(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプル（例えば組織サンプル、生検サンプル、大便サンプル、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル）における結腸直腸癌の検出のための方法およびバイオマーカー（例えば遺伝子発現バイオマーカー）に関する。ある実施形態では、本発明の方法およびバイオマーカーは、直腸癌の検出、および、結腸直腸癌の患者への予後の提供に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の結腸直腸癌の予後を決定する、対象の結腸直腸癌を診断する、対象の結腸直腸癌への素因を予測する、対象の結腸直腸癌の再発の可能性を予測する、または、特定の治療法を有する治療に対する疾病を有する対象を選択する、方法であって、
（ａ）対象からの生物学的サンプルを、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3, BNIP3, PLA2G2A, GZMK, MMP1, AKD1, XRCC4 RAET1L, TTC30A, HAS2, CPE, CXCL9, GBP4, RPS6KA6, ENPP5, RAP1B, DYNLL1およびRPS27Lからなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現レベルを検出するための結腸直腸癌情報提供的試薬に接触させるステップと、
（ｂ）in vitro分析で、上記結腸直腸癌情報提供的試薬を用いて、１個以上の上記遺伝子の発現レベルを検出するステップとを含み、
１個以上の上記遺伝子の発現の変化したレベルが、対象の悪い予後、対象の結腸直腸癌の診断、対象の結腸直腸癌の素因への予測、対象の結腸直腸癌の再発の可能性の予測、または、対象が特定の治療法を有する治療に対する候補者であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる２個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる３個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる５個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１０個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１２個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１３個の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１個以上の上記遺伝子が、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3、およびBNIP3の組を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記生物学的サンプルが、組織サンプル、生検サンプル、血液サンプル、および大便サンプルからなるグループから選ばれることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
対象が、あらかじめ結腸直腸癌と診断されていることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記遺伝子の発現の基準レベルと比べて、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L)、および(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、およびその組み合わせからなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現の減少したレベルが、対象の悪い予後に関連することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記遺伝子の発現の基準レベルと比べて、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)、および(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現の増加したレベルが、対象の悪い予後に関連することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
悪い予後が、減少した生存を含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
悪い予後が、結腸直腸癌の再発または転移を含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記基準レベルが、ステージIまたはIVの結腸直腸癌と診断された対象からのレベルであることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記基準レベルが、結腸直腸癌と診断されていない対象からのレベルであることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１７】
上記予後が、５年間再発無しの生存を含むことを特徴とする請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
治療計画を決定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
上記治療計画が、悪い予後を有すると確認された対象への化学療法を行うことと、良い予後を有すると確認された対象への化学療法を行わないこととを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記化学療法が、アジュバント化学療法であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
結腸直腸癌がステージI、IIまたはIIIであることを特徴とする請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対してハイブリダイズする１個以上の核酸プローブ、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物の増幅と検出とのための核酸プライマー、および、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対して特異的な抗原結合タンパク質からなるグループから選ばれることを特徴とする請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
上記遺伝子産物が、上記遺伝子由来のＲＮＡ転写物であり、上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各上記遺伝子産物に対してハイブリダイズする１個以上の核酸プローブ、または、１個以上の上記遺伝子の各上記遺伝子産物の増幅と検出とのための核酸プライマーであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
対象の結腸直腸癌に関する予後を行う方法であって、（ａ）対象からの生物学的サンプルを、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現レベルを検出するための結腸直腸癌情報提供的試薬に接触させるステップと、（ｂ）in vitro分析で、上記結腸直腸癌情報提供的試薬を用いて、１個以上の上記遺伝子の発現レベルを検出するステップとを含み、
１個以上の上記遺伝子の発現の変化したレベルが、対象の結腸直腸癌に関する悪い予後を示すことを特徴とする方法。
【請求項２５】
(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の結腸直腸癌を有するまたは有する疑いがある対象からのサンプルにおいて変化した遺伝子発現を検出する１個以上の結腸直腸癌情報提供的試薬を含むことを特徴とするキット。
【請求項２６】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる２個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる３個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる５個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１０個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１２個以上の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１３個の遺伝子の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項３２】
１個以上の上記遺伝子が、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3、およびBNIP3の組を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項３３】
１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対して特異的にハイブリダイズするプローブであることを特徴とする請求項２５ないし３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物を増幅するプライマーの組であることを特徴とする請求項２５ないし３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に結合する抗原結合タンパク質であることを特徴とする請求項２５ないし３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対してハイブリダイズし、各遺伝子産物のシーケンシングを可能にする、シーケンシングプライマーであることを特徴とする請求項２５ないし３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
結腸直腸癌と診断された対象の予後を決定するための、請求項２５ないし３６のいずれか１項に記載のキットの、使用。
【請求項３８】
対象の結腸直腸癌を診断するための、請求項２５ないし３６のいずれか１項に記載のキットの、使用。
【請求項３９】
治療の成功の可能性を決定するための、および／または、治療に対する患者を選択するための、請求項２５ないし３６のいずれか１項に記載のキットの、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、本発明は、生物学的サンプル（例えば組織サンプル、生検サンプル、大便サンプル、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル）における結腸直腸癌の検出のための方法およびバイオマーカー（例えば遺伝子発現バイオマーカー）に関する。ある実施形態では、本発明の方法およびバイオマーカーは、直腸癌の検出、結腸直腸癌の患者への予後の提供、および、それに伴う診断に有用である。
【０００２】
〔背景技術〕
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、世界中の男女両方に非常に一般的なタイプの癌の一つであり、毎年約１２０万人の新たなケースが記録されている（文献１）。予後は、診断時の腫瘍のステージに非常に依存する。癌に関する米国の共同委員会によれば、ステージI、II、IIIおよびIVの５年間の生存率はそれぞれ９３％、８３％、６０％および８％である（文献２）。しかしながら、ステージIIbの患者（pT3-4、リンパ節ネガティブ）に対する予後は、ステージIIIb（pT1-2、リンパ節ポジティブ、８３％）に対する予後よりも非常に低い（７２％）（文献２）。
【０００３】
アジュバント化学療法は、ステージIIIのＣＲＣで著しく生存を改善し、これらの患者の標準的な治療として受け入れられている（文献３）。ステージIIのＣＲＣの患者の大部分は外科手術のみで治癒するが、腫瘍といくつかの検査されたリンパ節の孔は、生存の減少に関連し、通常は、アジュバント化学療法が考慮される。現在の臨床ファクターに基づいた再発の危険の増大していないステージIIの患者の割合は、依然として再発を発生している。アジュバント化学療法で全てのステージIIのＣＲＣの患者を治療することも考えられるが、この効果は決定的でない（文献４−６）。
【０００４】
これは、高リスクのステージIIの患者のより正確な予測のための新しいバイオマーカー、したがって、改善された個々の癌のケアの必要性をも浮き彫りにしている。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、生物学的サンプル（例えば組織サンプル、生検サンプル、大便サンプル、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル）における結腸直腸癌の検出のための方法およびバイオマーカー（例えば遺伝子発現バイオマーカー）に関する。ある実施形態では、本発明の方法およびバイオマーカーは、直腸癌の検出、および、結腸直腸癌の患者への予後の提供に有用である。
【０００６】
例えば、本発明の実施形態は、対象における、直腸癌の診断または予後の予測の方法を提供し（例えば、ステージI、IIまたはIIIの結腸直腸癌）、（ａ）（例えば、ステージI、IIまたはIIIの結腸直腸癌と診断された）対象からの生物学的サンプルを、例えば、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3またはBNIP3から選ばれる１個以上（例えば、２個以上、３個以上、５個以上、１０個以上または１３個すべて）の遺伝子の発現レベルを検出するための試薬に接触させるステップと、（ｂ）in vitro分析を用いて、１個以上の上記遺伝子の発現レベルを検出するステップとを含み、１個以上の上記遺伝子の発現の変化したレベルが、対象の結腸直腸癌の診断、または、対象の悪い予後を示す。ある実施形態では、生物学的サンプルは、組織サンプル、生検サンプル、血液サンプル、または大便サンプルである。ある実施形態では、遺伝子の、対照サンプルの発現レベルと比べて、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1BおよびCXCL10のうちの１個以上の遺伝子の発現の減少したレベル、および／または、遺伝子の、対照サンプルの発現レベルと比べて、SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, ENPP3およびBNIP3のうちの１個以上の遺伝子の発現の増加したレベルが、対象の悪い予後に関連する。ある実施形態では、発現は、核酸レベル（例えばｍＲＮＡ）で検出され、他の実施形態では、タンパク質レベルで検出される。ある実施形態では、予後は、結腸直腸癌の、５年間の再発無しの生存、減少した生存、または、再発または転移である。ある実施形態では、対照サンプルは、ステージIまたはIVの結腸直腸癌と診断された対象からのサンプルまたは結腸直腸癌と診断されていない対象からのサンプルである。ある実施形態では、予後に基づいて、治療計画（例えば悪い予後を有すると確認された対象への化学療法）が決定される。
【０００７】
さらなる実施形態は、例えばPIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3またはBNIP3から選ばれる１個以上（例えば２個以上、３個以上、５個以上、１０個以上または１３個全部）の遺伝子の、対象（例えば、ステージI、IIまたはIIIの結腸直腸癌）からのサンプルにおける変化した遺伝子発現を検出する試薬を含むキットを提供する。さらなる実施形態は、結腸直腸癌を診断する、または、結腸直腸癌と診断された対象の予後を決定するためのキットの使用を提供する。
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、対象の結腸直腸癌の予後を決定し、対象の結腸直腸癌を診断し、対象の結腸直腸癌への素因を予測し、対象の結腸直腸癌の再発の可能性を予測し、または、特定の治療法を有する治療に対する疾病を有する対象を選択する、方法であって、（ａ）対象からの生物学的サンプルを、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3, BNIP3, PLA2G2A, GZMK, MMP1, AKD1, XRCC4 RAET1L, TTC30A, HAS2, CPE, CXCL9, GBP4, RPS6KA6, ENPP5, RAP1B, DYNLL1およびRPS27Lからなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現レベルを検出するための結腸直腸癌情報提供的試薬に接触させるステップと、（ｂ）in vitro分析で、上記結腸直腸癌情報提供的試薬を用いて、１個以上の上記遺伝子の発現レベルを検出するステップとを含み、１個以上の上記遺伝子の発現の変化したレベルが、対象の悪い予後、対象の結腸直腸癌の診断、対象の結腸直腸癌の素因への予測、対象の結腸直腸癌の再発の可能性の予測、または、対象が特定の治療法を有する治療に対する候補者であることを示す方法を提供する。ある実施形態では、結腸直腸癌がステージI、IIまたはIIIである。
【０００９】
ある実施形態では、１個以上の遺伝子は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる２個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の遺伝子は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる３個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の遺伝子は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる５個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の遺伝子は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１０個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の遺伝子は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１２個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の遺伝子は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１３個の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3、およびBNIP3の組を含む。
【００１０】
ある実施形態では、上記生物学的サンプルが、組織サンプル、生検サンプル、血液サンプル、および大便サンプルからなるグループから選ばれる。ある実施形態では、対象が、あらかじめ結腸直腸癌と診断されている。
【００１１】
ある実施形態では、上記遺伝子の発現の基準レベルと比べて、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L)、および(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、およびその組み合わせからなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現の減少したレベルが、対象の悪い予後に関連する。ある実施形態では、上記遺伝子の発現の基準レベルと比べて、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)、および(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現の増加したレベルが、対象の悪い予後に関連する。ある実施形態では、悪い予後が、減少した生存を含む。ある実施形態では、悪い予後が、結腸直腸癌の再発または転移を含む。ある実施形態では、上記基準レベルが、ステージIまたはIVの結腸直腸癌と診断された対象からのレベルである。ある実施形態では、上記基準レベルが、結腸直腸癌と診断されていない対象からのレベルである。ある実施形態では、上記予後が、５年間再発無しの生存を含む。
【００１２】
ある実施形態では、治療計画を決定するステップをさらに含む。ある実施形態では、上記治療計画が、悪い予後を有すると確認された対象への化学療法を行うことと、良い予後を有すると確認された対象への化学療法を行わないこととを含む。ある実施形態では、上記化学療法が、アジュバント化学療法である。
【００１３】
ある実施形態では、上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対してハイブリダイズする１個以上の核酸プローブ、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物の増幅と検出とのための核酸プライマー、および、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対して特異的な抗原結合タンパク質からなるグループから選ばれる。ある実施形態では、上記遺伝子産物が、上記遺伝子由来のＲＮＡ転写物であり、上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各上記遺伝子産物に対してハイブリダイズする１個以上の核酸プローブ、または、１個以上の上記遺伝子の各上記遺伝子産物の増幅と検出とのための核酸プライマーである。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、対象の結腸直腸癌に関する予後を行う方法であって、（ａ）対象からの生物学的サンプルを、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の発現レベルを検出するための結腸直腸癌情報提供的試薬に接触させるステップと、（ｂ）in vitro分析で、上記結腸直腸癌情報提供的試薬を用いて、１個以上の上記遺伝子の発現レベルを検出するステップとを含み、１個以上の上記遺伝子の発現の変化したレベルが、対象の結腸直腸癌に関する悪い予後を示すことを特徴とする方法を提供する。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上の遺伝子の結腸直腸癌を有するまたは有する疑いがある対象からのサンプルにおいて変化した遺伝子発現を検出する１個以上の結腸直腸癌情報提供的試薬を含むことを特徴とするキットを提供する。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる２個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる３個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる５個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１０個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１２個以上の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１３個の遺伝子の組を含む。ある実施形態では、１個以上の上記遺伝子が、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3、およびBNIP3の組を含む。
【００１６】
ある実施形態では、１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対して特異的にハイブリダイズするプローブである。ある実施形態では、１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物を増幅するプライマーの組である。ある実施形態では、１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に結合する抗原結合タンパク質である。ある実施形態では、１個以上の上記結腸直腸癌情報提供的試薬が、１個以上の上記遺伝子の各遺伝子産物に対してハイブリダイズし、各遺伝子産物のシーケンシングを可能にする、シーケンシングプライマーである。
【００１７】
ある実施形態では、キットは、結腸直腸癌と診断された対象の予後を決定するために用いられる。ある実施形態では、キットは、対象の結腸直腸癌を診断するために用いられる。ある実施形態では、キットは、治療の成功の可能性を決定するため、および／または、治療に対する患者を選択するために用いられる。
【００１８】
さらなる実施形態は、関係技術の当業者には、ここに含まれる開示に基づけば明らかであろう。
【００１９】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、テストシリーズにおける予後の遺伝子発現の分類器の確認に導く遺伝子選択基準を示す。１７６１７個の遺伝子の初期リストのうち、６７６０個の遺伝子が、ステージIとIVの腫瘍の間で、発現が異なっており、ステージ調整ｐ値＜０．５０であり、３３３９個の遺伝子（４９％）が、ステージIとIVの腫瘍の間で異なる発現を持つ遺伝子リストに対し共通であり、ステージIIのＣＲＣの患者の間で再発の高い危険性に関連する高発現および低発現遺伝子であった。危険性の高いステージIIのＣＲＣの患者を示すために、これらの遺伝子のうち、１３個の遺伝子発現分類器が確認された。この遺伝子分類器の予後影響力は、２個の独立サンプルシリーズにおいて良好に検証された。単変量Ｃｏｘ回帰分析から、危険比（ＨＲ）が得られた。
【００２０】
図２は、ステージIIのＣＲＣの患者の間で再発無しの生存（ＲＦＳ）を表すKaplan Meier生存曲線を示す。（Ａ）テストシリーズにおいて、再発グループの２個の危険性が十分に分離されている(p<0.001)。（Ｂ）および（Ｃ）両方の検証シリーズIおよびII（それぞれｂおよびｃ）において、予後の遺伝子発現分類器は、統計的に有意(それぞれp=0.02およびp=0.001)に、再発グループの低いおよび高い危険性を確認する。
【００２１】
図３は、図に示すように、１３個の遺伝子の予後の分類器が、投げ縄ペナルティー法によりテストシリーズの４４のステージIIのＣＲＣから確認された、生存（Ａ）、高い変動（Ｂ）および互いに対する低い相関（Ｃ）、に対する明らかな相関を有する遺伝子の確認に有利であることを示す。（Ａ）単変量Ｃｏｘ回帰分析（「材料および方法」を見よ）から生成されたＰ値は、分析に入れた３３３９個の遺伝子からのＰ値と比べて、平均的に有意に低かった(それぞれp=0.07対p=0.55)。（Ｂ）遺伝子発現の変動の計算もまた、１３個の遺伝子の平均変動が、遺伝子セットに対するものより高いことを示している(それぞれ、変動2.39対0.23)。（Ｃ）ヒートマップは、CXCL10およびCXCL13を例外として、１３個の遺伝子の間で低い相関を示し(範囲-0.37<r<0.44)、両方とも、染色体バンド4q21に位置し、r=0.70の相関係数を有する。
【００２２】
図４は、ステージIIおよびIIIのＣＲＣのサンプルと、１３個の遺伝子発現分類器の使用により計算された生存の可能性を示す。テストシリーズ（Ａ）および検証シリーズ（Ｂ）の両方において、予後の遺伝子発現分類器は、ステージIIの患者に対してのみの予後出力に応じて有意な分離を可能にした。
【００２３】
図５は、１３個の遺伝子のパネルに対するTaqMan（商標）アッセイ結果を用いたマイクロアレイデータの相関を示すプロットである。
【００２４】
図６は、定量的RT-PCR（TaqMan（商標））アッセイ結果を用いたマイクロアレイデータの相関を示す個々の遺伝子に対するプロットである。
【００２５】
〔定義〕
本発明の理解を容易にするために、多くの用語とフレーズを以下に定義する。
【００２６】
ここで用いられる場合、用語「感度」は、分析（例えば方法、試験）の性能の統計的尺度として定義され、真の陽性および偽の陰性の和で、真の陽性の数を割って計算される。
【００２７】
ここで用いられる場合、用語「特異性」は、分析（例えば方法、試験）の性能の統計的尺度として定義され、真の陰性および偽の陽性の和で、真の陰性の数を割って計算される。
【００２８】
ここで用いられる場合、用語「情報提供的」または「情報提供性」は、マーカーまたはマーカーパネルの品質を指し、特に陽性試料からマーカー（またはマーカーパネル）を発見できる可能性を指す。
【００２９】
ここで用いられる場合、用語「結腸直腸癌情報提供的試薬」は、ここで述べる癌遺伝子マーカーの発現の確認に対して情報提供的な試薬を指す。ある実施形態では、試薬は、以下の遺伝子の遺伝子発現産物（例えばＲＮＡ転写物またはタンパク質）の検出のための、プライマー、プローブまたは抗体である：PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3, BNIP3, PLA2G2A, GZMK, MMP1, AKD1, XRCC4 RAET1L, TTC30A, HAS2, CPE, CXCL9, GBP4, RPS6KA6, ENPP5, RAP1B,DYNLL1およびRPS27L。
【００３０】
ここで用いられる場合、用語「転移」は、体内の一組織または部分で発生した癌細胞が他の部分に移転して複製し続ける過程を指すように意図される。その後、転移細胞は腫瘍を形成し、この腫瘍がさらに転移することがある。したがって、この用語は、癌が最初に発生した体内部位から他の体内部位へ広がることを指す。ここで用いられる場合、用語「転移結腸直腸癌細胞」は、転移した結腸直腸癌細胞、すなわち、結腸直腸以外の体内部分に局在する結腸直腸癌細胞を指すように意図されている。
【００３１】
ここで用いられる場合、「転移性結腸直腸癌細胞の影響を受けやすいことが疑われる個体」は、転移結腸直腸癌細胞の発生について平均より高いリスクを有する個体を指すように意図されている。転移結腸直腸癌細胞の発生について特定のリスクを有する個体の例は、個体の血縁者の医療記録から血縁者間の結腸直腸癌の発生率が平均よりも高いことが示される個体、および／または、既に結腸直腸癌に罹って効果的な治療を受けており、したがって再発のリスクに直面する個体である。平均より高い転移性結腸直腸癌の発生リスクに寄与し、したがって個体が転移性結腸直腸癌細胞の影響を受けやすいことが疑われる個体であると分類されることに繋がる他の要因は、個体の特定の遺伝的、医学的、および／または行動的背景および特性に基づいている。
【００３２】
本願で使用する用語「新生物」は、組織の新生で異常な成長を指す。したがって、新生物は、前癌状態の新生物または悪性の新生物とすることができる。用語「新生物特異的マーカー」は、新生物の存在を示すのに使用することのできる任意の生体マーカーを指す。上記生体マーカーの例は、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜およびミトコンドリア）、および細胞全体を含むが、これらに限定されない。用語「結腸直腸の新生物に特異的なマーカー」は、結腸直腸の新生物（例えば、結腸直腸の前癌状態の新生物、結腸直腸の悪性の新生物、結腸直腸の転移性の新生物）の存在を示すのに使用することのできる任意の生体マーカーを指す。結腸直腸の新生物に特異的なマーカーの例は、ここで述べる１３個の遺伝子サインを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
ここで用いられる場合、用語「アンプリコン」は、プライマー対を用いて生成される核酸を指す。アンプリコンは一般的には、一本鎖ＤＮＡ（例えば、不斉増幅の生成物）であるが、ＲＮＡまたはｄｓＤＮＡであってもよい。
【００３４】
核酸との関連で使用する用語「増幅性」または「増幅」は、ポリヌクレオチドまたはその一部（一般的には、少量（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から開始）の複数のコピーを作製することを指し、この場合の増幅産物またはアンプリコンは通常は検出可能な増幅産物またはアンプリコンである。ポリヌクレオチドの増幅は様々な化学的および酵素的処理を含む。増幅手法の種類としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；例えば、米国特許第５，４９４，８１０号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）中に標的ＤＮＡ分子または鋳型ＤＮＡ分子の１つまたは少数のコピーから複数のＤＮＡコピーを発生させることがある。さらなる増幅手法の種類は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法（例えば、米国特許第５，６３９，６１１号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、アセンブリＰＣＲ法（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ヘリカーゼ依存増幅法（例えば、米国特許第７，６６２，５９４号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ホットスタートＰＣＲ法（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および米国特許第５，３３８，６７１号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、配列間特異的ＰＣＲ法、インバースＰＣＲ法（例えば、Triglia, et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16:8186参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ライゲーション介在ＰＣＲ法（例えば、Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997)および米国特許第５，５０８，１６９号を参照；当該文献および当該米国特許を参照することにより、それらの全開示内容を本願に援用するものとする）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、Herman, et al., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ミニプライマーＰＣＲ法、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅法（例えば、Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、マルチプレックスＰＣＲ法（例えば、Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156およびBallabio, et al., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）、ネステッドＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ法（例えば、Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Higuchi, etl al., (1992) Biotechnology 10:413-417およびHiguchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）、逆転写ＰＣＲ法（例えば、Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容��本願に援用するものとする）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ法、およびタッチダウンＰＣＲ法（例えば、Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008、Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814、およびHecker, et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの増幅処理はまた、デジタルＰＣＲ（例えば、Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997)、Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999)、国際公開第ＷＯ  ０５０２３０９１Ａ２号、および米国公開特許出願第２００７  ０２０２５２５号を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）を用いることにより達成することが可能である。
【００３５】
ここで用いられる場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合則に関するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関連して使用される。例えば、配列「５’‐Ａ‐Ｇ‐Ｔ‐３’」は、配列「３’‐Ｔ‐Ｃ‐Ａ‐５’」に相補的な配列である。相補性は、幾つかの核酸塩基のみが塩基対合則にしたがって一致しているような部分的な相補性であってもよい。または、核酸ストランド間には“完全”または“全体”相補性が存在してもよい。核酸の螺旋構造間の相補性の度合いは、核酸の螺旋構造間の交配の効率性および強度に多大な効果をおよぼす。このことは、増幅反応ならびに核酸ストランド間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
【００３６】
ここで用いられる場合、用語「プライマー」は、精製した制限消化産物において自然発生するような天然のオリゴヌクレオチドまたは合成的に作製されるような非天然のオリゴヌクレオチドの区別なく、核酸ストランドに対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される状態（例えば、ヌクレオチドおよび生体触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）などの誘発剤の存在下であって、適切な温度およびｐＨ条件下）におかれた場合に合成反応の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅処理における最大の効率性を得るために、一般的には一本鎖のプライマーを使用するが、代わりに二本鎖のプライマーを使用してもよい。二本鎖のプライマーを使用する場合では、プライマーを用いて伸長生成物を調製する前に、先ず処理を行ってプライマーの二本鎖を分離させる。一部の実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。上記プライマーは、誘発剤の存在下において伸長生成物の合成の事前準備を行うのに十分な長さを有している。上記プライマーの具体的な長さは、温度、プライマーのソース、および上記方法の使用を含む多数の要因に応じて決定される。特定の実施形態では、上記プライマーは捕捉プライマーである。
【００３７】
ここで用いられる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む任意の核酸含有分子を指すが、これらに限定されない。上記用語が表す対象は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体を有する配列を含み、このような塩基類似体は、４‐アセチルシトシン、８‐ヒドロキシ‐Ｎ６‐メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５‐（カルボキシヒドロキシル‐）ウラシル、５‐フルオロウラシル、５‐ブロモウラシル、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオウラシル、５‐カルボキシメチル‐アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６‐イソペンテニルアデニン、１‐メチルアデニン、１‐メチルシュード‐ウラシル、１‐メチルグアニン、１‐メチルイノシン、２，２‐ジメチル‐グアニン、２‐メチルアデニン、２‐メチルグアニン、３-メチル‐シトシン、５‐メチルシトシン、Ｎ６‐メチルアデニン、７‐メチルグアニン、５‐メチルアミノメチルウラシル、５‐メトキシ‐アミノ‐メチル‐２‐チオウラシル、β‐Ｄ‐マンノシルケウオシン、５’‐メトキシカルボニルメチルウラシル、５‐メトキシウラシル、２‐メチルチオ‐Ｎ‐イソペンテニルアデニン、ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２‐チオシトシン、５‐メチル‐２‐チオウラシル、２‐チオウラシル、４‐チオウラシル、５‐メチルウラシル、Ｎ‐ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸、シュードウラシル、ケウオシン、２‐チオシトシン、および２，６‐ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
ここで用いられる場合、用語「核酸塩基」は、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、「ヌクレオチド残基」、「デオキシヌクレオチド残基」、「ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）」、または「デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）」を含む、当該分野で用いられる他の用語の同義語である。
【００３９】
ここで用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個の核酸単量体単位（例えば、ヌクレオチド）を含む核酸を指し、前記少なくとも２個の核酸単量体単位は、一般的には３個を超える単量体単位であり、より一般的には１０個を超える単量体単位である。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは一般的には、最終機能またはオリゴヌクレオチドの使用を含む多様な要因に応じて決定される。さらに説明すると、オリゴヌクレオチドは一般的には２００残基未満（例えば、１５残基〜１００残基）の長さである。しかし、本願に使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、より長いポリヌクレオチド鎖を含むよう意図されている。オリゴヌクレオチドはその長さによって称されることが頻繁にある。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは「２４‐ｍｅｒ」と称される。一般的には、ヌクレオシド単量体は、ホスホロチオデート、ホスホロジチオデート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、およびホスホラミデートなどを含み、付随する対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、およびＮａ+など）が存在する場合にはこれを含むリン酸ジエステル結合またはその類似物により結合される。さらに、オリゴヌクレオチドは一般的には一本鎖である。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法により適宜調製され、前記任意の好適な方法は、既存または天然の配列の単離法、ＤＮＡの複製法または増幅法、逆転写法、適当な配列のクローニング法および制限消化法、または、Narang et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99に記載のホスホトリエステル方法、Brown et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151に記載のホスホジエステル方法、Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862に記載のdiethylphosphoramidite方法、Matteucci et al. (1981) J Am Chem Soc. 103:3185-3191に記載のトリエステル方法、自動合成方法、米国特許第４，４５８，０６６号（"PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES"、発効日：１９８４年７月３日、Caruthers et al.）に記載の固相支持方法、または当業者に公知の他の方法により実現される直接化学合成法を含むが、これらに限定されない。上述の全ての文献については、参照することにより各々の開示内容を本願に援用するものとする。
【００４０】
生重合体の「配列」は、生重合体中の単量体単位（例えば、ヌクレオチドなど）の順番および識別性を指す。核酸の配列（例えば、塩基配列）は一般的には５’末端側から３’末端側に読まれる。
【００４１】
ここで用いられる場合、用語「対象」は、特定の処理を受ける任意の動物（例えば、哺乳類）を指し、前記任意の動物は、ヒト、ヒト以外の霊長類、および齧歯類などを含むが、これらに限定されない。通常、本願において用語「対象」および「患者」は互いに互換可能にヒト対象と関連して使用される。
【００４２】
本願に使用するように、用語「ヒト以外の動物」はヒト以外の全ての動物を指し、前記ヒト以外の全ての動物は、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻類、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などの脊椎動物を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、または前駆体の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチド、ＲＮＡ、または前駆体は、全長コード配列によってコードされることが可能であり、全長コード配列または断片の所望の活性特性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド配位子結合、シグナル伝達など）が保持されている場合に限ってはコード配列の任意の部分によってコードされることが可能である。用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域も含み、コード領域に隣接して５’末端側および３’末端側に約１ｋｂ離れて位置する配列を含んでいるので、遺伝子は全長ｍＲＮＡの長さに対応する。上記コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ中に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流側に位置してｍＲＮＡ中に現れる配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形式およびゲノム形式の両方を含む。遺伝子のゲノム形式またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と称される非コード領域によって分断化されるコード領域を含む。イントロンは、転写されて核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）となる遺伝子断片である。イントロンは、エンハンサーなどの制御要素を含んでよい。イントロンは、核転写産物または一次転写産物から除去されるか、またはスプライシングにより取り出される。したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）処理された転写産物中には不在となる。ｍＲＮＡは翻訳中に作用して、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を指定する。
【００４４】
本願に使用する用語「遺伝子座」は、染色体上または連鎖地図上の核酸配列を指し、コード配列並びに遺伝子制御に関与する５’配列および３’配列を含む。
【００４５】
〔発明の詳細な実施形態〕
本発明は、生物学的サンプル（例えば組織サンプル、生検サンプル、大便サンプル、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル）における結腸直腸癌の検出のための方法およびバイオマーカー（例えば遺伝子発現バイオマーカー）に関する。ある実施形態では、本発明の方法およびバイオマーカーは、直腸癌の検出、および、結腸直腸癌の患者への予後の提供に有用である。
【００４６】
KRASおよびBRAFの変異のような分子マーカーは、染色体およびマイクロサテライトの不安定性（ＭＳＩ）同様、ＣＲＣの予後の可能性に対して系統的に分析される。これまでのところ、KRASの変異の分析だけが、転移性の疾病においてEGFR抗体の効果に対する予測マーカーとして実際の臨床で行われている（文献７−１０）。他の公知の重要なＣＲＣ遺伝子の分析は、スクリーニングにも薦められていないし、予後および／または予測のマーカーとしても用いられていない（文献１１、１２）。
【００４７】
いくつかの研究は、ステージIIおよびIIIのＣＲＣの患者の予後の影響力を有する遺伝子発現のサインを確認した（文献１３−１９）。早期の研究では、小さいサンプルシリーズおよび独立したサンプルの検証の欠如が、引き出される結論の力を限定した。しかしながら、最近の公開物は、これらの限定に対処し、これらのうちの一つも特異的にステージIIのＣＲＣをターゲットにしていなくても、遺伝子のサインが示唆されることを約束した（文献１３、１４、１７、１８）。
【００４８】
この研究では、我々は、ステージIIのＣＲＣの患者のリスクの階層化を改善した。遺伝子発現レベルを正確に決定するために高解像度のエクソンレベルマイクロアレイを用いることによって、再発の予測のための遺伝子分類器を開発した。この発現サインの予測値は、２個の患者シリーズにわたって検証された。
【００４９】
マイクロアレイ技術は、発癌への洞察を得るのに高い適用性があることがわかった（文献２８）。この研究で、我々は、ゲノムの各遺伝子の各エクソンに対するプローブを持つ高解像度のマイクロアレイを用い、厳しい統計的アプローチと組み合わせて、高リスクのステージIIの患者グループを確認した。２個の独立したサンプルシリーズが分析され、その全長に沿って遺伝子をターゲットにする強い遺伝子発現値を生成した。これは、ここに示したサインの強さに貢献したと考えられ、これは、臨床的に独立した社内のサンプルシリーズに加えて、第３の独立した公的に利用可能なデータセットにおいても検証された。後者のシリーズ（検証シリーズII）のサンプルは、社内のデータシリーズと比べて異なったタイプの発現マイクロアレイによって分析され、主に遺伝子の３’末端がターゲットにされた（文献１３、１４、１８）。
【００５０】
独立したデータセットに適用するときには、予測者の重要性が低いことによって特徴付けられる高次元のデータの生存モデリングに過剰に適合する危険がある。この挑戦に対処するために、遺伝子の最適な選択のためにL1（投げ縄）ペナルティーを用いたＣｏｘ比例危険モデルが、強い予後値と高い発現変動と相互間の低い相関とを持つ遺伝子の選択に有利であり、過剰な適合を防止するために用いられる（文献２５、２９、３０）。投げ縄法は、乳癌の研究で述べられている（文献２５）。この方法は、「Cologuide」と名付けられたステージIIのＣＲＣの１３個の遺伝子の予後の分類器を確認した。
【００５１】
今日では、ステージIIの患者は、もし彼らが、臨床的および病理学的な評価に基づいて再発の危険が高ければ、アジュバント化学療法的治療が考慮される。ＡＳＣＯの推奨に沿えば、これに反対する要因は、進んだＴステージ、いくつかの検査されたリンパ節、腫瘍孔および低い腫瘍分化である（文献５）。高リスクの患者グループは、pT4ステージまたは低グレード腫瘍を持った患者を含まなかった。これは、最近のSalazar達の研究に追従しており、そのレベルと臨床リスクファクターとの間の危険階層化における不一致を示し（文献１７）、最も好ましくない結果を有する患者をより正確に指摘するためにさらなる分子情報の必要性を強調している。患者の生存との相関を有するMSI状態も示されている（文献１０）。この研究では、MSI腫瘍（テストシリーズおよび検証シリーズI）のうちで、MSIに関連する好ましい予後と一致して遺伝子発現サインに沿って高リスクサンプルとして分類されたものはなかった。
【００５２】
初めに、数千の遺伝子を、ステージIIの患者の結果にとって情報提供的なセットへと減少させる処理において、遺伝子が、転移能力に関連する発現レベルで確認されたが、これは例えば、ステージIとステージIVとの間で区別されるものである。遺伝子の機能的分析は、その生物学的関連性を支持した（表７）。Jorissenらは、ステージIIとIIIのＣＲＣの予後サブグループを見いだすために、種々のデータセットにおける重複する遺伝子を比較する、同様のアプローチを用いた（文献１３）。彼らは、その予後サインの確認のためにさらなる統計モデルは用いず、それゆえ、得られた大量の遺伝子(n=128)は、ルーチンの臨床試験への転送を複雑化する可能性がある（文献１３）。我々の研究では、我々は、このような転送を簡素化するために、余分でない遺伝子のセットを確認することを狙った。２個の分析、ColoPrintおよびOncotype DXが開始され、それぞれ、１８個および１２個の遺伝子の予後分類器を有する早いステージのＣＲＣ（文献３１、３２）の危険予知を改善させた（文献１７、３３）。ColoPrintは、１個の内部データセットだけの検証に限定され、サインの強さは、予想される試行における評価を待っている（文献３４）。Oncotype DX 19は、ゲノムの広範囲な遺伝子発現アプローチによって確認されなかったが、要求された予後値のために文献から選択された数百の遺伝子の分析後（文献３３、３５）、さらなる検証をも要求した（文献３６）。
【００５３】
この研究でのテストシリーズは、ＣＲＣの患者の連続的な収集物からのサンプルからなる。ステージIIの患者の生存率と十分比較して、ステージIIの患者の１６％が高リスクの患者と確認された（文献２）。検証シリーズIおよびIIの療法において、同様のサイズのサブグループが確認された（それぞれ１３％、１６％）。一般に、ステージIIの患者の予後の階層化を求める他の研究では、高い割合の患者が、３７〜５１％の範囲の悪い予後のグループに分類された（文献１３、１４、１７、１８）。これはおそらく、患者を分類するのに用いられる異なった統計を反映している。再発疾病（３７％の５年ＲＦＳ）を有するステージIIの患者に対して濃縮するために、検証シリーズIがあらかじめ選択された。ここで、サンプルの１３％のみにおける高リスクプロフィールの確認は、この患者のトータルの再発率を正確に表しておらず、全ての３個のサンプルシリーズ（発現値の２０番目と８０番目の百分位数）で患者の階層化のための同じ厳しい基準を用いた結果である。ここで表される遺伝子サインは、３個の患者シリーズにわたって予後情報を、説得力を持って保持している。「Cologuide」−ステージIIは、分類器を構成する遺伝子の中で共変が無いか非常に低いことを統計的手段によって確認され、短い遺伝子リストを臨床試験に転送するときの利益を保証する。
【００５４】
免疫監視およびそれに続く破壊を回避することは、HanahanおよびWeinbergによって癌の新規な特徴として最近示唆された（文献３７）。我々は最近、ＣＲＣの免疫指標が、疾病開始時の年齢と著しく関連することを示した（文献３８）。示された「Cologuide」分類器における遺伝子のいくつかは、ケモカイン、BNIP3, AZGP1およびENPP3のような免疫システムにも関連している。サインにおける別の興味深い遺伝子は、KLK6で、これはKLK3に対する同族体であり、前立腺癌へのバイオマーカーを検出して監視するのに広く用いられる前立腺癌に特異的な抗体（ＰＳＡ）をエンコードする（文献３９）。
【００５５】
＜Ｉ．  診断方法およびスクリーニング方法＞
上述したように、本発明の実施形態は、癌マーカー遺伝子（例えば、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3, BNIP3, PLA2G2A, GZMK, MMP1, AKD1, XRCC4 RAET1L, TTC30A, HAS2, CPE, CXCL9, GBP4, RPS6KA6, ENPP5, RAP1B,DYNLL1またはRPS27L）およびその組み合わせの発現の変化したレベルの検出を利用する、診断、予後およびスクリーニングの方法およびキットを提供する。ある実施形態では、上記方法およびキットは、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、から選ばれる、２個以上、３個以上、５個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、または１３個の癌マーカー遺伝子の、対象における発現の変化したレベルの検出を利用するあるいは検出を可能にする。ある実施形態では、上記方法およびキットは、遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ転写物またはタンパク質または、表１のカラムＡに載っている、１個以上、２個以上、３個以上、５個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、または１３個の癌マーカー遺伝子）の検出のための結腸直腸癌情報提供的試薬を利用する。ある実施形態では、表１のカラムＢに載っている１個以上の癌マーカー遺伝子が、カラムＡの対応する癌マーカー遺伝子の代わりに用いられ、適切な結腸直腸癌情報提供的試薬をこの方法およびキットに利用される。典型的な、限定しない実施形態を以下に述べる。
【００５６】
表１
【００５７】
【表１】
2014533100.tif 000002
【００５８】
遺伝子を含んでいる疑いがある患者のサンプルはどれも、本発明の実施形態の方法に従って試験することができる。限定しない実施例によって、サンプルは、組織（例えば結腸直腸の生検サンプルまたは他の組織サンプル）、血液、大便またはそれらの分画（例えば血漿、血清など）であってよい。
【００５９】
ある実施形態では、患者のサンプルは、偽遺伝子または偽遺伝子を含む細胞のためのサンプルを単離または濃縮するように設計された予備処理に付される。この目的のために、当業者に公知の種々の技術を使用可能であり、限定されないが、遠心分離、免疫捕捉、細胞溶解、および、核酸ターゲット捕捉（例えば、参照によりここにその全体を盛り込む、EP特許No. 1 409 727を参照）を含む。
【００６０】
本発明は結腸直腸癌の予後を検出および提供するのに特異的ないくつかのマーカーを例示しているが、結腸直腸癌の存在または非存在に関連するいずれのマーカーも、単独、または、ここに述べるマーカーと組み合わせて用いることができる。ここで用いられるマーカーは例えば、その産生または変異または非産生が、結腸直腸の新生物またはその予後に特有であるような核酸を含む。所定の分析に用いられるマーカーの特定の組に依存して、統計分析は変わる。例えば、マーカーの特定の組み合わせが結腸直腸癌に高い特異性を有する場合は、陽性の結果の統計の重要性は高い。しかしながら、このような特異性は、感度を犠牲にして達成されることがありうる（例えば、結腸直腸癌が存在するときでも陰性の結果が生じる）。さらに、種々の組み合わせは非常に感度が高い（例えば偽の陰性が少ない）が、特異性が低い。
【００６１】
種々の民族グループまたは性別、種々の地理的分布、種々の疾病ステージ、種々の特異性レベル、または種々の感度レベルに最適な機能を示すマーカーの特定の組み合わせが用いられうる。疾病の進行に対し療法的な養生法の効果に対し特に感度のある特定の組み合わせもまた行える。特異的な療法および／または治療計画の効果を決定するために、療法および／または治療計画の後に、対象を監視することができる。複合フォーマットまたはパネルフォーマットに含めるために、他の癌、疾病、感染、および代謝状態のマーカーも考慮される。
【００６２】
この方法は、ほ乳類の特定のタイプに限定されない。ある実施形態では、ほ乳類はヒトである。ある実施形態では、結腸直腸新生物は前癌状態である。ある実施形態では、結腸直腸新生物は悪性である。ある実施形態では、結腸直腸新生物は癌のステージ（例えばステージI、II、IIIまたはIV）と無関係の結腸直腸癌である。ある実施形態では、結腸直腸癌はステージIIである。
【００６３】
＜Ａ．  ＤＮＡおよびＲＮＡ検出  −  結腸直腸癌情報提供的試薬＞
本発明の癌マーカー遺伝子の発現は、当業者に公知な種々の核酸技術を用いて検出され、これは、限定されないが、核酸シーケンシング、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅を含む。これらの技術は、癌マーカー遺伝子の遺伝子産物を増幅するためにハイブリダイズする、または増幅するのに用いられうる、核酸のプローブおよびプライマーのような結腸直腸情報提供的試薬を利用し、その結果、各癌マーカー遺伝子の発現レベルを決定することができる。
【００６４】
＜１．  シーケンシング＞
核酸シーケンシング技術の説明的で非限定的な例は、限定されないが、チェーンターミネーター(Sanger)シーケンシングおよびダイターミネーターシーケンシングを含む。当業者は、細胞内ではＲＮＡは安定性が低く、実験的にヌクレアーゼ攻撃の傾向がより高いので、ＲＮＡは通常、シーケンシング前にＤＮＡに逆転写されることを認識している。
【００６５】
チェーンターミネーターシーケンシングは、修飾されたヌクレオチド基質を用いるＤＮＡ合成反応の配列特異的停止を用いる。伸長は、テンプレートのＤＮＡの特異的な位置で、当該位置でテンプレートのＤＮＡに対し相補的な、放射性または他のラベルされた、短いオリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始される。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、標準的な４つのデオキシヌクレオチド塩基および低濃度の１種類の連鎖停止ヌクレオチド、最も一般的にはジ−デオキシヌクレオチドを用いて伸長する。この反応は、各塩基が交代してジ−デオキシヌクレオチドとされている４個の個別のチューブにて繰り返される。ＤＮＡポリメラーゼによる連鎖停止ヌクレオチドの導入が限定されている結果、特定のジ−デオキシヌクレオチドが用いられる位置でのみ停止する関連する一連のＤＮＡフラグメントが生じる。各反応チューブに対し、フラグメントは、厚板のポリアクリルアミドゲルまたは粘性ポリマーで満たされたキャピラリーチューブでの電気泳動によって大きさごとに分離される。ゲルの最上部から底までスキャンして、ラベル化プライマー由来の視覚的マークがどのレーンで生成されているかを読むことによって、配列は決定される。
【００６６】
ダイターミネーターシーケンシングは、停止剤を代替的にラベルする。完全なシーケンシングは、ジ−デオキシヌクレオチドの連鎖停止剤のそれぞれを、異なる波長で蛍光を発する個々の蛍光色素でラベルすることによって、単一の反応で実行できる。
【００６７】
本開示の方法での使用には、種々の核酸シーケンシング法が考慮され、例えば、チェーンターミネーター(Sanger)シーケンシング、ダイターミネーターシーケンシングおよび高スループットのシーケンシング法を含む。これらのシーケンシング法は公知であり、例えば、以下を参照されたい：Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1997); Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977); Drmanac, et al., Nat. Biotechnol. 16:54-58 (1998); Kato, Int. J. Clin. Exp. Med. 2:193-202 (2009); Ronaghi et al., Anal. Biochem. 242:84-89 (1996); Margulies et al., Nature 437:376-380 (2005); Ruparel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5932-5937 (2005), and Harris et al., Science 320:106-109 (2008); Levene et al., Science 299:682-686 (2003); Korlach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:1176-1181 (2008); Branton et al., Nat. Biotechnol. 26(10):1146-53 (2008); Eid et al., Science 323:133-138 (2009); これらのそれぞれは、その全体が参照によってここに盛り込まれる。
【００６８】
ある実施形態では、サンプル中のＲＮＡ分子の配列と頻度の分析を提供するために、ディープシーケンシングが利用される。適切なディープシーケンシングは、限定されないが、単一分子リアルタイムシーケンシング(Pacific Biosciences)、合成によるシーケンシング(Illumina, Inc.)、４５４パイロシーケンシング(Roche Diagnostics, Inc.)、SOLiDシーケンシング(Life Technologies, Inc.)およびイオン半導体シーケンシング(Life Technologies, Inc.)のような、次世代シーケンシング技術を含む。
【００６９】
＜２．  ハイブリダイゼーション＞
核酸のハイブリダイゼーション技術の説明のための非限定的な例は、限定されないが、in situハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイ、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、およびサザンブロット法またはノーザンブロット法を含む。
【００７０】
in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、ラベルされた相補的なＤＮＡまたはＲＮＡのストランドをプローブとして用い、組織の一部または部位で(in situ)、または、組織が十分小さければ、組織全体（ホールマウントＩＳＨ）で、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡの配列を局在化させるタイプのハイブリダイゼーションである。ＤＮＡのＩＳＨは、染色体の構造を決定するのに用いることができる。ＲＮＡのＩＳＨは、組織の部位またはホールマウント内にｍＲＮＡとその他の転写物（例えば偽遺伝子）を測定して局在化させるのに用いられる。サンプルの細胞および組織は通常、定位置にてターゲットの転写物を固定してプローブのアクセスを増加させるために処理される。プローブは、温度を上昇させるとターゲット配列へとハイブリダイズし、その後、過剰のプローブは洗い流される。放射線、蛍光または抗体でラベルされた塩基でラベルされたプローブは、それぞれ、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法または免疫組織化学を用いて、組織内で局在化し、定量される。ＩＳＨは、放射性でラベルされたまたは他の非放射ラベルされた２個以上のプローブを用いて、２個以上の転写物を同時に検出することもできる。
【００７１】
ある実施形態では、遺伝子発現は、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて検出される。ある実施形態では、ＦＩＳＨ分析は、細菌の人工染色体（ＢＡＣｓ）を用いる。これらは、ヒトゲノムシーケンシングプロジェクトで広く用いられ（Nature 409: 953-958 (2001)参照）、特異的なＢＡＣｓを含んだクローンは、多くの供給元（例えばＮＣＢＩ）を介して捜し出され得る分配者を介して利用可能である。ヒトゲノムからの各ＢＡＣクローンは、明確にそれを確認する基準名を与えられている。これらの名前は、対応するGenBank配列を見いだして分配者からクローンのコピーを注文するのに用いることができる。
【００７２】
本発明は、さらに、ヒト結腸直腸細胞、ヒト結腸直腸組織またはヒト結腸直腸の細胞または組織の周りの液体に対し、ＦＩＳＨ分析を行う方法を提供する。特定のプロトコルはこの分野で公知であり、本発明に容易に適用できる。方法論に関するガイダンスは、以下のものを含む多くの参考文献から得ることができる：in situハイブリダイゼーション：Medical Applications (eds. G. R. Coulton and J. de Belleroche), Kluwer Academic Publishers, Boston (1992); in situハイブリダイゼーション：In Neurobiology; Advances in Methodology (eds. J. H. Eberwine, K. L. Valentino, and J. D. Barchas), Oxford University Press Inc., England (1994); in situハイブリダイゼーション：A Practical Approach (ed. D. G. Wilkinson), Oxford University Press Inc., England (1992)); Kuo, et al., Am. J. Hum. Genet. 49:112-119 (1991); Klinger, et al., Am. J. Hum. Genet. 51:55-65 (1992); and Ward, et al., Am. J. Hum. Genet. 52:854-865 (1993))。商業的に利用可能で、ＦＩＳＨ分析を行うプロトコルを提供するキットもある（例えばOncor, Inc., Gaithersburg, MDから利用可能である）。方法論のガイダンスを提供する特許は、米国5,225,326; 5,545,524; 6,121,489および6,573,043を含む。これらの参考文献の全ては、その全体が参照によってここに盛り込まれ、この分野の類似の参考文献とともにおよびここでの実施例セクションで提供される情報とともに用いることができ、特定の研究室のために便利な手続上のステップを確立する。
【００７３】
ある実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いる。ヌクレアーゼプロテクションアッセイは、低いトータル濃度でも、公知の配列の１個以上のＲＮＡ分子を確認するのに有用である。抽出されたＲＮＡは、まず、所定の配列に相補的なアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡと混合され、相補的なストランドは、ハイブリダイズされて、二本鎖ＲＮＡ（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）を形成する。それから、混合物は、一本鎖ＲＮＡのみを特異的に切断し、二本鎖ＲＮＡには反応性を持たないリボヌクレアーゼに曝露される。反応が完了すると、感受性の強いＲＮＡ領域は、非常に短いオリゴマーまたは個々のヌクレオチドに分解し、また、生存したＲＮＡフラグメントは、追加されたアンチセンスストランドに対し相補的で、それゆえ所定の配列を含んだものである。適切なヌクレアーゼプロテクションアッセイは、限定されないが、米国5,770,370; EP 2290101A3; 米国20080076121; 米国20110104693に記載のものを含み、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる。ある実施形態では、本発明は、HTG Molecular Diagnostics, Inc. (Tuscon, AZ)によって提供される定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いる。
【００７４】
＜３．  マイクロアレイ＞
異なった種類の生物学的分析は、限定されないが、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化学化合物マイクロアレイ、および、抗体マイクロアレイを含むマイクロアレイと呼ばれる。ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子チップ、ＤＮＡチップまたはバイオチップとして普通に知られ、固体表面に結合されて、数千の遺伝子に対して同時に発現プロフィールまたは発現レベルの監視の目的のためのアレイを形成する微視的なＤＮＡスポットの収集物である。接着されたＤＮＡフラグメントは、プローブとして知られ、これら数千のものが、一本鎖ＤＮＡマイクロアレイに用いることができる。マイクロアレイは、疾病の細胞と正常な細胞との遺伝子発現を比較することによって、疾病の遺伝子または転写物（例えばここに記載の遺伝子）を確認するのに用いることができる。マイクロアレイは、種々の技術を用いて製造でき、これらの技術は、限定されないが、微細な尖ったピンを用いたガラススライド上へのプリンティング、あらかじめ作られたマスクを用いたフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラーを用いたフォトリソグラフィー、インクジェットプリンティング、または、マイクロ電極アレイ上の電気化学を含む。
【００７５】
サザンブロット法およびノーザンブロット法は、それぞれ、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡのシーケンスを検出するのに用いられる。サンプルから抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、フラグメント化され、マトリックスゲル上で電気泳動によって分離され、メンブランフィルターに転写される。フィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡは、所定の配列に相補的なラベルされたプローブとともにハイブリダイゼーションに付される。フィルターに結合したハイブリダイズされたプローブが検出される。処理の変形例は、逆ノーザンブロット法であり、そこでは、膜に接着された基質の核酸が、単離されたＤＮＡフラグメントの集積物であり、プローブが、組織から抽出されてラベルされたＲＮＡである。
【００７６】
＜３．  増幅＞
核酸（例えば癌マーカー遺伝子）は、検出の前または同時に増幅してもよい。核酸増幅技術の説明のための実施例は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。当業者は、ある増幅技術（例えばＰＣＲ）では、増幅前にＲＮＡがＤＮＡに逆転写される（例えばＲＴ−ＰＣＲ）必要がある一方、他の増幅技術ではＲＮＡを直接増幅する（例えばＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識している。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許4,683,195, 4,683,202, 4,800,159および4,965,188、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる）は、通常、ＰＣＲと呼ばれ、変性、逆ストランドに対するプライマーペアのアニーリング、およびプライマーの伸長という多重サイクルを用い、ターゲットの核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形例では、ｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作るために逆転写が用いられ、次いで、ｃＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅され、ＤＮＡの多数のコピーを生成する。ＰＣＲの他の種々の置換としては、例えば、米国特許4,683,195, 4,683,202および4,800,159や、Mullis et al., Meth. Enzymol. 155: 335 (1987)およびMurakawa et al., DNA 7: 287 (1988)を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる。
【００７８】
転写媒介増幅（米国特許5,480,784および5,399,491、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる）は、通常、ＴＭＡと呼ばれ、実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件で自己触媒的にターゲットの核酸配列の多数のコピーを合成し、ターゲット配列のＲＮＡの多数のコピーが、自己触媒的にさらなるコピーを生成する。例えば、米国特許5,399,491および5,824,518を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる。米国公開20060046265（その全体が参照によってここに盛り込まれる）に記載の変形例においては、ＴＭＡは、随意的に、遮断部分、終結部分、および他の修飾部分の使用を盛り込み、ＴＭＡ処理の感度と正確さを改善する。
【００７９】
リガーゼ連鎖反応（Weiss, R., Science 254: 1292 (1991)、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる）は、通常、ＬＣＲと呼ばれ、ターゲットの核酸配列の隣接領域に対してハイブリダイズする相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドの２組を用いる。ＤＮＡヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーションおよび連結反応の反復サイクルにおいてＤＮＡリガーゼによって共有結合でリンクされ、検出可能な二本鎖の連結されたオリゴヌクレオチド産物を生成する。
【００８０】
ストランド置換増幅（Walker, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992); 米国特許5,270,184および5,455,166、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる）は、通常、ＳＤＡと呼ばれ、ターゲットの配列の逆ストランドに対するプライマー配列のペアのアニーリング、ｄＮＴＰαＳの存在下でプライマーの伸長による二重のヘミホスホロチオエートのプライマーの伸長産物の生成、半修飾された制限エンドヌクレアーゼの認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介のニック付け、および、ポリメラーゼ媒介のニックの３’末端からのプライマーの伸長による存在ストランドの置換および次のラウンドのプライマーアニーリング、ニック付けおよびストランド置換に対するストランドの生成、およびそれによる産物の幾何学的増幅、のサイクルを用いる。熱ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、本質的に同じ方法において、より高温で、好熱性のエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを用いる（欧州特許0 684 315）。
【００８１】
他の増幅方法は、例えば、核酸配列ベースの増幅（米国特許5,130,238、これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる）であって、通常、ＮＡＳＢＡと呼ばれるもの、ＲＮＡレプリカーゼを用いてプローブ分子自体を増幅するもの（Lizardi et al., BioTechnol. 6: 1197 (1988)、これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる）であって、通常、Ｑβレプリカーゼと呼ばれるもの、転写ベースの増幅法（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)）、および、自立配列複製（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる）を含む。公知の増幅方法のさらなる議論については、Diagnostic Medical Microbiologyの、Persing, David H., “In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques”: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))を参照されたい。
【００８２】
＜４．  検出方法＞
増幅されないまたは増幅された核酸は、任意の公知の手段で検出することができる。例えば、ここに記載の癌マーカー遺伝子は、検出可能にラベルされたプローブでハイブリダイズし、得られたハイブリッドの測定によって検出することができる。検出方法の説明のための非限定的な実施例を以下に述べる。
【００８３】
一つの説明のための検出方法は、リアルタイムで、増幅処理の定量的評価を提供する。「リアルタイム」での増幅処理の評価は、増幅反応中に連続的または周期的に反応混合物中でアンプリコンの量を決定することと、決定された値を用いて、サンプル中に初めに存在するターゲット配列の量を計算することとを含む。リアルタイムの増幅に基づいて、サンプル中に存在する初めのターゲット配列の量を決定する、種々の方法がこの分野でよく知られている。これらは、米国特許6,303,305および6,541,205に記載の方法を含み、これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる。サンプル中に初めに存在するターゲット配列の量を決定するが、リアルタイムの増幅によらない他の方法は、米国特許5,710,029に記載され、これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる。
【００８４】
増幅産物は、種々の自己ハイブリダイゼーションプローブを用いてリアルタイムで検出され、そのほとんどは、ステムループ構造を有する。このような自己ハイブリダイゼーションプローブは、プローブが自己ハイブリダイゼーション状態にあるか、ターゲット配列に対するハイブリダイゼーションによって変化した状態にあるかに依存して、異なって検出可能なシグナルを放出する。非限定的な例によって、「分子トーチ」は、結合領域（例えば非ヌクレオチドリンカー）によって接続されて、所定のハイブリダイゼーション分析条件の下で互いに対してハイブリダイズする、自己相補性の明確な領域（「ターゲット結合ドメイン」および「ターゲット閉鎖ドメイン」と称する）を含む。好ましい実施形態では、分子トーチは、１ないし２０塩基の長さのターゲット結合ドメインにおける一本鎖塩基領域を含み、ストランド置換条件下で増幅反応において存在するターゲット配列に対するハイブリダイゼーションに対して利用しやすい。ターゲット結合ドメインに存在する一本鎖領域に結合し、ターゲット閉鎖ドメインの全部または一部を置換するターゲット配列の存在下を除いて、ストランド置換条件下では、分子トーチの完全または部分的に相補的な２つの相補的な領域のハイブリダイゼーションが好ましい。分子トーチのターゲット結合ドメインおよびターゲット閉鎖ドメインは、分子トーチが自己ハイブリダイズされたときには、分子トーチがターゲット配列にハイブリダイズされたときとは異なったシグナルが生成されて、それによって、非ハイブリダイゼーション分子トーチの存在下でテストサンプルにて二重のプローブターゲットの検出ができるように位置する、検出可能な、相互作用するラベルまたはラベルのペア（例えば発光性／消光剤）を含んでいる。分子トーチおよび種々のタイプの相互作用ラベルペアは、米国特許6,534,274に記載され、これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる。
【００８５】
ある実施形態では、癌マーカー遺伝子の検出および発現の定量のために、TaqMan（商標）検出システムが用いられる。TaqManプローブシステムは、Taqポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、相補的なターゲット配列へのハイブリダイゼーション中、および蛍光物質ベースの検出中に、二重にラベルされたプローブを切断する。他のリアルタイムＰＣＲ法のように、得られる蛍光シグナルは、ＰＣＲの指数関数的段階中、生成物の蓄積の定量的な測定が可能である、しかしながら、TaqManプローブは、検出の特異性を著しく増加させる。TaqManプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５'末端に共有結合で結合された蛍光物質と、３'末端の消光剤とからなる。いくつかの異なる蛍光物質（例えば、６−カルボキシフルオレセイン、頭字語FAM、またはテトラクロロフルオレセイン、頭字語TET）および消光剤（例えばテトラメチルローダミン、頭字語TAMRA、または、ジヒドロシクロピローロインドールトリペプチドのマイナーグルーブバインダー、頭字語MGB）が利用可能である。消光剤分子は、FRETを介して循環体の光源によって刺激されると、蛍光物質によって放出された蛍光を消光する。蛍光物質と消光剤とが近接している限り、消光によっていずれの蛍光シグナルも抑制される。TaqManプローブは、それが、特定のプライマーの組によって増幅されるＤＮＡ領域内でアニーリングするように設計されている。Taqポリメラーゼは、プライマーを伸長させ、初期ストランドを生成（再び、一本鎖テンプレート上ではあるが、ダイアグラムに示したのとは反対の向きに、すなわち、相補的なストランドの３’から５'へと）すると、ポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性が、テンプレートにアニーリングしたプローブを分解させる。プローブの分解によって、そこから蛍光物質が解放され、消光剤への近接が停止し、これによって、消光効果を軽減し、蛍光物質の蛍光を可能にする。したがって、リアルタイムＰＣＲ熱循環体で検出された蛍光は、開放された蛍光物質およびＰＣＲにおけるＤＮＡテンプレートの量に直接比例する。
【００８６】
自己相補性を有する検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、ターゲットの相補的配列を有する核酸分子、増幅反応に存在するターゲット配列が無いときに閉鎖構造にてプローブを保持する親和性ペア（または核酸アーム）、および、ペアが閉鎖構造にあるときに相互作用するラベルペア、を含む。ターゲット配列とターゲット相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、親和性ペアのメンバーが分離され、それゆえ、プローブが開放構造にシフトする。開放構造へのシフトは、ラベルペアの相互作用の減少により検出でき、これは例えば、蛍光物質および消光剤（例えばDABCYL およびEDANS）とすることができる。分子ビーコンは、米国特許5,925,517および6,150,097に記載され、これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる。
【００８７】
他の自己ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に公知である。非限定的な例によって、米国特許5,928,862（これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる）に記載のような、相互作用ラベルを有するプローブ結合ペアが、本発明の使用に適合する。一塩基多型(SNPs)を検出するのに用いられるプローブシステムも、本発明に用いることができる。さらなる検出システムは、米国公開20050042638に記載のような「分子スイッチ」を含み、これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる。挿入色素および／または蛍光色素を含むもののような、他のプローブも、本発明の増幅産物の検出に有用である。例えば米国特許5,814,447（これは、その全体が参照によってここに盛り込まれる）を参照されたい。
【００８８】
他の説明のための検出方法、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ(HPA)は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えばアクリジニウムエステルラベル(AE)プローブ）をターゲット配列にハイブリダイズすること、非ハイブリダイゼーションプローブに存在する化学発光ラベルを選択的にハイブリダイズすること、および、残っているプローブから生成される化学発光を照度計で測定することを要する。例えば米国特許5,283,174およびNorman C. Nelson et al., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17（Larry J. Kricka ed., 2d ed. 1995, これらはそれぞれ、その全体が参照によってここに盛り込まれる）を参照されたい。
【００８９】
＜Ｂ．  タンパク質の検出  −  結腸直腸癌情報提供的試薬＞
ここに記載の癌マーカー遺伝子は、当業者に公知の種々のタンパク質技術を用いてタンパク質として検出することができ、限定されないが、タンパク質シーケンシングおよびイムノアッセイを含む。
【００９０】
＜１．  シーケンシング＞
タンパク質シーケンシング技術の説明のための非限定的な例は、限定されないが、質量分析およびEdman分解を含む。
【００９１】
質量分析は、原理的には任意のサイズのタンパク質をシーケンシングすることができるが、サイズが増加するにつれて、コンピュータ処理が困難になる。タンパク質はエンドプロテアーゼによって消化され、得られた溶液は高速液体クロマトグラフィーカラムを通される。このカラムの端部では、溶液は、高い正電位に荷電された狭いノズルから外の質量分析計に噴射される。小滴の電荷によって小滴がフラグメント化し、単一のイオンのみが残る。その後、ペプチドはフラグメント化し、フラグメントの質量と電荷の比が測定される。質量分析は、コンピュータで分析され、しばしば、あらかじめシーケンシングされたタンパク質のデータベースと比較され、フラグメントのシーケンスが決定される。異なる消化酵素を用いてこの処理が繰り返され、シーケンス間の重なりが、タンパク質のシーケンスを組み立てるのに用いられる。
【００９２】
Edman分解反応では、シーケンシングすべきペプチドが固体表面（例えばポリブレンでコーティングされたガラスファイバー）上に吸着される。Edman試薬である、フェニルイソチオシアネート(PTC)が、１２％トリメチルアミンの穏やかな塩基バッファ溶液とともに、吸着されたペプチドに加えられ、Ｎ末端のアミノ酸のアミノ基と反応する。末端のアミノ酸誘導体は、その後、無水酸の添加により選択的に切り離されることができる。誘導体は、異性化して、置換フェニルチオヒダントインを生成し、これは、洗浄されて、クロマトグラフィーによって確認することができ、このサイクルを繰り返すことができる。各ステップの効率は、約９８％であり、これにより、約５０個のアミノ酸を高信頼度で決定することができる。
【００９３】
＜２．  イムノアッセイ＞
イムノアッセイの説明のための非限定的な例は、限定されないが、免疫沈降、ウエスタンブロット、ELISA、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリーおよび免疫ＰＣＲを含む。当業者に公知の種々の技術を用いて検出可能にラベルされたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（例えば比色分析、蛍光、化学発光または放射性）が、イムノアッセイでの使用に好適である。
【００９４】
免疫沈降は、抗原に特異的な抗体を用いて溶液から抗体を沈降させる技術である。この処理は、複合体中にあると思われるタンパク質をターゲットにすることによって、細胞抽出物中に存在するタンパク質複合体を確認するのに用いることができる。複合体は、初めに細菌から単離された、タンパク質Ａやタンパク質Ｇなどのような、不溶性の抗体結合タンパク質によって溶液から取り出される。抗体も、溶液から容易に単離できるセファロースビーズと結合することができる。洗浄後、沈殿物は、質量分析、ウエスタンブロットまたは複合体中の成分を確認するための任意の数の他の方法を用いて分析することができる。
【００９５】
ウエスタンブロットすなわち免疫ブロットは、組織ホモジェネートまたは抽出物の所定のサンプルにおいてタンパク質を検出する方法である。これは、ゲル電気泳動を用いて、変性したタンパク質を質量によって分離する。その後、タンパク質は、ゲルから膜、典型的にはポリビニルジフルロリドまたはニトロセルロース、の上へ転写され、タンパク質は、所定のタンパク質に特異的な抗体を用いて検査される。結果として、研究者は、所定のサンプル中のタンパク質の量を検査して、いくつかのグループ間でレベルを比較することができる。
【００９６】
ELISA、酵素結合免疫吸着法は、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出する生物学的技術である。これは、最小２個の抗体を用い、そのうちの１個は抗原に特異的であり、他方は酵素に結合している。２番目の抗体によって、色を生成するまたは蛍光を生成する基質が、シグナルを生成する。ELISAの変形例は、サンドイッチELISA、競合ELISAおよびELISPOTを含む。ELISAは、サンプル中の抗体または抗原の存在を評価するのに用いられるので、血清抗体濃度の決定にも、抗原の存在の検出にも、有用なツールである。
【００９７】
免疫組織化学および免疫細胞化学は、各抗体に結合する組織または細胞中の抗原の原理から、それぞれ、組織部位または細胞中にタンパク質を局在化させる処理を指す。視覚化は、色を生成する抗体をタグとすることによって、または蛍光タグによって実現される。色タグの典型的な例は、限定されないが、西洋わさびのペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。蛍光タグの典型的な例は、限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリトリンを含む。
【００９８】
フローサイトメトリーは、液体の流れの中に懸濁された微細粒子をカウント、検査、および分類する技術である。これは、光学的／電子的検出器を通る単一細胞という物理的および／または化学的特徴の同時のマルチパラメトリック分析を可能にする。単一波長または単一色の光ビーム（例えばレーザー）は、流体力学的に集中した液体流上のほうを向く。多くの検出器が、流れが光ビームを流れる点に向けられ、一つは、光ビームの線に沿っており（前方散乱すなわちFSC）、またいくつかは、それと垂直である（側方散乱(SSC)および１個以上の蛍光検出器）。ビームを通る各懸濁粒子は、なんらかの方法で光を散乱させ、粒子の蛍光成分は、光源よりも低い周波数で光を出射するよう刺激されてもよい。散乱光と蛍光との組み合わせが検出器によって採集され、また、各検出器で、一つには、各蛍光出射ピークに対して、輝度の変動を分析することによって、各個々の粒子の物理的および化学的な構造についての種々の事実を推測することができる。FSCは、細胞の体積と相関し、SSCは、粒子の密度または内部の複雑さ（例えば、核の形状、細胞質の小粒の量およびタイプ、または膜の荒さ）と相関する。
【００９９】
免疫ポリメラーゼ連鎖反応(IPCR)は、抗体ベースのイムノアッセイでのシグナル生成を増加させる核酸増幅技術を用いる。タンパク質のＰＣＲ等価物はないので、すなわち、タンパク質は、核酸がPCRで複製されるとの同じ方法では複製できないので、検出感度を増加させる唯一の方法は、シグナル増幅によるものである。ターゲットタンパク質は、オリゴヌクレオチドに直接または間接に接合している抗体と結合する。結合していない抗体は、洗い流され、残った、結合した抗体は、そのオリゴヌクレオチドが増幅される。タンパク質の検出は、リアルタイム法を含めて、標準的な核酸検出方法を用いて、増幅されたオリゴヌクレオチドの検出によって行われる。
【０１００】
＜ＩＩ．  データ分析＞
ある実施形態では、検出分析によって生成した生データ（例えば所定のマーカーの発現レベル）を、臨床医のための予測値のデータに変えるのに、コンピュータベースの分析プログラムが用いられる。臨床医は、任意の好適な手段を用いて予測データにアクセスできる。それゆえ、ある好適な実施形態では、本発明は、遺伝学や分子生物学の訓練を受けていないと思われる臨床医が、生データを理解する必要がないというさらなる利益を提供する。データは、最も有用な形で、臨床医に直接提示される。そして、臨床医は、対象の治療を最適化するために、情報をすぐに利用することができる。
【０１０１】
本発明は、分析を行う研究所、情報提供者、医療関係者および対象から、およびそれらへ、情報を受けて処理して送信できる任意の方法を考慮する。例えば、本発明のある実施形態では、サンプル（生検、血清および大便サンプル）は、対象から得られ、世界の任意の場所に（例えば対象の居住する国とは異なる国で、または、最終的にその情報が使われる所に）位置するプロフィールサービス（例えば医療施設、ゲノムプロフィールビジネスなどの臨床研究所）に送られ、生データを生成する。サンプルが、組織または他の生物学的サンプルを含む場合、対象は、医療センターを訪れ、病院側でサンプルを採取してもらい、病院側にプロフィールセンターへ送ってもらうか、または、対象は、自分でサンプルを集め（例えば尿サンプル）、それをプロフィールセンターへ直接送る。サンプルが、あらかじめ決定された生物学的情報を含む場合、その情報は、対象によって、プロフィールセンターへ直接送られる（例えば、その情報を含む情報カードは、コンピュータによってスキャンされ、データは、電子伝達システムを用いて、プロフィールセンターのコンピュータへ送信される）。サンプルは、一旦プロフィールセンターで受け取られると、処理されて、対象にとって望まれる診断または予後の情報についての具体的なプロフィールが生成される（例えば発現データ）。
【０１０２】
その後、プロフィールデータは、治療を行う臨床医による解釈に適したフォーマットに調整される。例えば、発現の生データを提供するよりもむしろ、調整されたフォーマットは、特定の治療オプションのアドバイスとともに、対象の診断または危険評価（例えば疾病のない生存や、転移の予後）を表すことができる。データは、任意の適切な方法によって、臨床医に提示される。例えば、ある実施形態では、プロフィールサービスは、臨床医のために印刷可能なレポート（例えば治療のポイント）または、コンピュータのモニターにて臨床医に提示可能なレポートを生成する。
【０１０３】
ある実施形態では、情報はまず、治療を行う所で、または、地域の施設で、分析される。そして、生データは、さらなる分析のための、および／または、生データを臨床医または患者に有用な情報に変換するための、中央処理施設へ送られる。中央処理施設は、プライバシー（全てのデータは、均一な安全プロトコルで中央施設に格納される）、速さおよびデータ分析の均一性の点で有利である。そして、中央処理施設は、対象の治療に付随するデータの成り行きを制御することができる。例えば、中央処理施設は、電子伝達システムを用いて、データを、臨床医、対象または研究者に提供することができる。
【０１０４】
ある実施形態では、対象は、電子伝達システムを用いて、データに直接アクセスできる。対象は、結果に基づいて、さらなる介入またはカウンセリングを選ぶことができる。ある実施形態では、データは、研究に用いられる。例えば、データは、疾病の特定の状態やステージを示す有用なものとしての、または、治療計画を決定するための予後の手引きとしての、マーカーの盛り込みまたは消去をさらに最適化するのに用いることができる。
【０１０５】
＜ＩＩＩ．  構成およびキット＞
ここに記載の診断方法に用いられる構成は、限定されないが、上述の１個以上の結腸直腸癌情報提供的試薬を含むキットを含む。ある実施形態では、キットは、(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L) のうちの１つ、(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)のうちの１つ、および、(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、からなるグループから選ばれる１個以上、２個以上、５個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、または１３個の結腸直腸癌であるまたはその疑いがある患者からのサンプルにおいて変化した遺伝子発現を検出するための１個以上の結腸直腸癌情報提供的試薬を含む。ある実施形態では、キットは、検出試薬およびバッファに加え、癌遺伝子マーカーに特異的な結腸直腸癌情報提供的試薬を含む。
【０１０６】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌情報提供的試薬は、１個以上の遺伝子の各遺伝子産物に対して特異的にハイブリダイズするプローブ、１個以上の遺伝子の各遺伝子産物を増幅するプライマーの組、１個以上の遺伝子の各遺伝子産物に結合する抗原結合タンパク質、または、１個以上の遺伝子の各遺伝子産物に対してハイブリダイズし、各遺伝子産物のシーケンシングを可能にする、シーケンシングプライマーである。本発明のプローブおよび抗体の構成は、アレイの形で提供することもできる。好ましい実施形態では、キットは、全ての対照、分析を行うための使用説明書、および、分析と結果の表示のための必要なソフトウェアを含めた、検出分析を行うのに必要な構成成分の全てを含む。
【０１０７】
ある実施形態では、キットは、対象からのサンプルにおいて癌の検出と特徴付けとのためにキットに含まれる試薬の使用の指示書を含む。ある実施形態では、指示書は、さらに、in vitroの診断製品のラベルをするときに、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に要求される使用目的の記述を含む。ＦＤＡは、in vitroの診断製品を医療機器として分類し、それが５１０（ｋ）の手順で承認されることを要求している。５１０（ｋ）に必要な情報は、（１）商標または商品名、一般または通常の名前を含む、in vitroの診断製品の名前、および、機器の分類名、（２）製品の使用目的、（３）もし当てはまる場合は所有者または５１０（ｋ）開陳者の官庁登録番号、in vitroの診断製品がＦＤ＆Ｃの法令のセクション５１３下で位置する分類、もしわかれば適切なパネル、または、もし所有者または操作者が、機器がこのセクション下で分類されないことを決定する場合は、in vitroの診断製品がそのように分類されないことの決定および決定の根拠の陳述、（４）in vitroの診断製品を記載するのに十分な、提案されたラベル、および広告、使用目的、および使用方法、なお、もし当てはまる場合は写真や製品図面も供給すべきである、（５）機器が、米国での商業的流通で同等のタイプの他のin vitroの診断製品と類似しているか異なっているかを示す陳述、および、その陳述を支持するデータ、（６）実質的な同等物の決定の根拠となる、安全性と効果のデータの５１０（ｋ）の要約、または、実質的な同等物を見いだすＦＤＡを支持する５１０（ｋ）の安全性と効果の情報が、書面での申請の３０日以内に任意の人間に利用可能であることの陳述、（７）提出者が、自分の可能な限りの知識の範囲内で、上市前届出に提出されたデータと情報とが、正確であり、重要な事実を省いていないと信じることの陳述、（８）ＦＤＡが実質的な同等性の決定を行うのに必要な、in vitroの診断製品に関する追加情報を含む。追加情報は、米国のＦＤＡのインターネットウェブページで利用可能である。
【０１０８】
＜ＩＩＩ．  使用方法＞
ここに記載のように、本発明は、対象の結腸直腸癌の予後を決定し、対象の結腸直腸癌を診断し、対象の結腸直腸癌への素因を予測し、対象の結腸直腸癌の再発の可能性を予測し、または、特定の治療法を有する治療に対する疾病を有する対象を選択する、結腸直腸癌情報提供的試薬および方法を提供する。結腸直腸癌は、ステージI, II, IIIまたはIVの結腸直腸癌とすることができる。ある好ましい実施形態では、本発明の実施形態は、結腸直腸癌（例えばステージIIの結腸直腸癌）と診断された患者に予後を提供する構成および方法を提供する。例えば、ある実施形態では、PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1B, SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, CXCL10, ENPP3およびBNIP3のうちの１個以上の、対照サンプル（例えば、癌でない結腸直腸組織またはステージIまたはIVの結腸直腸癌）と比べて変化した発現が、悪い予後に関連する。特に、ある実施形態では、遺伝子の、対照サンプルの発現の基準レベルと比べて(PIGRまたはPLA2G2A)のうちの１つ、(CXCL13またはGZMK)のうちの１つ、(MMP3またはMMP1)のうちの１つ、(TUBA1B, RAP1B, DYNLL1,またはRPS27L)、および(CXCL10, CXCL9またはGBP4)のうちの１つ、のうちの１個以上の発現の減少したレベル、および／または、対照サンプルの発現の基準レベルと比べて(SESN1またはAKD1)のうちの１つ、(AZGP1またはXRCC4)のうちの１つ、(KLK6またはRAET1L) のうちの１つ、(EPHA7またはTTC30A)のうちの１つ、(SEMA3AまたはHAS2)のうちの１つ、(DSC3またはCPE)のうちの１つ、(ENPP3またはRPS6KA6)、および(BNIP3またはENPP5)のうちの１つ、のうちの１個以上の発現の増加したレベル、が、悪い予後に関連する（例えば、減少した生存または増加した転移の危険）。ある実施形態では、基準レベルは、ステージIまたはIVの結腸直腸癌と診断された対象からのものである。ある実施形態では、基準レベルは、結腸直腸癌と診断されていない対象からのものである。ある実施形態では、基準レベルと比べて、発現レベルが、悪い予後を示す。ある実施形態では、悪い予後は、生存の減少した機会である。ある実施形態では、悪い予後は、結腸直腸癌の、再発または転移の増加した機会である。ある実施形態では、予後は、５年間再発無しの生存の可能性である。
【０１０９】
ある実施形態では、予後情報は、対象の治療計画を決定するのに用いられる。例えば、ある実施形態では、悪い予後を有することがわかった対象には、アジュバント化学療法を行うことができ、良い予後を有することがわかった対象は、外科手術のみで治療することができる。さらなる実施形態では、本発明の分析は、結腸直腸癌の治療薬の臨床試験中に用いられる。上述の遺伝子産物の分析は、治療薬での治療が全体の患者人口よりも多かれ少なかれ効果的であるような特別な患者人口を規定するということが考慮される。したがって、本発明のある実施形態では、対象が、本発明の分析を用いてスクリーニングされ、上述のような遺伝子発現の特定のプロフィールを有する患者が、特定の治療薬または治療計画での治療に選ばれるような方法が提供される。
【０１１０】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態と様子とをさらに示して説明するために提供され、本発明の範囲を制限するものとは解釈されない。
【０１１１】
〔実施例１〕
〔材料および方法〕
〔患者および腫瘍サンプル〕
３個の独立した患者シリーズからの全部で３１５個のＣＲＣが、テストシリーズおよび２個の検証シリーズ(IおよびII)を含むグローバル遺伝子発現で分析された。
【０１１２】
テストシリーズは、オスロ大学病院、Aker, ノルウェーで２００５年と２００８年との間に連続的に集められた同じ数の患者からの、１１２個の新鮮な冷凍の第１のＣＲＣサンプル（ステージI−IV）から成っていた。生存者に対する中央値のフォローアップタイムは４７ヶ月（３２〜６１ヶ月）であった。ノルウェーのガイドラインに沿ってアジュバント化学療法が行われ、術前の放射線治療を受けていた患者はいなかった。シリーズは、４４個のステージIIおよび３３個のステージIIIの患者を含んでいた。全員が治療的切除を受け、腸の穿孔の報告はなかった。検証シリーズIは、１９８７年〜１９８９年の期間にオスロ地域の病院から集められた５２個のステージIIおよび４３個のステージIIIのＣＲＣサンプルから成っていた。アジュバント化学療法は、１９９７年にノルウェーで７５年間ステージIIIの患者の標準的治療として導入されたものであるが、このアジュバント化学療法を受けていた患者はいなかった。中央値のフォローアップタイムは７１ヶ月（４〜１２０ヶ月）であった。両方のシリーズに対し、International Union Against Cancer (UICC)/American Joint Committee on Cancer (AJCC)からのガイダンスに沿って腫瘍ステージが決定された。両方のシリーズについてMSI状態があらかじめ報告されている（文献２０、２１）。２個の社内のサンプルシリーズの詳細な記述を表４にまとめた。
【０１１３】
生データは、マイクロアレイデータのためのGene Expression Omnibus (GEO) public repositoryに預けられた（アクセス番号GSE24550, GSE29638およびGSE30378）。本研究に含まれる全てのサンプルのアクセス番号を表５に挙げている。
【０１１４】
〔外部検証シリーズ〕
検証シリーズIIは、ＧＥＯ（GSE14333およびGSE17538）からアクセスされる、１０８個のステージIIのＣＲＣサンプルからの遺伝子発現データから成っていた。臨床サンプルは、米国およびオーストラリアからのもので、ＧＥＯエントリーに従ったものであり、化学治療や放射線治療を受けていた患者はいなかった。利用可能な臨床病理学的データを表４にまとめた。プローブ細胞強度（ＣＥＬ）ファイルの相関分析によって、我々は、２個のデータセットにおいて、Moffit Cancer Centreからの、重複するサンプルを見出した。重複しないサンプル(n=108)を結合させて、多くのステージIIの腫瘍を有する検証シリーズを得た（文献１３、１４、１８）。本研究に含まれるサンプルを表５に挙げた。
【０１１５】
〔サンプル調製および遺伝子発現分析〕
各腫瘍から組織を取り出し、液体窒素で迅速に凍らせ、処理まで−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡ単離の前に、各サンプルから組織部分を取り出し、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色し、腫瘍細胞の中身を病理学者が評価した。製造者による推奨通りにDNA/RNA Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)を用いてＲＮＡを単離した。ＵＶ分光学(NanoDrop ND-100, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)およびAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を用いて量と質を測定した。
【０１１６】
遺伝子発現測定には、５百万個を越える形態と約１．４百万個のプローブの組とを有するGeneChip(R) Human Exon 1.0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)を用いた。リボソームＲＮＡ削減反応への入力として、全部で１μｇのＲＮＡが用いられ(RiboMinus(TM) Human/Mouse Transcriptome Isolation kit, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)、その後、GeneChip(R) Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix)に従ってｃＤＮＡ合成、増幅、およびＤＮＡセンスストランドラベリングを行った。マニュアルの推奨通りに、各１１個のサンプルを、１６ないし１８時間ハイブリダイズし、洗浄し、染色し、スキャンした。各サンプルに対し、Affymetrix GeneChip(R) Command Console software (version 1.0)によって、強度の度合いを格納するＣＥＬファイルを生成させた。ffymetrix(R) Expression Console software (HuEx-1_0-st-v2.r2 gene-core library file)を用いて、Robust Multichip Analysis (RMA)によって、これらのファイルを、遺伝子レベルで、バックグラウンド補正、変位値標準化および要約によってさらに処理した。HuEx-1_0-st-v2.na31.hg19.transcript.csvの注釈ファイルが、注釈された17,617個の遺伝子を確認した。
【０１１７】
GSE14333およびGSE17538のデータセットからのサンプルをAffymetrix HGU133 Plus2.0アレイ上で分析した。ステージIIの患者からのＣＥＬファイルをダウンロードし、Affymetrix(R) Expression Console softwareを用いて、ＲＭＡによって分析した。ライブラリおよび注釈ファイルとして、それぞれThe HG-U133_Plus_2.cdfおよびHGU133_Plus_2.na31.annot.csvのファイルを用いた。
【０１１８】
〔遺伝子発現サインの発生〕
多変量生存モデリングの前に、テストシリーズからの遺伝子発現データセットをフィルター処理して、可能性のある予後予測値を有する遺伝子を濃縮した。まず、４４個のステージIIのＣＲＣから単変量危険比（ＨＲ）を計算した（Ｃｏｘ回帰分析、同じ癌からの再発や死亡がイベントとして規定される５年再発無しの生存（ＲＦＳ））。この分析は、Ｒコンピュータ環境に対し、加重相関ネットワーク分析(WGCNA)ソフトウェアパッケージ（文献２２、２３）を用いて行われた。テストシリーズ（Ｒで走るLimmaソフトウェアパッケージにおいて実行される経験的なBayesの抑制されたｔ−統計）として同じバイオバンクからの２３個のステージIと１２個のステージIVのＣＲＣサンプルの分析によって、転移に関連する発現のある遺伝子を確認した（文献２４）。各遺伝子について偽の発見率（ＦＤＲ）を計算し、０．５０より小さい、調整されたＰ値を持つ遺伝子のみがダウンロード分析に含まれた(n=6,760遺伝子)。ステージIからIVまでの腫瘍の発現調整の方向（ステージIVにて上昇調整または下降調整）と、（ＨＲによって示されるように）ステージIIの腫瘍において高いまたは低い発現レベルでの患者の生存との関連との間で、一致を示す遺伝子のみが保持された(n=3,339遺伝子、図１)。分析に用いられるＲコマンドを表６に挙げている。
【０１１９】
Ｃｏｘ比例危険モデル（文献２５、２６）におけるＬ１ペナルティー（投げ縄）推定を用いて、フィルター処理されたこの３，３３９個の遺伝子の組に対する発現レベルが、テストシリーズのステージIIの腫瘍（再発の危険）の多変量生存モデリングのための入力として用いられた。パラメーターλ（λ１）を調整する関数としての非ゼロ回帰係数を有する遺伝子の数を計算するために、可能性クロス検証法を用いた。クロス検証からの最適なλ１値は０個の遺伝子に対応した。我々は、ペナルティー（λ１）の厳しさを減らして、非ゼロ回帰係数を有する遺伝子を組織的に少しずつ増やすことを選んだ。このアプローチによって、初めの１５個の最適な遺伝子の組が確認された。全てのサンプルは、遺伝子ごとに基づいて、（それぞれ、高いまたは低い発現が再発の高リスクと関連しているかによって、）その発現が８０％を超えるか２０％を下回るときはいつでも、再発の高リスクを示す正の予後スコアを与えられた。１個ないし１５個の遺伝子の各可能なサインを用いて、再発の高リスクと関連する遺伝子の数が、全てのサンプルについてまとめられた。我々は、具体的には、サンプルの少なくとも１０％が再発の高リスクなグループにあるサインを選択した。ＲＦＳと最も強い関連を持つものを確認するために、各サインに対してＰ値（Wald統計）が計算された。
【０１２０】
〔遺伝子発現サインの検証〕
テストシリーズにおいて確認された最適な予後サインが、さらに、両方の検証シリーズにおいて検証に付された。サインにおいて各遺伝子の８０％および２０％のレベルを越える遺伝子の数に基づいて、各シリーズ内のステージIIのＣＲＣサンプルが、再発の低リスクグループまたは高リスクグループに分類された。検証シリーズIIの発現データは、Affymetrix HG-U133 Plus2.0マイクロアレイから得られ、多重プローブの組によりターゲットにされた遺伝子に対し、十分に注釈されたプローブの組からの中央値発現がさらに用いられた（“_x_at”で注釈された低い特異性を持つプローブの組を除く）。
【０１２１】
イベントとしてＣＲＣからの再発や死亡が規定されている５年ＲＦＳを推定するために、ログランクテストのKaplan Meier生存分析が用いられ、患者は、最後に、フォローアップ、他の癌からの死、癌以外の死、または、５年以内での治療に関連する死であったかが調べられた。検証シリーズIIからの生存データが、疾病の無い生存として示され、その公開物（文献１３、１８）によれば、イベントとして疾病の再発が規定されているので、我々の規定通りである。比例危険回帰モデルにおいて、単変量および多変量の両方のＣｏｘ回帰分析のＰ値を計算するために、Wald統計が用いられた。多変量分析では、全てのパラメーターが、全ての臨床および分子パラメーターに対し、階段状前進モデルに入れられた。０．０５より小さいＰ値が統計的に有意と考えられた。Kaplan MeierとＣｏｘ回帰分析において、PASW 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)が用いられた。サンプルと遺伝子発現データとの間の相関係数(Pearson)を計算するために、Partek Genomics Suite (version 6.5, Partek Incorporated, MI)が用いられた。機能濃縮分析は、注釈、視覚化および統合された発見のためのデータベースによって行われ(DAVID)（文献２７）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)により規定された公知のパスウェイが分析に含まれた。０．０５より小さい修正Fisher’s ExactＰ値を有する濃縮されたKEGGパスウェイが統計的に有意と考えられた。
【０１２２】
〔結果〕
〔ステージIIのＣＲＣに対する予後の遺伝子発現のサインの段階的確認〕
テストシリーズからの発現データに基づいて１７，６１７個の遺伝子の初期リストがフィルター処理され、転移関連の発現変化（ステージIV対ステージI）を有する３，３３９個の遺伝子を、したがって、予後（ステージIIの悪い生存におけるステージIV様の発現）と関連しておりそれゆえ強い予後分類器（〔材料および方法〕を参照されたい）を、濃縮した。したがって、投げ縄ペナルティー多変量Ｃｏｘ比例危険分析によって、１個ないし１５個の遺伝子のサイズの予後遺伝子発現サインが（ペナルティーの厳しさを減少させて）確認された。サンプルは、遺伝子発現尺度の８０％および２０％での閾値に基づいて、各サインに対して低リスクおよび高リスクの再発グループに分けられた。
【０１２３】
悪い生存と関連する実際の遺伝子の数に対するテストシリーズ（Ｐ値）での予測処理に基づいて、予後遺伝子発現サインがランク付けされ、１３個の遺伝子発現サインが最適であると確認された。遺伝子発現サインの組み合わせのランキングによって、再発の高リスクの患者から再発の低リスクの患者を分離するには、正の予後スコアを有する５個以上の遺伝子が必要であることが明らかになった。悪い予後は、遺伝子PIGR, CXCL13, MMP3, TUBA1BおよびCXCL10の低発現と、SESN1, AZGP1, KLK6, EPHA7, SEMA3A, DSC3, ENPP3およびBNIP3の高発現とに関連した（表１）。可変の選択に対する適合した投げ縄ペナルティーアルゴリズムによれば、確認された遺伝子は、生存に高く関連するとともに、分析に用いられた遺伝子と比べて、遺伝子発現に高い変動と低レベルの相関を示した（図３）。
【０１２４】
テストシリーズにおいて、患者の１６％が、再発の高リスクを持つものとして確認され、５年のＲＦＳ率は、再発の低リスクとして確認された患者における８９％と比べて、１４％であった（図２Ａ、表２、p<0.001; HR=18.2）。
【０１２５】
〔ステージII  ＣＲＣサンプルの２個の独立サンプルにおける遺伝子発現のサインの検証〕
検証シリーズIにおいて、患者の１３％が再発の高リスクを持つものとされた。低リスクグループおよび高リスクグループの間には統計的に有意な差があった（５年のＲＦＳはそれぞれ６９％と２９％、図２Ｂ、表２、p=0.02; HR=3.6）。この患者に対し、１０年のフォローアップタイムが利用可能であった。リスクグループ間の生存率の差は、１０年後にも統計的に有意なままであった（p=0.02; HR=3.1）。
【０１２６】
１３個の遺伝子の予後発現サインに対する外部の独立した検証シリーズとして、検証シリーズIIのステージIIのＣＲＣサンプルが用いられた。これらの患者は、社内のデータセットとは異なる人々から集められ、Affymetrixのマイクロアレイの別バージョンに基づいて分析された。このシリーズの高リスクの患者は、５年のＲＦＳが、低リスクの患者における９１％と比べて、５５％であった（図２Ｃ、表２、p=0.001; HR=6.5）。
【０１２７】
〔１３個の遺伝子の予後の分類器と臨床パラメーターとの間の相関〕
予後サインが、種々の臨床病理学的特徴から独立して強い予後分類器であるかどうかを評価するために、臨床データを、単変量および多変量の両方のＣｏｘ回帰分析に含めた（表２）。単変量分析においては、予後サインは、テストシリーズおよび検証シリーズIの両方において予後と関連して最も強く変化した。検証シリーズIIにおいてアジュバント化学療法および／または放射線療法を受けた患者は、治療を受けなかった患者と比べて、より悪い結果を示した（p=0.02; HR=3.7）。多変量分析においては、予後サインは、３個全てのサンプルシリーズにおいて、独立した予後分類器であった（表２、p<0.004; 多変量HR >5.1）。１３個の遺伝子分類器によるリスク階層化と、３個のシリーズにおける種々の臨床および分子パラメーターとの間には関連は無かった（表３）。
【０１２８】
〔ステージIIの腫瘍に対する特異性〕
ステージIIのＣＲＣに対する１３個の遺伝子予後分類器が、悪い予後のステージIIIの患者も確認できるかを調査するために、ステージIIとIIIの両方のサンプルを含めて予後スコアを再計算した。予想通り、テストシリーズにおけるステージIIのサンプルは、再発の低リスクグループおよび高リスクグループに分離され、一方、サインは、ステージIIIのサンプルを分離できなかった（図４Ａ）。検証シリーズIのサンプルは、ノルウェーにおいてアジュバント化学療法がステージIIIの標準的な治療になる前に集められたので、このサンプルシリーズの患者は、治療の恩恵の影響を受けなかった。にもかかわらず、ステージIIのサンプルだけが、低リスクグループおよび高リスクグループに有意に分離された（図４Ｂ）。
【０１２９】
表１．  予後の発現のサインおよびその予後に対する単変量相関における１３個の遺伝子の確認
【０１３０】
【表２】
2014533100.tif 000003
【０１３１】
表２．  テストシリーズからのステージIIのＣＲＣサンプルおよび検証シリーズIおよびIIにおける１３個の遺伝子の予後のサインおよび臨床ファクターの単変量および多変量のＣｏｘ回帰分析（５年のＲＦＳ）
【０１３２】
【表３】
2014533100.tif 000004
【０１３３】
表３．  ステージIIのＣＲＣサンプルにおける１３個の遺伝子の予後のサインおよび臨床ファクターに対する相関
【０１３４】
【表４】
2014533100.tif 000005
【０１３５】
表４．  テストシリーズおよび検証シリーズの臨床病理学的情報の要約
【０１３６】
【表５】
2014533100.tif 000006
【０１３７】
＊  ：社内のバイオバンクからのサンプル。
†  ：ＧＥＯのデータセットGSE14333およびGSE17538から回収されたサンプル。
‡  ：フォローアップタイムは、疾病からの生存者のみを含む。
**  ：フォローアップタイムは、再発までの時間または死／最後のフォローアップまでの時間を含む。
††：ステージIIのみ。ＮＡ、情報利用不可；ＲＦＳ、再発無しの生存。
【０１３８】
表５．  研究に含まれるすべてのサンプルのＧＳＥデータセットアクセスナンバーおよびＧＥＯサンプル確認
【０１３９】
【表６】
2014533100.tif 000007
2014533100.tif 000008
2014533100.tif 000009
2014533100.tif 000010
【０１４０】
補足表３．  分析におけるソフトウェアパッケージと基本的なＲコマンドの概観
【０１４１】
【表７】
2014533100.tif 000011
【０１４２】
表６．  機能分析および重要なＫＥＧＧパスウェイ
【０１４３】
【表８】
2014533100.tif 000012
2014533100.tif 000013
【０１４４】
〔実施例２〕
この実施例では、TaqMan（商標）分析を用いて遺伝子発現のリアルタイム定量を用いたマイクロアレイの結果の確認、ならびに、オリジナルの１３個の遺伝子パネルにおける遺伝子の代わりをすることができる遺伝子の確認について述べる。Affymetrixマイクロアレイ(GeneChipR Human Exon 1.0 ST)からの発現データによってColoGuideExが展開され、また、両方のマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって１９個のステージIIの結腸直腸癌サンプルにおける同じ遺伝子を分析することによって、他の遺伝子発現プラットフォームへの転送能力が示された。１３個の遺伝子に対して予後スコアが展開され、ここで、１９個のサンプルのうちの１５個が、オリジナルのマイクロアレイベースのColoGuideExとして、二分された同じグループにグループ分けされた。これは、最終的なＲＴ−ＰＣＲベースの分類器となることを意図したものではなく、ＲＴ−ＰＣＲベースのアプローチそのものの柔軟性や、他の発現プラットフォームへの転送能力の点でColoGuideExの一般的な強さを示す、初めの１９個の選択されたサンプルについてセットアップされた未加工モデルを意図したものである。
【０１４５】
手短に言えば、１３個の遺伝子パネルに対してTaqMan（商標）プライマーおよびプローブが選択され、テストされて、表７において分析確認器が提供される。
【０１４６】
表７
【０１４７】
【表９】
2014533100.tif 000014
【０１４８】
患者サンプルの遺伝子発現レベルを分析するために試薬を用いた。結果を図５に示す。このプロットは、悪い予後と関連するレベルで発現される、サンプルに関するColoGuideExの遺伝子の数における、TaqMan定量的ＲＴ−ＰＣＲと、マイクロアレイデータのとの間の良い対応を示す。個々の遺伝子に対するプロットを図６に示す。現時点では、サンプルのサブセットだけがｑＰＣＲで分析された(n = 19 ステージIIサンプル)ので、悪い予後と関連するような遺伝子発現レベルを示すための閾値は最終的なものではない。ここで示した分類においては、マイクロアレイデータに対して、遺伝子ごとに悪い予後を有するサンプルの同じ量を分類するために、ｑＰＣＲデータに対する発現レベル閾値が設定された。例えば、マイクロアレイによるPIGR発現は、悪い予後を有するような、発現の最も低い（１９個中で）５個のサンプルを分類した。したがって、ｑＰＣＲによる発現が最も低いこの５個のサンプルも、この遺伝子に対して悪い予後に分類された。悪い予後に関連するレベル（ColoGuideExの公開物で用いられた閾値）でColoGuideExにおいて１３個の遺伝子のうちの５個以上を発現するときに悪い予後を有する患者の分類によって、１９人の患者のうちの１５人（７９％）が、ｑＰＣＲおよびマイクロアレイデータによって同じカテゴリーに分類された。
【０１４９】
TaqMan分析によって１３個の遺伝子のそれぞれについて発現レベルを評価し、関連するＰ値と共にマイクロアレイとＲＴ−ＰＣＲデータとの間のPearson相関係数を表８に示す。１３個の遺伝子のうちの１２個に対し、Pearson相関は r > 0.8であり、Ｐ値 < 0.0001であった。
【０１５０】
表８
【０１５１】
【表１０】
2014533100.tif 000015
【０１５２】
さらなる実験において、パネルに置き換えることができる遺伝子を確認するために、マイクロアレイデータを分析した。表９は、２個の別個の独立した臨床サンプルの組について、結果を示し、対となって相関している遺伝子と、対応するPearson相関係数および関連する有意なレベル（Ｐ値）とを挙げている。
【０１５３】
表９
【０１５４】
【表１１】
2014533100.tif 000016
【０１５５】
〔参考文献〕
1 Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 2010;127:2893-917.
2 O'Connell JB, Maggard MA, Ko CY. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J Natl Cancer Inst 2004;96:1420-5.
3 NIH consensus conference. Adjuvant therapy for patients with colon and rectal cancer. JAMA 1990;264:1444-50.
4 Figueredo A, Coombes ME, Mukherjee S. Adjuvant therapy for completely resected stage II colon cancer. Cochrane Database Syst Rev 2008;CD005390.
5 Benson AB, III, Schrag D, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on adjuvant chemotherapy for stage II colon cancer. J Clin Oncol 2004;22:3408-19.
6 Gray R, Barnwell J, McConkey C, et al. Adjuvant chemotherapy versus observation in patients with colorectal cancer: a randomised study. Lancet 2007;370:2020-9.
7 Farina-Sarasqueta A, van LG, Moerland E, et al. The BRAF V600E mutation is an independent prognostic factor for survival in stage II and stage III colon cancer patients. Ann Oncol 2010;21:2396-402.
8 Roth AD, Tejpar S, Delorenzi M, et al. Prognostic role of KRAS and BRAF in stage II and III resected colon cancer: results of the translational study on the PETACC-3, EORTC 40993, SAKK 60-00 trial. J Clin Oncol 2010;28:466-74.
9 Walther A, Houlston R, Tomlinson I. Association between chromosomal instability and prognosis in colorectal cancer: a meta-analysis. Gut 2008;57:941-50.
10 Popat S, Hubner R, Houlston RS. Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. J Clin Oncol 2005;23:609-18.
11 Locker GY, Hamilton S, Harris J, et al. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer. J Clin Oncol 2006;24:5313-27.
12 Van SS, Allen WL, Turkington RC, et al. Implementing prognostic and predictive biomarkers in CRC clinical trials. Nat Rev Clin Oncol 2011;8:222-32.
13 Jorissen RN, Gibbs P, Christie M, et al. Metastasis-Associated Gene Expression Changes Predict Poor Outcomes in Patients with Dukes Stage B and C Colorectal Cancer. Clin Cancer Res 2009;15:7642-51.
14 Van Laar RK. An online gene expression assay for determining adjuvant therapy eligibility in patients with stage 2 or 3 colon cancer. Br J Cancer 2010;103:1852-7.
15 Jiang Y, Casey G, Lavery IC, et al. Development of a clinically feasible molecular assay to predict recurrence of stage II colon cancer. J Mol Diagn 2008;10:346-54.
16 Bertucci F, Salas S, Eysteries S, et al. Gene expression profiling of colon cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters. Oncogene 2004;19;23:1377-91.
17 Salazar R, Roepman P, Capella G, et al. Gene expression signature to improve prognosis prediction of stage II and III colorectal cancer. J Clin Oncol 2011;29:17-24.
18 Smith JJ, Deane NG, Wu F, et al. Experimentally derived metastasis gene expression profile predicts recurrence and death in patients with colon cancer. Gastroenterology 2010;138:958-68.
19 Wang Y, Jatkoe T, Zhang Y, et al. Gene expression profiles and molecular markers to predict recurrence of Dukes' B colon cancer. J Clin Oncol 2004;22:1564-71.
20 Berg M, Danielsen SA, Ahlquist T, et al. DNA sequence profiles of the colorectal cancer critical gene set KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53 related to age at disease onset. PLoS One 2010;5:e13978.
21 Diep CB, Thorstensen L, Meling GI, et al. Genetic tumor markers with prognostic impact in Dukes' stages B and C colorectal cancer patients. J Clin Oncol 2003;21:820-9.
22 Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics 2008;9:559.
23 Langfelder P, Horvath S. Package 'WGCNA'. 
24 Smyth GK, Ritchie M, Thorne N, et al. limma: Linear Models for Microarray Data User's Guide.
25 Goeman JJ. L1 penalized estimation in the Cox proportional hazards model. Biom J 2010;52:70-84.
26 Goeamn J. Package 'penalized'.
27 Huang daW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 2009;4:44-57.
28 Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification. N Engl J Med 2006;354:2463-72.
29 Tibshirani R. The lasso method for variable selection in the Cox model. Stat Med 1997;16:385-95.
30 Tibshirani R. Regression shrinkage and seleciton via the LASSO. Journal of the Royal Statistical Society Series 1996;58:267-88.
31 Agendia Inc. ColoPrint. 
32 Genomic Health Inc. Oncotype DX colon cancer assay.
33 O'Connell MJ, Lavery I, Yothers G, et al. Relationship between tumor gene expression and recurrence in four independent studies of patients with stage II/III colon cancer treated with surgery alone or surgery plus adjuvant fluorouracil plus leucovorin. J Clin Oncol 2010;28:3937-44.
34 PARSC study (NCT00903565): A Prospective Study for the Assessment of Recurrence Risk in Stage II Colon Cancer Patients Using ColoPrint (PARSC).
35 Clark-Langone KM, Wu JY, Sangli C, et al. Biomarker discovery for colon cancer using a 761 gene RT-PCR assay. BMC Genomics 2007;8:279.
36 Webber EM, Lin JS, Evelyn PW. Oncotype DX tumor gene expression profiling in stage II colon cancer. Application: prognostic, risk prediction. PLoS Curr 2010;2.
37 Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646-74.
38 Agesen TH, Berg M, Clancy T, et al. CLC and IFNAR1 are differentially expressed and a global immunity score is distinct between early- and late-onset colorectal cancer. Genes Immun 2011.
39 Kim JT, Song EY, Chung KS, et al. Up-regulation and clinical significance of serine protease kallikrein 6 in colon cancer. Cancer 2011;117:2608-19。
【０１５６】
本願明細書の上述の部分において言及した全ての刊行物および特許を参照することにより、それらの開示内容を本願に援用する。上で説明した本願の方法およびシステムについては、本発明の範囲および要旨を逸脱しない範囲で多様な変更および変形が加えられることは、当事者にとって明らかであろう。本願発明を特定の好適な実施形態に関連させて説明してきたが、特許請求の範囲に記載する発明がこれら特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるであろう。実際、発明を実現するために本願に記載の様態を多様に変更して得られる、当業者にとって明らかな様態についても、添付の特許請求の範囲に含めるよう意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】テストシリーズにおける予後の遺伝子発現の分類器の確認に導く遺伝子選択基準を示す図である。
【図２】ステージIIのＣＲＣの患者の間で再発の無い生存（ＲＦＳ）を表すKaplan Meier生存曲線を示す図である。
【図３】１３個の遺伝子の予後の分類器が、投げ縄ペナルティー法によりテストシリーズの４４のステージIIのＣＲＣから確認された、生存（Ａ）、高い変動（Ｂ）および互いに対する低い相関（Ｃ）、に対する明らかな相関を有する遺伝子の確認に有利であることを示す図である。
【図４】ステージIIおよびIIIのＣＲＣのサンプルと、１３個の遺伝子発現分類器の使用により計算された生存の可能性を示す図である。
【図５】１３個の遺伝子のパネルに対するTaqMan（商標）アッセイ結果を用いたマイクロアレイデータの相関を示すプロットを示す図である。
【図６】定量的RT-PCR（TaqMan（商標））アッセイ結果を用いたマイクロアレイデータの相関を示す個々の遺伝子に対するプロットを示す図である。
【図１】
2014533100.tif 000017
【図２】
2014533100.tif 000018
【図３】
2014533100.tif 000019
【図４】
2014533100.tif 000020
【図５】
2014533100.tif 000021
【図６】
2014533100.tif 000022
【国際調査報告】
2014533100.tif 000023
2014533100.tif 000024
2014533100.tif 000025
2014533100.tif 000026