(57)【要約】  本開示は、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに特異的に結合する抗原結合部位と、その組成物、及び使用方法に関する。 【選択図】図２
2014526886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位がＭＩＦ及びＤ−ＤＴに特異的に結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項２】
請求項１に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位が、ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに特異的に結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項３】
請求項２に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに交差反応的に結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項４】
請求項２に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位が二重特異性であることを特徴とする抗原結合部位。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位がＭＩＦ媒介及びＤ−ＤＴ媒介シグナル変換を特異的に阻害できることを特徴とする抗原結合部位。
【請求項６】
請求項５に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位がＭＩＦ及びＤ−ＤＴ−活性と拮抗できることを特徴とする抗原結合部位。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該単離した抗原結合部位が１００ｎＭより少ない半数効果濃度でＭＩＦとＤ−ＤＴに結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該単離した抗原結合部位が、１×１０７Ｍ−１より小さい解離定数（ＫＤ）でＭＩＦとＤ−ＤＴに結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該単離した抗原結合部位が、ＭＩＦの構造エピトープを認識し、同じ構造エピトープがＤ−ＤＴに存在し、前記単離した抗原結合部位が両構造エピトープを認識することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該単離した抗原結合が抗体、その断片、あるいは抗体由来の骨格であることを特徴とする抗原結合部位。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体由来の骨格において、当該抗体由来の骨格が、二重特異性ｓｃＦｖ、３価の二重特異性抗体、架橋したＦａｂ又は二重特異性ＩｇＧからなる群から選択された、二重特異性抗体由来の骨格であることを特徴とする骨格。
【請求項１２】
請求項１０に記載の抗体又はその断片において、当該抗体又はその断片が、モノクロノーある抗体又はポリクロナール抗体であることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１３】
請求項１０に記載の抗体又はその断片において、当該抗体がヒト、ヒト化、又はキメラ抗体であることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１４】
請求項１０に記載の抗体又はその断片において、当該抗体又はその断片が、ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域を含むことを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１５】
請求項１０に記載の抗体又はその断片において、当該抗体又はその断片が、ＩｇＧイソタイプであることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１６】
請求項１０に記載の抗体又はその断片において、当該抗体又はその断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’、ｓｃＦＶからなる群から選択されることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１７】
請求項１乃至１０に記載の単離した抗原結合部位において、当該単離した抗原結合部位が、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ，ラクダ抗体、アンキリン、ドメイン抗体、リポカイン、小分子免疫薬、マキシボディ、タンパク質Ａ、及びアフィリンからなる群から選択されることを特徴とする抗原結合部位。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、抗原結合部位が更に、カニクイザルＭＩＦ及び／又はカニクイザルＤ−ＤＴに結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位が、ネズミＭＩＦ及び／又はネズミＤ−ＤＴに結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位が更に、ラットＭＩＦ及び／又はラットＤ−ＤＴに結合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項２１】
請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位が、表１に記載のいずれかの抗体のＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義された６ＣＤＲｓを含むことを特徴とする抗原結合部位。
【請求項２２】
請求項１に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位が請求項２１に記載の抗体と交差競合することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項２３】
請求項１に記載の単離した抗原結合部位において、当該抗原結合部位が請求項２１に記載の抗体と同じエピトープと相互作用することを特徴とする抗原結合部位。
【請求項２４】
単離した抗体又はその断片と交差競合する請求項１に記載の単離した抗原結合部位において、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２のＣＤＲ２；配列番号３のＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５のＣＤＲ２；配列番号６のＣＤＲ３；を含むことを特徴とする単離した抗原結合部位。
【請求項２５】
単離した抗体又はその断片と交差競合する請求項１に記載の単離した抗原結合部位において、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１８のＣＤＲ２；配列番号１９のＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１のＣＤＲ２；配列番号２２のＣＤＲ３；を含むことを特徴とする単離した抗原結合部位。
【請求項２６】
単離した抗体又はその断片と交差競合する請求項１に記載の単離した抗原結合部位において、配列番号３３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４のＣＤＲ２；配列番号３５のＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７のＣＤＲ２；配列番号３８のＣＤＲ３；を含むことを特徴とする単離した抗原結合部位。
【請求項２７】
請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片において、その抗体が配列番号１４を含むＶＨと、配列番号１３を含むＶＬとを含むことを特徴とする単離した抗体又はその断片。
【請求項２８】
請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片において、その抗体が配列番号３０を含むＶＨと、配列番号２９を含むＶＬとを含むことを特徴とする単離した抗体又はその断片。
【請求項２９】
請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片において、その抗体が配列番号４６を含むＶＨと、配列番号４５を含むＶＬとを含むことを特徴とする単離した抗体又はその断片。
【請求項３０】
単離した抗体又はその断片において、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２のＣＤＲ２；配列番号３のＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５のＣＤＲ２；配列番号６のＣＤＲ３；を含むことを特徴とする単離した抗体又はその断片。
【請求項３１】
単離した抗体又はその断片において、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１８のＣＤＲ２；配列番号１９のＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１のＣＤＲ２；配列番号２２のＣＤＲ３；を含むことを特徴とする単離した抗体又はその断片。
【請求項３２】
単離した抗体又はその断片において、配列番号３３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４のＣＤＲ２；配列番号３５のＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７のＣＤＲ２；配列番号３８のＣＤＲ３；を含むことを特徴とする単離した抗体又はその断片。
【請求項３３】
請求項１ないし３２のいずれか１項の記載から選択された抗原結合部位を含むことを特徴とする医薬組成物とその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３４】
請求項１乃至３３のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位の薬剤としての使用。
【請求項３５】
請求項２２乃至２６のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位の薬剤としての使用。
【請求項３６】
請求項１乃至３５のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片の薬剤としての使用。
【請求項３７】
請求項１乃至３６のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位をエンコードする核酸。
【請求項３８】
請求項１乃至３７のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片をエンコードする核酸において、配列番号１６を含むＶＨと、配列番号１５を含むＶＬを含むことを特徴とする核酸。
【請求項３９】
請求項１乃至３８のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片をエンコードする核酸において、配列番号３２を含むＶＨと、配列番号３１を含むＶＬを含むことを特徴とする核酸。
【請求項４０】
請求項１乃至３８のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその断片をエンコードする核酸において、配列番号４８を含むＶＨと、配列番号４７を含むＶＬを含むことを特徴とする核酸。
【請求項４１】
請求項１に記載の単離した抗原結合部位をエンコードする核酸配列であって、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４７、及び配列番号４８からなる群から選択された核酸に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有することを特徴とする核酸配列。
【請求項４２】
請求項３７乃至４１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターを含む単離した宿主細胞。
【請求項４４】
請求項４３に記載の単離した宿主細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４５】
請求項４３に記載の単離した宿主細胞が、ヒト細胞であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１乃至４５のいずれか１項に記載の単離した抗原結合部位を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願のクロスリファレンス]
本出願は、２０１１年７月１５日に出願された米国暫定出願第６１／５０８，０９１号の優先権を主張する。この出願は全体が引用により組み込まれている。
【０００２】
[発明の属する技術分野]
本開示は、一般的に、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）とＤ−ドーパクロームトートメラーゼ（Ｄ−ＤＴ）に交差反応性がある抗体及びその断片に関する。特に、この開示はＭＩＦ及びＤ−ＤＴと交差反応性があり、ＭＩＦ媒介及び／又はＤ−ＤＴ媒介のシグナル伝達を妨げる抗体及びその断片に関する。この開示は更に、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴ交差反応抗体を含む治療法、及び、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴと相互作用する能力を共有する化合物を用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ、また、ＧＩＦ、ＧＬＩＦ、グリコシル化阻止因子、Ｌ−ドーパクロームイソメラーゼ、又はＬ−ドーパクロームトートメラーゼとしても知られている）は、Ｄａｖｉｄ，Ｊ．（１９６６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５６：７２−７７及びＢｌｏｏｍ，Ｂ．Ｒ  ＆  Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．（１９６６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５３，８０−８２に記載されており、先天性免疫反応及び炎症反応の中心的調節因子として認識されている（Ｃａｌａｎｄｒａ，Ｔ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．０３；７９１−８００）。
【０００４】
ＭＩＦ遺伝子は、ヒトゲノムの染色体２２に位置しており、ホモ三量体を形成する、１２．５ｋＤａの長い１１５アミノ酸非グリコシル化タンパク質をエンコードする。（Ｓｕｎ，Ｈ．Ｗ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５１９１−５１９６）。
【０００５】
ＭＩＦは、事実上すべての細胞タイプに構造的に発現する。マクロファージが炎症する間、Ｔ細胞と下垂体は、ＭＩＦの優勢産生源である。（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ，Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５；７５６−７５９；Ｃａｌａｎｄｒａ，Ｔ．（１９９４）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８９５−１９０２）。分泌されたＭＩＦは、例えばＴ−細胞とマクロファージに発現し、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮγ、ＩＬ−２）の放出と、細胞侵入、及び細胞遊走を誘発するレセプタＣＤ７４、ＣＸＣＲ２、及びＣＸＣＲ４、と作用する。（Ｌｅｎｇ  Ｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４６７−１４７６；Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ，Ｊ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３：５８７−５９６）。
【０００６】
前炎症性メディエータとしてのＭＩＦは、いくつかの炎症性疾患に関係しており過剰発現することが認識されており、ＭＩＦの多型は自己免疫疾患の重症度と相関することがわかっている。（Ｈｏｉ，Ａ．Ｊ．（２００７）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ＆  Ａｌｌｅｒｇｙ−Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，６：１８３−１９０；Ｂａｕｇｈ，Ｊ．Ａ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．３：１７０−１７６）。
【０００７】
加えて、ＭＩＦが、ｐ５３−媒介性アポトーシスと細胞停止をマイナスに調整し、これによってＭＩＦ、細胞成長、及び腫瘍形成間にリンクを提供することが更に研究されている。（Ｃａｌａｎｄｒａ，Ｔ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．０３；７９１−８００；  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１３７５−１３８２）。
【０００８】
広範囲に及ぶ免疫介在性炎症疾患の発症のみならず、癌や更なる適応症においてもＭＩＦがキープレーヤとして認識されると、ＭＩＦは、例えば小分子あるいはモノクロナール抗体などの化合物と拮抗する有望な治療ターゲットとなった。
【０００９】
ＭＩＦに特異な抗体は、例えば、全体が引用により組み込まれている、ＷＯ１９９４／０２６３０７号（Ｔｈｅ  Ｐｉｃｏｗｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国特許出願第０８／４７１，７０５号；全体が引用により組み込まれている、ＷＯ１９９８／０１７３１４号（Ｔｈｅ  Ｐｉｃｏｗｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）ＷＯ２００１／０３８５６６号（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  Ｚｕｒ  Ｆｏｒｄｅｒｕｎｇ  Ｄｅｒ  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  Ｅ．Ｖ．）、米国特許出願第１２／２３４，４０７号；全体が引用により組み込まれている、ＷＯ２００２／０３６７７４号（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ−Ｇｅｓｅｌｌｓｈａｆｔ  Ｚｕｒ  Ｆｅｏｄｅｒｕｎｇ  Ｄｅｒ  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎ  Ｆｏｒｓｈｕｎｇ  Ｅ．Ｖ．）、ＷＯ２００９／０８６９２０号（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓ．Ａ．，Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国特許出願第１２／３４６，３０９号、及び第１２／７６７，６３５号）；  全体が引用により組み込まれている、ＷＯ２００９／１１７７１０号（Ｃａｒｏｌｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、ＷＯ２００９／１１７７０６号（Ｃａｒｏｌｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、米国特許出願第１２／９１８，９６８号；全体が引用により組み込まれている、ＷＯ２００５／０２０９１９号（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）、ＷＯ２００５／０９４３２９号（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国特許出願第１０／９２７，４９４号；全体が引用により組み込まれている、ＷＯ２００５／０９４３３８Ａ２号（Ｎｏｒｔｈ  Ｓｈｏｒｅ−Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｊｅｗｉｓｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、米国特許出願第１０／５９４，６４１号；に開示されている。
【００１０】
特に、ＭＩＦがトートメラーゼとして酵素的に活性であり、Ｄ−ドーパクロームを５，６−ヒドロキシインドール−２カルボキシル酸に変換するとの発見に基づいて、ＭＩＦの同族体が同定された。これは、類似するが同一ではない生成物であり、５，６−ジヒドロキシインドールを生成するトートメラーゼ活性を共有している。Ｄ−ドーパクローム・トートメラーゼ（Ｄ−ＤＴ）と呼ばれるＭＩＦ同族体は、ＭＩＦに対して４７％という低い配列相同性を示す。２００８年には、Ｄ−ＤＴとＭＩＦは、特異的機能性を共有して、肺腺がん細胞から、例えば、ＣＸＣＬ８やＶＥＧＦなどの血管新生増殖因子の発現と分泌を促進することがわかった。（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ａ．Ｍ．（２００８）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１８（４）：２３３０−２３３７）。
【００１１】
したがって、ＭＩＦとＤ−ＤＴ媒介シグナル伝達を阻害する治療が求められている。
【発明の概要】
【００１２】
出願人は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに特異的に結合する抗原−結合部を初めて開示する。このような、ＭＩＦとＤ−ＤＴの両方を阻害する化合物は、効能が優れており、有望な治療方法を提供する。ＭＩＦに特異的であり、第２にＤ−ＤＴに特異的な化合物を平行して用いる組み合わせ治療と比較すると、ＭＩＦとＤ−ＤＴに特異的に結合する、二重特異性又は交差反応性抗原−結合部にはいくつもの利点がある。ＭＩＦとＤ−ＤＴの両方を阻害する単独の治療薬剤の投与によって、二つの化合物を投与する場合に比べて、薬物動態と薬物力学といった薬理学的特性の調査と制御がより容易になる。更に、効能の低下につながるＭＩＦ又はＤ−ＤＴ媒介によるシグナル伝達を介した回避機構を、両分子を平行してターゲットにすることによって、有意に小さくすることができる。その結果、ＭＩＦとＤ−ＤＴをターゲットにする抗原結合部が、高い医学的要求を伴う臨床開発用の優れた化合物を提供する。
【００１３】
驚いたことに、ＭＩＦとＤ−ＤＴ間の低い配列相同性にも関わらず、交差反応抗体がうまく同定され、特徴づけられた。更に、この開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに二重特異性であるあるいは交差反応性である抗原結合部を提供し、ＭＩＦとＤ−ＤＴ媒介シグナル伝達経路を無効にするあるいは強化する。
【００１４】
この抗体は、遺伝子組み換えＭＩＦ及び遺伝子組み換えＤ−ＤＴタンパク質を用いる選定戦略時に同定される。ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいて、ＭＩＦとＤ−ＤＴ双方に特異的な抗体の結合が検出された。同定したクローンは、ＩｇＧフォーマットに変換され、真核細胞中に発現する。精製後、選定した抗体の更なる特性評価である、ＭＩＦとＤ−ＤＴについての半数効果濃度判定（ＥＣ５０判定）で、双方の交差反応性を確認した。加えて、更なる機能分析を行って、選択した抗体についての機能活性を示した。ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体について、ＭＩＦとそのレセプタであるＣＤ７４との結合を阻害する能力を分析した。更に、ＩＬ−１βやＩＬ−６など、炎症性サイトカインのＭＩＦ依存性放出の抗体−媒介による阻害を調べた。その結果、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体のヒトにおける活性と効能が予測される。
【００１５】
ＭＩＦとＤ−ＤＴをターゲットにした組み合わせ方法が提言されている（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ａ．Ｍ．（２００８）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１８（４）：２３３０−２３３７）が、両タンパク質に交差反応性がある単独の化合物の同定は、Ｄ−ＤＴとＭＩＦが３３％の同一性と４７％の相同性を共有しているのみであるため、期待されていなかった。ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応性抗体が同定されるまで、大量のクローンをスクリーニングした。分析した２７０００のクローンから取り出した３０００以上のクローンが、一方又は両方の抗原に対する特異性を示したが、初回のスクリーニングステップと二回目のスクリーニングステップで、３つのクローンのみがＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応性であることがわかった。ここに開示されている方法を用いることで、当業者には、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応性抗原結合部と、ＭＩＦとＤ−ＤＴとに対して二重特異性である抗原結合部をどのように同定するかが自明となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒト由来のＭＩＦとＤ−ＤＴのアミノ酸配列の比較を示す。ヒトＤ−ＤＴとヒトＭＩＦは、３３％の同一性と４７％の相同性を共有している。
【図２】ＥＬＩＳＡ中の、遺伝子組み換えＭＩＦと遺伝子組み換えＤ−ＤＴに対する選択されたＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の特異的結合を示す。６．２５ｎＭの濃度で使用した抗体を用いた。試験を行ったすべての抗体について、ＭＩＦとＤ−ＤＴの背景上に５倍以上の蛍光強度が見られた。（Ａ＝ＭＯＲ０１４０９３；Ｂ＝ＭＯＲ０１４１１６；Ｃ＝ＭＯＲ０１４１３８）
【図３】抗体Ａ及びＢの、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する半数効果濃度の判定（Ａ＝ＭＯＲ０１４０９３；Ｂ＝ＭＯＲ０１４１１１６）
【図４】抗体Ｃの、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する半数効果濃度の判定（Ｃ＝ＭＯＲ０１４１３８）
【図５】ＭＩＦとＣＤ７４の相互作用の抗体−媒介による阻害（Ａ＝ＭＯＲ０１４０９３；Ｂ＝ＭＯＲ０１４１１６；Ｃ＝ＭＯＲ０１４１３８）
【図６】ＭＩＦとＬＰＳを用いて抗原投与した単離したヒトモノサイトからのＩＬ−１β及びＩＬ−６放出の抗体−媒介による阻害（Ａ＝ＭＯＲ０１４０９３；Ｂ＝ＭＯＲ０１４１１６；Ｃ＝ＭＯＲ０１４１３８）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
このように、一の態様において、本開示は抗原−結合部に関し、この抗原−結合部は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに特異的に結合する。好ましい態様では、抗原−結合部が、ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに特異的に結合する。
【００１８】
一の態様において、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに特異的に結合する抗原−結合部に関し、この抗原−結合部が二重特異性である。
【００１９】
一の態様において、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部が、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合する。
【００２０】
好ましい態様では、この単離した抗原−結合部が、ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに交差反応結合する。
【００２１】
別の態様において、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部はＭＩＦ−媒介及びＤ−ＤＴ−媒介によるシグナル変換を特に阻害することができる。一実施例では、この単離した抗原−結合部が、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴ−活性に特に拮抗する。
【００２２】
別の態様において、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、単離した抗原−結合部が、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ又は１ｎＭより小さい半数効果濃度で、ＭＩＦとＤ−ＤＴに結合する。
【００２３】
別の態様において、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、単離した抗原−結合部が、１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１より小さい解離定数（ＫＤ）で、ＭＩＦとＤ−ＤＴに結合する。
【００２４】
別の態様において、本開示は、単離した二重特異性抗原−結合部に関し、この二重特異性抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この二重特異性抗原−結合部が、ＭＩＦ−媒介及びＤ−ＤＴ−媒介によるシグナル変換を特に阻害することができる。一実施例では、この単離した二重特異性抗原−結合部がＭＩＦ及びＤ−ＤＴ−活性に特に拮抗する。
【００２５】
別の態様において、本開示は、単離した二重特異性抗原−結合部に関し、この二重特異性抗原−結合部が特にＭＩＦとＤ−ＤＴに結合するとともに、単離した抗原−結合部が、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ又は１ｎＭより小さい半数効果濃度で、ＭＩＦとＤ−ＤＴに結合する。
【００２６】
別の態様において、本開示は、単離した二重特異性抗原−結合部に関し、この二重特異性抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、単離した二重特異性抗原−結合部が、１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１より小さい解離定数（ＫＤ）で、ＭＩＦとＤ−ＤＴに結合する。
【００２７】
一の態様において、単離した抗原−結合部が、ＭＩＦの立体構造エピトープを認識し、同様の立体構造エピトープがＤ−ＤＴに存在し、単離した抗原−結合部が、両方の立体構造エピトープを認識する。
【００２８】
一の態様において、本開示は、抗原−結合部に関し、この抗原−結合部が、抗体又は抗体断片である。一実施例では、この抗体又は抗体断片がヒト抗体又はヒト化抗体である。一実施例では、この抗体又は抗体断片が、キメラ抗体である。一実施例では、この抗体又は抗体断片が、ヒト重鎖定常領域と、ヒト軽鎖定常領域を含む。一実施例では、この抗体又は抗体断片が、ＩｇＧアイソタイプである。一実施例では、この抗体又は抗体断片が、どのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＡ）であっても、どのクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＡｌ及びＩｇＡ２）又は、その派生物（例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ）であってもよい。一実施例では、この抗体がＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡアイソタイプである。一実施例では、この抗体又は抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’、Ｆ（ａｂ）２’及びｓｃＦＶからなる群から選択される。一実施例では、この抗体が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び合成抗体からなる群から選択される。一実施例では、この抗体又は抗体断片が、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００２９】
一実施例では、本開示は、抗体又はその抗体断片に関し、この抗体又はその抗体断片がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、二つの同一抗原結合領域を有する。一実施例では、抗体又はその断片が、二つの抗原結合領域を含み、各抗原結合領域が、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応的に結合する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、二つの重鎖（Ｈ）と、二つの軽鎖（Ｌ）を有し、各重鎖と各軽鎖が同一である。
【００３０】
一実施例では、この抗体又はその抗体断片がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、二つの抗原結合領域を具えている。各抗原結合領域が、６つのＣＤＲｓを有し、両抗原結合領域のＨＣＤＲ３が同一である。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、二つの抗原結合領域を有し、各抗原結合領域が６つのＣＤＲｓを有する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、二つの抗原結合領域を有し、各抗原結合領域が、同じ６つのＣＤＲｓセットを有する。
【００３１】
一実施例では、この抗体又はその抗体断片がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、二つの抗原結合領域を有し、各抗原結合領域が、重鎖（以下、ＶＨと略す）と軽鎖（以下、ＶＬと略す）の同じ可変領域を有する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、二つの抗原結合領域を有し、この二つの抗原結合領域が、同じＨＣＤＲ１、同じＨＣＤＲ２、同じＨＣＤＲ３、同じＬＣＤＲ１、同じＬＣＤＲ２、同じＬＣＤＲ３を共有している。
【００３２】
一実施例では、この抗体又は抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’、及びｓｃＦＶからなる群から選択される。
【００３３】
一の態様では、本開示は、抗原−結合部に関し、関し、この抗原−結合部が抗体−由来の骨格である。一実施例では、この抗体−由来の骨格が、二重特異性抗体−由来の骨格である。一実施例では、この二重特異性抗体−由来の骨格が、二重特異性−ｓｃＦｖ、四価染色体二重特異性抗体、架橋Ｆａｂ又は二重特異性ＩｇＧである。
【００３４】
一の態様では、この抗体又はその抗体断片が、単鎖抗体である。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が二重特異性である。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、二重特異性抗体−由来の骨格であり、その二重特異性抗体−由来の骨格が、二重特異性−ｓｃＦｖ、四価染色体二重特異性抗体、架橋Ｆａｂ又は二重特異性ＩｇＧである。
【００３５】
一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部が、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ，ラクダ抗体、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫疾患治療薬、マキシボディ、プロテインＡ及びアフィリンからなる群から選択される。
【００３６】
本開示の一実施例では、生理学的条件下において交差反応抗原結合部が、ＭＩＦかＤ−ＤＴのいずれかと結合する。本開示の一実施例では、生理学的条件下において交差反応抗原結合部が、ＭＩＦとＤ−ＤＴに同時に結合する。本開示の一実施例では、生理学的条件下において交差反応抗原結合部が、ＭＩＦかＤ−ＤＴのいずれかに結合するか、あるいはＭＩＦとＤ−ＤＴに同時に結合する。
【００３７】
一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴ、更に、カニクイザルＭＩＦ又はカニクイザルＤ−ＤＴに交差反応結合する。一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに、更に、カニクイザルＭＩＦとカニクイザルＤ−ＤＴに交差反応結合する。
【００３８】
一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに、及び、マウスＭＩＦとマウスＤ−ＤＴに交差反応結合する。一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部が、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに、及びマウスＭＩＦとマウスＤ−ＤＴに交差反応結合する。
【００３９】
一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに、及び、ラットＭＩＦとラットＤ−ＤＴに結合する。一の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部が、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この抗原−結合部がヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに、及びラットＭＩＦとラットＤ−ＤＴに結合する。
【００４０】
一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、哺乳類ＭＩＦと哺乳類Ｄ−ＤＴに交差反応結合する。一実施例では、哺乳類ＭＩＦと哺乳類Ｄ−ＤＴが、ひと、マウス、ラット、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）からなるリストから選択される種由来である。
【００４１】
一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに交差反応結合する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、マウスＭＩＦとマウスＤ−ＤＴに交差反応結合する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、ラットＭＩＦとラットＤ−ＤＴに交差反応結合する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ＭＩＦとアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）Ｄ−ＤＴに交差反応結合する。一実施例では、この抗体又はその抗体断片が、カニクイザルＭＩＦとカニクイザルＤ−ＤＴに交差反応結合する。
【００４２】
一の態様では、本開示は、表１のいずれかの抗体の、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義された６ＣＤＲｓを含むＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合する、単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００４３】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、表１に記載の抗体に交差−拮抗する、抗体又はその抗体断片に関する。
【００４４】
ある実施例では、表１に記載の抗体と交差−拮抗する抗体が、表１に記載の抗体の一つの、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する結合を、ＥＬＩＳＡをベースとした交差−拮抗において、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減する。
【００４５】
ある実施例では、表１に記載の抗体と交差−拮抗する抗体が、表１に記載の抗体の一つの、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する結合を、例６によるＥＬＩＳＡをベースとした交差−拮抗アッセイにおいて、陽性対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減する。
【００４６】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、表１に記載された抗体と同じエピトープと相互作用（例えば、結合、安定化、空間分布により）する抗体又はその抗体断片に関する。
【００４７】
ある実施例では、本開示の抗体と同じＭＩＦとＤ−ＤＴのエピトープに結合する抗体が、ヒトモノクロナール抗体である。ある実施例では、本開示の抗体と同じＭＩＦとＤ−ＤＴのリニアエピトープに結合する抗体が、ヒトモノクロナール抗体である。ある実施例では、本開示の抗体と同じＭＩＦとＤ−ＤＴの立体構造エピトープに結合する抗体が、ヒトモノクロナール抗体である。このようなヒトモノクロナール抗体は、本明細書に記載されたように作成し、単離することができる。
【００４８】
別の態様では、本開示は、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１９、配列番号：２５、配列番号：３５、及び配列番号：４１からなる群から選択された、重鎖ＣＤＲ３を含む単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００４９】
別の態様では、本開示は、配列番号：１４を含むＶＨと、配列番号：１３を含むＶＬを含む単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００５０】
別の態様では、本開示は、配列番号：３０を含むＶＨと、配列番号：２９を含むＶＬを含む単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００５１】
別の態様では、本開示は、配列番号：４６を含むＶＨと、配列番号：４５を含むＶＬを含む単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００５２】
別の態様では、本開示は、重鎖可変領域、配列番号：１のＣＤＲ１；配列番号：２のＣＤＲ２；配列番号：３のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：４のＣＤＲ１；配列番号：５のＣＤＲ２；配列番号：６のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００５３】
別の態様では、本開示は、重鎖可変領域、配列番号：１７のＣＤＲ１；配列番号：１８のＣＤＲ２；配列番号：１９のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：２０のＣＤＲ１；配列番号：２１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００５４】
別の態様では、本開示は、重鎖可変領域、配列番号：３３のＣＤＲ１；配列番号：３４のＣＤＲ２；配列番号：３５のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：３６のＣＤＲ１；配列番号：３７のＣＤＲ２；配列番号：３８のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片に関する。
【００５５】
別の態様では、本開示は、本開示の抗体又は抗体断片を含む医薬組成物と薬学的に許容可能なキャリアに関する。
【００５６】
別の態様では、本開示は、単離した抗原−結合部に関し、この抗原−結合部がＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合するとともに、この単離した抗原−結合部が薬剤として使用される。
【００５７】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：１のＣＤＲ１；配列番号：２のＣＤＲ２；配列番号：３のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：４のＣＤＲ１；配列番号：５のＣＤＲ２；配列番号：６のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片に交差−拮抗する抗体又はその抗体断片に関する。
【００５８】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：１７のＣＤＲ１；配列番号：１８のＣＤＲ２；配列番号：１９のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：２０のＣＤＲ１；配列番号：２１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片に交差−拮抗する抗体又はその抗体断片に関する。
【００５９】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：３３のＣＤＲ１；配列番号：３４のＣＤＲ２；配列番号：３５のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：３６のＣＤＲ１；配列番号：３７のＣＤＲ２；配列番号：３８のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片に交差−拮抗する抗体又はその抗体断片に関する。
【００６０】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：１のＣＤＲ１；配列番号：２のＣＤＲ２；配列番号：３のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：４のＣＤＲ１；配列番号：５のＣＤＲ２；配列番号：６のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片の結合を、例６によるＥＬＩＳＡをベースとした交差−拮抗アッセイにおいて、陽性対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減する、抗体又はその抗体断片に関する。
【００６１】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：１７のＣＤＲ１；配列番号：１８のＣＤＲ２；配列番号：１９のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：２０のＣＤＲ１；配列番号：２１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片の結合を、例６によるＥＬＩＳＡをベースとした交差−拮抗アッセイにおいて、陽性対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減する、抗体又はその抗体断片に関する。
【００６２】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：３３のＣＤＲ１；配列番号：３４のＣＤＲ２；配列番号：３５のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：３６のＣＤＲ１；配列番号：３７のＣＤＲ２；配列番号：３８のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片の結合を、例６によるＥＬＩＳＡをベースとした交差−拮抗アッセイにおいて、陽性対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減する、抗体又はその抗体断片に関する。
【００６３】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：１のＣＤＲ１；配列番号：２のＣＤＲ２；配列番号：３のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：４のＣＤＲ１；配列番号：５のＣＤＲ２；配列番号：６のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片と同じエピトープと相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）、抗体又はその抗体断片に関する。
【００６４】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：１７のＣＤＲ１；配列番号：１８のＣＤＲ２；配列番号：１９のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：２０のＣＤＲ１；配列番号：２１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片と同じエピトープと相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）、抗体又はその抗体断片に関する。
【００６５】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合し、重鎖可変領域、配列番号：３３のＣＤＲ１；配列番号：３４のＣＤＲ２；配列番号：３５のＣＤＲ３；軽鎖可変領域、配列番号：３６のＣＤＲ１；配列番号：３７のＣＤＲ２；配列番号：３８のＣＤＲ３を含む、単離した抗体又はその抗体断片と同じエピトープと相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）、抗体又はその抗体断片に関する。
【００６６】
別の態様では、本開示は、核酸に関し、この核酸が配列番号：１６を含むＶＨ及び配列番号：１５を含むＶＬを含む。
【００６７】
別の態様では、本開示は、核酸に関し、この核酸が配列番号：３２を含むＶＨ及び配列番号：３１を含むＶＬを含む。
【００６８】
別の態様では、本開示は、核酸に関し、この核酸が配列番号：４８を含むＶＨ及び配列番号：４７を含むＶＬを含む。
【００６９】
別の態様では、本開示は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４７、配列番号：４８からなる群から選択された核酸と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合する単離された抗原−結合部をエンコードする核酸配列に関する。
【００７０】
別の態様では、本開示は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４７、配列番号：４８からなる群から選択された核酸を含むベクターに関する。
【００７１】
別の態様では、本開示は、ベクターを含む単離された宿主細胞に関し、このベクターが配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４７、配列番号：４８からなる群から選択された核酸を含み、この宿主細胞が、このベクターでエンコードしたポリペプチドを発現できる。
【００７２】
別の態様では、本開示は、ベクターを含む単離された宿主細胞に関し、このベクターが配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４７、配列番号：４８からなる群から選択された核酸を含み、この宿主細胞が、このベクターでエンコードしたポリペプチドを発現でき、この宿主細胞が哺乳類細胞である。
【００７３】
別の態様では、本開示は、ベクターを含む単離された宿主細胞に関し、このベクターが配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４７、配列番号：４８からなる群から選択された核酸を含み、この宿主細胞が、このベクターでエンコードしたポリペプチドを発現でき、この宿主細胞がヒト細胞である。
【００７４】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応結合する単離した抗原−結合部を具えるキットに関する。
【００７５】
定義
本開示をより理解しやするするために、最初にいくつかの用語を定義する。追加の定義については、詳細な説明を通じて行う。
【００７６】
用語「ＭＩＦ」は、アクセッション番号：ＣＡＧ３０４０６．１に定義されているＭＩＦを意味し、アミノ酸配列：
2014526886.tif 000003
によって、エンコードされる。
【００７７】
用語「Ｄ−ＤＴ」は、アクセッション番号：ＮＰ＿００１３４６に規定されるＤ−ＤＴを意味し、アミノ酸配列：
2014526886.tif 000004
によって、エンコードされる。
【００７８】
ここで用いられている用語「シグナル伝達」又は「シグナル活性」は、一般的に、成長因子のレセプタへの結合といった、タンパク質−タンパク質相互作用によって開始され、細胞の一の部分から細胞の別の部分へシグナルを伝達する生化学的因果関係を意味する。シグナル伝達を生じさせる一連の反応において、リガンドの各レセプタとの相互作用が、一またはそれ以上のタンパク質上のチロシン残基、セリン残基、又はトレオニン残基の一またはそれ以上のリン酸化反応を起こす。シグナル伝達プロセスは、通常、核事象を含み、遺伝子発現に変化を生じさせる。例えば、細胞外ＭＩＦについては、その伝達には、細胞外ＭＩＦと、特定の細胞集団の表面に存在するレセプタとの特定の相互作用が含まれる。細胞外ＭＩＦのレセプタは、限定するものではないが、例えば、ＣＤ７４、ＣＤ７４／ＣＤ４４であり、ＣＸＣＲ２とＣＸＣＲ４のようなケモキンレセプタである。これによって、ＭＩＦと各レセプタとの相互作用が生じた時のシグナル伝達が、ＶＥＧＦやＣＸＣＬ８などの血管新生因子の生成を促進する。したがって、Ｄ−ＤＴとの相互作用が生じた際の細胞外Ｄ−ＤＴのレセプタは、シグナル伝達を誘発し、その結果、例えば、限定するものではないが、ＶＥＧＦやＣＸＣＬ８などの血管新生因子が生成されることになる。
【００７９】
ここで用いられている用語「アンタゴニスト」は、抗原の生化学反応を中和する抗原結合部を意味する。用語「拮抗化」は、したがってこのようなコンテキストで使用される。例えば、アンタゴニストは、抗原によって媒介されるシグナル伝達を阻害する。拮抗活性を測定する分析例は、以下の実験例に詳細に述べられている。いくつかの実施例では、本開示の抗体が、ＭＩＦのＣＤ７４に対する相互作用を低減する、小さくする又は阻害している。いくつかの実施例では、この抗体が、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦ−１β、ＩＬ−６）のＭＩＦ−依存性放出を低減する、小さくする、又は阻害している。いくつかの実施例では、例えば、ＳＥＴ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又はＢＩＡｃｏｒｅを用いてＭＩＦとＤ−ＤＴへの結合によって、抗体の活性を測定することができる。
【００８０】
ここで用いられている用語「価数」は、ポリペプチド中の潜在的標的結合部位の数を意味する。各標的結合部位は、一の標的分子又は標的分子の特異的部位に、特異的に結合する。ポリペプチドが一以上の標的結合部位を有する場合、各標的結合部位は、同じ、又は異なる分子に特異的に結合できる（例えば、異なる抗原といった異なる分子、又は、同じ分子の異なるエピトープ）。したがって、用語「一価」及び「二価」は、このコンテキストで使用される。
【００８１】
ここで用いられている用語「抗原結合部」は、所定の抗原に特異的に結合する能力をもたらすポリペプチドを含む部位を意味する（例えば、ＭＩＦやＤ−ＤＴ）。例えば、抗体、抗体派生物、抗体様骨格、及び代替の骨格は、少なくとも一の抗原結合部を有する。抗原結合部は、また、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及び二重特異的−ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６−１１３６参照）。抗原結合部を有する分子の更なる例は、以下に記載されており、フィブロネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ，ｆｕｌｌｙ  ｏｗｎｅｄ  ｂｙ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｗａｌｔｈｍａ，ＭＡ）、ラクダ抗体、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ａｎｄ  Ａｂｌｙｎｘ  ｎｖ，Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、小分子免疫薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びアフィリン（ｇａｍｍａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｏｒ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。
【００８２】
ここで用いられている用語「抗体」は、完全抗体と、その断片又は単鎖を含む。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合された少なくとも二つの重鎖（Ｈ）と二つの軽鎖（Ｌ）を含むタンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（以下、ＶＨと略す）と、重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略す）と、軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、一のドメインＣＬからなる。ＶＨとＶＬ領域は、更に、相補性決定常領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性であり、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が組み入れられている領域に分けられる。ＶＨとＶＬは各々、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置した、３つのＣＤＲｓと４つのＦＲｓでできている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクタ細胞）と古典的な補体系の第１コンポーネント（Ｃ１ｑ）を含み、免疫グロブリンの宿主組織又は因子への結合を媒介することができる。抗体は、アイソトープ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）であってもよく、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、サブクラス又はこれらの変形バージョン（例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ）であってもよい。
【００８３】
用語「重鎖可変領域ＣＤＲ１」及び「Ｈ−ＣＤＲ１」は、相互に交換可能に用いられている。用語「重鎖可変領域ＣＤＲ２」と「Ｈ−ＣＤＲ２」、用語「重鎖可変領域ＣＤＲ３」と「Ｈ−ＣＤＲ３」、用語「軽鎖可変領域ＣＤＲ１」と「Ｌ−ＣＤＲ１」、用語「軽鎖可変領域ＣＤＲ２」と「Ｌ−ＣＤＲ２」と、用語「軽鎖可変領域ＣＤＲ３」と「Ｌ−ＣＤＲ３」も同様である。
【００８４】
抗原結合は、完全抗体の「断片」によって行われる。抗体の用語「抗体断片」に含まれる結合抗体の例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋でリンクされた二つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ）２断片；ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；及び単離した相補性決定常領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００８５】
「単鎖断片（ｓｃＦｖ）」は、単一のタンパク質鎖であり、ＶＬ領域とＶＨ領域が対をなして、一価の分子を形成している（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３参照）。二つのドメインＶＬとＶＨは、別々の遺伝子によってコード化されるが、組み換え技術を用いて、単一のタンパク質鎖にすることができる人工ペプチドリンカによって合わせることができる。このような単鎖抗体は、一またはそれ以上の抗原結合部を含む。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、この断片は、完全抗体と同じ方法で、スクリーニングして実用化することができる。
【００８６】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ−細胞レセプタで特に認識されるか、分子と相互作用するタンパク性領域を含む。一般的に、エピトープは、アミノ酸や炭水化物、又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面群に属し、一般的に、特異的三次元構造特性、並びに比電荷特性を有する。当業者には自明であるように、実用的には、抗体が特異的に結合するものはなんでもエピトープとなりうる。エピトープは、抗体が結合するこれらの残基を含んでいてもよく、「リニア」又は「立体構造」であってもよい。
【００８７】
用語「リニアエピトープ」は、タンパク質と、相互作用する分子（抗体など）の間の相互作用が生じるすべてのポイントが、そのタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じている（連続して）エピトープを意味する。
【００８８】
用語「立体構造エピトープ」は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って不連続アミノ酸が三次元立体構造中に集まっているエピトープを意味する。立体構造エピトープでは、相互作用のポイントが、互いから分離されているタンパク質のアミノ酸残基に亘って生じる。
【００８９】
用語「交差競合」は、抗原の得意領域に結合する能力を共有している抗原結合部（抗体など）を意味する。本開示では、「交差競合」している抗原結合部は、標準競合的結合アッセイにおいてＭＩＦ及び／又はＤ−ＤＴに関する別の抗原結合部の結合を阻害する能力を有する。このような抗体は、非限定的な理論によれば、それが競合する抗体としてのＭＩＦとＤ−ＤＴタンパク質の、同じ、又は、関連する、又は近い（例えば、構造的に似ている、又は空間的に近い）エピトープに結合することができる。交差競合の研究は、例えば、抗原に結合するための抗体の競合を行いうる、お互いに競合的に結合する抗体を発見する。例えば、本開示は、表１に記載の抗体と交差競合する（例えば、結合、安定化、空間分布によって）抗体を提供する。このような抗体は、非限定的な理論によれば、それが競合する抗体としてのＭＩＦとＤ−ＤＴタンパク質の、同じ、又は、関連する、又は近い（例えば、構造的に似ている、又は空間的に近い）エピトープに結合することができる。抗体またはその他の結合剤が、別の抗体又は結合分子のＭＩＦ又はＤ−ＤＴへの結合を阻害できる能力、又は、範囲、したがって、本発明による交差競合といえるかどうかは、標準的な競合結合アッセイを用いて決めることができる。抗体Ａが、抗体Ｂの結合を少なくとも６０％、特に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％少なくすれば、交差競合が存在し、逆に、この抗体の一つが欠けている陽性対照と比較してもよい。当業者には自明なように、競合は、様々な設定のアッセイで評価することができる。一の適切なアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ社の技術を使用しており（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００の機会（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて）、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の範囲を測定することができる。交差競合を測定する別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの方法（例えば、例６）を使用している。更に、その交差競合に基づいた「ビニング」抗体用の高スループットプロセスが国際特許出願第ＷＯ２００３／４８７３１号に記載されている。交差競合は、探している抗体が表１に記載の抗体の一つの結合を、６０％又はそれ以上、特に７０％又はそれ以上、更に、８０％又はそれ以上小さくする場合に、及び表１に記載の抗体の一つが、その抗体のＭＩＦ又はＤ−ＤＴへの結合を、６０％又はそれ以上、特に７０％又はそれ以上、更に、８０％又はそれ以上小さくする場合に、存在する。
【００９０】
ここで用いられているように、用語「ヒト抗体」は、骨格とＣＤＲ領域がヒト由来の配列からの可変領域を有する抗体を含むものを意図している。ここで用いられているように、ヒト抗体は、重鎖又は軽鎖可変領域又は完全長重鎖又は軽鎖領域を含む。所定のケースでは、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は少なくとも９５％、あるいは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列である。これによって、このヒト抗体は、Ｂ−細胞から単離されたＶＨ／ＶＬのＰＣＲ増幅によって生成された、あるいは、合成的に生成された、ヒト生殖細胞系列遺伝子から抽出された抗体を含む技術基盤から得ることができる。技術基盤は、ファージ、リボソーム又はイーストに示されたヒト免疫グロブリン遺伝子を含むライブラリィベースのアプローチを含む。各情報ディスプレイ技術は、科学団体では標準である。更に、ヒト免疫グロブリンレパートリを担持する遺伝子導入マウスの免疫付与は、対象の抗原に対するヒト抗体を生成するもう一つのアプローチである。ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ（登録商標）概念に基づく抗体ライブラリから選択される抗体又はその断片（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６）は、完全なヒトと考えられている。
【００９１】
ここで用いられている用語「モノクロナール抗体」は、単分子組成物の抗体分子の調製を意味する。モノクロナール抗体組成物は、独自の結合特異性と特定のエピトープの親和性を有する独自の結合部位をディスプレイする。
【００９２】
「ヒト化」抗体は、ヒトの免疫原性がより低いが、非ヒト抗体の活性を維持している抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持し、その抗体の残りの部分を、そのヒトと同様の部分で置き換えることで達成できる（例えば、可変領域中の定常領域、並びに骨格部分）。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｅ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ（１９９１）Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ（１９９４）Ｉｍｍｕｎ．，３１：１６９−２１７参照。人間工学技術のその他の例には、限定するものではないが、米国特許第５，７６６，８８６号に開示されたゾーマ（Ｘｏｍａ）技術がある。
【００９３】
用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域又はその一部が、変化、置換又は好感されて、抗原結合部位（可変領域）が、異なる又は変化したクラスの、エフェクタ機能の、及び／又は種の定常領域に、又は、キメラ抗体に新しい特性と授ける、全体的に異なる分子、例えば、酵素、トキシン、ホルモン、成長因子、薬剤その他、にリンクしている抗体；又は、（ｂ）可変領域又はその一部が、別の又は変化した抗原特異性を有する可変領域に変化した、置換した、あるいは好感された抗体である。例えば、マウス抗体は、定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域で置き換えることによって、修飾できる。このヒト定常領域での置換によって、キメラ抗体が、原マウス抗体に比較した時の、ヒトの抗原性が低下した抗原を認識する特異性を維持することができる。
【００９４】
用語「単離した」は、例えば、抗原特異性が異なるその他の抗体又は抗原結合部を実質的に持たない、抗体又は抗原結合部を意味する。更に、単離された抗体抗原結合部は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に持たない。
【００９５】
用語「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子で提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４などのＩｇＧ）を意味する。イソタイプは、これらのクラスの一変形バージョンも含んでおり、この変形は、Ｆｃ機能を変えて、例えば、エフェクタ機能又はＦｃレセプタへの結合を強化又は低減する。例えば、ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡは、エフェクタ機能を有意に低減したＩｇＧイソタイプの変形バージョンである。アミノ酸の特異的置換は、非修飾抗体に比べて、ＦｃガンマＲＩレセプタに対する結合親和性を低減する。ＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡは、米国特許出願第０８／４７９，７５２号（ＳＣＯＴＧＥＮ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＩＮＣ．）に記載されており、これは引用により全体が組み込まれている。本開示の所定の実施例では、抗原−結合部が、抗体であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩＧＥ又はＩｇＤタイプである。特定の実施例では、この抗体がＩｇＧタイプである。本開示の所定の実施例では、この抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４といったサブタイプである。特定の実施例では、この抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。その他の特定の実施例では、この抗体が、ＩｇＧ１又はＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡといったサブタイプである。
【００９６】
抗原に「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」といったフレーズ（例えば、ＭＩＦ−結合抗体）は、タンパク質の不均一集団中の抗原又はその他の生物製剤（例えば、ヒトＭＩＦ又はヒトＤ−ＤＴ）の存在で決定できる結合反応を意味する。これによって、「抗原を認識する」及び「抗原に特異的である」とのフレーズは、ここでは、用語「抗原に特異的に結合する」と交換可能に使用されている。抗原結合部位、例えば、モノクロナール抗体、の抗原への特異的結合は、この分野で知られており、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｌｏｔ、ＢＩＡｃｏｒｅ及びＳＥＴを含む、様々な確立された方法で決定することができる。本開示において、抗原結合部位は、その抗原結合部位がある特異的抗原、又は少なくとも一以上の抗原の選択に、バックグラウンドを超えて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、結合できることを示している場合は、その抗原結合部位は、一の抗原、又は、一以上の抗原の選択に対して特異的であると考えられる。これによって、選択された抗原に特異的でないことが知られている抗原結合部位によって、又は、関係のない抗原への結合と比較することによって、バックグラウンドがきまる。
【００９７】
本開示では、抗原結合部の半数効果濃度測定が、各抗原に対して、１００ｎＭより小さい、９０ｎＭより小さい、８０ｎＭより小さい、７０ｎＭより小さい、６０ｎＭより小さい、５０ｎＭより小さい、４０ｎＭより小さい、３０ｎＭより小さい、２９ｎＭより小さい、２８ｎＭより小さい、２７ｎＭより小さい、２６ｎＭより小さい、２５ｎＭより地裁、２４ｎＭより小さい、２３ｎＭより小さい、２２ｎＭより小さい、２１ｎＭより小さい、２０ｎＭより小さい、１５ｎＭより小さい、１０ｎＭより小さい、５ｎＭより小さい、４ｎＭより小さい、３ｎＭより小さい、２ｎＭより小さい、１ｎＭより小さいと測定されるのであれば、抗原結合部が抗原に特異的であると考えられる。
【００９８】
ここで使用されているように、用語「親和性」は、例えば、モノクロナール抗原などの抗原結合部と、単一抗原性部位との相互作用の強度を意味する。各抗原性部位内で、抗体「アーム」の可変領域が、弱い非共有結合力を介して多数の部位における抗原と相互作用する。相互作用が大きければ大きいほど、親和性が強くなる。
【００９９】
ここで用いられているように、用語「ＫＤ」は、解離定数を意味する。これは、Ｋａに対するＫｄの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）で表される。モノクロナール抗体などの抗原結合部のＫＤの値は、この分野で良く確立された方法を用いて測定することができる。モノクロナール抗体などの抗原結合部のＫＤを測定する方法は、ＳＥＴ（可溶平衡滴定）又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）などのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴である。本開示では、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体は、通常、解離速度定数（ＫＤ）（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）が、５×１０−２Ｍより小さい、１０−２Ｍより小さい、５×１０−３Ｍより小さい、１０−３Ｍより小さい、５×１０−４Ｍより小さい、１０−４Ｍより小さい、５×１０−５Ｍより小さい、１０−５Ｍより小さい、５×１０−６Ｍより小さい、１０−６Ｍより小さい、５×１０−７Ｍより小さい、１０−７Ｍより小さい、５×１０−８より小さい、１０−８Ｍより小さい、５×１０−９Ｍより小さい、１０−９より小さい、５×１０−１０Ｍより小さい、１０−１０Ｍより小さい、５×１０−１１Ｍより小さい、１０−１１Ｍより小さい、５×１０−１２Ｍより小さい、１０−１２Ｍより小さい、５×１０−１３Ｍより小さい、１０−１３Ｍより小さい、５×１０−１４Ｍより小さい、１０−１４Ｍより小さい、５×１０−１５Ｍより小さい、１０−１５Ｍより小さい、あるいはこれより小さい。
【０１００】
ここで用いられているように、用語「抗原結合領域」は、抗原結合部と抗原間の特異的結合に関与している抗原結合部のドメインを意味する。例えば、抗体又はその断片の抗原結合部は、重鎖（以下、ＶＨと略す）と軽鎖（以下、ＶＬと略す）のＮ−末端可変領域のアミノ酸残基によって形成される。ＶＨとＶＬの可変領域は、それぞれ、相補性決定常領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、３つの超可変領域を具えている。ＶＨの３つのＣＤＲｓとＶＬの３つのＣＤＲｓは、互いに対して三次元配置となって、抗原結合表面を形成している。
【０１０１】
用語「交差反応性結合」及び用語「交差特異性」及び「交差反応性」は、ここでは、交換可能に用いられており、一より多い抗原に特異的に結合する能力を有する抗原結合部を意味する。例えば、本開示では、抗原結合領域が、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに交差反応的に結合する。好ましくは、抗原結合領域は、ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに交差特異的に結合する。例えば、本開示では、交差反応的にＭＩＦとＤ−ＤＴに結合する抗体が、二本のアームを有しており、両アームが同じ抗原結合領域を有する。
【０１０２】
本開示では、フレーズ「交差特異的にＭＩＦとＤ−ＤＴに結合する」と「ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応」は、交換可能に使用されており、ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応的に結合する抗原結合部を意味する。抗原特異性は、上記に定義されており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｌｏｔ，ＢＩＡｃｏｒｅ、又はＳＥＴといった当業者に公知の方法によって測定することができる。本開示では、抗原結合部は、抗原結合部が、少なくとも２つの抗原の特異的選択に対して、バックグラウンドを超えて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、結合できることが示されている場合、無限数の抗原に交差反応すると考えられる。したがって、バックグラウンドは、選択された抗原に対して非特異的であることが知られている抗原結合部によって、あるいは関係のない抗原に対する結合と比較することによって、決定される。
【０１０３】
本開示において、抗原結合部は、抗原結合部の半数効果濃度試験が、各抗原について、１００ｎＭより小さい、９０ｎＭより小さい、８０ｎＭより小さい、７０ｎＭより小さい、６０ｎＭより小さい、５０ｎＭより小さい、４０ｎＭより小さい、３０ｎＭより小さい、２９ｎＭより小さい、２８ｎＭより小さい、２７ｎＭより小さい、２６ｎＭより小さい、２５ｎＭより小さい、２４ｎＭより小さい、２３ｎＭより小さい、２２ｎＭより小さい、２１ｎＭより小さい、２０ｎＭより小さい、１５ｎＭより小さい、１０ｎＭより小さい、５ｎＭより小さい、４ｎＭより小さい、３ｎＭより小さい、２ｎＭより小さい、１ｎＭより小さいと測定されるのであれば、抗原結合部が無制限数の抗原に特異的であると考えられる。半数効果濃度試験は、以下に記載した明細書によって決定することができる。
【０１０４】
本開示では、抗原結合部の交差反応性は、一の種に制限されない。本開示では、ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに交差特異的に結合する抗原結合部は、更に、一またはそれ以上の哺乳類種（例えば、マウス、ラット、アカゲザル及びカニクイザル）由来のＭＩＦ及び／又はＤ−ＤＴに交差反応する。
【０１０５】
用語「二重特異性」は、ここでは、二つの異なる抗原結合領域を有する抗体、抗体は生物、抗体様骨格又は代替骨格を意味し、組み込まれた各抗原結合領域が、特定の抗原に対する二重結合特異性を担っている。例えば、本開示では、二重特異性分子が、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに交差反応的に結合する一の抗原結合部と、更なる抗原に特異的に結合する第２の抗原結合領域を有する。抗原結合は、二重特異性抗体由来骨格内に組み込むことができる。この例が以下に示されており、二重特異性−ｓｃＦｖ（ＢＩＴＥ（登録商標）；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、四価の二重特異性抗体フォーマット（ＴａｎｄＡｂ（登録商標）Ａｆｆｉｍｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＡＧ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）架橋Ｆａｂｓ、及び二重特異性ＩｇＧｓ（ＴＲＩＯＮ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。
【０１０６】
用語「アミノ酸」は、天然に生じたアミノ酸と合成アミノ酸、並びにアミノ酸類似体、及び天然アミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似構造を意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードでコード化されるもの、並びに、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンといった、後に修飾されたアミノ酸である。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を有する組成物、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及び、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、ミチオニンメチルスルホニウムといった、Ｒ基を意味する。このような類似体は、Ｒ基（例えば、ノルロイシン）で修飾されるか、あるいはペプチド骨格で修飾されるが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を残している。アミノ酸類似構造は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する。
【０１０７】
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、ここでは交換可能に使用されており、アミノ酸残基のポリマを意味する。この用語は、一またはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学類似構造であるアミノ酸ポリマにも適用され、天然アミノ酸ポリマにも、非天然に生じるアミノ酸ポリマにも適用される。特にディスプレイされていない限り、特定のポリペプチド配列は、保存的に修飾されたその異形にも、暗黙的に及ぶ。
【０１０８】
用語「核酸」は、ここでは用語「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用されており、単一基準又は二重基準形の、デオキシリボ核酸又はリボ核酸及びそのポリマを意味する。この用語は、既知の核酸類自体又は修飾した骨格残基又はリンケージを含む核酸に及ぶ。これは、合成、天然又は非天然であり、基準核酸と同様の結合特性を有する核酸に及ぶ。このような類似体には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）を含む。特に説明がない限り、特定の核酸シーケンスは、また、保存的な修飾異形（例えば、変性コドン置換）、相補的配列、並びに明らかにディスプレイされている配列にも及ぶ。特に、以下に詳細に述べるように、変性コドン置換は、一またはそれ以上の選択された（又はすべての）コドンの第３位が、混合されたベース及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている、配列を生成することで達成できる。（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８；及び、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【０１０９】
用語「遺伝子組み換え宿主細胞」（又は、単に「宿主細胞」）は、組み換え遺伝子発現ベクターを導入した細胞を意味する。このような用語は、特定の主題となる細胞のみならず、このような細胞の産物も意味するよう意図していると考えるべきである。変位株又は環境の影響によって、連続する世代において所定の変化が生じ、このような子孫は、事実上、親細胞と同じではなくなるが、ここで用いられているように、用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【０１１０】
用語「ベクター」は、あるポリヌクレオチドがリンクされている別のポリヌクレオチドを運ぶことができるポリヌクレオチドを意味することを意図している。ある種のベクターは、「プラズミド」であり、これは、その中に追加のＤＮＡセグメントが結合できる環状二重標準ＤＮＡループを意味する。別の種のベクターは、ウイルス性ベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルス性ゲノムに結合できる。ある種のベクターは、そのベクターを導入する宿主細胞（例えば、複製の細胞起源と、エピソーム性哺乳類ベクターを有する細菌性ベクター）中で自己複製することができる。その他のベクター（例えば、非−エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主に導入する際に、宿主細胞のゲノムに統合することができ、これによって、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、ベクターが操作可能にリンクしている遺伝子の発現を導く区都ができる。これらのベクターは、ここでは、「遺伝子組み換え発現ベクター」（あるいは、単に「発現ベクター」）と呼んでいる。一般的に、遺伝子組み換えＤＮＡ技術において効用のある発現ベクターは、しばしば、プラズミドの形である。プラズミドはもっとも一般的に、ベクターの形で使用されているため、本明細書では、「プラズミド」と「ベクター」は、交換可能に使用することができる。しかしながら、この開示は、同等に機能するウイルスベクター（例えば、複製能欠如性レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス）などのこのようなその他の形の発現ベクターを含むことを意図している。
【０１１１】
したがって、この分野で知られており、上述した方法論によって決定されるような、ＭＩＦ及び／又はＤ−ＤＴの一またはそれ以上の機能特性（例えば、生化学的、免疫化学的、細胞、生理学的、あるいはその他の生物学的活性、など）を「阻害する」抗体は、特に、抗体が欠如しているときに見られる活性（例えば、特異性に関係のない対照抗体が存在する場合）に対する特定の活性における、統計的に有意な減少に関連すると考えられる。
【０１１２】
にまたはそれ以上の核酸又はポリペプチド配列のコンテキストにおけるフレーズ「パーセント同一」又は「パーセント同一性」は、二又はそれ以上の同じ配列又は部分列を意味する。比較ウインド上で比較して、あるいは、以下の配列比較ある以後リズムの一つを用いてまたは、手動アラインメントと目視検査で測定した時の指定された領域上で比較して、最大一致整列した時に、二つの配列が、同じ特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域において、または、特定されていない場合は配列全体において、６０％同一、選択的に、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一）のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、二つの配列は「実質的に同一」である。選択的に、少なくとも約５０のヌクレオチド（又は１０アミノ酸）長である領域、又はより好ましくは、１００乃至５００あるいは１０００又はそれ以上のヌクレオチド（又は、２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸）長である領域上に、同一性が存在する。
【０１１３】
追加で又は代替的に、本開示のタンパク質配列は、更に、「問い合わせ配列」として用いることができる、例えば、関連する配列を同定するためにパブリックデータベースのサーチを実行することができる。例えば、このようなサーチは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて、実行することができる。配列比較のために、通常、一の配列が基準配列となり、それに対してテスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するに際して、テスト及び基準配列をコンピュータに入力し必要があれば部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用してもよく、代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムで、プログラムパラメータに基づいて基準配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１１４】
パーセント配列同一性と配列類似性の決定に適した二つのアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムである。これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；とＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析法を実行するソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードに整列する時の、正の値の閾値スコアに合致するまたはそれを満足する、問い合わせ配列中の長さＷのショートワードを同定することによる、第１のハイスコア配列対（ＨＳＰｓ）を認識するステップを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値である（Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。これらの初期の隣接ワードのヒットが、それらを含むより長いＨＳＰｓを見つけるサーチ開始の種となる。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増える限り、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（合致する残基対のリワードスコア；常に＞０）とパラメータＮ（合致しない残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列では、スコアマトリックスを用いて、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ下がったとき；一またはそれ以上の負のスコア残基整列の累積によって、累積スコアがゼロ又はそれ以下になったとき；又はいずれかの配列の最後に達した時に、止まる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、両ストランドの比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両ストランドの比較を使用する。
【０１１５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、また、二つの配列間の類似性の統計分析も行う（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性測定法の一つは、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、二つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の合致が偶然生じる確率のディスプレイである。例えば、テスト核酸と基準核酸との比較における最小和確率が約０．２より小、より好ましくは約０．０１より小、そして最も好ましくは約０．００１より小である場合に、その核酸が基準配列に類似すると考えられる。
【０１１６】
二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０残基重量テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用して決定することもできる。更に、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソルトウエアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈｕ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重、及び１、２、３、４、５又は６のレングスウエイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用して決定することもできる。
【０１１７】
上述した配列同定のパーセンテージ以外の、二つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるとのもう一つのディスプレイは、以下に述べるような、第１の核酸でコード化されたポリペプチドが、第２の核酸でコード化されたポリペプチドに対する抗体と免疫的に交差反応することである。このように、ポリペプチドは、典型的には、例えば、二つのペプチドが伝統的な置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であるとのもう一つのディスプレイは、以下に述べるように、厳しい条件下で二つの分子あるいはその補体が互いにハイブリダイズすることである。二つのアミノ酸配列が実質的に同一であるとのもう一つのディスプレイは、同じプライマを用いて、その配列を増幅できることである。
【０１１８】
本開示の様々な態様を、以下のセクション及びサブセクションにより詳細に述べる。
【０１１９】
改変抗体と修飾抗体
本開示の抗体は、表１に示す抗体由来の修飾抗体であってもよい。これによって、表１に示す抗体が、修飾抗体を改変する出発材料として使用される。
【０１２０】
一方又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）中の、例えば、一またはそれ以上のＣＤＲ領域内で、及び／又は一またはそれ以上の骨格領域内で、一またはそれ以上の残基を修飾することによって、抗体を改変することができる。追加であるいは代替的に、定常領域内の残基を修飾することによって抗体を改変して、例えば、抗体のエフェクタ機能を変えることができる。
【０１２１】
抗体を改変又は修飾することによって、親クローンの改良された変種を得ることができる。一方、様々な技術、例えば、親和性を改良する技術、免疫原性を改変する技術、及び抗体のエフェクタ機能を増やす技術が、この分野で確立されている。
【０１２２】
抗体は、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定常領域（ＣＤＲｓ）に位置するアミノ酸残基を通じて、標的抗原と相互作用する。したがって、親和性成熟は、抗体の結合特性を変える特異的ＣＤＲｓを修飾するステップを具える。親和性修飾は、超可変領域における特定部位の突然変異誘発を含み、アミノ酸置換、追加又は削除を含んでいてもよい。もう一つのタイプの親和性成熟は、各ＣＤＲｓのライブラリを使った特異的抗体中の特異的ＣＤＲｓの完全な交換である。その結果、修飾した抗体を標準抗原結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＢｉａＣｏｒｅ、ＳＥＴ分析）で分析して、各抗原への改良した親和性を得ることができる。（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに付与された米国特許第５，２２５，５３９号、及びＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌに付与された米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、及び第６，１８０，３７０号参照）。
【０１２３】
ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互反応に関与しているので、様々な特性を有する異なる抗体由来の骨格配列に移植した特異的天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的天然抗体の特性を模倣した遺伝子組み換え抗体を発現することは可能である。このような骨格配列は、公開ＤＮＡデータベースから、あるいは生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「Ｖａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅでインターネットで入手可能である）に見ることができる。また、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；及びＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．ｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６；にも見ることができる。各文献の内容は、引用によりここに明確に組み込まれている。
【０１２４】
二重特異性分子及び多価抗体
もう一つの態様では、本開示は、ＭＩＦ−結合抗原結合部とＤ−ＤＴ結合抗原結合部を含む、二重パラトープ、二重特異性、複数特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、又は多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子を特徴とする。別の態様では、本開示は、ＭＩＦ−結合抗原結合部とＤ−ＤＴ結合抗原結合部を含み、このＭＩＦ−結合抗原結合部とＤ−ＤＴ結合抗原結合部が同じでない二重パラトープ、二重特異性、複数特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、又は多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子を特徴とする。
【０１２５】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦ−結合抗体とＤ−ＤＴ結合抗体、又はこれらの断片を含む二重パラトープ、二重特異性、複数特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、又は多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子を特徴とする。別の態様では、本開示は、ＭＩＦ−結合抗体とＤ−ＤＴ結合抗体、又はこれらの断片を含む二重パラトープ、二重特異性、複数特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、又は多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子であって、ＭＩＦ−結合抗原とＤ−ＤＴ結合抗原が、同じでない抗原結合部を含むことを特徴とする。別の態様では、二重特異性抗原結合部が、二重特異性−ｓｃＦｖ、三価の二重特異性抗体、架橋Ｆａｂ又は二重特異性ＩｇＧからなる群から選択される。
【０１２６】
別の態様では、本開示は、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応性抗原由来の少なくとも二つの同じ又は異なる抗原結合部を含む多価の化合物を提供する。
【０１２７】
別の態様では、本開示は、少なくとも二つの同じ又は異なる抗原結合部を含む多価の化合物を提供しており、ここで、一方の抗原結合部は、ＭＩＦに結合し、第２の抗原結合部はＤ−ＤＴに結合し、抗原結合部は、タンパク質溶融又は共有結合あるいは非共有結合を介してリンクできる。
【０１２８】
三価の化合物は、例えば、本開示の抗体を、本開示の抗体の定常領域、例えばＦｃ、又はヒンジ領域に結合する抗体と架橋させることで、得ることができる。三量体形成ドメインは、例えば、ＢｏｒｅａｎのＥＰ特許第１０１２２８０Ｂ１号に記載されている。四量体形成ドメインは、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７号に形成されている。
【０１２９】
本開示の抗体、又はその抗原結合部は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、レセプタ用の別の抗体又はリガンド）にリンクして、少なくとも二つの異なる結合部位又はターゲット分子に結合する二重特異性分子を生成できる。
【０１３０】
本開示の二重特異性分子を作成するには、抗体が、別の抗体、抗体断片、ペプチド、又は結合模倣薬といった、一またはそれ以上の他の結合分子に機能的にリンク（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、又は別の方法で）して、二重特異性分子とする。
【０１３１】
本開示の二重特異性分子は、構成要素結合特異性をコンジュゲートすることによって、この分野で知られている方法を用いて作成することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に発生して、後に互いにコンジュゲートすることができる。結合特性がタンパク質又はペプチドである場合、様々な結合剤又は架橋剤を用いて共有結合できる。架橋剤の例には、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）、５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ  （２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＴＮＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ｏＰＤＭ）、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）、及び、ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈａｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）がある。（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８６４８参照）。その他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．ＭＩＦｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３），及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５がある。架橋剤は、ＳＡＴＡとｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣであり、両方とも、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）社から入手できる。
【０１３２】
結合特異性が抗体である場合、抗体は、二つの重鎖のＣ−末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートすることができる。特定の実施例では、このヒンジ領域を修飾して、例えば、コンジュゲートの前に、奇数のスルフヒドリル残基を含むようにしている。
【０１３３】
代替的に、両方の結合特異性は、同じベクタ内でエンコードして、同じ宿主細胞中で発現させ、アセンブルすることができる。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ，Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、又はリガンド×Ｆａｂ溶融タンパク質である場合に、特に有益である。本開示の二重特異性分子は、一の単鎖抗体と結合決定因子を含む単鎖分子、又は二つの結合決定因子を含む単鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は、少なくとも二つの単鎖分子を含む。二重特異性分子の作成方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；及び米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１３４】
更なる臨床的利点は、一の抗体中の２又はそれ以上の抗原の結合によってもたらされる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９−１６３；Ａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５４：９０−９４；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３：３６１−３６７；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＪＢＣ  ２７９：２８５６−２８６５；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）ＪＢＣ  ２０：１９６６５−１９６７２；Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２６：６４９−６５８；Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  ９：１８４−１９３；  Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１８：６５−７４；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１２９０−１２９７；Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９３：６７２−６９２；及びＭｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）ｍＡｂｓ  １：１２８−１４１）。
【０１３５】
二重特異性又は交差反応性分子の特異的ターゲットへの結合は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析法、生物学的検定法（例えば、成長阻害）、又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  アッセイによって確認できる。これらの各アッセイは、通常、対象となる複合体に特異的な標識付試薬（例えば、抗体）を用いて、特定の対象の抗原−抗体複合体の存在を検出する。
【０１３６】
骨格
「抗原−結合部」を含むその他の抗体／免疫グロブリン骨格又は足場は、本開示に従って使用することができる。これは、非免疫グロブリンベースの抗体と、本開示のＣＤＲｓを移植できる骨格を含む。
【０１３７】
フィブロネクチン足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３ドメイン）の１０番目のモジュール）に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、７つ又は８つのβストランドを有しており、これらが二つのβシート間に配置されている。このβシート自体が互いに固まって、タンパク質のコアを形成している。更に、このドメインは、βストランドを互いにつなぎ、暴露した溶剤であるループ（ＣＤＲｓに類似する）を含む。βシートサンドイッチの各エッジにこのようなループが少なくとも３つあり、このエッジが、βストランドの方向に直交するタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号）。これらのフィブロネクチンベースの足場は、フォールド全体が、最も小さい機能性抗体フラグメントのものに近いが、免疫グロブリンではなく、ラクダとラマＩｇＧ中の抗原認識ユニット全体を含む重鎖の可変領域である。項の構造によって、非免疫グロブリン抗体が、自然界では同様である抗原結合特性と、抗体の抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、インビトロでの抗体の親和性成熟過程と同様であるインビトロでのループランダム化とシャッフリング戦略で用いることができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、分子のループ領域を、標準的なクローニング技術を用いて本開示のＣＤＲｓで置き換えることができる足場として使用することができる。
【０１３８】
ラマ種などの新世界ラクダ類（アルパカ、ラマ、ラマビクーニャ）を含むキャメル及びヒトコブラクダ（フタコブラクダとヒトコブラクダ）科の員から得たラクダ抗体たんぱく質は、サイズ、構造的複雑性、被験者の抗原性で特徴づけられていた。自然界で見られるこの科の哺乳類由来のある種のＩｇＧ抗体には、軽鎖が欠けており、したがって、その他の動物由来の抗体にある二つの重鎖と二つの軽鎖を有する典型的な４鎖第４級構造とは、構造的に区別される。ＷＯ１９９４／０４６７８参照。
【０１３９】
アンキリン技術は、異なる標的との結合に使用できる可変領域を有する足場としてのリピートモジュールからのアンキリンを伴うタンパク質を使用することに基づいている。アンキリンリピートモジュールは、２つの逆平行α−へリックスとβ−ターンからなる３３のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイ法によって最も最適化される。
【０１４０】
アビマーは、天然Ａ−ドメインから取り出される。これらのドメインは、生来、タンパク質−タンパク質の相互作用に用いられ、ヒトでは２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡ−ドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合した様々な「Ａ−ドメイン」モノマー（２−１０）なる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、２００５００５３９７３号、第２００５００４８５１２号、第２００６０００８８４４号に記載されている方法論を用いて、標的抗原に結合できるアビマーを作成することができる。
【０１４１】
アフィボディ親和性リガンドは、タンパク質ＡのＩｇＧ−結合ドメインの一つの足場に基づく３へリックスバンドルでできた、小さい、単純なタンパク質である。タンパク質Ａは、バクテリアＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の表面たんぱく質である。この足場ドメインは、５８のアミノ酸からできており、そのうち１３のアミノ酸を無作為に抽出して、多くのリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリをつくる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号参照）。アフィボディ分子は抗体を模倣しているが、１５０ｋＤａである抗体の分子量に比較すると、分子量は６ｋＤａである。サイズは小さいが、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
【０１４２】
アンチカリンは、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社によって開発された製品である。アンチカリンは、リポカリンから取り出され、一般的に化学的に敏感な又は不溶性化合物の生理学的輸送又は保存に関与する、小さくかつ強力な、広範囲に及ぶタンパク質群である。いくつかの天然リポカインは、ヒトの組織又は体液中に生じる。このたんぱく質構成は、硬い骨格の頂部にある超可変ループによって免疫グロブリンを連想させる。しかしながら、抗体又はその遺伝子組み換え断片と対照的に、リポカインは、１６０乃至１８０のアミノ酸残基を伴う単鎖ポリペプチドでできており、単一の免疫グロブリンドメインよりわずかに大きいだけである。結合ポケットを構成している４つのループセットは、明らかな構造的柔軟性を示すとともに、様々な側鎖を容認している。結合部位は、したがって、独自の工程で再形成して、高い親和性と特異性を有する上述の形状の異なる標的分子を認識することができる。リポカイン族の一つのタンパク質である、Ｐｉｅｒｉｓ  Ｂｒａｓｓｉｃａｅ社のビリン−結合タンパク質（ＢＢＰ）を用いて、４つのループセットを突然変異させてアンチカリンを開発した。アンチカインを記載している特許出願の一例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／１６８７３号である。
【０１４３】
アフィリン分子は、小さい、非免疫グロブリンタンパク質であり、タンパク質と小分子に対する特異的親和性があるように設計されている。新しいアフィリン分子は、二つのライブラリから非常に迅速に選択できる。各ライブラリは、ことなるヒト由来の骨格タンパク質に基づく。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に構造的相同性は示さない。現在、二つのアフィリン骨格が用いられており、一つはγ結晶である、ヒト構造水晶体タンパク質であり、もう一つは、「ユビキチン」スーパーファミリィタンパク質である。両方ともヒト骨格は非常に小さく、高温安定性を示すとともに、ｐＨの変化や変性剤に対して耐性がある。この高い安定性は、主に、タンパク質の拡張されたβシート構造による。γ結晶由来のタンパク質の例は、ＷＯ２００１／０４１４４号に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、ＷＯ２００４／１０６３６８号に記載されている。
【０１４４】
タンパク質エピトープ模倣薬（ＰＥＭ）は、中くらいのサイズの、環状、ペプチド様分子（ＭＷ１−２ｋＤａ）であり、タンパク質−タンパク質相互作用に生じる主二次構造である、タンパク質のβ−ヘアピン二次構造を模している。
【０１４５】
抗体の生成
（ｉ）抗体を核酸でエンコード
本開示は、上述したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応性抗体のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをエンコードする、実質的に生成した核酸分子を提供している。特定の実施例では、この核酸分子は、表１に同定されている分子である。本開示のその他の核酸分子は、表１に同定した分子のヌクレオチド配列とほぼ同一（例えば、少なくとも６５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％）である核酸配列を含む。上述した核酸の従来の適当な発現ベクターへのサブクローニングと、適宜の発現システム中の発現ベクターの発現は、ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに交差反応性であるこれらのポリ核酸によってエンコードされたポリペプチドを作る。
【０１４６】
また、本開示で提供されているものは、上述したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の重鎖又は軽鎖からの少なくとも一のＣＤＲ領域と、通常３つすべてのＣＤＲ領域をエンコードするポリヌクレオチドである。その他のポリヌクレオチドは、上述のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域は入れ一のすべて又はほとんどすべてをエンコードする。この遺伝情報の構造によって、様々な核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配列をエンコードする。
【０１４７】
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、あるいは、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体又はその結合断片をエンコードする既存の配列（例えば、以下の例に述べる配列）のＰＣＲ突然変異生成によって、作成することができる。核酸の直接的な化学合成は、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９のリン酸ジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９のジエチルリン酸アミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号のソリッドサポート法などの、この分野で知られている方法で行うことができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異株の導入は、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７；及びＥｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７に記載されているように行うことができる。
【０１４８】
また、本開示が提供しているものは、上述のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体を生成するための発現ベクターと宿主細胞である。ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の鎖又は結合部をエンコードするポリヌクレオチドを発現させるのに、さまざまな発現ベクターを用いることができる。哺乳類宿主細胞での抗体の生成には、ウイルス性の発現ベクターと、非ウイルス性の発現ベクターの両方を使用することができる。非ウイルス性ベクター及びシステムは、プラズミド、エピソマールベクター、典型的に、タンパク質又はＲＮＡを発現させる発現カセットを伴うベクター、及びヒト実行クロモソームを含む（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５参照）。例えば、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応性ポリヌクレオチド及びポリペプチドを哺乳類（例えば、ヒト）細胞中に発現させるのに有用な非ウイルス性ベクターには、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ，Ｂ  ＆  Ｃ，ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ，ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ，Ｂ  ＆  Ｃ，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），ＭＰＳＶベクター、及びその他のタンパク質を発現させる、この分野で知られている様々なその他のベクターがある。有用なウイルス性ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰ  Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス、バクテリアウイルスベクター、及び、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）がある。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３参照。
【０１４９】
発現ベクターの選択は、そのベクターが発現する宿主細胞によって決まる。通常、発現ベクターは、プロモータとその他の調節配列（例えば、エンハンサ）が含まれており、これらＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の鎖又は断片をエンコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合している。いくつかの実施例では、誘導プロモータが働いて、誘導条件下以外での挿入した配列の発現を防いでいる。誘導プロモータには、例えば、アラビノーゼ、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ、あるいは熱ショックプロモータがある。形質転換有機体の培地は、非誘導条件下で、発現生成物が宿主細胞によってより良好に容認される配列をコード化する集団をバイアスすることなく、膨張する。プロモータに加えて、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の鎖又は断片を十分に発現させるには、その他の調製要素が必要とされる、あるいは望ましい。これらの要素には、通常、ＡＴＧ開始コドンと、隣接するリボソーム結合部位、あるいはその他の配列がある。加えて、発現効率は、使用する細胞系に適したエンハンサを含めることによって強化される（Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５；及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサ又はＣＭＶエンハンサを用いて、哺乳類宿主細胞の発現を増やすことができる。
【０１５０】
発現ベクターは、挿入したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の配列によってエンコードしたポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供する。より頻繁に、挿入したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の配列は、ベクターに含まれる前に、シグナル配列に結合する。ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインをエンコードしている配列を受けるのに使用されるベクターは、その定常領域又は定常部分もエンコードすることができる。このようなベクターによって、定常領域を持つ融合タンパク質として様々な領域の発現ができ、これによって、完全抗体又はその断片の生成が行われる。通常は、このような定常領域はヒトである。
【０１５１】
ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の鎖を内部に持ち発現させる宿主細胞は、原核生物でも真核生物でもよい。大腸菌は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させる原核生物宿主である。その他の使用に適した微生物宿主には、枯草菌などの最近や、サルモネラ菌、セラチア菌などの腸内細菌、及び様々なシュードモナス種がある。これらの原核生物宿主で、発現ベクターを作ることができるものは、宿主細胞（複製起点）に適合する発現制御配列を含む。さらに、ラクトースプロモータ系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、β−ラクタマーゼプロモータ系、又はラムダファージ由来のプロモータ系といった、多数の様々な公知のプロモータが存在する。これらのプロモータは、選択的にオペレータ配列を伴って、通常、発現を制御するとともに、転写と翻訳を開始し、完了するためのリボソーム結合部位その他を有する。イーストなどのその他の微生物も、本開示のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応ポリペプチドを発現させるのに用いることができる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
【０１５２】
いくつかの好ましい実施例では、哺乳類宿主細胞を用いて、本開示のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応ポリペプチドを発現させ生成している。例えば、これは、内因性グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は、正常な臨死動物細胞、又は正常あるいは異常な不死動物細胞、又はヒト細胞を含む外因性発現ベクターを含む哺乳動物細胞株であってもよい。（例えば、ＳＰ２／０骨髄腫細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＮＳ０細胞）。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ−細胞及びハイブリドーマを含む、無傷免疫グロブリンを分泌できる数多くの適切な宿主細胞株が開発された。ポリペプチドを発現する哺乳動物組織株培地の使用は、概要が、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，ＦＲＯＭ  ＧＥＮＥＳ  ＴＯ  ＣＬＯＮＥＳ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８７で議論されている。哺乳動物宿主細胞の発現ベクターは、複製起源、プロモータ、エンハンサなどの発現制御配列（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８参照）と、リボソーム結合部位、ＲＮＡ接合部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ配列などの必要な情報処理部位を含んでいてもよい。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子由来の、又は哺乳動物ウイルス由来のプロモータを含んでいる。適切なプロモータは、構造的であり、細胞型特異的、発生時期特異的、及び／又は変調又は調整可能である。有益なプロモータには、限定するものではないが、メタロチオネインプロモータ、構造的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン含有ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰｐｏｌＩＩＩプロモータ、構造的ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン誘導可能ＣＭＶプロモータ（ヒト前初期ＣＭＶプロモータなど）、構造的ＣＭＶプロモータ、及びこの分野で知られているプロモータ−エンハンサの組み合わせ、がある。
【０１５３】
対象となるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法は、細胞の宿主によって変わる。例えば、原核生物細胞には、通常塩化カルシウムトランスフェクションが使用されるが、その他の細胞の宿主には、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが用いられる。（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照）。その他の方法には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介による転写、注入とマイクロ注入、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン核酸コンジュゲート、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、へルぺスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への溶融（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，（１９７７）Ｃｅｌｌ  ８８：２２３）、ＤＮＡの薬剤強化摂取、エックスビボ形質導入がある。遺伝子組み換えタンパク質の長期かつ高収率での産生には、安定した発現が望まれる。
【０１５４】
（ｉｉ）モノクロナール抗体の生成
モノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準体細胞交雑といった、従来のモノクロナール抗体方法論を含む、様々な技術で精製することができる。例えば、Ｂ−リンパ球のウイルス形質転換又は発がん性形質転換といった、モノクロナール抗体を生成する多くの技術を使用することができる。
【０１５５】
ハイブリドーマを作成する動物系は、ネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は、確立された産生方法である。融合のための免疫化脾細胞を単離する免疫方法と技術は、この分野で良く知られている。融合パートナー（例えば、ネズミの骨髄腫細胞）と融合手順も公知である。
【０１５６】
本開示のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上述したように調製したネズミモノクロナール抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをエンコードするＤＮＡは、対象となるネズミハイブリドーマから取得でき、標準分子生物学的手法を用いて、非ネズミ（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作るには、公知の方法を用いてネズミの可変領域をヒトの定常領域に結合させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許許第４，８１６，５６７号参照）。ヒト化抗体を作るには、公知の方法を用いてネズミのＣＤＲ領域を、ヒト骨格に挿入することができる。Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，２２５，５３９号、及びＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号参照。
【０１５７】
所定の実施例では、本開示の抗体が、ヒトモノクロナール抗体である。このようなヒトモノクロナール抗体は、ネズミ系ではなくヒト免疫系の部分を持つ遺伝子組み換え又は染色体組み換えマウスを用いて作ることができる。これらの遺伝子組み換え又は染色体組み換えマウスは、ここで、ＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウス、とそれぞれ呼ばれるマウスを含み、これらは以下ではまとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ぶ。
【０１５８】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、不再配列ヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ及びκ鎖座を不活性化する標的変異体と共にエンコードする。ヒト免疫グロブリン遺伝子微小遺伝子座を含む。（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９参照）。したがって、このマウスは、発現が制御されたマウスＩｇＭ又はκを示し、免疫化に応じて、導入したヒト重鎖及び軽鎖遺伝子導入が、クラススイッチングと体細胞変異を受けて、親和性が高いヒトＩｇＧＫモノクロナール抗体を生成する。（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、及びＨａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭＡｂマウスの調製と使用、及びこのようなマウスによって行われるゲノム修飾は、更に、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７９−５９１；  及びＦｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８４１に述べられている。これらはすべて、引用により全体が本明細書に組み込まれている。更に、米国特許第５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、及び第５，７７０，４２９号；すべて、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙに付与；Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，５４５，８０７号；ＰＣＴ公開公報ＷＯ１９９２／１０３９１８号、ＷＯ１９９３／１２２２７号、ＷＯ１９９４／２５５８５号、ＷＯ１９９７／１１３８５２号，ＷＯ１９９８／２４８８４号、及びＷＯ１９９９／４５９６２号、すべてＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙの出願；及びＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００１／１４４２４号、参照。
【０１５９】
別の実施例では、本開示のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子とヒト軽鎖トランスクロソームを有するマウスなど、導入遺伝子及びトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを用いて作られる。このようなマウスは、ここでは、「ＫＭマウス」と呼ばれ、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．が出願したＰＣＴ公開公報ＷＯ２００２／４３４７８号に詳細に記載されている。
【０１６０】
更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の導入遺伝子動物システムがこの分野で入手可能であり、本開示のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の作成に用いることができる。例えば、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替の導入遺伝子システムを使用することができる。このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌに付与された、米国特許第５，９３９，５９８号；第６，０７５，１８１号；第６，１１４，５９８号；第６，１５０，５８４号；及び第６，１６２，９６３号に記載されている。
【０１６１】
更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソーム動物系がこの分野で入手可能であり、本開示のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の作成に用いることができる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれるヒト重鎖トランスクロモソームとヒト軽鎖トランスクロモソームを両方持つマウスを使用することができる。このようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に述べられている。更に、ヒト重鎖トランスクロモソームと軽鎖トランスクロモソームを有するウシがこの分野で記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本開示のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の作成に使用できる。
【０１６２】
本開示のヒトモノクロナール抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするファージ提示法を用いて作成することもできる。このようなヒト抗体を単離するファージ提示法は、この分野で確立されている、あるいは、以下の例に記載されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；及び第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された、米国特許第５，４２７，９０８号及び第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，９６９，１０８号及び第６，１７２，１９７号；及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，８８５，７９３号；第６，５２１，４０４号；第６，５４４，７３１号；第６，５５５，３１３号；第６，５８２，９１５号；及び第６，５９３，０８１号参照。
【０１６３】
本開示のヒトモノクロナール抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブライをスクリーニングするリボソーム提示法、ｍ−ＲＮＡ提示法、バクテリア提示法、及びイースト提示法を用いて調整することもできる。一般的に、ヒト抗体ライブラリを提示する真核細胞は、この分野では一般的である。（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：４９３７−４２；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０（１−２）：５１−６７；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４（３）：２８１−２８８；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（９）：４８２５−６；Ｆｕｋｕｄａ  Ｉ，Ｋｏｊｏｈ  Ｋ，Ｔａｂａｔａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４（１９）：ｅ１２７；Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０４４４−４８；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１）：２９−３４；Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａ  Ｓｃｉ，９７（２０）：１０７０１−１０７０５；Ｗｅａｖｅｒ−Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５６４（１−２）：２４−３４参照）。
【０１６４】
本開示のヒトモノクロナール抗体は、ヒト免疫細胞を再構成して、免疫が付与されたときにヒト抗体反応が生じるようにした、ＳＣＩＤマウスを用いて調整することもできる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，４７６，９９６号、第５，６９８，７６７号に記載されている。
【０１６５】
（ｉｉｉ）骨格又はＦｃエンジニアリング
あるタイプの骨格修飾は、骨格領域内、あるいは一またはそれ以上のＣＤＲ領域内で一またはそれ以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞−エピトープを取り除くことによって、その抗体の潜在的な免疫原性を下げるステップを含む。この方法は、「脱免疫原性」とも呼ばれ、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．が出願した米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号により詳細に記載されている。
【０１６６】
骨格又はＣＤＲ領域内での修飾に加えてあるいはこれに代えて、本開示の抗体を走査して、Ｆｃ領域内の修飾を含めて、典型的には、血中半減期、補体結合、Ｆｃレセプタ結合、及び／又は抗原−依存性の細胞障害性といった、その抗体の一またはそれ以上の機能特性を変更することができる。更に、本開示の抗体は、化学的に修飾する（例えば、一またはそれ以上の化学的部分が抗体に付着できる）、または、グリコシル化を変えるように修飾する、再度、抗体の一またはそれ以上の機能特性を変更する、ことができる。これらの各実施例を、以下にさらに詳細に説明する。
【０１６７】
一実施例では、ＣＨ１のヒンジ領域を、そのヒンジ領域のシステイン残基の数を例えば、増やすあるいは減らすなどして変更するように修飾する。この方法はＢｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，６７７，４２５号に更に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、重鎖又は軽鎖のアッセンブリを易にする、あるいは、抗体の安定性を上げるあるいは下げるために変更する。
【０１６８】
別の実施例では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を下げる。特に、一またはそれ以上のアミノ酸変異株を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェース領域に導入して、その抗体が、天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対して、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合が弱くなるようにする。この方法は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【０１６９】
更なる実施例では、少なくとも一のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することによってこのＦｃ領域を変化させ、抗体のエフェクタ機能を変更する。例えば、一またはそれ以上のアミノ酸を別のアミノ酸残基で置き換えて、抗体のあるエフェクタリガンドに対する親和性を変えるが、親抗体の抗原結合能力は維持するようにする。親和性が変わるエフェクタリガンドは、例えば、Ｆｃレセプタ、又は補体のＣ１成分であってもよい。対応する修飾したイソタイプバージョンは、科学界ではＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡとして知られている。上述した通り、この方法は、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌによる、米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０１７０】
更なる実施例では、アミノ酸残基から選択された一またはそれ以上のアミノ酸を、別のアミノ酸残基で置換して、抗体がＣ１ｑ結合を変化させる、及び／又は、補体依存性細胞障害を低減する又はなくすようにしている。この方法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【０１７１】
更なる実施例では、一またはそれ以上のアミノ酸残基を変化させることによって、抗体の補体を固定する能力を変える。この方法は、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌによるＰＣＴ公開ＷＯ１９９４／９３５１号に更に記載されている。
【０１７２】
更なる実施例では、Ｆｃ領域を修飾して、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を上げる、及び／又は、一またはそれ以上のアミノ酸を修飾することによってＦｃγレセプタに対する抗体の親和性を上げる。この方法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ２０００／４２０７２号に更に記載されている。更に、ヒトＩｇＧ１の、ＦｃγＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対する結合部位をマッピングする旨、及び結合が改善した変異体が、記載されている。（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４参照）。
【０１７３】
更なる実施例では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗体を作ることができる（すなわち、抗体がグリコシル化していない）。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を上げるように修飾することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の一またはそれ以上のグリコシル化部位を変えることによって行われる。例えば、一またはそれ以上の可変領域骨格グリコシル化部位をなくして、その部位におけるグリコシル化をなくす一またはそれ以上のアミノ酸の置換を行うことができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める。この方法は、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号に詳細に記載されている。
【０１７４】
追加で、又は代替的に、少量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体や、増加した分割ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体といった、変化形グリコシル化を有する抗体を作ることができる。このような、変化形グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を上げることが示されている。このような、炭水化物修飾は、例えば、宿主細胞中の抗体を変化形グリコシル化機構で発現させることによって行うことができる。変化形グリコシル化機構を伴う細胞は、この分野で記載されており、本開示の遺伝子組み換え抗体を発現させる宿主細胞として使用して、変形グリコシル化を伴う抗体を生成することができる。例えば、Ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によるＥＰ１，１７６，１９５号は、機能的に分裂したＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株を記載している。この遺伝子は、低フコシル化を示すこのような細胞株中に抗体が発現するように、フコシル転移酵素をエンコードするＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ２００３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）−結合炭水化物に付着させる能力が低く、その宿主細胞に発現した抗体の低フコシル化を招く変異ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞について述べている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照）。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ公開ＷＯ１９９９／５４３４２号は、糖タンパク質−修飾グリコシル転移酵素（例えば、β（１，４）−Ｎアセチルグリコサミニル−転移構想ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように改変して、その改変細胞株に発現した抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性を増加させる、増加した分割ＧｌｃＮａｃ構造を示す細胞株について記載している。（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照）。
【０１７５】
別の実施例では、抗体をその生化学的半減期が長くなるように修飾している。様々な方法で行うことができる。例えば、Ｗａｒｄに付与された米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、以下の変異体のうちの一またはそれ以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、及びＴ２５６Ｆ。代替的に、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号に記載されているように、生化学的半減期を長くするために、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で変更して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの二つのループから取り出した、サルベージレセプタ結合エピトープを含むようにできる。
【０１７６】
医薬組成物
本開示は、薬学的に許容可能なキャリアと共に調整したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗原結合部（完全又は結合断片）を含む医薬組成物を提供する。本開示の一の実施例では、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体（完全又は結合断片）は、薬学的に許容可能なキャリアと共に調整される。この組成物は、更に、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴに関連する疾患を治療又は防止するのに好適な一またはそれ以上の治療薬剤を含むものでもよい。薬学的に、キャリアはこの組成物を強化するあるいは安定化させる、あるいは、組成物の調製を容易にする。薬学的に許容可能なキャリアは、溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌及び抗カビ剤、等張及び吸収遅延剤、その他の生理学的に適合するものを含む。
【０１７７】
本開示の医薬組成物は、この分野で知られている様々な方法で投与することができる。投与ルート及び／又はモードは、望まれる結果によって異なる。静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、又は標的部位近傍への投与が好ましい。薬学的に許容可能なキャリアは、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、経口投与、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は点滴）が好ましい。投与ルートに依存して、活性化合物、すなわち、抗原結合部、抗体、二重特異性及び多重特異性分子、を、その化合物を酸の作用及びその化合物を不活性にする自然状態から保護する材料でコーティングしてもよい。
【０１７８】
この組成物は、無菌かつ流体でなくてはならない。正しい流体性は、例えば、レクチンなどのコーティングの使用によって、分散する場合は必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持できる。多くの場合は、組成物中に、例えば、砂糖、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムといった等張剤を含めることが好ましい。注入可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１７９】
本開示の医薬組成物は、この分野でよく知られており、通常行われている方法に従って調整することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０ｔｈ  ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件の下製造される。通常、治療的有効投与量又は有効容量のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗原結合部を、本開示の医薬組成物に使用する。ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗原結合部は、この分野の当業者に知られている従来の方法で、薬学的に許容可能な投薬形態に調製される。投薬計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、複数分割投与量を時間をかけて投与してもよく、投与量は、治療状態の危急性によるディスプレイに応じて少なくしたり、増やしたりしてもよい。投与を容易にし、投与量を均一にするために投与単位形のパレンタル組成物を調整することが特に有益である。ここで用いる投与単位形とは、治療する対象に単一投与として適した、物理的に分散した単位を意味し、各単位は、必要な薬学的キャリアに応じた所望の治療効果が生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。
【０１８０】
本開示の医薬組成物の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性とならないようにして、特定の患者、蘇生、及び投与モードのための所望の治療反応を達成するのに効果的な活性成分量となるように変化させることができる。選択された投与レベルは、使用した本開示の特定の組成物、又はそのエステル、延、又はアミドの活性を含む様々な薬物動態的要因、投与ルート、投与時間、使用した特定の化合物の排泄率、治療期間、使用した特定の組成物と組み合わせた用いたその他の薬剤、化合物、及び／又は物質、治療を受けている患者の年齢、性別、体重、疾患、一般的な健康状態、及び既存症、などに依存する。
【０１８１】
医師又は獣医は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルで医薬組成物に使用した本開示の抗体の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を順次増やしてゆくことができる。一般的に、本開示の組成物の有効投与量は、個尾に述べたアレルギー性炎症疾患の治療用には、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物化、その他の投与薬剤、治療が予防的なものか又は治療的なものか、を含めて様々な要因によって変わる。治療投与は、安全性と効果を最適にするように暫増する必要がある。抗体を用いて全身投与を行うためには、投与量は、宿主体重の、約０．０００１乃至１００ｍｇ／ｋｇの範囲、より実用的には、０．０１乃至１５ｍｇ／ｋｇである。例示的な治療計画は、２週間に一度、１か月に一度、又は３か月乃至６か月に一度の全身投与を必要とする。抗体を用いた硝子体内投与では、投与量は約０．０００１ｍｇ乃至約１０ｍｇの範囲である。例示的な治療計画は、２週間に１度、１か月に一度、あるいは３乃至６か月に一度の全身投与を必要とする。
【０１８２】
本開示の抗原結合部と抗体は、通常、何度も投与される。単回投与間のインターバルは、毎週、毎月、あるいは毎年であってもよい。全身投与のいくつかの方法では、血漿抗体濃度が１−１０００μｇ／ｍｌとなるように、及びいくつかの方法では２５−５００μｇ／ｍｌとなるように調整される。代替的に、抗原結合部位は、徐放性製剤として投与することができる。この場合、より頻度の低い投与が必要である。投与量と頻度は、患者における抗原結合部位の半減期によって変わる。一般的に、ヒト抗体及びヒト化抗体は、キメラ抗体や非ヒト抗体より半減期が長い。投与量と投与頻度は、治療が予防的なものか、血腸的なものかによって変わる。予防的アプリケーションでは、比較的低い投与量を比較的頻度の低いインターバルで、長期にわたって投与する。残り一生にわたって治療を受け続ける患者もいる。治療的アプリケーションでは、比較的短いインターバルで、比較的高い投与量を、疾患の進行が遅くなる又は止まるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、投与する必要があることがある。その後、患者は、予防的投与計画で投与することができる。
【０１８３】
ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体（完全抗体又は結合断片）を含む医薬組成物又は滅菌組成物を作成するには、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体（完全抗体又は結合断片）を、薬学的に許容可能なキャリア又は賦形剤と混合する。
【０１８４】
その抗体又は断片の望ましい投与は、モル／ｋｇ体重ベースで、抗体又はポリペプチドとほぼ同じである。抗体又は断片の望ましい血漿濃度は、モル／ｋｇ体重ベースで、抗体又はポリペプチドとほぼ同じである。投与量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、少なくとも１００μｇであってもよい。対象に投与する回数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上であってもよい。
【０１８５】
本開示の抗体又はその断片についての、患者に投与する量は、患者の体重の０．０００１乃至１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。投与量は、患者の体重の０．０００１乃至２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１乃至０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１乃至０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１乃至０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１乃至０．１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１８６】
本開示の抗体又はその断片の投与量は、投与する単回投与量（ｍｇ／ｋｇ）を掛けた患者の体重（ｋｇ）を用いて計算する。本開示の抗体又はその断片の投与量は、患者の体重の、１５０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、１２５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、１００μｇ／ｋｇ又はそれ以下、９５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、９０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、８５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、８０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、７５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、７０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、６５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、６０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、６５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、６０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、５５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、５０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、４５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、４０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、３５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、３０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、２５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、２０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、１５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、１０μｇ／ｋｇ又はそれ以下、５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、２．５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、２μｇ／ｋｇ又はそれ以下、１．５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、１μｇ／ｋｇ又はそれ以下、０．５μｇ／ｋｇ又はそれ以下、０．５μｇ／ｋｇ又はそれ以下であってもよい。
【０１８７】
本開示の抗体又はその断片の単回投与量は、０．１ｍｇ乃至２０ｍｇ、０．１ｍｇ乃至１５ｍｇ、０．１ｍｇ乃至１２ｍｇ、０．１ｍｇ乃至１０ｍｇ、０．１ｍｇ乃至８ｍｇ、０．１ｍｇ乃至７ｍｇ、０．１ｍｇ乃至５ｍｇ、０．１ｍｇ乃至２．５ｍｇ、０．１ｍｇ乃至０．２５ｍｇ、０．２５ｇ乃至２０ｍｇ、０．２５ｇ乃至１５ｍｇ、０．２５ｍｇ乃至１２ｍｇ、０．２５ｍｇ乃至１０ｍｇ、０．２５ｍｇ乃至８ｍｇ、０．２５ｍｇ乃至７ｍｇ、０．２５ｍｇ乃至５ｍｇ、０．５ｍｇ乃至２．５ｍｇ、１ｍｇ乃至２０ｍｇ、１ｍｇ乃至１５ｍｇ、１ｍｇ乃至１２ｍｇ、１ｍｇ乃至１０ｍｇ、１ｍｇ乃至８ｍｇ、１ｍｇ乃至７ｍｇ、１ｍｇ乃至５ｍｇ、１ｍｇ乃至２．５ｍｇ、であってもよい。
【０１８８】
本開示の抗体又はその断片の投与量は、対象中に、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なく２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なく１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なく２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なく３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成する。代替的に、本開示の抗体又はその断片の投与量は、その対象中に、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なく２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なく１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なく２２５ｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なく３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成する。
【０１８９】
本開示の抗体又はその断片の投与量を繰り返し、投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２か月、７５日、３か月、又は少なくとも６か月に分けて行ってもよい。
【０１９０】
特定の患者に対する行こう量は、治療を行っている疾患、患者の全体的な健康状態、投与の方法、ルート、及び投与量、及び、副作用の重症度によって異なる。（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ参照）
【０１９１】
投与ルートは、例えば、局所又は皮膚への適用、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内、脳脊髄内、病巣内の注射又は点滴によって、あるいは、放出システム又はインプラントによる（例えば、Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６；Ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ  １５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ（１９８２）Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５；Ｅｐｓｔｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２：Ｈｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，３５０，４６６ａｎｄ６，３１６，０２４参照）。必要な場合は、この組成物は、可溶剤と、リドカインなどの局所麻酔を含めて、注入部位の痛みを抑えるようにしてもよい。更に、吸入器、又はネブライザを用いるとともに、エアロゾル化剤を調製して、肺内投与を行ってもよい。米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号、及び第４，８８０，０７８号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ１９９２／１９２４４、ＷＯ１９９７／３２５７２、ＷＯ１９９７／４４０１３、ＷＯ１９９８／３１３４６、ＷＯ１９９９／６６９０３号参照。これらは、ここに全体を引用することにより組み込まれている。
【０１９２】
本開示の組成物は、この分野で知られている一またはそれ以上の様々な方法を用いて、一またはそれ以上の投与ルートを介して投与することができる。当業者には自明なように、投与のルート及び／又はモードは、所望する結果によって変わる。本開示の抗体又はその断片の選択された投与ルートには、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は、例えば注射や点滴といった、その他の非経口投与ルートであってもよい。非経口投与は、通常注射による腸内及び局所投与以外の投与モードを意味しており、限定するものでなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、経皮、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、及び、胸骨下の注入及び点滴以外の投与を意味する。代替的に、本開示の組成物は、局所、表皮又は粘膜投与ルートといった、非経口ルートを介して、鼻腔内、経口、経膣直腸、舌下又は経皮投与できる。
【０１９３】
本開示の抗体又はその断片と組み合わせて投与できるその他の治療（例えば、予防的薬剤又は治療的薬剤）は、本開示の抗体又はその断片から、５分未満離して、３０分未満離して、１時間離して、約１時間離して、約１乃至約２時間離して、約２乃至約３時間離して、約３乃至約４時間離して、約４乃至約５時間離して、約５乃至約６時間離して、約６乃至約７時間離して、約７乃至約８時間離して、約８乃至約９時間離して、約９乃至約１０時間離して、約１０乃至約１１時間離して、約１１乃至約１２時間離して、約１２時間乃至１８時間離して、約１８時間乃至２４時間離して、約２４時間乃至約３６時間離して、約３６時間乃至４８時間離して、約４８時間乃至５２時間離して、５２時間乃至６０時間離して、６０時間乃至７２時間離して、７２時間乃至８４時間離して、８４時間乃至９６時間離して、９６時間乃至１２０時間離して、投与できる。２又はそれ以上の治療を、同じ患者の来訪で投与してもよい。
【０１９４】
本開示の抗体又はその断片と、その他の治療は、循環的に投与できる。循環治療は、第１の治療の投与（例えば、第１の予防的又は治療的薬剤）をある時間行った後、第２の治療（例えば、第２の予防的又は治療的薬剤）をある時間行い、選択的に、第３の治療（例えば、予防的又は治療的薬剤）をある時間行う、などして、この逐次投与を繰り返す。すなわち、このサイクルは、この治療の一つに対する抵抗力の発達を低減するため、この治療の一つの副作用を防ぐ又は低減するため、及び／又は、治療の効果を改善するためである。
【０１９５】
所定の実施例では、本開示の抗体又はその断片を、インビボで確実に正しく分布されるように調製できる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本開示の治療用化合物がＢＢＢを確実に超えるようにする（所望であれば）ためには、本開示の抗体又はその断片を、例えば、リポソーム中で調製することができる。リポソームの製造方法は、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；及び第５，３９９，３１１号を参照されたい。リポｓ−無は、特定の細胞又は器官に選択的に運ばれる一またはそれ以上の部位を有しており、したがって、標的薬剤送達を強化する。（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的部位には、葉酸又はビオチン（例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，４１６，０１６号）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタント・タンパク質Ａレセプタ（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）；がある。また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照されたい。
【０１９６】
本開示は、本開示の抗体又はその断片を単独で含む医薬組成物の、又は、その他の治療薬と共に行う、その抗体又はその断片を必要とする対象への投与のためのプロトコルを提供する。本開示の組み合わせによる治療（例えば、予防的又は治療的薬剤）は、対象に、同時に又は順次に投与できる。本開示の組み合わせによる治療（例えば、予防的又は治療的薬剤）は、循環的に行うこともできる。循環的治療には、第１の治療の投与（例えば、第１の予防的又は治療的薬剤）をある時間行った後、第２の治療（例えば、第２の予防的又は治療的薬剤）をある時間行い、この逐次投与を繰り返す。すなわち、このサイクルは、この治療（薬剤）の一つに対する抵抗力の発達を低減するため、この治療の一つの副作用を防ぐ又は低減するため、及び／又は、治療（薬剤）の効果を改善するためである。
【０１９７】
本開示の組み合わせ治療（例えば、予防的又は治療的薬剤）は、同時に対象に投与してもよい。用語「同時に」とは、治療薬（例えば、予防的又は治療的薬剤）を正確に同時に投与することに限定するものではなく、むしろ、本開示の抗体又はその断片を含む医薬組成物を対象に順次、及び本開示の抗体が他方の治療とたがいに作用して、単独で投与した場合よりも高い利点を提供するような時間インターバルで投与することを意味している。例えば、各治療は、池沼に同時に、又は異なる時点で任意の順序で投与してもよいが、同時に投与しない場合は、これらの治療は、所望の治療的又は予防的効果を提供するような十分に近い時間で投与すべきである。画治療は、任意の適切な形で、任意の適切なルートで対象に個別に投与してもよい。様々な実施例では、この治療（例えば、予防的又は治療的薬剤）は、対象に１５分未満で、３０分未満で、１時間未満離れて、約１時間離して、約１時間乃至約２時間離して、約２時間乃至約３時間離して、約３時間乃至約４時間離して、約４時間乃至約５時間離して、約５時間乃至約６時間離して、約６時間乃至約７時間離して、約７時間乃至約８時間離して、約８時間乃至約９時間離して、約９時間乃至約１０時間離して、約１０時間乃至約１１時間離して、約１１時間乃至約１２時間離して、２４時間離して、４８時間離して、７２時間離して、又は１週間離して、投与される。別の実施例では、２又はそれ以上の治療（例えば、予防的又は治療的薬剤）を同じ患者の来訪の中で投与する。
【０１９８】
組み合わせ治療の予防的又は治療的薬剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる。代替的に、この組み合わせ治療の予防的又は治療的薬剤は、個別の医薬組成物中で対象に同時に投与してもよい。この予防的又は治療的薬剤は、同じ又は異なる投与ルートで対象に投与することができる。
【０１９９】
完全に説明した本開示を、以下の例示と請求の範囲によって更に説明する。これは、説明のためのものであって、更なる限定を意味するものではない。
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【０２００】
物質及び方法
完全に説明した本開示を、以下の例示と請求の範囲によって更に説明する。これは、説明のためのものであって、更なる限定を意味するものではない。
【０２０１】
１：抗体同定用のファージディスプレイ抗体ライブラリ
ＭＩＦとＤ−ＤＴを交差特定的に認識する抗体を選択するために、市販のファージディスプレイライブラリである、ＭｏｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリを使用した。ＭＩＦとＤ−ＤＴに交差特異的治療抗体は、両タンパク質に結合親和性を有するクローンを同定して選択することによって生成した。この抗体ライブラリは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６）に基づいており、ファージ表面にＦａｂをディスプレイするＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いている（ＬｏｈｎｉｎｇのＷＯ２００１／０５９５０）。
【０２０２】
（ａ）パニング
ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体を同定するために、このプロジェクトを通して様々なパニング戦力を実行した。これによって、組み換え型、生成ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴをパニング抗原として使用した。組み換え型ＭＩＦは、受託番号：ＣＡＧ３０４０６．１に規定されているＭＩＦを意味し、Ｄ−ＤＴは、受託番号：ＮＰ＿００１３４６に規定されているＤ−ＤＴを意味する。両抗原とも、選択とスクリーニング工程様に、タグのない、ＨＩＳ−タグのついた、あるいはビオチン化した抗原として使用した。
【０２０３】
ここに記載したすべてのパニング戦略と抗原は、抗体選択工程様に使用した。各パニング戦略は、少なくとも３つの独立した一連のパニングと、含有された独自の抗原、抗原濃度、及び洗浄厳重性からなる。更に、ここに記載したすべてのパニング戦略と抗原を組み合わせたり、混合して、様々なパニング戦略として使用した。
【０２０４】
ｉ）ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに対する固相パニング
固相パニング用に、ブロックしたファージを、固体表面（例えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート）上に被覆した組み換え型ＭＩＦ又はＤ−ＤＴタンパク質で、又は、ｒｅａｃｔｉ−ｂｉｎｄニュートラビシンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に固定した組み換え型ビオチン化ＭＩＦ又はＤ−ＤＴをインキュベートした。ＰＢＳＴとＰＢＳを十分に用いて、非特異ファージを洗い流した。少なくとも３回の一連のパニングを行い、その３回の一連のパニングを通じて常に、あるいは代替の方法で、抗原ＭＩＦ又はＤ−ＤＴを使用した。
【０２０５】
各一連のパニングで、残りのファージを溶離して、溶離したファージを即座に用いてＥ．ｃｏｌｉＴＧ１バクテリア感染させた。ヘルパーファージを用いてそのファージをレスキューした後、ポリクロナール増幅ファージ出力を再度滴定し、続く選択ステップで使用した。
【０２０６】
個々のパニングで、出力滴定に応じて、各個々のパニングラウンド後にそくていした抗原濃度と洗浄厳重性を調製して、各抗原に対して高い親和性を持つクローンの選定を促進した。
【０２０７】
ｉｉ）ＭＩＦに対するポリクロナール抗ＭＩＦ抗体捕捉パニング
更に、ポリクロナールＭＩＦ−特異的抗血清を用いて、パニング目的で、固体表面上の精製したＭＩＦタンパク質をファージライブラリに提示した。これによって、ポリクロナールＭＩＦ−特異的抗体を、マキシソーププレート上に一晩被覆した。ＰＢＳで洗浄し、５％のミルク／ＰＢＳでブロックした後、生成したＭＩＦタンパク質をそのプレートにさらして、１時間更にインキュベートした。これによって、被覆したＭＩＦ−特異的抗体によってＭＩＦを捕捉し、様々な方向にファージを提示した。ＭＩＦとＤ−ＤＴをに対する固相ファージパニングの記載に従って、少なくとも３ラウンドのパニングを行った。
【０２０８】
（ｉｉｉ）ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに対する半溶液パニング
半溶液パニング用に、組み換え型ヒトＭＩＦを、カルボキシル酸Ｍ−２７０−Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合させた。
【０２０９】
予め洗浄したファージを、回転機の上でＭＩＦで被覆したビーズで１−２時間インキュベートした。次いで、磁気選別機を用いてビーズを回収して、ＰＢＳＴとＰＢＳで洗浄した。ビーズに結合したファージを、３００μＬ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０のＲＴで７分間溶離した。溶離したファージを即座に用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１バクテリア感染させた。ファージの感染、増幅、ファージ精製、および出力滴定の決定は、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する固相パニングで上述したように行った。
【０２１０】
（ｉｖ）ビオチン化ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する溶液ファージパニング
様々なビオチン化した組み換え型ＭＩＦ又はビオチン化組み換え型Ｄ−ＤＴタンパク質を用いて、溶液ファージパニングの各ラウンドを実行した。タンパク質は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ（登録商標）タンパク質ビオチン化キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、製造者の指示書に従ってビオチン化した。ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ）とＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体を洗浄して、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）でブロックした。ファージの上澄みを、ブロックした２ｍＬの反応管に移して、適切なビオチン化抗体を加え、回転機上で、室温で６０分間インキュベートした。１００μｌのブロックしたストレプタビジン磁気ビーズを各パニングプールに加えて、混合物を室温の回転機で２０分間インキュベートした。磁気粒子分離機（Ｄｙｎａｌ）を約３分間用いて、ビーズを回収し、溶液は廃棄した。ファージに結合しているバックグラウンドを、ＰＢＳＴを用いて広範囲に洗浄することで除去した。結合したファージは、各チューブに２００μｌ、２０ｍＭ  ＤＴＴ／１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８）を加えてＤｙｎａｂｅａｄｓから溶離し、室温で１５分間インキュベートした。磁気粒子分離機を用いてＤｙｎａｂｅａｄｓを除去し、上澄を大腸菌ＴＧ−１にさらした。２００μｌのＰＢＳと一度混合することによって、追加のファージをＤｙｎａｂｅａｄｓから回収して、上澄を回収し、上述した大腸菌ＴＧ−１に加えた。固相ファージパニングで述べたものと同様に、ファージ感染を行った。
【０２１１】
（ｖ）非ビオチン化ＭＩＦ−Ｈｉｓに対する溶液相パニング
ビオチン化は、天然３次元構造のＭＩＦに負の影響を持つため、代替の溶液相パニング戦略を追加で含めた。このパニング工程は、代替は上述した通りであるが、非ビオチン化ＭＩＦ分子の使用ができ、ファージ−ＭＩＦ−Ｈｉｓ複合体のＨｉｓタグを、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズによって捕捉した。
【０２１２】
（ｂ）選択したＦａｂ断片のサブ・クローニングと微表情微小発現分析
可溶Ｆａｂの急速発現を容易にするために、選択したＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージのＦａｂをエンコードするインサートを、制限酵素切断部位を介して、特異性発現ベクターにサブクローンした。Ｆａｂでエンコードしたベクターを用いてＴＧ１−Ｆバクテリアを形質転換した後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を含むペリプラスム抽出物の単一クローン発現と調製を行った。Ｆａｂ−含有ペリプラスム抽出物を、初期スクリーニング段階に用いた。
【０２１３】
二次スクリーニング段階には、精製したＦａｂを用いた。ＴＧ−１細胞中のＦａｂ断片の発現は、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加えた５００ｍｌの２×ＹＴ培地を用いて、振とうフラスコ中で行った。ＯＤ６００ｎｍがになるまで、３０℃の温度で培地を振った。３０℃の温度で２０時間、０．７５ｍＭのＩＰＴＧを加えることで、発現が誘発された。リゾチームと、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で単離したＦａｂ断片を用いて、細胞を破砕した。ＵＶ−分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定した。Ｆａｂ断片の純度を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて変性、低減させた態様で、及びＨＰ−ＳＥＣによる自然な状態で、Ｆａｂ断片の純度を分析した。
【０２１４】
２．ＩｇＧへの転化
完全長ＩｇＧｓを発現させるために、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４＿Ｐｒｏ，及びヒトＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡ  について、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、Ｆａｂ発現ベクターから適宜のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈＩＧベクターへサブクローンした。
【０２１５】
３．ヒトＩｇＧの一過性発現と精製
真核ＨＫＢ１１細胞を、等量のＩｇＧ重鎖及び軽鎖発現ベクター（ｐＭＯＲＰＨ２）又は、ＩｇＧｓの重鎖及び軽鎖をエンコードする発現ベクターＤＮＡで形質転換した。形質転換後３乃至７日で、細胞培養上清を大まかに採取した。除菌後、溶液を標準タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅａｒｅ）にかけた。特に記載がない限り、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）か、又は、クエン酸塩緩衝液（１００ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．０）に緩衝液の交換を行い、サンプルを除菌した（０．２μｍ  ポアサイズ）。紫外分光光度計で、タンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の変性、低減状態及び非低減状態で、あるいは、ＨＰ−ＳＥＣによって自然な状態で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＩｇＧの純度を分析した。
【０２１６】
４．スクリーニング
（ｉ）ＭＩＦとＤ−ＤＴについてのＥＬＩＳＡスクリーニング
５０以上の個別パニングアプローチを一緒に行った。スクリーニングをして、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する交差特異性を確認して、独自の抗体クローンを同定したファージは、５０プール以上となった。
【０２１７】
ＥＬＩＳＡと、濃度１μｇ／ｍｌで、ｒｅａｃｔｉ−結合ニュートラビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に被覆したビオチン化組み換え型ヒトＭＩＦ又はＤ−ＤＴによって、室温で１．５時間、一次スクリーニングを行った。ｒｅａｃｔｉ−結合ニュートラビジンプレートは、スクリーニングの前に、ＰＢＳ／５％スキムミルクパウダーで前処理を行った。
【０２１８】
ＰＢＳＴを用いて洗浄した後、Ｆａｂ−含有ペリプラスム抽出物、又は生成したＩｇＧｓを塗布して、室温で２時間インキュベートした。
【０２１９】
続いて洗浄した後、抗原−特異的に結合したＦａｂ又はＩｇＧを、ＡＰ−ヤギ−非ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−γ断片特異的（Ｆａ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次抗体を介して検出し、次いでＡｔｔｏｐｈｏｓ（Ｆａ  ＲＯＣＨＥ）を塗布した。
【０２２０】
結果：
一次スクリーニングでは、分析した全〜２７０００クローンのうち、〜３０００のヒットが、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴに特異的に結合するものと同定された。これらの３０００の一次ヒットから、７４０のクローンを続く分析にかけて、４１０のクローンが独自のものであると認定された。これらの４１０のクローンを更にスクリーニングしたところ、３つのクローンのみが、Ｆａｂ及びＩｇＧフォーマットでＭＩＦとＤ−ＤＴに交差反応すると立証された。
【０２２１】
実施例
実施例１：ＥＬＩＳＡによる組み換え型ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する抗体の特異的結合
ヒトＭＩＦとＤ−ＤＴに対する抗体の交差反応性を、ＥＬＩＳＡによって測定した。濃度１μｇ／ｍｌのビオチン化組み換え型ヒトＭＩＦ又はＤ−ＤＴを、室温で、１．５時間、ｒｅａｃｔｉ−結合ニュートラビジンで被覆した黒３８４−ウエルプレート上に被覆した。Ｒｅａｃｔｉ−結合ニュートラビジンプレートは、ＰＢＳ／５％スキムミルクパウダーで前処理を行った。ＰＢＳＴで洗浄した後、精製ＩｇＧｓを、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴを被覆したプレートにそれぞれ、濃度６．２５ｎＭで塗布し、室温で２時間インキュベートした。続いて洗浄した後、抗原特異性結合ＩｇＧを、ＡＰ−ヤギ−非ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−γ断片特異的（Ｆａ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次抗体を介して検出し、製造者のマニュアルに従って行ったＡｔｔｏｐｈｏｓ  （Ｆａ  ＲＯＣＨＥ）を塗布した。Ｔｅｃａｎ  Ｒｅａｄｅｒ  ＧｅｎｉｏｓＰｒｏによって蛍光強度を測定し、個々のクローンの蛍光濃度を対照抗体と比較した。
【０２２２】
結果：
広範囲にわたって特性評価を行った後、３つの個々のクローンがヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴに交差反応的であることを順次同定した。これらのクローンは、両抗原についての陰性対照と比較して、少なくとも５倍のシグナル強度で交差反応結合を示した（図２）。特に、従来技術のモノクロナール抗ＭＩＦ−抗体ＩＩＩＤ９、Ｂａｘ６９及びＢａｘ９４（ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８６９２０号参照）を、ＭＡＢ２８９（Ｒ＆Ｄ）と２Ａ１０（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に、ヒトＭＩＦのみで検出し、Ｄ−ＤＴは検出しなかったものと同じ条件で試験を行い、これらは交差反応性ではなかった。
【０２２３】
実施例２：ＥＬＩＳＡによるＭＩＦとＤ−ＤＴ交差反応抗体の半数効果濃度測定
更なる特性評価を行うために、ＭＩＦとＤ−ＤＴに対する各交差反応性抗体についての半数効果濃度を、実施例１によるＥＬＩＳＡのセッティングに基づいて測定した。個々の抗体の濃度は、滴定を行い、ＭＩＦで被覆したプレートとＤ−ＤＴで被覆したプレートの上に、０ｎＭから１６６ｎＭまでの８の異なる濃度を順次塗布した。１μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化組み換え型ヒトＭＩＦ又はＤ−ＤＴを、ｒｅａｃｔｉ−結合ニュートラビジンで被覆した黒３８４−ウエルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）上で、室温で、１．５時間、被覆した。Ｒｅａｃｔｉ−結合ニュートラビジンプレートは、ＰＢＳ／５％スキムミルクパウダーで、予め前処理を行った。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ被覆プレートに、それぞれ、精製したＩｇＧｓを加え、室温で２時間インキュベートした。次いで洗浄した後、抗原特異的結合ＩｇＧを、ＡＰ−ヤギ−非ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−γ断片特異的（Ｆａ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次抗体を介して検出し、製造者のマニュアルに従ってＡｔｔｏｐｈｏｓ  （Ｆａ  ＲＯＣＨＥ）を塗布した。Ｔｅｃａｎ  Ｒｅａｄｅｒ  ＧｅｎｉｏｓＰｒｏによって蛍光強度を測定し、個々のクローンの蛍光濃度を、典型的な抗体滴定曲線にプロットした。非線形回帰分析法により、プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、半数効果濃度測定値を測定した。
【０２２４】
結果：
３つのＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体すべて（Ａ＝ＭＯＲ０１４０９３；  Ｂ＝ＭＯＲ０１４１１６；  Ｃ＝ＭＯＲ０１４１３８）について、半数効果濃度測定を行うことができ、この濃度は０．３ｎＭ乃至２２ｎＭの範囲であった（図３及び図４）
【０２２５】
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【０２２６】
実施例３：ＭＩＦとＤ−ＤＴ交差反応抗体によるＣＤ７４に対するＭＩＦ−結合の阻害    選択されたＭＩＦとＤ−ＤＴ交差反応抗体の、ＭＩＦのレセプタＣＤ７４に対する結合能力を、固定化ＣＤ７４エクトドメイン（ｓＣＤ７４７３−２３２）を用いて、インビトロでの競合試験で分析した。３８４ウエルプレートの個々のウエルを、４℃で、２６μｇ／ｍｌのｓＣＤ７４７３−２３２で一晩被覆し、洗浄し、ＰＢＳ／５％  ＢＳＡで２時間ブロックした。抗−ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体又は対照抗体（５０μｇ／ｍｌ）と組み合わせたビオチン化ＭＩＦ（５μｇ／ｍｌ）を２組、同時適用して、室温で２時間インキュベートした。ストレプタビジン−コンジュゲートアルカリ性ホスファターゼを１時間加えて、結合した、ビオチン化ＭＩＦを測定し、次いで、Ａｔｔｏｐｈｏｓで洗浄し検出した。Ｔｅｃａｎ  Ｒｅａｄｅｒ  ＧｅｎｉｏｓＰｒｏを介して、蛍光強度を測定した。この値を、対照抗体を持つビオチン化ヒトＭＩＦを含むウエルに対する蛍光強度パーセンテージとしてプロットした。
【０２２７】
本出願に開示したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体を取り出すとＣＤ７４に対するＭＩＦ−結合を阻害するという意味で異なる機能性を示した。一の抗体（ＭＯＲ０１４０９３）は、ＭＩＦ／ＣＤ７４相互作用の大祖８０％を阻害するが、二つの抗体（ＭＯＲ０１４１１６とＭＯＲ０１４１３８）は、ＣＤ７４に対するＭＩＦ−結合の阻害は、わずかであるかなかった（図５）。
【０２２８】
実施例４：ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体によるＩＬ−６及びＩＬ−１β放出の阻害
更なる特性評価を行うために、単核白血球のＩＬ−６及びＩＬ−１βからのＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体放出を、３つの同定した交差特異的抗体について分析した。
【０２２９】
Ｂｉｏｃｏｌｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ）を用いた標準プロトコルに従って、ドナー血液から抹消血単核球（ＰＢＭＣｓ）を単離した。ＰＢＭＣｓから単核白血球の分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃからの「ヒト単核白血球単離キットＩＩ」を用いて行った。これは、間接的磁気ラべリングシステムである。磁気分離は、ＬＳコラムの付いたＶａｒｉｏ  ＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）分離機上で、指示マニュアルに従って行った。
【０２３０】
単離した単核白血球（−０．２×１０６細胞／ｍｌ；２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中）を９６−ウエルプレートに移して、ウエル当たりの最終濃度が１００μｇ／ｍｌの特定のＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体で、３７℃、５％ＣＯ２で、１時間、インキュベートした。次いで、抗体で処理した単核白血球を、０．１ｎｇ／ｍｌの大腸菌（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ０１１１：Ｂ４  Ｏ１１１：Ｂ４）ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ））で刺激して、３７℃、５％ＣＯ２で、一晩インキュベートした。上澄を回収して、ＩＬ−６及びＩＬ−１β濃度を、ビーズベースのＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定し、負の対照として使用した非特定抗体と比較した。
【０２３１】
上記による分析時に、抗体ＭＯＲ０１４１１６（Ｂ）は、ＬＰＳでの刺激で誘発された２０％乃至３０％のＩＬ−６及びＩＬ−１βの放出を維持した。一方、抗体ＭＯＲ０１４０９３（Ａ）は、１０％のＩＬ−１βを阻害し、抗体ＭＯＲ０１４１３８（Ｃ）は、分析した両炎症性サイトカインに対して効果を示さなかった。
【０２３２】
実施例５：  ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の同定のための選択戦略
ファージディスプレイ抗体ライブラリからのＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体の同定のために、組み換え型ヒトＭＩＦ及び組み換え型ヒトＤ−ＤＴを抗体として交替で用いた、溶液ファージパニングを行うことができる。３段階のパニング工程を通してＭＩＦとＤ−ＤＴを交替で用いることによって、両抗原に保存されている抗原結合部位検出特異領域のみが同定される。
【０２３３】
両抗原である、組み換え型の精製したヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴを、選択及びスクリーニング工程様のビオチン化抗原として用い、その機能活性を、以下に述べる互変異性酵素アッセイによって事前に試験して、両タンパク質の正しい折り畳み構造と生理学的３Ｄ構造を確実にする。
【０２３４】
互変異活性アッセイ
ＭＩＦ並びにＤ−ＤＴは、酵素活性（互変異性）を有する。この酵素活性領域は、その生理学的活性に不可欠であると考えられている。基板ヒドロシキフェニルピリミジン（ＨＰＰ）が使用されている。代替的に、Ｄ−ドーパクロームを基盤として用いて、後変異活性を分析してもよい。ＭＩＦ又はＤ−ＤＴを含有する溶液を、３７００μｌのホウ酸バッファに加えて、ＰＢＳを加えて、トータルで４０００μｌとして、最終ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ濃度を５０ｎＭとする。そのうち９６μｌを９６ウエルプレートにす。４μｌの２５ｍＭ４−ＨＰＰ（ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｃａｔ．＃１１４２８６−５Ｇ，ＭＷ＝１８０．１６）、ｐＨ６．０を各ウエルに加えて、３０６ｎｍで３０秒間、吸光度を迅速に読み取る。ＭＩＦとＤ−ＤＴの両タンパク質の互変異活性は、その生理学的一致を表している。
【０２３５】
ビオチン化ヒトＭＩＦとヒトＤ−ＤＴを用いた、交互の溶液相ＭＩＦ−Ｄ−ＤＴ−ＭＩＦパニング
ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０，ｃ＝１０ｍｇ／ｍｌ，Ｄｙｎａｌ）とファージディスプレイ抗体ライブラリのファージ調製液を洗浄し、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）でブロックした。５０μｌの各ファージ−抗体調製液を４５０μｌのＰＢＳと混合し、更に、５００μｌの２×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／０．１％Ｔｗｅｅｎを加える。同時に、１ｍｌのストレプトアビジン結合磁気ビーズを、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒに再懸濁させる。洗浄後、１００μｌのＰＢＳにビーズを懸濁させ、１００μｌの１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを加える。これら、ファージ、並びに磁気ビーズを、室温で、回転機で１．５時間インキュベートする。
【０２３６】
化学ブロック後に、ファージ−抗体調製液をストレプトアビジン結合磁気ビーズで、３０分間インキュベートして、非特異的に磁気ビーズに付いたファージ−抗体をすべて予め吸収する。インキュベーション後に、磁気セパレータを用いてビーズを単離し、ファージ含有上澄液を第１ラウンドのパニングに使用する。
【０２３７】
第１パニングラウンド
第１のパニングラウンドには、予めブロックされており、予め吸収したファージ−抗体を１００ｎＭのビオチン化ヒトＭＩＦに加え、ロータで１時間、室温で、インキュベートした。そののち、ファージ−抗原混合物を、予めブロックしたストレプトアビジン結合磁気ビーズを含む管に移し、磁気ローテータを用いて磁気ビーズが捕捉される前に更に２０分間回転させながらインキュベートし、その上澄を注意深くビーズから取り除いて廃棄した。次いで、残りのビーズを、５００μｌのＰＢＳＴで、インキュベートすることなく５回洗浄し、更にＰＢＳＴで２回洗浄ステップを行い、５分間インキュベートし、回転させ、インキュベートせずにＰＢＳで３回洗浄した。
【０２３８】
ファージ溶離、ファージ感染、ファージレスキュー
最後の洗浄工程の後に、磁気ビーズを２００μｌ、２０ｍＭのＤＴＴ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）溶離バッファに再懸濁させ、ストレプトアビジン結合磁気ビーズによって捕捉されたヒトＭＩＦからファージを溶離させる。次いで、単離したファージを、予め温めた大腸菌ＴＧ−１＋培地を含む５０ｍｌのファルコン管に移し、振動させることなく３７℃で４５分間インキュベートして、大腸菌のファージ感染を誘発した。
【０２３９】
インキュベーション後に、４０００ｇ、４℃で、５分間の遠心分離により単離して、ペレットを６００μｌの２×ＹＴ培地で再懸濁させ、最近懸濁液を、２乃至４つの大きなＬＢ／ＣＡＭ／Ｇｌｕ寒天プレートに乗せた。プレートは、一晩３０℃で保存した。
【０２４０】
次の日に、５ｍｌの２×ＹＴ／Ｃａｍ／Ｇｌｕ／グリセロール（１５％）と、無菌ドリガルスキゴムべらを用いて、寒天プレートから細菌をこすり落とし、懸濁液を〜０．４−０．５のＯＤ６００ｎｍになるまで希釈するか、あるいは、〜０．４−０．５のＯＤ６００ｎｍに達するまで３７℃でインキュベートした。５ｍｌの各懸濁液を、別の管に移して、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ調製液を加え（全体で、４．５×１０１０ファージ／５ｍｌ培地）、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２４１】
その後、感染した大腸菌を、５分間、４０００ｇ、４℃で遠心分離し、上積みを捨てる。ペレットを２０ｍｌの２×ＹＴ／Ｃａｍ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧ（０．２５ｎＭ）培地で再懸濁させ、グルコースのない状態でファージ生成を誘発する。大腸菌懸濁液を２２℃で１８時間インキュベートして、振動（２５０ｒｐｍ）させ、１０分間、４０００ｇ、４℃で遠心分離する。ファージ含有上澄を回収して、５ｍｌの氷のように冷たいＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ６００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）に加えて、氷の上で３０分間インキュベートする。沈殿したファージを、３５分間、２２０００ｇ、４℃の遠心分離で単離して、上澄を捨てる。沈殿したファージ−抗体のペレットを、５００μｌのＰＢＳに再懸濁させて、次のパニングラウンドに使用する。
【０２４２】
第２パニングラウンド
第２パニングラウンドには、第１パニングラウンドで単離した出力ファージを、１００ｎＭのビオチン化ヒトＤ−ＤＴを用いて、ロータで１時間、室温で、インキュベートする。その後、ファージ−抗原混合物を、予めブロックしたストレプタビジン結合磁気ビーズを含む管に移して、磁気セパレータを用いて磁気ビーズを捕捉する前に、更に２０分間回転させながらインキュベートし、上澄を注意深く捨てる。次いで、残りのビーズを、５００μｌのＰＢＳＴでインキュベートすることなく５回洗浄し、更に、ＰＢＳＴでの洗浄ステップを３回と、５分間のインキュベートと回転、及びインキュベートを行うことなくＰＢＳで洗浄するステップを３回行う。
【０２４３】
パニングの第２ラウンドの後、抗原−特異性ファージを溶離して、上述の方法に従って単離する。
【０２４４】
第３パニングラウンド
第３パニングラウンドでは、第２パニングラウンドで単離した出力ファージを用いて、１０ｎＭビオチン化ヒトＭＩＦで、ロータで１時間室温でインキュベートする。その後、ファージ−抗原混合物を、予めブロックしたストレプタビジン結合磁気ビーズを含む管に移し、磁気ビーズを磁気セパレータで捕捉する前に更に２０分間回転させながらインキュベートして、上澄を注意深く捨てる。次いで、残りのビーズを、５００μｌのＰＢＳＴでインキュベートすることなく５回洗浄し、更に、ＰＢＳＴでの洗浄ステップを３回と、１０分間のインキュベートと回転、及びインキュベートを行うことなくＰＢＳで洗浄するステップを３回行う。
【０２４５】
パニング第３ラウンド後、抗原−特異的ファージを上述の方法に従って溶離し、ファージ−ＤＮＡを感染細菌から単離し、Ｆａｂ−エンコードしたＤＮＡを、物質と方法１（ｂ）に記載したように、特異的Ｆａｂ−ベクターにサブクローニングする。
【０２４６】
変換後の単離したＦａｂ又はＩｇＧｓは、スクリーニングして、上述のアッセイに従って特性を評価する。
【０２４７】
実施例６：ＥＬＩＳＡベースの交差競合アッセイ
ＭＩＦ及びＤ−ＤＴに交差反応結合する抗体又はその他の結合剤の交差競合を、以下の標準工程によるＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出することができる。
【０２４８】
ＥＬＩＳＡアッセイの一般的な原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウエル上にＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体を被覆するステップを含む。ある発現量の二次的、潜在的交差競合的、ＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ抗体を溶液に加える（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートに結合しない）。次いで、限られた量のＭＩＦ−Ｆｃ又はＤ−ＤＴ−Ｆｃをウエルに加える。
【０２４９】
ウエル上に被覆された抗体と、溶液中の抗体が、限られた数のＭＩＦ又はＤ−ＤＴ分子の結合と競合する。このプレートを洗浄して、被覆した抗体に結合しなかったＭＩＦ又はＤ−ＤＴ分子を除去するとともに、二次的、溶液相抗体、並びにこの二次的溶液相抗体とＭＩＦ又はＤ−ＤＴとの間にできた複合体も除去する。結合したＭＩＦ又はＤ−ＤＴの量を、適宜のＭＩＦ又はＤ−ＤＴ検出剤を用いて測定する。ＭＩＦ又はＤ−ＤＴは、例えば、Ｆｃ、Ｆｌａｇ、その他といったタグと溶融し、適宜のタグ特異的抗体を介して検出できる。
【０２５０】
被覆した抗体に交差競合する溶液中の抗体は、被覆した抗体が、第２の溶液相抗体がない状態で結合できるＭＩＦ又はＤ−ＤＴ分子の数に対して、被覆した抗体が結合できるＭＩＦ又はＤ−ＤＴ分子の数を低下させることができる。
【０２５１】
このアッセイは、Ａｂ−ＸとＡｂ−Ｙと呼ばれる二つの抗体について以下により詳細に説明する。Ａｂ−Ｘが固定化抗体として選択されている場合、これはＥＬＩＳＡのウエル上に被覆され、その後、プレートを適宜のブロッキング溶液でブロックして、順次加える試薬の非特異的結合を最小にする。次いで、過剰量のＡｂ−ＹをＥＬＩＳＡプレートに加えて、ＥＬＩＳＡプレートを被覆する間に、ウエルごとのＡｂ−Ｙ  ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ結合部位のモル数が、使用するＡｂ−Ｘ  ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ結合部位のウエルごとのモル数より少なくとも１０倍になるようにする。次いで、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴを加えて、ウエルごとのＭＩＦ又はＤ−ＤＴを加えたモル数が、各ウエルを被覆するのに使用するＡｂ−Ｘ  ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ結合部位のモル数より少なくとも２５倍小さくなるようにする。適宜のインキュベーション期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ検出試薬を加えて、被覆したＭＩＦ／Ｄ−ＤＴ交差反応抗体によって特異的に結合されたＭＩＦ又はＤ−ＤＴ分子（この場合、Ａｂ−Ｘ）の量を測定する。このアッセイのバックグラウンドシグナルは、被覆した抗体（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相抗体（この場合Ａｂ−Ｙ）、バッファのみ（すなわち、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴがない）、及びＭＩＦ又はＤ−ＤＴ検出試薬によってウエルで得られたシグナルであると定義される。このアッセイの陽性対照シグナルは、被覆した抗体（この場合Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相抗体、バッファのみ（すなわち、第２の溶液相抗体がない）、ＭＩＦ又はＤ−ＤＴ、及びＭＩＦ又はＤ−ＤＴ検出試薬によってウエル内で得られるシグナルであると定義される。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍であるという態様で行われる必要がある。
【０２５２】
被覆抗体として使用するのにどの抗体を選択するのか、及び第２（競合）抗体としてどの抗体を使用するのか、から生じるアーチファクト（例えば、Ａｂ−ＸとＡｂ−Ｙ間のＭＩＦ又はＤ−ＤＴに対する親和性の有意な差異）を防止するために、交差ブロッキングアッセイは、二つのフォーマットで行う必要がある。１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆された抗体であり、Ａｂ−Ｙが溶液中の競合抗体であり、２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆された抗体であり、Ａｂ−Ｘが溶液中の競合抗体である。
【０２５３】
本開示を完全に説明し、以下の実施例と請求項によってより明確になる。これらは、説明のためのものであり、更なる限定を意味するものではない。
【０２５４】
均等物
上述した明細書は、当業者が本開示を実施するのに十分であると考えられる。上述の記載と例は本開示の好ましい実施例の詳細であり、発明者らが意図したベストモードを記載したものである。しかしながら、上述の説明がどんなに詳細に記載されていても、本開示は、多くの方法で実施することができ、本開示は、特許請求の範囲とその均等物に従って解釈するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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