(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）を有するピリジン化合物に関する。本発明の別個の態様は、前記化合物を含む医薬組成物、ならびに神経障害および精神障害を治療する治療薬としての化合物の使用に関する。【化２８】2014526453.tif 000032
2014526453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化２７】
2014526453.tif 000031
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立して、ＮまたはＣＲ３であるが、但し、１つのＸがＮであり、残りのＸはそれぞれ独立して、ＣＲ３であり、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、フェニルおよびピリジルであり、ここで該ベンジル、フェニルおよびピリジルは、１つまたは複数のハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル／フルオロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ／フルオロアルコキシで任意選択で置換されており、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＮ（ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル）２、ＣＨＯ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル／フルオロアルキル、環状アミノ含有複素環、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ／フルオロアルコキシである）
を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ２がＣ１〜Ｃ４アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がメチルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２がＣ３〜Ｃ６シクロアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がＣ１〜Ｃ４アルキルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＣ３〜Ｃ６シクロアルキルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がテトラヒドロピラニルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１が、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択で置換されているベンジルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１が、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択で置換されているフェニルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１が、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択で置換されているピリジルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１が、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで置換されているフェニルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ１がＮである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ２がＮである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ３がＮである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘ４がＮである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ３が水素である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ３がハロゲンまたはＣＨＯである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ３がＣ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ３がＣ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルケニルである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ３が環状アミノ含有複素環である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
１−（３−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２−クロロ−６−メチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２，６−ジクロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２，６−ジメチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，７，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，８，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２，６−ジクロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２，６−ジメチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；１−（２−クロロ−６−メチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン；および１−（３−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン
から成る群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
不安障害を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項２４】
認知障害を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項２５】
統合失調症を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項２６】
療法における使用のための請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経障害および精神障害を治療する治療薬として有用な化合物に関する。本発明の別の態様は、上記化合物を含む医薬組成物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は、ニューロンにおける一連のプロセスを調節する細胞内二次メッセンジャーとして機能する。細胞内ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、アデニルシクラーゼおよびグアニルシクラーゼにより生成され、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）により分解される。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの細胞内レベルは、細胞内シグナル伝達により制御され、ＧＰＣＲ活性化に応答したアデニルシクラーゼおよびグアニルシクラーゼの刺激／抑制は、環状ヌクレオチド濃度を制御する十分特性化された方法である（Antoni, Front. Neuroendocrinol. 2000, 21, 103-132）。
【０００３】
ホスホジエステラーゼ２Ａ（ＰＤＥ２Ａ）は、組織に応じてｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのいずれかを代謝し得るが、ｃＧＭＰに対してより高い親和性を有する二重基質酵素である。ｃＡＭＰは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に由来し、多くの異なる生物で細胞内シグナル伝達に使用され、ｃＡＭＰ依存性経路を伝達する。末梢で発現されるが、ＰＤＥ２Ａの最も高い発現レベルは、脳中に存在する。最近の免疫組織化学的研究により、ヒトを含む哺乳動物種を越えた脳におけるＰＤＥ２Ａ発現の一貫したパターンが実証されている（Stephenson, et al. J. Histochem. Cytochem. 2009, 57, 933）。酵素発現は、認知機能および気分制御に関連した領域（皮質、線条体、海馬、扁桃体および手綱を含む）で顕著であることが示された。
【０００４】
選択的ＰＤＥ２Ａ阻害剤であるＢａｙ  ６０−７５５０は、一次ニューロン培養物および海馬切片においてｃＧＭＰを優先的に増加させる。Ｂａｙ  ６０−７５５０はまた、ラット海馬切片において長期増強（ＬＴＰ）誘導も増加させる。Ｂａｙ  ６０−７５５０は、その生化学的効果および電気生理学的効果と一致して、新たな物体および社会認識の課題において有効であることが見出された（Boess, et al. Neuropharmacology 2004, 47, 1081）。より最近では、Ｂａｙ  ６０−７５５０は、トリプトファン欠乏により生じる物体認識の不足を脱却させることが報告されていた（van Donkelaar, et al. Eur. J. Pharmacol. 2008, 600, 98）。前脳に突出しているセロトニン作動性ニューロンの細胞体を含有することが知られている領域である背側縫線核で同定されるＰＤＥ２陽性細胞を踏まえると、これらの結果は興味深い（Stephenson, et al. J. Histochem. Cytochem. 2009, 57, 933）。高齢ラットにおける類似の研究により、物体認識に対するＢａｙ  ６０−７５５０の有益な効果は神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）阻害剤により脱却され得ることが実証されており、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＰＤＥ２Ａ阻害の効果は、ｃＧＭＰのレベルの変更に起因することを示唆した（Domek-Lopacinska and Strosznajder Brain Res. 2008, 1216, 68）。
【０００５】
最近の研究により、ＰＤＥ２Ａ阻害が不安状態の治療にも有効であり得ることが示されている（Masood, et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008, 326, 369、およびMasood, et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009, 331, 699）。ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）による中枢グルタチオンレベルの欠乏によるマウスにおける酸化的ストレスの誘導は、オープンフィールド(open field)時間および高架式十字迷路(elevated plus maze)アッセイにより評価される多数の不安様挙動の増加をもたらす。これらの作用は、Ｂａｙ  ６０−７５５０による処理で脱却された。ＰＤＥ２阻害剤Ｂａｙ  ６０−７５５０もしくはＮＤ７００１、またはＮＯ供与体デタノノエート(detanonoate)のいずれかの投与によるｃＧＭＰシグナル伝達の増加により、潜在的抗不安薬の評価に関して十分に確立された手順である高架式十字迷路試験、ホールボード(hole-board)試験およびオープンフィールド試験における挙動に対して、拘束ストレスの不安誘起作用が拮抗された。これらの薬物はまた、高架式十字迷路試験およびホールボード試験において非ストレスマウスにおける挙動に対して抗不安効果をもたらした。対比して、ｃＧＭＰシグナル伝達を低減させるＮＯＳ阻害剤の投与は、拘束ストレスと同様に不安誘起作用をもたらした。
【０００６】
ホスホジエステラーゼ１０Ａ（ＰＤＥ１０Ａ）は、ｃＡＭＰをＡＭＰへ、同様にｃＧＭＰをＧＭＰへ変換することができる別の二重特異性酵素である（Soderling, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96, 7071）。ＰＤＥ１０Ａは、ｃＡＭＰ、およびｃＡＭＰに対してより高い親和性を有するｃＧＭＰの両方を加水分解する。ＰＤＥ１０Ａは、線条体、中隔側坐核におけるニューロン、ならびに嗅結節（Seeger, et al. Brain Research, 2003, 985, 113-126）および視床、海馬、前頭皮質および嗅結節（Menniti et al., William Harvey Research Conference, Porto, December, 2001）におけるニューロンで発現される。これらの脳の部位は全て、統合失調症の病理学的機序に関与すると記載されており、（Lapiz, et al. Neurosci Behav Physiol 2003, 33, 13）そのため酵素の位置は、精神病の病理学的機序において優勢な役割を示すこととなる。線条体では、ＰＤＥ１０Ａは、中型有棘ニューロンで優勢に見出され、ＰＤＥ１０Ａは、これらのニューロンのシナプス後膜に主に関連している（Xie et al., Neuroscience 2006, 139, 597）。この位置では、ＰＤＥ１０Ａは、２つの神経伝達物質系である中型有棘ニューロンに関するドーパミン作動性およびグルタミン作動性入力により誘導されるシグナルカスケードに対して重要な影響を及ぼす場合があり、精神病の病理学的機序において優勢な役割を果たす。
【０００７】
精神病患者は、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰレベルならびにそれらの下流の基質の機能障害を有することがわかっている（Muly, Psychopharmacol Bull 2002, 36, 92）。さらに、ハロペリドール(haloperidol)処置は、ラットおよび患者において、それぞれｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルの増加に関連付けられてきた（Leveque et al., J. Neurosci. 2000, 20, 4011）。ＰＤＥ１０ＡはｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方を加水分解するため、ＰＤＥ１０Ａの阻害はまた、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの増加を誘導し、それにより環状ヌクレオチドレベルに対してハロペリドールと類似の効果を有する。ＰＤＥ１０Ａ阻害剤の抗精神病薬潜在力は、Kostowski他の研究によりさらに支持される（Pharmacol Biochem Behav 1976, 5, 15）。彼らは、中等度の選択的ＰＤＥ１０Ａ阻害剤であるパパベリン(papaverine)が、精神病の動物モデルであるラットにおいてアポモルフィン誘導性常同性を低減させ、ラット脳におけるドーパミン濃度を同時に低減させながら、ラットにおけるハロペリドール誘導性カタレプシーを増加させること（古典的な抗精神病薬でも見られる活動である）を示した。精神病の陽性症状を主に改善させ得る古典的な抗精神薬に加えて、ＰＤＥ１０Ａはまた、精神病の陰性症状および認識症状を改善させる潜在力を保有する。
【０００８】
中型有棘ニューロンに関するドーパミン作動性入力に焦点を当てると、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルをアップレギュレートすることにより、Ｄ１アゴニストおよびＤ２アンタゴニストとして作用する。というのは、Ｇｓタンパク質共役ドーパミンＤ１受容体の活性化が、細胞内ｃＡＭＰを増加させる一方で、Ｇｉタンパク質共役ドーパミンＤ２受容体の活性化は、アデニルシクラーゼ活性の阻害を介して細胞内ｃＡＭＰレベルを減少させるためである。Ｄ１受容体シグナル伝達により媒介される細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇は、前脳皮質におけるワーキングメモリーに関与する一連のニューロンプロセスを調節するようであり（Sawaguchi, Parkinsonism Relat. Disord. 2000, 7, 9）、Ｄ１受容体の活性化が、統合失調症患者におけるワーキングメモリー障害を改善し得ることが報告されている（Castner, et al., Science 2000, 287, 2020）。
【０００９】
精神病の陰性症状に対するＰＤＥ１０Ａ阻害の効果は、Rodefer他によりさらに示されており（Eur. J Neurosci 2005, 21, 1070）、彼らは、パパベリンがラットにおけるＮＭＤＡアンタゴニストであるフェンシクリジン(phencyclidine)の亜慢性投与により誘導される注意セットの移行障害を脱却させることを示し得る。新たな刺激に対して注意を移行させる機能障害を含む注意欠陥は、統合失調症の陰性症状に属する。研究では、注意欠陥は、フェンシクリジンを７日間投与した後、休薬期間を置くことにより誘導された。ＰＤＥ１０Ａ阻害剤パパベリンは、亜慢性処置により誘導される永続的欠陥を脱却させることが可能であった。
【００１０】
これらの収束的知見により、ＰＤＥ２Ａおよび／またはＰＤＥ１０Ａの阻害が、ある特定の神経障害および精神障害の治療に関する治療標的であり得ることが示される。したがって、本発明は、ピリジンを含有するトリアゾロピラジン、その調製、その医学的使用およびそれを含む医薬に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、ＰＤＥ２Ａおよび／またはＰＤＥ１０Ａを阻害する化合物を提供することである。したがって、本発明は、式Ｉ
【００１２】
【化１】
2014526453.tif 000003
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立して、ＮまたはＣＲ３であるが、但し、１つのＸがＮであり、残りのＸはそれぞれ独立して、ＣＲ３であり、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、フェニルおよびピリジルであり、ここで該ベンジル、フェニルおよびピリジルは、１つまたは複数のハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル／フルオロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ／フルオロアルコキシで任意選択で置換されており、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＮ（ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル）２、ＣＨＯ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル／フルオロアルキル、環状アミノ含有複素環、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ／フルオロアルコキシである）
を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１３】
本発明の別個の態様では、上記化合物は、式Ｉを有する例示的な化合物の１つから選択される。
【００１４】
本発明は、治療上有効な量の式Ｉを有する化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
不安、認知障害または統合失調症を患う対象を治療する方法であって、治療上有効な量の式Ｉを有する化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明はさらに、不安、認知障害または統合失調症を治療するための医薬の製造における式Ｉを有する化合物の使用を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、不安、認知障害または統合失調症を治療するのに使用するための化合物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＰＤＥ２Ａおよび／またはＰＤＥ１０Ａを阻害する式Ｉを有する化合物の発見に基づいており、したがって、ある特定の神経障害および精神障害の治療に有用である。本発明の特定の態様は、以下でより詳細に説明されるが、この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる様式の詳細な列挙、または本発明に付加され得る全ての特徴であるとは意図されない。したがって、下記明細は、本発明の幾つかの実施形態を説明すると意図され、本発明の全ての置き換え、組合せおよび変動を網羅して明記するとは意図されない。
【００１９】
化合物が互変異形態で存在することができることは、当業者に理解されよう。特定の互変異体の１つに対して本出願で言及される場合、その互変異形態およびそれらの混合物を包含することは理解されよう。
【００２０】
主題となる本発明は、発明の概要で規定されるような式Ｉを有する化合物、その医薬組成物および使用に関する。
【００２１】
【化２】
2014526453.tif 000004
【００２２】
一実施形態では、Ｒ２はＣ１〜Ｃ４アルキルである。一実施形態では、Ｒ２はメチルである。
【００２３】
一実施形態では、Ｒ２はＣ３〜Ｃ６シクロアルキルである。
【００２４】
一実施形態では、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキルである。
【００２５】
一実施形態では、Ｒ１はＣ３〜Ｃ６シクロアルキルである。
【００２６】
一実施形態では、Ｒ１はテトラヒドロピラニルである。
【００２７】
一実施形態では、Ｒ１は、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択で置換されているベンジルである。
【００２８】
一実施形態では、Ｒ１は、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択で置換されているフェニルである。
【００２９】
一実施形態では、Ｒ１は、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択で置換されているピリジルである。
【００３０】
一実施形態では、Ｒ１は、１つまたは２つのＦ、ＣｌまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで置換されているフェニルである。
【００３１】
一実施形態では、Ｘ１はＮである。一実施形態では、Ｘ２はＮである。一実施形態では、Ｘ３はＮである。一実施形態では、Ｘ４はＮである。
【００３２】
一実施形態では、Ｒ３は水素である。一実施形態では、Ｒ３はハロゲンまたはＣＨＯである。
【００３３】
一実施形態では、Ｒ３はＣ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシである。
【００３４】
一実施形態では、Ｒ３はＣ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルケニルである。
【００３５】
一実施形態では、Ｒ３は環状アミノ含有複素環である。
【００３６】
一実施形態では、Ｒ３はＣＮ、−ＣＯ２Ｈまたは−ＣＯＮ（ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル）２である。
【００３７】
ラセミ形態は、既知の方法により、例えば光学活性な酸を用いたそのジアステレオマー塩の分離、および塩基での処理により光学活性なアミン化合物を遊離させることにより、光学対掌体へと分割され得る。かかるジアステレオマー塩の分離は、例えば分別結晶により達成することができる。この目的に適した光学活性な酸としては、ｄ−酒石酸もしくはｌ−酒石酸、ｄ−マンデル酸もしくはｌ−マンデル酸、またはｄ−カンファスルホン酸もしくはｌ−カンファスルホン酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。ラセミ化合物を光学対掌体へ分割させる別の方法は、光学活性なマトリクス上のクロマトグラフィーに基づく。本発明の化合物はまた、キラル誘導体化試薬（例えば、キラルアルキル化またはアシル化試薬）からのジアステレオマー誘導体の形成およびクロマトグラフィー分離、続くキラル助剤の切断により分割され得る。上記方法のいずれも、本発明の化合物自体の光学対掌体を分割するのに、あるいは合成中間体の光学対掌体（これらは続いて、本明細書中に記載される方法により本発明の化合物である光学分割された最終生成物へ変換させることができる）を分割するのに適用され得る。
【００３８】
当業者に既知の光学異性体の分割に関するさらなる方法を使用してもよい。かかる方法としては、Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, New York, 1981においてJ. Jaques、A. ColletおよびS. Wilenにより論述されたものが挙げられる。光学活性な化合物はまた、光学活性な出発原料から調製することもできる。
【００３９】
定義
本明細書中で使用する場合、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」という用語は、１〜６個（両端を含む）の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を指す。例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、２−メチル−１−プロピル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、「直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ４アルキル」という用語は、１〜４個の炭素原子を有する飽和炭化水素を指す。例としては、メチル、エチルおよびｎ−プロピルを指す。
【００４０】
同様に、「Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ」という用語は、酸素上に開いた原子価を有する１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和酸素含有炭化水素基を指す。例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−ブトキシおよびｔ−ブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「Ｃ１〜Ｃ６フルオロアルキル」という用語は、１つまたは複数のフッ素原子で置換されている１〜６個（両端を含む）の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を指す。例としては、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、１−フルオロエチル、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、１，２−ジフルオロエチルおよび３，４−ジフルオロヘキシルが挙げられる。同様に、「直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ４フルオロアルコキシ」という用語は、酸素上に開いた原子価を有する１つまたは複数のフッ素原子で置換されている１〜４個の炭素原子を有する飽和炭化水素を指す。
【００４２】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００４３】
「Ｃ２〜Ｃ４アルケニル」という用語は、２〜４個の炭素原子および１つの二重結合を有する分岐または枝なしアルケニル基を指し、エテニル、プロペニルおよびブテニルが挙げられる。「Ｃ２〜Ｃ４アルキニル」という用語は、２〜４個の炭素原子および１つの三重結合を有する分岐または枝なしアルキニル基を意味し、エチニル、プロピニルおよびブチニルが挙げられる。
【００４４】
本発明の目的では、「環状アミノ含有複素環」という用語は、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリンを指す。「環状アミノ含有複素環」は、１つまたは複数の直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ４アルキルで任意選択で置換されている。
【００４５】
「ＣＯＮ（ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル）２という用語は、アミド部分の置換基がそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルから成る群から選択されるアミド基を指す。例としては、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＯＮ（ＣＨ３）２および−ＣＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３が挙げられる。
【００４６】
「治療」または「治療すること」という用語は本明細書中で使用する場合、疾患もしくは障害の進行または重症度を改善あるいは脱却させること、あるいはかかる疾患もしくは障害の１つまたは複数の症状または副作用を改善あるいは脱却させることを意味する。「治療」または「治療すること」という用語はまた本明細書中で使用する場合、疾患もしくは障害の体系、状態または状況の進行を阻害あるいは阻止すること、例えば遅延、停止、抑制、妨害または遮断することを意味する。本発明の目的では、「治療」または「治療すること」はさらに、有益な臨床結果または所望の臨床結果を獲得するためのアプローチを意味し、ここで「有益な臨床結果または所望の臨床結果」としては、症状の改善、障害もしくは疾患の程度の縮小、疾患もしくは障害状況の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患もしくは障害状況の遅延または緩徐化、疾患もしくは障害状況の改善または緩和、および疾患もしくは障害の寛解（部分的であろうと全体的であろうと、検出可能であろうと検出不可能であろうと）が挙げられるが、限定されない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「有効な量」という語句は、本発明の化合物に適用される場合、意図される生物学的効果を引き起こすのに十分な量を示すと意図される。
【００４８】
「治療上有効な量」という語句は、本発明の化合物に適用される場合、障害もしくは疾患状況、または障害もしくは疾患の症状の進行を改善、緩和、安定化、脱却、緩徐化または遅延させるのに十分である化合物の量を示すと意図される。ある実施形態では、本発明の方法は、化合物の組合せの投与を提供する。かかる場合では、「有効な量」は、意図される生物学的効果を引き起こすのに十分な組合せの量である。
【００４９】
薬学的に許容される塩
本発明はまた、本発明の化合物の塩、通常は薬学的に許容される塩を含む。かかる塩としては、薬学的に許容される酸付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、無機酸ならびに有機酸の塩が挙げられる。
【００５０】
適切な無機酸の代表例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸等が挙げられる。適切な有機酸の代表例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、イタコン酸、乳酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸(bismethylene salicylic)、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、テオフィリン酢酸、ならびに８−ハロテオフィリン（例えば、８−ブロモテオフィリン等）が挙げられる。薬学的に許容される無機または有機付加塩のさらなる例としては、S. M. Berge, et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 2に列挙される薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００５１】
さらに、本発明の化合物は、非溶媒和形態、ならびに薬学的に許容される溶媒（例えば、水、エタノール等）との溶媒和形態で存在してもよい。
【００５２】
医薬組成物
本発明はさらに、治療上有効な量の式Ｉを有する化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、治療上有効な量の、実験の部で開示される具体的な化合物の１つおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明の化合物は、単独で、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組み合わせて、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびにRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19thEdition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されるもののような従来技術に従う任意の他の既知の補助剤および賦形剤とともに配合され得る。
【００５４】
経口投与用の医薬組成物は、カプセル、錠剤、糖衣錠、丸剤、ロゼンジ剤、散剤および顆粒剤のような固体投薬形態が挙げられる。適切な場合、組成物は、腸溶性コーティングのようなコーティングを用いて調製されてもよく、あるいは組成物は、当該技術分野において既知の方法に従って徐放または持続放出のような有効成分の制御された放出を提供するように配合されてもよい。経口投与用の液体投薬形態としては、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。
【００５５】
非経口投与用の医薬組成物としては、滅菌水溶性および非水容性注射液剤、分散液、懸濁剤または乳剤、ならびに使用前に滅菌注射液剤または分散液で再構成されるべき滅菌粉剤が挙げられる。
【００５６】
経口投薬は通常、１回または複数回の投薬、通常は１日につき１回〜３回の投薬で投与される。正確な投薬量は、投与の頻度および様式、治療される対象の性別、年齢、体重および全身状態、治療される状態の性質および重症度ならびに治療されるべき任意の合併症(concomitant diseases)、ならびに当業者に明白である他の因子に依存する。配合物もまた、当業者に既知の方法により単回投薬形態で提示される。説明の目的で、経口投与に関する単回投薬形態は、約０．０１〜約１０００ｍｇ、約０．０５〜約５００ｍｇ、または約０．５〜約２００ｍｇを含有し得る。
【００５７】
本発明の化合物は概して、遊離物質として、またはその薬学的に許容される塩として利用される。一例は、遊離塩基を利用した化合物の酸付加塩である。式Ｉを有する化合物が遊離塩基を含有する場合、かかる塩は、式Ｉの遊離塩基の溶液または懸濁液を、モル当量の薬学的に許容される酸で処理することにより、従来の様式で調製される。適切な有機および無機酸の代表例は、上述される。
【００５８】
非経口投与に関して、滅菌水溶液、水性プロピレングリコール、水性ビタミンＥまたはゴマ油もしくはピーナッツ油中の式Ｉを有する化合物の溶液を用いてもよい。かかる水溶液は、必要であれば適切に緩衝させるべきであり、液体希釈剤はまず、十分な生理食塩水またはグルコースと等張性にすべきである。水溶液は、静脈内、筋内、皮下および副腔内投与に特に適している。式Ｉを有する化合物は、当業者に既知の標準的な技法を使用して、既知の滅菌水性媒質へ容易に組み込ませ得る。
【００５９】
適切な医薬品担体としては、不活性固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液および各種有機溶媒が挙げられる。固体担体の例としては、ラクトース、石膏(terra alba)、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、硫酸マグネシウム、ステアリン酸およびセルロースの低級アルキルエーテルが挙げられる。液体担体の例としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、担体または希釈剤としては、当該技術分野で既知の任意の徐放材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル（単独で、またはワックスと混合して）が挙げられ得る。続いて、式Ｉを有する化合物および薬学的に許容される担体を組み合わせることにより形成される医薬組成物は、開示される投与経路に適した様々な投薬形態で容易に投与される。配合物は、薬学の技術分野で既知の方法により単回投薬形態で利便性よく提示され得る。
【００６０】
固体担体が経口投与に使用される場合、製剤は、錠剤化されてもよく、粉剤またはペレット剤形態で硬質ゼラチンカプセル中に入れてもよく、あるいは製剤は、トローチまたはロゼンジの形態で存在してもよい。固体担体の量は多様であるが、投薬単位１回につき約２５ｍｇ〜約１ｇの範囲に及ぶ。液体担体が使用される場合、製剤は、シロップ、乳剤、軟質ゼラチンカプセルまたは滅菌注射液（例えば、水性もしくは非水性液懸濁剤または溶剤）の形態で存在し得る。
【００６１】
治療用途
不安、認知障害または統合失調症を患う対象を治療する方法であって、治療上有効な量の式Ｉを有する化合物を投与することを含む方法が本発明で提供される。
【００６２】
本発明はさらに、不安障害、認知障害または統合失調症を治療するための医薬の製造における式Ｉを有する化合物の使用を提供する。本発明の別の態様は、不安障害、認知障害、または統合失調症を治療する際に使用するための化合物を提供する。本発明は、不安、認知障害、または統合失調症を治療する方法であって、治療上有効な量の式Ｉを有する化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
本発明は、不安、パニック障害、広場恐怖症、特定恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害、外傷後ストレス障害、急性ストレス障害および全般性不安障害から選択される不安障害を治療する方法を提供する。
【００６４】
本発明はさらに、認知障害を患う対象を治療する方法であって、対象に治療上有効な量の式Ｉを有する化合物を投与することを含む方法を提供する。本発明に従って治療され得る認知障害の例としては、アルツハイマー病、多発脳梗塞性認知症、アルコール性認知症または他の薬物関連の認知症、頭蓋内腫瘍または脳外傷に関連した認知症、ハンチントン病またはパーキンソン病に関連した認知症、あるいはエイズ関連の認知症、および加齢関連の認知低下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明はまた、運動障害を治療する方法であって、対象に治療上有効な量の式Ｉを有する化合物を投与することを含む方法を提供する。本発明に従って治療され得る運動障害の例としては、ハンチントン病およびドーパミンアゴニスト療法に関連したジスキネジーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はさらに、パーキンソン病および下肢静止不能症候群(restless leg syndrome)から選択される運動障害を治療する方法を提供し、この方法は、対象へ治療上有効な量の式Ｉを有する化合物を投与することを含む。
【００６６】
本発明は、統合失調症（例えば妄想型、解体型、緊張型、未分化型または残遺型の統合失調症）、統合失調症様障害、統合失調性感情障害（例えば、妄想型または抑鬱型の統合失調性感情障害）、妄想性障害、物質誘発性精神病性障害（例えば、アルコール、アンフェタミン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、オピオイドまたはフェンシクリジンにより誘発される精神病）、妄想型の人格障害および統合失調型の人格障害（ここで、薬物中毒は、アルコール、アンフェタミン、コカインまたはアヘン剤中毒である）を治療する方法を提供する。
【００６７】
実験項
式Ｉを有する化合物は、下記方法および例で概説される方法により調製することができる。以下の方法では、変形または修飾を利用することが可能であり、それら自体は、当該技術分野で熟練した化学者に既知であるか、またはこの分野の当業者に明らかであり得る。さらに、本発明の化合物を調製する他の方法は、下記反応スキームおよび例を鑑みて当業者に容易に明らかである。例えば、方法は、本発明の化合物の合成中の選択的保護基の使用について記載している。当業者は、特定の反応に関して適切な保護基を選定することが可能である。かかる基の保護および脱保護に関する方法は、当業者に既知であり、T. Green, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 1991, 2ndEdition, John Wiley & Sons, New Yorkに見出され得る。
【００６８】
使用される略記および化合物
ＡｃＯＨ＝酢酸（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２４２８５３）。アセトニトリル（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ２７１００４）。ＡＰＰＩ＝大気圧光電離。Ａｑ＝水。塩水＝塩化ナトリウムの飽和水溶液（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ７６５３）。Ｂｏｃ２Ｏ＝二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ３６１９４１）。２−クロロ安息香酸（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  １３５５７７）。３−クロロ安息香酸（例えば、Ｆｌｕｋａ  ２３５３０）。３−クロロベンゾイルクロリド（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ２６８０１）。クロロホルム（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ２４３２）。２−クロロ−６−メチル−安息香酸（例えば、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｘ１８３４８またはＭａｔｒｉｘ  ００２７９４）。２−クロロ−６−メチル−ベンゾイルクロリド（例えば、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ  ３８１６０またはＢｅｔａｐｈａｒｍ  １５−４７１０６）。ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  １３９００９）。ＤＣＭ＝塩化メチレン／ジクロロメタン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ２７０９９７）。２，６−ジクロロ−安息香酸（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄ５７４５０）。２，３−ジアミノピリジン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  １２５８５７）。３，４−ジアミノピリジン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ７１４８）。ジエチルエーテル（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ３４６１３６）。ＤＭＡＰ＝４−（ジメチルアミノ）ピリジン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ５２２８０５）。２，６−ジメチルベンゾイルクロリド（例えば、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ  ０１７５２６またはＡＢＣＲ  ＡＢ１７３１１５）。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２２７０５６）。ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ３８７６４９）。ＥＬＳ＝蒸発光散乱。エタノール（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ４５９８４４）。ピルビン酸エチル（例えば、Ｆｌｕｋａ  １５９６０）。ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル（例えば、Ｆｌｕｋａ  ３４９７２）。２−フルオロ−３−ニトロ−ピリジン（例えば、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ  ０３２５０またはＭａｔｒｉｘ  ０１８３３９）。ｈ＝時間（秒）。１，４−ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌ（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ３４５５４７）。ヘプタン（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ７３０４９１）。ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー。３０％過酸化水素水（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２１６７６３）。ヒドラジン水和物（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２２５８１９）。鉄粉（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  １２３１０）。ＬＣ＝液体クロマトグラフィー。ＬＣ／ＭＳ＝液体クロマトグラフィー／質量分析。４Ｍ＝４モル溶液。メタノール（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ３４８６０）。ＭＴＢＥ＝メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ３０６９７５）ＭＷ＝マイクロ波。ＭＷ条件＝Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ機器またはＣＥＭ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ−４８機器を使用した封管中で実施される反応。Ｎａ２ＣＯ３（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ７７９５）。Ｎ���ＨＣＯ３（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ６０１４）。ＮａＯＨ（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ５８８１）。Ｎａ２ＳＯ４（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２３８５９７）。３−ニトロ−ピリジン−４−イルアミン（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ６４６９６２）。１０％木炭上パラジウム(10% palladium on charcoal)（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５９９０）。ＰＤＡ＝光ダイオードアレイ。Ｐｄ（ＤＰＰＦ）Ｃｌ２＝［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ６９７２３０）。Ｐｄ（ＤＰＰＦ）Ｃｌ２−ＤＣＭ錯体＝ジクロロメタンとの［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）錯体（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ３７９６７０）。ペンタン（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ２３６７０５）。ＰｈＰＯＣｌ２＝フェニルホスホン酸ジクロリド（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ３８９５６０）。ＰＯＣｌ３＝塩化ホスホリル（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  ２６２０９９）。ＰｙＢｒｏＰ＝ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)（例えば、Ｆｌｕｋａ  １２８０９）。ラセミアラニン（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａ７５０２）。ＲＴ＝保持時間。Ｓａｔ＝飽和。Ｔ＝時間。Ｔｆ２Ｏ＝トリフルオロメタンスルホン酸無水物（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  １７６１７６）。ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー。Ｅｔ３Ｎ＝トリエチルアミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ０８８６）。
【００６９】
ＬＣ／ＭＳ法１３１：ＬＣ／ＭＳは、陽イオンモードで作動するＡＰＰＩ供給源を備えたＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ１５０ＥＸ上で実行させた。ＨＰＬＣは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ１０−ＡＤｖｐ  ＬＣポンプ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ  ＰＤＡ検出器（２５４ｎＭで作動）およびＳＣＬ−１０Ａシステム制御装置で構成された。オートサンプラーはＧｉｌｓｏｎ  ２１５であり、カラムオーブンはＪｏｎｅｓ  クロマトグラフィー  ７９９０Ｒであり、ＥＬＳ検出器は、Ｓｅｄｅｒｅ  Ｓｅｄｅｘ  ８５であった。ＬＣ条件：カラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−１８であった（４．６×３０ｍｍ、３．５マイクロメートル、水＋０．０５％ＴＦＡ（Ａ）およびメタノール＋０．０５％ＴＦＡで構成される３．０ｍＬ／分の二元勾配で６０℃で作動）。勾配：０．０１分：１７％Ｂ、０．２７分  ２８％Ｂ、０．５３分  ３９％Ｂ、０．８０分  ５０％Ｂ、１．０７分  ５９％Ｂ、１．３４分  ６８％Ｂ、１．６０分  ７８％Ｂ、１．８７分  ８６％Ｂ、２．１４分  ９３％Ｂ、２．３８分  １００％Ｂ、２．４０分  １７％Ｂ、２．８０分  ７％Ｂ、総実行時間：２．８分。
【００７０】
ＬＣ／ＭＳ法１３２：ＬＣ／ＭＳ法  １３１と同じハードウェア。ＬＣ条件：カラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−１８であった（４．６×３０ｍｍ、３．５マイクロメートル、水＋０．０５％ＴＦＡ（Ａ）およびメタノール＋０．０５％ＴＦＡで構成される２．５ｍＬ／分の二元勾配で６０℃で作動）。勾配：０．０１分  ５％Ｂ、２．３８分  １００％Ｂ、２．４０分  ５％Ｂ、２．８０分  ５％Ｂ。総実行時間：２．８分。
【００７１】
方法５５０：ＬＣ−ＭＳは、カラムマネージャ、二元溶媒マネージャ、サンプルオーガナイザ、ＰＤＡ検出器（２５４ｎＭで作動）、ＥＬＳ検出器および陽イオンモードで作動するＡＰＰＩ供給源を備えたＴＱ−ＭＳを含むＷａｔｅｒｓ  Ａｑｕｉｔｙで構成されるＷａｔｅｒｓ  Ａｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＭＳ上で実行させた。ＬＣ条件。カラムは、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８であった（１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、水＋０．０５％トリフルオロ酢酸（Ａ）およびアセトニトリル＋５％水＋０．０５％トリフルオロ酢酸で構成される１．２ｍｌ／分の二元勾配で６０℃で作動）。勾配：０．００分  １０％Ｂ、１．００分  １００％Ｂ、１．０１分  １０％Ｂ、１．１５分  １０％Ｂ。総実行時間：１．１５分。
【００７２】
【表１】
2014526453.tif 000005
【００７３】
一般的な方法
【００７４】
【化３】
2014526453.tif 000006
簡潔に述べると、本発明の化合物Ｉは、それぞれ方法１および方法２として記載される条件下でヒドラジンＩＩから調製することができる。ヒドラジンＩＩは、方法３として記載される条件下で化合物ＩＩＩから調製することができる。幾つかの場合では、同様に、方法４を使用してＩＩＩを直接Ｉへ変換することも可能である。前駆物質ＩＩＩは、方法５または方法６のいずれかを使用して、ラクタムＩＶから得ることができる。
【００７５】
方法Ｉは、適切な溶媒（例えば、アセトニトリル）中で、高温で適当な酸塩化物Ｒ１ＣＯＯＣｌでヒドラジンＩＩを処理することで構成される。場合によっては、ＰＯＣｌ３またはＰｈＰＯＣｌ２を添加することが好適であり得る。酸塩化物は、ＰＯＣｌ３の添加により原位置で相当する酸から調製することができる。あるいは、例Ｉａ１に記載されるように、ヒドラジンＩＩをＲ１ＣＯ２ＨおよびＰｙＢｒｏＰと反応させて、相当するヒドラジドを得て、続いてそれを２工程でＰｈＰＯＣｌ２および塩基で処理して、本発明の化合物を得る。
【００７６】
方法２は、方法１の代替法であり、方法２では、ヒドラジンＩＩを塩化メチレン（ＤＣＭ）のような適切な溶媒中で適当なアルデヒドＲ１ＣＨＯと縮合させて、相当するヒドラゾンを形成する。続いて、例えばSadana他（A.K. Sadana, Y. Mirza, K.R. Aneja, O. Prakash European Journal of Medicinal Chemistry 2003, 38, 533）により報告される条件下で、適切な酸化剤を添加することによって、本発明の化合物を得る（ここでは、酸化剤はヨードベンゼンジアセテート(iodobenzene diacetate)（ＰｈＩ（ＯＡｃ）２）である）。あるいは、Mogilaiah他（K. Mogilaiah, T. Kumara Swamy, K. Shiva Kumar J. Heterocyclic Chem. 2009, 46, 124）により報告される手順を使用することが可能である（ここでは、中間体ヒドラゾンは、クロラミン−Ｔによる処理により酸化的に環化される）。
【００７７】
方法３は、化合物ＩＩＩ（式中、Ｘは塩素原子または別の脱離基（例えば反応スキーム中に描かれるホスホニウム種）のいずれかである）におけるＸのヒドラジンによる置換を含む。反応は通常、適切な溶媒（例えば、エタノール）中で、高温でヒドラジン水和物を用いて行われる。ＩＩｃおよびＩＩｄの調製は方法３の例である。
【００７８】
方法４は、例Ｉｄ１に関して記載されるように適切な溶媒（例えば、アセトニトリル）中で、高温で適当な酸ヒドラジドＲ１ＣＯＮＨＮＨ２と反応させることにより、化合物ＩＩＩを本発明の化合物Ｉへ直接変換することである。
【００７９】
方法５は、ＩＩｄに関して記載されるように過剰の塩化ホスホリル中で基質を加熱することにより、ラクタムＩＶを化合物ＩＩＩ（式中、Ｘは塩素原子である）へ変換することである。場合によっては、適切な塩基（例えば、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ））を添加することが好適であり得る。
【００８０】
方法６は、適切な塩基（例えば、ＤＩＰＥＡ）の存在下でベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)（ＰｙＢｒｏＰ）または類似のペプチドカップリング剤でラクタムＩＶを処理して、化合物ＩＩＩ（式中、Ｘは反応スキームに描かれたホスホニウム種である）を提供することである。この方法は、文献で他のラクタムに関して既知である（T.D. Ashton, P.J. Scammells Australian Journal of Chemistry 2008, 61, 49）。ＩＩａの調製は、方法６の例である。
【００８１】
中間体の調製
【００８２】
【化４】
2014526453.tif 000007
（３−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−イル）−ヒドラジン（ＩＩａ）。２−フルオロ−３−ニトロピリジン（１２ｇ）、Ｅｔ３Ｎ（３０ｍＬ）およびラセミアラニン（１１．８７ｇ）の混合物をメタノール（２００ｍＬ）中で一晩還流させた。混合物を周囲温度に冷却して、濾液を真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭと水との間で分配させた。有機層をＮａ２ＣＯ３で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮して、２−（３−ニトロ−ピリジン−２−イルアミノ）−プロピオン酸（７．８ｇ）を得た。この材料をＡｃＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解させて、鉄（８．２ｇ）を添加した。混合物を１．５時間還流させた。周囲温度に冷却した後、混合物を濾過して、濾液を真空中で濃縮した。残渣を水で洗浄して、乾燥させて、３−メチル−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（１．４ｇ）を得た。この材料を５％ＮａＯＨ水（９２ｍＬ）および水（１８ｍＬ）と混合した後、３０％過酸化水素水（９．２ｍＬ）を添加した。混合物を６０℃で１０時間撹拌した。周囲温度に冷却した後、ｐＨを中性に調節して、３−メチル−１Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（１．２ｇ）を沈殿させた。この材料をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解させて、周囲温度で１６時間、ＰｙＢｒｏＰ（４．６ｇ）およびＤＩＰＥＡ（１．６ｍＬ）で処理した。沈殿した白色固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、２−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−３−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン（０．４ｇ）を得た。この材料（０．４ｇ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）をエタノール（５ｍＬ）中で１０分間還流させた。周囲温度に冷却した後、沈殿した白色固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、次工程にとって十分純粋なＩＩａ（０．２ｇ）を得た。
【００８３】
【化５】
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【００８４】
（３−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−イル）−ヒドラジン（ＩＩｃ）。クロロホルム（１００ｍＬ）中の３，４−ジアミノピリジン（１０ｇ）およびピルビン酸エチル（５３ｇ）の混合物を周囲温度で一晩撹拌した。沈殿した固体を濾別して、ＤＣＭで洗浄して、乾燥させて、２−メチル−４Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−３−オン（１４ｇ）を黄褐色固体として得た。この材料２ｇをＤＭＦ（１０ｍＬ）中に懸濁させて、周囲温度で一晩、ＰｙＢｒｏＰ（６ｇ）およびＤＩＰＥＡ（３．３ｍＬ）で処理した。沈殿した固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、３−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−２−メチル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン（１．７ｇ）を白色固体として得た。この材料をエタノール（５０ｍＬ）中に懸濁させて、ヒドラジン水和物を添加して、得られた混合物を８５℃で１５分間加熱した。固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、次工程にとって十分純粋な黄色固体としてＩＩｃ（０．９５ｇ）を得た。
【００８５】
【化６】
2014526453.tif 000009
【００８６】
（３−メチル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−２−イル）−ヒドラジン（ＩＩｂ）。ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中の３−ニトロ−ピリジン−４−イルアミン（１５ｇ）の懸濁液に、トリエチルアミン（３０ｍＬ）、Ｂｏｃ２Ｏ（２３．５ｇ）およびＤＭＡＰ（１．３１ｇ）を添加した。混合物を周囲温度で２日間撹拌した。固体を濾別して、濾液を真空中で濃縮した。残渣をＭＴＢＥで洗浄した。黄色結晶を収集して、（３−ニトロ−ピリジン−４−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１７ｇ）を得た。この材料およびピルピン酸エチル（１００ｍＬ）をエタノール（１５０ｍＬ）中に溶解させて、１０％木炭上パラジウム（３ｇ）の存在下で５０℃で２日間、水素ガス（５０ｐｓｉ）で処理した。触媒を濾別して、濾液を真空中で濃縮した。残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン／ＥｔＯＡｃ  １０：１→２：１）で精製して、２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ピリジン−３−イルアミノ）−プロピオン酸エチルエステル（５ｇ）を黄色固体として得た。類似の様式で調製したこの化合物のより大量サンプル（９ｇ）を、１，４−ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌ（４０ｍＬ）中で周囲温度で５時間撹拌した。沈殿した固体を濾別して、ＭＴＢＥで洗浄して、乾燥させた。濾液を乾固するまで濃縮して、ＭＴＢＥで洗浄して、乾燥させて、生成物の第２の収集物(crop)を得た。白色固体としての３−メチル−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−２−オン塩酸塩（５ｇ）の総収率。この材料２．２ｇを水（２０ｍＬ）中に懸濁させて、３０％過酸化水素水（１．２ｍＬ）およびＮａＯＨ（ｐＨを７〜８に調節するため）で処理した。混合物を７５℃で２日間撹拌した。さらに多くの３０％過酸化水素水（０．１５ｍＬ）を添加して、撹拌をさらに２日間続けた。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＥｔＯＡｃで洗浄して、３−メチル−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−２−オン（０．８ｇ）を黄褐色固体として得た。この材料０．７ｇおよびＰｙＢｒｏＰ（２．１１ｇ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に懸濁させた。ＤＩＰＥＡ（１．１６ｍＬ）を添加して、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。沈殿した固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、２−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−３−メチル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン（０．７ｇ）を白色固体として得た。この材料４３０ｍｇをエタノール（１３ｍＬ）中に懸濁させて、８５℃で２０分間、ヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）で処理した。固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、次工程にとって十分純粋な黄褐色固体としてＩＩｄ（１８０ｍｇ）を得た。
【００８７】
【化７】
2014526453.tif 000010
【００８８】
３−クロロ−２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン（ＩＩＩｄ）。ピルビン酸エチル（１．２２ｍＬ）をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解させて、メタノールＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の２，３−ジアミノピリジン（１．０９ｇ）の冷溶液に添加して、混合物を周囲温度で撹拌した。固体を濾別して、冷メタノールで洗浄して、２−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−オン（１．１ｇ）を灰色固体として得た。この材料１．０ｇをアセトニトリル（１０ｍＬ）中に懸濁させて、塩化ホスホリル（１．１６ｍＬ）を添加した。混合物を、ＭＷ条件下で１２０℃で０．５時間加熱した。粗製混合物を水とＥｔＯＡｃとの間で分配させた。有機層を塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮して、次工程にとって十分純粋な赤色固体としてＩＩＩｄ（４６０ｍｇ）を得た。
【００８９】
【化８】
2014526453.tif 000011
【００９０】
（２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジン（ＩＩｄ）。エタノール（５ｍＬ）中のＩＩＩｄ（０．６１ｇ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を室温で１０分間撹拌した。沈殿した白色固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、次工程にとって十分純粋なＩＩｄ（０．４３ｇ）を得た。
【００９１】
【化９】
2014526453.tif 000012
【００９２】
（８−メトキシ−２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジン（ＩＩｅ）。０℃での９６％Ｈ２ＳＯ４水（２０ｍＬ）中の４−クロロ−ピリジン−２−イルアミン（５ｇ）の溶液に、７０％ＨＮＯ３水（２．５ｍＬ）および９６％Ｈ２ＳＯ４水（１０ｍＬ）の混合物溶液を滴下した。添加が完了した後、混合物を室温で２時間撹拌した。溶液を氷／水上へ注ぎ、６Ｍ  ＮａＯＨ水を滴下して、ｐＨを９に調節した。次に、固体を濾別して、水で洗浄して、乾燥させた後、固体をアルミナ上のクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  ２：１）で精製して、４−クロロ−３−ニトロ−ピリジン−２−イルアミン（１．２ｇ）を得た。この材料２００ｍｇをメタノール（３ｍＬ）中に溶解させて、ＮａＯＭｅ（１２５ｍｇ）を添加した後、混合物を６０℃で１６時間撹拌した。３７％ＨＣｌ水を滴下して、ｐＨを６に調節した。混合物を０℃に冷却して、沈殿した固体を濾別して、水で洗浄して、乾燥させて、４−メトキシ−３−ニトロ−ピリジン−２−イルアミン（１８０ｍｇ）を得た。この材料をメタノール（２０ｍＬ）中に溶解させて、１０％木炭上パラジウムの存在下で室温で２時間、水素ガス（１ｂａｒ）で処理した。混合物を濾過して、濾液を真空中で濃縮して、４−メトキシ−ピリジン−２，３−ジアミン（５０ｍｇ）を得た。この手順を繰り返して、より多くの材料を生産した。次工程で、４−メトキシ−ピリジン−２，３−ジアミン（６．８ｇ）をエタノール（２００ｍＬ）中に溶解させた。この溶液にピルピン酸メチル（４．９ｍＬ）を室温で徐々に添加して、混合物を周囲温度で３時間撹拌した後、揮発性物質を真空中で除去した。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  ５：１から０：１）で精製して、８−メトキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−オン（６．１ｇ）を得た。ＤＭＦ（１２ｍＬ）中のこの材料３ｇの懸濁液に、ＰｙＢｒｏＰ（７．６５ｇ）を、続いてＤＢＵ（３．５８ｇ）を添加した。混合物を一晩撹拌した後、沈殿した固体を濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、３−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−８−メトキシ−２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン（３．５ｇ）を得た。この材料１．５ｇをエタノール（１０ｍＬ）およびＤＣＭ（６０ｍＬ）の混合物中に溶解させた。ヒドラジン一水和物（３．６ｇ）を添加して、混合物を周囲温度で一晩撹拌した後、揮発性物質を真空中で除去した。残留固体をエタノールで粉体化して(triturate)、濾別して、エタノールで洗浄して、乾燥させて、（８−メトキシ−２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジンＩＩｅ（０．９ｇ）を得た。
【００９３】
本発明の化合物
【００９４】
【化１０】
2014526453.tif 000013
【００９５】
例Ｉａ１  １−（３−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＩＩａ（１００ｍｇ）、ＰｙＢｒｏＰ（２７７ｍｇ）、３−クロロ−安息香酸（８８．９ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．３ｍＬ）の混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＤＣＭ（５ｍＬ）中で撹拌して、相当するヒドラジド（１５０ｍｇ）を沈殿させた。この材料をアセトニトリル（１０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（０．４ｍＬ）の混合物中に周囲温度で５分間懸濁させた。ＰｈＰＯＣｌ２（０．１３ｍＬ）を添加して、混合物を周囲温度で撹拌して、均質となった。白色固体が沈殿するまで、撹拌を続けた。この材料を濾別して、アセトニトリルで洗浄して、乾燥させた。この材料（１４０ｍｇ）をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解させて、周囲温度で０．５時間、Ｎａ２ＣＯ３（１０ｍｇ）で処理した。次に、空気へと開放させたフラスコ中で容量をおよそ５０％低減させた。沈殿した固体を濾別して、乾燥させて、例Ｉａ１（６０ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．５９分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度１００％／１００％、観察された質量２９６．１。
【００９６】
【化１１】
2014526453.tif 000014
【００９７】
例Ｉａ２  １−（２−クロロ−６−メチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩａ（９０ｍｇ）、ＰｙＢｒｏＰ（２６４ｍｇ）、２−クロロ−６−メチルベンゾイルクロリド（８７ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．７ｍＬ）の混合物をＤＭＦ（２ｍＬ）中で周囲温度で２日間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０／１）で精製して、相当するヒドラジド（８０ｍｇ）を得た。類似の様式で調製したこの材料のより大量部分（１００ｍｇ）をアセトニトリル（５ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（０．４２ｍＬ）の混合物中に溶解させて、周囲温度で５分間、ＰｈＰＯＣｌ２（０．０８ｍＬ）で処理した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０／１）で精製して、例Ｉａ２（８５ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．５５分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度９７．８％／１００％、観察された質量３１０．１。
【００９８】
【化１２】
2014526453.tif 000015
【００９９】
例Ｉａ３  １−（２，６−ジクロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩａ（８０ｍｇ）、ＰｙＢｒｏＰ（２２１ｍｇ）、２，６−ジクロロ−安息香酸（８７ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）の混合物をＤＭＦ中で周囲温度で２日間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０／１）で精製して、相当するヒドラジド（１００ｍｇ）を得た。この材料をアセトニトリル（３ｍＬ）中に懸濁させて、周囲温度で５分間、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ）およびＰｈＰＯＣｌ２（０．０８ｍＬ）で処理した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０／１）で精製して、例Ｉａ３（１５ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３１）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．０７分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度９６．１％／１００％、観察された質量３３０．１。
【０１００】
【化１３】
2014526453.tif 000016
【０１０１】
例Ｉａ４  １−（２，６−ジメチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，６，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＩＩａ（１００ｍｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）の混合物に、２，６−ジメチルベンゾイルクロリド（９６ｍｇ）を添加して、混合物を周囲温度で５分間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０／１）で精製して、相当するヒドラジド（１１４ｍｇ）を得た。この材料４５ｍｇをアセトニトリル（２ｍＬ）中に懸濁させて、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）で５分間、続いてＰｈＰＯＣｌ２（０．１１ｍＬ）で処理した。混合物を分取用ＴＬＣ（溶離液：ペンタン／ＥｔＯＡｃ  １／１）で直接精製して、例Ｉａ４（７．２ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．５４分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度９８．０％／１００％、観察された質量２９０．０。
【０１０２】
【化１４】
2014526453.tif 000017
【０１０３】
例Ｉｂ１  １−（２−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，７，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩｂ（４８０ｍｇ）、２−クロロ−安息香酸（４３０ｍｇ）およびＰｙＢｒｏＰ（１．３３ｇ）の混合物をＤＭＦ（１２ｍＬ）中に懸濁させて、ＤＩＰＥＡ（０．９７ｍＬ）を添加した。混合物を一晩撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＤＣＭ中に懸濁させた。固体を濾別して、ＤＣＭで洗浄して、乾燥させて、２−クロロ−安息香酸Ｎ’−（３−メチル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−２−イル）−ヒドラジド（４００ｍｇ）を黄色固体として得た。この材料を０℃でアセトニトリル（３０ｍＬ）中に懸濁させた。ＤＩＰＥＡ（１．７ｍＬ）およびＰｈＰＯＣｌ２（０．３５ｍＬ）を添加した。混合物を０℃で０．５時間撹拌した後、それを周囲温度に加温して、１０分間撹拌した。揮発性物質の大部分を真空中で除去した。固体を濾別して、アセトニトリルで洗浄して、乾燥させて、固体（０．３ｇ）を得た。この材料をメタノール（３０ｍＬ）中に溶解させて、周囲温度で１時間、Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍｇ）で処理した。固体を濾別して、残渣を真空中で濃縮した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  １０：１）で精製して、例Ｉｂ１（１８０ｍｇ）を白色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．５４分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度９９．０％／１００％、観察された質量２９６．１。
【０１０４】
【化１５】
2014526453.tif 000018
【０１０５】
例Ｉｃ１  １−（２−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，８，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩｃ（２００ｍｇ）、２−クロロ−安息香酸（１７９ｍｇ）およびＰｙＢｒｏＰ（５５４ｍｇ）の混合物をＤＭＦ（７ｍＬ）中に懸濁させた。ＤＩＰＥＡ（０．４１ｍＬ）を添加して、混合物を周囲温度で撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＤＣＭ中に懸濁させた。固体を濾別して、ＤＣＭで洗浄して、乾燥させて、２−クロロ−安息香酸Ｎ’−（２−メチル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジド（３１３ｍｇ）を黄色固体として得た。この材料２５０ｍｇをアセトニトリル（２００ｍＬ）中に懸濁させて、０℃でＤＩＰＥＡ（１．１ｍＬ）およびＰｈＰＯＣｌ２（０．２２ｍＬ）で処理した。１０分後、混合物を周囲温度に加温して、さらに５分間撹拌した。揮発性物質の大部分を真空中で除去した。固体を濾別して、アセトニトリルで洗浄して、乾燥させた。この材料（０．３２ｇ）をメタノール（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２０ｍＬ）の混合物中に溶解させた。Ｎａ２ＣＯ３（３０ｍｇ）および数滴の水を添加して、混合物を周囲温度で０．５時間撹拌した。固体を濾別した。濾液を真空中で濃縮した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  １０：１）で精製して、例Ｉｃ１（１６２ｍｇ）を白色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．５８分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度９４．０％／１００％、観察された質量２９６．１。
【０１０６】
【化１６】
2014526453.tif 000019
【０１０７】
例Ｉｄ１  １−（２−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩＩｄ（４５０ｍｇ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）中に溶解させて、溶液を窒素でフラッシュした後、２−クロロベンズヒドラジド（０．４４ｇ）を添加した。混合物をＭＷ条件下で１５０℃で０．５時間加熱した。粗製混合物を水とＥｔＯＡｃとの間で分配させて、ＮａＨＣＯ３で塩基性化した。固体を濾別して、濾液の有機部分を塩水で洗浄して、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。残渣をシリカ上のクロマトグラフィー（溶離液  １：１のヘプタン／ＥｔＯＡｃ→ＥｔＯＡｃ）で精製して、粘着性固体を得た。この材料をジエチルエーテルおよびＥｔＯＡｃの１０：１の混合物中に懸濁させて、固体を濾別して、乾燥させて、例Ｉｄ１（８２ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３１）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．３３分、ＰＤＡ／ＥＬＳ−純度９７．１％／１００％、観察された質量２９６．２。
【０１０８】
【化１７】
2014526453.tif 000020
【０１０９】
例Ｉｄ２  １−（２，６−ジクロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩｄ（１００ｍｇ）および２，６−ジクロロベンゾイルクロリド（１１８ｍｇ）を使用して、例Ｉｄ３に関して記載されるように調製して、相当するヒドラジド（１７０ｍｇ）を得て、このヒドラジドを例Ｉｄ２（１８ｍｇ）に変換した。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．７７分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９９．０％／１００％、観察された質量３３０．１。
【０１１０】
【化１８】
2014526453.tif 000021
【０１１１】
例Ｉｄ３  １−（２．６−ジメチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＩＩｄ（５０ｍｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）の混合物に、２，６−ジメチルベンゾイルクロリド（４８ｍｇ）を添加して、混合物を周囲温度で５分間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０／１）で精製して、相当するヒドラジド（４５ｍｇ）を得た。この材料をアセトニトリル（２ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）と混合して、周囲温度で３分間、ＰｈＰＯＣｌ２（０．０４ｍＬ）で処理した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ３０／１）で精製して、例Ｉｄ３（１２ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．７８分、ＰＤＡ純度１００％、観察された質量２９０．０。
【０１１２】
【化１９】
2014526453.tif 000022
【０１１３】
例Ｉｄ４  １−（２−クロロ−６−メチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩｄ（９０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．４ｍＬ）をＤＭＦ中に溶解させて、２−クロロ−６−メチルベンゾイルクロリド（１０６ｍｇ）を添加した。混合物を周囲温度で５分間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０：１）で精製して、２−クロロ−６−メチル−安息香酸Ｎ’−（２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジド（１１０ｍｇ）を得た。この材料およびＤＩＰＥＡ（０．２４ｍＬ）をアセトニトリル（２ｍＬ）中で混合して、周囲温度で５分間、ＰｈＰＯＣｌ２（０．１ｍＬ）で処理した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ペンタン／ＥｔＯＡｃ  １：３）で精製して、例Ｉｄ４（６０ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．７９分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９８．４％／１００％、観察された質量３１０．３。
【０１１４】
【化２０】
2014526453.tif 000023
【０１１５】
例Ｉｄ５  １−（３−クロロ−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩｄ（２００ｍｇ）および３−クロロベンゾイルクロリド（２００ｍｇ）を使用して、例Ｉｄ４に関して記載されるように調製して、相当するヒドラジン（１３０ｍｇ）を得た。この材料をアセトニトリル（１０ｍＬ）中に懸濁させて、混合物が均質になり、続いて白色固体が沈殿するまで、ＤＩＰＥＡ（０．４ｍＬ）およびＰｈＰＯＣｌ２（０．１１ｍＬ）で処理した。この材料を濾別して、アセトニトリルで洗浄して、乾燥させた。乾燥させた材料（１７０ｍｇ）をメタノール（２０ｍＬ）中に溶解させて、周囲温度で２時間、Ｎａ２ＣＯ３（１０ｍｇ）で処理した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ／メタノール  ２０：１）で精製して、例Ｉｄ５（３１．２ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法１３２）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．８８分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９９．６％／１００％、観察された質量２９６．２。
【０１１６】
【化２１】
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【０１１７】
例Ｉｄ６  １−（２，６−ジクロロ−４−ヨード−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。４−アミノ−２，６−ジクロロ−フェノール（５０ｇ）を還流下で１８時間、１，４−ジオキサン（０．８Ｌ）中でＢｏｃ２Ｏ（６９ｇ）で処理した後、揮発性物質を真空中で除去して、（３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７０ｇ）を得て、これは、さらに精製することなく次工程に関して使用された。この手順を繰り返して、より多くのこの材料を得た。化合物８６ｇおよび２，６−ジメチルピリジン（４９ｇ）をＤＣＭ（０．９Ｌ）中に溶解させた。Ｔｆ２Ｏ（１０４ｇ）を−７８℃で滴下した。混合物を室温に加温して、その後、それを２時間撹拌した。粗製混合物を水とＤＣＭとの間で分配させた。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  ３０：１）で精製して、トリフルオロ−メタンスルホン酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，６−ジクロロ−フェニルエステル（７３ｇ）を得た。この材料をメタノール（５８０ｍＬ）およびＤＭＦ（３８４ｍＬ）の混合物中でＰｄ（ＤＰＰＦ）Ｃｌ２（４ｇ）、トリエチルアミン（１０２ｍＬ）と混合した。混合物を一酸化炭素の雰囲気下で一晩還流させた後、それを冷却して、真空中で濃縮した。残渣を水とＥｔＯＡｃとの間で分配させた。有機層を塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  ８０：１）で精製して、４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，６−ジクロロ−安息香酸メチルエステル（１２ｇ）を得た。この材料７ｇを３７％ＨＣｌ水（７０ｍＬ）中に溶解させて、水（１００ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（３．７５ｇ）の溶液を０℃で滴下した。混合物を０℃で３０分間撹拌した後、それを濾過して、ヨウ化カリウム（２４ｇ）の予め冷却した溶液に濾液を０℃で添加した。混合物を室温に加温して、一晩撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和ＮａＨＳＯ３水で洗浄した後、それをＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  ５０：１）で精製して、２，６−ジクロロ−４−ヨード−安息香酸メチルエステル（７．９ｇ）を得た。この材料をピリジン（４０ｍＬ）および水（７ｍＬ）の混合物中に溶解させて、１３０℃で３０時間、ヨウ化リチウム（３．２ｇ）で処理した後、揮発性物質を真空中で除去した。残渣を２Ｍ  ＨＣｌ水とＥｔＯＡｃとの間で分配させた。有機層を真空中で濃縮して、２，６−ジクロロ−４−ヨード−安息香酸（３ｇ）を得た。この材料０．５ｇを６０℃で３時間、塩化チオニル（８ｍＬ）中で撹拌した後、過剰の塩化チオニルを真空中で除去した。残渣をエーテルで洗浄して、乾燥させて、２，６−ジクロロ−４−ヨード−ベンゾイルクロリド（０．５３ｇ）を得て、これは、次工程で直接使用された。次工程では、それをＤＭＦ（２０ｍＬ）およびＤＩ��ＥＡ（０．５７ｍＬ）の混合物中に溶解させた。この溶液にＩＩｄ（２７７ｍｇ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去して、残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  １００：１から３０：１）で精製して、２，６−ジクロロ−４−ヨード−安息香酸Ｎ’−（２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジド（２５０ｍｇ）を得た。この手順を繰り返して、より多くの材料を得た。化合物３８０ｍｇを１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中に溶解させた。塩化ホスホリル（４ｍＬ）を添加して、混合物を９０℃で１．５時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＤＣＭと水との間で分配させた。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水で洗浄して、ＮａＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  ２：１）で精製して、例Ｉｄ６（４５．５ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法ＷＸＥ−ＡＢ１０）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝２．３９分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９７．１％／９８．３％、観察された質量４５６．０。
【０１１８】
【化２２】
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【０１１９】
例Ｉｄ７  １−（２−クロロ−４−ヨード−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。塩化チオニル（６ｍＬ）中の２−クロロ−４−ヨード−安息香酸（４７０ｍｇ）の混合物を６０℃で３時間撹拌した。過剰の塩化チオニルを真空中で除去した。残渣をエーテルで洗浄して、乾燥させて、２−クロロ−４−ヨード−ベンゾイルクロリド（０．５ｇ）を得て、これは、次工程で直接使用された。次工程では、それを１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）中に溶解させた。塩化ホスホリル（５ｍＬ）およびＩＩｄ（２４６ｍｇ）を添加して、混合物を９０℃で１．５時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を水とＤＣＭとの間で分配させた。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水で洗浄して、ＮａＳＯ４で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン：ＥｔＯＡｃ  １０：１から５：１）で精製して、例Ｉｄ７（２５０ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法ＷＸＥ−ＡＢ１０）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝２．２６分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９９％／９９％、観察された質量４２２．０。
【０１２０】
【化２３】
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【０１２１】
例Ｉｄ８  １−（２−メチル−フェニル）−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＩＩｄ（４００ｍｇ）をＤＩＰＥＡ（０．８ｍＬ）およびＤＭＦ（８ｍＬ）の混合物中に溶解させた。２−メチル−ベンゾイルクロリド（３６８ｍｇ）を添加して、混合物を周囲温度で０．５時間撹拌した後、揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ２５：１）で精製して、２−メチル−安息香酸Ｎ’−（２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）ヒドラジド（３１０ｍｇ）を得た。この材料１００ｍｇをアセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解させて、ＤＩＰＥＡ（０．２４ｍＬ）およびＰｈＰ（Ｏ）Ｃｌ２（０．０７ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で１５分間撹拌した後、粗製混合物を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＥｔＯＡｃ：ペンタン  ３：２）で精製して、例Ｉｄ８（５ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法ＷＸＥ−ＡＢ０１）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝２．０５分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９５．３％／９５．７％、観察された質量２７６．２。
【０１２２】
【化２４】
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【０１２３】
例Ｉｅ１  １−（２−クロロ−フェニル）−６−メトキシ−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のＩＩｅ（５００ｍｇ）の懸濁液に、化合物２−クロロ−ベンズアルデヒド（３７７ｍｇ）を添加した。混合物を４０℃で２日間撹拌した後、揮発性物質を真空中で除去した。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン／ＥｔＯＡｃ  １：０から０：１）で精製して、Ｎ−［１−（２−クロロ−フェニル）−メチリジン］−Ｎ’−（８−メトキシ−２−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−ヒドラジン（０．５ｇ）を得た。この材料をＤＣＭ（６０ｍＬ）中に溶解させて、（ビスアセトキシ）ヨードベンゼン（５４０ｍｇ）を添加して、反応溶液を室温で一晩撹拌した。揮発性物質を真空中で除去して、残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離液：ペンタン／ＥｔＯＡｃ  １：０から０：１）で精製して、例Ｉｅ１（１００ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法５５０）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝０．５５分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度９０％／１００％、観察された質量３２６．０。
【０１２４】
【化２５】
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【０１２５】
例Ｉｅ２  １−（２−クロロ−６−メチル−フェニル）−６−メトキシ−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のＩＩｅ（０．５ｇ）の懸濁液に、２−クロロ−６−メチル−ベンズアルデヒド化合物（３７７ｍｇ）を添加した。混合物を４０℃で２日間撹拌した後、（ビスアセトキシ）ヨードベンゼン（８６４ｍｇ）を添加して、周囲温度で一晩撹拌を続けた。揮発性物質を真空中で除去して、残渣を分取用ＴＬＣ（溶離液：ＥｔＯＡｃ）で精製して、例Ｉｅ２（１８５ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法ＷＸＥ−ＡＢ０１）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．９分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度１００％／１００％、観察された質量３４０．１。
【０１２６】
【化２６】
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【０１２７】
例Ｉｅ３  １−（２，６−ビスメチル−フェニル）−６−メトキシ−４−メチル−２，３，５，９，９ｂ−ペンタアザ−シクロペンタ［ａ］ナフタレン。ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のＩＩｅ（０．５ｇ）の懸濁液に、２．６−ビスメチル−ベンズアルデヒド（３７７ｍｇ）を添加して、混合物を４０℃で２日間撹拌した後、（ビスアセトキシ）ヨードベンゼン（８６４ｍｇ）を添加して、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。揮発性物質を真空中で除去して、残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ）で精製して、例Ｉｅ３（１７５ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（方法ＷＸＥ−ＡＢ１０）：ＲＴ（ＰＤＡ）＝１．８８分、ＰＤＡ／ＥＬＳ純度１００％／１００％、観察された質量３２０．１。
【０１２８】
ＰＤＥ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明の化合物の阻害活性を、下記方法に関連して決定した。
【０１２９】
ＰＤＥ１０Ａ酵素
活性なＰＤＥ１０Ａ酵素は、ＰＤＥアッセイで使用するために幾つかの方法で調製される（Loughney, K. et al. Gene 1999, 234, 109-117、Fujishige, K. et al. Eur J Biochem. 1999, 266, 1118-1127およびSoderling, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96, 7071-7076）。ＰＤＥ１０Ａは、それらが触媒ドメインを発現する限りは、完全長タンパク質として、または切断型タンパク質として発現させることができる。ＰＤＥ１０Ａは、種々の細胞型で、例えば昆虫細胞または大腸菌(E. coli)で調製することができる。触媒的に活性なＰＤＥ１０Ａを得る方法の例は下記の通りである：ヒトＰＤＥ１０Ａの触媒ドメイン（アクセッション番号ＮＰ００６６５２を有する配列由来のアミノ酸４４０〜７７９）を標準的なＲＴ−ＰＣＲにより総ヒト脳総ＲＮＡから増幅させて、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位へクローニングさせる。大腸菌(coli)における発現は、標準的なプロトコルに従って実施される。簡潔に述べると、発現プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌(E. coli)株へ形質転換させて、細胞を接種した培養物５０ｍＬを０．４〜０．６のＯＤ６００へ成長させた後、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導する。誘導後、室温で一晩細胞をインキュベートして、その後細胞を遠心分離により収集する。ＰＤＥ１０Ａを発現する細胞を１２ｍＬ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ−ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびプロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁させる。細胞を超音波により溶解させて、全ての細胞が溶解した後、Ｎｏｖａｇｅｎのプロトコルに従ってＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を添加する。ＰＤＥ１０ＡをＱセファロース上で部分的に精製して、最も活性な分画をプールした。
【０１３０】
ＰＤＥ１０Ａ阻害アッセイ
典型的なＰＤＥ１０Ａアッセイを下記の通りに実施した：固定量のＰＤＥ２Ａ酵素（環状ヌクレオチド基質の２０〜２５％を変換するのに十分）、緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）、１０ｎＭ  トリチウム標識ｃＡＭＰおよび様々な量の阻害剤を含有するサンプル６０μＬ中でアッセイを実施した。反応は、環状ヌクレオチド基質の添加により開始され、反応は室温で１時間進行させた後、イットリウムシリケート(yttrium silicate)ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０μＬ（０．２ｍｇ）と混合させることにより終結させた。ビーズを暗所に１時間定着させた後、プレートをＷａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンターで計数した。測定したシグナルを、非阻害対照（１００％）に対する活性に変換して、ＸｌＦｉｔ（モデル２０５、ＩＤＢＳ）を使用してＩＣ５０値を算出した。
【０１３１】
ＰＤＥ２Ａ酵素
同様に、活性なヒトＰＤＥ２Ａ酵素（ＡＴＣＣ６８５８５）は、ＰＤＥアッセイで使用するために多数の方法で調製され、手順は当業者に既知である。
【０１３２】
ＰＤＥ２Ａ阻害アッセイ
典型的なＰＤＥ２Ａアッセイは下記の通りに実施した：固定量のＰＤＥ２Ａ酵素（環状ヌクレオチド基質の２０〜２５％を変換するのに十分）、緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１５ｎＭ  トリチウム標識ｃＡＭＰおよび様々な量の阻害剤を含有するサンプル６０μＬ中でアッセイを実施した。反応は、環状ヌクレオチド基質の添加により開始され、反応は室温で１時間進行させた後、イットリウムシリケートＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０μＬ（０．２ｍｇ）と混合させることにより終結させた。ビーズを暗所に１時間定着させた後、プレートをＷａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンターで計数した。測定したシグナルを、非阻害対照（１００％）に対する活性に変換して、ＸｌＦｉｔ（モデル２０５、ＩＤＢＳ）を使用してＩＣ５０値を算出した。
【０１３３】
選択した例に関して得られたデータを、以下の表に列挙する。
【０１３４】
【表２】
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【国際調査報告】
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