(57)【要約】  本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列を有するhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、かつ、配列番号2のヌクレオチド配列を有するサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構成された転写単位に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の調節エレメント：
- 配列番号1のヌクレオチド配列を有し、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、転写活性特性を本質的に有するヌクレオチド酸を有するhCMVieウイルスエンハンサー、および
- 配列番号2のヌクレオチド配列を有し、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、転写プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸を有するサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域
を含むポリヌクレオチドにより構成される転写単位。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、前記プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、以下の：
- 配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、
- 配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
から選択される少なくとも1つの5′非翻訳領域（5′UTR）を含み、
前記配列番号3、4、5と少なくとも70%の配列同一性を有する前記ヌクレオチド酸が、mRNA安定化および翻訳促進の特性を本質的に有する、請求項１に記載の転写単位。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、前記プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置するイントロンをさらに含み、前記イントロンは、以下の：
- 配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSAイントロン、または、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neoイントロン、および、配列番号13の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSAイントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
から選択される、請求項１に記載の転写単位。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがイントロンをさらに含み、前記イントロンは、以下の：
- 配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
- 配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neoイントロン、または、配列番号13の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチンイントロン、または、配列番号53の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
- 配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSAイントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
から選択され、前記イントロンは、前記5′UTR領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する、請求項２に記載の転写単位。
【請求項５】
プロモータ領域が、- CDK9のプロモータ領域であり、5′UTR領域がeIF4GI遺伝子の5′UTR領域であり、かつ、イントロンがEF1α遺伝子のイントロンであり、配列番号33のヌクレオチド配列を有する転写単位、または、
- 配列番号33の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、CDK9のプロモータ領域と連結したCMVエンハンサーの組合せにより得られる量より多い目的タンパク質の大量生産が可能なヌクレオチド酸
である、請求項４に記載の転写単位。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に定義された少なくとも1つの転写単位、および、目的タンパク質をコードするヌクレオチド酸の組込みを可能にする少なくとも1つのクローニングサイトを含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に定義された少なくとも1つの転写単位、および、目的タンパク質をコードするヌクレオチド酸の組込みを可能にする部位特異的組換えを可能にする少なくとも1つの部位を含む、発現ベクター。
【請求項８】
真核生物耐性遺伝子、細菌抵抗性遺伝子、細菌性複製起点、専用の遺伝子増幅ユニットをさらに含む、請求項６または７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記目的タンパク質が、凝固に関与するタンパク質、または、免疫グロブリン、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、または、補体因子、および融合タンパク質により構成される群から選択される、請求項６または７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に定義された発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞がYB2/0細胞株である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞のトランスフェクションのための請求項６に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれか１項に定義された発現ベクター、および、ヌクレオチド酸でコードされた目的タンパク質の発現を可能にする請求項１０または１１に定義された宿主細胞を含む、発現システム。
【請求項１４】
ヌクレオチド酸でコードされた目的タンパク質を産生するための、請求項９に記載の宿主細胞における請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも1つの転写単位を含む発現ベクターの使用であって、前記目的タンパク質は、少なくとも1つのRSVプロモータ、pCI-neoイントロン、ポリアデニル化配列、真核生物耐性遺伝子、細菌抵抗性遺伝子、細菌性複製起点、専用の遺伝子増幅ユニットを含む基準の発現ベクターよりも高い力価で産生され、前記基準のベクターは同じヌクレオチド配列を含む、使用。
【請求項１５】
以下のステージ：
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも1つの転写単位、および、目的タンパク質をコードするcDNAを含む発現ベクターの宿主細胞への導入、
- 前ステージで取得した、前記目的タンパク質を安定に発現している宿主細胞の選択および同定、
- 前記目的タンパク質の抽出および精製
を含む、インビトロでの組換えタンパク質の産生方法。
【請求項１６】
前記目的タンパク質を安定に発現している取得した宿主細胞の選択および同定のステージをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現ベクターに使用可能な新規の転写単位に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、組換えタンパク質発現は、依然として、薬理学的な抗体などの治療タンパク質産生の主要な方法の1つである。
一般的に、組換えタンパク質をコードする核酸は、目的分子の転写および翻訳を可能にする遺伝因子を含む発現ベクターに導入される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的の1つは、特定の抗原ひいては所与の組換えタンパク質を標的とする抗体にも連結せず、培地にも連結しない、生産性向上可能な組換えタンパク質産生の転写単位の提供である。
【０００４】
本発明の目的の1つは、ラットYB2/0細胞株および関連株、または、CHO細胞株および関連株などの哺乳動物細胞における従来の発現ベクターと比較して、目的タンパク質に関してより良い転写および翻訳能の提供が可能な普遍的転写単位を提供することである。
【０００５】
本発明の他の目的の1つは、クローニングの問題の限定のために、発現株に対するトランスフェクションの有効性、または、目的の遺伝子が遺伝的不安定性および絶滅に成り得る発現ベクターとレシピエント株のゲノムとの間の干渉を利用し、発現ベクターサイズ限定を可能にする転写単位の提供である。
【０００６】
最後に、別の目的は、潜在的な健康上のリスクの限定のために、ウイルスプロモータが欠けている転写単位の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、発現ベクターを構築する転写単位に関する。
一般的な様態によると、本発明は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドにより構成される転写単位に関する: 
(i)-  配列番号１のヌクレオチド配列を有するhCMVieウイルスエンハンサー（E2）、または
-  配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を含有し、かつ、転写活性特性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
（ii）-  配列番号2のヌクレオチド配列を有するサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または
-  配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を含有し、かつ、転写プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ここで、本発明においての「調節エレメント」とは、目的タンパク質をコードする核酸の転写および/または翻訳の制御が可能な非コード化遺伝子エレメントという意味である。
【０００９】
ここで、「転写単位」とは、RNAへ目的の核酸が転写するのに必要な調節エレメントを含むポリヌクレオチドという意味である。該転写単位に連結した目的の遺伝子からmRNA合成可能なRNAポリメラーゼ、ならびに、プラスあるいはマイナス方向にmRNAへの転写を調節する転写活性または阻害因子は、かかる転写単位に結合される。
【００１０】
ここで、「プロモータ領域」とは、特に注目する遺伝子の転写開始が可能な特定のDNA配列を含むDNA領域という意味である。
本発明の意味において、用語「プロモータ領域」および「プロモータ」は互換する。
プロモータ領域は、RNA合成の開始前に、RNAポリメラーゼが最初に結合するDNAのゾーンを含む。
一般に、プロモータは、制御すべき目的の核酸に近くに（約20から100ヌクレオチド）、かつ、遺伝子転写開始点の上流に位置する。プロモータの存在は、特定の遺伝子の転写に不可欠である。
配列番号2で表されるCDK9のプロモータは、TATAボックスが欠けているGCリッチプロモータである。
【００１１】
本発明に従う転写単位に含まれる「配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸」は、配列番号2で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域のヌクレオチド酸と同じ遺伝子転写開始能力を本質的に有するヌクレオチド酸である。
遺伝子の転写を開始するCDK9遺伝子のプロモータ領域の能力は、Liuらによる方法（Gene 252, 51-59 (2000)）に従い測定できる。
【００１２】
ここで、「エンハンサー」とは、遺伝子の転写を刺激するために、転写因子などのタンパク質を結合するDNAセグメントという意味である。エンハンサーは必ずしも制御すべき目的の遺伝子に近接せず、かつ、5′または3′末端、あるいは、制御すべき遺伝子の中央、あるいは、イントロンに位置し得る。
発現ベクターにおけるエンハンサーの存在により、遺伝子の転写レベル向上が可能である。
【００１３】
「配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、転写活性特性を本質的に有するヌクレオチド酸」とは、配列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー（以後、E2 と呼ぶ）のヌクレオチド酸と遺伝子転写を刺激する同じ能力を本質的に有するヌクレオチド酸である。
遺伝子の転写活性特性は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を使用して測定できる。
いくつかのエンハンサーは、本発明に従い転写単位に共存し得る；このことにより、遺伝子転写刺激が更に可能となる。
【００１４】
結果として、本発明の転写単位は以下を含む：
-  配列番号1のヌクレオチド配列を有し、または、ヌクレオチド酸は配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するhCMVieウイルスエンハンサー（E2）、ならびに
-  SV40エンハンサーおよびEμエンハンサーから選択される少なくとも1つの他のエンハンサー。
【００１５】
上記および下記において、核酸における2つの配列の間の同一性割合を計算する式は、以下である: 
同一の残基数×100     
最も短い配列の残基数
【００１６】
本発明の特定の実施形態では、エンハンサーは、プロモータ領域の上流に位置する。言い換えると、発現ベクターにおけるコード配列のクローン作製を容易にするために、エンハンサーはプロモータ領域のDNAの5′末端に位置する。エンハンサーは、位置に依存しない(non-positional)遺伝子因子である。
【００１７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構築する：
(i)-  配列番号１のヌクレオチド配列を有するhCMVieウイルスエンハンサー（E2）、または
-  配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、転写活性特性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(ii)-  配列番号2のヌクレオチド配列を有するサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または
-  配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、ここで、エンハンサーは、プロモータ領域の上流に位置する。
【００１８】
また、本発明の転写単位は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置するヌクレオチド酸を含み、該ヌクレオチド酸は以下の：
(i)-  配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）（RU-5′）の調節R領域（U1）、または
-  配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
(ii)-  配列番号4のヌクレオチドの配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域（U2）、または
-  配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
(iii)-  配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域（U3）、または
-  配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
から選択される少なくとも1つの5′非翻訳領域（5′UTR）を含み、
配列番号3、配列番号4、または、配列番号5で表される配列の1つと少なくとも70%の配列同一性を有する上記のヌクレオチド酸は、本質的にmRNA安定化および翻訳促進の特性を有する。
【００１９】
mRNA安定化および翻訳促進の特性は、Fritzら（Sci. STKE, 5 December 2000Vol. 2000, Issue 61, p. pl1)およびRossら(Microbiol Rev. 1995 Sep; 59(3):423-50）により測定可能である。
翻訳の促進は、タンパク質レベルの上昇を示す一方で、q-RT-PCR分析で一定であるmRNA量の比較により実施し得る。
【００２０】
遺伝子における5′非翻訳領域は、翻訳開始部位の上流に位置するメッセンジャーRNA （mRNA）部分に対応する。この領域は、リボゾーム結合を可能にするものであり、かつ、当該遺伝子の発現調節に関係し得る。
翻訳開始部位は、タンパク質の翻訳開始を誘導するヌクレオチドのトリプレットである。このトリプレットはしばしばトリプレットATGである。
【００２１】
本発明の転写単位に含まれる「配列番号3、配列番号4、または、配列番号5で表される配列の1つと少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸」は、リボゾーム結合およびmRNA安定化を可能にする。
【００２２】
プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する上記のヌクレオチド酸は、以下から選択される1つの5′UTR領域を含み得る：
(i)-  配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域（U1）、または
-  配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
(ii)-  配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域（U2）、または
-  配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
(iii)-  配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域（U3）、または
-  配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００２３】
「プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する」5′UTR領域とは、プロモータ領域のDNAの3′末端の後および翻訳開始部位のDNAの5′末端の前に位置する5′UTR領域という意味である。
【００２４】
プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する上記のヌクレオチド酸は、2つの5′UTR領域を含む。
転写単位における2つ以上の5′領域の存在により、mRNAの安定性および翻訳効率に対するプラスの効果の蓄積またはシナジーが可能になる。
【００２５】
配列番号6により表されるヌクレオチド酸、または、配列番号6と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸であり、本発明の転写単位に使用して上記のヌクレオチド酸は、HTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域およびNF‐κB抑制因子（NRF）遺伝子の5′UTR領域を含み得る。
【００２６】
また、配列番号7により表されるヌクレオチド酸、または、配列番号7と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸であり、本発明の転写単位に使用して上記のヌクレオチド酸は、HTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域および真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域を含み得る。
【００２７】
また、配列番号8により表されるヌクレオチド酸、または、配列番号8と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸であり、本発明の転写単位に使用して上記のヌクレオチド酸は、NF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域および真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域を含み得る。
【００２８】
また、配列番号9により表されるヌクレオチド酸、または、配列番号9と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸であり、上記のプロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置するヌクレオチド酸は、以下から選択される3つの5′UTR領域、つまり、HTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、NF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および、真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域を含み得る。
【００２９】
本発明の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列で表されるHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構成され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００３０】
組合せたエレメントの利点は、5′UTR領域と転写単位における他のエレメントとの間の潜在的なシナジーにより与えられる。
【００３１】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号14により表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号3で表されるHTLV-1ウイルスのLTRの5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号14と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００３２】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列で表されるNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構成され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００３３】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号15により表され、かつ、以下の：
(i)列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号4により表されるNRF遺伝子の5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号15と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００３４】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列で表される真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構成され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００３５】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号16により表され、かつ、以下の：
(i)列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号5により表されるeIF4GI遺伝子の5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチド構築されるか、
または、配列番号16と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００３６】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、2つの5′UTR領域を含む。かかる転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列で表されるHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号4のヌクレオチド配列で表されるNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構築され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００３７】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号17により表され、かつ、以下の：
(i)列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号6で表される5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号17と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００３８】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、2つの5′UTR領域を含む。かかる転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構築され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００３９】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号18により表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号7で表される5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号18と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００４０】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、2つの5′UTR領域を含む。かかる転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
(iv)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構築され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００４１】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号19により表され、かつ、以下の：
(i)列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号8で表される5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号19と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００４２】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の転写単位は、3つの5′UTR領域を含む。かかる転写単位は、以下の調節エレメント：
(i)配列番号1のヌクレオチドにより表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
(iv)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
（v）配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸
を含むポリヌクレオチドで構築され、
上記の5′UTR領域は、プロモータ領域の下流および翻訳開始部位の上流に位置する。
【００４３】
より特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号20により表され、かつ、以下の：
(i)列番号1で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2により表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号9で表される5′UTR領域
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号20と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００４４】
また、本発明の転写単位は、プロモータ領域の下流に位置する1つ以上のイントロンを含み得る。
ここで、「イントロン」は、非コード部分という意味である。イントロンは、エキソンの間に位置する。転写後、メッセンジャーRNAを産出するために、この部分はプレメッセンジャーRNAから切り出される（イントロンのスプライシング）。異種イントロンの存在により、DNA構築物における外来性遺伝子の発現を最適化できる。実際、後者は、mRNAを安定化させるか、または、転写を増強する調節エレメントを含み得る。
【００４５】
本発明の転写単位の構成において、1つ以上のイントロンが、以下に位置し得る：
(i)5′UTR領域の下流および翻訳開始部位の上流、および/または
(ii)プロモータの下流および5′UTR領域の上流、および/または
(iii)翻訳開始部位の後、および、コード配列内、および/または
(iv)コード配列の終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間。
イントロンが翻訳開始部位の後で、かつ、コード配列内に位置している場合、翻訳中にmRNAリーディングフレームを変えず、かつ、スプライセオソームによるスプライスを可能にするドナーおよびアクセプター部位ならびに分枝部位配列（UAUAAC）の保存が重要である。
【００４６】
ここで、「該プロモータ領域の下流に位置するイントロン」とは、プロモータ領域のDNAの3′領域側に位置するイントロンという意味である。
【００４７】
該イントロンは、下記から選択され得る：
-  配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号71などの配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSAイントロン、または、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′-長末端反復（5′-LTR）イントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００４８】
本発明において、配列番号10で表されるヌクレオチド酸は、「EF1α」または「EFss」で示す。
本発明において、配列番号71で表されるヌクレオチド酸は、「エキソンが付いたEF1α」または「EF」で示す。このヌクレオチド酸は、配列番号10のEF1αイントロン、および、5′領域でのエキソン配列を含む。
【００４９】
本発明の転写単位は、以下を含む：
(i)配列番号1のヌクレオチ配列ドにより表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列を有するプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸を有するサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、および
(iii)  以下から選択されるイントロン：
-  配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSA、または、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
【００５０】
該エンハンサーは、転写単位の5′または3′末端、あるいは、イントロンのコード配列内に位置する；
該イントロンは、以下に位置する：
(i)5′UTR領域の下流および翻訳開始部位の上流、または
(ii)プロモータの下流および5′UTR領域の上流、または
(iii)翻訳開始部位の後、および、コード配列内、または
(iv)コード配列の終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間。
【００５１】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)ヌクレオチド配列番2により表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００５２】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号21で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号10のヌクレオチド配列で表されるEF１α遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号21の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００５３】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSA、または、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００５４】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号22で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSAイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号22の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００５５】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００５６】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号23で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００５７】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neoイントロン、または、配列番号13の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００５８】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号24で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号13のヌクレオチド配列表されるpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号24と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００５９】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号55の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００６０】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号55で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号53のヌクレオチド配列で表されるユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号55と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００６１】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、および
(iii)配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSAイントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００６２】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号56で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるCDK9遺伝子のプロモータ領域、および
(iii)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるヒトROSAイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号56と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００６３】
本発明の転写単位は、以下を含む：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列を有するプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸を有するサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または
(iii)以下から選択される少なくとも1つの5′非翻訳領域（5′UTR）：
-  配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、
-  配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)以下から選択される少なくとも1つのイントロン：
-  配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSA、または、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
-  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、
該エンハンサーは、転写単位の5′または3′末端、プロモータと5′UTR領域の間、または、イントロンに位置する；
該プロモータ領域は5′UTR領域の上流に位置して；
該イントロンは、以下に位置する：
(i)5′UTR領域の下流および翻訳開始部位の上流、および/または
(ii)プロモータの下流および5′UTR領域の上流、および/または
(iii)翻訳開始部位の後、および、コード配列内、および/または
(iv)コード配列の終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間。
【００６４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００６５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号25で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスのLTRのR領域、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号25と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００６６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSAイントロン、または、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００６７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号26で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスのLTRのR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列を有するマウスROSAイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号26の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配により表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００６９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号27で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスのLTRのR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号27と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００７０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００７１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号28で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスのLTRのR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号28と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００７２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００７３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号57で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスのLTRのR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号57と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００７４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1の長末端反復（LTR）のR領域、または、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるROSA遺伝子イントロン、および、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００７５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号64で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号3のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスのLTRのR領域、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるヒトROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号64の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００７６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００７７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号29で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号29と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００７８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００７９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号30で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号30の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００８０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００８１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号31で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTR遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号31の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００８２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００８３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号32で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号32と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００８４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii）配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００８５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号58で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号58と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００８６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、または、配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を含有るヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるヒトROSA遺伝子イントロン、および、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００８７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号65で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号4のヌクレオチド配列を有するNF‐κB抑制因子（NRF）の5′UTR領域、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるヒトROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号65の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００８８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iv)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００８９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号33で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域（U3）、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号33と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００９０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００９１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号34で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号34の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００９２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００９３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号35で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号35と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００９４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００９５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号36で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号36と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００９６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００９７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号59で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号59と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【００９８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、または、配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるヒトROSA遺伝子イントロン、および、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【００９９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号66で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号5のヌクレオチド配列を有する真核生物開始因子4GI（eIF4e）遺伝子の5′UTR領域、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列で表されるヒトROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号66の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１００】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号6で表される5′UTR領域、または、
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１０１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号37で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号37と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１０２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号6の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１０３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号38で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号38の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号6の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１０５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号39で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号39と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号6の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１０７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号40で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号40と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号6の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１０９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号60で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号60と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号6の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１１１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号67で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号6のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号67の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号7の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１１３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号41で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号41と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１１４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号7の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１１５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号42で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号42の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１１６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号7の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１１７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号43で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号43と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号7の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１１９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号44で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号44と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号7の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１２１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号61で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号61と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１２２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号7の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１２３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号68で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号7のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロンで構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号68の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１２４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号8の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１２５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号45で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号45と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１２６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号8の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１２７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号46で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号46の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１２８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号8の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１２９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号47で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号47と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号8の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１３１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号48で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号48と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１３２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号8の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１３３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号62で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号62と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１３４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号8の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１３５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号69で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号8のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロンで構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号69の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号9の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン、または、配列番号10と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１３７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号49で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号10のヌクレオチド配列を有する伸長因子１α（EF１α）遺伝子のイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号49と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１３８】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号9の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン、および、配列番号11の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１３９】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号50で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号11のヌクレオチド配列で表されるマウスROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号50の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号9の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン、または、配列番号12と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１４１】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号51で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号12のヌクレオチド配列を有するHTLV-1ウイルスの5′LTRイントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号51と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１４２】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号9の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン、または、配列番号13と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１４３】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号52で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号13のヌクレオチド配列を有するpCI-neo-キメライントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号52と少なくとも70%に配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１４４】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号9の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン、または、配列番号53と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１４５】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号63で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)配列番号53のヌクレオチド配列を有するユビキチン遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号63と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１４６】
本発明の特定の実施形態は、以下の調節エレメントを含むポリヌクレオチドで構成される転写単位に関する：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、または、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、本質的に転写活性特性を有するヌクレオチド酸、および
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、または、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、プロモータ活性を本質的に有するヌクレオチド酸、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、または、配列番号9の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン、または、配列番号54の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸。
【０１４７】
本発明のより特定の実施形態では、本発明の転写単位は、配列番号70で表され、かつ、以下の：
(i)配列番号1のヌクレオチド配列で表されるhCMVieウイルスエンハンサー、
(ii)配列番号2のヌクレオチド配列で表されるサイクリン依存性キナーゼ9（CDK9）のプロモータ領域、
(iii)配列番号9のヌクレオチド配列で表される5′UTR領域、および
(iv)  配列番号54のヌクレオチド配列を有するヒトROSA遺伝子イントロン
で構成されるヌクレオチド酸を含むポリヌクレオチドで構築されるか、
または、配列番号70の配列と少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド酸で構築される。
【０１４８】
有利な実施形態では、本発明は、プロモータ領域がCDK9のプロモータ領域であり、5′UTR領域がeIF4GI遺伝子の5′UTR領域であり、かつ、イントロンがEF1α遺伝子のイントロンである、配列番号33のヌクレオチド配列を有する転写単位に関するか、または、配列番号33の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ、CDK9のプロモータ領域と結合したCMVエンハンサーの組合せにより得られる量より多い目的タンパク質の大量生産ができるヌクレオチド配列に関する。
ここで「大量生産」とは、タンパク質力価または目的タンパク質の濃度とも呼ばれる、容積単位当り重量（g/L）で表さるタンパク質の量という意味である。
【０１４９】
さらに、本発明は、上記に定義した少なくとも1つの転写単位、および、目的タンパク質をコードする核酸の組込みを可能にする少なくとも1つのクローニングサイトを含む発現ベクターに関する。
該核酸は、ゲノムDNA、相補的DNA、合成核酸、キメラ核酸であり得る。
「クローニングサイト」とは、それぞれ、1つ以上の制限酵素により認識され、かつ、目標のヌクレオチド配列の挿入を可能にする1つ以上の制限部位を含むDNAの短セグメントという意味である。
【０１５０】
さらに、本発明は、上記に定義した少なくとも1つの転写単位、および、目的タンパク質をコードするヌクレオチド酸の組込みを可能にする部位特異的組換えに関わる少なくとも1つの部位に関する。
該ヌクレオチド酸は、ゲノムDNAまたは相補的DNA（cDNA）であり得る。
ここで「部位特異的組換えに関わる部位」とは、Creリコンビナーゼにより認識されるloxP部位、インテグラーゼIntにより認識されるxis部位、FLPリコンビナーゼにより認識されるFRT部位などのリコンビナーゼにより認識されるDNAの短セグメントという意味である。
【０１５１】
さらに、本発明の発現ベクターは、真核生物耐性遺伝子、細菌抵抗性遺伝子、細菌性複製起点、専用の遺伝子増幅ユニットを含み得る。
【０１５２】
真核生物耐性遺伝子は、ジェネティシン（G418）、ブラストサイジン、 ゼオシン抵抗性遺伝子であり得る。
細菌抵抗性遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン 、ブラストサイジン、 ゼオシン抵抗性遺伝子であり得る。
【０１５３】
細菌性複製起点（Ori）は、発現ベクターなどの遺伝物質の複製の開始を可能にするバクテリア起源の特別なDNA配列であり、この起点により、細菌中の細菌当たりのベクターコピー数の測定ができる。かかる複製起点は、Ori-P、Ori-C、Ori-f1、ColE1、pSC101 Ori、p15A Ori、pACYC Ori、SV40 Ori、pMB1 Ori、pUC oriから選択され得る。
【０１５４】
ここで「専用の遺伝子増幅ユニット」とは、遺伝子増幅および/または高生産性細胞を用いた有意な強化を実施できるユニットという意味である。多くの場合では、このユニットにより、用量依存的に作用する阻害剤抵抗性遺伝子の発現が可能になり；特に、遺伝子増幅または強力な発現部位への組込みの後で、阻害剤の投与量を増大することで、より強く抵抗性遺伝子を発現する細胞変異体が選択される。また、多くの場合、このユニットに近い遺伝子は遺伝子的増幅され、および/または、増大した発現を有する。かかるユニットは、メソトレキセート（MTX）抵抗性形質転換体の選択に基づく遺伝子フラグメントの増幅システムで、阻害剤がメソトレキセートであるdhfr（ジヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、または、阻害剤がメチオニル スルホキシミンであるグルタミンシンテターゼ遺伝子であり得る。このことで、酵素DHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）をコードする核酸を含む転写単位を、目的の組換え分子産生の発現ベクターへ事前導入することが必要となる（SHITARIら、1994）。
【０１５５】
本発明のベクターで産生される目的の組換えタンパク質は、一次配列が天然または修飾され、かつ、凝固カスケードに関与するタンパク質、または、免疫グロブリン、代謝酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、補体因子、融合タンパク質で構成される群から選択されたタンパク質である。
【０１５６】
本発明の目的は、本発明で説明した発現ベクターを含む宿主細胞の提供である。
該宿主細胞は、YB2/0細胞株（N°ATCC: CRL-1662）またはCHO細胞株などの哺乳動物細胞株であり得る。
【０１５７】
また、本発明は、宿主細胞のトランスフェクションのための上記の発現ベクターの使用に関する。
【０１５８】
本発明の別の目的は、ヌクレオチド酸でコードされた目的のタンパク質の発現を可能にする本発明の発現ベクターを含む発現系および上記の宿主細胞の提供である。
【０１５９】
さらに、本発明は、ヌクレオチド酸でコードされたタンパク質産生の上記の宿主細胞における本発明の少なくとも1つの転写単位を含む発現ベクターの使用に関するが、該タンパク質は少なくとも1つのRSVプロモータ、pCI-neoベクター由来のキメライントロン、ポリアデニル化配列、真核生物耐性遺伝子、細菌抵抗性遺伝子、細菌性複製起点、専用の遺伝子増幅ユニットを含み、基準の発現ベクターよりも高い力価で産生され、該基準ベクターは同じヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
また、本発明の主題は、以下のステージを含む、インビトロでの組換えタンパク質の産生方法である：
-  本発明の少なくとも1つの転写単位、および、ゲノム形態での、または、目的タンパク質をコードするcDNAの形態でのヌクレオチド配列を含む発現ベクターの宿主細胞内への導入、
-  前ステージで取得した、目的タンパク質を安定に発現する該宿主細胞の選択および同定、
-  目的タンパク質の抽出および精製。
【０１６１】
別の特定の実施形態では、本発明の産生方法は以下のステージを含む：
-  一過性トランスフェクションを行い、本発明の少なくとも1つの転写単位、および、ゲノム形態での、または、目的タンパク質をコードするcDNAの形態でのヌクレオチド配列を含む発現ベクターの宿主細胞内への導入、
-  目的タンパク質の抽出および精製。
【０１６２】
かかる組換えタンパク質は、凝固カスケードに関与するタンパク質、または、免疫グロブリン、代謝酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、補体因子、融合タンパク質であり得る。
【０１６３】
さらに、本発明の方法は、安定に目的タンパク質を発現させ、取得された宿主細胞の選択および同定のステージを含み得る。
【０１６４】
本発明は、以下の実施例によって例証される。本発明は、しかしながら、これらの図および実施例によって限定されるものでない。
図
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１はhCMVieエンハンサー（E2）、CDK9遺伝子のプロモータ領域、HTLV-1ウイルス（U1）のLTRのR領域、NRF遺伝子（U2）の5′UTR領域、eIF4G遺伝子（U3）の5′UTR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U1U2U3ベクターを図示する。
【図２】図2はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、NRF遺伝子の5′UTR領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U2U3ベクターを図示する。
【図３】図3はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、NRF遺伝子の5′UTR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U2ベクターを図示する。
【図４】図4はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、HTLV-1ウイルスのLTRのR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U1ベクターを図示する。
【図５】図5はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U3ベクターを図示する。
【図６】図6はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、HTLV-1ウイルスのLTRのR領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U1U3ベクターを図示する。
【図７】図7はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-EF1αベクターを図示する。
【図８】図8はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、HTLV-1ウイルスのLTRのR領域、NRF遺伝子の5′UTR領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-U1U2U3-EF1ベクターを図示する。
【図９】図9はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、HTLV-1ウイルスのLTRのR領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-U1U3-EF1αベクターを図示する。
【図１０】図10はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、NRF遺伝子の5′UTR領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-U2U3-EF1αベクターを図示する。
【図１１】図11はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、NRF遺伝子の5′UTR領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-U2-EF1αベクターを図示する。
【図１２Ａ】図12AはhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、HTLV-1ウイルスのLTRのR領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-U1-EF1αベクターを図示する。
【図１２Ｂ】図12BはhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、eIF4G遺伝子の5′UTR領域、EF1α遺伝子の第1イントロンを含む転写単位を含むE2-CDK9-U3-EF1αベクターを図示する。
【図１３】図13はhCMVieエンハンサー、CDK9遺伝子のプロモータ領域、EF1α遺伝子の第1イントロン、HTLV-1ウイルスのLTRのR領域、NRF遺伝子の5′UTR領域を含む転写単位を含むE2-CDK9-U1U2-EF1αベクターを図示する。
【図１４】図14はIgG1/K発現するCHK622-21バイシストロン性ベクターを図示する。目的の転写単位は、pCI-neo-キメライントロンと組合せてRSV LTRプロモータに依存する。
【図１５】図15は、抗-GGT抗体138H11Bの軽鎖および重鎖を含むHK622-21_138H11Bベクターを図示する。目的の転写単位は、pCI-neo-キメライントロンと組合せてRSV LTRプロモータに依存する。
【図１６】図16はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK622-21_138H11B_MB7ベクターを図示する。目的の転写単位は、pCI-neo-キメライントロンと組合せてRSV LTRプロモータに依存する。
【図１７】図17は、IgG1/K発現するE2-CDK9-U3-Genバイシストロン性ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2 およびeIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）に依存する。
【図１８】図18はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11Bを有する重鎖を含むE2-CDK9-U3-HK138H11B_MB7ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2 およびeIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）に依存する。
【図１９】図19はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1358-4ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、pCI-neo-キメライントロンに依存する。
【図２０】図20はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1358-5ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、EF1αイントロンに依存する。
【図２１】図21はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1358-8ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、mROSAイントロンに依存する。
【図２２】図22はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1358-11ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、5’LTRイントロンHTLV1に依存する。
【図２３】図23はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1358-10ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、エキソンを伴うイントロンpEFに依存する。
【図２４】図24はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1358-6ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、ヒトROSAイントロンに依存する。
【図２５】図25はシグナルペプチドMB7を有する軽鎖、および、抗-GGT抗体138H11BのシグナルペプチドMB7を有する重鎖を含むHK1248-9ベクターを図示する。目的の転写単位は、CDK9プロモータの（hCMVie）エンハンサーE2、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域（U3）、ユビキチン遺伝子イントロンイントロンに依存する。
【図２６】図26は基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、血清添加培地中の安定したプール内で、異なるイントロンを有するE2CDK9U3での抗-GGT抗体（138H11B）の生産性を図示する。「EF」は、配列番号71で表されるイントロンに対応する。「EFss」は、配列番号10で表されるイントロンに対応する。
【図２７】図27は基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、血清無添加培地中のプール内で、異なるイントロンを有するE2CDK9U3での抗-GGT抗体（3C23K）の生産性を図示する。「EF」は、配列番号71で表されるイントロンに対応する。「EFss」は、配列番号10で表されるイントロンに対応する。
【図２８】図28は、基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、E2CDK9U3およびEFssにおいての、3つの抗体、つまり、抗-GGT（138H11B）、抗-AMHRII（3C23K）、抗-CD20 (R603)の生産性を図示する。
【図２９】図29は、一過性トランスフェクションで評価されたCHO-S株への抗-Rh（D）T125抗体の遊離カッパ鎖の一過性トランスフェクションでの発現に関して、RSV LTRと組み合わせた異なるイントロンの効果比較を図示する。左から右へのドット列は、イントロン制御下での遊離カッパ鎖の発現レベルを表す：それぞれ、β-アクチン(Bact)、EF1α、mROSA、hROSA、5′-LTR HTLV1、ユビキチン (ubc) 、pCI neoである。基準ベクターはRSV_T125_K2である。Y軸は培地中の遊離カッパ鎖の濃度を表す。
【図３０】図30は、一過性トランスフェクションで評価されたCHO-S株での抗-Rh（D）T125抗体の遊離カッパ鎖の発現に関して、転写単位E2-CDK9-U3またはRSV LTRと組み合わせた異なるイントロンの効果比較を図示する。左から右へのドット列は、それぞれ、組み合わせの下での遊離カッパ鎖の発現レベルを表す：イントロンが無いE2-CDK9-U3、hROSAイントロンが有るE2-CDK9-U3、mROSAイントロンが有るE2-CDK9-U、EF1αイントロンが有るRSV LTR、mROSAイントロンが有るRSV LTR、EF1αイントロンが有るE2-CDK9-U3、hROSAイントロンが有るRSV LTR。基準ベクターは、RSV_T125_K2およびpRep4KT125である。Y軸は、培地中の遊離カッパ鎖の濃度を表す。E2 は、hCMVieエンハンサーを表す。U3 は、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域に対応する。
【図３１】図31は、ベクター関数（E2CDK9U3 / RSV LTR pCIneoイントロン）としてCHO-S株における抗-Rh（D）IgGを発現するトランスフェクタントの安定なプールでの発現比較、さらに詳細には、pCIneoイントロンを有する基準RSV LTR（HK463-18）と比較して、転写単位E2-CDK9-U3（HK E2 CDK9 U3）を含むベクターを有する全抗-Rh（D）抗体T125の安定したプールでの生産性を図示する。E2 は、hCMVieエンハンサーを表す。U3 は、eIF4G1遺伝子の5′UTR領域に対応する。
【図３２】図32は、ベクター関数（E2CDK9U3 / RSV LTR pCIneoイントロン）としてCHO-S株における抗-Rh（D）IgGを発現するトランスフェクタントの系統図を示す。この図は、pCIneoを有する基準RSV LTRイントロン（HK463-18）と比較して、転写単位E2-CDK9-U3（HK E2 CDK9 U3）を含むベクターを有する全抗-Rh（D）抗体T125産生のクローン生産性を示す。
【図３３】図33はE2-CDK9-U1、E2-CDK9-U2、E2-CDK9-U3、E2-CDK9-U2U3、E2-CDK9-U1U2U3T125 等の本発明の異なる転写単位を含むベクターからのYB2/0細胞株で取得されたT125カッパ鎖の平均力価比較を図示する。取得された6平均については、互いに有意な違いが有るかを測定するために比較した（多重範囲検定）。
【図３４】図34はE2-CDK9-U3ベクター、および、RSV＋pCIneoイントロンを含むHK463-18基準ベクターからYB2/0細胞株で取得した全抗-Rh（D）免疫グロブリンの平均力価比較を図示する。  取得された平均は、互いに有意な違いが有るかを測定するために比較した（多重範囲検定）。
【図３５】図35は、EF1αイントロンを含むE2-CDK9-U3ベクターからYB2/0細胞株で得られた抗-CD71免疫グロブリン（H7）の平均力価とEFイントロンを含むRSV_pCLneo基準ベクターから取得ものとの比較を図示する。取得された6平均については、互いに有意な違いが有るかを測定するために比較した（多重範囲検定）。
【実施例】
【０１６６】
実施例
1．材料および方法
1.1．一過性トランスフェクション
YB2/0細胞株では、親細胞をトランスフェクション前（D-1）に、フラスコ内のEMS（Invitrogen、注文生産）+ 5% FCS（Invitrogen）において2E5 cv/mlで播種する。エレクトロポレーションの日（D0）に、装置のT 0202プログラムを使用して、4-mmキュベット（Biorad）当たり4E6細胞を、4μgのプラスミドDNAでAMAXAによりヌクレオフェクトした100μlの緩衝液V（Cell line nucleofector kitV, Lonza）中に採る。細胞は、3mlのEMS媒体+5%のFCS中、7%のCO2、37℃でP6-ウエルプレートにて培養する。D+5に、上清をELISA分析用に採取する。
【０１６７】
CHO-Sでは、発現する配列は、FreeStyleキット（Invitrogen）のプロトコールによる一過性トランスフェクションにより評価する。親細胞をトランスフェクション前（D-1）に、FreeStyle  CHO  EM（Fisher Bioblock scientific）内の6E5 cv/mlで、三角フラスコ中、24時間、播種し、かつ、120rpmで撹拌しながら、37℃、8%のCO2でインキュベーションする。トランスフェクションの日に、FreeStyle  MAX試薬（Fisher Bioblock Scientific）/DNA複合体を1:1の比率で、Opti Pro SFM (Invitrogen)内で作成する。次に、複合体を、予め遠心した懸濁液中の細胞に沈着させ、かつ、cultiflask （Sartorius）（5ml）においてFreeStyle  CHO  EM内の1E6 cv/mlで採り、さらに、200rpm、37℃、8%のCO2でインキュベーションする。D+5 日に、培地中に分泌された分子レベルの評価に上清を採取する。
【０１６８】
1.2．安定したトランスフェクション
1.2.1  血清添加培地中のYB2/0細胞株の安定したトランスフェクション
細胞は安定成長させ、フラスコ内で、EMS（LFB)培地＋5%FCS中で、少なくとも4週間、解凍する。 細胞は、前日に、2E5cv/mlで、EMS培地+5%FCS中で継体培養する。
エレクトロポレーションの日に、細胞を、5E6 cv（直線化プラスミドDNAを含むelectrobuffer kit (Ozyme)からのqsf500μｌのエレクトロポレーション緩衝液）を有する4-mmキュベット（Biorad）、電圧230V、容量960μF、Gene Pulser Xcell（BioRad）でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後に、EMS培地+5%FCSで、24-ウエルプレート（P24）（25、000細胞/ウエル）でプレーティングを行う。
【０１６９】
D+3：次の最終濃度を得るために選択培地に置く：EMS + 5% FCS + G418 1 mg/ml + 1%  フェノールレッド。
D+7：対応する培地でプレートを新しくする。
D+10：細胞がコンフルエンスに近づいた時に、8 P24ウエルから3プールを作り、F25中、2E5cv/mlで、細胞を再培養し、さらに、最大の生産（D+7に、max prod）を行い、上清を採取してFast ELYSAキット(RD-biotech)で分析する。
【０１７０】
1.2.2  血清無添加培地中のYB2/0細胞株の安定したトランスフェクション
細胞は安定成長させ、cultiflask内で、250rpmで撹拌しながら、EMABPRO1培地（LFB）中、少なくとも3週間、解凍する。細胞はEMABPRO1培地中、3E5 cv/mlで、前日に再培養する。
エレクトロポレーションの日に、細胞を、5E6 cv（直線化プラスミドDNAを含むelectrobuffer kit (Ozyme) からのqsf500μｌのエレクトロポレーション緩衝液）を有する4-mmキュベット（Biorad）、電圧230V、容量950μF、Gene Pulser Xcell（BioRad）でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後に、細胞をF75 培養フラスコ中、EMABPRO1培地で3E5 cv/mlで採る。
【０１７１】
D+3：次の最終濃度を得るために選択培地に置く：低密度細胞クローニングLDCC + G418 1 mg/ml用EMABPRO1+ LFB添加物。
D+10：細胞密度が6E5 cv/mlを越える場合、細胞をF25 中、3E5 cv/ml EMABPRO1+G418 1 mg/mlで再培養するが、そうしない場合は、半分をLDCC 添加物 + G418 1 mg/mlに対しEMABPRO1 + LFBで希釈する。
D＋12以降、および、週3回：細胞密度が6E5 cv/mlを越える場合、F25中、3E5 cv/mlで細胞を再培養する。
D＋17以降、生存率が80%を越える場合、単純流加モードで産生する：3E5 cv/mlでのcultiflaskの接種、250rpmで撹拌しながら培養、D+3、D＋5、D＋７にグルコースとグルタミン供給添加。
D+10 に、上清を採取してFast ELYSAキット(RD-biotech)で分析する。
【０１７２】
1.2.3  CHO-S株の安定したトランスフェクション
大きな数（数千）のトランスフェクタントでの平均発現レベル、および、トランスフェクタントのプール（「安定したプールでのトランスフェクション」）でのClonePixFLにより選択された最善のクローンに基づいて、異なる構造を比較するためにトランスフェクタントのプールで評価を行う。
【０１７３】
1.2.3.1.  プールの取得およびプール内での評価
CHO-S株を、135rpm撹拌しながらFreestyle CHO EM培地 + 8 mMのグルタミン、37℃、8%  CO2でフラスコ内で培養する。
細胞は6x105 細胞/mlで、前日に再培養する。
エレクトロポレーションの日に、細胞を、5E6 cv（直線化プラスミドDNAを含むelectrobuffer kit (Ozyme) からのqsf500μｌのエレクトロポレーション緩衝液）での4-mmキュベット（Biorad）、電圧300V、容量500μF、Gene Pulser Xcell（BioRad）でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後に、細胞をF75 培養フラスコ中、3E5 cv/mlで採る。
【０１７４】
D+3：次の最終濃度を得るために選択培地に置く：低密度細胞クローニングLDCC + G418 1 mg/ml用Freestyle CHO EM + LFB添加物。
D+10：半分を、低密度細胞クローニングLDCC + G418 1 mg/ml用Freestyle CHO EM + LFB添加物で希釈。
D＋12以降、および、週3回：細胞密度が6E5 cv/mlを越える場合、F25内で、3E5 cv/mlで細胞を再培養する。
D＋17から、Freestyle CHO EM + G418 1 mg/ml 中、F25 またはF75フラスコで再培養する。
D＋25から、バッチモード産生を実施する：Freestyle CHO EM + G418 1 mg/ml 中、3E5 cv/mlで、F25 を接種する（プール中の産生）。
D+12 に、上清を採取してFast ELYSAキット(RD-biotech)で分析する。
【０１７５】
1.2.3.2.   プールの取得およびクローンの評価
前段階で得られた細胞のプールを、蛍光検出抗体の存在下で、半固形培地（CloneMedia CHO - Molecular Devices)）に播種する。
各プールの大きな産生をするクローンを、第1に、蛍光密度（ClonePixFLによるスクリーニングおよびピッキング）の関数として選択し、第2に、P24飽和度力価の関数として選択する。
次に、最善のクローンは、Freestyle CHO EM + G418 1 mg/ml 内で、3E5 cv/mlでのcultiflaskの接種で評価され、かつ、250rpmで撹拌しながら培養する。
生存率が50%未満である場合、上清を採取してFast ELYSAキット(RD-biotech)で分析する。
【０１７６】
1.3.   分泌された組換えタンパク質レベルの評価
抗-Rh（D）抗体T125、抗-CD20、抗-AMHRII、抗-GGT  IgG1の遊離カッパ鎖レベルの評価は、酵素免疫吸着アッセイ（ELISA）法で測定する。
培養上清での遊離カッパ鎖は、96-ウエルプレートに吸着させるヤギ抗ヒトカッパ抗体（Caltag Lab）で2時間かけて捕獲する。次に、捕獲した抗体は、ビオチン化ヤギ抗ヒトカッパ抗体（Pierce）により明らかになり、その後に、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Pierce）を添加する。各ステージ間でタンパク質、および、複合体形成に関連しない試薬を除去するために、4回洗浄をする。酵素基質OPD（Sigma）の添加で評価を実施し、かつ、反応は1N HClで停止させる。読み取りを492nmで分光光度的に実行する。抗体濃度は、標準域との比較で測定する。
一過性および安定したトランスフェクションで産生したIgG1sは、メーカの指示書に従い、Fast ELYSAキット(RD-biotech)で評価する。光学密度は、450nmで、分光光度的に読み取る。抗体濃度は、キットに含まれた標準域との比較で測定する。
【０１７７】
1.4.  統計分析
遊離カッパ鎖または全ての免疫グロブリン産生の結果は、それぞれの実験の中央値から規格化した値と比較する。統計分析は、STATGRAPHICS Centurion XVソフトウエアを使用して実施した。多重範囲検定は、95.0% LSD法を用いてデータに適用した。データ対は、95％の信頼水準で統計的に有意な違いを有する。
【０１７８】
実施例1：  E2-CDK9-U1U2U3ベクターの構築（図１）
・2-CDK9ベクターのBamHIおよびNheI消化
・5630ベースのフラグメント回収、204ベースのフラグメント除去
・合成挿入物のBamHIおよびNheI消化
・1271ベースの挿入物のゲルに関する回収
・ライゲーションおよびE2-CDK9-U1U2U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１７９】
実施例2:  E2-CDK9-U2U3ベクターの構築（図2）
・E2-CDK9-U2U3ベクターのPmeI消化
・6620ベースのフラグメント回収、281ベースのフラグメント除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9-U2U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８０】
実施例3:  E2-CDK9-U2ベクターの構築（図3）
・E2- CDK9-U2U3の SpeI+NheI消化
・6296ベースのフラグメント回収、324ベースのフラグメント除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9-U2の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８１】
実施例4:  E2-CDK9-U1ベクターの構築（図4）
・E2- CDK9-U1U2U3の SpeI+NheI消化
・5911ベースのフラグメントのゲル回収、990ベースのフラグメント除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9-U1の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８２】
実施例5:  E2-CDK9-U3ベクターの構築（図5）
・E2- CDK9-U1U2U3のHpaI+PmeI消化
・5957ベースのフラグメントのゲル回収、944ベースのフラグメント除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9-U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８３】
実施例6:  E2-CDK9-U1U3ベクターの構築（図6）
・5’UTR U2領域放出のためのE2-CDK9-U1U2U3のSpel消化
・6235ベースのフラグメントのゲル回収、666ベースのフラグメント除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9-U1U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８４】
実施例7:   E2-CDK9-EF1αベクターの構築（図7）
・E2- CDK9のSpeI+NheI消化
・5636ベースのフラグメントのゲル回収、198ベースのフラグメント除去
・合成挿入物のSpeIおよびNheI消化
・1001ベースの挿入物のゲル回収
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1αの取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８５】
実施例8:   E2-CDK9-EF1α-U1U2U3ベクターの構築（図8）
・E2- CDK9-EF1αのSpeI+BamHI消化
・7236ベースのフラグメントのゲルに関する回収、666ベースのフラグメントの除去
・合成挿入物のBamHIおよびNhe消化
・1271ベースの挿入物のゲル回収
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1α-U1U2U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８６】
実施例9:   E2-CDK9-EF1α-U1U3ベクターの構築（図9）
・E2- CDK9-EF1α-U1U2U3のSpeI消化
・7236ベースのフラグメントのゲル回収、666ベースのフラグメント除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1α-U1U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８７】
実施例10:   E2-CDK9-EF1α-U2U3ベクターの構築（図10）
・E2- CDK9-EF1α-U1U2U3のHpaI/PmeI消化
・7230ベースのフラグメントのゲル回収、672ベースのフラグメンの除去
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1α-U2U3の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８８】
実施例11:   E2-CDK9-EF1α-U2U3ベクターの構築（図11）
・E2- CDK9-EF1αのSpeI消化
・6637ベースのフラグメントのゲル回収
・合成挿入物のSpeI消化
・666ベースの挿入物のゲル回収
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1α-U2の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１８９】
実施例12:   E2-CDK9-EF1α-U1ベクターの構築（図12A）
・E2- CDK9-EF1αのBamI+SpeI消化
・ゲル回収
・合成挿入物のBamI+SpeI消化
・947ベースの挿入物のゲル回収
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1α-U1の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１９０】
実施例13:   E2-CDK9-EF1α-U1U2 ベクターの構築（図13）
・E2-CDK9-EF1α-U1のSpeI消化
・9612ベースのフラグメントのゲル回収
・合成挿入物のSpeI消化
・947ベースの挿入物のゲル回収
・ライゲーションおよびE2-CDK9- EF1α-U1U2 の取得
・適切なプライマーを用いた、PCRなどの好適な方法による細菌のクローンのスクリーニング
【０１９１】
実施例14:  YB2/0細胞株での抗-GGT抗体の発現のためのE2-CDK9-U3-HK138H11Bベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターは、ハイブリドーマ源の 5′RACE シーケンシングの結果を考慮してYB2/0細胞株で構築する。
抗体138H11の重鎖のヌクレオチド酸、および、該抗体の軽鎖のヌクレオチド酸は、CHK622-21ベクター内でクローニングする。
【０１９２】
シグナルペプチドを有しない抗体138H11の軽鎖のクローニング
・CHK622-21ベクター（図14）のDraIIIおよびSpeI消化
・nucleospin （商品名）extractによる9917bpのフラグメント回収
・99bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KP１（acagctcttactagtgccgccaccatggacatgagggtgccagctcagctgctgggac）およびGGT-KP2（ctggatgtcgcatctagcgcctggcagccacagcagcagcagtcccagcagctgag）を使用したTAQプルーフリーディングを用いた15ダイマーサイクルの第1PCR
・306bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KP3（gcgctagatgcgacatccagatgacacaatctagctcctctttcagtgtgag）およびGGT-KD3（CAAAAGTCCAGGGTGTGGACAGATAC）を使用した15サイクルの第2PCR
・75bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KD1（CACCCTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGCTGGAAATCAAAAG）およびGGT-KD2（GAAAGATGAAGACACTTGGTGCAGCCACGGTTCTTTTGATTTCC）を使用した15ダイマーサイクルの第3PCR
・ゲルの精製および第2PCRで取得した生成物のnucleospin extractによる精製
・第1PCR1 および第3PCR3 で取得した生成物の精製およびnucleospin extractによる精製
・445bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KP1およびGGT-KD2を用いたPCRによる3フラグメントのアセンブリー
・t445bpのフラグメントのDraIIIおよびSpeI消化、および、精製による420bpのフラグメント回収およびnucleospin extract
・10337bpのCHK622-21_138H11Bベクターを取得するために、消化CHK622-21ベクターにおける、該消化フラグメントのライゲーション
・143bpのアンプリコンを得るプライマー5'1PLC 、および、GGT-KP2を用いたPCRによるスクリーニング
【０１９３】
シグナルペプチドを有する抗体138H11の軽鎖のクローニング
・CHK622-21ベクターのDraIIIおよびSpeI消化
・nucleospin extractによる9917bpのフラグメント回収
・90bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KP１MB7（tacagctcttactagtgccgccaccatgcgatggagctggatcttcctg）およびGGT-KP2MB7（atctggatgtcggcgttggcgctggtgatgctcagcagcagcaggaagatc）を使用したTAQプルーフリーディングを用いた15ダイマーサイクルの第1PCR
・304bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KP3MB7（gccaacgccgacatccagatgacacaatctagctcctctttcagtgtgag）およびGGT-KD3を使用した15サイクルの第2PCR
・75bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KD1およびGGT-KD2を使用した15ダイマーサイクルの第3PCR
・ゲルの精製および第2PCRで取得した生成物のnucleospin extractによる精製
・第1PCR1 および第3PCR3 で取得した生成物の精製およびnucleospin extractによる精製
・434bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-KP1MB7 およびGGT-KD2を用いたPCRによる3フラグメントのアセンブリー
・434bpのフラグメントのDraIIIおよびSpeI消化、および、精製による408bpのフラグメント回収およびnucleospin extract
・10325bpのCHK622-21_138H11B_MB7ベクターを取得するために、消化CHK622-21ベクターにおける、該消化フラグメントのライゲーション
・33bpのアンプリコンを得るプライマー5′1PLC 、および、1 GGT-KP2を用いたPCRによるスクリーニング
【０１９４】
シグナルペプチドを有しない抗体138H11の重鎖のクローニング
・CHK622-21_138H11BベクターのNheIおよびApaI消化
・nucleospin extractによる10316bpのフラグメント回収
・97bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-GP１（tacagctcttgctagcgccgccaccatg）およびGGT-GP2（caccagctgcacttggcactgcaccccctccaggatg）を使用した15サイクルの第1PCR
・400bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-GP3（caagtgcagctggtggagagcggcggaaccctggtgaag）およびGGT-GApal（gggggaacacggatgggcccttagtg）を使用した15サイクルの第2PCR
・2つのPCRで取得した生成物の精製およびnucleospin extractによる精製
・482bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-GP1およびGGT-GApalを用いたPCRによる3フラグメントのアセンブリー
・4564bpのフラグメントのNheIおよびApaI消化、および、精製およびnucleospin extract による456bpのフラグメント回収
・10772bpのHK622-21_138H11Bベクターを取得するために、消化CHK622-21ベクターにおける、該消化フラグメントのライゲーション（図15）
・604bpのアンプリコンを得る適切なプライマーを用いたPCRによるスクリーニング
【０１９５】
シグナルペプチドMB7を有する抗体138H11の重鎖のクローニング
・CHK622-21_138H11B_MB7ベクターのNheIおよびApaI消化
・nucleospin extractによる10304bpのフラグメント回収
・94bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-GP１MB7（tacagctcttgctagcgccgccaccatgcgatggagctggatcttcctgctgctgctgag）およびGGT-GP2MB7（caccagctgcacttgggcgttggcgctggtgatgctcagcagcagcaggaagatc）を使用した15サイクルの第1PCR
・400bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-GP3およびGGT-GApalを使用した15サイクルの第2PCR
・2つのPCRで取得した生成物の精製およびnucleospin extractによる精製
・479bpのフラグメントを取得するために、プライマーGGT-GP1およびGGT-GApalを用いたPCRによる3フラグメントのアセンブリー
・4794bpのフラグメントのNheIおよびApaI消化、および、精製およびnucleospin extract による453bpのフラグメント回収
・10757bpのHK622-21_138H11B_MB7ベクターを取得するために、消化CHK622-21ベクターにおける、該消化フラグメントのライゲーション（図16）
・601bpのアンプリコンを得る適切なプライマーを用いたPCRによるスクリーニング。
【０１９６】
E2-CDK9-U3-Gen汎用ベクターにおけるシグナルペプチドMB7を有する抗体138H11の重鎖のクローニング
・E2-CDK9-U3-Gen汎用ベクター（図17）のNhelおよびAsel消化
・nucleospin extractによる8928bpのフラグメント回収
・HK622-21_138H11B_MB7ベクターのNhelおよびAsel消化
・nucleospin extractによる1435bpのフラグメント回収
・E2-CDK9-U3-H138H11B_MB7ベクターを取得するために、消化E2-CDK9-U3-Genベクターにおける、該消化フラグメントのライゲーション
・512bpのアンプリコンを得る適切なプライマーを用いたPCRによるスクリーニング
【０１９７】
E2-CDK9-U3-Gen汎用ベクターにおけるシグナルペプチドMB7を有する抗体138H11の軽鎖のクローニング
・E2-CDK9-U3-H138H11B_MB7ベクターのSpelおよびXbal消化
・消化ベクターの脱リン酸化およびnucleospin extractによる10347bpのフラグメント回収
・HK622-21_138H11B_MB7ベクターのSpelおよびXbal消化
・nucleospin extractによる709bpのフラグメント回収
・E2-CDK9-U3-HK138H11B_MB7ベクターを取得するために、消化E2-CDK9-U3-Genベクターにおける、該消化フラグメントのライゲーション（図18）
・407bpのアンプリコンを得る適切なプライマーを用いたPCRによるスクリーニング
【０１９８】
実施例15:   E2-CDK9-U3-pCI-neo-HK138H11Bベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、pCI-neo-キメライントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-4ベクター（図19）をYB2/0細胞株で構築する。
【０１９９】
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターにおけるpCI-neo-キメライントロンのクローニング
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターは、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントを、nucleospin extractにより取得する。pCI-neo-キメライントロンのヌクレオチド酸は、163bpのアンプリコンを得るプライマーP1pCiNeo-NheI (acagaggagagctaggtaagtatcaaggttacaagac)およびP2p-pCI-neo-NheI (tacgcattgagctagctgtggagagaaaggcaaagtg)、ならびに、164bpのアンプリコンを得るプライマーP1pCiNeo-SpeI (acagaggagaactaggtaagtatcaaggttacaagac)およびP2p-pCI-neo-SpeI (cagccacagtactagctgtggagagaaaggcaaagtg)を使用してCHK6220-21ベクターから増幅する。
【０２００】
PCRは、KAPA HiFi酵素で実施する。プライマーのそれぞれは、挿入部位でE2-CDK9-U3-HK138H11B_MB7ベクターの配列に相補的な15ベース、ならびに、再挿入するイントロンの配列に属する20数個のベースで構築する。
挿入部位を再形成するために追加のベースを添加した。
pCI-neo-キメライントロンを、IN-FUSION注入方法で消化2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。IN-FUSION注入方法は、Ozyme (ref. 639690)の市販のキットに記載される方法である。
HK1358-4ベクターを得るために、PCRで得た163bpおよび164bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターは単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、570bpのアンプリコンを得る5′1PLC/CHoptiREVプライマー、および、387bpのアンプリコンを得る5′PLC/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０１】
実施例16:   E2-CDK9-U3-pEFベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、EF1αイントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-5ベクター（図20）をYB2/0細胞株で構築する。
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターを、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントをnucleospin extractにより取得する。EF1αイントロンのヌクレオチド酸を、969bpのアンプリコンを得るプライマーP1EF-NheI (ACAGAGGAGAGCTAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCC)およびP22-pEF-NheI (tggtggcggcgctagctgaaatggaagaaaaaaactttgaac)、ならびに、970bpのアンプリコンを得るプライマーP1pEF-SpeI (ACAGAGGAGAACTAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCC)およびP22-pEF-SpeI (tggtggcggcactagtctgaaatggaagaaaaaaactttgaac)を使用してK622-37EFベクターから増幅する。
EF1αイントロンを、IN-FUSION注入方法で消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。
ベクターHK1358-5ベクターを得るために、PCRで取得した969bpおよび979bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7は単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、1534bpのアンプリコンを得るelF4g1-1/CHoptiREVプライマー、および、1351bpのアンプリコンを得るelF4g1-1/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０２】
実施例17:   E2-CDK9-U3-mROSAベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、mROSAイントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-8ベクター（図21）をYB2/0細胞株で構築する。
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターを、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントをnucleospin extractにより取得する。mROSAイントロンのヌクレオチド酸を、381bpのアンプリコンを得るプライマーP1p-mROSA-NheI (acagaggagagctaggtaggggatcgggactctgg)およびP22-hROSA-NheI (tggtggcggcgctagctgtcaggagaggaaagagaag)、ならびに、382bpのアンプリコンを得るプライマーP1pmROSA-SpeI (acagaggagaactaggtaggggatcgggactctgg) およびP22-hROSA-SpeI (tggtggcggcactagtctgtcaggagaggaaagagaag)を使用してK622-37 mRosaベクターから増幅する。
mROSAイントロンを、IN-FUSION注入方法で消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。
ベクターHK1358-8ベクターを得るために、PCRで取得した381bpおよび382bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7は単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、949bpのアンプリコンを得るelF4g1-1/CHoptiREVプライマー、および、765bpのアンプリコンを得るelF4g1-1/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０３】
実施例18:   E2-CDK9-U3-HTLV1ベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、5′-LTR HTLV1イントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-11ベクター（図22）をYB2/0細胞株で構築する。
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターを、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントをnucleospin extractにより取得する。HCLV-1イントロンのヌクレオチド酸を、318bpのアンプリコンを得るプライマーP1htlv-NheI (acagaggagagctagggctcgcatctctccttcac) およびP22-htlv-NheI (tggtggcggcgctagGTAGGCGCCGGTCACAGC)、ならびに、318bpのアンプリコンを得るプライマーP1htlv-SpeI (acagaggagaactaggctcgcatctctccttcac) およびP22-htlv-SpeI (tggtggcggcactagtGTAGGCGCCGGTCACAGC)を使用してK622-37EFベクターから増幅する。
5′-LTR HTLV1イントロンを、IN-FUSION注入方法で、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。
ベクターHK1358-11ベクターを得るために、PCRで取得した318bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7は単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、519bpのアンプリコンを得る5′HTLV/CHoptiREVプライマー、および、702bpのアンプリコンを得る5′HTLV/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０４】
実施例19:   E2-CDK9-U3-pEF-exonベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、エキソンベースを持つEF1αイントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-10ベクター（図23）をYB2/0細胞株で構築する。
【０２０５】
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターを、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントをnucleospin extractにより取得する。EF1α-exonイントロンのヌクレオチド酸を、991bpのアンプリコンを得るプライマーP12EF-NheI (ACAGAGGAGAGCTAGCGGGTTTGCCGCCAGAACACAG) およびP22-pEF-NheI (TGGTGGCGGCGCTAGCTGAAATGGAAGAAAAAAACTTTGAAC)、ならびに、992bpのアンプリコンを得るプライマーP12EF-SpeI (ACAGAGGAGAACTAGCGGGTTTGCCGCCAGAACACAG) およびP22-pEF-SpeI (TGGTGGCGGCACTAGTCTGAAATGGAAGAAAAAAACTTTGAAC)を使用してK622-37EFベクターから増幅する。
EF1α-exon イントロンを、IN-FUSION注入方法で、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。
ベクターHK1358-10ベクターを得るために、PCRで取得した991bpおよび992bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7は単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、843bpのアンプリコンを得る5′EF/CHoptiREVプライマー、および、1023bpのアンプリコンを得る5′EF1/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０６】
実施例20:   E2-CDK9-U3-hROSAベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、hROSAイントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-6ベクター（図24）をYB2/0細胞株で構築する。
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターを、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントをnucleospin extractにより取得する。hROSAイントロンのヌクレオチド酸を、1247bpのアンプリコンを得るプライマーP1hROSA-NheI (acagaggagagctaggtaggggagcggaactctggtg) およびP22-hROSA-NheI (tggtggcggcgctagctgtcaggagaggaaagagaag)、ならびに、1248bpのアンプリコンを得るプライマーP1hROSA-SpeI (acagaggagaactaggtaggggagcggaactctggtg) およびP22-hROSA-SpeI (tggtggcggcactagtctgtcaggagaggaaagagaag)を使用してK622-37EFベクターから増幅する。
hROSAイントロンを、IN-FUSION注入方法で、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。
ベクターHK1358-6ベクターを得るために、PCRで取得した1247bpおよび1248bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7は単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、1812bpのアンプリコンを得る適切なプライマー、および、1629bpのアンプリコンを得るelF4g1-1/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０７】
実施例21:   E2-CDK9-U3-UBCベクターの構築
抗-GGT 138H11_Bキメラ抗体の安定したプールでの発現について、ユビキチン遺伝子イントロンがE2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入されたHK1358-9ベクター（図25）をYB2/0細胞株で構築する。
E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターを、NhelおよびSpelで消化する。7978bpおよび3088bpのフラグメントをnucleospin extractにより取得する。UbCイントロンのヌクレオチド酸を、906bpのアンプリコンを得るプライマーP12UBC-NheI (ACAGAGGAGAGCTAGAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTG) およびP22-UBC-NheI (tggtggcggcgctagCTAACAAAAAAGCCAAAAACGGC)、ならびに、906bpのアンプリコンを得るプライマーP1UBC-SpeI (acagaggagaactaGTGAGTAGCGGGCTGCTGG) およびP22-UBC-SpeI (tggtggcggcactagtCTAACAAAAAAGCCAAAAACGGC)を使用してK622-37UBCベクターから増幅する。
ユビキチンイントロンを、IN-FUSION注入方法で、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7ベクターに挿入する。
ベクターHK1358-6ベクターを得るために、PCRで取得した906bpおよび906bpの2つのフラグメント、ならびに、消化E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7は単一段階で組み立てる。イントロンのベクターへの挿入は、830bpのアンプリコンを得る適切なプライマー、および、1629bpのアンプリコンを得る5′UBC/GGT KD3プライマーで検証する。
【０２０８】
実施例22:   異なるイントロンを有した転写単位E2CDK9U3を含むベクターによる、2つの全抗-GGTおよび抗-AMHRII抗体の産生
2つの全抗-GGT（138H11B MB7）および抗-AMHRII（3C23K）抗体は、エキソンを持つEF1αイントロン（EF）、エキソンを持たないEF1αイントロン（EFss）、ユビキチンイントロン、hROSAイントロン、5′LTRイントロンHTLV1、pCI-neo-キメライントロン、β-actinイントロンを有する、または、イントロンを有しないE2CDK9U3におけるクトルにより、血清添加培地、および、血清無添加培地中のYB2/0細胞株で、それぞれ、安定したプールから産生した。これらのベクターにより得た抗体力価を、図26および27に示す。
E2CDK9U3+イントロン構造による増加は、同じIgGをコードする基準ベクターとの比較により推定するが、これにおいては、E2CDK9U3+イントロン構造の代わりにRSV LTR + pCIneoイントロンをを含むTU構造を用いる。
【０２０９】
図26は、基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、血清添加培地中のプール内で、異なるイントロンを有するE2CDK9U3での抗-GGT抗体（138H11B）の生産性を図示する。特に、以下を示す：
・RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、イントロン追加が無いE2CDK9U3の組み合わせはすでに大幅な増加（2.2倍）を提供する。
・試験されたイントロンの全てが、E2CDK9U3の組み合わせで追加的増加を提供する：基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、マウスおよびヒトROSAイントロンの場合はいくぶん控えめであり、ユビキチンおよびEFイントロン（小さい5′エキソンを有する場合も有さない場合も）の場合は非常に有意であり、約6倍の最大増加を可能にする。
【０２１０】
特に、図27は以下を示す：
・E2CDK9U3との組合せのイントロン階層構造は、抗-GGT抗体での試験の関連で維持される。特に、（エキソンを持つ、或いは、持たない）EFおよびユビキチンイントロンは、最強であり（基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、約2倍）、mROSA イントロンは有意な効果を持つ（1.6倍）。hROSAイントロンは、ここはで試験していない。
・この試験では、基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、この試験では増加は意義が少ないが理由は不明である。しかしながら、イントロン階層構造には疑問が投げかけられておらず、かつ、発現させる同じ抗体および血清無添加培地中の同じ方法を用いているが、その後の試験は、血清添加培地中で得られたのと同等の非常に高い増加を示した（EFssイントロンの場合5倍、図28参照）。
【０２１１】
実施例23:  転写単位E2CDK9U3+EFss (またはEF)を含むベクターにより、血清添加、および、血清無添加YB2/0細胞株における3つの異なる抗体の産生
3つの抗体をコードする配列：抗-CD20 (R603)、抗-GGT (138H11B MB7)、抗-AMHRII (3C23K)を、転写単位E2CDK9U3+EFssを含むベクターに組込んだ。E2CDK9U3+EFssの代わりにRSV LTR+pCI neoイントロン（基準対照）の制御下にあるものを除いた、これらのベクター、および、これらのホモログは、抗-CD20および抗-AMHRII の場合で血清添加および血清無添加、抗-GGTの場合で血清添加、非依存性トランスフェクションでプール内で発現した。
E2CDK9U3 + EFイントロン構造による増加は、同じIgGをコードする基準ベクターとの比較により推定するが、これにおいては、E2CDK9U3 + EFイントロン構造の代わりにRSV LTR + pCIneoイントロンをを含むTU構造を用いる。
【０２１２】
図28は、基準RSV LTR+pCI neoイントロンと比較して、E2CDK9U3 + EFssイントロンにおいての3つの抗- GGT (138H11B)、抗- AMHRII (3C23K)、抗- CD20 (R603)抗体の生産性を図示する。
特に、これは、E2CDK9U3+ EFssイントロンの組み合わせが、RSV LTR + pCI neoイントロンと比較して有意な増加をさらに提供することを示す：血清添加培地中の3つの抗体の場合は4.6〜6.1倍。血清無添加培地中では、試験した2つの抗体の場合、結果には幅が有るがE2CDK9U3+ EFssイントロンの組み合わせの有意な効果を示す（図27に、すでに最低の増加である2倍を示した）。
【０２１３】
実施例24:   RSV LTRとの組み合わせでのイントロンの比較
試験するイントロン：抗体のカッパ軽鎖を産生させるために、Bact (β-アクチン)、EF1α、mROSA、hROSA、5′-LTR HTLV1、ubc (ビキチン)を、RSV LTR を含む発現ベクターK622_37に挿入した。従って、構成されたベクターの生産性増加を、基準ベクターであるRSV_int_KT125_2STPおよびRSV_T125_K2と比較する。
異なる3週にわたり実施した3つの転写から得た結果は、図29に示したが、また、これにより、イントロンの間の有意な違いを認めることができる。
多重比較をCHO-S株において、異なるイントロンにより得られたIg軽鎖の産生の平均値（ng/mL）について実施した（表1）。平均値の違いを識別するのに使用した方法は、Fisher's LSD法である。多重範囲検定は、95.0%LSD法で実施した。これらのデータ対は、95％の信頼水準で統計的に有意な違いを有した。
【０２１４】
【表１】
2014530634.tif 000002
【０２１５】
5つの均一集団を、X列を用いて同定する。EF1αイントロンが有意に効果的である。mROSA イントロンが第2位である。他のイントロンは、RSV LTRと組み合わせて、好ましい効果がない。
【０２１６】
実施例25:   E2-CDK9-U3 およびRSV LTRにおいての転写単位の比較
試験する異なる転写単位を、T125抗体のカッパ軽鎖の産生のために試験する。従って、構築するベクターの生産性の増加を、基準ベクターpRep4KT125およびRSV_T125_K2と比較する。
異なる3週にわたり実施した3つの転写から得た結果は、図30 に示したが、また、これにより、試験した組み合わせの間の有意な違いを認めることができる。
多重比較をCHO-S株において、異なる組み合わせにより得られたIg軽鎖の産生の平均値（ng/mL）について実施した（表2）。平均値の違いを識別するのに使用した方法は、Fisher's LSD法である。多重範囲検定は、95.0%LSD法で実施した。これらのデータ対は、95％の信頼水準で統計的に有意な違いを有した。
【０２１７】
【表２】
2014530634.tif 000003
【０２１８】
5つの均一集団を、X列を用いて同定する。
EF1αとE2-CDK9-U3との組み合わせが有意に効果的である。従って、E2-CDK9-U3においては、EF1αイントロンが63%の増加を提供する。
また、EFイントロンを有するRSV LTR、および、mROSAイントロンを有するE2-CDK9-U3の組み合わせが有意に効果的である。
度合いは低くなるものの、試験をした他の組み合わせは、基準RSV T125 K2よりも効果的である。
【０２１９】
実施例26:  CHO-S細胞にE2CD9U3を含むベクター全抗-Rh（D）抗体（HK）の産生
全抗-Rh（D）抗体（HK）は、E2-CDK9-U3構造の転写単位を含むベクターでトランスフェクトしたCHO-S細胞、および、RSV-pCI-neoイントロン（基準ベクター）構図の転写単位を含むベクターでトランスフェクションしたCHO-S細胞で、それぞれ産生する。
下記の表3はベクターHK463-18、または、ベクターHK E2-CDK9-U3でトランスフェクションした細胞のプールにより産生した全抗-Rh（D）抗体のアッセイ結果を示す。図31は、この結果を図示する。
【０２２０】
【表３】
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【０２２１】
E2-CDK9-U3転写単位により、基準ベクターと比べて6倍の生産性の増加を得ることが可能になる。
【０２２２】
下記の表4はベクターHK463-18、または、ベクターHK E2-CDK9-U3でトランスフェクションした前記載のプール由来の最善のクローンで産生された全抗-Rh（D）抗体のアッセイ結果を示す。図3は、この結果を図示する。
【０２２３】
【表４】
2014530634.tif 000005
【０２２４】
実施例27:   YB2/0細胞株でのT125カッパ鎖の産生
T125カッパ鎖は、本発明に従う異なる転写単位構成を含む異なるベクターにより一過性にトランスフェクトしたYB2/0細胞株で発現した。試験を行った転写単位構成、および、得られた発現の結果を図33に示す。
【０２２５】
実施例28:   YB2/0細胞でE2-CDK9-U3を含むベクターでの全抗-Rh（D）抗体（HK）の産生
全抗-Rh（D）抗体（HK）はE2-CDK9-U3構造の転写単位を含むベクターで、または、RSV-pCI-neoイントロン（基準ベクター）構図の転写単位を含むベクターで、安定したトランスフェクトにおいてYB2/0細胞で産生した。抗-Rh（D）抗体の発現結果は、μg/mL単位で図34に示す。
【０２２６】
実施例29:   E2-CDK9-U3を含むベクターによるYB2/0細胞での全抗-CD71 抗体（H7）の産生
抗-CD71抗体は転写単位E2-CDK9-U3およびEFイントロンを含むベクターで、または、RSV-pCI-neoイントロンを含む基準ベクターでトランスフェクションしたYB2/0細胞で産生する。抗-CD71抗体の発現結果は、μg/mL単位で図35に示す。
【図１】
2014530634.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014530634.tif 000010
【図６】
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【図７】
2014530634.tif 000012
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2014530634.tif 000016
【図１２Ａ】
2014530634.tif 000017
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2014530634.tif 000019
【図１４】
2014530634.tif 000020
【図１５】
2014530634.tif 000021
【図１６】
2014530634.tif 000022
【図１７】
2014530634.tif 000023
【図１８】
2014530634.tif 000024
【図１９】
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【図２０】
2014530634.tif 000026
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2014530634.tif 000031
【図２６】
2014530634.tif 000032
【図２７】
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【図２８】
2014530634.tif 000034
【図２９】
2014530634.tif 000035
【図３０】
2014530634.tif 000036
【図３１】
2014530634.tif 000037
【図３２】
2014530634.tif 000038
【図３３】
2014530634.tif 000039
【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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