(57)【要約】  本発明は、医薬組成物の哺乳動物への送達後に、生物学的有効物質に対する所望されない免疫応答の誘発がないか又は減少した誘発のみがある効果を有する、哺乳動物における生物学的有効物質の送達のための医薬組成物の製造における抗原隠蔽剤として使用するための、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドに関し、その際、生物学的活性物質は、哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができ、医薬組成物は、生物学的有効物質及びヒトラクトフェリン誘導ペプチドの超分子凝集体を含む。
2014501723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における生物学的活性物質の送達のための医薬組成物の製造における抗原隠蔽剤として使用するためのヒトラクトフェリン誘導ペプチドであって、生物学的活性物質が、哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができ、医薬組成物が、生物学的活性物質及びヒトラクトフェリン誘導ペプチドの超分子凝集体を含み、医薬組成物の哺乳動物への送達後に、生物学的活性物質に対する所望されない免疫応答の誘発がないか又は減少した誘発のみがある効果を有する、前記ヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号１のＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲによるアミノ酸配列、又は該配列に少なくとも９０％相同性である配列を有する、請求項１に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項３】
前記配列が、配列番号１の配列に少なくとも９０％相同性であり、かつ２位及び１９位においてシステイン残基が存在する、請求項２に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項４】
所望されない免疫応答が、ＩｇＧ免疫応答である、請求項１から３までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項５】
所望されない免疫応答が、ＩｇＥ免疫応答である、請求項１から３までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項６】
哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質が、生物学的活性タンパク質もしくは生物学的活性ペプチド、抗血清、又はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項７】
所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質が、哺乳動物に移入される血液の試料中で含まれる、請求項１から６までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項８】
所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質が、哺乳動物に移植される臓器中又は臓器の表面上に含まれる、請求項１から７までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項９】
生物学的活性物質及びヒトラクトフェリン誘導ペプチドが、超分子凝集体中で互いに共有結合しない、請求項１から８までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項１０】
生物学的活性物質及びヒトラクトフェリン誘導ペプチドが、超分子凝集体中で互いに共有結合する、請求項１から８までのいずれか１項に記載のヒトラクトフェリン誘導ペプチド。
【請求項１１】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチドと生物学的活性作用剤とを自然条件下で混合し、該混合物をインキュベートして超分子凝集体を形成させ、そして該混合物を最終医薬組成物に添加することによって、請求項１から１０までのいずれか１項において定義された医薬組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
免疫グロブリンＧについての一般知識：免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、抗体分子である。ＩｇＧは、最も豊富な免疫グロブリンであり、かつ哺乳動物における及びヒトにおける血清免疫グロブリンの主な部分を構成する、血液中及び組織液中でおよそ均等に分布されている。ＩｇＧ分子は、プラズマＢ細胞によって合成及び分泌される。
【０００２】
ＩｇＧ抗体は、主に二次免疫応答において含まれる。特定のＩｇＧの存在は、一般に、抗体応答の成熟に相当する。ＩｇＧは、ヒト胎盤を通過することができ、それによって子宮中の胎児の保護を提供する、抗体アイソタイプのみである。母乳中で分泌されるＩｇＡに加えて、胎盤を介して吸収される残りのＩｇＧは、自己免疫系を発達する前に体液性免疫を有する新生児を提供する。
【０００３】
ＩｇＧは、多くの種類の病原体、例えばウィルス、細菌及び真菌に結合でき、かつ凝集反応及び不動化、補体活性化（古典経路）、それらの毒性の食作用及び／又は中和のためのオプソニン化作用によってそれらに対して体を保護することができる。ＩｇＧは、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）における重要な役割も果たす。
【０００４】
免疫応答を生じる哺乳動物ＩｇＧは、他と、免疫応答カスケードと、シグナル伝達経路と強い関連がある。ハプテン又は免疫原のモチーフ及びレセプター、並びにレセプターファミリーは、個別に、哺乳動物個体において多くの公知の及び公知でない方法で、関連及び調整する。
【０００５】
これは、治療剤として導入された任意の生物学的活性剤が、多くの個々の投与後でさえ所望される及び所望されない免疫応答を導入してよいためである。
【０００６】
ＷＯ ２００７／０４８５９９号は、生物学的バリアーを介して輸送するための少なくとも１つのシグナル物質、及び少なくとも１つの活性成分が含まれ、その際キャリヤー、シグナル物質及び活性成分が、互いに共有結合を示さないことを特徴とする、ポリマーキャリヤーを基礎とする粒状の薬物デリバリーシステムを記載している。シグナル物質は、ラクトフェリン、又はラクトフェリンに由来するペプチドである。
【０００７】
特に好ましい一実施態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列
ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ（ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号３）、
ＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣ（ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号４）、
ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳ（ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号５）、
ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲ（ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号６）、
ＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲ （ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号２９）、及び
ＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣ（ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号３０）、
又はそれらの誘導体を有するペプチドの群から選択される。
【０００８】
好ましい一実施態様において、ＷＯ ２００７／０４８５９９号の細胞貫通ペプチドは、ＷＯ ２００７／０４８５９９号における配列番号３、配列番号４、配列番号２９又は配列番号３０において示したようなアミノ酸配列を含み、又は少なくとも４０％の、有利には少なくとも５０％の相同性、特に有利には７５％より多い、又はより好ましくは９０％より多い相同性を有する対応する配列である。
【０００９】
ＷＯ ２００７／０７６９０４号Ａ１は、ヒトラクトフェリンタンパク質の、又はウシラクトフェリンタンパク質の、少なくとも８つの連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを記載しており、その際該ペプチドは、細胞貫通ペプチドとして作用するために適している。ＷＯ ２００７／０７６９０４号Ａ１において、及びＷＯ ２００７／０４８５９９号において挙げられている多くのペプチドは、同一である。
【００１０】
ＷＯ ２００７／０７６９０４号Ａ１における実施例において良好な効果を有する最も見込みのある細胞貫通ペプチドは、ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ（ＷＯ ２００７／０７６９０４号Ａ１における配列番号３、本発明における配列番号１）である。
【００１１】
ラクトフェリン誘導細胞貫通ペプチドは、生体膜を介して、経口摂取されてよい医薬有効成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド又はワクチン接種のための抗原であるカーゴ分子（ｃａｒｇｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の輸送を許容し、かつ従って、ヒト又は動物におけるこれらの分子の有効な摂取を可能にすることを意図している。
【００１２】
課題及び解決
病気を治療するために哺乳動物に送達される生物学的活性物質が所望されない免疫応答を誘発する場合に、これは、同一の生物学的活性物質が後に再度ある生物に送達されるべきである場合に、深刻な問題となってよい。
【００１３】
本発明の課題は、医薬組成物の哺乳動物への送達後に、生物学的活性物質に対する所望されない免疫応答の誘発がないか又は減少した誘発のみがある効果を有する、哺乳動物における生物学的活性物質の送達のための医薬組成物の製造における、アジュバントとして又は賦形剤として使用されてよい抗原隠蔽剤を見出すことであり、その際生物学的活性物質は、哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができる。
【００１４】
前記課題は、医薬組成物の哺乳動物への送達後に、生物学的活性物質に対する所望されない免疫応答の誘発がないか又は減少した誘発のみがある効果を有する、哺乳動物における生物学的活性物質の送達のための医薬組成物の製造における抗原隠蔽剤として使用するための、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドによって解決され、その際、生物学的活性物質は、哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができ、医薬組成物は、生物学的活性物質及びヒトラクトフェリン誘導ペプチドの超分子凝集体を含む。
【００１５】
発明の詳細
本発明は、医薬組成物の哺乳動物への送達後に、生物学的活性物質に対する所望されない免疫応答の誘発がないか又は減少した誘発のみがある効果を有する、哺乳動物における生物学的活性物質の送達のための医薬組成物の製造における抗原隠蔽剤として使用するための、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドによって解決され、その際、医薬組成物のみが、生物学的活性物質及びヒトラクトフェリン誘導ペプチドの共役を含む。
【００１６】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチドがヒトラクトフェリンから誘導されるために、ヒト免疫原性系に対する免疫原性がない。
【００１７】
驚くべきことに、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、薬剤の開発におけるモデル種として使用される哺乳動物、有利には生産動物又は家畜、例えば豚、羊、雌牛もしくは犬の免疫原性系に対する免疫原性がないか、又は低い範囲の免疫原性のみであるが、その配列は遺伝的に保存されない。従って、本発明の利益は、ヒトにおける適用に制限されないが、しかし獣医師適用及び、動物モデルを使用するヒトの治療の開発に適用されてよい。
【００１８】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチド
ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、１９〜３０アミノ酸の長さを有してよい。
【００１９】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、１９〜３０アミノ酸の長さを有してよく、かつ配列番号１のＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲによるアミノ酸配列、又は配列番号１の配列に少なくとも９０％、９５％又は９８％相同性である配列を含んでよい。
【００２０】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、有利には、配列番号１のＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲによるアミノ酸配列、又は該配列に少なくとも９０％、９５％又は９８％相同性である配列である。
【００２１】
最も有利には、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、配列番号１の配列に少なくとも９０％、９５％又は９８％相同性であり、２位及び１９位においてシステイン残基が存在する。有利には、システイン残基は、内部Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−架橋を形成する、酸化型で存在する。
【００２２】
ペプチドＧＭＰ合成、例えばＮ−アセチル化、アシル化、メチル化、ベンジル化、Ｃ−アミド化、エステル化、Ｃ−末端バルクエステル化、等配電子アミノ酸改質及び天然でないアミノ酸、例えばチオフェニル−アラニン又はシクロプロリン−アラニン、又は任意のアミド骨格、エステル骨格もしくはエーテル骨格での他のアミノ酸置換において使用される任意の追加の標準化学改質を含んでよい。
【００２３】
しかしながら、内部Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−架橋の形成を除いて、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、追加の化学改質を示さないことが好ましい。
【００２４】
哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質
哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質は、通常、医薬形で又は医薬配合物の形で構成されるか、又は含まれる。
【００２５】
哺乳動物による所望される免疫応答を誘発するために使用されると意図される生物学的活性物質、例えばワクチンは、"所望されない免疫応答"の定義の範囲ではない。
【００２６】
哺乳動物による所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質は、有利には、生物学的活性タンパク質もしくは生物学的活性ペプチド、抗血清、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の群から選択されてよい。また、他の"可溶性レセプター"又は"可溶性レセプターバインダー"を提供する組み換えタンパク質、又は改質組み換えタンパク質、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化したもの、並びに小分子を含む所望されない副作用として免疫原性のリスクを有する治療剤が挙げられ、その際、かかるリスクは、公知であるか、又は潜在的に関連する抗生物質、ペプチド薬及びペプチド擬態である。
【００２７】
所望されないＩｇＧ免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質は、哺乳動物に移入される血液の試料で構成されてよい。
【００２８】
所望されないＩｇＧ免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質は、哺乳動物に移植される器官の表面中又は表面上で構成される。
【００２９】
所望されない免疫応答
哺乳動物による所望されない免疫応答は、免疫応答とは異なる又は所望されない副作用における免疫応答である、所望される有益な治療効果を作用させるために哺乳動物に送達される生物学的活性物質に対する抗体の製造による、免疫系の応答である。
【００３０】
所望されない免疫応答は、（一般の）ＩｇＧ免疫応答であってよい。
【００３１】
所望されない免疫応答は、（一般の）ＩｇＥ免疫応答であってよい。
【００３２】
たとえ、所望されない免疫応答が、所望されない免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質を有する又は含む医薬形又は医薬配合物での最初の送達で、所望されない副作用を生じてはならない場合でも、所望されない免疫応答は、所望されない（ＩｇＧ又はＩｇＥ）免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質を有する又は含む医薬配合物が、第二の時間又は他の時間又は数時間又はある時間にわたって送達される又は送達されるべきである場合に、所望されない副作用を生じてよい。この場合に、例えば、血漿において存在するＩｇＧレベルが、生物活性を部分的に又は完全に不活性化し、かつその所望される治療効果を減少させてよい。いくつかの場合において、生物活性の部分的又は完全な不活性化は、刺激、熱又は他の所望されない副作用とも並行してよい。これらの副作用は、不特定的に、ＩｇＧ抗体凝集体又は生物学的活性物質を有するペプチドの存在によって誘発されてよい。
【００３３】
哺乳動物による所望されないＩｇＧ免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質の典型的な例は、例えば以下である：
有毒動物の毒物に対する抗毒物抗血清。例えばヘビ、昆虫、クモ又はあるクラゲ（抗血清は、動物によって、通常ウマによって製造され、該抗血清は、毒物と接触されるヒトを治療することを意図する）。抗血清の第一の送達後に、個々のヒトは、通常、抗血清中で含まれるウマタンパク質、主にウマＩｇＧ抗体に対する所望されない一般のＩｇＧ免疫応答を生じる。
【００３４】
ウマによって製造された特異的な抗ヘビ毒抗血清は、ヘビ毒の厳しい作用を治療するために、あるヘビ種によって噛まれたヒトに送達される場合によく知られている。抗ヘビ毒血清の第一の送達後に、個々のヒトは、毒物の不活性化によって治療されてよいが、しかし血清中で含まれるウマタンパク質、主にウマＩｇＧ抗体に対する所望されない一般のＩｇＧ免疫応答を生じてよい。同一人物が、あとで同一又は他のヘビに噛まれた場合に、再度のウマ抗ヘビ毒抗血清での治療は、ウマ血清タンパク質に対して生じたＩｇＧ抗体の存在するレベルのために、危険であってよい。
【００３５】
抗リンパ球／抗胸腺リンパ球グロブリンを使用する、ヒト低リスク骨髄異形成症候群の免疫調節性治療も公知である。ウサギ又はウマ中で製造されたヒト免疫原性細胞に対して向けられた抗体でのこれらの治療グロブリンにおいては、ある期間にわたってヒトの患者に送達される。この場合においても、グロブリン断片中で含まれるウサギ又はウマタンパク質、主にウマＩｇＧ抗体に対する所望されないＩｇＧ免疫応答の危険性がある。この所望されないＩｇＧ免疫応答は、存在する治療又は繰り返される治療に負に影響してよい。
【００３６】
さらに、癌細胞上のエピトープに対して生じたモノクローナル抗体を有する又は含む医薬配合物の適用が公知である。
【００３７】
本発明の意味で所望されないＩｇＧ免疫応答の抑圧が有利であってよい他の場合は、臓器移植の分野であってよく、所望されないＩｇＧ免疫応答の意味で、輸血された血液と患者の免疫系との不適合性が生じてよい。
【００３８】
本発明の意味で所望されないＩｇＧ免疫応答の抑圧が有利であってよい他の場合は、輸血の分野であってよく、所望されないＩｇＧ免疫応答の意味で、移植された臓器、例えば腎臓、肝臓、肺又は心臓等と患者の免疫系との不適合性が生じてよく、かつ従って少なくとも部分的に反発又は拒絶反応を促進してよい。
【００３９】
哺乳動物による所望されないＩｇＧ免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質は、従って、薬理学的又は生物学的活性タンパク質又はペプチド、特にそれらが送達される哺乳動物に対して天然でないタンパク質又はペプチドを含んでよい。
【００４０】
天然でないとは、生物学的活性タンパク質又はペプチドが、他の種から、有利には他の哺乳動物種から、それらが送達される種と比較して、又は半合成源の同一種から生じることを意味する。
【００４１】
天然でないとは、送達されるべきと意図される、哺乳動物のＩｇＧ免疫応答によって検出可能な、それらを製造する方法で改質されている生物学的活性タンパク質又はペプチドを意味してよい。
【００４２】
所望されないＩｇＧ免疫応答を誘発できる生物学的活性物質が送達されてよい、好ましい哺乳動物は、ホモサピエンスである。
【００４３】
例えば、ある哺乳動物から生じるタンパク質は、組み換え微生物によって製造された場合に、哺乳動物のＩｇＧ免疫応答によって検出されるようになってよい。
【００４４】
例えば、組み換え原核生物中で製造された真核性の源の生物から生じるグリコシル化タンパク質は、通常、糖鎖形成を欠いている。従って、組み換えタンパク質は、医薬配合物の形で生物に戻されて送達される場合に、元の源の哺乳動物のＩｇＧ免疫応答によって検出されるようになってよい。
【００４５】
所望されないＩｇＥ免疫応答に関する副作用は、例えばアレルギー、アナフィラキシーとして、又はアナフィラキシーショックとしてよく知られている。
【００４６】
哺乳動物による所望されないＩｇＧ又はＩｇＥ免疫応答を誘発することができる生物学的活性物質は、配合物を含んでよい。
抗血清、又はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、又は他の"可溶性レセプター"もしくは"可溶性レセプターバインダー"を提供する組み換えタンパク質、又は改質された組み換えタンパク質、例えばポリエチレングリコールポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化した、不完全な、又は遺伝的に改質されたもの、並びに小分子、例えば抗生物質、を含む所望されない又は危険な又は致命的な副作用、例えばアナフィラキシー及びアナフィラキシーショックとして免疫原性のリスクを有する治療剤、麻酔剤を含むか、又はそれらからなる配合物を含んでよく、その際かかるリスクは、免疫原性が潜在的に関連する、ペプチド薬及びペプチド擬態、成長因子もしくはネクローシス因子、又は混合物、例えば体液画分、例えばヒトの血液からの血液因子、細胞培養物を含むあらゆる生物学的活性化合物と同様に公知である。
【００４７】
さらに、ヒトラクトフェリン断片の免疫調節剤効果は、アレルギーの分野における潜在的な免疫応答を誘発する作用剤を操作するための抗原隠蔽作用のために使用されてよい。例えば、ヒトラクトフェリン断片の、花粉、牧草花粉、乳タンパク質、メリチン、卵タンパク質等との関連は、それらのエピトープ及び抗原に対するヒトのアレルギー反応を操作してよい。
【００４８】
医薬組成物
ヒトラクトフェリン誘導ペプチドは、哺乳動物における生物学的活性物質の送達のための医薬組成物の製造における、抗原隠蔽剤として使用されてよい。
【００４９】
医薬組成物は、医薬形、又は有利にはペレット、顆粒、ミニタブレット、タブレットもしくはカプセル、又は他の医薬形から選択される多粒子医薬形であってよい。医薬組成物は、獣医薬組成物を含んでもよい。
【００５０】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質を含む医薬組成物は、さらに、医薬形の調合物において有用であると当業者に公知である賦形剤を含んでよい。典型的な賦形剤は、酸化防止剤、増白剤、結合剤、希釈剤、充填剤、香料、流動助剤、フレグランス、滑剤、浸透促進剤、顔料、可塑剤、ポリマー、孔形成剤、溶剤又は安定剤である。
【００５１】
医薬組成物は、８０質量％まで、５０質量％まで、２５質量％まで、１０質量％までの、又は任意の医薬賦形剤、例えば医薬形の調合物において有用であると当業者に公知であるさらなる賦形剤を有してよく、実質的に含んでよく、又は含有してよい。
【００５２】
超分子凝集体
最も有利には、ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質は、複合体又は接合体とも言われてよい超分子凝集体を形成し、その際ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質は、互いに共有結合しない。この場合に、超分子凝集体は、共に、例えばイオン力によって、又はファンデルワールス力によって維持される。
【００５３】
これらの超分子凝集体は、水性もしくはプロセス媒体の溶液又は懸濁液中で生物学的活性物質に、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドを結合することによって、非常に有利に製造されてよい。この溶液は、短時間、有利には２分間まで穏やかに混合され、又は１時間まで、２時間まで，又はそれ以上インキュベートされる。
【００５４】
ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質に加えて、超分子凝集体は、さらに、キャリヤー、例えばキャリヤーポリマー、例えば樹状突起ポリマーを有するか、又は含んでよい。
【００５５】
また、可能であり、あまり好ましくないが、ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質は、超分子凝集体を形成し、その際ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質は、互いに共有結合する。この場合において、超分子凝集体は、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドにおける反応基と、生物学的活性物質における反応基との化学反応によって形成されてよい。代わりに追加の化学反応性のリンカー分子が、分子を連結するために使用されてよい。
【００５６】
有利には、超分子凝集体は、少なくとも２０質量％、少なくとも５０質量％、少なくとも８０質量％、少なくとも９０質量％又は１００質量％のヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性物質を有してよく、実質的に含んでよく、又は含有してよい。超分子凝集体は、他の賦形剤を含んでよい医薬組成物の一部であってよい。
【００５７】
有利には、医薬組成物は、少なくとも２０質量％、少なくとも５０質量％、少なくとも７５質量％、少なくとも９０質量％又は１００質量％の超分子凝集体を有してよく、実質的に含んでよく、又は含有してよい。
【００５８】
医薬組成物の製造方法
本発明は、本明細書において定義された医薬組成物を、ヒトラクトフェリン誘導ペプチドと生物学的活性作用剤とを自然条件下で混合して、その混合物をインキュベートして、超分子凝集体を（共有又は非共有）形成させ、そしてその混合物を医薬組成物に添加することによる製造方法にも関する。
【００５９】
最も単純な実施態様において、最終の医薬組成物が実質的にヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性作用剤のみを含有することを意味する混合物を言う、医薬組成物と同一であってよい。しかしながら、多くの場合において、他の医薬賦形剤を添加して、（最終の）医薬組成物を形成することが有利又は適切であってよい。
【００６０】
自然条件は、ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性作用剤の生物学的活性が維持される条件を意味する。自然条件は、例えば、ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性作用剤を、水性緩衝液、例えばｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水、又は生理的塩化ナトリウム溶液中で混合することであってよい。
【００６１】
混合物をインキュベートして、超分子凝集体を形成させることは、十分な時間、ヒトラクトフェリン誘導ペプチド及び生物学的活性作用剤を凝集させることを意味する。通常、室温で２時間までの混合及びインキュベートが十分であってよい。しかしながら、１時間まで、２時間まで又はそれ以上のインキュベートがさらに適していてよい。超分子凝集体を形成するために適した温度は、０〜３７℃、有利には４〜３０℃の範囲であってよく、およそ１８〜２８℃の室温が適していてよい。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ゼータシザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）で測定した粒子の直径を示す図。
【図２】ゼータシザーで測定した粒子のゼータポテンシャルを示す図。
【図３】対照群におけるＩｇＧレベルを示す図。
【図４】"Ｂ"−調合物（ｈＬｆ）で処理した群におけるＩｇＧレベルを示す図。
【図５】"Ａ"−調合物（細菌溶解物）で処理した群におけるＩｇＧレベルを示す図。
【図６】"Ａ＋Ｂ"−調合物（細菌溶解物＋ｈＬｆ）で処理した群におけるＩｇＧレベルを示す図。
【００６３】
実施例
実施例１：細菌溶解物を有するヒトラクトフェリン断片（ｈＬｆ）の非共有結合
材料：
大腸菌からの細菌溶解物、配列番号１  ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのヒトラクトフェリン断片、ｐＨ＝７．４（欧州薬局方）のリン酸緩衝生理食塩水：リン酸水素二ナトリウム二水和物５．９７ｇ（リン酸水素二ナトリウム４．７６ｇに相当）、リン酸二水素カリウム０．３８ｇ、及び塩化ナトリウム１６ｇを、蒸留水１．８ｌ中で溶解した。その後、調製した透明な溶液を、２ｌのメスフラスコ中に入れ、蒸留水で目盛線まで満たし、そして続いて均質化した。そしてｐＨを、ＰＥボトル中で最終溶液を満たす前に、１ＮのＨＣｌ３ｍｌを使用して、２３．２℃で７．４３まで調製した。
【００６４】
装置：
Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０；サイズパラメータ：
材料：タンパク質ＲＩ：１．４５ 吸収：０．００ 分散：水 ２５℃：０．８８７２ｃＰ ＲＩ：１．３３０；３７°Ｃ：０．６８６４ｃＰ ＲＩ：１．３３０、細胞：ＤＴＳ １０６０Ｃ：クリアな使い捨てのゼータ細胞
測定：自動３運転、位置決め方法：最適な位置のための検出、自動アテンション選択、解析モデル：一般目的
ゼータパラメータ：誘電率：２５℃で７８．５及び３７℃で７４．４
モデル：Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ Ｆ（ＫＡ）値：１．５、測定：自動３運転
自動アテンション選択
【００６５】
試料配合物
ペプチド酸化：ペプチドを、ｐＨ＝７．４（欧州薬局方）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍＭ（２．７５ｍｇ／ｍＬ）未満、例えば１０ｍＬ中で５ｍｇ（＝０．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度まで溶解した。その溶液を３７℃で５分間純粋な酸素でパージした。２時間３７℃でインキュベートした。
【００６６】
細菌溶解物の希釈のために、細菌細胞溶解物１ｍＬをｐＨ７．４（欧州薬局方）のＰＢＳで１０ｍＬまで希釈した。
【００６７】
溶解物粒子への付着は、ｈＬＦ０．０９７７１４２８６ｍｇを有する細菌溶解物１ｍｌ（＝１．２ｍｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ）を添加することによって達せられた。
【００６８】
ペプチドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液２０μＬを、予め希釈したワクチン１ｍＬ（０．１２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１００〜１５０ｒｐｍの低い撹拌下で２時間、４℃であらゆる泡の形成を妨げながらインキュベートした。
【表１】
2014501723.tif 000003
【００６９】
結果
ゼータポテンシャル（図１）
Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物が、負に荷電した表面粒子からなる懸濁液であることを示した。ｈＬＦペプチド断片は、例え凝集体の形成が観察されても、全体的に正の荷電を示し、かつ第二の第一への添加は、溶解物の表面特性の変化をもたらす。
【００７０】
粒径（図２）
図の"粒径"は、平均を示す。
粒径のデータは、以下の結果を示す：
・凝集は、全ての場合において生じる傾向がある：ワクチンのみ、ｈＬＦ断片のみ、及びそれらの組合せ。
・これらの凝集の現象は、大きい粒径を導く。
・凝集及び沈澱が生じてよく、音波破砕及び／又は適した撹拌によって戻る。
【００７１】
実施例２：抗原、ヒトラクトフェリン断片、及び抗原とヒトラクトフェリン断片との組合せでの処理によるラット免疫系の免疫調節
材料
細菌溶解物：肺炎桿菌ＣＥＣＴ １４１；１２０億の細菌／ｍＬ（１０倍の最終濃度）、フェノールなしで標準の非グリセリン化形成
ｈＬＦ断片、配列番号１  ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ  親液生成物として酸化型；それぞれ５０ｍｇのバイアル中で、２５ｍＬのバイアル中で再構成させるために投与され、かつアッセイの長さのためのストック溶液として使用される。一度の再構成は、冷たく保たれる（４℃）。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、あらゆる適した方法で滅菌し、そして合成後に直ちに使用しない場合に適した容器で貯蔵する。その貯蔵は４℃でより長い時間を考慮する。
【００７２】
方法
ｈＬＦストック溶液の再構成を、ＰＢＳ２０ｍＬの添加によってバイアル中でｈＬＦフラグメント５０ｍｇの再構成によって実施した。明らかな、均一な、粒子のない溶液に対して完全な正確な再構成を確実にした。そのバイアルを、閉じたバイアルの反転を繰り返すことによって穏やかに振盪した。結果は、基準濃度２．５ｍｇ／ｍＬに対する試験のためのｈＬＦストック溶液であった。
【００７３】
動物試験のためのｈＬＦ希釈を、毎日実施した。このために、再構成したｈＬＦストック溶液１ｍＬを、新たなバイアル２５ｍＬ中に移し、続いてＰＢＳ２１．５ｍＬを添加し、そして閉じたバイアルの反転を繰り返すことによって注意深く混合して、泡の形成を避けた。結果は、規準濃度０．１ｍｇ／ｍＬの毎日のストック希釈であった。
【００７４】
"Ａ＋Ｂ"形成
毎日のｈＬｆ希釈液４．５ｍｌを、適したバイアル（５ｍｌの容量又はそれより多い）に移し、続いて１２０億の細菌／ｍＬ細菌溶解物０．５ｍｌを添加し、そして泡の形成を妨げるために閉じたバイアルの反転を繰り返すことによって注意深く撹拌した。その結果は、１２：１の比を確実にする、Ａ＋Ｂワクチン５ｍｌ、１２０億の細菌／ｍｌ、ｈＬｆ断片０．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００７５】
"Ｂ"形成
毎日のｈＬｆ希釈液４．５ｍｌを、適したバイアル（５ｍｌの容量又はそれより多い）に移し、続いてＰＢＳ０．５ｍｌを添加し、そして閉じたバイアルの反転を繰り返すことによって注意深く撹拌し、泡の形成を妨げた。結果は、０．１ｍｇ／ｍｌのｈＬｆ断片溶液５ｍｌであった。
【００７６】
"Ａ"形成
細菌溶解物（１２０億の細菌／ｍｌ）０．５ｍｌを、適したバイアル（５ｍｌの容量又はそれより多い）に移し、続いてＰＢＳ４．５ｍｌを添加し、そして閉じたバイアルの反転を繰り返すことによって注意深く撹拌し、泡の形成を妨げた。結果は、１２０億の細菌／ｍＬ（"Ａ"細菌溶解物）の細菌溶解物５ｍｌであった。
【００７７】
投与量及び治療の投与
"Ａ＋Ｂ"投与
群Ａ＋Ｂからのそれぞれ３匹のラットへの"Ａ＋Ｂ"０．５ｍＬの投与（腹腔内投与）。
群α＋βからのそれぞれ３匹のラットへの"Ａ＋Ｂ"０．５ｍＬの投与（胃内）。
"Ｂ"投与
群ＢからのラットへのＢ０．５ｍＬの投与（腹腔内投与）。
群βからのラットへのＢ０．５ｍＬの投与（胃内）。
"Ａ"投与
群Ａからの３匹のラットへのワクチンＡ０．５ｍＬの投与。
群αからの３匹のラットへのワクチンＡ０．５ｍＬの投与。
【００７８】
動物治療
肺炎桿菌ＣＥＣＴ １４１の経口溶解物を、胃内又は腹腔内に投与される場合に、モデル生物としてラットにおけるＩｇＧ免疫応答を誘発する接種材料のためのモデルとして使用した。アミノ酸配列番号１  ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲを有するヒトラクトフェリン誘導ペプチドを、次の方法で、肺炎桿菌ＣＥＣＴ １４１の溶解物との複合体を形成するために使用した。
【００７９】
３匹のラットの６つの群を使用した。
ａ．群Ａ：腹腔内に細菌溶解物（調合物"Ａ"）を投与する。
ｂ．群Ｂ：腹腔内にｈＬｆ断片（調合物"Ｂ"）を投与する。
ｃ．群Ｃ：複合体（調合物"Ａ＋Ｂ"）が腹腔内を投与する。
ｄ．群α：胃内に調合物"Ａ"を投与する。
ｅ．群β：胃内に調合物"Ｂ"を投与する。
ｆ．群γ：胃内に調合物"Ａ＋Ｂ"を投与する。
試験の期間：４週間（２８日）。
【００８０】
生成物適用のパターン
【表２】
2014501723.tif 000004
【００８１】
パラメータ及びサンプリングスケジュール
測定されるべきパラメータは合計ＩｇＧである。その方法をＥＬＩＳＡによって実施する。全ての群についてのサンプリングスケジュールは以下である（表３）：
【表３】
2014501723.tif 000005
【００８２】
結果
経時的なＩｇＧレベルにおける変化
対照群（図３）
対照群の動物において、ＩｇＧレベルを、種々の研究時間で観察された統計学上の有意差なしに、経時的に一定に維持した。
【００８３】
ヒトラクトフェリン（ｈＬｆ、"Ｂ調合物"）を有する群（図４）
ヒトラクトフェリンでの処理は、投与の形式に独立する任意の研究時間でｈＬｆ処理を受けるラットのＩｇＧレベル間で観察された統計学上の有意差なしに、経時的にＩｇＧレベルに対するあらゆる効果を誘発したことを示さない。
【００８４】
細菌抽出物（"Ａ調合物"）で処理した群（図５）
細菌抽出物での腹腔内処理を受けた動物において、ＩｇＧレベルが経時的に著しく増加する傾向を観察した。さらに、ＩｇＧレベルが、経時的なＩｇＧレベルの増加を説明する、この処理の効果が蓄積することを意味する、細菌抽出物の投与量の数で増加することに注意すべきである。同様の挙動が、細菌抽出物で胃内処理した動物において観察される。これらの結果は非常に重要であり、それというのも、ＩｇＧレベルに対する細菌抽出物の効果が、投与の形式に独立することを示すからである。
【００８５】
細菌抽出物＋ｈＬｆで処理した群（図６）
細菌抽出物＋ｈＬｆでの処理を受ける動物に関して、２つの基本的な事実に注意すべきである。第一に、ＩｇＧが、使用された投与の形式に独立して、対照群において検出されたレベルから著しく変化しないことを観察できる。一方で、全ての研究時間で検出されたＩｇＧレベルは、腹腔内投与又は胃内投与での細菌抽出物の効果に基づいて予期されたレベルを超えない。
【００８６】
種々の群間のＩｇＧレベルの比較解析
腹腔内投与
対照 対 細菌抽出物群：
対照群のＩｇＧレベルと、細菌抽出物での処理を受ける群において見出されたＩｇＧレベルとを比較した場合に、細菌溶解物の第一の投与の６日目で開始した後の群における統計学的に有意な増加を見出す（ｐ＜０．００１）。これらの差を、２７日で研究を完了するまで全ての時間で維持する。
【００８７】
対照群 対 ｈＬｆ群：
腹腔内投与で、任意の研究時間でｈＬｆでの処理を受けるラットのＩｇＧレベルと対照群において見出されたＩｇＧレベルとの間で統計学上の有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【００８８】
対照群 対 ｈＬｆ＋細菌抽出物群：
任意の研究時間でｈＬｆ＋細菌抽出物での複合処理を受けるラットのＩｇＧレベルと対照群において見出されたＩｇＧレベルとの間で統計学上の有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【００８９】
細菌抽出物群 対 ｈＬｆ群：
細菌抽出物のみでの処理を受けたラットにおいて見出されたＩｇＧレベルは、第一の投与の２７日目で研究を完了するまで第一日（６ｄ）からｈＬｆ群のみでの処理を受けた動物において見出されたＩｇＧレベルよりも著しく高い（ｐ＜０．００１）。
【００９０】
細菌抽出群 対 ｈＬｆ＋細菌抽出物群：
細菌抽出物のみでの処理を受けたラットにおいて見出されたＩｇＧレベルは、第一の投与後に全ての研究時間で、ｈＬｆと細胞抽出物とを組み合わせた処理を受けた動物において見出されたＩｇＧレベルよりも著しく高い（ｐ＜０．００１）。
【００９１】
ｈＬｆ群 対 ｈＬｆ＋細菌抽出物群：
ｈＬｆでの処理を受けたラットのＩｇＧレベルと、ｈＬｆ＋細菌抽出物での組み合わせた処理を受けた動物において検出されたＩｇＧレベルとの間に、統計学上の有意差は見出されなかった（ｐ＞０．００５）。これは、細菌抽出物での処理の効果を隠すｈＬｆの保護効果があることを示唆する。
【００９２】
胃内投与
種々の処理を胃内で投与する場合に、その結果は、腹腔内投与において記載された結果と同様であるが、しかしながら投与の双方の形式間でのわずかな差が見られた。この場合に、ＩｇＧレベルに関する差異は、細菌抽出物で処理された動物において検出され、かつ残りの群（対照、ｈＬｆ、ｈＬｆ＋抽出物）は、投与の腹腔内形式が使用される場合に生じるように、６日の代わりに処理の開始１３日後から開始して、統計学上の差が生じ（ｐ＜０．００１）、すなわち、胃内投与における免疫応答においてわずかな遅延があるとみられる。一方で、ｈＬｆ群において優位なＩｇＧレベルで、ｈＬｆでの処理を受ける動物の群と、ｈＬｆ＋抽出物での処理を受ける動物の群との間の研究の６日での有意差を見出す。
【００９３】
実施例２
天然グリコシル化タンパク質に由来する細胞培養及び血液の３つの異なる種類を、天然で、すなわち前記のヒトラクトフェリンペプチドの同一の２２量体を有する表において示された濃度での同様の生理学的標準電解質緩衝液中で、共に混合した（配列番号１  ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲの配列を使用する）。
【００９４】
蛍光ラベルを使用する標準相関時間共焦点顕微鏡の構成での、拡散速度での変化の即時測定は、低い濃度（ＨＢＳ中でｈＬｆ９４ｎＭ、０．１％ＢＳＡ、１３０ｎＭのＩｇＧ１）でさえ、実施例１の化合物種を含む治療タンパク質種の例に対して、断片の非特異性の中程度の結合による全ての３つの化合物種についての調合の容易さを示した。
【００９５】
ｆ１段は、実験の最適化なしに、ｈＬｆ断片のチャネルにおいて蓄積された見かけの拡散速度の変化を示す。タンパク質Ｉは、その組み換えヒト変種において又は血液生成物として公知の、血液タンパク質画分のアルブミンであり、タンパク質ＩＩは、選択ＩｇＧ抗体である。双方とも市販源である。断片のそれぞれ約４％又は１５％に対する顕微鏡の焦点の体積要素において"フリー"として参考の動きとしてのｈＬｆは、非特異的に結合し、かつゆっくりと動く。ｈＬｆ断片の超分子凝集体は、試料調合物において具体化されることを示す。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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