(57)【要約】  プロテイナーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片の定量化のためのバイオアッセイが、サンプルを、前記ネオエピトープに特異的に結合する抗体と接触させるステップと、結合のレベルを決定するステップとを含む。検出され得るチチンの部分配列として：    【表１】2014526042.tif 000017が挙げられる。
2014526042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイナーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片の定量化のためのバイオアッセイ方法であって、前記ペプチド断片を含むサンプルを、前記ネオエピトープに対して特異的結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの、前記サンプル中のペプチド断片に対する結合のレベルを決定するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記免疫学的結合パートナーが、前記チチンタンパク質のＣ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対して特異的結合親和性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫学的結合パートナーが、前記チチンタンパク質のＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対して特異的結合親和性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫学的結合パートナーが、プロテアーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成され、チチンの以下の部分配列：
【表１】
2014526042.tif 000011
のいずれか１つを示すネオエピトープを含むペプチド断片に対して特異的結合親和性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＮ末端の以下の配列：
【表２】
2014526042.tif 000012
のいずれか、またはペプチドのＣ末端の以下の配列：
【表３】
2014526042.tif 000013
に対して特異的結合親和性を有する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＣ末端の以下の配列：
【表４】
2014526042.tif 000014
に対して特異的結合親和性を有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫学的結合パートナーが、特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記方法が競合イムノアッセイとして行われ、前記免疫学的結合パートナーおよび競合薬剤が前記サンプルの存在下でインキュベートされ、前記競合薬剤が、前記サンプル中の前記ペプチド断片と競合して前記免疫学的結合パートナーに結合する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記競合薬剤が、前記ネオエピトープを示すような、合成ペプチドである、または前記エピトープが由来する前記タンパク質の切断によって形成される精製された天然のペプチドである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、尿、血清、血液、血漿または唾液のサンプルである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが患者由来のサンプルであり、前記方法が、前記ペプチド断片の決定された前記結合のレベルと、（ａ）比較可能な健康個体および／または（ｂ）病的な心臓状態に特徴的な値とを比較するステップをさらに含む請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
チチンタンパク質のプロテイナーゼ切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープに対する免疫学的結合パートナー。
【請求項１３】
アミノ酸配列のＮ末端：
【表５】
2014526042.tif 000015
のいずれか、またはアミノ酸配列のＣ末端：
【表６】
2014526042.tif 000016
と特異的に免疫反応性である請求項１１に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１４】
モノクローナル抗体またはその結合断片である請求項１２または請求項１３に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１５】
請求項１４に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
【請求項１６】
請求項４に記載の前記タンパク質の前記部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドに対する免疫応答をもたらすための、担体にハプテンとしてコンジュゲートされている、または、イムノアッセイで使用するための、固体表面に固定されるか、もしくは検出可能なマーカーにコンジュゲートされている請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
請求項４に記載の前記タンパク質の前記部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによる前記タンパク質の切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１９】
請求項４に記載の前記タンパク質の前記部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによる前記タンパク質の切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現をコードするコード配列および発現シグナルを含む核酸配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換され、前記ペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーに結合する競合薬剤と、任意選択的に、洗浄試薬、バッファー、停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、較正基準物質、抗マウス抗体、およびイムノアッセイキットを用いてアッセイを行うための使用説明書の１つ以上とを含むイムノアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管イベント（急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、冠状動脈の高石灰化および症候性非ＡＭＩが挙げられるがこれらに限られない）の評価に有用なバイオマーカーアッセイに関する。特に、本発明によれば、チチンの分解断片に関するバイオマーカーが有用であることがわかる。
【背景技術】
【０００２】
チチンは、コネクチンとしても知られ、心筋および骨格筋で発現されるサルコメアのタンパク質である。チチンは、知られている最大の哺乳動物タンパク質であり、最大３７００ｋＤａに達することがあるサイズを有する１。この主な機能および十分に説明されている機能は、心筋のストレッチ中にパッシブ型張力を回復させることによって、長い分子スプリングとして作用することである２〜４。チチンは、サルコメアにおいて共発現される２つのアイソタイプを有し、Ｎ２Ａは、２つのうちでより大きいものであり、骨格筋および心筋の双方においてみられ、アイソタイプＮ２Ｂは、より小さく、より固く、心筋においてのみみられる１、５〜７。チチンのアイソタイプの異なる剛性のために、２つのアイソタイプの間での、適応的な、または非適応的な比率の変更は、これらの対応するキナーゼ領域との相乗効果で、病理学的イベント中に、心筋収縮特性に影響を及ぼす原因となり得ると提唱されている３、５、８〜１２。アイソタイプの修飾および比率の変更は、動物モデルにおいて初めて記載されたが、臨床研究によっても、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、大動脈弁狭窄（ＡＳ）、拡張期心不全（ＤＨＦ）および虚血性心疾患（ＩＨＤ）中のアイソタイプシフトが報告されている１１、１３〜１６。チチン関連の研究の主な限界は、チチンアイソタイプレベルを検出および定量化するのに利用できる方法にあり、これらの方法は、イムノブロッティングおよびゲル電気泳動等の感度が十分でない方法、または量的ＲＴ−ＰＣＲ等の、より高い感度を実現できるが、チチンアイソタイプレベルの総量に関する情報を提供できるだけである技法のいずれかに基づいている。これらの方法は全て、組織を採集および同定する侵襲性の手段を利用するものである。感度および特異性が低いことが、これらの方法の診断バイオマーカーまたは予後バイオマーカーとしての不十分な利用に寄与するおそれがあり、かつチチンアイソタイプレベルの機能的研究との相関関係を制限するおそれがある。対照的に、本発明者らは、本発明によって、チチンの特定の分解断片の検出が、いくつかの重要な臨床的状況において優れた臨床的有用性を有するということを発見した。
【０００３】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含むいくつもの異なるプロテアーゼによって分解される。ＭＭＰに由来するタンパク質の分解では、特定の切断部位／断片が生じ、これにより今度は新しいエピトープが生産される。本発明者らは以前、ネオエピトープが、いくつかの異なる病理における不均衡なＥＣＭリモデリングのバイオマーカーとしての潜在的な有用性を有し得ること、血清、血漿および尿などの数々の生体液において測定され得ることを報告した１７〜２２。このアプローチの重要な利点は、それが、タンパク質の特有の「フィンガープリント」のタンパク質分解的切断を表し、かつ生理学および病理学の双方において、特定の組織ターンオーバーを直接的に反映する、特定のネオエピトープを測定する非侵襲性の方法であることである。
【発明の概要】
【０００４】
従って、本発明は、第１態様において、プロテイナーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片の定量化のためのバイオアッセイ方法であって、前記ペプチド断片を含むサンプルを、前記ネオエピトープに対して特異的結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの、前記サンプル中のペプチド断片に対する結合のレベルを決定するステップとを含む方法を提供する。
【０００５】
チチンタンパク質は、チチンの全アイソタイプを含み、それぞれ上述したものが挙げられる。検出されるチチン断片は、任意の哺乳動物、例えば、齧歯類（特にマウスおよびラットを含む）、イヌ、およびサルを含む霊長類に由来するサンプル中に存在してよい。しかしながら、サンプルは好ましくはヒトに由来するものである。同様に、アッセイが基礎とするチチン配列は、これらの供給源のいずれかに由来してよい。通常、検出される断片は、天然に形成され、かつ前記サンプル中に天然に存在する。
【０００６】
前記免疫学的結合パートナーは、前記チチンタンパク質のＣ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対して、または前記チチンタンパク質のＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対して、特異的結合親和性を有してよい。
【０００７】
前記免疫学的結合パートナーは、プロテアーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成され、チチンの以下の部分配列：
【表１】
2014526042.tif 000003
のいずれか１つを示すネオエピトープを含むペプチド断片に対して特異的結合親和性を有してよい。
【０００８】
前記免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端の以下の配列：
【表２】
2014526042.tif 000004
のいずれか、またはペプチドのＣ末端の以下の配列：
【表３】
2014526042.tif 000005
に対して特異的結合親和性を有してよい。
【０００９】
前記免疫学的結合パートナーは好ましくは、ペプチドのＣ末端の以下の配列：ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫ↓  ’１３５４２に対して特異的結合親和性を有してよい。
【００１０】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片である。
【００１１】
前記方法は、好ましくは競合イムノアッセイとして行われ、前記免疫学的結合パートナーおよび競合薬剤が、前記サンプルの存在下でインキュベートされ、前記競合薬剤は、前記サンプル中の前記ペプチド断片と競合して前記免疫学的結合パートナーに結合する。任意選択的に、前記競合薬剤は、前記ネオエピトープを示すような、合成ペプチドであるか、前記エピトープが由来する前記タンパク質の切断によって形成される精製された天然のペプチドである。
【００１２】
前記サンプルは、好ましくは、尿、血清、血液、血漿または唾液のサンプルである。本発明には、前記サンプルが、患者に由来するサンプルであり、前記方法が、前記ペプチド断片の決定された前記結合レベルと、（ａ）比較可能な健康個体および／または（ｂ）病的な心臓状態に特徴的な値とを比較することをさらに含む方法が含まれる。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、チチンタンパク質のプロテイナーゼ切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープに対する免疫学的結合パートナーを含む。
【００１４】
前記免疫学的結合パートナーは、アミノ酸配列のＮ末端：
【表４】
2014526042.tif 000006
のいずれか、またはアミノ酸配列のＣ末端：
【表５】
2014526042.tif 000007
と特異的に免疫反応性であってよい。
【００１５】
前記免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体またはその結合断片であってよい。
【００１６】
本発明は、さらなる態様において、上述のモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、上記の前記タンパク質の前記部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによるチチンタンパク質の切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドを提供する。前記ペプチドは、前記ペプチドに対する免疫応答をもたらすための、担体にハプテンとしてコンジュゲートされてよく、または、イムノアッセイで使用するための、固体表面に固定されるか、もしくは検出可能マーカーにコンジュゲートされてよい。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、上記の前記タンパク質の前記部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによる前記タンパク質の切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。
【００１９】
なおさらなる態様において、本発明は、上記の前記タンパク質の前記部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによる前記タンパク質の切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現をコードするコード配列および発現シグナルを含む核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２０】
なおさらなる態様において、本発明は、上述したベクターで形質転換され、前記ペプチドを発現する宿主細胞を提供する。
【００２１】
なおさらなる態様において、本発明は、上述した免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーに結合する競合薬剤と、任意選択的に、洗浄試薬、バッファー、停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、較正基準物質、抗マウス抗体、およびイムノアッセイキットを用いてアッセイを行うための使用説明書の１つ以上とを含むイムノアッセイキットを提供する。
【００２２】
数々の外因性メタロプロテアーゼによるヒト組織の消化中に、多数のタンパク質分解されたペプチド産物を、質量分光測定法２３を用いて同定した。これらのうち、チチン特異的断片１２６７０’  ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫ  １２６７９’が、ＭＭＰ１２切断特異的であると同定された。プロテオーム分析により、配列はＮ２Ｂチチンアイソタイプに特有のものであり、かつヒトおよびマウスと相同であることが明らかとなった。少なくともマウスモデルでは、ＭＭＰ１２は、アテローム発生等の心血管イベントに関係しているが、関連文献においてチチン分解に影響を及ぼすと以前に説明された唯一のＭＭＰは、心臓サルコメアのＺ盤領域に位置するＭＭＰ２であり、虚血および再潅流関連イベントにおけるチチン分解に寄与している２４、２５。本発明者らの質量分光測定法に導かれた発見により、本発明者らは、ＭＭＰ１２が、関連の病理学的イベントに以前に記載されるよりも活発に関与する物質であり得ると仮定し、本発明者らは、この仮定により、質量分光測定法で同定されるチチンのＮ２ＢアイソタイプのＭＭＰ１２特異的断片が、病理学的な心血管イベントを監視するのに潜在的に有用であり得ると仮定した。
【００２３】
本発明によれば、以下のペプチド配列および切断部位が有用である。
プロテアーゼ切断部位に↓を付す
ＭＭＰ１２  １３５１９’  ↓ＧＥＹＶＣＤＣＧＴＤ  ’１３５２８
ＭＭＰ１２  １３５３２’  ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫ↓  ’１３５４２
ＭＭＰ１２  １３５４３’  ↓ＶＥＫＰＬＹＧＶＥＶ  ’１５５３
【００２４】
本発明は、添付の図面を参照する以下の実施例によってさらに記載され、説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】以下の例１において測定される、本発明のモノクローナル抗体の、標的ペプチドに対する反応性を示す図である。
【図２】例２において決定される、モノクローナル抗体の、ヒト血清および尿サンプルに対する反応性を示す図である。
【図３】例３において得られる、対照患者および心臓病に罹患している患者に由来するヒト血清におけるチチン断片含有量の測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２６】
［例１］
＜チチン断片に対するモノクローナル抗体の開発＞
実験に用いた試薬は全て、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）からの標準の高品質化学製品であった。モノクローナル抗体の産生に用いた合成ペプチドは、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａから購入した。
【００２７】
＜免疫化用ペプチドの選択＞
アッセイ用に選択したペプチドの配列を、ヒト組織に対して実施された質量分光測定法２３に基づいて選んだ。ペプチド断片は、Ｕｎｉｐｒｏｔを利用して同定した（受託番号Ｃ０ＪＹＺ２）。同定した配列の各遊離末端の最初の１０アミノ酸を、ターゲット配列とみなした。全ての関連配列を相同性について分析し、続いて、ＣＨＥＣＫ  ＸＸ  ＮＰＳ＠：ｎｅｔｗｏｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ２８を用いて相同性についてｂｌａｓｔ検索した。アミノ酸位置１２６７０’と１２６７９’（チチン）との間に位置する配列ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫを、免疫原として選択した。配列は、ＵｎｉｐｒｏｔおよびＰＢＩＬ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓによって、ヒトチチンおよびマウスチチンに特有であると同定された。選択した配列はまた、選択的スプライシングによって生産された８つのチチンアイソタイプ中、６つに存在することもわかった。これらは、アイソタイプ３（ｓｍａｌｌ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎ２−Ｂ）、７（ｃａｒｄｉａｃ  ｎｏｖｅｘ−２）および８（ｃａｒｄｉａｃ  ｎｏｖｅｘ−１）（心筋に存在することが知られている）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＷＺ４２−３、Ｑ８ＷＺ４２−７およびＱ８ＷＺ４２−８）、ならびにアイソタイプ２、４および５（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＷＺ４２−２、Ｑ８ＷＺ４２−４およびＱ８ＷＺ４２−５）であった２６、２７。
【００２８】
＜免疫化手順＞
４から６週齢の６匹のＢａｌｂ／Ｃマウスに、フロインド不完全アジュバント（ＫＬＨ−ＣＧＧ−ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫ配列番号７）を用いて２００μＬの乳化された抗原（免疫化１回につき５０μｇ）をその腹部に皮下接種によって免疫化した。安定した力価レベルが得られるまで、免疫化を２週間隔で実行した。各採血時に、血清抗体力価を測定し、抗体力価が最も高く、かつ血清および尿に対する反応性が最も良かったマウスを、融合用に選択した。選択したマウスは、細胞融合のために脾臓を外科的摘出する３日前に、０．９％塩化ナトリウム溶液１００μＬ中の５０μｇの免疫原を用いて静注によりブーストした。
【００２９】
＜融合および抗体スクリーニング＞
融合手順は、他の文献で説明されている２９。簡潔に言うと、マウス脾細胞を、ＳＰ２／０ミエローマ融合パートナー細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、限界希釈法を用いてクローン化し、９６ウェルマイクロタイタプレート内に移してさらに増殖させた。標準的な限界希釈を用いてモノクローナル増殖を促進した。間接ＥＬＩＳＡを用いて上清をスクリーニングし、ビオチン化したペプチドＢｉｏｔｉｎ−ＣＧＧ−ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫを、ストレプトアビジンコーティングしたマイクロタイタプレート上の捕捉ペプチドとして用いた。
【００３０】
＜クローンの特性評価＞
ヒトの血清、血漿および尿における、モノクローナル抗体の本来の反応性およびペプチド結合を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタプレート上の１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ペプチドコーター、および増殖モノクローナルハイブリドーマ由来の上清を用いた予備的ＥＬＩＳＡを使用して評価した。クローン特異性を、遊離ペプチド（ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫ）およびナンセンスペプチドに対して試験した。モノクローナル抗体のアイソタイプ化を、Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰキット（ｃａｔ．５３００−０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ））を用いて実行した。メーカの使用説明書に従って、選択したクローンを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムを用いて精製し、透析した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）。
【００３１】
図１において、標的配列ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫに対するモノクローナル抗体の反応性（円、破線）を、脱選択（ｄｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（かつＣ末端伸長）配列ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫＶ（四角、実線）と比較する。データから明らかに、標的配列ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫに対する反応性が強く、伸長ペプチドに対しては結合が検出されないことが示される。これらのデータから、遊離Ｃ末端リジン残基を有する配列との強い結合親和性、すなわち、モノクローナル抗体のネオエピトープ特異性が確認されることが示唆される。
【００３２】
［例２］
＜ＭＭＰ１２チチンアッセイプロトコール＞
以下の競合的ＥＬＩＳＡプロトコールを最適化して、ＭＭＰ１２チチンモノクローナル抗体に使用した。選択したモノクローナル抗体を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）抗体標識キット（Ｉｎｎｏｖａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）をメーカの使用説明書に従って用いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。９６ウェルストレプトアビジンプレート（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、アッセイバッファーである２５ｍＭのトリスＢＴＢ中に溶解した６．８ｎｇのビオチン化合成ペプチドＢｉｏｔｉｎ−ＣＧＧ−ＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫでコーティングし、４℃で３０分間インキュベートした。２０μＬのペプチドキャリブレータまたはサンプル、その後、１００μＬの２８０ｎｇコンジュゲートモノクローナル抗体を適当なウェルに加え、４℃で１時間インキュベートした。最後に、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ（ｃａｔ．４３８ＯＨ）、Ｔａａｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、プレートを暗所にて２０℃で１５分間インキュベートした。上述の全てのインキュベーションステップは、３００ｒｐｍでの振盪を含んだ。各インキュベーションステップの後、プレートを洗浄バッファー（２０ｍＭ  トリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２）中で５回洗浄した。ＴＭＢ反応は、１００μＬの停止溶液（１％  ＨＣｌ）を加えることによって停止させ、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍにて測定した。較正曲線を、４パラメトリック数学適合モデルを用いて、２倍に希釈した後の標準ペプチドについて２００ｎｇの出発濃度としてプロットした。
【００３３】
図２において、ヒト血清中に存在するチチン断片に対する反応性を示す。ＡＭＩを有する個体から得たヒト血清サンプルを２倍に希釈して、上述したＭＭＰ１２チチンＥｌｉｓａにおいてインキュベートした。ヒト血清で得られる曲線と標準曲線との類似性から、モノクローナル抗体の親和性は、合成ペプチドＮＶＴＶＥＡＲＬＩＫ、およびヒト血清中に存在する断片と類似していることが示唆される。
【００３４】
［例３］
＜心血管イベントを有する対象由来の血清サンプルの、ＭＭＰ１２チチンＥＬＩＳＡにおける評価＞
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、冠状動脈の高石灰化、および症候性非ＡＭＩとそれぞれ診断された対象に由来する血清を、ＭＭＰ１２チチンＥＬＩＳＡにおいて試験し、健康な対照と比較した（図３）。
【００３５】
マーカーの統計的に有意な増大が、３つの全ての患者群について測定された。対照の平均レベルは、１１６．６ｎｇ／ｍｌであると測定された。ＭＭＰ１２チチンレベルは、調査した全ての患者群において上昇し、ＡＭＩ患者の平均値は１３７．９ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）であり、冠状動脈の高石灰化患者では１４０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）であり、虚血性心疾患では１５０．６ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）であった（図３）。
【００３６】
ＥＣＭ分解由来のタンパク質断片からなる生化学的マーカーが、疾患の症状および進行の情報を示すことができ、このことは診断および予後の目的のために有用である可能性がある。これらのマーカーは潜在的に、治療介入戦略がもたらす変化を検出し得、かつ薬効の代理マーカーとして役立ち得る３０。
【００３７】
本明細書中では、別段に明示的に示されない限り、語「または」は、述べられている条件の一方または双方が満たされる場合に、真の値を返す演算子の意味で用いられるものであり、条件の１つだけが満たされることを要求する演算子「排他的なまたは（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｒ）」とは対照的である。語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で用いられ、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するわけではない。上で認めた全ての先行する教示は、参照することによって本明細書の一部をなすものとする。公開されている任意の先行文献の本明細書中での承認は、その教示が、豪州その他において、出願当時、共通の一般的知識であったという自認または表明であるととられるべきでない。
【００３８】
［文献リスト］
【表６Ａ】
2014526042.tif 000008
【表６Ｂ】
2014526042.tif 000009
【表６Ｃ】
2014526042.tif 000010
【図１】
2014526042.tif 000018
【図２】
2014526042.tif 000019
【図３】
2014526042.tif 000020
【配列表】
2014526042000001.app
【国際調査報告】
2014526042.tif 000021
2014526042.tif 000022