(57)【要約】  ガラクトース・プロモーターで形質転換されているコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属の組換え酵母を提供する。酵母は、好ましくはコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）であり、そしてプロモーターは、好ましくはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターである。組換えポリペプチドを産生するためのベクターおよび方法もまた提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトース・プロモーターで形質転換されている、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属の組換え酵母。
【請求項２】
ガラクトース・プロモーターが、Ｓ．セレビシエＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターより選択される、請求項１記載の酵母。
【請求項３】
Ｓ．セレビシエＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターの両方で形質転換されている、先行する請求項いずれか記載の酵母。
【請求項４】
酵母がＳ．セレビシエＧＡＬ４オペロンで形質転換されている、先行する請求項いずれか記載の酵母。
【請求項５】
酵母がＳ．セレビシエＭｉｇ１タンパク質の発現カセットを含む、先行する請求項いずれか記載の酵母。
【請求項６】
酵母がコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）である、先行する請求項いずれか記載の酵母。
【請求項７】
組換えポリペプチド産生のためのプロセスであって、コマガタエラ属の酵母において組換えポリペプチドの発現カセットを発現させる工程を含み、発現カセットがガラクトース・プロモーターに機能可能であるように連結されている、前記プロセス。
【請求項８】
酵母が請求項１〜７のいずれか一項に請求されるような酵母である、請求項７記載のプロセス。
【請求項９】
コマガタエラ属の酵母株を調製するための方法であって、ガラクトース・プロモーターを含むベクターで酵母を形質転換する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
ガラクトース・プロモーターで形質転換されている、組換えメチロトローフ酵母株。
【請求項１１】
ＧＡＬ１０プロモーターで形質転換されている、メチロトローフ酵母。
【請求項１２】
組換えポリペプチド産生のためのプロセスであって、メチロトローフ酵母において組換えポリペプチドの発現カセットを発現させる工程を含み、発現カセットがＧＡＬ１０プロモーターに機能可能であるように連結されている、前記プロセス。
【請求項１３】
酵母株を調製するための方法であって、ＧＡＬ１０プロモーターを含むベクターでメチロトローフ酵母を形質転換する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
コマガタエラ属の酵母における組換えポリペプチド発現のためのベクターであって、コマガタエラ属ゲノムに相同な領域が隣接するガラクトース・プロモーターを含む、前記ベクター。
【請求項１５】
ＧＡＬ１０プロモーターを含むメチロトローフ酵母株における組換えポリペプチド発現のためのベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母株、および酵母においてポリペプチドを発現するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタノールを炭素供給源として同化する酵母種は、すべての既知の酵母のうち明確な比率を形成する。これらの酵母の分類／名称変更は、近年、多くの変化を経てきている（概説には、Ｃ．Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００５，  （５５），  ９７３−９７６およびＪ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９，  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０２９５−００９−０６３８−４を参照されたい）。これらの「メチロトローフ」酵母は、組換えポリペプチドの産生において、特に有用であることが見出されてきている。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）として以前知られていた多くの酵母、特に、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）として知られていた酵母は、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌ）に割り当て直されており、そしてピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）として知られていた酵母は、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）に割り当て直されている。本明細書において、命名慣例は、Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９，  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０２９５−００９−０６３８−４にしたがった。
【０００３】
組換え遺伝子発現および翻訳は複雑であり、そして完全には理解されていないプロセスである。酵母などの真核生物において、組換えタンパク質の生産性に影響を及ぼす重要な要因には、プロモーター、関心対象の遺伝子のコピー数、組込み部位（組込み組換え体）、プラスミドコピー数および安定性（自己複製プラスミドに基づく系）、プレプロ配列のプロセシング、分泌リーダー、分泌能およびフォールディング能、ならびに５’−非翻訳リーダー配列の存在が含まれる。
【０００４】
メチロトローフ酵母、ピキア・パストリスの特徴的な特性の１つは、ガラクトースを含む多くの炭素供給源を同化不能である（Ｎ．Ｊ．Ｗ．  Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ  Ｒｉｊ，  Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ  ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｓｔｕｄｙ，  Ｊ．  Ｌｏｄｄｅｒ監修，  １９７０，  Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）ことであり、これは、ＧＡＬレギュロンが存在しないかまたは機能しないことを示す。本発明につながる研究の途上で、ガラクトース同化に関して「陽性」と記載されるピキア・パストリス株（ＣＢＳ９１７３およびＣＢＳ９１７５（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、オランダ・ユトレヒト））であってさえ、ガラクトースが単独の炭素供給源である培地上では増殖しないことが観察された。
【０００５】
酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＧＡＬレギュロンは、徹底的に研究され、そして性質決定されてきている。Ｓ．セレビシエのＧＡＬ１／ＧＡＬ１０遺伝子制御配列は、ガラクトースおよびグルコース両方に反応性である。制御配列は、炭素供給源としてガラクトースを利用する際に関与する酵素の発現制御を通じて、Ｓ．セレビシエにおけるガラクトース代謝の制御に関与する（Ｌｏｈｒら，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：７７７−７８７  （１９９５））。近年の進展により、異なる酵母種間のＧＡＬレギュロンの進化的側面が記載されてきており（ＳｌｏｔおよびＲｏｋａｓ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  Ｊｕｎｅ  １；  １０７（２２）：  １０１３６−１０１４１）、これは非メチロトローフ酵母ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）にＧＡＬレギュロンが存在するが、バイオテクノロジー的に重要な酵母であるピキア・パストリス、コマガタエラ・パストリスまたはハンゼヌラ・ポリモルファには存在しないことを示す。ガラクトースは、ＧＡＬ２遺伝子にコードされる特異的パーミアーゼによって、Ｓ．セレビシエ酵母細胞内に輸送されることが知られる。Ｓ．セレビシエにおけるＧＡＬレギュロン遺伝子の発現は、緊密にそして正確に制御される。ガラクトースが炭素供給源として存在すると、ＧＡＬレギュロン遺伝子の発現が活性化／増進される。細胞が炭素供給源としてのグルコース上で増殖する場合、ガラクトースがグルコースとともに存在していたとしても、グルコースがＧＡＬレギュロンのリプレッサーとして作用する。ＧＡＬ４遺伝子の産物（ＧＡＬ４ｐタンパク質）は、ＧＡＬレギュロン遺伝子の制御において重要な役割を果たし、そしてＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子の発現に関与する。天然Ｓ．セレビシエＧＡＬレギュロンにおいて、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子は、酵母によるガラクトース代謝に必要とされるタンパク質、ガラクトキナーゼ、トランスフェラーゼ、およびエピメラーゼをコードする。ガラクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．６）は、糖、ガラクトース（誘導因子）のガラクトース−１−リン酸への変換を触媒する酵素である。要約すると、天然Ｓ．セレビシエ系において、ガラクトースの非存在下では、ＧＡＬ８０タンパク質がＧＡＬ４タンパク質に結合し、そしてＧＡＬ４タンパク質がＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子の転写増進因子として作用することを防ぐ。ガラクトースが存在する場合、ガラクトースがＧＡＬ８０タンパク質に結合し、ＧＡＬ４タンパク質からのＧＡＬ８０タンパク質の解離を導く。次いで、ＧＡＬ４タンパク質は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子の各々と会合したＵＡＳＧ（ガラクトース特異的上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））に結合し、そしてＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子の転写を活性化する。
【０００６】
ＵＳ２００３／０４００４７は、ハンゼヌラ・ポリモルファ（現在、オガタエア・ポリモルファとして知られる）において、ＣＭＫ２遺伝子を発現するためのＧＡＬ１プロモーターの使用を開示する。バイオテクノロジー的に重要な酵母であるコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）（一般的にはピキア・パストリスまたはコマガタエラ・パストリスとして知られる）におけるＧＡＬ系の制御は記載されてきていない。さらに、メチロトローフ酵母において、組換えタンパク質発現のためのＧＡＬ１０プロモーターの使用は記載されてきていない。
【０００７】
酵母、ピキア・パストリスにおける炭素異化代謝産物抑制の理解は、大部分、ＡＯＸ１プロモーター系を用いた組換え系に対する影響に限定されている（例えば、ＩｎａｎおよびＭｅａｇｈｅｒ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ９２，  Ｎｏ．  ６，  ５８５−５８９．  ２００１を参照されたい）。酵母、Ｓ．セレビシエにおける異化代謝産物抑制は、徹底的に性質決定されてきており、そしてよりよく理解されている（概説には、Ｊｕａｎａ  Ｍ．  Ｇａｎｃｅｄｏ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｊｕｎｅ  １９９８，  ｐ．  ３３４−３６１を参照されたい）。Ｓ．セレビシエにおけるグルコース抑制は、ジンクフィンガータンパク質であるＭｉｇ１（ガラクトース遺伝子発現の多コピー阻害剤（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって仲介される（ＮｅｈｌｉｎおよびＲｏｎｎｅ  Ｈ，  １９９０，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ９（９）：２８９１−８））。Ｍｉｇ１タンパク質は、多くの遺伝子のプロモーターに結合し、そしてその転写を抑制する。Ｍｉｇ１タンパク質による抑制は、直接抑制、および転写活性化因子をコードする遺伝子の抑制を通じた間接的抑制の両方であると考えられている。この一例は、Ｍｉｇ１タンパク質による直接抑制、およびＳ．セレビシエ中のＧＡＬ４遺伝子の抑制を通じた間接的抑制の両方で抑制される、ＧＡＬ遺伝子である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ２００３／０４００４７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃ．Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００５，  （５５），  ９７３−９７６
【非特許文献２】Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９，  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０２９５−００９−０６３８−４
【非特許文献３】Ｎ．Ｊ．Ｗ．  Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ  Ｒｉｊ，  Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ  ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｓｔｕｄｙ，  Ｊ．  Ｌｏｄｄｅｒ監修，  １９７０，  Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ
【非特許文献４】Ｌｏｈｒら，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：７７７−７８７（１９９５）
【非特許文献５】ＳｌｏｔおよびＲｏｋａｓ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  Ｊｕｎｅ  １；  １０７（２２）：  １０１３６−１０１４１
【非特許文献６】ＩｎａｎおよびＭｅａｇｈｅｒ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ９２，  Ｎｏ．  ６，  ５８５−５８９．  ２００１
【非特許文献７】Ｊｕａｎａ  Ｍ．  Ｇａｎｃｅｄｏ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｊｕｎｅ  １９９８，  ｐ．  ３３４−３６１
【非特許文献８】ＮｅｈｌｉｎおよびＲｏｎｎｅ  Ｈ，  １９９０，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ９（９）：２８９１−８
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの側面にしたがって、ガラクトース・プロモーターで形質転換されている、コマガタエラ属の組換え酵母を提供する。
本発明のさらなる側面にしたがって、組換えポリペプチド産生のためのプロセスであって、コマガタエラ属の酵母において組換えポリペプチドの発現カセットを発現させる工程を含み、発現カセットがガラクトース・プロモーターに機能可能であるように連結されている、前記プロセスを提供する。
【００１１】
本発明の別の側面にしたがって、酵母株を調製するための方法であって、ガラクトース・プロモーターを含むベクターでコマガタエラ属の酵母を形質転換する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらにさらなる側面にしたがって、コマガタエラ属の酵母における組換えポリペプチド発現のためのベクターであって、コマガタエラ属ゲノム、好ましくはアルコールオキシダーゼ遺伝子、そして最も好ましくはコマガタエラ・ファフィのＡＯＸ１遺伝子に相同な領域が隣接するガラクトース・プロモーターを含む、前記ベクターを提供する。
【００１３】
コマガタエラ属ゲノムに相同な領域が存在することによって、ガラクトース・プロモーターを含むベクターが、コマガタエラ属ゲノム内に取り込まれることが可能になる。適切な相同領域を選択することによって、効果的に転写されることが知られる部位への組込みが可能になる。あるいは、酵母自己複製配列、または発現系を含有する酵母ＤＮＡプラスミドもまた使用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のこれらの側面において使用可能なコマガタエラ属の酵母には、限定されるわけではないが、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィおよびコマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。コマガタエラ・ファフィが特に好ましい。使用可能なコマガタエラ属株の例には、ＡＴＣＣ  ７６２７３、２８４８５、２０１９４９および２０８６４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国バージニア州マナサス）；  ＮＣＹＣ  １７５（基準株、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国ノーウィッチ）；  ＧＳ１１５、ＫＭ７１およびＸ３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）；ならびにＣＢＳ９１７３およびＣＢＳ９１７５（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、オランダ・ユトレヒト）が含まれる。コマガタエラ・パストリスの好ましい株は、ＮＲＲＬ  Ｙ−１６０３と称されるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能な株、またはＣＢＳ７０４と称されるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから入手可能な株である。コマガタエラ・ファフィの好ましい株は、ＮＲＲＬ  Ｙ−７５５６と称されるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能な株、またはＣＢＳ２６１２と称されるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから入手可能な株である。コマガタエラ・シュードパストリスの好ましい株は、ＮＲＲＬ  Ｙ−２７６０３と称されるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能な株、またはＣＢＳ９１８７と称されるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから入手可能な株である。本発明の多くの態様において、最も好ましい酵母は、ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０と称されるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なコマガタエラ・ファフィ株、またはＣＢＳ７４３５と称されるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから入手可能なコマガタエラ・ファフィ株である。
【００１５】
本発明で使用可能なガラクトース・プロモーターには、サッカロミセス・セレビシエＧＡＬレギュロン由来のプロモーター、そして特にＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターが含まれる。好ましくは、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０の組み合わせがプロモーターとして使用される。特定の態様において、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターは、異なる転写方向に配向される。ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターの両方を使用する場合、いずれか、そして特にＧＡＬ１０が、ポリペプチドの単一発現カセットに機能可能であるように連結されてもよい。いくつかの態様において、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターは、異なるポリペプチド、例えば抗体断片の重鎖および軽鎖の発現カセットに、機能可能であるように連結されてもよい。他の態様において、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターは、同じタンパク質の発現カセットに、機能可能であるように連結されてもよい。こうした態様において、使用するタンパク質をコードする遺伝子は、潜在的な不安定性を回避するために、最も好ましくは異なる遺伝子である。
【００１６】
特定の非常に好ましい態様において、ガラクトース・プロモーター、ならびに好ましくはＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターの両方を、サッカロミセス・セレビシエＧＡＬ４オペロンと組み合わせて使用する。
【００１７】
関連する態様において、メチロトローフ酵母ゲノム、好ましくはアルコールオキシダーゼ遺伝子、そして最も好ましくはコマガタエラ・ファフィのＡＯＸ１遺伝子に相同な領域が好ましくは隣接した、ＧＡＬ１０プロモーターを含む、メチロトローフ酵母株において組換えポリペプチドを発現するためのベクター、あるいは酵母自己複製配列または酵母ＤＮＡプラスミドを含むベクター、ＧＡＬ１０プロモーターで形質転換されている組換えメチロトローフ酵母、メチロトローフ酵母において組換えポリペプチドの発現カセットを発現させる工程を含み、発現カセットがＧＡＬ１０プロモーターに機能可能であるように連結されている、組換えポリペプチド産生のためのプロセス、およびＧＡＬ１０プロモーターを含むベクターでメチロトローフ酵母を形質転換する工程を含む、酵母株を調製するための方法を提供する。
【００１８】
本発明のこれらの関連態様において使用可能なメチロトローフ酵母には、限定されるわけではないが、メタノール上で増殖可能な酵母、そして特に、コマガタエラ属およびオガタエア属のメンバーが含まれる。好ましい酵母には、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ・シュードパストリスおよびオガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（ピキア・アングスタとしても知られる）が含まれる。コマガタエラ・ファフィが特に好ましい。使用可能な酵母の例には、本発明の第一の側面に関して、上に列挙するコマガタエラ属のものが含まれる。
【００１９】
本発明で使用するベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性マーカー、例えばカナマイシンまたはゼオシン耐性、あるいは栄養要求マーカー、例えば非形質転換宿主株が合成不能なアミノ酸を合成する能力を与える遺伝子を含む。選択可能マーカーの例は当該技術分野に周知である。
【００２０】
本発明の特定の態様において、ベクターおよび宿主株は、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎなどのオペレーター配列を含む。多くの例では、１、２または３のオペレーターが存在する。いくつかの態様において、オペレーター配列は、転写開始点と重複する。好ましくは、オペレーター配列（単数または複数）は、完全なパリンドローム配列であり、特に配列ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣである。２またはそれより多いオペレーターが存在する場合、オペレーターの２つは、好ましくは８５〜１５０塩基対離れており、好ましくは９０〜１２６塩基対離れており、そして最も好ましくは９１または９２塩基対離れている。オペレーター配列は、ポリペプチドの発現カセットに機能可能であるように連結されたガラクトース・プロモーターの上流または下流に位置してもよく、そして特定の例では、少なくとも１つのオペレーターがポリペプチドの発現カセットに機能可能であるように連結されたガラクトース・プロモーター上流に位置し、そして少なくとも１つのオペレーターが下流に位置してもよい。ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターが、異なる転写方向に配向されて使用され、そして各々がポリペプチドの発現カセットに機能可能であるように連結されている場合、オペレーター配列は、各プロモーターの下流に位置してもよい。
【００２１】
オペレーター系は、一般的に、適切なリプレッサー配列とともに使用されることが認識されるであろう。リプレッサー配列は、リプレッサータンパク質を産生し、例えばｌａｃオペレーターを用いる場合はｌａｃＩ遺伝子配列である。他のｌａｃリプレッサー配列もまた使用可能であり、例えばｌａｃＩＱ配列を用いて、ｌａｃリプレッサータンパク質レベルを増加させてもよい。リプレッサー配列はまた、宿主細胞ゲノムによって、またはさらなる適合性プラスミドを用いることによって、提供されてもよい。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明のベクターは、存在してもよい任意のオペレーター配列と会合するものに加えて、またはその代替として、リプレッサータンパク質の発現カセットを含む。１つの好ましい例は、サッカロミセス・セレビシエＭｉｇ１タンパク質を発現するカセットである。Ｍｉｇ１タンパク質の発現を仲介する炭素供給源、例えばグルコースを含むフィードの存在下で、Ｍｉｇ１タンパク質は、ＧＡＬ１プロモーターに調節される発現カセットの発現を阻害するよう働く。フィードを調整して、Ｍｉｇ１を仲介する炭素供給源を、Ｍｉｇ１発現を抑制する炭素供給源と交換するか、またはＭｉｇ１発現を抑制する炭素供給源を優勢にすると、ＧＡＬ１プロモーターに調節される発現カセットの阻害が減少する。したがって、Ｍｉｇ１などのリプレッサータンパク質のこうした発現カセットの存在は、ターゲット組換えポリペプチドの発現を調節するオプションを提供する。特定の態様において、ＧＡＬ４オペロンを使用する場合、Ｍｉｇ１タンパク質発現の仲介または抑制を使用して、ＧＡＬ４オペロンの発現効果を調節してもよい。
【００２３】
本発明で使用するベクターはまた、１またはそれより多い、宿主ゲノムＤＮＡに相同な核酸配列である挿入可能核酸配列も含んでもよい。こうした配列は、宿主ゲノムの望ましい位置でのベクターの組込みを達成するよう選択され、そして例は当該技術分野に周知であり、アルコールオキシダーゼ遺伝子配列、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子配列、ｐ４０遺伝子配列およびＨＩＳ４遺伝子配列が含まれる。
【００２４】
本発明のベクターはまた、例えば構造遺伝子またはカセットの挿入を容易にする、１またはそれより多い挿入部位、例えば、ポリリンカー部位；終結配列、特に３’終結配列、ならびに細菌宿主におけるこれらのベクターの増幅および維持を可能にする細菌プラスミドＤＮＡおよび／またはバクテリオファージＤＮＡも含んでもよい。
【００２５】
本発明のベクターは、当該技術分野に知られる方法、例えば所望のヌクレオチド配列の遺伝子合成によって、そして／または適切な挿入部位を含むベクター内への構成要素の連結によって、組み立てられる。
【００２６】
メチロトローフ酵母は、当該技術分野に知られる方法、例えば化学的形質転換、エレクトロポレーションおよびスフェロプラスト融合によって、本発明記載のベクターで形質転換される。
【００２７】
本発明記載のベクターで形質転換される株は、一般的に、ベクター上に存在する任意の選択マーカーに適した方法によって、例えば、存在しない栄養素の合成を選択可能マーカーが可能にする場合、栄養要求宿主株に関する所定の栄養素の非存在下で培養することによって、あるいは抗生物質耐性マーカーを使用する場合、所定の抗生物質の存在下で培養することによって、選択される。
【００２８】
発現系は、使用する細胞に関して当該技術分野に周知の方法によって発現される。好ましい発現法には、特に発酵によって、増殖培地中で組換え細胞を培養し、そして次いで、発現されたタンパク質を回収する工程が含まれる。用語「増殖培地」は、組換え細胞を増殖させるために用いる栄養培地を指す。多くの態様において、栄養溶液を使用する。所定の組換え細胞に適した増殖培地が当該技術分野に周知である。本発明の特定の態様において、増殖培地は、グルコース、ガラクトース、スクロースおよびソルビトールからなる群より選択される糖を含む。望ましい場合、さらなる炭素供給源、例えばメタノールを使用してもよい。
【００２９】
本発明記載のベクターの発現のための、そして例えば組換えポリペプチドの性質に依存した、条件、特にフィードおよび増殖条件は、望ましい実行基準を達成するために多様でありうることが認識されるであろう。例えば、いくつかの例において、ポリペプチドのより高い全体収量は、宿主細胞の培養を通じて、組換えポリペプチドの発現を支持することによって達成可能である。他の場合、望ましい細胞密度を達成するまで、組換えポリペプチドの発現を抑制し、そして次いで、例えば炭素供給源を調整し、そして／またはオペレーター配列の性質に適した誘導因子、例えばＩＰＴＧを添加することによって、発現を脱抑制し、そしてまたは誘導することによって、より高い収量を達成可能である。本発明の特定の好ましい態様において、抑制は、グルコースを含むフィード溶液を優勢なまたは単独の炭素供給源として維持し、そして次いで、望ましい時点で、グルコースを代替炭素供給源、例えばスクロース、ソルビトールまたは好ましくはガラクトース、あるいはその組み合わせと交換し、そして／または誘導因子を添加することによって、抑制を達成する。
【００３０】
本発明は以下の実施例によって、限定なしに例示される。
【実施例】
【００３１】
比較実施例１
ガラクトース上でのコマガタエラ属酵母株の増殖
各々、一般的にピキア・パストリスまたはコマガタエラ・パストリスとして知られる株、ＡＴＣＣ  ７６２７３、２８４８５、２０１９４９および２０８６４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国バージニア州マナサス）；  ＮＣＹＣ  １７５（基準株、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国ノーウィッチ）；  ＧＳ１１５、ＫＭ７１およびＸ３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）の増殖を、当該技術分野においてよく確立されているように、最小寒天プレート（リン酸緩衝液、酵母窒素原礎培地、ビオチン、ヒスチジン、および主な炭素供給源としてのグルコースまたはガラクトースいずれか）上、２つ組でストリークプレーティングすることによって、調べた。プレートを２５〜３０℃で７２時間インキュベーションした。増殖を記録し、そして培養を、さらに２回、連続して、上記のような新鮮な培地上に再度ストリークプレーティングして、増殖が、提供された炭素供給源に関連するものであり、そして出発ストック培養由来の栄養素を持ち越したのではないことを確実にした。株はいずれも、単独の炭素供給源としてガラクトースを含有する最少培地上では増殖しなかった。グルコースを含有する最少培地上では、すべての株で集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）増殖が観察された。
【００３２】
コマガタエラ属株によるガラクトース代謝が存在しないことをさらに確認するため、ＡＰＩ５０ＣＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ、フランス・マルシーレトワール）試験ストリップを用いることによって、ガラクトースを同化する能力に関して、これらの株を試験した（当該技術分野でよく確立されているように）。試験した８つのコマガタエラ属宿主株は、ガラクトース代謝に関して陰性の試験結果を生じた。
【００３３】
得た結果によって、試験したコマガタエラ属宿主株はいずれも、単独炭素供給源としてのガラクトース上では代謝することもまた増殖することも不可能である一方、予期されるように、すべての宿主株は、主な炭素供給源としてグルコースを含有する培地上で、よく増殖する（対照）ことが示された。
【００３４】
比較実施例２
プレート上、ガラクトース上でのＧａｌ陽性ピキア属酵母株の増殖
コマガタエラ（ピキア）・パストリス株ＣＢＳ９１７３およびＣＢＳ９１７５（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、オランダ・ユトレヒト）は、オンラインのＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅデータベース（ｗｗｗ．ｃｂｃ．ｋｎａｗ．ｎｌ、２０１１年５月２７日にアクセス）に、炭素供給源としてのガラクトースの同化に関して、陽性（「ｗ」、弱いＣＢＳ９１７３、「＋」、陽性ＣＢＳ９１７５）と記載されている。実施例１に記載するように、単独の炭素供給源としてのガラクトース上で増殖する能力に関して、両方の宿主株を試験した。
【００３５】
ＣＢＳ９１７３およびＣＢＳ９１７５株はどちらも、ガラクトースを含有する培地上で有意な増殖を示さず、ＣＢＳ９１７３（ＣＢＳ−ＫＮＡＷデータベースにおいて、「弱い」増殖と示される）およびＣＢＳ９１７５（ＣＢＳ−ＫＮＡＷデータベースにおいて、「陽性」増殖と示される）の間に有意な相違はなかった。
【００３６】
ＣＢＳ−ＫＮＡＷデータベースにおけるデータを前提とすると、驚くべきことに、単独炭素供給源としてガラクトースを含む最少培地上ではどちらの株に関しても増殖は観察されず、単独の炭素供給源としてグルコースを含む同じ培地中の両方の株の増殖に比較して、これらの間に相違はなかった。
【００３７】
比較実施例３
液体中、ガラクトース中でのＧａｌ陽性コマガタエラ属酵母株の増殖
液体中の株ＣＢＳ９１７３およびＣＢＳ９１７５の増殖を調べた。各株の１ｍｌ凍結ストック培養を融解し、そしてこれを用いて、３Ｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中、６００ｍｌのＹＮＢ＋Ｇｌｙブロス（１．５ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、１２ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、２．７ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、３２ｇ／Ｌグリセロール）、ｐＨ５．０に接種した。フラスコを２８〜３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間インキュベーションした。細胞を採取し、そして無菌１／４リンゲル溶液中で洗浄し、そしてこれを用いて、２５０ｍｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中、５０ｍｌの新鮮なＹＮＢ＋Ｇｌｙブロスおよび１％ガラクトースを補充したＹＮＢ（ＹＮＢ＋Ｇａｌ）に接種した。フラスコを上述のようにインキュベーションした。定期的な間隔で試料を採取し、増殖を測定した（光学密度ＯＤ６００）。結果によって、ＣＢＳ９１７３またはＣＢＳ９１７５のいずれも、単独炭素供給源としてガラクトースを含む増殖培地中では増殖しないことが示された。インキュベーション終了時（３３６時間）のＹＮＢ＋Ｇａｌフラスコ由来の各培養のアリコットを新鮮なＹＮＢ＋Ｇｌｙ培地（２５０ｍｌフラスコ中５０ｍｌ）に移し、そして上述の条件下で５日間インキュベーションした。どちらの株もよく増殖した（ＯＤ６００＝１３〜１７）ことから、ガラクトース含有培地中でインキュベーションした際、株は増殖しないが、細胞生存度を維持するため、利用可能な炭素供給源を含有する培地に株を移すと、増殖が回復する／観察されることが確認された。
【００３８】
総合すると、比較実施例１〜３に記載する結果は、コマガタエラ・パストリス株がガラクトースを代謝せず、そしてしたがってガラクトースが単独の炭素供給源である増殖培地中では増殖しないという驚くべき観察を明らかに立証する。
【００３９】
実施例４
ベクター構築
ヒト血清アルブミン（ｈ−ＳＡ（配列番号４）、接合因子α分泌リーダー配列（ＭＦα）を含む）の遺伝子が修飾ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０（ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０）プロモーターの下流にクローニングされているベクターを構築した（配列番号１）。ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを修飾して（ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０）、完全パリンドロームＬａｃオペレーター配列を含ませた（配列番号１の６４８〜６６７位）。細胞において、ＬａｃＩリプレッサー遺伝子が存在せず、そしてしたがってＬａｃＩリプレッサータンパク質が存在しない場合、ＬａｃＩリプレッサータンパク質の結合は完全パリンドロームＬａｃオペレーター部位で生じえない。ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０プロモーター配列を含有する配列番号１をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてやはりＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化されたｈ−ＳＡ断片（配列番号２）をｍＧＡＬ１０プロモーター下流にクローニングした（０１４２−１−２）。次いで、この断片を、ゼオシン耐性マーカーおよびピキア・パストリス５’ＡＯＸ領域を含有するベクター（配列番号３）に連結した。配列番号３をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして０１４２−１−２をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化した。２つの断片を一緒に連結し、そして次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ−ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。当該技術分野においてよく確立されているように、制限消化によって組換えプラスミドをスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定によって、真正性を確認した。ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系を用いてｈ−ＳＡを発現する、生じたプラスミドを、ｐＡＶＥ２９７と名付けた。
【００４０】
ヒト血清アルブミンの遺伝子（天然ｈ−ＳＡリーダーを含むｈ−ＳＡ（配列番号６））をＮｄｅＩ／ＸｍｎＩ／ＰｓｉＩ断片として、ｐＡＶＥ２９７のＮｄｅＩ／ＸｍｎＩ断片内にクローニングした。遺伝子配列は２つのＸｍｎＩ部位を有し、そしてＰｓｉＩは、望ましくない断片を半分に「切断する」ため、配列番号６は、ＰｓｉＩで「切断」されていることに注目されたい。制限消化によって組換えプラスミドをスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定によって、真正性を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３２６と名付けた。ベクターｐＡＶＥ３２６は、酵母コマガタエラ属のゲノム内に組み込まれた際、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系を用いて、ｈ−ＳＡを発現／分泌するよう設計されている。
【００４１】
当該技術分野においてよく確立されているように、大腸菌ＬａｃＩ遺伝子を、ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、ＭｆｅＩ／ＢｇｌＩＩで消化したプラスミドｐＡＶＥ２９７内にクローニングした。制限消化によって組換えプラスミドをスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定によって、真正性を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３０４と名付けた。驚くべきことに、ＤＮＡ配列決定は、ｐＡＶＥ３０４中のＬａｃＩ遺伝子配列が、クローニング中に一部切除され（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、そしてしたがって、一部切除遺伝子によって産生されるＬａｃＩリプレッサータンパク質がおそらく機能しないことを示した。ＬａｃＩ遺伝子を再設計し、そして次いで、合成大腸菌ＬａｃＩ遺伝子（配列番号５）を、ＢｔｓＩ／ＳｓｐＩ断片として、ｐＡＶＥ３０４のＢｔｓＩ／ＳｓｐＩ断片内にクローニングした。
【００４２】
制限消化によって組換えプラスミドをスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定によって、真正性を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ５０６と名付けた。ベクターｐＡＶＥ５０６は、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系を用いてｈ−ＳＡを発現／分泌するよう設計されており、発現抑制調節は、ＧＡＬ１０プロモーター（ｍＧＡＬ１０）内の完全パリンドロームＬａｃオペレーター配列、および酵母コマガタエラ属のゲノム内に組み込まれた際に完全パリンドロームｌａｃオペレーター部位にＬａｃＩリプレッサータンパク質が結合することによって、提供される。
【００４３】
合成ＧＡＬ４遺伝子をＧＡＬ４天然プロモーターと一緒に設計し（配列番号７）、そしてこれを、ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片として、ベクターｐＴＥＦ−Ｂｓｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片内にクローニングした。ベクターｐＴＥＦ１／Ｂｓｄは、ＣＹＣ１転写終結配列のすぐ上流のＥＭ７細菌プロモーターまたはＳ．セレビシエＴＥＦ１プロモーターいずれかから発現されるブラスチシジン耐性遺伝子を含有する。該ベクターにはまた、大腸菌中で増殖させるため、ｐＵＣ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子も含まれる。制限消化によって組換えプラスミドをスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定によって、真正性を確認した。抗生物質カナマイシンを用いた耐性／選択のための遺伝子（配列番号８）を、ＮｃｏＩ／Ｅｃｏ５３ＫＩ断片として、このプラスミドのＮｃｏＩ／ＳｔｕＩ断片内にクローニングした。制限消化によって組換えプラスミドをスクリーニングし、そしてＤＮＡ配列決定によって、真正性を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３４５と名付け、これは、配列番号９に提供する配列を有した。ベクターｐＡＶＥ３４５は、酵母コマガタエラ属ゲノム内に組み込まれた際、ＧＡＬ４「アクチベーター」タンパク質を恒常的に発現するように設計されている。
【００４４】
ｐＡＶＥ３５５の生成の出発ベクターは、ベクターｐＴＥＦ１／Ｂｓｄであった（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）。ベクターｐＴＥＦ１／Ｂｓｄは、ＣＹＣ１転写終結配列のすぐ上流のＥＭ７細菌プロモーターまたはＳ．セレビシエＴＥＦ１プロモーターいずれかから発現されるブラスチシジン耐性遺伝子を含有する。該ベクターにはまた、大腸菌中で増殖させるため、ｐＵＣ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子も含まれる。ブラスチシジン耐性遺伝子を、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングされた合成カナマイシン耐性遺伝子で置き換えた。ＤＮＡ配列を提供する（配列番号１０）。連結混合物を大腸菌クローニング宿主株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換体の最初のスクリーニングは、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩを用いた制限消化によった。ＤＮＡ配列決定によって、配列の真正性を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３５５と名付けた。コマガタエラ属ＧＡＰプロモーターの調節下の合成Ｓ．セレビシエＭｉｇ１遺伝子（配列番号１１）を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてベクターｐＡＶＥ３５５にクローニングして、ベクターｐＡＶＥ３５９を生成した。ベクターｐＡＶＥ３５９は、コマガタエラ属ゲノム内に組み込まれた際、Ｍｉｇ１タンパク質を恒常的に発現するよう設計されている。
【００４５】
実施例５
酵母宿主株の形質転換
以下の方法を用いて、ゲノム内に適切な発現ベクターカセットが組み込まれた組換えコマガタエラ属クローンを生成した。当該技術分野においてよく確立されているように、コマガタエラ属宿主ゲノム内への発現ベクター組込みは、（常にではないが）主に、ゲノム内への組込み部位での発現カセットのコピー数に関連した、発現レベルの相違を示す、クローンを産生する。次いで、関心対象のターゲット／望ましい遺伝子の生産性に関して、クローンをスクリーニングする。非組換えコマガタエラ属宿主株を、２５０ｍｌコニカルフラスコ中、５０ｍｌ体積の無菌ＹＰＤブロス（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌデキストロース）内に接種し、そしてフラスコを、軌道振盪インキュベーター中、１６〜１７時間または増殖（培養光学密度を測定することによって決定）が１．３〜１．５のＯＤ６００ｎｍに到達するまで、３０℃でインキュベーションした。次いで、この培養（０．１〜０．５ｍｌ）を用いて、２Ｌコニカルフラスコ中、５００ｍｌ体積の新鮮なＹＰＤブロスに接種して、そして上述のようにインキュベーションした。細胞を採取し、そして＋４℃、１５００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを５００ｍｌの氷冷（０℃）無菌水中に再懸濁し、そして上述のように再度遠心分離して、そして細胞ペレットを２５０ｍｌの氷冷（０℃）無菌水中で再度、再懸濁した。この細胞懸濁物を、上述のように再度遠心分離して、そして細胞ペレットを２０ｍｌの氷冷（０℃）１Ｍソルビトール溶液中に再懸濁した。ソルビトール溶液中の細胞懸濁物を上述のように再度遠心分離して、そして細胞ペレットを１ｍｌの氷冷（０℃）中に再懸濁した。
【００４６】
１Ｍソルビトール溶液、８０μｌの細胞懸濁物を２０〜４０μｇの直鎖化ベクターＤＮＡ（５〜１０μｌ無菌水中）と混合し、そしてこれらをあらかじめ冷却した（氷冷（０℃））０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し、そしてキュベットを氷上で５分間インキュベーションした。
【００４７】
当該技術分野においてよく確立されているように、細胞をエレクトロポレーションすることによって、ＤＮＡの形質転換を行った（１５００Ｖ充電電圧、２５μＦキャパシタンス、２００Ω抵抗）。エレクトロポレーション直後、１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトール溶液をエレクトロポレーションキュベットに添加し、そしてキュベットの内容物を無菌１５ｍｌ試料試験管に移し、そして３０℃で（静置）１〜２時間インキュベーションした。インキュベーション後、当該技術分野においてよく確立されているように、ソルビトールおよび適切な濃度の選択抗生物質（発現ベクターに含まれている選択マーカーに基づく）を補充したＹＰＤ寒天プレート上に、エレクトロポレーション後の混合物をプレーティングした。コロニーが形成されるまで、プレートを３〜１０日間、３０℃でインキュベーションした。ソルビトール／選択抗生物質を補充したＹＰＤ寒天上に、個々のコロニーを再度ストリークして、単一クローン性を確立し、そして選択抗生物質に対する耐性を再確認した。形質転換体組込みクローンをさらに拡大して、当該技術分野においてよく確立されているように、グリセロールストック凍結バイアル（１ｍｌ、−７０℃で保存）を産生した。構築した株の説明を表１に提供する。クローンの性能は、以下に提供する実施例中に記載され、ここで、組換え株命名、例えばＣＬＤｘｘｘは宿主株および発現ベクター、例えばｐＡＶＥｙｙｙの組み合わせを示す。第二の発現カセット（例えばｐＡＶＥｙｙｙ）を組換え株（例えばＣＬＤｘｘｘ）に形質転換する場合、生成される新規の株は、ＣＬＤｘｘｘｐＡＶＥｙｙｙと示される。形質転換由来の個々のクローンを、単位名称（ｄｅｎｏｍｉｎａｔｉｏｎ）ＣＬＤｘｘｘ−０１、−０２、−０３、−０４等によって記載する。
【００４８】
表１：組換え株
【００４９】
【表１】
2014522663.tif 000002
【００５０】
＊ＮＲＲＬ１１４３０＝コマガタエラ・ファフィ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国イリノイ州ペオリア）。
【００５１】
実施例６
ＣＬＤ３９０およびＣＬＤ３９１のクローンの凍結グリセロールストックを融解し、そして２０ｇ／Ｌグルコースを補充した５０ｍｌ  ＹＰブロス（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）内に個々に接種した。フラスコから定期的にサンプリングし、そして当該技術分野においてよく確立されているように、増殖（ＯＤ６００）およびｈ−ＳＡ分泌（ＥＬＩＳＡ）を測定することによって、増殖およびｈ−ＳＡ分泌を測定した。記載する条件下で、フラスコを１２０時間インキュベーションした。ｈ−ＳＡ体積力価を表２に提示する。
【００５２】
表２：体積ｈ−ＳＡ力価
【００５３】
【表２】
2014522663.tif 000003
【００５４】
驚くべきことに、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０プロモーター系を用いて、ｈ−ＳＡ（天然ｈ−ＳＡ分泌リーダーを用いる）の恒常的発現および分泌が示された。これは、組換えタンパク質発現のための酵母コマガタエラ属におけるＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系の最初の実証であり、そして増殖研究（実施例１〜３に記載）が、コマガタエラ属株がガラクトースを代謝または同化しないことを明らかに示し、そしてしたがって、一般の当業者はコマガタエラ属株はＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系の活性を支持するために必要な機能性要素／補助要素を所持しないと仮定するであろうことを前提とすると、これは完全に予期されなかった。同等に驚くべきことであるのは、Ｓ．セレビシエにおいて、ＧＡＬレギュロンを抑制することが当該技術分野に周知であるグルコースの存在下で、組換えタンパク質の発現および分泌が観察されたことであった。
【００５５】
実施例７
ＣＬＤ３９０およびＣＬＤ３９１のクローンの凍結グリセロールストックを融解し、そして多様なさらなる炭素供給源を補充した５０ｍｌ  ＹＰブロス（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）内に個々に接種して、ＹＰブロスを用いた際、増殖およびｈ−ＳＡ分泌レベルに対するさらなる炭素供給源の影響を決定した。フラスコを、軌道振盪装置中、３０℃、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。さらなる炭素供給源の濃度は、２０ｇ／Ｌガラクトース、２０ｇ／Ｌスクロース、および２０ｇ／Ｌソルビトールであった。フラスコから定期的にサンプリングし、そして当該技術分野においてよく確立されているように、増殖（ＯＤ６００）およびｈ−ＳＡ分泌（ＥＬＩＳＡ）を測定することによって、増殖およびｈ−ＳＡ分泌を測定した。記載する条件下で、フラスコを１２０時間インキュベーションした。ｈ−ＳＡ体積力価（ｎｇ／ｍｌ）を、特異的生産性（ｎｇ／ｍｌ／ＯＤ６００）に変換した。ＹＰ＋グルコース培地中で達成された特異的生産性（実施例６、ＹＰ＋グルコース＝１．０）に対して表された結果を表３に提示する。
【００５６】
表３
【００５７】
【表３】
2014522663.tif 000004
【００５８】
得た結果によって、増殖培地にガラクトース、スクロースまたはソルビトールを補充すると、ｈ−ＳＡの発現および分布の劇的でそして予期されぬ増加（グルコースで達成されたもの（実施例６）に比較して）が示された。グルコースを補充した増殖培地で達成された生産性に比較して、生産性は、ＣＬＤ３９０（宿主ＡＴＣＣ２０８６４）で１７〜２７倍、そしてＣＬＤ３９１（宿主ＣＢＳ９１７５）でおよそ７倍に増加した。宿主細胞が、単独の炭素供給源としてのガラクトース上では増殖せず、またはこうしたガラクトースを代謝しなかったことを明らかに示す実施例１〜３に記載する結果を前提とすると、ガラクトースの存在下での特異的生産性の増加は、驚くべきことであった。当業者は、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０プロモーター系が、宿主として酵母コマガタエラ属を用いた組換えタンパク質産生のためにどのように利用可能であるか、そしてまた、ガラクトース、スクロースおよびソルビトールなどの炭素供給源の驚くべき影響を用いて、さらになお生産性を増加させ、そして最適化することがどのように可能であるかを認識するであろう。
【００５９】
実施例８
ＣＬＤ３９１の凍結グリセロールストックを融解し、そして多様なさらなる炭素供給源を補充した２つ組（フラスコ１およびフラスコ２）の５０ｍｌ  ＹＰブロス（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）中に個々に接種して、実施例７で観察された増殖およびｈ−ＳＡ分泌レベルに対するグルコース、ガラクトースおよびソルビトール炭素供給源の影響を確認した。フラスコを、軌道振盪装置中、３０℃、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。さらなる炭素供給源の濃度は、２０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌガラクトース、および２０ｇ／Ｌソルビトールであった。フラスコから定期的にサンプリングし、そして当該技術分野においてよく確立されているように、増殖（ＯＤ６００）およびｈ−ＳＡ分泌（ＥＬＩＳＡ）を測定することによって、増殖およびｈ−ＳＡ分泌を決定した。記載する条件下で、フラスコを１２０時間インキュベーションした。ｈ−ＳＡ体積力価（ｎｇ／ｍｌ）を、特異的生産性（ｎｇ／ｍｌ／ＯＤ６００）に変換した。ＹＰ＋グルコース培地中で達成された特異的生産性に対して表された結果を表４に提示する。
【００６０】
表４
【００６１】
【表４】
2014522663.tif 000005
【００６２】
得たデータによって、実施例７に記載する驚くべき結果が確認された。グルコースを補充したＹＰ培地中でＣＬＤ３９１を増殖させた際、発現および分泌が確認され、増殖培地にガラクトースまたはソルビトールを補充して、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０発現系を用いると、組換えタンパク質の恒常的発現および分泌は有意に増加した（１１〜４２倍）。
【００６３】
実施例９
ＣＬＤ３９１の凍結グリセロールストックを融解し、そして５０ｍｌのＹＰブロス（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）に接種して、そして軌道振盪装置中、３０℃、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。細胞を採取し、無菌リン酸緩衝生理食塩水溶液を用いて洗浄し、そして再懸濁した細胞を、５０ｍｌ  ＹＰブロスのみを含有する２つ組のフラスコ（フラスコ１およびフラスコ２）、および２０ｇ／Ｌグルコースを補充した２つ組のフラスコに個々に接種して、増殖、ならびにｈ−ＳＡ発現および分泌レベルに対するグルコースの影響を決定した。フラスコを軌道振盪装置中、３０℃、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。フラスコから定期的にサンプリングし、そして当該技術分野においてよく確立されているように、増殖（ＯＤ６００）およびｈ−ＳＡ分泌（ＥＬＩＳＡ）を測定することによって、増殖およびｈ−ＳＡ分泌を測定した。記載する条件下で、フラスコを１２０時間インキュベーションした。ｈ−ＳＡ体積力価（ｎｇ／ｍｌ）を、特異的生産性（ｎｇ／ｍｌ／ＯＤ６００）に変換した。ＹＰ＋グルコース培地中で達成された特異的生産性に対して表された結果を表５に提示する。
【００６４】
表５
【００６５】
【表５】
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【００６６】
得た結果によって、コマガタエラ属におけるＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系が、恒常的にタンパク質を発現し（ＹＰ培地）、増殖培地にグルコースを補充すると、タンパク質発現および分泌に「抑制」効果を有することが示される。したがって、当業者は、増殖培地へのグルコース補充（基礎培地、ボーラスフィードまたは連続フィードとして添加される）を用いて、コマガタエラ属におけるＧＡＬ１／ｍＧＡＬ系を用いた組換えタンパク質産生をどのように最適化することが可能かを理解するであろう。
【００６７】
実施例１０
ＣＬＤ３９１の凍結グリセロールストックを融解し、そして多様なさらなる炭素供給源を補充した５０ｍｌ  ＹＰブロス（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）内に個々に接種して、増殖およびｈ−ＳＡ分泌レベルに対するさらなる炭素供給源の影響を確認した。フラスコを、軌道振盪装置中、３０℃、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。さらなる炭素供給源の濃度は、２０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌグリセロール、および２０ｇ／Ｌガラクトースであった。２０ｇ／Ｌガラクトースに加えて２０ｇ／Ｌグルコース、および２０ｇ／Ｌガラクトースに加えて２０ｇ／Ｌグリセロールを補充したＹＰブロスを用いて、炭素供給源組み合わせの影響を調べた。フラスコから定期的にサンプリングし、そして当該技術分野においてよく確立されているように、増殖（ＯＤ６００）およびｈ−ＳＡ分泌（ＥＬＩＳＡ）を測定することによって、増殖およびｈ−ＳＡ分泌を測定した。記載する条件下で、フラスコを１２０時間インキュベーションした。ｈ−ＳＡ体積力価（ｎｇ／ｍｌ）を、特異的生産性（ｎｇ／ｍｌ／ＯＤ６００）に変換した。ＹＰ＋グルコース培地中で達成された特異的生産性に対して表された結果を表６に提示する。
【００６８】
表６
【００６９】
【表６】
2014522663.tif 000007
【００７０】
得た結果によって、さらなる炭素供給源としてグルコースまたはグリセロールを補充したＹＰブロスで、恒常的発現が達成されることが示された。ガラクトースを補充したＹＰブロスは、グルコースまたはグリセロールを補充したＹＰブロス両方と比較した際、組換えタンパク質発現の「誘導／増進」を示した。グルコースおよびグリセロールを、ガラクトースを含有するＹＰブロスに添加すると、どちらも組換えタンパク質発現の「誘導／増進」を無効にした。実施例７、８、９、および１０において当業者に提示する結果は、（ｉ）グルコースおよび／またはグリセロール補充（基礎増殖培地に、ボーラス添加として添加するかまたは培養中にフィードする）を用いて、コマガタエラ属組換え体がタンパク質を発現するのをどのように「抑制」可能であるか、あるいは（ｉｉ）他の炭素供給源、例えばガラクトース、スクロースおよびソルビトールを添加して（基礎増殖培地に、ボーラス添加として添加するかまたは培養中にフィードする）、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０発現系を用いた発現をどのように増進／刺激することが可能であるかを示すであろう。当業者には、発現を「抑制する」かまたは「誘導／増進する」炭素供給源の組み合わせを用いて、コマガタエラ属において、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系からの組換えタンパク質の発現をどのように微調整し、そしてしたがってその産生を最適化することが可能であるかもまた明らかであろう。
【００７１】
実施例１１
ベクターｐＡＶＥ３４５でのＣＬＤ４４６の形質転換から単離されたＣＬＤ４４６ｐＡＶＥ３４５クローンを、無菌コニカル試験管中、２％ｗ／ｖグルコースおよび１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充した３ｍｌのＹＰブロス内に、個々に接種した。培養を、２２０ｒｐｍで振盪しながら、２８℃で１６±２時間インキュベーションした。次いで、５０μｌの各培養を用いて、ディープウェルマイクロタイタープレート中、２％ｗ／ｖグルコースを含むＹＰブロス（ＹＰｇｌｕ）２ｍｌに、別個に接種した。また、クローンのサブセットを、２％ｗ／ｖガラクトースを補充したＹＰブロス（ＹＰｇａｌ）中でも増殖させた。プレートを封印して、ウェル間の交差汚染を防止する一方、増殖を促進するため、ガス交換（空気）を可能にした。プレートを４５０ｒｐｍで振盪しながら、１６±２時間、２８℃で、全部で５日間インキュベーションした。試料を定期的に抜き取り、増殖（ＯＤ６００）および力価（ＥＬＩＳＡ）を測定した。５日間のインキュベーション後、ＹＰ＝２％ｗ／ｖグルコース（ＹＰｇｌｕ）中で増殖させたＣＬＤ４４６は、６４ｎｇ／ｍｌのｈ−ＳＡ力価（７ｎｇ／ｍｌ／ＯＤに標準化）を達成した。ＣＬＤ４４６に比較したＣＬＤ４４６ｐＡＶＥ３４５クローン（ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０に加えてＧＡＬ４）に関して得た結果（１２０時間インキュベーション）を表７（ＹＰｇｌｕ）および表８（ＹＰｇａｌ）に示す。
【００７２】
表７
【００７３】
【表７】
2014522663.tif 000008
【００７４】
表８
【００７５】
【表８】
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【００７６】
表７に提示する結果は、ＧＡＬ４タンパク質を細胞中で同時発現すると、コマガタエラ属において、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系を用いて分泌されるｈ−ＳＡの特異的生産性が有意に増加することを明らかに例示し、ＧＡＬ４同時発現を伴わない株と比較した際、相対生産性は最大およそ５０倍増加した。これは完全に予期されなかった。驚くべきことに、ガラクトースを補充したＹＰブロス中でクローンを増殖させると、ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系とのＧＡＬ４同時発現は、評価したクローンの大部分に関して、相対生産性のさらなる増加（ＹＰｇｌｕ培地に対して）を示す（表８）。ＹＰｇｌｕ中で増殖させたＣＬＤ４４６（ＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０、ＧＡＬ４を含まない）に比較して、ＹＰｇａｌ中で増殖させたクローンは、最大＞１２０倍、発現／分泌されるｈ−ＳＡの特異的生産性増加を達成した。当業者は、先に実施例１０に例示するようなＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０／ＧＡＬ４系と組み合わせて、コマガタエラ属宿主株および増殖培地補充物（例えばグルコース、ガラクトース、スクロース、グリセロール、ソルビトール）の組み合わせを最適化することによって、組換えタンパク質力価をどのようにさらに最適化可能であるかを理解するであろう。
【００７７】
実施例１２
コマガタエラ属宿主株ＮＲＲＬ１１４３０を、先に記載するようにベクターｐＡＶＥ５０６で形質転換した。形質転換後の個々の組込みクローン（選択寒天プレート上のコロニー）を、マイクロタイタープレート（２８℃）中、２％ｗ／ｖグルコースを補充したＹＰ培地中で１２０時間拡大し、そして当該技術分野においてよく確立されているように、ＥＬＩＳＡを用い、ｈ−ＳＡ力価に関してスクリーニングした。最大１０６５ｎｇ／ｍｌ／ＯＤ６００ｎｍの恒常的力価で、ある範囲の生産性の形質転換体を得た。
【００７８】
実施例１３
ベクターｐＡＶＥ５０６での宿主ＮＲＲＬ１１４３０の形質転換から単離された代表的なＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ５０６クローン（実施例１２）を、無菌コニカル試験管中、２％ｗ／ｖグルコースを補充したＹＰブロス３ｍｌ内に個々に接種した。培養を２２０ｒｐｍで振盪しながら、２８℃で１６±２時間インキュベーションした。次いで、各培養５０μｌを用いて、ディープウェルマイクロタイタープレート中、２％ｗ／ｖグルコースを含むＹＰブロス（ＹＰｇｌｕ）２ｍｌに、別個に接種した。また、２つ組のセットクローンを、２４時間間隔でボーラス添加として添加される５ｍＭ（最終濃度）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とともに、２％ｗ／ｖグルコースを補充したＹＰブロス中でも増殖させた。プレートを封印して、ウェル間の交差汚染を防止する一方、増殖を促進するため、ガス交換（空気）を可能にした。プレートを４５０ｒｐｍで振盪しながら、１６±２時間、２８℃で、全部で５日間インキュベーションした。試料を定期的に抜き取り、増殖（ＯＤ６００）および力価（ＥＬＩＳＡ）を測定した。クローンの代表的なセットに関するデータ（１２０時間インキュベーション）を、表１０（ＩＰＴＧなし）および表１１（＋ＩＰＴＧ）に示す。ＩＰＴＧの存在下での倍誘導（（ＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ３２６（ＩＰＴＧなし）に比較したＩＰＴＧの存在下でのＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ５０６クローンの特異的生産性）マイナス（ＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ３２６（ＩＰＴＧなし）に比較したＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ５０６クローンの特異的生産性））を表３に提示する。
【００７９】
表１０
【００８０】
【表９】
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【００８１】
表１１
【００８２】
【表１０】
2014522663.tif 000011
【００８３】
表１２：ＩＰＴＧの存在下での相対倍誘導
【００８４】
【表１１】
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【００８５】
＊ＹＰｇｌｕ培地中で増殖させた際、ｈ−ＳＡはまったく検出されず、ＬａｃＩによる基礎発現の非常に堅固な調節があることが示され、２４時間間隔で５ｍＭ  ＩＰＴＧをボーラスフィードしたＹＰｇｌｕ中でクローンを増殖させると、抑制／誘導が見られた。
【００８６】
表１０に提示するデータは、ＣＬＤ４４６によって例示されるように、コマガタエラ属におけるＧＡＬ１／ｍＧＡＬ１０系を用いた組換えタンパク質の発現／分泌が、Ｌａｃオペレーター／ｌａｃリプレッサー系（ｐＡＶＥ５０６）を用いた発現調節とカップリングさせた際、生産性の驚くべきそして有意な増加（およそ１６０倍）を生じることを明らかに示す。これは完全に予期されなかった。当業者は、ＬａｃＯ／ＬａｃＩ調節系が、一般的に、基礎（恒常的）発現を減少させるために使用され、次いで、誘導因子、ＩＰＴＧが添加されてタンパク質発現を誘導するように使用されることを認識するであろうし、例えばクローンＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ５０６−１０は、ＩＰＴＧの非存在下で、増殖培地中にｈ−ＳＡの分泌をまったく示さない。２４時間間隔で５ｍＭ  ＩＰＴＧをボーラスフィードしつつ、表１０に記載するクローンを増殖培地中で増殖させると、表１１に提示した相対的な（対照ＣＬＤ４４６に比較した）データによって、クローンによるある程度の反応範囲が例示される。対照の系（ＣＬＤ４４６）に対して、相対生産性の最大＞１００倍の増加が示された。ＩＰＴＧの非存在下で、ｈ−ＳＡ分泌を示さないクローンＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ５０６−１０は、＞＞１０００倍増加を伴う、生産性の劇的な増加を示した（表１２）。他のクローンは、およそ１．２〜２４倍の間の倍増加を示した（表１２）。
【００８７】
実施例１４
コマガタエラ属宿主におけるＳ．セレビシエＭｉｇ１タンパク質の組込みおよび発現を最初に確認するため、ベクターｐＡＶＥ３５９（Ｓ．セレビシエＭｉｇ１）を組換えコマガタエラ属株ＮＲＲＬ１１４３０内に形質転換して、クローンＮＲＲＬ１１４３０ｐＡＶＥ３５９を生成した。また、ｐＡＶＥ３５９をＣＬＤ４４６にもクローニングして、クローンＣＬＤ４４６ｐＡＶＥ３５９を生成した。当該技術分野においてよく確立されているように、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブロット（抗Ｍｉｇ１抗体）に供することによって、Ｍｉｇ１タンパク質の発現に関してクローンを調べた。ウェスタンブロット分析によって、Ｓ．セレビシエＭｉｇ１タンパク質の発現および細胞内集積を確認した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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