(57)【要約】  本発明はＰＣＳＫ９結合ポリペプチドと同ポリペプチドを使用する方法を提供する。
2014519848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
ＧＸ１Ｘ２ＥＣＬＸ３ＮＸ４ＧＧＣＳＸ５Ｘ６ＣＸ７Ｘ８ＬＫＩＧＹＥＣＬＣＰＤＧＦＱＬＶＡＱＲＲＣＥ（ここで、Ｘ１はＤ又はＴであり；Ｘ２はＬ又はＮであり；Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され；Ｘ４はＬ又はＮであり；Ｘ５は、Ｈ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され；Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｔ及びＶからなる群から選択され；Ｘ７は、Ｋ、Ｎ、Ｒ及びＱからなる群から選択され；Ｘ８は、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲからなる群から選択される）(配列番号：１)を有するＰＣＳＫ９結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号：２−２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
免疫グロブリン配列をさらに含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記免疫グロブリン配列が抗体定常領域である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記抗体定常領域がＦｃ領域である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ抗体由来である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
前記変異体が発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が原核細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸の発現に適した条件下で、請求項１０に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項１４】
宿主細胞からポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
【請求項１６】
被験体におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させる含有する方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】
被験体におけるコレステロール関連疾患を治療する方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含んでなる方法。
【請求項１８】
被験体における高コレステロール血症を治療する方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含んでなる方法。
【請求項１９】
第２の医薬を有効量、被験体に投与することをさらに含み、ここでポリペプチドが第１の医薬である、請求項１６、１７又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の医薬がＬＤＬＲのレベルを上昇させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の医薬がＬＤＬコレステロールのレベルを低下させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第２の医薬がスタチンを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
スタチンが、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
第２の医薬がＨＤＬコレステロールレベルを上昇させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
試料中のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを試料に添加することを含んでなる方法。
【請求項２６】
被験体においてＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含んでなる方法。
【請求項２７】
試料中のＰＣＳＫ９タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）試料を請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させ；
（ｂ）ポリペプチドとＰＣＳＫ９タンパク質との間の複合体の形成を検出する
ことを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１１年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４９９０３４号の優先権を主張する。上記出願の全ての教示が出典明示によりここに援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ-Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットに提出された配列表を含み、その全体が出典明示によりここに援用される。２０１２年６月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ４５６２Ｒ１Ｗ.ｔｘｔと命名され、１０６６６バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＰＣＳＫ９に結合するポリペプチドと同ポリペプチドの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
プロプロテイン転換酵素スブチリシン／ケキシン(kexin)９型(ＰＣＳＫ９)は、プロプロテイン転換酵素の哺乳動物スブチリシンファミリーのメンバーであり、肝臓ＬＤＬレセプター(ＬＤＬＲ)の強力なネガティブレギュレーターとして機能する。ＰＣＳＫ９は、血流中を循環する低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)粒子レベルをコントロールすることにより、コレステロール代謝における重要な役割を担っている。ＰＣＳＫ９のレベル上昇は、肝臓におけるＬＤＬ-レセプターレベルを低下させ、血漿中のＬＤＬコレステロールが高レベルになり、冠動脈疾患への罹患率を増加させる結果となることが示されている(Petersonら, J Lipid Res. 49(7):1595-9 (2008))。よって、ＰＣＳＫ９の活性とＰＣＳＫ９が様々な病的状態において担っている対応の役割を阻害又は拮抗するＰＣＳＫ９の治療ベースのアンタゴニストを製造することは非常に有益である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＰＣＳＫ９に結合する様々なポリペプチドに部分的に基づいている。ＰＣＳＫ９は重要で有益な治療標的となり、本発明は、Ｐ９の発現及び／又は活性に関連した病的状態を標的とするのに使用される治療及び診断剤としてＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。従って、本発明は、ＰＣＳＫ９に関連した方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明はアミノ酸配列：
ＧＸ１Ｘ２ＥＣＬＸ３ＮＸ４ＧＧＣＳＸ５Ｘ６ＣＸ７Ｘ８ＬＫＩＧＹＥＣＬＣＰＤＧＦＱＬＶＡＱＲＲＣＥ（ここでＸ１はＤ又はＴであり；Ｘ２はＬ又はＮであり；Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され；Ｘ４はＬ又はＮであり；Ｘ５は、Ｈ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され；Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｔ及びＶからなる群から選択され；Ｘ７は、Ｋ、Ｎ、Ｒ及びＱからなる群から選択され；Ｘ８は、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲからなる群から選択される）(配列番号：１)を有するＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリン配列、例えば抗体定常領域(例えばＦｃ領域)で、特にＩｇＧ抗体からのものであってよいものをさらに含む。
【０００７】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、発現ベクター等、このようなポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様では、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞を提供する。このような宿主細胞は、例えば原核又は真核宿主細胞でありうる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、本発明は、発現に適した条件下で、本発明のベクター又は核酸を含む宿主細胞を培養することを含む、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。いくつかの実施態様では、本方法は、宿主細胞からポリペプチドを回収することをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチドと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物を提供する。
【００１０】
いくつかの実施態様では、本発明は、被験体におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させる方法であって、本発明のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は被験体におけるコレステロール関連疾患を治療する方法であって、本発明のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は被験体における高コレステロール血症を治療する方法であって、本発明のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、これらの方法は、第２の医薬を有効量、被験体に投与することをさらに含み、ここでポリペプチドは第１の医薬である。いくつかの実施態様では、第２の医薬は、ＬＤＬＲのレベルを上昇させる。いくつかの実施態様では、第２の医薬はＬＤＬコレステロールレベルを低下させる。いくつかの実施態様では、第２の医薬はスタチンを含む。いくつかの実施態様では、スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、第２の医薬はＨＤＬコレステロールレベルを上昇させる。
【００１１】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを試料に添加することを含む、試料中のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを有効量、被験体に投与することを含む、被験体におけるＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施態様では、本発明は、試料を本発明のポリペプチドと接触させ、ポリペプチドとＰＣＳＫ９タンパク質との間の複合体の形成を検出することを含む、試料中のＰＣＳＫ９タンパク質を検出する方法を提供する。
【００１３】
ここに記載のあらゆる実施態様又はその任意の組合せは、ここに記載の本発明の任意のかつ全てのＰＣＳＫ９結合ポリペプチド、方法及び使用に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＬＤＬＲに結合したＰＣＳＫ９の結晶構造の一部を示し、ＰＣＳＫ９の３．５Å内にあるＬＤＬＲのＥＧＦ(Ａ)ドメイン上の所定の残基を強調したものである。
【図２】第１の配列(配列番号：２８)として野生型ＥＧＦの可変領域(２９３−３１２)の配列及びＥＧＦライブラリーから選択される変異体(配列番号：２−２７それぞれ)を示す。ＩＧＹＥＣＬＣＰＤＧＦＱＬＶＡＱＲＲＣＥ(配列番号：２９)の配列を持つ定常領域(３１３−３３２)は、全てのクローンについて同一であり、示さない。位置の番号付けは、全長ＬＤＬＲからのものである。「ｓ／ｎ比」はシグナル：ノイズ比のことで、ここで「シグナル」は、３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレートにコートされたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎにより捕捉されたビオチン化ＰＣＳＫ９に対して検出されるスポットファージＥＬＩＳＡシグナルであり；「ノイズ」はＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ単独に対するＥＬＩＳＡシグナルである。
【図３】競合結合ＥＬＩＳＡにより測定されるＥＧＦペプチド(Ａ)及びＥＧＦ-Ｆｃ融合タンパク質(Ｂ)の阻害活性を示す。競合物の段階希釈物を０．５μＭのビオチン化ＰＣＳＫ９と混合し、ｒＬＤＬＲでコーテトされたプレートに添加した。結合したビオチン化ＰＣＳＫ９をストレプトアビジン-ＨＲＰにより検出した。値は３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図４】抗ヒトＦｃでコートされたセンサーチップにより捕捉されたＥＧＦｗｔ-Ｆｃ又はＥＧＦ６６-Ｆｃを示す。ＥＧＦｗｔ-Ｆｃ(Ａ)及びＥＧＦ６６-Ｆｃ(Ｂ)のセンサーグラムを、１ｍＭのＣａＣｌ２(上部パネル)又は１０ｍＭのＥＤＴＡ(下部パネル)の存在下、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃについては０．０７８−１０μＭの範囲で、ＥＧＦ６６-Ｆｃについては０−２．５μＭの範囲で、ＰＣＳＫ９溶液を注入することにより記録した。
【図５】ＥＧＦｗｔ-Ｆｃ又はＥＧＦ６６-Ｆｃの存在下、ＰＣＳＫ９処理時にＦＡＣＳによりモニターされたＨｅｐＧ２細胞表面でのＬＤＬＲレベルを示す。相対蛍光単位(ＲＦＵ)を使用してＬＤＬＲ発現レベルを定量し、ＰＣＳＫ９を投与しなかったコントロール細胞のパーセントとして表した。値は３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図６】マウスモデルにおけるＰＣＳＫ９処理時に肝臓ＬＤＬＲレベルを救済する、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃ及びＥＧＦ６６-Ｆｃの能力を示す。マウスには、ビヒクル(Ｖ)、ＥＧＦ-Ｆｃ(ＷＴ)又はＥＧＦ６６-Ｆｃ(ＭＵＴ)を注射し、続いて組換えヒトＰＣＳＫ９(３０μｇ／マウス)のボーラス注射を続けた。１時間後、肝臓を収集し、免疫ブロット法によりＬＤＬＲを定量した。各レーンは３匹のマウスのプール化肝臓試料を表す。バンド強度を定量し、移動レセプター量に対して正規化し、未処理群(＝１．０)のフラクションとして表した。
【図７】Ｄ３１０Ｋ変異がＰＣＳＫ９に対するファージ-ディスプレイＥＧＦの結合を無効にすることを示す。結合曲線はファージＥＬＩＳＡにより測定され、ここで、１：３段階希釈を用いたＥＧＦ-ディスプレイファージをプレート固定化ＰＣＳＫ９に添加し、結合ファージを抗Ｍ１３-ＨＲＰにより検出した。
【図８】ＥＧＦ６６-Ｆｃ／ＰＣＳＫ９複合体のＳＥＣ-ＭＡＬＳ分析を示す。単独で注入されたＥＧＦ６６-Ｆｃ及びＰＣＳＫ９のサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)プロファイルを青と赤のトレースとして示す。１：３又は３：１のモル比のＥＧＦ６６：ＰＣＳＫ９混合物を注入し、ＳＥＣプロファイルを緑と黒で示した。マルチアングル光散乱(ＭＡＬＳ)により測定された平均分子量(ｋＤａ)を、各ピークについて示す。第１のピークの分子量は、１：２の化学量論(１ＥＧＦ６６-Ｆｃ及び２ＰＣＳＫ９)と一致しており、第２のピークは１：１である。
【図９Ａ】ＥＧＦ６６の分子モデリングを示す。(Ａ)ＰＣＳＫ９との改善された接点についての可能性を示す、ＥＧＦ６６におけるＤ２９９Ａ、Ｎ３０１Ｌ、Ｖ３０７Ｉ、Ｎ３０９Ｒ及びＤ３１０Ｋ変異についてのモデル化変化。ＥＧＦドメインの骨格は、棒体として示されるモデル化変異残基を持つリボン体として示されている。選択中、野生型として残存しているＮ２９５及びＨ３０６は、棒体として示されている。変異残基との潜在的親油性相互作用は、ＰＣＳＫ９の他のグレー面上のより薄い影付きイタリック体のラベルを用いて示している。ＰＣＳＫ９の触媒三連残基に隣接する面は、より濃いグレーの影が付けられており、Ｓ１５３(ＰＣＳＫ９の自己融解プロセシングにより生成されるＮ末端)を、「Ｎ」と標識する。
【図９Ｂ】ＥＧＦ６６の分子モデリングを示す。(Ｂ)ＥＧＦ６６のＤ３１０Ｋ側鎖のモデルであり、ここで末端アミンが、βヘパリン上へのＮ末端鎖の充填を安定化させるために、Ｃａ２＋イオンの必要性に取って代わる。左パネルの点線は、Ｃａ２＋イオンの３．０Å内にある原子を示す。右パネルの点線は、リジン側鎖とＣａ２＋結合ループ内の原子との間の潜在的な水素結合相互作用を示す。水素結合を形成する実際の原子は、リジンの末端アンモニウム基の正確な位置に依存することに留意のこと。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ここに記載され又は参照される技術及び手順は、一般的によく理解されており、通常、当業者により一般的な方法、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第3版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.  CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubelら編, (2003)); シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor編(1995)), Harlow 及び Lane, 編. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, 編, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, 編, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), 編, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, 及びD. G. Newell, 編, 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 及び C. C. Blackwell, 編.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller 及び M. P. Calos, 編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら, 編, 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coliganら, 編, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway 及び P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., 編, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd 及び C. Dean, 編, Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow 及びD. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, 編, Harwood Academic Publishers, 1995); 及び Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVitaら, 編, J.B. Lippincott Company, 1993)に記載されている幅広く利用される方法を使用して一般に用いられる。
【００１６】
Ｉ．定義
特に定義がなされていない場合、ここで使用される技術及び科学用語は、この発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 及び March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 第4版, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、当業者に、本出願に使用される多くの用語に対する一般的指針を提供する。特許出願及び文献を含むここに引用される全ての文献は、その全体が出典明示により援用される。
【００１７】
この明細書を解釈する目的では、以下の定義が適用され、適切である場合は、単数で使用される用語は複数もまた含み、その逆もしかりである。ここで使用される用語は、特定の実施態様を記載するだけの目的のものであり、限定することを意図するものではないことが理解されなければならない。以下に記載の任意の定義が出典明示によりここに援用される任意の文献と矛盾する場合には、以下に記載の定義が優先する。
【００１８】
「親和性」は、分子(例えば、ポリペプチド)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば、他のポリペプチド)との間の非共有的相互作用の全合計の強度を意味する。他の定義が示されない場合、ここで使用される「結合親和性」は、結合対(例えば、リガンドとレセプター)のメンバーの間での１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、解離定数(「Ｋｄ」又は「ＫＤ」)により、一般的に表すことができる。親和性は、ここに記載のものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的及び例示的実施態様を以下に記載する。
【００１９】
「ＰＣＳＫ９結合ポリペプチド」又は「ＰＣＳＫ９に結合するポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドがＰＣＳＫ９を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＰＣＳＫ９に結合可能であるポリペプチドを意味する。一実施態様では、無関係の非ＰＣＳＫ９タンパク質に対するＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの結合の程度は、例えば定量的ＥＬＩＳＡにより測定される場合、ＰＣＳＫ９に対する結合の約１０％未満の結合である。
【００２０】
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を意味する。
【００２１】
ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、定常領域の少なくとも一部を含んでいる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、天然配列Ｆｃ領域及び可変Ｆｃ領域を含む。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン(Ｌｙｓ４４７)は、存在してもしていなくてもよい。ここで特定されない限りは、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991に記載されるような、ＥＵインデックスと称されるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００２２】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」なる用語は交換可能に使用され、このような細胞の子孫を含む外来性の核酸が導入された細胞を意味する。宿主細胞は、一次形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそこから派生する子孫を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、親細胞と、核酸内容において完全同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。
【００２３】
ここで使用される「高コレステロール血症」なる用語は、コレステロールレベルが所望のレベルを超えて上昇している状態を意味する。ある実施態様では、ＬＤＬコレステロールレベルが所望のレベルを超えて上昇している。ある実施態様では、血清ＬＤＬコレステロールレベルが所望のレベルを超えて上昇している。
【００２４】
「個体」又は「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、限定されるものではないが、家畜化された動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及び齧歯動物(例えば、マウス及びラット)を含む。ある実施態様では、個体又は被験体はヒトである。
【００２５】
「単離された」ポリペプチドは、その天然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、例えば電気泳動(例えば、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、等電点電気泳動(ＩＥＦ)、キャピラリー電気泳動)、又はクロマトグラフィー(例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ)により定量されて、９５％又は９９％を越える純度まで精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えばFlatmanら, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００２６】
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸分子は、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、その天然の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか又は染色体外にも存在する。
【００２７】
「薬学的製剤」又は「薬学的組成物」なる用語は、そこに含まれる活性成分の生物活性を有効にするために許容可能な形態であり、製剤が投与されるであろう被験体に対して、許容できない毒性のある付加的な成分を含有してない調製物を意味する。
【００２８】
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に無毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を意味する。薬学的に許容可能な担体は、限定されるものではないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
【００２９】
ここで使用される「プロプロテイン転換酵素スブチリシンケキシン９型(ＰＣＳＫ９)」、「ＰＣＳＫ９」、又は「ＮＡＲＣ-１」なる用語は、他の定義が示されないならば、哺乳動物、例えば霊長類(例えばヒト)及び齧歯動物(例えばマウス及びラット)を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＰＣＳＫ９を意味する。本用語はまた「全長」の未プロセシングＰＣＳＫ９、並びに細胞中でのプロセシングに起因する任意の形態のＰＣＳＫ９又はその任意の断片を含む。また本用語は、ＰＣＳＫ９の天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又はアレル変異体も含む。
【００３０】
ここで使用される「ＰＣＳＫ９活性」又は「ＰＣＳＫ９の生物活性」なる用語は、ＰＣＳＫ９の任意の生物学的効果を含む。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９の生物活性は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ-レセプター(ＬＤＬＲ)に結合する能力である。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９はＬＤＬＲに結合し、それが関与する反応を触媒する。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９活性は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲの有効性を低下又は低減させる能力を含む。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９の生物活性は、ＰＣＳＫ９の被験体におけるＬＤＬの量を増加させる能力を含む。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９の生物活性は、ＰＣＳＫ９の、被験体においてＬＤＬに結合するのに利用されるＬＤＬＲの量を低減させる能力を含む。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９の生物活性は、ＰＣＳＫ９のシグナル伝達に起因する任意の生物活性を含む。
【００３１】
ここで使用される場合、「治療」(及び「治療する(treat)」又は「治療している(treating)」等の文法的変形)は、治療される個体の疾患の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床病理過程中に実施することができる。治療の所望される効果は、限定されるものではないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び緩解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延化させ又は疾患の進行を遅延化するために使用される。
【００３２】
ここで使用される「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を増殖可能な核酸分子を意味する。本用語は、自己複製核酸構造としてのベクター並びにそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。ある種のベクターは、それらが作用可能に結合している核酸の発現を指示可能である。そのようなベクターはここでは「発現ベクター」と称される。
【００３３】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを用いて得られた実験結果に部分的に基づいている。得られた結果は、これらのポリペプチドを用いてＰＣＳＫ９の生物活性をブロックすることにより、ＬＤＬＲの減少の防止を生じることを示している。従って、ここで記載される本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、例えばコレステロール関連疾患等の、ＰＣＳＫ９に関連した病状の標的化に使用される重要な治療及び診断剤を提供する。
【００３４】
ある実施態様では、「コレステロール関連疾患」は、次のものの任意の一又は複数を含む：高コレステロール血症、心疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠動脈心疾患、脳卒中、循環器疾患、アルツハイマー病、及び一般的な脂質異常症で、例えば高全血清コレステロール、高ＬＤＬ、高トリグリセリド、高ＶＬＤＬ、及び／又は低ＨＤＬにより顕在化可能なもの。ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを単独で又は一又は複数の他の薬剤と組合せて使用して治療することのできる原発性又は続発性脂質異常症のいくつかの非限定的例は、メタボリックシンドローム、真性糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、家族性高コレステロール血症、特にヘテロ接合性高コレステロール血症、ホモ接合性高コレステロール血症、家族性欠損アポリポタンパク質(apoplipoprotein)Ｂ-１００；多遺伝子性高コレステロール血症；レムナント除去疾患、肝臓リパーゼ欠乏症；次の任意のものに続発する脂質異常症：食事の不摂生、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロゲスチン療法、ベータ-ブロッカー、及びチアジド系利尿剤を含む薬剤；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性胆汁性肝硬変、糖原病、肝細胞腫、胆汁うっ滞、先端巨大症、インスリノーマ、成長ホルモン単独欠損症、及びアルコール誘発性高トリグリセリド血症を含む。また、ここに記載のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、動脈硬化性疾患、例えば冠動脈心疾患、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中(虚血性及び出血性)、狭心症、又は脳血管疾患、及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞の防止又は治療にも有用である。ある実施態様では、ここに記載のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、非致死性心発作、致死性及び非致死性脳卒中、ある種の心臓手術、心不全のための入院、心臓病に罹患している被験体の胸部痛、樹立心臓病による心血管イベント、例えば前心発作、前心臓手術、及び／又は動脈血栓の証拠を伴う胸部痛の危険性低減に有用である。ある実施態様では、ここに記載のＰＣＳＫ９結合ポリペプチド及び方法は、再発性心血管イベントの危険性の低減に使用することができる。
【００３５】
Ａ．組換え方法及び組成物
ここに記載のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載の組換え方法及び組成物を使用して生成することができる。一実施態様では、ここに記載のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む一又は複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含んでなる(例えば、形質転換される)。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はリンパ球系細胞(例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。一実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを作製する方法が提供され、該方法は、上で提供されたような、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、場合によっては、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)からそれを回収することを含む。
【００３６】
ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの組換え産生のために、例えば上述のＰＣＳＫ９結合ポリポリペプチドをコードする核酸を単離し、宿主細胞においてさらにクローニング及び／又は発現するために、一又は複数のベクター中に挿入する。このような核酸は、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離し配列決定することができる。
【００３７】
ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドコード化ベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、ここに記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要とされない場合は、細菌中で産生されうる。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同５７８９１９９号、及び同５８４０５２３号を参照のこと。(また、大腸菌における抗体断片の発現を記述しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo,編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照)。発現後、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。
【００３８】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母は、その糖鎖付加経路が「ヒト化」されている真菌及び酵母株を含むＰＣＳＫ９結合ポリペプチドコード化ベクターに対する適切なクローニング又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒト糖鎖付加パターンを持つＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), 及び Liら, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
【００３９】
糖鎖付加ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からまた誘導される。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。昆虫細胞に関連して、特にヨトウガ細胞の形質移入に使用されうる、多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【００４０】
また、植物細胞培養体も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同６０４０４９８号、同６４２０５４８号、同７１２５９７８号、及び同６４１７４２９号(トランスジェニック植物において抗体を生産するためのPLANTIBODIESＴＭ技術を記述)を参照。
【００４１】
また、脊椎動物細胞も宿主として使用されうる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合化された哺乳動物細胞株も有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７)；ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)系(例えば、Grahamら, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されているような２９３又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているようなＴＭ４細胞)；サル腎臓細胞(ＣＶ１)；アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６)、ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８)；ヒト肝臓細胞(Ｈｅｐ Ｇ２)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２)；ＴＲＩ細胞(例えば、Matherら, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)に記載)；ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77；4216 (1980))；及び骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、及びＳｐ２／０を含む。
【００４２】
Ｂ．アッセイ
ここで提供されるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、当該技術分野で知られている様々なアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
【００４３】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、例えば既知の方法、特にＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等により、そのＰＣＳＫ９結合アッセイについて試験される。いくつかの実施態様では、本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、生物層干渉法又は表面プラズモン共鳴法により、そのＰＣＳＫ９結合活性について試験される。
【００４４】
２．活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物活性を有するそのＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを同定するために提供される。ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの生物活性は、ＰＣＳＫ９の一又は複数の生物活性をブロック、拮抗、抑制、干渉、調節及び／又は低減することを含む。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物活性を有するＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。
【００４５】
ある実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドはヒトＰＣＳＫ９に結合し、ＬＤＬＲとの相互作用を防止する。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドはヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合し、及び／又は少なくとも約２０％−４０％、４０−６０％、６０−８０％、８０−８５％、又はそれ以上（例えば、インビトロ競合結合アッセイでの結合を測定することによる）、ＬＤＬＲに対するヒトＰＣＳＫ９の結合を実質的に阻害する。ある実施態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ここに開示のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲダウンレギュレーションアッセイを使用してインビトロで測定した際にＬＤＬＲレベルに対するＰＣＳＫ９媒介性効果を拮抗させる単離されたＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。
【００４６】
Ｃ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様では、ここに提供される任意のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、生体試料中におけるＰＣＳＫ９の存在を検出するのに有用である。ここで使用される「検出する」なる用語は定量的又は定性的検出を含む。ある実施態様では、生体試料は、血液、血清又は他の生体由来の液状試料である。ある実施態様では、生体試料は細胞又は組織を含む。
【００４７】
一実施態様では、診断又は検出の方法に使用されるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。さらなる態様では、生体試料におけるＰＣＳＫ９の存在を検出する方法が提供される。ある実施態様では、本方法は、生体試料におけるＰＣＳＫ９の存在を検出することを含む。ある実施態様では、ＰＣＳＫ９はヒトＰＣＳＫ９である。ある実施態様では、本方法は、ＰＣＳＫ９に対するＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの結合を許容する条件下で、ここに記載されたＰＣＳＫ９結合ポリペプチドと生体試料を接触させ、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドとＰＣＳＫ９との間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。このような方法は、インビトロ又はインビボ法であってもよい。一実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを用いた治療に好適な被験体を選択するために使用され、例えば、そこでは、ＰＣＳＫ９又はＬＤＬコレステロールが、患者を選択するためのバイオマーカーである。
【００４８】
本発明のポリペプチドを使用して診断される例示的な疾患は、コレステロール関連疾患(「血清コレステロール関連疾患」を含む)、特に次のものの任意の一又は複数を含む：高コレステロール血症、心疾患、メタボリックシンドローム、冠動脈心疾患、脳卒中、循環器疾患、アルツハイマー病、及び一般的な脂質異常症で、例えば高全血清コレステロール、高ＬＤＬ、高トリグリセリド、高超低密度リポタンパク質(ＶＬＤＬ)、及び／又は低ＨＤＬにより顕在化可能なもの。一態様では、本発明は、有効量のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体における高コレステロール血症、及び／又は脂質異常症の少なくとも一の症状、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患(ＣＶＤ)又は冠動脈心疾患を治療又は防止する方法を提供する。ある実施態様では、本発明は、被験体における、高コレステロール血症、及び／又は脂質異常症の少なくとも一の症状、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ又は冠動脈心疾患の治療又は防止に使用される、有効量のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。本発明は、個体での、高コレステロール血症、及び／又は脂質異常症の少なくとも一の症状、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ又は冠動脈心疾患を治療又は防止する医薬の製造における、細胞外又は循環ＰＣＳＫ９に拮抗する有効量のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの使用を提供する。
【００４９】
ある実施態様では、標識されたＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。標識は、限定されるものではないが、直接検出され得る標識又は部分(例えば蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射標識)、並びに部分、例えば酵素又はリガンドで、例えば酵素反応又は分子相互作用を介して間接的に検出されるものを含む。例示的な標識は、限定されるものではないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、デンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ(luceriferase)、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン類、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスファートデヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼで、ＨＲＰ等の染料前駆物質を酸化させるために過酸化水素を使用する酵素とカップリングしたもの、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル等を含む。
【００５０】
Ｄ．薬学的製剤
またこの発明は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを含んでなる薬学的製剤を含む組成物、及びＰＣＳＫ９結合ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物を包含する。ある実施態様では、組成物は、ＰＣＳＫ９に結合する一又は複数のポリペプチド、又はＰＣＳＫ９に結合する一又は複数のポリペプチドをコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、適切な担体、例えば薬学的に許容可能な賦形剤、特にバッファーで、当該技術分野でよく知られているものをさらに含みうる。
【００５１】
ここに記載されるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの薬学的製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、一又は複数の任意の薬学的に許容可能な担体と、所望の純度を有するこのようなポリペプチドを混合することにより、調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A. Ed. (1980))。薬学的に許容可能な担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えばＺｎ-タンパク質錯体)；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ここで、例示的な薬学的に許容可能な担体は、さらに、間質薬剤分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(ｓＨＡＳＥＧＰ)、例えばヒト可溶性ＰＨ-２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX(登録商標）、Baxter International社)を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、一又は複数の付加的なグルコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組合せられる。
【００５２】
ここでの製剤は、治療される特定の効能に必要な付加的な一を越える活性成分、好ましくは互いに悪影響を与えない相補活性を有するものをさらに含みうる。例えばスタチンをさらに提供することが望ましい。このような活性成分は、意図する目的に対して効果的な量で組合せて、適切に存在する。
【００５３】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【００５４】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
【００５５】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を介して濾過することにより、容易に達成されうる。
【００５６】
Ｅ．治療方法及び組成物
ここに提供されるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの任意のものは治療方法に使用されうる。
【００５７】
一態様では、医薬として使用されるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。他の態様では、コレステロール関連疾患に関連した状態の治療に使用するためのＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。ある実施態様では、ＬＤＬコレステロールのレベル上昇に関連した状態の治療に使用するためのＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。ある実施態様では、治療方法に使用するためのＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが提供される。ある実施態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの治療的有効量を個体に投与することを含むＬＤＬコレステロールのレベル上昇に関連した状態の個体を治療する方法に使用するための、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、ここに記載の方法及び使用は、少なくとも一の付加的な治療剤、例えばスタチンを有効量、個体に投与することをさらに含む。ある実施態様では、本発明は、被験体におけるＬＤＬコレステロールレベルの低下に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。さらなる実施態様では、本発明は、被験体における血清ＬＤＬコレステロールレベルの低下に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、被験体におけるＬＤＬＲの利用能の増加に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、被験体における、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の結合阻害に使用されるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるのに有効なＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体におけるＬＤＬコレステロールレベルの低下方法に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、血清ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるのに有効なＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体における血清ＬＤＬコレステロールレベルの低下方法に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、ＬＤＬの利用能を増加させるのに有効なＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体におけるＬＤＬＲの利用能の増加方法に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の結合を阻害するのに有効な量のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体におけるＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の結合の阻害方法に使用される、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを提供する。上記実施態様の任意のものにおける「個体」は、好ましくはヒトである。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの使用を提供する。一実施態様では、医薬はコレステロール関連疾患を治療するためのものである。ある実施態様では、コレステロール関連疾患は高コレステロール血症である。他の実施態様では、医薬は、有効量の医薬を、高コレステロール血症に罹患している個体に投与することを含む、高コレステロール血症を治療する方法において使用するためのものである。
【００５９】
ある実施態様では、治療される疾患は、ＰＣＳＫ９活性の除去、阻害又は低減により改善、寛解、阻害又は防止される任意の疾患又は状態である。ある実施態様では、スタチンの使用を介して一般的に対処可能な(治療可能又は防止可能な)疾患又は疾病もまた治療されうる。ある実施態様では、ＬＤＬＲ発現の増加又はコレステロール合成の防止が有益である疾患又は疾病も、本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドにより治療することができる。ある実施態様では、本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチド及び治療法で治療可能な個体は、ＬＤＬアフェレーシスを示す個体、ＰＣＳＫ９-活性化変異(機能獲得型変異、「ＧＯＦ」)を有する個体、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症(ｈｅＦＨ)を患っている個体、スタチン不耐性又は制御されないスタチンの原発性高コレステロール血症を患っている個体、予防的に治療されうる高コレステロール血症を発症する危険性のある個体を含む。他の兆候は、二次的原因に関連した脂質異常症、例えば２型真性糖尿病、胆汁うっ滞性肝疾患(原発性胆汁性肝硬変)、ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下症、肥満症、アテローム性動脈硬化症及び循環器疾患の予防及び治療を含む。
【００６０】
ある実施態様では、ここで記載の方法及び使用は、少なくとも一の付加的な治療剤、例えばスタチンを有効量、個体に投与することをさらに含む。ある実施態様では、付加的な治療剤は、アテローム性動脈硬化症及び／又は循環器疾患を予防及び／又は治療するためのものである。ある実施態様では、付加的な治療剤は、再発性心血管イベントの危険性を低下させる方法に使用されるものである。ある実施態様では、付加的な治療剤は被験体におけるＨＤＬコレステロールのレベルを上昇させるためのものである。
【００６１】
さらなる態様では、本発明は、例えば任意の上述の治療法に使用するための、ここで提供される任意のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを含有する薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、ここで提供される任意のＰＣＳＫ９結合ポリペプチド、及び薬学的に許容可能な担体を含有する。他の実施態様では、薬学的製剤は、ここで提供される任意のＰＣＳＫ９結合ポリペプチド、及び少なくとも一の付加的な治療剤、例えばスタチンを含有する。
【００６２】
本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、単独又は他の薬剤と組合せて、治療に使用することができる。例えば、本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドＫは、少なくとも一の付加的な治療剤と同時投与されてもよい。ある実施態様では、このような付加的な治療剤は、ＬＤＬＲのレベルを上昇させる。ある実施態様では、付加的な治療剤は、例えばスタチン、例えばアトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、及びそれらの任意の組合せ、例えばVYTORIN(登録商標)、ADVICOR(登録商標)又はSIMCOR(登録商標)等のＬＤＬコレステロール低下剤である。ある実施態様では、付加的な治療剤はＨＤＬコレステロール上昇剤である。
【００６３】
上述のこのような併用療法は、組合せ投与(２又はそれ以上の治療剤が、同じ又は別々の製剤に含まれる)と、別個の投与（本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの投与が、付加的な治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に生じる場合）を含む。
【００６４】
本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチド(及び任意の付加的な治療剤)は、非経口、肺内、及び経鼻、局所的治療が所望される場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与可能である。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投与は、短期間又は慢性的であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば注射、特に静脈又は皮下注射とすることができる。限定されるものではないが、様々な時点での単一又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む、様々な投与スケジュールが、ここで考慮される。
【００６５】
本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、良好な医療行為に一致する方式で、処方され、用量決定、及び投与されるであろう。ここで考慮される要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、患者個体の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医者に知られている他の要因が含まれる。ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが、必要ではないが、場合によっては当該問題の疾患を予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方されうる。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在するＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの量、疾患又は治療の種類、及び上述にて論議した他の要因に依存する。これらは、ここに記載した同じ投薬量及び投与経路、又はここに記載の約１〜９９％の用量、又は経験的／臨床的に適切に決定された任意の投薬量及び任意の経路により、一般的に使用される。
【００６６】
疾患の予防又は治療のために、（単独で、一又は複数の他の付加的な治療剤との併用で使用される場合）ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重篤度及び経過、ポリペプチドが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、事前治療、患者の臨床病歴及びポリペプチドに対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）の一又は複数回の用量で患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量のポリペプチドが投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。
【００６７】
ある実施態様では、フラット固定(flat-fixed)投与レジメンが、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを個体に投与するために使用される。疾患のタイプ及び重篤度に応じて、例示的なフラットフィックス投与量は、１０〜１００ｍｇのＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの範囲であってよい。ポリペプチドの例示的な一投与量は約１０ｍｇ〜約６００ｍｇの範囲であろう。ポリペプチドの他の例示的な投与量は約１００ｍｇ〜約６００ｍｇの範囲であろう。ある実施態様では、１５０ｍｇ、３００ｍｇ、又は６００ｍｇのＰＣＳＫ９結合ポリペプチドが個体に投与される。しかしながら、他の投与レジメンも有用でありうる。この治療の進行は、一般的な技術及びアッセイにより、容易にモニターされる。
【００６８】
Ｆ．製造品
本発明の他の態様では、上述の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、組成物自体、又は病状の治療、予防及び／又は診断に有効な他の組成物と組合せて収容され、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。さらに製造品は、(ａ)本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドを含有する組成物を収容する第１の容器；及び(ｂ)さらに細胞傷害剤又は他の治療剤を含有する組成物を収容する第２の容器を具備していてよい。ある実施態様では、第２の容器は第２の治療剤を収容し、第２の治療剤は「スタチン」クラスのコレステロール低下剤である。ある実施態様では、スタチンは、アトルバスタチン(例えば、LIPITOR(登録商標)又はTorvast)、フルバスタチン(例えば、LESCOL(登録商標))、ロバスタチン(例えば、MEVACOR(登録商標)、ALTOCORTM、又はALTOPREV(登録商標))、メバスタチン(ピタバスタチン(例えば、LIVALO(登録商標)又はPITAVA(登録商標))、プラバスタチン(例えば、PRAVACHOL(登録商標)、SELEKTINE(登録商標)、LIPOSTAT(登録商標))、ロスバスタチン(例えば、CRESTOR(登録商標))、シンバスタチン(例えば、ZOCOR(登録商標)、LIPEX(登録商標))、又はそれらの任意の組合せ、例えばVYTORIN(登録商標)、ADVICOR(登録商標)又はSIMCOR(登録商標)であり、及び／又はこれらを含む。
【００６９】
本発明のこの実施態様の製造品は、組成物が、特定の病状を治療するのに使用可能であることを示したパッケージ挿入物をさらに含んでいてよい。代替的に、又は付加的に、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２(又は第３)の容器をさらに具備していてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【実施例】
【００７０】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。一般的な記載が上で与えられたので、様々な他の実施態様を実施することができることが理解される。
【００７１】
実施例１：高親和性のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの生成
ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲの第１の上皮増殖因子様ドメイン、ＥＧＦ(Ａ)に結合し、構造的研究は、ＥＧＦ(Ａ)結合部位がプロテアーゼドメインに位置していることを明らかにした(Kwonら (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(6), 1820-1825)。天然に生じるＰＣＳＫ９機能獲得型変異Ｄ３７４Ｙ(Cunninghamら (2007) Nat Struct Mol Biol 14(5), 413-419; Lagaceら (2006) J Clin Invest 116(11), 2995-3005; Timmsら (2004) Hum Genet 114(4), 349-353)が、ＰＣＳＫ９-ＥＧＦ(Ａ)界面領域の周囲に位置しており、ＥＧＦ(Ａ)ドメインの家族性高コレステロール血症関連変異Ｈ３０６Ｙに近接している。また、複合体の構造は、ＰＣＳＫ９-Ｄ３７４Ｙ及びＥＧＦ-Ｈ３０６Ｙ変異の観察された親和性増加を理解するための分子的基盤も提供する(Kwonら, 上掲)。
【００７２】
また、野生型ＬＤＬＲ-ＥＧＦ(Ａ)ドメイン単独及びＥＧＦ(Ａ,Ｂ)タンデムドメインは、ＰＣＳＫ９に対するＬＤＬＲ結合の競合的阻害剤であり、細胞ベースアッセイにおいてＬＤＬＲレベルを部分的に回復させることができる(Shanら (2008) Biochem Biophys Res Commun 375(1), 69-73; Bottomleyら (2009) J Biol Chem 284(2), 1313-1323; McNuttら (2009) J Biol Chem 284(16), 10561-10570)。しかしながら、野生型ＥＧＦ(Ａ)のＰＣＳＫ９に対する結合親和性は低く、中性のｐＨで〜１μＭのＫＤ値であることが報告されている一方(Shanら, 上掲)、ＥＧＦ(Ａ,Ｂ)の親和性はほんの僅かにより良い（ＫＤ ０．３４μＭ)(Bottomleyら，上掲)。よって、野生型ＥＧＦ(Ａ)ドメインは、強力なＰＣＳＫ９中和剤として考慮するには十分な効力を欠く。
【００７３】
より強力なＥＧＦ(Ａ)ドメインインヒビターを同定するために、我々は、ファージ表面ディスプレイで１０９の理論的多様性を有するＥＧＦ(Ａ)ライブラリーを設計し、改善された結合親和性を有する複数のＥＧＦ変異体を同定し、アンタゴニスト活性を同定した。ＬＤＬＲのＥＧＦ(Ａ)ドメイン(Ｇ２９３−Ｅ３３２)を、過去に記載のファージミドｐＳ２２０２ｄを修飾することにより、Ｍ１３バクテリオファージの表面にディスプレイさせた(Skeltonら (2003) J Biol Chem 278(9), 7645-7654)。標準的な分子生物学的技術を使用し、ＬＤＬＲのＥＧＦ(Ａ)ドメインをコードするＤＮＡ断片で、Ｅｒｂｉｎ ＰＤＺドメイン及びｇＤタグをコードするｐＳ２２０２ｄの断片を置換した。得られたファージミド(ｐ３ＥＧＦ(Ａ))は、マルトース結合タンパク質分泌シグナルをコードするオープンリーディングフレームと、続いてＥＧＦ(Ａ)を含み、Ｍ１３マイナーコートタンパク質ｐ３のＣ末端ドメインで終結する。大腸菌包含ｐ３ＥＧＦ(Ａ)を、Ｍ１３-ＫＯ７ヘルパーファージで同時感染させ、培養体を、５０μｇ／ｍｌのカルベンシリン、及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンが補填された３０ｍｌの２ＹＴ培地中において、３０℃で一晩増殖させた。増殖したファージを標準的なプロトコル(Tonikianら (2007) Nat Protoc 2(6), 1368-1386)に従い精製し、１ｍｌのＰＢＴバッファー(ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、及び０．１％のTween(登録商標)20)に再懸濁させ、ｐ３ＥＧＦ(Ａ)ＤＮＡを被包し、ＥＧＦ(Ａ)ドメインをディスプレイするファージ粒子を生成した。ディスプレイレベルを、ファージＥＬＩＳＡを使用して分析した。
【００７４】
ライブラリーを、ＰＣＳＫ９：ＥＧＦ(Ａ,Ｂ)複合体の結晶構造に基づき、ＰＣＳＫ９から３．５Å内にあったＥＧＦ(Ａ)残基(システインを除外)をランダム化させることにより設計した(Kwonら, 上掲)。ライブラリー多様性を最大にするために、Ｃａ２＋結合ループ(Ｎ末端及びβヘアピンループ)の残基をまたランダム化させ、Ｃａ２＋結合を保存する試みはせず、Ｃａ２＋を含有しないバッファーでファージパニングを実施した。ＥＧＦ(Ａ)ドメイン変異ライブラリーを、クンケル変異原性法に従って構築した(Kunkelら (1987) Methods Enzymol 154, 367-382)。残基Ｎ２９５、Ｄ２９９、Ｎ３０１、Ｈ３０６、Ｖ３０７、Ｎ３０９及びＤ３１０を、ＮＮＫコドンを用いてランダム化させた。停止テンプレートは、Ｈ３０６−Ｄ３１０領域に３つの停止コドンを有するｐ３ＥＧＦ(Ａ)の単鎖ＤＮＡであり、〜２×１０１０の独特のメンバーを有するライブラリーを構築するために使用した。ライブラリーを、ビオチン化ＰＣＳＫ９に対し、溶液中における結合選択のラウンドを介して循環させた。ラウンド１では、２０μｇのビオチン化ＰＣＳＫ９を、１ｍｌのファージライブラリー(〜１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ)と共に、ＰＢＳ、１％のＢＳＡ及び０．１％のTween20において４℃で２時間インキュベートし、ブロッキングバッファー(ＰＢＳ、１％のＢＳＡ)で予めブロックされた２００μｌのDynabeads(登録商標) MyOne Streptavidinにより、室温で１５分、捕捉させた。上清をデカントし、ＰＢＳ、０．１％のTween(登録商標)20で、ビーズを３回洗浄した。結合したファージを４００μｌの０．１Ｍ ＨＣｌで７分溶出させ、６０μｌの１Ｍトリス、ｐＨ１３で直ぐに中和させた。溶出したファージをTonikianら (2007) Nat Protoc 2(6), 1368-1386に記載されたようにして増幅させた。ラウンド２では、プロトコルは、１０μｇのビオチン化ＰＣＳＫ９と１００μｌのDynabeadsを使用した以外は、ラウンド１と同じであった。ラウンド３では、２μｇのビオチン化ＰＣＳＫ９を、先のラウンドで増幅したファージと共にインキュベートし、ファージ-ＰＣＳＫ９複合体を、ブロッキングバッファーであらかじめ処理されたNeutrAvidin被覆プレートに捕捉させた。ラウンド４は、ビオチン-ＰＣＳＫ９-ファージ複合体を捕捉するために、ストレプトアビジンコーティングプレートを使用することを除き、ラウンド３と同一であった。ファージを、３０℃で、Ｍ１３-ＫＯ７ヘルパーファージを共に、大腸菌ＸＬ１-ブルーにおいて増殖させた。
【００７５】
結合選択の４つのラウンドの後、個々のファージクローンを取り上げ、９６ウェルブロックに、５０μｇ／ｍｌのカルベンシリンとＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージを含有せしめた４５０μｌの２ＹＴ培地に播種し、３７℃で一晩増殖させた。上清を次のようにしてスポットファージＥＬＩＳＡを用いて分析した：ビオチン化ＰＣＳＫ９をNeutrAvidinでコートされた３８４ウェルMaxiSorpＴＭ免疫プレートに捕捉させ、ＰＢＴバッファーで希釈された(１：３)ファージ上清をウェルに添加した。プレートを洗浄し、結合したファージを抗Ｍ１３-ＨＲＰと、続いてＴＭＢ基質を用いて検出した。これらのアッセイにおいて、NeutrAvidin単独に結合するファージを、バックグラウンド結合を評価するために、並行して試験した。ＰＣＳＫ９に対するその結合シグナルがNeutrAvidin(バックグラウンド)に対して４倍を越えるクローンを、ポジティブとみなした。ポジティブクローンをＤＮＡ配列分析に供した。
【００７６】
シグナルウインドウ＜０．２、及びシグナル：ノイズ比＜２でのファージＥＬＩＳＡアッセイを使用し、固定化ＰＣＳＫ９に、野生型ＥＧＦ(Ａ)ディスプレイファージを適用することにより、何の結合シグナルも検出できなかった(図２、第１列)。４つのラウンドのパニング後、２６の独特のクローンを、ＥＬＩＳＡにより検出された中程度から強度の結合シグナルを用いて同定した(シグナルウインドウ＞０．２、及びシグナル：ノイズ比＞４)(図２)。これらのクローンの配列アラインメントにより、Ａｓｎ２９５は高度に保存されているが、Ａｓｎ３０９は、Ａｒｇ又はＬｙｓのいずれかに対して変異していることが示された。４つのクローンは、シグナルウインドウ＞１．４、及びシグナル：ノイズ比＞２０で強い結合親和性を示し、より広範な特徴について選択された。それらは、ＥＧＦ５２、ＥＧＦ５９、ＥＧＦ６６及びＥＧＦ７５と命名した。野生型ＥＧＦ(Ａ)(ＥＧＦｗｔ)と比較して、これら４つのクローンの主要な配列変異は、Ｌｅｕに対してＡｓｎ３０１；Ａｒｇ又はＬｙｓに対してＡｓｎ３０９、及びＬｙｓに対してＡｓｐ３１０であった。加えて、Ａｓｐ２９９は、ＥＧＦ５２、ＥＧＦ６６及びＥＧＦ７５については、それぞれＳｅｒ、Ａｌａ及びＬｙｓに変化したが、ＥＧＦ５９においては未変化のままであった。
【００７７】
主としてＡｓｐ２９９で異なるＥＧＦ５２及びＥＧＦ５９についての類似のスポットＥＬＩＳＡシグナルは、この位置が結合については重要でないことを示唆した。それぞれＡｒｇ、Ｌｙｓ及びＬｙｓに対して、Ｎ３０９で単一変異を有するこれらのクローン、ＥＧＦ５０、ＥＧＦ５６及びＥＧＦ６２では、野生型と比較して、結合性の増加度合いは中程度であり、４つの最も好ましいクローンと比較すると、増加度合いはかなり低下していることが示された。このことは、Ｎ３０９による結合に対する適度な寄与を示唆している。Ａｓｎ３０１は、４つ全ての高親和性バインダーにおいて、Ｌｅｕに対して変異しており、親和性の増加について、重要な役割を担っていることが示唆された。結合に対するＡｓｐ３１０変異の寄与を評価するために、我々は、Ｄ３１０Ｋの単一変異を生じさせ、ファージＥＬＩＳＡを使用し、ＰＣＳＫ９に対するＥＧＦ-ディスプレイファージの結合曲線を測定した。図７に示されるように、Ｄ３１０Ｋの単一変異は、競合的な結合を無効にし、Ｄ３１０Ｋ単独では親和性を増加させることはできなかったが、高親和性結合を達成するには、他の変異、例えばＮ３０１Ｌと組合せなければならないことが示された。
【００７８】
実施例２：改善された親和性を有するＥＧＦ変異体及び阻害効力
４つの選択されたＥＧＦ変異体を、まずペプチド合成と、ついで、インビトロ折畳により作製した。全ＥＧＦ合成ペプチド、ＥＧＦｗｔ、ＥＧＦ５２、ＥＧＦ５９、ＥＧＦ６６、及びＥＧＦ７５を、自動化されたProtein Technologies社の合成器で調製した。典型的には、４０のアミノ酸ペプチドを、標準的なＦｍｏｃ合成プロトコルを使用し、Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)-Ｒａｐｐポリマー(置換＝０．２４  ｍｅｑ／ｇｍ)にアセンブリした。Ｆｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)-ＯＨを６つのシステインアミノ酸に組み入れた。線状鎖の完成時に、ペプチドを、室温で３時間、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／トリイソプロピルシラン(ＴＩＳ)／水(９５：２．５：２．５)を用いて、固形支持体から切断した。ＴＦＡを蒸発させ、ペプチドをエチルエーテルで沈殿させ、酢酸、アセトニトリル、水で抽出し、凍結乾燥させた。粗線状ＥＧＦペプチドをドメインに再度溶解させ、アセトニトリル／水のバッファーを使用し、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより精製した。精製した画分をｌｃｍｓ(ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ)により分析し、プール化し、凍結乾燥させた。
【００７９】
ペプチド折畳では、典型的には５０ｍｇの純粋な線状ＥＧＦペプチドを、５００ｍｌの水に溶解させ(０．１ｍｇのペプチド／ｍｌ水)、ｐＨを＞８に調節した。線状ペプチドを室温で３日間、空気で酸化させ、ついで凍結乾燥させた。粗環状ペプチドを分取逆相ＨＰＬＣにより単離した。完全に環状化したペプチドの同定を、質量分析より確認し、最終的な質量は、３つのジスルフィド結合の形成に相当する線状ペプチド未満の６質量単位であった。システインの対形成は以下の通りであった、Ｃｙｓ(Ｉ及びＩＩＩ)、Ｃｙｓ(ＩＩ及びＩＶ)、及びＣｙｓ(Ｖ及びＶＩ)。
【００８０】
ＥＧＦ変異体及びＥＧＦｗｔを、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対し、短いリンカーを介してＥＧＦに融合することにより、ＥＧＦ(Ａ)-Ｆｃ融合タンパク質に再形成した。ＬＤＬＲのＥＧＦドメイン(Ｇ２９３−Ｅ３３２)、並びに実施例１に記載の変異体、プラスＧＧＧＳＧＡＡＱＶＴＮＫＴＨＴ(配列番号：３０)の配列を有するリンカーと、続いてヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン(Ｃ２２２−Ｋ４４３)を、ＥＧＦ-Ｆｃ-ｐＲＫ５と命名したｐＲＫ５ベクターにクローニングした。ＥＧＦ-Ｆｃタンパク質を、一過的にＣＨＯで発現させ、プロテインＡ樹脂において、続いてゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質の同定を質量分析及びＳＤＳ-ＰＡＧＥにより確認した。ヒスチジン(Ｈｉｓ)８ Ｃ末端タグを有するヒトＰＣＳＫ９(GenBank(登録商標) EF692496)相補性デオキシリボリボ核酸(配列番号：３１)を、哺乳動物発現ベクター(ｐＲＫ５)においてクローニングした。組換えヒトＰＣＳＫ９タンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において、一過的に発現させ、ニッケルニトリロトリ酢酸アガロースカラム(Qiagen; Germantown, MD)にけるアフィニティークロマトグラフィーと、続いてSephacryl(登録商標) S 200 カラム(GE Healthcare; Piscataway, NJ)でのゲル濾過を使用し、条件培地から精製した。タンパク質の同定を質量分析、並びに還元及び非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより確認した。ついで、製造者の説明書に従い、EZ-link(登録商標) Sulfo-NHS-ビオチン化キット(カタログ番号21435, Thermo Scientific, Rockford, IL)を使用し、インビトロでタンパク質をビオチン化した。
【００８１】
単一のＥＧＦ-Ｆｃタンパク質は２つのＥＧＦドメインを含んでいたため、ＥＧＦ-Ｆｃは、同時に２つのＰＣＳＫ９に結合することが可能であった。これは、ＭＡＬＳ(マルチアングル光散乱)に連結したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)の使用により、溶液において、ＥＧＦ６６-Ｆｃ／ＰＣＳＫ９複合体の化学量論を測定することにより調べた。４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２ｍＭのＣａＣｌ２において、ＥＧＦ６６-ＦｃをＰＣＳＫ９と混合し、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)及びマルチアングル光散乱(ＭＡＬＳ)で分析する前に、２４時間、インキュベートした。それぞれ３：１及び１：３のモル比、約１５０μｇのＥＧＦ６６-Ｆｃ：ＰＣＳＫ９複合体を分析した。さらに、２つのタンパク質を、独立してコントロールとして使用した。同じバッファーを使用し、Superdex 200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)で１分当たり０．５ｍＬの流量で、分離を実施した。溶出プロファイルを２８０ｎｍでＵＶ吸光度(Agilent 1260 DAD)、静的光散乱(Wyatt Technologies Dawn Hellios-II)、及び示差屈折指標(Wyatt Technologies Optilab rEX)によりモニターした。散乱強度及び示差屈折指標のデータを、 Astra 5.3.4.20ソフトウェアパック(Wyatt Technologies)を使用するＺｉｍｍプロットを介して解析し、Superdex 200カラムから溶出した様々な単分散ピークのモル質量を測定した。
【００８２】
モル比１：３又は３：１のＥＧＦ６６-Ｆｃ／ＰＣＳＫ９混合物の双方のＳＥＣプロファイルにより、２つの主要な複合体ピークと、ついで過剰分子のモノマーピークが得られた。双方の場合における第１のピークの平均分子量は約１７０ｋＤａであり、１：２複合体の化学量論とほぼ一致し、第２のピークは約１２０ｋＤａで、１：１複合体と一致した(図８)。過剰のＰＣＳＫ９の存在下で、形成された複合体は１：２複合体であり、ＥＧＦ-Ｆｃタンパク質が、ＰＣＳＫ９と二価的に相互作用可能であることを示している。
【００８３】
ＥＧＦペプチドとＥＧＦ-Ｆｃ融合タンパク質のブロッキング活性を、競合結合ＥＬＩＳＡにより測定した。３８４ウェルのMaxiSorpＴＭプレート(Nalge Nunc International; Rochester, NY)のウェルを、コーティング用バッファー(５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６)において、１μｇ／ｍＬの組換えヒトＬＤＬＲ細胞外ドメイン(ｒＬＤＬＲ)(R&D Systems; Minneapolis, MN)を用い、４℃で一晩コートした。ついで、アッセイ用バッファー(２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のTween(登録商標)20)において、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＣＳＫ９を、同容量の連続希釈ＥＧＦペプチド(０．０１７-６０００ｎＭ)又はＥＧＦ-Ｆｃ(０．０３４-６０００ｎＭ)と混合し、３０分、インキュベートした。溶液をｒＬＤＬＲでコートされたプレートに添加し、２時間インキュベートした。結合したビオチン化ｒＰＣＳＫ９を、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare; Buckinghamshire, UK)及び基質３',３',５,５'テトラメチルベンジジン(TMBE 1000, Moss; Pasadena, MD)の逐次添加により測定した。二重ウェルからの平均吸光度を抗体濃度の関数としてプロットし、データをKaleidaGraph (Synergy Software; Reading, PA)を使用し、各抗体についての４パラメーター式に適合させた。
【００８４】
合成ＥＧＦペプチドについての結果を図３Ａに示す。ＥＧＦ変異体のＩＣ５０値は、ＥＧＦｗｔの３８−２４７倍低く、ＥＧＦ６６は最も強力なアンタゴニストであった(表Ｉ)。全てのＥＧＦ-Ｆｃ変異体はＥＧＦｗｔ-Ｆｃと比較してＰＣＳＫ９-ＬＤＬＲ結合の阻害において、より効果的であることが示されており(図３Ｂ)、合成ＥＧＦペプチド変異体(図３Ａ、表Ｉ)の結果と類似していた。双方のアッセイにおいて、ＥＧＦ６６-Ｆｃが最も強力なアンタゴニストであった。
【００８５】
表Ｉ．ＥＧＦ(Ａ)ドメイン変異体によるＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の阻害
ＩＣ５０は、方法の項に記載したように、競合体が、競合結合ＥＬＩＳＡにおいてＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の５０％をブロックした濃度である。値は３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
2014519848.tif 000003
【００８６】
ＰＣＳＫ９に対するＥＧＦ-Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性を、Octet RED 384 (Fortebio)において、生体層インターフェロメトリーを使用して測定した。Ｆｃバイオセンサー(Fortebio, カタログ番号18-5063)に、０．０５％のTween20及び０．５％のＢＳＡ及び１ｍＭのＣａＣｌ２を含むｐＨ７．５のトリスＨＣｌバッファーにＥＧＦ-Ｆｃが入ったものを充填し、同じバッファーで洗浄し、同じバッファーに０−５００ｎＭの範囲の濃度のＰＣＳＫ９が入ったウェルに移した。バッファーのみを含む参照セルに対するシグナルを、結合データの全てから引いた。親和性ＫＤを、Octetソフトウエアを使用し、定常状態アルゴリズムに対する応答の非線形フィッティングにより得た。表ＩＩにまとめた測定ＫＤ値は、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃと比較して、ＥＧＦ-Ｆｃ変異体の親和性が７．５〜３３倍増加したことを示している。
【００８７】
表ＩＩ．生体層インターフェロメトリーにより測定されたＰＣＳＫ９に対するＥＧＦｗｔ-Ｆｃ及びその変異体の結合親和性。ＫＤ値を定常状態等式に対してデータをフィッティングすることにより決定した。値は３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
2014519848.tif 000004
【００８８】
実施例３：ＰＣＳＫ９に対するＥＧＦ６６-Ｆｃのカルシウム非依存性結合
ＥＧＦ(Ａ)ドメインのＰＣＳＫ９との相互作用には、カルシウムが必要である(Malbyら (2001) Biochemistry 40(8), 2555-2563; Sahaら (2001) Structure 9(6), 451-456)。残基Ｇｌｕ２９６及びＡｓｐ３１０の側鎖は、ＥＧＦ(Ａ)ドメインによる単一のＣａ２+原子の配位に対する重要な寄与体である。全てのＥＧＦ変異体は、Ａｓｐ３１０の代わりに位置３１０にＬｙｓ残基を有し、カルシウム結合が厳しく妥協されたものであることを示唆している。よって、我々は、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃと比較して、ＥＧＦ６６-ＦｃのＰＣＳＫ９結合に対するカルシウムの必要性を調査した。Ｃａ２＋の存在又は不在において、ＰＣＳＫ９とＥＧＦｗｔ-Ｆｃ又はＥＧＦ６６-Ｆｃの結合親和性を、Biacore(登録商標)3000(GE Healthcare)における表面プラズモン共鳴により測定した。センサーチップを、製造者により供給された使用説明書に従い、ヒト抗体捕捉キット(カタログ番号BR-1008-39)を使用して調製した。操作用バッファー(５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０)で希釈されたＥＧＦｗｔ-Ｆｃ(０．３０７μｇ／ｍｌ)及びＥＧＦ６６-Ｆｃ(０．３５μｇ／ｍｌ)、ＥＧＦ７５-Ｆｃ(１μｇ／ｍｌ)、ＥＧＦ５２-Ｆｃ(１μｇ／ｍｌ)及びＥＧＦ５９-Ｆｃ(１μｇ／ｍｌ)の注入により、それぞれ８５．９ＲＵ、２３１．８ＲＵ、１４４ＲＵ、１４２ＲＵ及び１４６ＲＵの結合シグナルが得られた。１ｍＭのＣａＣｌ２又は１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下、ＰＣＳＫ９溶液の３分間の注入の間、センサーグラムを記録した。データを、３０μｌ／分の流量、及び２５℃の温度で、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃについては０．０７８μＭ〜１０μＭ、ＥＧＦ６６-Ｆｃについては０μＭ〜２．５μＭの範囲で、ＰＣＳＫ９の２倍連続希釈から得た。捕捉抗体のみを含む参照セルのバックグラウンドシグナルを引くことにより、データを補正した。動力学的パラメータ(ｋａ及びｋｄ)を、Biacore(登録商標)3000BIA評価ソフトウェア、バージョン４．１を使用して、データをフィッティングすることにより測定し、ＫＤ値を算出した(ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ)。
【００８９】
我々は、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃが、カルシウムの存在下、９３５ｎＭのＫＤでＰＣＳＫ９に結合するが、カルシウムが不在(すなわち、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下)の場合は、何の結合シグナルも検出されないことを、この実験で見出した(図５Ａ、表ＩＩＩ)。これに対して、カルシウムの存在又は不在下、ＰＣＳＫ９についての４つ全てのＥＧＦ変異タンパク質の親和性は、ほぼ同様であった(図５Ｂ、表ＩＩＩ)。ＥＧＦ６６-Ｆｃ及びＥＧＦ５２-Ｆｃは事実上同一の結合定数を示すが、主として２倍低減したｋｏｎであるため、ＥＧＦ５９-Ｆｃ及びＥＧＦ７５-Ｆｃは、Ｃａ２＋の不在下で、２倍低減した親和性のみを有した(表ＩＩＩ)。理論に縛られることを望むものではないが、ＥＧＦ変異体のＣａ２＋-独立性は、Ｃａ２＋を含まないバッファーにおいて実施されるクローン選択プロセスの結果であると思われる。この特定の淘汰圧は、Ａｓｐ３１０のリジンへの変化を含む「適応」変異を伴うクローンの出現に好まれていた。さらに、結果は、Ｃａ２＋が存在するか又は存在しない場合に、ＥＧＦ６６-Ｆｃが、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃと比較して約１２倍の改善された親和性を有する最も高い結合親和性(ＫＤ ７１ｎＭ)を有することを示していた。
【００９０】
表ＩＩＩ．表面プラズモン共鳴により測定したＣａ２＋の存在又は不在下でのＰＣＳＫ９に対するＥＧＦｗｔ-Ｆｃ又はＥＧＦ５２-Ｆｃ、ＥＧＦ５９-Ｆｃ、ＥＧＦ６６-Ｆｃ又はＥＧＦ７５-Ｆｃの結合性の動力学的パラメータ
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【００９１】
実施例４：ＥＧＦ６６-Ｆｃのインビトロ及びインビボ効果
その優れた阻害活性に基づき、Ｈｅｐｇ２細胞を用いたＬＤＬＲ分解アッセイおいて、ＥＧＦ６６-ＦｃをＰＣＳＫ９アンタゴニストとして使用した。ＨｅｐＧ２細胞(ATCC; Manassas, VA)を、２ｍＭのグルタミン(Sigma)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)及び１０％のＦＢＳ(Sigma)を含む高グルコース培地(DMEM, Gibco; Carlsbad, CA)に、ウェル当たり１×１０５細胞で、４８ウェルプレート(Corning；Corning, NY)に播種し、一晩インキュベートした。ついで、培地を、１０％のリポタンパク質欠乏血清(LPDS, Intracel; Frederick, MD)を含むＤＭＥＭと交換した。２４時間後、１５μｇ／ｍｌのＰＣＳＫ９を連続希釈されたＥＧＦｗｔ-Ｆｃ及びＥＧＦ６６-Ｆｃ融合タンパク質と混合し、細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳですすぎ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ(EMD; Gibbstown, NJ)を使用して剥離させた。遠心分離後、再懸濁させた細胞を、１：２０の抗ＬＤＬＲ抗体(Progen Biotechnik; Heidelberg, Germany)と共に、氷上で１５分インキュベートした。ついで、試料をＰＢＳで洗浄し、１：２００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ Alexa Fluor(登録商標) 488 (Invitrogen; Carlsbad, CA)と共に、氷上で１５分インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳに再懸濁させ、デュアルレーザーフローサイトメーター(FACScan, Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ)で分析した。相対的蛍光単位(ＲＦＵ)を使用し、ＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬＲ発現レベルを定量した。細胞表面ＬＤＬＲレベルを、ＰＣＳＫ９の不在下(＝コントロール)において測定されたＬＤＬＲレベルのパーセントとして表した。
【００９２】
ＥＧＦ６６-Ｆｃタンパク質は、濃度依存的な形でＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬＲの分解を防止した(図５)。試験された最も高い濃度(５μＭ)で、ＬＤＬＲ表面レベルは、ＰＣＳＫ９の不在下で測定されたコントロールレベルの約８０％であった。比較すると、ＥＧＦ-Ｆｃは、ＬＤＬＲ表面レベル(図５)の回復においてあまり強力ではなく、試験した最も高い濃度(２０μＭ)でコントロールレベルの５６％に達した。コントロールの５０％までＬＤＬＲレベルが回復する濃度(有効濃度、ＥＣ５０)は、ＥＧＦ６６-Ｆｃ及びＥＧＦｗｔ-Ｆｃに対してそれぞれ１．６μＭ及び１１μＭであった。
【００９３】
増加した親和性及び細胞有効性が、改善された治療可能性に翻訳されうるかどうかを決定するために、我々は、マウスモデルにおいて、ＰＣＳＫ９を用いた処置時に、肝臓ＬＤＬＲを救済するＥＧＦｗｔ-Ｆｃ及びＥＧＦ６６-Ｆｃの効果を比較した。８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、認可されている販売者から購入し、実験開始の２週間前に収容した。体重及びｉ.ｖ.経路で介して示された用量で投与されたＥＧＦｗｔ-Ｆｃ又はＥＧＦ６６-Ｆｃ融合タンパク質、又はＰＢＳ(ビヒクル／コントロール)に基づき、マウスを３つのグループにランダム化した(３マウス／グループ)。２時間後、ＰＢＳに３０μｇのＰＣＳＫ９が入ったものを、マウスにｉ.ｖ.投与した。１時間後、肝臓を収集し、ＳＮＡＰ凍結させた。
【００９４】
約２００ｍｇの各肝臓を、製造者の使用説明書に従い、TissueLyser(Qiagen)を使用し、プロテアーゼインヒビター混合物(ProteoExtract(登録商標) Native Membrane Protein Extraction Kit, カタログ番号444810, Calbiochem)が補填された抽出用バッファー１でホモジナイズした。可溶化液を遠心分離し、細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビター混合物(Calbiochem)が補填された抽出用バッファーＩＩに再懸濁させた。４℃でゆっくりと撹拌した３０分後、試料を遠心分離し、膜タンパク質を含む上清をブラッドフォードアッセイを使用して定量した。４×ＳＤＳ試料用バッファーを添加した。各グループについて(ｎ＝３)、肝臓タンパク質を、全体でタンパク質が１００μｇになるようにプール化し、５分煮沸した。試料を、４−１２％のビス-トリスＭｉｄｉゲルに充填し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。iBlot(登録商標)(Invitrogen)を使用して、ニトロセルロース膜に移した後、膜を、室温で１時間、５％の脱脂乳でブロックした。４℃で一晩、５％の脱脂乳において、１：２００の抗ＬＤＬＲ(Abcam)と共に、ブロットをインキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ-Ｔ(１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のTween(登録商標)20)で１５分、３回洗浄した。ついで、５％の脱脂乳において１時間、１：５０００の抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare)と共にインキュベートした。ＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、ＥＣＬ-プラス(GE Healthcare)を使用し、ＸＡＲフィルム(Kodak)に露光させてタンパク質を可視化した。ついで、膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄し、室温で２時間、１：５０００の抗トランスフェリンレセプター(Invitrogen)と共にインキュベートした。ＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、膜を１：１００００の抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare)中で１時間インキュベートし、再度洗浄した。ＥＣＬ-プラスを使用し、ＸＡＲフィルムに露光して、タンパク質を可視化した。
【００９５】
まず、マウスに、ビヒクル、ＥＧＦｗｔ-Ｆｃ、及びＥＧＦ６６-Ｆｃと、続いて組換えヒトＰＣＳＫ９(３０μｇ／マウス)のボーラスを注射し、肝臓を収集し、１時間後に分析した。図６に示されるように、ＰＣＳＫ９での処置により、通常のレベル(ＰＣＳＫ９での処理なし)の＜１０％まで、肝臓ＬＤＬＲが劇的に低下した。ＥＧＦｗｔ-Ｆｃを用いた前処理で、最も高い用量(６０ｍｇ／ｋｇ)で、コントロールレベルの５０％未満まで、肝臓ＬＤＬＲが救済されたが、ＥＧＦ６６-Ｆｃを用いた前処理では、２０ｍｇ／ｋｇの中程度の用量で７０％、最も高い用量(６０ｍｇ／ｋｇ)で〜１００％まで、ＬＤＬＲレベルを救済した。その結果から、ＥＧＦ６６の改善された親和性は、インビボで有意に改善されたアンタゴニスト効能に翻訳されることが示唆された。
【００９６】
実施例５：ＥＧＦ変異体の構造分析
ＰＣＳＫ９に対するＥＧＦ６６結合に何故カルシウムが必要でないのか、特定のアミノ酸が、何故ファージ最適化プロセス中に選択されたのかを調査するために、ＥＧＦ６６のモデルを作製した(図９Ａ)。ＥＧＦ６６に存在する変異をＬＤＬレセプターのＥＧＦ(Ａ)ドメインとＰＣＳＫ９との間の複合体の構造を使用し、ＰｙＭＯＬ(The PyMOL Molecular Graphics System, V1.2r3pre, Schrodinger LLC)で手作業でモデリングした(PDB Accession code 3BPS) (Kwonら, 上掲)。５つ全ての場合で、変異は、骨格の立体構造に何の変異も必要なく、適応させることができた。標準的なＰｙＭＯＬ回転異性体ライブラリーからの側鎖配置を、ＰＣＳＫ９の原子又はＥＧＦドメインの他の原子との衝突が最小となるように選択した。このライブラリーにおける配置は、公開されているタンパク質構造における、一般的に天然に生じる側鎖立体構造から誘導され、よって、低エネルギー状態である。Ｄ３１０Ｋの場合、野生型タンパク質において観察されたＣａ２＋イオン近傍にＮε原子を導くために、最初の低エネルギーのリジン側鎖立体構造を、ｃｈｉ-４では〜１２０°変化、ｃｈｉ-３では〜１０°シフト増大させた。全ての側鎖二面角はねじれ形であり、他のタンパク質原子との衝突が最小であるため、この位置でのリジンは、骨格立体構造において有意な変化はなく、Ｃａ２＋結合ループにおいて、アンモニウムイオンを持つ低エネルギー立体構造を採択することができる。
【００９７】
Ｄ２９９は、２６のファージ配列の１４に保存されている。ＰＣＳＫ９(Ｓ１５３)のＮ-末端からの水素結合の距離よりわずかに遠いが、アスパラギン酸側鎖は、ＰＣＳＫ９Ｎ-末端アミンとの有益な有極接点に関与しうる(Bottomleyら, 上掲)。ＥＧＦ６６におけるこの位置で、アラニンを選択する理由は、モデル構造からは直ぐには明らかではない。野生型ＥＧＦにおけるＮ３０１は、２つの分子内水素結合に関与しているが、ＰＣＳＫ９に対する如何なる分子間接触もない。野生型残基は、ファージ選択中、維持されている(１０ケース)かロイシンで置き換えられている(１６例)。ＥＧＦモデルは、この位置のロイシンが、ＰＣＳＫ９のＩ３６９(Ｃγ１及びＣδ１)、Ｖ３８０(Ｃα)及びＳ３８１(Ｃβ)との好ましい疎水性相互作用に寄与可能であることを示唆している。Ｖ３０７は主要なＥＧＦ βヘアピンの一端に位置する。この部位での多くのファージ選択は、β-ストランド立体構造を安定化させる助けとなるβ-分子状アミノ酸である。さらに、ＥＧＦ６６におけるＶ３０７Ｉ置換により、ＰＣＳＫ９のＤ３７４(Ｃβ)、Ｖ３８０(Ｃγ２)又はＣ３７８(Ｓγ)との付加的な疎水性接触が可能になりうる。Ｎ３０９の側鎖は２つの水素結合、一つは分子内(Ｅ３１６Ｏε)、一つは分子間(ＰＣＳＫ９-Ｔ３７７Ｏγ１)に関与している。ファージクローンの一つを除いて全てが、塩基性残基でＮ３０９が置き換えられている。この優先性は、Ｅ３１６との相互作用の増大により(ＥＧＦ β-ヘアピンを安定化)、又はＴ３７７のメチル基、及びＣ３７５-Ｃ３７８ジスルフィドにより形成されるＰＣＳＫ９表面の非極性パッチ、及び塩基性残基のメチレン基との間の疎水性接触の改善により推進されうる。
【００９８】
２つの付加的な残基をファージ-ライブラリーで変えたが、ＥＧＦ６６における野生型残基は維持した。残基２９５でのアスパラギン酸は、ファージ配列の一つを除き全てに存在しており、その２つの側鎖水素結合相互作用の重要性(Ｃ２９７骨格Ｎに対しては分子内、Ｄ２３８Ｏδに対して分子間)が示唆される。残基３０６は野生型ＥＧＦドメインにおけるヒスチジンであり、ＰＣＳＫ９のＤ３７４との電荷-電荷相互作用を介して、低ｐＨにて、ＰＣＳＫ９に対するＬＤＬＲの親和性の増大に寄与していることが提案されている(Bottomleyら, 上掲)。また、イミダゾール環は、ＥＧＦドメイン内のＰ３２０の側鎖に対して充填されている。Ｈ３０６の芳香性は、ファージ配列の全て(Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ)で保存されている。ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンは、Ｐ３２０側鎖と接触可能であり、この環スタッキングが、ＥＧＦのＮ-及びＣ-末端サブドメインの配向性を安定化させるのに重要である可能性が示唆される。ＥＧＦ-Ｈ３０６Ｙは、ＰＣＳＫ９により堅牢に結合することが示されており、Ｄ３７４に対する直接的水素結合の潜在的形成により理論的に説明される（上掲のBottomleyら）。
【００９９】
Ｃａ２＋のキレート化は、ＥＧＦドメインの共通する特徴であり、ドメインの折畳を安定化させると仮定され、ドメイン間の相互作用における役割を担っていると推測される(Handfordら(1991) Nature 351: 164-167)。ＬＤＬＲのＥＧＦ(Ａ)ドメインは、Ｃａ２＋をキレート化し、Ｄ３１０の側鎖は、イオンの接触において重要な役割を担っている。さらに、ＰＣＳＫ９へのＥＧＦの結合は、Ｃａ２＋依存性である。この役割の付与により、おそらく、２６のファージ誘導性配列の１３が、この部位でアスパラギン酸に保存されていることは、驚くべきことではない。しかしながら、２６のファージ誘導配列のうち９では、Ｃａ２＋のキレート化ができないであろう、リジンにより置き換えられたＤ３１０を有している。注目すべきは、ファージ選択は、外因的に添加されたＣａ２＋の不在下で実施され、これがこの位置で代償性アミノ酸変化を持つファージクローンに対して淘汰圧を付与したのであろうる。理論に縛られることを望むものではなく、Ｄ３１０Ｋ変異により、ＥＧＦをＰＣＳＫ９結合に対してコンピテントにするＣａ２＋の必要性が軽減されうる。一つの興味ある可能性は、Ｋ３１０の側鎖アミノ基が、３０９-３１６β-ヘアピン(Ｌ３１１とＧ３１４の骨格酸素)とＥＧＦ６６のＮ末端鎖(例えば、Ｍ２９２とＴ２９４の骨格酸素；Ｅ２９６の側鎖)との間を架橋するために、極性相互作用を使用することにより、Ｃａ２＋イオンに対して類似した役割を担っており、それによってＥＧＦドメインにおける後者の充填を安定化させる(図９Ｂ)。
【０１００】
上述の発明は、理解を明確にする目的で、例証と実施例によっていくらか詳細に記載したが、記述及び実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。ここに引用された全ての特許及び科学文献の開示は、出典明示によりその全てが明示的に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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