(57)【要約】  本出願は、免疫学の分野、特に、優先的には、防御免疫応答を誘導し、かつ、ワクチン誘発性疾患の増長を回避するために免疫細胞を標的化エンハンサーであるナノエマルションと混合した呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）表面タンパク質、Ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）タンパク質およびＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ）タンパク質サブユニットワクチンのワクチン組成物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）表面抗原またはその抗原性フラグメントと、
（ｂ）約１０００ｎｍ以下の平均サイズを有する液滴ならびに：
（ｉ）水相；
（ｉｉ）少なくとも１種類の油；
（ｉｉｉ）少なくとも１種類の界面活性剤；および
（ｉｖ）少なくとも１種類の有機溶媒
を含んでなる免疫増強ナノエマルションまたはその希釈溶液と
を含んでなり、前記少なくとも１つのＲＳＶ表面抗原が前記ナノエマルション内に含まれる、ワクチン組成物
【請求項２】
前記表面抗原がＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の抗原性フラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の抗原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＲＳＶ表面抗原が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＨＲＳＶ−Ｌ１９として寄託されているヒト呼吸器合胞体ウイルスに由来する、請求項１または請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ＲＳＶ表面抗原が、弱毒化表現型を表す少なくとも１つのヌクレオチド改変をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ＲＳＶ表面抗原またはその抗原性フラグメントが融合タンパク質中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ＲＳＶ表面抗原が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のペプチドフラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のペプチドフラグメント、またはそれらの任意の組合せである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＲＳＶ表面抗原が多価である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記多価表面抗原がＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の抗原性フラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の抗原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せである、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記免疫増強ナノエマルションがＴｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答、またはそれらの任意の組合せを誘導し得る、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種類の薬学上許容される担体をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記ワクチン組成物が非経口、経口、鼻腔内、または直腸のいずれかの投与用に製剤化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記非経口投与が皮内、皮下、腹腔内または筋肉内注射による、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
単離されたＲＳＶビリオン粒子をさらに含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記ＲＳＶビリオン粒子が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＨＲＳＶ−Ｌ１９として寄託されているヒト呼吸器合胞体ウイルスに由来する、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記ＲＳＶビリオン粒子が前記ナノエマルションにより不活化される、請求項１４または請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ＲＳＶウイルスゲノムが少なくとも１つの弱毒化突然変異を含んでなる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記ワクチン組成物が、
（ａ）被験体に対して全身有毒がなく；
（ｂ）投与の際に生じる炎症が最小または皆無であり；または
（ｃ）それらの任意の組合せである、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記ナノエマルション滴が、約１０００ｎｍ未満、約９５０ｎｍ未満、約９００ｎｍ未満、約８５０ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７５０ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６５０ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５５０ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４５０ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３５０ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ超、約７０ｎｍ超、約１２５ｎｍ超、約１２５ｎｍ超および約６００ｎｍ未満、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される平均直径を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記ナノエマルションが、
（ａ）水相；
（ｂ）約１％の油〜約８０％の油；
（ｂ）約０．１％の有機溶媒〜約５０％の有機溶媒；および
（ｃ）約０．００１％の界面活性剤〜約１０％の界面活性剤
を含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記ナノエマルションが、
（ａ）水相；
（ｂ）約１％の油〜約８０％の油；
（ｃ）約０．０１％の有機溶媒〜約５０％の有機溶媒；
（ｄ）約０．００１％〜約１０％の１種類以上の非イオン性界面活性剤；および
（３）陽イオン性界面活性剤
を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
被験体への投与に続き、被験体が１回のワクチン投与の後に血清転換を受ける、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
薬剤の製造のための請求項１〜２２のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２４】
前記薬剤が小児を処置するために使用される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が高齢被験体、移植被験体、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する被験体、またはそれらの任意の組合せを処置するために使用される、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、免疫学の分野、特に、少なくとも１つのＲＳＶ免疫原をナノエマルションアジュバントと組み合わせて含んでなるナノエマルション呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン組成物に関する。ＲＳＶ免疫原は、ＲＳＶ表面タンパク質、Ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）タンパク質およびＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ）タンパク質など、サブユニットワクチンを形成するために好適ないずれのＲＳＶ抗原であってもよい。本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、防御免疫応答を誘導し、ワクチン誘発性の疾患増長を回避する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、世界中の小児および高齢における重篤な呼吸器系疾患の主因であり、この病原体に対して利用可能なワクチンは無い。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）は、小児における急性下気道疾患の最も多い病原体であり、生涯において反復感染をひき起こし得る。ＨＲＳＶは、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)の肺炎ウイルス属に分類される。この科の他のメンバーと同様に、ＨＲＳＶは、感染周期の初期段階に重要な役割を果たす２つの主要な表面糖タンパク質（ＧおよびＦ）を有する。Ｇタンパク質は細胞表面受容体へのウイルスの接着を媒介し、Ｆタンパク質はウイルスと細胞膜の融合を促進し、ウイルスリボヌクレオタンパク質を細胞の細胞質へ侵入させる。
【０００３】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染は一般に細気管支炎をもたらし、先進国における小児の入院の主因である。さらに、ＲＳＶは、高齢者、移植患者、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者において主要な病原体と記載されることが増えている(Hacking and Hull, 2002)。小児および高齢者集団を扱うための安全な免疫原性ワクチンの開発は例のない機会と言える。
【０００４】
ホルムアルデヒドなどの、ワクチン製剤のためのこれまでのウイルス不活化法は、肺疾患の増長と死という結果をもたらした。ＲＳＶに取り組むためのウイルスワクチンの開発に対する包括的研究は、限定された成功に直面した。ＲＳＶワクチン開発の主要な取り組みをいくつか挙げれば、幼時の感染、先天免疫の回避、自然感染は感染を予防する免疫を誘導することができないこと、およびワクチンの安定性、純度、再現性および効力に関連する問題と相まったワクチン増長病状の実証(Graham, 2011; Swanson and Settembre, 2011)がある。
【０００５】
アプローチには、ホルマリンによる不活化またはウイルス、およびＲＳＶに感染した際の、ワクチン誘発性の疾患増長の実証が含まれた。このホルマリン不活化ワクチンが疾患増長を示したという所見には、防御免疫応答のためには、増長を防ぐために重要な免疫応答の歪曲を示すことが不可欠であること、および中和抗体の生成のためには、コンフォメーションエピトープを維持するためにその天然状態のＦタンパク質を有することが不可欠であることが含まれた(Krujigen, 2011; Swanson 2011; McLellan et al., 2011)。ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンの疾患増長がＧタンパク質によるものではないこと、およびＧタンパク質抗体はウイルス力価を低減することができ、実際に疾患増長から防御するという実証は、Ｇタンパク質をワクチン候補に組み込むことができるということを示唆する(Radu et al, 2010; Haynes et al, 2009; Johnson et al, 2004)。弱毒生ワクチンの使用は、これらのワクチンが示した免疫原性は最小であった(Gomez et al 2009)ことから、限定された成功に直面した。組換えウイルスにより発現されるＦおよびＧタンパク質ワクチンの利用は、低レベルの抗原発現、一過性レベルの発現、細胞の特異性および精製されたＦタンパク質は構造的に未熟である可能性があり、中和抗体を惹起するためには適当な型でないという実証に関連した低い免疫原性を示した(Singh and Dennis, 2007; Kim et al, 2010)。サブユニットワクチンを使用する場合には、サブユニットワクチンはＦおよびＧタンパク質の非効率かつ不適当な発現によって妨げられたことから、適当な免疫応答を誘導するためには最適なレベルのＦタンパク質を含むことが重要である(Nallet et al., 2009; Huang and Lawlor 2010)。Ｆタンパク質を含有するサブユニットワクチンは、アジュバントを用いた場合でも、完全な防御性がなく、最適でないという所見(Langley et al., 2009)は、ワクチンとしての使用のためには、Ｆタンパク質はビリオン中にその天然状態で提供されることが不可欠であることを示唆している。
【０００６】
ナノエマルションに関連する先行教示が米国特許第６，０１５，８３２に記載されており、これはグラム陽性細菌、細菌胞子、またはグラム陰性菌を不活化する方法に関するものである。これらの方法は、グラム陽性細菌、細菌胞子、またはグラム陰性菌を細菌不活化（または細菌胞子不活化）エマルションと接触させることを含む。米国特許第６，５０６，８０３号は、エマルションを用いて微生物体（例えば、ヒト上またはヒト体内の細菌、ウイルス、胞子、真菌）を死滅させるか、または中和する方法に関するものである。米国特許第６，５５９，１８９号は、サンプルをナノエマルションと接触させることを含む、サンプル（ヒト、動物、食品、医療デバイスなど）を除染するための方法に関するものである。このナノエマルションは、細菌、ウイルス、真菌、原虫または胞子と接触させると、それらの病原体を死滅させるか、または無力化する。この抗微生物ナノエマルションは、第四級アンモニウム化合物、エタノール／グリセロール／ＰＥＧのうち１つ、および界面活性剤を含んでなる。米国特許第６，６３５，６７６号は、２つの異なる組成物、およびそれらの組成物のいずれかでサンプルを処理することによりサンプルを除染する方法に関するものである。組成物１は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、および胞子に対して抗微生物性のエマルションを含んでなる。これらのエマルションは、油と第四級アンモニウム化合物を含んでなる。米国特許第７，３１４，６２４号は、被験体を、粘膜表面を介して免疫原とナノエマルションの組合せで処置することを含む、免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関するものである。このナノエマルションは、油、エタノール、界面活性剤、第四級アンモニウム化合物、および蒸留水を含んでなる。ＵＳ−２００５−０２０８０８３およびＵＳ−２００６−０２５１６８４は、好ましいサイズの液滴を含むナノエマルションに関するものである。ＵＳ−２００７−００５４８３４は、第四級アンモニウムハリドを含んでなる組成物および感染性病態を処置するためにそれらを使用する方法に関するものである。前記第四級アンモニウム化合物は、エマルションの一部として提供され得る。ＵＳ−２００７−００３６８３１およびＵＳ２０１１−０２００６５７は、抗炎症薬を含んでなるナノエマルションに関するものである。ナノエマルションを記載している他の刊行物としては、「真菌、酵母および糸状菌感染を処置する方法」に関する米国特許第８，２２６，９６５号；「爪真菌症を処置するための方法および組成物」に関するＵＳ２００９−０２６９３９４；「ヘルペスウイルス感染を処置するための方法」に関するＵＳ２０１０−００７５９１４；「ナノエマルション治療用組成物およびその使用方法」に関するＵＳ２０１０−００９２５２６；「座瘡の治療および予防のための組成物、その組成物の製造方法、およびその使用方法」に関するＵＳ２０１０−０２２６９８３；「病原性微生物を不活化するための組成物、その組成物の製造方法、およびその使用方法」に関するＵＳ２０１２−０１７１２４９；および「ナノエマルション組成物を用いたアンチエージングおよびしわ処置法」に関するＵＳ２０１２−００６４１３６がある。しかしながら、これらの参照文献に本発明の方法、組成物およびキットを教示するものはない。
【０００７】
特に、米国特許第７，３１４，６２４号は、ナノエマルションワクチンを記載している。しかしながら、この参照文献には、本発明の免疫原を用いてＲＳＶに対する防御免疫応答を誘導できるという教示はない。
【０００８】
ワクチンに関する従来技術には下記のものが含まれる。例えば、「免疫応答を誘導するための組成物」に関する米国特許第７，７３１，９６７号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）には、少なくとも２種類のアジュバントを含んでなる抗原／アジュバント複合体が記載されている。「アジュバント系およびワクチン」に関する米国特許第７，３５７，９３６号（ＧＳＫ）には、アジュバントと抗原の組合せが記載されている。「サポニンを含有する水中油エマルション」に関する米国特許第７，３２３，１８２号（ＧＳＫ）には、油／水製剤を用いたワクチン組成物が記載されている。「ヘルペスに対する免疫応答を誘導する方法」に関する米国特許第６，８６７，０００号（Ｗｙｅｔｈ）には、ウイルス抗原とサイトカイン（ＩＬ１２）の組合せが記載されている。全て「ワクチン」に関する米国特許第６，６２３，７３９号、同第６，３７２，２２７号、および同第６，１４６，６３２号（ＧＳＫ）は、抗原および／または抗原組成物と、代謝可能な油とαトコフェロールからなるアジュバントとを、水中油エマルションの形態で含んでなる免疫原性組成物に関するものである。「サブミクロンの油滴エマルションを含んでなるアジュバント製剤」に関する米国特許第６，４５１，３２５号（Ｃｈｉｒｏｎ）は、代謝可能な油と乳化剤と抗原性物質とを含んでなり、油と乳化剤が水中油型エマルションの形態で存在するアジュバント組成物に関するものである。前記アジュバント組成物はいずれのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーも含有せず、前記抗原性物質はアジュバント組成物の内部相には存在しない。最後に、「ワクチンおよび使用方法」に関するＵＳ２００４０１５１７３４（ＧＳＫ）には、１以上の性感染症（ＳＴＤ）に罹患しているか、またはそれに感受性のある女性対象を処置する方法が記載されている。この方法は、それを必要とする女性対象にＳＴＤ原因病原体に由来または関連する１以上の抗原とアジュバントを含んでなる有効量のワクチン製剤を投与することを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，０１５，８３２号公報
【特許文献２】米国特許第６，５０６，８０３号公報
【特許文献３】米国特許第６，５５９，１８９号公報
【特許文献４】米国特許第６，６３５，６７６号公報
【特許文献５】米国特許第７，３１４，６２４号公報
【特許文献６】ＵＳ−２００５−０２０８０８３
【特許文献７】ＵＳ−２００６−０２５１６８４
【特許文献８】ＵＳ−２００７−００５４８３４
【特許文献９】ＵＳ−２００７−００３６８３１
【特許文献１０】ＵＳ２０１１−０２００６５７
【特許文献１１】米国特許第８，２２６，９６５号公報
【特許文献１２】ＵＳ２００９−０２６９３９４
【特許文献１３】ＵＳ２０１０−００７５９１４
【特許文献１４】ＵＳ２０１０−００９２５２６
【特許文献１５】ＵＳ２０１０−０２２６９８３
【特許文献１６】ＵＳ２０１２−０１７１２４９
【特許文献１７】ＵＳ２０１２−００６４１３６
【特許文献１８】米国特許第７，７３１，９６７号公報
【特許文献１９】米国特許第７，３５７，９３６号公報
【特許文献２０】米国特許第７，３２３，１８２号公報
【特許文献２１】米国特許第６，８６７，０００号公報
【特許文献２２】米国特許第６，６２３，７３９号公報
【特許文献２３】米国特許第６，３７２，２２７号公報
【特許文献２４】米国特許第６，１４６，６３２号公報
【特許文献２５】米国特許第６，４５１，３２５号公報
【特許文献２６】ＵＳ２００４０１５１７３４
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hacking, D., Hull, J. 2002. Respiratory syncytial virus - virus biology and host response. J. Infection. 45: 18-24.
【非特許文献２】Graham, B. 2011. Biological challenges and technological opportunities for respiratory syncytial virus vaccine development. Immunological Reviews. 239: 149-166.
【非特許文献３】Swanson, K., Settembre, E. 2011. Structural basis for immunization with post-fusion respiratory syncytial virus fusion F glycoprotein (RSV F) to elicit high neutralizing antibody titers. PNAS. 108: 9619-9624.
【非特許文献４】Kruijens D., Schijf, M. 2011. Local innate and adaptive immune responses regulate inflammatory cell influx into the lungs after vaccination with formalin inactivated RSV. Vaccine. 29: 2730-2741.
【非特許文献５】McLellan, J., Y Yang. et al., 2011. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Fusion glycoprotein in the post-fusion conformation reveals preservation of neutralizing epitopes. J Virology. Epub. 1128/JVI00555-11.
【非特許文献６】Radu, G, Caidi, H. et al. 2010. Prophylactic treatment with a G glycoprotein monoclonal antibody reduces inflammation in a respiratory syncytial virus (RSV-G) challenge naive and formalin-inactivated RSV-immunized BALB/c mice. J Virol. 84:9632-9636.
【非特許文献７】Haynes, L, Caidi, H. et al. 2009. Therapeutic monoclonal antibody treatment targeting respiratory syncytial virus (RSV) G protein mediates viral clearance and reduces pathogenesis of RSV infection in BALB/c mice. J Infect Dis. 200:439-447.
【非特許文献８】Johnson, T, and Graham, B. 2004. Contribution of respiratory syncytial virus G antigenicity to vaccine-enhanced illness and the implications for severe disease during primary respiratory syncytial virus infection. Pediatr Infect Dis J. 23:46-57.
【非特許文献９】Johnson, T, Teng, M, et al. 2004. Respiratory syncytial virus (RSV) G glycoprotein is not necessary for vaccine-enhanced disease induced by immunization with formalin-inactivated RSV. J Virol. 78:6024-6032.
【非特許文献１０】Gomez, M., Mufson, M.  et al. 2009. Phase-I study MEDI-534, of a live attenuated intranasal vaccine against respiratory syncytial virus and parainfluenza-3 virus in seropositive children. Ped Infect J. 28: 655-658.
【非特許文献１１】Singh, S., Dennis, V. 2007. Immunogenicity and efficacy of recombinant RSV-F vaccine in a mouse model. Vaccine. 125: 6211-6223.
【非特許文献１２】Kim, S., J Jang., et al., 2010. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28: 3801-3808.
【非特許文献１３】Nallet, S., Amacker, M. et al. 2009. Respiratory Syncytial Virus subunit vaccine based on a recombinant fusion protein expressed transiently in mammalian cells. 27: 6415-6419.
【非特許文献１４】Huang K., Lawlor, H. 2010. Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing. Virus Genes. 40: 212-221.
【非特許文献１５】Langley, J., Sales V., et al. 2009. A dose ranging study of a subunit Respiratory Syncytial Virus subtype A vaccine with and without aluminum phosphate adjuvantation in adults ≧ 65 years of age. Vaccine. 27: 5913-5919.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当技術分野では、有効なＲＳＶワクチンならびにその製造および使用方法の必要がある。本発明は、これらの必要を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、少なくとも１つの中枢的免疫原性ウイルス表面抗原、例えば、ＦおよびＧタンパク質、またはそれらの抗原性フラグメントと、送達・免疫増強水中油型ナノエマルションを組み合わせることによって、ＲＳＶ感染に対する防御免疫応答を送達および誘導するための新規なアプローチを提供する。例えば、本発明のナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答、またはそれらの任意の組合せを誘導する。
【００１３】
本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、少なくとも１つのＲＳＶ免疫原を含んでなり、そのＲＳＶ免疫原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性フラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せである。さらに、本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する液滴を含んでなる。本ＲＳＶサブユニットワクチン中に存在するナノエマルションは、（ａ）水相、（ｂ）少なくとも１種類の油、（ｃ）少なくとも１種類の界面活性剤、（ｄ）少なくとも１種類の有機溶媒、および（ｅ）任意選択の少なくとも１種類のキレート剤を含んでなる。好ましくは、ＲＳＶ免疫原は、ナノエマルション滴中に存在する。別の実施形態では、本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、鼻腔内に投与され得る。本発明のさらに別の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは、有機溶媒を含まない。さらに、本ナノエマルションＲＳＶワクチンにさらなるアジュバントを加えてもよい。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチン中にはＲＳＶビリオン粒子も存在する。好ましくは、ＲＳＶビリオン粒子は、ナノエマルション滴中に存在する。ＲＳＶビリオン粒子は、ナノエマルションにより不活化することができる。一実施形態では、ＲＳＶウイルスゲノムは、少なくとも１つの弱毒化突然変異を含んでなる。
【００１５】
本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、液体分散物、ゲル、エアゾール、肺エアゾール、鼻腔エアゾール、軟膏、クリーム、または固体剤形などの薬学上許容される剤形に製剤化してもよい。
【００１６】
ＲＳＶ表面抗原および／またはＲＳＶビリオン粒子は、いずれのＲＳＶ株に由来してもよい。一実施形態では、ＲＳＶ表面抗原および／またはＲＳＶビリオン粒子は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｌ１９株（ＲＳＶ−Ｌ１９）に由来する。別の実施形態では、ＲＳＶ−Ｌ１９ウイルスは、ウイルス粒子に関連するＦｕｓｉｏｎ（Ｆ）およびＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ）構造タンパク質の高生産株である。さらに別の実施形態では、ＲＳＶ−Ｌ１９ウイルスは、弱毒化ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）Ｌ１９株である。一実施形態では、本ワクチン組成物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＨＲＳＶ−Ｌ１９として寄託されているヒト呼吸器合胞体ウイルスを含んでなる。
【００１７】
一実施形態では、ＲＳＶ表面抗原は、弱毒化表現型を表す少なくとも１つのヌクレオチド改変をさらに含んでなる。別の実施形態では、ＲＳＶ表面抗原またはその抗原性フラグメントは、融合タンパク質中に存在する。ＲＳＶ表面抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のペプチドフラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のペプチドフラグメント、またはそれらの任意の組合せであり得る。さらに、ＲＳＶ表面抗原は多価であり得る。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、免疫原性製剤を調製するための方法が提供され、これにより、ＨＲＳＶ−Ｌ１９などのＲＳＶ株は弱毒化突然変異および欠失で遺伝的に操作され、弱毒化表現型となる。得られた弱毒化ＲＳＶウイルスは、適当な細胞株内で培養し、採取する。採取したウイルスを次に細胞成分および血清成分から精製する。精製したウイルスを次にワクチン組成物を使用するための許容される医薬担体中に混合する。よって、少なくとも１つの弱毒化突然変異を含んでなるＲＳＶウイルスゲノム（例えば、ＲＳＶ  Ｌ１９株）を、好ましくは、Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、Ｆおよび／もしくはＧタンパク質の抗原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて含んでなるワクチン組成物が提供される。さらに別の実施形態では、本ワクチン組成物は、弱毒化表現型を示すヌクレオチド改変を含んでなるＲＳＶウイルスゲノム（例えば、ＲＳＶ  Ｌ１９株）を含んでなる。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、本ワクチン組成物は被験体に対して全身毒性がなく、投与時に炎症が最小限であるか、または炎症を起こさない。別の実施形態では、被験体は１回のワクチン投与の後に血清転換を受ける。
【００２０】
一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質および／またはそれらの抗原性フラグメントを含んでなるナノエマルション製剤を被験体に投与することを含む、ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対する免疫を増強するための方法が記載される。本発明の別の実施形態は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる疾患に対する免疫の増強を誘導するための方法であって、本発明による有効量のワクチン組成物を被験体に投与する工程を含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、被験体は、少なくとも１回のナノエマルションＲＳＶワクチン投与の後に防御免疫応答を生じることができる。さらに、免疫応答は、１以上のＲＳＶ株に対して防御性があり得る。ＨＲＳＶに対する免疫増強の誘導は、最適なレベルの抗原の存在に依存する。さらに、ロバストな免疫応答を提供するためには、抗原の臨界レベルを特定することが重要である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質レベルが中和抗体の存在および持続性ならびにウイルスの攻撃からの防御と直接的相関があるという実証は、その天然配向で発現される、最適レベルの臨界的な免疫原性Ｆタンパク質を産生するウイルス株を確保することは、ワクチン候補としての用途に将来性を見出せることを示す。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態では、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質、および／またはそれらの抗原性フラグメント、および／またはＲＳＶビリオン粒子は、ナノエマルション製剤により不活化およびアジュバント効果を受けて、非感染性かつ免疫原性のウイルス製剤となる。ナノエマルションとワクチン候補を単に混合することで、粘膜免疫応答と全身免疫応答の両方が得られることが示されている。ＲＳＶビリオン粒子とナノエマルションを混合すると、液滴の油核中に抗原粒子が離散した状態となる。抗原はこの核の中に組み込まれ、これにより、抗原を正常な抗原コンフォメーションを促す遊離形態とすることができる。
【００２２】
本ＲＳＶワクチンは、液体分散物、ゲル、エアゾール、肺エアゾール、鼻腔エアゾール、軟膏、クリーム、または固体投与形として製剤化することができる。さらに、本ＲＳＶワクチンは、非経口、経口、鼻腔内、または直腸など、薬学上許容されるいずれの方法によって投与してもよい。非経口投与は、皮内、皮下、腹腔内または筋肉内注射であり得る。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、本ナノエマルションＲＳＶワクチン組成物は、（ａ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と少なくとも１種類の非陽イオン性界面活性剤；（ｂ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤および少なくとも１種類の非陽イオン性界面活性剤、この場合、前記非陽イオン性界面活性剤は非イオン性界面活性剤である；（ｃ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と少なくとも１種類の非陽イオン性界面活性剤、この場合、前記非陽イオン性界面活性剤はポリソルベート非イオン性界面活性剤、ポロキサマー非イオン性界面活性剤、またはそれらの組合せである；（ｄ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、またはそれらの組合せである少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤；（ｅ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、またはそれらの組合せである少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤、この場合、前記非イオン性界面活性剤は約０．０１％〜約５．０％、または約０．１％〜約３％で存在する；（ｅ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と少なくとも１種類の非陽イオン性界面活性剤、この場合、前記非陽イオン性界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、前記非イオン性界面活性剤は約０．０５％〜約１０％、約０．０５％〜約７．０％、約０．１％〜約７％、または約０．５％〜約４％の濃度で存在する；（ｆ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤、この場合、前記陽イオン性界面活性剤は約０．０５％〜約２％または約０．０１％〜約２％の濃度で存在する；または（ｇ）それらの任意の組合せを含んでなる。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態では、本ＲＳＶワクチンは、低分子量キトサン、中分子量キトサン、高分子量キトサン、グルカン、またはそれらの任意の組合せを含んでなる。前記低分子量キトサン、中分子量キトサン、高分子量キトサン、グルカン、またはそれらの任意の組合せは、ナノエマルション内に存在し得る。
【００２５】
以上の一般的説明ならびに以下の図面の簡単な説明および詳細な説明は例であり、説明的なものであって、特許請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図される。他の目的、利点、および新規な特徴は、当業者には以下の発明の詳細な説明から容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】合計３０μｇのＨＡを含む場合と含まない場合の２０％Ｗ８０５ＥＣ  ＮＥのＴＥＭ断面画像を示す。右のパネルは、ＨＡ抗原が油滴中に存在することを示す。濃く染色された抗原は、ＮＥ粒子の外側に存在する。
【図２】ＲＳＶで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のＲＳＶ特異的ＩｇＧのエンドポイント力価を示す。Ｆタンパク質と混合した２０％Ｗ８０５ＥＣで免疫した群だけがワクチン接種に応答した。バーは群の平均を表す。
【図３Ａ】ＮＥ＋Ｆｐｔｎで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のＲＳＶ特異的ＩｇＧ１（Ａ）、ＩｇＧ２ａ（Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（Ｃ）、およびＩｇＥ（Ｄ）のエンドポイント力価を示す。血清は２回目の免疫から２週間後に得た。
【図３Ｂ】ＮＥ＋Ｆｐｔｎで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のＲＳＶ特異的ＩｇＧ１（Ａ）、ＩｇＧ２ａ（Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（Ｃ）、およびＩｇＥ（Ｄ）のエンドポイント力価を示す。血清は２回目の免疫から２週間後に得た。
【図３Ｃ】ＮＥ＋Ｆｐｔｎで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のＲＳＶ特異的ＩｇＧ１（Ａ）、ＩｇＧ２ａ（Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（Ｃ）、およびＩｇＥ（Ｄ）のエンドポイント力価を示す。血清は２回目の免疫から２週間後に得た。
【図３Ｄ】ＮＥ＋Ｆｐｔｎで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のＲＳＶ特異的ＩｇＧ１（Ａ）、ＩｇＧ２ａ（Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（Ｃ）、およびＩｇＥ（Ｄ）のエンドポイント力価を示す。血清は２回目の免疫から２週間後に得た。
【図４】ナノエマルション（ＮＥ）−Ｆタンパク質によるマウスのワクチン接種の結果、生ＲＳＶで鼻腔内抗原投与を行った後に疾患を弱化することを示す。免疫マウス０日目および２８日目にＮＥ＋Ｆタンパク質、Ｆタンパク質単独を２回鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種するか、またはＰＢＳのみで処置した。対照および接種マウスに追加免疫（ｉ．ｎ．）の２週間後に１０５ＰＦＵの生ＲＳＶで抗原投与を行った。ウイルス転写産物の発現を感染８日後に肺ＲＮＡのＱＰＣＲによって測定した。
【図５】ナノエマルション（ＮＥ）−ＲＳＶ免疫は、非接種マウスに比べて免疫増強を誘導しないことを示す。マウスに下記のようにＮＥ−ＲＳＶを接種した。５６日目に対照マウスおよび接種マウスに抗原投与した。抗原投与８日後にプレチスモグラフィーにより気道過敏症を評価した。柱は、メタコリンの最適な静脈内投与を１回行った後の気道抵抗の増大を表す。
【図６Ａ】ナノエマルション（ＮＥ）＋Ｆタンパク質接種マウスにおける炎症および粘液産生は対照と異ならないことを示す。（Ａ）対照ＲＳＶを感染させ、ＮＥ＋Ｆタンパク質を接種したマウスの、感染８日後の代表的な組織構造を示す（過ヨウ素酸シッフ、ＰＡＳ；ヘマトキシリンおよびエオジン、Ｈ＆Ｅ）。好酸球は存在しなかった。（Ｂ）では、Ｍｕｃ５ａｃおよびＧｏｂ５の発現を、感染８日後に肺ＲＮＡのＱＰＣＲにより評価した。
【図６Ｂ】ナノエマルション（ＮＥ）＋Ｆタンパク質接種マウスにおける炎症および粘液産生は対照と異ならないことを示す。（Ａ）対照ＲＳＶを感染させ、ＮＥ＋Ｆタンパク質を接種したマウスの、感染８日後の代表的な組織構造を示す（過ヨウ素酸シッフ、ＰＡＳ；ヘマトキシリンおよびエオジン、Ｈ＆Ｅ）。好酸球は存在しなかった。（Ｂ）では、Ｍｕｃ５ａｃおよびＧｏｂ５の発現を、感染８日後に肺ＲＮＡのＱＰＣＲにより評価した。
【図７Ａ】ナノエマルション（ＮＥ）＋Ｆタンパク質接種がＴｈ１およびＴｈ２の混合応答を誘導することを示す。マウスに、下記のようにＮＥ＋Ｆタンパク質、Ｆタンパク質単独を接種し、生ＲＳＶで抗原投与を行った。（Ａ）では、ＩＬ−１２（ｐ４０）および（Ｂ）ＩＬ−１７サイトカインの発現を肺ＲＮＡからＱＰＣＲにより評価した。（Ｃ）では、肺関連リンパ節（ＬＡＬＮ）細胞懸濁液にＲＳＶ（ＭＯＩ，０．５）を再投与した。各サンプルのサイトカイン産生をアッセイするために、分析用にＢｉｏｐｌｅｘに採取した上清。
【図７Ｂ】ナノエマルション（ＮＥ）＋Ｆタンパク質接種がＴｈ１およびＴｈ２の混合応答を誘導することを示す。マウスに、下記のようにＮＥ＋Ｆタンパク質、Ｆタンパク質単独を接種し、生ＲＳＶで抗原投与を行った。（Ａ）では、ＩＬ−１２（ｐ４０）および（Ｂ）ＩＬ−１７サイトカインの発現を肺ＲＮＡからＱＰＣＲにより評価した。（Ｃ）では、肺関連リンパ節（ＬＡＬＮ）細胞懸濁液にＲＳＶ（ＭＯＩ，０．５）を再投与した。各サンプルのサイトカイン産生をアッセイするために、分析用にＢｉｏｐｌｅｘに採取した上清。
【図７Ｃ】ナノエマルション（ＮＥ）＋Ｆタンパク質接種がＴｈ１およびＴｈ２の混合応答を誘導することを示す。マウスに、下記のようにＮＥ＋Ｆタンパク質、Ｆタンパク質単独を接種し、生ＲＳＶで抗原投与を行った。（Ａ）では、ＩＬ−１２（ｐ４０）および（Ｂ）ＩＬ−１７サイトカインの発現を肺ＲＮＡからＱＰＣＲにより評価した。（Ｃ）では、肺関連リンパ節（ＬＡＬＮ）細胞懸濁液にＲＳＶ（ＭＯＩ，０．５）を再投与した。各サンプルのサイトカイン産生をアッセイするために、分析用にＢｉｏｐｌｅｘに採取した上清。
【図８】種々の製剤による投与／免疫後に測定されたＦタンパク質単位を示す。（１）４．５μｇのＦタンパク質、（２）２．５μｇのＦタンパク質、（３）５．５μＬのＲＳＶ／β−プロピオラクトン（β−ＰＬ）；（４）５．６μＬのＲＳＶ；（５）０．５μｇのＦ／５．６μＬのＲＳＶ；（６）１μｇのＦ／５．６μＬのＲＳＶ／β−プロピオラクトン（β−ＰＬ）；および（７）２．５μｇのＦ／５．６μＬのＲＳＶ。
【図９】（１）Ｆタンパク質単独；（２）ＲＳＶウイルス単独；および（３）ＲＳＶウイルス＋Ｆタンパク質による免疫の後の、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７Ａ、およびＧｏｂ５に関する肺でのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１０】免疫し、かつ抗原投与したマウスの組織検査を示す。図１０Ａは、一次ＲＳＶ感染の組織検査を示し；図１０Ｂは、ＲＳＶ−ＮＥで免疫した動物の組織検査を示し；図１０Ｃは、Ｆタンパク質で免疫した動物の組織検査を示し；図１０Ｄは、ＲＳＶ＋Ｆタンパク質で免疫した動物の組織検査を示す。
【図１１】Ｌ１９およびＡ２によるＨＲＳＶ感染細胞溶解液（ＳＤＳ処理）のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１２】ＲＳＶ  Ｌ１９株およびＲＳＶ  Ａ２株のＨＲＳＶ細胞溶解液（細胞および上清）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１３】ＨＲＳＶ  Ｌ１９株およびＡ２株精製ウイルスのＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１４】ウイルス感染から２４時間後のＨＲＳＶ  Ｌ１９株およびＡ２株ＦおよびＧタンパク質発現のウエスタンブロットを示す。
【図１５】ウエスタンブロット評価によるウイルスの不活化を示す。各レーンは、以下のものを含有する：（１）Ｗ８０５ＥＣ（レーン１）、（２）Ｗ８０５ＥＣ＋０．０３％Ｂ１，３グルカン（レーン２）、（３）Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％キトサン（中分子量）＋酢酸（レーン３）、（４）Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％Ｐ４０７（レーン４）、（５）Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％キトサン（低分子量）＋０．１％酢酸（レーン５）、（６）媒体単独（レーン６）；（７）βＰＬ不活化ウイルス（レーン７）、および（８）Ｌ１９陽性対照（レーン９）。
【図１６】抗ＲＳＶ抗体（抗Ｇ）；Ｌ１９ウイルス４×１０６ＰＦＵ／レーン、２×１０６ＰＦＵ／レーン、および１×１０６ＰＦＵ／レーン＋／−βＰＬ不活化を示されたようにＷ８０５ＥＣと組み合わせて行ったウエスタンブロット解析を示す。検体は新鮮な状態で（図８Ａ）または４℃または室温（ＲＴ）で１４日間保存した後に（図８Ｂ）分析した。ＭＭ＝分子量。
【図１７】キトサンとともに、また、伴わずに種々のナノエマルション製剤でＩＭ接種したマウスにおける接種から３週間後の免疫応答（ＩｇＧ、μｇ／ｍｌ）を示す。（１）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋２．５％Ｗ８０５ＥＣ＋０．１％低分子量キトサン；（２）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋５％Ｗ８０５ＥＣ；（３）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋２．５％Ｗ８０５ＥＣ；（４）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋βＰＬ不活化ウイルス；および（５）ナイーブマウス（ワクチン無し）。
【図１８】コットンラットにおける２種類のナノエマルションアジュバントワクチンの評価のための接種計画を示す（実施例１３）。評価される２種類の製剤には、Ｗ８０５ＥＣとＷ８０Ｐ１８８５ＥＣ（１：１：５）が含まれる（下記の表５および６を参照）。コットンラットに、６．６μｇのＦ−ｐｔｎを含有するナノエマルションアジュバントワクチン３０μｌ  ２用量をＩＮで施した。２３週目にこれらのラットに５×１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２株で抗原投与を行った。４日目に動物の半数を犠牲にし、半数を８日目に犠牲にした。
【図１９】コットンラットにおけるＷ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルション不活化ＲＳＶワクチンの免疫原性試験の結果を示す。左のパネルでは、Ｙ軸はＦタンパク質に対する特異的抗体のエンドポイント力価を示し、Ｘ軸は期間を週数で示す。右のパネルでは、Ｙ軸は血清抗体レベルをμｇ／ｍｌで示し、Ｘ軸は期間を週数で示す。Ｄ４およびＤ８は、抗原投与後の血清中の抗体レベルを示す。
【図２０】コットンラットにおけるＷ８０５ＥＣナノエマルション不活化ＲＳＶワクチンの免疫原性試験の結果を示す。Ｙ軸はＦタンパク質に対する特異的抗体のエンドポイント力価を示し、Ｘ軸は期間を週数で示す。
【図２１】コットンラットにおけるＲＳＶ中和の免疫原性を示す。コットンラットに３０μｌのワクチンを鼻腔内接種し、４週目に追加免疫し、０週目、４週目、６週目、および８週目に採血した。試験群として、３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）かまたは６．６μｇのＦタンパク質を含有する３．２×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）のいずれかと混合した２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションを施した２群、ならびに３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）かまたは６．６μｇのＦタンパク質を含有する３．２×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）のいずれかと混合した２０％Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションを施した２群を含んだ。中和単位（ＮＥＵ）は、５０％のプラーク減をもたらした最大希釈率の逆数を表す。ＮＥＵの測定は、４週目（追加免疫前）と６週目（追加免疫の２週間後）に行った。６週目に得られた検体は、ＮＥＵ分析を可能とするのに十分な体液性免疫応答を生じていた。データは９５％信頼区間（ＣＩ）で幾何平均として表されている（図２１Ａ）。ＥＵとＮＥＵの間の相関は、スピアマンのρを用いた場合の、６週目の全ての動物に関するものである。
【図２２】４日目および８日目の中和抗体を示す。図２２Ａは、Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示し、図２２Ｂは、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示す。全てのコットンラットが、ワクチンＲＳＶ  Ｌ１９株に対して高い中和抗体（ＮＵ）を示した。中和抗体は、抗原投与後に確実に上昇していた（Ｙ軸）。８日目に中和単位（ＮＵ）は４日目のＮＵよりも高かった。ナイーブコットンラットは、それらの血清中に中和活性を示さなかった。
【図２３】血清抗体の比活性（中和単位／ＥＬＩＳＡ単位）が、抗原投与後４日目に比べて８日目に増加する傾向にあることを示した血清抗体の比活性を示す。図２３Ａは、４日目および８日目の、Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果（Ｙ軸のＮＵ／ＥＵ）を示す。図２３Ｂは、４日目および８日目の、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果（Ｙ軸のＮＵ／ＥＵ）を示す。
【図２４】３用量のＲＳＶ  Ｌ１９アジュバントワクチンを施した後にＲＳＶ  Ａ２株で抗原投与を行ったコットンラットに関する４日目の交差防御を示す。図２４Ａは、Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示し、図２４Ｂは、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示す。血清中和活性は、ＲＳＶ  Ｌ１９株またはＲＳＶ  Ａ２株に対して等しいＮＵを示し、これら２つのＲＳＶ株間での交差防御を示す。
【図２５】コットンラットの肺における４日目のウイルス排除（ＲＳＶ  Ａ２株）を示す。ワクチン接種を行ったコットンラット（Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションとＲＳＶ  Ｌ１９株の組合せ、またはＷ８０５ＥＣナノエマルションとＲＳＶ  Ｌ１９株の組合せを接種）は、コットンラットの肺からの、ＲＳＶ  Ａ２株として投与されたウイルスの完全な排除を示した。ナイーブ動物は肺１グラム当たり＞１０３ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２株を示していた。
【図２６】ＩＭコットンラットワクチン接種および抗原投与計画を示す。
【図２７】３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株と混合した２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＩＭ接種したコットンラットにおける血清免疫応答を示す。Ｙ軸は、１４週間の、そして抗原投与４日後、および抗原投与８日後の血清ＩｇＧ（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図２８】３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株と混合した２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＩＭ接種したコットンラットにおける血清免疫応答を示す。図２８Ａは、１４週間の、そして抗原投与４日後、および抗原投与８日後のエンドポイント力価（Ｙ軸）を示す。図２８Ｂは、１４週間の、そして抗原投与４日後、および抗原投与８日後のＥＬＩＳＡ単位（Ｙ軸）を示す。
【図２９】ＩＭワクチン接種コットンラットがナイーブ動物に比べて、抗原投与４日後にＲＳＶの完全な排除を示したことを示す。コットンラットの肺における４日目のウイルス排除（ＲＳＶ  Ａ２株）を示す。ＩＭ接種コットンラット（Ｗ８０５ＥＣナノエマルションとＲＳＶ  Ｌ１９株の組合せを接種）は、コットンラットの肺からの、ＲＳＶ  Ａ２株として投与されたウイルスの完全な排除を示した。ナイーブ動物は、肺１グラム当たり１０３ｐｆｕ以上のＲＳＶ  Ａ２株を示していた。
【図３０】２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションアジュバントで不活化した１．７μｇのＦタンパク質とともに２×１０５のプラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬ１９  ＲＳＶウイルスを含有するＲＳＶワクチンをＩＭまたはＩＮ接種したマウスに関する、８週間にわたる（Ｘ軸）、抗Ｆ抗体（Ｙ軸）の測定を示す。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０／アーム）に０週目および４週目にＩＮまたはＩＭで接種を行った。血清を抗Ｆ抗体に関して分析した。
【図３１】ＲＳＶ特異的サイトカインの測定を示す。２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションアジュバントで不活化した１．７μｇのＦタンパク質とともに２×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬ１９  ＲＳＶウイルスを含有するＲＳＶワクチンを０週目および４週目にＩＮまたはＩＭ接種したＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０／アーム）の接種後の脾臓、子宮頸および腸管リンパ節（ＬＮ）からの細胞でサイトカインを測定した。測定したサイトカインには、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１７を含んだ。
【図３２】２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションアジュバントで不活化した１．７μｇのＦタンパク質とともに２×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬ１９  ＲＳＶウイルスを含有するＲＳＶワクチンを０週目および４週目にＩＮまたはＩＭ接種したＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０／アーム）の接種後の肺組織におけるサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１７の測定を示す。ＩＬ−４およびＩＬ−１３はＩＭ投与後の方が高い発現を示し、ＩＬ−１７はＩＮ投与後の方が高い発現を示す。
【図３３】１．７μｇのＦタンパク質とともに２×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬ１９  ＲＳＶウイルスを含有するＲＳＶワクチンを０週目および４週目にＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０／アーム）にＩＮまたはＩＭ接種した後のマウスにおける気道抵抗（ｃｍＨ２０／ｍＬ／秒）の測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．概要
本発明は、ＲＳＶワクチンのこれまでのデータに見られた不適切な免疫応答に取り組むために、ナノエマルションと混合したＲＳＶ表面抗原ＦおよびＧタンパク質の新規な製剤を提供する。ＲＳＶに対する最適なワクチンは、急性ウイルス感染を予防するだけでなく、再感染も予防すると思われる。
【００２８】
本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性フラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せである、少なくとも１つのＲＳＶ免疫原を含んでなる。さらに、本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有するナノエマルション滴を含んでなる。好ましくは、ＲＳＶ免疫原は、ナノエマルション滴中に存在する。本発明の別の実施形態では、ＲＳＶビリオン粒子もまた、本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチン中に存在する。好ましくは、ＲＳＶビリオン粒子はナノエマルション滴中に存在する。
【００２９】
本発明は、中枢的免疫原性ＲＳＶウイルス表面抗原Ｆおよび／またはＧタンパク質を送達・免疫増強水中油型ナノエマルションと組み合わせることによりＲＳＶ感染に対する防御免疫応答を送達および誘導するための新規なアプローチを提供する。免疫応答を歪曲して疾患の増長をもたらすウイルスタンパク質ＮＳ１などの他のウイルス成分とは独立に、主要なウイルス免疫原であることが示されている単離されたＲＳＶウイルス表面抗原の利用は、サブユニットワクチンの重要な基礎である。さらに、１以上の前記ＲＳＶ表面抗原とナノエマルションを混合すること（前記ナノエマルションは優先的には前記抗原を封入し、適当な免疫細胞への送達系として、またさらには有効な免疫増強成分として働く）は、本発明の新規性を強調する。完全に機能的なヒトワクチンには不足する結果を伴う他のサブユニットワクチンおよび組換えワクチンに比べて、本ナノエマルションＲＳＶサブユニットウイルス表面抗原は、これまでの候補に比べて、ロバストな、持続可能な防御免疫応答を生成するその能力において著しい新規性を提供する。
【００３０】
ＲＳＶに対する免疫増強の誘導は、最適なレベルの抗原の存在および提示に依存する。単離されたＲＳＶ表面抗原とナノエマルションの組合せは、免疫応答の適当な抗原提示細胞にワクチンを送達するための新規なアプローチを提供する。
【００３１】
本発明のナノエマルション組成物はワクチンアジュバントとして機能する。アジュバントは、下記のような働きをする：（１）抗原（特異的防御免疫応答を刺激する物質）を免疫系に接触させ、生成される免疫の種類および免疫応答の量（大きさまたは期間）に影響を及ぼす；（２）ある特定の抗原の毒性を低減する；（３）防御応答に必要とされる抗原の量を低減する；（４）防御に必要とされる用量数を低減する；（５）集団の応答の不十分なサブセットの免疫を増強する、および／または（７）いくつかのワクチン成分への溶解性を与える。
【００３２】
一実施形態では、多価サブユニットワクチンは、ＲＳＶから誘導してナノエマルションと混合した表面抗原ＦおよびＧタンパク質を用いて構築することができる。
【００３３】
別の実施形態では、誘導体および融合タンパク質は、ＲＳＶ表面抗原ＦおよびＧタンパク質から設計した後にナノエマルションと混合してサブユニットワクチンを作出することができる。
【００３４】
一実施形態では、サブユニットワクチンは、ナノエマルションと混合した１以上のＲＳＶ表面抗原、すなわち、ＦおよびＧタンパク質を用いて構築することができる。ＦおよびＧタンパク質の両方をともに加え、ナノエマルションと混合してサブユニットワクチン組成物を得ることがもっぱら可能である。別の実施形態では、ＦまたはＧタンパク質のいずれかをナノエマルションと混合したものが、本発明による好適なサブユニットワクチンである。Ｆおよび／またはＧタンパク質の抗原性フラグメントもまた、本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンに使用可能である。
【００３５】
ナノエマルションは、油−水界面に界面活性剤を含むナノメーターサイズの液滴から構成される水中油型エマルションである。それらのサイズのために、ナノエマルション滴は、細胞成熟および免疫系への効率的な抗原提示を惹起する樹状細胞により飲作用を受ける。種々の抗原と混合した場合、ナノエマルションアジュバントは強力な体液性および細胞性ＴＨ１型応答ならびに粘膜免疫を惹起し、上方調節する(Makidon et al., “Pre-Clinical Evaluation of a Novel Nanoemulsion-Based Hepatitis B Mucosal Vaccine," PLoS ONE. 3(8): 2954; 1-15 (2008); Hamouda et al., "A Novel Nanoemulsion Adjuvant Enhancing The Immune Response from Intranasal Influenza Vaccine in Mice in National Foundation for Infectious Disease," 11th Annual Conference on Vaccine Research. Baltimore, MD (2008); Myc et al., "Development of immune response that protects mice from viral pneumonitis after a single intranasal immunization with influenza A virus and nanoemulsion," Vaccine, 21(25-26):3801-14 (2003); Bielinska et al., "Mucosal Immunization with a Novel Nanoemulsion-Based Recombinant Anthrax Protective Antigen Vaccine Protects against Bacillus anthracis Spore Challenge," Infect Immun., 75(8): 4020-9 (2007); Bielinska et al., "Nasal Immunization with a Recombinant HIV gp120 and Nanoemulsion Adjuvant Produces Th1 Polarized Responses and Neutralizing Antibodies to Primary HIV Type 1 Isolates," AIDS Research and Human Retroviruses, 24(2): 271-81 (2008); Bielinska et al., "A Novel, Killed-Virus Nasal Vaccinia Virus Vaccine," Clin. Vaccine Immunol., 15(2): 348-58 (2008); Warren et al., “Pharmacological and Toxicological Studies on Cetylpyridinium Chloride, A New Germicide,” J. Pharmacol. Exp. Ther., 74:401-8) (1942))。このような抗原の例としては、炭疽(Bielinska et al., Infect. Immun., 75(8): 4020-9 (2007))、完全なワクシニアウイルス(Bielinska et al.,  Clin. Vaccine Immunol., 15(2): 348-58 (2008))またはヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０タンパク質(Bielinska et al., AIDS Research and Human Retroviruses. 24(2): 271-81 (2008))の防御抗原（ＰＡ）が含まれる。これらの研究は、ＲＳＶ抗原を含む様々な抗原を伴うナノエマルションアジュバントの広範な適用を実証している。
【００３６】
本発明の一実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する液滴と、（ａ）水相；（ｂ）約１％の油〜約８０％の油；（ｃ）約０．１％〜約５０％の有機溶媒；（ｄ）約０．００１％〜約１０％の界面活性剤または洗剤；または（ｅ）それらの任意の組合せとを含んでなる。本発明の別の実施形態では、ナノエマルションワクチンは、（ａ）水相；（ｂ）約１％の油〜約８０％の油；（ｃ）約０．１％〜約５０％の有機溶媒；（ｄ）約０．００１％〜約１０％の界面活性剤または洗剤；および（ｅ）ＲＳＶのＦおよびＧ表面抗原またはその免疫原性フラグメントを含んでなる。本発明の別の実施形態では、ナノエマルションは有機溶媒を含まない。
【００３７】
ナノエマルションおよび／またはナノエマルションワクチン中に存在する各成分の量は、治療用ナノエマルションおよび／またはナノエマルションＲＳＶワクチンを指す。
【００３８】
これらの方法は、被験体にナノエマルションＲＳＶワクチンを投与することを含み、ここで、ナノエマルションワクチンは、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する液滴を含んでなる。本発明の例示的実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは、（ａ）水相、（ｂ）少なくとも１種類の油、（ｃ）少なくとも１種類の界面活性剤、（ｄ）少なくとも１種類の有機溶媒、（ｅ）ＲＳＶ表面抗原ＦおよびＧタンパク質をさらに含んでなり、および（ｆ）任意選択により少なくとも１種類のキレート剤、またはそれらの任意の組合せを含んでなる。本発明の別の実施形態では、ナノエマルションは有機溶媒を含まない。
【００３９】
一実施形態では、成人、高齢被験者、若年被験者、乳児、高リスク被験者、妊婦、および免疫不全被験者から選択される被験者である。別の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは鼻腔内に投与可能である。
【００４０】
本ナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチン組成物は、他の粘膜経路の鼻腔内経路によるなど任意の薬学上許容される経路によって送達することができる。他の例示的な薬学上許容される方法としては、鼻腔内、口内、舌下、経口、直腸、眼内、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、大槽内、腹膜内）、肺、腟内、局部投与、局所投与、乱刺後の局所投与、粘膜投与、エアゾールを介した投与、または頬側もしくは鼻腔スプレー製剤を介した投与が含まれる。さらに、本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、液体分散物、ゲル、エアゾール、肺エアゾール、鼻腔エアゾール、軟膏、クリーム、半固体剤形、または懸濁液などの任意の薬学上許容される剤形に製剤化することができる。さらに、本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、放出制御製剤、徐放製剤、即放製剤、またはそれらの任意の組合せであり得る。さらに、本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、パッチなどの経皮的送達系であってもよく、または加圧もしくは空気圧装置（すなわち、「遺伝子銃」）により投与してもよい。
【００４１】
Ａ．ＲＳＶ  Ｌ１９株
本発明の一実施形態では、本ナノエマルションＲＳＶワクチンに利用されるＲＳＶ株はＲＳＶ  Ｌ１９株である。さらに、本ナノエマルションＲＳＶ株に利用されるＦおよび／もしくはＧタンパク質、またはそれらの抗原性フラグメントは、ＲＳＶ  Ｌ１９株由来のものであり得る。
【００４２】
驚くことに、ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルスに感染した細胞は、ＲＳＶ  Ａ２ウイルスに感染した細胞の３〜１１倍の量のＲＳＶウイルスタンパク質を産生することが発見された（下記実施例６を参照）。本発明の一実施形態では、本発明のワクチン中に存在するＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス、より好ましくは、精製された弱毒化ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）Ｌ１９株（ＨＲＳＶ−Ｌ１９）を含むヒトＲＳＶ  Ｌ１９ウイルスである。本発明のさらに他の実施形態では、ＲＳＶウイルスゲノムは、限定されるものではないが、弱毒化表現型を表すヌクレオチド改変を含む少なくとも１つの弱毒化突然変異を含んでなり得る。さらに、本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス由来のＦもしくはＧタンパク質、またはそれらの抗原性フラグメントを含んでなり得る。
【００４３】
ＲＳＶ  Ｌ１９株は、マウスにおいて感染および呼吸器系疾患の増長（ＥＲＤ）を引き起こすことが分かっていた。さらに、公開されているデータは、それがナノエマルションとともに製剤化された場合、マウスにおいてＥＲＤを誘導することなく防御を付与したことを示していた。
【００４４】
ＲＳＶ  Ｌ１９単離株は、１９６７年１月３日にミシガン州アナーバーで、呼吸器系疾患を有するＲＳＶ感染小児からＷＩ−３８細胞として単離され、ＳＰＡＦＡＳ初代鶏腎細胞中で継代培養され、その後、ＳＰＡＦＡＳ初代鶏肺細胞で継代培養された後、ＭＲＣ−５細胞(Herlocher 1999)、次いでＨｅｐ２細胞(Lukacs 2006)に移行された。ＲＳＶ  Ｌ１９ゲノム（１５，１９１ｎｔ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ６１４８１３）とＲＳＶ  Ａ２株（１５，２２２ｎｔ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７４５６８）を比較すると、ゲノムの９８％が同一であることを示す。Ｌ１９とＡ２の間のコードの違いの大部分はＦ遺伝子およびＧ遺伝子にある。これら２株のアミノ酸アラインメントは、Ｆタンパク質は１４のアミノ酸差異（９７％同一）を持ち、Ｇタンパク質は２０のアミノ酸差異（９３％同一）を持つことを示した。
【００４５】
ＲＳＶ  Ｌ１９株は、気管内投与による１×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／マウスの接種(Lukacs 2006)を用いて粘液産生および有意なＩＬ−１３誘導を刺激することによりヒト感染を模倣する動物モデルにおいて実証されている。
【００４６】
重要かつ独特なことに、ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス株は、他の株よりも有意に高いＦタンパク質生産量（１ＰＦＵ当たりおよそ１０〜３０倍超）を産生するという点で独特である。Ｆタンパク質含量は免疫原性において重要な因子であり得、Ｌ１９株は現在のところ最もロバストな免疫応答を惹起する。Ｌ１９株は増殖期間がより短く、従って、製造上の見通しからより効率的であろう。
【００４７】
最も著しくは、ナノエマルション不活化・アジュバントＲＳＶ  Ｌ１９ワクチンは、一般的に受け入れられているコットンラットモデルにおいて免疫原性が高い。コットンラットは、１回の免疫後に抗体力価の上昇を惹起し、２回目の免疫後に著しい免疫増強（およそ１０倍増）を惹起する。生成された抗体は生ウイルスの中和に極めて有効であり、中和と抗体力価の間には直線的関係がある。さらに、コットンラットで生成された抗体は、ＲＳＶ  Ｌ１９株で免疫し、ＲＳＶ  Ａ２株で抗原投与した場合に交差防御を示した。ＩＭおよびＩＮ免疫とも、２回目の追加免疫として抗原に曝露した後にも、または生ウイルスに曝露した後にも呼び出しまたは想起が可能な記憶を確立した。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、本発明のＲＳＶワクチンは、そのワクチン中には存在しない少なくとも１つの他のＲＳＶ株に対して交差反応性がある（または１以上のＲＳＶ株に対して交差反応性がある）。当業者に知られているように、交差反応性は、下記のように測定可能である：１）ワクチン接種した動物または個人由来の血清が、投与されたワクチンには使用されていなかった株に対して抗体を産生するかどうかを知るためにＥＬＩＳＡ法を用いる；２）免疫細胞は、投与されたワクチンには使用されていなかった株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏにて刺激した際にサイトカインを生じる。交差防御は、ある株を接種した動物の血清中の抗体が、投与されたワクチンには使用されていない別のウイルスの感染力を中和する場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定可能である。
【００４９】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、「約」は当業者に理解され、それが用いられる文脈によってある程度まで可変である。それが用いられる文脈を考慮して当業者に明らかでない用語が使用されている場合には、「約」はその特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００５０】
ＲＳＶ表面抗原の「抗原性フラグメント」とは、好ましくは、天然型または突然変異型ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはＲＳＶ  Ｇタンパク質の少なくとも約５個の連続するアミノ酸を有するペプチドを意味する。抗原性フラグメントは、例えば約５アミノ酸長からＦまたはＧタンパク質の全長以内までの、任意の好適な長さであってよい。Ｆタンパク質は約５１８アミノ酸長であり、Ｇタンパク質は約２４２アミノ酸長である。例えば、抗原性フラグメントはまた、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０などから、Ｇタンパク質抗原性フラグメントでは約２４２アミノ酸長まで、Ｆタンパク質抗原性フラグメントでは約５１８アミノ酸長である。
【００５１】
用語「ナノエマルション」は、本明細書で使用する場合、小型の水中油型分散物または液滴、ならびに水不混和性油相が水相と混合された際に、極性残基（すなわち、長鎖炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭基を水に向ける、疎水性力の結果として形成し得る他の脂質構造を含む。これらの他の脂質構造には、限定されるものではないが、単層、少数層、および多層の脂質小胞、ミセル、および層状の相が含まれる。本発明は、当業者ならば、本明細書に開示される具体的実施形態を理解するために必要があればこの区別を認識できると考える。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、または免疫応答を惹起することができる１以上のエピトープ（直鎖、コンフォメーション、一連のもの、Ｔ細胞）を含み得る誘導体もしくはフラグメントを意味する。抗原は、単離されたウイルスタンパク質またはペプチド誘導体として分離することができる。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「Ｆタンパク質」は、ＲＳＶ融合タンパク質の全または部分的アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書で使用する場合、Ｆタンパク質には、ＲＳＶ融合タンパク質／ポリペプチドのＦ１もしくはＦ２のいずれか、または両方の成分が含まれる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「Ｇタンパク質」は、ＲＳＶ  Ｇ接着タンパク質／ポリペプチドの全または部分的アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、その本来の場所から独立したタンパク質、糖タンパク質、ペプチド誘導体、またはフラグメントもしくはポリヌクレオチドを意味する。組換え遺伝学的手段によって独立に得られるウイルス成分は一般に、相対的に精製された産物をもたらす。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は、抗原（例えば、ＲＳＶ表面抗原）に対する免疫応答を増強する薬剤を意味する。本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」は、被験体の免疫系が外来と認識する免疫原（すなわち、抗原）に対する、免疫系による被験体（例えば、ヒトまたは他の動物）の応答を意味する。免疫応答には、細胞媒介性免疫応答（免疫系の抗原特異的Ｔ細胞および非特異的細胞−Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７により媒介される応答）と体液性免疫応答（抗体により媒介される応答）の両方が含まれる。用語「免疫応答」は、免疫原（例えば、ＲＳＶ表面抗原）に対する初期の「先天免疫応答」と「後天免疫」の結果である記憶応答の両方を包含する。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「ＲＳＶ表面抗原」は、ＲＳＶウイルスのエンベロープに由来するタンパク質、糖タンパク質およびペプチドフラグメントを意味する。好ましいＲＳＶ表面抗原は、ＦおよびＧタンパク質である。ＲＳＶ表面抗原は一般に、感染細胞培養物からのウイルス単離物から抽出されるか、または合成よるか、もしくは組換えＤＮＡ法により作出される。ＲＳＶ表面抗原は、化学的、遺伝的または酵素的手段によって改変して融合タンパク質、ペプチドまたはフラグメントを得ることができる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「免疫原」は、被験体において免疫応答を惹起することができる抗原を意味する。好ましい実施形態では、免疫原は、本発明のナノエマルションと組み合わせて投与した場合に、免疫原（例えば、病原体または病原体生成物）に対して免疫を惹起する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「免疫増強」は、本発明のワクチンが投与されなかった場合の後天免疫のレベルに比べての、本発明のワクチンの投与後に所与の病原体に対する後天免疫レベルの増強を意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「ビリオン」は、感染哺乳動物細胞培養物から得られる、単離された成熟型呼吸器合胞体ウイルス粒子を意味する。本明細書で使用する場合、ビリオンは、ＲＳＶ−１またはＲＳＶウイルス粒子のいずれかを意味し得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「多価ワクチン」は、単一のウイルス病原体または複数の株の２以上の抗原決定基を含んでなるワクチンを意味する。本明細書で使用する場合、多価ワクチンは、複数のＲＳＶウイルス表面抗原Ｆ、Ｆ１、Ｆ２およびＧタンパク質を含んでなる。多価ワクチンは、ＲＳＶ−１およびＲＳＶ−２の両方に由来する抗原を用いて構築することができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「不活化」ＲＳＶは、宿主細胞に感染することができず、かつ、関係のある動物モデルにおいて非感染性であるビリオン粒子を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「サブユニット」は、個々の、またはワクチン組成物を含んでなるナノエマルションとさらに混合された、単離され、かつ、一般的には精製されたＲＳＶ糖タンパク質を意味する。サブユニットワクチン組成物は、成熟ビリオン、細胞、または細胞もしくはビリオンの溶解液を含まない。サブユニットワクチンに含まれるウイルス表面抗原を得る方法は、標準的な組換え遺伝学的技術および合成方法を使用し、標準的な精製プロトコールを用いて実施することができる。
【００６４】
ＩＩＩ．ナノエマルションＲＳＶワクチンの特性決定
Ａ．安定性
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、約４０℃、相対湿度約７５％で、少なくとも最大約２日、少なくとも最大約２週間、少なくとも最大約１か月、少なくとも最大約３か月、少なくとも最大約６か月、少なくとも最大約１２か月、少なくとも最大約１８か月、少なくとも最大約２年、少なくとも最大約２．５年、または少なくとも最大約３年の期間安定であり得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、約２５℃、相対湿度約６０％で、少なくとも最大約２日、少なくとも最大約２週間、〜約１か月、少なくとも最大約３か月、少なくとも最大約６か月、少なくとも最大約１２か月、少なくとも最大約１８か月、少なくとも最大約２年、少なくとも最大約２．５年、または少なくとも最大約３年、少なくとも最大約３．５年、少なくとも最大約４年、少なくとも最大約４．５年、または少なくとも最大約５年の期間安定であり得る。
【００６６】
さらに、本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、約４℃で、少なくとも最大約１か月、少なくとも最大約３か月、少なくとも最大約６か月、少なくとも最大約１２か月、少なくとも最大約１８か月、少なくとも最大約２年、少なくとも最大約２．５年、少なくとも最大約３年、少なくとも最大約３．５年、少なくとも最大約４年、少なくとも最大約４．５年、少なくとも最大約５年、少なくとも最大約５．５年、少なくとも最大約６年、少なくとも最大約６．５年、または少なくとも最大約７年の期間安定であり得る。
【００６７】
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、約−２０℃で、少なくとも最大約１か月、少なくとも最大約３か月、少なくとも最大約６か月、少なくとも最大約１２か月、少なくとも最大約１８か月、少なくとも最大約２年、少なくとも最大約２．５年、少なくとも最大約３年、少なくとも最大約３．５年、少なくとも最大約４年、少なくとも最大約４．５年、少なくとも最大約５年、少なくとも最大約５．５年、少なくとも最大約６年、少なくとも最大約６．５年、または少なくとも最大約７年の期間安定であり得る。
【００６８】
これらの安定性パラメーターは、ナノエマルションアジュバントおよび／またはナノエマルションＲＳＶワクチンにも適用可能である。
【００６９】
Ｂ．免疫応答
被験体の免疫応答は、ナノエマルションＲＳＶワクチンの投与後にＲＳＶ免疫原に対する抗体の力価および／または存在を決定して免疫原に対する体液性応答を評価することによって測定することができる。血清転換とは、免疫原に対する特異的抗体の生成を意味し、これを用いて防御免疫応答の存在を評価してもよい。このような抗体に基づく検出は、多くの場合、ウエスタンブロット法または酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイまたは血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて測定される。当業者ならば適当な検出方法を容易に選択および使用することができるであろう。
【００７０】
被験体の免疫応答を測定するための別法は、免疫原特異的細胞応答（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）または免疫原特異的リンパ球増殖アッセイを介するものなど、細胞性免疫応答を測定することである。さらに、病原体による抗原投与を用いて、被験体、またはより大きな可能性としては動物モデルのいずれかで免疫応答を測定することもできる。当業者ならば被験体の免疫応答を決定する方法を精通しており、本発明はいずれの特定の方法にも限定されない。
【００７１】
本発明の開発の過程で行った実験で、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に付加され、鼻腔内に投与されたナノエマルションは安全かつ有効なＢ型肝炎ワクチンであることが実証された。粘膜用ワクチンは、Ｔｈ１関連の細胞性免疫応答とともに中和抗体の産生を誘導した。ＨＢｓＡｇナノエマルション混合物の１回の鼻腔免疫で血清抗体の急速な誘導がもたらされ、この誘導は現行で投与されている筋肉内ワクチンに匹敵していた。さらに、抗体応答における親和性成熟も実証され、ワクチンの潜在的有効性が予想される(Makidon et al., 2008)。
【００７２】
最も重要には、以下の実施例に詳説されるように、ナノエマルション中に製剤化され、鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）投与されたＲＳＶワクチンは全て、免疫動物の感染を防ぐ防御免疫応答を惹起した。さらに、ナノエマルション不活化・アジュバントＲＳＶワクチンは、一般的に受け入れられているコットンラットモデルにおいて高い免疫原性がある。コットンラットは、１回の免疫後に抗体力価の上昇を惹起し、２回目の免疫後に著しい免疫増強（およそ１０倍増）を惹起した。生成された抗体は生ウイルスの中和に極めて有効であり、中和と抗体力価の間には直線的関係がある。さらに、コットンラットで生成された抗体は、ＲＳＶ  Ｌ１９株で免疫し、ＲＳＶ  Ａ２株で抗原投与した場合に交差防御を示した。ＩＭおよびＩＮ免疫とも、２回目の追加免疫として抗原に曝露した後にも、または生ウイルスに曝露した後にも呼び出しまたは想起が可能な記憶を確立した。
【００７３】
ワクチン防御有効性のもう１つの出現成分は、Ｔ−ヘルパー−１７（Ｔｈ１７）サイトカイン応答の誘導である。ＩＬ−１７が病原体に対する正常な免疫応答に寄与するという実証はさらに、ワクチン接種戦略の妥当性を示すためにも利用されている(DeLyrica et al. 2009; Conti et al., 2009)。本発明の開発において、ナノエマルションによる粘膜免疫は、Ｔｈ１およびＴｈ１７免疫の活性化にアジュバント効果をもたらすことができる。ナノエマルションによる粘膜免疫は、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の誘導を直接助ける先天免疫の活性化をもたらした。これらの結果はさらに、不活化されたＲＳＶビリオンに対する細胞性免疫の誘導に関するワクチン接種分野において重要なナノエマルションの免疫増強特性を明らかにする(Bielinska et al., 2010; Lindell et al, 2011)。
【００７４】
Ｃ．ウイルスの不活化
ワクチンは、特にワクチンが完全なウイルスを含んでなる場合には、例えば、ワクチンが、それが治療および／または予防する疾患を引き起こさないようにするために、不活化されたウイルスを含んでなる必要がある。言い換えれば、ウイルスの不活化は、そのワクチンが感染性粒子を含まないことを保証する。アプローチは、ホルマリンによるウイルスの不活化を含んでいた。しかしながら、ホルマリンで不活化されたワクチンは、疾患増長の回避に重要な免疫応答の歪曲の兆候、および防御免疫応答に不可欠である成熟樹状細胞によるプライミングを含む疾患増長を示した。弱毒生ワクチンの使用は、それらのワクチンが最小の免疫原性しかないことが示されていることから、限定された成功に直面した。
【００７５】
本発明の方法および組成物では、ナノエマルションは、完全なウイルスおよび／またはウイルス抗原を不活化し、アジュバントとなる働きをして非感染性かつ免疫原性のウイルスを提供する。あるいは、ウイルス（完全体または抗原）はナノエマルションと合わせる前に不活化することもできる。ウイルス不活化の化学的方法の例には、限定されるものではないが、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトン（β−ＰＬ）が含まれ、ウイルス不活化の物理的方法には熱もしくは放射線の使用、または非感染性粒子を産生するための分子遺伝学的手段によるものが含まれる。ナノエマルションとワクチン候補を単に混合することで、粘膜免疫応答と全身免疫応答の両方が得られることが示されている。ＲＳＶビリオン粒子とナノエマルションを混合すると、液滴の油核中に抗原粒子が離散した状態となる。抗原はこの核の中に組み込まれ、これにより、抗原を正常な抗原コンフォメーションを促す遊離形態とすることができる。
【００７６】
ＩＶ．ナノエマルションＲＳＶワクチン
Ａ．ＲＳＶ免疫原
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチン中に存在するＲＳＶ免疫原は、Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、および／またはそれらの抗原性フラグメントなどのＲＳＶ表面抗原である。Ｆタンパク質、Ｇタンパク質およびそれらの抗原性フラグメントは、いずれの既知のＲＳＶ株から得ることもできる。さらに、ＲＳＶワクチンは、ＲＳＶの天然株、組換え株、および突然変異株を含む完全なＲＳＶウイルスを含んでなることができ、これが１以上のＲＳＶ抗原と組み合わせられる。本発明の一実施形態では、ＲＳＶウイルスは、アシクロビル耐性など、１以上の抗ウイルス薬に耐性であってもよい。本発明のワクチンには任意の既知のＲＳＶ株を使用することができる。本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、２株以上のＲＳＶに由来するＲＳＶ完全ウイルス、ならびに２株以上のＲＳＶに由来するＲＳＶ抗原を含んでなることができる。
【００７７】
ＲＳＶの有用株の例としては、限定されるものではないが、サブグループＡおよびＢ遺伝子型を含む任意のＲＳＶ株、ならびにＡＴＣＣに寄託されたＲＳＶ株、例えば、（１）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１５４０として寄託されているヒトＲＳＶ  Ａ２株；（２）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２６として寄託されているヒトＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株；（３）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−７９４として寄託されているウシＲＳＶ  Ａ  ５１９０８株；（４）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−９５５として寄託されているヒトＲＳＶ  ９３２０株；（５）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１３３９として寄託されているウシＲＳＶ  ３７５株；（６）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１４００として寄託されているヒトＲＳＶ  Ｂ  ＷＶ／１４６１７／８５株；（７）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１４８５として寄託されているウシＲＳＶアイオワ株（ＦＳ１−１）；（８）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１４８６として寄託されているヤギＲＳＶ  ＧＲＳＶ株；（９）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１５８０として寄託されているヒトＲＳＶ  １８５３７株；（１０）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１５４０Ｐとして寄託されているヒトＲＳＶ  Ａ２株；（１１）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５０として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株Ａ２  ｃｐｔｓ−２４８；（１２）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５１として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株Ａ２  ｃｐｔｓ−５３０／１００９；（１３）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５２として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株Ａ２  ｃｐｔｓ−５３０；（１４）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５３として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株Ａ２  ｃｐｔｓ−２４８／９５５；（１５）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５４として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株Ａ２  ｃｐｔｓ−２４８／４０４；（１６）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５５として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株Ａ２  ｃｐｔｓ−５３０／１０３０；（１７）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２５７９として寄託されているＲＳＶ突然変異株サブグループＢ  ｃｐ２３クローン１Ａ２；および（１８）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２５４２として寄託されているヒトＲＳＶ突然変異株サブグループＢ、Ｂ１株、ｃｐ５２クローン２Ｂ５が含まれる。
【００７８】
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンでは、任意の好適な量のＲＳＶ免疫原を使用することができる。例えば、本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、約１００μｇ未満のＲＳＶ免疫原（合計ＲＳＶ免疫原であって、各ＲＳＶ免疫原ではない）を含んでなり得る。本発明の別の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは、約９０μｇ未満、約８０μｇ未満、約７０μｇ未満、約６０μｇ未満、約５０μｇ未満、約４０μｇ未満、約３０μｇ未満、約２０μｇ未満、約１５μｇ未満、約１０μｇ未満、約９μｇ未満、約８μｇ未満、約７μｇ未満、約６μｇ未満、約５μｇ未満、約４μｇ未満、約３μｇ未満、約２μｇ未満、または約１μｇ未満のＲＳＶ免疫原（合計ＲＳＶ免疫原であって、各ＲＳＶ免疫原ではない）を含んでなり得る。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、本発明のＲＳＶワクチンは、約１．０×１０５ｐｆｕ（プラーク形成単位（ｐｆｕ））、最大約１．０×１０８ｐｆｕ、およびその間の任意の量のＲＳＶウイルスまたは抗原を含んでなる。ＲＳＶウイルスまたは抗原は、ナノエマルションアジュバントの存在により不活化される。例えば、本ＲＳＶワクチンは、約１．０×１０５、１．１×１０５、１．２×１０５、１．３×１０５、１．４×１０５、１．５×１０５、１．６×１０５、１．７×１０５、１．８×１０５、１．９×１０５、２．０×１０５、２．１×１０５、２．２×１０５、２．３×１０５、２．４×１０５、２．５×１０５、２．６×１０５、２．７×１０５、２．８×１０５、２．９×１０５、３．０×１０５、３．１×１０５、３．２×１０５、３．３×１０５、３．４×１０５、３．５×１０５、３．６×１０５、３．７×１０５、３．８×１０５、３．９×１０５、４．０×１０５、４．１×１０５、４．２×１０５、４．３×１０５、４．４×１０５、４．５×１０５、４．６×１０５、４．７×１０５、４．８×１０５、４．９×１０５、５．０×１０５、５．５×１０５、６．０×１０５、６．５×１０５、７．０×１０５、７．５×１０５、８．０×１０５、８．５×１０５、９．０×１０５、９．５×１０５、１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、７．０×１０６、７．５×１０６、８．０×１０６、８．５×１０６、９．０×１０６、９．５×１０６、１．０×１０７、１．５×１０７、２．０×１０７、２．５×１０７、３．０×１０７、３．５×１０７、４．０×１０７、４．５×１０７、５．０×１０７、５．５×１０７、６．０×１０７、６．５×１０７、７．０×１０７、７．５×１０７、８．０×１０７、８．５×１０７、９．０×１０７、９．５×１０７、１．０×１０８ｐｆｕのＲＳＶウイルスを含んでなり得る。
【００８０】
本発明の一実施形態では、本ＲＳＶワクチンは、ＲＳＶ株のＦおよび／またはＧタンパク質、例えば限定されるものではないが、ＲＳＶ  Ｌ１９株のＦおよび／またはＧタンパク質を含んでなる。別の実施形態では、本ＲＳＶワクチンは、約０．１μｇ、最大約１００μｇ、およびその間の任意の量のＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質、例えば、ＲＳＶ  Ｌ１９株のＦおよび／またはＧタンパク質を含んでなる。例えば、本ＲＳＶワクチンは、約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１．０μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２．０μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、約３．０μｇ、約３．１μｇ、約３．２μｇ、約３．３μｇ、約３．４μｇ、約３．５μｇ、約３．６μｇ、約３．７μｇ、約３．８μｇ、約３．９μｇ、約４．０μｇ、約４．１μｇ、約４．２μｇ、約４．３μｇ、約４．４μｇ、約４．５μｇ、約４．６μｇ、約４．７μｇ、約４．８μｇ、約４．９μｇ、約５．０μｇ、約５．１μｇ、約５．２μｇ、約５．３μｇ、約５．４μｇ、約５．５μｇ、約５．６μｇ、約５．７μｇ、約５．８μｇ、約５．９μｇ、約６．０μｇ、約６．１μｇ、約６．２μｇ、約６．３μｇ、約６．４μｇ、約６．５μｇ、約６．６μｇ、約６．７μｇ、約６．８μｇ、約６．９μｇ、約７．０μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０．０μｇ、約１０．５μｇ、約１１．０μｇ、約１１．５μｇ、約１２．０μｇ、約１２．５μｇ、約１３．０μｇ、約１３．５μｇ、約１４．０μｇ、約１４．５μｇ、約１５．０μｇ、約１５．５μｇ、約１６．０μｇ、約１６．５μｇ、約１７．０μｇ、約１７．５μｇ、約１８．０μｇ、約１８．５μｇ、約１９．０μｇ、約１９．５μｇ、約２０．０μｇ、約２１．０μｇ、約２２．０μｇ、約２３．０μｇ、約２４．０μｇ、約２５．０μｇ、約２６．０μｇ、約２７．０μｇ、約２８．０μｇ、約２９．０μｇ、約３０．０μｇ、約３５．０μｇ、約４０．０μｇ、約４５．０μｇ、約５０．０μｇ、約５５．０μｇ、約６０．０μｇ、約６５．０μｇ、約７０．０μｇ、約７５．０μｇ、約８０．０μｇ、約８５．０μｇ、約９０．０μｇ、約９５．０μｇ、または約１００．０μｇのＲＳＶ  Ｆタンパク質、例えば、ＲＳＶ  Ｌ１９株のＦタンパク質を含んでなり得る。
【００８１】
本発明のワクチン中に存在するＲＳＶ免疫原は、（１）ＲＳＶ  Ｆタンパク質、（２）ＲＳＶ  Ｇタンパク質、（３）ＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性フラグメント、（４）ＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫原性フラグメント、（５）ＲＳＶ  Ｆタンパク質の誘導体、（６）ＲＳＶ  Ｇタンパク質の誘導体、（７）ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性フラグメントを含んでなる融合タンパク質、（８）ＲＳＶ  Ｇタンパク質またはＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫原性フラグメントを含んでなる融合タンパク質、（９）またはそれらの任意の組合せであり得る。好ましくは、本発明のＲＳＶワクチンは、少なくとも１つのＦタンパク質免疫原と少なくとも１つのＧタンパク質免疫原とを含んでなる。
【００８２】
本発明の一実施形態では、Ｇタンパク質の免疫原性フラグメントは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含んでなる。他の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇタンパク質フラグメントは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の約４、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約２８０、約２８５、約２８９、約２９０、約２９５、または約２９９個の連続するアミノ酸を含んでなる。ＲＳＶ  Ｇ糖タンパク質は、約２８９〜約２９９個のアミノ酸（ウイルス株による）を有する。Ｇ免疫原性タンパク質フラグメント内で保存的アミノ酸置換を行ってＧタンパク質誘導体を作出することができる。
【００８３】
本発明の別の実施形態では、Ｆタンパク質の免疫原性フラグメントは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含んでなる。他の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質フラグメントは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の約４、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、または約５００個の連続するアミノ酸を含んでなる。Ｆ免疫原性タンパク質フラグメント内で保存的アミノ酸置換を行ってＦタンパク質誘導体を作出することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、Ｆタンパク質誘導体は免疫原性があり、Ｆタンパク質と、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、または５０％からなる群から選択される同一性％を有する。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質誘導体は免疫原性があり、Ｇタンパク質と、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、または５０％からなる群から選択される同一性％を有する。
【００８５】
一実施形態では、ワクチン組成物は、単離されたウイルス表面抗原ＦおよびＧタンパク質と、好ましい水中油型ナノエマルションとともに混合した単離された完全なＲＳＶビリオン粒子との組合せで構築される。
【００８６】
Ｂ．ナノエマルション
１．液滴サイズ
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、約１，０００ｎｍ未満、約９５０ｎｍ未満、約９００ｎｍ未満、約８５０ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７５０ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６５０ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５５０ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４５０ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３５０ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２２０ｎｍ未満、約２１０ｎｍ未満、約２０５ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１９５ｎｍ未満、約１９０ｎｍ未満、約１７５ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍより大きい、約７０ｎｍより大きい、約１２５ｎｍより大きい、またはそれらの任意の組合せの平均直径を有する液滴を含んでなる。一実施形態では、前記液滴は、約１２５ｎｍより大きく約６００ｎｍ以下の平均直径を有する。異なる実施形態では、前記液滴は、約５０ｎｍより大きく、または約７０ｎｍより大きく、約１２５ｎｍ以下の平均直径を有する。
【００８７】
２．水相
水相は、限定されるものではないが、水（例えば、Ｈ２Ｏ、蒸留水、精製水、注射水、脱イオン水、水道水）および溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を含むいずれの種類の水相も含んでなることができる。特定の実施形態では、水相は、ｐＨ約４〜１０、好ましくは約６〜８の水を含んでなる。水は脱イオン水（以下、「ＤｉＨ２Ｏ」）であり得る。いくつかの実施形態では、水相は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含んでなる。水相はさらに無菌かつ発熱物質不含であり得る。
【００８８】
３．有機溶媒
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチン中の有機溶媒としては、限定されるものではないが、Ｃ１−Ｃ１２アルコール、ジオール、トリオール、リン酸ジアルキル、リン酸トリアルキル、例えば、リン酸トリ−ｎ−ブチル、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。本発明の一態様において、有機溶媒は、非極性溶媒、極性溶媒、プロトン性溶媒、または非プロトン性溶媒から選択されるアルコールである。
【００８９】
ナノエマルションＲＳＶワクチンに好適な有機溶媒としては、限定されるものではないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、プロパノール、オクタノール、グリセロール、中鎖トリグリセリド、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸、ｎ−ブタノール、ブチレングリコール、芳香性アルコール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、ソルビトール、工業用メチル化アルコール、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、１，４−ジオキサン(1,4-dixoane)、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、ポリエチレングリコール、有機リン酸に基づく溶媒、それらの半合成誘導体、およびそれらの任意の組合せが含まれる。
【００９０】
４．油相
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチン中の油は、化粧品として許容されるまたは薬学上許容されるいずれの油であってもよい。油は揮発性であっても不揮発性であってもよく、動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーン油、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せから選択され得る。
【００９１】
好適な油としては、限定されるものではないが、鉱油、スクアレン油、香味油、シリコーン油(silicon oil)、精油、水不溶性ビタミン、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、アントラニル酸メンチル(Menthyl anthranhilate)、オクタン酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ネオペンチルグリコールジカプレートセトール類(neopentyl glycol dicarpate cetols)、セラフィル（登録商標）、オレイン酸デシル、アジピン酸ジイソプロピル、乳酸Ｃ１２−１５アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ネオペンタン酸イソステアリル、乳酸ミリスチル、ステアロイルステアリン酸イソセチル、ステアロイルステアリン酸オクチルドデシル、炭化水素油、イソパラフィン、流動パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガン油、カノーラ油、ラー油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、ブドウ種子油、カラシ油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、落花生油、パインシード油、ケシ種子油、パンプキン種子油、米糠油、ベニバナ油、茶油、トリュフ油、植物油、アプリコット（核）油、ホホバ油（simmondsia chinensis種子油）、ブドウ種子油、マカダミア油、麦芽油、アーモンド油、ナタネ油、ヒョウタン油、ダイズ油、ゴマ油、ヘーゼルナッツ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大麻油、ボア(Bois)油、ククイナッツ油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、オールスパイス油、杜松子油、種子油、アーモンド種子油、アニス種子油、セロリー種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、リーフ油、バジルリーフ油、ベイリーフ油、シナモンリーフ油、コモンセージリーフ油、ユーカリリーフ油、レモングラスリーフ油、メラルーカリーフ油、オレガノリーフ油、パチョリリーフ油、ペパーミントリーフ油、パインニードル油、ローズマリーリーフ油、スペアミントリーフ油、ティーツリーリーフ油、タイムリーフ油、冬緑油、フラワー油、カモミール油、クラリーセージ油、チョウジ油、ゼラニウムフラワー油、ヒソップフラワー油、ジャスミンフラワー油、ラベンダーフラワー油、マヌカフラワー油、マジョラムフラワー油(Mar
horam flower oil)、オレンジフラワー油、ローズフラワー油、イランイランフラワー油、樹皮油、桂皮油、シナモン樹皮油、サッサフラス樹皮油、木油、クスノキ油、セダーウッド油、シタン油、ビャクダン油）、根茎（ショウガ）木油、樹脂油、オリバナム油、ミルラ油、果皮油、ベルガモット果皮油、グレープフルーツ果皮油、レモン果皮油、ライム果皮油、オレンジ果皮油、タンジェリン果皮油、根部油、吉草油、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、それらの半合成誘導体、およびそれらの任意の組合せが含まれる。
【００９２】
油は、揮発性シリコーン成分などのシリコーン成分をさらに含んでなり、これはシリコーン成分中の唯一の油であってもよいし、または他のシリコーンおよび非シリコーン、揮発性および非揮発性油と組み合わせてもよい。好適なシリコーン成分としては、限定されるものではないが、メチルフェニルポリシロキサン、シメチコン、ジメチコン、フェニルトリメチコン（またはその有機修飾型)、高分子シリコーンのアルキル化誘導体、セチルジメチコン、ラウリルトリメチコン、高分子シリコーンのヒドロキシル化誘導体、例えば、ジメチコノール、揮発性シリコーン油、環状および直鎖シリコーン、シクロメチコン、シクロメチコンの誘導体、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、揮発性直鎖ジメチルポリシロキサン、イソヘキサデカン、イソエイコサン、イソテトラコサン、ポリイソブテン、イソオクタン、イソドデカン、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。
【００９３】
揮発性油は有機溶媒であってもよいし、または揮発性油は有機溶媒の他に存在してもよい。好適な揮発性油としては、限定されるものではないが、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、駆風薬、アズレン、メントール、カンファー、ツジョン、チモール、ネロール、リナロール、リモネン、ゲラニオール、ペリリルアルコール、ネロリドール、ファルネソール、イランゲン、ビサボロール、ファルネセン、アスカリドール、ケノポジ油、シトロネラール、シトラール、シトロネロール、カマズレン、セイヨウノコギリソウ、グアイアズレン、カモミール、半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。
【００９４】
本発明の一態様において、シリコーン成分中の揮発性油は、油相中の油と異なる。
【００９５】
５．界面活性剤
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチン中の界面活性剤は、薬学上許容されるイオン性界面活性剤、薬学上許容される非イオン性界面活性剤、薬学上許容される陽イオン性界面活性剤、薬学上許容される陰イオン性界面活性剤、または薬学上許容される両性イオン性界面活性剤であり得る。
【００９６】
例示的な有用界面活性剤は、引用することにより本明細書に具体的に組み込まれる、Applied Surfactants: Principles and Applications. Tharwat F. Tadros, Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 3-527-30629-3に記載されている。
【００９７】
さらに、界面活性剤は、薬学上許容されるイオン性高分子界面活性剤、薬学上許容される非イオン性高分子界面活性剤、薬学上許容される陽イオン性高分子界面活性剤、薬学上許容される陰イオン性高分子界面活性剤、または薬学上許容される両性イオン性高分子界面活性剤であってもよい。高分子界面活性剤の例として、限定されるものではないが、複数（少なくとも１つ）のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）側鎖を有するポリ（メチルメタクリレート）主鎖のグラフト共重合体、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシル化アルキルフェノールホルムアルデヒド縮合物、脂肪酸疎水性物質を有するポリアルキレングリコール修飾ポリエステル、ポリエステル、それらの半合成誘導体、またはそれらの組合せが含まれる。
【００９８】
界面活性薬剤または界面活性剤は、極性またはイオン性の親水性部分に結合している非極性疎水性部分、通常には、８〜１８個の炭素原子を含む直鎖または分岐した炭化水素またはフッ化炭素鎖からなる両親媒性分子である。親水性部分は、非イオン性、イオン性、または両性イオン性であり得る。炭化水素鎖は水性環境において水分子と弱く相互作用するが、極性またはイオン性の頭基は、双極子またはイオン−双極子相互作用によって水分子と強く相互作用する。親水性基の性質に基づいて、界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、非イオン性、および高分子の界面活性剤に分類される。
【００９９】
好適な界面活性剤としては、限定されるものではないが、９〜１０単位のエチレングリコールを含んでなるエトキシル化ノニルフェノール、８単位のエチレングリコールを含んでなるエトキシル化ウンデカノール、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、エトキシル化水素化リシン油、ラウリル硫酸ナトリウム、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのジブロック共重合体、エチレンオキシド−プロピレンオキシドブロック共重合体、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドに基づく四官能性ブロック共重合体、グリセリルモノエステル、カプリン酸グリセリル、カプリル酸グリセリル、グリセリルコケート(Glyceryl cocate)、エルカ酸グリセリル、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、ラノリン脂肪酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、グリセリルＰＡＢＡ、パルミチン酸グリセリル、リシノール酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、グリセリルチグリコレート(Glyceryl thiglycolate)、ジラウリン酸グリセリル、ジオレイン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、グリセリルセスイオレエート(Glyceryl sesuioleate)、ステアリン酸乳酸グリセリル、ポリオキシエチレンセチル／ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンコレステロールエーテル、ラウリン酸もしくはジラウリン酸ポリオキシエチレンラウレート、ステアリン酸もしくはジステアン酸ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ステロイド、コレステロール、βシトステロール、ビサボロール、アルコールの脂肪酸エステル、ミリスチン酸イソプロピル、ｎ−酪酸脂肪族イソプロピル、ｎ−ヘキサン酸イソプロピル、ｎ−デカン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル(Isoproppyl palmitate)、ミリスチン酸オクチルドデシル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシル化アミド、アルコキシル化糖誘導体、天然油および蝋のアルコキシル化誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、ノノキシノール−１４、ＰＥＧ−８ラウレート、ＰＥＧ−６コカミド、ＰＥＧ−２０メチルグルコースセスキステアレート、ＰＥＧ４０ラノリン、ＰＥＧ−４０ヒマシ油、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、グリセリルジエステル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、およびポリオキシエチレンラウリルエーテル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、またはそれらの混合物が含まれる。
【０１００】
さらなる好適な界面活性剤としては、限定されるものではないが、ラウリン酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、およびそれらの混合物などの非イオン性脂質が含まれる。
【０１０１】
さらなる実施形態において、界面活性剤は、約２〜約１００基の範囲のポリオキシエチレン頭基を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルであるか、または構造Ｒ５−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−ＯＨを有するアルコキシル化アルコールであり、式中、Ｒ５は、約６〜約２２個の炭素原子を有する分岐または非分岐のアルキル基であり、ｙは約４〜約１００であり、好ましくは約１０〜約１００である。好ましくは、アルコキシル化アルコールは、Ｒ５がラウリル基であり、ｙが２３の平均値を有する種である。
【０１０２】
異なる実施形態では、界面活性剤は、ラノリンアルコールのエトキシル化誘導体であるアルコキシ化アルコールである。好ましくは、ラノリンアルコールのエトキシル化誘導体は、平均エトキシル化値が１０であるラノリンアルコールのポリエチレングリコールエーテルであるラネス−１０である。
【０１０３】
非イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、エトキシル化界面活性剤、エトキシル化アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化モノアルカオールアミド(monoalkaolamide)、エトキシル化ソルビタンエステル、エトキシル化脂肪アミノ、エチレンオキシド−プロピレンオキシド共重合体、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ノノキシノール９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、クレモホール（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシルα−Ｄ−グルコピラノシド、デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシルα−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ−ヘキサデシルβ−Ｄ−マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ−１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアレート、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５プロピレングリコールステアレート、キラヤ樹皮からのサポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商��）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、タージトール１５−Ｓ−１２タイプ、タージトール１５−Ｓ−３０タイプ、タージトール１５−Ｓ−５タイプ、タージトール１５−Ｓ−７タイプ、タージトール１５−Ｓ−９タイプ、タージトールＮＰ−１０タイプ、タージトールＮＰ−４タイプ、タージトールＮＰ−４０タイプ、タージトールＮＰ−７タイプ、タージトールＮＰ−９タイプ、タージトール、タージトールＴＭＮ−１０タイプ、タージトールＴＭＮ−６タイプ、テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリトンＣＦ−２１、トリトンＣＦ−３２、トリトンＤＦ−１２、トリトンＤＦ−１６、トリトンＧＲ−５Ｍ、トリトンＱＳ−１５、トリトンＱＳ−４４、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１０２、トリトンＸ−１５、トリトンＸ−１５１、トリトンＸ−２００、トリトンＸ−２０７、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、トリトン（登録商標）Ｘ−１１４、トリトン（登録商標）Ｘ−１６５、トリトン（登録商標）Ｘ−３０５、トリトン（登録商標）Ｘ−４０５、トリトン（登録商標）Ｘ−４５、トリトン（登録商標）Ｘ−７０５−７０、ツイーン（登録商標）２０、ツイーン（登録商標）２１、ツイーン（登録商標）４０、ツイーン（登録商標）６０、ツイーン（登録商標）６１、ツイーン（登録商標）６５、ツイーン（登録商標）８０、ツイーン（登録商標）８１、ツイーン（登録商標）８５、チロキサポール、ｎ−ウンデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１０４】
さらに、非イオン性界面活性剤はポロキサマーであってよい。ポロキサマーは、ポリオキシエチレンのブロック、その後にポリオキシプロピレンのブロック、その後にポリオキシエチレンのブロックで構成される高分子である。ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンの単位の平均数は、その高分子に付いている数字に基づいて変化する。例えば、最小の高分子であるポロキサマー１０１は、平均２単位のポリオキシエチレンを持つブロック、平均１６単位のポリオキシプロピレンを持つブロック、その後に平均２単位のポリオキシエチレンを持つブロックからなる。ポロキサマーは、無色の液体およびペーストから白色固体までに及ぶ。化粧品およびパーソナルケア製品では、ポロキサマーは、皮膚清浄剤、入浴製品、シャンプー、ヘアコンディショナー、うがい液、アイメークアップ除去剤、ならびに他のスキンおよびヘア製品の製剤に用いられる。ポロキサマーの例としては、限定されるものではないが、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１０５ベンゾエート、およびポロキサマー１８２ジベンゾエートが含まれる。
【０１０５】
好適な陽イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、第四級アンモニウム化合物、塩化アルキルトリメチルアンモニウム化合物、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム化合物、陽イオン性ハロゲン含有化合物、例えば、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、塩化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、テトラクロロヨウ素酸ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、グリニャード試薬Ｔ、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂−１，３−ジアミノプロパン、臭化トンゾニウム、臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウム、１，３，５−トリアジン−１，３，５（２Ｈ，４Ｈ，６Ｈ）−トリエタノール、１−デカナミニウム、塩化Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化２−（２−（ｐ−（ジイソブチル）クレゾスキシ(cresosxy)）エトキシ）エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化２−（２−（ｐ−（ジイソブチル）フェノキシ）エトキシ）エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキル１または３ベンジル−１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリニウム、塩化アルキルビス（２−ヒドロキシエチル）ベンジルアンモニウム、塩化アルキルデメチル(demethyl)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチル３，４−ジクロロベンジルアンモニウム（１００％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチル３，４−ジクロロベンジルアンモニウム（５０％Ｃ１４、４０％Ｃ１２、１０％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチル３，４−ジクロロベンジルアンモニウム（５５％Ｃ１４、２３％Ｃ１２、２０％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（１００％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウ（１００％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（４１％Ｃ１４、２８％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（４７％Ｃ１２、１８％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（５５％Ｃ１６、２０％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（５８％Ｃ１４、２８％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６０％Ｃ１４、２５％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６１％Ｃ１１、２３％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６１％Ｃ１２、２３％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６５％Ｃ１２、２５％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６７％Ｃ１２、２４％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６７％Ｃ１２、２５％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（９０％Ｃ１４、５％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（９３���Ｃ１４、４％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（９５％Ｃ１６、５％Ｃ１８）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジデシルジメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（Ｃ１２−１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（Ｃ１２−１８）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルジメチルベンジルアンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム（９０％Ｃ１４、５％Ｃ１６、５％Ｃ１２）、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム（ダイズ油の脂肪酸の場合にはアルキル基およびアルケニル基の混合物）、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム（６０％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウム（５０％Ｃ１２、３０％Ｃ１４、１７％Ｃ１６、３％Ｃ１８）、塩化アルキルトリメチルアンモニウム（５８％Ｃ１８、４０％Ｃ１６、１％Ｃ１４、１％Ｃ１２）、塩化アルキルトリメチルアンモニウム（９０％Ｃ１８、１０％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチル（エチルベンジル）アンモニウム（Ｃ１２−１８）、塩化ジ−（Ｃ８−１０）−アルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルメチルベンジルアンモニウム、塩化ジ
デシルジメチルアンモニウム、塩化ジイソデシルジメチルアンモニウム、塩化ジオクチルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルビス（２−ヒドロキシエチル）オクチル水素アンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ドデシルカルバモイルメチルジネチル(dinethyl)ベンジルアンモニウム、塩化ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウム、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジン、塩化ミリスタルコニウム（および）Ｑｕａｔ  ＲＮＩＵＭ１４、塩化Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシプロピルアンモニウム重合体、塩化ｎ−テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム一水和物、塩化オクチルデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルドデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチフェノキシエトキシエチル(Octyphenoxyethoxyethyl)ジメチルベンジルアンモニウム、オキシジエチレンビス（アルキルジメチルアンモニウムクロリド）、第四級アンモニウム化合物、塩化ジココアルキルジメチル、トリメトキシシリ(Trimethoxysily)プロピルジメチルオクタデシルアンモニウム、トリメトキシシリルクワット(Trimethoxysilyl quats)、塩化トリメチルドデシルベンジルアンモニウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１０６】
例示的な陽イオン性ハロゲン含有化合物としては、限定されるものではないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスホニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム、またはハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。いくつかの特定の実施形態では、好適な陽イオン性ハロゲン含有化合物としては、限定されるものではないが、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルベンジルジメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム（ＣＰＢ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチジメチルエチルアンモニウム(cetyidimethylethylammonium)、臭化セチルトリブチルホスホニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、および臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。特に好ましい実施形態では、陽イオン性ハロゲン含有化合物はＣＰＣであるが、本発明の組成物は、特定の陽イオン性含有化合物を用いた製剤に限定されない。
【０１０７】
好適な陰イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシまたはヒツジ胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、ドキュセートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、合成グリココール酸ナトリウム塩水和物、合成グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸３−硫酸二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン溶液、Ｎ−ラウロイルサルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール溶液、Ｎｉａｐｒｏｏｆ  ４、Ｔｙｐｅ  ４、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−ブタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、１−ノナンスルホン酸ナトリウム、１−プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム無水物、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム無水物、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸(Taurohyodeoxycholic acid)ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸３−硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）ドデシル硫酸、ツイーン（登録商標）８０、ウルソデオキシコール酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１０８】
好適な両性イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、Ｎ−アルキルベタイン、ラウリルアミンド(amindo)プロピルジメチルベタイン、グリシン酸アルキルジメチル、プロピオン酸Ｎ−アルキルアミノ、ＣＨＡＰＳ、最小９８％（ＴＬＣ）、ＣＨＡＰＳ、ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ、最小９８％（ＴＬＣ）、ＣＨＡＰＳ、電気泳動用、最小９８％（ＴＬＣ）、ＣＨＡＰＳＯ、最小９８％、ＣＨＡＰＳＯ、ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ、ＣＨＡＰＳＯ、電気泳動用、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩、３−ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩、ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート、それらの半合成誘導体、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは陽イオン性界面活性剤を含んでなり、この陽イオン性界面活性剤は塩化セチルピリジニウムであり得る。本発明の他の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは陽イオン性界面活性剤を含んでなり、この陽イオン性界面活性剤の濃度は、約５．０％未満であり、約０．００１％を超える。本発明のさらに別の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは陽イオン性界面活性剤を含み、この陽イオン性界面活性剤の濃度は、約５％未満、約４．５％未満、約４．０％未満、約３．５％未満、約３．０％未満、約２．５％未満、約２．０％未満、約１．５％未満、約１．０％未満、約０．９０％未満、約０．８０％未満、約０．７０％未満、約０．６０％未満、約０．５０％未満、約０．４０％未満、約０．３０％未満、約０．２０％未満、または約０．１０％未満からなる群から選択される。さらにナノエマルションワクチン中の陽イオン性薬剤の濃度は、約０．００２％を超え、約０．００３％を超え、約０．００４％を超え、約０．００５％を超え、約０．００６％を超え、約０．００７％を超え、約０．００８％を超え、約０．００９％を超え、約０．０１０％を超え、または約０．００１％を超える。一実施形態では、ナノエマルションワクチン中の陽イオン性薬剤の濃度は、約５．０％未満であり、約０．００１％を超える。
【０１１０】
本発明の別の実施形態では、ナノエマルションワクチンは少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と少なくとも１種類の非陽イオン性界面活性剤とを含んでなる。非陽イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（ツイーン）、例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０などの非イオン性界面活性剤である。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は約０．０１％〜約５．０％の濃度で存在するか、または非イオン性界面活性剤は約０．１％〜約３％の濃度で存在する。本発明のさらに別の実施形態では、ナノエマルションワクチンは、非イオン性界面活性剤と組み合わせて約０．０１％〜約２％の濃度で存在する陽イオン性界面活性剤を含んでなる。
【０１１１】
特定の実施形態では、ナノエマルションは、陽イオン性ハロゲン含有化合物をさらに含んでなる。本発明は、特定の陽イオン性ハロゲン含有化合物に限定されない。限定されるものではないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスホニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム、およびハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムを含む様々な陽イオン性ハロゲン含有化合物が企図される。本発明のナノエマルションは、また、特定のハロゲン化物に限定されない。限定されるものではないが、塩化物、フッ化物、臭化物、およびヨウ化物からなる群から選択されるハロゲン化物を含む様々なハロゲン化物が企図される。
【０１１２】
なおさらなる実施形態では、ナノエマルションは、第四級アンモニウム含有化合物をさらに含んでなる。本発明は、特定の第四級アンモニウム含有化合物に限定されない。限定されるものではないが、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ｎ−アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ｎ−アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、および塩化ｎ−アルキルジメチルベンジルアンモニウムを含む様々な第四級アンモニウム含有化合物が企図される。
【０１１３】
一実施形態では、ナノエマルションおよび／またはナノエマルションワクチンは、陽イオン性界面活性剤を含んでなり、この陽イオン性界面活性剤は塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）であり得る。セチルピリジニウムクロリドである。ＣＰＣは、約５．０％未満で約０．００１％超のナノエマルションＲＳＶワクチン濃度を有してよく、またはさらには約５％未満、約４．５％未満、約４．０％未満、約３．５％未満、約３．０％未満、約２．５％未満、約２．０％未満、約１．５％未満、約１．０％未満、約０．９０％未満、約０．８０％未満、約０．７０％未満、約０．６０％未満、約０．５０％未満、約０．４０％未満、約０．３０％未満、約０．２０％未満、約０．１０％未満、約０．００１％を超える、約０．００２％を超える、約０．００３％を超える、約０．００４％を超える、約０．００５％を超える、約０．００６％を超える、約０．００７％を超える、約０．００８％を超える、約０．００９％を超える、約０．０１０％を超える濃度を有してよい。
【０１１４】
さらなる一実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０であり得るポリソルベート界面活性剤などの非イオン性界面活性剤を含んでなり、約０．０１％〜約５．０％、または約０．１％〜約３％の濃度のポリソルベート８０を含んでよい。本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、少なくとも１種類の保存剤をさらに含んでなってもよい。本発明の別の実施形態では、ナノエマルションＲＳＶワクチンは、キレート剤を含んでなる。
【０１１５】
６．追加成分
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンにおける使用に好適な追加化合物としては、限定されるものではないが、有機リン酸塩系溶媒、増量剤、着色剤、薬学上許容される賦形剤、保存剤、ｐＨ調整剤、バッファー、キレート剤などの１以上の溶媒が含まれる。追加化合物は、予め乳化したナノエマルションワクチンに混合することもできるし、または追加化合物を、乳化させる原混合物に添加することもできる。これらの実施形態のあるものでは、１以上の追加化合物は、その使用の直前に、既存のナノエマルション組成物に混合される。
【０１１６】
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチン中の好適な保存剤としては、限定されるものではないが、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン、イミダゾリジニル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、ブロノポール、クロロクレゾール、パラベンエステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、α−トコフェルノール(tocophernol)、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、それらの半合成誘導体及びそれらの組合せが含まれる。他の好適な保存剤としては、限定されるものではないが、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン（ビス（ｐ−クロロフェニルジグアニド）ヘキサン）、クロルフェネシン（３−（−４−クロロフェオキシ(chloropheoxy)）−プロパン−１，２−ジオール）、Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（メチルおよびメチルクロロイソチアゾリノン）、パラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルヒドロベンゾエート）、フェノキシエタノール（２−フェノキシエタノール）、ソルビン酸（ソルビン酸カリウム、ソルビン酸）、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ（フェノキシエタノール、メチル、エチル、ブチル、プロピルパラベン）、Ｐｈｅｎｏｒｏｃ（フェノキシエタノール０．７３％、メチルパラベン０．２％、プロピルパラベン０．０７％）、Ｌｉｑｕｉｐａｒ油（イソプロピル、イソブチル、ブチルパラベン）、Ｌｉｑｕｉｐａｒ  ＰＥ（７０％フェノキシエタノール、３０％ｌｉｑｕｉｐａｒ油）、Ｎｉｐａｇｕａｒｄ  ＭＰＡ（ベンジルアルコール（７０％）、メチルおよびプロピルパラベン）、Ｎｉｐａｇｕａｒｄ  ＭＰＳ（プロピレングリコール、メチルおよびプロピルパラベン）、Ｎｉｐａｓｅｐｔ（メチル、エチルおよびプロピルパラベン）、Ｎｉｐａｓｔａｔ（メチル、ブチル、エチルおよびプロピエルパラベン）、Ｅｌｅｓｔａｂ  ３８８（プロピレングリコール中フェノキシエタノールとクロルフェネシン及びメチルパラベン）及びＫｉｌｌｉｔｏｌ（７．５％クロルフェネシンおよび７．５％メチルパラベン）が含まれる。
【０１１７】
本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、少なくとも１種類のｐＨ調整剤をさらに含んでなってよい。本発明のナノエマルションワクチン中の好適なｐＨ調整としては、限定されるものではないが、ジエチアノールアミン(diethyanolamine)、乳酸、モノエタノールアミン、トリエチルアノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、それらの半合成誘導体およびそれらの組合せが含まれる。
【０１１８】
さらに、本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、キレート剤を含んでなり得る。本発明の一実施形態では、キレート剤は、約０．０００５％〜約１．０％の量で存在する。キレート剤の例としては、限定されるものではないが、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ポリリン酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、およびジメルカプロールが含まれ、好ましいキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸である。
【０１１９】
本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、薬学上許容される緩衝剤などの緩衝剤を含んでなり得る。緩衝剤の例としては、限定されるものではないが、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、≧９９．５％（ＮＴ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、≧９９．０％（ＧＣ）、Ｌ−（＋）−酒石酸、≧９９．５％（Ｔ）、ＡＣＥＳ、≧９９．５％（Ｔ）、ＡＤＡ、≧９９．０％（Ｔ）、酢酸、≧９９．５％（ＧＣ／Ｔ）、酢酸、発光用、≧９９．５％（ＧＣ／Ｔ）、酢酸アンモニウム溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中約５Ｍ、酢酸アンモニウム、発光用、≧９９．０％（乾燥物質に対する理論値、Ｔ）、重炭酸アンモニウム、≧９９．５％（Ｔ）、二塩基性クエン酸アンモニウム、≧９９．０％（Ｔ）、ギ酸アンモニウム溶液、Ｈ２Ｏ中１０Ｍ、ギ酸アンモニウム、≧９９．０％（乾燥物質に対する理論値、ＮＴ）、シュウ酸アンモニウム一水和物、≧９９．５％（ＲＴ）、二塩基性リン酸アンモニウム溶液、Ｈ２Ｏ中２．５Ｍ、二塩基性リン酸アンモニウム、≧９９．０％（Ｔ）、一塩基性リン酸アンモニウム溶液、Ｈ２Ｏ中２．５Ｍ、一塩基性リン酸アンモニウム、≧９９．５％（Ｔ）、二塩基性リン酸アンモニウムナトリウム四水和物、≧９９．５％（ＮＴ）、硫酸アンモニウム溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中３．２Ｍ、二塩基性酒石酸アンモニウム溶液、Ｈ２Ｏ中２Ｍ（２０℃において無色溶液）、二塩基性酒石酸アンモニウム、≧９９．５％（Ｔ）、ＢＥＳ緩衝生理食塩水、分子生物学用、２×濃度、ＢＥＳ、≧９９．５％（Ｔ）、ＢＥＳ、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、ＢＩＣＩＮＥバッファー溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中１Ｍ、ＢＩＣＩＮＥ、≧９９．５％（Ｔ）、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、≧９９．０％（ＮＴ）、重炭酸塩バッファー溶液、＞０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、＞０．２ＭのＮａＨＣＯ３、ホウ酸、≧９９．５％（Ｔ）、ホウ酸、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、ＣＡＰＳ、≧９９．０％（ＴＬＣ）、ＣＨＥＳ、≧９９．５％（Ｔ）、酢酸カルシウム水和物、≧９９．０％（乾燥材料に対する理論値、ＫＴ）、炭酸カルシウム、沈殿、≧９９．０％（ＫＴ）、三塩基性クエン酸カルシウム四水和物、≧９８．０％（乾燥物質に対する理論値、ＫＴ）、クエン酸濃縮溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中１Ｍ、クエン酸、無水、≧９９．５％（Ｔ）、クエン酸、発光用、無水、≧９９．５％（Ｔ）、ジエタノールアミン、≧９９．５％（ＧＣ）、ＥＰＰＳ、≧９９．０％（Ｔ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、分子生物学用、≧９９．０％（Ｔ）、ギ酸溶液、Ｈ２Ｏ中１．０Ｍ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、≧９９．０％（ＮＴ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、≧９９．５％（ＮＴ）、グリシン、≧９９．０％（ＮＴ）、グリシン、発光用、≧９９．０％（ＮＴ）、グリシン、分子生物学用、≧９９．０％（ＮＴ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、分子生物学用、２×濃度、ＨＥＰＥＳ、≧９９．５％（Ｔ）、ＨＥＰＥＳ、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、イミダゾールバッファー溶液、Ｈ２Ｏ中１Ｍ、イミダゾール、≧９９．５％（ＧＣ）、イミダゾール、発光用、≧９９．５％（ＧＣ）、イミダゾール、分子生物学用、≧９９．５％（ＧＣ）、リポタンパク質リフォールディ��グバッファー、酢酸リチウム二水和物、≧９９．０％（ＮＴ）、三塩基性クエン酸リチウム四水和物、≧９９．５％（ＮＴ）、ＭＥＳ水和物、≧９９．５％（Ｔ）、ＭＥＳ一水和物、発光用、≧９９．５％（Ｔ）、ＭＥＳ溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ、ＭＯＰＳ、≧９９．５％（Ｔ）、ＭＯＰＳ、発光用、≧９９．５％（Ｔ）、ＭＯＰＳ、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、酢酸マグネシウム溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中約１Ｍ、酢酸マグネシウム四水和物、≧９９．０％（ＫＴ）、三塩基性クエン酸マグネシウム九水和物、≧９８．０％（乾燥物質に対する理論値、ＫＴ）、ギ酸マグネシウム溶液、Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ、二塩基性リン酸マグネシウム三水和物、≧９８．０％（ＫＴ）、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の中和溶液、分子生物学用、シュウ酸二水和物、≧９９．５％（ＲＴ）、ＰＩＰＥＳ、≧９９．５％（Ｔ）、ＰＩＰＥＳ、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、溶液（オートクレーブ済み）、リン酸塩緩衝生理食塩水、ウェスタンブロット法におけるペルオキシダーゼコンジュゲート用洗浄バッファー、１０×濃度、ピペラジン、無水、≧９９．０％（Ｔ）、一塩基性Ｄ−酒石酸カリウム、≧９９．０％（Ｔ）、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中５Ｍ、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中約１Ｍ、酢酸カリウム、≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸カリウム、発光用、≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸カリウム、分子生物学用、≧９９．０％（ＮＴ）、重炭酸カリウム、≧９９．５％（Ｔ）、炭酸カリウム、無水、≧９９．０％（Ｔ）、塩化カリウム、≧９９．５％（ＡＴ）、一塩基性クエン酸カリウム、≧９９．０％（乾燥材料、ＮＴ）、三塩基性クエン酸カリウム溶液、Ｈ２Ｏ中１Ｍ、ギ酸カリウム溶液、Ｈ２Ｏ中１４Ｍ、ギ酸カリウム、≧９９．５％（ＮＴ）、シュウ酸カリウム一水和物、≧９９．０％（ＲＴ）、二塩基性リン酸カリウム、無水、≧９９．０％（Ｔ）、二塩基性リン酸カリウム、発光用、無水、≧９９．０％（Ｔ）、二塩基性リン酸カリウム、分子生物学用、無水、≧９９．０％（Ｔ）、一塩基性リン酸カリウム、無水、≧９９．５％（Ｔ）、一塩基性リン酸カリウム、分子生物学用、無水、≧９９．５％（Ｔ）、三塩基性リン酸カリウム一水和物、≧９５％（Ｔ）、一塩基性フタル酸カリウム、≧９９．５％（Ｔ）、酒石酸カリウムナトリウム溶液、Ｈ２Ｏ中１．５Ｍ、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、≧９９．５％（ＮＴ）、四ホウ酸カリウム四水和物、≧９９．０％（Ｔ）、四シュウ酸カリウム二水和物、≧９９．５％（ＲＴ）、プロピオン酸溶液、Ｈ２Ｏ中１．０Ｍ、ＳＴＥバッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ７．８、ＳＴＥＴバッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ８．０、５，５−ジエチルバルビツール酸ナトリウム、≧９９．５％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム溶液、分子生物学用、Ｈ２Ｏ中約３Ｍ、酢酸ナトリウム三水和物、≧９９．５％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム、無水、≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム、発光用、無水、≧９９．０％（ＮＴ）、酢酸ナトリウム、分子生物学用、無水、≧９９．０％（ＮＴ）、重炭酸ナトリウム、≧９９．５％（Ｔ）、酒石酸水素ナトリウム一水和物、≧９９．０％（Ｔ）、炭酸ナトリウム十水和物、≧９９．５％（Ｔ）、炭酸ナトリウム、無水、≧９９．５％（乾燥物質に対する理論値、Ｔ）、一塩基性クエン酸ナトリウム、無水、≧９９．５％（Ｔ）、三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物、≧９９．０％（ＮＴ）、三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物、発光用、≧９９．０％（ＮＴ）、三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧９９．５％（ＮＴ）、ギ酸ナトリウム溶液、Ｈ２Ｏ中８Ｍ、シュウ酸ナトリウム、≧９９．５％（ＲＴ）、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、≧９９．０％（Ｔ）、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、発光用、≧９９．０％（Ｔ）、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧９９．０％（Ｔ）、二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、≧９９．０％（Ｔ）、二塩基性リン酸ナトリウム溶液、Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ、二塩基性リン酸ナトリウム、無水、≧９９．５％（Ｔ）、二塩基性リン酸ナトリウム、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、≧９９．０％（Ｔ）、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧９９．０％（Ｔ）、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、分子生物学用、≧９９．５％（Ｔ）、一塩基性リン酸ナトリウム溶液、Ｈ２Ｏ中５Ｍ、二塩基性ピロリン酸ナトリウム、≧９９．０％（Ｔ）、四塩基性ピロリン酸ナトリウム十水和物、≧９９．５％（Ｔ）、二塩基性酒石酸ナトリウム二水和物、≧９９．０％（ＮＴ）、二塩基性酒石酸ナトリウム溶液、Ｈ２Ｏ中１．５Ｍ（２０℃において無色溶液）、四ホウ酸ナトリウム十水和物、≧９９．５％（Ｔ）、ＴＡＰＳ、≧９９．５％（Ｔ）、ＴＥＳ、≧９９．５％（乾燥物質に対する理論値、Ｔ）、ＴＭバッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ７．４、ＴＮＴバッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ８．０、ＴＲＩＳグリシンバッファー溶液、１０×濃度、ＴＲＩＳ酢酸塩−ＥＤＴＡバッファー溶液、分子生物学用、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水、１０×濃度、ＴＲＩＳグリシンＳＤＳバッファー溶液、電気泳動用、１０×濃度、ＴＲＩＳリン酸塩−ＥＤＴＡバッファー溶液、分子生物学用、濃縮、１０×濃度、トリシン、≧９９．５％（ＮＴ）、トリエタノールアミン、≧９９．５％（ＧＣ）、トリエチルアミン、≧９９．５％（ＧＣ）、酢酸トリエチルアンモニウムバッファー、揮発性バッファー、Ｈ２Ｏ中約１．０Ｍ、リン酸トリエチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、Ｈ２Ｏ中約１．０Ｍ、酢酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、Ｈ２Ｏ中約１．０Ｍ、リン酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、Ｈ２Ｏ中約１Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー溶液、分子生物学用、濃縮液、１００×濃度、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ７．４、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ８．０、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）酢酸塩、≧９９．０％（ＮＴ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、発光用、≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、分子生物学用、≧９９．８％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）炭��塩、≧９８．５％（Ｔ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ７．２、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ７．４、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ７．６、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、ｐＨ８．０、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩、≧９９．０％（ＡＴ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩、発光用、≧９９．０％（ＡＴ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩、分子生物学用、≧９９．０％（ＡＴ）、およびＴｒｉｚｍａ（登録商標）マレイン酸塩、≧９９．５％（ＮＴ）が含まれる。
【０１２０】
本ナノエマルションＲＳＶワクチンは、エマルションの形成を助けるための１種類以上の乳化剤を含んでなり得る。乳化剤は、２つの隣接する液滴間の直接接触を防ぐ種類の連続膜を形成するための、油／水界面で凝集する化合物を含む。本発明の特定の実施形態は、それらの望ましい特性を損なうことなく、水または他の水相で所望の濃度に容易に希釈できるナノエマルションワクチンを特徴とする。
【０１２１】
７．免疫調節剤
上記の通り、ＲＳＶワクチンは、１種類以上の免疫調節剤をさらに含んでなり得る。免疫調節剤の例としては、限定されるものではないが、キトサンおよびグルカンが含まれる。免疫調節剤は、本ワクチン組成物中に、限定されるものではないが、約０．００１％〜最大約１０％、その間の任意の量、例えば、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％を含む、薬学上許容される量で存在することができる。
【０１２２】
Ｖ．医薬組成物
本発明のナノエマルションＲＳＶサブユニットワクチンは、治療上有効な量のナノエマルションＲＳＶワクチンと薬学上許容される送達のための好適な薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物に製剤化することができる。このような賦形剤は、当技術分野で周知である。
【０１２３】
「治療上有効な量」とは、ナノエマルションＲＳＶワクチンを含んでなる組成物中で投与される免疫原に関連するＲＳＶ病原体により引き起こされる疾患を予防、治療または改善に有効な、ナノエマルションＲＳＶワクチンの任意の量を意味する。「防御免疫応答」とは、その免疫応答が疾患の予防、治療または改善に関連することを意味する。完全な予防は、本発明に包含されるが、必ずしも必要でない。免疫応答は、本明細書に述べた方法を使用するか、または当業者に公知の任意の方法により評価することができる。
【０１２４】
鼻腔内投与は、投与中の並行吸入を伴う、または伴わない、鼻を介する投与を含む。このような投与は一般に、ナノエマルションＲＳＶワクチンを含んでなる組成物による鼻粘膜、鼻甲介または鼻腔との接触を介する。吸入による投与は、鼻腔内投与を含み、または経口吸入を含み得る。このような投与は、経口粘膜、気管支粘膜、および他の上皮との接触も含んでよい。
【０１２５】
医薬投与用の例示的剤形は本明細書に記載される。例としては、限定されるものではないが、液体、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲル、生体接着性ゲル、スプレー、エアゾール、ペースト、フォーム、日焼け止め剤、カプセル、マイクロカプセル、懸濁液、ペッサリー、散剤、半固体剤形などが含まれる。
【０１２６】
医薬ナノエマルションＲＳＶワクチンは、表皮または真皮中への即放、徐放、制御放出、遅延放出またはその任意の組合せ向けに製剤化することができる。いくつかの実施形態では、製剤は、浸透促進剤を含んでなり得る。好適な浸透促進剤としては、限定されるものではないが、エタノールなどのアルコール、トリグリセリドおよびアロエ組成物が含まれる。浸透促進剤の量は、製剤の約０．５重量％〜約４０重量％を構成することができる。
【０１２７】
本発明のナノエマルションＲＳＶワクチンは、電気泳動送達／電気泳動を用いて適用および／または送達することができる。さらに、本組成物は、パッチなどの経皮送達系であってもよく、または加圧もしくは空気圧装置（すなわち、「遺伝子銃」）により投与してもよい。電流の適用を含んでなるこのような方法は当技術分野で周知である。
【０１２８】
投与用の医薬ナノエマルションＲＳＶワクチンは、単回投与で適用しても複数回投与で適用してもよい。
【０１２９】
局所適用される場合、ナノエマルションＲＳＶワクチン閉塞型または半閉塞型であり得る。閉塞または半閉塞は、局所製剤に包帯、ポリオレフィンフィルム、衣料品、不透性バリアまたは半不透性バリアをかけることによって実施できる。
【０１３０】
本発明による例示的ナノエマルションアジュバント組成物は、「Ｗ８０５ＥＣ」アジュバントと呼ばれる。このＷ８０５ＥＣアジュバントの組成を下表に示す（表１）。Ｗ８０５ＥＣアジュバントの平均液滴サイズは約４００ｎｍである。このナノエマルションの成分は全て、ＦＤＡの承認医薬品有効成分リストに含まれる。
【表１】
2014526471.tif 000002
【０１３１】
ナノエマルションアジュバントは、油、精製水、非イオン性洗剤、有機溶媒および陽イオン性界面活性剤などの界面活性剤の乳化によって形成される。例示的な特定のナノエマルションアジュバントは、「６０％Ｗ８０５ＥＣ」と呼ばれる。この６０％Ｗ８０５ＥＣアジュバントは、下表２に示される成分から構成される：精製水、ＵＳＰ；ダイズ油ＵＳＰ；脱水アルコール、ＵＳＰ［無水エタノール］；ポリソルベート８０、ＮＦおよび塩化セチルピリジニウム、ＵＳＰ（ＣＰＣ  この例示的ナノエマルションの全成分は、ＦＤＡの承認医薬品の承認有効成分のリストに含まれる）。 
【表２】
2014526471.tif 000003
【０１３２】
処置の標的患者集団としては、限定されるものではないが、乳児、高齢者、移植患者、および慢性閉塞性肺疾（ＣＯＰＤ）患者が含まれる。
【０１３３】
ＶＩ．製造方法
本発明のナノエマルションは、従来のエマルション形成技術を使用して形成することができる。例えば、米国特許出願第２００４／００４３０４１号参照。例示的な方法では、比較的高い剪断力の下（例えば、高動水力および機械力を使用）で油を水相と混合して、約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する油滴を含んでなるナノエマルションを得る。本発明のいくつかの実施形態は、エタノールなどのアルコールを含んでなる油相を有するナノエマルションを使用する。油相および水相は、フレンチプレスまたは高剪断ミキサー（例えば、Ａｄｍｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｈ．製の、ＦＤＡ承認高剪断ミキサーが利用可能である）などの、エマルションを形成するのに十分な剪断力を作り出すことができる任意の装置を使用してブレンドすることができる。このようなエマルションの製造方法は、引用することによりそれらの全内容が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１０３，４９７号および同第４，８９５，４５２号に記載されている。
【０１３４】
例示的な一実施形態では、本発明の方法において使用されるナノエマルションは、水またはＰＢＳなどの水性連続相に分散した油性不連続相の液滴を含んでなる。本発明のナノエマルションは安定であり、長期保存後も分解しない。本発明の特定のナノエマルションは、嚥下され、吸入され、または被験体の皮膚に接触した場合、非毒性かつ安全である。
【０１３５】
本発明の組成物は、多量に生産することができ、広範な温度域で何カ月も安定である。ナノエマルションは、半固体クリームから薄いローション、液体までの質感を有することができ、例えば手または点鼻剤／スプレーにより、上述のような任意の薬学上許容される方法によって局所適用することができる。
【０１３６】
前述のように、エマルションの少なくとも一部は、限定されるものではないが、単層、多層、および少数層の脂質小胞、ミセル、および層状の相を含む脂質構造の形態であり得る。
【０１３７】
本発明は、記載のナノエマルションの多くの変形が、本発明の方法において有用となることを企図する。候補のナノエマルションが、本発明との併用に適しているかどうかを決定するためには、３つの基準を分析する。本明細書に記載の方法および標準を使用して、候補のエマルションが適しているかどうかを決定するために、それらを容易に試験することができる。第一に、ナノエマルションが形成され得るかどうかを決定するために、所望の成分を本明細書に記載の方法を使用して調製する。ナノエマルションを形成できなかった場合、その候補は却下される。第二に、候補のナノエマルションは、安定なエマルションを形成すべきである。ナノエマルションは、その意図する使用を可能にする十分な期間、それがエマルション形態を維持する場合に安定である。例えば、保存、輸送がなされるナノエマルションについては、ナノエマルションが数カ月から数年間、エマルション形態を維持することが望ましい場合がある。相対的に不安定な典型的ナノエマルションは、数日内にそれらの形態を喪失する。第三に、候補ナノエマルションは、その意図する使用に合った効率を有するべきである。例えば、本発明のエマルションは、ＲＳＶウイルスを死滅させる、もしくは検出可能なレベルまで無力にするか、または防御免疫応答を検出可能なレベルまで誘導するべきである。本発明のナノエマルションは、多くの異なる種類の容器および送達系で提供することができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、ナノエマルションは、クリームまたは他の固体もしくは半固体形態で提供される。本発明のナノエマルションは、ヒドロゲル製剤に配合することができる。
【０１３８】
ナノエマルションは、任意の好適な容器で配送することができる（例えば、被験者または顧客に）。所望の適用に合った、ナノエマルションの１以上の単回使用量または多回使用量を提供する好適な容器を使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ナノエマルションは、懸濁液または液体形態で提供される。このようなナノエマルションは、スプレーボトルおよび任意の好適な加圧スプレー装置を含む任意の好適な容器で送達することができる。このようなスプレーボトルは、鼻腔内または吸入によりナノエマルションを送達するために好適であり得る。
【０１３９】
これらのナノエマルション含有容器はさらに、使用説明書とともに包装してキットとすることができる。
【０１４０】
ヒトにおけるＲＳＶ感染を治療または予防するための本発明によるワクチンを製造するための例示的方法は、（１）真核生物宿主において、全長またはフラグメントＲＳＶ表面抗原、例えば、Ｆタンパク質を合成すること；および／または（２）真核生物宿主において、全長またはフラグメントＲＳＶ表面抗原、例えば、Ｇタンパク質を合成し、この合成が組換えＤＮＡ遺伝子ベクターおよび構築物を利用して実施されることを含む。次に、１以上の表面抗原を真核生物宿主から単離した後に、１以上のＲＳＶ表面抗原を水中油型ナノエマルションとともに製剤化することができる。さらなる方法では、完全なＲＳＶビリオンを真核生物宿主で培養することができ、その後、ＲＳＶビリオンを真核生物宿主から単離することができる。単離されたＲＳＶビリオンを、次に、水中油型ナノエマルション中の単離された表面抗原とともに製剤化することができる。真核生物宿主は例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞であり得る。
【実施例】
【０１４１】
ＶＩＩ．実施例
本発明を以下の実施例を参照してさらに説明するが、これらの実施例は単に例示のために示されるものである。本発明はこれらの実施例に限定されず、本明細書に提供される教示から明らかなあらゆる変形形態を含む。本明細書に引用される公的に入手可能な文献は、限定されるものではないが米国特許を含め全てが引用することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１４２】
実施例１
本実施例の目的は、ナノエマルションＲＳＶワクチンに使用すべきナノエマルションの調製を記載することであった。
【０１４３】
ナノエマルションを製造するために、水可溶性成分をまず水に溶かした。次に、大豆油を加え、この混合物を高剪断ホモジナイゼーションおよび／またはマイクロフルイダイゼーションを用い、粘稠な白色エマルションが形成するまで混合する。このエマルションをさらに水で希釈して、所望の濃度のエマルションまたは陽イオン性界面活性剤を得ることができる。
【０１４４】
ナノエマルション（ＮＥ）組成物は表３に従って調製した。
【表３】
2014526471.tif 000004
【０１４５】
次に、このナノエマルションを１種類以上のＲＳＶ免疫原と合わせて本発明によるナノエマルションＲＳＶワクチンを形成することができる。
【０１４６】
実施例２
本実施例の目的は、ＲＳＶワクチン用のアジュバントとして有用な例示的ナノエマルションを記載することである。
【０１４７】
合計１０種類のナノエマルション製剤を調製した：Ｗ８０５ＥＣ単独、６種類のＷ８０５ＥＣ＋ポロキサマー４０７およびポロキサマー１８８（Ｐ４０７およびＰ１８８）製剤、ならびに２種類のＷ８０５ＥＣ＋キトサン、および１種類のＷ８０５ＥＣ＋グルカン製剤を作製し、４０℃の加速化条件下で２週間にわたって安定性を評価した（表４）。１０種類のナノエマルションは全て４０℃で少なくとも２週間安定であった。
【表４】
2014526471.tif 000005
【０１４８】
以下の製剤は、本発明のＲＳＶワクチンにおいて有用な例示的ナノエマルションである：（１）製剤１、（ａ）ＣＰＣ／ツイーン８０（１：６の比率）を含んでなり、（ｂ）粒子サイズ約５００ｎｍのＷ８０５ＥＣ（ＮＥ８０）（表５）；および製剤２、（ａ）ＣＰＣ／ツイーン８０／Ｐ１８８（１：１：５の比率）を含んでなり、（ｂ）粒子サイズ約３００ｎｍのＷ８０Ｐ１８８５ＥＣ（ＮＥ１８８）（表６）。
【表５】
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【表６】
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【０１４９】
実施例３  ナノエマルションとウイルス抗原との会合の実証
材料および方法：  透過電子顕微鏡写真および切片化技術：２０ｍＬのＮＥアジュバントを単独でまたはＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）とともに１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム溶液で固定した。固定した調製物をヒストゲルと１：１０比で混合して固体塊を形成した。この固体混合物をスライスして厚さ１ｍｍの切片とし、再蒸留脱イオン水ですすいだ。これらの横断面サンプルを再蒸留脱イオン水中、Ｄｕｒｃｕｐａｎ（登録商標）キット（Ｆｌｕｋａ、ＥＭ  ＃１４０２０）の成分Ａの漸増濃度（３０％、５０％、７０％、９０％、１００％）で脱水した。これらのサンプルをＤｕｒｃｕｐａｎ（登録商標）キットの包理溶液（成分Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの混合物）に移した。包埋したサンプルを厚さ７５ｎｍの切片とし、３００メッシュの炭素コーティングした銅グリッドに置いた。グリッド状の切片を蒸留脱イオン水（ｐＨ７）中、飽和酢酸ウラニルで１０分間染色した後、クエン酸鉛で５分間染色した。これらのサンプルを、コンピューター制御のコンピュステージ、高解像度（２Ｋ×２Ｋ）デジタルカメラを備えたＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ−１００  ＴＥＭで可視化し、デジタル画像を作成し、Ｘ−Ｓｔｒｅａｍイメージングソフトウエア（ＳＥＭ  Ｔｅｃｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて取り込んだ。
【０１５０】
結果：  電子顕微鏡写真：２０％Ｗ８０５ＥＣ  ＮＥの横断面ＴＥＭは、均一な内部核材料を有するＮＥ液滴を示した。３０μｇのＨＡを含有するＮＥワクチンは、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）抗原に相当する液滴の油核内に離散した抗原材料／粒子を示す。抗原は核内に組み込まれ、核材料に取り囲まれているので、電子密度により暗く見えるということがない。これが核内の白い対比染色効果を生んでいる。核内への抗原の局在は、エマルション中の抗原感受性タンパク質サブユニットを保護し、抗原を分解から保護することができるので、安定性が増す。濃い色に染まったＮＥ粒子の外側にあるＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）粒子は極めて少なかった（図１）。
【０１５１】
実施例４
本実施例の目的は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、Ｗ８０５ＥＣ（アジュバント）と組換えＦタンパク質を含んでなるナノエマルションに基づく組換えＦタンパク質ワクチンの免疫原性、例えば、ＲＳＶに対する感染防御免疫を評価することであった。本実施例の原理：  死滅ウイルス製剤ではなく組換えタンパク質を使用すると、一貫性、安全性、および製造に関して多くの利点が潜在的に提供される。
【０１５２】
動物を無作為に３群に分けた。０日目に各群に鼻腔内免疫を行い、２８日目に追加免疫を行った（鼻孔に、各鼻孔に半量）。プライム免疫の前に動物から採血し、その後、試験期間中、２週間毎に採血した。ＮＥ−Ｆタンパク質の接種がウイルス排除および免疫病理学に影響を及ぼすかどうかを調べるため、次に、追加免疫から２週間後に、マウスに生きた感染性ＲＳＶを鼻腔内投与した（１０５ＰＦＵ）。
【０１５３】
供試材料：  （１）終濃度２０％に希釈した６０％Ｗ８０５ＥＣ。Ｗ８０５ＥＣの成分を下表７に示す。
【表７】
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【０１５４】
（２）組換えＦタンパク質：（バキュロウイルス宿主−Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．  Ｃａｔ  １１０４９−Ｖ０８Ｂ）；（３）リン酸緩衝生理食塩水（無菌）１×：ＣｅｌｌＧｒｏにより供給；（４）供試動物： ＢＡＬＢ／ｃマウス８〜１０週齢、雌（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【０１５５】
試験計画の検証：  ３群のＢＡＬＢ／ｃマウスを次のようにＦタンパク質に対して免疫した：（１）プライム免疫：群Ｉ−４．４５μｇのＦタンパク質＋２０％Ｗ８０５ＥＣ  総容量１５μｌ（ｎ＝８）；群ＩＩ−４．４５μｇのＦタンパク質  総容量１５μｌ（ｎ＝５）；および群ＩＩＩ−ＰＢＳ  総容量１５μｌ（ｎ＝１０）；および（２）追加免疫：群Ｉ−１０μｇのＦタンパク質＋２０％Ｗ８０５ＥＣ  総容量１５μｌ（ｎ＝８）；群ＩＩ−１０μｇのＦタンパク質  総容量１５μｌ（ｎ＝５）；および群ＩＩＩ−ＰＢＳ  総容量１５μｌ（ｎ＝１０）。
【０１５６】
動物を無作為に３群に分けた。０日目に各群に鼻腔内免疫を行った（鼻孔に、各鼻孔に半量）。動物から試験期間中、２週間毎に採血した。最後のブーストから１４日後に、マウスに１０５ＰＦＵのＬ１９を鼻腔内接種した。
【０１５７】
方法：  供試製剤：  ワクチン混合物を次のように製剤化した。初回免疫：（１）９０μｌの組換えＦタンパク質（濃度０．４４５ｍｇ／ｍｌ）を４５μｌの６０％Ｗ８０５ＥＣと混合した。終濃度：Ｆタンパク質−０．３ｍｇ／ｍｌ；ＮＥ−２０％。投与容量−１５μｌ／動物。（２）５０μｌの組換えＦタンパク質（濃度０．４４５ｍｇ／ｍｌ）を２５μｌのＰＢＳ  １×と混合した。終濃度：Ｆタンパク質−０．３ｍｇ／ｍｌ；ＮＥ−０％。投与容量−１５μｌ／動物。追加免疫用：（１）９０μｌの組換えＦタンパク質（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を４５μｌの６０％Ｗ８０５ＥＣと混合した。終濃度：Ｆタンパク質−０．６７ｍｇ／ｍｌ；ＮＥ−１５％。投与容量−１５μｌ／動物；および（２）５０μｌの組換えＦタンパク質（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を２５μｌのＰＢＳ  １×と混合した。終濃度：Ｆタンパク質−０．６７ｍｇ／ｍｌ；ＮＥ−０％。投与容量−１５μｌ／動物。
【０１５８】
試験方法：  接種手順：  マウスをイソフルランで麻酔し、頭を約４５℃横に向けた後、７．５μｌのワクチンを左の鼻孔に投与した。上述のように、動物を再麻酔して、再拘束した。残りの７．５μｌのワクチンを右の鼻孔に投与した。身体検査：  試験中、各個の動物について毎週、姿勢、活動性、および起毛(pilorection)をモニタリングした。採血：  初回免疫から２、４および６週間後に、マウスから伏在静脈切除により採血した。
【０１５９】
血清ＥＬＩＳＡ：  抗原特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＥ応答は、プレートコーティングのために５μｇ／ｍｌのＦタンパク質を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。抗マウスＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ結合抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から入手した。アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＥは、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）から購入した。
【０１６０】
生Ｌ１９  ＲＳＶによる鼻腔内抗原投与：  追加免疫から２週間後にマウスに生きた感染性ＲＳＶで鼻腔内抗原投与を行った（１０５ＰＦＵ）。
【０１６１】
気道過敏症（ＡＨＲ）：  ＡＨＲは、低一回換気量（Ｂｕｘｃｏ）用に特に設計したＢｕｘｃｏマウスプレチスモグラフを使用して測定した。供試マウスをナトリウムペントバルビタールで麻酔し、１８ゲージのメタルチューブの気管カニューレ挿管を行った。次に、マウスにＨａｒｖａｒｄポンプ人工呼吸器を装着した（換気容量＝０．４ｍｌ、頻度＝１２０回／分、終末呼気陽圧２．５〜３．０ｃｍ  Ｈ２Ｏ）。プレチスモグラフを密閉し、コンピューターにより読み取りをモニタリングした。このボックスは閉鎖系であるので、肺容積の変化は差圧変換器によって測定されたボックス圧（Ｐｂｏｘ）の変化によって表される。ベースラインレベルが安定化し、最初の読み取りがなされたところで、メタコリン投与を尾静脈注射により行った。用量応答曲線（０．０１〜０．５ｍｇ）を求めた後、最適用量としてメタコリン０．２５０ｍｇを選択した。この用量を本研究の残りの実験で用いた。メタコリン投与の後、応答をモニタリングし、ピーク気道抵抗を気道過敏症の指標として記録した。
【０１６２】
安楽死および生体材料採取の手順：  マウスをイソフルラン窒息により安楽死させた。肺関連リンパ節を免疫応答の評価のために採取した。生１９  ＲＳＶをマウスに鼻腔内接種すると、粘液過剰分泌および炎症を含む、中度の疾患表現型を伴う感染が生じる。この表現型の重篤度を、対照動物および免疫動物において組織学的分析およびウイルスに関するＱＰＣＲおよびサイトカイン遺伝子発現ならびに粘液関連遺伝子Ｍｕｃ５ａｃおよびＧｏｂ５を用いて評価した。
【０１６３】
定量的ＰＣＲ：  最小の肺葉を取り出し、１ｍｌのトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズした。ＲＮＡを製造者のプロトコールに従って単離し、５μｇを逆転写させて遺伝子発現を評価した。肺サンプル中のサイトカインｍＲＮＡの検出を、従前に開発されたプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて判定し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。Ｍｕｃ５ａｃ、Ｇｏｂ５の転写産物レベルは、従前に記載されているように［１］、注文プライマーを用いて決定した。内部対照としてＧａｐｄｈを分析し、Ｇａｐｄｈに対して遺伝子発現を正規化した。遺伝子発現レベルの変化倍率を、任意の値１を割り付けた非感染マウスにおける遺伝子発現との比較により算出した。ＲＳＶ転写産物は、ライン１９の配列と合うように従前に公開されているプライマーを適合させることにより、ＳＹＢＲグリーンケミストリーを用いて増幅した。
【０１６４】
ＳＶＧセンス：５’−ＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴ−３’
ＲＳＶＧアンチセンス：５’−ＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＴ−３’
ＲＳＶＮセンス：５’−ＣＡＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡ−３’
ＲＳＶＮアンチセンス：５’−ＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴタグＡＧＴＡＴＣＡＡ−３’
ＲＳＶＦセンス：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＴＧＣＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＣＡＧＡＡ−３’
ＲＳＶＦアンチセンス：５’−ＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴＡＧＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴ−３’
肺におけるＲＳＶ転写産物のレベルを、ＧＡＰＤＨのコピー数に対して表した。
【０１６５】
プラークアッセイ：  マウスの肺を切除し、秤量し、１×ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離（５０００×ｇ  １０分）により明澄化し、上清の連続希釈液を作製し、サブコンフルエントのＶｅｒｏ細胞に加えた。ウイルスを１時間接着させた後、上清を除去し、０．９％メチルセルロース／ＥＭＥＭに置き換えた。培養５日目に、一次抗体としてのヤギ抗ＲＳＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、二次抗体としてのＨＲＰ−ウサギ抗ヤギ抗体、および基質としての４−クロロナフトール(4-chloronapthol)（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた免疫組織化学技術により、プラークを可視化した。
【０１６６】
リンパ節の再刺激：  肺関連リンパ節（ＬＡＬＮ）細胞懸濁液を、ウェル当たり１×１０６細胞の二反復で播種した後、培地またはＲＳＶ（ＭＯＩ約０．５）のいずれかで再刺激した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清を、製造者のプロトコールに従ったＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ  ２００システムでの分析のために回収した。Ｔｈサイトカイン（ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）に対する抗体ビーズを含有するキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、各サンプルにおけるサイトカイン産生をアッセイした。
【０１６７】
組織学：  右の肺葉を単離し、すぐに１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。次に、肺サンプルを処理し、パラフィンに包埋し、切片とし、Ｌ−リシンコーティングスライド上に載せ、ヘマトキシリン(Hemotoxylin)およびエオジン（Ｈ＆Ｅ）ならびに過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）を使用する標準的な組織学的技術を用いて染色した。ＰＡＳ染色は粘液および粘液産生細胞を同定するために行った。
【０１６８】
結果  体液性応答の評価  特異的血清ＩｇＧ評価：  プライム免疫から２、４および６週間後のマウスから得た血清を用いて、ＥＬＩＳＡを用い、特異的ＩｇＧのエンドポイント力価を評価した。エンドポイント力価は、バックグラウンドの３倍の吸光度を生じる最大血清希釈率と定義した。エンドポイント力価の結果を図２に示す。ナノエマルション(nanoemulsoin)Ｆタンパク質で免疫したマウスだけが、６週間目に５×１０６に迫る群平均力価で、高力価の特異的抗Ｆタンパク質ＩｇＧ抗体によってワクチン接種に応答した。
【０１６９】
免疫に対する血清中の特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＥ体液性応答の評価：  ２回目の免疫（６週目）から２週間後にマウスから得た血清を用いて、ＥＬＩＳＡを用い、特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＥのエンドポイント力価を評価した（図３）。エンドポイント力価は、バックグラウンドの３倍の吸光度を生じる最大血清希釈率と定義した。ＮＥ＋Ｆタンパク質で免疫したマウスは、高レベルの特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ抗体を産生した（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。血清ＩｇＥ力価は低いながら存在し、ＮＥ＋Ｆタンパク質免疫マウスでは６６３前後の平均であった（図３Ｄ）。
【０１７０】
ＲＳＶ抗原投与：  抗原投与８日後の肺におけるＲＳＶ遺伝子発現。ＮＥ−Ｆタンパク質によるワクチン接種がマウスをＲＳＶの呼吸器系投与から防御したかどうかを決定するために抗原投与試験を行った。プライム免疫から６週間後に、マウスに生きた感染性ＲＳＶで鼻腔内免疫投与を行った（１０５ＰＦＵ）。抗原投与から８日目に、ウイルス量を肺においてＱＰＣＲおよびプラークアッセイにより評価した。ＱＰＣＲにより評価されたように、ＮＥ−Ｆタンパク質を接種したマウスの肺では、非免疫マウスおよびＦタンパク質のみで免疫したマウスに比べて、ＲＳＶ  ＦおよびＲＳＶ  ＮおよびＲＳＶ  Ｇの転写産物レベルに有意な減少が検出された（図４）。これらのデータは、ＮＥ−Ｆタンパク質ワクチンが下部呼吸器系抗原投与後のウイルス排除を劇的に改善することを示す。
【０１７１】
ナノエマルション＋−ＲＳＶは、気道過敏症を促進しない。従前に報告されているように、ホルマリン固定ＲＳＶによるワクチン接種は、生ウイルス投与の際に気道過敏症（ＡＨＲ）および好酸球増加症の発症を促進する。このことを考慮し、ナノエマルション＋Ｆタンパク質の接種が気道過敏症、または免疫増強の他のエビデンスを促進するかどうかを評価した。対照ＲＳＶ感染マウスに比べて、ナノエマルション−ＲＳＶ免疫マウスは、静脈内メタコリン投与後の気道抵抗にベースラインの増加のみを示した（図５）。
【０１７２】
ナノエマルション＋Ｆタンパク質免疫は、生抗原投与後の粘液分泌と関連している。１９  ＲＳＶ株によるマウスの鼻腔内接種は、粘液過剰分泌および炎症を含む、中度の疾患表現型を伴う感染を生じる。この表現型の重篤度を、対照動物および免疫動物において、組織学的分析およびウイルスに関するＱＰＣＲおよびサイトカイン遺伝子発現を用いて評価した。組織学的分析により評価されるように（図６Ａ）、抗原投与後８日目に、ＮＥ＋Ｆタンパク質接種マウスは、抗原投与した非免疫マウスに比べて同等の粘液過剰分泌を示した。ＮＥ−Ｆタンパク質免疫マウスでは、非免疫対照に比べて同等の粘液関連遺伝子Ｍｕｃ５ａｃおよびＧｏｂ５発現が測定された（図６Ｂ）。
【０１７３】
ナノエマルション＋Ｆタンパク質免疫は、抗原投与後にＴｈ１およびＴｈ２混合サイトカインの誘導を促進する。ナノエマルション＋Ｆタンパク質免疫におけるウイルス排除を促進した免疫表現型をさらに特徴付けるために、本発明者らはサイトカイン遺伝子発現に関するＱＰＣＲを用いた。対照マウスと比較し、ナノエマルション＋Ｆタンパク質接種マウスは、抗原投与後８日目の肺におけるＲＳＶ転写産物のレベルにより評価した場合、ＩＬ−１２およびＩＬ−１７を示さなかった（それぞれ図７ＡおよびＢ）。バリデーションの手段として、サイトカインプロフィールをマルチプレックス抗体ベースアッセイ（Ｂｉｏｐｌｅｘ）により、気管支肺胞洗液および肺ホモジネートで評価した。ＮＥ−ＲＳＶワクチン接種は、ＩＦＮ−γ応答の増強を示した。ＩＬ−１７は、非ワクチン接種マウスに比べて産生の増大を示した（図７Ｃ）。
【０１７４】
結論：  Ｆタンパク質を混合した２０％Ｗ８０５ＥＣで免疫した群だけが、高力価の特異的抗ＲＳＶ  ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体によるワクチン接種に応答した。これは最小のＩｇＥ産生と関連していた。ナノエマルション＋Ｆタンパク質ワクチン接種はまた、生ＲＳＶ投与後のウイルス排除および防御の増強とも関連していた。興味深いことに、免疫応答の表現型は、ＩＬ−１２またはＩＬ−１７の産生とは関連が無かった。
【０１７５】
Ｔｈ１、Ｔｈ２混合パターンのサイトカイン放出は、ＮＥ＋Ｆタンパク質免疫マウスに関し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＳＶ  Ｌ１９で再刺激した後のリンパ節において両方とも見られた。しかしながら、これは免疫増強とは関連が無かったが、有意な粘液産生は見られた。
【０１７６】
実施例５
ＲＳＶは、乳児、高齢者、および免疫不全者における重篤な気道疾患の主因である。現在、利用可能なワクチンは無い。表面タンパク質Ｆに対する抗体がＲＳＶ感染に対する宿主の防御に重要であると考えられるが、防御は不完全であり、持続期間も限られている。
【０１７７】
材料および方法：  Ｌ１９  ＲＳＶウイルスを、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションとの製剤化により不活化した。０週目および４週目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１．２μｇのＲＳＶ  Ｆタンパク質１．３×１０５ＰＦＵ／用量＋２０％Ｗ８０５ＥＣまたは組換えＲＳＶ  Ｆ  ２．５μｇ／用量＋２０％Ｗ８０５ＥＣを含有する１２μＬの不活化Ｌ１９ウイルスを鼻腔内接種した。両ワクチン製剤を、抗原投与時の非免疫動物と比較した。免疫動物からの血清を免疫前と２回目の免疫後４週間目に採取した。免疫後１０週目に１０５ＰＦＵのＬ１９  ＲＳＶ株を動物の口咽頭に投与し、ＰＣＲおよび顕微鏡による組織病理学的変化を用いてウイルスＲＮＡの排除を検査した。
【０１７８】
結果：  不活化完全ウイルスおよび組換えＦタンパク質は両方とも免疫応答を生じ、抗原投与後にウイルスｍＲＮＡを減少させた（マン・ホイットニーによりｐ＜０．０１）。抗Ｆ  ＥＬＩＳＡ単位は完全なウイルスの接種の後に幾何平均（ＧＭ）５１（９５％ＣＩ  １４−１８９）に達し、Ｆタンパク質接種後のＧＭ４７０（９５％ＣＩ  ２３５−９４２）に比べて低かった（マン・ホイットニーによりｐ＝０．０２）。図８参照。Ｆタンパク質は、完全なウイルスを接種したマウスの１００％で抗原投与後に検出できなかったが、組換えＦタンパク質を接種した１００％のマウスが、抗原投与後、肺に検出可能なＦタンパク質ｍＲＮＡを有していた（フィッシャーの正確確率検定によりｐ＝０．００８）。図９および表８参照。さらに、完全なウイルスを接種した動物の組織病理学は、Ｆタンパク質を接種した動物よりも粘液が少なかった。図１０Ａ〜１０Ｄ参照。
【表８】
2014526471.tif 000009
【０１７９】
結論：  完全なウイルスおよび組換えＦタンパク質は免疫応答を誘導し、抗原投与後にウイルスｍＲＮＡを減少させた。抗体力価が低いにもかかわらず、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションにより不活化され、アジュバント効果を受ける完全ウイルスのワクチンは、抗原投与時にウイルス排除の向上および組織病理学の軽減をもたらす。
【０１８０】
実施例６
本実施例の目的は、ＲＳＶ  Ａ２株のＨＲＳＶタンパク質発現をＲＳＶ  Ｌ１９株と比較すること、また、細胞溶解液と上清を比較することである。
【０１８１】
材料および方法：  サンプルは全て、Ａ２またはＬ１９ウイルスのいずれかからの同量のｐｆｕをＨＥＰ−２細胞に感染させることによって調製した。感染２４時間後、感染細胞を下記のいずれか１つで処理した：
（１）細胞関連タンパク質に関して確認するための細胞溶解液；上清培地を排出した後、細胞をＳＤＳで処理した。この細胞溶解液を、細胞に関連するＦタンパク質の量に関してアッセイした。
【０１８２】
（２）全細胞および上清タンパク質；細胞および上清を凍結および解凍を３回繰り返して細胞を溶解させ、全ての細胞溶解液を用いて、細胞および培地中のＦタンパク質をアッセイした。
【０１８３】
感染４日後に、ＨＥＰ−２感染細胞からＬ１９およびＡ２ウイルスを抽出および精製した。精製したウイルスのタンパク質含量を比較した。
【０１８４】
結果：  正規化したサンプルを、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を用いてウエスタンブロットにてアッセイした。ＦおよびＧタンパク質含量をＬ１９株とＡ２株の間で比較した。イメージキャプチャーおよびコダックソフトウエアを用いてバンドの濃さを比較した。ｍｏｃｋ非感染細胞培養を対照として調製した。
【０１８５】
結果のデータを図１１〜１３および表９〜１１に詳細に示す。図１１は、Ｌ１９およびＡ２を用いたＨＲＳＶ感染細胞溶解液（ＳＤＳ処理）のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示し、図１２は、Ｌ１９およびＡ２  ＨＲＳＶ細胞溶解液（細胞および上清）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、図１３は、ＨＲＳＶ  Ｌ１９およびＡ２精製ウイルスのＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。表９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの、Ｌ１９およびＡ２レベル由来の匹敵するＨＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質を示す。表１０は、感染細胞（溶解液、上清）からの、匹敵するＨＲＳＶ  Ｌ１９およびＡ２  ＦおよびＧタンパク質を示す。最後に、表１１は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥからの、匹敵するＨＲＳＶ  Ｌ１９およびＡ２  ＦおよびＧタンパク質を示す。
【表９】
2014526471.tif 000010
【表１０】
2014526471.tif 000011
【表１１】
2014526471.tif 000012
【０１８６】
要旨：ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス感染細胞は、Ａ２感染細胞の３〜１１倍多い量のＲＳＶウイルスタンパク質を産生する。
【０１８７】
実施例７
本実施例の目的は、異なる感染時間（２４時間対４日）で異なるＲＳＶウイルス株（Ｌ１９対Ａ２）に感染したＨｅｐ−２細胞におけるＦタンパク質発現を比較することであった。
【０１８８】
材料および方法：  Ｈｅｐ−２細胞にＬ１９またはＡ２いずれかのＲＳＶウイルスを感染させた。合計、４本のフラスコを２セット。
【０１８９】
ウイルス感染から２４時間後に、第１のセットのＨｅｐ−２細胞を培養上清とともに、または伴わずに溶解した。サンプルは下記のように調製した。
【表１２】
2014526471.tif 000013
【０１９０】
Ｃ＋ＴＣＣＣ＋Ｔ＝細胞＋Ｔｒｉｓバッファー（培養培地を排出し、同容量のＴｒｉｓバッファーに置き換えた）；
Ｃ＋Ｍ＝細胞＋培養培地（培養培地を保持）。
【０１９１】
感染４日後、第２のセットのＨｅｐ−２細胞を培養上清とともに、または伴わずに溶解した。サンプルは下記のように調製した。
【表１３】
2014526471.tif 000014
【０１９２】
Ｃ＋Ｔ＝細胞＋Ｔｒｉｓバッファー（培養培地を同容量のＴｒｉｓバッファーに置き換えた）
Ｍ＝培養培地（培養培地を別に回収した）
Ｃ＋Ｍ＝細胞＋培養培地（培養培地を保持した）
各サンプルの一部（７．５μＬ）をウエスタンブロット解析に適用した。ＦおよびＧタンパク質バンドの濃度は、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒイメージングソフトウエア５．Ｘを用いて測定した。
【０１９３】
結果：  結果を図１４に示し、この図は、ウイルス感染から２４時間後のＨＲＳＶ  Ｌ１９およびＡ２  ＦおよびＧタンパク質発現のウエスタンブロットを示している。さらに、下表１４は、ウエスタンブロットからのＨＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質バンドの濃度分析を示す。
【表１４】
2014526471.tif 000015
【０１９４】
要旨：  細胞に関連するウイルス粒子と培養培地に関連するウイルス粒子は両方とも、Ｌ１９感染細胞では、ＲＳＶ  Ａ２株感染細胞に比べてはるかに多いＦ（平均約６倍）を発現する。
【０１９５】
さらに、細胞に関連するウイルス粒子と培養培地に関連するウイルス粒子は両方とも、Ｌ１９感染細胞では、ＲＳＶ  Ａ２株感染細胞に比べてはるかに多いＧを発現する。
【０１９６】
実施例８
本実施例の目的は、マウスにおける鼻腔ワクチン接種によるＲＳＶの不活化に関して、β−プロピオラクトンおよびＷ８０５ＥＣナノエマルションを含む数種の異なるアプローチを比較することであった。
【０１９７】
方法：  抗ウイルス活性およびアジュバント活性の両方を有する水中油型ナノエマルションＷ８０５ＥＣを、β−プロピオラクトン（β−ＰＬ）で不活化したウイルス（Ｌ１９株＠２×１０５ｐｆｕ／用量）と比較した。これらの２種類のワクチンを０週目および４週目にＢＡＬＢ／Ｃマウスに鼻腔内（ＩＮ）投与した。投与前および追加免疫３週後にマウスから採血し、その後、Ｆタンパク質に対する特異的抗体を検査した。
【０１９８】
８週目に動物に１×１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ｌ１９を鼻腔投与し、気道過敏症（ＡＨＲ）、肺のサイトカイン、およびウイルスタンパク質ｍＲＮＡ排除をＰＣＲを用いて確認した。
【０１９９】
結果：  Ｗ８０５ＥＣおよびβ−ＰＬは両方ともＲＳＶを完全に不活化し、免疫応答を誘導した。β−ＰＬワクチンは、ナノエマルションで不活化したワクチンに比べて高い抗体応答を誘導した（ｐ＝０．００６）。しかしながら、ナノエマルションで不活化したワクチンを接種した動物は、抗原投与後、肺におけるタンパク質ＦおよびＧ  ｍＲＮＡがより低いこと（それぞれｐ＝０．０６および０．０００４）を証拠とする、ＲＳＶのより高い排除を示した。さらに、ナノエマルションで不活化したワクチンを受容する動物は、有意に低いＡＨＲを示した（ｐ＝０．０２）。両ワクチンとも、非ワクチン接種対照に比べて有意なレベルの肺ＩＬ−１７を誘導した（＜０．０１）が、ナノエマルションで不活化したワクチンによって、有意により高いレベルが誘導された（ｐ＝０．００９）。
【０２００】
結論：  β−ＰＬで不活化したＲＳＶウイルスワクチンは、マウスＲＳＶ感染モデルにおいて、ウイルス投与後のＡＨＲと関連している。これに対し、ナノエマルションウイルス不活化はＡＨＲを生じず、有意なＩＬ−１７産生の増大およびウイルス排除の改善を誘導した。このことは、ＲＳＶに対してワクチン接種の利益をもたらし得る免疫防御の新規な経路を示唆する。
【０２０１】
実施例９
本実施例の目的は、本発明のワクチンに有用なＲＳＶウイルス株を記載することである。
【０２０２】
Ｌ１９  ＲＳＶ株を、ナノエマルション不活化／ナノエマルションアジュバントＲＳＶワクチンの抗原として評価した。この株は、マウスにおいて感染と呼吸器系疾患（ＥＲＤ）の増長を引き起こすことが分かっていた。さらに、公開されたデータは、ナノエマルションを用いて製剤化された場合、それがマウスにおいてＥＲＤの誘導なく防御を付与したことを示した。このＬ１９株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た野生型Ａ２株と比較した。
【０２０３】
ＲＳＶ  Ｌ１９単離株は、１９６７年１月３日にミシガン州アナーバーで、呼吸器系疾患を有するＲＳＶ感染小児からＷＩ−３８細胞として単離され、ＳＰＡＦＡＳ初代鶏腎細胞中で継代培養され、その後、ＳＰＡＦＡＳ初代鶏肺細胞で継代培養された後、ＭＲＣ−５細胞(Herlocher 1999)、次いでＨｅｐ２細胞(Lukacs 2006)に移行された。ＲＳＶ  Ｌ１９ゲノム（１５，１９１ｎｔ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ６１４８１３）とＲＳＶ  Ａ２株（１５，２２２ｎｔ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７４５６８）を比較すると、ゲノムの９８％が同一であることを示す。Ｌ１９とＡ２の間のコードの違いの大部分はＦ遺伝子およびＧ遺伝子にある。これら２株のアミノ酸アラインメントは、Ｆタンパク質は１４のアミノ酸差異（９７％同一）を持ち、Ｇタンパク質は２０のアミノ酸差異（９３％同一）を持つことを示した。
【０２０４】
ＲＳＶ  Ｌ１９株は、気管内投与による１×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／マウスの接種(Lukacs 2006)を用いて粘液産生および有意なＩＬ−１３誘導を刺激することによりヒト感染を模倣する動物モデルにおいて実証されている。
【０２０５】
ＲＳＶ  Ｌ１９株の選択の原理：  重要かつ独特なことに、ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス株は、他の株よりも有意に高いＦタンパク質生産量（１ＰＦＵ当たりおよそ１０〜３０倍超）を産生するという点で独特である。Ｆタンパク質含量は免疫原性において重要な因子であり得、Ｌ１９株は現在のところ最もロバストな免疫応答を惹起する。Ｌ１９株は増殖期間がより短く、従って、製造上の見通しからより効率的であろう。ＮａｎｏＢｉｏは、Ｌ１９株の単一プラークの単離およびウイルスの精製によるマスター・ウイルス・シード・バンクおよびワーキング・ウイルス・シード・バンクの樹立の後に、適格なＶｅｒｏ細胞株においてワクチン用のＲＳＶ  Ｌ１９株ウイルスを生産することを提案する。３つのウイルス株を比較する結果を表１５に示す。
【表１５】
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【０２０６】
実施例１０
本実施例の目的は、種々のナノエマルションアジュバントによるＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス株の不活化を記載することである。
【０２０７】
ナノエマルション（１）Ｗ８０５ＥＣ、（２）Ｗ８０５ＥＣとＰ４０７；（３）Ｗ８０５ＥＣとＰ１８８、（４）Ｗ８０５ＥＣと高分子量および低分子量キトサン、ならびに（５）Ｗ８０５ＥＣとグルカンを、ＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス株を用いて試験し、ウイルス不活化を判定した。
【０２０８】
２０％ナノエマルションによる不活化は室温で２時間行い、０．２５％βＰＬによる不活化は４℃で１６時間、次いで、３７℃で２時間行った。処理したウイルスをＨｅｐ−２細胞で３回継代培養し、細胞溶解液に対してウエスタンブロット解析を実施して生ウイルスの存在を調べた。図１５参照。特に、図１５はウエスタンブロット評価によるウイルス不活化を示し、レーンは（１）Ｗ８０５ＥＣ（レーン１）、（２）Ｗ８０５ＥＣ＋０．０３％Ｂ１，３グルカン（レーン２）、（３）Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％キトサン（中分子量）＋酢酸（レーン３）、（４）Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％Ｐ４０７（レーン４）、（５）Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％キトサン（低分子量）＋０．１％酢酸（レーン５）、（６）培地単独（レーン６）；（７）βＰＬ不活化ウイルス（レーン７）、および（８）Ｌ１９陽性対照（レーン８）を含有する。
【０２０９】
ＲＳＶ  Ｌ１９は評価したナノエマルション製剤により、また、βＰＬにより完全に不活化された。図１５は、細胞培養におけるＮＥ処理ウイルスの３回の連続継代培養の結果、ウエスタンブロットにおいてＲＳＶ抗体に対してブロットした場合にウイルス抗原は検出されないことを示す。この３回の細胞培養継代試験ンは、ウイルスの不活化を判定するために十分に確立され、受け入れられている方法である。当然のことながら、図１５の全てのレーンは、ウイルスバンドではなくウシ血清アルブミンである太いバックグラウンドバンドを持っている。ウイルスタンパク質は陽性対照でのみ検出することができる（レーン８）。
【０２１０】
実施例１１
本実施例の目的は、ＲＳＶワクチンの短期安定性を評価することであった。
【０２１１】
最終ナノエマルション濃度が２０％となるように、目的用量のＲＳＶ  Ｌ１９ウイルス製剤を製剤化した。ワクチンを室温（ＲＴ）および４℃で保存した。安定性試験パラメーターとしては、物理的および化学的分析を含んだ（表１６）。
【表１６】
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【０２１２】
ＲＳＶ  Ｌ１９株の物理的外観、平均粒径、ゼータ電位およびウエスタンブロットの判定基準は、Ｗ８０５ＥＣ＋／−βＰＬ不活化を伴ってＲＴおよび４℃で１４日間保存した後（最長試験）も適合していた。Ｗ８０５ＥＣ＋３％Ｐ４０７、Ｗ８０５ＥＣ＋０．３％キトサン−ＬＭＷ、およびＷ８０５ＥＣ＋０．３％キトサン−ＭＭＷは最大７〜８日間試験し、この場合にも安定性を示した。Ｗ８０５ＥＣ／Ｐ１８８（１：１：５）およびＷ８０５ＥＣ／Ｐ１８８（１：５：１）製剤は、ＲＳＶ  Ｌ１９株ではなく生ウイルスＲＳＶ  Ａ２株でも最大１４日間試験したところ、１：１：５製剤は安定性を示したが、１：５：１製剤は潜在的凝集を示した（表１７）。 
【表１７】
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【０２１３】
図１６は、０日目（図１６Ａ）とＲＴまたは４℃で１４日間の保存の後（図１６Ｂ）のウエスタンブロットによるＷ８０５ＥＣ＋／−βＰＬ不活化を伴うＲＳＶ  Ｌ１９株のＧバンド強度の例を示す。特に、図１６は、示されたように、抗ＲＳＶ抗体（抗Ｇ）；Ｌ１９ウイルス４×１０６ＰＦＵ／レーン、２×１０６ＰＦＵ／レーン、および１×１０６ＰＦＵ／レーン＋／−βＰＬ不活化とＷ８０５ＥＣを組み合わせて行ったウエスタンブロット解析を示す。検体をそのまま（図１６Ａ）または４℃もしくは室温（ＲＴ）で１４日後（図１６Ｂ）に分析した。
【０２１４】
実施例１２
本実施例の目的は、マウスにおけるＲＳＶワクチンの免疫原性を評価することであった。
【０２１５】
マウスに表１８に示されるように、筋肉内免疫を行った。０週目にマウスに５０μｌのＲＳＶアジュバントワクチンＩＭを施した。０週目および３週目にマウスから採血し、血清抗体を調べた。ナノエマルションが寄与するアジュバント活性に加えて、免疫応答を増強するために、免疫調節剤としてキトサンを使用した。
【表１８】
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【０２１６】
キトサンを含有するナノエマルションを接種したマウスは、単回用量のナノエマルションアジュバントＲＳＶワクチンの後、キトサンを含まないナノエマルションに比べて免疫応答の増強を示した（図１７）。特に、図１７は、キトサンとともに、また、伴わずに種々のナノエマルション製剤でＩＭ接種したマウスにおける接種から３週間後の免疫応答（ＩｇＧ、μｇ／ｍｌ）を示す。（１）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋２．５％Ｗ８０５ＥＣ＋０．１％低分子量キトサン；（２）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋５％Ｗ８０５ＥＣ；（３）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋２．５％Ｗ８０５ＥＣ；（４）ＲＳＶ  Ｌ１９株＋βＰＬ不活化ウイルス；および（５）ナイーブマウス（ワクチン無し）。図１７に示される結果は、最高レベルのＩｇＧが、ＲＳＶ  Ｌ１９株＋２．５％Ｗ８０５ＥＣ＋０．１％低分子量キトサンを接種したマウスで見られたこと、次に高いレベルのＩｇＧが、ＲＳＶ  Ｌ１９株＋２．５％Ｗ８０５ＥＣを接種したマウス、その次に、ＲＳＶ  Ｌ１９株＋５％Ｗ８０５ＥＣを接種したマウスで見られたことを示す。ワクチン接種マウスで見られた最低レベルのＩｇＧは、ＲＳＶ  Ｌ１９株＋βＰＬ不活化ウイルスの場合であった。
【０２１７】
実施例１３
本実施例の目的は、コットンラットにおいて本発明によるＲＳＶワクチンの免疫原性を判定することであった。
【０２１８】
コットンラットは、ＲＳＶワクチンの免疫原性および有効性を評価するために承認されている動物種である。マウスにおいて作製されたデータを用い、コットンラットにおける評価のために２つのナノエマルションを選択した。この供試される２つの初期製剤にはＷ８０５ＥＣおよびＷ８０Ｐ１８８５ＥＣ（１：１：５）が含まれた（上記表５および表６参照）。
【０２１９】
コットンラットに、６．６μｇのＦ−ｐｔｎを含有するナノエマルションアジュバントワクチン３０μｌ  ２用量をＩＮで施した。２３週目にこれらのラットに５×１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２株を投与した。４日目に動物の半数を犠牲にし、半数を８日目に犠牲にした。ワクチン接種計画を図１８に示す。
【０２２０】
以下に示す免疫原性データは、ＲＳＶ−ナノエマルションワクチンによるＩＮ免疫時に陽性免疫応答が見られたことを示す。第２の用量を投与した際、抗体力価の急速かつ有意な上昇が達成された。図１９に示すデータは、２１週目に、全ての動物の抗体レベルが、４週目に１回目のブーストを投与したすぐ後に得られた最大値の約１０分の１となったことを示す。抗原投与前の２回目のブーストを投与したところ、６週目、すなわち、１回目のブーストの２週間前に達成されたレベルとほぼ同じ免疫応答が生じた。両ナノエマルションは、強く有意な免疫応答の惹起に同等に効率的であった（図１９および２０）。（図１９および２０のＹ軸はＦタンパク質に対する特異的抗体のエンドポイント力価または抗体量を示し、Ｘ軸は期間を週数で示す。）
ＥＬＩＳＡ単位／μｇ／ｍｌ：  Ｆタンパク質に対する特異的抗体の量を、任意に１００ＥＵを割り付けた定義された参照血清に対するＥＬＩＳＡにおける曲線下面積により算出した。
【０２２１】
実施例１４
本実施例の目的は、中和抗体に対する本発明によるＲＳＶワクチン効果、ならびにＩＮ投与後の他のＲＳＶ株に対する、ＲＳＶ  Ｌ１９株を含んでなるＲＳＶワクチンの交差反応性を決定することであった。
【０２２２】
コットンラットに３０μｌのワクチンを鼻腔内接種し、４週目に追加免疫を行い、０、４、６、および８週目に採血した。２３週目に動物に５×１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２株で抗原投与を行った。試験群には、３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）かまたは６．６μｇのＦタンパク質を含有する３．２×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）のいずれかと混合した２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションを施した２群、ならびに３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株（ｎ＝８）かまたは６．６μｇのＦタンパク質を含有する３．２×１０５ＰＦＵのＬ１９  ＲＳＶ（ｎ＝８）のいずれかと混合した２０％Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションを施した２群を含んだ。
【０２２３】
動物の半数を４日目に犠牲にし、半数を８日目に犠牲にした。個々のコットンラットの血清の中和抗体を調べた。中和単位（ＮＥＵ）は、５０％のプラーク減をもたらした最大希釈率の逆数を表す。ＮＥＵの測定は、４週目（追加免疫前）と６週目（追加免疫の２週間後）に行った。６週目に得られた検体は、ＮＥＵ分析を可能とするのに十分な体液性免疫応答を生じていた。データは９５％信頼区間（ＣＩ）で幾何平均として表されている（図２１Ａ）。ＥＵとＮＥＵの間の相関は、スピアマンのρを用いた場合の、６週目の全ての動物に関するものである（図２１Ｂ）。
【０２２４】
特に、図２１は、６週間時点での中和抗体力価を示す（図２１Ａ）。６０％Ｗ８０５ＥＣまたは６０％Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣで不活化した３．２×１０６ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株を接種した全ての動物がロバストな中和抗体を生じたことは注目に値する。ＥＵと中和抗体（ＮＥＵ）の間には統計学的に有意な正の相関が存在する（図２１Ｂ）。
【０２２５】
中和単位（ＮＵ）：  ウイルスプラークを５０％減少させる最大血清希釈率の逆数。
【０２２６】
比活性（ＮＵ／ＥＵ）：  ＥＵ  Ｆタンパク質抗体１つ当たりのウイルス中和抗体（ＮＵ）（図２１Ｂ）。
【０２２７】
図２２は、４日目および８日目の中和抗体を示す。図２２Ａは、Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示し、図２２Ｂは、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示す。全てのコットンラットが、ワクチンＲＳＶ  Ｌ１９株に対して高い中和抗体（ＮＵ）を示した。中和抗体は、抗原投与後に確実に上昇していた（Ｙ軸）。８日目に中和単位（ＮＵ）は４日目のＮＵよりも高かった。ナイーブコットンラットは、それらの血清中に中和活性を示さなかった。血清中和抗体および比活性は、抗原投与４日後から８日後まで増加傾向を示した。
【０２２８】
図２３は血清抗体の比活性を示す。この血清抗体の比活性（中和単位／ＥＬＩＳＡ単位）は、抗原投与後４日目に比べて８日目に増加する傾向にある。図２３Ａは、４日目および８日目の、Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果（Ｙ軸のＮＵ／ＥＵ）を示す。図２３Ｂは、４日目および８日目の、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果（Ｙ軸のＮＵ／ＥＵ）を示す。全てのコットンラットが高い中和活性を示した（図２３）。
【０２２９】
ワクチンを接種したコットンラットの血清は、抗原投与４日目にＲＳＶ  Ａ２株に対して（ＲＳＶ  Ｌ１９株に加えて）交差防御を示した（図２４）。特に、図２４は、３用量のＲＳＶ  Ｌ１９アジュバントワクチンを施した後にＲＳＶ  Ａ２株を施したコットンラットに関する４日目の交差防御を示す。図２４Ａは、Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示し、図２４Ｂは、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションをＲＳＶ  Ｌ１９株と組み合わせた場合の結果を示す。血清中和活性は、ＲＳＶ  Ｌ１９株またはＲＳＶ  Ａ２株に対して等しいＮＵを示し、これら２つのＲＳＶ株間での交差防御を示す。ワクチン接種したコットンラットは、ナイーブコットンラットに比べて、抗原投与４日後に投与したＲＳＶウイルスを全て排除した（図２５）。予測されたように、８日目までに全ての動物がウイルスを排除した。特に、図２５は、供試コットンラットの肺におけるＲＳＶ  Ａ２株ウイルス力価（ＰＦＵ／ｇ）の測定による、コットンラット肺の４日目のウイルス排除を示す。接種コットンラット（Ｗ８０Ｐ１８８５ＥＣナノエマルションとＲＳＶ  Ｌ１９株の組合せ、またはＷ８０５ＥＣナノエマルションとＲＳＶ  Ｌ１９株の組合せを接種）は、コットンラットの肺からの、ＲＳＶ  Ａ２株として投与されたウイルスの完全な排除を示した。これに対して、ナイーブ動物は肺１グラム当たり＞１０３ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２株を示す（検出限界は２．１×１０１ｐｆｕ／ｇであった）。
【０２３０】
実施例１５
本実施例の目的は、コットンラットにおいて本発明によるＲＳＶワクチンの筋肉内ワクチン接種を評価することであった。
【０２３１】
コットンラットに図２６に示す計画に従ってＩＭによるワクチン接種を行った。動物に３．３μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶアジュバントＲＳＶワクチン（２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションと３．３μｇのＦタンパク質を含有する１．６×１０５ＰＦＵのＲＳＶ  Ｌ１９株との混合物）５０μｌを施した。コットンラットはＲＳＶに対する特異的免疫応答を生じた。抗体レベルは、１４日目に２回目のブーストを投与するまで減少した（図２７および２８）。特に、図２７は、ワクチン接種を行ったコットンラットにおける血清免疫応答を示す。Ｙ軸は、１４週間の、そして抗原投与４日後、および抗原投与８日後の血清ＩｇＧ（μｇ／ｍＬ）を示す。図２８は、ワクチン接種を行ったコットンラットにおける血清免疫応答を示す。図２８Ａは、１４週間の、そして抗原投与４日後、および抗原投与８日後のエンドポイント力価（Ｙ軸）を示す。図２８Ｂは、１４週間の、そして抗原投与４日後、および抗原投与８日後のＥＬＩＳＡ単位（Ｙ軸）を示す。
【０２３２】
ＩＭ免疫の有効性は、ヒトで疾患を引き起こす株である生ＲＳＶ  Ａ２株で動物に抗原投与を行うことによって評価した。ＲＳＶ  Ｌ１９ナノエマルションアジュバントワクチンの追加免疫から２週間後に、５×１０５ｐｆｕ用量のＲＳＶ  Ａ２株を動物に投与した。齢が一致するナイーブ群にも抗原投与を行った。各群の動物の半数を、コットンラットの肺で最大ウイルス量が示された時点である抗原投与後４日目に犠牲にした。もう半分は８日目に犠牲にした。
【０２３３】
ウイルス排除：  肺培養は、ワクチン接種を行った全ての動物は抗原投与後４日目に肺にウイルスを持っていなかったが、ナイーブ動物は肺組織１ｇ当たり１０３ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２株のウイルス量を持っていた（図２１）。特に、図２９は、供試コットンラットの肺におけるＲＳＶ  Ａ２株ウイルス力価（ＰＦＵ／ｇ）の測定による、コットンラット肺の４日目のウイルス排除を示す。ワクチン接種を行ったコットンラット（Ｗ８０５ＥＣナノエマルションとＲＳＶ  Ｌ１９株の組合せを接種）は、コットンラットの肺からの、ＲＳＶ  Ａ２株として投与されたウイルスの完全な排除を示した。これに対し、ナイーブ動物は、肺１グラム当たり１０３ｐｆｕ以上のＲＳＶ  Ａ２株というウイルス量を示した（検出限界は２．１×１０１ｐｆｕ／ｇであった）。
【０２３４】
コットンラットの要旨：  ナノエマルションとして製剤化し、ＩＮまたはＩＭ投与した全てのＲＳＶワクチンは防御免疫応答を惹起し、この免疫応答は免疫動物の感染を防いだ。さらに、ナノエマルション不活化・アジュバントＲＳＶ  Ｌ１９ワクチンは、一般的に受け入れられているコットンラットモデルにおいて高い免疫原性がある。コットンラットは、１回の免疫後に抗体力価の上昇を惹起し、２回目の免疫後に著しい免疫増強（およそ１０倍増）を惹起した。生成された抗体は生ウイルスの中和に極めて有効であり、中和と抗体力価の間には直線的関係がある。さらに、コットンラットで生成された抗体は、ＲＳＶ  Ｌ１９株で免疫し、ＲＳＶ  Ａ２株で抗原投与した場合に交差防御を示した。ＩＭおよびＩＮ免疫とも、２回目の追加免疫として抗原に曝露した後にも、または生ウイルスに曝露した後にも呼び出しまたは想起が可能な記憶を確立した。
【０２３５】
実施例１６
本実施例の目的は、Ｗ８０５ＥＣナノエマルションアジュバントＲＳＶワクチンの鼻腔内（ＩＮ）投与と筋肉内（ＩＭ）投与を比較することであった。
【０２３６】
方法：  １．７μｇのＦタンパク質とともに２×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬ１９  ＲＳＶウイルスを含有するＲＳＶワクチンを、２０％Ｗ８０５ＥＣナノエマルションアジュバントで不活化した。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０／アーム）に０週目および４週目にＩＮまたはＩＭでワクチン接種を行った。血清を抗Ｆ抗体に関して分析した（図３０）。脾臓、子宮頸および腸管リンパ節（ＬＮ）からの細胞をＲＳＶ特異的サイトカインに関して分析した（図３１）。８週目にマウスに５×１０５ＰＦＵのＬ１９で口咽頭から抗原投与を行った。気道過敏症をプレチスモグラフィーにより評価した。抗原投与８日後に肺を分析して、サイトカインのｍＲＮＡ、ウイルスタンパク質、および組織病理学を評価した。
【０２３７】
結果：  ＩＭでワクチン接種を行ったマウスは、ＩＮでワクチン接種を行ったマウスに比べて、抗原投与の後に、高い抗Ｆ抗体を有し（ＧＭ３９６［９５％ＣＩ  ２４０−６５２］対２［９５％ＣＩ  ０−９１］）（図２２）、より多いＩＬ−４およびＩＬ−１３を生成した（ｐ＜０．０５）（図３１）。これに対して、脾臓細胞、子宮頸ＬＮおよび腸管ＬＮからのＩＬ−１７は、ＩＭワクチン接種よりもＩＮワクチン接種の後に高かった（それぞれＧＭ：５７対１、１１９対３および５１対４ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）（図３１）。図３２は、ＩＮまたはＩＭいずれかのワクチン接種の後の肺組織におけるサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１７の測定を示す。ＩＬ−４およびＩＬ−１３はＩＭ投与後により高い量で発現したが、ＩＬ−１７はＩＮ投与後により高い発現を示した。抗原投与時には、両免疫経路ともＦおよびＧタンパク質の排除をもたらしたが、検証的組織病理学を用いると、気道抵抗はＩＭ群の方が高かった（ｐ＝０．０３）（図３３）。肺のＩＬ−４およびＩＬ−１３は気道過敏症と強い正の相関を持っていた（それぞれｒ＝０．８９；ｐ＝０．００１およびｒ＝０．８；ｐ＝０．００７）。肺のＩＬ−１７はＩＮでワクチン接種したマウスにのみ生成され（ｐ＝０．００８）、気道過敏症と強い負の相関を持っていた（ｒ＝−０．８１、ｐ＝０．００７）。
【０２３８】
結論：  新規なナノエマルションアジュバントＷ８０５ＥＣを用いた場合、ＩＭワクチン接種に比べてＩＮワクチン接種は気道過敏症が少なくなり、これは高いＩＬ−１７産生と強い相関があった。粘膜ワクチン接種により生成されるＩＬ−１７は、ＲＳＶ感染における気道過敏症の軽減の重要なマーカーとなり得る。
【０２３９】
明細書における参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月8日(2014.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）表面抗原またはその抗原性フラグメントと、
（ｂ）約１０００ｎｍ以下の平均サイズを有する液滴ならびに：
（ｉ）水相；
（ｉｉ）少なくとも１種類の油；
（ｉｉｉ）少なくとも１種類の界面活性剤；および
（ｉｖ）少なくとも１種類の有機溶媒
を含んでなる免疫増強ナノエマルションまたはその希釈溶液と
を含んでなり、前記少なくとも１つのＲＳＶ表面抗原が前記ナノエマルション内に含まれる、ワクチン組成物
【請求項２】
（ａ）前記ＲＳＶ表面抗原がＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の抗原性フラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の抗原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せである;
（ｂ）前記ＲＳＶ表面抗原が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＨＲＳＶ−Ｌ１９として寄託されているヒト呼吸器合胞体ウイルスに由来する;あるいは
（ｃ）それらの任意の組合せである、
請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＲＳＶ表面抗原が、弱毒化表現型を表す少なくとも１つのヌクレオチド改変をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
（ａ）ＲＳＶ表面抗原またはその抗原性フラグメントが融合タンパク質中に存在する;
（ｂ）前記ＲＳＶ表面抗原が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のペプチドフラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のペプチドフラグメント、またはそれらの任意の組合せである;あるいは
（ｃ）それらの任意の組合せである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
（ａ）前記ＲＳＶ表面抗原が多価である;あるいは
（ｂ）前記ＲＳＶ表面抗原が多価であり、かつ前記多価表面抗原がＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の抗原性フラグメント、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の抗原性フラグメント、またはそれらの任意の組合せである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記免疫増強ナノエマルションがＴｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答、またはそれらの任意の組合せを誘導し得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
（ａ）アジュバント;
（ｂ）少なくとも１種類の薬学上許容される担体;または
（ｃ）それらの任意の組合せ
をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ワクチン組成物が、
（ａ）非経口、経口、鼻腔内、または直腸のいずれかの投与用;あるいは
（ｂ）皮内、皮下、腹腔内または筋肉内注射によるに非経口投与用、
に製剤化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
クチン組成物。
【請求項９】
（ａ）単離されたＲＳＶビリオン粒子;
（ｂ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＨＲＳＶ−Ｌ１９として寄託されているヒト呼吸器合胞体ウイルスに由来する、単離されたＲＳＶビリオン粒子;
（ｃ）前記ナノエマルションにより不活化される、単離されたＲＳＶビリオン粒子;
（ｄ）ＲＳＶウイルスゲノムが少なくとも１つの弱毒化突然変異を含んでなる、単離されたＲＳＶビリオン粒子;または
（ｅ）それらの任意の組合せ、
をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ワクチン組成物が、
（ａ）被験体に対して全身有毒がなく；
（ｂ）投与の際に生じる炎症が最小または皆無であり；または
（ｃ）それらの任意の組合せである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記ナノエマルション滴が、約１０００ｎｍ未満、約９５０ｎｍ未満、約９００ｎｍ未満、約８５０ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７５０ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６５０ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５５０ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４５０ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３５０ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ超、約７０ｎｍ超、約１２５ｎｍ超、約１２５ｎｍ超および約６００ｎｍ未満、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される平均直径を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記ナノエマルションが、
（ａ）水相；
（ｂ）約１％の油〜約８０％の油；
（ｂ）約０．１％の有機溶媒〜約５０％の有機溶媒；および
（ｃ）約０．００１％の界面活性剤〜約１０％の界面活性剤
を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記ナノエマルションが、
（ａ）水相；
（ｂ）約１％の油〜約８０％の油；
（ｃ）約０．０１％の有機溶媒〜約５０％の有機溶媒；
（ｄ）約０．００１％〜約１０％の１種類以上の非イオン性界面活性剤；および
（３）陽イオン性界面活性剤
を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
被験体への投与に続き、被験体が１回のワクチン投与の後に血清転換を受ける、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
薬剤の製造のための請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１６】
前記薬剤が小児を処置するために使用される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤が高齢被験体、移植被験体、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する被験体、またはそれらの任意の組合せを処置するために使用される、請求項１５に記載の使用。
【国際調査報告】
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