(57)【要約】  下記工程、ａ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程；ｂ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを吸着させる工程；およびｃ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程、を含む、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む原溶液（ｓｏｕｒｃｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）からＦＸＩおよびＦＸＩａを減少させるおよび／または除去する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程、
ａ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程；
ｂ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを吸着させる工程；及び
ｃ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａが取り除かれた液体を吸着媒体から分離する工程
を含む、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む原溶液からＦＸＩおよびＦＸＩａを減少させるおよび／または除去する方法。
【請求項２】
前記アフィニティークロマトグラフィーゲルの活性部位がアンチトロンビンですでに飽和しているか、または飽和させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シリカ、真珠岩、ゼオライト（ｚｅｏｌｉｔｈｅｓ）または珪藻土の群から選択されるケイ酸塩を、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの吸着剤としてさらに使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム水酸化物、または酸化アルミニウムの群から選択されるさらなる吸着媒体を使用する、請求項１から３に記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィー材料をアンチトロンビンＩＩＩで前処理した後、マトリックス材料に連結しているヘパリンまたはヘパランへの吸着を１回実施する、請求項１から４に記載の方法。
【請求項６】
前記原溶液が主としてγ免疫グロブリンを含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを取り除いた前記液体に、溶媒／界面活性剤処理、紫外線照射、殺菌（ｐａｓｔｅｕｒｉｚａｔｉｏｎ）、低ｐＨインキュベーション、カプリル酸沈殿またはナノフィルトレーションから選択される少なくとも１つのウイルス不活性化工程をさらに実施し、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを取り除いたウイルス不活性化溶液を得る、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
所望によりウイルスを不活性化した、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを取り除いた前記液体を濃縮して、所望により医薬組成物を得るために製剤される、医薬的に有効な成分の濃縮物を得る、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）γ免疫グロブリン含有組成物を、導電率１０−１８ｍＳの充填緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中のヘパリンアフィニティークロマトグラフィー樹脂にかける工程と、
（ｉｉ）その後、導電率１０−１８ｍＳの緩衝液で前記樹脂を洗浄し、工程（ｉ）のフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）と洗浄作業の流出液とを組み合わせる工程；
（ｉｉｉ）リン酸トリＮ−ブチル（ｔｒｉ−Ｎ−ｂｕｔｙｌ  ｐｈｏｓｐａｔｅ）および界面活性剤を用いる少なくとも１回のウイルス不活性化ステップを実施する工程；
（ｉｖ）その後、濃縮する工程；
（ｖ）所望により、得られた前記γ免疫グロブリン含有溶液を製剤する工程、
を特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって得ることが可能な医薬的に有効な成分の濃縮物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の濃縮物から得ることが可能な医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＸＩおよびＦＸＩａを、これら凝固因子を含む溶液から減少させるおよび／または除去する方法、本発明の方法によって得ることが可能なＦＸＩおよびＦＸＩａを含む濃縮物、ならびに本発明の方法によって得ることが可能なＦＸＩおよびＦＸＩａを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）は、血液凝固に関与するタンパク質であることが周知であり、凝固カスケードの内因系凝固経路の一部である。ＦＸＩは、凝固中の活性化合物である活性化ＦＸＩ（ＦＸＩａ）の前駆体である。そのため、前記ＦＸＩａによって、生命を血栓症事象の危険にさらすことにつながる凝固が、意図せず開始される場合があるため、患者の静脈内に投与する医薬品からＦＸＩａを除去することが必須である。他方では、ＦＸＩの欠如または不十分な活性に関する疾患を患っている患者にとって、または急速で有効な凝固が極めて重要となる大量出血を経験している患者にとっては、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの濃縮物が有益であろう。このような濃縮物は、血友病ＡおよびＢなどの凝固因子に対する阻害抗体に苦しんでいる患者にとっても有益となり得る。これらの阻害物質は、出血事象を引き起こし得、したがって、患者は、凝固および創傷閉鎖（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）を助ける薬剤を必要とする。
【０００３】
したがって、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを含む溶液から除去する、または少なくとも減少させることが本発明の目的である。本発明の別の目的は、ＦＸＩ、ＦＸＩａの治療上適用可能な濃縮物、または示した方法によるＦＸＩおよびＦＸＩａの混合物を含む治療上適用可能な濃縮物を提供することである。
【０００４】
ＦＸＩ濃縮物を調製するいくつかの方法が公知である。ＢｏｕｍａおよびＧｒｉｆｆｉｎは、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，１９７７，ｖｏｌ．２５２，ｎｏ．１８，ｐｐ．６４３２−６４３７に、５回のクロマトグラフィー工程によるヒト血漿からのＦＸＩ精製方法を公表した。使用されたクロマトグラフィーの材料は、時系列でＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）、ＱＡＥ−セファデックス（登録商標）、ＳＰ−セファデックス（登録商標）（２倍）および最終的にセファロース（登録商標）に結合したコンカナバリンＡである。使用された緩衝液はすべてポリブレン（登録商標）およびベンズアミジンを含む。
【０００５】
Ｍ．ＢＵＲＮＯＵＦ−ＲＡＤＯＳＥＶＩＣＨおよび、Ｔ．ＢＵＲＮＯＵＦは、ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ，１９９２，３２，ｐｐ．８６１−８６７に、ＦＸＩを吸着する、負に帯電されたフィルター（Ｚｅｔａ  ｐｌｕｓ  ５０Ｓ）でのクリオ−プアー血漿（ｃｒｙｏ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）の濾過、吸着したＦＸＩの溶出、および溶出液のカチオン交換樹脂（硫酸−セファロース（登録商標）ファストフロー）によるクロマトグラフィーによる、ＦＸＩ凍結乾燥物の生成を報告した。溶出されたＦＸＩは、凍結乾燥前にアンチトロンビンおよびヘパリンを製剤された。
【０００６】
ＨｉｒｏｓｈＩ  ＭａｓｈｉｋｏおよびＨｉｄｅｎｏｂｕ  Ｔａｋａｈａｓｈｉは、ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．ＨＯＰＰＥ−ＳＥＹＬＥＲ，１９９４，ｖｏｌ．３７５，ｐｐ．４８１−４８４に、高分子量キニノーゲン−アフィニティークロマトグラフィーおよびＱ−セファロース（登録商標）クロマトグラフィーに基づいたブタのＦＸＩおよびＦＸＩａの生成方法を開示した。彼らは、接触活性化を防止し、タンパク分解性消化を克服するために、ポリブレン（登録商標）およびベンズアミジンを使用緩衝液に添加した。彼らは、ヘパリンセファロース（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーによるＦＸＩ精製に失敗したことも報告した。
【０００７】
ＨｉｒｏｓｈＩ  ＭａｓｈｉｋｏおよびＨｉｄｅｎｏｂｕ  Ｔａｋａｈａｓｈｉの別の論文は、ＡＧＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＡＣＴＩＯＮＳ  ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＳ，（ＢＩＲＫＨＡＥＵＳＥＲ  ＶＥＲＬＡＧ，ＢＡＳＥＬ，ＣＨ），１９９２，ｖｏｌ．３８，ｐａｒｔ２，ｐｐ．２４９−２５６に、高分子量キニノーゲン、Ｑ−セファロース（登録商標）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）と共に、ポリブレン（登録商標）およびベンズアミジンの存在する緩衝液を用いたクロマトグラフィーに基づいたブタのＦＸＩおよびＦＸＩａの生成方法を論じた。
【０００８】
ＴａｉｔおよびＦｕｊｉｋａｗａは、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，１９８１，ｖｏｌ．２６２，ｎｏ．２４，ｐｐ．１１６５１−１１６５６に、３回のクロマトグラフィー工程ならびに緩衝液中のポリブレン（登録商標）およびベンズアミジンの使用により、ヒト血漿からＦＸＩおよびプレカリクレイン（ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）を精製する方法を開示した。高分子量キニノーゲンの軽鎖の一部である合成ペプチドが担体上で固定され、血漿からプレカリクレイン、ＦＸＩおよびいくらかのＩｇＧのキャリーオーバーを単離するために使用された。続いて、プレカリクレインおよびＦＸＩは、ヘパリン−アガロースクロマトグラフィーによって分離され、最終的にＣＭ−セファデックス（登録商標）によって精製されて（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）、ＦＸＩおよびプレカリクレインのあきらかに（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ）純粋な画分を得た。
【０００９】
Ｓａｉｔｏらは、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＯＮ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．８５０−８６１，１９７３に、Ｃａ３（ＰＯ４）２による血漿の吸着、複数回の硫安分画法、ならびにＦＸＩの活性化を妨げるポリプレン（登録商標）の存在と共に、ＱＡＥ−セファデックス（登録商標）（２倍）、セファデックス（登録商標）−Ｇ１５０、およびＳＰ−セファデックス（登録商標）による連続クロマトグラフィーからなるＦＸＩの精製方法を提示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＦＸＩ、ＦＸＩａまたは両方の混合物の含有量を、これらタンパク質、および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させる方法を提供する。これは、ケイ酸塩（特にシリカ、真珠岩、ゼオライト（ｚｅｏｌｉｔｈｅｓ）または珪藻土）、水酸化アルミニウム（Ａｌ２（ＯＨ）３）、酸化アルミニウム水酸化物（ＡｌＯ（ＯＨ））、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、またはアフィニティークロマトグラフィーに適切な材料から選択される吸着材料への前記タンパク質の吸着によって達成される。アフィニティークロマトグラフィーに適切な前記材料は、マトリックス材料（例えば、ゼオライト（ｚｅｏｌｉｔｈｅｓ）またはアクリレート（ａｃｒｌｙａｔｅｓ）および糖類のようなポリマー）に連結している多糖（例えば、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎｅ）、ヘパリン、またはヘパラン）、特にヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに使用されるゲル（例えば、ヘパリンセファロース（商標）ＦＦまたはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ６５０  Ｍ（商標）など）から構成される。
【００１１】
ソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む溶液は、血液もしくは血漿に由来するＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを含むどのような液体、あるいは生物工学的方法に由来する液体であってもよい。このような溶液の公知であるが限定されない例としては、クリオ−プアー血漿、Ｃｏｈｎ  ｐｒｏｃｅｓｓの中間体（例えば再構成ペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）およびその誘導体、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ  ｐｒｏｃｅｓｓの中間体（例えば再構成沈殿物Ａ）およびその誘導体、または組換えタンパク質発現の結果生じる溶液であるが、ガンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）溶液の場合であってもよいＦＸＩまたはＦＸＩａが不純物となる他のタンパク質から主として構成される溶液である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＦＸＩおよびＦＸＩａを、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させるおよび／または除去する方法は、下記工程、
ａ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程；
ｂ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを吸着させる工程；および
ｃ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程と、を含む。
【００１３】
マトリックスまたはゲルにＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを充填している間、マトリックスまたはゲルの活性部位がアンチトロンビンですでに飽和しているか、または飽和させられるかのどちらかである限り、ステップａ）を改変することもできる。
【００１４】
原溶液を吸着剤と混合し、撹拌し、吸着剤上に充填されたＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを沈降、濾過または遠心分離のような公知の方法によって上清から除去するバッチ吸着として吸着を実施してもよい。代替手法としては、クロマトグラフカラム中への吸着材料の装填し、および原溶液を適用して、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを吸着剤に充填する。
【００１５】
本発明の一実施形態において、シリカ、真珠岩、ゼオライト（ｚｅｏｌｉｔｈｅｓ）または珪藻土の群から選択されるケイ酸塩を、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの吸着剤（ａｄｓｐｒｂｅｍｓ）としてさらに使用してもよい。
【００１６】
さらなる一実施形態において、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム水酸化物、または酸化アルミニウムの群から選択されるさらなる吸着媒体を使用してもよい。
【００１７】
例えば、吸着材料として珪藻土または水酸化アルミニウムを用いてバッチ方式で実施する吸着と、吸着剤にヘパリンセファロース（商標）を用いてクロマトグラフカラムにおいて実施する吸着とを組み合わせることもできる。
【００１８】
さらに本発明の別の実施形態において、クロマトグラフィー材料をアンチトロンビンＩＩＩで前処理した後、マトリックス材料に連結しているヘパリンまたはヘパランへの１回の吸着を実施する。
【００１９】
ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの脱離を防止するために、充填された吸着剤を洗浄緩衝液で丁寧に洗浄し、結果として生じる洗浄溶液を、さらに処理されるフロースルーおよび／または上清に添加して、このＦＸＩ／ＦＸＩａが取り除かれた溶液中の、特にＩｇＧなどの、免疫グロブリンのような他の関心対象化合物の回収を最適化してもよい。ヘパリンセファロース（商標）で処理したＦＸＩ／ＦＸＩａが取り除かれた溶液は、典型的には０．１５ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌ未満、具体的には０．１ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌ未満、更に具体的には０．００から０．０５ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌを含む。このように取り除かれた溶液の国際単位（ＩＵ）で表現したＦＸＩａの含有量は、典型的には１０ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌ未満、具体的には５ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌ未満、さらに具体的には０．０から１．０ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌである。
【００２０】
ＦＸＩ／ＦＸＩａが取り除かれた溶液をさらに処理する工程は、１回以上のウイルス不活性化工程を組み込んでもよく、例として挙げられるのは、溶媒／界面活性剤処理（Ｓ／Ｄ処理）、紫外線照射、殺菌（ｐａｓｔｅｕｒｉｚａｔｉｏｎ）、低ｐＨインキュベーション、カプリル酸沈殿またはナノフィルトレーションである。他の工程は、クロマトグラフィー工程、医薬的に有効な化合物の濃縮物を得る濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、製剤および充填を含み、また、免疫グロブリン（特にＩｇＧ）、アルブミン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンまたはアルファ−１−アンチトリプシンなどの様々なタンパク質の生成から公知であり、医薬組成物を得るために必須であり、生成される生成物に依存する。
【００２１】
ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを、充填された吸着剤から（特に、吸着剤が、マトリックスに付着したヘパリンまたはヘパランを用いたアフィニティークロマトグラフィーゲルである場合）溶出してもよい。アフィニティークロマトグラフィーゲルからのＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの溶出は、０．２〜１．４ＭのＮａＣｌ、特に０．２５〜１．０ＭのＮａＣｌ、なおさらに特に０．２５〜０．５ＭのＮａＣｌおよび０．００３〜０．０３Ｍのリン酸または同等のイオン強度からなる溶出緩衝液を用いて実施される。したがって、得られたＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを含む溶液を、上記に述べた方法によってウイルス不活性化し、ウルトラダイアフィルトレーション（ｕｌｔｒａ／ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって濃縮して、ＦＸＩ、ＦＸＩａまたは両方を含む濃縮物を得ることもできる。前記濃縮物はアジュバントと共にさらに製剤されて、ＦＸＩまたはＦＸＩａの欠如または不活性に関連する疾患を治療することができる医薬組成物を得てもよい。
【００２２】
アンチトロンビンを突破させたにもかかわらず、ヘパリンクロマトグラフィーゲルの流出液のＦＸＩおよびＦＸＩａのレベルを前記タンパク質の検出限界より下で見出したことは、驚くべきことであった。ＦＸＩおよびＦＸＩａは、ヘパリンおよびヘパランアフィニティーゲルに強く結合することが公知であるので、アンチトロンビン、特にアンチトロンビン−βアイソフォームによって、置換されていたであろうと予測された。さらに驚くべきことには、１．５Ｍを超えるＮａＣｌ、特に約２．０ＭのＮａＣｌを基本的に含む、より高いイオン強度の緩衝液で、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を溶出する必要がある一方、０．２〜１．４ＭのＮａＣｌを基本的に含む、低〜中イオン強度の溶出緩衝液または同等のイオン強度の緩衝液で、アンチトロンビンで飽和しているヘパリンアフィニティーゲルからＦＸＩおよびＦＸＩａを選択的に溶出することができた。十分に高いイオン強度の緩衝液で溶出してＡＴ−ＩＩＩも溶出する場合、この機構（ｆｅａｔｕｒｅ）により、ＦＸＩ／ＦＸＩａの溶出に続くＡＴ−ＩＩＩの溶出の分離溶出、またはＦＸＩ、ＦＸＩａおよびＡＴ−ＩＩＩを含む混合物の同時溶出のどちらかが可能となる。
【００２３】
さらに驚くべきことに、接触活性化を防止し、タンパク分解性消化を克服するために先行技術文献によって一般に教示されるような緩衝液へのポリブレン（登録商標）およびベンズアミジンの添加が不必要であることを見出した。
【００２４】
本発明の１つの目的は、マトリックス材料に連結しているデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎｅ）、ヘパリン、またはヘパランを用いるアフィニティークロマトグラフィーゲルを、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）で前処理することによって、最も有利に実施される。前処理は、クロマトグラフィー材料の活性部位がＡＴ−ＩＩＩで飽和されるような範囲で実施されてもよい。ＦＸＩおよびＦＸＩａのためのアフィニティーゲルの結合能は改善され、他の凝固因子の結合は禁止または少なくとも高い度合まで妨害されるため、この手法は特に有益である。よって、アフィニティーゲルからの溶出の後、ＦＸＩおよびＦＸＩａを付随タンパク質から選択的に除去し、他の凝固因子を欠くＸＩおよびＦＸＩａの溶液を得ることが可能である。
【００２５】
本発明の方法によって得ることが可能な医薬的に有効な成分の濃縮物と同様に、それから得ることが可能な医薬組成物も、本発明の対象である。
【００２６】
本発明による医薬的に有効な成分の濃縮物または本発明の医薬組成物において、医薬的に有効な成分はＩｇＧである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ＦＸＩ、ＦＸＩａまたは両方の混合物の含有量を、これらタンパク質および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させる方法を提供する。これは、ケイ酸塩（特に珪藻土）、またはアフィニティークロマトグラフィーに適切な材料（例えばヘパリンセファロース（商標）ＦＦ、Ｔｏｙｏ−ｐｅａｒｌ  ＡＦヘパリン６５０Ｍ（商標）のような、特にヘパリンアフィニティークマトグラフィーまたはヘパランアフィニティークロマトグラフィーに使用されるゲル）から選択される吸着材料への前記タンパク質の吸着により達成される。
【００２８】
ソースを含む溶液は、血液または血漿に由来するＦＸＩおよび／もしくはＦＸＩａを含むどのような液体であっても、または、生物工学的方法に由来する液体であってもよい。このような溶液の限定されない公知の例は、クリオ−プアー血漿、Ｃｏｈｎ  ｐｒｏｃｅｓｓの中間体（例えば再構成ペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）およびその誘導体、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ  ｐｒｏｃｅｓｓの中間体（例えば再構成沈殿物Ａ）およびその誘導体、または組換えタンパク質発現の結果生じる溶液の他、ガンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）溶液の場合であってもよいＦＸＩもしくはＦＸＩａが不純物となる他のタンパク質から主として構成される溶液である。
【００２９】
ＦＸＩおよびＦＸＩａを、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させるおよび／または除去する方法は、下記工程：
ａ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程；
ｂ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを吸着させる工程；及び
ｃ）ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程を含む。
【００３０】
マトリックスまたはゲルにＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを充填している間、マトリックスまたはゲルの活性部位がアンチトロンビンですでに飽和しているか、または飽和させられるかのどちらかである限り、ステップａ）を改変することもできる。
【００３１】
代替手法は、クロマトグラフカラム中への吸着材料の装填および原溶液を適用し、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを吸着剤に充填する。
【００３２】
本発明の一実施形態において、珪藻土を、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの吸着剤としてさらに使用してもよい。
【００３３】
１０−１８ｍＳの導電率、特に１４−１７ｍＳの導電率を有する緩衝液中のタンパク質をクロマトグラフィー樹脂（ヘパリンセファロース（商標）ＦＦ）に充填することにより、ステップａ）およびｂ）は実施される。ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの脱離を防止するために、充填された吸着剤は同じ導電率の洗浄緩衝液で丁寧に洗浄され、結果として生じる洗浄溶液は、さらに処理されるフロースルーおよび／または上清に添加して、ＦＸＩ／ＦＸＩａが取り除かれた溶液としてフロースルー中に存在するＩｇＧの回収を最適化してもよい。ヘパリンセファロース（商標）で処理したＦＸＩ／ＦＸＩａが取り除かれた溶液は、典型的には０．１ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌ未満、さらに具体的には０．００から０．０５ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌを含む。このような取り除かれた溶液の国際単位（ＩＵ）で表したＦＸＩａの含有量は、典型的には５ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌ未満、さらに具体的には０．０から１．０ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌである。
【００３４】
ＦＸＩ／ＦＸＩａが取り除かれた溶液をさらに処理する工程は、１回以上のウイルス不活性化工程を組み込んでもよく、例として挙げられるのは、参照により組み込まれる欧州特許出願公開第１３１７４０に開示されているような溶媒／界面活性剤処理（Ｓ／Ｄ処理）、紫外線照射、殺菌（ｐａｓｔｅｕｒｉｚａｔｉｏｎ）、低ｐＨインキュベーション、カプリル酸沈殿またはナノフィルトレーションである。他の工程は、クロマトグラフィー工程、医薬的に有効な化合物の濃縮物を得る濃縮、製剤および充填を含み、また、免疫グロブリン（特にＩｇＧ）、アルブミン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンまたはアルファ−１−アンチトリプシンなどの様々なタンパク質の生成から公知であり、医薬組成物を得るために必須であり、生成される生成物に依存する。
【００３５】
ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａは、充填された吸着剤から、０．３６ＭのＮａＣｌおよび０．０１Ｍのリン酸、または同等のイオン強度からなる溶出緩衝液で溶出されてもよい。したがって、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａを含む得られた溶液を、上記に述べた方法によってウイルス不活性化し、ウルトラダイアフィルトレーションによって濃縮して、ＦＸＩ、ＦＸＩａまたは両方を含む濃縮物を得ることもできる。前記濃縮物はアジュバントと共にさらに製剤されて、ＦＸＩまたはＦＸＩａの欠如または不活性に関連する疾患を治療することができる医薬組成物を得てもよい。
【実施例】
【００３６】
ＸＩａ因子活性アッセイ
試料中に存在するＦＸＩａによって、組換え凝固因子ＩＸ（ＦＩＸａを欠く）をＦＩＸａに活性化する。リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、ＦＩＸａは、アッセイ溶液中に過剰に存在するトロンビン活性化ＦＶＩＩＩ：Ｃと酵素複合体を形成する。この酵素複合体は続いて、アッセイ溶液中に存在するＦＸをＸａ因子（ＦＸａ）に活性化する。ＦＸａの生成量は、市販の基質によって測定可能であり、試料中のＦＸＩａ濃度に正比例する。検量線と比較して定量を行う。
【００３７】
クリオ−プアー血漿のような、血漿分画方法の初期段階由来の試料を測定するとき、このアッセイはＦＩＸａおよびＦＸａの活性も示すということについて述べなければならない。したがって、ＦＩＸａおよびＦＸａが試料中に存在しているという必要条件と共に、要約されたＦＸＩａ、ＦＩＸａおよびＦＸａの活性はこのような試料に適用されるということが理解可能である。
【００３８】
実施例１：
出発材料を、カラムに装填したヘパリンセファロースＦＦで処理してクロマトグラフィー材料にＦＸＩおよびＦＸＩａを吸着させた。ＩｇＧ含有フロースルーをＨｙｆｌｏ、つまり珪藻土に接触させ、遠心分離を行って充填されたＨｙｆｌｏを除去した。続いてＩｇＧ含有上清は、中間のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩに処理された。これにより、生成された中間体の再構成は０．０２ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌおよび１ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌ未満であることが明らかになった。
【００３９】
実施例２：
珪藻土へのＦＸＩ／ＦＸＩａ捕獲を含めないこと以外は実施例１と同様の方法で、ペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩを生成した。ＦＸＩおよびＦＸＩａの測定は、０．０５ＩＵ  ＦＸＩ／ｍｌおよび３．５ｍＵ  ＦＸＩａ／ｍｌの含有量であることを明らかにした。
【００４０】
表１−表３は、操作１と比較して、ヘパリンゲルに対する出発材料の充填を減少させて操作２−操作５を実施したクロマトグラフィー前後の試料の分析結果を示す。
【００４１】
【表１】
2014501721.tif 000002
【００４２】
【表２】
2014501721.tif 000003
【００４３】
【表３】
2014501721.tif 000004
【国際調査報告】
2014501721.tif 000005
2014501721.tif 000006
2014501721.tif 000007
2014501721.tif 000008