(57)【要約】  本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療又は予防するための方法、前記治療又は予防において使用するための医薬組成物、並びに診断方法及びキットに関する。
2014510907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＴＲアミロイドーシスを診断するための方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の体液試料を準備するステップ、
（ｂ）前記体液におけるＴＴＲの濃度を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されるＴＴＲ濃度が対照試料よりも高い場合、前記ヒト対象がＴＴＲアミロイドーシスに罹患している又はそれを発症する危険性が高いと決定するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
前記体液が、血漿及び脊髄液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液中の前記ＴＴＲが、単量体形態である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＴＲが、四量体形態である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）及びｂ）の間にさらなるステップを含み、前記試料が、ＴＴＲ四量体を単量体に解離させるために、ｐＨ２．７のような低ｐＨにさらされる、請求項に記載の方法。
【請求項６】
ＴＴＲの濃度が、抗ＴＴＲ抗体を使用することによって決定される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸２４〜３５、５０〜６１、若しくは１０〜２４、又はその任意の組み合わせに選択的に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）抗ＴＴＲ抗体及び
ｂ）体液試料中のＴＴＲの発現レベルを検出するための１つ又は複数の試薬を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項１０】
抗ＨＳ抗体をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の試薬が、二次抗体及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、又は他の酵素レポーター系に対する比色定量基質、化学発光基質、又は化学蛍光基質からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＴＴＲとヘパラン硫酸（ＨＳ）との相互作用を妨害することができる有効量の薬剤を投与することによって、その必要のある患者においてトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを予防、軽減、及び／又は治療するための方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、ヘパラン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸多糖、非抗凝血性ヘパリンオリゴ糖、非抗凝血性ヘパリン多糖、及びそのミメティックからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＴＴＲペプチド又はその断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、抗ＴＴＲ抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＴＲアミロイドーシスの予防、軽減、及び／又は治療において使用するための、ＨＳとＴＴＲとの間の相互作用を妨害することができる薬剤。
【請求項１８】
前記薬剤が、ヘパラン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸多糖、非抗凝血性ヘパリンオリゴ糖、非抗凝血性ヘパリン多糖、及びそのミメティックからなる群から選択される、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記薬剤が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＴＴＲペプチド又はその断片である、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記薬剤が、抗ＴＴＲ抗体である、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２２】
ＨＳとＴＴＲとの間の相互作用を妨害することができる薬剤並びに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療又は予防するための方法、前記治療又は予防において使用するための医薬組成物、並びに診断方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、４つの１４ｋＤａサブユニットから構成される機能的血漿タンパク質である。ＴＴＲは、肝臓によって主に合成され、レチノール及びチロキシンに対するトランスポーターとして機能する。その生理学的機能に加えて、ＴＴＲは、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性心アミロイドーシス（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、及び散発性老人性全身性アミロイドーシス（ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｓｅｎｉｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）（ＳＳＡ）を含むアミロイドーシスのいくつかの異なる臨床型において、アミロイド線維の主成分として見いだされる。ＳＳＡは、心組織における野生型（ＷＴ）ＴＴＲ線維の選択的な沈着によって引き起こされ、８０歳を超える人口のほぼ２５％が罹患している。
【０００３】
ＴＴＲの約１００のアミノ酸突然変異が、家族型ＴＴＲアミロイドーシスに関連づけられている。四量体の不安定化によって開始されるプロセスによってＴＴＲがアミロイドを形成することが、研究により示された。不安定化は、ミスフォールドし凝集して線維状構造になり得る、単量体の蓄積をもたらす。大多数のＴＴＲ関連性アミロイドーシスは、他の点では安定なＷＴタンパク質の凝集及び沈着によって引き起こされる散発性の症例によって代表されるが、家族型疾患に関係するＴＴＲ突然変異のアミロイド原性（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の研究に相当な努力が傾注されてきた。
【０００４】
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、グルコサミン及びグルクロン酸の繰り返し単位からなる硫酸化多糖であり、多くのアミロイドーシスにおいてアミロイド沈着物に結合している。ＨＳがアミロイド沈着において重要な役割を果たすということを示唆する証拠が蓄積されているが、アミロイドーシスの病態におけるＨＳの明確な役割は、未解明のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＴＴＲアミロイドーシスにおけるＨＳの役割を詳細に説明する必要性、そして医薬を開発する必要性も当技術分野において残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、心筋症の心臓におけるＴＴＲとのＨＳの同時沈着が免疫組織化学的染色によって検出されたという研究に基づく。インビトロにおける研究によって、ＨＳ及びヘパリンが、多糖の硫酸化の程度と相関してＴＴＲ原線維発生を促進し、そしてＴＴＲ上の特異的な結合配列を通じて働くことが明らかになった。この促進作用は、ヒトＴＴＲを発現するショウジョウバエモデルでさらに検討された。したがって、ＴＴＲのヘパリン／ＨＳとの相互作用は、サイズ依存性及びサイズ選択的であり、硫酸化の程度がより高い多糖が好まれる。
【０００７】
本発明は、ＴＴＲアミロイドーシスを診断するための方法を提供する。方法は、（ａ）ヒト対象由来の体液試料を準備するステップ、（ｂ）前記体液におけるＴＴＲの濃度を決定するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されるＴＴＲ濃度が対照試料よりも高い場合、前記ヒト対象がＴＴＲアミロイドーシスに罹患している又はそれを発症する危険性が高いことを決定するステップを含む。
【０００８】
本発明はまた、体液試料におけるＴＴＲの発現レベルを検出するための抗ＴＴＲ抗体及び１つ又は複数の試薬を含む、上記の診断方法において使用するためのキットをも提供する。
【０００９】
本発明は、ＴＴＲとヘパラン硫酸（ＨＳ）との相互作用を妨害することができる有効量の薬剤を投与することによって、その必要のある患者においてトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを予防、軽減、及び／又は治療するための方法をさらに提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、ＴＴＲアミロイドーシスを予防、軽減、及び／又は治療するための、ＨＳとＴＴＲとの間の相互作用を妨害することができる薬剤の医学的用途にも関する。
【００１１】
さらに、本発明は、ＨＳとＴＴＲとの間の相互作用を妨害することができる薬剤並びに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明の詳細な実施形態は、従属請求項に記載される。
【００１３】
本発明の他の目的、実施形態、細部、及び利点は、以下の図面、詳細な説明、及び実施例から明らかになるであろう。
【００１４】
以下において、本発明を、添付の図に関連して、好ましい実施形態によって、より詳細に説明することとする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、心筋症の心臓における、ＴＴＲアミロイド及びＨＳの共局在を示す顕微鏡画像を示す図である。コンゴレッドにより染色した、心筋症と報告された７０歳の患者由来の心筋切片（１５μｍ厚）を偏光下で観察し（Ａ）、隣接する切片をアルシアンブルーにより染色した（Ｂ）。（Ａ）及び（Ｂ）中の矢印は、隣接する位置を示す。さらなる切片を、ＴＴＲ（Ｃ）及びＨＳ（Ｄ）に対する抗体により二重免疫染色した。（Ａ）及び（Ｂ）からの蛍光チャネルをマージすることにより、患者検体におけるＴＴＲ及びＨＳについての重複ポジティブシグナル（Ｅ）並びに年齢が一致する対照対象におけるＴＴＲのネガティブ染色（Ｆ）が示された。ＤＡＰＩ  核に対する対比染色（青色）。原寸：Ａ〜Ｆ：２００×、スケールバー：５０μＭ。
【図２】図２は、野生型ＴＴＲのｐＨ依存性の線維化を示す図である。ＴＴＲ（５０μＭ）を、表示されたｐＨ値のリン酸−クエン酸バッファー中に溶解し、４８時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後に、試料は、ＴｈＴ蛍光（Ａ）を使用して、それらの線維含有量について分析した。線維形成は、ｐＨ２．７でインキュベートした試料においてのみ検出され、同じｐＨでヘパリンの存在下においてインキュベートした試料（８０００ＡＵ；図３Ａ）と比較して、非常に少量（２００ＡＵ）であった。ＴＴＲ（５００μＭ）を、上記と同じ条件下でインキュベートし、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した（Ｂ）。ゲルの下部に移動した濃いバンドは、単量体及び二量体を示す。
【図３】図３は、ＷＴ  ＴＴＲ凝集に対する、ヘパリン及びＨＳの効果を示す図である（Ａ、Ｂ）。リン酸バッファー中に溶解したＴＴＲ（５０μＭ、ｐＨ２．７）を、４８時間、３７℃で、単独で又は様々なヘパリン若しくはＨＳ（１２μＭ）と共にインキュベートした。インキュベーションの後に、試料をＴｈＴと混合し、蛍光を測定した。示すデータは、三つ組の実験（平均±ＳＥＭ）を示す。（Ｃ）同じ条件下でヘパリン（０、５、又は２０μＭ）と共にインキュベートしたＴＴＲ（５００μＭ）を、「方法」において記載されるようにｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルは、ヘパリンと共に又はヘパリンなしでインキュベートしたＴＴＲの異なる移動パターンを示す。濃縮用ゲル中で移動させた線維は示されていない。（Ｄ）ヘパリンとのインキュベーションの後のＴＴＲの顕微鏡分析。試料をガラス上に配置し、コンゴレッドにより染色した。画像は、蛍光（原寸：２０×；スケールバー：５μｍ）及び偏光（挿入図）下で取得した。
【図４】図４は、ＴＴＲ線維へのヘパリン統合を示す図である。リン酸バッファー（ｐＨ２．７）中に溶解したＴＴＲを、４８時間、３７℃で、ヘパリン（３Ｈ標識及び非標識の混合物）と共に共インキュベートした。（Ａ）ＴＴＲ−ヘパリン共インキュベート試料及びヘパリン単独を、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより分離し、アルシアンブルーにより染色した。（Ｂ）同一のセットの試料を上記のようにｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ上で分離し、それぞれのレーンを６つの切片に切断した（Ａに示す）。ゲル片は、ヘパリンを抽出するためにＨ２０中で２時間インキュベートした。放射活性をシンチレーション測定によって測定した。
【図５】図５は、あらかじめ凝集させたＴＴＲと共にインキュベートした、ヘパリンの分析を示す図である。リン酸バッファー（ｐＨ２．７）中に溶解したＴＴＲを、４８時間、３７℃で、ヘパリンなしでインキュベートした。その後、ヘパリン（３Ｈ標識及び非標識の混合物）を追加し、ＴＴＲ−ヘパリン試料を３７℃でさらに１時間インキュベートした。試料を、その後、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを、図４Ａにおいて示されるように６つの切片に切断した。それぞれの切片における放射活性を、シンチレーション測定によって測定した。データは、三つ組の実験（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図６】図６は、やや酸性の条件でのＴＴＲに対するＨＳ／ヘパリンの結合を示す図である。（Ａ）解離ＴＴＲを、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定し、ヘパリン（１０μＭ）を、中性又はやや酸性の条件で固定ＴＴＲと相互作用させた。（Ｂ）様々なｐＨでのＴＴＲへのＨＳ  ＩＩ（１０μＭ）の結合をモニターし、それぞれの試料についての応答を応答単位（ＲＵ）として表現する。実験を３回繰り返した、また、グラフは代表的な結果を示す。（Ｃ）ｐＨ５．０又はｐＨ７．４で７日間、ヘパリン又はＨＳ  ＩＩと共にインキュベートしたＴＴＲ（５０μＭ）をＴｈＴ蛍光によって分析した。データは三つ組の実験（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図７】図７は、ＴＴＲに対するヘパラン硫酸（ＨＳ）及びヘパリンの結合親和性を示す図である。解離ＴＴＲを、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定した。ヘパリン（Ａ）、ＨＳ  ＩＩ（Ｂ）、又はＨＳ  Ｉ（Ｃ）を、ｐＨ５．０で表面上に一連の濃度（０．００１〜７０μＭの範囲）でインジェクトした。それぞれの濃度についての応答を、曲線の定常状態領域で測定した。見かけの平衡解離定数（ＫＤ）は、それぞれの濃度についての定常状態での応答をヘパリン／ＨＳ濃度に対してプロットすることによって計算した。データを式に適合させた：応答＝（Ｒｍａｘ＊Ｃ）／（ＫＤ＋Ｃ）、ここで、Ｃは、ヘパリン／ＨＳの濃度とする。系における質量移動限界の効果の可能性を評価するために、２つの分析物の流速（２０及び３０μｌ／分）について試験した。流速を変化させても、得られたＫＤ値に対して著しい効果はなく、質量移動効果は、アッセイにおいて制限因子にならなかったことを示した。示した値は、３つの独立した実験の平均値である。（Ｄ）解離ＴＴＲを固定した表面上にインジェクトしたチオフラビンＴ（５０μＭ）は、結合をもたらさなかった。対照的に、凝集ＴＴＲを固定した表面上へのチオフラビンＴのインジェクションは、著しい結合を明らかにした。
【図８】図８は、ＴＴＲ中のＨＳ／ヘパリン結合配列の同定を示す図である。（Ａ）ヒスチジン「（＋）」及び他の塩基性アミノ酸「＋」にマークしたＴＴＲアミノ酸配列。（Ｂ）等モルのＴＴＲペプチド又は完全長タンパク質（酸性解離あり又はなし）を、ｐＨ５．０で、３Ｈ標識ヘパリン（１５００ｃｐｍ）と共にインキュベートした。ペプチドに結合した３Ｈ標識ヘパリンの量を、ニトロセルロースフィルタートラップ法を使用して分析した。
【図９】図９は、ヘパリンへのＴＴＲペプチド結合のＳＰＲ分析を示す図である。ヘパリンは、表面チオールカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ（ＣＭ５）上に固定した。ヒスチジン残基を含有するＴＴＲ配列（図５Ａ）上の領域に由来するペプチド（２４〜３５、５１〜６１、及び８４〜９４）を、ｐＨ５．０でヘパリン表面と相互作用させた（ペプチド濃度２５μｇ／ｍｌ；流速２０μｌ／分）。ニトロセルロースフィルター結合アッセイによって分析した結果と一致して（図５Ｂ）、アミノ酸２４〜３５のペプチドのみがヘパリンと相互作用した（赤色）。
【図１０】図１０は、未変性ＴＴＲに対するＨＳ結合活性の低下を示す図である。（Ａ）等量の解離又は未変性タンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定し、ＨＳ  ＩＩを、ｐＨ５．０で固定ＴＴＲと相互作用させた。（Ｂ）ＨＳ  ＩＩ−ＴＴＲ相互作用シグナルの値は、様々なリガンド密度（２５０〜３０００ＲＵ）を有する３つのチップを使用して、繰り返し実験によって得た。シグナルは１０００ＲＵのリガンド密度に対して標準化した、また、平均値を示す。統計分析は、ｔ試験によって行った。
【図１１】図１１は、細胞培養におけるＴＴＲ線維形成に対するＨＳの効果を示す図である。解離ＴＴＲを、ＷＴ（ＣＨＯ−ＷＴ）及びＨＳ欠損（ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７）細胞に追加し、４８時間培養した。（Ａ）ＰＢＳにより十分に洗浄した後に、細胞に結合したＴＴＲ線維を抽出するために、細胞を１％  ＮａＯＨ中に溶解した。溶解した物質をＴｈＴと混合し、蛍光を測定した。値は、３つ組の実験（平均±ＳＥＭ）を示す。統計分析は、ｔ試験によって行った。（Ｂ）細胞を固定し、抗ＴＴＲ抗体（ＨＰＡ００２５５０；緑色）により免疫染色した。ＤＡＰＩ対比染色は青色で示す。原寸：２０×、スケールバー：２０μＭ。
【図１２】図１２は、インビボにおけるＴＴＲ線維形成に対するヘパリンの効果を示す図である。（Ａ）ＴＴＲ形質転換ハエの卵を、通常の培地（対照）又は低分子量ヘパリン（Ｋｌｅｘａｎｅ（登録商標））若しくはヘパリンを補足した培地上で培養した。頭部を羽化の９〜１７日後に収集し、生理食塩水中に溶解した。抽出物をＴｈＴ染色によって分析した。値は、二つ組の実験の平均を示す。（Ｂ）ショウジョウバエ頭部溶解産物におけるヘパリンの存在を、ドットブロット染色アルシアンブルーにより分析した。ヘパリン（２５ｎｇ及び５０ｎｇ）をポジティブ対照として使用した。２５マイクロリットルの溶解産物（ＴｈＴ分析に使用したのと同じ試料）をナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、アルシアンブルー（２５％イソプロパノール及び３％酢酸中に溶解した０．５％アルシアンブルー）により染色した。
【図１３】図１３は、未変性ＴＴＲ上のヘパリン／ＨＳ結合ドメインを示す図である。未変性ＴＴＲ上のヘパリン／ＨＳ結合部位を示す、ＰｙＭｏｌプログラムによって生成したＴＴＲ二量体のモデル（ＰＤＢ受託１ＤＶＱ（１））。ＴＴＲヘパリン／ＨＳ結合にとって重要であることが予想される、このドメインにおける塩基性アミノ酸のクラスター（３１−ＨＶＦＲＫ−３５）をマゼンタでマークする。結合部位は、未変性ＴＴＲ四量体形態の構造中に部分的に埋まっており、未変性ＴＴＲの低ＨＳ結合活性についての理論的根拠を提供する。
【図１４】図１４は、ショウジョウバエ頭部から調製した凍結切片の、ＴＴＲ形質転換ハエ（Ａ〜Ｇ）共焦点顕微鏡検査法分析におけるヘパリン−ＴＴＲ共局在の検出を示す図である。（Ａ）脳（Ｂｒ）、視葉（ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｂｅ）（Ｏｌ）、及び網膜（Ｒｅ）を示す、ＤＡＰＩ（青色）により染色したショウジョウバエ頭部の全体図の画像。標準的な培地（Ｂ）又はヘパリンを補足した培地（Ｃ）上で培養した形質転換ハエから調製した切片を、抗ＴＴＲ抗体により染色した（赤色）。（Ｄ）ヘパリンを補足した培地上で培養した形質転換ハエから調製した切片を、ＴＴＲ（赤色）及びヘパリン（緑色）に対する抗体により染色した。ＴＴＲ及びヘパリンの同時沈着が網膜において観察された。（Ｅ）ＴＴＲ及びヘパリンの染色のマージを示す、（Ｄ）においてマークした領域からｚ−スタックによって生成した拡大３Ｄ画像。（Ｆ）通常の培地で飼育した形質転換ハエから調製した切片におけるＴＴＲ及びヘパリンに対する染色、並びに（Ｇ）ヘパリンを補足した培地上で給餌した非形質転換ハエ由来の切片  原寸：Ａ  １０×；Ｂ、Ｃ  ２０×；Ｄ〜Ｇ  ６３×。スケールバーを示す。
【図１５】図１５は、ＴＴＲ凝集に対するヘパリン／ＨＳの効果を示す図である。（Ａ）四量体不安定化（酸性条件によって促進される）は、ヘパリン／ＨＳ結合ドメインが露出する単量体の形成に至る。やや酸性の条件は、ヘパリンへのＴＴＲの結合を促し、線維形成を促進するための足場を提供する。（Ｂ）心組織におけるＴＴＲアミロイドーシスの仮説のメカニズム。高齢者の心臓におけるＨＳ構造において起こり得る変化（硫酸化の程度の増加）（左）が、より若い個人における正常なＨＳ構造（右）と比較して、ＴＴＲ−ＨＳ相互作用を促進し、老化と関連する、心臓におけるＴＴＲの蓄積及び沈着を引き起こす可能性がある。
【図１６】図１６は、ＴＴＲのアミノ酸２４〜３５に対して産生される抗体が、四量体形態すなわち未変性ＴＴＲ、とは対照的に、ＴＴＲの単量体形態すなわち解離形態に対して特異的であることを示す図である。
【図１７】図１７は、抗体が、その変性形態ではなく、未変性ＴＴＲペプチドの２４〜３５を認識したことを示す図である。また、抗体が、ヒト血漿中のＴＴＲを認識することも示す。
【図１８】図１８は、細胞培養におけるＴＴＲ内部移行に対するＨＳの効果を示す図である。解離ＴＴＲ（５μＭ）を、ＷＴ（ＣＨＯ−ＷＴ）及びＨＳ欠損（ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７）細胞に追加し、Ｆ１２餓死培地（Ｇｉｂｃｏ）中で４８時間培養した。細胞は、抗ＴＴＲ抗体（明るい灰色）及び核染色のためのＤＡＰＩにより染色した。（ａ）ＴＴＲポジティブシグナルは、ＣＨＯ−ＷＴ細胞についての核と関連することが分かった。（ｂ）パネルａにおいてマークした領域の拡大図。（ｃ）ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７細胞はＴＴＲ染色されなかった。画像は、蛍光顕微鏡により撮影した。原寸、４０×。スケールバーを示す。
【図１９】図１９は、野生型細胞の核内に検出され得る、解離ＴＴＲの迅速な内部移行を示す図である。解離ＴＴＲ（５μＭ）を、ＷＴ（ＣＨＯ−ＷＴ）及びＨＳ欠損（ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７）細胞に追加し、Ｆ１２餓死培地（Ｇｉｂｃｏ）中で１．５時間培養した。細胞は、抗ＴＴＲ抗体（明るい灰色）及び核染色のためのＤＡＰＩにより染色した。（ａ）ＴＴＲは、ＣＨＯ−ＷＴ細胞の核周囲領域に観察される。（ｂ）パネルａにおいてマークした領域の拡大図。（ｃ）１μｍ厚の共焦点ｚ−スキャン画像をパネルｂにおいてマークした領域から撮った。画像は、Ｉｍａｒｉｓ  Ｂｉｔｐｌａｎｅ画像処理ソフトウェアを使用して、３Ｄモデルで処理した。（ｄ）ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７細胞はＴＴＲ染色されなかった。画像は、共焦点走査型蛍光顕微鏡により撮影した。原寸、２０×。スケールバーを示す。
【図２０】図２０は、凝集ＴＴＲが野生型細胞と結合することを示す図である。解離ＴＴＲ（５μＭ）を、ＷＴ（ＣＨＯ−ＷＴ）及びＨＳ欠損（ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７）細胞に追加し、Ｆ１２餓死培地（Ｇｉｂｃｏ）中で１．５時間培養した。細胞は、抗ＴＴＲ抗体（円で囲んだ領域）及び核染色のためのＤＡＰＩにより染色した。（ａ）凝集ＴＴＲと共にインキュベートしたＣＨＯ−ＷＴ細胞の代表的な画像。（ｂ）パネルａにおいてマークした領域の拡大図。（ｃ）ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７細胞はＴＴＲ染色されなかった。画像は、共焦点走査型蛍光顕微鏡により撮影した。原寸、２０×。スケールバーを示す。
【図２１】図２１は、ヘパリンが凝集ＴＴＲに結合することを示す図である。組換え野生型ＴＴＲ（５００μＭ）をリン酸バッファー（ｐＨ７．４又は２．７）中に溶解し、示した時間、３７℃でインキュベートした。（ａ）インキュベートした試料を、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥにより凝集についてのそれらの程度について分析した。（ｂ）試料は、室温で、３０分間、３Ｈ標識ヘパリンと共にインキュベートした。凝集の程度が様々な試料に結合したヘパリンの量を、ニトロセルロースフィルタートラップ法によって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）が、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連性のアミロイドーシスの病因において役割を果たすかどうかを決定することを目的とする研究に基づく。
【００１７】
アミロイド心筋症と診断された患者由来の心臓検体の免疫組織学的検査は、ＴＴＲアミロイド沈着物を伴う実質的なＨＳ蓄積を明らかにしたが（図１）、ＴＴＲポジティブシグナルのうちのいくつかは、大部分は血管壁において、ＨＳと重複しなかった。高程度のＨＳ−ＴＴＲ共局在についてのこの発見は、ＴＴＲアミロイドーシスにおいてＨＳが機能している可能性を検討する動機付けとなった。この問題について検討するために、本発明者らは、インビトロ及びインビボ実験によって、ヘパリン／ＨＳの非存在下又は存在下においてその凝集を評価するために、組換えヒトＷＴ  ＴＴＲを用いた。
【００１８】
ＴＴＲ凝集／アミロイドーシスが、オリゴマーを自発的に形成する不安定な単量体を生成する、未変性四量体の解離によって開始されることが証明された。以前の報告と一致して、本発明者らは、ゲル電気泳動によって分析されるように、ｐＨ２．７でのインキュベーションで組換えＷＴ  ＴＴＲの解離を確認した。アミロイド様線維の形成は、ＴｈＴ蛍光染色によって定量化し、オリゴマーの形成は、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって評価した。本発明者らは、ＷＴ  ＴＴＲが、ｐＨ２．７での４８時間３７℃でのインキュベーションに際してある程度まで自発的に凝集することを発見したが、より高いｐＨでは凝集しなかった（図２）。しかしながら、やや酸性の条件下での長期間のインキュベーションは、ＴＴＲの凝集をもたらし（図６Ｃ）、異なるｐＨ条件でのＴＴＲ凝集の動態の変化を示した。いかなる理論にも制限されるものではないが、これは、心筋症の心臓における酸素供給のたび重なる不足が、ＴＴＲ凝集を促し得る酸性化環境生じさせるインビボにおける状況を反映している可能性がある。
【００１９】
ＨＳの一般に使用される類似体であるヘパリンの追加は、ｐＨ２．７及び５．０でＴＴＲ線維化を非常に促進した（図３Ａ及び６Ｃ）。特に、ヘパリンの包含は、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ分析によって実証されるように、特異なパターンのＴＴＲ凝集体をもたらした。実質的な量の高分子が、ゲルの一番上にとどまり、オリゴマー種の低下又は不在を反映した（図３Ｃ）。ヘパリンが単量体／オリゴマー線維構築の割合を変化させる又は凝集経路の方向を変える可能性がある。
【００２０】
ヘパリンがＴＴＲ線維の中に組み込まれるという発見（図４）は、ＨＳ／ヘパリンが、足場の役割を果たし、ミスフォールドしたＴＴＲ単量体を「集め」、線維の中に組み込まれ得ることを示唆する。いかなる理論にも制限されるものではないが、これは、細胞表面上の又は細胞外マトリックスにおけるＨＳが、アンフォールドＴＴＲ単量体の蓄積及び凝集を促進するように足場／触媒として機能するインビボにおけるＴＴＲ−ＨＳ凝集を反映し得る。図１５中の図解は、ＨＳ媒介性のＴＴＲ線維化についてのこの仮説を示す。
【００２１】
ＨＳもまた、最近の報告と一致して、ＴＴＲ原線維発生を促進したが、ヘパリンと比較して程度が低かった（図３Ａ及び３Ｂ）。興味深いことには、ＨＳの促進能力は、硫酸化の程度と関連する。５％の三硫化二糖を含有するＨＳ  Ｉは、ＴＴＲ凝集に対してわずかな効果しか有していなかったが、４５％の三硫化構成成分を含有する高度に硫酸化されたＨＳ  ＩＩは、ＴＴＲ凝集に対してより強い効果を有した。ヘパリン又は２つのＨＳ調製物に対するＴＴＲ結合の比較は、親和性の差異が硫酸化の程度と相関することを明らかにした。ＴＴＲは、ＨＳ  ＩＩと比較した場合、ヘパリンに対して１０倍高い親和性を示し、低硫酸化ＨＳ  Ｉと比較した場合、１０００倍を超えるより高い親和性を示した（図７）。しかしながら、以前の結果は、コンドロイチン硫酸が、アミロイドペプチドの凝集を促進せず、ＨＳの微細構造もまたその効果にとって重要であることを示唆することを示した。
【００２２】
興味深いことに、高齢者の個人の大動脈におけるＨＳが若い対象由来のＨＳよりもより硫酸化されていることが分かったように、ＨＳ硫酸化の程度は、年齢依存性であることが報告されている。同時に、アミロイドの大動脈沈着は、８０歳を超えるすべての調査した対象において見つけられた。これは、大動脈アミロイドーシスとのＨＳ硫酸化における年齢依存性の変化の関連を示唆し得る。高齢者の心臓におけるＷＴ  ＴＴＲアミロイドーシスの高い発生率がＨＳ構造の同様の変化と関連するかどうかは、未だ確認されていない。
【００２３】
長い間問われてきた疑問は、ＷＴ  ＴＴＲが、十分に実証されている熱力学的安定性にもかかわらず、なぜアミロイドを形成するのかということである。ＷＴ  ＴＴＲ中のアミノ酸２４〜３５の配列がヘパリンに有効に結合することを示す本発明者らの結果は、この目的のために説明を与え得る。ＴＴＲの未変性形態では、このペプチドは隠れており（図１３）、ＨＳと相互作用することができない。タンパク質が解離すると、この配列は露出するようになり、ＨＳとの相互作用が促される。近接する３つの塩基性アミノ酸を有するペプチド（３１−ＨＶＦＲＫ−３５）の塩基性特性は、静電的相互作用による、負電荷ＨＳ／ヘパリンへの結合に適合する。このことは、同様のＨＳ／ヘパリン結合モチーフが、アミロイド−ベータ（１３−ＨＨＱＫ−１６）及び血清アミロイドＡ（３４−ＫＹＦＨＡＲＧＮ−４１）のような他のアミロイドペプチドについて同定されたので、興味深い。
【００２４】
さらに、Ｖ３０Ｍ突然変異（家族性アミロイド多発ニューロパチーと関連する）を含有する対応するペプチドよりも、ＷＴペプチド（アミノ酸２４〜３５）にヘパリンがより結合するという本発明者らの発見（図８Ｂ）は、今までによく理解されていないＶ３０Ｍ突然変異体及びＷＴ  ＴＴＲが組織特異的沈着において差異を示すという事象についての、可能性のあるメカニズムを示唆し得る。この異なる沈着パターンが、突然変異体ＴＴＲと比較したＷＴのＨＳ結合特性に相関するかどうか、さらに調査されるべきである。ＷＴ及びＶ３０Ｍ  ＴＴＲのアミロイド沈着物由来のＨＳ構造の検査は、組織特異的ＨＳ発現とのＴＴＲ沈着の相関を確立するのに有益であり得る。
【００２５】
さらに、本発明者らは、ＴＴＲ線維化に対するＨＳ／ヘパリンの効果を細胞モデルにおいて再現することができるかどうかについての知見を得たかった。ＨＳを発現するＷＴ  ＣＨＯ細胞とのＴＴＲのインキュベーションにより、実質的な量のアミロイド様線維が生成された、また、それに比べて、ＨＳ欠損ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７細胞は、わずかな量の線維しか産生しなかった（図１１）。この結果は、ＣＨＯ−ＷＴ細胞における強いＴＴＲ免疫染色と組み合わせて、ＴＴＲ線維化における細胞性のＨＳについての可能性のある役割を明確に示す。この効果は、さらにアミロイド形成的ＴＴＲを発現するショウジョウバエモデルにおいて実証された。ヘパリンを動物に給餌することにより、ＴＴＲアミロイド様線維の形成が促進され、これは、ヘパリン断片（Ｋｌｅｘａｎｅ（登録商標））を給餌したハエにおいて観察されない結果であった。同様に、ＴＴＲ及びＨＳに対する抗体による免疫組織染色により、ＴＴＲ及びヘパリンの同時沈着が確認された。
【００２６】
１８量体のヘパリン断片（４，５００ＤａのＭｒ）は、完全長ヘパリンよりもよくインビトロにおけるＴＴＲ凝集を促進したが（図３Ａ）、Ｋｌｅｘａｎｅ（登録商標）（４，５００Ｄａの平均Ｍｒを有する）は、インビボにおいてＴＴＲ線維化を促進しなかったことに注目すべきである。いかなる理論にも制限されるものではないが、この明らかな相違は、Ｋｌｅｘａｎｅ（登録商標）の分子の不均一性によるものであるかもしれない。調製物中のより小さな断片は、ハエモデルにおいてＴＴＲ凝集を妨害し得るが、インビトロにおける実験において使用されるヘパリン１８量体は、均質の調製物である。実際に、低分子量ヘパリン及びヘパリン様の断片は、ＳＡＡ及びアミロイド−ベータペプチドのアミロイド形成を阻害することが以前に示された。これは、最適なサイズのヘパリンがＴＴＲ−ＨＳ相互作用を妨害し、ＴＴＲ凝集を減じ得る可能性を高める。
【００２７】
この発見は、ＴＴＲ代謝を調整する際に、ＨＳが二重の役割を果たし得ることを示唆する。マクロファージのような細胞表面上で発現されたＨＳが、ＴＴＲの単量体形態の内部移行を促進して、その凝集を予防し（図１９）、また、細胞外マトリックス上で発現されたＨＳは、より安定した線維に形成される毒性オリゴマーを運ぶための足場として機能し得る（図２０）。
【００２８】
要約すれば、ＷＴ  ＴＴＲ線維化におけるアミロイド前駆体生成性の（ｐｒｏ−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）因子に関する情報は乏しい。大多数のＴＴＲ関連性アミロイドーシスが、ＷＴ  ＴＴＲ沈着によって引き起こされる散発性の症例であるので、ＷＴ  ＴＴＲ沈着の病理学的なメカニズムの理解は、ＳＳＡの予防及び治療にとって有益なことである。本発明者らのデータは、心筋症の心臓におけるＷＴ  ＴＴＲとのＨＳの同時沈着の最初の証拠を提供し、ＴＴＲの特異的なドメインに対する選択的な結合を通した、ＴＴＲ凝集におけるＨＳ／ヘパリンのアミロイド前駆体生成性機能を例示する。結果は、ＨＳが、高齢者集団の心臓においてＴＴＲ凝集／アミロイドーシスに影響を及ぼす、可能性のあるメカニズムを示唆する。結果は、他のアミロイド前駆体に関係する報告と一致しており、総合的に、アミロイド関連性の疾患についての効力のある治療剤の設計を支援し得る。
【００２９】
本発明の結果に基づいて、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）を含むが、これらに限定されないＴＴＲアミロイドーシスは、ＴＴＲとのＨＳの相互作用を妨害することにより、予防されてもよい、軽減されてもよい、回復させられてもよい、及び／又は治療されてもよい。これは、そのような予防、軽減、回復、及び／又は治療を必要とするヒト患者に、ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害する能力を有する、有効量のＨＳ／ヘパリン由来断片若しくはミメティック、ＴＴＲ由来ペプチド若しくは修飾ペプチド、又は抗ＴＴＲ抗体を投与することによって達成されてもよい。
【００３０】
ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害することができる薬剤の「有効量」とは、ＴＴＲの有害な効果が少なくとも改善するレベルを意味する。言いかえれば、そのような薬剤の有効量は、ＴＴＲとのＨＳの結合、そのような結合は有害である又は望まれない、を遮断する又は部分的に遮断するのに十分な量である。ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害することができる薬剤の投与量及びレジメンは、アミロイドーシスを治療する臨床技術分野における当業者らによって容易に決定することができる。一般的に、そのような干渉薬剤の投薬量は、治療される患者の年齢、性別、及び健康状態；もしあれば併用療法の種類；治療の頻度及び望まれる効果の性質；組織損傷の程度；症状の継続期間；並びに個々の医師によって調整される他の変動要素などに依存して変動するであろう。望まれる用量は、望まれる結果を得るために１つ又は複数の使用において投与することができる。
【００３１】
ＨＳとＴＴＲとの物理的な相互作用を妨害する薬剤は、１つ又は複数の薬学的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物として製剤されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物が、単位剤形として提供される。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、経口送達、静脈内、腹腔内、皮下、経皮的、局所的、及び局所投与を含むが、これらに限定されない様々なルートによって投与されてもよい。
【００３３】
非経口又は局所的投与の目的のために、医薬組成物は、たとえば溶液、懸濁液、又はエマルションとして製剤されてもよい。製剤は、滅菌水性又は非水性溶媒、共溶媒、可溶化剤、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤、及び／又は粘性の薬剤を必要に応じて含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害する薬剤が、注射用滅菌水中に溶解され、ｐＨは、好ましくは、約６〜８に調整され、溶液は、好ましくは、等張となるように調整される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物が、要望に応じて還元されることとなる濃縮形態又は粉末の形態で提供されてもよい。凍結乾燥の場合には、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖（スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）、及びアルブミンを含むある種の凍結保護剤が、好ましい。還元用の溶液がパッケージングに追加される場合、それは、たとえば、注射用の純水又は塩化ナトリウム溶液又はデキストロース又はグルコース溶液からなってもよい。
【００３５】
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸剤、トローチ、ロゼンジ、粉末、及び顆粒剤を含む。そのような固体剤形では、活性化合物は、スクロース、ラクトース、又はデンプンのような少なくとも１つの不活性賦形剤と混合されてもよい。そのような剤形はまた、通常の手段であるように、医薬補助物質、たとえばステアレート潤滑３５薬剤又は香味料を含んでいてもよい。固体経口製剤はまた、活性成分の放出を調整する腸溶性又は他のコーティングと共に調製することもできる。
【００３６】
経口投与のための液体剤形は、水及びアルコールのような当技術分野において一般に使用される不活性で無毒性の希釈剤を含有する薬学的に許容できるエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。そのような組成物はまた、湿潤剤、バッファー、乳化剤、懸濁化剤、甘味料、及び香味料のような補助剤を含んでいてもよい。
【００３７】
本発明の医薬製剤を製剤化するための手段及び方法は、当業者らに知られており、それ自体知られている様式で、たとえば、従来の混合、造粒、溶解、凍結乾燥、又は同様のプロセスの手段によって、製造されてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害することができる薬剤は、ヘパリン／ＨＳ断片又はそのミメティックである。適したヘパリン／ＨＳ分子は、非抗凝血性ヘパリンの二糖、四量体、六量体、八量体、十量体、１２量体、１４量体、１６量体、及び１８量体を含むが、これらに限定されない。しかしながら、いくつかの実施形態では、完全長非抗凝血性ヘパリンが、使用されてもよい。さらに、ヘパリン／ＨＳポリマー、オリゴマー、又は断片の硫酸化の程度は、三硫化及び一硫化単糖の間で変動してもよい。いくつかの実施形態では、非凝固薬ヘパリンの治療上の効率が、硫酸化の程度が高くなるほど、治療上の効率が高くなるように、変動してもよい。
【００３９】
用語「ヘパリン／ＨＳミメティック」は、ヘパリン／ＨＳと類似しているが、異なる硫酸化オリゴ糖を指す。そのようなオリゴ糖は、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸化Ｋ５多糖、硫酸化天然多糖及びオリゴ糖（植物及び海由来の）、並びに合成硫酸化オリゴ糖を含むが、これらに限定されない。さらに、構造は、長さ及び硫酸化のレベルを含めて、本発明の様々な実施形態において変動してもよい。
【００４０】
他の実施形態では、ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害することができる薬剤が、ＴＴＲ由来ペプチド又はその修飾ペプチドである。そのようなペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるもの、配列番号１のアミノ酸２４〜３５を含む又はそれからなるペプチド、配列番号１のアミノ酸５０〜６１又は１０〜２４を含む又はそれからなるもの、アミノ酸配列ＫＶＬＤＡＶＲＧＳＰＡＩＮＶＡＶＨＶＦＲＫ（配列番号２）を含む又はそれからなるもの、好ましくは、アミノ酸配列ＡＶＨＶＦＲＫＡＡ（配列番号３）を含む又はそれからなるもの、より好ましくは、アミノ酸配列ＶＨＶＦＲＫ（配列番号４）を含む又はそれからなるもの、及び前記ペプチドの任意の組み合わせを含む。本発明において使用するに適した修飾ペプチドは、配列番号１又はその断片において示される配列と比較して、それらのアミノ酸配列中に少なくとも１つの修飾を有し、ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害する能力を保持するものを含む。言いかえれば、本発明において使用するのに適したペプチドは、それらがＴＴＲとＨＳとの相互作用を妨害する能力をなお有することを条件として、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するものを含む。
【００４１】
さらに他の実施形態では、ＨＳとＴＴＲとの相互作用を妨害することができる薬剤が、遮断抗体、好ましくは、配列番号１に示されるようなＴＴＲのアミノ酸２４〜３５に又は配列番号１のアミノ酸５０〜６１若しくは１０〜２４又はその任意の組み合わせに特異的に結合する抗体である。治療用抗ＴＴＲ抗体は、当技術分野において知られている任意の標準的な方法によって産生されてもよい。そのような抗体は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、又は組換え抗体であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。他のいくつかの好ましい実施形態では、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶ、又は単鎖ＦＶ断片のような抗体断片が使用されてもよい。
【００４２】
本発明において使用するための抗ＴＴＲ抗体は、化学的に又は遺伝子操作によって、望まれる作用部位に対する抗体のターゲティングをもたらす他の薬剤にコンジュゲートされてもよい。その代わりに、他の化合物が、化学的に又は遺伝子操作によって、抗体に対してさらなる特性、とりわけ、ＨＳとＴＴＲとの相互作用によって媒介される有害な効果の軽減を促進する抗体の能力を増強する特性を拡張する又は提供するために、本発明による抗体にコンジュゲートされてもよい。
【００４３】
いくつかの態様では、本発明は、ＴＴＲアミロイドーシスの予測及び／又は早期診断法のための診断方法に関する。いくつかの実施形態では、抗ＴＴＲ抗体が、ＦＡＰ、家族性心アミロイドーシス、及びＳＳＡのようなＴＴＲアミロイドーシスに罹患していることが疑われる又は罹患する危険性がある患者の血漿又は脊髄液中の、未変性ＴＴＲ濃度を検出するために使用されてもよい。現時点では、ＴＴＲアミロイドーシスの原因は、十分に理解されていない。いかなる理論にも制限されるものではないが、ＳＳＡについての１つの可能性のある原因は、肝臓におけるＴＴＲの産生の増加及び血漿への放出であるかもしれない。他のいくつかの実施形態では、抗ＴＴＲ抗体、とりわけ、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸２４〜３５又は配列番号１のアミノ酸５０〜６１若しくは１０〜２４又はその任意の組み合わせに選択的に結合するものが、ＴＴＲアミロイドーシスに罹患していることが疑われる又は罹患する危険性がある患者の血漿又は脊髄液中の、ＴＴＲ単量体濃度を検出するために使用されてもよい。一般的に、未変性ＴＴＲ四量体は、病的であると見なされない。さらに、いかなる理論にも制限されるものではないが、未変性四量体が解離し、これはおそらく低ｐＨによって引き起こされ、配列番号１のアミノ酸２４〜３５から構成される隠れた部位を露出する単量体がもたらされると考えられる。その後、これらの隠れた部位は、ＨＳと相互作用し、病的な単量体凝集に至る可能性がある。未変性ＴＴＲ四量体の濃度の増加及びＴＴＲ単量体の濃度の増加は、したがって、ＴＴＲの早期診断又はＴＴＲの発病の予測に使用されてもよい。
【００４４】
血漿又は脊髄液のような体液中のＴＴＲ四量体又は単量体の濃度は、当技術分野において知られている従来の方法によって決定されてもよい。たとえば、抗ＴＴＲ抗体、とりわけ、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸２４〜３５又は配列番号１のアミノ酸５１〜６０若しくは１０〜２４又はその任意の組み合わせに結合するものが、ＥＬＩＳＡアッセイ又は単量体ＴＴＲの検出のための他の免疫学的技術に使用されてもよい。さらに、抗ＨＳ抗体及び抗ＴＴＲ抗体の組み合わせは、ＴＴＲ−ＨＳの複合体を検出するために使用されてもよい。これは、たとえば、商業的に入手可能なＤｕｏｌｉｎｋ技術によって、好ましくは血漿若しくは脊髄液において又は固定組織若しくは細胞において、ＨＳとＴＴＲとの相互作用／複合体を検出することによって、達成されてもよい。他の適した方法は、当業者に利用可能である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、抗ＴＴＲ抗体が、検出可能な抗体を提供するために、化学的に又は遺伝子操作によって標識されてもよい。そのような標識抗体は、ＴＴＲの診断において使用されてもよく、画像処理目的にとって有用なツールとなる。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、ＴＴＲアミロイドーシスに罹患していることが疑われる又は罹患する危険性がある患者の、血漿又は脊髄液のような体液中のＴＴＲの量を評価するための１つ又は複数の試薬を含む、ＴＴＲアミロイドーシスの予測及び／又は早期診断法において使用するためのキットに関する。その量又は濃度が評価されることとなるＴＴＲは、ＴＴＲ四量体又は単量体形態をしていてもよい。評価において使用されることとなる試薬は、本明細書において記載される任意の実施形態による抗ＴＴＲ抗体、とりわけ、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸２４〜３５、アミノ酸５１〜６０、アミノ酸１０〜２４、又はその任意の組み合わせに結合するモノクローナル抗体であってもよい。キットは、たとえば免疫学的方法、放射線、若しくは酵素法、又は当技術分野において知られている他の方法によって、ＴＴＲ、とりわけ単量体ＴＴＲが体液中に存在する場合、それに対する前記抗体の結合を検出するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットが、ＥＬＩＳＡアッセイによって、前記抗体への結合がもしあれば、それを検出するための手段を含む。いくつかのさらなる実施形態では、キットが、ＴＴＲ−ＨＳの複合体を検出するための抗ＨＳ抗体を含んでいてもよい。上記の構成成分のいずれも、マイクロタイタープレートのような固体支持体上に固定されて提供されてもよい。
【００４７】
以下の実施例は、より詳細に本発明をさらに明らかにするために示されるが、本発明の範囲を制限するようには意図されない。さらなる適用及び用途は、当業者、すなわち、炎症性障害及びその治療に精通している臨床医によって容易に理解される。
【実施例】
【００４８】
技術が進歩するにつれて、様々な方法で本発明の概念を実施することができることは当業者にとって明白であろう。本発明及びその実施形態は、下記に記載される実施例に制限されず、請求項の範囲内で変更されてもよい。
【００４９】
材料及び方法
ＴＴＲの凝集
組換え野生型ＴＴＲを、以前に記載されるように細菌中で発現し、精製した（Ｆｕｒｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：２４１５−２４２１）。精製タンパク質を、チオフラビンＴ蛍光については５０μＭ又はｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥについては５００μＭの最終濃度まで、２０ｍＭリン酸バッファー−クエン酸（ｐＨ２．７、３．５、４．５、又は７．４）中に溶解した。ヘパリン（３Ｈ標識又は非標識）及びＨＳを、それぞれの図の説明文中に示される濃度までＴＴＲ溶液に追加した。試料を、指定する時間、３７℃でインキュベートした。
【００５０】
ＴＴＲペプチド
ＴＴＲの様々なセグメントに対応する合成ペプチドは、民間の供給者から購入した又は専門家によって合成された。ペプチドの純度及び配列は、ＭＳ／ＭＳ分析によって検証した。
【００５１】
ヘパリン及びＨＳ
ヘパリンは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でゲルクロマトグラフィーによって分析されるように、１４ｋＤａの平均分子量を有する。ＨＳ試料は、ブタ組織から単離し、ＨＳ／ヘパリンリアーゼによる酵素学的切断の後にＲＰＩＰ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。ＨＳ  Ｉは、５％の三硫化二糖（ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ）種を含有し、ＨＳ  ＩＩは、４５％のその種を含有した。３Ｈ標識ヘパリンは、ヘパリンのＮ−脱アセチル化、その後に続くＮ−［３Ｈ］無水酢酸による再Ｎ−アセチル化によって調製した。ヘパリンオリゴ糖は、ヘパリンの部分的な脱アミノ切断、その後に続くＮａＢＨ４による還元によって生成した。断片化ヘパリン試料は、Ｂｉｏ−ｇｅｌ  Ｐ−１０カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上での分離の後に収集した。糖の量は、カルバゾール試薬反応によって定量化した。
【００５２】
ＴＴＲ凝集体の検出
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイ−インキュベーションの後に、５μｌの試料を、２０μＭ  ＴｈＴの最終濃度まで、水中でＴｈＴと混合した。混合物を、平底黒色９６ウェルプレート（Ｇｒａｉｎｅｒ）に移し、蛍光は、それぞれ、４４０及び４８０ｎｍの励起波長及び発光波長で測定した（ゲイン＝５５、ＦＡＲｃｙｔｅ機器）。様々なｐＨで凝集した試料は、ＴｈＴ染色前の、インキュベーションの終了後に中性のｐＨに調整した。実験は、二つ組又は三つ組で実行した。
【００５３】
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ−インキュベーションの後に、１０μｌの試料を、２．５μｌの５×試料バッファー（０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．０５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）と混合し、ＳＤＳなしの１０％ポリアクリルアミドゲル上にロードした。２．５時間、１００Ｖでの電気泳動の後に、ゲルをクーマシーブルーにより染色し、スキャンした。ヘパリンの検出については、ゲルは、アルシアンブルーにより染色した。３Ｈ標識ヘパリンの定量については、ゲル中の対応するレーンを、濃縮用ゲルを含む６つの切片に切断し、シンチレーションバイアルに移し、３ｍｌのＨ２０に入れた（図４Ａを参照されたい）。２時間のインキュベーションの後に、２ｍｌのシンチレーションカクテルを追加し、放射活性を測定した。
【００５４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ヘパリン／ＨＳとのＴＴＲの相互作用は、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉａｃｏｒｅ２０００）を使用して評価した。ＴＴＲは、酸性バッファー（ｐＨ２．７）中で解離させ、その後、５０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）カップリングバッファー中に希釈し、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、３０００ＲＵのレベルまでＣＭ５センサーチップ上に固定した。結合及び反応速度分析については、ヘパリン又はＨＳを、表面上にインジェクトし（図の説明文中に示される濃度）、様々なｐＨで平衡化した。表面は、それぞれの試料の後に、０．５Ｍ  ＮａＣｌによる３０秒間の洗浄ステップにより再生した。得られたセンサーグラムはすべて、基準フローセル及びバッファーブランク試料を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０においてダブルリファレンスサブトラクションを行った（double-reference subtracted）。
【００５５】
細胞培養におけるＴＴＲ凝集
野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＷＴ）細胞及びＨＳ欠損ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ６０及び５０μｇ／ｍｌ）を補足したＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞は、８ウェルＬａｂＴｅｃチャンバー（Ｎｕｎｃ）において６０００細胞／ウェルの密度で接種し、４８時間培養した。ＴＴＲは、酸性バッファー（ｐＨ２．７）中で解離させ、細胞に追加する前に中性のｐＨにＮａＯＨにより中和し（最終濃度５μＭ）、これらを、餓死培地（０．１％ＦＢＳ）中で培養した。４８時間後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳ中で十分に洗浄した。細胞は、その後、１％  ＮａＯＨにより溶解した。溶解産物を遠心分離し（１００００ｒｐｍで１０分間）、上清を、２０μＭ  ＴｈＴの最終濃度まで水中でＴｈＴと混合した。蛍光を上記に記載されるように測定した。ＴＴＲを追加していない培養細胞は、バックグラウンド蛍光を引き算するために対照として使用した。免疫細胞染色（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｓｔａｉｎｉｎｇ）については、細胞を、氷冷９５％エタノール及び５％酢酸中で固定し、ＰＢＳにより洗浄した。細胞を、０．４％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により透過処理し、抗ＴＴＲ抗体（１μｇ／ｍｌ、ＨＰＡ００２５５０、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と共にインキュベートし、１時間、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ４８８抗ウサギＩｇＧ（８μｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベーションした。スライドに、ＤＡＰＩ対比染色剤を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）をマウントした。ＴＴＲ免疫シグナルは、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡｘｉｏＣａｍ機器により取った。
【００５６】
心組織におけるＴＴＲ沈着の検出
心筋症及び対照の心組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片（１５μｍ）を、キシレン中で脱パラフィンし（３０分間）、エタノールバス（９９．９％〜７０％）によって１０分間の間隔で再水和した。コンゴレッド染色については、切片は、最初に、飽和ＮａＣｌ溶液（８０％エタノール／０．１％  ＮａＯＨ；３０分間）中でインキュベートし、その後、ろ過した０．４％コンゴレッド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）飽和ＮａＣｌ溶液に移した（３０分間）。硫酸化グリコサミノグリカンの染色については、切片は、最初に、９５％エタノール／１０％  ＡｃＯＨにおいてインキュベートし（１〜２分間）、その後、硫酸化アルシアンブルー（０．４５％アルシアンブルー８ＧＸ  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（０．４５％  Ｎａ２ＳＯ４／４５％エタノール／１０％  ＡｃＯＨ；４５分間）により染色した。ＴＴＲ及びＨＳの免疫染色については、切片は、抗原性賦活化のためにマイクロ波で加熱し、その後、０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で透過性にした（１５分間）。一次抗体インキュベーションは、４℃で一晩実行した（抗ＴＴＲ：上記に記載；抗ＨＳ、１：２５０  １０Ｅ４：Ｄｒ．Ｇｕｉｄｏ  Ｄａｖｉｄ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍからの寄贈）。蛍光検出については、切片は、室温で、３０分間、４μｇ／ｍｌの適切な二次Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８又は５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）抗体と共にインキュベートし、核は、ＤＡＰＩにより対比染色した。発色性の検出については、適切なＭａｃｈ  ３  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ検出キット（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）は、Ｖｕｌｃａｎ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）により発色させた。蛍光明視野画像は、Ｎｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００Ｆ機器（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）により撮影した。
【００５７】
形質転換ショウジョウバエＴＴＲモデルの分析
突然変異体ＴＴＲを過剰発現する形質転換キイロショウジョウバエ株（Ｄｈｅｔ  ＴＴＲ−Ａ）は、記載されるように生成した（７）。ＴＴＲ形質転換（ｗ；ＧＭＲ−Ｇａｌ４／＋；ＵＡＳ−ＴＴＲ−Ａ／＋）及び非ＴＴＲ形質転換対照ハエ（ｗ；ＧＭＲ−Ｇａｌ４／＋；＋／＋）を研究に使用した。ＴＴＲ発現は、ＧＭＲ−Ｇａｌ４ドライバーの制御下にあり、これは、眼の発達段階の間に光受容体細胞に対してＴＴＲ発現を指示する。動物は、標準的なマッシュポテト／酵母／寒天培地上で室温で培養した。卵は、培地と混合したヘパリン（Ｋａｂｉｖｉｔｒｕｍ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）又は低分子量ヘパリン（Ｋｌｅｘａｎｅ（登録商標））１０ｍｇ／ｍｌを補足した標準的な飼料により飼育した。９〜１７日後に、動物を分析のために収集した。ＴｈＴ染色については、それぞれのグループの１５の頭部を７５μｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中でホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後に、試料を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍで１０分間）、結果として生じる上清を、ＴｈＴと混合した（２０μＭ  ＴｈＴの最終濃度）。蛍光を上記に記載されるように測定した。非ＴＴＲ形質転換ハエは、バックグラウンド蛍光を引き算するために対照として使用した。免疫染色については、ショウジョウバエ（１０〜１４日齢）の頭部から調製したクライオスタット切片（１５μｍ）を空気乾燥し、ＰＦＡ（４％）中で固定した。ＰＢＳ中で洗浄した後に、切片をメタノールバス（２５％〜１００％）によって１０分間の間隔で脱水した。Ｈ２Ｏ２−処理（２％）の後にメタノールバスによる再水和を続け、切片をＰＢＴ（０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）中５％  ＢＳＡにより遮断した。一次抗体（上記に記載される抗ＴＴＲ及び抗ＨＳ／ヘパリン）を遮断溶液中で一晩インキュベートした。蛍光検出については、切片は、遮断溶液中で１時間、２μｇ／ｍｌの適切な二次Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５５５及び６３３抗体と共にインキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後に、切片を、封入剤中のＤＡＰＩにより染色した。画像は、ＰｌａｎＡｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ２０ｘ／０．１６又はＣ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３ｘ／１．２対物レンズを使用して、倒立共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７００、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）により撮影した。
【００５８】
結果
心筋症の心臓におけるＨＳ及びＴＴＲアミロイドの同時沈着
心筋症と診断された患者由来の心臓の１５μｍ厚切片のコンゴレッド染色は、偏光（図１Ａ）下で観察した場合に、青りんご色の複屈折を明らかにし（図１Ａ）、検体におけるアミロイド沈着を実証した。隣接する切片の硫酸化アルシアンブルー染色は、コンゴレッドポジティブ形態に類似するパターンを明らかにした（図１Ｂ）。二重免疫染色により、ＴＴＲ沈着が、大部分、ＨＳと共局在していることを確認した（図１Ｃ、Ｄ、及びＥ）。それに比べて、年齢が一致する対照由来の心臓切片の染色は、ＴＴＲについての免疫シグナルを生成しなかった（図１Ｆ）。ＴＴＲ及びＨＳの同時沈着は、細胞外空間において目立ち、筋細胞膜に密接に結合しているように見えたが、血管系における同時沈着は、より多様であり、いくつかの血管壁は、ＨＳポジティブ染色されなかった（図１Ｃ及びＥ）。ＴＴＲ沈着もＨＳ蓄積も、対照組織において検出されなかった（図１Ｆ）。
【００５９】
ヘパリン及びＨＳは、ＷＴ  ＴＴＲの線維化を促進する
チオフラビンＴ蛍光分析は、細菌系において発現された組換えヒトＷＴ  ＴＴＲが、低ｐＨ（２．７）条件でさえ、４８時間の３７℃でのインキュベーションに際して非常に低い自発的な線維化を示すことを明らかにした（図２）。しかしながら、この条件でヘパリン（ＨＳの類似体）を追加すると、ＴＴＲ凝集を促し、実質的な量のアミロイド様線維が形成された（図３Ａ）。１８糖残基未満の断片（１２量体及び６量体）が、より長いポリマーよりも効果がかなり低かったので、ヘパリン由来オリゴマーとのＴＴＲのインキュベーションにより、ヘパリンのサイズ依存性の効果が明らかにされた。特に、１８量体と共にインキュベートしたＴＴＲは、完全長ヘパリン（約５０量体）とのＴＴＲインキュベーションと比較して、より多くのアミロイド様線維をもたらした。硫酸化の程度がより高いＨＳ（ＨＳ  ＩＩ）は、ヘパリンと比較して低い程度とはいえ、ＴＴＲの線維化を有効に増強したが、低硫酸化ＨＳ（ＨＳ  Ｉ）は、ＴＴＲ凝集に対する効果がわずかであった（図３Ｂ）。
【００６０】
ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによる、ヘパリンと共に又はヘパリンなしでインキュベートしたＴＴＲの分析は、ＴＴＲヘパリン凝集体が異なる移動パターンを示したことを示した。ヘパリンなしのＴＴＲ凝集体の連続的なスミアの出現とは対照的に、ヘパリンとの同時インキュベーションは、単量体、二量体、及び四量体を示す、インキュベーション前に観察された非凝集バンドとは別に、ゲルの一番上に移動する実質的な高分子ＴＴＲ凝集体をもたらした（図３Ｃ）。ＴＴＲ凝集に対するヘパリンのこの効果は、より高濃度でより明白となり、用量依存性の効果を示唆する。ＴＴＲヘパリンインキュベーションは、蛍光及び偏光顕微鏡下で可視化されるように、コンゴレッドポジティブ線維を生成したが（図３Ｄ）、ヘパリンなしでインキュベートしたＴＴＲは、コンゴレッドネガティブであった。
【００６１】
ヘパリンが、結果として生じるＴＴＲ線維の中に吸収され／一緒に線維化されたか又は原線維発生について触媒として単に作用したかどうかを決定するために、ＴＴＲを、３Ｈ標識及び非標識ヘパリンの混合物と共にインキュベートした。共インキュベートしたヘパリン−ＴＴＲ及びヘパリン単独の試料を、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ上で分離した。アルシアンブルー染色は、２つの試料の間で区別できなかったヘパリン移動パターンを可視化した（図６Ａ）。ゲル切片（図６Ａにおいて示されるように切断した）中の放射活性を計算することによる３Ｈ標識ヘパリンの分析は、単独でインキュベートされたヘパリンが、アルシアンブルー染色と一致して、切片４、５、及び６において主に回収されたことを示す（図６Ｂ）。対照的に、ＴＴＲと共に共インキュベートしたヘパリンは、切片４、５、及び６に加えて、切片１（濃縮用切片）において実質的に回収された。特に、アルシアンブルーは、おそらく結果として生じるＴＴＲアミロイド様線維によるマスキング効果により、ヘパリン−ＴＴＲ共インキュベート試料について切片１におけるヘパリンを染色しなかった。
【００６２】
切片１において回収されたヘパリンが、凝集ＴＴＲと相互作用しているヘパリンの結果ではないことを検証するために、３Ｈ標識ヘパリンを、あらかじめ凝集させたＴＴＲと共にインキュベートした。同じ方法による産物の分析は、ヘパリン単独のもの（図４Ｂ）とほぼ同一である、３Ｈ標識ヘパリンの分布パターンを示し（図５）、凝集ＴＴＲと相互作用したヘパリンが全く又はほとんどなかったことを示した。
【００６３】
ＴＴＲヘパリン／ＨＳ相互作用の特徴付け
ＴＴＲヘパリン／ＨＳ相互作用についてのメカニズムをさらに調査するために、本発明者らは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法を使用した。解離ＴＴＲを、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定し、ヘパリンを、中性（ｐＨ７．４）及びやや酸性（ｐＨ５．０）の条件でリガンドと相互作用させた。解離ＴＴＲに対するヘパリン結合は、やや酸性のｐＨにおいて観察されたが、中性の条件においては観察されず、相互作用についてのｐＨ依存性を実証した（図６Ａ）。ｐＨ依存性の相互作用はまた、ｐＨ５．０で実質的な結合を示したが、ｐＨ５．５での結合を著しく低下させたＨＳ  ＩＩ（硫酸化の程度がより高いＨＳ種）についても観察された（図６Ｂ）。ＳＰＲ分光法による分析もまた、ヘパリンに対するＴＴＲの親和性がＨＳ  ＩＩに対してよりも１０倍高く、低硫酸化ＨＳ  Ｉに対してよりも１０００倍以上高いので、ＨＳ／ヘパリンの硫酸化の程度が、この相互作用において役割を果たすことを示した（図７Ａ、Ｂ、及びＣ）。このｐＨ及び硫酸化の程度に依存性の相互作用は、７日間、ｐＨ５．０及び７．４で、ヘパリン及びＨＳ  ＩＩと共にインキュベートしたＴＴＲの線維形成を測定することによって、さらに確認した（図６Ｃ）。
【００６４】
ＴＴＲ−ヘパリン相互作用を特徴付けるために、本発明者らは、３Ｈヘパリンと共にＴＴＲ及びそのペプチド断片をインキュベートした。結合は、ニトロセルロースフィルタートラップ法によって分析した（１８）。試験した１６のペプチドの中で、アミノ酸２４〜３５（ＰＡＩＮＶＡＶＨＶＦＲＫ）のペプチドのみがヘパリンに結合した（図８Ｂ）。このヘパリンに結合するペプチドは、ＴＴＲヘパリン／ＨＳ相互作用において見られるｐＨ依存性のおそらく一因となった、ヒスチジンを含む３つの塩基性アミノ酸を含有する。この選択的結合特性を、ＳＰＲ分析によってさらに検証した（図９）。家族性アミロイドニューロパチーと関連するＶ３０Ｍ突然変異を含有する２４〜３５ペプチドは、ＷＴペプチドと比較して、ヘパリンに対して実質的により低い結合を示した（図８Ｂ）。
【００６５】
結合アッセイから、本発明者らは、ヘパリンが、解離ＴＴＲに優先的に結合することに気づいた（図８Ｂ）。検証のために、本発明者らは、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に解離ＴＴＲ及び未変性ＴＴＲを固定し、ｐＨ５．０で表面上にＨＳ  ＩＩをインジェクトした。得られたセンサーグラムは、解離ＴＴＲに対するＨＳ  ＩＩのより強い結合を明らかにした（図１０）。これらの結果は、ＴＴＲのヘパリン／ＨＳ結合ドメインが、未変性状態でフォールドされているタンパク質において隠れていることを示唆する。
【００６６】
ＨＳ／ヘパリンは、細胞培養において及びインビボにおいてＴＴＲの線維化を促進する
ＴＴＲ線維化におけるＨＳ／ヘパリンの効果がまた細胞にも適用可能であるかどうかを調査するために、解離ＴＴＲを、４８時間、チャイニーズハムスター卵巣ＷＴ（ＣＨＯ−ＷＴ）細胞及びＨＳ欠損（ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７）細胞の培養物と共にインキュベートした（１９）。インキュベーションの後に、細胞は、遊離ＴＴＲを除去するためにＰＢＳ中で十分に洗浄した。細胞溶解産物のＴｈＴ蛍光分析は、ＨＳ欠損ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７細胞と比較して、ＣＨＯ−ＷＴ細胞における実質的な量のアミロイド様線維を明らかにし（図１１Ａ）、ＴＴＲ線維化に対するＨＳの効果を実証した。抗ＴＴＲ抗体による細胞の免疫細胞染色は、ＨＳ欠損細胞（ＣＨＯ−ｐｇｓＤ−６７７）における極微量のポジティブ免疫シグナルを検出し、それに比べて、ＣＨＯ−ＷＴ細胞において、強いポジティブシグナルが見られた（図１１Ｂ）。
【００６７】
ＴＴＲ線維化に対するヘパリンの効果をインビボにおいて評価するために、発明者らは、ヒトＴＴＲの遺伝子操作突然変異体形態を発現する形質転換ショウジョウバエモデルを用いた（１６、２０）。形質転換ハエは、ヘパリン又は低分子量ヘパリン（Ｋｌｅｘａｎｅ（登録商標）を補足した又は補足していない標準的な培地で飼育した。生理食塩水中に抽出したハエ頭部溶解産物のＴｈＴ蛍光分析（方法を参照されたい）は、ヘパリンを補足して給餌したハエが、ＴｈＴ−ポジティブアミロイド様線維を生成したが、添加剤を全く与えなかった又はＫｌｅｘａｎｅ（登録商標）を与えたハエは、いかなる線維をも生成しなかったことを示した（図１２Ａ）。ヘパリンを給餌したハエ頭部における実質的な線維形成の観察に確証を与えるために、頭部溶解産物を、アルシアンブルーにより染色したドットブロットによって分析した（図１２Ｂ）。ヘパリンを給餌したハエ由来の頭部溶解産物における強い染色が観察されたが、対照のハエ又はＫｌｅｘａｎｅを給餌したハエ由来の対応する試料において染色は検出されなかった。ヘパリン補足培地上で培養したＴＴＲ形質転換ハエの頭部から調製した切片の免疫組織染色は、網膜におけるＴＴＲ及びヘパリンの同時染色を明らかにした（図１５Ｄ；Ｅ、ＴＴＲ及びヘパリンの同時沈着物質の３Ｄ画像）。通常の培地で飼育した形質転換ハエから調製した切片（図１５Ｆ）も、ヘパリン補足培地で飼育した非形質転換ハエから調製した切片（図１５Ｇ）も、網膜において、ＴＴＲ及びヘパリンについての同時染色を示さなかった。
【図１３】
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【図１４】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月14日(2013.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＴＲアミロイドーシスを診断するための方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の体液試料を準備するステップ、
（ｂ）単量体ＴＴＲに対して特異的であり、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸２４〜３５に選択的に結合する抗ＴＴＲ抗体を使用して、前記体液におけるＴＴＲの濃度を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されるＴＴＲ濃度が対照試料よりも高い場合、前記ヒト対象がＴＴＲアミロイドーシスに罹患している又はそれを発症する危険性が高いと決定するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
前記体液が、血漿及び脊髄液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）及びｂ）の間にさらなるステップを含み、前記試料が、ＴＴＲ四量体を単量体に解離させるために、ｐＨ２．７のような低ｐＨにさらされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ａ）単量体ＴＴＲに対して特異的であり、配列番号１に示されるＴＴＲのアミノ酸２４〜３５に選択的に結合する抗ＴＴＲ抗体及び
ｂ）体液試料中の単量体ＴＴＲの発現レベルを検出するための１つ又は複数の試薬を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において使用するための診断キット。
【請求項６】
抗ＨＳ抗体をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記１つ又は複数の試薬が、二次抗体及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、又は他の酵素レポーター系に対する比色定量基質、化学発光基質、又は化学蛍光基質からなる群から選択される、請求項５又は６に記載のキット。
【請求項８】
ＴＴＲとヘパラン硫酸（ＨＳ）との相互作用を妨害することができる有効量の薬剤を投与することによって、その必要のある患者においてトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを予防、軽減、及び／又は治療するための方法。
【請求項９】
前記薬剤が、ヘパラン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸多糖、非抗凝血性ヘパリンオリゴ糖、非抗凝血性ヘパリン多糖、及びそのミメティックからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＴＴＲペプチド又はその断片である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、抗ＴＴＲ抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＴＲアミロイドーシスの予防、軽減、及び／又は治療において使用するための、ＨＳとＴＴＲとの間の相互作用を妨害することができる薬剤。
【請求項１４】
前記薬剤が、ヘパラン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸多糖、非抗凝血性ヘパリンオリゴ糖、非抗凝血性ヘパリン多糖、及びそのミメティックからなる群から選択される、請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記薬剤が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＴＴＲペプチド又はその断片である、請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記薬剤が、抗ＴＴＲ抗体である、請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１８】
ＨＳとＴＴＲとの間の相互作用を妨害することができる薬剤並びに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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