(57)【要約】  遺伝子突然変異、詳細には、一塩基多型（SNP）および／または体細胞突然変異を解析する方法、ならびに、１つの対立遺伝子型を他の対立遺伝子型と比べて選択的に増幅する方法が記載される。この方法は、第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度（Tm）で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接し、プローブおよび第一対立遺伝子のTmよりも高いTmでサンプルと結合する増幅プライマーを使用する。増幅反応は、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズし、それによって第一対立遺伝子を増幅できるような温度で実施されうる。増幅された配列は、増幅の間、ブロッキングプローブとして機能したものと同一のプローブを用いて検出されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第一対立遺伝子および第二対立遺伝子を有する遺伝子座の第一対立遺伝子を選択的に増幅ならびに検出する方法であって、
a）下記を含有する反応混合物、すなわち、
i）増幅されるべき遺伝子座に少なくとも相当する核酸を含有するサンプル；
ii）第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度（Tm）で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ；および
iii）核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記プライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接した第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー：サンプルのTmが、プローブ：第一対立遺伝子のTmより高い、プライマー；
を含有する反応混合物を用意するステップと；
b）反応混合物をプローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと；
c）反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、前記増幅が融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度が、プローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子とハイブリダイズし、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと； 
d）プローブ：第一対立遺伝子のTm以下の温度で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し；プローブ：第二対立遺伝子のTm以下の高温で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し；その２つを比較することによって、増幅された第一対立遺伝子を検出するステップ
とを含む方法。
【請求項２】
第一対立遺伝子が突然変異対立遺伝子であり、第二対立遺伝子が野生型対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融解段階の温度が、プライマー：サンプルのTmおよびプローブ：第二対立遺伝子のTmより高い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子座が、複対立遺伝子の遺伝子座であり；すなわち、その遺伝子座に存在しうる、野生型対立遺伝子および２つより多くの突然変異対立遺伝子がある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
プローブ：野生型対立遺伝子のTmがプローブ：突然変異対立遺伝子の任意のTmよりも低くなるように、前記プローブが選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
それぞれの存在しうるプローブ：対立遺伝子の組合せのTmが異なる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記のそれぞれの組合せのTmが、少なくとも0.1℃、好ましくは少なくとも0.25℃、より好ましくは少なくとも0.5℃、最も好ましくは少なくとも0.75℃異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが第二対立遺伝子の一方の鎖と完全に相補的である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第一対立遺伝子が、1つ以上の点突然変異によって第二対立遺伝子の配列と異なる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第一対立遺伝子が、複数の一塩基多型（SNP）によって第二対立遺伝子の配列と異なる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第一対立遺伝子が、１つ以上の欠失および／または挿入によって第二対立遺伝子の配列と異なる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブがDNAである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第一対立遺伝子と第二対立遺伝子との間の配列の違いが、プローブが結合する領域の内部にある、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが標識されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブが、プローブが標的鎖とハイブリダイズしているか否かよって異なるシグナルを生じる蛍光標識によって標識されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子座が複対立遺伝子であり、検出するステップが更に、反応混合物を1つ以上の中間温度に上昇させ、ハイブリダイズしたプローブ分子を各中間温度で検出することを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第一プライマーが、プローブ標的の3'側に結合し、第二プライマーがプローブ標的の5'側に結合する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
プライマーの一方が律速的な量で供給され、増幅反応が非対称PCRである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
標的遺伝子座が、KRAS、EGFR、またはBRAFヒト遺伝子から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
標的遺伝子座が、KRASのコドン12および13、KRASのコドン61、ならびにKRASのコドン146から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
標的遺伝子座が、EGFRのエクソン18、19、20、または21から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
標的遺伝子座が、BRAFのアミノ酸残基600、および対応するヌクレオチド残基である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
プローブ配列が、
KRASのコドン12および13を標的とする、5' AGTTGGAGCTGGTGGCGTAG 3'（HYB_KRAS_CD12/13、配列番号１）、
KRASのコドン61を標的とする、5' AGGTCAAGAGGAGTACAGTG 3'（HYB_KRAS_CD61、配列番号２）、
KRASのコドン146を標的とする、5' TGTAGTCGTTTCTGTTCTGT 3'（HYB_KRAS_CD146、配列番号３）、
EGFRのエクソン18を標的とする、5' GCTGGGCTCCGGTGCGTTCG 3'（EGFRX18_HYB、配列番号４）、
EGFRのエクソン19を標的とする、5' CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCC 3'（EGFRX19_HYB_DEL、配列番号５）、
EGFRのエクソン20を標的とする、5' CTACCGGTCGCACGGTCGCACCCTGTTGGGGGTGCACAC 3' (EGFRX20_HYB、配列番号６）、
EGFRのエクソン21を標的とする、5' TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG 3'（EGFRX21_HYB、配列番号７）、および
BRAFのアミノ酸600を標的とする、5' CTACAGTGAAATCTCGATGG 3'（BRAF_V600、配列番号８）
からなる群より選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号１から配列番号８より選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１から配列番号８より選択されるヌクレオチド配列からなる、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】
被験体からのサンプル中の体細胞変異を検出する方法であって、前記サンプルが少なくとも第一対立遺伝子および第二対立遺伝子を有する遺伝子座に由来する核酸を含有し、第一対立遺伝子は突然変異対立遺伝子であり、第二対立遺伝子は野生型対立遺伝子であって、前記方法が、
a）下記を含有する反応混合物、すなわち、
i）サンプル；
ii）第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度（Tm）で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ；および
iii）核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、そのプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接した第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー：サンプルのTmが、プローブ：第一対立遺伝子のTmよりも高い、プライマー；
を含有する反応混合物を用意するステップと；
b）反応混合物をプローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと；
c）反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、その増幅が融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度が、プローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子にハイブリダイズされ、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと；
d）反応混合物の温度をプローブ：突然変異対立遺伝子のTm以下に維持するステップと；
e）反応混合物の温度をステップd）の温度より高いが、プローブ：野生型対立遺伝子のTm以下に維持するステップと；
f）ステップd）およびe）においてハイブリダイズしたプローブを検出し、それによってサンプル中の突然変異対立遺伝子の有無を決定するステップ
とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子突然変異、詳細には、一塩基多型（SNP）および／または体細胞突然変異を解析する方法に関する。本発明の態様はまた、１つの対立遺伝子型を他の対立遺伝子型と比べて選択的に増幅する方法に関する。本発明の更なる態様は、遺伝子突然変異の解析に用いられる核酸プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
一塩基多型（SNP）は、個別化医療に対して大きな潜在的重要性を持つと考えられており、単一のアミノ酸変化を引き起こす特定のSNPは、特定の治療計画に対する患者の反応性に変化を生じさせる可能性がある。SNPはまた、特定のがん遺伝子を活性化する体細胞の突然変異を伴う、癌および他の細胞増殖性疾患の発症においても重要でありうる。
【０００３】
どのようなSNPが患者に存在するかを決定できることは重要である。二本鎖DNAの融解温度（Tm）は、塩基対ハイブリダイゼーションの程度に依存し、プローブと標的配列との間に（例えば、SNPの存在による）ミスマッチがあると、Tmは、ミスマッチのない場合と比較して異なるものである。SNPが存在する場合に、特定のオリゴヌクレオチドプローブと遺伝子標的との間のDNAハイブリダイゼーションの融解温度（Tm）の変化を検出することを含む方法が知られている。しかし、体細胞突然変異は、特定のサンプルにおいて、野生型配列が大部分を占め、突然変異配列がごくわずかなコピー数しか存在しない可能性があるという問題を抱えている。例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）型の技術によって、突然変異配列を選択的に増幅できることは、有用であろう。
【０００４】
米国特許第5,849,497号は、目的の領域にハイブリダイズするが、ハイブリダイズしない3’ミスマッチ塩基をもまた含むオリゴヌクレオチドブロッキングプローブを用いた、PCR増幅の特異的阻害について記載する。このミスマッチは、PCRの間の鎖の伸長を阻止する。この方法は、特異的な既知の配列の増幅を妨げるために有用であると言われている。この特許は、挿入された領域に対するブロッキングプローブを設計することによって、挿入配列を含む対立遺伝子の増幅を妨げる方法の使用を提案する。しかし、この特許は、他の対立遺伝子型と比べて１つのSNP変異を選択的に増幅するための方法を教示しない。更に、目的の標的配列を知っていることが必要である。
【０００５】
Benderら、Biotechniques 2007, vol 42, no 5, pp 609-614は、原核生物のRT-PCRにおいてDNAによってもたらされるPCR産物の形成を妨げるための、PNA（ペプチド核酸）ブロッキングプローブの使用を記載する。そのプローブは、mRNAから生成されるcDNAには存在しないゲノムDNA中の領域に結合するように設計され、従って、ゲノムDNAではなく、cDNAのみが増幅される。
【０００６】
VestheimおよびJarman, Frontiers in Zoology 2008, 5:12は、オキアミのDNA配列のPCR増幅を妨げ、オキアミの胃内容物サンプルから獲物のDNAの増幅を可能にするための、ブロッキングプライマーの使用を記載する。そのプライマーは、オキアミのrDNA配列に対して設計される。
【０００７】
変異型と野生型配列との両方を含むサンプルから、変異SNP配列が選択的に増幅され得る方法を提供することは、本発明の目的の範囲内である。更に、増幅された配列がSNPの含有量について解析され得る方法を提供することは、本発明の態様の目的の範囲内である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第一の態様では、少なくとも第一対立遺伝子および第二対立遺伝子を有する遺伝子座の第一対立遺伝子を選択的に増幅ならびに検出する方法が提供され、この方法は：
a）下記を含有する反応混合物、すなわち、
i）増幅されるべき遺伝子座に少なくとも相当する核酸を含有するサンプル；
ii）第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度（Tm）で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ；および
iii）核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、そのプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接した第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー：サンプルのTmが、プローブ：第一対立遺伝子のTmよりも高い、プライマー；
を含有する反応混合物を用意するステップと；
b）反応混合物をプローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと；
c）反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、その増幅は融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度は、プローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子にハイブリダイズされ、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと；
d）プローブ：第一対立遺伝子のTm以下の温度で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し；プローブ：第二対立遺伝子のTm以下の高温で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し；その２つを比較することによって、増幅された第一対立遺伝子を検出するステップ
とを含む。
【０００９】
このようにして、本発明は、第一対立遺伝子、例えば突然変異対立遺伝子が、第二対立遺伝子、例えば野生型対立遺伝子と比べて選択的に増幅されることを可能にする。更に、増幅された配列は、増幅の間にブロッキングプローブとして機能したものと同じプローブを用いて検出されうる。これは、手順を著しく簡素化する。
【００１０】
伸長段階およびアニーリング段階の温度は同じでもよいが、好ましくは異なる。融解段階の温度は、プライマー：サンプルのTmおよびプローブ：第二対立遺伝子のTmの温度より高くてもよい。しかし、これは必須ではなく、例えば、プライマー：サンプルのTmは、プローブ：第二対立遺伝子のTmより低くてもよく、この場合には、増幅反応の間を通してプローブが効率的に第二対立遺伝子とハイブリダイズし続けるように、融解段階は、これらの２つの値の間の温度であってもよい。
【００１１】
伸長段階の間、オリゴヌクレオチドプローブは、第二対立遺伝子とハイブリダイズし続ける。これは、同じ核酸にハイブリダイズしたプライマーの鎖伸長を妨げるが、第一対立遺伝子にハイブリダイズしたプライマーは、プローブがその対立遺伝子にハイブリダイズしていないため、自由に鎖伸長を受けることができる。このようにして、第一対立遺伝子は、選択的に増幅される。以下に記載されるように、特定の実施形態では、プライマーの一方または両方は、プローブが結合のためにプライマーと競合するように、プローブ結合部位と重複していてもよく、これは、プライマーの結合を妨げ、従って鎖伸長を妨げる。他の実施形態では、プライマーおよびプローブは重複しないが、プライマーは更なる鎖伸長を妨げる。
【００１２】
遺伝子座は、複対立遺伝子の遺伝子座でありうる。すなわち、その遺伝子座に、２つより多くの対立遺伝子が存在しうる。このような状況では、１つの対立遺伝子が野生型対立遺伝子を指してよく、その他は突然変異対立遺伝子である。プローブは、好ましくは、プローブ：野生型対立遺伝子のTmが、プローブ：突然変異対立遺伝子の任意のTmより低くなるように選択される。この方法は、存在する任意の突然変異対立遺伝子を選択的に増幅するために使用されうる。この方法が体細胞突然変異を調べるために使用される場合、これは特に有効であり、異なる細胞株に存在するいくつかの異なる突然変異が存在しうる。好ましい実施形態では、プローブ：対立遺伝子のそれぞれの起こり得る組合せのTmは異なる。好ましくは、Tmは、少なくとも0.25℃、より好ましくは少なくとも0.5℃、最も好ましくは少なくとも0.75℃異なる。これは、それぞれの対立遺伝子間で行われる精密な識別を可能にする。例えば、４つの対立遺伝子があり、２つだけを増幅しようとする場合、伸長温度は、プローブが他の２つの対立遺伝子とハイブリダイズするような適切なレベルに設定されうる。
【００１３】
プローブは、好ましくは実質的に、より好ましくは完全に、標的対立遺伝子の一方の鎖と相補的である。プローブは、第二対立遺伝子の一方の鎖と完全に相補的でありうる。第一対立遺伝子は、1つ以上の点突然変異（一塩基多型、SNP）によって第二対立遺伝子の配列と異なりうる。第一対立遺伝子は、例えば異なるコドンに１つより多くのSNPを含む可能性がある。１つより多くのSNPを含む可能性のある突然変異対立遺伝子を選択的に増幅できることは、本方法の利点の１つである。あるいは、第一対立遺伝子は、第二対立遺伝子の配列と1つ以上の欠失によって異なりうる。
【００１４】
好ましくは、プローブはDNAである。
【００１５】
第一対立遺伝子と第二対立遺伝子との間の配列の違いは、好ましくは、プローブが結合する領域の内部である。すなわち、プローブと第一対立遺伝子との間のミスマッチはいずれも、プローブの末端にはない。
【００１６】
プローブは、最大10、20、30、40、または50ヌクレオチドの長さでありうる。異なる対立遺伝子に対するTmの間で、またはより短いプローブとともにプライマーのTmを用いて、適切な識別を実現することは困難でありうるが、より長いかまたはより短いプローブが可能である。
【００１７】
プローブは、標識されうる。例えば、プローブは、蛍光標識もしくは放射性標識を含有してもよく、または二次プローブが結合しうるリガンドによって標識されてもよい。好ましくは、プローブは蛍光標識によって標識され、また好ましくは、標識は、プローブが標的鎖とハイブリダイズしている（すなわち、プローブが二本鎖核酸の一部である）か否か（プローブが一本鎖であるか）によって異なるシグナルを生じる。好ましいプローブは、HyBeacon（登録商標）プローブ（例えば、Mol Cell Probes. 2002 Oct;16(5):319-26, "Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon probes and direct PCR amplification from saliva", French DJ, Archard CL, Andersen MT, McDowell DGを参照）である。異なるシグナルの発生は、プローブが標的に結合しているかどうかについての容易で迅速な分析を可能にする。
【００１８】
ハイブリダイズしたプローブ分子を検出するステップは更に、増幅混合物中の第一対立遺伝子および第二対立遺伝子の相対量の定量を含みうる。本発明の特定の実施形態では、検出ステップは増幅ステップの前後に行われうる。好ましい実施形態では、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率は、下記によって、すなわち、反応混合物を、プローブ：第一対立遺伝子のTmまたはそれ未満の第一温度で維持するステップと、ハイブリダイズしたプローブ分子を検出するステップと、反応混合物を、プローブ：第一対立遺伝子のTmより高いが、プローブ：第二対立遺伝子のTmまたはそれ未満の第二温度に上昇させるステップと、ハイブリダイズしたプローブ分子を検出するステップとによって測定されうる。第一のより低い温度では、プローブは、第一対立遺伝子と第二対立遺伝子との両方にハイブリダイズするが、第二のより高い温度では、プローブは、第二対立遺伝子のみにハイブリダイズする。
【００１９】
遺伝子座が複対立遺伝子である場合、検出ステップは更に、反応混合物を1つ以上の中間の温度に上昇させるステップと、ハイブリダイズしたプローブ分子を各中間温度で検出するステップとを含みうる。これは、プローブ：対立遺伝子のそれぞれの組合せが異なるTmを有する場合、特に好ましい。本発明のこの実施形態は、単独の実験で、複数の異なる突然変異対立遺伝子の増幅と定量との両方を可能にする。
【００２０】
プライマーは好ましくは、プローブが結合する領域の外側の領域に結合する。すなわち、第一プライマーは、プローブ標的の3'側に結合するが、一方、第二プライマーはプローブ標的の5'側に結合する（プライマーは二本鎖DNAの異なる鎖に結合することを考慮すること）。プライマーが鎖伸長を受ける際、これは結合したプローブによって阻害され、鎖は増幅できない。特定の実施形態では、プライマーは、プローブが結合する領域に隣接して結合してもよく、または、好ましくはないが、1、2、3、もしくはそれ以上のヌクレオチドがプローブと重複すらしていてもよい。当然、２つのプライマーは、異なる程度でプローブ標的と重複してもよく、または、一方は重複し、他方は重複しなくてもよい。プローブとプライマーが重複する場合、プローブは、好ましくはプライマーの3'末端で、プライマーと結合において競合し、このようにして伸長を阻害しうる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。特定の実施形態では、プライマーは、異なる濃度で供給されうる。好ましくは、プライマーの一方が律速的な量で供給され、増幅反応は非対称PCRである。非対称PCRでは、律速プライマーが使い果たされると、他方のプライマーだけが鎖伸長を開始するために利用可能であるため、２つの標的DNA鎖の一方が選択的に増幅される。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが、選択的増幅の標的とされる鎖になりうる。好ましくは、選択的に増幅される鎖は、プローブに対して相補的な鎖である。
【００２２】
標的遺伝子座は、多型、例えばSNPを含むと考えられる任意の適切な遺伝子座でありうる。好ましい標的遺伝子座は、KRAS、EGFR、またはBRAFヒト遺伝子である。好ましい実施形態では、標的遺伝子座は、KRASのコドン12および13、KRASのコドン61、ならびにKRASのコドン146から選択される。あるいは、標的遺伝子座は、EGFRのエクソン18、19、20、または21のいずれかまたはすべてでありうる。更なる選択肢は、BRAFのアミノ酸残基600、および対応するヌクレオチド残基である。
【００２３】
好ましいプローブ配列は、下記を含む。すなわち、
KRASのコドン12および13を標的とする、5' AGTTGGAGCTGGTGGCGTAG 3'（HYB_KRAS_CD12/13、配列番号１）
KRASのコドン61を標的とする、5' AGGTCAAGAGGAGTACAGTG 3'（HYB_KRAS_CD61、配列番号２）
KRASのコドン146を標的とする、5' TGTAGTCGTTTCTGTTCTGT 3'（HYB_KRAS_CD146、配列番号３）
EGFRのエクソン18を標的とする、5' GCTGGGCTCCGGTGCGTTCG 3'（EGFRX18_HYB、配列番号４）
EGFRのエクソン19を標的とする、5' CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCC 3'（EGFRX19HYB_DEL、配列番号５）
EGFRのエクソン20を標的とする、5' CTACCGGTCGCACGGTCGCACCCTGTTGGGGGTGCACAC 3' (EGFRX20_HYB、配列番号６）
EGFRのエクソン21を標的とする、5' TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG 3'（EGFRX21 HYB、配列番号７）
BRAFのアミノ酸600を標的とする、5' CTACAGTGAAATCTCGATGG 3'（BRAF_V600、配列番号８）。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１から配列番号８より選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１から配列番号８より選択されるヌクレオチド配列からなる、オリゴヌクレオチドプローブを提供する。プローブは好ましくはDNAである。プローブは更に、プローブと結合した1つ以上の標識、好ましくは、その配列の１つ以上のヌクレオチドと結合した蛍光標識を含みうる。標識は、プローブが標的配列とともに二本鎖の二重らせん内にあるか、または一本鎖であるかによって、異なるシグナルを生じるように選択されうる。
【００２５】
上記のプローブ配列番号１〜配列番号８によって認識される標的配列の増幅を可能にするために選択されたプライマー配列もまた、提供される。
【００２６】
本発明の更なる態様は、被験体からのサンプル中の体細胞変異を検出する方法を提供し、そのサンプルは少なくとも第一対立遺伝子および第二対立遺伝子を有する遺伝子座に由来する核酸を含有し、第一対立遺伝子は突然変異対立遺伝子であり、第二対立遺伝子は野生型対立遺伝子であって、この方法は、
a）下記を含有する反応混合物、すなわち、
i）サンプル；
ii）第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度（Tm）で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ；および
iii）核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、そのプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接した第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー：サンプルのTmが、プローブ：第一対立遺伝子のTmより高い、プライマー；
を含有する反応混合物を用意するステップと；
b）反応混合物をプローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと；
c）反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、その増幅は融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度は、プローブ：第一対立遺伝子のTmとプローブ：第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子にハイブリダイズされ、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと；
d）反応混合物の温度をプローブ：突然変異対立遺伝子のTm以下に維持するステップと；
e）反応混合物の温度をステップd）の温度より高いが、プローブ：野生型対立遺伝子のTm以下に維持するステップと；
f）ステップd）およびe）においてハイブリダイズしたプローブを検出し、それによってサンプル中の突然変異対立遺伝子の有無を決定するステップ
とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、野生型K-RAS遺伝子の部分配列を示す。
【図２】図２は、K-RASのコドン12および13の起こり得る突然変異およびそれに対応するDNA配列、ならびにこれらのSNPのそれぞれを検出するために使用されるプローブ、HYB_KRAS_CD12/13の配列を示す。
【図３】図３は、コドン61（KRAS_Gln61Leu突然変異；HYB_KRAS_CD61プローブ）および146（KRAS_Ala146Thr突然変異；HYB_KRAS_CD146プローブ）の周辺の領域についてのプローブ、野生型、および突然変異の配列を示す。
【図４】図４は、HYB_KRAS_CD12/13プローブ対野生型DNAの融解曲線を示す。
【図５】図５は、野生型および突然変異対立遺伝子のそれぞれとハイブリダイズしたCD12/13プローブのTmを表す表を示す。
【図６】図６は、野生型の融解曲線と比較した、それぞれのCD12/13対立遺伝子に対する融解曲線を示す
【図７】図７は、２つのサンプル‐１つの野生型のホモ接合体、および１つのGly13Arg／野生型のヘテロ接合体を比較した融解曲線を示す。
【図８】図８は、KRASコドン61突然変異の融解曲線を示す。
【図９】図９は、KRASコドン146突然変異の融解曲線を示す。
【図１０】図１０は、EGFRのエクソン18領域についてのEGFRプローブ配列（EGFRX18_HYB）を示す。
【図１１】図１１は、EGFRのエクソン19についてのEGFRプローブ配列（EGFRX19_HYB）を示す。
【図１２】図１２は、様々な長さの多数の欠失突然変異とハイブリダイズするエクソン19プローブを示す。
【図１３】図１３は、エクソン20における挿入およびSNP突然変異を検出するために設計されたEGFRプローブ配列を示す。
【図１４】図１４は、エクソン21中の２つのSNP、1573 T>Gおよび2182 T>Aを検出するために設計された、EGFRプローブ配列EGFRX21_HYBを示す。
【図１５】図１５は、EGFRX19_HYBプローブを用いて試験されたサンプル由来の融解曲線を示す。
【図１６】図１６は、EGFRX20_HYBプローブを用いて試験されたサンプル由来の融解曲線を示す。
【図１７】図１７は、BRAF V600についてのhyBeacon（登録商標）プローブBRAFV600_HYB、および様々な標的配列を示す。
【図１８】図１８は、BRAFV600領域を増幅するために使用されるプライマー配列の位置を示す。
【図１９】図１９は、臨床サンプルBRAFの融解曲線を示す。
【図２０】図２０は、プローブ：野生型二本鎖のTmを上回る保持／伸長温度セットを用いて、プローブが、突然変異配列と有意にハイブリダイズすることなく、野生型と選択的に結合することが可能である過程を説明するための融解曲線を示す。
【図２１】図２１は、高い温度で（例えば、66.5℃で）行われる第一アニーリング（ブロッキング）段階と、低い温度で（例えば、63℃）行われる第二アニーリング（プライマー）段階とを含む増幅方法を詳細に示す。
【図２２】図２２は、本発明の増幅方法における増幅反応の１サイクルの間の温度について示す。
【図２３】図２３は、本発明の増幅方法において、突然変異配列が選択的に増幅される一方で、野生型は阻害されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、望ましくない対立遺伝子の増幅を妨げるためのブロッカーと、突然変異対立遺伝子の存在を報告するレポーターとの両方として単一のプローブを用いた、低コピー数の突然変異（例えば体細胞変異）が選択的に増幅および検出されうる方法を提供する。更に、プローブは、単一の実験から、同一遺伝子座の中の異なる多数の対立遺伝子（例えば、代替SNP）を検出するために使用され得る。本方法は、SNPならびに挿入または欠失などの突然変異を検出するために使用され得る。
【００２９】
本発明者らは、本明細書において、異なる遺伝子座に対する本方法の適用可能性を示す多数の実施例を記載するが、本方法がより一般的な適用可能性を有することは明らかである。
【００３０】
例えば個別化医療を目的として、標的療法を目指すために、臨床サンプルを特定する必要がある。これは、迅速かつ信頼性のある体細胞突然変異のスクリーニングを必要とする。本発明者らは本明細書において、本方法が、K-RAS、EGFR、およびBRAF遺伝子における３つの主要な体細胞突然変異に適用され得ることを示す。本明細書に示される方法は、（プローブが一本鎖であるかまたは二本鎖であるかどうかに応じて異なるレポーターシグナルを生じる）hyBeacon（登録商標）プローブ、および（標的配列の一方の鎖を選択的に増幅する）非対称PCRを使用する。本方法の典型的な感度は、1〜5コピーの突然変異対立遺伝子であり、野生型に対して5％より大きいSNPの比率である。単一のプライマーセットおよびプローブを用いた単一のアッセイは、同一プローブ配列内で複数のSNPを検出することができ、例えば、単一のプローブHYB KRAS CD12/13は、K-RASコドン12および13中の12個すべての突然変異を検出する。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］
K-RAS
野生型K-RAS遺伝子の部分配列は、図１に示される。コドン12/13、16、および146の標的領域は、太字で強調表示される。
【００３２】
K-RASのコドン12および13は、多数のSNPを生じやすく、その結果、Gly12および／またはGly13の、Ser、Arg、Cys、Asp、Ala、Valへの突然変異を生じる。これらの起こり得る突然変異およびそれに対応するDNA配列は、図２に示される。図２にはまた、これらのSNPのそれぞれを検出するために使用されるプローブ、HYB_KRAS_CD12/13の配列も示される。明らかなように、プローブ配列は、関連の野生型標的配列と完全に相補的であり、起こり得る突然変異配列のそれぞれと比較して１つのミスマッチ塩基を有する。ミスマッチは、どちらかの末端ではなく、プローブの内部にある。プローブは、hyBeacon（登録商標）プローブであり、プローブが一本鎖型と比較して二本鎖である時にそれらの放射を変化させる、一対のフルオロフォアを有する。フルオロフォアの位置は図示されている。
【００３３】
図３は、コドン61（KRAS_Gln61Leu突然変異；HYB_KRAS_CD61プローブ）および146（KRAS_Ala146Thr突然変異；HYB_KRAS_CD146プローブ）の周辺の領域についてのプローブ、野生型、および突然変異の配列を示す。これらの実施例では、単一の突然変異対立遺伝子、および単一のミスマッチ塩基しか存在しない。この場合も、hyBeacon（登録商標）プローブが用いられた。
【００３４】
図４は、HYB_KRAS_CD12/13プローブ対野生型DNAの融解曲線を示す。図５は、野生型および突然変異対立遺伝子のそれぞれとハイブリダイズしたCD12/13プローブのTmを表す表を示す。各Tmは、少なくとも他のTmの大部分と明確に区別でき、特に0.1℃の許容誤差では、唯一の重複の可能性は、それぞれ56.7℃および56.5℃のTm を有するGly12SerとGly13Serであることが示される。図６は、野生型の融解曲線と比較した、それぞれのCD12/13対立遺伝子に対する融解曲線を示す。これらの実験は、HYB_KRAS_CD12/13プローブが、コドン12および13において起こり得るそれぞれの対立遺伝子を区別するために使用され得ることを示す。
【００３５】
図７は、２つのサンプル‐１つの野生型のホモ接合体、および１つのGly13Arg／野生型のヘテロ接合体を比較した融解曲線を示す。ヘテロ接合体は、ホモ接合体と明確に区別でき、Gly13Argのピークの温度は、図６に示されたものと一致する。
【００３６】
図８および９は、それぞれKRASコドン61および146突然変異の融解曲線を示す。
【００３７】
まとめると、これらの実験は、単一コピー（1〜5コピー）に至るアッセイ感度を裏付ける。融解曲線は、コドン12、13、61、および146における突然変異の分析を提供する。コドン12および13における12個のすべての突然変異は、野生型と識別可能であり、かつ互いに識別可能である。
【００３８】
［実施例２］
EGFR
図１０は、EGFRのエクソン18領域についてのEGFRプローブ配列（EGFRX18_HYB）を示す。プローブ配列は、野生型領域と完全に相補的であるが、３つの起こり得るSNP突然変異（2155 G>A、2155 G>T、および2156 G>C）があり、そのそれぞれは、単一ミスマッチ塩基によってプローブ配列と異なる。この場合も、EGFRX18_HYBプローブは、２つの蛍光部分を有するhyBeacon（登録商標）プローブである。
【００３９】
図１１は、EGFRのエクソン19についてのEGFRプローブ配列（EGFRX19_HYB）を示す。突然変異型がSNPであるエクソン18とは異なり、エクソン19は様々な欠失突然変異を有しうる。起こり得る欠失領域は図１１に太字で示され、更に図１２は、様々な長さの多数の欠失突然変異とハイブリダイズするエクソン19プローブを示す。プローブの下線を引いた領域は、標的とハイブリダイズせず、したがってループを形成する。これは、SNP中の塩基ミスマッチの存在とほぼ同様に、プローブ：標的二本鎖のTmを変化させる。Tmの変化は、ハイブリダイズしない領域の大きさによって決まるため、このプローブは特定の突然変異を識別するために使用され得る。
【００４０】
図１３は、別のEGFRプローブ配列を示し、この場合には、エクソン20における挿入およびSNP突然変異を検出するために設計された。SNPは2303 G>Tであり、更に、塩基2307での9 bp挿入、ならびに塩基2310および2319での２つの3 bp挿入の、３つの起こり得る挿入がある。プローブは、9 bp挿入突然変異体と完全に相補的な配列で設計され、従って、他の突然変異体とハイブリダイズする場合、プローブには9 bpループが形成され、3 bp挿入突然変異体のいずれかとハイブリダイズする場合、標的には3 bpループが形成される。SNP突然変異体とのハイブリダイゼーションは、9 bpのプローブのループだけでなく、単一塩基のミスマッチを生じる。この配置は、それぞれの起こり得るハイブリダイゼーションに対して、明確に区別できるTmをもたらすことを意図して選択された。
【００４１】
図１４は、エクソン21中の２つのSNP、1573 T>Gおよび2182 T>Aを検出するために設計された、EGFRプローブ配列EGFRX21_HYBを示す。
【００４２】
図１５は、EGFRX19_HYBプローブを用いて試験されたサンプル由来の融解曲線を示す。サンプルAは挿入突然変異体であり、59℃に明確なピークを示すが、一方、サンプルBは野生型であり、73℃での野生型のピークのみを示す。この野生型のピークはまた、サンプルAでも見られる。対照として含まれる野生型ゲノムDNAもまた73℃のピークを示す。
【００４３】
EGFRX20_HYBプローブを用いて試験されたサンプル由来の融解曲線は、図１６に示される。すべてのサンプルは野生型であり、約66.8℃でのピークを示す。
【００４４】
［実施例-BRAF］
BRAF遺伝子は、アミノ酸600にいくつかの潜在的なSNP突然変異：1799 T>A、G、またはC、ならびに多重突然変異、1799 TG>AT、1798 GT>AAまたはAG、および1797 AGT>GAGを含む。hyBeacon（登録商標）プローブBRAFV600_HYBは、野生型配列の一部と完全に相補的である。プローブおよび様々な標的配列は、図１７に示される。
【００４５】
図１８は、BRAFV600領域を増幅するために使用されるプライマー配列の位置を示す。これらのプライマー配列はプローブ領域の外側にある。プライマーの標的は下線で示され、プローブの標的は太字で示される。図はゲノム配列を示し、プローブは、プライマーの１つと同様に、相補的である。
【００４６】
これらのプライマーは、多数のサンプルを増幅し、リアルタイムPCRを用いて増幅された配列へのプローブのハイブリダイゼーションを測定するために使用された。融解曲線は、図１９に示される。すべてのサンプルの主要なピークは約52℃であり、それは野生型配列を表す。突然変異配列は約44℃のピークに集まっている。いくつかのサンプルは両方の温度でのピークを示し、それはヘテロ接合体サンプルを表す。
【００４７】
［実施例-突然変異遺伝子型の選択的増幅］
バックグラウンドの野生型配列に対する、任意の与えられたサンプル中での体細胞突然変異の割合の低さのため、突然変異検出の性能および感度を改善するためのアッセイ設計への体系的なアプローチが通常は必要とされる。一般的に、特定の突然変異部位からの増幅を目的とするためには、その突然変異の情報が必要であり、複数の突然変異のためには複数のプライマーが必要である。しかし、本明細書に開示される方法は、このような情報は必要ない。体細胞突然変異と同様に、本方法は、他の用途を見出だしうるものであり、例えば、少量のHIV薬剤耐性変異株は、患者の抵抗性についての総合的な負担を増加させるにもかかわらず、通常、従来の遺伝子型決定では認識されない。
【００４８】
本明細書に記載される増幅方法は、標的DNAの一方の鎖を選択的に増幅する非対称PCRを用いる。従来のPCRのように標準的な温度サイクリングが行われるが、限定された量の１つのプライマー（律速プライマー）が用いられる。限定された量のプライマーが枯渇すると、複製は、過剰量のプライマーの伸長によって等差級数的に増加する。
【００４９】
通常、選択的に増幅された鎖がプローブとハイブリダイズできるように、プローブは、プライマー制限されていない鎖と相補的である。プローブは、その際、ハイブリダイゼーションが起こるならば、（例えば、配列が突然変異体ではなく野生型の配列であるならば）その鎖の増幅を阻害しうる。
【００５０】
当業者は、目的とする標的配列を増幅するために、本方法に使用するための適切なプライマーを設計することができるであろう。
【００５１】
使用されるプローブは、突然変異体と結合する際よりも野生型と結合する際に、有意に高い融解温度（Tm）を有する。これは、増幅を妨げるためのブロッカーと、野生型または突然変異配列の存在を報告するレポーターとの両方としての、プローブの使用を可能にする。
【００５２】
プローブ：野生型二本鎖のTmを上回る保持／伸長温度セットを用いて、プローブが、突然変異配列と有意にハイブリダイズすることなく、野生型と選択的に結合することが可能である。増幅プライマーのアニーリングもまた、プローブ：突然変異体二本鎖のTmを上回るように選択される。増幅プライマーは野生型対立遺伝子と突然変異対立遺伝子との両方に結合するが、野生型の増幅は、ブロッキングプローブにより有意に減少する。これは、その後の増幅期間に、突然変異体の数を選択的に増加させる。
【００５３】
その過程を説明するための融解曲線は、図２０に示される。第一アニーリングステップは、高い温度（この場合、66.5℃）においてである。このブロッキングステップでは、プローブは野生型に結合し、フォワードプライマーのハイブリダイゼーションを阻害する。Tmが高すぎるため、プローブの突然変異体への結合は起こらない。第二アニーリングステップでは、より低い温度で（ここでは、57℃）、フォワードプライマーは競合的に突然変異体と結合する。Tmが高すぎるため、プローブの突然変異体への結合はほとんど起こらない。
【００５４】
増幅方法は、図２１〜２３に更に詳細に示される。高い温度で（例えば、66.5℃で）行われる第一アニーリング（ブロッキング）段階では（図２１）、プローブブロッカーは野生型と適合し、フォワードプライマーよりも高いTmを有する。塩基ミスマッチはブロッカーのTmを有意に低下させる。低い温度で（例えば、63℃）行われる第二アニーリング（プライマー）段階では（図２１）、プローブとフォワードプライマーは競合するが、プローブの大部分は野生型に結合しているため、残りのフォワードプライマーは突然変異体に結合する可能性が高い。温度はまだ高すぎるため、プローブが突然変異配列に結合して阻害することはできない。
【００５５】
図２２は、増幅反応の１サイクルの間の温度を示す。融解段階は95℃で行われ、その後、温度はブロッキングアニーリング段階のために66.5℃に下げられる。温度はその後、プライマーアニーリング段階および伸長段階のために更に63℃に下げられた後、再度95℃に戻る。図２３に示されるように、突然変異配列は増幅される一方で、野生型は阻害される。依然としていくらかの野生型配列の増幅はありうるが、突然変異配列は選択的に増幅され、サンプル中の相対存在量を増加させる。
【００５６】
一旦サンプルが増幅されると、突然変異配列の種類は、KRAS、EGFR、またはBRAFについて上述された融解曲線分析を行うことによって決定されうる。hyBeacon（登録商標）プローブ、または同様のプローブを用いる利点は、同じ単一のプローブが、野生型の増幅を阻害することによって突然変異配列の増幅を増強するだけでなく、アッセイの最後に野生型：突然変異型の両方の比を報告することである。本方法は、プローブ領域の中の任意の突然変異配列の増幅を可能にし、かつ、任意のSNP情報とは完全に無関係であって、すなわち、プローブ配列内の未知のSNPを報告することができる。単一のプローブは、その単一のプローブ内および／または伸長部に沿った複数のプローブ内の複数のコドンにおける突然変異SNPを増幅することができる。この技術はまた、挿入／欠失を検出するためにも使用でき、非対称的な増幅に適合する。
【図１】
2014501533.tif 000002
【図４】
2014501533.tif 000003
【図６ａ】
2014501533.tif 000004
【図６ｂ】
2014501533.tif 000005
【図６ｃ】
2014501533.tif 000006
【図６ｄ】
2014501533.tif 000007
【図２】
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【図３】
2014501533.tif 000009
【図５】
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【図７】
2014501533.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014501533.tif 000014
【図１１】
2014501533.tif 000015
【図１２】
2014501533.tif 000016
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2014501533.tif 000019
【図１６】
2014501533.tif 000020
【図１７】
2014501533.tif 000021
【図１８】
2014501533.tif 000022
【図１９】
2014501533.tif 000023
【図２０】
2014501533.tif 000024
【図２１】
2014501533.tif 000025
【図２２】
2014501533.tif 000026
【図２３】
2014501533.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月6日(2013.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014501533000001.app
【国際調査報告】
2014501533.tif 000028
2014501533.tif 000029
2014501533.tif 000030