(57)【要約】本発明は、特にストレプトキナーゼ(R1)とストレプトキナーゼアクチベータとを、対照溶液または希釈血漿試料と反応させることからなるステップを含み、該ストレプトキナーゼアクチベータが、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択される、試料中のプラスミノゲンをアッセイするための方法に関する。本発明は、この方法を実行するための液体組成物、プラスミノゲンアッセイキットならびにフィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されるストレプトキナーゼアクチベータの使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)
(ｉ)ストレプトキナーゼ(R1)とストレプトキナーゼアクチベータとを、
(ii)対照溶液または希釈血漿試料と
反応させるステップと、
(ｂ)前記反応を、反応を追跡するための手段(SPm)を用いて追跡するステップと、
(ｃ)対照溶液または希釈血漿試料中のプラスミノゲンの量を、前記反応の追跡の結果の関数として決定するステップと
を含み、
前記ストレプトキナーゼアクチベータが、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されることを特徴とする、
試料中のプラスミノゲンをアッセイするための方法。
【請求項２】
反応ステップａ)が、抗凝固剤、好ましくはヒルジンの存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応ステップａ)の前に、即時使用可能な溶液中にストレプトキナーゼアクチベータを保存するステップを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
保存ステップが、−20℃から37℃の間の温度にて行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
保存ステップが、12時間を超える期間、好ましくは24時間から24ヶ月の間、特に24時間から18ヶ月の間の期間行われることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記反応ステップａ)の前に、ストレプトキナーゼ(R1)およびストレプトキナーゼアクチベータを37℃付近でプレインキュベートするステップも含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
反応ステップａ)が、37℃付近にて、好ましくは３〜６分程度行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
反応ステップａ)が、酸性化ステップにより、好ましくはクエン酸を加えることにより停止されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体からなる群から選択されることを特徴とするストレプトキナーゼアクチベータを含む、試料中に存在するプラスミノゲンのアッセイ用組成物。
【請求項１０】
抗凝固剤、好ましくはヒルジンも含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
即時使用可能な溶液中にあることを特徴とする請求項９または10に記載の組成物。
【請求項１２】
ストレプトキナーゼと、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されるストレプトキナーゼアクチベータと、
ストレプトキナーゼとストレプトキナーゼアクチベータと希釈血漿試料との間の反応を追跡するための手段(SPm)と
を含む第１試薬組成物(R1)を含む、インビトロでの試料中のプラスミノゲンのアッセイ用キット。
【請求項１３】
追跡するための前記手段が、プラスミンおよびプラスミン-ストレプトキナーゼ複合体に特異的な発色基質を含む第２試薬組成物として提供される請求項12に記載のアッセイ用キット。
【請求項１４】
前記第１試薬組成物が、抗凝固剤をさらに含む請求項12または13に記載のアッセイ用キット。
【請求項１５】
フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されることを特徴とするストレプトキナーゼアクチベータを含む試薬の、試料中のプラスミノゲンをアッセイするための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、試料中のプラスミノゲンを、特に液体試薬により、特に長期間保存できる即時使用可能な(ready-to-use)試薬によりアッセイするための方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種のアッセイは、試料のプラスミノゲンの活性化を必要とし、該活性化は、通常、ストレプトキナーゼを用いて行われる。
この関係において、解決策は、ストレプトキナーゼを、フィブリノゲンであるストレプトキナーゼアクチベータとともに用いることからなる。しかし、フィブリノゲンを液体の状態で保存することは難しく、その結果、アッセイの結果が、フィブリノゲン保存時間の関数として改変されることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来技術
よって、これらの問題点を克服するために、米国特許第5879923号は、規定されたアミノ酸であるオリゴペプチドにより安定化されたプラスミン溶液を開示している。この解決策は、プラスミン溶液の安定化に限定され、フィブリノゲンのようなプラスミノゲンアクチベータ溶液の安定化に適切でないので、完全に満足できるものではない。さらに、この解決策は、患者の血液を採取する長時間前に調製される即時使用可能な液体試薬に基づいて、患者の血液中に存在するプラスミノゲンをアッセイするために満足できるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の開示
本発明は、従来技術の問題点を克服することを意図し、特に、
(ａ)
(ｉ)ストレプトキナーゼとストレプトキナーゼアクチベータとを、
(ii)対照溶液または希釈血漿試料と
反応させるステップと、
(ｂ)前記反応を、反応を追跡するための手段(SPm)を用いて追跡するステップと、
(ｃ)対照溶液または希釈血漿試料中のプラスミノゲンの量を、前記反応の追跡の結果の関数として決定するステップと
を含む、試料中のプラスミノゲンをアッセイするための方法を提案することを意図する。特定の実施形態では、該方法は、上記のステップからなる。
【０００５】
本発明によると、本明細書で提供する方法において用いられるストレプトキナーゼアクチベータは、フィブリンDD断片および／またはDD断片誘導体からなる群から選択される１以上の化合物である。DD(またはＤダイマー)断片により、２つの架橋されたＤドメイン(それぞれは、異なるフィブロゲン(fibrogen)分子に由来する)を含有し、例えばフィブリンの酵素溶解により得ることができるフィブリンの小断片を意味する。
【０００６】
よって、本発明において用いられるDD断片は、フィブリンまたは溶解された血餅に由来することがある。組換えDD断片を用いることも可能である。未精製DD断片、例えばフィブリン分解画分も用いることができる。DD断片誘導体により、上で定義するDD断片の少なくともいくらか、特にストレプトキナーゼ活性化に関与するDD断片のアミノ酸を含む分子を意味する。特定の実施形態では、誘導体は、DD断片と少なくとも70%の配列同一性、より具体的にはDD断片と少なくとも80%、最も具体的には少なくとも90%または95%を超える配列同一性を有する。
【０００７】
さらに特定の実施形態では、DD断片誘導体は、例えば、DD断片より多くのアミノ酸を含み、例えばＤダイマー/Ｅ断片複合体を含む。
【０００８】
反応を追跡するための手段または化合物(SPm)は、例えば、基質上、ストレプトキナーゼおよびストレプトキナーゼアクチベータにより形成される酵素生成物上、または前記酵素上にグラフトされた分子であってよい。このようなグラフト化は、例えば、化学合成により行う。反応を追跡するための手段(SPm)は、基質、前記酵素の生成物または前記酵素と会合できる分子であってもよい。
【０００９】
追跡するための手段または化合物は、例えば、色もしくは蛍光の消滅を生じるかまたは引き起こすことにより、あるいは反応媒体の吸光度を改変することにより前記酵素の反応を追跡することを可能にするように選択される。
【００１０】
特定の実施形態では、反応を追跡するための化合物は、プラスミンおよびプラスミン-ストレプトキナーゼ複合体に特異的な発色基質である。このような化合物の例は、当該技術において知られており、例えば、限定されないが、Chromogenixにより販売されるS-2403(商標)、S-2251(商標)、およびHyphen Biomed社により販売されるSPm41である。
【００１１】
特定の実施形態では、反応は、抗凝固剤、好ましくはヒルジンまたは任意のその他のトロンビン阻害剤の存在下で行うことができる。
【００１２】
有利には、方法は、反応ステップａ)の前に、即時使用可能な溶液中にストレプトキナーゼアクチベータを保存するステップを含む。よって、方法は、使用の直前にストレプトキナーゼアクチベータ溶液を調製する必要がない。さらに、ストレプトキナーゼアクチベータは、溶液中で安定であり、物理化学的特性およびプラスミノゲンアッセイの実行における効力を変更することなく、例えばストレプトキナーゼとともに貯蔵できる。特定の実施形態では、ストレプトキナーゼおよびストレプトキナーゼアクチベータは、一緒に包装できる。
【００１３】
特定の実施形態では、ストレプトキナーゼアクチベータ保存ステップは、−20℃から37℃の間の温度にて行われる。特定の実施形態では、ストレプトキナーゼアクチベータは、２〜10℃、より具体的には４〜８℃の間にて保存する。特定の実施形態では、ストレプトキナーゼアクチベータは、室温での保存に適切であるか、または特定の保存条件を必要としない。
【００１４】
有利な実施形態によると、保存ステップは、12時間を超える期間、好ましくは24時間から24ヶ月の間、特に24時間から18ヶ月の間の期間行われる。
場合によって、ストレプトキナーゼアクチベータは、保存剤および／またはシプロフロキサシンのような抗生物質の存在下で保存する。
【００１５】
有利には、方法は、ストレプトキナーゼ(R1)およびストレプトキナーゼアクチベータを37℃付近でプレインキュベートするステップであって、前記反応ステップａ)の前に行われるステップも含む。
【００１６】
特定の実施形態によると、反応ステップａ)は、37℃付近にて、好ましくは３〜６分程度行われる。
特定の実施形態によると、反応ステップａ)は、酸性化ステップにより、好ましくはクエン酸を加えることにより停止される。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体からなる群から選択される１以上の化合物であることを特徴とするストレプトキナーゼアクチベータを含む、試料中に存在するプラスミノゲンのアッセイ用組成物に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、上記の組成物は、抗凝固剤、好ましくはヒルジンも含む。
特定の実施形態では、上記の組成物は、即時使用可能な溶液中にある。
特定の実施形態では、ストレプトキナーゼアクチベータを含む組成物は、ストレプトキナーゼを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、組成物は、即時使用可能な溶液として特に適切である。特定の実施形態では、組成物は、100μg/ml程度のストレプトキナーゼアクチベータの溶液を含むか、または100μg/mlの濃度、例えば100μg/mlから１mg/mlの間の濃度に容易に希釈できる溶液を含む。特定の実施形態では、組成物は、使用前に、さらなる希釈のようなさらなる操作を必要としない。
【００２０】
特定の実施形態では、組成物は、フィブリノゲンを含まない。より具体的な実施形態では、組成物は、DD断片および／または１以上のDD断片誘導体を含み、別のストレプトキナーゼアクチベータを含まない。さらに具体的な実施形態では、組成物は、１つだけのストレプトキナーゼアクチベータ、より具体的にはDD断片および／または１以上のDD断片誘導体を含む。
【００２１】
本発明は、上記の１以上の実施形態に従って記載する組成物を含む、試料中のプラスミノゲンのアッセイ用キットにも関する。
有利には、上記のアッセイ用キットは、上記の方法を実行するために構成される。
【００２２】
特に、本発明は、ストレプトキナーゼ、ストレプトキナーゼアクチベータ、およびストレプトキナーゼとストレプトキナーゼアクチベータと希釈血漿試料との間の反応を追跡する手段(SPm)の１以上を含む、試料中のプラスミノゲンのアッセイ用キットに関し、ここで、該ストレプトキナーゼアクチベータは、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体からなる群から選択される１以上の化合物である。より具体的には、具体的なキットは、インビトロでの使用を構想する。このことは、試薬がインビトロでの使用のために適切であり、インビボでの使用のために適合しない保存剤のような試薬を含み得ることを意味する。特定の実施形態では、試料中のプラスミノゲンのアッセイ用キットは、ストレプトキナーゼと、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体からなる群から選択されるストレプトキナーゼアクチベータとを含む。さらに具体的な実施形態では、キットは、反応(すなわちストレプトキナーゼとストレプトキナーゼアクチベータと希釈血漿試料との間の)を追跡するための手段(SPm)をさらに含む。
【００２３】
特定の実施形態では、ストレプトキナーゼおよびストレプトキナーゼアクチベータは、キット中に一緒に包装される。さらに特定の実施形態では、キット中のストレプトキナーゼ溶液は、約12,500〜15,000 IU/mlでの使用のために特に適切である。
【００２４】
特定の実施形態では、アッセイ用キットは、酵素と基質との間の反応の追跡に基づいて対照溶液または希釈血漿試料中のプラスミノゲンの量を迅速に決定するために、対照溶液または希釈血漿試料と反応するような容積および量に校正された少なくとも１の組成物を特徴とする。
例えば、キットの組成物は、ある容積のストレプトキナーゼおよびストレプトキナーゼアクチベータ組成物が、ある容積の対照溶液または希釈血漿試料と混合されるように選択される。特定の実施形態では、キットの組成物は、ストレプトキナーゼ溶液が約12,500〜15,000 IU/mlを含有するように選択される。特定の実施形態では、ストレプトキナーゼアクチベータ溶液は、約100μg/mlを含有する。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、試料中のプラスミノゲンをアッセイするためのストレプトキナーゼアクチベータの使用からなり、該ストレプトキナーゼアクチベータは、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体からなる群から選択される。
【００２６】
さらなる特徴、詳細および利点は、添付の図面を参照する以下の記載から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の特定の実施形態による方法の全般的な図を示す。
【図２】フィブリノゲン置き換え試験における検量線を示す。
【図３】異なるフィブリンDD断片濃度を用いる例示的な試験における検量線を示す。
【図４】例示的な実施形態におけるストレプトキナーゼの最適量を決定するための曲線を示す。
【図５】30℃の水浴中でのインキュベーションの際の、DD断片(Ａ)または比較としてフィブリノゲン(Ｂ)を含む例示的なR1試薬の安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
より明確にするために、同一または同様の要素には、全ての図面において同じ参照符号を付す。
【００２９】
発明の実施形態の詳細な説明
図１を参照して、好ましい態様に従う方法の実施形態は、試薬R1およびR2の組成物(これらは、例えば即時使用可能な液体の形状LRTでともに保存される)に基づく。
第１試薬組成物R1は、DD断片を含む。DDは、血餅を得るためにトロンビンを用いてフィブリノゲンをフィブリンに凝血させ、血餅を次いでプラスミノゲンの存在下でtPAにより分解してフィブリン分解生成物を生成させることにより得られる。Ｄダイマーは、イオン交換クロマトグラフィーと、必要に応じて補足のゲルろ過クロマトグラフィーを用いてさらに精製される。DD断片は、好ましくは0.1mg/ml程度の濃度で第１試薬組成物R1中に含まれる。Tris、Na2EDTA、NaClおよびBSAを含むベースマトリクスが好ましいが、他のベースマトリクスも用いてよい。定性アッセイのために、いわゆる「Plgフリー」、すなわち、ごく微量のプラスミノゲンを含むかまたは好ましくはプラスミノゲンを含まないDD断片を用いることが好ましい。
【００３０】
第１試薬組成物R1は、少なくとも１の保存剤、好ましくはシプロフロキサシン、0.9g/lのアジ化ナトリウムおよび0.25 ATU/mlのヒルジンも含む。
最後に、第１試薬組成物R1は、ストレプトキナーゼを含む。上記のように、最も具体的には、ストレプトキナーゼアクチベータは、フィブリンＤダイマーである。
【００３１】
第２試薬組成物R2は、Hyphen Biomed社により販売される合成基質SPm41を含み、これは、プラスミノゲン(plg)、ストレプトキナーゼおよびフィブリノゲン(またはDD断片)の存在下でパラニトロアニリンを放出する。R2は、別の基質も含んでよく、該基質と酵素(この場合、プラスミノゲン-ストレプトキナーゼ複合体)との相互作用が反応媒体の吸光度または蛍光を改変する。
好ましくは、第２試薬組成物R2は、酸性pHに、好ましくは酒石酸により緩衝される。
【００３２】
ステップ(ai〜aii)において、ある容積の第１試薬組成物R1をある容積の対照溶液(cal)または希釈血漿試料(Sam)と混合し、混合物を３分間、37℃にてインキュベートする。
ステップ(aiii)において、ある容積の第２試薬組成物R2をこの混合物に加え、混合し、３分間、37℃にてインキュベートする。
次いで、ステップ(ｂ)において、反応における変化を、基質、この場合はSPm41の消費と相関する吸光度または光学密度(OD)の改変により観察する。SPm41の場合、吸光度は、405nmにて測定する。
ステップ(ｃ)において、吸光度(OD)の変動により、プラスミノゲン含量(%plg)を、例えば検量線により決定できる。
そして、ステップ(ｄ)において、反応を、例えばある容積の20g/lのクエン酸(H+)を加えることにより好ましくは停止する。
【実施例】
【００３３】
比較プラスミノゲンアッセイ試験を、従来技術に従ってフィブリノゲン(+fbg)を用いてが、フィブリノゲンを用いずに(−fbg)、またはフィブリン誘導体を用いるフィブリノゲン代替物を用いて、以下の表１に従って行った。
【００３４】
【表１】
2014526243.tif 000002
【００３５】
表１において、系列Ｃは、150%のプラスミノゲン濃度について１／20の希釈の校正組成物に相当する。系列Ｃ:２は、系列Ｃの半分の希釈の校正組成物に相当し、系列Ｃ:８までそのように続く。系列０は、０%のプラスミノゲン濃度の校正組成物に相当する。系列r2は、検量線の一次相関係数の二乗に相当する。
【００３６】
図２の検量線は、上記の表１の結果に相当する。ｙ座標は405nmでの光学密度の値(OD)に相当し、ｘ座標はプラスミノゲン含量(%plg)に相当する。これらの曲線は、フィブリノゲンの存在(+fbg)もしくは非存在(−fbg)、または表１で言及する濃度での試験した異なる基質(FFE、FE、FD、DD)に関係する。
【００３７】
図２からわかるように、フィブリノゲンなし(−fbg)の試験に相当する検量線は、フィブリンFFE、FE、FD断片を用いるフィブリノゲン置き換えの試験のものと実質的に重なる。
驚くべきことに、フィブリンDD断片に相当する曲線(+DD)は、全フィブリノゲン(+fbg)に相当する曲線よりも高い質のものであることが、図２および表１から明らかである。実際に、r2係数は、DDについて0.9995であるのに対して、試料(+fbg)について0.9976であり、このことはよりよい線形性を意味する。さらに、DD曲線は+fbg曲線より上にあり、このことはより高いOD、よってプラスミノゲン含量のより正確な定量を意味する。
【００３８】
最適DD断片含量を決定するための試験も、以下の表２に従って行った。
【００３９】
【表２】
2014526243.tif 000003
【００４０】
図３の検量線は、上記の表２の結果に相当する。ｙ座標は405nmでの光学密度の値(OD)に相当し、ｘ座標はプラスミノゲン含量(%plg)に相当する。表２に相当する曲線は、よって、異なる試験におけるフィブリンDD断片のμg/mlでの濃度に関係する。
【００４１】
図３および表２からわかるように、100μg/mlのDD断片含量は、プラスミノゲンアッセイを最適化するために十分である。実際に、0.9995のr2では、線形性は満足できるものであり、曲線は、他のDD断片濃度に相当するものに対して中間の位置にある。
【００４２】
さらに、試験を行って、以下の２つのR1試料：0.7mg/mlのフィブリノゲンを含むもの(結果を表３に示す)および100μg/mlのDD断片を含むもの(結果を表４に示す)中の最適ストレプトキナーゼ含量を決定した。
【００４３】
【表３】
2014526243.tif 000004
【００４４】
表３に相当するストレプトキナーゼ濃度の関数としての吸光度変化曲線(示さず)の分析の後に、0.7mg/mlのフィブリノゲンを含むR1試料において、20,000 IU/ml付近のストレプトキナーゼ濃度にて開始するプラトーが観察できることがわかる。表３において、系列(2000 IU/ml)について1.848、および系列(30,000 IU/ml)について1.862のΔOD (150〜0%)が実際に観察される。よって、最適ストレプトキナーゼ濃度は20,000 IU/mlと見積もられ、この値ではODはもはや著しく増加しない。
【００４５】
【表４】
2014526243.tif 000005
【００４６】
図４に示され、表４に対応する、ストレプトキナーゼ濃度(IU/mlでの[Strept])の関数としての吸光度(DO)変化曲線からわかるように、曲線の飽和の開始が、5000 IU/mlのストレプトキナーゼ濃度にて開始することが観察できる。プラトーは、図４において、12,500/15,000 IU/mlの間でより明らかに観察できる。これと並行して、表４では、ΔOD (150〜0%)が、系列(12,500および15,000 IU/ml)について1.954および1.986、ならびに系列(30,000 IU/ml)について1.961であることがわかる。よって、最適ストレプトキナーゼ濃度は12,500から15,000 IU/mlの間、好ましくは15,000 IU/mlであると見積もられる。
【００４７】
驚くべきことに、DD断片を用いると、より少ないストレプトキナーゼが必要であり(+DD試料について12,500〜15,000 IU/mlであるのに対して、+fbg試料について20,000)、全フィブリノゲンを用いるよりもよい結果が得られることが、表４および図４から明らかである。実際に、ODの飽和は、より低いストレプトキナーゼ濃度(5000 IU/ml)にて開始する。
【００４８】
DD断片を含むR1試薬組成物の安定性をさらに調べた。このために、0.1mg/mlの濃度のDD断片、10000UI/mLのストレプトキナーゼを含むR1試薬組成物、および基質SPm41を2.25mg/mLの濃度で含むR2試薬組成物を、上記の方法において用いた。様々な濃度の200μlの試料(100%の濃度に相当する1/30の希釈から得た)と、200μlのR1試薬組成物とを混合し、37℃にて３分間インキュベートした。その後、200μlの試薬組成物R2を加え、混合物を再び37℃にて３分間インキュベートする。そして、反応を、200μlのクエン酸２%を用いて停止する。
試験は、３ヶ月にわたって異なる時点にて行い、試薬は室温に保つ。
結果を表５に示す。
【００４９】
【表５】
2014526243.tif 000006
【００５０】
異なる時点にて異なる技術者が関与したことにより150%にて得られた結果はいくらかの変動を示すが、これらのデータから、R1試薬組成物が長期間にわたって室温にて安定であり、３ヶ月の期間にわたって使用した場合に同等の結果をもたらすことが明らかである。
【００５１】
同様に、30℃の水浴中での保存の際のR1試薬組成物の安定性を考慮した。データを以下の表６に示す。他の実験条件は、上記のとおりであった。
【００５２】
【表６】
2014526243.tif 000007
【００５３】
これらのデータを図5Aに示す。
同様の実験を、0.7mg/mLのフィブリノゲンおよび11000UI/mLのストレプトキナーゼを含むR1試薬組成物を用いて行った。R2試薬組成物および実験条件は、上記のとおりであった。R1のインキュベーションは、30℃にて水浴中で行った。データを以下の表７および図5Bに示す。
【００５４】
【表７】
2014526243.tif 000008
【００５５】
これらのデータは、30℃にて維持したR1を用いてOD決定が実質的に変動することを示す。本発明の範囲を逸脱することなく、当業者は、本発明の方法を、ストレプトキナーゼの代わりにウロキナーゼに基づき、対応するアクチベータ、好ましくはフィブリン断片から選択されるウロキナーゼアクチベータを用いるアッセイに適応させることができる。
【図１】
2014526243.tif 000009
【図２】
2014526243.tif 000010
【図３】
2014526243.tif 000011
【図４】
2014526243.tif 000012
【図５】
2014526243.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月31日(2013.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)
(ｉ)ストレプトキナーゼ(R1)とストレプトキナーゼアクチベータとを、
(ii)対照溶液または希釈血漿試料と
反応させるステップと、
(ｂ)前記反応を、反応を追跡するための手段(SPm)を用いて追跡するステップと、
(ｃ)対照溶液または希釈血漿試料中のプラスミノゲンの量を、前記反応の追跡の結果の関数として決定するステップと
を含み、
前記ストレプトキナーゼアクチベータが、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されることを特徴とする、
試料中のプラスミノゲンをアッセイするための方法。
【請求項２】
反応ステップａ)が、抗凝固剤、好ましくはヒルジンの存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応ステップａ)の前に、即時使用可能な溶液中にストレプトキナーゼアクチベータを保存するステップを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
保存ステップが、-20℃から37℃の間の温度にて行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
保存ステップが、12時間を超える期間、好ましくは24時間から24ヶ月の間、特に24時間から18ヶ月の間の期間行われることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記反応ステップａ)の前に、ストレプトキナーゼ(R1)およびストレプトキナーゼアクチベータを37℃付近でプレインキュベートするステップも含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
反応ステップａ)が、37℃付近にて、好ましくは３〜６分程度行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
反応ステップａ)が、酸性化ステップにより、好ましくはクエン酸を加えることにより停止されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗凝固剤と、ストレプトキナーゼと、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体からなる群から選択されることを特徴とするストレプトキナーゼアクチベータとを含む、試料中に存在するプラスミノゲンのアッセイ用組成物。
【請求項１０】
前記抗凝固剤が、ヒルジンであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
即時使用可能な溶液中にあることを特徴とする請求項９または10に記載の組成物。
【請求項１２】
ストレプトキナーゼと、フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されるストレプトキナーゼアクチベータと、
ストレプトキナーゼとストレプトキナーゼアクチベータと希釈血漿試料との間の反応を追跡するための手段(SPm)と
を含む第１試薬組成物(R1)を含む、インビトロでの試料中のプラスミノゲンのアッセイ用キット。
【請求項１３】
追跡するための前記手段が、プラスミンおよびプラスミン-ストレプトキナーゼ複合体に特異的な発色基質を含む第２試薬組成物として提供される請求項12に記載のアッセイ用キット。
【請求項１４】
前記第１試薬組成物が、抗凝固剤をさらに含む請求項12または13に記載のアッセイ用キット。
【請求項１５】
フィブリンDD断片および／または少なくとも１のDD断片誘導体を含む群から選択されることを特徴とするストレプトキナーゼアクチベータとストレプトキナーゼとを含む組成物の、血漿試料中のプラスミノゲンをアッセイするための使用。
【国際調査報告】
2014526243.tif 000014
2014526243.tif 000015
2014526243.tif 000016