(57)【要約】本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）遺伝子発現を標的とする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ）などの治療用核酸を含む組成物、その治療用核酸の１つまたは複数（例えば、カクテル）を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法ならびに脂質粒子を送達および／または投与する（例えば、ヒトにおけるアルコール症を処置するため）方法を提供する。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡを含む組成物であって、前記干渉ＲＮＡがセンス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、前記干渉ＲＮＡが約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡを含む組成物であって、前記干渉ＲＮＡがセンス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、前記干渉ＲＮＡが約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む組成物。
【請求項２】
前記干渉ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡおよびその組合せからなる群から選択される二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記干渉ＲＮＡが約１９〜約２５個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記干渉ＲＮＡが化学的に合成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記干渉ＲＮＡが、前記干渉ＲＮＡの１つまたは両方の鎖中に３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記干渉ＲＮＡが、前記二本鎖領域中に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記二本鎖領域中のヌクレオチドの約３０％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）ヌクレオチドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記２’ＯＭｅヌクレオチドが、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドまたはそれらの混合物を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記干渉ＲＮＡが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）遺伝子発現をサイレンシングする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ａ）請求項１に記載の干渉ＲＮＡ、
（ｂ）カチオン性脂質および
（ｃ）非カチオン性脂質
を含む核酸−脂質粒子。
【請求項１３】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、それらの塩またはそれらの混合物を含む、請求項１１に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項１４】
前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、それらの塩またはそれらの混合物を含む、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項１５】
前記カチオン性脂質が、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ）、それらの塩またはそれらの混合物を含む、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項１６】
前記非カチオン性脂質がリン脂質である、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項１７】
前記非カチオン性脂質がコレステロールまたはその誘導体である、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項１８】
前記非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物である、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項１９】
前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはそれらの混合物を含む、請求項１６または請求項１８に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２０】
前記非カチオン性脂質が、ＤＰＰＣとコレステロールとの混合物である、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２１】
粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含む、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２２】
粒子の凝集を阻止する前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質コンジュゲートである、請求項２１に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２３】
前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ−リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）コンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２４】
前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートがＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートである、請求項２２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２５】
前記ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートが、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２６】
粒子の凝集を阻止する前記コンジュゲートされた脂質が、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質コンジュゲートである、請求項２１に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２７】
前記ＰＯＺ−脂質コンジュゲートがＰＯＺ−ＤＡＡコンジュゲートである、請求項２６に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２８】
前記干渉ＲＮＡが前記粒子中に完全にカプセル化されている、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項２９】
約５：１〜約１５：１の脂質：干渉ＲＮＡ質量比を有する、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項３０】
約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍのメジアン直径を有する、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項３１】
前記カチオン性脂質が、前記粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を構成する、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項３２】
前記非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記リン脂質が前記粒子中に存在する全脂質の約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項３３】
前記リン脂質が前記粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記粒子中に存在する全脂質の約３２ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％を構成する、請求項３２に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項３４】
粒子の凝集を阻止する前記コンジュゲートされた脂質が前記粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成する、請求項２１に記載の核酸−脂質粒子。
【請求項３５】
請求項１２に記載の核酸−脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３６】
ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡを細胞中に導入するための方法であって、前記細胞を請求項１２に記載の核酸−脂質粒子と接触させるステップを含む方法。
【請求項３７】
前記細胞が哺乳動物中にある、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
全身的経路で前記哺乳動物に前記粒子を投与することによって、前記細胞を接触させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物がアルコール症と診断されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記干渉ＲＮＡが、前記細胞においてＡＬＤＨ２遺伝子発現をサイレンシングする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物におけるＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、請求項１２に記載の核酸−脂質粒子を前記哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４３】
前記粒子を全身的経路で投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒトがアルコール症に罹患している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記粒子の投与が、前記哺乳動物中のＡＬＤＨ  ＲＮＡレベルを、前記粒子の非存在下のＡＬＤＨ  ＲＮＡレベルと比較して少なくとも約５０％低減させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸−脂質粒子がＡＬＤＨ２遺伝子発現をサイレンシングする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
ヒトにおけるアルコール症に伴う１つまたは複数の症状を処置および／または改善するための方法であって、前記ヒトに治療有効量の請求項１２に記載の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法。
【請求項４９】
前記粒子を全身的経路で投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヒトがアルコール症を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸−脂質粒子の干渉ＲＮＡが前記ヒトにおけるＡＬＤＨ２遺伝子の発現を阻害する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
ＡＬＤＨの発現を阻害することを必要とする哺乳動物におけるＡＬＤＨの発現を阻害するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量の請求項１２に記載の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法。
【請求項５３】
前記粒子を全身的経路で投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ヒトがアルコール症を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記粒子の投与が、前記哺乳動物におけるＡＬＤＨ遺伝子発現を、前記粒子の非存在下の前記ＡＬＤＨ遺伝子発現と比較して少なくとも約５０％低減させる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
ＡＬＤＨ２の発現が前記哺乳動物において阻害される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
ヒトにおけるアルコール症を防止および／または処置するための方法であって、前記ヒトに治療有効量の請求項１２に記載の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法。
【請求項５９】
前記粒子を全身的経路で投与する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ヒトがアルコール症に罹患している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸−脂質粒子の干渉ＲＮＡが前記ヒトにおけるＡＬＤＨ２遺伝子の発現を阻害する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
本明細書の実施例４の表Ａに示す識別番号１、識別番号２、識別番号３、識別番号４、識別番号５および識別番号６からなる群から選択される二本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６３】
本明細書の実施例４の表Ａに示す一本鎖センス鎖分子から選択される一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項６４】
本明細書の実施例４の表Ａに示す一本鎖アンチセンス鎖分子から選択される一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項６５】
生細胞中でのＡＬＤＨ遺伝子発現を阻害するための本発明のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項６６】
生細胞中でのＡＬＤＨ遺伝子発現を阻害するための本発明の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年２月１５日に出願した米国仮特許出願第６１／５９９，２３８号および２０１１年１０月５日に出願した米国仮特許出願第６１／５４３，７００号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。これらの出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供される。これを参照により本明細書に組み込む。配列表を含むテキストファイルの名称はＴＥＫＭ＿０７４＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ．である。テキストファイルは１２ＫＢであり、２０１２年１０月４日に作製したもので、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルコール症は、ビール、ワインおよび蒸留酒などのアルコール飲料を過剰量飲酒することに対する嗜癖または依存である。アルコール症は、アルコール乱用またはアルコール依存症と称されることもある。
【０００４】
アルコール症を支える生物学的機序は不確かであるが、危険因子には、ストレス、精神衛生上の問題および遺伝的素因が含まれる。長期のアルコール乱用は脳内での生理学的変化を生み出し、これは、アルコール消費の中断によってアルコール禁断症候群をもたらす。アルコールは体内のほぼすべての臓器に損傷を与え、アルコール依存症患者は、医学的および精神的障害に罹患するリスクに曝される。
【０００５】
アルコール症の処置は解決の難しいものであり、これには、一般にアルコール依存症患者をアルコール飲酒から離脱させるためのアルコール解毒が含まれる。ベンゾジアゼピンなどの神経学的に活性な薬物を用いてアルコール禁断症状に対処することができる。心理療法などの医療後のケアは、通常、アルコール節制を維持するために要求される。
【０００６】
ジスルフィラムは、摂取されたアルコール（エタノール）に対する急性過敏症を引き起こす薬物であり、慢性アルコール症の処置において使用されることがある。アルコールは、肝臓で酵素アルコールデヒドロゲナーゼによってアセトアルデヒドに分解され、次いで、これは酵素アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸に転換される。ジスルフィラムは酵素アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを遮断する。したがって、ジスルフィラムは、アルコールを消費したヒトの血液中のアセトアルデヒド濃度が、ジスルフィラムの非存在下で同量のアルコールを消費したヒトの血液中で見られるアセトアルデヒド濃度より、大幅に高くなる（例えば、５〜１０倍高くなる）ようにすることができる。アセトアルデヒドは、「二日酔い」の症状の主原因の１つであり、そのため、ジスルフィラムの消費は、アルコールに対する重度の負の反応をもたらす。その症状には、皮膚の紅潮、心拍数の加速、息切れ、吐き気、嘔吐、ズキズキする頭痛、視覚障害、精神的錯乱、姿勢の崩れ（postural  fainting）および循環虚脱が含まれる。
【０００７】
しかし、患者による服薬遵守の欠如ならびに眠気、頭痛および、それほど頻繁ではないが、神経毒性などの一連の副作用のため、ジスルフィラムには臨床上の限界がある。ジスルフィラムは、効果的にするために通常毎日投与されるが、そのため、患者がその薬物の使用を中断するのが容易である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、哺乳動物、特にヒトにおけるアルコールの代謝に関与するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を抑止、低減および／または排除するための組成物および方法に対するニーズが依然としてある。そうした組成物および方法は、例えばアルコール症の処置において用いることができる。特に、ジスルフィラムの有効期間より大幅に長い期間（例えば、数週間または数カ月）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を抑止、低減および／または排除し、それによってそうした比較的長期間持続するＡＬＤＨの阻害剤を消費した後、ヒト対象が、アルコール嫌悪療法を中断するのが困難になるようにする組成物および方法に対するニーズがある。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を抑止、低減および／または排除し、ジスルフラム（disulfuram）より少ないまたはより重度ではない副作用しかもたない組成物および方法に対する特別のニーズもある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の簡単な概要
本明細書でより全般的に説明するように、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、より広い部類のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）酵素のメンバーである。ヒトの肝臓においてアセトアルデヒドを酢酸に転換させるのに主に関与していると考えられるＡＬＤＨファミリーのメンバーはアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）酵素であるが、ＡＬＤＨ１などのＡＬＤＨの他のイソ型もヒトにおけるアルコールの代謝に関係している。本発明の目的は、１つまたは複数のＡＬＤＨ酵素、特にＡＬＤＨ２酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供することである。阻害は、ＲＮＡ干渉の機序によるものである。したがって、本発明の組成物および方法は、例えば、アセトアルデヒドの酢酸への転換を阻害または遮断し、それによってアルコールを消費するヒトの体内におけるアセトアルデヒドの量を増大させ、その結果体内でのアセトアルデヒドの存在に伴う悪影響（例えば、頭痛および吐き気）を増強させることによって、ヒトのアルコール症を処置するのに有用である。
【００１０】
したがって、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）遺伝子発現を標的とする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ）などの治療用核酸を含む組成物、治療用核酸の１つまたは複数（例えば、カクテル）を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法ならびに脂質粒子を送達および／または投与する（例えば、アルコール症を処置するために）方法を提供する。
【００１１】
より特別には、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現を阻害またはサイレンシングする非修飾および化学修飾干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）分子を含む組成物を提供する。本発明は、本明細書で説明する干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の１つまたは複数（例えば、カクテル）、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含み、粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含むことができる血清安定性の核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）およびその処方物も提供する。干渉ＲＮＡ分子の例には、これらに限定されないが、二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、例えばｓｉＲＮＡ、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡおよびその組合せが含まれる。
【００１２】
一態様では、本発明は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む、ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする干渉ＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＤＨゲノムの同じおよび／または異なる領域を標的とする少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の干渉ＲＮＡ分子の組合せ（例えば、カクテル）を含む組成物を提供する。本発明の干渉ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＡＬＤＨ遺伝子発現を阻害またはサイレンシングすることができる。
【００１３】
例えばＡＬＤＨ２遺伝子発現を阻害するｓｉＲＮＡ分子の設計において使用できるＡＬＤＨ２転写物配列の非限定的な例は、受託番号ＮＭ＿０００６９０．３（遺伝子ＩＤ２１７、イソ型１）およびＮＭ００１２０４８８９．１（遺伝子ＩＤ２１７、イソ型２）としてＧｅｎｂａｎｋ（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）に示されている。
【００１４】
例えば、ＡＬＤＨ１遺伝子発現を阻害するｓｉＲＮＡ分子の設計において使用できるＡＬＤＨ１転写物配列の非限定的な例は、受託番号ＮＭ＿０００６８９．４（ＡＬＤＨ１Ａ１、遺伝子ＩＤ２１６）およびＮＭ＿０００６９２．４（ＡＬＤＨ１Ｂ１、遺伝子ＩＤ２１９）としてＧｅｎｂａｎｋ（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）に示されている。
【００１５】
他の態様では、本発明は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）遺伝子発現を標的とする干渉ＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子の同じおよび／または異なる領域を標的とする少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の干渉ＲＮＡ分子の組合せ（例えば、カクテル）を含む組成物を提供する。本発明の干渉ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＡＬＤＨ遺伝子発現を阻害するまたは完全にサイレンシングすることができる。
【００１６】
本発明の組成物中に存在する干渉ＲＮＡ配列のそれぞれは、例えば二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中において、２’ＯＭｅヌクレオチドなどの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを独立に含むことができる。ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドは２’ＯＭｅヌクレオチドで修飾されていることが好ましい。特定の実施形態では、本発明の組成物中に存在する干渉ＲＮＡ配列のそれぞれは、センスおよび／またはアンチセンス鎖中に少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドを含む。
【００１７】
ＡＬＤＨ２遺伝子発現を阻害するための本発明の実施において有用な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の例には、本明細書の実施例４の表Ａに示す化学修飾されたセンスおよびアンチセンス鎖配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子（１〜６まで番号付けされている）が含まれる。実施例４の表Ａに示す二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、文字「ｍ」で特定されるリボヌクレオチド単位上の２’−Ｏ−メチル部分の存在によって化学修飾されている。本発明は、実施例４の表Ａに示すセンスおよびアンチセンス配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、そのセンスおよびアンチセンス鎖が化学修飾されていない分子も含む。本発明は、実施例４の表Ａに示すセンス鎖配列（化学修飾されているかまたは化学修飾されていない）のいずれか１つを有する単離された一本鎖の核酸分子も含む。本発明は、実施例４の表Ａに示すアンチセンス鎖配列のいずれか１つを有する単離された一本鎖の核酸分子（化学修飾されているかまたは化学修飾されていない）も含む。
【００１８】
本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）分子の１つまたはカクテルおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００１９】
他の態様では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする核酸−脂質粒子を提供する。核酸−脂質粒子は典型的には、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングする１つまたは複数の非修飾および／または修飾干渉ＲＮＡ、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含む。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングする１つまたは複数の非修飾および／または修飾干渉ＲＮＡ、カチオン性脂質、非カチオン性脂質ならびに粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を含む。
【００２０】
他の実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡ分子は、核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中に完全にカプセル化されている。干渉ＲＮＡのカクテルを含む処方物に関して、異なる種類の干渉ＲＮＡ分子を同じ核酸−脂質粒子中に同時カプセル化するか、またはカクテル中に存在する各種の干渉ＲＮＡ種をそれ自体の粒子中にカプセル化することができる。
【００２１】
本発明は、核酸−脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２２】
本発明の核酸−脂質粒子は、１つまたは複数のＡＬＤＨ遺伝子（例えば、ＡＬＤＨ２遺伝子）の発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子の予防的または治療的送達に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する干渉ＲＮＡ分子の１つまたは複数を核酸−脂質粒子中に処方し、その粒子を、そうした処置を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する。特定の例では、治療有効量の核酸−脂質粒子を、哺乳動物に、例えばヒトのアルコール症を防止または処置するために）投与することができる。本発明の核酸−脂質粒子は、大部分のＡＬＤＨ２遺伝子発現部位であるヒトの肝細胞を標的とするのに特に有用である。核酸−脂質粒子の投与は、例えば経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下または皮内などの当業界で公知の任意の経路によってよい。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば腸内経由または非経口経路の投与により全身的に投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ遺伝子発現の下方制御は、核酸−脂質粒子投与後の哺乳動物からの生物学的試料中のＡＬＤＨ  ＲＮＡまたはタンパク質レベルを検出することによって判定される。他の実施形態では、ＡＬＤＨ遺伝子発現の下方制御は、核酸−脂質粒子投与後の哺乳動物からの生物学的試料中のＡＬＤＨ  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを検出することによって判定される。特定の実施形態では、ＡＬＤＨまたはＡＬＤＨ遺伝子発現の下方制御は、粒子投与後の哺乳動物におけるアルコール離脱に伴う症状を監視することによって検出される。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡを細胞中に導入するための方法であって、細胞を本発明の核酸−脂質粒子と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
他の実施形態では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、その方法それぞれが、哺乳動物に本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルコール症に伴う１つまたは複数の症状を処置および／または改善するための方法であって、その方法それぞれが、ヒトに治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２７】
他の態様では、本発明は、ＡＬＤＨの発現を阻害することを必要とする哺乳動物（例えば、アルコール症に罹患しているヒト）におけるＡＬＤＨの発現を阻害するための方法であって、その方法それぞれが、哺乳動物に治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルコール症を防止および／または処置するための方法であって、その方法それぞれが、ヒトに治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかであろう。
【００３０】
発明の詳細な説明
Ｉ．はじめに
本明細書で説明する干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）薬物療法は、有利には、ヒトにおけるアルコール症を処置するための特筆すべき新規の組成物および方法を提供する。本発明の実施形態は、例えば１日に１回、１週間に１回または数週間に１回（例えば、２、３、４、５または６週間に１回）投与することができる。数日または数週間の期間ＡＬＤＨを阻害するのに有効である本発明の組成物を消費した後、アルコール依存症患者がアルコール嫌悪療法を中断するのはより困難である。
【００３１】
さらに、本明細書で説明する脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、体内の標的とする組織および細胞中への干渉ＲＮＡなどの核酸薬物の効果的な送達を可能にする。脂質粒子の存在は、血流中でのヌクレアーゼ分解からの保護をもたらし、標的組織における優先的蓄積を可能にし、そこでｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉のそれらの目的とする機能を果たすことができる、細胞の細胞質中への薬物投入の手段を提供する。
【００３２】
ＩＩ．定義
本明細書で使用するように、以下の用語は、別段の指定のない限り、それらの帰属する意味を有する。
【００３３】
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」（ＡＬＤＨと略される）という用語は、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド）のカルボン酸（例えば、酢酸）への酸化（脱水素化）を触媒する酵素を意味する。構造的にかつ機能的に関係するアルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは、哺乳動物中に存在しており、ヒトにおけるアセトアルデヒドの酢酸への転換に主に関与していると考えられるミトコンドリア的に局在化した酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）を含む。
【００３４】
本明細書で用いる「干渉ＲＮＡ」、または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、その干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列として同じ細胞中にある場合、標的遺伝子または配列の発現を低減させるまたは阻害する（例えば、干渉ＲＮＡ配列に対して相補的であるｍＲＮＡの分解を媒介するまたはその翻訳を阻害することによって）ことができる一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ｓｓＤＮＡｉオリゴヌクレオチド）または二本鎖のＲＮＡ（すなわち、二重鎖（duplex）ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ）を含む。したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的である一本鎖ＲＮＡあるいは２つの相補鎖または単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子または配列と実質的な同一性または完全な同一性を有するか、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含むことができる。干渉ＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはその部分配列に対応させることができる。干渉ＲＮＡ分子は化学的に合成されることが好ましい。
【００３５】
干渉ＲＮＡは、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば約１５〜６０、１５〜５０または１５〜４０個の（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個の（二重鎖）ヌクレオチドの長さの干渉ＲＮＡを含み、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３個の（二重鎖）ヌクレオチドの長さ（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３個のヌクレオチドの長さであり、その二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個の塩基対の長さ、好ましくは約１８〜２２、１９〜２０または１９〜２１個の塩基対の長さである）である。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜約４個のヌクレオチドまたは約２〜約３個のヌクレオチドの３’オーバーハングおよび５’リン酸末端を含むことができる。ｓｉＲＮＡの例には、これらに限定されないが、一方の鎖がセンス鎖であり他方の鎖が相補的アンチセンス鎖である２つの別個の鎖分子から構築された二本鎖のポリヌクレオチド分子；センスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーで連結された一本鎖分子から構築されている二本鎖のポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を備えた二本鎖のポリヌクレオチド分子；ならびにその環状ポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロセッシングして活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成させることができる、２つ以上のループ構造ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを備えた環状一本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００３６】
ｓｉＲＮＡは化学的に合成することが好ましい。ｓｉＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＩＩＩまたはダイサーでの、より長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５個のヌクレオチドの長さより大きいｄｓＲＮＡ）の切断によって生成させることもできる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡをプロセッシングして生物学的に活性なｓｉＲＮＡにする（例えば、Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９９巻：９９４２〜９９４７頁（２００２年）；Calegariら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９９巻：１４２３６頁（２００２年）；Byromら、Ambion  TechNotes、１０巻（１号）：４〜６頁（２００３年）；Kawasakiら、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：９８１〜９８７頁（２００３年）；Knightら、Science、２９３巻：２２６９〜２２７１頁（２００１年）；およびRobertsonら、J.Biol.Chem.、２４３巻：８２頁（１９６８年）を参照されたい）。ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０個のヌクレオチド〜約１００、２００、３００、４００または５００個のヌクレオチドの長さであることが好ましい。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００個もの長さまたはそれ以上の長さのヌクレオチドであってよい。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写物全体または遺伝子転写物の一部についてコードすることができる。特定の例では、ｓｉＲＮＡはプラスミドによってコードすることができる（例えば、ヘアピンループで自動的に二つ折りされて二重鎖となる配列として転写される）。
【００３７】
本明細書で用いる「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対して１００％の相補性をもたない干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）配列の部分を指す。干渉ＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６個またはそれ以上のミスマッチ領域を有することができる。ミスマッチ領域は連続的であっても、また１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられていてもよい。ミスマッチモチーフまたは領域は、単一のヌクレオチドを含むことも、また２、３、４、５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むこともできる。
【００３８】
「標的遺伝子の発現を阻害する」という語句は、本発明の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）が標的遺伝子（例えば、ＡＬＤＨ遺伝子）の発現をサイレンシングする、低減させるまたは阻害する能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を試験するために、テスト試料（例えば、標的遺伝子を発現する対象生物体からの生物学的試料または標的遺伝子を発現する培養物中の細胞の試料）を、標的遺伝子の発現をサイレンシングする、低減させるまたは阻害する干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と接触させる。テスト試料中での標的遺伝子の発現を、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と接触していない対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する対象生物体からの生物学的試料または標的遺伝子を発現する培養物中の細胞の試料）での標的遺伝子の発現と比較する。対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する試料）を１００％の値と指定することができる。特定の実施形態では、対照試料に対して、テスト試料の値が、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１０％、５％または０％である場合、標的遺伝子の発現のサイレンシング、阻害または低減は達成されている。適切なアッセイには、これらに限定されないが、当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはｍＲＮＡレベルの試験、例えばドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュでのハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能ならびに当業者に公知の表現型アッセイなどが含まれる。
【００３９】
干渉ＲＮＡなどの治療用核酸の「有効量」または「治療有効量」は、所望の効果、例えば干渉ＲＮＡの非存在下で検出された正常な発現レベルと比較して、標的配列の発現の阻害をもたらすのに十分な量である。特定の実施形態では、干渉ＲＮＡで得られた値が対照に対して約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または０％である場合に、標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は達成されている。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための適切なアッセイには、これらに限定されないが、当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはｍＲＮＡレベルの試験、例えばドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュでのハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能ならびに当業者に公知の表現型アッセイなどが含まれる。
【００４０】
干渉ＲＮＡによる免疫応答の「減少（decrease）」、「減少（する）（decreasing）」、「低減（reduce）」または「低減（する）（reducing）」は、所与の干渉ＲＮＡ（例えば、修飾干渉ＲＮＡ）に対する免疫応答の検出可能な減少を意味するものとする。修飾干渉ＲＮＡによる免疫応答の減少量は、非修飾干渉ＲＮＡの存在下での免疫応答のレベルと比較して判定することができる。検出可能な減少は、非修飾干渉ＲＮＡの存在下で検出される免疫応答より約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低くてよい。干渉ＲＮＡに対する免疫応答の減少は一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのキラー細胞によるサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ−６またはＩＬ−１２）の減少、または干渉ＲＮＡの投与後の哺乳動物対象の血清中でのサイトカイン産生の減少によって測定される。
【００４１】
本明細書で用いる「キラー細胞（responder  cell）」という用語は、非修飾ｓｉＲＮＡなどの免疫賦活性干渉ＲＮＡと接触させた場合、検出可能な免疫応答をもたらす細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。キラー細胞の例には、例えば樹枝状細胞、マクロファージ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、脾細胞などが含まれる。検出可能な免疫応答には、例えばサイトカインまたは増殖因子、例えばＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦおよびその組合せの産生が含まれる。検出可能な免疫応答には、例えばテトラトリコペプチド反復配列１（ＩＦＩＴ１）ｍＲＮＡでのインターフェロン誘発タンパク質の誘発も含まれる。
【００４２】
「実質的な同一性」は、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする配列または参照配列の特定領域にわたって特定パーセントの同一性を有する配列を指す。
【００４３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、その下で核酸が、一般に核酸の複合混合物中でその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なった環境下では異なってくることになる。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な案内は、Tijssen、Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology--  Hybridization  with  Nucleic  Probes、「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  assays」（１９９３年）に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特異的な配列についての熱融点（thermal  melting  point）（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、そこで、標的に対して相補的であるプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である（Ｔｍで、標的配列が過剰に存在するので、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで実現することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍（two  times  background）、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。
【００４４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りであってよい：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄。ＰＣＲについて、低ストリンジェンシー増幅のためには約３６℃の温度が一般的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃〜４８℃で変化してよい。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅のためには約６２℃の温度が一般的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて約５０℃〜約６５℃の範囲であってよい。高ストリンジェンシー増幅と低ストリンジェンシー増幅の両方のための典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０ｓｅｃ〜２ｍｉｎの変性フェーズ、３０ｓｅｃ〜２ｍｉｎ続くアニーリングフェーズおよび約７２℃で１〜２ｍｉｎの拡張フェーズを含む。低および高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコールおよび指針は、例えばInnisら、PCR  Protocols、A  Guide  to  Methods  and  Applications、Academic  Press,  Inc.N.Y.（１９９０年）に提供されている。
【００４５】
それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を用いて生み出される場合に起こる。そうした場合、核酸は一般に中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例は、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、４５℃、１×ＳＳＣでの洗浄を含む。正ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に理解されよう。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するための追加的な指針は、多くの文献、例えばCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら、eds.に提供されている。
【００４６】
２つ以上の核酸の関連で「実質的に同一性の」または「実質的な同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、またはマニュアルでの整列化および外観検査により測定して、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって比較し最大の一致を目指して整列化した場合に、同一である、または特定のパーセンテージの同一ヌクレオチド（すなわち、指定領域にわたって少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。その関連で示される場合、この定義は、配列の相補性も同様に指す。実質的な同一性は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０個のヌクレオチドの長さの領域にわたって存在することが好ましい。
【００４７】
配列比較のため、一般に１つの配列が、それとテスト配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テストおよび参照配列がコンピュータに打ち込まれ、必要なら部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを使用するか、または代替のパラメーターを指定することができる。次いで、プログラムパラメーターをもとにして、配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対するテスト配列についての配列同一性パーセントが計算される。
【００４８】
本明細書で用いる「比較ウィンドウ」は、そこで、２つの配列が最適に整列化された後、配列を、同数の近接位置の参照配列と比較できる約５〜約６０、一般に約１０〜約４５、より一般的に約１５〜約３０からなる群から選択されるいくつかの近接位置のいずれか１つのセグメントへの参照を含む。比較のための配列の整列化方法は当業界で周知である。比較のための配列の最適な整列化は、SmithおよびWaterman、Adv.Appl.Math.、２巻：４８２頁（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol、４８巻：４４３頁（１９７０年）のホモロジー整列化アルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似した方法の探求、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（GAP,  BESALDHIT,  FASTA,  and  ALDHASTA  in  the  Wisconsin  Genetics  Software  Package、Genetics  Computer  Group、575  Science  Dr.、Madison、WI）またはマニュアルによる整列化および外観検査（例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら、eds.（１９９５年補足）を参照されたい）によって実行することができる。
【００４９】
配列同一性パーセントおよび配列相似性を判定するのに適したアルゴリズムの非限定的な例は、それぞれAltschulら、Nuc.Acids  Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびAltschulら、J.Mol.Biol、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。本明細書で説明するパラメーターで、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を用いて、本発明の核酸についての配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアはNational  Center  for  Biotechnology  Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手することができる。他の例は、タンパク質またはヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）配列を整列化するためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムなどの配列同一性パーセントを決定するためのグローバル整列化アルゴリズムである。
【００５０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の相似性の統計的分析も実行する（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９０巻：５８７３〜５７８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される相似性の１つの尺度は最小合計確率（smallest  sum  probability）（Ｐ（Ｎ））である。これは、それによって２つのヌクレオチド配列間の整合が偶然生じる確率の目安を提供する。例えば、参照核酸に対するテスト核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
【００５１】
本明細書で用いる「核酸」という用語は、一本鎖かまたは二本鎖の形態で少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むポリマーを指し、それにはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡは、例えばアンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予備縮合（pre-condensed）ＤＮＡ、ＰＣＲ産生物、ベクター（ＰＩ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡまたはこれらの群の誘導体および組合せの形態であってよい。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）およびその組合せの形態であってよい。核酸は合成、天然由来および非天然由来であり、参照核酸と類似した結合特性を有する公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を含む。そうした類似体の例には、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。特に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指定のない限り、具体的な核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列ならびに明確に示されている配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基（mixed-base）および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を形成させることによって遂行することができる（Batzerら、Nucleic  Acid  Res.、１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ohtsukaら、J.Biol.Chem.、２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Rossoliniら、Mol.Cell.  Probes、８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基およびホスフェート基を含む。ヌクレオチドは、ホスフェート基を介して一緒に結合している。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび天然の類似体ならび、これに限定されないが、新規の反応基、例えばこれらに限定されないがアミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびアルキルハライドなどを配置する修飾を含む、プリンおよびピリミジンの合成誘導体がさらに含まれる。
【００５２】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
【００５３】
本明細書で用いる「遺伝子産生物」は、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産生物を指す。
【００５４】
「脂質」という用語は、これに限定されないが、脂肪酸のエステルを含み、水に不溶性であるが多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。これらは通常少なくとも３つの部類に分けられる、すなわち：（１）油脂ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質（compound  lipid）」；ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」である。
【００５５】
「脂質粒子」という用語は、対象の標的部位（例えば、細胞、組織、臓器など）に治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を送達するために使用できる脂質処方物を含む。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を防ぐ任意選択のコンジュゲートされた脂質から形成された核酸−脂質粒子である。他の好ましい実施形態では、治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を、その粒子の脂質部分の中にカプセル化し、それによって酵素分解からその核酸を保護することができる。
【００５６】
本明細書で用いる「ＳＮＡＬＰ」という用語は安定な核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を防ぐ任意選択のコンジュゲートされた脂質）から作製された粒子を表し、ここで核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は脂質中に完全にカプセル化されている。特定の例では、それらが静脈内（ｉ．ｖ．）注射の後、長い循環寿命を示すことができ、それらが遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔てられた部位）で蓄積することができ、かつ、これらの遠位部位で標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるので、ＳＮＡＬＰは、全身的な用途に非常に有用である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０３６８３に示されているように、核酸を、縮合剤で複合化し、ＳＮＡＬＰ中にカプセル化することができる。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【００５７】
本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は一般に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍの平均径を有し、これらは実質的に非毒性である。さらに、本発明の脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中で、ヌクレアーゼでの分解に対して抵抗性がある。核酸−脂質粒子およびその調製方法は、例えば米国特許公開番号第２００４０１４２０２５号および同第２００７００４２０３１号に開示されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【００５８】
本明細書で用いる「脂質カプセル化された（lipid  encapsulated）」とは、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの治療用核酸を完全カプセル化、部分カプセル化またはその両方で提供する脂質粒子を指すことができる。好ましい実施形態では、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は、（例えば、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸−脂質粒子を形成させるために）脂質粒子中に完全にカプセル化されている。
【００５９】
「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を指す。そうした脂質コンジュゲートには、これらに限定されないが、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート、例えばジアルキルオキシプロピルと結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールと結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールと結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと結合したＰＥＧおよびセラミドとコンジュゲートされたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ−ＤＡＡコンジュゲート；例えば２０１０年１月１３日出願の米国仮出願番号第６１／２９４，８２８号および２０１０年１月１４日出願の米国仮出願番号第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート）およびそれらの混合物が含まれる。ＰＯＺ−脂質コンジュゲートの追加的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／００６２８２に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質と直接コンジュゲートさせることが可能であり、またはリンカー部分を介して脂質と結合させることができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質と連結させるのに適した任意のリンカー部分を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記特許文献のそれぞれの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【００６０】
「両親媒性脂質」という用語は、一部分において、脂質材料の疎水性部分が疎水性相中へ指向し、親水性部分が水相の方へ指向する適切な任意の材料を指す。親水性の特徴は、炭水化物、ホスフェート、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよび他の同様の基などの極性または荷電基の存在に由来する。疎水性は、これらに限定されないが、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに１つもしくは複数の芳香族、脂環式または複素環式基で置換されたそうした炭化水素基を含む無極性基を含めることによって付与することができる。両親媒性化合物の例には、これらに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が含まれる。
【００６１】
リン脂質の代表的な例には、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ−アシルオキシ酸（acyloxyacid）などのリンを含まない他の化合物も、両親媒性脂質と指定される基の範囲内である。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。
【００６２】
「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで荷電されていないかまたは中性の両性イオン形態で存在する多くの脂質種のいずれかを指す。生理学的ｐＨで、そうした脂質は、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールを含む。
【００６３】
「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質ならびに他の任意の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
【００６４】
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負の電荷をもつ任意の脂質を指す。これらの脂質には、これらに限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオル（palmitoyloleyol）ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）および中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれる。
【００６５】
「疎水性脂質」という用語は、これらに限定されないが、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに１つもしくは複数の芳香族、脂環式または複素環式基で任意選択で置換されたそうした炭化水素基を含む無極性基を有する化合物を指す。適切な例には、これらに限定されないが、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが含まれる。
【００６６】
「カチオン性脂質」および「アミノ脂質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、それらには、１つ、２つ、３つもしくはそれ以上の脂肪酸または脂肪族アルキル鎖およびｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有するそれらの脂質およびその塩が含まれる。カチオン性脂質は、一般にカチオン性脂質のｐＫａより低いｐＨでプロトン化されており（すなわち、正に荷電している）、ｐＫａを超えるｐＨで実質的に中性である。本発明のカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と称することもできる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は：プロトン化可能な第三アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭部基；各アルキル鎖が独立に０〜３個（例えば、０、１、２または３個）の二重結合を有するＣ１８アルキル鎖；頭部基とアルキル鎖の間のエーテル、エステルまたはケタール結合を含む。そうしたカチオン性脂質には、これらに限定されないが、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＸＴＣ２およびＣ２Ｋとしても公知である）、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＭＣ２としても公知である）およびＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（ＭＣ３としても公知である）が含まれる。
【００６７】
「塩」という用語は、カチオン性脂質と１つまたは複数のアニオンとの間で形成される複合体などの任意のアニオンおよびカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定的な例には、無機および有機アニオン、例えばヒドリド、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、オキサレート（例えば、ヘミオキサレート）、ホスフェート、ホスホネート、ハイドロジェンホスフェート、ジハイドロジェンホスフェート、オキシド、カーボネート、ビカーボネート、ナイトレート、ナイトライト、ニトリド、ビサルファイト、スルフィド、サルファイト、ビサルフェート、サルフェート、チオサルフェート、ハイドロジェンサルフェート、ボレート、ホーメート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、タートレート、ラクテート、アクリレート、ポリアクリレート、フマレート、マレエート、イタコネート、グリコレート、グルコネート、マレート、マンデレート、チグレート、アスコルベート、サリシレート、ポリメタクリレート、パークロレート、クロレート、クロライト、ヒポクロライト、ブロメート、ヒポブロマイト、ヨーデート、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、アーセネート、アーセナイト、クロメート、ジクロメート、シアニド、シアネート、チオシアネート、ヒドロキシド、ペルオキシド、ペルマンガネートおよびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、本明細書で開示するカチオン性脂質の塩は、結晶塩である。
【００６８】
「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子を含む直鎖状または分枝状、非環状または環状の飽和脂肪族炭化水素を含む。代表的な飽和直鎖アルキルには、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが含まれ、飽和分枝状アルキルには、これらに限定されないが、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれ、不飽和環状アルキルには、これらに限定されないが、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが含まれる。
【００６９】
「アルケニル」という用語は、隣接炭素原子間に少なくとも１個の二重結合を含む上記に定義したようなアルキルを含む。アルケニルにはｃｉｓ異性体とｔｒａｎｓ異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖状および分枝状アルケニルには、これらに限定されないが、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが含まれる。
【００７０】
「アルキニル」という用語は、隣接炭素間に少なくとも１個の三重結合を追加的に含む上記に定義したような任意のアルキルまたはアルケニルを含む。代表的な直鎖状および分枝状アルキニルには、これらに限定されないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどが含まれる。
【００７１】
「アシル」という用語は、結合点の炭素が以下で定義するようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む。以下のもの：−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニルおよび−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルはアシル基の非限定的な例である。
【００７２】
「複素環」という用語は、飽和、不飽和または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１または２個のヘテロ原子を含み、その窒素および硫黄ヘテロ原子が任意選択で酸化されていてよく、その窒素ヘテロ原子が任意選択で四級化されていてよい５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式、複素環式環であって、上記複素環のいずれかがベンゼン環と縮合している二環式環を含む複素環式環を含む。その複素環は任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合していてよい。複素環には、これらに限定されないが、以下で定義するヘテロアリールならびにモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（piperidinyl）、ピペリジニル（piperizynyl）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル（tetrahydroprimidinyl）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
【００７３】
「任意選択で置換されたアルキル」、「任意選択で置換されたアルケニル」、「任意選択で置換されたアルキニル」、「任意選択で置換されたアシル」および「任意選択で置換された複素環」という用語は、置換されている場合、少なくとも１個の水素原子がある置換基で置き換えられていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置き換えられる。この関連で、置換基には、これらに限定されないが、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙが含まれる。ここで、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じかまたは異なっており、独立に水素、アルキルまたは複素環であり、そのアルキルおよび複素環置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙの１つまたは複数でさらに置換されていてよい。「任意選択で置換された」という用語は、置換基のリストの前で用いられる場合、そのリスト中の置換基のそれぞれが本明細書で説明するように任意選択で置換されていてよいことを意味する。
【００７４】
「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。
【００７５】
「融合性」という用語は、ＳＮＡＬＰなどの脂質粒子が細胞膜と融合する能力を指す。その膜は、原形質膜であっても細胞小器官、例えばエンドソーム、細胞核等を取り囲む膜であってもよい。
【００７６】
本明細書で用いる「水溶液」という用語は、全体的にまたは部分的に水を含む組成物を指す。
【００７７】
本明細書で用いる「有機脂質溶液」という用語は、全体的にまたは部分的に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
【００７８】
本明細書で用いる「遠位部位」は、近接毛細血管床（adjacent  capillary  bed）に限定されず、生物体全体にわたって広く分布している部位を含む物理的に隔てられた部位を指す。
【００７９】
ＳＮＡＬＰなどの核酸−脂質粒子に関連して「血清安定な」ということは、遊離ＤＮＡまたはＲＮＡを著しく劣化させることになる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、その粒子がそれほど劣化しないことを意味する。適切なアッセイには、例えば標準的な血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイまたはＲＮＡｓｅアッセイが含まれる。
【００８０】
本明細書で用いる「全身的送達」は、生物体内で干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性薬剤の広範な生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を指す。いくつかの投与技術は、そのほかのものはできない、特定の薬剤の全身的送達をもたらすことができる。全身的送達は、有用な好ましくは治療量の薬剤が身体の大部分に曝露されることを意味する。広範な生体内分布を得るということは、通常、投与部位より遠位にある疾患部位に到達する前にその薬剤が急速に分解したり一掃されたり（初回通過臓器（肝臓、肺等）によるまたは急速な非特異的細胞結合によるなど）しないような血液寿命を必要とする。脂質粒子の全身的送達は、例えば静脈内、皮下および腹腔内を含む当業界で公知の任意の手段によるものであってよい。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身的送達は静脈内による送達である。
【００８１】
本明細書で用いる「局所送達」は、生物体内の標的部位への干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性薬剤の直接的な送達を指す。例えば、薬剤を、疾患部位、他の標的部位または標的臓器、例えば肝臓、心臓、膵臓、腎臓などに直接注射することによって局所的に送達することができる。
【００８２】
「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、テンジクネズミ、ウサギ、家畜などの任意の哺乳動物種を指す。
【００８３】
「細網内皮系」または「ＲＥＳ」という用語は、単球およびマクロファージなどの細網結合組織中に位置する食細胞を含む細網内皮細胞を含む免疫系の部分を指す。これらの細胞は一般にリンパ節および脾臓の中で蓄積する。肝臓のクッパー細胞および組織の組織球もＲＥＳの一部である。ＲＥＳは、一次リンパ器官と二次リンパ器官に分けられる。一次（「中枢」）リンパ器官は、ＲＥＳの細胞が産生される部位である。ＲＥＳの細胞は骨髄中で産生される。Ｔ細胞成熟のための要求部位であるので、胸腺も含まれる。二次（「末梢」）リンパ器官は、ＲＥＳの細胞が機能する部位である。これには、リンパ節、へんとう腺、脾臓および「ＭＡＬＴ」（粘膜関連リンパ組織）が含まれる。ＭＡＬＴはさらに、「ＧＡＬＴ」（腸管関連リンパ組織）と「ＢＡＬＴ」（気管支関連リンパ組織）に分けられる。肝臓のクッパー細胞はこの系の一部として役割を果たすが、組織中に組織化はされず；むしろ、これらは、肝臓類洞中全体に分散される。中枢神経系（ＣＮＳ）のミクログリアはＲＥＳの一部と考えることができる。これらは、ＣＮＳ損傷に応答して増殖するスカベンジャー細胞である。
【００８４】
ＩＩＩ．実施形態の説明
本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子、特にＡＬＤＨ２遺伝子の発現を標的とする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ）などの治療用核酸、その治療用核酸の１つまたは複数（例えば、カクテル）を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法、および脂質粒子を送達および／または投与する（例えば、ヒトにおけるアルコール症の処置のために）方法を提供する。
【００８５】
一態様では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする干渉ＲＮＡ分子を提供する。干渉ＲＮＡ分子の非限定的な例には、ｓｉＲＮＡ、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡおよびそれらの混合物などのＲＮＡｉを媒介することができる二本鎖のＲＮＡが含まれる。特定の例では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子の異なる領域を標的とする干渉ＲＮＡの組合せ（例えば、カクテル、プールまたは混合物）を含む組成物を提供する。特定の例では、本発明の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングし、ＡＬＤＨを不活性化し、かつ／またはＡＬＤＨの複製を阻害することができる。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）であって、その干渉ＲＮＡがセンス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、その干渉ＲＮＡが約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１５〜６０、１５〜３０、１５〜２５、１９〜３０、１９〜２５、２０〜６０、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２１〜３０、２１〜２９、２２〜３０、２２〜２９、２２〜２８、２３〜３０、２３〜２８、２４〜３０、２４〜２８、２５〜６０、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５または２５〜３０個のヌクレオチドの長さまたは約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５個のヌクレオチドの長さ）の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡを提供する。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、例えば干渉ＲＮＡの二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’ＯＭｅヌクレオチドを含むことができる。干渉ＲＮＡ中のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドは、２’ＯＭｅヌクレオチドで修飾されていることが好ましい。特定の例では、干渉ＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、二本鎖領域中に少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンス鎖は、例えば干渉ＲＮＡの二本鎖領域中に、修飾された（例えば、２’ＯＭｅ−修飾された）アデノシンおよび／または修飾された（例えば、２’ＯＭｅ−修飾された）シトシンヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００８８】
特定の実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）分子は、１つまたは両方の鎖中に１、２、３または４個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。特定の例では、干渉ＲＮＡは少なくとも１つの平滑末端を含むことができる。特定の実施形態では、干渉ＲＮＡの１つまたは両方の鎖中の３’オーバーハングは、標的配列またはその相補鎖に対して相補性を有する、１、２、３もしくは４個の修飾および／または非修飾デオキシチミジン（「ｔ」または「ｄＴ」）ヌクレオチド、１、２、３もしくは４個の修飾（例えば、２’ＯＭｅ）および／または非修飾ウリジン（「Ｕ」）リボヌクレオチドあるいは１、２、３もしくは４個の修飾（例えば、２’ＯＭｅ）および／または非修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ独立に含むことができる。
【００８９】
本発明は、本明細書で説明する干渉ＲＮＡの１つまたは複数（例えば、カクテル）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００９０】
他の態様では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、一般に本明細書で説明する干渉ＲＮＡの１つまたは複数（例えば、カクテル）、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含む。核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、本明細書で説明する干渉ＲＮＡの１つまたは複数（例えば、カクテル）、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を含むことが好ましい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中に完全にカプセル化されている。干渉ＲＮＡカクテルを含む処方物に関して、カクテル（例えば、異なる配列を有する干渉ＲＮＡ化合物）中に存在する異なる種類の干渉ＲＮＡ種が同じ粒子中に同時カプセル化されていても、またカクテル中に存在する各種類の干渉ＲＮＡ種が別個の粒子中にカプセル化されていてもよい。干渉ＲＮＡカクテルは、同一の、類似したもしくは異なる濃度またはモル比で、２つ以上の個々の干渉ＲＮＡ（それぞれ独特の配列を有する）の混合物を用いて本明細書で説明する粒子中に処方することができる。一実施形態では、干渉ＲＮＡのカクテル（異なる配列を有する複数の干渉ＲＮＡに相当する）を、同一の、類似したもしくは異なる濃度またはモル比の各干渉ＲＮＡ種を用いて処方し、異なる種類の干渉ＲＮＡを同じ粒子中に同時カプセル化する。他の実施形態では、カクテル中に存在する各種の干渉ＲＮＡ種を、同一の、類似したもしくは異なる干渉ＲＮＡ濃度またはモル比で異なる粒子中にカプセル化し、こうして形成された粒子（それぞれ異なる干渉ＲＮＡペイロードを含む）を別個に（例えば、治療レジメンにしたがって異なる時間で）投与する、または合わせて単一の単位用量として一緒に投与する（例えば、薬学的に許容される担体で）。本明細書で説明する粒子は血清安定性であり、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性があり、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
【００９２】
本発明の核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中のカチオン性脂質は、例えば本明細書で説明する式Ｉ〜ＩＩＩの１つもしくは複数のカチオン性脂質または他の任意のカチオン性脂質種を含むことができる。１つの特定の実施形態では、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）、それらの塩およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００９３】
本発明の核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中の非カチオン性脂質は、例えば１つまたは複数のアニオン性脂質および／または中性脂質を含むことができる。いくつかの実施形態では、その非カチオン性脂質は以下の中性脂質成分：（１）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；（２）コレステロールまたはその誘導体；あるいは（３）リン脂質の１つを含む。特定の好ましい実施形態では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはそれらの混合物を含む。特に好ましい実施形態では、非カチオン性脂質はＤＰＰＣとコレステロールとの混合物である。
【００９４】
本発明の核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中の脂質コンジュゲートは、粒子の凝集を阻止するものであり、例えば本明細書で説明する脂質コンジュゲートの１つまたは複数を含むことができる。１つの特定の実施形態では、脂質コンジュゲートはＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。ＰＥＧ−脂質コンジュゲートの例には、これらに限定されないが、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートおよびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、脂質粒子中のＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートまたはそれらの混合物を含むことができる。他の実施形態では、脂質コンジュゲートはＰＯＺ−ＤＡＡコンジュゲートなどのＰＯＺ−脂質コンジュゲートを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約１３ｍｏｌ％〜約４９．５ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数の非カチオン性脂質；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻止する１つまたは複数のコンジュゲートされた脂質を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。
【００９６】
この実施形態の１つの態様では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５２ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約３６ｍｏｌ％〜約４７ｍｏｌ％を構成するリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「１：５７」処方物と称する。１つの特定の実施形態では、この１：５７処方物は、約１．４ｍｏｌ％ＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約５７．１ｍｏｌ％カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、約７．１ｍｏｌ％ＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）および約３４．３ｍｏｌ％コレステロール（またはその誘導体）を含む四成分系である。
【００９７】
この実施形態の他の態様では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５６．５ｍｏｌ％〜約６６．５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約３１．５ｍｏｌ％〜約４２．５ｍｏｌ％を構成するコレステロールまたはその誘導体；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「１：６２」処方物と称する。１つの特定の実施形態では、この１：６２処方物は、リン脂質フリーであり、約１．５ｍｏｌ％ＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約６１．５ｍｏｌ％カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩および約３６．９ｍｏｌ％コレステロール（またはその誘導体）を含む三成分系である。
【００９８】
１：５７および１：６２処方物に関する追加の実施形態は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０および公開されている米国特許出願公開番号第２０１１／００７１２０８Ａ１号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【００９９】
他の実施形態では、本発明は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数の非カチオン性脂質；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を構成する粒子の凝集を阻止する１つまたは複数のコンジュゲートされた脂質を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。
【０１００】
この実施形態の１つの態様では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約４７ｍｏｌ％〜約６９ｍｏｌ％を構成するリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「２：４０」処方物と称する。１つの特定の実施形態では、この２：４０処方物は、約２ｍｏｌ％ＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約４０ｍｏｌ％カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、約１０ｍｏｌ％ＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）および約４８ｍｏｌ％コレステロール（またはその誘導体）を含む四成分系である。
【０１０１】
他の実施形態では、本発明は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を構成する１つまたは複数の非カチオン性脂質；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成する粒子の凝集を阻止する１つまたは複数のコンジュゲートされた脂質を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。
【０１０２】
この実施形態の１つの態様では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を構成するリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「７：５４」処方物と称する。特定の例では、７：５４処方物中のこの非カチオン性脂質混合物は：（ｉ）粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のリン脂質；および（ｉｉ）粒子中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む。１つの特定の実施形態では、この７：５４処方物は、約７ｍｏｌ％ＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）、約５４ｍｏｌ％カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、約７ｍｏｌ％ＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）および約３２ｍｏｌ％コレステロール（またはその誘導体）を含む四成分系である。
【０１０３】
この実施形態の他の態様では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数（例えば、カクテル）の干渉ＲＮＡ分子；（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩；（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を構成するコレステロールまたはその誘導体；および（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「７：５８」処方物と称する。１つの特定の実施形態では、この７：５８処方物は、リン脂質フリーであり、約７ｍｏｌ％ＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）、約５８ｍｏｌ％カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩および約３５ｍｏｌ％コレステロール（またはその誘導体）を含む三成分系である。
【０１０４】
７：５４および７：５８処方物に関する追加の実施形態は、公開されている米国特許出願公開番号第２０１１／００７６３３５Ａ１号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１０５】
本発明は、ＳＮＡＬＰなどの核酸−脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【０１０６】
本発明の核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、１つまたは複数のＡＬＤＨ遺伝子の発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の治療的送達に有用である。いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ遺伝子の異なる領域（例えば、重なった配列および／または重なっていない配列）を標的とする干渉ＲＮＡのカクテルを、同じかまたは異なる核酸−脂質粒子に処方し、その粒子をそうした処置を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する。特定の例では、治療有効量の核酸−脂質粒子を、哺乳動物に、例えばヒトにおけるアルコール症を処置するために投与することができる。
【０１０７】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書で説明する１つまたは複数の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）分子を、その細胞を本明細書で説明する核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ処方物）と接触させることによって細胞中に導入するための方法を提供する。１つの特定の実施形態では、その細胞は細網内皮細胞（例えば、単球またはマクロファージ）、線維芽細胞、内皮細胞または血小板細胞である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、以下の投与経路：経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下および皮内の１つによって投与される。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は全身的に、例えば腸内経由または非経口投与経路で投与される。
【０１０９】
特定の実施形態では、例えば急性または慢性のアルコール症を処置するために、本発明の核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）などのペイロードを他の組織と比較して肝臓に優先的に送達することができる。
【０１１０】
特定の態様では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、哺乳動物に、治療有効量の本明細書で説明する１つまたは複数の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）（例えば、１つまたは複数のＡＬＤＨ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ）を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ処方物）を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＬＤＨ干渉ＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与は、ＡＬＤＨ  ＲＮＡレベルを、干渉ＲＮＡの非存在下（例えば、緩衝対照または無関係の非ＡＬＤＨを標的とする干渉ＲＮＡ対照）で検出されるＡＬＤＨ  ＲＮＡレベルと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその中の任意の範囲）低減させる。他の実施形態では、１つまたは複数のＡＬＤＨ標的干渉ＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与は、ＡＬＤＨ  ＲＮＡレベルを、例えば緩衝対照または無関係の非ＡＬＤＨを標的とする干渉ＲＮＡ対照などの陰性対照に対して、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００日間またはそれ以上（またはその中の任意の範囲）低減させる。
【０１１１】
他の態様では、本発明は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、哺乳動物に治療有効量の本明細書で説明する１つまたは複数の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）（例えば、ＡＬＤＨ遺伝子の１つまたは複数の領域を標的とするｓｉＲＮＡ）を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ処方物）を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＬＤＨ干渉ＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与は、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡレベルを、干渉ＲＮＡの非存在下（例えば、緩衝対照または無関係の非ＡＬＤＨを標的とする干渉ＲＮＡ対照）で検出されるＡＬＤＨ  ｍＲＮＡレベルと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその中の任意の範囲）低減させる。他の実施形態では、１つまたは複数のＡＬＤＨ標的干渉ＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与は、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡレベルを、例えば緩衝対照または無関係の非ＡＬＤＨを標的とする干渉ＲＮＡ対照などの陰性対照に対して、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００日間またはそれ以上（またはその中の任意の範囲）低減させる。
【０１１２】
他の態様では、本発明は、アルコール症に付随する１つまたは複数の症状を処置する、防止する、その発症のリスクまたは可能性を低減させる（例えば、それに対する感受性を低減させる）、その発現を遅延させる、かつ／または改善することを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるアルコール症に付随する１つまたは複数の症状を処置する、防止する、その発症のリスクまたは可能性を低減させる（例えば、それに対する感受性を低減させる）、その発現を遅延させる、かつ／または改善するための方法であって、哺乳動物に治療有効量の、ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする本明細書で説明する１つまたは複数の干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ処方物）を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１１３】
他の態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）（例えば、アルコール症に罹患しているヒト）におけるＡＬＤＨを不活性化するための方法であって、哺乳動物に治療有効量のＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする本明細書で説明する１つまたは複数の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ処方物）を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＬＤＨ標的干渉ＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与は、ＡＬＤＨ酵素レベルを、干渉ＲＮＡの非存在下（例えば、緩衝対照または無関係の非ＡＬＤＨを標的とする干渉ＲＮＡ対照）で検出されるＡＬＤＨ酵素レベルと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその中の任意の範囲）低下、低減または減少させる。
【０１１４】
例を挙げると、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡは、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて測定することができる。分岐ＤＮＡアッセイは、ｂＤＮＡ分子を、捕獲した標的ＲＮＡからのシグナルを増幅するために使用するサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション法である。再度例を挙げると、ＡＬＤＨ酵素活性は、ＮＡＤおよび基質（例えば、アセトアルデヒド）をタンパク質試料に加え、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの生成を測定することによって、分光光度的に測定することができる（例えば、Sheppard,  Albersheim  &  McClearn、J.Biol.Chem.１９７０年２４５巻（１１号）：２８７６頁；Arolfoら、Alcoholism:  Clinical  and  Experimental  Research  ２００９年３３巻（１１号）：１９３５頁；Garverら、Alcohol  &  Alcoholism  ２０００年３５巻（５号）：４３５頁）を参照されたい）。
【０１１５】
ＩＶ．治療用核酸
「核酸」という用語は、一般にオリゴヌクレオチドと称される最大で６０個のヌクレオチドを含む断片、およびポリヌクレオチドと称されるより長い断片を有する任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（oligonucletoide）は約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書で説明する脂質粒子などの担体系と一緒になっている（associated  with）。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全にカプセル化されている。核酸は、本発明の脂質粒子単独で、またはペプチド、ポリペプチドもしくは慣用的な薬物などの小分子を含む脂質粒子と組み合わせて投与する（例えば、同時投与する）ことができる。
【０１１６】
本発明の関連で、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーもしくはオリゴマーまたは天然由来の塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドモノマーのポリマーもしくはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、非天然由来のモノマーもしくは同様に機能するその一部を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。そうした修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば高い細胞取り込み、低い免疫原性およびヌクレアーゼの存在下での高い安定性などの特性のため、しばしば天然形態のものより好ましい。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドは通常、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’および３’炭素でホスフェートと共有結合して交互型の非分岐ポリマーを形成しているデオキシリボースと呼ばれる五炭糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、五炭糖がリボースである類似した反復構造からなる。
【０１１８】
核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであっても二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡであっても、またＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。好ましい実施形態では、核酸は二本鎖のＲＮＡである。二本鎖のＲＮＡの例は本明細書で説明されており、それらには、例えばｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡｉ剤、例えばダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡが含まれる。他の実施形態では、核酸は一本鎖である。一本鎖核酸には、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟ｍｉＲＮＡおよび三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１１９】
本発明の核酸は一般に、核酸の具体的な形態に応じて様々な長さのものであってよい。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００〜約１００，０００個のヌクレオチド残基の長さであってよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１０〜約１００個のヌクレオチドの長さの範囲であってよい。様々な関連実施形態では、一本鎖と二本鎖および三本鎖の両方のオリゴヌクレオチドは、約１０〜約６０個のヌクレオチド、約１５〜約６０個のヌクレオチド、約２０〜約５０個のヌクレオチド、約１５〜約３０個のヌクレオチドまたは約２０〜約３０個のヌクレオチドの長さの範囲であってよい。
【０１２０】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、または標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。本明細書で用いる「特異的にハイブリダイズ可能である」および「相補的である（complementary）」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間で、安定で特異的な結合が起こるのに十分な程度の相補性を表す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことは理解される。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的配列の結合が標的配列の正常な機能に干渉して有用性またはそれからの発現の喪失を引き起こす場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイもしくは治療処置の場合の生理学的条件下、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが実行される条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。したがって、オリゴヌクレオチドは、標的とするまたはそれに特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較して、１、２、３個またはそれ以上の塩基置換を含むことができる。
【０１２１】
Ａ．ｓｉＲＮＡ
本発明の非修飾および修飾ｓｉＲＮＡ分子はＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は一般に約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約１５〜約３０個のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ｓｉＲＮＡは通常、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列より免疫賦活性が低く、対象の標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅプリンまたはピリミジンヌクレオチド、例えば２’ＯＭｅ−グアノシン、２’ＯＭｅ−ウリジン、２’ＯＭｅ−アデノシンおよび／または２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの１つの鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）中またはその両方の鎖中に存在してよい。いくつかの好ましい実施形態では、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの１つまたは複数は、ｓｉＲＮＡの１つの鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）中またはその両方の鎖中で修飾されている（例えば、２’ＯＭｅ修飾されている）。これらの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の修飾された（例えば、２’ＯＭｅ修飾された）アデノシンおよび／または修飾された（例えば、２’ＯＭｅ修飾された）シトシンヌクレオチドをさらに含むことができる。他の好ましい実施形態では、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドだけが、ｓｉＲＮＡの１つの鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）中またはその両方の鎖中で修飾されている（例えば、２’ＯＭｅ修飾されている）。ｓｉＲＮＡ配列はオーバーハング（例えば、Elbashirら、Genes  Dev.、１５巻：１８８頁（２００１年）またはNykanenら、Cell、１０７巻：３０９頁（２００１年）に記載されているような３’または５’オーバーハング）を有していても、またオーバーハングが欠けていてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。
【０１２２】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖の二本鎖領域中への２’ＯＭｅウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの選択的組み込みは、そのｓｉＲＮＡ分子への免疫応答を低減させるまたは完全に妨げる。特定の例では、特異的ｓｉＲＮＡ配列の免疫賦活特性およびそれらが遺伝子発現をサイレンシングする能力は、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域中への最少で選択的な２’ＯＭｅ修飾の導入によって、平衡を保つかまたは最適化することができる。これは、治療的に実行可能なｓｉＲＮＡ用量で、サイトカイン導入、毒性および非修飾ｓｉＲＮＡの使用に付随する標的外の影響を伴うことなく、実施することができる。
【０１２３】
修飾ｓｉＲＮＡは一般に、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域に約１％〜約１００％（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中の修飾ヌクレオチドの一部またはすべては、お互いから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のヌクレオチドまたはそれ以上で隔てられている。好ましい１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のどの修飾ヌクレオチドも互いに隣接していない（例えば、各修飾ヌクレオチド間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の非修飾ヌクレオチドのすき間がある）。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約５０％未満（例えば、約４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％または３６％未満、好ましくは約３５％、３４％、３３％、３２％、３１％または３０％未満）は修飾された（例えば、２’ＯＭｅ）ヌクレオチドを含む。これらの実施形態の１つの態様では、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖の二本鎖領域中のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの約５０％未満は選択的に（例えば、それだけで）修飾されている。これらの実施形態の他の態様では、そのｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約５０％未満は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの両方の鎖中に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、二本鎖領域中に存在する２’ＯＭｅヌクレオチドは２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドだけである。これらの実施形態のさらに他の態様では、そのｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約５０％未満は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは二本鎖領域中に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約５０％未満は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの両方の鎖中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは二本鎖領域中に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約５０％未満は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖中に２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、二本鎖領域中の２’ＯＭｅヌクレオチドは互いに隣接していない。
【０１２５】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約１％〜約５０％（例えば、約５％〜５０％、１０％〜５０％、１５％〜５０％、２０％〜５０％、２５％〜５０％、３０％〜５０％、３５％〜５０％、４０％〜５０％、４５％〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４５％、１５％〜４５％、２０％〜４５％、２５％〜４５％、３０％〜４５％、３５％〜４５％、４０％〜４５％、５％〜４０％、１０％〜４０％、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２５％〜４０％、２５％〜３９％、２５％〜３８％、２５％〜３７％、２５％〜３６％、２６％〜３９％、２６％〜３８％、２６％〜３７％、２６％〜３６％、２７％〜３９％、２７％〜３８％、２７％〜３７％、２７％〜３６％、２８％〜３９％、２８％〜３８％、２８％〜３７％、２８％〜３６％、２９％〜３９％、２９％〜３８％、２９％〜３７％、２９％〜３６％、３０％〜４０％、３０％〜３９％、３０％〜３８％、３０％〜３７％、３０％〜３６％、３１％〜３９％、３１％〜３８％、３１％〜３７％、３１％〜３６％、３２％〜３９％、３２％〜３８％、３２％〜３７％、３２％〜３６％、３３％〜３９％、３３％〜３８％、３３％〜３７％、３３％〜３６％、３４％〜３９％、３４％〜３８％、３４％〜３７％、３４％〜３６％、３５％〜４０％、５％〜３５％、１０％〜３５％、１５％〜３５％、２０％〜３５％、２１％〜３５％、２２％〜３５％、２３％〜３５％、２４％〜３５％、２５％〜３５％、２６％〜３５％、２７％〜３５％、２８％〜３５％、２９％〜３５％、３０％〜３５％、３１％〜３５％、３２％〜３５％、３３％〜３５％、３４％〜３５％、３０％〜３４％、３１％〜３４％、３２％〜３４％、３３％〜３４％、３０％〜３３％、３１％〜３３％、３２％〜３３％、３０％〜３２％、３１％〜３２％、２５％〜３４％、２５％〜３３％、２５％〜３２％、２５％〜３１％、２６％〜３４％、２６％〜３３％、２６％〜３２％、２６％〜３１％、２７％〜３４％、２７％〜３３％、２７％〜３２％、２７％〜３１％、２８％〜３４％、２８％〜３３％、２８％〜３２％、２８％〜３１％、２９％〜３４％、２９％〜３３％、２９％〜３２％、２９％〜３１％、５％〜３０％、１０％〜３０％、１５％〜３０％、２０％〜３４％、２０％〜３３％、２０％〜３２％、２０％〜３１％、２０％〜３０％、２１％〜３０％、２２％〜３０％、２３％〜３０％、２４％〜３０％、２５％〜３０％、２５％〜２９％、２５％〜２８％、２５％〜２７％、２５％〜２６％、２６％〜３０％、２６％〜２９％、２６％〜２８％、２６％〜２７％、２７％〜３０％、２７％〜２９％、２７％〜２８％、２８％〜３０％、２８％〜２９％、２９％〜３０％、５％〜２５％、１０％〜２５％、１５％〜２５％、２０％〜２９％、２０％〜２８％、２０％〜２７％、２０％〜２６％、２０％〜２５％、５％〜２０％、１０％〜２０％、１５％〜２０％、５％〜１５％、１０％〜１５％、または５％〜１０％）は修飾ヌクレオチドを含む。これらの実施形態の１つの態様では、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖の二本鎖領域中のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの約１％〜約５０％は選択的に（例えば、それだけで）修飾されている。これらの実施形態の他の態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約１％〜約５０％は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの両方の鎖中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、二本鎖領域中に存在する２’ＯＭｅヌクレオチドは２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドだけである。これらの実施形態のさらに他の態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約１％〜約５０％は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは二本鎖領域中に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約１％〜約５０％は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの両方の鎖中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも１つの２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは二本鎖領域中に２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約１％〜約５０％は２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは修飾ｓｉＲＮＡの両方の鎖中で２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、ｓｉＲＮＡは２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される２’ＯＭｅヌクレオチドを含み、二本鎖領域中の２’ＯＭｅヌクレオチドは互いに隣接していない。
【０１２６】
ｓｉＲＮＡ中に導入できる追加的な範囲、パーセンテージおよび修飾のパターンは米国特許公開番号第２００７０１３５３７２号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１２７】
１．ｓｉＲＮＡ配列の選択
適切なｓｉＲＮＡ配列は、当業界で公知の任意の手段を用いて特定することができる。一般に、Elbashirら、Nature、４１１巻：４９４〜４９８頁（２００１年）およびElbashirら、EMBO  J.、２０巻：６８７７〜６８８８頁（２００１年）に記載されている方法を、Reynoldsら、Nature  Biotech.、２２巻（３号）：３２６〜３３０頁（２００４年）に示されている合理的な設計ルールと組み合わせる。
【０１２８】
非限定的な例として、対象の標的遺伝子からの転写物のＡＵＧ出発コドンのヌクレオチド配列３’を、ジヌクレオチド配列（例えば、ＡＡ、ＮＡ、ＣＣ、ＧＧまたはＵＵ、ここでＮ＝Ｃ、ＧまたはＵである）について走査することができる（例えば、Elbashirら、EMBO  J.、２０巻：６８７７〜６８８８頁（２００１年）を参照されたい）。ジヌクレオチド配列のすぐ３’側のヌクレオチドは、潜在的ｓｉＲＮＡ配列（すなわち、標的配列またはセンス鎖配列）として特定される。一般に、ジヌクレオチド配列のすぐ３’側の１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５個またはそれ以上のヌクレオチドは潜在的ｓｉＲＮＡ配列として特定される。いくつかの実施形態では、ジヌクレオチド配列はＡＡまたはＮＡ配列であり、ＡＡまたはＮＡジヌクレオチドのすぐ３’側の１９個のヌクレオチドは潜在的ｓｉＲＮＡ配列として特定される。ｓｉＲＮＡ配列は、通常、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置で間隔があけられている。ｓｉＲＮＡ配列のサイレンシング効率をさらに増進させるために、潜在的ｓｉＲＮＡ配列を分析して、例えば標的細胞または生物体中に、他のコード配列と相同性の領域を含まない部位を特定することができる。例えば、約２１個の塩基対の適切なｓｉＲＮＡ配列は一般に、標的細胞または生物体中のコード配列と相同性の１６〜１７個超の近接塩基対はもたないことになる。ｓｉＲＮＡ配列がＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーターから発現されることになる場合、４個超の近接Ａ’またはＴ’が欠けたｓｉＲＮＡ配列が選択される。
【０１２９】
潜在的ｓｉＲＮＡ配列が特定されたら、相補配列（すなわち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。潜在的ｓｉＲＮＡ配列は当業界で公知の様々な基準を用いて分析することもできる。例えば、それらのサイレンシング効率を増進させるために、合理的設計アルゴリズムによってｓｉＲＮＡ配列を分析して以下の特徴：（１）約２５％〜約６０％のＧ／ＣのＧ／Ｃ含量；（２）センス鎖の１５〜１９位で少なくとも３つのＡ／Ｕ；（３）内部反復はなし；（４）センス鎖の１９位にＡ；（５）センス鎖の３位にＡ；（６）センス鎖の１０位にＵ；（７）センス鎖の１９位にＧ／Ｃはなし；および（８）センス鎖の１３位にＧはなしの１つまたは複数を有する配列を特定することができる。これらの特徴のそれぞれの適切な値を指定するものであり、ｓｉＲＮＡの選択に有用であるアルゴリズムを組み込んでいるｓｉＲＮＡ設計ツールは、例えば、http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.htmlに見ることができる。当業者は、上記特徴の１つまたは複数を有する配列を、さらなる分析および試験のために、潜在的ｓｉＲＮＡ配列として選択できることを理解されよう。
【０１３０】
さらに、以下の基準、すなわち：（１）列の中に４つ以上の同じ塩基のストレッチを含む配列；（２）Ｇのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特徴に起因する非特異的効果の可能性を低減させるため）；（３）三重塩基（triple  base）モチーフ（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＡＡＡまたはＴＴＴ）を含む配列；（４）列の中に７つ以上のＧ／Ｃのストレッチを含む配列；および（５）内部折り返し構造をもたらす候補中の４つ以上の塩基の直列反復を含む配列、の１つまたは複数を有する潜在的ｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡとしてしばしば排除することができる。しかし、当業者は、上記特徴の１つまたは複数を有する配列も、潜在的ｓｉＲＮＡ配列としてさらに分析および試験するために選択することができることを理解されよう。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、潜在的ｓｉＲＮＡ配列は、例えばKhvorovaら、Ｃｅｌｌ、１１５巻：２０９〜２１６頁（２００３年）；およびSchwarzら、Cell、１１５巻：１９９〜２０８頁（２００３年）に記載されている、ｓｉＲＮＡ二重鎖非対称をもとにしてさらに分析することができる。他の実施形態では、潜在的ｓｉＲＮＡ配列は、例えばLuoら、Biophys.Res.Commun.、３１８巻：３０３〜３１０頁（２００４年）に記載されている標的部位での二次構造をもとにしてさらに分析することができる。例えば、標的部位での二次構造を、Ｍｆｏｌｄアルゴリズム（http://mfold.burnet.edu.au/rna_formで入手することができる）を用いてモデル化して、塩基対合およびステム−ループの形態の二次構造がより少ない標的部位でのアクセス性に好都合なｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。
【０１３２】
潜在的ｓｉＲＮＡ配列が特定されたら、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカインアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルを用いて、配列を、任意の免疫賦活特性の存在について分析することができる。ＧＵ−リッチモチーフ（例えば、５’−ＧＵ−３’，５’−ＵＧＵ−３’，５’−ＧＵＧＵ−３’，５’−ＵＧＵＧＵ−３’等）などのｓｉＲＮＡ配列のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中のモチーフは、その配列が免疫賦活性であるかどうかの目安も提供することができる。ｓｉＲＮＡ分子が免疫賦活性であることが分かったら、次いでこれを修飾して、本明細書で説明するようなその免疫賦活特性を減少させることができる。非限定的な例として、細胞が検出可能な免疫応答をもたらすような条件下で、ｓｉＲＮＡ配列を哺乳動物のキラー細胞と接触させ、ｓｉＲＮＡが免疫賦活性であるか非免疫賦活性ｓｉＲＮＡであるか判定することができる。哺乳動物のキラー細胞は、無処置の哺乳動物（すなわち、それまでｓｉＲＮＡ配列の遺伝子産生物と接触していない哺乳動物）からのものであってよい。哺乳動物のキラー細胞は、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、マクロファージなどであってよい。検出可能な免疫応答は、サイトカインまたは増殖因子、例えばＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはその組合せなどの産生を含むことができる。次いで、センスおよび／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドの少なくとも１つを修飾ヌクレオチドで置き換えることによって、免疫賦活性であると特定されたｓｉＲＮＡ分子を修飾してその免疫賦活特性を減少させることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域中のヌクレオチドの約３０％未満（例えば、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満）を、２’ＯＭｅヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドで置き換えることができる。次いで修飾ｓｉＲＮＡを上述したような哺乳動物のキラー細胞と接触させて、その免疫賦活特性が低減しているまたは妨げられていることを確認することができる。
【０１３３】
免疫応答を検出するための適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイには、これらに限定されないが、Davidら（米国特許第４，３７６，１１０号）の二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫アッセイ手法；モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Wideら、KirkhamおよびHunter,  eds.、Radioimmunoassay  Methods、E.and  S.Livingstone、Edinburgh（１９７０年））；Gordonら（米国特許第４，４５２，９０１号）の「ウエスタンブロット」法；標識リガンドの免疫沈降（Brownら、J.Biol.Chem．、２５５巻：４９８０〜４９８３頁（１９８０年））；例えばRainesら、J.Biol.Chem．、２５７巻：５１５４〜５１６０頁（１９８２年）によって記載されているような酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学的手法（Brooksら、Clin.Exp.Immunol、３９巻：４７７頁（１９８０年））；および活性の中和（Bowen-Popeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻：２３９６〜２４００頁（１９８４年））が含まれる。上記の免疫アッセイに加えて、米国特許第３，８１７，８２７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号および同第４，０９８，８７６号に記載されているものを含むいくつかの他の免疫アッセイを利用することができる。これらの文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１３４】
免疫応答を検出するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデルの非限定的な例には、例えばJudgeら、Mol.Ther.、１３巻：４９４〜５０５頁（２００６年）に記載されているようなｉｎ  ｖｉｖｏマウスサイトカイン誘発アッセイが含まれる。特定の実施形態では、実行することができるアッセイは以下の通りである：（１）ｓｉＲＮＡを、側部尾静脈で標準的な静脈内注射によって投与することができ；（２）投与後約６時間で、血液を心穿刺により採取し、サイトカイン分析用の血漿として処理することができ；（３）製造業者の取扱説明書にしたがってサンドイッチＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカインを定量化することができる（例えば、マウスおよびヒトＩＦＮ−α（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；ヒトＩＬ−６およびＴＮＦ−α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ならびにマウスＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））。
【０１３５】
サイトカインおよび増殖因子と特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の供給業者から市販されており、これらは当業界で公知の方法を用いて作製することができる（例えば、Kohlerら、Nature、２５６巻：４９５〜４９７頁（１９７５年）ならびにHarlowおよびLane,  ANTIBODIES、A  LABORATORY  MANUAL、Cold  Spring  Harbor  Publication、New  York（１９９９年）を参照されたい）。モノクローナル抗体の作製はこれまで記載されており、これらは当業界で公知の任意の手段（Buhringら、Hybridoma、１０巻、１号、７７〜７８頁（１９９１年））で遂行することができる。いくつかの方法では、検出し易くするために、モノクローナル抗体に標識を付ける（例えば、分光的、光化学的、生化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物で）。
【０１３６】
２．ｓｉＲＮＡ分子の作製
ｓｉＲＮＡは、例えば、１つまたは複数の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖として、より長い二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡとしての形態を含むいくつかの形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、酵素的に、または部分的／全体的な有機合成によって産生することができ、修飾されたリボヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的または有機合成によって導入することができる。特定の例では、各鎖は化学的に調製される。ＲＮＡ分子の合成方法は当業界で公知であり、それらは、例えばVermaおよびEckstein（１９９８年）に記載されているかまたは本明細書で説明するような化学的合成方法である。
【０１３７】
ＲＮＡ集団を用いて長い前駆体ＲＮＡを提供することができるまたは選択された標的配列との実質的なまたは完全な同一性を有する長い前駆体ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡを作製することができる。ＲＮＡは、当業者に周知の方法にしたがって、細胞または組織から単離し、合成しかつ/またはクローン化することができる。ＲＮＡは、混合集団（ｃＤＮＡから転写され、差し引きされ、選択される等により細胞または組織から得られる）であっても、また単一の標的配列を表してもよい。ＲＮＡは、天然由来（例えば、組織または細胞試料から単離された）であっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されても（例えば、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼおよびＰＣＲ産生物またはクローンｃＤＮＡを用いて）、また化学的に合成されてもよい。
【０１３８】
合成ＲＮＡ用の長いｄｓＲＮＡを形成するために、補体もｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、ハイブリダイズされてｄｓＲＮＡを形成する。天然由来のＲＮＡ集団を使用する場合、例えば、ＲＮＡ集団に対応するｃＤＮＡを転写することによって、またはＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、ＲＮＡ補体も提供される（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅＩＩＩまたはダイサーによる消化のためのｄｓＲＮＡを形成させるために）。次いで前駆体ＲＮＡをハイブリダイズして消化のための二本鎖のＲＮＡを形成させる。ｄｓＲＮＡは対象に直接投与するか、または投与の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで消化させることができる。
【０１３９】
ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ合成し、核酸をハイブリダイズし、ｃＤＮＡライブラリーを作製しスクリーニングし、ＰＣＲを実施するための方法は当業界で周知であり（例えば、GublerおよびHoffman、Gene、２５巻：２６３〜２６９頁（１９８３年）；Sambrookら（上記）；Ausubelら（上記）を参照されたい）、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Innisら、eds、１９９０年）を参照されたい）がある。発現ライブラリーも当業者に周知である。本発明における使用の一般的方法を開示している追加的な基礎的教科書には、Sambrookら、Molecular  Cloning、A  Laboratory  Manual（2nd  ed.１９８９年）；Kriegler、Gene  Transfer  and  Expression:A  Laboratory  Manual（１９９０年）；およびCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら、eds．、１９９４年）が含まれる。これらの文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡは化学的に合成することが好ましい。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、Usmanら、J.Am.Chem.Soc、１０９巻：７８４５頁（１９８７年）；Scaringeら、Nucl.Acids  Res.、１８巻：５４３３頁（１９９０年）；Wincottら、Nucl.Acids  Res．、２３巻：２６７７〜２６８４頁（１９９５年）；およびWincottら、Methods  Mol.Bio.、７４巻：５９頁（１９９７年）に記載されているものなどの当業界で公知の様々な技術のいずれかを用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成では、５’末端でのジメトキシトリチルおよび３’末端でのホスホラミダイトなどの一般的な核酸の保護および結合基を使用する。非限定的な例として、小規模な合成は、０．２μｍｏｌスケールプロトコールを用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成装置で実施することができる。あるいは、０．２μｍｏｌスケールでの合成をＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からの９６ウェルプレート合成装置で実施することができる。しかし、より大きいまたはより小さいスケールの合成も本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチド合成用の適切な試薬、ＲＮＡ脱保護法およびＲＮＡ精製法は当業者に公知である。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡ分子は、タンデム型合成技術によって合成することもできる。ここで両方の鎖は、その後に切断されてハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する別個の断片または鎖を提供する、切断可能なリンカーにより分離された単一の連続したオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成される。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。ｓｉＲＮＡのタンデム型合成は、マルチウェル／マルチプレート合成ｐｌａＡＬＤＨｏｒｍｓと回分反応器、合成カラムなどを用いる大規模合成ｐｌａＡＬＤＨｏｒｍｓの両方に容易に適合させることができる。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子を、一方のオリゴヌクレオチドがセンス鎖を含み他方がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む、区別できる２つのオリゴヌクレオチドから構築することができる。例えば、各鎖を別個に合成し、合成および／または脱保護に続く、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションによって一緒に結合させることができる。他の特定の場合、ｓｉＲＮＡ分子を、単一の連続したオリゴヌクレオチド断片として合成することができる。ここで、その自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域はハイブリダイズしてヘアピン二次構造を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
【０１４２】
３．ｓｉＲＮＡ配列の修飾
特定の態様では、ｓｉＲＮＡ分子は二本鎖領域中に２つの鎖および少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを有する二重鎖を含み、各鎖は、約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さである。修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列より免疫賦活性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持していることが有利である。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子中に導入される化学修飾の度合いは、ｓｉＲＮＡの免疫賦活特性の低減または妨げと、ＲＮＡｉ活性の保持の間のバランスに影響を及ぼす（strike）。非限定的な例として、対象の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ二重鎖中の選択的ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドで、最小限修飾されて（例えば、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満修飾されて）、標的遺伝子発現をサイレンシングする能力を保持しながら、ｓｉＲＮＡによってもたらされる免疫応答を排除することができる。
【０１４３】
本発明で使用するのに適した修飾ヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）、２’−デオキシ、５−Ｃ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’−チオ、２’−アミノまたは２’−Ｃ−アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれる。例えばSaenger、Principles  of  Nucleic  Acid  Structure、Springer-Verlag  Ed.（１９８４年）に記載されているものなどのノーザン構造（Northern  conformation）を有する修飾ヌクレオチドもｓｉＲＮＡ分子での使用に適している。そうした修飾ヌクレオチドには、これらに限定されないが、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロ（２’Ｃｌ）ヌクレオチドおよび２’−アジドヌクレオチドが含まれる。特定の例では、本明細書で説明するｓｉＲＮＡ分子には、１つまたは複数のＧ−クランプヌクレオチドが含まれる。Ｇ−クランプヌクレオチドは修飾されたシトシン類似体を指し、この修飾は、二重鎖内の相補型グアニンヌクレオチドのワトソン−クリック（Watson-Crick）面とフーグステン（Hoogsteen）面の両方と水素結合する能力を付与する（例えば、Linら、J.Am.Chem.Soc、１２０巻：８５３１〜８５３２頁（１９９８年）を参照されたい）。さらに、ヌクレオチドベースの類似体、例えばＣ−フェニル、Ｃ−ナフチル、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミドおよびニトロアゾール誘導体、例えば３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドールおよび６−ニトロインドールを有するヌクレオチド（例えば、Loakes、Nucl.Acids  Res.、２９巻：２４３７〜２４４７頁（２００１年）を参照されたい）を、ｓｉＲＮＡ分子中に取り込むことができる。
【０１４４】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１つまたは複数の化学修飾、例えば末端キャップ部分、ホスフェート骨格修飾などをさらに含むことができる。末端キャップ部分の例には、これらに限定されないが、反転デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分、３’−３’−反転脱塩基部分、３’−２’−反転ヌクレオチド部分、３’−２’−反転脱塩基部分、５’−５’−反転ヌクレオチド部分、５’−５’−反転脱塩基部分、３’−５’−反転デオキシ脱塩基部分、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホルアミデート、５’−ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、５’−アミノ、３’−ホスホロチオエート、５’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよび架橋型もしくは非架橋型メチルホスホネートまたは５’−メルカプト部分（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号；Beaucageら、Tetrahedron  ４９巻：１９２５頁（１９９３年）を参照されたい）が含まれる。ホスフェート骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間結合をもたらす）の非限定的な例には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよびアルキルシリル置換体（例えば、Hunzikerら、Nucleic  Acid  Analogues:Synthesis  and  Properties、Modern  Synthetic  Methods、VCH、３３１〜４１７頁（１９９５年）；Mesmaekerら、Novel  Backbone  Replacements  for  Oligonucleotides,  Carbohydrate  Modifications  in  Antisense  Research,  ACS、２４〜３９頁（１９９４年）を参照されたい）が含まれる。そうした化学修飾は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’末端および／または３’末端で行うことができる。これらの文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖は、約１〜約４（例えば、１、２、３または４）個の２’−デオキシリボヌクレオチド、修飾（例えば、２’ＯＭｅ）および／または非修飾ウリジンリボヌクレオチドおよび／または修飾（例えば、２’ＯＭｅ）および非修飾ヌクレオチドの他の任意の組合せを有する３’末端オーバーハングをさらに含むことができる。
【０１４６】
ｓｉＲＮＡ分子中に導入することができる修飾ヌクレオチドおよび化学修飾の種類の追加的な例は、例えば英国特許第２，３９７，８１８Ｂ号および米国特許公開番号第２００４０１９２６２６号、同第２００５０２８２１８８号および同第２００７０１３５３７２号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１４７】
本明細書で説明するｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖中に１つもしくは複数の非ヌクレオチドを任意選択で含むことができる。本明細書で用いる「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはホスフェート置換体を含む１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み込むことができ、残りの塩基がそれらの活性を示すようにする任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、一般に認識されるヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンを含まず、したがって１’位での塩基を欠いているという点で脱塩基である。
【０１４８】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの化学修飾は、ｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートを結合させることを含む。コンジュゲートは、例えば生分解性リンカーなどの共有結合によってｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンス鎖の５’および／または３’末端で結合させることができる。コンジュゲートは、例えばカルバメート基または他の連結基を介してｓｉＲＮＡと結合させることもできる（例えば、米国特許公開番号第２００５００７４７７１号、同第２００５００４３２１９号および同第２００５０１５８７２７号を参照されたい）。特定の例では、コンジュゲートは細胞へのｓｉＲＮＡの送達を容易にする分子である。ｓｉＲＮＡとの結合に適したコンジュゲート分子の例には、これらに限定されないが、ステロイド、例えばコレステロール、グリコール、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸（塩）（例えば、葉酸、葉酸類似体およびその誘導体）、糖類（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコース等）、リン脂質、ペプチド、細胞取り込みを媒介することができる細胞受容体のためのリガンドおよびその組合せが含まれる（例えば、米国特許公開番号第２００３０１３０１８６号、同第２００４０１１０２９６号および同第２００４０２４９１７８号；米国特許第６，７５３，４２３号を参照されたい）。他の例には、米国特許公開番号第２００５０１１９４７０号および同第２００５０１０７３２５号に記載されている、親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、干渉物質（intercalator）、小溝結合剤（minor  groove  binder）、開裂剤および架橋剤コンジュゲート分子が含まれる。さらに他の例には、米国特許公開番号第２００５０１５３３３７号に記載されている２’−Ｏ−アルキルアミン、２’−Ｏ−アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、Ｃ５−カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジニウム基、アミジニウム（amidininium）基、カチオン性アミノ酸コンジュゲート分子が含まれる。追加的な例には、米国特許公開番号第２００４０１６７０９０号に記載されている、疎水性基、膜活性化合物、細胞透過性化合物、細胞標的シグナル、相互作用修飾因子および立体安定剤コンジュゲート分子が含まれる。他の例には、米国特許公開番号第２００５０２３９７３９号に記載されているコンジュゲート分子が含まれる。使用されるコンジュゲートの種類およびｓｉＲＮＡ分子とのコンジュゲーションの度合いは、改善された薬物動態的プロファイル、生物学的利用能および／またはＲＮＡｉ活性を保持しながらのｓｉＲＮＡの安定性について評価することができる。したがって、当業者は、様々な周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養またはｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルのいずれかを用いて、それと結合している種々のコンジュゲートを有するｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングして改善された特性および完全なＲＮＡｉ活性を有するものを特定することができる。上記特許文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１４９】
４．ｓｉＲＮＡ実施形態の例
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５もしくは１９〜２５個のヌクレオチドの長さまたは１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個のヌクレオチドの長さ）を含む。１つの特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学的に合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの発現をサイレンシングすることができる。
【０１５０】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは二本鎖領域中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約５０％未満（例えば、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満）は修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約１％〜約５０％（例えば、約５％〜５０％、１０％〜５０％、１５％〜５０％、２０％〜５０％、２５％〜５０％、３０％〜５０％、３５％〜５０％、４０％〜５０％、４５％〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４５％、１５％〜４５％、２０％〜４５％、２５％〜４５％、３０％〜４５％、３５％〜４５％、４０％〜４５％、５％〜４０％、１０％〜４０％、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２５％〜４０％、３０％〜４０％、３５％〜４０％、５％〜３５％、１０％〜３５％、１５％〜３５％、２０％〜３５％、２５％〜３５％、３０％〜３５％、５％〜３０％、１０％〜３０％、１５％〜３０％、２０％〜３０％、２５％〜３０％、５％〜２５％、１０％〜２５％、１５％〜２５％、２０％〜２５％、５％〜２０％、１０％〜２０％、１５％〜２０％、５％〜１５％、１０％〜１５％、または５％〜１０％）は修飾ヌクレオチドを含む。
【０１５１】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドおよびそれらの混合物を含む修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）、例えば２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドまたはそれらの混合物などを含む。１つの特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドまたはそれらの混合物を含む。特定の例では、ｓｉＲＮＡは２’ＯＭｅ−シトシンヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡはヘアピンループ構造を含む。
【０１５２】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖領域の１つの鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）または両方の鎖の中に修飾ヌクレオチドを含む。ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域中の選択的位置で修飾されていることが好ましい。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび／またはアンチセンス鎖中のウリジンヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、６個またはそれ以上は、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドなどの修飾ウリジンヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、センスおよび／またはアンチセンス鎖中のどのウリジンヌクレオチドも２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび／またはアンチセンス鎖中のグアノシンヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、６個またはそれ以上は、２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドなどの修飾グアノシンヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、センスおよび／またはアンチセンス鎖中のどのグアノシンヌクレオチドも２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチドである。
【０１５３】
特定の実施形態では、例えば、５’−ＧＵ−３’モチーフを排除するためにミスマッチを導入することによって、かつ／または２’ＯＭｅヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを導入することによって、ｓｉＲＮＡ配列中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７個またはそれ以上の５’−ＧＵ−３’モチーフを修飾することができる。５’−ＧＵ−３’モチーフは、センス鎖中、アンチセンス鎖中またはｓｉＲＮＡ配列の両方の鎖中にあってよい。５’−ＧＵ−３’モチーフは互いに隣接していてよく、あるいはそれらは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられていてよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列より免疫賦活性が低い。そうした実施形態では、低い免疫賦活特性を有する修飾ｓｉＲＮＡ分子は、標的配列に対するＲＮＡｉ活性を有利に保持する。他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫賦活特性および標的遺伝子発現をサイレンシングするその能力は、ｓｉＲＮＡ配列中、例えばｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域中への最少で選択的な２’ＯＭｅ修飾の導入によって平衡を保つかまたは最適化することができる。特定の例では、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡより、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％免疫賦活性が低い。修飾ｓｉＲＮＡ分子および対応する非修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫賦活特性は、例えば、哺乳動物での全身投与、または適切な脂質ベースの送達系（本明細書で開示するＳＮＡＬＰ送達系など）を用いた哺乳動物のキラー細胞のトランスフェクション後、約２〜約１２時間、ＩＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６レベルを測定することによって判定できることは当業者に容易に明らかであろう。
【０１５５】
他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１０倍以下のＩＣ５０（すなわち、半数阻害濃度）を有する（すなわち、修飾ｓｉＲＮＡは対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１０倍以下のＩＣ５０を有する）。他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列の３倍以下のＩＣ５０を有する。さらに他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは対応する非修飾ｓｉＲＮＡの２倍以下ＩＣ５０を有する。用量応答曲線を作製することができ、修飾ｓｉＲＮＡおよび対応する非修飾ｓｉＲＮＡについてのＩＣ５０値を当業者に公知の方法を用いて簡単に決定できることは、当業者に容易に明らかであろう。
【０１５６】
他の実施形態では、非修飾または修飾ｓｉＲＮＡ分子は、陰性対照（例えば、緩衝剤のみ、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列、スクランブルされたｓｉＲＮＡ配列等）に対して標的配列の発現の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％をサイレンシングすることができる。
【０１５７】
さらに他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列に対して標的配列の発現の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％をサイレンシングすることができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中にホスフェート骨格修飾を含まない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中に１、２、３、４個またはそれ以上のホスフェート骨格修飾を含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡはホスフェート骨格修飾を含まない。
【０１５９】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中に２’−デオキシヌクレオチドを含まない。さらに他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中に１、２、３、４個またはそれ以上の２’−デオキシヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは２’−デオキシヌクレオチドを含まない。
【０１６０】
特定の例では、センスおよび／またはアンチセンス鎖中の二本鎖領域の３’末端でのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドではない。他の特定の場合、センスおよび／またはアンチセンス鎖中の二本鎖領域の３’末端近傍のヌクレオチド（例えば、３’末端の１、２、３または４個以内のヌクレオチド）は修飾ヌクレオチドではない。
【０１６１】
本明細書で説明するｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖領域の一方の側または両側に１、２、３、４個またはそれ以上のヌクレオチドの３’オーバーハングを有していても、また二本鎖領域の一方の側または両側にオーバーハングを欠いていてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。特定の実施形態では、センスおよび／またはアンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、１、２、３、４個またはそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’ＯＭｅヌクレオチドおよび／または本明細書で説明するかまたは当業界で公知の他の任意の修飾ヌクレオチドを独立に含む。
【０１６２】
特定の実施形態では、ＡＬＤＨ  ＲＮＡまたはＡＬＤＨ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、その核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨを標的とする１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子；（ｂ）カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよび／またはγ−ＤＬｅｎＤＭＡ）；および（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥおよび／またはコレステロール）を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含むことができる。
【０１６３】
治療目的のための、上記ＡＬＤＨ遺伝子のいずれかの発現のサイレンシングにおけるその有用性に加えて、本明細書で説明するｓｉＲＮＡは、研究および開発用途ならびに診断、予防、予後、臨床および他のヘルスケア用途においても有用である。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡを、ＡＬＤＨ遺伝子ファミリーの特定のメンバーが治療標的である可能性を有するかどうかのテストを指向した標的妥当性試験において使用することができる。
【０１６４】
Ｂ．ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ
本明細書で用いる「ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ」または「前駆体ＲＮＡｉ分子」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏでダイサーによってプロセッシングされて、標的遺伝子のＲＮＡ干渉のためにＲＩＳＣ複合体中に組み込まれた活性なｓｉＲＮＡを産生する任意の前駆体分子を含むものとする。
【０１６５】
一実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、ダイサーによってプロセッシングされてｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さを有する。この実施形態によれば、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、（ｉ）約２５〜約６０個のヌクレオチドの長さ（例えば、約２５〜６０、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ）、好ましくは約２５〜約３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のヌクレオチドの長さ）である第１のオリゴヌクレオチド配列（センス鎖とも称される）、および（ｉｉ）細胞の細胞質中で見られる条件などの生物学的条件下で第１の配列とアニーリングする第２のオリゴヌクレオチド配列（アンチセンス鎖とも称される）を含む。第２のオリゴヌクレオチド配列は、約２５〜約６０個のヌクレオチドの長さ（例えば、約２５〜６０、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ）、好ましくは約２５〜約３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のヌクレオチドの長さ）であってよい。さらに、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡの配列の１つ、特にアンチセンス鎖の領域は、標的遺伝子から産生されたＲＮＡのヌクレオチド配列に対してＲＮＡｉ応答の引き金を引くのに十分に相補的である、少なくとも約１９個のヌクレオチド、例えば約１９〜約６０個のヌクレオチド（例えば、約１９〜６０、１９〜５５、１９〜５０、１９〜４５、１９〜４０、１９〜３５、１９〜３０または１９〜２５個のヌクレオチド）、好ましくは約１９〜約２３個のヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２または２３個のヌクレオチド）の長さの配列を有する。
【０１６６】
第２の実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、ダイサーによるそのプロセッシングを増進させるいくつかの特性を有する。この実施形態によれば、このｄｓＲＮＡは、ダイサーによってプロセッシングされてｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さを有し、かつ以下の特性、すなわち：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称性である、例えばアンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する；かつ／または（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡのダイサー結合およびプロセッシングの活性なｓｉＲＮＡへの方向性を導くためのセンス鎖上の修飾３’末端をもつことの少なくとも１つを有する。この後者の実施形態によれば、センス鎖は約２２〜約２８個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は約２４〜約３０個のヌクレオチドを含む。
【０１６７】
一実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡはアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。他の実施形態では、センス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサー結合およびプロセッシングのために修飾される。適切な修飾因子には、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および立体障害分子、例えば蛍光性分子などが含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、これらは、ｄｓＲＮＡの長さが変化しないようにｄｓＲＮＡ中のリボヌクレオチドを置き換える。他の実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡはアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有しており、センス鎖はダイサープロセッシングのために修飾される。他の実施形態では、センス鎖の５’末端はホスフェートを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端はホスフェートを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖またはその両方の鎖は１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖（stand）は、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む３’−オーバーハングを含む。アンチセンス鎖は追加の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドも含み得る。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件などの生物学的条件下でアニールする。さらに、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡの配列の１つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも約１９個のヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１−ヌクレオチド領域中にあり、標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に対して十分に相補的である。さらに、この実施形態によれば、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、以下の追加の特性：（ａ）アンチセンス鎖は典型的な２１−ｍｅｒからの右方シフトを有する（すなわち、典型的な２１−ｍｅｒと比較した場合、アンチセンス鎖はその分子の右側にヌクレオチドを含む）；（ｂ）その鎖は完全には相補的でない可能性がある、すなわち、その鎖は単純なミスマッチ対を含む可能性がある；および（ｃ）ロックト核酸（複数可）などの塩基修飾がセンス鎖の５’末端中に含まれていてよいということの１つまたは複数を有することもできる。
【０１６８】
第３の実施形態では、センス鎖は約２５〜約２８個のヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７または２８個のヌクレオチド）を含み、センス鎖の３’末端の２個のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は５’末端にホスフェートを含む。アンチセンス鎖は約２６〜約３０個のヌクレオチド（例えば、２６、２７、２８、２９または３０個のヌクレオチド）を含み、１〜４個のヌクレオチドの３’−オーバーハングを含む。３’−オーバーハングを含むヌクレオチドは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドで修飾されている。アンチセンス鎖は、３’−オーバーハングに隣接するアンチセンス鎖の第１のモノマーで始まり、その３’−オーバーハングに隣接する第１のモノマーからヌクレオチド１５〜１９個伸びる交互型の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。例えば、２７−ヌクレオチドアンチセンス鎖について、アンチセンス鎖の５’末端の第１の塩基を位置番号１と数えると、２’ＯＭｅ修飾は塩基９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２６および２７に配置されることになる。一実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは以下の構造：
【化１】
2014530602.tif 000002
を有する。ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「ｐ」＝ホスフェート基であり、「Ｘ」＝２’ＯＭｅ  ＲＮＡであり、「Ｙ」は任意選択で２’ＯＭｅ  ＲＮＡモノマーである１、２、３または４個のＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。
【０１６９】
第４の実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、ダイサーによるそのプロセッシングを増進させるいくつかの特性を有する。この実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、ダイサーによってプロセッシングされてｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さを有しており、以下の特性：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称性である、例えばセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する；および（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡのダイサー結合およびプロセッシングを活性なｓｉＲＮＡへの方向へ導くためのアンチセンス鎖上の修飾３’末端を有することの少なくとも１つを有する。この実施形態によれば、センス鎖は約２４〜約３０個のヌクレオチド（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のヌクレオチド）を含み、アンチセンス鎖は約２２〜約２８個のヌクレオチド（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のヌクレオチド）を含む。一実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡはセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサー結合およびプロセッシングのために修飾される。適切な修飾因子には、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および立体障害分子、例えば蛍光性分子などが含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、これらは、ｄｓＲＮＡの長さが変化しないように、ｄｓＲＮＡ中のリボヌクレオチドを置き換える。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡはセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有し、アンチセンス鎖はダイサープロセッシングのために修飾される。一実施形態では、アンチセンス鎖は５’−ホスフェートを有する。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件などの生物学的条件下でアニールする。さらに、ｄｓＲＮＡの配列の１つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９個のヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドはアンチセンス鎖の３’末端に隣接しており、標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に対して十分に相補的である。さらに、この実施形態によれば、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、以下の追加の特性：（ａ）アンチセンス鎖は典型的な２１−ｍｅｒからの左方シフトを有する（すなわち、典型的な２１−ｍｅｒと比較した場合、アンチセンス鎖はその分子の左側にヌクレオチドを含む）；および（ｂ）その鎖は完全には相補的でない可能性がある、すなわち、その鎖は単純なミスマッチ対を含む可能性があるということの１つまたは複数を有することもできる。
【０１７０】
好ましい実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは非対称構造を有しており、センス鎖は２５−塩基対長さを有し、アンチセンス鎖は、２個の塩基３’−オーバーハングを含む２７−塩基対長さを有する。特定の例では、非対称構造を有するこのｄｓＲＮＡは、リボヌクレオチドのうちの２つの代わりに、センス鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドをさらに含む。他の特定の場合、非対称構造を有するこのｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５位（ここでアンチセンス鎖の５’末端での第１の塩基は１位である）で２’ＯＭｅ修飾をさらに含む。特定の追加的な例では、非対称構造を有するこのｄｓＲＮＡは、１、２、３または４個の２’ＯＭｅヌクレオチドを含むアンチセンス鎖上に３’−オーバーハング（例えば、アンチセンス鎖上の２６および２７位での２’ＯＭｅヌクレオチドの３’−オーバーハング）をさらに含む。
【０１７１】
他の実施形態では、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列を最初に選択することによって設計することができる。いくつかの例では、アンチセンスｓｉＲＮＡは、５’末端上に約５〜約１１個のリボヌクレオチドを含むように修飾されて約２４〜約３０個のヌクレオチドの長さを提供する。アンチセンス鎖が２１個のヌクレオチドの長さを有する場合、３〜９、好ましくは４〜７、またはより好ましくは６個のヌクレオチドを５’末端上に付加させることができる。付加されたリボヌクレオチドは標的遺伝子配列に対して相補的であってよいが、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡの間の完全な相補性は必要としない。すなわち、得られるアンチセンスｓｉＲＮＡは標的配列と十分に相補的である。次いで約２２〜約２８個のヌクレオチドを有するセンス鎖が産生される。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールするのにアンチセンス鎖と十分に相補的である。一実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖のダイサープロセッシングを導くための修飾３’末端を含むように合成される。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’−オーバーハングを有する。他の実施形態では、センス鎖は、ダイサー結合およびプロセッシングのための修飾３’末端を含むように合成され、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’−オーバーハングを有する。
【０１７２】
関連する実施形態では、アンチセンスｓｉＲＮＡを、５’末端上に約１〜約９個のリボヌクレオチドを含むように修飾して約２２〜約２８個のヌクレオチドの長さを提供することができる。アンチセンス鎖が２１個のヌクレオチドの長さを有する場合、１〜７、好ましくは２〜５、またはより好ましくは４個のリボヌクレオチドを３’末端に付加させることができる。付加されたリボヌクレオチドは任意の配列を有してよい。付加されたリボヌクレオチドは標的遺伝子配列に対して相補的であってよいが、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡの間の完全な相補性は必要としない。すなわち、得られるアンチセンスｓｉＲＮＡは標的配列と十分に相補的である。次いで約２４〜約３０個のヌクレオチドを有するセンス鎖が産生される。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールするのに、アンチセンス鎖と十分に相補的である。一実施形態では、アンチセンス鎖は、ダイサープロセッシングを導くための修飾３’末端を含むように合成される。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は３’−オーバーハングを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、ダイサー結合およびプロセッシングのための修飾３’末端を含むように合成され、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は３’−オーバーハングを有する。
【０１７３】
適切なダイサー−基質ｄｓＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を設計し、合成し、修飾するための当業界で公知の任意の手段を用いて、特定し、合成し、修飾することができる。特定の実施形態では、本発明のダイサー−基質ｄｓＲＮＡは、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることができる。特定の実施形態では、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡを標的とするダイサー−基質ｄｓＲＮＡを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数のダイサー−基質ｄｓＲＮＡ分子；（ｂ）カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよび／またはγ−ＤＬｅｎＤＭＡ）；および（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥおよび／またはコレステロール）を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含むことができる。
【０１７４】
本発明のダイサー−基質ｄｓＲＮＡに関連する追加の実施形態ならびにそうしたｄｓＲＮＡを設計し合成する方法は、米国特許公開番号第２００５０２４４８５８号、同第２００５０２７７６１０号、および同第２００７０２６５２２０号、同第２０１１／００７１２０８号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１７５】
Ｃ．ｓｈＲＮＡ
「小ヘアピンＲＮＡ」、または「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするのに用いることができるタイトヘアピンターンを作る短いＲＮＡ配列を含む。本発明のｓｈＲＮＡは、化学的に合成するか、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写することができる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、次いでこれは、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。
【０１７６】
本発明のｓｈＲＮＡは、一般に約１５〜６０、１５〜５０または１５〜４０個の（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個の（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３個の（二重鎖）ヌクレオチドの長さである（例えば、二本鎖のｓｈＲＮＡの各相補配列は１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３個のヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｈＲＮＡは約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個の塩基対の長さ、好ましくは約１８〜２２、１９〜２０または１９〜２１個の塩基対の長さである）。ｓｈＲＮＡ二重鎖は、アンチセンス鎖上に約１〜約４個のヌクレオチドまたは約２〜約３個のヌクレオチドの３’オーバーハング、および／またはセンス鎖上に５’−ホスフェート末端を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、約１５〜約６０個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０または１５〜２５個のヌクレオチドの長さ）、好ましくは約１９〜約４０個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１９〜４０、１９〜３５、１９〜３０または１９〜２５個のヌクレオチドの長さ）、より好ましくは約１９〜約２３個のヌクレオチドの長さ（例えば、１９、２０、２１、２２または２３個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖配列を含む。
【０１７７】
ｓｈＲＮＡの非限定的な例には、そのセンスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されている、一本鎖分子から構築された二本鎖のポリヌクレオチド分子；および、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖のポリヌクレオチド分子が含まれる。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、約１〜約２５個のヌクレオチド、約２〜約２０個のヌクレオチド、約４〜約１５個のヌクレオチド、約５〜約１２個のヌクレオチドまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むループ構造によって連結されている。
【０１７８】
適切なｓｈＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を設計し、合成し、修飾するための当業界で公知の任意の手段を用いて、特定し、合成し、修飾することができる。特定の実施形態では、本発明のｓｈＲＮＡは、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることができる。特定の実施形態では、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数のｓｈＲＮＡ分子；（ｂ）カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよび／またはγ−ＤＬｅｎＤＭＡ）；および（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥおよび／またはコレステロール）を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含むことができる。
【０１７９】
本発明のｓｈＲＮＡに関連する追加の実施形態ならびにそうしたｓｈＲＮＡを設計し合成する方法は、米国特許出願公開番号第２０１１／００７１２０８号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。      
【０１８０】
Ｄ．ａｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡと同様に、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、アンチセンス鎖の５’末端に対してヌクレオチド１０とヌクレオチド１１の間の標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）をリクルートし、哺乳動物の細胞における様々な遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Sunら、Nat.Biotech.、２６巻：１３７９〜１３８２頁（２００８年））。一般に、ａｉＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、その二重鎖は、アンチセンス鎖の３’および５’末端にオーバーハングを含む。相補的アンチセンス鎖と比較した場合、両末端上でセンス鎖がより短いので、ａｉＲＮＡは一般に非対称である。いくつかの態様では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に用いられるものと同様の条件下で設計し、合成し、アニールすることができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列を、ｓｉＲＮＡ配列を選択するために上述した方法を用いて選択し、形成させることができる。
【０１８１】
他の実施形態では、種々の長さ（例えば、約１０〜２５、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１３〜１７または１４〜１７個の塩基対、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の塩基対）のａｉＲＮＡ二重鎖を、アンチセンス鎖の３’および５’末端でのオーバーハングで、対象のｍＲＮＡを標的とするように設計することができる。特定の例では、ａｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、約１０〜２５、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１３〜１７または１４〜１７個のヌクレオチドの長さ、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドの長さである。他の特定の場合、ａｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は約１５〜６０、１５〜５０または１５〜４０個のヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個のヌクレオチドの長さであり、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３個のヌクレオチドの長さである。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、５’アンチセンスオーバーハングは１、２、３、４個またはそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」等）を含む。他の実施形態では、３’アンチセンスオーバーハングは１、２、３、４個またはそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」等）を含む。特定の態様では、本明細書で説明するａｉＲＮＡ分子は、例えば二本鎖（二重鎖）の領域中、および／またはアンチセンスオーバーハング中に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列について上記した修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を含むことができる。好ましい実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、例えば２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドまたはそれらの混合物などを含む。
【０１８３】
特定の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子、例えば本明細書で説明するｓｉＲＮＡ分子の１つのアンチセンス鎖に対応するアンチセンス鎖を含むことができる。特定の実施形態では、本発明のａｉＲＮＡはＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングすることができる。特定の実施形態では、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡを標的とするａｉＲＮＡを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数のａｉＲＮＡ分子；（ｂ）カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよび／またはγ−ＤＬｅｎＤＭＡ）；および（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥおよび／またはコレステロール）を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含むことができる。
【０１８４】
適切なａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を設計し、合成し、修飾するための当業界で公知の任意の手段を用いて特定し、合成し、修飾することができる。本発明のａｉＲＮＡ分子に関連する追加の実施形態は、２００８年１２月２３日出願の米国特許出願番号第１２／３４３，３４２号および２００９年４月１５日出願の米国特許出願番号第１２／４２４，３６７号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１８５】
Ｅ．ｍｉＲＮＡ
一般に、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御する約２１〜２３個のヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、それらが転写されるそのＤＮＡからの遺伝子によってコードされるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質中に翻訳されず（ノンコーディングＲＮＡ）；その代わり、各一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）はプレｍｉＲＮＡと称される短いステム−ループ構造中に、最後に機能的成熟ｍｉＲＮＡ中にプロセッシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つまたは複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に対して部分的または完全に相補的であり、それらの主要機能は遺伝子発現を下方制御することである。ｍｉＲＮＡ分子の特定については、例えばLagos-Quintanaら、Science、２９４巻：８５３〜８５８頁；Lauら、Science、２９４巻：８５８〜８６２頁；およびLeeら、Science、２９４巻：８６２〜８６４頁に記載されている。
【０１８６】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセッシングされた成熟ｍｉＲＮＡ分子よりずっと長い。ｍｉＲＮＡは、一次転写物またはキャップおよびポリＡテールを有するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして最初に転写され、細胞核中で、プレｍｉＲＮＡとして公知の短い約７０−ヌクレオチドステム−ループ構造にプロセッシングされる。このプロセッシングは、動物中で、ヌクレアーゼドローシャおよび二本鎖のＲＮＡ結合タンパク質パシャからなるマイクロプロセッサー複合体として公知のタンパク質複合体によって実行される（Denliら、Nature、４３２巻：２３１〜２３５頁（２００４年））。次いでこれらのプレｍｉＲＮＡは、細胞質中で、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成も開始させるエンドヌクレアーゼダイサーとの相互作用によって、プロセッシングされて成熟ｍｉＲＮＡとなる（Bernsteinら、Nature、４０９巻：３６３〜３６６頁（２００１年）。ＤＮＡのセンス鎖かまたはアンチセンス鎖は、鋳型として機能してｍｉＲＮＡをもたらすことができる。
【０１８７】
ダイサーがプレｍｉＲＮＡステム−ループを切断する場合、２つの相補性の短いＲＮＡ分子が形成されるが、１つだけはＲＩＳＣ複合体中に組み込まれる。この鎖はガイド鎖として公知であり、５’末端の安定性をベースにして、ＲＩＳＣ複合体中で触媒的に活性なＲＮａｓｅであるアルゴノートタンパク質によって選択される（Preallら、Curr.Biol、１６巻：５３０〜５３５頁（２００６年））。アンチガイドまたはパッセンジャー鎖として公知の残りの鎖は、ＲＩＳＣ複合体基質として分解する（Gregoryら、Cell、１２３巻：６３１〜６４０頁（２００５年））。活性なＲＩＳＣ複合体中に組み込まれた後、ｍｉＲＮＡ塩基はそれらの相補性ｍＲＮＡ分子と対になり、標的ｍＲＮＡの分解および／または翻訳サイレンシングを誘発する。
【０１８８】
哺乳動物のｍｉＲＮＡ分子は、通常、標的ｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ中の部位に対して相補的である。特定の例では、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡとのアニーリングは、タンパク質翻訳機構を遮断することによってタンパク質翻訳を阻害する。他の特定の場合、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡとのアニーリングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と同様のプロセスによって、標的ｍＲＮＡの切断と分解を容易にする。ｍｉＲＮＡは、標的にされたｍＲＮＡに対応するゲノム部位のメチル化も標的とすることができる。一般に、タンパク質の補体に関連したｍｉＲＮＡ機能を集合的にｍｉＲＮＰと称する。
【０１８９】
特定の態様では、本明細書で説明するｍｉＲＮＡ分子は、約１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０または１５〜４０個のヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３個のヌクレオチドの長さである。特定の他の態様では、ｍｉＲＮＡ分子は１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列について上記した修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を含むことができる。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、例えば２’ＯＭｅ−グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ−ウリジンヌクレオチドなどまたはそれらの混合物を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、ＡＬＤＨ遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる。特定の実施形態では、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は：（ａ）ＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とする１つまたは複数のｍｉＲＮＡ分子；（ｂ）カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡおよび／またはγ−ＤＬｅｎＤＭＡ）；および（ｃ）非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥおよび／またはコレステロール）を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡおよび／またはＰＯＺ−ＤＡＡ）をさらに含むことができる。
【０１９１】
他の実施形態では、ＡＬＤＨ  ｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡの活性を遮断する１つまたは複数の薬剤を、本発明の脂質粒子（例えば、核酸−脂質粒子）を用いて投与する。遮断剤の例には、これらに限定されないが、立体遮断型オリゴヌクレオチド、ロックト核酸オリゴヌクレオチドおよびモルホリノオリゴヌクレオチドが含まれる。そうした遮断剤は、ｍｉＲＮＡまたは標的ＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位と直接結合することができる。      
【０１９２】
Ｖ．治療用核酸を含む担体系
一態様では、本発明は、１つまたは複数の治療用核酸（例えば、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ）を含む担体系を提供する。いくつかの実施形態では、担体系は、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）、カチオン性脂質またはリポソーム核酸複合体（すなわち、リポプレックス）、リポソーム、ミセル、ビロソームあるいはそれらの混合物などの脂質ベースの担体系である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）などのポリマーベースの担体系である。追加の実施形態では、担体系は、シクロデキストリンポリマー−核酸複合体などのシクロデキストリンベースの担体系である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ペプチド−核酸複合体などのタンパク質ベースの担体系である。担体系は、ＳＮＡＬＰなどの脂質粒子であることが好ましい。当業者は、本発明の治療用核酸を裸分子（naked  molecule）として送達することもできることを理解されよう。
【０１９３】
Ａ．脂質粒子
特定の態様では、本発明は、１つまたは複数の治療用核酸（例えば、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ）およびカチオン性（アミノ）脂質またはその塩の１つまたは複数を含む脂質粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は１つまたは複数の非カチオン性脂質をさらに含む。他の実施形態では、脂質粒子は、粒子凝集を低減させるまたは阻止することができる１つまたは複数のコンジュゲートされた脂質をさらに含む。
【０１９４】
本発明の脂質粒子は、治療用核酸、例えば干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、治療用核酸は、脂質粒子中の治療用核酸が水溶液中でヌクレアーゼ分解に対して抵抗性があるように、脂質粒子の脂質部分中に完全にカプセル化されている。他の実施形態では、本明細書で説明する脂質粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。本発明の脂質粒子は一般に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍまたは約７０〜約９０ｎｍの平均径を有する。本発明の脂質粒子は一般に、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約２５：１、約３：１〜約２０：１、約５：１〜約１５：１または約５：１〜約１０：１の脂質：治療剤（例えば、脂質：核酸）比（質量／質量比）も有する。
【０１９５】
好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ）、カチオン性脂質（例えば、本明細書で示す式Ｉ〜ＩＩＩの１つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩）、非カチオン性脂質（例えば、１つまたは複数のリン脂質とコレステロールとの混合物）および粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質（例えば、１つまたは複数のＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む血清安定性の核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）である。ＳＮＡＬＰは、本明細書で説明する遺伝子の１つまたは複数を標的とする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の非修飾および／または修飾干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含むことができる。核酸−脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば米国特許第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第５，７０５，３８５号、同第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，１１０，７４５号および同第６，３２０，０１７号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９６４に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０１９６】
本発明の核酸−脂質粒子では、核酸を、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化し、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護することができる。好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡなどの核酸を含むＳＮＡＬＰを、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化し、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。特定の例では、その粒子を、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５または６０分間ヌクレアーゼに曝露させた後でも、ＳＮＡＬＰ中の核酸は実質的に分解していない。他の特定の場合、ＳＮＡＬＰ中の核酸は、粒子を血清中、３７℃で少なくとも約３０、４５もしくは６０分間または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６時間インキュベーションした後でも、実質的に分解していない。他の実施形態では、核酸は粒子の脂質部分と複合化されている。本発明の処方物の利益の１つは、核酸−脂質粒子組成物が、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性であるということである。
【０１９７】
「完全にカプセル化される」という用語は、核酸−脂質粒子中の核酸が、遊離ＤＮＡまたはＲＮＡを著しく分解させることになる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露の後、実質的に分解されないことを表す。完全にカプセル化された系では通常、遊離核酸の１００％が分解する処置において、好ましくは粒子中の核酸の約２５％未満が分解し、より好ましくは粒子中の核酸の約１０％未満、最も好ましくは約５％未満が分解する。「完全にカプセル化される」ということは、核酸−脂質粒子が血清安定性である、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与によってそれらがそれらの成分パーツに急速に分解しないことも表す。
【０１９８】
核酸の関連で、完全なカプセル化は、核酸と会合すると高い蛍光をもつ染料を使用する、膜非透過性蛍光染料排除アッセイを実施することによって判定することができる。ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）およびＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などの特異的な染料は、プラスミドＤＮＡ、一本鎖デオキシリボヌクレオチドおよび／または一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチドの定量的決定に使用可能である。カプセル化は、その染料をリポソーム処方物に加え、得られる蛍光を測定し、少量の非イオン性洗剤の添加によって観察される蛍光と比較することによって判定される。リポソーム二重層の洗剤媒介による破壊によって、カプセル化された核酸が放出され、膜非透過性染料と相互作用できるようにする。核酸カプセル化はＥ＝（Ｉ０−Ｉ）／Ｉ０として計算することができる。ここでＩおよびＩ０は洗剤の添加前後の蛍光強度を指す（Wheelerら、Gene  Ther.、６巻：２７１〜２８１頁（１９９９年）を参照されたい）。
【０１９９】
他の実施形態では、本発明は、複数の核酸−脂質粒子を含む核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）組成物を提供する。
【０２００】
いくつかの例では、ＳＮＡＬＰ組成物は、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化されている核酸を含み、その結果、その粒子の約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）はその中にカプセル化された核酸を有する。
【０２０１】
他の例では、ＳＮＡＬＰ組成物は、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化されている核酸を含み、その結果、投入核酸の約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）はその粒子中にカプセル化されている。
【０２０２】
本発明の脂質粒子の使用目的に応じて、その成分の割合を変えることができ、特定の処方物の送達効率を、例えばエンドソーム放出パラメーター（ＥＲＰ）アッセイを用いて測定することができる。
【０２０３】
１．カチオン性脂質
様々なカチオン性脂質またはその塩のいずれも、単独か、あるいは１つもしくは複数の他のカチオン性脂質種または非カチオン性脂質種と組み合わせて、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）において使用することができる。カチオン性脂質にはその（Ｒ）型および／または（Ｓ）型の鏡像異性体が含まれる。
【０２０４】
一態様では、以下の構造を有する式Ｉのカチオン性脂質：
【化２】
2014530602.tif 000003
【０２０５】
またはその塩が本発明において有用である：ここで、
【０２０６】
Ｒ１およびＲ２は同じであるかまたは異なっており、独立に水素（Ｈ）または任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルもしくはＣ２〜Ｃ６アルキニルである、あるいはＲ１とＲ２は一緒になって、４〜６個の炭素原子および窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）およびそれらの混合物からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子の任意選択で置換された複素環式環を形成していてよく；
【０２０７】
Ｒ３は存在しないかまたは水素（Ｈ）もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであって四級アミンを提供しており；
【０２０８】
Ｒ４およびＲ５は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたＣ１０〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１０〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ１０〜Ｃ２４アルキニルまたはＣ１０〜Ｃ２４アシルであり、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは少なくとも２つの不飽和部位を含み；
【０２０９】
ｎは０、１、２、３または４である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである。好ましい１つの実施形態では、Ｒ１とＲ２はどちらもメチル基である。他の好ましい実施形態では、ｎは１または２である。他の実施形態では、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａより高い場合、Ｒ３は存在せず、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａより低い場合、Ｒ３は水素であり、それによってアミノ頭部基はプロトン化される。代替の実施形態では、Ｒ３は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであって四級アミンを提供する。他の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は独立に、任意選択で置換されたＣ１２〜Ｃ２０もしくはＣ１４〜Ｃ２２アルキル、Ｃ１２〜Ｃ２０もしくはＣ１４〜Ｃ２２アルケニル、Ｃ１２〜Ｃ２０もしくはＣ１４〜Ｃ２２アルキニルまたはＣ１２〜Ｃ２０もしくはＣ１４〜Ｃ２２アシルであり、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは少なくとも２つの不飽和部位を含む。
【０２１１】
特定の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は、ドデカジエニル部分、テトラデカジエニル部分、ヘキサデカジエニル部分、オクタデカジエニル部分、イコサジエニル部分、ドデカトリエニル部分、テトラデカトリエニル（tetradectrienyl）部分、ヘキサデカトリエニル部分、オクタデカトリエニル部分、イコサトリエニル部分、アラキドニル部分およびドコサヘキサエノイル部分ならびにそのアシル誘導体（例えば、リノレオイル、リノレノイル、γ−リノレノイル等）からなる群から独立に選択される。いくつかの例では、Ｒ４およびＲ５の１つは、分枝状アルキル基（例えば、フィタニル部分）またはそのアシル誘導体（例えば、フィタノイル部分）を含む。特定の例では、オクタデカジエニル部分はリノレイル部分である。他の特定の場合、オクタデカトリエニル部分はリノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、Ｒ４およびＲ５はどちらもリノレイル部分、リノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレオイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＡＰ）またはそれらの混合物である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は１つまたは複数のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質はそのシュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）塩であり、これは好ましくは結晶塩である。
【０２１３】
ＤＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｅｎＤＭＡなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許公開番号第２００６００８３７８０号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡおよびＣ２−ＤＬｉｎＤＡＰなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、国際特許出願番号ＷＯ２０１１／０００１０６に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２１４】
他の態様では、以下の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質（またはその塩）
【化３】
2014530602.tif 000004
は本発明において有用である：
【０２１５】
ここで、Ｒ１およびＲ２は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたＣ１２〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ１２〜Ｃ２４アルキニルまたはＣ１２〜Ｃ２４アシルであり；Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはＣ２〜Ｃ６アルキニルである、あるいはＲ３とＲ４は一緒になって、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１〜２個のヘテロ原子の任意選択で置換された複素環式環を形成していてよく；Ｒ５は存在しないかまたは水素（Ｈ）もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであって四級アミンを提供しており；ｍ、ｎ，およびｐは同じであるかまたは異なっており、独立に０、１または２のいずれかであり、ただしｍ、ｎおよびｐは同時に０であることはなく；ｑは０、１、２、３または４であり；ＹおよびＺは同じであるかまたは異なっており、独立にＯ、ＳまたはＮＨである。好ましい実施形態では、ｑは２である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」または「Ｃ２Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ；「Ｃ３Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ；「Ｃ４Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルペピアジノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジオレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジステアロイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−モルホリノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−塩化ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、２，２−ジリノレイル−４，５−ビス（ジメチルアミノメチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−メチルピペリジン−［１，３］−ジオキソラン（Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペリジン）、またはそれらの混合物である。好ましい実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質はＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡである。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は１つまたは複数のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質はそのシュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）塩であり、これは好ましくは結晶塩である。
【０２１８】
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０８６５５８に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ、ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡおよびＤ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペラジン（methylpiperzine）などのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日出願の「Improved  Amino  Lipids  and  Methods  for  the  Delivery  of  Nucleic  Acids」という名称のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２１９】
他の態様では、以下の構造を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質：
【化４】
2014530602.tif 000005
【０２２０】
またはその塩は本発明において有用である。ここで：Ｒ１およびＲ２は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルもしくはＣ２〜Ｃ６アルキニルである、またはＲ１とＲ２は一緒になって、４〜６個の炭素原子ならびに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）およびそれらの混合物からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子の任意選択で置換された複素環式環を形成していてよく；Ｒ３は存在しないかまたは水素（Ｈ）もしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであって四級アミンを提供しており；Ｒ４およびＲ５は存在しないかまたは存在しており、存在する場合、同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルであり；ｎは０、１、２、３または４である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである。好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２はどちらもメチル基である。他の好ましい実施形態では、Ｒ４およびＲ５はどちらもブチル基である。さらに他の好ましい実施形態では、ｎは１である。他の実施形態では、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａより高い場合、Ｒ３は存在せず、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａより低い場合、Ｒ３は水素であり、それによってアミノ頭部基はプロトン化される。代替の実施形態では、Ｒ３は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであって四級アミンを提供する。他の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は独立に、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６もしくはＣ２〜Ｃ４アルキルまたはＣ２〜Ｃ６もしくはＣ２〜Ｃ４アルケニルである。
【０２２２】
代替の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、アミノ頭部基とアルキル鎖の１つまたは両方の間にエステル結合を含む。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は１つまたは複数のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質はそのシュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）塩であり、これは好ましくは結晶塩である。
【０２２３】
式ＩＩＩのアルキル鎖のそれぞれは、６、９および１２位でｃｉｓ二重結合を含む（すなわち、ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ−Δ６，Δ９，Δ１２）が、代替の実施形態では、１つもしくは両方のアルキル鎖中のこれらの二重結合の１つ、２つまたは３つはｔｒａｎｓ構造であってよい。
【０２２４】
特に好ましい実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は構造：
【化５】
2014530602.tif 000006
を有する。
【０２２５】
γ−ＤＬｅｎＤＭＡなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、２００９年７月１日出願の「Improved  Cationic  Lipids  and  Methods  for  the  Delivery  of  Nucleic  Acids」という名称の米国仮出願番号第６１／２２２，４６２号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２２６】
特定の実施形態では、以下の構造を有するカチオン性脂質：
【化６】
2014530602.tif 000007
は本発明において有用である。
【０２２７】
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（「ＭＣ３」）などのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質（例えば、ＭＣ３の特定の類似体）の合成は、２００９年６月１０日出願の「Novel  Lipids  and  Compositions  for  the  Delivery  of  Therapeutics」という名称の米国仮出願番号第６１／１８５，８００号および２００９年１２月１８日出願の「Methods  and  Compositions  for  Delivery  of  Nucleic  Acids」という名称の米国仮出願番号第６１／２８７，９９５号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２２８】
本発明の脂質粒子中に含めることができる他のカチオン性脂質またはその塩の例には、これらに限定されないが、ＷＯ２０１１／０００１０６（この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのカチオン性脂質、ならびにＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−塩化ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ｂｅｔａ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９、１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチ−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’、１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレヨキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−���メチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジオエイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジミリストレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−塩化トリメチルアミノプロパン（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ；ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡとしても公知である）などのカチオン性脂質およびそれらの混合物が含まれる。本発明の脂質粒子中に含めることができる追加のカチオン性脂質またはその塩は米国特許公開番号第２００９００２３６７３号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２２９】
ＣＬｉｎＤＭＡなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許公開番号第２００６０２４０５５４号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＣ、ＤＬｉｎＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰおよびＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０８６５５８に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日出願の「Improved  Amino  Lipids  and  Methods  for  the  Delivery  of  Nucleic  Acids」という名称のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。いくつかの他のカチオン性脂質および関連類似体の合成は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，７５３，６１３号および同第５，７８５，９９２号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９０に記載されている。これらの開示をそれぞれ、全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。さらに、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できるＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できるＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）；ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から入手できるＤＯＧＳを含む）などのカチオン性脂質のいくつかの市販の製剤を使用することができる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％または約５５ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６１ｍｏｌ％、６２ｍｏｌ％、６３ｍｏｌ％、６４ｍｏｌ％または６５ｍｏｌ％（またはその任意の割合）を構成する。
【０２３１】
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％または約４０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２３２】
本発明の脂質粒子で使用するのに適したカチオン性脂質の追加的なパーセンテージおよび範囲は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０、米国特許公開出願番号第２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００１０６および米国特許公開出願番号第２０１１／００７６３３５号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２３３】
本発明の脂質粒子中に存在するカチオン性脂質のパーセンテージは目標量であり、処方物中に存在するカチオン性脂質の実際量は、例えば±５ｍｏｌ％変動する可能性があることを理解すべきである。例えば１：５７脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）処方物において、カチオン性脂質の目標量は５７．１ｍｏｌ％であるが、カチオン性脂質の実際量は、その目標量の±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％または±０．１ｍｏｌ％であってよく、処方物の残りは他の脂質成分で構成される（合計すると粒子中に存在する全脂質が１００ｍｏｌ％となる）。
【０２３４】
２．非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中で使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体をつくることができる様々な中性の非荷電性、両性イオンまたはアニオン性脂質のいずれかであってよい。
【０２３５】
非カチオン性脂質の非限定的な例には、リン脂質、例えばレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイオル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよびそれらの混合物が含まれる。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはＣ１０〜Ｃ２４個の炭素鎖を有する脂肪酸、例えばラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルから誘導されるアシル基である。
【０２３６】
非カチオン性脂質の追加の例には、コレステロールおよびその誘導体などのステロールが含まれる。コレステロール誘導体の非限定的な例には、５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテルおよび６−ケトコレスタノールなどの極性類似体；５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノンおよびコレステリルデカノエートなどの非極性類似体ならびにそれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体はコレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテルなどの極性類似体である。コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテルの合成は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つまたは複数のリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つまたは複数のリン脂質、例えばコレステロールフリー脂質粒子処方物を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えばリン脂質フリー脂質粒子処方物を含むかまたはそれからなる。
【０２３８】
本発明で使用するのに適した非カチオン性脂質の他の例には、非リン含有脂質、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル（hexadecyl  stereate）、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン−ラウリルサルフェート、アルキル−アリールサルフェートポリエチルオキシル化（polyethyloxylated）脂肪酸アミド、ジオクデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが含まれる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％〜約４２ｍｏｌ％または約３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％または４５ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２４０】
脂質粒子がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含む実施形態では、その混合物は、粒子中に存在する全脂質の最大で約４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％または６０ｍｏｌ％を構成することができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、その混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％または約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成することができる。特定の好ましい実施形態では、混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％または１０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む１：５７脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約３４ｍｏｌ％（またはその任意の割合）でのコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣなどのリン脂質を約７ｍｏｌ％（またはその任意の割合）で含むことができる。他の非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む７：５４脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約３２ｍｏｌ％（またはその任意の割合）でのコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣなどのリン脂質を約７ｍｏｌ％（またはその任意の割合）で含むことができる。
【０２４２】
他の実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％または約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成することができる。特定の好ましい実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３４ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３３ｍｏｌ％または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％または３５ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。一般に、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む１：５７脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の割合）でのＤＰＰＣまたはＤＳＰＣなどのリン脂質との混合物中、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約３４ｍｏｌ％（またはその任意の割合）で含むことができる。一般に、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む７：５４脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の割合）でのＤＰＰＣまたはＤＳＰＣなどのリン脂質との混合物中、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約３２ｍｏｌ％（またはその任意の割合）で含むことができる。
【０２４３】
脂質粒子がリン脂質フリーである実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する全脂質の最大で約２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％または６０ｍｏｌ％を構成することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、リン脂質フリー脂質粒子処方物中のコレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３９ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％〜約３８ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％または４０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成することができる。非限定的な例として、１：６２脂質粒子処方物は、粒子中に存在する全脂質の約３７ｍｏｌ％（またはその任意の割合）でコレステロールを含むことができる。他の非限定的な例として、７：５８脂質粒子処方物は粒子中に存在する全脂質の約３５ｍｏｌ％（またはその任意の割合）でコレステロールを含むことができる。
【０２４５】
他の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質のみ）または約６０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質およびコレステロールまたはその誘導体）（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２４６】
本発明の脂質粒子で使用するのに適した非カチオン性脂質の追加的なパーセンテージおよび範囲は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０、米国特許公開出願番号第２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００１０６および米国特許公開出願番号第２０１１／００７６３３５号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２４７】
本発明の脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質のパーセンテージは目標量であり、処方物中に存在する非カチオン性脂質の実際量は、例えば±５ｍｏｌ％変動する可能性があることを理解すべきである。例えば１：５７脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）処方物において、リン脂質の目標量は７．１ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３４．３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％または±０．１ｍｏｌ％であってよく、コレステロールの実際量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％または±０．１ｍｏｌ％であってよく、処方物の残りは他の脂質成分で構成される（合計すると粒子中に存在する全脂質が１００ｍｏｌ％となる）。同様に、７：５４脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）処方物において、リン脂質の目標量は６．７５ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３２．４３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％または±０．１ｍｏｌ％であってよく、コレステロールの実際量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％または±０．１ｍｏｌ％であってよく、処方物の残りは他の脂質成分で構成される（合計すると粒子中に存在する全脂質が１００ｍｏｌ％となる）。
【０２４８】
３．脂質コンジュゲート
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は脂質コンジュゲートをさらに含むことができる。コンジュゲートされた脂質は、それが粒子の凝集を防ぐという点で有用である。適切なコンジュゲートされた脂質には、これらに限定されないが、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート、ＰＯＺ−脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー−脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）およびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、その粒子はＰＥＧ−脂質コンジュゲートかまたはＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートをＣＰＬと一緒に含む。
【０２４９】
好ましい実施形態では、脂質コンジュゲートはＰＥＧ−脂質である。ＰＥＧ−脂質の例には、これらに限定されないが、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０２６３７２に記載されているようなジアルキルオキシプロピルと結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば米国特許公開番号第２００３００７７８２９号および同第２００５００８６８９号に記載されているようなジアシルグリセロールと結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質と結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、例えば米国特許第５，８８５，６１３号に記載されているようなセラミドとコンジュゲートされたＰＥＧ、コレステロールとコンジュゲートされたＰＥＧまたはそれらの誘導体およびそれらの混合物が含まれる。これらの特許文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。［０００１］本発明で使用するのに適した追加のＰＥＧ−脂質には、これに限定されないが、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルバモイルグリセリド（carbomoylglyceride）（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）が含まれる。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧの合成はＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０８６５５８に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。さらに追加の適切なＰＥＧ−脂質コンジュゲートには、これらに限定されないが、１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ）が含まれる。２ＫＰＥＧ−ＤＭＧの合成は米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２５０】
ＰＥＧは、２個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ反復単位の直鎖状水溶性ポリマーである。ＰＥＧはその分子量によって分類される；例えば、ＰＥＧ２０００は約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．および他の会社から市販されており、それらには、これらに限定されないが以下の：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（tresylate）（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）ならびに末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含むそうした化合物（例えば、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２等）が含まれる。米国特許第６，７７４，１８０号および同第７，０５３，１５０号に記載されているもの（例えば、ｍＰＥＧ（２０ＫＤａ）アミン）などの他のＰＥＧも、本発明のＰＥＧ−脂質コンジュゲートを調製するのに有用である。これらの特許の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えばＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含むＰＥＧ−脂質コンジュゲートを調製するのに特に有用である。
【０２５１】
本明細書で説明するＰＥＧ−脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を備えることができる。特定の例では、そのＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
【０２５２】
特定の例では、ＰＥＧはアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で任意選択で置換されていてよい。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートされていても、またリンカー部分を介して脂質と連結されていてもよい。例えば非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含むＰＥＧを脂質と連結させるのに適した任意のリンカー部分を用いることができる。好ましい実施形態では、そのリンカー部分は非エステル含有リンカー部分である。本明細書で用いる「非エステル含有リンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合（−ＯＣ（Ｏ）−）を含まないリンカー部分を指す。適切な非エステル含有リンカー部分には、これらに限定されないが、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、アミノ（−ＮＲ−）、カルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、スクシニル（−（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、スクシンアミジル（−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、エーテル、ジスルフィドならびにその組合せ（カルバメートリンカー部分とアミドリンカー部分の両方を含むリンカーなど）が含まれる。好ましい実施形態では、カルバメートリンカーが、ＰＥＧを脂質と連結させるために使用される。
【０２５３】
他の実施形態では、エステル含有リンカー部分が、ＰＥＧを脂質と連結させるために使用される。適切なエステル含有リンカー部分には、例えば炭酸（−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、スクシノイル、リン酸エステル（−Ｏ−（Ｏ）ＰＯＨ−Ｏ−）、スルホン酸エステルおよびその組合せが含まれる。
【０２５４】
様々な鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンは、ＰＥＧにコンジュゲートされて脂質コンジュゲートを形成することができる。そうしたホスファチジルエタノールアミンは市場で入手するか、または当業者に公知の慣用的技術を用いて単離または合成することができる。Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含むホスファチジル−エタノールアミンが好ましい。モノ−またはジ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンも使用することができる。適切なホスファチジルエタノールアミンには、これらに限定されないが、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が含まれる。
【０２５５】
「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」という用語は、これらに限定されないが、米国特許第６，３２０，０１７号および同第６，５８６，５５９号に記載されている化合物を含む。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。これらの化合物は式：
【化７】
2014530602.tif 000008
を有する化合物を含む。
【０２５６】
ここで、Ｒは水素、アルキルおよびアシルからなる群から選択されるメンバーであり；Ｒ１は水素およびアルキルからなる群から選択されるメンバーである；または、任意選択で、ＲおよびＲ１とそれらが結合している窒素はアジド部分を形成しており；Ｒ２は水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリールおよびアミノ酸の側鎖から選択される群のメンバーであり；Ｒ３は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびＮＲ４Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、Ｒ４およびＲ５は独立に水素またはアルキルであり；ｎは４〜８０であり；ｍは２〜６であり；ｐは１〜４であり；ｑは０または１である。他のポリアミドを本発明の化合物中で使用できることは当業者に明らかであろう。
【０２５７】
「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」という用語は、その両方がエステル結合によってグリセロールの１位および２位に結合した２〜３０個の炭素を独立に有する、２つの脂肪酸アシル鎖、Ｒ１およびＲ２を有する化合物が含まれる。アシル基は飽和していても、また様々な不飽和度を有していてもよい。適切なアシル基には、これらに限定されないが、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）およびイコソイル（Ｃ２０）が含まれる。好ましい実施形態では、Ｒ１とＲ２は同じである、すなわちＲ１とＲ２はどちらもミリストイル（すなわち、ジミリストイル）であり、Ｒ１とＲ２はどちらもステアロイル（すなわち、ジステアロイル）等である。ジアシルグリセロールは以下の一般式：
【化８】
2014530602.tif 000009
を有する。
【０２５８】
「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」という用語は、その両方が独立に２〜３０個の炭素を有する２つのアルキル鎖、Ｒ１およびＲ２を有する化合物を含む。アルキル基は飽和していても、また様々な不飽和度を有していてもよい。ジアルキルオキシプロピルは以下の一般式：
【化９】
2014530602.tif 000010
を有する。
【０２５９】
好ましい実施形態では、ＰＥＧ−脂質は以下の式：
【化１０】
2014530602.tif 000011
を有するＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートである。
【０２６０】
ここで、Ｒ１およびＲ２は独立に選択され、約１０〜約２２個の炭素原子を有する長鎖のアルキル基であり；ＰＥＧはポリエチレングリコールであり；Ｌは、上述したような非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。長鎖のアルキル基は飽和であっても不飽和であってもよい。適切なアルキル基には、これらに限定されないが、デシル（Ｃ１０）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）およびイコシル（Ｃ２０）が含まれる。好ましい実施形態では、Ｒ１とＲ２は同じである、すなわちＲ１とＲ２はどちらもミリスチル（すなわち、ジミリスチル）であり、Ｒ１とＲ２はどちらもステアリル（すなわち、ジステアリル）等である。
【０２６１】
上記式ＶＩＩにおいて、ＰＥＧは約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。特定の例では、ＰＥＧは約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧは約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧはアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で任意選択で置換されていてよい。特定の実施形態では、末端ヒドロキシル基はメトキシまたはメチル基で置換されている。
【０２６２】
好ましい実施形態では、「Ｌ」は非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカーには、これらに限定されないが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分およびその組合せが含まれる。好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分はカルバメートリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＡＡコンジュゲート）である。他の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分はアミドリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ａ−ＤＡＡコンジュゲート）である。さらに他の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分はスクシンアミジルリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＡコンジュゲート）である。
【０２６３】
特定の実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは：
【化１１】
2014530602.tif 000012
から選択される。
【０２６４】
ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、当業者に公知の標準的な技術および試薬を用いて合成される。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは種々のアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメートおよび尿素結合を含むことを理解されよう。当業者は、これらの結合を形成させるための方法および試薬が周知のものであり、容易に入手できることを理解されよう。例えば、March、ADVANCED  ORGANIC  CHEMISTRY(Wiley  １９９２年）；Larock、COMPREHENSIVE  ORGANIC  TRANSFORMATIONS(VCH  １９８９年）；およびFurniss、VOGEL’S  TEXTBOOK  OF  PRACTICAL  ORGANIC  CHEMISTRY、5th  ed.(Longman  １９８９年）を参照されたい。存在する任意の官能基は、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートの合成の異なるポイントで保護および脱保護が必要となる可能性があることも理解されよう。当業者はそうした技術が周知であることを理解されよう。例えば、GreenおよびWuts、PROTECTIVE  GROUPS  IN  ORGANIC  SYNTHESIS（Wiley  １９９１年）を参照されたい。
【０２６５】
ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲートまたはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートであることが好ましい。これらの実施形態では、ＰＥＧは約７５０または約２，０００ダルトンの平均分子量を有することが好ましい。１つの特に好ましい実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡを含み、その「２０００」はＰＥＧの平均分子量を表し、「Ｃ」はカルバメートリンカー部分を表し、「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを表す。他の特に好ましい実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡを含み、その「７５０」はＰＥＧの平均分子量を表し、「Ｃ」はカルバメートリンカー部分を表し、「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを表す。特定の実施形態では、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基はメチル基で置換されている。当業者は、他のジアルキルオキシプロピルを、本発明のＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートにおいて使用できることを容易に理解されよう。
【０２６６】
上記に加えて、当業者には、ＰＥＧの代わりに他の親水性ポリマーを使用できることは容易に明らかであろう。ＰＥＧの代わりに使用できる適切なポリマーの例には、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および誘導化されたセルロース、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが含まれる。
【０２６７】
上記成分に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬをさらに含むことができる（例えば、Chenら、Bioconj.Chem.、１１巻：４３３〜４３７頁（２０００年）；米国特許第６，８５２，３３４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６２８１３を参照されたい。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む）。
【０２６８】
適切なＣＰＬには式ＶＩＩＩの化合物：
Ａ−Ｗ−Ｙ（ＶＩＩＩ）
が含まれる。
【０２６９】
ここで、Ａ、ＷおよびＹは以下で記載する通りである。
【０２７０】
式ＶＩＩＩを参照して、「Ａ」は、脂質アンカーとして役割を果たす、両親媒性脂質、中性脂質または疎水性脂質などの脂質部分である。適切な脂質の例には、これらに限定されないが、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが含まれる。
【０２７１】
「Ｗ」は親水性ポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。親水性ポリマーは、非免疫原性である、または低い固有免疫原性を有する生体適合ポリマーであることが好ましい。あるいは、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと使用される場合、弱い抗原性であってよい。適切な非免疫原性ポリマーには、これらに限定されないが、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびその組合せが含まれる。好ましい実施形態では、そのポリマーは約２５０〜約７，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２７２】
「Ｙ」はポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択されたｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨで正電荷、好ましくは少なくとも２個の正電荷を有する化合物、誘導体または官能基を指す。適切なポリカチオン性部分には、塩基性アミノ酸およびその誘導体、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシンおよびヒスチジン；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖（polyamine  sugar）；およびアミノ多糖が含まれる。ポリカチオン性部分は直鎖状、例えば直鎖状テトラリシン、分枝状またはデンドリマー状の構造であってよい。ポリカチオン性部分は、選択されたｐＨ値で約２〜約１５個の正電荷、好ましくは約２〜約１２個の正電荷、より好ましくは約２〜約８個の正電荷を有する。どのポリカチオン性部分を用いるかという選択は、所望される粒子施用（application）のタイプによって決定することができる。
【０２７３】
ポリカチオン性部分での電荷は粒子部分周り全体に分布していても、あるいは、それらは粒子部分の１つの特定の領域での電荷密度の離散的な濃度、例えば電荷スパイクであってもよい。電荷密度が粒子上に分布している場合、その電荷密度は均等に分布していても、不均等に分布していてもよい。ポリカチオン性部分のすべての電荷分布の変動は本発明に包含される。
【０２７４】
脂質「Ａ」と非免疫原性ポリマー「Ｗ」は種々の方法によって、好ましくは共有結合によって結合させることができる。当業者に公知の方法を「Ａ」と「Ｗ」の共有結合のために用いることができる。適切な結合には、これらに限定されないが、アミド、アミン、カルボキシル、カーボネート、カルバメート、エステルおよびヒドラゾン結合が含まれる。「Ａ」および「Ｗ」は、結合を達成させるために相補性官能基を有していなければならないことは当業者に明らかであろう。一方の脂質上と他方のポリマー上のこれらの２つの基の反応は所望の結合を提供することになる。例えば、脂質がジアシルグリセロールである場合、末端ヒドロキシルは、例えばＮＨＳおよびＤＣＣで活性化されて活性エステルを形成し、次いでアミノ基を含むポリマー、例えばポリアミドと反応し（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号および同第６，５８６，５５９号を参照されたい。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む）、アミド結合が２つの基の間で形成することになる。
【０２７５】
特定の例では、ポリカチオン性部分は、標的リガンドまたはカルシウムを錯化させるためのキレート部分などの結合したリガンドを有することができる。好ましくは、リガンドが結合した後、カチオン性部分は正電荷を保持する。特定の例では、結合したリガンドは正電荷を有する。適切なリガンドには、これらに限定されないが、反応性官能基を有する化合物またはデバイスが含まれ、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生物親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、生物医学デバイス、分析的に検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫促進剤、放射性標識、発蛍光団（fluorogen）、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的部分または毒素が含まれる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％〜約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％または約１．４ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２７７】
他の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する全脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％または約２ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２７８】
他の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）は粒子中に存在する全脂質の約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％または１０ｍｏｌ％（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
【０２７９】
本発明の脂質粒子で使用するのに適した脂質コンジュゲートの追加的なパーセンテージおよび範囲は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０、米国特許公開出願番号第２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００１０６および米国特許公開出願番号第２０１１／００７６３３５号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２８０】
本発明の脂質粒子中に存在する脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）のパーセンテージは目標量であり、処方物中に存在する脂質コンジュゲートの実際量は、例えば±２ｍｏｌ％で変動する可能性があることを理解すべきである。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）処方物において、脂質コンジュゲートの目標量は１．４ｍｏｌ％であるが、脂質コンジュゲートの実際量は目標量の±０．５ｍｏｌ％、±０．４ｍｏｌ％、±０．３ｍｏｌ％、±０．２ｍｏｌ％、±０．１ｍｏｌ％または±０．０５ｍｏｌ％である可能性があり、処方物の残りは他の脂質成分で構成される（合計すると粒子中に存在する全脂質が１００ｍｏｌ％となる）。同様に、７：５４脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）処方物において、脂質コンジュゲートの目標量は６．７６ｍｏｌ％であるが、脂質コンジュゲートの実際量は目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％または±０．１ｍｏｌ％である可能性があり、処方物の残りは他の脂質成分で構成される（合計すると粒子中に存在する全脂質が１００ｍｏｌ％となる）。
【０２８１】
当業者は、脂質コンジュゲートの濃度は、使用する脂質コンジュゲートおよび脂質粒子が融合性となるその割合（rate）に応じて変動する可能性があることを理解されよう。
【０２８２】
脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子から引き出す割合、次いで脂質粒子が融合性となるその割合を制御することができる。例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを脂質コンジュゲートとして使用する場合、脂質粒子が融合性となるその割合は、例えば、脂質コンジュゲートの濃度を変える、ＰＥＧの分子量を変える、またはＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲート上のアルキル基の鎖長および飽和度を変えることによって変えることができる。さらに、例えばｐＨ、温度、イオン強度等を含む他の変数を用いて、脂質粒子が融合性となるその割合を変えかつ／または制御することができる。脂質粒子が融合性となるその割合を制御するために用いることができる他の方法は、本開示を読むことによって当業者には明らかになるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）のサイズも制御することができる。
【０２８３】
Ｂ．追加的な担体系
本発明で使用するのに適した追加的な脂質ベースの担体系の非限定的な例には、リポプレックス（例えば、米国特許公開番号第２００３０２０３８６５号；およびZhangら、J.Control  Release、１００巻：１６５〜１８０頁（２００４年）を参照されたい）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば、米国特許公開番号第２００２０１９２２７５号を参照されたい）、可逆的にマスキングされたリポプレックス（例えば、米国特許公開番号第２００３０１８０９５０号を参照されたい）、カチオン性脂質ベースの組成物（例えば、米国特許第６，７５６，０５４号；および米国特許公開番号第２００５０２３４２３２号を参照されたい）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許公開番号第２００３０２２９０４０号、同第２００２０１６００３８号および同第２００２００１２９９８号；米国特許第５，９０８，６３５号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７２２８３を参照されたい）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許公開番号第２００３００２６８３１号を参照されたい）、ｐＨ感受性リポソーム（例えば、米国特許公開番号第２００２０１９２２７４号；およびオーストラリア特許出願公開番号第２００３２１０３０３号を参照されたい）、抗体コーティングされたリポソーム（例えば、米国特許公開番号第２００３０１０８５９７号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５０００８を参照されたい）、細胞型特異性リポソーム（例えば、米国特許公開番号第２００３０１９８６６４号を参照されたい）、核酸およびペプチドを含むリポソーム（例えば、米国特許第６，２０７，４５６号を参照されたい）、放出可能な親水性ポリマーで誘導化された脂質を含有するリポソーム（例えば、米国特許公開番号第２００３００３１７０４号を参照されたい）、脂質捕捉された核酸（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０５７１９０およびＷＯ０３／０５９３２２を参照されたい）、脂質カプセル化された核酸（例えば、米国特許公開番号第２００３０１２９２２１号；および米国特許第５，７５６，１２２号を参照されたい）、他のリポソーム組成物（例えば、米国特許公開番号第２００３００３５８２９号および同第２００３００７２７９４号；ならびに米国特許第６，２００，５９９号を参照されたい）、リポソームとエマルジョンの安定化された混合物（例えば、欧州特許第１３０４１６０号を参照されたい）、エマルジョン組成物（例えば、米国特許第６，７４７，０１４号を参照されたい）ならびに核酸マイクロエマルジョン（例えば、米国特許公開番号第２００５００３７０８６号を参照されたい）が含まれる。
【０２８４】
本発明で使用するのに適したポリマーベースの担体系の例には、これらに限定されないが、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）が含まれる。ポリプレックスを形成させるために、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は一般に、細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用し、エンドサイトーシスによって細胞中に入ることができる正電荷を帯びた粒子中に核酸を縮合させる、直鎖状、分枝状、星型もしくは樹枝状のポリマー構造を有するカチオン性ポリマーで複合化させる。いくつかの実施形態では、このポリプレックスは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーで複合化された核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号を参照されたい；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ（商標）（直鎖状の形態のＰＥＩ）として市販されている）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマー（例えば、Lynnら、J.Am.Chem.Soc、１２３巻：８１５５〜８１５６頁（２００１年）を参照されたい）、キトサン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（例えば、Kukowska-Latalloら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA、９３巻：４８９７〜４９０２頁（１９９６年）を参照されたい）、ポルフィリン（例えば、米国特許第６，６２０，８０５号を参照されたい）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許公開番号第２００４０１５６９０９号を参照されたい）、多環式アミジニウム（例えば、米国特許公開番号第２００３０２２０２８９号を参照されたい）、第一アミン、イミン、グアニジンおよび／またはイミダゾール基を含む他のポリマー（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ／９６０２６５５；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２１９３１；Zhangら、J.Control  Release、１００巻：１６５〜１８０頁（２００４年）；およびTieraら、Curr.Gene  Ther.、６巻：５９〜７１頁（２００６年）を参照されたい）およびそれらの混合物を含む。他の実施形態では、ポリプレックスは、米国特許公開番号第２００６０２１１６４３号、同第２００５０２２２０６４号、同第２００３０１２５２８１号および同第２００３０１８５８９０号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６６０６９に記載されているようなカチオン性ポリマー−核酸複合体；米国特許公開番号第２００４００７１６５４号に記載されているような生分解性ポリ（β−アミノエステル）ポリマー−核酸複合体；米国特許公開番号第２００４０１４２４７５号に記載されているようなポリマーマトリックスを含む微小粒子；米国特許公開番号第２００３０１５７０３０号に記載されているような他の微小粒子組成物；米国特許公開番号第２００５０１２３６００号に記載されているような縮合核酸複合体；ならびにオーストラリア特許出願公開番号第２００２３５８５１４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６５５１に記載されているようなナノカプセルおよびマイクロカプセル組成物を含む。
【０２８５】
特定の例では、干渉ＲＮＡは、シクロデキストリンまたはそのポリマーと複合化させることができる。シクロデキストリンベースの担体系の非限定的な例には、米国特許公開番号第２００４００８７０２４号に記載されているシクロデキストリン修飾ポリマー−核酸複合体；米国特許第６，５０９，３２３号、同第６，８８４，７８９号および同第７，０９１，１９２号に記載されている直鎖状シクロデキストリンコポリマー−核酸複合体；ならびに米国特許第７，０１８，６０９号に記載されているシクロデキストリンポリマー−複合化物質−核酸複合体が含まれる。他の特定の場合、干渉ＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドと複合化させることができる。タンパク質ベースの担体系の一例には、これに限定されないが、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２１９３１に記載されているカチオン性オリゴペプチド−核酸複合体が含まれる。
【０２８６】
ＶＩ．脂質粒子の調製
その中で干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの核酸が粒子の脂質部分中に捕捉され、分解から保護される本発明の脂質粒子、例えばＳＮＡＬＰは、これらに限定されないが、連続混合法、直接希釈法およびインライン希釈法を含む当業界で公知の任意の方法で形成させることができる。
【０２８７】
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ〜ＩＩＩの脂質またはその塩を単独か、または他のカチオン性脂質と組み合わせて含むことができる。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、１４：０  ＰＥ（１，２−ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ））、１６：０  ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ））、１８：０  ＰＥ（１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））、１８：１  ＰＥ（１，２−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、１８：１  ｔｒａｎｓ  ＰＥ（１，２−ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ））、１８：０−１８：１  ＰＥ（１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ））、１６：０−１８：１  ＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ））、ポリエチレングリコールベースのポリマー（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールまたはＰＥＧ修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、その誘導体またはその組合せである。
【０２８８】
特定の実施形態では、本発明は、連続混合法、例えば第１のリザーバーに核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を含む水溶液を提供するステップと、第２のリザーバーに有機脂質溶液（有機脂質溶液中に存在する脂質は有機溶媒、例えばエタノールなどの低級アルカノール中に溶解している）を提供するステップと、水溶液と有機脂質溶液を混合し、それによって、その脂質小胞内に核酸をカプセル化する脂質小胞（例えば、リポソーム）がほぼ瞬間的に形成されるように、有機脂質溶液を水溶液と混合させるステップとを含む方法によって作製される核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。この方法およびこの方法を実施するための装置は米国特許公開番号第２００４０１４２０２５号に詳細に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２８９】
脂質および緩衝溶液を混合チャンバーなどの混合環境中に連続的に導入する処理は、脂質溶液の緩衝溶液での連続希釈を引き起こし、それによって、混合により脂質小胞をほぼ瞬間的に生成させる。本明細書で用いる「脂質溶液を緩衝溶液で連続的に希釈する」という語句（およびその変形）は一般に、小胞の生成をもたらすのに十分な力での水和プロセスで、脂質溶液を十分迅速に希釈することを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することによって、有機脂質溶液は、緩衝溶液（すなわち、水溶液）の存在下で連続した段階的な希釈を施されて核酸−脂質粒子を形成する。
【０２９０】
連続混合法を用いて形成された核酸−脂質粒子は一般に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍもしくは８０ｎｍまたは約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍまたは１５０ｎｍ未満（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）のサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意選択で、均一な粒子サイズが達成されるようにサイズ調節される（sized）。
【０２９１】
他の実施形態では、本発明は、脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液を形成させるステップと、その脂質小胞溶液を制御量の希釈緩衝液を含む収集容器に直ちに直接導入するステップを含む、直接希釈法によって作製された核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。好ましい態様では、収集容器は、収集容器の内容物を撹拌して希釈を容易にするように構成された１つまたは複数のエレメントを含む。一態様では、収集容器中に存在する希釈緩衝液の量は、それに導入される脂質小胞溶液の容積と実質的に等しい。非限定的な例として、等しい容積の希釈緩衝液を含む収集容器に導入すると、４５％エタノール中の脂質小胞溶液はより小さい粒子を有利にもたらすことになる。
【０２９２】
さらに他の実施形態では、本発明は、希釈緩衝液を含む第３のリザーバーが第２の混合領域と流体的に連結されているインライン希釈法によって作製された核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。この実施形態では、第１の混合領域で形成された脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液は、第２の混合領域で希釈緩衝液と直ちに直接混合される。好ましい態様では、第２の混合領域は、脂質小胞溶液および希釈緩衝液の流れが対向する１８０°の流れで出会うように配置されたＴ型コネクターを含むが；より小さい角度、例えば約２７°〜約１８０°（例えば、約９０°）を提供するコネクターを使用することができる。ポンピング機構は制御可能な緩衝液の流れを第２の混合領域へ送り出す。一態様では、第２の混合領域に提供される希釈緩衝液の流量は、第１の混合領域からそれに導入される脂質小胞溶液の流量と実質的に等しくなるように制御される。この実施形態は、有利なことに、第２の混合領域中で脂質小胞溶液と混合する希釈緩衝液の流れをより制御できるようにし、したがって第２の混合プロセスを通した緩衝液中の脂質小胞溶液の濃度を制御できるようにする。そうした希釈緩衝液流量の制御は、有利には、低い濃度での小粒子サイズの形成を可能にする。
【０２９３】
これらの直接希釈およびインライン希釈法を実施するためのこれらの方法および装置は米国特許公開番号第２００７００４２０３１号に詳細に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２９４】
直接希釈法およびインライン希釈法を用いて形成される核酸−脂質粒子は一般に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、もしくは８０ｎｍまたは約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍまたは１５０ｎｍ未満（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）のサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意選択で、均一な粒子サイズが達成されるようにサイズ調節される。
【０２９５】
必要なら、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、リポソームをサイズ調節するために利用できる方法のいずれかでサイズ調節することができる。このサイズ調節は、所望のサイズ範囲および比較的狭い粒子サイズ分布を達成するために実施することができる。
【０２９６】
いくつかの技術が、粒子を所望の大きさにサイズ調節するために利用可能である。リポソームのために使用され、本発明の粒子に同等に適用可能な１つのサイズ調節法は米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。浴かまたはプローブ超音波処理による粒子懸濁液の超音波処理によって、約５０ｎｍ未満のサイズの粒子への漸進的なサイズリダクションがもたらされる。均質化は、大きい粒子にせん断エネルギーをかけてより小さく粉砕する別の方法である。典型的な均質化手順では、選択された粒子サイズ、通常約６０〜約８０ｎｍが認められるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーで粒子を再循環させる。両方の方法において、粒子サイズ分布を慣用的なレーザービーム粒子サイズ識別またはＱＥＬＳによって監視することができる。
【０２９７】
細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通した粒子の押し出しも、粒子サイズを比較的明確なサイズ分布に低下させるための効果的な方法である。一般に、所望の粒子サイズ分布が達成されるまで、懸濁液を、膜を通して１回または複数回循環させる。粒子を、順により小さい孔の膜を通して押し出して、サイズを徐々に低下させることができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、粒子中に存在する核酸を、例えば米国特許出願番号第０９／７４４，１０３号に記載されているように予備縮合させる。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０２９９】
他の実施形態では、本方法は、本発明の組成物を用いた細胞のリポフェクションをもたらすのに有用な非脂質ポリカチオンを加えるステップをさらに含むことができる。適切な非脂質ポリカチオンの例には、臭化ヘキサジメトリン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから、ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）の商標名のもとで販売されている）またはヘキサジメトリンの他の塩が含まれる。他の適切なポリカチオンには、例えばポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩の添加は、粒子が形成された後であることが好ましい。
【０３００】
いくつかの実施形態では、形成された核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）における核酸と脂質の比（質量／質量比）は約０．０１〜約０．２、約０．０５〜約０．２、約０．０２〜約０．１、約０．０３〜約０．１または約０．０１〜約０．０８の範囲となる。出発原料（投入）の比もこの範囲内となる。他の実施形態では、粒子の調製には、１０ｍｇの全脂質当たり約４００μｇの核酸、または約０．０１〜約０．０８、より好ましくは約０．０４（これは５０μｇの核酸当たり１．２５ｍｇの全脂質に相当する）の核酸と脂質の質量比が用いられる。他の好ましい実施形態では、粒子は約０．０８の核酸：脂質質量比を有する。
【０３０１】
他の実施形態では、形成される核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）における脂質と核酸の比（質量／質量比）は、約１（１：１）〜約１００（１００：１）、約５（５：１）〜約１００（１００：１）、約１（１：１）〜約５０（５０：１）、約２（２：１）〜約５０（５０：１）、約３（３：１）〜約５０（５０：１）、約４（４：１）〜約５０（５０：１）、約５（５：１）〜約５０（５０：１）、約１（１：１）〜約２５（２５：１）、約２（２：１）〜約２５（２５：１）、約３（３：１）〜約２５（２５：１）、約４（４：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２０（２０：１）、約５（５：１）〜約１５（１５：１）、約５（５：１）〜約１０（１０：１）の範囲、または約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、１０（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）もしくは２５（２５：１）またはその任意の割合もしくはその中の範囲となる。出発原料（投入）の比もこの範囲内となる。
【０３０２】
上記で論じたように、コンジュゲートされた脂質はＣＰＬをさらに含むことができる。ＳＮＡＬＰ−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有ＳＮＡＬＰ）を作製するための様々な一般的方法を本明細書で論じる。２つの一般的手法は、「ポスト挿入（post-insertion）」法、すなわち、例えば事前形成されたＳＮＡＬＰ中へのＣＰＬの挿入と、例えばＳＮＡＬＰの形成ステップの間にＣＰＬを脂質混合物中に含める「標準」法を含む。ポスト挿入法は、ＣＰＬを主にＳＮＡＬＰ二重層膜の外面に有するＳＮＡＬＰをもたらし、標準技法は、ＣＰＬをその内面と外面の両方に有するＳＮＡＬＰを提供する。この方法は、リン脂質（コレステロールを含むことができる）から作製された小胞に特に有用であり、またＰＥＧ−脂質（ＰＥＧ−ＤＡＡおよびＰＥＧ−ＤＡＧなど）を含む小胞にも有用である。ＳＮＡＬＰ−ＣＰＬを作製する方法は、例えば米国特許第５，７０５，３８５号、同第６，５８６，４１０号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号および同第６，８５２，３３４号；米国特許公開番号第２００２００７２１２１号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６２８１３に教示されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０３０３】
ＶＩＩ．キット
本発明は、キットの形態の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）も提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、脂質粒子の種々のエレメント（例えば、活性薬剤または治療剤、例えば核酸およびその粒子の個々の脂質成分）を保持するために区分化された容器を含む。キットは、その粒子が本明細書で示すプロセスの１つで作製される、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を保持する容器（例えば、バイアルまたはアンプル）を含むことが好ましい。特定の実施形態では、キットは、エンドソーム膜不安定化因子（例えば、カルシウムイオン）をさらに含むことができる。キットは一般に、本発明の粒子組成物を、薬学的に許容される担体中の懸濁液として、または脱水形態で、その再水和（凍結乾燥されている場合）および投与のための取扱説明書と一緒に含む。
【０３０４】
本発明のＳＮＡＬＰ処方物は、対象の特定の細胞、組織または臓器を優先的に標的とするように調整することができる。ＳＮＡＬＰの優先的な標的化は、ＳＮＡＬＰ自体の組成物を制御することによって実施することができる。特定の実施形態では、本発明のキットは、その粒子が懸濁液として、または脱水形態で容器中に存在するこれらの脂質粒子を含む。
【０３０５】
特定の例では、粒子の標的化をさらに増進させるために、脂質粒子の表面と結合した標的部分を有することが望ましいことがある。標的部分（例えば、抗体、タンパク質等）を脂質（本発明の粒子で用いられるものなど）と結合させる方法は当業者に公知である。
【０３０６】
ＶＩＩＩ．脂質粒子の投与
形成されたら、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は細胞中への核酸（例えば、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ）の導入に特に有用である。したがって、本発明は、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を細胞中へ導入するための方法も提供する。特定の実施形態では、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は、感染細胞、例えば細網内皮細胞（例えば、マクロファージ、単球等）ならびに線維芽細胞、内皮細胞（血管の内部表面を裏打ちするものなど）および／または血小板細胞を含む他の細胞タイプ中に導入される。本方法は、上述したような粒子を最初に形成させ、次いでその粒子を、干渉ＲＮＡの細胞への送達が行われるのに十分な時間細胞と接触させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。
【０３０７】
本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、粒子がそれと混合されるまたは接触するほとんどすべての細胞タイプにも吸着させることができる。吸着したら、粒子を細胞の一部で形質膜陥入させ、粒子は脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合させることができる。粒子の核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）部分の移動または組み込みは、これらの経路のいずれか１つにより行うことができる。特に、融合が起こる場合、粒子膜は細胞膜と一体化され、粒子の内容物は細胞内液と一緒になる。
【０３０８】
本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、単独か、または投与経路および標準的な薬剤実務にしたがって選択された薬学的に許容される担体（例えば、生理学的生理食塩水またはリン酸緩衝液）との混合物で投与することができる。一般に、標準的な緩衝食塩水（例えば、１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）が薬学的に許容される担体として使用されることになる。他の適切な担体には、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性を高めるための糖タンパク質を含む、水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが含まれる。適切な追加的な担体は、例えば、REMINGTON’S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES、Mack  Publishing  Company、Philadelphia、PA、17th  ed.（１９８５年）に記載されている。本明細書で用いる「担体」には、あらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、賦形剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体液剤、懸濁剤、コロイドなどが含まれる。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与した場合、アレルギー性または同様の有害反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。
【０３０９】
薬学的に許容される担体は通常、脂質粒子形成に続いて添加される。したがって、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）が形成された後、粒子を、標準緩衝食塩水などの薬学的に許容される担体中に希釈することができる。
【０３１０】
薬剤処方物中の粒子の濃度は、幅広く、すなわち約０．０５％未満、通常約２〜５％または少なくとも約２〜５％から、約１０〜９０重量％までも変化してよく、選択された具体的な投与方式にしたがって、主に流体の容積、粘度等によって選択されることになる。例えば、処置に伴う流体ロードを低下させるために、その濃度を増大させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症に付随するうっ血性心不全または重度の高血圧症を有する患者において特に望ましい可能性がある。あるいは、刺激性脂質を含む粒子は、投与部位での炎症を抑えるために希釈して低濃度にすることができる。
【０３１１】
本発明の医薬組成物は、慣用的な周知の殺菌技術で殺菌することができる。使用のために水溶液をパッケージ化することができる、または、無菌状態下で濾過し、凍結乾燥し、その凍結乾燥された調製物を投与前に滅菌水溶液と混合することができる。この組成物は、生理学的条件近傍下で要求される薬学的に許容される補助剤、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムを含むことができる。さらに、粒子懸濁液は、貯蔵時の際の遊離基および脂質過酸化損傷に対して脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。親油性遊離基クエンチャー、例えばアルファトコフェロールおよび水溶性鉄特異性キレート剤、例えばフェリオキサミンが適している。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、干渉ＲＮＡ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む１つまたは複数の核酸の治療的送達のための方法において特に有用である。特に、１つまたは複数のＡＬＤＨアイソザイムの転写および／または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによって、ヒトにおけるアルコール症の処置のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法を提供することが本発明の目的である。
【０３１３】
Ａ．Ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与
ｉｎ  ｖｉｖｏでの処置のための全身的送達、例えば、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／００７１９６、ＷＯ０５／１２１３４８、ＷＯ０５／１２０１５２およびＷＯ０４／００２４５３に記載されているものなどの核酸−脂質粒子を用いて遂行されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。本発明は、血清中で核酸をヌクレアーゼ分解から保護するものであり、非免疫原性でありサイズが小さく、反復投与に適している、完全にカプセル化された脂質粒子も提供する。
【０３１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のためには、投与は、例えば注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）、経皮投与または経直腸投与による当業界で公知の任意の仕方であってよい。投与は、単一用量または分割用量で実施することができる。医薬組成物は非経口、すなわち関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内で投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物はボーラス注射によって静脈内または腹腔内で投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい）。細胞内核酸送達は、Straubringerら、Methods  Enzymol.、１０１巻：５１２頁（１９８３年）；Manninoら、Biotechniques、６巻：６８２頁（１９８８年）；Nicolauら、Crit.Rev.Ther.Drug  Carrier  Syst.、６巻：２３９頁（１９８９年）；およびBehr、Acc.Chem.Res.、２６巻：２７４頁（１９９３年）においても論じられている。脂質ベースの治療剤を投与するさらに他の方法は、例えば米国特許第３，９９３，７５４号、同第４，１４５，４１０号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２２４，１７９号、同第４，５２２，８０３号および同第４，５８８，５７８号に記載されている。脂質粒子は、疾患部位での直接注射または疾患部位から遠位にある部位での注射によって投与することができる（例えば、Culver、HUMAN  GENE  THERAPY、MaryAnn  Liebert，  Inc.、Publishers、New  York.７０〜７１頁（１９９４年）を参照されたい）。上記文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０３１５】
本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）が静脈内で投与される実施形態では、粒子の全注射用量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％または２５％が、注射後約８、１２、２４、３６または４８時間血漿中に存在する。他の実施形態では、脂質粒子の全注射用量の約２０％、３０％、４０％超、さらに約６０％、７０％または８０％までも、注射後約８、１２、２４、３６または４８時間血漿中に存在する。特定の例では、約１０％超の複数の粒子が、投与後約１時間、哺乳動物の血漿中に存在する。他の特定の場合、脂質粒子の存在は、粒子の投与後少なくとも約１時間検出可能である。いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡ分子などの治療用核酸の存在は、細胞中で投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間検出可能である。他の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）による、ウイルスまたは宿主配列などの標的配列の発現の下方制御は、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間検出可能である。さらに他の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）による、ウイルスまたは宿主配列などの標的配列の発現の下方制御は、感染細胞および／または感染され得る細胞中で優先的に起こる。他の実施形態では、投与部位に対して近位または遠位の部位での細胞中における干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の存在または効果は、投与後約１２、２４、４８、７２もしくは９６時間または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６もしくは２８日間検出可能である。追加の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は非経口または腹腔内で投与される。
【０３１６】
本発明の組成物は、単独かまたは他の適切な成分と組み合わせて、エアゾール処方物（すなわち、これらを「噴霧する（nebulize）」ことができる）にして吸入（例えば、鼻腔内または気管内）により投与することができる（Brighamら、Am.J.Sci.、２９８巻：２７８頁（１９８９年）を参照されたい）。エアゾール処方物を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴射剤中に入れることができる。
【０３１７】
特定の実施形態では、医薬組成物を、鼻腔内での噴霧、吸入および／または他のエアゾール送達ビヒクルにより送達することができる。経鼻エアゾール噴霧剤により核酸組成物を肺へ直接送達するための方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物を用いた薬物の送達（米国特許第５，７２５，８７１号）も薬剤技術分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroetheylene）支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。上記特許の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０３１８】
例えば関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路などによる非経口投与に適した処方物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および対象レシピエントの血液との等張性を処方物に付与する溶質を含むことができる水性および非水性の等張性滅菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。本発明の実施に際して、組成物を、例えば静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内または髄腔内で投与することが好ましい。
【０３１９】
一般に、静脈内で投与する場合、脂質粒子処方物を適切な薬剤用担体で処方する。多くの薬学的に許容される担体を、本発明の組成物および方法において使用することができる。本発明で使用するのに適した処方物は、例えば、REMINGTON’S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES、Mack  Publishing  Company、Philadelphia、PA、17th  ed.（１９８５年）に見られる。様々な水性担体、例えば水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができ、それらは、安定性を高めるためにアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を含むことができる。一般に、標準的な緩衝食塩水（１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を薬学的に許容される担体として使用するが、他の適切な担体でも十分である。これらの組成物は、濾過などの慣用的なリポソーム殺菌技術により殺菌することができる。この組成物は、生理学的条件近傍下で要求される薬学的に許容される補助剤、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含むことができる。これらの組成物は、上記で参照した技術を用いて殺菌することができる、あるいは、それらを無菌状態下で作製することができる。得られる水性液剤を使用のためにパッケージ化する、または無菌状態下で濾過し、凍結乾燥し、凍結乾燥された調製物を投与前に滅菌水溶液と混合することができる。
【０３２０】
特定の用途では、本明細書で開示する脂質粒子を経口投与によって個体に送達することができる。粒子を添加剤と合体させ、摂取可能な錠剤、頬側用錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ剤、エリキシル剤、うがい薬、懸濁剤、経口噴霧剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用することができる（例えば、米国特許第５，６４１，５１５号、同第５，５８０，５７９号および同第５，７９２，４５１号を参照されたい、これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む）。これらの経口剤形は以下の：結合剤、ゼラチン；添加剤、滑沢剤および／または香味剤を含むこともできる。単位剤形がカプセル剤である場合、これは上述した材料に加えて、液体担体を含むことができる。種々の他の材料がコーティングとして存在することができ、あるいは投薬単位の物理的形態を改変することができる。もちろん、任意の単位剤形を調製するのに使用されるどの材料も薬学的に純粋で、かつ使用される量で実質的に非毒性でなければならない。
【０３２１】
一般に、これらの経口処方物は少なくとも約０．１％の脂質粒子またはそれ以上を含むことができるが、もちろん、粒子のパーセンテージは変えることができ、好都合には全処方物の重量もしくは容積の約１％もしくは２％から約６０％もしくは７０％またはそれ以上であってよい。当然、調製できるそれぞれ治療上有用な組成物中の粒子の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投薬量が得られるようにする。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの因子ならびに他の薬理学的考慮事項は、そうした薬剤処方物を調製する技術分野の技術者によって考慮されることになる。したがって、様々な投薬量および処置レジメンを望み得る。
【０３２２】
経口投与に適した処方物は：（ａ）水、生理食塩水またはＰＥＧ４００などの賦形剤に懸濁された有効量のパッケージ化治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）などの液体製剤；（ｂ）それぞれが所定量の治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を液体、固体、顆粒またはゼラチンとして含むカプセル剤、サシェイ剤または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁剤；および（ｄ）適切な乳剤を含むことができる。錠剤形態物は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の添加剤、着色剤、充てん剤、結合剤、賦形剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、染料、崩壊剤および薬剤として適合する担体の１つまたは複数を含むことができる。ロゼンジ剤形態物は、香味剤、例えばスクロース中の治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）、ならびに、ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性なベースまたはスクロースおよびアカシアエマルジョン、ゲル中に治療用核酸を含むトローチ、および治療用核酸に加えて当業界で公知の担体を含む同様のものを含むことができる。
【０３２３】
それらの他の使用例では、脂質粒子を様々な局所剤形中に混ぜ込むことができる。例えばＳＮＡＬＰなどの核酸−脂質粒子を含む懸濁液をゲル剤、油剤、乳剤、局所クリーム剤、ペースト剤、軟膏剤、ローション剤、泡状剤、ムース剤などとして、処方し投与することができる。
【０３２４】
本発明の脂質粒子の医薬品を調製する場合、中身のない粒子または外部表面と会合した核酸などの治療剤を有する粒子を低減または排除するように精製された多量の粒子を使用することが好ましい。
【０３２５】
本発明の方法は様々な宿主において実施することができる。好ましい宿主には哺乳動物種、例えば霊長類（例えば、ヒトおよびチンパンジーならびにヒト以外の霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯動物（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギおよびブタが含まれる。
【０３２６】
投与される粒子の量は、治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）と脂質の比、使用される具体的な治療用核酸、処置を受ける疾患または障害、患者の年齢、体重および状態ならびに臨床医の判断によることになるが、一般にｋｇ体重当たり約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重または投与（例えば、注射）当たり約１０８〜１０１０個の粒子である。
【０３２７】
Ｂ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの投与
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの投与のため、治療用核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）の送達は、植物由来もしくは動物由来、脊椎動物または無脊椎動物、および任意の組織またはタイプにかかわらず、培養液内で成長した任意の細胞に対してであってよい。好ましい実施形態では、その細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【０３２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する場合、細胞と脂質粒子の接触は、生物学的に適合する媒体中で行われる。粒子の濃度は、具体的な用途に応じて広範に変動するが、一般に約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。脂質粒子での細胞の処置は通常、生理学的温度（約３７℃）で約１〜４８時間、好ましくは約２〜４時間の期間実施される。
【０３２９】
好ましい実施形態の１つの群では、脂質粒子懸濁液を、約１０３〜約１０５個の細胞／ｍｌ、より好ましくは約２×１０４個の細胞／ｍｌの細胞密度を有する６０〜８０％コンフルエントで播種された細胞に加える。細胞に加えられる懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１μｇ／ｍｌである。
【０３３０】
細胞の組織培養が要求され得る程度は、当業界で周知である。例えば、Freshney、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、3rd  Ed.、Wiley-Liss、New  York（１９９４年）、Kuchlerら、Biochemical  Methods  in  Cell  Culture  and  Virology、Dowden,  Hutchinson  and  Ross,  Inc.（１９７７年）およびそこで参照されている文献は細胞の培養への一般的指針を提供している。培養された細胞系はしばしば細胞の単層の形態となるが、細胞懸濁液も使用される。
【０３３１】
エンドソーム放出パラメーター（ＥＲＰ）アッセイを用いて、本発明のＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは、米国特許公開番号第２００３００７７８２９号に詳細に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。より具体的には、ＥＲＰアッセイの目的は、エンドソーム膜の結合／取り込みまたはそれとの融合／その不安定化へのそれらの相対的効果に対する、ＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子の様々なカチオン性脂質およびヘルパー脂質成分の効果を確認することである。このアッセイは、ＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子の各成分がいかに送達効率に影響を及ぼすかを定量的に判定し、それによって、ＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子を最適化できるようにする。通常、ＥＲＰアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）等）の発現を測定するものであり、いくつかの例では、発現プラスミドについて最適化されたＳＮＡＬＰ処方物も干渉ＲＮＡをカプセル化するのに適している。他の例では、ＥＲＰアッセイを、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の存在下または非存在下での標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するように適合させることができる。種々のＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子のそれぞれについてＥＲＰを比較することによって、最適な系、例えば細胞中での最も高い取り込みを有するＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。
【０３３２】
Ｃ．脂質粒子の送達のための細胞
本発明の組成物および方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＬＤＨ遺伝子発現を標的とすることによってアルコール症を処置するのに特に適している。本発明は哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯動物（例えば、マウス、ラットおよびテンジクネズミ）、ウサギ、ブタおよび霊長類（例えば、サル、チンパンジーおよびヒト）などを含む任意の脊椎動物種からの様々な細胞タイプについて実施することができる。
【０３３３】
Ｄ．脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、約１、２、３、４、５、６、７、８時間またはそれ以上の時間、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、粒子の投与後、約８、１２、２４、４８、６０、７２もしくは９６時間または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５もしくは２８日間、対象において検出可能である。粒子の存在は、その対象からの細胞、組織または他の生物学的試料中で検出することができる。粒子は、例えば粒子の直接的な検出、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）配列などの治療用核酸の検出、対象とする標的配列の検出（すなわち対象とする配列の発現または減少した発現を検出することによって）、ＥＢＯＶタンパク質（例えば、インターフェロン）によって調節された化合物の検出、対象中のウイルス量の検出あるいはその組合せによって検出することができる。
【０３３４】
１．粒子の検出
ＳＮＡＬＰなどの本発明の脂質粒子は、当業界で公知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、当業界で周知の方法を用いて、標識を、脂質粒子のある成分に直接的または間接的に取り付けることができる。様々な標識を、必要とされる感度、脂質粒子成分とのコンジュゲート化のし易さ、安定性の要件ならびに利用可能な器具類および廃棄条項に応じて、標識を選択して使用することができる。適切な標識には、これらに限定されないが、スペクトル標識、例えば蛍光染料（例えば、フルオレセインおよび誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミンおよび誘導体、例えばテキサスレッド、テトラロージミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ（商標）など；放射性標識、例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ等；酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等；スペクトル比色分析標識、例えばコロイド状金もしくは着色ガラスまたはプラスチックビーズ、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等が含まれる。標識は、当業界で公知の任意の手段を用いて検出することができる。
【０３３５】
２．核酸の検出
核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）は本明細書では、当業者に周知のいくつかの手段のいずれかによって検出し、定量化される。核酸の検出はサザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動法、ＰＣＲ、放射性同位元素標識法、シンチレーション計数法および親和性クロマトグラフィーなどの周知の方法によって進めることができる。追加的な生化学的分析方法、例えば分光光度法、Ｘ線検査、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高拡散クロマトグラフィーも使用することができる。
【０３３６】
核酸ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが当業者に公知である。例えば、一般的なフォーマットには、サンドイッチアッセイおよび競合または置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば「Nucleic  Acid  Hybridization,  A  Practical  Approach」、Eds.HamesおよびHiggins、IRL  Press（１９８５年）に概略的に記載されている。
【０３３７】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅させる、核酸増幅システムの使用によって高めることができる。分子プローブとして使用するためまたは後続のサブクローニング用に核酸断片を形成させるために配列を増幅させるのに適したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅技術は公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（商標））を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそうした増幅法によって当業者を導くのに十分な技術の例は、Sambrookら、In  Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press(２０００年）；およびAusubelら、SHORT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY,  eds.、Current  Protocols、Greene  Publishing  Associates,  Inc.  and  John  Wiley  &  Sons,  Inc.(２００２年）；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号；PCR  Protocols、A  Guide  to  Methods  and  Applications(Innisら  eds.)Academic  Press  Inc.  San  Diego、CA（１９９０年）；Arnheim  &  Levinson（１９９０年１０月１日）、C  &  EN  ３６；The  Journal  Of  NIH  Research、３巻：８１頁（１９９１年）；Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８６巻：１１７３頁（１９８９年）；Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻：１８７４頁（１９９０年）；Lomellら、J.Clin.Chem.、３５巻：１８２６頁（１９８９年）；Landegrenら、Science、２４１巻：１０７７頁（１９８８年）；Van  Brunt、Biotechnology、８巻：２９１頁（１９９０年）；WuおよびWallace、Gene、４巻：５６０頁（１９８９年）；Barringerら、Gene、８９巻：１１７頁（１９９０年）；およびSooknananおよびMalek、Biotechnology、１３巻：５６３頁（１９９５年）に見られる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当業界で記載されている他の方法は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβ−レプリカーゼ系である。これらの系を、選択配列が存在する場合だけＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが伸長するまたは連結するように設計されている変異体を直接特定するのに使用することができる。あるいは、選択配列を一般に、例えば非特異的ＰＣＲプライマーを用いて増幅させ、その増幅された標的領域を、変異を示す特異的な配列について後でプローブすることができる。上記文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【０３３８】
例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅法におけるプローブとして使用するため、遺伝子プローブまたは阻害剤成分として使用するための核酸は一般に、例えばNeedham  VanDevanterら、Nucleic  Acids  Res.、１２巻：６１５９頁（１９８４年）に記載されているような自動合成装置を用いて、Beaucageら、Tetrahedron  Letts.、２２巻：１８５９  １８６２頁（１９８１年）によって記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法にしたがって化学的に合成される。ポリヌクレオチドの精製は、必要な場合、一般にPearsonら、J.Chrom.、２５５巻：１３７  １４９頁（１９８３年）に記載されているような未変性アクリルアミドゲル電気泳動かまたは陰イオン交換ＨＰＬＣによって実施される。合成ポリヌクレオチドの配列は、GrossmanおよびMoldave(eds.)Academic  Press、New  York、Methods  in  Enzymology、６５巻：４９９頁におけるMaxamおよびGilbert（１９８０年）の化学的分解法を用いて立証することができる。
【０３３９】
転写のレベルを判定するための代替の手段は、インサイチュでのハイブリダイゼーションである。インサイチュでのハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、Angererら、Methods  Enzymol、１５２巻：６４９頁（１９８７年）に概略が記載されている。インサイチュでのハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を固体支持体、一般にスライドグラスに固定する。ＤＮＡをプローブしようとする場合、その細胞を熱かまたはアルカリで変性させる。次いで細胞を適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させて標識された特異的プローブのアニーリングができるようにする。プローブは、放射性同位体または蛍光性レポーターで標識することが好ましい。
【実施例】
【０３４０】
ＩＸ．実施例
本発明を、具体的な実施例でより詳細に説明することとする。以下の実施例は例示のためであり、本発明を限定しようとするものでは全くない。当業者は、変更または改変しても本質的に同じ結果が得られる重要ではない様々なパラメーターを容易に理解されよう。
【０３４１】
（実施例１）
この実施例は、ＡＬＤＨ２を標的とするｓｉＲＮＡを含む血清安定な核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウス肝細胞系内でのアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子発現を低減することを実証する。
【０３４２】
材料：
これらの試験で使用するすべてのｓｉＲＮＡ分子は、標準的な手順を用いて化学的に合成し、アニールした。
【０３４３】
この試験で用いたアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）標的ｓｉＲＮＡ配列：
【表１】
2014530602.tif 000013
【０３４４】
ここで「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「ｍ」は２’−Ｏ−メチル化リボヌクレオチドを表し、いずれかの接頭辞を欠いているものはデオキシヌクレオチドを表す。
【０３４５】
さらに、対照として非標的ｓｉＲＮＡを試験に含めた。このｓｉＲＮＡは蛍ルシフェラーゼ遺伝子を標的とし、哺乳動物細胞において特異的な遺伝子サイレンシング活性をまったくもたないものとする。
【０３４６】
方法：
核酸−脂質粒子は以下の「１：５７」処方物：１．４％ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ；５７．１％ＤＬｉｎＤＭＡ；７．１％ＤＰＰＣ；および３４．３％コレステロールからなるものであった。典型的には、１：５７処方物では、ＤＬｉｎＤＭＡの量は５７．１ｍｏｌ％±５ｍｏｌ％であり、脂質コンジュゲートの量は１．４ｍｏｌ％±０．５ｍｏｌ％であり、１：５７処方物の残りは非カチオン性脂質（例えば、リン脂質、コレステロールまたはこの２つの混合物）で構成されており、最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は約０．１１〜０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。ｓｉＲＮＡをロードした粒子が形成されると、平均粒子サイズは直径で８５〜１００ｎｍであった。
【０３４７】
哺乳動物の細胞処理およびｍＲＮＡ分析：
初代培養肝細胞をマウスから単離し、９６ウェルプレート中で付着培養物（adherent  culture）として保持した。ＡＬＤＨ−２標的または非標的対照ＳＮＡＬＰを０．０３１２５〜０．５μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度で培地に加え；各処理条件を３連のウェル中で実施した。ＳＮＡＬＰの存在下で約２４ｈインキュベーションした後、細胞を収集し、ｍＲＮＡ分析用に溶解した。細胞溶解物中のマウスＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて測定し、マウスグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。
【０３４８】
結果：
表Ａは、任意に「１００．０％」と設定した未処理培養ウェル中で測定されたＧＡＰＤＨ正規化ＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡの量（９連ウェルの平均、±６．９％標準偏差）に対する脂質−核酸処理の遺伝子サイレンシング活性（３連ウェルの平均、±標準偏差）を示す。
【表２】
2014530602.tif 000014
【０３４９】
結論：
マウスＡＬＤＨ２を標的とする４つのｓｉＲＮＡ処方物は、単離された初代培養マウス肝細胞において、すべて用量応答的な形で遺伝子サイレンシング活性を示した。試験した４つのうち、二重鎖１は最も活性が高く、二重鎖４が最も活性が低かった。
【０３５０】
（実施例２）
この実施例は、ＡＬＤＨ２を標的とするｓｉＲＮＡを含むＳＮＡＬＰは、静脈内経路の投与により、全動物系においてアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子発現を低減させることを示している。
【０３５１】
材料：
この試験で使用したマウスＡＬＤＨ−２  ｓｉＲＮＡ二重鎖１および非標的対照ｓｉＲＮＡは実施例１で説明されている。
【０３５２】
方法：
ＳＮＡＬＰ処方物を実施例１に記載されているようにして調製した。
【０３５３】
動物処置：
雌性のＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｓから入手した。この動物に、単一用量のＳＮＡＬＰ処方ｓｉＲＮＡまたはリン酸緩衝生理食塩水を側部尾静脈で１０ｍＬ／ｋｇ静脈内注射により投与した。投与されたｓｉＲＮＡ用量は体重ｋｇ当たり０．０２５、０．０５０または０．２５ｍｇであった。ＳＮＡＬＰ注射の約４８ｈ後、動物を安楽死させ、肝臓組織をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）ＲＮＡ安定化溶液中に採取した。
【０３５４】
組織分析：
肝臓組織を、基本的にJudgeら、２００６年、Molecular  Therapy  １３巻：４９４頁に記載されているようにして、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）分岐ＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ；現在はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの一部）を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化されたマウスＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡレベルについて分析した。
【０３５５】
結果：
表Ｂは、任意に「１００．０％」と設定した対照ＰＢＳ処置動物で測定されたＧＡＰＤＨ正規化肝臓ＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡの量（６匹の動物の平均、±６．３％標準偏差）に対するＳＮＡＬＰ処置の遺伝子サイレンシング活性（３匹の動物の平均、±標準偏差）を示す。
【表３】
2014530602.tif 000015
【０３５６】
結論：
マウスＡＬＤＨ２を標的とするＳＮＡＬＰ処方ｓｉＲＮＡ１の単一の静脈内投与はマウスにおいて、用量応答的な形で、ＡＬＤＨ２遺伝子サイレンシング活性をもたらした。
【０３５７】
（実施例３）
この実施例は、本発明の血清安定性の核酸−脂質粒子の作製方法を説明する。
【０３５８】
ｓｉＲＮＡ分子を、標準的な手順を用いて化学的に合成しアニールする。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を以下の脂質：（１）脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ（３−Ｎ−［（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン）；（２）カチオン性脂質、例えばＤＬｉｎＤＭＡ；（３）リン脂質ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ；Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）；および（４）それぞれ１．４：５７．１：７．１：３４．３のモル比の合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む血清安定性の核酸−脂質粒子中にカプセル化する。すなわち、ｓｉＲＮＡ分子を、以下の「１：５７」処方物の核酸−脂質粒子：１．４％ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ；５７．１％カチオン性脂質；７．１％ＤＰＰＣ；および３４．３％コレステロール中にカプセル化する。この１：５７処方物は目標処方物であり、存在する脂質（カチオン性と非カチオン性の両方）の量と、処方物中に存在する脂質コンジュゲートの量は変わり得ることを理解すべきである。典型的には、１：５７処方物において、カチオン性脂質の量は５７．１ｍｏｌ％±５ｍｏｌ％であり、脂質コンジュゲートの量は１．４ｍｏｌ％±０．５ｍｏｌ％であり、１：５７処方物の残りは非カチオン性脂質（例えば、リン脂質、コレステロールまたは２つの混合物）で構成される。処方物を、米国特許出願番号第２００７／００４２０３１号に記載されている方法を用いて作製する。これを全体として参照により本明細書に組み込む。形成されたら、核酸−脂質粒子をＰＢＳに対して透析し、使用前に０．２μｍフィルターでフィルター滅菌する。平均粒子サイズは７５〜９０ｎｍの範囲であってよく、最終ｓｉＲＮＡ／脂質比は０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であってよい。
【０３６０】
（実施例４）
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト細胞における、ＡＬＤＨ２遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介による低減を説明する。
【０３６１】
材料：
これらの試験で使用したすべてのｓｉＲＮＡ分子を、標準的な手順を用いて化学的に合成しアニールした。
【０３６２】
この実施例の表Ａは、本実施例で説明する実験で用いたアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）標的ｓｉＲＮＡ配列を示す：
【表４】
2014530602.tif 000016
【０３６３】
方法：
核酸−脂質粒子は以下の「１：５７」処方物：１．４％ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ；５７．１％ＤＬｉｎＤＭＡ；７．１％ＤＰＰＣ；および３４．３％コレステロールを含んだ。典型的には、１：５７処方物において、ＤＬｉｎＤＭＡの量は５７．１ｍｏｌ％±５ｍｏｌ％であり、脂質コンジュゲートの量は１．４ｍｏｌ％±０．５ｍｏｌ％であり、１：５７処方物の残りは非カチオン性脂質（例えば、リン脂質、コレステロールまたは２つの混合物）で構成され、最終ｓｉＲＮＡ／脂質比は約０．１１〜０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。ｓｉＲＮＡ−ロードした粒子が形成されると、平均粒子サイズは直径で８５〜１００ｎｍであった。
【０３６４】
哺乳動物の細胞処理およびｍＲＮＡ分析：ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌腫）細胞を、９６ウェルプレート中で付着培養物として保持した。ＡＬＤＨ２標的または非標的対照核酸−脂質粒子を３．９１および１５．６３ｎｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度で培地に加え；各処理条件を２連のウェル中で実施した。約４８時間核酸−脂質粒子インキュベーションした後、細胞を収集し、ｍＲＮＡ分析用に溶解した。細胞溶解物中のヒトＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡを、分岐ＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ；現在Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの一部）を用いて測定し、ヒトグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。
【０３６５】
結果：
この実施例の表Ｂは、核酸−脂質粒子処理の遺伝子サイレンシング活性（２連ウェルの平均、±標準偏差）が、任意に「１００．０％」と設定した未処理培養ウェル中で測定されたＧＡＰＤＨ正規化ＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡの量（２連のウェルの平均、±７．４％標準偏差）に対するＧＡＰＤＨ正規化ＡＬＤＨ２  ｍＲＮＡパーセンテージとして説明されていることを示している。
【表５】
2014530602.tif 000017
【０３６６】
結論：
脂質粒子中に処方された６つのｓｉＲＮＡはすべて、用量応答的な形で、ヒトＨｅｐＧ２細胞中のＡＬＤＨ２活性をサイレンシングした。試験した６つのｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ２は最も活性が高く、ｓｉＲＮＡ３は最も活性が低かった。
【０３６７】
本明細書において参照した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物のすべてを、本発明の説明と矛盾しない程度に、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０３６８】
上記より、例示のために本発明の特定の実施形態が本明細書で説明されているが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な改変を加えることができることを理解されよう。
【配列表】
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【国際調査報告】
2014530602.tif 000018