(57)【要約】  タンパク質含有原料から濃縮したペプチド分画を製造する方法では、タンパク質加水分解産物を、固定相を介したクロマトグラフィにより、溶出剤として水溶液を用いてその物理化学的特性に応じて分離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィによって固定相を介して溶出剤として水溶液を用いて、タンパク質加水分解産物をその物理化学的特性に応じて分離することを特徴とする、タンパク質含有原料から濃縮したペプチド分画を製造するための方法。
【請求項２】
クロマトグラフィ前に、特異的プロテアーゼを用いた加水分解において前記原料を１〜１００個のアミノ酸のペプチドサイズに調節することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフィ前に、ｐＨ値、濃度の調節及び／又はタンパク質加水分解産物の清澄化を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
クロマトグラフィのために、固定相として技術的吸着剤又はイオン交換体を官能化なしに又は中性の親水性の、酸性の又は塩基性の官能化ありで使用することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィのために、固定相として吸着剤としての分離樹脂を使用することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記分離樹脂がマクロ孔の又はゲル状のポリマー樹脂であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
クロマトグラフィのために固定相として吸着剤としての粒状炭又は熱分解した分離樹脂を使用することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
供給溶液が５〜５０％の乾燥物質濃度を有することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
固定相が、３００Ｄａ〜１００００Ｄａのモレキュラーシーブ効果を有する架橋度を有することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
クロマトグラフィの流速が１時間当たり０．２〜４ベッドボリュームであることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
溶出温度が−４℃〜９８℃であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
溶出温度が７０℃〜９５℃であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
純水を溶出剤として使用することを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
溶出剤として塩、酸、塩基又は溶媒の添加を有する希釈した水溶液を使用することを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
クロマトグラフィにおいて予め設定可能な機能的特性に応じてペプチドの濃縮を行うことを特徴とする請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
クロマトグラフィにおいて不所望の副成分を除くペプチド精製を行うことを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項記載の方法において、前記請求項の方法により製造したペプチド混合物を、更なる、特にクロマトグラフィによる精製工程によって更に分別して、１種又は複数種のペプチドの任意の高い濃縮度にすることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか１項記載の方法によって製造した、濃縮したペプチド分画。
【請求項１９】
飼料、食品、化粧品における機能性物質としての及び医薬作用物質としての、請求項１から１８のいずれか１項により得られたペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質含有原料からの濃縮したペプチド分画の製造方法及びその使用に関する。
【０００２】
ペプチド混合物は、タンパク質の酵素による加水分解の場合に、天然の動物及び微生物による消化でも、プロテアーゼ又はプロテアーゼ含有微生物を用いたタンパク質含有原料の技術的処理でも、発生する。原料中のタンパク質は、通常は、１００〜数千のモノマー単位の鎖長を有し、その順序がタンパク質毎に強く変動する、２０個の種々のα−Ｌ−アミノ酸からのポリアミドの混合物である。相応して、タンパク質混合物の、そして、純粋な個々のタンパク質の場合ですら、タンパク質加水分解処理の際に、極めて多数のポリマー破片が発生する。
【０００３】
酵素−技術的加水分解プロセスで発生するペプチド混合物は、使用される原料、使用される酵素及び調節される加水分解度に依存して、その組成において異なる。しかし、同じ加水分解条件下では、その組成は同じように再現することができる。
【０００４】
タンパク質加水分解産物からの極めて多くのペプチドのために、一部では、当初の加水分解産物においてすら、濃縮なしに、特殊な機能的特性及び生物学的活性が検出されている。
【０００５】
いくつかのペプチドは、傑出した親水性及び疎水性の領域を有してよく、したがって、表面活性であってよい。これらは、界面活性剤又は界面活性剤構成要素として適し、かつ、フォーム安定性の、乳化性の、静電防止性の又は清浄化する特性を有してよい。
【０００６】
いくつかのペプチドはそれ自体でアロマを付与する物質であってよく、又は、反応アロマの製造のための基礎として利用されてよい。
【０００７】
いくつかのペプチドは、その還元性又は酸化性の特性を介して、タンパク質のジスルフィド架橋の程度に影響してよい。
【０００８】
いくつかのペプチドは、抗菌作用を有する。
【０００９】
いくつかのペプチドは、髪及び結合組織に補修機構を引き起こす。
【００１０】
いくつかのペプチドは、同化作用又は脂肪代謝活性化作用、免疫調節作用又は血圧降下作用を有する。
【００１１】
タンパク質含有原料の加水分解によって、プロテアーゼを用いて、個々に及び組み合わせて、実質的に制限のないバリエーションにおいて、ペプチド混合物が製造でき、そのうちいくつかは文献に記載されており、いくつかは例えば飼料又は食品として市販されており、そして、その特性故に機能的添加剤として食品、化粧品及び医薬製品において使用できるいくつかの特性を有する。機能性ペプチドの濃縮又は不所望な副成分の分離は、先行技術に応じて個々のケースにおいて沈殿法又は限外濾過によって行われる。両方法は、比較的非特異的であり、そして、１つの方法工程あたり２つの分画への１の分離のみを可能にする。
【００１２】
医薬適用のための極めて高価なペプチドは、先行技術によればクロマトグラフィによっても分別されるが、しかし、使用される樹脂は極めて高価であり、機械的に大分離カラムにおいて安定でなく、そして、溶出剤として高価な有機溶媒が使用される。したがって、全体として、この方法は、経済的に大工業的なペプチド混合物（例えば食品適用のための）獲得のためには、考慮されない。
【００１３】
粗溶液における及び濃縮した分画におけるペプチドの有効性の算出、追跡及び定量化のための方法は、先行技術に属する。そして、アロマ特性はそれ自体で又は標準化した反応により感覚的に検証されてよく、抗生特性は寒天分散法を用いて、髪の補修特性は引張伸び測定によって又は特異的な結合特性はリガンドクロマトグラフィによって検出されることができる。生理学的作用は、動物試験において又は他の適したバイオアッセイを用いて検証されている。
【００１４】
タンパク質加水分解産物におけるペプチドは、フィード領域、食品領域、化粧品領域及び医薬領域における多数の適用において有効成分として予定することを可能にする物理化学的特性及び生理学的特性を有する。機能性ペプチドは、タンパク質加水分解産物において通常は極めて多い過剰量の作用しないペプチドの他に、極めて少ない割合だけで存在するため、その作用は顕著に発揮されることはないか、又は、その作用が発揮される場合でも、混合物の他の成分は不所望な特性、例えば色又は匂いによって適用が妨げられる。一般的に大工業的な規模において、検査した化学的又は物理学的特性を有する分画でタンパク質加水分解産物を分離する経済的な方法が存在しない場合には、極めて高価な技術を用いて又は極めて特殊な溶解特性に基づいて所定のペプチドが単離可能である例外は除かれる。
【００１５】
しかし、過去数年の調査の認識に基づいて、機能性ペプチドには極めて大きな適用ポテンシャルが予想される。しかし、大工業規模での機能性ペプチドの販売のための背景は、機能性ペプチドがタンパク質加水分解産物において極めて少ない濃度でだけ存在するか、或いはしかし、不所望な副成分、例えば着色物質、苦み物質又は匂い物質が不随することにある。
【００１６】
確かに、糖獲得及び水後処理の領域からは、クロマトグラフィが物質分離及び物質精製のために１００ｍ3より大きいカラムにおいて運転される大工業的なプロセスクロマトグラフィ法が知られている。しかし、この大工業的方法は、極めて粗な分別化のためにだけ適し、それというのも、使用されるクロマトグラフィ樹脂はその吸着挙動において、極めて選択的とは認められず、そして、そのクロマトグラフィ分離挙動はこの既知の技術的適用を超えるとも知られていないからである。
【００１７】
この技術的背景に基づき、本発明は、ペプチド含有混合物を経済的に大規模で分別し、そうして得られたペプチドを濃縮し、そして、加水分解産物の作用しないペプチド又は更なる不所望な成分、例えば着色物、欠陥アロマ（Fehlarome）及び／又は塩を分離することを課題とする。
【００１８】
前記技術的課題は、請求項１によれば、クロマトグラフィによって固定相を介して溶出剤として水溶液を用いて、タンパク質加水分解産物をその物理化学的特性に応じて分離するべく調整されている、タンパク質含有原料からの濃縮したペプチド分画の製造方法によって解決される。
【００１９】
意外なことに、いくつかの、大工業的プロセスクロマトグラフィにおいて、例えば糖テクノロジーにおいて、廃水処理において、又は化学的大工業において使用される十分な多孔性の固定相もまた完全に、ペプチドを約５０個アミノ酸の分子サイズまで、塩基性、酸性、疎水性、分子量及び相互の特異的相互作用といった尺度に応じて分別して、その物理化学的特性に応じて濃縮したペプチド分画を得ることを可能にすることが見出された。
【００２０】
そのような固定相の典型的代表物は、ジビニルベンゼン架橋したポリスチレン樹脂であってアニオン性又はカチオン性の官能性を有するもの、架橋したビニルアルコール−スチレン−コポリマー又は架橋したフェノール−ホルムアルデヒド重縮合物、例えばＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社の製品シリーズＡｍｂｅｒｌｉｔｅ又はＬａｎｘｅｓｓ社の製品シリーズＬｅｗａｔｉｔである。
【００２１】
好ましくは、タンパク質含有原料も、市販で入手されるタンパク質加水分解産物も、事前に特異的なプロテアーゼで所定の程度まで加水分解されており、それによって、さらに好ましくは１〜１００、特に２〜２０個のアミノ酸のペプチドフラグメントが得られている。
【００２２】
加水分解産物は通常は、例えば、蒸発によって更に濃縮され、所望のｐＨ値に調節され、場合によっては例えば濾過によって清澄化され、そして、０．３ベッドボリューム（Bettvolume、ＢＶ）までで、好ましくは０．１ベッドボリュームで、固定相で充填したクロマトグラフィカラムに付与されてよい。そのような供給溶液は好ましくは５％〜５０％の乾燥物質の濃度を有する。
【００２３】
溶出を、好ましくは純水を用いて更なる添加物なしに行い、しかし、場合によって大抵は塩又は溶媒の少量の添加を伴ってもよい。
【００２４】
所望の分別に応じて、ヒドロキシ官能化されている固定相が使用され、それによって、分離を疎水性に応じて行うか、又はアニオン性又はカチオン性官能化されている固定相が使用され、それによって、分離をイオン排除及びイオン交換に応じて行う。
【００２５】
クロマトグラフィには多岐にわたる方法で分離樹脂が使用でき、特にクロマトグラフィのために固定相として使用される分離樹脂はマクロ孔又はゲル状ポリマー樹脂であり、これは好ましくは１００００Ｄａの分子量までの部分浸入を可能にする分岐度及び３００Ｄａ〜１００００Ｄａのゲル濾過効果を有する。
【００２６】
いくつかの場合には、クロマトグラフィのために固定相として好ましくは技術的吸着剤が官能化なしに使用することもでき、例えば吸着剤技術から知られている粒状炭又は熱分解分離樹脂であり、これは熱分解のために粒状炭と類似の吸着特性を有してよい。
【００２７】
分離樹脂には、複数のクロマトグラフィサイクルの過程において好ましくは混合物からの吸着したペプチドの結合平衡が調整され、これは結合していないペプチドに対する異なる親和性によって分離の過程を実質的に影響する。
【００２８】
更なるプロセスパラメーターは、溶出温度−４℃〜９８℃、特に７０℃〜９５℃で、１時間当たり０．２〜４ベッドボリュームのクロマトグラフィの流速である。
【００２９】
クロマトグラフィカラムの溶出物において、新しい分離を確立するときは、まず検査した機能的特性が同定される。分離樹脂及び分離条件の選択は、不所望な特性を有する成分が可能な限り、所望される機能性の領域内に溶出しないように行われる。分画領域の決定は、測定が容易にできる、溶出物の物理化学的パラメーターに応じて行われる。
【００３０】
クロマトグラフィの結果は、予め設定可能な機能的特性に応じたペプチドの濃縮及び／又は不所望の副成分、例えば着色物質、苦み物質又は匂い物質を除くペプチド精製である。
【００３１】
そうして得られたペプチド混合物は、更なる、特にクロマトグラフィによる精製工程によっても更に分別されて、飼料、食品、化粧品において機能性物質として、そして医薬作用物質として使用できる、１種又は複数種のペプチドの任意に高い濃縮度にまでしてよい。
【００３２】
機能性でない分画は、一緒にされ、濃縮され、そして、食品領域、飼料領域、発酵媒体領域又は肥料領域において、その当初の利用に供される。
【００３３】
本発明の知見は、実施例に基づいてさらに説明されるが、実施例は本発明を限定する性質は有しない。
【００３４】
実施例１：
分子量２５０〜２５００Ｄａを有するペプチド割合約９０％を有する、市販で入手できる酵素によるコムギタンパク質加水分解産物から、分析用分離カラムを介してＨＰＬＣ装置を用いて組成プロファイルを作成する。コムギタンパク質加水分解産物を５０％（ｗ／ｗ）の水溶液に、そしてｐＨ値４．５に調整し、濾過し、例示的にいくつかの特性に関して次のように特性決定した：
乾燥物質（％）に対する導電性
乾燥物質（％）に対する色割合（Ｅ430／ｃｍ）
１％の溶液のフォーム形成挙動（１分のフリット通気後のフォーム体積、０．１試料体積／ｓ）
フォーム安定性（半値時間）
匂い（官能試験）
味（官能試験）
引張伸び試験における、光、熱気及び／又は洗剤に暴露した髪に対する補修作用。
【００３５】
二重ジャケット−ガラスカラム（ＩＤ：３５ｍｍ、長さ１０００ｍｍ）を、ＤＶＢ架橋した、マクロ孔の、スルホン化したポリスチレン樹脂（カルシウム形態、単分散かつ粒径０．４ｍｍ）で充填する。二重ジャケットを、循環サーモスタットで８５℃に加熱する。コムギタンパク質加水分解産物を５０％（ｗ／ｗ）の濃度及び５０ｍｌの体積で（０．１ベッドボリューム、ＢＶに相応）、カラムに付与し、中間硬度の熱した水道水及び１ＢＶ／ｈの体積流でクロマトグラフィする。１．５ＢＶの溶出体積後に、新たに０．１ＢＶのコムギタンパク質加水分解産物の供給と、新たに水での溶出を行う。この経過を、分離樹脂の再生なしに少なくとも１０回繰り返し、このことは基本的に任意に頻繁に可能である。各クロマトグラフィサイクルの溶出物を１００ｍｌの１５個の分画に収容する。
【００３６】
例示的に、ｐＨ経過の、色経過の、電導性の及び２１４ｎｍでの吸収のオンライン追跡によって、相応する特性を有するペプチドの濃縮が溶出の過程において見て取ることができる。
【００３７】
個々の分画のペプチド組成プロファイルを、上述のＨＰＬＣ方法を用いて記録した。
【００３８】
個々の分画のＨＰＬＣプロファイルは相互に顕著に異なり、かつ、個々のペプチドは異なる分画において明白に濃縮する。
【００３９】
さらに、コムギタンパク質加水分解産物の特性決定のために観察された機能的特性を、個々の分画においても検査し、かつ、出発溶液と比較した。
【００４０】
溶出分画は、様々なＥ430／ＴＳ比を有し、色割合はいくつかの分画において濃縮し、他の分画において相応して減少する。いくつかの分画は、供給溶液とは対照的に無色であり、もはや苦みはなく、そして、同じ濃度で３０倍高められたフォーム安定性を示す。既に供給溶液から知られ、かつ、検出された髪補修特性は、同様に、いくつかの分画において再検出できたが、他の分画ではできなかった。
【００４１】
実施例２：
平均ペプチドサイズ１５００Ｄａを有するダイズタンパク質加水分解産物を、実施例１に記載のものと同様に特性決定し、クロマトグラフィ用に準備をする。クロマトグラフィは例示的に２つの異なる試験においてｐＨ値５．０及びｐＨ値１０．０で実施する。
【００４２】
二重ジャケット−ガラスカラム（ＩＤ：１０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）を、ＤＶＢ架橋した、ポリスチレン−ビニルアルコール共重合化した分離樹脂（イオン性官能化なし、単分散、粒径０．２ｍｍ）で充填する。二重ジャケットを、循環サーモスタットで１０℃に冷却する。ダイズタンパク質加水分解産物を３５％（ｗ／ｗ）の濃度及び３ｍｌの体積で（０．１ＢＶ）、カラムに付与し、蒸留水及び１ＢＶ／ｈの体積流でクロマトグラフィする。１．５ＢＶの溶出体積後に、新たに０．１ＢＶのコムギタンパク質加水分解産物の供給と、新たに水での溶出を行う。
【００４３】
この経過を、分離樹脂の再生なしに３回繰り返す。溶出物を３ｍｌの１５個の分画に収容する。溶出サイクルの分画から例示的に組成プロファイルを上述のＨＰＬＣ方法を用いて記録する。さらに、ダイズタンパク質加水分解産物の特性決定のために観察された特性を個々の分画においても検査し、出発溶液と比較する。
【００４４】
個々の分画のＨＰＬＣプロファイルは相互に顕著に異なり、かつ、個々のペプチドは異なる分画において明白に濃縮する。特にｐＨ５．０での試験では、ｐＨ１０．０での試験に比較して、完全に別の分画化が得られる。
【００４５】
溶出分画は、相互にその色割合、そのフォーム形成挙動及びその感覚的特性において異なる。
【００４６】
実施例３：
ペプチドサイズ＜２０００Ｄａを有する、酵素によるコラーゲン加水分解産物から、分析用分離カラムを介してＨＰＬＣ装置を用いて組成プロファイルを作成する。コラーゲン加水分解産物を４０％（ｗ／ｗ）で水に溶解させ、そしてｐＨ値８．０に調整し、実施例１に記載のように特性決定する。
【００４７】
二重ジャケット−ガラスカラム（ＩＤ：３５ｍｍ、長さ１０００ｍｍ）を、ＤＶＢ架橋した、マクロ孔の、スルホン化したポリスチレン樹脂（ナトリウム形態、単分散かつ粒径０．４ｍｍ）で充填する。二重ジャケットを、循環サーモスタットで８５℃に加熱する。ラーゲン加水分解産物を４０％（ｗ／ｗ）の濃度及び５０ｍｌの体積で（０．１ＢＶ）、カラムに付与し、熱した脱イオン水及び１ＢＶ／ｈの体積流でクロマトグラフィする。１．５ＢＶの溶出体積後に、新たに０．１ＢＶのコラーゲン加水分解産物の供給と、新たに水での溶出を行う。この経過を、分離樹脂の再生なしに少なくとも１０回繰り返す。溶出物をサイクル毎に１００ｍｌの１５個の分画に収容する。
【００４８】
個々の分画のＨＰＬＣプロファイルはこの例でも顕著に相互に異なり、かつ、個々のペプチドは異なる分画において明白に濃縮する。
【００４９】
本発明の方法は、各実施形態において、その形態において新種のペプチド分画を提供し、好ましい機能的特性を示し、かつ、使用する原料よりも顕著により高い利用価値を有する。前述の分離方法もまたその紹介した組み合わせ及び適用において、幅広い利用のためにタンパク質加水分解産物の大きな機能的ポテンシャルを導き出すことができる。
【００５０】
異なる条件下のプロセスパラメーターの変動及び複数のクロマトグラフィの組み合わせによって、純粋なペプチドにまで及ぶ常に新しいペプチド混合物を生じることができる。本発明の方法及びそこから生じる生成物は、さもなければ粗悪であるにすぎないか又は全く利用可能でない、食品生産及び農業生産の副分画からの顕著な付加価値を提示する。特異的適用に十分な機能的特性を有しない全ての部分分画は、少なくとも原料の当初の利用に戻すことができ、通常は、これらは酵素による分解によっても価値の増大を被るが、しかし、決して価値がないわけでない。
【００５１】
クロマトグラフィによる分離の溶出物は、大抵は水を用いて更なる添加物なしに行われ、化学薬品を用いたクロマトグラフィカラムの再生は必要でない。クロマトグラフィのために使用される分離樹脂（例えば水後処理におけるその使用によって知られている）も、フィード適用及び食品適用から使用される酵素も、市販されている。
【国際調査報告】
2014527185.tif 000002
2014527185.tif 000003
2014527185.tif 000004
2014527185.tif 000005
2014527185.tif 000006
2014527185.tif 000007