(57)【要約】  全血の第１試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞を、所望によりＣＤ２８に対する抗体またはＣＤ２８とＣＤ４９ｄとに対する抗体が存在する状態で、特定のインフルエンザウイルス型の抗原を用いて刺激する工程；  ３５℃から３９℃、特に３７℃で、所望によりＣＯ２を添加しながら、少なくとも０．５時間、とりわけ１．５時間から２．５時間、特に２時間の、充分な時間の培養により、抗原提示細胞（ＡＰＣ）にインフルエンザ抗原を処理させる工程；  次に分泌阻害剤を添加する工程；  激しく混合する工程；  続いて３５℃から３９℃までの温度で、少なくとも１時間、とりわけ２．５時間の間、２回目の培養を行う工程、および  前記抗原特異的Ｔ細胞の細胞内ＩＮＦ‐γ産生と細胞内ＩＬ‐２産生の両方からプロファイルを決定する工程を含み、  急性インフルエンザ感染症の存在が、以前にインフルエンザウイルスに感染した患者または感染していない患者であってワクチン接種が成功した患者のＩＦＮ‐γ単一陽性Ｔ細胞／ＩＬ‐２単一陽性Ｔ細胞の比と比べて大きいＩＦＮ‐γ単一陽性Ｔ細胞／ＩＬ‐２単一陽性Ｔ細胞の比が伴うＩＦＮ‐γ単一陽性細胞へのプロファイルシフトによって示される、  急性インフルエンザ感染、または以前に克服したインフルエンザ感染の後の予備免疫もしくはワクチン接種に起因する誘導された免疫応答に関して、前記インフルエンザウイルス型の感染の感染状態を全血から迅速に決定するためのインビトロ方法。【選択図】  図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血の第１試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞を、所望によりＣＤ２８に対する抗体またはＣＤ２８とＣＤ４９ｄとに対する抗体が存在する状態で、特定のインフルエンザウイルス型の抗原を用いて刺激する工程；
３５℃から３９℃、特に３７℃で、所望によりＣＯ２を添加しながら、充分な時間の培養、少なくとも０．５時間、とりわけ１．５時間から２．５時間、特に２時間の培養により、抗原提示細胞（ＡＰＣ）にインフルエンザ抗原を処理させる工程；
次に分泌阻害剤を添加する工程；
激しく混合する工程；
続いて３５℃から３９℃までの温度で、少なくとも１時間、とりわけ２．５時間の間の、２回目の培養を行う工程、および
前記抗原特異的Ｔ細胞の細胞内ＩＮＦ‐γ産生と細胞内ＩＬ‐２産生の両方からプロファイルを決定する工程
を含み、
前記インフルエンザウイルスに対するワクチン接種が成功した、以前に前記インフルエンザウイルスに感染した、または前記インフルエンザウイルスに感染していない患者のＩＦＮ‐γ単一陽性Ｔ細胞／ＩＬ‐２単一陽性Ｔ細胞の比が１よりも小さいのに対し、１よりも大きいＩＦＮ‐γ単一陽性Ｔ細胞／ＩＬ‐２単一陽性Ｔ細胞の比を伴うＩＦＮ‐γ単一陽性細胞へとプロファイルシフトしていることが、急性インフルエンザ感染症の存在を示す、
急性インフルエンザ感染であるか、または以前に克服したインフルエンザ感染の後の予備免疫もしくはワクチン接種に起因する誘導された免疫応答であるかに関して、前記インフルエンザウイルス型の感染の感染状態を全血から迅速に決定するためのインビトロ方法。
【請求項２】
前記第１試料と同一になるよう調製された、第２試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、０．９％ＮａＣｌ含有ＰＢＳまたは５％グルコース含有ＰＢＳなどの生理的緩衝液を添加することによって、陰性対照が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１試料と同一になるよう調製された、第３試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、ＳＥＢを添加することによって、陽性対照が実施される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１試料と同一になるよう調製された、第４試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、ワクチン接種用抗原を添加することによって、ワクチン接種対照が生じた、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分泌阻害剤が、ブレフェルジンＡ、モネンシンなどからなる群より選択される、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プロファイルの決定がフローサイトメトリー、自動化顕微鏡法、または多重ＥＬＩＳＡ法によって達成される、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記各試料の全血がヒトまたは動物に由来する、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性インフルエンザ感染症または以前のインフルエンザ感染またはワクチン接種に起因する継続性免疫化に関して、特定のインフルエンザウイルス型の感染症の感染状態を全血から迅速に決定するためのインビトロ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、一般にフルと呼ばれており、それは鳥類および哺乳類を冒す、インフルエンザウイルスが原因の感染症である。この疾患の最も一般的な症状は、寒気、発熱、喉の痛み、筋肉痛、ひどい頭痛、咳、脱力感／めまい、および全身の不快感である。
【０００３】
突然変異または遺伝子再集合によって新しいインフルエンザウイルスは常に進化している。突然変異はそのウイルスの表面にあるヘマグルチニン抗原およびノイラミニダーゼ抗原に小さな変化を引き起こし得る。これは抗原連続変異と呼ばれ、抗原連続変異によって多種多様な株が徐々に生じて、以前に存在した株に対して免疫を有する人々に感染することができるものに進化する。次にこの新しい変異体がより古い株に置き換わってヒト集団に急速に広まり、多くの場合、流行病を引き起こす。しかしながら、連続変異によって作製される株はより古い株にまだ結構類似しているので、まだそれらに免疫を有する人々もいる。対照的に、インフルエンザウイルスが遺伝子再集合するとき、例えば鳥類株とヒト株の間の遺伝子再集合によって、インフルエンザウイルスは完全に新しい抗原を獲得する。これは抗原不連続変異と呼ばれる。全く新しい抗原を有するヒトインフルエンザウイルスが作製される場合、全ての人が感受性となり、そして、その新規のインフルエンザが管理できないほど広まり、世界的流行を引き起こす。
【０００４】
典型的には、インフルエンザは、そのウイルスを含むエアロゾルを作り出す咳またはくしゃみによって空気伝染する。インフルエンザは鳥の糞または鼻汁との直接的な接触、または汚染された表面との接触によっても伝染し得る。空気中のエアロゾルがほとんどの感染の原因であると考えられてきたが、その伝達手段は最も重要であるにもかかわらず、完全に解明されてはいない。
【０００５】
インフルエンザは様々な種および株のウイルスによって引き起こされるので、どの年でも他の株が流行を引き起こしている間に絶滅する株もあり得、さらに別の株が世界的流行を引き起こすこともあり得る。典型的には、ある年の通常の２回のインフルエンザのシーズン（半球毎に１回）に世界中で３百万から５百万の重病の症例が存在し、最大で５００，０００件の死亡例が存在する。ある定義ではそれが毎年のインフルエンザの流行である。
【０００６】
２０世紀では３回のインフルエンザの世界的流行が起こり、数千万もの人々が死亡した。これらの世界的流行のそれぞれは、ヒトにおける新しい株のウイルスの出現によって引き起こされた。多くの場合、これらの新しい株は、既存のインフルエンザウイルスが他の動物種からヒトに広まるとき、または既存のヒトの株が通常は鳥またはブタに感染するウイルスから新しい遺伝子を抜き取るときに出現する。Ｈ５Ｎ１という名称の鳥類株が１９９０年代にアジアに出現した後、その株によってインフルエンザの新しい世界的流行についての心配が引き起こされたが、その株は人々の間で容易に広まる型には進化していない。２００９年の４月に、最初に「豚インフルエンザ」と称され、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１としても知られているヒト、ブタ、および鳥インフルエンザの遺伝子を組み合わせた新しいインフルエンザ株が進化し、メキシコ、米国、および他のいくつかの国に出現した。世界保健機構は２００９年６月１１日に世界的流行の発生を公的に宣言した。
【０００７】
ウイルスの分類ではインフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科の５つの属のうちの３つであるインフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣを構成するＲＮＡウイルスである。
【０００８】
インフルエンザウイルスＡ
野生の水鳥が多くの種類のインフルエンザＡの自然宿主である。時折、ウイルスが他の種に伝播し、そしてその時に家禽での壊滅的な流行の原因となり得、またはヒトインフルエンザの世界的流行が生じ得る。Ａ型ウイルスはこれらの３種類のインフルエンザの中で最も悪性のヒト病原体であり、そして、最も重症の病気の原因となる。インフルエンザＡウイルスはこれらのウイルスに対する抗体反応に基づいて異なる血清型に細分化され得る。ヒトにおいて確認された血清型は、公知のヒトでの世界的流行による死亡数の順序で、
・Ｈ１Ｎ１、１９１８年のスペイン風邪および２００９年の豚インフルエンザの原因
・Ｈ２Ｎ２、１９５７年のアジア風邪の原因
・Ｈ３Ｎ２、１９６８年の香港風邪の原因
・Ｈ５Ｎ１、２００４年の鳥インフルエンザの原因
・Ｈ７Ｎ７、並外れた人畜共通感染力を有する［２３］
・Ｈ１Ｎ２、ヒト、ブタおよび鳥類における地域的流行病
・Ｈ９Ｎ２
・Ｈ７Ｎ２
・Ｈ７Ｎ３
・Ｈ１０Ｎ７
である。
【０００９】
インフルエンザウイルスＢ
インフルエンザＢはほぼ例外なくヒトに感染し、そして、インフルエンザＡよりも一般的ではない。インフルエンザＢの感染に感受性がある他の動物はアザラシとフェレットのみである。この種類のインフルエンザはＡ型よりも２〜３倍遅い速度で突然変異を起こし、結果としてあまり遺伝的に分化しておらず、たった１つのインフルエンザＢ血清型が存在する。この低下した抗原変化速度が、（種交差性抗原不連続変異を阻害する）その限定的な宿主域と組み合わさって、インフルエンザＢの世界的流行が起こらない事を確実にしている。
【００１０】
インフルエンザウイルスＣ
インフルエンザウイルスＣはヒト、イヌおよびブタに感染し、時折、重病および地域的な流行の両方の原因となる。しかしながら、インフルエンザＣは他の型よりも一般的ではなく、通常、子供に軽度の病気を引き起こすだけである。
【００１１】
インフルエンザＡ感染症およびＢウイルス感染症の予防として、ワクチン接種があり得る。インフルエンザウイルスは、免疫系によって認識されるその構造を頻繁に変更している。様々な種類のインフルエンザウイルス、例えば、「通常の」季節性インフルエンザ病の原因であるインフルエンザウイルス、例えばＨ３Ｎ２とより危険なウイルス、例えばＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）が同時に活動することがあり得る。通常、先進国の人々はインフルエンザに対するワクチン接種を受けることができる。多くの場合、家禽は群れの壊滅を避けるためにワクチンの接種を受ける。最も一般的なヒト用ワクチンは、３種類のウイルス株に対する精製不活性化抗原を含有する三価インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）である。典型的には、このワクチンは２種類のインフルエンザＡウイルス亜型と１種類のインフルエンザＢウイルス株に由来する物質を含む。ＴＩＶにはその疾患を伝染させるリスクが無く、そして、ＴＩＶは非常に低い反応性を有する。インフルエンザウイルスは急速に進化し、そして、新しい株が短時間でより古い株に置き換わるので、ある年に製剤されたワクチンは次の年には効果が無いことがあり得る。インフルエンザを治療するために抗ウイルス薬を使用することができ、ノイラミニダーゼ阻害剤（タミフルまたはリレンザなど）が特に効果的である。
【００１２】
Ｈ３Ｎ２およびより危険な株、例えばＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）
通常、先進国の人々はインフルエンザに対するワクチン接種を受けることができる。多くの場合、家禽は群れの壊滅を避けるためにワクチンの接種を受ける。最も一般的なヒト用ワクチンは、３種類のウイルス株に対する精製不活性化抗原を含有する三価インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）である。典型的には、このワクチンは２種類のインフルエンザＡウイルス亜型と１種類のインフルエンザＢウイルス株に由来する物質を含む。ＴＩＶにはその疾患を伝染させるリスクが無く、そして、ＴＩＶは非常に低い反応性を有する。インフルエンザウイルスは急速に進化し、そして、新しい株が短時間でより古い株に置き換わるので、ある年に製剤されたワクチンは次の年には効果が無いことがあり得る。インフルエンザを治療するために抗ウイルス薬を使用することができ、ノイラミニダーゼ阻害剤（タミフルまたはリレンザなど）が特に効果的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
国際公開第２００７／１０７７１４Ａ２号は、被験者（individual）において細胞内での病原体の感染を評価する、および／または細胞内の病原体の感染をモニターする方法であって、その被験者が細胞内の病原体の抗原に応答して（ａ）ＩＦＮ‐γのみを分泌するＴ細胞、（ｂ）ＩＬ‐２のみを分泌するＴ細胞、または（ｃ）ＩＦＮ‐γとＩＬ‐２の両方を分泌するＴ細胞を有するか決定すること、および所望によりこのサイトカインプロファイルにおけるどのような変化も測定することを含む方法を開示する。詳細が記載される病原体はＣＭＶ、肝炎ウイルス、ＥＢＶまたはＨＳＶである。これらのウイルスはインフルエンザウイルスのようにその抗原パターンを急速に変化させることはないので、国際公開第２００７／１０７７１４Ａ２号から分かる方法は、本発明の根底にある問題の解決には容易に適用され得ない。
【００１４】
ＰＬｏＳ  ｏｎｅ誌、第６巻、第３号、Ｅ１７８１３頁のアーバン・セスターらの論文は、Ｔ細胞ベースのＩＦＮ‐γ放出アッセイでは活動性結核（ＴＢ）を治療が成功した病気または潜在性の結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症と区別することができないことを開示している。その論文の筆者らは、生体外でフローサイトメトリーによって測定された抗原特異的Ｔ細胞のＩＦＮ‐γとＩＬ‐２のサイトカインプロファイルがインビボでのＴＢ疾患の活動性と相関し得ると推論した。活動性ＴＢを有する２４人の患者とＴＢの治療が成功した２８人の患者のＣＤ４発現Ｔ細胞における抗原特異的サイトカインプロファイルを、フローサイトメトリーを使用して測定するためにツベルクリン（ＰＰＤ）、ＥＳＡＴ‐６およびＣＦＰ‐１０を刺激として使用した。また、潜在性結核菌感染症とＢＣＧワクチン接種のそれぞれと合致する免疫を有する２５人の被験者を動員した。サイトカイン分泌性ＰＰＤ反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度は、ＴＢが治療された患者と比べて活動性ＴＢを有する患者で高かったが（中央値でＣＤ４発現Ｔ細胞の０．３９％に対して０．８１％、ｐ＝０．０２）、被験者基準では群間での区別は出現頻度の部分的一致のため不可能であった。サイトカインプロファイルを評価すると、ＩＦＮ‐γとＩＬ‐２の両方を分泌するＰＰＤ特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞が、治療されたＴＢ、潜在性感染およびＢＣＧワクチン接種において優勢であったが、活動性ＴＢではそのサイトカインプロファイルはＩＦＮ‐γのみを分泌する細胞へと変えられた（ｐ＜０．０００１）。ＥＳＡＴ‐６またはＣＦＰ‐１０反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカインプロファイルはそれらの群の間で異ならなかった。受信者操作特性（ＲＯＣ）分析により、ＰＰＤ特異的ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２二重陽性Ｔ細胞の５６％より低い出現頻度が、非活性状態との有効な区別を可能とする活動性ＴＢの正確なマーカーである（特異度１００％、感度７０％）ことが明らかになった。結論として、ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２二重陽性ＰＰＤ特異的循環ＣＤ４Ｔ細胞の５６％よりも低い出現頻度は活動性ＴＢの強力な指標である。
【００１５】
ワクチン接種前に患者が未感染であるか、現時点で活動性インフルエンザを患っていないか、そして、その場合、その患者に「通常の」インフルエンザウイルスが感染しているのか、または、例えばＨ５Ｎ１が感染しているのか分かることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、様々なインフルエンザ株に対するＴ細胞性免疫応答を全血試料中のＴ細胞の抗原特異的刺激を助力として検出および特徴解析することができたという観察に基づいている。インフルエンザ反応性Ｔ細胞は、白血球の固定と赤血球の溶解の後に細胞内サイトカイン染色とその後のフローサイトメトリーによる全ての各Ｔ細胞の中でのインフルエンザ反応性Ｔ細胞の出現頻度の分析を助力として検出できた。いくつかの被験者では低レベルの既存のインフルエンザ特異的Ｔ細胞が観察され、全ての被験者でワクチン接種後にインフルエンザ特異的Ｔ細胞の明確な増加が観察された。興味深いことに、この増加にはワクチン接種から１週間後に最も優勢であった活性化Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの変化が伴った。いくつかの他のワクチン未接種の被験者は急性インフルエンザ感染症を示唆する臨床的徴候を示し、それらの被験者で新規に誘導された免疫応答を確認するためにインフルエンザ特異的Ｔ細胞の分析が実施された。これらの被験者では、活性化Ｔ細胞のサイトカインプロファイルにさらに一層顕著な変化が存在した。本発明のインビトロ方法により被験者の実際の感染状態の決定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】世界的流行性インフルエンザのワクチンを使用する免疫により、世界的流行性インフルエンザと季節性インフルエンザの両方の抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞応答が誘導される。
【図１−２】世界的流行性インフルエンザのワクチンを使用する免疫により、世界的流行性インフルエンザと季節性インフルエンザの両方の抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞応答が誘導される。
【図１−３】世界的流行性インフルエンザのワクチンを使用する免疫により、世界的流行性インフルエンザと季節性インフルエンザの両方の抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞応答が誘導される。
【図１−４】世界的流行性インフルエンザのワクチンを使用する免疫により、世界的流行性インフルエンザと季節性インフルエンザの両方の抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞応答が誘導される。
【図２−１】エフェクターメモリー表現型を有するＴｈ１細胞がワクチン接種によって主に誘導される。
【図２−２】エフェクターメモリー表現型を有するＴｈ１細胞がワクチン接種によって主に誘導される。
【図３−１】既存の免疫が抗原特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の強力な誘導を妨げる。
【図３−２】既存の免疫が抗原特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の強力な誘導を妨げる。
【図４】ワクチンにより誘導された抗体は季節性抗原とわずかな交差反応性しか示さない。
【図５−１】ＰｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカイン発現プロファイルの差異によって、メモリー応答またはワクチン接種応答が急性感染と区別される。
【図５−２】ＰｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカイン発現プロファイルの差異によって、メモリー応答またはワクチン接種応答が急性感染と区別される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法は、急性インフルエンザ感染であるか、ワクチン接種に起因する誘導された免疫応答または以前に克服したインフルエンザ感染に起因する予備免疫であるかに関して、特定のインフルエンザウイルス型の感染症の感染状態をヒトおよび動物の全血から迅速に決定するためのインビトロ方法であって、
・全血の第１試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞を、所望によりＣＤ２８に対する抗体またはＣＤ２８とＣＤ４９ｄとに対する抗体が存在する状態で、前記インフルエンザウイルス型の抗原を用いて刺激する工程；
・３５℃から３９℃、特に３７℃で、所望によりＣＯ２を添加しながら、少なくとも０．５時間、とりわけ１．５時間から２．５時間、特に２時間の、充分な時間の培養により、抗原提示細胞（ＡＰＣ）にインフルエンザ抗原を処理させる工程；
・次に分泌阻害剤を添加する工程；
・激しく混合する工程；
・続いて３５℃から３９℃、特に３７℃で、少なくとも１時間、特に２．５時間、とりわけ３．５時間から６時間、特に４時間の間、所望によりＣＯ２を添加しながら、２回目の培養を行う工程；
・前記抗原特異的Ｔ細胞の細胞内ＩＮＦ‐γ産生と細胞内ＩＬ‐２産生の両方からプロファイルを決定する工程；
を含み、
・以前に前記インフルエンザウイルスに感染したかまたは感染していない患者であって前記インフルエンザウイルスに対するワクチン接種が成功した患者のＩＦＮ‐γ単一陽性Ｔ細胞／ＩＬ‐２単一陽性Ｔ細胞の比が１よりも小さいのに対し、１よりも大きいＩＦＮ‐γ単一陽性Ｔ細胞／ＩＬ‐２単一陽性Ｔ細胞の比を伴うＩＦＮ‐γ単一陽性細胞へとプロファイルシフトしていることが、急性インフルエンザ感染症の存在を示す方法である。
【００１９】
本発明によれば、前記第１試料と同一になるよう調製された（authentic）、第２試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、０．９％ＮａＣｌ含有ＰＢＳまたは５％グルコース含有ＰＢＳなどの生理的緩衝液を添加することによって、陰性対照を実施することができる。
【００２０】
前記第１試料と同一になるよう調製された、第３試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、ＳＥＢを添加することによって、陽性対照を実施することができる。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態では、前記第１試料と同一になるよう調製された、第４試料の全血中に存在する抗原特異的Ｔ細胞に、ワクチン接種用抗原を添加することによって、ワクチン接種対照が生じ得る。本発明に従う方法では分泌阻害剤は、ブレフェルジンＡ、モネンシンなどからなる群より選択される。そのサイトカインプロファイルの決定はフローサイトメトリー、自動化顕微鏡法、または多重ＥＬＩＳＡ法によって達成され得る。
【実施例】
【００２２】
本発明は、特許請求の範囲を限定するものとされない以下のより具体的な実施例と説明によってさらに例示される。抗原特異的抗体応答の誘導は世界的流行性Ｈ１Ｎ１ワクチンまたは季節性インフルエンザ（フル）ワクチンによるワクチン接種の後によく特徴解析されている。しかしながら、世界的流行性Ｈ１Ｎ１に対する細胞性免疫応答の動態および季節性インフルエンザワクチンに対する交差反応性は、抗原特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの変化に関してこれまで知られていない。
【００２３】
１９人の免疫応答性被験者に世界的流行性Ｈ１Ｎ１ワクチンであるパンデムリックスを接種し、そして、世界的流行性Ｈ１Ｎ１と季節性インフルエンザワクチンに特異的なＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度をワクチン接種前と接種から１週間、２週間および１０週間の後に細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐１７）を用いてモニターした。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）での刺激が陽性対照として働いた。サイトカイン分析とは別に、特異的Ｔ細胞の表現型をメモリーマーカーおよび成熟マーカーにより特徴解析した。また、特異的抗体の誘導をＥＬＩＳＡと中和アッセイによりモニターした。加えて、７人の急性Ｈ１Ｎ１感染症の患者を分析した。
【００２４】
ワクチン接種の前では、世界的流行性Ｈ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のレベルは事例の６８％において検出限界未満であった。対照的に、季節性インフルエンザに対する免疫は７９％において検出可能であった。ワクチン接種後に特異的Ｔ細胞応答は全ての事例において検出限界よりも上に上昇した。出現頻度の中央値は４６３％上昇し（ＩＱＲ  ２９１〜７１５％）、そして、追跡調査期間を通じて変動しなかった。興味深いことに、季節性ワクチンに対するＴ細胞のレベルの中央値が同時に０．１０％から０．２４％まで上昇したが、ＳＥＢ反応性Ｔ細胞がワクチン接種後に特に誘導されることはなかった。ワクチン接種前後のインフルエンザ特異的細胞はＩＦＮ‐γとＩＬ‐２を共発現していたが、ＩＬ‐１７は検出可能ではなかった。対照的に、活動性Ｈ１Ｎ１感染症の患者のＴ細胞は主にＩＦＮ‐γだけを発現した。その細胞性免疫と対照的に、Ｈ１Ｎ１世界的流行性抗体応答だけが誘導され、季節性インフルエンザワクチンに対する交差反応性抗体は誘導されなかった。
【００２５】
結論として、世界的流行性Ｈ１Ｎ１ワクチン接種は、Ｈ１Ｎ１反応性Ｔ細胞性免疫の特異的誘導の他に、季節性インフルエンザワクチンに対する交差防御的Ｔ細胞応答も誘導する。加えて、サイトカインプロファイル作成は、活動性Ｈ１Ｎ１感染症の患者を特定するための診断手段として適用され得る。
【００２６】
試験対象
２００９年の１０月／１１月に１９人の免疫応答性被験者の間でワクチン接種試験を実施した。それらの被験者の中で１０人（平均年齢４３．６４±１０．０５歳）が約３週間（平均１８．９±７．９日）前に季節性インフルエンザに対するワクチン接種（ベグリバク（Ｂｅｇｒｉｖａｃ）２００９／２０１０、ノバルティス社、ドイツ、マールブルク）を前もって受けていたが、９人（平均年齢３７．８±１５．９歳）は受けていなかった。全ての被験者が１標準用量のｐｄｍＨ１Ｎ１ワクチン（パンデムリックス、グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルスｓ．ａ．社、ベルギー、リクサンサール）を受容し、そして、全ての被験者がインフォームドコンセントを提出した。パンデムリックスを用いるワクチン接種の前、ならびにその１週間、２週間、および１０週間の後に全血試料を採取した。急性感染における細胞性免疫の特徴を解析するため、臨床的／疫学的またはウイルス学的な基準でインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１感染症と新たに診断された７人の被験者（平均年齢４９．２８±１１．０７歳）の追加の全血試料を分析した。
【００２７】
インフルエンザ特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の定量と表現型分析
ヘパリン処理した全血試料に由来するＴ細胞を、以前に記述されているように［１］インビトロで６時間刺激した。１回の刺激当たり総計で４５０μｌの血液を使用した。ベルギー、リクサンサールのグラクソ・スミスクライン・バイオロジカルスｓ．ａ．社の好意により提供されたＰｄｍＨ１Ｎ１抗原（Ａ／カリフォルニア（Ｈ１Ｎ１）に由来する、３０μｇ／ｍｌのＨＡ含量のｐｄｍＨ１Ｎ１が世界的流行性ワクチンパンデムリックスに使用されている）と季節性インフルエンザ２００９／２０１０ワクチンであるベグリバク（Ｆｌｕ０９、３０μｇ／ｍｌのＨＡ含量；ノバルティス社、ドイツ、ニュルンベルク）を、それぞれ１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８と抗ＣＤ４９ｄ（クローンＬ２９３と９Ｆ１０；ＢＤ社、ドイツ、ハイデルベルク）が存在する状態で刺激として使用して抗原特異的活性化とサイトカイン発現を誘導した。陰性対照および陽性対照としてそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と２．５μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、シグマ社、ドイツ、ダイセンホーフェン）を用いて細胞を刺激した。刺激された細胞を固定し、そして、ある力価の抗ＣＤ４（クローンＳＫ３）、抗ＣＤ６９（クローンＬ７８）、抗ＩＦＮ‐γ（クローン４Ｓ．Ｂ３）、抗ＩＬ‐２（クローンＭＱ１−１７Ｈ１２）、抗ＩＬ‐１７Ａ（クローンＳＣＰＬ１３６２）、抗ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ‐４、クローンＢＮＩ３；全てＢＤ由来）および抗ＣＤ１２７（クローンｅＢｉｏＲＤＲ５、イーバイオサイエンス‐ＮａｔｕＴｅｃ社、ドイツ、フランクフルト）を使用して免疫染色した。少なくとも１０，０００個のＣＤ４発現Ｔ細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ社）上でＦＡＣＳｄｉｖａソフトウェアＶ６．１．３．を使用して分析した。抗原特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の分析のため、抗原で刺激された後の活性化ＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度からそれぞれの陰性対照を減算した。検出限界は０．０５％のＩＦＮ‐γ産生ＣＤ６９陽性ＣＤ４発現Ｔ細胞であった。
【００２８】
インフルエンザ特異的抗体応答の定量
標準的ＥＬＩＳＡ（ビロテック（Ｖｉｒｏｔｅｃｈ）社、ドイツ、リュッセルスハイム）を製造業者の指示に従って使用してｐｄｍＨ１Ｎ１特異的ＩｇＧ誘導の動態を分析した。また、ベグリバクを用いるワクチン接種を前もって受けていない対象の血清試料中のｐｄｍＨ１Ｎ１と季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１Ｎ１季節性、Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＢ）の個々の成分に対するウイルス中和抗体の存在を、以前に記述されている方法［２、３］に基づくそれぞれのマイクロ中和アッセイにより決定した。詳しく述べると、加熱不活化した（３０分、５６℃）血清を使用してウイルス希釈剤［ＥＭＥＭ（バイオクローム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）社、ドイツ）＋０．１％抗生物質＋２％ＦＢＳ（バイオクローム社、ドイツ）］中に１：１０から１：１２８０までの２倍段階希釈物を二組調製した。その希釈された血清を等体積（１００μｌ）のインフルエンザＡウイルス［Ａ／カリフォルニア／７／２００９に由来するＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａ（Ｈ１Ｎ１）］を２ｘ１０３ＴＣＩＤ５０／ｍｌで含有するウイルス希釈剤と混合し、湿室中で９０分間（３７℃、５％のＣＯ２）保温し、そして、１００μｌを９６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞単一層（ＥＣＣＣ、英国、ソールズベリー）に移動した。ウイルス希釈剤中のインフルエンザウイルス（ウイルス対照）またはウイルス希釈剤のみ（細胞対照）を含む８つの対照ウェルが各プレートに含まれた。１時間の保温の後に１００μｌの重層媒体［１：１のウイルス希釈剤と３．２％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、シグマ・アルドリッチ社）］を２４時間から２８時間、各ウェルに添加した。その後、その単一層を氷冷アセトン：メタノール（４０％：６０％；１０分、室温）で固定した。ダルベッコＡ洗浄緩衝液（１０００ｍｌの脱イオン水中に８．０ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｇのＫＣｌおよび０．２ｇのＫ２ＨＰＯ４を溶解、ｐＨ７．３）中の１％ウシ血清アルブミン（メルク社、ドイツ）、０．１％チメロサール（シグマ・アルドリッチ社）を用いて固定した細胞を３７℃、５％のＣＯ２で３０分間ブロッキング処理した後、それらの細胞は続いてブロッキング緩衝液中に１：１０，０００に希釈した２５μｌの核タンパク質に対する抗インフルエンザモノクローナル抗体（ＭＡＢ８２５１、ミリポア社）およびブロッキング緩衝液中に１：１０００に希釈した２５μｌ／ウェルのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｐ０１６１、ダコ・サイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社、デンマーク）と共にそれぞれ３７℃、５％のＣＯ２で３０分間保温され、そして、０．０３％のＨ２Ｏ２を含む、３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール（シグマ・アルドリッチ社）を４．０ｍｌのＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（シグマ・アルドリッチ社）および１６ｍｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．９５〜５．０５）中に溶解して新規に調製したものをウェル当たり５０μｌ使用して基質反応を３０分間実施した。自動化ＥＬＩＳＰＯＴ計測器（ＡＩＤディアグノスティカ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）ＧｍｂＨ社、ドイツ、シュトラスベルク）を使用して免疫染色されたフォーカスの数を計測し、記録した。���和抗体の力価は、免疫染色されたフォーカスの数を対照値の５０％以下まで低下させる最大希釈度の逆数として表された。
【００２９】
結果
世界的流行性インフルエンザワクチンを用いた免疫により、世界的流行性インフルエンザ抗原と季節性インフルエンザ抗原の両方に対して応答する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞が誘導される。
【００３０】
インフルエンザ特異的細胞性免疫の誘導を１９人の被験者において世界的流行性インフルエンザワクチンであるパンデムリックスを用いた免疫の前ならびに免疫から１週間、２週間、および１０週間の後に評価した。これらの被験者の中で１０人は季節性インフルエンザワクチンを用いるワクチン接種を前もって受けていた。世界的流行性インフルエンザ抗原（ｐｄｍＨ１Ｎ１）と交差反応性季節性インフルエンザ抗原（Ｆｌｕ０９）の両方について特異的であるＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度を全血試料より生体外で直接的に決定した。抗原特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞は、インビトロの特異的刺激の後の活性化マーカーＣＤ６９とサイトカインＩＦＮ‐γの誘導を基にフローサイトメトリーを用いて特定された。１９人全ての被験者における基準Ｔ細胞頻度を評価すると、ｐｄｍＨ１Ｎ１に特異的な低レベルのＣＤ４発現Ｔ細胞（中央値（ＩＱＲ）０．０３％（０．０４％））と季節性インフルエンザ抗原に特異的な低レベルのＣＤ４発現Ｔ細胞が検出された（０．１０％（０．０７％）、表１）。
【００３１】
図１：世界的流行性インフルエンザのワクチンを使用する免疫により、世界的流行性インフルエンザと季節性インフルエンザの両方の抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞応答が誘導される。世界的流行性インフルエンザワクチンを用いた免疫の前ならびに免疫から１週間、２週間、および１０週間の後に採取された全血試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、陰性対照）、世界的流行性Ｈ１Ｎ１抗原（ｐｄｍＨ１Ｎ１）、２００９季節性インフルエンザワクチンベグリバク（Ｆｌｕ０９）および黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、陽性対照）でそれぞれ刺激し、そして、フローサイトメトリーを用いて反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞（ＣＤ６９陽性／ＩＦＮ‐γ陽性）の数を計測した。季節性ワクチンによるワクチン接種を前もって受けていなかった１人の代表的な被験者についての典型的なドットプロットが示されている。数値は抗原反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞のパーセンテージを表す。代表例（図１）に示されているように、ワクチン接種前に存在した低レベルの特異的Ｔ細胞がワクチン接種後に増加し、そして、ワクチン接種から１週間後にピーク値が認められた（図１および表１）。全般的に、パンデムリックスを用いるワクチン接種によって、そのワクチン中に存在するｐｄｍＨ１Ｎ１抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度が最も強力に誘導された（１週間後の４．６３倍の中央値の増加、表１）。興味深いことに、あまり明白ではないが、これに伴って、季節性インフルエンザ抗原に対して交差反応する細胞のパーセンテージが同時に増加した（２．７１倍の中央値の増加）。対照的に、陽性対照刺激であるＳＥＢに対して反応性を有するＴ細胞の出現頻度は時間が経っても変化しなかった（図１および表１）。これらの結果は、世界的流行性インフルエンザワクチンであるパンデムリックスを用いるワクチン接種によって、世界的流行性Ｈ１Ｎ１抗原に対する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞性免疫であって、季節性インフルエンザワクチンの抗原と交差反応する特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞性免疫が誘導されることを示している。エフェクターメモリー表現型を有するＴｈ１細胞がワクチン接種によって主に誘導される。
【００３２】
ワクチン誘導性ｐｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の表現型の特性の変化をより詳細に分析するために、我々は様々な機能性マーカー（ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐１７、ＣＤ６９、ＣＴＬＡ‐４）とメモリーマーカーであるＣＤ１２７の発現をモニターした。
【００３３】
図２：エフェクターメモリー表現型を有するＴｈ１細胞がワクチン接種によって主に誘導される。パンデムリックスを用いるワクチン接種後のｐｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の表現型の特徴解析。（Ａ）ワクチン接種から１週間後の（季節性インフルエンザに対するワクチン接種を前もって受けていなかった）代表的な被験者の血液試料における、ｐｄｍＨ１Ｎ１抗原で刺激されたＣＤ４発現Ｔ細胞のＩＦＮ‐γおよびＣＤ６９、ＩＬ‐２、ＩＬ‐１７、ＣＴＬＡ‐４およびＣＤ１２７の発現のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）全てのＩＦＮ‐γ陽性ＣＤ４発現Ｔ細胞のＣＴＬＡ‐４シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、および（Ｃ）ｐｄｍＨ１Ｎ１抗原を用いる刺激の後の全ての試験された被験者の全てのＩＦＮ‐γ陽性ＣＤ４発現Ｔ細胞の中のＣＤ１２７発現細胞のパーセンテージが時間に関して示されている（第１０週でｎ＝１０）。棒は中央値と四分位範囲（ＩＱＲ）を表す。
【００３４】
パンデムリックスワクチン接種から１週間後のｐｄｍＨ１Ｎ１特異的Ｔ細胞の代表的なドットプロットに示されているように、エフェクターサイトカインであるＩＬ‐２とＩＦＮ‐γのＣＤ６９との顕著な共発現によって、特異的Ｔ細胞は主にＴｈ１エフェクター型細胞であり、一方ＩＬ‐１７発現細胞は検出されなかったことが示された（図２Ａ）。出現頻度の動態と合致して、Ｔ細胞活性化の最も重要な陰性共刺激性表面受容体であるＣＴＬＡ‐４はパンデムリックスワクチン接種から１週間後にピークに達し、その後、ほとんどワクチン接種前のレベルにまで減少した（ｐ＜０．０００１、図２Ｂ）。他方、ＣＤ１２７発現インフルエンザ特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のパーセンテージの中央値（ＩＱＲ）は最初、ワクチン接種後の第１週の間に９７．６％（５．０％）から８０．０％（１２．１％）まで減少したが、追跡調査中に１０週間後に９８．０％（６．０％）まで再び増加した。これはエフェクターメモリー細胞への分化へと続くナイーブＴ細胞の活性化を意味する（ｐ＜０．０００１、図２Ｃ）。季節性インフルエンザワクチンに特異的なＣＤ４発現Ｔ細胞は同様の発現プロファイルと特性を示した（データを示さず）。まとめると、インフルエンザ特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の表現型の特徴解析により、ワクチン接種直後の期間にダイナミックな変化を示す主にＴｈ１エフェクターメモリー細胞の誘導がワクチンによって引き起こされることが示された。
【００３５】
既存の免疫が抗原特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の強力な誘導を妨げる
基底レベル、およびパンデムリックスワクチン接種後のインフルエンザ特異的免疫の誘導における、季節性インフルエンザ抗原に対する既存の細胞性免疫の影響を評価するために、被験者群を、季節性インフルエンザワクチンを用いるワクチン接種を前もって受けていなかった被験者と受けていた被験者とに分けた。
【００３６】
図３：既存の免疫が抗原特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞の強力な誘導を妨げる。季節性インフルエンザワクチンを用いるワクチン接種を前もって受けていない被験者（Ａ）と前もって受けた被験者（Ｂ）における世界的流行性Ｈ１Ｎ１抗原（ｐｄｍＨ１Ｎ１）、季節性インフルエンザワクチンベグリバク（Ｆｌｕ０９）および黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、陽性対照）に対して特異的な反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度が時間に関して示されている。検出限界（０．０５％のＩＦＮ‐γ産生ＣＤ６９陽性ＣＤ４発現Ｔ細胞）は水平線によって表されている。（Ｃ）世界的流行性インフルエンザワクチンによるワクチン接種後の第１週の間でのｐｄｍＨ１Ｎ１、Ｆｌｕ０９およびＳＥＢに特異的なＣＤ４発現Ｔ細胞の出現頻度の上昇がワクチン接種前に得られた基準頻度の倍数として表された。試験された被験者はワクチン接種前の状態（季節性インフルエンザに対して前もってワクチン接種されたか否か）によって細分化された。各被験者のＴ細胞頻度ならびに中央値およびＩＱＲが示されている。
【００３７】
両方の群におけるインフルエンザ反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞とＳＥＢ反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞の動態が図３ＡおよびＢに示されている。興味深いことに、ｐｄｍＨ１Ｎ１特異的Ｔ細胞の頻度上昇の中央値は、季節性インフルエンザに対するワクチン接種を前もって受けた被験者と比べて（２．９４倍）前もって受けていない被験者で有意に高かった（７．１５倍、ｐ＝０．０１、図３Ｃ）。注目すべきことに、その２群の間のこの差異は、季節性インフルエンザ抗原に対して反応するＣＤ４発現Ｔ細胞についても見出された（４．０３倍対１．７４倍、ｐ＝０．００４１）。ＳＥＢ反応性Ｔ細胞の出現頻度はそれらの群のいずれにおいても上昇しなかった（ｐ＝０．１１、図３Ｃ）。これらの結果は、既存の免疫がパンデムリックスによるワクチン接種後のインフルエンザ特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のあまり明白ではない誘導と関連を有することを示している。
【００３８】
ワクチン誘導性抗体は季節性抗原とわずかな交差反応性しか示さない
パンデムリックスワクチンの細胞性応答および液性応答に対する効果を比較するため、インフルエンザ特異的抗体の誘導を測定した。重要なことに、ワクチン接種によってｐｄｍＨ１Ｎ１特異的ＩｇＧの力価の著しい連続的な増加が誘導され、それはワクチン接種から約２週間後にピークに達し、そして、その後の８週間にわたってほとんど一定のままであった。
【００３９】
図４：ワクチンにより誘導された抗体は季節性抗原とわずかな交差反応性しか示さない。世界的流行性Ｈ１Ｎ１抗原に対する特異的抗体応答の誘導を、季節性インフルエンザワクチンを用いるワクチン接種を前もって受けていない被験者（Ａ）および前もって受けた被験者（Ｂ）においてＥＬＩＳＡによりモニターした。ワクチン接種を前もって受けていない被験者（Ｃ）と前もって受けた被験者（Ｄ）の血清試料をｐｄｍＨ１Ｎ１と季節性インフルエンザワクチンの単一の成分（Ｈ１Ｎ１季節性、Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＢ（ＩｎｆＢ））に対するウイルス中和抗体について試験した。ＩＣ５０値は５０％のウイルス中和を引き起こすそれぞれの血清希釈度を表す。
【００４０】
これらの動態はワクチン接種前の状態と無関係であった（図４ＡおよびＢ）。パンデムリックスが誘導した抗体の交差反応性の可能性を評価するため、季節性インフルエンザに対するワクチン接種を前もって受けていない被験者に由来する血漿試料をそれぞれｐｄｍＨ１Ｎ１と季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１Ｎ１季節性、Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＢ）の個々の混合物に対する中和抗体の存在について分析した。ＥＬＩＳＡからの結果と一致して（図４Ａ）、ｐｄｍＨ１Ｎ１特異的中和抗体の最大力価がパンデムリックスワクチン接種後の最初の２週間の間に既に誘導され、そして、その力価が第１０週を通じて変動しなかった（図４Ｃ）。対照的に、季節性Ｈ１Ｎ１の力価はわずかな増加しか観察されなかった。これは季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株に対するごくわずかな中和交差反応性を表している。同じく、Ｈ３Ｎ２中和抗体の力価とインフルエンザＢ中和抗体の力価に対して有意な効果は全くなかった。季節性インフルエンザに対するワクチン接種を前もって受けていた被験者は、パンデムリックスワクチン接種後にほとんど変動しない、より高レベルの季節性ワクチンの成分に対する中和抗体を有した（図４Ｄ）。興味深いことに、世界的流行性インフルエンザワクチンでの免疫前のｐｄｍＨ１Ｎ１中和抗体の力価もわずかに増加した。これは、季節性ワクチンによって誘導されたある程度の交差反応性を表している可能性がある。注目すべきことに、それらの力価はパンデムリックスワクチン接種後に増加を示したが、季節性インフルエンザに対するワクチン接種を前もって受けなかった被験者におけるそれらのレベルに達しなかった。したがって、これらの結果は、パンデムリックスを用いるワクチン接種が季節性Ｈ１Ｎ１抗原に対するある程度の交差反応性と共にｐｄｍＨ１Ｎ１特異的抗体応答を誘導することを実証している。細胞性免疫と合致して、既存の液性免疫はパンデムリックスを用いるワクチン接種後のｐｄｍＨ１Ｎ１特異的力価のあまり明白ではない誘導と関連を有した。
【００４１】
ｐｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカイン発現プロファイルの差異がワクチン接種応答を急性感染症から区別する
以前の研究から、急性ウイルス感染症または細菌感染症は抗原特異的Ｔ細胞のサイトカイン発現プロファイルの変化を伴うことが示されている。世界的流行性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスによる急性感染症においてもこのことが当てはまるかどうか検討するため、ワクチン接種後に誘導された特異的Ｔ細胞のＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２発現プロファイルを世界的流行性Ｈ１Ｎ１インフルエンザの症候性感染症を患う７人の患者のプロファイルとの比較により分析した。以前に記載されているように全血を世界的流行性インフルエンザ抗原および季節性インフルエンザ抗原で刺激し、そして、ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２の単一発現または二重発現についてＣＤ４発現Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＳＥＢを用いる刺激がインフルエンザに無関係の特異性を有する細胞についての陽性対照として働いた。
【００４２】
図５：ＰｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカイン発現プロファイルの差異によって、メモリー応答またはワクチン接種応答が急性感染と区別される。（Ａ）世界的流行性インフルエンザワクチンによるワクチン接種後の（季節性インフルエンザに対するワクチン接種を前もって受けていない）健康な１人の被験者および（Ｂ）症状の発生後１週間以内の急性世界的流行性Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染症の１人の患者の血液試料中の、ｐｄｍＨ１Ｎ１抗原を用いる刺激後のＣＤ４発現Ｔ細胞におけるＩＦＮ‐γとＩＬ‐２の発現のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロット。（Ｃ）世界的流行性インフルエンザワクチンで免疫した後の１９人の被験者全ておよび（Ｄ）急性世界的流行性Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染症の７人の患者のｐｄｍＨ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞について時間に対するＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２サイトカインプロファイル作成を実施した。１μｌの全血当たりのＩＦＮ‐γ単一陽性（黒色の円）、ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２二重陽性（灰色の円）およびＩＬ‐２単一陽性（白色の円）ＣＤ４発現Ｔ細胞の絶対数の中央値とＩＱＲが示されている。ＳＥＢを用いる刺激（陽性対照）の後の各値がワクチン接種群（Ｅ）と感染患者（Ｆ）について示されている。
【００４３】
ワクチン接種前後のインフルエンザ特異的ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２サイトカインプロファイルおよび急性感染患者におけるインフルエンザ特異的ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２サイトカインプロファイルの代表的なドットプロットが図５ＡおよびＢに示されている。興味深いことに、ワクチン被接種者におけるＴ細胞応答はＩＦＮ‐γとＩＬ‐２の両方を共発現する多機能性ＣＤ４発現Ｔ細胞によって全般的に占められたが、単一サイトカイン産生細胞は多くなかった（図５Ｃ）。後者の中では、専らＩＬ‐２を発現する細胞が、ＩＦＮ‐γのみを産生する細胞よりも全般的に優位を占めた。この比率はワクチン接種からわずか１週間後に変化した。その後、プロファイルはワクチン接種前に見出されるプロファイルへ大きく正常化した（図５Ｃ）。図５Ｄに示されているように、このサイトカインプロファイルは、急性感染症の患者で見出される、ＩＦＮ‐γのみを発現する細胞が最も数が多くＩＬ‐２単一産生細胞は全く存在しないプロファイルと、著しく異なっていた。注目すべきことに、ＳＥＢ反応性ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカインプロファイルはワクチン接種（図５Ｅ）または急性感染症（図５Ｆ）による影響を受けなかったので、これらのプロファイルは実にインフルエンザ特異的である。これらの結果は、世界的流行性Ｈ１Ｎ１インフルエンザに関するワクチン接種応答と急性感染症とを区別することが、Ｈ１Ｎ１特異的ＣＤ４発現Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの作製によって可能になり得ることを示唆する。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
参照文献
１．Sester, U., et al., PD-1 expression and IL‐2 loss of cytomegalovirus- specific T cells correlates with viremia and reversible functional anergy. Am J Transplant, 2008. 8(7): p. 1486-97.
２．Zielinska, E., et al., Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virol J, 2005. 2: p. 84.
３．Rowe, T., et al., Detection of antibodyto avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol, 1999. 37(4): p. 937-43.
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【国際調査報告】
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