(57)【要約】  本発明は、シスプラチンなどの白金系抗腫瘍剤およびセイヨウキョウチクトウ(Nerium oleander)などのキョウチクトウ属の種からの抽出物を含む治療用組合せ、ならびに、前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、または大腸癌などのある種の癌にかかっているヒトを含む対象を治療するために前記組合せを使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(I)白金を含む抗腫瘍剤および(II)キョウチクトウ属の種からの抽出物を含む治療用組合せ。
【請求項２】
(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果を有する量で存在する、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項３】
(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果がない量で存在する、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項４】
(I)がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびホスファプラチンからなる群より選択される、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項５】
(I)がシスプラチンである、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項６】
(II)がキョウチクトウ(ネリウム・インディクム(Nerium indicum))、セイヨウキョウチクトウ(ネリウム・オレアンデル(Nerium oleander))、およびキョウチクトウ(ネリウム・オドルム(Nerium odorum))からなる群より選択される種からの抽出物である、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項７】
(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項８】
(II)が水性抽出物である、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項９】
(II)がアロエをベースとする抽出物である、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項１０】
(I)がシスプラチンであり、(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項１１】
(I)と(II)とが別々の製剤として存在する、請求項1に記載の治療用組合せ。
【請求項１２】
癌治療を必要とする患者に、治療的有効量の請求項1に記載の治療用組合せを投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項１３】
(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果を有する量で存在する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果がない量で存在する、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
(I)がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびホスファプラチンからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
(I)がシスプラチンである、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
(II)がキョウチクトウ(Nerium indicum)、セイヨウキョウチクトウ(Nerium oleander)、およびキョウチクトウ(Nerium odorum)からなる群より選択される種からの抽出物である、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、請求項12に記載の方法。
【請求項１９】
(II)が水性抽出物である、請求項12に記載の方法。
【請求項２０】
(II)がアロエをベースとする抽出物である、請求項12に記載の方法。
【請求項２１】
(I)がシスプラチンであり、(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、請求項12に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療用組合せの(I)および(II)が、同時に、別々に、または連続的に患者に投与される、請求項12に記載の方法。
【請求項２３】
(II)が患者に筋肉内投与、舌下投与、または筋肉内および舌下投与される、請求項12に記載の方法。
【請求項２４】
(II)が患者に2回以上の投与で舌下投与される、請求項12に記載の方法。
【請求項２５】
治療される癌が前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、または大腸癌である、請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白金系抗腫瘍剤およびキョウチクトウ属の種からの抽出物を含む治療用組合せ、ならびにある種の癌にかかっている患者を治療するために前記組合せを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
より有効な癌治療方法が継続的に必要とされるので、治療される患者に対する毒性がより低い新規薬物を開発するために多大な努力が払われ続けている。その一方で、別のアプローチとして、既存の抗癌剤を他の薬物と組み合わせることによりその毒性を低下させることが試みられている。
【０００３】
シスプラチンなどの白金系抗癌剤は種々のタイプの癌の化学療法に使用されているが、それらの毒性は依然として重大な問題となっている。さらに、いくつかの腫瘍におけるシスプラチン耐性の出現のために、毒性により制限される投与量でのその有用性が低下している。これらの制限を軽減するために、シスプラチンは一般に、5-フルオロウラシルなどの、シスプラチンとは異なる器官に毒性作用を及ぼす他の薬物と組み合わせて使用される。
【０００４】
セイヨウキョウチクトウ(ネリウム・オレアンデル(Nerium oleander))抽出物は、種々の多糖およびタンパク質、ならびに抗癌活性を示すことが知られる2種の有毒な強心配糖体、オレアンドリン(oleandrin)およびオレアンドリゲニン(oleandrigenin)を含む。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一つの実施形態は、(I)白金を含む抗腫瘍剤および(II)キョウチクトウ属の種からの抽出物を含む治療用組合せである。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果を有する量で存在する、上記治療用組合せである。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果がない量で存在する、上記治療用組合せである。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、(I)がシスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、オキサリプラチン(oxaliplatin)、サトラプラチン(satraplatin)、ピコプラチン(picoplatin)、ネダプラチン(nedaplatin)、トリプラチン(triplatin)、およびホスファプラチン(phosphaplatins)からなる群より選択される、上記治療用組合せである。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、(I)がシスプラチンである、上記治療用組合せである。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、(II)がキョウチクトウ(ネリウム・インディクム(Nerium indicum))、セイヨウキョウチクトウ(ネリウム・オレアンデル(Nerium oleander))、およびキョウチクトウ(ネリウム・オドルム(Nerium odorum))からなる群より選択される種からの抽出物である、上記治療用組合せである。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、上記治療用組合せである。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、(II)が水性抽出物である、上記治療用組合せである。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、(II)がアロエをベースとする抽出物である、上記治療用組合せである。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、(I)がシスプラチンであり、(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、上記治療用組合せである。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、(I)と(II)とが別々の製剤として存在する、上記治療用組合せである。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、癌治療を必要とする患者に、(I)白金を含む抗腫瘍剤および(II)キョウチクトウ属の種からの抽出物を含む治療用組合せを投与することを含む、癌を治療する方法である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果を有する量で存在する、上記方法である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、(I)が、(II)の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果がない量で存在する、上記方法である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、(I)がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびホスファプラチンからなる群より選択される、上記方法である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、(I)がシスプラチンである、上記方法である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、(II)がキョウチクトウ(Nerium indicum)、セイヨウキョウチクトウ(Nerium oleander)、およびキョウチクトウ(Nerium odorum)からなる群より選択される種からの抽出物である、上記方法である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、上記方法である。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、(II)が水性抽出物である、上記方法である。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、(II)がアロエをベースとする抽出物である、上記方法である。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、(I)がシスプラチンであり、(II)がセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物である、上記方法である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、前記治療用組合せの(I)および(II)が同時に、別々に、または連続的に患者に投与される、上記方法である。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、(II)が患者に筋肉内投与、舌下投与、または筋肉内および舌下投与される、上記方法である。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、(II)が患者に2回以上の投与で舌下投与される、上記方法である。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、治療される癌が前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、または大腸癌である、上記方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Anvirzel(商標)、シスプラチン、および前記2つの組合せの存在下でのLNCaP前立腺癌細胞株の細胞の相対的減少を示すグラフである。
【図２】Anvirzel(商標)、シスプラチン、および前記2つの組合せの存在下でのA375黒色腫癌細胞株の細胞の相対的減少を示すグラフである。
【図３】Anvirzel(商標)、シスプラチン、および前記2つの組合せの存在下でのPANC-1膵臓癌細胞株の細胞の相対的減少を示すグラフである。
【図４】Anvirzel(商標)、シスプラチン、および前記2つの組合せの存在下でのCOLO699N肺癌細胞株の細胞の相対的減少を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、白金を含む抗腫瘍剤とキョウチクトウ属の種からの抽出物との組合せが相乗的に増大した抗腫瘍活性を示すことが見いだされた。その結果として、前記白金系抗腫瘍剤の別の方法では効果がないが良好な耐容性を示す用量が、それ自体では効果のない抽出物の投与量と組み合わされた場合に、臨床的に有用な抗腫瘍効果を及ぼす。
【００３２】
本発明の治療用組合せは、白金を含む抗腫瘍剤およびキョウチクトウ属の種からの抽出物を含む。
【００３３】
本発明の治療用組合せにおいて使用される抗腫瘍剤は任意の公知の抗癌剤もしくは抗腫瘍剤または白金を含有する薬物であってよい。非限定的な例としては、米国特許第8,034,964号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどの、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびホスファプラチンが挙げられる。これらの化合物は当業者に公知の方法により調製することができる。好ましくは、抗腫瘍剤はシスプラチンである。シスプラチンは、精巣癌、膀胱癌および卵巣癌を治療するために広く使用される2価の無機水溶性白金含有錯体である。
【００３４】
本発明の治療用組合せにおいて使用される白金系抗腫瘍剤は、当業者に公知の任意の製薬上許容される賦形剤、担体、補助剤、または希釈剤と組み合わせることができる。
【００３５】
本発明の治療用組合せにおいて使用される抽出物は、キョウチクトウ属の任意の種に由来するものであってよい。非限定的な例としては、キョウチクトウ(Nerium indicum)、セイヨウキョウチクトウ(Nerium oleander)、およびキョウチクトウ(Nerium odorum)からの抽出物が挙げられる。好ましくは、抽出物はセイヨウキョウチクトウに由来する。
【００３６】
セイヨウキョウチクトウの抽出物は当業者に公知の方法により調製することができる。前記方法としては、熱水(米国特許第6,565,897号および第5,135,745号)、室温の水および水性アルコール、特に水性メタノールおよびエタノール(米国特許出願公開第2007/0154573 A1号)、超臨界二酸化炭素(米国特許第7,402,325号)、ならびにアロエ(米国特許出願公開第2010/0092585 A1号)による抽出が挙げられる。米国特許第6,565,897号、第5,135,745号、および第7,402,325号ならびに米国特許出願公開第2007/0154573 A1号および第2010/0092585 A1号に開示されるこれらの前記抽出法は参照により本明細書に組み込まれる。Anvirzel(商標)はセイヨウキョウチクトウの熱水抽出物であり、その主成分としてオレアンドリンおよびオレアンドリゲニンを含有する。
【００３７】
本発明の組合せにおいて使用される抽出物は、当業者に公知の任意の製薬上許容される賦形剤、担体、補助剤、または希釈剤を含有することができる。例としては、マンニトール、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００３８】
好ましくは、本発明の治療用組合せはシスプラチンおよびセイヨウキョウチクトウ種からの抽出物を含む。
【００３９】
白金を含む抗腫瘍剤およびキョウチクトウ属の種からの抽出物は、本発明の治療用組合せにおいて、別々の製剤または一体化された製剤のいずれかとして存在し得る。
【００４０】
本発明の癌を治療するための方法は、癌治療を必要とする患者に白金を含む抗腫瘍剤およびキョウチクトウ属の種からの抽出物を含む治療用組合せを投与することを含む。本明細書において使用される場合、用語「患者」は癌にかかっている哺乳動物を指す。好ましい患者はヒトである。
【００４１】
白金を含む抗腫瘍剤は、キョウチクトウ属の種からの抽出物の非存在下で抗腫瘍活性の増加をもたらす効果を有する量または有しない量のいずれかで、本発明の治療用組合せ中に存在することができ、かつ本発明の方法に使用することができる。「効果を有する」量または用量は、特定の癌細胞の成長もしくは増殖を阻害する効果、腫瘍の成長を阻害する効果、腫瘍体積の増加を阻害する効果、または癌細胞もしくは腫瘍における癌治療効果をもたらす量または用量である。
【００４２】
白金を含む抗腫瘍剤は当業者に公知の任意の方式により患者に投与することができ、例えばシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンの場合には静脈内投与、サトラプラチンの場合には経口投与することができる。成人に対する典型的なシスプラチン投与量は、3日間の70〜100 mg/m2/日およびそれに続く2週間の休薬であり、これを1サイクルとする。患者は最大6サイクルの治療を受けることができるが、毒性の問題のために、大部分の患者はこのような治療に4サイクルしか耐えることができない。典型的な成人（身長170 cmおよび体重70 kg）は、1.83 m2を有し(The Journal of Pediatrics 1978 93:1:62-66; Gehan EA, George SL)、約125〜185 mgの投与量に相当する。
【００４３】
本方法において使用される抽出物は、1回投与または複数回投与のいずれかで、筋肉内投与、舌下投与、または筋肉内および舌下投与することができる。Anvirzel(商標)の通常の投与量は、筋肉内投与で0.5〜1.0 mL、舌下投与で1.0〜2.0 mL、または24時間の合計量が2 mL以下となるような筋肉内および舌下投与の組合せである。舌下のみで投与されるAnvirzel(商標)は、一連のより小さいサブドーズ、典型的には24時間あたり2〜4回の0.5 mL以下の投与に分割される。
【００４４】
医薬品において一般的であるが、本発明の治療用組合せの成分のそれぞれの治療用量は患者の状態および薬物が投与される経路により変化し得る。用量、およびおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、および応答に応じて変化するであろう。ある場合にはこれらの範囲外の投与量を使用することが必要になり得ることが当業者には明白であろう。さらに、臨床医または治療する医師は、個々の患者の応答と関連して、治療を中断、調節または終了するやり方および時点を承知するであろうことに留意されたい。用語「治療量」および「治療的有効量」は、上記の投与量および投与頻度スケジュールに包含される。
【００４５】
本発明の治療用組合せは、同時に、別々に、または連続的に患者に投与することができる。
【００４６】
本発明の治療用組合せは、あらゆるタイプの癌を治療するために本方法に従って使用することができる。例としては、前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、および大腸癌が挙げられる。
【００４７】
以下の非限定的な実施例により、セイヨウキョウチクトウ抽出物とシスプラチンとの共投与の相乗的細胞増殖抑制効果を証明する。
【００４８】
これらの実施例は本発明のある特定の実施形態を示すが、根底にある発明の概念の意図および範囲を逸脱することなく種々の部分の修正および改変をおこなうことが可能であること、および、それが本明細書に提示および説明した特定の形態に限定されないことは当業者には明白であろう。
【実施例】
【００４９】
生存率アッセイ
互いに補足する3種の異なる生存率アッセイを選択し、濃度および細胞株に依存する結果を得た。3種のアッセイは、メチルテトラゾリウム色素アッセイ、スルホローダミンB蛍光色素アッセイ、およびクリスタルバイオレット色素アッセイである。
【００５０】
メチルテトラゾリウム色素アッセイはミトコンドリアにおける酵素活性を測定する。色素前駆体が細胞により取り込まれ、そこで還元されて紫色のホルマザンを形成する。これは単にミトコンドリア活性を測定するものなので、死んだばかりの細胞もミトコンドリアにおいて低い酵素活性を有することから、必ずしも細胞自体の生死の信頼できる指標であるとは限らない。細胞内グルコース濃度、pH、およびアッセイまでの時間のすべてが測定に影響を与える。
【００５１】
スルホローダミンBおよびクリスタルバイオレットアッセイはタンパク質に関する情報を提供するものであり、メチルテトラゾリウム色素アッセイを補足するために使用された。スルホローダミンBアッセイは少数の細胞の検出に対して感度が高く、細胞数とその染色強度との間に直線関係を示す。これは培養細胞の細胞タンパク質の定量のために使用される。タンパク質に静電結合してDNAを染色する色素であるクリスタルバイオレットを使用するアッセイは、細胞の生存率を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提供する。
【００５２】
メチルテトラゾリウム、スルホローダミンB、およびクリスタルバイオレットアッセイを細胞生存率を評価するために使用した。インキュベーション時間は24時間、48時間、および72時間であった。セイヨウキョウチクトウ抽出物であるAnvirzel(商標)（Salud Integral, Hondurasより入手したセイヨウキョウチクトウの熱水抽出物）を0.01 ng/mL〜10 ng/mLの範囲の濃度で試験した。シスプラチン(Sigma, P4394)を0.1μg/mL〜100μg/mLの範囲の濃度で試験した。
【００５３】
培養の対数増殖期の間にトリプシン処理(トリプシン-0.25% EDTA, Invitrogen, 25200-072)により細胞を剥離して、ウェルあたり200μlの培地の最終体積で96ウェルプレート (Corning, Costar 359)に播種した(18.000細胞/ウェル)。培養が70〜80%コンフルエントとなった後、培地を除去し、水により希釈したAnvirzel(商標)およびN,N-ジメチルホルムアミド(Fluka, 40255)により希釈したシスプラチンを段階的濃度で細胞に加えた。24時間、48時間、および72時間のインキュベーションの後に吸光度を測定した。
【００５４】
スルホローダミンBアッセイのために、96ウェルプレートを10%トリクロロ酢酸(Fluka, 91228)により固定し、4℃で1時間インキュベートした。その後、プレートを水ですすぎ、細胞を0.4%スルホローダミンB(Sigma, 341738)により染色し、室温(RT)で15分間に渡り1%酢酸(Carlo Ebra, 401422)に溶解した。結合していない染料を1%酢酸により2回洗浄した。最後に、10 mMトリス緩衝液pH 10.5(Sigma, T6791)を加えて色素を溶解した。
【００５５】
クリスタルバイオレットアッセイのために、培地を96ウェルプレートから除去して、プレートをPBS(Sigma, P3813)によりすすいだ後、室温で20分間10%ホルマリン(MERCK, 1.04003.2500)を加えることにより細胞をすすいだ。ホルマリンを除去して、水に溶解した0.25%クリスタルバイオレット水溶液(Sigma, HT901)を室温で10分間に渡り加えた。水により洗浄することにより結合していないクリスタルバイオレットをすすぎ、最後に33%酢酸を加えて色素を溶解した。
【００５６】
メチルテトラゾリウムアッセイのために、それぞれのウェルに色素(Sigma, M2128; 5 mg/mL、リン酸緩衝食塩水により希釈したもの)を加えて、プレートを37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了後、培地を捨て、細胞をリン酸緩衝食塩水によりすすいだ。最後に、ホルマザン結晶をジメチルスルホキシド(Sigma, D4540)に溶解した。
【００５７】
各プレートの光学濃度をμQuant分光光度計により測定し、データをGen5ソフトウェアにより解析した(μQuant Biomolecular Spectrophotometer MQX200およびGen5(商標)Microplate Data Collection & Analysis software, BioTek(登録商標)Instruments.Inc, April 2008)。すべてのアッセイで570 nmの吸光度を測定し、ノイズを差し引くために第2の波長を測定した。この第2の波長は、メチルテトラゾリウムアッセイでは630 nmであり、スルホローダミンBおよびクリスタルバイオレットアッセイでは690 nmであった。
【００５８】
細胞株
ヒト癌細胞株は、European Collection of Cell CulturesによりHealth Protective Agency, UKから入手し、ヒト前立腺癌(PC3、LNCaPおよび22Rv1)、ヒト乳癌(MDA-MB 231、T47D、MCF-7)、非小細胞肺癌(CALU-1、COLO699N、COR-L 105)、大腸癌(HCT-116、HT55、HCT-15)、黒色腫(A375)、および膵臓癌(PANC-1)に由来する株が含まれた。
【００５９】
細胞を75 cm2フラスコ(Orange Scientific, 5520200, Belgium)の中で、各細胞株に対して適切な量の熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS, Invitrogen, 10106-169, California)および2 mM L-グルタミン(Sigma, G5792, Germany)を含有するそれぞれの株に対して指示された培地中で培養し、5% CO2雰囲気下、37℃でインキュベートした。
【００６０】
統計的解析
各細胞株に対してすべての処理を3回繰り返しておこなった。すべての効果の統計的有意性は、「平均値の差」の検定(p < 0.05)により評価した。
【００６１】
Anvirzel(商標)濃度は0.01 ng/mL〜10 ng/mLの範囲であり、シスプラチン濃度は0.1μg/mL〜100μg/mLの範囲であった。驚くべきことに、Anvirzel(商標)(0.01〜0.1 ng/mL)およびシスプラチン(0.1μg/mL)の両方の濃度が低い方が、高い濃度の場合（信頼できない、再現性のない結果が得られた）よりも良い結果を与えた。また、結果が時間依存性であったことが、48時間および72時間のインキュベーションの後に観察された。
【００６２】
実施例1：LNCaP細胞株
下記の表1は、細胞集団密度を吸光度データから推定した、前立腺癌由来細胞株であるLNCaP細胞を用いて得られた結果を示す。
【００６３】
クリスタルバイオレットアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は1.307（無次元量）の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(1.249)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.408に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、さらに値が0.178(p=0.00008<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００６４】
スルホローダミンBアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は2.616の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(2.667)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が1.681に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、さらに値が1.033(p=0.007<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００６５】
メチルテトラゾリウムアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は0.429の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下ではいくらか低い値(0.292)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.161に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、さらに値が0.033(p=0.005<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００６６】
表1：LNCaP前立腺癌細胞株における吸光度の統計的評価
【表１】
2014530878.tif 000002
【００６７】
表1におけるこれらの結果を図1にグラフとして描く。
【００６８】
実施例2：A375細胞株
下記の表2は、細胞集団密度を吸光度データから推定した、黒色腫由来細胞株であるA375細胞を用いて得られた結果を示す。
【００６９】
クリスタルバイオレットアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は2.791の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(2.71)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が1.304に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、値が0.178(p=0.00008<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００７０】
スルホローダミンBアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は2.836の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(2.854)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が2.421に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、さらに値が1.89(p=0.01<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００７１】
メチルテトラゾリウムアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は0.45の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(0.49)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.332に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、値が0.072(p=0.002<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００７２】
表2：A375黒色腫癌細胞株における吸光度の統計的評価
【表２】
2014530878.tif 000003
【００７３】
表2におけるこれらの結果を図2にグラフとして描く。
【００７４】
実施例3：PANC-1細胞株
下記の表3は、細胞集団密度を吸光度データから推定した、膵臓癌由来細胞株であるPANC-1細胞を用いて得られた結果を示す。
【００７５】
クリスタルバイオレットアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は0.964の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(1.04)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.753に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、値が0.283(p=0.01<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００７６】
スルホローダミンBアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は2.332の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(2.328)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が1.861に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、さらに値が1.25(p=0.002<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００７７】
メチルテトラゾリウムアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は0.546の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも同様の値(0.518)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.286に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、値が0.143(p=0.0007<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００７８】
表3：PANC-1膵臓癌細胞株における吸光度の統計的評価
【表３】
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【００７９】
表3におけるこれらの結果を図3にグラフとして描く。
【００８０】
実施例4：COLO699N細胞株
下記の表4は、細胞集団密度を吸光度データから推定した、肺癌由来細胞株であるCOLO699N細胞を用いて得られた結果を示す。
【００８１】
クリスタルバイオレットアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は0.918の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも同様の値(0.826)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.801にわずかに減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、値が0.361(p=0.01<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００８２】
スルホローダミンBアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は2.636の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下でも本質的に同じ値(2.633)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が1.975に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、さらに値が1.046(p=0.00001<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００８３】
メチルテトラゾリウムアッセイにより、48時間のインキュベーションの後、無刺激細胞は0.82の見かけの吸光度を示し、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)の存在下ではいくらか高い値(0.953)が得られた。0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合、見かけの吸光度が0.636に減少したが、0.01 ng/mLのAnvirzel(商標)および0.1μg/mLのシスプラチンが存在した場合には、値が0.058(p=0.001<0.05)に減少した。見かけの吸光度の同様の減少は、72時間のインキュベーションの後にも見いだされた。
【００８４】
表4：COLO699N肺癌細胞株における吸光度の統計的評価
【表４】
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【００８５】
表4におけるこれらの結果を図4にグラフとして描く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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