(57)【要約】  本発明は、アミノ酸で安定化されエタネルセプトの長期的な貯蔵に適した安定化された水性エタネルセプト医薬組成物、これらの組成物の製造方法、投与方法およびこれを内包するキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタネルセプトならびにエタネルセプトの不安定性、凝集、ミスフォールディングおよび／またはフラグメント化を阻止するための安定剤を含む水性医薬組成物であって、前記安定剤がセリン、プロリンおよびグルタメートからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸化合物を含む、水性医薬組成物。
【請求項２】
緩衝液、等張性調整剤および賦形剤から選択される、１つ以上の追加的な成分を更に含む、請求項１に記載の水性医薬組成物。
【請求項３】
安定剤がグルタメートであり、製剤がアルギニンを含まないかまたは本質的に含んでおらず、製剤が、
約９０％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３含量のＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項４】
安定剤が、グルタメートであり、製剤が、約２５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌまでのエタネルセプト、最大約１５０ｍＭのグルタメート、約６重量％未満のスクロース、場合によって最大約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウムを含む、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物であって、前記エタネルセプト組成物が約６．０から６．６までのｐＨを有し、場合によって、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、エタネルセプト組成物。
【請求項５】
約９０重量％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３のＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項４に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項６】
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在するならば、ピーク３により表される組成物の量が約３重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項７】
Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で約１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項８】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１５０ｍＭ未満のグルタメート、約０％から３％までのスクロース、約１ｍＭから３０ｍＭまでのホスフェート緩衝剤、場合によって最大約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、約６．０から６．６までのｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項９】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００ｍＭから約１２０ｍＭまでのグルタメート、約４重量％未満のスクロースおよび約１０ｍＭから３０ｍＭまでのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項１０】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００ｍＭのグルタメート、約２重量％未満のスクロース、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１０〜３０ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項１１】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約５０ｍＭのグルタメート、約２重量％未満のスクロース、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１０〜３０ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項１２】
安定剤がセリンであり、製剤がアルギニンを含まないかまたは本質的に含んでおらず、製剤が、
約９０％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３含量のＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項１３】
安定剤がセリンであり、製剤が、最大約１５０ｍＭのセリン、約０．５重量％から約３重量％までのスクロース、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウムを含み、エタネルセプト組成物が約６．０から６．６までのｐＨを有し、場合によって、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項１４】
（ａ）約９０重量％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３のＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
（ｂ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析；および
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項１３に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１５】
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在するならば、ピーク３により表される組成物の量が約３重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項１４に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１６】
Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で約１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、請求項１４に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１７】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００ｍＭから１２０ｍＭまでのセリン、約４重量％未満のスクロースおよび約１０ｍＭから３０ｍＭまでのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する、請求項１４に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１８】
安定剤がプロリンであり、組成物がアルギニンを含んでいないかまたは本質的に含んでおらず、組成物が、
約９０％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３含量のＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項１９】
最大約１５０ｍＭのプロリンを含み、約０．５重量％から約３重量％までのスクロース、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウム、約１５ｍＭから約１００ｍＭまでのＮａＣｌを更に含み、エタネルセプト組成物が約６．０から６．６までのｐＨを有し、場合によって、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、請求項１８に記載のプロリンにより安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項２０】
約９０重量％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３の、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項１９に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２１】
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在するならば、ピーク３により表される組成物の量が約３重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２０に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２２】
Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で約１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、請求項２０に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２３】
約５０ｍＭのプロリン、約４重量％未満のスクロース、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約１０〜３０ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する、請求項２０に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２４】
アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、請求項１に記載の組成物であって、Ｍ３またはＴ２またはＴ４における組成物が、下記の基準：
（Ａ）（ｉ）組成物中の凝集体、モノマーおよびフラグメント３の量のＳＥＣ分析ならびに（ｉｉ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１、ピーク２およびピーク３に対応する組成物中の材料の量のＨＩＣ分析により測定される、エンブレル（登録商標）の商標で販売されている市販のエタネルセプトと同等またはより良好な安定性、ならびに、
（Ｂ）（ｉ）ピーク３が存在しないかまたは本質的に存在せず、（ｉｉ）ピーク２が約９５重量％超の組成物を表すＨＩＣクロマトグラム、凝集体に対応するピークを本質的に含まないＳＥＣクロマトグラム、およびモノマー含量が少なくとも約９５重量％の組成物を表すＳＥＣクロマトグラム
の片方または両方を満たしている長期的な貯蔵安定性を示す、エタネルセプト組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタネルセプトの長期的な貯蔵のためにアミノ酸によって安定化された水性医薬組成物、この組成物の製造方法、これらの投与方法およびこれを内包するキットに関する。本発明は、安定化のためにアルギニンを必要としないエタネルセプト製剤を含む。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、しばしば、これらの使用前に貯蔵しておかなければならない。長期間貯蔵された場合、ポリペプチドは、溶液中では大抵不安定である（Ｍａｎｎｉｎｇら、１９８９年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：９０３−９１８）。これらの貯蔵寿命を延長するために、乾燥、例えば凍結乾燥等、追加的な加工ステップが開発されてきた。しかしながら、凍結乾燥された医薬組成物は、使用に不都合である。
【０００３】
ポリペプチド安定性を改善するための典型的な行為は、製剤に用いる要素の濃度を変更することにより実行でき、または賦形剤を加えて製剤を改質することにより実行できる（例えば、米国特許第５，５８０，８５６号および第６，１７１，５８６号を参照されたい。）。しかしながら、添加剤の使用は依然として、不活性ポリペプチドを生じさせ得る。更に、凍結乾燥の場合、再水和ステップは、例えば凝集または変性によりポリペプチドの不活性化を生じさせ得る（Ｈｏｒａら、１９９２年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、９：３３−３６；Ｌｉｕら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、３７：１７７−１８４）。ポリペプチドの凝集は免疫原性を生じさせ得るため、望ましくない（Ｃｌｅｌａｎｄら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、１０：３０７−３７７；およびＲｏｂｂｉｎｓら、１９８７年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３６：８３８−８４５）。
【０００４】
ポリペプチド安定性を改善するための別の方法は、特定の濃度でＬ−アルギニンを使用することである（米国特許第７，６４８，７０２号）。
【０００５】
使用前に最大２年間貯蔵されるポリペプチドの１つがエタネルセプト（エンブレル（登録商標）、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結した７５キロダルトン（ｐ７５）のヒト腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体型融合ポリペプチドである。エタネルセプトは、９３４個のアミノ酸からなり、大体１５０キロダルトンという見かけの分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、２００２年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．）。エタネルセプトのＦｃ成分は、定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインおよびヒンジ領域を内包するが、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは内包しない。Ｆｃドメインは、上述したドメインの１つまたはすべてを内包し得る。エタネルセプトは、通常は組換えＤＮＡ技術により、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の哺乳類細胞発現系中で産生される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５８０，８５６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１７１，５８６号明細書
【特許文献３】米国特許第７，６４８，７０２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｎｎｉｎｇら、１９８９年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：９０３−９１８
【非特許文献２】Ｈｏｒａら、１９９２年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、９：３３−３６
【非特許文献３】Ｌｉｕら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、３７：１７７−１８４
【非特許文献４】Ｃｌｅｌａｎｄら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、１０：３０７−３７７
【非特許文献５】Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９８７年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３６：８３８−８４５
【非特許文献６】Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、２００２年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、その長期的な貯蔵を可能にする、エタネルセプトの新規で安定な液体製剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、エタネルセプトならびにエタネルセプトの不安定性、凝集、ミスフォールディングおよび／またはフラグメント化を阻止するための安定剤を含む水性医薬組成物であって、安定剤がセリン、プロリンおよびグルタメートからなる群より選択されるアミノ酸化合物を含む、組成物である。
【００１０】
下記の論述で使用されている様々な専門用語は後で、「定義」という題名の部分および本明細書の残り部分の至る所において規定されている。
【００１１】
本発明の安定化されたエタネルセプト製剤は、（１）約９０％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３含量の、Ｍ３またはＴ２またはＴ４（本明細書で規定された）におけるＳＥＣ分析、ならびに、（２）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す。
【００１２】
関連する一態様において、プロリン、セリンまたはグルタメートを含有する製剤は、（１）約９０重量％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３の、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、（２）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す。
【００１３】
安定化された製剤の好ましい態様において、製剤は、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在するならば、ピーク３により表される組成物の量が約１重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す。
【００１４】
上記で要約した安定化されたエタネルセプト製剤は、場合によって好ましくは、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない。
【００１５】
本発明の製剤は、貯蔵の１ヶ月後、２ヶ月後または３ヶ月後に５℃で実施される、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）およびＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）分析により測定される、優れた安定性を有する。これらの製剤は、アルギニンが必須成分である市販のエタネルセプトの製剤と同等でありまたはより良好である。したがって、本発明は、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、セリン、プロリンまたはグルタメートによって安定化されたエタネルセプトの製剤であって、Ｍ３またはＴ２またはＴ４における組成物が、下記の基準の片方または両方を満たしている長期的な貯蔵安定性を示す、エタネルセプトの製剤を更に対象としている：
（Ａ）（ｉ）（本明細書中で規定された）組成物中の凝集体、モノマーおよびフラグメント３の量のＳＥＣ分析ならびに（ｉｉ）（本明細書中で規定された）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１、ピーク２およびピーク３に対応する組成物中の材料の量のＨＩＣ分析により測定される、エンブレル（登録商標）の商標で販売されている市販のエタネルセプトと同等またはより良好な安定性、ならびに、
（Ｂ）（ｉ）ピーク３が存在しないかまたは本質的に存在せず、（ｉｉ）ピーク２が組成物の約９５重量％超を表すＨＩＣクロマトグラム、凝集体に対応するピークを本質的に含まないＳＥＣクロマトグラム、およびモノマー含量が組成物の少なくとも約９５重量％を表すＳＥＣクロマトグラム。
【００１６】
安定剤がグルタメートである本発明の一実施形態において、安定化された製剤は、約２５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌまでのエタネルセプト、最大約１５０ｍＭのグルタメート、約６重量％未満のスクロース、場合によって最大約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウムを含み、ここで、前記組成物が約６．０から６．６までのｐＨを有し、場合によって好ましくは、組成物がアルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない。
【００１７】
グルタメートにより安定化された製剤の更なる一実施形態は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１５０ｍＭ未満のグルタメート、約０％から３％までのスクロース、約１ｍＭから３０ｍＭまでのホスフェート緩衝剤、場合によって最大約１００ｍＭのＮａＣＬを含み、約６．０から６．６までのｐＨを有する。
【００１８】
更なるグルタメートにより安定化された製剤は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００ｍＭから約１２０ｍＭまでのグルタメート、約４重量％未満のスクロースおよび約１０〜３０の、好ましくは約２５ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する。
【００１９】
更なるグルタメートにより安定化された製剤は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００ｍＭのグルタメート、約２重量％未満のスクロース、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１０−３０の、好ましくは約２５ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する。
【００２０】
更に別の本発明のグルタメートにより安定化された組成物は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約５０ｍＭのグルタメート、約２重量％未満のスクロース、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１０−３０の、好ましくは約２５ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する。
【００２１】
安定剤がセリンである更なる一実施形態において、安定化されたエタネルセプト組成物が、最大約１５０ｍＭのセリン、約０．５重量％から約３重量％までのスクロース、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウムを含み、ここで、組成物が約６．０から６．６までのｐＨを有し、場合によって、および好ましくは、組成物がアルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない。
【００２２】
セリンにより安定化されたエタネルセプト組成物の更なる一実施形態は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００〜１２０ｍＭのセリン、約１重量％のスクロースおよび約１０〜３０の、好ましくは約２５ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する。
【００２３】
安定剤がプロリンである更なる一実施形態において、プロリンにより安定化されたエタネルセプト組成物は、最大約１５０ｍＭのプロリン、約０．５重量％から約３重量％までのスクロース、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウム、約１５ｍＭから約１００ｍＭまでのＮａＣｌを含み、ここで、組成物が約６．０から６．６までのｐＨを有し、場合によって好ましくは、組成物がアルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない。
【００２４】
本発明のプロリンにより安定化されたエタネルセプト組成物の更なる一実施形態は、約５０ｍＭのプロリン、約４重量％未満のスクロース、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約１０−３０の、好ましくは約２５ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から６．５までのｐＨを有する。
【００２５】
本発明のエタネルセプト組成物は、許容されるレベルのサブビジブル粒子を含有する製剤を提供する能力を更に与える。したがって、本発明は、Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で約１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、セリン、プロリンまたはグルタメートにより安定化されたエタネルセプト製剤を更に対象としている。サブビジブル粒子は、ＦｌｏｗＣａｍ分析を用いた公知の方法により測定することができる。
【００２６】
本発明の安定化されたエタネルセプト組成物は、（ａ）約９０重量％超のモノマー含量および約３重量％未満の凝集体含量の、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析ならびに（ｂ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析により更に特徴付けられる。
【００２７】
製剤の安定性は、組成物の量が、ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約１％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約３重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を示すことで、更に特徴付けられ得る。
【００２８】
安定剤はグルタメートである更なる一実施形態において、エタネルセプト製剤の安定性が、約９７重量％超のモノマー含量および約１重量％未満の凝集体含量の、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、およびＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約８２重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約１５重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴付けられ得る。これらの特性は、アルギニンを安定剤として必要とすることなく、達成することができる。
【００２９】
安定剤がセリンである更なる一実施形態において、安定化されたエタネルセプト製剤が、約９７重量％超のモノマー含量および約１重量％未満の凝集体含量の、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約４重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約８２重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約１５重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする。これらの特性は、アルギニンを安定剤として必要とすることなく、達成することができる。
【００３０】
好ましい本発明の安定化された組成物は、ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約２％未満であり、好ましくは約１％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％超であり、好ましくは約９７％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約１重量％未満であり、好ましくは０％から１％までである、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を示す。これらの特性は、アルギニンを安定剤として必要とすることなく、達成することができる。
【００３１】
アルギニン含有製剤にして提供される市販のエタネルセプトと差異化されているように、本発明者らは、本明細書中で説明および例示したエタネルセプトの製剤の実施形態が、長期的な安定化のためにアルギニンを必要とせず、しかし、所望ならばアルギニンを依然として加えてもよいという点が、米国特許第７，６４８，７０２号に照らして驚異的であることを見出した。アルギニンを用いないで安定化されたエタネルセプト製剤を提供する能力は、安定化のためにアルギニンを必要とする現行の市販エタネルセプト製剤（すなわち、エンブレル（登録商標））に比較してより低いコストで入手可能になり得る貯蔵安定なエタネルセプトの代替製剤を患者および医療供給者に提供することにより、医療制度に関した潜在的に顕著な利益を意味している。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、「不安定」という用語または同様の用語は、望ましくない種々の転換を貯蔵中に受けてしまうという、エタネルセプトモノマーの傾向を表す。このような転換は、本質的に無傷のエタネルセプトモノマーの複数のコピーが種々の非共有結合式吸引（例えば、静電気的相互作用）を介して相互に不可逆的に会合することになる、オリゴマーおよび高分子量凝集体（以降は「凝集体」という用語）の形成を含む。貯蔵中の望ましくない転換はまた、より小さなフラグメントおよび／または短縮化された種へのエタネルセプトモノマーの分解も含み得る。理想的には、エタネルセプトの製剤は、貯蔵中にエタネルセプトの凝集体、ミスフォールドされた蛋白質、オリゴマーおよび／またはフラグメントの形成を起こすという製剤の傾向を、可能な上限まで最小化すべきである。望ましくない凝集体またはフラグメントの形成を低減する能力から生じる重要な利益は、薬物の潜在的な毒性および／または免疫原性の低減である。
【００３３】
本発明のエタネルセプト製剤は、場合によって好ましくはアルギニンを含んでいないかまたは本質的に含んでいない。「アルギニンを本質的に含んでいない」という用語は、アルギニンが、たとえ存在していたとしても製剤中のエタネルセプトモノマーの安定化に、安定化の観点から当業者がその存在を有益または必要だと判断するほどには寄与していないことを意味するように意図されている。
【００３４】
これらの態様およびその他の態様は、下記の説明から明確になるが、これらにおける変更および修正は、本開示の新規な構想の趣旨および範囲から逸脱することなく影響され得る。
【００３５】
前述の概略的な説明と下記の詳細な説明は両方とも、主張されているように、例示的および説明的なものにすぎず、本発明の制限的なものではないと理解すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の様々な実施形態が、ここで詳細に説明される。本明細書の中および請求項の全体で使用されるとき、「一」、「１つ」および「この」の意味は、特に逆の記載がない限り、複数形への言及を含む。また、本明細書中で使用されるときおよび請求項を通して使用されるとき、「中の」の意味は、特に逆の記載がない限り、「中の」および「上の」を含む。更に、本明細書中で使用されている幾つかの用語は、以下でより具体的に規定されている。
【００３７】
定義
本明細書中で使用されている用語は一般に、本発明に関する文脈内および各用語が使用されている特定の文脈中において、当分野におけるこれらの通常の意味を有する。本発明を説明するために使用されている特定の用語は、本発明の説明に関する実務者に追加的な手引きを提供するために後述されており、または本明細書中の別の場所で説明されている。特定の用語に関する同義語が、提供されている。１つ以上の同義語についての詳述は、その他の同義語の使用を排除しない。本明細書中で論述した任意の用語の例を含めて、本明細書中のどこであっても例の使用は説明的なものにすぎず、本発明または例示された任意の用語の範囲および意味を決して限定しない。本発明は、本明細書中で与えられた様々な実施形態に限定されはしない。
【００３８】
逆の規定がない限り、本明細書中で使用されたすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野における通常の技術の１つにより一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾している場合、定義を含めて本文書が規制する。
【００３９】
「およそ」、「約」または「大体」は一般に、所与の値または範囲の２０％以内、１０％以内、５、４、３、２または１％以内を意味するものとする。与えられている数量は大体のものであり、「およそ」、「約」または「大体」という用語が、特に記載がなければ推定できることを意味する。
【００４０】
「エタネルセプト」または「エタネルセプトモノマー」または「モノマー」という用語は、エンブレル（登録商標）と同義である。これは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結した７５キロダルトン（ｐ７５）のヒト腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体型融合ポリペプチドである、ポリペプチドを指す。これは、９３４個のアミノ酸からなり、大体１５０キロダルトンという見かけの分子量を有する。本出願の目的に関しては、「エタネルセプト」という用語はまた、エタネルセプトの機能、効力またはアビディティに顕著に影響しないアミノ酸構造の小さな改質（アミノ酸の欠失、付加および／または置換を含める）を有するエタネルセプトも包摂する。「エタネルセプト」という用語は、エンブレル（登録商標）のすべての形態および製剤を包摂しており、限定されはしないが濃縮製剤、既成注射製剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、水、アルコールおよび／またはその他の成分によって戻される製剤等が挙げられる。
【００４１】
本明細書中で使用されるときの「モノマー」という用語は、上記で言及した二量体型エタネルセプト融合蛋白質を意味するように意図されている。
【００４２】
「セリン」という用語は、コドンがＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵおよびＡＧＣであるアミノ酸を指す。
【００４３】
「プロリン」という用語は、コドンがＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧであるα−アミノ酸を指す。
【００４４】
「グルタメート」という用語は、α−アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）の脱プロトン化された形態または塩を指す。本出願の目的に関して、「グルタメート」という用語はまた、グルタミン酸自体も包摂する。
【００４５】
「糖」という用語は、単糖、二糖および多糖を指す。糖の例には、限定されないがスクロース、トレハロース、デキストロース等が挙げられる。
【００４６】
「ポリオール」という用語は、複数のヒドロキシル基を内包するアルコールを指す。ポリオールの例には、限定されはしないがマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。
【００４７】
「長期的な貯蔵」という用語は、医薬組成物が３ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、好ましくは１年間以上の間貯蔵され得ることを意味すると理解されている。長期的な貯蔵はまた、医薬組成物が、２〜８℃の液体として貯蔵されること、または、例えば−２０℃において冷凍されることもしくはより冷たくして冷凍されることを意味するとも理解されている。組成物が１回以上冷凍および融解され得ることもまた、予期されている。
【００４８】
長期的な貯蔵に関する「安定な」または「安定化された」という用語は、医薬組成物中に含有されたエタネルセプトが、貯蔵の開始における組成物の活性に対するその活性の２０％超、またはより好ましくは１５％超、または更により好ましくは１０％超、最も好ましくは５％超を喪失しないことを意味すると理解されている。
【００４９】
「哺乳類」という用語は、限定されないがヒトを含める。
【００５０】
「医薬として許容される担体」という用語は、無毒性で固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤助剤、または、任意の慣例的な種類の賦形剤を指す。医薬として許容される担体は、採用された投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、製剤のその他の成分と適合性である。
【００５１】
「組成物」という用語は、当分野において慣例的であり治療目的、診断目的または予防目的での対象内への投与に適した、医薬として許容される担体または賦形剤等の担体を通常は含有する混合物を指す。組成物は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞中または培養媒体中に存在する、細胞培養物を含み得る。例えば、経口投与用の組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、口腔用リンス液または散剤を形成し得る。
【００５２】
「医薬組成物」および「製剤」という用語は、互換可能に使用される。
【００５３】
「処置」という用語は、哺乳類における疾患用の治療薬の任意の投与または施用を指し、例えば、退縮を起こすことまたは喪失した、欠如したもしくは欠損した機能を回復もしくは修復することまたは非効率的なプロセスを刺激することにより疾患を阻害すること、その進行を停止させること、疾患を軽減することを含める。この用語は、所望される薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを含み、哺乳類における病理学的な状態または障害のあらゆる処置を包含する。上記効果は、障害もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防する観点から予防的であり得、ならびに／または、障害および／もしくは障害に起因し得る悪影響に対する部分的または完全な治癒の観点から治療的であり得る。上記効果は、（１）障害にかかりやすくなっている恐れがあるが症候性にはまだなっていない対象内で、障害が発生または再発するのを予防すること、（２）障害を阻害すること、例えばその進行を停止させること、（３）例えば、喪失した、欠如したもしくは欠損した機能を回復もしくは修復することまたは非効率的なプロセスを刺激することにより障害またはその症状の退縮を起こすこと等、障害または少なくともその付随症状を停止または終結させ、その結果、宿主が障害またはその症状にもはや苦しまなくすること、または（４）障害またはそれに伴う症状を軽減すること、緩和することまたは改善することを含み、ここで、改善することは、炎症、疼痛および／または腫瘍サイズ等のパラメータの規模の低減を少なくとも指すために広義の意味で使用される。
【００５４】
「疾患」という用語は、医療介入を必要とするまたは医療介入が望ましくなる任意の状態、感染、障害または症候群を指す。このような医療介入は、処置、診断および／または予防を含み得る。
【００５５】
「治療的有効量」という用語は、生きた対象に投与された場合、生きた対象に所望の効果をもたらす量を指す。例えば、生きた対象への投与に関する本発明のポリペプチドの有効量は、インテグリンαｖβ３介在疾患を予防および／または処置する量である。正確な量は処置の目的に依存し、当業者ならば公知の技術を用いて確認することができる。当分野で公知なように、局所的送達に対した全身的送達の調節、年齢、体重、全体的健康感、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用および状態の重症度が必要であり得、当業者ならば通例の実験により確認することができる。
【００５６】
「Ｔ１」という用語は、エタネルセプト製剤が約１週間４０℃で貯蔵された時点を指す。
【００５７】
「Ｔ２」という用語は、エタネルセプト製剤が約２週間４０℃で貯蔵された時点を指す。
【００５８】
「Ｔ４」という用語は、エタネルセプト製剤が約４週間４０℃で貯蔵された時点を指す。
【００５９】
「Ｍ３」という用語は３つの時点をまとめて指し、特に、５℃の貯蔵温度における約１ヶ月、約２ヶ月または約３ヶ月のいずれかの貯蔵の持続期間後にエタネルセプト製剤に関して観察された分析結果を指す。例えば、Ｍ３において実施された分析についての本明細書中での言及は、このような分析が、エタネルセプト製剤が約１ヶ月、約２ヶ月または約３ヶ月から選択される持続期間の間貯蔵された時点で行われることを意味すると理解すべきである。したがって、エタネルセプト製剤がＭ３における特定の分析値または測定値を示すという、本明細書中での要件は、次の貯蔵持続期間（５℃における大体１ヶ月、大体２ヶ月または大体３ヶ月の貯蔵）の少なくとも１つに対応する時点で必須値が観察されるならば満足される。
【００６０】
ＨＩＣクロマトグラフィー結果の論述に関して本明細書中で使用されたときの「ピーク１」、「ピーク２」および「ピーク３」という用語は、米国特許第７，２９４，４８１号で論述されたのと同じピーク１、ピーク２およびピーク３を指す。
【００６１】
本発明の実施形態
エタネルセプトの水性製剤および凍結乾燥製剤を含めるエタネルセプト（エンブレル（登録商標））を含有する医薬組成物が長期的に貯蔵された場合、エタネルセプトの活性は、凝集によるエタネルセプトモノマーの不安定および／またはフラグメントの形成を含める化学分解のため、喪失し得るまたは低下し得る。したがって、本発明は、エタネルセプトの安定で長期的な貯蔵を可能にし、その結果、エタネルセプトが液体状態または冷凍状態のいずれかでの貯蔵の間安定になる、エタネルセプトの水性製剤の幾つかの実施形態を提供する。提供される製剤には、限定されないが、アルギニンを含有せず再水和等の余分なステップを全く必要としない製剤が挙げられる。
【００６２】
これらの実施形態は、以下でより詳細に説明される。
【００６３】
エタネルセプト
本発明の組成物のすべては、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））を含む。本出願の背景技術の部分で説明したように、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結した７５キロダルトン（ｐ７５）のヒト腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体型融合ポリペプチドである。エタネルセプトは、９３４個のアミノ酸からなる。エタネルセプトのＦｃ成分は、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインおよびヒンジ領域を内包する。Ｆｃドメインは、上述したドメインの１つまたはすべてを内包し得る。
【００６４】
本医薬組成物中での貯蔵に適したエタネルセプトは、抗体の場合におけるハイブリドーマ等、エタネルセプトを発現する生きた宿主細胞により産生することができ、または、融合ポリペプチドまたは抗体の場合におけるポリペプチドを産生するように遺伝子操作された宿主細胞により産生することができる。細胞を遺伝子操作してポリペプチドを産生する方法は、当分野では周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ら、ｅｄｓ．（１９９０年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。このような方法は、ポリペプチドの発現をコードして可能にする核酸を、生きた宿主細胞中に導入することを含む。これらの宿主細胞は、培養物中で増殖された細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは動物細胞であり得る。細菌宿主細胞には、限定されはしないが、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適切なＥ．コリ株の例には、ＨＢ１０１、ＤＨ５．α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および、外来ＤＮＡを開裂することがない任意のＥ．コリ株が挙げられる。使用することができる真菌宿主細胞には、限定されはしないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞が挙げられる。使用可能な動物細胞系の幾つかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷ１３８である。新しい動物細胞系は、当業者に周知の方法を用いて（例えば、転換、ウイルス感染および／または淘汰により）確立され得る。場合によって、エタネルセプトは、宿主細胞により媒体中に分泌され得る。
【００６５】
発現したエタネルセプトの精製は、任意の標準法により実施することができる。エタネルセプトが細胞内に産生された場合、粒状残屑は、例えば遠心分離または限外濾過により除去される。エタネルセプトが媒体中に分泌された場合、このような発現系からの上清は、最初に、標準的なポリペプチド濃縮用フィルターを用いて濃縮することができる。プロテアーゼ阻害薬もまた、蛋白質分解を阻害するために加えられ得るし、抗生物質が、微生物の増殖を予防するために含まれ得る。
【００６６】
エタネルセプトは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィー、ならびに、限定されないがプロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴ（登録商標）によるクロマトグラフィー、アニオン交換またはカチオン交換樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿が挙げられる公知の精製技術または今後見出せるの精製技術の任意の組合せを用いて、精製することができる。
【００６７】
セリン、プロリンまたはグルタメートにより安定化されたエタネルセプト
本発明は、エタネルセプトならびにエタネルセプトの不安定性、凝集  ミスフォールディングおよび／またはフラグメント化を阻止するための安定剤を含む、安定な水性医薬組成物であって、安定剤がセリン、プロリンおよびグルタメートからなる群より選択される化合物を含む、組成物を提供する。好ましい一実施形態において、安定剤がグルタメートを含む。
【００６８】
本発明に関するいかなる特定の理論にも拘束されることは意図していないが、セリン、プロリンおよびグルタメートが配座安定剤として作用して、エタネルセプトの凝集傾向を低減すると考えられている。凝集の低減は、長期間、例えば２年間以上続くと考えられている。セリン、プロリンおよびグルタメートは、タンパク質の表面から排除されて正味の配座安定化をもたらすため、エタネルセプトを含有する水性医薬組成物を安定化することができると考えられている。セリン、プロリンおよび／またはグルタメートの安定化効果には、限定されはしないが、エタネルセプトモノマーの、このモノマーを含有する製剤中での凝集の低減という利益が挙げられる。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、精製されたエタネルセプトを安定剤と組み合わせることにより調製できる。更に、緩衝液、等張性調整剤および更なる賦形剤およびその他の一般的に使用される不活性成分が、必要に応じて加えられ得る。簡潔性のために、これらは、本明細書において後でより完全に論述される。当業者ならば、組成物中に含まれることになる様々な成分を組み合わせることは、任意の適切な順番で行うことができることを理解している。例えば、緩衝液は最初、中間または最後に加えることができ、等張性調整剤も最初、中間または最後に加えることができる。当業者ならば、これらの化学物質の幾つかは、特定の組合せにおいて不適合性であり得、したがって、同様の特性を有する相異なる化学物質により容易に置換されるが、適切な混合物中では適合性であることもまた理解している。
【００７０】
好ましい一実施形態において、提供される製剤中でのセリン、プロリンまたはグルタメートによる安定剤の濃度は、好ましくは最大約１５０ｍＭである。
【００７１】
セリン、プロリンおよびグルタメートは、販売業者から入手することができる。
【００７２】
安定剤がグルタメートを含む一実施形態において、本発明の製剤は、約２５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでのエタネルセプト、最大１５０ｍＭのグルタメート、約６重量％未満のスクロース、場合によって最大約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウムを含み得、ここで、製剤がｐＨ６．０から約ｐＨ７．０までを、より好ましくは約６．０から約６．６までを、最も好ましくは約６．３から約６．５までを有する。
【００７３】
安定剤がセリンを含む一実施形態において、本発明の製剤が、約２５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでのエタネルセプト、約１５０ｍＭ未満のセリン、約０．５重量％から約３重量％までのスクロース、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウムを含み得、ここで、製剤がｐＨ６．０から約ｐＨ７．０までの、より好ましくは約６．０から約６．６までの、最も好ましくは約６．３から約６．５までを有する。
【００７４】
安定剤がプロリンを含む一実施形態において、本発明の製剤は、約２５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでのエタネルセプト、約１５０ｍＭ未満のプロリン、約０．５重量％から約３重量％までのスクロース、約１ｍＭから約３０ｍＭまでのリン酸ナトリウム、約１５ｍＭから約１００ｍＭまでのＮａＣｌを含み得、ここで、製剤がｐＨ６．０から約ｐＨ７．０までの、より好ましくは約６．０から約６．６までの、最も好ましくは約６．３から約６．５までを有する。
【００７５】
セリン、プロリンまたはグルタメートを含む本発明によるエタネルセプト製剤は、好ましくは、約８０重量％から約９５重量％までのモノマー含量、約４重量％未満の凝集体含量および約８重量％未満のフラグメント３含量のＴ２におけるＳＥＣ分析を特徴とする。
【００７６】
安定化のためにセリン、プロリンまたはグルタメートを含有する本発明の特定の製剤において、製剤は、
（ａ）約９０重量％超、９１重量％超、９２重量％超、９３重量％超、９４重量％超、９５重量％超、９６重量％超または９７重量％超のモノマー含量および約３重量％未満、２重量％未満または１重量％未満の凝集体含量のＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
（ｂ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満、２重量％未満または１重量％であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超、８１重量％超、８２重量％超、８３重量％超、８４重量％超または８５重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満、１９重量％未満、１８重量％未満、１７重量％未満、１６重量％未満、１５重量％未満、１４重量％未満または１３重量％である、Ｔ２におけるＨＩＣ分析、ならびに、
（ｃ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満、２重量％未満または１重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超、８１重量％超、８２重量％超、８３重量％超、８４重量％超または８５重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満、１９重量％未満、１８重量％未満、１７重量％未満、１６重量％未満、１５重量％未満、１４重量％未満または１３重量％である、Ｔ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、安定性を示す。
【００７７】
「ＳＥＣ」、「Ｔ２」  「Ｔ４」  「Ｍ３」  「ＨＩＣ」  「モノマー含量」  「凝集体」および「フラグメント３」  「ピーク１」、「ピーク２」および「ピーク３」という用語は、以下の例において規定されている。
【００７８】
安定化のためにセリン、プロリンまたはグルタメートを含有する特に好ましい製剤は、好ましくは、ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約１％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％超であり、最も好ましくは約９９重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約３重量％未満である、Ｔ４またはＴ２におけるＨＩＣ分析を有することを特徴とする。
【００７９】
エタネルセプトの安定化のためにセリン、プロリンおよび／またはグルタメートを用いる更なる好ましい製剤は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１５０ｍＭ未満のセリン、プロリンまたはグルタメート、最も好ましくはグルタメート、約０％から３％までのスクロース、約１ｍＭから３０ｍＭまでのホスフェート緩衝剤を含み、約６．０から６．６までのｐＨを有し、約９７重量％超のモノマー含量および約１重量％未満の凝集体含量のＴ４におけるＳＥＣ分析、ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約８２重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約１５重量％未満である、Ｔ２におけるＨＩＣ分析、ならびに、ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約２重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約８４重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約１３重量％未満である、Ｔ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、安定化されたエタネルセプト組成物がセリン、プロリンまたはグルタメートによって安定化され、製剤がアルギニンを含まないかまたは本質的に含んでおらず、製剤が、
約９０％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３含量の、Ｍ３におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３におけるＨＩＣ分析
の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す。
【００８１】
好ましくは、本発明のセリン、プロリンまたはグルタメートにより安定化された組成物は、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が約９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在するならば、ピーク３により表される組成物の量が約１重量％以下である、Ｍ３におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す。
【００８２】
本発明の更なる一態様において、本発明のセリン、プロリンまたはグルタメートにより安定化された組成物は、
約９０重量％超のモノマー含量、約３重量％未満の凝集体含量および約５重量％未満のフラグメント３の、Ｍ３またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が約３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が約２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す。
【００８３】
更なる好ましいグルタメートにより安定化されたエタネルセプト製剤は、約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１２０ｍＭのグルタメート、約１％のスクロースおよび約２５ｍＭのホスフェートを含み、約６．３から約６．５までのｐＨを有し、上記で言及したＳＥＣ分析特性およびＨＩＣ分析特性を示す。
【００８４】
好ましくは、５℃または２５℃における１ヶ月間、２ヶ月間または３ヶ月間の貯蔵後の本発明による安定化されたエタネルセプト製剤は、（ａ）ピーク３が本質的に存在しないＨＩＣクロマトグラムを特徴とし、（ｂ）凝集体に対応するピークを含まないかまたは本質的に含まないＳＥＣクロマトグラムを特徴とし、（ｃ）モノマー含量が少なくとも約９７重量％の組成物を表すＳＥＣクロマトグラムを特徴とする。
【００８５】
アルギニンを含まない、セリン、プロリンまたはグルタメートにより安定化されたエタネルセプト製剤は、現在入手可能な市販のエンブレルのアルギニン含有製剤と同等でありまたはより良好である、５ｏＣにおける３ヶ月の貯蔵にわたる安定性を示すことが見出される。したがって、本発明は、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、セリン、プロリンまたはグルタメートにより安定化されたエタネルセプトの製剤であって、Ｍ３またはＴ２またはＴ４における組成物が、下記の基準の片方または両方を満たしている長期的な貯蔵安定性を示す：
（Ａ）（ｉ）（本明細書中で規定された）組成物中の凝集体、モノマーおよびフラグメント３の量のＳＥＣ分析ならびに（ｉｉ）（本明細書中で規定された）ＨＩＣクロマトグラムピーク１、ピーク２およびピーク３に対応する組成物中の材料の量のＨＩＣ分析により測定される、エンブレル（登録商標）の商標で販売されている市販のエタネルセプトと同等またはより良好な安定性、ならびに、
（Ｂ）（ｉ）ピーク３が存在しないかまたは本質的に存在せず、（ｉｉ）ピーク２が約９５重量％超の組成物を表すＨＩＣクロマトグラム、凝集体に対応するピークを本質的に含まないＳＥＣクロマトグラム、およびモノマー含量が少なくとも約９５重量％の組成物を表すＳＥＣクロマトグラム。
【００８６】
本発明はアルギニンの使用を排除しないが、本発明による安定化用のセリン、プロリンおよび／またはグルタメートを含むエタネルセプト製剤は、安定化用のアルギニンを必要としないので、好ましくは、アルギニンを含まないかまたは本質的に含んでいない。
【００８７】
提供される医薬組成物の別の成分
本発明の製剤はまた、緩衝剤、等張性調整剤、賦形剤、医薬として許容される担体およびその他の一般的に使用される医薬組成物の不活性成分も含み得る。簡潔性のために、これらは、本出願において後でより完全に論述される。
【００８８】
緩衝液は、ｐＨを所望の範囲に維持する。適切な緩衝液には、ヒスチジン、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、様々な形態のアセテートおよびジエタノールアミンが挙げられる。製剤中での緩衝液の濃度は、好ましくは約１ｍＭから約１Ｍの間であり、より好ましくは約１０ｍＭから約２００ｍＭの間である。緩衝液は当分野では周知であり、公知の方法により製造され、販売業者から入手することもできる。
【００８９】
適切な緩衝液の例は、ホスフェート、ヒスチジン、シトレート、マレエート、タルトレート、スクシネート、アセテート、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、ビカルボネートである。
【００９０】
好ましい一実施形態において、緩衝液はリン酸ナトリウムである。
【００９１】
好ましい一実施形態において、医薬組成物のｐＨは、生理的レベルになっているまたは付近にある。したがって、好ましくは、提供される組成物のｐＨは、約５．８から約８．４の間であり、更により好ましくは約６．２から約７．４の間である。当業者ならば、ｐＨは、特定の製剤中でのエタネルセプトの安定性および溶解度を最大化するために、必要に応じて調節され得ることを理解している。したがって、生理的範囲外だが患者が耐えられるｐＨのエタネルセプト製剤もまた、本発明の範囲内である。
【００９２】
等張性調整剤は、溶液の質量オスモル濃度に寄与する分子である。医薬組成物の質量オスモル濃度は、好ましくは、有効成分の安定性を最大化し、および／または投与の際の患者への不快感を最小化するように調節される。一般には、医薬組成物が血清と等張であること、すなわち、等張性調整剤の添加により実現される同一または同様の質量オスモル濃度を有することが好ましい。
【００９３】
好ましい一実施形態において、提供される製剤の質量オスモル濃度は、約１８０ｍＯｓＭから約４２０ｍＯｓＭまでである。しかしながら、質量オスモル濃度は、特定の条件の要求に応じて、より高くなることまたはより低くなることのいずれもあり得ると理解すべきである。
【００９４】
質量オスモル濃度を調整するのに適した等張性調整剤の例には、限定されないが、アミノ酸（アルギニンを含めない）（例えば、システイン、ヒスチジンおよびグリシン）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびクエン酸ナトリウム）および／または糖類（例えば、スクロース、グルコースおよびマンニトール）が挙げられる。
【００９５】
好ましい等張性調整剤は、グリシン、アラニン、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムである。
【００９６】
好ましい一実施形態において、製剤中での等張性調整剤の濃度は、好ましくは約１ｍＭから約１Ｍの間であり、より好ましくは約１０ｍＭから約２００ｍＭまでである。等張性調整剤は当分野では周知であり、公知の方法により製造され、販売業者から入手することもできる。
【００９７】
溶液になっていても（同様に乾燥された形態または冷凍された形態になっていても）ポリペプチドを安定化する、化学添加剤、共溶質または共溶媒とも呼ばれる賦形剤もまた、医薬組成物に加えてよい。賦形剤は当分野では周知であり、公知の方法により製造され、販売業者から入手することもできる。
【００９８】
適切な賦形剤の例には、限定されないが、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース等の糖／ポリオール、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡまたは組換えＨＡ）、デキストラン、ポリ（ビニアルコール）ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）等のポリマー、多価アルコール（例えば、ＰＥＧおよびグリセロール）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の非水性溶媒、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、アラニン、グリシン、リシンヒドロクロリド、サルコシンおよびγ−アミノ酪酸等のアミノ酸、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０（ポリソルベート８０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ポリソルベート２０）、ＳＤＳ、ポリソルベート、ポロキサマー等の界面活性剤、ならびに、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、金属イオン（例えば、亜鉛、カルシウムおよびマグネシウム）、ＣＨＡＰＳ、モノラウレート、２−Ｏ−β−マンノグリセレート等の種々の賦形剤、または上記の任意の組合せが挙げられる。
【００９９】
好ましい賦形剤は、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えアルブミン、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、アラニン、グリシン、リシンヒドロクロリド、サルコシン、ＳＤＳ、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ＣＨＡＰＳ、スクロースモノラウレートおよび２−Ｏ−β−マンノグリセレートである。
【０１００】
本発明の製剤中での１つ以上の賦形剤の濃度は、好ましくは約０．００１重量％から５重量％の間であり、より好ましくは約０．１重量％から２重量％までである。
【０１０１】
処置の方法
別の実施形態において、本発明は、治療的有効量の本発明の医薬組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類を処置する方法を提供し、ここで、哺乳類が、エタネルセプトによって有益に処置され得る疾患または障害を有する。
【０１０２】
好ましい一実施形態において、エタネルセプトは、組成物によって処置しようとするものと同じ種の哺乳類に由来する。
【０１０３】
好ましい一実施形態において、哺乳類はヒトである。
【０１０４】
提供される組成物によって処置され得る疾患または障害には、限定されないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ウェゲナー疾患（肉芽腫症）、クローン病（または炎症性腸疾患）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、Ｃ型肝炎、子宮内膜症、喘息、悪液質、乾癬およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。本発明の組成物によって処置され得る追加的な疾患または障害には、ＷＯ００／６２７９０、ＷＯ０１／６２２７２、米国特許出願第２００１／００２１３８０号米国および特許７，６４８，７０２Ｂ２で説明されたものが挙げられ、これらの関連部分は、参照により本明細書に組み込む。
【０１０５】
提供される医薬組成物は、処置を必要としている対象に対して、静脈注射等の注射により全身に投与することもできるし、または、適切な部位への注射もしくは施用により投与することもできるし、例えば部位が手術を受けている場合における部位への直接注射もしくは直接施用により投与することもできるし、または局所的施用により投与することもできる。
【０１０６】
一実施形態において、本発明は、それを必要としている哺乳類に、治療的有効量の提供されるエタネルセプト組成物の１つを投与することを含む、関節リウマチの処置および／または予防の方法を提供する。
【０１０７】
提供される組成物中でのエタネルセプトの治療的有効量は、処置しようとする状態、状態の重症度、先行療法ならびに患者の病歴および治療剤への応答に依存する。適当な用量は、患者に１回投与され得るまたは一連の投与にわたって投与され得るように、担当医の判断に従って調節することができる。
【０１０８】
一実施形態において、成人用量当たりの効果的なエタネルセプト量は、約１〜５００ｍｇ／ｍ２までであり、または約１〜２００ｍｇ／ｍ２までであり、または約１〜４０ｍｇ／ｍ２までであり、または約５〜２５ｍｇ／ｍ２までである。
【０１０９】
代替的には、固定用量が投与され得、その量は、２〜５００ｍｇ／用量、２〜１００ｍｇ／用量または約１０〜８０ｍｇ／用量までの範囲であり得る。
【０１１０】
用量が１週間当たり１回より多く投与されることになるならば、例示的な用量範囲は、前述した用量範囲と同じでありまたはより低く、好ましくは、２５〜１００ｍｇ／用量のパー用量範囲において１週間当たり２回以上投与される。
【０１１１】
別の実施形態において、注射による投与に関して許容される用量は、８０〜１００ｍｇ／用量を含み、または代替的には、用量当たり８０ｍｇを含む。
【０１１２】
用量は、毎週投与してもよいし、隔週で投与してもよいし、または数週間（例えば２週間から８週間）隔てて投与してもよい。
【０１１３】
一実施形態において、エタネルセプトは、単回皮下（ＳＣ）注射により、２５ｍｇ／ｍｌから７５ｍｇ／ｍｌまでで投与される。
【０１１４】
ある場合において、患者の状態の改善は、最大約１００ｍｇの用量の医薬組成物を、１週間当たり１回から３回までで、少なくとも３週間の期間にわたって投与することにより得られる。より長い期間の処置が、所望の改善度を誘起するために必要になり得る。不治の慢性状態に関しては、レジメンは無期限に継続され得る。小児科患者（４〜１７歳）に関しては、適切なレジメンは、０．４ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでの用量のエタネルセプトを、１週間当たり１回以上投与することを含み得る。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明の医薬製剤は、バルク製剤にして調製することもでき、したがって、医薬組成物の成分は、投与に必要とされることになるものより高く調節され、投与前に適切に希釈される。
【０１１６】
医薬組成物は、必要に応じて、単独の治療薬として投与してもよいし、または追加的な療法と組み合わせて投与してもよい。したがって、一実施形態において、提供される処置および／または予防の方法は、治療的有効量の別の活性作用物質の投与と組み合わせて使用される。他の活性作用物質は、本発明の医薬組成物の投与前、投与中または投与後に投与され得る。別の活性作用物質は、提供される組成物の一部として投与してもよいし、または代替的には別個の製剤として投与してもよい。
【０１１７】
提供される医薬組成物の投与は、様々な方法で実現され得、非経口投与、経口投与、口腔内投与、舌下投与、経鼻投与、直腸投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、心臓内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、気管内投与、脊髄内投与、筋肉内注射、硝子体内注射および局所的施用が挙げられる。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、関節内投与、滑液嚢内投与、硝子体内投与および／または脊髄内投与に関して特に有用である。非経口投与は、大量注射または連続注入によるものであり得る。注射用の医薬組成物は、更なる保存剤と一緒に単位剤形中で提供してもよく、例えば、アンプル中または多回用量容器中で提供してもよい。更に、近年幾つかの薬物送達手法が開発されてきており、本発明の医薬組成物は、これらの新しい方法、例えば、Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（登録商標）、Ｇｅｎｊｅｃｔ（登録商標）、ＧｅｎＰｅｎ（登録商標）等の注入ペン、ならびにＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（登録商標）およびＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（登録商標）等の無針デバイスを用いた投与に適している。本医薬組成物はまた、今後見出される投与方法にも適合され得る。Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−１５３３もまた参照されたい。
【０１１９】
提供される医薬組成物はまた、デポ製剤として処方することもできる。このような長時間作用型製剤は、移植（例えば皮下移植または筋肉内移植）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、製剤は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂、またはやや難溶の誘導体として、例えばやや難溶の塩として改質してもよい。
【０１２０】
医薬組成物は、所望ならば、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を内包し得るバイアル、パックまたは分注デバイスに入れて提供され得る。一実施形態において、分注デバイスは、注射用に準備された単回用量の液体製剤を有する注射器を含み得る。注射器は、投与に関する説明書が付随していてもよい。
【０１２１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の水性医薬組成物を内包するキットまたは容器を対象としている。水性医薬組成物中でのポリペプチドの濃度は幅広い範囲であり得るが、一般には、水性製剤１ミリリットル当たり約０．０５マイクログラムから約２０，０００マイクログラム（μｇ／ｍｌ）までの範囲内である。キットはまた、使用に関する説明書を伴っていてもよい。
【０１２２】
本発明は、その中での数多くの修正および変更が当業者には明白であるため説明的なものにすぎないとして意図された下記の実施例において、より詳細に説明される。
【実施例】
【０１２３】
［実施例１］
セリンによって安定化されたエタネルセプト
セリン、プロリンまたはグルタメートによる安定化を有するエタネルセプト製剤は、下記の手順を用いて調製することができる。
【０１２４】
各固体製剤成分は、所与の体積の製剤緩衝液のために必要とされる量に量り取られる。これらの成分は、所与の体積の製剤緩衝液の取扱いおよび測定ができるビーカーまたは容器中に合わせて入れられる。目標の所与の製剤緩衝液の大体３／４に等しい体積の脱イオン水がビーカーに加えられ、成分が次いで可溶化される。緩衝液のｐＨは、１Ｍの水酸化ナトリウムおよび／または１Ｍの塩化水素を用いて、目標の製剤ｐＨに調節される。最終的な製剤緩衝液体積は次いで、脱イオン水の添加により目標の体積まで増大された。エタネルセプト蛋白質溶液は、透析材料製ハウジング（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ  透析装置１０，０００ＭＷＣＯ等）に入れられ、エタネルセプト蛋白質溶液は次いで、４℃で１２時間所望の製剤緩衝液と接触させる。製剤緩衝液体積と蛋白質溶液体積との比は、１０００：１以上にすべきである。透析ハウジングおよびそれを含む蛋白質溶液は次いで、４℃で更に１２時間、等しい体積の第２の製剤緩衝液中に入れられる。得られた蛋白質溶液は、透析材料製ハウジングから除去され、蛋白質の濃度が紫外分光法を用いて測定される。蛋白質濃度は、遠心分離（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１０，０００ＭＷＣＯ遠心濃縮器等）および／または製剤緩衝液による希釈を用いて、所望のレベルに調節される。
【０１２５】
組成物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、変性ＳＥＣ（ｄＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ナトリウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、長期的な安定性に関して試験することができるし、様々な時点における結合および生体活性に関して試験することもできる。生体活性は、任意の数の周知のアッセイにより測定することができる。
【０１２６】
例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの技術は、Ｈａｗｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１１年、２８：２３０２および／またはｖａｎ  Ｍａｒｒｓｃｈａｌｋｅｒｗｅｅｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０１１年、７８：２１３で説明されている。同様に、変性式サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の技術もまた、当業者には周知である。
【０１２７】
組成物は、２年間以上の期間にわたって安定と考えられている。
【０１２８】
【表１】
2014530254.tif 000002
【０１２９】
【表２】
2014530254.tif 000003
【０１３０】
【表３】
2014530254.tif 000004
【０１３１】
【表４】
2014530254.tif 000005
【０１３２】
【表５】
2014530254.tif 000006
【０１３３】
［実施例２］
プロリンによって安定化されたエタネルセプト
【０１３４】
【表６】
2014530254.tif 000007
【０１３５】
【表７】
2014530254.tif 000008
【０１３６】
【表８】
2014530254.tif 000009
【０１３７】
［実施例３］
グルタメートによって安定化されたエタネルセプト
グルタメートによって安定化された組成物は、実施例１で説明したものと同様の手順を用いて調製および試験することができる。
【０１３８】
アルギニンを含有しない、グルタメートにより安定化されたエタネルセプト組成物が、以下に例示されている。
【０１３９】
【表９】
2014530254.tif 000010
【０１４０】
【表１０】
2014530254.tif 000011
【０１４１】
【表１１】
2014530254.tif 000012
【０１４２】
【表１２】
2014530254.tif 000013
組成物は、長期的な安定性に関して試験することができ、生体活性は、実施例１において論じたのと同じようにして測定することができる。
【０１４３】
組成物は、２年間以上の期間にわたって安定と考えられている。
【０１４４】
［実施例４］
エタネルセプトの調製
ステップ１．細胞増殖。  当分野で公知の方法により、産生バイオリアクターの播種のために十分な数の細胞を産生するのに必要な細胞増殖が、エタネルセプト融合蛋白質を発現するＣＨＯ細胞のクローンを用いて実施される。この発現プロセスの産生物（採取した細胞培養液）は、更なる不純物と一緒に、正確に折り畳まれたエタネルセプトの混合物、ならびに正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび／または凝集したエタネルセプトを生じさせる。このような蛋白質混合物を含む採取した細胞培養液は、界面活性剤によるウイルス不活性化を施される。
【０１４５】
ステップ２．アフィニティークロマトグラフィー。  アフィニティークロマトグラフィーは、上記のステップ１の慣例的なプロテインＡアフィニティーカラムを用いて周知の方法により得られて採取した細胞培養物に対して実施される。産生物回収は大体８５％である。得られた産生物は、正確に折り畳まれたエタネルセプト、不正確に折り畳まれたエタネルセプト、ならびに／または正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび／もしくは不正確に折り畳まれたエタネルセプトの凝集体、または蛋白質フラグメントを含む、複合蛋白質混合物である。このプロテインＡアフィニティーカラム精製ステップから得られた産生物は、ｐＨ３．５に調節され、次いでウイルス不活性化ステップを施される。ウイルス不活性化の後、産生物はｐＨ５．５に調節され、購入したカプセルフィルターを用いた公知の方法により更に澄明化される。
【０１４６】
ステップ３Ａ．ミックスモードカチオン交換クロマトグラフィー。  ３１．８Ｌ（４５ｃｍの直径×２０ｃｍの層高さ）充填層ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣクロマトグラフィーカラムが、上記のステップ２で得られた産生物を精製するために使用される。使用前に、カラムは、２ＣＶの２５ｍＭ  アセテートｐＨ５．５によって平衡にされ、２ＣＶの０．１Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌで消毒され、２ＣＶの２５ｍＭ  アセテート、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で中和される。カラムは次いで、流出液がｐＨ５．５および３．５ｍＳ／ｃｍになるまで、８〜１０ＣＶの２５ｍＭ  アセテートｐＨ５．５によって平衡にされる。上記のステップ２からのプロテインＡプールは、ＷＦＩによって≦６ｍＳ／ｃｍに希釈され、各サイクルのために最大１５ｇ／媒体Ｌのカラム充填に適用される。カラムは、２００ｃｍ／ｈの線速度において動作して、６分間の滞留時間を与える。充填後、カラムは、２ＣＶの２５ｍＭアセテートｐＨ５．５で洗浄される。産生物は次いで、８．５ＣＶでの、２５ｍＭアセテート、ｐＨ５．５から、２５ｍＭアセテート、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５の１５％から８５％までのグラジエントで溶離される。産生物収集は、０．１５ＯＤ（Ａ２８０、１．０ｃｍの経路長）で始まり、収集は、ピーク最大値の５０％で終了する。溶出液体積は大体５ＣＶである。残留している産生物および汚染物質は、２ＣＶの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０によってカラムから取り除かれ、廃棄される。ミックスモードカラムから得られた産生物は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ１０、０．２２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅカプセルフィルター（０．６９ｍ２）を用いて濾過される。このステップから得られた産生物は、ステップ２で得られたプロテインＡ材料の約７０％の回収を表す。
【０１４７】
ステップ３Ｂ．ミックスモードアニオン交換クロマトグラフィー。  ２７．０Ｌ（４５ｃｍの直径×１７ｃｍの層高さ）充填層ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ  クロマトグラフィーカラムが、上記のステップ３Ａで得られた産生物を更に精製するために使用される。使用前に、カラムは、２ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０によって平衡にされ、２ＣＶの０．１Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌで消毒され、２ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和されて平衡にされる。産生物充填の前に、カラムは、３ＣＶの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０によって平衡にされる。上記のステップ３ＡからのＣａｐｔｏ  ＭＭＣプールは、プール１ｋｇ当たり約０．０４５ｋｇの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３によって、ｐＨ８．１に調節される。上記のステップ３Ａからの産生物は、伝導率を１２．０ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ８．０に調節するために、ＷＦＩによって１：３．８においてインライン希釈された。得られた材料は次いで、最大１５ｇ／媒体Ｌのカラム充填に適用される。カラムは、１７０ｃｍ／ｈの線速度において動作して、６分の滞留時間を与える。充填後、カラムは、２ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で洗浄される。産生物は次いで、１０ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０から、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０グラジエント（２０％から９０％まで）で溶離される。産生物収集は、０．１５ＯＤ（Ａ２８０、１．０ｃｍの経路長）で始まり、収集は、ピーク最大値の２５％で終了する。溶出液体積は４〜６ＣＶである。溶離された産生物は、市販のカプセルフィルターを用いて濾過され、次いで公知の方法により、ウイルス濾過ステップおよびタンジェンシャルフロー濾過ステップを施される。ステップ３Ｂからの全体的な産生物回収（最後のウイルス濾過ステップおよびタンジェンシャルフロー濾過ステップを含める）は、大体６８％だった。濾過ステップ前に測定された産生物回収は、約７５％だった。このステップからの溶出画分に関して得られたＨＩＣデータの概略図は、図１２で表されている。
【０１４８】
分析：  この例で得られる最後の濾過産生物は、ＨＩＣにより測定された約９０重量％超の正確に折り畳まれたエタネルセプト、ＨＩＣにより測定された５重量％未満の不正確に折り畳まれたエタネルセプト種、ＨＩＣ分析による約３重量％未満の短縮化された材料（そのＴＮＦＲ部分が切り落とされているエタネルセプトのフラグメントであると考えられる）、ならびに、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された９５重量％超の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの合計量を有することが見出される。
【０１４９】
エタネルセプト製剤の分析
Ａ．熱安定性貯蔵
透析および濃縮の後、上記で例示したエタネルセプト製剤の試料は、バイオセーフティキャビネット内で濾過滅菌された。滅菌されたピペットおよびオートクレーブ処理されたピペット先端を用いて、エタネルセプト製剤の試料は、予めラベル付けされてオートクレーブ処理された１ｍＬ凍結乾燥バイアルに移された。バイアルは、無菌ブチルストッパーで栓をされ、アルミニウムキャップで圧着された。すべてのバイアルは次いで、熱安定性オーブンに移された。試料は、（１）４０℃で２週間および（２）２５℃で４週間という、２つの熱安定性レジームを施された。本明細書を通して、これらの２つの温度レジームは、それぞれ「Ｔ２」および「Ｔ４」と表される。
【０１５０】
Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
本明細書中で開示されたエタネルセプト製剤は、分析物がサイズにより分離されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー法の周知の技術を用いて分析された（Ｒｏｇｎｅｒ，Ｍ．（２０００）．Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｍ．Ｋａｓｔｎｅｒ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．６１：８９−１４５を参照されたい。）。上述したエタネルセプトの試料の熱安定性を評価するために、試料は、文献（ｖａｎ  Ｍａａｒｓｃｈａｌｋｅｒｗｅｅｒｄ，Ａ．，Ｇ．Ｊ．Ｗｏｌｂｉｎｋら（２０１１）．「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｅｓｔｉｎｇ．」Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ７８（２）：２１３−２２１）に基づいたＳＥＣ方法により検査された。移動相緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物および１５０ｍＭのアルギニンを含有するように調製された。ｐＨは、１ＭのＨＣｌを用いて６．５に調節された。すべての分離は、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−ゲルＧ４０００  ＳＷｘｌ  ７．８ｍＭ×３０ｃｍ（型番８５４２）に線形に取り付けられた、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−ゲル  ＳＷｘｌ  ６ｍＭ×４ｃｍガードカラム（型番８５４３）を用いて実施された。分離を実施するために、カラムは室温（２３℃）にされ、０．５ｍＬ／分の流量で移動相によって平衡にされた。５マイクロリットルの５０ｍｇ／ｍＬエタネルセプト製剤が、オートサンプラを用いてカラムに注入された。分離は、０．５ｍＬ／分の流量で３０分間かけて達成された。カラム溶離液は、この時間中に２８０ｎｍの波長で監視された。
【０１５１】
Ｃ．サイズ排除クロマトグラフィークロマトグラムの統合
すべての統合は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて実施された。統合前に、エタネルセプトを含有しない緩衝液に関したＳＥＣクロマトグラムは、すべてのクロマトグラムから差し引かれた。すべての統合は、１２分間の保持時間と２６分間の保持時間の間に実施された。幾つかのパラメータが、ピークを規定するために使用された。検出されたピークに関する最小面積は、０．０５ｍＡｕ＊ｍｉｎにセットされた。ピーク検出に関する二次元感度は、０．０１ｍＡｕおよび７５秒にセットされた。ピークの肩部分は、手動式統合ツールを用いて手動により加えられた。すべての検出されたピークは、２つのステップで手動により調節された。最初に、ピークベースライン（ピークの底部境界）が水平に調節された。二番目に、ピークベースラインの垂直位置が、クロマトグラムベースラインの垂直位置に調節された。クロマトグラムベースライン値は、分析物が存在しないときのシグナルとして規定された。分析物が存在しないときのシグナルは、１２分間の保持時間でのｍＡｕにおける吸光度として規定された。
【０１５２】
Ｄ．エタネルセプト製剤のＳＥＣ画分
上述したエタネルセプト製剤のＳＥＣ分析では、３つのＳＥＣクロマトグラフィー画分が、同定されて研究された。分析された画分は、ＳＥＣカラムからの溶離の順番において、（１）無傷のエタネルセプト分子間の非共有結合式静電気的吸引を介しておそらくは集合した、無傷のエタネルセプトＴＮＦＲ：ＦＣ融合蛋白質の凝集体（以下、「凝集体」または凝集体含量）を表す高分子量画分、（２）無傷のエタネルセプトＴＮＦＲ：Ｆｃ融合蛋白質を表すモノマー含量（以下、「モノマー含量」の「モノマー」と呼ぶ）、（３）分子のヒンジ領域における融合蛋白質のＦａｂ部分のアームの喪失の際に、ＴＮＦＲ：分子融合蛋白質の一部分がモノマーから開裂されることになった、１個のフラグメントまたはエタネルセプト分子のフラグメントの母集団をおそらくは表す画分だった。ＳＥＣにより測定される最も一般的なフラグメントまたは短縮化された種は、フラグメント３と呼ばれる。ＳＥＣ分析を実施した際、凝集体が最初に溶離し、続いてモノマーが溶離し、続いてフラグメント３が溶離するのが観察される。
【０１５３】
下記の表は、上述したＳＥＣ分析により測定された凝集体、モノマーおよびフラグメント３の相対量を示している。
【０１５４】
【表１３】
2014530254.tif 000014
【０１５５】
【表１４】
2014530254.tif 000015
【０１５６】
【表１５】
2014530254.tif 000016
【０１５７】
【表１６】
2014530254.tif 000017
【０１５８】
【表１７】
2014530254.tif 000018
【０１５９】
エタネルセプト製剤のＨＩＣ分析
下記の表（表６および表７）は、試料３：５および試料３：８に対して実施された疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣクロマトグラフィー」）の結果を示している。ＨＩＣクロマトグラフィーは、当分野で公知であり参照により本明細書に組み込む米国特許７，２９４，４８１において概ね説明された方法により、実施された。試料は、ｔ０（５℃における調製の２４時間以内）で評価され、２５℃における貯蔵の２週間（ｔ２）（表６を参照）または２５℃における貯蔵の４週間後（ｔ４）（表７を参照）のいずれかで再び評価された。ＨＩＣクロマトグラム中のピーク１は、ＳＥＣデータについての論述において上記で言及されたように、ＳＥＣを用いて同定されて定量化される「フラグメント３」であるまたはこれを含むと考えられており、ピーク２は、ＳＥＣデータについての論述において上記で言及されたエタネルセプトモノマーであり、ピーク３は、ＳＥＣデータについての論述において上記で言及された「凝集体」を含む。更に、ここで使用される「ピーク１」、「ピーク２」および「ピーク３」という用語はまた、参照により本明細書に組み込む米国特許７，２９４，４８１の図４で言及して開示されたＨＩＣピーク１、ピーク２およびピーク３への参照も成していると理解すべきである。
【０１６０】
【表１８】
2014530254.tif 000019
【０１６１】
【表１９】
2014530254.tif 000020
【０１６２】
以下の表８から表１６は、製剤３：５（上記実施例３参照）に対して実施された安定性試験の結果を含み、実施例４（エタネルセプトの調製）において概ね説明された方法により生成されたエタネルセプト材料を含有している。製剤３：５の安定性は、５℃を含める様々な温度における１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月の貯蔵に基づいた、サブビジブル粒子についてのＳＥＣ、ＨＩＣおよびＦｌｏｗＣａｍ分析を用いて評価された。下記は、これらの安定性実験を実施するために使用された方法である。
【０１６３】
バルクのエタネルセプト貯蔵。  処方されていないバルクのエタネルセプトは、エンブレル（登録商標）の添付文書により指示されているように、２〜８℃で貯蔵された。
【０１６４】
ＵＶ分光法。  ＵＶ分光法は、様々な安定性試料中の蛋白質濃度を測定するために使用された。バルク物質（５０ｍｇ／ｍＬのエンブレル）の２８０ｎｍにおける吸光度は、０．１ｍｍの経路長のセルを使用すると、０．６２５であると測定され、１．３０ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍの減衰係数につながった。この値は、この企画におけるすべての計算に使用された。
【０１６５】
エタネルセプト製剤の透析および濃度。  すべての緩衝液は、すべての緩衝液成分を含有する２つの１Ｌ分量にして調製された。バルク材料は、脱イオン水中でカセットを５分間のすすぎ洗いした後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析装置（１０ｋＤの分画、１−３ｍＬの体積）中に充填された。透析試料は、１Ｌの緩衝液中で２〜８℃において５時間透析を施され、続いて、第２の１Ｌの緩衝液中で２〜８℃において２回目の透析を一晩施された。エタネルセプト製剤３：５を透析したとき、２つの４Ｌ透析イベントが、２４ｍＬのストック蛋白質が製剤のために必要とされたため、使用された。
【０１６６】
すべての試料は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１０Ｋ分画遠心分離器フィルター（２ｍＬサイズ）を用いて、これらの目標値を超えるまで濃縮された。ＵＶは、試料の新しい濃度を測定するために使用され、試料は次いで、製剤緩衝液を用いて適切なレベルに希釈された。
【０１６７】
熱安定性試料インキュベーション。  透析および濃縮の後、熱安定性試料は、バイオセーフティキャビネット内で濾過滅菌された。滅菌されたピペットおよびオートクレーブ処理されたピペット先端を用いて、試料は、予めラベル付けされてオートクレーブ処理された１ｍＬ凍結乾燥バイアルに移された。バイアルは、無菌ブチルストッパーで栓をされ、アルミニウムキャップで圧着された。すべてのバイアルは次いで、熱安定性オーブンに移された。
【０１６８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、相異なる方法を用いて実施された。本明細書中で「方法２」と識別されているＳＥＣ方法の１つでは、移動相緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物および１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌを含有するように調製された。ｐＨは、１ＭのＮａＯＨを用いて６．５に調節された。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｙａｒｒａ  ３ミクロンＳＥＣ３０００、３０ｃｍ×４．６ｍｍを用いて実施された。分離を実施するために、カラムは室温（２３℃）にされ、０．５ｍＬ／分の流量で移動相によって平衡にされた。１マイクロリットルの５０ｍｇ／ｍＬエタネルセプト製剤が、オートサンプラを用いてカラムに注入された。分離は、０．５ｍＬ／分の流量で１０分間かけて達成された。カラム溶離液は、この時間中に２８０ｎｍの波長で監視された。
【０１６９】
以下「方法３」と呼ぶ代替的なＳＥＣ方法では、ＮａＣｌが、１００ｍＭの濃度、ｐＨ６．３において、アルギニンＨＣｌの代わりに移動相のための塩として使用された。
【０１７０】
本明細書中で「方法１」と呼ぶ更なる代替的なＳＥＣ方法では、ＳＥＣ分析は、次のように実施された。移動相緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物および１５０ｍＭのアルギニンを含有するように調製された。ｐＨは、１ＭのＨＣｌを用いて６．５に調節された。すべての分離は、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−ゲルＧ４０００  ＳＷｘｌ７．８ｍＭ×３０ｃｍ（型番８５４２）に線形に取り付けられた、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−ゲル  ＳＷｘｌ  ６ｍＭ×４ｃｍガードカラム（型番８５４３）を用いて実施された。分離を実施するために、カラムは室温（２３℃）にされ、０．５ｍＬ／分の流量で移動相によって平衡にされた。５マイクロリットルの５０ｍｇ／ｍＬエタネルセプト製剤が、オートサンプラを用いてカラムに注入された。分離は、０．５ｍＬ／分の流量で３０分間かけて達成された。カラム溶離液は、この時間中に２８０ｎｍの波長で監視された。
【０１７１】
サイズ排除クロマトグラフィークロマトグラムの統合。  すべての統合は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて実施された。統合前に、エタネルセプトを含有しない緩衝液に関したＳＥＣクロマトグラムは、すべてのクロマトグラムから差し引かれた。すべての統合は、２分間の保持時間と８分間の保持時間の間（ＣＨＳ）、または１２分間の保持時間と２６分間の保持時間の間（Ｉｎｎｏｖａｔｏｒ）に実施された。幾つかのパラメータが、ピークを規定するために使用された。検出されたピークに関する最小面積は、０．０５ｍＡｕ＊ｍｉｎにセットされた。ピーク検出に関する二次元感度は、０．０１ｍＡｕおよび７５秒にセットされた。ピークの肩部分は、手動式統合ツールを用いて手動により加えられた。検出されたすべてのピークは、２つのステップで手動により調節された。最初に、ピークベースライン（ピークの底部境界）が水平に調節された。二番目に、ピークベースラインの垂直位置が、クロマトグラムベースラインの垂直位置に調節された。クロマトグラムベースライン値は、分析物が存在しないときのシグナルとして規定された。この場合、分析物が存在しないときのシグナルは、２分間の保持時間でのｍＡｕにおける吸光度として規定された。
【０１７２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。  製剤試料は、クロマトグラフィーカラムへの注入前に、希釈無しでＨＰＬＣバイアル中に充填された。試料は、以下の表に列挙されたパラメータに従ってＨＩＣにより分離された。
【０１７３】
【表２０】
2014530254.tif 000021
【０１７４】
製剤３：５の試験についてのＦｌｏｗＣＡＭ（登録商標）方法の説明。方法開発作業は、Ｍａｎｕｅｌ  Ｐｒｉｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎ−Ｓａｍｐｌｅ手順（液液界面）を用いて、開始時に７／１０／１２に対して実施された。著明な混合効果がフローセルに見られたので、代替的なエアギャップ手順（Ｍａｎｕａｌ  Ｐｒｉｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓａｍｐｌｅ）が試料評価のために選択された。
【０１７５】
ベースライン（Ｔ０）製剤３：５の試料は、冷凍状態で受領され、周囲温度で融解されるまで、−２０℃で貯蔵しておかれた。融解したらすぐに、製剤は、冷蔵温度（２〜８℃）で貯蔵された。Ｔ０試料方法は、フローセルをコンディショニングするためのマッチング緩衝液予備処理ステップを含んでいた。試料を充填する前に、０．４ｍＬ以上のマッチング製剤緩衝液が、システムの中を素早く通って行った。この予備処理は必要とされておらず、したがって、ｔ３試験の時点に関しては使用されないことが判明した。
【０１７６】
５℃および２５℃において３ヶ月の熱応力を受けた製剤３：５の試料は、ＦｌｏｗＣＡＭ分析により評価された。すべての試料は、これらを分析した日に融解した。融解したらすぐに、これらの試料は、冷蔵温度（２〜８℃）で貯蔵された。
【０１７７】
計装および周辺機器
ＦｌｏｗＣＡＭ機器：モデルＶＳ１、シリアル番号５５１、Ｓｏｎｙ  ＳＸ９０カメラ付き、および１ｍＬ注射器（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）付きのＣ７０ポンプ
ＦｌｏｗＣＡＭソフトウェア：ＤＳＰファームウェアバージョン：５４；バージョン３．０．３
フローセル：深さ８０μｍおよび幅７００μｍのＦｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｅｗ（ＦＯＶ  ＦＣ８０）（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
対物レンズ：１０倍
【０１７８】
コンテキスト設定（方法および設定パラメータ）
方法：Ｍａｎｕａｌ  Ｐｒｉｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎ−Ｓａｍｐｌｅ（エアギャップ）
試料分析：０．２００ｍＬ容量。０．１７０ｍＬ分析
流量：０．１００ｍｌ／分
自動撮像速度：毎秒２２フレーム
効率：３８．７％
操作時間：１．７分間
直近への距離：０ミクロン
Ｃｌｏｓｅ  Ｈｏｌｅｓ：５イテレーション
画像：５のコラージュ画像ボーダーパディング
粒子セグメンテーション：暗閾値１５．００、明閾値１５．００
許容領域：左１５、右１２５５、上０、下９５９
カメラ：シャッター  ８
ゲイン  ５７
自動撮像速度：毎秒２２フレーム
フラッシュカメラディレイ：１００マイクロ秒
フラッシュ持続：１８．５マイクロ秒
直径（ＥＳＤ）：最小２．００ミクロン、最大１０００．００ミクロン
【０１７９】
試料を流す前に、フローセルおよび対物レンズが据え付けられ、視野およびフォーカス最適化が実施された。システム確認試験は、ブランク水および粒径標準物質を複数のレプリカ中に流すことを含んでいた。試料を流す前に、清浄化手順が、粒子数が、典型的には試料間で１０００粒子／ｍＬ未満の、またはレプリカ試料間で試料粒子／ｍＬの５％未満の許容されるレベルであることを確実にするために着手された。通例の清浄化プロセスは、清浄化剤の間に、カウントレベルの測定前の最後の洗い流しとして水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑタイプ１、０．２２μｍ濾過済み、１８．２ＭΩ）を使用した。粒子数が１ｍＬレベル当たりの許容される粒子に到達したらすぐに、試料は、試料チップ中にピペットで慎重に移され、試料分析の開始前にフローの中に充填された。
【０１８０】
運転品質は、ｘ−ｙキャプチャープロットを含む（フローパターンの変遷を可視化するため）ＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄＳｈｅｅｔ中の一連の診断ツール、直径サイズプロットに対するアスペクト比（スタック粒子を識別する）、運転中の画像レビュー、および様々な粒子特性（例えばサイズ、円形度、長さ、アスペクト比）を用いた運転の完了時における画像分析を用いて、各運転の間および直後に測定された。
【０１８１】
個々の粒径は、球相当径（ＥＳＤ）として知られるＦｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓソフトウェア測定技術によって測定された。ＥＳＤは、３６回の試料測定（５°毎に実施される）に基づいた、粒子の平均フェレー測定（ｍｅａｎ  ｆｅｒｅｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）である。フェレー測定とは、粒子の反対側に接触している平行な正接間での、垂直距離である。
【０１８２】
下記のデータ表は、３ヶ月の熱応力にわたる、製剤３：５の挙動を説明している。
【０１８３】
（注記：表８から表１３では、括弧内の数（例えば、３：６）は、試験されている製剤を指す。記号「Ｃ」は、実施例４に従って調製された５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプトが２５ｍＭ  ホスフェート緩衝剤、１％スクロース、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび２５ｍＭ  アルギニンヒドロクロリドからなる製剤中に存在していた対照試料である。）
【０１８４】
【表２１】
2014530254.tif 000022
【０１８５】
【表２２】
2014530254.tif 000023
【０１８６】
【表２３】
2014530254.tif 000024
【０１８７】
【表２４】
2014530254.tif 000025
【０１８８】
【表２５】
2014530254.tif 000026
【０１８９】
【表２６】
2014530254.tif 000027
【０１９０】
製剤３：５は、ＦｌｏｗＣａｍフローイメージングシステムを用いて、サブビジブル粒子に関して評価された。これらの機器は、サブビジブル粒子（ＳＶＰ）のレベルを測定するように設計されている。これらは開始時に測定され（表１４）、次いで３ヶ月後に５℃（表１５）および２５℃（表１６）で測定された。３ヶ月の熱応力後の製剤３：５中での低レベルの凝集体またはミスフォールドされた材料を指し示している、上記で示されたＳＥＣおよびＨＩＣデータと一致することに、製剤３：５は、低レベルのサブビジブル粒子（１ｍＬ当たり５μｍ超のサイズを有する１ｍＬ当たり１００００個未満の粒子）を示していた。
【０１９１】
表１４から表１６中で提供されたデータにおいて、比較用製剤は、上記の表８から表１３において示されたものと同じであり、すなわち、実施例４において調製された５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプトと同じであり、２５ｍＭのホスフェート緩衝剤、１％のスクロース、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび２５ｍＭのアルギニンヒドロクロリドを含む製剤にして提供される。）
【０１９２】
【表２７】
2014530254.tif 000028
【０１９３】
【表２８】
2014530254.tif 000029
【０１９４】
【表２９】
2014530254.tif 000030
【０１９５】
上記の表８から表１６で提供されたデータは、本発明によるアミノ酸により安定化された製剤が、アルギニンを安定剤として含む比較用製剤と同等またはより良好な貯蔵安定性を実現できることを実証している。
【０１９６】
本発明のその他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書中で開示された本発明の実践から当業者には明確である。本明細書および例は、例示的なものにすぎないとみなされるように意図されており、本発明の真正の範囲および趣旨は、下記の請求項により示されている。
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月18日(2014.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタネルセプトならびにエタネルセプトの不安定性、凝集、ミスフォールディングおよび／またはフラグメント化を阻止するための安定剤を含む水性医薬組成物であって、前記安定剤がセリン、プロリンおよびグルタメートからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸化合物を含む、水性医薬組成物。
【請求項２】
緩衝液、緊張性調整剤および賦形剤から選択される、１つ以上の追加的な成分を更に含む、請求項１に記載の水性医薬組成物。
【請求項３】
安定剤がグルタメートであり、製剤がアルギニンを含まないかまたは本質的に含んでおらず、製剤が、
９０％超のモノマー含量、３重量％未満の凝集体含量および５重量％未満のフラグメント３含量であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項４】
安定剤が、グルタメートであり、製剤が、２５ｍｇ／ｍｌから７５ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、最大１５０ｍＭのグルタメート、６重量％未満のスクロース、場合によって最大１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭから３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項２に記載の安定化された組成物であって、組成物が６．０から６．６のｐＨを有し、場合によって、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、エタネルセプト組成物。
【請求項５】
９０重量％超のモノマー含量、３重量％未満の凝集体含量および５重量％未満のフラグメント３であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項４に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項６】
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在する場合、ピーク３により表される組成物の量が３重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項７】
Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項８】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、１５０ｍＭ未満のグルタメート、０％から３％のスクロース、１ｍＭから３０ｍＭのホスフェート緩衝剤、場合によって最大１００ｍＭのＮａＣｌを含み、６．０から６．６のｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項９】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、１００ｍＭから１２０ｍＭのグルタメート、４重量％未満のスクロースおよび１０ｍＭから３０ｍＭのホスフェートを含み、６．３から６．５のｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項１０】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約１００ｍＭのグルタメート、２重量％未満のスクロース、約１００ｍＭのＮａＣｌ、１０〜３０ｍＭのホスフェートを含み、６．３から６．５のｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項１１】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、約５０ｍＭのグルタメート、２重量％未満のスクロース、約１００ｍＭのＮａＣｌ、１０〜３０ｍＭのホスフェートを含み、６．３から６．５のｐＨを有する、請求項５に記載のグルタメートにより安定化された組成物。
【請求項１２】
安定剤がセリンであり、製剤がアルギニンを含まないかまたは本質的に含んでおらず、製剤が、
９０％超のモノマー含量、３重量％未満の凝集体含量および重量％未満のフラグメント３含量であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
の少なくとも１つを特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項１３】
安定剤がセリンであり、製剤が、最大１５０ｍＭのセリン、０．５重量％から３重量％のスクロース、１ｍＭから３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含み、組成物が６．０から６．６のｐＨを有し、場合によって、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項１４】
（ａ）９０重量％超のモノマー含量、３重量％未満の凝集体含量および５重量％未満のフラグメント３であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
（ｂ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項１３に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１５】
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在する場合、ピーク３により表される組成物の量が３重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項１４に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１６】
Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、請求項１４に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１７】
約５０ｍｇ／ｍｌのエタネルセプト、１００ｍＭから１２０ｍＭのセリン、４重量％未満のスクロースおよび１０ｍＭから３０ｍＭのホスフェートを含み、６．３から６．５のｐＨを有する、請求項１４に記載のセリンにより安定化された組成物。
【請求項１８】
安定剤がプロリンであり、組成物がアルギニンを含んでいないかまたは本質的に含んでおらず、組成物が、
９０％超のモノマー含量、３重量％未満の凝集体含量および５重量％未満のフラグメント３含量であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２に記載の安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項１９】
最大１５０ｍＭのプロリンを含み、０．５重量％から３重量％のスクロース、１ｍＭから３０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５ｍＭから１００ｍＭのＮａＣｌを更に含み、６．０から６．６のｐＨを有し、場合によって、アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、請求項１８に記載のプロリンにより安定化されたエタネルセプト組成物。
【請求項２０】
９０重量％超のモノマー含量、３重量％未満の凝集体含量および５重量％未満のフラグメント３であるＭ３またはＴ２またはＴ４におけるＳＥＣ分析、ならびに、
ＨＩＣクロマトグラムのピーク１により表される組成物の量が３重量％未満であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が８０重量％超であり、ＨＩＣクロマトグラムのピーク３により表される組成物の量が２０重量％未満である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析
を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項１９に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２１】
ＨＩＣクロマトグラムのピーク２により表される組成物の量が９５重量％以上であり、ピーク３がＨＩＣクロマトグラムに存在する場合、ピーク３により表される組成物の量が３重量％以下である、Ｍ３またはＴ２またはＴ４におけるＨＩＣ分析を特徴とする、長期的な貯蔵安定性を示す、請求項２０に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２２】
Ｍ３またはＴ２またはＴ４において１ｍＬ当たり平均で１０，０００個以下の５μｍ超のサイズを有するサブビジブル粒子を有する、請求項２０に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２３】
約５０ｍＭのプロリン、４重量％未満のスクロース、約２５ｍＭのＮａＣｌ、１０〜３０ｍＭのホスフェートを含み、６．３から６．５のｐＨを有する、請求項２０に記載のプロリンにより安定化された組成物。
【請求項２４】
アルギニンを含まないかまたはアルギニンを本質的に含んでいない、請求項１に記載の組成物であって、Ｍ３またはＴ２またはＴ４における組成物が、下記の基準：
（Ａ）（ｉ）組成物中の凝集体、モノマーおよびフラグメント３の量のＳＥＣ分析、ならびに（ｉｉ）ＨＩＣクロマトグラムのピーク１、ピーク２およびピーク３に対応する組成物中の材料の量のＨＩＣ分析で測定して、エンブレル（登録商標）の商標で販売されている市販のエタネルセプトと同等またはより良好な安定性、ならびに、
（Ｂ）（ｉ）ピーク３が存在しないかまたは本質的に存在せず、（ｉｉ）ピーク２が組成物の９５重量％超を表すＨＩＣクロマトグラム、凝集体に対応するピークを本質的に含まないＳＥＣクロマトグラム、およびモノマー含量が組成物の少なくとも９５重量％を表すＳＥＣクロマトグラム
の片方または両方を満足する、長期的な貯蔵安定性を示す、エタネルセプト組成物。
【国際調査報告】
2014530254.tif 000031