(57)【要約】【課題】２〜６のｐＨを有する食品中での酵母菌の増殖を制御するまたは防止するための方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、ａ）エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）と、ｂ）塩基性アミノ酸のポリマーおよび塩基性アミノ酸α−アミドのエステル、および／またはそれらの塩から成る群から選択される塩基性アミノ酸の誘導体との組み合わせを抗酵母菌剤として、２〜６のｐＨを有する食品に添加することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜６のｐＨを有する食品中での酵母菌の増殖を制御するまたは防止するための方法であって、ａ）エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）と、ｂ）塩基性アミノ酸のポリマーおよび塩基性アミノ酸α−アミドのエステル、および／またはそれらの塩から成る群から選択される塩基性アミノ酸の誘導体との組み合わせを抗酵母菌剤として該食品に添加することを含む、上記方法。
【請求項２】
エピガロカテキンガラートが緑茶エキスとして食品に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
塩基性アミノ酸のポリマーがポリリシンである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ポリリシンがε−ポリリシンである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
塩基性アミノ酸α−アミドのエステルがラウリン酸アルギナートである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
エピガロカテキンガラートが０．０００１〜２重量％の濃度で、好ましくは０．００１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．５重量％、さらにより好ましくは０．０１〜０．１重量％の濃度で食品に添加される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
塩基性アミノ酸の誘導体が、０．００００１〜１重量％の濃度で、好ましくは０．０００１〜０．１重量％、より好ましくは０．０００５〜０．０１重量％、さらにより好ましくは０．００１〜０．００５重量％の濃度で食品に添加される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
食品が３〜５のｐＨ、好ましくは３〜３．５、より好ましくは約３．２のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
食品が飲料である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
酵母菌が、Candida albicans、Saccharomyces cerevisiaeおよび／またはZygosaccharomyces bailiiである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ａ）エピガロカテキンガラートと、ｂ）ラウリン酸アルギナートおよびポリリシンの両方とを含む、食品に添加するための組成物。
【請求項１２】
ａ）とｂ）との重量比が、０．０１ａ：１ｂ〜５０００ａ：１ｂ、特に５ａ：１ｂ〜２０００ａ：１ｂ、好ましくは１０ａ：１ｂ〜１０００ａ：１ｂ、より好ましくは５０ａ：１ｂ〜５００ａ：１ｂ、さらにより好ましくは１００ａ：１ｂである、請求項１２記載の組成物。
【請求項１３】
２〜６のｐＨを有し、かつａ）エピガロカテキンガラートとｂ）ラウリン酸アルギナートおよびポリリシンの両方とを含む食品。
【請求項１４】
ａ）を０．０００１〜２重量％の濃度で、好ましくは０．００１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．５重量％、さらにより好ましくは０．０１〜０．１重量％の濃度で含み、かつｂ）を０．００００１〜１重量％の濃度で、好ましくは０．０００１〜０．１重量％、より好ましくは０．０００５〜０．０１重量％、さらにより好ましくは０．００１〜０．００５重量％の濃度で含む、請求項１４記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性食品中の酵母菌を抑制する方法、食品へ添加するための組成物および上記組成物を含む酸性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母菌は、食品の微生物による腐敗の有意な画分を形成する。食品の安全性および食品腐敗の防止は、世界中で絶えず存在する関心事であり、食品工業の重要な部分を占める酸性食品、例えば飲料、乳製品、インスタント食品、スープまたはソース、については特にそうである。食品の腐敗は、食品製造者にとって、大きな経済的問題である。また、良好な味と高い品質とを組み合わせたヘルシーで１００％天然の食品に関する要求が高まっている。食品製造者は、食べても安全であり、かつ低温または環境温度での貯蔵における保証された保存期間を有する製品を届けることにより、消費者の要求を満たしながら、公衆の健康および安全を保護することが必要である。
【０００３】
酸性食品は、保存剤の使用における可能性が限られているので、保存が困難である。保存剤の安定性および抗微生物活性を維持する点で、そのような酸性環境に耐え得る保存剤のみが適する。これは、例えば多くのタンパク質、アミノ酸および酵素を、酸性食品における保存剤としての使用に適しないものにする。
【０００４】
エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）は、その有益な生理学的特性のために知られている、緑茶エキスに存在する天然の生成物である。ＥＧＣＧおよび関連するカテキン誘導体は、抗酸化剤として、および血圧、血糖値およびコレステロール値の上昇を抑制するものとして作用することが記載されている（欧州特許第１２９７７５７号明細書）。
【０００５】
ＥＧＣＧおよび／または密接に関連するカテキンを含む組成物はまた、抗微生物活性を有することが報告されている。
【０００６】
独国特許出願公開第１９９１７８３６号明細書は、柑橘系フルーツに基づく保存剤を記載しており、柑橘系フルーツエキスに存在し得る活性なフラボノイド成分の１つとしてＥＧＣＧに言及している。この文献はさらに、ブドウエキス組成物が、インビトロでいくつかの微生物、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌および酵母菌、に対して活性であることを開示している。
【０００７】
国際公開第２００６／１１７０２９号パンフレットは、主に嫌気性細菌によって引き起こされる口臭に対して使用するための、ポリリシンおよびポリヒドロキシフェノール性化合物を含む組成物を記載している。ポリヒドロキシフェノール性化合物は、ＥＧＣＧを含み得る緑茶エキス、またはオリーブエキスである。上記組成物の抗菌活性は、例えば抗菌成分としてポリリシンおよび緑茶エキスを含む口内噴霧製剤またはミント錠剤を使用した後の、口腔中の嫌気性菌代謝産物の量の減少を測定することにより評価される。
【０００８】
特開平１１−２９２７１０号公報は、アルコール、天然エキス、界面活性剤および水を含む殺菌剤組成物を記載している。天然エキスは、リンゴフェノン、ヒノキチオール、ポリリシンおよび緑茶エキスから選択される。ＥＧＣＧが、緑茶エキスに含まれ得るカテキンの１つとして言及されている。上記文献に示された実施例は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する種々の組成物の活性を示している。
【０００９】
国際公開第２００９／０３１０４１号パンフレットは、緑茶エキスであり得る抗菌化合物または抗菌物質としてのラウリン酸アルギナート（ＬＡＥ）またはその誘導体を含む組成物を記載している。この文献には、種々の微生物に対する上記組成物の活性が、培養培地において分析されている。酵母菌に対する活性の評価が示された実施例では、抑制活性が緑茶エキスについては観察されておらず、１００００ｐｐｍより上の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示しているが、ＬＡＥは、酵母菌Saccharomyces cerevisiaeおよびKluyveromyces marxianusをそれぞれ２４および７ｐｐｍのＭＩＣで抑制することを示している。さらに、ＬＡＥと緑茶エキスとの組み合わせについて、酵母菌の抑制における相互作用は観察されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第１２９７７５７号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１９９１７８３６号明細書
【特許文献３】国際公開第２００６／１１７０２９号パンフレット
【特許文献４】特開平１１−２９２７１０号公報
【特許文献５】国際公開第２００９／０３１０４１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚いたことに、ＥＧＣＧが、塩基性アミノ酸の誘導体および／またはその塩との組み合わせにおいて、酸性食品（すなわち、２〜６のｐＨを有する食品）中の酵母菌に対する優れた抑制活性を示すことが今分かった。
【００１２】
塩基性アミノ酸誘導体は、塩基性アミノ酸のポリマーおよび塩基性アミノ酸α−アミドのエステルからなる群から選択される。
【００１３】
ＥＧＣＧおよび塩基性アミノ酸誘導体は、それら自体、高い抗酵母菌活性を有することが知られていない。驚いたことに、本発明者らは、ＥＧＣＧと塩基性アミノ酸の誘導体との組合せが、酸性食品における有効な抗酵母菌剤として作用することを今見出した。予期せぬことに、酸性食品における上記組合せの抗酵母菌活性は、個々に使用されるときの上記化合物の活性の合計よりも有意に高い。これは恐らく、酵母菌に対する上記組合せの相乗効果による。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、１局面では、本発明は、２〜６のｐＨを有する食品中での酵母菌の増殖を制御するまたは防止するための方法に関し、上記方法は、ａ）エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）と、ｂ）塩基性アミノ酸のポリマーおよび塩基性アミノ酸α−アミドのエステル、および／またはそれらの塩から成る群から選択される塩基性アミノ酸の誘導体との組み合わせを抗酵母菌剤として上記食品に添加することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載された方法は、酸性食品中の酵母菌の増殖を制御または防止するための全て天然の化合物を使用するだけでなく、有利には、比較的少量の保存剤（すなわち抗酵母菌剤）をも必要とする。
【００１６】
本明細書に記載された抗酵母菌の組合せが添加されるところの使用される食品は、酸性食品であり、これは、自然に酸性であり得、または酸性のものを添加することによって酸性にされ得る。酸性食品は、２〜６の、好ましくは３〜５の、より好ましくは３〜３．５の、さらにより好ましくは約３．２のｐＨを有する食品である。酸性食品は、固体食品または液体食品であり得る。そのような酸性食品は、例えば、飲料（例えば、ソフトドリンク、フルーツまたは野菜に基づくジュース、ビール、ワイン、ミルクおよび液体ヨーグルト）、スープ、ドレッシング、ソース、ピューレ、トッピング、ジャム、乳製品、肉および魚製品、冷凍品および高温処理品、ならびにインスタント食品を包含する。
【００１７】
本明細書に記載された方法は、ａ）ＥＧＣＧとｂ）塩基性アミノ酸のポリマーおよび塩基性アミノ酸α−アミドのエステル、および／またはそれらの塩から成る群から選択される塩基性アミノ酸の誘導体との組み合わせを抗酵母菌剤として使用する。
【００１８】
本願の文脈において、抗酵母菌剤は、抗酵母菌活性を有する化合物、すなわち酵母菌の増殖を抑制するおよび／または酵母菌に対する殺生物効果を有する化合物の組合せである。本明細書に記載された抗酵母菌剤は、食品に適用されるとき、食品中の酵母菌の増殖を制御しまたは防止することにより保存剤として作用する。この結果、酵母菌の、および／または酵母菌の代謝活性から誘導される毒性の化合物および／または食品を害する化合物の食品中での存在を減少または抑制する。それによって、食品の安定性が高められる。
【００１９】
上記組合せにおける成分ａ）であるエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）は、天然のポリヒドロキシフェノール性化合物であり、植物由来のエキス、例えば緑茶エキスに存在する。ＥＧＣＧは、単離された形状で酸性食品に添加され得、または緑茶エキスの一部であり得る。典型的に、適する緑茶エキスは、許容され得る感覚特性および溶解性の組合せを有する。ＥＧＣＧの他の源、例えば柑橘系フルーツエキスも使用され得る。ＥＧＣＧは、商業的に得られ得、当業者に公知の方法に従って天然源から抽出され得、または合成ルートによって調製され得る。
【００２０】
上記組合せの成分ｂ）は、塩基性アミノ酸のポリマーおよび塩基性アミノ酸α−アミドのエステル、および／またはそれらの塩から成る群から選択される塩基性アミノ酸の誘導体である。
【００２１】
塩基性アミノ酸誘導体は、遊離の化合物として、塩として、または遊離の化合物と塩との組合せとして食品に添加され得る。食品への添加のために適切な、例えばＧＲＡＳに適合する（連邦規則集２１ＣＦＲ１８２により一般に安全と認められた）、塩基性アミノ酸誘導体の任意の塩が使用され得る。適する塩は、例えば、塩化物塩、臭化物塩および硫酸水素塩を包含する。
【００２２】
本願の文脈内の塩基性アミノ酸は、７より上の等電点（ｐＩ）を有するアミノ酸である。塩基性アミノ酸の群内の好ましいアミノ酸は、天然アミノ酸、すなわち、天然に存在するアミノ酸である。それらは、リシン（ｐＩは９．７４である）、アルギニン（ｐＩは１０．７６である）およびヒスチジン（ｐＩは７．５９である）を包含する。リシンおよびアルギニンの誘導体の使用が好ましい。
【００２３】
本明細書の文脈内で、塩基性アミノ酸のポリマーとは、塩基性アミノ酸の５〜１０００個のモノマーのポリマーを包含し、例えばポリリシン、ポリアルギニンおよびポリヒスチジンが挙げられる。重合度は、好ましくは、５〜５００モノマー、より好ましくは５〜１００、最も好ましくは１０〜５０モノマーであり得る。ポリリシンは、Ｌ−リシンのホモポリマーであり、好ましく使用される。ポリリシンは、α−ポリリシン、ε−ポリリシンまたはそれらの混合物として使用され得、好ましくはε−ポリリシンとして使用される。ε−ポリリシンは好ましくは、遊離カルボキシル基とε−アミノ基との間のペプチド結合によって結合された２５〜３５のＬ−リシンモノマーを含む。ポリリシンは市販されており、また、一般に好気性菌による醗酵により製造される。
【００２４】
本明細書の文脈内で、塩基性アミノ酸α−アミドのエステルとは、カルボキシル酸基およびアミノ基の代わりに、エステル基および、アミノ酸のα炭素に結合したアミド基を有する塩基性アミノ酸を意味する。アミノ酸の塩基性側鎖は遊離形または塩の形である。そのような塩基性アミノ酸α−アミドのエステルの塩の形は、下記構造を有する。
【００２５】
2014507120.tif 000002
ここで、Ｘは対イオン、例えばＢｒ、ＣｌまたはＨＳＯ４イオンであり、Ｒ１は８〜１４の炭素原子を有する直鎖状アルキル鎖であり、Ｒ２は芳香族基または１〜１８の炭素原子の直鎖状もしくは分岐鎖状アルキル鎖であり、Ｒ３は、下記：
2014507120.tif 000003
の１つであり、ｎは０〜４である。
【００２６】
塩基性アミノ酸α−アミドのエステルは好ましくは、アルギニンのα−アミドのエステルである。そのようなエステルの特定の例は、ラウリン酸アルギナート（lauric arginate）である。ラウリン酸アルギナートは、ラウリン酸およびアルギニンから誘導され、特に、アルギニン一塩酸塩のラウリンアミドのエチルエステルである。ラウリン酸アルギナート（Minerat（商品名）−Ｎおよびラウリンアミドアルギニンエチルエステル、すなわちＬＡＥ、としても知られる）は、ラウリン酸、エタノールおよびＬ−アルギニンから合成され得る。ＬＡＥは、種々の濃度で、マルトデキストリン担体に結合された粉末として、およびＬＡＥ一塩酸塩のプロピレングリコール中の溶液として市販されており、それらは食品に直接添加され得る。
【００２７】
ＬＡＥの塩化物塩の化学構造は、以下の通りである。
2014507120.tif 000004
【００２８】
種々の塩基性アミノ酸誘導体の組合せが成分ｂ）として使用され得る。例えば、成分ｂ）は、種々の塩基性アミノ酸ポリマーの組合せ、種々の塩基性アミノ酸α−アミドエステルの組合せ、または塩基性アミノ酸ポリマーと塩基性アミノ酸α−アミドエステルとの組合せであり得る。
【００２９】
従って、ＥＧＣＧは、例えば、ＬＡＥとの組合せ、ポリリシンとの組合せ、またはＬＡＥおよびポリリシンとの組合せで使用され得る。
【００３０】
本明細書に記載された方法は有利には、酸性食品に添加されなければならないａ）およびｂ）成分の各々が比較的少量であることを要求する。
【００３１】
上記２つの成分は、酵母菌抑制をもたらすのに十分な量および割合で添加される。特定の酸性食品のための抗酵母菌剤の成分の各々の最適な量および割合を選択することは、十分に当業者の範囲内である。最適な量および割合は、ＥＧＣＧと塩基性アミノ酸誘導体との種々の組合せが添加された酸性食品において、例えば酵母菌コロニー形成単位（ＣＦＵｓ）の量を、当業者に公知の方法によって比較することにより評価され得る。
【００３２】
ＥＧＣＧは一般に、０．０００１〜２重量％の濃度で、好ましくは０．００１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．５重量％、さらにより好ましくは０．０１〜０．１重量％の濃度で酸性食品に添加され得る。
【００３３】
塩基性アミノ酸誘導体は一般に、０．００００１〜１重量％の濃度で、好ましくは０．０００１〜０．１重量％、より好ましくは０．０００５〜０．０１重量％、さらにより好ましくは０．００１〜０．００５重量％の濃度で酸性食品に添加され得る。種々の塩基性アミノ酸誘導体の組合せが成分ｂ）として使用されるとき、種々の塩基性アミノ酸誘導体（例えば、ＬＡＥおよびポリリシン）の合計の濃度も一般に、０．００００１〜１重量％、好ましくは０．０００１〜０．１重量％、より好ましくは０．０００５〜０．０１重量％、さらにより好ましくは０．００１〜０．００５重量％である。
【００３４】
上記重量％は、酸性食品の合計重量に対する活性化合物の重量を示し、上記活性化合物は、ＥＧＣＧ（緑茶エキスではない）および塩基性アミノ酸誘導体（塩のアニオンを除く）である。組合せの成分ａ）およびｂ）が酸性食品に添加されるところの重量比は、０．０１ａ：１ｂ〜５０００ａ：１ｂ、特に５ａ：１ｂ〜２０００ａ：１ｂ、好ましくは１０ａ：１ｂ〜１０００ａ：１ｂ、より好ましくは５０ａ：１ｂ〜５００ａ：１ｂ、さらにより好ましくは１００ａ：１ｂであり得る。
【００３５】
ＥＧＣＧおよび塩基性アミノ酸誘導体は、各々個々にまたはプレ混合物として酸性食品に添加され得る。成分の各々またはプレ混合物は、固体形状で（例えば粉末として）または液体形状で（例えば溶液、分散物またはシロップとして）添加され得る。抗酵母菌剤はまた、担体によって食品に添加され得る。適する担体は、シリカ、シクロデキストリンおよび／またはマルトデキストリンを包含する。一般に、液体の、顆粒のまたはマッシュされた食品の場合には、添加が、抗酵母菌剤を酸性食品と混合することによって行われる。抗酵母菌剤はまた、例えば噴霧することによって、食品の表面に施与され得る。
【００３６】
また、他の添加剤が、別個に、またはＥＧＣＧおよび／または塩基性アミノ酸誘導体と予め混合されて、酸性食品に添加され得る。好ましい添加剤（これらも、抗酵母菌活性の何らかの増加を示す）は、バニリン、シナモンエキス、モノおよび／またはジグリセリド、ホップエキス、桂皮酸またはその塩、カプロン酸、ヘキサメタリン酸ナトリウム、脂肪酸ラクチレート（例えば、カプロイルラクチレートナトリウムおよびラウロイルラクチレートナトリウム）、ソルビン酸またはその塩、プロピオン酸またはその塩、およびPurac製の培養された糖（例えば、PuraQ Verdad NV10およびPuraQ Verdad NV15、それらは、コーンシュガー、例えば砂糖、有機酸、ペプチドおよびアロマの醗酵製品からなる）を包含する。他の添加剤は、例えば、フレーバー増強剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、乳化剤および保存剤を包含する。本発明の方法は一般に、さらなる食品保存剤の使用を必要としないが、必要ならば添加され得る。
【００３７】
一般に、酸性食品に添加される全成分がＧＲＡＳに適合するのが好ましい。また、上記添加が、例えば味、テクスチャーおよび色に関する、酸性食品の、感覚器官が感知し得る品質に悪影響を及ぼさないのが好ましい。
【００３８】
本明細書に記載された方法は、食品の腐敗と一般に関係する酵母菌、例えばCandida（例えば、C. albicans）、Saccharomyces（例えば、S. cerevisiae）およびZygosaccharomyces（例えば、Z. bailii）、に対して非常に有効であることが分かる。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は、食品への添加のための、エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）、ラウリン酸アルギナート（ＬＡＥ）およびポリリシンを含む組成物、およびＥＧＣＧ、ＬＡＥおよびポリリシンを含む酸性食品に関する。
【００４０】
上述したように、ａ）ＥＧＣＧとｂ）ＬＡＥおよびポリリシンの両方とを含む組成物は、本明細書に記載の方法に従って有効に使用され得る。したがって、上記組成物は、成分ａ）およびｂ）を、０．０１ａ：１ｂ〜５０００ａ：１ｂ、特に５ａ：１ｂ〜２０００ａ：１ｂ、好ましくは１０ａ：１ｂ〜１０００ａ：１ｂ、より好ましくは５０ａ：１ｂ〜５００ａ：１ｂ、さらにより好ましくは１００ａ：１ｂの重量比で含み得る。
【００４１】
ａ）ＥＧＣＧおよびｂ）ＬＡＥおよびポリリシンの両方を含む酸性食品は一般に、ａ）を０．０００１〜２重量％、好ましくは０．００１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．５重量％、さらにより好ましくは０．０１〜０．１重量％の濃度で、およびｂ）、すなわちＬＡＥおよびポリリシンの合計を、０．００００１〜１重量％、好ましくは０．０００１〜０．１重量％、より好ましくは０．０００５〜０．０１重量％、さらにより好ましくは０．００１〜０．００５重量％の濃度で含む。
【実施例】
【００４２】
本発明を下記の実施例によってさらに説明するが、本発明は、下記の実施例にまたは下記の実施例によって限定されない。
【００４３】
実施例１：酵母菌の抑制
５３重量％のＥＧＣＧを有する緑茶エキスＥＧＣＧ５０を、Layn（中国麗江）から購入した。ε−ポリリシン（５０重量％のポリリシン）を、Chisso（日本国）から購入した。ＬＡＥ（Minerat（商品名）−Ｎ（４０重量％））を、Vedeqsa（スペイン国）から購入した。
【００４４】
Candida albicansが、市販の飲料から単離され、Saccharomyces cerevisiae（ＣＢＳ２１９０）およびZygosaccharomyces bailii（ＣＢＳ６７０８）が、ＣＢＳ（Centraalbureau voor Schimmelcultures）から得られた。
【００４５】
Ａ）最小発育阻止濃度の決定
酵母菌培養物が、液体培地（１リットルにつき、５ｇの濾過されたモルトエキス（Oxoid Ltd.、英国）、４０ｇのグルコースおよび５ｇのBacto Peptone（Becton Dickinson、米国）、ｐＨ３．５、製造者の指示に従って調製された）中でねじ蓋付きの管において２５℃で少なくとも４８時間増殖された。
【００４６】
ＭＩＣの決定のために、液体培地が、増加する量の抑制剤をともなって、上述したように調製された。各抑制剤を含む培地２００μＬが、滅菌した９６ウエルのマイクロタイタープレートのパネルに移された。完成したウエルプレートが、さらなる使用まで４℃で貯蔵された。抑制剤含有液体培地の接種のために、７２〜８４時間増殖された培養物の５μＬが使用された。各組成物のための最適な密度（ＯＤ）が、接種の９６時間後に測定された。得られたＭＩＣ値を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2014507120.tif 000005
【００４８】
Ｂ）組合せ試験
酵母菌の抑制が、ＥＧＣＧとポリリシンまたはＬＡＥとの組合せに関して評価された。
【００４９】
酵母菌培養物が、脱塩水１リットルにつき、４０ｇのスクロース、０．３５ｇのリンゴフレーバー（Givaudan）、８．３ｇのリンゴジュース濃縮物（Gargill）および１ｇのクエン酸を含むモデル飲料中で増殖された。ｐＨは約３．５であった。培養物が、ねじ蓋付きの管において、２５℃で少なくとも４８時間、増殖された。
【００５０】
２つの成分を組み合わせる試験が、滅菌した９６ウエルのマイクロタイタープレートにおいて行われた。モデル飲料が、増加する量の２種類の抑制剤を伴って上述したように調製された。各抑制剤の濃度は、８の等しい濃縮工程において与えられた。それらは、特定の抑制剤のための特定の酵母菌の見積もられるＭＩＣ値の０乃至１〜２倍の範囲であった。各培地の２００μＬが、滅菌した９６ウエルのマイクロタイタープレートのパネルに移された。完成したウエルプレートは、さらなる使用まで４℃で貯蔵された。この試験の接種のために、７２〜８４時間の増殖培養物の５μＬが使用された。各組成物のＯＤが、接種の９６時間後に測定された。結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2014507120.tif 000006
【国際調査報告】
2014507120.tif 000007
2014507120.tif 000008
2014507120.tif 000009