(57)【要約】【課題】【解決手段】架橋剤と架橋する細胞組織ゲル、及び該架橋剤の反応基に結合するクエンチ剤が記載されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋剤と架橋する１つ以上のマトリックス分子、及び前記架橋剤の反応基に結合するクエンチ剤を含む、細胞組織ゲル。
【請求項２】
前記架橋剤が、エポキシド、ジアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、ゲニピン、リボフラビン、フラボノイド、６−マレイミドヘキサン酸活性エステル、ジスクシンイミジルスベレート、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、及びビス（スルホスクシンイミジル）スベレートからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項３】
前記クエンチ剤が、ジアミン、オリゴアミン、ポリアミン、ジカルボキシレート、オリゴ−カルボキシレート、ポリカルボキシレート、ポリスルフヒドリル化合物、及びポリヒドロキシ化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項４】
前記架橋剤がゲニピンであり、前記クエンチ剤がポリ−Ｌ−リジンである、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項５】
前記ポリ−Ｌ−リジンが２０ｋＤａを超える平均分子量を有する、請求項４に記載の細胞組織ゲル。
【請求項６】
前記ポリ−Ｌ−リジンが９９ｋＤａ以上の平均分子量を有する、請求項５に記載の細胞組織ゲル。
【請求項７】
前記ポリ−Ｌ−リジンが２１２ｋＤａ以上の平均分子量を有する、請求項５に記載の細胞組織ゲル。
【請求項８】
前記架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルであり、前記クエンチ剤が水である、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項９】
前記架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルであり、前記クエンチ剤がポリリジン又はγ−ポリグルタミン酸である、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１０】
前記１つ以上のマトリックス分子が、コラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、テナシン、ラミニン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、寒天、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、及びグリコーゲンからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１１】
前記１つ以上のマトリックス分子が、コラーゲン、ヒアルロナン、及びゼラチンからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１２】
前記１つ以上のマトリックス分子がコラーゲン及びヒアルロナンである、請求項１１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１３】
前記１つ以上のマトリックス分子がゼラチンを包含する、請求項４に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１４】
前記１つ以上のマトリックス分子がコラーゲンを包含する、請求項８に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１５】
前記１つ以上のマトリックス分子がゼラチンを包含する、請求項９に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１６】
栄養素及び生物活性剤を更に含む、請求項１に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１７】
前記栄養素が細胞培養培地である、請求項１６に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１８】
前記細胞活性剤が、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血管内皮細胞増殖因子、結合組織成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞成長因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、角化細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｍｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮単球活性化ポリペプチド、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＢＲＡＫ、トランスフォーミング成長因子β、及び腫瘍壊死因子からなる群から選択される成長因子である、請求項１６に記載の細胞組織ゲル。
【請求項１９】
幹細胞を更に含む、請求項１６に記載の細胞組織ゲル。
【請求項２０】
前記コラーゲン及び前記ヒアルロナンが、０．０１〜１００：１の重量比である、請求項１２に記載の細胞組織ゲル。
【請求項２１】
請求項１に記載の細胞組織ゲルを含有する細胞移植材を提供する工程、及び前記移植材を対象の一部位に置く工程を含む、幹細胞を対象に送達する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
接着特性を有する細胞組織ゲルには多種多様な用途がある。一般的に、このようなゲルは架橋剤を使用して形成される。しかし、架橋剤は有毒となり得る。毒性が低い細胞組織ゲルが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、架橋剤と架橋し、架橋剤の反応基に結合できるクエンチ剤を包含する細胞組織ゲルが、接着強度の改善及び毒性の低下を示すという予想外の発見に基づく。
【０００３】
従って、本発明は、架橋剤と架橋する１つ以上のマトリックス分子、及び架橋剤の反応基に結合するクエンチ剤を含有する細胞組織ゲルに関する。
【０００４】
１つ以上のマトリックス分子には、限定するものではないが、コラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、テナシン、ラミニン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、寒天、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、及びグリコーゲンが包含される。いくつかの実施形態において、１つ以上のマトリックス分子は、コラーゲン、ヒアルロナン、及びゼラチンの１つを包含する。
【０００５】
架橋剤は、一般的に２つの二官能反応基を有し、この二官能基は同じあることも異なることもできる。架橋剤には、限定するものではないが、エポキシド、ジアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、ゲニピン、リボフラビン、フラボノイド、６−マレイミドヘキサン酸活性エステル、ジスクシンイミジルスベレート、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、及びビス（スルホスクシンイミジル）スベレートが包含される。クエンチ剤には、限定するものではないが、ジアミン、オリゴアミン、ポリアミン、ジカルボン酸、オリゴカルボン酸、ポリカルボン酸、ポリスルフヒドリル含有化合物、ポリヒドロキシ含有化合物、及びヘテロ二官能基含有化合物が包含される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、架橋剤はゲニピンであり、クエンチ剤はポリ−Ｌ−リジンである。ポリ−Ｌ−リジンは平均分子量が２０ｋＤａ超、例えば、９９ｋＤａ超、又は２１２ｋＤａ超であることができる。場合によっては、架橋剤はエチレングリコールジグリシジルエーテルであり、クエンチ剤は水である。架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルであるとき、クエンチ剤はポリリジン又はγ−ポリグルタミン酸であることができる。
【０００７】
本発明の細胞組織ゲルは、細胞成長のための栄養素（例えば、細胞培養培地）、生物活性剤、及び／又は細胞（例えば、幹細胞）を更に含有できる。生物活性剤は、成長因子、例えば、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、結合組織成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞成長因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、角化細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｍｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮単球活性化ポリペプチド、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＢＲＡＫ、トランスフォーミング成長因子β、及び腫瘍壊死因子であることができる。
【０００８】
本発明は、（ｉ）上記の細胞組織ゲル及び細胞を含有する細胞移植材を提供する工程、及び（ｉｉ）前記細胞移植材を対象の一部位に置く工程を包含する、細胞（例えば、幹細胞）を対象に送達する方法にも関する。細胞送達に使用される細胞移植材の製造における細胞組織ゲルの使用も、本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下に記載する。本発明のその他の特徴又は利点は、以下の実施例の詳細な記載から及び添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書には、細胞成長を支持できる生物適合性細胞組織ゲルが記載されている。この細胞組織ゲルは、架橋剤と架橋した１つ以上のマトリックス分子（下記参照）、及び前記架橋剤の反応基に結合するクエンチ剤を含有する。細胞組織ゲルは、細胞成長のための栄養素（例えば、細胞培養培地）、生物活性剤、又は細胞（例えば、幹細胞）を更に包含できる。
【００１１】
マトリックス分子
【００１２】
マトリックス分子（例えば、巨大分子化合物）は、細胞を移植部位に留める効果がある。マトリックス分子は、細胞外マトリックスに存在する細胞外分子であることができる。例としては、限定するものではないが、コラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、テナシン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリペプチド、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、寒天、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、グリコーゲン及びこれらの誘導体が挙げられる。加えて、マトリックス分子は、フィブリン、フィブリノゲン、トロンビン、及びポリグルタミン酸、合成ポリマー（例えば、アクリレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ（乳酸−グリコール酸共重合体））
であることができる。本明細書に記載の組織ゲルに使用されるマトリックス分子は、ゲルの粘度を増大するための高分子量を有することが好ましい。
【００１３】
天然コラーゲン又はその機能変異体のいずれも、本発明の組織ゲルの調製に使用できる。現時点で、少なくとも２８の遺伝的に異なる種のコラーゲンが発見されている。コラーゲンは、ヒト及び動物の皮膚、腱、靭帯、及び骨などのコラーゲンに富む組織から容易に単離及び精製できる。コラーゲンの単離及び精製方法は、当該技術分野で周知である。（例えば、米国特許第５，５１２，２９１号；米国特許出願公開第２００４０１３８６９５号；Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８２，ｐｐ．３３−６４，１９８２に記載の方法；Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｏｎｅｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｌｅａｔｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．ＬＸＶ，ｐｐ．４４０−４５０，１９７０；米国特許第６，０９０，９９６号を参照）。コラーゲンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．）に記載されているような、組換え技術によって調製することもでき、又は種々の供給業者（例えば、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ）から購入することもできる。一例を挙げる。脂肪及び筋膜を除去したウシの深屈筋腱を、水洗及び凍結し、スライサーで０．５ｍｍの切片に切断する。適量の腱切片を最初に５０ｍｌの水で室温にて２４時間抽出する。水溶性画分を廃棄した後、腱切片を酸性溶液（例えば、０．２Ｎ  ＨＣｌ）で適温（例えば、室温）にて適切な時間（例えば、１２〜２４時間）抽出する。ＨＣｌ溶液を廃棄し、腱を水ですすいで残留酸を除去する。続いて、すすいだ腱を塩基性溶液（例えば、０．７５Ｍ  ＮａＯＨ）で適温（例えば、室温）にて適切な時間（例えば、１２〜２４時間）抽出する。塩基性溶液を廃棄した後、腱切片を酸性溶液（例えば、０．１Ｎ  ＨＣｌ）でｐＨ４〜７（例えば、５）に中和し、続いて腱中の残留塩基を除去するために反復洗浄する。続いて、腱をアルコール（例えば、イソプロパノール）で室温にて十分な時間（例えば、１６時間）脱脂する。続いて、抽出剤をデカンテーションし、腱を更にアルコール（例えば、イソプロパノール）で室温にて十分な時間（例えば、１２〜２４時間）抽出し、コラーゲン含有溶液を生成する。この溶液はクリーンフード内で乾燥できる。こうして得られたコラーゲン粉末を、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン又はペプシン）の存在下で酸性溶液（例えば、０．５Ｍ又は０．２５Ｍ酢酸）中に分散し、４℃で適切な時間インキュベートする。続いて、この混合物を、１００メッシュのステンレス鋼製メッシュフィルターで濾過し、可溶化コラーゲンを５％ＮａＣｌ溶液で沈殿することができる。沈殿したコラーゲンは上記の酸性溶液に再溶解でき、こうして得られた溶液を１００メッシュのステンレス鋼製メッシュフィルターで濾過して、非可溶化粒子を除去することができる。続いて、コラーゲン溶液を蒸留水で透析して、酸を除去する。
【００１４】
用語「ヒアルロナン」は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＤ−グルクロン酸、及びその誘導体の繰り返し二糖単位を包含する、天然のアニオン性非硫酸化グリコサミノグリカンを表す。  天然のヒアルロナン（ヒアルロン酸又はヒアルロネートとしても知られる）は、その天然供給源（例えば、連鎖球菌のカプセル、雄鶏の鶏冠、軟骨、滑膜関節液、臍帯、皮膚組織及び眼の硝子体）から、従来方法により単離できる。例えば、Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ  Ｌａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６２（４）：３２１−３２６，２００５；及びＩｃｈｉｋａ  Ａｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ７５（３）：８０５−８１０，２００９参照。あるいは、販売会社、例えばＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ及びＨｙａｌｕｒｏｎ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから購入することもできる。天然ヒアルロナンの誘導体としては、限定するものではないが、ヒアルロナンエステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンアミド製品、架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステル又はその重金属塩、ヒアルロン酸の部分又は全エステル、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、及びアミン若しくはジアミン修飾ヒアルロン酸が挙げられる。これら誘導体は、その官能基（例えば、カルボン酸基、ヒドロキシ基、還元末端基、Ｎ−アセチル基）の１つ以上を化学修飾することによって得ることができる。カルボキシル基は、エステル化又はカルボジイミド及びビスヒドラジドに媒介される反応により修飾することができる。ヒドロキシ基の修飾としては、限定するものではないが、硫酸化、エステル化、イソウレアカップリング、臭化シアン活性化、及び過ヨウ素酸酸化が挙げられる。還元末端基は、還元的アミノ化によって修飾できる。還元末端基を、リン脂質、染料（例えば、蛍光体又は発色団）、又は親和性マトリックスの調製に適した作用剤に結合することもできる。天然ヒアルロナンの誘導体は、架橋剤（例えば、ビスエポキシド、ジビニルスルホン、ビスカルボジイミド、小さいホモ二官能性リンカー、ホルムアルデヒド、シクロヘキシルイソシアニド、及びリジンエチルエステル、金属カチオン、ヒドラジド、又はこれらの混合物）を用いた架橋によって、又は内部エステル化、光架橋、若しくは表面プラズマ処理によっても得ることができる。
【００１５】
ヒアルロナン、特に高分子量の（すなわち、５ｋＤａを超える）ヒアルロナンは、血管新生の促進に有効であり、それによって傷の回復を促進することが明らかにされている。米国仮特許出願第６１／３９０，７８９号参照。本発明を実施するため、ヒアルロナンは、５０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ（例えば、７０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、又は７００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ）の分子量を有することができる。
【００１６】
また、幹細胞は、コラーゲン及びヒアルロナンを０．０１〜１００（コラーゲン）：１（ヒアルロナン）の特定の重量比で含有する細胞組織ゲル中で増殖したときに生存率の改善を示すことも明らかにされている。米国特許出願第１２／９７４，５３５号参照。本明細書に記載の細胞組織ゲルを作製するためには、ヒアルロナンの濃度は０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ）であることができ、コラーゲンの濃度は０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌであることができる。好ましくは、コラーゲン濃度は０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、ヒアルロナン濃度は０．０１〜３５ｍｇ／ｍｌである。より好ましくは、コラーゲン濃度は３〜７５ｍｇ／ｍｌ（例えば、６ｍｇ／ｍｌ又は９ｍｇ／ｍｌ）であり、ヒアルロナン濃度は０．２〜２０ｍｇ／ｍｌである。
【００１７】
架橋剤
【００１８】
架橋剤は、標的分子と反応し、標的分子を互いに結合することができる。架橋剤は一般的に、標的分子の反応基と反応できる反応基を少なくとも２つ含有する。下の表１は、代表的な反応基及び官能基を示す。架橋剤及び反応基は当該技術分野において周知である。
【００１９】
本発明で有用な架橋剤としては、限定するものではないが、イミドエステル、エポキシド（例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル）、ジアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、２，３−ジブロモプロピオニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及びクロラムブシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ゲニピン、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、リボフラビン、バイオフラボノイド、フラボノイド（例えば、プロアントシアニジン、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン、ケルセチン、カルコン、アピゲニン、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｉｉｎ）、ポリメトキシ化フラボン、クエルシトール（ｑｕｅｒｃｉｔｏｉ）、ケンペロール、ミリセチン、アントシアニン、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒｉｔｒｏｌ）、イソフラボノイド、ダイゼイン、ゲニステイン、ノビレチン、タンゲレチン、及びタンニン酸）、６−マレイミドヘキサン酸活性エステル、ジスクシンイミジルスベレート、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、アジド、ジアジリン、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、及びこれらの誘導体が挙げられる。架橋剤は、複数の同一又は異なる官能性反応基を含有するポリマー、例えば、ポリエポキシ化合物、及びポリ（ヒドロキシ酸）であることもできる。
【００２０】
反応基及びその標的官能基
【００２１】
【表１】
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【００２２】
クエンチ剤
【００２３】
クエンチ剤は、架橋剤の反応基と反応することができる作用剤である。標的分子が架橋剤と架橋されたとき、クエンチ剤を、標的分子の官能基と反応しなかった架橋剤の反応基との反応に用いることができる。フリーの反応基を「使い果たす」ことにより、クエンチ剤は架橋剤の毒性を完全又は部分的に低減することができる。クエンチ剤は、アミン、スルフヒドリル、カルボニル、グリコール、カルボキシル、アジド又は光架橋基を含有する化合物であることができる。換言すると、クエンチ剤は、架橋剤の反応基と反応できる部分を含有する。例えば、アミン反応基を有する架橋剤の場合、クエンチ剤としては、限定するものではないが、ジアミン、オリゴアミン、並びにポリリジン及びポリグルタミンのようなポリアミンが挙げられる。カルボキシル反応基を有する架橋剤の場合、有用なクエンチ剤は、ジカルボン酸、オリゴカルボン酸、又はポリグルタメート若しくはポリグルタミン酸のようなポリカルボン酸であり得る。その他の代表的なクエンチ剤としては、スルフヒドリル反応基のクエンチに使用できるポリスルフヒドリル含有化合物、及びヒドロキシル反応基のクエンチに使用できるポリヒドロキシ含有化合物が挙げられる。
【００２４】
細胞成長のための栄養素
【００２５】
用語「栄養素」は、細胞成長に不可欠な栄養源を表す。栄養素は、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、炭素源（例えば、ブドウ糖）、脂肪酸、又はこれらの混合物であることができる。１つの実施例において、本発明の組織ゲルに使用される栄養素は、細胞増殖培地であり、例えば、最小必須培地、イーグル基礎培地、ダルベッコ改変イーグル培地、ハム栄養混合物Ｆ−１０又はＦ−１２、１９９培地、ＲＰＭＩ培地、エームズ培地、ＢＧＪｂ培地（フィットン−ジャクソン改変）、クリック培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、フィッシャー培地、グラスゴー最小必須培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｌ−１５培地、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、スイムＳ−７７培地、ウェイマウス培地、又はウィリアム培地Ｅである。
【００２６】
生物活性剤
【００２７】
細胞生存率を改善、細胞増殖を促進、又は細胞分化を誘発する任意の作用剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖、又は小分子）を本発明の組織ゲル作製に使用できる。１つの実施例において、生物活性剤は成長因子であり、例えば、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、結合組織成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞成長因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、セロトニン、フォンヴィレブランド因子、トランスフォーミング成長因子、角化細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、グリア細胞由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮単球活性化ポリペプチド、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子である。別の実施例において、生物活性剤は、サイトカイン又はケモカインであり、限定するものではないが、ＩＬ−２、乳房発現ケモカイン（例えば、ＢＲＡＫ）、腎臓発現ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１４）などである。生物活性剤は、細胞分化因子であることもでき、例えば、デキサメタゾン、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−ホスフェート、レチノイン酸、プロリン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、及びウシ血清アルブミン、及びＴＧＦ−β３などである。好ましい実施形態において、分化因子は、間葉系幹細胞の軟骨形成を促進する化合物（米国特許第５，９０８，７８４号に開示されている化合物参照）、骨形成を促進する化合物（例えば、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールホスフェート）、脂肪生成を促進する化合物（例えば、インスリン、イソブチル−メチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシン）、心筋分化を促進する化合物（例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４）、内皮細胞分化を促進する化合物（例えば、ＥＢＭ−２、デキサメタゾン、及びＶＥＧＦ）、平滑筋細胞分化を促進する化合物（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、神経誘導を促進する化合物（例えば、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＢ２７サプリメント、ＤＭＳＯ、ブチル化ヒドロキシアニソール、ホルスコリン、バルプロ酸、ＫＣｌ、Ｋ２５２ａ、及びＮ２サプリメント）及び内胚葉系分化を促進する化合物（例えば、デキサメタゾン、ＨＧＦ、及びＦＧＦ−４）である。生物活性剤は、漢方薬又はその有効成分であることもできる。
【００２８】
細胞包埋組織ゲルの調製
【００２９】
本明細書に記載の組織ゲルは、上に記載した構成成分のすべてを所望の重量比で混合し、その混合物をゲル形成に好ましい条件下に保つことによって調製できる。細胞埋設ゲルを調製するために、所望の細胞をゲル形成の前にゲル構成成分と混合することができる。細胞は、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル、及びヒト）から得られた細胞に由来できる。例として、限定するものではないが、胎盤由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、ストロマ細胞（例えば、脂肪由来ストロマ細胞）、間葉系幹細胞、組織前駆細胞、芽細胞、又は線維芽細胞が挙げられる。
【００３０】
このようにして調製された細胞包埋組織セルを、組織修復及びその他の治療目的で、所望の部位に移植することができる。
【００３１】
更なる説明なく、当業者は、上記の記載に基づき、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例示にすぎず、本開示の残りの部分をいかなる形でも制限しないとみなされるべきである。本明細書に引用したすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
実施例：ポリ−Ｌ−リジンを含有する架橋組織ゲル
【００３３】
（Ａ）材料及び方法
【００３４】
本研究で試験したクエンチ剤には、スペルミン、プロタミン、１，６−ヘキサンジアミン、種々の分子量の組のポリ−Ｌ−リジンが包含される。ポリ−Ｌ−リジンの平均分子量は、３．４、２０、９９、２１２及び２２５ｋＤａであった。
【００３５】
等規定度のポリアミンのそれぞれを、リン酸緩衝生理食塩水中でゼラチン（３００ｍｇ／ｍＬ）と予備混合した。ブタ皮膚試料（１０×３０×０．７〜０．９ｍｍ３）の真皮側に塗布する前に、２０ｍｇ／ｍＬのゲニピン溶液及び上記のポリアミン−ゼラチン溶液を等量で混合して接着剤を形成した。この領域に接着剤（１×１ｃｍ２）５０ｇを置いた。接着剤の接着強度を、ＬＲＸ材料試験装置（Ｌｌｏｙｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国）を用いて、分離速度１０ｍｍ／分にて測定した。
【００３６】
接着剤の細胞毒性作用を、２４ウェルプレートの１つのウェルの中心に１０μＬの接着剤をアプライすることによって評価した。線維芽細胞（２．０×１０４個／ウェル）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で３８時間培養した。生存細胞の数を血球計で計数した。
【００３７】
ポリ−Ｌ−リジンの存在時及び不在時の接着剤のレオロジー特性を、ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ  ＲＳ１５０（Ｈａａｋｅ、ドイツ）を用いて、１組のコーン及びカップにより測定した。実時間の貯蔵弾性率（Ｇ’）を固定剪断応力（１Ｐａ）及び周波数（１Ｈｚ）にて時間と共に記録した。反応温度がＧ’に与える影響も観測した。
【００３８】
（Ｂ）接着強度
【００３９】
結果は、分子量が２０ｋＤａを超えるポリアミンは接着剤の接着強度を改善することを示している。分子量２１２ｋＤａのポリ−Ｌ−リジンを選択して、追加研究を実施した。これらの追加研究で、ポリ−Ｌ−リジンを有する接着剤の接着強度は、４６．８ｍＮまで、ポリ−Ｌ−リジン濃度の上昇と共に増大することが明らかになった。１７．５ｍＮのポリ−Ｌ−リジンを用いて作製した接着剤及びポリリジンなしの接着剤で実施した研究は、ポリリジンありの接着剤の最大接着強度がポリリジンなしの接着剤よりも高いことを示した。
【００４０】
ゲニピンの濃度に関係なく、ポリ−Ｌ−リジン量の増大と共に接着剤の接着強度の増大が観察された。さらに、ゲニピンの濃度の上昇に伴い、接着強度が増強された。
【００４１】
（Ｃ）毒性
【００４２】
ポリ−Ｌ−リジンが存在しない接着剤の毒性は、ゲニピンの濃度上昇と共に増大した。ポリ−Ｌ−リジンの添加により、ゲニピンの細胞毒性作用が有意に低減した。７．５ｍｇ／ｍＬのゲニピン及び４６．８ｍＮのポリ−Ｌ−リジンで、有意な細胞毒性作用は認められなかった。
【００４３】
（Ｄ）レオロジー特性
【００４４】
ポリ−Ｌ−リジンが接着剤の物理的及び化学的特性に与える影響を更に理解するため、実時間の貯蔵弾性率（Ｇ’）を観測した。固定剪断応力（１Ｐａ）及び周波数（１Ｈｚ）を用いた振動試験で、Ｇ’値は、液体状態から接着剤が形成するにともなって増大した。Ｇ’値は、ポリ−Ｌ−リジンを添加した接着剤の方が有意に高かった。異なる反応温度におけるＧ’値を観測した結果、５０℃で実施した反応で、約９０分で急激な増大が観察された。相転移は、ポリ−Ｌ−リジンが接着剤の架橋反応に関与し、接着剤の弾性率を大幅に増大することを示した。ポリ−Ｌ−リジン不在の場合には相転移は観察されなかった。
【００４５】
その他の実施形態
【００４６】
本明細書に開示された特徴はすべて、いかなる組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示された特徴のそれぞれは、同一の、等価の、又は類似の目的を果たす別の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、他に明示されない限り、開示された各特徴は、等価又は類似の特徴の包括的系列の一例でしかない。
【００４７】
上記の記述から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の使用法及び条件に適応するために本発明に種々の変更及び修正を加えることができる。従って、その他の実施形態も本特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
2014519843.tif 000003
2014519843.tif 000004
2014519843.tif 000005