(57)【要約】  ナノチャンネル（２１０）中に存在する生体分子（３２０）の迅速な定量のための方法および装置が権利請求される。特に、本発明は、液体の駆動および一過性に固定化された生体分子（３４０）のナノチャンネルを横切る濃度勾配を生成する選択的に官能基化された表面についての新規概念に関する。本概念は、着目の生体分子（３２０）相互作用の定量化を可能とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの基材（２０１、２０２）の間に画定され、バイオマーカーが固定化される１つまたは数個の選択的に官能基化された領域（２１１）を有するナノチャンネル（２１０）を含む、蛍光標識生体分子（３２０）を検出し、定量化するためのバイオセンサー（２００）であって、前記ナノチャンネルはさらに、側面インプット開口部（２２０）および側面アウトプット開口部（２３０）によって画定されており、前記インプット開口部（２２０）は、生体分子（３２０）を含有する溶液を前記ナノチャンネル（２１０）に進入させるように適合されており、前記アウトプット開口部（２３０）は、毛細管現象によって前記ナノチャンネル（２１０）を通して前記溶液を推進するように適合されている、前記バイオセンサー（２００）。
【請求項２】
前記バイオマーカー（３１０）が、特定の生体分子（３２０）と生物学的または化学的に相互作用し、および／または前記溶液（３００）中に含有される非特異的生体分子（３３０）と相互作用しないように適合されている、請求項１に記載のバイオセンサー（２００）。
【請求項３】
前記基材（２０１、２０２）が、シリコン、ガラス、プラスチックおよび酸化物化合物から成る群から選ばれる材料から作られている、請求項１または２に記載のバイオセンサー（２００）。
【請求項４】
前記アウトプット開口部（２３０）が、前記ナノチャンネル（２１０）を通して前記溶液を推進するように適合された駆動要素（２４１または２４２）を有しているかまたはそれと接触している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサー（２００）。
【請求項５】
前記ナノチャンネル（２１０）および前記側面開口部（２２０、２３０）内部の非官能基化表面が、１ｎｍから１０００ｎｍの間の厚さを有する、金属化合物、プラスチック化合物および酸化物化合物から成る群から選ばれる材料の薄層を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサー（２００）。
【請求項６】
前記側面開口部（２２０、２３０）が、１００ｎｍ２から２０ｍｍ２までの面積を有し、かつ前記ナノチャンネル（２１０）が、２ｎｍから１０００ｎｍの高さ、２ｎｍから２０ｍｍの幅、および２ｎｍから２０ｍｍの長さを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサー（２００）。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の数個のバイオセンサー（２００）を含むアレイであって、前記バイオセンサー（２００）がカプセルシステム（１０１）内部または表面（１０２）上に固定されている、前記アレイ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に定義された１つまたは数個のバイオセンサー（２００）から成り、かつ蛍光励起および検出のための光学的手段（５００）を含む、アセンブリー。
【請求項９】
前記光学的手段（５００）が、検出器アレイ（ＣＭＯＳもしくはＣＣＤ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、または光電子増倍管（ＰＭＴ）などの単一光子検出器である検出器を含む蛍光測定ユニットである、請求項８に記載のアセンブリー。
【請求項１０】
溶液（３００）中の蛍光標識生体分子（３２０）の存在を検出し、定量化する方法であって、以下の：
ａ）少なくとも１つの、請求項１〜６のいずれか１項に定義されたバイオセンサー（２００）；
ｂ）バイオマーカー（３１０）に対して特異的であることができ、前記ナノチャンネル中に固定化され、かつ、前記カプセルシステム（１０１）または前記表面（１０２）中には固定化されない標識生体分子（３２０および／または３３０）を含有する水溶液（３００）を、側面インプット開口部（２２０）から前記側面アウトプット開口部（２３０）まで前記ナノチャンネル（２１０）を横切って置くことによる、前記バイオセンサー（２００）の充填メカニズム；
ｃ）光学システム（５００）；
ｄ）前記ナノチャンネル（２１０）内部のバイオマーカー（３１０）上に固定化された特定の生体分子（３２０）に結合したフロオロフォアの光退色による前記生体分子（３２０）の検出、ならびに前記ナノチャンネル（２１０）の長さにわたる濃度勾配の決定、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
前記生体分子（３２０）が、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、アミノ酸、核酸、酵素、脂質分子、ペプチド、ポリサッカライドまたはウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的に官能基化されたナノ流体バイオセンサーにおける光学システムを用いた蛍光標識生体分子の検出のための方法および装置に関する。本発明は、生体医学サンプルおよび生物学サンプルの迅速な定量のために有利に使用されることができる。
【背景技術】
【０００２】
ナノ流体バイオセンサーは、溶液中の生体分子の存在を定量化するために使用される、ナノメーターサイズの限局域（confinement）および／または側面開口部を有する流体システムとして定義される。現在のナノ流体バイオセンサー開発の大半は、生物工学的および生命工学的応用を目的とする。本発明の範囲において、バイオセンサーは、インビトロの診断への応用のために、溶液中の生体分子の存在の定量化に使用される。
【０００３】
スイス特許出願第ＣＨ０１８２４／０９号は、生体分子相互作用の検出のための側面開口部を有するバイオセンサーを開示し、ＰＣＴ国際特許出願第ＩＢ２０１０／０５０８６７号は、単純な光学システムと一緒のそれらの使用を開示する。これらの構成における生体分子の拡散は遅く、安定な測定条件に到達するまでの長い待ち時間または生体分子相互作用の観察のための高濃縮溶液のいずれかを必要とする。
【０００４】
生物学的マーカーとも呼ばれるバイオマーカーは、生体分子の存在を検出するための特異的指示薬として使用される。生物学的過程、発病過程、または治療的介入への薬理反応の指示薬として客観的に測定され、評価されることが特徴である。
【０００５】
特定の生体分子の検出に関する現在のプラクティスは、２つのカテゴリー：（ａ）標識化技術、および（ｂ）無標識技術に分けることができる。
【０００６】
標識化技術の中で広く使用されるのは、蛍光、比色、放射能、燐光、生物発光および化学発光である。官能基化磁性ビーズも標識化技術と考えられる。標識化技術の利益は、無標識方法に比較した感度および特異的標識による分子認識である。
【０００７】
無標識技術の中で広く使用されるのは、電流測定センサー、容量センサー、電気伝導度センサー、またはインピーダンス測定センサーを指す電気化学的バイオセンサーであり、迅速で安価であるという利益を有する。それらは、生体分子が電極上またはその近くに捕捉されるかまたは固定化されるときの電極構造の電気的性質の変化を測定するが、これらの概念はすべて分子特異的な対比、感度および信頼性を欠いている。
【０００８】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、主に血清中の可溶性生体分子の存在を検出するために使用される重要な生化学技術であり、したがって、医学における診断ツールおよび様々な産業における品質管理チェックとして広く使用されている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ分析は高価で、大量の溶液を必要とし、かつ、時間がかかる。
【０００９】
生体分子による診断のための他の重要な技術は、ウエスタンおよびノーザンブロット、タンパク質電気泳動およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかしながら、これらの方法は高濃縮の分析物を必要とし、ハイスループットのサンプル試験が可能でない。
【発明の概要】
【００１０】
目的
本発明の目的は、複雑な操作を必要としない、安価で迅速なナノ流体バイオセンサーを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、バイオセンサーの高い感度を得るために、ナノ流体工学を用いて光学的測定体積を幾何学的に限定し、かつ、ナノチャンネル表面を選択的に官能基化することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、生体分子が固定化されたバイオマーカーと相互作用する確率を増大させるために、ナノメーターサイズの限局域（ナノチャンネル）を横切って対流を押し進めることによって検出の感度を高めることである。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の図面および好ましい実施態様を参照することによってますます明らかとなるであろう。
【００１４】
発明の概要
本発明は、選択的に官能基化された表面を有するナノメーターサイズの限局域に生体分子を進入させることが、生体分子が固定化されたバイオマーカーと相互作用する確率を大きく増大させるという発見に基づく。これは、蛍光標識生体分子の存在の超低濃度における定量を可能とする。
【００１５】
本発明はまた、生体分子に結合したフルオフォア（fluorophore）の光退色のモニタリングが、バイオマーカーと相互作用してナノチャンネル内に固定化された生体分子と単純に検出体積を通って拡散している生体分子とを識別するために使用可能であるという発見にも基づく。
【００１６】
さらに、本発明は、分析する溶液をナノチャンネルを通して対流させるために駆動部品を使用する可能性に脚光を当てる。
【００１７】
本明細書において、用語「駆動部品」は、ナノチャンネルを通る溶液の流れを推進するために使用可能な任意の要素、例えば、吸収要素、として理解されなければならない。
【００１８】
本発明の範囲において、その高い表面積対体積比のためにナノ流体工学が使用され、これは、検出体積中に含まれる表面が、生体分子と表面上に固定化されたバイオマーカーの間の相互作用の確率を最大化することを意味する。それはまた、検出体積内の基材の割合が低いことによって、溶液のバックグラウンドシグナルを大きく低下させる。
【００１９】
したがって、本発明は、請求項に定義されたバイオセンサーに関する。
【００２０】
それはまた、上記バイオセンサーを使用するアセンブリーおよび方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】ナノ流体バイオセンサー２００のアレイを収容するカプセルシステム１０１の透視図である。蛍光標識された生体分子を含有する溶液３００が、ピペットシステム４００によってカプセル１０１の内部に置かれる。レーザービーム５１０に基づく光学システム５００が測定のために使用される。
【図１ｂ】ナノ流体バイオセンサー２００のアレイを収容する表面１０２の透視図である。蛍光標識された生体分子を含有する溶液３００が、ピペットシステム４００によって表面１０２上に置かれる。レーザービーム５１０に基づく光学システム５００が測定のために使用される。
【図２ａ】バイオマーカー３１０により官能基化された領域２１１および該官能基化を阻止する他の領域２０３によって局所的に構築される２つの基材２０１および２０２によって画定されるナノ流体バイオセンサーの断面図を示す。生体分子を含有する試薬溶液３００がナノチャンネル２１０に進入し、外部駆動部品２４１によって駆動される。レーザービーム５１０は、検出体積５２０中の固定化された生体分子３４０の光退色をモニターする。
【図２ｂ】２つの基材２０１および２０２によって画定されたナノ流体バイオセンサーの断面図を示す。基材のうちの１つだけが、バイオマーカー３１０によって官能基化された領域２１１および該官能基化を阻止する他の領域２０３によって局所的に構築される。生体分子を含有する試薬溶液３００がナノチャンネル２１０に進入し、内部駆動部品２４２によって駆動される。レーザービーム５１０は、検出体積５２０中の固定化された生体分子３４０の光退色をモニターする。
【図３】ナノチャンネルの長さにわたる特定の生体分子の経時的な濃度展開を図示する。
【図４】所与の時間ｔ1の間のナノチャンネルの長さにわたる特定の生体分子の濃度プロフィールを示す。マークされた領域は、特定の生体分子の検出された部分を表す。
【図５】ナノチャンネルの長さにわたる非特異的生体分子（バックグラウンド）の経時的な濃度展開を図示する。
【図６】所与の時間ｔ1の間のナノチャンネルの長さにわたる非特異的生体分子の濃度プロフィールを示す。マークされた領域は、バックグラウンドに相当する特定の生体分子の検出された部分を表す。
【図７】固定化された特定の生体分子に結合したフルオロフォアの標準的な光退色曲線を図示する。
【図８】ナノチャンネル内部の非特異的生体分子についての、時間の関数としての蛍光強度曲線を図示し、バックグラウンドノイズのみが検出されることを示す。
【図９】時間の関数としての、ナノチャンネル内部の溶液の流速を示す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用されるとおり、用語「生体分子」は、例えば、抗体またはサイトカイン、などのタンパク質、ペプチド、核酸、脂質分子、ポリサッカライドおよびウイルスを含む（が、それらに限定されない）、総称であることを意図する。
【００２３】
本明細書中で使用されるとおり、用語「ナノチャンネル」は、少なくとも１つのナノメーターサイズの寸法を有する、よく画定された微細加工構造体を意味する総称であることを意図する。スリットに進入しなければならず、かつ、同程度の大きさの、最小の検出されるべき生体分子のサイズのために、ナノチャンネルのナノメーターサイズの寸法は、２ｎｍより高く定められる。典型的に同程度の大きさである、光学システムの検出体積の範囲のために、本発明は、１ミクロンよりも低い高さを有するナノチャンネルに限定される。
【００２４】
本発明は、官能基化された表面の限局により特異的バイオマーカーとの相互作用の確率を増大させることによって、生体分子の検出を促進することを目的とする。図１ａおよび図１ｂに示すように、ナノ流体バイオセンサー２００のアレイがカプセルシステム１０１中または表面１０２上に固定化される。蛍光標識された着目の生体分子を含有する混合溶液３００が、ピペットシステム４００によってカプセル１０１の内部または表面１０２上に置かれる。混入を回避するために、カプセル１０１は密閉されてよい、最後に、バイオセンサーナノチャンネル内部にレーザービーム５１０の焦点を合わせることによってバイオセンサー２００内部の生体分子相互作用を測定するために、光学ユニット５００が使用される。
【００２５】
図２ａおよび図２ｂは、検出の原理および本発明によるバイオセンサーの断面を図示する。該システムは、側面インプット開口部２２０と側面アウトプット開口部２３０をつなぐナノチャンネル２１０からなる。外部（２４１）または内部（２４２）にあることができる駆動部品が、側面アウトプット開口部２３０の隣に設置される。最初に、バイオマーカー３１０が、基材２０１および２０２のうちの１つまたは両方の選択的に官能基化されたナノチャンネル表面上に固定化される。他のナノチャンネル表面および側面開口部表面は、非官能基化層２０３の沈着によって保護されてよい。検出体積５２０は、ナノチャンネル２１０の体積および検出体積５２０によって画定される交差体積（intersection volume）が最大となるようにナノチャンネル２１０の内部に焦点を合わせ、かつ、側面インプット開口部２２０に直接隣接していなければならない。次に、蛍光標識された特定の生体分子３２０および非特異的生体分子３３０を含有する溶液３００が、毛細管現象によって側面インプット開口部２２０からシステム中に充填される。駆動部品２４１または２４２に達したら、溶液３００は、例えば吸収によって駆動部品を満たし、バイオセンサーを横切る強制的な対流を生じさせる。駆動部品２４１または２４２がその最大充填容量を達成したら、対流が停止し、システムが平衡に達する。対流の間、ブラウン運動のおかげで生体分子３２０はナノチャンネル２１０内部に固定化されたバイオマーカー３１０と相互作用し、分子複合体３４０を生成することができる。ナノチャンネル２１０を横切る濃度勾配が得られる。非特異的生体分子３３０はナノチャンネル２１０中に拡散するであろうが、固定化されたバイオマーカー３１０とは分子複合体を形成しないだろう。非特異的生体分子３３１が側面アウトプット開口部２３０中に存在するであろうし、いくらかの３３２は駆動部品２４１または２４２内部にも存在しうる。レーザービーム５１０によって励起される際、固定化された蛍光放出性複合体３４０および光学的検出体積を横切って拡散する拡散性の蛍光放出性生体分子３３０の両方が光学システムによって検出される。
【００２６】
本発明は、分子相互作用を検出するために現在使用されている技術と区別できる。側面開口部に連結されている選択的に官能基化されたナノチャンネルを横切る固定化された複合体の濃度を測定する独特の方法は、単一の表面またはリザーバー上での相互作用の測定に基づく現在の技術とは異なる。これらの解決法は、本発明において表される独特のデザインにおいて発生する相互作用事象の確率増大からの利益を受けるものではない。
【００２７】
図３は、溶液が特定の生体分子を含有する場合の、バイオセンサーを横切る濃度の経時的な展開を示す。毛細管による充填の直後、時点ｔ0において、側面インプット開口部内部にはバックグラウンド濃度ｃ0の蛍光標識された分子がある。ナノチャンネルに進入する特定の生体分子は、すぐにナノチャンネルの官能基化表面と相互作用して、濃度の増加をもたらす（破線の曲線）。最大濃度ｃsatは、所与の位置ｘについて、すべてのバイオマーカーが特定の生体分子と相互作用した場合に相当する。時間の関数として、濃度勾配は、ｔinfの点線の曲線となる傾向にあり、ナノチャンネルバイオマーカーの全体的飽和に相当する（点線の曲線）。
【００２８】
図４は、溶液がすでにバイオセンサーならびに吸収部品を満たしている場合に相当する、時点ｔ1におけるバイオセンサーを横切る濃度勾配を図示する。ブラウン運動のおかげで、生体分子はナノチャンネルに進入し続け、バイオマーカーと相互作用し続けるが、バックグラウンド濃度ｃ0次第で、飽和への移行ｔinfは非常に長いかもしれない。これは、ナノチャンネルを横切る濃度プロフィールの安定的測定を可能とする。測定体積（斜線部）は、幅ｂを有するレーザービームとナノチャンネルの交差部に相当する。
【００２９】
図５は、溶液が非特異的生体分子のみを含有する場合の、バイオセンサーを横切る濃度の経時的な展開を示す。毛細管による充填の直後、時点ｔ0において、側面インプット開口部内部およびナノチャンネル内部にはバックグラウンド濃度ｃ0の蛍光標識分子がある。官能基化表面との相互作用がないため、さらなる濃度増加は予測されない。この場合、濃度ｃ0は、すべての位置ｘおよび時間に関して一定のままである。
【００３０】
図６は、溶液が特定の生体分子を含有せず、すでにバイオセンサーならびに吸収部品を満たしている場合に相当する、時点ｔ1におけるバイオセンサーを横切る濃度勾配を図示する。測定体積（斜線部）は、幅ｂを有するレーザービームとナノチャンネルの交差部に相当する。
【００３１】
図７は、溶液が特定の生体分子を含有する場合の、ナノチャンネル内の所与の位置に関する、測定の間の蛍光強度の経時的な展開を示す。光学システムのシャッターが開いたとき、測定が開始する。測定体積内に存在する固定化されかつ蛍光標識された分子の数に関する定量的情報を含む標準的な光退色曲線が得られる。
【００３２】
図８は、溶液がいかなる特定の生体分子も含有しない場合の、ナノチャンネル内の所与の位置に関する、測定の間の蛍光強度の経時的な展開を示す。光学システムのシャッターが開いたとき、測定が開始する。測定体積内には、定常的なバックグラウンドシグナルをもたらす拡散性の蛍光標識生体分子しかないため、光退色曲線は得られない。
【００３３】
図９は、時間の関数としての、ナノチャンネル内部の溶液の対流の展開を示す。最初に、時間ｔcapの間に毛細管によってナノチャンネルが充填され、これは、結果として流速の増加を生じる。吸収部品に到達すると、溶液はナノチャンネルを完全に満たし、流れは毛細管現象によってはそれ以上推進されず、むしろ、吸収により推進される。これは、結果として時間ｔactの間の流速の変化を生じる。最後に、ナノチャンネル内部の溶液の流れは０となる傾向にあり、生体分子の動きはブラウン運動のみによる。測定時点ｔmは、対流の停止後となるはずである。
【００３４】
本発明によれば、上記装置は、他の固定化された生体分子と相互作用するかまたはしない生体分子の検出、計数、同定および特徴づけのための大きな改善を提供する。本発明の応用は、生物医学的分析、生物学的分析または食品分析ならびに分析化学および生物分析化学における基礎的研究に及ぶ。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
2014507668.tif 000014
2014507668.tif 000015
2014507668.tif 000016