(57)【要約】  本発明は、皮膚細胞に試験物質を処理するステップ；および、前記ステップの試験物質を処理した皮膚細胞において、ＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認するステップを含む皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法を開示する。また、皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することができる装置を含む、皮膚細胞分化促進物質のスクリーニングキットを開示する。そして、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む、皮膚細胞分化促進、皮膚保湿、皮膚障壁機能強化またはアトピー症状軽減若しくは治療用組成物を開示する。
2014501503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚細胞に試験物質を処理するステップ；および
前記ステップの試験物質を処理した皮膚細胞において、ＤＵＯＸ１（Ｄｕａｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  １）遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０１７４３４）の相対的発現程度を確認するステップを含む皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認するステップの後、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を増加させる物質を皮膚細胞分化促進物質と判断するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認するステップに付加して、
試験物質を処理した皮膚細胞において、フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ロリクリン（Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）、ケラチン１（Ｋｅｒａｔｉｎｅ  １）およびケラチン１０（Ｋｅｒａｔｉｎ  １０）からなる群より選択された一つ以上の遺伝子の相対的発現程度を確認するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
フィラグリン、ロリクリン、ケラチン１およびケラチン１０からなる群より選択された一つ以上の遺伝子の相対的発現程度を確認するステップの後、前記選択された一つ以上の遺伝子の発現程度を増加させる物質を皮膚細胞分化促進物質と判断するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記皮膚細胞は、皮膚角質細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
スクリーニング方法は、皮膚細胞分化促進による皮膚保湿用物質のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
スクリーニング方法は、皮膚細胞分化促進による皮膚障壁機能強化用物質のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
スクリーニング方法は、皮膚細胞分化促進によるアトピー症状軽減または治療用物質のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することができる装置を含む、皮膚細胞分化促進物質のスクリーニングキット。
【請求項１０】
ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む皮膚細胞分化促進用組成物。
【請求項１１】
ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む皮膚保湿用組成物。
【請求項１２】
ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む皮膚障壁機能強化用組成物。
【請求項１３】
ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含むアトピー症状軽減または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）は、皮膚（ｓｋｉｎ）の最外郭に位置し、表皮の中でも最も最外郭の層は、角質層である。角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）により構成された角質層が正常に存在する場合、外部からの多様な刺激を防御し、体内から発散される水分を保持することができる。角質形成細胞は、皮膚の最下層である基底層（ｂａｓａｌ  ｌａｙｅｒ）で増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）しながら、徐々に有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）、顆粒層（Ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）を経て分化される。こうした角化過程（ｋｅｒａｔｉｎｏｚａｔｉｏｎ）を通じて、角質形成細胞は、天然保湿因子（ＮＭＦ；Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）と脂質（セラミド、コレステロールまたは脂肪酸）を形成しながら、角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）を形成することになる。こうした角質層が正常に形成されてようやく皮膚障壁（ｓｋｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）機能が十分に遂行され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法および皮膚細胞分化促進物質のスクリーニングキットを提供しようとするものである。また、本発明は、皮膚細胞分化促進、皮膚保湿、皮膚障壁機能強化またはアトピー症状軽減若しくは治療用組成物を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一側面は、皮膚細胞に試験物質を処理するステップ；および、前記ステップの試験物質を処理した皮膚細胞においてＤＵＯＸ１（Ｄｕａｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  １）遺伝子の相対的発現程度を確認するステップを含む皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００５】
本発明の他の一側面は、皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することができる装置を含む皮膚細胞分化促進物質のスクリーニングキットを提供する。
【０００６】
本発明の他の一側面は、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む皮膚細胞分化促進、皮膚保湿、皮膚障壁機能強化またはアトピー症状軽減若しくは治療用組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一側面による皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法は、皮膚細胞に試験物質を処理し、ＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することにより、簡便、迅速かつ効率的に皮膚細胞分化促進物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】正常ヒト表皮角化細胞における、カルシウム濃度によるＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を示したグラフである。
【図２】皮膚角質細胞にＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理した場合の、これを処理しなかった場合と対比したＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２遺伝子の発現程度を示したグラフである。
【図３】皮膚角質細胞にＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理した場合の、これを処理しなかった場合と対比したフィラグリンとロリクリンの発現程度を示したグラフである。
【図４】皮膚角質細胞にＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理した場合の、これを処理しなかった場合と対比したケラチン１とケラチン１０の発現程度を示したグラフである。
【図５】皮膚角質細胞にドクダミまたは苦楝皮抽出物を処理した場合の、処理しなかった場合と対比したＤＵＯＸ１とフィラグリンの発現程度を示したグラフである。
【図６】皮膚角質細胞にドクダミまたは苦楝皮抽出物を処理した場合の、処理しなかった場合と対比したケラチン１とケラチン１０の発現程度を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
デュアルオキシダーゼ（Ｄｕａｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）１は、ＤＵＯＸ１またはＴｈＯＸ  １（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ）ともいい、ＤＵＯＸ１遺伝子によってエンコードされる。これは、甲状腺で初めて発見された。人間には、ｈＤＵＯＸ１とｈＤＵＯＸ２の２つのイソ型（ｉｓｏｔｙｐｅ）があり、ｈＤＵＯＸ１は気道上皮細胞、ｈＤＵＯＸ２は唾液腺や消化管において多く発現される。ＤＵＯＸ１は、合計７つのイソ型を有するＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ（ＮＯＸ）に属する（Ｎｏｘ１，Ｎｏｘ２，Ｎｏｘ３，Ｎｏｘ４，Ｎｏｘ５，ＤＵＯＸ１，ＤＵＯＸ２）。そのうちＮＯＸは、捕食細胞の細菌捕食作用において活性酸素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）を生成するタンパク質として多く研究されているが、最近では、免疫細胞ではなく、細胞組織においても多様なイソ型が発見されて研究されている。ＮＯＸ／ＤＵＯＸ群は、活性酸素を生成する生物学的役割を通じて、高血圧（ＮＯＸ１）、免疫（ＮＯＸ２／ＤＵＯＸ）、耳形成（ＮＯＸ３）、甲状腺ホルモン生成（ＤＵＯＸ１および２）等に関与するものと知られている。
【００１０】
皮膚障壁の最外郭をなす角質層は、天然保湿因子と脂質等からなっている。フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）タンパク質は、転写後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を経て複数の種類の親水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）に分解され、アミノ酸プール（ｐｏｏｌ）が天然保湿因子（ＮＭＦ）を構成し、これは角質層の水分保持を助けるものと知られている。また、フィラグリン遺伝子の突然変異が皮膚保湿因子を減少させ、皮膚障壁機能を損傷させ、アレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）や微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）に対する皮膚防御能力を低下させ、Ｔ細胞群を活性化して自己免疫メカニズムによる慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を引き起こして、アトピー性湿疹（Ａｔｏｐｉｃ  ｅｃｚｅｍａ）を誘導する重要遺伝危険要素であるものとも知られている。しかしながら、これに対する治療や対策方法は、未だ明確に提示されていない。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明者らは、正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）にＤＵＯＸ１が相対的に多く発現しており、分化過程においてその発現程度が増加することを確認した。また、ＤＵＯＸ１を除去した場合（ｓｉＲＮＡ）、フィラグリン遺伝子とともにロリクリン（Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）、ケラチン１およびケラチン１０といった様々な分化遺伝子マーカーの発現程度が増加することを確認して、ＤＵＯＸ１の発現が、皮膚細胞分化に関与するフィラグリン、ロリクリン（Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）、ケラチン１およびケラチン１０遺伝子の発現と関連があることを確認した。これを土台に、皮膚細胞においてＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を増加させる物質は、皮膚細胞分化を促進させる物質であると判断することができる。すなわち、皮膚細胞に任意の物質を処理し、ＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することにより、その任意の物質が皮膚細胞分化を促進させる物質であるかどうかを簡便に確認することができる。
【００１３】
本発明の一側面は、皮膚細胞に試験物質を処理するステップ；および、前記ステップの試験物質を処理した皮膚細胞において、ＤＵＯＸ１（Ｄｕａｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  １）遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０１７４３４）の相対的発現程度を確認するステップを含む皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
本明細書において「皮膚」とは、動物の体表を覆う組織を意味するものであって、顔またはボディ等の体表を覆う組織だけでなく、頭皮や毛髪を含む最広義の概念である。
【００１５】
本発明の一側面において、前記皮膚細胞は、皮膚角質細胞を含む。本発明の他の一側面において、前記皮膚細胞は、ヒトの皮膚角質細胞を含む。本発明の他の一側面において、前記皮膚細胞は、ヒトの正常皮膚角質細胞を含む。
【００１６】
本明細書において、「相対的発現程度」は、試験物質を処理しなかった皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度と比較したときの発現程度であってよい。前記において発現程度は、発現の量および発現の質（ｑｕａｌｉｔｙ）を含む。
【００１７】
本発明の一側面によるＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認するステップの後、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を増加させる物質を皮膚細胞分化促進物質と判断するステップをさらに含んでよい。具体的に、試験物質を処理しなかった皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度よりも、被験物質を処理した皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度が高ければ、処理した試験物質がＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を増加させたものと判断してよい。逆に、試験物質を処理しなかった皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度よりも、被験物質を処理した皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度が低ければ、処理した試験物質がＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を増加させなかったものと判断してよい。先に見たところのように、処理した試験物質がＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を増加させれば、皮膚細胞分化を促進する物質であると判断してよい。
【００１８】
本発明の一側面による、試験物質を処理した細胞でＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認するステップにおいて、ＲＴ‐ＰＣＲ，ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット（ｉｍｍｕｎｏ  ｂｌｏｔ）を利用して、その相対的発現程度を確認してよい。
【００１９】
本発明の一側面による皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法は、ＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認するステップに付加して、試験物質を処理した皮膚細胞において、フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ロリクリン（Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）、ケラチン１（Ｋｅｒａｔｉｎｅ  １）およびケラチン１０（Ｋｅｒａｔｉｎ  １０）からなる群より選択された一つ以上の遺伝子の相対的発現程度を確認するステップをさらに含んでよい。皮膚細胞発現に関与する前記遺伝子マーカーの相対的発現程度を確認して、対象被験物質が皮膚細胞分化促進物質であるかどうかをより明確に判断することができる。
【００２０】
本発明の一側面によるフィラグリン、ロリクリン、ケラチン１およびケラチン１０からなる群より選択された一つ以上の遺伝子の相対的発現程度を確認するステップの後、前記選択された一つ以上の遺伝子の発現程度を増加させる物質を皮膚細胞分化促進物質と判断するステップをさらに含んでよい。具体的に、試験物質を処理しなかった皮膚細胞における前記選択された一つ以上の遺伝子の発現程度よりも、被験物質を処理した皮膚細胞における前記選択された一つ以上の遺伝子の発現程度が高ければ、処理した被験物質が前記選択された一つ以上の遺伝子の発現程度を増加させたと判断してよい。先に見たところのように、前記選択された一つ以上の遺伝子の発現程度を増加させれば、処理した被験物質が皮膚細胞分化を促進する物質であると判断してよい。
【００２１】
一方、皮膚細胞分化がうまく行われなければ、皮膚角質層が正常な機能を行うことができないため、皮膚の水分保持力が低下し、皮膚障壁機能が低下する。また、アトピーといった皮膚疾患の場合、様々な要因によって正常な皮膚角質層の機能が保持されずに発生する疾患であって、皮膚の炎症および皮膚の乾燥が主たる症状として現れる。したがって、皮膚細胞分化を促進する物質は、皮膚保湿、皮膚障壁機能強化およびアトピー症状軽減または治療の効果を示し得る。すなわち、本発明の一側面による皮膚細胞分化促進物質のスクリーニング方法を利用して、皮膚保湿用物質、皮膚障壁機能強化用物質およびアトピー症状軽減または治療用物質をスクリーニングしてよい。
【００２２】
本発明の一側面は、皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することができる装置を含む、皮膚細胞分化促進物質のスクリーニングキットを提供する。前記スクリーニングキットを利用して皮膚細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の相対的発現程度を確認することにより、簡便、迅速かつ効率的に皮膚細胞分化促進物質を検索することができる。
【００２３】
先に見たところのように、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質は、皮膚細胞の分化を促進し、皮膚保湿効果を有し、皮膚障壁機能を強化し、アトピー症状を軽減または治療する効果を示す。そこで、本発明の一側面は、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む、皮膚細胞分化促進用組成物、皮膚保湿用組成物、皮膚障壁機能強化用組成物およびアトピー症状軽減または治療用組成物を提供する。本発明の他の一側面は、前記スクリーニングされたＤＵＯＸ１遺伝子の発現を増加させる物質を有効成分として含む、皮膚細胞分化促進用組成物、皮膚保湿用組成物、皮膚障壁機能強化用組成物およびアトピー症状軽減または治療用組成物を提供する。
【００２４】
本発明の一側面において、前記組成物は、化粧品組成物であってよい。本発明の他の一側面において、前記組成物は、薬学組成物であってよい。本発明の他の一側面において、前記組成物は、健康食品組成物であってよい。
【００２５】
以下、実施例を挙げつつ、本発明の構成および効果をより具体的に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明に対する理解を助けるために、例示の目的としてのみ提供されたものであるに過ぎず、本発明の範疇および範囲がそれによって制限されるものではない。
【００２６】
［実施例１］カルシウムによるＤＵＯＸ１遺伝子の発現変化の評価
一般的に、細胞内カルシウム濃度が高いと、皮膚細胞の分化が促進されるものと知られている。この実験は、細胞内カルシウム濃度を異ならせて処理することにより、皮膚細胞分化の程度を変化させた後、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度を評価することとする。
【００２７】
Ｌｏｎｚａ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した正常ヒト角質細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）を継代培養し、３７℃、５％ＣＯ２条件下のＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養した。細胞培養は、Ｌｏｎｚａ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）の指針書に従った。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブレットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ビーピーイー（ＢＰＥ：Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ：２ｍｌ）、ヒューマンイージーエフ（ｈＥＧＦ：ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：０．５ｍｌ）、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ：０．５ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ：０．５ｍｌ）、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ：０．５ｍｌ）、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ：０．５ｍｌ）、ゲンタマイシン硫酸＋アムホテリシンＢ（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏｆｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００，０．５ｍｌ））を添加して使用した。
【００２８】
ヒト角質細胞培養液に、各々カルシウム１２０μＭと１．２ｍＭ添加して２４時間細胞を培養し、それぞれ低カルシウム群（Ｃａｌｃｉｕｍ）（対照群）と高カルシウム群（実験群）とした。インターロイキン処理２４時間後、１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で細胞を二回洗浄し、トリアゾール（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して細胞内の全体ＲＮＡ（総ＲＮＡ）を分離した。分離されたＲＮＡは、キアゲン社のＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してもう一度精製した後、アジレント社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。前記分離されたＲＮＡから、インヴィトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）II  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ）方法により、複数のＮＯＸ遺伝子発現を定量的に分析した。ＮＯＸ１（Ｈｓ００２４６５８９＿ｍ１）、ＮＯＸ２（Ｈｓ００１６６１６３＿ｍ１）、ＮＯＸ３（Ｈｓ００２１０４６２＿ｍ１）、ＮＯＸ４（Ｈｓ００２７６４３１＿ｍ１）、ＮＯＸ５（Ｈｓ００２２５８４６＿ｍ１）、ＤＵＯＸ１（Ｈｓ００２１３６９４＿ｍ１）およびＤＵＯＸ２（Ｈｓ００２０４１８７＿ｍ１）の発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(R)ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓａｙｋｉｔ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を利用して評価した。その結果を図１に示した。
【００２９】
図１から見られるように、正常ヒト角質細胞においては、基本的に、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現程度が高く、カルシウムを利用して皮膚細胞の分化を増加させると、ＤＵＯＸ１遺伝子がさらに著しく増加する。すなわち、ＤＵＯＸ１遺伝子が皮膚細胞の分化と関連があり、具体的には、ＤＵＯＸ１遺伝子の発現増加は、皮膚細胞の分化と関連があることを確認することができる。
【００３０】
［実施例２］ＤＵＯＸ１除去によるフィラグリン遺伝子および複数の分化マーカーの発現変化の評価
ＤｈａｒｍａｃｏｎｅからＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ（ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ）を購入した。
【００３１】
実施例１と同様に、正常ヒト角質細胞を培養して、６ウェルプレート（６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に２×１０４細胞／ｃｍ２の条件で培養し、２４時間後、５０ｎＭのＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡをＲＮＡｉマックス試薬（ＲＮＡｉ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して各々トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。６時間後、細胞培養液を交換し、トランスフェクション２４時間後に１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を二回洗浄した後、トリアゾール（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して細胞内の全体ＲＮＡ（総ＲＮＡ）を分離した。分離されたＲＮＡをキアゲン社のＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してもう一度精製し、アジレント社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インヴィトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）II  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用して前記分離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ）により定量的に分析した。ＤＵＯＸ１（Ｈｓ００２１３６９４＿ｍ１）とヒト角質細胞の分化マーカー遺伝子であるフィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００２０１６）（Ｈｓ００８５６９２７＿ｇ１）、ロリクリン（Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０００４２７）（Ｈｓ０１８９４９６２＿ｓ１）、ケラチン１（Ｋｅｒａｔｉｎ  １）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００６１２１）（Ｈｓ００１９６１５８＿ｍ１）、ケラチン１０（Ｋｅｒａｔｉｎ  １０）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０００４２１）（Ｈｓ００１６６２８９＿ｍ１）の発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(R)ｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓａｙｋｉｔ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を利用して評価した。その結果を、図２〜図４に示した。
【００３２】
図２は、ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理したときのＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２の発現程度を、ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理しなかった対照群と比較して示したグラフである。図３は、ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理したときのフィラグリン、ロリクリン遺伝子の発現程度を、ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理しなかった対照群と比較して示したグラフであり、図４は、同様に、ケラチン１およびケラチン１０遺伝子の発現程度を示したグラフである。
【００３３】
前記結果から見られるように、ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理する場合、各々ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２遺伝子の発現程度が減少する。また、フィラグリン、ロリクリン、ケラチン１およびケラチン１０遺伝子の発現程度も、ＤＵＯＸ１またはＤＵＯＸ２  ｓｉＲＮＡを処理しなかった場合に比べて減少する。すなわち、ＤＵＯＸ１を除去する場合、皮膚細胞分化に関与する前記遺伝子の発現程度が減少することを確認することができる。
【００３４】
［実施例３］試験物質のＤＵＯＸ１とフィラグリン等の遺伝子発現程度の評価
皮膚細胞の分化を促進する物質として知られているドクダミと苦楝皮抽出物を利用して、ＤＵＯＸ１、フィラグリン、ケラチン１およびケラチン１０の発現程度を確認した。
【００３５】
Ｌｏｎｚａ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）のヒト皮膚角質細胞を購入して、３７℃、５％ＣＯ２条件下のＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）においてＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に培養した。
【００３６】
ヒト角質細胞のみを培養した無処理群（対照群）およびヒト角質細胞培養液にどくだみまたは苦楝皮抽出物を各々１０μＭずつ添加した実験群を、２４時間培養した。ドクダミと苦楝皮抽出物は、韓国植物抽出物バンクから購入して使用した。ドクダミまたは苦楝皮抽出物の処理２４時間後、１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を二回洗浄し、トリアゾール（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して細胞内の全体ＲＮＡ（総ＲＮＡ）を分離した。分離されたＲＮＡをキアゲン社のＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してもう一度精製した後、アジレント社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）と濃度を確認した。前記分離されたＲＮＡから、インヴィトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）II  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ）により遺伝子発現の変化を定量的に分析した。ＤＵＯＸ１（Ｈｓ００２１３６９４＿ｍ１）とヒト角質細胞の分化マーカー遺伝子であるフィラグリン（Ｈｓ００８５６９２７＿ｇ１）、ケラチン１（Ｈｓ００１９６１５８＿ｍ１）、ケラチン１０（Ｈｓ００１６６２８９＿ｍ１）の発現パターンの変化は、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(R)ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓａｙｋｉｔ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を利用して評価した。その結果を、図５および図６に示した。
【００３７】
図５は、ドクダミまたは苦楝皮エキスを処理したときのＤＵＯＸ１とフィラグリン遺伝子の発現程度を、処理しなかった対照群と比較して示したグラフであり、図６は、ケラチン１とケラチン１０遺伝子の発現程度を同様の方法で示したグラフである。
【００３８】
前記結果から見られるように、ドクダミおよび苦楝皮抽出物は、ヒト角質細胞において、ＤＵＯＸ１遺伝子、フィラグリン、ケラチン１とケラチン１０遺伝子の発現程度を著しく増加させた。すなわち、皮膚細胞分化促進効果、さらには皮膚保湿、皮膚障壁機能強化およびアトピー症状軽減または治療効果のある物質は、前記遺伝子の発現程度を増加させることを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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