(57)【要約】本発明は、閾値を有し、かつチクソトロピー性である、せん断減粘性α-ラクトアルブミンハイドロゲル、その製造方法及びその使用に関する。【選択図】なし
2014512179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程:
a)  60mMより少ないか等しいイオン強度を有する酸性水溶液中でα-ラクトアルブミンを懸濁させる;前記懸濁は本質的には:
(a1)  合計:(g/lで表現される数値Ca-La)+10により定義されるmMで表現されるプロトンの濃度を有する酸性水溶液を用意し;
(a2)  前記酸性水溶液中にα-ラクトアルブミンを懸濁させ;及び
(a3)  必要に応じて、1.5と2.5との間の値にpHを調整することであり;
b)  工程a)の終わりに得られた前記α-ラクトアルブミン懸濁液からゲルを形成する;前記ゲルの形成が以下の条件下:
-  60℃より下の温度で;
-  37と1000の間のレイノルズ数によって規定された強さの撹拌で;
-  10時間から1週間(168時間)の間、及び
-  前記α-ラクトアルブミン懸濁液から水の蒸発なし
で行う、
ことを含むα-ラクトアルブミンの水性懸濁液から5と60mg/mlとの間のCa-La濃度でα-ラクトアルブミンハイドロゲルを製造する方法。
【請求項２】
前記レイノルズ数が300と500との間である請求項1の方法。
【請求項３】
前記温度が35と55℃の間である請求項1又は2の方法。
【請求項４】
pHが1.8と2.2の間である請求項1〜3のいずれか1つの方法。
【請求項５】
工程a)の終わりに得られたα-ラクトアルブミンがろ過される請求項1〜4のいずれか１つの方法。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1つの方法により得られうる降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲル。
【請求項７】
5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量、1.5と2.5との間のpH、及び60mMより少ないか等しいイオン強度を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲル。
【請求項８】
食品テクスチャード剤としての5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルの使用。
【請求項９】
5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルを含む食品生産物。
【請求項１０】
傷の処置及び/又は治療用の5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲル。
【請求項１１】
5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルを少なくとも1つ、及び任意に、治療剤又は抗菌剤のような活性化合物を少なくとも1つ含むドレッシング。
【請求項１２】
化粧組成物製造用の5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルの使用。
【請求項１３】
5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルを少なくとも1つ含む化粧組成物。
【請求項１４】
塗料製造用の5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルの使用。
【請求項１５】
5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する、降伏点を有し、かつチクソトロピー性であるα-ラクトアルブミンせん断減粘性化ハイドロゲルを少なくとも1つ含む塗料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミルクインダストリの副生物:α-ラクトアルブミンを使用する有用な性質を有するハイドロゲルの製造方法、結果として得られるハイドロゲル、及び特にバイオマテリアルを製造するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明に関連して得られたハイドロゲルは、特定のレオロジー（流動学的）特性を有し、その特性は、ある用途でそれらを有用にし、事実、それらは、十分な応力(stress)下で、液状となるまで破壊(destructured)され、次いで一旦放置すると再形成(restructured)し得るチクソトロピー性ゲルである。
ハイドロゲルを製造するために使用されるプロテインは、α-ラクトアルブミン(以下でa-Laと示す)、特にウシ類由来のa-Laである。このミルクプロテインは、特にホエー中により存在する。それゆえ、ミルクプロテインは、チーズがミルク“カード(curds)”(カゼイン(caseins)が沈殿し及びホエーが除去されたもの)から得られるため、チーズ産業で大量に入手し得る天然プロテインであるという有用性を有する。
【０００３】
ゲルは、適切な溶媒の存在下で、化学的又は物理的相互作用を介して自己集合(self-assembles)し、ネットワークとして組織化されるようになる分子から構成される。ゲルの形成を生じる特定のプロセスは、物理化学的性質及びゲルの成分の相互作用に依存する。溶媒が水の場合、用語ハイドロゲルが使用される。
ハイドロゲルは、水に当初可溶であるが、架橋後不溶になるポリマー鎖のネットワークである。ハイドロゲルは、高吸収性天然又は合成ポリマーである(それらは99％以上の水を含み得る)。また、それらは、高含水量であるため、天然組織とかなり類似した範囲の柔軟性を有する。それらの物理特性、透過性及び生体適合性は、それを分子輸送及び再生医学を含む医学用途に使用されるバイオマテリアルとしての優れた候補物とし得る。ハイドロゲルは、横結合性に依存して、２つのカテゴリーに分けられる:共有結合で架橋する一般的な方法から得られる化学ゲル及び巨大分子(macromolecule)(例えば、炭水化物又はプロテイン巨大分子)の自己集合から得られ、分子の絡み合い(entanglements)及び/又は弱い結合(疎水性結合、イオン結合、水素結合及びファンデルワールス力)により互いに保持されたネットワークを構成する物理ゲル;これら物理ゲルの分子相互作用は、温度、pH、イオン強度、光又は更にある生物学的分子のような環境変化により分離させ得る。よって、ゲル化は、1以上のこれら刺激に対して可逆的である。
【０００４】
ミルクプロテインからのハイドロゲルの製造は、すでに知られている。ミルクプロテインは、それらの構造的及び物理化学的な性質、例えばイオン及び小分子を結合する能力のような性質、又は自己集合化及びゲル化の性質によって生活性分子用の天然媒体である。ミルクプロテイン(カゼイン又はホエープロテイン)に基づく多くの量の材料は、既に種々の工業で使用されていたが、これらプロテインの多くの研究が継続されており、かつ新規で革新的なナノ体、例えば、他の天然バイオポリマーと組み合わせたミルクプロテインから得られた可食性で生分解性の食品膜(Chen 1995; Le Tien, Vachon et al. 2001);デリバリーシステムとして特に開発されたカゼイン又は他のミルクプロテインのコアセルベート又はナノベシクル(Audic, Chaufer et al. 2003; Semo, Kesselman et al. 2007; Livney 2010);又は他のミルプロテインゲル、を開発することを目的としている。
ミルクプロテインゲルの中で、まずカゼインのゲルを挙げることができる。このゲルは、種々の条件下で得ることができる:酸性度pH4.6通して;レンネット(rennet)（この活性成分はキモシン(chymosin)であり、ミセルの凝集を導くたんぱく質分解を行いかつプロバイオテック(probiotic)バクテリアのカプセル化のために使用される酵素である）の作用を通して(Heidebach, Forst et al. 2009a);トランスグルタミナーゼ（プロテインの重合に寄与するある種のアミノ酸(特にグルタミン酸及びリジン)を架橋しかつプロバイオテック細胞のマイクロカプセル化にも使用される酵素）の作用を通して(Heidebach, Forst et al. 2009b);腸内での分子の制御された輸送(酸性pH(胃)でのハイドロゲルの縮小及び中性pHでの膨潤そして活性成分の放出(腸))用のゲニピン(genipin)（天然プロテイン-架橋剤）(Song, Zhang et al. 2009)を通して、得られ得る。
【０００５】
加温することによりホエープロテインのゲル化を誘因することも知られた技法である(Paulsson, Hegg et al. 1986)。他のハイドロゲルのように、ホエープロテインから形成されるゲルは、pH-感応性でありかつ分子の標的輸送に使用し得る膨潤挙動を示す (Gunasekaran, Ko et al. 2007)。β-ラクトグロブリンゲルは、熱誘因性でもあり、広く研究されており、かつTEM(走査型電子顕微鏡)、WAXS (広角X-線散乱)及びFTIR(フーリエ変換赤外分光)のような種々の技術を用いて特徴付けられる(Kavanagh, Clark et al. 2000)。プロテインの変性は、特に遊離チオールを有し、それゆえジスルフィド架橋に変換し得るβ-ラクトグロブリン(b-Lg)と、牛血清アルブミン(BSA)、それらの間の疎水相互作用を導き得る:例えば、BSAナノスフェアが磁気粒子及び/又は光増感剤を使用して生産され、がんの治療に使用可能である(Rodrigues, Simioni et al. 2009)。冷却ゲル化法が最近開発され、分子輸送用に潜在的に有用であるゲルが得られている。これらゲルの利点は、ホエーの熱処理後であるが、後続の塩の添加又はpHを下げることにより誘因されるゲル化の前に、熱感受性生活性剤を添加し得ることにある。
【０００６】
多くの流体測定が、β-ラクトグロブリンゲル単体(Gosal, Clark et al. 2004b)又はα-ラクトアルブミンとの混合物として行われている(Kavanagh, Clark et al. 2000)。それらは、ゲルの物理特徴に影響する因子、pH及びイオン強度を測定することを可能にする(Loveday, Rao et al. 2009)。高温(80℃)に長期間晒すことにより誘因されたβ-ラクトグロブリン(b-Lg)ゲルは、２段階で形成され、部分的に分解したβ-ラクトグロブリンのポリペプチド類から本質的に構成されるように見える(Akkermans, Venema et al. 2008; Oboroceanu, Wang et al. 2010)。b-Lgゲルは、特に水/アルコール混合物中でプロテインを溶解することによっても得られる。これらゲルのレオロジー学的及び構造的特徴は異なっている(Gosal, Clark et al. 2004a; Gosal, Clark et al. 2004c; Loveday, Rao et al. 2009)。
【０００７】
ホエープロテインから得られる他の種の公知のゲルは、α-ラクトアルブミンナノチューブから形成される(Ipsen, Otte et al. 2001)。これらナノチューブは、ある条件(最少プロテイン濃度及びプロテイン/カルシウム比)下でのα-ラクトアルブミンフラグメントの自己集合により形成される(Graveland-Bikker, Ipsen et al. 2004; Ipsen and Otte 2007)。これらファイバーの特殊性は、それらがカルシウムの存在下でのみ、バチルス-リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)から抽出された特定のセリンプロテアーゼにより制御されたたんぱく質分解に予め付されたプロテインを用いて得られることである(Ipsen and Otte 2007)。
【０００８】
高温(80℃)で誘因された無傷の(intact)α-ラクトアルブミンからのゲルの形成は、β-ラクトグロブリンのゲル化に対するα-ラクトアルブミンの影響を特に研究している２つの文献において、中性pHで示されている(Hines and Foegeding 1993; Kavanagh, Clark et al. 2000)。特にKavanagh等のチームは、b-Lgとa-La間の種々の濃度比での及びプロテインのみ(コントロールを構成)での80℃のゲル化をモニターしている。a-Laのみに対応するコントロールは、pH7で、b-Lgのみで観察されるより遅い10倍のゲル時間である。これらa-Laゲルは、研究者に注目されず、よって、構造的及びレオロジーの観点から特徴付けられていない。Kavanagh等により記載された条件により製造されたa-Laゲルは、出願人により製造され(実施例3参照);出願人により開発されたハイドロゲルとは異なる巨視的な特徴を示し;硬く、弾性及び不可逆性である(応力を付与しても形状が変化しない)。
【０００９】
最後に、C. Blanchetによる論文("Repliement des proteines et formation de fibres amyloides. Le cas de l'α- lactalbumine"["プロテイン折り畳み構造及びアミロイドファイバーの形成。α-ラクトアルブミンの場合"]、06/23/2008に保護)は、40℃、pH2、種々の塩濃度(0〜150mMのNaCl)でα-ラクトアルブミンの懸濁液を製造する方法を記載しているが;これら方法はゲルを製造する特定の目的で行われていないが、α-ラクトアルブミンの挙動を特徴付けている。
しかし、150mMのNaClで得られたゲルが特徴付けられた:それらはせん断減粘性化挙動を有する;記載されたそのようなゲルがチクソトロピー性挙動を示しうることがこの論文で示唆されておらず、及びそのような挙動がこの文献から推論できない。
【００１０】
出願人は、この論文に記載されたとおりにα-ラクトアルブミンハイドロゲルを製造するプロセスを再現し、得られたゲルがチクソトロピー性でないことを実験的に確認できている(以下の実施例4参照)。
せん断減粘性化(又は擬塑性)流体は、それに付与されるせん断応力又は歪み速度を増加させると、粘度が減少する流体である (実施例2の前文参照)。
せん断減粘性化流体は、必ずしもチクソトロピー性ではなく、これは例えばカーボポールゲルについて事実であることを明記すべきである(Piau 2007; Tokpavi, Jay et al. 2009)。
これら研究に関して、出願人は、降伏点を有しかつチクソトロピー性であるせん断減粘性化α-ラクトアルブミンハイドロゲルの開発を試みた。
一般的に認められているチクソトロピーの定義を下記する(Mewis 1979; Pignon, Magnin et al. 1998):十分長い期間の休止状態から開始して、一定のせん断速度が印加された時、その粘度が時間と共に減少し、その構造が変化するならば、その材料はチクソトロピー性と一般に称される。可逆的な様式で、せん断が阻害されると、粘度が再び上昇し、次いで、材料が徐々に静止状態で有する粘稠性(consistency)及び構造を回復する(図1)。
【００１１】
この特徴は、特に、食品(ミルク又は大豆プロティンゲル、WO2008/130252)、塗料又は化粧製品における多くの製品を塗り広げるためにかなり必要とされている。また、分子のターゲットデリバリーや組織再構築において、ハイドロゲルのその場(in situ)での非侵襲の注入法として、この特徴は、かなり有用でありうる。Nature Nanotechnologyで公表された文献は、例えば、PEG-シリカのチクソトロピー性ゲルが、3D細胞培養において、使用でき、かつ種々の利点を有していることを示している(Pek, Wan et al. 2008)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によるハイドロゲルは、最少応力がある歪(本発明に関して、0.1より大きく、好ましくは0.1と1との間の臨界歪γcで示される)を超えて材料が流動するように付与される必要があるため、降伏点を有するとされる。臨界歪は、ハイドロゲルが流動を開始するように、十分高い応力(降伏応力)が完全に静止したハイドロゲルに付与された場合に得られる;臨界歪は、貯蔵弾性率G'の曲線と損失弾性率G"の曲線との交差によって図で確認される(実施例2及び図6参照)。
【００１３】
より詳細には、本発明は、以下の工程:
a)  60mMより少ないか等しい、好ましくは50mMより少ないイオン強度、及びより好ましくは30mMの値を有する酸性水溶液中でα-ラクトアルブミンを懸濁させる;前記懸濁は本質的には:
(a1)  合計:(g/lで表現される数値Ca-La)+10により定義されるmMで表現されるプロトンの濃度を有する酸性水溶液を用意し;
(a2)  前記酸性水溶液中にα-ラクトアルブミンを懸濁させ;及び
(a3)  必要に応じて、1.5と2.5との間、好ましくは1.8と2.2との間の値にpHを、より好ましくは2.0のpHに調整することであり;
b)  工程a)の終わりに得られた前記α-ラクトアルブミン懸濁液からゲルを形成する;前記ゲルの形成が以下の条件下:
-  60℃より下、好ましくは35と55℃の間の温度で;
-  37と1000の間、好ましくは300と500との間のレイノルズ数によって規定された強さの撹拌で;
-  10時間から1週間(168時間)、特に48と96時間の間、及び
-  前記α-ラクトアルブミン懸濁液から水の蒸発なし
で行う、
ことを含むα-ラクトアルブミンの水性懸濁液から5と60mg/mlとの間のCa-La濃度でα-ラクトアルブミンハイドロゲルを製造する方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
水性α-ラクトアルブミン懸濁液は、次の内容での溶液とも規定できる。
驚くべきことに、a-Laハイドロゲルを製造するために使用された水溶液のイオン強度が低い又はゼロにもかかわらず、出願人は、それでもチクソトロピー性ハイドロゲルを得ることが可能であり、このハイドロゲルが経時的に十分な安定性を示していることに気付いた;事実、出願人は、低イオン強度であるハイドロゲルが、高イオン強度(>60mM)で得られたもの(これは経時的に粘稠になる)より、経時的に安定であることを観測している。更に、極低塩量であるハイドロゲルの製造は、例えば、食品テキスチャード加工(texturing)剤としての用途で有用である。
α-ラクトアルブミンは、14kDaの小球状金属プロテインであり、4つのジスルフィド橋を有し、リゾチームと構造的に相同であり、機能的構造にカルシウムの存在を必要とする。それはヒトホエーにおいて最も豊富なプロテインであり、牛ホエーb-Lgに次いで豊富なプロテインである。それは、正確な条件下で、特定の部分的に折り畳まれた(folded)状態:溶融乳球(molten globule、MG)状態を取ることができるため、フォールディング(folding)研究におけるモデルプロテインの1つである(Permyakov and Berliner 2000)。
【００１５】
a-Laは、アレルゲン性が最も小さいミルクプロテインであり(Restani, Ballabio et al. 2009)、他のミルクプロテインの存在下で消化酵素への一定の耐性があるにもかかわらず、a-Laに対する種々のプロテアーゼの作用により放出されるペプチドが広く研究されている。
ホエー中でa-Laを富化する又はa-Laを精製する多くの方法;膜ろ過;カラムクロマトグラフィ(IEX, SEC, HIC);膜ろ過と組み合わせた、カゼイン又はb-Lgを分解する酵素加水分解、あるいはa-Laを沈殿させるために熱処理と組み合わせた等電沈殿が、工業的スケールで使用されている(Kamau, Cheison et al. 2010)。
【００１６】
本発明による方法は、いかなるα-ラクトアルブミンでも行い得、1つの特定の実施の形態によれば、その方法は、牛、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダ、馬等のミルクを起源とするチーズ工業から得られるα-ラクトアルブミンを含む。
本発明による方法の実行に関して、使用されるα-ラクトアルブミン源は、少なくとも85％、有利には少なくとも90％の純度を有することが好ましい。α-ラクトアルブミンが豊富で、少なくとも45重量％のα-ラクトアルブミン量を有するホエーで本発明による方法を行うことも可能である。
望ましくは、工程a)の終わりに得られたα-ラクトアルブミン懸濁液はろ過される。このろ過は、カットオフ閾値を有するフィルターを用いて行うことができ、そのフィルターは、20kDaより小さいか等しい分子量を有する物質、例えばa-Laプロテイン、を通過し得るが、微生物及び他の汚染物質を保持し;使用されるものは0.5μmより小さいか等しいカットオフ閾値のフィルター、例えば市販の0.22μmフィルター製でありうる。
【００１７】
ゲルを形成する工程b)の実施は、全α-ラクトアルブミン懸濁液について均一温度で行われる。
工程b）の間に行われるα-ラクトアルブミン懸濁液の撹拌も撹拌容器にわたって均一であることが必要である。
容器及び攪拌機の幾何学的形状及び大きさとは独立して、弱いがゼロではない撹拌強度を特徴づけるために、出願人は、本発明による方法を行うのに適しているレイノルド数の数値範囲を決定し;よって、レイノルド数は37と1000との間であることが必要であり、300と500との間であることが好ましい。レイノルド数を測定するためのモードは、以下の実施例1で詳説する。
【００１８】
例として、方法を実験室スケール(1mlと100mlとの間のα-ラクトアルブミン懸濁液体積)で行う場合、撹拌は、回転板を使用して、又はそれ以外に磁気棒と共に使用して行い得、磁気棒は容器の直径の70％と90％との間の長さであり;この場合、撹拌速度は、10と300との間の毎分回転数(rpm)である。
a-Laゲルは、MG形態に好適であり、それゆえプロテインのフィブリル化に好適である酸性pHで形成される。pH値は、例えば、pH3では可能でないので、ゲルの形成に極めて重要である(Kavanagh, Clark et al. 2000)。
本発明による方法の工程(a1)の実施の間に、ハイドロゲルの形成に要求される酸性pHを得ることを可能にするプロテインの量が、強酸、例えばHClで得ることができる。
a-Laを懸濁させる工程(a2)の前に工程(a1)による酸性化を行うことが必須である。
【００１９】
本発明によるハイドロゲルの製造に使用され、0と60mMとの間であるイオン強度は、例えば、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等のようなアルカリ又はアルカリ土類金属のハロゲン化物;アルカリ又はアルカリ土類金属の炭酸塩、又はそれらの混合物；例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムのようなリン酸塩、あるいは例えば、硫酸ナトリウムや硫酸マグネシウム等のような硫酸塩から選択される塩の添加により得られる。
水性a-La溶液の塩濃度は、所望のイオン強度に応じて当業者により普通に測定される。
【００２０】
本発明による方法を行う１つの具体的な変形例によれば、塩の添加なしに行われる。
以下の実施例2は、本発明の方法により得られたa-Laハイドロゲルのレオロジー特性を示している。
また、本発明は、本発明の方法により得られるα-ラクトアルブミンハイドロゲルに関する。
それらは、より具体的に、5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン量;1.5と2.5との間のpH、好ましくは1.8と2.2との間のpH、より好ましくは2.0のpH;60mMより少ないか等しいイオン強度、好ましくは50mMより少ないか等しい、及びより好ましくは30mMの値を有するハイドロゲルである。
【００２１】
これらハイドロゲルは、降伏点を有するせん断減粘性化流体の挙動(0.1と1との間の臨界歪が付与された場合、流れが生じる)を有することにより特徴付けられ、チクソトロピー性であり;これらハイドロゲルの粘度は、それに付与されるせん断応力又は歪速度が増加するならば減少し;加えて、これらハイドロゲルは、せん断(液化)の影響下で破壊され、せん断が停止されたなら再形成(固化)されるようになる。
ミルクやホエーのような天然源から製造されるので、本発明によるα-ラクトアルブミンハイドロゲルは、持続可能な開発の範囲内に入る。製品は、天然物であり、それゆえ生分解性、生体適合性、非毒性であり、及びGARS(generally recognized as safe)であると見なされる。更に、製造プロセスは、溶媒や架橋剤を使用しないので、グリーンケミストリープロセス、即ち環境を保全するマイルドケミストリーと相性がよい。
【００２２】
ホエープロテイン、及び特にα-ラクトアルブミンは、注目すべき特性:
-  それらの物理化学的性質は知られている:構造、安定性、溶解性、金属との親和性、疎水性等;
-  プロテインの自己集合が、ナノテクノロジーの基礎の1つである、ファイバーの形態で生じる;
-  それらは高い栄養価値を有する;
-  それらは、それの蛋白質分解に由来するペプチドを使用することで特に観察された種々の生物学的効果を示す
を有する(Madureira, Pereira et al. 2007)。
【００２３】
更に、工業的スケールでのこれらプロテインの使用は:
-  それらの原料、ホエーは安価である;
-  工業的スケールでホエープロテインを精製する方法は既に知られている;
-  利用できる量が多い:まず、ホエーに含まれるa-La量のため(牛ホエー中1g/lより多い)及び、第2に、チーズ産業の副産物であり、活用すべき物質であるので、入手可能なホエーの量のため
の理由で好適である。
【００２４】
ホエーは、チーズ製造者及びカゼイン生産者からの主な廃棄物である。ホエー中の主プロテインは、β-ラクトグロブリン(b-Lg)、α-ラクトアルブミン(a-La)、イムノグロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)及びラクトフェリン(Lf)である。
世界中で入手可能なホエーの量はかなり多い。フランスでは、150億リットルのホエーが、ウシのチーズ生産により年毎に生じている。回収法の欠如により、家畜により自己消費されなかったホエーは、川に廃棄され又は野原に撒き散らされ、自然環境に有害な影響:水路、湖と地下水の汚染、及び臭気汚染、を与えている。この汚染は、主に、ホエーの有機物(ラクトース及び窒素性物質)の発酵及び許容閾値以下への水の溶存酸素量の減少による。事実、この廃棄物の化学的酸素要求量及び生物学的酸素要求量(COD及びBOD)が高く(50〜70g/lのCOD)、それは深刻な汚染物質を形作る。ホエーの回収及び再生を目的とした経済的に許容可能な装置の設置は、現在、この環境ダメージを低下させるために必要とされている。
【００２５】
a-Laの高い栄養、機能性及び生物学的な値が、食品、医薬及び化粧品分野で興味を持たれていることは当然である。本発明によるa-Laハイドロゲルの用途は、当然ながら、ハイドロゲルの形態、例えば、スピンコーティングし、次いでゲルを乾燥することによる膜の形態、又はゲルの押出やエレクトロスピニングによるスレッドの形態、であると考え得る。
出願人は、5と60mg/lとの間のα-ラクトアルブミン含量を有し、酸性のpH、即ち1.5と2.5との間、好ましくは1.8と2.2との間、より好ましくは2.0のpHで製造されるa-Laハイドロゲルが、どのようなイオン強度でも、せん断減粘性であり、降伏点を有し、かつチクソトロッピクであることを実証している。
これらハイドロゲルは、その製造の終わりに酸性のpHを有している場合でも、ハイドロゲルを提供することを望む用途に適合させ、同時にそれらのレオロジー性を保持するためにpHを増加させることが可能である。
【００２６】
それゆえ、他の主題によって、本発明は、5と60mg/lとの間のα-ラクトアルブミン含量を有し、酸性のpHで製造されるが、そのpHを後にレオロジー性が有用であると実証されている用途のために増加させ得るチクソトロピー性ハイドロゲルに関する。
可食性製品から構成されるので、a-Laハイドロゲルは、食品製造業の分野で特に多くの用途を見い出されている。
【００２７】
それゆえ、本発明は、5と60mg/lとの間のα-ラクトアルブミン含量を有するチクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルを含む食品(製品)及び、当該α-ラクトアルブミンハイドロゲルの食品テキスチャード加工剤としての用途に関する。1つの特定の実施の形態によれば、そのゲルのイオン強度は0と60mMとの間、好ましくは50mMより小さいイオン強度であり、及び有利には30mMの値を有する。
【００２８】
食品生産物の望まれる粘稠性に応じて、食品生産物の全重量に対して、チクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルを0.5％と98％との間で含ませ得る。
上で要約したα-ラクトアルブミンの性質により、本発明のハイドロゲルは、バイオマテリアルの製造に特に適している。用語"バイオマテリアル(biomaterials)"は、生体の種々の組織、器官又は体液と、診断、予防又は治療目的で、一時的又は恒久的に接触することを意図する材料を意味することを意図し、;バイオマテリアルは、生体に移植されることも意図した材料を含む。
【００２９】
それゆえ、本発明は、傷の治療及び/又は治療のために使用される生産物としての用途のための、5と60mg/lとの間のα-ラクトアルブミン含量を有するチクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルに関し;特にこれらのハイドロゲルは、0と60mg/mlとの間のイオン強度を有する。事実、α-ラクトアルブミンハイドロゲルは、ドレッシングの製造用に一般的に考慮された基準:生体適合性及び細胞毒性の不在;湿潤環境を維持するための傷の乾燥の防止;ほこり及びバクテリアに対する保護;ガス交換の維持;傷への適用容易性及び回復後の除去容易性、を満たす。
【００３０】
加えて、それらの有効性を改善するために、ハイドロゲルは、例えば、特定の活性分子(例えば:EGF)や抗微生物性化合物をデリバリーして上皮形成を促進することにより、皮膚の回復を促進し得る化合物のような1以上の活性化合物をも含み得る。
それゆえ、本発明は、5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する少なくとも1つのチクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルで構成されたドレッシングに関し;1つの特定の変形によれば、これらのハイドロゲルは、0と60mg/mlとの間、好ましくは50mMより小さいイオン強度であり、及び有利には30mMの値を有する。任意に、ドレッシングは、少なくとも1つの活性化合物、例えば治療剤や抗微生物剤、を含む。
【００３１】
1つの変形によれば、本発明によるドレッシングは、空気透過性で、液体及び微生物の不透過性である外側の膜を含み;膜は、例えばポリウレタンから構成し得る。
他の主題によれば、本発明は、5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有する少なくとも1つのチクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルを含む化粧品組成物、及び特にスキンケアを意図する組成物での皮膚保湿剤(ゲル、クリーム、ローション等)や界面活性剤(洗浄製品、シャンプー等)のような化粧品組成物を製造するための少なくとも1つのチクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルの使用に関し;1つの特定の変形によれば、これらのハイドロゲルは、0と60mg/mlとの間、好ましくは50mMより小さいイオン強度であり、及び有利には30mMの値を有する。
【００３２】
最後に、それらのチクソトロピー性挙動のため、5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有するハイドロゲルは、塗料、特に工業用塗料、を製造するために有利に使用される。事実、ハイドロゲルは、輸送及び貯蔵の間、これら塗料を固体状態のままにすることが可能であり、望ましくない流出を避けることが可能であり、一方、同時に、使用時に容易に延展する。加えて、ハイドロゲルは、通常は連続撹拌タンク中で使用される工業塗料の安定性及び保存性の改善を可能にする。加えて、使用するときにのみ撹拌を行うことにより、それらは省エネを可能にする。
【００３３】
それゆえ、本発明は、更に、塗料、特に工業塗料、を製造するための、5と60mg/mlとの間のα-ラクトアルブミン含量を有するチクソトロピー性α-ラクトアルブミンハイドロゲルの使用、及びそのようなハイドロゲルを含む塗料に関し;1つの特定の変形によれば、これらのハイドロゲルは、0と60mMとの間、好ましくは50mMより小さいイオン強度であり、及び有利には30mMの値を有する。
上記の構成に加えて、本発明は、本発明の例示的な実施の形態及び添付の図に言及する下記されている記述から明らかになる他の構成も含む:
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図1は、一定のせん断速度がそれに付与された時、粘度が経時的に減少し、せん断が中止されたならば再び可逆的に増加するチクソトロピー性流体の挙動を表している。
【図２】図2は、調和せん断応力(harmonic shear)での小さな歪で、20mg/mlにおけるa-Laと30mMのNaClとのハイドロゲルの、15℃で、経時での、破壊と再形成のモニタリングを表している。弾性率G'(中実円)及び粘性率G"(開口円)での変化を、時間と付与された歪(十字)の関数として、モニタリングするための種々の手順が、適用されており;個々の工程で付与された応力が、以下の実施例2で詳説されている。
【図３】図3は、せん断速度10s-1での大歪破壊(large strain destructuring)後、20mg/mlにおけるa-Laと30mMのNaClとのハイドロゲルの、15℃で、経時での、再形成のモニタリングを表し;弾性率G'は中実円として、粘性率G"は開口円として表されている。
【図４】図4は、せん断速度10s-1での大歪破壊後、20mg/mlにおけるa-Laと30mMのNaClとのハイドロゲルの、15℃で、経時での、再形成のモニタリング(工程6)の末期、歪振幅を増加させることで調和せん断破壊する工程7、及び最後に粘稠性での小歪回復をモニタリングする工程8を図示している。
【図５】図5は、せん断速度10s-1での大歪破壊後、20mg/mlにおけるa-Laと30mMのNaClとのハイドロゲルの、15℃で、経時での、再形成の動態(工程6)(弾性率G'は中実円として、粘性率G"は開口円として表されている)と、(工程8)歪振幅を増加させることで調和せん断応力での小歪で破壊した後(弾性率G'は中実円として、粘性率G"は開口円として表されている)の動態との比較を図示している。
【図６】図6は、20mg/mlにおけるa-Laと30mMのNaClとのハイドロゲルの、15℃で、経時での、歪振幅を増加させることで調和せん断応力での破壊のモニタリングを表している:ゾル-ゲル転移が現れ始めるおよそ0.2を超える臨界歪γcの同定 (工程7)。
【図７】図7は、調和せん断応力での小歪におけるa-Laのハイドロゲルの、15℃で、経時での、破壊と再形成のモニタリングを表している;20mg/ml - 0mMのNaCl。
【図８】図8は、調和せん断応力での小歪におけるa-Laのハイドロゲルの、15℃で、経時での、破壊と再形成のモニタリングを表している;20mg/ml - 60mMのNaCl。
【図９】図9は、調和せん断応力での小歪におけるa-Laのゲルの、15℃で、経時での、破壊と再形成のモニタリングを表している;40mg/ml - 60mMのNaCl。
【図１０】図10は、NaClのイオン強度とa-Laの濃度の関数としての粘弾性率G'とG"のレベルの比較である:a-Laの20mg/mlにおけるハイドロゲルの率G'は中実円盤により表され、a-Laの20mg/mlにおけるハイドロゲルの率G"は中空円盤により表され、a-Laの40mg/mlにおけるハイドロゲルの率G'は中実三角により表され、a-Laの40mg/mlにおけるハイドロゲルの率G''は中空三角により表される。レベルを、低再形成動態(kinetics)ゾーンに相当する工程3の同じ500sの再形成時間で比較した。
【図１１】図11は、a-Laの濃度とNaClのイオン強度の関数としての臨界歪γcのレベルを比較したグラフである(20mg/ml濃度におけるa-Laとしての開口円盤、40mg/ml濃度におけるa-Laとしての中実円盤)。個々の条件で、破壊現象が再現可能であり、物理化学的修正及び何らかの変性を付与することなく、種々のせん断応力の付与された系で高い許容性を実証している。
【図１２】図12は、調和せん断応力での小歪で、20mg/mlにおけるa-Laと0mMのNaClとの２つのハイドロゲル(１つ目は精製a-Laから製造し、２つ目は45％a-Laリッチであるホエーから製造される)の、15℃で、経時での、破壊と再形成のモニタリングを表している。弾性率G'(精製a-Laから製造したハイドロゲル用の中実円; 45％a-Laリッチのホエーから製造したハイドロゲル用の中実三角)と、粘性率G"(精製a-Laから製造したハイドロゲル用の開口円;45％a-Laリッチのホエーから製造したハイドロゲル用の開口三角)の変化を時間及び応力(十字)の関数としてモニタリングするための種々の手順が適用され;工程1から3の間に付与された応力が以下の実施例2で詳説されている。
【図１３】図13は、一方が、C. Blanchet (B)の論文の手順により製造されたハイドロゲルを、２つ目が、発明(A)によるハイドロゲルを含むエッペンドルフ管の２つのイメージである。左のイメージは、それらが製造された後(両方が管の円錐端に存在する)のこれら２つのハイドロゲルを示す;右のイメージは撹拌後のこれら２つのハイドロゲルを示す;本発明によるハイドロゲル(A)はエッペンドルフ管の底部に存在し、ハイドロゲル(B)は頂部(円錐端)に残存している。
【実施例】
【００３５】
実施例１-本発明による方法を行うための撹拌強度のレイノルド数の値の範囲の測定
レイノルド数は撹拌強度を表す;撹拌反応器中、それは
【００３６】
【数１】
2014512179.tif 000003
【００３７】
に等しい:
-  ρは混合流体の密度Kg.m-3である、
-  Vは磁気棒の回転速度(m/s)である、
-  μは混合流体の粘度(Pa.s)である、及び
-  dは撹拌具のサイズ(例えば、磁気棒のケースの長さ)(m)である。
【００３８】
磁気棒の回転速度Nは、0〜300rpmの範囲については、撹拌機により付与される速度により規定される。
速度V(m/s)と回転速度N(rpm)との間の関係は次に示される:
【００３９】
【数２】
2014512179.tif 000004
【００４０】
即ち、レイノルド数:
【００４１】
【数３】
2014512179.tif 000005
【００４２】
を評価できる。
混合流体(アルファ-ラクトアルブミン粉末+水性懸濁液)は、アルファ-ラクトアルブミン粉末の濃度が、水に添加された時、懸濁液の粘度を大きく変化させないほど十分低いので、水とかなり近い粘度を有し:結果として、懸濁液の初期混合の間、撹拌された懸濁液の粘度及び密度は水と等しい値、即ちρ = 1000K/μ3、μ = 10-3Pa.sを取るであろう。
使用した磁気棒のサイズは、長さd = 6×10-3mである。
下の表は、アルファ-ラクトアルブミンの懸濁液からチクソトロピー性ゲルを得るために推奨される混合物の好適なレイノルド数の値の例をまとめている。
【００４３】
【表１】
2014512179.tif 000006
【００４４】
実施例２ - 本発明によるα-ラクトアルブミンハイドロゲルの製造
2.1. - 精製a-Laから製造されたハイドロゲル
精製プロテイン"牛乳タイプIIIからのα-ラクトアルブミン、カルシウム減損(depleted)≧85%"(シグマによりカタログリファレンスL6010として販売されており、凍結乾燥されている)は、NaClを任意に含むHClの水溶液に再懸濁させる。
HCl濃度はa-Laの最終濃度に依存する。それは望むa-Laの濃度の数値に10を加えることによりmMとして計算される。
例えば、それが40mg/mlのa-Laを有することを望む場合、それを再懸濁させるためのHCl濃度は40 + 10 = 50mMとなる。
【００４５】
まず、HCl溶液を所定濃度で調整し、0と60mMの間でNaClを追加することが必要である。次に、a-Laの要求量を秤量することが必要である。この量は、プロテインの最終濃度及び製造されるゲルの体積に依存する。使用するa-La濃度は5〜60mg/mlの範囲である。
プロテインは規定された体積のHCl溶液に溶解され、そしてpHが2、3(few)のマイクロリットルの1M HClにより2.0±0.1に調整される。溶液は、磁気棒を使用する磁気撹拌に付され、37〜45℃の範囲とし得る温度で一晩保温される。翌日、即ち約16時間後、ゲルが形成されている。
2.2.45%濃縮a-Laを有するホエーから製造されたハイドロゲル
先の手順が、カンパニーアーマープロティンズ(company Armor Proteines)により供給された、45重量%濃縮a-Laを有する乳清を使用して、再実施される。
【００４６】
実施例3 - レオロジーによるa-Laハイドロゲルの粘弾性特性の測定
レオロジーの概念
レオロジーは、物体の流れ又は歪を、それらに加えられる応力の影響下で、研究する物理学の一分野であり、これら応力の付与速度又はより一般的に経時でのそれらの変動を考慮されている
高濃度α-ラクトアルブミンで、アミロイド繊維の形成は、溶液の粘度の増加を伴う。繊維が形成されたなら、それらは相互作用してゲルを形成する。この粘度の増加は、レオメトリーによりモニターされている。レオメトリーに配置されたサンプルは、付与されたせん断速度
【００４７】
【数４】
2014512179.tif 000007
【００４８】
に依存する所定の応力(τ)を付与されるであろう。応力τはせん断速度
【００４９】
【数５】
2014512179.tif 000008
【００５０】
と共に変化し、２つの値の比は検討された流体の粘度(η)を規定することを可能にする。τが
【００５１】
【数６】
2014512179.tif 000009
【００５２】
と比例している場合、ηが一定であり、流体がニュートン流体である一方、τが
【００５３】
【数７】
2014512179.tif 000010
【００５４】
と比例していない場合、流体は非ニュートン流体であり、種々の性質:
-  τと
【００５５】
【数８】
2014512179.tif 000011
【００５６】
が増加したときに粘度ηが減少するならば、流体はせん断減粘性化流体である;
-  逆に、τと
【００５７】
【数９】
2014512179.tif 000012
【００５８】
が増加したときに粘度ηが増加するならば、流体はせん断高粘性化(thickening)流体である
を有し得る。
【００５９】
チクソトロピー性流体は、せん断減粘性であり、粘度は、材料の構造破壊により、経時で同じ応力下で減少する。これら流体は、応力が停止した場合、材料が、再形成され、その初期の粘弾性特性が回復するので、可逆性である。
材料の粘弾性特性は、フックの法則による動粘度係数を測定することにより得られる:
【００６０】
【数１０】
2014512179.tif 000013
【００６１】
(式中、Gは２成分G'及びG"を有し、これらは材料の粘性又は弾性を定量化することを助ける。G'は貯蔵(弾性)係数であり、G"は損失(粘性)係数である。弾性性質が優勢である場合、G' >> G"、逆に、粘性性質が優勢である場合、G' << G"である)。
【００６２】
ゲルの流体測定による挙動
3.1.流体測定
a-Laゲルのせん断流下での挙動の特徴付けは、ロータリーレオメトリーにより行われた。測定は、応用-トルクロータリーレオメーター(ARG2、TAインスツルメンツ、78ギュアンコート(Guyancourt)、フランス)を使用して行われた。使用されたジオメトリは、チタン製円錐-プレートジオメトリである(角度4°、直径20mm、切稜(truncation)113μm)。測定の間のサンプルの蒸発を防ぐために、サンプル周辺の雰囲気を水で飽和させた。調和せん断での測定のために、予備的研究は、歪及び最適周波数のレベルを規定することを可能にし、測定は線形状態の範囲の部分である。この範囲内で、印加された調和せん断応力は、懸濁液のレオロジー挙動を変化させず、かつそれらを乱すことなくゲルの粘弾性係数を単に調査する。0.1Hzの周波数は、加えた歪及び試料の再形成時間に関わらず線形状態の部分であるとして規定された。従って、調和せん断時の全ての測定は、この0.1Hzの周波数で行われる。再形成のモニタリング時に、0.01の歪γもまた、G'及びG"の測定を妨げないように規定され、試料の再形成をモニタリングするために系統的に使用される。
【００６３】
3.2.せん断下でのゲルの破壊-再形成の時間的モニタリング
3.2.1.小歪での挙動
調和せん断による粘稠性モニタリング手順は、与えられた濃度及びイオン強度条件下で、種々のサンプルについて設定し、系統的に使用した。
図２は、以下の表Iに記載された歪振幅条件による、a-Laゲル(20mg/mlのa-La - 30mMのNaCl)の調和せん断の遷移を示す:
【００６４】
【表２】
2014512179.tif 000014
【００６５】
一定の歪振幅での工程1、3及び5の間、その再形成に対応するゲルの粘稠性の回復を証明し得る。
工程2及び4の間、歪振幅の緩やかな増加により、先のせん断によりもたらされるゲルの破壊をモニターすることが可能にする。歪振幅の増加時に、弾性係数G'と粘性係数G"は、それを超えるとレベルが大きく落ちる臨界歪(cまで規則的に減少し、ゲルの破壊と弾性挙動から粘性挙動への変化(G'がG"より小さくなる)を証明する。
工程3及び5の開始時での粘稠性の回復は、経時のG'とG"の増加により特徴付けられ、ゲルのチクソトロピー性挙動を明確に証明する。再形成の間、約300sである粘稠性の強い回復と共に再形成される短い時間Tr1、続いてその間にG'とG"の増加がより遅い動態(kinetics)に続くより長い時間Tr2があることを指摘し得る。
同様の観察が、上記最初の３つの工程をa-Laの45重量%濃縮ホエーから製造されたハイドロゲルに適用する時に、なされ、それゆえ、得られたゲルがそれ自体でもチクソトロピー性である。
【００６６】
3.2.2.大歪での挙動
より大きな振幅の歪でのチクソトロピー性挙動を証明するために、大きな歪の単純(simple)せん断を付与し、続いて、経時のゲルの粘稠性の回復をモニターするために、小さい歪の調和せん断を付与した。到達する破壊のレベル及び再形成動態に対するせん断速度の効果を証明するために、種々の大きな歪せん断速度を付与した。
【００６７】
【表３】
2014512179.tif 000015
【００６８】
図3には、10s-1のせん断速度で300s間大きな歪のせん断後の粘稠性の回復が示されている(工程6)。経時で、弾性と粘性係数が大きく増大する第1期間Tr1、その間の再形成動態がかなりゆっくりである第2期間Tr2があることを再び指摘し得る。
1000min(16hを超える)にわたる再形成の長いモニタリングに続いて、歪振幅が増加することで周波せん断の破壊手順が再度適用され(工程7)(図4参照)、小歪で粘稠性の回復が続いた(工程8)(図4参照)。
【００６９】
図5は、大きな歪単純せん断(工程6)後又は歪振幅が増加することでの周波せん断(工程8)後のいずれかの粘稠性の2つの回復の比較を示している。結果は、適用されたこれら2つの破壊モードにより異なる再形成動態を証明している。増加する大きな歪単純せん断後に、歪動態は、増加する振幅の小歪調和せん断の間より、かなり遅い。実際、大きな歪せん断は、小さい歪せん断の間に得られるより高いレベルで試料を破壊させるために調整される。この結果は、再度、試料においてそのせん断の間に達成される破壊のレベルに対する応力の種類及びその強度の重要性を証明しており、チクソトロピー性系の挙動の指標である。
図6に表わされていることは、歪振幅の増加時の調和せん断での破壊の工程(工程7)の間に測定される歪の関数としての粘弾性係数の変化である。それを超えると、ゲルが流動を開始する臨界歪γcは、G'とG"との交差点により示され、約0.2であることが証明されている。
【００７０】
3.3.a-Laゲルのチクソトロピー性挙動におけるイオン強度の効果
a-Laゲルの再形成-破壊の動態及び達成された粘稠性のレベルのNaClイオン強度の関数としての差を評価するために、表Iに表されているものと同一の手順が、a-Laの種々の懸濁液で行われている。結果は、図7〜9で得られる。
【００７１】
図10に表わされたことは、NaClイオン強度及びa-La濃度の関数としての粘弾性係数G'とG"との変化である。レベルは、低速再形成動態領域、即ち再形成の間に達した"横ばい(plateau)"、に対応する工程3の破壊時間である同じ500sで比較した。イオン強度が増加した場合、ゲルの粘稠性の減少に対応する、G'とG"のレベルが低下したことが証明されている。a-La濃度の増加は、粘弾性係数の増加を導く。
【００７２】
図11は、種々の試料に印加された破壊の比較を示し;これら結果は、イオン強度が増加する場合やプロテイン濃度が減少する場合、臨界歪がより高いレベルに移ることを証明している。一つの及び同じ試料の続く破壊は、同じオーダーの規模の臨界歪を示し(図で表されていない)、続く破壊-再形成作用を受けることに関するかなり良好な安定した系であり、またG'とG"測定の再現性により経時でかなり良好な安定性であることが証明されている。
【００７３】
実施例4 - C. Blanchetの論文に記載された条件によるα-ラクトアルブミンハイドロゲルの製造
この試験の目的は、C. Blanchet等により記載された手順により得られるa-La懸濁液を再現し、そのレオロジー性質を特徴付けることである。
実験は、論文の203頁に記載された条件下かつ手順により行われ:a-Laプロテイン(30mMのNaClと共に10mg/ml)は懸濁液中に入れ、この懸濁液のpHは2に調整され、懸濁液はエッペンドルフ管に入れ;管を40℃で撹拌する(撹拌条件は本発明によるハイドロゲルを製造するためのものが使用される)。
【００７４】
並行して、30mMのNaClと10mg/mlのa-Laを含むハイドロゲルが、本発明による方法により製造される。
図13の左側のイメージは、得られたハイドロゲルの外観を表している(文献による(B)と本発明による(A)):ハイドロゲル(B)はハイドロゲル(A)より低い均質外観を有する。
これら2つのハイドロゲルは、それらが撹拌された場合、同じ挙動を有していないことも観察されており:図13の右のイメージが撹拌後のこれら2つのハイドロゲルを示している。そのチクソトロピー性挙動のために、本発明によるハイドロゲル(A)の粘度が、撹拌の間に低下し、ゲルがエッペンドルフ管の底部で流動し;逆に、撹拌は、ハイドロゲル(B)に何らかの流れを引き起こすことはなく、ゲルはエッペンドルフ管の頂部(円錐端)に残存していた。
【００７５】
実施例5 - pH7及び80℃でのα-ラクトアルブミンハイドロゲルの製造
この試験の目的は、Kavanagh, G.M., A.H. Clark, et al. (2000) "Heat-induced gelation of beta-lactoglobulin/alpha-lactalbumin blends at pH 3 and pH 7." Macromolecules 33(19): 7029-7037に記載されたハイドロゲルを再現すること、そしてそのレオロジー性質を特徴づけることである。
【００７６】
文献に記載された条件
a-La濃度15%(w/w)、即ち150mg/ml
T℃ = 80℃
溶媒 = 脱イオン水
pH = 7.0
ゲルは80℃で1〜2h後に観察される。
【００７７】
実行条件
a-La濃度15%(w/w)、即ち150mg/ml
T℃ = 80℃1h
溶媒 = 脱イオン水
pH = 7.2
a-La濃度は、Nanodrop(商標)ND-1000 分光光度計(LabTech)を使用し、溶液の280nmの吸収を測定することにより確認し:測定は、5倍にそれぞれ希釈されたプロテインの3溶液:A1 = 61;A2 = 62;A3 = 61で行われる。a-La濃度は、ビア-ランバート(Beer-Lambert)法A = ε C l (式中、ε= 27880L・mol-1・cm-1及びl = 1cm)により測定される。よって、a-La溶液のモル濃度Cは、10.9mMであり、154mg/mlの重量濃度に対応する(a-Laの分子量は14150g.mol-1である)。
【００７８】
製造されたa-La溶液は、200μlの2つの管に分けられる。1つの管は、撹拌せずに80℃で1h置き、他方の管は、対照として室温で保持される。
1時間より短い時間で、ハイドロゲルが80℃に置いた管内で形成された。得られたゲルは硬く、先端をゲル中に押し込むことができなかったが、ある程度の弾性を示している。管の形状を保ちつつモールドから除去することも可能である。このことは、本発明によるハイドロゲルでは事実ではなく、より柔らかい粘稠性を有している。
こうして得られたハイドロゲルは、より透明な外観を有し、本発明によるハイドロゲルは不透明である(それらは散乱光を透過しうるが、物体をこれらハイドロゲルを通して区別できない)。最後に、それを強く振ると、形状が変化せず、それは不可逆である。
よって、ここで製造されたハイドロゲルは、本発明の方法により製造されたチクソトロピー性ゲルの外観及び物理性質のいずれも有していない。
【００７９】
2014512179.tif 000016
【００８０】
2014512179.tif 000017
【図１】
2014512179.tif 000018
【図２】
2014512179.tif 000019
【図３】
2014512179.tif 000020
【図４】
2014512179.tif 000021
【図５】
2014512179.tif 000022
【図６】
2014512179.tif 000023
【図７】
2014512179.tif 000024
【図８】
2014512179.tif 000025
【図９】
2014512179.tif 000026
【図１０】
2014512179.tif 000027
【図１１】
2014512179.tif 000028
【図１２】
2014512179.tif 000029
【図１３】
2014512179.tif 000030
【国際調査報告】
2014512179.tif 000031
2014512179.tif 000032
2014512179.tif 000033
2014512179.tif 000034
2014512179.tif 000035
2014512179.tif 000036
2014512179.tif 000037
2014512179.tif 000038