(57)【要約】  ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量を低減させる方法であって、短行程蒸留下で、ステロール含有微生物油を蒸留することを含み、前記蒸留は、ステロールを含む蒸留物画分および短行程蒸留に供されていないステロール含有微生物油組成物中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを有するトリアシルグリセロール含有画分を生成する方法が開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量を低減させる方法であって、
ａ）短行程蒸留条件下で、ステロール含有微生物油を少なくとも１回蒸留することであって、前記油は、
（ｉ）１つ以上の多価不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセロール；および、
（ｉｉ）少なくとも３００ｍｇ／油１００ｇのステロール画分；
を含み、
前記蒸留は、前記ステロールを含む蒸留物画分および短行程蒸留に供されていない前記ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを有するトリアシルグリセロール含有画分を生成すること；および
ｂ）場合により、前記トリアシルグリセロール含有画分を回収すること
を含む方法。
【請求項２】
前記短行程蒸留条件が、３０ｍＴｏｒｒ以下の真空レベルおよび３００℃以下の温度におけるステロール含有微生物油の少なくとも１回の通過を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステロール画分が、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロールおよびデスモステロールからなる群から選択される１つ以上のステロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステロール画分が、エルゴステロールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トリアシルグリセロール含有画分中のステロールの量の低減が、前記ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量と比較して少なくとも４０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
低減したステロール画分を有する前記トリアシルグリセロール含有画分が、短行程蒸留に供されていない前記ステロール含有微生物油組成物と比較して改善された澄明性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度が、２８０℃以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ステロール含有微生物油組成物が、誘導結合プラズマ発光分光法により測定して２０ｐｐｍ未満のリンを有するリファインド脂質組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ステロール含有微生物油組成物を、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル菌類、またはそれらの混合物から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロール含有微生物油組成物を、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属からの油性微生物から得る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステロール含有微生物油組成物を、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の生成について遺伝子操作されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蒸留が、前記微生物油組成物の２回以上の連続短行程蒸留を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
それぞれの連続短行程蒸留が、直前の短行程蒸留よりも高い温度におけるものである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８４２号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有する脂質の精製を対象とする。短行程蒸留（ＳＰＤ）を使用して、特に、トリアシルグリセロールが濃縮され、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む微生物油組成物から不所望なステロール（例えば、エルゴステロール）の量を低減させる方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
微生物、例えば糸状菌、酵母および藻類は、脂肪酸、グリセロ脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、ステロール脂質およびプレノール脂質を含む種々の脂質を生成する。これらの脂質の一部を、脂質が生成される微生物細胞から抽出することが有利であり、したがって種々の方法が実施されている。
【０００４】
微生物から一般に抽出される脂質の１つのクラスは、グリセロールの脂肪酸エステル（「トリアシルグリセロール」または「ＴＡＧ」）を含むグリセロ脂質である。ＴＡＧは、脂肪酸についての一次貯蔵単位であり、したがって長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ならびに短鎖飽和および不飽和脂肪酸および長鎖飽和脂肪酸を含有し得る。ＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；ω−３］およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；ω−３］を医薬品および食品に含めることへの関心が高まっている。したがって、ＰＵＦＡを含む脂質組成物を効率的におよびコスト効率的に抽出、リファインおよび精製する手段が、特に望まれる。
【０００５】
多くの典型的な脂質単離手順は、微生物細胞の破砕（例えば、機械的、酵素的または化学的手段を介する）、後続の有機または低公害溶媒を使用する油抽出を含む。破砕プロセスは微生物細胞から細胞内脂質を放出させ、それらを抽出の間に溶媒に容易に接近可能とする。抽出後、溶媒を典型的には除去する（例えば、蒸発により、例えば、真空の適用、温度または圧力の変化などによる）。
【０００６】
得られる抽出油は、脂肪体中に蓄積する親油性構成成分が濃縮される。一般に、脂肪体の主要な構成要素は、ＴＡＧ、エルゴステロールエステル、他のステロールエステル、遊離エルゴステロールおよびリン脂質からなる。脂肪体中に存在するＰＵＦＡは、主にＴＡＧ、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびリン脂質の構成成分としてであるが、遊離脂肪酸の形態でもあり得る。続いて、抽出油をリファインして高度に精製されたＰＵＦＡ濃縮ＴＡＧ画分を生成することができる。精製ＴＡＧ画分に関する最終規格は、用途依存的であり得、例えば、油を添加剤または補助品（例えば、食料組成物、特殊調製粉乳、動物飼料などにおけるもの）として、化粧または医薬組成物などにおいて使用すべきか否かに依存する。許容可能な汚染物質基準は、自ら課す（特定の汚染物質は、不所望な特性、例えばかすみ／混濁、臭気をもたらす）かまたは外部栄養物審議会（例えば、Ａ  Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．），Ｍａｒｃｈ  ２００６は、ω−３ＥＰＡ、ω−３ＤＨＡおよびそれらの混合物についての最大の酸、ペルオキシド、アニシジン、ＴＯＴＯＸ、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシンおよびポリ塩化ジベンゾフランの値を規定する）により決定される。
【０００７】
特許文献１（ＧＩＳＴ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）は、ＰＵＦＡを含む微生物油（例えば、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのもの）を極性溶媒により処理して溶媒中に可溶性である少なくとも１つのステロール（例えば、デスモステロール）を抽出し、次いでステロールを含有する溶媒の少なくとも一部を油から分離し、油は、１．５％未満のステロール含有率を有する方法を記載している。
【０００８】
特許文献２（Ｍａｒｔｅｋ）は、微生物バイオマス（例えば、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））からＰＵＦＡを含む中性脂肪を回収する方法であって、バイオマスを非極性溶媒と接触させて抽出プロセスにおいて脂質を回収する工程、脂質組成物をリファインおよび／または漂白および／または脱臭する工程、極性溶媒を脂質組成物に添加する工程、混合物を冷却して少なくとも１つの他の化合物（例えば、三飽和グリセリド、リン含有材料、ワックスエステル、飽和脂肪酸含有ステロールエステル、ステロール、スクアレン、炭化水素）を選択的に沈殿させ、次いで脂質組成物からこの不所望な化合物の量を低減させる工程を含む方法を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，１６６，２３０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，６９５，６２６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の方法は、ＰＵＦＡ、具体的には高度不飽和脂肪酸の高温への曝露を回避し、微生物油からエルゴステロール（エルゴスタ−５，７，２２−トリエン−３β−オール；ＣＡＳ登録番号５７−８７−４））汚染物質の量を低減させる有効な手段として短行程蒸留の技術を利用しなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の実施形態において、本発明は、ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量を低減させる方法であって、
ａ）短行程蒸留条件下で、ステロール含有微生物油を少なくとも１回蒸留すること（前記油は、
（ｉ）１つ以上の多価不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセロール；および、
（ｉｉ）少なくとも３００ｍｇ／油１００ｇのステロール画分；
を含み、
前記蒸留は、ステロールを含む蒸留物画分および短行程蒸留に供されていないステロール含有微生物油組成物中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを有するトリアシルグリセロール含有画分を生成する）；および
ｂ）場合により、トリアシルグリセロール含有画分を回収すること
を含む方法に関する。
【００１２】
第２の実施形態において、短行程蒸留条件は、３０ｍＴｏｒｒ以下の真空レベルおよび３００℃以下の温度におけるステロール含有微生物油の少なくとも１回の通過を含む。
【００１３】
第３の実施形態において、ステロール画分は、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロールおよびデスモステロールからなる群から選択される１つ以上のステロールを含む。
【００１４】
第４の実施形態において、トリアシルグリセロール含有画分中のステロールの量の低減は、ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量と比較して少なくとも４０％である。好ましくは、トリアシルグリセロール含有画分中のステロールの量の低減は、ステロール含有微生物油組成物中のステロールの量と比較して少なくとも７０％であり、より好ましくは、少なくとも８０％である。
【００１５】
第５の実施形態において、低減したステロール画分を有するトリアシルグリセロール含有画分は、短行程蒸留に供されていないステロール含有微生物油組成物と比較して改善された澄明性を有する。
【００１６】
第６の実施形態において、ステロール含有微生物油組成物は、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル、菌類、またはそれらの混合物から得る。好ましくは、ステロール含有微生物油組成物は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属からの油性微生物から得、より好ましくは、ステロール含有微生物油組成物は、多価不飽和脂肪酸の生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得る。
【００１７】
第７の実施形態において、蒸留工程は、微生物油組成物の２回以上の連続短行程蒸留を含み得る。それぞれの連続短行程蒸留は、直前の短行程蒸留の温度よりも高い温度におけるものであり得る。
【００１８】
生物寄託
以下の生物材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受託番号および寄託日を有する。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
上記列挙した生物学的材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って寄託された。列挙された寄託株は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行為により付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００２１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２から誘導した。同様に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９から誘導した。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の方法の概要をフローチャートの形態で提供する。具体的には、微生物発酵手順は未処理微生物バイオマスを生成し、それを場合により機械的に加工することができる。未処理微生物バイオマスの油抽出は、残留バイオマスおよび抽出油をもたらす。次いで、短行程蒸留（ＳＰＤ）条件を使用する抽出油の蒸留が、精製トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）画分（すなわち、ＳＰＤ精製微生物油）中のステロールの量を低減させる。
【図２】以下の（Ａ）ｐＺＫＵＭ；および（Ｂ）ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎについてのプラスミドマップを提供する。
【００２３】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データについて使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に従う。
【００２４】
配列番号１〜８は、表１に指定するとおり、遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、タンパク質（またはその一部）、またはプラスミドである。
【００２５】
【表２】
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【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書に引用される全ての特許および非特許文献の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００２７】
量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、または好ましい上方値および好ましい下方値の列挙として挙げられる場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関わらず、任意の範囲上限または好ましい上方値と、任意の範囲下限または好ましい下方値との任意のペアから形成される全ての範囲を具体的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が引用されている場合、特に記載のない限り、この範囲は、その終点、および範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。本発明の範囲が、範囲を定義する場合において規定の値に限定されることは意図されない。
【００２８】
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、またはその任意の他の変形は、非排他的包含をカバーするものと意図される。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに必ずしも限定されるものではなく、表現的に列挙されていないかまたはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、表現的に逆の記載がない限り、「または」は、包含的なまたはを指すかまたは排他的なまたはを指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つにより充足される：Ａは真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在せず）、Ｂは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢは真である（または存在する）。
【００２９】
また、本発明の要素または構成成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成成分の例の数（すなわち、出現率）に関して非限定的であると意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含めるように読まれるべきであり、要素または構成成分の単数形の単語形態は、数字が明らかに単数を意味しない限り複数形も含む。
【００３０】
本明細書において使用される用語「発明」または「本発明」は、特許請求の範囲および本明細書に記載の本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されるものと読まれるべきではない。
【００３１】
以下の定義を本開示において使用する：
「二酸化炭素」は「ＣＯ２」と略す。
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略す。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略す。
「リン脂質」は、「ＰＬ」と略す。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略す。本明細書において、用語「トリアシルグリセロール」（ＴＡＧ）は、用語「トリアシルグリセリド」と同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂肪を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに短鎖飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
「遊離脂肪酸」は、「ＦＦＡ」と略す。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略す。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略す。
「乾燥セル重量」は、「ＤＣＷ」と略す。
「ミリｔｏｒｒ」は、「ｍＴｏｒｒ」として略す。
【００３２】
「低減した」という用語は、より小さい量、例えば、元の量よりもほんのわずかに少ない量を有し、または例えば量が規定材料中で完全に欠落すること、および中間の全ての量を含むことを意味する。
【００３３】
本明細書において使用される用語「微生物バイオマス」は、ＰＵＦＡを含むＴＡＧを含む微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズされた細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または破砕細胞の形態であり得る。
【００３４】
用語「未処理微生物バイオマス」は、溶媒による抽出前の微生物バイオマスを指す。場合により、未処理微生物バイオマスは、溶媒による抽出前に少なくとも１つの機械的プロセス（例えば、バイオマスの乾燥、バイオマスの破砕、またはそれらの組合せによる）に供することができる。
【００３５】
本明細書において使用される用語「残留バイオマス」は、溶媒により少なくとも１回抽出された、ＰＵＦＡを含むＴＡＧを含む微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。
【００３６】
用語「脂質」は、任意の脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質は、多くの重要な生物学的機能を有する多様な群の化合物、例えば細胞膜の構造的構成成分、エネルギー保存源、およびシグナル伝達経路中間体である。脂質はケトアシルまたはイソプレン基のいずれかに、完全にまたは部分的に由来する、疎水性または両親媒性の小分子として広く定義することができる。Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）分類体系（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づく脂質の一般的概要を以下の表２に示す。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
用語「ステロール含有微生物油組成物」は、２５℃において液体であり、（ｉ）少なくとも１つのステロール；および（ｉｉ）１つ以上のＰＵＦＡを含むトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）を含む脂質物質を指す。より具体的には、微生物バイオマスに由来するステロール含有微生物油組成物は、１つ以上のステロールを含む、少なくとも３００ｍｇ／油１００ｇのステロール画分を有する。
【００３９】
細胞の膜透過性において機能するステロールは、全ての主要な群の生物から単離されているが、単離される優勢なステロールの多様性が存在する。高等動物における優勢なステロールは、コレステロールである一方、β−シトステロールは一般に高等植物において優勢なステロールである（しかし、カンペステロールおよびスチグマステロールを伴うことも多い）。微生物に見出される優勢なステロールに関する一般化は、より困難である。それというのも、組成が特定の微生物種に依存するためである。例えば、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、主に、エルゴステロールを含み、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ）属の菌類は、主に、コレステロールおよびデスモステロールを含み、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のストラメノパイルは、主に、ブラシカステロールおよびスチグマステロールを含む。ステロール含有微生物油中に見出されることが多いステロールのまとめを以下の表３に示し；対照的に、それらのステロールは、典型的には、魚油中に見出されない。表３のステロールは、ステロール含有微生物油中に存在する場合、高融点およびより低い貯蔵温度において低減した溶解度に起因して微生物油から沈殿する傾向があり、混濁油をもたらす。これらのステロールの濃度を低減させることにより微生物油の不所望な混濁性を最小化することが極めて望ましい。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
好ましいステロール含有微生物油は、１つ以上のステロールを含む、少なくとも３００ｍｇ／油１００ｇのステロール画分を有する。
【００４２】
ステロール含有微生物油組成物は、好ましくは、総脂質中約２５％のＰＵＦＡ、好ましくは、総脂質中少なくとも約３０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中少なくとも約３５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中少なくとも約４０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中少なくとも約４０〜４５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質中少なくとも約４５〜５０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、少なくとも約５０〜６０％のＰＵＦＡ、最も好ましくは、総脂質中少なくとも約６０〜７０％のＰＵＦＡまたはそれ以上も含む。
【００４３】
ステロール含有微生物油組成物は、典型的には微生物発酵により提供される微生物バイオマスに由来する。したがって、本発明において有用なステロール含有微生物油組成物は、水を含み得る。好ましくは、油は、１０重量パーセント未満の含水率、より好ましくは、５重量パーセント未満の含水率、最も好ましくは、３重量パーセント以下の含水率を有する。
【００４４】
油性生物において、油は総脂質の大部分を構成する。「油」は主としてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から構成されるが、他の中性脂肪、リン脂質（ＰＬ）および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）も含有し得る。油中の脂肪酸組成および総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００４５】
「中性脂肪」は、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見出される脂質を指し、細胞のｐＨにおいて脂質は荷電基を担持しないため、そのように称される。一般にこれらは完全に非極性であり、水についての親和性を有さない。中性脂肪は、一般に脂肪酸とのグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールもしくはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とも称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールからＦＦＡを放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００４６】
用語「抽出油」は、油が合成される細胞材料、例えば微生物から分離された油を指す。抽出油は、広範な方法を介して得られ、最も単純なものは物理的手段のみを伴う。例えば、種々のプレス構造（例えばスクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなど）を使用する機械的圧潰が、細胞材料から油を分離し得る。あるいは、油抽出は種々の有機溶媒（例えばヘキサン、イソヘキサン）による処理、酵素的抽出、浸透圧衝撃、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）、鹸化およびそれらの方法の組合せを介して行うことができる。抽出油のさらなる精製または濃縮は、任意選択である。
【００４７】
「リファインド脂質組成物」という用語は、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書に開示される超臨界二酸化炭素（ＣＯ２）抽出の生成物である微生物油組成物を指す。リファインド脂質組成物は、中性脂肪および／または遊離脂肪酸を含み得る一方、リン脂質を実質的に含まない。リファインド脂質組成物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＯＣＳ）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃａ  ２０−９９、標題「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｉｎ  Ｏｉｌ  ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＣＳ，６ｔｈｅｄ．，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ，２００９、参照により本明細書に組み込まれる）により測定して好ましくは、３０ｐｐｍ未満のリン、より好ましくは、２０ｐｐｍ未満のリンを有する。リファインド脂質組成物は、微生物バイオマスの油組成物に対してＴＡＧが濃縮されていてよい。リファインド脂質組成物は、例えば本明細書に記載の短行程蒸留を介するさらなる精製に付して「精製油」を生成することができる。
【００４８】
したがって、本明細書に記載の方法に好ましいステロール含有微生物油組成物は、超臨界ＣＯ２抽出に由来するリファインド脂質組成物であり、リファインド脂質組成物は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含むＴＡＧを含み、少なくとも１つのステロールを含む。
【００４９】
「蒸留」という用語は、混合物を沸騰液体混合物中でのそれらの揮発性の差異に基づき分離する方法を指す。蒸留は、単位操作、または物理的分離プロセスであり、化学反応ではない。
【００５０】
「短行程蒸留」（「ＳＰＤ」と略す）という用語は、極端に高い真空下で操作し、蒸発後に蒸留すべき材料からの揮発性化合物が凝縮表面に短距離のみ移動するようにＳＰＤ装置が蒸発器に近接した内部凝縮器を備える分離法を指す。結果として、この分離法からの熱分解は最小である。
【００５１】
「ＳＰＤ精製油」という用語は、１つ以上のＰＵＦＡを含むトリアシルグリセロール画分を含有する微生物油であって、短行程蒸留条件下での少なくとも１回の蒸留のプロセスに付した微生物油を指す。蒸留プロセスは、短行程蒸留前の油のステロール含有量と比較してＳＰＤ精製油中のステロールの量を低減させる。
【００５２】
本明細書において用語「総脂肪酸（ＴＦＡ）」は、例えば微生物バイオマスまたは油であり得る所与の試料中において、（当技術分野において公知の）塩基エステル交換法により脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化することができる全ての細胞脂肪酸の総和を指す。したがって、総脂肪酸は、（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧを含む）中性脂肪画分からの、および（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分を含む）極性脂質画分からの脂肪酸を含むが、ＦＦＡは含まない。
【００５３】
細胞の「総脂質含有率」という用語は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含有率は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥ（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）の尺度として近似させることができる。したがって総脂質含有率（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、例えばＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００５４】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書においてＴＦＡの重量パーセント（％ＴＦＡ）、例えばＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラムとして表現される。本開示において、特に具体的な記載のない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００５５】
場合によっては、細胞中の所与の脂肪酸含有率をその乾燥細胞重量の重量パーセント（％ＤＣＷ）として表現することが有用である。したがって例えばエイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、以下の式に従って求められる：（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００。しかしながら、乾燥細胞重量の重量パーセント（％ＤＣＷ）としての細胞中の所与の脂肪酸含有率は、以下のとおり近似させることができる：
（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００。
【００５６】
「脂質プロファイル」および「脂質組成」という用語は同義であり、特定の脂質画分、例えば総脂質中または油中などに含有される個々の脂肪酸の量を指し、その量はＴＦＡの重量パーセントとして表現される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
【００５７】
用語「脂肪酸」は、変動する約Ｃ１２からＣ２２の鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の両方も公知である。優勢な鎖長は、Ｃ１６からＣ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である）の簡易表記体系により表される。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）、および「ω−６脂肪酸」（「ω−６」または「ｎ−６」）と「ω−３脂肪酸」（「ω−３」または「ｎ−３」）の区別に関する追加的詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。
【００５８】
本明細書でＰＵＦＡを記載するために使用される命名法を表４に示す。「略記法」と題された欄ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、この目的で１番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸ならびにそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略語、ならびにそれぞれの化合物の化学名をまとめる。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
「高レベルＰＵＦＡ生成」という用語は、微生物宿主の総脂質の少なくとも約２５％のＰＵＦＡ、好ましくは、総脂質の少なくとも約３０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約３５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４０〜４５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４５〜５０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、少なくとも約５０〜６０％のＰＵＦＡ、最も好ましくは、総脂質の少なくとも約６０〜７０％のＰＵＦＡの生成を指す。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でなく；したがって例えばＰＵＦＡは、ＦＦＡとして、またはエステル化形態、例えばアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質で総脂質中に存在し得る。
【００６１】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄＥｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。一般に、油性微生物の細胞油はＳ字形曲線に従い、脂質の濃度は対数後期または初期静止期においてそれが最大に達するまで増加し、次に後期静止期および死滅期中に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％を超えて、油として蓄積することは珍しくない。
【００６２】
ステロール含有微生物油組成物は、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル、菌類、およびそれらの混合物からなる群から選択される微生物宿主細胞に由来し得る。好ましくは、微生物宿主細胞は油性であり、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のメンバーであり得る。「油性酵母」という用語は、油を生成し得る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例には、決して限定されるものではないが、以下の属：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【００６３】
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、成長培地内に存在する全炭素対窒素比に応答して誘発される。油性微生物中で遊離パルミテート（１６：０）のデノボ合成をもたらすこのプロセスについては、米国特許第７，２３８，４８２号明細書において詳述されている。パルミテートは、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を介して形成される、鎖長のより長い飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である。
【００６４】
幅広い脂肪酸（飽和および不飽和脂肪酸、ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む）を、脂肪酸の主要貯蔵単位であるＴＡＧ中に取り込むことができる。本明細書に記載の方法および宿主細胞において、長鎖ＰＵＦＡのＴＡＧ中への取り込みが最も望ましいが、ＰＵＦＡの構造的形態は限定的でない（したがって、例えば、ＥＰＡは、総脂質中にＦＦＡとして、またはエステル化形態、例えばアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質で存在し得る）。より具体的には、本方法の一実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡおよびそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＰＵＦＡのように、少なくともＣ２０鎖長を有する。一実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＰＡおよびＤＨＡからなる群から選択される。
【００６５】
ほとんどのＰＵＦＡは中性脂肪としてＴＡＧ中に取り込まれて脂肪体中に貯蔵される。しかしながら、油性生物中の総ＰＵＦＡの計測は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびＴＡＧ画分中に局在するＰＵＦＡを最低限含むべきであることに留意することが重要である。
【００６６】
少なくとも１つのＰＵＦＡ、例えばＥＰＡ（またはその誘導体）を含み、（本明細書に記載の蒸留に供されていない組成物に対して）低減した量のステロールを有するＳＰＤ精製油は、周知の臨床的および薬学的価値を有する。例えば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３Ａ１号明細書参照。例えば、ＰＵＦＡを含む脂質組成物を、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を防止もしくは治療するために食事代用品または補助品、特に特殊調製粉乳として使用することができる。あるいは、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）を、通常使用において受容者が食事補給について所望量を受容するように配合された調理油、脂肪またはマーガリン中に取り込むことができる。ＰＵＦＡは、特殊調製粉乳、栄養補助品または他の食品中にも取り込むこともでき、抗炎症またはコレステロール低下剤として使用することができる。場合により、組成物は、ヒトまたは動物のいずれかの薬学的使用に使用することができる。
【００６７】
ヒトまたは動物のＰＵＦＡの補給は、添加ＰＵＦＡ、およびそれらの代謝結果のレベルの増加をもたらし得る。例えば、ＥＰＡによる治療は、ＥＰＡのレベルの増加だけでなく、ＥＰＡの下流生成物、例えばエイコサノイド（すなわち、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）、ＤＰＡｎ−３およびＤＨＡのレベルの増加ももたらし得る。複雑な調節機序は、種々のＰＵＦＡを組み合わせ、またはＰＵＦＡの異なるコンジュゲートを添加してそのような機序を防止、制御または克服して個体における所望レベルの規定のＰＵＦＡを達成することを望ましくし得る。
【００６８】
あるいは、ＰＵＦＡ、またはその誘導体は、動物および水産飼料、例えば乾燥飼料、半湿潤および湿潤飼料の合成において利用することができる。それというのも、これらの配合物は、一般に、栄養組成物の少なくとも１〜２％がω−３および／またはω−６ＰＵＦＡであることを要求するためである。
【００６９】
本発明は、短行程蒸留条件を使用するステロール含有微生物油組成物の蒸留を介して、低減した量のステロールを有するＴＡＧ含有画分を含むＳＰＤ精製油を生成する方法に関するが、ステロール含有微生物油組成物自体を得るために有用であり得る関連方法の概要が認識される。図１にフローチャートの形態で図示されるとおり、ほとんどのプロセスは、微生物発酵から開始し、特定の微生物を、成長およびＰＵＦＡの生成を可能とする条件下で培養する。適切な時間において、微生物細胞を発酵容器から回収する。この未処理微生物バイオマスは、種々の手段、例えば、乾燥、破砕、ペレット化などを使用して機械的に加工することができる。次いで、未処理微生物バイオマスの油抽出を実施し、残留バイオマス（例えば、細胞デブリス）および抽出油を生成する。次いで、短行程蒸留条件を使用する抽出油（ステロールおよびＰＵＦＡを含むトリアシルグリセリド［ＴＡＧ］を含有する）の蒸留は、精製ＴＡＧ画分（すなわち、ＳＰＤ精製微生物油）中のステロールの量を低減させる。図１のそれらの態様のそれぞれを以下にさらに詳述する。
【００７０】
本発明において有用なステロール含有微生物油は、典型的には微生物発酵により提供される微生物バイオマスに由来する。微生物バイオマスは、天然か組換えかにかかわらず、所望のＰＵＦＡを含有する脂質を生成し得る、任意の微生物からのものであり得る。好ましくは、微生物は高レベルＰＵＦＡ生成が可能であり得る。
【００７１】
例としてＡＲＡ油の商業的供給源は、典型的には、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（糸状菌）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属（紅藻）の微生物から生成される。最も注目すべきことに、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）はＡＲＡ含有真菌油（ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）；米国特許第５，６５８，７６７号明細書）を生成し、これは実質的にＥＰＡを含まず、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）またはピシウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｕｏｓｕｍ）のいずれかに由来する。
【００７２】
同様に、ＥＰＡは、利用される規定の微生物の天然能力に基づく多数の異なる方法を介して、微生物を利用して生成することができる［例えば、従属栄養珪藻キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種（米国特許第５，２４４，９２１号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）種またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種（米国特許第５，２４６，８４１号明細書）；ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の糸状菌（米国特許第５，２４６，８４２号明細書）；またはモルティエラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、またはＭ．ハイグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）（米国特許第５，４０１，６４６号明細書）；およびナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属の真正眼点藻（Ｋｒｉｅｎｉｔｚ，Ｌ．ａｎｄ  Ｍ．Ｗｉｒｔｈ，Ｌｉｍｎｏｌｏｇｉｃａ，３６：２０４−２１０（２００６））］。
【００７３】
ＤＨＡも、天然微生物の天然能力に基づく方法を使用して生成することができる。例えばシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（米国特許第５，３４０，７４２号明細書；米国特許第６，５８２，９４１号明細書）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）（米国特許第６，５０９，１７８号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種ＹＳ−１８０（米国特許第６，２０７，４４１号明細書）；スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＬＦＦ１株（米国特許出願公開第２００４／０１６１８３１Ａ１号明細書）；クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）（米国特許出願公開第２００４／００７２３３０Ａ１号明細書；ｄｅＳｗａａｆ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．，８１（６）：６６６−７２（２００３）およびＡｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６１（１）：４０−３（２００３））；エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）種（特開平５−３０８９７８号公報（１９９３））；およびジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ＃２８２０７；特開１９９５８８／１９８９号公報］について開発された方法参照。さらに以下の微生物がＤＨＡ生成能を有することが公知である：ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（深海から単離された細菌；ＡＴＣＣ＃１５３８１）；微小藻類キクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）；ならびに鞭毛菌類、例えばスラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３４３０４；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌｉｐｉｄｓ，２７：１５（１９９２））およびＡＴＣＣ＃２８２１１、ＡＴＣＣ＃２０８９０、およびＡＴＣＣ＃２０８９１と称されるスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種。現在、ＤＨＡを商業生成する少なくとも３つの異なる発酵法が存在する：ＤＨＡＳＣＯ（商標）を生成するためのＣ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）；以前にＤＨＡＧｏｌｄとして公知の油を生成するためのシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；およびＤＨＡｃｔｉｖｅ（商標）を生成するためのウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）種の発酵（Ｎｕｔｒｉｎｏｖａ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００７４】
組換え手段を使用するＰＵＦＡの微生物生成は、天然微生物源からの生成と比べて、いくつかの利点を有することが予期される。例えば、宿主中への新しい生合成経路の導入により、および／また不所望な経路の抑制により宿主の天然の微生物脂肪酸プロファイルを変えることができ、それにより所望のＰＵＦＡ（またはそのコンジュゲート形態）の生成レベルの増加および不所望なＰＵＦＡの生成の減少がもたらされるため、油生成に好ましい特徴を有する組換え微生物を使用し得る。第２に組換え微生物は、規定の用途を有し得る特定形態でＰＵＦＡを提供し得る。さらに培養条件を制御することにより、とりわけ微生物により発現される酵素のための特定基質源を提供することにより、または化合物／遺伝子操作を付加して不所望な生化学的経路を抑制することにより、微生物油生成を操作することができる。したがって、例えば、こうして生成されるω−３脂肪酸とω−６脂肪酸との比を改変し、または他のＰＵＦＡの下流もしくは上流生成物の顕著な蓄積なしに、規定のＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の生成を遺伝子操作することが可能である。
【００７５】
したがって、例えば、適切なＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、例えばδ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよびＣ２０／２２エロンガーゼの規定の組合せを導入することにより、ＥＰＡを生成する天然能力を欠く微生物を遺伝子操作してＰＵＦＡ生合成経路を発現
させることができるが、導入される規定の酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）は、本発明を決して限定するものではないと認識されるべきである。
【００７６】
いくつかの酵母が、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成するように組換え遺伝子操作されている。例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）および油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，４６５，５６４号明細書；米国特許第７，５８８，９３１号明細書；米国特許第７，９３２，０７７号明細書；米国特許第７，５５０，２８６号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；および米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書）における研究参照。
【００７７】
一部の実施形態において、微生物宿主細胞が油性である場合に利点が認識される。油性酵母は天然で油合成および蓄積が可能であり、総油含有率は、細胞乾燥重量の約２５％を超えて、より好ましくは、細胞乾燥重量の約３０％を超えて、最も好ましくは、細胞乾燥重量の約４０％を超えて構成し得る。代替実施形態において、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非油性酵母を、細胞乾燥重量の２５％を超える油を生成し得るように、それを遺伝子操作して油性にすることができる（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
【００７８】
典型的に油性酵母として同定される属には、限定されるものではないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。より具体的には、例証的な油合成酵母には、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が含まれる。
【００７９】
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり；さらなる実施形態において、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−９（２００２））。
【００８０】
一部の実施形態において、油性酵母は「高レベル生成」が可能であることが望ましいことがあり、生物は総脂質の少なくとも約５〜１０％の所望のＰＵＦＡ（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３および／またはＤＨＡ）を生成し得る。より好ましくは、油性酵母は、総脂質の少なくとも約１０〜７０％の所望のＰＵＦＡを生成する。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でないが、好ましくは、ＴＡＧはＰＵＦＡを含む。
【００８１】
したがって、本明細書に記載のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、および遺伝子産物は、異種微生物宿主細胞中、特に油性酵母細胞（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中で生成することができる。組換え微生物宿主中における発現は、種々のＰＵＦＡ経路中間体を生成するのに、または従来は宿主を使用して可能でなかった新しい生成物を合成するために宿主中に既存のＰＵＦＡ経路をモジュレートするのに、有用であり得る。
【００８２】
上記に提供される引用教示に基づき、好ましいω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成のために多数の油性酵母を遺伝子操作することができるが、油性酵母の代表的ＰＵＦＡ生成株であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）について表５に記載する。これらの株は、以下のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子：δ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼの種々の組合せを有するが、導入される規定の酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）および生成される規定のＰＵＦＡは、決して本発明を限定するものではないことが認識されるべきである。
【００８３】
【表６】
2014510166.tif 000008
【００８４】
【表７】
2014510166.tif 000009
【００８５】
ＰＵＦＡ生合成経路を油性酵母中に導入する手段は周知であるため、当業者は、本発明の方法論が、上記のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株にも、本発明が実証される種（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））または属（すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ））にも限定されないことを認識する。それよりむしろ、ＰＵＦＡを生成し得る、任意の油性酵母または任意の他の好適な微生物が、本方法論において使用するのに同等に好適である。
【００８６】
所望のＰＵＦＡを含有する脂質を生成する微生物種は、ＰＵＦＡが微生物により生成される条件下で発酵培地中で培養し、成長させることができる。典型的には、微生物に炭素および窒素源を、微生物の成長および／またはＰＵＦＡの生成を可能とする多数の追加の化学物質または物質とともにフィードする。発酵条件は、上記引用において記載されるとおり使用される微生物に依存し、得られるバイオマス中のＰＵＦＡの高い含有率について最適化することができる。
【００８７】
一般に、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成期の長さ、油蓄積相の長さ、ならびに細胞回収時期および方法を改変することにより、培地条件を最適化することができる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、複合培地、例えば酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ）中で、または限定最小培地（例えば成長に必要な構成成分を欠き、それによりＰＵＦＡの生成を可能にする所望の組換え発現カセットの選択を強制する、酵母窒素原礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＩＭ））中で成長させる。
【００８８】
所望量のＰＵＦＡが微生物により生成された場合、発酵培地を処理してＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを得ることができる。例えば、発酵培地を濾過し、または別の方法により処理して水性構成成分の少なくとも一部を除去することができる。発酵培地および／または微生物バイオマスを低温殺菌し、または他の手段により処理して、微生物油および／またはＰＵＦＡ生成物を損ない得る、内在微生物酵素の活性を低減させることができる。
【００８９】
微生物バイオマスは、例えば、バイオマスの乾燥、バイオマスの破砕（例えば、細胞溶解を介する）、バイオマスのペレット化、またはそれらの組合せにより機械的に加工することができる。未処理微生物バイオマスは、例えば、所望の含水率に乾燥させ、容易な取扱のために造粒もしくはペレット化し、および／または例えば物理的手段、例えばビードビーター、スクリュー押出などを介して機械的に破砕して細胞内容物へのより大きい接近可能性を提供することができる。微生物バイオマスは、油抽出を依然として行っていないため、いかなる機械的加工の後であっても未処理バイオマスと称する。
【００９０】
米国仮特許出願第６１／４４１，８３６号明細書（代理人整理番号ＣＬ５０５３ＵＳＰＲＶ、２０１１年２月１１日に出願）および米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号明細書（代理人整理番号ＣＬ５０５３ＵＳＮＡ（本願と同時出願）（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のとおり、機械的加工の好ましい方法は、吸油し得る粉砕剤（例えば、シリカ、ケイ酸塩）を用いる乾燥酵母の２軸スクリュー押出を行って破砕バイオマス混合物を提供し、次いで結合剤（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、可溶性デンプン）を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供し、続いて固定可能な混合物から固体ペレット（例えば、約１ｍｍ直径×６〜１０ｍｍ長さのもの）を形成することを含む。
【００９１】
任意選択の機械的加工後、微生物油を、油を生成した微生物中に存在し得る他の細胞材料から抽出を介して分離する。未処理バイオマスから微生物油を抽出するための手段は、当技術分野において周知である。これらの方法は、残留バイオマス（すなわち、細胞デブリスなど）および抽出油をもたらし；好ましい方法は、溶媒抽出に依拠する。
【００９２】
より好ましい実施形態において、超臨界ＣＯ２抽出を、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書に開示されるとおり実施する。この特定の方法論は、未処理微生物バイオマスを溶媒抽出に供してリン脂質および残留バイオマスを除去し、次いで得られた抽出物を分別して少なくとも１つのＰＵＦＡを有するリファインド脂質組成物を有する抽出油を生成し、リファインド脂質組成物は未処理微生物バイオマスの油組成物に対してＴＡＧが濃縮されている。
【００９３】
一部の実施形態において、抽出油は、さらなる加工工程、例えば脱ガム処理（例えば、リン酸を使用）、漂白（例えば、シリカまたはクレーを用いる）、および／または脱臭に付してリファインド脂質組成物をもたらすことができる。
【００９４】
本発明によれば、次いで、抽出油またはリファインド脂質組成物を、短行程蒸留条件下で蒸留に供する。具体的には、蒸留工程は、短行程蒸留（ＳＰＤ）蒸留器を介するステロール含有微生物油の少なくとも１回の通過を含む。市販のＳＰＤ蒸留器は、化学エンジニアリングの技術分野において周知である。好適な蒸留器は、例えば、Ｐｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）から入手可能である。ＳＰＤ蒸留器は、蒸発器および凝縮器を含む。典型的な蒸留は、蒸発器の温度、凝縮器の温度、蒸留器中への油のフィード速度および蒸発器の真空レベルにより制御する。
【００９５】
当業者が認識するとおり、ＳＰＤ蒸留器を介する通過の数は、ステロール含有微生物油の水分のレベルに依存する。含水率が低ければ、ＳＰＤ蒸留器を介する単一の通過で十分であり得る。
【００９６】
しかしながら、好ましくは、蒸留は、ＳＰＤ蒸発器を介するステロール含有微生物油の２回以上の連続通過を含む複数回通過プロセスである。第１の通過は、典型的には、約１から５０ｔｏｒｒ圧、好ましくは、約５から３０ｔｏｒｒ圧下で、蒸発器の比較的低い表面温度、例えば、約１００から１５０℃で実施する。このことは、残留水および低分子量有機材料が蒸留されるため、脱水油をもたらす。次いで、脱水油を蒸発器のより高温およびより低圧において蒸留器を介して通過させてステロールが濃縮された蒸留物画分および短行程蒸留に供されていない油と比較して低減した量のステロールを有するＴＡＧ含有画分を提供する。ＴＡＧ含有画分の追加の通過は、蒸留器を介して行ってさらなるステロールを除去することができる。それぞれの追加の通過について、蒸留温度は、直前の蒸留の温度に対して増加させることができる。好ましくは、ステロール画分の量の低減が、ステロール含有微生物油のステロール画分と比較して少なくとも約４０％〜７０％、好ましくは、少なくとも約７０％〜８０％、より好ましくは、約８０％超になるように十分な通過を実施する。
【００９７】
好ましくは、ＳＰＤ条件は、３０ｍＴｏｒｒ以下、好ましくは、５ｍＴｏｒｒ以下の真空レベルにおけるステロール含有微生物油の少なくとも１回の通過を含む。好ましくは、ＳＰＤ条件は、約２２０から３００℃、好ましくは、約２４０から２８０℃における少なくとも１回の通過を含む。
【００９８】
ＳＰＤプロセスは、ＳＰＤに供されなかったステロール含有微生物油組成物と比較して改善された澄明性を有する低減したステロール画分を有するＴＡＧ含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製油）をもたらす。改善された澄明性は、油の混濁性または不透明性の欠落を指す。ステロール含有微生物油は、約１０℃未満の温度における貯蔵時に、低温における油中のステロールの低減した溶解度に起因して混濁する。蒸発プロセスは、得られるＴＡＧ含有画分が低減した量の存在するステロールを有し、したがって約１０℃における貯蔵時に澄明なままであるか、または実質的に澄明であるようにステロール画分の実質的部分を除去するように作用する。油の澄明性を評価するために使用することができる試験法は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＯＣＳ）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｃ  １１−５３（“Ｃｏｌｄ  Ｔｅｓｔ”，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＣＳ，６ｔｈｅｄ．，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ，２００９、参照により本明細書に組み込まれる）である。
【００９９】
驚くべきことに、蒸留プロセスにおけるステロールの量の低減は、高度不飽和脂肪酸、例えばＥＰＡが濃縮された油の顕著な分解なしで達成することができる。油の分解は、ＰＵＦＡ含有率およびクロマトグラフィープロファイリング（以下実施例３に実証）に基づき評価することができる。
【０１００】
ＴＡＧ含有画分の回収は、蒸発器を介する通過の完了後に画分を好適な容器に迂回させることにより達成することができる。
【実施例】
【０１０１】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ挙げられるものと理解すべきである。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認してその趣旨および範囲を逸脱することなく本発明の種々の変更および改変を行い、それを種々の使用および条件に適応させることができる。
【０１０２】
以下の略語を使用する：「Ｃ」は摂氏であり、「ｍｍ」はミリメートルであり、「μｍ」はマイクロメートルであり、「μＬ」はマイクロリットルであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「Ｌ」はリットルであり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｍＭ」はミリモル濃度であり、「ｍＴｏｒｒ」はミリＴｏｒｒであり、「ｃｍ」はセンチメートルであり、「ｇ」はグラムであり、「ｗｔ」は重量であり、「ｈ」または「ｈｒ」は時間であり、「ｔｅｍｐ」または「Ｔ」は温度であり、「ｉ．ｄ．」は内径である。
【０１０３】
実施例１Ａ
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株からのＥＰＡを含む未処理微生物バイオマスの調製
本実施例は、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株および２段階流加プロセスを使用するこの株を培養するために使用された手段を記載する。微生物バイオマスを前処理して５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを有する乾燥未処理微生物バイオマスをもたらした。
【０１０４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の遺伝子型
Ｙ９５０２株の作製は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ９５０２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを生成し得た。
【０１０５】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ９５０２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ｕｎｋｎｏｗｎ９−、ｕｎｋｎｏｗｎ１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹＩＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。上記発現カセットの構造は、簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」により表され、Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結する。略語は、以下のとおりである：ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）δ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）δ−９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由��する合成突然変異体δ−８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化δ−８デサチュラーゼ遺伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９δ−９エロンガーゼ（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）と、δ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、δ−９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前出）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）δ−９エロンガーゼ［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する合成突然変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］であり；ＥａＤ５ＳＭは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］に由来する合成突然変異体Δ５デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）δ−１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１７デサチュラーゼ遺伝子であり；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］であり；ＭＣＳは、ヘアリーベッチ根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来するコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子であり；ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【０１０６】
Ｙ９５０２株の総脂質含有率および組成の詳述な分析のために、細胞を２段階で合計７日間成長させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ９５０２株は３．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生成し、細胞の総脂質含有率は３７．１［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は２１．３であり、それぞれの脂肪酸濃度をＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（パルミテート）は２．５、１６：１（パルミトレイン酸）は０．５、１８：０（ステアリン酸）は２．９、１８：１（オレイン酸）は５．０、１８：２（ＬＡ）は１２．７、ＡＬＡは０．９、ＥＤＡは３．５、ＤＧＬＡは３．３、ＡＲＡは０．８、ＥＴｒＡは０．７、ＥＴＡは２．４、ＥＰＡは５７．０、その他は７．５。
【０１０７】
Ｙ９５０２株からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の作製
株からのＺ１９７８株の開発は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／２１８５９１号明細書（代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＮＡ、２０１１年８月２６日出願）および同第１３／２１８７０８号明細書（代理人整理番号ＣＬ５４１１ＵＳＮＡ、２０１１年８月２６日出願）に記載されている。
【０１０８】
具体的には、Ｙ９５０２株のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図２Ａ；配列番号１；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載）を使用してＵｒａ３突然変異体遺伝子をＹ９５０２株のＵｒａ３遺伝子中に統合した。形質転換は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の方法論に従って実施した。合計２７個の形質転換体（８つの形質転換体を含む第１の群、８つの形質転換体を含む第２の群、および１１個の形質転換体を含む第３の群から選択）を、５−フルオロオロチン酸［「ＦＯＡ」］プレート（ＦＯＡプレートは、１リットル当たり以下を含む：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素原礎培地、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジンおよび１００ｍｇ／Ｌから１０００ｍｇ／Ｌの濃度の範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく適切量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）（それというのも、供給業者から受容したそれぞれのバッチ内で変動が生じるためである））上で成長させた。さらなる実験は、形質転換体の第３の群のみが実際のＵｒａ−表現型を有することを決定した。
【０１０９】
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のため、細胞を遠心分離により回収し、脂質をＢｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載のとおり抽出した。脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を、ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換により調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、続いて３０−ｍＸ０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣにより分析した。オーブン温度は３．５℃／ｍｉｎにおいて１７０℃（２５ｍｉｎ保持）から１８５℃であった。
【０１１０】
直接的な塩基エステル交換のため、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、蒸留水中で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で真空下で５〜１０分間乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）および既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５，Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に添加し、次いで試料をボルテックスに付し、５０℃において３０分間ロックした。３滴の１ＭのＮａＣｌおよび４００μｌのヘキサンの添加後、試料をボルテックスに付し、回転させた。上層を取り出し、ＧＣにより分析した（前出）。
【０１１１】
あるいは、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載の塩基触媒エステル交換法の改変を、発酵またはフレーク試料からのブロス試料の定型分析に使用した。具体的には、ブロス試料を室温水中で急速解凍し、次いで０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心チューブフィルター（カタログ番号８１６１）を有するタール塗布２ｍＬ微小遠心チューブ中に（０．１ｍｇに）秤量した。予め測定されたＤＣＷに応じて、試料（７５〜８００μｌ）を使用した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４３０遠心分離機を使用して、試料を１４０００ｒｐｍにおいて５〜７分間または必要な限り遠心分離してブロスを取り出した。フィルターを取り出し、液体を抜き、約５００μｌの脱イオン水をフィルターに添加して試料を洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再度取り出し、液体を抜き、フィルターを再挿入した。次いで、チューブを遠心分離機中に再挿入し、このときは頂部を開放し、約３〜５分間乾燥させた。次いで、フィルターをチューブの約１／２の箇所で切断し、新たな２ｍＬ丸底Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（カタログ番号２２３６３３５−２）中に挿入した。
【０１１２】
切断フィルター容器の周縁に接触するにすぎないが、試料またはフィルター材料に接触しない適切なツールによりフィルターをチューブの底部に押圧した。トルエン中の既知量のＣ１５：０ＴＡＧ（前出）を添加し、５００μｌの新たに作製された１％のナトリウムメトキシドのメタノール中溶液を添加した。試料ペレットを適切なツールにより完全に崩壊させ、チューブを密閉し、５０℃加熱ブロック（ＶＷＲカタログ番号１２６２１−０８８）中に３０分間装入した。次いで、チューブを少なくとも５分間冷却させた。次いで、４００μｌのヘキサンおよび５００μｌの１ＭのＮａＣｌの水中溶液を添加し、チューブを２回６秒間ボルテックスに付し、１分間遠心分離した。約１５０μｌの頂部（有機）層をインサートを有するＧＣバイアル中に装入し、ＧＣにより分析した。
【０１１３】
ＧＣ分析を介して記録されたＦＡＭＥピークを、既知の脂肪酸と比較したその滞留時間により特定し、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部標準（Ｃ１５：０ＴＡＧ）と比較することにより定量した。したがって、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（μｇ）［「μｇＦＡＭＥ」］は式：（規定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ）に従って算出する一方、Ｃ１５：０ＴＡＧの１μｇは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇＦＡ」］は式：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３に従って算出する。０．９５０３の変換係数は、０．９５から０．９６の範囲であるほとんどの脂肪酸について決定される値の近似であることに留意されたい。
【０１１４】
それぞれの個々の脂肪酸の量をＴＦＡの重量パーセントとしてまとめる脂質プロファイルを、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の総和により割って１００を掛けることにより決定した。
【０１１５】
このように、ＧＣ分析は、第３群のｐＺＫＵＭ−形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０および＃１１にそれぞれ２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％および２９．６％のＥＰＡのＴＦＡが存在することを示した。これらの７つの株を、Ｙ９５０２Ｕ１２、Ｙ９５０２Ｕ１４、Ｙ９５０２Ｕ１７、Ｙ９５０２Ｕ１８、Ｙ９５０２Ｕ１９、Ｙ９５０２Ｕ２１およびＹ９５０２Ｕ２２株（集合的にＹ９５０２Ｕ）株とそれぞれ命名した。
【０１１６】
次いで、構築物ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ（図２Ｂ；配列番号２）を作製して１つのδ−９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および１つのδ−９エロンガーゼ突然変異体遺伝子をＹ９５０２Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２１）に統合した。ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎプラスミドは、以下の構成成分を含有した：
【０１１７】
【表８】
2014510166.tif 000010
【０１１８】
ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩにより消化し、次いでＹ９５０２Ｕ１７株の形質転換に使用した。形質転換体細胞を最小培地［「ＭＭ」］プレート上にプレーティングし、３０℃に３〜４日間維持した（最小培地は、１リットル当たり：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸を有さない酵母窒素原礎培地、１．０ｇのプロリン、およびｐＨ６．１（調整不要）を含む）。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線し、次いで液体ＭＭ中に３０℃において接種し、２５０ｒｐｍ／ｍｉｎにおいて２日間振とうさせた。細胞を遠心分離により回収し、高グルコース培地［「ＨＧＭ」］中で再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／ｍｉｎにおいて５日間振とうさせた（高グルコース培地は、１リットル当たり：８０ｇのグルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整不要）を含む）。細胞を上記の脂肪酸分析に供した。
【０１１９】
ＧＣ分析は、選択された９６個のｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎを有するＹ９５０２Ｕ１７の株のほとんどが５０〜５６％のＥＰＡのＴＦＡを生成することを示した。５９．０％、５６．６％、５８．９％、５６．５％、および５７．６％のＥＰＡのＴＦＡを生成した５つの株（すなわち、＃３１、＃３２、＃３５、＃７０および＃８０）を、それぞれＺ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１と命名した。
【０１２０】
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するこれらのｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ形質転換体株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ｕｎｋｎｏｗｎ９−、ｕｎｋｎｏｗｎ１０−、ｕｎｋｎｏｗｎ１１−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０１２１】
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１株のＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２）のノックアウトは、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎによる形質転換により生成されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０１２２】
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１株のＹＰＤプレートからの細胞を、成長させ、以下の方法論に従って総脂質含有率および組成について分析した。
【０１２３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の特定株の総脂質含有率および組成の詳細な分析のため、フラスコアッセイを以下のとおり実施した。具体的には、新たに画線された細胞の１つのループを３ｍＬの発酵培地［「ＦＭ」］培地中に接種し、２５０ｒｐｍおよび３０℃において一晩成長させた（発酵培地は、１リットル当たり：６．７０ｇ／Ｌの酵母窒素原礎培地、６．００ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．００ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２０ｇのグルコースおよび５．００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）を含む）。ＯＤ６００ｎｍを計測し、細胞のアリコートを１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＦＭ培地で０．３の最終ＯＤ６００ｎｍまで添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃におけるシェーカーインキュベーターにおける２日後、６ｍＬの培養物を遠心分離により回収し、１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＨＧＭ中で再懸濁した。２５０ｒｐｍおよび３０℃におけるシェーカーインキュベーターにおける５日後、１ｍＬのアリコートを脂肪酸分析（前出）に使用し、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］測定のために１０ｍＬを乾燥させた。
【０１２４】
ＤＣＷ測定のため、１０ｍＬの培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機中のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ローター中で４０００ｒｐｍにおける５分間の遠心分離により回収した。ペレットを２５ｍＬの水中で再懸濁し、上記のとおり再回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水中で再懸濁し、事前に秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を真空オーブン中で８０℃において一晩乾燥させた。細胞の重量を測定した。
【０１２５】
細胞の総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を算出し、ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］および乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］をまとめるデータとともに考察した。
【０１２６】
したがって、以下の表７は、フラスコアッセイにより測定されたＺ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１株の総脂質含有率および組成をまとめる。具体的には、この表は、細胞の総乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］および乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］をまとめる。
【０１２７】
【表９】
2014510166.tif 000011
【０１２８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の発酵：振とうフラスコ中で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の凍結培養物から接種材料を調製した。インキュベーション期間後、培養物を使用して種発酵槽に接種した。種培養物が適切な標的細胞密度に達したとき、次いでそれを使用してより大きな発酵槽に接種した。発酵は、２段階流加法であった。第１の段階において、高細胞密度への急速成長を促進する条件下で酵母を培養し；培養培地は、グルコース、種々の窒素源、微量金属、およびビタミンを含むものであった。第２の段階において、酵母を窒素飢餓状態にし、グルコースを連続的にフィードして脂質およびＰＵＦＡの蓄積を促進した。標準操作条件につき温度（３０〜３２℃に制御）、ｐＨ（５〜７に制御）、溶解酸素濃度およびグルコース濃度を含むプロセス可変要素をモニタリングおよび制御して一貫したプロセス性能および最終ＰＵＦＡ油の品質を確保した。
【０１２９】
発酵当業者は、発酵ラン自体、培地条件、プロセスパラメーター、スケールアップなど、ならびに培養物をサンプリングする特定の時点に応じて規定のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の油プロファイルに変動が起きることを把握する（例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書参照）。
【０１３０】
発酵後、酵母バイオマスを脱水および洗浄して塩および残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小化した。次いで、ドラム乾燥させて水分を５％未満に低減させて短期貯蔵および輸送の間の油安定性を確保した。
【０１３１】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株のバイオマスの特性決定
乾燥未処理酵母バイオマスの脂肪酸組成を、以下のガスクロマトグラフィー［「ＧＣ」］法を使用して分析した。具体的には、トリグリセリドを、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用するエステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に変換した。得られたＦＡＭＥを、トルエン／ヘキサン（２：３）中での希釈後に３０−ｍＸ０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＯＭＥＧＡＷＡＸ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０  ＧＣを使用して分析した。オーブン温度を５℃／ｍｉｎにおいて１６０℃から２００℃、次いで１０℃／ｍｉｎにおいて２００℃から２５０℃（１０分間保持）増加させた。
【０１３２】
ＧＣ分析を介して記録されたＦＡＭＥピークは、既知のメチルエステル［「ＭＥ」］と比較してそれらの保持時間により同定し、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部標準（Ｃ１５：０トリグリセリド、試料についてエステル交換手順を介して採取）と比較することにより定量した。したがって、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（ｍｇ）［「ｍｇＦＡＭＥ」］は、式：（規定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／１５：０ＦＡＭＥピーク面積）＊（内部標準Ｃ１５：０ＦＡＭＥのｍｇ）に従って算出する。次いで、ＦＡＭＥ結果を、１．０４２〜１．０５２の適切な分子量変換係数により割ることにより対応する脂肪酸のｍｇに補正することができる。
【０１３３】
ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの個々の脂肪酸の量をまとめる脂質プロファイルは、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の総和により割り、１００を掛けることにより（±０．１重量％以内に）近似させた。
【０１３４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株からの乾燥未処理酵母バイオマスは、表８に示すとおり、５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含有した。
【０１３５】
【表１０】
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【０１３６】
実施例１Ｂ
未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスからの低減したステロール含有率を有するＳＰＤ精製微生物油の調製
本実施例は、実施例１Ａの乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスを、押出およびペレット化を介して破砕し、超臨界流体抽出［「ＳＣＦＥ」］を使用して油を抽出し、短行程蒸留条件を使用する蒸留により油のステロール含有率を低減させるために使用された手段を記載する。
【０１３７】
乾燥未処理酵母バイオマスの押出を介する破砕およびペレット化
実施例１Ａの乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスを、２軸スクリュー押出機にフィードした。具体的には、８４重量パーセントの酵母（約３９％の総微生物油を含有）および１６％の珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４；ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）の混合物を、４０ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−４０ｍｍ  ＭＣ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２３ｋｇ／ｈｒの速度においてフィードした。２６．５％のスクロースから作製された水／スクロース溶液を、押出機の破砕帯域後に７０ｍＬ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、３７ｋＷモ−ターおよび高トルクシャフトにより、１４０ｒｐｍにおいて稼働させた。％トルク範囲は１７〜２２であった。得られた破砕酵母粉末を、最終水冷バレル中で３５℃に冷却した。湿潤押出粉末を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンから組み立てられ、８０ＰＲＭに設定されたＬＣＩ  Ｍｕｌｔｉ−Ｇｒａｎｕｌａｔｏｒモデル番号ＭＧ−５５（ＬＣＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）中にフィードした。押出物を、２７ｋｇ／ｈｒ、定常２．２アンペア電流の流れにおいて形成し、慣用の乾燥装置を使用して乾燥させた。約１ｍｍの直径×６から１０ｍｍの長さの乾燥ペレットは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＡ３５水分分析装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により計測して１．７％の最終含水率を有した。
【０１３８】
押出酵母バイオマスの抽出
押出酵母ペレットを、抽出溶媒としての超臨界流体相二酸化炭素（ＣＯ２）を使用して抽出してＥＰＡを含有するトリグリセリド濃縮抽出油を生成した。具体的には、酵母ペレットを３２０Ｌステンレス鋼抽出容器に装填し、ポリエステルフォーム濾過マット（Ａｅｒｏ−Ｆｌｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ＩＮ）のプラグ間に充填した。容器を密封し、次いでＣＯ２を市販の圧縮器（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）により熱交換器（予熱器）を介して計量供給し、垂直抽出容器中にフィードして破砕酵母のペレットからトリグリセリド濃縮油を抽出した。抽出温度は予熱器により制御し、抽出圧力は抽出容器と分別器容器との間に位置する自動制御弁（Ｋａｍｍｅｒ）により維持した。ＣＯ２および油抽出物は、この制御弁を介して低圧に膨張させた。抽出油を膨張溶液から沈殿物として分別器中で回収した。分別器中の膨張ＣＯ２相の温度は、分別器の上流に位置する追加の熱交換器の使用により制御した。この低圧ＣＯ２流は、分別器容器の頂部を流出し、フィルター、凝縮器、および質量流量計を介して圧縮器に再循環させて戻した。抽出油を分別器から周期的に抜き、生成物として回収した。
【０１３９】
抽出容器に、最初に１５０ｋｇの抽出酵母ペレットを装填した。次いで、トリグリセリド濃縮油をペレットから超臨界流体ＣＯ２により５０００ｐｓｉｇ（３４５ｂａｒ）、５５℃、および出発酵母ペレット１ｋｇ当たり３２ｋｇのＣＯ２の溶媒フィード比において抽出した。合計３９．６ｋｇの抽出油を分別器容器から回収し、それに約１０００ｐｐｍの２つの酸化防止剤のそれぞれ：Ｃｏｖｉ−ｏｘ  Ｔ７０（Ｃｏｇｎｉｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）およびＤａｄｅｘ  ＲＭ（Ｎｅａｌａｎｄｅｒｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を添加した。抽出油は、ＧＣ分析（下記）により測定して６６１ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇを含有した。
【０１４０】
具体的には、エルゴステロール含有率は、紫外線（ＵＶ）検出を有する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。抽出油試料（１００ｍｇ）を、１４ｍＬの９：１０の２−プロパノール：１−ヘプタノールにより希釈し、十分に混合した。９６％純度エルゴステロール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）の較正スタンダードを、２−プロパノール中の１０から３００μｇ／ｍＬの範囲で調製した。試料およびスタンダードを、１２．５分間における水中０．０２％の炭酸アンモニウム−６５％から１００％のアセトニトリルのアセトニトリル勾配を使用するＸＤＢ−Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（４．６ｍｍのｉｄ．、１５０ｍｍの長さ、５μｍの粒子サイズ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）上でのクロマトグラフィーにかけた。注入容積は５μＬであり、流速は１．２ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は５０℃であった。エルゴステロールピークのＵＶ（２８２ｎｍ）応答を、同一条件下で分析した較正スタンダードと比較した。
【０１４１】
ＳＰＤ条件下での蒸留
抽出油を脱ガスし、次いで６インチのステンレス鋼分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度を使用して通過させた。残留水を除去した。蒸発器および凝縮器の表面温度は、それぞれ１４０℃および１５℃に設定した。真空は１５ｔｏｒｒに維持した。約３重量％の抽出油を蒸留物中の水として取り出した。脱水抽出油は、リン脂質を実質的に含まず、０．５ｐｐｍのリンを含有した。視覚調査時、脱水抽出油は室温において混濁していた。
【０１４２】
脱水抽出油を６インチの分子蒸留器を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度において２回目として通過させた。真空を１ｍｔｏｒｒに低下させ、蒸発器および凝縮器の表面温度をそれぞれ２４０℃および５０℃に維持した。約７重量％の脱水抽出油を蒸留物として取り出し；この画分は主として遊離脂肪酸およびエルゴステロールを含有した。２８４ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇ（抽出油のエルゴステロール含有率と比較してエルゴステロール含有率の約５７％低減）を含有するトリアシルグリセロール含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製油）も得た。ＳＰＤ精製油は、数日間の１０℃における貯蔵後に澄明であった。
【０１４３】
実施例２
未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスからの低減したステロール含有率を有するＳＰＤ精製微生物油の調製
本実施例は、乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスを、押出を介して破砕し、超臨界流体抽出［「ＳＣＦＥ」］を使用して油を抽出し、短行程蒸留条件を使用する蒸留により油のステロール含有率を低減させるために使用された手段を記載する。
【０１４４】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスの調製
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株（実施例１Ａ）を、２段階流加プロセスにおいて培養し、得られた微生物バイオマスを実施例１Ａに記載の方法論に従って脱水し、洗浄し、乾燥させた。
【０１４５】
乾燥未処理酵母バイオマスの押出を介する破砕
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスを、２軸スクリュー押出機にフィードした。具体的には、酵母バイオマス（約３７％の総微生物油を含有）を、７０ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−７０ｍｍ  ＳＣＤ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、２７０ｋｇ／ｈｒの速度において珪藻土の不存在下でフィードした。
【０１４６】
押出機は、１５０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび総アンペア範囲の３３パーセントにおいて稼働させた。得られた破砕酵母バイオマスを最終水冷バレル中で８１℃に冷却した。破砕バイオマスの含水率は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＡ３５水分分析装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により計測して２．８重量％であった。
【０１４７】
押出酵母バイオマスの抽出
押出酵母バイオマスを珪藻土と混合して床の圧密を防止し、抽出溶媒としての超臨界流体相二酸化炭素（ＣＯ２）を使用して抽出してＥＰＡを含有する粗製トリグリセリド油（すなわち、「抽出油」）を生成した。具体的には、合計８２．７ｋｇの押出酵母バイオマスを、４１ｋｇの珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４；ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）と混合し、実施例１Ｂに記載のものと同一の様式で構成された３２０Ｌのステンレス鋼抽出容器に装填したが、以下を除いた：（ｉ）抽出温度を予熱器により４０℃に制御し；（ｉｉ）抽出圧力を４５００ｐｓｉｇ（３１０ｂａｒ）に維持し；（ｉｉｉ）抽出に出発酵母１ｋｇ当たり４４ｋｇのＣＯ２の溶媒フィード比を使用した。このようにして、２３．２ｋｇの油を破砕酵母から抽出した。抽出油は、実施例１Ｂの方法論によるＧＣ分析により測定して７７４ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇを含有した。
【０１４８】
ＳＰＤ条件下での蒸留
抽出油を、２インチのガラス分子蒸留器を介して通過させて脱水抽出油を提供した。流速は、約４８０ｇ／ｈｒに維持した。真空、蒸発器および凝縮器温度は、それぞれ０．２ｍｍＨｇ、１３０℃および６０℃であった。次いで、以下の表に示すとおり脱水抽出油を蒸留器を介して１ｍｔｏｒｒの真空において異なる温度において３回通過させ、それぞれの通過後、トリアシルグリセロール含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製油）のエルゴステロールレベル、ＥＰＡ含有率（ＴＦＡの重量％として）および総ω−３含有率（ＴＦＡの重量％として）を上記のとおり測定した。
【０１４９】
【表１１】
2014510166.tif 000013
【０１５０】
したがって、２１０℃において、ＳＰＤ精製油のエルゴステロールレベルは、１１０ｍｇ／油１００ｇであり、それは２４０℃において約５３ｍｇ／油１００ｇに低減された。エルゴステロールは、温度を２７０℃にさらに増加させた場合に１ｍｇ／油１００ｇにほぼ完全に除去された。このことは、抽出油のエルゴステロール含有率と比較して１回目の通過、２回目の通過および３回目の通過それぞれにおけるエルゴステロール含有率の約５７％、約８６％および約９９．８％の低減に対応する。
【０１５１】
ＳＰＤ精製油のＰＵＦＡ含有率に関して、表９のデータは、油を２７０℃におけるＳＰＤ蒸留器を介して通過させた場合であっても、ＥＰＡも総ω−３含有物も顕著な分解が生じなかったことを実証する。
【０１５２】
３回目の通過のＳＰＤ精製油を、クロマトグラフィープロファイリングを使用して予想外の構成成分および汚染物質の出現についてさらに分析した。具体的には、試験は、（ｉ）火炎イオン化検出を有するガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＦＩＤ）；（ｉｉ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；および（ｉｉｉ）質量分析、光散乱および紫外線検出を有する液体クロマトグラフィーにより行った（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＥＬＳＤ／ＵＶ）。ＧＣ／ＦＩＤプロファイルは、ＳＰＤ精製油試料のメチルエステルについてランした。ＴＬＣおよびＨＰＬＣ／ＭＳ／ＥＬＳＤ／ＵＶプロファイルは、ＳＰＤ精製油について直接ランした。全ての場合において、ＳＰＤ精製油プロファイルを、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株バイオマスを用いて調製された参照油と比較した。
【０１５３】
具体的には、参照油は、実施例１Ａに記載の方法論に従って乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株バイオマスから生成した。５５．６ＥＰＡ％ＴＦＡを生成し得るＹ４３０５株は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３Ａ１号明細書に記載されている。乾燥未処理バイオマスを、油とイソヘキサン溶媒との比を１：７として媒体ミルを使用して機械的に破砕した。残留バイオマス（すなわち、細胞デブリス）を、デカンター遠心分離機を使用して除去し、溶媒を蒸発させてトリグリセリドを含有する抽出油を得た。抽出油を、低温アセトンを使用して、抽出油と溶媒との比を１：１．５として脱ガム処理し、次いで５０％の水性クエン酸により酸脱ガム処理した。次いで、脱ガム処理油を酸活性化クレーにより漂白し、２１０℃において３０分間脱臭して参照油試料を得た。
【０１５４】
３回目の通過のＳＰＤ精製油のクロマトグラフィープロファイルは、参照試料のプロファイル中に見られないいかなるピークも含有しなかった。両方の試料を同日に同一条件下でランした。さらに、参照試料のプロファイルの対応するピークよりも顕著に高い応答を有するＳＰＤ精製油の未同定ピークは存在しなかった。また、３回目の通過のＳＰＤ精製油のピークは、低温（すなわち、それぞれ２１０℃および２４０℃）において生成された１回目の通過または２回目の通過のＳＰＤ精製油の対応するピークよりも高い応答を有さなかった。これらの分析は、ＳＰＤを使用する高温におけるエルゴステロールの除去が、油中に分解生成物の出現をもたらさないことを示し；したがって、この加工技術の適用によってはＰＵＦＡの顕著な分解が生じないことが仮定される。
【０１５５】
実施例３
未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスからの低減したステロール含有率を有するＳＰＤ精製微生物油の調製
本実施例は、乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスを、媒体ミルを使用する機械的破砕を介して破砕し、イソヘキサン溶媒を使用して粗製油を抽出し、短行程蒸留条件を使用する蒸留によりアセトン脱ガム処理油のステロール含有率を低減させるために使用された手段を記載する。
【０１５６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の遺伝子型
米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載のＹ８６７２株の作製  ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ８６７２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約６１．８％のＥＰＡを生成し得た。
【０１５７】
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ８６７２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、およびＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。略語は実施例１Ａに定義されるとおりである。
【０１５８】
Ｙ８６７２株の総脂質含有率および組成の詳細な分析のため、細胞を２段階で合計７日間成長させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ８６７２株は３．３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生成し、細胞の総脂質含有率は２６．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は１６．４であり、それぞれの脂肪酸濃度をＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（パルミテート）は２．３、１６：１（パルミトレイン酸）は０．４、１８：０（ステアリン酸）は２．０、１８：１（オレイン酸）は４．０、１８：２（ＬＡ）は１６．１、ＡＬＡは１．４、ＥＤＡは１．８、ＤＧＬＡは１．６、ＡＲＡは０．７、ＥＴｒＡは０．４、ＥＴＡは１．１、ＥＰＡは６１．８、その他は６．４。
【０１５９】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスの調製
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株を、実施例１Ａに記載の方法論に従って、２段階流加プロセスにおいて培養し、得られた微生物バイオマスを脱水し、洗浄し、乾燥させた。
【０１６０】
抽出油を生成するための乾燥未処理酵母バイオマスの媒体ミルおよびイソヘキサン溶媒を介する破砕および抽出
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスを、イソヘキサン溶媒を用いて媒体ミルを使用して機械的に破砕した。残留バイオマス（すなわち、細胞デブリス）を、デカンター遠心分離機を使用して除去し、溶媒を蒸発させてトリグリセリドを含有する抽出油を得た。
【０１６１】
抽出油を実施例１Ｂの方法論を使用して分析した。表１０に示すとおり、微生物油は５８．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含有した。
【０１６２】
【表１２】
2014510166.tif 000014
【０１６３】
抽出油の一部を、低温アセトンを使用して抽出油と溶媒との比を１：１．５として脱ガム処理した。アセトン脱ガム処理油は、８８０ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇおよび７４．５ｐｐｍのリンを含有した。
【０１６４】
ＳＰＤ条件下での蒸留
アセトン脱ガム処理油を、実施例１Ｂの方法論に従って短行程蒸留に供した（但し、蒸発器温度を２５５℃に設定した）。第１の通過の間に蒸留物はほぼ回収されなかった。それというのも、アセトン脱ガム処理油中にほとんど水が存在しなかったためである。第２の通過の間、約１２重量％の蒸留物が回収された。トリアシルグリセロール含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製油）の最終エルゴステロールレベルは、１０６ｍｇ／１００ｇ（アセトン脱ガム処理油のエルゴステロール含有率と比較してエルゴステロール含有率の約８８％の低減）であり；ＳＰＤ精製油は、６６ｐｐｍのリンを含有した。
【図１】
2014510166.tif 000015
【図２】
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【配列表】
2014510166000001.app
【国際調査報告】
2014510166.tif 000017