(57)【要約】  本発明は、線維化を阻害する、及び／又は逆転させる方法及び組成物を提供する。本発明はさらに、細胞又は組織においてBMPシグナル伝達を引き起こしかつEMTを阻害する、及び／又は逆転させるBMPアゴニストであるペプチド及びポリペプチドを提供する。【選択図】  図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維化を特徴とする疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、該対象に、有効量の配列番号1〜77のペプチドセットを投与し、それによって該対象を治療することを含む前記方法。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが配列番号1に対して少なくとも90％の同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドを、薬学的に許容しうる担体と共に製剤化する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドを対象に経口的に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドを対象に局所的に、経腸的に、又は非経口的に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記の疾患又は障害が、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記の疾患又は障害が慢性腎疾患(CKD)である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
1日あたり0.0001〜10,000 mg／kg体重の用量を対象に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記の投与する用量が1日あたり1〜100 mg／kg体重である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
配列番号55のアミノ酸配列を含む、線維化を特徴とする疾患又は障害を治療するためのペプチド。
【請求項１２】
配列番号1〜77のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項11記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号1〜54のいずれか1つのアミノ酸配列からなる、請求項11記載のペプチド。
【請求項１４】
請求項11〜13のいずれか1項記載のペプチド及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項11〜13のいずれか1項記載のペプチド及び使用説明書を含むキット。
【請求項１６】
請求項14記載の医薬組成物及び使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権及び参照による組み込み
本出願は、先の米国仮出願第61／509,340号(2011年7月19日出願)の出願日の利益を主張するものであり、その記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。また本出願は、先の米国仮出願第61／662,337号(2012年6月20日出願)の出願日の利益を主張するものでもあり、その記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。本明細書中で引用又は参照した全ての文献、並びに本明細書中で引用した文献中で引用又は参照されている全ての文献、並びに本明細書中に記述した、又は参照により本明細書中に組み込まれるあらゆる文献中の、あらゆる製品に関するあらゆる製造業者の説明書、解説書、製品仕様書、及び製品シートは、参照により本明細書中に組み込まれるものとし、かつ本発明の実施に際して採用しうるものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、線維化及び／又は線維化に関する状態を治療するための組成物、該組成物の製造の方法、並びに線維化及び／又は線維化に関する状態を治療するための方法に関する。本発明はさらに、上皮間葉転換(EMT)過程の逆転及び／又は阻害を含む、線維化及び／又は線維化を生じる基礎状態の治療のためのポリペプチド又はペプチドの設計、調製、及び使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
線維化は身体の自然な治癒過程が不首尾に終わる場合に生じ、一般的には、あるタイプの根本的原因、例えば、組織損傷、感染、自己免疫反応、化学的傷害、アレルギー反応、毒物、放射線、機械的傷害、又は他の様々な持続的刺激に関連する慢性炎症状態に応答した組織の過度の異常増殖、硬化、及び／又は瘢痕化を特徴とする(TA Wynn, J. Pathol., 2008, 214：199-210)。臨床的及び病因的徴候の幅は広い場合があるが、線維化障害は、それらの障害が一般的に、正常組織に進行的に損傷を与えかつその細胞構造を機能が失われる程度にまで変化させる細胞外マトリックス成分の増加した、及び過度の蓄積をもたらす様々な増殖因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子、及び線維形成性サイトカインの放出を促進し続ける、ある種の潜在的な持続性刺激物質を共有しているという点で似通っている。この過程は通常、数ヶ月及び数年にわたって生じるものであり、また最終的には臓器機能不全又は死をもたらす可能性がある。よく見られる線維化疾患の具体例としては、例えば、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症(同上)が挙げられる。
【０００４】
典型的には、組織損傷後の自然治癒過程は、血小板誘発性の血栓形成及び一時的な細胞外マトリックス(ECM)の形成に始まる治癒カスケードを開始させる、損傷部位付近の上皮及び／又は内皮細胞による炎症性メディエーターの放出から始まる。血小板脱顆粒もまた血管の拡張及び透過性増加をもたらし、また活性化された筋線維芽細胞並びに上皮及び／又は内皮細胞は、基底膜をさらに破壊して傷害部位へのさらなる炎症細胞の動員能力を高めるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を産生する(同上)。該細胞は、該部位への追加的な免疫系細胞の動員及び増殖を刺激する様々な増殖因子、サイトカイン、及びケモカインもまた産生し、数ある応答の中でも特に、血管新生及び活性化リンパ球による線維化誘導サイトカイン及び増殖因子(例えば、腫瘍増殖因子-β(TGF-β))の分泌をもたらすカスケードを引き起こす。これらの事象により線維芽細胞がさらに活性化され、該線維芽細胞が筋線維芽細胞へと転換され、該筋線維芽細胞が創部に移動して創収縮を促進する。収縮している創部では、上皮及び／又は内皮細胞が分裂することにより損傷組織を再生し、それによって自然な創傷治癒過程を完了する(同上)。
【０００５】
線維化は、代謝回転されず、かつ最終的には瘢痕組織の生成又は形成、及び瘢痕化により引き起こされる随伴性の臓器又は組織機能不全をもたらすECM物質の過度の蓄積を含むカスケードを誘発誘発する持続的かつ慢性的な炎症状態の存在のため、前記過程とは異なる(同上)。
【０００６】
トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)及び結合組織増殖因子(CTGF)などの線維化誘導タンパク質は、線維化疾患に関与することが示唆されている。TGF-βは線維芽細胞がECMを合成するよう誘導するので、このサイトカインは線維化反応の中心的なメディエーターであると長く信じられてきた(LeRoyら、Eur. Cytokine Netw., 1：215-219)。ヒト内皮細胞により分泌されるタンパク質として10余年前に発見されたCTGF(Bradmanら、J. Cell Biol., 1991, 114：1285-1294)は、TGF-βにより誘導されるものであり、また線維芽細胞に対するTGF-βの作用の下流のメディエーターと考えられている(Leaskら、J. Invest. Dermatol., 2004, 122：1-6；Grotendorst, G.R., Cytokine Growth Factor Rev., 1997, 8：171-179)。同様に、TGF-βは、フィブロネクチン転写物の選択的スプライシングを通じて生じるフィブロネクチンの変異体である、基質タンパク質フィブロネクチンのED-A型(ED-A FN)の発現を誘導する(Oyamaら、Biochemistry, 1989, 28：1428-1434)。このED-A FNの誘導は、TGF-β1により誘発されるα-SMA及びI型コラーゲンの発現増強に必要である(Seriniら、J. Cell Biol., 142：873-881)。このため、TGF-βは、例えば肺(Simeら、Clin. Immunol., 2001, 99：308-319)及び腎臓(Lan, Int. J. Biol. Sci., 2011, 7：1056-1067)を含む多くの組織における線維化の誘導の「マスタースイッチ」であるとされている。この点に関して、TGF-βは特発性肺線維症を患う患者の肺、又は慢性腎疾患患者の腎臓においてアップレギュレートされ、またラットの肺又は腎臓における活性TGF-βの発現は劇的な線維化反応を誘導し、一方でTGF-β1に応答する能力の欠如はブレオマイシン誘導性の線維化(Zhaoら、Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2002, 282：L585-L593)又は腎間質線維化(Zeisbergら、Nat Med, 2003, 9：964-8)からの保護を与える。
【０００７】
上皮間葉転換(EMT)の過程もまた、損傷組織が線維化反応を起こすための共通のメカニズムであると広く示唆されている。EMTは、十分に分化した上皮細胞が間葉表現型へと転換され、該間葉表現型がその後線維芽細胞及び筋線維芽細胞を生じるその過程であり、また上皮傷害後の線維化及び瘢痕形成において中心的な役割を果たしていると次第に認識されつつある。この過程が肺及び他の臓器における傷害後の線維化に寄与するその程度は、活発な調査の対象である。近年、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-βがin vitro及びin vivoで肺胞上皮細胞(AEC)においてEMTを誘導すること、並びに上皮及び間葉マーカーが特発性肺線維症(IPF)を患う患者由来の肺組織のII型過形成(AT2)細胞に共局在していることが実証され、AECが肺線維化において極端な可塑性を呈しかつ線維芽細胞及び／又は筋線維芽細胞の供給源としての役割を果たしうることが示唆された。TGF-β1は、正常な乳房上皮細胞におけるEMTのインデューサーとして最初は記載され(Miettinenら、1994, 127：2021-2036)、またその後に幾つかの異なる上皮細胞(例えば、腎近位尿細管、水晶体、及び直近では肺胞上皮細胞)においてin vitroでEMTを仲介することが示された(Fanら、Kidney Int, 1999, 56：1455-1467；Halesら、Curr Eye Res, 1994, 13：885-890；Kasaiら、Respir Res, 2005, 6：56；Saikaら、Am J Pathol, 2004, 164：651-663；及びWillisら、Am J Pathol, 2005, 166：1321-1332)。従って、EMTは、その基礎疾患の病因を問わず、線維化において共通の普遍的な役割を果たしている可能性がある。
【０００８】
線維化及びその根底にある分子過程に関する知識の広さ(又はその不足)にもかかわらず、線維化疾患は有効な治療法が存在しない最大の障害群の1つであり、またそれ故に線維化疾患は未だ満たされない重要な医療ニーズの象徴である。多くの場合、線維症を患う患者にとって唯一の救済策は臓器移植である。しかしながら、臓器の供給量は需要を満たすには不十分であるため、患者は適切な臓器を受け取るのを待つ間に死亡することが多い。肺の線維化はそれだけでも強皮症肺疾患、特発性肺線維症、放射線-及び化学療法-誘導肺線維症における死亡並びに塵粒子の職業性吸入により引き起こされる状態における死亡の主な原因となりうる。主に線維化疾患の病因が本質的に不明であるという理由から、適当な抗-線維化療法の不在が生じる。有効な治療的アプローチを特定するためには、線維化疾患において正常組織の修復がどのように制御され、かつこの過程がいかにして不首尾に終わるのかを理解することが不可欠であろう。
【０００９】
線維化状態を治療することができる新規の治療的解決策は当分野を進歩させるだろう。特に、あらゆるタイプの線維化疾患に共通する根本的原因を首尾よく標的化する療法は、線維化又はその根底にある線維化を引き起こす分子過程(例えば、EMT)を遅延させる、逆転させる、及び／又は排除することができる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は一部、本発明者らによる、以前に開示したポリペプチド／ペプチドのサブクラスはBMP(骨形成タンパク質)受容体(例えば、I型及びII型の両受容体)のアゴニストであるという発見、並びにかかるポリペプチド／ペプチドは上皮間葉転換(EMT)及び線維化を阻害及び／又は逆転させる能力があり、またそれ故に線維化及び線維化に関するか又は線維化を伴う状態を治療的に処理するために使用することができるという発見に基づいている。従って、本発明は、線維化及び／又は線維化状態(例えば、EMT)をもたらすかもしくは引き起こすある特定の基礎状態を治療する、阻害する、逆転させる、及び／又は排除するための、ある特定のポリペプチド／ペプチドの設計、調製、及び使用に関する。本発明の有用性、特に、本発明のポリペプチド／ペプチド及び方法の有用性は、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症に関連する線維化を含むがこれらに限定されない、身体のあらゆる組織及び／又は臓器におけるあらゆる線維化状態の治療に及ぶ。
【００１１】
近年、線維形成の中心的なメディエーターとしてのトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)がEMTのインデューサーであって、該EMTがその後線維化を仲介することが見出された。BMP-7がTGF-β-誘導EMTを逆転させることがさらに確認され、それによってEMTを介して生じている線維化を中和する上でのBMP-7の役割が示唆された。本発明者らは、以前に開示したペプチドの特定のサブクラス(本明細書中でさらに説明する)が、BMPアゴニスト、すなわち、BMP又はその特定の下位部分を模倣するペプチドであって、かつBMP受容体に結合し該BMP受容体を介してBMPシグナル伝達を活性化するペプチドであり、これらが糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症を含む様々な状態に関するEMT及び線維化の阻害及び／又は逆転に有効であることを見出した。
【００１２】
従って、第1の態様では、本発明は、I型及びII型受容体を含むBMP受容体のアゴニストであり、かつ以前に開示したペプチドのサブクラスである、ある特定のペプチド又はポリペプチド(すなわち、互換的に本発明の「化合物」、「ペプチド」、又は「ポリペプチド」と称しうるもの)に関する。本発明のBMP-アゴニスト化合物は、BMPシグナル伝達を誘導し、それによって、TGF-βにより誘導されるEMT及び線維化に対するBMPの中和作用を模倣することが見出された。他の態様では、本発明は、生物学的プロセス及び化学的プロセス又は合成プロセスを介することを含む、本発明のBMP-アゴニストペプチドを作製するための方法を提供する。さらに他の態様では、本発明は、本発明のペプチド、又はプロペプチド(切断されるか又は別の形で修飾されることにより本発明の所望のBMP-アゴニストペプチドを生成しうるもの)をコードする単離された核酸分子に関し、該核酸分子としては、例えば、本発明のペプチドを送達する必要がある対象に該ペプチドを送達するための手段としての体細胞遺伝子導入を目的とした場合などに、in vitro又はin vivoで本発明のペプチドを作製するために使用される核酸分子が挙げられる。さらに他の態様では、本発明は、本発明の1種もしくはそれ以上のペプチド、又は本発明のプロペプチド、又はかかるペプチドもしくはプロペプチドをコードする1種もしくはそれ以上の核酸分子、及び1種もしくはそれ以上の薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症の治療を含むがこれらに限定されない、線維化疾患を有する対象において、線維化又は線維化を引き起こす関連基礎状態(例えば、EMT)を治療又は予防(すなわち、予防的投与)するために治療上有効な量の本発明のペプチド又は医薬組成物を投与するための方法に関する。さらに別の態様では、本発明は、1つもしくはそれ以上の容器、1種もしくはそれ以上の本発明のペプチドもしくはポリペプチド、又は1種もしくはそれ以上の本発明のペプチドもしくはポリペプチドを含む医薬組成物、及びキットもしくは医薬パッケージの内容物を使用するための説明書を有する、該キット又は該医薬パッケージに関する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77(本明細書中で以下に挙げた表1又は別の箇所に示す)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。ある特定の他の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77のペプチドと類似した配列を有するペプチドを挙げることが可能であり、また具体的には、本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも99％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも95％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも90％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも85％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも80％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも75％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも70％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも65％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも60％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００１４】
他の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、本発明のペプチド(及び／又は場合によってはプロペプチド)のあらゆる適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片、並びにこれらに関する小分子を挙げることができる。ある実施形態では、該ペプチドは上皮間葉転換(EMT)過程をモジュレートする。別の実施形態では、該ペプチドは線維化をモジュレートする。特定の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチド(そのあらゆる適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片を含みうる）は、BMPシグナル伝達過程を模倣する。他の特定の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチド(そのあらゆる適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片を含みうる)は、TGF-β-誘導EMTを中和し、阻害し、及び／又は逆転させるであろう。さらに他の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチド(そのあらゆる適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片を含みうる)は、線維化を阻害するか、逆転させるか、又は別の形で除去するであろう。
【００１５】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、表1の配列番号1〜77のペプチド又は表1の特定の実施形態以外で本発明の範囲内にある、あらゆるペプチドもしくはプロペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、単離された核酸分子はDNA発現又はクローニングベクターでありうるし、また該ベクターは該核酸に機能しうる形で連結しうるプロモーター配列を状況に応じて含んでいてもよく、その場合、該プロモーターは本発明のペプチド又はプロペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を引き起こす。さらに別の実施形態では、該ベクターにより細胞、例えば、原核生物又は真核生物の細胞、好ましくは哺乳動物細胞、又はより好ましくはヒト細胞を形質転換することができる。さらに別の実施形態では、該ベクターは、哺乳動物細胞に感染しかつウイルスに感染した動物において配列番号1〜77のポリペプチドの発現を引き起こすことができるウイルスベクターでありうる。さらに他の実施形態では、前記核酸分子は、宿主細胞において有効な発現を達成するためのあらゆる適切な、及び／又は有利なエレメントを、該宿主細胞が原核生物の宿主細胞であるか真核生物の宿主細胞であるかに関係なく、またその発現がin vitroで行われるかin vivoで行われるかに関係なく含む。さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、体細胞遺伝子導入により本発明のペプチドを投与する必要がある対象に該ペプチドを投与するために、本発明のペプチド、又はそのあらゆる変異体、類似体、ホモログ、もしくは断片(例えば、そのあらゆる有用なプロペプチド)をコードする核酸配列を導入するための体細胞遺伝子導入ベクターを含んでいてもよい。
【００１６】
プロペプチドの場合、該プロペプチドは、ある特定の条件下で活性化されうる本発明のペプチドの不活性型である。プロドラッグ又はプロ抗体を作製するための方法は公知である。ある実施形態では、該プロペプチドは、目的のペプチドにつながれた1種又はそれ以上の追加のポリペプチド配列を含んでいてもよい。1つの形態では、該プロペプチドは単一ポリペプチド翻訳生成物であって、該生成物は、該生成物の発現に伴って最初に存在しかつ目的のペプチドの活性を低下させるか又は排除するか又はマスクする完全長ポリペプチド配列のリーダー又は末端部分を含む。また該リーダー又は末端部分が(例えば、プロテアーゼ切断により)除去されると、該ペプチドはそのBMPシグナル伝達活性を取り戻す。
【００１７】
本発明の医薬組成物の実施形態では、該組成物は、薬学的に許容しうる担体と共に、又は薬学的に許容しうる担体無しで、本発明のペプチド又はポリペプチドを含みうる。
【００１８】
本発明の医薬組成物の他の実施形態では、本発明の組成物は、1種又はそれ以上の追加の活性薬剤を含みうる。1種又はそれ以上の追加の活性薬剤は、他の抗-線維化療法を含みうる。1種又はそれ以上の追加の活性薬剤は、線維化状態を引き起こすか又は線維化状態に関与しているか又は線維化状態に関する基礎疾患又は状態に関する他の療法も含みうる。例えば、線維化が糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症の一要素である、ある特定の実施形態では、追加の1種又はそれ以上の活性薬剤は、線維化そのものとは異なるこれらの基礎状態の他の症状又は態様の治療に対して有効である薬剤を含みうる。
【００１９】
本発明のペプチドの作製及び／又は調製を含む態様では、本発明は、配列番号1〜77をコードする核酸分子を含有する細胞を、該ペプチドの発現を提供する条件下で培養し；さらに発現されたペプチドを回収する方法を含む、ある特定の実施形態に関する。ある特定の他の実施形態では、該核酸分子は配列番号1〜77の、又は本発明の任意の他のBMP-アゴニストペプチドの、適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片をコードしうる。
【００２０】
キットを含む態様では、ある特定の実施形態においては、本発明のキットは、1つ又はそれ以上の容器、本明細書中に記載したペプチド又は医薬組成物及び該キット中の内容物を使用するための説明書を含む。該ペプチドは、ある特定の実施形態では、配列番号1〜77の、又は本発明の任意の他のBMP-アゴニストペプチドの、適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片であってもよい。他の実施形態における該キットは、1種又はそれ以上の他の活性薬剤、例えば線維性要素を生じるか又は含む状態を治療する上で有効でありうる活性薬剤、例えば、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、又は強皮症を治療するための第2の薬剤を含んでいてもよい。該キットは、さらに他の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチド、又は配列番号1〜77の、もしくは本発明の任意の他のBMP-アゴニストペプチドの変異体、類似体、ホモログ、もしくは断片をコードする単離された核酸分子も含んでいてもよい。該キットの核酸分子は、線維化の治療の必要がある対象への、線維化の治療の方法での体細胞遺伝子導入に適したものであってもよい。
【００２１】
線維化を治療するための、又は線維化状態に関するかもしくは線維化状態の根底にある状態を治療するための本発明のペプチド、又は本発明のペプチドをコードする核酸分子の使用を含む態様では、本発明は、様々な実施形態において、治療中の線維化は糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、又は強皮症に関するものであると規定する。ある特定の実施形態では、本発明は、慢性腎疾患(CKD)に関連する線維化、すなわち、CKDに関連する腎線維化を治療するための方法を提供する。ある特定の他の実施形態では、本発明の方法は特発性肺線維症を治療することを含む。さらに他の実施形態では、本発明は、肝硬変に関連する線維化を治療するための方法に関する。さらに他の実施形態では、本発明は、心臓線維症を治療するための方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症に関連する線維化を治療するための方法を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、強皮症に関連する線維化を治療するための方法を提供する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象に、治療上有効な量の本発明のBMP-アゴニストペプチド、又はその変異体、類似体、ホモログ、もしくは断片(例えば、表1の配列番号1〜77として同定したペプチドのいずれか1種又はそれ以上)を適切な手段を介して投与することにより、疾患過程に関連する線維化、例えば、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、又は強皮症に関連する線維化を治療する、阻害する、及び／又は逆転させるための方法を提供する。本発明のペプチドの投与は、経口的、非経口的、注入、注射、吸入もしくは経皮を含む適切な手段によるものであっても、又はあらゆる実行可能な手段を通じたものであってもよい。さらに別の実施形態では、本発明のペプチド(本発明のペプチドのあらゆるプロペプチド、又はあらゆる変異体、類似体、ホモログ、もしくは断片を含む)を、in vivoで宿主において本発明のペプチドをコードしかつ発現するよう設計された核酸分子として送達することができる。
【００２３】
本発明の方法では、投与する本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77のペプチドと類似した配列を有するペプチドを挙げることが可能であり、また具体的には、投与する本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも99％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも95％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも90％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも85％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも80％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも75％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも70％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも65％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも60％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００２４】
これらの実施形態及び他の実施形態は、後述の詳細な説明中に開示されているか、又は後述の詳細な説明から自明であり、かつ後述の詳細な説明に包含されるものとする。
【００２５】
以下の詳細な説明は、具体例として提供されるものであって、記載されている特定の実施形態のみに本発明を限定する意図はなく、添付図面と併せると最もよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、同定されたペプチド(配列番号1〜11)の2種の濃度(100μM及び200μM)に対するE-カドヘリン蛍光の定量的比色分析を図示したものである。蛍光のレベルにより示されるE-カドヘリン発現の消失は、上皮表現型の消失の指標である。同様の分析を、サイトケラチン及び頂端部アクチン-結合膜貫通タンパク質-1(MUC-1)の消失を含む上皮表現型の消失の他のマーカーを用いて行ってもよい。E-カドヘリン発現の消失は、開始刺激とは関係のない、EMTの普遍的な特徴である(Hay E D, Acta Anat., 1995, 154：8-20)。間葉表現型の逆転は、E-カドヘリンの産生の増加により観察することもできる(Vanderburg CR, Acta Anat, 1996, 157：87-104)。
【図２】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図３】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図４】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図５】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図６】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図７】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図８】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図９】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１０】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１１】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１２】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１３】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１４】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１５】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１６】図2〜16は、E-カドヘリン(上皮表現型のマーカー)のレベルに対する被験化合物(配列番号1〜11)の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。図2は、培養培地のみに曝露したHK-2細胞において発現されたE-カドヘリンの免疫蛍光染色に起因する蛍光を示したものであり、一方図3(100 mM D-グルコースの存在下の細胞)は、D-グルコースにより誘導されたE-カドヘリン発現の消失(細胞の免疫蛍光染色により観察)を示したものである。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号1)(TFA、酢酸塩、及び塩化物塩)、並びに100 mM D-グルコースと100μMの化合物(配列番号2〜11)で処理したHK-2細胞に対する免疫蛍光を示したものである。いずれの場合も蛍光顕微鏡写真から化合物の効果を評価する方法が不明であったため、比色分析方法を開発し(実施例1〜4の方法及び材料の項、第C節を参照されたい)、さらに該分析の結果を表3及び図1に示した。
【図１７】図17は、実施例2で検討した研究の背景にあるSTZ実験プロトコルを図示したものである。実験は、標準的な動物舎条件下、普通食で維持した非近交系CD1マウスに対して実施した。マウスに、クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 4.5)中のストレプトゾトシン(STZ)の単回腹腔内注射を200 mg／kgの用量で行った。血糖は、グルコースオキシダーゼ酵素試験(Medisense glucometer, Abbott Laboratories, Bedford, MA)を利用して尾静脈サンプリングにより測定した。糖尿病性腎症は、STZ注射後5もしくは6ヶ月目(ビヒクル対照群)又は6ヶ月目(THR123群もしくはBMP-7群)の終わりに犠牲死させたマウス群において評価した。実験計画の詳細を図17に示す。STZを注射したマウス群に、STZ注射の5ヶ月後から6ヶ月後までの1ヶ月間、Thrasos化合物の経口投与を5 mg／kg体重の用量で連日施した。BMP-7は1ヶ月目から6ヶ月目まで300μg／kg体重の用量で腹腔内に投与した。
【図１８】図18〜22は、図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究における、マウスの組織の代表的な顕微鏡写真である。より具体的に言えば、これらは、対照マウス由来、糖尿病性腎症誘導から5ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導から6ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までBMPで処理した該誘導から6ヶ月後のマウス由来、及び糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までTHR-123化合物(配列番号1)で処理した誘導から6ヶ月後のマウス由来の腎臓切片の代表的な顕微鏡写真である。図18：対照マウス(STZなし、n＝5)由来の腎臓切片の代表的な組織像。
【図１９】図18〜22は、図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究における、マウスの組織の代表的な顕微鏡写真である。より具体的に言えば、これらは、対照マウス由来、糖尿病性腎症誘導から5ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導から6ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までBMPで処理した該誘導から6ヶ月後のマウス由来、及び糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までTHR-123化合物(配列番号1)で処理した誘導から6ヶ月後のマウス由来の腎臓切片の代表的な顕微鏡写真である。図19：図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究に基づく、STZ-誘導糖尿病性腎症から5ヶ月後のマウス(n＝6)由来の腎臓切片の代表的な組織像。
【図２０】図18〜22は、図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究における、マウスの組織の代表的な顕微鏡写真である。より具体的に言えば、これらは、対照マウス由来、糖尿病性腎症誘導から5ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導から6ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までBMPで処理した該誘導から6ヶ月後のマウス由来、及び糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までTHR-123化合物(配列番号1)で処理した誘導から6ヶ月後のマウス由来の腎臓切片の代表的な顕微鏡写真である。図20：図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究に基づく、糖尿病性腎症誘導から6ヶ月後のマウス(n＝10)由来の腎臓切片の代表的な組織像。
【図２１】図18〜22は、図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究における、マウスの組織の代表的な顕微鏡写真である。より具体的に言えば、これらは、対照マウス由来、糖尿病性腎症誘導から5ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導から6ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までBMPで処理した該誘導から6ヶ月後のマウス由来、及び糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までTHR-123化合物(配列番号1)で処理した誘導から6ヶ月後のマウス由来の腎臓切片の代表的な顕微鏡写真である。図21：図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究に基づく、糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までBMP-7で処理した該誘導から6ヶ月後のマウス(n＝4)由来の腎臓切片の代表的な組織像。
【図２２】図18〜22は、図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究における、マウスの組織の代表的な顕微鏡写真である。より具体的に言えば、これらは、対照マウス由来、糖尿病性腎症誘導から5ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導から6ヶ月後のマウス由来、糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までBMPで処理した該誘導から6ヶ月後のマウス由来、及び糖尿病性腎症誘導の1ヶ月後から6ヶ月後までTHR-123化合物(配列番号1)で処理した誘導から6ヶ月後のマウス由来の腎臓切片の代表的な顕微鏡写真である。図22：図17に概略を示しかつ実施例2及び3、並びに図24〜29で検討した研究に基づく、糖尿病性腎症誘導の5ヶ月後から6ヶ月後までTHR-123(配列番号1)で処理した該誘導から6ヶ月後のマウス(n＝9)由来の腎臓切片の代表的な組織像。
【図２３】図23は、図18〜22において確認される、腎臓切片のH＆E(ヘマトキシリン-エオジン)染色及びマッソン三色染色の定量化を図示したものである。マッソン三色染色切片を使用することにより、間質へのコラーゲンの蓄積を分析した。この染色を用いると、コラーゲンは青色に着色し、かつ細胞は赤色になる。図は、糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後のマウス腎臓における間質線維化の実質的な増加を示している。しかしながら、間質線維化を示すコラーゲンの蓄積は、糖尿病性腎症誘導後の1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で処理した後のマウスでは著しく減少した。分析方法については実施例1〜4の方法Cにおいて検討した。最後の1ヶ月間をTHR-123で処理したことの効果は、最後5ヶ月間のBMP-7処理で観察された効果と同様であり、また線維化の逆転を示唆するには十分に大きいものであった。
【図２４】図24は、間葉マーカーであるFSP-1(線維芽細胞分泌タンパク質-1)の発現の純増が、正常動物について観察された純増と比較して、糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後でそれぞれ27及び29倍であったことを図示したものである。この増加は、糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で処理したマウスにおいては著しく減少した。1ヶ月の処理後、THR-123は、マーカー濃度を、6ヶ月目のレベルが5ヶ月目のレベルの1／10未満となるまで低下させた。
【図２５】図25は、マウスが、糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後に、正常動物と比較して高い割合の損傷尿細管を示したことを図示したものである。ただし、尿細管の損傷は、糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で処理したマウスにおいては著しく減少した。従って、STZへの曝露は、腎皮質において無傷の尿細管の進行性の消失をもたらす。1ヶ月後に開始したBMPの投与は進行を食い止め、また研究の最後の1ヶ月間のTHR-123の投与は尿細管の消失を逆転させたように見える。
【図２６】図26は、腎臓の相対的間質容積が糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後のマウスにおいて有意に増加し、また糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で、又はBMP-7(1ヶ月目から6ヶ月目まで)で処理したマウスにおいては著しく減少したことを図示したものである。従って、最初の1ヶ月の後から開始したBMP7による処理は間質容積の増加の進行を食い止め、またTHR-123(配列番号1)による処理は進行を逆転させたように見える。
【図２７】図27は、糸球体表面が、糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後のマウスにおいて有意に増加し、また糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で、又はBMP-7(1ヶ月目から6ヶ月目まで)で処理したマウスにおいては著しく減少したことを図示したものである。従って、BMP7による処理は糸球体の劣化を遅延させるように見えるが、THR-123(配列番号1)は効果がないように見える。
【図２８】図28は、メサンギウム基質が糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後のマウスにおいて増加したことを図示したものである。この増加は、糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で、又はBMP-7(1ヶ月目から6ヶ月目まで)で処理したマウスにおいては有意に減少した。配列番号1による処理は、6ヶ月目にレベルを37％まで減少させた。
【図２９】図29は、BUNレベルが糖尿病性腎症誘導から5及び6ヶ月後のマウスにおいて増加したことを図示したものである。しかしながら、糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR-123(配列番号1)で、又はBMP-7(1ヶ月目から6ヶ月目まで)で処理したマウスにおいては、BUNレベルは対照動物のBUNレベルまで下落し、このことは、THR-123処理後の腎機能の有意な改善を示唆している。従って、本研究の最後の5ヶ月間にわたって投与したBMP7はBUNレベルの増加を2％に維持したが、犠牲死前の最後の1ヶ月間のTHR-123(配列番号1)による処理はBUNの増加を5ヶ月目の85％から12％まで減少させた。
【図３０】図30には、THR-123と名付けた本発明のペプチドの構造を表す略図を提供する。この化合物は表1の配列番号1に相当する。該略図には、左側にhBMP7の構造に関する三次元スティックモデルがさらに含まれており、1位のシステインと11位のシステイン残基の間のジスルフィド結合の戦略的配置によって少なくとも部分的にTHR-123に模倣されているhBMP7中の保存ループの位置が示されている。
【図３１】図31には、I型及びII型BMP受容体への結合に関するTHR-123(配列番号1)とBMP-7の比較を示す表を提供する。BMP-7と同様に、THR-123はALK2とALK3(I型)の両方のBMP受容体及びBMPR-II(II型)BMP受容体に結合する。しかしながら、BMP-7はALK6(I型)受容体に結合するが、THR-123は結合しない。特に注目すべきは、BMP7と違って、THR-123はALK6 BMP I型受容体ECDに結合しないということである。
【図３２】図32は、THR-123(配列番号1)がSmad1/5/8リン酸化及び核移行を誘導することを示したものであり、このことは、この化合物がBMPシグナル伝達のアゴニストであることを示唆している。ヒト腎近位尿細管上皮細胞(HK-2)をTHR-123の存在下(右パネル)及び非存在下(左パネル)でインキュベートした。該細胞を洗浄し、次いでリン酸化Smad1/5/8に対する一次抗体と共にインキュベートし、続いて蛍光標識した二次抗体を用いて免疫染色した。腎線維化におけるpSmad1/5/8の意義は、腎線維化傷害の中心でなるTGF-β-依存性線維化誘導経路のBMP7による抑制と関係がある。具体的には、かかるTGF-β-依存性線維化誘導経路のBMP7による抑制は、下流BMP標的タンパク質であるSmad1、5、及び8の活性化により一部仲介される(Manson SRら、J. Urol. 85：2523-30, 2011)。
【図３３】図33は、片側性尿管閉塞(UUO)後の間質容積の増加を示したものであり、その増加はこの図で明らかである。UUO動物は、間質腔の3倍の増大を示した。BMP-7又はTHR-123(配列番号1)を投与した動物では、間質腔の増大は有意に減少し、このことはThrasos化合物による間質線維化の予防を示唆している。
【図３４】図34は、片側性尿管閉塞(UUO)後の腎間質の増大を示したものであり、コラーゲンの沈着(線維化の指標)を分析することによりこれをさらに調べた。総コラーゲンの尺度であるヒドロキシプロリン含有量は、ビヒクルで処理したUUO腎臓では偽手術を施した腎臓と比較して3倍増加した。THR-123(配列番号1)及びBMP-7はUUO-誘導増加ヒドロキシプロリン含有量を有効に減少させ、このことは、THR-123がUUO-誘導腎線維化を改善することを示唆している。
【図３５】図35には、ヒト腎尿細管上皮細胞(HK-2)におけるp38 MAPKのリン酸化のレベルに対するTHR-123(配列番号1又は「THR-C」)及び特異的阻害剤SB 203580の効果の比較を示す棒グラフを提供する。p38 MAPKの意義は、このタンパク質がTGF-β-依存性EMTの非-Smad-依存性経路に関与しているという点である。TGF-β-依存性EMTに関係している他の非-Smad-依存性経路としては、RhoA、Ras、PI3キナーゼ、Notch、及びWntシグナル伝達経路が挙げられる。結果は、THR-123がHK-2細胞において基底p38リン酸化を有効に阻害したことを示している。陽性対照としての役割を果たす特異的阻害剤SB203580及びBMP-7は予想通りにp38リン酸化を阻害した。THR-123は、1μMという低濃度でも、本アッセイにおいては10μMの特異的阻害剤と同じくらい強力であった。
【図３６】図36には、TNF-α刺激の結果生じるp38 MAPKのリン酸化のレベルに対するTHR-123(配列番号1又は「THR-C」)及び特異的阻害剤SB 203580の効果の比較を示す棒グラフを提供する。炎症促進因子による調節p38 MAPK活性は線維化と関係があることが示されている。結果は、TNFαがHK-2細胞においてp38リン酸化を誘導したこと、及びTNFαにより誘導されたリン酸化がTHR-123のみにより、又はSB 203580との併用により有効に阻害されたことを示している。
【図３７】図37には、ヒト腎尿細管上皮細胞(HK-2)における、TNF-αにより誘導される炎症マーカーIL-6産生のレベルに対するTHR-123(又は「THR-1405」)及び特異的阻害剤SB 203580の効果の比較を示す棒グラフを提供する。結果は、TNFαがHK-2細胞においてIL-6産生を刺激したことを示している。THR-123又はSB 203580のみの添加により、HK-2細胞によるTNFα-誘導IL-6産生は有意に減少した。両方を組み合わせての添加により、THR-123単独と比較してIL-6産生により大きな減少が生じた。これらの結果は、THR-123によるp38活性化の遮断により腎線維化の進行の重要な決定因子である細胞性炎症が阻害されることを示唆している。
【図３８】p38マイトジェン-活性化プロテインキナーゼ(MAPK)を介した腫瘍壊死因子-a(TNF-a)産生は、腎毒性薬剤シスプラチンにより誘発されるAKIの発症における極めて重要なメカニズムのうちの１つである(Ramesh, G及びReeves, WB. Am J Physiol Renal Physiol 289：F166-F174, 2005)。そのためTHR-123を、該化合物が動物においてシスプラチン-誘発腎毒性を阻害することができるかどうかを判定するためにさらに調べた。図中の上部右及び左のパネルはICAM-1発現について免疫染色した腎臓切片を示したものであり、また下部右及び左のパネルはマクロファージの存在についての免疫染色を示したものである。左列の腎臓切片はシスプラチン単独で処理し、また右列パネルの腎臓切片はシスプラチン及びTHR-123で処理した。上部パネル中の矢印は、THR-123により低減されるICAM-1発現を示している。下部パネル中の矢印は、Mac CD-68染色により検出されるマクロファージの浸潤を示しており、かかる浸潤はTHR-123により低減された。結果は、傷害腎PTECにおいてp38 MAPKを阻害することができるTHR-123は、尿細管へのマクロファージの浸潤を阻害することが可能であり、またそれ故にラットにおけるシスプラチン-誘導腎毒性において炎症を阻害することが可能であったということを示している。
【図３９】図39は、腎近位尿細管上皮細胞(HK-2)における上皮間葉転換(EMT)がTHR-123により予防されることを明示したものである。高グルコースへのHK-2細胞の曝露はE-カドヘリン発現の有意な消失(下部パネル)をもたらし、このことは、EMTが誘導されたことを示唆している。THR-123は、腎PTECにおいて上皮表現型のD-グルコース(50 mM)により誘導される消失(E-カドヘリンの発現により評価)を有効に予防する。これらの結果は、高血糖状態(糖尿病状態)下では、Thrasos化合物は尿細管間質線維化に関与する必須のメカニズムである上皮間葉転換(EMT)過程を予防することができるということを示唆している。
【図４０】図40は、マウスにおける慢性腎疾患の進行性糖尿病性腎症モデルに対する、経口的に投与したTHR-123の効果を明示したものである。マウスを糖尿病性腎症誘導後1ヶ月間(5ヶ月目から6ヶ月目まで)THR123で経口的に処理した場合、この化合物は腎線維化を抑制し(右下パネル)、かつ間質容積を減少させた(棒グラフ)。
【図４１】図41は、THR-123は多能性幹細胞(C3H10T1/2)の骨芽細胞分化を誘導できなかったということを明示したものである。培地単独、BMP-7又はTHR-123で処理したマウス多能性間葉系幹細胞(C3H10T1/2)を、骨形成マーカーであるアルカリホスファターゼ活性について染色した。細胞の染色は、培地単独(対照、パネルA)又はTHR-123(パネルB)で処理した場合には観察されなかった。陽性対照としての役割を果たすBMP-7、2μg／mL(パネルC)は、アルカリホスファターゼ活性について染色されたように、多能性幹細胞の骨芽細胞分化を誘導した。細胞はヘマトキシリンで対比染色した。
【図４２−１】腎尿細管における内因性Alk-3発現の腎臓線維化に対する役割。A.定量的リアルタイムPCR。全RNAは、腎毒性血清腎炎の誘導の前(0日目)及び後(免疫の1週間後、3週間後、6週間後及び9週間後)にC57BL/6マウスの腎臓から単離した。定量的RT PCRは、指定遺伝子のための特異的プライマーセットを使用して実施した。グラフは各時点での18sRNAに対する相対的発現を示したものである。B〜D.対照又は腎毒性血清で処理した腎臓のマッソン三色染色の代表的な写真。倍率×100。E〜G.活性なBMPシグナル伝達の指標であるリン酸化Smad1に特異的な抗体で標識した、対応する腎臓(B〜D)の代表的な写真。倍率×200。H.略図。γGTプロモーターの制御下でCre-リコンビナーゼを発現するマウスを、LacZレポーター遺伝子がLoxP配列導入STOPカセットによりRosa26プロモーターと隔てられているマウスと交配させることにより、γGT-Cre；R26R-STOP-LacZレポーターマウスを作製した。I〜J.β-ガラクトシダーゼ染色。対照R26R-STOP-LacZマウスの腎臓(I)及びγGT-Cre；R26R-STOP-LacZレポーターマウスの腎臓(J)を酵素的に染色することにより、エオジンで対比染色されたβ-ガラクトシダーゼ活性(青色沈殿物)を検出した。パネル中の矢印は代表的なLacZ染色を示している。倍率×400。K.略図。腎尿細管上皮細胞においてAlk-3を条件付きで欠損するマウス(γGT-Cre,Alk-3flox/flox)は、γGT-Creマウスを、LoxP配列導入Alk-3対立遺伝子を担持するマウスと交雑させることにより作製した。L〜M.Alk-3の免疫組織化学的分析。対照Alk-3flox/floxマウス(L)におけるAlk-3の強発現。γGT-Cre；Alk-3flox/floxマウス(M)では尿細管性Alk-3タンパク質発現は検出されなかった。N〜U.組織病理像。γGT-Cre；Alk-3flox/floxマウス及び同腹対照マウス(Alk-3flox/flox)に腎毒性血清を接種した。腎臓を染色しているマッソン三色の倍率×200での代表的な写真。V.NTN腎臓における線維化の定量化。マッソン三色染色写真をimageJソフトウェアにより分析し、線維化面積を定量化した。各時点で4〜6匹のマウスを分析した。W.γG-Cre；Alk-3flox/floxマウス(n＝5)及び同腹対照マウス(n＝3)におけるNTNの60日目の血中尿素窒素測定。X, Y.対照(Alk3flox/flox)マウス及びγGTCre；Alk3flox/floxマウスにおける腎臓のE-カドヘリン／FSP1免疫標識。Z.E-カドヘリン／FSP1二重陽性尿細管の割合は、スライド1枚あたり500個の尿細管、1実験群あたり5枚のスライドとして、二重標識尿細管の数を数えることにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として表記した。
【図４２−２】図４２−１の続きである。
【図４２−３】図４２−２の続きである。
【図４２−４】図４２−３の続きである。
【図４３】γGT-Cre；Alk3flox/floxマウスにおける尿細管p-smad2の蓄積の増加。A,B. Alk3flox/floxマウス及びgGTCre；Alk3flox/floxマウスにおける腎臓のリン酸化-smad2(p-smad2)免疫標識。C.p-smad2陽性尿細管の割合は、スライド1枚あたり500個の尿細管、1実験群あたり5枚のスライドとして、尿細管において評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として表記した。
【図４４】γGT-Cre；Alk3flox/floxマウスにおけるマクロファージの蓄積。凍結切片をマクロファージについてMac-1抗体を使用して標識し、さらに免疫蛍光分析を蛍光顕微鏡法により実施した。疾患のない腎臓(A及びB)では、少数のマクロファージが認められた。Alk3flox/floxマウスのNTN腎臓では、マクロファージが蓄積し(C)、またかかるマクロファージの蓄積はγGT-Cre；Alk3flox/floxマウスのNTN腎臓で顕著であった(D)。5回の独立した実験から得た代表的な写真を掲載した。
【図４５−１】THR-123の薬物動態。A.BMP7の構造を、該構造に対応付けた、解析によって判明した残基重要性(residue weights)と共に示した図。B,C.個々のI型受容体、Alk-3(B)及びAlk-6(C)に特異的な放射性-リガンド受容体結合アッセイ。Alk-3又はAlk-6の高度に精製された細胞外ドメイン(ECD)(Fcドメインとの融合タンパク質として発現される)は受容体としての役割を果たした。各アッセイでは、精製された受容体を各ウェルに固定し、さらにペプチド類似体又は非標識BMP7を添加し、続いて125I-標識BMP7を添加した。放射標識されたBMP7複合体をオートガンマカウンターで計数した。結果は平均±s.e.mとして表記した。両アッセイで陽性対照としての役割を果たす非標識BMP7は、線形の用量依存性反応曲線を与えた。D,E.全放射能測定により決定した、尾静脈経由のTHR-123(125I-Tyr)のiv注射後のWistarラットの体循環におけるTHR-123の濃度。アルファ相(D)は注射した用量の約90％に相当し、かつ非常に短い半減期を有していた。ベータ相(E)は注射した用量の残り10％に相当し、かつずっと長い半減期(55〜58分)を有していた。F.125I-THR-123の組織分布。ラットへの125I標識-THR-123の6.25 mg／kg-体重の用量での静脈内投与の6時間後に、組織を採取して自動ガンマウェルカウンターにより分析した。放射能の大半は腎臓及び膀胱に局在していた。G.THR-123の経口投与及び身体からのTHR-123の排出。5 mg／kg体重の用量で経口的に投与した125I標識-THR-123の放射能は、投与後1〜6時間は腎臓に局在し、また3時間前後でピークに達した。125I標識-THR-123由来の放射能は、投与の24時間後に腎臓から完全に除去された。
【図４５−２】図４５−１の続きである。
【図４５−３】図４５−２の続きである。
【図４５−４】図４５−３の続きである。
【図４６】THR-123のin vitro安定性。THR-123を、新たに採取したラット血液(雄のSprague-Dawley、0.35 kg BW)及び血漿、並びにPBS-マンニトール緩衝溶液中に0.1 mg／mLの最終濃度でスパイクした。血液、血漿及び緩衝液入りマスターチューブを37℃で最長6時間インキュベートしてから、500μL(血液)及び250μL(血漿及び血液)の二重サンプルを0、7.5、15、30、60、120、240及び360分の時点で分析用に捕集した。サンプルを、1μg／mLの検出限界を有するLC-MS-MS法を利用して、THR-123について分析した。THR-123は、血漿中では緩やかに分解(半減期は358分)され、また血中ではより速やかに分解され、その半減期はたった70分であった。PBS-マンニトール緩衝液中では、400分を越えても分解は観察されなかった。
【図４７−１】THR-123の抗炎症活性。PTEC-由来HK-2(HK-2)細胞を24-ウェルプレートで培養した(30,000個の細胞／ウェル)。細胞をK-SFM培地単独又はTNF-α(5 ng／mL)に曝露した。TNF-αインキュベーションの24時間後、細胞を予め温めておいた培養培地で2回洗浄し、その後細胞を、様々な濃度のTHR-123又はBMP7と共に60時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、培養培地を回収してELISA分析を実施した。A：IL-6、B：IL-8及びC：ICAM-1の結果を示す。分析は3回ずつ実施し、データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。
【図４７−２】図４７−１の続きである。
【図４８】THR-123は、NP-1細胞においてTGF-β-誘導アポトーシスを阻害した。NP-1細胞を指定分子の存在下で24時間、TGF-β(3 ng／mL)と共にインキュベートした。アポトーシスはアネキシンV標識(Roche)により分析した。TGF-βのみ(A)、TGF-β＋BMP-7(1μg／mL)(B)、TGF-β＋THR-123(10μM)(C)及びTGF-β＋対照ペプチド(D)で処理した細胞の代表的な合成写真(グリーン：アネキシンV及び明視野像)。TGF-βはアポトーシスを増加させ、またBMP-7及びTHR-123はアポトーシスを減少させた。
【図４９】THR-123は、NP-1細胞において低酸素-誘導アポトーシスを阻害した。NP-1細胞は、指定分子の存在下で24時間、低酸素(2.5％O2)下でインキュベートした。アポトーシスはアネキシンV標識(Roche)により分析した。低酸素のみ(A)、低酸素＋BMP-7(1μg／mL)(B)、低酸素＋THR-123(10μM)(C)及び低酸素＋対照ペプチド(D)で処理した細胞の代表的な合成写真(グリーン：アネキシンV及び明視野像)。低酸素はアポトーシスを増加させ；BMP-7及びTHR-123はアポトーシスを減少させた。
【図５０】THR-123はヒト近位尿細管上皮細胞(HK2)においてシスプラチン-誘導アポトーシスを阻害した。不死化ヒト近位尿細管上皮-由来HK-2(ヒト腎臓-2)細胞を24-ウェルプレートに継代した(25,000〜30,000個以下の細胞／ウェル)。該細胞を、K-SFM培地単独又はTHR-123含有K-SFM培地に曝露した。BMP7は実験の陽性対照としての役割を果たした。インキュベーションの2時間後、細胞をシスプラチンに60時間曝露した(A〜C)。D.細胞をシスプラチンに6時間曝露し、その後THR-123を培地に添加した。アポトーシスは、アネキシンV-FITCアポトーシス検出キット(TACS Annexin V-FITC)(R＆D Systems)の染色とその後の蛍光顕微鏡法により判定した。最終濃度：THR-123 250μM、BMP-7 1μg／mL、シスプラチン10μM。
【図５１−１】THR-123は、NP-1細胞において上皮間葉転換を阻害した。A〜E：明視野像。EGFと共にTGF-β(無血清DMEM培地中各3 ng／mL)に48時間曝露した細胞はEMTを起こし、また対照細胞と比較してその細胞形態の顕著な伸長を示した(A,B)。BMP-7(1μg／mL)又はTHR-123(10μM)との共インキュベーションによりこれらの表現型の変化が予防された(C,D)。対照ペプチドはTGF-β-誘導EMTに対して効果を示さなかった(E)。F〜J.E-カドヘリン免疫蛍光標識。NP-1細胞は細胞辺縁にE-カドヘリンを発現した(F)。TGF-βに48時間曝露した細胞は、対照細胞と比較してE-カドヘリンレベルの顕著な低下を呈した(F,G)。BMP-7(1μg／mL)又はTHR-123(10μM)の共インキュベーションにより、E-カドヘリンの消失が予防された(H,I)。対照ペプチドはTGF-β-誘導EMTに対して効果を示さなかった(J)。代表的な結果を示す。
【図５１−２】図５１−１の続きである。
【図５２−１】THR-123は、MCT細胞において上皮間葉転換を阻害した。THR-123によるEMTの阻害。TGF-β(無血清DMEM培地中各2.5 ng／mL)に48時間曝露した細胞はEMTを起こし、またその細胞形態の顕著な伸長を示した(B)。THR-123(10μM)の共インキュベーションにより、これらの表現型の変化が予防された(C)。D, E 間葉マーカーCTGF(D)及びSnail1(E)のqPCR分析。全RNAを細胞から抽出した。1μgの全RNAを相補的cDNAを作製するために使用し、その後qPCRを実施した。N＝3。データはグラフ内に平均±s.e.m.として表記した。
【図５２−２】図５２−１の続きである。
【図５３−１】NP-1細胞におけるTHR-123によるEMTの逆転。A〜E：倒立顕微鏡写真。A.NP1細胞の基底多角形上皮性の性質。B.TGF-β及びEGFとの48時間のインキュベーションによりEMTが誘導され、また伸長した、紡錘形の細胞が示された。C, D.BMP7(1μg／mL)(C)又はTHR-123(10μM)(D)を、TGF-β及びEGFでさらに48時間誘導した間葉様細胞に添加した。該細胞は形態の逆転を示し、また多角形上皮性の性質を再度示した(C,D)。E.対照ペプチドはEMTを逆転させなかった。F.長さと幅の比を逆転実験において算出した。ウェルの異なる領域における細胞の代表的な写真5枚を、倒立顕微鏡を使用して撮影した。合計100個の細胞を分析した(写真1枚あたり20個の細胞)。上皮細胞形態は低い比を特徴とし、また間葉細胞は高い比を呈した。データをグラフ内に平均＋s.e.m.として提示した。G.基本的な長さ対幅比のNP-1細胞は1.4±0.2(平均±SD)を呈した。平均＋1SDを上皮の特徴と推定し、さらに各実験環境における上皮の特徴の割合を推定した。BMP7で処理したNP-1細胞の18％及びTHR-123で処理したNP-1細胞の24％が上皮の特徴を取り戻した。H〜L.E-カドヘリンについての免疫蛍光写真。TGF-βとのインキュベーションにより、無処理細胞と比較してE-カドヘリンレベルが低下した(H,I)。BMP-7(J)及びTHR-123(K)はTGF-βと共にインキュベートしたNP-1細胞におけるE-カドヘリン発現を逆転させた。対照ペプチドはE-カドヘリンレベルに対して効果を呈しなかった(L)。3回の独立した実験から得た代表的な結果を示す。
【図５３−２】図５３−１の続きである。
【図５３−３】図５３−２の続きである。
【図５４−１】THR-123はMCT細胞においてTGF-β-誘導EMTを逆転させた。A〜E.TGF-β及びEGFの48時間のインキュベーションにより細胞にEMTを誘導した(E)。EMTの誘導後、細胞をBMP-7(1μg／mL)(C)、THR-123(10μM)(D)又は対照ペプチド(E)と共にさらに48時間インキュベートした。EMTの逆転が観察された(C,D)。対照ペプチドは効果を呈しなかった(E)。F.長さと幅の比を逆転実験において算出した。ウェルの異なる領域における細胞の代表的な写真5枚を、倒立顕微鏡を使用して撮影した。合計100個の細胞を分析した(写真1枚あたり20個の細胞)。上皮細胞形態は低い比を特徴とし、また間葉細胞は高い比を呈した。データをグラフ内に平均±s.e.m.として提示した。G：MCT細胞における3以下の長さ対幅比を上皮の特徴と推定し、さらに各実験環境における上皮の特徴の割合を推定した。BMP7で処理したMCT細胞の52％及びTHR-123で処理したMCT細胞の41％が上皮の特徴を取り戻した。実験は3回繰り返した。
【図５４−２】図５４−１の続きである。
【図５４−３】図５４−２の続きである。
【図５５】虚血再灌流傷害により誘導した急性の尿細管損傷に対するTHR-123の効果。虚血再灌流傷害(IRI)は、25分間にわたる左腎茎のクランピングにより誘導した。虚血再灌流傷害後、犠牲死の日までマウスにTHR-123を経口的に(5mg／kg／日)投与するか、又はPBSを投与した。A.リン酸緩衝食塩水で処理したマウスにおける虚血性再灌流後の腎臓組織像は、重度の急性尿細管壊死を示した。矢印は壊死尿細管を示している。B.虚血性再灌流処置後のTHR-123の同時施与により処理したマウスにおける腎臓組織像は、軽度の尿細管壊死を示した。C.THR-123で処理したマウスにおける腎尿細管壊死の割合は、リン酸緩衝液で処理したマウスより有意に少なかった。各群において10視野を分析した。D.IRI7日目にQuantiChrom比色尿素アッセイにより推定した血中尿素窒素。全ての群で差は認められなかった。PBS群(n＝5)及びTHR-123-処理群(n＝4)を分析した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。
【図５６−１】片側性尿管閉塞(UUO)を患うマウスに対するTHR-123の効果。UUOの当日に、BMP-7(300μg／Kg／隔日、腹腔内投与)又はTHR-123(5 mg／Kg／日、経口又は腹腔内投与)を開始した。A〜D：正常腎臓、5日目のUUO腎臓のマッソン三色染色。A.正常腎臓切片。B.5日目のUUOマウス腎臓は、正常糸球体、尿細管萎縮、尿細管拡張及び間質炎症を示した。C,D.THR-123を5 mg／kg(C)又は15 mg／kg(D)で用いて経口的に処理したUUOマウスの腎臓は、より少ない尿細管萎縮、尿細管拡張及び間質炎症を示した。E.相対的間質容積についての形態計測解析。間質容積は点算法により算出した。F〜I.正常腎臓、7日目のUUO腎臓のマッソン三色染色。BMP7を腹腔内に(G)又はTHR-123を腹腔内に(H)／経口的に(I)用いて処理したUUOマウスは、PBS処理(F)と比較して少ない腎臓間質容積を示した。I.相対的間質容積についての形態計測解析。間質容積は点算法により算出した。尿細管間質病変の定量化のために、1つの腎臓あたり8視野を各マウスにおいて分析した。正常マウス(n＝4)、5日目の無処理UUOマウス(n＝4)、5 mg／kgのTHR-123で処理した5日目のUUOマウス(n＝4)、15 mg／kgのTHR-123で処理した5日目のUUOマウス(n＝4)、PBSで処理した7日目のUUOマウス(n＝8)、BMPで処理した7日目のUUOマウス(n＝8)並びにTHR-123で処理した7日目のUUOマウス(i.p.及び経口共にn＝7)。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。
【図５６−２】図５６−１の続きである。
【図５７−１】片側性尿管閉塞(UUO)を患うマウスに対するTHR-123の効果(H＆E染色)。UUOを実施した日に、BMP7(300μg／Kg／隔日、腹腔内投与)又はTHR-123(5 mg／Kg／日、経口もしくは腹腔内投与)の処理を開始した。A.正常腎臓切片。B.5日目のUUOマウス。C,D.THR-123を5 mg／kg(C)又は15 mg／kg(D)で用いて経口的に処理したUUOマウスの腎臓。E〜H.7日目のUUO腎臓の組織像。PBSで処理した7日目のUUO腎臓(E)と比較した場合、BMP7を腹腔内に(F)又はTHR-123を腹腔内に(G)／経口的に(H)用いて処理したUUOマウスは腎臓において保存された尿細管を呈した。正常マウス(n＝4)、5日目の無処理UUOマウス(n＝4)、5 mg／kgのTHR-123で処理した5日目のUUOマウス(n＝4)、15 mg／kgのTHR-123で処理した5日目のUUOマウス(n＝4)、PBSで処理した7日目のUUOマウス(n＝8)、BMPで処理した7日目のUUOマウス(n＝8)並びにTHR-123で処理した7日目のUUOマウス(i.p.及び経口共にn＝7)。
【図５７−２】図５７−１の続きである。
【図５８】UUOを患うマウスにおける線維化マーカーについての遺伝子発現解析。正常腎臓、及び指定の処理を行ったか又は行っていない7日目のUUO腎臓におけるフィブロネクチン-EIII及びI型コラーゲンの定量的RT-PCR分析。
【図５９−１】AA-123は腎毒性血清腎炎を患うマウスにおいて腎線維化を逆転させた。A〜D.無処理対照マウス(A)；6週目のNTNマウス(B)；NTN後9週目のマウス(C)；及びNTN 6週目にTHR-123の投与を開始した9週目のNTNマウス(D)から得た腎臓切片の代表的なマッソン三色染色写真、オリジナル倍率×200。E〜G.対照マウス(0週)(n＝5)、NTNの誘導から1週間後(n＝6)、3週間後(n＝8)、及び6週間後(n＝6)のマウス、並びにNTN 6週目にTHR-123の投与を開始した9週目のNTNマウス(THR-123(6〜9W)(n＝6))から得た、糸球体硬化スコアの割合(E)、尿細管萎縮指数(F)、及び線維化指数(G)を評価する、形態計測解析。H.NTN 6週目(n＝3)、NTN 9週目(n＝5)、及びNTN 6週目にTHR-123の投与を開始したNTN 9週目(n＝5)のマウスに対する血中尿素窒素測定。I〜L.対照無処理マウス(I)、6週目のNTNマウス(J)、9週目のNTNマウス(K)、及びNTN 6週目にTHR-123の投与を開始した9週目のNTNマウス(L)から得た腎臓のE-カドヘリン／FSP1免疫標識。代表的な結果を示す。M.E-カドヘリン／FSP1二重陽性尿細管の割合は、スライド1枚あたり500個の尿細管、1実験群あたり5枚のスライドとして二重標識尿細管の数を数えることにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として表記した。
【図５９−２】図５９−１の続きである。
【図５９−３】図５９−２の続きである。
【図６０】腎毒性血清腎炎を患うマウスから得た腎臓に対する光学顕微鏡(H＆E)分析。無処理対照マウス(A)；6週目のNTNマウス(B)、9週目のNTNマウス(C)；及びNTN誘導から6週間後にTHR-123の投与を開始した9週目のNTNマウス(D)から得た腎臓の代表的な組織H＆E染色、倍率×200。
【図６１】腎毒性血清腎炎を患うマウスにおける線維化マーカーについての遺伝子発現解析。対照マウス(NTS 0週目)(n＝5)、NTN 1週間後(n＝6)、NTN 3週間後(n＝8)、及びNTN 6週間後(n＝6)のマウス、並びにNTN誘導から6週間後にTHR-123の投与を開始したNTN 9週目のマウス(THR-123(6〜9W)(n＝6))の腎臓における、フィブロネクチン(FN-EIII)及びI型コラーゲン(COL-I)についての定量的リアルタイムPCR測定を介した折りたたみ遺伝子の発現。
【図６２】腎毒性血清腎炎を患うマウスにおけるマクロファージの解析。A〜C.無処理対照マウス(A)、6週目のNTNマウス(B)；及び9週目のNTNマウス(C)、並びにNTNの誘導から6週間後にTHR-123の投与を開始したNTN処理9週目のマウス(D)から得た腎臓のMac-1免疫標識、倍率×400。E.1視野あたりのマクロファージの数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野内の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。
【図６３】NTNにおけるリン酸化-smad1/5標識。A〜C.指定動物群の凍結腎臓切片を、リン酸化-smad1/5(p-smad1/5)抗体、続いてFITC結合二次抗体を用いて標識した。p-smad1/5レベルを蛍光顕微鏡法により分析した。パネル(C)中の矢印は核に蓄積したp-smad1/5を示している。D.p-smad1/5レベルの定量化。1視野あたりのp-smad1/5の数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野内の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。
【図６４−１】AA-123はCOL4A3欠損マウスにおいて腎線維化を阻害した。A〜C.16週齢の野生型マウス(A)；16週齢のCOL4A3-／-マウス(B)、及びTHR-123で処理した16週齢のCOL4A3-／-マウス(C)から得た糸球体の代表的な組織PAS染色、オリジナル倍率×400。D〜F.16週齢の野生型マウス(D)；16週齢のCOL4A3-／-マウス(E)、及びTHR-123で処理した16週齢のCOL4A3-／-マウス(F)から得た腎臓の代表的な組織マッソン三色染色、オリジナル倍率×100。G〜I.16週齢の野生型マウス(n＝5)、16週齢のCOL4A3-／-マウス(n＝5)及びTHR-123で処理した16週齢のCOL4A3-／-マウス(n＝5)から得た、正常糸球体の割合(G)、尿細管損傷指数(H)、相対的間質容積(I)を評価する形態計測解析。J.20週齢の野生型マウス(n＝5)、16週齢のCOL4A3-／-マウス(n＝5)及びTHR-123で処理したCOL4A3-／-マウス(n＝5)の血中尿素窒素測定。K〜M.腎臓のFSP1／E-カドヘリン免疫標識。代表的な結果を示す。N.E-カドヘリン／FSP1二重陽性尿細管の割合、スライド1枚あたり500個の尿細管、1実験群あたり5枚のスライド。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として表記した。
【図６４−２】図６４−１の続きである。
【図６５】COL4A3欠損マウスにおけるマクロファージの解析。A〜C. 16週齢の野生型マウス(A)、16週齢のCOL4A3-／-マウス(B)及びTHR-123で処理した16週齢のCOL4A3-／-マウス(C)から得た腎臓のMac-1免疫標識。オリジナル倍率×400。D.1視野あたりのマクロファージの数の形態計測解析(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。野生型マウスは図中ではCOL4A3＋／＋と表記した。
【図６６】COL4A3欠損マウスにおけるリン酸化-smad1/5染色。A,B.指定動物群の凍結腎臓切片を、リン酸化-smad1/5(p-smad1/5)抗体、続いてFITC結合二次抗体により標識した。p-smad1/5レベルを蛍光顕微鏡法により分析した。パネル(B)中の矢印は、核に蓄積したp-smad1/5を示している。C.p-smad1/5レベルの定量化。1視野あたりのp-smad1/5の数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。
【図６７−１】THR-123はマウス糖尿病性腎症の経過を逆転させた。ストレプトゾトシン-誘導糖尿病CD-1マウスを、BMP7(300μg／kg 隔日、IP、糖尿病誘導の1ヶ月後から6ヶ月後まで)又はTHR-123(5 mg／kg／日、経口、糖尿病誘導の5ヶ月後から6ヶ月後まで)で処理した。無処理対照マウス(A,F)；5ヶ月目の糖尿病性腎症マウス(DN)(B,G)；6ヶ月目のDNマウス(C,H)；BMP7で処理した6ヶ月目のDNマウス(D,I)；及びTHR-123で処理した6ヶ月目のDNマウス(E,J)から得た腎臓切片の代表的な組織PAS染色(A〜E)及びマッソン三色染色(F〜J)。倍率×400(A〜E)及び×100(F〜J)。K〜N：糸球体及び尿細管間質の形態計測解析。糸球体表面積(K)、メサンギウム基質(L)、尿細管萎縮(M)及び相対的間質容積(N)を分析した。糸球体の定量化の場合、各マウスにおいて20個の糸球体を分析した。尿細管間質病変の定量化の場合、1つの腎臓あたり8視野を各マウスにおいて分析した。O：糖尿病マウスにおける血中尿素窒素レベルに対するTHR-123の効果。P〜T：FSP1及びE-カドヘリンの検出のための、正常(Q)マウス腎臓又はBMP7(S)もしくはTHR-123(T)で処理した糖尿病(Q〜T)マウス腎臓の免疫蛍光分析(倍率×200)。パネル(Q)及び(R)中の矢印は、FSP1及びE-カドヘリン二重陽性尿細管を示している。U.FSP1＋細胞の割合の定量分析を示す(U)。マウス1匹あたり10視野を分析した。全ての分析において、対照(n＝5)、糖尿病5ヶ月目(n＝6)、糖尿病6ヶ月目(n＝10)、BMP7で処理した糖尿病(n＝4)及びTHR-123で処理した糖尿病(n＝9)を分析した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として表記した。
【図６７−２】図６７−１の続きである。
【図６７−３】図６７−２の続きである。
【図６８】糖尿病マウスにおける腎臓のPAS染色。対照(A)、5ヶ月目の糖尿病性腎症(DN)(B)、6ヶ月目のDN(C)、BMP7(D)又はTHR-123(E)で処理したDNのPAS染色(×200)を示す。対照(n＝5)、糖尿病5ヶ月目(n＝6)、糖尿病6ヶ月目(n＝10)、BMP-7で処理した糖尿病(300μg／kg 隔日、IP、糖尿病誘導の1ヶ月後から6ヶ月後まで、n＝4)、THR-123で処理した糖尿病(5 mg／kg／日、経口、糖尿病誘導の5ヶ月後から6ヶ月後まで、n＝9)を分析した。代表的な写真を示す。
【図６９】THR-123は糖尿病性腎症を患うマウスにおいてマクロファージの浸潤を減少させた。正常(A)及びビヒクル、BMP7又はTHR-123で処理した糖尿病性腎症(DN)(B〜D)のMac-1免疫蛍光研究。倍率×400。マクロファージは正常腎臓の皮質野には殆ど存在しない(A)。DNの5又は6ヶ月後には、マクロファージが萎縮尿細管の周囲に頻繁に見られた(B,C)。BMP7(D)及びTHR-123(E)はマクロファージによる浸潤を有意に減少させた。代表的な写真を示す。F.1視野あたりのマクロファージの数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。糖尿病性腎症は図中ではDNと表記した。
【図７０】THR-123はDNにおいてリン酸化-smad1/5標識を増加させた。A〜D.指定動物群の凍結腎臓切片を、リン酸化-smad1/5(p-smad1/5)抗体、続いてFITC結合二次抗体を用いて標識した。p-smad1/5レベルを蛍光顕微鏡法により分析した。パネル(C)及び(D)中の矢印は核に蓄積したp-smad1/5を示している。(E)p-smad1/5レベルの定量化。1視野あたりのp-smad1/5の数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。糖尿病性腎症は図中ではDNと表記した。
【図７１−１】カプトプリルとTHR-123の組み合わせは、進行性糖尿病性腎症に関連する線維化の進行を阻害した。ストレプトゾトシン-誘導糖尿病CD-1マウスを、カプトプリル(p.o. 50 mg／Kg／日、糖尿病誘導の7ヶ月後から8ヶ月後まで)又はカプトプリルとTHR-123(p.o. 5 mg／kg／日、糖尿病誘導の7ヶ月後から8ヶ月後まで)の組み合わせを用いて処理した。7ヶ月目のDN(A,E)；8ヶ月目のDN(B,F)；カプトプリルで処理した8ヶ月目のDN(C,G)；カプトプリルとTHR-123の組み合わせを用いて処理した8ヶ月目のDN(D,H)の腎臓切片の代表的な組織PAS染色(A〜D)及びマッソン三色染色(E〜H)。倍率×400(A〜D)及び×100(E〜H)。I〜L：糸球体表面積(I)、メサンギウム基質(J)、尿細管萎縮(K)及び相対的間質容積(L)の形態計測解析。糸球体の定量化の場合、各マウスにおいて20個の糸球体を分析した。尿細管間質病変の定量化の場合、1つの腎臓あたり8視野を各マウスにおいて分析した。M：糖尿病マウスにおける血中尿素窒素レベルに対するTHR-123の効果。N〜Q：E-カドヘリン／FSP1の検出のための免疫蛍光分析(倍率×200)。パネル(N)及び(O)中の矢印は、E-カドヘリン／FSP1二重陽性尿細管を示している。R.E-カドヘリン／FSP1二重陽性尿細管の割合に関する定量分析を示す。1つの腎臓あたり10視野を分析した。全ての分析を、無処理で7ヶ月目の糖尿病マウス(n＝2)、無処理で8ヶ月目の糖尿病マウス(n＝3)、カプトプリルで処理した8ヶ月目の糖尿病(n＝3)及び8ヶ月目の糖尿病におけるカプトプリルとTHR-123の併用療法(n＝4)において実施した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として表記した。
【図７１−２】図７１−１の続きである。
【図７１−３】図７１−２の続きである。
【図７２】THR-123及びカプトプリルは糖尿病性腎症を患うマウスにおいてマクロファージの浸潤を低減した。7ヶ月目の糖尿病性腎症(DN)(A)、8ヶ月目のDN(B)、カプトプリルで処理した8ヶ月目のDN(C)及びカプトプリルとTHR-123の組み合わせで処理した8ヶ月目のDN(D)のMac-1免疫蛍光研究を示す。DNマウスでは、尿細管に蓄積するマクロファージが7〜8ヶ月目のDNで有意に増加した。カプトプリルは部分的に、またカプトプリルとTHR-123の組み合わせは完全に、マクロファージによる浸潤を阻害した。代表的な写真を示す。E.1視野あたりのマクロファージの数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。糖尿病性腎症は図中ではDNと表記した。
【図７３】糖尿病マウスの血糖値及び体重。血糖値(A,B)及び体重(C,D)の測定。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。
【図７４】DNにおけるカプトプリル／THR-123アポトーシス。A〜C.尿細管細胞のアポトーシスを、指定動物群の凍結腎臓切片においてTUNEL染色により分析した。パネル(A)中の矢印は、TUNEL陽性尿細管細胞を示している。(D)TUNEL陽性尿細管細胞の定量化。1視野あたりのTUNEL陽性尿細管の数(倍率×200)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。糖尿病性腎症は図中ではDNと表記した。
【図７５】カプトプリル／THR-123はDNにおいてリン酸化-smad1/5標識を増加させた。A〜C.指定動物群の凍結腎臓切片を、リン酸化-smad1/5(p-smad1/5)抗体、続いてFITC結合二次抗体により標識した。リン酸化-smad1/5レベルを蛍光顕微鏡法により分析した。パネル(C)中の矢印は、核に蓄積したリン酸化-smad1/5を示している。(D)p-smad1/5レベルの定量化。1視野あたりのp-smad1/5の数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。糖尿病性腎症は図中ではDNと表記した。
【図７６−１】THR-123は腎疾患モデルにおいて受容体としての尿細管Alk3に作用した。A〜D. Alk3flox/floxマウス及びγGTCre；Alk3flox/floxマウスにおける、IRIモデルの腎臓傷害に対するTHR-123の効果。虚血再灌流傷害後、犠牲死の日まで該マウスにTHR-123を経口的に(5mg／kg／日)投与した。A〜C. 指定マウス群の代表的なH＆E染色写真を示す。D.IRIにおける腎尿細管壊死の割合。各群において10視野を分析した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。E〜T. Alk3flox/floxマウス及びγGTCre；Alk3flox/floxマウスにおけるNTNモデルの腎臓傷害に対するTHR-123の効果。指定マウス群にNTNを導入してから6週間後、マウスをPBS又はTHR-123で経口的に処理した。E〜H. 指定マウス群の代表的なMTS染色写真を示す。I. 指定群における9週目のNTNモデルからの形態計測解析。J〜N. Alk3flox/floxマウス及びγGTCre；Alk3flox/floxマウスにおけるNTNモデルの腎臓のマクロファージ蓄積分析。J〜M. 指定マウス群のMac-1免疫蛍光研究。N. 1視野あたりのマクロファージの数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として示した。O〜SはEMT分析であり、O〜RはPBS又はTHR-123で処理したNTN-誘導Alk3flox/floxマウス及びGTCre；Alk3flox/floxマウスにおける腎臓のE-カドヘリン／FSP1免疫標識である。S.E-カドヘリン／FSP1二重陽性尿細管の割合。スライド1枚あたり500個の尿細管、1実験群あたり5枚のスライドを分析した。データはグラフ内に平均±s.e.m.として表記した。T. 指定マウス群(全てn＝4)における6及び9週目のNTNでの血中尿素窒素測定。
【図７６−２】図７６−１の続きである。
【図７７】THR-123は、Alk-3欠失マウスのIRI腎臓におけるマクロファージ蓄積を阻害しなかった。虚血再灌流傷害(IRI)は、25分間にわたる左腎茎のクランピングにより誘導した。虚血再灌流傷害後、犠牲死の日まで該マウスにTHR-123を経口的に(5mg／kg／日)投与するか、又はPBSを投与した。A〜C.指定群におけるMac-1免疫蛍光研究。D.1視野あたりのマクロファージの数(倍率×400)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。
【図７８】THR-123はAlk-3欠失マウスのIRI腎臓におけるアポトーシスを阻害しなかった。虚血再灌流傷害(IRI)は、25分間にわたる左腎茎のクランピングにより誘導した。虚血再灌流傷害後、犠牲死の日まで該マウスにTHR-123を経口的に(5mg／kg／日)投与するか、又はPBSを投与した。A〜C.尿細管細胞のアポトーシスを、指定動物群の凍結腎臓切片においてTUNEL染色により分析した。D.TUNEL陽性尿細管細胞の定量化。1視野あたりのTUNEL陽性尿細管の数(倍率×200)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。
【図７９】THR-123はAlk-3欠失マウスのNTN腎臓におけるアポトーシスを阻害しなかった。A〜D.尿細管細胞のアポトーシスを、指定動物群の凍結腎臓切片においてTUNEL染色により分析した。代表的な写真を示す。D.TUNEL陽性尿細管細胞の定量化。1視野あたりのTUNEL陽性尿細管の数(倍率×200)は、1実験群あたり5枚のスライドを用いて、スライド1枚あたり5箇所のランダムな視野中の陽性標識細胞を計数することにより評価した。データはグラフ内に平均＋s.e.m.として示した。
【図８０】図80は、蛍光顕微鏡写真のRGB画像の定量分析の根拠となる幾何学的基礎を図示したものである。
【図８１−１】図81は、Photoshopで得たヒストグラムのRGB解析を利用した、試験化合物に対する蛍光顕微鏡写真の分析の1例を示したものである。図81Aは100 mM D-グルコースで処理した細胞の視野の分析の1例であって、0％のE-カドヘリンシグナルに相当し；図81Bは培地のみに曝露した細胞の視野の分析の1例であって、100％のシグナルに相当し；また図81Cは100 mM D-グルコースと100μM試験ペプチドの両方に曝露した細胞の視野の分析の1例である。この分析を基に、60％のスコアをこの画像に割り当てた、すなわち、該試験ペプチドの効果は、100 mM D-グルコースの存在にもかかわらず、培地単独の場合に観察されたE-カドヘリンシグナルの60％を維持することであった。
【図８１−２】図８１−１の続きである。
【図８１−３】図８１−２の続きである。
【００２７】
いかなる形でも本発明を制限する意図はなく、又は上記図面により提供される開示内容を制限する意図はないが、該図面はTHR-123(配列番号1)がSmad及びp38 MAPK BMPシグナル伝達の両方を通じて作用し、かつ腎炎、高-グルコース(高血糖)誘導上皮間葉転換(EMT)及び腎線維化を阻害することを一括して明示するものである。上記図面中に提供したデータはさらに、骨形成性を誘導することなくBMPシグナル伝達経路(例えば、Smad及びp38 MAPK)を標的化する本発明の化合物が、腎疾患への新規薬理学的介入を提供しうることを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
最近になって、TGF-βスーパーファミリータンパク質のペプチドアゴニストがUS 7,482,329、WO2007／035872、及びWO2006／009836(これらの文献は各々、それらの全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする)に記載された。本発明は、これらの化合物の一部がBMP受容体(例えば、I型及びII型受容体)を介してBMPシグナル伝達を誘導し、それによってTGF-β1-誘導EMT、ひいては線維化の阻害及び／又は逆転をもたらすことができるという知見に基づいている。近年、線維形成の中心的なメディエーターとしてのトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)がEMTを誘導し、EMTが今度は線維化を仲介することが見出された。BMP-7がTGF-β-誘導EMTを逆転させることがさらに確認され、それによって、EMTを介して生じる線維化を中和する上でのBMP-7の役割が示唆された。本発明のペプチド(本明細書中にさらに詳しく記載する)は、様々な状態、例えば、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症に関連するEMT及び線維化の阻害及び／又は逆転に有効であることが見出された。
【００２９】
用語の定義及び使用
本発明は、後述する本発明の実施形態の詳細な説明及び本明細書中に含まれる実施例を参照することで、より容易に理解されるであろう。本発明の方法及び技術を開示及び記載する前に、本発明は具体的な分析又は合成方法に限定されるものではなく、それら自体は当然変更しうることを理解されたい。同様に、本明細書中で使用した用語は単に特定の実施形態を説明するためのものであって、限定を意図したものではないということも理解されたい。他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の熟練者が通常理解している意味を有する。
【００３０】
本明細書及び添付した特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上明らかに他の意味を指している場合を除き、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「遺伝子(a gene)」への言及は、1種又はそれ以上の遺伝子への言及であり、また当業者に公知のその等価物などを含む。
【００３１】
「芳香族アミノ酸」は、本明細書中で使用する場合、共役電子系を有する少なくとも1つの環(芳香族基)を含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。該芳香族基は、置換基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、スルファニル、ニトロ及びアミノ基、並びに他のものでさらに置換されていてもよい。遺伝的にコードされている芳香族アミノ酸の具体例としては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。一般的に見られる遺伝的にコードされていない芳香族アミノ酸としては、フェニルグリシン、2-ナフチルアラニン、□-2-チエニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【００３２】
「脂肪族アミノ酸」は、本明細書中で使用する場合、飽和又は不飽和の直鎖、分岐又は環状炭化水素側鎖を有する無極性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされている脂肪族アミノ酸の具体例としては、アラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンが挙げられる。コードされていない脂肪族アミノ酸の具体例としては、ノルロイシン(Nle)が挙げられる。
【００３３】
「酸性アミノ酸」は、本明細書中で使用する場合、pK値が7未満の側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの損失により生理的pHでは負電荷を帯びる側鎖を有する。遺伝的にコードされている酸性アミノ酸の具体例としては、アスパラギン酸(アスパルテート)及びグルタミン酸(グルタメート)が挙げられる。
【００３４】
「塩基性アミノ酸」は、本明細書中で使用する場合、pK値が7を上回る側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により生理的pHでは正電荷を帯びる側鎖を有する。遺伝的にコードされている塩基性アミノ酸の具体例としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸の具体例としては、非環状アミノ酸であるオルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノブチル酸及びホモアルギニンが挙げられる。
【００３５】
「極性アミノ酸」は、本明細書中で使用する場合、生理的pHでは電荷を帯びないが、2つの原子によって共有される１対の電子がその原子のうちの１つにより密接に保持される結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされている極性アミノ酸の具体例としては、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。遺伝的にコードされていない極性アミノ酸の具体例としては、シトルリン、N-アセチルリジン及びメチオニンスルホキシドが挙げられる。
【００３６】
当業者には理解されるように、上記の分類は絶対的なものではなく、数種のアミノ酸は2つ以上の特徴的性質を呈し、またそれ故に2つ以上のカテゴリーに含まれる可能性がある。例えば、チロシンは芳香族環と極性ヒドロキシル基の両方を有する。従って、チロシンは二重の性質を有しており、また芳香族カテゴリーと極性カテゴリーの両方に含めることができる。
【００３７】
「対象」は、本明細書中で使用する場合、好ましくは哺乳動物、例えばヒトであるが、動物、例えば、飼い慣らされた動物(例えば、イヌ、ネコなど)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど)及び実験動物(例えば、ラット、マウス、モルモットなど)であってもよい。
【００３８】
化合物の「有効(な)量」は、本明細書中で使用する場合、所望の治療的及び／又は予防的効果を達成するのに十分な量、例えば、治療しようとする疾患、例えば、先に挙げたTGF-βスーパーファミリーポリペプチドに関連する疾患に関連する症状の予防又は低減をもたらす量である。対象に投与する化合物の量は、疾患の種類及び重症度並びに個体の特徴、例えば、一般的な健康状態、年齢、性別、体重及び薬物への耐性に依存する。該量は疾患の程度、重症度及び種類にも依存する。当業者であれば、これら及び他の要因に応じて適当な用量を決定することができるであろう。典型的には、本発明の化合物の、治療的又は予防的効果を達成するのに十分な有効量は、約0.000001 mg／kg体重／日〜約10,000 mg／kg体重／日である。好ましくは、この用量範囲は約0.0001 mg／kg体重／日〜約100 mg／kg体重／日である。本発明の化合物は、互いに組み合わせて、又は1種又はそれ以上の追加の治療化合物と共に投与することもできる。
【００３９】
「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドもしくはポリペプチド又は生物学的に活性なその部分は、組織分化因子-関連ポリペプチドが由来する細胞もしくは組織供給源からの細胞材料もしくは他の夾雑ポリペプチドを実質的に含まないか、又は化学的に合成する場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【００４０】
用語「変異体」は、本明細書中で使用する場合、本発明の化合物とは異なるが、その必須の性質を保持している化合物を指す。この非限定例は、基準化合物に関して保存的置換を有する、一般に縮重変異体として知られるポリヌクレオチド又はポリペプチド化合物である。変異体の別の非限定例は、構造的には異なるが、本発明の化合物と同じ活性ドメインを保持している化合物である。変異体は、N-末端又はC-末端の伸長、キャップが付加されたアミノ酸、反応性アミノ酸側鎖官能基の修飾、例えば、リジン残基からの分岐、PEG化、及び／又はポリペプチド化合物のトランケーションを含む。一般に、変異体は全体的に極めて類似しており、また多くの領域で本発明の化合物と同一である。従って、変異体はコード領域、非コード領域、又はその両方に変更を含んでいてもよい。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、1種又はそれ以上の治療法の局所投与又は同時投与に見られるような用語「局所」又は「局所的に」は、治療薬の、傷害部位に近接しているかもしくはその周囲の、傷害部位に隣接しているかもしくは傷害部位のすぐ近くの、傷害部位の周辺のもしくは傷害部位に接している、又は傷害組織もしくは臓器内又はその内部の身体部位への送達を指す。局所投与は、一般的には全身投与経路を含まない。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に有効なレジメン」は、薬物の濃度、量又はレベル、タイミング、及び繰り返しなどの側面、並びに投与すれば線維化を治療するのに有効である薬物の投与の経過中に加えたそのあらゆる変更を含む、1種又はそれ以上の治療薬の投与のための体系的計画を指す。当業者(一般的には、線維化状態を有する患者を治療する開業医を含む)であれば、過度の実験を行うことなく薬学的に有効なレジメンを決定する方法を評価しかつ理解するであろう。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、用語「同時投与する」、又は「同時投与」などは、2種又はそれ以上の薬剤、治療法、化合物、療法、又は同様のものを、同時に又はほぼ同時に投与する行為を指す。本発明の異なる薬剤、例えば、化学療法薬、抗線維化療法、又は免疫療法薬を投与する様式又は順序は変更してもよいし、またいずれか特定の順序に限定されることはない。同時投与するということは、2種又はそれ以上の薬剤を身体の異なる領域に、又は異なる送達スキームを介して投与する状況、例えば、第1薬剤を全身投与しかつ第2薬剤を組織傷害部位又は線維化が進行している部位に局所投与する状況、又は第1薬剤を局所投与しかつ第2薬剤を血中に入れて全身投与する状況を指す場合もある。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「実質的に線維化を逆転させる」は、標的組織又は臓器内の治療中の線維性物質又は成分が減少しているか又は完全に根絶されている状況を指す。線維化の実質的な逆転は、好ましくは、治療前と比較して、線維性成分又は物質の最少約10％、又は約25％、又は約50％、又はより好ましくは少なくとも約75％、又はより好ましくは約85％、又はさらにより好ましくは約90％、又はより好ましくはさらに約95％、又はより好ましくはさらに99％又はそれ以上が除去されている状況を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「実質的に線維化を阻害する」への言及は、所望の標的線維化部位における線維化の正味の量又はレベルが時間と共に増加しない状況を指す。
【００４６】
用語「薬学的に許容しうる」は、本明細書中で使用する場合、本明細書中に記載した化合物の生物学的な活性又は性質を無効にせず、かつ比較的毒性のない物質(例えば、担体又は希釈剤)を指す(すなわち、該物質は、望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、又は該物質を含有する組成物の成分のいずれかと有害な形で相互作用することなく個体に投与される)。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「選択的に」は、ある集団において別の集団よりも高い頻度で起こる傾向があることを意味する。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、互いに「連結(coupled)」している2種又はそれ以上の薬剤への言及に見られるような用語「連結」は、2種又はそれ以上の薬剤間の共有結合又は別の形の安定な会合を指す。例えば、本発明の治療用ペプチド(BMPアゴニストペプチド)は、第2の抗-線維化剤と、共有結合を介して、共有結合でつながれたリンカー部分を介して、又はイオン相互作用を通じて連結されていてもよい。好ましくは、互いに連結している1種又はそれ以上の薬剤は、実質的なそれらの同じ独立した機能及び特徴を保持している。例えば、治療薬は、別の薬剤と連結した場合に、該治療薬がまるで独立しているかのようにその同じ活性を保持していてもよい。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、用語「標的化部分」は、本発明の治療薬、又は他の薬剤(例えば、本発明のBMPアゴニストペプチド)の、本発明の標的細胞(例えば、傷害を有する組織及び線維化が起きている組織)を標的化する、該標的細胞と結合する、又は該標的細胞内に入るその能力を増強することができる部分である。ある特定の実施形態では、標的化部分はポリペプチド、炭水化物又は脂質である。場合によっては、標的化部分は抗体、抗体フラグメント又はナノボディである。例示的な標的化部分としては、腫瘍標的化部分、例えばソマトスタチン(sst2)、ボンベシン／GRP、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、ニューロペプチドY(NPY／Y1)、ニューロテンシン(NT1)、血管作動性腸ポリペプチド(VIP／VPAC1)及びコレシストキニン(CCK／CCK2)が挙げられる。ある特定の実施形態では、標的化部分は、本発明の薬剤と非共有結合的に会合する。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「レジメン」は、薬物又は薬剤がどのように投与されるかを特徴付ける様々なパラメーター、例えば、用量レベル、タイミング、及び反復、並びに種々の薬物又は薬剤の互いに対する比率を指す。用語「薬学的に有効なレジメン」は、所望の治療結果又は効果、例えば、EMT及び／又は線維化の実質的な阻害又は逆転を提供する特定のレジメンを指す。用語「反復」は、1種又はそれ以上の薬剤の投与を数セット繰り返すという一般概念を指す。例えば、薬物Xと薬物Yの組み合わせを、用量Zで第1日目に患者に与えてもよい(同時又はほぼ同時に任意の様式で同時投与する)。薬物X及びYは、その後用量Zで、又は別の用量で第2日目に再度投与してもよい(同時又はほぼ同時に任意の様式で同時投与する)。第1日目と第2日目の間のタイミングは、1日もしくは数日以内、又は1週間、又は数週間もしくは数ヶ月とすることができる。同様に、反復投与を同じ日に、指定の分数(例えば、10分、20分、30分もしくはそれ以上)又は時間数(例えば、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間)で分けて行ってもよい。有効な投与レジメンは、当業者、例えば処方医であれば標準的技法を利用して決定できるであろう。
【００５１】
線維化疾患
線維化疾患は、線維芽細胞の活性化、コラーゲン及びフィブロネクチンの産生増加、並びに収縮性筋線維芽細胞への分化転換を特徴とする。この過程は通常は数ヶ月及び数年かけて生じるものであり、また臓器機能不全又は死をもたらす可能性がある。線維化疾患の具体例としては、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症及び強皮症(全身性硬化症；SSc)が挙げられる。線維化疾患は有効な治療法が存在しない最大の障害群の1つであり、またそれ故に、線維化疾患は未だ満たされない重要な医療ニーズの象徴である。多くの場合、線維症を患う患者にとって唯一の救済策は臓器移植であり；臓器の供給量は需要を満たすには不十分であるため、患者は適切な臓器を受け取るのを待つ間に死亡することが多い。肺の線維化はそれだけでも強皮症肺疾患、特発性肺線維症、放射線-及び化学療法-誘導肺線維症における死亡並びに塵粒子の職業性吸入により引き起こされる状態における死亡の主な原因となりうる。主に線維化疾患の病因が本質的に不明であるという理由から、適当な抗-線維化療法の不在が生じる。線維化疾患において正常組織の修復がどのように制御され、かつこの過程がいかにして不首尾に終わるのかを理解することが不可欠であろう。
【００５２】
TGF-β及び線維化におけるその役割
トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)及び結合組織増殖因子(CTGF)などの線維化誘導タンパク質は、線維化疾患に関与することが示唆されている。TGF-βは線維芽細胞がECMを合成しかつ収縮させるよう誘導するので、このサイトカインは線維化反応の中心的なメディエーターであると長く信じられてきた(1)。ヒト内皮細胞により分泌されるタンパク質として10余年前に発見されたCTGF(2)は、TGF-βにより誘導されるものであり、また線維芽細胞に対するTGF-βの作用の下流のメディエーターと考えられている(3,4)。同様に、TGF-βは、フィブロネクチン転写物の選択的スプライシングを通じて生じるフィブロネクチンの変異体である、基質タンパク質フィブロネクチンのED-A型(ED-A FN)の発現を誘導する(5)。このED-A FNの誘導は、TGF-β1により誘発されるα-SMA及びI型コラーゲンの発現増強に必要である(6)。このため、TGF-βは、肺(7)及び腎臓(文献参照)を含む多くの組織における線維化の誘導の「マスタースイッチ」であるとされている。この点に関して、TGF-βはIPFを患う患者の肺、又はCKD患者の腎臓においてアップレギュレートされ、またラットの肺又は腎臓における活性TGF-βの発現は劇的な線維化反応を誘導し、一方でTGF-β1に応答する能力の欠如はブレオマイシン誘導性の線維化(8)又は腎間質線維化(30)からの保護を与える。
【００５３】
上皮間葉転換(EMT)及び線維化におけるその役割
十分に分化した上皮細胞が間葉表現型へと転換されて線維芽細胞及び筋線維芽細胞を生じるその過程であるEMTは、上皮傷害後の修復及び瘢痕形成において重要な役割を果たしていると次第に認識されつつある。この過程が肺及び他の臓器における傷害後の線維化に寄与するその程度は、活発な調査の対象である。近年、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-βがin vitro及びin vivoで肺胞上皮細胞(AEC)においてEMTを誘導すること、並びに上皮及び間葉マーカーが特発性肺線維症(IPF)を患う患者由来の肺組織のII型過形成(AT2)細胞に共局在していることが実証され、AECが肺線維化において極端な可塑性を呈しかつ線維芽細胞及び／又は筋線維芽細胞の供給源としての役割を果たしうることが示唆された。TGF-β1は、正常な乳房上皮細胞におけるEMTのインデューサーとして最初は記載され(9)、またその後に幾つかの異なる上皮細胞系(例えば、腎近位尿細管、水晶体、及び直近では肺胞上皮細胞)においてin vitroでEMTを仲介することが示された(10〜14)。
【００５４】
TGF-β1により誘導されるEMT及び線維化の逆転
EMTの逆転を生じさせるために幾つかの治療介入が行われている。BMP-7(骨形成タンパク質-7)は、TGF-β-誘導Smad3-依存性EMTを直接中和することにより成体の尿細管上皮細胞においてTGF-β1-誘導EMTを逆転させ、またEMTを介して起こる腎線維化の逆転の証拠がin vivoで示された(20)。BMP-7はSmad2のダウン-レギュレーションを伴って水晶体上皮におけるEMTを遅延させることが可能であり、一方、抑制性Smad7の過剰発現はEMTを予防し、かつSmad2及びSmad3の核移行を減少させた(21)。EMTはSmad3ノックアウトマウスで改善され(15,16)、またTGF-βシグナル伝達のアンタゴニストであるSmad7、又はSmad依存的な様式で作用する骨形成タンパク質-7(BMP-7)は腎及び水晶体の上皮における線維化を逆転させるか又は遅延させることができる(21、22)。さらに、HGFは、転写的に不活性なSnoN／Smad複合体の形成をもたらし、それによってTGF-β1の作用をブロックするSmad転写コリプレッサーSnoNのアップレギュレーションにより、ヒト腎臓上皮細胞においてEMTをブロックする(23)。これらの研究により、TGF-βのEMTを誘導する作用を中和するための戦略としてSmad活性をモジュレートすることの実現可能性が示唆される。TGF-β-誘導EMT及び他のシグナル伝達経路とのその相互作用を仲介する正確な分子メカニズムの知識は、TGF-βシグナル伝達の有益な作用を乱すことなくEMTを阻害する／逆転させる戦略を開発するために重要である。
【００５５】
骨形成タンパク質(BMP)
骨形成タンパク質(BMP)は、細胞の増殖、分化、移動及び生存を制御する、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーのメンバーである。BMPはI型及びII型として知られる2つの異なる種類のセリン／トレオニンキナーゼ受容体を通じて作用する。II型受容体はBMPにより占有されるとリン酸化され、その後ALKとも称されるI型受容体をリン酸化する。リン酸化されたI型受容体が今度は特異的な細胞内シグナル伝達経路を仲介し、またそれ故に、このリン酸化されたI型受容体が下流シグナル伝達の特異性を決定する。構造的に類似した3種類のI型受容体ALK2、ALK3(BMPR-IA)及びALK6(BMPR-IB)が同定されている。重要なことに、I型及びII型受容体は共に同種及び異種複合体を形成する。標的細胞のBMP-刺激は細胞表面で受容体複合体の再構成を引き起こし、これが2つの下流BMPシグナル伝達経路である標準Smad-依存性経路(Smad1/5/8経路)及び非標準Smad-非依存的シグナル伝達経路(例えばp38マイトジェン-活性化プロテインキナーゼ経路、MAPK)の活性化に影響を与える。Smad1/5/8経路は、閉塞により腎傷害が誘導された後の腎臓の修復を促進することが示されている(Manson SR, Niederhoff RA, Hruska KA, Austin PF., J Urol. 85：2523-30, 2011)。対照的に、p38MAPK経路が糖尿病及び虚血／再灌流に関連する腎損傷を促進する上で重要な役割を果たすことを示唆する証拠がある(Evans Jら、(2002) EndocrinRev 5：599-622, 2002；Furuichi Kら、Nephrol Dial Transplant 17：399-407, 2002)。従って、Smad1/5/8シグナル伝達を誘導しかつp38 MAPKリン酸化を阻害する化合物は、幅広い治療能力を備えた、魅力的な抗-炎症標的及び抗-線維化標的である。
【００５６】
BMPもまた、胚形成及び骨形成において重要な役割を果たす細胞外形態形成シグナル伝達タンパク質である。胚形成時、BMPは上皮間葉転換(EMT)を刺激するが、これは中胚葉及び神経管の形成に不可欠である。しかしながら、細胞接着性の消失と細胞運動性の上昇を特徴とするEMTは発癌時及び転移時にも刺激されており、またBMPシグナル伝達がある特定の種類の癌細胞において細胞の運動性及び侵襲性を増大させることも示された(Langenfeld,ら、Oncogene 25：685-692, 2006；Kang,ら、Exp. Cell Res. 316：24-37, 2010)。現在20種を超える公知BMPが存在し、これらのタンパク質のうちの幾つかは、腫瘍増殖及び原発腫瘍(特に、骨に転移する乳房及び前立腺の腫瘍)からの転移と関連していることが示されている(Alarmo及びKallioniemi, Endocrine-Related Cancer 17：R123-R139, 2010；Dai,ら、Cancer Res. 65：8274-8285, 2005)。
【００５７】
上述の通り、BMPは膜結合型で高親和性のI型及びII型セリン／トレオニンキナーゼ受容体に結合し、形態形成的細胞機能、例えば、細胞増殖、細胞成長、分化、骨形成、神経形成、及び胚形成を刺激するシグナル伝達カスケードをSmad経路及び他の細胞内エフェクターを通じて開始させる(Walshら、Trends in Cell Biology 20：244-256, 2010)。モルフォゲンとして、BMPは、再生医学、特に骨形成の刺激及び骨折の治癒に有用であることが判明している(Rider及びMulloy, Biochem. J. 429：1-12, 2010)。細胞のBMP活性は、BMPに結合してBMP受容体の活性化を予防し、それによってBMP-開始シグナル伝達を予防する幾つかの生物学的BMPアンタゴニストにより高度に調節されている(Rider及びMulloy, Biochem. J. 429：1-12, 2010)。これらのBMP-アンタゴニストの発現又は活性の変化は、ヒトの疾患、例えば、線維症及び癌の進行の一因となっている可能性がある(Walshら、Trends in Cell Biology 20：244-256, 2010)。
【００５８】
これらのBMP-結合アンタゴニストに加えて、BMP受容体アンタゴニスト、例えば、小分子阻害剤ドルソモルフィン及びドルソモルフィン誘導体が最近になって記載された。BMP受容体アンタゴニストは、BMP受容体及びシグナル伝達経路における突然変異により誘導される臨床的障害、例えば、癌、骨疾患、及び血管疾患に有用でありうることが示唆されている(Miyazono,ら、J. Biochem. 147：35-51, 2010)。
【００５９】
本発明のある態様では、以前に開示したペプチドのサブクラスが、線維化との関連において、EMTの阻害及び／又は逆転をもたらし、またその結果として少なくとも部分的にEMTに起因するあらゆる線維化状態にある線維化の阻害及び／又は逆転をもたらす、BMPシグナル伝達を誘発又は誘導する上で有用かつ有効なBMPアゴニストであることを見出した。
【００６０】
BMPアゴニストペプチド
ある態様では、本発明は、EMT過程を阻害するため、線維化を阻害するため、並びにEMT過程及び／又は線維化に関連する疾患及び障害、例えば、腎線維化を治療するために使用されるペプチド並びにこれらのペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００６１】
これらのペプチドの変異体、類似体、ホモログ、又は断片(例えば種ホモログ)もまた本発明に含まれ、同様にその縮重形態も本発明に含まれる。本発明のペプチドは、N-末端又はC-末端又はN-末端とC-末端の両方にキャップが付加されていてもよい。本発明のペプチドはPEG化、又は修飾されていてもよく、例えば、反応性側鎖を含有する任意のアミノ酸残基(例えば、リジン残基)の位置で分岐していてもよい。本発明のペプチドは、直鎖状であっても、もしくは環化されていても、又は別の形で制約を受けていてもよい。該ペプチドの尾部配列はその長さが異なっていてもよい。
【００６２】
前記ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、D-アミノ酸及びL-アミノ酸、並びにそれらの任意の組み合わせを含有しうる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、遺伝的にコードされていない、一般的に見られるアミノ酸を含みうる。これらの遺伝的にコードされていないアミノ酸としては、β-アラニン(β-Ala)及び他のω-アミノ酸、例えば、3-アミノプロピオン酸(Dap)、2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr)、4-アミノブチル酸など；α-アミノイソブチル酸(Aib)；イプシロン-アミノヘキサン酸(Aha)；δ-アミノ吉草酸(Ava)；N-メチルグリシン又はサルコシン(MeGly)；オルニチン(Orn)；シトルリン(Cit)；t-ブチルアラニン(t-BuA)；t-ブチルグリシン(t-BuG)；N-メチルイソロイシン(MeIle)；フェニルグリシン(Phg)；シクロヘキシルアラニン(Cha)；ノルロイシン(Nle)；2-ナフチルアラニン(2-Nal)；4-クロロフェニルアラニン(Phe(4-Cl))；2-フルオロフェニルアラニン(Phe(2-F))；3-フルオロフェニルアラニン(Phe(3-F))；4-フルオロフェニルアラニン(Phe(4-F))；ペニシラミン(Pen)；1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic)；β-2-トリエチルアラニン(Thi)；メチオニンスルホキシド(MSO)；ホモアルギニン(hArg)；N-アセチルリジン(AcLys)；2,3-ジアミノブチル酸(Dab)；2,3-ジアミノブチル酸(Dbu)；p-アミノフェニルアラニン(Phe(pNH.sub.2))；N-メチルバリン(MeVal)；ホモシステイン(hCys)及びホモセリン(hSer)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書中に記載した通り、多数のBMP-7アゴニストが最近になって特許公報、例えば、US 7,482,329、WO2007／035872、及びWO2006／009836に開示された。本明細書中に記載した通り、本出願の発明者らは、線維化の阻害及び／又は逆転に特に有効であり、またそれ故に、線維化により引き起こされる疾患及び障害の治療に特に有効である、これらのペプチドの一部を同定した。
【００６４】
ある実施形態では、本発明の方法に使用するペプチドは、配列番号55：
(H)-CY[YF][DN][ND][SN]S[SNQ]V[LI]CK[RK]YRS-(OH)
に示す一般構造を有する。
【００６５】
他の実施形態において、本発明により提供される代表的なペプチドを表1にまとめた。
【表１】
2014527040.tif 000003
2014527040.tif 000004
2014527040.tif 000005
【００６６】
以下の規約を、配列番号1〜77を含む本明細書中の配列を参照する際に使用する：
標準1文字アミノ酸は、20種の天然に存在するアミノ酸を符号化したものである。
【００６７】
山括弧は非天然アミノ酸記述子を包含するものであり、例えば、<YD>はD-チロシンを表す。
【００６８】
角括弧は選択肢のリストを包含するものであり、該リストにおいては、1文字符号を個別に解釈し、かつ複合的な1文字符号をコンマで区切る：例えば、[ACH,DF,RK]は、「Ala、Cys、His、Asp-Phe又はArg-Lys」を表す。
【００６９】
丸括弧は原子を包含するものであり、例えば、(OH)はヒドロキシル基を表す。
【００７０】
ペプチドキャッピング基は配列の最初と最後にハイフンで表記する：例えば、(H)-はキャップのないN-末端アミノ基を表すが、(CH3CO)-はアセチル化されたN-末端を表し；-(OH)はキャップのないC-末端ヒドロキシル基を表すが、-(NH2)はアミド化されたC-末端を表す。
【００７１】
全ての場合において、表中のペプチドはジスルフィド結合を利用して環化することができる。1位のCysを11位のCysにジスルフィド結合させる。
【００７２】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
DYFDDSSNVLX11KKYRS (配列番号2)(配列中のX11はDapである)
でありうる。
【００７３】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
X1YFDDSSNVLDKKYRS (配列番号3)(配列中のX1はDapである)
でありうる。
【００７４】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYYDNSSSVLCKRX14RS (配列番号4)(配列中のX14はD-Tyrである)
でありうる。
【００７５】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
X1YYDNSSSVLDKRYRS (配列番号9)(配列中のX1はDapである)
でありうる。
【００７６】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SX8VX10CKX13YRS (配列番号55)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００７７】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYYX4X5X6SX8VX10CKX13YRS (配列番号56)(配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００７８】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYFX4X5X6SX8VX10CKX13YRS (配列番号57)(配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００７９】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3NX5X6SX8VX10CKX13YRS (配列番号58)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８０】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3DX5X6SX8VX10CKX13YRS (配列番号59)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８１】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4NX6SX8VX10CKX13YRS (配列番号60)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８２】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4DX6SX8VX10CKX13YRS (配列番号61)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８３】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5SSX8VX10CKX13YRS (配列番号62)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８４】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5NSX8VX10CKX13YRS (配列番号63)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８５】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SSVX10CKX13YRS (配列番号64)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８６】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SNVX10CKX13YRS (配列番号65)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８７】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SQVX10CKX13YRS (配列番号66)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８８】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SX8VLCKX13YRS (配列番号67)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００８９】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SX8VICKX13YRS (配列番号68)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX13はLys又はArgである)
でありうる。
【００９０】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SX8VX10CKRYRS (配列番号69)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuである)
でありうる。
【００９１】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下：
CYX3X4X5X6SX8VX10CKKYRS (配列番号70)(配列中のX3はPhe又はTyrであり；配列中のX4はAsp又はAsnであり；配列中のX5はAsp又はAsnであり；配列中のX6はAsn又はSerであり；配列中のX8はAsn、Gln又はSerであり；配列中のX10はIle又はLeuである)
でありうる。
【００９２】
他の実施形態では、本発明のペプチドとして、配列番号1〜77のペプチドのあらゆる適切な変異体、類似体、ホモログ、又は断片を挙げることができる。本発明の化合物としては、配列番号1〜77に対して相同性を有する化合物、例えば、好ましくは50％又はそれ以上のアミノ酸同一性、より好ましくは75％又はそれ以上のアミノ酸同一性、さらにより好ましくは90％又はそれ以上のアミノ酸同一性を有する化合物が挙げられる。
【００９３】
ある特定の他の実施形態では、本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77のペプチドと類似した配列を有するペプチドを挙げることが可能であり、また具体的には、本発明のBMP-アゴニストペプチドとして、配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも99％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも95％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも90％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも85％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも80％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも75％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも70％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも65％もしくはそれ以上の配列同一性、又は配列番号1〜77のいずれかに対して少なくとも60％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００９４】
基準配列に対する同一性が100％未満であるポリペプチド配列の場合、同一でない位置は基準配列の保存的置換であることが好ましいが、必ずしもそうではない。保存的置換としては、典型的には、以下の複数の基：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン；リジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン、の間での置換が挙げられる。従って、本発明に含まれるのは、例えば、配列上、構造上、機能上、及び抗原的特性又は他の機能上、対応する元の配列を有するポリペプチドと相同であり続けるように変異させた配列を有するペプチドである。かかる変異は、例えば、保存的アミノ酸変化、例えば、大まかに類似した分子特性をもつアミノ酸間の変化を伴う変異でありうる。例えば、脂肪族基を持つグループのアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの間での交換は、保存的とみなすことができる。これらのうちの１つとグリシンとの置換もまた保存的とみなすことができる場合がある。他の保存的交換としては、脂肪族基を持つグループのアスパルテートとグルタメートの間；アミド基を持つグループのアスパラギンとグルタミンの間；ヒドロキシル基を持つグループのセリンとトレオニンの間；芳香族基を持つグループのフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの間；塩基性基を持つグループのリジン、アルギニン及びヒスチジンの間；並びに硫黄含有基を持つグループのメチオニンとシステインとの間の交換が挙げられる。メチオニンとロイシンとのグループ内での置換もまた保存的とみなすことができる場合がある。好適な保存的置換グループは、アスパルテート-グルタメート；アスパラギン-グルタミン；バリン-ロイシン-イソロイシン；アラニン-バリン；フェニルアラニン-チロシン；及びリジン-アルギニンである。
【００９５】
本発明は、アミノ酸配列全体が延長されるが、その化合物が依然として適当なTDFアゴニスト又はアンタゴニスト特性を保持するような挿入を含む、変更された配列を有する化合物も提供する。加えて、変更された配列は、該化合物のアミノ酸配列全体を切り詰めるが該化合物が依然としてそのBMP-アゴニストの機能特性を保持するランダムな、又は計画的な内部欠失を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、配列番号1〜77中の1個又はそれ以上のアミノ酸残基を、置き換えられる残基と類似した物理的及び／又は化学的特性を有する他のアミノ酸残基に置き換える。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、以下により詳しく記載したように、1個のアミノ酸が同じ指定クラス内に含まれる別のアミノ酸と置き換えられている置換である。挿入、欠失、及び置換は、それらが化合物の機能特性を無効にしない場合に適当である。変更された化合物の機能性は、以下に記載した、変更された化合物のBMP-アゴニスト特性を評価するために設計したin vitro及びin vivoアッセイに従って分析することができる。
【００９６】
配列番号1〜77のアミノ酸残基、配列番号1〜77の類似体又はホモログとしては、上記のもの全ての遺伝的にコードされているL-アミノ酸、天然に存在する遺伝的にコードされていないL-アミノ酸、合成D-アミノ酸、又はD-エナンチオマーが挙げられる。
【００９７】
また、本発明のペプチドは、プロペプチド又はプロポリペプチドの形態で提供しうると考えられる。本発明の目的上、プロペプチド又はプロポリペプチドは、切断可能な、又は別の形で除去可能な部分をさらに含む本発明のペプチドの成熟形態と比較して実質的に不活性である(すなわち、BMPシグナル伝達活性を実質的に欠いた)該ペプチドの前駆体バージョン又は変異体を指す。本発明のペプチドの前駆体形態は、好ましくは活性を持たないか、又は該ペプチドの活性が抑制されているかもしくは別の形で低減されている。かかる前駆体形態には、様々な理由で、例えば、本発明のペプチドの細胞産生時の細胞分泌に有用でありうるか、又はプロペプチドもしくはプロポリペプチドが作用の標的である傷害部位と接触するまで本発明のペプチドの活性をマスクするために有用でありうる、切断可能な部分又は伸長されたアミノ酸配列、例えば、リーダー配列又は末端ポリペプチド配列を含めることができる。例えば、プロペプチド又はプロポリペプチドは、病的状態のみの特徴であって健康な組織には存在しない高められた活性(例えばプロテアーゼ又は酵素)のため患部組織内でのみ除去可能なマスキング部分又はリーダー部分を除去するための切断可能な部分を含有していてもよい。かかるマスク及びリーダー配列は当分野で公知である。このようにして、本発明のペプチドを、所望の治療部位に対する特異性を高めながら「標的化」させることができる。
【００９８】
本発明のペプチドはPEG化、又は修飾されていてもよく、例えば、反応性側鎖を含有する任意のアミノ酸残基、例えば、リジン残基、又はリンカー上の化学反応性基の位置で分岐していてもよい。本発明のペプチドは、直鎖状であっても、又は環化されていてもよい。該ペプチドの尾部配列はその長さが異なっていてもよい。
【００９９】
前記ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、D-アミノ酸及びL-アミノ酸、並びにそれらの任意の組み合わせを含有しうる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、遺伝的にコードされていない、一般的に見られるアミノ酸を含みうる。これらの遺伝的にコードされていないアミノ酸としては、β-アラニン(β-Ala)及び他のω-アミノ酸、例えば、3-アミノプロピオン酸(Dap)、2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr)、4-アミノブチル酸など；α-アミノイソブチル酸(Aib)；イプシロン-アミノヘキサン酸(Aha)；δ-アミノ吉草酸(Ava)；N-メチルグリシン又はサルコシン(MeGly)；オルニチン(Orn)；シトルリン(Cit)；t-ブチルアラニン(t-BuA)；t-ブチルグリシン(t-BuG)；N-メチルイソロイシン(MeIle)；フェニルグリシン(Phg)；シクロヘキシルアラニン(Cha)；ノルロイシン(Nle)；2-ナフチルアラニン(2-Nal)；4-クロロフェニルアラニン(Phe(4-Cl))；2-フルオロフェニルアラニン(Phe(2-F))；3-フルオロフェニルアラニン(Phe(3-F))；4-フルオロフェニルアラニン(Phe(4-F))；ペニシラミン(Pen)；1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic)；β-2-トリエチルアラニン(Thi)；メチオニンスルホキシド(MSO)；ホモアルギニン(hArg)；N-アセチルリジン(AcLys)；2,3-ジアミノブチル酸(Dab)；2,3-ジアミノブチル酸(Dbu)；p-アミノフェニルアラニン(Phe(pNH2))；N-メチルバリン(MeVal)；ホモシステイン(hCys)及びホモセリン(hSer)が挙げられるが、これらに限定されない。前記化合物の天然には存在しない変異体を変異誘発技術により、又は直接合成により生産してもよい。
【０１００】
本発明のペプチドをコードする核酸分子
別の態様では、本発明は、配列番号1〜77(その縮重変異体を含む)、又は本明細書中に含まれるかもしくは本明細書中で意図されるあらゆるBMPアゴニストペプチドをコードする1種又はそれ以上のポリヌクレオチド又は核酸分子も含む。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、表1の配列番号1〜77のペプチド、又は表1の特定の実施形態以外で本発明の範囲内にあるあらゆるペプチドもしくはプロペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、単離された核酸分子はDNA発現又はクローニングベクターでありうるし、また該ベクターは該核酸に機能しうる形で連結しうるプロモーター配列を状況に応じて含んでいてもよく、その場合、該プロモーターは本発明のペプチド又はプロペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現をもたらす。さらに別の実施形態では、該ベクターを細胞、例えば、原核生物又は真核生物の細胞、好ましくは哺乳動物細胞、又はより好ましくはヒトの細胞に入れて形質転換させることができる。さらに別の実施形態では、該ベクターは、哺乳動物細胞に感染しかつウイルスに感染した動物において配列番号1〜77のポリペプチドの発現を引き起こすことができるウイルスベクターでありうる。さらに他の実施形態では、該核酸分子は、宿主細胞が原核生物の宿主細胞であるか真核生物の宿主細胞であるかにかかわらず、また該宿主細胞における発現がin vitroで行われるかin vivoで行われるかにかかわらず、該発現のためのあらゆる適切な、及び／又は有利なエレメントを含む。さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、本発明のペプチドを投与する必要がある対象に該ペプチドを体細胞遺伝子導入により投与するために、本発明のペプチド、又はそのあらゆる変異体、類似体、ホモログ、もしくは断片(例えば、そのあらゆる有用なプロペプチド)をコードする核酸配列を導入するための体細胞遺伝子導入ベクターを含んでいてもよい。
【０１０２】
本発明のポリペプチドの1種又はそれ以上の組換え発現の場合、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全部又は一部を含有する核酸を、適当なクローニングベクター、又は発現ベクター(すなわち、挿入したポリペプチドコード配列の転写及び翻訳のための必要なエレメントを含有するベクター)に当分野で周知でありかつ以下に詳述する組換えDNA技術により挿入する。
【０１０３】
一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書中では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であるため、互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、技術的にはプラスミドではないそうした他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損ウイルス、アデノウイルス及びアデノ-随伴ウイルス)を含むものとする。かかるウイルスベクターは、対象の感染及び該対象における化合物の発現を可能にする。
【０１０４】
本発明の別の態様は、本明細書中に記載したペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞に関するものである。本発明の組換え発現ベクターは、原核生物又は真核生物の細胞における該ペプチドの発現のために設計することができる。適切な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)でさらに検討されている。
【０１０５】
原核生物におけるポリペプチドの発現は、融合又は非融合ポリペプチドの発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌(Escherichia coli)で実施されることが最も多い。融合ベクターは、幾つかのアミノ酸を、該ベクター内でコードされているポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的には、3つの目的：(i)組換えポリペプチドの発現を増加させること；(ii)組換えポリペプチドの溶解性を増大させること；及び(iii)アフィニティー精製においてリガンドとして働くことにより組換えポリペプチドの精製を助けること、を果たす。しばしば、融合発現ベクターの場合、タンパク質分解的切断部位を融合部分と組換えポリペプチドとの結合部に導入することにより、融合ポリペプチドの精製後の該融合部分からの該組換えポリペプチドの分離を可能にする。かかる酵素、及びそれらの同族認識配列としては、第Xa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合ポリペプチド、又はポリペプチドAをそれぞれ標的組換えポリペプチドに融合するpGEX (Pharmacia Biotech Inc；Smith及びJohnson, 1988. Gene 67：31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)並びにpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)が挙げられる。
【０１０６】
本発明のペプチドを作製する方法
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを作製するための方法に関する。かかる方法としては、一般に、かかる課題を遂行するための当分野で公知のあらゆる適切な方法、例えば、合成ペプチド化学、適当な原核生物もしくは真核生物の宿主細胞及び発現系を使用した本発明のペプチドの組換え発現、又は体細胞遺伝子導入の特徴としての該ペプチドの組換え発現、すなわち、治療部位の投与レジメンの一環としての発現を挙げることができる。
【０１０７】
ある実施形態では、ペプチドは、標準的なペプチド合成技術、例えば、固相又は液相ペプチド合成を利用して化学的に合成することができる。つまり、配列番号1〜77として開示した化合物を、例えば、当分野で周知の組成物及び方法(例えば、Fields, G. B. (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego.を参照されたい)を利用して固体支持体上又は溶液中で化学的に合成してもよい。
【０１０８】
別の実施形態では、ペプチドは組換えDNA技術により産生され、例えば細菌、酵母、バキュロウイルス又は真核生物細胞での化合物の過剰発現は、十分な量の該化合物を与える。複数の物質の不均一混合物、例えば、反応混合物又は細胞溶解物又は他の粗画分からの化合物の精製は、当分野で周知の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は他のポリペプチド精製方法により達成される。これらは、配列番号1〜77で記載される化合物を、切断可能であるか又は他の意味で不活性のエピトープ又は配列への融合物として発現させることにより促進することができる。発現系の選択肢、並びに精製の方法は、当業者には周知である。
【０１０９】
本発明の1種又はそれ以上の化合物の組換え発現の場合、このペプチドをコードするヌクレオチド配列の全部又は一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター(すなわち、挿入したポリペプチドコード配列の転写及び翻訳のための必要なエレメントを含有するベクター)に挿入してもよい。幾つかの実施形態では、調節エレメントは異種である(すなわち、天然の遺伝子プロモーターではない)。代わりに、必要な転写及び翻訳シグナルを、遺伝子及び／又はそれらの隣接領域の本来のプロモーターにより供給してもよい。
【０１１０】
様々な宿主-ベクター系を利用することによりペプチドコード配列(複数可)を発現させてもよい。これらの宿主-ベクター系としては、以下：(i)ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染させた哺乳動物細胞系；(ii)バキュロウイルスなどに感染させた昆虫細胞系；(iii)酵母ベクターを含有する酵母又は(iv)バクテリオファージ、DNA、プラスミド DNA、もしくはコスミドDNAで形質転換した細菌が挙げられるが、これらに限定されない。使用する該宿主-ベクター系に応じて、幾つかの適切な転写及び翻訳エレメントのうちのいずれか1つを使用してもよい。
【０１１１】
発現ベクター又はそれらの誘導体としては、例えば、ヒト又は動物のウイルス(例えば、ワクシニアウイルス又はアデノウイルス)；昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)；酵母ベクター；バクテリオファージベクター(例えば、ラムダファージ)；プラスミドベクター及びコスミドベクターが挙げられる。
【０１１２】
望ましい特異的様式で目的の挿入配列の発現をモジュレートするか、又は該配列によりコードされている発現ペプチドを修飾もしくはプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。加えて、ある特定のプロモーターからの発現を、選択した宿主株においてある特定のインデューサーの存在下で増強してもよく；その結果、遺伝子操作した化合物の発現の制御が容易になる。その上、種々の宿主細胞が、発現されたペプチドの翻訳時及び翻訳後のプロセシング及び修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化など)のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有している。従って、適当な細胞系又は宿主系を選択することにより、外来ペプチドの所望の修飾及びプロセシングが確実に達成されるようにしてもよい。例えば、細菌系でのペプチド発現を利用することにより非グリコシル化コアペプチドを産生させることが可能であり；一方の哺乳動物細胞での発現は異種ペプチドの「本来の」グリコシル化を保証する。
【０１１３】
本発明のペプチドの生物学的活性は、このクラスのペプチドの生物学的活性を測定するために開発された従来の任意のin vivo及びin vitroアッセイを利用して特徴付けることができる。損傷を受けた骨、肝臓、腎臓、又は神経組織、歯周組織(例えば、セメント質及び／もしくは歯周靱帯)、胃腸及び腎臓の組織、並びに免疫細胞により仲介される損傷を受けた組織を修復又は再生するための用途における化合物又は類似体の効力を試験するための具体的なin vivoアッセイは、例えば、EP 0575,555；WO93/04692；WO93/05751；WO/06399；WO94/03200；WO94/06449；及びWO94/06420を含む公的に入手可能な文献に開示されている。
【０１１４】
医薬組成物
本発明のペプチド及び／又は核酸分子、並びにその誘導体、断片、類似体及びホモログは、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には、薬学的に許容しうる担体と共に、又は該担体無しで、核酸分子、ポリペプチド、又は抗体を含む。本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容しうる担体」は、医薬調製品の投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌化合物、等張及び吸収遅延化合物などを含むものとする。適切な担体は、当分野の標準的な参照テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版(本文献は参照により本明細書中に組み込まれるものとする)に記載されている。かかる担体又は希釈剤の好適な具体例としては、水、食塩水、リンガー液、デキストロース液、及び5％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び非水ビヒクル、例えば不揮発性油を使用してもよい。医薬活性物質のためのかかる媒質及び化合物の使用は当分野で周知である。従来の任意の媒質又は化合物が活性化合物と不適合である場合を除き、前記組成物におけるその使用が意図される。補足的な活性化合物もまた、前記組成物に組み入れることができる。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の具体例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(すなわち、局所)、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下適用のために使用する溶液又は懸濁液は、次の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌化合物、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート化合物、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び張性の調整用の化合物、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含みうる。pHは酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１１６】
注射用途に適した医薬組成物は、滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌水溶液(水溶性の場合)又は分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、CREMOPHORr(商標)(BASF, Parsippany, N.J.)又はリン酸緩衝食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、前記組成物は無菌でなくてはならず、また容易なシリンジ通過性が存続する程度まで流動性であるべきである。前記組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用に対して保護されていなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど)、並びにそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の前記作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、等張化合物、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを前記組成物に含めることが好ましいだろう。注射用組成物の持続吸収は、前記組成物に、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより達成することができる。
【０１１７】
滅菌注射用溶液は、前記ペプチドを必要な量で、適当な溶媒中に、先に列挙した成分の1つ又は組み合わせと共に組み込み、必要に応じて、その後ろ過滅菌することにより、調製できる。一般に、分散液は、前記活性化合物を、基礎分散媒と先に列挙した成分のうちの所要の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、前以て滅菌ろ過しておいたその溶液から前記の活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１１８】
経口組成物は一般に不活性希釈剤又は可食性担体を含む。それらの経口組成物は、ゼラチンカプセルに封入するか、又は圧縮して錠剤とすることができる。経口治療的投与を目的として、前記活性化合物を賦形剤と共に組み込み、かつ錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、含嗽剤として使用するために流動性担体を使用して調製することも可能であり、この際、該流動性担体中の前記化合物は経口的に適用され、ゆすがれ、さらに吐き出されるか又は飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質を、前記組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などには、次の成分：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガガントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、もしくはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；又は香味剤、例えばハッカ、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバー、あるいは類似した性質を持つ化合物のいずれかを含有させることができる。
【０１１９】
全身投与は、経粘膜又は経皮手段によることもできる。経粘膜又は経皮投与の場合、透過すべきバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。かかる浸透剤は当分野では一般に知られており、また該浸透剤としては、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧又は坐剤の使用を通じて達成することができる。経皮投与の場合、前記活性化合物を、当分野では一般に知られているような軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに製剤化する。
【０１２０】
前記化合物は、直腸送達のために、坐剤の形態(例えば、カカオバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含むもの)又は停留浣腸剤の形態の医薬組成物として調製することもできる。前記化合物は、ex vivo外植片又は移植片の調整又は処理に使用するために調製することができる。
【０１２１】
ある実施形態では、前記活性化合物を、植込錠及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤などの、該化合物を身体からの急速な排出から保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ酢酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。また前記の物質は、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液(感染させた細胞にウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて標的化したリポソームを含む)もまた、薬学的に許容しうる担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１２２】
経口又は非経口組成物を、投与及び用量の均一化を容易にするために単位用量形態で製剤化することは特に有利である。本明細書中で使用する単位用量形態は、治療すべき対象のための単位用量として適した、物理的に独立した単位を指し；各単位は、所要の医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすよう計算された所定量の活性化合物を含有している。本発明の単位用量形態の仕様は、該活性化合物の特有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、並びに個体の治療のためにかかる活性化合物を配合する分野につきものの制約により決定され、かつそれらに依存する。
【０１２３】
本発明はさらに、体細胞遺伝子導入において有用な医薬組成物も意図する。本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは、対象に、例えば、静脈内注射、局所投与(例えば、米国特許第5,328,470号を参照されたい)により、又は定位的注入(例えば、Chen,ら、1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：3054-3057を参照されたい)により、送達することができる。該遺伝子治療用ベクターの医薬調製物は、許容しうる希釈剤中に該遺伝子治療用ベクターを含みうるか、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスで構成されうる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター(例えば、レトロウイルスベクター)を組換え細胞から無傷で産生させることができる場合、医薬調製物にその遺伝子送達システムを産生する細胞を1種又はそれ以上含めることができる。医薬組成物は、容器、パック、又はディスペンサー中に、投与に関する説明書と共に含めることができる。
【０１２４】
また本発明は、本発明のペプチドを1種又はそれ以上の追加の活性薬剤と共に同時投与するための医薬組成物及び製剤を意図したものでもある。1種又はそれ以上の追加の活性薬剤は、他の抗-線維化療法を含みうる。1種又はそれ以上の追加の活性薬剤は、線維化状態を生じる、又は線維化状態に関与する、又は線維化状態に関する基礎疾患又は状態に関する他の療法も含みうる。例えば、線維化が糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症の1つの要素である、ある特定の実施形態では、追加の1種又はそれ以上の活性薬剤として、線維化そのものとは異なるこれらの基礎状態の他の症状及び態様の治療に対して有効な薬剤を挙げることができる。組み合わせて使用されるべき追加の抗線維化剤としては、例えば、主にサイトカイン、ケモカイン、特定のMMP、接着分子(インテグリン)、及びVEGFなどの血管新生のインデューサーを阻害することを目的とする薬物、並びに線維芽細胞の増殖及び活性化を阻害するか、又は筋線維芽細胞のアポトーシスを積極的に誘導するか、又はECMを除去もしくは分解する薬物、例えば、コラゲナーゼ、を挙げることができる。ただし、今のところ、使用されている抗-線維化薬物又は抗-線維化薬物の組み合わせの中で有効であると証明されているものは存在しないことに留意すべきである。抗-炎症化合物は単独では有効ではないが、併用することは可能である。ステロイド系抗-炎症化合物(例えば、プレドニゾン)及びACE阻害剤(例えば、ペリンドプリル、カプトプリル、エナラプリル)は、線維化を治療するために本発明のペプチドと組み合わせて試験及び使用することができる。
【０１２５】
治療の方法
本発明は、線維化に関連する障害のリスクがある(すなわち、該障害を起こしやすい)か又は該障害を有する対象を治療する、予防的かつ治療的な方法を提供する。本発明の方法及びペプチドは、病因が何であろうと、又は線維化を生じる疾患もしくは障害が何であろうと、あらゆる線維化状態に対して有効である。ある特定の実施形態では、本発明の方法及びペプチドは、少なくとも部分的にEMTにより引き起こされる線維化に対して有効であり、そのため、本発明の方法及びペプチドはEMTの阻害及び／又は逆転を生じ、またその結果として線維化の阻害及び／又は逆転を生じる。
【０１２６】
本明細書中に開示した線維化を治療する方法は、当分野で公知の任意の他の線維化を治療する方法と組み合わせうることが理解され、かつ本明細書中で意図される。
【０１２７】
本明細書中に開示した線維化を治療する方法は、線維化が疾患、放射線への偶発的曝露、偶発的組織傷害、放射線への治療曝露、又は外科的処置の結果であるかどうかにかかわらず、あらゆる線維化状態を治療しうることが理解され、かつ本明細書中で意図される。従って、本明細書中に開示した方法は、線維化の原因として、強皮症肺疾患、特発性肺線維症(IPF)、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎(BOOP)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、石綿肺、偶発的放射線誘発肺線維症、治療用放射線誘発肺線維症、関節リウマチ、サルコイドーシス、珪肺症、結核、Hermansky Pudlak症候群、砂糖きび肺、全身性エリテマトーデス、好酸球肉芽腫、Wegener肉芽腫、リンパ脈管筋腫症、嚢胞性線維症、ニトロフラントイン曝露、アミオダロン曝露、ブレオマイシン曝露、シクロホスファミド曝露、もしくはメトトレキサート曝露により引き起こされる肺線維化、並びに心筋梗塞、傷害関連組織瘢痕化、瘢痕形成手術、又は治療用放射線誘発線維症が挙げられるがこれらに限定されない線維化を治療するために使用しうることが理解され、かつ本明細書中で意図される。従って、例えば、咽頭癌の放射線治療後の咽頭における線維化は、本明細書中に開示した方法で治療することができる。
【０１２８】
従って、様々な実施形態において、本発明は、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症、全身性硬化症、腎炎、及び強皮症に関連する線維化を含むがこれに限定されない、身体のあらゆる組織及び／又は臓器におけるあらゆる線維化状態を治療するためのポリペプチド／ペプチド及び該ポリペプチド／該ペプチドを投与する方法に関する。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本明細書中に開示したペプチドは、腎臓の機能不全、疾患及び傷害、例えば尿管閉塞、急性及び慢性の腎不全、腎線維化、並びに糖尿病性腎症を治療するために使用される化合物でありうる。Klar, S., J. Nephrol. 2003 March-April；16(2)：179-85により、BMP-7処理を傷害時に開始した場合、該処理が尿管閉塞(UUO)のラットモデルにおいて腎傷害を有意に減少させることが示された。その後の研究から、腎線維化が始まった後に投与した場合でもBMP-7処理は腎線維化を軽減することが示唆された。具体的には、本発明のペプチドは、腎疾患、例えば慢性腎疾患を治療するために使用することができる。
【０１３０】
ある特定の他の実施形態では、CKDを治療するために本発明を使用してもよい。慢性腎疾患(CKD)は、推定13％のアメリカ人を苦しめている疾患である。疾患の起源にかかわらず、線維化は、疾患進行、及び最終的には臓器不全を招くCKDにおける最終的な共通経路である。慢性腎疾患は、腎不全の影響のため、又はCKD患者集団における高レベルの心血管死亡率のせいで、進行性で、治療が不可能であり、また最終的には命に関わる。
【０１３１】
ある特定の他の実施形態では、前記ペプチドを腎線維化及びCKDの予防又は治療に使用することができる。組換えヒト骨形成タンパク質(BMP)-7の外因性投与は、実験的腎疾患を患うげっ歯動物において腎糸球体及び腎間質の線維化を軽減することが示された(Wang及びHirschberg, Am J Physiol Renal Physiol. 2003 May；284(5)：F1006-13)。
【０１３２】
さらに他の実施形態では、本発明のペプチドを慢性肝疾患の予防又は治療に使用することができる。肝線維化は、肝臓への連続的かつ反復性の傷害により引き起こされる慢性肝疾患(CLD)に応じて開始される瘢痕化過程である。CLDの幾つかの主な原因としては、B型及びC型ウイルス性肝炎、アルコール性肝硬変、及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)が挙げられる。初期段階のCLDの症状は、原因となっている損傷の種類によって異なり、また臨床的には無症状である場合があるか、又は急性の炎症、脱力及び黄疸を含む可能性がある。CLDの後期段階は、肝臓構造の広範なリモデリング及び慢性臓器不全を特徴とする。
【０１３３】
さらに他の実施形態では、本発明のペプチドを、様々な肺関連線維化状態及び他の線維化状態、例えば、特発性肺線維症(IPF)、全身性硬化症、及び臓器移植片の線維化の予防又は治療に使用することができる。IPFは、酸素摂取を妨げる肺の進行性の瘢痕化を特徴とする、消耗性でありかつ致死的な肺疾患である。IPFの原因は不明である。瘢痕化が進行するにつれ、IPFを患う患者は、息切れ(呼吸困難)、及び日常機能、例えば、日常生活動作をこなすことの難しさを経験する。IPFの約40,000の症例が米国及びカナダで毎年診断されており、これらの国での全体の有病率は150,000と推定される。同様の有病率が、抗線維化療法の恩恵を受けうる6種の他の間質性肺疾患及び全身性硬化症に関しても見られる。FDAが承認したIPFの治療法は存在せず、患者の約3分の2が診断後5年以内に死亡する。患者はコルチコステロイド及び免疫抑制剤で治療されることが多い；ただし、生存又は生活の質を改善すると臨床的に証明されたものはない。肺線維化の安定化又は逆転が肺機能を安定させてこの破壊的な疾患の影響力を小さくすることもありうると考えられている。本発明のペプチド及び方法を、IPFに関連する肺線維化を阻害又は逆転させるために使用してもよい。
【０１３４】
また本発明を、過度の線維化が複数の臓器系、例えば、皮膚、血管、心臓、肺、及び腎臓で起こる変性障害である全身性硬化症を治療するために使用してもよい。男性よりも女性を多く冒す(女性と男性の比率は3：1)この致死的な疾患の有効な治療法は存在しない。全身性硬化症の年間発症率は、人口100万人あたり19症例と推定される。本発明のペプチド及び方法を、全身性硬化症を阻害又は逆転させるために使用してもよい。
【０１３５】
同様に、本発明を、臓器移植に関連する線維化を治療するために使用してもよい。2005年には、50,000件を上回る固形臓器移植が米国、日本及び5つの主要なヨーロッパ市場で行われた。移植術の総数は、2015年までに67,000超まで増加すると予想される。2005年末の米国のみにおける機能的移植片と共に生きる患者の数はおよそ164,000人であった。様々な臓器を移植する能力には著しい進歩が見られるものの、臓器機能の長期維持(1年超)及び患者の生存は主に慢性拒絶反応のために進歩が見られない。慢性拒絶反応の正確な徴候は移植した臓器によって異なるが、いずれの場合も、機能の喪失を招く線維化を最終的に生じる筋線維芽細胞又は関連細胞の増殖を呈する。現時点では、進行性慢性同種移植片拒絶反応の線維増殖性病変の治療に利用できる薬物はない。
【０１３６】
従って、様々な態様において、本発明は、あらゆる線維化状態、特に、EMTの結果生じるか又はEMTを伴う線維化状態の治療目的で本明細書中に開示したペプチドを投与する方法を含む。本発明のモジュレーション方法は、細胞を本発明のペプチドと接触させ、それによって該細胞の活性の1つ又はそれ以上をモジュレートすることを含む。ある実施形態では、この化合物は1つ又はそれ以上の活性を刺激する。
【０１３７】
これらのモジュレーション方法は、in vitroで(例えば、細胞を前記ペプチドと共に培養することにより)、あるいは、in vivoで(例えば、前記ペプチドを対象に投与することにより、もしくは後に対象において前記ペプチドを発現する体細胞遺伝子導入ベクターを前記ペプチドの投与のための手段として投与することにより)実施することができる。従って、本発明は、線維化を特徴とする疾患又は障害に苦しむ個体を治療する方法を提供する。本発明の組成物を投与するための有効な用量及びスケジュールは経験的に決定してもよく、また、かかる決定を下すことは当分野の技術範囲内である。該組成物の投与のための用量範囲は、複数の症状／1種の障害に及ぶ所望の効果を生み出すのに十分な大きさの範囲である。該用量は、有害な副作用、例えば、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど多くすべきではない。一般に、該用量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかによって異なり、また該用量は当業者が決定することができる。該用量は、何らかの禁忌がある場合には個々の医師が調整することができる。用量は変更することが可能であり、また1日又は数日間、1日1回又はそれ以上の回数の用量投与の形で投与することができる。指針は、所与のクラスの医薬製品の適当な用量についての文献中に見出すことができる。例えば、抗体の適当な用量を選択する際の指針は、抗体の治療用途に関する文献中に、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferroneら、eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22及びpp. 303-357；Smithら、Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haberら、eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389中に見出すことができる。単独で使用する抗体の典型的な1日用量は、上記の要因に応じて、1日あたり約1μg／kg〜最高100 mg／kg体重又はそれ以上の範囲をとりうる。異なる複数の投薬レジメンを必要に応じて使用してもよい。
【０１３８】
線維化を阻害又は予防するための、本明細書中に開示した組成物(例えば本発明のペプチド)の投与後に、この治療用ペプチドの効力を当業者に周知の様々な方法で評価することができる。例えば、本明細書中に開示した組成物(例えばペプチド)が上皮タンパク質マーカーの増加又は増加発現及び間葉系タンパク質マーカーの減少を引き起こすか、又は線維化を減少させることを観察することにより、該組成物が対象において線維化を治療又は阻害する際に有用であることが当業者には理解されよう。
【０１３９】
本明細書中に開示した線維化相互作用を阻害する組成物は、線維化のリスクがある患者又は対象、例えば、放射線損傷による線維化が生じる可能性のある、咽頭癌などの癌の放射線治療を受ける予定の患者、に予防的に投与してもよい。
【０１４０】
例えば、本明細書中に開示した組成物及び方法は、例えば、強皮症肺疾患、特発性肺線維症(IPF)、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎(BOOP)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、石綿肺、偶発的放射線誘発肺線維症、治療用放射線誘発肺線維症、関節リウマチ、サルコイドーシス、珪肺症、結核、Hermansky Pudlak症候群、砂糖きび肺、全身性エリテマトーデス、好酸球肉芽腫、Wegener肉芽腫、リンパ脈管筋腫症、嚢胞性線維症、ニトロフラントイン曝露、アミオダロン曝露、ブレオマイシン曝露、シクロホスファミド曝露、メトトレキサート曝露、心筋梗塞、傷害関連組織瘢痕化、瘢痕形成手術、及び治療用放射線誘発線維症が挙げられるがこれらに限定されない様々な線維化関連疾患のための新規薬物候補を単離及び試験するツールとして使用することもできる。
【０１４１】
キット及び／又は医薬パッケージ
本発明はさらに、本明細書中に開示した方法を実践する際に使用しうる試薬又は成分に関するキット及び医薬パッケージも意図する。該キットには、本明細書中で検討した、又は本明細書中に開示した方法の実施において必要であるかもしくは有益であると理解されるであろう、あらゆる材料又は材料の組み合わせを含めることができる。例えば、該キットに、本発明のペプチド、又は1種もしくはそれ以上の追加の活性薬剤を含めてもよい。加えて、キットには、その治療及び／又は診断目的のために、該キットの成分を使用するための説明書一式を含めることもできる。
【０１４２】
本出願全体にわたり、様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の開示内容は、本発明が関連する技術の現状をより詳しく説明するために、それらの全内容が参照により本出願に組み込まれるものとする。同様に、本明細書中に開示した参考文献は、該参考文献が依拠する文章中で検討されている、そこに含まれる物質に関して、参照により個別かつ明確に本明細書中に組み込まれるものとする。
【０１４３】
本発明の範囲又は趣旨を逸脱することなく本発明に様々な改変及び変更を行いうることは、当業者には明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書を考慮しかつ本明細書中に開示した本発明を実施することで当業者には明らかとなろう。本明細書及び実施例は単なる例示として考慮すべきであり、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲により示されるものとする。
【０１４４】
以下の実施例により本発明の幾つかの実施形態を明示する。該実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０１４５】
本実施例において記載した構造、材料、組成物、及び方法は、本発明の代表的な実施例を意図したものであり、本発明の範囲が該実施例の範囲によって制限されないことは理解されよう。当業者であれば、本明細書中に開示した構造、材料、組成物及び方法に変更を加えて本発明を実施しうること、並びにかかる変更は本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されよう。
【０１４６】
実施例1：グルコース-誘導EMTに対する本発明のBMPアゴニストペプチドの効果
上皮間葉転換(EMT)又は腹膜中皮細胞の中皮間葉転換は、初期の線維化メカニズムであると考えられてきた。EMTは、上皮細胞層が極性及び細胞間接触を喪失して細胞骨格の劇的なリモデリングを受けるその過程である。上皮細胞接着及び細胞骨格成分の喪失と同時に、EMTを起こしている細胞は間葉成分の発現を獲得し、また移動性の表現型を示す。高濃度のグルコースが、E-カドヘリンの発現減少とα-平滑筋アクチン、フィブロネクチン、及びI型コラーゲンの発現増加、並びに細胞移動の増加により示唆される、HPMCの上皮間葉転換(EMT)を誘導することが示されている。TGF-βシグナル伝達の活性化は、培養上皮細胞においてEMTを誘導するには十分である(Miettinen PJら、J Cell Biol 127：2021-2036, 1994)。腎疾患において尿細管萎縮及び筋線維芽細胞の外観にEMTが果たす役割は、数年前に初めて提唱された(Strutz Fら、Exp Nephrol 4：267-270, 1996)。しかしながら、TGF-βが腎尿細管EMTのメディエーターであるという証拠は最近になってようやく報告された(Oldfield MDら、J Clin Invest 108：1853-1863, 2001；Fan JMら、Kidney Int 56：1455-1467, 1999)。例えば、終末糖化産物(AGE)はin vitroで、及び糖尿病ラットにおいて、TGF-βシグナル伝達の活性化によりEMTを誘導することが見出されており、このことは、糖尿病性腎症の進行にこのTGF-β誘導反応が果たす重要な役割を示している(Oldfield MDら、J Clin Invest 108：1853-1863, 2001)。様々な種類の上皮細胞においてEMTを誘導するための、TGF-βにより活性化されるシグナル伝達経路の近年の研究を基に、この反応に特異的なTGF-β及びBMPシグナル伝達経路のモデルが生み出されている。
【０１４７】
慢性の高血糖は2型糖尿病における腎線維化の公知の原因である。本実施例のアッセイでは、ヒト近位尿細管上皮細胞(HK2)において、それらを高レベルのD-グルコース(100 mM及び200 mM)に曝露することにより、上皮表現型から間葉表現型への分化転換(EMT)を誘導した。図2は、培地のみに曝露した細胞におけるE-カドヘリン(蛍光標識した抗-E-カドヘリン抗体)の存在を示したものである。100 mM D-グルコースへの曝露により、蛍光シグナルの消失により明示されるE-カドヘリン発現の消失が生じた。本アッセイを利用し、試験化合物を、それらが高レベルのD-グルコースの存在下でEMT過程を阻害する能力に基づいて評価した。図4〜16は、それぞれ、100 mM D-グルコース及び100μMの配列番号1〜11に曝露したHK2細胞の蛍光顕微鏡写真である。配列番号10及び11以外の全てが上皮表現型を保持することができた(すなわち、EMTを阻害することができた)という点に留意されたい。
【０１４８】
結果を図1及び下記表3に提供する。下記表3では、化合物の反応を、方法及び材料の項、第C部の方法で、本明細書中に記載した通りに画像解析を利用してスコアを付けた。0％の反応は100 mM(又は200 mM)D-グルコース(無処理)に対するシグナルに相当し、100％の反応はD-グルコースの非存在下での培地に対するシグナルに相当する。配列番号10及び配列番号11に記載のペプチドは非常に弱い抗-線維化作用を有していた。
【表２】
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【０１４９】
配列番号5の結果をそのラクタム結合形態(配列番号9)の結果と比較し、また配列番号1の結果をそのラクタム結合形態(配列番号2及び3)の結果と比較することにより、ジスルフィド架橋のラクタム架橋との置き換えが活性に影響を与え、また実際に活性を増加させる場合があることが示唆された。さらに、配列番号5をそのN-末端にキャップが付加された形態(配列番号6及び7)と比較すると、N-末端のキャップ付加もまた活性を増加させる場合があることが示唆された。EMT過程を阻害することができた全ての試験化合物は、抗-炎症性アッセイにおいていずれも陽性を示し；抗-炎症性アッセイにおいて陽性を示した配列番号11がEMT過程を阻害できなかったという事実は、抗-炎症活性は抗-EMT活性としては不十分だということを意味している。
【０１５０】
実施例2：配列番号1のEMT及び線維化逆転効果に関するin vivo試験
図17に概要を示したマウスSTZ試験で得られた、図18〜22のH＆E及びマッソン三色染色時の線維化の分析。in vitro EMT実験のE-カドヘリン蛍光を定量化するために上記で使用したものと同じ画像の比色分析方法を利用して、画像を定量化し、その結果を図23に示した。
【０１５１】
THR-123で処理した動物は犠牲死前の最後の1ヶ月間だけ処理したにもかかわらず、線維化染色組織のレベルは6ヶ月目のレベルのように低くなり、また実際に5ヶ月目のレベルよりも低くなり、線維化の逆転が示唆された。
【０１５２】
実施例3：6ヶ月での全試験マウスの腎臓切片の組織形態計測解析
タンパク質FSP1は間葉組織のマーカーである。線維化の指標として、蛍光組織免疫学を利用してFSP1の存在を測定した。図24に見られるように、5ヶ月にわたる間葉組織の純増は正常動物について観察された純増の27倍であり、また6ヶ月にわたる純増は正常動物について観察された純増の29倍であった。これらの間葉組織の純増は、STZ-誘導糖尿病が上皮細胞の間葉細胞への転換を引き起こしたということの有力な証拠を示すものである。5ヶ月間のBMP7による処理は6ヶ月での純増を3分の1まで減少させたが、最終月のみの間の配列番号1による処理は増加を、配列番号1処理の開始時に存在するレベルをはるかに下回るたった2分の1にまで減少させた。これもまた、EMT過程の逆転の証拠を示すものである。この逆転は、例えば、損傷した尿細管の割合(図25)及び間質容積の増加(図26)といった尿細管間質組織の他の形態計測パラメーターにも反映されていた。
【０１５３】
しかしながら、BMP7又は配列番号1による処理が6ヶ月にわたる本研究を通して観察された糸球体表面積の24％の増加に殆ど効果を与えなかった糸球体組織については、多少一致する効果が見られた(図27)。メサンギウム基質における、5ヶ月での64％の増加及び6ヶ月での104％の増加はBMP7処理による影響を受けなかったが、配列番号1による処理は6ヶ月でのレベルを37％まで減少させた(図28)。
【０１５４】
糖尿病性腎症の影響を逆転させる配列番号1の効力は、血清血中尿素窒素(BUN)レベルにより判断される腎機能にも反映されていた。5ヶ月の終わりには、該レベルは正常動物と比較して85％まで増加し、また6ヶ月までに該レベルは正常動物と比較して94％増加し、このことは、腎クリアランスの大幅な低下を示している。残り5ヶ月にわたって投与したBMP7はBUNレベルを2％まで増加させ、また犠牲死前の最後の1ヶ月間のみの配列番号1による処理は、増加を、処理の開始時の増加をはるかに下回る17％まで減少させた(図29)。
【０１５５】
実施例4：ヒト近位尿細管上皮細胞(HK2)におけるグルコース-誘導EMT
近位尿細管上皮細胞の分化転換は腎線維化の発生における重要な段階であり、しかもこの分化転換は上皮表現型マーカーであるE-カドヘリン発現の消失と関連していることが示されている。これにより、ヒト腎近位尿細管上皮(HK-2)細胞においてE-カドヘリン発現の消失を誘導するために高濃度のD-グルコース(50〜100 mM)を使用し、かつ化合物をE-カドヘリン発現の消失を回復させるそれらの能力について試験する、細胞ベースのスクリーニングアッセイの開発のための基礎が提供される。
【０１５６】
実施例1〜4のための方法及び材料：
A.アッセイプロトコル
材料：
・ヒト近位尿細管上皮細胞HK-2(ATCC ＃CRL-2190)
・無血清ケラチノサイト培地(GIBCO ＃17005-042, K-SFM)
・表皮成長因子(EGF：5 ng／mL)
・ウシ下垂体抽出物(BPE：40μg／mL)
・一次抗体、マウスIgG抗-E-カドヘリン(R＆D Systems ＃ MAB1838)
・BSA[Sigma ＃A7030]
・二次抗体、FITC結合ヤギ抗-マウスIgG(Fab2)フラグメント(Sigma-Aldrich ＃ F-2653)
・パラホルムアルデヒド(10％))
・トリトンX-100(Sigma ＃ T- 9284)
・PBS(Fisher Scientific ＃BP399-1)
・D-PBS(Invitrogen ＃ 14190-144)
・ポリプロピレン製チップ(Axygen, Inc. 0.5〜10μL, cat ＃ T-300-L-R；1-200μL, Cat ＃ T-200-L-R；1〜1000μL, Cat ＃ T-1000-C-L-R)
・50 mLポリプロピレン製培養試験管(Fisher Scientific, cat ＃ 06-443-18)
・24-ウェルCoster細胞培養プレート(Fisher Scientific ＃ 07-200-84)
試薬及び試験試料：
・陽性対照：BMP-7、濃度0.1及び1μg／mLでアッセイ
・試験化合物(ペプチド)：各々最終濃度100μM及び200μMで試験
細胞培養アッセイのためのアッセイ手順：
・24-ウェル培養プレートでアッセイを行う。
【０１５７】
・HK-2細胞を、栄養補助剤を添加した1 mLのK-SFM培地(増殖培地)に1ウェルあたり25,000〜30,000個の細胞の密度で播く
・HK-2細胞を37℃で24時間インキュベートし、細胞をプレートに付着させる
・翌日の午後、最初の2つの対照ウェル以外の全てのウェルにおいて培地を栄養補助剤無添加K-SFM培地(無血清培地)と交換する。
【０１５８】
・HK-2細胞を37℃で一晩インキュベートし続ける。
【０１５９】
・翌日、培地を全ウェルから吸い出す。細胞を増殖培地(最初の2つの対照ウェル)でインキュベートするか、又は細胞を試験化合物に37℃で2時間曝露する。各試験化合物の最終濃度を100及び200μMとする。BMP-7は、本アッセイにおいては陽性対照としての役割を果たす。
【０１６０】
・インキュベーション後、D-グルコースを、最初の2つの対照ウェル以外の全ウェルに添加する。D-グルコースの最終濃度を50及び100 mMとする。
【０１６１】
・HK-2細胞を37℃で60時間インキュベートする。
【０１６２】
・培地を全ウェルから吸い出す。該ウェルに、D-グルコース単独、又はD-グルコース及び試験化合物、又はD-グルコース及びBMP-7を含有する、温めておいた増殖培地又は無血清培地を添加する。D-グルコース及び試験化合物の最終濃度を上記と同じにする。
【０１６３】
・HK-2細胞を37℃で24時間インキュベートし続ける。
【０１６４】
B.E-カドヘリン発現に対するHK-2細胞の免疫蛍光染色及び顕微鏡法
・培地を全ウェルから吸い出し、さらに細胞をPBSで2回洗浄する。
【０１６５】
・細胞をPBS中3.7％のパラホルムアルデヒドで室温にて15分間固定する。
【０１６６】
・細胞をPBS中0.2％のトリトンX-100と共に5分間インキュベートする
・細胞をPBSで1回洗浄する
・細胞をPBS中2％のBSAで室温にて1時間ブロッキングする。
【０１６７】
・一次抗体(マウス抗-E-カドヘリン抗体)を、PBS中1％のBSAを使用して1：20に希釈する
・細胞を、希釈した一次抗体と共に室温で1時間インキュベートする。
【０１６８】
・細胞をPBSで2回洗浄する
・二次抗体(FITC標識ヤギ抗マウスIgG)を、PBS中1％のBSAを使用して1：20に希釈する
・細胞を希釈した二次抗体と共に室温で1時間インキュベートする
・細胞をPBSで2回洗浄する
・細胞をPBS(1 mL／ウェル)に入れる
・細胞を蛍光顕微鏡により可視化し、その後直ちに写真を撮る。
【０１６９】
C.免疫蛍光画像の比色定量
恐らくは経験豊富な研究者である場合を除き、試験化合物がどの程度活性であるかを、E-カドヘリンの細胞性蛍光の画像を(培地単独と比較して)見ることにより判断するのは困難である。シグナルの強さは、上皮表現型(すなわち、E-カドヘリン発現)の消失が試験処理により逆転するその程度である。蛍光強度は見てすぐにわかるシグナルであろうが、何らかの内部基準なしに正確に測定することを難しくする外的特性を持つという欠点がある。一方、色などの内的特性は強度に依存しない。画素領域に関してRGB強度ヒストグラムに反映される色ずれ(内的特性)が存在することが見出された。CRTの色は、3つの発光色：レッド、グリーン及びブルー(RGB)から構成されている。その強度レベルは一般的には1バイト幅(0〜255)であり、そのため画素の色は3つの量{R, G, B}として符号化される。白{255, 255, 255}から黒{0, 0, 0}までの様々なグレーの色合いの場合、R＝G＝Bである。一方で、紫は{200, 100, 200}である。これがつまり、in vitro抗-線維化活性を測定するための定量的基準を提供するために採用した、E-カドヘリン蛍光写真の画像解析の基礎である。
【０１７０】
D.E-カドヘリン線維化アッセイの定量化方法
蛍光領域をデジタル写真上で選択し、その画素のRGB統計値をコンピューターで算出した。各画素に関連するこれら3つの値R、G及びBは、三次元の色-強度ベクトルと考えることができる。このベクトルの長さはL＝√(R2＋G2＋B2)である。色ベクトル{ρ,γ,β}は単位ベクトル(長さ＝1.0)である、すなわち、{ρ,γ,β}≡{R/L, G/L, B/L}＝{R/L, G/L, B/L)であって、従って強度とは無関係であるため、内的特性である。色ベクトルは単位球面の表面(全成分が正である場合のみ第1象限)上の点と考えることができる。画像フィールドの色ベクトルを算出する最良の方法は平均ベクトルと同じであるが、一般的には代わりにPhotoshop(Adobe Systems)などの画像解析プログラムから、(例えば、PhotoShopで画像／ヒストグラム画像解析機能を使用して)ヒストグラムとして各R、G及びB成分の統計値を取得する。これらのヒストグラムはガウス型となる傾向があるが、裾を有するため、選択した画像領域を表す色強度ベクトル全般の成分値としては各ヒストグラムの平均値よりも中央値を使用するのが一番よい。
【０１７１】
蛍光抗体が膜上のE-カドヘリンに結合する時に色変化が生じるのであれば、その時は2つの異なる色ベクトルが存在することになり、一方は培地で処理した細胞を表し、また他方はD-グルコースで処理した細胞を表す。これら2つの点は大円の弧を描く(球面を二分する)。試験物質処理の結果得られる全てのデータ点は、これらの端点間の弧(本明細書中ではシグナルアークと表記する)に沿って存在しているべきである(図42参照)。D-グルコースで処理した細胞を表すシグナルアークの一方の端を0とし、また正常な培地で処理した細胞を表す他方の端を1.0とすることにより、試験物質で処理した細胞を表す色ベクトルに、該色ベクトルが弧に沿って位置するその距離に基づいて値を割り当てることができる。
【０１７２】
ベクトル
2014527040.tif 000007
は、それぞれ、D-グルコースで処理した(線維化)細胞及び無処理(培地のみ)細胞に対する色ベクトルである。それらの色ベクトルは、
2014527040.tif 000008
のベクトル積、ベクトル
2014527040.tif 000009
に垂直な全ての点で構成される大円上に位置している。色ベクトル
2014527040.tif 000010
はデータ点(試験物質で処理した細胞の画像領域に対する色ベクトル)であり、
2014527040.tif 000011
の間のシグナルアークの付近に位置することが予想されるが、正確にその上に位置しているとは限らない。シグナルアーク上に位置する、
2014527040.tif 000012
の成分であるベクトル
2014527040.tif 000013
を見つけるために、本発明者らは先ず、
2014527040.tif 000014
の両方を含む大円を描くベクトル積
2014527040.tif 000015
を計算した。ベクトル
2014527040.tif 000016
はこれら2つの大円の2つの交点のうちの1つであり、ベクトル積
2014527040.tif 000017
で与えられる。つまり、色ベクトル
2014527040.tif 000018
に関連するシグナルは、
2014527040.tif 000019
の角度を
2014527040.tif 000020
の角度で割った比である。
【０１７３】
1例を挙げると、添付の図面(図43)は、100 mM D-グルコース、培地単独並びに100 mM D-グルコース及び100μMの試験化合物で処理した細胞の蛍光画像を表示したものである。100 mM D-グルコースの画像はRGB中央値(47, 94, 74)を有し、色ベクトル{ρ,γ,β}0％＝(0.674, 0.531, 0.514)を与える。培地の画像はRGB中央値(1, 93, 31)を有し、色ベクトル{ρ,γ,β}100％＝(0.010, 0.949, 0.316)を与える。これらのベクトル間の角度は28.4°であり、またそれらのベクトルが位置する大円を描く法線ベクトルは
2014527040.tif 000021
＝(-0.662, -0.231, 0.713)である。実験化合物の画像はRGB中央値(1, 105, 75)を有し、色ベクトル{ρ,γ,β}?％＝(0.008, 0.814, 0.581)を与える。成分ベクトル
2014527040.tif 000022
は(0.158, 0.887, 0.434)と計算される。
2014527040.tif 000023
の角度は＋17.0°であるため、このシグナルは17.0°／28.4°＝59.8％である。
【０１７４】
E.エラー検出
色ベクトルがシグナルアークから遠く離れすぎている可能性を疑うべきである。シグナルアークからの距離は、色ベクトル
2014527040.tif 000024
がなす角度で与えられる。点がシグナルアークから離れて位置するその距離の尺度として、本発明者らは、
2014527040.tif 000025
がなす角度と、
2014527040.tif 000026
がなす角度との比を利用した。該比の0.1よりも大きい値は、懸念すべき合理的な基準である。
【０１７５】
実施例5：線維化障害の治療における本発明のペプチドの使用
線維化疾患は、線維芽細胞の活性化、コラーゲン及びフィブロネクチンの産生増加、並びに収縮性筋線維芽細胞への分化転換を特徴とする。この過程は通常は数ヶ月及び数年かけて生じるものであり、また臓器機能不全又は死をもたらす可能性がある。線維化疾患の具体例としては、糖尿病性腎症、肝硬変、特発性肺線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症及び強皮症(全身性硬化症；SSc)が挙げられる。線維化疾患は有効な治療法が存在しない最大の障害群の1つであり、またそれ故に、線維化疾患は未だ満たされない重要な医療ニーズの象徴である。多くの場合、線維症を患う患者にとって唯一の救済策は臓器移植であり；臓器の供給量は需要を満たすには不十分であるため、患者は適切な臓器を受け取るのを待つ間に死亡することが多い。肺の線維化はそれだけでも強皮症肺疾患、特発性肺線維症、放射線-及び化学療法-誘導肺線維症における死亡並びに塵粒子の職業性吸入により引き起こされる状態における死亡の主な原因となりうる。主に線維化疾患の病因が不明であるという理由から、適当な抗-線維化療法の不在が生じる。線維化疾患において正常組織の修復がどのように制御され、かつこの過程がいかにして不首尾に終わるのかを理解することが不可欠である。
【０１７６】
TGFβ及び線維化におけるその役割
トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)及び結合組織増殖因子(CTGF)などの線維化誘導タンパク質は、線維化疾患に関与することが示唆されている。TGF-βは線維芽細胞がECMを合成し収縮させるよう誘導するので、このサイトカインは線維化反応の中心的なメディエーターであると長く信じられてきた(1)。ヒト内皮細胞により分泌されるタンパク質として10余年前に発見されたCTGF(2)は、TGF-βにより誘導されるものであり、またTGF-βが線維芽細胞に与える作用の下流のメディエーターと考えられている(3、4)。同様に、TGF-βは、フィブロネクチン転写物の選択的スプライシングを通じて生じるフィブロネクチンの変異体である、基質タンパク質フィブロネクチンのED-A型(ED-A FN)の発現を誘導する(5)。このED-A FNの誘導は、TGF-β1により誘発されるα-SMA及びI型コラーゲンの発現増強に必要である(6)。このため、TGF-βは、例えば肺(7)及び腎臓(文献参照)を含む多くの組織における線維化の誘導の「マスタースイッチ」であるとされている。この点に関して、TGF-βはIPFを患う患者の肺、又はCKD患者の腎臓においてアップレギュレートされ、またラットの肺又は腎臓における活性TGF-βの発現は劇的な線維化反応を誘導し、一方でTGF-β1に応答する能力の欠如はブレオマイシン誘導性の線維化(8)又は腎間質線維化(30)からの保護を与える。
【０１７７】
上皮間葉転換(EMT)及び線維化におけるその役割
十分に分化した上皮細胞が間葉表現型へと転換されて線維芽細胞及び筋線維芽細胞を生じる過程であるEMTは、上皮傷害後の修復及び瘢痕形成において重要な役割を果たしていると次第に認識されつつある。この過程が肺及び他の臓器における傷害後の線維化に寄与するその程度は、活発な調査の対象である。近年、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-βがin vitro及びin vivoで肺胞上皮細胞(AEC)においてEMTを誘導すること、並びに上皮及び間葉マーカーが特発性肺線維症(IPF)を患う患者由来の肺組織のII型過形成(AT2)細胞に共局在していることが実証され、AECが肺線維化において極端な可塑性を呈しかつ線維芽細胞及び／又は筋線維芽細胞の供給源としての役割を果たしうることが示唆された。TGF-β1は、正常な乳房上皮細胞におけるEMTのインデューサーとして最初は記載され(9)、またその後に幾つかの異なる上皮細胞系(例えば、腎近位尿細管、水晶体、及び直近では肺胞上皮細胞)においてin vitroでEMTを仲介することが示された(10〜14)。
【０１７８】
EMT及び線維化におけるSmad-依存性及び非依存性シグナル伝達の役割
動物モデルにおけるTGF-β-依存性Smad経路のモジュレーションは、in vivoでの線維化EMTにおけるTGF-βの役割の有力な証拠を提供する。傷害後のin vivoでの水晶体上皮細胞のEMTはSmad3ヌルマウスで完全に予防され、さらにTGF-βで処理したSmad3-/-水晶体上皮細胞の初代培養物はEMTから保護される(15)。同様に、腎臓の場合、Smad3ヌルマウスは実験的に誘導した尿細管間質線維化から保護されるとともに低減されたEMT及びコラーゲンの蓄積を示し、一方で、Smad3-/-動物から得た腎尿細管上皮細胞の培養物はEMTのブロック及びTGF-β1の自己誘導の減少を示した(16)。ヒト近位尿細管上皮細胞の場合、CTGFの増加及びE-カドヘリンの増加はSmad3-依存性であり、MMP-2の増加はSmad2-依存性であり、またα-SMAの増加はその両方に依存性を示した(17)。ドミナントネガティブな手段を利用した、近年の正常なマウス及びヒト上皮細胞におけるTGF-β-誘導EMTのトランスクリプトーム解析により、Smadシグナル伝達は全被験標的遺伝子の調節に不可欠であることが示された(18)。TGF-β-依存性EMTに関与する非-Smad-依存性経路としては、RhoA、Ras、p38 MAPK、PI3キナーゼ、Notch及びWntシグナル伝達経路が挙げられる。大抵の場合、完全なEMTの誘導に必要であるが十分ではない場合もありうる、主要経路を占める複数のSmadによるこれらの協同性経路の刺激により、特定の組織内でのEMT誘導の背景及び詳細が提供される(19)。
【０１７９】
TGF-β1-誘導性のEMT及び線維化の逆転
EMTの逆転を生じさせるために多くの治療介入が行われている。BMP-7は、TGF-β-誘導Smad3-依存性EMTを直接中和することにより成体尿細管上皮細胞においてTGF-β1-誘導EMTを逆転させ、EMTを介して起こる腎線維化の逆転の証拠がin vivoで示された(20)。BMP-7はSmad2のダウン-レギュレーションを伴って水晶体上皮におけるEMTを遅延させることが可能であり、一方、抑制性Smad7の過剰発現はEMTを予防し、またSmad2及びSmad3の核移行を減少させた(21)。EMTはSmad3ノックアウトマウスで改善され(15,16)、またTGF-βシグナル伝達のアンタゴニストであるSmad7、又はSmad依存的な様式で作用する骨形成タンパク質-7(BMP-7)は腎及び水晶体の上皮における線維化を逆転させるか又は遅延させることができる(21、22)。さらに、HGFは、転写的に不活性なSnoN／Smad複合体の形成をもたらし、それによってTGF-β1の作用をブロックするSmad転写コリプレッサーSnoNのアップレギュレーションにより、ヒト腎臓上皮細胞においてEMTをブロックする(23)。これらの研究により、TGF-βのEMTを誘導する作用を中和するための戦略としてSmad活性をモジュレートすることの実現可能性が示唆される。TGF-β-誘導EMT及び他のシグナル伝達経路とのその相互作用を仲介する正確な分子メカニズムに関する知識は、TGF-βシグナル伝達の有益な作用を乱すことなくEMTを阻害する／逆転させる戦略を開発するために重要である。
【０１８０】
EMTの調査及び本発明のBMPアゴニストペプチドによるそのレギュレーション
EMTの調査には、EMTプロファイルを説明するマーカーのパネルの利用が必要である。上皮表現型の消失は、特定の上皮タンパク質の発現、例えば、接着関連タンパク質(例えば、E-カドヘリン)、サイトケラチン、及び頂端部アクチン-結合膜貫通タンパク質-1(MUC-1)の発現の消失により明確に定義されうる。特に、E-カドヘリンの消失は、開始刺激とは関係のないEMTの普遍的な特徴であり(24)、また場合によっては、E-カドヘリンが産生されると浸潤性の間葉表現型の逆転が観察されることがある(25)。高血糖状態はヒト腎上皮細胞においてEMTを誘導する可能性があり、該細胞はより伸長し、基質への接着が低下してそれらの頂端-基底極性を喪失することが示されている。この過程で、該細胞は、より線維芽細胞に近い表現型と一致する特徴である、TGFβのde novo発現の増加、E-カドヘリン発現の消失(26)並びにフィブロネクチン及びコラーゲンなどの細胞外マトリックス分子の合成を示す。筋線維芽細胞の活性化は、細胞接着、アクチン再構成、及び慢性腎線維化の亢進された細胞進行の過程において重要な役割を果たす。特発性肺線維症(IPF)は、EMT過程を通じた上皮細胞及び線維芽細胞のマトリックス分泌筋線維芽細胞への分化を伴い、かつ肺の瘢痕化を生じる、肺胞上皮傷害に対する慢性の調節不全反応である。この過程で、細胞は、筋線維芽細胞活性化及びコラーゲン産生を引き起こし、その結果として肺線維化を生じる、TGFβのde novo発現の増加及びE-カドヘリン発現の消失を示す(27、28、29)。
【０１８１】
BMP-7は、TGF-βシグナル伝達経路に干渉し、それによってEMT過程、筋線維芽細胞の増殖及び上皮細胞のアポトーシスの逆転をもたらすことが示されている。この作用は、動物モデルでの腎線維化(30)の治療において考慮すべき利点を有する。本明細書中で検討したペプチドは、両II型BMP受容体と特異的に、かつI型BMP受容体と選択的に相互作用してBMPシグナル伝達を誘導し、それによって骨形成誘導作用以外のBMP7の作用を模倣する細胞応答を誘導する。これら化合物の全てではないがその多くが、高血糖状態にある腎尿細管上皮細胞においてEMT過程を阻害する。EMTは尿細管間質線維化の発生に必須のメカニズムである。ヒト近位尿細管上皮細胞を高グルコースに曝露した場合、E-カドヘリン発現の有意な消失が検出される。BMP-7と同様に、これらの化合物は、これらの細胞においてE-カドヘリン発現の消失を効果的に予防する。従って、これらの結果は、これらのペプチドアゴニストのBMPシグナル伝達特性及び腎保護作用の重要性を説明するものである。
【０１８２】
BMPシグナル伝達の活性化を通じたEMTの制御は肺再生事象にとって重要であるが、肺線維化においては該制御が著しく撹乱される(31)。従って、BMPシグナル伝達活性を回復させるためのこれらのBMP経路ペプチドアゴニストの使用は、ヒト肺線維化を治療する治療可能性を大いに秘めた戦略の1つである。これらの結論は、EMTを介して線維化を生じる他の線維化状態にもあてはまる場合がある。
【０１８３】
線維化疾患の治療のためのペプチドアゴニストの使用可能性
セリン-トレオニン・シグナル伝達経路は、受容体と細胞内メッセンジャー分子との、少なくとも2つの競合する組み合わせからなる。TGF-β側ではTGF-βのII型受容体、I型受容体ALK2及び3並びにSMAD1及び5がEMT過程及び線維形成を促進するように働き、一方、BMP側ではBMPのII型受容体、I型受容体ALK2、3及び6、並びにSMAD1、5及び8が分化した上皮状態を促進するように働く。さらに、これら2つの状態は、反対の状態のシグナル伝達物質をダウンレギュレートすることによって安定する傾向がある。TGF-β側による細胞の刺激にはBMP、BMP受容体及びSMAD1、5及び8の発現をダウンレギュレートする作用があり、逆の場合も同様である。従って、これら2つの経路は双安定生化学的スイッチとして働く。線維化を治療する、及び／又は逆転させるための戦略は、TGF-β側を阻害することを目的としたもの(TGF-βのアンタゴニスト及び阻害剤、例えば、抗-TGF-β抗体、デコイ受容体及びTGF-β結合タンパク質)であってもよく、又はBMP-7もしくはBMP経路の他のアゴニスト、例えばこれらのペプチドを使用してBMP側を刺激することを目的としたものであってもよい。
【０１８４】
TGF-β1による腎尿細管上皮細胞の処理はEMTを誘導する(E-カドヘリン発現は減少するが、間葉マーカー、例えば、α-SMA、フィブロネクチン、コラーゲンI及びCTGFの発現は増加する)。BMP-7はこれらの作用全てを用量依存的な様式で阻害する。事実、BMP-7は、TGF-β1-誘導EMTを逆転させて内因性E-カドヘリンの再発現をもたらすことができる(32)。幾つかの慢性腎臓傷害の動物モデルでは、BMP-7は腎機能の進行性喪失及び腎線維化を和らげる(33〜36)。
【０１８５】
線維化の徴候を示す症例においても同様の観察を行う。特発性肺線維症の動物モデルでは、BMP-7が、肺において実験的に誘導した線維化(31)を、TGFβ-誘導EMTをモジュレートしかつ肺線維芽細胞によるコラーゲン産生を阻害することにより和らげることが示されている(37)。BMP-7が抗-炎症剤及び抗-線維形成剤として重要な役割を果たすという証拠が存在する肝臓線維形成の症例においても同様である(38)。心臓線維症は、胎児心臓における心内膜床の形成時に生じる事象と類似した内皮-間葉転換(EndMT)を示唆する、内皮細胞を起源とする線維芽細胞の出現と関連がある。TGF-β1で処理した心臓内皮細胞はEndMT過程を経ることが観察され、一方でBMP-7は内皮表現型を保存する。圧負荷及び慢性同種移植片拒絶反応のマウスモデルでは、組換えヒトBMP-7の全身投与によりEndMT及び心臓線維症の進行が有意に阻害される(39)。
【０１８６】
慢性腎線維化に関連する血管石灰化の症例においては、幾つかの研究の結果により、BMP-7もまた有効な治療であることが示唆されている。血管壁において骨芽細胞様の表現型を呈する細胞は、血管石灰化の病因において重要でありうる。オステオカルシンの発現は骨芽細胞機能のマーカーとして利用される。オステオカルシンは無処理尿毒症動物で増加するが、BMP-7で処理した場合は非尿毒症対照動物と同様のレベルまでダウンレギュレートされることが示されている(40)。上記線維化疾患の全てにおいて、EMTは組織における線維形成の不可欠な側面として認識されており、またBMPシグナル伝達の刺激はEMT過程を阻害するか又は逆転させるのに有効であることが示されている。
【０１８７】
高D-グルコース(高血糖状態)のヒト腎近位尿細管上皮細胞にE-カドヘリン発現の消失と共にEMTが誘導されたことを考慮すると、本出願のペプチドは、ヒト腎近位尿細管上皮細胞に対するその作用を阻害するBMPシグナル伝達経路の有効なアゴニストであることが示された。さらに、これらのペプチドは、TGF-β1により誘導されるEMTを逆転させて内因性E-カドヘリンの再発現及び上皮形態の保存をもたらすことが示された(Nature Medicineの記事から得た図面41を参照されたい)。慢性腎臓傷害の幾つかの動物モデルでは、経口的に投与したこれらのペプチドのうちの1つが、腎機能の進行性喪失及び腎間質線維化を和らげた。特発性肺線維症の動物モデルでは、このペプチドアゴニストは肺上皮細胞のブレオマイシン誘導EMT及び肺線維化を有効に阻害した(実施例7及びこれに関連する図面を参照されたい)。THR-123処理マウス(1日経口用量5 mg／kg)は16日での犠牲死までに80％の生存率を示し、一方、ビヒクルで処理したマウスは8日までに100％の死亡率を示した。肺組織の組織形態計測解析により、THR-123で処理した動物において有意に低い肺線維化を示した。さらに、これらのBMPシグナル伝達経路のペプチドアゴニストは、他の線維化疾患、例えば、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症及び強皮症の腎リスク(全身性硬化症)の治療に関する治療可能性を提供した。
【０１８８】
さらに、TGF-β作用及び組織線維化のアンタゴニストであるBMPシグナル伝達のペプチドアゴニストは、他の線維化疾患、例えば、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、心臓線維症及び強皮症の腎リスク(全身性硬化症)の治療のための潜在的な治療用途を提供する可能性がある。これらの線維化疾患におけるかかる化合物(複数種可)の効果を試験するために、スクリーニングのための幾つかの細胞アッセイ及び動物モデルを検討した。テンプレートについては下記表を参照されたい。
【０１８９】
本発明のBMP-アゴニスト及びアンタゴニストペプチドをスクリーニングするためのテンプレート：
テンプレートA：本発明のペプチドを試験するための線維化疾患の細胞モデル(in vitroアッセイ)：
【表３】
2014527040.tif 000027
【表４】
2014527040.tif 000028
【０１９０】
実施例6：肺線維化モデルにおいて本発明のペプチドの抗-線維化活性を試験するためのin vitro及びin vivoアッセイ
A.in vitroアッセイ(理論)
目的：
化合物を、ヒト気管支上皮細胞(HBEC)を使用し、抗-線維化活性(EMT過程の阻害又は逆転)についてin vitroでスクリーニングした。本アッセイでは、試験化合物がE-カドヘリン発現(上皮マーカー)のTGF-β-仲介ダウン-レギュレーション、並びに幾つかの間葉マーカー、すなわち、ビメンチン及びα-平滑筋アクチン(α-SMA)のTGF-β-仲介アップ-レギュレーションを阻害するその能力を測定した。さらに、同じ細胞を使用することにより、試験化合物によるEMTの阻害／逆転がBMPシグナル伝達メカニズムにおけるSmad依存性の一次過程であるかどうかを調べた。
【０１９１】
前記アッセイを、活性化合物を最適化するためにも使用した。化合物に応答した、上皮マーカーであるE-カドヘリン、並びに間葉マーカーであるN-カドヘリン、ビメンチン、α-平滑筋アクチン(α-SMA)、MMP-2、MMP-9及びI型コラーゲン・α1(COL1A1)の発現(アップ又はダウン)を、ウェスタンブロット解析により、またその後は定量的ELISAアッセイにより、測定した。
【０１９２】
実験計画及び方法：
細胞培養：
ヒト気管支上皮細胞(HBEC；Lonza, MD, USA)を、加湿インキュベーター内で5％CO2の存在下、37℃でBEGM培地(Lonza)にて維持した。HBECを用いたさらなる実験は全て、他に指示しない限り、BEGM培地のみで実施した。
【０１９３】
EMTアッセイ：
HBECを、1：100 BEGM：BEBM(6ウェルプレート)に106個の細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を1日付着させた後、5 ng／mLのTGF-β1(R＆D Systems, MN, USA)を含有する培地と交換した。該HBECをその後3〜5日間分化させた。ヒトBMP7組換えタンパク質は、本アッセイにおいては陽性対照として使用することが可能であった。試験化合物の存在下でのEMTアッセイのために、HBECを、EMT誘導に先立って1時間、漸増濃度(1〜200μM)の試験化合物と共にインキュベートし、EMT誘導をTGF-β1(5 ng／mL)の添加と48時間又は3〜5日間のインキュベーションにより開始した。Smad経路阻害剤SB431542(10μM, Sigma-Aldrich)及びERK経路阻害剤PD98059(10μM, Calbiochem)もまた参照阻害剤として使用することが可能であった。
【０１９４】
位相差顕微鏡法：
TGF-β1の存在下でインキュベートしたHBECは、位相差顕微鏡法により評価することが可能であった。TGF-βによる処理は、一般的に、緩い細胞間接触と、よりまばらになりかつ伸長した線維芽細胞形態へと変化する細胞を生じる。抗-線維化化合物はこれらの形態変化を予防することが予想された。
【０１９５】
免疫蛍光染色及び顕微鏡法：
上記のように、HBEC細胞をウェルに播き、48時間又は3〜5日間のTGF-β1(5 ng／mL)の添加(EMT誘導)に先だって1時間試験化合物に曝露した。該細胞を洗浄し、1：1アセトン：メタノール混合液で室温(RT)にて2分間固定し、さらに1％ヤギ血清及び1％BSAを含有するPBSでRTにて7分間ブロックした。リン酸化SMAD1/5/8及び／又はリン酸化SMAD2/3の存在、並びに細胞核内へのそれらの移行を同定するために、該細胞をその後、最初はリン酸化SMAD1/5/8又はリン酸化SMAD2/3に特異的な一次ウサギ抗体、その次にウサギIgGに対するFITC-標識二次抗体を用いて免疫染色した。免疫染色した細胞を、倒立蛍光顕微鏡(Axiovert；Carl Zeiss)を使用し、倍率200×(20×対物レンズと10×接眼レンズ)で可視化及び撮影した。
【０１９６】
ウェスタンブロッティング：
上皮及び間葉マーカーのアップ又はダウン-レギュレーションを判定するために、次の抗体：E-カドヘリン(Abcam, MA, USA)、N-カドヘリン(Zymed, CA, USA)、ビメンチン(Abcam)、α-SMA(Sigma)、MMP-2(R＆D Systems)、pSmad2(Cell Signaling, MA, USA)、及びpSmad1/5/8(Cell Signaling)をウェスタンブロット・フォーマットで使用した。インキュベートした細胞を、1％NP-40、150 mM NaCl、50 mM Tris pH 8.0、1 mM オルトバナジウム酸ナトリウム、5 mM NaF及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma, NY, USA)を含有するTRIS緩衝液で溶解させた。細胞溶解物を次に4〜10％勾配アクリルアミドゲル上でSDS PAGEに供した。電気泳動したタンパク質バンドをその後PVDF膜に転写し、さらにTris緩衝食塩水(TBS)、0.1％Tween-20、5％脱脂粉乳で室温(RT)にて1時間ブロックした。ブロットを次にTBS 0.1％Tween(TBS-T)で3回洗浄し、さらにRTで1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ-標識二次抗体(Invitrogen)と共にインキュベートした。TBS-Tでの洗浄を繰り返した後、化学発光(ECL；Pierce, L, USA)により製造業者の説明書に従って免疫反応性タンパク質を検出した。GAPDHに対する抗体をローディング対照として使用することが可能であった。
【０１９７】
ELISAアッセイ：
試験化合物に対するHBEC細胞の用量関連抗-線維化反応は、ELISAアッセイより、上皮マーカーE-カドヘリン(＃7886, Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA)に対する抗体を使用し、また間葉マーカーを検出するためにはMMP-2(DMP200, R＆D Systems, MN, USA)、MMP-9(DY911, R＆D Systems, MN, USA)、αSMA(ACTA2, antibodies-online Inc, Atlanta, GA 30346, USA)、N-カドヘリン(ABIN867238, antibodies-online Inc, Atlanta, GA, USA)、ヒト・ビメンチン(ABIN869687, antibodies-online Inc, Atlanta, GA, USA)、又はヒトI型コラーゲン・α1(COL1A1)(ABIN512856, antibodies-online Inc, Atlanta, GA, USA)に対する抗体を使用して判定することが可能であった。
【０１９８】
アッセイの妥当性確認：
データにより、初代ヒト気管支上皮細胞(HBEC)は、典型的な形態変化、並びにウェスタンブロット法及び定量的ELISA法によるEMTマーカーのそのタンパク質レベルでの進行により明らかとなったように、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)に応答してEMTを起こす能力があることが示された。N-カドヘリン、ビメンチン、MMP-2を含む幾つかの間葉マーカー及び筋線維芽細胞マーカーa-SMAの増加発現がタンパク質レベルで検出された。対照的に、上皮マーカーE-カドヘリンのダウン-レギュレーション、並びにメタロプロテアーゼMMP-2の増強発現がTGF-β1の存在下で観察された。この作用は、主にSMAD2/3依存性のメカニズムを介して仲介されることも示されており、またBMP経路活性化によりさらにモジュレートされる可能性もある。
【０１９９】
化合物活性の実証：
本発明の化合物(複数可)もまたHBECにおいてEMTをモジュレートすることにより気道の線維化発症に関与する場合があるかどうかを判定するために、HBECを試験化合物のみと共に、又はEMT誘導前にTGF-β1と共に、インキュベートした。かかる試験化合物(複数可)は、TGF-β1により誘導されるI型コラーゲンの発現を阻害することが見出された。その上、TGF-β1により誘導されるメタロプロテアーゼMMP-2及びMMP-9の過剰発現は、該試験化合物(複数可)により阻害された。該試験化合物がMMP2タンパク質のTGF-β1-仲介アップレギュレーションに与える拮抗作用は、位相差顕微鏡法を使用して細胞形態を評価することによりさらに確認された。該試験化合物は、N-カドヘリン、ビメンチン、MMP-2を含む幾つかの間葉マーカー及び筋線維芽細胞マーカーa-SMAのTGFβ誘導増加発現を阻害するのに有効であった。このことは、上皮表現型E-カドヘリンの著しい回復と関連していた。BMPシグナル伝達が該試験化合物の存在下で進行していることを保証するために、BMPシグナル伝達の下流エフェクターであるSmad1、5及び8のリン酸化形態と交差反応する抗体を使用した。Smad1/5/8のリン酸化の増加(TGF-β1を同時に添加すれば無効にできるであろう作用)が該試験化合物の存在下で認められた。これらの結果により、HBECにおけるEMT時のTGF-β及びその経路に対する、試験化合物(複数可)による反作用が示唆された。
【０２００】
従って、前記の結果により、肺線維化時の気管支上皮細胞から間葉細胞への分化のメカニズムに関するさらなる研究の基盤、及び肺線維化の新規治療手段を開発するための基盤が提供された。
【０２０１】
in vivoアッセイ(実施化)
目的：
上記in vitro肺線維化アッセイにおいて活性を示すことが見出された試験化合物を、次に、ブレオマイシンの単回気管内投与によりマウスに肺線維化を誘導した動物モデルにおいて試験した。このモデルでのエンドポイントは、生存、及び肺組織における線維化の程度の組織形態計測評価とした。本研究はAnimal Welfare Act Regulation, 9 CFR 1-4のガイドラインに従って実施した。
【０２０２】
材料及び方法：
試験化合物の製剤化：
凍結乾燥形態の前記試験化合物を、50 mM 酢酸緩衝液、pH 4.5に20 mg／mLの初濃度で溶解した。このストック溶液を次に幾つかの1 mLアリコートに分割し、急速冷凍してから、使用するまで-70℃で保存した。使用の当日には、各アリコートを解凍し、さらに必要な使用濃度までPBS(pH 7.5)で希釈した。該使用濃度は、意図する用量(mg／kg体重)及び経口用量から決定した。
【０２０３】
材料：
1.体重が21〜26 gのBALB/cマウス(Charles River Laboratories, Cambridge)
2.ブレオマイシン(Blenoxane, Sigma, St. Louis, MO)
3.シクロホスファミド(一水和物としてSigma-Aldrichから入手、St. Louis, MO)。
【０２０４】
実験計画：
動物モデル：
試験化合物(配列番号1〜11)がブレオマイシン誘導肺線維化を和らげることができるその程度を評価するための研究を、標準的な動物舎条件下、普通食で維持したBALB/cマウス(Charles River)に対して実施した。肺線維化を開始させるために、マウスを12.5 mg／mLケタミン250μLの腹腔内注射により麻酔し、続いて50μLの滅菌PBS中2 U／kg体重のブレオマイシン(Blenoxane, Sigma, St. Louis, MO)の気管内注入を行った。さらに、該マウスにシクロホスファミド(150 mg／kg体重)の単回腹腔内注射を施した。ブレオマイシン及びシクロホスファミドを投与したこの動物を、各群最低でも6匹の動物を有する2つの群に分けた。ビヒクル処理群(第1群)には1日経口用量のPBS(pH 7.5)を与えた。化合物処理群処理群(第2群)には、試験する化合物を、予備試験では1日経口用量5 mg／kgだけ与え、また追跡試験では用量反応を確立するため、及び最小有効量を決定するために典型的には0.03、0.1、0.3及び1.0 mg／kgの用量レベルで与えた。これらの処理をブレオマイシン投与後最長16日間継続した。第3のマウス対照群には、ブレオマイシン及びシクロホスファミドではなくPBSを気管内に与えた。
【０２０５】
肺の調製及び肺線維化の組織学的評価：
生前試験の終了後、前記動物を安楽死(メトキシフルラン麻酔)させてから、その肺に氷冷ハンクス平衡塩類溶液を灌流させることにより血液由来の細胞を除去し、さらにその後30 cm H2Oの定圧下で10％中性緩衝ホルマリン(NBF)を用いて膨張させた。肺を気管部で結紮し、一塊として取り出し、さらにNBFに24時間浸漬した。その後、組織試料を70％アルコールに移してからパラフィン包埋を行い、続いて切片を作成してから、ヘマトキシリン、エオジン及びマッソン三色で染色した。コラーゲンの蓄積(マッソン三色)の程度を判定することにより肺線維化を評価するために、切片を顕微鏡的に解析した。
【０２０６】
Smadシグナル伝達：
リン酸化Smad1, 5, 8(BMPシグナル伝達)又はリン酸化SMAD2/3(TGF-βシグナル伝達)のレベルを測定するために、各群のマウスから得たスライドを個別に染色した。切片を脱パラフィン処理し、再水和させて、さらに抗原回復に供した。続いて、内因性ペルオキシダーゼを3％H2O2で失活させてから、50％ヤギ血清で20分間ブロックした。一次リン酸化Smad1,5,8又はリン酸化Smad2,3抗体(ウサギポリクローナル、Cell Signaling Technology, Danvers, MA)を各切片群に添加し、さらに25％ヤギ血清にて4℃で一晩インキュベートした。切片を次にビオチン化ヤギ抗-ウサギ二次抗体(Vector Labs Burlingame, CA)と共に60分間インキュベートし、続いてストレプトアビジン-HRP(Dako, Mississauga, ON)で10分間処理した。目的の抗原を、褐色色原体3,3-ジアミノベンジジン(Dako, Mississauga, ON)を使用することにより可視化し、さらにハリス・ヘマトキシリン液(Sigma, Oakville, ON)で対比染色した。
【０２０７】
EMTに関する肺の免疫組織化学：
上皮及び／又は間葉マーカーの存在を評価するために、肺組織切片を脱ろう処理し、再水和させて、10％ヤギ血清で室温にて60分間ブロックし、さらにα-SMA又はビメンチン(間葉マーカー)又はE-カドヘリン(上皮マーカー)について免疫蛍光的に染色した。切片を4℃で一晩、抗-α-SMA抗体もしくは抗-ビメンチン抗体と共にインキュベートするか、又は抗-E-カドヘリン抗体と共インキュベートし、その後、必要に応じて、ヤギ抗-マウスIgG-TRITC抗体又はヤギ抗-ウサギIgG-FITC抗体と共に1時間インキュベートした。核を同定するために、DAPI(95％エタノール中500 ng／mL)を使用することにより核を20秒間染色し、さらに80％グリセロールを用いてカバーガラスを載せた。デジタルカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用してスライドを調べた。
【０２０８】
TUNELアッセイ：
アポトーシス細胞を、TUNEL検出キット(In Situ Cell Death Detection Kit, Roche Applied Science)により検出した。組織切片を脱パラフィン処理し、再水和させて、さらに蒸留脱イオン水で洗浄した。プロテイナーゼKによる処理後、断片化DNAを、ターミナルトランスフェラーゼを使用してフルオレセイン-dUTPで標識した。スライドにDAPI含有Vectashieldを滴下した。切片を、蛍光検出系を備えた蛍光顕微鏡を使用して解析した。4,000個又はそれ以上の細胞を1細胞群として、TUNEL＋細胞のマニュアル計数によりアポトーシス割合を得た。
【０２０９】
組織ホモジネート調製：
コラーゲンアッセイ：
全マウス群から得た肺を、コンプリート・プロテアーゼ・インヒビター(Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, Indiana, USA)に入れてホモジナイズした。ホモジネートを900 x gで10分間遠心分離してから、解析時まで凍結した。
【０２１０】
シリウスレッド試薬を各肺ホモジネート(50 mL)に添加し、さらに室温で30分間混合した。コラーゲン-色素複合体を16,000 gで5分間の遠心分離により沈殿させてから、この沈殿物を1 mLの0.5 M NaOHに再懸濁した。各試料中のコラーゲンの濃度は、製造業者の説明書通りに540 nmにおける吸光度として測定し、さらに値を既知標準曲線から推定した。
【０２１１】
ケモカイン、MMP-2及びMMP-9のレベルはR＆ D Systems, CA, USAから入手したELISAキットを使用して測定した。
【０２１２】
結果：
動物死亡率：
ビヒクル処理マウス(第1群)の場合、ブレオマイシン及びシクロホスファミドを投与してから8日後までの死亡率は100％であった。ブレオマイシン＋シクロホスファミドを投与した化合物処理マウス(第2群)の場合、生存は、線維化の開始から16日後(生前試験の終了)の時点で80％もの高さであったが、ビヒクル処理マウスは8日までに100％の死亡率を示した。
【０２１３】
肺線維化：
肺線維化は、マッソン三色で染色されたコラーゲン蓄積肺切片を含む視野の割合を判定することにより組織形態計測学的に評価した。ブレオマイシン及びシクロホスファミドによる処理の10日後、ビヒクル処理動物は31％のスコアの増加した肺線維化を示した。このことは、これらの動物全ての死亡と関連していた。しかし、THR-123を経口的に与えた場合、THR-123はブレオマイシン＋シクロホスファミド誘導肺線維化を16日までに16％まで低減し、全マウスが生き残った。
【０２１４】
他の予想された結果：
ブレオマイシン処理マウスの肺は、肺組織切片におけるEMTマーカーの進行によって明らかにされたように、EMT過程を示した。N-カドヘリン、ビメンチンを含む幾つかの間葉マーカー及び筋線維芽細胞マーカーa-SMAの増加発現が観察された。対照的に、上皮マーカーE-カドヘリンのダウン-レギュレーション、並びにメタロプロテアーゼMMP-2の増強発現がこれらの切片で観察された。本発明者らは、この効果が主にSMAD2/3依存性のメカニズムを介して仲介されるものであり、またBMP経路活性化によりさらにモジュレートされうるものであることにも注目した。
【０２１５】
前記の化合物による処理は、生存、並びにN-カドヘリン、ビメンチン、MMP-2を含む幾つかの間葉マーカー及び筋線維芽細胞マーカーa-SMAの発現におけるブレオマイシン-誘導増加の阻害に、有意な増加をもたらした。このことは、EMTの予防を示す、上皮表現型E-カドヘリン発現の著しい回復と関連していた。また、化合物で処理したブレオマイシン処理動物は、肺組織において、主要なBMPシグナル伝達経路の関与を示す、Smad1/5/8の増加したリン酸化及びそれらの核移行を示した。その上、ブレオマイシンで処理したマウスにおいて観察されたコラーゲン並びにメタロプロテアーゼMMP-2及びMMP-9の増加発現が、前記化合物で処理した全ての動物において阻害された。
【０２１６】
この広く用いられている肺線維化動物モデルにおけるこれらの結果(予想された結果を含む)は、試験した前記化合物が、線維化を著しく低減し、また結果的に動物の生存を有意に改善することにより、肺の病状を緩和できるということの証拠である。
【０２１７】
実施例7：本発明のBMPアゴニストペプチドはBMP7シグナル伝達経路及びAlk-3受容体を介して腎尿細管上皮細胞における線維化及びEMTを逆転させる
BMP及びTGFβなどのTGFβスーパーファミリーに関連する分子は、炎症、アポトーシス及び細胞変化の重要な調節因子である。ここで、BMP7受容体であるアクビチン様キナーゼ3(Alk-3)は腎臓傷害に応答して有意に上昇すること、及び腎尿細管上皮におけるその特異的欠失は加速されたTGFβ／Smad3シグナル伝達、尿細管上皮傷害及び腎臓線維化を招くことが実証され、Alk-3仲介シグナル伝達の腎保護的な役割が示唆された。この活性を治療的に利用するために、Alk-3受容体への特異的結合を示す経口的に摂取可能な小環状BMPペプチド模倣物を構築する目的で有機合成化学を利用することにより、ALK-3／BMPリガンド-受容体複合体の構造-機能解析を実施した。スクリーニングにより、幾つかの異なるin vitro及びin vivo実験において炎症、アポトーシス及び上皮間葉転換プログラムを阻害したペプチド、THR-123(表1の配列番号1)が同定された。THR-123は5つの異なるマウスモデルにおいて腎傷害及び線維化を抑制しかつ逆転させ、またTHR-123とアンギオテンシン-変換酵素阻害剤カプトプリルの組み合わせは、腎臓線維化を制御する上で相加的な治療効果を呈した。本発明者らの結果により、THR-123が、クリニックにおいて線維化を逆転させるための潜在的有用性を有する新規抗-線維化剤であることが実証された。
【０２１８】
序論：
トランスフォーミング増殖因子(TGF)-βスーパーファミリーのメンバーである骨形成タンパク質-7(BMP7)は、TGF-β-仲介線維形成活性のアンタゴニストとして機能する1〜3。BMP7は、異なる細胞型においてアクビチン様キナーゼ(Alk)-2、-3、-6に結合して別個の活性を示し4、抗-炎症機能及び抗-アポトーシス機能を呈し、さらに骨形成を促進する5,6。機能的観点から見れば、BMP7の抗-線維化活性はクリニックで試験するための魅力的な候補であるが、異なる受容体を介したその複数の活性(特に骨形成)はある特定の臨床開発課題を生み出している。この点については、様々な研究により、BMP7の骨形成作用はAlk-6を介してのみ仲介されること、またその抗-線維化作用は恐らくAlk-3を介して、また場合によってはAlk-2を介して仲介されることが示唆されている7〜12。BMPシグナルはSmad1/5を介するが、TGFβシグナルはSMAD2/3を介する4。
【０２１９】
多くの異なる病因に起因する末期腎疾患(ESRD)は、尿細管間質線維化の程度と正の相関を呈する13〜17。ここで、Alk-3が炎症、アポトーシス及びEMTプログラムを制御することにより線維化を阻害する働きをすることが実証された。BMP7活性を模倣する小環状ペプチド(THR-123)はAlk-3に結合して腎臓線維化を逆転させた。THR-123は、特異的かつ有効な治療法が利用できない進行性の腎線維化疾患に対する新規治療薬である。
【０２２０】
結果：
(A)  尿細管上皮細胞のAlk-3受容体は線維化の負の調節因子としての役割を果たす
腎保護特性及び抗-線維化作用は、BMP7に関しては様々な腎疾患モデルにおいて実証されている2,18〜20。幾つかの研究により、BMP7発現は急性及び慢性の腎臓傷害において抑制されることが示唆されている21〜24。本発明者らは、BMP7により調節される幾つかの分子の発現レベルについて、慢性の腎傷害を有するマウスにおいて異なる時点でスクリーニングした。評価した、BMP7により調節された13種類の分子の中で、Alk-3の発現だけが腎臓傷害の1週間後にピークに達した(図42 A)。3〜6週の間は、Alk-3の発現は対照腎臓と比較すると高いままであった(図42 A)。9週では、Alk-3の発現は対照腎臓と比較すると減少した(図42 A)。BMP7の発現レベルは腎臓傷害後に試験した全分子の中で最も減少し、傷害後3週間でその最低レベルに達し、また9週目まで低いままであった(図42 A)。
【０２２１】
BMP7はAlk-3に結合し、さらに受容体により調節されるSmad1/5をリン酸化する4。NTNにより誘導された慢性の腎臓線維化を有するマウス(図42 B〜D)では、尿細管の核内に蓄積するリン酸化Smad1(pSmad1)が傷害後1週間で検出された。興味深いことに、pSmad1は腎臓傷害の約6週間後に再度減少し(図42 E〜G)、従ってAlk-3の発現で観察されたもの(図42 A)と同様の傾向を示した。これらの結果から、BMP7／Alk-3軸は腎上皮傷害及び間質線維化と負に相関していることがさらに示唆された。この観察結果を機能的に処理するために、本発明者らは、γGT-Creマウス25及びAlk-3の対立遺伝子にLoxP配列が導入されているマウス26を使用して尿細管上皮細胞のAlk-3受容体を欠失させた。
【０２２２】
対照マウスにおけるNTNの誘導から6週間後、これらのマウスにおける線維化は、γGT-Cre；Alk-3 fl／flマウス(Alk-3欠失マウス)における線維化と比較して少なかった(図42 T〜V)。Alk-3欠失マウスにおけるこの加速された線維化は、尿細管上皮細胞の核内の増加したpSmad2(図43)により実証されたように、TGF-β経路の増強された活性化と関連していた。血清BUN測定により判断した腎機能は、対照マウスと比較して、線維化を有するAlk3欠失マウスで有意に高かった(図42 W)。まとめると、これらの結果により、Alk-3が線維化から腎間質を保護する上で重要な役割を果たしうることが示唆された。
【０２２３】
マクロファージ流入を伴う炎症及び腎上皮アポトーシスは、腎線維化の重要な火付け役であると考えられている28。重要なことに、以前の研究により、腎臓において炎症、アポトーシス及びEMTプログラムを制御する際のBMP7／Alk-3／Smad1/5シグナル伝達経路の重要性が実証された。本発明者らは、Alk3欠失マウスに関しては、腎尿細管上皮の線維化がMAC-1陽性マクロファージ(図44)の流入の増加をもたらし、またより多くの数の尿細管上皮細胞が、該細胞におけるEMTプログラムの指標である上皮マーカーE-カドヘリンと間葉マーカーFSP1／S100A4の共局在を呈することを実証した(図42 X〜Z)。
【０２２４】
(B)  BMPシグナル伝達経路アゴニストであるTHR-123の設計
BMPシグナル伝達経路の環状ペプチドアゴニストは、側鎖の溶媒露出度を、一直線に並べた複数のTGF-βスーパーファミリー配列の最も高い可変性を有する領域31と比較し、受容体相互作用に関与している可能性が最も高いTGF-β2 29,30及びBMP7 31の3D構造の領域を同定することにより、設計した。目的の領域をさらに改良するために、各位置における物理化学的残基特性をそれらの活性との相関関係に基づいて比較検討する構造-変化解析(SVA)プログラム32を使用した。目標は、受容体-結合領域を同定し、その後その配列を特異的BMP活性に関して最適化することとした。次に、最も高いスコアが付いた残基の位置をBMP-7の3-D構造31に対応付けた。同定された3つの構造領域31のうち、フィンガー2ループを中心に設計したペプチドが最も有望であることが判明した。これらは、BMP7(図45 A)のフィンガー2ループと立体配座が類似したループを安定化するために1番目の残基位置と11番目の残基位置の間のジスルフィド結合を介して環化されている、約20 kDaの分子量をもつ16残基長のペプチドであった。
【０２２５】
(C)  THR-123のリード最適化及び特徴付け
最適化のための予備スクリーニングは、ヒト腎尿細管上皮細胞系(HK-2)を使用するin vitro細胞ベースアッセイにおける抗炎症性の効能に基づくものとした。該アッセイでは、腫瘍壊死因子(TNF)-αによる前記細胞の刺激の結果によって生じたサイトカインIL-6の産生の増加を逆転させる化合物の能力を試験した。配列-活性解析を、前記SVAプログラムを利用して実施した。6回の最適化サイクル後、THR-123(図2A)がリード化合物として浮上し、これを他の関連のある抗-線維化アッセイ(下記参照)でさらに評価した。
【０２２６】
最初に、BMPの幾つかのI型受容体の細胞外ドメイン(ECD)の、THR-123への特異的親和性を解析した。固定化受容体ECDへの非放射性BMP7の結合を125I-標識BMP7との競合により判定し、さらにScatchard解析により解析することで該受容体ECD各々に対するBMP7の有効な解離定数を決定した。特定の受容体ECDに対するTHR-123の有効な解離定数の推定値を取得するために、非放射性BMP7の解離定数に、THR-123のED50と非放射性BMP7のED50との比を乗じた。データにより、THR-123はBMP7と、Alk-3(図45 B)に関して競合し、またわずかにAlk-2(データは示さず)に関して競合するが、Alk-6(図45 C)については全く競合が観察されないことが実証され、このことは、前記3種の公知BMP I型受容体のうち、Alk-3がTHR-123の主な標的であるを示唆していた。
【０２２７】
全血及び血漿におけるTHR-123の安定性をin vitroで試験した。PBS-マンニトール緩衝液中では、THR-123は400分強もの間安定していた(図46)。ラット血漿中では、THR-123は緩やかに分解されかつその半減期は358分であったが(図46)、全血中では、THR-123は急速に分解された(半減期は70分)(図46)。
【０２２８】
THR-123の体循環での持続性を、iv投与した125I-標識化合物及びその後の放射能減衰を利用して評価した。血漿及び全血の両方において、THR-123レベルは5分以内に速やかに減少し(ほぼ90％)、このことは、α-相(図45 D)におけるTHR-123の非常に短い半減期を示唆していた。125I-THR-123のβ-相評価により、半減期は55〜58分と示された(図45 E)。125I-THR-123の静脈内投与の6時間後では、放射能の大半は依然として腎臓及び膀胱に局在しており(図45 F)、このことは、THR-123が腎臓に蓄積し、さらに膀胱を介して尿中に排泄されることを示唆していた。経口投与した125I-標識THR-123は摂取後1時間以内に主に腎皮質に局在し、また約3時間でピークに達した(図45 G)。摂取の24時間後には、125I-THR-123の放射能の大部分が腎臓から完全に除去された(図45 G)。
【０２２９】
(D)  THR-123は、尿細管上皮細胞の炎症性サイトカイン産生、アポトーシス及びEMTプログラムを阻害した。
炎症は腎線維化の重要な特徴である。BMP7は抗-炎症活性を示し5,33、従ってヒト腎尿細管上皮細胞系(HK-2細胞)における幾つかの炎症誘発性サイトカインの発現に対するTHR-123の効果に関する調査を促した。BMP7及びTHR-123は用量依存的な様式でTNF-α誘導IL-6産生を阻害した(図47 A)。THR-123はHK-2細胞においてTNF-α-誘導IL-8(図47 B)及びICAM-1(図47 C)産生もまた阻害し、このことは、BMP7の機能と同様に、THR-123が抗-炎症特性を呈することを示唆していた。
【０２３０】
BMP-7は尿細管上皮細胞(TEC)をアポトーシスから保護するという報告もある22。TECにおけるTGF-β-誘導アポトーシスをアネキシンV標識により解析した(図48 A)。BMP7及びTHR-123は類似した抗-アポトーシス活性を呈したが(図48 B,C)、かかる抗-アポトーシス活性は、対照スクランブル環状ペプチドを使用した場合には検出されなかった(図48 C,D)。TECの低酸素誘導アポトーシスはBMP7及びTHR-123によっても阻害された(図49 A〜D)。さらに、シスプラチン誘導アポトーシスはTHR-123により阻害された(図50 A〜D)。
【０２３１】
BMP7はTGF-β誘導上皮間葉転換(EMT)プログラムを阻害することが示されている2。BMP7と同様に、THR-123もTGF-β誘導EMTプログラムを阻害した(図51 A〜D、図52 A〜C)。TGF-βはE-カドヘリン発現を阻害したが(図51 F及びG)、BMP7及びTHR-123は共に、TGF-βにより抑制されたE-カドヘリンを正常レベルまで回復させた(図51 H及びI)。対照環状スクランブルペプチドは、EMTプログラムに対して有意とはいえない効果を呈した(図51 J)。snail及びCTGFなどの、EMTプログラムに関連する遺伝子のTGF-β誘導発現は、THR-123により阻害された(図52 D, E)。TGF-β及び表皮成長因子(EGF)とのインキュベーションの48時間後、腎上皮細胞はEMTプログラムを呈した(図53 A, B, F, G及び図54 A, B, F, G)。これらの細胞におけるTGF-β-誘導EMTは、BMP7又はTHR-123での処理により逆転した(図53 C, D, F, G及び図54 C, D, F, G)。対照ペプチドはEMTに対して有意とはいえない効果を示した(図53 E及び図54 E)。THR-123により誘導されるEMTの逆転は、E-カドヘリン発現(図53 H〜L)及びSmad1/5リン酸化(図54 H)の回復と関連していた。
【０２３２】
(E)  THR-123は急性及び慢性の腎傷害並びに線維化から腎臓を保護する
急性腎傷害に対するTHR-123の効果を、マウスにおいて虚血再灌流傷害(IRI)モデルを使用して解析した。IRIの7日後、対照マウスは、尿細管拡張及び好酸性で均一な細胞質を有する扁平な上皮細胞を特徴とする急性腎尿細管壊死と一致する腎臓形態を呈した(図55 A, C)。THR-123処理マウスは、対照マウスと比較して、IRI腎臓に有意に少ない尿細管の損傷を示した(図55 A〜C)。血中尿素窒素レベルは両群同程度であった(図55 D)。
【０２３３】
片側性尿管閉塞(UUO)は、重度の腎間質性傷害及び線維化の十分に確立されたモデルである(図56、図57)。UUOの5日後、腎臓は正常腎臓と比較して有意に増加した間質容積を示した(図56 A, B, E、及び図57 A, B)。THR-123の経口投与(5mg／Kg又は15mg／Kg)は、無処理マウスと比較して、UUO腎臓における間質容積の増大を阻害した(図56 B〜E及び図57 C, D)。UUOの7日後、腎臓は間質容積の増加と共に重度の線維化を呈した(図56 F, J及び図57 E)。BMP-7の腹腔内投与は、対照マウスと比較して間質容積の増大を改善した(図56 F, G, J及び図57 E, F)。THR-123の腹腔内投与及び経口投与は共に線維化を阻害した(図56 H〜J及び図57 G, H)。THR-123処理により減少した尿細管損傷は、フィブロネクチン及びI型コラーゲンなどのマトリックス成分の発現の減少と関連していた(図58)。
【０２３４】
次に、ヒツジ抗-糸球体抗体により誘導された腎毒性腎炎(NTN)モデルに対するTHR-123の効果を分析した。NTNを有する腎臓は、間質の損傷及び線維化と共に重度の半月体形成性糸球体腎炎を呈する2,34。かかる病変は、CD-1マウスにおいて徐々に発生した(図59 A〜C及びE〜G並びに図60 A〜C)。NTN誘導の6週間後、マウスは、重度の間質の損傷及び線維化と共に重度の半月体形成性糸球体腎炎を呈した(図59B及び図60B)。THR-123処理(NTN誘導の6週間後に開始)は糸球体病変(硬化)並びに尿細管の萎縮及び線維化を改善し(図59 D〜G及び図60 D)、これはフィブロネクチン及びI型コラーゲンなどのマトリックス成分の発現減少と関連していた(図61)。血中尿素窒素はTHR-123処理後に減少した(図59 H)。本発明者らは、EMTプログラムを有する尿細管細胞を、線維芽細胞特異的タンパク質(FSP)-1及びE-カドヘリンの両方に関して陽性であると同定した。以前の報告2と同様に、EMTプログラムは、正常腎臓と比較してNTN腎臓で顕著であった(図59 I〜K, M)。THR-123処理は、EMTプログラムを呈する細胞の数を有意に減少させた(図59 L, M)。NTN腎臓は、対照正常腎臓と比較してMac-1陽性マクロファージの蓄積増加を呈し；またTHR-123処理はマクロファージの蓄積を阻害した(図62)。THR-123処理腎臓はリン酸化-smad1/5の蓄積増加を提示し、Alk3が仲介する経路の潜在的刺激が明らかとなった(図63)。
【０２３５】
アルポート症候群は、IV型コラーゲンタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性腎疾患である35。IV型コラーゲン鎖のα3鎖が欠損しているマウス(COL4A3KOマウス)は、アルポート症候群に関連する腎疾患を模倣する。16週齢の時点で、COL4A3KOマウスは、野生型腎臓と比較して増加した糸球体異常、尿細管の萎縮及び線維化を呈した(図64 A〜F)。THR-123処理は、糸球体異常を変化させることはなかったが(図64 C, G)、尿細管萎縮及び間質線維化を有意に阻害した(図64 F, H, I)。血中尿素窒素レベルは野生型マウスと比較してCOL4A3KOマウスで増加した(図64 J)。THR-123はCOL4A3KOマウスにおいて血中尿素窒素レベルを有意に改善した(図64 J)。COL4A3KO腎臓では、EMTプログラムを呈する細胞の数が、野生型腎臓と比較して有意に多かった(図64 K, L, N)。THR-123処理は、かかるEMTプログラムの獲得を阻害した(図64 M, N)。COL4A3KO腎臓へのマクロファージの浸潤は対照腎臓と比較して増加し、かつTHR-123処理はマクロファージの浸潤を阻害し(図65)、THR-123処理COL4A3KO腎臓はリン酸化-smad1/5の蓄積増加と関連していた(図66)。
【０２３６】
次に、マウスにおいて糖尿病性腎症(DN)を制御する上でのTHR-123の効果を評価した。ストレプトゾトシン(STZ)を注射したCD-1マウスは、6ヶ月目までに、対照マウスと比較して、間質の損傷に関連する糸球体表面積の増加を伴う糸球体メサンギウム基質の増大を呈し、このことは、進行性のDNを示唆していた(図67 A〜C、F〜H、図68 A〜C)。BMP-7とTHR-123はいずれも糖尿病マウスにおいて糸球体表面積の増加を阻害しなかったが(図67 D, E, K)、BMP-7及びTHR-123は共にSTZ-誘導6ヶ月DNにおけるメサンギウムの増大を阻害した(図67 B〜E, L)。さらに、THR-123処理(5〜6ヶ月目)は、DNを5ヶ月間患っていたマウス(THR-123投与開始前)と比較して、メサンギウム基質の増大を逆転させた(図67 B, E, L)。DNマウスは、対照マウスと比較して増加した尿細管萎縮及び間質容積を示した(図67 F〜H, M, N, 図68 A〜C)。BMP-7(1〜6ヶ月目の処理)又はTHR-123(5〜6ヶ月目の処理)での処理は、尿細管萎縮及び間質容積の増加を阻害した(図67 I, J, M, N、図68 D, E)。THR-123は尿細管萎縮及び間質容積の増加(図67 M, N)を逆転させた。血中尿素窒素レベルは、STZ投与後に5及び6ヶ月目で測定したところ、DNで増加していた(図67 O)。BMP-7及びTHR-123は共にDNにおける腎機能不全を逆転させた(図67 O)。BMP-7処理及びTHR-123処理は共に、EMTプログラム(図67 P〜R, S〜U)、及びマクロファージ浸潤(図69)を阻害した。THR-123処理腎臓は、リン酸化-smad1/5の蓄積増加とも関連していた(図70)。
【０２３７】
アンギオテンシン-変換酵素阻害剤(ACE-I)は、糖尿病性腎症を含む幾つかの慢性進行性腎疾患の進行を制御するために使用される、十分に確立された薬品である36,37。そこで、本発明者らは、進行性糖尿病性腎疾患に関連する線維化を有するマウスにおいて、THR-123及びACE-I[カプトプリル(CPR)]を組み合わせて試験した。糖尿病の誘導から7ヶ月後、DN腎臓は糸球体表面積及びメサンギウム基質沈着の有意な増加を示した(図71 A)。CPR及びCPR／THR-123併用処理を、DN誘導後7ヶ月目の、重度のDNを患うマウスにおいて開始した(図71 A〜H)。糸球体表面積は、解析した全ての群で同一のままであった(図71 A〜D, I)。CPR処理は、これらの実験においてメサンギウム基質増大の進行を阻害しなかったが(図71 A〜C, J)、CPRとTHR-123との組み合わせは、無処理対照マウスと比較して、メサンギウムの増大を有意に減少させた上に逆転させた(図71 D, J)。糖尿病の誘導の7ヶ月後から8ヶ月後(後期)の間に、DN腎臓は尿細管萎縮及び間質容積の増大を呈した(図71 E, F, K, L)。CPR単独ではDN腎臓における尿細管-間質変化が部分的に阻害されたが、CPRとTHR-123の組み合わせは尿細管萎縮及び間質容積の増大を完全に阻害した(図71 G, H, K, L)。血中尿素窒素レベル解析により、DNマウスは糖尿病の誘導の7ヶ月後から8ヶ月後の間に有意な腎機能悪化を呈したことが明らかとなった(図71 M)。CPRは腎機能の進行性の消失を阻害しなかったが(p＝0.08)、併用療法は有意に阻害した(図71 M)。EMTプログラムはCPR単独により阻害され(図71 N〜P, R)、またCPR／THR-123併用処理によっても阻害された(図71 N, O, Q, R)。CPRとCPR-THR-123併用療法は共にマクロファージ浸潤を阻害した(図27)。血糖値及び体重は、ほぼ同月齢の無処理糖尿病マウスと比較して、解析した全ての群で変化しなかった(図73)。CPRは糖尿病の腎臓においてアポトーシスを有意に阻害し(図74)、またCPR-THR-123併用療法は相加的な抗-アポトーシス効果を呈した(図74)。CPR-THR-123処理腎臓はリン酸化-smad1/5の蓄積増加と関連していた(図75)。
【０２３８】
(F)  THR-123はAlk-3受容体を尿細管上皮細胞特異的に欠損させたマウスにおける腎傷害及び線維化を阻害しない
THR-123はAlk-3受容体に結合してBMP7を模倣する作用を誘導した(上記参照)。上記の実験はいずれも、THR-123が炎症、アポトーシス及びEMTプログラムを阻害することにより腎傷害及び線維化を抑制する働きをすることを示唆している。マウスにおいてかかる腎保護活性を発揮する上でのTHR-123の標的の妥当性を機能的に確認するために、腎傷害を発症させたAlk-3欠失マウスにおけるTHR-123の効力を試験した(図42 K)。Alk-3欠失マウス及びその同腹(対照)マウスにIRIを発症させた。Alk-3が欠損しているマウスは、対照マウスと比較して、加速された急性腎傷害を呈した(図76 A〜D)。THR-123は対照マウスにおいて腎傷害を阻害したが、Alk-3欠失マウスにおいては治療効果を呈しなかった(図76 A〜D)。対照マウスにおけるTHR-123Alk-3依存性作用は、マクロファージ蓄積の減少(図77)及び尿細管アポトーシスの増加(図78)と関連していた。
【０２３９】
対照マウスと比較して、加速された腎不全及び線維化がAlk-3欠失NTNマウスにおいて観察された(図76 E, G, I)。THR-123は、対照マウスにおいては腎傷害及び線維化を首尾よく制御するが(図76 E, F, I)、Alk-3欠失マウスにおいては何の効果も有していない(図76 E〜I)ことが実証された。対照NTNマウスに対するTHR-123のかかる治療効果は、腎臓におけるマクロファージ蓄積の阻害(図76 J, K, N)及び尿細管におけるEMTプログラムの阻害(図76 O, P, S)と関連していたが、その一方で、THR-123はAlk3欠失NTNマウスにおいてはマクロファージ蓄積(図76 L, M, N)とEMTプログラム(図76 Q, R, S)のいずれも阻害しなかった。THR-123は野生型NTN腎臓においてアポトーシスを阻害したが、Alk3欠失マウスにおいてはアポトーシスに対する効果を有していなかった(図79)。最後に、THR-123は対照NTNマウスにおいて腎機能を回復させたが、THR-123のかかる腎保護作用はAlk3-欠失マウスにおいては認められなかった(図76 T)。
【０２４０】
考察：
TGFスーパーファミリータンパク質は腎線維化の発症にかなりの影響を与えている38。殆どの場合、このファミリー内の分子の多くが、最も重要なことにはTGFβ1及びTGFβ2が、筋線維芽細胞を動員し、EMTプログラムを促進し、炎症に影響を与え、さらに上皮細胞アポトーシスを誘導するそれらの能力のために、線維化の正の調節因子として同定されている2,5,22,33。線維化におけるTGFβ1の役割にかなり注目が集まっているものの、過去10年間の多くの研究により、BMP-7(TGFスーパーファミリー内の他の分子)が線維化を阻害しかつ逆転させる働きをすることも確認されている2。BMP-7の作用は、その抗-炎症作用、抗-アポトーシス作用及びEMT抑制作用を介して理解される2,5,22,33。BMP-7はSmad-依存性経路を介してTGFβ1の作用を相殺する2。
【０２４１】
上記の点に関して、BMP-7は骨芽細胞のAlk-6受容体に結合して骨形成を誘導することもできる7,9,11,12。腎臓では、尿細管上皮細胞は主にAlk-3受容体を発現する39。従って、理想的な治療用分子は、Alk-3に結合するがAlk-6受容体には結合しないものであろう。加えて、BMP-7のレベルは腎傷害の存在下で減少するものの、腎疾患の進行におけるAlk-3の役割は不明である21〜24。従って、本研究では、腎線維化におけるAlk-3の役割を研究し、さらにAlk-3には結合できるがAlk-6には結合できない新規分子を構築するための戦略を立てて、これらの分子をそれらの作用機序及び治療効力について試験した。組換えヒトBMP-7の全身投与が、腎尿細管上皮細胞のAlk-3受容体への結合を介して腎線維化を逆転させることが実証された。これらの結果は、BMP-7及びAlk-3の発現が線維化の進行と逆相関することもまた示唆している。まとめると、これらの結果は、BMP-7がTGFβ1の作用に対抗して恐らくは腎保護的な役割を果たすことを示唆していた2。
【０２４２】
同様に、本研究では、Alk-3が傷害時の腎臓の健康状態の正の調節因子でもあることを確認した。Alk-3は腎傷害に保護的な形で応答し、またその欠如は腎線維化の進行を増強した。これらの結果をBMP-7の抗-線維化活性と結び付けて考えたところ、Alk-3受容体に結合するBMP-7作用の小ペプチド模倣物を設計するための必要な理論的根拠が提供された。
【０２４３】
THR-123は、新規で経口摂取可能なAlk-3受容体のペプチドアゴニストであり、かつBMP-7模倣物である。THR-123は腎疾患の進行を抑制し、かつ確立された腎線維化を逆転させた。
【０２４４】
重要なことに、THR-123とカプトプリルの組み合わせは、糖尿病性腎疾患に関連する腎線維化を制御する際に劇的な相加的治療効果を示すことが実証された。まとめると、これらの結果は、THR-123が炎症、アポトーシス、EMTプログラムを阻害し、かつ腎線維化を逆転させたことを示していた。この作用はAlk-3受容体により仲介されるものであった39。Alk-2受容体もまたTHR-123の作用に寄与しうる可能性があるが、遺伝的マウスモデル実験は、かかるAlk-2仲介活性が存在したとしても重要なものではないことを示唆していた。
【０２４５】
要約すると、本研究により、腎臓に傷害がある場合はAlk-3受容体が線維化の負の調節因子となることが示唆された。かかる腎保護特性は、腎臓におけるそのリガンドBMP-7の作用を反映したものである。AA-123のデザインはこの相乗作用を利用しており、線維化を有するマウスに経口的に投与した場合には実質的な治療効力を呈した。これらの前臨床試験は、将来の抗-線維化薬としてのこの薬剤の想定しうる臨床試験の設計についての知識をもたらした。
【０２４６】
実施例7に使用した方法及び材料：
試薬
E-カドヘリンに対するモノクローナル抗体はBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ)から購入した。FSP1に対するポリクローナル抗体は、Dr. Eric Neilson, Vanderbilt University Medical Centerにより提供された。Mac-1抗体はAbD Serotec (Oxford, United Kingdom)から購入した。リン酸化Smad1/5抗体はCell Signaling Technology (Beverly MA)から購入した。BUNの測定は、QuantiChrom(商標) Urea Assay Kit (BioAssay System, Hayward, CA)又は比色キットDIUR-500 QuantiChrom(商標) Urea Assay Kit (Gentaur, Kampenhout Belgium)により実施した。IL-6、IL-8及びICAM-1用のElisaキットはR＆D system (Minneapolis, MN)から購入した。
【０２４７】
NTN腎臓のマイクロアレイ解析
完全フロイントアジュバント中の正常なヒツジIgG(200μg)の皮下注射(1日目)とその後の腎毒性血清注射液の静脈内注射(50μL、5〜7日目)により予備免疫を行うことで、C57BL6マウスにNTNを誘導した。マウスをNTNの誘導後1、3、6、9週目に犠牲死させた。全RNAは、トリゾール／InvitrogenのRNA抽出用PureLink RNA Mini Kitにより腎臓から単離した。10ナノグラムの全RNAを、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して相補的cDNAを作製するために使用した。定量的PCRを、ABIprism 7000(Applied Biosystems)使用し、BMP7、BMP受容体Alk2、Alk-3、Alk6及びBMPR II、並びにBMP-結合タンパク質chordin、crim1、fibrillin1、follistatin、KCP、USAG1、gremlin及びnogginの遺伝子発現プロファイルを解析するために実施した(表：プライマー配列(下記))。
【表５】
2014527040.tif 000029
【０２４８】
腎尿細管におけるAlk-3の条件欠失
Alk-3 floxマウスはDr. Yuji Mishina, National Institutes of Healthにより物質移動合意書と共に提供された。γGT-CreマウスはDr. Eric Neilson, Vanderbilt University Medical Centeから提供された。NTNは上記の方法により誘導した。
【０２４９】
虚血再灌流傷害
8週齢のC57Bl6マウスを本研究に使用した。マウスにケタミンとキシラジンの混合物を用いて麻酔をかけ、その後左腎茎を25分間クランプした。手術後の同日にTHR-123処理(p.o. 5 mg／Kg／日)又はビヒクル処理を開始した。手術の7日後にマウスを犠牲死させた。
【０２５０】
片側性尿管閉塞
マウスにケタミンとキシラジンの混合物を用いて麻酔をかけた。尿管を周辺組織から調製し、さらに2本の結紮糸を約5 mm離して左腎の尿管の上部3分の2の所に取り付けることにより、確実な閉塞を得た。手術後の同日に、マウスにBMP7(300μg i.p.／Kg／隔日)、THR-123(p.o. 5 mgもしくは15 mg／Kg／日、i.p. 5 mg／Kg／日)又は対照としてのPBS(i.p.)による処理を開始した。マウスを手術後5〜7日目に犠牲死させた。
【０２５１】
腎毒性血清誘導腎炎(NTN)
NTNを上記の方法によりCD1マウスに誘導した。NTN誘導の6週間後、THR-123(p.o. 5 mg／Kg／日)を9週まで開始した。マウスを1週目、3週目、6週目及び9週目に犠牲死させた。
【０２５２】
糸球体硬化の解析のために、マウス1匹あたり20個の糸球体をランダムに採取し、さらに各糸球体を次のスケール：硬化が認められなければ0、糸球体表面積の0〜1/4が硬化していれば1、1/4〜1/2が硬化していれば2、1/2〜3/4が硬化していれば3、及び、3/4超が硬化しているか又は半月体を有していれば4、に従って評価した。糸球体硬化スコアを、各マウスについてこれらの数の算術平均として算出した。全マウスから得た糸球体硬化スコアを任意に4つの群；疾患なし、軽度、中等度及び重度、に分けた。これら4群に該当するマウスの割合を算出した。
【０２５３】
尿細管萎縮スコアの場合、スライド1枚あたり10箇所の200×視野をランダムに選択し、さらに尿細管萎縮を次のスケール：萎縮が認められなければ0、1視野の0〜1/4を萎縮した尿細管が占めていれば1、1/4〜1/2なら2、1/2〜3/4なら3、及び、より多ければ4、に従って評価した。次に、尿細管萎縮スコアを、マウス1匹あたりのこれらの数の算術平均として算出した。全マウスから得た尿細管萎縮スコアを任意に4つの群；すなわち、疾患なし、軽度、中等度及び重度、に分けた。これら4群に該当するマウスの割合を算出し、グラフに示した。
【０２５４】
間質線維化の解析の場合、マッソン三色で染色された各腎臓切片について10箇所の200×視野を同様にランダムに選択し、さらに間質線維化を次のスケール：線維化が認められなければ0、1視野の0〜1/4が間質線維化の影響を受けていれば1、1/4〜1/2なら2、1/2〜3/4なら3、及び、より多ければ4、に従って評価した。線維化指数を、マウス1匹あたりのこれらの数の算術平均として算出した。全マウスから得た線維化指数を任意に4つの群；すなわち、疾患なし、軽度、中等度及び重度、に分けた。これら4群に該当するマウスの割合を算出した。
【０２５５】
IV型コラーゲンa3鎖ノックアウトマウス(COL4A3-／-)
8週齢COL4A3-／-マウスをTHR-123(p.o. 5 mg／Kg／日)又はビヒクルで処理した。COL4A3-／-マウスを16週齢で犠牲死させた。
【０２５６】
正常糸球体の割合の形態計測解析の場合、スライド1枚あたり100個の糸球体をランダムな視野から計数し、また1実験群あたり5枚のスライドを計数した。正常糸球体の数を計数した糸球体の総数に占める割合として表記した。
【０２５７】
糖尿病性腎症
8週齢の雄CD-1マウスを全ての糖尿病実験で使用した。マウスにストレプトゾトシン(STZ：200 mg／Kg)の単回腹腔内(i.p.)注射を実施した。糖尿病の誘導は、STZ注射の2週間後までに血糖値が＞16 mMとなることと定義した。糖尿病の誘導から1ヶ月後、マウスを3つの群(BMP7処理、ビヒクル処理及び無処理)に分けてBMP7(i.p. 300μg／kg／隔日)又はビヒクル注射を開始した。糖尿病の誘導から5ヶ月後、THR-123(p.o. 5 mg／Kg／日)投与を糖尿病マウスで開始した。マウスを糖尿病の誘導から5(処理前)又は6ヶ月後に犠牲死させた。
【０２５８】
カプトプリル(CPR)とTHR-123の併用療法試験の場合、糖尿病マウスを、糖尿病の誘導から7ヶ月後に3つの群(ビヒクル、CPR、及びCPR-THR-123併用)に分けた。CPR(p.o. 50 mg／Kg／日)処理又はCPRとTHR-123の併用(p.o. 5 mg／Kg／日)処理を開始した。マウスを糖尿病の誘導から7ヶ月後(処理前)又は8ヶ月後に犠牲死させた。
【０２５９】
糸球体損傷の場合、本発明者らはメサンギウム基質の増大及び糸球体の肥大について評価した。点算法を利用することによりメサンギウム基質の沈着を定量化した。各マウスから得た20個のPAS-染色糸球体を、667(29x23)の点を含有するデジタル顕微鏡画面グリッドで解析した。ピンク色又は赤色のメサンギウム基質沈着に該当するグリッド点の数を糸球体内の点の総数で割ることにより、所与の糸球体におけるメサンギウム基質沈着の割合を得た。
【０２６０】
形態計測解析
腎臓切片をヘマトキシリン-エオジン、マッソン三色、及び過ヨウ素酸-シッフで染色した。腎傷害の程度を、尿細管間質性傷害及び糸球体損傷の形態計測評価により推定した。相対的間質容積は、顕微鏡にはめ込まれた10-mm2 グラティキュールを使用して形態計測解析により評価した。5〜10箇所のランダムに選択した皮質領域を各動物について評価した。300〜500の尿細管を、それらの拡張した内腔及び肥厚した基底膜について評価することにより、萎縮尿細管の割合を推定した。この方法をUUO、COL4A3KO及び糖尿病の研究のために使用した。
【０２６１】
LacZの検出
-Creを有するか又は有していない6週齢のR26Rstop LacZ floxマウス27から得た腎臓試料(1 mm2)を、4％パラホルムアルデヒドで4℃にて4時間固定した。試料をPBS pH 7.3で3回洗浄し、その後LacZ染色用緩衝液(PBS中、1 mg／mL X-gal、35 mM フェロシアン化カリウム、35 mM フェリシアン化カリウム、2 mM MgCl2、0.02％NP-40、0.01％デオキシコール酸ナトリウム)を用いて37℃で一晩染色した。PBS pH 7.3による洗浄後、試料をパラフィンに包埋した。切片(10μm)をその後脱パラフィン処理し、さらにエオジンで対比染色した。
【０２６２】
in vitro EMT
EMTを、3 ng／mLの組換えヒトTGF-β1との48時間のインキュベーションによりNP1細胞又はMCT細胞に誘導した。EMTが起きた場合、培地を除去してDMEM中のTHR-123(10μM)又は組換えヒトBMP7(100 ng／mL)と交換した。48時間後、該細胞を、以前に記載したようにE-カドヘリンに対する一次モノクローナル抗体(2.5 g／mL)及びローダミン-結合二次抗体(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)を使用して免疫細胞化学により特徴付けた。染色を蛍光顕微鏡法により可視化し、さらにSpot Advanced Software(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)を使用して代表的な写真を記録した。また、タンパク質及び全RNAを実験の終了時に回収した。EMTの形態計測解析の場合、明視野写真中の細胞の長さ／幅をimage Jソフトウェアにより測定した。長さ／幅の比を算出した。
【０２６３】
炎症性サイトカインの産生
ヒト近位尿細管上皮細胞-由来HK-2細胞を24-ウェルプレート(30,000個の細胞／ウェル)で培養した。細胞をK-SFM培地単独又はTNF-β(5 ng／mL)に曝露した。TNF-αインキュベーションの24時間後、細胞を温めておいた培養培地で2回洗浄し、さらにその後、細胞を様々な濃度のTHR-123又はBMP7と共に60時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、培養培地を回収し、IL-6、IL-8及びICAM-1についてELISA分析を実施した。
【０２６４】
アポトーシス
HK-2細胞を24-ウェルプレート(25,000〜30,000個の細胞／ウェル)に継代した。細胞をウェルに付着させた後、細胞をK-SFM培地単独又はTHR-123含有K-SFM培地に曝露した。BMP7を実験の陽性対照とした。インキュベーションの2時間後、細胞をシスプラチンに60時間曝露した。アポトーシスをアネキシンV-FITCによる染色とその後の蛍光顕微鏡法により判定した。最終濃度：THR-123 250μM、BMP7 1μg／mL、シスプラチン10μM。
【０２６５】
統計解析
データは平均±s.e.mとして表記した。分散分析(ANOVA)と、その後のマウス試料の多重比較のためのBonferroni／Dunnの検定を利用することにより、有意と判定した。統計的有意性はP＜0.05と定義した。Graph-pad Prismソフトウェアを統計解析のために使用した。
【０２６６】
実施例7で引用した参考文献
以下の参考文献は実施例7において引用したものであり、その各々の記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
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【０２６７】
本明細書中で引用した追加の参考文献
以下の参考文献は本明細書全体にわたって引用したものであり、その各々の記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
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【０２６８】
参照による組み込み
本出願を通じて引用した全ての参考文献、特許、係属中の特許出願及び公開特許の記載内容は、参照により明確に本明細書中に組み込まれるものとする。
【０２６９】
等価物
当業者であれば、通常の実験のみを利用して、本明細書中に記載した本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を理解するか、又は確認することができるであろう。かかる等価物は添付の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４５−３】
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【図４５−４】
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【図４６】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５４−３】
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【図５５】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図５９−３】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４−１】
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【図６４−２】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【図６７−３】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７１−３】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６−１】
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【図７６−２】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１−１】
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【図８１−２】
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【図８１−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2014527040.tif 000147
2014527040.tif 000148
2014527040.tif 000149