(57)【要約】  非侵襲性方式で得られているドナー細胞を再プログラミングすることによって、ｉＰＳＣおよび関心対象の分化した細胞を生成するための方法。特に、ドナー細胞は剥離した上皮尿細胞である。分化した細胞は、再プログラミングしたｉＰＳＣを分化させることによって、または尿細胞を直接再プログラミングすることによって、得られうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
別の細胞タイプのドナー細胞から関心対象の分化した細胞を生成するための方法であって
ｉ）非侵襲性方式でドナーから得られる細胞供給源から細胞を増大させ、ここで前記細胞供給源は、尿、糞便、唾液、毛髪、鼻分泌物、耳垢、涙液または膣管（ｖａｇｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）より選択され、そして
ｉｉ）前記の増大させた細胞から
ａ）前記細胞を再プログラミングして、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にして、そして前記ｉＰＳＣを関心対象の前記細胞に分化させることによるか、または
ｂ）前記細胞を直接再プログラミングして、関心対象の分化した細胞にすることによって
分化した細胞を生成する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
工程ｉ）の前記ドナー細胞が、剥離した尿細胞（ｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ）である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞が、疾患個体からまたは健康な個体から得られており、そして上皮細胞、線維芽細胞様細胞または癌細胞から選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
前記再プログラミングが、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘファミリー遺伝子より選択される因子を含む、外因性再プログラミング因子の混合物によって達成される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記再プログラミングが、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＮａｎｏｇより選択される因子を含む、外因性再プログラミング因子の混合物によって達成される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記再プログラミングが、ゲノム組込みを伴わず、そして／または癌遺伝子の発現を伴わずに、細胞による再プログラミング因子の発現を伴う、請求項４または５の方法。
【請求項７】
前記再プログラミングが、１またはそれより多い前記再プログラミング因子の効率を増加させるかまたは該因子を置換する、小分子、低分子干渉ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを適用する工程をさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１の方法。
【請求項９】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法であって
ｉ．ドナーから非侵襲性方式で得られる細胞供給源から細胞を増大させ、ここで前記供給源は、尿、糞便、唾液、毛髪、鼻分泌物、耳垢、涙液または膣管より選択され、そして
ｉｉ．前記の増大させた細胞を再プログラミングしてｉＰＳＣにする
工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記細胞が尿細胞である、請求項９の方法。
【請求項１１】
請求項１の方法によって得られる分化した細胞、該細胞に由来するオルガノイドまたは組織であって、遺伝疾患の原因に関与する欠陥を修正する核酸分子を所持するように遺伝子修飾されている、前記細胞、オルガノイドまたは組織。
【請求項１２】
前記疾患のためのモデルとしての、またはその治療のために化合物をスクリーニングするための、請求項１１の分化した細胞の使用。
【請求項１３】
人工多能性幹細胞の生成のための尿細胞の使用。
【請求項１４】
関心対象の分化した細胞を生成するための尿細胞の使用。
【請求項１５】
ａ）尿細胞を再プログラミングして、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣにして、そして次いで、前記ｉＰＳＣを関心対象の細胞に分化させることによるか、または
ｂ）人工多能性幹細胞を生成する中間工程を伴わずに、尿細胞を直接再プログラミングして、関心対象の分化した細胞にすることによって
前記の分化した細胞を得る、請求項１４の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞および分化した細胞、ならびにこれらを生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精から得られる胚盤胞由来の細胞であり、自己再生し、そして哺乳動物、例えばヒトの体の成熟した細胞タイプいずれに分化する能力も有する（この特性は「多能性」として知られる）。特定の組織培養条件下で、ＥＳＣは多能性特性を失うことなく、長期間、未分化のまま維持可能である。これらの特性のため、ＥＳＣは、再生医学において多大な興味を喚起してきた。潜在的に、ＥＳＣ由来の組織をヒトの臨床治療（急性状態または遺伝的および変性疾患のいずれか）に用いることも可能である。ＥＳＣはまた、例えば治療に対する組織特異的感受性を研究するため、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子疾患をモデリングするため、薬剤スクリーニングに用いることも可能である。しかし、厳しい倫理的および実際的（免疫拒絶のリスク）限界が、クリニックにおいて、そして多くの国において、また研究においても、ＥＳＣの適用を深刻に阻止してきている。
【０００３】
外因性因子によって、体細胞をｉＰＳＣに変換可能であるという最近の発見（この方法はまた、「外因性因子による核再プログラミング」とも称されてきている（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，  Ｃｅｌｌ  ２００６；  １２６：６６３−７６））は、個別化医学の現在の認知を変化させる潜在能力を有し、そしてまた、ヒト疾患の価値あるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルも提供しうる（ＹａｍａｎａｋａおよびＢｌａｕ，  ２０１０；  Ｎａｔｕｒｅ  ４６５，  ７０４−７１２；  Ｌｉａｎら，  ２０１０；  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０４，  ３９−４４）。
【０００４】
著しいことに、ｉＰＳＣは、ＥＳＣと類似であり、そして患者特異的治療において用いられ、したがって免疫拒絶のリスクを回避する潜在能力を有する。これらの特性のため、ｉＰＳＣは世界中で多大な注目を浴びた。ｉＰＳＣの生成には、ドナーから組織を収集し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでドナー細胞を増大させ、そして化学物質カクテルを伴いまたは伴わず、そして細胞培養条件の変動を伴い、精製されたタンパク質、タンパク質抽出物、ＲＮＡ分子、非組込みプラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルス）として、細胞に提供される外因性因子のカクテルに、細胞を曝露することが必要である。
【０００５】
これらの因子の適用は、ＥＳＣ様形態を持つコロニーが進行性に生じてくる効果を有する。これらのコロニーは、ｉＰＳＣコロニーに相当し、これを摘み取り、そして続いて増大させ、そして性質決定して、これらの振る舞いがＥＳＣに類似であることを検証してもよい。
【０００６】
これまで、ヒトｉＰＳＣは、皮膚（線維芽細胞およびケラチノサイト）、羊液、胚外組織（胎盤および臍帯（Ｃａｉら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １１２２７−１１２３４）、臍帯血、骨膜、歯科組織、脂肪組織、神経幹細胞、肝細胞、羊膜由来間葉系幹細胞および末梢血細胞（ＹｅおよびＣｈｅｎｇ，  ２０１０；  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ５，  ５２１−５３０；  Ｃａｉら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １１２２７−１１２３４））を用いて生成されてきている。これらの組織由来の細胞の再プログラミングは、多様な頻度で達成されてきており、起源の細胞（「ドナー細胞」）の問題であることが示される。現在、ｉＰＳＣ生成に用いられるドナー細胞が不均一であるため、ｉＰＳＣおよびＥＳＣを用いた比較試験を行うための標準を設定し、そして試験結果から意味がある結論を導き出すことが困難である。
【０００７】
ｉＰＳＣを生成するための理想的なドナー細胞タイプは、容易にアクセス可能であり、容易に再プログラミング可能であり、そして普遍的であるべきである（任意の年齢、性別、民族、および体の状態）。現在、皮膚線維芽細胞が再プログラミングに最も頻繁に用いられる細胞供給源の中にあるが、これらには、専門家によって無菌環境において行われる必要がある不快な生検だけでなく、使用前の長期の増大もまた、必要である。これらはまた、光および放射線への曝露のため、体細胞突然変異のリスクも有し、そして該処置は、重度の皮膚疾患または火傷においては禁忌を示す。近年、３つの研究グループが、ＣＤ３４＋細胞可動化の必要を伴わない、末梢血細胞の再プログラミングを達成したと報告した（Ｌｏｈら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  １５−１９；  Ｓｅｋｉら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  １１−１４；  Ｓｔａｅｒｋら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  ２０−２４）。Ｂｒｏｗｎら，  ２０１０，  ＰｌｏＳ  ＯＮＥ，  ２０１０，  ５，  ６，  １−９は、末梢血からのＴリンパ球由来ｉＰＳＣの生成を記載する。これらの処置は最小限の侵襲性であり、少量の血液しか必要とせず、そして長期の細胞培養を必要としないため、効率が非常に低いという事実にもかかわらず、重要な進歩に相当する。しかし、これらの報告にしたがって用いられる主なドナー細胞は、特定のＴ細胞受容体再配置を所持する成熟Ｔ細胞であり、特定の潜在的な臨床適用には望ましくない。また、Ｔ細胞は、任意の細胞タイプに限定なしに分化するのに必要な、完全な遺伝情報を所持していない。
【０００８】
それに加えて、稀な場合には、血液を受け入れる／提供することは、倫理的な懸念から、例えば宗教的信念のために適用されず、そして感染性疾患、血液疾患、または免疫抑制を伴う患者においては実現可能ではない可能性もある。後者の背景においては、凝血（例えば血友病）、白血病および遺伝的または後天性（例えば癌およびＡＩＤＳ）免疫抑制に影響を及ぼす状態を考慮すべきである。
【０００９】
新規組織の再プログラミングを追求する中で、ｉＰＳＣはまた、マウス髄膜（Ｑｉｎら，  ２００８；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；  ２８３，  ３３７３０−３３７３５）および乳腺上皮細胞（Ｌｉら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  ５１−６３）、ならびにヒトにおいて、骨膜および脂肪幹細胞（Ｅｓｔｅｂａｎら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，  ７１−７９）、臍帯マトリックスおよび胎盤（Ｃａｉら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １１２２７−１１２３４）からも産生されてきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，  Ｃｅｌｌ  ２００６；  １２６：６６３−７６
【非特許文献２】ＹａｍａｎａｋａおよびＢｌａｕ，  ２０１０；  Ｎａｔｕｒｅ  ４６５，  ７０４−７１２
【非特許文献３】Ｌｉａｎら，  ２０１０；  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０４，  ３９−４４
【非特許文献４】Ｃａｉら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １１２２７−１１２３４
【非特許文献５】ＹｅおよびＣｈｅｎｇ，  ２０１０；  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ５，  ５２１−５３０
【非特許文献６】Ｌｏｈら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  １５−１９
【非特許文献７】Ｓｅｋｉら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  １１−１４
【非特許文献８】Ｓｔａｅｒｋら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  ２０−２４
【非特許文献９】Ｂｒｏｗｎら，  ２０１０，  ＰｌｏＳ  ＯＮＥ，  ２０１０，  ５，  ６，  １−９
【非特許文献１０】Ｑｉｎら，  ２００８；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；  ２８３，  ３３７３０−３３７３５
【非特許文献１１】Ｌｉら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  ５１−６３
【非特許文献１２】Ｅｓｔｅｂａｎら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，  ７１−７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ｉＰＳＣ技術の将来的な適用に向かう進歩を加速するには、普遍的な供給源に相当するドナー細胞由来のｉＰＳＣ、ならびに該細胞に由来する任意の細胞タイプの分化した細胞、組織またはオルガノイド、ならびにこうしたドナー細胞に直接由来する分化した細胞を提供することが望ましい。さらに、先行技術の方法にしたがってｉＰＳＣを生成するためのドナー細胞の単離は、通常、関心対象のドナー組織を得るために侵襲性の工程を必要とするため、本発明者らは、非侵襲性細胞供給源に由来するｉＰＳＣ、およびこうしたｉＰＳＣを産生するための方法を追求した。
【００１２】
ＷＯ２００８／１５３６８５は、尿試料を提供し、そして次いで該試料から尿前駆細胞（ｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を単離することによって、尿前駆細胞（ＵＰＣ）の培養物を産生するための方法を記載する。該前駆細胞は、他の細胞タイプにさらに分化する潜在能力を有する。
【００１３】
分化した細胞の培養物を得るため、ＷＯ２０１０／０６５２３９は、尿から幹細胞を単離し、そして次いで特定の細胞タイプに分化させる方法を示唆する。
これらの方法に共通するのは、得られた尿細胞の分化が、限定された数の細胞タイプに関してのみ可能であることである。
【００１４】
非侵襲性に得られる細胞供給源から、最終的に生成される細胞タイプに関して限定されない分化能を持つ多能性細胞を得るための方法を提供することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の根底にある問題を解決するため、本発明者らは、個体から単離し、そして次いでｉＰＳＣ（いかなる特定の細胞タイプにも分化しうる）に再プログラミングするか、または特定の細胞タイプ、組織またはオルガノイドに直接分化させる（「分化転換させる（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）」、すなわちｉＰＳＣ生成の中間工程を伴わずに直接分化させる）ための、理想的な細胞供給源によって満たされるべき基準を考慮した：細胞は、まったく関連リスクを伴わずまたは最小限の関連リスクのみで容易にアクセス可能であるべきであり、これらは十分な量で入手可能であり、男性および女性両方に普遍的に存在するべきであり（倫理的懸念、人種、年齢、あるいは健康または疾患状態に関する制限を伴わず）、そしてこれらは、優れた効率で再プログラミングに感受性であるべきである。本発明者らは、驚くべきことに、尿などの非侵襲性供給源由来の、体細胞、すなわち最終的に分化した細胞が、ｉＰＳＣあるいは関心対象の特定の細胞または細胞系譜に効率的に再プログラミング可能であることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２つの代表的なＵｉＰＳＣクローンを用いて産生された三胚葉の複雑な派生物を含む奇形腫のヘマトキシリン／エオジン染色スライド。
【図２】Ａ．代表的なＵｉＰＳＣクローンから、報告するプロトコルにしたがって産生したニューロン様細胞の位相差および免疫蛍光写真。Ｂ．報告されるプロトコルを用いて、代表的なＵｉＰＳＣクローンを心筋細胞様細胞に分化させた。位相差、ＰＡＳ染色および免疫蛍光写真。Ｃ．報告されるプロトコルを用いて、代表的なＵｉＰＳＣクローンを肝細胞様細胞に分化させた。位相差、ＰＡＳ染色および免疫蛍光写真。Ｄ．代表的なＵｉＰＳＣクローンに由来する心筋細胞において測定した活動電位。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、別の細胞タイプのドナー細胞から関心対象の分化した細胞を生成するための方法であって
ｉ）非侵襲性方式でドナーから得られる細胞供給源由来の細胞を増大させ、ここで前記細胞供給源は、尿、糞便、唾液、毛髪、鼻分泌物、耳垢、涙液または膣管（ｖａｇｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）より選択され、そして
ｉｉ）前記の増大させた細胞から
ａ）前記細胞を再プログラミングして、ｉＰＳＣにして、そして次いで、該ｉＰＳＣを関心対象の細胞に分化させることによるか、または
ｂ）前記細胞を直接再プログラミングして、関心対象の分化した細胞にすることによって
分化した細胞を生成する
工程を含む、前記方法に関する。
【００１８】
好ましい態様にしたがって、工程ｉ）で得られる前記ドナー細胞は、尿中に存在する尿管から剥離した細胞（以下、これらの細胞を尿細胞（ｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ）と称する）である。
【００１９】
以下において、尿細胞に由来するｉＰＳＣは、「ＵｉＰＳＣ」と称される（別に言及しない限り、例えばＵｉＰＳＣの使用に関して、この用語はまた、他の非侵襲性に得られるドナー細胞から得られるｉＰＳＣも含む）。
【００２０】
細胞供給源が尿である態様において、工程ｉ）は、当該技術分野に知られる方法にしたがって実行可能であり、通常、
ａ）ドナーから尿を収集し、
ｂ）剥離した細胞を尿から単離し、そして
ｃ）前記の剥離した細胞を増大させる
副工程を含む。
【００２１】
剥離した細胞ｉｉ）は、再プログラミングに受け入れられる、尿中に見られるいかなる細胞タイプであってもよい。
特定の態様にしたがって、剥離した細胞は、上皮細胞、例えばヒト剥離近位尿細管上皮細胞（ＨＥＰＴＥＣ）のような腎尿細管細胞である。
【００２２】
他の態様にしたがって、剥離した細胞は線維芽細胞様細胞である。さらなる態様にしたがって、剥離した細胞は、Ｚｈａｎｇら，  ２００８；  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １８０，  ２２２６−２２３３に記載されるように、前駆体様細胞、内皮様細胞、平滑筋様細胞または間質様細胞である。
【００２３】
細胞ｉｉ）はまた、剥離した癌細胞、例えば腎癌または膀胱癌細胞であってもよい。
尿収集後、尿細胞を遠心分離し、そして関心対象の細胞タイプ、例えばＨＥＰＴＥＣまたは線維芽細胞様細胞の増殖を支持し、それによって望ましくない細胞タイプの細胞の増殖を防止する培地中で細胞を増殖させることによって、関心対象の細胞タイプを濃縮する。
【００２４】
こうした培地は、文献から知られ、そして／または商業的に入手可能である。例えば、上皮細胞の必要性を特異的に満たす培地には、限定されるわけではないが、どちらもＬｏｎｚａから入手可能な腎上皮基礎培地（ＲＥＢＭ）およびＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットＣＣ−４１２７  ＲＥＧＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なＥｐｉＧＲＯ培地、腎上皮細胞基礎培地（ＡＴＣＣ）、気道または乳腺上皮細胞培地を含む他の上皮細胞培地、例えばＬｏｎｚａ、ＡＴＣＣ、またはＣｅｌｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓなどから入手可能なものなど、あるいはその組み合わせが含まれる。同様に、Ｗｉｅｓｅｒら，  ２００８（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５，  Ｆ１３６５−１３７５）に記載されるものに基づく単数または複数の培地も含まれる。
【００２５】
尿から線維芽細胞様細胞を濃縮するのに適した培地の例は、やはりＬｏｎｚａより入手可能なＦＧＭ（登録商標）−２線維芽細胞増殖培地である。
本発明の方法で用いるのに好ましいドナー細胞である尿細胞に加えて、非侵襲性方式でドナー個体から得られている他の細胞を増大させ、そして再プログラミングしてｉＰＳＣにしてもよいし、または関心対象の細胞タイプに直接分化させてもよく、例えばこうした細胞は、糞便、唾液、毛髪、鼻分泌物、耳垢、涙液または膣管から得られる細胞である。こうした細胞を単離し、そして増大させるための方法が当該技術分野に知られ、例えば結腸から糞便中に剥離した細胞（Ｂａｎｄａｌｅｔｏｖａら，  ２００２．  Ａｐｍｉｓ  １１０，  ２３９−２４６）、または毛髪由来の皮膚乳頭（ｐａｐｉｌｌａ）細胞（Ｗａｒｒｅｎら，  １９９２；  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９８，  ６９３−６９９）からのものが知られる。
【００２６】
別の有用な細胞供給源は、血液透析中、腹膜中の血管を通じて、血液と物質を交換するために、腹腔内に挿入され、腎臓におけるのと「同様の」方式で、血液がろ過されるのを可能にする液体である。この液体は収集可能であり、そして多くの細胞を含有することが知られている。
【００２７】
「再プログラミングする」［（工程ｉｉ）、態様ａ）］は、外因性因子によって、体細胞をｉＰＳＣに変換する分野で知られる用語である。
本発明の実験において、尿細胞のＵｉＰＳＣへの再プログラミングは、元来、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，  ２００６；  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−７６に記載されるように、４つの再プログラミング因子、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ（「山中因子」または「山中カクテル」）を送達するレトロウイルスベクターを用いて行われた。
【００２８】
原理的には、ドナー細胞、特に尿細胞を、ｉＰＳＣ、特にＵｉＰＳＣに変換することが可能な、任意の再プログラミング法が使用可能である。
再プログラミングは、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘファミリー遺伝子より選択される１またはそれより多い因子によって達成可能である。さらに、因子の組み合わせは、サイトカインを伴い、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子の１またはそれより多い遺伝子産物を含んでもよい。サイトカインは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）の少なくとも１つであってもよい。
【００２９】
好ましくは、これらの因子は、非ウイルス性発現ベクター中に挿入され、これが体細胞に導入される。
ＵｉＰＳＣ、またはその分化した細胞が、療法適用を意図される場合、癌遺伝子を使用せず、そして／または再プログラミング因子をコードするＤＮＡが個体ゲノムＤＮＡに組み込まれることを伴わない方法が用いられる。
【００３０】
したがって、療法目的のため、ＵｉＰＳＣまたはその分化した細胞を生成するための、本発明の好ましい方法は、レンチウイルスまたはレトロウイルスを使用しないか、あるいは導入遺伝子のゲノム組込みリスク、およびこうした組込みに関連する望ましくない副作用が最小限になるかまたは完全に消滅するように修飾されたウイルスを用いる。また、導入遺伝子組込みが挿入突然変異誘発のリスクを所持し、これは治療される患者における腫瘍形成と関連しうることを考慮しなければならない。
【００３１】
療法適用のためにＵｉＰＳＣを生成するのに好ましい方法は、再プログラミング遺伝子のゲノム組込みを回避し（Ｓｕｎら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ９：５，  ８８０−８８５に概説される）、そして／またはＫｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃのような癌遺伝子を回避するものであり、例えば
・Ｃｒｅレコンビナーゼ切除可能レンチウイルスを用いる（Ｓｏｌｄｎｅｒら，  ２００９；  Ｃｅｌｌ  １３６：９６４−７７）；
・ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧのみを用いて、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を省く（Ｌｉら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．  Ｊｕｎ  １２（３）：２３７−４７）；
・再プログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８およびＳＶ４０ＬＴをコードする、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１（エプスタイン−バー核抗原１）に基づくエピソームベクターを用いることによって、ウイルス不含および導入遺伝子不含ヒトｉＰＳ細胞誘導を達成する（Ｙｕら，  ２００９；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：７９７−８０１）；
・山中因子の多シストロン導入遺伝子を所持するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクター（Ｗｏｌｔｊｅｎら，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７６６−７０）；非ウイルス性ミニ環状ＤＮＡ（Ｊｉａら，  ２０１０；  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｒ  ７（３）：１９７−９）を用いるウイルス不含再プログラミング技術を用いる；
・組換えタンパク質に基づく方法、例えば細胞透過性ペプチド（ｃｐｐ）にコンジュゲート化された組換えタンパク質の形の４つの山中因子で、細胞を処理する（Ｋｉｍら，  ２００９；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：４７２−６）；先行する化学物質処理を伴いまたは伴わず、精製タンパク質、タンパク質抽出物として細胞に提供される、外因性因子のカクテルに、細胞を曝露する（Ｃｈｏら，  ２０１０；  Ｂｌｏｏｄ  １１６，  ３８６−３９５；  Ｈａｎら，  ２０１０；  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  Ａｕｇ  １９；  ５（８）：ｅ１２２９７；  ＳｏｌａｎｋｉおよびＬｅｅ，  ２０１０；  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １１，  ７５５−７５７）。
・小分子、例えばバルプロ酸、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（Ｈｕａｎｇｆｕら，  ２００８；  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：７９５−７；  Ｈｕａｎｇｆｕら，  ２００８；  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：１２６９−７５）；またはいくつかの他の小分子、例えばグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）の阻害剤、ＭＥＫ−ＥＲＫ経路およびＴＧＦβ経路阻害剤を添加して、再プログラミング因子の効率を増加させるか、または該因子のいくつかを置換する（Ｌｉｎら，  ２００９；  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：８０５−８；  Ｌｉら，  ２００９；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：１６−９；  Ｓｈｉら，  ２００８；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：５２５−８；  Ｉｃｈｉｄａら，  ２００９；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ５：４９１−５０３）；あるいはビタミンＣを添加する（Ｅｓｔｅｂａｎら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，  ７１−７９）；
・低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、例えばｐ５３  ｓｉＲＮＡを添加して、山中因子による再プログラミングの効率を改善する（Ｚｈａｏら，  ２００８；３：  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４７５−９）；
・再プログラミングカクテルにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を添加する（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，  ２００９；  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １８：７４９−５８；  Ｊｕｄｓｏｎら，  ２００９；  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｍａｙ；  ２７（５）：  ４５９−４６１）。
・再プログラミング因子をコードするｍＲＮＡ、または修飾ｍＲＮＡを送達し（Ｙａｋｕｂｏｖら，  ２０１０；  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３９４，  １８９−１９３）、それによって修飾の場合、例えばＫｏｗａｌｓｋａら，  ２００８，  ＲＮＡ．  ２００８  Ｊｕｎ；１４（６）：１１１９−３１に記載されるように、翻訳および／または安定性を増加させるようにする。
【００３２】
再プログラミングの安全性および／または効率は、組織培地または環境を変化させる、例えば血清を含有する培地をノックアウト血清代替剤（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって置換するか、または環境を変化させる（例えば酸素濃度が調節可能な特定のインキュベーターを用いて、低酸素付加する）ことによって、さらに最適化可能である。
【００３３】
最適化は、例えば、所定の増大させた尿細胞集団に関して、連続実験を行うことによって達成可能である。例えば、より容易に再プログラミングされる細胞集団に関して選択するため、外因性因子を産生するレトロウイルスに感染させる前に、多くの個体由来の尿細胞を異なる培地（例えば上皮細胞または線維芽細胞培地）中で増殖させてもよい。感染後、血清を含有するかまたは血清を含まず、そして添加される化学物質（上記を参照されたい）を含むかまたは含まない、培地の異なるカクテルを使用し（異なる時点での変化を伴う）、最適な効率が達成可能である条件を探す。また、因子、例えばＮａｎｏｇ（または他の因子、例えばマイクロＲＮＡ）を含むまたは含まない４つの山中因子の異なる組み合わせに細胞を感染させてもよい。何周期の感染（１、２または３周期）で、最適な結果が得られうるかを試験してもよい。細胞をフィーダー細胞上で分割する場合、異なるタイプのフィーダー層、例えばマウス線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、羊膜細胞、羊膜等を用いてもよい。
【００３４】
まずｉＰＳＣを生成するのではなく、ドナー細胞を直接再プログラミングして、関心対象の分化した細胞にする［工程ｉｉ）、態様ｂ）］こともまた、「分化転換」として知られ、これは、１つの分化した状態から別の状態に、細胞または組織を変化させることを意味する（ＶｉｅｒｂｕｃｈｅｎおよびＷｅｒｎｉｇ，  ２０１１，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１１；２９（１０）：８９２−９０７）。
【００３５】
この態様において、ｉＰＳ再プログラミングのための因子に関して、ウイルスベクター、プラスミドに基づくベクター等を用いて、細胞タイプ特異的転写因子を過剰発現する。
尿細胞（または他の非侵襲性に得られた細胞）をニューロンに直接分化転換するため、ヒト線維芽細胞をニューロンに変換するために記載されたように（Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎら，  ２０１０；  Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，  １０３５−１０４１）、またはＭａｒｒｏら，  ２０１１，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  Ｏｃｔ  ４；  ９（４）：３７４−８２に記載されるように、肝細胞をニューロンに変換するために、３つの因子、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、およびＭｙｔ１ｌを用いてもよい。
【００３６】
Ｅｆｅら，  ２０１１，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１１  Ｍａｒ；  １３（３）：２１５−２２は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、分化した心筋細胞の自発的に収縮するパッチに直接再プログラミング可能である方法を記載する。
【００３７】
尿ドナー細胞を心筋細胞に変換するため、Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５、およびＢａｆ６０ｃを用いて、中胚葉から心筋細胞を得るために成功裡に実行されている方法（Ｔａｋｅｕｃｈｉら，  ２００９；  Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，  ７０８−７１１）を用いてもよい。
【００３８】
Ｏｃｔ４過剰発現のみを用いることによって、造血細胞への分化転換を行うことも可能である（Ｓｚａｂｏら，  ２０１０；  Ｎａｔｕｒｅ  ４６８，  ５２１−５２６）。
尿細胞を、ニューロン、ケラチノサイト、線維芽細胞、心筋細胞、肝臓、腎臓、血液細胞などに分化転換させる因子に関するスクリーニングは、上記の分化転換プロトコルおよび最初の山中プロトコル（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，  ２００６）と同様に実行可能である。系譜特異的転写因子に関する豊富な知識に基づいて、関心対象の特定の細胞タイプを維持し、そして培養するために一般的に用いられる培養条件と組み合わせて、尿由来細胞を直接分化転換する潜在能力に関して、こうした因子を組み合わせて（上記論文におけるように）試験してもよい。分化転換効率を最適化するために、再プログラミング効率を最適化するための上記原理にしたがった連続実験もまた、実行してもよい。
【００３９】
本発明の方法は、好ましくは、ヒトドナー細胞からＵｉＰＳＣまたは分化した細胞を産生するために用いられるが、これを他の哺乳動物（例えばサル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ラット、およびマウス）由来の細胞にも適用してもよい。
【００４０】
剥離した尿細胞から、関心対象の分化した細胞を、直接または中間ＵｉＰＳＣを通じて産生できれば、高品質ＥＳＣ様細胞を生成する、普遍的で容易な再生法が提供される。最小限の衛生手段が取られ、そして年齢、性別、または状態に関わらず、いかなるヒトからも採取されるならば、ドナー細胞の収集は、どこでもそして誰によっても実行可能であるという利点を有する。さらに、透析を必要とする腎不全患者、または膀胱手術後、尿を産生しない患者において、腎機能の欠損を置換するために腹膜内に灌流させる液体を、再プログラミングまたは分化転換のための細胞の供給源として用いてもよい。
【００４１】
本発明の方法は、世界中の再プログラミング法を比較し、そして安全なｉＰＳＣの臨床適用に向かって分野を進歩させるユニークな機会を提供する。
原理的に、ＵｉＰＳＣ、または他の非侵襲性に得られるドナー細胞から本発明の方法によって得られるｉＰＳＣは、他の細胞タイプから生成される、当該技術分野に知られるｉＰＳＣと同じ目的に使用可能である。
【００４２】
ＵｉＰＳＣの好適な特徴のため、該細胞は、研究および商業的観点の両方から有用であり、後者は、例えば、健康な個体または疾患を有する患者由来のＵｉＰＳＣ、あるいは該細胞から得られる細胞、細胞系譜、オルガノイドまたは組織を、例えばスクリーニング目的のために提供することによる。
【００４３】
ＵｉＰＳＣを用いて、ＥＳ細胞の使用につきものの倫理的および免疫学的課題を回避しながら、組織修復または置換のための細胞を生成することも可能である。
本発明のＵｉＰＳＣ、該細胞に由来する組織またはオルガノイドは、それぞれ、重度の火傷を負った患者の治療に特に有用であり、患者は、尿細胞から直接またはＵｉＰＳＣを通じてのいずれかで得られる分化した細胞から得られる人工皮膚を提供されるであろう。
【００４４】
血液疾患の治療のため、ＵｉＰＳＣまたは該細胞から得られる分化した細胞、あるいは尿細胞の直接分化転換によって得られる細胞を、例えば体細胞突然変異誘導性白血病を患う患者に注入することも可能である。
【００４５】
血友病の治療において、遺伝子修正されたＵｉＰＳＣを自己移植に用いてもよく、そして例えばＨＩＶにおけるように免疫細胞の量を減少させる疾患の場合、造血細胞に変換されたＵｉＰＳＣを用いて、注入によって免疫細胞集団を補充してもよい。鎌状赤血球貧血症においては、遺伝子修正されたｉＰＳもまた使用可能である（Ｈａｎｎａら，  ２００７；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，  １９２０−１９２３）。
【００４６】
当該技術分野において知られるｉＰＳＣ同様、ＵｉＰＳＣ（または他の非侵襲性に得られたドナー細胞から得られたｉＰＳＣ）を、特定の細胞タイプまたは組織が破壊されるかまたは機能不全になり、そして体がこれを補充不能である変性疾患の療法において、用いてもよい。変性状態、例えばパーキンソン病において、ＵｉＰＳＣでの治療は、罹患した部位に、次いで組織損傷を修復するために使用可能な未分化細胞を提供する。したがって、ＵｉＰＳＣでの療法は、同じ機能を実行する新規の健康な細胞または組織を再導入するであろう。ＵｉＰＳＣはまた、患者と適合するであろう完全新規臓器を発展させるために使用される潜在能力を有し、そして自己細胞、すなわち治療しようとする患者のドナー細胞由来の細胞であるため、移植拒絶の可能性が減少しており、例えば糖尿病の場合、ｉＰＳＣからと同様に、インスリン分泌膵島様クラスターが生成可能である（Ｔａｔｅｉｓｈｉら，  ２００８；  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５，  Ｆ１３６５−１３７５）。
【００４７】
ＵｉＰＳＣはまた、疾患モデルとして有用な疾患特異的細胞株の生成のため、そして／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬剤候補のスクリーニングのため、そして／または遺伝子療法によって遺伝的欠陥を修正するためにも使用可能である（Ｌａｕら，  ２００９；  Ｆ１０００  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．  １：  ８４によってｉＰＳＣに関して概説されるように）。ＵｉＰＳＣからの最終分化した細胞（例えば肝細胞または心筋細胞）の生成は、例えば、患者特異性（個別化医療のため）または化合物の一般的適用可能性を定義する目的で、それぞれの細胞系譜に対する化合物のスクリーニングおよびさらなるプロファイリングを可能にするであろう。例えば、Ｄｉｍｏｓら  ２００８（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｕｇ  ２９；  ３２１（５８９３）：１２１８−２）によって記載される通りである。ＵｉＰＳＣを筋萎縮性側索硬化症の家族性型のモデルとして；あるいはパーキンソン病、１型糖尿病、デュシェンヌおよびベッカー型筋ジストロフィー、アデノシン脱アミノ酵素不全関連重度複合免疫不全、シュバックマン−ボディアン−ダイアモンド症候群、ＩＩＩ型ゴーシェ病、ハンチントン病、ダウン症候群、およびレッシュ−ナイハン症候群のキャリアー状態を含む、１０の異なる遺伝病の患者からｉＰＳ細胞を産生した、Ｐａｒｋら，  ２００８（Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐ  ５；１３４（５）：８７７−８）によって記載されるように、他の遺伝病のそれぞれ、モデルとして、または治療のため、用いてもよい。また、脊髄性筋萎縮症およびパーキンソン病のヒト細胞に基づくモデルを、Ｅｂｅｒｔら；  ２００９（Ｎａｔｕｒｅ  Ｊａｎ  １５；  ４５７（７２２７）：２７７−８）およびＳｏｌｄｎｅｒら，  ２００９（Ｃｅｌｌ．  Ｍａｒ  ６；  １３６（５）：９６４−７７）に記載されるのと同様に生成してもよいし、あるいは続いてヘモグロビンを産生する造血細胞に分化させる、皮膚線維芽細胞由来のｉＰＳＣに関して、Ｙｅら，  ２００９（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  Ｊｕｎ  １６；１０６  （２４）：９８２６−３）に記載されるのと同様に、ホモ接合体ベータ−サラセミア患者由来の細胞から得られたＵｉＰＳＣを用いてもよい。こうしたＵｉＰＳＣは、遺伝子操作に際して、正常に機能する自己造血細胞を生じることも可能である。ＵｉＰＳＣはまた、ファンコーニ貧血患者から採取された皮膚線維芽細胞からｉＰＳ細胞を得て、ＦＡＮＣＡおよびＦＡＮＣＤ２をコードするレンチウイルスベクターを用いて修正し、そして続いて表現型的に疾患でない体細胞を得た、Ｒａｙａら，  ２００９（Ｎａｔｕｒｅ  Ｊｕｌ  ２；  ４６０（７２５１）：５３）に記載されるように、ファンコーニ貧血患者の遺伝子欠陥を修正するのにも使用可能である。
【００４８】
ＵｉＰＳＣはまた、家族性自律神経障害（ＦＤ）患者からｉＰＳＣを生成し、ｉＰＳ細胞に再分化させ、そして候補薬剤をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いた、Ｌｅｅら，  ２００９（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｐ  １７；  ４６１（７２６２）：４０２）によって生成されるｉＰＳのようにも使用可能である。
【００４９】
ＵｉＰＳＣが、疾患モデルとして潜在的に大きな価値を有する疾患に関する別の例は、プラダー・ウィリー症候群である（Ｙａｎｇら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  ４０３０３−４０３１１）。ＵｉＰＳＣを用いた遺伝子療法が、大きな潜在能力を有する遺伝子疾患の他の例は、表皮水疱症である（例えば、Ｗａｌｌｙら，  ２０１０；  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９，  ４７１５−４７２５；  Ｗａｌｌｙら，  ２００８；  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２８，  ５６８−５７４に記載されるように、Ｋ１４  ｍＲＮＡ再プログラミングによる）。一般的に、遺伝子操作されたＵｉＰＳＣに基づく遺伝子療法は、単一遺伝子障害によって引き起こされる疾患を治療するのに最大の潜在能力を有する；現在までに、およそ４０００のこうした遺伝子疾患が記載されてきている。
【００５０】
最終分化した細胞を用いる上記疾患モデルにおいて、こうした細胞は、あるいは、ＵｉＰＳＣから得られてもよいし、ドナー細胞の直接再プログラミングによって得られてもよい。本発明の目的のため、「直接再プログラミング」は、本明細書に定義されるような「分化転換」と同義で用いられる。
【００５１】
ドナー細胞が癌細胞、例えば腎または膀胱癌細胞である、おそらく、癌の初期段階に相当する場合、ＵｉＰＳＣまたはその分化した細胞は、それぞれの癌のモデルとして有用である。
【００５２】
遺伝子療法は、疾患を引き起こす遺伝的影響を修正するための、個体の細胞内の１またはそれより多い遺伝子の挿入、改変、または切除を含む。これまでに、主に、単一遺伝子における突然変異によって引き起こされる一遺伝子性疾患が治療のために考慮されてきている。遺伝子療法の最も一般的な型は、突然変異遺伝子を置換するための、特定されないゲノム位置への機能遺伝子の挿入を伴う。突然変異はまた、直接修正されてもよい。
【００５３】
遺伝子療法適用のため、遺伝子修飾された細胞は、ＵｉＰＳＣまたは該細胞に由来する（またはドナー細胞の直接再プログラミングによって得られる）分化した細胞である；あるいは、好ましさは劣るが、増大されたドナー細胞を、再プログラミング前に遺伝子修飾してもよい。本発明の範囲において、遺伝子修飾された細胞は、体細胞遺伝子療法において、広く用いられうる。遺伝子欠陥の修正は、ＵｉＰＳＣまたは該細胞に由来する（またはドナー細胞の直接再プログラミングによって得られる）分化した細胞を再注入するかまたは移植する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるため、生殖系列への遺伝子導入のリスクは最小限である。機能しない組織および臓器を補完するかまたは置換するため、ＵｉＰＳＣに由来する分化した細胞（または先にｉＰＳ再プログラミングを伴わずに直接分化転換した細胞）として、修正した細胞を注入するかまたは移植する。当該技術分野に知られる方法にしたがって、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスを含むウイルスベクター（再活性化のリスクを最小限にするように修飾されているもの）によって、プラスミドに基づくベクターまたはさらに裸のＤＮＡを用いることによって、修正遺伝子を細胞内に導入することも可能である。
【００５４】
遺伝子欠陥の修正は、多くの方式で、例えば正しく機能する遺伝子をコードするＤＮＡを送達することによって、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを送達することにより、突然変異遺伝子をノックダウンすることによって、ジンクフィンガータンパク質を用いて、ノックアウトまたは組換えを実行することによって、あるいはトランススプライシング事象を可能にするベクターを用いることによって、実行可能である。
【００５５】
非侵襲性の方式でドナー細胞を得るため、健康な個体が、あらかじめ、そして予防的に、自身の尿から得られるＵｉＰＳＣ、ならびに由来する細胞系譜、オルガノイドまたは人工皮膚のような組織を調製し、そして保存することに関する許容性が高い可能性があり、これによって、重度の疾患または火傷のような傷害が発生した場合に、より速やかに使用することが可能になるであろう。
【００５６】
ＵｉＰＳＣから生成される、例えば異なる皮膚タイプを持つ個体のドナー細胞に由来する、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは人工皮膚（Ｂｉｌｏｕｓｏｖａら，  ２０１０；  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｄｅｃ  ９）はまた、試験のため、美容産業において有用である可能性もある。
【００５７】
ＵｉＰＳＣはまた、動物、特に哺乳動物、例えば競走馬またはペットをクローニングするのにも有用でありうる。
【実施例】
【００５８】
材料および方法
免疫蛍光顕微鏡
細胞を４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、洗浄し、ブロッキングし、そしてブロッキング溶液（３％正常ヤギ血清および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ）中で３０分間透過処理した。次いで、これらをブロッキング溶液中の一次抗体と４℃で一晩インキュベーションし、２回洗浄し、そして対応する二次抗体と室温で１時間インキュベーションした。細胞を２回洗浄し、そしてＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で５分間染色し、そして次いで、観察し、そしてＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２スペクトル共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ウェツラー）を用いて写真撮影した。免疫蛍光前に、拍動領域を鋏で切り離し、低カルシウムＰＢＳを含む１．５ｍＬ試験管内に収集し、そして室温で３０分間放置した。これらの細胞塊を、０．５〜１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ２を含有する酵素緩衝液内に移し、そして３７℃で３０〜４０分間インキュベーションした。ＤＭＥＭ／Ｈａｍ  Ｆ１２  １：１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットＣＣ−４１２７  ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）で消化を終結させた。次いで、試料を遠心分離し、そしてペレットをＤＭＥＭ／Ｈａｍ  Ｆ１２  １：１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットＣＣ−４１２７  ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。細胞懸濁物をゼラチンコーティングカバーガラス上にプレーティングし、そして固定および免疫蛍光前に、少なくとも２日間、３７℃で培養した。
【００５９】
組織特異的分化および電気生理学的測定
ニューロン、肝細胞および心筋細胞分化を、記載されるように行った（Ｐａｎｋｒａｔｚら，  ２００７，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，  １５１１−１５２０；  Ｓｏｎｇら，  ２００９，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９，  １２３３−１２４２；  Ｚｗｉら，  ２００９，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２０，  １５１３−１５２３）。Ｎ２およびＢ２７をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ヘパリンをＳｉｇｍａから購入し、ＥＧＦをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。アクチビンＡおよびオンコスタチンＭをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入し、ＢＭＰ２、ＦＧＦ４、ＨＧＦおよびＫＧＦをＰｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ（米国ロッキーヒル）から購入し、そしてデキサメタゾンをＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国ファーミングデール）より購入した。Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国ウォリントン）から購入したキットを用いて、ＲＰＭＩ  １６４０、ヘパトＺＹＭＥ−ＳＰＦ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を行った。標準的ホールセルパッチクランプを用い、活動電位表現型を記録して（ＨＥＫＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州サウスボロー）（Ｃｈａｎら，  ２００９  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ２０，  １０４８−１０５４）、ｉＰＳＣ由来心筋細胞（第２３日）の電気生理学的性質決定を行った。Ｓｕｔｔｅｒマイクロピペット吸引装置Ｐ−９７を用いて、１．５ｍｍ薄壁ホウケイ酸ガラス管からパッチピペットを調製し、そして該ピペットは（ｍＭ）：１１０  Ｋ＋アスパラギン酸、２０  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、０．１  Ｎａ−ＧＴＰ、５  Ｍｇ−ＡＴＰ、５  Ｎａ２−ホスホクレアチン、５  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳを含有し、そしてＫＯＨでｐＨを７．３に調整した内部溶液で満たした際、３〜５ＭΩの典型的な耐性を有した。外部タイロードの浴溶液は（ｍＭ）：  １４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、０．４  ＫＨ２ＰＯ４、１．８  ＣａＣｌ２、１０グルコース、５  ＨＥＰＥＳからなり、そしてＮａＯＨでｐＨを７．４に調整された。自発的電気活性を測定し、一方、ｉＰＳＣ由来心筋細胞は、電流インプットがないと不活性のままであった。自発的に興奮するｉＰＳＣ由来の心筋細胞から２０の連続活動電位を記録して、分析のための安定な波形を確実にした。＋１５．９ｍＶの液間電位のためにデータを修正した。先に記載されるプロトコル（Ｎｇら，  ２０１０；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４８，  １１２９−１１３７）を用い、共焦点カルシウム画像化で、カルシウム過渡応答を検出した。簡潔には、単離したｉＰＳＣ由来心筋細胞に（ｍＭ）：  １４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、０．４  ＫＨ２ＰＯ４、１．８  ＣａＣｌ２、１０グルコース、５  ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨ  ７．４であるタイロード溶液中、５μＭ  Ｆｌｕｏ−３  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で２５分間装填した。Ｏｌｙｍｐｕｓ正立顕微鏡（ＩＸ７１）上に搭載された共焦点画像化系（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｓｙｓｔｅｍバージョン４．２  ＦＶ３００  ＴＩＥＭＰＯ）で、カルシウム過渡応答を記録し、そして次いで、バックグラウンドを差し引いたベースライン蛍光に��して規準化したバックグラウンド減算蛍光強度変化として定量化した。分析のため、データをＦｅｌｉｘ３２（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）ソフトウェアに入力した。
【００６０】
ｉ）尿収集および細胞増大
尿収集の前に、適切な容器（５００ｍｌまで）を滅菌した。尿の中間流のみを無菌容器内に収集した。標本の一般的な体積は１５０〜２００ｍＬであった。次いで、尿試料を組織培養フード内で、５０ｍＬ試験管に移し、そしてこれらの試験管を室温で４００ｇ、１０分間、遠心分離した。組織培養フード内で、上清を注意深く廃棄し、試験管中におよそ１ｍＬまたはそれ未満の尿を残した。ペレットを個々に再懸濁し、そして１つの試料収集から得た５０ｍＬ試験管すべてを、単一の５０ｍＬ試験管内にプールした。アンホテリシンＢおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する、ほぼ１０ｍＬのＰＢＳを添加した。試料を４００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ほぼ０．２ｍＬの試料のみを残した。ほぼ１ｍＬの一次培地を添加して、細胞ペレットを再懸濁した。一次培地のレシピは、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ  Ｆ１２  １：１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットＣＣ−４１２７  ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）、アンホテリシンＢ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有した。１ｍＬの一次培地中のＬ−ゼラチンでコーティングした１２ウェルプレート上に、該細胞を移した。最初の２日間は、数１００ｍＬの一次培地を添加して、抗生物質濃度を保持し、そして栄養レベルを維持した。翌日、培地を、Ｓｉｎｇｌｅ  ＱｕｏｔキットＣＣ−４１２７  ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）を含有するＲＥＢＭ（腎上皮基礎培地、Ｌｏｎｚａ）培地（２つの組み合わせを尿細胞培地と称する）に、注意深く交換し、尿細胞によって分泌される因子が存在することを可能にし、そして不要なストレスを回避するため、処置を完全には実行しなかった。３〜６日後、可視の細胞／コロニーがルーチンに現れた。最初の完全培地交換は、最初の細胞／コロニーが見られた後に行った。培養が集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）まで成長したら、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．２５％トリプシンの補助で、細胞をより大きな表面上にスプリットした。この処置および他の処置は、広州生物医薬健康研究院（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ）の倫理委員会の承認を得た。ＲＰＴＥＣをＷｉｅｓｅｒら，  ２００８，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５，  Ｆ１３６５−１３７５によって記載されるように生成し、そして尿細胞培地中に維持した。Ｃｏｒｉｅｌｌ細胞リポジトリーより皮膚線維芽細胞を得て、そしてＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％（体積／体積）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で維持した。
【００６１】
一見して、尿細胞培養物は、主に、扁平細胞（尿道由来のものと同様）およびわずかな血液細胞（大部分、赤血球）からなるが、２〜３日後、これらの細胞は消滅し、そして迅速に成長する小さいコロニー（平均、試料あたり３つ）によって置き換えられた。これらのコロニーは、尿細胞単離に関する先の報告（Ｄｏｒｒｅｎｈａｕｓら，  Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２０００；  ７４，  ６１８−６２６）と一致して、２つの主な形態：１型または２型に対応した。１型細胞は、より丸い傾向があり、そして隣の細胞とごく近接して成長し、上皮表現型を連想させた。２型細胞は、穏やかにより伸長しており、そしてわずかにより分散して増殖する傾向があった。いくつかの試料収集において、すべてのコロニーは２つのタイプの１つに対応したが、他のものでは混合されていた。これらの細胞培養物が高密度に到達した際にプールし、そしてさらなる性質決定のため、または平行した再プログラミングのため、スプリットした。１型細胞が豊富なものは、免疫蛍光顕微鏡によって評価されるように、Ｅ−カドヘリンおよびベータカテニン（接着結合マーカー）、ならびにＺＯ−１（閉鎖体タンパク質１；密着結合マーカー）が陽性である、よく形成された細胞間結合を示した。これらはまた、上皮マーカーである中間径フィラメントケラチン７、および腎近位尿細管マーカーＣＤ１３に関して陽性であった。さらに、アクチンの分布は、ストレスファイバー中というよりも皮質性であった。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）もまた、Ｅ−カドヘリン、オクルディンおよびクローディン１（密着結合タンパク質）、ならびに腎近位尿細管溶質キャリアーファミリー２輸送体ＳＬＣ２Ａ１の分析によって立証されるように、主に上皮起源であることを支持した。腎近位上皮細胞（ＲＰＴＥＣ；  Ｗｉｅｓｅｒら，  ２００８；  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５，  Ｆ１３６５−１３７５）および皮膚線維芽細胞を、免疫蛍光およびｑＰＣＲの、それぞれ、陽性および陰性対照として用いた。２型細胞が豊富な培養は、かなり類似の免疫蛍光パターンを示したが、強度はより穏やかで、そして分布はより斑状であった；ｑＰＣＲの結果は同様に匹敵した。どちらの場合も、線維芽細胞様マーカー、フィブロネクチンおよびビメンチンに関して、染色はほとんど観察されなかった。
【００６２】
ｉｉ）ＵｉＰＳＣ生成および増大
中国人またはコーカソイドのいずれか起源の１２人の若い成人由来の試料を再プログラミングし、７人は男性に、そして５人は女性に相当した。第２〜３継代の尿細胞を、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびｃ−Ｍｙｃを生じるレトロウイルスで形質導入した（Ｃａｉら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １１２２７−１１２３４；  Ｅｓｔｅｂａｎら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，  ７１−７９）：ヒトＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ転写因子を産生するレトロウイルスプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）より購入した。ウイルス上清をトランスフェクション４８時間後から開始して２日連続で採取した。第２〜４継代の尿細胞をトリプシン処理し、そして６ウェルプレート上に植え付けた。ウェルあたり６０，０００細胞を添加した。ヒトＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−ＭｙｃのｃＤＮＡを含有するレトロウイルスｐＭＸベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクションする（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを用いる）ことによって生成したウイルス上清に、細胞を感染させた。２周期の感染を成功裡に行った（各１２時間）。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加して感染効率を増加させた。感染第２周期後（ＧＦＰ発現ベクターでの対照形質導入によって立証されるように、感染効率は１００％近かった）、形質導入細胞の組織培地を尿細胞培地に交換し、そして毎日取り替えた。第３日または第４日、細胞をトリプシン処理し、そしてその数を数えた。ルーチンに、５０，０００細胞を１０ｃｍ培養プレート中、そしてヒトＥＳＣ培地（Ｆ１２［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］＋２０％ＫＳＲ［ノックアウト血清代替剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］＋１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子＋非必須アミノ酸［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、Ｌ−グルタミン、およびベータ・メルカプトエタノール）を用いて、フィーダー層上に植え付け、培地を毎日取り替えた。第５日、培地をヒトＥＳＣ培地＋１ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ；Ｓｉｇｍａ）または半ＥＳＣ培地＋半ｄＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ高グルコース［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］＋２０％ヒト限定ウシ胎児血清［ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ］＋ＶＰＡからなる）に交換した。ＶＰＡは、第５日〜第１２日までのみ維持した。培地をｍＴｅｓＲ１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）に交換し、そして実験最終日まで毎日取り替えた。第１６日から、十分に大きく、そしてヒトＥＳＣ様と同定可能である（はっきりした境界線があり、そして顕著な仁を含有する大きな核を持つ、平らな形態である）これらのコロニーを、機械的に摘み取り、そしてフィーダー上でヒトＥＳＣ培地中、またはＭａｔｒｉｇｅｌ上のｍＴｅｓＲ１培地上で増大させることも可能である。
【００６３】
ｉｉｉ）ＵｉＰＳＣ性質決定
Ｃａｉら，  ２０１０；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  １１２２７−１１２３４；  Ｅｓｔｅｂａｎら，  ２０１０；  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，  ７１−７９に記載されるように、ＡＰ染色、導入遺伝子組込み、核型決定、および重硫酸配列決定を行った。
【００６４】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ遺伝子分析装置（ＡＢＩ３０３１、ＡＢＩ）を用いて、ＳＴＲ分析を行った。ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、そしてＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国ペーズリー）を用いて総ＲＮＡを抽出した。サーマルサイクラーＤｉｃｅ  ＴＭリアルタイム系（ＡＢＩ７３００、ＡＢＩ、米国カリフォルニア州フォスター）およびＳＹＢＲグリーンプレミックスＥＸ  ＴａｑＴＭ（タカラ、日本・滋賀）を用いて、ｑＰＣＲを行った；規準化にベータアクチンを用い、そしてすべての項目を３つ組で測定した。ＩｌｌｕｍｉｎａのヒトＨＴ−１２  Ｖ４．０発現Ｂｅａｄｃｈｉｐを、製造者の使用説明書にしたがって用いて、ＤＮＡマイクロアレイを行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐ読み取り装置を用いて、チップをスキャンし、そしてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏアプリケーションを用いて、データを分析した。奇形腫に関しては、免疫低下ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右後肢に、２ｘ１０６  ＵｉＰＳＣを皮下または筋内注射した。８〜１０週後、腫瘍を切除し、固定し、そしてパラフィン中に包埋し、切片作製し、そしてヘマトキシリン／エオジンで染色した。ＥＢ分化に関しては、フィーダー上のｉＰＳＣをディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、そして掻き取ることによって収集した。遠心分離後、細胞ペレットを、ｂＦＧＦを含まないヒトＥＳＣ培地中に再懸濁し、そして非接着性プレート中で８日間増殖させた。次いで、ＥＢをゼラチン・コーティング・プレートに移し、免疫蛍光分析のためにプロセシングする前に、さらに８時間分化させた。
【００６５】
初代培養および生じたＵｉＰＳＣの性質決定によって、小さいコロニーが第９日〜第１６日にルーチンに出現し、これは、認識可能なパターンを伴わずに、ドナー間で多様であることが示された。これらのコロニーの多くは、進行性に、ヒトＥＳＣ様形態を採用し、そしてこれらを第１６日〜第２５日の間に摘み取った。再プログラミング効率もまた、ドナー間で多様であったが、一般的に、かなり高く、０．１％〜４％の間で振動した。ＵｉＰＳＣはまた、６５歳の男性個体からも産生され、再プログラミング効率はより低かった（０．０１％）が、なお、末梢血細胞に関して報告されるものよりも有意に高かった。さらに、形質導入前に、何人かのドナー由来の尿細胞を凍結および融解することが可能であり、そしてこれは再プログラミング効率を損なわなかった。尿細胞はまた、効率の重大でない低下はあったものの、より後の継代でも感染可能であった。
【００６６】
コロニー増大後、アルカリホスファターゼ染色（ＡＰ）を含む標準法によって、ＵｉＰＳＣを性質決定し、そしてこれは全コロニーの暗い染色によって視覚化される、強いＡＰ染色を伴う明らかに陽性の細胞コロニーを示した。これらのコロニーはさらに、ＥＳマーカー、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に関する間接的免疫蛍光染色において陽性に染色された。さらに、内因性ＥＳＣ遺伝子に関するｑＰＣＲに加えて、これらの導入遺伝子のサイレンシングを観察した。ＤＮＡマイクロアレイによって、包括的な遺伝子発現がＨ９  ＥＳＣに近いことが示され、これはＵｉＰＳＣのものに対してプロットされたＥＳ細胞のマイクロアレイの恣意的な蛍光単位が、４５°の角度の直線傾斜を示すためである。ドナー尿細胞およびＵｉＰＳＣの単一タンデムリピート分析（ＳＴＲ）によって、すべての場合で起源がマッチしていることが示された。状況がこうしたものであれば、後者は、可能性が低い混入および性的パートナー由来の細胞の再プログラミングを排除する。
【００６７】
コロニー増大後、ＵｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ染色を含む標準的な方法によって性質決定され、そして全コロニーの暗い染色によって視覚化される強いＡＰ染色を伴う明らかに陽性の細胞コロニーを示す一方、非トランスフェクション細胞は、アルカリホスファターゼに関するいかなる染色も示さなかった。これらは、ゲノムＤＮＡ内への導入遺伝子組込み後、正常核型を示し、そしてさらに、ＥＳマーカー、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に関する間接的免疫蛍光染色において陽性に染色された。さらに、内因性ＥＳＣ遺伝子に関するｑＰＣＲに加えて、これらの導入遺伝子のサイレンシングを観察した（以下の表に示す；ｈＴＥＲＴは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を示す）。値はドナー尿細胞を指す；Ｈ９  ＥＳＣを対照として用いた。ＤＮＡマイクロアレイによって、包括的な遺伝子発現がＨ９  ＥＳＣに近いことが示され、これはＵｉＰＳＣのものに対してプロットされたＥＳ細胞のマイクロアレイの恣意的な蛍光単位が、４５°の角度の直線傾斜を示すためである。重硫酸配列決定によって、同じドナーの２つの代表的なＵｉＰＳＣクローンにおいて、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ近位プロモーターにおける大規模な脱メチル化が示された。ドナー尿細胞およびＵｉＰＳＣの単一タンデムリピート分析（ＳＴＲ）によって、起源がマッチしていることが示され、そしてＤＮＡマイクロアレイによって、包括的な遺伝子発現プロファイルがＨ９  ＥＳＣに近いことが示された。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
ｉｖ）ＵｉＰＳＣの多分化潜在能力を提供する
ＵｉＰＳＣが多能性であることを立証するため、奇形腫（図１）を通じた非特異的分化および胚様体（ＥＢ）形成を行った。どちらの場合でも、三胚葉からの派生物の出現が観察され、そして奇形腫は、壊死または腫瘍被膜浸潤の明らかな徴候を伴わず、かなり複雑な構造を含有した（図１）。次いで、神経系譜（神経幹細胞、ニューロンおよび星状細胞）（図２Ａ）、心筋細胞（図２Ｂ）および肝細胞（図２Ｂ）への方向性ＵｉＰＳＣ分化；過ヨウ素酸シッフ染色を用いたグリコーゲン集積の検出を行い、これを適切なマーカーに関する免疫蛍光顕微鏡、およびまたｑＰＣＲ（肝細胞および心筋細胞のみ）によって検証した。注目すべきことに、１１人のドナーに対応する１２のＵｉＰＳＣで神経分化が生じ、３人のドナーの４クローンで肝細胞が生じ、そして１１人のドナーの１４クローンで心筋細胞が生じた。ビデオは、高い比率の自発的拍動ＥＢ（３０〜７５％）を示した。同様に、活動電位の電気生理学的測定（図２Ｄ）およびカルシウム過渡応答が見られた（２つのクローンの心筋細胞の電気生理学的特性は、ヒトＥＳＣまたは線維芽細胞由来ｉＰＳＣから生じる心筋細胞と類似の振る舞いを示した）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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