(57)【要約】本発明は、腺腫および癌種を示す特異的メチル化パターンの決定ならびにそれらの使用のための方法および組成に関する。具体的には、本発明は、癌および腺腫試料に由来するＤＮＡにおいて、協調的にメチル化される定義されたＣｐＧ遺伝子座の分析、協調的にメチル化された遺伝子座を識別するための方法、ならびに、１つ以上のマーカー領域における協調的にメチル化される遺伝子座の分析を腺腫および癌のアッセイの設計に使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化が腺腫を示す、マーカー核酸におけるメチル化ＣｐＧ遺伝子座の組を識別する方法であって、
ａ）複数の正常試料に由来するマーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組のメチル化状態を決定することと、
ｂ）複数の腺腫試料に由来する前記マーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組のメチル化状態を決定して、前記定義された組の中からＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットを識別することと、を含み、
前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座の全てでメチル化される前記複数の正常試料に由来する前記マーカー核酸の個々のコピーの割合は、前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座の全てでメチル化される前記複数の腺腫試料に由来する前記マーカー核酸の個々のコピーの割合を下回り、
前記マーカー核酸における前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座の全てにおけるメチル化は、腺腫を示す、方法。
【請求項２】
前記複数の腺腫試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合を上回る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の腺腫試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合よりも少なくとも１標準偏差上回る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の腺腫試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合よりも少なくとも２標準偏差上回る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の腺腫試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合よりも少なくとも３標準偏差上回る、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
メチル化が癌を示す、マーカー核酸におけるメチル化ＣｐＧ遺伝子座の組を識別する方法であって、
ａ）複数の正常試料に由来するマーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組のメチル化状態を決定することと、
ｂ）複数の癌試料に由来する前記マーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組のメチル化状態を決定して、前記定義された組の中からＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットを識別することと、を含み、
前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座の全てでメチル化される前記複数の正常試料に由来する前記マーカー核酸の個々のコピーの割合は、前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座の全てでメチル化される前記複数の癌試料に由来する前記マーカー核酸の個々のコピーの割合を下回り、
前記マーカー核酸における前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおけるメチル化は、癌を示す、方法。
【請求項７】
前記複数の癌試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合を上回る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の癌試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合よりも、少なくとも１標準偏差上回る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の癌試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合を、少なくとも２標準偏差上回る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の癌試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、前記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される前記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合を、少なくとも３標準偏差上回る、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組からなる、請求項１または請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組のメチル化状態の前記決定は、前記試料に由来するＤＮＡを重亜硫酸塩で処理することを含む、請求項１または請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組のメチル化状態の前記決定は、マーカー核酸の複数の個々のコピーにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれのデジタル分析を含む、請求項１または請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記デジタル分析は、デジタル配列決定を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記デジタル分析は、デジタルＰＣＲを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記腺腫試料は、結腸直腸腺腫試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌試料は、結腸直腸癌試料を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
試料中の癌または腺腫を検出する方法であって、少なくとも１つの癌または腺腫マーカー核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセット中のそれぞれのＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することを含み、前記癌または腺腫マーカー核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセット中の前記ＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおけるメチル化は、前記試料中の癌または腺腫を示す、方法。
【請求項１９】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、少なくとも３つのＣｐＧ遺伝子座を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、少なくとも４つのＣｐＧ遺伝子座を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、少なくとも５つのＣｐＧ遺伝子座を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記決定は、単一の核酸検出アッセイにおいて前記遺伝子座のそれぞれのメチル化状態を決定するように構成される核酸検出アッセイにおける前記ＣｐＧ遺伝子座の分析を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記決定は、単一の反応混合物において前記遺伝子座のそれぞれのメチル化状態を決定するように構成される核酸検出アッセイにおける前記ＣｐＧ遺伝子座の分析を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸検出アッセイは、プライマー伸長アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸検出アッセイは、核酸増幅アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸検出アッセイは、核酸配列決定アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸検出アッセイは、構造特異的切断アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸検出アッセイは、５’ヌクレアーゼ切断アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸検出アッセイは、侵襲的切断アッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸検出アッセイは、ライゲーションアッセイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの癌または腺腫マーカー核酸分子は、複数の癌または腺腫マーカーに由来する核酸分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の癌または腺腫マーカーは、少なくとも３つの癌または腺腫マーカーを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の癌または腺腫マーカーは、少なくとも４つの癌または腺腫マーカーを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌または腺腫マーカー核酸分子は、ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、ＴＦＰＩ２、ＬＲＡＴの２つの領域、およびＥＹＡ４核酸分子からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の癌または腺腫マーカーは、ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、ＴＦＰＩ２、ＬＲＡＴの２つの領域、およびＥＹＡ４からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの癌または腺腫マーカー核酸分子は、ビメンチン核酸分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビメンチン核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、遺伝子座３７、４０、および４５を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの癌または腺腫マーカーは、ＢＭＰ３核酸分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＢＭＰ３核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、遺伝子座３４、５３、および６１を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの癌または腺腫マーカーは、セプチン９核酸分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項４１】
前記セプチン９核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、遺伝子座５９、６１、６８、および７０を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの癌または腺腫マーカーは、ＴＦＰＩ２核酸分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＴＦＰＩ２核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、遺伝子座５５、５９、６３、および６７を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの癌または腺腫マーカーは、ＥＹＡ４核酸分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＥＹＡ４核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の前記定義されたサブセットは、遺伝子座３１、３４、３７、および４４を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の癌または腺腫マーカーは、ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、およびＴＦＰＩ２マーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
メチル化が腺腫を示す、マーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択する方法であって、
ａ）複数の正常試料に由来するマーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することと、
ｂ）複数の腺腫試料に由来する前記マーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおける前記複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することと、
ｃ）前記マーカー核酸における前記複数の前記ＣｐＧ遺伝子座のそれぞれの遺伝子座に対するメチル化比を決定することと、
ｄ）前記マーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択することであって、ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組は、腺腫と相関する有利なメチル化比を有する複数のＣｐＧ遺伝子座を含む、選択することと、
を含む、方法。
【請求項４８】
前記メチル化比の前記決定は、前記正常試料における前記複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおける平均メチル化と、前記腺腫試料における前記複数のＣｐＧ遺伝子座中の各対応するＣｐＧ遺伝子座における平均メチル化との比率を決定することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
メチル化が癌を示す、マーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択する方法であって、
ａ）複数の正常試料に由来するマーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することと、
ｂ）複数の癌試料に由来する前記マーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおける前記複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することと、
ｃ）前記マーカー核酸における前記複数の前記ＣｐＧ遺伝子座のそれぞれの遺伝子座に対するメチル化比を決定することと、
ｄ）前記マーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択することであって、ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組は、癌と相関する有利なメチル化比を有する複数のＣｐＧ遺伝子座を含む、選択することと、
を含む、方法。
【請求項５０】
前記メチル化比の前記決定は、前記正常試料における前記複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおける平均メチル化と、前記癌試料における前記複数のＣｐＧ遺伝子座中の各対応するＣｐＧ遺伝子座における平均メチル化との比率を決定することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記正常、腺腫、または癌試料において分析されるマーカー核酸の前記複数の個々のコピーは、少なくとも１００のコピーを含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記正常、腺腫、または癌試料において分析されるマーカー核酸の前記複数の個々のコピーは、少なくとも１０００のコピーを含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記正常、腺腫、または癌試料において分析されるマーカー核酸の前記複数の個々のコピーは、少なくとも１０，０００のコピーを含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記正常、腺腫、または癌試料において分析されるマーカー核酸の前記複数の個々のコピーは、少なくとも１００，０００のコピーを含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数の正常、腺腫、または癌試料は、少なくとも１０の試料を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数の正常、腺腫、または癌試料は、少なくとも２５の試料を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の正常、腺腫、または癌試料は、少なくとも１００の試料を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組は、少なくとも３つのＣｐＧ遺伝子座を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組は、少なくとも４つのＣｐＧ遺伝子座を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組は、少なくとも５つのＣｐＧ遺伝子座を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組のメチル化状態の前記決定は、前記試料に由来するＤＮＡを重亜硫酸塩で処理することを含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
ＣｐＧ遺伝子座の前記定義された組のメチル化状態の前記決定は、前記マーカー核酸における複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれのデジタル分析を含む、請求項４７または請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
前記デジタル分析は、デジタル配列決定を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記デジタル分析は、デジタルＰＣＲを含む、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１１年２月２日に出願された、米国特許仮出願第６１／４３８，６４９号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、腺腫および癌種を示す特異的メチル化パターンの判定ならびにそれらの使用のための方法および組成に関する。具体的には、本発明は、癌および腺腫試料に由来するＤＮＡにおける協調的にメチル化される定義されたＣｐＧ遺伝子座の分析、協調的にメチル化される遺伝子座を識別するための方法、ならびに１つ以上のマーカー領域における協調的にメチル化される遺伝子座の分析を改善された感度および特異性を有する腺腫および癌のアッセイの設計に使用する方法に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
より高等な真核生物において、ＤＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドにおいて、グアノシンに対して５’に位置するシトシンにおいてメチル化され得る。この修飾は、特に、しばしば遺伝子のプロモーター領域内に見られる、ＣｐＧアイランドとして既知のＣｐＧが豊富な領域に関与する場合に、遺伝子発現に重要な調節作用を有する。ヒトゲノム全体のＣｐＧ部位のおおよそ７５％がメチル化されているが、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位は、通常はメチル化されておらず、ＣｐＧアイランドの異常メチル化は、癌を含む、ある特定の疾患と関連付けられている。例えば、ＣｐＧアイランドの過剰メチル化は、ヒトの癌、例えば、結腸直腸癌における、定義された腫瘍抑制因子の転写不活性化と関連する。したがって、過剰メチル化核酸の検出は、種々の形態の癌の易罹患性またはその発症を示し得る。
【０００４】
ＣｐＧアイランドのメチル化因子表現型（ＣＩＭＰ）と癌との関連を示唆する指摘（例えば、Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８；７２：１４１−１９６およびＪｏｎｅｓ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２；３：４１５−４２８を参照されたい）にもかかわらず、メチル化状態単独の分析が、有用な診断または予後の手段であり得るという考えは、意見が分かれている。Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １７９（３）：２００５の論説でＩｓｓａらによって論じられたように、研究者らは、ＣＩ，ＭＰと癌との間の関連性の確認において、入り混じった結果を得た。ＣＩＭＰは、複数の他の悪性腫瘍に見られることが報告されており（Ｓｈｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００２；９４：７５５−７６１、Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｎｅｒｏ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；８：２２１７−２２２４、Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９７：２８２３−２８２９、Ｕｅｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６０：１８３５−１８３９、Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５９：５４３８−５４４２、Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００１；１５８：１１２１−１１２７、Ａｂｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：８２８−８３４）、複数の団体が、類似のマーカーおよび技術を使用して当初の発見を確認しているが（Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ  ＶＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６２：６０１１−６０１４、ｖａｎ  Ｒｉｊｎｓｏｅｖｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ２００２；５１：７９７−８０２）、他の団体は、このような関連性を確立することができなかった（Ｅａｄｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；６１：３４１０−３４１８、Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６０：１２９−１３３）。２００３年にようやく、公表文献が、結腸直腸癌における全てのメチル化イベントは、新形成ではなく加齢に関連すると結論付けた（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００３；４：１２１−１３１）。
【０００５】
矛盾する結果は、部分的に、結腸直腸癌における異常なＤＮＡメチル化イベントの７０〜８０％が、加齢に関連するものであり（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９；９６：８６８１−８６８６）、癌に関連する表現型は、それらを除いた場合にのみ明確であるという事実に起因している。過度に高感度の非定量的な方法は、メチル化を過大に見積もり、癌と関連するメチル化と、そうでないものとの違いが分からなくなる可能性があることも示されている。Ｉｓｓａは、「メチル化イベント（単独で）は、ＣＩＭＰ標的遺伝子が、全ての結腸直腸癌のスクリーニングには有用でなく(多くの偽陰性が予測される)、非ＣＩＭＰ標的遺伝子もまた、腫瘍を有さない高齢の個体の正常と見られる粘膜でメチル化されるために高い偽陽性率をもたらす可能性が高いという理由から、かつて理想的であると考えられた普遍的な癌のマーカーを提供することができない」と述べる（Ｉｓｓａ，ｅｔ  ａｌ．、上記）。
【０００６】
癌検出におけるメチル化分析の臨床的特異性を高めるための１つのアプローチは、複数のマーカー遺伝子を調べることである。例えば、Ｚｏｕらは、癌試料において、ＢＭＰ３、ＥＹＡ２、ＡＬＸ４、およびビメンチンのメチル化状態を試験した。メチル化レベルは、４つの遺伝子のそれぞれについて、癌および腺腫の両方において、正常上皮よりも有意に高かったが、レシーバー動作曲線によって判定される感度は、いずれのまたは全てのマーカーを組み合わせても、最良の単一のマーカーと比較して有意に改善されなかった。（Ｚｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２００７；１６（１２）：２６８６）。
【０００７】
Ｚｏｕはまた、１つを上回るマーカー遺伝子にメチル化を示す新生物を検査し、試験した癌の７２％および腺腫の８４％が２つ以上の遺伝子に過剰メチル化を示し、共メチル化の頻度が高かったことを発見した。Ｚｏｕは、これらのマーカー遺伝子の４つのうちの１つ以上（少なくとも１つ）、４つのうちの２つ以上、４つのうちの３つ以上、４つのうち４つのメチル化が、それぞれ７０の正常上皮の２４％、７％、３％、および０％と比較して、７４の癌の８８％、７２％、５３％、および４１％、ならびに６２の腺腫の９８％、８４％、６０％、および３９％に認められたことを報告し、より多くの遺伝子が共メチル化の組に含まれるにつれて、アッセイは次第により特異的になるが、感度は急激に減少することを示した。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明は、結腸直腸癌と関連するメチル化の検出に有用な、遺伝子の特定領域およびゲノム核酸の特定領域を識別する方法に関する。方法は、例として、例えば、組織生検、摘便、または他の体液において、改善された感度および特異性で、メチル化された配列を検出することを含む。好ましい実施形態において、本発明は、非正常細胞、例えば、癌または腺腫細胞におけるメチル化を、正常細胞におけるバックグラウンドのメチル化と比較した際に、有利なメチル化比を示すメチル化遺伝子座を識別することを含む、メチル化分析方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、マーカー配列内のメチル化可能部位の組中の複数の遺伝子座のそれぞれにおけるメチル化を分析する方法であって、部位の定義された組内の全ての遺伝子座にメチル化が存在することは、癌および腺腫細胞において、正常細胞よりも頻繁に発生し、その結果、試料の遺伝子座の定義されたサブセット中の全ての遺伝子座におけるメチル化の発見は、腺腫および癌を示す、方法に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、メチル化が腺腫を示す、マーカー核酸におけるメチル化ＣｐＧ遺伝子座の組を識別する方法であって、
ａ）  複数の正常試料に由来するマーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組のメチル化状態を決定することと、
ｂ）  複数の非正常（例えば、腺腫または癌）試料に由来する上記マーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおけるＣｐＧ遺伝子座の上記定義された組のメチル化状態を決定して、上記定義された組の中からＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットを識別することと、を含み、
上記定義されたサブセット中の全ての上記ＣｐＧ遺伝子座でメチル化される上記複数の正常試料に由来する上記マーカー核酸の個々のコピーの割合は、上記定義されたサブセット中の全ての上記ＣｐＧ遺伝子座でメチル化される上記複数の非正常試料に由来する上記マーカー核酸の個々のコピーの割合を下回り、上記マーカー核酸における上記定義されたサブセット中の上記ＣｐＧ遺伝子座の全てにおけるメチル化は、非正常状態、例えば、腺腫および／または癌を示す、方法を提供する。ある特定の実施形態において、上記複数の非正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の上記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化されるマーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の上記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化されるマーカー核酸の個々のコピーの平均割合を上回る。好ましい実施形態において、複数の非正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の上記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化されるマーカー核酸の個々のコピーの平均割合は、上記複数の正常試料におけるＣｐＧ遺伝子座の上記定義された組中の全ての遺伝子座でメチル化される上記マーカー核酸の個々のコピーの平均割合よりも、少なくとも１標準偏差、好ましくは２標準偏差、より好ましくは３標準偏差上回る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、ＣｐＧ遺伝子座の定義された組にあるものと同じ遺伝子座からなる。
【００１１】
ＣｐＧ遺伝子座の組のメチル化状態の決定は、当業者に既知の任意の方法によって達成することができる。いくつかの実施形態において、方法は、試料に由来するＤＮＡを重亜硫酸塩で処理することを含む。重亜硫酸塩修飾処理は、例えば、米国特許第６，０１７，７０４号に記載され、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣｐＧ遺伝子座の定義された組のメチル化状態の決定は、マーカー核酸の複数の個々のコピーにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれのデジタル分析を含む。いくつかの好ましい実施形態において、デジタル分析は、デジタル配列決定および／またはデジタルＰＣＲを含む。
【００１２】
ある特定の好ましい実施形態において、非正常試料は、腺腫試料を含み、特に好ましい実施形態においては、結腸直腸腺腫試料を含む。いくつかの好ましい実施形態において、非正常試料は、癌試料を含み、ある特定の好ましい実施形態においては、結腸直腸癌試料を含む。
【００１３】
本発明は、例えば、対象に由来する試料において、癌または腺腫を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの癌または腺腫マーカー核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセット中のそれぞれのＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することを含み、癌または腺腫核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおけるメチル化は、試料中の癌または腺腫を示す、方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態において、定義されたサブセットは、少なくとも３つのＣｐＧ遺伝子座を含むが、いくつかの好ましい実施形態においては、定義されたサブセットは、少なくとも４つのＣｐＧ遺伝子座または少なくとも５つのＣｐＧ遺伝子座を含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、決定は、単一の核酸検出アッセイにおいて遺伝子座のそれぞれのメチル化状態を決定するように構成される核酸検出アッセイにおけるＣｐＧ遺伝子座の分析を含む。いくつかの好ましい実施形態において、決定は、単一の反応混合物において上記遺伝子座のそれぞれのメチル化状態を決定するように構成される核酸検出アッセイにおけるＣｐＧ遺伝子座の分析を含む。いくつかの実施形態において、核酸検出アッセイは、プライマー伸長アッセイを含む。ある特定の好ましい実施形態において、核酸検出アッセイは、核酸増幅アッセイ、核酸配列決定アッセイ、構造特異的切断アッセイ、５’ヌクレアーゼ切断アッセイ、侵襲的切断アッセイ、および／またはライゲーションアッセイのうちの１つ以上を含み得る。
【００１５】
本発明の方法は、単一の癌または腺腫マーカー核酸の分析に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの癌または腺腫マーカー核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセット中のそれぞれのＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態は、複数の癌または腺腫マーカーに由来する核酸分子の分析を含む。いくつかの実施形態において、複数の癌または腺腫マーカーは、少なくとも３つの癌または腺腫マーカーを含むが、いくつかの実施形態においては、複数には、少なくとも４つの癌または腺腫マーカーが含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、癌または腺腫マーカーおよび核酸分子は、ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、ＴＦＰＩ２、ＬＲＡＴの２つの領域、およびＥＹＡ４マーカーおよび核酸分子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のアッセイ方法を、便潜血マーカー（例えば、ヘモグロビン、α−デフェンシン、カルプロテクチン、α１−アンチトリプシン、アルブミン、ＭＣＭ２、トランスフェリン、ラクトフェリン、およびリゾチーム）等の１つ以上の他の癌マーカーの分析と組み合わせる。
【００１６】
本明細書に記載の方法のある特定の好ましい実施形態において、癌または腺腫マーカー核酸分子は、ビメンチン核酸分子を含み、いくつかの特に好ましい実施形態においては、ビメンチン核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、遺伝子座３７、４０、および４５を含む。
【００１７】
本明細書に記載の方法のある特定の好ましい実施形態において、癌または腺腫マーカー核酸分子は、ＢＭＰ３核酸分子を含み、いくつかの特に好ましい実施形態においては、ＢＭＰ３核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、遺伝子座３４、５３、および６１を含む。
【００１８】
本明細書に記載の方法のある特定の好ましい実施形態において、癌または腺腫マーカー核酸分子は、セプチン９核酸分子を含み、いくつかの特に好ましい実施形態においては、上記セプチン９核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、遺伝子座５９、６１、６８、および７０を含む。
【００１９】
本明細書に記載の方法のある特定の好ましい実施形態において、癌または腺腫マーカー核酸分子は、ＴＦＰＩ２核酸分子を含み、いくつかの特に好ましい実施形態においては、上記ＴＦＰＩ２核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、遺伝子座５５、５９、６３、および６７を含む。
【００２０】
本明細書に記載の方法のある特定の好ましい実施形態において、癌または腺腫マーカー核酸分子は、ＥＹＡ４核酸分子を含み、いくつかの特に好ましい実施形態においては、上記ＥＹＡ４核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、遺伝子座３１、３４、３７、および４４を含む。
【００２１】
本明細書に記載の方法のある特定の好ましい実施形態において、少なくとも１つの癌または腺腫マーカーまたは核酸分子は、ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、およびＴＦＰＩ２マーカーまたは核酸分子を含む、複数のマーカーまたは核酸分子を含む。
【００２２】
本発明は、メチル化が非正常状態、例えば、腺腫または癌を示す、マーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択する方法であって、ａ）複数の正常試料に由来するマーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することと、ｂ）複数の非正常（例えば、腺腫もしくは癌）試料に由来する上記マーカー核酸の複数の個々のコピーのそれぞれにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態を決定することと、ｃ）マーカー核酸における複数の上記ＣｐＧ遺伝子座のそれぞれの遺伝子座に対するメチル化比を決定することと、ｄ）マーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択することと、を含み、ＣｐＧ遺伝子座の定義された組は、非正常状態（腺腫もしくは癌）と相関する有利なメチル化比を有する複数のＣｐＧ遺伝子座を含む、方法をさらに提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、メチル化比の決定は、正常試料における複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおける平均メチル化と、非正常試料における上記複数のＣｐＧ遺伝子座中の各対応するＣｐＧ遺伝子座における平均メチル化との比率を決定することを含む。好ましい実施形態において、正常および非正常（例えば、腺腫または癌）試料における分析されるマーカー核酸の複数の個々のコピーは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１０００個、なおもさらに好ましくは少なくとも１０，０００個、ならびになおもさらに好ましくは１００，０００個のコピーを含む。分析されるコピーの数は、これらの整数に限定されないが、約１０を上回る任意の整数であり得る。異なる試料の種類、例えば、正常および非正常に由来するコピーの数は、必ずしも等しいとは限らない。
【００２４】
本明細書に記載されるマーカー核酸におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組を選択する方法のある特定の好ましい実施形態において、比較される複数の正常および非正常（例えば、腺腫または癌）試料は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２５、なおもさらに好ましくは少なくとも１００の試料を含む。分析される試料の数は、これらの整数に限定されないが、約１０を上回る任意の整数であり得る。異なる試料の種類、例えば、正常および非正常の異なる試料の数は、必ずしも等いとは限らない。
【００２５】
ある特定の実施形態において、ＣｐＧ遺伝子座の定義された組は、少なくとも３つのＣｐＧ遺伝子座、好ましくは少なくとも４つのＣｐＧ遺伝子座、より好ましくは少なくとも５つのＣｐＧ遺伝子座を含む。
【００２６】
複数のＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態の決定は、以下により詳細に記載されるものを含む、当業者に既知の任意の方法によって達成することができる。いくつかの実施形態において、方法は、試料に由来するＤＮＡを重亜硫酸塩で処理することを含む。いくつかの実施形態において、ＣｐＧ遺伝子座の定義された組のメチル化状態の決定は、マーカー核酸の複数の個々のコピーにおける複数のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれのデジタル分析を含む。いくつかの好ましい実施形態において、デジタル分析は、デジタル配列決定および／またはデジタルＰＣＲを含む。分析のために、試料、例えば、便試料を調製する方法はまた、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許出願公開第７００５２６６号、同第６，３０３，３０４号、同第５，７４１，６５０号、同第５，９５２，１７８号、および同第６，２６８，１３６号を参照されたく、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
〔定義〕
本発明の理解を促進するために、多数の用語および語句を、以下に定義する。
【００２８】
本明細書に使用される際、用語「デジタル配列決定」および「単一分子配列決定」は、互換的に使用され、個々の核酸分子のヌクレオチド配列を決定することを指す。個々の分子の配列決定のためのシステムには、４５４  ＦＬＸ（商標）または４５４  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、ＳＯＬＥＸＡ（商標）／Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＳＯＬＩＤ（商標）ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の機器）、ならびにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等の企業によって依然として開発中の他のプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書に使用される際、遺伝子座または領域のメチル化に関して使用される用語「バックグラウンド」は、正常細胞または試料において、一般的に正常細胞では非メチル化である核酸の遺伝子座または領域で観察されるメチル化を指す。例えば、ＣｐＧアイランドは、一般的に、正常ヒト細胞においては非メチル化であると考えられるが、メチル化は、正常細胞のＣｐＧアイランドにおいて完全に存在しないわけではない。
【００３０】
本明細書に使用される際、例えば、ＣｐＧ遺伝子座において、シトシンのメチル化状態に関して使用される「メチル化」または「メチル化された」とは、シトシン残基の５位におけるメチル基の存在または非存在（すなわち、特定のシトシンが、５−メチルシトシンであるかどうか）を指す。メチル化は、例えば、シトシンのメチル化状態の分析のための日常的な方法によって証明されるように、例えば、重亜硫酸塩での処理による特定のＣ残基のウラシルへの変換の感度（またはその欠如）を決定することによって、直接決定することができる。例えば、試料を、その中のシトシン残基が非メチル化であればその残基が変換されるであろうと予測される方法で（例えば、試料中の非メチル化シトシンの大部分または全てが、ウラシルに変換される条件下で）、重亜硫酸塩で処理した際に、ウラシルに変換されないシトシン残基は、一般的に、「メチル化されている」と見なすことができる。
【００３１】
本明細書に使用される際、用語「デジタルＰＣＲ」、「単一分子ＰＣＲ」、および「単一分子増幅」は、単一の開始分子から増幅産物またはシグナルを提供するように構成される、ＰＣＲおよび他の核酸増幅方法を指す。典型的には、試料を、それぞれの部分または希釈物が、平均で、１つを上回らない標的核酸のコピーを有するように、例えば、連続希釈または十分に小さな部分に分割することによって（例えば、マイクロチャンバまたはエマルジョン中に）分割する。単一分子ＰＣＲの方法は、例えば、少なくとも１つのチャンバが少なくとも１つの標的を有するように、試料を複数のチャンバに分割すること、およびその標的を増幅して標的分子を有するチャンバの数を判定することを含む方法に関する米国特許出願公開第６，１４３，４９６号、流体の含有および分割のためのアセンブリに関する米国特許出願公開第６，３９１，５５９号、ならびに、試料を表面親和性によってチャンバに分割し、その後で硬化可能な「置換流体」でチャンバを密封する、試料チャンバを有するアセンブリに試料を分割する方法に関する米国特許出願公開第７，４５９，３１５号に記載される。米国特許出願公開第６，４４０，７０６号および米国特許出願公開第６，７５３，１４７号、ならびにＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．９２３６−９２４１，Ａｕｇｕｓｔ  １９９９もまた参照されたい。メチル化検出と合わせたジタルＰＣＲの組み合わせについて記載した米国特許出願公開第２００８０２５４４７４号もまた参照されたい。
【００３２】
本明細書に使用される際、診断アッセイ、例えばメチル化アッセイに関して使用される「感度」は、臨床的感度、すなわち、診断アッセイを使用して陽性結果をもたらす陽性試料の割合を指す。感度は、概して、既知の陽性試料に対するアッセイによって決定される真陽性数と偽陰性数の合計で除した、アッセイによって識別される真陽性数として計算される。同様に、用語「特異性」は、既知の陰性試料（複数可）でのアッセイによって判定される真陰性数と偽陽性数の合計で除した、アッセイによって判定される真陰性の割合または数を指す。
【００３３】
本明細書において、診断または分析アッセイに関して使用される際、用語「相補的」とは、一緒に使用した場合に、別々のアッセイのいずれか１つを単独で使用した場合に得られる結果よりも、高感度および／または特異的な結果をもたらす、別々のアッセイを指す。
【００３４】
本明細書に使用される際、用語「有益な」または「有益性」とは、マーカーまたはマーカーパネルのクオリティ、および具体的には陽性試料中のマーカー（またはマーカーパネル）を見出す可能性を指す。
【００３５】
本明細書に使用される際の用語「試料」は、その最も広い意味で使用される。例えば、ヒトの遺伝子もしくは染色体、またはヒトの染色体と関連する配列を含有する疑いのある試料は、細胞、細胞から単離された染色体（例えば、分裂中期の染色体の広がり）、ゲノムＤＮＡ（溶液中、もしくはサザンブロット分析等では固体支持体に結合して）、ＲＮＡ（溶液中、もしくはノーザンブロット分析等では固体支持体に結合して）、ｃＤＮＡ（溶液中または固体支持体に結合して）等を含み得る。
【００３６】
本明細書に使用される際、用語「ＣｐＧアイランド」とは、（同じ種、同じ個体、または亜集団（例えば、株、民族亜集団等）当たりの）平均ゲノムＣｐＧ発生率と比較して、高い割合のＣｐＧ部位を含むゲノムＤＮＡ領域を指す。ＣｐＧアイランドには種々のパラメータおよび定義が存在し、例えば、いくつかの実施形態において、ＣｐＧアイランドは、５０％を上回るＧＣ率を有し、６０％を上回る観測／予測ＣｐＧ比を有するとして定義される（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１−２８２、Ｂａｙｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：１０７−１１６、Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８−１８６、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ＣｐＧアイランドは、５５％超のＧＣ含有量および０．６５の観測ＣｐＧ／予測ＣｐＧを有し得る（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  ９９：３７４０−３７４５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣｐＧアイランドの長さに関してもまた、種々のパラメータが存在する。本明細書に使用される際、ＣｐＧアイランドは、長さが、１００ｂｐ未満、１００〜２００ｂｐ、２００〜３００ｂｐ、３００〜５００ｂｐ、５００〜７５０ｂｐ、７５０〜１０００ｂｐ、１０００ｂｐ、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、ＣｐＧアイランドは、対照と比べて変化したメチル化パターンを示す（例えば、癌を有さない対象と比べて、癌対象における変化したメチル化、組織特異的に変化したメチル化パターン、結腸直腸新形成を有さない対象と比べて、結腸直腸新形成（例えば、結腸直腸癌、結腸直腸腺腫）を有する対象の便における変化したメチル化）。いくつかの実施形態において、変化したメチル化は、過剰メチル化を伴う。いくつかの実施形態において、変化したメチル化は、低メチル化を伴う。
【００３７】
本明細書に使用される際、用語「ＣｐＧショア」または「ＣｐＧアイランドショア」とは、変化したメチル化パターンであるか、またはそれを有する可能性があるＣｐＧアイランドの外側のゲノム領域を指す（例えば、Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８−１８６を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣｐＧアイランドショアは、対照と比べて変化したメチル化パターンを示し得る（例えば、癌を有さない対象と比べて癌対象において変化したメチル化、組織特異的な変化したメチル化パターン、結腸直腸新形成を有さない対象と比べて、結腸直腸新形成（例えば、結腸直腸癌、結腸直腸腺腫）を有する対象の便における変化したメチル化）。いくつかの実施形態において、変化したメチル化は、過剰メチル化を伴う。いくつかの実施形態において、変化したメチル化は、低メチル化を伴う。ＣｐＧアイランドショアは、ＣｐＧアイランドと比べて、種々の領域に位置し得る（例えば、Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１；１７８−１８６を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの実施形態において、ＣｐＧアイランドショアは、ＣｐＧアイランドから、１００ｂｐ未満、１００〜２５０ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、１０００〜１５００ｂｐ、１５００〜２０００ｂｐ、２０００〜３０００ｂｐ、３０００ｂｐ、またはそれ以上離れて位置する。
【００３８】
用語「標的」は、核酸の検出または分析の方法に関して使用される際、例えば、標的核酸を含有する疑いのある試料において、検出または分析される特定のヌクレオチド配列を有する核酸を指す。いくつかの実施形態において、標的は、メチル化状態を決定するのに望ましい、特定の配列を有する核酸である。ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される際、「標的」は、概して、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーによって結合される核酸の領域を指す。したがって、「標的」は、試料中に存在し得る他の核酸配列と区別しようとするものである。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。用語「試料鋳型」は、標的の存在について分析される試料を起源とする核酸を指す。
【００３９】
本明細書に使用される際、用語「遺伝子座」は、遺伝子、または染色体もしくはＲＮＡ分子上の任意の他の特徴的な配列等、定義された核酸の領域またはセグメント内のＣｐＧジヌクレオチドにおける、例えば、突然変異、多型性、またはＣ残基の特定の位置を指す。遺伝子座は、いかなる特定の寸法または長さにも限定されず、染色体の一部、遺伝子、機能的遺伝要素、または単一のヌクレオチドもしくは塩基対を指し得る。メチル化され得るＣｐＧ部位に関して本明細書に使用される際、遺伝子座は、ＣｐＧジヌクレオチド中のＣ残基を指す。
【００４０】
本明細書に使用される際、用語「メチル化比」とは、複数の非正常細胞（例えば、癌性または前癌性細胞等、特定の疾患状態にある細胞）における特定のメチル化領域または遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子もしく領域中のＣｐＧ遺伝子座）に観測されるメチル化の量または程度を、複数の正常細胞（例えば、対象となる特定の疾患状態にない細胞）における同じ領域または遺伝子座に観測されるメチル化の量または程度と比較して、指す。例えば、正常細胞の試料抽出では８．３９８８９％の平均メチル化、および複数の腺腫細胞の試料抽出では７４．０７７１％の平均メチル化を示すＣｐＧ遺伝子座については、メチル化比は、正常細胞：腺腫細胞について判定される平均の比率、または０．１１３４８として表すことができる。メチル化比は、必ずしも、何らかの特定の方式で、または何らかの特定の計算によって、表す必要はない。例であり、限定する目的ではないが、上記のメチル化比は、代替的には、例えば、８．３９８８９：７４．０７７１、８．３９８８９／７４．０７７１、７４．０７７１：８．３９８８９として、計算した「バックグラウンドに対するメチル化の倍率」８．８１９８７として等で、表すことができる。
【００４１】
本明細書に使用される際、用語「有利なメチル化比」とは、メチル化が、細胞の状態、例えば、特定の疾患状態（例えば、正常、前癌性、癌性）と相関する、遺伝子座のメチル化比を指し、同じ疾患状態と相関する他のメチル化遺伝子座と比較した場合、正常細胞集団の同じ遺伝子座におけるメチル化のバックグラウンドレベルと比較して、非正常細胞集団ではより高い割合のメチル化を示す。いくつかの事例において、例えば、メチル化マーカー配列内のある特定のＣｐＧ遺伝子座は、バックグラウンドと比較して、同じマーカー配列中の他の遺伝子座よりも、はるかに高いシグナル対ノイズ比、すなわち、メチル化の程度を示す。他の事例において、ある特定の疾患関連マーカー遺伝子または領域は、いくつかまたは全ての遺伝子座において、別のマーカー配列内のいくつかまたは全ての遺伝子座に観測されるメチル化比と比較して、有利なメチル化比を示す。
【００４２】
本明細書に使用される際、用語「協調的にメチル化された」とは、細胞の状態、例えば、特定の疾患状態（例えば、正常、前癌性、癌性）と相関する特定のメチル化パターンを示す、マーカー配列中のメチル化遺伝子座、例えば、ＣｐＧ遺伝子座に関して使用される。好ましい実施形態において、全てが疾患状態と相関する形式でメチル化されたメチル化遺伝子座は、その疾患状態を有する細胞において、協調的にメチル化されていると見なすことができる。「協調的メチル化」は、協調する遺伝子座の全てがメチル化されている状況に限定されない。細胞の状態と相関する遺伝子座の特定の組におけるいずれのメチル化パターンも、全てが「協調的にメチル化された」の意味の範囲内に含まれ、このパターンには、協調的遺伝子座の全てがメチル化されるパターン、遺伝子座が再現可能なメチル化および非メチル化パターンを呈するパターン、その組内のいずれの遺伝子座もメチル化されていないパターンを含む。
【００４３】
本明細書に使用される際、用語「協調的メチル化分析」は、「多重メチル化分析」と互換的に使用され、マーカー配列中の複数の個々のメチル化遺伝子座、例えば、ＣｐＧ遺伝子座のメチル化状態が、同時に決定されるアッセイを指す。好ましい実施形態において、協調的メチル化分析は、デジタル／単一コピー方法（例えば、デジタル配列決定）または試験される各分子の選択されたＣｐＧ遺伝子座の全てを調べるように構成されるアッセイ方法を使用して行われ、その結果、試験される各単一分子のメチル化パターンが明らかになる。
【００４４】
本明細書に使用される際、ＣｐＧ遺伝子座（または他のメチル化遺伝子座）の「定義された組」とは、メチル化分析のために選択されたマーカー遺伝子または領域におけるＣｐＧ遺伝子座の組を指す。マーカー遺伝子もしくは領域におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組は、遺伝子もしくは領域中の全てのＣｐＧ遺伝子座を含んでもよく、または、その遺伝子もしくは領域中の全てに満たない数の遺伝子座を含んでもよい。
【００４５】
本明細書に使用される際、ＣｐＧ遺伝子座（または他のメチル化遺伝子座）の「定義されたサブセット」は、マーカー遺伝子または領域におけるＣｐＧ遺伝子座の定義された組のサブセットを指し、そのメチル化は、非正常状態、例えば、腺腫または癌を示すことが決定している。例えば、結腸直腸癌の存在を決定するための協調的メチル化分析において、少なくとも１つの癌のマーカー核酸分子におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットのメチル化状態を、試料中の癌を示す定義されたサブセット中の全ての上記ＣｐＧ遺伝子座における同時メチル化とともに、決定する。マーカー遺伝子もしくは領域におけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、定義された組中の全てのＣｐＧ遺伝子座を含んでもよく、または、その遺伝子もしくは領域における遺伝子座の定義された組中の全てに満たない数の遺伝子座を含んでもよい。
【００４６】
本明細書に使用される際、用語「結腸直腸癌」は、小腸より下の腸管（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸を含む大腸（結腸）、ならびに直腸）の細胞の癌によって特徴付けられる病状として、結腸直腸癌を定義する、広く認められた医学的定義を含むことを意図する。さらに、本明細書に使用される際、用語「結腸直腸癌」は、十二指腸および小腸（空腸および回腸）の細胞の癌によって特徴付けられる病状をさらに含むことを意図する。
【００４７】
本明細書に使用される際、用語「転移」とは、身体の１つの器官または部分を起源とする癌細胞が、身体の別の部分に移転し、複製し続けるプロセスを指すことを意図する。転移細胞は、続いて、腫瘍を形成し、それがさらに転移する可能性がある。転移は、したがって、癌がもともと発生した身体の一部から、身体の他の部分への癌の拡大を指す。本明細書に使用される際、用語「転移結腸直腸癌細胞」は、転移した結腸直腸癌細胞、すなわち、十二指腸、小腸（空腸および回腸）、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸を含む大腸（結腸）、ならびに直腸以外の体の部分に位置する、結腸直腸癌細胞を指すことを意図する。
【００４８】
本明細書に使用される際、「個体は、転移結腸直腸癌に対する易罹患性を有する疑いがある」とは、転移結腸直腸癌を発症する危険性が平均を上回る個体を指すことを意図する。転移結腸直腸癌を発症する特定の危険性にある個体の例は、家族の病歴が、家族内の平均を上回る結腸直腸癌の発生率を示すもの、ならびに／または既に結腸直腸癌を発症し、効果的に治療され、したがって、再発および再発生の危険に直面するものである。平均を上回る結腸直腸癌発症の危険性に寄与し得、したがって、個体が、転移結腸直腸癌に対する易罹患性を有する疑いがあるとして分類されることにつながるであろう他の要因は、個体の特異的な、遺伝的、医学的、および行動的な背景および特性に基づくものであり得る。
【００４９】
本明細書に使用される際の用語「新生物」は、あらゆる新しい異常な組織の成長を指す。したがって、新生物は、前悪性新生物または悪性新生物であり得る。
【００５０】
用語「新生物特異的マーカー」は、新生物の存在を示すために使用可能な任意の生物学的物質を指す。生物学的物質の例には、限定することなく、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜およびミトコンドリア）、ならびに全細胞が含まれる。いくつかの事例において、マーカーは、特定の核酸領域、例えば、遺伝子、遺伝子内領域等である。マーカーである核酸の領域は、例えば、「マーカー遺伝子」、「マーカー領域」、「マーカー配列」等を指し得る。
【００５１】
用語「結腸直腸新生物特異的マーカー」は、結腸直腸新生物（例えば、前悪性結腸直腸新生物、悪性結腸直腸新生物）の存在を示すために使用可能な任意の生物学的物質を指す。結腸直腸新生物特異的マーカーの例には、限定されないが、剥離上皮マーカー（例えば、ｂｍｐ−３、ｂｍｐ−４、ＳＦＲＰ２、ビメンチン、セプチン９、ＡＬＸ４、ＥＹＡ４、ＴＦＰＩ２、ＮＤＲＧ４、ＦＯＸＥ１、長鎖ＤＮＡ、ＢＡＴ−２６、Ｋ−ｒａｓ、ＡＰＣ、メラノーマ抗原遺伝子、ｐ５３、ＢＲＡＦ、およびＰＩＫ３ＣＡ）、ならびに便潜血マーカー（例えば、ヘモグロビン、α−デフェンシン、カルプロテクチン、α１−アンチトリプシン、アルブミン、ＭＣＭ２、トランスフェリン、ラクトフェリン、およびリゾチーム）が含まれる。米国特許出願公開第７４８５４２０号、米国特許出願公開第７４３２０５０号、米国特許出願公開第５３５２７７５号、米国特許出願公開第５６４８２１２号、米国特許再発行第３６７１３号、米国特許出願公開第５５２７６７６号、米国特許出願公開第５９５５２６３号、米国特許出願公開第６０９０５６６号、米国特許出願公開第６２４５５１５号、米国特許出願公開第６６７７３１２号、米国特許出願公開第６８００６１７号、米国特許出願公開第７０８７５８３号、および米国特許出願公開第７２６７９５５号もまた参照されたく、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
さらなるマーカーには、以下の表１のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
【表１】
2014519310.tif 000002
2014519310.tif 000003
2014519310.tif 000004
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【００５４】
Ｉｌａｎａ  Ｋｅｓｈｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８，１４９−１５３（１  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００６）およびＧｅｒｄ  Ｐ  Ｐｆｅｉｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００７，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，Ｐａｇｅｓ  ９９−１０８もまた参照されたく、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５５】
本明細書に使用される際、用語「腺腫」は、腺起源の良性腫瘍を指す。これらの成長は良性であるが、時間とともに、悪性に進化する可能性がある。本明細書に使用される際の用語「結腸直腸腺腫」は、細胞がその中で認識可能な腺構造を形成するか、または細胞がその中で腺上皮から明確に導出される、良性の結腸直腸腫瘍を指す。
【００５６】
核酸との関連において、用語「増幅する」または「増幅」は、典型的に少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から開始する、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部分の複数のコピーの生成を指し、増幅産物またはアンプリコンは、一般的に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的および酵素的プロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、例えば、米国特許第５，４９４，８１０号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の際の、標的または鋳型ＤＮＡ分子の１つまたは少数のコピーからの複数のＤＮＡコピーの生成は、増幅の形態である。さらなる増幅の種類には、限定されないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（例えば、米国特許第５，６３９，６１１号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、アセンブリＰＣＲ（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６２，５９４号を参照されたい）、ホットスタートＰＣＲ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および同第５，３３８，６７１号を参照されたく、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、配列間特異的ＰＣＲ、逆ＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｒｉｇｌｉａ，ｅｔ  ａｌｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：８１８６を参照されたい）、ライゲーション媒介性ＰＣＲ（例えば、Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：１８５４−１８５８（１９９７）、米国特許第５，５０８，１６９号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３（１３）９８２１−９８２６を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ミニプライマーＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（１２）：ｅ５７を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、多重ＰＣＲ（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６（２３）１１１４１−１１１５６、Ｂａｌｌａｂｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８４（６）５７１−５７３、Ｈａｙｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：８０を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ネスト化ＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６（１５）７３５１−７３６７を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａ��ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１３−４１７、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１０２６−１０３０を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、逆転写ＰＣＲ（例えば、Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１６９−１９３を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、およびタッチダウンＰＣＲ（例えば、Ｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）１９（１４）４００８、Ｒｏｕｘ，Ｋ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６（５）８１２−８１４、Ｈｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（３）４７８−４８５を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。ポリヌクレオチド増幅はまた、デジタルＰＣＲを使用して達成することができる（例えば、Ｋａｌｉｎｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５；１９９９−２００４，（１９９７）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６；９２３６−４１，（１９９９）、国際特許出願公開第０５０２３０９１Ａ２号、米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製なしで、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，９６５，１８８号の方法を指す。標的配列を増幅させるためのこのプロセスは、非常に過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望される標的配列を含有するＤＮＡ混合物に導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序の熱サイクル処理を行うことから構成される。２つのプライマーは、二本鎖の標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次いで、プライマーを標的分子内のそれらの相補的配列とアニーリングさせる。アニーリング後、プライマーを、新しい相補鎖の組を形成するように、ポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長のステップを、何度も反復して（すなわち、変性、アニーリング、および伸長が、１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が存在し得る）、高濃度の所望の標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対的位置によって決定され、したがって、この長さは、制御可能なパラメータである。プロセスの反復する態様のため、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と称される。所望される標的配列の増幅セグメントが、混合物における優勢配列（濃度に関して）となるため、それらは、「ＰＣＲにより増幅された」と称され、「ＰＣＲ産物」および「アンプリコン」である。
【００５８】
本明細書に使用される際、用語「核酸検出アッセイ」は、目的の核酸のヌクレオチド組成を決定する任意の方法を指す。核酸検出アッセイには、限定されないが、ＤＮＡ配列決定法、プローブハイブリッド形成法、構造特異的切断アッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）が含まれ、例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，０９０，５４３号、および同第６，８７２，８１６号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）、および米国特許出願公開第２００９／０２５３１４２号に記載され、これらのそれぞれは、全ての目的に関して参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、酵素不適合切断法（例えば、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ、米国特許第６，１１０，６８４号、同第５，９５８，６９２号、同第５，８５１，７７０号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ポリメラーゼ連鎖反応、分枝ハイブリッド形成法（例えば、Ｃｈｉｒｏｎ、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，７１０，２６４号、同第５，１２４，２４６号、および同第５，６２４，８０２号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ローリングサークル複製（例えば、米国特許第６，２１０，８８４号、同第６，１８３，９６０号、および同第６，２３５，５０２号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、分子指標技術（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｅセンサー技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、同第６，２２１，５８３号、同第６，０１３，１７０号、および同第６，０６３，５７３号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、サイクリングプローブ技術（例えば、米国特許第５，４０３，７１１号、同第５，０１１，７６９号、および同第５，６６０，９８８号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇシグナル増幅法（例えば、米国特許第６，１２１，００１号、同第６，１１０，６７７号、同第５，９１４，２３０号、同第５，８８２，８６７号、および同第５，７９２，６１４号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒｎａｙ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，１８９−９３（１９９１））、ならびにサンドイッチハイブリッド形成法（例えば、米国特許第５，２８８，６０９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【００５９】
本明細書に使用される際、ポリヌクレオチド（すなわち、連続したヌクレオチド）に関して使用される用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に対して相補的である。相補性は、一部の核酸塩基のみが塩基対形成規則に従って適合する、「部分的」なものであってもよい。あるいは、核酸間に、「完全」または「全体的」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリッド形成の効率および強度に、有意な影響を有する。これは、増幅反応ならびに核酸間の結合に依存する検出方法において、特に重要である。
【００６０】
本明細書に使用される際、用語「プライマー」は、精製された制限分解物にあるように、天然に存在するか、または合成で生成されたかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘発される条件下に（例えば、ヌクレオチドおよび生体触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等）等の誘発剤の存在下で）置かれる場合、その開始点として機能することが可能な、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、典型的には、最大の増幅効率のため一本鎖であるが、代替として、部分的または完全に二本鎖であってもよい。鋳型核酸とハイブリッド形成するプライマーの部分は、誘発剤の存在下で、伸長産物の合成を開始するのに十分に長い。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用する方法を含む、多数の因子に依存することになる。プライマーは、標識、タグ、捕捉部分等を含み得る。
【００６１】
本明細書に使用される際、用語「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない分子を含有する、任意の核酸を指す。この用語は、限定されないが、４アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイド−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含む、あらゆる既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体を包含する。
【００６２】
本明細書に使用される際、用語「核酸塩基」は、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、「ヌクレオチド残基」、「デオキシヌクレオチド残基」、「ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）」、またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む、当該技術分野で使用される他の用語と同義である。
【００６３】
「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）、典型的には３つを上回るモノマー単位、およびさらに典型的には１０を上回るモノマー単位を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドの正確な寸法は、概して、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用を含む、種々の因子に依存する。さらに説明すると、オリゴヌクレオチドは、典型的に、２００残基未満の長さ（例えば、１５〜１００）であるが、しかしながら、本明細書に使用されるように、この用語はまた、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することを意図する。オリゴヌクレオチドは、しばしば、それらの長さで言及される。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４量体」と称される。典型的に、ヌクレオシドモノマーは、リン酸ジエステル結合によって、またはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）等を含み、例えば、関連する対イオンが存在する場合は、このような対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋等を含む、その類似体によって、結合される。さらに、オリゴヌクレオチドは、典型的には一本鎖である。オリゴヌクレオチドは、任意で、既存もしくは天然の配列の単離、適切な配列のＤＮＡ複製もしくは増幅、逆転写、クローン生成、および制限分解、あるいは、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のリン酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト法、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１のトリエステル法、自動化合成方法、またはＣａｒｕｔｈｅｒｓらに対して、１９８４年７月３日に発行された「ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」と題される米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法、または当業者に既知の他の方法等の方法による直接の化学合成を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって、調製される。これらの参考文献は全て、参照により組み込まれる。
【００６４】
バイオポリマーの「配列」は、バイオポリマー中のモノマー単位（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸等）の順序および同一性を指す。核酸の配列（例えば、塩基配列）は、典型的に、５’から３’の方向で読み取られる。
【００６５】
用語「野生型」は、遺伝子または遺伝子産物を天然に存在する源から単離した際に、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団中に最も高頻度で観察されるものであり、したがって、その遺伝子の無作為に設計された「正常」または「野生型」形態である。対照的に、用語「修飾された」、「変異体」、および「変異形」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した際、配列およびまたは機能的特性に修飾（すなわち、変化した特性）を示す、遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は、単離可能であり、これらは、それらが野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変化した特性を有するという事実によって、識別されるということを留意されたい。
【００６６】
本明細書に使用される際、用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、全長または断片ポリペプチドの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル変換、免疫原性等）が保持される限り、全長コード配列またはコード配列の任意の部分によって、コードすることができる。この用語はまた、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、構造遺伝子のコード領域、ならびに５’および３’の両末端上の、いずれかの末端で約１ｋｂ以上の距離にわたりコード領域に隣接して位置する配列を包含する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される、非コード配列により分断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（例えば、ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、調節要素（例えば、エンハンサー）を含み得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライシング除去」され、イントロンは、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の際に、発生期のポリペプチドにおいてアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
【００６７】
イントロンを含有することに加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列を含んでもよい。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するか、またはそれに影響を及ぼす、プロモーターおよびエンハンサー等の調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写終結、転写後の切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００６８】
本明細書に使用される際、用語「多重メチル化」、「連続メチル化」、および「特異的メチル化」は、協調的または多重メチル化アッセイにおいて、マーカー配列がメチル化されていると称するためにはメチル化されている必要のある、マーカー配列内のＣｐＧ部位または遺伝子座の定義された組み合わせを指して互換的に使用される。例えば、ＢＭＰ３のＣｐＧ部位の特異的メチル化アッセイは、ＢＭＰ３マーカーにおいて、試料をメチル化されていると分類するためには、図１Ａおよび１Ｂへの参照により番号付けされる２３、３４、５３、６１、７０、および７４におけるＣｐＧ位置が、全てメチル化されていることを要し得る。ＢＭＰ３の特異的メチル化は、この特定の遺伝子座の組に限定されるものではないが、より多い、より少ない、または異なるＣｐＧ遺伝子座の集合が含まれてもよい。多重メチル化アッセイにおける共分析のために選択されるＣｐＧ遺伝子座は、好ましくは、例えば、正常（非腺腫、非癌）試料の分析によって選択され、正常試料にはあまり頻繁に表れないＣｐＧメチル化の組み合わせを識別する。好ましい実施形態において、メチル化部位の組み合わせは、癌および腺腫試料において良好なシグナル対ノイズを生成するように選択される（すなわち、癌試料における特定の組み合わせの遺伝子座での平均多重メチル化を、正常試料におけるそれらの遺伝子座での平均多重メチル化で除したものが、高い）。
【００６９】
本明細書に使用される際、用語「個々」および「平均」メチル化は、全ての分子であって、その塩基がメチル化された全ての分子を、例えば、同じマーカーにおける他の遺伝子座のメチル化状態にかかわらず、数に含むように、それぞれのＣｐＧ遺伝子座を個々に分析する分析法を指して互換的に使用される。一般的には、マーカー／領域における全ての遺伝子座のメチル化率を、次いで平均化し、そのマーカーに対するメチル化パーセント数を得る。
【００７０】
本明細書に使用される際、用語「キット」とは、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの関連において、このような送達システムには、反応試薬（例えば、適切な容器に入ったオリゴヌクレオチド、酵素等）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための説明書類等）の保管、輸送、もしくは１つの位置からもう１つの位置までの送達を可能にする、システムが含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１つ以上の容器（例えば、箱）が含まれる。本明細書に使用される際、用語「細分化キット」は、２つ以上の別個の容器であって、それぞれが、全キット構成要素の一部を含む、２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、一緒または別個に、意図される受容者に送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイで使用するための酵素を含み得、一方で第２の容器は、オリゴヌクレオチドを含む。用語「細分化キット」は、連邦食品衣料品化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）の第５２０条（ｅ）項により規制される、検体特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含するように意図するが、それらに限定されない。実際には、２つ以上の別個の容器であって、それぞれが全キット構成要素の一部分を含む、２つ以上の別個の容器を含むいずれの送達システムも、用語「細分化キット」に含まれる。対照的に、「複合キット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一の容器（例えば、所望される構成要素のそれぞれを収容する単一の容器内）に含む、送達システムを指す。用語「キット」は、細分化および複合両方のキットが含まれる。
【００７１】
本明細書に使用される際、用語「情報」は、事実またはデータの任意の集合を指す。インターネットを含むがこれに限定されないコンピュータシステム（複数可）を使用して記憶または処理された情報に関して、この用語は、任意の形式（例えば、アナログ、デジタル、光学等）で記憶された任意のデータを指す。本明細書に使用される際、用語「対象に関連する情報」とは、対象（例えば、ヒト、植物、または動物）に関係する事実またはデータを指す。用語「ゲノム情報」は、限定されないが、核酸配列、遺伝子、対立遺伝子頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型と相関する表現型等を含む、ゲノムに関係する情報を指す。「対立遺伝子頻度情報」とは、限定されないが、対立遺伝子同一性、対立遺伝子の存在と対象（例えば、ヒト対象）の特徴との間の統計的相関性、個体または集団における対立遺伝子の存在または不在、対立遺伝子が１つ以上の特定の特徴を有する個体に存在する可能性が高い割合等を含む、対立遺伝子頻度に関係する事実または情報を指す。
【００７２】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕
図１Ａおよび図１Ｂは、本分析に使用する例示的なマーカー領域の配列およびＣｐＧ情報を提供する。各標的遺伝子に対して、領域の天然の配列を上の列に示す。重亜硫酸塩および増幅によってＴに変換される、非メチル化Ｃ残基を、Ｔ残基として示す。候補メチル化位置を、四角に囲んで示す。塩基およびＣｐＧ位置の参照番号付けを、各天然配列の上に示す。増幅のためのプライマー位置を、下線の塩基位置の列として示す．
〔図２〕
図２Ａ〜図２Ｊは、平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を提供する。各マーカーに対して、番号付けされたＣｐＧ位置は、図１Ａおよび１Ｂにおける参照番号で示される通りである。各特異的遺伝子座における平均メチル化を、正常、腺腫、および癌の試料に対して、各列の下部に示す。各遺伝子座の正常／突然変異のメチル化比（各遺伝子座におけるメチル化比）を、腺腫および癌試料データの各列の下部に示す。各表の右端の平均の列は、試料のそれぞれについて全ての示されるＣｐＧ遺伝子座にわたるメチル化の平均を示す。全遺伝子座における全正常試料の平均および標準偏差の値は、各表の正常試料の値の下に示される通りである．
〔図３〕
図３Ａ〜図３Ｉは、図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を提供する。図３Ａの正常試料については、各マーカーに対する平均、標準偏差、および平均＋２または３標準偏差を示す。腺腫および癌試料については、図３Ｂおよび３Ｃの網掛けセルは、正常試料におけるそのマーカーの決定された平均メチル化＋３標準偏差を上回る、そのマーカーに対する平均メチル化値として反映される、陽性結果を示す．
図３Ｄおよび図３Ｅは、正常ＤＮＡ中への腺腫および癌のＤＮＡの２０倍希釈の計算した効果を示し、図３Ｆおよび３Ｇは、計算した１０倍希釈を示し、図３Ｈおよび３Ｉは、計算した５倍希釈を示す。計算した希釈のそれぞれにおいて、マーカーに対する平均メチル化を、２０、１０、または５で除し、そのマーカーに対する正常ＤＮＡの平均メチル化に加えた。図３Ｄ〜３Ｉの網掛けセルは、正常試料におけるそのマーカーの決定された平均メチル化＋２標準偏差（９７．５％の特異性）を上回る、そのマーカーに対する平均メチル化値を示す．
図３Ｂ〜図３Ｉは、それぞれの下に、試料の種類およびそのパネルの希釈率における、各マーカーに対する陽性値の割合を示す。ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、およびＴＦＰＩ２マーカーのうち、少なくとも１つに対して陽性シグナルが得られる試料の割合を、各パネルの底部に示す．
〔図４〕
図４Ａおよび図４Ｂは、本分析に使用する例示的な遺伝子の配列およびＣｐＧ情報を提供する。結腸直腸の腺腫および癌試料における協調的メチル化分析のためのＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットに含まれる、各マーカー遺伝子のＣｐＧ遺伝子座を、黒色背景に白色文字で示す．
〔図５〕
図５Ａ〜図５Ｉは、メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を提供する。各マーカーを、図４Ａおよび４Ｂに示される定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座のそれぞれにおいて試験し、メチル化率のデータは、試験したＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を有するマーカーコピーの割合を反映する（協調的メチル化または「多重メチル化」分析）。図５Ａの正常試料については、各マーカーに対する平均多重メチル化、標準偏差、および平均＋２または３の標準偏差を示す。腺腫および癌試料については、図５Ｂおよび５Ｃの網掛けセルは、正常試料におけるそのマーカーの決定された平均多重メチル化＋３標準偏差を上回る、そのマーカーに対する多重メチル化値として反映される、陽性結果を示す．
図５Ｄおよび図５Ｅは、正常ＤＮＡ中への腺腫および癌のＤＮＡの２０倍希釈の計算した効果を示し、図５Ｆおよび５Ｇは、計算した１０倍希釈を示し、５Ｈおよび５Ｉは、計算した５倍希釈を示す。計算した希釈のそれぞれにおいて、マーカーに対する平均多重メチル化を、２０、１０、または５で除し、そのマーカーに対する正常ＤＮＡの平均多重メチル化に加えた。図５Ｄ〜５Ｉの網掛けセルは、正常試料中におけるそのマーカーの決定された平均多重メチル化＋２標準偏差（９７．５％の特異性）を上回る、そのマーカーに対する平均多重メチル化値を示す．
図５Ｂ〜図５Ｉは、それぞれの下に、試料の種類およびそのパネルの希釈率における、各マーカーに対する陽性値の割合を示す。ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、およびＴＦＰＩ２マーカーのうち、少なくとも１つに対して陽性シグナルが得られる試料の割合を、各パネルの底部に示す．
〔図６〕
示されるように、個々／平均メチル化または多重メチル化分析法のいずれかを使用して、示される計算した希釈のそれぞれにおいて、示されるマーカーのそれぞれを試験した、腺腫および癌試料における各マーカーに対して計算された陽性値パーセントを比較する、表およびグラフを示す．
〔図７〕
個々／平均メチル化または多重メチル化分析法のいずれかを使用して、示される正常ＤＮＡへの計算した希釈のそれぞれにおいて、これらの試料における最も低い平均バックグラウンドを有する４つのマーカー（ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、ＴＦＰＩ２）を使用して決定された、腺腫および癌試料における決定された陽性値パーセントを比較する、表およびグラフを示す。
【００７３】
〔発明を実施するための形態〕
本発明の実施形態を、この要約、および上述の発明の概要に記載し、これは、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されているが、請求される発明は、このような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。
【００７４】
本発明は、腺腫および癌種を示す特異的メチル化パターンの決定のための方法および組成、ならびにそれらの使用に関する。具体的には、本発明は、癌および腺腫試料に由来するＤＮＡにおける協調的にメチル化されるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットの分析、協調的にメチル化される遺伝子座の識別のための方法、ならびに１つ以上のマーカーまたは領域における協調的にメチル化される遺伝子座の分析を改善された感度および特異性を有する腺腫および癌のアッセイの設計に使用する方法に関する。
【００７５】
本発明は、メチル化状態が、例えば、癌性、前癌性、正常等の細胞状態を示すマーカー核酸内で、非正常細胞における個々のメチル化遺伝子座、例えば、ＣｐＧ遺伝子座のサブセットは、概して、正常細胞における対応する遺伝子座において観測されるメチル化のバックグラウンドレベルと比べて、より高いメチル化の程度を示し、一方で、非正常細胞における他のメチル化遺伝子座は、バックグラウンドレベルに近似のメチル化レベルを示し得るという観測に関する。いくつかの実施形態において、正常細胞と比較した、複数の癌性または前癌性細胞における特定の遺伝子座に観測されるメチル化の程度は、メチル化比として表される。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態は、既知または予想されるマーカー遺伝子をスクリーニングして、他のマーカー遺伝子または同じマーカー遺伝子の他の遺伝子座と比較した際に、バックグラウンドのメチル化と比べて、より高い疾患関連メチル化の比率を示す、特定のメチル化遺伝子座を識別することに関する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、マーカー分子または試料が、複数の選択された遺伝子座の全てにおいてメチル化を示す程度を測定するための協調的メチル化分析に関する。
【００７７】
本発明は、腺腫試料または癌試料における十分に有意な数の個々のＤＮＡ分子において、メチル化マーカー（またはこのようなマーカー内の標的領域）における個々のＣｐＧ遺伝子座の定義された組のメチル化状態を分析し、同じ腺腫または癌試料における他の遺伝子座と比較して、有利なメチル化比を有するＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットを識別することに関する。試料中の有利なメチル化比を有するＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセットは、特定のマーカーもしくはマーカー標的領域におけるＣｐＧ遺伝子座の組の全体を含んでもよく、またはそのマーカーの特徴付けられた領域におけるＣｐＧ遺伝子座の全てに満たなくてもよい。
【００７８】
マーカーのメチル化状態を分析する従来の方法は、概して、混合した分子集団の分析を伴う。例えば、試料からのマーカー核酸の増幅は、概して、標的分子の多数のコピーから生じるアンプリコンの混合物を生成する。増幅条件が、遺伝子変異形に選択的でない場合、アンプリコン産物は、変異形および正常もしくは野生型のＤＮＡの混合物を含む。プライマーが、突然変異または特定のメチル化部位に特異的である場合でさえも、ＤＮＡが多数の細胞に由来する標的ＤＮＡの多数のコピーから増幅される場合、結果として得られるアンプリコンの他の塩基位置には異種性が存在し得る。これらの混合したアンプリコンを直接配列決定する場合、結果として得られる配列トレースは、混合集団のコンセンサス配列を明らかにし、その集団のごく一部に存在する特定の配列または突然変異は、実質的に検出不可能である。複数の研究者らが、このような増幅から個々のクローンの配列決定を行い、混合物に由来する個々の分子に対する配列情報を試験したが、わずかな数の分子のみが分析され、収集されたデータは、マーカー内の任意の特異的遺伝子座が、同じ標的内の他のメチル化された遺伝子座と比較して、有利なメチル化比を予想通り呈すること、または有利なメチル化比を有する遺伝子座の協調的分析が、新生物の検出におけるアッセイの特異性および感度を改善することに有用であり得ることのいずれも示唆しなかった。本発明の態様は、正常および非正常試料の両方において、非常に多数の個々の分子からメチル化比の情報を収集することにより、マーカー領域または配列内のいくつかのメチル化遺伝子座が、非正常細胞において、バックグラウンド（正常細胞の同じ遺伝子座におけるメチル化）と比較して、同じマーカー領域または遺伝子における他の個々の遺伝子座よりも高いメチル化の程度を示すことを明らかにするという観測に基づく。バックグラウンドと比較して高いメチル化レベルを有する、非正常配列におけるこれらの遺伝子座は、正常細胞に観測されるバックグラウンドのメチル化レベルよりも、識別することが容易であるという点で、特に有利であると見なすことができる。この利点の１つの態様は、これらの特定の遺伝子座の分析が、より高感度で、正常細胞のより広範なバックグラウンドにおける、癌関連のメチル化の識別を可能にすることである。
【００７９】
本発明はまた、複数の遺伝子座の協調的分析が、特に、有意な数の正常細胞もまた含み得る試料における癌性または前癌性細胞の識別に関して、有意に強化された感度レベルを提供するという観測に関する。例えば、図６は、腺腫および癌の細胞を検出する感度を比較する。示されるマーカー遺伝子のそれぞれに対して、メチル化を、「個々」の平均メチル化と示される、マーカー領域全体の平均として（例えば、遺伝子座２６、３７、４０、４５、５２、５４、５９、６３、および７４の全てにわたるビメンチンマーカーの平均メチル化、図３Ａ〜Ｉを参照されたい）、または選択された遺伝子座のサブセットの全てにおいてメチル化（例えば、遺伝子座３７、４０、および４５の３つ全てにおけるビメンチンマーカーのメチル化、図５Ａ〜Ｉを参照されたい）を示す分子の割合として、すなわち、「多重」と示される複数の個々の遺伝子座の協調的メチル化分析のいずれかで、判定した。同じ試料の感度はまた、計算した正常ＤＮＡへの５、１０、または２０倍希釈で示す。図６は、アッセイの感度が、希釈なしの組織から直接的に分析したＤＮＡにおいて類似であり得ながらも、正常ＤＮＡからのバックグラウンドの量が、希釈率が大きくなると増加するため、協調的メチル化分析は、平均メチル化分析よりもはるかに感度が高いことを示す。例えば、セプチン９の分析において、腺腫および癌試料は、マーカーにわたる平均メチル化を分析する場合は、未希釈および５倍希釈のプロファイルにおいてのみバックグラウンドを上回って検出可能であるが、一方で、これらの同じ試料は、遺伝子座３７、４０、および４５の協調的メチル化分析を使用する場合、２０倍希釈で約６９〜７４％の感度、および１０倍希釈で９０〜９３％の感度で検出可能である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明は、疾患状態を識別するためのメチル化アッセイを設計するための方法であって、Ｉ）少なくとも１つの配列を分析のために選択することと、ＩＩ）正常細胞集団および非正常細胞集団の配列における複数の遺伝子座のメチル化状態を決定して、正常および非正常の両細胞のそれぞれの複数の遺伝子座のそれぞれに対する平均のメチル化率を決定することと、ＩＩＩ）上記複数の遺伝子座における有利なメチル化比を有する少なくとも２つの遺伝子座を識別することと、を含む、方法を提供する。
【００８１】
Ｉ．配列（複数可）の選択。特定の疾患状態と関連するメチル化マーカーは、多数の疾患状態に対して識別されている。例えば、結腸直腸新生物に特異的なマーカーには、例えば、ｂｍｐ−３、ｂｍｐ−４、ＳＦＲＰ２、ビメンチン、セプチン９、ＡＬＸ４、ＥＹＡ４、ＴＦＰＩ２、ＮＤＲＧ４、ＦＯＸＥ１、長鎖ＤＮＡ、ＢＡＴ−２６、Ｋ−ｒａｓ、ＡＰＣ、メラノーマ抗原遺伝子、ｐ５３、ＢＲＡＦ、およびＰＩＫ３ＣＡが挙げられる。さらなるマーカーには、限定されないが、上述の表１のものが挙げられる。有利なメチル化比を有するものを識別するための候補メチル化遺伝子座の分析は、標的配列の全ての遺伝子座（例えば、全てのＣｐＧ）の分析を含んでもよく、または、それは、メチル化遺伝子座のサブセットの分析を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＣｐＧは、特定のメチル化のホットスポットにおけるそれらの位置によって、分析のために選択されるが、一方で他の実施形態においては、分析のための遺伝子座は、便宜上、プライマー結合部位または他の配列特性に対して位置付けられてもよい。図１Ａは、マーカー新生物に関連するマーカーの例示的な選択を提供し、ＣｐＧ遺伝子座におけるＣ残基のそれぞれを、四角で示す。各標的遺伝子に対して、その領域の天然配列を、上の列に示し、非メチル化およびメチル化ＤＮＡの配列を、重亜硫酸塩変換および増幅後に現れるであろうものとして、その下に示す。重亜硫酸塩および増幅によって、Ｔ残基に変換されるであろう非メチル化Ｃ残基を、Ｔとして示す。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、試料中の複数の有利な遺伝子座を協調的に分析し、それによって、試料中の細胞の疾患状態を決定するための核酸検出アッセイの使用を提供する。
【００８３】
ＩＩ．選択した配列（複数可）の遺伝子座に対するメチル化比の決定。上で論じたように、遺伝子座に対するメチル化比の決定は、正常細胞集団におけるその遺伝子座に対する平均メチル化率を決定することと、非正常細胞集団の同じ遺伝子座における平均メチル化率を決定することと、を含む。上述のように、マーカー遺伝子のメチル化分析に広く使用される方法は、混合核酸、例えば、混合細胞集団に由来する未分画ＤＮＡから生成されたアンプリコン等（多細胞組織試料から精製されたＤＮＡ等）において行われる。いくつかの研究は、未分画試料のＤＮＡから作製されたアンプリコンの個々のクローンを分析したが、分析されたクローンの数は、典型的に、少なすぎたため、配列内の個々のＣｐＧ遺伝子座におけるメチル化比に、有意または再現可能な差異を見出すことができなかった。例えば、Ｚｏｕらは、結腸直腸癌における高度にメチル化された遺伝子の比較において、各試料から６つのクローンのみを分析した（Ｚｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２００７；１６（１２）：２６８６）が、Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇらは使用した。本発明は、例えば、個々のＤＮＡ分子の直接的な配列決定、またはクローン増幅したＤＮＡの配列決定による、個々のＤＮＡ分子の大規模な分析を含む。
【００８４】
本発明を任意の特定の方法に限定するものではないが、核酸の個々のコピーを（例えば、ＰＣＲを使用して）クローン増幅する方法を、正常および非正常試料に由来する非常に多くの個々のマーカーの迅速分析に使用することができる。単一分子増幅方法は、マイクロチャンバ、エマルジョン反応、固体支持体での「ブリッジＰＣＲ」、または個々の標的分子から生じる増幅産物を分離する多数の確立された方法のうちの任意のものの使用を含み得る。単一分子増幅に続いて、アンプリコンの配列決定を行うことができる。
【００８５】
改善された個々の分子を配列決定する方法は、分子を細胞にクローニングする必要性、またはいくつかの方法においては、配列決定する前にクローン増幅する必要性を、直接的に除去する。細胞へのクローニングの排除は、より大規模な分子の収集を、さらに劇的に効率的にする。個々の分子配列決定のためのプラットフォームには、４５４  ＦＬＸ（商標）または４５４  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、ＳＯＬＥＸＡ（商標）／Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｉｏｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）、およびＳＯＬＩＤ（商標）ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の装置、ならびに、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等の企業によって依然として開発中の他のプラットフォームが含まれる。配列情報が生成される化学的性質は、別の次世代配列決定プラットフォームによって異なるが、それらの全てが、同時に動作する配列決定反応において非常に多数の個々の配列決定テンプレートから配列データを生成する、共通の特性を共有する。反応からのデータを、例えば、フローセル、化学もしくは光学センサー、および／またはスキャナーを使用して収集し、配列を統合し、生物情報学ソフトウェアを使用して分析する。
【００８６】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、デジタル配列決定を使用して、メチル化マーカーを分析し、同じマーカーの他の遺伝子座と比較して統計的に有意に有利なメチル化比を有する、新生物に関連するメチル化遺伝子座を識別する方法を提供する。好ましい実施形態において、デジタル配列決定は、高度または大規模に並列な形式で行われ、有利なメチル化比を有するＣｐＧメチル化部位の識別に、より高い正確性を提供する。
【００８７】
上述の大規模並列デジタル配列決定法については、各分子を、各ＣｐＧ遺伝子座におけるメチル化について分析し、そのため、いずれの組み合わせのＣｐＧ遺伝子座にメチル化を有するＤＮＡコピーの割合も、実験の動作後に分析することができる。さらに、各特定のマーカー配列、例えば、各標的核酸分子、またはクローンのアンプリコンは、例えば、少なくとも１００回、時には１０００回を超え、さらにいくつかの事例においては１００，０００回を超えて、または５００，０００回もの回数で、何度も調べることができる。したがって、少数の個々の標的分子の分析では検出不可能であろう、癌または腺腫を示す協調的メチル化のパターンを、明らかにすることができる。
【００８８】
ＩＩＩ．協調的分析のためのメチル化遺伝子座のサブセットの選択
上述のように、正常試料および非正常試料（例えば、腺腫または癌の試料）の両方に由来する非常に多数の複製マーカーＤＮＡにおける、ＣｐＧ遺伝子座の組のメチル化状態の決定は、マーカー遺伝子または領域のある特定のある特定のＣｐＧ遺伝子座が、協調的にメチル化される傾向にあり得ることを明らかにする。さらに、その協調的メチル化が試料中の腺腫または癌を示す、複数のＣｐＧ遺伝子座を調べる核酸検出アッセイの設計は、全てのマーカー遺伝子にわたって平均のメチル化パーセントを調べるアッセイと比較して、改善されたシグナル対ノイズ比を有するアッセイを提供することができる。
【００８９】
ＣｐＧ遺伝子座のサブセットを選択する１つの態様は、例えば、デジタル分析法の使用によって、協調的にメチル化されていると決定された遺伝子座を選択することを含む。別の態様は、正常ＤＮＡを腺腫または癌のＤＮＡと比較した際に、有利なメチル化比を有することが決定されたＣｐＧ遺伝子座を選択することを含む。アッセイの設計は、同じマーカーの他の遺伝子座と比較して、最も有利なメチル化比を有するＣｐＧ遺伝子座を利用してもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。いくつかの実施形態において、複数のＣｐＧ遺伝子座をサブセットとして選択することは、最も有利なメチル化比を有する複数の遺伝子座を選択することを含む。他の実施形態において、複数のＣｐＧ遺伝子座をサブセットとして選択することは、単一のアッセイにおいて標的ＤＮＡのコピーにおける選択されたＣｐＧ遺伝子座の全てを調べるために、最も有利なメチル化比を有する遺伝子座を選択すること、続いて、特定の核酸検出アッセイの構成について第１の選択遺伝子座に対して便宜的な位置にある、少なくとも追加のＣｐＧ遺伝子座を選択すること（例えば、侵襲的切断アッセイ、ライゲーションアッセイ、増幅アッセイ等を構成するために、互いに特定の近位性を有するＣｐＧ遺伝子座の選択）を含む。いくつかの実施形態において、ＣｐＧ遺伝子座の候補サブセットを、さらに分析して、それらの候補遺伝子座で協調的にメチル化される非正常試料に由来するマーカーＤＮＡのコピー、および正常試料におけるほとんどまたは全く協調的メチル化を有さないものの割合、を判定する。
【００９０】
腺腫または癌の検出のための試料の分析
メチル化分析の従来の方法（例えば、従来的なメチル化特異的ＰＣＲ、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、例えば、米国特許出願公開第５，７８６，１４６号、同第６，０１７，７０４号、同第６，２００，７５６号、同第６，２６５，１７１号を参照されたい）は、典型的に、非デジタル形式で分析を行い、例えば、ＤＮＡ標的核酸の混合物から導出される共増幅された分子の混合物を分析し、そのため、増幅産物の分析は、アンプリコン集団の総合または平均のメチル化状態を反映する配列情報を提供するが、複数のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいて協調的メチル化を有する開始分子の割合についての情報は提供しない。いくつかの事例において、研究者らは、多数のクローン化したアンプリコンを分析しており、それによって、標的マーカー遺伝子内のＣｐＧ遺伝子座におけるメチル化の多様性を明らかにすることができる。しかしながら、個々のクローンの配列決定は、ＣｐＧ遺伝子座の特異的サブセットの統計的に有意な協調的メチル化を示すのに十分なデータを提供していない。
【００９１】
従来の方法とは対照的に、大規模並列デジタル配列決定方式で、メチル化マーカー遺伝子を分析し、新生物（腺腫および癌種）と関連する特異的ＣｐＧ遺伝子座の統計的に有意な協調的メチル化を識別することを試みた。この分析方法により、以下のことが可能となった．
１．いずれの遺伝的（突然変異）マーカーも試験する必要なしに、新生物を検出する手段として、マーカー遺伝子における協調的メチル化について、試料を分析すること．
２．いずれの遺伝的（突然変異）マーカーも試験する必要なしに、新生物を検出する手段として、複数のマーカー遺伝子における協調的メチル化について、試料を分析すること。
【００９２】
結腸直腸腺腫、結腸直腸癌、正常結腸直腸上皮、および他のＧＩ癌から、生検によって得られた多数の組織試料に、「デジタル」配列決定を使用し、複数の遺伝子内の多数の特定領域の配列決定を行うことを決定した。この種類の配列決定は、それぞれ個々のメチル化される遺伝子に対するメチル化パターンを提供する。１回目の実行について、９個の正常組織、３８個の腺腫、および３６個の癌試料を、次のマーカー、ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、ＴＦＰＩ２、ＬＲＡＴの２つの領域、およびＥＹＡ４がある。
【００９３】
驚くべきことに、遺伝子のいくつかにおいて、正常試料におけるメチル化として観測されるバックグラウンドは、配列内に無作為に分散し、一方で、癌および腺腫と関連するメチル化は、そうではないことを発見した。したがって、診断アッセイにおいて、ある特定の規則を適用する場合、例えば、Ｃ残基ａ、ｂ、およびｃの全てがメチル化されている必要があるとする場合、その配列の３つ全ての位置でメチル化を示すＤＮＡコピーの数は、その位置のサブセットでメチル化を呈するＤＮＡコピーの数と比較して減少する。試験したマーカー遺伝子または領域のいくつかにおいて、選択部位の全てでメチル化を示す正常ＤＮＡにおけるＤＮＡコピーの数の減少は、癌および／または腺腫試料に由来するＤＮＡにおける減少よりもある程度大きく低下し、有意に強化された特異的なシグナル対バックグラウンドノイズ比をもたらす。ある特定の遺伝子については、正常ＤＮＡからのバックグラウンドは、多重メチル化（協調的メチル化）分析を使用することによって劇的に減少し、一方で、癌および腺腫のＤＮＡからのシグナルには相当する減少は見られない。他の遺伝子については、正常試料におけるバックグラウンドは、あまり減少せず、および／または癌ＤＮＡからのシグナルもまた、多重メチル化分析により低下し、その結果、シグナル対ノイズ比に正味の改善がほとんどないか、または全くなく、取り組まれている多重メチル化分析を使用する利点は少なくなる。多重メチル化分析において好ましいシグナル対ノイズ比を有する遺伝子は、経験的に容易に決定される。
【００９４】
本明細書に提示される多重メチル化データ（例えば、図２Ａ〜Ｊを参照されたい）から、次のことが可能である．
ａ．正常および非正常（例えば、癌および腺腫）の細胞間に、より高度な区別をもたらす遺伝子配列内の領域を識別すること．
ｂ．より大きなシグナル対ノイズ比（正常細胞のバックグラウンドと比較した非正常細胞のシグナル）を有する特定の遺伝子を識別すること．
ｃ．より大きなシグナル対ノイズ比を有する特定のメチル化遺伝子座を識別すること．
ｄ．腺腫および癌の試料において協調的にメチル化されるが、正常試料ではメチル化されない、特定のメチル化遺伝子座を識別し、その結果、これらの遺伝子座における協調的メチル化の検出は、腺腫または癌の高感度指標となること．
ｅ．アッセイ感度の減少が少ない正常ＤＮＡに、メチル化されたＤＮＡをさらに希釈することを可能にする、非常に低いバックグラウンドのメチル化を有する遺伝子を識別すること．
ｆ．互いに診断的に相補的である、すなわち、組み合わせて分析した場合に、単独で分析される遺伝子と比較して、上昇した感度および／または上昇した特異性の診断情報をもたらす、遺伝子を識別すること．
ｇ．上昇した特異性で上昇した感度、例えば、１００％の特異性で、癌および腺腫に対して１００％の感度をもたらす、遺伝子の組み合わせを識別すること。
【００９５】
〔実験的実施例〕
〔実施例１〕
〔癌および腺腫試料におけるメチル化されたＣｐＧ遺伝子座の特異的サブセットの識別のためのデジタルＰＣＲおよび配列決定の使用〕
凍結した組織試料から抽出したＤＮＡを、ＥＰＩＴＥＣＴ重亜硫酸塩変換キット（Ｑｉａｇｅｎ）で処理して、非メチル化シトシンをウラシルに変換した。メチル化されているシトシンは、変換されないままである。各遺伝子領域に対するプライマーは、増幅産物の組成が、元の標的配列のものと同じままであり、メチル化および非メチル化の配列が等しい効率で増幅されるように、各配列に対して設計した。ｄＵを含有する変換されたＤＮＡの増幅により、ｄＵ残基の代わりにＴ残基を有するアンプリコンを生成した。アンプリコンを、次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａの機器で配列決定を行うために調製した。各組織試料について、各標的のための増幅反応物を、同じ重亜硫酸塩処理したＤＮＡの試料から調製した。
【００９６】
配列決定を行った後、データを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法に類似であるが、各位置における混合シグナルが個々の分子から計算される精度および分解能がより高度である、平均メチル化として定量的に分析した。各アンプリコン配列に対して、ＣｐＧ遺伝子座の組を、異なる組織におけるメチル化パーセントについて評価して、癌および／または腺腫試料においては正常組織よりも高頻度で共メチル化される、遺伝子座のサブセットを識別した。
【００９７】
〔Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プロトコル：〕
配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ，ＧＡＩＩｘ，Ｄａｔａ収集ソフトウェアバージョン２．５およびＰｉｐｅｌｉｎｅ分析ソフトウェアバージョン１．５に推奨される手順に従って行った。簡単に言うと、Ｉｌｌｕｍｉｎａの手順は、ａ）インデックス付け、フローセルの付加、増幅、および配列決定を可能にする既知の配列の付加による試料ＤＮＡからのライブラリの調製、ｂ）フローセル表面へのライブラリの付加、ｃ）ブリッジ増幅による単一分子に由来するＤＮＡ断片のクラスターの生成、ならびにｄ）標識化した可逆的ターミネーターを使用する反復プライマー伸長反応の使用時に配列決定を行って、アンプリコンの各クラスターのヌクレオチド配列を決定することを含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、補足的方法およびデータを伴うＢｅｎｔｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６，５３−５９（６  Ｎｏｖ．ｒ  ２００８）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７５１７を参照されたい。インデックス付けに固有のタグ配列を使用することにより、単一のフローセルにおける複数の試料の分析を可能にする。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｒａｉｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８  Ｏｃｔ；５（１０）：８８７−９３（Ｅｐｕｂ  １４  Ｓｅｐｔ．２００８）を参照されたい。
【００９８】
試料の組：Ｎ＝８２、４２の結腸直腸癌、３１の前癌性腺腫、および９の正常結腸粘膜から抽出した組織ＤＮＡから構成される。
【００９９】
〔フローセルの構成〕
試料を、合計７レーンについて１レーン当たり１２でインデックス付けした。フローセルは、８レーンで構成され、そのうちの１つは、ｐｈｉＸクオリティコントロール専用である。
【０１００】
〔ライブラリの調製：〕
患者に由来する組織から抽出したＤＮＡを、重亜硫酸塩で処理し、開始物質のおおよそ１０，０００のゲノムコピーを使用して２段階増幅を行った。第１段階では、マーカー配列に特異的な末端を有する（Ｔ１）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プライマーを使用した。これらの末端は、第２段階に必要なＩｌｌｕｍｉｎａによって生成された配列である。第２段階の（Ｔ２）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ＰＣＲでは、Ｔ１に付加されたＩｌｌｍｕｎａ末端に特異的なプライマーを使用し、インデックス、配列決定プライマー、およびフローセル付加配列を組み込む。ライブラリ調製の際に、複数のｑＰＣＲ検査を試料に実行して、ライブラリ中の全てのアンプリコンの等モル表示を確実にした。
【０１０１】
〔プライマー設計：〕
変換された非ＣｐＧシトシンを有する領域に特異的な順方向および逆方向プライマーを設計して（例えば、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒソフトウェアを使用して）、非メチル化特異的な方法で、特異的バイオマーカー部位のそれぞれを増幅する。ＣｐＧシトシンが、プライマー設計において避けられない場合は、縮重混合物（Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ａ）をプライマーのこれらの部位に使用する。一次アンプリコンの外側の追加の配列を調べる必要がある場合は、追加のプライマーを設計することができる。標的配列中のＣｐＧが避けられない場合、プライマーが、ＣｐＧ部位に縮重塩基を組み込んでもよい（ＢｉＳｅａｒｃｈソフトウェア）。
【０１０２】
第２段階のＰＣＲのためのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのフローセル付加（ブリッジ増幅部位）のための配列、配列決定プライマー部位（試料読み取り用）、インデックス部位、および配列決定プライマー部位（インデックス読み取り用）を含む。プライマーの組（ｘ）のそれぞれは、合計１２ｘの組に対し１２の異なるインデックスタグを有する。インデックス独立型プライマーの組（ｎ＝ｘ）を、変換された非メチル化ＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）および変換されたメチル化ＤＮＡ上で最適化する。例えば、対照ＤＮＡを、増幅し、精製し（例えば、ＡＭＰＵＲＥ処理（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用して）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で泳動させて、増幅した核酸の寸法および数量を評価する。
【０１０３】
〔実験ステップ：〕
ＤＮＡの単離および重亜硫酸塩変換：
１）ＤＮＡを、ＤＮＡＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＱＩＡＡＭＰキット（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して、組織から抽出して精製し、濃度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、吸光度（Ａ２３０／Ａ２６０／Ａ２８０）によって測定した。高いＡ２３０値を呈する高い試料については、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ蛍光（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ＴＥＣＡＮ  Ｆ−２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーと併せて使用した．
２）試料は、必要に応じて、蒸発濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、少なくとも２００ｎｇ／ｕＬの濃度に調節した．
３）各試料について、２ｕｇのＤＮＡを、ＥＰＩＴＥＣＴ  ９６ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、重亜硫酸塩で処理した．
４）回収率を、吸光度およびＯＬＩＧＯＧＲＥＥＮ蛍光（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって評価し、変換効率を、未変換ＤＮＡに特異的なシトシン含有の非ＣｐＧプライマーを使用して、定量的ＰＣＲにより評価した。変換効率は、９９％を上回ると判定した。
【０１０４】
第１段階のＰＣＲ：
５）８４個の試料を、マーカーに特異的な（Ｔ１）プライマーの組を使用して、３０ｎｇのＤＮＡを有する反応物において増幅させた。使用したサイクル数は、各マーカーの組に特異的であり、メチル化および非メチル化の両方のＤＮＡでの初期対照反応によって実験的に決定した。サイクル数は、おおよそで平均の計算Ｃｔ値に設定する。例えば、次のサイクル数を、示されるマーカーに対して使用した．
ＴＦＰＩ１２、２６サイクル
ＳＥＰＴ９、２７サイクル
ＢＭＰ３、２８サイクル
ＶＩＭ、２８サイクル
ＥＹＡ４、２９サイクル
６）各反応物からの増幅産物を、ＥＢ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）での溶出とともに、ＡＭＰＵＲＥビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用して精製した．
７）各マーカーに対する生成物を、上述のように、Ｔ２プライマーの組を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。マスタープレートは、各試料に対して等量の各バイオマーカーを含有するように調製した。
【０１０５】
第２段階のＰＣＲ：
８）第１段階の試料を、続いて、Ｔ２でインデックス付けした１２個のプライマーを用いて増幅させた．
９）各反応物に対する生成物を、再度精製し、今回はフローセル特異的プライマーおよびＰｈｉＸコントロールＤＮＡの連続希釈を使用して作製した標準曲線を用いて、ｑＰＣＲにより濃度を測定した。
【０１０６】
最終的なライブラリ調製：
１０）各プレートの１２個のカラムを、等モル割合で、１つのマスターカラムに合わせた。１ｕＬの各ライブラリを、高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に充填し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで泳動させた。最終的なｑＰＣＲもまた、ＰｈｉＸ標準物を用いて４８０  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で行った．
１１）ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上で配列決定し、各試料の各マーカーについて、配列データを得た．
１２）各ＣｐＧ部位における平均メチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した。図２Ａ〜Ｊを参照されたい．
１３）各マーカーにおけるＣｐＧ遺伝子座の定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てでメチル化される分子の割合を、各試料の各マーカーに対して計算した。図５Ａ〜Ｉを参照されたい。
【０１０７】
上述の明細書に述べられた全ての出版物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は、本発明の範囲および精神を逸脱することなしに、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、請求される発明が、このような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、当業者には明らかである、本発明を実行するための記載された手段の種々の修正は、以下の特許請求の範囲内に含まれるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】本分析に使用する例示的なマーカー領域の配列およびＣｐＧ情報を示す。
【図１Ｂ】本分析に使用する例示的なマーカー領域の配列およびＣｐＧ情報を示す。
【図２Ａ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｂ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｃ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｄ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｅ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｆ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｇ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｈ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｉ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図２Ｊ】平均メチル化を、示されるマーカー領域内の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した、正常、腺腫、および癌の試料の分析を示す表を示す。
【図３Ａ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｂ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｃ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｄ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｅ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｆ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｇ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｈ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図３Ｉ】図２Ａ〜Ｊに示される全てのＣｐＧ遺伝子座にわたる平均のメチル化を、各試料の各マーカーに対して計算した、各試料の分析を示す表を示す。
【図４Ａ】本分析に使用する例示的な遺伝子の配列およびＣｐＧ情報を示す。
【図４Ｂ】本分析に使用する例示的な遺伝子の配列およびＣｐＧ情報を示す。
【図５Ａ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｂ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｃ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｄ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｅ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｆ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｇ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｈ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図５Ｉ】メチル化を、示されるマーカー領域の示されるＣｐＧ位置のそれぞれにおいて決定した（すなわち、試料を、定義されたサブセット中のＣｐＧ遺伝子座の全てにおいてメチル化を示すＤＮＡコピーの割合についてアッセイした）、各試料の分析を示す表を示す。
【図６】示されるように、個々／平均メチル化または多重メチル化分析法のいずれかを使用して、示される計算した希釈のそれぞれにおいて、示されるマーカーのそれぞれを試験した、腺腫および癌試料における各マーカーに対して計算された陽性値パーセントを比較する、表およびグラフを示す。
【図７】個々／平均メチル化または多重メチル化分析法のいずれかを使用して、示される正常ＤＮＡへの計算した希釈のそれぞれにおいて、これらの試料における最も低い平均バックグラウンドを有する４つのマーカー（ビメンチン、ＢＭＰ３、セプチン９、ＴＦＰＩ２）を使用して決定された、腺腫および癌試料における決定された陽性値パーセントを比較する、表およびグラフを示す。
【図１Ａ】
2014519310.tif 000017
【図１Ｂ】
2014519310.tif 000018
【図２Ａ】
2014519310.tif 000019
【図２Ｂ】
2014519310.tif 000020
【図２Ｃ】
2014519310.tif 000021
【図２Ｄ】
2014519310.tif 000022
【図２Ｅ】
2014519310.tif 000023
【図２Ｆ】
2014519310.tif 000024
【図２Ｇ】
2014519310.tif 000025
【図２Ｈ】
2014519310.tif 000026
【図２Ｉ】
2014519310.tif 000027
【図２Ｊ】
2014519310.tif 000028
【図３Ａ】
2014519310.tif 000029
【図３Ｂ】
2014519310.tif 000030
【図３Ｃ】
2014519310.tif 000031
【図３Ｄ】
2014519310.tif 000032
【図３Ｅ】
2014519310.tif 000033
【図３Ｆ】
2014519310.tif 000034
【図３Ｇ】
2014519310.tif 000035
【図３Ｈ】
2014519310.tif 000036
【図３Ｉ】
2014519310.tif 000037
【図４Ａ】
2014519310.tif 000038
【図４Ｂ】
2014519310.tif 000039
【図５Ａ】
2014519310.tif 000040
【図５Ｂ】
2014519310.tif 000041
【図５Ｃ】
2014519310.tif 000042
【図５Ｄ】
2014519310.tif 000043
【図５Ｅ】
2014519310.tif 000044
【図５Ｆ】
2014519310.tif 000045
【図５Ｇ】
2014519310.tif 000046
【図５Ｈ】
2014519310.tif 000047
【図５Ｉ】
2014519310.tif 000048
【図６】
2014519310.tif 000049
【図７】
2014519310.tif 000050
【配列表】
2014519310000001.app
【国際調査報告】
2014519310.tif 000051