(57)【要約】  シスチン／グルタミン酸アンチポーターを介して細胞中に導入することが可能な標識基質を含むイメージング剤が記載される。かかる基質は、シスチン／グルタミン酸アンチポーターを介して標識イメージング剤を細胞中に導入し、続いて検出することにより、細胞中の酸化ストレスをイメージング又は検出するために使用できる。【選択図】図１
2014526505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を含んでなるイメージング剤。
【化１】
2014526505.tif 000015
式中、
Ｘは各々独立にＨ、−(ＣＨ2)mＨ又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＨであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数である。
【請求項２】
標識誘導体が次の式IIの化合物を含む、請求項１記載のイメージング剤。
【化２】
2014526505.tif 000016
式中、
Ｒ2は各々独立にＨ、18Ｆ、3Ｈ、−(ＣＨ2)mＲ3又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＲ3であり、
Ｒ3は18Ｆ又は3Ｈであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数である。
【請求項３】
Ｒ2が18Ｆ又は3Ｈであり、ｎが５に等しい、請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
Ｒ2が単独で存在する18Ｆである、請求項３記載のイメージング剤。
【請求項５】
18Ｆ又は3Ｈが単独で存在している、請求項２記載のイメージング剤。
【請求項６】
シスチン／グルタミン酸輸送体を有する標的のイメージング方法であって、
次の式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を含むイメージング剤を標的中に導入する段階、及び
標的中の標識誘導体を検出する段階
を含んでなる方法。
【化３】
2014526505.tif 000017
式中、Ｘは各々独立にＨ、−(ＣＨ2)mＨ又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＨであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数でである。
【請求項７】
標識誘導体が次の式IIの化合物を含む、請求項６記載の方法。
【化４】
2014526505.tif 000018
式中、
Ｒ2は各々独立にＨ、18Ｆ、3Ｈ、−(ＣＨ2)mＲ3又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＲ3であり、
Ｒ3は18Ｆ又は3Ｈであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数である。
【請求項８】
細胞中の酸化ストレスを検出する方法であって、
次の式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を含むイメージング剤を導入する段階、及び
細胞中の標識誘導体を検出する段階
を含んでなる方法。
【化５】
2014526505.tif 000019
式中、
Ｘは各々独立にＨ、−(ＣＨ2)mＨ又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＨであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数である。
【請求項９】
標識誘導体が次の式IIの化合物を含む、請求項８記載の方法。
【化６】
2014526505.tif 000020
式中、Ｒ2は各々独立にＨ、18Ｆ、3Ｈ、−(ＣＨ2)mＲ3又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＲ3であり、
Ｒ3は18Ｆ又は3Ｈであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数でである。
【請求項１０】
Ｒ2が18Ｆ又は3Ｈであり、ｎが５に等しい、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には標識分子イメージング剤に関し、さらに詳しくはシスチン／グルタミン酸輸送体を介して細胞に取り込まれるイメージング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子イメージングの概念は、病理学的状態の分子シグナチュアの特異的コントラスト増強を約束すると共に、特定の病理学的適応症において特異的に調節される標的化可能なバイオマーカーを要求する。かかる特異的分子コントラスト剤は疾患のイメージング及び診断のため大いに有用であり得るものの、真に特異的なバイオマーカーの確認は非常に困難であることが判明している。かかる特異的バイオマーカーに対するコントラスト剤が創製されても、かかるコントラスト剤の市場はこの適応症の罹患率によって限定される。したがって、各種の病理学的適応症をイメージ化するために利用できる分子コントラスト剤を開発することに大きな関心が集まっている。大抵のイメージング剤は特定の組織又は細胞タイプ或いは特定の療法を標的化し、さもなければ時間と共に急速に分解する。広範な用途に向けられるイメージング剤の一例は、グルコース輸送体を利用する18Ｆ−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）である。18Ｆ−ＦＤＧは、グルコース要求量の増加した細胞によって優先的に取り込まれ、次いで細胞内に捕捉される。ＦＤＧは、多くの癌の診断、ステージング及びモニタリング並びに心臓及び脳における代謝のモニタリングのため臨床的に使用できる。18Ｆ−ＦＤＧは、腎細管中に見出されるナトリウム依存性グルコース輸送体の基質ではなく、このことがその腎再吸収を防止してクリアランスを促進する。
【０００３】
インビボ酸化ストレスは、細胞ストレスの指標として認められている。このストレスをイメージ化しようという努力には、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）を用いて動物のイメージングを行うことが含まれていた。ＥＰＲは、酸化ストレスにおいてフリーラジカルの生成と共に生じる不対電子を検出するための技法である。本質的に、酸化ストレスの尺度としての臓器抗酸化活性に対して感受性を有するＥＰＲプローブと見なされる薬剤が使用される。
【０００４】
他の研究者達はまた、１３−Ｃ−グリシン化学シフトＭＲＩを用いて、インビボでの腫瘍の化学療法治療の動物モデルにおいてグリシンの取込み及びグルタチオンへの転化を検出することに目を向けた。さらに他の研究者達は、化学療法治療をモニターするためにインビボでアポトーシス細胞を検出するためのイメージング剤を開発した。かかるイメージング剤には、例えば、やや大きいタンパク質である標識アネキシンＶ、及びアポトーシス細胞中にのみ特異的に侵入することが報告されている１群の小分子であるＮｅｕｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＡｐｏｓｅｎｓｅがある。
【０００５】
また、細胞酸化ストレスの条件下で活性化される細胞アミノ酸輸送体（シスチン／グルタミン酸アンチポーター、Ｘc-）を利用するイメージング剤も報告されている。これは、２００９年４月２７日に提出された、「標識分子イメージング剤、製造方法及び使用方法」と称する米国特許出願第１２／４３０５７３号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されている。
【０００６】
この輸送機構を利用する他の基質を用いてシスチン／グルタミン酸アンチポーター輸送機構を活用することも有利であり得る。それ故、取込みに関してシスチンと競合する小分子はイメージング剤用の良好な候補となり得る。さらに、競合機構はその代謝に関係した細胞又はその組織の状態に関する情報を提供し得る。したがって、シスチンと競合する標識分子の使用は、有効な治療療法を設計するために使用される腫瘍タイプを同定するための貴重なツールを提供し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
国際公開第２０１１／０５７９８６号
【発明の概要】
【０００８】
本発明のイメージング剤及び方法は、細胞酸化ストレスの条件下で活性化される細胞アミノ酸輸送体（シスチン／グルタミン酸アンチポーター、ｘc-）を利用する。さらに、シスチン／グルタミン酸輸送体のアップレギュレーションは、ある種の腫瘍における化学療法耐性にも関連している。したがって、高いシスチン取込みを有する腫瘍の非侵襲的イメージングは特定の療法に対して耐性を有する可能性がある腫瘍を同定することができ、これは治療計画の有効な変更を可能にするであろう。
【０００９】
本発明の一実施形態は、次の式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を含んでなるイメージング剤からなる。
【００１０】
【化１】
2014526505.tif 000003
式中、Ｘは各々独立にＨ、−(ＣＨ2)mＨ又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＨであり、ｎは３〜７の整数であり、ｍは１〜３の整数である。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を用いて細胞をイメージングする方法からなる。本方法の一例は、一般に、シスチン／グルタミン酸輸送体を介して式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を含むイメージング剤を標的中に導入する段階、及び陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、オートラジオグラフィー、シンチレーション検出又はこれらの組合せの１以上を用いてイメージング剤を検出する段階を含んでなる。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、シスチン／グルタミン酸輸送体を介して式Ｉの18Ｆ又は3Ｈ標識誘導体を含むイメージング剤を導入することにより、細胞中の酸化ストレスを検出する方法からなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で表されている。
【図１】図１は、ＤＥＭ処理によって酸化ストレスに暴露された細胞において3Ｈ−Ｌ−Ａｓｕ（3Ｈ−Ｌ−アミノスベリン酸）の取込みが増加することを示している。
【図２】図２は、試料当たりの適用用量のパーセントで表した各標識化合物の取込み、及びシスチン／グルタミン酸輸送体阻害剤であるスルファサラジン（ＳＳＺ）の存在下での取込みを示している。
【図３】図３は、シスチン／グルタミン酸輸送体を介しての取込みに対する競合を評価するための追加化合物の選別を示している。
【図４】図４は、ＤＥＭ処理ＥＬ４細胞における3Ｈ−Ｌ−ＧＬＵ取込みに関するＬ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−Ａｓｕ、Ｌ−アミノアジピン酸（Ｌ−ＡＡＡ）及びＤ−Ａｓｕの用量依存性阻害応答を示している。
【図５】図５は、エクスビボのＥＬ４異種移植腫瘍組織における3Ｈ−Ｌ−Ａｓｕ及び3Ｈ−２−デオキシ−２−フルオログルコース（3Ｈ−ＦＤＧ）の取込みの比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。
【００１５】
本明細書中で使用される「シスチン／グルタミン酸輸送体」という用語は、シスチン／グルタミン酸アンチポーター、シスチン／グルタミン酸交換体、シスチン輸送体、ｘc-、ｘｃ(−)、Ｘｃ(−)、系ｘｃ(−)及びアミノ酸輸送系Ｘｃ(−)という用語と互換的に使用されかつこれらを包含する。この輸送系は２種のタンパク質の二量体を含み、特に限定されないが、タンパク質ｘＣＴ（ＳＬＣ７Ａ１１）及びタンパク質ＣＤ９８（４Ｆ２ｈｃ、４Ｆ２表面抗原のＨ鎖、ＳＬＣ３Ａ２）、ｘｃ(−)系に対して特異的なサブユニットであるタンパク質ｘＣＴ、様々な基質に関する複数の輸送体に共通するサブユニットであるタンパク質ＣＤ９８、並びに複数の輸送体に共通する別のサブユニットであるｒＢＡＴと二量体化することもできるタンパク質ｘＣＴを包含する。また、Ｌ−ＡＳＵ及びＬ−Ａｓｕという表記は、いずれもＬ−アミノスベリン酸に対応する。
【００１６】
シスチン／グルタミン酸輸送体は、大抵の組織で通例は発現されないか又は極めて低い発現を示すが、酸化ストレスに暴露された細胞ではアップレギュレートされる。２つのジスルフィド結合システインアミノ酸からなるシスチンは、この輸送体に対する天然の基質である。輸送体のアップレギュレーション効果はシスチン取込みの増加であり、次いでこれは細胞内でシステインに還元される。細胞内システインは、グルタチオン合成のための律速基質である。グルタチオンは、酸化ストレスから細胞を守るための主たる酸化防止剤である。細胞内システインは、２つの経路の一方（即ち、グルタチオン合成又はタンパク質合成）に取り込まれる。
【００１７】
一般に、本発明のイメージング剤は、シスチン／グルタミン酸アンチポーターの基質となるために必要な属性を維持するアミノ置換Ｃ６〜Ｃ１０ジカルボン酸の標識類似体を含んでいる。かかる類似体は、次の式Ｉの放射性同位体標識誘導体によって表される。
【００１８】
【化２】
2014526505.tif 000004
式中、
Ｘは各々独立にＨ、−(ＣＨ2)mＨ又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＨであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数である。
【００１９】
若干の実施形態では、式Ｉはアミノスベリン酸からなる。
【００２０】
イメージング剤は、イメージング剤の自己蛍光放出又は光学的性質のようなその放出信号によって検出できる。化合物の検出方法には、必ずしも限定されないが、意図される用途及び医学又は研究職員にとってイメージング方法論に応じて核シンチグラフィー、陽電子放出断層撮影法（「ＰＥＴ」）、単光子放出コンピューター断層撮影法（「ＳＰＥＣＴ」）、磁気共鳴イメージング、磁気共鳴分光法、コンピューター断層撮影法又はこれらの組合せが挙げられる。
【００２１】
シスチン／グルタミン酸輸送体に対する本発明の標識基質はまた、治療目的のため、標識化合物（例えば、特に限定されないが、18Ｆ又は3Ｈで標識された式Ｉの薬剤）を標的中に導入するためにも使用できる。本明細書中で使用される標的は、生きている被験体の細胞又は組織（インビボ）或いは単離された細胞又は組織（エクスビボ）を意味し得る。
【００２２】
若干の実施形態では、18Ｆ又は3Ｈラベルは、次の式IIで表されるように、炭素鎖のアルキル基上に位置している。
【００２３】
【化３】
2014526505.tif 000005
式中、
Ｒ2は各々独立にＨ、18Ｆ、3Ｈ、−(ＣＨ2)mＲ3又は−Ｏ−(ＣＨ2)mＲ3であり、
Ｒ3は18Ｆ又は3Ｈであり、
ｎは３〜７の整数であり、
ｍは１〜３の整数である。
【００２４】
若干の実施形態では、式IIの化合物は、アルキル主鎖に沿って単一の放射性同位体ラベルが配置された単一標識化合物である。放射性同位体ラベルの位置が炭素鎖に沿った任意の位置にあり得ることは言うまでもない。若干の他の実施形態では、化合物はアルキル鎖に沿った複数の位置で標識されていてもよい。
【００２５】
表１は、標識化合物の非限定的な代表例を示している。
【００２６】
【表１】
2014526505.tif 000006
記載された化合物の多くは１以上の非対称中心を含むことがあり、したがって鏡像異性体、ジアステレオマー及び他の立体異性形態を生じることがある。これらは絶対立体化学の観点から(Ｒ)−又は(Ｓ)−として定義できる。本発明は、全てのかかる可能な異性体並びにこれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を包含するものとする。光学的に活性の(Ｒ)−及び(Ｓ)−異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を用いて製造でき、或いは通常の技法を用いて分割できる。
【００２７】
他のシスチンと異なり、標識化合物が細胞中に輸送された場合、これらはタンパク質合成又はグルタチオン合成経路中に組み込まれないことがある。同じ輸送体を介して化合物が細胞外に輸送されることもあり得るものの、Ｌ−グルタミン酸の細胞内濃度は極めて高く、したがって細胞エクスポートにとって有利な基質であり、結果として化合物の大部分は細胞内に捕捉される。
【００２８】
検査した多種多様のヒト組織及び細胞のうち、ｘc-輸送体は主として脳において発現されるが、また膵臓及び培養細胞株においても発現される。ｘc-輸送体の発現は大抵の組織において非常に低いが、酸化ストレスの条件下及び培養中の細胞が増殖する場合にアップレギュレートされることがある。ｘc-輸送体は、アポトーシス刺激、酸化ストレス、炎症、シスチン欠乏及び化学療法耐性を含む複数の条件下で誘発される。例えば、18ＦはインビボＰＥＴイメージング並びに細胞酸化ストレスのインビトロ検出のために使用できる。
【００２９】
同様に、シスチン／グルタミン酸輸送体のアップレギュレーションは、ある種の腫瘍における化学療法耐性にも関連している。したがって、高いシスチン取込みを有する腫瘍の非侵襲的イメージングは特定の療法に対して耐性を有する可能性がある腫瘍を同定することができ、これは治療計画の有効な変更を可能にするであろう。
【００３０】
以下、イメージング剤及び使用方法の様々な実施形態を例示するために使用される非限定的な例を示す。
【００３１】
実験手順：
スキーム１：
【００３２】
【化４】
2014526505.tif 000007
実験手順：
【００３３】
【化５】
2014526505.tif 000008
（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル ５−エチル ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタンジオエート（２）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中の（Ｓ）−５−ｔｅｒｔ−ブトキシ−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタン酸（１．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液にトリエチルアミン（０．６９ｍＬ、４．９５ｍｍｏｌ）を添加し、外部の氷−メタノール冷浴で混合物を０℃に冷却した。同じ温度で、４−ジメチルアミノピリジン（０．０４ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、続いてクロロギ酸エチル（０．３８ｍＬ、３．９６ｍｍｏｌ）を順次に添加し、混合物を１時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１５０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水性相を追加のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られた残留物を４０ｇシリカゲルカラム（溶離剤：ヘキサン〜ヘキサン中３０％酢酸エチル）上で精製することで、（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル ５−エチル ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタンジオエート（０．８０ｇ、７３％収率）を濃厚油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：５．１０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｍ，３Ｈ），２．３９（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｍ，１Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：３５４(Ｍ＋Ｎａ)+。
【００３４】
【化６】
2014526505.tif 000009
（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル ５−エチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタンジオエート（３）：
アセトニトリル（４５ｍＬ）中の（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル ５−エチル ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタンジオエート（１．５ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．１１ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）の混合物に、過剰のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３．０ｇ、１３．７５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。混合物を同じ温度で一晩撹拌した。次いで、（出発原料が完全には消費されなかったので）さらに１．０ｇのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートを添加し、さらに６時間撹拌することで生成物の生成に向けて反応を推進した。反応の完了後、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物を４０ｇシリカゲルカラム（溶離剤：ヘキサン〜ヘキサン中２０％酢酸エチル）上で精製することで、（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル ５−エチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタンジオエート（１．７６ｇ、９０．２％収率）を無色の濃厚油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．８１（ｄｄ，Ｊ＝５．２，４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｓ，１８Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：１７２．８，１６９．３，１５２．３，８２．９，８１．３，６０．４，５８．１，３１．０２，２８．０，２７．９，２４．６及び１４．２。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：４５４(Ｍ＋Ｎａ)+。
【００３５】
【化７】
2014526505.tif 000010
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（４）：
乾燥テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル ５−エチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタンジオエート（１．７ｇ、３．９３ｍｍｏｌ）の溶液をアセトン／ドライアイス浴で−７８℃に冷却し、水素化ジイソブチルアルミニウム（ヘキサン中１．０Ｍ、５．９ｍＬ、５．９０ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。反応は４時間撹拌した後に完了し、次いで水（１．５ｍＬ）でクエンチし、外部の冷浴を取り除くことで室温まで放温した。得られた白色の濃厚溶液をセライト粉末で濾過し、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、４０ｇシリカゲルカラム（溶離剤：ヘキサン〜ヘキサン中３０％酢酸エチル）上で精製することで、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．９０ｇ、５９．１％収率）を濃厚油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：９．７９（ｓ，１Ｈ），４．７７（ｄｄ，Ｊ＝９．３，５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｓ，１８Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：２０１．２，１６９．２，１５２．４，８３．１，８１．５，５８．１１，４０．７，２８．０，２７．９及び２１．９。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：４１０(Ｍ＋Ｎａ)+。
【００３６】
【化８】
2014526505.tif 000011
（７Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ７−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−ヒドロキシオクト−２−インジオエート（５）：
乾燥ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルプロピオレート（４２．７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、リチウムジイソプロピルアミド（ＴＨＦ／エチルベンゼン中２．０Ｍ、０．１５ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下において−７８℃でゆっくりと添加した。得られた反応混合物を同じ温度で１．０時間撹拌し続け（リチウムプロピオレート陰イオンを生成させるため）、次いで（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．０７５ｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）の１．０ｍＬ ＴＨＦ溶液をゆっくりと添加した。混合物を同じ温度で（ＴＬＣによって完了するまで）９０分間撹拌した。次いで、反応物を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（０．５ｍＬ）でクエンチし、外部のアセトン／ドライアイス浴を取り除くことで室温まで温めた。反応溶液酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、ＮＨ4Ｃｌの飽和水溶液（１５ｍＬ）を撹拌しながら添加した。水性相を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残留物を１２ｇシリカゲルカラム（溶離剤：ヘキサン〜ヘキサン中４０％酢酸エチル）上で精製することで、（７Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ７−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−ヒドロキシオクト−２−インジオエート（ジアステレオマー混合物、４０ｍｇ、４０．３％収率）を油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．７６（ｄｔ，Ｊ＝９．２，５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｍ，１Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ），１．５２（ｓ，１８Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：１６９．６３，１６９．５２，１５２．４７，１５２．４０，１５２．３４，８４．９６，８４．９４，８３．６３，８３．０９，８３．０４，８１．４８，８１．４６，７７．８９，７７．８４，６１．９０，６１．３７，５８．４７，５８．３１，３３．７５，３３．７０，２８．０２，２７．９６，２７．９３，２５．１３及び２４．７２。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：５３６(Ｍ＋Ｎａ)+。
【００３７】
【化９】
2014526505.tif 000012
（２Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシオクタンジオエート（６）：
２５ｍＬ丸底（ＲＢ）フラスコを窒素でパージし、（７Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ７−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−ヒドロキシオクト−２−インジオエート（０．０４ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、酢酸エチル（５ｍＬ）及び炭素上５％パラジウム（約２．０ｍｇ乾燥重量）を仕込んだ。ＲＢフラスコを排気し、バルーン中の水素ガスを（１３ｐｓｉ又は約１．０気圧の圧力に）充填し、室温で一晩撹拌した。この時間後、水素を排出し、窒素をＲＢフラスコ内に充填した。触媒をこの時間後、水素を排出し、窒素をＲＢフラスコ内に充填した。触媒をＣｅｌｉｔｅ ５４５のパッドによる濾過で除去し、フィルターケーキをメタノール（１０ｍＬ）及び水（２．０ｍＬ）で洗浄した。５４５のパッドによる濾過で除去し、フィルターケーキを酢酸エチル（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮することで、（２Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシオクタンジオエート（ジアステレオマー混合物、０．０４ｇ、９９．３％収率）を油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．７３（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），２．２７−１．５６（ｍ，６Ｈ），１．５１（ｓ，１８Ｈ），１．４５（２ｓ，１８Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：１７３．６０，１７３．５８，１７０．０１，１６９．７５，１５２．５８，１５２．４８，８２．８６，８２．８２，８１．２８，８１．２５，８０．４２，８０．４０，７１．１９，７０．６５，５８．９２，５８．６８，３４．３７，３４．１５，３２．３０，３２．２２，３２．１５，３２．０５，２８．０７，２８．０２，２７．９４，２５．６９及び２５．５５。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：５４０(Ｍ＋Ｎａ)+。
【００３８】
【化１０】
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（２Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（トシルオキシ）オクタンジオエート（７）：
（２Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシオクタンジオエート（０．０３ｇ０．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、シセイソプロピルエチルアミン（０．１２ｍＬ、０．６９ｍｍｏｌ）及び触媒量の４−ジメチルアミノピリジン（約１．０ｍｇ）を室温で添加した。得られた反応混合物をさらに５分間撹拌し、次いで固体４−メチルベンゼンスルホン酸無水物（０．１９ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を一度に添加し、一晩撹拌し続けた。出発原料が消費されなかったので、４−メチルベンゼンスルホン酸無水物の第２の部分（０．０９５ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加し、次いで反応物を室温でさらに１２時間撹拌し続けた。最後に、反応混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１０ｍＬ）で希釈し、１０分間撹拌した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を４ｇシリカゲルカラム（溶離剤：ヘキサン〜ヘキサン中４０％酢酸エチル）上で精製することで、（２Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（トシルオキシ）オクタンジオエート（ジアステレオマー混合物、１２ｍｇ、２９％収率）を粘稠な油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：７．８１（２ｄ，２Ｈ），７．３５（ｍ，２Ｈ），４．６０（ｍ，２Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ），２．３５−１．５５（ｍ，８Ｈ），１．５１（ｍ，１８Ｈ），１．４４（ｍ，１８Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：１７１．８４，１７１．８２，１６９．２８，１６９．２６，１５２．３２，１４４．５７，１３４．２７，１２９．８４，１２９．８２，１２７．７５，１２７．７２，８２．９１，８２．８８，８２．１７，８２．０，８１．３５，８１．３０，８０．５０，５８．５７，５８．２８，３１．２５，３０．６８，３０．５８，２８．２９，２８．９２，２８．５０，２８．０８，２８．０５，２８．０２，２８．００，２７．９３，２４．５７，２４．３０及び２１．６５。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：６９４(Ｍ＋Ｎａ)+。
【００３９】
トリチウム化：
【００４０】
【化１１】
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（Ｓ）−２−アミノ ４，５−3Ｈ−スベリン酸の製造：
５０ｍＬ丸底（ＲＢ）フラスコを窒素でパージし、（Ｓ）−２−アミノ ４，５−デヒドロスベリン酸塩酸塩（５．０ｍｇ）、メタノール（４ｍＬ）及び炭素上５％パラジウム（約１．０ｍｇ乾燥重量）を仕込んだ。ＲＢフラスコを排気し、トリチウムガスを（１３ｐｓｉ又は約１．０気圧の圧力に）充填し、室温で一晩撹拌した。この時間後、水素を排出し、窒素をＲＢフラスコ内に充填した。触媒をＣｅｌｉｔｅ ５４５のパッドによる濾過で除去し、フィルターケーキをメタノール（１０ｍＬ）及び水（２．０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮することで、（Ｓ）−２−アミノ ４，５−3Ｈ−スベリン酸塩酸塩を白色固体として得た。
【００４１】
実施例１
マウスリンパ腫細胞（ＥＬ４）を１００μＭマレイン酸ジエチルの存在下又は不存在下で２４時間培養し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、５×１０6細胞のアリコートに分割し、シスチン／グルタミン酸輸送体の阻害剤の存在下又は不存在下で［3Ｈ］−Ｌ−２−アミノスベリン酸（3Ｈ−Ｌ−Ａｓｕ）と共に１５分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄し、１ｍｌ容量の１Ｍ ＨＣｌ中に集め、シンチレーションバイアルに移した。各試料に１２ｍｌのＲｅａｄｙ Ｇｅｌシンチレーション液を添加し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒを用い他シンチレーション計数によって細胞取込みを測定した。図１は、ＤＥＭ処理によって酸化ストレスに暴露された細胞において3Ｈ−Ｌ−Ａｓｕ取込みが増加することを示している。さらに、シスチン／グルタミン酸輸送体阻害剤であるスルファサラジン（ＳＳＺ、５００μＭ）、グルタミン酸（Ｌ−ＧＬＵ、２．５ｍＭ)及び過剰の非標識Ｌ−ＡＳＵ（２．５ｍＭ）によって９５％を超える取込みが阻害された。このデータは、これらの細胞における3Ｈ−Ａｓｕ取込みがシスチン／グルタミン酸輸送体を介して起こり、酸化ストレスに対して敏感であることを示唆している。
【００４２】
実施例２
５×１０6個のＤＥＭ処理細胞を（５００μＭのＳＳＺの存在下又は不存在下で）
０．３３μＣｉの［3Ｈ］−Ｌ−ＡＳＵ、［3Ｈ］−Ｌ−ＧＬＵ又は［3Ｈ］−Ｌ−シスチンのいずれかと共に１５分間インキュベートした後、ＰＢＳ中で３回洗浄し、液体シンチレーション計数によって取込みを分析した。図２は、試料当たりの適用用量のパーセントで表した各標識化合物の取込み、及びシスチン／グルタミン酸輸送体阻害剤の存在下での取込みを示している。このデータはＬ−ＡＳＵ取込みがＬ−ＧＬＵ取込みより約４．５倍効率的であることを示しており、これは標識Ｌ−Ａｓｕ誘導体がＬ−Ｇｌｕ誘導体より有望なイメージング剤を生じ得ることを示唆している。さらに、Ｌ−ＡＳＵ及びＬ−ＧＬＵの取込みはいずれもＳＳＺによってほぼ完全に阻害され、この取込みは主としてシスチン−グルタミン酸輸送体の効果であることを示唆している。Ｌ−ＡＳＵは僅かに高いＳＳＺ阻害を示した。Ｌ−シスチンは適用用量のパーセントとしてＬ−ＧＬＵより僅かに高い取込みを与えたが、ＳＳＺは取込みの２／３しか阻害しなかった。これは、検出された取込みの約１／３が別の輸送系又は非特異的結合によるものであることを示唆している。
【００４３】
実施例３
3Ｈ−ＧＬＵ又は3Ｈ−ＡＳＵの取込みに競合する能力に関して非標識化合物を分析することは、輸送体基質及びイメージング剤開発のための可能な手がかりとなり得る化合物の選択を可能にする。輸送体に対する良好な基質である化合物は、高い濃度（２．５ｍＭ）で９０％以上の取込み阻害をもたらすと期待される。図３は、シスチン／グルタミン酸輸送体を介しての取込みに対する競合を評価するための追加化合物の選別を示している。Ｌ−ＧＬＵ、Ｌ−アミノアジピン酸（Ｌ−ＡＡＡ）、Ｌ−アミノピメリン酸（Ｌ−ＡＰＡ）、Ｌ−ＡＳＵ、Ｄ−ＡＳＵ及び３−メチル−Ｌ−ＧＬＵは９０％を超える3Ｈ−Ｌ−ＡＳＵ取込みの阻害を示し、これらの化合物がシスチン／グルタミン酸輸送体の適切な競合阻害剤であることを示唆している。Ｎ−エチル−Ｌ−Ａｓｕ、スベリン酸、ジアミノピメリン酸（ＤｉＡＰＡ）及びγ−グルタミルグリシンは４５％より低い阻害を示し、これらがシスチン／グルタミン酸輸送体の良好な競合阻害剤でないことを示唆している。
【００４４】
実施例４
阻害の用量応答を分析することにより、我々は3Ｈ−Ｌ−グルタミン酸又は3Ｈ−Ｌ−アミノスベリン酸取込みの阻害に関して化合物をランク付けすることができる。図４は、ＤＥＭ処理ＥＬ４細胞における3Ｈ−Ｌ−ＧＬＵ取込みに関するＬ−ＧＬＵ、Ｌ−ＡＳＵ及びＬ−ＡＡＡの用量依存性阻害応答を示している。Ｌ−ＡＳＵはＬ−ＧＬＵ（ＩＣ５０＝４．７μＭ）より僅かに低い濃度（ＩＣ５０＝２．９μＭ）で取込みを阻害し、それがシスチン／グルタミン酸輸送体のより良好な競合阻害剤であることを示唆している。しかし、Ｌ−ＡＡＡ（やはりグルタミン酸より長い炭素鎖を有する既知のシスチン／グルタミン酸輸送体基質）はより高い濃度（ＩＣ５０＝２３．９μＭ）を必要とし、Ｄ−Ａｓｕ（ＩＣ５０＝３６．２μＭ）も同様である。
【００４５】
実施例５
我々は、エクスビボの腫瘍組織における3Ｈ−ＡＳＵの取込みを3Ｈ−ＦＤＧ（普通の18Ｆ−ＦＤＧイメージング剤のトリチウム化形態）の取込みと比較した。２種の薬剤は、比放射能及び放射能量に関してマッチしていた。０．３３３μＣｉの薬剤をＥＬ４異種移植腫瘍組織スライスの同等なアリコートと共に３０分間インキュベートした（腫瘍を５００μｍステップでＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーに３回通して処理し、新鮮な緩衝液で洗浄した）。スライスを３回洗浄し、１Ｍ ＨＣｌで溶解し、シンチレーション計数によって評価した。図５は、3Ｈ−Ｌ−Ａｓｕがこれらの組織スライスにおいて3Ｈ−ＦＤＧより７０％高い取込みを与えたことを示している。
【００４６】
細胞中に取り込まれたこれらの薬剤は、特に限定されないが細胞酸化ストレスを含む病態又は状態のイメージングを含め、インビボで細胞酸化ストレスをイメージングするために使用できる。これらの薬剤から恩恵を受けるイメージング用途には、特に限定されないが、化学療法治療モニタリング、虚血症／卒中、炎症、外傷性脳損傷及び臓器移植モニタリングがある。
【００４７】
3Ｈや18Ｆのような放射性同位体ラベルは、インビボＰＥＴ並びに細胞酸化ストレスのインビトロ検出のため特に有用であり得る。本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明したが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想の範囲内に含まれる全てのかかる修正及び変更を包含することを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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