(57)【要約】  本発明は、VCAM-1に対して特異的なナノボディに、医用イメージングにおけるその使用ならびに診断、予後診断および治療法におけるその使用に関する。
2014527797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)アミノ酸配列(i)CDR1としてのYTNSIMYMA(配列番号1)、(ii)CDR2としてのAIRFPDDS(配列番号2)および(iii)CDR3としてのRSSPYSFAWNDPSNYNY(配列番号3)、または
b)アミノ酸配列(i)CDR1としてのFTYSSYYMS(配列番号4)、(ii)CDR2としてのGINVDGSN(配列番号5)および(iii)CDR3としてのGSGRDSYDCYSGSWCP(配列番号6)、または
c)アミノ酸配列(i)CDR1としてのFTFSNYYMT(配列番号7)、(ii)CDR2としてのRINSDGS(配列番号8)および(iii)CDR3としてのGKSSV(配列番号9)、または
d)アミノ酸配列(i)CDR1としてのFTFSSYYMS(配列番号10)、(ii)CDR2としてのGINVDGSN(配列番号11)および(iii)CDR3としてのGSGRDSYDCYSGSWCP(配列番号12)
を含むVCAM-1に対するナノボディ
あるいは、それぞれ配列番号1、配列番号2および配列番号3、または配列番号4、配列番号5および配列番号6、または配列番号7、配列番号8および配列番号9、または配列番号10、配列番号11および配列番号12の配列の1つ、2つまたは3つにおける1つまたは2つのアミノ酸の保存的置換を含むa)、b)、c)またはd)で定義されたナノボディの機能的に保存性の変異体。
【請求項２】
配列番号13、配列番号14、配列番号15および配列番号16のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のナノボディ。
【請求項３】
配列番号13のアミノ酸配列からなる、請求項1または2に記載のナノボディ。
【請求項４】
検出可能なマーカーと結合されている、請求項1から3のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項５】
前記検出可能なマーカーが放射性核種である、請求項4に記載のナノボディ。
【請求項６】
インビボでの非侵襲的医用イメージングにおける造影剤として使用するための、請求項1から5のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項７】
診断または予後診断法において使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項８】
薬物として使用するための、請求項1から3のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項９】
試料中のVCAM-1のインビトロでの検出のための、請求項1から5のいずれか一項に記載のナノボディの使用。
【請求項１０】
請求項1から3のいずれか一項に記載のナノボディを、薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項1から3のいずれか一項に記載のナノボディをコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項１２】
請求項11に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項11に記載の核酸または請求項12に記載のベクターがトランスフェクトされた、それに感染した、またはそれで形質転換された細胞。
【請求項１４】
請求項1から3のいずれか一項に記載のナノボディを発現する組換え宿主細胞を生産する方法であって、
(i)請求項11に記載の核酸または請求項12に記載のベクターをインビトロまたはエクスビボでコンピテント宿主細胞に導入するステップと、
(ii)得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養するステップと、
(iii) 場合によって、前記ナノボディを発現するかつ/または分泌する細胞を選択するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項1から3のいずれか一項に記載のナノボディを生産する方法であって、
(i)前記ナノボディの発現を可能にするための適切な条件下で請求項13に記載のトランスフェクト細胞または感染細胞または形質転換細胞を培養するステップと、
(ii)発現ナノボディを回収するステップと
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテロームプラークのインビボでの検出を可能にする抗VCAM-1ナノボディに関する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患は、死亡の世界的な主要原因であり、冠疾患は、それだけでこれらの死亡の半数以上の原因である。冠事象の発症は、大多数の場合、易破綻性冠動脈アテロームプラークの破綻に起因する。冠疾患の診断のための現在の標準的技術である、冠動脈造影では、非狭窄性プラークの同定は可能でない。
【０００３】
核イメージングは、易破綻性アテロームプラークの分子イメージングのための重要な利点を明らかに有する。様々な化学的性質の多くのトレーサー、その主なものとしてのリポタンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗体、糖、アンチセンスヌクレオチドおよびナノ粒子が、分子イメージングについて実験的に評価された(Riouら(2009年)、Curr. Med. Chem.、16巻、1499〜1511頁)。評価された主な標的は、酸化LDLおよびそれらの受容体、マクロファージの細胞イメージング、またはこの細胞型により発現される酵素の受容体のイメージングによる炎症現象、アポトーシス現象ならびに血管新生現象であった。炎症過程を標的とするトレーサーのうち、SPECT(単一光子放出コンピュータ断層撮影)モードにおける核イメージング用の99mTc-MCP-1およびPET(陽電子放射断層撮影)法用の[18F]-FDGは、実験的なアテローム動脈硬化性病変におけるマクロファージの蓄積の非侵襲的なインビボイメージングを可能にした。臨床レベルでは、[18F]-FDGおよび99mTc-アネキシンA5は、症候性患者の頸動脈アテロームプラークにおけるそれぞれマクロファージおよびアポトーシス細胞の蓄積の非侵襲的イメージングを可能にした。しかし、これらの放射性トレーサーのいずれも現在のところ臨床診療で系統的に用いられていない。その理由は、主として冠病変における十分な病変対バックグラウンドノイズ比をそれらが達成することができないためである。実際、病変の体積が小さく、それらが非結合循環トレーサーを含む血液と近接しているため、冠動脈における易破綻性プラークの核イメージングは、特に困難である。したがって、冠動脈アテロームのイメージングの実現可能性を示す臨床的検査は、現時点では存在しない。
【０００４】
VCAM-1は、その発現が粥腫発生促進条件で誘導される、免疫グロブリンのファミリーの糖タンパク質である。その発現は、アテロームプラークの発生の部位に限定され、易破綻性プラークの発生の全過程を通して持続する。VCAM-1の役割は、プラークへの炎症細胞(リンパ球および単球)の動員を保証することである。したがって、VCAM-1の発現は、易破綻性プラークの定義における主要な基準の1つとして認識されている、マクロファージの蓄積と直接相関する(Naghaviら(2003年)、Circulation、108巻、1772〜1178頁)。本発明者らは、VCAM-1に結合することができるペプチド配列を含む放射性トレーサーを以前に開発した。本発明者らは、エクスビボでのオートラジオグラフ画像上でのこの放射性トレーサーの結合がアテロームプラークの発生の部位およびVCAM-1の発現と相関していたことをアテローム動脈硬化症のウサギモデルにおいて示した(Broisatら(2007年)、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging、34巻、830〜840頁)。しかし、このトレーサーの循環血液活性があるため、医用イメージングにインビボでそれを使用することは可能でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO95/14785
【特許文献２】WO96/22378
【特許文献３】US5,882,887
【特許文献４】US6,013,516
【特許文献５】US4,861,719
【特許文献６】US5,278,056
【特許文献７】WO94/19478
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Riouら(2009年)、Curr. Med. Chem.、16巻、1499〜1511頁
【非特許文献２】Naghaviら(2003年)、Circulation、108巻、1772〜1178頁
【非特許文献３】Broisatら(2007年)、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging、34巻、830〜840頁)
【非特許文献４】Osbornら(1989年)、Cell. 59巻、1203〜1211頁)
【非特許文献５】Lefranc(2003年)、Dev. Comp. Immunol.、27巻、55頁
【非特許文献６】Lehninger(1975年)、Biochemistry、2nd Edition、Worth Publishers, Inc. New-York: NY.、71〜77頁
【非特許文献７】Merrifield(19962)、Proc. Soc. Ex. Boil.、21巻、412頁
【非特許文献８】Merrifield(1963年)、J. Am. Chem. Soc.、85巻、2149頁
【非特許文献９】Tamら(1983年)、J. Am. Chem. Soc.、105巻、6442
【非特許文献１０】Maniatisら(1982年)、Molecular Cloning: a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratories、NY、51〜54頁および412〜430頁
【非特許文献１１】Mizukamiら(1987年)、J. Biochem.、101巻、1307〜1310頁
【非特許文献１２】Masonら(1985年)、Cell、41巻、479〜487頁
【非特許文献１３】Gilliesら(1983年)、Cell、33巻、717〜728頁
【非特許文献１４】Miyajiら(1990年)、Cytotechnology、3巻、133〜140頁
【非特許文献１５】Bradyら(1984年)、Gene、27巻、223〜232頁
【非特許文献１６】O'Hareら(1981年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78巻、1527〜1531頁
【非特許文献１７】Arbabi Ghahroudiら(1997年)、FEBS Lett.、414巻、521〜526頁
【非特許文献１８】Saerensら(2005年)、J. Mol. Biol.、352巻、597〜607頁
【非特許文献１９】Vaneyckenら(2010年)、J. Nucl. Med.、51巻、1099〜1106頁
【非特許文献２０】Vaneyckenら(2011年)、FASEB J.、25巻、2433〜2446頁
【非特許文献２１】Gainkamら(2008年)、J. Nucl. Med.、49巻、788〜795頁
【非特許文献２２】Temmaら(2010年)、J. Nucl. Med.、51巻、1979〜1986頁
【非特許文献２３】Kugeら(2010年)、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging、37巻、2093〜2104頁
【非特許文献２４】Ruddら(2002年)、Circulation、105巻、2708〜2711頁
【非特許文献２５】Wykrzykowskaら(2009年)、J. Nucl. Med.、50巻、563〜568頁
【非特許文献２６】Laitinenら(2006年)、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging、33巻、1461〜1467頁)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
実際、一般的に、質の高い医用画像を作成するために、シグナル対ノイズ比が高いものであるべきである。したがって、理想的な放射性トレーサーは、高いコントラストレベルを有する画像をトレーサーの投与後に速やかに得ることができるように、その標的に対する高い親和性および特異性、十分な溶解度および安定性、効率的な放射性標識、小さいサイズによって、ならびに血液からの速やかな除去によって特徴付けられる。これは、アテロームプラークの場合に、サイズが小さく、血管内に局在しているため、特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特有のCDR配列を含む、cAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8およびcAbVCAM1-9と呼ばれる4種のナノボディが、驚くべきことにVCAM-1に結合する他のナノボディと異なり、上で定義したすべての特徴を有し、したがって、アテロームプラーク、特に冠動脈アテロームプラークの非侵襲的な医用イメージング用の効率的な放射性トレーサーであったという本発明者らによる発見によっている。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、
a)アミノ酸配列(i)CDR1としてのYTNSIMYMA(配列番号1)、(ii)CDR2としてのAIRFPDDS(配列番号2)および(iii)CDR3としてのRSSPYSFAWNDPSNYNY(配列番号3)、または
b)アミノ酸配列(i)CDR1としてのFTYSSYYMS(配列番号4)、(ii)CDR2としてのGINVDGSN(配列番号5)および(iii)CDR3としてのGSGRDSYDCYSGSWCP(配列番号6)、または
c)アミノ酸配列(i)CDR1としてのFTFSNYYMT(配列番号7)、(ii)CDR2としてのRINSDGS(配列番号8)および(iii)CDR3としてのGKSSV(配列番号9)、または
d)アミノ酸配列(i)CDR1としてのFTFSSYYMS(配列番号10)、(ii)CDR2としてのGINVDGSN(配列番号11)および(iii)CDR3としてのGSGRDSYDCYSGSWCP(配列番号12)
を含むVCAM-1に対するナノボディ
あるいは、それぞれ配列番号1、配列番号2および配列番号3、または配列番号4、配列番号5および配列番号6、または配列番号7、配列番号8および配列番号9、または配列番号10、配列番号11および配列番号12の配列の1つ、2つまたは3つにおける1つまたは2つのアミノ酸の保存的置換を含むa)、b)、c)またはd)で定義されたナノボディの機能的に保存性の変異体である。
【００１０】
本発明はまた、非侵襲的インビボ医用イメージングにおける造影剤として使用するための、診断または予後診断法における使用のための、および薬物として使用するための上で定義したナノボディに関する。
【００１１】
本発明の目的はまた、試料中のVCAM-1のインビトロでの検出のためのこのナノボディの使用である。
【００１２】
最後に、本発明は、このナノボディを、薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
VCAM-1
「VCAM-1」または「血管細胞接着分子1」という用語は、その転写が内皮細胞において誘導されるが、他の細胞型によっても発現される、細胞接着のためのタンパク質を意味する。VCAM-1は、1989年にOsbornら(Osbornら(1989年)、Cell. 59巻、1203〜1211頁)によって発見され、クローニングされた。VCAM-1は、特にリンパ球および単球により構成的に発現されるVLA-4(最晩期抗原4)とも呼ばれるα4β1インテグリンと相互作用する。ICAM-1、2および3などの他の接着分子と同様に、VCAM-1は、アテローム動脈硬化症時の内皮への単球の接着に関与する。VCAM-1はまた、腸にリンパ球を動員するためにα4β7インテグリンと相互作用する。
【００１４】
抗VCAM-1ナノボディ
本発明に関して、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、同じ意味を有し、無差別に用いられる。通常の抗体において、2つの重鎖は、ジスルフィド架橋により互いに結合しており、各重鎖は、ジスルフィド架橋により軽鎖に結合している。2種類の軽鎖、すなわち、ラムダ(λ)およびカッパ(κ)軽鎖が存在する。抗体の機能活性を決定する重鎖の5つの主なクラス(またはアイソタイプ)、すなわち、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEが存在する。各鎖は、異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、2つのドメイン、すなわち、可変ドメイン(VL)および定常ドメイン(CL)を含む。重鎖は、4つのドメイン、すなわち、可変ドメイン(VH)および3つの定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3、CHと総称する)を含む。重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域は、結合の認識および抗原に対する特異性を決定する。軽(CL)および重(CH)鎖の定常領域のドメインは、抗体の鎖の会合、分泌、経胎盤移動度、補体への結合およびFc受容体への結合などの重要な生物学的特性を与える。断片Fvは、軽鎖および重鎖の可変部からなる免疫グロブリンのFab断片のN末端部分である。抗体の特異性は、抗体の結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体の結合部位は、超可変領域または相補性を決定する領域(CDR)に主として由来する残基で構成されている。時折、非超可変領域または「フレームワーク」領域(FR)の残基がドメインの全体的な構造およびしたがって結合部位に影響を与えることがある。
【００１５】
本発明において、「CDR」という用語は、免疫グロブリンの天然結合部位の天然Fv領域の結合親和性および特異性をともに定義する、アミノ酸の配列を意味する。免疫グロブリンの重および軽鎖のそれぞれは、それぞれH-CDR1、H-CDR2、H-CDR3およびL-CDR1、L-CDR2、L-CDR3と呼ばれる3つのCDRを有する。したがって、抗原への結合の部位は、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域のCDRの全部を含む6つのCDRを含む。
【００１６】
抗体またはナノボディの配列におけるCDRの位置の決定は、以前に記載された技術を用いることにより当業者によって行うことができる。一般的に、CDRは、3730XL DNA AnalyzerおよびABI PRISM BigDye Terminator cycなどの適切なシステムにより抗体またはナノボディのDNAの配列を決定し、次に、それにより得られた配列を、国際的ImMunoGeneTicsデータベースまたはIMTG(Lefranc(2003年)、Dev. Comp. Immunol.、27巻、55頁)などの専用データベースにより解析することにより同定することができる。
【００１７】
本発明において、「フレームワーク領域」、「フレームワーク」または「FR」という用語は、CDRの間に挿入されたアミノ酸配列を意味する。
【００１８】
本発明において、「ナノボディ」、「VHH」、「VHH抗体断片」および「単一ドメイン抗体」という用語は、無差別に用いられ、天然で軽鎖を含まない、ラクダ科に見いだされる種類の抗体の単一重鎖の可変ドメインを意味する。軽鎖がないため、ナノボディのそれぞれは、それぞれCDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれる3つのCDRを有する。本発明によるナノボディは、特に、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマまたはアルパカのナノボディであり得る。好ましくは、発明によるナノボディは、ヒトコブラクダのナノボディである。
【００１９】
「VCAM-1に対するナノボディ」とは、ここでVCAM-1に選択的に結合することができるナノボディを意味する。優先的に、ナノボディは、VCAM-1に特異的である。すなわち、それは、他の分子を排除してVCAM-1に結合する。
【００２０】
本発明者らは、他の抗VCAM-1ナノボディが有さない予期しないさらなる特徴を有する、VCAM-1に対する4種のナノボディをより明確に同定した。実際、これらの4種のナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8、cAbVCAM1-9は、ヒトおよびマウスVCAM-1に対して交差反応を有する。それらは、マウスまたはヒトVCAM-1に対する非常に強い親和性を有し、インビボでアテロームプラークにおいて非常に強く結合するが、患者の臓器におけるバックグラウンドノイズの誘発を伴わない。
【００２１】
これらの4種のナノボディは、以下のように配列が決定された。
-  ナノボディcAbVCAM1-5は、アミノ酸配列
QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTNSIMYMAWFRQAPGKKREGVAAIRFPDDSAYYAGSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNNLNPEDTAMYYCAARSSPYSFAWNDPSNYNYWGQGTQVTVSS (配列番号13)、を有する。
-  ナノボディcAbVCAM1-3は、アミノ酸配列cAbVCAM1-3
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTYSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINVDGSNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYYCATGSGRDSYDCYSGSWCPKGQGTQVTVSS (配列番号14)、を有する。
-  ナノボディcAbVCAM1-8は、アミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMTWVRRAPGKGLEWVSRINSDGSTLYLPSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTGWYYCVEGKSSVRGQGTQVTVSS (配列番号15)、を有する。
-  ナノボディcAbVCAM1-9は、アミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINVDGSNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYYCATGSGRDSYDCYSGSWCPKGQGTQVTVSS (配列番号16)。を有する。
【００２２】
これらの4種のナノボディのCDRは、より明確に配列が決定され、以下の通りである。
●cAbVCAM1-5
○CDR1: YTNSIMYMA (配列番号1)
○CDR2: AIRFPDDS (配列番号2)
○CDR3: RSSPYSFAWNDPSNYNY (配列番号3)
●cAbVCAM1-3
○CDR1: FTYSSYYMS (配列番号4)
○CDR2: GINVDGSN (配列番号5)
○CDR3: GSGRDSYDCYSGSWCP (配列番号6)
●cAbVCAM1-8
○CDR1: FTFSNYYMT (配列番号7)
○CDR2: RINSDGS (配列番号8)
○CDR3: GKSSV (配列番号9)
●cAbVCAM1-9
○CDR1: FTFSSYYMS (配列番号10)
○CDR2: GINVDGSN (配列番号11)
○CDR3: GSGRDSYDCYSGSWCP (配列番号12)
【００２３】
これは、当業者に周知であるので、CDR1、CDR2およびCDR3の組合せは、抗原に対する結合の部位を定義するのに十分である。したがって、本発明の目的は、
a)アミノ酸配列(i)CDR1としての配列番号1、(ii)CDR2としての配列番号2および(iii)CDR3としての配列番号3、または
b)アミノ酸配列(i)CDR1としての配列番号4、(ii)CDR2としての配列番号5および(iii)CDR3としての配列番号6、または
c)アミノ酸配列(i)CDR1としての配列番号7、(ii)CDR2としての配列番号8および(iii)CDR3としての配列番号9、または
d)アミノ酸配列(i)CDR1としての配列番号10、(ii)CDR2としての配列番号11および(iii)CDR3としての配列番号12
を含むVCAM-1に対するナノボディ
あるいは、それぞれ配列番号1、配列番号2および配列番号3、または配列番号4、配列番号5および配列番号6、または配列番号7、配列番号8および配列番号9、または配列番号10、配列番号11および配列番号12の配列の1つ、2つまたは3つにおける1つまたは2つのアミノ酸の保存的置換を含むa)、b)、c)またはd)で定義されたナノボディの機能的に保存性の変異体に関する。
【００２４】
本発明者らは、これらのナノボディの「フレームワーク」領域(FR)の配列決定も行った。対応する配列は、以下の通りである。
●cAbVCAM1-5
○Region FR1: QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASG (配列番号17)
○Region FR2: WFRQAPGKKREGVA (配列番号18)
○Region FR3: AYYAGSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNNLNPEDTAMYYCAA (配列番号19)
○Region FR4: WGQGTQVTVSS (配列番号20)
●cAbVCAM1-3
○Region FR1: QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASG (配列番号21)
○Region FR2: WVRQAPGKGLEWVS (配列番号22)
○Region FR3: TYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYYCAT (配列番号23)
○Region FR4: KGQGTQVTVSS (配列番号24)
●cAbVCAM1-8
○Region FR1: QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (配列番号25)
○Region FR2: WVRRAPGKGLEWVS (配列番号26)
○Region FR3: TLYLPSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTGWYYCVE (配列番号27)
○Region FR4: RGQGTQVTVSS (配列番号28)
●cAbVCAM1-9
○Region FR1: QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (配列番号29)
○Region FR2: WVRQAPGKGLEWVS (配列番号30)
○Region FR3: TYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYYCAT (配列番号31)
○Region FR4: KGQGTQVTVSS (配列番号32)
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、本発明者らにより同定されたナノボディの1つの、上で定義した配列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の連鎖を含むまたはからなるナノボディに関する。
【００２６】
好ましくは、本発明によるナノボディは、したがって、配列番号13、配列番号14、配列番号15および配列番号16のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸の配列、あるいはそれぞれ配列番号13、配列番号14、配列番号15または配列番号16のアミノ酸の配列に含まれるCDRの1つ、2つまたは3つにおける1つまたは2つのアミノ酸の保存的置換を含む後者の機能的に保存性の変異体を含むまたはからなるナノボディである。上で定義した機能的に保存性の変異体は、「フレームワーク」領域、特に上で定義した「フレームワーク」領域などのCDRでないそれぞれ配列番号13、配列番号14、配列番号15または配列番号16のアミノ酸配列の領域における1つまたはいくつかの置換、特に1つまたはいくつかの保存的置換をさらに含み得る。より好ましくは、本発明によるナノボディは、配列番号13、配列番号14、配列番号15および配列番号16のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含むまたはからなるナノボディである。好ましくは、とりわけ、本発明によるナノボディは、配列番号13のアミノ酸配列を含むまたはからなるナノボディである。
【００２７】
本発明に関連して、「機能的に保存性の変異体」という表現は、本発明によるナノボディにおける所定のアミノ酸が、ナノボディの全体的な立体配座および機能の変化を伴わずに置換されている、類似の特性(例えば、極性、水素結合能、酸性度、塩基性度、疎水性、芳香族基の存在等)を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを含む、変異体を意味する。類似の特性を有するアミノ酸は、当業者に周知であり、例えば、親水性塩基性アミノ酸のアルギニン、ヒスチジンおよびリシンであり、置き換え可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンにより置き換えることができる。そのような変化は、ナノボディの見かけの分子量または等電点に全くまたはほとんど影響を及ぼさないはずである。天然アミノ酸は、D立体配置のアミノ酸、ベータまたはガンマアミノ酸などの非天然アミノ酸により置き換えることができる。
【００２８】
保存的置換の例を下のTable 1(表1)に示す。
【００２９】
【表１】
2014527797.tif 000003
【００３０】
あるいは、保存アミノ酸は、下のTable 2(表2)に示すように、Lehninger(1975年、Biochemistry、2nd Edition、Worth Publishers, Inc. New-York: NY.、71〜77頁)に記載されている通りに分類することができる。
【００３１】
【表２】
2014527797.tif 000004
【００３２】
他の代替によれば、保存的置換の例を下のTable 3(表3)に示す。
【００３３】
【表３】
2014527797.tif 000005
【００３４】
これらの機能的に保存性の変異体は、VCAM-1に結合するそれらの能力を維持している。優先的には、これらの機能的に保存性の変異体は、対応するナノボディに比較して等しいまたは高いVCAM-1との結合親和性を有する。
【００３５】
対象のナノボディのアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、本発明によるナノボディ、特に上で定義したナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8およびcAbVCAM1-9を、ポリペプチドを製造する従来の技術により製造することができる。例えば、それらは、固相における周知の合成法(Merrifield(19962)、Proc. Soc. Ex. Boil.、21巻、412頁、Merrifield(1963年)、J. Am. Chem. Soc.、85巻、2149頁、Tamら(1983年)、J. Am. Chem. Soc.、105巻、6442頁)を用いることにより、好ましくは市販のペプチド合成装置(Applied Biosystems、Foster City、Californiaにより製造されたものなど)、かつ製造業者の指示に従うことにより合成することができる。
【００３６】
あるいは、本発明によるナノボディは、当業者に周知の組換えDNA技術により合成することができる(Maniatisら(1982年)、Molecular Cloning: a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratories、NY、51〜54頁および412〜430頁)。例えば、それらは、対象のポリペプチドをコードするDNA配列を発現ベクターに組み込み、これらのベクターを対象のポリペプチドを発現する適切な原核生物または真核生物宿主に導入した後にDNA発現産物として得ることができ、それからそれらを当業者に周知の技術を用いることにより単離することができる。これは当業者に周知であるので、タンパク質を組換えDNA技術により合成する場合、それを一般的に合成し、その精製を促進する標識と結合させる。そのような標識は、当業者に周知であり、例えば、ヘキサヒスチジン(6His)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)を含む。好ましくは、本発明によるナノボディは、ヘキサヒスチジン標識を含む。したがって、本発明の目的はまた、それらのC末端またはN末端、好ましくはそれらのC末端に6つのヒスチジン残基をさらに含む、配列番号13、配列番号14、配列番号15および配列番号16の配列によって構成される群から選択されるアミノ酸の配列を含むまたはからなるナノボディによって構成される。したがって、配列番号33、配列番号34、配列番号35および配列番号36の配列によって構成される群から選択されるアミノ酸の配列を含むまたはからなるナノボディも本発明の一部である。
【００３７】
本発明の他の目的は、本発明によるナノボディをコードする核酸配列を含む核酸に関する。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明による核酸は、アミノ酸配列番号13、配列番号14、配列番号15または配列番号16の配列の1つにより定義されるナノボディをコードする核酸配列を含むまたはからなる。好ましくは、本発明による核酸は、アミノ酸配列番号13の配列により定義されるナノボディをコードする核酸配列を含むまたはからなる。
【００３９】
一般的に、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの適切なベクターに含めることができる、DNAまたはRNA分子である。
【００４０】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換させ、導入された配列の発現(例えば、転写および翻訳)を促進するために、DNAまたはRNA配列を宿主細胞に導入することができる担体を意味する。
【００４１】
したがって、本発明の他の目的は、本発明による核酸を含むベクターに関する。
【００４２】
そのようなベクターは、ポリペプチドの発現をもたらすまたは方向付けるためのプロモーター、アクチベーター、ターミネーター等などの調節エレメントを含み得る。動物細胞用の発現ベクターに用いられるプロモーターおよびアクチベーターの例は、SV40の初期プロモーターおよびアクチベーター(Mizukamiら(1987年)、J. Biochem.、101巻、1307〜1310頁)、Moloneyマウスの白血病ウイルスのプロモーターLTRおよびアクチベーター、免疫グロブリン鎖のプロモーター(Masonら(1985年)、Cell、41巻、479〜487頁)およびアクチベーター(Gilliesら(1983年)、Cell、33巻、717〜728頁)等を含む。
【００４３】
動物細胞用の発現ベクターを用いることができる。適切なベクターの例は、pAGE107(Miyajiら(1990年)、Cytotechnology、3巻、133〜140頁)、pAGE103(Mizukamiら(1987年)、J. Biochem.、101巻、1307〜1310頁)、pHSG274(Bradyら(1984年)、Gene、27巻、223〜232頁)、pKCR(O'Hareら(1981年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78巻、1527〜1531頁)、pSG1ベータd2-4(Miyajiら(1990年)、Cytotechnology、3巻、133〜140頁)等を含む。
【００４４】
プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミドまたは例えば、pUC、pcDNA、pBRなどの組込みプラスミド等を含む。
【００４５】
ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスおよびAAVのそれを含む。そのような組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクションによるまたは補助プラスミドもしくはウイルスによる一過性トランスフェクションによるなどの当業者に周知の技術により作製することができる。ウイルスパッケージング細胞の一般的な例は、PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞、293細胞等を含む。それらの複製のためのそのような欠失組換えウイルスを作製する詳細な手順は、例えば、WO95/14785、WO96/22378、US5,882,887、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056およびWO94/19478に見いだすことができる。
【００４６】
本発明の他の目的は、本発明による核酸および/またはベクターによりトランスフェクトされ、感染され、または形質転換された細胞に関する。
【００４７】
「形質転換」という用語は、宿主細胞が、対象の物質、一般的に遺伝子または導入された配列によりコードされるタンパク質を産生するために遺伝子または導入された配列を発現するための、宿主細胞への遺伝子または「外来」(すなわち、外因性もしくは細胞外)RNAもしくはDNA配列の導入を意味する。導入されたDNAもしくはRNAを受け入れ、発現する宿主細胞は、「形質転換」された。
【００４８】
本発明による核酸は、適切な発現システムにおいて本発明によるナノボディを生産するために用いることができる。「発現システム」という用語は、例えば、ベクターにより運ばれ、宿主細胞に導入された外来DNAによりコードされるタンパク質の発現のための適切な条件下の宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
【００４９】
通常の発現システムは、大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルス(Baculovirus)ベクターならびに哺乳動物宿主細胞およびそれらのベクターを含む。宿主細胞の他の例は、原核生物細胞(細菌など)および真核生物細胞(酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等)を含む。特定の例は、大腸菌、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)またはサッカロミセス属(Saccharomyces)酵母、哺乳動物細胞株(例えば、Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞等)ならびに初代哺乳動物または樹立培養の細胞培養物(例えば、リンパ芽球、繊維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生された)を含む。例はまた、マウスのSP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、マウスのP3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子が不完全であるCHO細胞、ラットのYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662)等を含む。
【００５０】
本発明はまた、本発明によるナノボディを発現する組換え宿主細胞を作製する方法に関し、前記方法は、(i)上述のような核酸または組換えベクターをインビトロまたはエクスビボでコンピテント宿主細胞に導入するステップ、(ii)得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養するステップおよび(iii)前記ナノボディを発現する、かつ/または分泌する細胞を場合によって選択するステップからなるステップを含む。そのような組換え宿主細胞は、本発明によるナノボディを生産するために用いることができる。
【００５１】
本発明によるナノボディは、例えば、化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的手法などの、単独または組合せとしての当業者に公知の手法により生産することができる。
【００５２】
特に、本発明はさらに、本発明によるナノボディを生産する方法に関し、前記方法は、(i)前記ナノボディの発現を可能にするための適切な条件下で本発明による形質転換宿主細胞を培養するステップおよび(ii)発現ナノボディを回収するステップからなるステップを含む。
【００５３】
本発明によるナノボディは、例えば、A-セファロースタンパク質、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル上電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの免疫グロブリンを精製するための通常の方法により培地から適切に分離することができる。
【００５４】
標識ナノボディ
本発明によるナノボディは、医用イメージングに特に有用である。これに関連して、ナノボディを検出可能なマーカーと結合させることは、特に興味深い。本発明者らは、ナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8、およびcAbVCAM1-9が、検出可能なマーカー、特にテクネチウム99mなどの放射性核種と結合させた場合にそれらの特性を保持していたことを示した。
【００５５】
したがって、本発明はまた、検出可能なマーカーと結合させた上で定義したナノボディに関する。
【００５６】
「検出可能なマーカーと結合させたナノボディ」とは、ここで検出可能なマーカーが間接的もしくは直接的にナノボディに結合している、またはナノボディに組み込まれていることを意味する。検出可能なマーカーは、特に、置換(例えば、チロシン残基におけるHをIで置換することにより)により、錯体化またはキレート化によりナノボディに結合させることができる。
【００５７】
「検出可能なマーカー」とは、ここで検出可能なシグナルを生ずる化合物を意味する。それをトレーサーと結合させた場合、それは、生物におけるトレーサーの結末を追跡する可能性をもたらす。検出可能なマーカーは、MRI造影剤、シンチグラフィー造影剤、X線イメージング造影剤、超音波造影剤、光イメージング造影剤であり得る。検出可能なマーカーの例は、放射性核種、フルオレセイン、アレクサ(Alexa)、シアニンなどの発蛍光団、ルミノールなどの化学発光化合物、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼなどの生物発光化合物およびナノ粒子またはガドリニウムなどの造影剤を含む。用いられる検出システムに依存する、適切な検出可能なマーカーの選択は、当業者の実行可能な範囲にある。例として、検出システムがMRIである場合、検出可能なマーカーは、好ましくは酸化鉄またはガドリニウムのナノ粒子であり、検出システムが蛍光によるイメージングである場合、検出可能なマーカーは、好ましくはフルオレセイン、アレクサまたはシアニンであり、検出システムが化学発光によるイメージングである場合、検出可能なマーカーは、好ましくはルミノールであり、検出システムが生物発光によるイメージングである場合、検出可能なマーカーは、好ましくはルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼであり、検出システムが核イメージングである場合、検出可能なマーカーは、好ましくはTEPイメージング用のフッ素18(18F)またはSPECTイメージング用のテクネチウム99m(99mTc)などの放射性核種である。
【００５８】
好ましくは、検出可能なマーカーは、放射性核種である。核イメージング技術に特に用いられる放射性核種の例は、テクネチウム99m(99mTc)、ヨウ素123(123I)、ヨウ素125(125I)、インジウム111(111In)、フッ素18(18F)、ガリウム67(67Ga)、ガリウム68(68Ga)、銅64(64Cu)およびヒトに使用することができる他の放射性核種を含む。したがって、好ましくは、放射性核種は、99mTc、123I、125I、111In、18F、64Cu、67Gaおよび68Gaからなる群から選択される。好ましくは、とりわけ、放射性核種は、99mTcである。
【００５９】
造影剤としての使用
本発明者らは、ナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8、およびcAbVCAM1-9がアテロームプラーク、特に大動脈プラークの特異的トレーサーを形成し、イメージングによるその検出を可能にすることを示した。
【００６０】
したがって、本発明は、上で定義したナノボディを医用イメージング、特にインビボでの非侵襲的医用イメージングにおける造影剤としてのその使用に推すものである。
【００６１】
本発明はまた、医用イメージング、特にインビボでの非侵襲的医用イメージングに有用な造影剤を製造するための上で定義したナノボディの使用に関する。
【００６２】
「造影剤」とは、ここで、生物に投与され、造影剤を用いない場合に医用イメージングにおいて可視でないまたは全く可視でない、臓器または構造(組織、細胞、受容体)を検出できる方法でマーキングする可能性をもたらす物質または組成物を意味する。拡張して、「造影剤」という表現は、上で定義したマーカーと結合させたトレーサーを表すために用いる。
【００６３】
本発明において、「イメージング法」は、生物または生物の臓器の内部を見る可能性をもたらす方法を意味する。イメージング法の例は、冠動脈内エコー検査などの侵襲的技術、ならびに磁気共鳴イメージング、X線イメージング、エコー検査、光イメージングなどの非侵襲的技術、またはシンチグラフィー、特に単一光子放出断層撮影(SPECT)および陽電子放射断層撮影(PET)などの核医学を含む。好ましくは、本発明によるイメージング法は、シンチグラフィー、特にSPECTまたはPETシンチグラフィーである。
【００６４】
シンチグラフィーは、放射性核種でマーキングされたトレーサーからなる放射性医薬品とも呼ばれる造影剤の投与(一般的に静脈内経路による)に基づいている。放射されたガンマまたはベータ線を検出することにより、生物におけるこの造影剤の具体的な位置の測定を確定する。
【００６５】
単一光子放出断層撮影および陽電子放射断層撮影は、シンチグラフィーに基づくものであり、患者の周りを回転する一連のカメラにより臓器およびそれらの代謝の三次元の画像および再構成をもたらす可能性を与える断層撮影核医学イメージング技術である。
【００６６】
本発明はまた、上で定義したナノボディを患者に投与する、医用イメージング法、特に、インビボでの非侵襲的医用イメージングに関する。本発明による医用イメージング法は、患者の身体部位におけるナノボディの結合または結合の非存在を検出するステップおよびナノボディの結合を検出することができる患者の身体部位を見るステップをさらに含むことができる。
【００６７】
本発明において、「患者」は、ヒトまたはげっ歯類(ラット、マウス、ウサギ)、霊長類の動物(チンパンジー)、ネコ科の動物(ネコ)、イヌ科の動物(イヌ)などの非ヒト哺乳動物を意味する。好ましくは、個体はヒトである。
【００６８】
当業者に公知である、投与方法は、本発明によるナノボディを患者に投与するために用いることができる。特に、ナノボディは、例えば、経口的に、吸入によりまたは非経口経路(特に静脈内注射により)により投与することができる。非経口経路を選択する場合、ナノボディは、アンプルまたはフラスコに包装された、注射可能な溶液および懸濁液の形態であり得る。非経口投与剤形は、常法によって、本発明によるナノボディを緩衝液、安定剤、保存剤、可溶化剤、等張剤および懸濁化剤と混合することによって得られる。公知の技術により、これらの混合物を静脈注射剤として滅菌または包装することができる。当業者は、例えば、緩衝剤としてのリン酸塩に基づく緩衝液を用いることができる。懸濁化剤の例としては、メチルセルロース、アラビアゴムおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどがある。安定剤の例としては、亜硫酸ナトリウムおよびメタ亜硫酸ナトリウムなどがあり、保存剤の例としては、p-ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾールおよびクロロクレゾールなどがある。
【００６９】
ナノボディの投与量は、投与経路、患者の体格および/または体重ならびに用いられる検出技術に当然依存する。
【００７０】
本発明において、「身体部位」という用語は、生物の所定の部位を意味する。これは、例えば、肺、心臓、肝臓、脾臓もしくは腎臓などの臓器、臓器もしくは組織の一部、または動脈もしくは静脈、特に大動脈もしくは冠動脈などの血管であり得る。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明によるナノボディを、患者におけるアテローム性動脈硬化巣、特に大動脈、頸動脈または冠動脈アテローム性動脈硬化巣を見るための医用イメージングにおける造影剤として用いる。
【００７２】
本発明において、「アテローム動脈硬化性プラーク(atherosclerotic plaque)」、「アテローム動脈硬化症プラーク(atherosclerosis plaque)」および「アテロームプラーク」という用語は、無差別に用いられ、血管の壁の病変を意味する。好ましくは、アテローム動脈硬化性プラークは、脂質コアおよび線維性皮膜を含み、皮膜は、平滑筋細胞、コラーゲンおよび細胞外マトリックスからなり、脂質コアを動脈内腔から隔離している。アテローム動脈硬化性プラークは、例えば、大動脈、頸動脈または冠動脈に見いだすことができる。プラークが薄い線維性皮膜(約65〜150μmの厚さを有する)および大きい脂質コアを含む場合、それは、「易破綻性プラーク」または「不安定プラーク」と呼ばれる。破綻する傾向がある、これらの不安定プラークは、冠動脈ならびに大動脈およびその枝において遭遇される。易破綻性冠動脈プラークの破綻は、「急性冠動脈症候群」を引き起こす。完全閉塞性血栓症の場合、これは、心筋梗塞である。動脈の血栓症が不完全のままである場合、これは、不安定狭心症である。頸動脈では、易破綻性プラークは、より狭窄性であり、さほど炎症性でない。それらは、VCAM-1も発現する。
【００７３】
好ましくは、本発明によるナノボディを、易破綻性アテローム動脈硬化性プラーク、特に大動脈または冠動脈の易破綻性プラークを見るための医用イメージングにおける造影剤として用いる。
【００７４】
診断における使用
アテロームプラークの出現は、それ自体が心血管疾患であり、様々な心血管合併症を発生させ得るアテローム動脈硬化症の徴候である。したがって、アテロームプラークの検出は、心血管疾患の特徴付けである。他方で、イメージングによる発達、すなわち、事前に同定されたアテロームプラークの進行または退縮を追跡調査する可能性は、心血管疾患が診断された患者における治療処置の有効性を評価する方法である。
【００７５】
したがって、本発明は、診断および予後予測法における使用のための上で定義したナノボディに関する。
【００７６】
「診断法」または「診断」とは、ここで個人に病態があるかどうかを判断する可能性をもたらす方法を意味する。
【００７７】
「予後診断法」または「予後診断(prognosis)」とは、ここで個人が病態を発現するリスクがあるかどうかを判断する可能性をもたらす方法を意味する。
【００７８】
好ましくは、上で定義したナノボディを心血管疾患の診断に用いる。
【００７９】
本発明において、「心血管疾患」とは、心血管系を冒すアテローム形成過程に関連する疾患、病変または症状を意味する。これは、特に、アテロームプラークの発達(プラークは、国際Stary分類に従って進行度I〜VIで分類される)を特徴付ける状態、ならびにアテロームプラークの形成に起因する合併症(狭窄、虚血)および/または急性虚血事象(血栓症、塞栓症、梗塞、動脈破綻)への進展を含む。心血管疾患は、例えば、アテローム動脈硬化症、アテロームプラーク、特に、易破綻性プラーク、冠疾患、狭心症、血栓症、脳血管事象、心筋梗塞、血管狭窄、梗塞を意味する。好ましくは、本発明によるナノボディをアテローム動脈硬化症または冠疾患を診断するために用いる。
【００８０】
「アテローム動脈硬化症」とは、ここで動脈血管を冒す疾患を意味する。アテローム動脈硬化症は、主としてマクロファージの蓄積に起因し、低密度リポタンパク質によって促進される、動脈の壁における慢性炎症反応によって特徴付けることができる。
【００８１】
「冠疾患」は、心血管疾患の最も一般に知られている徴候である。それは、冠動脈または複数の冠動脈の収縮(狭窄)または石灰化(硬化)に引き続く、心筋の不十分な潅流に起因する、進行性疾患である。冠疾患の主な症状は、狭心症(angina pectoris)とも呼ばれる、狭心症(安定狭心症又は不安定狭心症)を構成する疼痛と自己表現する。冠動脈または複数の冠動脈の完全閉塞は、梗塞につながる。
【００８２】
「梗塞」は、動脈閉塞に起因する壊死の限局性中心を意味する。より具体的には、心筋梗塞は、血小板凝集と次に冠動脈閉塞を引き起こすプラーク破綻(一般的に易破綻性プラーク)に二次的な、急性冠動脈血栓症に一般的に起因する心筋の壊死である。
【００８３】
冠動脈アテロームプラークの存在は、特にこれが不安定プラークの場合、対象を急性虚血発作、特に、心筋梗塞のリスクに曝す。したがって、本発明によるナノボディは、急性虚血発作の発生のリスク、特に、患者における心筋梗塞の発生のリスクを検出するために用いることができる。
【００８４】
「発生のリスク」とは、ここで個人が病態を発現する,確率を意味する。
【００８５】
「急性虚血発作」は、生物の体内の動脈血の供給の減少を意味する。その主な局所的原因は、血栓症および塞栓症である。
【００８６】
「血栓症」は、血栓の形成をもたらす血管腔(動脈、静脈、毛細血管または心腔)における血液の凝固に対応する。
【００８７】
「塞栓症」は、最もしばしば凝血塊(血栓)からなる異物の移動、および内径がそれを通過させるのに不十分である血管内でのその突然の停止である。塞栓症の局所的結果は、最もしばしば梗塞につながる、血管閉塞に関連する循環撹乱である。
【００８８】
アテロームプラークは、頸動脈にも局在し得る。これらの病変は、脳出血性(動脈瘤破裂)または虚血性(脳梗塞)血管事象をもたらす。したがって、本発明によるナノボディは、患者における脳血管発作の発生のリスクを検出するために用いることができる。
【００８９】
これはさらに、腎動脈に局在するアテロームプラークであり得、腎臓は、アテローム動脈硬化症の標的臓器の1つである。顕著な狭窄は、動脈高血圧および/または腎不全をもたらし得る。腎動脈のアテローム性疾患も急性血管事象である腎塞栓症につながり得る。したがって、本発明によるナノボディは、患者における腎塞栓症の発生のリスクを検出するためにも用いることができる。
【００９０】
アテロームプラークは、下肢の動脈(肢の急性虚血のリスク)または大動脈(動脈瘤の破裂/大動脈解離のリスク)に局在し得る。したがって、本発明によるナノボディは、患者における肢の虚血または動脈瘤の破裂の発生のリスクを検出するために用いることができる。
【００９１】
したがって、上で定義したナノボディは、好ましくは、心筋梗塞、脳血管発作、腎動脈塞栓症および肢の急性虚血事象からなる群から選択される急性虚血事象の発生のリスクを検出するために用いる。
【００９２】
本発明はまた、患者における心血管疾患を診断し、かつ/または急性虚血事象の発生のリスクを検出するための方法、特にインビトロでの方法に関し、前記方法は、上で定義したナノボディを前記患者に投与するステップおよび前記患者の生体(organism)における前記ナノボディを検出するステップからなるステップを含み、心血管系における前記ナノボディの選択的局在(preferential localization)の検出が、心血管疾患および/または急性虚血事象の発生のリスクの指標である。
【００９３】
「選択的局在」とは、心血管系におけるナノボディの検出量が生物におけるナノボディの非特異的局在に対応するバックグラウンドノイズよりも大きいことを意味する。
【００９４】
本発明はまた、心血管疾患が診断された対象における心血管疾患の治療的モニタリングにおける使用のための上で定義したナノボディに関する。
【００９５】
それはまた、心血管疾患が診断された対象における心血管疾患の治療的経過観察に有用な造影剤を製造するための上で定義したナノボディの使用に関する。
【００９６】
「治療的経過観察」とは、ここで、彼/彼女に施される治療への対象の反応の観察を意味する。治療の治療効果は、一般的に疾患の進行の減速または抑制を、疾患の、またはこの疾患に関連する1つもしくはいくつかの症状の逆転を伴う。逆に、治療効果の欠如は、安定性によって、あるいは疾患または1つもしくはいくつかのその症状の進行の加速によっても表現することができる。
【００９７】
例えば、本発明の意味における心血管疾患がアテロームプラークである場合、治療的経過観察は、アテロームプラークの消失、退縮、維持または成長を観察することによって行うことができる。したがって、本発明による使用は、
a)アテロームプラークが検出された対象に上で定義したナノボディを投与するステップと、
b)前記アテロームプラークにおけるナノボディとの結合を検出するステップと、
c)前記対象に治療を施す前と後にステップa)およびb)を反復するステップと
からなるステップを含むことができ、
前記プラークにおけるナノボディの結合の欠如または減少が治療効果を有する治療の指標である。
【００９８】
薬物としての使用
本発明はさらに、薬物、特に、心血管疾患を治療することを目的とする薬物を製造するための上で定義したナノボディの使用に関する。それを必要とする患者への治療上有効量の上で定義したナノボディの投与を含む治療方法も本発明の一部である。
【００９９】
単独またはアテロームプラークの安定剤と結合させたVCAM-1リガンドの使用は、プラークの破綻の確率の低減を実際に可能にする。
【０１００】
心血管疾患の「治療」とは、特に破綻性アテローム動脈硬化症プラークのステージへのアテローム動脈硬化症プラークの進展を減速もしくは抑制すること、またはアテローム動脈硬化症プラーク、特に破綻性プラークの退縮を含む、心血管疾患の「治療処置」(または根治的処置)を意味する。特に急性虚血発作の予防を含む心血管疾患の「予防処置」も意味する。
【０１０１】
本発明によるナノボディは、安定剤を病変と接触させるように、アテロームプラークの安定剤と有利に結合させる。適切な安定剤の選択は、当業者の実行可能な範囲にある。安定剤の例としては、特に非ステロイド抗炎症薬などの抗炎症分子などがある。
【０１０２】
本発明は、より詳細には、アテローム動脈硬化症の治療および/または急性虚血発作の予防のための、好ましくは易破綻性アテローム動脈硬化性プラークを治療するために使用するための上で定義したナノボディに関する。
【０１０３】
本発明はまた、アテローム動脈硬化症を治療することおよび/または心血管疾患を有する可能性がある患者における急性虚血発作を予防することを目的とする薬物を製造するための上で定義したナノボディの使用に関する。
【０１０４】
本発明はまた、それを必要とする患者への治療上有効量の上で定義したナノボディの投与を含む、それを必要とする患者におけるアテローム動脈硬化症を治療し、かつ/または急性虚血発作を予防する方法に関する。
【０１０５】
優先的には、本発明によるナノボディは、易破綻性アテロームプラーク、さらに好ましくは易破綻性冠動脈または大動脈アテロームプラークを治療するために用いる。
【０１０６】
優先的には、前記急性虚血発作は、心筋梗塞、脳血管発作、腎塞栓症、肢の急性虚血および大動脈瘤破裂からなる群から選択される。
【０１０７】
本発明によるナノボディは、例えば、適切な形態で、経口的に、吸入により、非経口経路により(例えば、静脈内注射により)投与することができる。非経口経路を考える場合、ナノボディは、アンプルまたはフラスコに包装された注射可能な溶液および懸濁液の形態であり得る。非経口投与用の剤形は、常法によって、ナノボディを緩衝液、安定剤、保存剤、可溶化剤、等張剤および懸濁化剤と混合することによって得られる。公知の技術により、これらの混合物を滅菌し、静脈注射剤の形態で包装する。緩衝液として、当業者は、有機リン酸塩に基づく緩衝液を用いることができ、懸濁化剤の例は、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。さらに、本発明による有用な安定剤は、亜硫酸ナトリウムおよびメタ亜硫酸ナトリウムであるが、p-ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾールおよびクロロクレゾールを保存剤として挙げることができる。
【０１０８】
ナノボディの投与量は、投与方法、患者の体格および/または体重ならびにそれと関連させることができる細胞毒性薬の性質に当然依存する。
【０１０９】
本発明はまた、上で定義したナノボディを、薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物に関する。
【０１１０】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、特にヒトに投与したとき、二次性、アレルギー性または他の不幸な反応をもたらさない分子実体および組成物を意味する。
【０１１１】
本発明において、「薬学的に許容される担体」という表現は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌もしくは抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質用のそのような媒体および薬剤の使用は、当業者に周知である。通常の媒体または薬剤が有効成分と不適合性である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が考えられる。さらなる有効成分も組成物に組み込むことができる。
【０１１２】
インビトロでVCAM-1を検出するための使用
本発明はまた、試料中のVCAM-1のインビトロでの検出のための上で定義したナノボディの使用に関する。
【０１１３】
「試料」とは、ここでより大きい要素の一部を意味する。好ましくは、試料は、生体起源の物質である。生体試料の例は、腎臓、肝臓、心臓、肺等、動脈、静脈などの臓器または組織の一部、血漿、血小板、血球の亜集団等などの血液およびその複合物を含むが、それらに限定されない。
【０１１４】
本発明を以下の図および実施例によってより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】非処理bEND5マウス細胞(点線)またはTNFαで処理した同細胞(実線)上の抗VCAM-1ナノボディ(cAbVCAM1-1: 1; cAbVCAM1-2: 2; cAbVCAM1-3: 3; cAbVCAM1-4: 4; cAbVCAM1-5: 5; cAbVCAM1-6: 6; cAbVCAM1-7: 7; cAbVCAM1-8: 8; cAbVCAM1-9: 9およびcAbVCAM1-10: 10)のフローサイトメトリー分析を示す図である。PE(Ct+)でマーキングしたマウス抗VCAM-1モノクローナル抗体を陽性対照として用い、ナノボディcAbBcII10(Ct-)を負の対照として用いた。
【図２】非処理のbEND5細胞(白色バー)、TNFαで処理した同細胞(したがってVCAM-1を発現する;黒色バー)またはTNFαで処理し、非標識の過剰の抗VCAM-1ナノボディとともにインキュベートした同細胞(灰色バー)への99mTcで標識した抗VCAM-1ナノボディ(cAbVCAM1-1: 1; cAbVCAM1-2: 2; cAbVCAM1-3: 3; cAbVCAM1-4: 4; cAbVCAM1-5: 5; cAbVCAM1-6: 6; cAbVCAM1-7: 7; cAbVCAM1-8: 8; cAbVCAM1-9: 9およびcAbVCAM1-10: 10)の正規化した結合を示すヒストグラムを示す図である。*:P<0.05対99mTc-AbBcII10、†:P<0.05対TNFαで処理し、過剰の非標識抗VCAM-1ナノボディとともにインキュベート
【図３】抗VCAM-1ナノボディでマーキングされた、C57Bl/6J対照マウスおよびApoE-/-マウスの心臓(C)、筋肉(M)、唾液腺(GS)試料、骨髄(MO)、リンパ神経節(GL)、脾臓(R)および胸腺(T)の試料を含むリンパ組織の試料、ならびに大動脈試料(A)における免疫組織化学検査の結果(VCAM-1)を示す図である。結果の特異性は、一次抗体(ct)の非存在下におけるマーキングの非存在により示される。スケールバーは、100μmを表す大動脈(A)の場合を除いて、20μmを表す。
【図４】C57Bl/6J対照マウスの大動脈(白色バー)および病変の拡大指標(extension index)に従って順序付けしたApoE-/-動脈セグメント(+++:黒色バー;++:斜線でハッチングしたバー;+:垂直線でハッチングしたバー;-:ドット付きバー)におけるナノボディcAbVCAM1-5および対照ナノボディcAbBcII10の大動脈吸収(%ID/g単位)を示すヒストグラムを示す図である。結果は、平均値±平均値の標準誤差で表す。*:P<0.05対C57Bl/6J、†:P<0.05対次の病変の拡大指標
【図５】ナノボディcAbVCAM1-5および対照ナノボディcAbBcII10を用いてオートラジオグラムの定量により得られた病変対対照比を示すヒストグラムを示す図である。*:P<0.05対cAbBcII10。VCAM-1をさらに免疫標識した、隣接するスライド上の99mTc-cAbVCAM1-5および99mTc-cAbBcII10を用いて得られた代表的オートラジオグラム(ARG)(VCAM-1)も図の右上に示す。スケールバーは200μmを表す。
【図６】ナノボディが放射性識標後0時間目(A)および6時間目(B)にインビトロで、ならびに注射後3時間目(C)に血液中インビボで安定であることを示す99mTc-cAbVCAM1-5ナノボディのHPLCプロファイルを示す図である。
【図７】C57Bl/6Jマウスにおける静脈内注射後3時間目のインビボでのSPECT/CTにより全身において得られた99mTc-cAbBcII10(A)および99mTc-cAbVCAM1-5(B)対照ナノボディの最大強度投射(MIP)の画像を示す図である。膀胱(V)、腎臓(Re)、リンパ神経節(GL)、骨髄(MO)、胸腺(T)および脾臓(Ra)が示されている。
【図８】ナノボディ99mTc-cAbBcII10(cAbBcII10)または99mTc-cAbVCAM1-5(cAbVCAM1-5)を注射した後3時間目にC57Bl/6Jマウスの大動脈弓において撮影したインビボでのCT、SPECTおよびマージド(merging)SPECT/CTイメージングにおける代表的冠動脈像を示す図である。SPECT画像のスケールは、直接比較を可能にするように1〜3.4%の注射量に調整した。腋下リンパ神経節(In)、胸腺(t)がSPECT/CT画像上に示されている。矢印は、SPECT画像における大動脈弓を示す。Lは、左を表し、Rは、右を表し、Pは、後面を表す。
【図９】ナノボディ99mTc-cAbBcII10(cAbBcII10)または99mTc-cAbVCAM1-5(cAbVCAM1-5)を注射した後3時間目にApoE-/-マウスの大動脈弓のレベルにおいて撮影したインビボでのCT、SPECTおよびマージドSPECT/CTによるイメージングにおける代表的冠動脈像を示す図である。SPECT画像のスケールは、直接比較を可能にするように1〜3.4%の注射量に調整した。腋下リンパ神経節(In)、胸腺(t)および大動脈弓(ao)がSPECT/CT画像上に示されている。矢印は、SPECT画像における大動脈弓を示す。Lは、左を表し、Rは、右を表し、Pは、後面を表す。
【図１０】SPECT画像の定量に基づく、対照ナノボディcAbBcII10またはナノボディcAbVCAM1-5の投与後にC57Bl/6J対照マウス(白色バー)またはApoE-/-マウス(黒色バー)において得られたインビボでの弓対血液(左パネル)および弓対心臓(右パネル)比を示すヒストグラムを示す図である。*:P<0.05対99mTc-cAbBcII10、†:P<0.05対C57Bl/6J
【図１１】非トランスフェクト(A)またはウサギVCAM-1をコードするプラスミドをトランスフェクトした(B)CHOハムスター細胞上の抗VCAM-1ナノボディ(cAbVCAM1-1: 1; cAbVCAM1-2: 2; cAbVCAM1-3: 3; cAbVCAM1-4: 4; cAbVCAM1-5: 5; cAbVCAM1-6: 6; cAbVCAM1-7: 7; cAbVCAM1-8: 8; cAbVCAM1-9: 9およびcAbVCAM1-10: 10)の流動細胞分析による分析(点線)を示す図である。ナノボディを用いない条件を負の対照として用いた(実線)。これらのナノボディcAbVCAM1-1およびcAbVCAM1-5は、ウサギVCAM-1を発現するCHO細胞に結合している。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例に、他の抗VCAM-1ナノボディと比較したときの本発明によるナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8およびcAbVCAM1-9の特有の特性を示す。
【０１１７】
装置および方法
ナノボディの発生および生産
VCAM-1を標的とするナノボディは、一般的に以前に公表された方法(Arbabi Ghahroudiら(1997年)、FEBS Lett.、414巻、521〜526頁)に従って発生させた。より具体的には、ヒトコブラクダをヒトおよびマウス組換えVCAM-1タンパク質(RnD Systems、Minneapolis、USA)の両方により免疫化した。血中リンパ球を単離し、RNAを精製した。単鎖抗体の可変ドメイン(VHHまたはナノボディ)を2段階RT-PCR法を用いて増幅し、バクテリオファージM13のタンパク質3と同時性でクローニングした。ナノボディをファージディスプレイに供し、固定化免疫原上のバイオパニングに用いた。可溶性ナノボディを含む全細菌抽出物を、TNFαで刺激したbEND5細胞におけるELISAおよびフローサイトメトリーにおける陽性シグナルに基づいて個々のVCAM-1リガンドを選択するために用いた。配列決定の後、選択した抗VCAM-1ナノボディおよび無関係の対照ナノボディcAbBcII10を大腸菌中でヘキサヒスチジンによるタグ付きタンパク質として生産させ、Saerensら(2005年)、J. Mol. Biol.、352巻、597〜607頁に記載されているように精製した。
【０１１８】
非標識ナノボディのインビトロ評価
細胞株-bEND5マウスの内皮細胞株(ECACC、Salisburg、GB)を補足DMEM中で培養した。VCAM-1の発現は、18時間にわたる10ng/mLのTNFαによる刺激により誘導した。
【０１１９】
フローサイトメトリー-TNFαで刺激した105個のbEND5細胞および非刺激細胞をPEでマーキングした200ngのマウス抗VCAM-1モノクローナル抗体(mAb;Abcam)とともに、または1μgのナノボディ、1μgの抗Hisタグモノクローナル抗体(Serotec)および200ngの抗マウスラットIgG1(BD Biosciences)とともに連続的にインキュベートした。結合をFACS Canto II分析装置(BD Biosciences、Franklin Lakes、USA)で測定し、データをFlowJoソフトウエアパッケージ(TreeStar、Ashland、USA)により解析した。
【０１２０】
熱安定性-Tm(開折温度)の値は、Vaneyckenら(2010年)、J. Nucl. Med.、51巻、1099〜1106頁に記載されているように分光旋光計J-715(Jasco、Easton、MD、USA)で得た。
【０１２１】
表面プラスモン共鳴(SPR)に基づく親和性の評価-ヒトまたはマウス組換えVCAM-1ナノボディの親和性は、Biacore 3000装置でのSPR分析により測定した。組換えマウスICAM-1(RnD Systems)を負の対照として用いた。組換えタンパク質を製造業者の指示に従ってセンサーチップCM5(Biacore、Uppsala、Sweden)上に固定化した。0.005% Tween-20(登録商標)を含むPBS中50〜1nMのナノボディの連続半希釈物(half-dilutions)を試験した。親和定数は、標準関連性モデル(standard association model) 1:1(BIAevaluationソフトウエアパッケージ)の調整を用いることにより決定した。
【０１２２】
SPRを用いることによるエピトープについての競合-どのナノボディが同じエピトープに対して競合したかを判定するためにSPRを用いた。用いる手順は、Vaneyckenら(2011年)、FASEB J.、25巻、2433〜2446頁に記載されているものと同じである。
【０１２３】
放射性標識ならびにHPLCによるインビトロおよびインビボ安定性の測定
Gainkamら(2008年)、J. Nucl. Med.、49巻、788〜795頁に記載されているようなトリカルボニル法を用いることにより、ナノボディを99mTcで放射性標識した。放射化学的純度は、標識後直ちに、PBS中20℃で6時間後に、および注射後(p.i.)3時間目にマウス血液中で評価した。後者の場合、100μLの試料採取した全血を遠心分離し、血漿をNanosep 10K Omega膜を用いてろ過した。放射化学的純度は、ACN/TFA勾配で移動相により溶離するカラムC4を用いることによりRP-HPLCにより測定した。放射能は、放射線検出器(γ-RAM Model 4、LabLogic)を用いることにより観測した。
【０１２４】
99mTcでマーキングしたナノボディのインビトロでの評価
250×103個のbEND5細胞を24ウエルプレート(plaques)に播種し、10ng/mLのTNFαで18時間にわたり刺激した。5nMの各ナノボディ-99mTcを0.5mLのPBS+1%のヒト血清アルブンミン(human albumen serum)(HAS)中で37℃で1.5時間インキュベートした。結合特異性を測定するために、500倍過剰の非標識ナノボディを用いた競合試験を行った。洗浄後、結合99mTc -ナノボディを収集し、ガンマ線計数器(Cobra II Inspector 5003、Canberra Packard、USA)で計数した。実験は、3連で行った。ウエルへの非特異的結合を差し引き、結果をTNFα陰性条件に対して正規化した。
【０１２５】
動物モデルおよび大動脈の処理
すべての動物実験は、「Recherche du Service de Sante des Armees de Grenoble(CRSSA)」(グレノーブルの陸軍医療保健施設の研究センター)の委員会により承認された。31±1週齢の雌対照マウスおよびApoE-/-マウスを用いた(Charles-River、France)。ApoE-/-マウス(n=37)に0.39%のコレステロールを含むWestern飼料(Safe、France)を給餌したが、C57Bl/6J対照マウス(n=9)には標準飼料を与えた。C57Bl/6J対照マウス(n=4)においてさらに評価したナノボディcAbVCAM1-5(n=6)を除いて、各抗VCAM-1ナノボディを3匹のApoE-/-マウスにおいて評価した。抗体cAbBcII10は、ApoE-/-マウス(n=4)および対照マウス(n=5)の両方において負の対照として評価した。99mTcで放射性標識したナノボディの投与(67±4MBq i.v.)の2時間後に、2%イソフルラン(Baxter)を用いてマウスを麻酔し、SPECT/CT収集を行った(nanoSPECT、Bioscan、下文参照)。マウスを過量のペントバルビタールナトリウム(CEVA)により安楽死させ、大動脈ならびに他の主要臓器を注意深く回収した。大動脈を10%のホルマリンの溶液中で付着組織から分離し、上行大動脈から腸骨動脈まで12セグメントに切断した。病変の拡大指標を次のように各セグメントに割り当てた:(-)病変なし(対照セグメント)、(+)動脈セグメントの長さの50%までの範囲にわたる病変、(++)動脈セグメントの長さの50%を超える範囲にわたる病変および(+++)セグメントの全長に広がる病変。大動脈セグメントおよび組織試料の重量を測定し、それらの放射能をウエルガンマ線計数器(Cobra II、Packard)により測定した。結果は、バックグラウンドノイズおよび放射性崩壊に関して補正し、1gの組織当たりの注射量の百分率(%ID/g)として表した。大動脈病変および対照の吸収は、それぞれ(+++)または(-)と分類されたすべてのセグメントにおける平均吸収と定義した。病変対対照、病変対血液および病変対心臓比も測定した。
【０１２６】
20および8μmの厚さを有する隣接凍結切片を、それぞれVCAM-1のマイクロオートラジオグラフィー(BASS-5000、Fujifilm)および免疫組織学的マーキングによるイメージングにより得られた12大動脈セグメントから得た。
【０１２７】
さらに、99mTc-cAbVCAM1-5の血液クリアランスは、注射後の種々の時点に血液試料を回収することにより、3匹のC57Bl/6Jマウスにおいて評価した。結果は、総血液容積における%IDで表した(%ID/TBV)。
【０１２８】
免疫組織化学検査
10%のロバ血清を用いて20℃で1時間のブロッキングの後、抗VCAM-1ヤギ一次抗体(Santa-Cruz Biotechnology、0.5μg/ml)を大動脈切片に4℃で一夜適用した。抗ヤギロバビオチニル化二次抗体(Jackson ImmunoResearch)を20℃で1時間インキュベートし、DABを発色剤として用いた。切片をヘマトキシリンにより対比染色した。マーキング特異性は、対照スライド上の一次抗体を省略することによって確認した。対照マウスおよびApoE-/-マウスのサブグループにおいて、VCAM-1免疫マーキングを心臓、筋肉、唾液腺、骨髄、リンパ神経節、脾臓および胸腺について行った。
【０１２９】
SPECT/CTイメージング
静脈内注射の2時間前に、麻酔動物を温度調節機能付きベッドにおき、全身SPECT/CT収集を行った(nanoSPECT、Bioscan)。おおよそのCT収集時間は、次の収集パラメーターを用いることにより10分であった:45kVp、240投影および1投影当たり1,000ms。らせんSPECT収集は、24投影および45分の収集を用いることにより1mmの分解能を有する小開口径(stenopeic)多孔コリメーターを装着した4ヘッド（ヘッド当たり9×1.4mm(全直径)）で行った。CTおよびSPECT収集を専用ソフトウエアパッケージ(InVivoScope)を用いて再構成し、マージし、定量化した。弓対血液および弓対心臓比を測定するために、関心領域(ROI)を大動脈弓、左心室腔および左心室壁に描いた。
【０１３０】
オートラジオグラフィー
各動物について、12大動脈セグメントの異なるレベルで得られた20μmの厚さを有する3群のスライドの一夜暴露の後にオートラジオグラフ画像が得られた。画像を専用ソフトウエアパッケージ(Image Gauger、Fujifilm)を用いて定量化した。アテローム動脈硬化性病変および負の対照VCAM-1大動脈壁の周りにROIを描いた。結果をバックグラウンドノイズについて補正し、平均病変対対照比の形で表した。
【０１３１】
ウサギVCAM-1に対する非放射性標識ナノボディの反応性の評価
ウサギVCAM-1をコードするプラスミドを一時的にトランスフェクトした、またはしなかった105個のCHO細胞を1μgのナノボディ、1μgの抗Hisタグモノクローナル抗体(Serotec)および200ngの抗マウスラットIgG1(BD Biosciences)とともに連続的にインキュベートした。結合をFACS Canto II分析装置(BD Biosciences、Franklin Lakes、USA)で測定し、データをFlowJoソフトウエアパッケージ(TreeStar、Ashland、USA)により解析した。負の対照は、ナノボディを省略することによって実施した。
【０１３２】
統計解析
すべての結果を平均値±平均値の標準誤差の形で表示した。対応のあるデータおよび対応のないデータを比較するためにマン-ホイットニーのUおよびウィルコクソンのノンパラメトリック検定を用いた。差は、p<0.05で有意とみなした。
【０１３３】
結果
抗VCAM-1ナノボディの発生
本発明者らは、ヒトおよびマウスVCAM-1に対する交差反応ナノボディを開発しようとした。したがって、ナノボディは、ヒトおよびマウス組換えタンパク質VCAM-1によりヒトコブラクダを免疫化し、それによってもたらされたファージディスプレイにより得られた免疫ナノボディのライブラリーをバイオパニングすることにより発生させた。個々のナノボディを含む全細菌抽出物を、VCAM-1組換えタンパク質とのそれらの結合についてELISAで、VCAM-1を発現するbEND5細胞へのそれらの結合についてフローサイトメトリーでスクリーニングした。
【０１３４】
配列を決定した後、31種の抗VCAM-1ナノボディを同定し、抗原に結合するループにおける配列の類似性に基づく12ファミリーに分類した。ナノボディの6ファミリーは、マウスVCAM-1(mVCAM-1)に特異的であり、6ファミリーは、マウスVCAM-1とヒトVCAM-1(hVCAM-1)の両方に結合した。全抽出物のELISAシグナルおよびフローサイトトリーに基づいて、10種のナノボディ(cAbVCAM1-1〜-10と呼ぶ)をより詳細に分析するために選択した。ナノボディの生産収量は、0.5〜10.5mg/L(細菌培養物)であった(Table 4(表4))。
【０１３５】
インビトロでの特徴付け
bEND5細胞におけるフローサイトメトリー実験により、12の選択したナノボディがVCAM-1と相互作用したことが示された(図1)。Table 4(表4)に要約したSPR分析により示されたように、すべての選択したナノボディが0.2〜45.7nMの範囲の高い親和性でVCAM-1に結合した。さらに、10種の選択したナノボディのうち、6種は、1ナノモル程度にとどまる親和性でhVCAM-1と交差反応性を示した(Table 4(表4))。これらの6種のナノボディは、cAbVCAM1-1、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-5、cAbVCAM1-8、cAbVCAM1-9およびcAbVCAM1-10であった。SPR競合試験に基づいて、ナノボディcAbVCAM1をエピトープターゲティングに関してcAbVCAM1-1/5、cAbVCAM1-2/3/6/7/9/10およびcAbVCAM1-4/8の3つのカテゴリーに分類した。すべてのナノボディが59.4〜87℃超の範囲の開折温度によって示されたように強い熱安定性を示した(Table 4(表4))。
【０１３６】
【表４Ａ】
2014527797.tif 000006
【０１３７】
【表４Ｂ】
2014527797.tif 000007
【０１３８】
99mTcによる放射性標識ステップおよび精製の後に、放射化学的純度は、10種のナノボディcAbVCAM1および対照ナノボディcAbBcII10について95%より大きかった。bEND5細胞におけるインビトロ結合試験(図2)によって示されたように、99mTcによる標識は、大部分のリガンドについてVCAM-1の認識により影響されない。本発明者らは、TNFαにより刺激された陽性VCAM-1内皮細胞への結合が刺激細胞上より有意に強かったことを実際に示した。さらに、TNFαにより刺激された細胞への結合が、過剰のマーキングされていないナノボディとの競合により首尾よく抑制され、これは、それらの特異性を示すものである。
【０１３９】
体内分布の分析
ApoE-/-マウスにおける99mTcにより標識されたナノボディの体内分布をTable 5(表5)に要約する。対照cAbBcII10を含むすべてのナノボディは、97±16〜315±33%ID/gと腎臓における強い吸収および膀胱における強い活性を示した。興味深いことに、99mTc-cAbVCAM1の吸収は、リンパ組織において高く、99mTc-cAbVCAM1-3(脾臓および胸腺)、99mTc-cAbVCAM1-4/5(脾臓、胸腺および骨髄)および99mTc-cAbVCAM1-9(胸腺)については統計的差に達しすらした(p<0.05対99mTc-cAbBcII10)。肺および肝臓(それぞれ2.5±0.8および2.7±0.9%ID/gの平均吸収)を除いて、吸収は、血液および心筋を含む他の試験した組織において2%ID/g未満であった。
【０１４０】
Table 4(表4)に示すように、アテローム動脈硬化性病変における吸収は、10種のナノボディcAbVCAM1のうちの6種について2%ID/gより大きく、99mTc-cAbVCAM1-9について2.99±0.14%ID/gの最大値が示された(P<0.05対99mTc-cAbBcII10)。
【０１４１】
病変対対照、病変対血液および病変対心臓比は、体内分布データ(Table 4(表4))から決定した。病変対対照比は、1つを除くすべての評価したナノボディcAbVCAM1について2より大きく、cAbVCAM1-5について4.95±0.85の最大比が示された(P<0.05対99mTc-cAbBcII10)。病変対血液比は、1つを除くすべての評価したナノボディcAbVCAM1について1より大きく、99mTc-cAbVCAM1-3について5.6±0.39の最大比が示された(P<0.05対99mTc-cAbBcII10)。最後に、病変対心臓比は、すべてのナノボディについて1より大きく、99mTc-cAbVCAM1-5について8.30±1.11の最大比が示された(P<0.05対99mTc-cAbBcII10)。
【０１４２】
【表５】
2014527797.tif 000008
【０１４３】
免疫組織化学検査
図3に示すように、VCAM-1の構成的発現が、対照マウスC57Bl/6Jおよび高コレステロール血症マウスApoE-/-の両方におけるリンパ組織(すなわち、骨髄、リンパ神経節、脾臓および胸腺)に認められたが、心臓、筋肉および唾液腺におけるVCAM1の発現は認められなかった。さらに、強いVCAM-1マーキングが大動脈病変、内皮ならびにアテローム動脈硬化性プラーク内にも認められたが、C57Bl/6J対照マウスの大動脈には認められなかった。
【０１４４】
アテローム動脈硬化性病変におけるcAbVCAM1-5の吸収:エクスビボおよびインビボでのイメージング
Table 4(表4)に要約した選択基準に基づいて、ナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8およびcAbVCAM1-9は、医用イメージングにおける放射性トレーサーとして用いるのに最も有望であると本発明者らによりみなされた。ナノボディcAbVCAM1-5をさらなる評価の対象として特に選択した。
【０１４５】
大動脈吸収-ApoE-/-マウスにおいて、本発明者らは、99mTc-cAbVCAM1-5の大動脈吸収が病変の拡大指標と一致していたことを示した。実際、99mTc-cAbVCAM1-5の吸収は、アテローム動脈硬化性病変の相対体積と同時に増加したが、そのような勾配は、99mTc-cAbBcII10については認められなかった(図4)。大動脈における99mTc-cAbVCAM1-5の吸収をオートラジオグラフィーによってさらに特徴付けした。図5に示すように、99mTc-cAbVCAM1-5が陽性VCAM-1アテローム動脈硬化性病変に蓄積し、8.7±0.5の病変対対照比をもたらした(p<0.05対cAbBcII10)。
【０１４６】
安定性-本発明者らは、HPLCにより、SPECTイメージングの時に、99mTc-cAbVCAM1-5は、インビトロで放射性標識後6時間まで、血液中インビボで注射後3時間安定であることを示した(図6)。
【０１４７】
対照マウスにおける体内分布-99mTc-cAbVCAM1-5が血流から速やかに除去され、腎臓、脾臓およびリンパ組織に吸収されたことが、対照マウスC57Bl/6Jおよびアテローム動脈硬化症マウスApoE-/-の両方においてインビボでのSPECT画像上で明確に確認されたが、99mTc-cAbBcII10の注射後には腎臓および膀胱のみが可視であった(図7)。対照マウスC57Bl/6Jのリンパ組織における99mTc-cAbVCAM1-5の吸収が体内分布分析によりエクスビボでさらに確認された(Table 6(表6))。
【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
実際、本発明者らは、99mTc-cAbVCAM1-5の吸収がそれぞれ脾臓、胸腺および骨髄において7.4±0.2、1.5±0.1および7.9±2.0%ID/gであることを示した(p<0.05対遊離組織(free tissues)における99mTc-cAbBcII10)。
【０１５０】
SPECT/CTイメージング- SPECT/CTイメージングの後、99mTc-cAbVCAM1-5の吸収がApoE-/-マウスの大動脈弓のアテローム動脈硬化性病変に見られたが、トレーサーの吸収はC57Bl/6J動物の同じ場所に認められなかった(図8および図9)。したがって、弓対血液および弓対心臓比がC57Bl/6Jマウスと比較して、また負の対照ナノボディと比較してApoE-/-マウスにおいて有意に高いことが証明される(P<0.05;図10)。
【０１５１】
ウサギVCAM-1に対する非放射性標識ナノボディの反応性-本発明者らは、フローサイトメトリーにより、cAbVCAM1-1およびcAbVCAM1-5がウサギVCAM-1に特異的に結合したことを示した(図11)。
【０１５２】
考察
本試験は、そのような交差反応性リガンドが十分に特徴付けがなされた動物モデルにおいてバリデートされた結果の臨床診療への移転のために特に興味深い程度に、ヒトおよびマウスVCAM-1同族体の両方を認識するナノボディを発生させるために本発明者らにより開発された。6種の交差反応性ナノボディを含む、1ナノモル程度のマウスおよび/またはヒト同族体に対する親和性を有する10種の抗VCAM-1ナノボディを発生させ、生産した。さらに、2種のナノボディcAbVCAM1-1およびcAbVCAM1-5は、ウサギVCAM-1に対して交差反応性である。ナノボディ、特にcAbVCAM1-5の高い耐熱性は、高い放射化学的純度(>95%)を有する99mTcにより50℃でそれらを放射性標識する可能性をもたらした。さらに、陽性VCAM-1マウス内皮細胞におけるインビトロ結合試験により、これらの標識ナノボディがmVCAM1の特異的リガンドのままであったことが明らかにされている。
【０１５３】
それらのサイズが小さいため、ナノボディは、インビボで速やかな血液クリアランスを有し、ApoE-/-マウスへの注射後3時間目に平均循環活性が0.8%ID/gという結果となっている。さらに、心筋におけるバックグラウンドノイズ活性も最小限である。重要なことに、大動脈病変における抗VCAM-1ナノボディの吸収は、特にナノボディcAbVCAM1-5およびcAbVCAM1-3について、負の対照ナノボディcAbBcII10の吸収より有意に高かった。したがって、病変対対照、病変対血液および病変対心臓比は、特にナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8およびcAbVCAM1-9について、1より大きかった。
【０１５４】
リンパ組織における吸収
アテローム動脈硬化性病変に吸収されることに加えて、本発明によるナノボディは、体内分布およびSPECTイメージング実験により示されたように、正常および高コレステロール血症マウスの両方におけるリンパ組織によっても吸収された。特に、mVCAM-1に対する最も強い親和性を有する3種の交差反応性ナノボディ(cAbVCAM1-5/3/9)は、脾臓および骨髄において最も強い吸収を示した。mVCAM-1の構成的発現が免疫組織化学検査により脾臓、骨髄、リンパ神経節および胸腺に認められた。したがって、リンパ組織への抗VCAM-1抗体の結合は、VCAM-1タンパク質へのそれらの特異的結合におそらく起因していた。
【０１５５】
特別興味深い化合物の選択
Table 4(表4)に要約したパラメーターに基づいて、ナノボディcAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3、cAbVCAM1-8およびcAbVCAM1-9は、特に医用イメージングにおける使用を視野に入れると、他のナノボディと比較して特に好都合な特性を有すると本発明者らによって確認された。最も有望なナノボディは、ナノボディcAbVCAM1-5である。実際、cAbVCAM1-5は、最高の病変対対照および病変対心臓比ならびに強い病変対血液比を示す。さらに、それは、ヒトおよびマウスVCAM-1の両方に対する十分な親和性を有し、最高の耐熱性および最高の生産収量を有する。最後に、cAbVCAM1-5は、アテローム動脈硬化症の試験における参照動物モデルである、ウサギVCAM-1に対して交差反応性である。cAbVCAM1-3は、最高の病変対血液比ならびに強い病変対対照および病変対心臓比を有する。cAbVCAM1-8は、特に高い病変対心臓比およびヒトVCAM-1に対する最高の親和性を有する。最後に、cAbVCAM1-9は、アテローム動脈硬化性病変における最高の取込みならびにヒトおよびマウスVCAM-1に対する非常に十分な親和性を有する。さらに、cAbVCAM1-5、cAbVCAM1-3およびcAbVCAM1-9は、それらのCDRにおいてリシンを有さない。これは、リシンの存在が、PETイメージングを目的としてナノボディをそれらのアミン残基を介して蛍光または放射性標識により標識することを可能にするカップリング技術に対して不利な点を有し得る場合に有利である。
【０１５６】
cAbVCAM1-5のインビボでのイメージング
99mTc-cAbVCAM1-5は、HPLCによって示されたように、インビトロで放射性標識後6時間までならびにインビボでマウス血液中で安定である。これは、注射後3時間目にSPECT/CTイメージングを適用する可能性をもたらす。この時に、ApoE-/-マウスの大動脈弓に位置していたアテローム動脈硬化性病変は、心筋および血液における低いバックグラウンドノイズ活性で、SPECT/CTイメージングによって本発明者らにより成功裏に同定された。オートラジオグラフィーおよび免疫組織化学検査により、99mTc-cAbVCAM1-5の大動脈吸収が陽性VCAM-1アテローム動脈硬化性病変に集中していたことが確認された。したがって、これらの実験から、99mTc-cAbVCAM1-5は、アテローム動脈硬化性病変において起こる炎症過程の非侵襲的なインビボイメージングのための適切な放射性トレーサーであることがわかる。
【０１５７】
他の放射性トレーサーとの比較
抗体由来の他の放射性トレーサーがSPECTを用いて易破綻性アテロームプラークを撮像することについて最近評価された(Temmaら(2010年)、J. Nucl. Med.、51巻、1979〜1986頁、Kugeら(2010年)、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging、37巻、2093〜2104頁)。しかし、完全な抗体のクリアランスが低いため、標的対バックグラウンドノイズ比が最適に及ばないものとなり、抗体断片を用いる必要性が力説される。アテローム動脈硬化性病変のSPECTまたはPETイメージングについて以前に評価された他の放射性トレーサーのうち、18FDGは、ヒトにおける頸動脈病変のインビボでのイメージングを可能にする、マクロファージにおける高い吸収を示した(Ruddら(2002年)、Circulation、105巻、2708〜2711頁)。しかし、心筋における強いバックグラウンドノイズのため、心筋における吸収を低減することを意図した特定の食事を使用する可能性があるにもかかわらず、冠病変のイメージングは依然として非常に困難なままである(Wykrzykowskaら(2009年)、J. Nucl. Med.、50巻、563〜568頁)。同様に、アテローム動脈硬化症マウスモデルにおいて、Laitinenらは、注射後1時間目の18FDGの心筋における吸収は、アテローム動脈硬化性病変における0.41±0.16%ID/gに対して18.13±10.59%ID/gであったことを示した(Laitinenら(2006年)、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging、33巻、1461〜1467頁)。
【０１５８】
結論
本発明者らは、医用イメージングに使用するための重要な特性を有する、ヒトVCAM-1に対して交差反応性の4種の抗VCAM-1ナノボディを同定し、生産した。本発明者らは、特に、99mTc-cAbVCAM1-5が、SPECT/CTイメージングによりインビボでアテローム動脈硬化性病変を成功裏に同定する可能性をもたらしたことを直接的に示した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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