(57)【要約】  本開示は、ある実施形態において、フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物を含む組成物について記載する。さらなる実施形態では、組成物は細胞培養培地成分をさらに含む。本開示は、（ａ）血小板を溶解して溶解物を用意するステップ、（ｂ）細胞片を除去するステップ、および（ｃ）塩化カルシウムなどの金属塩を添加して除去可能な塊体を形成することによってフィブリノゲンを枯渇させるステップを含む、組成物の調製方法も提供する。さらに、本開示は、前記方法を使用して生成される生成物についても記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結融解プロセスによって生成される血小板溶解物と比較して、減量したフィブリノゲンを伴う血小板溶解物成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物はフィブリノゲンが実質的に枯渇していることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、前記血小板溶解物の成分はＰＤＧＦが実質的には枯渇していないことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が、フィブリノゲン濃度５０μｇ／ｍＬ未満の水性溶液であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物において、フィブリノゲン濃度が４μｇ／ｍＬ未満であることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物において、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度が１５ｎｇ／ｍＬより高いことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項４に記載の組成物から水を除去するプロセスによって作製されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
細胞の培養方法において、細胞が請求項１に記載の培地中で培養されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記細胞が前駆細胞または幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記幹細胞が、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、体細胞の幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来の幹細胞、内皮幹細胞、歯髄幹細胞、胚性幹細胞、骨髄または造血幹細胞、羊膜幹細胞、リンパ球系または骨髄系幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物を含む有効量の医薬組成物を、これを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする、眼の疾患または状態を処置または防止する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物を含む組成物を、創傷に適用するステップを含むことを特徴とする、創傷処置または創傷閉鎖方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物を含むことを特徴とする創傷被覆材。
【請求項１４】
請求項１３に記載の創傷被覆材において、包帯、ガーゼ、シアノアクリラート接着剤または縫合剤から選択されることを特徴とする創傷被覆材。
【請求項１５】
請求項１３に記載の創傷被覆材において、抗生物質をさらに含むことを特徴とする創傷被覆材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／５０１，４１１号明細書および２０１１年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／５４７，８９７号明細書に基づく優先権を主張するものであり、この両者の内容全体を参照によって本願明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本開示は、ある実施形態において、フィブリノゲンおよび寒冷沈降物を枯渇させた血小板溶解物を含む組成物について記載する。さらなる実施形態では、組成物は細胞培養培地成分をさらに含む。本開示は、（ａ）血小板を溶解して溶解物を用意するステップ、（ｂ）細胞片を除去するステップ、および（ｃ）塩化カルシウムなどの金属塩を添加して除去可能な塊体を形成することによってフィブリノゲンを枯渇させるステップを含む、組成物の調製方法も提供する。さらに、本開示は、前記方法を使用して生成される生成物についても記載する。
【背景技術】
【０００３】
再生医療とは、自らを治癒する身体能力を高めるために多くの技術が使用される広範な分野である。かかる技術の１つには細胞治療がある。細胞治療に使用されてきた種々の細胞型には、胚細胞、新生児細胞、体細胞、異種細胞および人工多能性細胞が含まれるがこれらに限定されない。とりわけ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨、軟骨および腱などの骨格組織の再生、さらには神経変性の治療および造血細胞移植の支援でも治療有効性を示している。たとえば、Ｄｏｕｃｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓ，（２００５），２０５：２２８−２３６およびＬａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，（２００７），２１３：１８−２６を参照されたい。
【０００４】
過去の努力では、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する成長培地を使用してドナー細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖してきた。培養培地中にＦＢＳが存在すると、レシピエントに移植する前にドナー細胞を洗浄しても、ＦＢＳに対する抗体が生成し、その結果、アルツス（ａｒｔｈｕｓ）様の反応が発生していた。Ｓｅｌｖａｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，（１９９７），８９（３）：７７６−９。動物のプリオンの感染、ウイルス感染および人獣共通感染症の感染に関する懸念もＦＢＳの使用を取り巻いている。成長培地中のＦＢＳを使用すると、これに関連する障害が起こりうるため、細胞の機能を維持することができる非異種の成長添加剤に特に関心が生じている。
【０００５】
ＭＳＣをｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させようとする試みにおいて、ＦＢＳの代替物として自家および同種のヒト血清の両方が試験された。同種血清では、細胞成長の停止およびＭＳＣの死滅という結果になった。Ｓｈａｈｄａｄｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００５）２３（９）：１３５７−６６．自家血清はＭＳＣを効果的に増殖させるが、コストおよび血清の利用可能性などの実用的な懸念のため、この手法はやや非実用的である。たとえば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ｂｒ，（２００５），８７（１０）：１４２６−３３を参照されたい。過去の研究では、ヒト血小板から放出される成長因子が、ＭＳＣを含むいくつかの細胞型の成長を効果的に増進することが示されている。それゆえ、最近の試みは、細胞培養添加剤としてＦＢＳの代わりに血小板溶解物を使用することに焦点が当てられている。
【０００６】
血小板は、複数の成長因子、たとえば複数の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）および形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を放出することができる。Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，（２００３），１８（１）：９３−１０３。細胞培養培地にこれらの成長因子を添加するという目的には、血小板溶解物の方が、血小板粘着法および血小板凝集法の両者より優れていることが示された。Ｄｏｕｃｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓ，（２００５），２０５：２２８−２３６。
【０００７】
細胞成長を増進させるにもかかわらず、未加工の血小板溶解物を使用することにはそれなりの一連の障害がある。ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞治療の臨床用途では、最近までＦＢＳが細胞培養成長添加剤として使用されてきているが、臨床用途で血小板溶解物を使用することについての検討が依然としてなされている。この検討には、細胞片、凝固因子および寒冷沈降物の存在、ならびに血小板溶解物の存在下で培養した細胞の免疫抑制の特性が含まれている。さらに、細胞培養物中に未加工の血小板溶解物を使用すると、フィブリノゲンがフィブリンに転換する。一般的には、ヘパリンを細胞培養物に直接添加してこの転換を防止する。たとえば、Ｓｃｈａｌｌｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００８），１４（３）：１８５−９６を参照されたい。このようにヘパリンを使用しても、培地中に大きな線維の鎖状体（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｓｔｒａｎｄｓ）が形成し、ＭＳＣ単層に付着する場合がある。この場合、患者にこの線維の鎖状体を注入するリスクがあり、ことによると微小血管または大血管の閉塞が発生する。したがって、線維の鎖状体の生成を減少させる改良型の方法を見出す必要性がある。
【０００８】
酵素前駆体プロトロンビンは肝臓で産生される。プロトロンビンは第Ｘａ因子によって、２つの部位で酵素により開裂し、トロンビンを生成する。続いて、トロンビンはフィブリノゲンをフィブリンに転換することによって凝固を媒介する。フィブリンはトランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子で架橋され、血餅を形成することができる。フィブリンは、上記のように患者に移植された場合に危険な、線維の鎖状体中に癒着することがある。ヘパリンを使用すると、トロンビンおよび第Ｘａ因子の両者に対してアンチトロンビンへの親和性を高め、場合によっては凝固カスケードを中断することができる。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、ある実施形態において、フィブリノゲンおよび寒冷沈降物を枯渇させた血小板溶解物を含む組成物について記載する。さらなる実施形態では、組成物は細胞培養培地成分をさらに含む。本開示は、（ａ）血小板を溶解して溶解物を用意するステップ、（ｂ）細胞片を除去するステップ、および（ｃ）塩化カルシウムなどの金属塩を添加して除去可能な塊体を形成することによってフィブリノゲンを枯渇させるステップを含む、組成物の調製方法も提供する。さらに、本開示は、前記方法を使用して生成される生成物についても記載する。
【００１０】
ある実施形態において、血小板溶解物の組成物はフィブリノゲンが実質的に枯渇している。いくつかの実施形態では、組成物のフィブリノゲン濃度は約２μｇ／ｍＬ以下または約４μｇ／ｍＬ以下である。いくつかの実施形態では、組成物のＰＤＧＦ−ＢＢ濃度は約１５、３０または４０ｎｇ／ｍＬより高い。いくつかの実施形態では、組成物はクエン酸デキストロース（ＡＣＤ：ａｃｉｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を含有しないか、または酸性シトラートなどの、カルシウムをキレートする抗凝固剤をあまり多くは含有しない。いくつかの実施形態では、組成物は細胞片を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は寒冷沈降物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物はトロンビンが実質的に枯渇している。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本開示は、前記組成物を含む細胞培養培地を使用して細胞を培養する方法に関する。標準的な細胞培養培地はアミノ酸ならびに任意選択でインスリン、ホルモン、抗生物質および糖類を含有する。いくつかの実施形態では、培養される細胞は、体細胞、新生児細胞、胚細胞、異種細胞または多能性細胞である。いくつかの実施形態では、培養される細胞はＭＳＣである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本開示は、齧歯類、ブタ、霊長目、ヒト霊長目および非ヒト霊長目から選択される種に由来する細胞を増幅させることに関する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）血小板を溶解して溶解物を用意するステップ、（ｂ）細胞片を除去するステップ、および（ｃ）フィブリノゲンを実質的に枯渇させるステップを含む、組成物の調製方法に関する。ある実施形態では、方法は（ｄ）カルシウムをキレートする抗凝固剤、たとえばＡＣＤを除去し、組成物にカルシウムを再び増加させる（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞片は、フィブリノゲンを枯渇させる前、フィブリノゲンを枯渇させた後、またはフィブリノゲンを枯渇させる前後の両方で除去される。いくつかの実施形態では、細胞片を除去する前、細胞片を除去した後、細胞片の除去が未完了のとき、フィブリノゲンを枯渇させる前、フィブリノゲンを枯渇させた後、またはフィブリノゲンの枯渇が完了する前に、多くの血小板溶解物が貯留される。いくつかの実施形態では、貯留は濾過の前または後のいずれかに行われる。いくつかの実施形態では、血小板は１回または複数回融解することによって溶解される。いくつかの実施形態では、二価の金属塩、標準的にはカルシウム塩などの金属塩が、個別のまたは貯留された溶解物のいずれかに添加される。いくつかの実施形態では、ヘパリンが、個別のまたは貯留された溶解物に添加される。いくつかの実施形態では、貯留された溶解物は可視の血餅が出現するまで観察される。いくつかの実施形態では、前記可視の血餅は、たとえば遠心分離によって除去される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示する方法によって生成される生成物に関する。いくつかの実施形態では、生成物は滅菌であるか、細菌をほぼ含まず、たとえばマイコプラズマ陰性である。いくつかの実施形態では、生成物のフィブリノゲン濃度は２、３、４、５、１０、２０または５０μｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、生成物のＰＤＧＦ−ＢＢ濃度は１、５、１０、１５または４０ｎｇ／ｍＬより高い。
【００１５】
ある実施形態において、開示は、フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物または成分を含む有効量の医薬組成物を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書で提供する疾患または状態を処置または防止する方法に関する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本開示は、局所用剤としての用途および／または眼科用の細胞生成物の生成に関する。ある実施形態において、本開示は、本明細書に開示する組成物を含む有効量の医薬組成物を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、眼の疾患または状態を処置または防止する方法に関する。ある実施形態では、対象がこれを必要とする理由は、以下の診断を受けているか、リスクを負っているか、症状を呈しているからである。強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍もしくは擦過傷、角膜血管新生、フックスジストロフィー、角結膜炎、虹彩炎、ぶどう膜炎、白内障、脈絡網膜の炎症、後部毛様体炎、脈絡網膜瘢痕、脈絡網膜変性、クロリオダル（ｃｈｒｏｒｉｏｄａｌ）ジストロフィー、脈絡膜出血もしくは破裂、脈絡膜剥離、網膜剥離、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑変性、網膜色素変性、黄斑浮腫、緑内障、飛蚊症、視神経症、視神経乳頭ドルーゼン、弱視、暗点、夜盲症、充血眼、眼球乾燥症または失明。
【００１７】
ある実施形態において、本開示は、本明細書で開示する血小板溶解物成分を含む有効量の組成物を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、眼の疾患または状態を処置または防止する方法に関する。
【００１８】
ある実施形態において、組成物は、本明細書で開示する組成物を含む溶液を対象の眼に滴下することによって投与される。ある実施形態において、組成物は、たとえば、外眼部の細胞を通して眼房水または硝子体液中に挿入される、注射器または細いカテーテルもしくはタブなど他の移送器具によって、眼内に投与される。
【００１９】
ある実施形態において、本開示は、免疫抑制の単球を産生するために、フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物を使用することを企図する。
【００２０】
ある実施形態において、本開示は、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞、筋細胞ならびに神経細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで産生するために、本明細書において生成し開示する間葉系幹／間質細胞を使用することを企図する。
【００２１】
ある実施形態において、本開示は、凍結融解プロセスによって生成した血小板溶解物と比較して、フィブリノゲンの量を減少させた血小板溶解物成分を含む組成物において、たとえば当該組成物はフィブリノゲンが実質的に枯渇しているが、血小板溶解物成分はＰＤＧＦが実質的には枯渇されていない組成物に関する。ある実施形態では、組成物はフィブリノゲン濃度が２または４μｇ／ｍＬ未満で、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度が１５ｎｇ／ｍＬより高い水性溶液である。ある実施形態では、本開示は、本明細書で開示する血小板溶解物の組成物から凍結乾燥で水を除去するプロセスによって作製される組成物に関する。
【００２２】
ある実施形態において、本開示は、細胞が、本明細書で開示する血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、細胞の培養方法を企図する。ある実施形態では、細胞は、前駆細胞または幹細胞、たとえば多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、体細胞の幹細胞、間葉系幹／間質細胞、脂肪由来の幹／間質細胞、内皮幹細胞、歯髄幹細胞、胚性幹細胞、骨髄もしくは造血幹細胞、羊膜幹細胞、リンパ球系もしくは骨髄系幹細胞である。
【００２３】
ある実施形態において、本開示は、本明細書で開示する血小板溶解物の組成物または成分を含む組成物を、創傷に適用するステップを含む、創傷処置または創傷閉鎖方法を企図する。ある実施形態において、本開示は、本明細書で開示する血小板溶解物の組成物または成分を含む創傷被覆材を企図する。創傷被覆材の例には、包帯、ガーゼ、接着剤、たとえばシアノアクリラート接着剤、または縫合剤が含まれる。ある実施形態では、創傷被覆材は、抗生物質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、グラフによるデータであり、フィブリノゲンが減少しても、ＦＤ−ＰＬおよびｐｈＰＬは、ＥＬＩＳＡで測定すると、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦおよびＢＤＮＦのような望ましい成長因子を同様のレベルで含有していることを示す。
【図２】図２は、７日間保管した後の顕微鏡分析であり、ＦＤ−ＰＬ（上）は細片を実質的に含まないが、ｐｈＰＬ（下）は、種々のサイズの粒子を含有することを示す。
【図３】図３は、ＭＳＣをＦＢＳ、ｐｈＰＬおよびＦＤ−ＰＬ中でｅｘ  ｖｉｖｏ増幅させるデータであり、ＭＳＣをＦＤ−ＰＬ中で培養すると、ＦＢＳおよびｐｈＰＬの両者と比較して倍の時間を大いに短縮することができることを示す。
【図４】図４は、ＦＤ−ＰＬ（ＧＭＰ）およびｐｈＰＬ（ＲＧ）中で培養した場合の、ＩＤＯ誘導に基づくＭＳＣのＩＮＦ−γ反応性を示すデータであり、ＦＤ−ＰＬで増幅したＭＳＣにはより優れた免疫抑制の潜在能力があることを示す。
【図５】図５は、ＦＤ−ＰＬ（上）、ｐｈＰＬ（中）および血清（下）の顕微鏡分析（右は左の拡大画像）であり、ＦＤ−ＰＬはＣＤ１１ｂおよびＣＤ３３陽性の単球集団の結合および増幅を促進する能力があることを示す。
【図６】図６は、ｐｈＰＬ（左）、ＦＤ−ＰＬ（中）および血清（右）を使用してヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）を培養する場合の増殖（上）および生存率（下）のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ヘパリンおよび金属塩の使用による、血小板溶解物からのフィブリノゲンの枯渇
血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）すなわち血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）は、前駆体である巨核球の断片に由来するＤＮＡを含有する、核をもたない細胞である。血小板は哺乳動物の血液中を循環し、止血に関与して、血餅を形成する。血小板フェレーシスとは、血小板を採取する方法のことである。血小板は、全血から、または血小板を分離して血液の他の部分をドナーに戻すデバイスによって、貯留することができる。血清は、通常、「ソフトスピン」と呼ばれる大きな遠心分離機の中に入れられる。この設定では、血小板は血漿中に浮遊したままである。多血小板血漿（ＰＲＰ）をＲＢＣから除去し、次いで、より高速の設定で遠心分離して、血漿から血小板を収集する。回収した血小板は、通常冷却して細胞の劣化を遅延させる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語、用語「血小板溶解物」は血小板溶解の生成物を意味する。血小板溶解物には、溶解した血小板が含有される任意の培地を含めることもできる。凍結融解は、本開示における細胞を溶解する典型的な方法であるが、唯一の方法というわけではない。力学的溶解は、標準的には剪断力の使用によるものであり、溶解物を生成するために企図される別の方法である。溶解緩衝液は、標準的には細胞を低張液中に入れることによって作用するものであり、さらに別の選択肢である。溶解プロセスは、これらの方法の組合せからなるものとしてもよい。
【００２７】
ある実施形態において、本開示は、ヘパリンおよびカルシウム塩を血小板溶解物に直接添加してフィブリノゲンを枯渇させ、溶解物のカルシウムを再び増加させ、シトラートを中和する方法に関する。別の実施形態では、得られた溶解物を細胞培養培地と組み合わせる。過去には、血小板溶解物を添加する前に、ヘパリンが細胞培養培地に直接添加されていたが、この従来の方法を使用することでフィブリノゲンが枯渇するという証拠は示されていなかった。たとえば、Ｓｃｈａｌｌｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００８），１４（３）：１８５−９６を参照されたい。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本開示は、補体が実質的に枯渇している血小板溶解物の組成物に関する。補体の枯渇は、本明細書に記載するとおり、複数の方法で実現することができる。この枯渇ゆえの１つの用途は、ヒト血小板溶解物が非ヒト細胞に対してもちうる、補体の媒介によるいかなる免疫反応のリスクも最小限に抑えながら、実施形態を非ヒト細胞で使用することができる、ということである。
【００２９】
通常、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）は抗凝固剤として使用される。たとえば、米国公開特許出願第１２／４４１，８７０号明細書（ＡＣＤは「重要な血液抗凝固剤」と記載されている）を参照されたい。カルシウムの有効性を減少させることによって、ＡＣＤは、これが依拠するカルシウムの凝固機序を取り去る。たとえば、Ｒｅｉｃｈ−Ｓｌｏｔｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒ，（２００９），２４（６）：２６５−８を参照されたい。正常な細胞活動で使用するためのカルシウムもＡＣＤによって減少するため、潜在的毒性を示す。本開示ではヘパリンが抗凝固剤として使用され、これにより、潜在的に毒性の、ＡＣＤのカルシウム枯渇による影響を回避する。カルシウム塩、理想的にはＣａＣｌ２などの塩を添加すると、シトラート毒性をさらに中和し、血小板溶解物のカルシウムを再び増加させる。いくつかの実施形態では、ＣａＣｌ２は、緩衝液、たとえばＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ中に溶解される。いくつかの実施形態では、ＣａＣｌ２は、約ｐＨ７．４の滅菌の等張電解質溶液中に溶解される。ある実施形態では、ＡＣＤ（カルシウムをキレートする抗凝固剤）の除去は、本明細書で開示する方法の一部である。カルシウムキレート剤は細胞培養物に有害であり、カルシウムを適切に供給すると、最適な機能が得られる。さらに、ヘパリンが誘導する成長因子の安定化および生成物の清澄性は、本開示で具現化される成果である。ある実施形態では、本明細書で開示する方法は、ＡＣＤの使用を必要としない。
【００３０】
フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物（ＦＤ−ＰＬまたはマルチプレートＦＤ）は、未加工の血小板溶解物と比較して優っている。利点には、以下の発見が含まれるが、これらに限定されない。マルチプレートＦＤは、ＭＳＣを増幅させることにおいて未加工の血小板溶解物およびＦＢＳより優れている、マルチプレートＦＤは非異種である（すなわち人獣共通感染症またはプリオンの感染のリスクがない）、マルチプレートＦＤは培養培地中にヘパリンを追加する必要性がない、マルチプレートＦＤは、線維の鎖状体が培地中に形成してＭＳＣ単層に付着するリスクを回避する（すなわち微小血管または大血管の閉塞のリスクを低減する）、マルチプレートＦＤは、自己免疫および同種免疫治療用のＭＳＣの作製において、安定性に関して未加工の血小板溶解物より優れている、マルチプレートＦＤは、ウシ胎仔血清を使用する際にみられる免疫抑制特性を保持し、複数の系列および種由来の細胞を増幅するため、未加工の血小板溶解物より用途が広い。
【００３１】
本開示に記載する実施形態は、再生医療、免疫治療、生物活性因子の放出、がん、および他の関連分野の臨床処置に適用することができる。
【００３２】
血小板溶解物中のタンパク質含有量の分析
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｃ  Ｓｅｒｉｅｓ４０００を使用して、約１７４のタンパク質の相対的発現レベルを比較した。タンパク質は、４つの溶液（ヒト血清、乏血小板血漿、未処理の血小板溶解物（ｐｈＰＬ）およびフィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物（ＦＤ−ＰＬ））のうち少なくとも１つに検出された。１１６のタンパク質のうち、８７をＦＤ−ＰＬ中に検出することができ、一方ｐｈＰＬ中には１１３のタンパク質が検出可能であった。血清中には６７が検出され、ＰＰＰ中には６０のタンパク質が検出された。すべての試料中で最も豊富なタンパク質は、主として、ＭＳＰ−α、ＡＣＲＰ３０、アンギオゲンニン（ＡＮＧＩＯＧＥＮＮＩＮ）およびＲＡＮＴＥＳであった。マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ−α鎖）は、別名ＨＧＦ様タンパク質（幹細胞成長因子様タンパク質）およびＭＳＴ１（マクロファージ刺激１）である。これは７０ｋＤａのジスルフィド結合したヘテロ二量体（４７および２２ｋＤａのサブユニット）であり、活性化すると、ＣＤ１３６を介してシグナル伝達する。３０ｋＤａの脂肪細胞補体関連タンパク質（ＡＣＲＰ３０）は、アディポネクチンと構造的に同一であり、強力なインスリンエンハンサーである。アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）も、肝臓によって産生される豊富な血漿タンパク質であり、血管新生および抗炎症の両特性を有することが示されている。ＲａｎｔｅｓすなわちＣＣＬ５は、主として走化性サイトカインとしての活性で知られているが、直接的な抗ウイルス剤として宿主防御における潜在的な役割をもちうる。各々またはこれらのタンパク質は正常な血漿の成分と考えることができるため、これらのレベルが、試験した種々の溶液間で類似していても驚くことではなかった。したがって、比率分析を、血清対ＰＰＰ、ＦＤ−ＰＬ対ＰＰＰ、およびｐｈＰＬ対ＰＰＰ間で実施して、血小板の脱顆粒／凝固または溶解によってどの因子が放出または枯渇されるのかを判定した。６のタンパク質がＦＤ−ＰＬ中で相対的タンパク質発現の増加を示したが、３７のタンパク質が低減した。特に注目されるのは、ｐｈＰＬと比較した際のＦＤ−ＰＬ中のレプチン、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢのレベルの増加、ならびにいくつかのＭＭＰ、炎症性ケモカインの減少であった。
【００３３】
別の分析では、正常なヒト血清、乏血小板血漿、未処理の血小板溶解物（ｐｈＰＬ）およびフィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物（ＦＤ−ＰＬ）にトリプシン消化を施し、質量分析法を使用してタンパク質発現を分析した。アポリポタンパク質が、検出されたタンパク質のうち最も出現度が高いファミリーであり（Ｎ＝３）、これに続くのが補体カスケードの構成員であった（Ｎ＝６）。ＥＬＩＳＡデータを確認すると、ＭＳ−分析は、血小板溶解物の作製プロトコールがフィブリノゲンを枯渇させることを示していた。ＦＤ−ＰＬ中で、フィブリノゲンレベルはｐｈＰＬと比較して少なくとも１０倍低減しており、ｐｈＰＬのフィブリノゲンレベルは乏血小板血漿より血清でのレベルに類似している。作製プロトコールは、補体４、補体Ｃ１ｓ副成分、および補体因子Ｂも選択的に枯渇させるが、これらはｐｈＰＬおよびＰＰＰには保持されている。血清およびＰＰＰの両者と比較して、血小板溶解物（ｐｈＰＬおよびＦＤ−ＰＬ）は、検出可能なレベルの、アクチン、フィラミン、タリンおよびザイキシンのような、いくつかの細胞骨格タンパク質および細胞骨格関連のタンパク質を含有する。ＰＬは両者とも検出可能なレベルのチモシンβ４を含有し、ＦＤ−ＰＬはｐｈＰＬの約２倍の量のＴｈＢ４を有する。さらに、ＦＤ−ＰＬは、ヘモペキシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩ、α−２−マクログロブリンおよびα−１Ｂ−糖タンパク質を含む因子が枯渇されているが、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、アポリプロタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｌ１、クラスタリン／アポリポタンパク質Ｊおよび血小板塩基性タンパク質については増強されている。
【００３４】
補体およびＭＭＰの枯渇に加えて、フィブロゲン（Ｆｉｂｒｏｇｅｎ）およびフィブリンの枯渇は、ＦＤ−ＰＬの生成物の安全性を高める。フィブリノゲンはフィブリンに転換される。フィブリンは炎症を誘発すると報告されている。Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９８５，４（５）：５３７−５３を参照されたい。フィブリンは、ＣＥＣにＩＬ−８を産生させることができる。Ｒａｍｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９４，３５（１２）：３９８０−９０およびＤｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０００，４１（１）：６７−７２）を参照されたい。さらに、フィブリノゲンはＴＬＲ４によって単球に直接シグナル伝達して、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＩＰ−２を増加させることができる。Ｓｍｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６７（５）：２８８７−９４およびＳｉｔｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：１４６２&#8211;１４７０，１９９８を参照されたい。このため、好中球の表面のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のα−サブユニットに結合し、これによりＥｒｋシグナル伝達経路が活性化されることによって、好中球の炎症反応が長引く可能性がある。Ｒｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２００２&#8211;２０１０，２００１を参照されたい。最後に、吸着したフィブリノゲンは、多くの移植された材料に対する急性炎症反応の原因となる血漿の主要な成分であることが示されている。Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：２１４７&#8211;２１５６，１９９３を参照されたい。したがって、本発明者らの血小板溶解物からフィブリノゲンを枯渇させると、この生成物が、培養において細胞（ＴＬＲ４を発現するＭＳＣのような）に悪影響を及ぼす可能性が減り、この生成物を患者に直接局所適用するためのより優れた安全性プロファイルを産み出す。
【００３５】
治療の適応症
ある実施形態において、本開示は、本明細書に含まれるフィブリノゲンを枯渇させた血小板ライステート（ｌｙｓｔａｔｅ）の組成物を、直接、または凍結乾燥すなわちフリーズドライなどのプロセスによって水を枯渇させて使用して、細胞培養物に添加することができる無水生成物および薬学的に許容される添加剤を提供すること、および本明細書で提供される治療適用に使用することができることを企図している。
【００３６】
ドライアイは、造血幹細胞移植後の慢性移植片対宿主病に伴う主要な合併症である。Ｐｅｚｚｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｂｍｔ．２０１２．６４では、自家血小板溶解物を眼のＧｖＨＤの処置に使用することができると報告された。ある実施形態において、本開示は、有効量の、本明細書で開示するフィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物の組成物を対象の眼に投与することを含むドライアイの処置に関する。
【００３７】
Ｓａｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２０１２，４２６（１−２）：１−６では、血小板溶解物を含有する点眼剤が角膜潰瘍の処置に有用であると報告された。ある実施形態において、本開示は、有効量の、本明細書で開示するフィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物の組成物を対象の眼に投与することを含む、角膜の疾患または状態の処置に関する。
【００３８】
ＦＤ−ＰＬおよびｐｈＰＬには複数の類似点があるが、本発明者らの作製手順により、ＦＤ−ＰＬを特異な生成物にする、複数のタンパク質の選択的な枯渇および蓄積がある。特に注目されるのは、ＦＤ−ＰＬは、ＴＢ４（血管新生、生存促進および抗炎症特性を有し、現在、眼の組織再生の臨床評価がなされている因子）の量を増加させたという事実である。
【００３９】
Ｒａｎｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００９，１３（８Ｂ）：２０３０−８では、血小板溶解物がヒト線維芽細胞の引っ掻き創傷閉鎖を促進すると報告された。ある実施形態において、本開示は、創傷治癒用途用の、フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物の組成物または成分の使用に関する。ある実施形態において、本開示は、フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物成分を含む組成物を、対象に、または対象の創傷のある部位に、投与または適用するステップを含む、創傷を処置する方法に関する。医薬組成物は、フィブリノゲンを枯渇させた血小板溶解物の組成物を含有するローションもしくは油または水性溶液の形態とすることができる。
【００４０】
用語
本明細書で使用する場合、用語「細胞培養培地」とは、哺乳動物の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を助けることができる任意の培地を意味する。標準的には、これは、アミノ酸、１種または複数種の抗生物質、ビタミン、塩およびグルコースを含有する約ｐＨ７．４の等張液を含む。これらの基準のいくつかまたはすべてを含有する培地の例には、ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「ヘパリン」とは、抗凝固特性を有する任意の種々の硫酸化多糖類、断片および誘導体を意味する。標準的には、ヘパリン類組成物は、分子量約３ｋＤａ〜約３０ｋＤａの範囲の混合物である。ヘパリンは、酵素阻害剤アンチトロンビン（ＡＴ）に結合する。結合すると、ＡＴは構造変化を起こし、活性化する。活性化したＡＴは、トロンビンおよび他のプロテアーゼを不活化することができる。これはトロンビンがフィブリノゲンをフィブリンに転換するのを防止し、それにより、凝固プロセスを中断する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「ＭＳＣ」とは、間葉系幹細胞、または間葉系間質細胞として知られているものを意味する。ヒトＭＣＳは、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６およびＣＤ１６６を含む表面マーカーによって、通常、確認される。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織または血液など、身体内の複数の部位から得ることができる多能性細胞である。ＭＳＣは、本開示に記載する実施形態を使用して増殖されることになる典型的な細胞型であるが、唯一の型というわけではない。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＤＧＦ」とは血小板由来成長因子を意味する。ヒト血小板溶解物中には、複数の型のＰＤＧＦ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＡＡ６０５５２．１）があり、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＣＡＡ４５３８３．１）が含まれる。３つのＰＤＧＦアイソフォームのすべてがＰＤＧＦＲαに結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢはＰＤＧＦＲβに結合する。ＰＤＧＦＲは両者ともチロシンキナーゼ受容体である。ＰＤＧＦＲは、ＰＤＧＦが結合するとリン酸化する。次にこれがキナーゼ触媒活性を刺激し、さらにはＳＨ２を含有する下流のシグナル伝達分子との結合部位を形成する。Ｈｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ，（１９９９），Ｏｃｔ；７９（４）：１２８３−３１６を参照されたい。ＰＤＧＦがＰＤＧＦＲに結合すると、多くの生物学的効果を誘導することができる。ＰＤＧＦは、多種多様な生物学的機能を有する。ＰＤＧＦは胚発生に不可欠であり、中枢神経系の発育に関与し、間質液圧を維持し、血管系に血管新生効果を有し、創傷治癒の速度を速めることが指摘されている。ＰＤＧＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ヒト血小板溶解物の成分として、細胞、とりわけＭＳＣを増殖させるために、ＦＢＳの実現可能な代替物であると指摘されている。たとえば、Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅｓ  ｏｎ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，（２０１０），１２（７）：８８８−９８を参照されたい。十分な配列相同性および機能的属性があれば、ＰＤＧＦという用語は、いかなる特定の配列にも限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：回収およびフィブリノゲンの枯渇のためのＰＬの作製
カルシウムキレート剤として作用する体積約１０％のシトラートを血小板フェレーシス生成物（ｐｈＰＬ）に添加して、患者に注入する前に、不注意による生成物の凝固を防止する。カルシウムを再び増加させるステップをｐｈＰＬの作製プロセスに挿入することを試験して、より安全で均一な生成物が生成されるかどうかを評価した。このため、複数の濃度の塩化カルシウムおよび複数のインキュベーション時間を評価した。
この試験中に以下の条件を評価した。
１．ＰＬ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２、室温（１  １２時間）
２．ＰＬ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３７Ｃ（１〜１２時間）
３．ＰＬ＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、室温（１〜１２時間）
４．ＰＬ＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、３７Ｃ（１〜１２時間）
５．ＰＬ＋１６ｍＭ  ＣａＣｌ２、室温（１〜１２時間）
６．ＰＬ＋１６ｍＭ  ＣａＣｌ２、３７Ｃ（１〜１２時間）
７．ＰＬ＋２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、室温（１〜１２時間）
８．ＰＬ＋２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、３７Ｃ（１〜１２時間）
【００４５】
この試験で得たデータは、５ｍＭのＣａＣｌ２はいずれの温度でも血餅を形成することができないことを示すものであった。１２時間、１０ｍＭのＣａＣｌ２、３７Ｃでは血餅を形成することができたが、この血餅はほぼ完全に凝固しており、上清をほとんど回収できなかった。これより高濃度のＣａＣｌ２でも、１時間より長くインキュベートした場合に、概して完全に硬質の血餅が形成された。次の実験では、ＣａＣｌ２濃度を６〜１０ｍＭの間で評価した。凝固が発生した場合、概して速やかに発生し、完全に凝固した。さらに、血餅の形成を開始するのにどの濃度のＣａＣｌ２が必要であるかについては、バッチ間でばらつきがあった。
【００４６】
このプロセスをさらに改良するために、１）ヘパリンを濃度２Ｕ／ｍＬで添加して凝固の進行を制御し、２）ＣａＣｌ２をｐｌａｓｍａｌｙｔｅ対水中に溶解して安定性を高め、３）凍結融解を２回実施して血小板膜溶解を増加させ、４）室温または３７で１時間、次いで４Ｃで終夜、血餅を形成させた。未改変のｐｈＰＬを細胞培養培地に入れて希釈すると、基本培地中に存在するカルシウムはシトラートのキレート能力を封じるのに十分であり、このため遊離のフィブリノゲンがフィブリンに転換し、続いて融合して血餅を形成することができる。
【００４７】
最初の実験の群５〜８を使用した。すべての群に、ある程度の血餅の形成が見られ、４℃で終夜溶液をインキュベートすると血餅が安定化した。最初の実験と比較すると、施した改変により、翌日溶液を回転させ、溶液の大部分（すなわち７０〜８０％）を回収することができた。これに対してＣａＣｌ２濃度がより高い最初の実験では、回収率はほぼ２０％であった。ヘパリンを溶液に添加したことによって、残余のフィブリノゲンの一部が残っていたが、これは続くゲル形成を発生させるには十分ではなかった。凍結融解を２回行った結果、ＰＤＧＦ−ＢＢのような成長因子を放出したことが明らかになった。これらの実験に基づいて、２回の凍結融解手順に続いて、２Ｕ／ｍＬのヘパリンの存在下での２０ｍＭのＣａＣｌ２の適正を再評価した。次いで精度を確立するため、このプロセスを、複数の作製ランで予め形成した。ＦＤ−ＰＬの生成物については確実に生成することができ、これにより、フィブリノゲンの含有量は４ｕｇ／ｍｌ未満でバッチ間のばらつきは約１２％となった。未加工のｐｈＰＬのフィブリノゲンの含有量は通常で６０μｇ／ｍＬであった。特に注目されるのは、フィブリノゲンが減少しても、ＦＤ−ＰＬおよびｐｈＰＬは、ＥＬＩＳＡで測定すると、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦおよびＢＤＮＦのような望ましい成長因子を同様のレベルで含有しているという事実である。図１を参照されたい。
【００４８】
凍結ヒト血小板フェレーシス生成物からのＦＤ−ＰＬ（マルチプレートＦＤ）の標準的なＧＭＰ調製を以下に示す。約５人のヒトドナーによる再検査済み期限切れ血小板フェレーシス生成物をフリーザーから取り出し、４℃で終夜融解した。次に、試料をｃＧＭＰのクラス１０，０００のクリーンルームに移して−２０℃で再凍結した。各試料から小アリコートを微生物学的試験用に取り出した。次いで、汚染のない試料とアリコートを４℃で終夜融解した。次にＣＯＢＥ細胞処理装置を使用し、試料を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞片を小球状にした。次いで、各試料の上清を４０μｍフィルターに通過させ、次いで一緒に貯留した。次いで、この貯留した試料の濾液を２５０ｍＬの遠心分離管に入れ、４℃にて３０００ｇで１５分間遠心分離して残余の細片をいずれも小球状にした。次いで、得られた貯留試料の上清に、日付に基づく８桁のＩＤを付与した（たとえば２０１０年１２月１３日＝１３１２２０１１）。次いで、１６〜２０ｍＭのＣａＣｌ２（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａに溶解した）を添加してカルシウムを再び増加させ、試料中のシトラート含有物を中和した。次いで、１．５〜２．５Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのヘパリン（１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬストック）を試料に添加してこのプロセスを調整した。試料を可視の血餅が出現するまで３７℃＋／−２℃で２〜４時間保持した。次いで、試料を血餅のサイズが安定化するまで４℃で１６〜２４時間置いた。試料を１５分間３０００ｇで遠心分離した。次いで、試料を０．２ｕｍ濾過に通して浄化した。次いで、試料を４℃または−８０±１０℃もの低温のいずれかで凍結して保管した。凍結した場合、貯留試料の小アリコートを、マイコプラズマ滅菌試験およびフィブリノゲン／ＰＤＧＦの定量用に取り出した。マイコプラズマ検出が陰性、フィブリノゲン濃度が２μｇ／ｍＬ未満、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度が１５ｎｇ／ｍＬより高かった場合に、試料を認可した。
【００４９】
実施例２：フィブリノゲンレベルの最適な低減は、生化学的因子または成長因子、サイトカインまたはケモカインを実質的には変化させない。
融解した血小板単位を４０μｍのＰＡＬＬ輸血フィルター（ＰＡＬＬ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ，ＩＮＣ、プエルトリコ、Ｆａｊａｒｄｏ）に個別に通過させて濾過し、回収袋に貯留した。貯留した濾過済みの溶解物を、ラベルをつけた２５０ｍｌの円錐管（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、米国、マサチューセッツ州、Ｌｏｗｅｌｌ）に均等に小分けし、室温にて２０分間４６００ｒｐｍで回転させた。回転した溶解物を再濾過し（４０μｍ）、ラベルをつけた新たな２５０ｍＬ円錐管に小分けし、０．２μｍで漸次濾過した（未改変のＰＬ）。次いで、未改変の血小板溶解物のアリコートを種々の濃度のＣａＣｌ２と組み合わせ、特定の温度で時間を変えてインキュベートした。好ましい製剤は、血小板単位を２回凍結融解し、次いで２Ｕ／ｍｌのヘパリンスルファートと組み合わせて２０ｍＭのＣａＣ１２でカルシウムを再び増加させ、次いで３７℃＋／−２℃で２時間インキュベートして、血餅を形成させるものであることがわかった。この後、４℃で１６時間インキュベートして血餅のサイズを安定化させた。この手順によってフィブリノゲンを１５０倍より多く低減することができ、バッチ間のばらつきは約１０％であった。生化学的見地では、ＣａＣｌ２をマルチプレートＦＤに添加すると、容量オスモル濃度ならびにカルシウム濃度および塩化物濃度が、未加工の血小板溶解物より高くなるが、他の多くの因子、すなわち、Ｎａ、Ｋ、グルコース、総タンパクおよびアルブミンのレベルは未改変のＰＬとマルチプレートＦＤとで大して差異はなかった。
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【００５０】
血小板溶解物は、通常の血小板脱顆粒放出生成物のみならず、通常は放出されない細胞内の成分も含有するという点で、血清および血漿の両者とは異なる。さらに、血小板溶解物は、通常の血漿または血清と比較して、多分に高濃度の血小板を含有し、したがって、放出因子の濃度はかなり高いものとなる。乏血小板血漿（ＰＰＰ）中に行き渡っているサイトカインおよび成長因子の大まかな概観を得るために、血清および血小板溶解物ならびにマルチプレートＦＤを、タンパク質アレイスクリーニング技術で使用した。この技術はサンドイッチ免疫測定法の原理に基づいている。抗体パネル（捕捉体）を膜表面の特定の点位置に固定した。生体試料とともにアレイ膜をインキュベートすると、対応する抗体によりサイトカインが捕捉される。結合したサイトカインは、ビオチン化抗体カクテルで検出される。次いで、シグナル伝達が化学発光を使用して可視化される。ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｃ４０００を使用すると、１７４のサイトカインを同時に検出することができた。作製プロトコールに従って、α−ＭＥＭ培地中で希釈した、ＰＰＰ、血清または血小板溶解物およびマルチプレートＦＤについて、膜を同等の量の総タンパクとともにインキュベートした。
【００５１】
これらのアレイを使用すると、いくつかのタンパク質が群間で同様に発現したが、場合により、血小板溶解物およびマルチプレートＦＤは、いくつかのタンパク質について他より高発現を示した。特に注目されるのは、血清およびＰＰＰに対してＰＬに見られた、高レベルのタンパク質、たとえば３つのすべてのＰＤＧＦアイソフォーム、ＥＧＦおよびＢＤＮＦ、ならびにプロテアーゼ阻害剤、たとえばＴＩＭＰ−１およびＰＡＩ−１である。アレイのデータを確認し、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＢＮＤＦ、ＴＧＦ−ｂ１およびＶＥＧＦのレベルを、ＰＰＰ、血清、血小板溶解物およびマルチプレートＦＤにおいて分析した。ＰＰＰおよび血清の両者と比較して、マルチプレートＦＤおよび血小板溶解物ｐｈＰＬは、各サイトカインについて濃度が高かった。平均すると（Ｎ＝３バッチ）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−ｂ１またはＢＤＮＦのレベルには、マルチプレートＦＤとＰＬとの間で統計的な差異がなかったが、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＴＧＦ−ｂ１のレベルに関するバッチ間のばらつきでは、ＰＬと比較してマルチプレートＦＤの方が低かった。血小板溶解物からフィブリノゲンを枯渇させると、精度に関してより信頼度の高い生成物が得られる。
【００５２】
実施例３：マルチプレートＦＤは、未加工の血小板溶解物（ｐｈＰＬ）より安定性が高い。
ＭＳＣにｐｈＰＬを成長添加剤として使用する計画が報告されている。しかし、ｐｈＰＬを成長添加剤として使用する培養物は、フィブリンのゲル形成を防止するためにヘパリン（通例２Ｕ／ｍｌ）を添加することを含む。フィブリノゲンを枯渇させていない血小板溶解物（ｐｈＰＬ）を処理した際に、溶液を作製して０．２μｍで濾過すると、目視では透明で、目立った細片を含有しないが、凍結して再融解または４℃で保管すると、新たな沈殿物がこのｐｈＰＬ中に形成することが観察された。これが経時で蓄積して溶液を混濁し、これは遠心分離だけでは除去することができず、通常、再濾過が必要になる。したがって、ＦＤ−ＰＬが類似の沈殿物を蓄積しやすいのかどうかについてよりよく理解するために、ｐｈＰＬおよびＦＤ−ＰＬを同一の血小板フェレーシスの貯留物から作製した。生成物を、使用するまで−３０℃で凍結した。次いで、ｐｈＰＬおよびＦＤ−ＰＬのアリコートを４℃で終夜融解し、３０００ｘｇで１０分間遠心分離して寒冷沈降物を除去し、０．２μｍで濾過し、その直後、または４℃で２４時間もしくは７日間保管後に粒子分析を実施した。
【００５３】
ｐｈＰＬおよびＦＤ−ＰＬについて、Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用して粒子分析を実施し、前方および側方散乱信号を使用して粒子径、存在量および粒度を推定した。ＦＳＣおよびＳＳＣのレーザー出力を対数目盛で設定し、すべての径の粒子が確実に記録されるように設定した。粒子の相対的定量化を得るために、データ取得収集を、各試料につき厳密に１５秒間に設定した。濾過直後は、ｐｈＰＬおよびＦＤ&#8211;ＰＬは両者とも、検出された細片は少量であり、ＦＤ−ＰＬでは経時で目立った変化はなかった。逆に、濾過の２４時間後でさえ、ｐｈＰＬは粒子数および粒子径の増加を示し、見た目には７日間継続した。顕微鏡分析により、７日間でＦＤ−ＰＬは細片を実質的に含まなかったが、ｐｈＰＬは種々の径の粒子を含有するという同様の観察結果を示すことができた。図２を参照されたい。開示する作製プロセスを使用すると、含有する細片が著しく少なく、安定性がより高い血小板溶解物の生成物を生成することができる。
【００５４】
未加工のものおよびマルチプレートＦＤを、同一の５人のドナーによる血小板フェレーシス生成物の貯留物から作製した後、アリコートを−８０℃で１か月凍結した。次に、アリコートを４℃で終夜融解し、３０００ｘｇで回転して寒冷沈降物を除去し、次いで０．２ｍｍで漸次濾過した。濾過後、無希釈のまたは希釈した（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ中２０％）血小板溶解物およびマルチプレートを、フローサイトメトリーで細片について直ちに分析し、その後４℃で保管し、引き続き４日間毎日分析した。濾過直後には、血小板溶解物およびマルチプレートＦＤの両者とも、無希釈のおよび希釈した試料の両者に類似の量の細片があるが、２４時間後までに、マルチプレートＦＤと比較して、血小板溶解物には細片形成の著しい進行性の蓄積があった。フローサイトメトリー分析と一致して、細片の蓄積を可視化すると、マルチプレートＦＤには、細片の蓄積が血小板溶解物より劇的に少なく、著しく小さいことが示されている。血小板溶解物では、細片は経時で凝集するようであり、３日目までにこの凝集体は５〜１０μｍの範囲の径に到達する可能性があるが、一方、細片は凝集しないようであり、概して２μｍ未満である。
【００５５】
実施例４：マルチプレートＦＤは、ＦＢＳおよび未加工の血小板溶解物よりＭＳＣ増殖速度が速く、免疫表現型および免疫抑制特性を維持する。
自家および同種ＭＳＣは、虚血および免疫調節異常の両方に関与する状態を処置することが報告されている。ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞操作の大部分は、ＭＳＣを接着培養物中で増殖させるためにウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に依拠してきた。ＦＢＳは異種であるため、これに曝露された細胞は、免疫原性をもつようになる可能性があり、ＦＢＳで培養された細胞を反復投与すると、患者に有害反応が生じる可能性があると報告されている。このため、ＭＳＣは、ヒト血清および多血小板血漿を含む、ヒト由来のＦＢＳの代替物中で培養されている。ＦＢＳをヒト血小板由来成長因子（ヒト血小板溶解物、ｈＰＬの形態で）に置換すると、ＭＳＣの成長を促進することができると報告されている。
【００５６】
成長添加剤としての機能がＦＤ−ＰＬ中に保持されているかどうかを評価するために、一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実施して、ＦＤ−ＰＬの生成物をｐｈＰＬと比較した。間葉系の系列、内皮および上皮の系列からの初代細胞を試験した。間葉系細胞を健常な志願者の骨髄から単離し、継代まで増幅させた。継代後、２つの間葉系間質細胞の調製物を、ＦＢＳ、ｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬを伴う培地を含有する組織培養フラスコ中に１０００細胞／ｃｍ２で播種した。次いで、ＭＳＣを３日間成長させ、収集し、細胞数を計数した。次いで、集団倍加時間（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を計算した。ｐｈＰＬおよびＦＤ−ＰＬの両者とも、倍加時間を著しく短縮することができた。互いを直接比較すると、ＦＤ−ＰＬ中で増幅されたＭＳＣは、ｐｈＰＬ中のＭＳＣと比較して倍加時間がより短かった（図３）。表現型の上では、ＦＢＳ、ｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬの中で成長させたＭＳＣはすべて、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＨＬＡ−Ｉ、ＣＤ１０５を含むＭＳＣの典型的なマーカーを発現し、ＣＤ４５もＣＤ１１ｂもＣＤ３４もＣＤ１９も発現しなかった。これらの実験は、ＭＳＣの成長は、ＦＢＳおよびｐｈＰＬの両者と比較して、ＦＤ−ＰＬ中でより速く、これはＭＳＣの免疫表現型に悪影響を及ぼすものではないことを示している。
【００５７】
ＭＳＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化および増殖させると報告されている。ＭＳＣがＴ細胞の増殖に影響を及ぼすとされている１つの機序は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるものである。ＩＤＯは、必須アミノ酸Ｌ−トリプトファンの分解を触媒してＮ−ホルミルキヌレニンにする免疫調節酵素である。ＩＤＯは、キヌレニン経路によるトリプトファン異化の最初の酵素であり律速酵素である。局所的にトリプトファンが枯渇するとＴ細胞の成長が阻止されることが示されている。刺激を与えないＭＳＣはＩＤＯを発現しないが、ＩＤＯの遺伝子発現は、ＩＮＦ−γのような炎症性サイトカインによって急激に増加する。ＩＤＯ発現を上方制御するＭＳＣの能力は、Ｔ細胞の増殖を抑制するＭＳＣの能力と相互に関連している。
【００５８】
ｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬの中で成長させたＭＳＣが、炎症性刺激に対してＩＤＯを上方制御する能力に影響を及ぼすかどうかを評価するために、骨髄由来のＭＳＣ集団をｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬ中で２継代（すなわち２週間）増殖させた。各集団を６ウェルプレートに密度１００，０００細胞／ウェルで播種し、終夜置いた。翌日、ＭＳＣを、それぞれの培地中で４時間、５ｎｇ／ｍｌのＩＮＦ−γで刺激するか、または刺激しないまま放置のいずれかとした。細胞を洗浄し、ｂ−メルカプトエタノールを伴うＲＬＴ緩衝液に溶解し、ＲＮＡを抽出するまで−８０℃で保管した。ＤＮＡを含まない全ＲＮＡを抽出し、記載したとおり逆転写した。リアルタイムｑＰＣＲアッセイを、ＡＢＩ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムサーマルサイクラーおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ヒトプライマー配列（５’３’順方向、逆方向）を使用して、ＩＤＯおよびｂ−アクチン（ハウスキーピング遺伝子）について、２通り実施した。リアルタイムＰＣＲ分析では、ｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬのいずれかの中で成長させた刺激を与えないＭＳＣにはＩＤＯの遺伝子発現量があまりないが、両方の培地中のＭＳＣにおいてＩＤＯの発現を増加させるのに十分なＩＮＦ−γでの４時間の刺激が示された。図４を参照されたい。
【００５９】
実施例５：ＦＤ−ＰＬはｅｘ  ｖｉｖｏでＴ細胞の増殖を抑制する。
ＣｏｎＡは、Ｔ細胞に結合し、非特異的に活性化するレクチンである。ＰＨＡおよびＰＭＡは、細胞中の多くの増殖シグナル伝達経路を活性化することができるホルボールエステル化合物である。Ｔ細胞に特異的なＣＤ３／ＣＤ２８刺激プロトコールを利用した。蛍光マーカーＣＦＳＥで標識した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＣＤ３／ＣＤ２８刺激を使用すると、フローサイトメトリーを使用して、シグナル強度の相対的な減少を基に、Ｔ細胞の増殖を追跡することができ、次いで、活性化したＴ細胞の増殖に処置が影響を及ぼすかどうかを評価することができる。
【００６０】
ＭＳＣを使用してまたは使用せずにＰＢＭＣ増殖アッセイを実施した際、ＰＢＭＣ単独を、ＦＢＳを伴う１０％ＲＰＭＩ中で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した場合、Ｔ細胞は活発に増殖したが、ＦＢＳをＦＤ−ＰＬで置換した場合、刺激したＰＢＭＣは増殖しないことが観察された。３つの個々の実験の分析から、血清と比較して、ＦＤ−ＰＬは、刺激したＰＢＭＣにおけるＴ細胞の増殖反応を、ＦＢＳと比較して４．７倍抑制することができたことがわかる。
【００６１】
ＰＢＭＣ応答細胞はリンパ球および単球（通常４：１の比率で）を含むリンパ骨髄系細胞の異種混合物を代表するため、次の一連の実験を実施して、ＦＤ−ＰＬがＴ細胞または単球に直接作用したのかどうかを判定した。免疫磁気分離法を使用して、負の選択を実施し、高純度のＴ細胞および単球の集団を取り出し、未分画のＰＢＭＣと比較した。ＰＢＭＣ単独を血清中で刺激した場合、Ｔ細胞は活発に増殖したが、ｐｈＰＬ中では増殖は鈍かった。驚いたことに、Ｔ細胞単独を刺激した場合、血清およびｐｈＰＬの両培養物中で増殖が発生した。したがって、ＦＤ−ＰＬはＴ細胞の増殖を直接的に抑制してはいないということが示されている。この仮説を確認するため、加減実験を実施し、Ｔ細胞に特定の濃度の単球を添加すると、ｐｈＰＬの条件で、Ｔ細胞増殖を用量依存的に低減することができることが示された。次に、血清、ｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬ（１０％濃度）の中で３日間培養した未標識のＰＢＭＣを使用して一連の実験を実施すると、ＦＤ−ＰＬのみが、ＣＤ１４陰性でＣＤ１１ｂおよびＣＤ３３陽性の単球集団の付着および増幅を促進することができ、血清またはｐｈＰＬを使用してもこれを容易に生成することができないことがわかった。図５を参照されたい。したがって、ＦＤ−ＰＬは、単球に対する独自の作用によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活発な抗炎症特性を有する。
【００６２】
実施例６：ＦＤ−ＰＬは、多くの細胞型をｅｘ  ｖｉｖｏで培養するための用途がより広い。
Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の凍結した初代ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）をその最適化した培地および成長添加剤カクテルで１継代増幅させた。継代して、ＨＣＥＣを種々の条件に置き、血清、ｐｈＰＬまたはＦＤ−ＰＬが、最適化した成長添加剤カクテルと置換することができるかどうかを判定した。ＨＣＥＣを６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルで播種し、培地には以下を含めた。
ａ）最適培地＋最適成長因子カクテル、
ｂ）最適培地＋同種血清、１、５および１０％濃度にて、
ｃ）最適培地＋同種ｐｈＰＬ、１、５および１０％濃度にて、
ｄ）最適培地＋同種ＦＤ−ＰＬ、１、５および１０％濃度にて。
【００６３】
３日培養した後、ＨＣＥＣを回収して、各条件について細胞数および生存率を分析した。図６を参照されたい。その結果、ＦＤ−ＰＬの濃度を高めるとＨＣＥＣの生存率が高まり、濃度を高めると用量依存性の増殖反応を生じさせうることが示された。ＨＣＥＣの増殖反応は５％濃度で最大であり、市販の成長因子カクテルと同等であった。逆に、血清および未処理のＰＬは両者とも、濃度を高めると生存率が低減し、濃度に関わらず、市販の成長因子カクテルに匹敵する増殖反応を生じさせることができなかった。したがって、ＦＤ−ＰＬは、血清またはｐｈＰＬと比較して、上皮細胞において、毒性プロファイルおよび機能的利用を向上させることを示した。
【００６４】
ＭＳＣを、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、未改変の血小板溶解物、またはＦＤ−ＰＬを含有する培地中で培養した。２ｕｎｉｔｓ／ｍＬのヘパリンを未加工の血小板溶解物を含有する培地に添加して、フィブリノゲンがフィブリンに転換するのを防止した。未加工の血小板溶解物およびＦＤ−ＰＬの両群におけるＭＳＣの増殖は、ＦＢＳ群におけるＭＳＣの増殖より優れていた。７２時間後。
【００６５】
種々の細胞型を、ＦＤ−ＰＬまたはｐｈＰＬを含有する培地中で培養した。ＦＤ−ＰＬおよびｐｈＰＬの両者とも、ヒト、ブタおよび霊長目由来のＭＳＣを成長させることができた。ＦＤ−ＰＬは、未分画の末梢血単核細胞から免疫抑制単球由来の細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで生成することにおいても、血清およびｐｈＰＬより優れていた。ＦＤ−ＰＬは、４Ｔ１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト角膜上皮細胞およびヒト内皮細胞を増殖させることもできたが、一方、ｐｈＰＬは、これらの細胞の増幅または生存を促進しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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