(57)【要約】。【課題】エフェクタ機能が低下したＦｃ変異株【解決手段】本発明は変異株が親ポリペプチドに比べてタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下したＦｃ領域を有する親ポリペプチドの変異株の生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異株の生産方法であって、上記変異株は親ポリペプチドにと比べてタンパクＣ１ｑおよび／または少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下しており、下記(i)〜(iii) の中から選択されるアミノ酸変異を親ポリペプチドのＦｃ領域に導入することを特徴とする方法（Ｆｃ領域のアミノ酸の番号はＥＵ指数に従う数え方、Kabatでの相当法である）：
(i)  ２９４Ｄｅｌ  (このアミノ酸変更294delは親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である)、
(ii) ２９３Ｄｅｌ、
(iii) ２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ。
【請求項２】
上記のアミノ酸変更２９３Ｄｅｌが親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記のアミノ酸変更ｄｅｌ２９３／ｄｅｌ２９４が親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
親ポリペプチドのＦｃ領域が、SEQ ID NO 1のＦｃ領域、SEQ ID NO 2のＦｃ領域、 SEQ ID NO 3のＦｃ領域、SEQ ID NO 4のＦｃ領域およびその断片から成る群の中から選択されるＩｇＧ Ｆｃ領域である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
親ポリペプチドのＦｃ領域が、４３４Ｙ、３７８Ｖ、２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙおよび２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙから選択されるアミノ酸変更を有する野生型ＩｇＧＦｃ領域の変異株である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
変異株をFc融合タンパク、Ｆｃコンジュゲートおよび抗体から成る群の中から選択する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記アミノ酸変更を親ポリペプチドのＦｃ領域に導入する段階が下記（i）〜（iii）を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
(i) 親ポリペプチドをコードする核酸を用意する段階、
(ii) 段階(i)で用意した核酸を改質して上記変異株をコードする核酸を作る段階、
(iii) 段階(ii)で得られた核酸を宿主細胞で発現させて上記変異株を回収する。
【請求項８】
Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異株であって、この変異株は請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法で得られ、親ポリペプチドに比べてタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下している変異株。
【請求項９】
上記変異株が、膜レセプタ、ヒト可溶性タンパク、トキシン、ウイルス、細菌および真菌タンパクから成る群の中から選択される標的分子に対する中和抗体である請求項８に記載の変異株。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の変異株をコードする単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１０の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ  応答の誘導が望ましくない病的状態の予防または治療に使用される親ポリペプチドの変異株であって、この変異株はタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が親ポリペプチドより低く且つそのＦｃ領域内にその親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した時に２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから選択されるアミノ酸の変更を含む（ただし、親ポリペプチドの変異株は２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙまたは２９３Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ変異株ではない）ことを特徴とする変異株（Ｆｃ領域のアミノ酸の番号はＥＵ指数に従う数え方またはKabat相当である）
【請求項１４】
請求項８、９または１３に記載の変異株を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフェクタ活性を低下させたＦｃ変異株の調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
種々の病的状態、例えば癌、自己免疫性疾患、移植拒絶反応や感染症の治療で抗体を用いた治療方法が使用されることが増えている。2010年には３７種以上の抗体および誘導タンパクが臨床用途で承認され、1,137種以上が臨床開発中である。この1,137種の７１％が完全ＩｇＧであった。その大部分（９１％）はＩｇＧからのＦｃ領域を含み、モノクローナル完全長抗体(mAbs)またはイムノアドヘシンともよばれる融合タンパクに対応する（非特許文献１：Thompson Pharma August 2010）。
【０００３】
種々の研究から、抗体のエフェクタ機能は免疫療法の効率、特に標的細胞の破壊が求められる癌の治療効率に極めて重要であることが分かっている。標的細胞を根絶することができるエフェクタ機能の大部分は抗体依存細胞介在細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）（ＡＤＣＣ）、補体依存細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity）（ＣＤＣ）および抗体依存細胞介在食作用（antibody-dependent cellular phagocytosis ）（ＡＤＣＰ）を含む。ＣＤＣは主としてＦｃ領域と第１補体成分Ｃ１ｑ との直接結合（バイン遺伝子）によってトリガーされ、ＡＤＣＰおよびＡＤＣＣはＦｃ領域とＦｃガンマーレセプタ(FcγR)との結合によってトリガーされる。さらに、抗体のＦｃ領域は新生Ｆｃレセプタ（ＦｃＲｎ）との相互作用による血清持続性に関与する。従って、過去10年間にわたって非常に多くの研究はＡＤＣＣおよびＣＤＣ応答を誘導し且つＦｃＲｎに対する親和性の改善によってその血清半減期を増やす抗体能力の向上に焦点を合わせたものである。
【０００４】
しかし、ある特定状態の治療には治療効果を発揮するのにＡＤＣＣ，ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰの誘導を必要としない。あるケース、例えば進行中の移植拒絶反応を抗ＣＤ３モノクローナル抗体オルソクローンＯＫＴ３で治療するケースのように、副作用を減らし且つＩｇＧ細胞毒性を防ぐために、上記の誘導は避けなければならない。オルソクローンＯＫＴ３の投与は、オルソクローンＯＫＴ３をＦｃγレセプタに結合した結果である炎症誘発性サイトカインの全長性大量放出を誘導することが示されている。さらに、ＦｃγＲの活性化は治療、例えばＥＧＦＲ標的抗体、セツキシマブに関する治療に悪影響がある可能性があることもわかっっている。この悪影響は発癌促進Ｍ２マクロファージを活性化し、患者の無進行生存を低下させることを示唆している（非特許文献２：Pander J. et al., 2011）。
【０００５】
一般に、内因性または感染性の標的に対する遮断剤または中和剤として、または、細胞レセプタのアゴニストまたはアンタゴニストとして抗体またはイムノアドヘシンのみを用いるときは、上記抗体のＦｃ領域またはイムノアドヘシンのＦｃγＲおよびＣ１ｑへの結合による免疫系の補充は、免疫療法の治療効率にとって重要ではない上に、避けなければならない。
【０００６】
この点において、４つのヒトＩｇＧサブクラスは互いに異なるエフェクタ機能を示すことがわかっている。すなわち、ＩｇＧ１およびｌｇＧ３はＡＤＣＣとＣＤＣ活性の両方をトリガーし、ｌｇＧ２はＣＤＣ活性を誘発するが、ＡＤＣＣ活性は誘発せず、ｌｇＧ４はＣ１ｑおよびＦｃガンマーレセプタに対する親和性が低いために補体および細胞の活性化を誘導する能力は極めて低い。従って、ｌｇＧ４は宿主エフェクタ機能の補充が望ましくない免疫療法に好ましいサブクラスになった。ｌｇＧ４抗体の中和は特定状態の治療で既に承認されている。例えば、ナタリズマブは多発性硬化症の治療での抗ｃｃ４インテグリンｍＡｂである。このような事実にもかかわらず、そのインビボ不安定性および動態のために、免疫療法でのｌｇＧ４の使用に関しては依然として消極的である。
【０００７】
変形例ではｌｇＧ４Ｆｃ変異株がアミノ酸変更を有するＳ２２８Ｐが考えられた。この変異は重鎖ダイマー形成を安定化させ、依然として低い比率（＜８，３％）でＦａｂアーム交換できることが示された（非特許文献３：Labrijn et al., Nature Biotech, 2009, 27, 767-771）。低エフェクタ活性および改善された薬理学的特性を有する新規な治療的ｍＡｂｓを産生するためにＩｇＧハイブリッドも設計された（非特許文献４：Reddy et al., The journal of Immunology, 2000, 164, 1925-1933）。
【０００８】
アレキシオン ファーマスーティカル(Alexion Pharmaceuticals)社はエクリズマブとよばれる補体成分Ｃ５に対するヒト化ｌｇＧ２／４カッパ抗体を開発した。エクリズマブの重鎖は定常部１（ＣＨ１）におけるヒトｌｇＧ２配列、定常部２（ＣＨ２）のヒンジおよび隣接部およびＣＨ２の残部および定常部３（ＣＨ３）におけるヒトｌｇＧ４配列から成る。エクリズマブは欧州医薬品庁によって発作性夜間ヘモグロビン尿症および溶血性尿毒症症候群の治療用として承認されている。
【０００９】
ｌｇＧ２とｌｇＧ４の間の構造の違いに基づいて、Ａｎ達はｌｇＧ４からの４つのアミノ酸（すなわち268Q/309L/330S/331S）をｌｇＧ２主鎖における対応位置に導入することによって変更されたエフェクタ機能を有するｌｇＧ２変異株を考えた。得られたＩｇＧは、Ｃ１ｑ，ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲｌｌｌａに対する検出可能な結合性を全く示さず且つＦｃγＲｌｌｂ／ｃに対する不十分な親和性を示し、一方で、依然として野生型ｌｇＧ２と同様な血清半減期を有している（非特許文献５：An et ai, mAbs, 2009,1 :6,572-579）。
【００１０】
さらに、ＩｇＧ１のＦｃ領域における種々の部位特異的突然変異およびランダムな突然変異を生成するの研究によって、ＩｇＧ１のＣ１ｑへの結合性に関与する重要なアミノ酸が同定され、種々のＡＤＣＣ促進レセプタが見出された（非特許文献６：Strohl, Current opinion in Biotechnol, 2009, 20, 685-691参照）。低ヒンジ領域におけるアミノ酸、特に、位置２３４および２３５のロイシン残基はＣ１ｑ，ＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩの両方に対するＩｇＧ１Ｆｃ領域の親和性にとって重要であることが示された。決定位置もＣＨ２領域で発見された。例えばアミノ酸位置３２７、３３０および３３１。このアミノ酸位置の突然変異はＡＤＣＣとＣＤＣ応答の両方を誘導する能力を大幅に低下させる。
【００１１】
Ｘｕ達はヒトＩｇＧ１ベースのＯＫＴ３抗体における突然変異２３４Ａ／２３５Ａの導入によって、ＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩおよびＣ１ｑに対する結合性が大幅に低下することを示した。これらＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩおよびＣ１ｑは未変更のＯＫＴ３抗体で観察されたサイトカイン放出症候群を阻止し、進行中の移植拒絶反応を食い止める能力を維持する（非特許文献７：Xu et al., Cell Immunol, 2000, 1 :16-26）。
【００１２】
Hezareh達は抗ＨＩＶ−１ＩｇＧ１変異株が突然変異２３４Ａ／２３５Ａを含む場合にエフェクタ分子に対する親和性に関して上記と同じ観察結果を得ている（非特許文献８：Hezareh et al., Journal of virology, 2001 , 12161 -1 2168）。
【００１３】
同様に、Oganesyan達は、三重変異体２３４Ｆ／２３５Ｅ／３３１Ｓを抗−ＣＤ１９ＩｇＧ１に導入することによって、複数のエフェクタ分子、すなわちＦｃγＲＩ，ＦｃγＲｌｌａおよびＦｃγＲＩＩＩおよびＣ１ｑに対する結合性が完全に失われたことを報告している（非特許文献９：Oganesyan et al. Acta cryst., 2008, D64, 700-704）
【００１４】
同様に、InvivoGen社は、突然変異体２３３Ｐ／２３４Ｖ／２３５Ａ／２３６Ｄｅｌ／３２７Ｇ／３３０Ｓ／３３１Ｓを含む遺伝子操作ＩｇＧ１Ｆｃ変異株をコードするプラスミドを販売した。このような突然変異体はＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導するＩｇＧ１ Fc変異株の能力を劇的に低下させる。
【００１５】
上記の全ての発明はこれらの位置で予期しない残基によるヒトアミノ酸の置換を示唆し、これらのヒトアミノ酸を患者に投与されるｍＡｂ中で使用したときに免疫応答を生じる可能性がある。
【００１６】
さらに、Ｆｃ領域の位置２９７でのアスパラギン上のグリコシル化が、モノクローナル抗体のＦｃγＲに結合し、ＡＤＣＣをトリガーする能力に対する直接的影響を有することが示されている（非特許文献１０：Abes et al., Pharmaceuticals, 2010, 3, 146-157参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Thompson Pharma August 2010
【非特許文献２】Pander J. et al., 2011
【非特許文献３】Labrijn et al., Nature Biotech, 2009, 27, 767-771
【非特許文献４】Reddy et al., The journal of Immunology, 2000, 164, 1925-1933
【非特許文献５】An et ai, mAbs, 2009,1 :6,572-579
【非特許文献６】Strohl, Current opinion in Biotechnol, 2009, 20, 685-691
【非特許文献７】Xu et al., Cell Immunol, 2000, 1 :16-26
【非特許文献８】Hezareh et al., Journal of virology, 2001 , 12161 -1 2168
【非特許文献９】Oganesyan et al. Acta cryst., 2008, D64, 700-704
【非特許文献１０】Abes et al., Pharmaceuticals, 2010, 3, 146-157
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記の従来技術にはＡＤＣＣおよびＣＤＣに対する低活性を示すＦｃ変異株が記載されてはいるが、Ｃ１ｑおよびＦｃガンマレセプタに対する親和性を低下させた新規なＦｃ変異株の調製方法に対するニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異株の生産方法であって、その変異株は親ポリペプチドと比べてタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下し、２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから成る群の中から選択されるアミノ酸の変異を親ポリペプチドのＦｃ領域に導入することを特徴とする方法に関するものである（ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の番号はＥＵインデックスに従う数え方またはKabatでの相当物（Kabat numbering）である）。
【００２０】
本発明の他の対象は、Ｆｃ領域を含む親ポリペプチドの変異株であって、親ポリペプチドと比べてタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下し、且つ、親ポリペプチドのＦｃ領域と比べてＦｃ領域内に２９４Ｄｅｌ，２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌの中から選択されるアミノ酸変更を含む変異株にある（ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の番号はＥＵインデックスに従う数え方またはKabatでの相当物である）。
【００２１】
本発明のさらに他の目的は、上記変異株を含む医薬組成物、および、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答の誘導が望ましくない病的状態の予防または治療での上記変異株の使用にある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】は天然ヒトＩｇＧ１配列の位置２１６−４４７（ＥＵインデックスに従う）とヒトｌｇＧ２ (SEQ I D NO:7)、ヒトｌｇＧ３ (SEQ I D NO:8)およびヒトｌｇＧ４ (SEQ I D NO:9)の対応配列との整合性（アランメント）を示す図。ＩｇＧ１配列はＧ１ｍ１，１７アロタイプ(SEQ I D NO:5)およびＧ１ｍ３アロタイプ(SEQ I D NO:6)である。ＩｇＧ１の「低部ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」領域は位置２２６から開始する（矢印参照）。
【図２】はヒトＩｇＧ１重鎖(Fc226, SEQ No 1 )に由来するアミノ酸残基２２６−４４７(ＥＵインデックス)をコードするヒトＦｃ遺伝子が２つの制限サイトBamHIおよびEcoRI制限の間にクローンされたプラスミドベクターpMGM05-R603を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ａ．定義
以下、本発明をより完全に理解できるようにするために、いくつかの定義をする。以下の定義は文法的に均等なものを含む。
本明細書および特許請求の範囲でＦｃ領域の残基の番号付けは非特許文献１１（Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.、1991）に記載のKabat et al.,のＥＵインデックスに従った免疫グロブリン重鎖の数え方である。非特許文献１１の内容は本明細書の一部を成す。「ＥＵインデックス（指数）」または「相当Kabat」とはヒトＩｇＧ1 ＥＵ抗体の残基の数え方である。
【非特許文献１１】Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.、1991
【００２４】
「ポリペプチド」または「タンパク」とは、少なくとも２つの共有結合で結合されたアミノ酸を意味し、タンパク、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。
「アミノ酸」とは特定の定義された位置に存在する２０の天然または類似の非天然のアミノ酸を意味する。
【００２５】
「アミノ酸の変更、変異」とはポリペプチドのアミノ酸配列の変化を意味する。この「アミノ酸変更、変異」は「アミノ酸変化」ともよばれ、アミノ酸の置換、挿入および／またはポリペプチド配列の欠失を含む。「アミノ酸の置換」または「置換」とは親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸を他のアミノ酸と置換することを意味する。例えば、置換Ｎ４３４Ｓとは位置４３４でのアスパラギンがセリンと置換した変異ポリペプチド、この場合Ｆｃ変異株を意味する。「アミノ酸の挿入」または「挿入」とは親ポリペプチド配列の特定位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入Ｇ＞２３５−２３６とは位置２３５と２３６の間にグリシンを挿入することを示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは親ポリペプチド配列の特定位置のアミノ酸を取り去ることを意味する。例えば、Ｅ２９４ｄｅｌまたは２９４ｄｅｌは位置２９４でのアミノ酸（ここではグルタミン酸）の欠失を示す。アミノ酸変更は定時性突然変異または突然変異の組合せを意味する。
【００２６】
アミノ酸突然変異の組合せの場合の好ましいフォーマットは以下である：２９４Ｄｅｌ／２５９ｌ／３１５Ｄ／４３４ＹまたはＥ２９４Ｄｅｌ／Ｖ２５９ｌ／Ｎ３１５Ｄ／Ｎ４３４Ｙ。これは変異株のＦｃ領域中にその親ポリペプチドと比べて４つのアミノ酸変異（一つは位置２９４、一つは位置２５９、一つは位置３１５、一つは位置４３４）が存在することを意味する。すなわち、位置２９４のアミノ酸すなわちグルタミン酸が欠失し、親ポリペプチドの位置２５９のアミノ酸すなわちグルタミン酸がイソロイシンに置換され、親ポリペプチドの位置３１５のアミノ酸すなわちアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、親ポリペプチドの位置４３４のアミノ酸すなわちアスパラギンがチロシンに置換されることを意味する。同様に、アミノ酸変更２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌとはポリペプチド親と比べて位置２９３および２９４のアミノ酸が欠失をしていることを意味する。
【００２７】
「抗体」という用語はここで最も広い意味で使われる。「抗体」は少なくとも(i) Ｆｃ領域および(ii) 免疫グロブリンの可変部に由来する結合ポリペプチド領域を含む任意のポリペプチドを意味する。この結合ポリペプチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗原に特異的に結合できる。免疫グロブリンの可変部から生じる結合ポリペプチド領域は一つ以上のＣＤＲを有する。抗体には完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多くの特異抗体、少なくとも一つの可変部を有するＦｃ-融合タンパク、合成抗体(ここでは「ミメティック抗体」ともいう)、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体−融合タンパク、抗体複合体および各々の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
「完全長の抗体」または「免疫グロブリン」とは抗体の天然の生物構造を構成する構造を意味し、変数領域および定常領域を含む。「完全長の抗体」はモノクローナル完全長抗体、野性型完全長抗体、キメラの完全長抗体、ヒト化完全長抗体を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
ヒトおよびハツカネズミを含む大部分の哺乳類では、完全長の抗体の構造は一般にテトラマである。このテトラマは２つの全く同じ一組のポリペプチド鎖から成り、その1つの「軽」鎖（一般に約25kDaの分子量を有する）であり、その1つは「重」鎖（一般に約50-70kDaの分子量を有する）である。いくらかの哺乳類、例えばラクダおよびラマでは、完全長の抗体が２つの重鎖だけから成り、各重鎖はＦｃ領域に付いた変数領域から成る。
【００３０】
各連鎖のアミノ末端部分は主として抗原認識に関与する少なくとも約100〜110のアミノ酸の可変部を含む。可変部では3つの輪状構造が重鎖および軽鎖の各々のＶ領域と集まり、抗原結合部位を形成する。輪状構造の各々をコンプレメンタリティ-決定領域（以下に「ＣＤＲ」）という。ここでのアミノ酸配列の変異が最も重大である。
【００３１】
各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクタ機能に関与する定常部を定義する。
【００３２】
ヒト免疫グロブリンの場合、軽鎖はカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、αまたはエプシロンに分類され、それぞれＩＭ、ＩＤ、ＩｇＧ、ＩＡおよびＩＥとして抗体のアイソタイプを定義する。
【００３３】
「ＩｇＧ」は認識された免疫グロブリン・ガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトではＩｇＧはサブクラスまたはアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から成る。ハツカネズミではＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３から成る。完全長のＩｇＧはテトラマで、２対の全く同じ２つの免疫グロブリン鎖から成り、１つの軽鎖と１つの重鎖とを有する各一組から成り、各軽鎖は免疫グロブリン・領域ＶＬおよびＣＬから成り、各重鎖は免疫グロブリン領域ＶＨ、Ｃγ１（ＣＨ１とも呼ばれる）、Ｃγ２（ＣＨ２とも呼ばれる）およびＣγ３（ＣＨ３とも呼ばれる）から成る。ヒトＩｇＧ１では、「ＣＨ１」は位置１１８−２１５、ＣＨ２領域は位置２３１−３４０、ＣＨ３領域は位置３４１−４４７にある（ＥＵインデックスに従う）か、またはそれぞれ１１４−２２３、２４４−３６０および３６１−４７８（Kabatの数え方に従う）にある。ＩｇＧ１も位置２１６−２３０（ＥＵインデックスに従う）または２２６−２４３（Kabat）と称するヒンジ領域にある。
【００３４】
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは第1定常免疫グロブリン領域を除く抗体の定常部から成るポリペプチドを意味する。従って、ＦｃはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧの最後の２つの定常部の免疫グロブリン領域、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常部の免疫グロブリン領域、これら領域への可撓性ヒンジＮ末端を意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含むことができる。ＩｇＧの場合、Ｆｃは免疫グロブリン領域ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ２とＣＨ３の間の低部ヒンジ領域を含む。換言すれば、ＩｇＧ１のＦｃ領域は「低部ヒンジＣＨ２−ＣＨ３」領域、すなわちアミノ酸Ｃ２２６からカルボキシル末端までの領域から成る（ここで、数え方はＥＵインデックスまたはKabatでの同等物に従う）。他のＩｇＧサブクラスの類似領域はヒトＩｇＧ１のそれとＩｇＧサブクラスの重鎖または重鎖断片のアミノ酸配列のアラインメントで決定できる。
【００３５】
「Ｆｃポリペプチド」とはＦｃ領域の全部または一部のポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドには抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、Ｆｃ-共役およびＦｃ断片を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
「親ポリペプチド」または「ペアレントポリペプチド」とは変異株を発生するために修正される未変更のポリペプチドを意味する。このポリペプチドは単一ポリペプチド鎖または共有結合ではなく一緒にリンクした複数のポリペプチド鎖から成ることができる。親ポリペプチドは天然由来のポリペプチド（野生型ポリペプチド）、天然由来のポリペプチドの変異株または遺伝子操作物または合成ポリペプチドにすることができる。天然由来のポリペプチドの変異株または遺伝子操作物は天然由来の遺伝子によってコードされないポリペプチドである。例えば、遺伝子操作ポリペプチドはキメラ抗体またはヒト化抗体にできる。
【００３７】
親ポリペプチドはそれをコードするポリペプチド自体またはアミノ酸配列を表すこともできる。本発明での親ポリペプチドはＦｃ領域が野生型Ｆｃ領域、その断片およびそのミュータントから成る群の中から選択される。従って、親ポリペプチドは野生型Ｆｃ領域と比べてそのＦｃ領域中に既存のアミノ酸突然変異（すなわちＦｃミュータント）を含むことができる。親ポリペプチドは抗体、免疫グロブリン、Ｆｃ融合ポリペプチド、Ｆｃ共役であるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
「変異株ポリペプチド」、「ポリペプチド変異株」または「変異株」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親ポリペプチド配列とは異なるポリペプチド配列を有するものを意味する。
【００３９】
「野生型またはＷＴ」とは天然のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子の（allelic）変異を含む。ＷＴタンパク、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧ、その他は突然変異生成のような分子生物学的手法によって修正されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。例えば、「野生型Ｆｃ領域」としては、ＩｇＧ１のＦｃ領域（SEQ ID：NO1）、ＩｇＧ2のＦｃ領域（SEQ ID：NO2）、ＩｇＧ３のＦｃ領域（SEQ ID：NO3）およびＩｇＧ４のＦｃ領域（SEQ ID：NO4）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「Ｆｃレセプタ」または「ＦｃＲ」という用語はＦｃ領域（例えば抗体のＦｃ領域）に結合するレセプタを表すのに用いられる。
「Ｆｃガンマレセプタ」、「Ｆｃγレセプタ」または「ＦｃγＲｓ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を結合するヒトレセプタを意味する。本明細書のＦｃγＲｓは対立遺伝子の（allelic）変異株を含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）サブクラスまたこれらのレセプタのスプライスされた形態のものを含む。
【００４１】
これらのＦｃγＲｓはさらに、免疫機能を誘発または抑制するので活性化レセプタ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲｌｌａ／ｃ、ＦｃγＲｌｌｌａ／ｂ）または抑制性レセプタ（ＦｃγＲｌｌｂ）として定義される。
ＦｃγＲＩファミリは３つの遺伝子（ＦＣＧＲＩＡ、ＦＣＧＲＩＢおよびＦＣＧＲＩＣ）から成るが、ＦＣＧＲＩＡの産物のみが完全長の表面レセプタとして同定されている。この産物、すなわちＦｃγＲＩは樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、さらに活性化好中球によって発現する。
【００４２】
ＦｃγＲＩＩファミリは、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲｌｌｂおよびＦｃγＲｌｌｃタンパクをコードする３つの遺伝子（ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２ＢおよびＦＣＧＲ２Ｃ）から成る。ＦｃγＲｌｌａは単球、ある樹状細胞および好中球で発現する。ＦｃγＲｌｌｃはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現する。ＦｃγＲｌｌｂはで広く発現されたＦｃγＲである。ＦｃγＲｌｌｂはＮＫ細胞およびＴ細胞を除く全ての白血球に実質的に存在する。
【００４３】
ＦｃγＲＩＩＩは、ＦｃγＲｌｌｌａおよびｃγＲｌｌｌｂをコードする２つの遺伝子ＦＣＧＲ３ＡおよびＦＣＧＲ３Ｂから成る。ＦｃγＲｌｌｌａタンパクは、単球、組織特異性マクロファージ、樹状細胞、δ／γΤ細胞およびナチュラルキラー細胞で膜貫通タンパクとして発現する。ＦｃγＲｌｌｌｂは好中球および好塩基球の表面で発現したＧＰＩアンカー型レセプタである。
【００４４】
ＦｃγＲｌｌａをコードする遺伝子の２つの対立遺伝子は、位置１３１で２つの変異株（低応答ＦｃγＲｌｌａＲ１３１および高応答ＦｃγＲｌｌａＨ１３１）を産生する。同様に、ＦｃγＲｌｌｌａをコードする遺伝子の２つの対立遺伝子は位置１５８で２つの変異株（低応答ＦｃγＲｌｌｌａＦ１５８および高応答ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８）を産生する。
【００４５】
抗体依存細胞毒性の重要な媒介物と考えられているＮＫ細胞は、ＦｃγＲｌｌｌａおよびＦｃγＲｌｌｃのみを発現し、他のＦｃγＲｓ、特に抑制性ＦｃγＲｌｌｂはどれも発現しないことは注目に値する。
各ＦｃγＲタンパクはＩｇＧサブクラスに対して優先的に結合する特異的リガンドおよびＩｇＧサブクラスに対して明白な親和性を有する。
【００４６】
ＦｃγＲｓの活性化は、種々の免疫応答、例えば食作用、呼吸バースト、および、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるサイトカイン産生（ＴＮＦ−ａ，ＩＬ−６）、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）および、好中球およびＮＫ細胞による脱顆粒をトリガーする。ＦｃγＲｓの活性化はさらに、免疫複合体のクリアランスにおいて重要な役割を果たす。一方で、抑制性レセプタＦｃγＲｌｌｂはＢ−細胞ホメオスタシスにおいて重要な調節要素である。これは細胞活性化の閾値および程度を管理する。
【００４７】
本明細書の「抗体依存細胞介在細胞毒性」またはＡＤＣＣとは、免疫系のエフェクタ細胞が、特異抗体によって結合されている標的細胞を能動的に溶解する細胞性免疫の機構を意味する。ＡＤＣＣは大抵の場合、ＮＫ細胞とその他の免疫細胞、例えば好中球および好酸球によって介在される。一般に、ＡＤＣＣはＮＫ細胞の活性化で生じる。ＮＫ細胞の活性化は、そのＦｃレセプタを、標的細胞の表面に存在する抗原に結合したＩｇＧのＦｃ領域に結合することに関与する。このような相互作用はＮＫ細胞によるサイトカインおよび細胞毒性顆粒の放出を誘導する。ＡＤＣＣを誘導する抗体の能力を評価するために非特許文献１２（de Romeuf et al. Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43）に記載のアッセイを実行できる。
【非特許文献１２】de Romeuf et al. Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43
【００４８】
本明細書のＣ１ｑは、分子量が460,000 kDaで、６つのコラーゲンの「茎」が６つの球状頭部領域に結合したチューリップの花束にたとえられる構造を有する約六価の分子である。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと一緒に形成し、複合体Ｃ１は補体カスケード経路の第１成分である。
【００４９】
「補体依存細胞毒性」またはＣＤＣとは補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的補体経路の活性化は、同種抗原に結合した抗体にＣ１ｑを結合することによってイニシエートする。補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑはＩｇＧ１、ｌｇＧ２またはｌｇＧ３の少なくとも２つの分子に結合しなければならないが、ＩｇＭの分子は一つだけである。抗体がＣＤＣを誘導する能力を評価するために、非特許文献１３（Romeuf et al., Br J Haematol. 2008 Mar;140(6) :635-43）に記載のアッセイを実行できる。
【非特許文献１３】Romeuf et al., Br J Haematol. 2008 Mar;140(6) :635-43
【００５０】
Ｆｃガンマレセプタおよびその機能は非特許文献１４（Nimmerjahn and Ravetch, Nature reviews Immunology, 2008, 8, 34-47）に説明されている。
【非特許文献１４】Nimmerjahn and Ravetch, Nature reviews Immunology, 2008, 8, 34-47
【００５１】
Ｃ１ｑおよびその機能は例えば非特許文献１５（Kishore et al., Immunopharmacology, 2000, 49:1 59-1 70）および非特許文献１６（Sjoberg et al. Trends Immunol. 2009 30(2) :83-90）に説明されている。
【非特許文献１５】Kishore et al., Immunopharmacology, 2000, 49:1 59-1 70
【非特許文献１６】Sjoberg et al. Trends Immunol. 2009 30(2) :83-90
【００５２】
「ＦｃＲｎ」または「新生Ｆｃレセプター」はＩｇＧ抗体Ｆｃ領域を結合し、少なくともＦＣＲＮ遺伝子によっ、部分的にコードされるタンパクを意味する。ＦｃＲｎはヒト、ハツカネズミ、ラット、ウサギおよびサルを含む任意のものからのものにすることができる。公知のように、機能性ＦｃＲｎタンパクは２つのポリペプチド、大抵は重鎖および軽鎖から成る。軽鎖はβ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はＦＣＲＮ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパクはβ-2ミクログロブリンを有するα鎖の錯体を言う。ヒトではＦｃＲｎをコードする遺伝子はＦＣＧＲＴと呼ばれる。FcRnは母親から新生児への受動液性免疫の伝達に関与し、且つＩｇＧのクリアランスの管理にも関与する。
【００５３】
ＦｃＲｎおよびその機能は例えば非特許文献１７（Roopenian, Nature Reviews Immunology, 2007, 7, 71 5-725）に説明されている。
【非特許文献１７】Roopenian, Nature Reviews Immunology, 2007, 7, 715-725
【００５４】
ｂ．ＦｃのＣ１ｑおよびＦｃγＲへの結合性を低下させる方法
本発明は、親ポリペプチドと比べてＣ１ｑおよび／または少なくとも一つのＦｃγレセプタに対する親和性の低下を示すＦｃ変異株の調製方法に関するものである。
【００５５】
本発明者は、野生型と遺伝子操作されたＩｇＧの両方のＦｃ領域に、単一のアミノ酸変異を導入することによって、Ｃ１ｑとＦｃγの両方で上記ＩｇＧの結合性を大幅に低下させることができることを示した。この単一の変異は位置２９４でのアミノ酸の欠失（以下、２９４Ｄｅｌという）に対応する。アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う数え方またはKabatでのその同等物である。
【００５６】
より正確には、、ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例のＩＩＩ．２．１およびＩＩＩ．２．２参照）を通じて、野生型Ｆｃ領域（すなわちSEQ ID Νー１のアミノ酸配列を有するＦｃ領域）を含むＩｇＧ１のアミノ酸配列に２９４Ｄｅｌを導入することによって得られたＩｇＧ１変異株は、結合できなかった、あるいは、対応する野生型ＩｇＧ１変異株と比べて、Ｃ１ｑタンパク、ＦｃγＲｌｌｂ（ＣＤ３２ｂともよばれる）、ＦｃγＲｌｌａ（ＣＤ３２ａともよばれる）、ＦｃγＲｌｌｌａ（ＣＤ１６ａともよばれる）およびＦｃγＲＩ（ＣＤ６４ともよばれる）への結合性が低下するということを本発明者は示した。変異２９４Ｄｅｌの導入によって野生型ＩｇＧ１と比べてＦｃＲｎに対する親和性が増加するように初期に設計されたＩｇＧ１ポリペプチド中のＣ１ｑおよびＦｃγレセプタに対する結合親和性を無効にするまたは制限することができたことは注目に値する。
【００５７】
例えば、野生型ＩｇＧ１と比べて変異２９４Ｄｅｌ／２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙを有するＩｇＧ１変異株はＣ１ｑおよびＦｃγＲレセプタの両方に結合できなかった。
【００５８】
逆に、そのＩｇＧ１親、従って変異２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙを有するＩｇＧ１親は野生型ＩｇＧ１と比べてＣ１ｑおよびＦｃγＲｌｌｌａに結合する能力が増加した。
【００５９】
変異株２９４Ｄｅｌ／２５９ｌ／３１５Ｄ／４３４Ｙと、アミノ酸変更２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙを含むその親ポリペプチドとの比較によって、同様の結果が得られた。この親ポリペプチドはＩｇＧ１野生型と比べてＣ１ｑおよびＦｃγＲｌｌｌａに結合する能力は同等である。
【００６０】
同様に、２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ、２９４Ｄｅｌ／２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／２５９ｌ／３１５Ｄ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／３９７Ｍ、２９４Ｄｅｌ／３０２Ａ、２９４Ｄｅｌ／４３４Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３１５Ｄ、２９４Ｄｅｌ／２３０Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３０７Ａ、２９４Ｄｅｌ／２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／３７８Ｖおよび２９４Ｄｅｌ／４３４Ｙ変異株は、それぞれの親ポリペプチドと比べて、Ｃ１ｑおよびＦｃγレセプタから選択される少なくとも一つのタンパクに対する結合性が低下する。逆に、上記親ポリペプチドは、野生型ＩｇＧＩと比べてＣ１ｑおよびＦｃγレセプタから選択される少なくとも一つのタンパクを結合する能力が増加した。本発明者はさらに、野生型Ｆｃ領域を含むＩｇＧ１のアミノ酸配列に２９４Ｄｅｌを導入して得られるＩｇＧ１変異株は、それぞれの親ＩｇＧ１と比べてＦｃＲｎに対して同等の結合性を示すことができることを示した。同等の結合性とは、２９４Ｄｅｌアミノ酸変更の導入、変異によって生じる、変異株に対するＦｃＲｎ結合性の変更がその親ＩｇＧ１と比べてわずか３５％以下であることを意味する。３５％以下とは、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下および５％以下を意味する。
【００６１】
Ｃ１ｑおよびＦｃγＲｓを結合する能力を低下させることによって、変異２９４Ｄｅｌのの導入は、ＩｇＧ１変異株のＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性に、それぞれ親ＩｇＧ１と比べて影響を与えることが予想される。
【００６２】
位置２９３のアミノ酸はさらにグルタミン酸である。その欠失は、位置２９４のグルタミン酸の欠失と同じヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を導く。従って、変異株２９３Ｄｅｌおよび２９４Ｄｅｌは同じポリペプチドである。従って、本発明の第１の対象は、親ポリペプチドと比べてＣｌｑおよびＦｃγから選択される少なくとも一つのタンパクに対する結合性が低下した、Ｆｃ領域を含む親ポリペプチドの変異株を生産する方法であって、２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから成る群の中から選択されるアミノ酸変更を、親ポリペプチドのＦｃ領域内に導入する方法を提供することにある。Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はＥＵインデックスに従う数え方またはＫａｂａｔでのその同等物である。
【００６３】
好ましい実施例では、この変異株は親ポリペプチドに比べてタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのＦｃγレセプタに対する低下した結合性を示す。
「定義」と題した上記パートで説明したように、親ポリペプチドはＦｃ領域を含むポリペプチドを意味する。この親ポリペプチドは天然由来のポリペプチド（野生型ポリペプチド）、天然由来のポリペプチドの変異株、天然由来のポリペプチドの遺伝子操作物または合成ポリペプチドにすることができる。親ポリペプチドとしては、抗体、Ｆｃ融合タンパク、Ｆｃ−共役、Ｆｃ由来ポリペプチド、単離されたＦｃおよびＦｃ断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、設計されたポリペプチドはキメラ抗体またはヒト化抗体にすることができる。
【００６４】
親ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧサブクラスの野生型Ｆｃ領域、その断片およびそのミュータントから成る群の中から選択されるのが好ましい。本発明では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は「低部ヒンジＣＨ２−ＣＨ３」領域に対応する。野生型ヒトＩｇＧ１の「低部ヒンジＣＨ２−ＣＨ３」領域とは、ＥＵインデクサまたはKabaｔでの同等物に従う位置２２６から位置４４７までのアミノ酸を意味する。他のＩｇＧサブクラスの類似領域は［図１］に示すようにヒトＩｇＧ１のそれとＩｇＧサブクラスの重鎖のアミノ酸配列のアラインメントで決定できる。
【００６５】
ヒトＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４およびその種々のアロタイプを含む。ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３およびｌｇＧ４のＦｃ領域の配列はそれぞれSEQ ID Νー1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3およびSEQ ID NO 4の配列と相関する。
【００６６】
Ｆｃ領域の断片は、野生型Ｆｃ領域に由来の一つまたは複数のポリペプチドを含むポリペプチドとして定義される。Ｆｃ領域の上記断片は野生型Ｆｃ領域からの少なくとも１００の連続残基を含むのが好ましい。野生型Ｆｃ領域からの少なくとも１００の連続残基には少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも２００、少なくとも２１０が含まれる。
【００６７】
上記のように、親ポリペプチドは野生型Ｆｃミュータントから成ることができる。すなわち、Ｆｃ領域は野生型Ｆｃ領域と比べて既存のアミノ酸突然変異、例えば付加、挿入および／または置換を有することができる。
【００６８】
既に述べたように、「変異株ポリペプチド」または「変異株」とは少なくとも一つのアミノ酸変更によって親ポリペプチドのそれと異なるポリペプチド配列を意味する。本発明の場合には、少なくとも一つのアミノ酸変更は、変異２９４Ｄｅｌ、変異２９３Ｄｅｌおよび変異２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌの組合せから選択されるアミノ酸変更を必然的に含む。
【００６９】
本発明の変異ポリペプチドはその親ポリペプチドと比べて第１補体成分Ｃ１ｑに対する低下した結合性を示すことができる。換言すれば、Ｃ１ｑに対する変異株の親和性は親ポリペプチドのそれより低い。
本発明の変異株ポリペプチドも、その親ポリペプチドのそれより低い少なくとも一つのＦｃγレセプタに対する親和性を示すことができる。本発明のＦｃγレセプタとはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩレセプタである。少なくとも一つのＦｃγＲはＦｃγＲｌｌｌａ、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲｌｌｂから成る群から選択されるのが好ましい。
【００７０】
本発明のある実施例では、変異株ポリペプチドはその親ポリペプチドと比べて、Ｃ１ｑとＦｃγＲｌｌｌａの両方に対する低下した結合性を示す。
特定の実施例では、変異株ポリペプチドはその親ポリペプチドと比べて、Ｃ１ｑ、ＦｃγＲｌｌａおよびＦｃγＲｌｌｌａに対する低下した結合性を示す。
他の実施例では、変異株ポリペプチドはその親ポリペプチドと比べて、Ｃ１ｑ、ＦｃγＲｌｌｌａ、ＦｃγＲｌｌａおよびＦｃγＲＩに対する低下した結合性を示す。
さらに他の実施例では、変異株ポリペプチドはその親ポリペプチドと比べて、Ｃ１ｑ、ＦｃγＲｌｌｌａ、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲｌｌｂに対する低下した結合性を示す。
【００７１】
Ｃ１ｑまたはＦｃガンマレセプタに対する結合性は、従来技術の周知な方法、例えばＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリーおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価できる。
【００７２】
例えば、所定のタンパク（例えば、Ｃ１ｑまたはＦｃγＲ）に対する本発明の変異株の結合強度とその親ポリペプチドのそれとを比較することができる。実施例のセクションＩＩＩに記載のＥＬＩＳＡアッセイによって得られるその特定信号の比を計算する。本発明では、変異株の特定信号を親ポリペプチドの特定信号で割ることで得られる比が０．５０である場合に変異株はその親ポリペプチドと比べて、所定のタンパク、例えばＣ１ｑまたはＦｃγＲに対する低下した結合性を示す。この特定信号はＥＬＩＳＡアッセイで測定される。換言すれば、変異株の特定信号はその親ポリペプチドの特定信号より０．５０倍弱い。０．５０以下の比とは、０．４５以下の比、０．４０以下の比、０．３５以下の比、０．３０以下の比、０．２５以下の比、０．２０以下の比、０．１５以下の比、０．１０以下の比、０．０５以下の比、０．０１以下の比を含む。
【００７３】
好ましい実施例では、比は０．２０以下である。
ＥＬＩＳＡアッセイに好ましいフォーマットは所定のタンパクの被覆を含む。
変形例では、所定のタンパクに対する変異株の結合性とその親ポリペプチドの結合性を、適当なＥＬＩＳＡアッセイによるＥＣ５０の測定を通して比べることができる。ＥＣ５０とは、変異株の濃度の対数の関数としての所定の結合タンパクの百分率に関する曲線の５０％飽和を示す信号を供給する変異株の濃度を意味する。一般に、変異株はそのＥＣ５０がそのポリペプチド親のＥＣ５０より少なくとも１．５倍高い場合に、その親ポリペプチドと比べて、所定のタンパクに対する低下した結合性を示すことは認められている。
【００７４】
所定のタンパクに対する変異株の結合性も、解離定数（ＫＤ）の測定を通してＳＰＲによって評価できる。一般に、変異株はそのＫＤがそのポリペプチド親のＥＣ５０より少なくとも１．５倍高い場合に、その親ポリペプチドと比べて、所定のタンパクに対する低下した結合性を示すことは認められている。
【００７５】
Ｃ１ｑまたはＦｃγＲに対する変異株の親和性は、非常に弱く、ＥＬＩＳＡアッセイによる特定信号さらにはＳＰＲによるＫｄまたはＥＬＩＳＡアッセイによるＥＣ５０は、結合信号が暗雑音中または検出の閾値以下であるため、正確に測定できない可能性がある。このような場合には、変異株は所定のタンパクを結合しないとみなされる。
【００７６】
例えば、本発明方法で得られる変異株は少なくとも一つのＦｃγＲに結合することができず、Ｃ１ｑに対する低下した結合性を示す。このような変異株は本発明の実施例にはっきりと説明されている。ある実施例では、本発明の変異株はＣ１ｑおよびＦｃγレセプタから選択される少なくとも一つのタンパクに結合しない。
【００７７】
本発明者は、Ｃ１ｑおよびＦｃγレセプタに対する結合性を大きく損なうためには、２９４Ｄｅｌを導入するだけで十分であることを示した。換言すれば、Ｃ１ｑおよび／またはＦｃγレセプタに対する適切に低下した結合性を有する変異株を得るためには、２９４Ｄｅｌ以外の変異をポリペプチド親のＦｃ領域内に導入してはならない。
【００７８】
このような結果は特に驚くべきものである。なぜなら、本発明者の知る限りでは、従来技術には大抵、Ｆｃ変異株は、そのポリペプチド親と比べてそのＦｃ領域で少なくとも２つのアミノ酸変異を有するＣ１ｑおよびＦｃγレセプタに対する低下した結合性を示すと記載されているからである。
【００７９】
本発明のある実施例では、変異２９４Ｄｅｌが上記の変異株を得るために親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である。
本発明の他の実施例では、変異２９３Ｄｅｌが、上記の変異株を得るために親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である。
さらに他の実施例では、上記の変異株を得るためにアミノ酸変更ｄｅｌ２９３／ｄｅｌ２９４が、親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である。
【００８０】
従って、本発明の特定の実施例には下記の方法が含まれる：変異株が親ポリペプチドと比べてタンパクＣ１ｑおよび／または少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下し、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異株の生産方法であって、
（ｉ）２９４Ｄｅｌ（ここで、上記アミノ酸変更２９４ｄｅｌは親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である）
（ii）２９３Ｄｅｌ、
（iii）２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ、
から成る群の中から選択されるアミノ酸の変異を親ポリペプチドのＦｃ領域に導入する方法（ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はＥＵインデックスに従う数え方またはKabatでのその同等物である）。
【００８１】
本発明の他の実施例には、下記の方法が含まれる：変異株が親ポリペプチドと比べてタンパクＣ１ｑおよび／または少なくとも一つのレセプタＦｃγＲに対する結合性が低下し、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異株の生産方法であって、
（ｉ）２９４Ｄｅｌ（ここで、上記アミノ酸変更２９４ｄｅｌは親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である）
（iｉ）２９３Ｄｅｌ（ここで、上記アミノ酸変更２９３Ｄｅｌは親ポリペプチドのＦｃ領域に導入される唯一のアミノ酸変更である）、
（iii）２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ、
から成る群の中から選択されるアミノ酸の変異を親ポリペプチドのＦｃ領域に導入する方法（ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はＥＵインデックスに従う数え方またはKabatでのその同等物である）。
【００８２】
本発明の特定実施例では、本発明の方法は、Ｅ２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙを含む変異株とは異なる変異株を提供する。
【００８３】
いかなる理論に縛られるものではないが、本発明者は本発明によって提供される方法はＦｃ領域内の大きな構造上の再配列を有意に引き起こさず、それによって、場合によっては、Ｃ１ｑおよびＦｃγＲに対する結合性によって介在される他の機能がポリペプチド親の機能と比べて有意に変化しないと考える。本発明者がそれぞれ異なる親ポリペプチドに関して、そのＦｃ領域への変異２９４Ｄｅｌの導入が、新生Ｆｃレセプタ（ＦｃＲｎ）に対するその親和性を有意に損なうものではないことを示したことは注目に値する。例えば、ＩｇＧ１変異株２５６Ｎ／２９４Ｄｅｌ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙの特定信号はその親ポリペプチド２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙのそれの０．７５倍に等しく、ＩｇＧ１変異株３０７Ａ／２９４Ｄｅｌの特定信号はそのポリペプチド親３０７Ａのそれの０．９７倍に等しい。
【００８４】
上記変異株が野生型ＩｇＧ１と比べてＦｃＲｎに対する増加した結合性を示すことは注目に値する（実施例の［表１］〜［表４］参照）。換言すれば、場合によって、Ｆｃポリペプチド親および本発明の方法で得られた変異株はＦｃＲｎに対する近い結合特性を示すことができる。
【００８５】
本発明方法によって得られる変異株は、ここで使用したように、変異株の特異信号がその親ポリペチドでの特異信号の少なくとも０．６倍に等しい。この特異信号はＥＬＩＳＡにより決定され、このＥＬＩＳＡでは実施例のセクションＩＩＩで説明するようにＦｃＲｎ分子を固定するのが好ましい。少なくとも０．６倍とは０．６倍、０．６５倍、０．７０倍、０．７５倍、０．８０倍、０．８５倍、０．９０倍および０．９５倍であることを意味する。
【００８６】
既に述べたように、親ポリペチドのＦｃ領域はヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域、その断片およびそのミュータント（突然変異体）から成る群の中から選択することができる。
【００８７】
ヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域にはSEQ ID No.1、SEQ ID NO 2のポリペチド、SEQ ID NO 3のポリペチド、SEQ ID NO 4のポリペチド、SEQ ID NO 5のポリペチドが含まれる。
【００８８】
本発明の好ましい実施例では、親ポリペチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１およびｌｇＧ２からの野生型Ｆｃ領域、その断片およびそれのミュータントから成る群の中から選択する。より好ましい実施例では、ポリペチドペアレンドのＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１、その断片およびそのミュータントのＦｃ領域である。
【００８９】
上記にように、親ポリペチドのＦｃ領域は既存のアミノ酸の一つ以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換の中から選択される変異から成ることができる。換言すれば、親ポリペチドのＦｃ領域は野生型Ｆｃ領域のミュータント、好ましくはヒトＩｇＧ、すなわちＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３およびｌｇＧ４の野生型Ｆｃ領域のミュータントでもよい。
【００９０】
本発明の実施例では、親ポリペチドのＦｃ領域は約１〜約２０のアミノ酸突然変異、好ましくその対応する野生型Ｆｃ領域と比較して約１〜約１０のアミノ酸突然変異を有する。
【００９１】
上記の約１〜約２０のアミノ酸突然変異には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０のアミノ酸突然変異を含む。
【００９２】
ポリペチドペアレントのＦｃ領域は一般にその対応する野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有する。この少なくとも９０％のアミノ酸同一性には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および９９．５％のアミノ酸同一性が含まれる。
【００９３】
第１のポリペチド（Ａ）と第２のポリペチド（Ｂ）との間の同一性の百分比を決定するためには偶発的なギャップ（すなわちポリペチド（Ｂ）と比較したポリペチド（Ａ）の配列中に存在する偶発的な欠失および挿入）を取り入れたNeedleman-Wunschのグローバルアランメント・アルゴリズムのような公知の方法を使用してそれらの配列を整合させる。下記パラメータを用いてＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブサイト（www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/）に記載のアランメント・ツール「EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms」を利用できる：（ｉ）方法：ＥＭＢＯＳＳ：Needle（グローバル）、（ｉｉ）ギャップ延び：０．５、（ｉｉｉ）ギャップ開き：１０．０、（ｉｖ）分子：タンパク、（ｖ）マトリックス：Blosum62。
【００９４】
グローバルなアランメントが得られたら、同一性の百分比を従来法で決定でき、好ましくは、（Ａ）と（Ｂ）のアランメントのマッチした残基を、そして、（Ａ）と（Ｂとの間の最も長いポリペチド配列のアミノ酸数で割って求める。
【００９５】
親ポリペチドが既存のアミノ酸の突然変異から成るときには、その親ポリペチドはその基準ポリペチドすなわち野生型Ｆｃ領域から成る類似したポリペチドと比べて一つ以上の減少または増加するエフェクタ機能を示すであろう。ここで使用するエフェクタ機能にはＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣおよびＦｃＲｎへの結合が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００９６】
所望のエフェクタ機能プロフィールに依存する親ポリペチド中に存在する既存のアミノ酸の突然変異を決定することは公知の研究から当業者が行い得ることである。例えば、親ポリペチドは下記の中から選択されるアミノ酸位置に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有することができる：Ｆｃ領域の２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５，３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７。ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の番号の教え方はＥＵ指数または相当Kabatである。
【００９７】
親ポリペチドはさらに、下記のアミノ酸位置に一つだけのアミノ酸突然変異を有することができる：Ｆｃ領域の２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５，３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７。ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の番号の教え方はＥＵ指数または相当Ｋａｂである。「一つだけのアミノ酸突然変異」とは上記位置に一つ以上の突然変異を含まないことを意味する。例えば、親ポリペチドはＦｃ領域の位置３０７と４３４の両方の位置にアミノ酸の突然変異を含まない。従って、ポリペチドペアレントのＦｃ領域に唯一の突然変異が導入ささる本発明実施例では２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌであり、その変異株は上記のアミノ酸位置に複数のアミノ酸突然変異を有することはできない。特に、変異株はＦｃ領域の位置３０７と４３４にアミノ酸突然変異を有することはできない。Ｆｃ領域のアミノ酸の位置の数え方はＥＵ指数またはその対応Kabatである。
【００９８】
本発明の一つの実施例は、Ｆｃ領域を有する親ポリペチドの変異株の製造方法を示し、この変異株はＣ１ｑおよびＦｅｙリセプタから選択される少なくとも一つのタンパクに対する結合性（ビン遺伝子）が親ポリペチドと比べて低下し、２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異が親ポリペチドのＦｃ領域内に導入される。ただし、得られる変異株は２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙまたは２９３Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ突然変異から成ることはない。
【００９９】
本発明の他の実施例では、Ｆｃ領域を有する親ポリペチドの変異株の製造方法が示され、この変異株はＣ１ｑおよびＦｅｙリセプタから選択される少なくとも一つのタンパクに対する結合性が親ポリペチドと比べて低下し、２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから成る群の中から選択されるアミノ酸が親ポリペチドのＦｃ領域に導入される。ただし、親ポリペチドの上記突然変異は２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌを有する突然変異と３０７および４３４の両方の位置の突然変異とを組み合わせて有するものではない。Ｆｃ領域のアミノ酸の位置の数え方はＥＵ指数またはその対応Kabatである。同様に、ポリペチドペアレントはＦｃ領域の２９０から２９２までの位置と、２９５から３００までの位置に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有するか、有することはない。Ｆｃ領域のアミノ酸の位置の数え方はＥＵ指数またはその対応Kabaｔである。
【０１００】
従って、本発明のある実施例では、ポリペチドペアレントはＦｃ領域の２９０から２９２まで位置と２９５から３００までの位置のいずれにもアミノ酸突然変異を有しない。Ｆｃ領域のアミノ酸の位置の数え方はＥＵ指数またはその対応Kabatである。
【０１０１】
上記の２９０から２９２までおよび２９５から３００までのアミノ酸位置には２９０、２９１、２９２、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９および３００が含まれる。
【０１０２】
本発明の他の実施例では、ポリペチドペアレントはそのＦｃ領域に野生型Ｆｃ領域と比べていかなる突然変異も含まない。この種の実施例では、親ポリペチドはヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域およびその断片から成る群から選択されるＦｃ領域を含む。
【０１０３】
念のため、ヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域はSEQ ID NO 1のFc領域、SEQ ID NO 2のＦｃ領域、SEQ ID NO 3のＦｃ領域およびSEQ ID NO 4のＦｃ領域を含む。
【０１０４】
本発明の他の実施例では、親ポリペチドのＦｃ領域は４３４Ｙ、３７８Ｖ、３９７Ｍ、３０２Ａ、４３４Ｓ、３１５Ｄ、２３０Ｓ、３０７Ａ、２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙおよび２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異を含む野生型ＩｇＧのＦｃ領域の変異株である。
【０１０５】
本発明のある実施例では、親ポリペチドのＦｃ領域が４３４Ｙ、３７８Ｖ、３９７Ｍ、３０２Ａ、４３４Ｓ、３１５Ｄ、２３０Ｓ、３０７Ａ、２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙおよび２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙから成る群の中から選択される野生型ＩｇＧの変異株のＦｃ領域である。
【０１０６】
特定実施例では、タンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのリセプタＦｃγＲに対する結合性が親ポリペチドと比較して低下した、Ｆｃ領域を有する親ポリペチドの変異株の製造するための本発明方法が下記で特徴づけられる：
（ｉ）親ポリペチドのＦｃ領域に２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから選択されるアミノ酸突然変異を導入し、
（ii）親ポリペチドのＦｃ領域に導入される２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌの中から選択されるアミノ酸突然変異が変異株を得るために導入される唯一のアミノ酸突然変異であり、
（iii）親ポリペチドのＦｃ領域はＩｇＧの野生型Ｆｃ領域およびその断片トの群の中から選択する。
Ｆｃ領域のアミノ酸の位置の数え方はＥＵ指数またはその対応Kabatである。
【０１０７】
本発明の一つの実施例では、親ポリペチドのＦｃ領域に導入される２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌの中から選択されるアミノ酸突然変異の導入工程が下記の段階から成る：
（ａ）親ポリペチドをコードする核酸を提供し、
（ｂ）階段（ｉ）で与えられた核酸を変成して上記変異株をコードする核酸を得て、
（ｃ）階段（ｉｉ）で得られた核酸を宿主細胞で発現して上記変異株を回収する。
【０１０８】
本発明方法のいくつかの実施例では、親ポリペチドのＦｃ領域に導入したアミノ酸突然変異が２９４Ｄｅｌである。他の実施例ではこの突然変異は２９３Ｄｅｌである。
【０１０９】
この方法は分子生物学の従来のプラクティスで実行できる。本発明方法を実行するために当業者は例えば下記非特許文献１８〜２０に記載の周知の手順を利用できる。
【非特許文献１８】Molecular Cloning-A Laboratory Manual、第3版(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001 )
【非特許文献１９】The condensed protocols from Molecular cloning: a laboratory manual (Sambrook, Russell, CSHL Press, 2006)
【非特許文献２０】Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 2004).
【０１１０】
親ポリペチドの核酸は商用のものでも、分子生物学または化学合成の古典的手順で得られるものでもよい。階段（ｂ）の変異株をコードする核酸は公知の各種方法を使用して親ポリペチドの核酸を変成して得ることができる。これらの方法に部位特異的突然変異、ランダム突然変異生成、ＰＣＲ突然変異生成およびカセット突然変異生成を含むが、これに限定されるものではない。
【０１１１】
変異株をコードする核酸は宿主細胞中での発現のために発現ベクターに組み込むことができる。
【０１１２】
発現ベクターは制御または調節配列、選択可能なマーカー、フィージョンパートナーおよび／または追加要素とリンク可能、換言すれば機能関係を付けることが可能なタンパクを一般に有する。本発明の変異株は上記核酸を用いて形質転換した宿主細胞、好ましくは上記タンパクを発現または誘発するのに適した条件下に変異株をコードする核酸を含む発現ベクターを培養することで製造できる。多種多様な適当な宿主細胞系を使うことができ、哺乳動物細胞、植物細胞、バクテリア、昆虫細胞およびイーストが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、細胞なしの翻訳系でインビトロ合成することもでき、例としてはウサギ網状赤血球、コムギ胚および大腸菌からの抽出物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
例えば、American Type Culture Collectionから入手可能なＡＴＣＣ細胞系カタログに記載の各種の哺乳動物細胞系を使用できる。宿主細胞は下記にすることができるが、これらに限定されるものではない：ＹＢ２／０（ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．ＧＩＩ．ＩＧＡｇ．２０細胞、American Type Culture Collectio寄託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）、ＳＰ２／０、ＹＥ２／０、１Ｒ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａ、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ細胞株、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−ＬｅｃＩＯ、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ３、ＣＨＯＰｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒａ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、ＫＧＨ６、ＮＳＯ、ＳＰ０２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｃ１２７、ＪＣ、ＬＡ７、ＺＲ−４５−３０、ｈＴＥＲＴ、ＮＭ２Ｃ５、ＵＡＣＣ−８１２等。宿主細胞に外部核酸を入れる方法は公知で、各宿主細胞で異なる。
【０１１４】
宿主細胞は人間以外の遺伝子導入動物または遺伝子導入植物に属するものにすることができる。この場合、変異株はトランスジェニック生物から得られる。
【０１１５】
人間以外の遺伝子導入動物は受精卵に所望の遺伝子を直接注射することで得ることができる（非特許文献２１：Gordon et a/., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A. ;77:7380-4）。人間以外の遺伝子導入動物にはハツカネズミ、ウサギ、ラット、ヤギ、ウシまたは家禽等が含まれる。所望の遺伝子を有する人間以外の遺伝子導入動物は所望遺伝子を胎生期幹細胞に入れ、会合キメラ方法または注射キメラ法によって動物を調製することで得られる｛非特許文献２２：Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); 非特許文献２３：Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)。胎生期幹細胞の例にはハツカネズミの胎生期幹細胞(非特許文献２４：Evans and Kaufman, 1981 , Nature; 292:154-156)、ラット、ヤギ、ウサギ、サル、家禽、ウシ等が含まれる。さらに、人間以外の遺伝子導入動物をクローン技術を使用して調製することもできる。この場合には所望遺伝子を細胞核を取り除かれた卵子に移植する（非特許文献２５：Ryan et a/., 1997 Science; 278: 873 - 876 ; 非特許文献２６：Cibelli et a/., 1998 Science, 280 : 1256-1258)。記の方法で得た動物に異なる分子をコードするＤＮＡを導入し、異なる分子を形成し、蓄積させ、動物からポリペチド変異株を集めてポリペチド変異株を製造することもできる。ポリペチド変異株は動物の乳汁、卵等に形成され、蓄積できる。
【非特許文献２１】Gordon et a/., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A. ;77:7380-4
【非特許文献２２】Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)
【非特許文献２３】; Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)
【非特許文献２４】Evans and Kaufman, 1981 , Nature; 292:154-156
【非特許文献２５】Ryan et a/., 1997 Science; 278: 873 - 876
【非特許文献２６】Cibelli et a/., 1998 Science, 280 : 1256-125
【０１１６】
上記で引用した全ての実施例で、親ポリペチドは自然に生じるポリペチド（野生型ポリペチド）、自然に生じるポリペチドの変異株または遺伝子操作産物または合成ポリペチドにすることができる。
【０１１７】
本発明の一つの実施例では、親ポリペチドはＦｃ−融合タンパク、Ｆｃ−コンジュゲートおよび抗体から成る群から選択する。本発明で使用するように、Ｆｃ−融合タンパクおよびＦｃ−コンジュゲートはパートナーとリンクしたＦｃ領域を有する。Ｆｃ領域はパートナーにスペーサを介するか、介さずにリンクできる。
【０１１８】
本発明ではＦｃ融合タンパクは単一遺伝子によってコードされるタンパクであり、タンパク、ポリペチドまたはＦｃ領域にリンクされた小さいペプチドから成る。Ｆｃ融合タンパクは任意成分としてペプチド・スペーサを含むことができる。任意のタンパクまたは小さいペプチドをＦｃ領域にリンクして、Ｆｃ融合させることができる。タンパク融合パートナーはリセプタ、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキン（chemokine）またはその他のタンパクまたはタンパクドメインを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
特に、Ｆｃ−融合タンパクは免疫接着物すなわちヘテロな「接着」タンパク（リセプタ、リガンドまたは酵素）を免疫グロブリン不変領域（すなわちＦｃ領域）の断片に結合する抗体様タンパクにすることができる（免疫接着物に関しては非特許文献２７：Ashkenazi A, Chamow SM. 1 997, Curr Opin Immunol. ;9(2):1 95-200参照）。
【非特許文献２７】Ashkenazi A, Chamow SM. 1 997, Curr Opin Immunol. ;9(2):1 95-200
【０１２０】
小さいペプチドは、治療の標的にＦｃ融合を送る任意の治療薬を含むが、これに限定されるものではない。
【０１２１】
本発明では、ＦｃコンジュゲートはＦｃ領域をコンジュゲートパートナーに結合することで得られ、必要に応じてＦｃ領域をパートナーに結合するスペーサを含むことができる。コンジュゲートパートナーはタンパク性（proteinaceous）でも非タンパク性でもよい。このカップリング反応には一般にＦｃ領域上またはコンジュゲートパートナー上の官能基を使用する。
【０１２２】
適したコンジュゲートパートナーはポリペプチド製剤、ラベル（ラベルの例は下記を参照）、医薬品、細胞障害能薬剤、細胞毒（例えば化学療法剤）、トキシンおよびトキシンの能動断片を含むが、これらに限定されるものではない。適したトキシンおよびその対応断片にはジプテリア（diptheria）Ａ鎖、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖等が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞毒剤はＦｃ変異株に直接コンジュゲートできる、または、Ｆｃ変異株に共有結合で結合できるキレート剤によって配列できる任意の放射性核種にすることができる。追加実施例では、コンジュゲートパートナーはカリケアミシン（calicheamicin）、オウリスタチン（auristatins）、ゲルダナマイシン、メイタンシンおよびデュオカルミシアス（duocarmycins）およびその類似体から成る群の中から選択できる。
【０１２３】
既に述べたように、「抗体」という用語は最も広い意味で使われる。本発明では「抗体」は少なくとも（ｉ）Ｆｃ領域および（ｉｉ）免疫グロブリンの可変領域から得られる結合ポリペチド領域を有する任意のポリペチドを意味する。上記の結合ポリペチド領域は特に一つの所定標的抗原または一群の標的抗原を結合できる。免疫グロブリンの可変部から生じる結合ポリペチド領域は少なくとも一つのＣＤＲを有する。抗体は全長抗体、多重特異性抗体、少なくとも一つの可変部を有するＦｃ−融合タンパクまたは合成抗体（「抗体ミメティックス」とよばれる）、抗体−融合タンパク、抗体複合体およびその各々の断片を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
少なくとも一つの可変部を有するＦｃ−融合タンパクとは（ｉ）Ｆｃ領域および（ｉｉ）免疫グロブリンの可変領域から得られる結合ポリペチド領域を有する遺伝子工学で設計されたタンパクを意味する。特に重要な抗体には：（ａ）本発明のＦｃ変異株および（ｂ）免疫グロブリンの可変部から得られる下記のポリペチド領域（すなわち、それは少なくとも一つのＣＤＲを含む）の一つが含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域を有するＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨとＣＨ１領域を有するＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬとＶＨ領域を有するＦｖ断片、（ｉｖ）単利ＣＤＲ領域、（ｖ）Ｆ（ａｂ'）断片、２つの連結したＦ（ａｂ）断片を有する二価の断片、（ｖｉ）単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨ領域とＶＬ領域は２つの断片を連結して抗原結合部位を作るペプチド・リンカーによってリンクささる、（ｖｉｉ）二特異性な単一鎖Ｆｖおよび（ｖｉｉｉ）遺伝子融合によって得られる「二抗体（diabodieｓ）」または「酸抗体（triabodies）」、多価または多重特異性（multispecific）な断片。しかし、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
「全長(フルレングス）抗体」とは可変部と定常部とを含む抗体の自然に生じる生物学的形態を有する抗体を意味する。全長抗体は野生型抗体、野生型抗体のミュータント（例えば、既存の突然変異から成る）、野生型抗体の遺伝子操作物（例えば例えば、キメラ、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、下記参照）にすることができるが、これらに限定されるものではない。一般に全長抗体の構造はテトラマであるが、ラマやラクダのようないくつかの哺乳類の抗体の構造は免疫グロブリンがダイマーであることは周知である。
【０１２６】
全長抗体の足場（スキャフォルド）成分は異なる生物種からの混合物にすることができる。この種の抗体変異株はキメラ抗体および／またはヒト化抗体にすることができる。一般に「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方とも複数の生物種からの領域を結合した抗体である。例えば「キメラ抗体」は一般に、非ヒト動物、一般にはハツカネズミ（場合によってはラット）からの可変領域とヒトの定常領域とから成る。大抵の場合、ヒト化抗体は非ヒト免疫グロブリンから来る最小配列を含むキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体ではＣＤＲ以外の全抗体がヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、ＣＤＲｓ以外はヒト抗体と同一であるヒト以外の生物起源の核酸によってコードされるＣＤＲのいくつかまたは全てはヒト抗体の可変部のβ−シートフレームにグラフトされる。その特異性はＣＤＲによって決まる。この種の抗体の調製方法は周知で、例えば下記文献に記載されている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９２／１１０１８
【非特許文献２８】Jones, 1986, Nature 321 :522-525
【非特許文献２９】Verhoeyen et al., 1 988, Science 239:1 534-1 536,
【非特許文献３０】Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA))
【０１２７】
ここで使用する「全長ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」とはヒト遺伝由来の配列を完全に有する抗体を意味する。場合によっては、これはここで説明した突然変異を有するヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体でもよい。あるいは、抗体成分がヒトであるが、単一遺伝子由来でなくてもよい。従って、１つの抗体からのヒトＣＤＲは例えば一つ以上のヒト抗体からの配列、例えば足場の配列と組み合わせることができる。また、例えば、いろいろな生殖細胞系（germline）配列を組み合わせてヒト抗体またはヒト足場を形成することもできる。
【０１２８】
共有結合変成を含む全長抗体も本発明の範囲に含まれる。この種の突然変異はグリコシル化、標識化および共役を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
標識（ラベル）化は全長抗体と検出可能なラベルとのカップリングといわれる。ここで使用するラベルには下記が含まれるが、下記に限定されるもではない：(ａ）放射性または安定な同位元素である同位体ラベル、(ｂ）磁性ラベル、例えば磁性粒子、(ｃ）レドックス活性種、(ｄ）光学色素、例えば発色団、リン光体および蛍光団、酵素基、例えばワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、(ｅ）ビオチニル化（biotinylated）基、(ｆ）二次性リポータで認識される所定のポリペチドエピトープ、例えばロイシン・ジッパーペアー配列、二次性抗体様結合部、金属結合領域、エピトープタグ、その他。
【０１３０】
コンジュゲート（共役）とは全長抗体とポリペチドまたは非ペプチド分子、例えばリセプタの標的−結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキン（chemokine）、医薬、細胞毒剤（例えば化学療法剤）またはトキシンとのカップリングをいう。
【０１３１】
一つの実施例では、ポリペチドペアレントがキメラな免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、全ヒト免疫グロブリンから成る群の中から選択される。免疫グロブリンは活用化またはラベル化されていてもよいＩｇＧの中から選択するのが好ましい。
【０１３２】
ｃ．本発明の変異株
本発明の他の対象は、Ｆｃ領域を有する親ポリペチドの変異株であって、この変異株は親ポリペチドと比べてタンパクＣ１ｑおよびリセプタＦｃγＲｓから選択される少なくとも一つのタンパクに対する結合性が低下しており、ポリペチドペアレントのＦｃ領域と比較したときにそのＦｃ領域に２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから選択されるアミノ酸突然変異を有する変異株にある。この変異株は本発明方法によって獲得できる。
【０１３３】
上記変異株はタンパクＣ１ｑおよびリセプタＦｃγＲｓから選択される少なくとも一つのタンパクに対する結合性が親ポリペチドと比べて低下しており、そのポリペチドペアレントのＦｃ領域と比較した時にそのＦｃ領域内に２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから選択されるアミノ酸突然変異を有する。
【０１３４】
本発明の一つの実施例では、上記変異株は親ポリペチドと比べてＣ１ｑおよび少なくとも一つのリセプタＦｅｙに対する接合性が低下している。
【０１３５】
本発明の一つの実施例では、上記変異株は親ポリペチドのＦｃ領域と比べた唯一の突然変異がＦｃ領域の然変異２９４Ｄｅｌである。
【０１３６】
本発明の他の実施例では、上記変異株は親ポリペチドのＦｃ領域と比べた唯一の突然変異がＦｃ領域の突然変異２９３Ｄｅｌである。
【０１３７】
本発明の他の実施例では、上記変異株は親ポリペチドのＦｃ領域と比べた唯一の突然変異がＦｃ領域のアミノ酸突然変異２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌである。
【０１３８】
上記変異株の構造上および機能特性はそれを製造するのに使用した方法の特色から直接きたものである。この方法は「Ｃ１ｑおよびＦｃγＲｓに対するＦｃ結合を減少させる方法」と題したｂに記載の方法である。
【０１３９】
変異株の特性はＣ１ｑおよびＦｅｙリセプタに対する結合性以外の点では一般に親ポリペチドの特性から推論できるということは理解できよう。すなわち、Ｃ１ｑおよびＦｅｙリセプタに対する変異株の結合性は位置２９４でおよび／または位置２９３のアミノ酸突然変異によって管理される。
【０１４０】
従って、本発明の一つの実施例では、変異ポリペチドはポリペチドペアレントと比較してＣ１ｑおよびＦｃγＲｌｌｌａ、ＦｃγＲｌａ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩｌｂから選択される少なくとも一つのＦｃγリセプターに対する結合性が低下する。
【０１４１】
ここで、変異株が親ポリペチドと比較してＣ１ｑまたはＦｃγＲに対する結合性が低下するとは、その変異株の特異信号を親ポリペチドの特異信号で割って得られる比が０．５以下であることを意味する。上記の特異信号は例えばＥＬＩＳＡアッセーで求めることができる。換言すれば、変異株の信号は親ポリペチドの特異信号の最大でも０．５倍である。
【０１４２】
変異株のＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比べて２９４Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ以外に一つ以上のアミノ酸突然変異を有することができる。一般に変異株のＦｃ領域は対応する野生型Ｆｃ領域と比べて約１〜約２１のアミノ酸突然変異、好ましくは約１〜約１１のアミノ酸突然変異を有し、その突然変異は２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌを含む。
【０１４３】
親ポリペチドと同様に、上記変異株は野生型Ｆｃ領域と比べてＦｃ領域に２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０８、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７から選択するるアミノ酸位置に更に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有することができる。Ｆｃ領域のアミノ酸の位置はＥＵ指数または対応Kabatである。
【０１４４】
変異株はさらに、野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃ領域に２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７から選択されるアミノ酸位置に一つのアミノ酸突然変異のみを有することができる。Ｆｃ領域のアミノ酸の位置はＥＵ指数または対応Kabatである。
【０１４５】
「一つのアミノ酸突然変異のみ」とは変異株が上記の位置の一つの変異以外に突然変異を含まないということを意味する。例えば、野生型Ｆｃ領域と比べて変異株がＦｃ領域の位置３０７および４３４の両方の位置にアミノ酸突然変異を有しない。従って、本発明の一つの実施例では、変異株は２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙまたは２９３Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙから成るるアミノ酸突然変異は有するしない。特に、本発明の実施例では変異株は２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙまたは２９３Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ変異株から成ることはない。
【０１４６】
本発明の他の実施例では、変異株は２９４ｄｅｌまたは２９３ｄｅｌから成るアミノ酸突然変異と、位置３０７および４３４の突然変異とを組み合わせたものではない。従って、本発明の一つの実施例はポリペチドペアレントのＦｃ領域と比較して、そのＦｃ領域内に２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから選択されるアミノ酸突然変異を有する親ポリペチドに対してタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのリセプタＦｃγＲに対するＦｃ領域を有する親ポリペチドの変異株であって、親ポリペチドの変異株は位置３０７および４３４の突然変異と２９４ｄｅｌまたは２９３ｄｅｌから成るアミノ酸の突然変異とを組み合わせたものを除いたものである。
【０１４７】
本発明の他の実施例では、本発明変異株は３７８Ｖ、４３４Ｙ、３９７Ｍ、３０２Ａ、４３４Ｓ、３１５Ｄ、２３０Ｓ、３０７Ａ、２２８Ｒ、２３０／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、（２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙから選択される少なくと一つのアミノ酸突然変異とアミノ酸突然変異２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４ＹとをＦｃ領域に有する。
【０１４８】
本発明の他の実施例では、本発明変異株のＦｃ領域はＦｃ領域の２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ、２９４Ｄｅｌ／２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／２５９ｌ／３１５Ｄ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／３９７Ｍ、２９４Ｄｅｌ／３０２Ａ、２９４Ｄｅｌ／４３４Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３１５Ｄ、２９４Ｄｅｌ／２３０Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３０７Ａ、２９４Ｄｅｌ／２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／３７８Ｖおよび２９４Ｄｅｌ／４３４Ｙから成る群の中から選択される少なくとも一つの突然変異を有する野生型ＩｇＧの変異株Ｆｃの領域である。アミノ酸の番号の教え方はＥＵ指数または相当Kabatである。
【０１４９】
同様に、上記変異株は野生型Ｆｃ領域と比べてＦｃ領域の２９０から２９２までおよび２９５から３００まで位置のいずれか一つのアミノ酸突然変異を有していてもいなくてもよい。アミノ酸の番号の教え方はＥＵ指数または相当Kabatである。
【０１５０】
本発明の一つの実施例では、変異株はＣ１ｑおよび少なくとも一つのＦｃγＲに野生型Ｆｃ領域と比べて結合性が低下させることのできる２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌ以外の任意の突然変異をそのＦｃ領域に有することもできる。
【０１５１】
本発明の他の実施例では、変異株は野生型Ｆｃ領域と比べて２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌ以外の突然変異をそのＦｃ領域に有しない。
本発明の一つの実施例では、変異株のＦｃ領域はＩｇＧの野生型Ｆｃ領域に由来する。
【０１５２】
本発明の他の実施例では、変異株のＦｃ領域は２９３Ｄｅｌ，２９４Ｄｅｌ，２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ，３７８Ｖ／２９４Ｄｅｌ，４３４Ｙ／２９４Ｄｅｌ，２９４Ｄｅｌ／３９７Ｍ，２９４Ｄｅｌ／３０２Ａ，２９４Ｄｅｌ／４３４Ｓ，２９４Ｄｅｌ／３１５Ｄ，２９４Ｄｅｌ／２３０Ｓ，２９４Ｄｅｌ／３０７Ａ，２９４Ｄｅｌ／２２８Ｒ，２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ，２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙ／２９４Ｄｅｌおよび２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙ／２９４Ｄｅｌから成るＩｇＧ野生型Ｆｃ領域の変異株の群から選択される。アミノ酸の番号の教え方はＥＵ指数のＦｃアミノ酸番号または相当Kabatである。
【０１５３】
本発明の他の実施例では、変異株はＦｃ−融合タンパク質類、Ｆｃ−コンジュゲートおよび抗体から成る群から選択する。
【０１５４】
本発明の他の実施例では、変異株はキメラ免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリンおよび全長−ヒト免疫グロブリンから選択される抗体であ。免疫グロブリンはＩｇＧの中から選択するのが好ましい。
【０１５５】
本発明の他の対象は、上記定義の変異株をコードする単離された核酸にある。本発明はさらに、上記変異株をコードする核酸を有するベクターと、このベクターを有する宿主細胞とに関するものである。好ましい実施例では上記ベクターをコードする核酸は宿主細胞のゲノム中に安定して統合される。本発明はさらに、上記核酸またはそのゲノム内に安定して統合されたベクターを有するヒト以外のトランスジェニック動物にも関するものである。
【０１５６】
ｄ．本発明の変異株の使用
本出願人は、Ｆｃ領域の突然変異２９４ＤｅｌはＣ１ｑおよびＦｃγリセプタ、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲｌｌｂおよびＦｃγＲｌｌｌａに対してＦｃ変異株の親和性を著しく低下させるということを示した。これらのエフェクタ分子に対する親和性の低下はある場合には著しく大きく、Ｃ１ｑおよび／または一定のＦｃγＲへのＦｃ変異株の結合が通常のＥＬＩＳＡアッセイではインビトロで観測できない。Ｃ１ｑに対するＦｃ領域の結合はインビボでのＣＤＣの誘起にとって重要である。同様に、ＦｃγＲｌｌａおよびＦｃγＲｌｌｌａへのＦｃ領域の結合は、インビボでのＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ誘起のためのキー階段である。
【０１５７】
本発明変異株はＣ１ｑに対する親和性が低いため、親ポリペチドおよび一般に突然変異２９４Ｄｅｌまたは突然変異２９３Ｄｅｌを有しないＦｃ領域を有するポリペチドと比較して、ＣＤＣ活性を有しないか、生体内でＣＤＣ応答をほとんど誘発しないと考えられる。同様に、一定のＦｃγＲｓ（特にＦｃγＲｌｌａおよびＦｃγＲｌｌｌａ）に対する親和性が低いため、本発明の変異株はその親ポリペチドおよび一般に突然変異２９４Ｄｅｌまたは突然変異２９３Ｄｅｌを有しないＦｃ領域を有するポリペチドと比較して、ＡＤＣＣ活性を有しないか、生体内でＡＤＣＣ応答をほとんど誘発をしないと考えられる。インビトロなＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイでも同じ結果である。
【０１５８】
事実、野生型Ｆｃ領域（すなわちSEQ ID No. 1のアミノ酸配列を有するＦｃ領域）を有するＩｇＧ１のアミノ酸配列の２９４Ｄｅｌを導入することによって得られたＩｇＧ１変異株はＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を示さないか、活性が低下することを本発明者は示した。
【０１５９】
特に、野生型ＩｇＧ１と比べてＦｃＲｎに対する親和性が増加するように最初に遺伝子操作したＩｇＧ１ポリペチドでのＦｃＲｎに対する親和性を好ましく保存したまま、突然変異２９４Ｄｅｌの導入によってＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を制限することができる。
【０１６０】
例えば、突然変異２９４Ｄｅｌ／２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙを有するＩｇＧ１変異株はＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も示さないが、少なくともそのＩｇＧ１ペアレントに類似したＦｃＲｎに対する親和性を示す（実施例のセクションＩＩＩおよびのＩＶのＥＬＩＳＡおよびＳＰＲの結果参照）。
【０１６１】
同様な結果はアミノ酸突然変異２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙを有する親ポリペチドと比べて、変異株２９４Ｄｅｌ／２５９ｌ／３１５Ｄ／４３４Ｙでも得られた。
【０１６２】
本発明の変異株はそのエフェクタ活性プロフィールによって、広範囲の科学的分野にその用途を見付けることができる。本発明変異株は研究試薬、診断薬または治療薬として使うことができる。
【０１６３】
これらの用途ではＡＤＣＣまたはＣＤＣの活性化は必要ないので、例えば、本発明変異株は蛍光団または同位元素、例えばイリジウム１１１またはテクネチウム９９ｍでラベル化してインビボでのイメージングで使うことができる。
【０１６４】
治療で使用する場合には、本発明変異株を治療薬、例えば放射性核種、トキシン、サイトカインまたは酵素を標的細胞、例えば癌細胞へ運ぶために用いることができる。この場合、変異株を抗体と細胞毒剤との間のコンジュゲートにすることができる。その治療活性は細胞毒剤に依存する（例えば非特許文献３１）。
【非特許文献３１】Gilliland et al. PNAS、1980、77、4539-4543
【０１６５】
ポリペチド変異株は標的抗原を有する細胞を殺さずに標的分子のブロッキング剤または中和剤としても機能できる。また、標的分子をアゴナイズ、アンタゴナイズまたは抑制することもできる。
【０１６６】
これらの場合、標的細胞の喪失は望ましくなく、副作用とみなされる。例えば、Ｔ細胞上でＣＤ４リセプタをブロックする抗−ＣＤ４抗体の能力は抗炎症を効果的にし、ＦｃγＲｓを作る能力は標的細胞、結果的にはＴ細胞に対する免疫攻撃に向かう。また、エフェクタ機能はラジオコンジュゲート(radioconjugates)とよばれる放射性同位元素でラベル化した抗体に対する問題(イムノトキシンとよばれる)およびトキシン渡航体の抗体のコンジュゲートの問題になる。これらの医薬品は癌細胞を破壊するがＦｃγＲｓとＦｃとの干渉によって免疫細胞を作り、健康な免疫細胞に致命的なペイロード（照射またはトキシン）を与え、目標癌細胞とともに正常リンパ系組織も失われる結果になる。本発明の変異株はＣ１ｑおよび少なくとも一つのＦｃγリセプタに対する結合性を変えるが、抗原認識またはＦｃＲｎ親和性等の類似した他の機能は示すということを本発明者は示した。従って、他の重要な抗体特性、例えば抗体安定性、構造の保全またはＦｃＲｎおよびタンパクＡおよびＧのような他の重要なＦｃリガンドと相互作用能力は失わない。
【０１６７】
標的分子は任意の種類にすることができ、外因および内因性の分子を含む。標的分子（ポリペチド変異株が抗体の場合は抗原とよばれる）に制限はなく、イルス、細菌および菌類タンパク、プリオン、トキシン、酵素、膜受容器、医薬品および可溶タンパクにすることができる。
【０１６８】
膜受容器は下記にすることができるが、これらに限定されるものではない：ＲｈＤ抗原、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７１（トランスフェリンリセプタ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２４、リセプタＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）等のＥｒｂＢファミリーに属するような生長因子レセプタ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＩＧＦ−Ｒ１、ＰＩＧＦ−Ｒ、ＭＨＣクラスおよびＭＨＣクラスのＩＩ分子、例えばＨＬＡ−ＤＲ、タイプＩインターフェロン・リセプタ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−６Ｒのようなインターロイキンレセプタ、ミューレリアン（Mullerian）抑制物質タイプのＩＩリセプタのようなホルモンレセプタ、ＬＤＬ受容体、ＮＫｐ４４Ｌ、ＣＸＣＲ４のようなｃｈｅｍｏｋｉｎｅリセプタ、ＣＣＲ５、ＴＮＦＲ、ＣＤ１３７、インテグリン、ＣＤ２のような接着分子、ＩＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＧＴＰ結合タンパク質−連結リセプタ。
【０１６９】
膜タンパク質もＧＤ２、ＧＤ３、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６のような腫瘍マーカー、癌胎児性（carcinoembrionic）抗原（ＣＥＡ）、Ｔｎ、グリコプロテイン７２、ＰＳＭＡ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＤＣ細胞特異性ＢＤＣＡ−２のような他のタンパク、グルカゴン（glucagoｎ）様ペプチド（例えばＧＬＰ−１等）、酵素（例えばグルコセレブロシダーゼ、イデュロネート（iduronatｅ）−２−スルファターゼ（sulfatase）、α−ガラクトシアーゼ（galactosidase）−Ａ、アガルシダーゼ（agalsidase）αおよびβ、α−Ｌイズロニダーゼ、ブチルコリンエステラーゼ、キチナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ、ウリカーゼ、血小板活性化因子アセチル・ヒドロラーゼ、中性エンドペプチダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ等）、インターロイキンおよびサイトカイン結合タンパク（例えばＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合タンパク質等）、マクロファージ活性化因子、マクロファージ・ペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー・インヒビター、細胞壊死グリコプロテイン、イムノトキシン、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍サプレッサにすることができる。
【０１７０】
可溶タンパクには下記が含まれるが、下記に限定されるものではない：ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＦＮガンマ、ケモキンのようなサイトカイン、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦのような成育因子、ホルモン、ＦＶＩＩのような阻害抗体、転移成育因子、α−１抗トリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク−Ｅ、エリトロポエチン、高度グリコシル化エリトロポエチン、アンギオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビンレセプター活性化ペプチド、トロンボモジュリン、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルディン、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク、Ｂ細胞、リセプタ・アンタゴニスト（例えばＩＬ１−Ｒａ）、補体タンパク、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｈ因子、フィブリノゲン、因子Ｐ、ＣＳＡＰのような他のタンパク、ＣＤ１３７−リガンド、レクチン、シアル酸付加タンパク。
【０１７１】
本発明の変異株は微生物のトキシン（例えばテタヌストキシンまたは炭疽）中性化または肝炎、パピロナウイルスまたはＲＳウィルスによるウィルス感染を防止するために使うことができる。本発明の中性化変異株は中毒の場合にも使用できる。最後に、本発明の中性化変異株は癌または加齢野よる黄斑変成（degenerescence）のような他の病理の治療のためのＶＥＧＦのような自己抗原にも使用できる。
【０１７２】
本発明変異株はさらに、サイトカイン受容体、生長因子レセプタ、インテグリンのような膜受容体に用いることもできる。例えば、本発明変異株はリンパ球Ｔ増殖を抑制する抗−ＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）のような移植における免疫抑制剤として使うことができる。本発明変異株はさらに、炎症性プロセス（炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化、リウマチ様関節炎）を制限するため、例えばリウマチ様関節炎の場合のＩＬ−６リセプタのα鎖に対する抗体に用いることもできる。また、本発明変異株は癌の成長を抑制する、例えば抗−ＥＧＦＲ抗体または抗−ＨＥＲ−２レセプター抗体として用いることができる。本発明の抗−インテグリン変異株は血栓の発生抑制として、例えば激しい冠状血管遺伝的症候群または乾癬の処理に使うことができる。本発明の他の実施例では、本発明変異株を多発性硬化症の処理で使用できる。
【０１７３】
従って、本発明変異株は癌、炎症性無秩序、感染症、自己免疫性疾患または中毒を処理または防ぐための標的分子の中和、アンタゴニストまたはアゴニストとして使うことができる。
【０１７４】
「自己免疫性疾患」には、ここではアロジェニック島状移植片拒絶、脱毛症、強直性脊椎炎、抵リン脂質遺伝症候群、自己免疫アジソン病、抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）、副腎自己免疫性疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫心筋炎、自己免疫好中球減少症、自己免疫卵巣炎、自己免疫精巣炎、自己免疫血小板減少症、蕁麻疹、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、カッスルマン（Castleman）遺伝症候群、小児脂肪便症患、スプルース（spruce）-皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全遺伝症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、チュルグ−ストラウセ（Churg-Strauss）遺伝的症候群、慢性天疱瘡、ＣＲＥＳＴ遺伝症候群、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、円板状狼瘡、基本的混合クリオグロブリン血症、第ＶＩＩＩ因子欠失、線維筋痛−線維筋炎（fibromyalgia-fibromyositis）、糸球体腎炎、グラーブ（Grave）疾患、ギラン・バレー症候群、グッドパスチャー症候群、ＧＶＨ病（ＧＶＨＤ）、橋本甲状腺炎、血友病Ａ、特発の肺線維症、特発血小板減少症紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経病、ＩｇＭ多発性神経炎、免疫性性血小板減少症、若年性関節炎、川崎病、苔癬プランタス（plantus）、狼瘡、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、タイプ１真正糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺遺伝症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、一次性皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、胆汁性肝硬変症、乾癬、乾癬性関節炎、レオナルド（Reynauld）現象、ライター症候群、リウマチ様関節炎、サルコイドーシス、強皮症、スジョル源（Sjorgen）遺伝症候群、器官移植拒絶反応、遺伝的症候群、全長性エリテマトーデス、タカヤス（takayasu）動脈炎、一時性動脈炎/巨細胞動脈炎、血栓性血小板減少症紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎、な脈管炎、白斑およびワグナー（Ｗegner）肉芽腫症が含まれる。
【０１７５】
「炎症性無秩序」とは急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、激性関節炎、アジュバント関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性脈管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化、慢性細菌性またはウイルス性慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、冠状動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨変性、激性および遅延型過敏症反応関連炎症、吹出物関連炎症、末梢神経傷害または脱髄疾患、熱傷や乏血等の組織外傷関連炎症、髄膜炎、多器官外傷遺伝的症候群、肺線維症、敗血症、未分化敗血症性ショック、スティーヴンズ−ジョンソン遺伝的症候群、関節炎症、未分化脊椎関節炎を含む。
【０１７６】
「感染症」とはウィルス、バクテリア、菌類、原生動物および寄生生物等の病原に起因する疾患を含む。この感染症はアデノウィルス、サイトメガロウィルス、デング熱、Epstein-Barr、hanta、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペス・タイプＩ単純ヘルペス、タイプＩＩ単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）、風邪、はしか、お多福風邪、パポバ・ウィルス、小児麻痺、ＲＳウィルス、牛疫、ライノウィルス、ロタウィルス、風疹、ＳＡＲＳウィルス、痘瘡、ウイルス性髄膜炎を含むウィルスによって起こる。また、感染疾患はバシラスアントラシス、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）、トラコーマ病原体、ボツリヌス菌、クロストリジウムテトラニー、ジフテリア、大腸菌、レジオネラ属、ヘリコバクター属、マイコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマメシセリア、百日咳、緑膿菌、Ｓ肺炎、ストレプトコッカス、ブドウ球菌、コレラ菌（Vibria cholerae）、ペスト菌等を含むバクテリアに起因するものを含む。感染症はさらに菌類、例えばアスペルギルス‐フミガーツス Aspergillus fumigatus）、ブラストマイセス‐デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダアルビカンス、コシイオディデス（Coccidioides immitis）、クリプトコックス‐ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ‐カプスラーツム （Histoplasma capsulatum）、ペニシリウムマルネフェに起因するものがある。また、原生動物および寄生生物、例えばクラミジア、コクジディオ（kokzidioa）、ライシェマニア、マラリア、リケッチア、トリパノソーマ（trypanosoma）によって生じる感染症もある。
【０１７７】
本発明の変異株はさらに、追加の条件、例えば心臓条件、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋炎、心筋の他の条件、皮膚の条件、例えばロゼセア（rosecea）、座瘡および湿疹、硬骨および歯牙条件、例えば硬骨減失、骨粗鬆症、パジェット病、ランゲハウス（Langerhans）細胞組織球症、歯周疾患、活動停止オステオペニア、骨軟化症、単発性線維性異形成、多骨性線維骨異形成症、骨転移、骨痛管理、液性悪性高カルシウム血症、歯周再構成、脊髄損傷および骨折、ゴーシェ病のような代謝の条件、クッシング症候群のような内分泌条件、神経条件（これらに限定されない）の予防または治療に用いることができる。
【０１７８】
本発明の一実施例では、本発明の抗−ＲｈＤ変異株を赤毛猿（rhesus）不適合の治療または予防に使うことができる。
【０１７９】
他の実施例では、本発明の抗−ＣＤ２０変異株をリンパ性白血病の治療に使うことができる。
【０１８０】
他の実施例では、本発明変異株を自己免疫性疾患、例えば免疫性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、リウマチ様多発性関節炎および狼瘡エリトマトーデスの治療および／または予防に使うことができる。
【０１８１】
他の実施例では、親ポリペチドを商用抗体、抗−ＲｈＤ抗体（フランス特許第FR 09 5141 2に記載のＥＭＡＢ２（登録商標）またはＺＬＢ、チューリッヒのＭｏｎｏＲｈｏ（登録商標）または抗−ＣＤ２０（国際公開第ＷＯ２００６０６４１２１号公報参照）の中から選択できる。
【０１８２】
親ポリペチドはさらに、アバスチン（Avastin、登録商標）（抗−ＶＥＧＦ）、レミカデ（Remicade、登録商標）（抗−ＴＮＦ−α）、エルビツクス（Erbitux、登録商標）（抗−ＥＧＦＲ）、ベクティビックス（Vectibix、登録商標）（抗−ＥＧＦＲ）、ディサビリ（Tysabri、登録商標）（インテグリンの抗−α４鎖）、ヘルセプチン（Herceptin、登録商標）（抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ）であってもよい。これらに限定されるものではない。
【０１８３】
他の実施例では、変異株は膜受容器、ヒト可溶タンパク、トキシン、ウイルス性、細菌および菌類タンパク類の群の中から選択される標的分子に対する中和抗体である。
【０１８４】
本発明の変異株はＣ１ｑおよびある種のＦｃγＲｓに対する結合性が低いため、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介した免疫系の構成が治療の交換効率に重大でない条件の治療に使うのが特に適している。
【０１８５】
本発明のポリペチド変異株の投与によって副作用およびＩｇＧ介在細胞毒性を誘発する危険は大部分の抗体およびＦｃ領域に２９４Ｄｅｌまたは２９３Ｄｅｌを含まないイムノアドヘシン（immunoadhesins）より少ないと予期される。
【０１８６】
本発明のさらに他の対象は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答の誘起が望ましくない病的状態を予防または治療での本発明変異株の使用にある。
【０１８７】
本発明の他の実施例では、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答の誘起が望ましくない病的状態の予防または治療のための親ポリペチドの変異株に関するものであり、その変異株はＦｃ領域を有し、親ポリペチドと比較してタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのリセプタＦｃγＲに対する結合性が低下しており、２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌから成る群の中から選択されたアミノ酸突然変異をそのＦｃ領域内に有する。ただし、そのポリペチドペアレントのＦｃ領域と比較して、上記親ポリペチド変異株は２９４ｄｅｌまたは２９３ｄｅｌのアミノ酸突然変異と位置３０７および４３４の突然変異とを組み合わせて有することはない。Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はＥＵ指数または相当Ｋａｂａｔに従う。
【０１８８】
本発明の他の実施例は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答の誘起が望ましくない病的状態の予防または治療に用いられる親ポリペチドの変異株に関し、この変異株は親ポリペチドと比較してタンパクＣ１ｑおよび少なくとも一つのリセプタＦｃγＲに対する結合性が低下したＦｃ領域を有し、親ポリペチドのＦｃ領域と比較した時に２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄ／２９４Ｄｅｌから選択されるアミノ酸突然変異をそのＦｃ領域内に有する。ただし、上記の親ポリペチドの変異株は２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙまたは２９３Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ変異株から成るものは除く。
【０１８９】
変異株の治療効力がエフェクター細胞の活性化またはＣＤＣ活性化を必要としないときにはＡＤＣＣおよびＣＤＣ応答の誘起は望ましくない。そうした変異株には例えばブロッキングまたは中和抗体が含まれる。
【０１９０】
治療または予防にＣＤＣおよびＡＤＣＣの誘起を必要としない病的状態には移植片拒絶、自己免疫性疾患、炎症性の無秩序、感染症または癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の別の対象は本発明の変異株の、医薬組成物調製での使用にある。
【０１９１】
本発明変異株の上記使用で用いられる変異株の具体例では、親ポリペチドと比較してタンパクＣ１ｑおよびリセプタＦｃγＲｓに対する結合性が低下した、ポリペチドペアレントのＦｃ領域と比べて２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌおよび２９３Ｄｅ／２９４Ｄｅｌから選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異をそのＦｃ領域内に有する。
【０１９２】
変異株は２９４Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙまたは２９３Ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ変異株は本発明の具体例ではない。
【０１９３】
本発明の他の実施例では、本発明変異株は３７８Ｖ、４３４Ｙ、３９７Ｍ、３０２Ａ、４３４Ｓ、３１５Ｄ、２３０Ｓ、３０７Ａ、２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙから選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異と２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙのアミノ酸突然変異をＦｃ領域にさらに含む。
【０１９４】
本発明の他の実施例では、本発明変異株のＦｃ領域は、Ｆｃ領域の２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ、２９４Ｄｅｌ／２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／２５９ｌ／３１５Ｄ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／３９７Ｍ、２９４Ｄｅｌ／３０２Ａ、２９４Ｄｅｌ／４３４Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３１５Ｄ、２９４Ｄｅｌ／２３０Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３０７Ａ、２９４Ｄｅｌ／２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２９４Ｄｅｌ／３７８Ｖおよび２９４Ｄｅｌ／４３４Ｙから成る野生型ＩｇＧの変異株群の中から選択される少なくとも一つの突然変異をＦｃ領域に有する。Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はＥＵ指数または対応Kabatの数え方である。
【０１９５】
本発明の他の実施例では、変異株のＦｃ領域は２９４Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ、２９３Ｄｅｌ／２９４Ｄｅｌ、３７８Ｖ／２９４Ｄｅｌ、４３４Ｙ／２９４Ｄｅｌ、２９４Ｄｅｌ／３９７Ｍ、２９４Ｄｅｌ／３０２Ａ、２９４Ｄｅｌ／４３４Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３１５Ｄ、２９４Ｄｅｌ／２３０Ｓ、２９４Ｄｅｌ／３０７Ａ、２９４Ｄｅｌ／２２８Ｒ、２３０Ｓ／３１５Ｄ／４２８Ｌ／４３４Ｙ、２５９１／３１５Ｄ／４３４Ｙ／２９４Ｄｅｌおよび２５６Ｎ／３７８Ｖ／３８３Ｎ／４３４Ｙ／２９４Ｄｅｌから成るＩｇＧ野生型Ｆｃ領域の変異株の群から選択される。ここで、アミノ酸の数え方はＥＵ指数または対応KabatのＦｃアミノ酸の数え方である。
【０１９６】
本発明のさらに他の目的は、上記変異株を含む医薬組成物を提供することにある。上記変異株が抗体の場合、変異株はモノクローナルまたはポリクローナル抗体の形にできる。上記医薬組成物は所望純度のポリペチド変異株に任意成分の生理学滴に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合し、凍結乾燥製剤または水溶液の形にすることができる。
【０１９７】
本発明の医薬組成物は下記非特許文献３２に記載のような標準方法に従って作ることができる：
【非特許文献３２】Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Lippincott Williams & Wilkins; Twenty first Edition, 2005
【０１９８】
薬学的に許容される賦形剤は下記非特許文献３３に記載されている：
【非特許文献３２】Handbook of Pharmaceuticals Excipients, American Pharmaceutical Association (Pharmaceutical Press; 6th revised edition, 2009).
【０１９９】
患者の治療では治療有効量の変異株を投与することができる。「治療有効量」とは投与による効果が現れる服用量を意味する。正確な服用量は治療の目的に従って公知手技を使用して当業者が確認できる。その供与量は０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば０．１、１．０、１０または５０ｍｇ／ｋｇ体重手あり、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。周知のようにタンパク劣化、全身または局所デリバリの差、プロテアーゼ合成速度の他に加齢、体重、健康状態、性、ダイエット、投与時間、薬物相互作用に対して調節することが必要であり、ルーチン実験によって当業者が確認することができる。
【０２００】
変異株を含む上記医薬組成物の投与は種々の方法で行なうことができ、経口、静脈内、鼻腔内、眼口、皮下、経皮、非経口、臓器内、局所（例えばゲル）、経直腸、筋肉内、腹腔内、肺内が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０１】
本明細書に記載の変異株は他の治療、処置に付随して投与することができる。この場合の治療、処置は例えは小さな分子、他の生物学的製剤、放射線療法、外科を含むが含まれるが、これらに限定されるものではない。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０２０２】
Ｆｃ変異株をベースにしたＩｇＧ変異株の生産とこのＩｇＧの特徴
Ｉ. ２９３Ｆ哺乳類細胞でのＩｇＧ変異株の生産
I.1  ベクター構築
ヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖（Poul MA et al. Eur. J. Immunol. 25(7)：2005-2009 1 995）からのアミノ酸残基226-447（EU指数またはKabat相当）すなわちＦｃ断片（Fc226、SEQ ID No 1）を標準ＰＣＲプロトコールを使用してBamHI/Notl断片として成熟核発現ベクターpMGM05-R603（図２）にクローン化した。pMGM05-R603ベクターは、pCEP4（Invitrogen）に由来し、R603キメラ抗−ＣＤ２０抗体（LFB-R603）のＨ鎖を含む。この抗体のＬ鎖はpCEP4（pMGM01-R603）に由来する類似ベクターに挿入された。このＦｃ断片の全ての突然変異は、pMGM05-R603ベクターにオーバーラップＰＣＲで挿入された。例えば、変異株294Delはプライマの２セットのプライマーを使用して得た。第1のＰＣＲを実行するために5’プライマMG_619 5'-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3’（SEQSEQ ID No 10）と3’プライマMG_934 5’-GCTGTTGTACTGCTCCCGCGGCTT-3’（SEQSEQ ID No 11）を使用し、第２のＰＣＲでは5’プライマMG_933  5’ -AAGCCGCGGGAGCAGTACAACAGC-3’（SEQSEQ ID No 12）と3’プライマMG_621  5’ -ACTGCTCGATGTCCGTAC TATGCGGCCGCGAATTC-3’（SEQSEQ ID No 13）を使用した（BamHIおよびNotl制限サイトには下線を引いた。イタリック部分はクローン化階段で除去される非特異的テイルに対応する）。次いで、各ＰＣＲ断片画分を合わせ、得られた細長い断片をプライマMG_61 9およびMG_621を用いて標準プロトコルでＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ製品は1％（w/v）アガロースゲルで精製し、BamHIおよびNotl限定酵素で消化し、pMGM05-R603ベクターにクローン化した。突然変異を同じプライマ（MG_933およびMG_934）を用い、Quick-change Multiキット（Stratagene、La Jolia、 CA）を使用して生成させることもできる。
【０２０３】
I.2  細胞培養生産
フリースタイル（FreeStyle、登録商標）２９３Ｆ細胞（Invitrogen）をFreeStyle（登録商標） ＭＡＸ試薬（１μΙ/ml）を用い標準プロトコール（Invitrogen）を使用して等量（250ng/ml）のpMGM01-R603およびpMGM05-R603ベクターと共形質移入（co-transfected）した。細胞はポスト-トランスフェクションのために無血清培地中に懸濁して7日培養した後、細胞を１００ｇで１０分間遠心分離し、ＩｇＧを含む上澄を回収した。上澄（1ml）を滴定（I.3）し、-20℃で凍結し、ELISAで結合（binding）特性を調べた（III.1.1）。
【０２０４】
I.3  製造したＩｇＧ変異株の滴定
上記で回収した上澄中に分泌されたＩｇＧ変異株を精製済みＲ６０３抗体を標準として使用して組換えタンパクＬ（Pierce）上でELISAアッセイを使用して定量した。上澄および標準抗体をPBS/0.05％ Tween-20中に希釈し、予め0.25μgタンパクＬ／ウエルで被覆し、PBS中の5％スキムミルクでブロックしたMaxisorp immunoplates（Nunc）にテストした。37℃で1時間のインキュベーションした後、ウエルをPBS/0.05％ Tween-20で３回洗浄した。た。結合したＩｇＧ変異株をＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異）F(ab‘)２断片（Sigma）で定量した。生産されたＩｇＧ変異株（１〜４μg/ml）は精製したＲ６０３抗体で得た標準曲線を用いて定量した。
【０２０５】
II  Ｙ２Ｂ／Ｏ細胞でのＩｇＧ変異株の生産
II.1  ベクターの構築
Ｆｃ変異株2591/315D/434Y、2591/315D/434Y_294 Del、256N/378V/383N/434Yおよび256N/378V/383N/434Y_Del294はＹＢ２／０細胞株特異性抗−ＣＤ２０（Ｒ６０３）または抗−ＲｈＤ＋（Ｒ５９３）用いてＩｇＧフォーマットで調整した。ＹＢ２／０細胞株での生産力を最大にするために、重鎖およびＬ鎖のフルレングスの相補ＤＮＡと、2591/315D/434Yおよび256N/378V/383N/434Y変異株をコードするＦｃ断片とをドブネズミ(Rattus norvegicus)用コードン最適化(optimization)でネオ合成(neosynthesized)した。暗号スプライシング部位または制限サイトのような不必要なものは除去した。可変/定常結合部には制限サイト（Apalな）のみが存在した。
【０２０６】
必要な場合には下記を用いてアッセンブリーＰＣＲによって294Del突然変異を導入した：
PCR1  501bpのアンプリコンに至るDELI294P1（５’プライマ  5’−CAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGG-3’、SEQ ID NO 14）＋HCH20GA-Ascl（３‘プライマ  5’−AGCGGCGCGCCTCATCA-3’、SEQ ID NO 15）、
PCR2   541bpのアンプリコンに至るDEL294 P2（５‘プライマ  ５’ACCAAGGGCCCAAGCGTGT-3’、SEQ ID NO 17）＋HCH20GA-Apal（３‘プライマ  5’-CCCTGTAGGTGCTGTTGTACTGCTCCCGGGGCTTGGTCTTGGCGTTG-3’、SEQ ID NO 16）
PCR3  998bpのＰＣＲ製品に至るHCH20GA-AsclとHCH20GA-Apal。
【０２０７】
上記ＰＣＲ製品はAsclおよびApalで消化され、精製された979bp断片は親のＤＮＡ配列の置換で発現構造に挿入された。
【０２０８】
II.2  細胞培養生産
トランスフェクションはＹＢ２／０の安定したプールで行なった。ＹＢ２／Ｏ細胞系からの細胞をリニアーにした発現ベクターで電気穿孔（electroporate）し、ＥＭＳ媒体＋５％v/v希釈ＦＣＳ（InvitroGen）中に25,000セル/mLで希釈し、24-ウエルプレートに1ml/ウエルで分配した。３日間の細胞回収後、EMS＋５％ ＦＣＳ媒体中、最終2g/lのG418と最終１％のフェノールレッドを加え選択圧を加えた。10日間インキュベーション後、８つのP24ウエルの３つのプールを作り、細胞をＦ２５で2.105cv/mlに分割した。抗体産生はEMS＋5％ ＦＣＳ中で0.5g/l G418を用いて2〜8×105cv/mlの開始濃度でローラーボトルで実施した。最大細胞生産は５日間で得られ、上澄を回収し、FastElysa（RD Biotech）で滴定した。
抗体はプロテインＡ SepahroseタイプHiTrapプロテインＡ FF（GE-Helthcare）上で精製し、pH 3.0の25mMクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、得られた画分を中和し、４℃で一晩、pH 6.0でPBS中に透析した。
【０２０９】
精製したＩｇＧは非還元性および還元性条件下でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル濾過を用いて特徴付けし、会合物の含有量を推定した。いずれの突然変異体の場合でも、ＩｇＧは85％以上、大抵は95％以上に精製され、各ＩｇＧに対して特徴的な重鎖および軽鎖のバンドを表示した。エンドトキシンの存在を調べるために、ＬＡＬ（Limulus Amebocyte Lysate）エンドトキシンテストGel Clot法を用いて精製したＩｇＧをtestした。エンドトキシン・レベルおよび会合物の含有量が低いことから、製造された抗体は機能テストに適したものであることを証明した。
【０２１０】
III．ELISAによるＩｇＧ変異株の結合特徴
III.1  材料および方法
III.1.1  ２９３Ｆ細胞の上澄中に産生されたＩｇＧ変異株のELISAテスト
ELISAによっＩｇＧ変異株の以下のいくつかのリセプタに対する結合性をテストした：C1 q補体（Calbiochem）、ＦｃγＲl llaV1 58（R & D System）、FcRn-p3（β2ミクログロブリン鎖とバクテリフージ（bacteriphage）タンパクp3およびCVDEタンパクに溶解したα−鎖とから成る融合タンパクと呼ばれるFcRn-p3 (Popovet al, Mol. Immuno. 1 996、33:521-530に記載のハクロウイルス系で製造される）、FcγRllaR1 31（R & D System）、FcγRI（R & D System）およびFcγRIポンド（R & D System）。FcRnを除いて、ELISA検査、全てのリセプタに対してＰＢＳで実行した。FcRn/lgG結合はｐＨに依存し、ｐＨ６．０が最適であるので、FcRnではP6（100mMリン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウムｐＨ６．０）で実施した。Maxisorp immunoplatesをＰＢＳ中のO.5μg C1 q補体/ウエル、ＰＢＳ中の0.25μg ＦｃγＲlllaV158/ウエル、ＰＢＳ中0.1μ9 FcγRIまたはP6中の0.1μg FcRn-p3/ウエルで被覆した。固定ニッケルキレートプレート（Nunc）には0.01M KCI中の0.1μ9 ＦｃγＲIlaR1 31/ウエルまたは0.4g ＦｃγＲIlb/ウエルをコーティングした。4℃で一晩放置後、PBS/0.05％ Tween-20（FcRnの場合にはP6/0.05％Tween-20）で２回洗浄し、PBS/4％ BSA（またはFcRnの場合にはP6/4％BSA）で37℃で２時間飽和させた。それと並行して、上澄をＰＢＳ中に希釈し、最終ＩｇＧ濃度を0.5μg/ml（またはFcRn の結合テトスではP6中に0.3μg/mlとし、同じ濃度で室温で２時間、HRP F(ab')2ヤギ抗ヒトF(ab')2と混合する。次いで、F(ab')2-凝集ＩｇＧをC1 q、FcγRllaR1 31およびＦｃγＲlの場合には希釈なし（すなわちＩｇＧ、0.5μg/ml）で、FcγRlllaV1 58およびFcγRIの場合にはＰＢＳ中に0.25μg/mlに希釈して、FcRn-p3の場合にはP6中に0.0375μg/mlに希釈して飽和したELISAプレート上で1時間、攪拌下に培養した。次いで、プレートをTMB（Pierce）で標示させ、450nmで吸光度を測定した。
【０２１１】
III．1.2  精製したＩｇＧ変異株のELISAテスト
Y2B/0で製造したＩｇＧ変異株の下記のいくつかのリセプタに対する結合性をELISAでテストした：FcRn-p3（ＩＩ.1.1）、FcγRI（R&D System）、FcγRlllaV158（R&D System）、FcγRlllaFI58（HEK293F細胞でHis-タグ付きタンパクとして製造、PX Therapeutics）、FcγRllaR131（R&D System）、FcγRllaH131（HEK293F細胞でHis-タグ付きタンパクとして製造、PX Therapeutics）およびFcγRllb（R&D System）。ELISAテストはFcRnを除いて全てのリセプタに対してＰＢＳ中で実行した。FcRnではP6（100mMリン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、pH6.0）中で実行した。Maxisorp immunoplates（Nunc）をFcγRI、FcγRlllaV1 58、FcγRlllaFI 58およびFcγRllaH131の場合にはＰＢＳ中の100ng組換えタンパク/ウエルで被覆し、P6中では200ng のFcRn-p3/ウエルで被覆した。固定化ニッケルキレートプレート（Nunc）は0.01M KCI中の100ng ＦｃγＲIlaR131/ウエルまたは400ng FcγRllb/ウエルで被覆した。コーティング後、4℃で一晩放置した後、PBS/0.05％ Tween-20（またはFcRnの場合にはP6/0.05％ Tween-20）で2回洗浄し、37℃で2時間PBS/4％BSA（またはFcγRIの場合にははPBS/4％スキムミルクまたFcRnの場合にはP6/4％スキムミルク）で飽和させた。
【０２１２】
FcγRIIIaV158、FcγRlllaFI 58、FcγRllaR131、FcγRllaH131およびFcγRllbの結合テストのために、精製されたＩｇＧをＰＢＳ中に最終濃度２〜４μg/mlで希釈し、同じ濃度で室温で２時間、HRP F(ab‘)2ヤギ抗ヒトF(ab‘)2と混合した。次いで、ＰＢＳ中に段階的に希釈した後、F(ab‘)2-凝集ＩｇＧをゆっくり攪拌しながら1時間、飽和ELISAプレート上で30℃で培養した。各プレートでＴＭＢ（Pierce）で表示させ、450nmで吸光度を測定した。FcγRIおよびFcRnの場合には直接ELISAを実行した。精製されたＩｇＧは、4％スキムミルクと0.01％Tween 20を補給したＰＢＳ（またはFcRnの場合にはP6）中に希釈し、2時間、プレート上で培養した。次いで、細胞結合抗体を同じ緩衝液に希釈（1/2500）したHRP F(ab‘)2ヤギ抗ヒトF(ab‘)2で検出した。37℃で2時間培養後、、プレートをＴＭＢ（Pierce）で表示させ、450nmで吸光度を測定した。
【０２１３】
III.2  結果
III.2.1  ２９３Ｆ細胞の上澄で製造したＩｇＧ
各ＩｇＧ変異株に対して2つの独立した実験を実行した（生産、上澄滴定および5つのリセプタのELISA）。ELISAの結果はＩｇＧ-WTの信号に対するＩｇＧ変異株で得られた特性信号（OD450nm）の比で表した。このELISAテトスは、突然変異２９４Ｄｅｌは各親ポリペチドと比べてＣ１ｑ（比／ｌｇＧ−ＷＴ＜０．５０）およびＦｃγＲｓ（比／ｌｇＧ−ＷＴ＜０．２５）に対する変異株の結合能がドラスチックに悪くなるということを示している。これに反して、上記突然変異は、２９４Ｄｅｌを少なくともさ他の突然変異と組み合わせた変異株の場合、ＦｃＲｎ結合性は約０〜３５％減失するだけである。結果は下記［表１］および［表２］に示した。
【０２１４】
【表１】
2014519836.tif 000002
【０２１５】
【表２】
2014519836.tif 000003
［表２］は各タンパクの比を示す。
【０２１６】
III.2.2  精製済みＩｇＧでのELISAの結果
ELISA結果は、単一抗体濃度（FcγRIaおよびFcγRIIIaV158ではO.5μg/ml、FcγRlllaF158、FcγRllaR131およびFcγRIIaH131では1μg/ml、FcγRllbでは2μg/ml、FcRnでは5μg/ml）でＩｇＧ-WT（R603、キメラな抗-CD20抗体およびR593、ヒト抗-RhD+抗体）の信号に対するY2B/0細胞から得られた精製済みＩｇＧ変異株で得られた特性信号（OD450nm）の比で表した。これらELISAテストの結果はFcRnに対応する野生型ＩｇＧに比べて突然変異294Delは変異株の結合性を大きく変えないことを示している。各親ポリペチド（R603またはR593 2591/315D/434YおよびR603またはR593 256N/378V/383N/434Y）から成る変異株ＩｇＧと比較したときに、上記の突然変異は変異株259l/294Del/315D/434Yおよび256N/294Del/378V/383N/434Yの場合のFcRn結合性の約0〜30％を減失するだけである（表4）。これに対して、然変異294Delは各親ポリペチドと比べて、ＦｃγＲsを結合する変異株のキャパシティを大きく悪くする。
【０２１７】
【表３】
2014519836.tif 000004
【０２１８】
【表４】
2014519836.tif 000005
【０２１９】
IV  ＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）分析による結合特性
IV.1  材料および方法
ＩｇＧ変異株（II.2参照）と固定FcRnとの相互作用をCM5センサーチップを備えたBIAcore X100機器(Biacore、GE Healthcare)を使用してモニターした。この方法はFc-FcRn相互作用を分析するための公知方法（Popov S.et al., Mol Immunol。33(6)：521-530, 1996）と同様である。可溶性組換え型FcRnをアミン-カップリング化学反応を使用したセンサーチップのフローセル2にカップリングする。フローセルを30のμl/分の流速の0.1M N-ヒドロキシスシニミドと0.1M 3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカジボジイミドとの混合液(1:1)で3分間活性化させる。組換えヒトFcRn（5μg/ml、10mM酢酸ナトリウム中、pH 5.0）を、10μl/分で3分間、フローセル2に注入する。それによって表面密度は236レスポンスユニット（RU）になる。1Mエタノールアミン-HCI（pH 8.5）を30μI/分の速度で3分間注入して表面をずブロックする。フローセル1を FcRnなしの対象面として使用し、これもサンプルのフローセルと同様に調製した。このブランクのフローセル1からのデータをサンプル・データから差引いた。
【０２２０】
ＩｇＧ変異株は、平衡結合実験での運転緩衝液として使用したPBS/Tween-20（50mMリン酸緩衝液、pH 6.0、150mM NaCI、0.02％ NaN3、0.05％ Tween-20）で希釈した。全ての測定はＦｃ断片濃度を一般に0、8.75、35、70および200nMにして、25℃で10μΙ/分の流速で実行した。8分のデータを集め、0.05％ Tween-20を含むpH 7.5のPBSを30sパルスを用いて表面再生した。センサーグラム(Sensorgrams)を作り、ソフトウェアBIAevaluation バージョン3.1を使用して分析した。各注射で観測される平衡RUをFc濃度に対してプロットし、上記BIA評価用ソフトに含まれる運動親和性モデルを使用してプロット解析によって平衡KD値が誘びかれる。
【０２２１】
IV.2  結果
R593およびR603抗体の結合能（KD値）はそれぞれ190および99nMであった。R603のコンテキストとの対比において、259V/315D/およびR603のコンテキスのＫＤ値は259V/31/434Yの場合26nMで、pH 6.0でFcRnに対する親和性が３〜６倍増加することを示す。259V/294Del/315D/434YのKD値は28nM、R593およびR603では20nMであり、294Delはそれぞれの親ポリペチド変異株と比べてFcRnに対する親和性を余り変えないことを示している。
【０２２２】
【表５】
2014519836.tif 000006
【０２２３】
V  機能特性
V.1  材料と方法
V.1.1  抗原結合性
2×105細胞（RhD+赤血球またはRaji）を30分間の4℃で100μlの抗体で異なる濃度（0〜100μl/ml、終濃度）で培養した。洗浄後、フィコエリトリン（1：100希釈、100μl）とカップリングしたヤギ抗ヒトFcガンマでmAbsを30分間の4℃で視覚化した。細胞を洗浄し、流れ血球計算器(FC500、Beckman Coulter)で調べた。
【０２２４】
IV.1.2  ADCCアッセイ抗-RhD+
３人の個体バフィーコートからFicol Plus（Pharmacia）上の密度勾配遠心分離によって得られる単核細胞分画からリンパ球を調製した。遠心分離（15分、190g）で血小板を除去し、残った細胞をNH4CI中に溶解させる。単核細胞は37℃で/FCS25％中でプラスチックの軟組織培養フラスコに２回の連続した粘着（2×30分）に枯渇させた。単核細胞の最終百分比は全細胞数の15％以下でなければならない。非粘着リンパ球は洗浄した後、IMDM 中に8×107細胞／ml で再懸濁させた。治療濃縮物からの赤血球（グループO、Rhesus＋）をパパイン（1mg/ml）で10分間処理し、次いで食塩水で３回洗浄し、IMDM中に再懸濁した（4×107細胞/ml）。治療用IV Ig(Tegeline、LFB)からのヒト免疫グロブリン溶液をIMDM中に2 mg/mlおよび10mg/mlに希釈した。アッセイは96ウエルのミクロタイタープレート（NUNC）で実行した。培養上清または精製された抗Ｄ抗体（0.5％FCSを含むIMDM中200ng/mlで100μl）、エフェクター細胞(25μl)、赤血球（25μ赤血球（25μl）およびヒト免疫グロブリン（50μl）を湿ったC02リッチな雰囲気中で37℃で16時間培養した。エフェクタ細胞懸濁液の代わりテストした各サンプルに対してIMDMから成る非特異的リリースを培養した。プレートを遠心分離後、各ウエルに60μlの上澄を集め、60μlの2.7-ジアミノフルオロレン(diaminofluorenee)(DAF、Sigma)と混合した。5分後に、ODを620nmで測定した。赤血球（NH4Cl）の各種細胞溶解希釈度(溶解の100、75、50、25および0％に対応)で再構成した較正曲線を使用して細胞溶解のパーセントを推定した。
【０２２５】
IV.1.3  ＡＤＣＣ分析 抗−ＣＤ２０
1人の個体バフィーコートからFicol Plus（Pharmacia）上の密度勾配遠心分離によって得られる単核細胞分画からリンパ球を調製した。遠心分離（15分、190g）で血小板を除去し、残った細胞をNH4CI中に溶解させる。ネガティブセレクション単離キット（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ）を使用してＮＫ細胞を精製した。精製後の細胞は少なくとも90％ CD56+であった。PE-コンジュゲート抗-CD14、抗-CD3、抗-CD19抗体で染色された細胞は3％以下であった。上記の方法(Dall'Ozzo et al, 2003) でFCγRIIIA多相性(polymorphism)を求めた。RPMI-1 640中で培養したRajiリンパ芽Ｂ細胞（標的）に10％FCS、2mmol/lの L-グルタミンおよび1mmol/lのナトリウム・ピルベート（完全培地）を補充した。標的細胞に単クローン抗体（500-5ng/mlの範囲）の存在でエフェクタ-標的（E/T）比15/1でＮＫ細胞を混合した。ミクロプレート分光蛍光計（Tecan、Mannedorf-Zurich、スイス）を使用した蛍光定量法（Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit ref 1 1 644793001）によって上澄のLDH中のリリースを測定した。データは任意光学単位または蛍光単位（AFU）で表した。パーセント溶解度は以下の式：％溶解度= 100×(ER-SR)/(MR-SR)で計算した。ここで、ＥＲ、ＳＲ、ＭＲはそれぞれ実験リース、自生リースおよび最大リリースを表す。ＡＤＣＣ値は％ ＡＤＣＣ＝(mAbの存在下での％溶解度）-（mAbないの％溶解度）として表される。
【０２２６】
IV.1.4  ＣＤＣアッセイ
標的ASC-1細胞株を補体供給源としてのベビー・ウサギ血清（1/10に希釈）の存在下で抗-AMHRI抗体の濃度を増加させて（0〜2500ng/ml）で培養した。37℃で1時間培養した後、溶解された標的細胞によって上澄中にリリースされたLDHの量を蛍光定量機（Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit ref.11 644793001）で測定して、各抗体を介して出された補体依存性細胞毒性の百分比を計算した。パーセント細胞溶解度(リシス)は以下の式に従って計算した：％細胞溶解度＝ER-SA。ここでERは実験応答であり、SAは標的細胞を抗体なしに補体の存在下で培養した時に得られる自然活性値である。結果は抗体濃度の関数としての細胞溶解度パーセントで表した。Emax（最大リシスの百分比）およびEC50（最大リシスの50％を誘発する抗体量）はPRISMソフトウェアを使用して計算した。
【０２２７】
IV.2  結果
抗原認識テストの結果は、ｗｔ中または変異株の親の抗-RhD+ＩｇＧ１中へのDel294突然変異体の導入は、得られたＩｇＧ１変異株の抗原結合特性に影響を及ぼさないことを示している。事実、全ての抗-RhD+（R593）ＩｇＧ変異株は［表６］に示すようにRhD+ RBCs（赤血球）に結合する。
【０２２８】
【表６】
2014519836.tif 000007
【０２２９】
さらに、Feyリセプタに対する259l/294Del/5D 31/434Yおよび256N/294Del/378V/383N/434Yおよび294Del変異株の低親和性は一貫しており、これら変異株は［表７］に示すようにR593または親変異株ＩｇＧと比較してＡＤＣＣ活性を示さない。
【０２３０】
【表７】
2014519836.tif 000008
【０２３１】
さらに、Del294突然変異の導入（［表８］参照）はwt抗-CD20（R603）ＩｇＧ１またはV259l/N315D/N434Y抗-CD20（R603）ＩｇＧ１変異株の結合に影響を及ぼさない。
【０２３２】
【表８】
2014519836.tif 000009
【０２３３】
予想どおり、Ｃ１  ｑタンパクおよびＦｅγリセプタの両方に対してR603_259l/294Del/315D/434Y性およびR603_294DelＩｇＧ変異株の低親和性から見て、下記［表９］［表１０］に示すように、R603または親の変異株ＩｇＧと比較して上記変異株せＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も示さない。
【０２３４】
【表９】
2014519836.tif 000010
【０２３５】
【表１０】
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【０２３６】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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