(57)【要約】  対象における癌を検出するための方法が開示される。方法は、対象から採取した生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを検出すること；および生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルと比較することを含む。１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含む。
2014501387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の存在を検出するための方法であって：前記対象から採取した生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを検出すること；および
前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現のレベルを前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルと比較することを含み、
前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常より高いレベルが前記対象における前記癌の存在を示すことを特徴とし、
前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の前記正常レベルが事前に決定された数値であるかまたは前記生物学的サンプルと同じ起源または種類の既知の正常非癌性細胞の対照サンプルから得られることを特徴とし、かつ
前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項３】
請求項２に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
請求項１に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項５】
請求項１に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６  ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の前記方法であって、前記癌が癌腫であることを特徴とする前記方法。
【請求項７】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が乳癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６  ＣＸ３ＣＲ１、ＨＥＲ２、ＲＢＭ３およびＣＥＡからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項８】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が前立腺癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項９】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が脳癌、下垂体癌または骨癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が結腸直腸癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、セプラーゼポリペプチド、抗ｐ５３、オステオポンチンおよびフェリチンからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が卵巣癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＨＥ−４、ＯＶＸ−１マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびリゾフォスファチジルコリンからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が肺癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１キネシンファミリー構成要素４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）、神経ペントラキシンＩ（ＮＰＴＸ１）、線維芽細胞成長因子受容体１癌遺伝子パートナー（ＦＧＦＲ１ＯＰ）タンパク質およびＣＥＡからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の前記方法であって、前記癌腫が膵臓癌または胃癌であることを特徴としかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＥＡからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記方法であって、前記生物学的サンプルが血漿、唾液または尿であることを特徴とする前記方法。
【請求項１５】
癌を有する対象の予後を評価するための方法であって：
前記対象に由来する生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および
前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現のレベルを前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、
前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の前記対照レベルに対してより高いレベルが前記対象の予後が不良であることを示すことを特徴とし、
前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の前記対照レベルに対してより低いかまたは同様のレベルが前記対象の予後が良好であることを示すことを特徴とし、
不良な予後が前記癌が侵襲型または浸潤型であることを示すことを特徴とし、前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーが（１）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者、および／または（２）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６  ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の前記方法であって、前記生物学的サンプルが血漿、唾液または尿であることを特徴とする前記方法。
【請求項１９】
対象における癌治療の経過をモニタリングするための方法であって：
前記治療中または治療後に前記対象から採取した１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および  
前記１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現のレベルを前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、
前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記対照レベルが前記対象における前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの治療前レベルまたは事前に定められた参照レベルであることを特徴とし、
前記１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーが前記対照レベルと同様であるかまたはこれより低い場合に前記治療が有効であると考えられることを特徴とし、
前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーが（１）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者、および／または（２）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の前記方法であって、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６  ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の前記方法であって、前記生物学的サンプルが血漿、唾液または尿であることを特徴とする前記方法。
【請求項２３】
癌を検出するためのキットであって：
生物学的サンプル中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を判定するための試薬；および前記試薬を用いる方法の指示を含み、
前記試薬が抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体または両者を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項２４】
請求項２３に記載の前記キットであって：
（１）生物学的サンプル中のＣＸＣＬ１３および／またはＣＸＣＲ５の発現を判定するための試薬；および前記試薬を用いる方法の指示をさらに含み、
前記試薬が抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体または両者を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項２５】
請求項２４に記載の前記キットであって：
生物学的サンプル中のＣＸＣＬ１６および／またはＣＸＣＲ６の発現を判定するための試薬；および前記試薬を用いる方法の指示をさらに含み、
前記試薬が抗ＣＸＣＬ１６抗体、抗ＣＸＣＲ６抗体または両者を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項２６】
請求項２３に記載の前記キットであって：
生物学的サンプル中のＣＸＣＬ１６および／またはＣＸＣＲ６の発現を判定するための試薬；および前記試薬を用いる方法の指示をさらに含み、
前記試薬が抗ＣＸＣＬ１６抗体、抗ＣＸＣＲ６抗体または両者を含むことを特徴とする前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１１年１２月７日に出願された米国特許第１３／３１３，７０５号、２０１１年９月２９日に出願された米国特許第１３／２４８，９０４号、２０１１年９月１５日に出願された米国特許第１３／２３３，７６９号、および２０１０年１２月１４日に出願された米国特許第１２／９６７，２７３号からの優先権を主張する。本願は２０１１年１２月６日に出願された米国特許出願第１３／３１２，３４３号からの優先権も主張する。前述の全ての出願の全文を参照文献として本願に援用する。
【０００２】
本願は、全般的に癌の検出に関する。具体的には、本発明は抗ケモカインおよび／または抗ケモカイン受容体抗体を用いて癌を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は米国における主要な死因の１つである。大半の癌はたった１個の腫瘍細胞から始まる。腫瘍細胞は増殖して局所「腫瘍」を形成する。腫瘍は単純に腫脹を意味し；必ずしも癌性でない。その場所または発生箇所でのみ成長し、遠隔拡散できない腫瘍は良性腫瘍であり、癌ではない。しかし、拡散する能力のある腫瘍は（実際に拡散してもしなくても）悪性腫瘍または癌と呼ばれる。癌は、転移と呼ばれるプロセスを介し、血液またはリンパ系を経て所属リンパ節および遠隔部位に拡散しうる。転移した癌は、今度は数多くの様々な組織および器官に拡散するため、治療することがより難しい。乳癌、結腸癌、卵巣癌および前立腺癌などの多くの種類の癌において、早期治療が生存を高めることが証明されている。
【０００４】
ケモカインは、加水分解抵抗性である小さなサイトカイン様タンパク質のスーパーファミリーであり、血管新生または内皮細胞増殖の阻害を促進し、細胞骨格改変を誘導し、リンパ球を活性化または不活性化し、かつＧタンパク質共役受容体との相互作用により走化性を媒介する。ケモカインは、その受容体を発現する宿主細胞の増殖および遊走を媒介することができる。
【０００５】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２５（ＣＣＬ２５）は胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）とも呼ばれ、ＣＣケモカインファミリーに属する小さなケモカインである。ＣＣＬ２５は胸腺細胞、マクロファージおよび樹状細胞に対して走化性である。ＣＣＬ２５は、ケモカイン受容体ＣＣＲ９と結合することによりその効果を誘発し、かつＴ細胞の発達において１つの役割を果たすと考えられる。ヒトＣＣＬ２５は１５１アミノ酸を含むタンパク質前駆体として生成される。ＣＣＬ２５に対する遺伝子（ｓｃｙａ２５）は第１９染色体上に位置する。
【０００６】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体９（ＣＣＲ９）はＧＰＲ９−６としても知られ、胸腺では（未成熟Ｔ細胞上でも成熟Ｔ細胞上でも）非常に高度に発現しているものの、リンパ節および脾臓では発現が低い。ＣＣＲ９は腸でも豊富であり、その発現は腸のＴ細胞と関連している。ケモカイン結合タンパク質Ｄ６は過去にＣＣＲ９と呼ばれていたが、この分子は真の（シグナリング）ケモカイン受容体でないスカベンジャー受容体であることは、留意すべき点である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、対象における癌を検出するための方法に関する。方法は、対象から採取した生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを検出すること；および生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルと比較することを含み、生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常よりも高いレベルが対象における癌の存在を示すことを特徴とし、１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルが事前に決定された数値であるかまたは生物学的サンプルと同じ起源または種類の既知の正常非癌性細胞の対照サンプルから得られることを特徴とし、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＬ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の他の態様は、対象における癌を検出するための方法に関する。方法は、対象から採取した生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを検出すること；および生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルと比較することを含み、生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常よりも高いレベルが対象における癌の存在を示すことを特徴とし、１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルが事前に決定された数値であるかまたは生物学的サンプルと同じ起源または種類の既知の正常非癌性細胞の対照サンプルから得られることを特徴とし、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ１つまたはそれ以上の癌マーカーが：（１）ＣＣＬ２５およびＣＣＬ９からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカー；および（２）ＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーおよび／またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の他の態様は、癌を有する対象の予後を評価するための方法に関する。方法は、対象に由来する生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの対照レベルに対してより高い発現のレベルが対象の予後が不良であることを示すことを特徴とし、かつ生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの対照レベルに対してより低いかまたは同様の発現のレベルが対象の予後が良好であることを示すことを特徴とし、不良である予後は癌が侵襲型または浸潤型であることを示すことを特徴とし、芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍を特徴とし、かつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の他の態様は、癌を有する対象の予後を評価するための方法に関する。方法は、対象に由来する生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの対照レベルに対してより高い発現のレベルが対象の予後が不良であることを示すことを特徴とし、かつ生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの対照レベルに対してより低いかまたは同様の発現のレベルが対象の予後が良好であることを示すことを特徴とし、不良である予後は癌が侵襲型または浸潤型であることを示すことを特徴とし、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ１つまたはそれ以上の癌マーカーが：（１）ＣＣＬ２５およびＣＣＬ９からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカー；および（２）ＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーおよび／またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。    
【００１１】
本発明の他の態様は、対象における癌治療の経過をモニタリングするための方法に関する。方法は、治療中または治療後に対象から採取した１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、１つまたはそれ以上の癌マーカーの対照レベルが対象における１つまたはそれ以上の癌マーカーの治療前レベルまたは事前に決定された参照レベルであることを特徴とし、１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーが対照レベルと同様であるかまたはこれよりも低い場合は治療が有効であると考えられることを特徴とし、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の他の態様は、対象における癌治療の経過をモニタリングするための方法に関する。方法は、治療中または治療後に対象から採取した１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを１つまたそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、１つまたはそれ以上の癌マーカーの対照レベルが対象における１つまたはそれ以上の癌マーカーの治療前レベルまたは事前に決定された参照レベルであることを特徴とし、１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーが対照レベルと同様であるかまたはこれよりも低い場合は治療が有効であると考えられることを特徴とし、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ１つまたはそれ以上の癌マーカーが：（１）ＣＣＬ２５およびＣＣＬ９からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカー；および（２）ＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーおよび／またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の態様は、癌を検出するためのキットに関する。キットは、生物学的サンプル中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を判定するための試薬；および試薬を使用する方法についての指示を含み、試薬が抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体または両者を含むことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】乳癌組織によるＣＣＬ２５発現を示す。
【図２】ＣＣＬ２５が乳癌細胞株増殖のシスプラチン誘導性減少を阻害することを示す。
【図３】ＣＣＬ２５が乳癌細胞をシスプラチン誘導性アポトーシスから保護することを示す。
【図４】Ａ〜Ｂは乳癌細胞株におけるＣＣＬ２５−ＣＣＲ９相互作用によるＰＩ３ＫおよびＡｋｔの活性化を示す。
【図５】Ａ〜Ｂは乳癌細胞株のＣＣＬ２５処理後のＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲリン酸化を示す。
【図６−１】卵巣癌組織によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。
【図６−２】卵巣癌組織によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。
【図７Ａ】卵巣癌組織によるＣＣＬ２５発現の分析を示す。
【図７Ｂ】卵巣癌組織によるＣＣＬ２５発現の分析を示す。
【図８Ａ】卵巣癌組織によるＣＣＲ９発現の分析を示す。
【図８Ｂ】卵巣癌組織によるＣＣＲ９発現の分析を示す。
【図９】Ａ〜Ｂは卵巣癌細胞株によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。
【図１０】Ａ〜Ｂは卵巣癌細胞による低酸素調節ＣＣＲ９  ｍＲＮＡおよび表面タンパク質発現を示す。
【図１１】Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞の低酸素媒介性およびＣＣＬ２５媒介性遊走および浸潤を示す。
【図１２】Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性コラゲナーゼ発現を示す。
【図１３】Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ゼラチナーゼ発現を示す。
【図１４】Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ストロメライシン発現を示す。
【図１５】前立腺癌細胞によるＣＣＲ９発現を示す。
【図１６】Ａ〜Ｄは前立腺組織によるＣＣＲ９発現を示す。
【図１７】Ａ〜Ｄは前立腺癌組織によるＣＣＬ２５発現を示す。
【図１８】健常ドナーまたは前立腺疾患患者における血清ＣＣＬ２５レベルを示す。
【図１９】Ａ〜Ｃはマウス骨髄細胞によるＣＣＬ２５発現を示す。
【図２０】Ａ〜ＢはＣＣＲ９媒介性前立腺癌細胞遊走および浸潤を示す。
【図２１】前立腺癌細胞株によるＣＣＬ２５誘導性活性ＭＭＰ発現を示す。
【図２２】Ａ〜ＦはＣＣＲ９ノックダウンによるＰＣ３前立腺癌細胞株の骨転移の阻害を示す。
【図２３】肺癌患者の血清ＣＣＬ２５レベルを示す。
【図２４】Ａ〜Ｃは非腫瘍性肺組織および肺癌組織によるＣＣＲ９発現を示す。
【図２５】Ａ〜Ｃは結腸癌組織によるＣＣＲ９−ＣＣＬ２５発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の詳細な説明は、任意の当業者に本発明を作製しかつ使用することを可能とするために提示する。説明を目的として、本発明の完全な理解を提供するために具体的な用語が述べられている。しかし、これらの具体的な詳細は本発明を実施する上で必要とされないことが当業者に明らかとなるであろう。具体的な施用の説明は典型的な例としてのみ提供される。本発明は提示した実施例に限定されることを意図しないが、本願に開示される原則および特性と一致する可能な限り最も広い範囲に適合することとする。
【００１６】
別途定義しない限り、本発明に関連して用いられる科学的および技術的用語は当業者が共通して理解する意味を有する。さらに、文脈が別途必要としない限り、単数形の語句は複数形を含みかつ複数形の語句は単数形を含む。
【００１７】
本願で用いられる以下の用語は以下の意味を有する：
【００１８】
本願で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、かつ具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例：二重特異性抗体など）、および抗体フラグメントを包含する。「特異的に結合する」または「免疫反応する」によって、抗体が所望の抗原の１つまたはそれ以上の抗原決定基と反応しかつ他のポリペプチドとは反応（すなわち結合）しないか、または他のポリペプチドとさらにより低い親和性で結合することが意味される。用語「抗体」は、一般的には全長抗体の抗原結合領域または可変領域である、全長抗体の一部を含む抗体フラグメントも含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線形抗体；単鎖抗体（ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントより形成される多重特異性抗体を含む。本発明の一定の実施形態においては、たとえば腫瘍浸透性を高めるために、無傷の抗体よりもむしろ抗体フラグメントを用いることが望ましいこともある。この場合、その血清半減期を延長するために、技術上既知である任意の手段で修飾されている抗体フラグメントを用いることが望ましいこともある。
【００１９】
本願で用いられる用語「モノクローナル抗体」は相当均一な抗体の母集団から得られる抗体を意味し、すなわち母集団を構成する個々の抗体は少量存在しうる天然に発生する可能性のある変異を除いて同一である。本願のモノクローナル抗体は、具体的には、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方で、分子鎖の残りの部分が他の種に由来するかまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、および所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 （1984））。
【００２０】
非ヒト抗体の「ヒト化」型は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、ほとんどの場合、所望の特異性、親和性および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によってレシピエントの超可変領域に由来する残基が置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化および他のキメラ抗体を作製するための方法は技術上既知である。
【００２１】
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。本例においては、結合特異性のうち一方はＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６に対するものである。第２の結合標的は他の任意の抗原であり、細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットであることが好都合である。二重特異性抗体を作製するための方法は技術上既知である。
【００２２】
「ヘテロ複合体抗体」の使用も本発明の範囲内である。ヘテロ複合体抗体は共有結合で連結される２つの抗体より構成される。このような抗体は、たとえば免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化することが提唱されている（米国特許第Ｎｏ．４，６７６，９８０号）。架橋剤を包含するものを含むタンパク質合成化学における既知の方法を用いて、インビトロで抗体を調製できることが意図されている。
【００２３】
本願で用いる用語「腫瘍」は、新生物または細胞の異常増殖によって形成される固形病変を意味する。腫瘍は、良性であることも、前悪性であることも、あるいは悪性であることもある。
【００２４】
「原発性腫瘍」は、対象の体内の最初の部位に出現する腫瘍であり、かつ対象の体内で原発性腫瘍より遠隔の部位に出現する「転移性腫瘍」と識別することができる。
【００２５】
本願で用いられる用語「癌」は、調節されない細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳類における生理学的状態を意味するか、または記述する。典型的な癌は：癌腫、黒色腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽腫を含む。このような癌のより具体的な例は扁平上皮癌（例：上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃癌または胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮体癌、唾液腺癌、腎臓または腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞性リンパ腫、脳、および頭頸部癌、および随伴する転移を含む。
【００２６】
本願で用いられる用語「癌腫」は、形質転換上皮細胞、または組織発生が不明であるがサイトケラチンまたは細胞間橋の生成などの上皮細胞と関連する特異的な分子的または組織学的特性を有する形質転換細胞からなる浸潤性悪性腫瘍を意味する。本願の典型的な癌腫は卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、インスリノーマ、腺癌、線扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脳癌、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、下垂体癌および骨癌を含む。
【００２７】
本願で用いられる用語「リンパ腫」は、免疫系のリンパ細胞の癌である。リンパ腫は、典型的には固形腫瘍として存在する。典型的なリンパ腫は：小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、鼻型節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球型ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、皮膚原発ＣＤ３０陽性Ｔリンパ球増殖性疾患、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、不特定末梢Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫を含む。典型的な形態の古典的ホジキンリンパ腫は：結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、およびリンパ球減少または非減少型を含む。
【００２８】
本願で用いられる用語「肉腫」は、胚体中胚葉から発生した数多くの組織の１つにおける形質転換細胞から発生する癌である。したがって、肉腫は骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、および造血組織の腫瘍を含む。たとえば、骨肉腫は骨から発生し、軟骨肉腫は軟骨から発生し、脂肪肉腫は脂肪から発生し、かつ平滑筋肉腫は平滑筋から発生する。典型的な肉腫は：Ａｓｋｉｎ腫瘍、ボトリオディーズ（ブドウ肉腫）、軟骨肉腫、ＥｗｉｎｇのＰＮＥＴ、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫を含む。軟部組織肉腫のサブクラスは：胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞性腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管周皮細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパンジオサルコマル（リンパ管肉腫）、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫を含む。
【００２９】
本願で用いる用語「白血病」は、白血球の異常な増加を特徴とする血液または骨髄の癌である。白血病は一連の疾患を包含する幅広い用語である。さらには、血液腫瘍と呼ばれるさらにより幅広い群の一部である。白血病は種々の大分類に細分され；第１の分類は急性型白血病と慢性型白血病の分類である。急性白血病は幼若血液細胞数の急速な増加を特徴とする。そのような細胞による密集によって骨髄は健常な血液細胞を産生できなくなる。慢性白血病は、比較的成熟しているがやはり異常な白血球の過剰な蓄積を特徴とする。典型的には進行に数ヶ月から数年かかり、細胞は正常細胞よりもさらに高い率で生成され、血液中の異常な白血球が増加する。白血病は罹患する血液細胞によっても細別される。この分類により白血病はリンパ芽球性またはリンパ球性白血病と骨髄性または骨髄原性白血病に分類される。リンパ芽球性またはリンパ球性白血病では、癌性変化は、通常では続いてリンパ球を形成する種類の骨髄細胞に発生する。骨髄性または骨髄原性白血病では、癌性変化は、通常では続いて赤血球、他の一部の種類の白血球および血小板を形成する種類の骨髄細胞に発生する。これら２種類の分類の複合により、合計４つの主要カテゴリーが提供される。典型的には、これら４つの主要カテゴリーのそれぞれの中に数種類のサブカテゴリーがある。これらの分類スキームから外れた希少種もある。典型的な白血病は：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄原性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄原性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキット白血病、および成人性Ｔ細胞白血病を含む。
【００３０】
本願で用いられる用語「黒色腫」は、メラニン細胞の癌または悪性腫瘍である。メラニン細胞は、皮膚の色をもたらす暗色色素メラニンを産生する細胞である。主として皮膚に発生するが、腸および眼を含む身体の他の部分にも認められる。黒色腫は以下の定型およびサブタイプに分類される：悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、無色素性黒色腫、軟部組織黒色腫、小母斑様細胞を伴う黒色腫、スピッツ母斑の特性を有する黒色腫、およびぶどう膜黒色腫。
【００３１】
本願で用いられる用語「胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）」は胚細胞に由来する新生物である。胚細胞腫瘍は癌性腫瘍であることも、または非癌性腫瘍であることもある。正常の場合、胚細胞は性腺（卵巣および精巣）の内部に発生する。性腺の外部に由来する胚細胞腫瘍は、胚の発達中の錯誤により発生した先天性欠損でありうる。胚細胞腫瘍は：ジャーミノーマまたはセミノーマ胚細胞腫瘍と非ジャーミノーマまたは非セミノーマ胚細胞腫瘍の２分類に大別される。典型的なジャーミノーマまたはセミノーマ胚細胞腫瘍は：ジャーミノーマ、未分化胚細胞腫およびセミノーマを含む。典型的な非ジャーミノーマ胚細胞腫瘍または非セミノーマ胚細胞腫瘍は：胎児性癌、内胚葉洞腫瘍または卵黄嚢腫瘍（ＥＳＴ、ＹＳＴ）、絨毛癌、成熟型奇形腫、類皮嚢胞、未熟型奇形腫、悪性トランスフォーメーションを伴う奇形腫、多胚腫、性腺芽細胞腫、および混合ＧＣＴを含む。
【００３２】
本願で用いられる用語「転移」は、１つの器官または部分から隣接しない他の器官または部分への癌または癌腫の拡散を意味する。
【００３３】
用語「生物学的サンプル」は、組織、組織サンプル、細胞サンプル、腫瘍サンプル、糞便サンプル、および、たとえば血液、血漿、血清、唾液、尿、脳または脊髄液、リンパ液、および乳頭吸引物などの生体液を含む、哺乳類対象、好ましくはヒト対象から採取された生物学的材料のサンプルを意味する。生物学的サンプルは、たとえば、吸引生検、ブラシ生検、表面生検、針生検、穿孔生検、切除生検、開放生検、切開生検、および内視鏡的生検などの組織生検の形態で採取しうる。１つの実施形態においては、生物学的サンプルは血液、血清または血漿サンプルである。他の実施形態においては、生物学的サンプルは唾液サンプルである。さらに他の実施形態においては、生物学的サンプルは尿サンプルである。
【００３４】
生物学的サンプルの「分離物」（例：組織または腫瘍サンプルの分離物）は、サンプルより分別、誘導、抽出、精製または分離された材料または組成物（例：生物学的材料または組成物）を意味し、かつ好ましくは生物学的サンプルに付随する望ましくない組成物および／または不純物または汚染物をほとんど含まない。
【００３５】
「組織サンプル」は、対象、好ましくはヒト対象の無傷の組織より採取または切除された組織の一部、断片、部分、セグメント、または分画を含む。
【００３６】
「腫瘍サンプル」は、たとえば対象、好ましくはヒト対象から採取または切除された腫瘍（例：対象の組織から切除または摘出）などの、腫瘍の一部、断片、部分、セグメント、または分画を含む。腫瘍サンプルは、原発性腫瘍または転移性腫瘍から採取しうる。
【００３７】
治療を目的とした「哺乳類」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの家畜および畜産動物、および動物園、スポーツまたは愛玩用動物を含む、哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３８】
用語「上昇レベル」は、関連技術において習慣的に定義されるかまたは用いられる正常または対照レベルよりも高いレベルを意味する。たとえば、組織の免疫染色の上昇レベルは、当業者であれば対照組織の免疫染色のレベルよりも高いとみなす免疫染色のレベルである。
【００３９】
本願において、範囲は「おおよその」１つの特定の数値から、かつ／または「おおよその」他の特定の数値までとして表示することがある。そのような範囲が表示される場合、他の実施形態は１つの特定の数値からかつ／または他の特定の数値までを含む。同様に、先行する「おおよそ」の使用によって数値が近似として表示される場合、当該の特定の数値が他の実施形態を形成することが理解されるであろう。さらに、各範囲の端点は、もう一方の端点に関しても、もう一方の端点と無関係でも重要であることが理解されるであろう。本願には数多くの数値が開示されており、かつ本願において各数値はその具体的な数値自体に付け加えて「おおよその」その数値として開示されることも理解される。たとえば、数値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。ある数値が開示される場合、当業者が適切に理解するように、その数値「よりも小さいかまたはこれと等しい」、「その数値よりも大きいかまたはこれと等しい」、および数値間の可能な範囲も開示されることも理解される。たとえば、数値「１０」が開示される場合、「１０より小さいかまたはこれと等しい」、および「１０より大きいかまたはこれと等しい」も開示される。本願で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。
【００４０】
（ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現または活性を測定することにより癌を検出するための方法）
ＣＣＬ２５はＣＣＲ９ケモカイン受容体のリガンドである。ケモカインも受容体も、癌の転移および浸潤の調節において１つの役割を果たすと見られる。ＣＣＬ２５もＣＣＲ９も、卵巣癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、骨癌および膵臓癌を含めた複数の癌腫組織の種類において、正常組織と比較して局所的にアップレギュレートされる。ＣＣＬ２５レベルは、それらの癌を有する患者の血清においても上昇する。さらに、可溶性ＣＣＬ２５ケモカインは、癌細胞のインビボおよびインビトロ増殖および遊走を促進する。
【００４１】
ＣＣＲ９は、推定上化学療法剤に対する保護を支援する、癌細胞生存における多様な役割を有しうる、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のケモカイン受容体ファミリーの構成要素である。我々は、ＣＣＲ９のＣＣＬ２５との相互作用はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）発現をモジュレートし、かつ癌腫細胞の遊走および潜在的浸潤能力を増強することを示す。このことは、ＣＣＲ９−ＣＣＬ２５相互作用が癌腫細胞遊走および浸潤に寄与することを示唆する。従って、この軸を遮断することは癌腫細胞転移を阻害する可能性を有する。）
【００４２】
本願の１つの態様は、対象における癌の存在を検出するための方法であって：前記対象から採取した生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを検出すること；および前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルと比較することを含み、前記生物学的サンプル中の前記の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常よりも高いレベルが前記対象における癌の存在を示すことを特徴とし、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の前記正常レベルが事前に決定された数値であるかまたは前記生物学的サンプルと同じ起源または種類の既知の正常非癌性細胞の対照サンプルから得られることを特徴とし、かつ前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＬ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする方法に関する。
【００４３】
１つの実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者を含む。他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者を含む。
【００４４】
他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、（２）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者、および（３）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者を含む。他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および／または（２）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者、および／または（３）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者’および（４）１つまたはそれ以上の他の癌マーカーを含む。
【００４５】
さらに他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＨＥＲ２、ＲＮＡ結合モチーフ３（「ＲＢＭ３」）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、クロムグラニンＡ（ＣＧＡ）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、プロラクチン、Ｂ７−Ｈ３、セプラーゼポリペプチド、抗ｐ５３、オステオポンチン、フェリチン、リゾフォスファチジルコリン、キネシンファミリー構成要素４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）、神経ペントラキシンＩ（ＮＰＴＸ１）および線維芽細胞増殖因子受容体１癌遺伝子パートナー（ＦＧＦＲ１ＯＰ）タンパク質からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含む。
【００４６】
他の実施形態においては、前記癌は乳癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６  ＣＸ３ＣＲ１、ＨＥＲ２、ＲＢＭ３およびＣＥＡからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００４７】
他の実施形態においては、前記癌腫は前立腺癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＧＡ、ＤＨＥＡ、ＮＳＥ、ＰＡＰ、プロラクチンおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００４８】
他のさらなる実施形態においては、前記癌腫は結腸直腸癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、セプラーゼポリペプチド、抗ｐ５３、オステオポンチンおよびフェリチンからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００４９】
他のさらなる実施形態においては、前記癌腫は卵巣癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＨＥ−４、ＯＶＸ−１マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびリゾフォスファチジルコリンからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００５０】
他のさらなる実施形態においては、前記癌腫は肺癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、キネシンファミリー構成要素４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）、神経ペントラキシンＩ（ＮＰＴＸ１）、線維芽細胞受容体１癌遺伝子パートナー（ＦＧＦＲ１ＯＰ）タンパク質およびＣＥＡからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００５１】
他のさらなる実施形態においては、前記癌腫は膵臓癌または胃癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者、および（２）ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＥＡからなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含むことを特徴とする。
【００５２】
他の実施形態においては、癌腫は脳癌、下垂体癌または骨癌でありかつ１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする。
【００５３】
他の一部の実施形態においては、生物学的サンプルは血漿サンプル、唾液サンプルまたは尿サンプルである。
【００５４】
本願の文脈においては、用語「検出すること」は予測および可能性分析を包含することを意図している。本方法は、治療的介入、病期などの診断基準、および疾患モニタリングおよび癌のサーベイランスを含めて、治療様式に関する決定を下す際に臨床的に用いられることを意図している。本願に従って対象の状態を検討するための中間的な結果が提供されうる。そのような中間的な結果は、追加的な情報と複合され、医師、看護師、または他の実践者に対し、対象が疾患に罹患していると診断することを支援する。代替的に、本発明を用いて対象に由来する組織中の癌性細胞を検出し、さらに対象が癌に罹患していると診断するための有用な情報を医師に提供しうる。対象は好ましくはヒトであるが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなどの他の哺乳類も含みうる。
【００５５】
（癌を有する対象の予後を評価するための方法）
癌を検出するための本方法は、患者由来の生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを参照サンプルのそれと比較することにより、癌患者の予後を評価するために施用しうる。
【００５６】
したがって、本願の他の態様は癌を有する対象の予後を評価するための方法であって：前記対象に由来する生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記対照レベルに対してより高い発現のレベルが前記対象の予後が不良であることを示すことを特徴とし、前記生物学的サンプル中の前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記対照レベルに対してより低いかまたは同様の発現のレベルが前記対象の予後が良好であることを示すことを特徴とし、不良である予後は前記癌が侵襲型または浸潤型であることを示すことを特徴とし、前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする方法に関する。
【００５７】
１つの実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者をさらに含む。他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含む。
【００５８】
他の実施形態においては、前記の１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者、および（２）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含む。
【００５９】
さらに他の実施形態においては、前記の１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含む。
【００６０】
代替的に、生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌マーカーのレベルは、患者の予後を評価するために一連の病期に渡って測定されうる。１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルの正常な対照レベルと比較した上昇は、より好ましくない予後を示す。正常な対照レベルと比較した１つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルの類似は、患者のより好ましい予後を示す。
【００６１】
他の一部の実施形態においては、生物学的サンプルは血漿サンプル、唾液サンプルまたは尿サンプルである。
【００６２】
（癌治療の経過をモニタリングするための方法）
一定の実施形態においては、１つまたはそれ以上の癌マーカーのレベルを用いて癌の治療の経過をモニタリングする。この方法においては、被験生物学的サンプルは癌に対する治療を受けている対象から提供される。好ましくは、治療前、治療中または治療後の様々な時点において対象より複数の被験生物学的サンプルを採取する。次に、治療後サンプル中の癌マーカーの発現レベルを治療前サンプルの中の癌マーカーのレベル、または、その代わりに参照サンプル（例：正常対照レベル）と比較してもよい。たとえば、治療後マーカーレベルが治療前マーカーレベルより低い場合、治療が有効であると結論づけることができる。同様に、治療後マーカーレベルが正常対照マーカーレベルと同様、または同じである場合も、治療が有効であると結論づけることができる。
【００６３】
「有効な」治療とは、対象における癌マーカーのレベルまたは癌のサイズ、有病率または転移の可能性の低下につながるものである。治療が予防的に施用される場合、「有効な」は治療が癌の発生を遅延または予防するかまたは癌の臨床症状を緩和することを意味する。癌の評価は、標準的な臨床プロトコルを用いて行うことができる。さらに、治療の有効性は、癌を診断または治療するための任意の既知の方法と関連して判定することができる。癌は、たとえば病理組織学的に、または体重減少または食欲減退などの病的な異常によって特定することにより常用的に診断することができる。
【００６４】
したがって、本願の他の態様は、対象における癌治療の経過をモニタリングする方法であって：前記治療中または治療後に前記対象から採取した１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の１つまたそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および前記１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の前記１つまたそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを前記１つまたそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの前記対照レベルが前記対象における前記１つまたはそれ以上の癌マーカーの治療前レベルまたは事前に決定された参照レベルであることを特徴とし、前記１つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の前記１つまたそれ以上の癌マーカーが前記対照レベルと同様であるかまたはこれよりも低い場合は前記治療が有効であると考えられることを特徴とし、前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ前記１つまたはそれ以上の癌マーカーがＣＣＬ２５またはＣＣＲ９またはＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の両者を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６５】
１つの実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者をさらに含む。他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含む。
【００６６】
他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーは（１）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５またはＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５の両者、および（２）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６の両者をさらに含む。
【００６７】
さらに他の実施形態においては、前記１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含む。
【００６８】
（癌マーカー）
本願で用いる用語「癌マーカー」は、単独の、または他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと複合したその発現レベルが癌または癌の予後と相関するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味するか、または記述する。相関は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現上昇または発現減少のいずれかと関連することができる。たとえば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現が癌を示してもよく、またはポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現の欠落が癌患者の予後の不良と相関してもよい。
【００６９】
用語「癌マーカーの発現レベル」は、その場合はポリヌクレオチドの存在および／または量を判定する転写レベルか、またはその場合はポリペプチドの存在および／または量を判定する、翻訳レベルで測定することができる。癌マーカー発現は、任意の適切な方法を用いて特性分析することができる。
【００７０】
癌マーカーの例はＣＣＬ２５、ＣＣＲ９およびＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＲＮＡ結合モチーフ３（「ＲＢＭ３」）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、クロムグラニンＡ（ＣＧＡ）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、プロラクチン、Ｂ７−Ｈ３、セプラーゼポリペプチド、抗ｐ５３、オステオポンチン、フェリチン、リゾフォスファチジルコリン、キネシンファミリー構成要素４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）、神経ペントラキシンＩ（ＮＰＴＸ１）および線維芽細胞増殖因子受容体１癌遺伝子パートナー（ＦＧＦＲ１ＯＰ）タンパク質などの他のケモカイン、およびケモカイン受容体を含む。
【００７１】
１つの実施形態においては、本発明で用いられる癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、およびＣＸ３ＣＲ１を含む黒色腫マーカーパネルから選択される。黒色腫パネル中のマーカーは黒色腫を検出するために用いても、または黒色腫を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７２】
１つの実施形態においては、上記の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１を含む癌腫マーカーパネルから選択される。癌腫パネル中のマーカーは癌腫を検出するために用いても、または癌腫を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７３】
他の実施形態においては、上記の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、ＨＥＲ２、ＲＮＡ結合モチーフ  ３（「ＲＢＭ３」）および癌胎児抗原（ＣＥＡ）を含む乳癌マーカーパネルから選択される。乳癌パネル中のマーカーは乳癌を検出するために用いても、または乳癌を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７４】
他の実施形態においては、上記の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＧＡ、ＤＨＥＡ、ＮＳＥ、ＰＡＰ、プロラクチンおよびＢ７−Ｈ３を含む前立腺癌マーカーパネルから選択される。乳癌パネル中のマーカーは前立腺癌を検出するために用いても、または前立腺癌を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７５】
他の実施形態においては、上記の１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、セプラーゼポリペプチド、抗ｐ５３、オステオポンチンおよびフェリチンを含む結腸直腸癌パネルから選択される。結腸直腸癌パネル中のマーカーは結腸直腸癌を検出するために用いても、または結腸直腸癌を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７６】
他の実施形態においては、上記の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＨＥ−４、ＯＶＸ−１マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびリゾフォスファチジルコリンを含む卵巣癌マーカーパネルから選択される。卵巣癌パネル中のマーカーは卵巣癌を検出するために用いても、または卵巣癌を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７７】
他の実施形態においては、上記の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、キネシンファミリー構成要素４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）、神経ペントラキシンＩ（ＮＰＴＸ１）、線維芽細胞成長因子受容体１癌遺伝子パートナー（ＦＧＦＲ１ＯＰ）タンパク質およびＣＥＡを含む肺癌マーカーパネルから選択される。肺癌パネル中のマーカーは肺癌を検出するために用いても、または肺癌を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７８】
他の実施形態においては、上記の１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＣＬ２５、ＣＣＲ９、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＥＡを含む膵臓癌または胃癌マーカーパネルから選択される。膵臓癌パネル中のマーカーは膵臓癌または胃癌を検出するために用いても、または膵臓癌を有する対象の予後を予測するために用いてもよい。
【００７９】
他の実施形態においては、上記の１つまたはそれ以上の癌マーカーはＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の癌マーカーを含む脳癌、下垂体癌、骨癌、膵臓癌または胃癌パネルから選択される。
【００８０】
（検出方法）
癌マーカーの発現は、転写レベル（すなわちｍＲＮＡの量）または翻訳レベル（すなわちタンパク質の量）で判定することができる。一定の実施形態においては、癌マーカーの発現は定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットまたは当業者に既知の他の方法によってｍＲＮＡレベルで判定される。他の実施形態においては、癌マーカーの発現はＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、または抗ＣＣＬ２５および抗ＣＣＲ９抗体、抗ＣＸＣＬ１３および抗ＣＸＣＲ５抗体、および抗ＣＸＣＬ１６および抗ＣＸＣＲ６抗体などの抗癌マーカー抗体を用いた他の種類の免疫検出法によってタンパク質レベルで判定される。
【００８１】
一定の実施形態においては、抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体はＣＣＬ２５ペプチドまたはＣＣＲ９ペプチドと特異的に結合する抗体を含む。ＣＣＬ２５ペプチドの例はLAYHYPIGWAVL (SEQ ID NO（配列番号）:116), KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH (SEQ ID NO:117), FEDCCLAYHYPIGWAVLRRA (SEQ ID NO:118), IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN (SEQ ID NO:119), AMKLLDAR (SEQ ID NO:120), KVFAKLHHN (SEQ ID NO:121), QAGPHAVKKL (SEQ ID NO:122), FYLPKRHRKVCGNP (SEQ ID NO:123) YLPKRHRKVCGNPK  (SEQ ID NO:124), LPKRHRKVCGNPKS (SEQ ID NO:125), PKRHRKVCGNPKSR (SEQ ID NO:126), CGNPKSREVQRAMK (SEQ ID NO:127), GNPKSREVQRAMKL (SEQ ID NO:128), KFSNPISSSKRNVS (SEQ ID NO:129), PKSREV (SEQ ID NO:130), LHHNTQT (SEQ ID NO:131) and SSSKRN (SEQ ID NO:132)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。ＣＣＲ９ペプチドの例はQFASHFLPP (SEQ ID NO:133), AAADQWKFQ (SEQ ID NO:134), TFMCKVVNSM (SEQ ID NO:135), IAICTMVYPS (SEQ ID NO:136) and VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ (SEQ ID NO:137)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。
【００８２】
他の実施形態においては、抗ＣＸＣＬ１３および／または抗ＣＸＣＲ５抗体はＣＸＣＬ１３ペプチドまたはＣＸＣＲ５ペプチドと特異的に結合する抗体を含む。ＣＸＣＬ１３ペプチドの例はRSSSTLPVPVFKRKIP (SEQ ID NO:45), PRGNGCPRKEIIVWKK (SEQ ID NO:46), LPRGNGCPRKEIIVWK (SEQ ID NO:47), QILPRGNGCPRKEIIV (SEQ ID NO:48), ILPRGNGCPRKEIIVW (SEQ ID NO:49), RIQILPRGNGCPRKEI (SEQ ID NO:50), RGNGCPRKEIIVWKKN (SEQ ID NO:51), KRSSSTLPVPVFKRKI (SEQ ID NO:52), IQILPRGNGCPRKEII (SEQ ID NO:53), DRIQILPRGNGCPRKE (SEQ ID NO:54), RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:55), RCRCVQESSVFIPRRF (SEQ ID NO:56), GNGCPRKEIIVWKKNK (SEQ ID NO:57), CVQESSVFIPRRFIDR (SEQ ID NO:58), IDRIQILPRGNGCPRK (SEQ ID NO:59), LRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO:60), FIDRIQILPRGNGCPR (SEQ ID NO:61), RCVQESSVFIPRRFID (SEQ ID NO:62), CRCVQESSVFIPRRFI (SEQ ID NO:63), QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ ID NO:64), RFIDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65), VQESSVFIPRRFIDRI (SEQ ID NO:66), ESSVFIPRRFIDRIQI (SEQ ID NO:67), SLRCRCVQESSVFIPR (SEQ ID NO:68), NGCPRKEIIVWKKNKS (SEQ ID NO:69), PQAEWIQRMMEVLRKR (SEQ ID NO:70), RRFIDRIQILPRGNGC (SEQ ID NO:71), LRKRSSSTLPVPVFKR (SEQ ID NO:72), VQESSVFIPRR (SEQ ID NO:73, EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:74), KKNK (SEQ ID NO:75), RKRSSS (SEQ ID NO:76), RGNGCP (SEQ ID NO:77), VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO:78), DRIQILP (SEQ ID NO:79), RKEIIVW (SEQ ID NO:80) and KSIVCVDPQ (SEQ ID NO:81)からなる群から選択される１つまたはこれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。ＣＸＣＲ５ペプチドの例はTSLVENHLCPATE (SEQ ID NO:82), EGSVGWVLGTFLCKT (SEQ ID NO:83), LPRCTFS (SEQ ID NO:84), LARLKAVDNT (SEQ ID NO:85) and MASFKAVFVP (SEQ ID NO:86)からなる群から選択される１つまたはこれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。
【００８３】
抗ＣＸＣＬ１６および／または抗ＣＸＣＲ６抗体はＣＸＣＬ１６ペプチドまたはＣＸＣＲ６ペプチドと特異的に結合する抗体を含む。ＣＸＣＬ１６ペプチドの例はAAGPEAGENQKQPEKN (SEQ ID NO:87), SQASEGASSDIHTPAQ (SEQ ID NO:88), STLQSTQRPTLPVGSL (SEQ ID NO:89), SWSVCGGNKDPWVQEL (SEQ ID NO:90), GPTARTSATVPVLCLL (SEQ ID NO:91), SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO:92), RLRKHL (SEQ ID NO:93), LQSTQRP (SEQ ID NO:94), SSDKELTRPNETT (SEQ ID NO:95), AGENQKQPEKNA (SEQ ID NO:96), NEGSVT (SEQ ID NO:97), ISSDSPPSV (SEQ ID NO:98), CGGNKDPW (SEQ ID NO:99), LLPTSPPISQASEGASSDIHT (SEQ ID NO:100), STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT (SEQ ID NO:101), SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA (SEQ ID NO:102), TGSCYCGKR (SEQ ID NO:103), DSPPSVQ (SEQ ID NO:104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG (SEQ ID NO:105), WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ (SEQ ID NO:106), SDIHTPAQMLLSTLQ (SEQ ID NO:107), RPTLPVGSL (SEQ ID NO:108), TAGHSLAAG (SEQ ID NO:109), GKRISSDSPPSVQ (SEQ ID NO:110) and KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH (SEQ ID NO:111)からなる群から選択される１つまたはこれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。ＣＸＣＲ６ペプチドの例は、HQDFLQFSKV (SEQ ID NO:112), AGIHEWVFGQVMCK (SEQ ID NO:113), PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO:114) and YYAMTSFHYTIMVTEA (SEQ ID NO:115)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。
【００８４】
１つの実施形態においては、抗体は固形支持体に複合体化される。「固形支持体」により、本発明の抗体がそこに付着または結合することのできる非水性マトリクスが意味される。本願に包含される固相の例は、ガラスによって部分的にまたは全体的に形成されるもの（例：空隙率調節ガラス）、多糖類（例：アガロース）、ポリアクリルアミド、シリコン、およびポリスチレン、ポリプロピレンおよびポリビニルアルコールなどのプラスチックを含む。
【００８５】
（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））
一定の実施形態においては、癌マーカーは、典型的には抗体コーティングした分析プレートまたはウェルを用いて遂行される酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出される。一般的に使用されるＥＬＩＳＡ測定は、サンドイッチイムノアッセイまたは競合結合イムノアッセイのいずれかを用いる。
【００８６】
簡潔に述べると、サンドイッチイムノアッセイは、抗原またはリガンド上の異なる部位と結合する２種類の抗体を用いる方法である。抗原に対する特異性の高い一次抗体を、固形表面に結合させる。次に抗原を添加し、その後検出抗体と呼ばれる二次抗体を添加する。検出抗体は、一次抗体とは異なるエピトープで抗原と結合する。その結果、抗原は２種類の抗体によって「サンドイッチ」される。通常、抗原に対する抗体結合親和性はイムノアッセイの感度の主要な決定因子である。抗原濃度が上昇すると検出抗体の量が増加し、測定される応答がより高くなる。サンドイッチ結合測定の標準曲線は正の勾配を有する。結合の程度を定量するために種々のレポーターを用いることができる。典型的には、一次抗体と異なる種で生成されなければならない二次抗体（すなわち、一次抗体がウサギ抗体である場合、二次抗体はヤギ、ニワトリなどに由来するがウサギには由来しない抗ウサギ抗体である）に酵素を結合する。酵素に対する基質を、検出シグナルとして比色読み出しを形成する反応物に添加する。生成したシグナルは、サンプル中に存在する標的抗原の量に比例する。
【００８７】
結合事象を測定するために用いる抗体と結合したレポーターは、検出様式を決定する。比色検出には分光測定プレートリーダーを用いることができる。最近、イムノアッセイの感度を高めるために数種類のレポーターが開発されている。たとえば、さらにシグナルを増幅しかつ発光プレートリーダー上で読み取ることのできる化学発光基質が開発されている。また、測定の酵素段階が蛍光体タグ抗体に置き換えられた蛍光読み出しが非常に普及している。この読み出しは次に蛍光プレートリーダーで測定する。
【００８８】
競合結合測定法は、限られた数の抗体結合部位に対する標識化リガンドと非標識化リガンドの競合に基づいている。競合的阻害測定法は、しばしば小さな分析物に対して用いられる。これらの測定法は、分析物と適合化させた抗体対が存在しない場合にも用いられる。競合結合ＥＬＩＳＡにおいては１種類の抗体のみを用いる。これは、２種類の抗体が非常に小さな分子と結合しようとする場合に起こる立体障害によるものである。不変量の標識リガンド（トレーサー）および可変量の非標識リガンドを抗体と共にインキュベートする。質量作用の法則によれば、標識リガンドの量は標識および非標識リガンドの総濃度の関数である。非標識リガンドの濃度が上昇すると、抗体と結合することのできる標識リガンドが少なくなり、また測定される反応が減少する。したがって、シグナルが低下すればするほどサンプル中にある標識分析物は多くなる。競合結合測定の標準曲線は負の勾配を有する。  
【００８９】
（マイクロビーズ）
他の一定の実施形態においては、癌マーカーは抗体コーティングされたマイクロビーズを用いて検出される。一定の実施形態においては、マイクロビーズは磁気ビーズである。他の実施形態においては、ビーズは蛍光色素で内部的にカラーコードが付与され、またビーズの表面は、被験サンプル中の癌マーカーに結合することのできる抗癌マーカー抗体（例：抗ＣＣＬ２５または抗ＣＣＲ９抗体）でタグ付けされる。癌マーカーの方は、蛍光タグで直接標識されるか、または蛍光タグと複合体化された抗マーカー抗体を用いて間接的に標識される。したがって、一方はビーズ、もう一方は蛍光タグからの２つの色の発生源がある。代替的に、ビーズには種々のサイズによって内部的にコード付与することもできる。
【００９０】
測定法は、２種類の色素による異なる蛍光強度の混合、および種々のサイズのビーズを用いて、数百種類までの癌マーカーを測定することができる。測定中、色／サイズコードを付与したビーズ、蛍光標識抗マーカー抗体、およびサンプルを含む混合物を合わせ、精密流体工学を用いてビーズを整列する機器に注入する。次に、レーザー中にビーズを通過させ、またその色またはサイズに基づき、整列するかまたは色の強度を測定し、これを処理して各反応の定量的データとする。
【００９１】
サンプルを蛍光体で直接標識する場合、システムは溶液中の未結合蛍光体を除去せずにビーズ上の蛍光のみを読み取りかつ定量することができる。測定は、多様に着色するかまたは多様なサイズとしたビーズを識別することにより多重化することができる。非標識サンプルに対するサンプルが直接必要とされる場合、リアルタイム測定の実現が可能である。標準的な測定段階は、サンプルの、抗マーカー抗体でコーティングしたビーズとのインキュベーション、ビオチンまたは蛍光体標識二次抗体とのインキュベーション、および蛍光シグナルの検出を含む。蛍光シグナルは、（ビオチニル化二次抗体用にストレプトアビジン−蛍光体複合体を添加することにより）ビーズ上で発生させてビーズアナライザーで読み出すことができる。ビーズ表面に固定した抗マーカーに応じて、ビーズイムノアッセイをサンドイッチ型または競合型イムノアッセイとすることができる。
【００９２】
（検査スティック）
一部の実施形態においては、液状生体サンプル中の癌マーカーは検査スティックを用いて検出される。検査スティックは、典型的には液状物不浸透性ハウジングおよび１つまたはそれ以上の検出ゾーンを有する液状物浸透性「スティック」を含む。１つの実施形態においては、各検出ゾーンは生体サンプル中の癌マーカーと結合する乾燥結合試薬を含む。他の実施形態においては、乾燥結合試薬は標識結合試薬である。他の実施形態においては、検査スティックは、測定検査が成功裏に遂行されていること、すなわち検査スティック中に試薬が存在すること、および試薬が検査の実行中に可動化されかつ流路に沿って運ばれることを示す対照ゾーンをさらに含みうる。対照ゾーンは、装置内の試薬が免疫化学的相互作用を実施可能であることを示し、装置の化学的完全性を確認することもできる。一定の温度範囲内の乾燥条件下での装置の保管および輸送を考慮する場合、これは重要である。対照ゾーンは、典型的には検出ゾーンよりも下流に位置し、かつたとえば標識結合試薬に対する固定された結合試薬を含みうる。標識結合試薬は、対照ゾーンおよび検出ゾーンより上流に可動的な形態で存在しうる。標識結合試薬は、癌マーカーに対する標識結合試薬と同一であっても異なっていてもよい。
【００９３】
１つの実施形態においては、検査スティックは１つまたはそれ以上の流路と流動接続しかつその上流にある多孔性サンプル受容部を含む。多孔性サンプル受容部は全ての測定に共通でありうる。したがって、装置の共通サンプル施用領域に施用された液状サンプルは、１つまたはそれ以上の流路に沿ってそれぞれの検出ゾーンに移動することができる。多孔性サンプル受容部は、ハウジングの内部に提供されることも、または前記ハウジングの外部に少なくとも部分的に延伸しかつたとえば体液を採取する役割を果たすこともありうる。多孔性サンプル受容部は液状物レザバーとして作用することもある。多孔性サンプル受容部材は、液状物を迅速に吸収することのできる任意の吸収性、多孔性または線維性材料から作製することができる。材料の多孔性は一方向性（すなわち細孔または線維が部材の軸に完全にまたはおおむね平行に走る）でも、または多方向性（部材が非晶質の海面状構造を有するような全方向性）でもありうる。ポリプロピレン、ポリエチレン（好ましくは超高分子量）、ポリフッ化ビニリデン、エチレン酢酸ビニル共重合体、アクリロニトリルおよびポリテトラフルオロ−エチレンなどの多孔性プラスチック材料を用いることができる。他の適切な材料はグラスファイバーを含む。
【００９４】
所望する場合、吸収剤「シンク」を担体材料の遠位末端に提供することができる。吸収剤シンクは、たとえばワットマン３ＭＭクロマトグラフィーペーパーなどを含んでもよく、かつあらゆる未結合標識結合試薬を検出ゾーンより洗い出せるよう十分な吸収能力を提供しなければならない。そのようなシンクの代替物として、多孔性固相材料を検出ゾーンの先まで延伸する長さとすることが十分となり得る。
【００９５】
結合試薬の検出ゾーンへの施用後、多孔質固相材料の残余を処理して残る結合部位を全てブロックすることがある。ブロッキングは、たとえばタンパク質（例：ウシ血清アルブミンまたは牛乳タンパク質）、またはポリビニルアルコールまたはエタノールアミン、またはその組み合わせによる処理で達成することができる。多孔性担体をサンプルで湿らせた時に標識結合試薬の自由な運動性を助けるために、多孔性担体はショ糖または乳糖などの糖類、および／またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの他の物質をさらに含むこともある。そのような材料は、標識結合試薬を施用しようとする領域にたとえば水溶液として付着させてもよい。そのような材料を第１の施用として多孔質担体に施用した後標識を施用することも可能であり；代替的に、そのような材料を標識と混合し、さらに担体に施用することも可能であり、あるいは両者の組み合わせも可能である。そのような材料は、標識結合領域の上流に付着させても、または標識結合領域に付着させてもよい。
【００９６】
代替的に、製造時点では多孔質担体をブロックせず；その替わりに多孔質担体をブロックするための手段を多孔質担体の上流の材料に含めてもよい。テストストリップを湿らせた直後に多孔質担体をブロッキングするための手段が可動化し、またブロッキング手段は流動の進行につれてブロッキングしながら多孔質担体に流入および通過する。ブロッキング手段は、ＢＳＡおよびカゼインなどのタンパク質、さらにはＰＶＰ、ＰＶＡなどのポリマー、さらには糖類およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの界面活性剤を含む。ブロッキング手段は、マクロ孔質担体材料内に存在することも可能である。
【００９７】
乾燥させた結合試薬は、検出ゾーンを含む多孔質担体材料より上流に提供された多孔質担体材料上に提供してもよい。上流の多孔質担体材料はマクロ孔質であってもよい。マクロ孔質担体材料は、非特異的結合を最小化し、かつ液状サンプルがマクロ孔質体を湿らせた後の標識試薬の自由な動きを促進するために、低タンパク結合性または非タンパク結合性でなければならないか、またはＢＳＡまたはＰＶＡなどの試薬によって容易にブロックできなければならない。マクロ孔質担体材料は、必要であれば界面活性剤または溶媒によって前処理してより親水性とし、液状サンプルの迅速な取り込みを促進することができる。マクロ孔質担体に適した材料は、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのプラスチック材料、または紙またはグラスファイバーなどの他の材料を含む。標識結合試薬が検出可能な粒子によって標識されている場合、マクロ孔質体は粒子ラベルの最大粒径よりも少なくとも１０倍大きな孔径を有しうる。孔径が大きいほど標識試薬の放出は良好となる。マクロ孔質担体の代替物として、検出ゾーンよりも上流に提供された非孔質基板であって、前記非孔質基板が流路の一部を形成する非孔質基板上に標識結合試薬が提供されてもよい。他の実施形態においては、検査スティックは液状サンプルを受容するためのサンプル受容部材をさらに含みうる。サンプル受容部材は、ハウジングより延伸しうる。
【００９８】
ハウジングは、液体不透過性材料で構築しうる。ハウジングは、望ましくは環境光線を排除もするであろう。ハウジングは、装置の外部の可視光線入射の１０％未満、好ましくは５％未満、また最も好ましくは１％未満が装置の内部に透過する場合、環境光線を相当排除するとみなされるであろう。ポリカーボネート、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリスチロール、高密度ポリエチレン、または適切な遮光性色素を含有するポリプロピレンなどの光不透過性合成プラスチック材料は、ハウジングの製作における使用に適した選択である。ハウジングの外部に、ハウジング内の内部空間内に提供された測定と連絡する開口部が提供されてもよい。代替的に、開口部は多孔質サンプル受容部がハウジングからハウジング外部の位置まで延伸することを可能とする役割を果たしてもよい。
【００９９】
（マイクロアレイ）
他の実施形態においては、癌マーカーはその表面上に固定された癌マーカー特異性抗体を含むタンパク質マイクロアレイによって検出される。マイクロアレイは、マイクロアレイ上の抗体が被験サンプルの癌マーカーを捕捉し、かつ捕捉されたマーカーが、捕捉されたマーカーと特異的に結合する標識二次抗体によって検出される「サンドイッチ」測定法で用いることができる。好ましい実施形態においては、二次抗体はビオチニル化または酵素標識される。検出は、その後のストレプトアビジン−蛍光体複合体（蛍光検出用）または酵素基質（比色検出用）とのインキュベーションにより達成される。
【０１００】
典型的には、マイクロアレイ測定法は、サンプルとのインキュベーションおよび多様な試薬（例：一次抗体、二次抗体、レポーティング試薬など）とのインキュベーションを含む複数のインキュベーション段階を含む。インキュベーション段階の間の反復的な洗浄も必要とされる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ測定法は１回または２回のインキュベーションのみを必要とする迅速測定様式で実施される。タンパク質マイクロアレイをサンプルと必要な全ての試薬の混合物に曝露することにより、検出可能な免疫複合体（例：捕捉された癌マーカー／抗マーカー抗体／標識複合体）の形成を１回のインキュベーション段階で達成することも想定される。１つの実施形態においては、一次および二次抗体は同一の抗体である。
【０１０１】
他の実施形態においては、タンパク質マイクロアレイは競合イムノアッセイを提供する。簡潔に述べると、固定抗マーカー抗体を含むマイクロアレイを、標識癌マーカー標準品の存在下で被験サンプルとインキュベートする。標識癌マーカーは、固定抗原特異性抗体との結合について被験サンプル中の非標識癌マーカーと競合する。このような競合的条件においては、被験サンプル中の特異的癌マーカーの濃度の上昇は標識癌マーカー標準品の固定抗体との結合の減少、およびこれによる標識からのシグナル強度の低下につながるであろう。
【０１０２】
マイクロアレイは手動、半自動または自動モードで処理することができる。手動モードは、試薬およびサンプルのマイクロアレイへの送達、サンプルインキュベーションおよびマイクロアレイの洗浄を含む全ての測定段階についての手動操作を意味する。半自動モードは、インキュベーションおよび洗浄段階が自動的に作動する一方での、サンプルおよび試薬のマイクロアレイへの送達についての手動操作を意味する。自動モードにおいては、３つの段階（サンプル／試薬送達、インキュベーションおよび洗浄）はコンピュータまたはキーパッドを有する一体型ブレッドボードによって制御することができる。たとえば、マイクロアレイはＰｒｏｔｅｉｎＡｒｒａｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（パーキンエルマーライフサイエンス、マサチューセッツ州ボストン）またはＡｓｓａｙ１２００（登録商標）．Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｚｙｏｍｙｘ、カリフォルニア州ヘイワード）を用いて処理することができる。蛍光、比色および化学発光によるスキャナーを用いて、マイクロアレイシグナルを検出しかつマイクロアレイ画像をキャプチャすることができる。マイクロアレイ測定の定量は、質量分析法および表面プラズマ共鳴などの他の手段によって達成することもできる。キャプチャされたマイクロアレイ画像は、スタンドアローン型画像分析ソフトウェアによってか、または画像取得および分析ソフトウェアパッケージを用いて分析することができる。たとえば、抗原マイクロアレイの定量は蛍光ＰＭＴベーススキャナー―ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ３０００（ジェネラルスキャニング、マサチューセッツ州ウォータータウン）または比色ＣＣＤベーススキャナー―ＶｉｓｉｏｎＳｐｏｔ（Ａｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、メリーランド州イジャムズビル）を用いて実現することができる。典型的には、画像分析はデータ取得および別のソフトウェアパッケージによる測定レポートの作成を含むであろう。画像のキャプチャから測定レポートの生成までの測定プロセス全体を迅速化するために、画像キャプチャ、画像分析、およびレポート生成を含む全ての分析段階を、１つのソフトウェアパッケージに限定および／またはこれにより制御することができる。そのような一体化制御システムは、画像分析および測定レポートの生成をユーザーフレンドリーな様式で提供するであろう。
【０１０３】
（埋め込み式バイオセンサー）
他の実施形態においては、癌マーカーは埋め込み式バイオセンサーを用いて検出される。バイオセンサーは、生物学的相互作用の結果として電子的信号を生成する電子装置である。１つの実施形態においては、バイオセンサーは、典型的には結合ペアのもう一方の構成要素である、癌マーカーと結合する抗体、受容体、核酸、またはその他の結合ペアの構成要素を用いる。バイオセンサーは血液サンプルと共に用いられて、自動化イムノアッセイシステムにおいて典型的に必要とされるサンプル調製および／または分離段階を必要とせずに癌マーカーの存在を判定する。
【０１０４】
１つの実施形態においては、センサーはナノスケール装置である。センサーシステムは、ナノワイヤに着接する生物学的認識素子およびナノワイヤと関連する性質を判定することのできる検出器を含む。生物学的認識素子は、測定する癌マーカーが結合ペアの一方の構成要素である、結合ペアのもう一方の構成要素である（例：癌マーカーの受容体または抗癌マーカー抗体）。好ましくは、ナノワイヤセンサーは、その上に外面を形成してゲート電極を形成する半導体ナノワイヤ、および導体と電気的に接触してソース電極を形成する第１の末端、および導体と接触してドレイン電極を形成する第２の末端を含む。１つの実施形態においては、センサーは、絶縁材料で形成される基板、ソース電極、ドレイン電極、およびその間に排置される、生物学的認識素子がナノワイヤの表面に着接された半導体ナノワイヤを含む電界効果トランジスターである。生物学的認識素子とその特異的結合パートナーの間に結合事象が発生すると、電界効果トランジスターの電流−電圧特性に検出可能な変化が発生する。
【０１０５】
他の実施形態においては、センサーシステムはセンサーのアレイを含む。アレイ中の１つまたはそれ以上のセンサーは、付属のセンサーが周辺環境と相互作用するのを防ぐ保護部材を伴う。選択された時点で保護部材を不能とすることによってセンサーが作動を開始し、周辺の液状物または組織と相互作用するので、その結合ペアの構成要素が存在すれば生物学的認識素子がそのペアのもう一方の構成要素と相互作用することができる。
【０１０６】
他の実施形態においては、保護部材は、酸化することが可能で、生体適合性、生体吸収性であり、かつ電位が印可されると血液などの溶液に溶解しうる伝導性材料で形成される。たとえば、生体適合性金属または電気腐食性ポリマーなどの伝導性材料によって被覆される基板のウェル内でセンサーを形成することができる。他の実施形態においては、保護部材は事前に決定された時間で溶解する材料を用いて形成される。
【０１０７】
（質量分析）
他の実施形態においては、癌マーカーはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分析、またはタンデム質量分析（例：ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）などの質量分析（ＭＳ）を用いて検出される。  
【０１０８】
質量分析法は技術上周知であり、かつタンパク質などの生体分子を定量および／または同定するために用いられてきた。さらに、分離したタンパク質の新規シークエンシングを少なくとも部分的に可能である、質量分析技術が開発されている。一定の実施形態においては、気相イオン分光光度計が用いられる。他の実施形態においては、レーザー脱離／イオン化質量分析を用いてサンプルを分析する。モデムレーザー脱離／イオン化質量分析（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は、２つの主要な変法：マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）質量分析および表面増強レーザー脱離／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）で実践することができる。ＭＡＬＤＩにおいては、分析物はマトリクスを含有する溶液と混合され、さらに液状物の滴を基板の表面に付置する。次に、マトリクス溶液を生物学的分子と共結晶化させる。基板を質量分析計に挿入する。レーザーエネルギーを基板表面の方向に誘導し、そこで生物学的分子を有意に断片化することなく脱離させかつイオン化する。ＳＥＬＤＩにおいては、基板表面が脱離プロセスに能動的に関与するよう基板表面を修飾する。１つの実施形態においては、表面は吸着剤および／または目的のタンパク質と選択的に結合する捕捉試薬によって誘導体化される。他の実施形態においては、表面はレーザーで攻撃するとき脱離しないエネルギー吸収分子によって誘導体化される。他の実施形態においては、表面は、目的のタンパク質と結合しかつレーザー施用時に切断される光分解性結合を含む分子によって誘導体化される。これらの方法のそれぞれにおいて、誘導体化剤は、一般的に、サンプルが施用される基板表面の特定の位置に局在する。２つの方法は、たとえば、ＳＥＬＤＩアフィニティ表面を用いて分析物を捕捉しかつマトリクス含有液状物を捕捉した分析物に添加してエネルギー吸収材料を提供することによって組み合わせることができる。
【０１０９】
癌マーカーの存在の検出は、典型的にはシグナル強度の検出を包含するであろう。これはさらに基板とのポリペプチド結合の量および特性を反映することができる。たとえば、一定の実施形態においては、第１のサンプルと第２のサンプルのスペクトルのピーク値のシグナル強度を（例：肉眼、コンピュータ分析などにより）比較し、特定の生体分子の相対的な量を判定することができる。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（サイファージェンバイオシステムズ社、カリフォルニア州フレモント）などのソフトウェアプログラムを用いて質量スペクトルの分析を支援することができる。質量分析計およびその技術は、当業者に周知である。
【０１１０】
当業者は、質量分析計の任意の構成要素（例：脱離ソース、質量分析装置、検出など）および多様なサンプル調製を、本願に記載されるか、または技術上周知の他の適切な構成要素または調製と組み合わせることができることを理解する。たとえば、一部の実施形態においては、対照サンプルは重分子（例：１３Ｃ）を含むことがあり、これにより同じ質量分析の実行において被験サンプルを既知の対照サンプルと混合することが可能となる。
【０１１１】
１つの実施形態においては、レーザー脱離飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計を用いる。レーザー脱離質量分析においては、結合マーカーを有する基板をインレットシステムに導入する。マーカーはイオン化ソースからのレーザーによって脱離およびイオン化されて気相となる。生成されたイオンはイオン光学アセンブリに、次に飛行時間質量分析装置に捕集され、イオンは短い高電圧場を経て加速され高真空チャンバー中で浮動させられる。高真空チャンバーの末端で、加速されたイオンは異なる時間に高感度検出器表面を攻撃する。飛行時間はイオンの質量の関数であるので、イオン形成とイオン検出器衝突の間の経過時間を用いて特定の質量電荷比の分子の有無を鑑別することができる。
【０１１２】
一部の実施形態においては、第１または第２のサンプルに存在する１つまたはそれ以上の癌マーカーの相対量が、部分的に、コンピュータを用いたアルゴリズムの実行によって判定される。アルゴリズムは、第１の質量スペクトルおよび第２の質量スペクトルにおいて少なくとも１つのピーク値を同定する。次にアルゴリズムは、質量スペクトルの第１の質量スペクトルのピーク値のシグナル強度と第２の質量スペクトルのピーク値のシグナル強度を比較する。相対シグナル強度は、第１および第２のサンプルに存在する癌マーカーの量の指標である。既知の量の癌マーカーを含有する標準品を第２のサンプルとして分析し、第１のサンプル中に存在する生体分子の量をより良好に定量することができる。一定の実施形態においては、第１および第２のサンプル中の癌マーカーの同一性も判定することができる。
【０１１３】
（標準値、特異度および感度の判定）
本発明においては、ＣＣＬ２５の血中濃度などの癌マーカーの標準発現レベルは、統計的に決定することができる。たとえば、健常者のＣＣＬ２５の血中濃度を測定してＣＣＬ２５の標準血中濃度を統計的に決定することができる。統計的に十分な母集団を集めることができる場合、平均値から標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の２から３倍の範囲の数値がしばしば標準値として用いられる。したがって、平均値＋２×Ｓ．Ｄ．または平均値＋３×Ｓ．Ｄ．に対応する数値を標準値として用いうる。記載された通りに設定した標準値は、理論的にはそれぞれ健常者の９０％および９９．７％を含む。
【０１１４】
代替的に、標準値は癌患者における実際の発現レベル（例：ＣＣＬ２５の血中レベル）に基づいて設定することもできる。一般的に、この方式で設定される標準値は偽陽性百分率を最小化し、かつ検出感度を最大化することのできる条件を満足する数値の範囲から選択される。本願において、偽陽性百分率は、健常者のうち、そのＣＣＬ２５血中濃度が標準値よりも高いと判断される患者の百分率を意味する。対照的に、健常者のうち、そのＣＣＬ２５血中濃度が標準値よりも低いと判断される患者の百分率は特異度を示す。すなわち、偽陽性百分率と特異度の和は常に１である。検出感度は、癌の存在が判定されている者の母集団内の全癌患者のうち、その血中ＣＣＬ２５濃度が標準値よりも高いと判断される患者の百分率を意味する。
【０１１５】
本願で用いられる用語「検査の感度」は、スクリーニング検査が真の疾患を特定する能力であり、高感度検査であることを特徴とし低い偽陰性率を示し、さらに検査は疾患の有病率とは無関係である。検査の感度は、検査を受けた罹患患者総数に対する検査真陽性として算出され、百分率として表示される。
【０１１６】
用語「検査の特異性」は、疾患の非存在下で正しく陰性であるスクリーニング検査であり、高い特異度および低い偽陽性を有し、疾患の有病率とは無関係である。検査の特異度は、検査を受けた非罹患者数に対する検査真陰性として算出され、百分率として表示される。
【０１１７】
用語「ＰＰＶ」（陽性的中度）は疾患を有する検査陽性患者の百分率であり、またしたがって検査陽性の信頼性を評価する。計算法：
１．ＰＰＶ＝（真陽性）／（真陽性＋偽陽性）。
【０１１８】
用語「ＮＰＶ」（陰性的中度）は疾患のない検査陰性患者を意味し、かつ検査陰性の信頼性を評価する。計算法：
２．ＮＰＶ＝（真陰性）／（真陰性および偽陰性）。
【０１１９】
上に示す関係が指摘するように、検出正確度を評価するための指標である感度、特異度、陽性的中度および陰性的中度についての各数値は、ＣＣＬ２５の血中濃度のレベルを判断するための標準値に応じて変化する。
【０１２０】
標準値は、通常偽陽性比が低くかつ感度が高くなるように設定する。しかし、上に示す関係より明らかであるように、偽陽性比率と感度の間にはトレードオフが存在する。すなわち、標準値を低くすると、検出感度が上昇する。しかし、偽陽性比率も上昇するため、「低い偽陽性比率」を有するという条件を満足することは難しい。この状況を考慮すると、たとえば、本発明においては以下の予測結果をもたらす数値を好ましい標準値として選択しうる：（１）その偽陽性比率が５０％またはそれ以下である標準値（すなわち、その特異度が５０％未満でない標準値）および（２）その感度が２０％未満でない標準値。
【０１２１】
標準値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて設定することができる。ＲＯＣ曲線は、縦軸に検出感度および横軸に偽陽性比（すなわち「１−特異度」）を示すグラフである。ＲＯＣ曲線は、ＣＣＬ２５などの癌マーカーの血中濃度の高い／低い度合いを判定するための標準値を連続的に変化させた後で得られた感度と偽陽性比率の変化をプロットすることによって得ることができる。
【０１２２】
ＲＯＣ曲線を得るための「標準値」は、統計分析を行うために一時的に用いられる数値である。ＲＯＣ曲線を得るための「標準値」は、一般的に、選択可能な全ての標準値を包含することを可能とする範囲内で連続的に変化させることができる。たとえば、標準値は分析母集団において測定された最小および最大血中ＣＣＬ２５値の間で変化させることができる。
【０１２３】
得られたＲＯＣ曲線に基づき、本発明において用いる好ましい標準値を上記の条件を満たす範囲から選択することができる。代替的に、標準値は、血中ＣＣＬ２５測定値の大半を含む範囲から標準値を変化させることにより生成したＲＯＣ曲線に基づいて選択することができる。
【０１２４】
（癌を検出するためのキット）
本願の他の態様は、癌を検出するためのキットであって：生物学的サンプル中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を判定するための試薬；および前記試薬を使用する方法についての指示を含み、前記試薬が抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体または両者を含むことを特徴とするキットに関する。
【０１２５】
具体的な実施形態においては、前記キットは、生物学的サンプル中のＣＸＣＬ１３および／またはＣＸＣＲ５の発現を判定するための試薬；および前記試薬を使用する方法についての指示をさらに含み、前記試薬が抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体または両者を含むことを特徴とする。さらなる具体的な実施形態においては、前記キットは、生物学的サンプル中のＣＸＣＬ１６および／またはＣＸＣＲ６の発現を判定するための試薬；および前記試薬を使用する方法についての指示をさらに含み、前記試薬が抗ＣＸＣＬ１６抗体、抗ＣＸＣＲ６抗体または両者を含むことを特徴とする。
【０１２６】
他の具体的な実施形態においては、前記キットは、生物学的サンプル中のＣＸＣＬ１６および／またはＣＸＣＲ６の発現を判定するための試薬；および前記試薬を使用する方法についての指示をさらに含み、前記試薬が抗ＣＸＣＬ１６抗体、抗ＣＸＣＲ６抗体または両者を含むことを特徴とする。
【０１２７】
本発明は、制限的と解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本願の全体に引用された全ての参照文献、特許および公開特許明細の内容、さらには図面および表は、本願に参照文献として組み入れられる。
【実施例１】
【０１２８】
（多様な癌腫におけるＣＣＬ２５およびＣＣＲ９発現および活性のインビトロ分析）
図１に示すように、ＣＣＬ２５は乳癌組織によって発現される。乳癌組織をアイソタイプ対照または抗ＣＣＬ２５抗体で染色した。マゼンタ色はＣＣＬ２５染色を示す。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳシステムでデジタル画像をキャプチャした。示された乳癌の代表的な症例およびＣＣＬ２５の免疫強度。
【０１２９】
図２は、乳癌細胞株増殖におけるＣＣＬ２５のシスプラチン誘導性減少の阻害が証明されることを証明する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、シスプラチン濃度を上昇させながら、０または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋アイソタイプ対照または抗ＣＣＲ９  Ａｂで２４時間培養した。細胞増殖はＢｒｄＵ取り込みで判定し、測定は３回ずつ実施して３回繰り返した。アスタリクスはＣＣＬ２５処理ＢｒＣａ細胞と未処理ＢｒＣａ細胞の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１３０】
図３Ａ〜Ｂは、ＣＣＬ２５が乳癌細胞をシスプラチン誘導性アポトーシスから保護することを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、５ｍｇ／ｍＬシスプラチン単独または０または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣＣＲ９またはアイソタイプ対照とともに２４時間培養した（Ａ）。細胞を回収し、アネキシンＶおよびポピドンヨウ素（ＰＩ）で染色した。染色細胞のフローサイトメトリーによる分析ではアポトーシス（アネキシンＶ陽性）細胞を生存（非蛍光）および壊死（ＰＩ陽性）細胞と識別した。アスタリクスはＣＣＬ２５処理乳癌細胞と未処理乳癌細胞の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を、５ｍｇ／ｍＬ  シスプラチンまたは０または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋抗ヒトＣＣＲ９または１ｍｇ／ｍＬ  アイソタイプ対照Ａｂとともに２４時間培養した（Ｂ）。アポトーシス細胞の検出は、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法で遂行した。アポトーシス細胞は、標準的な蛍光フィルターセット（５２０±２０ｎｍ）により核緑色蛍光を示した。アスタリクスはシスプラチンＣＣＬ２５処理乳癌細胞株と未処理乳癌細胞株の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１３１】
図４Ａ〜Ｂは、乳癌細胞株におけるＣＣＬ２５−ＣＣ９相互作用によるＰＩ３Ｋ活性化およびＡｋｔ活性化を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＣＣＬ２５、シスプラチンおよび特異的キナーゼ阻害剤（ワートマニンおよびＰＦ−５７３，２２８）による処理後にＰＩ３ＫおよびＡｋｔを活性化するその能力について試験した。原位置での総ＰＩ３ＫおよびＡｋｔレベルおよびリン酸化ＰＩ３ＫおよびＡｋｔレベルを、シスプラチンおよびキナーゼ阻害剤の存在下でＣＣＬ２５刺激の前（０分）または刺激後（５または１０分）にＦａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣｅｌｌベースのＥＬＩＳＡで定量した。３回ずつ測定した３回の独立した実験から総ＰＩ３ＫまたはＡｋｔに対する活性化ＰＩ３Ｋ（Ａ）またはＡｋｔ（Ｂ）の比率±ＳＥＭを示す。アスタリクスは未処理細胞とＣＣＬ２５処理細胞とＣＣＬ２５＋シスプラチン処理細胞の間の統計的有意差を示す。
【０１３２】
図５Ａ〜Ｂは、乳癌細胞株のＣＣＬ２５処理後のＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲリン酸化を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＣＣＬ２５、シスプラチンおよび特異的キナーゼ阻害剤（ワートマニンおよびＰＦ−５７３，２２８）による処理後にＧＳＤ−３ｂおよびＦＫＨＲをリン酸化するその能力について試験した。原位置での総ＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲレベルおよびリン酸化ＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲレベルを、シスプラチンおよびキナーゼ阻害剤の存在下でＣＣＬ２５刺激の前（０分）または刺激後（５または１０分）にＦａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣｅｌｌベースのＥＬＩＳＡで定量した。３回ずつ測定した３回の独立した実験から総ＧＳＫ−３βまたはＦＫＨＲに対するリン酸化ＧＳＫ−３β（Ａ）またはＦＫＨＲ（Ｂ）の比率±ＳＥＭを示す。アスタリクスは未処理細胞とＣＣＬ２５処理細胞とＣＣＬ２５＋シスプラチン処理細胞の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１３３】
図６は卵巣癌組織によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。非腫瘍性（ｎ＝８）、漿液性腺癌（ｎ＝９）、漿液性乳頭状嚢腺腫（ｎ＝１）、類子宮内膜腺癌（ｎ＝５）、粘液性腺癌（ｎ＝２）、嚢腺腫（ｎ＝３）、粘液性ボーダーライン腺癌（ｎ＝１）、明細胞癌（ｎ＝５）、顆粒膜細胞腫瘍（ｎ＝３）、未分化胚細胞腫（ｎ＝３）、移行上皮癌（ｎ＝３）、ブレンネル腫瘍（ｎ＝１）、卵黄嚢腫瘍（ｎ＝４）、腺癌（ｎ＝１）および線維腫（ｎ＝２）に由来する卵巣癌組織をアイソタイプ対照または抗ＣＣＲ９およびＣＣＬ２５抗体で染色した。茶色（ＤＡＢ）はＣＣＲ６染色をし、かつマゼンタ色の染色はＣＣＬ２５を示す。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳシステムで各スライドのデジタル画像をキャプチャした。典型的な症例はＣＣＲ９およびＣＣＬ２５の免疫強度を示す。
【０１３４】
図７Ａ〜Ｂは卵巣癌組織によるＣＣＬ２５発現の分析を示す。ＣＣＬ２５発現を分析し、変形ボックスプロットで示した（Ａ）。ボックス内の下、中央および上の線は、それぞれ第１四分位（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）および第３四分位（Ｑ３）を示す。上と下のひげは中央値±１．５（Ｑ３−Ｑ１）を表す。非腫瘍との有意差を下のパネルに示す。表（Ｂ）は、非腫瘍性組織（ＮＮ）と、漿液性腺癌（ＳＡ）、類子宮内膜腺癌（ＥＣ）、粘液性腺癌（ＭＡ）、嚢腺腫（Ｃ）、粘液性ボーダーライン腺癌（ＭＢＡ）、明細胞癌（ＣＣＣ）、顆粒膜細胞腫瘍（ＧＣＴ）、未分化胚細胞腫（Ｄ）、移行上皮癌（ＴＣＣ）、ブレンネル腫瘍（ＢＴ）、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、腺癌（Ａ）および線維腫（Ｆ）とのそれぞれのｐ値または有意差を示す。
【０１３５】
図８Ａ〜Ｂは卵巣癌組織によるＣＣＲ９発現の分析を示す。ＣＣＲ９発現を分析し、変形ボックスプロットで示した（Ａ）。ボックス内の下、中央および上の線は、それぞれ第１四分位（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）および第３四分位（Ｑ３）を示す。上と下のひげは中央値±１．５（Ｑ３−Ｑ１を表し非腫瘍との有意差を下のパネルに示す。表（Ｂ）は、非腫瘍性組織（ＮＮ）と、漿液性腺癌（ＳＡ）、類子宮内膜腺癌（ＥＣ）、粘液性腺癌（ＭＡ）、嚢腺腫（Ｃ）、粘液性ボーダーライン腺癌（ＭＢＡ）、明細胞癌（ＣＣＣ）、顆粒膜細胞腫瘍（ＧＣＴ）、未分化胚細胞腫（Ｄ）、移行上皮癌（ＴＣＣ）、ブレンネル腫瘍（ＢＴ）、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、腺癌（Ａ）および線維腫（Ｆ）とのそれぞれのｐ値または有意差を示す。
【０１３６】
図９Ａ〜Ｂは卵巣癌細胞株によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。卵巣癌細胞をフルオレセイン（ＦＩＴＣ）複合体化抗ＣＣＲ９抗体またはＦＩＴＣ複合体化アイソタイプ対照抗体で染色しさらにＦＡＣＳで分析した（Ａ）。卵巣癌細胞をＦＩＴＣ複合体化抗ＣＣＲ９で染色し、細胞内ＣＣＬ２５をフィコエリスリン（ＰＥ）複合体化ＣＣＬ２５抗体で染色し、さらに核はＤｒａｑ−５で染色した（Ｂ）。融合データは、表面上のＣＣＲ９発現および核内のＣＣＬ２５発現を示す。
【０１３７】
図１０Ａ〜Ｂは卵巣癌細胞による低酸素調節ＣＣＲ９  ｍＲＮＡおよび表面タンパク質発現を示す。正常酸素条件および低酸素条件下のＳＫＯＶ−３細胞株または正常一次卵巣組織から総ＲＮＡを分離した。ＣＣＲ９  ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を３回ずつ実施した。転写物のコピーは、１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーの実数に対して＋ＳＥで表示する（Ａ）。正常酸素下および低酸素下のＳＫＯＶ−３細胞をＰＥ複合体化アイソタイプ対照抗体（Ａｂ）（塗りつぶしたヒストグラム）またはＰＥ複合体化抗ＣＣＲ９モノクローナルＡｂ（白抜きヒストグラム）で染色し、さらにフローサイトメトリーで定量した（Ｂ）。ＰＥ陽性細胞の平均蛍光強度の平均を示す。記号は、正常組織またはアイソタイプ対照とＯｖＣａ細胞の間（＠）または正常酸素と低酸素細胞間（＊）のＣＣＲ９発現の統計的に有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１３８】
図１１Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞の低酸素媒介性およびＣＣＬ２５媒介性遊走および浸潤を示す。ＳＫＯＶ−３細胞を、ＣＣＬ２５の走化性勾配に向かって遊走するその能力について試験した（Ａ）。遊走測定中、正常酸素または低酸素条件下で１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５を用いて、１．０μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９抗体（Ａｂ）またはアイソタイプ対照Ａｂと共に細胞を共培養した。またＳＫＯＶ−３細胞は、低酸素条件下または正常酸素条件下で１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５に応答してＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリクスに浸潤するかまたはこれを横切ってトランスロケーションするその能力についても試験した（Ｂ）。浸潤測定中、正常酸素または低酸素条件下で１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５を用いて、ＣＣＲ９に対するモノクローナル抗体１．０μｇ／ｍＬと共に細胞を共培養した。遊走または浸潤した細胞の個数（＋ＳＥ）は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す記号と共に示す。
【０１３９】
図１２Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性コラゲナーゼ発現を示す。細胞を、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−１３）ｍＲＮＡおよび活性タンパク質を発現するその能力について試験した。ＳＫＯＶ−３細胞は、正常酸素または低酸素条件下で、単独、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬアイソタイプ対照抗体（Ａｂ）、またはＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９  Ａｂと共に２４時間培養した。総ＲＮＡを分離し、コラゲナーゼのｍＲＮＡ発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、さらに転写コピーを実際の１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーに対して表示する（Ａ）。調製培地において活性コラゲナーゼをＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｋ測定で定量した（Ｂ）。記号は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４０】
図１３Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ゼラチナーゼ発現を示す。細胞を、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）ｍＲＮＡおよび活性タンパク質を発現するその能力について試験した。ＳＫＯＶ−３細胞は、正常酸素または低酸素条件下で、単独、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬアイソタイプ対照抗体（Ａｂ）、またはＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９  Ａｂと共に２４時間培養した。総ＲＮＡを分離し、ゼラチナーゼのｍＲＮＡ発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、さらに転写コピーを実際の１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーに対して表示する（Ａ）。調製培地中の活性ゼラチナーゼをＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｋ測定で定量した（Ｂ）。記号は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４１】
図１４Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ストロメライシン発現を示す。細胞を、ストロメライシン（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、およびＭＭＰ−１１）ｍＲＮＡおよび活性タンパク質を発現するその能力について試験した。ＳＫＯＶ−３細胞は、正常酸素または低酸素条件下で、単独、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬアイソタイプ対照抗体（Ａｂ）、またはＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９  Ａｂと共に２４時間培養した。総ＲＮＡを分離し、ストロメライシンのｍＲＮＡ発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、さらに転写コピーを実際の１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーに対して表示する（Ａ）。調製培地において活性ストロメライシンをＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｋ測定で定量した（Ｂ）。記号は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４２】
図１５は前立腺癌細胞株によるＣＣＲ９発現を示す。前立腺細胞株（Ｃ４−２Ｂ、ＬＮＣａＰ、およびＰＣ３）および正常前立腺細胞（ＲＷＰＥ−１）をＦＩＴＣ複合体化抗ヒトＣＣＲ９（緑）および７ＡＡＤ（核染色；赤）で染色した。陽性染色細胞をＡｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍで撮像および定量した。右のパネルはＣＣＲ９染色の平均蛍光強度を示す。
【０１４３】
図１６Ａ〜Ｄは前立腺組織によるＣＣＲ９発現を示す。国立衛生研究所（ＮＩＨ）、国立癌研究所（ＮＣＩ）およびアラバマ州立大学（バーミンガム）より組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を入手し、ＣＣＲ９について染色した。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅシステムで各スライドのデジタル画像をキャプチャした。前立腺癌（ＣａＰ）（Ａ）、マッチングした良性前立腺組織（ＭＢ）（Ｂ）および陰性対照の典型的な例を示し、スキャンして分析した全ての組織のＣＣＲ９強度をＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（ｖ．６．２５）で定量した。図２７ＤはＭＢと、良性前立腺肥大（ＢＨＰ）、前立腺癌（ＰＣａ）の間のＣＣＲ９免疫強度を示す。アスタリクスは、ＭＢと、ＢＰＨ、ＰＣａ組織間のＣＣＲ９免疫強度の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４４】
図１７Ａ〜Ｄは前立腺癌組織によるＣＣＬ２５発現を示す。エンドクリン−パラクリン細胞表現型の神経内分泌分化は、前立腺悪性腫瘍で頻繁に発生し、かつ転帰および治療上の潜在的重大性を有する。パラクリン細胞表現型は、前立腺および前立腺癌におけるアンドロゲン非感受性、分裂終了部分母集団と見なすことができる。図１７Ａは、前立腺上皮間新生物内のパラクリンパターンにおけるＣＣＬ２５の発現を示す。双頭矢印はＣＣＬ２５を産生する複数のパラクリン細胞を指し示し（赤）、茶色の矢印はＣＣＲ９を発現する細胞を指し示す（茶）。図１７ＢはＣＣＬ２５について赤く染色された細胞を示す。茶色の矢印は細胞ＮＳＥを指し示す。図１７ＡおよびＣは、それぞれ図１７ＤおよびＢよりも高い倍率を示す。
【０１４５】
図１８は健常ドナーまたは前立腺疾患患者における血清ＣＣＬ２５レベルを示す。ＥＬＩＳＡを用いて、健常ドナー、前立腺癌（ＰＣａ）、前立腺上皮間新生物（ＰＩＮ）、および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）由来の血清中のＣＣＬ２５を定量した。アスタリクスは、健常対照と比較したＣＣＬ２５レベルの有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１４６】
図１９Ａ〜Ｃはマウス骨髄細胞によるＣＣＬ２５発現を示す。非腫瘍担持（Ａ）および腫瘍担持（Ｂ）マウス由来の骨髄細胞を吸引し、ＦＩＴＣ複合体化抗ＣＣＬ２５抗体で染色した。陽性染色細胞（Ｃ）をＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで定量した。ＩＤＥＡＳソフトウェアを用いて画像ベース分析を実施したところ、前立腺腫瘍細胞攻撃後の骨髄によるＣＣＬ２５発現の１．６倍の増加を示した。
【０１４７】
図２０Ａ〜ＢはＣＣＲ９媒介性前立腺癌細胞遊走（Ａ）および浸潤（Ｂ）を示す。ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＣ４−２ｂ細胞を、無添加（白抜き棒グラフ）、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５（斜線棒グラフ）、または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬ抗ＣＣＬ２５（塗りつぶし棒グラフ）に向かって遊走するその能力について試験した。遊走および浸潤チャンバーに播種するために最初に用いた１０４個の細胞からＣＣＬ２５に応答して遊走および浸潤した細胞の個数（±ＳＥＭ）は、遊走がＣＣＬ２５依存的でありかつ抗ＣＣＬ２５抗体遮断によって阻害されることを示す。アスタリクスは、無添加とＣＣＬ２５処理細胞の間の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１４８】
図２１は、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＣ４−２ｂ前立腺細胞株によるＣＣＬ２５誘導性活性マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）発現を示す。細胞は、無添加（白抜き棒グラフ）または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５添加（塗りつぶし棒グラフ）で２４時間培養した。培養上清中のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、およびＭＭＰ−１１タンパク質レベルをＭＭＰ活性分析により判定した。アスタリスクは、未処理細胞株と比較したＣＣＬ２５処理細胞株のＭＭＰ分泌の有意な（ｐ＜０．０５）上昇または低下を示す。
【０１４９】
図２２Ａ〜ＦはＣＣＲ９ノックダウンによるＰＣ３前立腺癌細胞株の骨転移の阻害を示す。マウスを、ルシフェラーゼおよびドセタキセルの誘導によるＣＣＲ９特異性ｓｈＲＮＡ発現ＰＣ３細胞株で攻撃した（Ａ、Ｄ）。マウスはこの細胞株で腹腔内注射により攻撃した。その後、マウスは２１日間飲用物中に何も添加しないかまたはドキシサイクリン（０．２ｍｇ／ｍＬ）を投与された。Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｘｅｎｏｇｅｎ１００インビボ撮像システムにより転移と腫瘍増殖を毎週モニタリングした。攻撃より２４時間後には変化がなかったが（Ｂ、Ｅ）、攻撃の３週間後には、骨転移としてのＣＣＲ９ノックダウンＰＣ３（Ｆ）細胞の増殖はＣＣＲ陽性ＰＣ３細胞（Ｃ）と比較してより少なかった。
【０１５０】
図２３は肺癌患者の血清ＣＣＬ２５レベルを示す。ＣＣＬ２５  ＥＬＩＳＡを実施して、腺癌（ＡｄｅｎｏＣａ；ｎ＝１４）、扁平上皮癌（ＳＳＣ；ｎ＝１７）と診断された患者、および健常ドナー（ｃｏｎｔｒｏｌ；ｎ＝９）に由来する血清中のＣＣＬ２５レベルを定量した。ＥＬＩＳＡはＣＣＬ２５＞５ｐｇ／ｍＬを検出することができた。塗りつぶした円は個々の血清ＣＣＬ２５レベルを示し、線は各群の濃度の中央値を示す。アスタリクスは、対照群と肺癌群の間の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１５１】
図２４Ａ〜Ｃは非腫瘍性肺組織および肺癌組織によるＣＣＲ９発現を示す。非腫瘍性（ｎ＝８）（Ａ）、腺癌（ｎ＝２４）（Ｂ）、および扁平上皮癌（ｎ＝５４）（Ｃ）由来の肺組織をアイソタイプ対照または抗ＣＣＲ９抗体で染色した。茶色（ＤＡＢ）はＣＣＲ９染色を示す。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳシステムで各スライドのデジタル画像をキャプチャした。
【０１５２】
図２５Ａ〜Ｄは結腸癌組織によるＣＣＲ９−ＣＣＬ２５発現を示す。非腫瘍性（ｎ＝８）および腺癌（ｎ＝１６）由来の結腸組織を（Ａ）アイソタイプ対照、（Ｂ）抗ＣＣＲ９、または（Ｃ）抗ＣＣＬ２５抗体で染色した。茶色（ＤＡＢ）染色はＣＣＲ９陽性を示し、かつマゼンタ色の染色はＣＣＬ２５陽性を示す。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳシステムでデジタル画像をキャプチャした。
【実施例２】
【０１５３】
（リアルタイムＰＣＲ分析によりケモカイン発現レベルを検出すること）
（プライマー設計）
ＮＩＨ−ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベースよりＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１についてのメッセンジャーＲＮＡ配列を取得した。プライマーはＢｅａｃｏｎＪ  ２．０コンピュータプログラムを用いて設計した。コンピュータプログラム：Ｐｒｉｍｅｒ  ＰｒｅｍｉｅｒＪおよびＭＩＴ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３を用いてプライマーの熱力学分析を実施した。生成したプライマーセットをヒトゲノム全体と比較して特異性を確認した。
【０１５４】
（リアルタイムＰＣＲ分析）
癌細胞株（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴィル）を、非必須アミノ酸Ｌ−グルタミン酸、およびピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ−１６４０（完全培地）中で培養した。臨床切除組織より原発性腫瘍および正常ペアマッチング組織（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州フレデリックおよびＵＡＢ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ、アラバマ州バーミンガム）を採取した。メーカーのプロトコルに従ってＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、オハイオ州シンシナティ）を用い、１０６個の細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離した。ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼ（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）１０Ｕ／Ｆｌを用いて３７℃で１５分間処理することで、これらのサンプルより潜在的なゲノムＤＮＡ汚染を除去した。その後、ＲＮＡを沈殿させ、ＲＮＡ  Ｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）に再懸濁した。メーカーのプロトコルにしたがってＴａｑｍａｎ７逆転写試薬（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、総ＲＮＡ約２μｇを逆転写することによりｃＤＮＡを生成した。その後、メーカーのプロトコルにしたがってＳＹＢＲ７  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス試薬（アプライドバイオシステムズ）を用い、ｃＤＮＡをＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に対する特異的ヒトｃＤＮＡプライマーにより増幅した。これらの標的のｍＲＮＡのコピーレベルを、ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃｙｃｌｅｒおよびソフトウェア（カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いたリアルタイムＰＣＲ分析により評価した。
【０１５５】
ＣＸＣＬ１−、ＣＸＣＬ２−、ＣＸＣＬ３−、ＣＸＣＬ４−、ＣＸＣＬ５−、ＣＸＣＬ６−、ＣＸＣＬ７−、ＣＸＣＬ８−、ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１２−、ＣＸＣＬ１３−、ＣＸＣＬ１４−、ＣＸＣＬ１５−、ＣＸＣＬ１６−、ＣＸＣＲ１−、ＣＸＣＲ２−、ＣＸＣＲ３−、ＣＸＣＲ４−、ＣＸＣＲ５−、ＣＸＣＲ５ａ−、ＣＸＣＲ５ｂ−、ＣＸＣＲ６−、ＣＸＣＲ７−、ＣＣＬ１−、ＣＣＬ２−、ＣＣＬ３−、ＣＣＬ４−、ＣＣＬ５−、ＣＣＬ６−、ＣＣＬ７−、ＣＣＬ８−、ＣＣＬ９−、ＣＣＬ１０−、ＣＣＬ１１−、ＣＣＬ１２−、ＣＣＬ１３−、ＣＣＬ１４−、ＣＣＬ１５−、ＣＣＬ１６−、ＣＣＬ１７−、ＣＣＬ１８−、ＣＣＬ１９−、ＣＣＬ２０−、ＣＣＬ２１−、ＣＣＬ２２−、ＣＣＬ２４−、ＣＣＬ２５−、ＣＣＬ２５−１−、ＣＣＬ２５−２−、ＣＣＬ２７−、ＣＣＬ２８−、ＣＣＲ１−、ＣＣＲ２−、ＣＣＲ３−、ＣＣＲ４−、ＣＣＲ５−、ＣＣＲ６−、ＣＣＲ７−、ＣＣＲ８−、ＣＣＲ９−、ＣＣＲ１０−、ＣＣＲ１１−、ＸＣＬ１−、ＸＣＬ２−、ＸＣＲ１−、ＣＸ３ＣＲ１−、またはＣＸ３ＣＬ１特異性プライマーセットを用いて得られたＲＴ−ＰＣＲ生成物は、宿主配列にアニーリングしたプライマー（ＮＩＨ−ＮＣＢＩ遺伝子バンク）を排除したので、他の遺伝子標的と交差反応しなかった。プライマーは、ＣＸＣＲ５ａ対ＣＸＣＲ５ｂおよびＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１対ＣＣＬ２５−２をもたらす多型に対して、種々のサイズのアンプリコン生成物を生成した。この目的に向けて、腺腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、および／または骨髄腫細胞株および腫瘍組織のＲＴ−ＰＣＲ分析により、ケモカインおよびケモカイン受容体は癌細胞により識別的に発現されることが明らかとなった。
【実施例３】
【０１５６】
（抗ケモカインおよび抗ケモカイン受容体抗体はインビトロおよびインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する）
（抗血清の調製）
ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＲ９、ＣＸ３ＣＲ１、およびＣＸ３ＣＬ１（配列番号１−２１）から１５アミノ酸ペプチドを合成し（シグマジェノシス、テキサス州ザ／ウッドランド）、さらにその後の抗血清調製またはモノクローナル抗体生成のための免疫用に、鶏卵リゾチーム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）と複合体化して抗原を生成した。発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物測定（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社、ミシシッピー州ファルマス）によりケモカインペプチド複合体のエンドトキシンレベルを定量したところ＜５ＥＵ／ｍｇであることが示された。初回免疫用に、抗原１００μｇを免疫原としてフロイントの完全アジュバントＲｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔシステム（ＲＡＳ）と共に最終体積１．０ｍＬで用いた。この混合物の１００ｍＬ分取をウサギの背部の２部位に皮下投与し、また各後脚の筋肉に４００ｍＬずつ筋肉内投与した。３から４週間後、ウサギに、フロイントの不完全アジュバントに加えて抗原１００μｇを投与してその後３回免疫した。抗−ＣＸＣＲ１、−ＣＸＣＲ２、−ＣＸＣＬ１、−ＣＸＣＬ２、−ＣＸＣＬ３、−ＣＸＣＬ５、−ＣＸＣＬ６  −ＣＸＣＬ７、−ＣＸＣＬ８、−ＣＸＣＬ１２、−ＣＸＣＲ５ａ、−ＣＸＣＲ５ｂ、−ＣＸＣＬ１３、−ＣＸＣＲ６、−ＣＸＣＬ１６、−ＣＣＬ１６、−ＣＣＬ２５、−ＣＣＬ２５−１、−ＣＣＬ２５−２、−ＣＣＲ９、−ＣＸ３ＣＲ１、および−ＣＸ３ＣＬ１抗体価が１：１，０００，０００に達したときに抗血清を採取した。続いて、正常血清または抗血清を熱不活化しさらにＰＢＳで１：５０希釈した。
【０１５７】
（モノクローナル抗体の調製）
ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＲ９、ＣＸ３ＣＲ１、およびＣＸ３ＣＬ１から１５アミノ酸ペプチドを合成し（シグマジェノシス）、さらにその後の抗血清調製またはモノクローナル抗体生成のための免疫用に、鶏卵リゾチーム（Ｐｉｅｒｃｅ）と複合体化して「抗原」を生成した。発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物測定（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社、ミシシッピー州ファルマス）によりケモカインペプチド複合体のエンドトキシンレベルを定量したところ＜５ＥＵ／ｍｇであることが示された。初回免疫用に、抗原１００μｇを免疫原としてフロイントの完全アジュバントＲｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔシステム（ＲＡＳ）と共に最終体積２００μＬで用いた。その後、この混合物の１００μＬ分取をラット、マウス、または免疫グロブリンヒト化マウスの背部の２部位に投与した。２週間後、動物にはフロイントの不完全アジュバントに加えて抗原１００μｇを投与してその後３回免疫した。血清を採取し、かつ抗−ＣＸＣＲ１、−ＣＸＣＲ２、−ＣＸＣＬ１、−ＣＸＣＬ２、−ＣＸＣＬ３、−ＣＸＣＬ５、−ＣＸＣＬ６  −ＣＸＣＬ７、−ＣＸＣＬ８、−ＣＸＣＬ１２、−ＣＸＣＲ５ａ、−ＣＸＣＲ５ｂ、−ＣＸＣＬ１３、−ＣＸＣＲ６、−ＣＸＣＬ１６、−ＣＣＬ１６、−ＣＣＬ２５、−ＣＣＬ２５−１、−ＣＣＬ２５−２、−ＣＣＲ９、−ＣＸ３ＣＲ１、または−ＣＸ３ＣＬ１抗体価が１：２，０００，０００に達したとき、宿主を屠殺しかつ脾細胞を分離してハイブリドーマを生成した。簡潔に述べると、免疫した宿主の脾臓またはリンパ節に由来するＢ細胞を不死骨髄腫細胞株（例：ＹＢ２／０など）と融合させた。次に、選択培養条件（すなわちＨＡＴ添加培地）およびハイブリドーマクローニングの限定希釈法後にハイブリドーマを分離した。ＥＬＩＳＡを用いて所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を選択した。正常ラットまたはマウスに由来するハイブリドーマを、一般的に用いられる分子生物学的技術を用いてヒト化した。高親和性および増殖性ハイブリドーマをクローニングした後、腹水または培養上清から抗体を分離し、力価１：２，０００，０００に調節しさらにＰＢＳで１：５０希釈した。
【０１５８】
（抗血清またはモノクローナル抗体投与）
Ｔ、Ｂ、およびＮＫ細胞を欠く免疫不全ヌードＮＩＨ−ＩＩＩマウス（週齢８から１２週、チャールズリバーラボラトリー、マサチューセッツ州ウィルミントン）に１×１０６個の癌細胞を皮下に与えて腫瘍を確立した。確立された固形腫瘍は、その後宿主から切除して速やかに移植するか、または後日移植するために液体窒素に保存した。用時切除したかまたは液体窒素で凍結した腫瘍組織（１ｇ）を、腸脂肪組織に外科的に移植して腫瘍を生成した。一旦異種移植腫瘍の増殖がサイズ５ｍｍに達したならば、ＮＩＨ−ＩＩＩマウスに抗血清またはモノクローナル抗体のいずれかの２００μＬ腹腔内注射を３日毎に実施し、さらに腫瘍増殖の進行または退縮についてモニタリングした。
【０１５９】
（データ分析）
ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ２０００（イリノイ州シカゴ）ソフトウェアを用いて、データの統計的有意性を分析および確認した。その後、２因子不対検定を用いたスチューデントのｔ−検定でデータを分析した。この分析においては、投与サンプルを非投与サンプルと比較した。有意水準はｐ＜０．０５に設定した。
【０１６０】
（インビトロ増殖試験）
腺腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、および／または骨髄腫細胞株をＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６  ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に対して特異的な抗体の存在するまたは存在しない完全培地内で増殖させた。ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を発現する癌細胞株の増殖は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、またはＣＸＣＬ８に対する抗体によって阻害された。同様に、ＣＸＣＲ４を発現する癌細胞株の増殖はＣＸＣＲ４またはＣＸＣＬ１２に対する抗体によって阻害された。ＣＸＣＲ５ａまたはＣＸＣＲ５ａを発現する癌細胞株の増殖はＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、またはＣＸＣＬ１３に対する抗体によって阻害された。ＣＸＣＲ６を発現する癌細胞株の増殖はＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６に対する抗体によって阻害された。ＣＣＲ９を発現する癌細胞株の増殖はＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、またはＣＣＬ２５−２に対する抗体によって阻害された。ＣＸ３ＣＲ１を発現する癌細胞株の増殖はＣＸ３ＣＲ１またはＣＸＣ３Ｌ１に対する抗体によって阻害された。興味深いことに、可溶性リガンドＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、またはＣＸ３ＣＬ１に対する抗体は、膜受容体に向けられたものよりも、増殖阻害において効果的である。
【０１６１】
（インビトロ血管新生試験）
微小血管内膜細胞（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ワシントン州カークランド）を供給者のプロトコルにしたがって増殖させ、さらにＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に特異的な抗体の存在下または非存在下で、血管新生についてのインビトロ測定（ＢＤ−Ｂｉｏｃｏａｔ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）において微細血管細静脈を形成させた。血管新生は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６に対する抗体によって阻害された。
【０１６２】
（インビボ増殖試験）
癌細胞株または原発性腫瘍組織をＮＩＨ−ＩＩＩマウスに養子移入し、さらに目的の異種移植腫瘍を形成させた。ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２；ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬｌに対する抗体は、腫瘍サイズの進行および退縮に識別的に影響した。一定の場合において、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６に向けられた抗体は、効果的に腫瘍増殖の退縮にも進行の阻害にもつながる。ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に向けられた抗体は、腫瘍サイズの進行の阻害において効果的である。
【０１６３】
本願で用いられるケモカインのタンパク質配列はＮＩＨ−ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに以下のように記録される：(1) CXCR1 (ACCESSION#（受託番号） NP 000625), SEQ ID NO:1, (2) CXCR2(ACCESSION# NP  001548), SEQ ID NO:2, (3) CXCL1 (ACCESSION# NP 001502), SEQ ID NO:3, (4) CXCL2 (ACCESSION# NP 002080), SEQ ID NO:4, (5) CXCL3 (ACCESSION# NP 002081), SEQ ID NO:5, (6) CXCL5 (ACCESSION# NP  002985), SEQ ID NO:6, (7) CXCL6 (ACCESSION# NP 002984), SEQ ID NO:7, (8) CXCL7 (ACCESSION# NP 002695), SEQ ID NO:8, (9) CXCL8 (IL-8, ACCESSION# NP 000575), SEQ ID NO:9, (10) CXCR4 (ACCESSION# NP 003458), SEQ ID NO:10, (11) CXCL12 (ACCESSION# NP  000600), SEQ ID NO:11, (12) CXCR5A (ACCESSION# NP 116743), SEQ ID NO:12, (13) CXCR5B (ACCESSION# NP 001707), SEQ ID NO:13, (14) CXCL13 (ACCESSION# NP 006410), SEQ ID NO:14, (15) CXCR6 (ACCESSION# NP  006555), SEQ ID NO:15, (16) CXCL16 (ACCESSION# NP 071342), SEQ ID NO:16, (17) CCL16 (ACCESSION# NP 004581), SEQ ID NO:17, (18) CCL25 (ACCESSION# NP-005615.2), SEQ ID NO:18, (19) CCL25-1 (ACCESSION# NP  005615), SEQ ID NO:19, (20) CCL25-2 (ACCESSION# NP 683686), SEQ ID NO:20, (21) CX3CR1 (ACCESSION# NP  001328), SEQ ID NO:21, and (22) CX3CL1 (ACCESSION# NP  002987), SEQ ID NO:22.
【０１６４】
ｃＤＮＡ配列は既知でありかつＮＩＨ−ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにおいて以下の受入番号の下で利用可能である：(23) CXCR1 (ACCESSION# NM 000634), SEQ ID NO:23, (24) CXCR2(ACCESSION# NM  001557), SEQ ID NO:24, (25) CXCL1 (ACCESSION# NM 001511), SEQ ID NO:25, (26) CXCL2 (ACCESSION# NM 002089), SEQ ID NO:26, (27) CXCL3 (ACCESSION# NM 002090), SEQ ID NO:27, (28) CXCL5 (ACCESSION# NM  002994), SEQ ID NO:28, (29) CXCL6 (ACCESSION# NM 002993), SEQ ID NO:29, (30) CXCL7 (ACCESSION# NM 002704), SEQ ID NO:30, (31) CXCL8 (IL-8, ACCESSION# NM 000584), SEQ ID NO:31, (32) CXCR4 (ACCESSION# NM 003467), SEQ ID NO:32, (33) CXCL12 (ACCESSION# NM  000609), SEQ ID NO:33, (34) CXCR5A (ACCESSION# NM 032966), SEQ ID NO:34, (35) CXCR5B (ACCESSION# NM 001716), SEQ ID NO:35, (36) CXCL13 (ACCESSION# NM 006419), SEQ ID NO:36, (37) CXCR6 (ACCESSION# NM  006564), SEQ ID NO:37, (38) CXCL16 (ACCESSION# NM 022059), SEQ ID NO:38, (39) CCL16 (ACCESSION# NM 004590), SEQ ID NO:39, (40) CCL25 (ACCESSION# NM_005624.3), SEQ ID NO:40, (41) CCL25-1 (ACCESSION# NM 005624), SEQ ID NO:41, (42) CCL25-2 (ACCESSION# NM 148888), SEQ ID NO:42, (43) CX3CR1 (ACCESSION# NM 001337), SEQ ID NO:43, and (44) CX3CL1 (ACCESSION# NM 002996), SEQ ID NO:44.
【０１６５】
以下の表に示すように、大半が何らかの腫瘍が発現する個別のケモカインは変動しうる。本願の方法は、個別の患者に対し、患者自身の腫瘍において過剰発現されるケモカインに応じてカスタマイズしうる。本願の方法を用いて、腫瘍において過剰発現される個別のケモカインを同定し、かつその過剰発現されたケモカインに対する抗体を投与することが可能である。癌患者に合わせた治療の調節は新規であり、かつ本願の特に有益な態様である。
【０１６６】
表１は、検討した個別の腫瘍において過剰発現された個別のケモカインの種々の量を示す。
【０１６７】
【表１】
2014501387.tif 000003
【実施例４】
【０１６８】
（ＰＣａ化学療法抵抗性に関与するＣＣＲ９−ＣＣＬ２５誘発性抗アポトーシスおよび／または生存シグナル）
ＬＮＣａＰ（ホルモン反応性、野生型ｐ５３発現）、ＰＣ３（ホルモン抵抗性、ｐ５３完全欠損）、およびＤＵ１４５（ホルモン抵抗性、ｐ５３変異）細胞株を、ＣＣＬ２５を添加または無添加で、かつドキソルビシン（１μＭ／２μＭ／４μＭ）、エトポシド（２０μＭ／４０μＭ）、エストラムスチン（４μＭ／１０μＭ）、またはドセタキセル（１０ｎＭ／２０ｎＭ／４０ｎＭ）を添加または無添加で４、８、１２、および２４時間増殖させる。細胞生存、プロアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル（Ａｋｔ、Ｓｒｃ、ＣａｍＫＩＩ、ＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ  Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、ＢａＫ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＴＰ５３、カスパーゼ−３、−６、−８、−９、サバイビン、ビトロネクチン、β−カテニン）、および薬剤耐性または代謝を担う分子（Ｔｗｉｓｔ−１、Ｓｎａｉｌ−１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−π（ＧＳＴ−π）、ｐ５３、トポイソメラーゼＩ、ＩＩα、ＩＩβ、およびＡＢＣ薬物輸送体）の発現および活性化を、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングで評価する。簡潔に述べると、細胞処理後にリアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子発現の変化を試験する。シグナリング分子の活性化も、リン酸化特異性抗体（すなわちウェスタンブロット分析）によって試験する。活性化シグナリング分子の役割をさらに確認するため、ＣＣＬ２５処理後に、化学的阻害物質またはｓｉＲＮＡを用いて候補分子の発現または活性を阻害し、また標的遺伝子をリアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析で分析する。その後、化学療法剤に対する処理細胞の反応をＶｙｂｒａｎｔアポトーシス測定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）キットで評価する。
【０１６９】
（ＲＮＡ分離およびリアルタイムＰＣＲ）
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（インビトロジェン）法で総ＲＮＡを分離し、紫外線分光測定によって定量する。電気泳動法によりＲＮＡの品質を分析する。ＩＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）をメーカーの記載する通りに用いてｃＤＮＡ合成を完遂する。ＩＱ（登録商標）ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ）をメーカーの記載する通りに用い、さらにＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、ＢａＫ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＸＩＡＰ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＴＰ５３、チトクロームＣ、カスパーゼ−３、−６、−８、−９、サバイビン、ラミン、ＣａｍＫＩＩ、ビトロネクチン、β−カテニン、カドヘリン、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｓｎａｉｌ−１、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨに対して設計された特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実施する。結果をΔΔＣｔ法によって算出し、非処理群に対するｍＲＮＡ変化が何倍かを定量する。
【０１７０】
（ウェスタンブロッティング）
細胞を回収し、溶解緩衝液に再懸濁して総タンパク質を抽出する。溶解緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有し、プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭベンズアミジン、１０μｇ／ｍＬ大豆トリプシン阻害剤、５０μｇ／ｍＬロイペプチン、１μｇ／ｍＬペプスタチンおよび２０μｇ／ｍＬアプロチニンを添加する。細胞溶解液を氷上で３０分間保存し、４℃で２０分間遠心分離し（１４０００×ｇ）、さらに上清をｍＲＮＡレベルの有意なモジュレーションを示す遺伝子のウェスタンブロット分析に用いる。同様に、蛍光体特異性抗体を用いてＡｋｔ１／２／３、ｍＴＯＲ、ＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、およびＧＳＫ−３βのリン酸化のレベルの変化を試験する。さらに、特異抗体を用いて開裂後のカスパーゼおよびＰＡＲＰの活性化を評価する。ＥＣＬプラス試薬（Ｐｈａｒｍｅｃｉａ）によるＸ線フィルム上でのタンパク質バンドの化学発光検出後に得られた結果を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ画像分析ソフトウェア（ＮＩＨ）を用いてβアクチンおよび／またはＧＡＰＤＨに対して正規化する。
【０１７１】
（チトクロームＣ放出の検出）
細胞を採取し、さらにＰＢＳで洗浄し、さらに２２０ｍＭマンニトール、６８ｍＭショ糖、５０  ｍＭＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤を含有する抽出緩衝液に再懸濁する。氷上で３０分間インキュベートした後、Ｇｌａｓｓ−Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザーを用いて細胞をホモジナイズし、さらにホモジネートを１４，０００ｇで１５分間遠心分離する。サイトゾルの抽出物を、抗チトクロームＣモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いたウェスタンブロット分析に用いる。
【０１７２】
（ｓｉＲＮＡトランスフェクション、化学的阻害剤、およびアポトーシス検出）
前立腺癌細胞株を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（インビトロジェン）を用いて遺伝子特異性および非特異性対照ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）によってトランスフェクトする。至適な遺伝子ノックダウン時間およびｓｉＲＮＡ濃度をウェスタンブロット分析で確認し、またＣＸＣＬ１６、対照抗体、および／または抗ＣＸＣＲ６抗体を用いて、または用いずに薬剤処理した後の細胞の生存についてさらに評価する。生存、アポトーシス、および壊死細胞の変化の検出は以下のように評価する：細胞の生存は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、Ｖｙｂｒａｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓによってメーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）の記載通りに試験する。遺伝子ノックダウン後の下流遺伝子発現の変化は、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを用いて試験する。
【０１７３】
ＣＣＬ２５で処理した細胞は細胞生存および薬物輸送体タンパク質の発現の亢進を示し、これはホルモン反応性および非反応性細胞においてその発現パターンの差を示す。抗ＣＣＬ２５  ＡｂはＰＣａ細胞においてＣＣＬ２５の効果を有効に反転させる。ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシドおよびドセタキセルは、ＣＣＬ２５処理（またはＣＣＲ９遮断）していないＰＣａ細胞においてアポトーシスを誘導する。
【実施例５】
【０１７４】
（ＡＢＣ薬物輸送体におけるＣＣＲ９−ＣＣＬ２５誘導性変化）
ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＤＵ１４５細胞を、ＣＣＬ２５、抗ＣＣＬ２５抗体、対照抗体、および／または抗−ＣＣＲ９抗体を添加または無添加で、ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシド、またはドセタキセルと共にまたはこれを加えずに、前述の通りに４、８、１２または１６時間増殖させる。処理後、ＡＢＣ輸送体およびＴｗｉｓｔ−１のｍＲＮＡ発現の変化を、ＡＢＣおよびＴｗｉｓｔ−１  ｃＤＮＡに向けられた特異的プライマーを用いて、上述の通りにリアルタイムＰＣＲで定量する。ｍＲＮＡ発現の有意な変化を示す遺伝子をウェスタンブロット分析でさらに試験する。処理細胞に由来する核抽出物をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）測定によって評価し、ＣＸＣＬ１６結合によって誘導される転写因子がＡＢＣ輸送体およびＴｗｉｓｔ−１のプロモーター領域と結合するか判定する。
【０１７５】
（クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ））
実施例４の結果は、調節される遺伝子、さらにはＣＣＲ９−ＣＣＬ２５相互作用によって活性化される転写因子をモジュレートしうる遺伝子についての情報を提供する。これらの結果に基づき、標的転写因子および遺伝子を選択する。特異的ＰＣＲプライマーを、転写因子の結合部位を含むこれらの遺伝子のプロモーター領域に対して設計する。ＰＣＲプライマーを用いて、転写因子と共に沈殿するＤＮＡを増幅する。２０ｍＭ酪酸塩の存在下で細胞をトリプシン処理により回収する。５０，０００個の細胞をＰＢＳ／酪酸５００μＬに再懸濁する。１％ホルムアルデヒドを用いてタンパク質とＤＮＡを室温で８分間架橋し、さらに１２５ｍＭグリシンを５分間用いて架橋を停止する。細胞をソフト減速条件のスイングアウトローターで４℃、４７０ｇで１０分間遠心分離し、氷冷ＰＢＳ／酪酸０．５ｍＬ中でボルテックス振盪したのち遠心分離して２回洗う。溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０ｍＭ酪酸塩を添加し、ボルテックスで振盪し、またその後遠心分離することにより細胞を溶解する。この手順は、５００ｂｐのクロマチンフラグメントを生成することが知られている。超音波処理した溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２０ｍＭ酪酸塩を含有するＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ  ＣｈＩＰ緩衝液）で８倍希釈する。ＲＩＰＡ  ＣｈＩＰ緩衝液（３３０μＬ）をペレットに添加し、ボルテックスで混合する。ＣｈＩＰ材料の免疫沈降および洗浄は、特異的転写因子に向けられた抗体の使用によって実現される。抗体ビーズ複合体を収容するチューブにクロマチンを分取する。投入サンプルを、フェノール−クロロホルムイソアミルアルコール分離用チューブに入れる。免疫沈降材料を３回洗い、ＴＥ中にある間に新しいチューブに移す。１％ＳＤＳでのＤＮＡ溶離、架橋の逆転およびプロテイナーゼＫ消化は、６８℃で２時間１段階で実施する。アクリルアミド担体（シグマアルドリッチ）の存在下でフェノール−クロロホルムイソアミルアルコール、およびエタノール沈降によりＤＮＡを抽出し、ＴＥに溶解する。３〜４つの独立したＣｈＩＰから免疫沈降したＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで分析する。リアルタイムＰＣＲデータは、３回の独立した再現ＣｈＩＰ分析において、投入ＤＮＡに対する沈殿（抗体結合）ＤＮＡの百分率（±ＳＤ）で表示する。
【０１７６】
ＣＣＲ９−ＣＣＬ２５シグナリングを介したＣＲＥＢ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、およびＮＦｋＢなどの転写因子のリン酸化および活性化は、その後ＡＢＣ輸送体およびＴｗｉｓｔ−１の発現の増大につながる。同じプロモーターに負の調節要素が存在する場合、遺伝子発現の低下が認められる。ホルモン依存性および抵抗性ＰＣａ細胞はこれらの細胞内シグナリング分子の発現に差があるので、ホルモン依存性および抵抗性条件によってモジュレートされる遺伝子に多様性を示す。遺伝子発現におけるモジュレーションは、ＣＣＬ２５の存在下とＣＣＬ２５投与の非存在下で薬物投与による差を示す。
【実施例６】
【０１７７】
（ＣＣＬ２５指向的治療法のインビボ評価）
雄性ヌードマウスを、ルシフェラーゼ発現アンドロゲン反応性（ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ）および非反応性（ＰＣ３−Ｌｕｃ）細胞で皮下攻撃する。インビボ撮像システムを用いて腫瘍の発達を非侵襲的に測定する。測定可能な腫瘍の確立後、マウスを投与群（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）と対照群（Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫ）に分ける。「Ａ」群にはＣＣＬ２５中和抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を１日おきに投与し、また対照（Ｆ群）にはアイソタイプ対照抗体を投与する（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）。「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」および「Ｅ」群にはＣＣＬ２５中和抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を、それぞれドキソルビシン腹腔内注射（１から３日目、その後１５日目から１７日目に５ｍｇ／ｋｇ／日投与）、エトポシド静脈内注射（１０ｍｇ／ｋｇ／日；１、５、９、１４、１９および２４日目）、エストラムスチン静脈内注射（１〜５日目および２６〜３１日目に４ｍｇ／ｋｇ／日投与）、またはドセタキセル腹腔内注射（８ｍｇ／ｋｇ／日で週２回４週間）と共に投与する。これらの投与群の対照（それぞれ「Ｇ」、「Ｈ」、「Ｉ」および「Ｊ」）には、これらの薬剤を同様の濃度および注射プロトコルを用いてアイソタイプ対照抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）と共に投与する。「Ｋ」群にはＰＢＳを投与し、プラセボとなる。投与および対照の腫瘍進行および退縮をインビボ撮像で非侵襲的に評価する。投与群および非投与群から腫瘍を切除し、免疫組織化学検査によって細胞生存および薬剤抵抗性タンパク質の変化について評価する。本願で用いられる文脈においては、用語「ＣＣＬ２５中和抗体」は抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体を意味する。
【０１７８】
（統計（有意性）およびサンプルサイズ）
サンプルサイズ（または検定力）の算出は予備試験の設計および提案された実験の要件を判定することにとって重要である。我々の結果を解釈するためには、有意性検定および統計分析も重要である。従来のα値、すなわちｐ＝０．０１を用いて本試験の統計的有意性を評価する。提案された実験は、各群最小１０匹のマウスを必要とするであろう。データは平均±ＳＥＭで表示され、かつ正規分布サンプルについては両側対（または非対）スチューデントｔ−検定を、または正規分布しないサンプルについてはノンパラメトリック検定として非対マンホイットニーＵ検定により比較する。結果は、ＳＹＳＴＡＴ（Ｓｙｓｔａｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社）統計プログラムを用いて分析する。一因子および二因子分散ＡＮＯＶＡ分析を用いて、それぞれ群およびサブグループを評価する。したがって、結果はｐ値が＜０．０５である場合に統計的に有意とみなす。
【０１７９】
（動物）
週齢６から８週間の雄性ヌードマウスにＰＣａ細胞を皮下注射する。簡潔に述べると、５×１０６個のルシフェラーゼ発現ＰＣ３細胞を無菌ＰＢＳ１００μＬに再懸濁し、イソフルラン麻酔下でヌードマウスの側腹部に注射する。ルシフェラーゼ発現ＬＮＣａＰ細胞（５×１０６個）を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ベクトンディッキンソン）と混合し、イソフルラン麻酔下でヌードマウスの側腹部に注射する。
【０１８０】
（インビボ腫瘍増殖の分析）
腫瘍担持ヌードマウスに、撮像の１５分前に２５×５／８”ゲージ針を用いた腹腔内注射によりＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）１５０ｍｇ／ｋｇを投与する。マウスはＩＶＩＳ１００インビボ撮像システムを用いて撮像し、結果を光子／秒／ｃｍ２／ｓｒで表示する。腫瘍体積はノギスを用いて測定し、式（長径）×（短径）２×０．５で算出する。
【０１８１】
（細胞生存、アポトーシスおよび薬剤耐性遺伝子発現分析）
投与プロトコル完了の３日後に全群から腫瘍を切除する。腫瘍を４％ＰＦＡで固定し、さらにパラフィン包埋する。パラフィン切片（厚さ７μｍ）をガラススライドに載置し、脱パラフィンし、さらに再水和する（キシレンで５分、無水エタノール、９５％エタノールおよび７０％エタノールで１分ずつ）。再水和した切片を用いて、薬物輸送体、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、ＢａＫ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＸＩＡＰ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＴＰ５３、チトクロームＣ、カスパーゼ−３、−６、−８、−９、サバイビン、ラミン、ＣａｍＫＩＩ、ビトロネクチン、β−カテニン、カドヘリン、Ｔｗｉｓｔ−１、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＣＣＲ９およびＣＣＬ２５について、ペルオキシダーゼベースで免疫組織化学染色する。染色後、スライドをＡｐｅｒｉｏスキャンスコープ（Ａｐｅｒｉｏ）システムによりスキャンおよび分析する。
【０１８２】
ＣＸＣＬ１３中和は、薬剤に反応した細胞生存の低下による腫瘍体積の減少につながる。しかし、形成される腫瘍の間でも反応はホルモン感受性（ＬＮＣａＰ）およびホルモン抵抗性（ＰＣ３細胞）によって異なる。さらに、化学療法剤は機能的ＣＣＲ９−ＣＣＬ２５軸を有する腫瘍においては効果が低く、これによりこれらの薬剤を細胞外に輸送することが知られているＡＢＣタンパク質の発現が亢進しうる。
【０１８３】
上の記述は、当業者に対して本発明を実践する方法を教示することを目的とし、かつ記述を読めば当業者に対してすぐに明らかになるそれら全ての明白な変更およびその変法を詳述することを意図していない。しかし、そうした全ての明白な変更および変法が本発明の範囲に含まれることが意図され、それは以下の請求項によって定義される。請求項は、文脈が具体的にそうでないと示さなければ、そこで意図される目的に合致するために効果的な要素および段階を任意の順番で包含することを意図する。本明細書に引用された全ての参照文献は、その全文を本願に参照文献として援用する。
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１１】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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