(57)【要約】  対象の心不整脈を処置または予防するための組成物及び方法が本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不整脈を発症する危険性があるとして特定されている対象の心不整脈を処置または予防する方法であって、
哺乳動物細胞外マトリックスを含む、治療有効量の生体分解性スポンジ組成物を前記対象に投与する工程を含み、
前記生体分解性スポンジ組成物が、心外膜組織及び心嚢組織の間に挟まれ且つ該心外膜組織及び心嚢組織に接触し、さらに、抗不整脈薬、抗炎症薬、高脂血症治療薬、細胞及びタンパク質のうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞が幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテインが、ヒアルロン酸、プロテオグリカン及びアミノグリカンのうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、小腸粘膜下層、膀胱粘膜下層、胃粘膜下層、肝臓粘膜下層及び肝臓基底膜から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞を培養して作り出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、さらに、合成細胞外マトリックスを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、真皮、筋膜、心嚢、実質組織及び心筋細胞外マトリックスから成る組織の群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、哺乳動物組織由来からのコラーゲン足場であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記心不整脈が、心房細動または心室細動であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、心臓手術を受けたことがあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、心筋梗塞になったことがあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／１５３，４０２号の利益を主張する、２０１０年２月１７日に出願された米国特許出願第１２／７０７，４２７号、２０１１年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９１，７２３号及び２０１２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６５０，９１１号の一部継続出願であり、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
心不整脈は、重大な健康問題を提示する。心不整脈には、心室頻拍、上室頻拍及び心房細動が含まれるが、これらに限定されない。これらの中で、心房細動が最も一般的な心不整脈である。米国単独で、１００万人を超える人々が心房細動を患っていると推定されている。心房細動の発生率は、心房細動が加齢とともにより一般的になる傾向があることから、米国及び欧州の人口の高齢化傾向に伴って、今後数十年にわたり増加することが予測される。
【０００３】
心臓手術後の不整脈が、罹患及び死亡の主な原因である。不整脈の忍容性は、術前期の同様の不整脈のものより、術後の方が少ない。血行動態の不安定性は、心筋機能障害による可能性が高い。心肺バイパス、術中の伝導系への損傷、代謝及び電解質の異常、特に低カリウム血症及び低マグネシウム血症が、術後の不整脈の発生の増加の一因となる。交感神経系の緊張亢進を伴う手術のストレス、及び強心療法の使用が、追加因子である。遅発性不整脈が、瘢痕に関連するリエントリーにより発生する場合がある。
【０００４】
心房細動は、正常洞調律を維持する、及び／または心室拍動数を減少させることを目的とする薬物を用いて治療することができる。具体的には、過去の多くの試みは、薬物療法、高周波アブレーション、埋め込み型装置の使用及び関連手法に限定されている。薬物療法がいくつかの不整脈事象を軽減するための一般的な投与法に留まる一方で、全身作用は、しばしば忍容性が低いことが認識されている。さらに、多くの薬物によって示される催不整脈性の傾向が、多くの状況で死亡率を増加させる場合があると考えられている。心不整脈を治療または予防するためのより有効な組成物及び方法が望まれる。
【０００５】
本発明は、概して、滅菌された無細胞の細胞外マトリックス組成物及び心不整脈の治療または予防に使用するためのそのような組成物を作製する方法に関する。特に本発明は、細胞外マトリックス組成物を同時に滅菌及び脱細胞化する方法、並びに、そのような方法により得られる、心不整脈を治療または予防するために、心臓手術を受けたり心筋梗塞を患ったりした対象に使用される滅菌された無細胞組成物に関する。
【０００６】
組織組成物を滅菌するための従来技術は、組織組成物の特質をしばしば変化させ、及び／または増殖因子等の組織組成物の重要な構成要素に損傷を与える。その結果、それら従来の滅菌技術は、組織組成物をそれらの意図された目的にしばしばそぐわなくさせる。例えば、エチレンオキシドは、毒性、変異原性及び発がん性の物質であり、組織組成物を弱らせ、組織組成物の増殖因子の含有量を減少させ、組織組成物内のタンパク質を変性させる場合がある。同様に、従来の蒸気滅菌技術は組織組成物のバイオポリマーに不適合であり、ガンマ線照射は組織組成物の完全性を著しく減少させる。組織組成物の特質を変化させることなく組織組成物を滅菌するための公知技術も存在するが、抗菌洗浄等のそれらの技術の多くは、組織組成物を完全に滅菌できないことがしばしばあり、及び／または組織組成物に残留毒性汚染物質をしばしば残す。
【０００７】
さらに、組織組成物が対象の体内に移植するために考案される場合、組織組成物は、別個の時間がかかる脱細胞化プロセスにしばしばさらされなければならない。この脱細胞化プロセスは、組織組成物から細胞を除くことを目的とし、それによって対象の免疫システムが移植された組織組成物を拒絶する、及び／または著しい炎症反応を引き起こす可能性を減少させることができる。しかしながら従来の脱細胞化技術は組織組成物の部分を脱細胞化するに過ぎず、脱細胞化プロセスの後に天然細胞が組織組成物に残る。
【０００８】
ＮｏｖａＳｔｅｒｉｌｉｓ社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（‘８３２号特許）は、超臨界二酸化炭素を使用することにより様々な材料を滅菌する方法を開示する。しかしながら他の公知の滅菌方法と同様、‘８３２号特許に開示されたプロセスにより滅菌される組織組成物も、上記のように、別個の脱細胞化プロセスにさらされなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、細胞外マトリックス組成物等の組織組成物を滅菌及び脱細胞化する方法が当技術分野において必要である。より具体的に、（ａ）組織組成物の天然の特質を維持しながら組織組成物を滅菌し、（ｂ）組織組成物が無細胞になるように組織組成物を脱細胞化する方法が当技術分野において必要である。またさらに、心不整脈を治療又予防する目的上、組織組成物の滅菌及び／または脱細胞化中に、組織組成物へ添加物を組み込むことを強化する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的に従って、本明細書に具現化され広範に記載されるように、本発明は、対象における心不整脈を治療または予防するための組成物及び方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、心臓手術を受けたり心筋梗塞を起こしたりした対象の心不整脈を治療または予防するために用いる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を滅菌及び脱細胞化する方法に関する。一つの態様では、本方法は、選択されたＥＣＭ組織を採取し、選択されたＥＣＭ組織を凍結し、選択されたＥＣＭ組織を解凍し、ＥＣＭ材料を単離する工程を含む。単離されたＥＣＭ材料は、インキュベーション及びすすぎを施され、その後超臨界二酸化炭素内で処理され、続いて急速減圧に曝露される。ＥＣＭ材料の急速減圧中または急速減圧後、得られるＥＣＭ組成物に好ましい特性を与えるために、一つ以上の添加物がＥＣＭ材料に組み入れられる場合がある。急速減圧は、ＥＣＭ組成物内への１つ以上の添加物の組み込みを強化する。開示の方法により製造される滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物もまた開示される。
【００１２】
開示される方法及び組成物の更なる利点が、部分的に以下の記載において説明され、部分的に以下の詳細な説明から理解され、または、開示される方法及び組成物を実施することによって知られるであろう。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される要素及び組み合わせにより理解され実現されるであろう。前述の概略的な説明及び以下の詳細な説明は例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態のそれら及び他の特徴は、添付の図面を参照する発明の詳細な説明においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。図１は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物のＤＮＡ含有量を示す。
【図２】図２は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。図２は、生の処理されていないＳＩＳと比較した、滅菌後の各ＳＩＳ組成物から除去されたＤＮＡの割合を示す。
【図３】図３は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図３は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物のｂＦＧＦ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図４】図４は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図４は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物の活性ＴＧＦ-ベータ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図５】図５は、本明細書に記載のように、急速減圧中にｂＦＧＦがＳＩＳ組成物に組み込まれた実験の結果を示す。図５は急速減圧後の各ＳＩＳ組成物についてのｂＦＧＦ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図６】図６は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、二層のＳＩＳ組成物の引張強度が測定された実験の結果を示す。図６は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物について測定された引張強度を示す。
【図７】図７は、本明細書に記載の滅菌及び脱細胞化方法を含む様々な滅菌及び／または脱細胞化方法を受けて、ＳＩＳ組成物について天然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図７は、滅菌及び／または脱細胞化後の各ＳＩＳ組成物についてｂＦＧＦ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図８】図８は、様々な方法で処理された後のＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。その後組織は、ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために、超臨界ＣＯ２  、続いて急速な減圧（ＲＤＰ）に曝露された。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌またはエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図９】図９は、様々な方法で処理された後のＳＩＳからのＤＮＡの除去率を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。その後組織は、ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために、超臨界ＣＯ２  、続いて急速な減圧（ＲＤＰ）に曝露された。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌またはエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１０】図１０は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の活性形質転換増殖因子（ＴＧＦ-ベータ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）洗浄剤のみで処理したものである。その後組織は、ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために、超臨界ＣＯ２  、続いて急速な減圧（ＲＤＰ）に曝露された。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌またはエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１１】図１１は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）洗浄剤のみを用いて処理したものである。次に組織は、ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために、超臨界ＣＯ２  、その後急速な減圧（ＲＤＰ）に曝露された。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌またはエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図１２】図１２は、急速減圧によるＳＩＳへの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量の追加を示す。ベースライン測定は生または未処理のＳＩＳである。比較は、非滅菌またはエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲及びそれらの前後の記載を参照することによって、より速やかに理解されるであろう。しかしながら、本装置、システム及び／または方法が開示され記載される前に、別に特定されない限り、本発明は開示された特定の装置、システム及び／または方法に限定されるものではなく、従って勿論様々であり得ることが理解されるべきである。また、本明細書の用語は、具体的な態様を記載する目的でのみ使用され、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００１６】
開示される方法及び組成物のために使用され得るか、それらと併用して使用され得るか、それらの調製のために使用され得るか、またはそれらの産物である材料、組成物及び構成要素が開示される。これら及び他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互関係、群等が開示される際、これらの化合物の各様々な個別及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な言及が明白に開示されていない場合があるが、それぞれが、本明細書で具体的に企図され、説明されることが理解されよう。例えば、ペプチドが開示及び説明され、そのペプチドを含むいくつかの分子に行うことができるいくつかの修飾が説明される場合、ペプチドのあらゆる組み合わせ及び順列、並びに可能である修飾が、特にその逆が示されない限り、特に企図される。よって、分子Ａ、Ｂ及びＣのクラスが、分子Ｄ、Ｅ及びＦのクラスと同様に開示され、分子Ａ−Ｄの組み合わせの例が開示される場合、それぞれが個々に列挙されていないとしても、それぞれが個々及び集合的に企図される。よって、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆのそれぞれが、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；並びに例示的組み合わせＡ−Ｄの開示から、特に企図され、また開示されていると見なされるべきである。同様に、これらのいずれのサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図及び開示される。よって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅの小群は、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；並びに例示的組み合わせＡ−Ｄの開示から具体的に企図され、開示されていると見なされるべきである。この概念は、開示される組成物を作製及び使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用する。よって、実施され得る様々な付加的ステップがある場合、これらの付加的ステップのそれぞれが、開示される方法のいずれの特定の実施形態または実施形態の組み合わせとともに実施されてもよく、そのような組み合わせのそれぞれが、具体的に企図され、開示されていると見なされるべきである。
【００１７】
当業者は、本明細書に説明される、方法及び組成物の特定の実施形態との多くの均等物を認識するか、または単なる日常の実験を使用して確認し得る。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
【００１８】
開示される方法及び組成物は、説明される具体的な方法論、プロトコル及び試薬は変化し得るため、これらに限定されないということが理解されよう。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を説明する目的であるに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限するためのものではないということも理解されよう。
【００１９】
Ａ．定義
別途画定されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的な用語は、開示される方法及び組成物が属する技術分野の当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと同様または均等であるいずれの方法及び材料も、本方法及び組成物の実施または試験において使用され得るが、特に有益な方法、装置及び材料は、説明されるとおりである。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明白に定めない限り、複数形の指示対象を含むということに留意しなければならない。よって、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、複数のそのような化合物を含み、「化合物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、１つ以上の化合物及び当業者に既知のその均等物を指す等である。
【００２１】
本明細書で使用される用語「または」は、具体的な一覧の任意の一つの要素を意味し、また、その一覧の要素のいずれかの組み合わせを含む。
【００２２】
「任意の」または「任意で」は、続いて説明される事象、状況または材料が、発生または存在してもしなくてもよいことを意味し、その説明は、事象、状況または材料が、発生または存在する事例及び発生または存在しない事例を含む。
【００２３】
範囲は、本明細書で、「約」１つの特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までと表現され得る。そのような範囲が表現される際、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用して、値が概算として表現される際、特定の値は、別の実施形態を形成するということが理解されよう。各範囲の端点は他の端点に関連しており、及び他の端点とは独立している、という両方の点において有意であるということがさらに理解されよう。いくつかの値が本明細書に開示され、それぞれの値もまたそれ自体の値に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示される。例えば、値「１０」が開示される場合、ひいては「約１０」も開示される。当業者により適切に理解されるように、値が、その値「未満であるか、または等しい」、と開示される際、「その値より大きいか、または等しい」、及び値間の、可能性のある範囲もまた開示される、ということもまた理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、ひいては「１０未満または１０に等しい」、並びに「１０より大きいか、または１０に等しい」もまた開示される。出願の全体にわたって、データはいくつかの異なる形式で提供され、これらのデータは、端点及び始点、及びデータ点のいずれかの組み合わせの範囲を表す、ということも理解されよう。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０及び１５より大きい、それら以上である、それら未満である、それら以下である、またはそれらに等しい数、並びに１０と１５の間の数が開示されると考えられる、ということが理解されよう。２つの特定の構成単位間のそれぞれの構成単位もまた開示される、ということも理解されよう。例えば、１０及び１５が開示される場合、ひいては、１１、１２、１３及び１４もまた開示される。
【００２４】
本明細書の詳細な説明及び請求項の全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等のその単語の変化形は、「含むが、これらに限定されない」ということを意味し、例えば、他の添加物、構成要素、整数、またはステップを除外するためのものではない。
【００２５】
本出願の全体にわたって、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本出願が属する技術水準をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。また、開示された参照文献は、該参照文献が依拠する文中で説明されるそれらに含まれる材料について、個々に及び具体的に本明細書に組み込まれるものである。本明細書において、本発明が、先行発明を理由としてそのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものと何ら解釈されるべきではない。いずれの参照文献も先行技術を構成することを承認するものではない。参照文献の説明は、それらの著者が主張することを述べ、出願人は、引用文献の正確性及び適切性に挑戦する権利を留保する。
【００２６】
Ａ．方法
本明細書において、対象内の心不整脈を処置または予防する方法が開示される。方法は、哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、治療有効量の組成物を対象の心臓組織へ投与することを含み得る。
【００２７】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、天然由来に基づく。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織／臓器から直接的に抽出される。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、合成ＥＣＭをさらに含む。
【００２８】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、瘢痕形成を抑制する。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、損傷した組織の再生を促す。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、炎症を抑制する。
【００２９】
「処置」は、疾患、病状、または疾病を治癒、改善、安定、または予防するための患者の医学的管理を意味する。上記用語は、積極的治療、すなわち、疾患、病状、または疾病の改善に向けて具体的に行われる処置を含み、また原因療法、すなわち、関連する疾患、病状、または疾病の原因の除去に向けて行われる処置も含む。加えて、用語は、待機的療法、すなわち、疾患、病状、または疾病の治癒よりむしろ症状の軽減のために考案される処置、予防的療法、すなわち、関連する疾患、病状、または疾病の発症を最小限にするか、または部分的もしくは完全に抑制する処置、及び支持治療、すなわち、関連する疾患、病状、または疾病の改善に向けた別の特定の治療を補完するために用いられる処置を含む。
【００３０】
「予防する」または「予防すること」は、疾患または状態の頻度または重症度を軽減することを意味する。用語は、疾患または状態の絶対的な除外を必要としない。むしろ、用語は、疾患発生の機会を減少させることを含む。よって、哺乳動物ＥＣＭを含む治療上有効な量の組成物を、対象の心臓組織へ投与することを含む、対象内の心不整脈の発生及び／または重症度を軽減する方法が開示される。
【００３１】
用語「治療上有効な」は、疾患または疾病の１つ以上の原因、症状、または後遺症を改善するために十分な分量で使用される組成物の量を意味する。そのような改善は、軽減または変化のみを必要とし、必ずしも疾患または疾病の原因、症状、または後遺症の除去を必要としない。
【００３２】
本明細書で使用される、用語「心臓組織」は、心臓の心筋、心外膜、心内膜、及び心嚢（心膜）を含む。本明細書で使用されるその用語はまた、心臓へ流れ込むか、または心臓から流れ出る大血管を指す。本明細書で使用されるその用語はまた心臓に分布する迷走神経の部分を指す。
【００３３】
よって、いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を対象内の心臓へ投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を、対象の心筋へ投与することを含む。心筋は心室心筋であり得る。心筋は、心房心筋であり得る。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を対象の心外膜へ投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を対象の心内膜へ投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を対象の心嚢へ投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を対象の心外膜と心嚢との間のスペースに投与することを含む。
【００３４】
いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を対象の大血管へ投与することを含む。いくつかの態様において、血管は、対象の上大静脈、下大静脈、肺静脈、肺動脈、または大動脈である。例えば、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を１つ以上の大血管の外膜（外側部分）へ投与することを含み得る。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を心血行へ投与することを含む。よって、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を血管または心腔へ投与することを含む。
【００３５】
心臓の副交感神経支配は、迷走神経によって仲介される。右迷走神経は、洞房（ＳＡ）結節に分布する。副交感神経の過興奮は、これらの罹患部を徐脈性不整脈にかかりやすくする。左迷走神経は、過興奮した際、心臓を房室（ＡＶ）ブロックにかかりやすくする。よって、いくつかの態様において、方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を、心臓に分布する対象の迷走神経の一部に投与することを含む。
【００３６】
本明細書で使用される、用語「対象」は、投与の対象である、いずれかの個体を意味する。対象は、例えば、哺乳動物等の脊椎動物であり得る。よって、対象はヒトであり得る。用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、成体及び新生児の対象、並びに胎児は、男性か女性かに関わらず、網羅されることが意図される。患者は、疾患または疾病に苦しむ対象を指す。用語「患者」は、ヒト及び動物対象を含む。本明細書で使用される、用語「患者」及び「対象」は、交互に使用され得る。
【００３７】
いくつかの態様において、開示される方法の対象は、心不整脈を発症する危険性があるとして特定されている。いくつかの態様において、開示される方法の対象は、開心術を含むがこれに限定されない心臓手術を受けたことがある。いくつかの態様において、開示される方法の対象は、心臓切開処置を含むが、これらに限定されない、多数の組み合わせの心臓処置を受けたことがある。いくつかの態様において、開示される方法の対象は、心臓弁手術を受けたことがある。いくつかの態様において、開示される方法の対象は、少なくとも、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５歳である。いくつかの態様において、組成物は、心筋梗塞を起こしたことがある対象へ投与される。いくつかの態様において、開示される方法の対象は、肺気腫または慢性閉塞性肺疾患を有する。いくつかの態様において、開示される方法の対象は、不整脈の病歴を有する。
【００３８】
いくつかの態様において、開示される方法は、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）を含むパッチを心臓の心膜の開口部へ投与することを含まない。いくつかの態様において、開示される方法は、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）を含むパッチを心臓の心膜の開口部へ投与することから成らない。いくつかの態様において哺乳動物ＥＣＭは、ＳＩＳではない。よって、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、ＳＩＳから成らない。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、パッチではない。いくつかの態様において、開示される方法は、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物を心臓の心膜の開口部へパッチとして投与することを含まない。いくつかの態様において、開示される方法の心臓組織は、心嚢ではない。いくつかの態様において、開示される方法は、組成物を心嚢へ投与することを含まない。
【００３９】
しかしながら、他の態様において、開示される方法は、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）を含むパッチを心臓の心膜の開口部へ投与することを含む。開示される方法で使用される組成物は、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、細胞、及びスタチン薬物、副腎皮質ステロイド、抗不整脈薬、非ステロイド性抗炎症薬、他の抗炎症化合物等の薬剤、ナノ粒子及び金属化合物等の一つ以上の付加的な薬剤（すなわち、添加物）を含み得る。他の態様において、開示される方法は、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）を含むパッチを心臓の心膜の開口部に投与することを含むが、本方法は、付加的なステップをさらに含む。
【００４０】
また本明細書で、哺乳動物細胞外マトリックスを含み、抗不整脈薬、高脂血症治療薬、細胞、タンパク質、またはそれらの組み合わせをさらに含む、治療有効量の組成物を対象の心臓組織へ投与することを含む、対象内の心不整脈を処置または予防する方法が開示される。
【００４１】
１．心不整脈
心不整脈（律動不整としても言及される）は、心臓内に異常な電気活動を有する状態のいずれかの広範囲な異質な群に関する用語である。心拍（脈拍）は、速すぎたり、または遅すぎたり、規則的または不規則である場合がある。
【００４２】
いくつかの不整脈は、心停止及び突然死をもたらし得る、生命を脅かす医学的緊急事態である。その他は、心拍の異常認識（動悸）等の症状を引き起こし、煩わしいだけに過ぎない場合がある。また、いずれの症状も全く伴わなくても、潜在的に生命を脅かす可能性のある発作または塞栓を生じやすくする場合がある。
【００４３】
用語、洞性不整脈は、息を吸って吐くことに伴って発生する心拍の軽度の加速及び減速の正常現象を指す。これは通常、小児で非常に明白であり、年齢とともに着実に減る。これはまた、深く息を吸い込み、息を止める様式を伴う、瞑想呼吸運動中で提示され得る。
【００４４】
心拍のそれぞれは、洞性結節または洞房（ＳＡ）結節と呼ばれる、心臓の右房内の組織の小域からの電気刺激として始まる。刺激は、最初に両心房に収縮を引き起こし、次に、通常心房と心室間の唯一の電気的接続である、房室（またはＡＶ）結節または、主要なポンプ腔を活性化する。刺激は次に、心室心筋の同期収縮を引き起こしながら、ヒス・プルキンエ繊維を介して、両心室を通して広がる。
【００４５】
一分あたりの心拍が６０拍未満であれば除脈である。これは、洞性結節からの減速した信号（洞性除脈と称される）、洞性結節の正常活動の一時停止（洞停止と称される）、または心房から心室への途中の電気的刺激をブロックすること（ＡＶブロックまたは心臓ブロックと称される）によって、引き起こされ得る。心臓ブロックは、様々な度合い及び重症度がある。それは、ＡＶ結節の可逆性の毒作用（伝導を障害する薬物による）、または結節への不可逆性の損傷によって引き起こされ得る。
【００４６】
１分あたりの心拍が１００拍より速ければ、頻脈である。頻脈は、動悸をもたらし得る。しかしながら、頻脈は必ずしも不整脈というわけではない。心拍の増加は、身体運動または情動ストレスに対する一般的な反応である。これは、洞性結節への交感神経系の影響によって仲介され、洞性頻脈と呼ばれる。心臓内の交感神経系の活動を増加させる他の事物は、摂取または注入されるカフェインまたはアンフェタミン等の物質、及び甲状腺機能亢進（甲状腺機能亢進症）である。心拍は、交感神経興奮薬により増加され得る。
【００４７】
洞性頻脈ではない頻脈は、通常、自動能、リエントリー（興奮旋回）、または撃発活動の３つの機序のうちの１つによって開始され得る、異常刺激の付加に起因する。
【００４８】
自動能は、自然に刺激を放つ心筋細胞を指す。心臓内の全細胞は、活動電位を惹起する能力を有する。しかしながら、これらの細胞の内いくつかだけが、定期的に心拍を誘発するように作られている。これらの細胞は心臓の伝導系で見られ、ＳＡ結節、ＡＶ結節、ヒス束、及びプルキンエ繊維を含む。ＳＡ結節は、心臓の残りの部分よりも高い自動能を有する（より速いペースメーカー）、心房内の単一の特殊な箇所であり、故に、通常、心拍を整え、それぞれの心拍を惹起することに関与する。ＳＡ結節を待つことなく刺激を惹起するいずれかの心臓の部分は異所性始点と呼ばれ、定義により、病理学的現象である。これは、単一の期外収縮を時々引き起こすことがあり、あるいは、異所性始点がＳＡ結節より多い頻度で発火する場合、持続的な異常な調律を産生し得る。自動能を増加させる状態は、交感神経系の刺激及び低酸素症を含む。生じる心臓の調律は、最初の信号が開始される地点次第である。それがＳＡ結節である場合、調律は、速いが正常に留まり、異所性始点である場合、多くのタイプの不整脈が起こり得る。
【００４９】
リエントリー不整脈は、電気的刺激が、心臓の一端から他端へ移動後に停止するのではなく、心臓内の密接な回路を反回的に伝わる際に発生する。あらゆる心臓細胞は、あらゆる方向に刺激を伝えることが可能であるが、伝えることが可能であるのは、短時間に一度である。通常、活動電位の刺激は、迅速に心臓を通して広がるので、細胞のそれぞれが、１度だけ反応すればよい。しかしながら、いくつかの領域で伝導が異常に遅い場合、刺激の一部は、遅れて到着し、新しい刺激として扱われる可能性がある。タイミング次第で、これは持続的な異常回路の調律を産生し得る。リエントリー回路は、心房粗動、ほとんどの発作性上室頻拍、及び危険な心室頻拍に関与する。心腔全体が多数の極小のリエントリー回路に関わり、故に混乱した電気的に刺激に小刻みに震える際、細動中であると言われる。
【００５０】
細動は、一つまたは両方の心房（心房細動）、あるいは、一つまたは両方の心室（心室細動）に影響し得る。処置しないままにした場合、心室細動（ＶＦ、またはＶ‐ｆｉｂ）により数分以内に死に至る場合がある。
【００５１】
誘発される拍動は、個々の心臓細胞内のイオンチャネルのレベルでの問題が、電気的活動の異常伝搬をもたらし、持続的な異常調律へ導き得る際に、発生する。誘発される拍動は、比較的まれではあるが、抗不整脈薬の作用に起因し得る。
【００５２】
不整脈は速度（正常、頻脈、除脈）、または機序（自動能、リエントリー、細動）によって分類され得る。
【００５３】
由来の部位によって不整脈を分類することもまた適切である。例えば、心房の不整脈は、心房期外収縮（ＰＡＣ）、遊走性心房ペースメーカー、多源性心房頻拍、心房粗動、及び心房細動（Ａｆｉｂ）を含む。接合性不整脈は、上室頻拍（ＳＶＴ）、ＡＶ結節リエントリー性頻拍（発作性上室頻脈（ＰＳＶＴ）の最も一般的な原因）、接合性調律、接合性頻脈、及び房室結節性期外収縮を含む。房室不整脈は、ＡＶリエントリー性頻脈（ＡＶ結節以外の心房と心室間のどこかをリエントリー回路が横断する際に発生する）を含む。
【００５４】
心室の不整脈は、心室性期外収縮（ＰＶＣ）（心室期外収縮（ＶＥＢ）と呼ばれることもある）、促進型心室固有調律、単形性心室頻拍、多形性心室頻拍、及び心室細動を含む。
【００５５】
心臓ブロック（房室（ＡＶ）ブロックとしても知られ、除脈の最も一般的な原因）は、第１度心臓ブロック（体表面ＥＣＧのＰＲ間隔の長さが２００ｍｓｅｃより大きい）、第２度心臓ブロック（１型及び２型）、及び第３度心臓ブロック（完全心臓ブロックとしても知られる）を含む。
【００５６】
心不整脈は、しばしば聴診器を用いた心拍の聴診、または末梢脈拍に触れることによって最初に検出される。これらの方法は、通常特定の不整脈を診断することはできないが、心拍の一般的な兆候、及び規則的か不規則であるかを知らせ得る。心臓の電気的刺激の全てが、聞き取れる拍動または触診可能な拍動を形成するわけではなく、多くの心不整脈において、期外収縮または異常な拍動は、有効なポンプ作用を産生せず、「スキップ」拍動として経験される。
【００５７】
心リズムの判断のための最も単純な特定診断検査は、心電図である（ＥＧＧまたはＥＫＧと省略される）。ホルターモニターは、一日の全体を通して一時的及び予知不能に起こり得る不整脈を検出するために、２４時間にわたって記録されるＥＫＧである。
【００５８】
突発性不整脈死症候群（ＳＡＤＳ）は、不整脈によってもたらされる心停止による突然死を説明するために使用される用語である。しばしば、対象は、突然死する前に症状がない。米国での最も一般的な突然死の原因は、冠動脈疾患である。米国では約３００，０００人が、毎年この原因により突然死する。ＳＡＤＳは、例えば、若年が罹患する多くの遺伝性疾患及び心臓疾患によっても引き起こされ得る。
【００５９】
小児においては、例えば、ウイルス性心筋炎、ＱＴ延長症候群、ブルガダ症候群、カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍、及び肥大型心筋症、並びに不整脈源性右室異形成症は、ＳＡＤＳを引き起こし得る。
【００６０】
いくつかの態様において、心不整脈は、心房細動または心室細動である。
【００６１】
１．投与
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、シート、プラグ、積層品、織物、重合体マトリックス、複数のより糸、スポンジ、または１つ以上の細長い切れ等のような形態のパッチである。本明細書で使用される、「スポンジ」は、ＥＣＭの繊維を含む弾力性、吸収性、多孔性組成物である場合がある。一つの態様では、繊維は交絡する場合がある。スポンジは、心臓組織に1つ以上の開示される追加の薬剤（すなわち、添加物）を送達するために使用され得る。よって、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、心臓手術中に、対象の心臓組織に直接接触して設置される。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心臓の心膜の開口部へ投与される。いくつかの態様において、組成物は心膜の開口部に重なる。よって、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心臓手術中または心臓手術後に、心嚢の外科的開口部へ投与され得る。別の態様において、哺乳動物ＥＣＭは、例えば、大動脈、肺動脈、肺静脈、上大静脈、及び下大静脈等の大血管のような心内構造物に接触して設置され得る。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭ組成物、例えば、スポンジは、心外膜及び心膜の内壁の間に挟まれ、それらに接触し得る。
【００６２】
哺乳動物ＥＣＭは、シート、プラグ、積層品、織物、重合体マトリックス、複数のより糸、スポンジ、または１つ以上の細長い切れ等の固形形態であって、組成物は、当該技術分野で入手可能な標準の手段を用いて心臓組織に付着され得る。例えば、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、縫合や、フィブリン接着剤、ステープル等の生体接着物等により心臓組織に付着され得る。
【００６３】
開示される化合物及び哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、いずれかの好適な様式で投与され得る。例えば、組成物は、非経口（例えば、筋肉内注射）、局所的等で投与され得る。よって、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、注入可能である。開示される組成物は、普通の手段を使用して、心臓組織内へ注入され得る。例えば、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、注射器または心臓もしくは冠動脈カテーテルを介して、心臓組織へ送達され得る。心臓カテーテル法（ｈｅａｒｔ ｃａｔｈ）は、心臓の心腔または血管へのカテーテルの挿入である。これは、診断及び／または介入（インターベンション）目的の双方のためになされ得る。冠動脈カテーテル法は、冠動脈のカテーテル法を使用する、本技術のサブセットである。
【００６４】
よって、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心臓の心筋内へ注入され得る。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心臓の心外膜へ注入され得る。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心臓の心内膜へ注入され得る。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心臓の心嚢へ注入され得る。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、例えば、心嚢と心外膜との間、心外膜と心筋との間、及び心筋と心内膜との間等の、心臓の層間へ注入され得る。
【００６５】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、対象の心房または心室中隔へ投与され得る。例えば、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心室中隔欠損へ投与され得る。心室中隔欠損（ＶＳＤ）は、心臓の左心室と右心室を分ける壁である、心室中隔の欠損である。心室中隔は、下の筋性部及び上の膜性部から成り、伝導性心筋細胞により広範囲に刺激される。房室結節に近接する膜性部は、最も一般的に、成人及び年長児が罹患する。先天性ＶＳＤは、総じて最も一般的な先天性心臓欠損である。
【００６６】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、心房中隔欠損（ＡＳＤ）へ投与され得る。ＡＳＤは先天性心臓欠損の形態であり、心房中隔を介して、左心房と右心房との間に血液が流れるようにさせる。心房中隔は、右心房と左心房を分ける組織である。中隔なしで、または中隔に欠損がある場合、血液は心臓の左側から心臓の右側へ、またはその逆の方向へ、移動することが可能である。双方向の心房間交通に関係なく、このことは動脈血及び静脈血の混合をもたらす。動脈血及び静脈血の混合は、臨床的に重大であっても、血行動態に影響を及ぼすまたは及ぼさない場合がある。この血液の混合は、「シャント（短絡）」として知られるものをもたらすか、もたらさない可能性がある。存在するシャント量は、いくらかでもあれば、血行動態へ影響することになる（下記の病態生理学を見られたい）。「右左シャント」は、典型的により危険な状況をもたらす（下記の病態生理学を見られたい）。
【００６７】
哺乳動物ＥＣＭは、エアロゾル形態であり得る。よって、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、対象の心臓組織に噴霧され得る。
【００６８】
哺乳動物ＥＣＭは、微粒子形態であり得る。微粒子の哺乳動物ＥＣＭは、乳化した組成物の注入、乾燥微粒子、液体組成物、または半固体組成物の噴霧、積層、包装、散粉、塗装、もしくは他の同様の型の適用によって投与され得る。
【００６９】
いくつかの態様において、組成物は、心臓の心外膜の表面へ投与される。よって、いくつかの態様において、組成物は、心臓の心外膜の表面へ、注入されるか、噴霧されるか、または付着される。
【００７０】
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、及び一般的な状態、及び処置される疾病の重症度次第で、対象毎に変化し得る。よって、あらゆる組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書において教示される日常の実験により当業者が決定することができるであろう。よって、有効な投与量及び組成物を投与するためのスケジュールは、経験的に決定することができ、ゆえにそのような決定をすることは当業者の技能の範囲内である。組成物の投与のための投与量の範囲は、症状または疾病に影響する、所望の効果を産生するために十分多い量である。投与量は、好ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほど大量であるべきではない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、性別、及び疾患の広がり、投与の経路、または他の薬物が処方計画に含まれるかどうかにより変化する場合があり、当業者によって決定され得る。投与量は変化する場合があり、１日または数日間、毎日１回以上の用量投与で投与され得る。手引きは、与えられる分類の医薬品の適切な投与量に関する文献に見ることができる。
【００７１】
心不整脈を処置、抑制、または予防するための開示される組成物の投与に続いて、方法の有効性が当業者に既知の様々な方法で評価され得る。例えば、心電図を使用することにより、本明細書に開示される組成物が対象内の心不整脈を処置することに効果があることが当業者に理解されよう。
【００７２】
本明細書に開示される組成物は、心不整脈の危険性のある対象へ予防的に投与され得る。開示される組成物及び方法はまた、例えば、心不整脈を処置または予防するための新薬物の候補を単離し試験するためのツールとして使用され得る。開示される組成物はまた、研究ツールとして、様々な方法で使用され得る。他の使用は、開示され、本開示から明らかであり、及び／または当業者によって理解されよう。
【００７３】
１．組み合わせ療法
本明細書に開示される方法は、従来の抗不整脈療法で対象の処置を行うことをさらに含む場合がある。例えば、異なる作用機序により抗不整脈薬には多くの分類があり、これらの分類内に多くの異なる個々の薬物が存在する。よって、方法は、１つ以上の抗不整脈薬を対象に投与することをさらに含む場合がある。
【００７４】
例えば、心房細動等のいくつかの不整脈は、心臓内で、血液凝固を引き起こし、塞栓及び発作の危険性を増加させる。ワルファリン並びにヘパリン等の抗凝血薬及びアスピリン等の抗血小板薬物は、凝固の危険性を軽減させ得る。よって、方法は対象へ抗凝血薬を投与することをさらに含み得る。
【００７５】
不整脈はまた、胸壁に対して外部から、または埋め込み電極を通じてもしくは術中に心臓に対して内から、心臓全体にショックを加えることによって、電気的に処置することができる。電気的除細動は、薬理学的に、または基礎心拍へ同期したショックを適用することを介して達成され得る。それは、上室頻拍の処置に使用される。待機的電気的除細動において、患者は、通常、処置のため落ち着かせられるか、または軽く麻酔される。例えば、心房粗動は、電気的除細動によって処置され得る。よって、方法は、電気的除細動により対象を処置することをさらに含む場合がある。
【００７６】
同期した電気的除細動では、反転ショックは、ＥＣＧ上でＱＲＳ群のＲ波に対応する心周期における最適な時に、所定の数ミリ秒以上の選択された量の電流をパッドまたはパドルによって送達される。Ｒ波へのショックのタイミングを図ることは、心室細動を誘発し得る心周期の受攻期（または関連する不応期）中のショックの送達を予防する。
【００７７】
ショックが心周期に同期しないという点で、除細動は、電気的除細動と異なる。それは、心室細動の無秩序型調律に対して必要とされ、無脈性心室頻拍にも使用される。しばしば、より多くの電気が電気的除細動よりも除細動に必要とされる。心室細動を有するほとんどの対象は、意識がないため、一般的に鎮静剤を使用する必要性はない。よって、方法は、除細動を有する対象を処置することをさらに含む場合がある。
【００７８】
除細動または電気的除細動は、植え込み型除細動器（ＩＣＤ）によって遂行される場合がある。よって方法は、対象にＩＣＤを投与することをさらに含む場合がある。
【００７９】
不整脈の電気治療法は、心臓ペーシングもまた含む。一時的なペーシングは、非常に遅い心拍または除脈の可逆性の原因（例えば、薬物過剰摂取または心筋梗塞）のために必要であり得る。永久的ペースメーカーは、除脈が回復する見込みがない状況で、設置され得る。よって、方法は、対象にペースメーカーを投与することをさらに含む場合がある。
【００８０】
微細なプローブが、いくつかの態様において心臓内からの電気的活動をマッピングするために血管を通して挿入され得る。このことは、伝導の異常領域が、非常に正確に特定された後、加熱、冷却、電気またはレーザープローブで破壊されることを可能にする。
【００８１】
Ａ．組成物
哺乳動物ＥＣＭのパッチは、体が、心臓組織を再構築及び修復するために必要な細胞を動員する間、機械的足場としてふるまうことが示されている。本明細書で、心不整脈を付加的に処置する、及び／または予防するための哺乳動物ＥＣＭの驚くべき能力が開示される。よって、本明細書に、対象内の心不整脈を処置または予防するための開示される方法に使用する哺乳動物ＥＣＭを含む組成物が開示される。開示される組成物は、天然または合成であり得る。組成物は、脱細胞化されるか、幹細胞等の細胞を含む場合がある。
【００８２】
本明細書に開示される、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、例えば、パッチ、エマルション、注入可能な溶液、ゲル、流体、ペースト、粉末、より糸、スポンジ、細長い切れ、スプレー、蒸気、エアロゾル、クリーム、またはコーティングの形態であり得る。組成物は、例えば、細胞、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または他の生物学的部位を含む、１つ以上の付加的な構成要素をさらに含み得る。組成物がパッチの場合、それは、シート、積層品、織物、重合体マトリックス、複数のより糸、スポンジ、１つ以上の細長い切れ、またはその組み合わせから選択される形態であり得る。
【００８３】
本明細書に開示される、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、Ｂａｄｙｌａｋの米国特許第５，２７５，８２６号、Ｓｐｉｅｖａｃｋの米国特許第６，５７９，５３８号、Ｇｒｉｆｆｅｙの米国特許第６，９３３，３２６号で説明されるように、微粒子にされ、流動化され得る。流動化または乳化した組成物（液体または半固体形態）は、一定の濃度、例えば、０．００１ｍｇ／ｍＬより大きい細胞外マトリックスの濃度で存在し得る。細胞外マトリックス組成物のこれらの液体または半固体の構成要素の濃度は、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲にあり得る。濃度はさらに、例えば、以下の一連の範囲、すなわち、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１２５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、及び約３５ｍｇ／ｍＬ〜約４５ｍｇ／ｍＬ、並びに約４０ｍｇ／ｍＬ〜約４２ｍｇ／ｍＬ等のより具体的な範囲に見ることができる。この一連の範囲は、例示的であり、網羅的ではないことが意図される。これらの具体的に挙げられたいずれの範囲内のいずれの値も妥当であり、液体、エマルション、ゲル、ペースト、または組成物の他の液体もしくは半固体構成要素の濃度に有益な値であることが企図される。
【００８４】
１．哺乳動物細胞外マトリックス
細胞外マトリックス材料は、体内で軟組織を修復するための天然足場としての機能を果たす。動物実験は、本来の細胞外マトリックス材料が、再構築し、宿主組織によって置換されるということを示している。哺乳動物ＥＣＭは、血管、膀胱、硬膜、腹壁、腱及び靱帯を含む、様々な動物組織の建設的な再構築（リモデリング）を誘発する、異種間の組織グラフトとして、成功裏に使用されている吸収性生体材料である。哺乳動物ＥＣＭの実施例は、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）、胃粘膜下層（ＳＳ）、または肝臓基底膜（ＬＢＭ）を含む。
【００８５】
再構築プロセスは、急速新血管新生、及び新しい細胞外マトリックスの広範な沈着を支持する間葉系細胞及び上皮系細胞の豊富な蓄積を含む。例えば、ＳＩＳ細胞外マトリックスの非コラーゲン性の部分は、ヒアルロン酸、ヘパリン、デルマタン、及びコンドロイチン硫酸Ａ、並びにＦＧＦ‐２並びにＴＧＦ‐β増殖因子等の様々な糖タンパク質で構成される。
【００８６】
処理の後、哺乳動物ＥＣＭは、増殖及び分化因子として作用する、多くの内在性タンパク質を保持し得る。これらの因子は局所環境を刺激し、細胞を備える哺乳動物ＥＣＭを集合させ、それらはその後、哺乳動物ＥＣＭが置換する本来の組織へ分化することが可能である。
【００８７】
哺乳動物ＥＣＭは、コラーゲン、糖タンパク質、及びプロテオグリカン（全体にわたって反復するグリコサミノグリカンを有する）の３つの群に当てはまる重合した「構造」タンパク質の足場マトリックスである。これらの分子は実質的に重合して、細胞との動的相互作用で存在し機能タンパク質に近接して設置される（細胞上か、構造タンパク質への結合のいずれか一方で）タンパク質の足場またはマトリックスを形成する。よって、哺乳動物ＥＣＭはまた、マトリックス足場内に、構造タンパク質、及び幹細胞等の遊走するまたは動員された細胞に相互に作用する「機能」タンパク質を含む。マトリックス機能タンパク質はまた、マトリックス足場自体の生存及び維持中にその構成要素を再建し、維持するように、タンパク質発現細胞に相互に作用する。いくつかのタンパク質は、タンパク質の構造及び全体のマトリックス内での配置次第で、構造タンパク質及び機能タンパク質の双方であり得る。
【００８８】
例えば、心臓組織のＥＣＭは、コラーゲンＩ型（優性）、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型及びＶＩ型で構成され、マトリックスの乾燥重量の９２％を占めるように組み合わせられる。心臓組織のＥＣＭはまた、コンドロイチン硫酸Ａ並びにＢ、ヘパラン、ヘパリン、及びヒアルロン酸を含む、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）で構成される。フィブロネクチン並びにエンタクチン等の糖タンパク質、デコリン並びにパールカン等のプロテオグリカン、及び形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ‐β）、線維芽細胞増殖因子‐２（ＦＧＦ‐２）、並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子は、心筋再生マトリックスの活動において、中心的存在である。さらに、マトリックスの精密な化学構成は、例えば、マトリックス内で何型のコラーゲンが高頻度で存在するのか等、その機能において役割を果たすように見える。よって、いずれの組織再生プロセスの結果は、再生プロセスの基礎を形成するマトリックス足場の構造的及び機能的構成要素によって決定され得る。
【００８９】
ＥＣＭ内の細胞接着機能を促進するのは、細胞接着分子（ＣＡＭ）である。ＣＡＭは、内在的に利用可能であるか、または組成物の付加的な構成要素として加えられるかのいずれか一方であり得る。ＣＡＭは、細胞膜の表面にとどまる糖タンパク質、または細胞の細胞骨格系の構成要素に結びつく膜通型である。特定のＣＡＭは、カルシウム依存性である、カドヘリンを含み、３０個以上の型が知られている。またＣＡＭとして作用するものにタンパク質であるインテグリンがあり、それらがとどまる細胞の細胞骨格を、インテグリンタンパク質のアルファ及びベータ膜通型サブユニットを通じて、細胞外マトリックスまたは他の細胞に結合させる。細胞移動、胚形成、止血及び創傷治癒は、マトリックス内でインテグリンによって促進される。シンデカンは、細胞運動及び分化を惹起するためにリガンドに結合するプロテオグリカンである。免疫グロブリンは、いずれかの必要な免疫性及び炎症性反応を提供する。セレクチンは、細胞と細胞の相互作用を促す。
【００９０】
ｉ．天然由来及び調製
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、天然由来に基づく。天然の細胞外マトリックス足場及びそれらを形成するタンパク質は、それらの天然の環境、すなわち哺乳動物の細胞外マトリックスで検出され得る。これらの材料は、組織グラフト処置で哺乳動物に使用するために調製され得る。
【００９１】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織／臓器から抽出される。例えば、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織由来の、基底膜（または、移行上皮層）、固有層、粘膜下層、筋層、漿膜、またはその組み合わせを含む。よって、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物組織由来の基底膜（または、移行上皮層）を含む。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物組織由来の下外膜固有層を含む。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織由来の粘膜下層を含む。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織由来の筋層を含む。いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織由来の漿膜を含む。
【００９２】
例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）は、米国特許第５，２７５，８２６号に記載され、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）は、米国特許第５，５５４，３８９号に記載され、胃粘膜下層（ＳＳ）は、米国特許第６，０９９，５６７号に記載され、及び肝臓基底膜（ＬＢＭ）は、米国特許第６，３７９，７１０号に記載され、これらそれぞれは、天然の細胞外マトリックスの作製及び使用方法の教示のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
よって、いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）である。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）である。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、胃粘膜下層（ＳＳ）である。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、肝臓基底膜（ＬＢＭ）である。
【００９４】
いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、真皮からのものである。例えば、ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより生産されるＡｌｌｏＤｅｒｍ（商標）は、表皮、及び真皮内の細胞を除去するために確立される処理技術を使用して、結合組織マトリックスの通常の生化学及び分子構造を大きく変化させることなく、正常なヒトの皮膚から産生される無細胞組織マトリックスである。産生された結果物はフリーズドライ形態であり、それによって正常な組織マトリックス構成要素の分解または損失なしに、貯蔵寿命を延長し配送を容易にすることができる。ＡｌｌｏＤｅｒｍ（商標）は、正常な軟組織に存在する、デコリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ナイドジェン、増殖因子及び他の生化学タンパク質を保持し得る。加えて、ＡｌｌｏＤｅｒｍ（商標）は、血管通路の基底膜及び開始真皮組織のエラスチン並びにコラーゲン繊維の配向を含有し得る。
【００９５】
いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、筋膜からのものである。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、実質組織からのものである。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、心嚢からのものである。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、心筋細胞外マトリックスからのものである。いくつかの態様において、開示される組成物及び方法の哺乳動物ＥＣＭは、例えば、洗浄剤での冠動脈灌流によって作製された（Ｏｔｔ，ＨＣ，他、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００８年２月；１４（２）：２１３‐２１）、脱細胞化した心臓組織からのものである。
【００９６】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織または臓器ソースに由来するコラーゲン足場を含む。哺乳動物由来のコラーゲン足場は、いくつかの態様において、哺乳動物の組織由来の基底膜を含み得る。
【００９７】
いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。例えば、哺乳動物ＥＣＭは哺乳動物の細胞の培養物から産生され得る。哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織／臓器から抽出されたタンパク質から産生され得る。例えば、いくつかの態様において、哺乳動物ＥＣＭは、哺乳動物の組織または臓器ソースから抽出されたコラーゲンから合成される人工的なコラーゲン足場を含む。哺乳動物の由来のコラーゲンは、マトリックス含有組織から回収される場合があり、マトリックス組成物を形成するために使用され得る。細胞外マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）によって製造される産生物のような細胞培養物から合成され得る。加えて、真皮細胞外マトリックス材料、皮下細胞外マトリックス材料、大腸細胞外マトリックス材料、胎盤細胞外マトリックス材料、網細胞外マトリックス材料、心臓細胞外マトリックス材料、及び肺細胞外マトリックス材料は、ＳＩＳ、ＳＳ、ＬＢＭ、及びＵＢＳ材料に関して、本明細書に記載されるのと同様に、使用され、派生され、及び保存される場合がある。開示される組成物及び方法に従う使用のための基底膜の他の臓器の組織由来は、脾臓、リンパ節、唾液腺、前立腺、膵臓及び他の分泌線を含むが、これに限定されない。一般的に、細胞外マトリックスを有する哺乳動物の任意の組織が、細胞外マトリックスの構成要素を発生させるために使用され得る。
【００９８】
コラーゲンマトリックスは、様々な商業的に入手可能なコラーゲンマトリックスから選択され得るか、コラーゲンの幅広い種類の天然の由来から調製され得る。開示される組成物及び方法に従う使用のためのコラーゲンマトリックスは、高度保存コラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンを、それらの天然の構成及び天然の濃度において含む。コラーゲンは、動物由来、植物由来、または合成由来からのものである場合があり、これらの全ては、当技術分野で入手可能であり、標準である。
【００９９】
天然足場が使用される際の組成物内の足場材料の比率は、天然足場内の細胞外マトリックスタンパク質の天然バランスが、乾燥重量で９０％より大きい細胞外マトリックス材料を表すように大きいものであり得る。よって、組成物の足場構成要素の重量は、概して、組成物の合計乾燥重量の５０％より大きいものであり得る。足場は、重量で、合計の組成物の６０％、７０％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、及び９８％より大きい量の組成物を含む場合がある。
【０１００】
天然の細胞外マトリックスは、心不整脈を処置または予防するためのそれらの生物活性が、最大限まで保存されるように注意して調製され得る。保存され得る鍵となる機能は、細胞接着の制御もしくは惹起、細胞遊走、細胞分化、細胞増殖、細胞死（アポトーシス）、血管新生の刺激、タンパク質分解活性、酵素活性、細胞運動性、タンパク質並びに細胞改変、転写現象の活性化、翻訳現象の供給、例えば凝固の抑制等のいくつかの生物活性の抑制、幹細胞の誘引、及び走化性を含む。これらの活性を決定するためのアッセイは、当技術分野で標準である。例えば、材料分析は、材料組成物内に存在する分子を特定するために使用され得る。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞接着試験は、構造または組成物が、細胞接着の能力があるかということを確認するために行われ得る。
【０１０１】
哺乳動物ＥＣＭを含む、開示される組成物は、それらに非免疫原性を与えるために脱細胞化され得る。いくつかの態様において、脱細胞化プロセスは、細胞とともに偶発的に抽出されたタンパク質を置換することによって、または、細胞抽出後に外来性の細胞をマトリックス組成物に加えることのいずれか一方によって、鍵となるいくつかのタンパク質の機能を保持した状態で完了し、それら細胞は、心不整脈を処置または予防することに関わるタンパク質を産生するかまたは運ぶ。
【０１０２】
タンパク質を細胞外マトリックス組成物に加える際、タンパク質は単純に組成物とともに加えられるか、それぞれのタンパク質は、マトリックス内で分子に共有結合し得る。標準のタンパク質と分子の結合手順は、共有付着を遂行するために使用し得る。
【０１０３】
脱細胞化において、哺乳動物ＥＣＭの由来として由来組織／臓器から開始する際、由来組織／臓器の灌流プロセスが使用され得る。由来組織／臓器は、例えば、０．１％の過酢酸等の脱細胞化薬剤で潅流され、それによって臓器を無細胞にし得る。由来組織／臓器は、次に部分に切断され、後の使用のために（例えば、水性の環境、液体窒素、冷却、フリーズドライ、または真空プレスで）貯蔵され得る。いずれかの適切な脱細胞化薬剤は、由来組織／臓器の灌流プロセスで使用され得る。さらに以下では、心臓手術を受けたことがある、または心筋梗塞を起こしたことがある対象における心不整脈を処置または予防する開示の方法で使用するためのＥＣＭ材料を、滅菌すると同時により完全に脱細胞化する方法が開示される。
【０１０４】
粘膜下層組織に関して、抽出は、マトリックス内の増殖因子の存在を保存するために、中性のｐＨ（約ｐＨ５．５から約７．５までの範囲）付近で実行され得る。または、酸性状態（すなわち、ｐＨ５．５未満）が、グリコサミノグリカン構成要素の存在を保存するために、摂氏０℃と摂氏５０℃の間の範囲内の温度で使用され得る。これらの水抽出の酸性のまたは塩基性の環境を調節するために、尿素（約２Ｍ〜約４Ｍの濃度で）、グアニジン（約２Ｍ〜約６Ｍの濃度で、最も典型的には約４Ｍで）、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及び非イオン性またはイオン性の界面活性物質等の緩衝剤及びカオトロピック剤（概して、約２Ｍ〜約８Ｍの濃度で）が選択され得る。２ＭでｐＨ７．４の尿素により、ＦＧＦ‐２及び糖タンパク質フィブロネクチンが抽出される。ｐＨ７．４の緩衝剤とともに４Ｍのグアニジン使用することは、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ‐β）を有する画分を産出する。
【０１０５】
基底膜のコラーゲン性構造及び細胞解離中の膜構造の分解を最小化する要望のため、コラーゲンの特定酵素活性は、細胞解離ステップで使用される酵素溶液で最小化され得る。例えば、由来組織／臓器は、トリトン１００等の軽度の洗浄剤等のカルシウムキレート剤またはカオトロピック剤で処理され得る。細胞解離ステップはまた、組織／臓器の酵素処理なしで、カルシウムキレート剤またはカオトロピック剤を用いても行い得る。細胞解離ステップは、約０．０５〜約２％、より典型的には約０．１〜約１％の重量のプロテアーゼを含み、任意で、膜マトリックスの実質的な分解なしに、基底膜からの細胞の遊離及び分離を最適化するために有効な量で、カオトロピック剤またはカルシウムキレート剤を含む、撹拌した溶液内で由来組織の切片を懸濁することによって実行され得る。
【０１０６】
由来組織／臓器を細胞解離溶液に、マトリックスから全細胞を遊離させるために十分な時間、接触させた後、得られる組織／臓器の基底膜は、生理食塩水で１回以上すすがれ、任意で、以下に記載されるように使用されるまで凍結水和状態または部分的に脱水状態で貯蔵される場合がある。細胞解離ステップは、基底膜から全細胞を実質的に遊離させるために、細胞解離溶液を用いたいくつかの処理を必要とする場合がある。由来組織／臓器は、構成要素の細胞を除去するために、プロテアーゼ溶液を用いて処理される場合があり、得られる細胞外マトリックス材料は、いずれかの残存酵素活性を除去または抑制するためにさらに処理され得る。例えば、得られる基底膜は、加熱され得るか、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤で処理され得る。
【０１０７】
基底膜または他の天然の細胞外マトリックスの足場は、グルタルアルデヒドを用いたなめし、酸性ｐＨでのホルムアルデヒドなめし、エチレンオキシド処理、プロピレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ線照射、及び過酢酸滅菌を含む、従来の滅菌技術を使用して、滅菌され得る。材料の機械的強度及び生体栄養特質を著しく弱めない滅菌技術が好適に使用される。例えば、強いガンマ線照射は、グラフト材料の強度の損失を引き起こし得ると考えれている。実施例の滅菌技術は、グラフトを、過酢酸、低線量のガンマ線照射、ガスプラズマ滅菌、及び高圧／超臨界二酸化炭素にさらすことを含む。
【０１０８】
以下ではさらに、開示のＥＣＭ組成物を滅菌及び脱細胞化する方法が開示され、該方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及び生体栄養（bioptric）特質を著しく弱めないのみならず、該方法は、ＥＣＭ組成物の脱細胞化及びＥＣＭ組成物中への種々の添加物の組み込みを強化することにおいてより効果的である。よって、開示される滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知のＥＣＭ組成物に比べてより脱細胞化され、より多くの添加物を組み込みそして送達するためのより大きな能力を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【０１０９】
ｉｉ．合成ＥＣＭ
開示される方法で使用される合成ＥＣＭを含む組成物もまた開示される。開示される組成物及び方法で使用される合成ＥＣＭは、天然コラーゲンそっくりに重合する合成分子を使用して形成されてよく、それは哺乳動物ＥＣＭ足場の天然環境を模倣する足場環境を形成する。従って、ポリエチレンテレフタレート繊維（Ｄａｃｒｏｎ（商標））、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、グルタルアルデヒド架橋心嚢、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ニチノール、及び非動物由来のコラーゲン（植物または合成コラーゲン等）等の材料は、合成細胞外マトリックスの足場の構成要素として使用され得る。挙げられる合成材料は、当該技術分野で標準であり、ハイドロゲル及びマトリックス様の材料をそれらで形成することもまた標準である。それらの有効性は、哺乳動物において、典型的に天然の細胞外マトリックスを構成する構成要素、具体的に、それらに対応する増殖因子及び細胞に従って試験することにより、先に開示のようにｉｎ ｖｉｖｏで試験され得る。
【０１１０】
細胞外マトリックス様の材料は、概して、Ｒｏｓｓｏ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１９９：１７４‐１８０，２００４）で説明され、これらの材料の作製及び使用方法の教示のために、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、いくつかの細胞外マトリックス様の材料がここに挙げられる。具体的に、有益な生体分解性及び／または生体吸収性の重合体は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、及びそれらのランダム共重合体並びにブロック共重合体を含む。特定の重合体の実施例は、ポリ−Ｄ,Ｌ−ラクチド、ポリラクチド‐ｃｏ‐グリコライド（８５：１５）、及びポリラクチド‐ｃｏ‐グリコライド（７５：２５）を含む。開示される組成物及び方法の繊維性マトリックスで使用される、生体分解性及び／または生体吸収性重合体は、約４，０００〜約２５０，０００ｇ／モルを含む、約１，０００〜約８，０００，０００ｇ／モルの範囲内の分子量を有し得る。生体分解性及び／または生体吸収性の繊維化可能な材料は、生体分解性及び生体吸収性重合体であり得る。好適な重合体の実施例は、Ｂｅｚｗａｄａ，Ｒａｏ Ｓ．他、（１９９７）Ｐｏｌｙ（ｐ‐Ｄｉｏｘａｎｏｎｅ）ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ａ．Ｊ．Ｄｏｍｂ，Ｊ．Ｋｏｓｔ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｗｉｓｅｍａｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ．２９−６１に見ることができる。生体分解性及び／または生体吸収性重合体は、グリコリド、ラクチド、ジオキサノン、カプロラクトン、トリメチレンカーボネイト、エチレングリコール及びリジンからなる群から選択される単量体を含有し得る。材料は、これらの単量体を含有する、ランダム共重合体、ブロック共重合体、または、単量体、同種重合体、共重合体、及び／もしくは異種重合体のブレンドであり得る。生体分解性及び／または生体吸収性重合体は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）等の生体吸収性及び生体分解性の直鎖脂肪族ポリエステル及びそのランダム共重合体ポリ（グルコリド‐ｃｏ‐ラクチド‐）（ＰＧＡ‐ｃｏ‐ＰＬＡ）を含み得る。ＦＤＡは、医療用縫合を含む外科的応用での使用において、これらの重合体を承認している。これらの合成の吸収性材料の利点は、体液等の水性の環境でのエステル骨格の単純な加水分解による分解力である。分解産生物は、二酸化炭素及び水に究極的に代謝されるか、腎臓を介して排出され得る。これらの重合体は、体内に吸収されることができないセルロース系材料と非常に異なる。
【０１１１】
好適な生体適合性の重合体の他の実施例は、メタクリル酸エチル、及びポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等のハイドロゲルを含む、ポリヒドロキシアルキルメタクリル酸である。他の好適な生体吸収性材料は、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブリン、ヒアルロン酸、デキストラン、ポリアミノ酸、ポリリジン及びこれらの材料の共重合体を含む、バイオポリマーである。いずれかのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）型の重合体が、使用され得る。ＧＡＧは、例えば、ヘパリン、コンドロイチン硫酸ＡもしくはＢ、及びヒアルロン酸、またはそれらの合成類似体等を含み得る。上記実施例のいずれかの組み合わせ、共重合体、重合体、またはそれらのブレンドは、開示される組成物及び方法に従う使用のために企図される。そのような生体吸収性材料は、既知の方法によって調製され得る。
【０１１２】
任意の由来の核酸が、重合体の生体材料として使用され得る。由来は、自然発生の核酸、並びに合成核酸を含む。開示される組成物及び方法で使用される好適な核酸は、ＤＮＡ（Ａ、Ｂ及びＺ構造を含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡを一緒にまたは別個に含む）及びｃＤＮＡ、並びに合成または人工的な形態のポリヌクレオチド等の核酸の自然的発生の形態を含む。開示される組成物及び方法で使用される核酸は、架橋、メチル化並びにキャップ形成等の鎖内修飾、及び共重合体化によるものを含む、様々な方法で修飾され得る。加えて、他の有利な分子は、核酸鎖へ付着され得る。核酸は、自然的発生の配列または人工的な配列を有し得る。核酸の配列は、開示の多くの態様に無関係であり得る。しかしながら、特別な配列が、核酸の情報コーディング特質による何らかの重大な影響を予防するため、特定の細胞反応を誘発するため、または分子の物理的構造を管理するために使用され得る。核酸は、完成した生体材料内及びそれらの産生プロセス中での双方の様々な結晶構造で使用され得る。核酸の結晶構造は、核酸とともに使用する塩に影響され得る。例えば、ＤＮＡのＮａ、Ｋ、Ｂｉ及びＣａ塩の全ては異なる沈殿速度及び異なる結晶構造を有する。加えて、ｐＨは核酸の結晶構造に影響する。
【０１１３】
核酸の物理的特質は、他の物理的特性の存在によっても影響され得る。例えば、ヘアピンループを包含することによって、より弾力性がある生体材料をもたらし得るか、特定の切断部位を提供し得る。産生される核酸重合体及び共重合体は、組織の引張強度を増加するため、創傷治癒の改善のため、創傷治癒の迅速化のため、組織形成のための鋳型として、組織形成のガイドのため、神経成長を刺激するため、組織内の血管新生の改善のため、生体分解性の接着剤として、デバイスまたはインプラントコーティングとして、または組織もしくは体部位の機能を改善するため、を含む、様々な組織工学の応用のために使用され得る。重合体はさらに具体的に縫合物、足場及び創傷被覆材としても使用され得る。使用される核酸重合体または共重合体の型は得られる重合体生体材料の化学的及び物理的構造に影響し得る。
【０１１４】
ｉｉｉ．組み合わせ
本明細書に開示される組成物は、２つ以上の由来の、または２つ以上の異なる形態での哺乳動物ＥＣＭの組み合わせを含み得る。よって、開示される組成物は、本明細書に開示される、天然及び／または合成の哺乳動物ＥＣＭのいずれかの組み合わせを含み得る。
【０１１５】
よって、例えば、組成物は、例示であって限定されないが、小腸粘膜下層、肝臓基底膜、胃粘膜下層、膀胱粘膜下層、胎盤基底膜、膵臓基底膜、大腸粘膜下層、肺間質膜、気道粘膜下層、心臓細胞外マトリックス、真皮マトリックス、及び一般的に、任意の哺乳動物の胎児組織からの細胞外マトリックス等の由来の哺乳動物ＥＣＭの組み合わせを含み得る。これらの組織由来のうちの任意の１つは細胞外マトリックスを提供することができ、組成物における使用のために、それは続けて指定された形態（液体、半固体、または固体形態）になされ得る。
【０１１６】
２つ以上の由来からの哺乳動物ＥＣＭの組み合わせは、混合固体、混合液体、混合懸濁液、混合エマルション、混合ゲル、混合ペースト、または混合固体微粒子であり得る。これらの組成物の全ては、例えば、２つ以上の細胞外マトリックスからの粉末または微粒子の混合物、２つ以上の細胞外マトリックスからのペーストの混合物、２つ以上の細胞外マトリックスからの懸濁液の混合物、２つ以上の細胞外マトリックスからのエマルションもしくはゲル混合物、及び２つ以上の細胞外マトリックスからの液体の混合物等の２つ以上のソースからの細胞外マトリックスの混合物である。
【０１１７】
組成物は、３個の哺乳動物の組織由来、４個の哺乳動物の組織由来、５個の哺乳動物の組織由来、６個の哺乳動物の組織由来、及び、場合によっては１０個以上の組織由来から作製され得る。これらの組織由来は、同じ哺乳類（例えば、同じウシ、同じブタ、同じ齧歯類、同じヒト等）、同種の哺乳類、（例えば、ウシ、ブタ、齧歯類、ヒト等）、または異種の哺乳類（例えば、ブタからの肝臓マトリックス、ウシからの小腸粘膜下層、及びイヌからの膀胱粘膜下層、全て一緒に組成物内で混合される）からのものであり得る。
【０１１８】
組成物は、一緒に組み合わせられる２つ以上の液体マトリックス（異なる組織由来から）を含み得る。組成物は、一緒に組み合わせられる２つ以上のエマルションマトリックス（異なる組織由来から）であり得る。組成物は、一緒に組み合わせられる２つ以上の微粒子マトリックス（異なる組織由来から）であり得る。組成物は、２つ以上の細胞外マトリックスの液体混合物であり得る。組成物は、２つ以上の細胞外マトリックスの懸濁液混合物であり得る。
【０１１９】
例えば、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＳＩＳと、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＳＳ、あるいはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含む場合がある。例えば、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＳＳと、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＳＩＳ、あるいはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。例えば、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＬＢＭと、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＳＳ、あるいはＳＩＳ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。例えば、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＵＢＳと、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、もしくは液体の形態のＳＳ、あるいはＳＩＳ、またはＬＢＭとの組み合わせを含んでもよい。
【０１２０】
開示される組成物は、１つ以上の由来であるが２つ以上の相異なる形態の哺乳動物ＥＣＭの組み合わせを含み得る。例えば、組成物は、微粒子マトリックスと混ぜ合わされるゲルマトリックスを含み得る。いくつかの態様において、微粒子形態の哺乳動物ＥＣＭは、シート形態の哺乳動物ＥＣＭ上に散粉され得る。
【０１２１】
いくつかの態様において、組成物は、シート、懸濁液、エマルション、ゲル、または液体の形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳと、微粒子形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含む場合がある。いくつかの態様において、組成物は、微粒子、懸濁液、エマルション、ゲル、または液体の形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳと、シート形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、ゲル、または液体の形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳと、エマルション形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、または液体の形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳと、ゲル形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、シート、微粒子、懸濁液、エマルション、またはゲル形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳと、液体の形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、シート、微粒子、液体、エマルション、またはゲル形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳと、懸濁液の形態のＳＩＳ、ＳＳ、もしくはＬＢＭ、またはＵＢＳとの組み合わせを含んでもよい。
【０１２２】
本明細書で開示されるように、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、好ましい稠度に調製することができる。例えば、哺乳動物ＥＣＭは、血流の中への散逸を予防するのに最適な比率のゲルと微粒子との組み合わせとして、調製することができる。例えば、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、約４０％のゲル形態のＥＣＭ及び約６０％の乾燥微粒子形態のＥＣＭを含み得る。よって、本明細書に開示される、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、ゲル形態及び乾燥微粒子形態の双方であり、ゲル形態は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４４、４５、５０％のＥＣＭを組成物内に含む。よって、乾燥微粒子形態は、約９０、８５、８０、７５、７０、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５０％のＥＣＭを組成物内に含み得る。
【０１２３】
液体または半固体組成物（液体、ゲル、懸濁液、エマルション、またはペースト）の濃度の選択は重要である。例えば、液体形態は、非常に薄い約０．００１ｍｇ／ｍＬからより高い濃度の最大約２００ｍｇ／ｍＬまでの範囲で存在し得る。濃度は、例えば以下の一連の範囲、すなわち、約５〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約１２５ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬ、及び約４０〜約４２ｍｇ／ｍＬ等のより具体的な範囲にさらに見出されてもよい。この一連の範囲は例示的であり、網羅することを意図するものではない。これらの具体的に挙げられるいずれの範囲内のいずれの値も妥当であり、組成物の液体または半固体構成要素の濃度に有益な値であることが企図される。
【０１２４】
エマルションは、液体形態よりも濃縮される場合があり、体のある部分にマトリックス組成物を適用することに有益であり得る形状を保持する場合があり、従って、その特徴付けは「半固体」とされる。エマルションは、マトリックス組成物が適用される部位に適する、プラグのような形または他の形状を形成するように十分に濃縮され得る。濃いエマルションは、塗布されるか、または別の方法で部位にペーストとして適用され、そのエマルションの表面上に固体微粒子が散粉される。固体微粒子は、エマルションを形成するために再構成される場合があり、または処置される対象内の領域に散粉し得る、微粒子粉末として乾燥した状態で適用される場合がある。
【０１２５】
２つ以上の哺乳動物ＥＣＭのエマルションを形成する乾燥微粒子または再構成された微粒子は、ある比率において一緒に混合され得る。例えば、５０％のＳＩＳは、５０％のＳＳとバイアル内で混合され得る。この混合物はその後、好適な緩衝剤、例えば生理食塩水中で水和することによって流動化され得る。水和は、哺乳動物ＥＣＭ混合物の所望の濃度、例えば、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲内で遂行され得る。濃度はさらに、例えば、以下の一連の範囲、すなわち、約５〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約１２５ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬ、及び約４０〜約４２ｍｇ／ｍＬ等のより具体的な範囲に見出すことができる。この一連の範囲は例示的であって網羅的であることを意図しない。これらのいずれの具体的に挙げられる範囲内のいずれか値も妥当であり、組成物の液体または半固体構成要素の濃度のために有益な値であることが企図される。
【０１２６】
細胞外マトリックスの濃度が低下するほど、組成物はより液化し得る。細胞外マトリックスの濃度が高くなるほど、組成物はゲル様のエマルションまたは半固体の稠度により接近する。
【０１２７】
異なる由来（または同じ由来）からの任意の所与の組成物における２つ（またはそれより多い）の細胞外マトリックスの混合物の比率は、同等ではない場合がある。従って、例えば、ＬＢＭは、７５％で存在し、ＳＩＳは２５％で存在し得る（すなわち、３：１の比率）。いずれの適切な比率、すなわち、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５等も使用され得る。３つ以上の細胞外マトリックスの組織由来が組成物において示される場合、マトリックスの量において同じ型の均衡または不均衡が生じ得る。例えば、３つの由来からの細胞外マトリックスにおいて、それぞれの由来は等しい比率、すなわち、１：１：１（３３％／３３％／３３％）で存在し得る。または、１つの由来の微粒子の量が不均衡である場合があり、例えば２：１：１（５０％／２５％／２５％）であり得る。同様に、３つの全ての由来は、不均衡な量、例えば、５０％／３０％／２０％で存在し得る。
【０１２８】
２つ以上の哺乳動物ＥＣＭは、別々に流動化され（または乳化され）、流動化または乳化した組成物は一緒に混合され得る。別の代替物として、２つ以上の哺乳動物ＥＣＭは、別々に流動化または乳化され、別々に投与され得る。さらに、２つ以上の哺乳動物ＥＣＭは、固体の組み合わせ微粒子として投与のために微粒子の固体形態にとどまり、バイアル内で一緒に混合され得る。乾燥微粒子の哺乳動物ＥＣＭ混合物の再水和は、使用の直前に遂行され得る。
【０１２９】
２．タンパク質
哺乳動物ＥＣＭを含む、開示される組成物は、哺乳動物ＥＣＭで通常見られるもののような外来性のタンパク質をさらに含み得る。タンパク質は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖、糖タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞表面付随性タンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、血管新生増殖因子、内皮リガンド、マトリカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、カドヘリン、免疫グロブリン、繊維性コラーゲン、非繊維性コラーゲン、基底膜コラーゲン、マルチプレキシン、小ロイシンリッチプロテオグリカン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、ルミカン、エピフィカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、パールカン、アグリン、テスティカン、シンデカン、グリピカン、セルグリシン、セレクチン、レクチカン、アグリカン、ベルシカン、ニューロカン、ブレビカン、細胞質領域‐４４（ＣＤ‐４４）、マクロファージ刺激因子、アミロイド前駆体タンパク質、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ａ、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、フィブロネクチン（Ｆｎ）、テネシン、エラスチン、フィブリリン、ラミニン、ナイドジェン／エンタクチン、フィビュリンＩ、フィビュリンＩＩ、インテグリン、膜通型分子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ‐アルファ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ‐β）、線維芽細胞増殖因子‐２（ＦＧＦ‐２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とも呼ばれる）、トロンボスポンジン、オステオポンチン、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり得る。この列挙は網羅的であることを意図しない。
【０１３０】
よって、本明細書に開示される、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、コラーゲンＩ並びにＩＩＩ、エラスチン、ラミニン、ＣＤ４４、ヒアルロナン、シンデカン、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｎ、テネシン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｂ、インテグリン、デコリン、ＴＧＦ‐β、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１３１】
２．細胞
いくつかの態様において、本明細書に開示される哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、１つ以上の細胞をさらに含む。いくつかの態様において、細胞は非天然、すなわち哺乳動物ＥＣＭに対して異種である。いくつかの態様において、細胞は、自己由来である。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。幹細胞の網羅的でない列挙は、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植増幅心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外来細胞、内在細胞、幹細胞、造血性幹細胞、多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、胚細胞、未分化細胞、多能性の前駆細胞、単能性の前駆細胞、単球、心筋細胞、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、成体幹細胞、及び出生後の幹細胞を含む。
【０１３２】
いくつかの態様において、幹細胞は、心臓組織細胞に分化する潜在性を有する。よって、いくつかの態様において、幹細胞は、多能性である。いくつかの態様において、幹細胞は、血管芽細胞（アンジオブラスト）または血管芽細胞（ヘマンジオブラスト）である。いくつかの態様において、幹細胞は、筋芽細胞である。幹細胞は、幹細胞培養のために標準の方法を使用して得られ、維持され得る。
【０１３３】
２．医薬品
本明細書に開示される、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、対象の心臓へ投与され得るいずれかの既知または新種の物質をさらに含み得る。例えば、本明細書に開示される、哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、抗不整脈の薬剤をさらに含み得る。抗不整脈の薬剤は、心臓の速い及び／または不規則なリズム（心不整脈）を抑制するために使用される医薬品の群である。
【０１３４】
１９７０年に導入されたＶａｕｇｈａｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓ分類は、抗不整脈の薬剤に対して最も広く使用されている分類図式の１つである。本図式は、抗不整脈の効果の主要な機序に基づいて薬物を分類する。Ｖａｕｇｈａｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓ分類において抗不整脈の薬剤には５つの主な分類があり、分類Ｉの薬剤は、ナトリウム（Ｎａ＋  ）チャネルを妨害し、分類ＩＩの薬剤は、抗交感神経系薬剤であり（この分類のほとんどの薬剤はベータ遮断薬である）、分類ＩＩＩの薬剤は、カリウム（Ｋ＋  ）流出に影響し、分類ＩＶの薬剤は、カルシウムチャネル及びＡＶ結節に影響し、及び分類Ｖの薬剤は、他または知られていない機序によって作用する。
【０１３５】
分類Ｉａの薬剤は、キニジン、プロカインアミド、及びジソピラミドを含む。分類Ｉｂの薬剤は、リドカイン、フェニトイン、及びメキシレチンを含む。分類Ｉｃの薬剤は、フレカイニド、プロパフェノン、及びモリシジンを含む。分類ＩＩの薬剤は、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、及びアテノロールを含む。分類ＩＩＩの薬剤は、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、及びドフェチリドを含む。分類ＩＶの薬剤は、ベラパミル及びジルチアゼムを含む。分類Ｖの薬剤は、アデノシン及びジゴキシンを含む。
【０１３６】
よって、本明細書に開示される哺乳動物ＥＣＭを含む組成物は、１つ以上のキニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン及びジゴキシンをさらに含み得る。
【０１３７】
提供される組成物は、１つ以上の抗生物質（例えば、アミノグリコシド、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、アゾリド、メトロニダゾール、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、及びバンコマイシン）をさらに含み得る。
【０１３８】
提供される組成物は、１つ以上のステロイド（例えば、アンドラン（例えば、テストステロン）、コレスタン（例えば、コレステロール）、コール酸（例えばコール酸））、副腎皮質ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、エストラン（Estraenes）（例えば、エストラジオール）、及びプレグナン（例えば、プロゲステロン）さらに含み得る。
【０１３９】
提供される組成物は、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、レボルファノール、メペリジン、メサドン、オキシコドン（Oxydone）、プロポキシフェン、フェンタニール、メサドン、ナロキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン、及びペンタゾシンを含むが、これらに限定されない、１つ以上の麻薬性及び非麻薬性鎮痛薬の分類をさらに含み得る。
【０１４０】
提供される組成物は、アルクロフェナク、アルクロメタゾンジプロピオン酸エステル、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、アミプリローズ塩酸塩、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジドニナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、ベンジダミン塩酸塩、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、クロベタゾールプロピオン酸エステル、クロベタゾン酪酸エステル、クロピラク、プロピオン酸クロチカゾン、酢酸コルメタゾン（Cormethasone Acetate）、コルトドキソン、デカン酸、デフラザコート、デラテストリル、デポ−テストステロン、デソニド、デスオキシメタゾン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフロラゾン二酢酸エステル、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラック、フェンドサル、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコルト、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、フルチカゾンプロピオン酸エステル、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオン酸エステル、酢酸ハロプレドン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、イソフルプレドン酢酸エステル、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロルノキシカム、ロテプレドノールエタボン酸エステル、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、二酪酸メクロリソン、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、メステロロン、メタンドロステノロン、メテノロン、メテノロン酢酸エステル、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モルニフルマート（momiflumate）、ナブメトン、ナンドロロン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサンドロロン（Oxandrolane）、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、オキシメトロン、パラニリン塩酸塩、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、フェンブタゾンナトリウムグリセラート、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナゼート、プリフェロン、プロドール酸、プロクァゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレクス、サルナセジン、サルサラート、塩化サングイナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スタノゾロール、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダプ、テニダプナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テストステロン、テストステロンブレンド、テトリダミン、チオピナク、チクソコルトールピバル酸エステル、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロリド（Triclonide）、トリフルミダート、ジドメタシン、及びゾメピラックナトリウムを含むが、これらに限定されない、１つ以上の抗炎症性薬剤をさらに含み得る。
【０１４１】
提供される組成物はさらに１つ以上の高脂血症治療薬を含み得る。本明細書に開示されるように、用語「高脂血症治療薬」は、コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、及びトリグリセリドを含むが、これらに限定されない、様々な心臓疾患に付随する脂質の血清レベルを軽減するために、対象に投与され得る薬物を指す。
【０１４２】
例えば、高脂血症治療薬は、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、セルビスタチン、及びピタバスタチンを含むが、これらに限定されないスタチンであり得る。現在知られているまたは将来開発される、脂質軽減性及び／または抗炎症性特質を有する任意のスタチン薬物が、本明細書で説明される組成物に使用され得る、ということが企図される。
【０１４３】
提供される組成物は、エタノールアミン（ジフェンヒドラミンカルビノキサミン等）、エチレンジアミン（トリペレナミンピリラミン等）、アルキルアミン（クロルフェニラミン、デキスクロルフェニラミン、ブロンフェニラミン、トリプロリジン等）、アステミゾール、ロラタジン、フェキソフェナジン、ブロフェニラミン（Bropheniramine）、クレマスチン、アセトアミノフェン、プソイドエフェドリン、及びトリプロリジンを含むが、これらに限定されない、１つ以上の抗ヒスタミン薬剤をさらに含み得る。
【０１４４】
提供される組成物は、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン（AcrQnine）、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン（Ambomycin）、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、ビスナフィドジメシラート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼルシン、セデフィンゴール、クロランブシル、シロレマイシン（Cirolemycin）、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクォン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロルニチン塩酸塩（Eflomithine Hydrochloride）、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、ヨード化ケシ油エチルエステルＩ１３１（Ethiodized Oil I 131）、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ゴールドＡｕ１９８、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、インターフェロンアルファ‐２ａ、インターフェロンアルファ‐２ｂ、インターフェロンアルファ‐ｎｌ、インターフェロンアルファ‐ｎ３、インターフェロンベータ‐Ｉａ、インターフェロンガンマ‐Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、酢酸リュープロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、メイタンシン（Mavtansine）、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル（Mitosper）、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ベンダムスチン（Pentamustine）、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピプロスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、塩��プロカルバジン、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール（Safmgol）、塩酸サフィンゴール（Safmgol Hydrochloride）、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、塩化ストロンチウムＳｒ８９、スロフェヌル、タリソマイシン、タキサン、タキソイド、テコガランナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン（Temoporfm）、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、塩酸トポテカン、トレミフェンクエン酸塩、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン及びゾルビシン塩酸塩を含むが、これらに限定されない、１つ以上の抗悪性腫瘍薬物をさらに含み得る。
【０１４５】
本明細書で提供される組成物は、ゲムシタビン、５‐フルオロウラシル、ペントキシフィリン、及びビノレルビンを含むが、これらに限定されない、１つ以上の放射線増感剤をさらに含み得る。
【０１４６】
２．担体
開示される哺乳動物ＥＣＭは、投与、送達またはＥＣＭ及びそれらの使用の他の態様を助成するために、担体及び他の組成物に組み合わされるか、抱合されるか、連結され得る。便宜上、そのような組成物は、担体として本明細書に言及される。担体は、例えば、小分子、医薬品、脂肪酸、検出可能なマーカー、抱合タグ、ナノ粒子、または酵素であり得る。
【０１４７】
開示される組成物は治療上、薬学的に許容される担体との組み合わせで使用され得る。「薬学的に許容される」とは、生物学的またはその他の点で好ましくないものではない材料を意味し、すなわちその材料は、何らかの好ましくない生物学的効果を引き起こすことがなく、または、それが含有される医薬組成物のいずれの他の構成要素との間で相互に作用して悪影響を与えることはなく、組成物とともに対象に投与され得る。当業者に良く知られるように、担体は当然ながら、活性成分のいずれの分解も最小限にし、対象におけるいずれの有害な副作用も最小限にするように選択されるであろう。
【０１４８】
適した担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５で、説明される。典型的に、適切な量の薬学的に許容される塩が、製剤に等張性を与えるために製剤に使用される。薬学的に許容される担体の例は、生理食塩水、リンゲル液、及びブドウ糖液を含むが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、より好ましくは、約７〜約７．５である。さらに担体は、組成物を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の持効性製剤を含み、マトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微小粒子等の造形品の形態である。特定の担体が、例えば、投与の経路及び投与される組成物の濃度によって、より好ましくなり得ることは当業者に明らかであろう。
【０１４９】
薬学的担体は当業者に公知である。これらの最も典型的なものは、滅菌水、生理食塩水、及び生理的ｐＨでの緩衝液を含む、ヒトへの薬物の投与のための標準の担体であろう。
【０１５０】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、及び表面活性薬剤等を含み得る。医薬組成物はまた、抗菌薬、抗炎症薬、及び麻酔薬等の１つ以上の活性成分を含み得る。
【０１５１】
非経口投与のための調製物は、滅菌水または非水溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルである。水性の担体は、生理食塩水及び緩衝溶液系を含む、水、アルコール／水性の溶液、エマルション、または懸濁液を含む。非経口の媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油を含む。経静脈的媒体は、流体及び栄養補充物及び電解質補充物（例えば、リンゲルブドウ糖を基礎にしたもの）等を含む。防腐剤及び他の添加物はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等であり得る。
【０１５２】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉剤または油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または好ましい場合がある。
【０１５３】
経口投与のための組成物は、粉末もしく顆粒、懸濁液もしくは水溶液あるいは非水系媒体、カプセル、小袋、または錠剤を含む。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【０１５４】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、並びにリン酸等の無機酸、及びギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、並びにフマル酸等の有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、及びモノ、ジ、トリアルキル並びにアリールアミン並びに置換エタノールアミン等の有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与することもできる。
【０１５５】
Ｄ．組成物を作製する方法
本明細書に開示される組成物及び開示される方法を実施するために必要な組成物は、別途具体的に示されない限り、特定の試薬または化合物のための当業者に知られるいずれの方法を使用して作製されてもよい。例えば、米国特許第５，２７５，８２６号、米国特許第５，５５４，３８９号、米国特許第６，０９９，５６７号、及び米国特許第６，３７９，７１０号は、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）、胃粘膜下層（ＳＳ）、及び肝臓粘膜下組織（ＬＳ）、または肝臓基底膜（ＬＢＭ）をそれぞれ含む、組成物を作製する方法のために参照により本明細書に開示される。
【０１５６】
Ｅ．組成物を滅菌する方法
別に明確に述べない限り、本明細書に説明されるいずれの方法または態様も、そのステップを特定の順序で行うことを要するものと解釈されることを全く意図するものではない。従って、方法に係る請求項が特許請求の範囲において、または発明の詳細な説明において、ステップが特定の順序に限定されるべきであると特に述べない場合、いかなる点においても、順序を暗示することを全く意図するものではない。このことは、本明細書に記載された、ステップの配列または動作フローに関するロジックの事柄、文法的構成や句読点から派生する平易な意味、または、態様の数またはタイプを含む、解釈についてのいずれのあり得る非明示の原則に適用できる。
【０１５７】
本明細書で使用される用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が８０％となるように少なくとも８０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を説明することを意図したものである。本明細書に記載のいくつかの実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９０％となるように少なくとも９０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９５％となるように少なくとも９５％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９６％となるように少なくとも９６％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらに他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９７％となるように少なくとも９７％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９８％となるように少なくとも９８％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたまたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／または細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９９％となるように少なくとも９９％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。このように、本明細書で使われる、用語「無細胞」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％及びそれらの値の間に入る任意の割合のレベルに脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。
【０１５８】
本明細書で使用される、用語「添加物」は、本明細書に開示される滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物に所定の特質を与えるために、開示されるＥＣＭ材料に選択的に組み入れられ得る材料を指す。そのような添加物は、限定でなく例示的に、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、細胞及び例えば、スタチン薬物、副腎皮質ステロイド、抗不整脈薬、非ステロイド性抗炎症薬、他の抗炎症化合物等の薬剤、ナノ粒子及び金属化合物を含む場合がある。
【０１５９】
本明細書で使用される、用語「同時に」は、事象が同時に及び／または重複して起こることを指すとともに、事象が互いに前後約３０分以内に順次的に起こることを指す。従って、第１の事象が起こり、そして第２の事象が第１の事象と同時に起こった場合、または、第１の事象の前後３０分以内に起こった場合、第２の事象が第１の事象と同時に起こったという言う場合がある。例えば、第１の方法のステップが行われる場合、第１の方法のステップの五分後に行われる第２の方法のステップは、第１の方法ステップと「同時に」行われると言う場合がある。同様に、第２の方法ステップが第３の方法ステップを行う１０分前に行われた場合、第２の方法ステップが第３の方法ステップと「同時に」行われたと言う場合がある。
【０１６０】
本明細書で使用される、用語「エマルション」は、第１のＥＣＭ材料が第２のＥＣＭ材料に非混和性であり、第２のＥＣＭ材料内に第１のＥＣＭ材料が分散された混合物を指す。本明細書に記載される「エマルション」は、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションのどちらかを指す場合がある。
【０１６１】
本明細書で使用される、用語「懸濁液」は、限定でなく例示的に、微粒子ＥＣＭ等の固体のＥＣＭ材料が、限定でなく例示的に、ＥＣＭゲルまたはＥＣＭ液等の流体ＥＣＭ材料内に分散（懸濁）された混合物を指す。
【０１６２】
本明細書で使用される、用語「超臨界」は、材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているときの材料の流体状態を指す。材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているとき、典型的に気体及び液体の両方の機能特性を有し、超臨界流体として機能すると言われる。従って、例えば、二酸化炭素がその臨界温度（３１．１℃）及びその臨界圧力（１，０７１ｐｓｉ）以上に保持される場合、それは超臨界二酸化炭素流体としてふるまい、例えば、液体の密度を有しながら気体の拡散特性を示し得る。
【０１６３】
滅菌された無細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物及びそのような組成物の作製方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される、開示の細胞外マトリックス組成物は、単離されたＥＣＭ材料を同時に滅菌及び脱細胞化することによって形成される。より具体的に、開示の方法は、単離されたＥＣＭ材料の望ましい滅菌と脱細胞化とを同時に達成し、それによって組織組成物の天然の特性が維持され、ＥＣＭ材料が無菌且つ無細胞にされる。
【０１６４】
本明細書にさらに記載されるように、開示の方法は、ＥＣＭ材料を脱細胞化するために、ＥＣＭ材料の急速減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度に比べて著しく高い減圧速度で生ずる。本明細書に記載されるように、ＥＣＭ材料の脱細胞化に加え、ＥＣＭ材料の急速減圧はまた、所望の滅菌剤及び添加物のＥＣＭ材料への組み入れを強化するために使用され得る。
【０１６５】
ＥＣＭ組成物
実施態様において、滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／または基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素または材料を含む場合がある。開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。さらに、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ウマ、齧歯類等を含む一つ以上の哺乳動物のＥＣＭ構成要素または材料由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。従って、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、二つ以上のウシ、二つ以上のブタ、二つ以上のイヌまたは二つ以上のヒツジ等の二つ以上の同種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素または材料を含み得ることが企図される。さらに、開示の滅菌された、無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、または、ウシとヒツジ等の二つ以上の異種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素または材料を含み得ることが企図される。またさらに、開示の滅菌された、無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、第１の哺乳動物由来のＳＩＳ等の第１の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素または材料、並びに、限定でなく例示的に、第２の哺乳動物由来のＳＳ等の第２の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素または材料を含み得ることが企図される。
【０１６６】
様々な態様で、開示の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、実質的に平坦なシート、円筒状管、実質的に球状の構造、または多積層構造等を含む任意の適切な形状に作製され得る。開示の滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物はまた、限定でなく例示的に、固体、液体、ゲル、微粒子、スポンジ、エマルションまたは懸濁液の形態等を含む、任意の適切な形態に作製され得ることが企図される。一つの実施態様で、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、液体、微粒子、エマルション、懸濁液及び／またはゲルのＥＣＭ材料の内層を封入する固体のＥＣＭ材料の外層を含み得ることが企図される。
【０１６７】
もう一つの実施態様では、開示の滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭゲル内に懸濁されてＥＣＭ懸濁液を形成する一つ以上の型の微粒子ＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。この態様で、開示のＥＣＭ懸濁液内の微粒子は、直径が約５μｍないし約３００μｍの範囲にあり、平均直径が約９０μｍないし約１００μｍの範囲にあることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は、約５％ないし約５０％の範囲にあり、開示のＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は、約５０％ないし約９５％の範囲にあり得ることが企図される。従って、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合が約１０％であるとき、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約９０％であり得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合が約１５％であるとき、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約８５％であり得ることが企図される。より好適に、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約２０％ないし約３０％の範囲にあり、そのとき、開示のＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約７０％ないし約８０％の範囲にあり得る。このように、一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約２０％であり、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約８０％であり得る。もう一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約２５％であり、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約７５％であり得る。追加の実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液内のゲルの割合は約３０％であり、ＥＣＭ懸濁液内の微粒子の割合は約７０％であり得る。上記範囲は具体的な開始点の値及び終点の値を指すが、開示のＥＣＭ懸濁液は、上記の範囲内の任意のゲルの割合及び微粒子の割合から形成され得ることが企図される。
【０１６８】
さらなる態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、滅菌され脱細胞化されたＥＣＭを含み得ることが企図される。実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、ＥＣＭ加水分解物であり得る。それらの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、約５０％より多く加水分解されたＥＣＭ、より好適に、約７０％より多く加水分解されたＥＣＭ、最も好適に、約９０％より多く加水分解されたＥＣＭを含み得ることが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは約１００％加水分解されたＥＣＭを含み得る。またさらに、懸濁液のＥＣＭ構成要素は、限定でなく例示的に、フィブロネクチン及びラミニン等の糖タンパク質、限定でなく例示的に、ヘパラン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン及び増殖因子のうちの少なくとも一つを含み得ることが企図され、そのことによって天然細胞の構成要素のために追加の生物学的利用能を提供することができる。懸濁液のＥＣＭ構成要素は、開示のＥＣＭ懸濁液を対象内に移植した後、細胞の増殖と幹細胞の誘引を促進する構造的及び生化学的微環境を提供し得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、対象の細胞がそれら自身のＥＣＭを作製し始めることができるまで、好ましい生化学環境を保つ充填剤として機能し得ることが企図される。
【０１６９】
またさらに、ＥＣＭゲルによって保たれる所望の生化学環境は、天然組織における生化学環境に実質的に対応し得ることが企図される。このように、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルは、対象内の標的部位の弾性率と実質的に等しい弾性率を有し得ることが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルの弾性率は、約５ｋＰａないし約５０ｋＰａの範囲にあり、より好適に、約１０ｋＰａないし約１５ｋＰａの範囲にある。
【０１７０】
一つの限定でない実施態様において、開示のＥＣＭ懸濁液が対象の心臓上または心臓内の標的部位に注入するために構成されているとき、開示のＥＣＭ懸濁液のＥＣＭゲルの弾性率は、心筋の弾性率である、約１１．５ｋＰａであり得る。本明細書で使用される、用語「心臓上または心臓内」は、限定でなく例示的に、心嚢、心外膜、心筋、心内膜、心室、心房、大動脈、肺動脈、肺静脈、大静脈等の表面または内部にある位置を指す。もう一つの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、急性心筋梗塞及び／または慢性冠動脈性心疾患の後に起こる左室壁のネガティブ・リモデリングを治療的に防止するまたは食い止めるために、対象の心臓上または心臓内の標的部位に注入され得ることがさらに企図される。本明細書で使用される、用語「ネガティブ・リモデリング」は、心筋傷害に反応して起こる心臓の有害な及び／または好ましくない変化を指し、そのような好ましくない変化は、限定でなく例示的に、筋細胞バイオロジーにおける変化、筋細胞の消失、細胞外マトリックスの分解、細胞外マトリックス置換性線維形成、左室腔の形状の変化、増大する壁応力（後負荷）、後負荷不整合、発作性の心内膜下低灌流、増大する酸素利用率、持続性の血行力学的負荷、及び補償機構の活動悪化等を含む。開示のＥＣＭ懸濁液はまた、心不全を治療的に処置するために、対象の心臓上または心臓内の標的部位に注入され得ることがさらに企図される。
【０１７１】
一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、限定でなく例示的に、心嚢、心外膜、心筋、心内膜、心室、心房、大動脈等の上または内部の等の対象の心臓上または心臓内の標的部位に注入され得ることが企図される。任意に、一つの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、格子状のパターンに注入され得る。この態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、離間した、実質的に平行な第１の一連の線及び該離間した、実質的に平行な第１の一連の線に実質的に垂直な、離間した、実質的に平行な第２の一連の線として注入され、それによって格子状のパターンを画成することが企図される。
【０１７２】
もう一つの態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、対象の心臓上または心臓内の標的部位に適用され、約０．１ｍｍないし約１０ｍｍ、より好適に、約１ｍｍないし約５ｍｍ、最も好適に、約２ｍｍないし約４ｍｍの範囲にある厚さを有する、開示のＥＣＭ懸濁液の膜を形成することが企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液は、対象の心臓上または心臓内の標的部位に適用され、約３ｍｍの厚さを有する、ＥＣＭ懸濁液の膜を作る場合があることが企図される。
【０１７３】
さらなる実施態様において、開示のＥＣＭ懸濁液は、対象の心臓の心筋または瘢痕組織内に位置する標的部位に注入される場合があることが企図される。この態様では、開示されるＥＣＭ懸濁液が、心嚢の外表面に関して好ましい深さにおいて、対象の心臓内の心筋または瘢痕組織に注入される場合があることが企図される。開示のＥＣＭ懸濁液が注入される好ましい深さは、約０．５ｍｍないし約５ｍｍの範囲、より好適に、約１ｍｍないし約３ｍｍの範囲、最も好適に、約１．５ｍｍないし約２．５ｍｍの範囲にあることがさらに企図される。一つの実施態様において、開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは約２ｍｍであり得ることが企図される。この態様では、開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、心外膜と心筋の間の接合部に近接した位置に対応し得ることが企図される。開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、虚血性の、及び／または炎症を起こした、及び／または損傷した心臓組織に近接した位置に対応し得ることがさらに企図される。一つの実施態様では、開示のＥＣＭ懸濁液が注入される所望の深さは、壊死した、及び／または梗塞を起こした心筋に近接した位置に対応し得ることが企図される。
【０１７４】
実施態様において、開示のＥＣＭ懸濁液が、心筋梗塞が起こった後に対象の心筋内及び／または一つ以上の心腔内の標的部位に注入される場合、ＥＣＭ懸濁液は、二つの可能な期間、すなわち、対象の炎症反応が完全に発症する前、または、対象の炎症反応が減少した後のうちの一つの期間中に標的部位に注入されるべきであることが企図される。一つの態様において、ＥＣＭ懸濁液が対象の炎症反応が完全に始まる前に標的部位に注入される場合、ＥＣＭ懸濁液は、心筋梗塞の発生後に実質的に直ちに、治療上の再灌流及び／または心臓の血行再建術（例えば、冠動脈バイパスグラフトまたはステントによる）のときまでに標的部位に注入されるべきであることが企図される。もう一つの態様において、ＥＣＭ懸濁液が対象の炎症反応が減少したあとに標的部位に注入される場合、ＥＣＭ懸濁液は、ネガティブなリモデリング及び瘢痕組織形成が起こる心筋梗塞の急性期の後に、標的部位に注入されるべきであることが企図される。様々な態様では、開示のＥＣＭ懸濁液を対象の心臓上または心臓内に注入後、ＥＣＭ懸濁液は分散することなく標的部位に幹細胞を誘引し、これにより心臓の好ましいポジティブ・リモデリングを促進することができることが企図される。本明細書で使用される、用語「ポジティブ・リモデリング」は、損傷した心臓組織の有利な再生及び／または再構築を指し、そのようなポジティブ・リモデリングは、心臓の機能を維持し瘢痕組織の形成を防止しながら、新しい細胞の増殖を促進する。
【０１７５】
ＥＣＭ組成物の滅菌及び脱細胞化
任意に、開示の細胞外マトリックス組成物は、限定でなく例示的に、ＮｏｖａＳｔｅｒｉｌｉｓ社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（該特許は参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたシステム等の公知の滅菌システムを使用して滅菌することができることが企図される。従って、いくつかの態様では、開示の方法を実施するために使用されるシステムは、標準の圧縮保存シリンダ及びブースター（例えば、ハスケルブースターＡＧＴ７／３０）と連動して使用される標準のエアコンプレッサを含む場合がある。他の態様では、エアコンプレッサ及びブースターは、単一のコンプレッサに置き替えることができる。実施態様において、圧縮保存シリンダは、二酸化炭素を受け入れるように構成される場合があり、ブースターは、二酸化炭素ブースターであり得る。
【０１７６】
システムはさらに入口ポートを含む場合があり、それによってリザーバに収容された一つ以上の添加物を弁及び添加物ラインを通じて反応容器に加えることができる。本明細書で使用される、用語「反応容器」は、本明細書に開示されるように、ＥＣＭ材料を受け入れ、ＥＣＭ材料を一つ以上の滅菌剤及び添加物へ曝露することができるように構成された内部空間を有する任意の容器を指す。実施態様において反応容器は、限定されないが、バスケット、バケツ、外筒、箱、パウチ及びその他の公知の容器とすることができる。反応容器は再シール可能であり得ることが企図される。一つの態様では、反応容器は、ＥＣＭ材料が充填される注射器であり得ることが企図される。実施態様において反応容器は、Ｔｙｖｅｋ（商標）の包材（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を含むパウチである場合がある。
【０１７７】
限定でなく例示的に、二酸化炭素等の選択された一次滅菌剤が、弁及び供給ラインを介してヘッダーラインから反応容器に導入され得ることが企図される。さらに、限定でなく例示的に、０．５μｍフィルタ等のフィルタが、容器から材料が漏れるのを防ぐために、供給ラインに設けられ得ることが企図される。実施態様では、圧力計が、圧力を視覚的に監視することができるように、ヘッダーラインの遮断弁の下流に設けられる場合がある。逆止弁が、ブースターへの逆方向の流体流れを防ぐために、弁の上流のヘッダーラインに設けられる場合がある。ヘッダーラインに過圧状態が存在することを防止するために、圧力逃がし弁が任意で設けられ得る。
【０１７８】
一つの態様では、反応容器の減圧は、出口ライン及び反応容器と連通する弁を用いて達成され得る。この態様において、減圧された流体は、供給ラインを介して容器から出て、フィルタユニットにより濾過され、その後セパレータに案内され、二酸化炭素等の濾過された流体が排出ラインを介して排出され得ることが企図される。さらに、上流の構成要素の流体を単離できるように、弁が装置の様々なラインに組み込まれ得ることが企図される。
【０１７９】
一つの実施態様において、反応容器は、限定でなく例示的に、３１６ゲージステンレス鋼等のステンレス鋼を含む場合がある。もう一つの実施態様において、反応容器は、実験室規模または工業規模のいずれかで、滅菌される材料を収容するのに十分な全内部体積を有する場合がある。例えば、反応容器は、約８インチの長さ、約２．５インチの内径及び約６００ｍＬの内部体積を有する場合があることが企図される。追加の態様において、反応容器は、振動器、温度制御ユニット、インペラと磁気駆動部とを含む機械的攪拌システムを含む場合がある。一つの任意の態様では、反応容器は、３１６ゲージのステンレス鋼を含むバスケットを収容し得ることが企図される。この態様では、バスケットは滅菌される材料を保持し、さらにインペラを保護し、所定の方法で一次滅菌剤を案内するように構成される場合があることが企図される。
【０１８０】
反応容器は、飛沫や乱流による材料の損失なしに、また、逆拡散を介して圧力ラインを汚染することなしに、一定圧力で、または継続的な加圧及び減圧（圧力サイクル）条件下で動作させ得ることが企図される。さらに、システム内の弁は、反応容器をシステムの他の構成要素から容易に分離及び除去できるようにし得ることが企図される。一つの態様では、反応容器の内部空間へアクセスできるようにするために、減圧時に反応容器の頂部を取り外すことができる。
【０１８１】
任意に、システムは、ユーザが反応容器内の温度を調整可能に制御できるようにする温度制御ユニットを含む場合がある。
【０１８２】
使用するとき開示された装置は、本明細書に開示されるような滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製する方法に採用される場合がある。しかしながら、開示の装置は単に例示であって、開示の方法のステップを実行することが可能な任意の装置が、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが理解される。従って特許請求される方法は、特定の装置に限定されるものでは全くない。
【０１８３】
コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の有意な低減が、開示の方法に従い、一次滅菌剤を使用し滅菌温度及び圧力条件に単離されたＥＣＭ材料をさらすことにより、達成され得ることが企図される。任意に、一次滅菌剤は、所望の滅菌を達成するために、1つ以上の二次滅菌剤と組み合わせることができることが企図される。任意に、さらに、選択された添加物が、得られるＥＣＭ組成物に所望の特性を与えるためにＥＣＭ材料に組み込まれ得ることが企図される。またさらに、開示の方法は、対象の体内に移植するための滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが企図される。
【０１８４】
本明細書に記載のように、開示の方法は、ＥＣＭ材料を無細胞にするために、単離されたＥＣＭ材料の急速な減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速な減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度よりも著しく高い減圧速度で起こる。本明細書に記載のようにＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料への所望の滅菌剤及び添加物の組み込みを強化するために使用することができる。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、天然の増殖因子の保持性を向上させながら、ＥＣＭ材料を無細胞にすることができることが企図される。またさらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、ＥＣＭ材料の引張強度の保持性を向上させるために使用することができることが企図される。
【０１８５】
開示の方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及び生体栄養特性（bioptric properties）を著しく弱めることがないだけではなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化し、並びに、ＥＣＭ組成物に様々な添加物を組み入れる性能を強化することに、より有効である。従って、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知のＥＣＭ組成物に比べて、より脱細胞化された、並びに、より多くの添加物を組み込み、その後送達するより高い性能を有するＥＣＭ組成物を提供する。さらに、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知である滅菌され脱細胞化されたＥＣＭ組成物に比べて、より多い量及び／またはより高い濃度の保持された天然の増殖因子を有し、より高い引張強度を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【０１８６】
実施態様において、一次滅菌剤は、その臨界圧力及び臨界温度条件にある、または、それに近い条件にある二酸化炭素であり得る。しかしながら、例えば、ＥＣＭ材料の天然の特性を妨げない気体、液体または粉末の滅菌剤を含むいずれかの従来の滅菌剤が一次滅菌剤として使用され得ることが企図される。
【０１８７】
一つの実施態様において、開示される滅菌プロセスは、一次滅菌剤として二酸化炭素を用いて、約１，０００〜約３，５００ｐｓｉの範囲にある圧力及び約２５℃〜約６０℃の範囲にある温度で実施され得る。より好適に、超臨界二酸化炭素が使用される場合、滅菌プロセスは、１，０７１ｐｓｉ以上の圧力及び３１．１℃以上の温度で一次滅菌剤として二酸化炭素を使用し得ることが企図される。この態様では、滅菌されるＥＣＭ材料は、そのような圧力及び温度条件またはそれに近い条件にある二酸化炭素に、約１０分ないし約２４時間、より好ましくは、約１５分ないし約１８時間、最も好ましくは、約２０分ないし約１２時間の間、さらされる場合がある。好適に、開示のシステム及び方法に用いられる二酸化炭素は純粋であるか、または代替的に、二酸化炭素の滅菌特性を損なわない他のガスを微量のみ含むものであり得る。以下のさらなる検討を簡単にするために、用語「超臨界二酸化炭素」が使用されるが、そのような用語は、前述のような圧力及び温度範囲内にある二酸化炭素に限定されず、開示の方法の実施に十分に採用され得ることが理解されよう。開示された圧力及び温度範囲内で、二酸化炭素は気体、液体、流体またはプラズマ形態でＥＣＭ材料に与えられ得ることが企図される。
【０１８８】
いくつかの態様で、開示の方法で用いる二次滅菌剤は、限定でなく例示的に、過酸化物及び／またはカルボン酸等の化学滅菌剤を含み得る。好ましいカルボン酸は、アルカンカルボン酸及び／またはアルカン過カルボン酸（alkanepercarboxylic acids）を含み、それらは各々任意に、ハロゲン、酸素、窒素グループ等の1つ以上の電子求引性置換分とα位の炭素で置き換えることができる。開示の方法の実施に使用される化学滅菌剤の実施例に係る種類は、限定でなく例示的に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、酢酸（ＡｃＡ）、過酢酸（ＰＡＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びそれらの混合物を含む。一つの実施態様において、化学滅菌剤は、酢酸、過酸化水素及び過酢酸を含む混合物であるＳｐｏｒｅｃｌｅｎｚ（商標）滅菌剤を含み得る。
【０１８９】
二次滅菌剤は、一次滅菌剤の全体積を基準に、滅菌強化に有効な量の少なくとも約０．００１ｖｏｌ％以上で用いることができることが企図される。さらに、二次滅菌剤の量は、用いられる具体的な二次滅菌剤に依存する場合があることが企図される。従って、例えば、過酢酸は約０．００５ｖｏｌ％以上の比較的少量であり、一方で酢酸は、約１．０ｖｏｌ％以上の量で用いられる場合があることが企図される。従って、二次滅菌剤の濃度は、約０．００１ｖｏｌ％ないし約２．０ｖｏｌ％の範囲にあり、典型的に、限定でなく例示的な超臨界二酸化炭素等の開示された一次滅菌剤と組み合わせて、滅菌強化作用を達成するために、本明細書に開示のように使用され得ることが企図される。
【０１９０】
一つの態様では、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物の製造方法は、哺乳動物由来の選択された組織を採取する工程と、選択された組織を滅菌生理食塩水または他の生体適合性の液体（限定でなく例示的に、リンゲル液または平衡生物学的塩類溶液を含む）中ですすぐ工程を含む場合がある。この態様において、選択された組織は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるものまたはないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織であり得る。もう一つの態様において、本方法は、選択された組織を約１２〜約３６時間、より好ましくは、約１８〜約３０時間、最も好ましくは、約２２〜約２６時間の範囲にある期間、凍結する工程を含む場合がある。例えば、選択された組織がその間凍結される期間は、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間及び前述の値の間に入る時間の任意の他の期間であり得ることが企図される。追加の態様において、本方法は、冷低張トリス緩衝液中で選択された組織を解凍する工程を含む場合がある。任意に、この態様では本方法は、選択された組織を氷冷した冷低張トリス緩衝液中で、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて解凍する工程を含む場合がある。実施態様では、選択された組織を凍結及び解凍するステップは、６回まで周期的に繰り返すことができることが企図される。
【０１９１】
もう一つの態様において、本方法は、選択された組織由来のＥＣＭ材料を単離する工程を含む場合がある。この態様において、ＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるものまたはないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織等の公知の細胞外マトリックス構成要素を含む任意の材料とすることができる。一つの例示的な限定しない態様において、ＥＣＭ材料を単離するステップは、哺乳動物組織由来からＳＩＳを単離する工程を含む場合がある。この態様では、本方法は、小腸の壁を該小腸の長手方向の軸に実質的に平行な経路に沿って切開する工程と、切開の経路に沿って小腸を開く工程であって、それによって小腸が表面上で平らな状態になる、工程と、滅菌生理食塩水または他の生体適合性の流体で小腸をすすぐ工程と、粘膜下層及び基底膜層を本質的に残して、ＳＩＳから小腸の周囲の平滑筋層及び漿膜層、並びに粘膜を機械的に取り去る工程とを含み得る。しかしながら、ＥＣＭ材料は、米国特許第４，９０２，５０８号；米国特許第５，２７５，８２６号；米国特許第５，２８１，４２２号；米国特許第５，５５４，３８９号；米国特許第６，５７９，５３８号；米国特許第６，９３３，３２６号；米国特許第７，０３３，６１１号；Ｖｏｙｔｉｋ−Ｈａｒｂｉｎ他、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ” Ｊ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., Ｖｏｌ. ６７, ｐｐ. ４７８−４９１ （１９９７）；Ｈｏｄｄｅ他、“Ｖｉｒｕｓ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ： Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｖｉｒａｌ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ,” Ｂｉｏｔｅｃｈ. ＆ Ｂｉｏｅｎｇ., Ｖｏｌ. ７９, Ｎｏ. ２, ｐｐ. ２１ １−２１６ （２００１）；Ｂａｄｙｌａｋ他、“Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｓ ａ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ,” Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ. １３, ｐｐ. ３７７−３８３ （２００２) ；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、“Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｅｐａｉｒ,” Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ, Ｖｏｌ. １１２, ｐｐ. Ｉ−１３５−Ｉ−１４３ （２００５）；Ｈｏｄｄｅ他、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ａｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ： Ｐａｒｔ Ｉ. Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ,” Ｊ. Ｍａｔｅｒ. Ｓｃｉ.: Ｍａｔｅｒ. Ｍｅｄ., Ｖｏｌ. １８, ｐｐ. ５３７−５４３ （２００７)；並びに、Ｈｏｄｄｅ他、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ａｎ ��ｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ: Ｐａｒｔ ＩＩ. Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ,“ Ｊ. Ｍａｔｅｒ. Ｓｃｉ.: Ｍａｔｅｒ. Ｍｅｄ., Ｖｏｌ. １８, ｐｐ. ５４５−５５０ （２００７）（各々が参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載された等のいずれかの従来技術を使用して単離され得ることが企図される。
【０１９２】
さらなる態様において、本方法は、単離されたＥＣＭ材料を、０．５〜１％トリトンＸ−１００／０．５〜１％デオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｉｎｃ．）中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて２４時間ないし４８時間インキュベートする工程を含む場合がある。この態様において、胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平らな、またはシート状のＥＣＭ材料は、伸張された形態でインキュベートされ得ることが企図される。さらに、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等のＥＣＭ材料の導管または他の内腔を有するＥＣＭ材料は、浸漬を通じて、及び蠕動ポンプを使用することにより様々な開示された溶液を用いて灌流され得る。
【０１９３】
さらなる態様では、インキュベーション後に、本方法は、ＥＣＭ材料をＤＰＢＳですすぐ工程を含む場合がある。この態様で、ＥＣＭ材料をすすぐステップは、１回、２回、３回、４回、５回または６回を含む６回までＥＣＭ材料をすすぐこと（各々のすすぎは約３０分間持続する）を含み得ることが企図される。一つの実施態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎは約３０分持続する）ことを含み得ることが企図される。
【０１９４】
任意で、実施態様において、本方法はさらに、第２のインキュベーション手順を含む場合がある。これらの態様において、第２のインキュベーション手順は、ＥＣＭ材料を、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを含有する等張トリス緩衝液内で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートする工程を含み得る。等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートするステップは、人体の温度に実質的に対応する約３７℃の温度で行われ得ることが企図される。さらに、等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートするステップは、約３０分ないし約２４時間、より好ましくは約1時間ないし約１８時間、最も好ましくは約２時間ないし約１２時間の範囲にある期間、行われ得ることが企図される。さらなる態様において、第２のインキュベーション手順は、さらに、ＤＰＢＳでＥＣＭ材料をすすぐ工程を含む場合がある。この態様では、ＥＣＭ材料をすすぐステップは、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎが約３０分間持続する）ことを含み得ることが企図される。
【０１９５】
またもう一つの態様では、第２のインキュベーション手順が行われるか否かに関わらず、本方法はＥＣＭ材料を、約１℃〜約１０℃、より好適に約２℃〜約６℃、最も好適に約３℃〜約５℃の範囲にある温度で保存する工程を含む場合がある。実施態様において、ＥＣＭ材料は４℃で保存される場合がある。
【０１９６】
さらなる態様において、本方法は、ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に導入する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤が、ＥＣＭ材料とともに反応容器の内部空間に加えられ得る。これらの態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤は、ＥＣＭ材料の前後に、またはＥＣＭ材料と同時に反応容器の内部空間に加えられ得る。さらに、温度制御ユニットが、反応容器の内部空間内に所望の温度を作り出すように選択的に調整され得ることが企図される。さらなる態様において、本方法は、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力を平衡にする工程を含む場合がある。例えば、この態様では、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力が大気圧と実質的に等しい場合があることが企図される。さらに別の態様では、装置内の圧力を平衡にした後に、本方法は、反応容器のインペラを活動化させるために磁気駆動部を動作させる工程を含む場合がある。またさらなる態様では、本方法は、反応容器内で所望の圧力が得られるまで、反応容器に保存シリンダから一次滅菌剤を選択的に導入する工程を含む場合がある。この態様では、反応容器に一次滅菌剤を選択的に導入するステップは、反応容器への一次滅菌剤の流れ込みを増大させるために、エアコンプレッサとブースターとを選択的に活動化させることを含み得ることが企図される。実施態様において、エアコンプレッサ及びブースターは、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素を作製するのに必要な圧力及び温度等の超臨界圧力及び温度を、約２０分から約６０分の範囲にある期間の間、ＥＣＭ材料に施すように活動化される場合がある。
【０１９７】
さらなる態様において、本方法は、反応容器を急速に減圧する工程を含む場合がある。この態様では、所定量の、限定でなく例示的に超臨界二酸化炭素等の一次滅菌剤が、減圧ラインを通じて反応容器から放出され得る。一次滅菌剤は、反応容器に結合した弁を開くことを通じて反応容器から放出される場合があり、そのことによって反応容器内の圧力を急速に減少させることが企図される。本明細書で使用される、用語「急速減圧」は、４００ｐｓｉ／分以上の速度での反応容器の減圧を指す。例えば、反応容器は、約２．９ＭＰａ／分ないし約１８．０ＭＰａ／分（約４２０ｐｓｉ／分ないし約２，６１０ｐｓｉ／分）、より好適に、約５．０ＭＰａ／分ないし約１０．０ＭＰａ／分（約７２５ｐｓｉ／分ないし約１，４５０ｐｓｉ／分）、最も好適に、約７．０ＭＰａ／分ないし約８．０ＭＰａ／分（約１，０１５ｐｓｉ／分ないし約１，１６０ｐｓｉ／分）の範囲にある減圧速度で減圧され得ることが企図される。従って、これらの急速な減圧は、米国特許第７，１０８，８３２号に開示された３００ｐｓｉ／分の減圧速度よりも著しく大きい。いかなる特定の理論に拘束されることなく、開示の急速な減圧速度は、ＥＣＭ材料で達成される脱細胞化のレベルを増加させると考えられる。例えば、開示のＥＣＭ材料の急速な減圧は、結果として約９６％を超える（９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００．０％を含む）ＥＣＭ材料の脱細胞化のレベルをもたらし得る。
【０１９８】
実施態様において、本方法はさらに、ＥＣＭ材料に1つ以上の添加物を組み込むステップを含む場合がある。これらの態様では、1つ以上の添加物は、粉末または液体の形態のいずれかで提供され得ることが企図される。一つの任意の態様において、1つ以上の添加物を組み込むステップは、反応容器を急速に減圧するステップの間に、反応容器に1つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、1つ以上の添加物の導入は、従来の泡沫プロセスとして位置付けられる場合があることが企図される。別の任意の態様において、1つ以上の添加剤を組み込むステップは、反応容器を急速に減圧するステップの後、反応容器内に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物は、反応容器の急速な減圧がＥＣＭ材料を増大させ、及び／または伸展させた後にＥＣＭ材料に添加され、それによってＥＣＭ材料への添加物の浸透を向上させるようにすることが企図される。さらに、実施態様において、１つ以上の添加物は、反応容器の急速減圧の後、約３０分以内にＥＣＭ材料に添加され得ることが企図される。さらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込むステップは、反応容器を急速減圧するステップの間、及びそのステップの後の両方で、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物が速い方法及び遅い、拡張された方法の両方で反応容器内に放出され得ることが企図される。またさらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込むステップは、反応容器を急速に減圧するステップの前に、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。
【０１９９】
開示の添加物は、結果として得られる滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物に選択された特性を付与するために、ＥＣＭ材料に組み込まれ得る。このように、１つ以上の添加物は、本明細書に記載のように、ＥＣＭ材料の処理中に失われるＥＣＭ材料の構成要素を置換または補完するように選択され得ることが企図される。例えば、以下に記載されるように、１つ以上の添加物は、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、薬物または細胞を含む場合がある。さらに、１つ以上の添加物が、ＥＣＭ材料に非天然の構成要素を組み込むように選択され得ることが企図される。例えば、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞を動員するための増殖因子、血管新生サイトカイン及び抗炎症性サイトカインを含む場合がある。またさらに、１つ以上の添加物は、スタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤等の薬剤であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、イリジウムナノ粒子、ロジウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、亜鉛ナノ粒子及びその他金属ナノ粒子等のナノ粒子であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、金属化合物であり得ることが企図される。１つの実施態様において、１つ以上の添加物は、得られるＥＣＭ組成物を対象の体内に移植した後に、対象の免疫反応を薬学的に抑制するように選択され得る。
【０２００】
一つの態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、形質転換増殖因子ベータ−１、−２、−３（ＴＧＦ−β−１、−２、−３）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られる）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む１つ以上の増殖因子を含む場合がある。
【０２０１】
他の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、アンフィレグリン、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、トロンボスポンジン３、トロンボスポンジン４、トロンボスポンジン５及びアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を含む１つ以上のサイトカインを含む場合がある。
【０２０２】
追加の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ベータグリカン、シンデカン、デコリン、アグリカン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、ルミカン、エピフィカン、パールカン、アグリン、テスティカン、シンデカン、グリピカン、セルグリシン、セレクチン、レクチカン、ベルシカン、ニューロカン及びブレビカンを含む１つ以上のプロテオグリカンを含む場合がある。
【０２０３】
さらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）及びコンドロイチン硫酸Ａを含む1つ以上のグリコサミノグリカンを含む場合がある。
【０２０４】
またさらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、ベルシカン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリリン１、フィブリリン２、プラスミノーゲン、小ロイシンリッチタンパク質、細胞表面付随性タンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、マトリカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カドヘリン、免疫グロブリン、マルチプレキシン、細胞質領域―４４（ＣＤ−４４）、アミロイド前駆体タンパク質、テネシン、ナイドジェン／エンタクチン、フィビュリンI、フィビュリンII、インテグリン、膜通型分子及びオステオポンチンを含む１つ以上のタンパク質、ペプチドまたは核酸を含む場合がある。
【０２０５】
さらに別の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチン等のスタチン薬物、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤、抗菌剤、抗生物質等を含む１つ以上の薬剤を含む場合がある。
【０２０６】
実施態様において、反応容器中に１つ以上の添加物を導入するステップは、１つ以上添加物が、リザーバから入口ポートに流れるように弁を開けることを含む場合がある。加圧の前に、１つ以上の添加物は、シールに先だって反応容器内に直接導入、及び／または入口ポートを介して導入され得ることが企図される。
【０２０７】
開示される反応容器の急速減圧及び再加圧は、１つ以上の添加物の添加のあるなしに関わらず、任意の所望のサイクル数で繰り返され得ることが企図される。さらに、減圧と再加圧のサイクル、並びに、一次滅菌剤及び／または二次殺菌剤及び／または添加物の導入が、システムの様々な弁を選択的に開く及び／または閉じるように構成された制御器を介して自動的に制御され、所望の圧力条件及びサイクルを達成し得ることが企図される。
【０２０８】
いくつかの態様では、開示される方法は、さらに、反応容器の内容物を攪拌するステップを含む場合がある。これらの態様では、反応容器の内容物を攪拌するステップは、振動器を用いて反応容器の内容物を周期的に攪拌することを含み得ることが企図される。さらに、反応容器の攪拌は、断続的、継続的または連続的であり得ることが企図される。実施態様において、反応容器の内容物を攪拌するステップは、一次滅菌剤を反応容器内に導入するステップ中に起こる場合がある。反応容器の内容物の撹拌は、反応容器内の流体の空隙を排除しＥＣＭ材料と滅菌剤及び／または添加物とをより完全に接触させることにより、滅菌剤及び／または添加物の物質移動を強化し得ることが企図される。さらに、反応容器の内容物を攪拌するステップは、滅菌時間、温度、加圧／減圧サイクルを最適化するように攪拌の強度及び持続時間を選択的に調整することを含み得ることが企図される。
【０２０９】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料の滅菌及び脱細胞化が完了した後、本方法はさらに、反応容器を減圧する工程及び攪拌翼（インペラ）の動作を停止するように磁気駆動部を非活動化させる工程を含む場合がある。最後に本方法は、結果として得られる、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を反応容器の上部を通じて取り外すステップを含む場合がある。
【０２１０】
開示のステップの持続時間、並びに開示のステップに関連する温度及び圧力は、ＥＣＭ材料の特性の多様性を考慮して選択的に変更され得ることが企図される。例えば、ＥＣＭ材料が多積層構造であり、増大した厚さを有し、または注射器内に配置される場合、開示のステップの持続時間が増加され得ることが企図される。
【０２１１】
一つの任意の態様においては、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を微粒子形態に作製するために、本方法は、ＥＣＭ組成物を所望の長さを有する断片に切断する工程を含む場合がある。別の態様において、本方法は任意に、ＥＣＭ組成物の断片を凍結乾燥させる工程を含む場合がある。追加の態様において、本方法は任意に、ＥＣＭ組成物の凍結し水和した断片を粉砕する工程と、次いでＥＣＭ組成物の断片を、所望のサイズのＥＣＭ微粒子が単離されるまで、サイザースクリーンを通過させる工程を含む場合がある。さらなる任意の態様では、本方法は、本明細書に記載されるように、ＥＣＭ懸濁液を形成するために、滅菌生理食塩水または他の無菌の生体適合性流体でＥＣＭ微粒子を再水和させる工程を含む場合がある。
【０２１２】
実施例
以下の実施例は、当業者に、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、装置及び／または方法がどのように作製され、評価されるかという完全な開示及び説明を提供するように述べられるものであり、単に例示的であることが意図され、本開示を限定することを意図するものではない。数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、いくらかの誤差や偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃または雰囲気温度におけるものであり、圧力は大気圧またはその近傍におけるものである。
【０２１３】
実施例1：ＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）の治療を受ける患者における新規発症の術後心房細動の後向き評価
ＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）が利用された、後向き、多施設のツーアーム（２群）のカルテ審査が行われた。この後向き試験の目的は、正常な心膜防壁を再構成するためにＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）を利用することによって、新規発症の術後心房細動が心膜閉鎖を受けなかった患者と比べて、発生頻度が低くなるかどうかを評価することであった。
【０２１４】
ＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）は、開心術後の心嚢の再構成及び修復のために使用され得る。損なわれていなければ、心嚢は、心臓へ受動的抑制を提供して過拡張を防ぎ、突然の容積変化を調節することを助けることができる。ＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）で心嚢を再構成することによって、天然心膜の抑制を回復することができる。この後向き臨床試験の目的は、新規発症の術後心房細動の軽減が観察されるかどうかを、分離した冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）処置後に心膜閉鎖を受けなかった患者と比較して、天然心嚢をＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）で再構成した患者を分析することによって評価することであった。
【０２１５】
ＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）は、医師が処置のために必要であると判断する大きさに切断され得る、様々な寸法の４層のシートで供給された。
【０２１６】
この後向き研究のために使用される、新規発症の術後心房細動の定義は、Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＳＴＳ）Ａｄｕｌｔ Ｃａｒｄｉａｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｄａｔａｂａｓｅ ２００７で使用される定義に基づく。定義は以下のとおり、「患者が処置を必要とする心房細動／粗動（ＡＦ）の新規発症を有したかたどうかを示す。術前に存在していたＡＦの再発は含まない。術前心房細動（処置済みまたは未処置の）を有する患者は含まない。事象は新しい由来のものでなければならない」となる。
【０２１７】
全ての患者は、この後向き臨床試験の一部として含まれるために、以下の包含基準、すなわち、本心臓手術が対象の最初または一次の心臓手術であり、対象は必ず分離したＣＡＢＧ処置を受けていなければならない、を満たす必要があった。
【０２１８】
患者が、以下の除外基準、すなわち、心房細動の既往歴、開心術の既往歴、心膜炎の既往歴、過去６ヶ月以内のアミオダロンの既往歴、及び弁手術が付随して予定される、のうちの１つ以上を満たした場合、この後向き臨床試験の一部として含まれなかった。
【０２１９】
ＣｏｒＭａｔｒｉｘ（商標）ＥＣＭ（商標）で再構成される天然心嚢を有した患者は、分離されたＣＡＢＧ処置の後に心膜閉鎖を受けなかった患者と比べて、Ａ‐ｆｉｂの発生率において統計的に著しい減少を示した。Ａ‐ｆｉｂの通常の発生率は、約２５％である。これらの研究において、Ａ‐ｆｉｂの発生率は、４％と８％（１／２５と４／５２）の間であった。
【０２２０】
実施例２：無細胞マトリックスエマルションでの心臓リモデリングの調節は、心筋梗塞後のＣ‐キット陽性細胞を動員することにより筋線維芽細胞増殖を伴う。
天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解は、梗塞後の不適応な心臓リモデリングに関連するものであった。本明細書に示されるように、梗塞を起こした心筋へ注入された異種の無細胞マトリックスエマルションは、宿主Ｃ‐キット陽性細胞を動員することにより、筋線維芽細胞増殖及び血管形成を促した。
【０２２１】
６４匹のラットは４５分間の局所虚血にさらされ、次に３、７、２１、及び４２日間の再潅流にさらされた。組織学的検討は、免疫組織学的な染色によって実施され、心臓機能は、心エコー検査を使用して分析された。ＥＣＭエマルション（３０〜５０μＬ）は、再潅流後、虚血域（ａｒｅａ ａｔ ｒｉｓｋ）心筋へ注入され、エマルションの適用部位はマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｍｅ）染色で確認された。再潅流７日目、エマルション領域内のＣ‐キット陽性細胞の集団は、ウェスタンブロッティングによって検出された３１ｋＤａ幹細胞因子の著しく強化された発現と一致して、対照群と比較して大幅に増加した（３２±０．６* ｖｓ. １５±３／１０００核）。本変化に伴って、筋線維芽細胞は対照群と比べて、エマルション部位で著しい範囲まで堆積した（５９±８* ｖｓ. ３０±３／ＨＰＦ）。アルファ平滑筋アクチン陽性血管（７０±１０* ｖｓ. ２０±４／ＨＰＦ）及びｖＷＦ陽性血管（９５±１４* ｖｓ. ３４±８／ＨＰＦ）の密度のそれぞれが増加したことによって証拠立てられるように、ＶＥＧＦの強い免疫反応性がエマルション域で観察され、血管形成は対照に対して著しく強化された。再潅流４２日目、心エコー検査は、エマルション群の収縮末期容量（０．３±０．１* ｖｓ. ０．６±０．３ｍＬ）、短縮率（３３±５* ｖｓ. ２４±６％）及び駆出分画（６７±６* ｖｓ. ５３±１０％）で改善を示した。エマルション群での梗塞性の中央前中隔の壁の厚さもまた対照群でのものよりも著しく大きかった（０．１９±０．０２* ｖｓ. ０．１５±０．０２ｃｍ）。
【０２２２】
虚血性／再潅流心筋への無細胞系細胞外マトリックスエマルションの心筋内注入は、Ｃ‐キット陽性細胞の動員により、強化された筋線維芽細胞の増殖及び血管新生によって潜在的に仲介され、不適応の心臓リモデリングを弱め、心臓機能を保存した。*ｐ＜０．０５エマルション vs. 対照。
【０２２３】
実施例３
開示された滅菌及び脱細胞化方法の実施例の適用において、選択された組織が採取され滅菌生理食塩水ですすがれた。その後選択された組織は、２４時間凍結された。凍結された組織は５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて冷やした冷低張トリス緩衝液中で解凍された。本明細書に記載のように、細胞外マトリックス材料が次いで、各々の選択された組織から単離された。
【０２２４】
単離された細胞外マトリックス材料は、０．５〜１％トリトンＸ−１００／０．５〜１％デオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｉｎｃ．）中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて、２４〜４８時間インキュベートされた。胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平らな細胞外マトリックス材料は、伸張された形態でインキュベートされた。尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等の管状の細胞外マトリックス材料は、浸漬を通じ、蠕動ポンプを用いて溶液で灌流された。
【０２２５】
インキュベーション後、各々の細胞外マトリックス材料は、ＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを使用した各々のすすぎは、３０分間持続した。その後いくつかの細胞外マトリックス材料が、２〜１２時間に渡って３７℃で、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを含有する等張トリス緩衝液中で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートされた。該インキュベーションステップの後、細胞外マトリックス材料は、再びＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを用いた各々のすすぎは３０分間持続した。細胞外マトリックス材料は４℃で保存された。
【０２２６】
保存の４８時間以内に、細胞外マトリックス材料は、本明細書で開示のように、超臨界二酸化炭素内で２０〜６０分間、３１．１℃以上の温度及び１，０７１ｐｓｉ以上の圧力で処理された。この滅菌ステップの後、細胞外マトリックス材料は、２．７ＭＰａ／１０秒（３９１．６ｐｓｉ／１０秒）の速度で１分１９秒間、急速に減圧された。この間に、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａへ急速に減少した。
【０２２７】
細胞外マトリックス材料は、次いで、最終の滅菌を達成するために、３０分〜６時間、本明細書に開示のように、超臨界二酸化炭素及び過酢酸（ＰＡＡ）内で処理された。この処理ステップでは、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａに増加した。得られた滅菌無細胞の細胞外マトリックス材料は、その後、流体の漏れを防止するためにプラスチック製のパウチ内にシールされたＴｙｖｅｋ（商標）（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）のパウチに詰められた。
【０２２８】
表１は、ブタ尿管、ウシ心嚢及びブタ中皮の滅菌及び脱細胞化をまとめたものである。
【表１】
2014519911.tif 000002
【０２２９】
実施例４
ＥＣＭ材料サンプルのＤＮＡ含有量が、様々な滅菌及び脱細胞化技術を用いたそれぞれのＥＣＭ材料サンプルの脱細胞化の指標として測定された。測定されたＤＮＡ含有量は、ピコグリーン（ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ）アッセイで評価され、ＤＮＡは蛍光ラベルでラベルされ、分光光度計で検出された。測定されたＤＮＡ含有量は、サンプルの乾燥重量で正規化された。ＤＮＡ含有量は、以下の、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  による６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  による２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳ、の処理群について測定、評価された。
【０２３０】
図１は、乾燥重量で正規化されたそれぞれのサンプルの総ＤＮＡ含有量を示す。図２は、生の、未処理のＳＩＳと比較した、各それぞれのサンプルから除去されたＤＮＡの割合を示す。これらの結果は、非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた６０分間の処理を使用して滅菌することにより、生のＳＩＳに見られるＤＮＡの９６％を超えるものが除去されたことを示し、比較して、ＳＩＳがＥｔＯによって滅菌された場合は９４％のみ、ＳＩＳがいずれの方法でも滅菌されなかった場合は９３％のみであることを示した。
【０２３１】
実施例５
尿管が、強くない洗浄剤（ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡ内の０．５％トリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）を用いて２４時間処理され、次いで、本明細書で開示されたように、ＤＰＢＳ内で三回すすがれた。この前処理の後に、尿管は、本明細書に開示されたように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  での処理とを使用して脱細胞化され滅菌された。ヘマトキシリンエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色が、以下の処理の段階、すなわち、（Ａ）天然尿管、（Ｂ）前処理された尿管、及び（Ｃ）前処理された尿管に、本明細書に開示のように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  での処理を用いたものの１つのサンプルの尿管のために調製された。これらの染色は、急速減圧によりＤＮＡ含有量が著しく減少したことを示した。
【０２３２】
実施例６
ＥＣＭ材料サンプルの増殖因子の含有量が測定された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がＥＣＭ材料サンプルに対して実施され、各それぞれのサンプルの、ｂＦＧＦ及び活性型ＴＧＦベータの含有量が定量化された。以下の処理群、すなわち、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳの処理群が評価された。ｂＦＧＦ含有量及びＴＧＦベータ含有量の測定は、各それぞれのサンプルの乾燥重量で正規化された。それらの結果が図３及び図４に示されている。それらの結果は、ＥｔＯにさらしたことにより、両方の増殖因子の濃度が低下したことを示した。しかしながら、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２  を用いた滅菌では、増殖因子の濃度に影響はなかった。
【０２３３】
実施例７
本明細書に開示された方法により、超臨界ＣＯ２  が、一次滅菌剤として、また、ＳＩＳシート内へｂＦＧＦを添加するための担体として使用された。まず、それぞれのＳＩＳシートは、ｂＦＧＦの様々な量に従ってＴｙｖｅｋ（商標）パウチに入れられた。パウチは９．６ＭＰａで６０分間超臨界ＣＯ２  に曝露された。パウチは、７．２０ＭＰａ／分の速度で急速に減圧された。サンプルは、２０分間、超臨界ＣＯ２  において１６ｍＬのＰＡＡ中で直接処理された。以下の処理群、（１）ｂＦＧＦ無添加、（２）５μＬのｂＦＧＦ添加、（３）１５μＬのｂＦＧＦ添加が評価された。各μＬのｂＦＧＦは０．１μｇのｂＦＧＦを含有した。従って、各ＳＩＳシートは約０．５ｇの重量であったため、５μＬ及び１５μＬの群について、ｂＦＧＦの最大濃度はそれぞれ、約４１７０ｐｇ／ｍｇの乾燥重量及び約１２，５００ｐｇ／ｍｇの乾燥重量だった。それぞれのサンプルの乾燥重量に関して測定されたそれらの群のｂＦＧＦの含有量が、図５に示されている。これらの結果は、ｂＦＧＦの測定された濃度が最大の濃度に達しなかったこと、及び１５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプルは、５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプル中のｂＦＧＦの測定された濃度の３倍を超えるｂＦＧＦの測定された濃度を有しないことを示した。
【０２３４】
実施例８
二層のＳＩＳサンプルの引張強度が測定された。以下の処理群、（１）ＥｔＯ処理、（２）２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  処理、（３）６０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  処理、及び（４）１２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  処理が評価された。張強度試験の結果が図６に示されている。これらの結果は、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ／超臨界ＣＯ２  で２０分間または１２０分間処理されたＳＩＳのサンプルは、ＥｔＯで処理されたＳＩＳのサンプルよりも著しく強度が高いことを示すものであった。
【０２３５】
実施例９
急速減圧は、表２（下記）に挙げられたＥＣＭ材料の記載の濃度及び記載の期間の強くない洗浄剤の浸漬また灌流後に使用された。組織は採取され、生理食塩水ですすがれた。組織は少なくとも２４時間凍結された。組織は５ｍＭのＥＤＴＡを用いて冷やした冷低張トリス緩衝液中で解凍された。目的のＥＣＭが単離された。平らな組織（例えば、胃粘膜下層、小腸粘膜下層及び膀胱粘膜下層）について、組織は、組織引張装置において伸張され、伸張された形態で、溶液中でインキュベートされた。管状の組織（例えば、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ）について、組織は蠕動ポンプを使用して溶液で灌流され、インキュベーション中に浸漬された。組織は、ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて０．５％トリトンＸ−１００／０．５％デオキシコール酸内で、２〜２４時間インキュベートされた。組織はＤＰＢＳ内で、１回につき１５〜３０分間、３回すすがれた。組織は４℃で保存された。組織の保存の４８時間以内に、組織は超臨界ＣＯ２  内で２０〜１２０分間処理され、続いて急速に減圧（ＲＤＰ）された（圧力の減少は１分１９秒間に９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａ、２．７ＭＰａ／１０秒の減圧に対応）。
【表２】
2014519911.tif 000003
【０２３６】
結果は、超臨界ＣＯ２  曝露に続く急速減圧（ＳＣＣＯ２  ＋ＲＤＰ）が、ＥＣＭの増殖因子を維持しながら、細胞の残余物とＤＮＡの除去を確かに補助したことを示すものであった。
【０２３７】
実施例１０
様々なＥＣＭ組成物の増殖因子の含有量は、代表的な増殖因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて分析された。ｂＦＧＦは、それが天然のＥＣＭ組織によく見られる増殖因子であるため選択された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）が、以下の（１）未処理（生）のＳＩＳ、（２）洗浄剤浸漬（ＴＸ−デオキシ）のみの後のＳＩＳ、（３）ＴＸ−デオキシ及びＲＤＰ（ＳＣＣＯ２  を含む）の後のＳＩＳ、（４）ＴＸ−デオキシ、ＲＤＰ及びＰＡＡ（滅菌のためにＰＡＡとともにＳＣＣＯ２  ）の後のＳＩＳ、（５）ＴＸ−デオキシ及びＰＡＡの後のＳＩＳ、（６）ＥｔＯで滅菌されたＳＩＳ（Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．提供）、及び（７）非滅菌ＳＩＳ（Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．提供）のサンプルのｂＦＧＦ含有量を測定するために使用された。
【０２３８】
これらの検討において、ＳＩＳが、ＲＤＰを用いてまたは用いないで処理されたＥＣＭ組成物とＣｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．提供のＳＩＳとを比較するために使用された。処理されたＳＩＳのいくつかはまた、脱細胞化の後、記載されたＳＣＣＯ２  ＋ＰＡＡ方法により滅菌された。それぞれのＥＣＭ組成物の測定された増殖因子の含有量が図７に示されている。
【０２３９】
それらの結果は、ｂＦＧＦ含有量の維持において、急速減圧プロセスが他の脱細胞化プロセスよりも有効であり、残存するＤＮＡ及び細胞片を除去するための追加のＲＤＰ処理は、ｂＦＧＦの小さい損失しか生じさせないことを示すものであった。比較して、ＰＡＡ滅菌プロセスは、ＲＤＰが行われないときでさえ、ほぼすべての残ったｂＦＧＦを除去するように思われた。さらに、急速減圧プロセスは、Ｃｏｏｋの脱細胞化方法に比べ、天然ＳＩＳ内のｂＦＧＦ含有量をより多く保存した。これらの結果から、増殖因子はすべて同じようにＥＣＭ組成物に結合しているので、ｂＦＧＦ含有量が減少した場合、すべての他の増殖因子の含有量も同様に減少したものと見なされる。
【０２４０】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術水準をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【０２４１】
当業者には、本発明の範囲または思想から逸脱することなく様々な修正及び変形が本発明においてなされ得ることは明らかであろう。本発明の他の実施形態が、本明細書に開示された本発明の詳細な説明及び実施例を考慮することにより、当業者には明らかであろう。発明の詳細な説明及び実施例は単に例示的なものと見なされることが意図され、本発明の正確な範囲及び思想は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2014519911.tif 000004
【図２】
2014519911.tif 000005
【図３】
2014519911.tif 000006
【図４】
2014519911.tif 000007
【図５】
2014519911.tif 000008
【図６】
2014519911.tif 000009
【図７】
2014519911.tif 000010
【図８】
2014519911.tif 000011
【図９】
2014519911.tif 000012
【図１０】
2014519911.tif 000013
【図１１】
2014519911.tif 000014
【図１２】
2014519911.tif 000015
【国際調査報告】
2014519911.tif 000016