(57)【要約】  ネコでの使用に適切な抗体の調製方法が提供される。ネコニューロン成長因子NGF）と特異的に結合し、さらにp75又はTrkAネコNGFレセプターと結合するネコNGFの能力を中和するキメラ抗体及びネコ化抗体もまた提供される。本発明は、前記をコードする核酸、並びに前記抗体及び／又は核酸を用いてネコで痛み及び関節炎を治療する方法に及ぶ。
2014519317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ネコで使用される適切な抗体を調製する方法：
−ネコ以外の種に由来するドナー抗体を提供する工程であって、当該ドナー抗体がネコに存在するある標的抗原に対して結合特異性を有する、前記工程；
−当該ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基を、1つ以上のネコ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在する各アミノ酸残基と比較して、当該1つ以上のネコ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の対応する位置の1つ以上のアミノ酸残基と異なる、当該ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；及び
−当該ドナー抗体で同定された当該1つ以上のアミノ酸残基を、当該1つ以上のネコ抗体の対応する位置に存在する1つ以上のアミノ酸残基と置換する工程。
【請求項２】
同定された1つ以上のアミノ酸残基の置換工程が、置換される1つ以上のアミノ酸残基と最高の相同性を有する、対応する位置に存在する1つ以上のアミノ酸残基で当該同定された1つ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
さらに、ドナー抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインを、ネコ抗体に由来する重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインで置換する工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
重鎖の定常ドメインがHC2型ネコ定常ドメインで入れ替えられる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
標的抗原が神経成長因子（NGF）である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
ネコニューロン成長因子（NGF）と特異的に結合し、さらにp75又はTrkAネコNGFレセプターと結合するネコNGFの能力を中和するキメラ抗体又はその結合フラグメントであって、前記キメラ抗体が、ネコ以外の種の神経成長因子と結合する抗体由来の軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン、並びにネコ由来抗体から得られる軽鎖及び重鎖定常ドメインを含む、前記キメラ抗体又はその結合フラグメント。
【請求項７】
キメラ抗体が、配列番号：1のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％のアミノ酸同一性を有する配列を含む重鎖を含む、請求項6に記載のキメラ抗体。
【請求項８】
重鎖定常ドメインが、下流エフェクター機能を媒介しないようにアミノ酸置換又は欠失の方法によって精選又は改変される、請求項6又は請求項7に記載のキメラ抗体。
【請求項９】
重鎖定常ドメインが、配列番号：19のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％のアミノ酸同一性をもつ配列を有する非グリコシル化アミノ酸配列である、請求項8に記載のキメラ抗体。
【請求項１０】
ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合できる中和抗体又はその抗原結合フラグメントであって、当該抗体又は抗体の結合フラグメントが、配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号：22のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、前記中和抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
軽鎖が、配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
重鎖が、配列番号：24のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項10又は11に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合できる中和抗体又はその抗原結合フラグメントであって、当該抗体又は抗体の結合フラグメントが、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号：4のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、前記中和抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
抗体がキメラ抗体又はネコ化抗体である、請求項10から13のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
重鎖定常ドメインが、前記定常ドメインが下流エフェクター機能を媒介しないようにアミノ酸置換又は欠失の方法によって精選又は改変される、請求項10から14のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
当該抗体とネコNGFとの結合が、p75又はTrkAネコNGFレセプターと結合するネコNGFの能力を阻害する、請求項10から15のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
軽鎖が、配列番号：5のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13から16のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
重鎖が、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：17及び配列番号：18から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13から17のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
抗ネコNGF抗体又はそのネコNGF結合フラグメントであって、配列番号：26のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR1フレームワーク領域、配列番号：27のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR2フレームワーク領域、配列番号：28のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR3フレームワーク領域、及び配列番号：29のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR4フレームワーク領域の少なくとも1つを含む軽鎖可変領域、及び／又は配列番号：30のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR1フレームワーク領域、配列番号：31のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR2フレームワーク領域、配列番号：32のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR3フレームワーク領域、及び配列番号：33のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR4フレームワーク領域の少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む、前記抗ネコNGF抗体又はそのネコNGF結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号：26のFR1領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：26が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：D1がE又はNで、I2がV、P又はTで、E3がV又は Mで、M4がL又はIで、S7がTで、S10がFで、S12がP又はAで、T14がI又はAで、E17がDで、S18がP又はAで、V19がAで、I21がFで、さらにS22がFで置換。
【請求項２１】
配列番号：27のFR2領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：27が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19又は20に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：Y2がFで、L3がF又はRで、K5がRで、R8がQで、L12がRで、I14がMで、さらにY15がH又はAで置換されている。
【請求項２２】
配列番号：28のFR3領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：28が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19から21のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：G1がRで、F6がIで、S7がTで、T13がA又はSで、T16がI又はAで、K18がR又はTで、S20がA、G又はTで、R21がGで、V22がMで、Q23がEで、T24がA、V又はPで、E25がDで、V29がI、H 又はLで、さらにF31がYで置換。
【請求項２３】
配列番号：29のFR4領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：29が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19から22のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：F1がSで、Q3がPで、K6がH、Q、E、S又はTで、E8がDで、L9がV、I又はMで、さらにK10がR、D又はTで置換されている。
【請求項２４】
配列番号：30のFR1領域を有する重鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：30が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19から23のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：Q1がD又はEで、V2がEで、Q3がL又はRで、L4がVで、V5がMで、E6がQ又はDで、A9がGで、E10がD又はNで、L11がV又はRで、V12がR又はKで、Q13がK、T、E、N又はRで、P14がTで、G15がEで、E16がG、A又はTで、S17がAで、L18がVで、R19がK又はEで、L20がI又はPで、T21がF又はSで、A23がK、V又はQで、A24がT又はDで、さらにG26がAで置換。
【請求項２５】
配列番号：31のFR2領域を有する重鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：31が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19から24のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：V2がL、F又はIで、R3がC又はHで、A5がS、V又はTで、G7がA、E又はSで、K8がQ又はEで、L10がF又はPで、E11がQで、W12がC又はLで、M13がV又はIで、さらにG14がA又はSで置換されている。
【請求項２６】
配列番号：32のFR3領域を有する重鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：32が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19から25のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：R1がQ又はKで、L2がFで、T3がIで、I4がL、M又はVで、T5がSで、R6がA、T、K、G又はVで、T8がN、D、A又はSで、S9がA、D又はTで、K10がT、E、Q、N又はRで、N11がD又はKで、T12がI又はAで、V13がA、L又はGで、F14がY、V、A、S又はWで、L15がMで、Q16がE、D、H又はVで、M17がLで、H18がN、S、T、D、G又はRで、S19がNで、Q21がR、K又はTで、S22がT、I、A又はVで、E23がA、T、D、G又はSで、A26がG又はSで、T27がV、M、I又はAで、Y28がHで、Y29がH又はFで、さらにA31がT、V、G、L、I又はMで置換。
【請求項２７】
配列番号：33のFR4領域を有する重鎖可変ドメインを含み、前記配列番号：33が以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、請求項19から26のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント：W1がR、C又はLで、G2がAで、Q3がH、R、P又はVで、G4がDで、T5がA又はVで、T6がL、I、Q、M又はSで、V7がIで、T8がA、I又はRで、V9がGで、S10がPで、さらにA11がS又はQで。
【請求項２８】
抗体がHC2型ネコ定常ドメインを有する、請求項19から27のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はネコNGF結合フラグメント。
【請求項２９】
請求項1から5のいずれか1項に記載の方法にしたがって調製される抗体又はその結合フラグメント。
【請求項３０】
ネコNGFと結合したときに、p75又はTrkAネコNGFレセプターと結合するネコNGFの能力を中和する、請求項6から29のいずれか1項に記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３１】
1ｘ10-8以下の平衡解離定数（KD）を有する結合親和性でネコNGFと特異的に結合する、請求項6から30のいずれか1項に記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３２】
抗体が多重特異的抗体又は多価抗体である、請求項6から31のいずれか1項に記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３３】
抗体又は結合フラグメントがネコで免疫原性ではない、請求項6から32のいずれか1項に記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３４】
結合フラグメントが、単鎖Fv（scFv）抗体フラグメント、Fab抗体フラグメント、Fab’抗体フラグメント、及びF(ab’)2抗体フラグメントから成る群から選択される、請求項6から33のいずれか1項に記載の結合フラグメント。
【請求項３５】
以下の工程を含む、ネコで痛みを治療、阻止又は緩和する方法：
−治療的に有効な量の抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する工程（ここで、前記抗体はキメラ抗体又はネコ化抗体である）、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
【請求項３６】
抗ネコNGF抗体が請求項6から9のいずれか1項に記載のキメラ抗体である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
抗ネコNGF抗体が請求項10から12のいずれか1項に記載のネコ化抗体である、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
抗ネコNGF抗体が請求項13から18のいずれか1項に記載の抗体である、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
抗ネコNGF抗体が請求項19から28のいずれか1項に記載の抗体である、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
抗ネコNGF抗体が請求項29から34のいずれか1項に記載の抗体である、請求項35に記載の方法。
【請求項４１】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：22のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項４２】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項４３】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：1、配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性をもつ配列を有する軽鎖、及び／又は配列番号：2、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19及び配列番号：24から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項35に記載の方法。
【請求項４４】
痛みが、神経障害痛、炎症痛、そう痒症痛、術時痛、術後痛及び外科手術後痛から成る群から選択される、請求項35から43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
術後痛が、整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出術及び去勢術から成る群から選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
以下の工程を含む、ネコ対象動物で関節炎又は関節炎症状を治療する方法：
−治療的に有効な量の抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する工程（ここで前記抗体はキメラ抗体又はネコ化抗体である）、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
【請求項４７】
抗ネコNGF抗体が請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：23のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：22のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：1、配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の配列同一性をもつ配列を有する軽鎖、及び／又は配列番号：2、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19及び配列番号：24から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５１】
関節炎又は関節炎症状が、免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ及び変形性関節症から成る群から選択される症状を含む、請求項46から50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
関節炎又は関節炎症状の治療が、当該関節炎又は関節炎症状に付随するか又は前記に起因せしめ得る痛みの緩和、阻止、軽減、抑制又は開始の遅延を含む、請求項46から51のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
以下の工程を含む、ネコNGFの発現の増加又はNGFに対するネコ対象動物の感受性の増加によって引き起こされるか、前記に付随するか、又は前記を生じる症状を治療する方法：
−抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程（ここで前記抗体はキメラ抗体又はネコ化抗体である）、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
【請求項５４】
抗ネコNGF抗体が請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体である、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：23のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：22のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５６】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５７】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：1、配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性をもつ配列を有する軽鎖、及び／又は配列番号：2、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19及び配列番号：24から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５８】
以下の工程を含む、NGFによって増殖が誘発されるネコの腫瘍及び前記に付随する症状を治療する方法：
−抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程（ここで前記抗体はキメラ抗体又はネコ化抗体である）、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
【請求項５９】
抗ネコNGF抗体が請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：22のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６２】
抗ネコNGF抗体が、配列番号：1、配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性をもつ配列を有する軽鎖、及び／又は配列番号：2、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19及び配列番号：24から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６３】
腫瘍がオートクライン又はパラクラインNGFによって増殖が誘発される、請求項58から62のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６４】
腫瘍が骨肉腫である、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも1つのさらに別の治療薬剤を同時投与する工程を含む、請求項35から64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６６】
治療薬剤が、鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド及びステロイドから成る群から選択される、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも1つの治療薬剤が、抗生物質、抗真菌治療薬剤、抗原生動物治療薬剤及び抗ウイルス治療薬剤から成る群から選択される、請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも1つの治療薬剤が、炎症媒介物質の阻害剤、PGE-レセプターアンタゴニスト、免疫抑制剤、シクロスポリン、抗炎症性グルココルチコイド、認知機能不全又は認知障害の治療に用いられる薬剤、抗高血圧薬、心脈管系機能不全の治療に用いられる化合物、利尿剤、血管拡張剤、ベータ-アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト、アンギオテンシン-II変換酵素阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー及びHMG-CoAレダクターゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項65に記載の方法。
【請求項６９】
抗体又は抗原結合フラグメントが、約0.01mg/kg体重から約10mg/kg体重の用量範囲でネコに投与される、請求項35から68のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７０】
抗体又は抗原結合フラグメントが、約0.03mg/kg体重から約3mg/kg体重の用量範囲でネコに投与される、請求項35から68のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７１】
痛み又は痛みを生じるか若しくは痛みによって引き起こされる症状をネコで治療するための医薬組成物であって、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はその結合フラグメントの治療的に有効な量を、少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤とともに含む、前記医薬組成物。
【請求項７２】
さらに少なくとも1つの鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド又はステロイドを含む、請求項71に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
痛みを生じる症状が、慢性関節リウマチ、変形性関節症、急性痛、炎症、そう痒症、慢性痛、外科手術痛及び外科手術後痛から成る群から選択される、請求項71又は72に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項７５】
配列番号：3若しくは配列番号：23のアミノ酸配列を有する抗ネコNGFネコ化抗体若しくは抗体のフラグメントの軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードする、単離された核酸。
【請求項７６】
配列番号：4若しくは配列番号：22のアミノ酸配列を有する抗ネコNGFネコ化抗体若しくは抗体のフラグメントの重鎖可変ドメイン、又は配列番号：6、配列番号：7、配列番号：17、配列番号：18及び配列番号：24から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖をコードする、単離された核酸。
【請求項７７】
配列番号：1のアミノ酸配列を有する抗ネコNGFキメラ抗体又は当該抗体のフラグメントの軽鎖をコードする単離された核酸。
【請求項７８】
配列番号：2、配列番号：16又は配列番号：19のアミノ酸配列を有する抗ネコNGFキメラ抗体又は当該抗体のフラグメントの重鎖をコードする単離された核酸。
【請求項７９】
1つ以上の調節配列に作動できるように連結される、請求項74から78のいずれか1項に記載の単離された核酸。
【請求項８０】
請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８１】
さらに1つ以上の調節配列を含む、請求項80に記載の発現ベクター。
【請求項８２】
発現ベクターがプラスミド又はレトロウイルスベクターである、請求項80又は81に記載の発現ベクター。
【請求項８３】
請求項80から82のいずれか1項に記載の発現ベクターを取り込んでいる宿主細胞。
【請求項８４】
ネコ化抗ネコNGF中和抗体を生成する方法であって、前記方法が、請求項83に記載の宿主細胞を培養し前記細胞にネコ化抗ネコNGF中和抗体を発現させる工程を含む、前記方法。
【請求項８５】
ネコで痛みを治療、緩和又は阻止する方法であって、前記方法が、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸の治療的に有効な量をネコの投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８６】
ネコで痛みの治療又は予防に使用される、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体若しくは抗体の結合フラグメント、請求項71から73のいずれか1項に記載の医薬組成物、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸、請求項80から82に記載の発現ベクター又は請求項83に記載の宿主細胞。
【請求項８７】
痛みが以下から成る群から選択される、請求項86に記載の抗体又は抗体の結合フラグメント：急性痛、慢性痛、術時痛、術後痛、整形外科手術による痛み、軟組織外科手術に付随する痛み、炎症痛、そう痒症痛、卵巣子宮摘出術により生じる痛み、去勢術により生じる痛み、癌又は癌性症状に付随する慢性痛、及び慢性関節リウマチ、免疫媒介多発性関節炎若しくは変形性関節症に付随するか又は前記により生じる痛み。
【請求項８８】
関節炎の治療に使用される、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体若しくは抗体の結合フラグメント、請求項71から73のいずれか1項に記載の医薬組成物、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸、請求項80から82に記載の発現ベクター又は請求項83に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
関節炎が変形性関節症、免疫媒介多発性関節炎又は慢性関節リウマチである、請求項88に記載の抗体。
【請求項９０】
NGFによって増殖が誘発されるネコの腫瘍及び前記に付随する症状の治療に使用される、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体若しくは抗体の結合フラグメント、請求項71から73のいずれか1項に記載の医薬組成物、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸、請求項80から82に記載の発現ベクター又は請求項83に記載の宿主細胞。
【請求項９１】
腫瘍が骨肉腫である、請求項90に記載の抗体。
【請求項９２】
ネコの痛みの治療又は予防用医薬の調製における、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体若しくは抗体の結合フラグメント、請求項71から73のいずれか1項に記載の医薬組成物、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸、請求項80から82に記載の発現ベクター又は請求項83に記載の宿主細胞の使用。
【請求項９３】
当該痛みが、急性痛、慢性痛、術時痛、術後痛、整形外科手術による痛み、軟組織外科手術に付随する痛み、炎症痛、そう痒症痛、卵巣子宮摘出術により生じる痛み、去勢術により生じる痛み、癌又は癌性症状に付随する慢性痛、及び慢性関節リウマチ、免疫媒介多発性関節炎若しくは変形性関節症に付随するか又は前記により生じる痛みから成る群から選択される、請求項92に記載の抗体又は抗体の結合フラグメントの使用。
【請求項９４】
ネコの関節炎の治療、阻止、緩和又は予防用医薬の調製における、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体若しくは抗体の結合フラグメント、請求項71から73のいずれか1項に記載の医薬組成物、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸、請求項80から82に記載の発現ベクター又は請求項83に記載の宿主細胞の使用。
【請求項９５】
関節炎が変形性関節症、免疫媒介多発性関節炎又は慢性関節リウマチである、請求項94に記載の抗体又は抗体の結合フラグメントの使用。
【請求項９６】
NGFによって増殖が誘発されるネコの腫瘍及び前記に付随する症状の治療用医薬の調製における、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗体若しくは抗体の結合フラグメント、請求項71から73のいずれか1項に記載の医薬組成物、請求項74から78のいずれか1項に記載の核酸、請求項80から82に記載の発現ベクター又は請求項83に記載の宿主細胞の使用。
【請求項９７】
腫瘍が骨肉腫である、請求項96に記載の抗体又は抗体の結合フラグメントの使用。
【請求項９８】
請求項6から34のいずれか1項に記載の抗ネコNGF中和モノクローナル抗体又はそのフラグメントを生成する、細胞株又はその誘導若しくは子孫細胞。
【請求項９９】
ネコの痛みの治療用、又は痛みに付随する症状の治療用、又は変形性関節症、炎症、そう痒症、免疫媒介多発性関節炎若しくは慢性関節リウマチに付随する痛みの治療、緩和若しくは阻止用キットであって、前記が、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又はフラグメント及び前記の使用のための指示を含む、前記キット。
【請求項１００】
抗ネコNGFモノクローナル抗体又は結合フラグメントの検出で使用される、請求項6から34のいずれか1項に記載の抗ネコNGF抗体又は結合フラグメントを含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ神経成長因子のアンタゴニストとして作用する抗体及びそのフラグメントに関する。本発明は、前記を調製する方法並びにこれらの抗体及びフラグメントの神経成長因子関連症状（例えば痛み、痛み関連疾患及びネコで痛みの出現をもたらす症状）を処置する治療的使用に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（NGF）は天然に存在する分泌タンパク質であり、アルファ、ベータ及びガンマポリペプチド鎖から成る。NGFはニューロトロフィンファミリーのメンバーであり、多数の異なる役割に関係する。NGFは、感覚神経及び交感神経ニューロンの生存及び分化、並びに2つの膜結合レセプターp75（低親和性NGFレセプター）及びTrkA（トランスメンブレンチロシンキナーゼ及び高親和性NGFレセプター）を介するシグナルを増進させる。NGFとTrkA又はp75との結合は感覚神経ニューロンでニューロペプチドのアップレギュレーションをもたらす。
ヒトの痛み及び痛み感受性の治療でNGFアンタゴニストの使用が報告された（Cattaneo A., Curr. Op. Mol. Ther. 2010 12(1):94-106）。例えば、国際特許出願WO 2006/131951は、ラットアルファD11（αD11）モノクローナル抗体のヒト化型を記載している。αD11抗体はマウスNGFに対して結合特異性を有するが、NGFのヒト及びラット型と結合することもまた知られている。αD11ラット由来モノクローナル抗体のヒト化は、げっ歯類由来抗体に対して上昇するヒト抗マウス抗体（HAMA）応答から生じる中和抗体の産生を最小限にするために、ヒトに投与する前に要求される。さらにまた、マウス定常ドメインのヒト定常ドメインによる入れ替えは下流のエフェクター機能の選択を可能にする。
ネコにおける痛みの管理は、従来はいくつかのクラスの鎮痛薬（局所麻酔及び全身麻酔剤、オピオイド鎮痛薬、α2アゴニスト、非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）及びステロイドを含む）の投与により提供される。これらの各々は頻繁な投与を必要とし、さらに有効性及び安全性に限界がある。したがって、慢性痛（例えば神経障害に関するもの又は癌性痛）を有するネコのために投与頻度が低く、長時間持続性で効果的な形態が希求される。
【０００３】
NGFはネコの組織で発現されるが、その配列の部分的なクローンしか利用できない。この部分的mRNA配列は、Genbank アクセッション番号EF06510（URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov. フェリス・カツス（Felis catus）神経成長因子ベータ様mRNA）で規定されている。ネコNGFに対するアンタゴニストはこれまで記載されたことはなく、痛みを予防又は緩和するためにネコでNGF媒介シグナリングの遮断を利用することについて記載されたこともない。他の種で抗NGFアンタゴニストとして作用する公知の抗体をネコで使用することは現実的ではないであろう。なぜならば、別の種で発現された神経成長因子と結合特異性を有する抗体がネコの神経成長因子とも結合するという保証はないからである。さらにまた、そのような投与抗体のいずれかに対して中和抗体が生成され得る可能性がある（なぜならばそのような抗体はネコ免疫系によって異質と認識されるからである）。いかなる中和抗体生成も当該抗体のネコへの長期投与を制限するであろう。前記は、慢性痛関連症状又は癌性症状を治療するときに特に重要な要件である。さらにまた、別の種に由来する抗NGF抗体のネコへの投与は、当該抗体が最初に得られた種には存在しないがネコに存在する可能性がある他の標的エピトープと交差反応性を示すかもしれない。したがって、それらに対する中和抗体の生成は回避するが、ネコNGFのアンタゴニストとして作用し高レベルの結合親和性及びアビジチーを保持する、ネコの痛みの管理で使用される結合メンバーが強く希求される。
【発明の概要】
【０００４】
懸命な奮闘の結果、本発明者らは驚くべきことに、ネコNGFと特異的に結合する非免疫原性ネコ化キメラ抗体及びそれらから誘導した結合フラグメントを生成した。全く予期せぬことながら、本発明の抗体及び結合フラグメントとネコNGFとの結合は、ネコNGFと高親和性TrkAレセプター又はp75レセプターとの結合を阻害することによってネコNGFの生物学的活性を封鎖することが本明細書で示される。このことは、結果として感覚神経ニューロンでのニューロペプチドのアップレギュレーションを防ぎ、痛覚が軽減又は除去されるという効果をもたらす。この抗体は、それらが実質的に非免疫原性であるように（すなわち、ネコ対象動物へ投与したときそれらに対して中和抗体を生じない）、組換えDNAの方法を用いて生成された。当該抗体は標準的な方法論（例えばCDR移植など）を用いて作製されたのではないので、前記のような発見は全く驚くべきことであり予想に反する。
本発明の第一の特徴にしたがえば、ネコでの使用に適切な抗体を調製する方法が提供され、前記方法は以下の工程を含むか又は本質的に以下の工程から成る：
−ネコ以外の種に由来するドナー抗体を提供する工程（ここで前記ドナー抗体はネコに存在するある標的抗原に対して結合特異性を有する）；
−前記ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基を、1つ以上のネコ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在する各アミノ酸残基と比較して、前記1つ以上のネコ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の対応する位置の1つ以上のアミノ酸残基と異なる、前記ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；及び
−前記ドナー抗体の同定された前記1つ以上のアミノ酸残基を、前記1つ以上のネコ抗体で対応する位置に存在する1つ以上のアミノ酸残基と置換する工程。
【０００５】
本発明の方法はネコで使用するためにドナー抗体を改変し、前記改変抗体が、そのフレームワーク領域内のいずれの位置においても、ネコでは当該位置で異質であるようなアミノ酸を全く含まない態様で改変する。前記改変抗体は、したがって前記標的抗原に対してドナー抗体の特異性及び親和性を保持するが、重要なこととして、潜在的に異質なエピトープが生成されないように改変される。前記改変抗体はしたがってネコで異質とみなされず、（特に長期投与に続いて）抗体の効能の中和を生じ得る免疫応答をネコで誘発しない。
ある種の実施態様では、1つ以上の同定アミノ酸残基の置換工程は、前記置換される1つ以上のアミノ酸残基と最高の相同性を有する対応する位置に存在する1つ以上のアミノ酸残基で前記1つ以上の同定アミノ酸残基を置換する工程を含む。
ある種の実施態様では、本方法はさらに、ドナー抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインを、ネコ抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインで置換する工程を含む。典型的には、重鎖の定常ドメインはHC2型ネコ定常ドメインで入れ替えられる。
ある種の実施態様では、標的エピトープは神経成長因子（NGF）である。
本発明の第一の特徴の方法はCDR移植を含まない。本発明の第一の特徴の方法にしたがって調製される抗体は、ドナー抗体のCDR、本発明の第一の特徴の方法にしたがって調製されたネコ化フレームワーク領域及びネコ定常ドメインを含む。
【０００６】
本発明の第二の特徴にしたがえば、ネコニューロン成長因子（NGF）と特異的に結合するキメラ抗体又はその結合フラグメントが提供され、前記キメラ抗体は、ネコ以外の種の神経成長因子と結合する抗体由来の軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン、並びにネコ由来抗体から得られる軽鎖及び重鎖定常ドメインを含む。典型的には、前記キメラ抗体又は前記に由来する結合フラグメントは、ある結合エピトープでネコNGFと結合し、前記エピトープは、結合したときにネコNGFの生物学的機能の中和をもたらす。すなわち、前記キメラ抗体又は結合フラグメントとネコNGFとの結合は、TrkAレセプター又はp75レセプターと結合するNGFの能力を封鎖する。ある種の実施態様では、キメラ抗体又はその結合フラグメントは1ｘ10-8以下の結合親和性（KD）でネコNGFと結合する。
本発明のある実施態様では、ネコNGFと結合しさらにp75又はTrkAネコNGFレセプターと結合するネコNGFの能力を中和する、抗ネコNGFキメラ抗体又はその結合フラグメントが提供され、前記キメラ抗体は、配列番号：1のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含む重鎖を含む。配列番号：2の重鎖定常ドメインはフェリス・カツス由来の抗体から誘導され、前記はGenbankアクセッション番号BAA32229.1の下に寄託されている。さらに別の実施態様では、重鎖は配列番号：16のアミノ酸配列を有し、前記は、フェリス・カツス由来の抗体から誘導される重鎖定常ドメインに連接される定常ドメインで、Genbankアクセッション番号BAA32230.1の下に寄託されている。
典型的には、本発明の抗ネコNGFキメラ抗体の定常ドメインは、当該抗体定常領域に付随する下流エフェクター機能、例えば補体の固定、ADCC、Fcレセプター結合などを媒介しない。ある種の実施態様では、重鎖の定常ドメインの残基は、グリコシル化できない残基に置換され得る。ある種の実施態様では、非グリコシル化重鎖は、配列番号：19のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を有する。
【０００７】
本発明は、本発明の第一の特徴にしたがって調製される抗体に及ぶ。したがって、ある種のさらに別の特徴では、本発明はネコ化抗ネコNGF中和抗体に及ぶ。前記ネコ化抗体は、本発明者らが予想する、ネコNGFと他種NGFとの間で保存されている結合エピトープで非ネコNGFと結合する抗体の結合特異性を保持するが、一方、ネコ由来定常ドメインを提供し、さらに可変領域のフレームワーク領域（FR）の精選残基を顕著に改変して、CDR領域の結合親和性はそのままにT細胞エピトープ（CDR領域間に介在するフレームワーク領域に存在し得る）を、ドナー抗体フレームワーク領域内の特定残基をネコ由来アミノ酸で置換して除去することによって免疫原性が低下している。重要なことであるが、当該フレームワーク領域は、それらの全体がネコ起源抗体に由来するフレームワーク領域によって入れ替えられることはない。むしろ、フレームワーク残基の置換は熟慮され、かつ明瞭に限定される。
本発明のさらに別の又は関連する特徴にしたがえば、ネコニューロン成長因子（NGF）に特異的に結合するネコ化抗体又はその結合フラグメントが提供される。典型的には、ネコ化抗体又はその結合フラグメントは、ネコNGFと結合したときにネコNGFの生物学的機能を中和する。すなわち、ネコ化抗体又は結合フラグメントとネコNGFとの結合は、ネコNGFがTrkA NGFレセプター又はp75 NGFレセプターと結合する能力を封鎖する。ある種の実施態様では、ネコ化抗体又はその結合フラグメントは、1ｘ10-8以下のKDの結合親和性でNGFと結合する。典型的には、ネコ化抗体はネコで免疫原性ではない。
【０００８】
ある種の実施態様では、ネコ化抗体は、本発明の第一の特徴の抗体調製方法にしたがって調製される。
本発明のさらに別の又は関連する特徴では、ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合できる中和抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。前記抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
いくつかの実施態様では中和抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はネコ化抗体である。すなわちネコ対象動物に投与されたとき、当該ネコ化抗体に対して中和抗体が産生されないように脱免疫化されてあるアミノ酸配列を有する抗体である。ある種の実施態様では、ネコ化抗体は、本発明の第一の特徴の抗体を調製する方法にしたがって調製される。典型的には、当該抗体の重鎖定常ドメインは、定常ドメインが下流のエフェクター機能を媒介しないように、アミノ酸置換又は欠失の方法によって精選又は改変される。
【０００９】
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又はその結合フラグメントは、配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
さらに別の又は関連する特徴では、ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合できる中和ネコ化抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。前記ネコ化抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：22のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
典型的には、重鎖の可変領域（VH）は、少なくとも1つの免疫グロブリン定常ドメインを含む重鎖定常領域と連接される。典型的には、重鎖定常領域は3つの縦に並ぶ（すなわち一列に並んだ）定常ドメインで構成され、構造的可撓性を提供するためにヒンジ領域が当該ドメインの2つのドメインの間に提供される。種々のアイソタイプの定常領域は3つより多いか又は3つより少ない定常ドメインを含むことができる。ある種の実施態様では、当該重鎖定常領域はネコ由来定抗体から誘導される。2つの異なるネコ定常ドメインが公知であり（Genbankアクセッション番号BAA32229.1及びBAA32230.1で示される）、前記は、同じヒンジ領域及びそれらのCH3ドメイン間に8つのアミノ酸配列相違を有する。典型的には、前記定常ドメインは、CH1、CH2及びCH3を、前記CH1とCH2ドメインの間に位置する適切なリンカー（又は“ヒンジ”）と一緒に含む。典型的には、本発明の抗ネコNGF抗体は、定常ドメインに連接する重鎖可変ドメインを含み、ここで前記定常ドメインは、抗体のFc領域によって媒介される下流のエフェクター機能（例えば補体の固定、ADCC、Fcレセプター結合など）をもたらさない。
【００１０】
ある種の実施態様では、前記抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：24のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含む重鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。
具体的な実施態様では、前記ネコ化抗体又は前記に由来する結合フラグメントは、定常ドメイン内の少なくとも1つの残基が、当該残基のグリコシル化を防止するために置換又は欠失されてある重鎖を含むことができる。ある種の実施態様では、前記重鎖サブタイプはサブタイプIgG2のネコ抗体に由来する。ある種のさらに別の実施態様では、前記定常ドメインは、フェリス・カツスに由来する抗体から誘導され、前記はGenbankアクセッション番号BAA3220.1の下に寄託されている。
さらにまた別の又は関連する特徴では、本発明は、ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合し、さらにTrkA NGFレセプター及びp75 NGFレセプターとの結合に際してNGFの生物学的機能を中和するネコ化抗体又はその抗原結合フラグメントに及ぶ。前記ネコ化抗体又はその結合フラグメントは軽鎖及び重鎖を含み、ここで前記軽鎖の可変ドメイン（VL）は、配列番号：23のアミノ酸配列と同一若しくは実質的に相同なアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成り、さらに前記重鎖の可変ドメイン（VH）は、配列番号：22のアミノ酸配列と同一若しくは実質的に相同なアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
【００１１】
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又は結合メンバーは、配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは95％、もっとも好ましくは少なくとも98％同一性のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る軽鎖を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又は結合メンバーは、配列番号：24のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは95％、もっとも好ましくは少なくとも98％同一性の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る重鎖を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
ある種の実施態様では、前記抗体は少なくとも1つのレポーター分子と共役させることができる。ある種のさらに別の実施態様では、定常ドメインの少なくとも1つにおける少なくとも1つの残基は、当該残基のグリコシル化を防止するために置換又は欠失させることができる。
本発明のさらに別の又は関連する特徴では、ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合できる中和抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。前記抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
【００１２】
いくつかの実施態様では中和抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はネコ化抗体である。すなわちネコ対象動物に投与されたとき、当該ネコ化抗体に対して中和抗体が産生されないように脱免疫化されてあるアミノ酸配列を有する抗体である。ある種の実施態様では、抗体は、本発明の第一の特徴にしたがって調製される。典型的には、当該抗体の重鎖定常ドメインは、定常ドメインが下流のエフェクター機能を媒介しないように、アミノ酸置換又は欠失の方法によって精選又は改変される。
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又は当該抗体の結合フラグメントは、配列番号：5のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
さらに別の又は関連する特徴では、ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合できる中和ネコ化抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。前記ネコ化抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：4のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
【００１３】
典型的には、前記重鎖の可変領域（VH）は、少なくとも1つの免疫グロブリン定常ドメインを含む重鎖定常領域と連接される。ある種の実施態様では、重鎖定常領域はネコ由来抗体（例えばGenbankアクセッション番号BAA32229.1及びBAA32230.1で示されるもの）から誘導される。典型的には、前記定常ドメインは、CH1、CH2及びCH3を、前記CH1とCH2ドメインの間に位置する適切なリンカー（又は“ヒンジ”）と一緒に含む。典型的には、本発明の抗ネコNGF抗体は、定常ドメインに連接する重鎖可変ドメインを含み、ここで前記定常ドメインは、抗体のFc領域によって媒介される下流のエフェクター機能（例えば補体の固定、ADCC、Fcレセプター結合など）をもたらさない。
ある種の実施態様では、抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：6のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含む重鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。前記実施態様では、定常ドメインは、フェリス・カツス由来の抗体（Genbankアクセッション番号BAA32229.1の下に寄託されている）から誘導される。
具体的な実施態様では、ネコ化抗体又は前記に由来する結合フラグメントは、定常ドメインの少なくとも1つの残基が、当該残基のグリコシル化を防止するために置換又は欠失されてある重鎖を含むことができる。したがって、ある種のさらに別の実施態様では、抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：7のアミノ酸又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含む重鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。ある種の実施態様では、前記重鎖のサブタイプは、サブタイプIgG2のネコ抗体に由来する。
【００１４】
ある種のさらに別の実施態様では、定常ドメインは、Genbankアクセッション番号BAA32230.1の下に寄託されているフェリス・カツスに由来する抗体から誘導される。したがって、ある種のさらに別の実施態様では、本発明のさらに別のネコ化抗体の重鎖は、Genbankアクセッション番号BAA32230.1の下に寄託されているフェリス・カツスに由来する抗体から誘導された重鎖を含む。前記抗体は配列番号：17のアミノ酸配列を含む。ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：17の重鎖配列を改変して、グリコシル化に付すことができる任意のアミノ酸残基に置換することができる。したがって、本発明のさらにまた別の実施態様は、配列番号：18のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を有するネコ化抗体を提供する。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
さらにまた別の又は関連する特徴では、本発明は、ネコ神経成長因子（NGF）と特異的に結合し、さらにTrkA NGFレセプター及びp75NGFレセプターと結合したときにNGFの生物学的機能を中和するネコ化抗体又はその抗原結合フラグメントに及ぶ。前記ネコ化抗体又は当該抗体の結合フラグメントは軽鎖及び重鎖を含み、ここで前記軽鎖の可変ドメイン（VL）は、配列番号：3のアミノ酸配列と同一若しくは実質的に相同なアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成り、さらに前記重鎖の可変ドメイン（VH）は、配列番号：4のアミノ酸配列と同一若しくは実質的に相同なアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95又は99％のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
【００１５】
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又は結合メンバーは、配列番号：5のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは95％、もっとも好ましくは少なくとも98％同一性のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る軽鎖を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又は結合メンバーは、配列番号：6若しくは配列番号：17のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは95％、もっとも好ましくは少なくとも98％同一性の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る重鎖を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
ある種の実施態様では、前記抗体は少なくとも1つのレポーター分子に連接できる。
ある種のさらに別の実施態様では、定常ドメインの少なくとも1つにおける少なくとも1つの残基を、当該残基のグリコシル化を防止するために置換又は欠失させることができる。したがって、ある種のさらに別の実施態様では、ネコ化抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：7若しくは配列番号：18のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも95％、より好ましくは少なくとも98％同一性の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある種の実施態様では、前記同一性は、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは約20アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸の長さにわたる。
【００１６】
本発明者らはさらに一連のフレームワーク領域（FR）を規定した（前記フレームワーク領域は、相補性決定領域（CDR）と合体させてネコ化重鎖及び軽鎖可変ドメインを形成できる）。重鎖及び軽鎖ドメインの各々は、4つのフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3及びFR4と称される）を有する。
抗体分子はCDR1、CDR2及びCDR3領域並びに関連する介在フレームワーク領域を含む重鎖可変ドメインを含むことができる。重鎖可変ドメイン（VH）のCDRはHCDRとして知られ、これらのCDRはKabatの番号付与系にしたがえば以下の位置で見出される：HCDR1：Kabat残基31−35、HCDR2：Kabat残基50−65、HCDR3：Kabat残基95−102（Kabat EA et al. 1991 Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services）。
さらにまた、抗体はさらにCDR1、CDR2及びCDR3領域並びに関連する介在フレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインを含む。軽鎖可変ドメイン（VL）のCDRはLCDRとして知られ、これらのCDRはKabatの番号付与系にしたがえば以下の位置で見出される：LCDR1：Kabat残基24−34、LCDR2：Kabat残基50−56、LCDR3：Kabat残基89−97。
軽鎖又は重鎖可変ドメインは4つのフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3及びFR4）を含み、前記には以下の編成でCDRが介在する：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
【００１７】
さらにまた別の特徴では、本発明は抗NGF抗体又はそのNGF抗原結合フラグメントに及ぶ。前記抗体又は抗体のフラグメントは、
−配列番号：26のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR1フレームワーク領域、
−配列番号：27のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR2フレームワーク領域、
−配列番号：28のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR3フレームワーク領域及び
−配列番号：29のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR4フレームワーク領域の少なくとも1つを含む軽鎖可変領域、及び／又は
−配列番号：30のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR1フレームワーク領域、
−配列番号：31のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR2フレームワーク領域、
−配列番号：32のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR3フレームワーク領域及び
−配列番号：33のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR4フレームワーク領域の少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む。
典型的には、前記軽鎖及び重鎖CDRは、NGF（好ましくはネコNGF）と結合特異性を有する抗体に由来する。
【００１８】
ある種の実施態様では、上記記載の前記少なくとも1つのフレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインは、ネコ由来軽鎖定常ドメイン（典型的には軽鎖カッパ定常ドメインであるが場合によって軽鎖ラムダ定常ドメイン）と連接される。ある種の実施態様では、前記軽鎖は、配列番号：26のアミノ酸配列を有するFR1領域、配列番号：27のアミノ酸配列を有するFR2領域、配列番号：28のアミノ酸配列を有するFR3領域、及び配列番号：29のアミノ酸配列を有するFR4領域、又は前述のものと少なくとも85、90、95又は98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は少なくとも約5アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸の長さにわたる。
ある種のさらに別の実施態様では、上記記載のフレームワーク領域の少なくとも1つを含む重鎖可変領域は、少なくとも1つのネコ由来重鎖定常ドメインと連接される。ある種の実施態様では、前記定常ドメインのアミノ酸配列は一切の翻訳後修飾を欠くか、又は定常ドメインがグリコシル化されないように、N-結合若しくはO-結合グリコシレーションに付され得るいずれかの又は全ての残基を除去するために改変できる。ある種の実施態様では、重鎖は、配列番号：30のアミノ酸配列を有するFR1領域、配列番号：31のアミノ酸配列を有するFR2領域、配列番号：32のアミノ酸配列を有するFR3領域、及び配列番号：33のアミノ酸配列を有するFR4領域、又は前述のものと少なくとも85、90、95又は98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は少なくとも約5アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸の長さにわたる。
【００１９】
ある種のさらに別の実施態様では、改変は本明細書に記載のフレームワーク領域に対して実施できる。すなわち、本発明者らは、各フレームワーク領域のいくつかの残基について、与えられた位置についてアミノ酸残基に選択の幅があることを確認した。重要なこととして、これらフレームワーク領域の改変は、関連する相補性決定領域に立体構造の変化をもたらさない。なぜならば立体構造の変化は、得られた抗体の結合特異性及び／又は親和性を変更する可能性があるからである。ある種の実施態様では、本発明は、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸残基への2つ以上のアミノ酸置換の導入に及ぶ。
したがって、ある種の実施態様では、本発明は、ポリペプチド（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）に及び、前記ポリペプチドは、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、配列番号：26のアミノ酸配列を含むFR1領域を有する軽鎖可変ドメインを含む：D1はE又はNで、I2はV、P又はTで、E3はV又は Mで、M4はL又はIで、S7はTで、S10はFで、S12はP又はAで、T14はI又はAで、E17はDで、S18はP又はAで、V19はAで、I21はFで、さらにS22はFである。
ある種の実施態様では、配列番号：27のアミノ酸配列を有する軽鎖FR2領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：Y2はFで、L3はF又はRで、K5はRで、R8はQで、L12はRで、I14はMで、さらにY15はH又はAである。
【００２０】
ある種の実施態様では、配列番号：28のアミノ酸配列を有する軽鎖FR3領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：G1はRで、F6はIで、S7はTで、T13はA又はSで、T16はI又はAで、K18はR又はTで、S20はA、G又はTで、R21はGで、V22はMで、Q23はEで、T24はA、V又はPで、E25はDで、V29はI、H 又はLで、さらにF31はYで置換される。
ある種の実施態様では、配列番号：29のアミノ酸配列を有する軽鎖FR4領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：F1はSで、Q3はPで、K6はH、Q、E、S又はTで、E8はDで、L9はV、I又はMで、さらにK10はR、D又はTで置換される。
ある種の実施態様では、配列番号：30のアミノ酸配列を有する重鎖FR1領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：Q1はD又はEで、V2はEで、Q3はL又はRで、L4はVで、V5はMで、E6はQ又はDで、A9はGで、E10はD又はNで、L11はV又はRで、V12はR又はKで、Q13はK、T、E、N又はRで、P14はTで、G15はEで、E16はG、A又はTで、S17はAで、L18はVで、R19はK又はEで、L20はI又はPで、T21はF又はSで、A23はK、V又はQで、A24はT又はDで、さらにG26はAで置換される。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：31のアミノ酸配列を有する重鎖FR2領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：V2はL、F又はIで、R3はC又はHで、A5はS、V又はTで、G7はA、E又はSで、K8はQ又はEで、L10はF又はPで、E11はQで、W12はC又はLで、M13はV又はIで、さらにG14はA又はSで置換される。
【００２１】
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：32のアミノ酸配列を有する重鎖FR3領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：R1はQ又はKで、L2はFで、T3はIで、I4はL、M又はVで、T5はSで、R6はA、T、K、G又はVで、T8はN、D、A又はSで、S9はA、D又はTで、K10はT、E、Q、N又はRで、N11はD又はKで、T12はI又はAで、V13はA、L又はGで、F14はY、V、A、S又はWで、L15はMで、Q16はE、D、H又はVで、M17はLで、H18はN、S、T、D、G又はRで、S19はNで、Q21はR、K又はTで、S22はT、I、A又はVで、E23はA、T、D、G又はSで、A26はG又はSで、T27はV、M、I又はAで、Y28はHで、Y29はH又はFで、さらにA31はT、V、G、L、I又はMで置換される。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：33のアミノ酸配列を有する重鎖FR4領域は、以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上で改変され得る：W1はR、C又はLで、G2はAで、Q3はH、R、P又はVで、G4はDで、T5はA又はVで、T6はL、I、Q、M又はSで、V7はIで、T8はA、I又はRで、V9はGで、S10はPで、さらにA11はS又はQで置換される。
ある種の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。典型的には、抗体はネコ化抗体である。
【００２２】
さらにまた別の特徴では、本発明は抗NGF抗体又はそのNGF抗原結合フラグメントに及ぶ。前記抗体又は抗体の結合フラグメントは、
−配列番号：8のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR1フレームワーク領域、
−配列番号：9のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR2フレームワーク領域、
−配列番号：10のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR3フレームワーク領域及び
−配列番号：11のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR4フレームワーク領域の少なくとも1つを含む軽鎖可変領域、及び／又は
−配列番号：12のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR1フレームワーク領域、
−配列番号：13のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR2フレームワーク領域、
−配列番号：14のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR3フレームワーク領域及び
−配列番号：15のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR4フレームワーク領域の少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む。
典型的には、前記軽鎖及び重鎖CDRは、NGF（好ましくはネコNGF）と結合特異性を有する抗体に由来する。
典型的には、本発明のネコ化抗ネコNGF抗体の作製は、軽鎖又は重鎖可変ドメインのフレームワーク領域内への復帰突然変異の導入を必要としない。
【００２３】
ある種の実施態様では、上記記載の前記少なくとも1つのフレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインは、ネコ由来軽鎖定常ドメイン（典型的には軽鎖カッパ定常ドメインであるが場合によって軽鎖ラムダ定常ドメイン）と連接される。ある種の実施態様では、前記軽鎖は、配列番号：8のアミノ酸配列を有するFR1領域、配列番号：9のアミノ酸配列を有するFR2領域、配列番号：10のアミノ酸配列を有するFR3領域、及び配列番号：11のアミノ酸配列を有するFR4領域、又は前述のものと少なくとも85、90、95又は98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は少なくとも約5アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸の長さにわたる。
ある種のさらに別の実施態様では、上記記載のフレームワーク領域の少なくとも1つを含む重鎖可変領域は、少なくとも1つのネコ由来重鎖定常ドメインと連接される。ある種の実施態様では、前記定常ドメインのアミノ酸配列は一切の翻訳後修飾を欠くか、又は定常ドメインがグリコシル化されないように、N-結合若しくはO-結合グリコシレーションに付され得るいずれかの又は全ての残基を除去するために改変することができる。ある種の実施態様では、重鎖は、配列番号：12のアミノ酸配列を有するFR1領域、配列番号：13のアミノ酸配列を有するFR2領域、配列番号：14のアミノ酸配列を有するFR3領域、及び配列番号：15のアミノ酸配列を有するFR4領域、又は前述のものと少なくとも85、90、95又は98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。ある種の実施態様では、前記同一性は少なくとも約5アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸の長さにわたる。
【００２４】
ある種のさらに別の実施態様では、改変は本明細書に記載のフレームワーク領域に対して実施できる。すなわち、本発明者らは、各フレームワーク領域のいくつかの残基について、与えられた位置についてアミノ酸残基に選択の幅があることを確認した。重要なこととして、これらフレームワーク領域の改変は、関連する相補性決定領域に立体構造の変化をもたらさない。なぜならば立体構造の変化は、得られた抗体の結合特異性及び／又は親和性を変更する可能性があるからである。ある種の実施態様では、本発明は、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸残基への2つ以上のアミノ酸置換の導入に及ぶ。
したがって、ある種のさらに別の実施態様では、本発明は、ポリペプチド（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）に及び、前記は、21位のアミノ酸残基I（I21）をアミノ酸残基Aで置換することによって改変されてある、配列番号：8のアミノ酸配列を含むFR1領域を有する軽鎖可変ドメインを含む。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：10のアミノ酸配列を有する軽鎖FR3領域は、31位のアミノ酸残基F（F31）をアミノ酸残基Yで置換することによって改変できる。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：12のアミノ酸配列を有する重鎖FR1領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる（ここでアミノ酸は一文字コードによって示される）：G9はAであり得、D10はEであり得、G15はEであり得、G16はAであり得、R19はKであり得、A23はV又はMであり得る。さらにまた、Q1はD 又はHであり得、V2はEであり得、Q3はLであり得、E6はQであり得、G9はRであり得、L11はVであり得、V12はR又はSであり得、Q13はKであり得、L18はVであり得、R19はSであり得、L20はIであり得、T21はF又はSであり得、A23はKであり得、A24はTであり得、F27はY又はLであり得、S28はT又はNであり得、L29はF又はVであり得、さらにT30はS、G又はRであり得る。
【００２５】
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：13のアミノ酸配列を有する重鎖FR2領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：V2はL、W、F又はAであり、R3 はCであり、A5はP又はTであり、G7はE又はAであり、K8はQ又はTであり、L10はFであり、E11はQであり、W12はE又はTであり、M13はV又はLであり、さらにG14はA、T又はSである。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：14のアミノ酸配列を有する重鎖FR3領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：F2はLであり、S5はTであり、N8はTであり、A9はSであり、N11はDであり、L13はAであり、K21はRであり、T22はSである。さらにまた、T3はAであり、I4はL又はVであり、R6はA又はIであり、N8はSであり、A9はG又はTであり、K10はT、R、G又はQであり、T12はAであり、Y14はD又はSであり、L15はMであり、Q16はE、L又はRであり、M17はL又はTであり、N18はS、D又はTであり、S19はI、N、R又はTであり、K21はG又はTであり、T22はP又はAであり、E23はT、A又はDであり、T25はAであり、T27はV又はMであり、Y29はC又はFであり、C30はRであり、A31はG、I、T、S又はVであり、さらにR32はK、S、T、I、V、P、N又はである。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：15のアミノ酸配列を有する重鎖FR4領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：L6はIである。さらにまた、W1はRであり得、G2はRであり得、Q3はP、V、H又はRであり得、T5はA、V、I又はSであり得、L6はQであり得、S10はTであり得、さらにS11はQ、A又はPであり得る。
本発明の上記特徴のある種の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。典型的には、抗体はネコ化抗体である。
【００２６】
本発明の上記特徴のある種の実施態様では、本発明のネコ化NGF中和抗体又は前記由来の結合フラグメントは、1ｘ10-8以下の平衡解離定数（KD）を有する結合親和性でネコNGF（神経成長因子）と特異的に結合する。さらにまた、好ましくは、本発明のネコ化抗体はネコに存在する他のいずれの（NGF以外の）エピトープとも交差反応せず、さらにそれらをネコに投与したとき本発明の抗体に対して中和抗体を生成しない。さらにまた、好ましくは、前記抗体の定常ドメインは、いずれの下流のエフェクター機能（補体の固定及び活性化、ADCC並びにFcレセプター結合及び活性化を含むが、ただしこれらに限定されない）も媒介しない。
ある種のさらに別の実施態様では、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列に対する改変は本発明の抗体に対して実施できる。前記改変は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換又は欠失を含むことができる。前記アミノ酸の変更は、典型的には抗体の機能的特徴を改変するために実施される。例えば、アミノ酸の改変は、例えばFcレセプターと結合し、補体を活性化し又はADCCを誘発する抗体の能力を防止することによって、抗体の定常ドメインによって媒介される下流のエフェクター機能を妨げるために実施できる。さらにまた、改変は重鎖定常ドメインのヒンジ領域に対して実施して、抗体をネコに投与したとき当該抗体の循環半減期を改変することができる。
ある種の実施態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは下流のエフェクター機能を媒介しない。典型的には、抗体又は結合フラグメントはネコ重鎖サブタイプHC2を有する。
ある種の実施態様では、ネコ化抗体は、本発明の第一の特徴の抗体の調製方法にしたがって調製される。
【００２７】
本発明は、ネコNGFと結合し、p75又はTrkAレセプターと結合するその能力を封鎖する抗体フラグメントに及ぶ。
ある種の実施態様では、抗体の結合フラグメントは、可撓性リンカーによって連結された本発明の重鎖及び軽鎖配列を含み、単鎖抗体を形成することができる。
単鎖Fv（scFV）はVH及びVLドメインを含む。VH及びVLドメインは一緒になって標的結合部位を形成する。これら2つのドメインはペプチドリンカーによって共有結合により連結される。scFv分子は、軽鎖可変ドメインがN-末端で要求される事例ではVL-リンカー-VHの形態を有し、VHドメインがN-末端で要求される事例ではVH-リンカー-VLとしての形態有することができる。したがって、ある種のさらに別の実施態様では、抗原結合フラグメントは単鎖Fv（scFv）抗体フラグメントである。ある種のさらに別の実施態様では、抗体の結合フラグメントは、Fab抗体フラグメント、Fab’抗体フラグメント、F(ab’)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント及びscFv抗体フラグメントなど（ただしこれらに限定されない）から成る群から選択される。
【００２８】
ある種のさらに別の実施態様では、本発明は多重特異的抗体又は多価抗体を提供し、前記は、併用療法で使用される、種々の結合特異性を有するさらに別の抗体と連結又は連接された本発明の抗ネコNGF抗体又は前記に由来する結合フラグメントを含む。多重特異的抗体は、第一のネコNGFエピトープと特異的に結合する少なくとも1つのネコ化若しくはキメラ抗体又は前記に由来する結合フラグメント、及びネコNGFに存在する別のエピトープ又は異なる抗原に特異的な少なくとも1つの結合部位を含む。多価抗体は、同じネコNGFエピトープに対して結合特異性を有する複数の抗体又は抗体の結合フラグメントを含む。したがってある種の実施態様では、本発明は、本発明のネコ化若しくはキメラ抗体の4つ以上のFv領域又はFab領域を含む抗体融合タンパク質に及ぶ。さらにまた別の実施態様は、本発明の抗体に由来する1つ以上のFab領域を、ネコNGFに特異的な抗体に由来する1つ以上のFab又はFv領域とともに含む抗体融合タンパク質に及ぶ。ある種のさらに別の実施態様では、本発明は二重特異性抗体に及び、前記では、本発明の抗体又はその結合フラグメントは、第二の標的（前記標的はネコNGFではない）に対し結合特異性を有する第二の抗体又はそのフラグメントと結合される。好ましくは、前記第二の標的は、p75又はTrkAレセプターを介するNGF媒介シグナリングの防止を補助する。そのような多価、二重特異性又は多重特異性抗体は、当業者に周知の多様な又は組換え方法によって作製することができる。
【００２９】
本発明のさらにまた別の特徴はネコ化抗ニューロトロフィン中和抗体を提供し、前記は以下を含む：
（i）配列番号：3若しくは配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列をもつ軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4若しくは配列番号：22のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列をもつ重鎖可変ドメイン、又は
（ii）配列番号：1のアミノ酸配列を有する軽鎖及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列を有する重鎖をもつキメラ抗体。
ある種の実施態様では、前記ネコ化抗体は、配列番号：5又は配列番号：25のアミノ酸配列を有する軽鎖及び／又は配列番号：6又は配列番号：24のアミノ酸配列を有する重鎖をもつ。ある種の実施態様では、ニュートロフィンはネコ神経成長因子（NGF）である。
本発明のさらにまた別の特徴は、以下の工程を含む、ネコで痛みを治療、阻止又は緩和する方法を提供する：
−治療的に有効な量の抗ネコNGF抗体（又はその抗原結合フラグメント）を提供する工程（ここで、前記抗体は、本発明のネコ化若しくはキメラ抗体又は前記の結合フラグメントである）、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
【００３０】
ある種の実施態様では、ネコ化抗体は、配列番号：3若しくは配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4若しくは配列番号：22のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。ある種のさらに別の実施態様では、ネコ化抗体は、配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有する配列をもつ軽鎖、及び／又は配列番号：6若しくは配列番号：24のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは少なくとも98％同一性のアミノ酸同一性を有する配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る重鎖を含む。
ある種の実施態様では、ネコ化抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明の前述の特徴によって提供されるもののうち任意のものである。
ある種の実施態様では、キメラ抗体は、配列番号：1のアミノ酸配列を有する軽鎖及び／又は配列番号：2のアミノ酸を有する重鎖を含む。
【００３１】
ある種の実施態様では、痛みは神経障害痛である。特に、痛みは術後痛又は外科手術後痛であり得る。術後痛は任意の術技の後で生じ得る。前記術技には、ネコの整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出術、去勢術などが含まれ得る（ただし前記に限定されない）。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは癌又は癌性症状（腫瘍学的痛み）に付随する慢性痛である。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは、関節炎に付随するか又は前記から生じ、前記関節炎には、免疫媒介多発性関節炎、炎症、そう痒症、慢性関節リウマチ又は変形性関節症が含まれる。
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、ネコ対象動物における関節炎の治療方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
−治療的に有効な量の本発明の抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する工程、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
ある実施態様では、抗ネコNGF抗体はキメラ抗体であり、ここで、前記軽鎖は配列番号：1のアミノ酸配列を有し、及び／又は前記重鎖は配列番号：2のアミノ酸を有する重鎖を有する。
【００３２】
ある種の実施態様では、抗体はネコ化抗体である。ある種の実施態様では、ネコ化抗体は、配列番号：3若しくは配列番号：23のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：4若しくは配列番号：22のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
ある種の実施態様では、関節炎には、免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症及び関連症状から成る群から選択される症状が含まれる。
典型的には、関節炎の治療は、当該関節炎症状に付随するか又は前記症状に起因せしめ得る痛みの緩和、阻止、軽減、抑制又は痛みの開始の遅延を含む。
本発明のさらに別の特徴は、ネコNGFの発現の増加又はネコ対象動物におけるNGF感受性の増加によって引き起こされるか、前記に付随するか、又は前記を生じる症状の治療方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−本発明の抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、NGFによってネコで増殖が誘発される腫瘍及び前記に付随する症状の治療方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
−本発明の抗ネコNGF抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程、及び
−前記をその必要があるネコに投与する工程。
ある種の実施態様では、腫瘍は骨肉腫である。ある種の実施態様では、腫瘍はオートクライン又はパラクラインNGFによって増殖が誘発される。
【００３３】
ある種の実施態様では、本発明の前述の方法はさらに、本発明の抗NGF抗体の治療効果を強化及び／又は補完することができる少なくとも1つのさらに別の薬剤を同時投与する工程を含む。例えば、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド又はステロイドと一緒に同時投与できる。
適切な鎮痛剤の例には、ブトルファノール、ブプレノルフィン、フェンタニル、フルニキシンメグルミン、メルピジン、モルヒネ、ナルブフィン及びその誘導体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なNSAIDには、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、カルプロフェン、エトドラク、ケトプロフェン、メロキシカム、フィロコキシブ、ロベナコキシブ、デラコキシブなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ある種のさらに別の実施態様では、少なくとも1つのさらに別の薬剤は、抗生物質、抗真菌治療薬、抗原生動物治療薬、抗ウイルス治療薬又は類似の治療薬から選択される群の1つ以上であり得る治療的に活性な薬剤であり得る。さらにまた、前記少なくとも1つのさらに別の薬剤は、炎症媒介物質の阻害剤（例えばPGE-レセプターアンタゴニスト）、免疫抑制剤（例えばシクロスポリン）、又は抗炎症性グルココルチコイドであり得る。ある種のさらに別の実施態様では、前記少なくとも1つのさらに別の薬剤は、認知機能不全又は障害（老猫でだんだんと頻発し得る、例えば記憶低下又は関連症状）の治療に用いられる薬剤であり得る。さらにまた、前記少なくとも1つのさらに別の薬剤は、心脈管系機能不全の治療（例えば高血圧、心筋虚血、うっ血性心不全などの治療）に用いられる抗高血圧薬又は他の化合物であり得る。さらにまた、前記少なくとも1つのさらに別の薬剤は、利尿剤、血管拡張剤、ベータ-アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト、アンギオテンシン-II変換酵素阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー又はHMG-CoAレダクターゼ阻害剤から成る群から選択できる。
【００３４】
ある種の実施態様では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、前述の方法の部分として、約0.01mg/kg体重から約10mg/kg体重、特に0.03mg/kg体重から約3mg/kg体重の用量範囲でその必要があるネコに投与される。
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体又はその結合フラグメントを含む組成物に及ぶ。ある種の実施態様では、前記組成物はさらに少なくとも1つの医薬的に許容できる担体を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、ネコの痛み、又は慢性痛によって引き起こされるか若しくは慢性痛を生じる症状を治療する医薬組成物を提供し、前記は、医薬的に有効な量の本発明の抗ネコNGFネコ化抗体を少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤とともに含む。
ある種の実施態様では、前記組成物はさらに少なくとも1つの鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド又はステロイドを含む。
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明の抗体又は抗体の結合フラグメントをコードする単離された核酸に及ぶ。
したがって、本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を提供する。
【００３５】
ある種の実施態様では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号：3若しくは配列番号：23のアミノ酸配列を有する抗ネコNGFネコ化抗体若しくは抗体のフラグメントの軽鎖可変ドメイン又は配列番号：5若しくは配列番号：25のアミノ酸配列を有する完全な軽鎖をコードする。ある種のさらに別の実施態様では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号：4若しくは配列番号：22のアミノ酸配列を有する抗ネコNGFネコ化抗体若しくは抗体のフラグメントの重鎖可変ドメイン又は配列番号：6、配列番号：7、配列番号：17、配列番号：18若しくは配列番号：24のアミノ酸配列を有する重鎖をコードする。
ある種の実施態様では、前記単離された核酸はさらに、前記に作動できるように連結された1つ以上の調節配列をコードする。
さらに別の特徴では、本発明の重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン又は重鎖及び／又は軽鎖定常ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。ある種の実施態様では、前記発現ベクターはさらに1つ以上の調節配列を含む。ある種の実施態様では、前記ベクターはプラスミド又はレトロウイルスベクターである。
さらにまた別の特徴は、本発明の前述の特徴の発現ベクターを取り込んでいる宿主細胞を提供する。本発明のさらに別の特徴は、本発明の前述の特徴のいずれかの抗体を生成する宿主細胞を提供する。
本発明のさらにまた別の特徴は抗ネコNGF中和抗体を生成する方法を提供し、前記方法は、本発明の前述の特徴の宿主細胞を培養して前記細胞に抗ネコNGF中和抗体を発現させる工程を含む。
【００３６】
本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の抗ネコNGFネコ化抗体を生成する方法を提供する。前記方法は、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖を発現する本発明の前述の特徴のポリヌクレオチド／核酸又はベクターの１つ以上を適切な宿主細胞で発現する工程、発現されたポリペプチドを回収する工程（前記ポリペプチドは1つの宿主細胞で一緒に発現されるか、又は異なる宿主細胞で別々に発現され得る）、及び前記抗体を単離する工程を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、ネコで痛みを治療、緩和又は阻止する方法を提供し、前記方法は、本発明の前述の特徴のいずれかに示すポリヌクレオチドの有効量をネコに投与する工程を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、ネコの痛みの治療、緩和又は予防に使用される、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体若しくは抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴に示す医薬組成物、又は本発明の前述の特徴のいずれかに示す核酸又は前記を含むベクターを提供する。
ある種の実施態様では、痛みは急性痛である。ある種の実施態様では、痛みは慢性痛である。さらにまた、痛みは術後痛、又は任意の術技から生じる痛みであり得る。前記術技にはネコの整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出術、去勢術などが含まれ得る（ただし前記に限定されない）。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは癌又は癌性症状に付随する慢性痛である。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは、関節炎又は関節炎症状に付随するか又は前記から生じ、前記関節炎症状には、多発性関節炎、炎症、そう痒症、慢性関節リウマチ及び変形性関節症が含まれる。
【００３７】
本発明のさらにまた別の特徴は、変形性関節症及び／又は慢性関節リウマチの治療で使用される、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体若しくは抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴に示す医薬組成物、又は本発明の前述の特徴のいずれかに示す核酸若しくは前記を含むベクターを提供する。
本発明のさらにまた別の特徴は、ネコ対象動物のNGF誘発増殖腫瘍及び前記に付随する症状（特に骨肉腫）の治療に使用される、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体若しくは抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴に示す医薬組成物、又は本発明の前述の特徴のいずれかに示す核酸若しくは前記を含むベクターを提供する。ある種の実施態様では、腫瘍はオートクライン又はパラクラインNGFによって増殖が誘発される。
本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体若しくは抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴に示す医薬組成物、又は本発明の前述の特徴のいずれかに示す核酸若しくは前記を含むベクターの、ネコの痛みの治療又は予防用医薬の調製における使用を提供する。
ある種の実施態様では、痛みは急性痛である。さらに別の実施態様では、痛みは慢性痛である。さらにまた、痛みは術後痛、又は任意の術技から生じる痛みであり得る。前記術技には、ネコの整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出術、去勢術などが含まれ得る（ただし前記に限定されない）。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは癌又は癌性症状に付随する慢性痛である。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは、炎症、そう痒症、慢性関節リウマチ又は変形性関節症に付随するか又は前記から生じる。
【００３８】
本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体若しくは抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴に示す医薬組成物、又は本発明の前述の特徴のいずれかに示す核酸若しくは前記を含むベクターの、ネコの慢性関節リウマチ又は変形性関節症の治療、阻止、緩和又は予防用医薬の調製における使用を提供する。
本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗体若しくは抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴に示す医薬組成物、又は本発明の前述の特徴のいずれかに示す核酸若しくは前記を含むベクターの、ネコのNGF誘発増殖腫瘍及び前記に付随する症状（特に骨肉腫）の治療用医薬の調製における使用を提供する。ある種の実施態様では、腫瘍はオートクライン又はパラクラインNGFによって増殖が誘発される。
さらにまた別の特徴では、本発明の抗ネコNGF中和モノクローナル抗体又はそのフラグメントを生成する細胞株又はその誘導若しくは子孫細胞が提供される。前記抗体はネコ化抗体又はキメラ抗体であり得る。
本発明のさらにまた別の特徴は、ネコの痛みの治療用、又は痛みに付随する症状の治療用、又は変形性関節症、慢性関節リウマチ若しくは多発性関節炎に付随する痛みの治療、緩和若しくは阻止用キットを提供し、前記キットは、本発明の前述の特徴のいずれかに示す抗ネコNGF抗体又は結合フラグメント及び前記の使用のための指示を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、液体中の抗ネコNGFモノクローナル抗体のin vitro、ex vivo及びin vivo検出用診断キットを提供し、前記キットは前記抗体の濃度測定に使用される。前記キットは、本発明の任意の抗体又は前記の結合フラグメントを含むことができる。前記キットは前記を使用するための指示を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1Aは、ネコ-ラットキメラ抗体とネコNGFとの結合を示すグラフである。図1Bは、ネコ-ラットキメラ抗体とネズミNGFとの結合を表示するグラフを示す。
【図２】図2Aは、ネコ-ラットキメラ抗体がプロテインAを用いて精製できることを示す。図2Bは、当該キメラ抗体の重鎖及び軽鎖の両方を示すバンド形成を有するゲルを示す。
【図３】図3Aは、ネコ化抗体とネコNGFとの結合を示すグラフである。図3Bは、ネコ化抗体とネズミNGFとの結合を表示するグラフを示す。
【図４】図4Aは、ネコ化抗体がプロテインAを用いて精製できることを示す。図4Bは、当該ネコ化抗体の重鎖及び軽鎖の両方を示すバンド形成を有するゲルを示す。
【図５】NGF誘発TF1細胞増殖の抗ネコNGFネコ化抗体による阻害を示すグラフである。
【図６】抗原捕捉ネコ化抗体によって誘発される補体沈着を示すグラフを示す。
【図７】本発明のネコ-ラットキメラ抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す（リーダー配列及び配列末端に二重終止コドンを含む）（配列番号：20）。ラット由来の可変ドメイン残基は太字で示される。
【図８】本発明のネコ-ラットキメラ抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す（リーダー配列及び配列末端に二重終止コドンを含む）（配列番号：21）。ラット由来の可変ドメイン残基は太字で示される。
【図９】本発明のネコ化抗体の軽鎖可変ドメイン（配列番号：3）のアミノ酸残基を示す。3つのCDR残基（CDR1、CDR2及びCDR3）を含む残基には下線が付されている。星印は、ラットアルファD11抗マウスNGF抗体の等価残基との残基の違いを示す。残基の番号付与はKabatにしたがう。
【図１０】本発明のネコ化抗体の重鎖可変ドメイン（配列番号：4）のアミノ酸残基を示す。3つのCDR残基（CDR1、CDR2及びCDR3）を含む残基には下線が付されている。星印は、ラットアルファD11抗マウスNGF抗体の等価残基との残基の違いを示す。残基の番号付与はKabatにしたがう。
【図１１】本発明のネコ化抗体の軽鎖（配列番号：5）のアミノ酸配列を示し、ここで、太字の残基は可変ドメインのアミノ酸残基であり、その後の残基は軽鎖カッパ定常ドメインである。
【図１２】本発明のネコ化抗体の重鎖（配列番号：6）のアミノ酸配列を示し、ここで、太字の残基は可変ドメインのアミノ酸残基であり、その後の残基は定常ドメインの残基である。
【図１３】本発明のまた別のネコ化抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号：22−feN2-VH）。
【図１４】本発明のまた別のネコ化抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す（前記は軽鎖カッパ定常ドメインを有する）（配列番号：23−feN2-Vk）。
【図１５】本発明のまた別のネコ化抗体の完全な重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号：24−feN2-HC2）。
【図１６】本発明のまた別のネコ化抗体の軽鎖（軽鎖カッパ定常ドメインを有する）のアミノ酸配列を示す（配列番号：25−feN2-ILC）。
【図１７】本発明の方法に一致する方法によって調製された、イヌで炎症痛を軽減する抗イヌNGFモノクローナル抗体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
徹底的な実験の後に、本発明者らは、ラット抗マウスNGFモノクローナル抗体（MAb）αD11のアミノ酸配列を入手し、前記を用いて非免疫原性のキメラ及びネコ化抗NGF抗体を作製した。前記キメラ抗体は、ネコ抗体由来重鎖及び軽鎖定常ドメインに連接された、アルファD11ラット抗マウスNGF抗体由来の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む。さらにいっそう驚くべきことには、前記ネコ化抗体（標準的なCDR移植技術を用いて作製されたものではない）は、高親和性ネコNGF結合を有することが示されている。驚くべきことに、キメラ抗体及びネコ化抗体はどちらもネコNGFの生物学的機能を中和し、もっとも驚くべきことには、ネコNGFと細胞上のNGFレセプターTrkA及びp75との結合を阻害することによって中和する。さらにまた、予想に反して、ネコに投与したとき当該抗体に対して中和抗体が産生されないこともまた見出された。したがって、本発明のネコ化抗体及びキメラ抗体はともにネコにおける長期間の慢性痛除去に適切である。
【００４１】
本発明者らが用いた、本発明の抗体のための重鎖及び軽鎖可変ドメインを作製するプロセスは、軽鎖及び重鎖可変ドメインのフレームワーク領域内に存在する特定のラット（ドナー）のアミノ酸残基の入れ替えをもたらす。前記入れ替えに用いられる残基は、本発明者らの分析にしたがえば、当該CDR領域の立体構造を維持（したがって結合特異性及びアビジチーを維持）するが、もし未改変の形態で抗体がネコに投与されたならば当該抗体に対する中和抗体が生じる可能性がある免疫原性エピトープの存在を減少させる残基である。具体的には、本発明の抗体を調製する方法（ペチセーション（PETisation）として知られている）は、ドナー（例えばラット）抗体のフレームワーク領域の配列をネコ由来の1つの抗体又はプール抗体の配列と比較することによって、ネコへの投与の適切性についてドナー抗体のフレームワーク領域の配列を評価する工程を含む。比較はドナー配列と標的配列のただ1つのメンバーとの間で実施されるが、標的配列プールとの比較が好ましいことは明白であろう。なぜならば、標的配列プールとの比較は、標的種の各Kabatの位置で無理のない選択肢の数を広げることとなるからである。前記は、ドナーと標的との間の“マッチ”のチャンスを増加させるだけでなく、マッチが存在しない入れ替えの選択肢もまた増加させるであろう。結果として、ドナーに可能な限り近い特性をもつ入れ替えを選択することができる。ドナー配列とネコ配列が任意のKabat番号又は対応する位置で異なる場合、ドナー配列は、問題のアミノ酸残基をネコの当該位置で無理がないことが知られているアミノ酸残基で置換することによって改変される。
【００４２】
ドナーの免疫グロブリンフレームワーク領域に存在するアミノ酸残基の置換が必要な場合、典型的には、置換は保存的置換の原則を用いて実施される（保存的置換では、アミノ酸残基は、ネコの当該Kabatの位置で無理がなく、さらにドナー配列の置換されるアミノ酸とサイズ、荷電及び疎水性が可能な限り密接な関係を有するアミノ酸残基で入れ替えられる）。その意図は、ドナー抗体の三次元構造に混乱又は破壊を引き起こさないか又は前記を最小にする入れ替えを選択することである。ある種の状況では、明瞭な選択肢が存在せず、各選択が利益及び不利益を有するであろう。最終的な決定には三次元モデリング又は多様な選択配列の発現さえ要求され得る。しかしながら、一般的には明瞭な優先性が利用可能であろう。この方法の結果として、ドナー配列の変更は、当該残基が標的内で異質であるときにのみ実施され、入れ代わったアミノ酸は、前記が入れ替えたアミノ酸と可能な限り密接な関係を有する。したがって、異質なエピトープの発生は回避されるが、全体的な三次元構造は保存され、結果として親和性及び特異性もまた保存される。
当該軽鎖及び重鎖定常領域はネコ（標的）由来抗体から誘導される。前記重鎖定常ドメインは、それらが下流のエフェクター機能を媒介しないように精選又は改変される。極めて驚くべきことには、本発明にしたがって生成された抗体に対して中和抗体は生成されないか又は最小限しか生成されないことが見出されたので、本発明の抗体は驚くべきことに、長期の循環半減期及び反復投与の選択肢に付随する利益を有することが判明した。さらにまた、フレームワーク残基の置換が、CDR領域の三次元構造に影響しないような態様で実施されるので、所望の標的に対する結合特異性に多様性は存在しないであろう。
【００４３】
ヒト及びマウスには4つの主要なIgGアイソタイプが存在し、呼称は類似するが、それらは、作用態様及び機能（細菌生成物（例えばプロテインA及びプロテインG）に対する親和性、補体依存細胞溶解（CDC）活性化能力、並びに抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）による標的細胞の殺滅誘発能力を含む）に違いを有する。CDC及びADCC活性を有する（又は“武装した”）定常ドメインをもつIgGアイソタイプを選択することは、標的細胞の同族抗原を有する標的細胞を排除するように設計するときには（例えば腫瘍学において又は感染制御時に）臨床的に有利であると考えられる（例えば人間の医療における使用ではIgG1アイソタイプが上記の目的のために好ましい）。対照的に、免疫系の活性化は、他の設定では（例えば炎症、痛み又は自己免疫の除去では）望ましくないと考えられ、したがって最小限のCDC及びADCC活性を示すヒトIgGアイソタイプが好ましい（例えばそのような人間の医療における使用ではIgG4アイソタイプがしばしば好ましい）。CDC及びADCC活性を有する定常ドメインをもつIgGアイソタイプの選択は、同族抗原を有する標的細胞を排除するように設計するときには、例えば腫瘍学において又は感染制御時には有利であると考えられる。例えば人間の医療における使用ではIgG1アイソタイプが好ましい。対照的に、免疫系の活性化は、他の設定では（例えば炎症、痛み又は自己免疫の除去では）望ましくないと考えられ、したがって最小限又は“非武装”のCDC及びADCC活性を示すヒトIgGアイソタイプが好ましい。例えば人間の医療における使用ではIgG4アイソタイプが選択されるであろう。ネコMAbアイソタイプが同様な又は異なる活性スペクトルを有するのか否かは分からないが、武装又は非武装重鎖の選択は同様に重要であろうと推定される。
【００４４】
本発明のネコ化抗体及びキメラ抗体はともにネコ由来重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。さらにまた、ネコ化及びキメラ抗体の両方で、相補性決定領域（CDR）はラットアルファD11抗マウスNGF抗体から誘導される。前記αD11抗体は最初Cattaneoらが記載した（Cattaneo A, Rapposelli B, Calissano P. (1988) “Three distinct types of monoclonal antibodies after long-term immunization of rats with mouse nerve growth factor”J Neurochem 50(4):1003-1010）。アルファD11抗体は、続いてRubertiらによってクローニングされた（Ruberti, F. et al. (1993) “Cloning and Expression of an Anti-Nerve Growth Factor (NGF) Antibody for Studies Using the Neuroantibody Approach” Cellular and Molecular Neurobiology. 13(5):559-568）。
本発明のキメラ抗体では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、αD11抗体に由来する完全な可変ドメインである。
本発明のネコ化抗体では、αD11抗体に由来するCDR領域は、特定のアミノ酸残基を置換するという方法（ただしαD11抗体に存在するフレームワーク領域を土台にしている）によって改変されてあるフレームワーク領域と結合される。このプロセスは、ネコに当該抗体を投与した後でT細胞によって標的とされ得るエピトープの除去をもたらす。さらにまた、このフレームワーク領域の改変は、当該CDR領域の三次元構造を保存するが、当該抗体をネコに投与したとき前記に対する中和抗体の生成を妨げるような態様で精選される。
【００４５】
軽鎖及び重鎖可変領域の各々は4つのフレームワーク領域（FR1−FR4と称される）を含む。これらのフレームワーク領域の各々について、本発明者らは、特定の位置毎に好ましい残基（いわゆる優先残基）、及びさらに別の代替アミノ酸残基（前記もまた当該位置に提供し得る）を同定した。下記の表1から8は重鎖及び軽鎖の各々の4つのフレームワーク領域を示す。これらの表は、当該個々のフレームワーク領域に対応するアミノ酸の位置とともに、さらに完全な重鎖又は軽鎖可変ドメインの全長に沿って具体的な残基の位置を見分けるために用いられるKabat番号付与システムによるアミノ酸の位置を提供する。グループ1の残基として示される1つの残基又は複数の残基は優先残基であり、一方、グループ2の残基は代替残基である。しかしながら後者は一般的に、当該個々の位置に関してグループ1に示す残基よりも優先性は低いであろう。アミノ酸残基は一文字システムを用いて識別される。
【００４６】
表1：軽鎖可変ドメインFR1の残基
2014519317.tif 000003
表2：軽鎖可変ドメインFR2残基
2014519317.tif 000004
表3：軽鎖可変ドメインFR3残基
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表4：軽鎖可変ドメインFR4残基
2014519317.tif 000006
表5：重鎖可変ドメインFR1残基
2014519317.tif 000007
表6：重鎖可変ドメインFR2残基
2014519317.tif 000008
表7：重鎖可変ドメインFR3残基
2014519317.tif 000009
表8：重鎖可変ドメインFR4残基
2014519317.tif 000010
【００４７】
したがって、本発明のネコ化抗体は、本発明のキメラモノクローナル抗体（第一の種に由来する完全な可変領域（ラットアルファD11抗マウスNGF抗体）及び第二の種に由来する定常ドメイン（ネコ由来抗体）から成る）、又はCDR移植ネコ化抗体（重鎖及び軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）は、ドナー抗体に由来しフレームワーク領域（FR）に導入されたアミノ酸残基並びに標的の抗体又はネコ生殖細胞系列の配列に由来する定常領域（CR）を含む）とは異なる。
好ましくは、ネコ化抗体は、そのCDRが由来した親（ドナー）抗体の結合特性を実質的に保持する。前記は、ネコ化抗体が、そのCDRが由来したドナー抗体（本事例ではラット由来アルファD11抗マウスNGF抗体）と同じ又は実質的に同じ結合親和性を示すことを意味する。理想的には、ネコ化抗体の親和性は、標的エピトープに対するドナー抗体の親和性の10％より低くはなく、より好ましくは約30％より低くはなく、もっとも好ましくは親抗体の50％より低くはないであろう。抗原結合親和性をアッセイする方法は当業界で周知であり、1/2最大結合アッセイ、競合アッセイ及びスキャチャード分析が含まれる。
【００４８】
上記で規定したように、本発明は、本発明のキメラ化抗体又はネコ化抗体に由来する結合メンバー又は抗原結合フラグメントに及ぶ。そのような抗原結合フラグメントは、ネコNGFと特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって達成され得ることが示された。ある種の実施態様では、前記結合メンバー又は抗原結合フラグメントは単離された結合メンバーであり得る。本発明の結合メンバー又は抗原結合フラグメントは、本発明の抗体のフラグメント、例えば完全にネコ化された抗体分子のフラグメント、例えば重鎖若しくは軽鎖のみ、又は例えば重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインを含むことができる。ある種の実施態様では、結合メンバーは、典型的には抗体のVH及び／又はVLドメインを含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成る。結合メンバーのVHドメインはまた本発明の部分として提供される。VH及びVLドメインの各々には3つの相補性決定領域（“CDR”）が4つの付随フレームワーク領域（“FR”）と一緒に存在する。VHドメインは典型的には3つのHCDR（重鎖相補性決定領域）を含み、VLドメインは典型的には3つのLCDR（軽鎖相補性決定領域）を含む。したがって、結合メンバーは、VHドメイン（複数の付随するフレームワーク領域とともに一列に並んだVHCDR1（又はHCDR1）、CDR2（HCDR2）及びCDR3（HCDR3）領域を含む）を含むことができる。結合メンバーは、前記に加えて或いはまた別に、VLドメイン（付随するフレームワーク領域とともにVLCDR1、CDR2及びCDR3ドメインを含む）を含むことができる。VH又はVLドメインは、典型的には4つのフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3及びFR4）を含み、前記領域には以下の編成で3つの相補性決定領域が介在する：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
【００４９】
図9は、本発明の抗NGF抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。CDR1、CDR2及びCDR3領域には下線が付されている。さらにまた、図10は本発明の抗NGF抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。CDR1、CDR2及びCDR3領域には下線が付されている。
図9及び10では、軽鎖可変ドメイン（図9）及び重鎖可変ドメイン（図10）の残基は、便利にはKabatらによって考案された番号付与システムにしたがって番号が付与されている（Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242）。Kabat番号付与システムは一般的に、可変ドメインの残基（軽鎖の約1−104残基及び重鎖の1−113残基）を指すときに用いられる。この番号付与システムは特段の場合に本明細書で用いられる。Kabatのアミノ酸残基指定は、該当配列の対応する配列番号で列挙された配列で提供される本発明の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸残基の直線的番号付与と常に直接的に一致するとは限らない。特に実際の直線的アミノ酸配列は、フレームワーク領域であれ又は相補性決定領域（CDR）であれ、重鎖又は軽鎖の基本的可変ドメインの構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応して、厳格なKabat番号付与の場合よりも減少又は増加したアミノ酸を含むことができる。任意のある抗体の残基に対する正確なKabatの番号付与は、Kabatの番号付与が適用されている標準配列に対して当該抗体の配列アラインメントを実施することによって決定できる。
【００５０】
図10は、本発明のネコ化抗ネコNGF抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。前記はまた配列番号：4で示される。しかしながら、図10では、用いられた番号付与（Kabat）はアミノ酸残基80、80A、80B、及び80Cを示すが、配列番号：4では番号付与は連続的に続く（すなわち残基80、81、82、及び83）。同じことが図10のKabat残基100、100A、100B、100C、100D及び100Eにも当てはまる。
これまでに記載したように、抗体の結合フラグメントは、Fabフラグメント、Fab’フラグメント及びscFv（単鎖可変フラグメント）を含む群（ただしこれらに限定されない）から、又はペプチド模倣体、ジアボディ若しくは関連する多価誘導体から選択できる。
ある種の実施態様では、抗体の結合フラグメントは、Fab又はF(ab')2フラグメント（抗体のVL、VH、CL及びCH1ドメインから成る）である。ある種の実施態様では、VLドメインは配列番号：3のアミノ酸配列を有し、VHドメインは配列番号：4のアミノ酸配列を有する。ある種の実施態様では、CL及びCH1ドメインは、ネコ免疫グロブリンのCL及びCH1ドメインのアミノ酸配列を土台にする。
【００５１】
Fab、Fab’又はF(ab')2フラグメントの組換え体作製に用いられる技術は当業者に周知であり、PCT特許公開公報WO 92/22324及びSawaiらの論文（Sawai et al., “Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors”, 1995, AJRI 34:26-34）に開示された技術が含まれる。scFv（単鎖Fvフラグメント）の作製に用いることができる技術の例は以下に開示されている：Huston et al., “Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins”, Methods in Enzymology, vol. 203:46-88, 1991（前記文献の内容は参照により本明細書に含まれる）。
ある種の実施態様では、抗体フラグメントは、モリモトの方法にしたがってタンパク質分解消化により完全長抗体から誘導することができる（Morimoto et al.,“Single-step purification of F(ab')2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins G1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW”Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117, 1992）。抗体フラグメントはまた、宿主細胞によって直接生成することができる（Carter et al., “High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment”Bio/Technology 10:163-167, 1992）。
【００５２】
キメラ及びネコ化モノクローナル（ネコNGFと結合特異性を有し、ネコNGF機能と拮抗する）の提供に加えて、本発明はさらに、配列番号：3に規定されるVL（軽鎖可変）領域のアミノ酸配列及び配列番号：4に規定されるVH（重鎖可変）領域のアミノ酸配列を土台とする一対の結合ドメインを含む抗体以外の結合メンバーに及ぶ。特に本発明は単一結合ドメインに及び、前記は、本発明の抗体のネコ化抗体のVL又はVH領域のどちらかを土台にする。
したがって、本発明のある種のさらに別の実施態様では、本発明のネコ化抗体から誘導された単一結合ドメインを含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る結合メンバーが提供される。ある種の実施態様では、前記単一結合ドメインは、配列番号：4に規定されるVH（重鎖可変ドメイン）のアミノ酸配列から誘導される。そのような結合ドメインはネコNGFの標的薬剤として用いることができる。
【００５３】
ある種の実施態様では、さらに別の操作技術を用いて本発明の抗体を改変することができる（例えば、Fc領域（血清半減期を改変できる）、補体の固定、Fcレセプター結合及び／又は抗原依存細胞性細胞傷害の改変を含む）。さらにまた、ある種の実施態様では、グリコシル化パターンが変化されてある抗体又は抗体フラグメントを生成できる。ある種の実施態様では、本発明の抗体は、抗体のグリコシル化の程度を増加又は低下させるために改変される。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN-結合又はO-結合である。N-結合は、アスパラギン残基の側鎖と炭水化物部分との結合を指す。トリペプチド配列、アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、炭水化物部分とアスパラギン側鎖との酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のどちらかの存在は潜在的グリコシル化部位を作出する。O-結合グリコシル化は、糖類、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの1つとヒドロキシアミノ酸（もっとも一般的にはセリン又はスレオニンであるが5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いることができる）との結合を指す。本発明者らはグリコシル化されていないネコ重鎖定常領域のアミノ酸配列を提供した（前記は配列番号：7に規定されている）。
ある種のさらに別の実施態様では、本発明の抗ネコNGF抗体は、当該抗体をポリエチレングリコール（PEG）誘導体と反応させることによってPEG添加することができる。ある種の実施態様では、ネコ化又はキメラ抗体は脱フコシル化され、したがってフコース残基を欠く。
【００５４】
ある種の実施態様では、抗体の生物学的特性の改変は、（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造（例えばシート又はヘリックスの立体構造としての構造）、（b）標的部位における当該分子の荷電又は疎水性、又は（c）側鎖の嵩に影響を与える置換を選択することによって達成できる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性にしたがって以下のように分類できる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York, 1975）：（1）非極性残基：Ala（A）、VaI（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性残基：GIy（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性残基：Asp（D）、GIu（E）；（4）塩基性：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。或いはまた、天然に存在する残基は、以下のように共通の側鎖の特性を基準にして分類できる：（1）疎水性残基：ノルロイシン、Met、Ala、VaI、Leu、Ile；（2）中性親水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性残基：His、Lys、Arg；（5）鎖の方向性に影響する残基：Gly、Pro；（6）芳香族残基：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換では、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに由来する残基に交換することが要求されるであろう。そのような置換残基はまた保存的置換部位に、又はそのままの（例えば非保存的）部位に導入することができる。
【００５５】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、パートナー分子と連結された本発明の抗ネコNGF抗体又はその抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートに及ぶ。ある種の実施態様では、そのような抗体-パートナー分子結合物は、化学的リンカー（例えばペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー又はジスルフィドリンカー）の手段によって結合される。ある種の実施態様では、前記カップリングパートナーはエフェクター分子、標識、薬剤、又は担体分子である。本発明の抗体をペプチジル及び非ペプチジルカップリングパートナーのどちらともカップリングさせる適切な技術を当業者は周知しているであろう。適切な標識の例には、検出可能な標識（例えば放射能標識）又は酵素標識（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）又は化学的成分（例えばビオチン）が含まれる。或いはまた、標識は、機能性標識（例えばリシン）又はプロ-ドラッグ（前記はプロドラッグを抗体の結合部位で活性薬剤に変換することができる）であり得る。
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明のキメラ及びネコ化抗体、又は本発明の抗体のフラグメント及び結合メンバーをコードするポリヌクレオチド、及び特に単離ポリヌクレオチドに及ぶ。本明細書に規定するように、“ポリヌクレオチド”は、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを含み、前記は、未改変RNA若しくはDNAでも又は改変RNA若しくはDNAでもよく、一本鎖及び二本鎖RNA並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNAを含む（ただし前記に限定されない）。本発明のポリヌクレオチド（例えば本発明の1つのポリペプチド又は複数のポリペプチドをコードする）には、その対立遺伝子変種及び／又はそれらの相補物（そのようなヌクレオチド配列と中等度の又は高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む）が含まれる。
【００５６】
本発明はさらに、抗体模倣物、例えば本発明のキメラ及びネコ化抗ネコNGF抗体を土台にするドメイン抗体、ナノボディ、ユニボディ、バーサボディ及びデュオカリンに及ぶ。極めて多様な抗体模倣技術が当業者には知られている。例えば、いわゆるドメイン抗体（Domantis, UK）は、ヒト抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域に対応する抗体の小さな機能性結合ユニットである。そのようなドメイン抗体作製の指示は、米国特許6,291,158号、米国特許6,582,915号及び米国特許6,593,081号で見出すことができる。ナノボディは抗体由来治療タンパク質であり、ラクダ科動物で見出される天然に存在する重鎖抗体の固有の構造的及び機能的特性を含む。ユニボディはさらに別の抗体フラグメント技術であり、IgG4抗体のヒンジ領域の除去を基準にする。ヒンジ領域の欠失は、伝統的なIgG4抗体のほぼ半分のサイズである、一価の結合領域を有する分子を生じる。ユニボディは不活性で、したがって免疫応答を誘発しないIgG4抗体の特性を保存する。
さらに別の結合分子には、アフィボディ分子（米国特許5,831,012号）、DARPin（設計されたアンキリンリピートタンパク質）（PCT国際特許出願公開公報WO 02/20565）及びアンチカリン（米国特許7,250,297号及びWO 99/16873）が含まれる。バーサボディ（Amunix、米国特許出願公開公報2007/0191272）は、ミクロプロテインと称される、15％を超えるシステイン残基を有する3−5kDaの小タンパク質であり、典型的にタンパク質が提示する疎水性コアと入れ替わった高密度ジスルフィド結合の足場を形成する。
【００５７】
アビマーは抗体模倣物のもう1つのタイプである。アビマーはヒト血清蛋白質ファミリーの組換えに由来する。前記は、モデュール式結合ドメインで構成される1本のタンパク質鎖であり、当該ドメインの各々は特定の標的部位と結合するように設計される。アビマーは、1つのタンパク質標的上の複数の部位及び／又は複数のタンパク質標的上の複数の部位と同時に結合することができる。マルチポイント結合又はアビジチーとして知られているように、この結合メカニズムは、複数の細胞と複数の分子が体内で相互作用する態様を模倣し、アンタゴニスト及びアゴニストの作出を支援し、複数の機能及び強力な活性を有する薬剤をもたらす。アビマーライブラリーは、WO 2004/044011（前記文献は参照により本明細書に含まれる）にしたがって作製することができる。アビマーライブラリーはまた市場（Avidia Inc, Mountain View, California, USA）で入手できる。
【００５８】
抗体生成
本発明の抗体及び結合メンバーは化学的合成によって全体として又は部分として生成できる。例えば、本発明の抗体及び結合メンバーは、当業者に周知の技術（例えば標準的な液体ペプチド合成又は固相ペプチド合成の方法）によって調製できる。或いはまた、本抗体及び結合メンバーは、液相ペプチド合成技術を用いて、又はさらに固相、液相及び溶液化学の組合せによって調製できる。
本発明はさらに、本発明の抗体を含む少なくとも1つのアミノ酸をコードする核酸を、所望のペプチド又はポリペプチドがコードされ得る適切な発現系で発現させることによって本発明の抗体又は結合メンバーを生成することに及ぶ。例えば、軽鎖アミノ酸をコードする核酸及び重鎖アミノ酸をコードする第二の核酸を発現させ、本発明の抗体を提供することができる。
したがって、本発明のある種のさらに別の特徴では、本発明の抗体又は結合メンバーを形成するアミノ酸配列をコードする核酸が提供される。
典型的には、本発明の抗体又は結合メンバーを形成するアミノ酸配列をコードする核酸は、単離形若しくは精製形で提供されるか、又は天然では当該核酸に付随し得る物質を実質的に含まない（ただし例外として1つ以上の調節配列を有する）形態で提供され得る。本発明の抗体又は結合メンバーを発現する核酸は全体として又は部分として合成でき、前記にはDNA、cDNA及びRNAが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
【００５９】
本発明の抗体又は結合メンバーをコードする核酸は、当業者に周知の技術を用いて当業者は容易に調製することができる。前記は、例えば以下に記載されている技術である：Sambrook et al.“Molecular Cloning”, A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001（ISBN-0879695773）及びAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999（ISBN- 0471250929）。前記技術には（i）核酸サンプルの増幅にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用、（ii）化学合成、又は（iii）cDNA配列の調製が含まれる。本発明の抗体又は結合メンバーをコードするDNAは当業者に公知の任意の適切な方法で生成及び使用され得る。前記方法は、コードDNAを採取し、発現されるべき部分のどちらかの側の適切な制限酵素認識部位を同定し、さらに前記部分をDNAから切り出す工程を含む。続いて、前記切り出した部分を適切なプロモーターに作動できるように連結し、さらに適切な発現系（例えば市場で入手できる発現系）で発現させることができる。或いはまた、DNAの関連する部分を適切なPCRプライマーを用いることによって増幅させることができる。DNA配列の改変は部位特異的変異導入を用いて実施できる。
【００６０】
本発明の抗体又は結合メンバーをコードする核酸配列は、上記に記載の少なくとも1つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物として提供することができる。前記構築物は、組換え宿主細胞（上記のような1つ以上の構築物を含む）内に含まれ得る。発現は、便利には適切な条件下で、適切な核酸配列を含む組換え宿主細胞を培養することによって達成できる。発現に続いて、適切な技術を用いて抗体又は抗体フラグメントを単離及び／又は精製し、続いて適切に使用することができる。
多様な種々の宿主細胞でポリペプチドをクローニング及び発現させる系は良く知られている。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現に当業界で利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞及びNS0マウスミエローマ細胞が含まれる。一般的で好ましい細菌宿主は大腸菌（E. coli）である。抗体及び抗体フラグメントの原核細胞（例えばE. coli）での発現は当業界では良く確立されている。
培養真核細胞での発現もまた、結合メンバーの生成のための選択肢として当業者には利用可能である。
抗体を生成する一般的な技術は当分野の業者には周知であり、そのような方法は、例えば以下で考察されている：Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497；米国特許4,376,110号；Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor。組換え抗体分子の調製技術は、上記の参考文献に及び例えば欧州特許0,368,684号にも記載されている。
【００６１】
本発明のある種の実施態様では、抗体又は結合メンバーの重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸が利用される。規定すれば、そのような核酸は、前記コード核酸又はその相補性核酸から成る一本鎖、二本鎖核酸、又はこれら相補性（一本鎖）核酸そのものをコードする。
さらにまた、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に存在する重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメイン又はその変異体をコードする真性の配列を有する、酵素的に又は化学的に合成された核酸であり得る。
本発明の抗体は、組換え手段によって、直接的に生成されるだけでなく異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生成することができる（前記異種ポリペプチドは、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのN-末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである）。優先的に選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセッシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。本来の抗体のシグナル配列を認識及びプロセッシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核細胞シグナル配列によって代用される。
【００６２】
“単離された”という用語は、本発明のネコ化抗体、又は前記に由来する結合メンバー、又はそれらをコードするポリペプチドに対応して用いられるとき、前記抗体、結合メンバー又は核酸（ポリヌクレオチド）が単離及び／又は精製された形態で提供され（すなわちそれらはそれらの天然の環境から分離されてあるか、単離されているか、又は精製されてある）、さらに実質的に純粋若しくは均質な形態で提供され、又は核酸の場合には必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源を有する核酸又は遺伝子を含まないか又は実質的に含まない状態を指す。したがって、そのような単離抗体、結合メンバー及び単離された核酸は、それらに天然の状態で付随する物質（例えばそれらがその天然の環境で、又はそのような調製が組換えDNA技術によってin vitro又はin vivoで実施されるときそれらが調製される環境（例えば細胞培養）で一緒に見出される他のポリペプチド又は核酸）を含まないか又は実質的に含まないであろう。
抗体、結合メンバー及び核酸は希釈剤又はアジュバントとともに処方することができ、さらに実用的な目的のために単離された形態で提供されると考えられる。例えば、抗体及び結合メンバーは、マイクロアッセイで使用されるマイクロタイタープレートの被覆に用いられる場合にはゼラチン又は他の担体と混合できる。また前記は、診断又は治療で用いられるときには医薬的に許容できる担体又は希釈剤と混合されるであろう。抗体又は結合メンバーは、自然の状態で又は異種真核細胞（例えばCHO又はNSO細胞）系によってグリコシル化されていてもよく、またそれらは（例えば原核細胞での発現によって生成される場合には）グリコシル化されてなくてもよい。
抗ネコNGFネコ化抗体分子を含む不均質調製物もまた本発明の部分を形成する。例えば、そのような調製物は、完全長の重鎖及びC-末端リジンを欠く重鎖を有する抗体、種々の程度のグリコシル化を示す抗体、及び／又は誘導アミノ酸（例えばピログルタミン酸残基の形成のために環化されたN-末端グルタミン酸）を有する抗体の混合物であり得る。
【００６３】
医薬組成物
典型的には、本発明の医薬組成物は、液体処方物、凍結乾燥処方物、液体として再構成される凍結乾燥処方物、又はエーロゾル処方物として処方される。ある種の実施態様では、処方物中の抗体は、約5mg/mLから約250mg/mL、約0.5mg/mLから約45mg/mL、約0.5mg/mLから約100mg/mL、約100mg/mLから約200mg/mL、又は約50mg/mLから約250mg/mLの濃度で存在する。
ある種の実施態様では、処方物はさらに緩衝剤を含む。典型的には，処方物のpHは約pH5.5から約pH6.5である。ある種の実施態様では、緩衝剤は約4mMから約60mMのヒスチジン緩衝液、約5mMから約25mMのコハク酸緩衝液、又は約5mMから25mMの酢酸緩衝液を含むことができる。ある種の実施態様では、緩衝液は、約10mMから300mMの濃度、典型的には125mM周辺の濃度の塩化ナトリウム、及び約5mMから50mM、典型的には25mMの濃度のクエン酸ナトリウムを含む。ある種の実施態様では、処方物はさらに0％ちょうどから0.2％の濃度の界面活性剤を含むことができる。ある種の実施態様では、界面活性剤は、ポリソルベート-20、ポリソルベート-40、ポリソルベート-60、ポリソルベート-65、ポリソルベート-80、ポリソルベート-85及び前記の組合せから成る群から選択される（ただしこれらに限定されない）。好ましい実施態様では、界面活性剤はポリソルベート-20であり、さらに約125mMの濃度の塩化ナトリウム及び約25mMの濃度のクエン酸ナトリウムを含むことができる。
【００６４】
投与
本発明の抗体又は結合メンバーは単独で投与できるが、好ましくは医薬組成物として投与されるであろう。前記医薬組成物は、一般的には意図する投与経路にしたがって選択される医薬的に許容できる適切な賦形剤、希釈剤又は担体を含むであろう。適切な医薬担体の例には、水、グリセロール、エタノールなどが含まれる。
本発明のモノクローナル抗体又は結合メンバーは、任意の適切な経路により治療の必要があるネコ患畜に投与できる。典型的には、組成物は注射又は輸液により非経口的に投与できる。非経口的投与の好ましい経路の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜、吸入又は経皮投与。投与経路はさらに、局所及び経腸、例えば粘膜（肺を含む）、口、鼻、直腸を含むことができる。
組成物が、注射用組成物として（例えば静脈内、皮内又は皮下適用で）デリバーされる実施態様では、活性成分は非経口的に許容できる水溶液（発熱因子を含まず適切なpH、張度及び安定性を有する）の形態として存在し得る。当業者は、例えば等張なビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液又は乳酸リンゲル注射液）を用いて適切な溶液を容易に調製できる。保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加物も必要に応じて含むことができる。
組成物はまた微小球、リポソーム、他の微粒子デリバリー系、又は血液を含むある種の組織に配置される持続放出処方物により投与され得る。
【００６５】
上記に記載の技術及びプロトコール並びに本発明で用いることができる他の技術及びプロトコールの例は以下で見出すことができる：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7（前記文献の全内容は参照により本明細書に含まれる）。
本発明の抗体及び組成物は、典型的には“治療的に有効な量”で対象動物に投与される（この量は当該組成物が投与される対象動物に利益を示すために十分な量である）。投与される実際の用量並びに投与の頻度及びタイムコースは、治療される症状の性質及び重篤性とともに、治療される対象動物の年齢、性別及び体重の他に投与経路に左右され、当然それらを参考にして決定できる。さらにまた当然の斟酌が、組成物の特性、例えばその結合活性及びin vivo血中寿命、処方物中の抗体又は結合メンバーの濃度とともにデリバリーの経路、部位及び頻度に対して払われるべきである。
【００６６】
投薬レジメンには、本発明の抗体又は組成物の1回投与、又は抗体若しくは組成物の複数回投与が含まれる。抗体又は抗体含有組成物はさらに、連続して又は別々に他の治療薬及び医薬とともに投与され得る。前記他の治療薬及び医薬は、本発明の抗体又は結合メンバーが治療のために投与される症状の治療に用いられるものである。
対象動物に実施できる投薬レジメンの例は以下を含む群から選択できる（ただしこれらに限定されない）：1μg/kg/日から20mg/kg/日、1μg/kg/日から10mg/kg/日、10μg/kg/日から1mg/kg/日。ある種の実施態様では、投薬は、1μg/kgから100μg/kgの抗体血中濃度が得られるものであろう。しかしながら実際の組成物の投与用量並びに投与の頻度及びタイムコースは、治療される症状の性質及び重篤性に左右されるであろう。治療の処方（例えば投薬量の決定など）は、最終的には獣医学技術者及び他の獣医師の対応能力の範囲内及び自由裁量にあり、治療される疾患、個々の患畜の状態、デリバリー部位、投与方法、及び技術者に公知の他の要因が考慮されるであろう。
【００６７】
定義
特段に規定されなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明の分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
本明細書を通して、文脈が特段に要求しないかぎり、“含む”若しくは“含有する”又は変型、例えば“含み”若しくは“含有し”は、記述された整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群も排除しないことを暗示する。
本明細書で用いられるように、例えば“a”、“an”及び“the”という用語は、文脈がそうでないことを明瞭に要求しないかぎり単数及び複数の該当語を含む。したがって、例えば、“活性薬剤”又は“薬理学的に活性な薬剤”と言えば、ただ1つの活性薬剤だけでなく2つ以上の組み合わされた異なる活性薬剤を含み、一方、“a carrier”と言えば、ただ1つの担体と同様に2つ以上の担体の混合物も含まれる。
【００６８】
本明細書で規定するように、“痛み”という用語は、実際の又は潜在的な組織損傷に付随する、又はそのような損傷に関連して記載される不快な感覚的及び情緒的体験を意味する。
手術痛又は術後痛に関して、米国動物福祉法（Animal Welfare Act 2002. AWA regulations, CFR, Title 9 (Animals and Animal Products), Chapter 1 (Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agriculture). Subchapter A (Animal Welfare), Parts 1-4）は、痛みを伴う処置とは、当該処置を適用される人間の軽度の又は瞬間的な痛み又は苦痛（すなわち、注射又はそれより軽度の他の処置によって引き起こされる痛みよりも強い痛み）を超えるものを引き起こすことが合理的に予想される任意の処置であると規定する。したがって、ネコが痛みを伴う外科手術を受ける場合、当該動物は術後鎮痛剤を投与されるべきである。
さらに別の例では、ネコは、付随する症状、例えば関節炎、例えば慢性関節リウマチ、炎症、変形性関節症又は癌性若しくは悪性症状の結果として強い又は慢性の痛みを体験し続ける可能性がある。
【００６９】
“侵害受容”という用語は有害刺激の認知を指す。本明細書で規定するように、“神経障害痛”（“神経痛”としても知られている）は、神経発のシグナルに関する問題から生じる痛みである。前記は、体性感覚系に影響を及ぼす病巣又は疾患の結果として生じ得る。神経障害痛の原因が存在し、知覚不全（偶発的に生じる）と称される異常感覚に付随し得る。或いはまた、前記は異痛症に付随することがある（異痛症は、通常は痛みを引き起こさない接触又は刺激で痛みが発生又は悪化するときに生じる）。例えば、三叉神経痛を有する場合には、顔面のかすかな接触が痛みの引き金となり得る。又は糖尿病性神経障害の場合には、寝具の圧迫が痛みの引き金となり得る。神経障害痛はまた、通常は痛みを引き起こさない接触又は刺激で痛みが発生又は悪化する場合に異痛症から生じることがある。例えば、対象動物が三叉神経痛を有する場合には、顔面のかすかな接触が痛みの引き金となり得る。痛覚過敏が関連する神経障害痛は、通常はかすかな不快感を引き起こすだけの刺激又は接触から重篤な痛みが生じることを意味し、一方、感覚異常は、痛みが生じている領域に何も（例えばピン及び針が）接触していないときでも不快な又は痛みを伴う感覚が発生することを意味する。神経障害痛の他の形態はそう痒症又はかゆみ症を含み、前記は、皮膚のアレルギー又は炎症応答に付随し、炎症痛が組織の損傷及び修復プロセスから生じ得る。
【００７０】
本明細書に規定されるように、“NGF中和抗体”という用語又は類似の用語は、NGFの生物学的活性化及びシグナリングを中和することができる抗体を示す。中和抗体（アンタゴニスト抗体又は遮断抗体とも称され得る）は、特異的に及び好ましくは選択的にNGFと結合し、NGFの1つ以上の生物学的活性を阻害する。例えば、中和抗体はNGFとその標的リガンド（例えば細胞膜結合TrkA又はp75レセプター）との結合を阻害することができる。
本明細書で用いられる“相補性決定領域（CDR）”という用語は、本来の免疫グロブリン結合部位の天然のFv領域の結合親和性及び特異性を共同して規定するアミノ酸配列を指し、前記はKabatら（Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242）によって正確に示された。本明細書で用いられる“フレームワーク領域（FR）”という用語は、CDRの間に介在するアミノ酸配列を指す。抗体のこれらの部分は、CDRを適切な向きで保持する（CDRが抗原と結合することを可能にする）ために機能する。
【００７１】
本明細書で用いられる“定常領域（CR）”という用語は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。本発明では、定常領域は典型的にはネコ定常領域を意味する。すなわち、対象のネコ化抗体の定常領域はネコ免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は任意のネコ重鎖定常ドメインアイソタイプから選択できる。
本明細書で用いられる“キメラ抗体”という用語は、2つの異なる抗体（典型的には異なる種に由来する）に由来する配列を含む抗体を指す。典型的には、キメラ抗体は、ドナー種に由来する可変ドメイン（標的エピトープに特異的に結合する）及び当該抗体が投与される標的種から得られた抗体に由来する定常ドメインを含む。本発明のキメラ抗体は、ラット抗体に由来する重鎖及び軽鎖可変ドメイン、並びにネコ抗体に由来する軽鎖及び重鎖定常ドメインを含む。
本明細書で用いられる“免疫原性”という用語は、受容動物に投与されたときに、標的タンパク質又は治療的部分の免疫応答（液性又は細胞性）を誘引する能力の強さを指す。本発明は対象のネコ化抗体の免疫原性に関する。好ましくは、本発明の抗体は免疫原性をもたず（すなわち、ネコに投与されたときそれらに対して中和抗体は生じないであろう）、さらに前記抗体のFc領域によってエフェクター機能は媒介されない。
本明細書で用いられる“同一性”又は“配列同一性”という用語は、アラインメントを実施した配列の個々の任意のアミノ酸残基位置で、アミノ酸残基が当該アラインメント実施配列間で同一であることを意味する。本明細書で用いられる“類似性”又は“配列類似性”という用語は、アラインメントを実施した配列の個々の任意の位置で、アミノ酸残基が当該配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンはロイシンに置換され得る。前記は保存的置換と称することができる。好ましくは、本発明のアミノ酸配列を当該配列に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換によって改変するとき、これらの改変は、生じた抗体の結合特異性又は機能的活性に対して未改変抗体と比較して全く影響を及ぼさない。
【００７２】
本発明の（本来の）ポリペプチド及びその機能的誘導体に対する配列同一性は、配列アラインメントを実施し、配列同一性の部分として保存的置換を全く考慮することなく、最大相同性パーセンテージを達成するために必要な場合にはギャップを導入した後の、当該対応する本来のポリペプチドの残基と同一である当該候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージを示す。N-末端若しくはC-末端伸長も挿入も、配列同一性又は類似性の低下とは解されないであろう。2つ以上のアミノ酸配列のアラインメントを実施し、それらの配列同一性又は相同性を決定する方法及びコンピュータープログラムは当業者には周知である。例えば、2つのアミノ酸配列の同一性又は類似性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばBLAST（Altschul et al. 1990）、FASTA（Pearson & Lipman 1988）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith &  Waterman 1981）を用いて容易に計算できる。
本明細書で用いられるように、第二のアミノ酸残基に対して“最高の相同性”を有するアミノ酸残基と言えば、当該第二のアミノ酸残基と共通であるもっとも多くの特徴又は特性を有するアミノ酸残基を指す。あるアミノ酸残基が第二のアミノ酸残基と最高の相同性を有するか否かを決定するとき、典型的には、複数の因子、例えば電荷、極性、疎水性、サイドアームの質量及びサイドアームの大きさ（ただしこれらに限定されない）に関して評価を実施することができる。
第一の配列の個々のアミノ酸残基と一致する位置で第二の配列に存在するアミノ酸残基を指すために本明細書で用いられる“対応する位置”という用語は、2つの配列間で最大の配列同一性が可能となるように2つの配列でアラインメントを実施したとき、第一の配列の位置と同じ位置である第二の配列の位置を指すことが意図される。対応する位置のアミノ酸残基は同じKabat番号付与を有する。
【００７３】
本明細書で用いられる“本質的に〜から成る”又は“本質的に〜から成って”という用語は、ポリペプチドが記載されたものの他に追加される特色又は成分を有することができることを意味するが、ただしそのような追加の特色又は成分が、当該抗体又は抗体フラグメントのネコNGFに対する結合特異性を有する能力に実質的に影響を及ぼさないことを条件とする。すなわち、当該ポリペプチドを含む抗体又は抗体フラグメントは、ネコNGFと結合し、さらにネコNGFの機能的活性と拮抗する当該抗体又は抗体フラグメントの能力を妨げない追加の特色又は成分を有することができる。そのような改変は、当該抗体の免疫原性を低下させるためにアミノ酸配列に導入することができる。例えば、本質的に規定された配列から成るポリペプチドは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つ以上の追加のアミノ酸、欠失アミノ酸又は置換アミノ酸を当該配列のどちらかの末端又は両端に含むことができるが、ただしこれらのアミノ酸が、ネコNGFとの結合及びその生物学的機能の封鎖における当該抗体又はフラグメントの役割に干渉、阻害、遮断又は妨害しないことを条件とする。同様に、本発明のネコNGFアンタゴニスト抗体に寄与し得るポリペプチドは1つ以上の官能基で化学的に改変できるが、ただしそのような官能基が、ネコNGFと結合しその機能と拮抗する当該抗体又は抗体フラグメントの能力を妨げないことを条件とする。
【００７４】
本明細書で用いられるように、“有効な量”又は“治療的に有効な量”という用語は、ネコNGFとp75及び／又はTrkAレセプターとの結合の抑制に必要な、本発明の物質、結合化合物、小分子又は融合タンパク質の量を意味する。
“ポリペプチド”、“ペプチド”又は“タンパク質”という用語は、本明細書では互換的に用いられ、隣接残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された線状の一列のアミノ酸残基を指す。アミノ酸残基は通常は天然の“L”異性体型である。しかしながら、当該ポリペプチドが所望の機能的特性を維持するかぎり、“D”異性体型の残基で任意のL-アミノ酸残基を置換することができる。
本明細書で規定されるように、“抗体”は、問題の標的抗原（この場合はネコ神経成長因子）と特異的に結合する抗原結合タンパク質（組換えにより調製される1つ以上のポリペプチドを有する）、又は免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって遺伝的にコードされる抗原結合タンパク質を包含する。“抗体”という用語は、モノクローナル抗体及びキメラ抗体、特にウマ化抗体を包含し、さらにまたポリクローナル抗体又は任意のクラス若しくはサブタイプの抗体を包含する。“抗体”はさらにハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヘテロ抗体、及び抗原結合を維持する前記の機能的フラグメントに及ぶ。
【００７５】
“特異的に結合する”という語句は、タンパク質の不均質集団中に存在する特異的なタンパク質又は標的と抗体の結合を指す。したがって、特異的な免疫アッセイ条件に存在するときは、抗体は特定のタンパク質（この場合にはネコNGF）と結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質と有意な量では結合しない。
本明細書で規定されるように、“feline（ネコ科の動物）”はまた“cat（ネコ）”を指すことができる。Felineは二名法のフェリス・カツス（Felis catus）をもつ亜種のカテゴリーに分類でき、前記にはフェリス・カツス・ドメスチカ（Felis catus domestica）及びフェリス・シルベストリス・カツス（Felis silvestris catus）が含まれる。ネコ科の動物には家畜化された任意のネコが含まれ、さらに飼育血統及び家ネコ品種が含まれ、後者はまた愛玩動物又はコンパニオンアニマルとも称される。
本発明を以下の実施例を参照しながらこれから説明するであろう。これらの実施例は例証のために提供され、本発明を限定するものと解されることを意図しない。
【実施例１】
【００７６】
キメラ抗体の作製と前記の性状決定
軽鎖（配列番号：1（feN-chi-LC1））及び重鎖（配列番号：2（feN-chi-HC2））をCHO細胞でpcDNA3.1ベクターから同時発現させ、ネコ及びネズミNGFとの結合について上清をELISAによって試験した（二次抗ネコIgGポリクローナル抗体-HRPコンジュゲートを使用）。モックpcDNA3.1ベクター単独トランスフェクトCHO細胞の上清をコントロール（Mock）として用いた。
結果を図1に示す（1A−ネコNGFとの結合、1B−ネズミNGFとの結合）。これらの結果は、キメラ抗NGFモノクローナル抗体（Mab）とネコ及びネズミ両NGF との結合について明瞭なシグナルの検出を示している。
プロテインAアフィニティカラムを用いて上清を精製し、溶出ピークをUV吸収により識別し、SDS-PAGEによって分析した。結果を図2に示す。図2Aは、キメラ抗体はプロテインAで精製できることを示す。図2Bは、キメラネコMAbは重鎖及び軽鎖の両方の存在によって染色ゲルで同定されたことを示す。
【実施例２】
【００７７】
ネコ化抗体の作製
ネコ化可変ドメイン配列をC-末端ネコ定常重鎖又は定常軽鎖配列と結合させることによって、全抗体配列を作製した。
前記合体アミノ酸配列を、最適コドン精選及び完全に化学的な遺伝子合成によって哺乳動物細胞で発現可能な形態に変換し、哺乳動物細胞発現ベクターpcDNA3.1+でクローニングした。
得られたcDNAをCHO細胞にトランスフェクトし、以下の実施例で詳述するように上清を分析した。
【実施例３】
【００７８】
ネコ化抗体とNGFとの結合の決定
ネコ化重鎖（配列番号：6）及び軽鎖（配列番号：5）cDNAの結合物をCHO細胞にトランスフェクトして上清を採集し、ELISAフォーマットでネコNGF又はネズミNGF と反応させた。インキュベーション及び洗浄工程の後で、結合したネコ化抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ネコIgG特異的ポリクローナル抗体との反応によって検知し、TMBを用いて現像した。得られた生成物の光学密度を450nmで測定し、偽空ベクターをトランスフェクトしたものの上清（図1で“Mock”と表示）の光学密度と比較した。
結果を図3に示す。図3Aは、ネコ化抗体はネコNGFと結合することを示す。図3Bは、ネコ化抗体はネコNGFとの結合と同じ親和性でネズミNGFと結合することを示す。
【実施例４】
【００７９】
SDS-PAGEを用いる精製ネコ化抗体の分析
トランスフェクトCHO細胞上清のネコ化抗NGF MAb（実施例3）を、プロテインAアフィニティカラムを用いて精製し、溶出ピークをUV吸収により識別し、SDS-PAGEによって分析した。（LHS）feN-HC2及びfeN-kLC1発現構築物をコトランスフェクトしたCHO細胞由来MAbのプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによる精製プロフィール。（RHS）ピーク分画のクマシーブルー染色SDS-PAGE。ある程度の微量の軽鎖分解が観察された。
結果を図4に示す。図4Aは、ネコ化抗体はプロテインAで精製できることを示す。図4Bは、ネコ化抗体の重鎖及び軽鎖（feN-chi-HC2（IgG2重鎖）及びfeN-chi-kLC1（軽鎖））を表すバンドをもつゲルを示す。
【実施例５】
【００８０】
NGF誘発TF-1細胞増殖のネコ化抗体による阻害
実施例4のCHO細胞トランスフェクタント上清の連続希釈（‘アンタゴニスト’）を、0.3ng/mLのNGFの存在下でTF-1細胞とともにインキュベートした。生じた増殖をチミジン取り込みによって測定した。
結果（図5）は、ネコ化抗NGF MAbをトランスフェクトしたCHO細胞の上清によるNGF誘発増殖の明瞭な阻害を示している。
【実施例６】
【００８１】
抗原捕捉ネコ化抗体によって誘発される補体沈着
実施例4のCHO細胞トランスフェクタント上清を0.1ng/mLのNGFで被覆した抗体捕捉プレートでインキュベートした。このプレートを洗浄し、続いてヒト血清とともにインキュベートし、結合した補体C1qを抗ヒトC1qポリクローナル抗体HRPの結合によって測定し、上記のように現像した。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12376111
補体結合方法：
プレートを5μg/mLのマウスNGFを用い100μL/ウェルで被覆し、さらに5％のBSA/PBSで封鎖した。被覆ウェルをPBS/1％BSAで希釈した組換えネコ化抗NGF IgGを含む細胞培養上清とともに、1時間室温でインキュベートした（100μL/ウェル）。このプレートを洗浄し、さらにヒト血清（100μL/ウェル）とともに1時間室温でインキュベートした。前記ヒト血清は、ベロナール緩衝食塩水（0.5mM MgCl2、2mM CaCl2、0.05％ Tween-20、0.1％ゼラチン及び0.5％ BSAを含む）で1/100に希釈された。洗浄後、プレートを100μLのヒツジ抗C1q-HRP（Serotec）（PBS/1％BSAで1/800に稀釈）とともにインキュベートした。洗浄後、100μLのTMB基質（Thermo Scientific）を添加してプレートを現像した。現像反応を100μLのH2SO4（2N）の添加によって停止させ、吸収を450nmで測定した。
結果を図6に示す。これらの結果は、驚くべきことにfeN-chi-HC2（IgG2）重鎖を有するネコ化抗体は補体固定に活性を示さないことを示している。したがって、全く驚くべきことに、本発明の抗体がHC2サブタイプのネコ由来重鎖を有する場合、当該抗体とネコNGFとの結合は、補体の活性化又は他の下流エフェクター機能（例えばADCC）をもたらさないことがここで示された。したがって、前記抗体は、ネコNGF と膜結合TrkA又はp75レセプターとの結合を妨げることによってネコNGFの生物学的機能の活性と拮抗して、付随する下流の細胞内シグナリングカスケードを阻害する。さらにまた、NGF発現はしばしば神経の基部などで発生するので、本発明のNGF拮抗又は中和抗体（ネコ由来HC2（IgG2）重鎖を有し、より広範囲の免疫応答を誘導することなくネコNGFの生物学的活性を封鎖する）の能力は極めて所望されることであり、しかも予想に反することである。
【実施例７】
【００８２】
抗ネコNGFモノクローナル抗体の追加される変種形態
表1から8は、抗NGF抗体の完全なネコ型が、ネコグロブリン配列（特にネコ軽鎖（この事例ではただ1つの軽鎖が比較のために用いられた））の限定的セットとの比較によるペチセーションによって創出できることを示している。直接的シークェンシング及びデータベースの掘り起こしによって、追加されるネコ免疫グロブリンカッパ軽鎖及び重鎖cDNAが誘導され、αD11抗体配列との比較に用いられた。表9−16は、これらコンパレーターの追加はラットαD11とネコIgGとの間の相同なマッチ数を増加させ、したがってαD11可変フレームワーク配列をネコ化変種に変換するために必要な変更数を減少させることを示す。表9−16は、“セット1”配列として表1−8の配列変種を、さらに“セット2”ネコ配列として新たなcDNAシークェンシング及びデータベース掘り起こしに由来する追加の配列を含む。表1−8の好ましいネコ化抗NGFフレームワーク配列には“feN”と注釈が付され、“セット2”ネコ配列との比較による好ましいネコ化抗NGFフレームワーク配列には“feN2”と注釈が付される。また別のネコ抗NGF免疫グロブリン重鎖（feN2-VH）及びカッパ軽鎖（feN2-Vk）タンパク質配列は、図13、14、15及び16（配列番号：22−25）に示される。
【００８３】
表9：軽鎖可変ドメインFR1残基
2014519317.tif 000011
【００８４】
表10：軽鎖可変ドメインFR2残基
2014519317.tif 000012
【００８５】
表11：軽鎖可変ドメインFR3残基
2014519317.tif 000013
【００８６】
表12：軽鎖可変ドメインFR4残基
2014519317.tif 000014
【００８７】
表13：重鎖可変ドメインFR1残基
2014519317.tif 000015
【００８８】
表14：重鎖可変ドメインFR2残基
2014519317.tif 000016
【００８９】
表15：重鎖可変ドメインFR3残基
2014519317.tif 000017
【００９０】
表16：重鎖可変ドメインFR4残基
2014519317.tif 000018
【実施例８】
【００９１】
抗ネコNGFモノクローナル抗体−安全性及び発熱
本発明の抗ネコモノクローナル抗体をCHO細胞で発現させ、プロテインAクロマトグラフィー及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーとの組み合わせによって精製し、さらにリン酸緩衝食塩水で緩衝液交換を実施する。前記抗体を0.01−10mg/kg体重でネコの静脈内に注射し、獣医の目視精査による毒性徴候、体重変化、体温及び血液生化学について評価する。上記において又はいずれの血液生化学分析物においても観察される変化は期待されない。
【実施例９】
【００９２】
抗ネコNGFモノクローナル抗体のin vivo血漿薬理学動態−血清半減期及び免疫原性
本発明の抗ネコモノクローナル抗体をCHO細胞で発現させ、プロテインAクロマトグラフィー及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーとの組み合わせによって精製し、さらにリン酸緩衝食塩水への緩衝液交換を実施する。前記抗体を0.01−10mg/kg体重でネコの静脈内に注射し、血漿サンプルを次の2週間にわたって種々の時間に採取する。稀釈血漿サンプルを抗ネコNGF抗体濃度について、標的としてNGFを抗ネコポリクローナル抗体-セイヨウワサビペルオキシダーゼ二次試薬とともに用いELISAにより評価する。測定血中濃度は二相カイネティクスに一致し、数日間の組織分布（アルファ）相及び排除（ベータ）相を示す。
100から300時間の間には、抗ネコNGF抗体濃度の血中濃度に急激な低下が存在しないことが予想される。このことは、ネコ血液中に組換え抗NGFモノクローナル抗体に対する既存の中和抗体も輸液後に生成される中和抗体も全く存在しないことを示していよう。
【実施例１０】
【００９３】
抗ネコNGFモノクローナル抗体はin vivoで炎症痛を軽減する
炎症のネコモデル：
ネコの一本の肢のフットパッドに前炎症薬剤（例えばカオリン）を注射し（＝-1日目）、約24時間後に開始し当該ネコを一次的に跛行に至らしめる自家消散炎症を発生させる。このモデルではいったんカオリンに対する初期炎症応答が低下すると、約1−2週間の期間にわたって着実にネコの跛行が緩和され、続いて完全に回復する。
ネコのグループに本特許の抗ネコNGFモノクローナル抗体（0.01−10mg/kg体重）又はビヒクルコントロールとしてリン酸緩衝食塩水を静脈内注射する（＝0日目）。前記のネコを以下の目視採点方法により4−14日にわたって跛行について評価する：例えばスコア0、跛行無し（完全な体重保持）；スコア1、わずかな跛行（完全な体重保持ではないが良好に歩行する）；スコア2、軽度の跛行（わずかに体重保持し歩行は良好ではない）、スコア3、重度の跛行（体重を保持できない）。観察者はどのネコがどの注射を受けているか知らされていない。
跛行スコアは、ビヒクルコントロールと比較して、注射後2−4日目までに抗ネコNGFモノクローナル抗体を投与されたネコで軽減されると予想され、抗ネコNGFモノクローナル抗体が、ビヒクル単独で観察される効果よりもネコで痛みを軽減する効果を有することを示唆する。
【実施例１１】
【００９４】
in vivoで炎症痛を軽減する抗ネコNGFモノクローナル抗体の効果を示す比較例
抗体療法：
本発明の抗体を調製する方法を適用して、イヌでの使用に適切なイヌ化抗体を生成した。イヌ化αD11 VLドメインをイヌカッパ軽鎖定常ドメインに結合させ、さらにイヌ化αD11 VHドメインをイヌ重鎖アイソタイプに結合させた。重鎖及び軽鎖を発現する発現ベクターに由来する抗イヌNGFモノクローナル抗体をCHO細胞で発現させ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの組合せによって精製し、さらにリン酸緩衝食塩水に緩衝液交換した。
炎症のイヌモデル：
全ての実験は院内倫理委員会（CRL, Ireland）の事前の承認の下に実施された。ビーグル犬の一方の後肢のフットパッドにカオリンを注射し（＝-1日目）、約24時間後に開始し当該イヌを一次的に跛行に至らしめる自家消散炎症を発生させた。このモデルではいったんカオリンに対する初期炎症応答が低下すると、約1−2週間の期間にわたって着実にイヌの跛行が緩和され、続いて完全に回復する。
3匹のイヌのグループに抗イヌNGFモノクローナル抗体（200μg/kg体重）又はビヒクルコントロールとしてリン酸緩衝食塩水を静脈内注射した（＝0日目）。前記のイヌを以下の目視採点方法により7日間跛行について評価した：スコア0、跛行無し（完全な体重保持）；スコア1、わずかな跛行（完全な体重保持ではないが良好に歩行する）；スコア2、軽度の跛行（わずかに体重を保持し歩行は良好ではない）、スコア3、重度の跛行（体重を保持できない）。観察者はどのイヌがどの注射を受けているか知らされてなかった。
結果を図17に示す。跛行スコアは、ビヒクルコントロールと比較して、注射後3日目までに抗NGFモノクローナル抗体を投与されたイヌで軽減され、抗NGFモノクローナル抗体が、ビヒクル単独で観察される効果よりもイヌで痛みを軽減する効果を有することを示している。この長期に及ぶ活性は、抗イヌNGFモノクローナル抗体の血中薬理学動態と一致する（前記動態は、約30時間のゆっくりとした組織分布（アルファ）相及び相対的に貧弱なフットパッド領域の血管形成を示した）。図17に提示した結果は、本発明の方法によって調製した抗イヌNGF抗体はイヌで炎症痛を軽減し、その結果、跛行を緩和することを示している。
本明細書に引用した全ての文書類は参照により本明細書に含まれる。本発明に記載した実施態様の多様な改変及び変型が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者には明白であろう。本発明を特定の好ましい実施態様との関連でこれまで説明してきたが、特許請求の範囲に記載した本発明はそのような個々の実施態様に限定されるべきではないことは理解されよう。実際のところ、本発明の実施に関して記載した態様の当業者に明白な多様な改変は本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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