(57)【要約】本願発明は、ジャガイモ、ビート、サトウキビ、トウモロコシ、大豆等を含む作物種において、作物の播種前、播種時又は植物定着時の様な成長プロセスの任意の時期に、トレハロース及び/又はトレハロース誘導体を外部的に適用することにより、その収穫及び/又は生物量（biomass）を増大及び/又は維持する方法に関する。この方法は、作物生産に適用された場合は親植物の健康及び活力を増大させ、その結果、親植物から糖の減少したより健康的な生産物を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作物の収穫を増大させる方法であり、以下のステップを含む、
トレハロース及び水、又はトレハロースの修飾された形態及び水、又は水中のトレハロース誘導体を含む分子信号伝達液（molecular signaling solution）を調製するステップ；
前記分子信号伝達液を作物の葉に適用し、又は作物が成長する土壌に適用し、又は播種前に種に適用するステップ；及び
前記分子信号伝達液は、トレハロース又はトレハロースの修飾された形態又はトレハロース誘導体が植物の重要な炭素骨格又はエネルギー成分として作動するには不十分であるが、植物の収穫を増大させるには十分な割合で適用されるものであり、
前記分子信号伝達液は、エーカー当り１０から５００グラムのトレハロース又はトレハロースの修飾された形態又はトレハロース誘導体が適用される。
【請求項２】
前記トレハロース又はトレハロースの修飾された形態又はトレハロース誘導体が、エーカー当り１０から５００グラムの割合で適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分子信号伝達液が、作物の成長期の最後に作物に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分子信号伝達液が、種の発芽の初期から作物の成長の終了までの、作物の成長期の任意の時期に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作物に適応される分子信号伝達液が植物中のT-6-Pのレベルを増加させ、それにより一年生作物の親植物から、幼い娘胚及び親植物に依存し成長する娘植物の貯蔵器官に光合成物を、ほゞ完全に移転させることの出来る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であり、前記作物がトウモロコシであり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液を前記トウモロコシの葉に、ほぼその成長のV16期の後に、トレハロースをエーカー当り約１００グラムの割合で適用されるステップを含む、前記方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であり、前記作物がトウモロコシであり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液を前記トウモロコシの葉に、ほぼその成長のV16期又はその前に、トレハロースがエーカー当り約１００グラムの割合で適用されるステップを含む、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であり、前記作物がジャガイモであり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液が、収穫期の約２週間前に、エーカー当り約１００グラムの割合で適用されるステップを含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であり、前記作物がジャガイモであり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液が、収穫の約４週間前に、エーカー当り約１００グラムの割合で散布されるステップを含み、前記ジャガイモの糖度を低減させるために効果的である、前記方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であり、前記作物がテンサイであり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液が、収穫の約２週間前に、エーカー当り約３００グラムの割合で前記植物の葉に散布されるステップを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であり、前記作物がサトウキビであり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液が、収穫の約４週間前に、エーカー当り約４５０グラムの割合で前記植物の葉に散布されるステップを含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であり、前記作物が小麦であり、そして前記方法は、前記分子信号伝達液が、収穫期の約４週間前に、エーカー当り約１００グラムの割合で前記植物に散布されるステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光合成物及び光合成物の誘導体を「親」植物から種、塊茎, 果実等の様な作物の経済価値のある部分への移動を増大させるための信号を伝達するために、トレハロース及び/又はトレハロース誘導体を、外部的に作物に使用することに関する（光合成物は光合成により生成される化合物である）。
さらに、外部的な使用は、親植物から使用可能な光合成物を救済するために収穫直前に実行するのが最も好ましい。そうでなければ、親植物の光合成物は、娘細胞及び次の世代の植物に取り入れられることなく、畑のごみとなって終わることになる。
トレハロース又はトレハロース誘導体はまた作物を植える時期に又はその成長の時期に使用しても良い。このような早期の使用により、より健康的な作物となり、病気になりぬくく、及び早い時期に死に至る衰弱状態になりぬくい。さらに、例えば、ジャガイモの様なある種の植物に対してトレハロースを早期に使用することにより、その糖含有量の減少度のより少ない作物が得られる。その糖含有量の減少度の高い作物は、その作物生産物を、例えば、ポテトチップ等として高温オイルで揚げた場合、不健康な状況を作り出す恐れがある。さらに、外部シグナル伝達分子は収穫を向上させるのみならず、その作物成長の初期の段階で使用した場合、食物の見ための健康及び加工食物の健全性を向上させる。
【背景技術】
【０００２】
トレハロースは2つのグルコース分子の結合よりなる２糖であり、広く植物、昆虫、及び他の有機体により生成される。トレハロースはある種の昆虫及び僅の植物により豊富に生成されるが、殆どの植物種には僅かの量しか存在しない。最近までその主な知られた生物的活生は、ある種の有機体の細胞に比較的高度に自然に存在する場合、又は低温保存過程で添加物として加えた場合、抗凍結剤として作用することである。しかし、近年になって、トレハロース及び/又はその関連した形態のものは、非常に少量で存在した場合においても、植物においてシグナル伝達分子として作用する可能性が非常に高いものとして注目されてきた。トレハロースのある形態は、植物中の炭化水素生成及びフローの中心的な調整制御剤として機能する。ある部分では、それは成長を促進するために利用可能な炭化水素又はその余分な部分の蓄積を信号で伝達する。また、それはSnRK1キナーゼの活動を抑制し、その結果、成長を制限する主要因子を減少させる。
本願の出願前に公開された出願である米国特許出願US 2010/0024066は、植物の成長を調整するトレハロース‐６‐リン酸シンターゼの使用について記載している。この出願は、トレハロースは、細菌、糸状菌、昆虫及び植物に見られる、広い範囲に見出される２糖であることを示す背景技術の項目を含んでいる。
殆どの場合、トレハロースの合成プロセスは、トレハロース‐６‐リン酸シンターゼ（TPS）がトレハロース‐６‐リン酸（T6P）を合成し、続いてT6P ホスファターゼ (TPP)によりトレハロースに脱リン酸化する、２段階プロセスである。殆どの植物において、トレハロースは殆ど検出されないが、TPS 及びTPPの両方の遺伝子の複数の相同体が存在する。欧州特許、EP 0901527は、T6Pのレベルを修飾することにより植物代謝を制御することを開示している。より具体的には、このＥＰ特許は、T6Pの細胞内利用の増大により、植物の収穫が増大することを記述している。
そこで記載されているモデルは植物における一方向の代謝である：
UDP-Glu + G6P ----------> T6P ---------- Tre ----------> 2 Gluc
TPS              TPP                トレハラーゼ（Trehalase）
１）  UDP-グルコース及びグルコース-6-リン酸 （G6P)はトレハロース  リン酸シンターゼ（TPS）酵素により結合されてトレハロース‐６-リン酸（T6P)が形成される。
２）  T6Pはトレハロース  リン酸ホスファターゼ（TPP）酵素により脱リン酸化されてトレハロース（Tre）になる。
３）  トレハロースはトレハラーゼ酵素により2つのグルコース分子に分解される。
欧州特許EP0901527は、T-6-Pのレベルは、T-6-Pのレベルに影響することの可能な遺伝子構築体を持つ有機体の遺伝子操作により、又は、このような外部からの化合物を供給する例については記載していないが、T-6-Pのレベルに影響を与えることの出来る化合物を外部から供給することにより影響を与えることができることを記載している。
上に示したモデルにしたがい、植物に外部からトレハロースを使用することによりTPPのフィードバックを抑制することにより、T6Pの蓄積が増大することが期待される。利用可能な炭素がない場合、T6Pの蓄積によりシロイヌナズナの種の成長を阻害することができる(Schluepmann, 他. 「植物生理学」（Plant Physiology）, ２００２年６月、Vol. 135, 879-890ページ)ことが注目されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の目的
本発明の主要目的は、農作物の生産性及び成長を増進するための方法及び組成物を提供することである。他の目的は、植物が成熟し、老化した場合でも農作物の生産性を高める方法を提供することである。
【０００４】
他の目的は、厳しい環境によるストレスを受けている作物の生産性を高め及び成長を促進する方法及び組成物を提供することである。
【０００５】
他の目的は、作物の生産性を高め及び成長を促進する方法及び組成物を提供することであり、それは、親植物又は親植物の老化する枯れた身体においても残っている有用な光合成物及び/又は光合成物誘導体を「娘」の種、又は、親植物に依存して成長する娘植物の他の経済的に有用な部分に、より完全に移転させることによる。
【０００６】
他の目的は、作物の生産性を高め及び成長を促進し，及び生物量（バイオマス）を増大させる方法及び組成物を提供することであり、それは成長期にその種、又はその植物の「娘」の他の経済的に有用な部分から光合成物又は光合成物誘導体が、「親」植物に移転することを阻止することによる。
【０００７】
他の目的は、作物の生産性を高め及び成長を促進する方法及び組成物を提供することであり、それは、成長期に、特に種々のストレス下において、親植物が、生命があるなしに関わらず、その種、又はその植物の「娘」の他の経済的に有用な部分から光合成物又は光合成物誘導体が、「親」植物に移転することを阻止することによる。
【０００８】
他の目的は、植物において、細胞の死亡を和らげる方法及び組成物を提供する。
【０００９】
他の目的は、植物のABA及び/又はエチレンの生成を増大させる方法及び組成物を提供することである。
【００１０】
他の目的は、植物の、昆虫及び病害に対する抵抗力を増大させる方法及び組成物を提供することである。
【００１１】
他の目的は、親植物の成長期の任意の時期において、光合成物を娘の胚及びその貯蔵器官への移送を可能な限り増大させる方法及び組成物を提供することである。
【００１２】
他の目的は、親植物の成長期の任意の時期において、分裂組織細胞を含む全ての及びあらゆる細胞の光合成物の収集を増大させ、幹細胞を含む全ての及びあらゆる細胞の能力を増大させる方法及び組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、親植物の葉及び幹の様な一時的な貯蔵器官に過度の光合成物が蓄積されることを防止して、これらを植物の収穫可能な貯蔵器官に移転する方法及び組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、親植物の葉及び幹の様な一時的な貯蔵器官にある過度の光合成物の負の還流（feedback）を減少させる方法及び組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、幹細胞を含む全ての細胞の最適な及び最大の成長のために光合成物を適当に蓄積することによりすべての植物細胞の活力を増大させる方法及び組成物を提供することである。
「食物」生産を増大させることについて多数の調査・研究があることを考えると、現在の知識レベルをはるかに超えて、作物の生産性を向上させることに対す要求が、引き続き存在し、かつその要求は満たされていない。
【００１６】
本願発明のその他の特徴及び利益と共に、上記において確認された目的は、植物を生長させるものに関し、単に、作物に限定されるものではないが、特に作物をより生産的に成長させるための方法及び組成物の発明に属し、その方法は、完全及び効果的に光合成物を及び/又は親植物に起因する光合成物を用いて、そして、光合成物を幹細胞を含む全ての細胞に移転させ、及び光合成物を種又は「娘」植物を形成する他の経済的に利用可能な部分に、又は成長しつつある娘植物に関連した貯蔵器官に移転させることにより生産性を高めることである。
ある「シグナル伝達」分子は、収穫直前の様な遅い時期においてさえ、老化している親植物の実質的に「死骸」であるものから、光合成物又は光合成物の誘導物をより、又は最も完全に「娘」胚及び胚貯蔵成分に移転することにより、収穫を増大させることができることが分かった。さらに、これは特定のシグナル伝達分子が、作物の成長期の早い時期に、及びさらに追加的に収穫前の「最後のチャンス」シナリオとして適用された場合、光合成物又は光合成物の誘導物を、ほぼ完全に、成長する胚及び胚「食物」貯蔵組織に移転させることにより、収穫に損出が生ずることを防ぐことができる。作物の成長時期にこれらのシグナル伝達分子を早期に適用することにより、収穫を増大させるためのみでなく、より健康的な親植物及びより健康な食物生産品のために、光合成物を有利に移転させることができる。
植物に、トレハロース及びトレハロース誘導体の様なシグナル伝達分子を外部的に使用することにより、その様にしない場合には、娘胚、又は親植物に依存して成長する幼い、若い娘植物の貯蔵器官に組み入れられるよりも、むしろ親植物の老化した涸れた植物体において失われる光合成物が捕捉される。さらに、シグナリングトレハロース分子は、播種以前に、播種時に又は植物としての確立時に及び/又は親植物の成長のあらゆる時期において外部的に使用される。シグナル伝達分子を早い時期に適用することにより、親植物の健康及び活力は増大され、同時に、より健康的な食用生産物を作り出すがこれは、特に、親植物からの食用生産物の組成において糖分の過度の減少と関係する。親植物に対する健康上の利益は、その種が播種以前に処理される場合においてさえ効果的でありうる。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
伝統的に、作物の成長に影響を与えるという考え方は、しばしば作物として確立する初期に限定されて、そして作物として確立する時期は、作物の経済的に有用な部分がむしろ十分に成長するまで継続するものであり、その後は作物は老化し（すなわち、年をとる）そして、成熟及び種等の播種に「備える」と考えられていた。さらに、成長時期が進行し、種々のタイプのストレスが起こり、その際に種々のレベルの自食作用が「娘」、すなわち、種及び作物の類似の収穫可能な部分から光合成物を捕捉する（自食作用は、ある身体組織の新陳代謝破綻により植物の栄養を維持することを言う）。
娘胚及びその貯蔵器官から捕捉されたこれらの光合成物は、特に、種々のレベルの非生物的及び生物的ストレス下の娘植物の妊娠周期を完成させる為に、親植物の「適応度」を維持するための「感知される」必要物として、しばしば親植物に戻される。この自食作用の結果は収穫時の生産性を「減少」させ、又は損出を生み出す。予期された収穫におけるこの損出又は明らかな減少は、非常にしばしば作物に現れ、これは多くの場合ホルモンの不均衡、及び娘胚及び貯蔵器官への光合成物の移送のための伝達信号が不十分であることを示す。
本願発明の好ましい実施の態様においては、従来技術の一以上の欠陥を修正し、さらに上に述べた一以上の目的を実現するものである。本願発明によれば、トレハロース又はトレハロース誘導物を含む水溶液が低濃度で作物に外部的に適用されることにより、若い、幼い娘胚及び娘胚の貯蔵器官に蓄積される代わりに、親植物の死骸のごみの山として全て失われるであろう光合成物を、その成長期の終わりにその大半の部分を移転することができる。
更に、糖のシグナル伝達処理により、また、非常に幼い胚及び胚の貯蔵器官の自食作用が、付着する娘植物の再生産サイクルを完成させるために、親植物が必要とする光合成生成物（すなわち、光合成物）が感知される必要（perceived need）にさらされることを防ぐ。親植物が次年のための追加の蓄えを必要とする多年生作物（例えば、果物、ナッツ）と比べて、一年生植物(トウモロコシ、ジャガイモ、大豆等）においては、光合成物は完全に又は不可逆的に付着する娘植物に移転され、その移転は親植物の殆どセルロースの死骸しか残らない程度にまで最も完全に行われることがある。このように、収穫時期の一年生植物の収穫高は非常に増大し、そして既に使用可能に形成された光合成物に関して、作物の生産効率を最大にする。
さらに、外部的に適用されるトレハロース  シグナル伝達分子は、親植物の収穫及び健康度、及び親植物により生産される食物の健康に大きなプラスの影響を与える親植物の生長時期の初期に適用することができる。これは、植物中の糖の生産、代謝及び遣取りの特徴を変えることにより実行することができるが、これはT6P及び/又はトレハロースにより制御することの出来る植物キナーゼSnRK1及びTORにより部分的に仲介される。
シグナル伝達分子の病気の抑制効果は、ジャガイモのゼブラチップ病の極めて大きな減少により代表的に見ることができる。より健康的な食物はまた、シグナル糖処理されたジャガイモの糖含有量の減少が抑制されることに代表的に見ることができる。高温オイルでフライされた処理されないジャガイモ及び処理されたジャガイモを視覚により検査した場合、二つの成長しているジャガイモ植物種にトレハロースを適用したことにより得られる優位点を見ることが出来る。
その例は、トレハロースを適用したことによる作物の収穫に対する有意な効果を示す以下の例に見ることができる。
【実施例１】
【００１８】
トウモロコシ、栽培品種Asgrow 7371、の収穫前に、トレハロースがその葉に2度処理された。トレハロースの水溶液をエーカー当り１００ｇの割合で、成長のV16期の４週間後、そして同じ割合で再び葉に、一度、成長のV16期の後５週間後に与えた。トレハロース処理により収穫は最大１２５％増加した。
【００１９】
【表１】
2014527817.tif 000002
【実施例２】
【００２０】
トウモロコシ、栽培品種Dekalb C6805が南テキサスにおいて、成長のV16期又は成長のV16期の３週間前にトレハロース水溶液がエーカあたり１００ｇその葉に適用された。トウモロコシの収穫は、高温、風力の強い、土地の痩せた、病気や害虫等の疾病が非常に高いレベルで見られるこの地域において、この品種においてエーカー当り１５５ブッシェルから過去に例を見ない、エーカー当り３３７ブッシェルに増加した。トウモロコシ穀粒の種の重量は増加した。
【００２１】
【表２】
2014527817.tif 000003
【実施例３】
【００２２】
ジャガイモ、栽培品種  Eva、が収穫４週間前にトレハロースの水溶液をエーカー当り１００ｇの割合でその葉に外部的に適用することにより収穫を増大させることができた（表３）。収穫期の４週間前に適用する場合は、作物の成長期においてより健康的な食品を得るために、糖分濃度の減少を抑制することができる時間が十分ある
【００２３】
【表３】
2014527817.tif 000004
【実施例４】
【００２４】
ジャガイモ、栽培品種Eva、ペンシルベニア州、が収穫期４週間又は2週間前に、トレハロースがエーカー当り１００ｇの割合でその葉に適用された。ジャガイモは収穫され、糖分の減少について分析するため、テキサス州のカレッジステーションに送られた。収穫期４週間前の、より成長の活発な時期において、ジャガイモの塊茎における糖の減少は低下しており、成長期の末期及び収穫作物の末期に近くなると、糖はより直接に塊茎に振り分けられている様に思われる。
【００２５】
【表４】
2014527817.tif 000005
【実施例５】
【００２６】
ジャガイモ、栽培品種Snowden、ウィスコンシン州、が収穫期４週間前又は2週間前に、トレハロースがエーカー当り１００ｇの割合でその葉に適用された。ジャガイモは収穫され、糖分の減少について分析するため、テキサス州のカレッジステーションに送られた。糖の含有量の低減は減少しており、これは植物に適用されたトレハロースの用量に反比例していた。以下の表５に示すジャガイモ塊茎中の減少した糖含有量に対するトレハロース適用量の効果を参照願いたい。
【００２７】
【表５】
2014527817.tif 000006
【実施例６】
【００２８】
テンサイに対して、ユマ会社（Ｙｕｍａ  Ｃｏ．）において、トレハロースがエーカー当り３００ｇの割合でその葉に適用された。その処理の結果、エーカー当り約半トン近い糖がビートに余分に移転され、さらに、収穫時期の丁度2週間前に糖へのシグナリングによりＳＬＭ％が決定的に減少していた（表６）。
【００２９】
【表６】
2014527817.tif 000007
【実施例７】
【００３０】
テキサス州南部で育成したサトウキビに、収穫４週間前に、水溶液トレハロースをエーカー当り４５０ｇの割合で適用し、サトウキビから得られる糖が８９７ポンド増加した。
【００３１】
【表７】
2014527817.tif 000008
【実施例８】
【００３２】
カナダ、オンタリオで育成した小麦の葉に、収穫４週間前に、水溶液トレハロースをエーカー当り１００ｇの割合で葉に適用した。
【００３３】
【表８】
2014527817.tif 000009
【００３４】
作用機構及び作用方式
既に上で述べた様に、植物におけるトレハロース合成の現在のモデルは一方向の代謝であることを示唆している：
UDP-Glu + G6P ----------> T6P ---------- Tre ----------> 2 Gluc
TPS              TPP                トレハラーゼ（Trehalase）
１）  UDP-グルコース及びグルコース-6-リン酸 （G6P)がトレハロース  リン酸シンターゼ（TPS）酵素により結合されて、有効なシグナル伝達分子トレハロース６-リン酸 （T6P)が形成される。
２）  T6Pはトレハロース  リン酸ホスファターゼ（TPP）酵素により脱リン酸化されてトレハロース（Tre）となる。
３）  トレハロースはトレハラーゼ酵素により2つのグルコース分子に分解される。
この一方向モデルによれば、植物にトレハロースを適用してもT6Pの生成を増大させることは予想されなかった。しかし、トレハロースを植物に適用することによる生物学的活性は、少なくともその一部は、植物にトレハロースを適用した後に植物内部においてT6Pが増加したことによるものである。これは、追加のTreの量が増加したことによりTPP活性に対するフィ‐ドバックが抑制されるためと思われる、又は現在明らかになっていない酵素の活性又はキナーゼ活性によりTreがT6Pに転換されるためと思われる。
植物におけるT6P/Treの最も重要な活動は糖に関連したシグナル伝達への影響である。したがって、Tre/T6Pは、植物の成長及び、発芽、成長、分化、開花、果実/穀類の形成を含む各生育、及び炭水化物の貯蔵における中心的、制御的役割をする。またトレハロースはデンプン分解を抑制し、その結果、デンプンの蓄積を増大させる。これは、ジャガイモ及びトウモロコシの様なデンプン貯蔵作物の収穫の増大が観測されるベースとなっていると思われる。
トレハロースが植物に適応された場合、植物における収穫が増大するのは、トレハロース分子自身又はT6Pの他の可能な誘導体又はトレハロースを適用することによりトレハロースが有効要素として働くためと思われる。植物にトレハロースを適用することにより植物中のT6Pを豊富にするならば、T6Pに対する既知の植物の反応は以下に記すものになろう：
トレハロースを適用することから生じる植物に対する可能な生化学的な機構として次のものが考えられる：
トレハロース/T6Pは植物中の糖の状態を示すことの可能なシグナルとしての役割を持ち、それは光合成物の区分、主要な炭素固定、炭水化物保持、及び/又は植物の成長を変えることができ、
トレハロース/ T6Pは、植物中のアブジン酸（ＡＢＡ）及び/又はエチレンの生産を増大させ、これによって果実、穀物又は他の植物の成熟プロセスを進行又は向上させ、
トレハロース/ T6Pはテンサイ、サトウキビ及び他の作物の糖の生産及び貯蔵を増加させ、
トレハロース/ T6Pはデンプンの生産を増加させそしてデンプンの分解を抑制し、ジャガイモ及び他の作物中の貯蔵炭水化物の保持量を増大させ、及び/又は
トレハロース/ T6Pは、植物が花成期に入る準備をする糖の状態を伝達するシグナルとして作用することにより開花を誘導する。
【国際調査報告】
2014527817.tif 000010