(57)【要約】特有の構造を有する副溝結合剤ホスホラミダイトが特定の方法にしたがって合成された。これらの副溝結合剤ホスホラミダイトは、オリゴヌクレオチド接合体、特に、プローブおよびプライマーとして使用するためのものの調製において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
M-L-PA
式 I
[式中、
Mは、保護芳香族複素環アミンを含む副溝結合剤であり、
Lは、リンカーであり、そして、 
PAは、ホスホラミダイト基である]
を有する副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項２】
Lが、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせである、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項３】
Lが、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の原子を含む、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項４】
Mが、置換されている、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項５】
保護芳香族複素環アミンが、オリゴヌクレオチド構築の間は安定であり、オリゴヌクレオチド脱保護の間に除去される、保護基を含む、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項６】
保護芳香族複素環アミンが、インドールまたはベンズイミダゾールである、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項７】
保護芳香族複素環アミンが、カルバメート基である保護基を含む、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項８】
副溝結合剤が、インドール-またはベンズイミダゾール-に基づく類似体である、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項９】
式 IIまたは式 III：
【化１】
2014522660.tif 000058
[式中、
R1およびR2は、それぞれ独立して、PG、L、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、-(CH2CH2O)yCH2CH3 （ここで、yは1 から8である）であるか、あるいはR1 および R2 は、O、SおよびNから選択される0、1または2のヘテロ原子を含有する5または6員環構造を形成し; 
nは、1から4であり; 
Lは、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の原子を有し、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであるリンカーであり; 
PGは、保護基であり; そして、
PAは、ホスホラミダイト基である]
を有する請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項１０】
下記式：
【化２】
2014522660.tif 000059
を有する請求項 9の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項１１】
式 IVまたはV：
【化３】
2014522660.tif 000060
[式中、
R1は、L、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、-(CH2CH2O)yCH2CH3 （ここでyは1から8である）、または置換または非置換アリールまたはヘテロアリールであり; 
nは、1から4であり; 
Lは、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の原子を有し、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであるリンカーであり; 
PGは、保護基であり; そして、
PAは、ホスホラミダイト基である]
を有する請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項１２】
下記式：
【化４】
2014522660.tif 000061
を有する請求項 11の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項１３】
下記式：
【化５】
2014522660.tif 000062
を有する請求項 11の副溝結合剤ホスホラミダイト。
【請求項１４】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を合成する方法：
(a)ヌクレオシドホスホラミダイトを用いてオリゴヌクレオチド配列を合成する工程;
(b)副溝結合剤をオリゴヌクレオチド配列に組み入れ、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を形成させるために、請求項 1の副溝結合剤ホスホラミダイトを使用する工程;および、
(c)オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を脱保護する工程。
【請求項１５】
ヌクレオシドホスホラミダイトの一以上が標識ヌクレオシドホスホラミダイトである、請求項 14の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体が、検出可能な標識を含む核酸プローブである、請求項 14の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体が、遊離3’-ヒドロキシル基を含むプライマーである、請求項 14の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体が、さらに2’-OMe-リボ核酸単位を含む、請求項 14の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体が、さらにロックド核酸 (「LNA」) 単位を含む、請求項 14の方法。
【請求項２０】
請求項 14の方法によって調製される、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体。
【請求項２１】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を合成する方法：
(a)ヌクレオシドホスホラミダイトを用いてオリゴヌクレオチド配列を合成する工程;
(b)副溝結合剤をオリゴヌクレオチド配列に組み入れ、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を形成させるために、請求項 9の副溝結合剤ホスホラミダイトを使用する工程;および、
(c)オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を脱保護する工程。
【請求項２２】
請求項 21の方法によって調製される、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体。
【請求項２３】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を合成する方法：
(a)ヌクレオシドホスホラミダイトを用いてオリゴヌクレオチド配列を合成する工程;
(b)副溝結合剤をオリゴヌクレオチド配列に組み入れ、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を形成させるために、請求項 11の副溝結合剤ホスホラミダイトを使用する工程;および、
(c)オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体を脱保護する工程。
【請求項２４】
請求項 23の方法によって調製される、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本出願は、その内容全体を引用により本明細書に含める、「副溝結合剤ホスホラミダイト(Minor Groove Binder Phosphoramidites)および使用方法」と題する、2011年7月26日出願の米国仮特許出願第61/511,733号からの優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、副溝結合剤 (「MGB」)(minor groove binder) ホスホラミダイト(phosphoramidites)、それらの合成、およびオリゴヌクレオチド接合体 (conjugate)の合成におけるそれらの使用に関する。ホスホラミダイトは、例えば、固体支持体(solid support)上でのオリゴヌクレオチド接合体の自動合成のために有用である。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド接合体は、ハイブリダイゼーションに基づく手順において、プライマー、プローブ、アンタゴマー(antagomer) 等として、分子生物学において開発され、広範に適用されている。これらの試薬の分子生物学手順における使用は、ヌクレアーゼ感受性に対する耐性を改善するため、接合体標的二本鎖の二本鎖安定化を改善するため、および接合体溶解度の検出を可能とするかまたは改善するために、しばしば修飾を必要とする。これは次いで、一以上の非-同位体標識、例えば、蛍光色素、クエンチャー、介入物(intercalator)、ビオチン、ビーズ粒子、酵素、抗体、抗原、疎水性化合物、例えば、コレステロール、イオン性化合物、例えば、スペルミン等の封入(inclusion) を導いた。さらなる修飾が、安定性またはヌクレアーゼ耐性を上昇させるためにオリゴヌクレオチドにおいてバックボーンへと導入された。これらの修飾には、ロックド核酸(locked nucleic acid)、2’-O-アルキルリボース単位(unit)、メチルホスホネート(phosphonate)-またはホスホロチオエート(phosphorothioate)-、またはホスホロジチオエート(phosphorodithoate)-結合およびペプチド核酸の導入が含まれる。核酸における天然起源の(naturally occurring) 塩基は、オリゴヌクレオチド接合体の性質を目的に合わせるために常套的に修飾塩基により置換されている(米国特許第6,949,367号)。副溝結合剤(米国特許第5,801,155号)および介入物(米国特許第4,835,263号)は、二本鎖形成を安定化するために使用されてきた。診断および治療におけるこれらの化合物の広範な適用に伴い、共有結合した(covalently attached) 副溝結合剤オリゴヌクレオチド接合体についての増加しつつある要求を満足させるために試薬を改善する必要性が存在する。
【０００４】
副溝結合剤は、オリゴヌクレオチドに、合成後接合(conjugation) (米国特許第5,955,590号)またはMGB-修飾DNA 合成固体支持体 (米国特許第5,801,155号)を用いて結合させる(attached)ことができる。副溝結合剤接合体を合成するための試薬および方法はまた、米国特許第6,084,102号に記載されている。一例は、トリペペプチド(tripepeptide) 3-カルボミル(carbomyl)-1,2-ジヒドロ-3H-ピロロ[3,2,-e]インドール-7-カルボン酸残基のテトラフルオロフェニルエステル (TFP-DPI3 カルボキシレート)であり、これは天然起源の抗生物質である CC-1065の類似体である。TFP-DPI3 カルボキシレートは、MGB-オリゴヌクレオチド接合体の自動製造のための固体支持体を合成するために使用することができる。 あるいは、TFP-DPI3 は、合成後に(post synthetically) MGB リガンドに結合する(attach)ために使用することができる。
【０００５】
その他の副溝結合剤オリゴヌクレオチド接合体が報告されている。ブロモアセトアミド テザー(tether) を有するHoechst 33258 類似体がアルキルチオール官能基を有するオリゴヌクレオチドに結合された(coupled)(Wiederbolt et al.、J. Am. Chem. Soc.,7055-7062 (1997))。同じ方法がDAPI 類似体をオリゴヌクレオチドに接合させるために使用された (O’Donnell et al.、1995)。Hoechst 33258は、切断可能リンカーを介して固体支持体に、ヘキサ(エチレングリコール) リンカーによって繋ぎ止めることができる(tethered)。この固体支持体は次いで、Hoechst 33258 オリゴヌクレオチド接合体を合成するために使用することができる(Rajur et al.、The Journal of Organic Chemistry  62: 523-529 (1997))。Rajurおよびその共同研究者らは、Hoechst 33258-ヘキサ(エチレングリコール) ホスホラミダイトを合成することを試みたが、成功は報告されず、副溝結合剤のベンズイミダゾール基がホスフィチル化(phosphitylating)試薬についてヒドロキシル基と競合していたこと、あるいはおそらくは、その他の副反応に関与していたことが示唆された。
【０００６】
いくつかの副溝結合剤について、ホスホラミダイト調製は、望まれない反応の存在に起因するばかりでなく、それらのオリゴヌクレオチド合成溶媒、例えば、アセトニトリル中での非常に低い溶解度によっても、挑戦を提示しうる。溶解度は、例えば、CC-1065およびデュオカルマイシンファミリーに属するジヒドロピロロインドール (「DPI」)-含有 MGB剤については、一つの非常に明白な問題である (Boger et al.,J. Org. Chem.、1521-1530 (1987))。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
骨の折れる合成後結合(attachment)を排除し、それゆえ、自動化およびスケールアップを促進するような、オリゴヌクレオチド接合体の合成における副溝結合剤ホスホラミダイト(minor groove binder phosphoramidite)についての必要性が存在する。この目的を達成するためには、自動化オリゴヌクレオチド合成と適合性であり、芳香族複素環(ヘテロ芳香族) アミンの存在に関連する副反応を排除し、そして好適な有機溶媒中での溶解度を改善する、MGB 保護戦略についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本開示は、それらの構造、合成方法、およびオリゴヌクレオチド接合体におけるそれらの使用を含む、副溝結合剤ホスホラミダイトに関する。
【０００９】
一般に、本明細書に開示する副溝結合剤ホスホラミダイトは、下記式の化合物である:
【化１】
2014522660.tif 000002
[式中、Mは、保護(protected) 芳香族複素環アミンを含む、副溝結合剤 (「MGB」) であり、Lは、リンカーであり;そして、 PAは、ホスホラミダイト基である]。Lは、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであってよく、水素原子を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から 50 原子を有しうる(may have from 4 to 50 atoms, exclusive of hydrogen atoms that fill available valences, selected from a group consisting of C, N, O, P, and S)。本明細書に記載するホスホラミダイトのM 部分は、さらなる官能基を導入するかまたは MGBの性質を調節するために、置換されていてもよい。さらなる官能基の導入は表1 から 3に実証されており、以下に詳細に議論する。 MGBの性質の調節のさらなる例は、米国特許第7,582,739号に開示されている。
【００１０】
好ましい態様において、芳香族複素環アミン保護は、オリゴヌクレオチド構築 (assembly) の間は本質的に(essentially) 安定であり、オリゴヌクレオチド脱保護の間に除去される。別の好ましい態様において、芳香族複素環アミン保護基はカルバメート(carbamate)基である。別の好ましい態様において、芳香族複素環基は、インドールまたはベンズイミダゾール環である。さらに別の好ましい態様において、副溝結合剤は、CC-1065、デュオカルマイシン およびHoechst 33258の類似体を含む群から選択される。
【００１１】
より具体的には、副溝結合剤ホスホラミダイトは、下記式II および IIIの化合物を含みうる:
【化２】
2014522660.tif 000003
[式中、 R1およびR2はそれぞれ独立して、PG、L、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、-(CH2CH2O)nCH2CH3 （ここで n=1 から 8）であり、あるいはR1 および R2 は、O、SおよびNから選択される0、1または2のヘテロ原子を含んでいてもよい5または6員環構造を形成し; n=1から 4であり; Lは、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであって、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4 から50の原子を有する(having from 4 to 50 atoms, exclusive of hydrogens that fill available valences, selected from a group consisting of C, N, O, P, and S)リンカーであり; PGは、保護基であり; そして、PA は、ホスホラミダイト基である]。
【００１２】
副溝結合剤ホスホラミダイトは、下記式IVおよびVの化合物もまた含みうる:
【化３】
2014522660.tif 000004
[式中、R1は、L、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、-(CH2CH2O)nCH2CH3 （ここで、n=1 から 8）、置換または非置換アリールおよびヘテロアリールであり; n=1から4であり; Lは、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであり、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の原子を有する(having from 4 to 50 atoms, exclusive of hydrogens that fill available valences, selected from a group consisting of C, N, O, P, and S)リンカーであり; PGは、保護基であり; そして、PAは、ホスホラミダイト基である ]。
【００１３】
本発明の(the current )副溝結合剤ホスホラミダイトの合成のための好ましい方法は、以下の工程を含む方法を含む:
一過性に保護されたヒドロキシル基を含有する副溝結合剤中間体を合成する工程; 
該対応する副溝結合剤中間体の芳香族複素環アミンをカルバメート中間体として保護する工程;
該カルバメート中間体を一過性保護基を除去するように反応させて、カルバメート-保護副溝結合剤を遊離ヒドロキシル基を有する中間体として得る工程、および、
遊離ヒドロキシル基を有する該中間体を所望の副溝結合剤ホスホラミダイトへと変換する工程。
【００１４】
いくつかの態様において、副溝結合剤中間体は、 モノマー構成単位から構築された(assembled) 中間体である。CC 1065 類似体の場合、1,2-ジヒドロ-3H-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボン酸(DPI カルボン酸)に基づく出発モノマー単位は、化学文献 (Boger、D.、Coleman、R and Invergo、B.、J. Org. Chem.、52: 1521-1530 (1987)) に記載された手順にしたがって作ることができる。DPI 単位の本開示において使用される副溝結合剤(DPI 三量体)への構築(assembly)は、米国特許第5,801,155号に記載されている。モノマーサブユニットからのHoechst 33258 類似体の合成のための方法は、Wiederholt、K.、Rajur、S.、Giuliana、J.、O’Donnell、M.、and BcLaughlin、L.、J. Am. Chem. Soc.、118: 7055-7062 (1996) に記載されるように異なるサブユニットの体系的構築を必要とする。デュオカルマイシン類似体の異なるモノマー単位からの合成もまた、当該技術分野において公知である (Tichenor et al.、2006; Tichenor et al. 2007)。本発明の副溝結合剤ホスホラミダイトの芳香族複素環アミンのための好ましい保護基は、自動化オリゴヌクレオチド構築工程の間は安定であり、最終脱保護の間に除去され得る。さらなる態様において、得られた所望の保護副溝結合剤ホスホラミダイトは、オリゴヌクレオチド-副溝結合剤接合体の合成において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面の簡単な説明
【００１６】
【図１】図 1は、 DPI3 型副溝結合剤ホスホラミダイトの合成のための反応スキームを示す;
【図２】図 2は、 ジ-ベンズイミダゾール型副溝結合剤ホスホラミダイトの合成のための反応スキームを示す;
【図３】図 3は、活性化エステルトリ-ベンズイミダゾール型の副溝結合剤(binding agent) の合成のための反応スキームを示す;
【図４】図 4 は、トリ-ベンズイミダゾール型副溝結合剤ホスホラミダイトの合成のための反応スキームを示す;および、
【図５】図 5は、DPI3 ホスホラミダイトを用いて合成されたオリゴヌクレオチドプローブと、以前に開発された DPI3-ポリスチレン固体支持体上にて合成されたオリゴヌクレオチドプローブの、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster Virus)(「VZV」) PCR アッセイにおける性能の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
I.定義
【００１８】
「副溝結合剤」という用語は、非インターカレート様式にて核酸に結合する化合物をいう(米国特許第5,901,155号)。本開示の目的のために、「副溝結合剤」は、芳香族複素環アミンを含む。好ましい副溝結合剤は、CC-1065、デュオカルマイシン および Hoechst 33258の類似体である。
【００１９】
「芳香族複素環アミン」という用語は、環中に少なくとも一つの-NH- 基を含有する芳香族複素環をいう。「芳香族複素環アミン」の例は、ピロール、インドール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、プリン等である。
【００２０】
「アルキル」という用語は、接頭辞に示される数の炭素原子を有する、直鎖状、分枝状、または環式の飽和一価炭化水素ラジカルまたは環式および直鎖状または分枝状の飽和一価炭化水素ラジカルの組み合わせをいう。例えば、(C1-C8)アルキルは、メチル、エチル、n-プロピル、2-プロピル、tert-ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル等を含む意図である。本明細書中の定義のそれぞれについて (例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アリールアルキルオキシ)、アルキル部分における主鎖炭素原子の数を示す接頭辞が含まれない場合、ラジカルまたはその部分は8つ以下の主鎖炭素原子を有するものとする。
【００２１】
「ヘテロアルキル」という用語は、シアノ、--ORa、--NRbRc、および--S(O) nRd (ここでnは0から2の整数) から独立して選択される1、2または3の置換基を有し、ヘテロアルキルラジカルの結合点(the point of attachment)がヘテロアルキルラジカルの炭素原子を介するという理解である、本明細書において定義されるアルキルラジカルをいう。Ra は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキシアミド(carboxamido)、またはモノ-またはジ-アルキルカルバモイルである。Rb は、水素、アルキル、アリールまたはアリールアルキルである。 Rc は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキシアミド、モノ-またはジ-アルキルカルバモイルまたはアルキルスルホニルである。 Rdは、水素 (ただし、nは0)、アルキル、アリール、アリールアルキル、アミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、またはヒドロキシアルキルである。代表例としては、例えば、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-メトキシエチル、ベンジルオキシメチル、2-シアノエチル、および2-メチルスルホニル-エチルが挙げられる。上記のそれぞれについて、Ra、Rb、Rc、およびRd はNH2、フッ素、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、OHまたはアルコキシによってさらに置換されていてもよい。さらに、炭素原子の数を示す接頭辞(例えば、C1-C10) は、シアノ、--ORa、--NRbRc、および--S(O) nRd 部分を除いた(exclusive of)、ヘテロアルキル基の部分における炭素原子の総数をいう。
【００２２】
「保護基」は、分子における反応性基に結合した場合、反応性を、マスクする、低下させる、または、妨げる、アルキルまたはシクロアルキル基を除く部分をいう。「保護」分子は保護基によって保護される一以上の反応性基を有する。保護基の例は、そのすべてをそれら全体を引用により本明細書に含める、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley ＆ Sons, New York, 1999, Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996), および「Protection of Nucleosides for Oligonucleotide Synthesis」, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, ed. by Boyle, A. L., John Wiley ＆ Sons, Inc., 2000, New York, N.Y.においてみることができる。代表的なヒドロキシ保護基としては、アシル基、ベンジルおよびトリチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル (CBZ)、tert-ブトキシカルボニル (Boc)、トリメチルシリル (TMS)、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル (SES)、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル (FMOC)、ニトロ-ベラチルオキシカルボニル (NVOC)等が挙げられる。
【００２３】
「リンカー」という用語は、分子の様々な部分を構築するため、または、分子 (またはその部分)を固体支持体に共有結合するために使用される部分をいう。典型的には、リンカーまたは連結(linking)基は、本明細書において記載され使用される接合体のリガンドまたは成分(例えば、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、副溝結合剤、またはクエンチャー) における官能基と相互作用して共有結合を形成するために使用される官能基を有する。(その他の成分との相互作用の前の)連結基の上の官能基の例としては、-NH2、-NHNH2、-ONH2、NHC=(O)NHNH2、-OH、-COOH または -SHが挙げられる。連結基はまた、その他の基(例えば、ホスホラミダイト部分等) を接合体に結合させる分子の部分でもある。さらに、リンカーは、直鎖状または非環式部分、環式部分、芳香環またはそれらの組み合わせを含みうる。連結基は、二官能性リンカー、三官能性リンカーまたは多官能性リンカーであり得、例えば、文献に詳細に記載されている二-および三官能性リンカー、ならびに3’-アルキルアミンリンカー (米国特許第5,419,966号)またはプロリノールに基づくリンカー(米国特許第5,512,667号)でありうる。三-および四官能性リンカーもまた記載されている (米国特許第5,451,463、5,942,610 および5,696,251号)。固相合成における使用のための光分解性(Photocleavable) 連結基が記載されている (米国特許第5,739,386号)。三官能性リンカーはまた市販されている (Glen Research、Sterling、Va.)。さらに、連結基は、水素原子を除いて、C、N、O、P および Sからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の原子を有し(having from 4 to 50 atoms selected from the group consisting of C, N, O, P and S and exclusive of hydrogen atoms that fill available valences)、さらに、隣接するカルボニル基に直接的に結合した窒素原子を有する、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせでありうる。
【００２４】
「ホスホラミダイト」という用語は、典型的には、オリゴヌクレオチド合成において使用される三価リン基をいう。ホスホラミダイト方法によりオリゴヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細な説明は、そのそれぞれをその全体を引用により含める、Caruthers et al.、米国特許第4,458,066 および 4,415,732号; Caruthers et al.、Genetic Engineering、4:1-17 (1982); Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers、6-1頁 6-22、Applied Biosystems、Part No. 901237 (1991) に提供される。
【００２５】
「接合体(conjugate)」という用語は、二以上の成分、例えば、オリゴヌクレオチド、フルオロフォア、クエンチャー、副溝結合剤等の共有結合によって形成される分子をいう。
【００２６】
「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」 は互換的に用いられ、天然または合成のいずれかであって、修飾塩基、糖類似体等を有するヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、ヌクレオチドのポリマーをいう。特定の場合において、オリゴヌクレオチドは、2’-OMe-リボ核酸単位またはロックド核酸 (「LNA」) 単位を、単独でまたは互いにまたはその他の成分と組み合わせて含みうる。修飾塩基およびロックド核酸はさらに引用により含める米国特許第7,045,610号に議論されている。オリゴヌクレオチド接合体は、少なくとも一つの共有結合した(covalently attached)フルオロフォア、クエンチャー、副溝結合剤 (「MGB」) またはその他の有用な断片、ならびに記載された成分の組み合わせを有する、定義した通りのオリゴヌクレオチドをいうものであり得る。
【００２７】
II.合成
DPI3 型の副溝結合性(bindinding) リガンドの活性化ペンタフルオロフェニルエステル 1を以前に記載されているようにして調製し (米国特許第7,381,818号) 、４つの、二級アミンを含有する末端官能基と結合させ(coupled)、後の保護およびホスホラミダイト調製に好適な三量体2(a-d)を生成した(反応スキーム 1、図 1)。二級アミノ官能基の使用は、後の保護工程の間の環式副生物の形成可能性を妨げる(Basal and Hassner 2000)。三量体2(a-d)をDMAPの存在下で二炭酸ジエチル(diethyl pyrocarbonate)と反応させ、３つの芳香族複素環インドールアミノ(indolamino)基を保護し、カルボメート(carbomate) 3(a-d)を得た。二炭酸メチルおよび二炭酸tert-ブチルもまた試験し、それぞれのカルバメート(carbamate)が良好な収率で生じた。しかしながら、メチルカルバメート-保護ホスホラミダイトは、オンラインオリゴ合成のための標準的溶媒であるアセトニトリル中で難溶性でしかなく(sparingly soluble); 一方、BOC-カルボメート(carbomate) 保護は標準的脱保護工程 (濃NH4OH、+70℃、2 時間) の間に完全に除去することができなかった。それゆえ、エチルカルバメート保護が、速い脱保護を可能とし、必要とされるアセトニトリル中の溶解度を提供する、最適なものであると結論付けられた。ジメトキシトリチル保護基の除去により、一級アルコール4(a-d)が生じ、これは次いで最終ホスホラミダイト5(a-d)に2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite)を用いるホスフィチル化(phosphitylation)により変換された。
【００２８】
一つの態様において、1は、フェニル環上または5 員環上のいずれかあるいはそれら両方の上にて置換されていてもよい(すべて引用により含める、Boger et al、1997; Boger et al.、1992; 米国特許第7,799,926号)。これらの置換には、一以上の、 OH、OR1 （ここでR1 はアルキル）、-OC(O)R2 （ここでR2 はアルキルまたはフェニル）、-NH2、N(CH3)3、NO2、アルキルおよびAsO3H2  基が含まれる。その他の置換基の、フェニル、ピロリジン またはピロール環への導入もまた可能であり、当業者に理解されているであろう。ホスホネートおよびスルホネート(sulfonate)基が、色素を含有するフェニル環に導入された(両方を引用により含める、米国特許第7,671,218号および米国特許第6,130,101号)。ハロゲン-およびシアノ-基もまた、ザントマイヤー反応によりアミノ基を介して導入することができる(引用により含める、Sandmeyer、1947)。
【００２９】
ホスホラミダイトの結合点は、例えば、下記式 VIにより表されるようにDPI3 分子の代替部位におけるものでありうる:
【化４】
2014522660.tif 000005
式 VIにおいて、Lx は、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の 原子を有する(having from 4 to 50 atoms, exclusive of hydrogens that fill available valences, selected from group consisting of C, N, O, P, and S)、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであるリンカーである。Ry は、オリゴヌクレオチド合成に適合性の溶解度を有し、効率的に脱保護される保護基であり、Rx は、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、または-(CH2CH2O)nCH2CH3 （ここで n=1 から 8）である。
【００３０】
ジ-ベンズイミダゾール-に基づく副溝結合剤ホスホラミダイトの調製のための合成スキームを図 2に示す。化合物 8b を、中間体6 および7b から出発して以前に記載されているようにして調製した(Hoechst 33258 Tethered by a Hexa(ethylene glycol) Linker to the 5’-Termini of Oligodeoxynucleotide 15-Mers:  Duplex Stabilization and Fluorescence Properties. Sharanabasava B. Rajur, Jordi Robles, Kristin Wiederholt, Robert G. Kuimelis, and Larry W. McLaughlin. J. Org. Chem., 1997, 62 (3), pp 523-529.)。同様に、化合物 8aを化合物 7aから合成した(PCT 国際出願(2011)、WO 2011123890 A1. Preparation of benzimidazole derivatives as radioprotector compounds. By Martin, Roger Francis; White, Jonathan; Lobachevsky, Pavel; Winkler, David; Skene, Colin; Marcuccio, Sebastian)。中間体8a および8bを DMTClで処理して一時的にヒドロキシ基をブロックし、次いで二炭酸ジエチルで処理してベンズイミダゾール窒素を保護し、完全に保護された中間体10を得た。一過性の DMT 保護を希 TFAによる処理によって除去し、一級アルコール11を得、これを次いで最終ホスホラミダイト12に、2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite)によるホスフィチル化(phosphitylation)によって変換した。
【００３１】
図 3は、副溝結合剤活性化 (PFP) エステルの調製を示し、これはトリ-ベンズイミダゾール型副溝結合剤ホスホラミダイトを合成するために使用することができる。化合物 7b およびN-(4-ホルミル-2-ニトロフェニル)アセトアミドの酸化的環化 (Synthetic Utility of Catalytic Fe(III)/Fe(II) Redox Cycling Towards Fused Heterocycles: A Facile Access to Substituted Benzimidazole, Bisbenzimidazole and Imidazopyridine Derivatives. Malvinder P. Singh*, Sanjita Sasmal, Wei Lu, Manashi N. Chatterjee. Synthesis, 2000(10): 1380-1390)により化合物 13を得た。NaOHによる脱アセチル化により中間体 14を得、これを次いで触媒的に水素化してジアミン 15を得た。安息香酸メチル 4-ホルミルによる酸化的環化によりエステル 16を得、これを次いでけん化し、結果として得られた遊離酸 17のカルボキシ基をペンタフルオロフェニルエステルに変換して所望の活性化副溝結合剤 18を得た。PFP エステル 18は様々なアミノアルコールと反応させることにより、引き続くイミダゾールアミンの保護およびホスホラミダイト調製のために好適なリンカーを導入することができる。
【００３２】
トリ-ベンズイミダゾール副溝結合剤ホスホラミダイトもまた図 4に示すようにして調製した。以前に記載された(Fixed or Invertible Calixarene-Based Directional Shuttles. Teresa Pierro, Carmine Gaeta, Carmen Talotta, Agostino Casapullo, and Placido Neri Org. Lett. 2011, 13(10), 2650-2653.)化合物 19を酸性メタノール中でイミドエステル 20 に変換し、ジアミン 15と縮合させてRajur  et al (Hoechst 33258 Tethered by a Hexa(ethylene glycol) Linker to the 5’-Termini of Oligodeoxynucleotide 15-Mers:  Duplex Stabilization and Fluorescence Properties. Sharanabasava B. Rajur, Jordi Robles, Kristin Wiederholt, Robert G. Kuimelis, and Larry W. McLaughlin. J. Org. Chem., 1997, 62 (3), pp 523-529.)にしたがって 21 を酸性条件下で形成した。結果として得られた化合物 21の遊離ヒドロキシル基を、それを DMT 誘導体 (化合物 22)に変換することにより一時的にブロックした。これによりエチルカルバメート (化合物 23)としてのベンズイミダゾールアミンの引き続く保護が可能となった。一過性の DMT 基を希 TFA による処理により除去して遊離ヒドロキシル基を再生し、それを引き続き2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite)との反応により所望のホスホラミダイト 25へと変換した。
【００３３】
特定の態様において、オリゴヌクレオチド合成と適合性である溶解度を有し、効率的な脱保護を可能とする保護基が用いられる。本明細書において用いる場合、「保護基」または「その保護形態」は、分子における反応性基と結合した場合、反応性をマスクする、低下させる、または、妨げる、原子の集団(grouping) をいう。保護基の例は、Greene and Wuts, 1991, Beaucage and Iyer, 1992, および Harrison and Harrison et al., 1971-1996にみることができる。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル (CBZ)、tert-ブトキシカルボニル (Boc)、トリメチルシリル (TMS)、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル (SES)、トリチルおよび置換されたトリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル (FMOC)、ニトロ-ベラチルオキシカルボニル (NVOC) 等 (Boyle、2000もまた参照されたい)が挙げられる。代表的なヒドロキシ保護基としては、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されるもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテルならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが挙げられる。さらに、ヒドロキシ基は、光分解性(photoremovable) 基、例えば、アルファ-メチル-6-ニトピペロニル(nitopiperonyl)オキシカルボニルによって保護され得る (McGall、2001; Boyle、2000)。
【００３４】
特定の態様において、ホスホラミダイト 5(a-d)、12(a-b) および25が、標準的オリゴヌクレオチド合成および脱保護プロトコールを用いて自動合成機上でオリゴヌクレオチドへと組み入れられうる。
【００３５】
本主題の実施は、特に断りのない限り、当業者の能力の範囲内である、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および修飾、バイオコンジュゲート化学、核酸ハイブリダイゼーションおよび関連分野における常套技術を用いる。 これらの技術は完全に文献において説明されている (Ausubel、et al.、1987-1996; Gait、1984; Eckstein、1991)。
【００３６】
副溝結合剤ホスホラミダイトを合成する本発明の方法は、当該技術分野において公知のその他の副溝結合剤との使用のために修正可能である。本発明の方法にしたがって、ホスホラミダイト誘導体へと変換され得る、従来技術の公知の副溝結合化合物の例としては、天然起源化合物およびそれらの合成類似体、例えば、以下の表1に示す、 CC-1065、デュオカルマイシン SA、デュオカルマイシン A および Hoescht 33258 が挙げられる。本発明の方法によるホスホラミダイト誘導体へと変換され得るHoechst 33258 およびデュオカルマイシンのさらなる類似体は、それぞれ以下の表2および3に示される。Hoechst 3328 類似体は、Reddy et al, 1999;  Robles et al., 1996; Wiederholt et al, 1996; Bostock-Smith ＆ Searle, 1999; Dasari et al., 2010; Sando et al., 2007;  国際特許公開第WO 2007/016455号; Jan et al.、2006; 米国公開第2006/166223号; Tanada et al、2006; および国際特許公開第WO 2005/082894号によって開示されている。デュオカルマイシン類似体は、Ichumura et al.、1990; Smith et al.、2000; Amishiro et al.、1999; Howard et al.、2002; Boger et al.、1994; Boger et al.、2001; Robertson、et al.、2010; MacMillan et al.、2008; Tichenor et al.、2007 ; およびYamada et al.、2003によって開示されている。表2における類似体のいくつかは反応性中間体への前駆物質として合成されたが、非-反応性置換基を導入するために改変され得るそれらの構成(construction)についての詳細な合成方法は、当該技術分野において利用可能である。２つの特定の有用なアプローチは、Tichenor et al、129: 14092-14099 (2007)およびTichenor et al.、2006である。
【００３７】
様々な好適な CC-1065、Hoechst 33258およびデュオカルマイシン、副溝結合剤(「MGB」) は文献に記載されている。例えば、米国特許第5,801,155号; Wemmer、et al. 1997; Walker、et al. 1997; Zimmer、＆ Wahnert、1986; およびReddy, et al. 1999を参照されたい。
【００３８】
MGBへの結合のための様々なリンカーを導入する好適な方法は、例えば、米国特許第5,512,677; 5,419,966; 5,696,251; 5,585,481; 5,942,610 および 5,736,626号に記載されている。様々なリンカーを有する副溝結合剤ホスホラミダイトもまた記載されている。
【００３９】
好ましい副溝結合剤は、CC1065-、Hoechst 33258およびデュオカルマイシン-類似体から選択されるものである。これらの類似体は、インドール- およびベンズイミダゾール-に基づく副溝結合剤の代表である。
【００４０】
特に好ましい副溝結合剤としては、1,2-ジヒドロ-(3H)-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレートの二量体 (DPI2)、1,2-ジヒドロ-(3H)-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレートの三量体 (DPI3)、1,2-ジヒドロ-(3H)-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレートの四量体(DPI4)、およびその他の副溝結合剤が挙げられる。本開示の実施に関して使用できるさらなるMGB 部分は米国特許第5,801,155号に開示されている。特定の態様において、MGBは、水溶解度-増強基 (例えば、糖またはアミノ酸)と結合したものであってもよい。
【００４１】
その他の好ましい副溝結合剤は、表2に示されるHoechst 33258-類似体および表3に示されるデュオカルマイシン-類似体から選択される。当業者であれば、適当なリンカーをホスホラミダイトの合成のために好適なこれらの類似体へと導入することができることを認識している。本発明の(The current ) ホスホラミダイトは自動化オリゴヌクレオチド合成機上で反応させてオリゴヌクレオチド接合体を得るために使用される。ハロゲン、シアノ、アミノ、ヒドロキシル、-O-アルキル、アルキル、ヘテロアルキル、トリフルオロメチル、カルボキシル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル基等をアリール環に導入する方法は当該技術分野において公知である。
【００４２】
より具体的には、表1におけるものは、 CC-1065、デュオカルマイシン A、SA および Hoechst 33258が-OH、-OCH3、-CH3および-COOCH3 基により置換されている例である。 同様に、表2におけるものは、 Hoechst 33258 類似体が-tBu、-OH、-OCH3、-CH3、-NO2、-OEt、-CH2Cl、-Fl、-Br、-Cl、-I および-COOCH3により置換されている例である。表3における置換されたデュオカルマイシン類似体の例には、-OH、-OCH3、-CH3、-NO2、-CH2Cl、-CH2OH、-CH2Br、-CH2OS(=O)2CH3、 -COOH、および-COOCH3により置換されているものが含まれる。表 1-3に示される置換は、副溝結合剤の活性を調節することができる置換の例である。
【００４３】
表1. CC-1065、デュオカルマイシン A、SA および Hoechst 33258の構造
【表１】
2014522660.tif 000006
【００４４】
表2.  Hoechst 33258 類似体
【表２】
2014522660.tif 000007
【００４５】
【表３】
2014522660.tif 000008
【００４６】
【表４】
2014522660.tif 000009
【００４７】
【表５】
2014522660.tif 000010
【００４８】
【表６】
2014522660.tif 000011
【００４９】
【表７】
2014522660.tif 000012
【００５０】
【表８】
2014522660.tif 000013
【００５１】
表3.  デュオカルマイシン類似体
【表９】
2014522660.tif 000014
【００５２】
【表１０】
2014522660.tif 000015
【００５３】
【表１１】
2014522660.tif 000016
【００５４】
【表１２】
2014522660.tif 000017
【００５５】
副溝結合剤ホスホラミダイトを合成する本発明の方法はまた、ジアミジンフェニルインドール (DAPI)またはいくつかのフラミジン (Boykin D.W. J.Braz.Chem.Soc. (2002) V.13、6、763-771.) 類似体との使用のためにも修正可能なものである。より一般的には、これらの方法は芳香族複素環アミンを含む副溝結合リガンドへと修正可能である。
【００５６】
特に好ましい副溝結合剤ホスホラミダイトは、下記式II およびIIIの化合物を含みうる:
【化５】
2014522660.tif 000018
式中、R1およびR2はそれぞれ独立して、PG、L、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、-(CH2CH2O)nCH2CH3 （ここで、n=1から 8）であるか、あるいはR1 および R2 は、O、SおよびNから選択される0、1または2のヘテロ原子を含んでいてもよい5または6員環構造を形成し; n=1から4であり; Lは、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであって、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の 原子を有する(having from 4 to 50 atoms, exclusive of hydrogens that fill available valences, selected from a group consisting of C, N, O, P, and S)リンカーであり; PGは、保護基であり; および PA はホスホラミダイト基である。
【００５７】
その他の特に好ましい副溝結合剤ホスホラミダイトはまた、下記式 IVおよび Vの化合物を含みうる:
【化６】
2014522660.tif 000019
式中、R1 は、L、C1-8 アルキル、C1-8 ヘテロアルキル、保護C1-8 ヘテロアルキル、-(CH2CH2O)nCH2CH3（ここで、n=1 から 8である）、置換または非置換アリールおよびヘテロアリールであり; n=1から4であり; Lは、非環式、環式、芳香族またはそれらの組み合わせであって、水素を除いて、C、N、O、P、およびSからなる群から選択される、利用可能な原子価を満たす4から50の 原子を有する(having from 4 to 50 atoms, exclusive of hydrogens that fill available valences, selected from a group consisting of C, N, O, P, and S)リンカーであり; PGは、保護基であり; および PAは、ホスホラミダイト基である。
【００５８】
副溝結合剤オリゴヌクレオチド接合体は、プライマー、プローブ(US 6,312,984)、miRNA アンタゴニスト(米国出願公開第2011/0172289号)、遺伝子発現阻害剤(Kawashima et al.、Nucl. Acids Symp. Ser (Oxf) 49: 327-328 (2005))として、およびプライマー伸長法の配列-特異的停止(arrest) のために(Afonina et al PNAS、93: 3199-3204 (1996)) 使用されてきた。
【００５９】
意図される適用に応じて、MGB 基は、核酸配列内の3’ 末端(end)、5’ 末端、内部で、または複数位置にて結合され得る。
【００６０】
一般に、MGBのオリゴヌクレオチドの終端(terminus)への接合は最高の程度のハイブリッド安定性を提供するであろう。というのは、オリゴヌクレオチド二本鎖の融解が終端にて開始するからである。MGB-オリゴヌクレオチド接合体の意図される使用はまた、接合した(conjugated) MGBの位置の上に制限を設置しうる。例えば、オリゴヌクレオチドがプライマーとして使用するために設計される場合、3’-ヒドロキシ基は、遊離であって、重合酵素によって伸長されることができる必要がある。あるいは、標識 (labeled)5’-末端を有するオリゴヌクレオチドを必要とするアッセイは、 MGBの3’-末端結合を必要とするであろう。
【００６１】
MGB-修飾オリゴヌクレオチド接合体内のMGB の位置はまた、かかる接合体の差別的(discriminatory) 性質に影響しうる。二本鎖内の不対領域は、不対合(mispaired)塩基の近くの副溝の形状に変化をもたらすであろう。MGBは完全に-マッチした DNA 二本鎖の副溝内にもっともよく適合するため、副溝における形状変化をもたらすミスマッチは、MGBのミスマッチを含有する領域への結合強度を低下させるであろう。したがって、MGBがかかるハイブリッドを安定化する能力は低下するであろうし、それにより、MGB-オリゴヌクレオチド接合体が、ミスマッチを完全に-マッチした二本鎖から識別する能力は上昇するであろう。一方、ミスマッチがMGB-オリゴヌクレオチド接合体に相補的な領域の外側にある場合、同じ長さの非接合化(unconjugated)およびMGB-接合化(conjugated)オリゴヌクレオチドについての差別能力はおよそ同じであると期待される。オリゴヌクレオチドプローブが単一塩基対ミスマッチを識別する能力はその長さに依存するため、より短いオリゴヌクレオチドがミスマッチの識別においてより有効である。これに関連するMGB-オリゴヌクレオチド接合体の使用の主要な利点は、より大きな差別能力を有する、従来技術において使用されていたものと比較してより短いオリゴヌクレオチド (即ち、20-merまたはそれより短い)が、MGB 接合の明白な安定化効果に起因して使用することができるという事実にある。
【００６２】
本開示は一般に副溝結合剤に限定されない;それは、それらが適切な保護を必要とする少なくとも一つの芳香族複素環アミンを有する限り様々な官能基の分子のホスホラミダイトにも適用されうる。
【実施例】
【００６３】
実施例
以下の実施例は、本出願において請求項に記載される主題を例示するために提供されるが、限定するものではない。
【００６４】
実施例 1
この実施例は、本発明の方法にしたがって調製したDPI3 ホスホラミダイト 5d を用いて合成されたオリゴヌクレオチドプローブの性能と、DPI3-ポリスチレン 固体支持体上にて合成されたプローブ(米国特許第7,381,818号に記載されているようにして) の性能とを、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster Virus) (「VZV」) PCR アッセイにおいて比較するものである。VZV アッセイのためのプライマー、プローブおよびプロトコールは以前に報告されている (Afonina et al.、2007)。簡単に説明すると、10μL のサンプル核酸を20 μLのアッセイ試薬に添加し、アッセイは、50℃で2分間インキュベートし、95℃で2分間変性させ、95℃で15 秒間、50℃で30 秒間および72℃で30 秒間の50 サイクルを用いるABI 7900 サーモサイクラーにて行った。106 から10の標準的 10 倍段階希釈のコピーを使用した。固体支持体上で合成されたVZV プローブにより観察されたCt 値と本開示のホスホラミダイトを用いて合成されたプローブのCt 値は用量設定範囲にわたって非常に類似しており、図 5に示される通り類似の性能を示す。
【００６５】
実施例 2
この実施例は副溝結合剤ホスホラミダイト 5a-dの合成を示す。
【００６６】
化合物 2aの合成:
【化７】
2014522660.tif 000020
【００６７】
モルホリン (0.27 g、2.60 mmol) をDMF (35 ml)およびトリエチルアミン (0.439 g、4.34 mmol)中の化合物 1 (2.5 g、2.17 mmol)の懸濁液に添加した。1時間撹拌した後、反応を濃縮しメタノール (50 ml)で希釈した。 沈殿した物質を濾過により単離して濃黄褐色ペーストを得、これを次いでメタノール (3x20 ml)で洗浄し、減圧乾燥して化合物 2a (2.0 g、1.89 mmol、87％収率) を黄褐色固体として得た。粗生成物は次の工程にてさらに精製せずに使用するために十分に純粋であった。
【００６８】
化合物 2bの合成:
【化８】
2014522660.tif 000021
【００６９】
ジクロロメタン (100 ml)中の9-フルオレニルメトキシカルボニルクロライド (15.22 g、58.85 mmol)の溶液を1時間かけてジクロロメタン (50 ml)中の3-メチルアミノ-1-プロパノール (5.25 g、58.85 mmol) およびトリエチルアミン (9.0 ml、64.74 mmol)の氷-冷溶液に添加した。結果として得られた懸濁液を一晩-18℃で放置し、次いで塩水で希釈した。有機相を分離し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を1:4 酢酸エチル/ジクロロメタンで溶出するシリカで精製し、 (9H-フルオレン-9-イル)メチル 3-ヒドロキシプロピルメチルカルバメート(carbamate) (100％収率) を得た。p-トルオイルクロライド (4.26 g、27.56 mmol) を10分間かけてピリジン (100 ml)中の(9H-フルオレン-9-イル)メチル 3-ヒドロキシプロピルメチルカルバメート (7.8 g、25.05 mmol)の氷-冷溶液に滴下した。結果として得られた混合物を2時間 0℃で撹拌し、減圧下で濃縮し、酢酸エチルに再溶解した。溶液を 10％ クエン酸および塩水で洗浄し、次いで分離し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を30％ 酢酸エチル/ヘキサンで溶出するシリカで精製し、(9H-フルオレン-9-イル)メチル 3-(4-メチルベンゾイルオキシ)プロピルメチルカルバメート (97％収率) を得た。DMF (5 ml)中の(9H-フルオレン-9-イル)メチル 3-(4-メチルベンゾイルオキシ)プロピルメチルカルバメート (0.91 g、2.12 mmol) およびトリエチルアミン (5.0 ml) の溶液を1時間 +80℃で撹拌した。結果として得られた混合物を室温まで冷却し、化合物 1 (2.01 g、1.74 mmol) を添加した。反応を DMF (5 ml) で希釈し、2日間撹拌し、次いでエーテル (100 ml) で希釈した。沈殿した固体を濾過により単離し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥して化合物 2b (89％収率) を蒼白色固体として得、これは次の工程にてさらに精製せずに使用するために十分に純粋であった。
【００７０】
化合物 2cの合成:
【化９】
2014522660.tif 000022
【００７１】
p-トルエンスルホニルクロライド (12.583 g、66.0 mmol) をピリジン (9.7 ml)中のトリエチレングリコールモノエチルエーテル (10.484 ml、10.694 g、60.0 mmol) の氷-冷溶液に添加した。3.5時間撹拌した後、反応を10％ 塩酸で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機相を分離し、10％ 塩酸で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して十分に純粋なトリエチレングリコール モノエチルエーテルのp-トルエンスルホネート(19.92 g、59.9 mmol、100％) を帯赤色液体として得た。得られたトシレート (19.5 g、58.7 mmol) をメタノール (24 ml)中のメチルアミンの33％ 溶液に溶解し、18時間還流させ、冷却し、減圧下で濃縮した。 残渣を5％ HCl に溶解し、3回ジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機溶液を5％ HClで逆抽出した。すべての水性抽出物を合わせ、水 (14 ml)中の水酸化ナトリウム (6g) の溶液と混合した。結果として得られた溶液をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機溶液を水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗 2-(2-(2-エトキシエトキシ)エトキシ)-N-メチルエタンアミン (6.50 g) を帯黄色液体として得、これを次いでさらに精製せずに用いた。粗 2-(2-(2-エトキシエトキシ)エトキシ)-N-メチルエタンアミン (0.426 g、1.86 mmol) をトリエチルアミン (1.293 ml、0.939 g、9.28 mmol)およびDMF (5 ml) の混合物中の化合物 1 (1.07 g、0.928 mmol) の懸濁液に添加した。反応混合物を一晩撹拌し、エーテルで希釈した。得られた固体を濾過により収集し、エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させて所望の化合物 2c (0.93 g、0.80 mmol、86％) を蒼白色固体として得た。粗物質を次の工程にさらに精製せずに用いた。
【００７２】
化合物 2dの合成:
【化１０】
2014522660.tif 000023
【００７３】
中間体 2d を化合物 1 および2,2,2-トリフルオロ-N-メチル-N-[6-(メチルアミノ)ヘキシル]-アセトアミド (Xu et al.、1995) から出発して化合物 2aと同様にして90％収率にて調製し、次の工程にさらに精製せずに用いた。
【００７４】
化合物 3aの合成:
【化１１】
2014522660.tif 000024
【００７５】
DMF (20 ml) 中の化合物 2a (1.20 g、1.14 mmol)、4-N,N-ジメチルアミノピリジン (0.083 g、0.68 mmol)およびトリエチルアミン (1.150 g、11.36 mmol)の温かい (50℃)溶液に、二炭酸ジエチル (1.658 g、10.23 mmol)を撹拌しながら添加した。45分間撹拌した後、反応を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンに再溶解し、10％ クエン酸および飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。有機相を分離し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた物質を酢酸エチル中のアセトン (0-10％) のグラジエントで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて化合物 3a (1.09 g、0.89 mmol、収率=78％) を得た。 1H NMR (DMSO-d6):δ8.31 (d、J=9.3 Hz、1 H)、8.28 (d、J=9.3 Hz、1 H)、8.28 (d、J=9.3 Hz、1 H)、8.05 (d、J=9.0 Hz、1 H)、8.00 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.93 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.40-7.18 (m、9H)、7.07 (s、1H)、7.03 (s、1H)、6.87 (d、J=8.7 Hz、4H)、6.86 (s、1H)、4.45-4.00 (m、12H)、3.72 (s、6H)、3.70-3.50 (m、6H)、3.40-3.22 (m、8H)、2.97 (t、J=6.3 Hz、2H)、2.45 (t、J=7.5 Hz、2 H)、1.65-1.60 (m、4H)、1.45-1.34 (m、5H)、1.09 (t、J=6.9 Hz、6H)。
【００７６】
化合物 3bの合成:
【化１２】
2014522660.tif 000025
【００７７】
化合物 3b を化合物 2bから出発して化合物 3aと同様にして89％収率にて調製した。1H NMR (DMSO-d6):δ 8.34-8.16 (m、3H)、8.04 (d、J=9.0 Hz、1H)、7.90 (d、J=9.0、1 H)、7.93 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.90 (d、J=8.0 Hz、1H)、7.85 (d、J=8.0 Hz、1H)、7.42-7.18 (m、10H)、7.08-6.96 (m、3H)、6.88 (d、J=9.0 Hz、4H)、6.77 (d、J=7.5 Hz、1H)、4.45-4.00 (m、14H)、3.72 (s、6H)、3.70-2.90 (m、13H)、2.46-2.25 (m、5 H)、2.05 (m、2H)、1.65-1.50 (m、4H)、1.50-1.25 (m、5H)、1.25-1.00 (m、6H)。
【００７８】
化合物 3cの合成:
【化１３】
2014522660.tif 000026
【００７９】
化合物 3c を化合物 2cから出発して化合物 3aと同様にして71％収率にて調製した。1H NMR (DMSO-d6):δ 8.34-8.24 (m、3H)、8.05 (d、J=9.0 Hz、1H)、8.0 (d、J=9.0、1 H)、7.93 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.40-7.18 (m、9H)、7.07 (d、J=10.5 Hz、1H)、7.07 (d、J=10.5 Hz、1H)、6.87 (d、J=8.7 Hz、4H)、6.82 (d、J=10.5 Hz、1H)、4.45-4.00 (m、12H)、3.72 (s、6H)、3.70-3.20 (m、20H)、3.05-2.90 (m、5H)、2.46 (t、J=7.5 Hz、2 H)、1.65-1.50 (m、4H)、1.50-1.25 (m、5H)、1.25-1.00 (m、9H)。
【００８０】
化合物 3dの合成:
【化１４】
2014522660.tif 000027
【００８１】
化合物 3d を化合物 2dから出発して化合物 3aと同様にして75％収率にて調製した。 1H NMR (DMSO-d6):δ 8.31 (d、J=9.0 Hz、1H)、8.28 (d、J=9.3 Hz、1H)、8.27 (d、J=9.0 Hz、1 H)、8.04 (d、J=9.0 Hz、1H)、7.99 (dd、J=9.3、1.8 Hz、1 H)、7.93 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.40-7.18 (m、9H)、7.07 (d、J=2.4 Hz、1H)、7.04 (s、1H)、6.85 (d、J=8.7 Hz、4H)、6.81 (dd、J=2.4、1.8 Hz、1H)、4.45-4.00 (m、12H)、3.72 (s、6H)、3.50-3.20 (m、10H)、3.15-2.85 (m、8H)、2.45 (t、J=7.5 Hz、2 H)、1.65-1.05 (m、23H)。
【００８２】
化合物 4aの合成:
【化１５】
2014522660.tif 000028
【００８３】
ジクロロメタン (20 ml)、メタノール (5 ml)、および水 (0.1 ml) の混合物に、化合物 3a (1.05 g、0.83 mmol)、次いで、トリフルオロ酢酸 (0.305 g、2.67 mmol)を添加した。反応を10分間進行させ、次いでトリエチルアミン (0.289 g、2.86 mmol)の添加によりクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン (100 ml) に溶解し、飽和 NaClで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた物質を3:2 アセトン /ジクロロメタンで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて化合物 4a (0.67 g、0.69 mmol、83％収率) を淡褐色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6): δ 8.36-8.23 (m、3 H)、8.05 (d、J=8.7 Hz、1 H)、7.99 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.93 (d、J=9.3 Hz、1 H)、7.08 (s、1H)、7.04 (s、1H)、6.87 (s、1H)、4.45-4.00 (m、12H)、3.70-3.50 (m、6H)、3.45-3.22 (m、10H)、2.47 (t、J=7.2 Hz、2 H)、1.65-1.55 (m、2H)、1.50-1.30 (m、7H)、1.09 (t、J=7.2 Hz、6H)。
【００８４】
化合物 4bの合成:
【化１６】
2014522660.tif 000029
【００８５】
化合物 4b を化合物 3bから出発して化合物 4aと同様にして82％収率にて調製した。1H NMR (DMSO-d6): δ 8.35-8.16 (m、3 H)、8.10-7.8 (m、4 H)、7.40 (d、J=8.1 Hz、1H)、7.35 (d、J=8.1 Hz、1H)、7.09-6.93 (m、3H)、6.77 (d、J=7.8 Hz、1H)、4.45-3.95 (m、14H)、3.65-2.90 (m、13H)、2.49-2.25 (m、5H)、2.05-1.95 (m、2 H)、1.70-1.55 (m、2H)、1.55-1.20 (m、7H)、1.20-1.00 (m、6H)。
【００８６】
化合物 4cの合成:
【化１７】
2014522660.tif 000030
【００８７】
化合物 4c を化合物 3cから出発して化合物 4aと同様にして100％収率にて調製した。1H NMR (DMSO-d6): δ 8.35-8.22 (m、3 H)、8.05 (d、J=9.0 Hz、1 H)、8.00 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.93 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.05 (d、J=10.5 Hz、1H)、7.00 (m、1H)、6.82 (d、J=10.5 Hz、1H)、4.45-4.00 (m、12H)、3.70-3.20 (m、22H)、3.05-2.95 (m、3H)、2.46 (t、J=7.5 Hz、2 H)、1.70-1.55 (m、2H)、1.55-1.20 (m、7H)、1.20-1.00 (m、9H)。
【００８８】
化合物 4dの合成:
【化１８】
2014522660.tif 000031
【００８９】
化合物 4d を化合物 3dから出発して化合物 4aと同様にして80％収率にて調製した。1H NMR (DMSO-d6): δ 8.36-8.20 (m、3 H)、8.04 (d、J=9.0 Hz、1 H)、8.00 (dd、J=8.8、2.1 Hz、1 H)、7.93 (d、J=9.0 Hz、1 H)、7.07 (d、J=3.3 Hz、1H)、7 .04 (s、1H)、6.81 (dd、J=2.1、2.4 Hz、1H)、4.45-4.05 (m、12H)、3.50-3.20 (m、10H)、3.15-2.85 (m、8H)、2.46 (t、J=7.2 Hz、2 H)、1.65-1.05 (m、23H.)。
【００９０】
化合物 5aの合成:
【化１９】
2014522660.tif 000032
【００９１】
ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド (0.100 g、0.58 mmol) および2-シアノエチル N,N,N’N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite) (0.274 g、0.91 mmol) をジクロロメタン (10 ml)中の化合物 4a (0.63 g、0.65 mmol) の溶液に添加した。結果として得られた混合物をアルゴン下で室温で1時間撹拌し、次いで飽和水性 NaHCO3で希釈した。有機相を飽和水性 NaClで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を最小量の酢酸エチルに溶解し、過剰のエーテルで希釈した。固体物質を濾過により収集し、エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させてホスホラミダイト(phosphoramidite) 5a (0.67 g、0.57 mmol、88％収率) を淡褐色固体として得た。31P NMR (CDCl3): δ 146.90。
【００９２】
化合物 5bの合成:
【化２０】
2014522660.tif 000033
【００９３】
ホスホラミダイト 5b を化合物 4bから出発して化合物 5aと同様にして91％収率にて調製した。31P NMR (CDCl3): δ 147.22。
【００９４】
化合物 5cの合成:
【化２１】
2014522660.tif 000034
【００９５】
ホスホラミダイト 5c を化合物 4cから出発して化合物 5aと同様にして68％収率にて調製した。31P NMR (CDCl3): δ147.23。
【００９６】
化合物  5dの合成:
【化２２】
2014522660.tif 000035
【００９７】
ホスホラミダイト 5d を化合物 4dから出発して化合物 5aと同様にして69％収率にて調製した。31P NMR (CDCl3): δ 147.23。
【００９８】
実施例 3
この実施例は副溝結合剤ホスホラミダイト12a、bの合成を示す。
【００９９】
化合物 8aの合成:
【化２３】
2014522660.tif 000036
【０１００】
無水メタノール (10 ml) 中の化合物 7a (PCT 国際出願(2011)、WO 2011123890 A1) (0.70 g、2.26 mmol) および6 (Hoechst 33258 Tethered by a Hexa(ethylene glycol) Linker) to the 5’-Termini of Oligodeoxynucleotide 15-Mers:  Duplex Stabilization and Fluorescence Properties. Sharanabasava B. Rajur, Jordi Robles, Kristin Wiederholt, Robert G. Kuimelis, and Larry W. McLaughlin. J. Org. Chem., 1997, 62 (3), pp 523-529.) (1.81 g、4.0 mmol) の溶液に、酢酸 (0.240 g、0.229 ml、4.0 mmol) を添加した。反応をアルゴン下で6時間還流させ、次いで減圧下で濃縮した。得られた残渣をジクロロメタン中2％ トリエチルアミン、5％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて生成物 8a (1.55 g、2.29 mmol、101％) を淡黄色固体として得た。生成物は、1H NMRによりわずかな不純物としていくらかのトリエチルアンモニウムアセタートを含有していた。1H NMR.(DMSO-d6): δ 13.08 (s,0.5H)、13.05 (s、0.5H)、12.70 (br s、0.5H)、12.62 (s、0.5H)、10.0 (br s)、8.36 (s、0.5H)、8.25 (s、0.5H)、8.16 (dd、2H)、8.03 (m、1H)、7.72 (d、0.5H)、7.61 (d、0.5H)、7.48-7.41 (m、1H)、7.14 (d、2H)、6.94 (d、2H)、4.61 (t、1H)、4.20 (m、2H)、3.78 (m、6H)、3.58 (m、4H)、3.52 (m、14H)、3.58 (m、3H)、3.10 (m、4H)。
【０１０１】
化合物 9aの合成:
【化２４】
2014522660.tif 000037
【０１０２】
無水ピリジン (20 ml)中の化合物 8a (1.50 g、2.20 mmol) の溶液に、ジメトキシトリチルクロライド (0.79 g、2.33 mmol)を添加した。2.5時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンに再溶解し、 10％ クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。溶媒蒸発の後に得られた残渣をジクロロメタン中の7％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて1.19 g (55％) の所望のDMT 誘導体 9aを淡黄色非晶質固体として得た。 1H NMR.(DMSO-d6): δ 12.95 (s、1H)、12.61 (br s、1H)、8.35 (s、0.5H)、8.23 (s、0.5H)、8.14 (d、2H)、8.00 (dd、1H)、7.72 (d、0.5H)、7.60 (d、0.5H)、7.39-7.35 (m、3H)、7.35-7.12 (m、10H)、6,94 (d、2H)、6.86 (d、4H)、4.18 (t、2H)、3.77 (m、6H)、3.72 (s、6H)、3.62-3.48 (m、19H)、3.11 (m、4H)、3.03 (t、2H)。
【０１０３】
化合物 9bの合成:
【化２５】
2014522660.tif 000038
【０１０４】
無水ピリジン (30 ml) 中の化合物 8b (Hoechst 33258 Tethered by a Hexa(ethylene glycol) Linker to the 5’-Termini of Oligodeoxynucleotide 15-Mers:  Duplex Stabilization and Fluorescence Properties. Sharanabasava B. Rajur, Jordi Robles, Kristin Wiederholt, Robert G. Kuimelis, and Larry W. McLaughlin. J. Org. Chem., 1997, 62 (3), pp 523-529.) (2.30 g、3.34 mmol) の懸濁液にジメトキシトリチルクロライド (1.188 g、3.506 mmol) を添加し、結果として得られた溶液を一晩撹拌した。さらなるジメトキシトリチルクロライド (0.3eq.) を添加して反応を完了させ、これを次いでトリエチルアミンで処理し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をジクロロメタン中の5％ トリエチルアミン、10％メタノールで溶出する(euting) シリカでのクロマトグラフィーにかけて粗生成物 2 を淡褐色非晶質固体として得、これは依然としていくらかのトリエチルアンモニウム塩を含有していた。塩を除去するために、粗生成物をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し(ゆっくりと相分離) 、無水 MgSO4で乾燥させた。乾燥剤をろ別し(filtered off)、ジクロロメタンおよびDMFで洗浄し、合わせた濾液を減圧下で濃縮し、油状残渣を得、これを次いでエーテル中で粉砕した。エーテルのデカンテーションおよび減圧下での乾燥により 3.21 g (97％) の化合物 9b を黄色固体として得た。 1H NMR.(DMSO-d6): δ 12.95 (s、1H)、12.6 (m、1H)、8.38 (d、0.5H)、8.25 (d、0.5H)、8.14 (d、2H)、8.00 (m、1H)、7.71 (d、0.5 H)、7.60 (d、0.5 H)、7.5-7.1 (m、12 H)、7.0-6.8 (m、6H)、4.18 (t、2H)、3.76 (m、2H)、3.72 (s、6H)、3.6-3.5 (m、19H)、3.12 (m、4H)、3.03 (t、2H)。
【０１０５】
化合物 10aの合成:
【化２６】
2014522660.tif 000039
【０１０６】
5 mlの無水 DMF中の化合物 9a (1.07 g、1.09 mmol)、4-N,N,-ジメチルアミノピリジン (0.053 g、0.44 mmol)およびトリエチルアミン (0.996 g、1.372 ml、9.85 mmol))の撹拌溶液に50℃で一部にて 1.064 g (6.56 mmol)の二炭酸ジエチルを添加した。二炭酸ジエチル (2.0 eq)およびトリエチルアミン ( 3.0 eq) のそれぞれさらに二部を0.5 時間間隔で添加して反応を完了させた。反応を濃縮し、ジクロロメタンで希釈し、10％ クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をジクロロメタン中の3％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて1.20 g (98％) の完全にブロックした中間体 10aを黄色粘稠油として得た。 1H NMR.(DMSO-d6): δ 8.31 (d、0.25H)、8.27 (d、0.25H)、8.06 (m、1H)、7.87 (s、0.25H)、7.84 (s、0.25H)、7.82-7.68 (m、3H)、7.65 (d、0.25H)、7.62 (d、0.25H)、7.51 (t、0.5H)、7.42-7.36 (m、2H)、7.35-7.10 (m、9H)、6.87 (d、4H)、4.37 (m、4H)、4.17 (t、2H)、3.80 (m、6H)、3.72 (s、6H)、3.6-3.5 (m、18H)、3.16 (m、4H)、3.04 (t、2H)、1.19 (m、6H)。
【０１０７】
化合物 10bの合成:
【化２７】
2014522660.tif 000040
【０１０８】
5 mlの無水 DMF中の化合物 9b (1.0 g、1.0 mmol)、4-N,N,-ジメチルアミノピリジン (0.049 g、0.44 mmol)およびトリエチルアミン (0.613 g、 6.05 mmol) の撹拌溶液に50℃で一部にて 0.654g (4.04 mmol)の二炭酸ジエチルを添加した。45分間撹拌した後、さらにそれぞれ三部の二炭酸ジエチル (1.0 eq) およびトリエチルアミン (2.0 eq)を0.5 時間間隔にて添加して反応を完了させた。反応を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、MgSO4で乾燥させた。溶媒の蒸発後に得られた粗生成物をジクロロメタン中の7％ 酢酸エチル、5％ トリエチルアミンで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけた。生成物は異性体の混合物であり、いくつかの画分にて溶出した。すべての生成物を含有する画分をプールし、濃縮して0.66 g (58％)の化合物 10bを淡黄色-緑色非晶質固体として得た。 1H NMR.(DMSO-d6): δ 8.27 (m、0.5H)、8.04 (m、1H)、7.80- (s、0.25H)、7.77 (s、0.25H)、7.76-7.68 (m、3H)、7.63 (d、0.5H)、7.60 (d、0.5H)、7.50 (m、1H)、7.42-7.36 (m、2H)、7.34-7.18 (m、7H)、7.15 (t、0.5H)、7.11 (t、0.5H)、7.08-7.01 (m、2H)、6.86 (d、4H)、4.37 (m、4H)、4.17 (t、2H)、3.76 (m、2H)、3.72 (s、6H)、3.60-3.50 (m、4H)、3.20 (m、4H)、3.04 (t、2H)、1.18 (m、6H)。
【０１０９】
化合物 11aの合成:
【化２８】
2014522660.tif 000041
【０１１０】
トリフルオロ酢酸 (0.232 ml、0.356 g、3.12 mmol) をジクロロメタン (12 ml)、メタノール (3 ml)、および水 (0.06 ml) の混合物中の化合物 10a (1.08 g、0.96 mmol) の溶液に添加した。反応を45分間進行させ次いでトリエチルアミン (0.463 ml、0.337 g、3.33 mmol) の添加によりクエンチした。ジクロロメタンを減圧下での蒸発により除去し、残渣を75 mlのジクロロメタンに再溶解した。飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、MgSO4で乾燥させた後、溶液を濃縮し、残渣をジクロロメタン中の8％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて化合物 11a を異性体の混合物(0.71 g、90％、淡黄色粘稠油) として得た。 1H NMR.(DMSO-d6)： δ 8.30 (d、0.25H)、8.27 (d、0.25H)、8.08-8.02 (m、1H)、7.87 (s、0.25H)、7.84 (s、0.25H)、7.82-6.68 (m、3H)、7.64 (d、0.25H)、7.63 (d、0.25H)、7.51 (t、0.5H)、7.27 (t、0.5H)、7.20-7.10 (m、1H)、7.10-7.00 (m、2H)、4.52 (m、1H)、4.36 (m、4H)、4.20 (m、2H)、3.78 (m、6H)、3.65-3.45 (m、18H)、3.38 (m、2H)、3.16 (m、4H)、1.19 (m、6H)。
【０１１１】
化合物 11bの合成：
【化２９】
2014522660.tif 000042
【０１１２】
トリフルオロ酢酸 (0.134 ml、0.205 g、1.80 mmol) をジクロロメタン (8 ml)、メタノール (2 ml)、および水 (0.04 ml) の混合物中の化合物 10b (0.63 g、0.56 mmol) の溶液に添加した。反応を45分間進行させ、次いでトリエチルアミン (0.267 ml、0.194 g、1.92 mmol) の添加によりクエンチした。ジクロロメタンを減圧下での蒸発により除去し、残渣を 50 mlのジクロロメタンに再溶解した。飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、MgSO4で乾燥させた後、溶液を濃縮し、残渣をジクロロメタン中の5％ トリエチルアミン、 2％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて化合物 11bを異性体の混合物(0.42 g、90％、淡黄色粘稠油) として得た。 1H NMR.(DMSO-d6)： δ 8.30 (d、0.25H)、8.27 (d、0.25H)、8.08-8.02 (m、1H)、7.86-7.65 (m、3.5H)、7.62 (d、0.25H)、7.60 (d、0.25H)、7.50 (t、0.5H)、7.25 (t、0.25H)、7.18-7.10 (m、1H)、7.10-7.04 (m、2H)、4,57 (t、1H)、4.36 (m、4H)、4.19 (m、2H)、3.79 (m、2H)、3.65-3.45 (m、18H)、3.45-3.30 (m、5H)、3.19 (m、4H)、1.19 (m、6H)。
【０１１３】
化合物 12aの合成：
【化３０】
2014522660.tif 000043
【０１１４】
無水ジクロロメタン (10 ml)中の化合物 11a (0.62 g、0.86 mmol)の溶液に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド (0.133 g、0.78 mmol)、次いで、2-シアノエチル N,N,N’N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite) (0.299 g、0.315 ml、0.99 mmol) を添加した。反応混合物をアルゴン下で室温で 2.5時間撹拌し、次いでジクロロメタンおよび飽和炭酸水素ナトリウムで希釈した。有機相を分離し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた物質をジクロロメタン中5％ 酢酸エチル、3％ トリエチルアミンで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけ、所望のホスホラミダイト 12a (0.67 g、76％) を黄色-緑色粘稠油として得た。 31P NMR.(CDCl3)： δ 148.4。
【０１１５】
化合物 12bの合成：
【化３１】
2014522660.tif 000044
【０１１６】
無水ジクロロメタン (10 ml)中の化合物 11b (0.40 g、0.48 mmol)の溶液に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド (0.074 g、0.43 mmol)、次いで、2-シアノエチルN,N,N’N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite) (0.261 g、0.275 ml、0.86 mmol) を添加した。反応混合物をアルゴン下で室温で 2.5時間撹拌し、次いでジクロロメタンおよび飽和炭酸水素ナトリウムで希釈した。有機相を分離し、MgSO4 で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた物質をジクロロメタン中20％ アセトン、5％ トリエチルアミンで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけ、所望のホスホラミダイト 12b (0.43 g、87％) を黄色-緑色粘稠油として得た。 31P NMR.(CDCl3)： δ 148.4。
【０１１７】
実施例 4
この実施例は、副溝結合剤 PFP エステル 18の合成を示す。
【０１１８】
化合物 13の合成：
【化３２】
2014522660.tif 000045
【０１１９】
DMF (70 ml) 溶液中のジアミン 7b (3.39 g、10.5 mmol)およびN-(4-ホルミル-2-ニトロフェニル)アセトアミド (2.19g、10.5 mmol) の溶液を1時間 90℃で撹拌した。DMF (5 ml)中の無水 FeCl3 (17 mg、0.11 mmol) の溶液を添加し、反応を23時間 90℃で撹拌しつつ、撹拌混合物にわたって連続して軽い気流を流した。反応混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリルで希釈し、粉砕し、0.5 時間還流させた。固体物質を濾過により収集し、アセトニトリル (3x20 ml) で洗浄し、減圧下で乾燥させて粗生成物 13 (3.93 g、C18 HPLCによる純度 77％) を濃褐色固体として得た。結果として得られた固体をもう一度アセトニトリル (150 ml)中で0.5 時間還流させ、濾過し、乾燥させ、 3.40 gのより純粋なもの (C18 HPLCにより81％) を濃褐色固体として得た。
【０１２０】
化合物 14の合成：
【化３３】
2014522660.tif 000046
【０１２１】
メタノール (83 mL)および水 (21 mL) の混合物中の、化合物 13 (3.30 g、6.46 mmol) および水酸化ナトリウム (0.323 g、8.08 mmol)の懸濁液を70℃で 4時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して固体とし、これをアセトニトリルとの共-蒸発により乾燥させ、次いでジクロロメタン中5％ トリエチルアミン、20％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて、2.15 g (71％)の化合物  14 を橙色固体として得た。 1H NMR (DMSO-d6)：δ 13.1 (br s,1H),12.58 (br s、1H)、8.87 (s、1H)、8.27 (m、2H)、8.00 (m、1H)、7.86 (s、2H)、7.8-7.5 (m、1H)、7.5-7.3 (m、1H)、7.2-7.0 (m、2H)、6.92 (m、2H)、3.12 (br s、4H)、2.24 (s、3H)。
【０１２２】
化合物 15の合成：
【化３４】
2014522660.tif 000047
【０１２３】
化合物 14 (0.20 g、0.43 mmol) を10％ Pd/C (0.050 g) の存在下でメタノール (50 ml)中で50 psiにて一晩水素化した。触媒をガラス繊維フィルターを通してろ別し、メタノールで洗浄し、減圧下で濃縮して0.180 g ( 96％)の所望の ジアミン 15 を淡褐色固体として得た。 1H NMR (DMSO-d6)：δ 12.55 (br s、1H)、8.24 (br s、0.5H)、8.13 (br s、0.5H)、7.92 (m、1H)、7.6-7.0 (m、4H)、6.91 (br s、2H)、6.60 (d、1H)、3.12 (br s、4H)、2.42 (s、3H)。
【０１２４】
化合物 16の合成：
【化３５】
2014522660.tif 000048
【０１２５】
DMF (3 mL)中のジアミン 15 (0.168 g、0.383 mmol)およびメチル 4-ホルミルベンゾエート(benzoate)(0.063g、0.383 mmol)の溶液を1時間 +90℃で撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン (3 ml) に溶解し、3つ口フラスコに移した。DMF (0.1 ml)中の無水 FeCl3 (1 mg、0.004 mmol) の溶液を添加し、結果として得られた混合物を撹拌混合物にわたって軽い気流を連続して流しながら20時間 90℃で加熱した。反応を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をアセトニトリルで希釈し、10分間超音波処理することにより、固体が生成し、これを濾過により収集し、アセトニトリル (3x5 ml) で洗浄した。減圧下での乾燥により、 0.190 g (85％)のトリ-ベンズイミダゾール 16 を濃褐色固体として得た。 1H NMR (DMSO-d6)：δ 13.44 (br s、1H)、13.2-13.0 (br d、1H)、13.61 (m、1H)、8.8-7.0 (m、12 H)、6.93 (br s、1H)、3.89 (s、3H)、3.14 (br s、4H)、2.56 (s、3H)。
【０１２６】
化合物 17の合成：
【化３６】
2014522660.tif 000049
【０１２７】
メタノール (4 mL) および水 (1 mL) の混合物中の化合物 16 (0.160 g、0.28 mmol) および水酸化ナトリウム (0.014 g、0.343 mmol)の懸濁液を70℃で4.5時間撹拌した。反応を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して固体物質を得、これをアセトニトリルとの共-蒸発により乾燥させ、次いでエタノール中の5％ トリエチルアミン、5％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する画分の濃縮および減圧下での乾燥により、0.074 g (47％) の所望の酸 17を黄色固体として得た。 1H NMR (DMSO -d6)：δ 13.40 (br s、1H)、13.2 -13.0 (br d、1H)、12.61 (m、1H)、8.6-7.0 (m、12 H)、6.93 (d、2H)、3.17 (br s、4H)、2.36 (br s、3H)。
【０１２８】
化合物 18の合成：
【化３７】
2014522660.tif 000050
【０１２９】
DMF (2 ml)中の化合物 17 (0.065 g、0.11 mmol)およびトリエチルアミン (0.0.035 g、0.048 ml、0.34 mmol) の溶液に、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセタート (0.048 g、0.029 ml、0.17 mmol) を添加した。30分間撹拌した後、反応を 1時間間隔でさらに二部のトリエチルアミンおよびペンタフルオロフェニルトリフルオロアセタート (各1 eq.) で処理し、次いでDMFを減圧下で除去し、残渣をエーテル中で粉砕した。結果として得られた固体を濾過により収集し、エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させて0.10 g (120％)を黄色固体として得た。この物質はいくらかの塩を含有していたが、その他の点ではアミンを含有する基質との引き続く反応のために好適であった。
【０１３０】
実施例 5
この実施例は、副溝結合剤ホスホラミダイト 25の合成を示す。
【０１３１】
化合物 20の合成：
【化３８】
2014522660.tif 000051
【０１３２】
塩化水素ガスで、エーテル (100 ml)中の化合物 19 (Fixed or Invertible Calixarene-Based Directional Shuttles. Teresa Pierro, Carmine Gaeta, Carmen Talotta, Agostino Casapullo, and Placido Neri Org. Lett. 2011, 13(10), 2650-2653.)(3.0 g、13.68 mmol)およびメタノール (1.32 g、41 mmol) の冷 (氷/水浴)溶液にゆっくりと3 時間気泡させた。第二の部分のメタノール (6 eq) を添加し、結果として得られた溶液を4℃で2日間維持した。アルゴンで溶液に気泡させて過剰の塩化水素を除去し、沈殿した固体を濾過により収集した。エーテル (2x15 ml)での洗浄および減圧下での乾燥により、2.86 g (73％) の化合物 20 を白色固体として得た。1H NMR (DMSO -d6)：δ 8.12 (d、2H)、7.16 (d、2H)、4.37 (br s、2H)、4.26 (s、3H)、4.10 (t、2H)、3.85 (t、2H)、1.73 (m、2H)、1.40 (m、6H)。
【０１３３】
化合物 21の合成：
【化３９】
2014522660.tif 000052
【０１３４】
無水メタノール (20 ml)中の化合物 20 (1.951 g、6.78 mmol)の溶液に、1.68 g (3.83 mmol)の化合物 15、次いで、酢酸 (0.407 g、0.388 ml、6.78 mmol) を添加した。結果として得られた溶液を70℃で8時間、次いで一晩室温でアルゴン下で撹拌しながら還流させ、減圧下で濃縮した。得られた固体を水性トリエチルアミンで粉砕し、濾過により収集し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させた。さらなるエーテルでの洗浄および減圧下での乾燥により、2.41 g (98％) の化合物 21 を褐色固体として得た。
【０１３５】
化合物 22の合成：
【化４０】
2014522660.tif 000053
【０１３６】
ジメトキシトリチルクロライド (1.333 g、3.933 mmol) を、トリエチルアミン(ammine) (1.5 ml)、無水 DMF (20 ml) および無水ピリジン (30 ml) の混合物中の化合物 21 (2.40 g、3.745 mmol) の溶液に添加した。1時間撹拌した後、さらに一部のジメトキシトリチルクロライド (3.7 mmol)、次いでさらに三部を3日間かけて添加して、トリチル化を完了させた。反応を濃縮し、ジクロロメタンで希釈し、10％ クエン酸、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム (ゆっくりとした相分離) で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。乾燥剤をろ別し、ジクロロメタンで洗浄した。濾液の濃縮およびメタノール中での粉砕により、固体が生成し、これを次いで濾過により収集し、メタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させて2.61 g (74％) の化合物 22を緑色がかった-褐色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6)：δ 13.03 (br s、1H)、8.45-8.30 (m、2H)、8.20-8.00 (m、4H)、7.72 (m、2H)、7.60-6.90 (m、13H)、6.87 (m、4H)、4.06 (t、2H)、3.72 (s、6H)、3.65-2.50 (m、10H)、1.73 (m、2H)、1.58 (m、2H)、1.40 (m、2H)。
【０１３７】
化合物 23の合成：
【化４１】
2014522660.tif 000054
【０１３８】
5 mlの無水 DMF中の化合物 22 (1.0 g、1.06 mmol)、4-N,N,-ジメチルアミノピリジン (0.052 g、0.424 mmol)およびトリエチルアミン (0.644 g、 6.36 mmol))の撹拌溶液に 50℃で一部にて 0.688g (4.24 mmol) の二炭酸ジエチルを添加した。10分間撹拌した後、さらにそれぞれ12部の二炭酸ジエチル (2.0 eq)およびトリエチルアミン (3.0 eq)を0.5 時間間隔にて添加して反応を完了させた。反応を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、MgSO4で乾燥させた。溶媒の蒸発後に得られた粗生成物をジクロロメタン中10％ 酢酸エチル、5％ トリエチルアミンで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけた。生成物は異性体の混合物であり、いくつかの画分にて溶出した。すべての生成物を含有する画分をプールして濃縮し、0.65 g (53％) の化合物 23 を褐色半-固体として得た。 1H NMR (DMSO-d6)：δ 8.4 -8.3 (m、1H)、8.2-8.05 (m、2H)、7.90-7.68 (m、5H)、7.65-7.45 (m、1H)、7.40-7.10 (m、11H)、7.02 (d、2H)、6.88 (d、4H)、4.38 (m、6H)、4.03 (t、2H)、3.72 (s、6H)、3.20 (m、4H)、2.97 (t、2H)、2.51 (m、4H)、2.26 (s、3H)、1.75 (m、2H)、1.58 (m、2H)、1.39 (m、4H)、1.20 (m、9H)。
【０１３９】
化合物 24の合成：
【化４２】
2014522660.tif 000055
【０１４０】
トリフルオロ酢酸 (0.187 ml、0.127 g、1.70 mmol) をジクロロメタン (4 ml)、メタノール (1 ml)、および水 (0.02 ml) の混合物中の化合物 10b (0.61 g、0.53 mmol)の溶液に添加した。反応を1時間進行させ、次いでトリエチルアミン (0.506 ml、0.368 g、3.64 mmol)の添加によりクエンチした。ジクロロメタンを減圧下での蒸発により除去し、残渣をジクロロメタン中の5％ トリエチルアミン、 2％ メタノールで溶出するシリカでのクロマトグラフィーにかけて粗化合物 24 を異性体の混合物 (0.408 g、 淡黄色固体) として得た。いくらかの残余のトリエチルアンモニウム塩を除去するために、固体をジクロロメタン (50 ml)に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、0.340 g、(75％)の化合物 24を淡黄色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6)：δ 8.4-8.3 (m、1H)、8.2-8.05 (m、2H)、7.9-7.6 (m、6H)、7.51 (m、1H)、7.26-7.10 (m、2H)、7.04 (dd、2H)、4.36 (m、7H)、4.07 (t、2H)、3.42 (m、2H)、3.20 (m、4H)、2.50 (m、4H)、2.42 (s、3H)、1.76 (m、2H)、1.42 (m、6H)、1.21 (m、9H)。
【０１４１】
化合物 25の合成
【化４３】
2014522660.tif 000056
【０１４２】
乾燥ジクロロメタン (6 ml)中の化合物 24 (0.30 g、0.35 mmol) の溶液にジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド (0.30 g、0.35 mmol)、次いで、2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(phosphordiamidite) (0.116 g、0.122 ml、0.39 mmol) を添加した。2.5時間撹拌した後、反応をさらに一部のホスホラミダイト試薬 (0.2 eq、21 mg、0.07 mmol) で処理し、1時間撹拌し、ジクロロメタンおよび飽和水性 NaHCO3で希釈した。有機相を分離し、Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた残渣をエーテル/ペンタンの1：1混合物ですすぎ、乾燥アセトニトリルとの共-蒸発により2回乾燥させ、所望のホスホラミダイト 25 (0.320 g、0.30 mmol、85％)を黄緑色がかった半-固体として得た。 31P NMR (CDCl3)： δ 147.3。
【０１４３】
実施例 6
MGB ホスホラミダイトを用いるオリゴヌクレオチド合成。MGB ホスホラミダイト結合(coupling)効率および構造確認。
【０１４４】
試験オクタチミジレート(octathymidylate)を、チミジン-5’- または3’-ホスホラミダイトおよびDMT-O-ヘキシルスクシネート(succinate)固体支持体を用いてABI 3900 DNA 合成機にて合成した。活性化剤としてエチルチオテトラゾールを用いる標準的結合 (coupling)サイクルをすべての組み込みのために使用し、一方すべてのMGB 結合は2回繰り返した。一つを除くすべてのMGB ホスホラミダイトはアセトニトリル中の溶液として使用した。アセトニトリル中にて難溶性(sparingly soluble )でしかないホスホラミダイト 25は、アセトニトリルおよびジクロロメタンの3：1 (体積)混合物中の溶液として使用した。すべてのMGB-修飾オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、 25％/EtOH/濃NH4OH 混合物中で70℃で2時間脱保護した。粗反応混合物をSpeedVac エバポレーターで濃縮し、質量分析により分析して分子量を確認し、粗 MGB-オリゴヌクレオチド接合体の純度を決定した。MGB 結合効率は粗接合体の純度以上であると考えられた。
【０１４５】
【表１３】
2014522660.tif 000057
【０１４６】
参考文献
【０１４７】
米国特許文献
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米国特許公開第2011/0172289号
【０１４８】
国際特許文献
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国際特許公開第WO 20070/16455号
カナダ特許第261104号
【０１４９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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