくは活性を減少又は防止することができる。あるいは、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質の不在下での対象における症状のレベル又は程度と比較して、症状の増加を防止することができる。
【００９５】
ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ４／ＩＬ１３障害若しくは病変と関連付けられる１つ以上の症状の発症又は再発に先行して、その障害若しくは病変と関連付けられる症状の完全な発現前に投与され得る。ある実施形態において、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ４／ＩＬ１３関連障害若しくは病変、例えば、アレルゲン、汚染物質、毒性薬剤、感染及び／若しくはストレスを誘発又は増悪させる薬剤に曝露する前に、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、ＩＬ１３関連障害若しくは病変を誘発及び／又は増悪させる薬剤に曝露する前、曝露中、又は曝露直後に投与される。例えば、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、誘発剤又は増悪剤への曝露から１、５、１０、２５、若しくは２４時間；２、３、４、５、１０、１５、２０、若しくは３０日；又は４、５、６、７、又は８週間以上前又は後に投与され得る。典型的に、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、誘発剤又は増悪剤への曝露から２４時間〜２日前又は後の任意の時点で投与され得る。
【００９６】
本発明の別の実施形態において、ヒトＩＬ４若しくはＩＬ１３又は天然に存在する変異型の活性を阻害するＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、上記のように、第２の結合タンパク質又はＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質と付加的若しくは相乗的に作用し得るか、又は１つ以上の疾患症状若しくは後遺症を軽減するための相補機序を通じて作用し得る、小分子である活性剤と併せて使用され得る。例えば、ＩＬ４拮抗薬であるＩＬ４結合タンパク質は、ＩＬ１３結合タンパク質と共に投与され得る。多くの疾患病理は多要因であるため、有効性は、１つの経路上の複数の標的又は異なる経路上の複数の標的を阻害する薬剤を複合することによって改善され得る。本発明のＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質の１つの利点は、１つの結合タンパク質が１つの標的を阻害し、第２の結合タンパク質が異なる標的又は複数の標的を阻害するように、それらを一緒に遺伝的結合する能力である。あるいは、特定のシステイン残基は、結合を干渉しない結合タンパク質上の固有の一に導入され得、小分子治療薬を直接結合するために使用され得る。ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質と第２の治療薬との共投与も可能である。
【００９７】
追加の実施形態は、制限なしに、心臓血管病変、呼吸器病変、癌、皮膚病変、及び線維性病変を含む、ＩＬ４／ＩＬ１３関連障害又は病変を治療するため、より具体的に、ぜんそく及び／又は肺線維症を治療するための薬剤製造のための本発明による結合タンパク質の使用である。
【００９８】
ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質と共投与及び／又は共処方され得る好適な追加の治療薬の例としては、吸入ステロイド；β作動薬、例えば、短時間作用型若しくは長時間作用型β作動薬；ロイコトリエン若しくはロイコトリエン受容体の拮抗薬；ＡＤＶＡＩＲ（登録商標）等の混合薬；ＩｇＥ阻害剤、例えば、抗ＩｇＥ抗体（例えば、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））；ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ＰＤＥ４阻害剤）；抗コリン作用薬；クロモリン等の肥満細胞安定剤；ＩＬ４阻害剤（例えば、ＩＬ４阻害剤抗体、ＩＬ４受容体融合若しくはＩＬ４突然変異タンパク質）；ＩＬ５阻害剤；エオタキシン／ＣＣＲ３阻害剤、及び抗ヒスタミンが挙げられる。かかる混合は、ぜんそく及び他の呼吸器障害を治療するために使用され得る。ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質と共投与及び／又は共処方され得る治療薬の追加の例としては、特に、ＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５若しくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体又はその誘導体、例えば、７５ｋｄ  ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））；ＴＮＦ酵素拮抗薬、例えば、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン受容体拮抗薬；ＴＧＦβ拮抗薬；インターフェロンγ；ペルフェニドン；化学療法薬、例えば、メトトレキサート、レフルノミド、又はシロリムス（ラパマイシン）若しくはそれらの類似体、例えば、ＣＣＩ−７７９；ＣＯＸ２及びｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；免疫調節薬；及びＮＦｋＢ阻害剤のうちの１つ以上が挙げられる。
【００９９】
ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質を生成する方法
本発明によるＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合タンパク質は、リボソーム表示（国際公開第ＷＯ  ９８／４８００８号）、バクテリオファージの表面上の表示（同第ＷＯ  ９０／０２８０９号、同第ＷＯ  ０７／００６６６５号）（折り畳まれたタンパク質のエクスポートを許可する、異なるシグナル配列が必要とされ得る；Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＪＭＢ  ２００８  ３８２（５）１２１１〜１２２７）若しくは細菌細胞（第ＷＯ  ９３／１０２１４号）、プラスミド上の表示（第ＷＯ  ９３／０８２７８号）、又は細胞内発現及びタンパク質相補アッセイ（第ＷＯ  ００／３２８２３号）等による選択若しくはスクリーニング（第ＷＯ  ９８／３４１１２０号）等のいくつかの方法により得られる、及び／又は更に進化され得る。かかる方法は、当業者に既知である。
【０１００】
本発明による結合タンパク質の選択、スクリーニング、及び特性化に使用されるアンキリン反復タンパク質のライブラリは、当業者に既知のプロトコルに従って得られ得る（国際公開第ＷＯ  ０２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，３３２，４８９〜５０３，２００３、及びＢｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ）。ヒトＩＬ４及びＩＬ１３特異的結合タンパク質の選択のためのかかるライブラリの使用は、実施例１に示される。同様に、上に提示されるアンキリン反復配列モチーフを使用して、ヒトＩＬ４及び／若しくはＩＬ１３結合タンパク質の選択又はスクリーニングに使用され得る、アンキリン反復タンパク質のライブラリを構築することができる。更に、本発明の反復ドメインは、本発明による反復モジュール及び適切なキャッピングモジュール（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５３９，２〜６，２００３）から、標準組み換えＤＮＡ技術（例えば、第ＷＯ  ０２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．及びＢｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ）を使用して、モジュール構成され得る。
【０１０１】
所望のＩＬ４及び／若しくはＩＬ１３結合反復モジュールをコードする核酸が、例えば、結合ドメインを形成するように縦一列の反復でコードされる設計された反復モジュールを含む、本明細書に記載されるライブラリから同定されるとき、それらは、ＩＬ４及びＩＬ１３二重特異性結合ドメインを調製及び精製する目的で、治療薬としての使用又は宿主細胞の構成のための発現ベクターを形成するために単離及び使用される。宿主細胞は、細菌、昆虫、植物、又は哺乳類であり得る、及び／又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２，６５３、ＳＰ２／０，２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞から選択され得るか、又は前述の細胞型若しくは細胞株に関連する任意の誘導型、サブライン、不死化、又は形質転換細胞であり得る。
【０１０２】
本発明は、実施例に記載される特定の実施形態に制限されない。他のソースは、以下に記載される一般的な概要に従って使用及び処理され得る。
【実施例】
【０１０３】
以下に開示される出発物質及び試薬の全ては、当業者に既知であり、市販されているか、又はよく知られる技術を使用して調製され得る。
【０１０４】
材料
化学物質は、Ｆｌｕｋａ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。特に指定のない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）から入手した。クローニング及びタンパク質生成株は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）であった。使用されるＰＢＳは、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸、及び２．７ｍＭ  ＫＣｌをｐＨ  ７．４で含有した。
【０１０５】
設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリ
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリが説明される（国際公開第ＷＯ  ０２／２０５６５号；Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：５７５〜８２，２００４；Ｂｉｎｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３２：４８９〜５０３，２００３）。Ｎ２Ｃ（例えば、２アンキリン反復モジュール）及びＮ３Ｃ（例えば、３アンキリン反復モジュール）における桁は、Ｎ末端キャッピングモジュールとＣ末端キャッピングモジュールとの間に存在するランダム化アンキリン反復モジュールの数を説明する。反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．に基づき、反復モジュールと反復単位との境界が１つのアミノ酸位置によりシフトされるという修飾を有する。例えば、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）の反復モジュールの位置１は、本開示の反復モジュール（配列番号１）の位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．の反復モジュール又はＮキャップモジュールの位置３３は、本明細書に記載されるように、以下の反復モジュールの位置１に対応する。ＤＮＡ配列の全ては、配列決定によって確認した。
【０１０６】
実施例１：ＩＬ４及びＩＬ１３に対して結合特異性を有する反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
ＩＬ４及びＩＬ１３結合特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、リボソーム表示（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって、組み換えヒトＩＬ４標的タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０５１１２、配列番号４）及びＩＬ１３タンパク質を使用して行った。
【０１０７】
ヒトＩＬ４結合タンパク質の選択及びスクリーニング
ビオチニル化ヒトＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃２００−０４、大腸菌内で生成される成熟タンパク質）に関する計９ラウンドのリボソーム表示選択は、Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ  ＡＲタンパク質ライブラリを用いて行った。最初の４ラウンドは、以前に公開されたプロトコルによる標準リボソーム表示選択ラウンドであって、標的濃度の減少及び洗浄厳密性の増加を使用して、１ラウンドから４ラウンドまでの選択圧を増加させる（Ｂｉｎｚ，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｋｏｈｌ，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｂｒｉａｎｄ，Ｆｏｒｒｅｒ，Ｇｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：５７５〜８２，２００４、Ｚａｈｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２６９〜７９，２００７）。これら初期の４ラウンド後のプールは、粗抽出物ＥＬＩＳＡ及び粗抽出物細胞ＨＥＫ／ＳＴＡＴ６機能アッセイによるヒトＩＬ４への結合剤についてスクリーニングした。選択された結合剤は、単一クローンのＳＰＲ測定値により明らかにされるように（データ図示せず）、ナノモル親和性（ＫD）であった。
【０１０８】
より親和性の高いＡＲタンパク質を特異的に補強するために、それぞれ１つ又は２つの標準選択ラウンドが後に続く、選択厳密性が増加した２つのオフ速度選択ラウンドは、最初の４ラウンド後に行った（Ｚａｈｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：３５１６７〜７５，２００６）。
【０１０９】
このリボソーム表示の６番目のラウンドに続いて、これらのラウンドから得られる単一のクローンを粗抽出物細胞ＨＥＫ／ＳＴＡＴ６機能アッセイによりスクリーニングして、最も有能な候補を同定した。選択されたＡＲタンパク質のプールは、Ｔ５プロモーター系発現ベクターにサブクローン化した。発現に続いて、２００個の個別のＡＲタンパク質からの粗溶解物は、ＥＬＩＳＡにより組み換えＩＬ４の結合について、ＨＥＫ−ＳＴＡＴ６細胞内のＩＬ４依存性ＳＴＡＴ６リン酸化反応の阻害について評価した。溶解物は、特定のＡＲタンパク質をコードするプラスミドを大腸菌ＸＬ−１青色細胞に形質転換することによって調製した。５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％グルコースを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中の１．２ｍＬスターター培地に、単一コロニーを植菌した。スターター培地は、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で一晩培養した。翌日、一晩培養物の一部を０．９ｍＬ  ＬＢの接種材料として使用した。タンパク質発現は、５００μＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して誘発させた。培地は、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で４時間培養した。遠心分離によって細胞ペレットを採取し、５０μＬ  Ｂ−Ｐｅｒ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解した。これらの溶解物は、それらを後次のスクリーニングアッセイにおいて使用する前にＰＢＳで希釈した。
【０１１０】
ＩＬ４への結合を評価するために、結合タンパク質を含有する溶解物の各粗抽出物を、ニュートラアビジン及びビオチン化ＩＬ４で事前コーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間培養した。広範囲の洗浄後に、結合したＡＲタンパク質が、抗ＲＧＳ−Ｈｉｓ６−ＨＲＰ共役（３４４５０、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して検出された。
【０１１１】
平行して、同一の２００単一クローン大腸菌溶解物を細胞阻害アッセイに付した。各粗抽出試料の活性は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（商標）、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＳＴＡＴ６のＩＬ４依存性活性を阻害するそれらの能力についてアッセイした。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞の刺激は、以下のように行った。１日目に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに、１００μＬの細胞培養培地（４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ（１１９９５、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（１００８２、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０μｇ／ｍＬのブラスチシジンＳ、ペプチジルヌクレオシド抗生物質活性物質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、及び１００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、ストレプトミセスＣＬ９９０（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により生成された銅キレート化グリコペプチド抗生物質中、２．５×１０5／ｍＬの密度で８時間置いた。同日に、５０ｐｇ／ｍＬ（３．３ｐＭ）ヒトＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と事前混合された希釈されたＡＲタンパク質粗抽出物を含有する１００μＬの細胞培養培地を添加した。プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ2で一晩培養した。分泌された胚アルカリ（商標）ホスファターゼを測定するために、３０μＬの各細胞上清を８０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と、クリアな９６ウェルプレート内で混合した。プレートを３７℃で１時間培養し、プレートリーダーを使用して６２０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１１２】
２００クローンの初期スクリーニングは、ＩＬ４に対して高い親和性で結合し、シグナル伝達を効果的に阻害するＡＲタンパク質をほんのわずかに生成したため、オフ速度選択によってリボソーム表示の追加のラウンド（ラウンド７、８、及び９）に続いて得られる５１００超のＡＲタンパク質の単一クローン粗抽出物は、上記のように、ＩＬ４依存性ＳＴＡＴ６リン酸化反応を阻害するそれらの能力について試験した。これらのクローンの活性を、このアッセイにおいて、ベンチマークＡＲタンパク質、クローンＣ０６＿２８Ｅ５と比較したところ、第１ラウンドのスクリーニングにおいて、ＳＰＲにより明らかにされるように、５０ｐＭの明らかな親和性でＩＬ４に結合し、３ｐＭ  ＩＬ４の存在下で、３ｐＭのＩＣ５０でＳＴＡＴ６の生成を阻害することが分かった。よって、後次に選択されたクローンをベンチマークの試験値と比較することは、追加の高い能力の候補の適切な選択を可能にした。
【０１１３】
ＳＴＡＴ６リン酸化反応スクリーニングの結果に基づいて、ベンチマークのそれと比較してより良好であるか、又は等しい活性を有するＩＬ４の阻害を示した２２  ＡＲタンパク質（配列番号９〜３０）を、更なる特性化のために選択した。
【０１１４】
ＩＬ１３結合特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＩＬ１３変異型（Ｒ１３０Ｑ）標的タンパク質を使用して、リボソーム表示（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）により行った。ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ変異型（配列番号１のＲ１１０Ｑ）は、アトピー患者と関連があるヒトＩＬ１３の変異型である（Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：９８０〜９８７，２００２）。
【０１１５】
ヒトＩＬ１３結合タンパク質の選択及びスクリーニング
ヒトＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に関する計６ラウンドのリボソーム表示選択は、Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ  ＡＲライブラリの両方を用いて溶液中で行った。最初の４ラウンドの選択は、標準リボソーム表示選択を採用し、標的濃度の減少及び洗浄厳密性の増加を使用して、１ラウンドから４ラウンドまでの選択圧を増加させる（Ｂｉｎｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２：５７５〜５８２，２００４）。４ラウンドのパニング後、ＥＬＩＳＡ形式を使用して、粗抽出物中のヒトＩＬ１３への結合剤についてスクリーニングした。選択された結合剤は、単一クローンのＢＩＡｃｏｒｅ測定値により明らかにされるように（データ図示せず）、ナノモル親和性であった。
【０１１６】
４ラウンド目のリボソーム表示選択に続いて、選択された結合タンパク質のプールをＴ５プロモーター系発現ベクターにクローン化した。発現に続いて、２００の個別の結合タンパク質を、ニュートラアビジンプレート上で捕捉されたヒトＬ１３  Ｒ１３０Ｑに粗抽出物として結合することについて評価した。これらのうち、ＥＬＩＳＡによる最高の結合シグナルを有する３２個の結合タンパク質が発現され、固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製され、ＥＬＩＳＡ形式を使用して、ヒトＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ融合へのＩＬ１３Ｒ１３Ｑ依存性結合を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。結合タンパク質候補（１０ｎＭ又は１００ｎＭ最終濃度）は、１０ｎＭビオチン化ヒトＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑで３０分間事前培養し、結合タンパク質−ＩＬ１３混合物を、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で事前コーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートに添加し、１５分間培養して、遊離ビオチン化ＩＬ１３を捕捉し、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して検出した。結合タンパク質により生成される阻害の相対量は、結合タンパク質を添加しない１０ｎＭビオチン化Ｉｌ１３について測定されたシグナルと比較することによって評価した。ＩＬ１３Ｒ１３０Ｑに等モルである、１０ｎＭ結合タンパク質でのこのスクリーニングアッセイの結果に基づいて、ＩＬ１３結合タンパク質２Ｆ１を、全ての更なるスクリーニングのためのベンチマークとして選択した。
【０１１７】
より高い親和性のヒトＩＬ１３結合剤を同定するために、第４ラウンドの標準リボソーム表示スクリーニング（上記）からの出力を、高い選択厳密性でオフ速度選択ラウンドに付した。最終標準選択ラウンドを行って、オフ速度選択された結合タンパク質を増幅及び回復した。再度、上記のように、ＩＬ１３への結合について粗抽出物をスクリーニングし、２Ｆ１結合タンパク質に対するシグナルを評価した。高親和性結合タンパク質と低親和性結合タンパク質との分化を可能にするために、ベンチマーク結合タンパク質２Ｆ１より強力にＩＬ１３に結合する結合タンパク質のクリアな分化を可能にしたため、１：１０の粗抽出物の希釈を選択した。約７００の結合タンパク質クローンをこの方法でアッセイした。
【０１１８】
平行して、結合についてスクリーニングされた粗抽出物を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＳＴＡＴ６のＩＬ１３依存性活性を阻害するそれらの能力について評価した。高親和性結合タンパク質と低親和性結合タンパク質との分化を可能にするために、最適な粗抽出物の希釈（１：５２００）を選択した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞において、ＩＬ１３はＩＬ１３Ｒα１：ＩＬ４Ｒ複合体（２型受容体）を活性化し、ＳＴＡＴ−６シグナル伝達経路を介して胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子の選択を誘発する。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞の刺激は、以下のように行った。１日目に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに、１０％熱不活性化ＦＢＳ（１００８２，Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む１００μＬの細胞培養培地（４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ（１１９９５、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０μｇ／ｍＬのブラスチシジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、及び１００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））中、２．５×１０5／ｍＬの密度で２４時間置いた。２日目に、１ｎｇ／ｍＬ（８０ｐＭ）ヒトＩＬ１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と事前混合された適切な濃度のＡＲタンパク質を含有する１００μＬの細胞培養培地を細胞に添加した。プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ2で２４時間培養した。分泌された胚アルカリホスファターゼを測定するために、４０μＬの各細胞上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と、クリアな９６ウェルプレート内で混合した。プレートを３７℃で２時間培養し、プレートリーダーを使用して６５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１１９】
７００の試験された粗抽出物を評価することにより、９４個の結合タンパク質が、ベンチマーク結合タンパク質２Ｆ１より高い結合及び阻害活性を示すとして同定された。ＨＥＫ／ＳＴＡＴ６及びＥＬＩＳＡスクリーニングデータを互いに対してプロットして、スクリーニング及び活性アッセイの両方においてベンチマーク結合タンパク質２Ｆ１より良好に動作した結合タンパク質を同定した（図２Ａ及び２Ｂ）。このプロットにおいて、より低いＨＥＫ／ＳＴＡＴ６シグナルは、ＩＬ１３Ｒα１を通じたＩＬ１３依存性シグナル伝達のより高い阻害を示し、ＥＬＩＳＡシグナルの増加は、ＩＬ１３の親和性の増加を示す。ベンチマーク結合タンパク質２Ｆ１は、クロスヘアの交点において塗りつぶされた三角形で示される。灰色の陰影により示される右下四分円（９４）に含まれる全ての結合タンパク質を、更なる特性化のために同定した。
【０１２０】
実施例２：ＩＬ４及びＩＬ１３結合タンパク質の特性化
更なる特性化のために選択された２２のＡＲタンパク質は、大腸菌の細胞質中のＴ５プロモーターに基づく系を使用して発現され、固定化された金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介して精製した。つまり、ＡＲタンパク質を大腸菌ＸＬ−１青色細胞中で形質転換し、それを使用して、５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％グルコースを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）内に５ｍＬスターター培養物を植菌した。スターター培地は、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で一晩培養した。翌日、一晩培養物を５０ｍＬ  ＬＢの接種材料として使用した。ＯＤ600＝０．７の細胞密度で、５００μＭイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、タンパク質発現を誘発した。培地は、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で４時間培養した。遠心分離により細胞ペレットを採取した。１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、５０ＫＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ  Ｉの添加、及び氷上で３０分間の音波処理によって細胞を破壊した。遠心分離により不溶性分留を除去した。０．２２μＭフィルターを使用して、浄化した上清を濾過した。これらの上清を、２５０μＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ上流樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）で充填したカラム上に装填した。製造者の指示に従って、精製を行った。２０ｍＭイミダゾール及び１０％グリセロールを含有する２０ｍＬトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を洗浄緩衝液として使用し、２５０ｍＭイミダゾールを含有する６００μＬ  ＴＢＳを使用して、カラムからＡＲタンパク質を溶出した。
【０１２１】
選択されたヒトＩＬ４結合ＡＲタンパク質のＳＥＣ
２２の精製されたＡＲタンパク質試料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＰＢＳ  ｐＨ  ７．４移動相を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって凝集を分析した。１０μＬの各試料を、０．３ｍＬ／分の流量で実行毎に注入した。コンアルブミン、オボアルブミン、炭酸脱水酵素、リボヌクレアーゼＡ、及びアプロチニンタンパク質標準を使用して、カラムを較正した。カラムからのＡＲタンパク質の溶出は、２１４ｎｍでの吸光度により監視した。試料の溶出プロファイルを評価して、ＭＷ標準を使用して決定される１５ｋＤａタンパク質（Ｎ２Ｃライブラリの場合）（Ｎ３Ｃライブラリの場合１８ｋＤＡタンパク質）の適量で溶出する単一ピークによって証明されるように、優先的に溶出したＡＲタンパク質候補を同定した。特性化されたＩＬ４結合ＡＲタンパク質の生物物理学的特性の結果を表１にまとめる。
【０１２２】
精製されたヒットＡＲタンパク質の親和性決定
「ヒット」として選択された精製結合剤を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ−３６装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でそれらの親和性によりランク付けした。ＰｒｏｔｅＯｎは、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ）に類似する表面プラズモン共鳴に基づいて、実時間でタンパク質−タンパク質相互作用を測定する光学生体内感知装置である。急速実験プロトコルは以下のように行った。ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、ニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造者により記載されるように、アミンカップリング化学反応を使用して、＞５０００ＲＵの密度に共役的に固定した。１つのフローセル上で、ビオチン化ＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２５０ＲＵのレベルに固定し、一方で別のフローセルは、参照として使用し、単にニュートラアビジンで固定化した。精製されたＡＲタンパク質のそれぞれから、３つの異なる濃度（２５、１２．５、６．２５ｎＭ）を分析し、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用して適合させることにより、動態パラメーターを計算した。これらの測定から各ＡＲタンパク質について得られるｋa、ｋd、及びＫDは、表１に提示され、Ｅは塩基１０である。検索された値を使用して、それらの親和性によりＡＲタンパク質をランク付けした。
【０１２３】
【表２】
2014519808.tif 000004
【０１２４】
ＡＲタンパク質組成物
発現したタンパク質として表される２２  ＡＲタンパク質の組成物は、配列番号９〜３０に示される。２２  ＡＲタンパク質は、配列番号３１〜８１により示されるように、５１の固有のＡＲモジュールを表したことが分かった。いくつかの例において、（配列番号２に基づいて）Ｄ１Ｎ、Ｋ５Ｅ、Ｒ１１Ｓ、Ａ１２Ｖ、Ｒ１９Ｈ、Ｖ２８Ａ、及びＡ３０Ｖを単独又は混合で含む、Ｎキャップモジュール内で突然変異が発生した。あるＡＲタンパク質、Ｃ０６＿２６Ｈ２は、Ｃキャップ内でＧ１６Ｒを有することが分かった（配列番号３）。
【０１２５】
ＡＲ単位の特定の配列は、モジュール及び全ての２２  ＩＬ４結合タンパク質のそれぞれについて、配列表に示される。
【０１２６】
ＡＲタンパク質結合ドメインのそれぞれの組成物は、式ＡＲ１−ＡＲ２−ＡＲ３又はＡＲ１−ＡＲ２−ＡＲ３−ＡＲ４に従って、対応する配列番号として以下の表２に列挙される。
【０１２７】
【表３】
2014519808.tif 000005
【０１２８】
１５の固有の配列（配列番号３１〜４６）により表される２２のＡＲ１モジュールを比較することにおいて、Ｔの場合はＡＲ配列モチーフのＸ1、Ｄの場合はＸ2、Ｗの場合はＸ3、及びＤの場合はＸ6において選好があった。隣接した可変位置におけるアミノ酸の対の使用（Ｘ2Ｘ3及びＸ5Ｘ6）も以下に示されるように表にした（表３）。ＤＷは、Ｘ2Ｘ3の場合に最も頻繁に発生する二重項であり、ＴＤは、Ｘ5Ｘ6の場合に最も頻繁に発生する二重項であった。よって、ＡＲ１モジュールは、アミノ酸配列によって表すことができる。
Ｘ1Ｄ−［ＤＷ］−ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＴＤ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡ、式中、Ｘ1及びＸ4は、表４に示されるように、残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（Ｃ−ＡＲ１、配列番号８２）。あるいは、ＡＲ１モチーフは、式：
ＴＤ−［ＤＷ］−ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＴＤ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列から選択され得、式中、Ｘ4は、表４に列挙される残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（Ｆ−ＡＲ１、配列番号８５）。
【０１２９】
【表４】
2014519808.tif 000006
【０１３０】
１５の固有の配列（配列番号４７〜６１）によって表される２２のＡＲ２モジュールと比較したとき、ＡＲ配列モチーフのＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、又はＸ6のいずれかにおいて、優性残基（５０％を超える頻度）はなかった。隣接した可変位置におけるアミノ酸の対の使用（Ｘ2Ｘ3及びＸ5Ｘ6）も以下に示されるように表にした（表４）。ＡＭは、Ｘ2Ｘ3の場合に最も頻繁に発生する二重項であり、ＶＹは、Ｘ5Ｘ6の場合に最も頻繁に発生する二重項であった。よって、ＡＲ２モジュールは、アミノ酸配列：
Ｘ1Ｄ−［Ｘ2Ｘ3］−Ｇ  Ｘ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［Ｘ5Ｘ6］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表すことができ、式中、Ｘ1、Ｘ2Ｘ3、Ｘ4、及びＸ5Ｘ6は、表４に示される残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（Ｃ−ＡＲ２、配列番号８３）。あるいは、ＡＲ２モチーフは、式：
Ｘ1Ｄ−［ＡＭ］−ＧＸ4ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＶＹ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡによって表される配列から選択され得、式中、Ｘ1及びＸ4は、表４の残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（Ｆ−ＡＲ２、配列番号８６）。
【０１３１】
【表５】
2014519808.tif 000007
【０１３２】
１７の固有の配列（配列６２〜７８）により表される２２のＡＲ３モジュールを比較するとき、ＡＲ配列モチーフのＸ1、Ｘ2、Ｘ3、又はＸ6のいずれかにおいて優性残基（５０％を超える頻度）はなかったが、Ｘ4及びＸ5は、最も頻繁にＦであり、Ｘ5又はＸ6の少なくとも１つは頻繁にＦ又はＹであった。隣接した可変位置におけるアミノ酸の対の使用（Ｘ2Ｘ3及びＸ5Ｘ6）も以下に示されるように表にした（表５）。ＦＹは、Ｘ5Ｘ6の場合に最も頻繁に発生する二重項であった。よって、ＩＬ４に結合するＡＲ３モジュールは、アミノ酸配列：
Ｘ1Ｄ−［Ｘ2Ｘ3］−Ｇ−Ｆ−ＴＰＬＨＬＡＡ−［Ｘ5Ｘ6］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表すことができ、式中、Ｘ1及びＸ2Ｘ3、及びＸ5Ｘ6は、表５の残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（Ｃ−ＡＲ３、配列番号８４）。あるいは、ＡＲ３モチーフは、式：
Ｘ1Ｄ−［Ｘ2Ｘ3］−Ｇ−Ｆ−ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＦＹ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列から選択され得、式中、Ｘ1及びＸ2Ｘ3は、表５に列挙される残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（Ｆ−ＡＲ３、配列番号８７）。
【０１３３】
【表６】
2014519808.tif 000008
【０１３４】
３つのＡＲ４モジュール（配列番号７９〜８１）のみが存在し、どのコンセンサス又は集中的な配列式もこのセットに適合しなかった。
【０１３５】
精製ＡＲタンパク質によるＩＬ４依存性ＳＴＡＴ６リン酸化反応の中和
各精製ＡＲタンパク質の活性は、上記のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞を使用して、ＳＴＡＴ６のＩＬ４依存性活性を阻害するそれらの能力についてアッセイした。完全な阻害曲線を、各候補について評価し、吸光度データを、ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ）を使用して、Ｓ字形用量反応に対するＡＲタンパク質濃度の関数としてプロットし、３．３ｐＭ  ＩＬ４でＩＣ50値を決定した。これらのＡＲタンパク質について得られるＩＣ50値は、表６に提示されるように、１．３〜２３５ｐＭの範囲であった。
【０１３６】
ＩＬ４結合のためのＩＬ４ＲＡとの競合結合
ＩＬ４のビオチン化の場合、組み換えヒトＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ＥＺ−リンクＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３３６）を使用して、室温で２時間４：１の比でビオチン化した。タンパク質は、過剰なビオチン化試薬を除去するために、ＰＢＳ中で一晩透析した。カニクイザルＩＬ４（配列番号５）の競合結合は、同一の方法でビオチン化された単離タンパク質を使用して行った。
【０１３７】
ＩＬ４  ＲＡに結合するＩＬ４のＡＲタンパク質阻害は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、及びしたがってジスルフィド結合されたホモ二量体に融合されたＥＣＤ（配列番号５）を表すＧｌｙ２４−Ｈｉｓ２３２を含む、ＩＬ４  ＲＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価した。タンパク質は、製造者のプロトコルに従って、カルボキシル化されたＬｕｍｉｎｅｘ微小球に共役した。中和実験の場合、５０μＬ中の５０００  ＩＬ４ＲＡ−Ｆｃ共役されたビーズを、９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルに添加した。ビオチン化したヒトＩＬ４を、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）中のＡＲタンパク質の適切な希釈液と混合して、最終濃度６７ｐＭ  ＩＬ４を得た。プレートを、ビーズの凝集を回避するために激しく振とうするように設定されたプレート振とう器上で、暗所において室温で１時間培養した。プレートを、１５０μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で、真空マニホールドを使用して２回洗浄した後、２５μｇ／ｍＬで５０μＬのストレプトアビジンＰＥを添加し、室温で２０分間培養した。プレートを再度洗浄し、１５０μＬのシース液を添加し、プレートを振とう器上に５分間置いた。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００システムを使用してプレートを読み取り、データをＡＲタンパク質濃度の関数としてプロットした。ＩＣ50値は、ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ）を使用して、Ｓ字形用量反応の等式にデータを適合させることにより決定した（表６）。
【０１３８】
ＩＬ４依存性ＴＡＲＣ生成
ＴＡＲＣは、アレルギー性ぜんそくにおけるＴｈ２媒介性炎症の主要な調節因子である。ＩＬ４によるＡ５４９細胞のインビトロ刺激は、ＴＡＲＣの生成をもたらす。このアッセイは、阻害剤が一次細胞内でＩＬ４シグナル伝達を遮断する能力を示すため、上記のＨＥＫ−ＳＴＡＴ６アッセイを相補する。各ＡＲタンパク質は、以下のようにＡ５４９内のＩＬ４依存性ＴＡＲＣ生成の阻害についてアッセイした。１日目に、細胞を９６ウェル培養プレートに、１００μＬの細胞培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘを含むαＭＥＭ、＋１０％の加熱不活性化したＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウム、及び１×ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）中、２．５×１０5／ｍＬの密度で一晩置いた。この培地もアッセイ培地として機能する。２日目に、細胞を２００μＬの培養培地で１回洗浄し、２００ｎｇ／ｍＬ（１１ｎＭ）組み換えヒトＴＮＦ−α及び適切な濃度のＡＲタンパク質で事前混合された６７ｐＭ組み換えＩＬ４を含有する、２００μＬの培養培地で刺激した。プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ2で２４時間培養した。上清を採取し、更なる分析のために−８０℃で保存した。ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ  Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（ＲａｎｄＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造者のプロトコル及び試料の１：５希釈液を用いて、試料中のＴＡＲＣの量を定量した。データをＡＲタンパク質濃度の関数としてプロットし、ＰＲＩＺＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ）を使用して、Ｓ字形用量反応に適合させて、ＩＣ50値を決定した（表６）。
【０１３９】
ＲＡ−１細胞におけるＳＴＡＴ６シグナル伝達
各ＡＲタンパク質は、ＳＴＡＴ６−ｂｌａ  ＲＡ−１細胞内のＩＬ４誘発性ＳＴＡＴ６シグナル伝達の阻害についてアッセイした。ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標）ＳＴＡＴ６−ｂｌａ  ＲＡ−１細胞株は、Ｒａｍｏｓ−１（ＲＡ−１）細胞に安定して統合されるＳＴＡＴ６反応要素の制御下で、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有する。ＩＩ型複合体を通じてシグナル伝達する上記のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ６細胞とは対照的に、ＲＡ−１細胞はＩ型複合体を通じてシグナル伝達し、それを使用して、Ｉ型複合体を通じてＩＬ４刺激の阻害を確認することができる。
【０１４０】
このアッセイは、製造者であるＩｎｖｏｔｒｏｇｅｎにより推奨されるように行った（カタログ番号Ｋ１２４３）。１日目に、ＲＡ−１細胞を黒色の９６半領域ウェル細胞培養プレート（透明な底部を有する）に、３２μＬのアッセイ緩衝液中、９３７，５００細胞／ｍＬの密度で置いた。細胞を含まない対照ウェルの場合、３２μＬのアッセイ緩衝液を添加した。ＣＤ４０溶液を調製し（９５０アッセイ緩衝液に対して１００μｇ／ｍＬで５０μＬのストック）、４μＬを各ウェルに添加して（最終濃度は５５６ｎｇ／ｍＬであった）、細胞がＩＬ４に応答することを保証した。細胞は３０秒間で１４×ｇで回転させ、３７℃、５％  ＣＯ2中に１６時間置いた。２日目に、４μＬのアッセイ干渉液を、ｈＩＬ４の範囲で１０×濃度を含有する細胞に添加し、ＥＣ50を得た。阻害研究の場合、ＡＲタンパク質を含有する１０×阻害溶液を、１０×ｈＩＬ４とＥＣ80で事前混合した後、細胞に添加した。ｈＩＬ４の濃度は２０．８ｐＭであった。プレートを１４×ｇで３０秒間回転させ、３７℃、５％  ＣＯ2中に５時間置いた。その後、８μＬのＬｉｖｅ  ＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ  Ｂ／Ｇ（ＣＣＦ４−ＡＭ）溶液を各ウェルに添加し（６μＬの溶液Ａ、６０μＬの溶液Ｂ、及び９３４μＬの溶液Ｃで構成される）、１４×ｇで３０秒間回転させた。プレートを光から保護し、室温で２．５時間培養した。プレートを、４０９／２０ｎｍで２つの放出フィルター（１つは４６０／４０ｎｍ及び１つは５３０／３０ｎｍ）で励起フィルターを使用して、ボトム読み取り能力を有するＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ上で測定した。二重ミラーも使用した。蛍光読み取りを分析するために、４６０ｎｍ及び５３０ｎｍの両方からバックグラウンドを控除し（細胞を含まないウェルからの値）、４６０／５３０の比を決定した。次いでこの比をＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＺＭソフトウェアにおいて濃度に対してプロットし、ＩＣ50値を得た。
【０１４１】
【表７】
2014519808.tif 000009
【０１４２】
実施例２（表１）に記載される生物物理学的及び生化学的合成物を使用して、最適化のための９個のＡＲタンパク質分子、Ｃ０６＿１３Ａ１０、Ｃ０６＿２０Ｂ８、Ｃ０６＿２８Ｅ５、Ｃ０６＿４２Ａ１１、Ｃ０６＿４４Ｃ１２、Ｃ０６＿４４Ｆ６、Ｃ０６＿５３Ｆ６、Ｃ０６＿４３Ｇ２、及びＣ０６＿６Ｅ９を選択した。これらのＡＲタンパク質は、それぞれがＳＥＣによりモノマーであり、ＫD＜９．７Ｅ−１１で組み換えＩＬ４に結合することができ、能力＞６７ｐＭを有するＨＥＫ−ＳＴＡＴ６細胞内でＩＬ４依存性シグナル伝達を阻害し、ＩＣ50＜６６ｐＭでＩＬ４受容体への組み換えＩＬ４の結合を阻害するため、選択した。１０個の主要なＡＲタンパク質を更なる細胞ベースのアッセイに付し、追加の細胞ベースのアッセイにおいて、ＩＬ４依存性シグナル伝達の阻害を確認した。
【０１４３】
ＡＲタンパク質Ｃ０６＿４４Ｃ１２、Ｃ０６＿５３Ｇ６、及びＣ０６＿２８Ｅ５を最適化のために選択した。
【０１４４】
結合タンパク質候補の発現及び精製
更なる特性化のために選択された９４の結合タンパク質候補は、大腸菌の細胞質発現を可能にするＴ５プロモーターに基づく系を使用して発現され、固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介して精製した。つまり、大腸菌ＸＬ−１青色細胞を、結合タンパク質発現プラスミドで形質転換し、それを使用して、５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％グルコースを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）内に５ｍＬスターター培養物を植菌した。スターター培地は、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で一晩培養した。一晩の培養を使用して、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する５０ｍＬ  ＬＢを植菌した。ＯＤ600＝０．７の細胞密度で、５００μＭイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、タンパク質発現を誘発した。培地は、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で４時間培養した。遠心分離により細胞ペレットを採取した。１ｍｇ／ｍＬリゾチームの添加、及び氷上で３０分間の音波処理によって細胞を破壊した。遠心分離により不溶性分留を除去した。０．２２μＭフィルターを使用して、浄化した上清を濾過した。これらの上清を、２５０μＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ上流樹脂（ＱＩＡｇｅｎ）で充填したカラム上に装填した。製造者の指示に従って、精製を行った。２０ｍＭイミダゾール及び１０％グリセロールを含有する２０ｍＬトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を洗浄緩衝液として使用し、２５０ｍＭイミダゾール及び１０％グリセロールを含有する６００μＬ  ＴＢＳを使用して、結合タンパク質を溶出した。
【０１４５】
選択されたヒトＩＬ１３結合タンパク質のＳＥＣ
９４の結合タンパク質試料を、ＴＯＳＯＨ  Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム及びＰＢＳ  ｐＨ  ７．４移動相を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって凝集を分析した。２０μＬの各試料を、０．２ｍＬ／分の流量で実行毎に注入した。コンアルブミン、オボアルブミン、炭酸脱水酵素、リボヌクレアーゼＡ、及びアプロチニンタンパク質標準を使用して、カラムを較正した。カラムからの結合タンパク質の溶出は、２１４ｎｍでの吸光度により監視した。試料の溶出プロファイルを評価して、主にモノマーとして溶出された結合タンパク質候補を同定した。
【０１４６】
ＩＬ１３結合タンパク質の熱安定性：
選択されたＩＬ１３結合タンパク質試料の融解温度を、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ技術を使用して測定した（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：６：４２９〜４４０，２００１）。Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒは、熱の関数として展開するタンパク質の高スループット動態測定である。試料が加熱されると、試料緩衝液中のＡＮＳは、染料蛍光の増加を誘発する折り畳まれた分子に概して埋め込まれた疎水性領域に結合する。精製（上記）後、各試料を、ＰＤマルチトラップＧ２５樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳ緩衝液ｐＨ  ７．４に交換し、２８０ｎｍでの吸光度を使用して濃度を推定した。試料濃度は１〜５０μＭの範囲であった。結合タンパク質の展開は、連続傾斜面モードで、０．５℃毎に測定された蛍光を用いて、３７〜９５℃の間で監視した。測定される融解温度は、これらの使用の場合、５４℃〜＞９５℃の範囲であった。いくつかの試料について溶解は検出されず、安定性が９５℃を超えること、又はタンパク質濃度が低すぎて蛍光を正確に測定できないことのいずれかを示す（データ図示せず）。
【０１４７】
ＩＬ１３依存性ＳＴＡＴ６リン酸化反応の中和
各精製ＡＲタンパク質の活性は、上記のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞を使用して、ＳＴＡＴ６のＩＬ１３依存性活性を阻害するそれらの能力についてアッセイした。完全な阻害曲線を、各候補について評価し、吸光度データを、ＰＲＩＺＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＺＭ）を使用して、Ｓ字形用量反応に対するＡＲタンパク質濃度の関数としてプロットし、ＩＣ50値を決定した（データ図示せず）。
【０１４８】
単一点親和性のスクリーニング
全ての精製された結合タンパク質の親和性を、以下のように急速親和性スクリーニングプロトコルを使用して、ＰｒｏｔｅＯｎ（ＢｉｏＲａｄ）により評価した。ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏｒａｄ）上で、ニュートラアビジンを、製造者により記載されるように、アミンカップリング化学反応を使用して、＞５０００ＲＵの密度で共役的に固定した。１つのフローセル上で、ビオチン化ＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２５０ＲＵのレベルに固定し、一方で別のフローセルは、参照として使用し、単にニュートラアビジンで固定化した。精製された結合タンパク質のそれぞれから、５０ｎＭの濃度を分析し、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用して適合することにより、動態パラメーターを推定した。検索された値を使用して、明らかな親和性に関して結合タンパク質をランク付けした。これらの結合タンパク質は、オン速度（ｋa）（１．７〜９．６×１０5１／Ｍ・sの範囲）及びオフ速度（ｋd）（１．３×１０-5〜１．１×１０-4１／ｓの範囲）を有し、ＫD  ２．１×１０-11〜１．７×１０-8Ｍを提供する。
【０１４９】
初期スクリーニングに基づいて、更なる特性化のために１６個の主要分子を選択した。ＳＥＣから大量のモノマー溶出を呈し、親和性（ＫD）＜１．５ｎＭを有し、１００ｐＭより良好なＩＣ50でＩＬ１３依存性ＳＴＡＴ６リン酸化反応を阻害し、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析により５０℃を超えるＴｍを有した１６個の主要な結合タンパク質のパネルを、以下に記載される大規模発現、精製、及び特性化のために選択した。
【０１５０】
発現
大腸菌ＸＬ−１青色細胞は、結合タンパク質発現プラスミドで形質転換した。単一コロニーを選択し、カルベニシリンを含有する５００ｍＬ  ＴＢ培地内で３７℃で生育した。培養密度が０．７〜１．０単位の間のＡ600に到達したとき、発現は０．４ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発され、更に４時間３７℃で培養した。遠心分離により細菌ペレットを回復し、使用するまで凍結保存した。凍結した細菌ペレットを解凍し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及びＥＤＴＡを含まないタンパク質分解酵素抑制剤カクテルを含有する２０ｍＭイミダゾール中に溶解した。最懸濁したペレットを音波処理し、１７，０００×ｇで３０分間、ＪＡ−１７内で遠心分離することにより、細菌くずを収集した。可溶性溶解物を濾過し、２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を各溶解物に添加した後、少なくとも１時間、４℃でゆっくり攪拌して、Ｈｉｓ標的された結合タンパク質を捕捉した。樹脂を含有する溶解物をカラムに注ぎ入れ、８カラム体積の５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２０ｍＭイミダゾールで洗浄した。Ｈｉｓ標的されたタンパク質は、８カラム体積の５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ７．５、５００ｍＭイミダゾールを含有する５００ｍＭ塩化ナトリウムを用いて樹脂から溶出した。更なる精製は、ＰＢＳ  ｐＨ  ７．０中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーにより達成した。
【０１５１】
結合タンパク質リードの熱安定性
１６の結合タンパク質候補の熱安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定した。Ｔｍ測定の場合、ＤＳＣは、高スループットスクリーニングに使用されるＴｈｅｒｍｏｆｌｏｕｒ分析より精密な分析方法である。各サンプルをＰＢＳ  ｐＨ  ７．４に対して広範囲に透析し、１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。オートサンプラー（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を備えたモデルＶＰ  ＤＳＣ機器を使用して、これらサンプルの融解温度を測定した。サンプルを１０℃から９５℃まで毎分１℃の速度で加熱した。各試料走査間で収集された緩衝液のみの走査を試料走査から控除して、統合の基準の計算を可能にする。データを２つの状態展開モデルに適合させ、結果を表７に提示する。分析された結合タンパク質は、４８℃〜８５℃の広範な融解温度を表した。
【０１５２】
ヒトＩＬ１３の結合親和性
組み換えヒトＩＬ１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−ビオチンを使用して氷上で最小限にビオチン化し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する実験実行緩衝液中に脱塩した。ビオチン化したＩＬ１３は、３つの異なる表面密度で（約１５０、５０、及び２５ＲＵから）、３つの異なるＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡ（ストレプトアビジン）センサーチップの上に捕捉した。各結合タンパク質試料は、３つの異なる密度ＩＬ１３表面上の３倍希釈シリーズの最高濃度として、４０ｎＭで試験した。結合タンパク質試料の最高濃度の解離相を１時間監視した。以下の表７に提供される動態及び親和性定数の推定を抽出するために、異なる密度表面のそれぞれからの応答データを広域に適合させた。
【０１５３】
【表８】
2014519808.tif 000010
【０１５４】
ＩＬ１３依存性活性の中和
各結合タンパク質試料の活性は、８０ｐＭ  ＩＬ１３を使用して、上記のようにＩＬ１３依存性ＳＴＡＴ６リン酸化反応の阻害についてアッセイする。データを表７に示す。同様に、各結合タンパク質試料は、今後の毒物学及び薬物動態学的研究のために、この種との交差反応性を検証するために、カニクイザルからのＩＬ１３により刺激されたＳＴＡＴ６リン酸化反応を阻害する能力についてアッセイした。組み換えｃｙｎｏ  ＩＬ１３は、ＳＵＭＯ−タグ融合タンパク質として大腸菌から発現及び精製された。ＳＵＭＯ−タグは、後次に、阻害アッセイのための調製物中でＩＬ１３から酵素的に分裂した。ｃｙｎｏ  ＩＬ１３の中和は、以下のように行った。１日目に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに、１０％加熱不活性化したＦＢＳ（１００８２，Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む１００μＬの細胞培養培地（４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ（１１９９５、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０μｇ／ｍＬのブラスチシジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、及び１００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））中、２．５×１０5／ｍＬの密度で２４時間置いた。２日目に、１ｎｇ／ｍＬ（８０ｐＭ）組み換えｃｙｎｏ  ＩＬ１３と事前混合された適切な濃度のＡＲタンパク質を含有する１００μＬの細胞培養培地を細胞に添加した。プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ2で２４時間培養した。分泌された胚アルカリホスファターゼを測定するために、４０μＬの各細胞上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と、クリアな９６ウェルプレート内で混合した。プレートを３７℃で２時間培養し、プレートリーダーを使用して６５０ｎＭでの吸光度を読み取った。ｃｙｎｏ  ＩＬ１３阻害の結果を以下の表８に提示する。
【０１５５】
ＩＬ１３依存性ＴＡＲＣの生成
Ａ５４９細胞（ヒト肺癌由来の細胞株）からのＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７）放出は、ＩＬ１３により刺激され得る。
【０１５６】
各結合タンパク質は、以下のようにＡ５４９内のＩＬ１３依存性ＴＡＲＣ生成の阻害についてアッセイした。１日目に、細胞を９６ウェル培養プレートに、２００μＬの細胞培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘを含むαＭＥＭ、＋１０％の加熱不活性化したＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウム、及び１×ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ））中、１．０×１０6／ｍＬの密度で一晩置いた。この培地はアッセイ培地としても機能する。２日目に、細胞を２００μＬの培養培地で１回洗浄し、２００ｎｇ／ｍＬ（１１ｎＭ）の組み換えヒトＴＮＦ−α及び適切な濃度の結合タンパク質と事前混合された１ｎｇ／ｍＬ（８０ｐＭ）の組み換えＩＬ１３を含有する２００μＬの培養培地で刺激した。プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ2で２４時間培養した。上清を採取し、更なる分析のために−８０℃で保存した。製造者のプロトコルに従って、キットを使用して、試料中のヒトＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ  Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を測定し、試料は１：５の希釈で使用した。データを結合タンパク質濃度の関数としてプロットし、ＰＲＩＺＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＺＭ）を使用して、Ｓ字形用量反応に適合させて、ＩＣ50値を決定した（表８）。
【０１５７】
ＩＬ１３：ＩＬ１３Ｒα２結合
Ｒα２へのＩＬ１３結合の結合タンパク質阻害は、製造者のプロトコルに従って、カルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘ微小球に共役されたＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価した。ＩＬ１３のビオチン化の場合、組み換えヒトＩＬ１３  Ｒ１３０Ｑ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ＥＺ−リンクＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３３６）を使用して、室温で２時間４：１の比でビオチン化した。タンパク質は、過剰なビオチン化試薬を除去するために、ＰＢＳ中で一晩透析した。中和実験の場合、５０μＬ中の５０００のＩＬ１３  Ｒα２−Ｆｃに共役されたビーズを、９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルに添加した。１ｎｇ／ｍＬ（８０ｐＭ）での５０μＬのビオチン化ヒトＩＬ１３を、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）中の適切な希釈の結合タンパク質と混合した。プレートを、ビーズの凝集を回避するために激しく振とうするように設定されたプレート振とう器上で、暗所において室温で１時間培養した。プレートを、１５０μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で、真空マニホールドを使用して３回洗浄した後、２５μｇ／ｍＬで５０μＬのストレプトアビジンＰＥを添加し、室温で２０分間培養した。プレートを再度洗浄し、１００μＬのシース液を添加し、プレートを振とう器上に１分間置いた。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００システムを使用してプレートを読み取り、データを結合タンパク質濃度の関数としてプロットした。ＩＣ50値は、ＰＲＩＺＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰＡＤ  ＰＲＩＺＭ）を使用して、Ｓ字形用量反応の等式にデータを適合させることにより決定した。主要な結合タンパク質の阻害定数を以下の表に列挙する。
【０１５８】
【表９】
2014519808.tif 000011
【０１５９】
ＡＲタンパク質組成物
各結合タンパク質が（Ｎキャップ）−（ＡＲ）ｎ−（Ｃキャップ）の形式（ｎ＝２又は３）に従う、２Ｆ１のアンキリン反復ドメインの配列及び１６の主要な抗ヒトＩＬ１３結合タンパク質を分析した。
【０１６０】
２Ｆ１及び追加の１６個の結合タンパク質は、以下の配列表に列挙されるように、４６の別個のＡＲモジュールを表すことがわかり、ドットは、あるＡＲのその位置に存在するアミノ酸が、ＡＲ反復モチーフの対応するアミノ酸（配列番号１）に対応することを示す。フレームワーク突然変異が選択された結合タンパク質配列において認められたいくつかの場合において、それらが示される。いくつかの場合において、リボソーム表示選択プロセスの間に欠失が生じ、これらの欠失はダッシュ（−）で記される。結合タンパク質１０Ａ６は、２つのＡＲのみを含有する。全ての場合において、Ｃキャップ配列は、最後のＡＲの残基３３の直後に開始する。
【０１６１】
各結合タンパク質の結合ドメインタンデムＡＲ単位（ＡＲ１−ＡＲ２−ＡＲ３）のそれぞれの組成物を以下に列挙する（以下の表９）。
【０１６２】
【表１０】
2014519808.tif 000012
【０１６３】
１７の固有の配列（配列番号９〜２５）により表されるＡＲ１モジュールを比較するとき（以下の表１０）、モチーフの位置４（Ｘ3）においてＹ又はＦ、位置６（Ｘ4）においてＳ、位置１４（Ｘ5）においてＲ、位置１５（Ｘ6）においてＨ、及び位置２７（Ｘ7）においてＨ又はＹに対する選好があった。
【０１６４】
よって、ＩＬ１３結合ＡＲ１モジュールは、式：
Ｘ1ＤＸ2−［Ｆ，Ｙ］−ＧＳＴＰＬＨＬＡＡ−ＲＨ−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表すことができ、式中、Ｘ1は、以下に示される残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（ＡＲ１−Ｃ、配列番号１５６）。あるいは、ＡＲ１モチーフは、式：
ＴＤＹＧＳＴＰＬＨＬＡＡＲＨＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列から選択され得、式中、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（ＡＲ１−Ｆ、配列番号１５７）。
【０１６５】
【表１１】
2014519808.tif 000013
【０１６６】
１７の固有の配列（配列番号１２７〜１４３）により表される１７のＡＲ２モジュールを比較するとき（以下の表１１）、Ｘ1において優性残基（５０％を超える頻度）はなかったが、ＡＲ配列モチーフのランダム化位置Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、及びＸ6において、最も頻繁に使用されるアミノ酸があった。隣接した可変位置におけるアミノ酸の対の使用（Ｘ2Ｘ3及びＸ5Ｘ6）も以下に示されるように表にした。ＦＩは、Ｘ2Ｘ3の場合に最も頻繁に発生する二重項であった。よって、ＩＬ１３結合ＡＲ２モジュールは、式（括弧の付いた残基は、その位置の代替アミノ酸である）：
Ｘ1ＤＦＩＧ  ＤＴＰＬＨＬＡＡＹ−Ｘ6−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表すことができ、式中、Ｘ1は、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｅ、Ｈ、Ｍ、及びＦから選択され、Ｘ6は、Ｈ又はＲであり得、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（ＡＲ２−Ｃ、配列番号１５８）。あるいは、ＡＲ２配列は、式：
［Ａ，Ｄ，Ｎ，Ｔ，Ｋ］−ＤＦＩＧ  ＤＴＰＬＨＬＡＡＹ−［Ｈ，Ｒ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ｈ，Ｎ，Ｙ］−ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ２、配列番号１５９）により表されるアミノ酸配列から選択され得る。
【０１６７】
【表１２】
2014519808.tif 000014
【０１６８】
１２の固有の配列（配列１４４〜１５５）により表される１６のＡＲ３モジュールを比較するとき、ＡＲ配列モチーフのＸ1、Ｘ2、Ｘ5、又はＸ6のいずれかにおいて優性残基（５０％を超える頻度）はなかったが、Ｘ3は最も頻繁にＴであり、Ｘ4は、最も頻繁にＥであった。隣接した可変位置におけるアミノ酸の対の使用（Ｘ2Ｘ3及びＸ5Ｘ6）も以下に示されるように表にした。ＩＴは、Ｘ2Ｘ3の場合に最も頻繁に発生する二重項であった。ＳＭは、Ｘ5Ｘ6の場合に最も頻繁に発生する二重項であった。よって、ＩＬ１３に結合するＡＲ３モジュールは、アミノ酸配列：
Ｘ1Ｄ−Ｘ2ＴＧ−Ｅ−ＴＰＬＨＬＡＡ−［Ｘ5Ｘ6］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表すことができ、式中、Ｘ1及びＸ2は、以下の表１２の残基から選択され、Ｘ5Ｘ6は、ＳＭ、ＨＬ、及びＹＨの対から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（ＡＲ３−Ｃ、配列番号１６０）。あるいは、ＡＲ３モチーフは、式：
Ｘ1Ｄ−ＩＴ−Ｇ−Ｅ−ＴＰＬＨＬＡＡ−ＳＭ−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ7ＧＡＤＶＮＡにより表されるアミノ酸配列から選択され得、式中、Ｘ1は、以下の表１２に列挙される残基から選択され、Ｘ7は、Ｈ、Ｎ、又はＹであり得る（ＡＲ３−Ｆ、配列番号１６１）。
【０１６９】
【表１３】
2014519808.tif 000015
【０１７０】
実施例３：主要分子の最適化
大規模製造、処方、及び安定性のために選択されたＩＬ４結合ＡＲタンパク質を最適化するために、可変残基において見出されたいくつかの残基、配列番号１のＸ1〜Ｘ6を突然変異させることが必要であった。例えば、精製された組み換えタンパク質の酸化は、不均一性及び活性の喪失の生成に至り得る。これらの修飾のリスクを低減するために、可変配列において見出されるＭｅｔ残基は、類似の化学的メークアップのアミノ酸、又は他の配列関連するＩＬ４結合ＡＲタンパク質において見出されるものに突然変異させた。加えて、いくつかの突然変異は、潜在的Ｔ細胞エピトープの存在によって評価されるように、免疫原性の潜在的部位を排除するために行った。最後に、アンキリン反復フレームワークに対するランダムアミノ酸変化は、時として、リボソーム表示選択に使用されるＰＣＲステップの間に生じた。かかる残基は、コンセンサス設計されたアンキリン反復配列に戻った。
【０１７１】
ＡＲタンパク質Ｃ０６＿４４Ｃ１２は、ＩＬ４結合部位において潜在的な酸化を回避するために、ＡＲ２位置４（Ｘ3）をＭｅｔからＬｅｕに突然変異することにより設計した。ＡＲ２及びＡＲ３の位置２７（Ｘ7）は、近接する上流及び下流残基の分析に基づいて、潜在的Ｔ細胞エピトープを排除し、脱アミドの潜在的部位を除去するために、ＴｙｒからＡｌａに突然変異した。同様の突然変異をＣ０６＿２８Ｅ５に対して行い、ＡＲ１及びＡＲ２の位置２７をＴｙｒからＡｌａに変更した。Ｃ０６＿５３Ｇ６の場合、Ｎキャップの位置１を、ＡｓｎからＡｓｐに変更して、アンキリンコンセンサス配列を回復し、ＡＲ１の位置２７は、上記のようにＴｙｒからＡｌａに突然変異した。
【０１７２】
最適化後のこれら３つのタンパク質のモチーフ式（配列番号１に基づくＡＲモジュールは以下のとおりであった。
【０１７３】
【表１４】
2014519808.tif 000016
【０１７４】
本明細書に記載される突然変異は、各突然変異が活性に対して有する効果を決定するために、単一又は複合様式で行った。指定される配列の工学的ＡＲタンパク質は、組み換えＩＬ４への結合、ＩＬ４依存性シグナル伝達の阻害、ＳＥＣによる溶解度、及びＤＳＣによる融解温度の決定についてアッセイした（表１４）。
【０１７５】
【表１５】
2014519808.tif 000017
【０１７６】
最適化されたＩＬ４結合タンパク質の位置的タンデムＡＲ単位は、ＡＲ式：
［Ａ，Ｌ，Ｔ］−ＤＤ−［Ｓ，Ｗ］−Ｇ−［Ｄ，Ｉ，Ｙ］−ＴＰＬＨＬＡＡ−［Ｅ，Ｔ］−ＤＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ａ，Ｈ］−ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ１−Ｏ、配列番号８８）、
［Ａ，Ｎ，Ｑ］−Ｄ−［ＮＬ，ＲＬ，ＡＩ］−ＧＤＴＰＬＨＬＡＡ−［ＷＴ，ＦＶ，ＬＹ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ａ，Ｙ］ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ２−Ｏ、配列番号８９）、及び
［Ｔ，Ｖ，Ｙ］−Ｄ−［ＩＳ，ＬＡ，ＬＨ］−Ｇ−［Ｆ，Ｉ，Ｖ］−ＴＰＬＨＬＡＡＦ−［Ｗ，Ｙ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫ−［Ａ，Ｈ］−ＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ３−Ｏ、配列番号９０）により表され、
式中、括弧の付いたエントリは、所望の生物活性を呈する３つの最適化された結合タンパク質における代替アミノ酸残基又は残基の対を表す。したがって、ＩＬ４結合タンパク質は、指定された順序で縦一列に位置付けることにより、これらのＡＲモチーフから構成され得る。
【０１７７】
ＩＬ１３結合タンパク質
３つのＩＬ１３結合候補結合タンパク質、７Ｇ１１、６Ｇ９、及び９Ｆ８は、潜在的な大規模製造、処方、及び安定性のタンパク質最適化のために選択された。各候補は、部位配向された突然変異の複数ラウンドにより修飾された。
【０１７８】
概して、結合タンパク質の安定性を増加し、潜在的免疫原性を減少させ、Ｎ末端ＨＩＳタグを除去し、Ｎ末端メチオニンの処理を強化するか、又は推定抗原結合部位における酸化若しくは脱アミドの潜在的部位を除去することが分かった突然変異を設計した。全ての最終分子に導入される突然変異は、Ｎキャップを含み、生物物理的動作を改善する位置３（Ｇ〜Ｄ）は、全ての主要な分子候補に導入され、Ｃキャップの末端残基は、ジアラニンに変更した。加えて、候補６Ｇ９及び９Ｆ８は、モジュールに２７Ａｓｎ−Ｇｌｙ２８ジペプチドを含有することがわかり、したがって残基２７が置換された。
【０１７９】
一般的に全ての結合タンパク質に適用され得る、上記の突然変異の他に、結合タンパク質６Ｇ９、７Ｇ１１、及び９Ｆ８の活性に特異的な多数の突然変異が導入された。精製された組み換えタンパク質の酸化は、不均一性及び活性の喪失の生成に至り得る。これらの修飾のリスクを低減するために、６Ｇ９、９Ｆ８、及び７Ｇ１１のアンキリン反復モジュールにおいて見出されるＭｅｔ及びＣｙｓ残基は、類似の化学的マークアップのアミノ酸、又は他のＩＬ１３結合タンパク質において見出されるものに突然変異した。加えて、これらの結合タンパク質のアンキリン反復における多数の突然変異を、Ｔ細胞活性アッセイをスクリーニングすることにより示唆される免疫原性の潜在的部位を排除するために行った。最後に、大腸菌において発現するタンパク質の場合、Ｎ末端メチオニン残基の処理は、Ｎ末端メチオニンの直後のアミノ酸により影響され得る（Ｈｉｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８６：８２４７〜８２５１  １９８９）。このメチオニン残基の総処理は、精製された生成物の均一性を増加させることが望ましい。Ｎキャップにおいて、Ｎ末端メチオニン残基がＨＩＳタグ無しに発現されたときに効果的に処理され得るかどうかを決定するために、位置１は、アスパラギン酸からグリシン又はアラニンに変更した。６Ｇ９、９Ｆ８、及び７Ｇ１１について試験した特定の反復モジュール位置における結合タンパク質特異的突然変異のまとめを表１５に示す。
【０１８０】
上記の汎用及び特異的突然変異は、活性に対する各変化の結果を決定するために、単一で、又は複合様式で行った。工学的結合タンパク質は、組み換えＩＬ１３への結合、ＩＬ１３依存性シグナル伝達の阻害、及びＤＳＣによる融解温度の決定についてアッセイした。候補の全ては、ＳＥＣにより決定されるように、モノマーのままであった。大部分の場合、変異体の活性及び親和性は、親分子とは著しく異ならなかった。３つの親及び最適化された最終主要候補のそれぞれの特性を表１５に示す。
【０１８１】
【表１６】
2014519808.tif 000018
【０１８２】
主要候補の親和性分析
様々な工学的結合タンパク質分子のヒトＩＬ１３への結合を説明する完全な動態データは、単一点親和分析について上記のものに類似する方法を使用して測定した。つまり、ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を、アミンカップリング（ｐＨ  ５．０）を介して、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＣチップの全６つのチャネル上で類似のレベル（約１８００ＲＵ）に固定した。ビオチン化ｈＩＬ１３は、異なるチャネル上で異なる表面密度（６００〜１００ＲＵ）で捕捉した。異なる密度ＩＬ１３表面上の３倍濃度シリーズ中で希釈された４０ｎＭから始まるタンパク質結合を試験し、緩衝液試料を注入して、基準安定性を監視した。各結合タンパク質試料の全ての濃度の解離相を、１００μＬ／分の流量で１時間監視した。異なる密度の表面から得た全ての濃度シリーズの応答データを、１：１の単純ラングミュア結合モデルに広く適合させて、表１６に提供される動態の値（ｋon、ｋoff）及び親和性（ＫD）定数を抽出した。
【０１８３】
タグの付いていない結合タンパク質の生成
ＨＩＳタグのない結合タンパク質を、標準ＰＣＲ法によってリガーゼ独立性クローニング部位を含むように修飾され、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）大腸菌下部（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において発現したｐＥＴ２７ベクターにサブクローン化した。発現は、３０℃で１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより発現を誘発した後、ＴＢ培地内で行った。遠心分離による誘発から５時間後に細胞を採取し、−２０℃で凍結させた。凍結した細胞ペレットを、１ｍＬの緩衝液当たり０．１ｇのペレット濃度で、２０ｍＭヒスチジンｐＨ  ６．４で構成される溶解緩衝液中に再懸濁した。細胞溶解は、音波処理により達成され、溶解物は、＞１５，０００×ｇでの遠心分離に続いて、０．４５μｍフィルターを通して濾過することにより除去された。除去された溶解物を、溶解緩衝液中５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上に装填した。溶解緩衝液から緩衝液Ｂまでの線状勾配、２０カラム体積以上の６００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭヒスチジンｐＨ  ６．４は、Ｑカラムから結合タンパク質を溶出した。分留をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、それらを含有する結合タンパク質をプールして、７０℃まで２０分間加熱した後、氷上に３０分間置いた。沈殿された汚染タンパク質は、遠視分離により除去した。次いで結合タンパク質を含有する沈殿ステップの上清を限外濾過により濃縮し、移動相としてＰＢＳを用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。初期イオン交換クロマトグラフィー工程後の加熱工程は、９Ｆ８ｒ３等のより低い融解温度の結合タンパク質の場合は省略した。各作成物の生物物理学的特性及び生物活性測定値を表１６にまとめる。
【０１８４】
【表１７】
2014519808.tif 000019
【０１８５】
最適化されたＩＬ１３結合タンパク質の位置的タンデムＡＲ単位は、ＡＲ式：
［［Ｒ，Ｓ，Ｔ］−Ｄ−［Ｓ，Ｗ］−［Ｙ，Ｆ］−［Ｄ，Ｇ］−ＳＴＰＬＨＬＡＡＲ−［Ｅ，Ｈ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ１−Ｏ、配列番号１６８）、
［Ａ，Ｆ］−ＤＦＩＧＤＴＰＬＨＬＡＡＹＲＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ２−Ｏ、配列番号１６９）、及び
［Ｓ，Ｄ］−Ｄ−［ＨＧ，ＩＴ］−Ｇ−［Ｓ，Ｄ］−ＴＰＬＨＬＡＡ−［ＱＩ，ＳＴ］−ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡ（ＡＲ３−Ｏ、配列番号１７０）により表され、
式中、括弧の付いたエントリは、所望の生物活性を呈する３つの最適化された結合タンパク質内の代替アミノ酸残基又は残基の対を表す。したがって、ＩＬ１３結合タンパク質は、指定された順序で縦一列に位置付けることにより、これらのＡＲモチーフから構成され得る。式Ｎキャップ−［ＡＲ］ｎ−ＣキャップによるＩＬ１３結合タンパク質は、追加で、配列番号２又はその変異型、例えば、配列番号１７１の四季により例示されたものから選択されるＮキャップ、及び配列番号３若しくは１７２又はその変異型等のＣキャップを含む。
【０１８６】
実施例４：二価ＡＲタンパク質構成体
実施例３に記載される３つのＩＬ４結合ＡＲタンパク質分子は、ヒトＩＬ１３及びＩＬ４の両方のシグナル伝達を遮断することができる二重特異性分子を生成するために、６Ｇ９＿Ｖ１（配列番号９４）として指定される、以前に発見された抗ＩＬ１３  ＡＲタンパク質と複合された。各ＡＲタンパク質の核酸配列は、２つのＡＲタンパク質間の（ＧＧＧＧＳ）4リンカーをコードする配列を含むように合成した。式（ＧＧＧＧＳ）nを有する代替ＧＳリンカーを使用して、ＡＲタンパク質を接合してよい。リンカーの長さは、分子の結合ドメインの利用可能性、立体及び他の特性を制御するために異なり得る。ＩＬ４結合タンパク質に対するＮ末端、又はＩＬ４結合タンパク質に対するＣ末端のいずれかで連結される６Ｇ９を表す、合計６つの二重特異性ＡＲタンパク質（配列番号９５〜１００）を合成して、活性に対する互いに対するＡＲタンパク質の配向の影響を審査した。各コード化核酸配列を発現ベクターにクローン化し、単一特異性ＡＲタンパク質について上記のように、ＩＭＡＣクロマトグラフィーにより精製した。
【０１８７】
二重特異性ＡＲタンパク質は、ｈＩＬ１３及びＩＬ４への結合、並びにＩＬ１３及びＩＬ４依存性シグナル伝達を阻害する能力について評価した。
【０１８８】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞において、ＩＬ１３はＩＬ１３ＲＡ１：ＩＬ４Ｒ複合体（２型受容体）を活性化し、ＳＴＡＴ−６シグナル伝達経路を介して胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子の選択を誘発する。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞を使用するＳＴＡＴ６のＩＬ１３依存性活性のアッセイは、市販されている（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。高親和性結合タンパク質と低親和性結合タンパク質との分化を可能にするために、最適な粗抽出物の希釈（１：５２００）を選択した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＴ−６細胞の刺激は、以下のように行った。１日目に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに、１０％加熱不活性化したＦＢＳ（１００８２，Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む１００μＬの細胞培養培地（４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ（１１９９５、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０μｇ／ｍＬのブラスチシジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、及び１００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））中、２．５×１０5／ｍＬの密度で２４時間置いた。２日目に、１ｎｇ／ｍＬ（８０ｐＭ）ヒトＩＬ１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）又はｃｙｎｏ  ＩＬ１３と事前混合された適切な濃度のＡＲタンパク質を含有する１００μＬの細胞培養培地を細胞に添加した。プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ2で２４時間培養した。分泌された胚アルカリホスファターゼを測定するために、４０μＬの各細胞上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と、クリアな９６ウェルプレート内で混合した。プレートを３７℃で２時間培養し、プレートリーダーを使用して６５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１８９】
二重特異性ＡＲタンパク質の全ては、構成体の配向に関係なく、ｈＩＬ１３及びＩＬ４に対して高い親和性で結合する能力（表１７）、並びにＩＬ１３及びＩＬ４依存性シグナル伝達を阻害する能力（表１８及び１９）を保持した。
【０１９０】
【表１８】
2014519808.tif 000020
【０１９１】
【表１９】
2014519808.tif 000021
【０１９２】
【表２０】
2014519808.tif 000022
【０１９３】
実施例５：二重特異性ＡＲタンパク質の最適化
式Ｎキャップ−［ＡＲ］ｎ−Ｃキャップ、並びに上記のそれらの突然変異に基づくライブラリの形成において、様々な位置での残基の置換に加えて、一般的なＡＲタンパク質突然変異が組み込まれ得る。これらの突然変異は、任意のＡＲタンパク質分子に適用することができ、これらの突然変異は、以下の表２０にまとめられるように、全てのＡＲタンパク質に共通の配列の位置内で発生する。
【０１９４】
【表２１】
2014519808.tif 000023
【０１９５】
大腸菌において発現するタンパク質の場合、Ｎ末端メチオニン残基の処理は、Ｎ末端メチオニンの直後のアミノ酸により影響され得る（Ｈｉｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８２４７〜５１，１９８９）。このメチオニン残基の総処理は、精製された生成物の均一性を増加させることが望ましい。Ｎキャップにおいて、Ｎ末端メチオニン残基がＨＩＳタグ無しに発現されたときに効果的に処理され得るかどうかを決定するために、位置１は、アスパラギン酸からグリシン又はアラニンに変更した。Ｎキャップの位置３は、ＧｌｙからＡｓｐに突然変異し、この突然変異は、国際公開第ＷＯ  ２０１／００６０７４８号に記載されるように、ＡＲタンパク質コンセンサス配列を安定させることが分かった。ＡＲモジュールの位置２７は、多様性において、ＡＲタンパク質ライブラリ設計中のＡｓｎ、Ｔｙｒ、又はＨｉｓに制限される（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２：５７５〜５８２，２００４）。フレームワークの位置２８がＧｌｙであるとき、配列２７Ａｓｎ−Ｇｌｙ２８からなるＡＲタンパク質を単離する可能性がある。Ａｓｎ−Ｇｌｙジペプチドは、脱アミド反応を起こす傾向がある（Ｇｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：７８５〜９４，１９８７）。このようにして、単離されたＡｓｎ−Ｇｌｙ配列の位置２７は、一般にＴｙｒ又はＨｉｓのいずれかに突然変異され得る。加えて、リボソーム表示により選択されるＩＬ４結合ＡＲタンパク質は、Ｃキャップ内のアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ａｓｎで終了する。この配列は、スクリーニングのための発現ベクターにサブクローニングするための制限部位に対応するために、ＡＲタンパク質の上に追加される。これらの位置の好ましいアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ａｌａである。Ｃキャップは、安定化及び最適化された発現特性のために更に変異された（配列番号１０３）。
【０１９６】
例示の最適化二重特異性ＩＬ４／ＩＬ１３結合タンパク質は、配列番号１０４に示されるものである。
【０１９７】
実施例６：代理抗マウスＩＬ４  ＡＲタンパク質の生成
ヒト及びマウスＩＬ４は、わずか４１％の配列同一性を共有するため、ヒトＩＬ４に対して選択されたＡＲタンパク質がマウスＩＬ４と交差反応する可能性は低い。よって、マウスＩＬ４がぜんそく病理において役割を果たすことが示されたマウスモデルの研究を可能にするために、サブナノモル親和性でマウスＩＬ４に特異的に結合するＡＲタンパク質を選択することが必要であった。５ラウンドのリボソーム表示選択は、ビオチン化マウスＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を使用して、Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ  ＡＲタンパク質ライブラリ（Ｂｉｎｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：５７５〜８２，２００４）と競合した後、ニュートラアビジンビーズ上で捕捉した。高親和性の結合剤を同定するために、オフ速度選択方法を以下のように行った。ビオチン化ｍＩＬ４（５ｎＭ）をリボソーム表示されたＡＲタンパク質に２時間又は６時間結合した後、競合剤として２．１ｍＭ非ビオチン化ＩＬ４で４時間又は１６時間培養した。ビオチン化ｍＩＬ４に付着したままの遅いオフ速度を持つＡＲタンパク質は、ニュートラアビジン粒子上で捕捉した。追加ラウンドのリボソーム表示選択を標準条件下で行い、高親和性結合剤を補強した。選択されたＡＲタンパク質は、ｍＩＬ４依存性ＨＴ２増殖の阻害のために精製されたＡＲタンパク質を使用してスクリーニングした。マウス脾臓から単離されたＨＴ２細胞、Ｔ−リンパ球（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１８４１（商標））を、製造者の推奨を使用して培養した（ＲＰＭＩ  １６４０，２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００〜２００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、及び１０％  ＦＢＳ）。増殖アッセイの場合、細胞をフラスコから除去し、ＩＬ−２を含まない培養培地からなるアッセイ緩衝液中で４回洗浄し、５０μＬ中５．０×１０４細胞／ｍＬの密度で９６ウェルの底の不透明なプレートに置いた。細胞を７４ｐＭ  ＩＬ４及び適切な濃度のＡＲタンパク質で処理し、３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養した。細胞タイターＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７１）をアッセイプレート（１００μＬ）に添加し、被覆して、室温で４０分間振とう器上に置いた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、上位読み取りから測定した。ｍＩＬ４に対する親和性に基づいて、ＩＬ４Ｒに結合するｍＩＬ４の中和、ｍＩＬ４依存性ＨＴ２増殖の中和、熱安定性、及びサイズ排除クロマトグラフィーによる単分散に基づいて、ＡＲタンパク質Ｃ０６＿２１Ｈ２（配列番号１０５）を、インビボ研究の代理ｍＩＬ４結合ＡＲタンパク質として選択した。
【０１９８】
二重特異性活性
ぜんそくのマウスモデルにおけるＩＬ４及びＩＬ１３の両方の刺激性阻害の効果を試験するために、Ｃ０６＿２１Ｈ２及びＣ０２＿１１Ｇ１１を連結する二重特異性ＡＲタンパク質（配列番号１０６）、有能なマウスＩＬ１３阻害剤は、（ＧＧＧＧＳ）４ポリペプチドリンカーを介して、Ｃ０６＿２１Ｈ２のＮ末端をＣ０２＿１１Ｇ１１のＣ末端に連結するように設計した。Ｎ末端ヒスチジンタグは、上記のように、精製を支援するためにＮ末端に添付された。
【０１９９】
実施例７：１１Ｇ１１−２１Ｈ２の噴霧化
げっ歯類吸入系を使用する噴霧化を介してＡＲタンパク質を送達する能力を評価するために、代理二重特異性ＡＲタンパク質（１１Ｇ１１−２１Ｈ２）を用いて噴霧化安定性研究を行った。エアロゾルは、入口圧１３７．９ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で圧縮空気に接続されるＰａｒｉ  ＬＣ  Ｐｌｕｓジェットネブライザにより生成した。これは約５Ｌ／分の出力流量をもたらした。１１Ｇ１−２１Ｈ２の溶液処方は、ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬで調製した。エアロゾルは、１．５８−ｃｍ（直径）送達ラインの約６１．０ｃｍ（２４ｉｎ）を通して配向した。送達ラインは、約１０Ｌ／分の強制空気希釈流量で適合した。エアロゾルは、２４ポートノーズを通る、げっ歯類曝露チャンバのみの流れを通過した。チャンバ排出流量は、約２０Ｌ／分の体積流量に調節して、周囲条件に対してわずかに陰性であるチャンバをもたらす。エアロゾルは、１．０Ｌ／分の名目体積流量で４７ｍｍ  Ｚｅｆｌｕｏｒフィルター上で収集した。フィルターから回復した試料をＳＥＣ、及び２８０ｎｍでの吸光度により分析し、潜在的な凝集体及びＡＲタンパク質濃度を評価した。
【０２００】
粒径分布は、Ｍｅｒｃｅｒスタイル、７段階カスケードインパクター（ＩＮ−ＴＯＸ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）により測定した。インパクター試料は、２Ｌ／分の名目流量で、必要とされるエアロゾル濃度として、１〜２分の間収集した。インパクターデータを分析して、質量メジアン直径（ＭＭＡＤ）及び幾何学的標準偏差（ＧＳＤ）を決定した。フィルターから試料を抽出するために、それらを巻いてガラスバイアル瓶に入れた。４ミリリットルのＰＢＳを各バイアル瓶に添加した。バイアル瓶を密閉し、４５分間４０ｒｐｍで回転器上に置いた。分析のために、試料をＨＰＬＣバイアル瓶に移した。次いで試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。分析は、噴霧化されたＡＲタンパク質１１Ｇ１１−２１Ｈ２が、３０分及び１時間で凝縮されたエアロゾルとして収集され、主なピークが６．０９分で溶出したことを示した。試料カップポスト噴霧化において残存する１１Ｇ１１−２１Ｈ２の試料において、主なピークは５．９分で溶出した。より長い噴霧化時間による試料濃度の試料増加は、ピーク強度の増加により証明された。
【０２０１】
前述されるように、ＩＬ１３及びＩＬ４依存性Ｓｔａｔ６、並びにＩＬ４依存性ＨＴ２増殖アッセイにおいて、活性についても試験した。試験に先行して、エアロゾル化ＡＲタンパク質又はカップ内に保持されるＡＲタンパク質の濃度を、Ａ２８０により評価し、ＩＬ１３  ＳＴＡＴ６活性アッセイ（図２Ａ）又はＩＬ４依存性ＨＴ２増殖アッセイ（図２Ｂ）；噴霧化前ＡＲタンパク質（正方形）；エアロゾル化ＡＲタンパク質（三角形）；保持されたＡＲタンパク質（菱形）を使用して、活性を測定した。これらの実験は、二重特異性ＡＲタンパク質構成体、１１Ｇ１１−２１Ｈ２がＳＥＣにより単分散され、両方の活性を保持することを示した。図３に示されるカスケードインパクションデータは、噴霧化ＡＲタンパク質１１Ｇ１１−２１Ｈ２が、２．８４μＭのＭＭＡＤをげっ歯類曝露に適切な１．６６のＧＳＤと共に有することを示した。
【０２０２】
実施例８：１１Ｇ１１−２１Ｈ２の薬物動態プロファイル
１１Ｇ１１−２１Ｈ２の薬物動態プロファイルは、健常なマウス、又はぜんそく肺を模倣するオボアルブミンで感作及び惹起したマウスにおいて、４ｍｇ／ｋｇで気管内滴下を介して送達されるタンパク質について決定した。動物がつま先をつまむことに応答せず、気管内にカテーテルを挿入して応答しなくなるまで、３〜５％イソフルランで麻酔をかけた。２０ゲージ以下のカテーテルを気管に挿入し、化合物を平滑な動きで肺に滴下した。単一滴下中に挿入された溶液の体積は、約５０μＬであった。複数の時点（ｎ＝５マウス／時点）において、データを収集した。１１Ｇ１１−２１Ｈ２構成体の濃度は、ＡＲタンパク質特異性抗体を使用して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、肺ホモジネート、及び血清試料からＥＬＩＳＡにより決定した（図４）。正常なマウス対罹患したマウスにおいて得られるＰＫプロファイルに有意な差はなく、マウスＢＡＬ及び肺における予測末端半減期は約６〜８時間である。血清濃度により評価されるように、全体全身性曝露は、肺内で達成される曝露より著しく低い。ｔmaxにおいて、ＢＡＬレベルは平均で４０μｇ／ｍＬを超えるが、血清レベルは１００ｎｇ／ｍＬ未満であった（ＢＡＬ濃度に対して約４００倍低い）。ＢＡＬ試料、肺ホモジネート、又は血清中のＡＲタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡにより評価した。２４時間を超える血清濃度は、アッセイの検出レベル以下であった。
【０２０３】
比較するために、それらの小さな寸法に起因して、静脈内注射により全身投与されるＡＲタンパク質は、３０分未満の半減期で血液循環から除去される（データ図示せず）。
【０２０４】
実施例９：１１Ｇ１１−２１Ｈ２のインビボデータ
１１Ｇ１１−２１Ｈ２がＩＬ４及びＩＬ１３依存性転帰をインビボで阻害する能力を評価するために、マウス急性ＯＶＡ感作及び惹起モデルを使用した。つまり、８〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０日目及び７日目に、滅菌水中のオボアルブミン（ＯＶＡ、１０ｍｇ）及び水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ、２ｍｇ）の混合物を腹腔内注射により免疫付与した。次いで１４日目から開始して２日間、マウスを経鼻的にオボアルブミンで惹起し、１６日目に屠殺した。非感作群の場合、マウスに滅菌水のみを免疫付与し、吸入によりＰＢＳで処理した（ビヒクル対照）。全ての他の群の場合、マウスをＯＶＡで感作し、１１Ｇ１１（抗ＩＬ１３  ＡＲタンパク質）、２１Ｈ２（抗ＩＬ４  ＡＲタンパク質）、１Ｇ１１−２１Ｈ２（抗ＩＬ４、抗ＩＬ１３二重特異性ＡＲタンパク質）、又はＥ３＿５（非結合対照ＡＲタンパク質）を用いて２０ｍｇ／ｋｇ（単一特異性）又は４０ｍｇ／ｋｇ（二重特異性）で処理した。１１Ｇ１１−２１Ｈ２又はＥ３＿５は、ＯＶＡ惹起の前日から開始して屠殺の前日まで（１３日目〜１６日目）１日当たり１回の気管内滴下を介して送達した。最後のＯＶＡ惹起から４８時間語、マウスに麻酔をかけ、それらの肺機能（メタコリン惹起に対する応答）を全身プレチスモグラフィー（Ｂｕｘｃｏ）により試験した後、即時屠殺した。ＢＡＬ（１ｍＬ  ＰＢＳ）を死後に行い、細胞及び液体を全ての動物から収集し、細胞数及び差異を計算して、ＢＡＬ上清を−８０℃で凍結させた。
【０２０５】
図５に示されるように、１１Ｇ１１及び１１Ｇ１１−２１Ｈ２の両方に阻害されたＯＶＡは、メタコリンに応答して、気道の過剰反応性を誘発した。ｍＣＮＴＸ４１３を使用するＩＬ４及びＩＬ１３の両方の追加の遮断において、１１Ｇ１１−２１Ｈ２に阻害されたＯＶＡは、図６に示されるように、アレルゲン関連炎症性疾患の顕著な特徴であるマウスの肺への好酸球動員を誘発した。このモデルにおいて、好酸球動員は、主としてＴＨ２サイトカイン（すなわち、ＩＬ４、ＩＬ１３）依存性である。データは、総細胞浸潤の好酸球率として示される。
【０２０６】
実施例１０：ＩＬ１３結合タンパク質及びＣＹＮＯ  ＩＬ−１３の結晶構造
ＩＬ１３結合タンパク質６Ｇ９（配列番号１０９、１２７、及び１４４のＡＲから形成される配列番号１６２）と、二重特異性ＩＬ４／ＩＬ１３結合タンパク質（配列番号４１、１０４、及び１７７）及びｃｙｎｏ  ＩＬ１３において見出されるものと間の複合体の結晶構造は、１．６Å解像度で決定した。立体配座エピトープが同定されると同時に、結合タンパク質残基は標的認識に関与する。
【０２０７】
以下の省略形：ＨＥＰＥＳ：Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ＲＭＳＤ：２乗平均平方根；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィーが使用される。結合タンパク質６Ｇ９は発達して、高い親和性でＩＬ１３に結合し、その受容体ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４Ｒαを通じてシグナル伝達を遮断する。
【０２０８】
６Ｇ９は、ピコモル範囲においてＫDでヒトＩＬ１３に結合し、ｃｙｎｏ  ＩＬ１３に向かう交差反応性を呈する。作用の機序への洞察のために、結合タンパク質６Ｇ９は、ｃｙｎｏ  ＩＬ１３との複合体内で結晶化した。構造は、１．６Å解像度で決定した。
【０２０９】
タンパク質
Ｎ末端ＳＵＭＯタグを有するＣｙｎｏ  ＩＬ１３は、大腸菌内で発現し、ＨｉｓＴｒａｐ、ＳＵＭＯタグ分裂、及び最終ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２、ロット番号０８１１２６−ＣＰ００７２１ｙ）中のＳＥＣにより精製した。
【０２１０】
複合体の調製
結合タンパク質６Ｇ９を、２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ  ６．５（緩衝液Ａ）で平衡化されたＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で更に精製した。４０カラム体積中２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ  ６．５、１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の１１〜２９％勾配で溶出を行った。主なピーク分留を濃縮し、複合体形成に使用した。
【０２１１】
結合タンパク質：ＩＬ１３複合体は、１：１．１のモル比で過剰なＩＬ１３と６Ｇ９を混合することにより調製し、４℃で２時間培養した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上のＳＥＣは、非結合種を分離した。複合体を、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ  ５ｋＤａデバイスを使用して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中１３．７５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０２１２】
結晶化
複合体の結晶化は、Ｏｒｙｘ４ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２０℃で蒸気拡散法により行った。実験は、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  ３５５０プレートにおいて、シッティングドロップ形式で、等しい体積のタンパク質及びリザーバ溶液で構成された。初期スクリーニングは、ＰＥＧスイート（Ｑｉａｇｅｎ）及びインハウススクリーンＩＨ１及びＩＨ２、並びに１３．７５ｍｇ／ｍＬのタンパク質複合体溶液を用いて行った。プレート形状の積層された結晶は、０．１Ｍ  Ｎａ酢酸緩衝液、ｐＨ  ４．５、１８〜２５％  ＰＥＧ  ３３５０、及び０．２Ｍ硫酸リチウム又は０．２Ｍ硫酸アンモニウムのいずれかを含む、ＩＨ２条件Ａ１〜Ａ４から出現した。これらの結晶を使用して、０．１Ｍ  Ｎａ酢酸緩衝液、ｐＨ  ４．５、２５％  ＰＥＧ  ３３５０、及び、０．２Ｍ硫酸リチウムの安定化溶液中での微小種マトリックススクリーニングのための種を調製した。播種は、０．２μＬタンパク質、０．０５μＬ種、及び０．１５μＬリザーバを使用して行った。希釈したタンパク質複合体（４．８ｍｇ／ｍＬ）及び５０倍に希釈した種を条件の最適化に使用した。Ｘ線品質結晶は、０．１Ｍ  Ｎａ酢酸、ｐＨ  ４．５、１１％  ＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍ  Ｌｉ2ＳＯ4から得られた。結晶データを表２１に示す。
【０２１３】
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集の場合、１つの結晶を、０．１Ｍ  Ｎａ酢酸、ｐＨ  ４．５、２０％  ＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍ  ＬｉＣｌ、２０％グリセロールを含有する低温保護溶液に数秒間浸漬し、液体窒素中で凍結させた。回折データを、Ｓｗｉｓｓ光源シンクロトロンにおいて、０．２５°画像当たり０．２５秒の曝露を伴う１８０°の結晶回転により収集した。Ｘ線データ統計を表２１に示す。
【０２１４】
【表２２】
2014519808.tif 000024
【０２１５】
構造は分子置換により溶解した。結合タンパク質６Ｇ９（ＤＡＲ６Ｇ９ＸＰ０１）及びヒトＩＬ−１３（Ｉ１３００６２Ｇ０２）を結合する結晶構造は、検索モデルとして使用して。全ての結晶学的計算は、ＣＣＰ４一連のプログラムを用いて行った。モデル調節は、プログラムＣＯＯＴを使用して行った。精密化統計を表２１に提供する。
【０２１６】
結合タンパク質／ＩＬ１３境界面
複合体の結晶構造を図８に示す。結合タンパク質６Ｇ９は、らせんＤが結合タンパク質分子の主要な溝に適合するように、ＩＬ１３のらせんＡ及びＤを結合する。アンキリン反復の４回のβ回転により形成される隆起部は、らせんＡとＤとの間の空間に適合する。標的認識は、４つのβ回転全て及び溝を形成する５つのらせんのうち４つを伴う。境界面は広範であり、各モジュール上のほぼ１，０００Å２を被覆する。
【０２１７】
ＩＬ１３との複合体における結合タンパク質構造と単独の結合タンパク質構造との比較は、結合タンパク質分子が比較的堅固であることを示す。標的（ＩＬ１３）を結合するときに、結合タンパク質は図８に示されるように、約３．５°だけ開く。
【０２１８】
隆起部での分子間相互作用は、大部分が疎水性である（図９）。それらは、結合タンパク質残基Ｓｅｒ４５−Ｔｙｒ４６（β回転１）、Ｐｈｅ７８−Ｉｌｅ７９（β回転２）、Ｉｌｅ１１１−Ｖａｌ１１２（β回転３）、Ｌｙｓ１４４−Ｐｈｅ１４５（β回転４）を伴う。
【０２１９】
結合タンパク質の溝での相互作用は、疎水性及び電荷残基の両方を伴う（図１０）。計２０個の結合タンパク質において、残基は、４−Åカットオフ距離に基づいて、ＩＬ１３を結合することに関与する（図１１）。ＩＬ１３上の結合タンパク質エピトープは、１７個の残基（らせんＤから１０及びらせんＡから７）を含む（図１２）。図１２に示される配列は、配列（配列番号１０１内ではない）の開始時に、リーダー配列Ｐｒｏ残基の結果として、配列番号１０１から１残基差を有する。
【０２２０】
らせんＤの末端における３つの残基は、結合エネルギーのかなりの部分：Ｆ１０７、Ｒ１０８、及びＮ１１３に寄与すると考えられる（それぞれ、Ｆ１０６、Ｒ１０７、及びＮ１１２である配列番号１０１内ではなく、位置において１アミノ酸だけ異なる）。後者は、３つの塩架橋を形成する、Ｃ末端カルボキシル基をＲ２３（２）及びＲ５６に提供する（図１０）。Ｎ１１３の側鎖は、３  Ｈ結合（Ｄ４４、Ｓ４６、Ｒ５６に対する）及びＹ４６とのｖａｎ−ｄｅｒ−Ｗａａｌｓ接触を形成する。明らかに、この結合タンパク質は、ＩＬ１３のＣ末端残基としてＮ１１３の存在に対して非常に敏感でなければならない。より短いか、又はより長い１つの残基は、結合を制限する可能性が高い。
【０２２１】
６Ｇ９の中和効果は、受容体鎖ＩＬ１３Ｒα１とのＩＬ１３相互作用を遮断することに起因する。６Ｇ９は、ＩＬ１３：ＩＬ１３Ｒα１：ＩＬ４Ｒα複合体の結晶構造から判断され得るように、ＩＬ４Ｒαと干渉しない。
【０２２２】
静電相互作用
荷電された残基は相互作用において重要な役割を果たすが、それらの分布はかなり予想外である。らせんＡ及びＤにより形成されるＩＬ１３の結合表面は、多数の塩基性残基に起因して正に荷電される。しかしながら、結合タンパク質の溝は、左（Ｎ末端）半分、すなわち、正にそれがＩＬ１３に結合する場所に正電荷も担持する。なんらかの方法で、中心クラスタ（Ｒ２３、Ｒ５６、Ｒ９０）の正電荷は、ＩＬ１３  Ｃ末端電荷及びらせんＤの双極子により均衡される。Ｄ７７、Ｄ８１、Ｄ１１０、Ｅ１１４、Ｄ１４３、Ｄ１５１、及びＤ１５５を含む溝内の酸性パッチは、相互作用にそれほど寄与しない。
【０２２３】
交差反応性
ヒト及びｃｙｎｏ  ＩＬ１３は、６つの位置のみが異なる（図１２）。それらのうちの１つである位置１１は、偶然にも６Ｇ９エピトープ内にある。しかしながら、この残基（ヒトにおけるＡｒｇ、ｃｙｎｏにおけるＬｙｓ）は、側鎖の脂肪族部分を通じて、結合タンパク質に接触する。したがって、ヒトＩＬ１３とｃｙｎｏ  ＩＬ１３との間に結合の差は予想されない。
【０２２４】
また位置１１１におけるＲ／Ｑ置換は、結合に作用してはならない。興味深いことに、残基１１１は、相互作用に関与しないらせんＤのＣ末端部分における唯一の残基である（図１２）。この位置におけるＧｌｎは、ｃｙｎｏ  ＩＬ１３及びヒトＩＬ１３の天然変異型において観察される（古い文献では、Ｑ１３０と称される）。結論として、結合タンパク質６Ｇ９は、ｃｙｎｏ  ＩＬ１３及びヒトＩＬ１３の両変異型を等しく良好に結合する。
【０２２５】
ＩＬ１３構造
ＩＬ１３構造は、以前に決定された抗体複合体との比較に使用できる。これらの抗体の全ては、らせんＡ及びＤにより形成される表面で、ＩＬ１３を結合する。構造の重畳は、４らせん束内のらせんの配置が、全ての構造において本質的に同一であることを示す（図１３）。Ｎ及びＣ末端におけるいくつかの差は、対応する受容体分子との相互作用に起因し得る。同一のＣＤＲを共有する、ＩＬ１３抗体のうちの２つに差はないことに留意されたい。結合タンパク質複合体におけるらせんＤは直線であるが、抗体複合体において顕著に曲げられる。有角偏差は約１５°であり、残基１１０において３．３Åのシフトに変換される。
【０２２６】
らせんコアとは対照的に、らせんを接続するループＡＢ及びＣＤは、実質的な可変性を呈する。本構造において、ループＣＤは、完全に障害される。それらの可撓性を考慮して、ループの観察される配座は、ループが抗体との接触に関与しないため、血漿パッキングにより影響される可能性が最も高い。
【０２２７】
ＩＬ１３：結合タンパク質６Ｇ９の結晶構造は、この結合タンパク質が、ＩＬ１３のらせんＡ及びＤを認識することを明らかにした。エピトープは、ＩＬ１３抗体のうちの１つのエピトープと視覚的に同一である。Ｎ１１３のＣ末端カルボキシル基は、エピトープの主要素である。標的認識は、４つのβ回転全て及び溝を形成する５つのらせんのうち４つを伴う。Ｎ末端キャップからのＲ２３は、必須認識残基である。β回転により形成される隆起部での結合タンパク質ＩＬ１３相互作用は、主に疎水性である。溝における相互作用は、疎水性及び静電性の両方である。ＩＬ１３を結合するときに、結合タンパク質分子は約３．５°だけ開く。
【０２２８】
配列整合は、ｃｙｎｏ  ＩＬ１３についてここで同定された結合タンパク質エピトープが、ヒトＩＬ１３及びＲ１１１Ｑ（Ｒ１３０Ｑとして知られる）ヒト変異型とともに保存される。したがって、結合タンパク質６Ｇ９は、これらの種に向かって交差反応性であることが予想される。６Ｇ９の中和効果は、受容体鎖ＩＬ１３Ｒα１とのＩＬ１３相互作用を遮断することに起因する。６Ｇ９は、ＩＬ４Ｒαと干渉しない。ＩＬ１３のＲ１０８に結合した酢酸イオンは、結合タンパク質ＩＬ１３境界面に位置する。これは、酢酸だけでなく、恐らく他のアニオン、例えば、リン酸塩が、結合タンパク質による結合に負の影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０２２９】
【表２３−１】
2014519808.tif 000025
【０２３０】
【表２３−２】
2014519808.tif 000026
【０２３１】
【表２３−３】
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【０２３２】
【表２３−４】
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【０２３３】
【表２３−５】
2014519808.tif 000029
【０２３４】
【表２３−６】
2014519808.tif 000030
【０２３５】
【表２３−７】
2014519808.tif 000031
【０２３６】
【表２３−８】
2014519808.tif 000032
【０２３７】
【表２３−９】
2014519808.tif 000033
【０２３８】
【表２３−１０】
2014519808.tif 000034
【０２３９】
【表２３−１１】
2014519808.tif 000035
【０２４０】
【表２３−１２】
2014519808.tif 000036
【０２４１】
【表２３−１３】
2014519808.tif 000037
注記：配列番号４１、１０４、１７７、及び１７８は任意にＮ末端にＭｅｔ残基を有する。
【０２４２】
【表２４−１】
2014519808.tif 000038
【０２４３】
【表２４−２】
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【０２４４】
【表２４−３】
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【０２４５】
【表２５−１】
2014519808.tif 000041
【０２４６】
【表２５−２】
2014519808.tif 000042
【０２４７】
【表２５−３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014519808.tif 000051
【図７】
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【図８】
2014519808.tif 000053
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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