(57)【要約】本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、インスリン分泌細胞をアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させ、さらに、Ｃａ２チャネルおよびＣａ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤のうち少なくともいずれか、またはβ１インテグリンの発現もしくは活性を阻害する分子と接触させることを含む方法、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
ａ．インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させるステップと；
ｂ．インスリン分泌細胞の第１集団のＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大を  と比較して阻害する、陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の対照集団を、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬とさらに接触させるステップとを含み、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬のインスリン分泌細胞の対照集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をインスリン分泌細胞の第１集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の対照集団を、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤のうち少なくともいずれかとさらに接触させるステップとを含み、インスリン分泌細胞の第１集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大を、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤のうち少なくともいずれかのインスリン分泌細胞の対照集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかに対して有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の第２集団を、β１インテグリンの発現または活性を阻害する分子とさらに接触させるステップとを含み、インスリン分泌細胞の第１集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をβ１インテグリン阻害剤のインスリン分泌細胞の対照集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
ａ．インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと；
ｂ．インスリン分泌細胞の第１集団におけるβ１インテグリンの発現または活性を対照と比較して阻害する陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法。
【請求項７】
対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
ａ．インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと；
ｂ．インスリン分泌細胞の第１集団におけるＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのうち少なくともいずれかの活性化を対照と比較して阻害する陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法。
【請求項９】
対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
インスリン分泌細胞は膵臓β細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞をＡｐｏＣＩＩＩと少なくとも６時間接触させることを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
候補化合物は、１型糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
候補化合物は、２型糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、糖尿病の治療または発症抑制を行うのに有効な量のＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１５】
糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、有効な量の、β１インテグリンの発現および活性のうち少なくともいずれかの阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１６】
阻害剤は、抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリンｓｉＲＮＡ、β１インテグリンｓｈＲＮＡ、およびβ１インテグリンのアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成される群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、有効な量の、ＡｐｏＣＩＩＩによる膵臓β細胞への結合の阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１８】
阻害剤は、ＡｐｏＣＩＩＩに結合するアプタマーおよびＡｐｏＣＩＩＩに対する抗体で構成される群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
糖尿病を治療するための方法である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
糖尿病の発症抑制を行うための方法である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
対象者は１型糖尿病であるかまたは１型糖尿病を発症するリスクを有している、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
対象者は２型糖尿病であるかまたは２型糖尿病を発症するリスクを有している、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
対象者は２型糖尿病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
阻害剤は、ＡｐｏＣＩＩＩに結合するアプタマーおよびＡｐｏＣＩＩＩに対する抗体で構成される群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対照と比較してａｐｏＣＩＩＩを過剰発現する対象者にａｐｏＣＩＩＩ阻害剤を投与することを含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療および／または発症抑制を行うための候補化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
電位依存性カルシウム（Ｃａｖ）チャネルはβ細胞の生理および病態生理において極めて重要である。該チャネルはインスリン分泌の調節において中心的位置を占めるだけでなく、タンパク質リン酸化、遺伝子発現および細胞周期の調節を通じてβ細胞の発生、生存および増殖にも関与する。β細胞のＣａｖチャネルの機能および密度は、他の種類の細胞とも共通するかまたはβ細胞に特異的であるかいずれかの広く様々なメカニズム、例えばチャネルのリン酸化、他の分子との相互作用、およびグルコース代謝によるシグナル伝達による調節を受ける。Ｃａｖチャネルが正常に機能しないと、β細胞の機能不全が引き起こされ、最も一般的な代謝性疾患である糖尿病という形で現れるように死亡原因となることすらある。実際、Ｔリンパ球を介した自己免疫性の攻撃は１型糖尿病におけるβ細胞の死に重大な役割を果たす。加えて、１型糖尿病の血清中の因子は、β細胞のＣａｖチャネルの過剰な活性化により非生理的な量のＣａ２＋を膵臓β細胞内に侵入せしめ、結果としてβ細胞のアポトーシスをもたらす。疑いなく、このプロセスは自己免疫性の攻撃に加えてさらに疾患の発症を高める。そのような因子は２型糖尿病の血清中にもみられ、該血清中においても１型糖尿病の血清中と同じように作用する。実際、β細胞の量の減少およびβ細胞Ｃａｖチャネルの過剰な活性化は、後藤‐柿崎ラットにおけるような２型糖尿病の状態の下で出現する。
【０００３】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）の増加は、β細胞Ｃａｖチャネルの過剰活性化を介してβ細胞を破壊に至らしめる糖尿病誘発性の血清因子として作用することが実証されている。さらに、本発明者らは最近、ＡｐｏＣＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ抑制がＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇ（商標）ラットにおける糖尿病の発症を遅延させることを示した。通常は、ＡｐｏＣＩＩＩは血漿の構成成分である。ＡｐｏＣＩＩＩは主に肝臓内で、またわずかに腸内でも合成される。肝臓および腸の細胞はこのアポリポタンパク質を血中に放出し、該タンパク質は血中ではカイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の表面に位置している。ＡｐｏＣＩＩＩは、各々が約１０残基を含有している６個の両親媒性αヘリックスを形成する、７９個のアミノ酸残基からなる。ＡｐｏＣＩＩＩのＮＭＲ法による三次元構造および運動性は、該タンパク質の天然における脂質との結合状態を模倣した硫酸ドデシルナトリウムミセルとの複合体を形成した状態で、解像がなされている。６個の両親媒性αヘリックスは、集合して硫酸ドデシルナトリウムミセル表面の周囲に巻き付いたネックレス状の鎖となる。定説的に言えば、ＡｐｏＣＩＩＩは、リポタンパク質リパーゼの阻害により、また、リポタンパク質リパーゼおよびリポタンパク質受容体が存在する場である負に荷電した細胞表面に、トリグリセリドに富むリポタンパク質が結合するのを妨害することにより、トリグリセリド加水分解の有効な阻害剤としての役割を果たす。ＡｐｏＣＩＩＩは、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ‐ＢＩ）に結合することによりＬＤＬおよびＨＤＬからのコレステリルエステルの選択的取込みを妨げ、ＬＤＬ受容体へのアポリポタンパク質Ｂの結合を防止することによりコレステロールに富むＬＤＬのエンドサイトーシスを妨げる。高い血漿中ＡｐｏＣＩＩＩ濃度は肥満における異脂肪血症の特徴であって１型および２型いずれの糖尿病においても観察される一方、血漿中ＡｐｏＣＩＩＩ濃度の低いアシュケナージ系ユダヤ人の一群は年齢を重ねても心臓血管の健康および高いインスリン感受性を維持し、かつ並外れた長寿に達する。
【０００４】
脂質代謝における定説的な役割に加えて、ＡｐｏＣＩＩＩは細胞シグナル伝達において多岐にわたる役割も果たしている。ＡｐｏＣＩＩＩは、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ‐ＢＩ）、トール様受容体２（ＴＬＲ２）および未だ特徴解析されていない結合部位であって対応するシグナルを該部位の下流のエフェクター（例えばβ１インテグリン、百日咳毒素感受性Ｇタンパク質、ＮＦ‐κＢおよびプロテインキナーゼ）に中継する結合部位など、異なる細胞表面受容体に結合することができる。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞のＣａｖチャネルを過剰活性化する分子メカニズムについては何も知られていない。
【発明の概要】
【０００５】
第１の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
ａ）第１集団のインスリン分泌細胞を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させるステップと；
ｂ）第１集団のインスリン分泌細胞のＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大を対照と比較して阻害する、陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法を提供する。
【０００６】
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させるステップを含む。本実施形態は、文脈上明白にそうでないと解すべき場合を除き本明細書中に開示された任意の他の対照の使用と組み合わせることが可能であって、例えば、細胞の対照集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【０００７】
別の実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の該対照集団を、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬とさらに接触させるステップとを含み、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬のインスリン分泌細胞の対照集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をインスリン分泌細胞の第１集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。
【０００８】
別の実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の第２集団を、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤のうち少なくともいずれかとさらに接触させるステップとを含み、インスリン分泌細胞の第１集団において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をＳｒｃキナーゼ阻害剤およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤のうち少なくともいずれかのインスリン分泌細胞の対照集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。
【０００９】
さらなる実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の該対照集団を、β１インテグリンの発現または活性を阻害する分子とさらに接触させるステップとを含み、インスリン分泌細胞の第１集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をβ１インテグリンの発現または活性のインスリン分泌細胞の対照集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。
【００１０】
当業者には当然のことであろうが、単一の対照、例えば限定するものではないが上記に開示された対照のうちいずれかが、本発明の方法を実行するのに使用されてもよい。別例として、各実施形態が異なる対照細胞集団を利用する複数の対照実施形態（２個、３個またはそれ以上の実施形態、例えば限定するものではないが上記に開示された対照のうち任意のもの）が使用されてもよい。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと；
（ｂ）インスリン分泌細胞の第１集団におけるβ１インテグリンの発現または活性を対照と比較して阻害する陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと；
（ｂ）インスリン分泌細胞の第１集団におけるＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのうち少なくともいずれかの活性化を対照と比較して阻害する陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法を提供する。
【００１４】
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【００１５】
文脈上明白にそうでないと解すべき場合を除いて各々組み合わせることが可能な、本発明のこれらの態様のうちのいずれかの様々な実施形態において、該方法は、細胞をＡｐｏＣＩＩＩと少なくとも６時間接触させることを含み；候補化合物は、１型糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物であり、かつ／または、候補化合物は、２型糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、糖尿病の治療または発症抑制を行うのに有効な量のＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
第５の態様では、本発明は、糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、有効な量の、β１インテグリンの発現および活性のうち少なくともいずれかの阻害剤を投与することを含む方法を提供する。様々な実施形態において、該阻害剤は、抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリンｓｉＲＮＡ、β１インテグリンｓｈＲＮＡ、およびβ１インテグリンのアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成される群から選択される。
【００１８】
第６の態様では、本発明は、糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、有効な量の、ＡｐｏＣＩＩＩによる膵臓β細胞への結合の阻害剤を投与することを含む方法を提供する。様々な実施形態において、該阻害剤は、ＡｐｏＣＩＩＩに選択的なアプタマーおよび抗体で構成される群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アポリポタンパク質ＣＩＩＩとのインキュベーションにより、β細胞におけるＣａｖ１チャネルの密度および導電率の両方が増大することを示す図。（Ａ）対照のビヒクル溶液またはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）のうちいずれかとともにインキュベートされたマウス膵島β細胞の原形質膜パッチにおいて検出された単位（unitary）Ｃａｖ１チャネル電流の例。（Ｂ）対照のビヒクル（ｎ＝３３）またはＡｐｏＣＩＩＩ（ｎ＝３２）のいずれかに曝露されたマウス膵島β細胞に付随する原形質膜パッチにおいて測定された、単位Ｃａｖ１チャネルの平均数、開確率、平均閉時間および平均開時間。（Ｃ）対照のＲＩＮｍ５Ｆ細胞またはＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞のいずれかに付随する原形質膜パッチにおいて記録された単位Ｃａｖ１チャネル電流の例。（Ｄ）対照のＲＩＮｍ５Ｆ細胞（ｎ＝３４）またはＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞（ｎ＝３５）の原形質膜パッチにおいて検出された単位Ｃａｖ１チャネルの平均数、開確率、平均閉時間および平均時期間。対照群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。
【図２】アポリポタンパク質ＣＩＩＩとのインキュベーションにより全細胞Ｃａ２＋電流が増大し、Ｃａｖ１チャネル遮断薬であるニモジピンとの共インキュベーションによりＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩとのインキュベーションの影響が無効になることを示す図。（Ａ）対照のビヒクル溶液とともにインキュベートされた細胞（細胞容量：１０．１ｐＦ）およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）で処理された細胞（細胞容量：１１．１ｐＦ）からの実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝２６）およびＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（黒丸、ｎ＝２６）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。対照群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。（Ｃ）ニモジピン（Ｎｉｍ）と共にインキュベートされた細胞（細胞容量：１０ｐＦ）およびＡｐｏＣＩＩＩとともにＮｉｍに曝露された細胞（Ｎｉｍ／ＡｐｏＣＩＩＩ）（細胞容量：１１．９ｐＦ）からの実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｄ）Ｎｉｍで処理された細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＮｉｍ／ＡｐｏＣＩＩＩと共にインキュベートされた細胞（黒丸、ｎ＝２１）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。Ｎｉｍ単独群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。
【図３】ＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼの阻害はＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導性の全細胞Ｃａ２＋電流の増大をわずかに低減するが、ＰＫＣの阻害は影響を及ぼさないことを示す図。（Ａ）対照のビヒクル溶液とともにインキュベートされた細胞（細胞容量：８．５ｐＦ）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）で処理された細胞（細胞容量：８．２ｐＦ）およびＡｐｏＣＩＩＩ＋ＰＫＡ阻害剤Ｈ‐８９に曝露された細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９、細胞容量：８．４ｐＦ）からの実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝３７）、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（黒丸、ｎ＝３６）、およびＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９で処理された細胞（黒三角、ｎ＝３６）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。対照群に対し、＊Ｐは＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。（Ｃ）対照細胞（細胞容量：１２．５ｐＦ）、ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートされた細胞（細胞容量：１２．０ｐＦ）、ならびにＡｐｏＣＩＩＩおよびＰＫＣ阻害剤であるカルホスチンＣを用いた共処理（cotreatment）に供された細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣ、細胞容量：１２．１ｐＦ）において記録された実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｄ）対照細胞（白丸、ｎ＝３３）、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（黒丸、ｎ＝３３）およびＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣに曝露された細胞（黒三角、ｎ＝３３）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ群について、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣ群について、＋はＰ＜０．０５および＋＋はＰ＜０．０１である。（Ｅ）対照細胞（細胞容量：９．５ｐＦ）、ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートされた細胞（細胞容量：９．２ｐＦ）、ならびにＡｐｏＣＩＩＩおよびＳｒｃキナーゼ阻害剤であるＰＰ２に曝露された細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２、細胞容量：１０．０ｐＦ）において得られた実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｆ）対照細胞（白丸、ｎ＝４０）、ＡｐｏＣＩＩＩとインキュベートされた細胞（黒丸、ｎ＝４０）およびＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２とインキュベートされた細胞（黒三角、ｎ＝４０）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ群について、＊＊はＰ＜０．０１である。対照群に対するＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２群について、＋はＰ＜０．０５である。
【図４】ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害はＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導性の全細胞Ｃａ２＋電流の増大を中和し、この中和作用を得るためにはＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害で十分であることを示す図。（Ａ）ビヒクルとインキュベートされた細胞（対照、細胞容量：７．９ｐＦ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＣＩＩＩ）処理後の細胞（細胞容量：７．０ｐＦ）、ならびにＨ‐８９、カルホスチンＣおよびＰＰ２のタンパク質キナーゼ阻害剤カクテルの存在下でＡｐｏＣＩＩＩに曝露された細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２、細胞容量：７．２ｐＦ）において記録された実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｂ）対照細胞（ｎ＝３５）、ＡｐｏＣＩＩＩに曝露された細胞（ｎ＝３４）、およびＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２に曝露された細胞（ｎ＝３５）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。対照群およびａｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２群に対し、＊はＰ＜０．０５である。（Ｃ）対照細胞（細胞容量：８．５ｐＦ）、ＡｐｏＣＩＩＩ処理後の細胞（細胞容量：８．２ｐＦ）、ならびにタンパク質キナーゼ阻害剤Ｈ‐８９およびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩに曝露された細胞（ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９／ＰＰ２、細胞容量：８．７ｐＦ）からの実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｄ）対照細胞（ｎ＝２６）、ＡｐｏＣＩＩＩに曝露された細胞（ｎ＝２６）、およびＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９／ＰＰ２に曝露された細胞（ｎ＝２７）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。対照群に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。ＡｐｏＣＩＩＩ／Ｈ‐８９／ＰＰ２群に対し、＋Ｐ＜０．０５である。
【図５】アポリポタンパク質ＣＩＩＩとのインキュベーションによりβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現は変化しないことを示す図。（Ａ）対照のビヒクルまたはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）とのインキュベーションに供され、それぞれ抗Ｃａｖ１．２抗体、抗Ｃａｖ１．３抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体をプローブとして調査されたＲＩＮｍ５Ｆ細胞ホモジネートの代表的なイムノブロット。（Ｂ）ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションに供されたＲＩＮｍ５Ｆ細胞ホモジネートにおけるＣａｖ１．２サブユニット（斜線カラム、ｎ＝６）およびＣａｖ１．３サブユニット（黒カラム、ｎ＝６）の、対照（白カラム、ｎ＝６）と比較した相対存在量を示すイムノブロットの定量化。対照細胞およびＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞の間のＣａｖ１．２およびＣａｖ１．３サブユニットの全体的な相対存在量に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【図６】β１インテグリンのノックダウンは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導性の全細胞Ｃａ２＋電流の増大を無効にすることを示す図。（Ａ）β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１、陰性対照のｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ）、およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２でトランスフェクトされた細胞における、β１インテグリンおよびＧＡＰＤＨの免疫反応バンドの代表的ブロット。（Ｂ）ＮＣ  ｓｉＲＮＡ（白カラム、ｎ＝６）、β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１（斜線カラム、ｎ＝６）、およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２（黒カラム、ｎ＝６）でトランスフェクトされたＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ１インテグリンタンパク質のイムノブロットの定量化。ＮＣ  ｓｉＲＮＡに対し、＊＊はＰ＜０．０１である。（Ｃ）それぞれ、モックトランスフェクションおよび対照ビヒクルとのインキュベーション（ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１２．１ｐＦ）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび対照ビヒクル処理（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１１．４ｐＦ）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）とのインキュベーション（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ、細胞容量：１２．１ｐＦ）、β１インテグリンｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびビヒクル溶液への曝露（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照、細胞容量：１１．９ｐＦ）、ならびにβ１インテグリンｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＡｐｏＣＩＩＩへの曝露（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ、細胞容量：１２．４ｐＦ）が行われた後の個々の細胞において記録された実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｄ）ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照（黒丸、ｎ＝２９）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照（白丸、ｎ＝２８）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ（黒三角、ｎ＝２８）、β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照（白三角、ｎ＝２９）、およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ（黒四角、ｎ＝２９）に供された細胞におけるＣａ２＋電流密度‐電圧関係。ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照に対し、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩに対し、＋はＰ＜０．０５である。
【図７】ＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼの阻害は、基本条件下のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を変化させないことを示す図。（Ａ）対照のビヒクル処理された細胞（細胞容量：８．８ｐＦ）、およびＨ‐８９に曝露された細胞（細胞容量：８．５ｐＦ）からの実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＨ‐８９とともにインキュベートされた細胞（黒丸、ｎ＝２０）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。（Ｃ）対照細胞（細胞容量：１０．４ｐＦ）およびカルホスチンＣとのインキュベーションに供された細胞（ＣａｌｐＣ、細胞容量：１１．０ｐＦ）において記録された実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｄ）対照細胞（白丸、ｎ＝２９）およびＣａｌｐＣに曝露された細胞（黒丸、ｎ＝２９）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。（Ｅ）対照細胞（細胞容量：９．０ｐＦ）およびＰＰ２で処理された細胞（細胞容量：９．１ｐＦ）において得られた実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｆ）対照細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＰＰ２とともにインキュベートされた細胞（黒丸、ｎ＝１９）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。
【図８】ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害またはＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害は基本条件下のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流に影響を及ぼさないことを示す図。（Ａ）対照のビヒクル溶液とともにインキュベートされた細胞（細胞容量：１０．８ｐＦ）、ならびにＨ‐８９、カルホスチンＣおよびＰＰ２で構成されたタンパク質キナーゼ阻害剤カクテルで処理された細胞（Ｈ‐８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２、細胞容量：９．７ｐＦ）において得られた実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｂ）対照細胞（白丸、ｎ＝３０）およびＨ‐８９／ＣａｌｐＣ／ＰＰ２で処理された細胞（黒丸、ｎ＝３０）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。（Ｃ）対照のビヒクル処理された細胞（細胞容量：９．４ｐＦ）ならびにタンパク質キナーゼ阻害剤Ｈ‐８９およびＰＰ２で処理された細胞（Ｈ‐８９／ＰＰ２、細胞容量：９．１ｐＦ）において得られた実例の全細胞Ｃａ２＋電流のトレース。（Ｄ）対照細胞（白丸、ｎ＝２４）およびＨ‐８９／ＰＰ２で処理された細胞（黒丸、ｎ＝２４）における平均Ｃａ２＋電流密度‐電圧関係。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
引用された参照文献はすべて、参照により全体が本願に援用される。本願においては、別途記載のないかぎり、利用される技法は、いくつかの有名な参照文献、例えば：「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（サムブルック（Sambrook）ら、１９８９年、コールドスプリングハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press））、「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」（Ｄ．ゴッデル（D. Goeddel）編「酵素学方法論（Methods in Enzymology）」、１９９１年、第１８５巻、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Academic Press））、「酵素学方法論（Methods in Enzymology）」の「タンパク質精製のガイド（Guide to Protein Purification）」（（Ｍ．Ｐ．ドイツァー（M.P. Deutshcer）編、１９９０年、アカデミックプレス・インコーポレイテッド）；「ＰＣＲプロトコール：方法論および応用のためのガイド（PCR Protocols: Guide to Methods and Applications）」（イニス（Innis）ら、１９９０年、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス）、「動物細胞の培養：基本技術の手引き（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique）」第２版、（Ｒ．Ｉ．フレシュニーR.I. Freshney）、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク、リス・インコーポレイテッド（Liss, Inc.））、Ｅ．Ｊ．マレー（E.J. Murray）編、「遺伝子導入および発現のプロトコール（Gene Transfer and Expression Protocols）」、ｐ．１０９−１２８、ザ・ヒューマナプレス・インコーポレイテッド（The Humana Press Inc.）、米国ニュージャージー州クリフトン）、ならびにアンビオン１９９８年カタログ（Ambion 1998 Catalog）、米国テキサス州オースティン、アンビオン（Ambion））のうちいずれかにおいて見出すことができる。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、複数の指示物を含む。本明細書中で使用される「および、ならびに（and）」は、明示的にそうでないとされる場合を除き、「または、もしくは（or）」と互換的に使用される。
【００２２】
本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、組み合わせて使用されうる。
第１の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させるステップと；
（ｂ）インスリン分泌細胞の第１集団のＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大を対照と比較して阻害する、陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションが単一チャネルレベルにおいてＣａｖ１チャネルの開確率および密度の著しい増大を引き起こすことを発見した。この処理は全細胞Ｃａ２＋電流を著しく増大させ、Ｃａｖ１チャネル遮断薬であるニモジピンはこの増大を完全に無効化した。本発明者らはさらに、ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害は同じ中和作用をもたらすのに十分であること、ならびにβ１インテグリンのノックダウンはＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化するのを防止することを発見した。したがって、本発明者らは、Ｃａ２＋依存性の膵臓β細胞の死を抑制するための、したがって糖尿病の抑制および治療のうち少なくともいずれかのための標的を特定した。よって、本発明のこの態様の方法は、Ｃａ２＋依存性の膵臓β細胞の死の抑制するため、したがって糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための化合物を同定するために使用可能である。
【００２４】
本明細書中で使用されるように、「ａｐｏＣＩＩＩ」は、配列番号２（ヒト）（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＡ２５２３３）、配列番号４（ラット）（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡ４０７４６）、もしくは配列番号６（マカク）（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＡ４８４１９）において示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、または該タンパク質の機能的等価物を指す。
【００２５】
ａｐｏＣＩＩＩは、例えばシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）（米国ミズーリ州セントルイス）から入手可能な、ほぼ精製されたａｐｏＣＩＩＩであってよく、ここで「ほぼ精製された」とは、そのｉｎ  ｖｉｖｏにおける正常な細胞環境から取り出されることを意味する。別例として、ａｐｏＣＩＩＩは、１型糖尿病由来の血清のような混合物中に存在していてもよいし、該混合物中から下記に記載されるもののような標準的技法を使用して部分的または完全に精製されてもよい。好ましい実施形態では、ほぼ精製されたａｐｏＣＩＩＩが使用される。
【００２６】
下記に議論されるように、同じアミノ酸配列を有するがグリコシル化パターンにおいて異なる、３つの既知のヒトａｐｏＣＩＩＩアイソフォームが存在する。したがって、好ましい実施形態では、グリコシル化されたａｐｏＣＩＩＩが用いられ、グリコシル化は好ましくはシアリル化である。別の好ましい実施形態では、モノシアリル化またはジシアリル化されたａｐｏＣＩＩＩが使用される。そのようなグリコシル化物は、例えばシグマ・ケミカル・カンパニーから購入されてもよいし、下記に記載されるもののような標準的技法を使用して、部分的または完全に精製されてもよい。
【００２７】
任意の適切なインスリン分泌細胞、例えば、限定するものではないが膵臓β細胞などが使用されうる。本明細書中で使用されるように、「膵臓β細胞」は膵臓β島細胞を含有する任意の細胞集団である。該細胞は、任意の哺乳類生物種から得ることが可能であるし、アッセイがｉｎ  ｖｉｖｏで行われる場合は哺乳類生物種の体内に存在していてもよい。そのような膵臓β島細胞集団には、膵臓、単離された膵ランゲルハンス氏島（「膵島」）、単離された膵臓β島細胞、およびインスリン分泌細胞株が含まれる。膵臓の単離のための方法は当分野において良く知られており、また膵島を単離する方法は、例えば、セヴァン（Cejvan）ら、ダイアベティス（Diabetes）、２００３年、第５２巻、ｐ．１１７６−１１８１；サンブラ（Zambre）ら、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochem. Pharmacol.）、１９９９年、第５７巻、ｐ．１１５９−１１６４、およびファーガン（Fagan）ら、サージェリー（Surgery）、１９９８年、第１２４巻、ｐ．２５４−２５９、ならびにこれらの文献中において引用された参照文献に見出すことができる。インスリン分泌細胞株はアメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクション（American Tissue Culture Collection）（「ＡＴＣＣ」）（米国メリーランド州ロックヴィル）から入手可能である。膵臓β細胞が使用されるさらなる実施形態では、該細胞は、９５％を超えるβ細胞を膵島内に含有しているｏｂ／ｏｂマウスから得られるが、市販でも入手可能である。
【００２８】
Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかの測定は、当分野において標準的な方法、例えば、限定するものではないが単一チャネルおよび全細胞のパッチクランプ測定（セルアタッチ式およびパーフォレイテッド全細胞式のパッチクランプ技法）などによって実行されうる。本明細書中で使用されるように、「Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかの増大」とは、アッセイの過程において、試験化合物の非存在下で見られるよりも大きく増大することを指す。該方法は、その化合物が試験化合物の非存在下で見られるよりも大きくＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかの増大を促進する限りは、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおいてベースラインよりも特定の量だけ増大する必要はない。好ましい実施形態では、増大は、標準的な統計解析によって判断されるような統計的に有意な増大である。
【００２９】
膵臓β細胞をａｐｏＣＩＩＩと接触させるステップは、細胞を１つ以上の試験化合物と接触させるステップの前、後、または同時に、行うことができる。接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われても、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例：実験動物モデルにおいて）行われてもよい。本発明の候補同定法のうちのいずれかの方法を実行するために、任意の適切な培養条件が使用されうる。１つの実施形態では、細胞はＡｐｏＣＩＩＩと少なくとも６時間接触せしめられる。別の実施形態では、細胞は、１ｍＭ〜１５ｍＭのグルコース；好ましくは３ｍＭ〜１２ｍＭ；好ましくは約１１ｍＭのグルコースを含む培地中で増殖せしめられる。さらなる実施形態では、細胞はおよそ３７℃で（好ましくは、５％ＣＯ２などの加湿インキュベータ内で）培養されてから、ほぼ室温においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかの記録がなされる。上記およびその他の適切なアッセイ条件は、本明細書中の教示を基にすれば十分に当業者のレベルの範囲内にある。
【００３０】
１つの実施形態では、候補化合物は、１型糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。別の実施形態では、候補化合物は、２型糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。本発明はさらに、上記スクリーニング方法によって同定された化合物、および治療を必要とする対象者を治療するための該化合物の使用、を提供する。
【００３１】
別の実施形態では、該方法は、膵臓β細胞のＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるａｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大を阻害する試験化合物の大規模合成をさらに含む。
【００３２】
試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、そのようなポリペプチドは化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。組換え発現は、上記に開示されるように、当分野で標準的な方法を使用して遂行することができる。そのような発現ベクターはバクテリアまたはウイルスの発現ベクターを含むことが可能であり、そのような宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよい。固相技法、液相技法、もしくはペプチド縮合技法の良く知られた技法、またはこれらの任意の組合せを使用して調製された、合成ポリペプチドは、天然または非天然のアミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的なＢｏｃ（Ｎα‐アミノが保護されたＮα‐ｔ‐ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂であって標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコールが用いられてもよいし、または標準的な塩基に不安定なＮα‐アミノが保護された９‐フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってもよい。ＦｍｏｃおよびＢｏｃいずれのＮα‐アミノ保護アミノ酸も、シグマ（Sigma）、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル（Cambridge Research Biochemical）、またはその他の当業者によく知られた化学企業から入手可能である。加えて、ポリペプチドは当業者によく知られたその他のＮα‐保護基を用いて合成されてもよい。固相ペプチド合成は、当業者によく知られた技法によって行うことが可能であり、また自動合成装置の使用などによって提供されてもよい。
【００３３】
試験化合物が抗体を含む場合、そのような抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。該抗体は、ヒト化型、完全なヒト型、またはネズミ科動物型の抗体であってよい。そのような抗体は、良く知られた方法、例えばハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体；実験の手引き（Antibodies; A Laboratory Manual）」、１９８８年、コールドスプリングハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、に記載された方法によって作製可能である。
【００３４】
試験化合物が核酸配列を含む場合、そのような核酸も同様に、化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。組換え発現の技法は当業者には良く知られている（例えば上述のサムブルック（Sambrook）ら、１９８９年、を参照）。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。同様に、そのような核酸は、当分野の標準的技法を使用して、手動反応または自動反応によって化学合成または酵素的に合成することが可能である。化学合成されるかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの酵素的合成によって合成された場合、核酸は細胞内への導入に先立って精製されてもよい。例えば、核酸は、溶媒もしくは樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはこれらの組合せによって混合物から精製されうる。別例として、核酸は、試料の処理工程による損失を回避するために精製を伴わないかまたは最低限しか精製せずに使用されてもよい。
【００３５】
試験化合物がポリペプチド、抗体、または核酸以外の化合物を含む場合、そのような化合物は、有機化学合成を行なうための当分野の様々な方法のうちのいずれかにより作製されうる。
【００３６】
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）と接触させるステップを含む。この実施形態（本明細書中に開示された他の対照のうち任意のものと組み合わせて使用可能である）は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【００３７】
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の該対照集団を、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬、例えば、限定するものではないが、ω‐アガトキシンＩＶＡ、ω‐コノトキシンＧＩＶＡおよびＳＮＸ４８２（Ｃａｖ２チャネル遮断薬）；ならびにミベフラジルおよびＮＮＣ５５‐０３９６（Ｃａｖ３チャネル遮断薬）とさらに接触させるステップとを含み、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬のインスリン分泌細胞の対照集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をインスリン分泌細胞の第１集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。この実施形態では、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬は、Ｃａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかに選択的であり、かつＣａｖ１チャネル遮断薬としての役割は果たさない。本明細書中の教示に基づいて、所与のアッセイで有用に使用されうる任意のＣａｖ２チャネルおよびＣａｖ３チャネルのうち少なくともいずれかの遮断薬の量を決定することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【００３８】
別の実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の対照集団を、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤およびＰＫＡ阻害剤のうち少なくともいずれかとさらに接触させるステップとを含み、インスリン分泌細胞の第１集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大を、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤およびＰＫＡ阻害剤のうち少なくともいずれかのインスリン分泌細胞の対照集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。典型的なＳｒｃキナーゼ阻害剤には、ＰＰ１アナログ、ＰＰ２、および以下の実施例において開示される化合物が挙げられる。典型的なＰＫＡ阻害剤には、アデノシン３’，５’‐サイクリックモノホスホロチオエート‐Ｒ、Ｈ‐７、Ｈ‐８、Ｈ‐９、Ｈ‐８９、および以下の実施例において開示される化合物が挙げられる。
【００３９】
以下の実施例において示されるように、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのインテグリン依存性の共活性化を通じてβ細胞のＣａｖ１チャネルを過剰活性化することを発見した。したがって、ＰＫＡおよびＳｒｃのうち少なくともいずれかの阻害剤は、本発明の陽性の候補化合物を下方制御（down‐regulate）するはずである。ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのうち少なくともいずれかの任意の適切な阻害剤、例えば、限定するものではないが以下の実施例において開示されたものが、使用されうる。本明細書中の教示に基づいて、所与のアッセイで有用に使用されうる任意のＳｒｃキナーゼ阻害剤およびＰＫＡ阻害剤のうち少なくともいずれかの量を決定することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【００４０】
さらなる実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の対照集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと、インスリン分泌細胞の該対照集団を、β１インテグリンの発現または活性を阻害する分子とさらに接触させるステップとを含み、インスリン分泌細胞の第１集団においてＣａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかにおけるＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の増大をβ１インテグリン阻害剤のインスリン分泌細胞の対照集団と比較して強く阻害する陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である。以下の実施例において示されるように、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのβ１インテグリン依存性の共活性化を通じてβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化することを発見した。したがって、β１インテグリンの阻害剤は、本発明の陽性の候補化合物を下方制御（down‐regulate）するはずである。任意の適切なβ１インテグリン阻害剤、例えば、限定するものではないが以下の実施例において開示されたものが使用されうる（抗体、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）。本明細書中の教示に基づいて、所与のアッセイで有用に使用されうる任意のβ１インテグリン阻害剤の量を決定することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【００４１】
当業者には当然のことであろうが、単一の対照、例えば限定するものではないが上記に開示された対照のうちいずれかが、本発明の方法を実行するのに使用されてもよい。別例として、各実施形態が異なる対照細胞集団を利用する複数の対照実施形態が使用されてもよい（２個、３個またはそれ以上の実施形態、例えば限定するものではないが上記に開示された対照のうち任意のもの）。
【００４２】
第２の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと；
（ｂ）インスリン分泌細胞の第１集団におけるβ１インテグリンの発現または活性を対照と比較して阻害する陽性の試験化合物を同定するステップであって、陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法を提供する。
【００４３】
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【００４４】
本発明の第１の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、この第２の態様において使用されうる。
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、試験化合物の非存在下においてＡｐｏＣＩＩＩと接触させることを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【００４５】
第３の態様では、本発明は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インスリン分泌細胞の第１集団を、１つ以上の試験化合物の存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップと；
（ｂ）インスリン分泌細胞の第１集団におけるＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのうち少なくともいずれかの活性化を対照と比較して阻害する陽性の試験化合物を同定するステップとを含み、
陽性の試験化合物は、糖尿病の発症抑制および治療のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、方法を提供する。
【００４６】
１つの実施形態では、該方法は、ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのうち少なくともいずれかのβ１インテグリンを介した活性化の阻害剤を同定することを含む。
１つの実施形態では、対照は、インスリン分泌細胞の第２集団を、１つ以上の試験化合物の非存在下において、Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率のうち少なくともいずれかを増大させるのに有効な量のＡｐｏＣＩＩＩと接触させるステップを含む。この実施形態は、例えば、細胞の第２集団を、試験化合物がその中に溶解される調合物と類似または同一である調合物、例えばバッファーなどと接触させることを含むことができる。
【００４７】
本発明の第１の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、この第３の態様において使用されうる。
さらなる態様では、本発明は、糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、糖尿病の治療または発症抑制を行うために有効な量のＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの阻害剤を投与することを含む方法を提供する。典型的なＳｒｃキナーゼ阻害剤には、ＰＰ１アナログ、ＰＰ２、および以下の実施例において開示される化合物が挙げられる。典型的なＰＫＡ阻害剤には、アデノシン３’，５’‐サイクリックモノホスホロチオエート‐Ｒ、Ｈ‐７、Ｈ‐８、Ｈ‐９、Ｈ‐８９、および以下の実施例において開示される化合物が挙げられる。
【００４８】
別の態様では、本発明は、糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、有効な量の、β１インテグリンの発現および活性のうち少なくともいずれかの阻害剤を投与することを含む方法を提供する。様々な実施形態において、阻害剤は、抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリンｓｉＲＮＡ、β１インテグリンｓｈＲＮＡ、およびβ１インテグリンのアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成される群から選択される。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明は、糖尿病の治療または発症抑制を行うための方法であって、投与を必要とする対象者に、有効な量の、膵臓β細胞のＡｐｏＣＩＩＩ活性化の阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
本明細書中で使用されるように、ａｐｏＣＩＩＩ活性化の「阻害剤」には、ａｐｏＣＩＩＩのＤＮＡのＲＮＡへの転写を低減する化合物、ａｐｏＣＩＩＩ  ＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減する化合物、およびａｐｏＣＩＩＩタンパク質の機能を低減する化合物が含まれる。そのような阻害は、完全阻害でも部分阻害でもよいが、ａｐｏＣＩＩＩの発現および活性のうち少なくともいずれかが低減される結果、細胞内カルシウム濃度を増大させる能力の低減をもたらすような阻害である。そのような阻害剤は、ａｐｏＣＩＩＩに結合する抗体；ａｐｏＣＩＩＩ活性を妨げることができるアプタマー；ａｐｏＣＩＩＩのタンパク質、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド；ａｐｏＣＩＩＩのタンパク質、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および、ａｐｏＣＩＩＩ活性を妨げることができるその他の化学物質または生体化合物、で構成される群から選択される。
【００５１】
上記治療態様の各々の１つの実施形態では、該方法は糖尿病を治療するための方法である。この実施形態では、対象者は１型または２型糖尿病であると診断済みである。本明細書中で使用されるように、「糖尿病」は、膵臓によるインスリンの生産が不十分であるかまたは行われない結果、高レベルの血糖がもたらされることを特徴とする。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、「糖尿病の治療」とは、下記すなわち：（ａ）糖尿病または糖尿病合併症の重症度を低減すること；（ｂ）糖尿病合併症の発症を抑制または防止すること；（ｃ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の悪化を阻止すること；（ｄ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を抑制または防止すること；（ｅ）以前症状を有していた患者において糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を抑制または防止すること、のうち１つ以上を行うことを意味する。
【００５３】
糖尿病に特徴的な症状には、例えば、限定するものではないが、血糖レベルの上昇、インスリン産生の減少、インスリン抵抗性、タンパク尿、および糸球体クリアランスの低下が含まれる。本発明の方法に従って治療されうる糖尿病合併症には、例えば、限定するものではないが、神経の合併症（糖尿病性神経障害など）および平滑筋細胞制御不全に関連した合併症（例えば、限定するものではないが勃起機能不全、膀胱機能不全ならびに血管合併症、例えば、限定するものではないがアテローム性動脈硬化症、卒中および末梢血管疾患）が含まれる。
【００５４】
別の実施形態では、該方法は糖尿病の発症抑制のための方法である。この態様では、対象者は１型または２型糖尿病のリスクを有し、利点は糖尿病および糖尿病合併症のうち少なくともいずれかの発症を抑制することである。糖尿病を発症するリスクを有する任意の対象者、例えば、限定するものではないが、メタボリック症候群、糖尿病に関する既知の遺伝的リスク要因、糖尿病の家族歴、および肥満のうち１以上を備えた対象者が治療されうる。
【００５５】
さらなる実施形態では、糖尿病および糖尿病合併症のうち少なくともいずれかを治療または発症抑制するための方法は、対照と比較してａｐｏＣＩＩＩを過剰発現していると同定された個体を治療することをさらに含む。ａｐｏＣＩＩＩ発現の増大は糖尿病合併症の発症に先行し、したがって本実施形態は、本発明の方法を使用する治療に適した患者の早期発見を可能にする。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、「過剰発現」とは任意の量の対照を上回るａｐｏＣＩＩＩ発現である。任意の適切な対照、例えば、糖尿病に罹患していないことが分かっている対象者のａｐｏＣＩＩＩ発現レベル、またはあらかじめ決定された同様の患者試料集団に由来する標準化されたａｐｏＣＩＩＩ発現レベルを、使用することが可能である。対照に比べて多量に増大したａｐｏＣＩＩＩ発現は「過剰発現」と考えられ；様々な実施形態において、過剰発現は対照と比較して少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％またはそれ以上増大したａｐｏＣＩＩＩ発現を含む。好ましい実施形態では、ａｐｏＣＩＩＩ発現は血液試料または血清試料中において検出される。血清中のａｐｏＣＩＩＩのレベルを評価する１つの実施形態では、アルブミンは、例えばＭｏｎｔａｇｅ（登録商標）アルブミン枯渇キット（Albumin Deplete Kit）（ミリポア（Millipore））またはＡｌｂｕＳｏｒｂ（商標）（バイテックサポートグループ（Biotech Support Group））の使用など標準的技法を使用して血清試料から除去される。収集された血清試料は次いで一晩凍結乾燥され、ｓｅｐ‐Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８で処理されうる。溶出されたタンパク質は凍結乾燥され、その後１００μＬの０．１％ＴＦＡに溶解され、ＡＣＥ  Ｃ１８  １０ｃｍ×０．２１ｃｍカラムで２０−６０％として処理されて、ａｐｏＣＩＩＩが溶出する曲線について曲線下面積を求めることが可能である。ＡｐｏＣＩＩＩは、任意の適切な技法、例えば、限定するものではないがＭＡＬＤＩ質量分析法などを使用して、同定されてもよい。
【００５７】
本明細書中で使用されるように、「対象者」または「患者」という用語は、治療が望まれる任意の対象者、例えばヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、昆虫、ウマ、ニワトリなどを意味する。最も好ましくは、対象者はヒトである。
【００５８】
治療薬は、任意の適切な経路によって、例えば、限定するものではないが、経口、局所、非経口、鼻腔内、肺、または直腸内経路により、従来の無毒な薬学的に許容可能な担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位製剤に含めて、投与されうる。本明細書中で使用されるような非経口という用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内への注射または注入技法などが含まれる。加えて、本発明の化合物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤が提供される。治療薬は、１つ以上の無毒な薬学的に許容可能な担体、希釈剤およびアジュバントのうち少なくともいずれか、ならびに必要に応じてその他の活性成分を伴って存在しうる。治療薬は、経口使用に適した形態であってよく、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁剤、分散可能な散剤もしくは果粒剤、乳剤、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤としての形態であってよい。
【００５９】
用量域は、化合物の選択、投与経路、製剤の性質、対象者の病状の性質、および担当医の判断に応じて変化する。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高用量を必要とすると予想されるであろう。当分野において十分理解されているように、これらの用量レベルの変動は、最適化のための標準的な日常的実験を使用して調整することができる。
【００６０】
実施例１．アポリポタンパク質ＣＩＩＩはＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのβ１インテグリン依存性の共活性化によりβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化する
概要
アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）はトリグリセリド加水分解の阻害剤としての役割を果たすのみならず、炎症過程および膵臓β細胞の電位依存性Ｃａ２＋（Ｃａｖ）チャネルの過剰活性化のような糖尿病に関連する病理学的事象に関与する。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化する分子メカニズムについては何も知られていない。本発明者らは今回、ＡｐｏＣＩＩＩがＣａｖ１チャネルの開確率および密度を増大させたことを実証する。ＡｐｏＣＩＩＩは全細胞Ｃａ２＋電流を増大させ、Ｃａｖ１チャネル遮断薬であるニモジピンはこの増大を完全に無効にした。ＡｐｏＣＩＩＩのこの作用は、ＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼの個々の阻害によってはあまり影響を受けなかった。しかしながら、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害によりＡｐｏＣＩＩＩの該作用は中和され、またＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害によって同様の結果が得られた。さらに、β１インテグリンのノックダウンはＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化するのを防止した。これらのデータは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのβ１インテグリン依存性の共活性化によりβ細胞Ｃａｖ１チャネルを過剰活性化することを示している。
【００６１】
序論
電位依存性カルシウム（Ｃａｖ）チャネルは膵臓β細胞の生理および病態生理において極めて重要である（ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。該チャネルはインスリン分泌の調節において中心的位置を占めるだけでなく、タンパク質リン酸化、遺伝子発現および細胞周期の調節を通じてβ細胞の発生、生存および増殖にも関与する（ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。β細胞Ｃａｖチャネルの機能および密度は、他の種類の細胞とも共通するかまたはβ細胞に特異的であるかいずれかの広く様々なメカニズム、例えばチャネルのリン酸化、他の分子との相互作用、およびグルコース代謝によるシグナル伝達による調節を受ける（カテラル（Catterall）、２０００年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。Ｃａｖチャネルが正常に機能しないと、β細胞の機能不全が引き起こされ、最も一般的な代謝性疾患である糖尿病という形で現れるように死を招くことすらある（ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。実際、Ｔリンパ球を介した自己免疫性の攻撃は１型糖尿病におけるβ細胞の死に重大な役割を果たす。加えて、１型糖尿病の血清中の因子は、β細胞Ｃａｖチャネルの過剰活性化を通じて非生理的な量のＣａ２＋を膵臓β細胞内に侵入せしめ、結果としてβ細胞のアポトーシスをもたらす。疑いなく、このプロセスは自己免疫性の攻撃に加えてさらに疾患の発症を高める（ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。そのような因子は２型糖尿病の血清中にもみられ、該血清中においても１型糖尿病の血清中と同じように作用する。（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、１９９３年；ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、２００４年；ソル（Sol）ら、２００９年）。実際、β細胞の量の減少およびβ細胞Ｃａｖチャネルの過剰な活性化は、後藤‐柿崎ラットにおけるような２型糖尿病の状態の下で出現する（カトウ（Kato）ら、１９９６年）。
【００６２】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）の増加は、β細胞Ｃａｖチャネルの過剰活性化を介してβ細胞を破壊に至らしめる糖尿病誘発性の血清因子として作用することが実証されている（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、２００４年；ソル（Sol）ら、２００９年）。さらに、本発明者らは最近、ＡｐｏＣＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ抑制が、ヒトの１型糖尿病のラットモデルであるＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇラットにおける糖尿病の発症を遅延させることを示した（ホルムバリ（Holmberg）ら、２０１１年）。通常は、ＡｐｏＣＩＩＩは血漿の構成成分である。ＡｐｏＣＩＩＩは主に肝臓内で、またわずかに腸内でも合成される。肝臓および腸の細胞はこのアポリポタンパク質を血中に放出し、該タンパク質は血中ではカイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の表面に位置している（ギャガバデジ（Gangabadage）ら、２００８年；ヨング（Jong）ら、１９９９年）。ＡｐｏＣＩＩＩは、各々が約１０残基を含有している６個の両親媒性αヘリックスを形成する、７９個のアミノ酸残基からなる。ＡｐｏＣＩＩＩのＮＭＲ法による三次元構造および運動性は、該タンパク質の天然における脂質との結合状態を模倣した硫酸ドデシルナトリウムミセルとの複合体を形成した状態で、解像がなされている。６個の両親媒性αヘリックスは、集合して硫酸ドデシルナトリウムミセル表面の周囲に巻き付いたネックレス状の鎖となる（ギャガバデジ（Gangabadage）ら、２００８年）。定説的に言えば、ＡｐｏＣＩＩＩは、リポタンパク質リパーゼの阻害により、また、リポタンパク質リパーゼおよびリポタンパク質受容体が存在する場である負に荷電した細胞表面に、トリグリセリドに富むリポタンパク質が結合するのを妨害することにより、トリグリセリド加水分解の有効な阻害剤としての役割を果たす（ギャガバデジ（Gangabadage）ら、２００８年；ヨング（Jong）ら、１９９９年）。ＡｐｏＣＩＩＩは、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ‐ＢＩ）に結合することによりＬＤＬおよびＨＤＬからのコレステリルエステルの選択的取込みを妨げ、ＬＤＬ受容体へのアポリポタンパク質Ｂの結合を防止することによりコレステロールに富むＬＤＬのエンドサイトーシスを妨げる（クラベイ（Clavey）ら、１９９５年；ユアール（Huard）ら、１９９５年；シュウ（Xu）ら、１９９７年）。高い血漿中ＡｐｏＣＩＩＩ濃度は肥満における異脂肪血症の特徴であって１型および２型いずれの糖尿病においても観察される一方（チャン（Chan）ら、２００２年；ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、２００４年；スンドステン（Sundsten）ら、２００８年）、血漿中ＡｐｏＣＩＩＩ濃度の低いアシュケナージ系ユダヤ人の一群は年齢を重ねても心臓血管の健康および高いインスリン感受性を維持し、かつ並外れた長寿に達する（アツモン（Atzmon）ら、２００６年）。
【００６３】
脂質代謝における定説的な役割に加えて、ＡｐｏＣＩＩＩは細胞シグナル伝達において多岐にわたる役割も果たしている。ＡｐｏＣＩＩＩは、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ‐ＢＩ）、トール様受容体２（ＴＬＲ２）および未だ特徴解析されていない結合部位であって対応するシグナルを該部位の下流のエフェクター（例えばβ１インテグリン、百日咳毒素感受性Ｇタンパク質、ＮＦ‐κＢおよびプロテインキナーゼ）に中継する結合部位など、異なる細胞表面受容体に結合することができる（ファング（Fang）およびリウ（Liu）、２０００年；カワカミ（Kawakami）ら、２００６年；カワカミ（Kawakami）ら、２００７年；シュウ（Xu）ら、１９９７年）。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞のＣａｖチャネルを過剰に活性化する分子メカニズムについては何も知られていない。本研究において、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼのβ１インテグリン依存性の共活性化を通じてβ細胞Ｃａｖ１チャネルを上方制御することを実証する。
【００６４】
結果
アポリポタンパク質ＣＩＩＩは、β細胞におけるＣａｖ１チャネルの密度および導電率を増大させる
本発明者らのかつての研究から、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションはマウス膵島β細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を著しく増大させることが明らかとなっている（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、２００４年）。いかなる種類のβ細胞Ｃａｖチャネルが影響を受け、密度または導電率のいずれが影響を受けるかを明確にするために、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション後のマウス膵島β細胞（図１Ａ）およびＲＩＮｍ５Ｆ細胞（図１Ｃ）において、持続的開口を伴う大きな単位（unitary）Ｂａ２＋コンダクタンスを特徴とする、単位Ｃａｖ１チャネル電流を分析した。マウス膵島β細胞の実験では、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞の原形質膜パッチにおいて、対照細胞の原形質膜パッチよりも、より多層の（more layers of）単位Ｂａ２＋電流によって反映されるより多くのＣａｖ１チャネルを観察した（図１Ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（ｎ＝３２）の単位Ｃａｖ１チャネルの平均数、開確率および平均開時間は、対照ビヒクルに曝露された細胞（ｎ＝３３）よりも有意に大きかった（図１Ｂ）。ＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞のパッチにおいて記録された単位Ｃａｖ１チャネルの平均閉時間は、対照のパッチにおける平均閉時間よりも有意に短かった（図１Ｂ）。同様に、ＡｐｏＣＩＩＩの類似の作用はインスリン分泌性のＲＩＮｍ５Ｆ細胞のＣａｖ１チャネルについても生じた。ＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞の原形質膜パッチは、ビヒクルで処理された細胞の原形質膜パッチと比較してより多くのＣａｖ１チャネルを提供した（図１Ｃ）。前者のＣａｖ１チャネルは、後者のＣａｖ１チャネルよりも高頻繁で開口した（図１Ｃ）。ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション群（ｎ＝３５）は、ビヒクル溶液とのインキュベーション群（ｎ＝３４）と比較して、有意にＣａｖ１チャネルのチャネル数を増大させ、開確率を高め、平均開時間を延長し、かつ平均閉時間を短縮させた（図１Ｄ）。該データは明らかに、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖ１チャネルの密度および導電率の両方を増大させたことを示している。
【００６５】
Ｃａｖ１チャネルの薬理学的除去は、β細胞Ｃａｖチャネルのアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を防止する
単一チャネル分析によるＣａｖ１チャネルに対するＡｐｏＣＩＩＩの作用の検証は、必ずしもＡｐｏＣＩＩＩがＣａｖ１チャネルのみを攻撃するということを意味するものではない。該作用が他の種類のＣａｖチャネルについても生じるかどうかを調べるために、本発明者らは、Ｃａｖ１チャネル遮断薬であるニモジピンの非存在下および存在下におけるＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を分析した。ＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞の全細胞Ｃａ２＋電流は、ビヒクル溶液で処理された細胞よりも大きかった（図２Ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩ群において１０〜３０ｍＶの電圧範囲で観察された全細胞Ｃａ２＋電流密度は、対照群よりも有意に高かった（図２Ｂ）。極めて対照的なことに、全細胞Ｃａ２＋電流は、対照細胞と、ニモジピン存在下においてＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞との間で同様であった（図２Ｃ）。この２つの処理群の間で全細胞Ｃａ２＋電流密度に有意差はなかった（図２Ｄ）。該データは、ＡｐｏＣＩＩＩが専らβ細胞Ｃａｖ１チャネルに影響を及ぼすことを確認するものである。
【００６６】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共活性化を介してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化する
ＡｐｏＣＩＩＩによるβ細胞Ｃａｖ１チャネルの開確率の増大、およびＡｐｏＣＩＩＩシグナル伝達におけるプロテインキナーゼの媒介的役割は、ＡｐｏＣＩＩＩが何らかのプロテインキナーゼの上流にシグナルを送ってβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化することを示唆している（グイ（Gui）ら、２００６年；カワカミ（Kawakami）ら、２００６年；リュックシュロス（Rueckschloss）およびアイゼンバーグ（Isenberg）、２００４年；ウェイクス‐エドワーズ（Waitkus‐Edwards）ら、２００２年；ウー（Wu）ら、２００１年）。したがって、本発明者らは、β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化におけるＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの関与について調査した。
【００６７】
第１に、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＰＫＡ阻害剤Ｈ‐８９の影響について調べた。対照細胞において記録された全細胞Ｃａ２＋電流は、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞よりも大きく、ＡｐｏＣＩＩＩに加えてＨ‐８９とともにインキュベートされた細胞において記録された全細胞Ｃａ２＋電流は中間の大きさであった（図３Ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（黒丸、ｎ＝３６）において測定された平均Ｃａ２＋電流密度は、１０〜５０ｍＶの範囲の電圧において、ビヒクル対照細胞（白丸、ｎ＝３７）より有意に高かった（図３Ｂ）。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩおよびＨ‐８９で共処理された細胞（黒三角、ｎ＝３６）は、Ｃａ２＋電流密度の点ではＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞または対照細胞のいずれとも有意な差はなかった（図３Ｂ）。さらに、Ｈ‐８９処理は、基本条件下すなわちＡｐｏＣＩＩＩの非存在下におけるＣａ２＋電流密度に影響を及ぼさなかった（図７ＡおよびＢ）。これらの結果は、ＰＫＡ阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化をわずかに低減したことを示す。
【００６８】
第２に、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＰＫＣ阻害剤カルホスチンＣ（ＣａｌｐＣ）の影響について試験した。本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞およびＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣで共処理された細胞が同様の全細胞Ｃａ２＋電流を示し、該電流はビヒクルで処理された細胞において得られる全細胞Ｃａ２＋電流よりも大きいことを観察した（図３Ｃ）。電圧範囲１０〜５０ｍＶにおけるＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（黒丸、ｎ＝３３）および２０〜５０ｍＶの電圧範囲におけるＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣに曝露された細胞（黒三角、ｎ＝３３）の平均Ｃａ２＋電流密度は、ビヒクル対照細胞（白丸、ｎ＝３３）と比較して有意に増大した（図３Ｄ）。Ｃａ２＋電流密度に関してはＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞とＡｐｏＣＩＩＩ／ＣａｌｐＣで共処理された細胞との間に差はない（図３Ｄ）。更に、対照ビヒクルに曝露された細胞は、Ｃａ２＋電流密度に関してＣａｌｐＣで処理された細胞と同様であった（図７ＣおよびＤ）。該データは、ＰＫＣの阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に影響を及ぼさないことを実証している。
【００６９】
第３に、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＳｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ２の影響について評価した。本発明者らは、ビヒクル溶液とのインキュベーション後の細胞およびＡｐｏＣＩＩＩとともにインキュベートされた細胞において、それぞれ小さな全細胞Ｃａ２＋電流および大きな全細胞Ｃａ２＋電流を観察した（図３Ｅ）。ＡｐｏＣＩＩＩおよびＰＰ２に曝露された細胞は、全細胞Ｃａ２＋電流に関し、ビヒクル対照細胞とＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞との間であった（図３Ｅ）。ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞（黒丸、ｎ＝４０）において電圧範囲１０〜５０ｍＶで定量された全細胞Ｃａ２＋電流密度は、ビヒクル対照細胞（白丸、ｎ＝４０）において測定されたものと比較して有意に増大していた（図３Ｆ）。ＡｐｏＣＩＩＩおよびＰＰ２の共処理に供された細胞（黒三角、ｎ＝４０）は、電圧範囲２０〜４０ｍＶにおいてビヒクル対照細胞（白丸、ｎ＝４０）よりも有意に大きなＣａ２＋電流を示した。しかしながら、ＡｐｏＣＩＩＩ／ＰＰ２で共処理された細胞とビヒクル溶液とともにインキュベートされた細胞との間のＣａ２＋電流密度の差は、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞とビヒクル対照細胞との間の差ほど顕著ではない（図３Ｆ）。さらに、ビヒクルで処理された細胞（白丸、ｎ＝２０）およびＰＰ２とともにインキュベートされた細胞（黒丸、ｎ＝１９）は、同程度のＣａ２＋電流密度を示した（図７ＥおよびＦ）。これらの結果は、Ｓｒｃキナーゼの阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を減少させる傾向を有することを示唆している。
【００７０】
β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤の影響が微小および皆無であることから、本発明者らは上記すべてのキナーゼのより複合的な阻害が適用された場合に何が起こるかと考えた。この疑問を解決するために、本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞のβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対するプロテインキナーゼ阻害薬カクテルＨ‐８９、ＣａｌｐＣ、およびＰＰ２の影響について特徴解析を行った。ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞において大きな全細胞Ｃａ２＋電流が見られた一方、ビヒクル対照細胞ならびにＨ‐８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩ処理された細胞においてはより小さな全細胞Ｃａ２＋電流が生じた（図４Ａ）。ＡｐｏＣＩＩＩ処理群（黒丸、ｎ＝３５）は、電圧範囲１０〜５０ｍＶにおいて、ビヒクル対照群（白丸、ｎ＝３５）ならびにＨ‐８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２とともにＡｐｏＣＩＩＩ処理された群（黒三角、ｎ＝３４）と比較して、Ｃａ２＋電流密度が有意に増大した。Ｈ‐８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩに曝露された細胞におけるＣａ２＋電流密度のプロファイルは、ビヒクル対照細胞のプロファイルに類似していた（図４Ｂ）。更に、プロテインキナーゼ阻害薬カクテルＨ‐８９、ＣａｌｐＣおよびＰＰ２を用いた対照細胞の処理は、基本条件下、すなわちＡｐｏＣＩＩＩの非存在下での全細胞Ｃａ２＋電流に対しては有意な影響を及ぼさなかった（図８ＡおよびＢ）。これらの結果は、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を有効に除去することを実証している。
【００７１】
全細胞Ｃａ２＋電流に対するＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼの阻害剤単独での作用が微小であることから、ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害はβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を防止するのに十分であるかという疑問が必然的に生じた。本発明者らは、Ｈ‐８９およびＰＰ２の共処理後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞における全細胞Ｃａ２＋電流を分析することにより、この疑問の答えを出した。本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞の全細胞Ｃａ２＋電流が、対照細胞またはＨ‐８９およびＰＰ２の存在下でのＡｐｏＣＩＩＩ処理に供された細胞より大きいことを観察した（図４Ｃ）。ＡｐｏＣＩＩＩ群（黒丸、ｎ＝２６）において、対照群（白丸、ｎ＝２６）またはＨ‐８９およびＰＰ２の存在下でＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションに供された群（黒三角、ｎ＝２７）と比較して有意に高い全細胞Ｃａ２＋電流の密度が出現した（図４Ｄ）。さらに、対照細胞の全細胞Ｃａ２＋電流は、Ｈ‐８９およびＰＰ２で処理された細胞で観察されたものに類似していた（図８ＣおよびＤ）。該データは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共活性化を介して全細胞Ｃａ２＋電流を増大させることを明らかにしている。
【００７２】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現に影響を及ぼさない
ＡｐｏＣＩＩＩとの終夜インキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現に影響を及ぼす可能性がある。この可能性について試験するために、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現を分析した。本発明者らは、抗Ｃａｖ１．２抗体、抗Ｃａｖ１．３抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体によりそれぞれ明瞭なＣａｖ１．２、Ｃａｖ１．３およびＧＡＰＤＨの免疫反応バンドが検出されることを見出した。対照試料およびＡｐｏＣＩＩＩで処理された試料は、同様の強度のＣａｖ１．２、Ｃａｖ１．３およびＧＡＰＤＨ免疫反応性を示した（図５Ａ）。図５Ｂは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションに供されたＲＩＮｍ５Ｆ細胞ホモジェネートにおけるＣａｖ１．２サブユニット（斜線カラム、ｎ＝６）およびＣａｖ１．３サブユニット（黒カラム、ｎ＝６）の、ビヒクルとのインキュベーション（白カラム、ｎ＝６）と比較した相対存在量に、有意差がなかったことを示している（Ｐ＞０．０５）。該データは、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現をタンパク質レベルでは変化させなかったことを明らかにしている。
【００７３】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩはβ１インテグリンを介してβ細胞Ｃａｖチャネルを上方制御する
β１インテグリンは、ＡｐｏＣＩＩＩと、ＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼを含むいくつかのプロテインキナーゼとの間の媒介物としての役割を果たすことが確認されている（グイ（Gui）ら、２００６年；カワカミ（Kawakami）ら、２００６年；リュックシュロス（Rueckschloss）およびアイゼンバーグ（Isenberg）、２００４年；ウェイクス‐エドワーズ（Waitkus‐Edwards）ら、２００２年；ウー（Wu）ら、２００１年）。このことは、ＡｐｏＣＩＩＩがＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共活性化を介してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化したという本発明者らの結果と併せて、β１インテグリンがβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を媒介する可能性を提示している。本発明者らは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞の全細胞Ｃａ２＋分析と組み合わせてＲＮＡ干渉を行うことにより、この可能性について調査した。２つのβ１インテグリンｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションはβ１インテグリンの発現をタンパク質レベルで有意に減少させることが判明した（図６ＡおよびＢ）。本発明者らはさらに、陰性対照のｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＡｐｏＣＩＩＩへの曝露に供された細胞（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ）において検出された全細胞Ｃａ２＋電流は、様々な処理が施された他の細胞より大きいことも示した（図６Ｃ）。前記の処理には、モックトランスフェクションおよび対照ビヒクルとのインキュベーション（ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照）、陰性対照ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび対照ビヒクルへの曝露（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照）、β１インテグリンｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびビヒクル溶液を用いた処理（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照）、ならびにβ１インテグリンｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーション（β１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ）が含まれた。ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩ後の細胞（黒三角、ｎ＝２８）は、電圧範囲１０〜４０ｍＶにおいて、ＮＯ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２９）、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２８）、β１インテグリンｓｉＲＮＡ／対照（ｎ＝２９）、およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／ＡｐｏＣＩＩＩ（ｎ＝２９）と比較してＣａ２＋電流密度の有意な増大を示した（図６Ｄ）。ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩとβ１インテグリンｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩとの間のＣａ２＋電流密度の差は、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ／ａｐｏＣＩＩＩと他の処理との間の差より小さかった（図６Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化するためにβ１インテグリンに極めて依存していることを実証している。
【００７４】
考察
Ｃａｖチャネルの全体的な導電率は、細胞の原形質膜中の機能的チャネルの密度および活性に依存する。１型糖尿病の血清およびその因子ＡｐｏＣＩＩＩによる全細胞Ｃａ２＋電流の増大は、β細胞原形質膜の機能的Ｃａｖチャネルの密度上昇および導電率増大のうち少なくともいずれかに起因する可能性がある（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、１９９３年；ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、２００４年）。しかしながら、１件（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、１９９３年）を除く全ての研究（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）ら、２００４年；リスティチ（Ristic）ら、１９９８年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）は、これまでのところ全細胞レベルについてしかＣａｖチャネルに対する１型糖尿病の血清の作用を検討していない。ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）らによる研究では、１型糖尿病の血清によるβ細胞Ｃａｖチャネル活性の増大が、単一チャネルおよび全細胞レベルの両方において特徴解析された（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）、１９９３年）。残念ながらこの研究では、１型糖尿病の血清がβ細胞原形質膜における機能的Ｃａｖチャネルの密度を変化させることができるかどうかは解析されなかった（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）、１９９３年）。本発明者らはかつて、ＡｐｏＣＩＩＩが１型糖尿病の血清因子としての役割を果たしてβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化することを明らかにしたが、全細胞パッチクランプ分析しか実施されなかった（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）、２００４年）。疑いなく、ＡｐｏＣＩＩＩで処理された細胞における単一Ｃａｖチャネルの生物物理学的特性の詳細な検討が、このアポリポタンパク質によるβ細胞Ｃａｖチャネルの過剰活性化について機械論的に詳細な分析を行うために実行されるべきである。興味深いことに、本研究におけるセルアタッチモードの単一チャネル記録から、ＡｐｏＣＩＩＩとのインキュベーションは個々のβ細胞Ｃａｖ１チャネルの活性を増大させるだけでなく、β細胞原形質膜の記録エリア内の機能的Ｃａｖ１チャネルの数も増加させることが明らかである。単一Ｃａｖ１チャネルの活性の増大は、平均開時間の延長および平均閉時間の短縮に起因する開確率の増大として観察される。機能的Ｃａｖ１チャネルの数の増加は、より多くのレベルの単一Ｃａｖ１チャネルのコンダクタンスが出現することによって確認される。
【００７５】
インスリン分泌性のＲＩＮｍ５Ｆ細胞はＣａｖ１、Ｃａｖ２およびＣａｖ３チャネルを備えている（ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがＣａｖ１チャネルを選択的に過剰活性化するのか、またはこのインスリン分泌細胞内の上記３種のＣａｖチャネル全てに無差別に影響を及ぼすのかについて調査した。β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化は、Ｃａｖ１チャネルの薬理学的除去の後には生じ得ないことが判明した。これは、β細胞の生理および病態生理において他の種類のＣａｖチャネルを上回る重要な役割を果たしている主要なＣａｖチャネル種であるＣａｖ１チャネルを、ＡｐｏＣＩＩＩが選択的に過剰活性化することを意味している。ＡｐｏＣＩＩＩによるβ細胞Ｃａｖ１チャネルの選択的な過剰活性化は、Ｃａ２＋依存性のβ細胞死におけるこのリポタンパク質の病態生理学的役割を説明するものである（ユンッティ‐ベルグレン（Juntti‐Berggren）、２００４年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００５年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）。
【００７６】
ＰＫＡおよびＰＫＣのような一連のプロテインキナーゼは、Ｃａｖチャネルを有効にリン酸化してこれらのチャネルのリン酸化誘発性の構造変化により開チャネル密度および活性の増大をもたらすことができる（カテラル（Catterall）、２０００年；カヴァラリ（Kavalali）ら、１９９７年；ヤン（Yang）およびチェン（Tsien）、１９９３年）。ＡｐｏＣＩＩＩによる機能的Ｃａｖチャネルの数および開確率の増大はプロテインキナーゼによって媒介されるということも考えられる。ＡｐｏＣＩＩＩは単球細胞においてβ１インテグリンを通じてＰＫＣを活性化することが実証されている（カワカミ（Kawakami）ら、２００６年）。更に、β１インテグリンの活性化は、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの刺激を通じてニューロン、心室筋細胞および血管平滑筋細胞のＣａｖ１チャネルを上方制御することもできる（グイ（Gui）ら、２００６年；リュックシュロス（Rueckschloss）およびアイゼンバーグ（Isenberg）、２００４年；ウェイクス‐エドワーズ（Waitkus‐Edwards）ら、２００２年；ウー（Wu）ら、２００１年）。これらの成分はすべてβ細胞中に存在しており（ボスコ（Bosco）ら、２０００年；カンテンガ（Kantengwa）ら、１９９７年；ムカイ（Mukai）ら、２０１１年；ニコロバ（Nikolova）ら、２００６年；ヤン（Yang）およびベルグレン（Berggren）、２００６年）、ＡｐｏＣＩＩＩがβ１インテグリン‐ＰＫＡ／ＰＫＣ／Ｓｒｃキナーゼカスケードを使用してβ細胞Ｃａｖチャネルを過剰活性化することを示唆しているかもしれない。実際に、本研究は、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳｒｃキナーゼの複合的阻害がβ細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を事実上無効化すること、ならびにＰＫＡおよびＳｒｃキナーゼの共阻害がこの作用をなすのに十分であることを示している。しかしながら、ＰＫＡ、ＰＫＣまたはＳｒｃキナーゼを個々に阻害しても、β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化に対し、少しはあるにしても微小な作用しか生じなかった。従って、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩは並行するＰＫＡ経路およびＳｒｃ経路に依存してβ細胞Ｃａｖチャネルを上方制御すると結論する。
【００７７】
β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化が生じるには、終夜のインキュベーションを必要とする。故に、その作用はＣａｖチャネルの発現の増大によって説明がつくとも考えられる。したがって、本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩとの終夜インキュベーション後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞におけるＣａｖ１．２サブユニットおよびＣａｖ１．３サブユニットの免疫反応性を定量した。しかしながら、このインキュベーションはβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現に影響を及ぼさなかった。したがって本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩがβ細胞Ｃａｖ１チャネルの発現を高めるという可能性を除外した。
【００７８】
膜貫通受容体β１インテグリンは、他のインテグリンと非共有結合により結合して一連のヘテロダイマーを形成する。該ヘテロダイマーは、多数の可溶性タンパク質および表面結合タンパク質を認識して細胞‐細胞間、細胞‐細胞外マトリックス間および細胞‐病原体間の相互作用を媒介する（ルオ（Luo）ら、２００７年）。β１インテグリンは、ある種の細胞においてはＡｐｏＣＩＩＩの下流およびＰＫＡ／ＰＫＣ／Ｓｒｃキナーゼの上流に位置している（グイ（Gui）ら、２００６年；カワカミ（Kawakami）ら、２００６年；リュックシュロス（Rueckschloss）およびアイゼンバーグ（Isenberg）、２００４年；ウェイクス‐エドワーズ（Waitkus‐Edwards）ら、２００２年；ウー（Wu）ら、２００１年）。このことから本発明者らは、ＡｐｏＣＩＩＩ‐β１インテグリン‐ＰＫＡ／ＰＫＣ／Ｓｒｃキナーゼ経路が、β細胞内においてこのアポリポタンパク質がＣａｖ１チャネルを過剰活性化するメカニズムとして作用しているかどうかについて調べた。興味深いことに、β１インテグリンのノックダウンは、ＡｐｏＣＩＩＩの非存在下におけるβ細胞Ｃａｖチャネル活性には影響を及ぼさないが、β細胞ＣａｖチャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化を有意に無効化する。この結果は、β１インテグリンがβ細胞Ｃａｖ１チャネル活性に対するＡｐｏＣＩＩＩの作用を媒介するにあたって重要な役割を果たすことを明白に確証している。
【００７９】
結論として、本発明者らの研究結果は、ＡｐｏＣＩＩＩが、β１インテグリン依存的な方式で並列するＰＫＡ経路およびＳｒｃキナーゼ経路を通じてβ細胞Ｃａｖ１チャネルを選択的に過剰活性化することを実証している。β細胞Ｃａｖ１チャネルのＡｐｏＣＩＩＩ誘導性の過剰活性化は、β細胞原形質膜中の機能的Ｃａｖ１チャネルの密度増大および活性上昇を特徴とする。疑いなく、この新規なシグナル伝達経路は、糖尿病に関連するＣａ２＋依存的β細胞死の防止のための画期的新薬発見の基盤として役立つ潜在性を有している。
【００８０】
実験手順
細胞の培養および処理
成体の雄および雌のマウスからランゲルハンス島を単離し、単一β細胞となるように分散させた。約７０％コンフルエントのＲＩＮｍ５Ｆ細胞をトリプシン処理した。得られた細胞懸濁液をペトリ皿または１２ウェルプレートに播種した。細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ‐グルタミンおよび１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン（Invitrogen）、米国カリフォルニア州カールスバード）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、加湿された５％ＣＯ２インキュベータで３７℃に維持した。該細胞を一晩増殖させ、次いでｓｉＲＮＡトランスフェクションに供した。パッチクランプ分析については、細胞に、ＲＰＭＩ培地中それぞれ終濃度２０μｇ／ｍｌ、０．５μＭ、０．１μＭ、０．１μＭおよび５μＭのＡｐｏＣＩＩＩ、ＰＫＡ阻害剤Ｈ‐８９（カルビオケム（Calbiochem）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、ＰＫＣ阻害剤カルホスチンＣ（カルビオケム）、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ２（カルビオケム）およびＣａｖ１チャネル遮断薬ニモジピン（カルビオケム）を用いた終夜処理を施した。ＡｐｏＣＩＩＩは０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解させて１ｍｇ／ｍｌの保存溶液を作り、Ｈ‐８９、カルホスチンＣ、ＰＰ２およびニモジピンはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させてそれぞれ５ｍＭ、１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭの保存溶液を形成した。０．００２％ＴＦＡおよび０．０３％ＤＭＳＯのうち少なくともいずれかをビヒクル対照として使用した。
【００８１】
ｓｉＲＮＡの設計およびトランスフェクション
ラットのβ１インテグリンを標的とする２対の２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖（β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１、ＩＤ１２７９７１およびβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２、ＩＤ１２７９７２）を設計し、アプライド・バイオシステムズ／アンビオン（Applied Biosystems/Ambion）（米国テキサス州オースティン）によって化学合成した。これらの配列を、その特異性を確認するためにＢＬＡＳＴ探索に供した。いかなる遺伝子産物も標的としないＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ陰性対照ｓｉＲＮＡ（４３９０８４３）、およびヒト、マウスおよびラットの細胞内のＧＡＰＤＨを効率的にサイレンシングするＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ＧＡＰＤＨ陽性対照ｓｉＲＮＡ（４３９０８４９）は、アプライド・バイオシステムズ／アンビオン（米国テキサス州オースティン）から購入した。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を用いてリバーストランスフェクションした。簡潔に述べると、陰性対照ｓｉＲＮＡ、β１インテグリンｓｉＲＮＡ＃１またはβ１インテグリンｓｉＲＮＡ＃２をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）と混合した後に室温で２０分間インキュベートした。続いて、細胞を該ｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ混合物に加えた後に穏やかに撹拌し、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃に維持した。７２時間後、トランスフェクションされた細胞を約７０％コンフルエントまで増殖させ、イムノブロットアッセイまたは様々な処理に供した。
【００８２】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析
様々に処理された後のＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ‐１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）、ドイツ連邦共和国マンハイム）で構成されている溶解バッファー（ｐＨ７．５）中に溶解した。溶解産物は細胞残屑と核を除去するために８００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離処理された。得られた試料のタンパク質濃度は、バイオラッド（Bio‐Rad）のタンパク質測定試薬（バイオラッド（Bio‐Rad）、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて測定した。その後、該試料は、ＳＤＳサンプルバッファー中９６℃で３分間加熱することにより変性させ、硫酸ドデシルナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）およびイムノブロット解析に供した。簡潔に述べると、５０、９０または１８０μｇのタンパク質を、４％アクリルアミドの濃縮用ゲル（ｐＨ６．８）および８％アクリルアミドの分離用ゲル（ｐＨ８．８）で構成された不連続ゲル中で分離した。その後、分離されたタンパク質を疎水性のポリビニリデンジフルオリド膜（Ｈｙｂｏｎｄ（商標）‐Ｐ；ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、スウェーデン国ウプサラ）にエレクトロブロットした。該ブロットは、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｐＨ７．５）を含有する洗浄用バッファー中で５％脱脂粉乳とともに１時間インキュベーションすることによってブロッキングした。その後、該ブロットを、アフィニティ精製されたウサギポリクローナル抗体であってそれぞれβ１インテグリン（１：５００；ミリポア（Millipore）、米国マサチューセッツ州ビレリカ）、Ｃａｖ１．２（１：２００）およびＣａｖ１．３（１：２００）に対する抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、またそれぞれマウスモノクローナル抗体であってグリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体（ＧＡＰＤＨ、１：４０００；アプライド・バイオシステムズ／アンビオン、米国テキサス州オースティン）とともに室温で１時間、インキュベートした。洗浄用バッファーですすいだ後、該ブロットを、二次抗体（ワサビペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはワサビペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗マウスＩｇＧのいずれか；１：５０，０００；バイオラッド（Bio‐Rad）、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）とともに室温で４５分間インキュベートした。免疫反応バンドを、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（商標）ウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア、スウェーデン国ウプサラ）を用いて視覚化した。
【００８３】
電気生理学的機能
様々に処理された後のマウス膵島細胞およびＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、単一チャネルおよび全細胞のパッチクランプ測定に供した。セルアタッチモードおよびパーフォレイテッド全細胞モードのパッチクランプ構成を使用した。電極はホウケイ酸ガラスキャピラリーから作製され、口焼き（ファイヤーポリッシュ）され、先端付近にＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）を用いたコーティングを施した。電極のうちいくつかは、単一チャネル測定のために、（ｍＭ単位で）１１０のＢａＣｌ２、１０のＴＥＡ‐Ｃｌおよび５のＨＥＰＥＳ（Ｂａ（ＯＨ）２を用いてｐＨ７．４）を含有する溶液で充填された。その他の電極は、全細胞電流の記録のために、（ｍＭ単位で）７６のＣｓ２ＳＯ４、１のＭｇＣｌ２、１０のＫＣｌ、１０のＮａＣｌおよび５  ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを用いてｐＨ７．３５）、ならびにアムホテリシンＢ（０．２４ｍｇ／ｍｌ）からなる溶液で充填された。電極抵抗は、電極溶液で充填され、かつ浴槽液に浸漬された時に４〜６ＭΩの範囲であった。電極のオフセット電位はギガシール形成に先立って浴槽液中で補正された。単一チャネル記録は、（ｍＭ単位で）１２５のＫＣｌ、３０のＫＯＨ、１０のＥＧＴＡ、２のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２および５のＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ（ｐＨ７．１５）を含有する、脱分極用の外部記録液の中に浸された細胞を用いて実施した。この溶液は細胞内電位を０ｍＶとするために使用した。パーフォレイテッド全細胞電流測定については、細胞を、（ｍＭ単位で）１３８のＮａＣｌ、５．６のＫＣｌ、１．２のＭｇＣｌ２、１０のＣａＣｌ２、５のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有する溶液中に浸漬した。単一チャネル電流および全細胞電流は、それぞれＡｘｏｐａｔｃｈ（商標）２００Ｂ増幅器（モレキュラー・ディバイシーズ（Molecular Devices）、米国カリフォルニア州フォスターシティ）およびＥＰＣ‐９パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡエレクトロニーク（HEKA Elektronik）、ドイツ連邦共和国ランブレヒット／プファルツ）を用いて、室温（約２２℃）で記録した。単一チャネルおよび全細胞の電流データの取得および分析は、それぞれソフトウェアプログラムｐＣＬＡＭＰ（登録商標）１０（アクソン・インスツルメンツ（Axon Instruments））およびソフトウェアプログラムＰａｔｃｈＭａｓｔｅｒ／ＦｉｔＭａｓｔｅｒ（ＨＥＫＡ）を使用して行った。全細胞電流の大きさは細胞容量によって正規化された。
【００８４】
統計解析
データはすべて平均±ＳＥＭとして示されている。統計的有意差は一元配置分散分析とその後の最小有意差（ＬＳＤ）検定によって決定された。２群が比較された時、対応のないスチューデントｔ検定またはマン・ホイットニーＵ検定を使用した。有意水準は０．０５または０．０１に設定した。
【００８５】
実施例１の参照文献
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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