(57)【要約】少なくとも２つの異なる酵素と、それらの酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークとを有する、ナノ複合体を提供する。幾つかの態様において、酵素の活性は、カスケード反応を触媒する。2014522649.tif 000006
2014522649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる酵素と、前記少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークと、を含む、多酵素ナノ複合体。
【請求項２】
前記ポリマーネットワークが、前記少なくとも２つの異なる酵素の全てに固定される、請求項１に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項３】
前記２つの異なる酵素の活性が、カスケード反応を触媒する、請求項１に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項４】
前記少なくとも２つの異なる酵素が、相互に共有結合されるかまたは非共有結合される、請求項１に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項５】
前記共有結合が、インビボで分解性である、請求項４に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項６】
前記少なくとも２つの異なる酵素が、相互に結合されない、請求項１に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項７】
前記ポリマーネットワークが、少なくとも１つのモノマー単位から構成されるポリマーを含む、請求項１に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項８】
前記ポリマーネットワークが、少なくとも２つの異なるモノマー単位から構成されるポリマーを含む、請求項７に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項９】
前記ポリマーネットワークが、架橋剤を更に含む、請求項７または８に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項１０】
少なくとも２つの異なる酵素と透過性のシェルとを含む多酵素ナノ複合体であって、前記シェルが、前記少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークを含む、多酵素ナノ複合体。
【請求項１１】
ポリマーネットワークおよび少なくとも２つの異なる酵素から本質的になる多酵素ナノ複合体であって、前記ポリマーネットワークが、前記少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに共有結合的に固定され、前記少なくとも２つの異なる酵素の周囲に透過性のシェルを提供する、多酵素ナノ複合体。
【請求項１２】
請求項１に記載の多酵素ナノ複合体を生成する方法であって、
（ａ）前記少なくとも２つの異なる酵素を相互に結合する工程と、
（ｂ）（ａ）によって生成される前記結合された酵素をアクリル化する工程と、
（ｃ）少なくとも１つのモノマー単位および任意で架橋剤を使用して、（ｂ）によって生成される前記アクリル化された酵素をインサイチュで重合する工程と
を含む、方法。
【請求項１３】
（ｄ）前記結合を除去する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合する工程が、
（ｉ）各酵素に特異的なリガンドを単一の核酸に結合することと、
（ｉｉ）前記核酸に結合された前記リガンドが前記酵素に結合するように誘起することと、
（ｉｉｉ）核酸ハイブリダイゼーションが生じる条件を提供することと
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合する工程が、前記酵素を、互いにハイブリッド形成可能である１本鎖核酸に結合することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）における前記結合する工程が、リンカーの前記使用を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
第１の基質との第１の酵素反応において第１の生成物を生成する、第１の酵素と、
第２の酵素反応において前記第１の生成物と反応する、第２の酵素と、
前記第１の酵素および前記第２の酵素を被包するシェルを形成するように構成される、ポリマーネットワークと
を含み、
前記ポリマーネットワークが、前記第１の基質を前記シェルの外側の外部環境から、前記第１の酵素へと拡散させ、前記第１の生成物を生成することを可能にするのに十分な透過性を示し、
前記ポリマーネットワークが、前記第１の生成物を前記第１の酵素から離して前記第２の酵素へと拡散させ、前記第２の酵素反応が生じることを可能にするのに十分な透過性を示し、
前記第１の酵素が、前記第２の酵素に結合されるか、あるいは
前記ポリマーネットワークが、前記第１の酵素のポリペプチドまたは前記第２の酵素のポリペプチドに結合される、多酵素ナノ複合体系。
【請求項１８】
前記多酵素ナノ複合体がインビボに配置されるときに、前記ポリマーネットワークが、前記第１の酵素または前記第２の酵素の分解を阻害するのに十分な様式で前記第１の酵素および前記第２の酵素を被包する、請求項１７に記載の多酵素ナノ複合体系。
【請求項１９】
前記第１の酵素および前記第２の酵素が、相補的なポリヌクレオチドの鎖によって連結されている、請求項１７に記載の多酵素ナノ複合体系。
【請求項２０】
経口投与製剤において使用するのに適合された１つ以上の充填剤、結合剤、または緩衝剤と組み合わせられる、請求項１７に記載の多酵素ナノ複合体系。
【請求項２１】
前記ポリマーネットワーク内に被包される第３の酵素を更に含む、請求項１７に記載の多酵素ナノ複合体系。
【請求項２２】
容器と前記多酵素ナノ複合体系を使用するための指示書とを含むキット中に配置される、請求項１７に記載の多酵素ナノ複合体系。
【請求項２３】
表面修飾多酵素ナノ複合体を形成するために、少なくとも２つの異なる酵素と、前記ナノ複合体に表面を提供する前記少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークと、前記表面に結合される１つ以上の表面修飾剤と、を含む、表面修飾多酵素ナノ複合体。
【請求項２４】
前記１つ以上の表面修飾剤が、
前記ナノ複合体の溶解度を調節し、かつ／または
前記ナノ複合体の表面電荷を調節する、請求項２３に記載の表面修飾多酵素ナノ複合体。
【請求項２５】
前記１つ以上の表面修飾剤が、細胞標的化および／または細胞透過を促進する、請求項２３に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項２６】
前記１つ以上の表面修飾剤が、小分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、多糖類、および抗体からなる群より選択される、請求項２３に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項２７】
前記１つ以上の表面修飾が、ポリマーを含む、請求項２３に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項２８】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコールを含む、請求項２７に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項２９】
前記表面修飾多酵素ナノ複合体が、複数の異なる表面修飾を含む、請求項２３に記載の多酵素ナノ複合体。
【請求項３０】
請求項２３に記載の表面修飾多酵素ナノ複合体を生成する方法であって、前記表面修飾多酵素ナノ複合体を生成するために、
（ａ）前記少なくとも２つの異なる酵素を相互に結合する工程と、
（ｂ）（ａ）によって生成される前記結合された酵素をアクリル化する工程と、
（ｃ）少なくとも１つのモノマー単位および任意で架橋剤を使用して、（ｂ）によって生成される前記アクリル化された酵素をインサイチュで重合して、前記ナノ複合体に表面を提供する工程と、
（ｄ）１つ以上の表面修飾剤を、（ｃ）によって提供される前記表面に結合する工程と
を含む、方法。
【請求項３１】
前記表面修飾剤が、小分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、多糖類、および抗体からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
治療を必要とする対象において疾患または障害を治療するための方法であって、前記対象に、請求項１、１０、１１、１７、および２３のいずれかに記載の複数の前記ナノ複合体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つが、酵素補充療法として使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つが、前記対象において前記疾患または障害を引き起こす代謝産物のレベルを調節、増加、または減少させるために使用される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、米国特許法第119条(e)の下で、2011年6月6日に出願された「ORAL DELIVERY OF ENZYME BY NANOCAPSULES FOR TARGETED METABOLISM OF ALCOHOL OR TOXIC METABOLITES」を表題とする同時係属中の米国仮特許出願第61/504.975号および2011年8月31日に出願された「MULTIPLE-ENZYME NANOCOMPLEXES」を表題とする同時係属中の米国仮特許出願第61/529,767号の恩典を主張する。
【０００２】
政府の支援に関する声明
本発明は、アメリカ合衆国国防総省 国防脅威削減局から授与された助成金第HDTRA1-09-1-0001号の下で、政府による支援を受けてなされたものである。政府は本発明に関して一定の権利を有している。
【０００３】
本開示の分野
本開示は概して、酵素機能を協同的に行う複数の酵素を含有する、ナノ構造に関する。かかる構造を調製および使用する方法もまた、開示される。
【背景技術】
【０００４】
背景
酵素は、生物のあらゆる生物学的プロセスを媒介する精巧な生体触媒である。真核生物細胞において、大部分の酵素は、自由に細胞質ゾル内で拡散することはなく、空間的に細胞内オルガネラ内に規定されているかまたは他のタンパク質との酵素複合体として緊密に共存している（例えば、Conrado et al., Curr Opin Biotech 19, 492-499, (2008)（非特許文献1）； Yan et al., J Proteomics 72, 4-11, (2009)（非特許文献2）を参照のこと）。複数の酵素によって触媒される連続的な反応において、そのような緊密な拘束は、酵素間での中間体の拡散を最小限にし、全体的な反応の効率および特異性を向上させる（例えば、Yan et al., J Proteomics 72, 4-11, (2009)（非特許文献2）を参照のこと）。
【０００５】
典型的にインビボでは、代謝プロセスの間に生成される有毒な中間体は、そのような毒素を分解するよう設計され、かつ拘束された構造内に共存する隣接する酵素によって直ちに排除される（例えば、Kristensen et al., Natl Acad Sci USA 102, 1779-1784, (2005)（非特許文献3）を参照のこと）。一例として、ペルオキシソームは、重要な代謝および異化機能を有する様々なオキシダーゼ；有毒な中間体、例えば過酸化水素（H2O2）を保有している（例えば、Wanders et al., Annu Rev Biochem 75, 295-332, (2006)（非特許文献4）； およびSchrader et al., Histochem Cell Biol 122, 383-393, (2004)（非特許文献5）を参照のこと）。興味深いことに、自然は、このジレンマを、ペルオキシソーム内にカタラーゼ（Cat）を組み込むことによって回避している。カタラーゼは、H2O2の分解に関して高い活性および特異性を有し；そのようにして生成されたH2O2の迅速な排除は、それがペルオキシソームから外部に拡散し他の細胞成分に被害をもたらすのを防止する（例えば、Fujiwara et al., J Biol Chem 275, 37271-37277, (2000)（非特許文献6）； およびSheikh et al., P Natl Acad Sci USA 95, 2961-2966, (1998)（非特許文献7）を参照のこと）。
【０００６】
多酵素構造は自然界に広く存在するものであるが、酵素触媒および治療を含む現在の酵素に基づく応用は、依然として、単一酵素またはそれらの混合物の使用に限定されている（例えば、Leader et al., Nat Rev Drug Discov 7, 21-39, (2008)（非特許文献8）； Iso et al., J Microencapsul 6, 165-176, (1989)（非特許文献9）； Nouaimi-Bachmann et al., Biotechnol Bioen 96, 623-630, (2007)（非特許文献10）； およびMateo et al., Enzyme Microb Tech 40, 1451-1463, (2007)（非特許文献11）を参照のこと）。複数の酵素を組み込んだ無機およびポリマー物質が大規模に研究されているが；酵素は、薄いフィルムまたは大きな粒子（およそ100μm径）の形態のこれらの物質に無作為に固定され、それらの治療的応用が考慮されていなかった（例えば、Srere et al., P Natl Acad Sci USA 70, 2534-2538, (1973)（非特許文献12）； Mansson et al., P Natl Acad Sci---Biol 80, 1487-1491, (1983)（非特許文献13）； Kochschmidt et al., Eur J Biochem 81, 71-78, (1977)（非特許文献14）； およびSheldon et al., Adv Synth Catal 349, 1289-1307, (2007)（非特許文献15）を参照のこと）。
【０００７】
融合タンパク質技術は、多酵素構造を構築する1つのストラテジーを提供する（例えば、Riedel et al., Mol Microbiol 28, 767-775, (1998)（非特許文献1６）； Shibuya et al., Biosci Biotech Bioch 56, 884-889, (1992)（非特許文献17）； およびMao et al., J Biol Chem 270, 18295-18300, (1995)（非特許文献18）を参照のこと）。理想的には、そのような設計可能な機能を有する構造は、宿主細胞にトランスフェクトされるゲノム導入物を熟慮して遺伝子操作することによって達成され得る；にもかかわらず、このアプローチによってしばしば酵素の特異性および活性が消失または減少する（例えば、Stempfer et al., Nat Biotechnol 14, 481-484, (1996)（非特許文献19）； およびSeo et al., Appl Environ Microb 66, 2484-2490, (2000)（非特許文献20）を参照のこと）。さらに、適切な宿主細胞の発見および適当なスペーサーの設計は、融合タンパク質の構築のさらなる障害となる（例えば、Bulow et al., Bio-Technol 3, 821-823, (1985)（非特許文献21）を参照のこと）。最近、酵素複合体を構築するために翻訳後組立てが使用されたが；そのような組立てプロセスは、酵素成分間の特異的結合にのみ依存し、一般適用性を欠いている（例えば、Mingardon et al., Appl Environ Mirob 73, 7138-7149, (2007)（非特許文献22）； Fierobe et al., J Biol Chem 276, 21257-21261, (2001)（非特許文献23）； およびFierobe et al., J Biol Chem 277, 49621-49630, (2002)（非特許文献24）を参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Conrado et al., Curr Opin Biotech 19, 492-499, (2008)
【非特許文献２】Yan et al., J Proteomics 72, 4-11, (2009)
【非特許文献３】Kristensen et al., Natl Acad Sci USA 102, 1779-1784, (2005)
【非特許文献４】Wanders et al., Annu Rev Biochem 75, 295-332, (2006)
【非特許文献５】Schrader et al., Histochem Cell Biol 122, 383-393, (2004)
【非特許文献６】Fujiwara et al., J Biol Chem 275, 37271-37277, (2000)
【非特許文献７】Sheikh et al., P Natl Acad Sci USA 95, 2961-2966, (1998)
【非特許文献８】Leader et al., Nat Rev Drug Discov 7, 21-39, (2008)
【非特許文献９】Iso et al., J Microencapsul 6, 165-176, (1989)
【非特許文献１０】Nouaimi-Bachmann et al., Biotechnol Bioen 96, 623-630, (2007)
【非特許文献１１】Mateo et al., Enzyme Microb Tech 40, 1451-1463, (2007)
【非特許文献１２】Srere et al., P Natl Acad Sci USA 70, 2534-2538, (1973)
【非特許文献１３】Mansson et al., P Natl Acad Sci---Biol 80, 1487-1491, (1983)
【非特許文献１４】Kochschmidt et al., Eur J Biochem 81, 71-78, (1977)
【非特許文献１５】Sheldon et al., Adv Synth Catal 349, 1289-1307, (2007)
【非特許文献１６】Riedel et al., Mol Microbiol 28, 767-775, (1998)
【非特許文献１７】Shibuya et al., Biosci Biotech Bioch 56, 884-889, (1992)
【非特許文献１８】Mao et al., J Biol Chem 270, 18295-18300, (1995)
【非特許文献１９】Stempfer et al., Nat Biotechnol 14, 481-484, (1996)
【非特許文献２０】Seo et al., Appl Environ Microb 66, 2484-2490, (2000)
【非特許文献２１】Bulow et al., Bio-Technol 3, 821-823, (1985)
【非特許文献２２】Mingardon et al., Appl Environ Mirob 73, 7138-7149, (2007)
【非特許文献２３】Fierobe et al., J Biol Chem 276, 21257-21261, (2001)
【非特許文献２４】Fierobe et al., J Biol Chem 277, 49621-49630, (2002)
【発明の概要】
【０００９】
概要
本明細書に開示される本発明は、プログラム可能な機能を有する頑強な人工酵素ナノ複合体を提供する。下に詳細に論ずるように、単純な湿式化学アプローチを使用することによって、新規の酵素ナノ複合体を作製し、かつ広範な機能的適用のために特異的に設計することができる。
【００１０】
本開示は、少なくとも２つの異なる酵素と、それらの酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークとを含有する、ナノ複合体を提供する。かかる多酵素ナノ複合体は、酵素がそれらの活性を協同的に発揮できるようにする。幾つかの態様において、酵素の活性は、カスケード反応を触媒する。更に、複合体の機能は、単純な化学アプローチを通じてプログラム可能である。実験的実施例で実証されているように、これらの酵素複合体（「酵素ナノ複合体（ＥＮ）」と称される）は、向上した触媒効率ならびに増加した安定性を示す。同時に、これらの酵素複合体は、特定の化合物、例えば、インビボで有毒であり得る化合物（例えば、過酸化水素）を分解するように設計することができる。
【００１１】
したがって、一態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる酵素と、この少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークとを含む、多酵素ナノ複合体を提供する。一態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも２つの異なる酵素の全てに固定される。一態様において、２つの異なる酵素の活性は、カスケード反応を触媒する。
【００１２】
幾つかの態様において、少なくとも２つの異なる酵素は、相互に共有結合されるかまたは非共有結合される。一局面において、共有結合は、体内で分解性である。別の態様において、少なくとも２つの異なる酵素は、相互に結合されない。一態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも１つのモノマー単位から構成されるポリマーを含む。別の態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも２つの異なるモノマー単位から構成されるポリマーを含む。幾つかの態様において、ポリマーネットワークは、架橋剤を更に含む。
【００１３】
また、一態様において、少なくとも２つの異なる酵素と透過性のシェルとを含む多酵素ナノ複合体も提供され、このシェルは少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークを含む。本開示は、別の態様において、ポリマーネットワークおよび少なくとも２つの異なる酵素から本質的になる多酵素ナノ複合体を更に提供し、このポリマーネットワークは、少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに共有結合的に固定され、少なくとも２つの異なる酵素の周囲に透過性のシェルを提供する。
【００１４】
本発明のなおも別の実施形態は、多酵素反応を促進するように設計された要素および構造（例えば、要素の特定の３次元配置）を含む、多酵素ナノ複合体系である。本明細書に開示される系の発明の実施に関わる態様は、第１の基質との第１の酵素反応において過酸化水素を生成する第１の酵素、第２の酵素反応において過酸化水素を水に変換する第２の酵素、ならびに第１の酵素および第２の酵素を被包するシェルを形成するよう構成されるポリマーネットワークを含む。かかる系の態様において、ポリマーネットワークは、第１の基質がシェルの外側の外部環境から第１の酵素へと拡散し、結果として、過酸化水素が生成されることを可能にするのに十分な透過性を示し、更に、過酸化水素が第１の酵素から離れて第２の酵素へと拡散し、結果として、水が生成されることを可能にするのに十分な透過性を示す。本発明の特定の態様において、第１の酵素は、第２の酵素に結合される。本発明の幾つかの態様において、ポリマーネットワークは、第１の酵素のポリペプチドまたは第２の酵素のポリペプチドに結合される。
【００１５】
一態様において、本明細書に開示される多酵素ナノ複合体を、例えば、（ａ）少なくとも２つの異なる酵素を相互に結合する工程と、（ｂ）（ａ）によって生成される結合された酵素をアクリル化する工程と、（ｃ）少なくとも１つのモノマー単位および任意で架橋剤を使用して、（ｂ）によって生成されるアクリル化された酵素をインサイチュで重合する工程とによって、生成するための方法もまた提供される。一局面において、本方法は、（ｄ）結合を除去する工程を更に含む。本発明の特定の方法論的な態様において、結合する工程は、（ｉ）各酵素に特異的なリガンドを単一の核酸に結合することと、（ｉｉ）核酸に結合されたリガンドが酵素に結合するように誘起することと、（ｉｉｉ）核酸ハイブリダイゼーションが生じる条件を提供することとを含む。一局面において、結合する工程は、酵素を、互いにハイブリッド形成可能である１本鎖核酸に結合することを含む。別の態様において、（ａ）における結合する工程は、リンカーの使用を含む。
【００１６】
図面および本願を通じて、酵素ナノ複合体（EN）は、n(酵素)として表示され、ここで括弧内の酵素はナノ複合体のコア内の酵素を表す。例えば、n(Cat)は、カタラーゼ（Cat）を含むENを表す。同様に、n(HRP-GOx-Inv)は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、グルコースオキシダーゼ（GOｘ）およびインベルターゼ（Inv）を含むENを表す。
【００１７】
その他の略記には次のようなものが含まれる：AOx：アルコールオキシダーゼ；ssDNA：単鎖DNA；EDAC：1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；NAS：N-ヒドロキシスクシンイミドエステル；DLS：動的光散乱；TEM：透過型電子顕微鏡。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】DNA誘導アセンブリおよびナノカプセル化による酵素3種のナノ複合体の合成の略図である。I．（A）インベルターゼ（Inv）、（B）グルコースオキシダーゼ（GOx）および（C）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）と、それら各々の競合阻害剤：（a）ラクトビオン酸、（b）グルコサミンおよび（c）4-ジメチルアミノアンチピリンを含む阻害剤-DNA足場との自発的アセンブリによる酵素3種構造の形成。II．酵素3種構造の安定化は、この酵素ナノ複合体を空間的に束縛する薄い網状のポリマーのインサイチュ成長によってなされる。III．DNA性足場の除去により、有意に向上した安定性および近接した解像度（close-proximity definition）を有する酵素3種のナノ複合体の形成。そのような近接構造は、酵素間でのそれらの反応中間体の能動的な輸送を可能にし、有意に向上した反応効率を実現する。
【図２】酵素ナノ複合体の構造ならびに向上した活性および安定性を実証する画像および図表を含んでいる。（a）均一なサイズのn(HRP-GOx)の透過型電子顕微鏡（TEM）画像。（b）それぞれ単一の金ナノ粒子で標識されたHRPおよびGOxから調製されたn(HRP-GOx)のTEM画像であって、酵素2種のナノ複合体構造が確認できる。（c）n(HRP-GOx)、ならびに同一のタンパク質含有量であるn(HRP)およびn(GOx)の混合物の蛍光スペクトル。GOxおよびHRPをそれぞれ、FITCおよびRhBで事前に標識した。スペクトルは、Ex=450nmを用いて記録した。（d）（i）n(FITC標識GOx)（Ex=488nm、Em=510〜530nm）、（ii）n(RhB標識HRP)（Ex=532nm、Em=570〜600nm）およびFITC標識GOxおよびRhB標識HRPを用いて合成されたn(HRP-GOx)（Ex=488nm、Em=570〜600nm）の共焦点顕微鏡画像。（e）n(HRP-GOx)、n(HRP-GOx-Inv)およびそれらの天然酵素混合対応物の、65℃での酵素安定性の比較。（f）それぞれ酵素2種の系および酵素3種の系と表示されるn(HRP-GOx)およびn(HRP-GOx-Inv)（EN）とそれらの天然酵素混合対応物（遊離酵素）の、代謝回転速度の比較。代謝回転速度は、対応する天然酵素混合物の代謝回転速度に対して正規化した。（g）リン酸緩衝液（50 mM、pH=7.0）中のポリ（エチレングリコール）（PEG）濃度を漸増させつつ行った、n(HRP-GOx)ならびに同一の酵素含有量である天然HRPおよびGOxの混合物の活性比較。（h）PEG濃度を漸増させつつ行った、n(HRP-GOx-Inv)ならびに同一の酵素含有量である天然HRP、GOxならびにInvの混合物の活性比較。その相対活性を、同一の酵素含有量およびPEG濃度における遊離酵素混合物の活性によって正規化した。
【図３】カタラーゼ含有酵素ナノ複合体のインビボでの解毒能力を表している。（a および b）n(GOx)、n(GOx)とn(Cat)との混合物、ならびにn(GOx-Cat)を用いた処置後の細胞生存率アッセイ。細胞増殖率を、未処置の細胞の細胞増殖率を用いて正規化した。細胞生存率アッセイは、処置した細胞を、生存細胞により還元され強い蛍光性の赤色を示すCellTiter Blueと共に、37℃で3時間インキュベートすることによって行った。（c および d）PBS、n(Cat)、H2O2、n(GOx)およびn(GOx-Cat)を異なる部位に皮膚注射したマウスならびに各注射部位から得られた対応する皮膚組織切片の写真：（i）マウスの皮膚組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）染色（原寸40x）。（ii）マウス皮膚組織切片における細胞のアポトーシス。アポトーシスは、Cy3結合モノクローナルα平滑筋アクチン抗体（赤色）を用いて確認するTUNEL染色（緑色）によって決定した。核の染色にはDAPIを使用した（青色）。免疫染色された切片は蛍光顕微鏡を用いて評価し、撮像した（原倍率200x）。
【図４】経口n(AOx-Cat)アルコール解毒剤の効能を実証する比較チャートを表している。（a）アルコールのみ、アルコールと共にAOx、n(Cat)、n(AOx)、n(AOx)とn(Cat)との混合物、またはn(AOx-Cat)を強制飼養したマウスにおける血中アルコール濃度（BAC）。BACは、アルコール試験キットを用いて決定した。n(AOx-Cat)を用いて処置したマウスでは、アルコールのみ給餌したマウス（EtOH）と比較してBACが3時間以内に顕著に減少している（*P<0.05； **P<0.01）。各群につき4匹のマウスを使用した。（b）マウスの対応する血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）。対照群のマウスには日常食を給餌し、他の群のマウスにはエタノールと共にPBS、天然AOx、n(Cat)、n(AOx)、n(AOx)とn(Cat)との混合物、またはn(AOx-Cat)を含む液体食を強制飼養した。
【図５】n(HRP-GOx)（a）およびn(HRP-GOx-Inv)（b）の合成のためのDNA-阻害剤足場を示している。
【図６ａ】阻害剤による5'修飾前（黒色）および後（灰色）のDNAのMALDI-TOF質量スペクトルを示している。（a）ssDNA-1および4-アミノアンチピリン（4-AAP）修飾されたssDNA-1。
【図６ｂ】阻害剤による5'修飾前（黒色）および後（灰色）のDNAのMALDI-TOF質量スペクトルを示している。（b）ssDNA-2およびグルコサミン修飾されたssDNA-2。
【図６ｃ】阻害剤による5'修飾前（黒色）および後（灰色）のDNAのMALDI-TOF質量スペクトルを示している。（c）ssDNA-Iおよびグルコサミン修飾されたssDNA-I。
【図６ｄ】阻害剤による5'修飾前（黒色）および後（灰色）のDNAのMALDI-TOF質量スペクトルを示している。（d）ssDNA-IIおよび4-AAP修飾されたssDNA-II。
【図６ｅ】阻害剤による5'修飾前（黒色）および後（灰色）のDNAのMALDI-TOF質量スペクトルを示している。（e）ssDNA-IIIおよびラクトビオン酸修飾されたssDNAIII。
【図６ｆ】阻害剤による5'修飾前（黒色）および後（灰色）のDNAのMALDI-TOF質量スペクトルを示している。（f）ssDNA-IV。
【図７】（a）n(HRP-GOx)（灰色）およびn(HRP-GOx-Inv)（黒色）のサイズ分布チャートを表している。
【図８】EtOHおよびn(AOx-Cat)で処置された細胞の生存率を、天然AOx、およびn(AOx)とn(Cat)との混合物による生存率と比較して示している。
【図９】図4と同様、動物において尾静脈注射によってもBACの減少が得られたことを示している。（a）AOx含有ナノカプセル（n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)+n(Cat)、およびn(AOx-Cat)）、または天然AOxの注射後のマウスにおけるBAC。n(AOx-Cat)を用いて処置されたマウスでは、BACが3時間よりも前に劇的に減少している（*P<0.05； **P<0.01； アルコールのみを給餌したマウス（EtOH）との比較；EtOH給餌群のマウスn=4）。（b）EtOHおよびナノカプセルによって処置されたマウスにおけるALT。対照群のマウスには日常食を給餌し、他の群のマウスには異なる試料（PBS、天然AOx、n(Cat)、n(AOx)、n(AOx)とn(Cat)との混合物およびn(AOx-Cat））を注射し、その後にEtOHを含む液体食を給餌した。
【図１０】デュアルコア酵素ナノカプセルの構造的特徴。a．HRP-GOx デュアルコアナノカプセルのTEM画像。HRPおよびGOxの両方を、1.4nmの金ナノ粒子で個々に標識した。b．一対の染料を含むHRPGOxデュアルコアナノカプセルの蛍光スペクトル。スペクトルは、（FITCの吸光波長に対応する）450nm、その後に490〜630nmで記録した。ローダミンB（Rhodaomine B）の蛍光に対応する585nmの発光（ピークB）が、585nmにおけるFITCの発光（ピークA）によって励起されている。c．一対の染料を含むHRP-GOxデュアルコアナノカプセルの共焦点顕微鏡画像。HRPおよびGOxを、それぞれ、ローダミンBおよびFITCで標識した。i．デュアルコアナノカプセルにおけるGOx-FITCの蛍光画像。画像は、450nmにおけるFITCの吸光およびその後に510〜530nmにおけるFITCの蛍光によって記録した。ii. デュアルコアナノカプセルにおけるHRP-RhBの蛍光画像。画像は、540nmにおけるRhBの吸光およびその後の570〜600nmにおけるRhBの蛍光によって記録した。iii．デュアルコアナノカプセルにおけるHRP-RhB（FRET）の蛍光画像。画像は、450nmにおけるFITCの吸光およびその後の570〜600nmにおけるRhBの蛍光によって記録した。
【図１１】マルチコア酵素ナノカプセルと遊離酵素系の間の活性および安定性の比較。a．遊離酵素（黒色）およびマルチコア酵素ナノカプセル（赤色）の相対代謝回転速度。各系の代謝回転速度は、遊離酵素（酵素2種の系の場合はHRP/GOx、酵素3種の系の場合はHRP/GOx/Inv）またはマルチコア酵素ナノカプセル（それぞれ、HRP/GOxデュアルコア酵素ナノカプセルおよびHRP/GOx/Inv トリプルコア酵素ナノカプセル）の存在下での様々な濃度の基質（酵素2種の系の場合はグルコース、酵素3種の系の場合はスクロース）によるODSの酸化率によって決定される。遊離酵素系およびマルチコアナノカプセルにおける酵素の濃度および比は両方とも正確に同じである。すべてのアッセイは、100mMリン酸緩衝液（pH=7.0）中で行われる。b および c．様々な濃度のPEG3000リン酸緩衝液（50mM、pH=7.0）中での酵素2種の系bおよび酵素3種の系cの活性比較。d．[MODEL]。e および f．遊離酵素系およびマルチコア酵素ナノカプセル（e. HRP/GOx、f. HRP/GOx/Inv）の65℃での熱不活性化。
【図１２】a．37℃で2.5時間、尿酸（1.2 mg/mL、全ての写真の中の黒色の結晶）、PBS（10μL、対照実験用、i）ウリカーゼのみ（10μL、0.0013 mg/mL、ii）、ウリカーゼおよびカタラーゼ（計10μL、UOx 0.0013 mg/mL、Cat 0.0026 mg/mL、iii）ならびにウリカーゼ・カタラーゼデュアルコアナノカプセル（10μL、UOx 0.0013 mg/mL、Cat 0.0026 mg/mL、iv）の存在下でインキュベートしたHeLa細胞の光学顕微鏡画像。b．ウリカーゼのみ、遊離ウリカーゼおよびカタラーゼ、ならびにウリカーゼ・カタラーゼデュアルコアナノカプセルの相対代謝回転速度。代謝回転速度は、尿酸の酸化によって決定される。各系におけるウリカーゼ濃度はすべて同じであり、遊離UOx/Cat系および遊離UOx/Catデュアルコアナノカプセルにおけるカタラーゼ濃度も同じである。c．プロテイナーゼ（トリプシン）による遊離UOx/Cat系（黒色）およびUOx/Catデュアルコアナノカプセル（赤色）の不活性化。d．UOxのみの系、遊離UOx/Cat系、およびUOx/Catデュアルコアナノカプセルの細胞傷害性。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
組成物および方法について記載する前に、本発明は、記載されている特定の方法論、プロトコール、細胞株、アッセイおよび試薬に限定されず、それらは変化し得るものであることが理解されるべきである。本明細書で使用されている用語は、本発明の特定の態様を記載することを意図したものであり、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解されるべきである。
【００２０】
別途定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には、本明細書に記載されているのと類似または等価な任意の方法および材料を使用することができるが、ここには好ましい方法、デバイスおよび材料が記載されている。本明細書で引用されているすべての科学および特許文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなる記載も、先行技術であることを理由として本発明がそのような開示よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認とみなされるべきではない。
【００２１】
「約」という用語が数字表示の前に付いている場合、（+）または（-）10%、5%または1%、変動する。「約」が、量、例えばmgの前に使用される場合、それは、その重さの値が（+）または（-）10%、5%または1%、変動し得ることを示している。
【００２２】
定義
本発明にしたがいおよび本明細書で使用される場合、以下の用語は、そうでないことが明示的に示されていない限り、以下の意味を有するものと定義される。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形（「a」、「an」および「the」）は、文献が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を包含する。例えば、「細胞(a cell)」という用語は、その混合物を含む、複数の細胞を包含する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、その組成物および方法が言及されている要素を含むが、その他のものを排除しないことを意味することが意図されている。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、その組成物にとって本質的に重要なその他の要素を排除することを意味する。例えば、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求された発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しないその他の要素を排除しないであろう。「からなる」は、微量より多いその他の成分および言及されている実質的な方法の工程以外を排除することを意味する。これらの転換用語の各々によって定義される態様が、本発明の範囲に包含される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ナノ複合体」という用語は、少なくとも1つの寸法で1〜数百ナノメートルの間の大きさの構造物を表す。いくつかの態様において、それは、任意でポリマーに接続された有限数の化学的および／または生物学的分子を含む構造物を表す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「空間的に束縛される」という用語は、別の物体、例えばポリマーに対して相対的に空間的に制限されている粒子、例えば酵素の位置を表す。いくつかの態様において、本用語は、相互に対して実質的に固定された位置を有する2つ以上の粒子を表す。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ポリマーネットワーク」あるいは「ポリマーメッシュ」という用語は、互いの内部でおよび／または互いの間で相互接続され、ネットまたはメッシュを形成している、1つまたは複数のポリマーを表す。いくつかの態様において、ポリマーネットワークは、1つのまたは複数の位置で1つまたは複数の粒子に固定される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「協同的に」という用語は、2つ以上の酵素が協調的な様式で機能することを表す。1つの例は、2つ以上の酵素が、それらの活性を発揮するために、酵素複合体を形成すること、あるいは同じ基質と同時に反応すること、である。別の態様においては、酵素の1つが最初に基質と反応して生産物を生じ、次いでこの生産物が別の酵素と反応する基質となる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「代謝経路」という用語は、細胞内で起こる一連の化学反応を指す。各々の経路において、主要な化合物が、一連の化学反応によって修飾される。代謝経路の一覧表は、例えば、KEGG Pathway Database（www.genome.jp/kegg/pathway.htmlで利用可能）から公開されている。また、本明細書で使用されるとき、「代謝産物」という用語は、代謝の中間体および生成物を指す。代謝産物という用語は、通常、小分子に制限される。代謝産物は、エネルギー源、構造、シグナル伝達、酵素に対する刺激効果および阻害効果、それらの独自の触媒活性（通常は酵素の補因子として）、防御、ならびに他の生物との相互作用（例えば、色素、臭気物質、およびフェロモン）を含む、種々の機能を有する。一次代謝産物は、正常な成長、発生、および生殖に直接関与する。アルコールは、産業微生物学によって大規模に生成される一次代謝産物の一例である。二次代謝産物は、それらのプロセスに直接関与しないが、通常、重要な生態学的機能を有する。例としては、抗生物質および色素、例えば樹脂およびテルペンが挙げられる。幾つかの抗生物質は前駆体として一次代謝産物を使用し、例えば、アクチノマイシンは一次代謝産物のトリプトファンから作り出される。
【００３０】
多酵素ナノ複合体
本開示は、向上した触媒効率および高められた安定性を示すと同時に、必要に応じて、その環境に対して有毒であり得る中間体の放出を減少させることができる多酵素ナノ複合体または酵素ナノ複合体（EN）を提供する。
【００３１】
本明細書に開示される発明は、多くの態様を有する。本発明の態様には、少なくとも2つの異なる酵素およびポリマーネットワークを含むナノ複合体が含まれる。典型的に、ポリマーネットワークは、酵素の少なくとも1つに固定される。そのような多酵素ナノ複合体は、酵素がそれらの活性を協同的に発揮できるようにする。実験的実施例で実証されているように、これらの酵素複合体（「酵素ナノ複合体（EN）」と称される）は、向上した触媒効率および高められた安定性を示す。同時に、これらの酵素複合体は、特定の化合物、例えば、インビボ環境で有毒であり得る化合物（例えば、過酸化水素）、を分解するよう設計することができる。いくつかの態様において、酵素の活性は、カスケード反応を触媒する。さらに、複合体の機能は、単純な化学的アプローチを通じてプログラム可能である。
【００３２】
本発明の態様は、少なくとも2つの異なる酵素とポリマーネットワークとを含む多酵素ナノ複合体を含む。典型的に、ポリマーネットワークは、少なくとも2つの異なる酵素の少なくとも1つに固定される。1つの態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも2つの異なる酵素のすべてに固定される。他の態様において、ナノ複合体中の異なる酵素は、例えば、相補的なポリヌクレオチド鎖を介して、ひとまとめの状態に固定される。
【００３３】
本発明の実例において、少なくとも2つの異なる酵素は、相互に共有結合的または非共有結合的に連結される。1つの局面において、共有結合的連結は、インビボで分解可能なものである。別の局面において、少なくとも2つの異なる酵素は、相互に連結されない。1つの態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも1つのモノマー単位から構成されるポリマーを含む。別の態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも2つの異なるモノマー単位から構成されるポリマーを含む。いくつかの態様において、ポリマーネットワークは、架橋剤をさらに含む。
【００３４】
本発明の態様は、少なくとも2つの異なる酵素と透過性のシェルとを含む多酵素ナノ複合体を含み、シェルは少なくとも2つの異なる酵素の少なくとも1つに固定されているポリマーネットワークを含む。本開示はさらに、別の態様において、ポリマーネットワークおよび少なくとも2つの異なる酵素から本質的になる多酵素ナノ複合体を提供し、ここでポリマーネットワークは少なくとも2つの異なる酵素の少なくとも1つに共有結合により固定され、少なくとも2つの異なる酵素を囲む透過性のシェルを提供する。
【００３５】
本発明の関連する態様は、少なくとも２つの異なる酵素と、該少なくとも２つの異なる酵素のうちの少なくとも１つに固定されるポリマーネットワークとを含む、多酵素ナノ複合体を含み、ここで該ポリマーネットワークは架橋剤を含む。特定の態様において、架橋剤は、分解性の架橋剤である。任意で、架橋剤は、Ｎ，Ｎ'−メチレンビス（アクリルアミド）、１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン、エチレングリコールジアクリレート、Ｎ，Ｎ'−（１，２−ジヒドロキシ−エチレン）ビスアクリルアミド、またはポリ（エチレングリコール）ジアクリレートを含む、分解性の架橋剤である。特定の態様において、架橋剤は、非分解性の架橋剤である。任意で、架橋剤は、Ｎ，Ｎ'−ビス（アクリロイル）シスタミン、グリセロールジメタクリレート、ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］リン酸塩、またはビスアクリロイル化ポリペプチドを含む、非分解性の架橋剤である。
【００３６】
本発明のなおも別の態様は、特定の酵素反応を促進するように設計された様態で一緒に組み合わされた、要素および構造（例えば、要素の特定の３次元配置）を含む、多酵素ナノ複合体系である。例となる態様は、第１の基質との第１の酵素反応において第１の生成物を生成する第１の酵素、第２の酵素反応において第１の生成物と反応する第２の酵素、ならびに第１の酵素および第２の酵素を被包するシェルを形成するように構成されるポリマーネットワークを含む、多酵素ナノ複合体系を含む。かかる系において典型的に、ポリマーネットワークは、第１の基質が、シェルの外側の外部環境から、第１の酵素へと拡散し、結果として、第１の生成物が生成されることを可能にするのに十分な透過性を示す。かかる系において、ポリマーネットワークはまた、第１の生成物が、第１の酵素から離れて、第２の酵素へと拡散し、結果として、第２の酵素反応が生じることを可能にするのに十分な透過性も示すことができる。共通の系の態様において、第１の酵素が、第２の酵素に結合されるか、あるいはポリマーネットワークが、第１の酵素のポリペプチドまたは第２の酵素のポリペプチドに結合される。
【００３７】
本明細書に開示される系の例示的実施態様は、第1の基質との第1の酵素反応において過酸化水素を生成する第1の酵素、第2の酵素反応において過酸化水素を水（H2O）および／または酸素（O2）に変換する第2の酵素、ならびに第1の酵素および第2の酵素を被包するシェルを形成するように構成されたポリマーネットワークを含む。そのような系の態様において、ポリマーネットワークは、第1の基質（例えばエタノール）をシェルの外側の外部環境から第1の酵素の方に拡散させ過酸化水素を生成するのに十分な透過性を示す。この態様において、ポリマーネットワークは、過酸化水素を第1の酵素から離して第2の酵素の方に拡散させ水を生成するのに十分な透過性をさらに示すよう設計される。本発明の特定の態様において、第1の酵素は、第2の酵素に連結される。本発明のいくつかの態様において、ポリマーネットワークは、第1の酵素のポリペプチドまたは第2の酵素のポリペプチドに連結される。
【００３８】
本発明の典型的な系において、ポリマーネットワークは、多酵素ナノ複合体がインビボ環境に曝されたときに第1の酵素または第2の酵素の分解を阻害するのに十分な様式で第1の酵素および第2の酵素を被包する。一般の態様において、第1の酵素および第2の酵素は、任意で例えば化学リンカーまたはテザーの使用を介して連結される。本明細書に開示される本発明の特定の態様において、第1の酵素および第2の酵素は、相補的なポリヌクレオチドの鎖によって連結される。
【００３９】
本発明の様々な態様において、幅広い範囲の酵素を使用することができる。本明細書に開示される1つの実施態様において、第1の酵素はアルコールオキシダーゼであり；そして第2の酵素はカタラーゼである。本明細書に開示される別の態様において、第1の酵素はグルコースオキシダーゼであり；そして第2の酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。本発明の特定の態様は、ポリマーネットワーク内に被包された第3の酵素（例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等）を含む。
【００４０】
上記のように、本発明の様々な態様において、幅広い範囲の酵素を使用することができる。本発明の特定の態様は、過酸化水素から水および／または酸素への分解を触媒するカタラーゼを含み得る。カタラーゼはまた、過酸化水素による、ホルムアルデヒド、ギ酸、フェノール、アセトアルデヒドおよびアルコールを含む様々な代謝産物および毒素の酸化を触媒することができる。カタラーゼは、典型的に、以下の反応に従いそれを行う：
H2O2 + H2R → 2H2O + R
本発明の態様において使用することができる多くのカタラーゼポリペプチドが当技術分野で周知である；例えば、ヒト赤血球（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号C3556）、ウシ肝臓（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号C1345）、バイソン肝臓（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号C9447）、クロコウジカビ（Aspergillus nigar）（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号C3515）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号02071）、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Micrococcus lysodeikticus）（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号60634）由来のカタラーゼ等。
【００４１】
本発明の特定の態様は、ペルオキシダーゼを含み得る。ペルオキシダーゼ（EC番号1.11.1.x）は、典型的に以下の形式の反応を触媒する酵素である：
ROOR' + 電子供与体（2 e-） + 2H+ → ROH + R'OH
最適な基質は、これらの酵素の多くに関しては過酸化水素であるが、それ以外では脂質過酸化物等の有機ヒドロペルオキシドに対してより活性がある。ペルオキシダーゼは、それらの活性部位にヘム補因子を、あるいは酸化還元活性のあるシステインまたはセレノシステイン残基を含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのペルオキシダーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、セイヨウワサビ由来のペルオキシダーゼ（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号P8375）、ヒト赤血球由来のグルタチオンペルオキシダーゼ（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号G4013）等。
【００４２】
本発明の特定の態様は、アルコールオキシダーゼを含み得る。典型的なアルコールオキシダーゼ（EC 1.1.3.13）は、以下の化学反応を触媒する：
第1級アルコール + O2 → アルデヒド + H2O2
この例において、この酵素の2つの基質は第1級アルコールおよびO2であり、その2つの生産物がアルデヒドおよびH2O2である。本発明の態様において使用することができる多くのアルコールオキシダーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、酵母（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号A6941）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（例えば、SIGMA-ALDRICHカタログ番号A0438）、ピキア・パストリス（Pichea pastoris）（例えば、MP BIOMEDICALSカタログ番号：190155）由来のもの等。
【００４３】
本発明の特定の態様は、アルデヒドオキシダーゼを含み得る。典型的なアルデヒドオキシダーゼ酵素は、例えば、酸素および水の存在下でのアルデヒドから酸および過酸化水素への変換を触媒することによって、アルデヒドからカルボン酸を生成する。
アルデヒド + H2O + O2 ←→ カルボン酸イオン + H2O2 + H+
本発明の態様において使用することができる多くのアルデヒドオキシダーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、ヒト組換えポリペプチド（例えば、CYPEX製品番号CYP150、LABOME製品番号TP319221）等。
【００４４】
本発明の特定の態様は、グルコースオキシダーゼを含み得る。グルコースオキシダーゼは、グルコースから過酸化水素およびD-グルコノ-δ-ラクトンへの酸化を触媒するオキシド・レダクターゼである。本発明の態様において使用することができる多くのグルコースオキシダーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、クロコウジカビ（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号G7141）、ダクチリウム・デンドロイデス（Dactylium dendroides）（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号G7907）由来のもの等。
【００４５】
本発明の特定の態様は、例えばスクロースの加水分解を触媒する、インベルターゼを含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのインベルターゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、酵母等の生物から精製されたインベルターゼポリペプチド（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号14504）等。
【００４６】
本発明の特定の態様は、尿酸オキシダーゼを含み得る。尿酸オキシダーゼまたはウリカーゼ（EC 1.7.3.3）は、尿酸から、より水溶性のアラントインへの酵素的酸化を触媒するペルオキシソーム肝酵素である。尿酸オキシダーゼは、大抵の哺乳動物において見出される内因性の酵素であるが、ヒトにおいては見られない。尿酸オキシダーゼは、ヒトにおいては、化学療法を受けた後の急性腫瘍崩壊症候群患者における上昇した血清尿酸の制御のために使用される。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）において発現される組換え尿酸オキシダーゼであるラスブリカーゼ（SR 29142）は、急性腫瘍崩壊症候群の危険がある小児および大人の患者の無作為試験において尿酸の制御においてアロプリノールよりも優れていることが実証されている。加えて、尿酸オキシダーゼは、痛風の処置にも使用される。本発明の態様において使用することができる多くの尿酸オキシダーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換え形態（例えば、ラスブリカーゼ）およびアスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）（例えば、PROSPEC BIO製品番号ENZ-312）、酵母（例えば、WORTHINGTON BIOCHEMICAL製品番号LS003857）由来の形態等。
【００４７】
本発明の特定の態様は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを含み得る。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.10）は、アセトアルデヒドから酢酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素である。アセトアルデヒドから酢酸イオンへの酸化は、以下のように要約することができる：
CH3CHO + NAD+ + CoA → アセチルCoA + NADH + H+
ヒトにおいては、多くの遺伝子が、ALDH1A1、ALDH2およびALDH1B1（ALDH5としても公知）を含むこの酵素活性をコードしている。これらの酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼのより大きなクラスのメンバーである。このタイプの酵素のCAS番号は、[9028-91-5]である。本発明の特定の態様は、例えばアルデヒドの酸化（脱水素）を触媒する、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換えヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、R & D SYSTEMS製品番号5869-DH）および酵母等の生物から精製されたアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号A6338）等。
【００４８】
本発明の特定の態様は、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元（NAD+からNADHへ）を伴うアルコールとアルデヒドまたはケトンとの間の相互変換を促進するアルコールデヒドロゲナーゼを含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、精製されたヒトアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、ARP AMERICAN RESEARCH PRODUCTS INC.製品番号01-1746）、組換えヒトアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、MYBIOSOURCEカタログ番号MBS203604）およびウマの肝臓（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号05646）、出芽酵母（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号A7011）、パービバキュラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号75449）由来のアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド等。
【００４９】
本発明の特定の態様は、例えばギ酸から重炭酸イオンへの酸化を触媒するために、ギ酸デヒドロゲナーゼを含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのギ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換えポリペプチド（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号75274）および酵母等の生物から精製されたギ酸デヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号F8649）等。
【００５０】
本発明の特定の態様は、例えばグルコース-6-リン酸をリン酸基および遊離グルコースが生成する様式で加水分解するために、グルコース-6-ホスファターゼを含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのグルコース-6-ホスファターゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、ウサギの肝臓から精製されたグルコース-6-ホスファターゼポリペプチド（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号G5758）等。
【００５１】
本発明の特定の態様は、グルコシダーゼ、例えばグリコーゲンからグルコースへの分解に有用なもの（例えば、酸マルターゼ）、を含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのα-グルコシダーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換えヒトα-グルコシダーゼα（例えば、NOVUS BIOLOGICALS製品番号H00023193-P01）および酵母等の生物から精製された-グルコシダーゼポリペプチド（例えば、SIGMA-ALDRICH製品番号G0660）等。
【００５２】
本発明の特定の態様は、グリコーゲン分枝酵素、例えばグルコースからグリコーゲンへの変換に有用なもの、を含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのグリコーゲン分枝酵素ポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換えヒトα-グルコシダーゼα（例えば、NOVUS BIOLOGICALS製品番号H0002632-P01）および大腸菌等の生物から精製された-グルコシダーゼポリペプチド（例えば、PROZOMIX製品番号PRO-E0406）等。
【００５３】
本発明の特定の態様は、コエンザイムAデヒドロゲナーゼ、例えば脂肪酸β酸化の各サイクルのある工程を触媒するのに有用なもの、を含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのコエンザイムAデヒドロゲナーゼポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換えヒトコエンザイムAデヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、MYBIOSOURCEカタログ番号MBS142535）等。
【００５４】
本発明の特定の態様は、有機カチオン／カルニチン輸送体、例えば有機カチオン輸送体および／またはナトリウム依存高親和性カルニチン輸送体として有用なもの、を含み得る。本発明の態様において使用することができる多くのOCTN2ポリペプチドが当技術分野で公知である；例えば、組換えヒトOCTN2（例えば、NOVUS BIOLOGICALS SLC22A5組換えタンパク質製品番号H00006584-P01）等。
【００５５】
上記の具体的な酵素に加えて、公知の遺伝子（例えば、本明細書に開示されるものおよびGENBANK、UniProtKB/Swiss-Protに列挙されているもの等）によってコードされる多数のポリペプチドの任意の1つを、商業的に利用可能な組換えタンパク質サービス、例えばGENSCRIPTにより提供されるもの、により容易に作製することができる。
【００５６】
本発明のいくつかの態様において、本発明の組成物または系の態様は、多酵素ナノ複合体系を使用するための容器および指示書を含むキットとされる。任意で、そのようなキットにおいて、本系は、経口投与処方物としての使用に適合された1つまたは複数の薬剤、結合剤または緩衝剤と組み合わされる。本発明のいくつかの態様において、系は、非経口投与処方物としての使用に適合された1つまたは複数の薬剤、結合剤または緩衝剤と組み合わされる。
【００５７】
本発明の態様には、製造物および／またはキット、例えば、インビボで特定の化合物、例えば過酸化水素を分解するのに有用な材料を含むものが含まれる。任意で、製造物および／またはキットは、病理学的状態、例えば急性アルコール中毒を処置するのに有用な物質を含み得る。本発明の典型的な態様において、キットは、典型的にはラベルを有する、少なくとも1つの容器を含む。適当な容器には、例えば、ブリスターパック、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、様々な材料、例えば、金属（例えば、金属箔）、ガラスまたはプラスチックから形成され得る。本発明のいくつかの態様において、1つまたは複数の容器は、画像化技術において有効な活性剤を有する1つまたは複数の組成物を保持している。本発明の特定の態様において、1つまたは複数の容器は、病理学的状態、例えば急性アルコール中毒の処置に有効な活性剤を有する1つまたは複数の組成物を保持する。典型的に、1つまたは複数の容器上のラベルは、その1つまたは複数の組成物が病理学的状態の処置に使用されることを示す。そのようなラベルはまた、インビボまたはインビトロのいずれかの用途、例えば本明細書に記載されるものに関する使用方法を示し得る。本発明のキットはまた、1つまたは複数の上記の容器および緩衝剤を含むさらなる容器を含み得る。キットはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用説明を含む包装同封物を含む、販売者および使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。
【００５８】
本発明の特定の態様において、本明細書に開示される組成物または酵素ナノ複合体系は、病理学的状態、例えばアルコール毒性を改善または処置するよう設計された薬剤として処方される。例えば、本発明の特定の態様において、本明細書に開示される組成物または酵素ナノ複合体系は、病理学的状態、例えばアルコール毒性を予防するよう設計された薬剤として処方される。薬剤は、経口経路、（皮下、皮内、筋内、静脈内、関節内および髄内を含む）非経口経路、腹腔内経路、経粘膜（経鼻を含む）経路、経皮経路、直腸経路、および局所（皮膚、頬側、舌下、および眼内を含む）経路を含むがこれらに限定されない、医薬を投与するのに通常使用される従来的な経路を通じて投与され得る。静脈内送達は、ボーラス注射または点滴を通じて行われ得；点滴は、1分未満〜数時間の範囲の期間にわたって連続的になされ得る。特定の態様において、処置過程は、複数経路を通じた投与を伴い得る。
【００５９】
薬剤は、疼痛または別の障害の処置のために、静脈内経路および経口経路の組み合わせを通じて投与され得る。1つの態様においては、薬物濃度を所望のレベルにまで引き上げるために「負荷」用量がIV投与され、その後にそれを維持するために1つまたは複数の維持用量が経口経路を通じて投与され得る。薬剤は、液体、粉末、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、噴霧物およびエアゾールを含むがこれらに限定されない様々な形態の薬学的組成物として投与され得る。薬学的組成物は、担体、賦形剤、結合剤、安定剤、抗菌剤、抗酸化物質、希釈剤および／または支持体を含むがこれらに限定されない様々な薬学的に許容される添加物を含み得る。適当な賦形剤および担体の例は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」，Mack Pub. CO.； 17th edition New Jersey (2011)に記載されている。いくつかの態様において、薬剤は、糖水溶液としてのIV点滴を通じて投与され得る。薬剤はまた、薬剤送達を促進する別の物質と組み合わされ得る。例えば、薬剤は、リポソーム中に会合させられてもよい。リポソームが、今度は、ＩｇＧＦｃ受容体等の標的物質（単数または複数）と結合されてもよい。
【００６０】
経口投与に適した本明細書に開示される化合物の処方物は、各々が規定量の活性成分を含む個別単位、例えばカプセル、カシェもしくは錠剤として；粉末もしくは顆粒として；水性の液体もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型の乳濁液もしくは油中水型の乳濁液として、提供され得る。活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして提供され得る。経口的に使用することができる薬学的調製物には、錠剤、ゼラチンから製造されたプッシュフィット型のカプセル、およびゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトール、から製造された密封ソフトカプセルが含まれる。錠剤は、任意で1つまたは複数の付属成分との圧縮または成型によって製造され得る。圧縮錠は、任意で結合剤、不活性希釈剤、もしくは滑沢剤、表面活性または分散剤と混合された、自由流動性形態、例えば粉末または顆粒状の活性成分を、適当な機械において圧縮することによって調製され得る。湿製錠は、不活性の液体希釈剤によって湿らされた粉末化合物の混合物を適当な機械において成型することによって製造され得る。錠剤は、任意で、コーティングされまたは割線を加えられ得、かつその中に含まれる活性成分の緩慢な放出または制御された放出を提供するよう処方され得る。すべての経口投与用処方物は、そのような投与に適した用量とされるべきある。プッシュフィット型のカプセルは、増量剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプンおよび／または滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムおよび、任意で、安定剤と混合されて活性成分を含み得る。ソフトカプセルでは、活性化合物は、適当な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤が添加され得る。糖衣錠のコア部分は、適当なコーティングと共に提供される。この目的で、任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る、濃縮された糖溶液が使用され得る。錠剤または糖衣錠のコーティングには、異なる活性化合物用量の組み合わせの識別または特徴づけのために、染料または色素が添加され得る。
【００６１】
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続点滴による非経口投与用に処方され得る。注射用処方物は、例えば保存剤が添加されたアンプルまたは複数回分入り容器に入れられた、単位剤形で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液等の形態をとり得、かつ、処方のための剤、例えば懸濁剤、安定剤および／または分散剤を含み得る。処方物は、単回分入りまたは複数回分入り容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルで提供され得、かつ使用直前に滅菌性の液体担体、例えば生理食塩水または滅菌性・発熱物質非含有水の添加のみを必要とする粉末形態または冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時使用可能な注射溶液および懸濁液は、上記のような種類の滅菌性の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００６２】
非経口投与用の処方物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および処方物を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含み得る活性化合物の水性および非水性（油性）の滅菌溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。適当な脂溶性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含み得る。任意で、懸濁液はまた、高濃縮溶液を調製できるように、適当な安定剤または化合物の溶解度を高める薬剤を含み得る。
【００６３】
増量剤または希釈剤の例には、ラクトース、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、圧縮可能な糖、微結晶セルロース（MCC）、粉末セルロース、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン、デキストレイト、デキストラン、デキストリン、デキストロース、マルトデキストリン、炭酸カルシウム、第2リン酸カルシウム、第3リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ポロキサマー、例えばポリエチレンオキシド、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるがこれらに限定されない。増量剤は、例えば、使用されるラクトースがラクトース一水和物である場合のように、複合溶媒分子を含み得る。本発明の組成物の態様と共に使用するよう適合させることができる崩壊剤には、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、クロスポビドン（ポリビニルポリピロリドン）、メチルセルロース、微結晶セルロース、粉末セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプンおよびアルギン酸ナトリウムが含まれるがこれらに限定されない。本明細書の組成物において使用される錠剤用結合剤には、アカシア、アルギン酸、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、グアーガム、硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コポリビドン、メチルセルロース、液状グルコース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、ポビドン、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウム、デンプン、スクロース、トラガカントおよびゼインが含まれるがこれらに限定されない。
【００６４】
pH調整剤、例えば酸、塩基または緩衝剤の添加もまた、組成物の溶解速度を遅延または亢進する、あるいは組成物の化学的安定性の改善を助ける上で有益であり得る。加えて、本明細書に提供される処方物は、当該処方物の種類に関して当技術分野で従来的な他の薬剤を含み得る。適当な処方は、選択される投与経路に依存する。周知の技術、担体および賦形剤のいずれも、適切にかつ当技術分野で理解されているように使用され得る；例えば、Remington、前出、を参照のこと。薬学的組成物は、それ自体公知の様式で、例えば、従来的な混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、研和、乳化、被包、封入または圧縮プロセスによって、製造され得る。
【００６５】
本発明の実施態様によって示されるように、近距離構造は、ENに、有意に向上した触媒効率を授ける。このことは、インベルターゼ（Inv）、グルコースオキシダーゼ（GOx）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）により媒介されるスクロースおよびグルコースの逐次反応によって実証された。反応媒体に直接添加した、またはスクロースのInv媒介加水分解から生成されたグルコースは、GOx媒介反応を通じて酸化され、H2O2が生成される。生成されたH2O2は次に、HRP媒介反応を通じてo-ジアニシジンを酸化する。本発明の構造は、ナノ複合体内の複数の酵素が互いに空間的に拘束されている点だけでなく、そのような空間的拘束が、拮抗的ではなく共同的（相乗作用的）に作用する点でも独特である。
【００６６】
実施例1に示されるように、n(HRP-GOx)およびn(HRP-GOx-Inv)の代謝回転速度（o-ジアニシジン酸化速度）は、同一の酵素含有量のそれらの天然酵素の混合物の代謝回転速度と比較して、それぞれ、5倍および15倍高く、これによって向上した触媒効率が確認された。本願を通じて使用される場合、酵素ナノ複合体（EN）は、n(酵素)として表示され、ここで括弧内の酵素はナノ複合体のコア内の酵素を表す。例えば、n(Cat)は、カタラーゼ（Cat）を含むENを表し、n(HRP-GOx-Inv)は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、グルコースオキシダーゼ（GOｘ）およびインベルターゼ（Inv）を含むENを表す。
【００６７】
さらに、細胞または血流中の粘性環境を模倣する条件である35 重量%のポリエチレングリコール（PEG、Mw約3000）の存在下で、n(HRP-GOx)は、代謝回転速度に関して、対応する酵素混合物と比較して、34倍の増加を達成した。同様に、n(HRP-GOx-Inv)は、PEG溶液中での相対代謝回転速度に関して、最大24倍の向上を示した。
【００６８】
さらに、EN中の酵素の有意に向上した安定性も観察された。図2eに示されるように、n(HRP-GOx)およびn(HRP-GOx-Inv）は、65℃で60分間のインキュベーションの後、それぞれ、70%および75%の残存酵素活性を保持していた。同一条件下で、遊離酵素は、それらの活性の98%超を喪失する。
【００６９】
またさらに、ENは、遊離酵素混合物よりも少ない中間体を放出する。GOxおよびCatの場合、中間体にはH2O2が含まれ、これは有毒であり臓器および組織を損傷させ得るものである。実施例1のインビトロデータは、GOx単独では、細胞と共にインキュベートされたとき、GOx媒介グルコース酸化から生成されたH2O2により、細胞生存率の90%の損失をもたらしたことを示している。Catと同時インキュベートしたときは、損失は58%に低下した。しかし、n(GOx-Cat)の存在下では、そのような損失は、9%まで劇的に低下した。皮膚への損傷によって測定された、同様の結果もまた、インビボで観察された。
【００７０】
また、実施例1には、アルコールオキシダーゼ（AOx）およびカタラーゼ（Cat）を含む酵素ナノ複合体であるn(AOx-Cat）およびこのナノ複合体の、アルコール解毒剤としての能力が示されている。インビトロおよびインビボの両実験は、n(AOx-Cat)が有毒な副産物であるH2O2の放出を最小限に抑えつつアルコールを代謝しアルコールにより誘導される肝臓への損傷を減少させるのに非常に効果的であることを実証した。したがって、実験データは、本開示の酵素ナノ複合体（EN）が向上した触媒効率および高められた安定性を達成すると同時に、必要な場合、有毒であり得る中間体、例えばH2O2の放出を減少させることができることを明確に実証している。したがって、本開示の1つの態様は、第1の酵素および第2の酵素を含む2つ以上の酵素と、酵素の少なくとも1つ、あるいは少なくとも2つ、または3つ、または4つ、または5つ、またはすべてに固定されたポリマーネットワークとを含み、酵素がポリマーネットワークによって空間的に束縛されており、各酵素が協同的に基質と反応する、ナノ複合体を提供する。
【００７１】
基質との協同的な反応は、1つの態様において、酵素が直接的または間接的に協調的な様式で基質と反応することを意味することが意図されている。1つの局面において、酵素は、基質と順次反応する。この局面において、第1の酵素が最初に基質と反応し、それを1つまたは複数の生産物に変換する。例えば基質を別の分子と一体化させ、かつそれを2つ以上の分子に分解する。次に第2の酵素が、その生産物の1つまたは複数と反応する。換言すると、1つの態様において、第1の酵素の生産物は、第2の酵素の基質となる。
【００７２】
あるいは、第1および第2の酵素は、同時に基質と反応することができる。酵素は複合体を形成し、その複合体を通じてそれらの機能を発揮することができることが当技術分野で周知である。いくつかの例において、酵素は、酵素とそれらの補因子のように、物理的な複合体を形成することなくグループとして機能することもできる。別の例は、多くの酵素が、互いに対して物理的または機能的な関係を有することなく同時に、核酸、例えばDNAおよびRNAと相互作用し、複製、転写または翻訳をもたらすことである。これらの酵素の組み合わせのすべてが、本開示の目的において想定されている。
【００７３】
上記開示のいずれかにおいて、ナノ複合体はさらに、第3の酵素、第4の酵素および／または第5の酵素等を含む。追加の酵素は各々、ナノ複合体中の別の酵素と逐次反応を行うことができるか、または別の酵素と同時に機能することができる。
【００７４】
いくつかの態様において、ナノ複合体中の酵素の2つ以上は、代謝経路に属するものである。代謝経路は当技術分野で公知であり、さらに本明細書で説明されている。代謝経路の非限定的な例には、解糖／糖新生経路、クエン酸回路（TCA回路）経路、ペントースリン酸経路、ペントース・グルクロン酸相互変換経路、フルクトース・マンノース代謝経路、ガラクトース代謝経路、アスコルビン酸・アルダル酸代謝経路、デンプン・スクロース代謝経路、アミノ糖・ヌクレオチド糖代謝経路、ピルビン酸代謝経路、グリオキシル酸・ジカルボン酸代謝経路、プロパン酸代謝経路、ブタン酸代謝経路、c5分枝二塩基酸代謝経路、イノシトールリン酸代謝経路、酸化的リン酸化経路、光合成経路、光合成・アンテナタンパク質経路、光合成生物経路における炭素固定、原核生物経路における炭素固定経路、メタン代謝経路、窒素代謝経路、硫黄代謝経路、脂肪酸生合成経路、脂肪酸伸長経路、脂肪酸代謝経路、ケトン体合成・分解経路、角皮素、コルク質およびろう生合成新規(new!)経路、ステロイド生合成経路、一次胆汁酸生合成経路、二次胆汁酸生合成経路、ステロイドホルモン生合成経路、グリセロ脂質代謝経路、グリセロリン脂質代謝経路、エーテル脂質代謝経路、スフィンゴ脂質代謝経路、アラキドン酸代謝経路、リノール酸代謝経路、アルファ-リノレン酸代謝経路および不飽和脂肪酸生合成経路が含まれる。
【００７５】
代謝経路のさらなる非限定的な例には、プリン代謝経路、ピリミジン代謝経路、アラニン・アスパラギン酸・グルタミン酸代謝経路、グリシン・セリン・スレオニン代謝経路、システイン・メチオニン代謝経路、バリン・ロイシン・イソロイシン分解経路、バリン・ロイシン・イソロイシン生合成経路、リジン生合成経路、リジン分解経路、アルギニン・プロリン代謝経路、ヒスチジン代謝経路、チロシン代謝経路、フェニルアラニン代謝経路、トリプトファン代謝経路、フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン生合成経路、ベータ-アラニン代謝経路、タウリン・ヒポタウリン代謝経路、ホスホン酸・ホスフィン酸代謝経路、セレノ化合物代謝経路、シアノアミノ酸代謝経路、D-グルタミン・d-グルタミン酸代謝経路、D-アルギニン・d-オルニチン代謝経路、D-アラニン代謝経路およびグルタチオン代謝経路が含まれる。
【００７６】
代謝経路のさらなる非限定的な例には、n-グリカン生合成経路、様々な型のn-グリカンの生合成経路、ムチン型o-グリカン生合成経路、他の型のo-グリカンの生合成経路、グリコサミノグリカン生合成、コンドロイチン硫酸経路、グリコサミノグリカン生合成-ヘパラン硫酸経路、グリコサミノグリカン生合成-ケラタン硫酸経路、グリコサミノグリカン分解経路、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー生合成経路、スフィンゴ糖脂質生合成-ラクト・ネオラクト系経路、スフィンゴ糖脂質生合成-グロボ系経路、スフィンゴ糖脂質生合成-ガングリオ系経路、リポ多糖生合成経路、ペプチドグリカン生合成経路、他のグリカンの分解経路、チアミン代謝経路、リボフラビン代謝経路、ビタミンB6代謝経路、ニコチン酸・ニコチンアミド代謝経路、パントテン酸・CoA生合成経路、ビオチン代謝経路、リポ酸代謝経路、葉酸生合成経路、葉酸による1炭素貯蔵（one carbon pool）経路、レチノール代謝経路、ポルフィリン・クロロフィル代謝経路ならびにユビキチンおよびその他のテルペノイド-キノンの生合成経路が含まれる。
【００７７】
さらに、代謝経路のさらなる非限定的な例には、テルペノイド骨格生合成経路、モノテルペノイド生合成経路、セスキテルペノイド生合成経路、ジテルペノイド生合成経路、カロテノイド生合成経路、ブラシノステロイド生合成経路、昆虫ホルモン生合成経路、ゼアチン生合成経路、リモネン・ピネン分解経路、ゲラニオール分解経路、I型ポリケチド構造経路、12、14および16員マクロライド生合成経路、アンサマイシン生合成経路、II型ポリケチド骨格生合成経路、II型ポリケチド産物生合成経路、テトラサイクリン生合成経路、ポリケチド糖単位生合成経路、非リボソームペプチド構造経路、シデロフォア類非リボソームペプチド生合成経路、バンコマイシン類抗生物質生合成経路、フェニルプロパノイド生合成経路、スチルベノイド・ジアリルヘプタノイド・ジンジェロール生合成経路、フラボノイド生合成経路、フラボン・フラボノール生合成経路、アントシアニン生合成経路、イソフラボノイド生合成経路、インドールアルカロイド生合成経路、イソキノリンアルカロイド生合成経路、トロパン・ピペリジン・ピリジンアルカロイド生合成経路、アクリドンアルカロイド生合成経路、カフェイン代謝経路、ベタレイン生合成経路、グルコシノレート生合成経路、ベンゾオキサジノイド生合成経路、ペニシリン・セファロスポリン生合成経路、ベータ-ラクタム耐性経路、ストレプトマイシン生合成経路、ブチロシン・ネオマイシン生合成経路、クラブラン酸生合成経路、ピューロマイシン生合成経路およびノボビオシン生合成経路が含まれる。
【００７８】
さらに、代謝経路のさらなる非限定的な例には、安息香酸分解経路、アミノ安息香酸分解経路、フルオロ安息香酸分解経路、クロロアルカン・クロロアルケン分解経路、クロロシクロヘキサン・クロロベンゼン分解経路、トルエン分解経路、キシレン分解経路、ニトロトルエン分解経路、エチルベンゼン分解経路、スチレン分解経路、アトラジン分解経路、カプロラクタム分解経路、DDT分解経路、ビスフェノール分解経路、ダイオキシン分解経路、ナフタレン分解経路、多環芳香族炭化水素分解経路、シトクロムP450による生体異物代謝経路および薬物代謝-シトクロムP450経路が含まれる。
【００７９】
代謝経路にはまた、MAPKシグナル伝達経路、MAPKシグナル伝達経路-ハエ経路、MAPKシグナル伝達経路-酵母経路、ErbBシグナル伝達経路、Wntシグナル伝達経路、ノッチシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、TGF-βシグナル伝達経路、VEGFシグナル伝達経路、Jak-STATシグナル伝達経路、カルシウムシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達系経路、mTORシグナル伝達経路、植物ホルモンシグナル伝達経路、造血細胞系統経路、補体・凝固カスケード経路、トール様受容体シグナル伝達経路、NOD様受容体シグナル伝達経路、RIG-I様受容体シグナル伝達経路、細胞質DNA検知経路、ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害経路、抗原プロセシング・提示経路、T細胞受容体シグナル伝達経路、B細胞受容体シグナル伝達経路、FcεRIシグナル伝達経路、FcγR媒介食作用経路、経内皮遊走経路、IgA産生性腸内免疫ネットワーク経路およびケモカインシグナル伝達経路も含まれ得る。
【００８０】
特定の態様において、2つ以上の酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）およびグルコースオキシダーゼ（GOx）を含む。別の態様において、2つ以上の酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、グルコースオキシダーゼ（GOx）およびインベルターゼ（Inv）を含む。別の態様において、2つ以上の酵素は、グルコースオキシダーゼ（GOx）およびカタラーゼ（Cat）を含む。さらに別の態様において、2つ以上の酵素は、アルコールオキシダーゼ（AOx）およびカタラーゼ（Cat）を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、ナノ複合体は、その最長の軸に沿って測定した場合、約5nm〜約2000nmの長さである。このサイズは、ナノ複合体中の酵素のサイズおよび数ならびにポリマーネットワークの特性によって変化し得る。いくつかの態様において、ナノ複合体の長さは、少なくとも約10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、250nm、300nm、400nmまたは500nmである。いくつかの態様において、ナノ複合体の長さは、約50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、250nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1500nmまたは2000nm以下である。
【００８２】
ナノ複合体は、複合体中の酵素のサイズ、形状および数に依存して、任意の形状であり得る。1つの態様において、ナノ複合体は、実質的に円形である。別の態様において、ナノ複合体は、実質的に卵形、球形、円筒形またはピラミッド様である。
【００８３】
いくつかの態様において、ポリマーネットワークは、合計で、少なくとも1、2、3、4、5、7、10、15または20箇所で酵素に固定される。1つの態様において、ポリマーネットワークは、酵素のうちの少なくとも2つに固定される。1つの態様において、ポリマーネットワークは、少なくとも2または3または4または6箇所で各酵素に固定される。酵素をナノ複合体中に効果的に内包するためにナノ複合体の酵素一つ一つがポリマーネットワークで固定される必要がないことが想定されている。例えば、3つ以上の酵素では、それらのうちの2つがポリマーネットワークで固定されている場合、それ以外のものは、それらの位置によって固定された酵素に相対的に束縛され得る。そのような空間的束縛は、酵素間の結合によって強化され得るが、それは必須ではない。ポリマーネットワークがナノ複合体中の酵素のうちの1つのみに固定され得ること、およびその場合でも、ポリマーネットワークに固定されたものと他の酵素との会合により、ナノ複合体中での酵素の空間的束縛が果たされることも想定されている。1つの態様において、ポリマーネットワークは、ナノ複合体のあらゆる酵素に固定される。
【００８４】
ポリマーネットワークは任意の力、たとえば共有結合、水素結合、イオン結合、疎水結合、およびファンデルワールス力などが挙げられるがこれに限定されない力によって酵素に固定される。ある態様では、固定のために複数の力が働く。いくつかの態様においては、全ての固定位置において同じタイプの力が用いられているとは限らない。
【００８５】
ポリマーネットワークを固定する目的で、1つの態様において、ナノ複合体中の2つ以上の酵素は複数の重合性基を有する。重合性基はある種の様式で、化学条件下で重合する化学的部分である。重合条件の例としては、光重合、フリーラジカル重合、および触媒誘導重合が挙げられる。概して、重合性基のタイプは、該重合性基がナノ複合体を形成するのに用いるモノマーと重合可能である限り決定的ではない。重合性基の例としては光重合またはフリーラジカル重合によって重合される二重結合含有部分が挙げられる。いくつかの態様においては、重合性基はビニル基、アクリル基、アルキルアクリル基（すなわち、メタクリルのようなアルキル置換基を有するアクリル基）である。本明細書中で用いる場合、アクリル（アルキルアクリル、メタクリル等）はアクリルエステルならびにアクリルアミドを含む。いくつかの態様において、重合性基は酵素のリジン残基に共有結合したアクリル基である。
【００８６】
酵素は容易に修飾できる多くの異なる表面アミノ酸を含有できる。例えば、リジン、システイン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、プロリンおよびトリプトファンは、公知のプロセスおよび手法を用いて容易に修飾することができる。タンパク質を修飾するのに用いられる試薬は、少なくとも1つの重合性基と、タンパク質の表面のアミノ酸側鎖と反応する少なくとも1つの反応性基とを有するであろう。アミノ酸側鎖と反応させるのに用いられる反応性基の例としては、（リジンのような）アミンおよび（スレオニンまたはセリンのような）ヒドロキシを含有する残基と反応する（アシルハライドまたはN-ヒドロキシスクシンイミドエステルのような）活性化されたエステル；（システインのような）チオール含有残基と反応するマレイミド；およびある種のカップリング試薬で活性化された場合の、（グルタミン酸およびアスパラギン酸のような）カルボン酸含有残基と反応するアミンが挙げられる。このように、重合性基は単一酵素に共有結合している。重合性基は直接的に結合していてもよく、またはリンカーを介して結合していてもよい。
【００８７】
アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびリジン、ならびに電荷を有するように修飾されたアミノ酸のようなある種のアミノ酸の正または負の電荷の存在によって、イオン結合を用いて、ポリマーネットワークを1つまたは複数の酵素上に固定することができる。
【００８８】
いくつかの態様において、リンカーが酵素および重合性基の間に存在する。該リンカーは、重合性基と酵素とを分離する化学的部分である。リンカーとして用いられる試薬は、少なくとも1つの重合性基と、リンカーによって分離される少なくとも1つの反応性基とを有することになる。反応性基は、通常、タンパク質表面のアミノ酸側鎖との反応によって酵素と反応し、それらの間のリンカーによって、重合性基を単一酵素に共有結合させる。
【００８９】
いくつかの態様において、リンカーは分解性であってよい。分解性リンカーは、ある種の条件下で開裂する化学的部分である。例えば、分解性リンカーは、例えば、あるpH値（高いpHまたは低いpH）において加水分解されてもよく、あるいは光分解により（すなわち、ある波長の光を照射した場合に）開裂してもよく、またはある温度下で、還元-酸化条件下で、または酵素的に（すなわち、プロテアーゼによって）開裂してもよい。リンカーが、酵素と反応する反応性基と重合性基とを有してナノ複合体を形成する限り、いずれの適当な分解性リンカーを用いてもよい。分解性リンカーはまた、ナノ複合体の重合の間はやはり安定なものとすべきである。リンカーのタイプは、リンカーが開裂するであろう条件に基づいて選択されてよい。多数のリンカーが知られており、それは当業者には自明であろう。
【００９０】
これらのナノ複合体における酵素は、それらの複合体化されていない天然の形態の酵素よりも安定である。安定性は、経時的な酵素活性の消失、または酵素の分解または変性において決定される。いくつかの態様において、ナノ複合体はプロテアーゼによる分解に対して耐性である。ポリマーネットワークは、酵素のプロテアーゼへの曝露を低下させる。その結果、保護されていない天然の酵素よりもプロテアーゼの存在下で（例えば、インビボにて、血清中で、または細胞中で）、酵素の活性がより長く継続する。ポリマーネットワークは酵素の構造を安定化させ、かつ酵素の凝集を防止する。かくして、ナノ複合体はpHおよび温度の変化に対してより耐性である。例えば、ナノ複合体は、天然酵素よりも、室温または低下した温度（すなわち、冷蔵または凍結）にて、より長い貯蔵寿命を有する。同様に、ナノ複合体は、天然の酵素よりも、多数の凍結/解凍サイクル後に活性を消失する可能性がより低い。酵素の構造はポリマーネットワークによって安定化されるゆえに、ナノ複合体は有機溶媒および界面活性剤に対してより耐性である。
【００９１】
ポリマーネットワークはまた、有機溶媒での溶解性を増加させるように調整されてもよい。ナノ複合体と共に用いてもよい有機溶媒および界面活性剤の例としては、化粧品（すなわち、メーキャップ）および医薬で広く用いられるものの中でも、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、4-ジクロロベンゼン、パラ-ジクロロベンゼン、1,4-ジオキサン、1,4-ジオキサンPEG、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、ラウレス硫酸ナトリウムまたはオキシノール、ポリソルベート60、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール、2-ブトキシ-1-エタノール、アルキルフェノキシ、ポリエトキシエタノールが挙げられる。他の有機溶媒は当業者に明らかであろう。ポリマーネットワークは凝集を妨げるがゆえに、ナノ複合体は、保護されていない酵素が凝集する傾向にある場合、界面（すなわち、気体/液体または液体/固体）において、より安定である。
【００９２】
いくつかの態様において、ナノ複合体は、モノマーユニットと共重合された2つ以上の酵素である。モノマーユニットは、重合されかつ単一酵素と共にコポリマーを形成してナノ複合体のポリマーネットワークを形成する化学的部分である。いくつかの態様において、酵素が、ビニル、アクリル、アルキルアクリルまたはメタクリル基のような二重結合を有する重合性基を担う場合、モノマーユニットは、ビニル、アクリル、アクリルアミド、アルキルアクリル、アルキルアクリルアミド、メタクリルまたはメタクリルアミド基のような二重結合を有する重合性基も有する。酵素の重合性基、およびモノマーユニットの重合性基は、それらがナノ複合体を形成するのに用いられる条件下でコポリマーを形成することができる限り、同一であってよく、異なっていてもよい。例えば、ビニルおよびアクリル基は、フリーラジカル重合条件下でコポリマーを形成してよい。
【００９３】
いくつかの態様において、ナノ複合体は、2つ以上の異なるモノマーユニットと共重合した2つ以上の酵素である。概して、異なるモノマーユニットが、全て、ナノ複合体を形成するのに用いられる条件下でコポリマーを形成することができる限り、任意の数の異なるモノマーユニットを用いて酵素と共にコポリマーを形成してもよい。異なる側鎖を持つモノマーユニットを用いて、ナノ複合体の表面の特徴を改変してもよい。表面の特徴は、異なるモノマーユニットの間の比率を調整することによって制御されてもよい。いくつかの態様において、モノマーが、中性、非荷電、親水性、疎水性、正に荷電、または負に荷電されていてもよい。いくつかの態様において、ポリマーネットワークは、全体として、中性、非荷電、親水性、疎水性、正に荷電、または負に荷電されている。ナノ複合体の溶解性は、例えば、荷電された、および非荷電の、または親水性または疎水性モノマーユニットの間の比率を変化させることによって調整されてもよい。いくつかの態様において、ナノ複合体は正または負の電荷を有する。
【００９４】
いくつかの態様において、少なくとも1つのモノマーユニットは、生理学的pH（約7.4）において正または負の電荷を有する。pH＝7.4において電荷を有するモノマーユニットを用いることによって、荷電した、および荷電していないモノマーユニットの比率を変化させることにより、ナノ複合体の全電荷を変化させ、かつ調整してよい。いくつかの態様において、モノマーユニットはpH＝7.4において正の電荷を有する。正に荷電したモノマーユニットの使用は、正の電荷を有するナノ複合体の形成を可能とする。電荷は、中性および正に荷電したモノマーユニットの比率を変化させることによって調整し得る。
【００９５】
いくつかの態様において、ポリマーネットワークは、さらに、少なくとも架橋剤を含む。架橋剤は、2つ以上の重合性基を有する化学的化合物である。概して、架橋剤上の重合性基が、ナノ複合体を形成するのに用いられる条件下で酵素および少なくとも1つのモノマーの間で架橋されたコポリマーを形成することができる限り、いずれの架橋性化合物を用いてもよい。架橋剤の例としては、2つのビニル、アクリル、アルキルアクリル、またはメタクリル基を有する化合物が挙げられる。2つのアクリル基を有する具体的な架橋剤の例としては、N,N'-メチレンビスアクリルアミドおよびグリセロールジメタクリレートが含まれる。
【００９６】
いくつかの態様において、架橋剤は分解性架橋剤である。分解性架橋剤はある種の条件下で開裂し、その結果、ナノ複合体のポリマーネットワークの少なくとも一部が分解し、または除去される。例えば、分解性架橋剤はあるpH（高または低）において加水分解されてもよく、（エステラーゼまたはペプチダーゼのような）特異的酵素によって開裂されてもよく、ある波長への曝露によって光分解により開裂されてもよく、またはある温度において開裂されてもよい。低下したpHにおいて加水分解される架橋剤の例としては、生理学的pH（約7.4）において安定であるが、より低いpH（約5.5）において加水分解されるグリセロールジメタクリレートが挙げられる。分解性架橋剤の他の例としては、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第7,056,901号に記載されたアセタール架橋剤が挙げられる。
【００９７】
分解性架橋性基のさらなる具体的な例としては、N,N'-メチレンビス（アクリルアミド）、1,4-ビス（アクリロイル）ピペラジン、エチレングリコールジアクリレート、N,N'-（1,2-ジヒドロキシ-エチレン）ビスアクリルアミド、およびポリ（エチレングリコール）ジアクリレートが挙げられる。非分解性架橋性基のさらなる例としては、N,N'-ビス（アクリロイル）シスタミン、グリセロールジメタクリレート、ビス［2-（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェート、およびビスアクリロイル化ポリペプチドが挙げられる。
【００９８】
ある態様において、ポリマーネットワークは透過性である。本明細書中で用いる場合、透過性は、分子（例えば、エタノール）が、ポリマーネットワーク中のポアまたは穴を通って、またはポリマーマトリックスを通る拡散によって、ポリマーネットワークを通過できることを意味する。例えば、基質、補因子および他の化学的要素がポリマーネットワークを通過できると、ナノ複合体がその内部にある酵素の活性を保持できる。本発明のいくつかの態様において、選択された構成要素から、および/またはポリマーマトリックスを通した化合物の拡散に影響する特異的選択透過性特性を有するマトリックスを生じるように設計された選択された条件下で、ポリマーマトリックスが形成される。
【００９９】
分解性架橋剤は、ポリマーネットワークを除去することができるか、またはその密度を減少させることができ、かくして、補因子および基質のような種々の物質の通過を可能とする。例えば、低下したpHにおいて分解する分解性架橋剤を用いると、ナノ複合体がエンドサイトーシスによって細胞内部に移行した後に、ポリマーコーティングを除去するか、または減少させ得る。血清および後期エンドソームが、各々、約7.4および約5.5のpH値を有するのは周知である。かくして、pH約7.4で安定であるが、pH約5.5において分解する分解性架橋剤は、ナノ複合体が細胞に入った後にのみ、ポリマーコーティングを除去するか、または減少させるであろう。このようにして、酵素は血清中に存在するプロテアーゼから保護されるが、大きな基質を伴う酵素は依然として効果的に細胞に送達され得る。ポリマーコーティングが減少した後、酵素の活性は依然として存在する。しかしながら、ポリマーコーティングが除去された後は、細胞内プロテアーゼによる分解に対して酵素は感受性であり、この欠点は、血清中におけるナノ複合体の増大した安定性、および血清中プロテアーゼに対する耐性によって相殺される。
【０１００】
ある態様において、ナノ複合体は、表面修飾をさらに含む。表面修飾は、ナノ複合体の形成の後にナノ複合体の表面に加えられた化学的部分である。反応性側鎖がナノ複合体の形成に干渉しない限り、反応性側鎖（または保護された反応性側鎖）を有するモノマーユニットを用いて、ナノ複合体を形成してもよい。反応性側鎖は（もし必要であれば、脱保護の後）表面修飾剤と反応して、共有結合によってナノ複合体に表面修飾を施してもよい。表面修飾剤は、小分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、多糖、または抗体であってよい。表面修飾は、ナノ複合体の溶解性を改変し、ナノ複合体の表面電荷を変化させ、または発光、細胞標的化または細胞透過のようなさらなる機能をナノ複合体に付与し得る。細胞標的化を増強する表面修飾の結果、非標的化細胞と比較した場合に、標的化細胞へのナノ複合体の増大した形質導入がもたらされる。細胞透過促進剤が欠如したナノ複合体と比較した場合に、細胞透過を増強する表面修飾の結果、細胞へのナノ複合体の増大した形質導入がもたらされる。2種以上の表面修飾をナノ複合体上に存在させてよい。小分子表面修飾の例としては、フルオレセインまたはローダミンのような発光性化合物、または葉酸のような細胞標的化化合物が挙げられる。ポリマーは、溶解性を増大させるためのポリエチレングリコールを含む。特定の細胞表面特徴に対する抗体、細胞シグナリングタンパク質または成長ホルモンのようなペプチドを細胞標的化のために用いてよい。他のペプチド（TATまたはアンテナペディアホメオドメインなど）を用いて、ナノ粒子の細胞透過を増加させてよい。いくつかの態様において、表面修飾は抗体である。
【０１０１】
多酵素ナノ複合体を調製する方法
本開示の多酵素ナノ複合体は、まず、多酵素コアを形成し、次いで、ポリマーネットワークを該コアのまわりに固定することによって調製することができる。
【０１０２】
1.多酵素コアの調製
一時的多酵素コアの調製方法を図1に示し、実施例1において記載する。そのような例示的な手法についてのさらなる詳細は実施例2で見出すことができる。
【０１０３】
例示的方法においては、第一の工程において、DNA-阻害剤足場が合成される。図1に示されるように、各酵素についての競合的阻害剤は、各々、設計された配列を持つ一本鎖DNA（ssDNA）に結合され、DNA分子の相補的アセンブリによって、3つの阻害剤と連結されたDNA-阻害剤足場が形成される（例えば、Feldkamp et a；.Angew Chem Int Edit 45,1856-1887,（2006）参照）。
【０１０４】
ssDNAと阻害剤との結合は、当該分野で公知の方法で達成することができる。例えば、結合はssDNAの5'リン酸または5'アミンC6T基において起こり得る（例えば、実施例1セクション3.1における説明参照）。
【０１０５】
一旦ssDNA-阻害剤が調製されたならば、DNA-阻害剤足場は、ssDNA上の相補的配列によって自己集合できる。図5aは、2つのssDNA-阻害剤分子の集合を示す。従って、2つのssDNAは相互に対して相補的な配列を共有する。
【０１０６】
一方、図5bにおいて、4つのssDNA配列は3つまたは4つの阻害剤を足場上に集合させることができる。ここで、ssDNA-IはssDNA-IIの断片に対して相補的な配列を有し、これは次に、ssDNA-IIIの断片に対して相補的な配列を有し、これは次に、ssDNA-IVの断片に対して相補的な配列を有し、これは次に、ssDNA-Iの断片に対して相補的な配列を有する。
【０１０７】
図5bに示された設計戦略は、相補的な配列をssDNA分子に含めることによって、5つ、または6つ、またはそれを超える数のssDNA-阻害剤足場の形成に容易に適応することができる。
【０１０８】
一旦複数の阻害剤用の足場が合成されたならば、次いで、酵素を対応する阻害剤に結合させて、酵素-阻害剤-ssDNAコアを形成することができる。
【０１０９】
多酵素コアを当該分野に公知の他の方法で調製することができるのは当業者によって容易に認識されるであろう。例えば、1つまたは複数の阻害剤は、酵素基質で、リガンドで、または該酵素を認識する抗体さえ用いて、置換することができる。一方、ssDNAは、阻害剤、基質、または抗体を固定するポリマーによって置き換えることができる。
【０１１０】
従って、1つの態様において、複数のリガンドが固定されたポリマー性足場を含み、該リガンドが複数の酵素によって認識され、該酵素が基質と協働的に反応することを特徴とするナノ複合体も提供される。本明細書中で用いられる「リガンド」は、酵素を特異的に認識し、または酵素によって認識され、または酵素に結合するいずれの分子も網羅することを広く意図する。1つの局面において、ポリマー性足場はssDNAのような核酸である。そのようなポリマー性足場は、従って、多酵素ナノ複合体を調製するのに有用である。
【０１１１】
さらなる態様において、ポリマー性足場は、対応する酵素をさらに含む。
【０１１２】
2.多酵素ナノ複合体の調製
一旦多酵素コアが調製されたならば、次いで、ポリマーネットワークをコアに適用することができる。ポリマーネットワークは、共有結合または本明細書中に記載された他の力によって２つ以上の酵素に固定され、酵素を少なくとも1つの重合性基で誘導体化し；次いで、誘導体化されたタンパク質をモノマーユニットと共に共重合することができる。
【０１１３】
例示的な二段階の手法を用いて、酵素のまわりにポリマーネットワークを形成することができる。まず、重合性基を酵素表面に連結させる。次いで、緩衝溶液中での、官能性モノマーおよび、任意で架橋剤の重合によって、2つ以上の酵素をポリマースキンで包む。
【０１１４】
一旦重合性基が酵素表面に結合されたならば、モノマーを用いて、調節可能な組成、構造、表面特性、および官能性を持つポリマーコーティングを形成することができる。室温フリーラジカル重合技術を用いて、酵素活性の保持を確実としてもよい。これらのポリマーコーティングはカプセル化酵素のための人工的な膜として働くので、それらは適当な機械的強度を呈して、構造的一体性を提供し、有効な輸送経路を保有して、迅速な基質の輸送を可能とし、かつ特異的な官能性を含有して、基質選択性および水分保持を供する。
【０１１５】
ナノ複合体は、酵素の機能を変化させるものではなく、酵素は、先に示されたように、商業的供給元から直接的取得してもよいし、または他の報告された方法（例えば、GENSCRIPTによって供されたもののような組換え方法）を用いて取得してもよい。
【０１１６】
酵素を誘導体化または修飾するのに用いられる試薬は、以下の一般的構造を有し、ここで重合性基は、ナノ複合体を形成するのに用いられる条件下で1つまたは複数のモノマーおよび/または架橋剤と共にコポリマーを形成する化学的部分である。いくつかの態様において、重合性基は、ビニル、アクリル、アルキルアクリルおよびメタクリルのような二重結合含有基である。先に論じたように、アクリル（およびアルキルアクリルおよびメタクリル）は、アクリルエステルおよびアクリルアミド双方を含む。
【０１１７】
連結基は任意であって、重合性基およびタンパク質の間に存在させてもよい。連結基は、反応性基を重合性基から分離する化学的部分である。連結基はいずれの特定の化学構造にも限定されないが、重合反応に干渉すべきでない。いくつかの態様において、連結基は、ある種の条件下で開裂する分解性連結基である。例えば、アセタール、ケタールまたはエステルは、あるpHにおいて加水分解され得る。これらの官能基の１つまたは複数を有する連結基は、（例えば、エンドソームにおいて）pHの変化に応答して分解できる。
【０１１８】
反応性基は、アミノ酸側鎖と反応して、重合性基をタンパク質に共有結合により結合させる化学的部分である。多数の反応性基が知られており、それを用いて、異なるアミノ酸側鎖と反応させる。例えば、アシルハライド、または（N-ヒドロキシスクシンイミドエステルのような）活性化エステルは（例えば、リジン上の）アミン、または（例えば、セリンまたはスレオニン上の）ヒドロキシルと反応する。イソシアネートはアミンと反応する。エポキシドはアミンまたはチオール（例えば、システイン）と反応する。マレイミドはチオールと反応する。他の官能基は（カルボジイミド試薬のような）1つまたは複数のカップリング試薬の存在下で、アミノ酸側鎖と反応することができる。例えば、アミンは（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸上の）カルボン酸アミノ酸側鎖と反応することができる。他の反応性基は当業者には自明であろう。
【０１１９】
前記したタンパク質修飾の間、部位特異的な制御された修飾を実現するために、遺伝子組換え技術を用いて、特異的アミノ酸を空間的に規定された位置に導入することができる。この技術は、修飾の部位および密度の正確な制御を可能とする。
【０１２０】
タンパク質を誘導体化するのに用いられる具体的な化合物の例は当該分野で知られており、例えば、参照によりその内容が本明細書に組み入れられるPCT出願公開番号WO 2010/104865を参照されたい。このPCT出願は、さらに、重合プロセスの間にタンパク質をアクリレート化し、かつタンパク質ナノ複合体を一般的に調製する詳細な方法も開示する。
【０１２１】
モノマーユニットは、いくつかの態様において、側鎖および重合性基を有し、そこでは、重合性基は、ナノ複合体を形成するのに用いられる条件下で、酵素および任意の架橋剤と共にコポリマーを形成する化学的部分である。重合性基は、先に論じた全てのものを含む。酵素の重合性基、およびモノマーユニットの重合性基は、それらが、ナノ複合体を形成するのに用いる条件下でコポリマーを形成できる限り、同一であってもよく、または異なっていてもよい。例えば、ビニル基およびアクリル基は、フリーラジカル重合条件下でコポリマーを形成できる。
【０１２２】
側鎖は、重合に関与しないモノマーユニットの部分である。概して、側鎖は任意の構造を有してもよく、ナノ複合体の所望の特性に基づいて選択することができる。モノマーユニットの側鎖はナノ複合体の表面特性に影響する。いくつかの態様において、側鎖は中性であってもよく、中性で親水性（すなわち、水溶性であるが荷電していない）であってもよく、疎水性であってもよく、正に荷電していてもよく、あるいは負に荷電していてもよい。中性側鎖は、アミド、エステル、エーテル、ヒドロキシルを含み、そのいくつかは、それらの構造に依存して親水性または疎水性であってよい。正に荷電した側鎖は（モノおよびジアルキルアミンのような置換されたアミン、およびテトラ置換アンモニウム化合物、およびその環状変種を含めた）アミン、グアニジン、およびピリジンおよびイミダゾールのような複素環を含む。負に荷電した側鎖はカルボン酸を含む。疎水性側鎖は（直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基を含めた）アルキル基およびアリール基を含む。
【０１２３】
具体的なモノマーユニットおよびそれらの機能の例としては、アクリルアミド（中性、1）、2-ヒドロキシエチルアクリレート（中性、1）、N-イソプロピルアクリルアミド（中性、2）、アクリル酸ナトリウム（負に荷電、3）、2-アクリロイルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸ナトリウム（負に荷電、3）、アリルアミン（正に荷電、4）、N-（3-アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（正に荷電、4、5）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（正に荷電、5）、（3-アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム塩酸塩（正に荷電、5）、メチルメタクリレート（疎水性、6）およびスチレン（疎水性、6）が挙げられる。括弧中の数字は作用を指し：1〜5：疎水性表面および水分保持；2）温度応答性；3）負に荷電した表面；4）表面修飾のための反応性側鎖、5）正電荷表面、6）疎水性表面である。
【０１２４】
修飾された酵素およびモノマーユニットの重合は、タンパク質およびモノマーユニットで用いられる重合性基に適しかつ重合の間にタンパク質の機能を破壊しないいずれの方法を用いてもよい。重合方法の例としては、先に記載したもののような、二重結合含有重合性基の光重合およびフリーラジカル重合が挙げられる。いくつかの態様において、重合はフリーラジカル重合である。
【０１２５】
いくつかの態様において、重合は室温で行われるが、タンパク質の機能が重合の間に消失しない限り、温度は重合方法に依存して、望むように上昇させまたは低下させてよい。分解性架橋剤または連結基を用いる場合、ナノ粒子の機能はポリマーコーティングの分解後に測定することができる。重合反応があまりにもゆっくり起こる場合、または上昇した温度が重合を開始するのに必要な場合には、反応温度を上昇させてもよい。重合反応があまりにも迅速に起こる場合には、温度を低下させてもよい。
【０１２６】
いくつかの態様において、重合反応は水、または水性緩衝液中で行われる。他の有機溶媒は、該溶媒が、重合反応に干渉せず、またはタンパク質を分解しない限り、必要に応じて用いてよい。もし必要であれば、水または水性緩衝液および有機共溶媒の混合物が、反応に干渉せず、または酵素を損なわない限り、該溶媒混合物を用いて、反応成分を溶解させてよい。いくつかの態様において、重合反応は緩衝液中で行われる。
【０１２７】
いくつかの態様において、共重合工程は少なくとも2つの異なるモノマーユニットを含む。概して、この異なるモノマーユニットが、全て、ナノ複合体を形成するのに用いられる条件下でコポリマーを形成することができる限り、任意の数の異なるモノマーユニットを用いて、酵素と共にコポリマーを形成してもよい。異なる側鎖を持つモノマーユニットを用いて、ナノ複合体の表面特徴を改変してもよい。表面特徴は、異なるモノマーユニットの間の比率を調整することによって制御してもよい。いくつかの態様において、モノマーは中性でもよく、中性で親水性でもよく、疎水性でもよく、正に荷電されていてもよく、または負に荷電されていてもよい。ナノ複合体の溶解性は、荷電したおよび荷電していない、または親水性または疎水性モノマーユニットの間の比率を変化させることによって調整してよい。
【０１２８】
いくつかの態様において、共重合工程は、架橋剤をさらに含む。架橋剤は、連結基によって分離された少なくとも2つの重合性基を有する試薬である。架橋剤は2つより多い重合性基を有してよい。架橋剤上の全ての架橋性基が、ナノ複合体を形成するのに用いられる条件下でモノマーユニットおよび酵素と共にコポリマーを形成することができる限り、架橋剤上の重合性基は同一であってもよく、または異なっていてもよい。2つの重合性基を有する架橋剤は、重合性基が前記したものと同一である一般的な構造を有する。連結基が重合反応に干渉しない限り、連結基は任意の構造を有してもよい。適当なリンカーの例としては、（置換されたアルキル基を含めた）アルキル基、（置換されたアリール基を含めた）アリール基、ケトン、アミド、エステル、エーテルおよびその組合せが挙げられる。架橋剤の具体的な例としては、N,N'-メチレンビスアクリルアミドおよびグリセロールジメタクリレート、および前記したその他のものが挙げられる。
【０１２９】
いくつかの態様において、連結基は分解性である。分解性連結基はある種の条件下で開裂され得る。分解性連結基の構造は、連結基を開裂するのに必要とされる条件のタイプを決定する。例えば、pHの変化（すなわち、増大または減少）によって、光のある波長に対する曝露によって、または熱に応答して、連結基は開裂されてもよい。分解性架橋剤の例はグリセロールジメタクリレートである。
【０１３０】
いくつかの態様において、ナノ複合体を生産する方法は、ナノ複合体の表面を修飾する工程をさらに含む。モノマーユニットの側鎖（単数または複数）は重合後にはナノ複合体の表面に存在する。反応性側鎖（または保護された反応性側鎖）を有するモノマーユニットを用いて、ナノ複合体を調製してよい。反応性側鎖は重合に干渉しないが、ナノ複合体が形成された後に（すなわち、重合が完了した後に）、さらなる化学的修飾を受けてもよい。保護された反応性側鎖は標準的な化学的脱保護方法を用いて脱保護し、次いで、化学的修飾剤と反応させてもよい。反応性側鎖を化学的試薬で処理して、表面修飾剤をナノ複合体の表面に共有結合により結合させる。表面修飾は小分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、多糖、または抗体であってもよい。表面修飾は（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の親水性基を加えることによって）ナノ複合体の溶解性を改変してもよく、（例えば、荷電した表面修飾剤を加えることによって）ナノ複合体の表面電荷を変化させてもよく、または発光、細胞標的化または細胞透過のようなさらなる機能をナノ複合体に付与してもよい。小分子表面修飾の例としては、フルオレセインまたはローダミンのような発光性化合物、または葉酸のような細胞標的化化合物が挙げられる。ポリマーは溶解性を増大させるためのポリエチレングリコールを含む。ペプチドおよびポリペプチドを細胞標的化のために用いてもよく、これは特異的細胞表面特徴に対して選択的な抗体、細胞シグナリングペプチド、またはホルモンを含んでもよい。他のペプチド（TATまたはアンテナペディアホメオドメインなど）を用いて、ナノ粒子の細胞透過を増加させてもよい。いくつかの態様において、表面修飾は抗体である。ナノ複合体は、容易に誘導体化された表面を有するがゆえに、特異的な抗体をナノ複合体と結合させ、標的化送達のさらなる能力を供することができる。
【０１３１】
ナノ複合体のサイズおよび表面特徴は、異なるモノマー、および/またはナノ複合体を形成するのに用いられる架橋剤の重量比率を変化させることによって調整してもよい。例えば、（正に荷電した）DMAEMA対AAm（中性）の重量比率を、0：1、1：3および1：1で調節すると、各々、-12.8、8.64〜15.2mVの調整可能なゼータ電位を持つBSAナノ複合体の合成が可能となる。溶解性は、モノマーユニットおよび架橋剤のタイプおよび比率を変化させることによって容易に調整することもできる。疎水性または荷電したモノマーの量の増加は、水溶解性を増大させる。疎水性モノマーの量を増加させると、有機溶媒または混合された有機/水溶媒系でのナノ複合体溶解性を増大させる傾向がある。
【０１３２】
ポリマーネットワークの透過性は、ナノ複合体を調製するのに用いられる反応混合物中の架橋剤の比率を変化させることによって調整してもよい。概して、より少量の架橋剤を用いると、より高い透過性がもたらされる。同様に、ポリマーネットワークの透過性は、架橋剤上の連結基の長さを変化させることによって変化させてもよい。概して、より長い連結基は透過性を増大させる。
【０１３３】
多酵素コアをポリマーネットワークに固定した後に、ssDNA-阻害剤足場、またはコアを一時的に維持する目的を発揮する任意の他の種類の足場を除去することができる。この条件または試薬が酵素におけるポリマーネットワークの固定を破壊しない限り、阻害剤を酵素から解離させる条件または試薬によって、足場の除去を行うことができる。そのような条件および試薬の例は実施例にて提供されており、当業者によって容易に認識される。
【０１３４】
使用
本明細書中に記載された酵素ナノ複合体を用いると、効率が上がり、安定性が増大し、かつ中間体の産生が低下した協調的な様式で一連の酵素機能を行うことができる。1つまたは複数の中間体が毒性である場合、酵素ナノ複合体は、また、毒性中間体を減少させるか、またはその放出を排除する。酵素ナノ複合体の具体的な使用は、どのような酵素が当該複合体に含まれているかに依存する。
【０１３５】
さらに、酵素ナノ複合体を用いて、改良された安定性および/または長期効果を伴って、酵素をインビトロまたはインビボにて細胞に送達することもできる。ナノ複合体はプロテアーゼによる分解に対してより耐性であるので、タンパク質の活性は、天然の、または保護されていないタンパク質が投与された場合よりも、長い効果を有する。その結果、（保護されていないタンパク質と比較した場合に）同一の効果に対して（ナノ複合体の形態の）より少ない酵素で必要性を満たすため、有効性が改善される。
【０１３６】
本発明の態様は、有効濃度の上記ナノ複合体に細胞を曝露することによって、酵素を送達する方法を含む。細胞は培養中のものであってもよく（すなわち、インビトロ）、または生きた生物中に存在していてもよい（すなわち、インビボ）。
【０１３７】
いくつかの態様において、酵素の少なくとも1つは治療用酵素である。治療用酵素とは、対象において疾患または障害を処置するのに用いることができるもののことである。いくつかの態様において、対象は哺乳動物、またはヒトである。
【０１３８】
本明細書中に記載されたナノ複合体は、対象において疾患または障害を処置するのに用い得る酵素と共に用いてもよい。例えば、本発明によるナノ複合体は、過剰増殖性障害、がん、または腫瘍の治療で用いてもよい。他の態様において、ナノ複合体は化粧品で用いてもよい。
【０１３９】
さらに、そのような酵素はそれらの単離された形態よりも、高温かつ酸性および塩基性条件においてより安定であるので、そのような酵素ナノ複合体による非常に改良された使用法が確実に示される。
【０１４０】
薬学的組成物
本明細書に記載のナノ複合体は、診断または治療上の処置方法で用いるために種々の組成物に処方することができる。組成物（例えば、薬学的組成物）はキットとして構築することができる。概して、本発明の薬学的組成物は有効量（例えば、薬学的有効量）の本発明の組成物を含む。
【０１４１】
本発明の組成物は、本発明の組成物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として処方することができる。「薬学的に許容される担体」とは、生物学的ではないものではないかさもなくば望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、該物質は、いずれの望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、またはそれが含有される薬学的組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく対象に投与することができるものである。該担体は、当業者によく知られているように、有効成分の任意の分解を最小化し、かつ対象における任意の有害な副作用を最小化するように自然に選択され得る。薬学的に許容される担体および薬学的組成物の他の成分の議論については、例えば、Remington's Pharmaceutical Science,第18版,Mack Publishing Company,1990を参照されたい。いくつかの適当な薬学的担体は当業者に明らかであり、例えば、（滅菌水および/または脱イオン水を含む）水、（PBSのような）適切な緩衝液、生理食塩水、（DMEMのような）細胞培養培地、人工脳脊髄液等を含む。本発明の薬学的組成物またはキットは、本発明の組成物に加えて、他の剤を含有することができる。他の剤は、患者の治療の間に、任意の適切な時点において、同時投与または順次投与することができる。
【０１４２】
当業者であれば、特定の処方は、部分的には、使用される特定の剤、および選択された投与経路に依存するであろう。従って、本発明の組成物には多様な適当な処方がある。
【０１４３】
当業者であれば、適当なまたは適切な処方は、現在の特定の適用に基づいて選択し、適合させ、または開発することができる。本発明の組成物についての用量は単位投与形態とすることができる。本明細書中で用いる「単位投与形態」という用語は、動物（例えば、ヒト）対象のための単位用量として適切な、物理的に区分される単位を指し、各単位は、所望の効果を生じさせるのに十分な量にて計算され、薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤と一緒になって、単独で、または他の治療剤と組み合わせた、所定量の本発明の剤を含有する。
【０１４４】
当業者であれば、個々の患者において剤の所望の有効量または有効濃度を達成するために、用いられる組成物の正確な処方のための、適切な用量、スケジュールおよび投与の方法を容易に決定することができる。
【０１４５】
本発明の関係では、動物、特にヒトに投与される本発明の組成物の用量は、妥当な時間枠にわたって個体において少なくとも検出可能な量の、診断または治療応答を行うのに十分なものとすべきである。所望の効果を達成するのに用いられる用量は、投与される特定の剤の効能、宿主における剤に関連する薬力学、感染した個体の疾患状態の重症度、対象に投与されるべき他の医薬等を含めた種々の因子によって決定されるであろう。用量のサイズは、使用される特定の剤またはその組成に伴い得る任意の有害な副作用の存在によっても決定されるであろう。有害な副作用を最小に保つことが、それが可能な場合は常に、一般的には望ましい。生物学的に活性な物質の用量は変化し；各特定の剤についての適当な量は当業者に明らかであろう。
【０１４６】
本発明の別の態様は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける、本明細書中に開示された方法のいずれかに有用なキットである。そのようなキットは、本発明の組成物の1つまたは複数を含むことができる。任意で、該キットは該方法を行うための指示書を含む。本発明のキットの任意の要素は、適切な緩衝液、薬学的に許容される担体等、容器、または包装材料を含む。キットの試薬は、該試薬が安定であるように、例えば、凍結乾燥形態または安定化された液体の状態で、容器中に入っていてもよい。試薬は単回使用形態、例えば、単回投与形態としてもよい。
【実施例】
【０１４７】
これまでの記載から、種々の用法および条件に対して、それを採用するために本明細書中に記載された発明に対して変形および改変がなされ得ることは明らかであろう。そのような態様もまた後の特許請求の範囲内にある。
【０１４８】
本明細書中における変数の任意の定義における要素の一覧の記述も、列挙された要素の、任意の単一の要素または組合せ（または少数の組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書中における態様の引用は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様またはその部分と組み合わせたその態様を含む。
【０１４９】
単数で列挙された用語は、別途示さない限り複数形も含む。
【０１５０】
以下に開示される実施例は、本発明を例示するために提供されるが、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変形は、当業者には自明であって、添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される全ての刊行物、データベース、および特許（例えば、タンパク質送達のための応答性ポリマーナノカプセルに関する米国特許第6,153,217号；米国特許公開番号第20090060894号；2012年4月13日に出願された国際出願番号PCT/US2012/33515）は、全ての目的で、参照により本願明細書に組み入れられる。
【０１５１】
本開示のナノ複合体を調製し、特徴付けし、かつ使用する方法が以下の実施例に示される。出発物質は、当該分野で公知の手法に従って、または本明細書中に示されるように作成される。以下の実施例は、本発明がより十分に理解され得るように提供される。これらの実施例は例示的なものに過ぎず、断じて本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１５２】
実施例1：相乗機能を持つ高度に頑強な人工酵素ナノ複合体（EN）の設計
本実施例は、相乗機能を持つ高度に頑強な人工酵素ナノ複合体（EN）の一般的設計を示す。これは、相乗的または相補的機能を持つ酵素、または協働的に一緒に機能する酵素をナノ複合体に集合させるかまたは結合させ、続いて、該ナノ複合体をネットワーク-ポリマーカプセル内に被包することによって達成される。
【０１５３】
方法
酵素ナノ複合体（EN）の合成：DNA-阻害剤足場の合成は、阻害剤を、設計された配列を持つ一本鎖DNA（ssDNA）に結合し、続いてそれらを自然に集合させて足場を形成することによって達成した。簡単に述べると、10mgの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDAC）および60μLの5'-リン酸化ssDNA（5nmol/μL）を混合し、続いて、50μLの酵素阻害剤（0.2M）または（0.1MイミダゾールMES緩衝液に溶解させた）基質誘導体を加えた。次いで、混合物をボルテックスで徹底的に混合した。5分間の8000rpmにおける遠心分離後、混合物を2時間室温に保って、完全に反応させた。次いで、EDTA-リン酸緩衝液（10mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、10mM EDTA、pH＝7.4）を用いる脱塩樹脂上でのゲル濾過によって、結合したssDNAを精製した。次いで、相補的なssDNA-阻害剤分子を混合し、37℃にて10分間インキュベートし、室温まで冷却して、DNA-阻害剤足場を形成した。
【０１５４】
n（HRP-GOx）を合成するために、20mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH＝8.5）中のアクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NAS）と2時間反応させることによって、GOxおよびHRPをアクリロイル基で固定した。リン酸緩衝液（20mM、pH＝7.0）に対する透析の後、アクリルオキシ化HRP、アクリルオキシ化GOx、およびDNA-阻害剤足場（1.5：1.5：1、n/n/n）を混合し、室温に20分間保持して、酵素-足場複合体を形成した。次いで、モノマーとしてのアクリルアミド（全ての酵素に対して4：1の重量比率）、架橋剤としてのビス-メチルアクリルアミド（アクリルアミドに対して1：6の重量比率）、および阻害剤としての過硫酸アンモニウム/テトラメチルエチレンジアミンを用いるインサイチュ重合によって、複合体を被包した。被包された複合体を、PBSに対する透析によってまず精製し、次いで、10分間で37℃まで加熱し、サイズ排除クロマトグラフィー（セファロース6B）を用いてさらに精製した。n（HRP-GOx-Inv）、n（GOx-Cat）、n（AOx-Cat）、n（Cat）、n（AOx）、n（GOx）および他の酵素ナノ複合体の合成は、同様なアプローチを用いて行い、その詳細は実施例2において提供される。動的光散乱（DLS）、透過型電子顕微鏡観察（TEM）、蛍光顕微鏡画像およびスペクトル、細胞生存率アッセイ、毒性、および他の関連情報を含めたENの詳細な特徴づけもまた実施例2に提供される。
【０１５５】
インビボ実験：アルコール解毒剤のインビボ実験は、エタノール、天然酵素、および酵素ナノカプセルで処理した後のマウスの血中アルコール濃度（BAC）および血漿中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の変動をモニターすることによって達成した。同一の酵素含有量であるn（AOx）、n（Cat）、n（AOx）とn（Cat）との混合物、およびn（AOx-Cat）を含む、酵素ナノカプセルの4群を用いた。天然AOxは比較のために用いた。Jackson Laboratory（Bar Harbor,ME）由来の8〜10週齢の雄性C57B6マウスを実験のために用いた。マウスを8〜12時間絶食させ、続いて、アルコール含有液体食餌（AIN76A,Dyets Inc.,体重1kgあたり6gのEtOH（w/w）で投与）内に、（動物1匹あたり65μgのAOxで投与した）酵素ナノカプセルおよび天然AOxまたはナノカプセルで、強制飼養を行った。マウスの対象群については、EtOHを含まない、等カロリー食餌を強制飼養で与えた。アルコール強制飼養から45、90、180および360分後に、尾から血中試料を採取した。アルコールを供給された動物のBACは、エタノールアッセイキット（Bio Vision）を用いて決定した。バックグラウンドBACは、250μLのPBS緩衝液のみで強制飼養を行った対照マウスを用いることによって推定した。マウスの血漿中のALT値は、Ji et al.,Gastroenterology 124：1499-99（2003）に記載された方法に従うことによって、アルコール強制飼養から6〜8時間後に決定した。全ての動物は、地域委員会によって承認された実験動物の管理と使用についての手引きに従って処理した。
【０１５６】
n（GOx-Cat）のインビボ解毒能力は、雄性マウス（C57B6）を用いて行った。後大腿部にキシラジン（10mg/kg）とケタミン（85mg/kg）を組み合わせて筋肉内注射して、マウスを麻酔した。次いで、動物用シェーバーを用いて、動物の背中の毛を除去した。n（GOx）、n（Cat）およびn（GOx-Cat）を、各々、1回の注射当たり、1群当たり、50μlのPBS緩衝液中に分散させた35μgナノ複合体の用量にて、0時間目および24時間目に2回の皮膚注射行って皮内に送達した。等しい用量の過酸化水素（H2O2）溶液（3％w/v）およびPBS緩衝液も、各々陽性および陰性対象として、同一の動物の背中の異なるスポットに注射した。2度目の注射から24時間後に動物を麻酔し、次いで皮膚組織片をサンプリングし、固定し、Rocheより入手したインサイチュ細胞死滅検出キットを用いるH&E染色のために、かつ蛍光TU EL染色のために処理した。H&E画像はNikon Eclipse E600顕微鏡で獲得し、共焦点蛍光画像は、Hi et al., Hepatology 40：442-51（2004）従ってNikon PCM2000共焦点レーザー走査型顕微鏡で得た。
【０１５７】
結果
図1に示すように、各酵素の競合的阻害剤が、設計した配列の一本鎖DNAとそれぞれ結合し、DNA分子の相補的アセンブリによって、3種の阻害剤が連結されたDNA-阻害剤の足場が形成され、阻害剤と酵素との特異的結合が、酵素3種のナノ複合体を構築する（ステップI）。
【０１５８】
その後のインサイチュ重合によって、各ナノ複合体の周囲に網状ポリマーの薄層が生じ、酵素3種のコアと透過性シェルとを含むナノ複合体の形成をもたらす（ステップII）。最終的に、DNA-阻害剤足場を除去することによって、n（酵素）で表される非常に頑強なENを生じるが、この場合n（酵素）の括弧内の酵素は、ナノ複合体のコア内の酵素を指している（ステップIII）。酵素をナノ複合体内に被包すると非生理学的環境およびプロテアーゼ攻撃に対して効率的に安定化すること、さらに、形成されたナノ複合体は、容易に官能化されて望ましい表面特性および標的能を獲得することができるということに注目することが重要である（例えばYanら、Nat Nanotechnol 5,48〜53、（2010）参照）。
【０１５９】
EN構造の構築成功を、モデル酵素にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）およびグルコースオキシダーゼ（GOx）を使用して証明した。図2aは、動的光散乱（DLS）測定（図6）によって平均直径30±7nmと確認されているn（HRP-GOx）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示す。酵素2種の構造を確認するために、EN構築前に、各HRPおよびGOx分子を1.4nmの単一金ナノ粒子で標識した。図2bに示すように、金で標識したENのほとんどは、2つの金ナノ粒子を含んでおり、阻害剤と酵素との間の特異的結合が理由で、各ENがHRP1を分子、かつGOxを1分子、実際に含んでいることを示している。
【０１６０】
このようなナノ複合体構造は、構成する酵素を近接させて立体的に定義する。実施例としてローダミンB標識HRP（HRP-RhB）およびフルオレセイン-イソチオシアナート標識GOx（GOx-FITC）を使用した場合、図2cは、これらの混合物（同一のモル比）と同じ酵素含有量を有する、対応する酵素2種のENの蛍光スペクトルを比較したものである。FITCおよびRhBがそれぞれ495および540nmで最大励起波長を有するので、混合物は、励起波長450nmの場合、中央の波長520nmのFITC蛍光のみを示す。比較すると、ENは、FITCおよびRhBの両方からの強い蛍光（中央の波長はそれぞれ、520nmおよび585nm）を示し、GOx-FITCからHRP-RhBまでの効率的なフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を示す。この観察により、HRPとGOxとが、近距離（10nm未満）で密接に会合していることが明瞭に確認される（例えばSelvinら、Nat Struct Biol 7,730-734,（2000）参照）。近接構造をさらに確認するために、図2dは、GOx-FITCおよびHRP-RhBの共局在を明瞭に示しているENの蛍光顕微鏡画像を示す。488nmで励起すると、580nmでのFRET蛍光も同じ位置で記録され、近接構造がさらに検証された。
【０１６１】
観察されたように、このような近接構造は、ENに著しい触媒効率の増大を与える。このことは、インベルターゼ（Inv）、GOxおよびHRPによって媒介される、スクロースおよびグルコースの逐次的反応によって証明された。反応媒体中に直接添加したグルコース、またはスクロースのInv媒介性加水分解から生じたグルコースを、GOx媒介反応によって酸化し、H2O2の生成をもたらす。生成されたH2O2は、HRP媒介性の反応によってo-ジアニシジンをさらに酸化するが、これを全体的な酵素反応効率を調べるために使用する。
【０１６２】
図2fは、n（HRP-GOx）およびn（HRP-GOx-Inv）の代謝回転速度（o-ジアニシジン酸化速度）と、同じ酵素含有量を有するこれらの天然酵素混合物の代謝回転速度とを比較したものである。天然酵素混合物と比較して、n（HRP-GOx）およびn（HRP-GOx-Inv）は、緩衝液中でそれぞれ5および15倍まで代謝回転速度の増大を示し、触媒効率の増大が確認される。細胞または血流内の粘性環境をシミュレートするために（例えば、Ellisら、Trends Biochem Sci 26, 597-604,（2001）参照）、ポリエチレングリコール（PEG、MW約3000）を反応媒体に添加して粘度（媒体内の中間体の拡散抵抗）を高めた。予想通り、n（HRP-GOx）は全体的に、PEG濃度を増加すると相対的な代謝回転速度が増加し、PEGが35重量％存在する場合代謝回転速度は34倍のに増加した。同様に、n（HRP-GOx-Inv）は、PEG溶液において最大24倍、対的代謝回転速度の増大を示している。化学的な転換の著しい速度改善は、中間体の拡散を効果的に最小限に抑える近接構造に起因している。触媒効率増大の他に、n（HRP GOx）およびn（HRP-GOx-Inv）の著しい安定性の増大もまた示している。
【０１６３】
図2eは、n（HRP-GOx）およびn（HRP-GOx-Inv）の残留酵素活性と、これらの酵素混合物の対応する残留酵素活性とを比較している。65℃で60分間インキュベーションした後、n（HRP-GOx）およびn（HRP-GOx-Inv）は、これらの本来の活性の70％および75％を保持しているが、混合物は活性の98％より多くを失っている。
【０１６４】
活性および安定性が著しく増大したENを製造することが可能であることから、生体触媒作用、センシング、治療および他の用途のために新規のクラスの酵素機構が提供される。例えば、オキシダーゼは、痛風の治療などの多くの治療応用に使用または提案されている（例えば、Shermanら、Adv Drug Deliver Rev 60,59〜68,（2008）、Schelsingerら、Nat Rev Drug Discov 10,17〜18,（2011）、Sundyら、Arthritis Rheum 58,2882〜2891,（2008）、およびKehrerら、Crit Rev Toxicol 23,21〜48,（1993）参照）。
【０１６５】
それにもかかわらず、オキシダーゼ媒介性の反応は、一般に有毒なH2O2を生成し、臓器および組織に損傷をもたらす場合がある（例えば、Kehrerら、Crit Rev Toxicol 23,21〜48,（1993）参照）。幸運にも、この制限があるからEN技術を使用することに効率的に対処することができる。細胞とのn（GOx）のインキュベーションによって、GOx媒介性のグルコース酸化から生じたH2O2によって細胞生存率が90％喪失することがn（GOx）によって例証された（図3a）。培地の中にn（Cat）を添加することによって、H2O2のカタラーゼ媒介性分解により細胞生存率（58％）の損失を効率的に減少する。驚くべきことに、n（GOx-Cat）は、n（GOx）およびn（Cat）の（同じ酵素含有量の）混合物より、はるかに優れている。n（GOx-Cat）で処理した細胞は、未処理の細胞（91％）と同様の生存率を示す。図3bは、37℃で3時間CellTiter Blueで処理した後、同じ酵素含有量のn（GOx）、n（Cat）およびn（GOx）の混合物、およびn（GOx-Cat）で培養した細胞の写真を示す。一貫して、n（GOx-Cat）で培養された細胞は、他よりも非常に強い赤みを帯びた蛍光色を示し、H2O2がより効果的に排除されることに起因してさらに高い細胞生存率を示す。特定の理論または作用機構によって拘束されることなく、この観察結果は、予想外の現象、すなわち、酵素の近接構造が全体的な化学的変換効率を増強するだけでなく、有毒な中間体の効率的な除去をも促進し、起こり得る細胞損傷および組織損傷を回避する現象と一致している。
【０１６６】
ENのインビボ解毒能をさらに確認するために、n（GOx）、n（Cat）、およびn（GOx-Cat）をマウス（C57BL/6）の異なる注射部位に皮膚注射した。陽性および陰性対照として、等体積のH2O2溶液（3％w/v）およびPBSビヒクルを、同じマウスの離れた皮膚部位にそれぞれ注射した。注射の48時間後、H2O2処理した部位およびn（GOx）処理した部位で皮膚病変を観察した。
【０１６７】
対照的に、PBS、n（Cat）、またはn（GOx-Cat）を注射した場所では、皮膚損傷は観察されなかった（図3c）。さらなる毒性試験のためにマウスを屠殺し、注射部位の皮膚組織を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）ならびにTUNEL染色キットで染色した。明らかに、H2O2の投与は皮膚真皮に裂傷と膨張をもたらし；n（GOx）投与は同様に組織の膨張をもたらし、かつ軽微な程度であるが好中球の浸潤をもたらし；生じたH2O2による病態生理学的応答および損傷を示している（図3d）。細胞のアポトーシスは、H2O2またはn（GOx）のいずれかで処理した皮膚組織において明らかだった。一方、n（Cat）またはn（GOx-Cat）で処理した皮膚組織の細胞死は最小限であり、PBSで処理した試料の細胞死と同等であった（図3d）。
【０１６８】
GOxおよびCatをEN中で近接させて被包することにより、オキシダーゼの投与に関連した毒性および組織損傷を効率的に減少し得るということがこれらの観察によって明らかに証明され、現在のオキシダーゼ関連療法に光をあてる。
【０１６９】
この技術の治療上のさらなる意義は、可能性のあるアルコール解毒薬であるカタラーゼおよびアルコールオキシダーゼのENによって証明された。アルコール摂取は千年にも及ぶ人類文明の構成要素であるが、アルコール乱用は、一連の臓器損傷（例えば肝損傷）および社会問題を伴う（例えば、アルコールの影響下での暴力および運転（DUI）、例えば、Leeら、Lancet 2,759〜761,（1979）参照）。生物学的に、アルコールの代謝過程は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）によって媒介されるアルコール脱水素酵素（アセトアルデヒドへのエタノールの変換）およびアセトアルデヒド脱水素酵素（酢酸へのアセトアルデヒドの変換）の一連の作用に依存している（例えば、Crabbら、P Nutr Soc 63,49〜63,（2004）参照）。
【０１７０】
しかしながら、細胞外NAD+は低濃度であるため、このような脱水素酵素の細胞外での解毒剤としての使用が限定されている（例えば、Jiら、Hepatology 40,442〜451,（2004）参照）。この限定を回避するために、我々は、分子酸素を使用して効率的にアセトアルデヒドへのアルコールの酸化を媒介することができるn（AOx-Cat）（ここでAOxはアルコールオキシダーゼである）に基づいた、新規の酵素的な機構を設計した。
【０１７１】
他のオキシダーゼと同様、この酸化過程により有毒副産物H2O2も生成されるが、それにもかかわらず、生成されたH2O2は、EN内に近接して配置されたカタラーゼによって速やかに除去することができる（図8の細胞生存率を参照されたい）。n（AOx-Cat）内の被包されたAOxおよびCatの両方は、ポリマーシェルによってプロテアーゼ攻撃および非生理学的状態から十分に保護されており、これらを経口的および全身的に多用途に投与することを可能にしているということに注目することもまた重要である。
【０１７２】
図4は、n（AOx-Cat）に基づいた経口用アルコール解毒剤の有効性を証明している。天然AOx、n（AOx）、n（Cat）、同じ比率のn（AOx）とn（Cat）との混合物、またはn（AOx-Cat）と一緒に、アルコールを含む流動食をマウスに強制飼養した。全動物はアルコール中毒になって20分以内に眠り、アルコール食餌を用いたマウスの平均血中アルコール（BAC）は、投与後30分で374±25.8 mg/dLであった。アルコールのみを投与したマウスと比較して、n（AOx-Cat）を投与したマウスのBACは、注射後45分、90分および3時間で、それぞれ10.1％、31.8％および36.8％（図4a）減少した。n（AOx）（8.5％未満）またはn（AOx）とn（Cat）との混合物を投与したマウスではこれらの期間中、わずかなBAC減少しか観察されなかった（10.6％未満）。n（Cat）または天然AOxを用いたものではBAC減少を検出できなかった。コア酵素複合体を不活性化から保護することにおける、ENのポリマーシェルの不可欠な役割が、BCA減少について天然AOxが無効であることによってさらに確認される。アルコール強制飼養の6時間後に動物は起き始め、n（AOx-Cat）を用いた群が起きた時間は、他の群のものより1〜2時間早かった。
【０１７３】
アルコール摂食およびEN投与に関連した肝臓損傷を調べるために、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）を、治療後7時間解析した。ALTは、全アルコール摂食動物で著しく増加した。しかしながら、他の群と比較して、n（AOx-Cat）を用いたマウスではALTレベルがより低い傾向があった（図4b）。BAC減少に関して同様の結果を尾部静脈注射を施した動物においても得て（図9）、ENの多用途の投与が確認された。
【０１７４】
上記研究によって、BACおよび肝臓損傷を効率的に減少させるアルコール解毒剤を開発することが実現可能である、ということが確認される。n（AOx）、およびn（AOx）とn（Cat）との混合物の有効性より著しく高いn（AOx-Cat）の有効性によって、EN内に限定されるAOxとCatとの相乗効果がさらに確認される。実際、アルコールの酸化によって分子酸素が消費され、H2O2が放出される。カタラーゼにより有毒なH2O2分子が除去されて肝損傷が減少するだけでなく、カタラーゼ媒介性のH2O2分解により分子酸素もまた再生され、近接構造によってAOxに急速にフィードバックされることが可能である。
【０１７５】
この相乗効果は、酸素の局所的な欠乏を緩和し、BACの加速されたアルコール酸化と、より効率的な減少とをもたらす。H2O2生成の他に、アルコール酸化は別の有毒な中間体であるアセトアルデヒドも生じさせるということに留意されたい。より効率的なALT減少および肝臓損傷からの完全な保護は、アセトアルデヒドの効率的な除去に依存する。酵素3種のナノ複合体n（AOx-ADOx-Cat）の構築のための、活性の高いADOxが入手可能であれば、アルコール誘発性の肝障害から完全に保護することが期待される。それにもかかわらず、我々の知り得る限り、これは初のアルコール解毒剤であるように思え、広範囲の治療応用のためにENを使用することの大きな可能性について、明らかに証明されている。
【０１７６】
まとめると、ナノ空間内に複数の酵素を精密に構築し安定化することによって、頑強な酵素構造の設計について、本実施例から実証される。現在入手可能であるかまたは追加されている酵素の広大なライブラリーを考慮すると、治療応用を越えた広範囲の用途のために、新規のクラスの酵素機構を構築し得るであろう。より重要なことには、構築する酵素分子を慎重に選択してこれらの相乗効果および補完性効果を得るものの、この実施例により、進化を超えてプログラム可能な機能を備える、新たな酵素機構ファミリーの生成が予測される。
【０１７７】
実施例２：相乗的機能を持つ人工酵素ナノ複合体（ENS）を作製および使用するための例示的方法および材料
この実施例は、実施例１で論じた材料、方法および結果の、より多くの詳細を提示する。
【０１７８】
1.材料
試薬および溶媒は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）より購入し、特に断りのない限りさらなる精製を行わずに入手したまま使用した。HeLa細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）より購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）成長培地およびペニシリン/ストレプトマイシンは、Invitrogen（Carlsbad, CA）より入手した。ウシ胎児血清（FBS）は、Lonza Walkerrsville Inc（Walkerrsville, MD）より入手した。CellTiter-Blue細胞生存率キットは、Promega （Madison, WI）より購入した。酵素ナノ複合体の製造のためのN-（3-アミノプロピル）エタクリルアミドヒドロクロライドは、Polymer Science, Inc.より購入した。モノ-スルホ-N-ヒドロキシ-スクシンイミドAu-ナノ粒子は、NanoProbe, NYより購入した。ローダミンBイソチオシアネートおよびフルオレセインイソチオシアネートを含む蛍光染料は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）より入手した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼおよびカタラーゼを含む酵素は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）より購入した。雄性C57B6マウスは、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）より購入した。アルコール液体飼料AIN76Aは、Dyets, Incより入手した。エタノールアッセイキットは、Bio Vision（Mountain View, CA）より購入した。H&Eおよび蛍光TUNEL染色キットは、Rocheより購入した。
【０１７９】
酵素ナノ複合体を調製するために用いた一本鎖DNA（ssDNA）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）より購入した。それらの配列を下の表1に記載した。
【０１８０】
（表１）
2014522649.tif 000003
［Phos］は、リン酸化を表し、［ThiC6］は、チオールC6 S-Sを表し、［AmC6T］は、アミンC6を表す。
【０１８１】
2.計測器
UV可視スペクトルは、GeneSys 6 スペクトロメーター （Thermo Scientific）で獲得した。蛍光スペクトルは、QuantaMaster分光蛍光光度計（Photon Technology International）で得た。酵素ナノ複合体の動的光散乱研究は、Zetasizer Nano計測器（Malvern Instruments Ltd., United Kingdom）で測定した。透過型電子顕微鏡 （TEM）画像は、120 kVの加速電圧で動作するPhilips CM120電子顕微鏡で得た。 蛍光強度は、Fujifilm BAS-5000プレートリーダーで測定した。質量スペクトルは、Appliedで獲得し、Nikon TE2000S倒立蛍光顕微鏡で撮影した。
【０１８２】
3.酵素ナノ複合体（ENs）の調製
3.1 DNA-阻害剤足場の合成
DNA-阻害剤足場の合成は、結合および自己集合技術を組み合わせて使用することによって達成した。手短に言えば、まず一本鎖DNAを酵素の可逆的阻害剤（またはそれらの基質誘導体）と結合させ、一本鎖DNA-酵素阻害剤（ssDNA-阻害剤）を得た。結合の後、異なる種類のssDNA-阻害剤を一緒に混合し、10分間、37°Cに加熱した。室温まで冷却した後、ssDNA-阻害剤はそれらの相補鎖（単数または複数）と自己集合してDNA-阻害剤足場を形成した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、グルコースオキシダーゼ（GOx）およびインベルターゼ（Inv）に関するssDNA-阻害剤の詳細な合成スキームは、下のスキームおよび図５に示される。
【０１８３】
HRP（a）、GOx（b）、およびInv（c）に関するssDNA-阻害剤の合成の略図。
2014522649.tif 000004
【０１８４】
3.2 ssDNA-阻害剤のMALDI-TOFによる特性決定
ssDNA-阻害剤の結合がうまくいったことは、MALDI-TOFスペクトルによってそれらの分子量増加をモニターすることにより実証された。超高純度3-ヒドロキシピコリン酸（3-HPA）を以下の測定のマトリックスとして使用した。結合していないssDNAをMALDI-TOFによる特性決定の対照として用いた。酵素阻害剤と結合する前（黒色）および後（灰色）の、得られたssDNAスペクトルを図６に示す。
【０１８５】
3.3 n（HRP-GOx-Inv）の合成
n（HRP-GOx-Inv）を、方法記載箇所で説明n（HRP-GOx）の調製の方法に類似する方法を用いて合成した。手短に言えば、HRP、GOxおよびInvを、まず、アクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミド（NAS）と反応させ、それに続いて透析チューブ膜 （MWCO＝10kDa）を用いてリン酸緩衝液（20mM、pH＝7.2）に対して透析することにより精製した。アクリロキシ化HRP、GOx、Invと、HRP/GOx/Inv用のDNA-阻害剤用足場（1：1：1：5、n/n/n/n）とを一緒に混合してHRP-GOx-Inv酵素複合体を形成し、その後酵素複合体の表面をインサイチュ重合により被包した。未反応のモノマーを透析によって除去した後、試料を10分間37°Cに加熱し、その後サイズ排除クロマトグラフィー（Sepharose-6B）に通してDNA-阻害剤足場を除去した。
【０１８６】
3.4 二重蛍光標識したn（HRP-RhB-GOx-FITC）の合成
ローダミンB標識セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP-RhB）およびフルオレセインイソチオシアネート標識グルコースオキシダーゼ（GOx-FITC）を、蛍光染料の製造業者により提供されるプロトコールに従って調製した。蛍光色素、RhBおよびFITCを、まず無水DMSOに溶解して10mg/mLの原液を得た。次に、50μLの染料溶液を2mg酵素溶液（pH＝8.2、炭酸ナトリウム、100mM）に徐々に添加し、4℃で一晩反応させた。標識した酵素を、ゲル浸透クロマトグラフィー（Sepharose-6B）により精製した。カラムをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で予め平衡化し、同じ緩衝液でタンパク質を溶離させた。最初のカラーバンドを回収し、濃縮し、さらなる使用のために4℃で貯蔵した。HRP-RhBおよびGOx-FITCの濃度および染料/タンパク質比（D/P）は、403nmで102,000M-1cm-1（HRP）、280nmで44,100M-1cm-1（GOx）、および555nmで108,000M-1cm-1（RhB）、495nmで81,000M-1cm-1（FITC）の吸光係数によって求めた。
【０１８７】
HRP-RhB、GOx-FITCを酵素として、かつ酵素複合体を形成するためのHRP/GOx DNA-阻害剤足場を用いることにより、酵素ナノ複合体n（HRP-RhB-GOx-FITC）を調製した。その調製の詳細な手順は、上述のn（HRP-GOx）の手順と同じである。調製の後、二重蛍光標識したENを、ゲル濾過（Superdex-75）によってさらに精製した。555nmで強い吸光度を有する最初のバンドを回収し、濃縮し、蛍光特性決定のために4℃で貯蔵した。
【０１８８】
3.5 Auナノ粒子標識ENの合成
Auナノ粒子（モノ−スルホ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドAuナノ粒子）の過剰量を、1×PBS緩衝液中の天然HRPおよびGOx（3：1、n/n、Au/酵素）と1時間にわたりそれぞれ反応させた。過剰量のAuナノ粒子を、ゲル濾過（Superdex-75）によって除去した。Auナノ粒子、HRP、およびGOxの濃度を、次に、それらのモル吸光係数に基づくUV/visスペクトルにより決定した（ナノゴールド、420nmで155,000M-1cm-1、HRP、403nmで102,000M-1cm-1、GOx、453nmで11,200M-1cm-1）。結果として得られたAu標識HRP/GOx MCENは、0.83のAuNP/HRP比率、および0.95のAuNP/GOx比率を含む。
【０１８９】
次に、Au標識HRPおよびGOxを使用し、n(HRP-GOx)の調製と同じプロトコールを使用することにより、二重AuNP標識ENを調製した。調製後、サイズ排除クロマトグラフィー（Sepharose-6B）を通過させ、最初の着色バンドを収集することにより試料を精製した。その後試料を透過型電子顕微鏡（TEM）観察のために4℃で保存した。
【０１９０】
3.6 ssDNA-アルコールオキシダーゼ（ssDNA-AOx）およびssDNA-カタラーゼ（ssDNA-Cat）結合体の合成
アルコールオキシダーゼ（AOx）およびカタラーゼ（Cat）を、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4、0.15M NaCl）中に、2mg/mLの濃度でそれぞれ溶解した。N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）のストック溶液を、最初に、2mM DMSO溶液として調製し、続いて、1mL酵素溶液中へ25μLのSPDP溶液を徐々に添加することによって酵素と反応させた。反応物は、4℃で、撹拌しながら4時間にわたって保った。反応が終了した後、混合物を、50mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、10mM EDTA、pH7.2を、溶出緩衝液として使用するゲル濾過（Superdex-75）によって精製した。その間、ssDNA-1'およびssDNA-2'を、ジチオスレイトール（DTT）を用いて還元し、ゲル濾過（Superdex-75）により直ちに精製した。精製後続いて、還元したssDNA-1'およびssDNA-2'を、SPD-Pactivated CatおよびAOx溶液中に、モル比1.2/1（ssDNAに対する酵素）でそれぞれ加えた。混合物を、完全な結合のために、4℃で一晩反応したまま保ち、次に、NASを混合物中に加え、重合可能部位をssDNA−酵素結合体へ固定した。続いて試料を透析チューブ膜（MWCO 約10kDa）を用いた1×PBSに対する透析により精製し、結合していないssDNAを除去した。
【０１９１】
3.7 n(GOx-Cat)およびn(AOx-Cat)の合成
ssDNA-2-グルコサミン（GOxに対するssDNA-阻害剤）を、まず等量のアクリルオキシル化ssDNA-1と結合したCatと混合した（1/1、n/n）。混合物を10分間37℃に加熱し、次に氷浴を用いて冷却した。室温に戻した後インサイチュ重合を行い、GOxおよびCatの対を酵素−ナノ複合体中に被包した。
【０１９２】
1×PBSに対する透析による未反応モノマーおよび開始剤の除去後、試料を10分間37℃に加熱し、直ぐにサイズ排除クロマトグラフィーに通し、GOxのためのssDNA-阻害剤結合体を除去した。溶出された最初のバンドを収集し、濃縮し、n(GOx-Cat)のストック溶液を得た。n（GOx-Cat）ストック溶液を、さらなる使用のために4℃で保った。
【０１９３】
n(AOx-Cat)の調製は、上に言及するn(GOx-Cat)と同様である。重合に先立ち、アクリルオキシル化ssDNA-1と結合したCATおよびssDNA-2と結合したAOxを、等モル比率で混合した。重合後、反応混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーを通すことにより精製し、未反応モノマーおよび他の副産物を除去した。n（AOx-Cat）を次に凝縮し、インビトロおよびインビボテストのため、65μg／チューブ（100μL／チューブ）で分注した。AOxおよびCatのENは、両方の酵素を直接的に結合させ、それに続く同様の被包技術によっても調製することができることに注意されたい。
【０１９４】
4.単一酵素ナノ複合体の合成
GOx、AOx、およびCatの単一酵素ナノ複合体（n(GOx)、n(AOx)、およびn(Cat)として表示する）を、Yan et at, Nature Nanotechnology 5： 48-53 (2010)において報告される方法を使用して合成した。簡単に述べると、まずNASと反応させることによって酵素をアクリルオキシル化し、次に、インサイチュ重合により、ポリアクリルアミンの薄層を用いて被包した。1×PBSに対する透析によって未反応モノマーを除去した後、続いて単一酵素ナノ複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー（Sepharose-6B）を通すことによって精製した。その後ナノ複合体を、収集し、凝縮し、さらなる使用のために4℃で保存した。
【０１９５】
5. 活性アッセイおよびENの安定性
5.1 活性アッセイ
酵素複合体、n(HRP-GOx)、およびn(HRP-GOx-Inv)の活性を、o-ジアニシジン（ODS）の酸化速度をモニターすることにより評価した。簡単に述べると、0.2mM o-ジアニシジン、500pMのEN、および特定量の基質（n(HRP-GOx)用のグルコースまたはn(HRP-GOx-INV)用のスクロース）を含むリン酸緩衝液（0.1M、pH＝7.0）を、25℃で5分間にわたりインキュベートした。
【０１９６】
インキュベーションの間、460nmでの吸光度読み出しを、UV/vis分光計を用いて連続的に記録した。吸収曲線を、時間に対してプロットし、曲線のうち直線部分からの1分あたりのΔA460を算出した。活性アッセイを、一連の適切な濃度の基質を用いて繰り返し、一連の触媒速度を得て、Lineweaver-BurkプロットによりKMappおよびKcatappを得た。同様のアッセイを、また、対照実験として遊離酵素混合物（遊離HRP/GOx、および遊離HRP/GOx/Inv）を用いて実施した。
【０１９７】
（表2）HRP/GOxおよびHRP/GOx/インベルターゼの遊離酵素系ならびにそれらの対応するENの動態パラメーター
2014522649.tif 000005
【０１９８】
同様の活性アッセイもまた、一連の濃度（0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、m/v）のポリエチレングリコール（PEG、MW約3000）中で実施し、細胞または血流内での粘性環境をシミュレートした。簡単に述べると、まず特定の量のPEGをリン酸緩衝液（0.1M、pH＝7.0）中に加え、ストックPEG溶液を得た。次に、酵素ナノ複合体（またはそれらの対応する遊離酵素混合物）およびODSを加え、徹底的に混合し、500pMの酵素濃度、および0.2mMのODS濃度を伴うアッセイ溶液を得た。続いて調製されたままのアッセイ溶液の145μLを、透明な96ウェルプレート中に入れた。異なる濃度を伴う一連の基質を、5μLのPEG溶液中に溶解し、次に、反応溶液の各々のウェル中に加えた。次にプレートを30秒間にわたって振盪し、さらに5分間インキュベートした。各々の試料の450nmでの吸光度を、次に、プレートリーダーを用いて読み出した。
【０１９９】
5.2 熱安定性
n(HRP-GOx)、n(HRP-GOx-Inv)、遊離HRP/GOx混合物、および遊離HRP/GOx/Inv混合物の溶液を、まず65℃で、特定の期間（5〜60分）インキュベートし、続いて氷浴上で急冷し、その後室温へ戻した。これらの試料を用いて活性アッセイを実施し、ENおよびそれらの対応する遊離酵素混合物の残留活性を決定した。
【０２００】
6. ENの透過型電子顕微鏡（TEM）試験
ENの形態および構造を、TEMを用いて直接的に検討した。Philips CM120電子顕微鏡で試験を行い、120kVの加速電圧で作動させた。TEM試料は、炭素コーティングした銅グリッド上へ、2μLのn(HRP-GOx)を滴下コーティングすることによって調製した。試料液滴は、グリッドと45秒間にわたって接触させ、その後過剰量の試料を除去した。次にグリッドをすすぎ、続いて1％タングストリン酸ナトリウム（pH7.0）を用いて染色した。
【０２０１】
TEMでのより良好な画像取得のために、特徴づけの前にAuNPの銀による増感を実施した。簡単に述べると、まずAuNP標識したn（HRP−GOx）溶液を、TEMグリッドと45秒間にわたり接触させた。脱イオン水を用いたすすぎの後、このグリッドを、調製したての銀増感試薬（Nanoprobe, NY）の液滴上に1分間にわたり浮遊させた。その後グリッドを再びすすぎ、続いて1％タングストリン酸ナトリウム（pH7.0）を用いて染色した。このプロセスは、内部に3〜4nmの銀でコーティングされたAuNPを伴う、ネガティブ染色されたn（HRP−GOx）の形成をもたらした。
【０２０２】
7. ENの動的光散乱（DLS）試験
DLS実験は、10mWのヘリウム−ネオンレーザー（λ＝632.8nm）および熱電温度制御器を備えたZetasizer Nano機器（Malvern Instruments Ltd., UK）を用いて実施した。測定値を、90°散乱角で取った。結果（図7）は、ENの中心流体力学的直径が、n(HRP-GOx)について18±5nm、n(HRP-QOx-Inv)について37±8nmであることを示す。
【０２０３】
8. 細胞およびインビボテスト
8.1 細胞生存率アッセイ
EN、酵素ナノ複合体混合物、および遊離酵素混合物の解毒能力を、細胞生存率アッセイによって決定した。この試験は、n(GOx-Cat)、n(GOx)、およびn(Cat)とn(GOx)との混合物を例として採用する。ナノ粒子へ曝露する前に、HeLa細胞を96ウェルプレートに播種し（1ウェルあたり104個の細胞、1ウェルあたり100μL）、1日にわたってDMEM（培地中のグルコースは正常レベル）中で培養した。次に、n(GOx)、n(GOx)とn(Cat)との混合物、ならびにn(GOx-Cat)の同じ量（0.7mg/mL、2μL）をウェルに加え、37℃で5時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、CellTiter-Blue（20μL）を、各々のウェルに加え、さらに3時間にわたってインキュベートした。次にプレートを振盪台に置き、5分間、150rpmで溶液を徹底的に混合した。生存細胞はCellTiter Blueを還元し、蛍光性の赤みを帯びた色を示す。細胞生存率の定量化は、プレートリーダー（Ex＝535nm、Em＝585nm）を用いて蛍光強度を測定することによって達成した。
【０２０４】
8.2 マウスにおけるn(GOx-Cat)の解毒能力の分析
雄性マウス（C57B6）（8〜10週齢）の背中上の毛を、動物用シェーバーにより除去した。n(GOx-Cat)、n(GOx)、またはn(Cat)を、皮下注射で、0、24時間の2回、注射当たり35μgの酵素（PBS緩衝液 50μl中）をマウスの皮内に送達した。等体積の過酸化水素（H2O2）溶液（3％w/v）およびPBS緩衝液を、同じ動物の背中上の異なるスポットに、陽性および陰性対象として注射した。
【０２０５】
皮膚損傷は直接観察し、カメラを用いて記録した。皮膚組織を、最初の注射の48時間後に切片にした。組織損傷を調べるために、以前に記載された通りに（2）、H&E染色のために組織を加工した。蛍光TUNEL染色はまた、Rocheのin-situ Cell Death Detection Kitを用いて行い、皮膚組織におけるアポトーシス性細胞死を決定した。
【０２０６】
8.3 n(AOx-Cat)の細胞毒性
天然AOx、n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)とn(Cat)との混合物を対照として使用し、上述と同様の生存アッセイによってn(AOx-Cat)の毒性を評価した。ナノカプセルへ曝露する前日に、HeLa細胞（1ウェルあたり104個の細胞、1ウェルあたり100μL）を96ウェルプレートに播種した。まずナノカプセルまたは天然AOx（2μg）を、4時間にわたって細胞と共にインキュベートし、混合物から除去し、新鮮培地を用いてインキュベートした。等量のエタノール（3μL）を各々のウェルに加え、さらに37℃で5時間にわたって細胞と共にインキュベートした。インキュベーション後、CellTiter Blue（20μL）を各ウェルに加え、3時間インキュベートした。次にプレートを振盪台に置き、5分間、150rpmで溶液を徹底的に混合した。細胞生存率は、プレートリーダー（Ex＝535nm、Em＝585nm）を用いてそれらの蛍光強度を測定することによって定量化した。
【０２０７】
8.4 アルコール解毒剤および肝毒性のインビボ試験
アルコール解毒剤のインビボ試験を、エタノール（EtOH）および酵素ベースのアルコール解毒剤を用いた処置後のマウスの血液アルコール濃度（BAC）の変動と血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）のレベルとをモニターすることによって達成した。アルコール解毒剤の投与を、経口的および全身的の両方で実施した。全身投与については、ナノカプセルの4つの群、n(AOx)、n(Cat)、n(AOx)とn(Cat)との混合物、およびn(AOx-Cat)を使用し、ならびに、（ナノカプセル化していない）天然AOxを比較のために使用した。Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から入手した8〜10週齢の雄性C57B6マウスを、試験のために使用した。
【０２０８】
マウスは、8〜12時間にわたって絶食させた後、ナノカプセル（動物1匹あたり65μg）を尾静脈注射した。続いて、この注射の1時間後に、体重1kgあたり6gのEtOH（w/w）での用量のアルコール流動食（AIN76A, Dyets, Inc.）または等カロリーの対照でマウスを強制飼養した。
【０２０９】
マウスのBACおよびALTを、経口的に投与されたマウスと同じ方法を用いて決定した（詳細な方法は、実施例1に記載）。全ての動物を、地域委員会によって承認された、実験動物の管理と使用に関する指針に従って処置した。図9に示す通り、n(AOx-Cat)を用いて注射されたマウスにおけるBACおよびALTは劇的に低下したが、それは、経口投与で得られた結果と一致している。
【０２１０】
実施例3：カスケード酵素反応の加速のためのマルチコア酵素ナノカプセル（MCEN）
代謝は、地球上の全ての生存中の生物について生活を維持するために起こり、数百万の酵素カスケード化学反応が関与する。これらの複雑なプロセスは、生物が成長し、再生し、それらの構造を維持し、環境に対応することを可能にしており、そこにおいて酵素は専ら細胞内空間および空間的位置中に拘束される。代謝経路において絶妙な触媒特異性および効率を示す酵素の大半が、十分に特徴づけられ探索されてきたが、穏やかな条件下での複数の酵素カスケード反応を介する生体内変換を成功させることは依然として稀であり、従って、化学、生物学、材料、および化学工学における科学者にとって、非常に魅力的である。しかしながら、複数の酵素を、それらの相乗効果を注意深く考慮することなく、伝統的な固定化を通じて、あるいは全遺伝子クラスタークローニングによって一緒に発現させることを通じて雑に混合する場合、活性および安定性における大幅な低下が未解決の障害である。ヒントは、細胞シグナルアンカー、区画化されたポリマーソーム、メソポーラスナノ構造中での同時固定化を通じた細胞内配置などのケースが示す通り、幾何学的に関連のある近傍にあること、専用の旋回制御、正確な比率での固定、および安定化が、成功への重要な原則であることを証明した。しかし、既存の多酵素系の設計は全て、均質性と品質管理を欠き、医薬、マイクロチップ、小さな電極、およびロボットとして、依然として未発達かつ非現実的なままである。本発明者らは、寿命を十分に延長しながらも、ナノ空間にいくつかの異なる酵素を拘束しかつ対面させてドッキングすることによって単一タンパク質レベルで制御すると、多段階反応の代謝回転速度が劇的に増加するのではないかという仮説を立てた。
【０２１１】
本明細書において、本発明者らは、単一の小さなポリマーナノカプセル中に複数の触媒酵素を組み込むことにより作製した、高活性マルチコア酵素ナノカプセル（MCEN）を提示した（図1に示すスキーム1）。最初に、4つの予め設計された短いDNA配列を混合することによって阻害剤DNA足場を直接的に作製する。この内、3つの短いDNAは、それぞれ3つの酵素阻害剤（スクロース、グルコサミン、および4−ジメチルアミノアンチピリン）と正確に結合している（スキーム1D）。次に、インベルターゼ、グルコースオキシダーゼ（GOx）、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）（スキーム1A、1B、1C）をそれらの対応する阻害剤DNA足場とインキュベートすることにより、「キーロック」自己集合を通じて、酵素−阻害剤複合体が形成される。穏やかなインサイチュ重合を通じて酵素−阻害剤複合体上に非常に薄いポリマーネットワークをコーティングし、マルチコア酵素ナノカプセル（MCEN）を構築した（スキーム1（II））。最後に、酵素3種のナノカプセルを、阻害剤DNA足場を除去することによって得る（スキーム1（III））。MCENにおけるポリマーコーティングは、カプセル化酵素のための人工の膜としての役割を果たす。そのような人工膜は、従って、適切な力学的係数を示して構造的完全性を提供し、迅速な基質輸送を可能にする効果的な輸送経路を持ち、かつ基質選択性を提供するための特定の官能性を含むべきである。しかしながらデュアルまたはマルチコア構造のナノカプセルを作るための本発明者らのアプローチは、コアタンパク質間の反応中間体の迅速な輸送を可能とし、このことは、カスケード反応のために特に興味深い。
【０２１２】
ネガティブ染色されたTEM画像（図10a）は、HRP−GOxデュアルコアナノカプセルの大半が、約30nmで丸く、内部に2つの暗い点を有することを示した。HRPおよびGOxの両方が、単一の金ナノ粒子を用いてそれぞれ標識されているため、本発明者らは、ナノカプセルの大半が、内部にHRPおよびGOxの1セットのみを有していると推測することができる。蛍光スペクトル（図10b）および蛍光共焦点顕微鏡（図10c）を使用して、ナノカプセル中の、ローダミンB標識HRPとFITC標識GOxとの、2つの酵素間の空間的距離を反映するFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）効果を研究した。蛍光スペクトル上、450nmでの青色光により励起された、520nmでのFITC発光ピークだけがあり（図10b）、HRP上のローダミンBとGOx上のFITCとの間にFRET効果がないことを示す。逆に、デュアルコア酵素ナノカプセル溶液の蛍光スペクトル上には、450nmでの青色光だけによって励起された2つの蛍光発光ピーク（FITCについての520nmおよびローダミンBについての585nm）があり、FITCからローダミンBへのエネルギー移動があることを示す。FRET効果は非常に短い距離（10nm未満）でのみ起こるため、本発明者らは、HRPおよびGOxが1つのナノカプセル中に詰め込まれていると結論づける。共焦点顕微鏡法を通じたデュアルコア酵素ナノカプセルでは、蛍光スペクトルから得られるものと同様の結論が確認され、450nmで励起さた黄色を示したが（図11c-iii）、それは、実際には、緑色（図11c-ｉ）および赤色（図11c-ii）により混合される。このように、これらの結果は、各々のデュアルコアナノカプセルが内部に単一のHRPおよび単一のGOxを有し、それらが互いに非常に近接していることを示唆した。
【０２１３】
本発明者らは、マルチコア酵素ナノカプセルと遊離酵素系との間で、活性および安定性を比較した。本明細書において、HRPおよびGOxはデュアルコア酵素ナノカプセル系におけるカスケード反応酵素として使用され、インベルターゼ、GOx、およびHRPはトリプルコア酵素ナノカプセル系において使用される酵素である。各々の系の代謝回転速度は、遊離酵素の組み合わせまたはマルチコア酵素ナノカプセルの存在において、種々の基質（酵素2種の系のためのグルコースおよび酵素3種の系のためのスクロース）によるODSの酸化速度を用いて決定される。遊離酵素系およびマルチコアナノカプセル中の酵素のモル濃度および比率の両方は全く同じである。水性緩衝溶液中で、デュアルコアおよびトリプルコア酵素ナノカプセルについての代謝回転速度の増大は遊離酵素系を上回り、それぞれ460％および1500％に達した（図11a）。粘性効果（異なる濃度のPEG3000により、マルチコア酵素ナノカプセルの代謝回転速度に関してシミュレート）も研究する。なぜなら、細胞質の大半が、高い粘性液体で満たされているためである。PEG3000含量が増加する場合、遊離多重酵素系およびマルチコアナノカプセルの代謝回転速度は、同時に減少する（図11b、図11c）しかし、遊離酵素2種の系と比較した、デュアルコア酵素ナノカプセルについての代謝回転速度は、活性アッセイを0％〜35％PEG緩衝液中で行う場合、4倍から34倍まで上昇する。酵素2種の系の場合と同様に、トリプルコア酵素ナノカプセル系（インベルターゼ、GOx、およびHRP）は、PEG濃度を0％から35％に変化させた場合、代謝回転速度において遊離酵素3種の系を上回る9倍〜24倍の増大を有する。デュアルコアおよびトリプルコア酵素ナノカプセルは、また、遊離酵素2種および遊離酵素3種の系と比較し、高い温度に対するはるかに高い安定性を提示した。65℃で60分間にわたりインキュベートした後、デュアルコアおよびトリプルコアナノカプセルの残留活性は、それぞれ70％および75％である。同じ条件で、遊離酵素2種および遊離酵素3種の系の残存活性は、2％未満である。
【０２１４】
ウリカーゼは、痛風治療のための高度に潜在力のある酵素薬物であり、酸素を使用し転記尿酸を酸化し、ウリケートおよび過酸化水素を生成することができる。従って、ウリカーゼについての主な制約は、低酸素領域または深部組織での尿酸の低クリアランス効率および心臓に脅威を与える産物である過酸化水素である。これらの問題に対処するために、本発明者らは、高度に効率的で安全な痛風治療薬物候補としてウリカーゼおよびカタラーゼデュアルコアナノカプセルを構築する。ウリカーゼのみの場合と比較し、ウリカーゼおよびカタラーゼのデュアルコアナノカプセルは、尿酸分解において400％の増強を達成する（図12c）。MTTアッセイは、ウリカーゼが、細胞生存率の75％を上回る低下に導き、デュアルコアナノカプセルが、細胞培養培地からの尿酸の除去に起因して細胞生存率を120％まで上昇させることを示した（図12d）。デュアルコアナノカプセルは、37℃で90分間にわたるトリプシンを用いたインキュベーション後であっても75％を上回る残存活性を有すが、天然ウリカーゼの活性は、トリプシンを用いた20分間のインキュベーション後、1％未満である（図12e）。光学顕微鏡画像は、ＨｅＬa細胞（図12a）を、37℃で2.5時間にわたり、尿酸結晶の存在下で、ウリカーゼをなしに（図12（a）（i））、ウリカーゼのみを伴い（図12（a）（ii））、ウリカーゼおよびカタラーゼを伴い（図12（a）（iii））、ウリカーゼとカタラーゼのデュアルコアナノカプセルを伴い（図12（a）（iv））、インキュベートしたことを表した。ウリカーゼ単独では、尿酸結晶を分解することができたが細胞死が導かれ、これは細胞形態の丸まりおよび縮小により示される。ウリカーゼとカタラーゼがない系と比較し、ウリカーゼとカタラーゼのデュアルコアナノカプセルは、細胞生存率に対するいかなる負の効果も伴わず、細胞培養ウェル中の尿酸結晶の完全なクリアランスをもたらした。これらの研究全ては、ウリカーゼとカタラーゼのデュアルコアナノカプセルが、高度に潜在力のある、効率的で安全な痛風治療薬物候補であることを証明した。
【０２１５】
本発明者らは、有意に増強された活性および安定性を伴って1つのナノカプセル中に多酵素を被包するための革命的に新たな方法を実証した。DNA性の足場を使用した正確なマルチコア構造ナノカプセルは、反応中間体のコア酵素間での迅速な輸送を可能にし、これはカスケード反応を加速するためには特に重要である。さらに、コア酵素の適切な選択は、広範囲のカスケード反応を用いたナノカプセルの合成を可能にする。より一般的には、本試験は、酵素触媒の素晴らしい力を、広範囲の非生理学的な適用に向けて抽出することを可能にするであろう。
【０２１６】
マルチコア酵素ナノカプセル（MCEN）のスキーム。I：3つの酵素（酵素A-インベルターゼ；酵素B-グルコースオキシダーゼ；酵素C-セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、およびそれに対応する阻害剤DNA足場（阻害剤a-スクロース；阻害剤b-グルコサミン；阻害剤c-4-ジメチルアミノアンチピリン）の自己集合、II：インサイチュ重合を通じたマルチコア酵素ナノカプセル（MCEN）の形成、III：マルチコア酵素ナノゲルからの阻害剤DNA足場の除去。
【０２１７】
本発明が、上の態様と併せて記載されていること、および、先行する記載および実施例が、本発明の範囲を例示し、限定しないことを意図することを理解すべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明が関係する当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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