(57)【要約】  本発明は、網膜神経保護の方法または網膜疾患を治療する方法に関するものであり、治療が必要な患者に、治療有効量の７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン、そのエナンチオマーまたは薬剤的に許容可能な塩を含む治療有効量の医薬組成物を投与する工程を含む。疾患は、例えば、加齢黄斑変性、滲出型黄斑変性、乾燥型黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、高眼圧症、緑内障、網膜色素変性および多発性硬化症二次的神経炎から選択される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたはそのエナンチオマー若しくはその塩を含む治療有効量の医薬組成物で患者を治療することを含む、網膜神経保護の方法。
【請求項２】
医薬組成物が有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたはその塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
医薬組成物が有効量の（Ｒ）-（-）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたはその塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患が加齢黄斑変性、滲出型黄斑変性、乾燥型黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、高眼圧症、緑内障、網膜色素変性および多発性硬化症二次的神経炎から選択される、請求項１に記載の網膜神経保護の方法。
【請求項５】
包装材および当該包装材の中に含まれる医薬品を含む製品であって、前記医薬品は網膜疾患の治療に治療上有効であり、前記包装材は、前記医薬品が網膜疾患の治療に使用できることを示すラベルを含み、および前記医薬品は有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを含む、前記製品。
【請求項６】
７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはそのエナンチオマー、若しくはその互変異性体、またはその薬剤的に許容可能な塩を含む有効量の医薬組成物で患者を治療することを含む、網膜疾患を罹患している患者を治療する方法。
【請求項７】
医薬組成物は有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはその互変異性体、またはその薬剤的に許容可能な塩を含む、請求項６に記載の網膜疾患の治療方法。
【請求項８】
医薬組成物は有効量の（Ｒ）-（-）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはその互変異性体、またはその薬剤的に許容可能な塩を含む、請求項６に記載の網膜疾患の治療方法。
【請求項９】
疾患が加齢黄斑変性、滲出型黄斑変性、乾燥型黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、高眼圧症、緑内障、網膜色素変性および多発性硬化症二次的神経炎から選択される、請求項６に記載の網膜疾患の治療方法。
【請求項１０】
有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはその互変異性体、またはその薬剤的に許容可能な塩を含む医薬組成物を投与することによって、高眼圧症、緑内障、網膜色素変性および多発性硬化症二次的神経炎を含む病態から視力喪失した患者の視力を向上させる方法。
【請求項１１】
包装材および当該包装材の中に含まれる医薬品を含む製品であって、前記医薬品は網膜疾患の治療に治療上有効であり、前記包装材は、前記医薬品が網膜疾患の治療に使用できることを示すラベルを含み、および前記医薬品は有効量の７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはそのエナンチオマー、またはその互変異性体を含む、前記製品。
【請求項１２】
前記医薬品は有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたはその互変異性体を含む、請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
前記医薬品は有効量の（Ｒ）-（-）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたはその互変異性体を含む、請求項１１に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月２８日に提出した米国仮出願第６１／５６３，８８６号の利益を主張し、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、治療有効量の７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたは薬剤的に許容可能な塩を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、網膜の神経保護が必要な患者の網膜の神経保護に関する。
【背景技術】
【０００３】
３つのα１および３つのα２アドレナリン性受容体に分子的および薬理学的手法によって特徴付けをした。これらのα２受容体の活性化は、生理学的奏効を誘起し、有用な治療作用を有する。化合物７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンは、潜在能力のあるα２アドレナリン性受容体パンアゴニストとして知られ、３つのα２受容体のサブタイプを全て活性化する。
【０００４】
７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンのラセミ体混合物および２つのエナンチオマーは、米国特許第７，３２３，４７７  Ｂ２号に開示されている。米国特許第７，９４３，６４１号は、緑内障または高眼圧症を治療するための（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを含む組成物を開示している。結合試験は、部分アゴニストである（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンは、α２Ａ受容体のダウンレギュレーションをごくわずかに誘発するたけであることを示した。対照的に、完全アゴニストのブリモニジンは、α２Ａ受容体の密度をかなり低下させた。
【０００５】
ブリモニジンは化合物（５-ブロモ-キノキサリン-６-イル）-イミダゾリジン-２-イリデン-アミンであり、酒石酸塩は、商標ＡＬＰＨＡＧＡＮ（登録商標）Ｐ（Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．で入手可能）で販売されている。
【化１】
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【化２】
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【発明の概要】
【０００６】
本発明は、α２アドレナリン性受容体を調節するための有効成分として７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、α２アドレナリン性受容体を調節するための有効成分として（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、α２アドレナリン性受容体を調節するための有効成分として（Ｒ）-（-）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンは、潜在能力のあるα２アドレナリン性受容体であり、３つのα２受容体のサブタイプを全て活性化する。しかしながら、それはα２Ａ受容体の部分アゴニストであり、受容体の脱感作およびダウンレギュレーションがより少ない（表２に示す）。この特性は、特に薬剤を継続的に送達するとき、持続作用させるのに有益である。
我々は、（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンの医薬組成物が網膜の神経保護に役に立つことを発見した。
【０００８】
したがって、（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンは、限定されないが、加齢黄斑変性、滲出型黄斑変性、乾燥型黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、高眼圧症、緑内障、網膜色素変性および多発性硬化症二次的神経炎を含む眼の疾患の神経保護に利点がある。対象の化合物は、高眼圧症、緑内障、網膜色素変性および多発性硬化症二次的神経炎を含む病態から視覚喪失した患者の視覚を向上させるのにも役に立つ。この視覚向上または網膜の神経強化は、化合物の神経保護効果と独立して、発生させることができる。
【０００９】
「視覚喪失」とは、本明細書に使用するとき、視野、対比感度、夜間視力、色覚、明敏さを含む視覚機能の欠損を意味する。
【００１０】
「医薬組成物」とは、本明細書に使用するとき、疾患を治療するためにヒトの患者に投与することに適した組成物を意味する。ある実施形態では、したがって、本発明の化合物は薬剤的に許容可能な塩として処方され、１つ以上の薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含む。
【００１１】
「薬剤的に許容可能な塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保ち、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐトルエンスルホン酸、サリチル酸等の無機酸類と反応することによって得られるその塩類を意味する。（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンは、米国特許第７，４９１，３８３  Ｂ２号に開示される様に、効果を向上させる成分と処方されてもよい。
【００１２】
（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン化合物には、特に薬剤を継続的に送達する（例えば眼インプラントに）ときに、持続作用させるのに有益な生理化学的および薬物動態特性がある。
【００１３】
化合物は様々な経路によって投与され、限定されないが、点眼、直接注射、眼の後ろ側の使用、または時間をかけて放出するペレット、懸濁液、ゲル、溶液、クリーム、軟膏等の長時間の作用をさらに高めてもよい製剤、または当該技術分野に周知の適切な薬物送達システム（ＤＤＳ）等の持続的送達装置が挙げられる。局所的投与が好ましいが、当該化合物を米国特許出願公開第２００５０２４４４６３号に記述の眼内インプラントに使用してもよい。このような生体適合性の眼内インプラントとして、一定延長時間に眼に放出することを容易にするための（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンおよび（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンに関連するポリマーが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンが青色光によって生じる損傷を低下させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のある態様では、治療有効量の７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたは薬剤的に許容可能な塩を含む、から本質的に成る、またはから成る治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、から本質的に成る、またはから成る、網膜の神経強化が必要な患者の網膜の神経強化の方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様では、治療有効量の（Ｒ）-（-）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたは薬剤的に許容可能な塩を含む、から本質的に成る、またはから成る、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、から本質的に成る、またはから成る網膜の神経強化が必要な患者の網膜の神経強化の方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様では、治療有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンまたは薬剤的に許容可能な塩を含む、から本質的に成る、またはから成る治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、から本質的に成る、またはから成る、網膜の神経強化が必要な患者の網膜の神経強化の方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様では、治療有効量の７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはそのエナンチオマー、若しくはその互変異性体、または薬剤的に許容可能な塩を含む、から本質的に成る、またはから成る治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、から本質的に成る、またはから成る、網膜疾患の治療が必要な患者の網膜疾患の治療方法を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様では、治療有効量の（Ｒ）-（-）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはその互変異性体、または薬剤的に許容可能な塩を含む、から本質的に成る、またはから成る治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、から本質的に成る、またはから成る、網膜疾患の治療が必要な患者の網膜疾患の治療方法を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様では、治療有効量の（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリン若しくはその互変異性体、または薬剤的に許容可能な塩を含む、から本質的に成る、またはから成る治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、から本質的に成る、またはから成る、網膜疾患の治療が必要な患者の網膜疾患の治療方法を提供する。
【００２１】
本発明は例示の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、この実施形態は本発明の具体的な態様を説明するに過ぎない。本明細書に開示されたものの他に、本発明の様々な修正は、当初なされた請求項を含む明細書を注意深く読むことによって当業者に明らかになる。このような修正はどれも添付の請求項の範囲にあることを意図する。
【実施例】
【００２２】
実施例１
視覚向上モデル
体重が２〜３ｋｇの有色ウサギ（ダッチベルテッド種）１６例を用いて、（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンの神経強化の影響を評価した。ウサギに静脈内経路により（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを投与した。空間スイープ視覚誘発電位（ｓＶＥＰ）明瞭度。空間ｓＶＥＰ明瞭度をＰｏｗｅｒＤｉｖａソフトウェアバージョン１．８で評価した。意識のある動物に両側で記録を行った。その結果、（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンによって、投与から１０〜３０分後に正常なＤＢウサギの視覚明瞭度が向上することを示した。
【００２３】
実施例２
神経挫滅モデル
当該実施例は、ラットの神経挫滅モデルにおける（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンのレベルの神経保護的影響を述べる。体重が３００〜３５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ系ラットにケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔をかけた。右目に外眥切開を行い、直筋に隣接する上結膜を切開した。次に視神経が露出するまで鈍的に切開した。較正された交差して動く鉗子を用いて、眼球から２〜３ｍｍ遠位に、３０秒間、視神経を部分的に切開した。網膜の血液供給を妨げないように気をつけた。神経損傷の２時間前に、（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを皮下に０．０３、０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ投与し、負の対照としてビヒクルのＰＢＳを投与し、正の対照としてブリモニジン０．１ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射によって投与した。対照の動物にリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ビヒクルを投与した。実験は１２〜１５日後に終了した。
【００２４】
実施例３
慢性高眼圧症モデル
青緑色のアルゴンレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、パロアルト、カリフォルニア州）のレーザー光凝固術を用いて、体重が３５０〜４５０ｇの雄Ｗｉｔａｒラットの眼内圧（ＩＯＰ）を上昇させた。ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）、アセプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）、およびキシラジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）の混合物でラットに麻酔をかけた。角膜縁と上強膜の静脈の２つの部分に（１週間の間隔）、レーザー治療を行った。使用したエネルギー量は０．２秒間に１Ｗ、計１５０スポット（５０〜１００μＭ）であった。眼内圧を眼圧計（ＴＯＮＯ-ＰＥＮ：ｍｅｎｔｏｒ、ノーウェル、マサチューセッツ州）を用いて測定した。ＩＯＰ測定の間、ラットは３．０ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンの筋肉内注射によって鎮静していた。プロパラカイン０．５％を眼に局所的に与え、角膜に麻酔をかけた。レーザー治療の前に最初のＩＯＰ測定を行い、ベースラインのＩＯＰを測定し、週に１回次の測定を行った。
【００２５】
背中の皮下に挿入した浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐｓ、Ｄｕｒｅｔ  Ｃｏｒｐ．、クパチーノ、カリフォルニア州）を使用して、（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを、神経損傷の２時間前に、０．０３、０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ継続して皮下投与し、負の対照としてビヒクルＰＢＳを皮下投与し、一方では正の対照としてブリモニジン０．１ｍｇ／ｋｇを腹膜内注射によって投与した。対照の動物にリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ビヒクルを与えた。実験は１２〜１５日後に終了した。
【００２６】
実施例４
ブリモニジンおよび（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンについて、α２Ａ受容体活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＴＰアーゼアッセイの結果を表１に示す。（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンが、完全アゴニストのブリモニジンの効果の０．６の効果のレベルの部分アゴニストであることをデータは示している。
【表１】
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【００２７】
ＧＴＰアーゼアッセイでは、受容体活性がＧＤＰを分離し、非加水分解性の［35Ｓ］ＧＴＰγＳを受容体共役Ｇタンパク質に結合する。結合の程度は、受容体活性の測定値である。α２Ａ受容体およびＧiＧ-タンパク質の３つのサブユニットを一過性に発現しているＨＥＫ細胞から膜を調製した。４℃の膜緩衝液中のポリトロン・ディスラプター（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）を使用して、膜を解凍し、再懸濁し、ブラッドフォードアッセイによって定量化した。定量化したタンパク質をその後、反応緩衝液［５０ｍＭトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３μＭプロプラノロール、および０．１ｍＭＡＭＰ；ｐＨ７．４および４℃］に加え、１００μｇ／ｍＬの濃縮液を得て、１５分間インキュベートし、その後、６μＭＧＤＰの存在下でさらに１０分間インキュベートした。その後、上述の混合物を９６ウェルプレート中の５０μＬ／ウェルに分注し、アッセイ緩衝液［５０ｍＭ  トリス-ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．４および４℃］に溶解した試験化合物の等量と混合し、５分間インキュベートした。上述のインキュベーションの直後に、混合物をアッセイ緩衝液中の５０μＬの１．５ｎＭ［35Ｓ］ＧＴＰγＳと混合し、２５℃で６０分間にわたって振とうした。０．５％ＢＳＡで遮へいされたＧＦ／Ｂフィルターの上方の真空濾過によってアッセイを終えた。その後、フィルターを４℃の洗浄緩衝液［５０ｍＭ  トリス-ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５］で洗浄した。プレートを一晩乾燥させた後、取り込まれた［35Ｓ］ＧＴＰγＳを、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  １４５０Ｂ液体シンチレーションカウンタを用いて測定した、。
【００２８】
α2A-アドレナリン性受容体を遺伝子導入されたヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、３７℃および５％ＣＯ2で保持されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０）、０．２５ｕｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ-８８３３）、および１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２４０）中、Ｔ-１７５培養フラスコで、５０〜６０％の培養密度に成長させた。所望の培養密度に達した後、０、１，０００ｎＭブリモニジンおよび（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンで処置された増殖培地中に、細胞は、２４時間インキュベートし、３７℃および５％ＣＯ2で保持した。その後、室温で細胞をダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）で洗浄した。
【表２】
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【００２９】
膜［メチル-3Ｈ］ラウオルシン飽和結合
細胞を４℃のトリス-ＥＤＴＡ緩衝液［５０ｍＭトリス-ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ７．４］で収集し、４℃で５分間、５，０００ｘｇで遠心分離にかけた。４℃のトリス-ＥＤＴＡ緩衝液中の細胞ペレットを再懸濁することによって、膜の調製を行い、ポリトロン・ディスラプター（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）で２回溶解した（各７、５秒に設定）。溶解した懸濁液を４℃で３２分間、約３５，０００ｘｇで遠心分離にかけた。上清を容器に移した後に、ペレット化した材料を、ポリトロン・ディスラプターを使用して、４℃のトリス緩衝液［５０ｍＭトリス-ＨＣｌ；ｐＨ８．０］にさらに溶解した（各４、５秒に設定）。膜を分注し、４℃で３２分間、約３７，０００ｘｇでペレット化し、使用するまで-８０℃で保管した。
【００３０】
４℃のＨＢＳＳ-ＨＥＰＥＳ緩衝液［１部の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ：５部の１０ｘハンクス平衡塩類溶液：４３．８部のＨ2Ｏ；ＫＯＨでｐＨ７．４］中のポリトロン・ディスラプターを使用して、膜を解凍し、再懸濁し、ブラッドフォードアッセイによって定量化した。定量化したタンパク質をＨＢＳＳ-ＨＥＰＥＳ緩衝液でさらに希釈し、濃度が１００μｇ／ｍＬに達した。懸濁液を２００μＬｓ／ウェル±１０μＭフェントラミンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ-７５４７）および［メチル-3Ｈ］ラウオルシン（１５ｎＭ〜０．０５ｎＭ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＮＥＴ７２２２５０ＵＣ）で、９６ウェルのプレートに配置した。アッセイプレートをゆっくりと振とうし、２５℃で９０間インキュベートした。上述のインキュベーションの直後に、ＧＦ／Ｂフィルターの上方の真空濾過によってアッセイを終えた。その後、フィルターを４℃のＨＢＳＳ-ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。プレートを一晩乾燥させた後、取り込まれた［メチル-3Ｈ］ラウオルシンをＭｉｃｒｏｂｅｔａ  １４５０Ｂ液体シンチレーションカウンタを用いて測定した。。
【００３１】
結合試験は、部分アゴニストである（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンはα２Ａ受容体のダウンレギュレーションをごくわずかに誘発するたけであることを示した。対照的に、完全アゴニストのブリモニジンは、α２Ａ受容体の密度をかなり低下させた。
【００３２】
実施例５
ラットの網膜変性の青色光モデル
網膜疾患の治療においてα２Ａ部分アゴニストの利点を説明するために、ラットの網膜変性の青色光モデルにおける（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンとビヒクルを比較した。（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンを、０．３ｍｇ／ｋｇ／日および１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、皮下ポンプで継続的に投与し、それぞれ青色光の曝露から２日前に開始した。これらの濃度は、網膜中の１．３ｎｇ／ｇの（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンの薬物濃度となり、薬理活性に十分な濃度である。２４週の雄のＳｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ系ラット（体重４７０〜５５０ｇ）を当該試験に使用した。動物を実験前に１２時間の室内光、１２時間の暗周期に曝露した。全動物を青色光の前に一晩（１６〜２０時間）、暗順応させた。６１００〜６５００ルクスの強度下、ラットを４時間青色光に曝露した。ラットを青色光の後、別に３日間、暗所に置いておき、正常な１２時間の明／１２時間の暗に戻した。眼干渉断層撮影（ＯＣＴ）測定を青色光の曝露７日後に測定した。
【００３３】
図１に示す結果によると、生理食塩水の治療のみの青色光曝露によって、ＯＣＴによって測定された網膜厚、特に上網膜の厚みが劇的に減少した。組織学的な研究は、網膜厚の減少は光受容体の喪失に起因しうることを示している。（Ｓ）-（＋）-７-（１Ｈ-イミダゾール-４-イルメチル）-５，６，７，８-テトラヒドロ-キノリンによる治療は青色光によって生じる損傷を有意に減少させる。
【図１】
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【国際調査報告】
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