(57)【要約】  本開示は、キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ遺伝子の、検出のためのエンドポイントＰＣＲアッセイおよび高処理能力の接合性解析に部分的に関する。本開示はさらに、部分的には、接合性の決定に使用される参照としての野生型ＤＮＡの使用に関する。これらおよび他の関連する手順は、対象遺伝子を含むキャノーラ系統の接合性および変種を独自に同定するのに使用することができる。本開示は、例えば、キャノーラの植物または種子の試料から接合性を決定するための関連するキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｆａｄ−３ｃ遺伝子を含むキャノーラ植物の接合性を決定するための方法であって、
前記キャノーラ植物からゲノムＤＮＡ試料を得るステップと、
前記ゲノムＤＮＡ試料を第１のプライマーおよび第２のプライマーと接触させることによって接触試料を作製するステップであり、前記第１のプライマーが、目的の一塩基多型の位置の上流の前記ｆａｄ−３ｃ遺伝子の領域に優先的に結合し、前記第２のプライマーが、目的の一塩基多型の下流の前記ｆａｄ−３ｃ遺伝子の領域に優先的に結合し、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件にかけられたときにアンプリコンを生成するステップと、
前記接触試料をＰＣＲ条件にかけるステップであり、前記アンプリコンが生成されるステップと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブのそれぞれが、５０〜７０摂氏度の間の温度で一定時間アンプリコンとハイブリッド形成するのを可能にするステップであり、目的の前記一塩基多型が前記アンプリコン中に存在しないときに、前記第１の蛍光プローブが前記アンプリコンと優先的にハイブリッド形成し、目的の前記一塩基多型が前記アンプリコン中に存在するときに、前記第２の蛍光プローブが前記アンプリコンと優先的にハイブリッド形成するステップと、
可能にするステップにおいて指定された時間の後に前記温度を上昇させるステップと、
上昇させるステップ中に前記第１および第２のプローブのそれぞれによって生じる前記蛍光を捕捉するステップと、
前記キャノーラ植物の接合性を決定するステップであり、決定するステップが、第１および第２のプローブのそれぞれによって生じる蛍光の比較を含み、ホモ接合性ＳＮＰ陽性対照試料において生じた蛍光を優性に反映している第１および第２のプローブの蛍光は、目的の前記一塩基多型の存在を示し、ホモ接合性ＳＮＰ陰性対照試料において生じた蛍光を優性に反映している第１および第２のプローブの蛍光は、目的の前記一塩基多型の存在の欠如を示し、ヘテロ接合性ＳＮＰ陽性対照試料において生じた蛍光を優性に反映している第１および第２のプローブの蛍光は、前記キャノーラ植物が、目的の前記一塩基多型を含む第１のアレルと、目的の前記一塩基多型を欠いている第２のアレルとを含むことを示すステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記アンプリコンが、９１−１５４塩基対からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一塩基多型が、ＧからＡへの多型からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記野生型配列が、前記位置でグリシンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
異種交配させたキャノーラ植物の育種の遺伝子移入の検証に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーが配列番号２および配列番号３を含み、前記第１および第２のプローブが配列番号５および４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２のプローブが、蛍光色素およびクエンチャーの双方で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプローブが、前記第１のプローブの５’末端に前記蛍光色素としてＦＡＭを含み、前記第１のプローブの３’末端上にＭＧＢクエンチャーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のプローブが、前記第２のプローブの５’末端にＶＩＣで標識され、前記第２のプローブの３’末端にＭＧＢクエンチャーで標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のプローブが配列番号４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法の蛍光結果が、プレートリーダー内で直接に読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ試料が、畑のキャノーラ植物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上昇させるステップが、一定時間あたり実質的に均一な温度上昇で前記温度を上昇させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上昇させるステップ中に前記第１および第２のプローブのそれぞれによって生じる前記蛍光が、捕捉するステップにおいて、上昇させるステップの各上昇中に捕捉される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法を行うためのキットであって、前記第１のプライマーと、前記第２のプライマーと、前記第１のプローブと、前記第２のプローブとを含むキット。
【請求項１６】
前記第１のプライマーが配列番号２からなり、前記第２のプライマーが配列番号３からなり、前記第１のプローブが配列番号５からなり、前記第２のプローブが配列番号４からなる、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、２０１１年１０月２１日に出願された、米国仮出願第６１／５５０，１７０号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ属（Brassica）は、世界で最も重要な油料種子作物のうちの１つであり、かつ温暖な地理において栽培される重要な油料種子作物である、キャノーラを含む。キャノーラは、エルカ酸およびグルコシノレートが、従来の育種を通して排除または大幅に減少されている、セイヨウアブラナ（Brassica napus L.）（ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）とヤセイカンラン（Brassica oleracea）との種間交配の結果として得られた種）として従来特徴付けられてきた。キャノーラ油の大半は、人間の消費用に生産される植物油の形態にある。工業用途におけるキャノーラ油の使用に向けた市場も拡大している。
【０００３】
アブラナ属（Brassica）は、Ａゲノム、Ｂゲノム、またはＣゲノムのいずれかとして分類される固有のゲノムをそれぞれ有する３種の二倍体の種からなる。ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）植物は、二倍体のＡゲノムを有する。クロガラシ（Brassica nigra）植物は、二倍体のＢゲノムを有する。ヤセイカンラン（Brassica oleracea）植物は、二倍体のＣゲノムを有する。これらの種の雑種は、２種の二倍体の種間での交配を介して作製することができる。キャノーラは、二倍体のＣゲノムを有するヤセイカンラン（Brassica oleracea）と、二倍体のＡゲノムを有するブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）との交雑から生じたと考えられている複二倍体種である。細胞遺伝学的研究より、ＡＡおよびＣＣゲノムはある程度の関連性を示すことが明らかにされ、互いに部分的に相同であるので共通祖先のゲノムに由来していると考えられた（PrakashおよびHinata、1980）。技術的には二倍体に分類されるが、双方の原種のゲノムは、互いに重複した領域を高い百分率で含有する（Songら、1991）。遺伝子解析により、セイヨウアブラナ（Brassica napus）は、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）のＡＡゲノムから１０対の染色体を与えられ、母性ドナーとしてヤセイカンラン（Brassica oleracea）のそのＣＣゲノムから９対の染色体を与えられたことが明らかにされた（Songら、1992）。
【０００４】
脂肪酸不飽和の型および量は、食事および工業の用途の双方に対する意味を有するので、特定の変種のキャノーラ種子から得られる食用および工業用の油の質は、その構成脂肪酸によって決定される。従来のキャノーラ油は、約６０％のオレイン酸（Ｃ１８：１）、２０％のリノール酸（Ｃ１８：２）および１０％のリノレン酸（１８：３）を含有する。従来のキャノーラに典型的な多価不飽和リノレン酸のレベルは、油が酸化しやすいので望ましくなく、酸化の速度は、酸素の存在、光および熱への曝露、ならびに油中の天然のまたは添加された酸化防止剤および酸化促進剤の存在を含む、いくつかの因子によって影響される。酸化は、繰り返して揚げること（誘導酸化）または長期の保存（自動酸化）の結果として異臭および酸敗を引き起こす。酸化は、キャノーラ油の潤滑性および粘性の特性も変化させうる。
【０００５】
従来のキャノーラ油に対して低下したレベルの多価不飽和脂肪酸および上昇したレベルの一価不飽和オレイン酸を示すキャノーラ油プロファイルは、より高い酸化安定性に関連する。個々の脂肪酸の酸化に対する感受性は、それらの不飽和の程度に依存する。したがって、３つの炭素−炭素二重結合を有するリノレン酸の酸化の速度は、１つのみの炭素−炭素二重結合を有するオレイン酸の速度の２５倍であり、２つの炭素−炭素二重結合を有するリノール酸の速度の２倍である。リノール酸およびリノレン酸は、ヒドロペルオキシドを容易に形成するので、香りおよび匂いに対して最も大きい影響力も有する。高オレイン酸油（オレイン酸７０％以上）は、保存中、揚げ物中および精製中の酸化をより受けにくく、発煙なくより高温に加熱することができ、料理油としてより好適とされる。
【０００６】
キャノーラ油の質は、その構成脂肪酸、例えば、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）およびリノレン酸（Ｃ１８：３）などによって決定される。大部分のキャノーラ栽培品種は、通常、約５５〜６５％のオレイン酸および８〜１２％のリノレン酸を有する油を生じる。高濃度のリノレン酸は、油の不安定性および異型の香りをもたらすのに対し、高レベルのオレイン酸は、油の酸化安定性および栄養価を高める。したがって、オレイン酸が増加してリノレン酸が減少しているキャノーラ栽培品種の開発は、キャノーラ油の質のためにきわめて望ましい。
【０００７】
オレイン酸量が増加してリノレン酸量が減少しているキャノーラ栽培品種から２つの遺伝子座が同定され、それらのゲノム位置がマッピングされた。増加したオレイン酸および減少したリノール酸の生成に対して、１つの遺伝子座は主要な効果を有し、２つめの遺伝子座は副次的な効果を有する。高オレイン酸（Ｃ１８：１）のための主要な遺伝子座は、脂肪酸デサチュラーゼ−２（ｆａｄ−２）遺伝子であると決定され、それは、連鎖群、Ｎ５上に位置する。２つめの遺伝子座は、連鎖群Ｎ１上に位置する。リノレン酸（Ｃ１８：３）についての１つの主要な量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、ゲノムＣの脂肪酸デサチュラーゼ−３遺伝子（ｆａｄ−３ｃ）であり、これは連鎖群Ｎ１４上に位置する。第２の主要なＱＴＬはＮ４連鎖群上に存在し、ゲノムＡの脂肪酸デサチュラーゼ−３遺伝子（ｆａｄ−３ａ）である。ｆａｄ−２およびｆａｄ−３ｃ遺伝子のゲノム配列は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）誘導変異体および野生型のキャノーラ栽培品種の双方から増幅されて配列決定された。ｆａｄ−２およびｆａｄ−３ｃ遺伝子の変異体および野生型のアレル配列の比較により、ＥＭＳで変異された植物からの遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）が明らかにされた。変異体および野生型のアリル間の配列の相違に基づき、ｆａｄ−２およびｆａｄ−３ｃ遺伝子変異に対応する、２種のＳＮＰマーカーが開発された。（Huら、2006）。
【０００８】
第１代雑種のアブラナ属（Brassica）の種子を作製するための現在の方法は、コストおよび種子の純度の点で限界がある。一般に、これらの方法は、安定で同胞不和合性および自家不和合性であるホモ接合性に近い親の育種系統を必要とし、この親の育種系統は、近交系を作り出すために繰り返し自家受粉させて初めて利用できる。さらに、親の系統を開発および維持するための同系交配は、つぼみ受粉のような、労働集約的な技術によって達成され、アブラナ属（Brassica）雑種種子産生システムが自家不和合性形質に基づいているので、自家不和合性の強い植物を利用しなければならない。育種プロセス中の環境条件、例えば、温度および湿気などは、典型的には、植物の脂質代謝に影響を及ぼし、したがって、脂肪酸の含有量レベルにも影響する（Harwood、1999）。したがって、環境の変動は、植物の表現型選択の信頼性を低下させる。DengおよびScarth（1998）は、開花後の温度の上昇により、Ｃ１８：３のレベルが有意に低下してＣ１８：１が増加することを見出した。同様の結果が、他の研究で報告された（YermanosおよびGoodin、1965；Canvin、1965）。
【０００９】
低リノレン酸変種のための育種は、Ｃ１８：３含有量が多遺伝子の形質であって相対的に低い遺伝率を有する劣性の様式で遺伝するので、特に難しい。（低いＣ１８：３含有量（３％）を有する）「ステラー（Stellar）」と（「従来の」Ｃ１８：３レベル（９〜１０％）を有する）「ドラッカー（Drakkar）」との間の交配から得られる個体群の遺伝子解析により、低いＣ１８：３の形質は、相加効果を有する、Ｌ１およびＬ２と呼ばれる２つの主要な遺伝子座によって調節されていることが示された（Jourdrenら、1996b）。Ｃ１８：３含有量を調節しているこれらの２つの主要な遺伝子座は、２つのｆａｄ−３（脂肪酸デサチュラーゼ−３）遺伝子に該当することが見出された；１つは、（ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）に由来する）Ａゲノム上に、もう１つは、（ブラッシカ・オレセラ（Brassica olecera）に由来する）Ｃゲノム上に位置していた（Jourdrenら、1996；Barretら、1999）。
【００１０】
遺伝（相加性、優性、および上位性）および環境の影響によって継続して変化する形質は、一般に「量的形質」と呼ばれる。量的形質は、表現型の連続的分布を生じる遺伝子発現に対する環境の影響と、多遺伝子遺伝によって生じる複雑な分離パターンとの２つの因子に基づいて「質的」または「分離」形質と区別されうる。量的形質の発現と連鎖した１つまたは複数のゲノム領域の同定は、量的形質遺伝子座（「ＱＴＬ」）の発見をもたらした。Thormannら（1996）は、リノレン酸含有量について６０％の差異を説明する２つのＱＴＬをマッピングしたのに対して、Somersら（1998）は、Ｃ１８：３含有量について合わせて５１％の表現型の変化を説明する３つのＱＴＬを同定した。ChenおよびBeversdorf（1990）によって３遺伝子座相加モデルも報告された。RuckerおよびRobbelen（1996）は、いくつかの副次的な遺伝子が、不飽和化ステップに関与している見込みが最も高いことを示した。
【００１１】
Ｃ１８：３含有量の遺伝率は、２６〜５９％であると推定された（KondraおよびThomas、1975）（ここで、遺伝率の変動は、環境因子とはまったく異なり、遺伝学の作用である）。リノレン酸の遺伝の複雑性は、リノレン酸が、Ｃ１８：２の不飽和化またはＣ１６：３の伸長のいずれからも合成されうるという事実に起因しうる（Thompson、1983）。
【００１２】
リノレン酸とは対照的に、オレイン酸の遺伝はより単純であり、オレイン酸の遺伝率は比較的高い。高オレイン酸含有量は、オレイン酸をリノール酸（Ｃ１８：２）に不飽和化する役割を果たしている酵素をコードしているｆａｄ−２（脂肪酸デサチュラーゼ２）遺伝子と呼ばれる主要な遺伝子座によって調節されることが報告されている（Tanhuanpaaら、1998；Schierholtら、2001）。これまでのところ報告およびマッピングされているｆａｄ−２遺伝子の機能的な遺伝子コピーのすべては、Ａゲノム由来の連鎖群Ｎ５上に位置する（Schefflerら、1997；Schierholtら、2000）。ChenおよびBeversdorf（1990）は、オレイン酸の蓄積が２つの分離遺伝子系で調節されており、一方は鎖伸長の働きをし、他方は不飽和化に関与していることを報告した。Ｃ１８：１含有量の遺伝率は、それぞれ５３％から７８％（KondraおよびThomas 1975）および９４％（SchierholtおよびBecker、1999）であると推定された。遺伝率がより高いため、Ｃ１８：１含有量の発現は、環境的に影響をより受けにくく、相対的に安定である（SchierholtおよびBecker、1999）。
【００１３】
Ｎｅｘｅｒａ（商標）キャノーラ生殖質において、１つから２つの遺伝子がＣ１８：１含有量を調節することが見出され、少なくとも３つの遺伝子がＣ１８：３発現に関与する（Ｎｅｘｅｒａ（商標）は、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣの商標である）。分離している後代において、種子のＣ１８：３含有量の分布は連続的であり、それにより、望ましいＣ１８：３レベルを有する遺伝型クラスを同定するのを困難にさせている。さらに、温室（ＧＨ）および畑で栽培された植物間での脂肪酸含有量における相関が低く、望ましいレベルのＣ１８：３を有するＧＨ植物を確実に選択するのをさらに難しくさせている。
【００１４】
多様な方法を使用して、植物組織の試料において特定の遺伝子の存在を検出することができる。１つの例は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00：18〜24、2000）によって記載されているピロシーケンシング技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、挿入されたＤＮＡ配列およびそれに隣接したゲノムＤＮＡとオーバーラップするように設計される。オリゴヌクレオチドは、目的の領域（すなわち、挿入配列内の１種のプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１種）からの一本鎖ＰＣＲ産物（「アンプリコン」）とハイブリッド形成され、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄＮＴＰは、個別に添加され、その取り込みは、測定される光シグナルをもたらす。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基または多塩基の伸張の成功による、導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。（この技術は、それが既知のときには、特定の遺伝子の検出用ではなく、通常、最初のシーケンシングに使用される。）
【００１５】
蛍光偏光法は、アンプリコンの検出に使用されうるもう１つの方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドは、ゲノム隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするように設計される。オリゴヌクレオチドは、目的の領域（挿入ＤＮＡ内の１種のプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１種）からの一本鎖ＰＣＲ産物とハイブリッド形成され、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基の伸張は、ｄｄＮＴＰの組み込みをもたらす。組み込みは、蛍光光度計を使用して偏光における変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸張の成功による、導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００１６】
分子ビーコンは、配列検出における使用について記載されている。簡単に説明すると、分子ビーコンは、ＦＲＥＴプローブが隣接ゲノムと挿入ＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするように設計されうるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）オリゴヌクレオチドプローブを含む。ＦＲＥＴプローブの固有の構造により、それが、蛍光部分およびクエンチング部分をすぐ近くに保つ二次構造を含有する結果となる。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１種のプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１種）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。好結果のＰＣＲ増幅後、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去および蛍光部分とクエンチング部分との空間的な分離をもたらす。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功による、隣接ゲノム／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００１７】
加水分解プローブアッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲとしても知られ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の登録商標である）、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法を提供する。簡単に説明すると、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、事象特異的検出のために、導入遺伝子内のオリゴの一部と、隣接ゲノム配列内のオリゴの他の一部とを有するように設計されているＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを利用する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１種のプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１種）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション、およびその後のＰＣＲ増幅段階中のＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性による消化により、蛍光部分がＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から離されて切断および放出される結果となる。蛍光シグナルは、ハイブリダイゼーションおよび増幅の成功による、隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００１８】
分子マーカーもＤＮＡの配列特異的同定に有用である。分子マーカー選択は、遺伝子型に基づき、したがって、環境の影響に依存しない。分子マーカーは、温室で栽培された植物と畑で栽培された植物との間の脂肪酸含有量における低い相関に起因しうる、温室における植物の信頼できない選択の問題を軽減するのを助ける。意義深いことに、Ｃ１８：１およびＣ１８：３の含有量を調整している遺伝子と密接に連鎖する分子マーカーは、高Ｃ１８：１および低Ｃ１８：３のための遺伝子を有する植物の早期の選択を促進することができる。早期段階でのマーカー利用選抜は、温室空間の節約、温室使用効率の向上、および畑における育種作業負荷の減少に役立ちうる。
【００１９】
より一般に、分子マーカーは以下の点において形態学的マーカーを超える利点を有する：分子マーカーは高度に多型でありうるのに対して形態学的マーカーは厳密に表現型依存性である点；形態学的マーカーは特定の量的表現型の採点において干渉しうるのに対して分子マーカーは遺伝子型と表現型との間で１：１の関係を示す（したがって、所与の遺伝子座のすべての可能な遺伝子型の明確な採点を可能にする）点；および上位性の相互作用は個体群において有用な形態学的マーカーの数を制限する傾向があるのに対して分子マーカーは上位性に相互作用しない点。
【００２０】
様々な型の分子マーカー、例えば、ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）マーカー（Tanhuanpaaら、1995；Huら、1995；Rajcanら、1999；Jourdrenら、1996）、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）マーカー（Thormannら、1996）およびＳＣＡＲ（配列特徴的増幅領域）マーカー（Ｈｕら、１９９９）などが、セイヨウアブラナ（Brassica napus）において、低いＣ１８：３レベルに関連すると同定されている。分子マーカーは、高Ｃ１８：１含有量についても同定されている。ＲＡＰＤマーカーは、春のアブラナ（ナタネ（B. rapa ssp. oleifera））において、ＱＴＬに影響を及ぼしているオレイン酸濃度と連鎖すると同定され、後に、ＳＣＡＲマーカーに転換された（Tanhuanpaaら、1996）。Schierholtら（2000）は、冬のアブラナ（セイヨウアブラナ（B. napus L.））において、高オレイン酸変異と連鎖した３種のＡＦＬＰ（増幅断片長多型）マーカーを同定した。Tanhuanpaaら（1998）は、春のアブラナ（ナタネ（B. rapa ssp. oleifera））において、ｆａｄ−２遺伝子座の野生型および高オレイン酸のアレルを比較することによってオレイン酸のアレル特異的ＰＣＲマーカーを開発した。しかし、これらのマーカーの大部分は、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰおよびＲＦＬＰのように低い処理能力のマーカーであり、自動化を通した大規模スクリーニングに好適でない。
【発明の概要】
【００２１】
本開示は、キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ遺伝子の、検出のためのエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ、および高処理能力の接合性解析に部分的に関する。本開示はさらに、部分的には、接合性の決定に使用される参照としての、キャノーラにおける野生型ｆａｄ−３ｃ遺伝子の使用に関する。これらおよび他の関連する手順は、対象遺伝子を含むキャノーラ系統の接合性および変種を独自に同定するのに使用することができる。
【００２２】
本開示は、（例えば、キャノーラの）試料から接合性および変種を決定するための関連するキットも提供する。
【００２３】
したがって、本開示の一実施形態は、高処理能力の接合性および育種の解析用の可変的なプラットフォームである、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲに関する。本開示によって示されるエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ適用法の利用は、キャノーラのｆａｄ−３ｃ接合性および育種の解析用の、信頼性が高く、正確で、高処理能力の適用法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Huら（2006）（矢印）によって同定されたｆａｄ−３ｃ変異の位置を例示しているｆａｄ−３ｃ遺伝子配列（配列番号１）の一部分を示した図である。イントロン６はより薄い色の文字列中にあり、２つめの多型はアスタリスクで示されている。
【図２】エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに従って３種のｆａｄ−３ｃ遺伝子型を示している、（キャノーラの）接合性解析結果の例を示した図である（結果は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡを通して入手可能なＳＤＳ２．４ソフトウェアを使用して作製した）。［配列の簡単な説明］
【００２５】
配列番号１は、ｆａｄ−３ｃ変異の位置を例示するｆａｄ−３ｃ遺伝子配列の一部分を提供する。
【００２６】
配列番号２は、フォワードプライマーＤ−ＣＬ−ＦＡＤ３Ｃ−Ｆを提供する（これは、隣接ゲノム配列に結合する）。
【００２７】
配列番号３は、リバースプライマーＤ−ＣＬ−ＦＡＤ３Ｃ−Ｒ２を提供する（これは、挿入配列に結合する）。
【００２８】
配列番号４は、ＧからＡへの一塩基多型を有する変異ｆａｄ−３ｃ遺伝子の優先的な結合用のプローブＤ−ＣＬ−ＦＡＤ３Ｃ−ＦＡＭを提供する。
【００２９】
配列番号５は、野生型ｆａｄ−３ｃ遺伝子の検出用のプローブＤ−ＣＬ−３Ｃ−ＶＩＣを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ遺伝子の、検出のためのエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイおよび高処理能力の接合性解析に部分的に関する。本開示は、部分的には、接合性の決定に使用される参照としての、キャノーラにおける野生型ｆａｄ−３ｃ遺伝子の使用にさらに関する。これらおよび他の関連する手順は、対象遺伝子を含むキャノーラ系統の接合性および変種を独自に同定するのに使用することができる。本開示は、（例えば、キャノーラの）試料から接合性および変種を決定するための関連するキットも提供する。したがって、本開示の一実施形態は、高処理能力の接合性および育種の解析用の可変的なプラットフォームである、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲに関する。本開示によって示されるエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ適用法の利用は、キャノーラのｆａｄ−３ｃ接合性および育種の解析用の、信頼性が高く、正確で、高処理能力の適用法を提供する。
【００３１】
本発明の新規なアッセイは、Huら（2006）によって報告されたｆａｄ−３ｃアレルの一塩基多型（ＳＮＰ）変異に部分的に基づいて開発された。このアッセイは、変異体および野生型のｆａｄ−３ｃアレルを検出するために２つのプライマー領域および２種のＭＧＢプローブを利用する（表１を参照されたい）。このＳＮＰ変異を検出するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブは、ｆａｄ−３ｃ遺伝子配列を使用して、プライマー明示ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって部分的に設計された。ｆａｄ−３ｃ遺伝子についてホモ接合性、ヘミ接合性および野生型（変異なし）であるキャノーラ植物から抽出されたＤＮＡを使用して、この新しいｆａｄ−３ｃ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの有効性が検証された。ｆａｄ−３ｃ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、速いＰＣＲ熱サイクル条件を使用して、９６ウェルまたは３８４ウェルの双方の形式上でＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムを部分的に用いた性能について最適化もされた。
【００３２】
【表１】
2014530624.tif 000002
【００３３】
ＮＥＸ８２８およびクアンタム（Quantum）の葉の試料をアッセイに使用した。キャノーラ育種個体群からのＤＮＡを使用して、このアッセイの有効性を検証した。
【００３４】
本開示の態様は、本明細書中に例示および／または示唆されている診断用核酸分子を設計および／または作製するための方法を含む。特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブは、本明細書中に詳述されているように、ｆａｄ−３ｃ遺伝子内の本明細書中で同定されている特異的なＳＮＰに位置するＤＮＡ配列に部分的に従って、またはその上流もしくは下流に近接して、設計された。
【００３５】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、キャノーラ油生成植物の接合性を決定することに関する。本開示は、有性交配の後代が目的のＳＮＰを含有しているかどうかおよび後代の接合性を決定するために、本明細書中で同定されているＳＮＰの存在を検出することに部分的に関する。さらに、接合性を検出するための方法が含まれ、これは、例えば、市販前の認可を必要とする規制を満たすために、および組換え作物植物に由来した食物を標識するために役立つ。
【００３６】
本開示は、キャノーラ植物の高処理能力の接合性解析のために、内因性の非変異体ｆａｄ−３ｃ遺伝子を対照として利用する、蛍光に基づいたエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイに部分的に関する。
【００３７】
本開示は、キャノーラ接合性解析のためのエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）２重ＰＣＲの開発にも部分的に関する。さらに、本開示は、キャノーラｆａｄ−３ｃ遺伝子育種試験キットの開発に部分的に関する。
【００３８】
一般に、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、正／負の戦略に基づいており、これにより、「正」は、試料が、アッセイした遺伝子について陽性であることを表し、「負」は、試料が、アッセイした遺伝子について陰性であることを表す。これらのアッセイは、典型的には１セットのオリゴヌクレオチドプライマーおよび２種のオリゴヌクレオチドプローブを利用し、それぞれ、１種のプローブは、変異されたｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰを優先的にハイブリッド形成し、もう１種のプローブは、野生型ｆａｄ−３ｃ配列を優先的にハイブリッド形成する。
【００３９】
本開示に関連した利点としては、ＤＮＡの質および量に対する依存の低下などが挙げられる。さらに、本開示は、適切に扱われない場合、他のＳＮＰ検出アッセイを不成功にしうることが多い、長い最初の変性ステップを必要としない。さらに、本開示は、市販用の設定の範囲内で高処理能力の様式で多数のキャノーラ試料を効率良く解析するための方法を提供する。本開示のもう１つの利点は、時間を節約することである。キャノーラの接合性および育種の解析のための本エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）解析は、特に、多数の試料を解析するときに、他の適用形式を超える利点を提供する。
【００４０】
本開示は、植物育種解析に部分的に関する。本開示は、対象植物におけるオレイン酸およびリノレン酸レベルに影響を及ぼす、キャノーラ植物のＳＮＰの方法を含む。
【００４１】
さらに、本明細書中に記載の核酸プローブを使用して、ＰＣＲまたはＤＮＡハイブリダイゼーションなどの、他の既知の核酸検出法によって対象ＳＮＰの存在を検出することもできる。事象−特異的ＰＣＲアッセイについては、本明細書中で述べている。（Windelsら（Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999も参照されたい。）
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「後代」という用語は、親植物のいずれの世代の子孫をも意味する。
【００４３】
本開示の検出技術は、植物育種に関連して、例えば、目的のＳＮＰを含む親植物がもう１種の植物と交配された後に後代植物の接合性を決定するために、特に有用である。本出願および方法は、キャノーラ育種プログラムならびに品質管理プロセスに恩恵を与える。本明細書中に開示の方法およびアッセイを使用する、キャノーラ系統用のＰＣＲ検出キットは、現在、作製および使用することができる。さらに、本開示は、製品登録および製品管理に恩恵を与えうる。
【００４４】
望ましいｆａｄ−３ｃ遺伝子組成を含むキャノーラ植物は、本明細書中に言及されている系統のうちの任意の１種の種子から栽培されたキャノーラ植物からなる第１の親キャノーラ植物と、第２の親キャノーラ植物とを最初に有性交配させ、それによって複数の第１の後代植物を作製し、次いで、本開示によって開示されているような望ましいｆａｄ−３ｃ遺伝子を有する第１の後代植物を選択し、第１の後代植物を自家受粉させ、それによって複数の第２の後代植物を作製し、次いで、第２の後代植物から本開示による望ましいｆａｄ−３ｃ遺伝子を有する植物を選択することによって育種することができる。これらのステップは、第２の親キャノーラ植物または第３の親キャノーラ植物に対する第１の後代植物または第２の後代植物の戻し交配をさらに含みうる。次いで、本開示のキャノーラ種子を含むキャノーラ作物、またはその後代を植えることができる。
【００４５】
本開示は、望ましいｆａｄ−３ｃ遺伝子組成を含むキャノーラ植物を少なくとも一方の親として使用して交配させるプロセスをさらに含む。例えば、本開示は、望ましいｆａｄ−３ｃ遺伝子組成を含む任意のキャノーラ植物を一方または双方の親として有する第１代雑種植物を含む。本開示の範囲内にさらにあるのは、こうした第１代雑種によって産生された種子である。本開示は、本開示の方法を使用して、例示されている植物を異なる（例えば、近交系親）植物と交配させ、結果として得られる雑種種子を収穫およびアッセイすることによって第１代雑種種子を同定するための方法を含む。第１代雑種を作製するために使用されるキャノーラ植物は、雌親または雄親のいずれであってもよい。
【００４６】
トランスジェニック植物は、本明細書中に開示のｆａｄ−３ｃ遺伝子を含有するように作製されうることも理解されたい。さらに、本明細書中に開示のｆａｄ−３ｃ遺伝子特性を含むトランスジェニック植物を、異なる遺伝子組成を含む植物と掛け合わせ、それによって独立に分離した外因性遺伝子を含有する子孫を作製することもできる。適切な後代の自家受粉により、追加された外因性遺伝子についてホモ接合性である植物を作製することができる。親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との他配も意図され、栄養繁殖も同様である。異なる形質および作物に一般的に使用される他の育種法は、当技術分野において知られている。戻し交配育種は、簡単に浸透性交雑される高度に遺伝性の形質の遺伝子を、反復親である、望ましいホモ接合性栽培品種または近交系へ移入するために使用されてきた。移入される形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。結果として得られる植物は、反復親（例えば、栽培品種）の性状およびドナー親から移入された望ましい形質を有すると予想される。最初の交配後、ドナー親の表現型を有する個体が選択され、反復親に繰り返し交配される（戻し交配される）。結果として得られる親は、反復親（例えば、栽培品種）の性状およびドナー親から移入された望ましい形質を有すると予想される。本開示の方法は、後代植物においてｆａｄ−３ｃ導入遺伝子を検出するためおよび後代植物の接合性レベルを決定するための、高処理能力の、蛍光に基づいたエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを提供する。
【００４７】
本開示の方法、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法に使用することができる。本開示の方法、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、当技術分野において知られている一般公開されたプロトコルを使用して、ＳＮＰまたは単純配列反復（ＳＳＲ）の検出によって、遺伝的に連鎖した農学的に有用な形質を同定する、関連するアッセイ、増幅断片長多型アッセイ（ＡＦＬＰ）、制限断片長多型アッセイ（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡアッセイ（ＲＡＰＤ））と共に使用することができる。本明細書中に開示のＳＮＰは、ＭＡＢ法を使用して、本開示のキャノーラ植物（またはそれらの後代および他のあらゆるキャノーラ栽培品種もしくは変種）を用いた交配の後代において追跡することができる。ＤＮＡ分子は、この形質のマーカーとして使用することができ、当技術分野においてよく知られているＭＡＢ法は、本開示の少なくとも１種のキャノーラ植物、またはその後代、が親または祖先であった、キャノーラ植物においてＳＮＰを追跡するために使用することができる。本開示の方法は、本明細書中に開示の対象ＳＮＰを有するあらゆるキャノーラ変種の同定に使用することができる。
【００４８】
本開示の方法は、本明細書中で同定されているＳＮＰの組合せを含むキャノーラ植物を作製する方法を含み、ここで、前記方法は、本開示の植物を用いた育種を含む。より詳細には、前記方法は、本開示の２種の植物を交配することを含んでいてもよく、または本開示の１種の植物と他の任意の植物とを交配することを含んでいてもよい。例示的な方法は、本開示によって検出可能な、本開示のＳＮＰについて前記交配の後代を解析することによって前記後代を選択することをさらに含んでいてもよい。例えば、本開示は、他の望ましい形質、例えば、農業形質、例えば、多様な実施例において本明細書中で試験されているものなどを含む植物との育種サイクルを通してキャノーラ植物の接合性を追跡するために使用することができる。対象ＳＮＰおよび所望の形質を含む植物は、例えば、検出、同定、選択されて、さらなる回の育種においてすぐに使用されてもよい。対象ＳＮＰ／形質は、他の形質、例えば、可能な昆虫耐性形質（単数または複数）および／または除草剤耐性形質などと、育種を通して組み合わせることもでき、本開示によって追跡される。後者の一実施形態は、グリフォセートなどの除草剤に対する耐性をコードしている遺伝子と組み合わされた、１種または複数の対象ＳＮＰを含有する植物である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本開示は、１種または複数のｆａｄ−３ｃキャノーラ植物のための診断用のアンプリコン産物の生成のためのプライマー配列として有用な連続断片を含むＤＮＡ配列を含む。
【００５０】
関連実施形態は、本明細書中で同定されているＤＮＡ配列の一部の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、またはそれより多くの連続したヌクレオチド、またはそれらの相補鎖を含むＤＮＡ配列に関する。こうした配列は、ＤＮＡ増幅法においてＤＮＡプライマーとして有用でありうる。これらのプライマーを使用して生成されるアンプリコンは、本明細書中に言及されているｆａｄ−３ｃキャノーラ変種のいかなる組合せおよび接合性の診断用であってもよい。したがって、本開示は、こうしたＤＮＡプライマーおよび相同なプライマーによって生成されたアンプリコンも含む。
【００５１】
なおさらなる実施形態において、本開示は、本開示のｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰを作製する方法を含み、前記方法は、以下のステップを含む：（ａ）本明細書中に開示のＳＮＰのうちの１種を含み、ここに開示のオレイン酸および／またはリノレン酸の形質のうちの１つを与える）第１の親のキャノーラ系統と（これらのＳＮＰを欠いている）第２の親のキャノーラ系統とを有性交配して、それにより、複数の後代植物を作製するステップ；ならびに（ｂ）分子マーカーを使用することによって後代植物を選択するステップ。こうした方法は、前記ｆａｄ−３ｃ形質を含む純粋種またはホモ接合性のキャノーラ植物を作製するために、場合により、後代植物を第２の親のキャノーラ系統に戻し交配するさらなるステップを含んでいてもよい。
【００５２】
本開示の他の一態様によれば、前記ｆａｄ−３ｃキャノーラ植物との交配の後代の接合性を決定する方法が提供される。前記方法は、キャノーラＤＮＡを含む、試料を本開示のプライマーセットと接触させることを含みうる。前記プライマーは、少なくとも１種の前記ｆａｄ−３ｃキャノーラ植物からのゲノムＤＮＡを用いた核酸増幅反応において使用されるときには、少なくとも１種の前記キャノーラＳＮＰまたは野生型遺伝子の診断用である第１のアンプリコンを生成する。こうした方法は、核酸増幅反応を行い、それによって第１のアンプリコンを生成し、本明細書中に開示のｆａｄ−３ｃのＳＮＰおよび野生型遺伝子に特異的なプローブで第１のアンプリコンを検出することをさらに含む。該方法は、それにアニーリングされる開示のプローブを有するアンプリコンのアレル識別融解適用法を行い、アレル識別融解適用法において使用されるプローブの相対蛍光を比較することをさらに含む。プローブの相対蛍光は、試料が目的のＳＮＰを含有するかどうかを示し、そうである場合には、試料がＳＮＰについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかどうかを示す。
【００５３】
ＤＮＡ検出の技術分野においてよく知られている方法と共に、本明細書中に開示の組成物を使用して、ＤＮＡ検出キットを開発することもできる。キットは、試料中の対象キャノーラＳＮＰの同定に有用であり、このＤＮＡを含有するキャノーラ植物の育種のための方法に適用されうる。キットは、例えば本明細書中に開示の、アンプリコンと相同または相補的なＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして、使用することができる。キットは、検出法の性能に必要な試薬および物質を含有していてもよい。
【００５４】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（放射性同位体、リガンド、化学発光剤、または酵素など）が付加されている単離された核酸分子である。こうしたプローブは、標的核酸の鎖に相補的であり、本開示の場合には、キャノーラ植物からかまたはその事象からのＤＮＡを含む試料からかどうかにかかわらず、目的のｆａｄ−３ｃ遺伝子を含む前記キャノーラ植物のうちの１種からのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本開示によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ポリアミドおよび他のプローブ物質であって標的ＤＮＡ配列に特異的に結合してその標的ＤＮＡ配列の存在の検出に使用されうるものも含む。
【００５５】
ＰＣＲプライマー間で標的ＤＮＡとハイブリッド形成する蛍光レポーター（フルオロフォア）およびクエンチャーを含む特異的プローブが設計された。フルオロフォア分子は、オリゴヌクレオチドプローブの合成中にオリゴヌクレオチドプローブに付加され、それによってオリゴヌクレオチドプローブを標識化する。クエンチャー分子などの、他の分子をオリゴヌクレオチドプローブに付加することもできる。オリゴヌクレオチドプローブへのこれらの分子の付加は、一本鎖ＤＮＡとハイブリッドを形成するときおよび増幅プロセスを介してＤＮＡの新しい鎖を生成するときに、オリゴヌクレオチドプローブの機能を損なわない。
【００５６】
特定の波長で励起される多数のフルオロフォアが開発されており、当技術分野において知られている。フルオロフォアの励起は、フルオロフォアのすぐ近くに位置するクエンチャーによってクエンチされうる、フルオロフォアによる蛍光シグナルの放出をもたらす。クエンチャーがフルオロフォアから離されるときに、蛍光シグナルは、もはやクエンチされず、蛍光シグナルの蓄積は、標的ＤＮＡの量と直接に相関し、自動蛍光光度計を用いてリアルタイムで検出することができる。フルオロフォアは、組み合わせて使用されてもよく、このとき、２種以上のフルオロフォアの多重検出を可能にするように励起スペクトルおよび発光スペクトルは有意に異なる。フルオロフォアのいくつかの好ましい実施形態は、ＨＥＸ蛍光色素、ＴＥＴ蛍光色素、Ｃｙ３蛍光色素、Ｃｙ３．５蛍光色素、Ｃｙ５蛍光色素、Ｃｙ５．５蛍光色素、Ｃｙ７蛍光色素、またはＲＯＸ蛍光色素を含む。本発明のＦＲＥＴを使用したＰＣＲプロセスのための同種のアッセイ検出システムからなる方法と共に使用するためのフルオロフォアの好ましい一実施形態は、ＪＯＥ蛍光色素のＦＡＭ蛍光色素を含む。
【００５７】
特定の波長のフルオロフォアをクエンチするためにクエンチャーが開発されており、当技術分野において知られている。クエンチャーがフルオロフォアのすぐ近くにあるとき、フルオロフォアは、クエンチャーにエネルギーを移動する。クエンチャーは、発光減衰を通してまたは無放射的に、このエネルギーを移動して自然の基底状態に戻る。無放射または暗減衰において、フルオロフォアから移動されたエネルギーは、分子振動として放出される。より広範囲にわたるフルオロフォアの使用を可能にすることができるクエンチャーを提供するために、クエンチャーの選択では、低いバックグラウンド蛍光、高い感度、および最大スペクトルの重なりなどの質が考慮される。クエンチャーのいくつかの好ましい実施形態としては、Ｄａｂｃｙｌクエンチャー、Ｔａｍｒａクエンチャー、Ｑｘｌクエンチャー、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＦＱクエンチャー、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＲＱクエンチャー、またはＩＲ色素ＱＣ−１クエンチャーなどが挙げられる。クエンチャーの特に好ましい実施形態は、ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドに対してアンチセンスに設計されたオリゴヌクレオチドプライマー上で標識されたＢｌａｃｋｈｏｌｅクエンチャーを含むはずである。
【００５８】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングされ、それによってプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離／合成された核酸である。本開示のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用に関する。
【００５９】
プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチドまたはそれを超える長さである。こうしたプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリッド形成する。好ましくは、本開示によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なっていて標的配列にハイブリッド形成する能力を保持しているプローブが従来法によって設計されてもよい。
【００６０】
プローブおよびプライマーを調製および使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989などにおいて記載されている。ＰＣＲ−プライマー対は、例えば、その目的が意図されたコンピュータプログラムを使用することにより、既知の配列から導き出すことができる。
【００６１】
本明細書中に開示のＳＮＰの上流および下流のＤＮＡ配列に基づいたプライマーおよびプローブは、開示の配列を、従来法によって、例えば、こうした配列を再クローニングおよびシーケンシングすることによって、確認（および、必要であれば、修正）するのに使用することができる。
【００６２】
本開示の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェント条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリッド形成する。一般に、いかなる従来の核酸ハイブリダイゼーション法または増幅法も、ｆａｄ−３ｃ試料からＤＮＡの存在を同定するために使用することができる。核酸分子またはそれらの断片は、特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリッド形成する能力がある。本明細書中で使用される場合、２種の核酸分子は、２種の分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成する能力がある場合、互いに特異的にハイブリッド形成する能力があると言われる。１種の核酸分子は、それらが完全な相補性を示す場合、もう１種の核酸分子の「相補鎖」であると言われる。本明細書中で使用される場合、分子は、１種の分子のうちのすべてのヌクレオチドがもう１種のヌクレオチドに相補的であるときに、「完全な相補性」を示すと言われる。２種の分子は、それらが、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニーリングされた状態を維持するのを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリッド形成できる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、これらの分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニーリングされた状態を維持するのを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリッド形成できる場合、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989によって記載されている。したがって、完全な相補性からの逸脱は、そうした逸脱が、二本鎖構造を形成するための分子の能力を完全に排除しない限り、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして役割を果たすには、用いられる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成することができるように、配列において十分に相補的であることだけが必要とされる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較されている核酸配列の相補鎖と特異的にハイブリッド形成することになる核酸配列である。「ストリンジェント条件」という用語は、Sambrookら、1989、9.52〜9.55で述べられている特異的ハイブリダイゼーションの手順による、標的核酸への（すなわち、目的の特定の核酸配列への）核酸プローブのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989の9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。したがって、本開示のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ断片の相補的なストレッチと選択的に二重鎖分子を形成するそれらの能力のために使用されてもよい。
【００６４】
想定される用途に依存して、標的配列に対するプローブの多様な程度の選択性を達成するために、多様な条件のハイブリダイゼーションを使用することができる。高い選択性が必要とされる用途の場合、ハイブリッドを形成するために、典型的には、相対的にストリンジェントな条件を用いることになり、例えば、約０．５０ｍＭから約０２．００ｍＭのＭｇＣｌ２によって約５０℃から約７５℃の温度でもたらされるような、比較的低塩および／または高温の条件を選択することになる。温度および塩の双方が変更されてもよく、または温度もしくは塩濃度のいずれかが一定に保持されたままもう一方の変数が変更されてもよい。こうした選択的条件が、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを許容することは、たとえあるとしても、ほんのわずかである。ハイブリダイゼーションを介したＤＮＡ配列の検出は、当業者によく知られており、米国特許第４，９６５，１８８号および第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション解析の方法の好例である。
【００６５】
例示的な一実施形態において、本開示の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、それらの相補鎖および断片を含む、本明細書中に例示または示唆した１種または複数のプライマー（またはアンプリコンもしくは他の配列）と特異的にハイブリッド形成することになる。本開示の一態様において、本開示のマーカー核酸分子は、例示されている配列のうちの１つ、またはそれらの相補鎖および／もしくは断片において、本明細書中に記載のような核酸配列を有する。
【００６６】
本開示の他の一態様において、本開示のマーカー核酸分子は、こうした核酸配列と、８０％と１００％または９０％と１００％との間の配列同一性を共有する。本開示のさらなる一態様において、本開示のマーカー核酸分子は、こうした配列と、９５％、９６％、９７％、９８％、および／または９９％ならびに１００％の間の配列同一性を共有する。こうした配列は、遺伝的交配の後代を同定するための植物育種法におけるマーカーとして使用されてもよい。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られているいくつの方法によっても検出することができ、これらとしては、蛍光タグ、放射性タグ、抗体に基づいたタグ、および化学発光タグなどが挙げられうるが、これらに限定されない。
【００６７】
特定の増幅プライマー対を使用した（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェント条件」とは、プライマー対が、主にそれらの標的核酸配列と、高い優先度で、ハイブリッド形成するのを可能にし、それによってプライマー対の結合を可能にして、好ましくは、固有のアンプリコンを生成する条件である。
【００６８】
「（標的配列に）特異的」という用語は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプライマーが、主に、標的配列を含む試料中の核酸配列と、高い優先度で、ハイブリッド形成することを示す。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物を指す。例えば、有性交配から結果として生じたキャノーラ植物が、本明細書中に開示のような目的のＳＮＰを含有するかどうかを決定するためにである。キャノーラ植物組織試料から抽出されたＤＮＡは、ＳＮＰ部位に隣接したキャノーラ植物のゲノムにおいて上流または下流配列に由来する１種のプライマーおよびＳＮＰ部位に隣接したキャノーラ植物のゲノムにおいて上流または下流配列の他の末端に由来する第２のプライマーを含むプライマー対を使用して核酸増幅法にかけられてもよく、それにより、ＳＮＰの存在の診断用のアンプリコンを生成する。アンプリコンは、一定の長さであり、野生型または変異された遺伝子の診断用でもある配列を有する。アンプリコンは、長さにおいて、プライマー対に１ヌクレオチド塩基対を加えての合計の長さから、および／またはプライマー対に約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれよりも多いヌクレオチド塩基対を加えての（上に挙げたいずれかの増加分を加えたまたは引いた）合計の長さの範囲に及びうる。植物ゲノム配列由来であるプライマー対のメンバーは、ＳＮＰ配列から一定の距離に位置していてもよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲に及びうる。「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応において形成されうるプライマーダイマーを特別に除外する。
【００７０】
核酸増幅は、当技術分野において知られている、ＰＣＲなどの、多様な核酸増幅法のいずれによって達成されてもよい。多様な増幅法が、当技術分野において知られており、なかでも、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に、記載されている。ＰＣＲ増幅法は、最長２２ｋｂのゲノムＤＮＡを増幅するために開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野において知られている他の方法は、本開示の実施において使用されうる。ｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰの配列は、本明細書に記載の配列に由来するプライマーを使用してこうした配列を増幅して、その後、ＰＣＲアンプリコンのまたはクローン化ＤＮＡの標準的ＤＮＡシーケンシングによって検証されうる。
【００７１】
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技術によって検出されうる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムでの染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する一般的なよく知られた方法である。もう１つのこうした方法は、近くの隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の双方にオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される遺伝子ビット解析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル内に固定される。（挿入配列内の１種のプライマーおよび近くの隣接ゲノム配列内の１種を使用した）目的の領域のＰＣＲ後に、一本鎖ＰＣＲ産物は、固定されたオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができ、ＤＮＡポリメラーゼおよび予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを使用した一塩基伸張反応のための鋳型としての役割を果たす。読み出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡベースのものであってもよい。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸張の成功による、挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７２】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法である。簡単に説明すると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、目的のＳＮＰとオーバーラップするように設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（目的のＳＮＰの上流の少なくとも１種および下流の少なくとも１種）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。
【００７３】
増幅後、目的のＳＮＰの存在および試料の接合性を決定するために、（上記のＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブを使用して）アレル識別解析を行うこともできる。アレル識別解析中に、異なる２種のハイブリダイゼーションプローブ（ＳＮＰ配列に相補的なヌクレオチドを含む１種のプローブおよび野生型配列に相補的なヌクレオチドを有するもう１種のプローブ）は、アンプリコンとハイブリッド形成して消化され、それにより、ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブからクエンチャー部分を放出して蛍光をもたらす。野生型遺伝子に特異的なプローブ対ＳＮＰに特異的なプローブの相対蛍光の比較により、目的のＳＮＰの存在および接合性の指標が得られる。
【００７４】
本明細書中に言及または引用されているすべての特許、特許出願、仮出願、および出版物は、参照によりその全体が、それらが本明細書の明示された教示と矛盾しない程度まで組み込まれている。
【００７５】
以下の実施例は、本開示を実施するための手順を例示するためおよび本開示の特定の好ましい実施形態を実証するために含まれているものである。これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。以下の実施例において開示されている技術が、その実施のための好ましい様式を例示するために使用される特定のアプローチを表していることは、当業者によって理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に鑑み、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、依然として類似または同様の結果を得ながら、これらの特定の実施形態において多くの変更がなされうることを理解するはずである。他に示されていない限り、すべての百分率は重量によるものであり、すべての混合溶媒の割合は、特に明記されていない限り、容量によるものである。
【００７６】
特に明記されていない限り、以下の略語を使用する。
ｂｐ  塩基対
℃  摂氏度
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＦＲＥＴ  蛍光共鳴エネルギー移動
ＤＩＧ  ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ  キロベース
μｇ  マイクログラム
μＬ  マイクロリットル
ｍＬ  ミリリットル
Ｍ  モル質量
ＯＬＰ  重複プローブ
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ  植物転写単位
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＮＰ  一塩基多型
ＳＯＰ  標準操作手順
ＳＳＣ  塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ  Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３
Ｖ  ボルト
【実施例】
【００７７】
［実施例１］
ＦＡＤ−３ｃエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ
エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、ｆａｄ−３ｃの一塩基多型変異を検出するためおよび育種個体群の中でｆａｄ−３ｃ遺伝子変異を含有するキャノーラ植物の接合性の状態を決定するために開発された。ｆａｄ−３ｃ遺伝子のエキソン６および７に位置する高度に保存されたＤＮＡ配列に結合するように２種のプライマーを設計した。これらのプライマーは、変異したキャノーラ植物および変異していないキャノーラ植物において、ｆａｄ−ｓ３ｃの一塩基多型を含む１５４ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ変異は、Huら（2006）によって記載されており、遺伝子のエキソン６およびイントロン６のスプライス部位のジャンクション中に位置する（図１）。野生型ｆａｄ−３ｃ遺伝子および変異したｆａｄ−３ｃ遺伝子（一塩基多型、ＳＮＰからなる）の存在を検出するためのレポーター色素としてそれぞれＦＡＭおよびＶＩＣを用いて、２種のＴａｑＭａｎ（登録商標）副溝結合型非蛍光性クエンチャー（ＭＧＢＮＦＱ）プローブを設計した。これらの２種のプローブは、イントロン６上に位置する近隣の多型を回避するために特別な考慮をしてｆａｄ−３ｃの一塩基多型（図１）のすぐ近くに設計された。別の多型を回避することにより、ｆａｄ−３ｃ変異体植物の検出用のプローブの特異性を高める結果となった。ｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰを含有するキャノーラ植物用のＴａｑＭａｎ（登録商標）検出法を、キャノーラ変種「ＮＥＸ８２８」（ｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰを含有する）、対照キャノーラ変種「クアンタム（Quantum）」（ｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰを含有しない）、およびｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰについてヘテロ接合性であることが知られている植物から単離されたＤＮＡ試料に対して試験した。エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを使用して、高処理能力の適用法、例えば、９６ウェルおよび３８４ウェルのプレート形式で試験される、ｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰの存在を決定し、植物の接合性も決定した。
［実施例１．１］
【００７８】
ｇＤＮＡ単離
ｆａｄ−３ｃ変異および対照キャノーラ植物を含有する異なる１５６種のキャノーラ植物のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料をこの試験において試験した。改変したＱｉａｇｅｎ  ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ植物ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。新鮮なキャノーラリーフディスクを、１試料あたり４枚、ｇＤＮＡ抽出に使用した。販売会社の説明書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に従ってＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ法を用いて、ｇＤＮＡを定量した。試料を、ＤＮａｓｅを含まない水で希釈して、この試験の目的のために結果として５ｎｇ／μＬの濃度にした。
［実施例１．２］
【００７９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイおよび結果
ＴａｑＭａｎ（登録商標）エンドポイントアッセイにおける使用のために、特定のＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブを設計した。これらのプライマーおよびプローブは、目的のＳＮＰを含むｆａｄ−３ｃ遺伝子の領域を増幅および検出するように設計した。これらの試薬は、キャノーラ植物中の変異したｆａｄ−３ｃ遺伝子を検出するために、下の一覧に示されている条件で使用することができる。表１は、キャノーラ植物におけるｆａｄ−３ｃ  ＳＮＰの検出用に特別に開発されたプライマーおよびプローブの配列の一覧である。
【００８０】
【表２】
2014530624.tif 000003
【００８１】
増幅用のＰＣＲ反応混合物は、以下の通りである：６μｌの全反応物中、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＴＥｘｐｒｅｓｓマスターミックス、０．９μＭのフォワードプライマー（配列番号２）、０．９μＭのリバースプライマー（配列番号３）、０．２μＭのＦＡＤ−３Ｃ変異体プローブ（配列番号４）、０．２μＭの野生型プローブ（配列番号５）、１５ｎｇのｇＤＮＡ。この反応混合物を、以下の熱サイクル条件を使用して増幅した：最初の２段階は５０℃を２分間および９５℃を３０秒間；次の４０サイクルは９５℃で３秒間および６２℃で３０秒間。次いで、反応物を、サーマルサイクラーから取り出すまで１０℃で維持した。ＰＣＲ熱サイクルは、ＡＢＩ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｅｒｉｔｙサーマルサイクラー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のいずれかを使用して行うことができる。試料プレートは、ｆａｄ−３ｃ変異体（「ＮＥＸ  ８２８」）についてホモ接合性、ｆａｄ−３ｃ変異体についてヘテロ接合性、またはｆａｄ−３ｃ野生型（「クアンタム（Quantum）」）についてホモ接合性であったキャノーラ植物からの対照ＤＮＡから構成されていた。さらに、ＤＮＡを含有していない鋳型なしの対照を含めた。増幅後、製造業者によって記載されているようなアレル識別プレート読み取り手順に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムを使用してエンドポイント蛍光シグナル（ＶＩＣおよびＦＡＭ）を読み取った。次いで、このデータを、ＳＤＳ２．４ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して解析し、各試料の相対蛍光を決定した（図２）。
【００８２】
キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ変異についてのＴａｑＭａｎ（登録商標）検出法を、既知のホモ接合性、ヘミ接合性、および野生型の試料に対して試験した。（試料の反応物の）各プローブから生じた蛍光を、対照のプローブによって生じた蛍光と共に解析することにより、各試料の接合性の決定が補助される。このアッセイは、キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ変異および野生型一塩基多型の検出について高い特異性を実証し、対照から結果として生じるいかなる検出可能な偽陽性の生成も増幅もしなかった。イベント特有のプライマーおよびプローブは、キャノーラにおけるｆａｄ−３ｃ変異およびｆａｄ−３ｃ野生型遺伝子の検出用に使用することができ、これらの条件および試薬は、接合性アッセイに適用可能である。
【図１】
2014530624.tif 000004
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2014530624.tif 000006