(57)【要約】  骨肉腫の診断、治療およびモニタリングに有用な方法および組成物が提供される。骨肉腫のがん幹細胞（ＣＳＣｓ）または腫瘍開始細胞（ＴＩＣｓ）と関連付けられることが見出された特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対するアンチセンスは、腫瘍の成長および転移の抑制ならびに生存の延長に有用である。ｍｉＲ−１３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、骨肉腫の治療において、シスプラチンなどの標準的な化学療法との組み合わせで相乗効果を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨肉腫を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａから選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に特異的なアンチセンス分子を有効量投与する工程を含む方法。
【請求項２】
アンチセンス分子が安定化ＲＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項３】
安定化ＲＮＡがロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。
【請求項４】
アンチセンス分子がＤＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項５】
アンチセンス分子が、２０〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
アンチセンス分子が、２１〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
アンチセンス分子の配列が、
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
である請求項６記載の方法。
【請求項８】
アンチセンス分子が、２０〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
アンチセンス分子が、２１〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
アンチセンス分子の配列が、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アンチセンス分子が核酸送達ビヒクルに関連付けられている請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
骨肉腫が転移性骨肉腫である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む２０〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子。
【請求項１４】
単離された核酸分子が、２１〜３０ヌクレオチド長であり、５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む請求項１３記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
単離された核酸分子の配列が、５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
である請求項１４記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む２０〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子。
【請求項１７】
単離された核酸分子が、２１〜３０ヌクレオチド長であり、５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む請求項１６記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
単離された核酸分子の配列が、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
である請求項１７記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
核酸分子が核酸送達ビヒクルに関連付けられている請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
抗がん治療に対する骨肉腫の抵抗性を評価する方法であって、
骨肉腫細胞を含む組織試料を得る工程；
試料からＣＤ１３３を発現する細胞を単離する工程；
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の該ＣＤ１３３発現細胞による第１の発現レベルを測定する工程；
該ＣＤ１３３発現細胞を抗がん療法と接触させる工程；ならびに
該少なくとも１つのｍｉＲＮＡの該ＣＤ１３３発現細胞による第２の発現レベルを測定する工程を含み、第１の発現レベルよりも高い第２の発現レベルが、その骨肉腫が抗がん療法に抵抗性であることを示す方法。
【請求項２１】
抗がん療法が、シスプラチン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
骨肉腫のスクリーニング方法であって、対象由来の組織試料において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を特異的に検出できるアッセイを行う工程を含み、アッセイによる、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡの試料中における存在の検出が、対象が骨肉腫を有する危険性があることを示す方法。
【請求項２３】
組織が血液である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
組織が血清である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
骨肉腫をモニタリングする方法であって、
（ａ）骨肉腫を有する対象または骨肉腫の治療をしている対象から得られた組織試料において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを特異的に定量することができるアッセイを行う工程；ならびに
（ｂ）対象由来の後に得られた組織試料において工程（ａ）を繰り返す工程を含み、先に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い後に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、その骨肉腫が進行性であることを示し、そして先に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルよりも低い後に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、その骨肉腫が退行性であることを示す方法
を含む骨肉腫をモニタリングする方法。
【請求項２６】
組織が血液である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
組織が血清である請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１１年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／５３１，９４２号および２０１２年９月５日に出願された米国仮特許出願第６１／６９６，９８１号に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍が幹細胞様の性質を有する細胞の小集団を含むという証拠が増加している。しばしば「がん幹細胞」（ＣＳＣｓ）または「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣｓ）のいずれかと称されるこれらの細胞は、腫瘍の大部分の形成を負っている。これらのＣＳＣｓは、自己複製能および分化能の両方をもち、腫瘍の不均一性を生じさせると考えられている。さらに、それらは腫瘍の最も致死的特徴−薬物耐性や転移と関連付けられることが示されている。ＣＳＣｓの存在についての最初の証拠は、１９９４年の血液悪性腫瘍の研究によってもたらされた。より最近には、ＣＳＣｓは、乳がん、脳腫瘍、皮膚がん、肺がん、大腸がん、膵臓がん、肝臓がん、頭部および頸部がん、前立腺がん、卵巣がん、ならびに胃がんなどの多数の固形がんにおいて同定されている。
【０００３】
骨肉腫は、最もよく見られる原発性骨悪性腫瘍であり、全ての小児悪性骨腫瘍の６０％を占めている。多剤併用化学療法の導入前には、切断による長期生存率はわずか〜２０％であった。１９７０年代以来、化学療法と患肢温存手術との組み合わせが骨肉腫の主要な治療となっている。現在では、骨肉腫患者の５年生存は５０％〜８０％であると報告されている。しかしながら、この生存率は、過去１０年にわたって改善されておらず、骨肉腫患者の全く４０％がそれらの疾患が原因で亡くなっている。
【０００４】
腫瘍形成において重要な分子を標的とすることは、「標的療法」として知られ、ここ１０年のがん治療のエキサイティングな進展である。しかしながら、現在骨肉腫に利用できる標的療法は存在しない。したがって、新しい骨肉腫治療の開発が非常に必要とされている。
【０００５】
ＣＤ１３３は、ＡＣ１３３およびプロミニン１（ＰＲＯＭ１）としても知られ、機能が分かっていない５−膜貫通糖タンパク質である。プロミニンファミリーの最初に同定されたメンバーが５−膜貫通糖タンパク質であった。１９９７年には、Yin et alが、ＡＣ１３３抗原、すなわちＣＤ１３３のグリコシル化依存性エピトープを認識する新規なモノクローナル抗体を作製し、そして彼らは成人の血液由来のＣＤ３４陽性前駆細胞においてＡＣ１３３の発現を検出した。ＣＤ１３３ｃＤＮＡは、細胞外Ｎ−末端、細胞質Ｃ−末端、およびＮ−結合グルコシル化のための８つのコンセンサス部位を含む２つの細胞外大ループを有する５−膜貫通ドメイン分子をコードする。ＣＤ１３３の特徴的な性質は、細胞分化のあいだのその迅速な下方調節である。この性質が、ＣＤ１３３を、いくつかの組織における幹細胞および前駆細胞の同定ならびに単離のためのユニークな細胞表面マーカーとしている。ＣＳＣ理論によれば、ＣＳＣｓは、正常な幹細胞の幹細胞マーカーのいくつかを発現する。したがって、ＣＤ１３３を独立して、または他の幹細胞もしくは前駆細胞マーカーと組み合わせて発現する腫瘍細胞は、ＣＳＣｓに相当すると考えられる。しかしながら、これまで、ＣＤ１３３細胞表面マーカーを発現するＣＳＣｓの表現型の基礎にある分子的機序は、はっきりしていないままである。
【０００６】
マイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡ）は、最初に１９９３年にタンパク質非コード低分子ＲＮＡとして発見されたものであり、それらの標的遺伝子の発現を調節し、発達、分化、細胞増殖、アポトーシスおよびストレス応答などの様々な生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす低分子の制御ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの生合成は、機能的に成熟したｍｉＲＮＡを得るためには、いくつかの転写後のプロセッシング段階が必要とされる。ここ数年にかけて、多くのｍｉＲＮＡｓが種々のヒトがんにおいて研究されている。ｍｉＲＮＡｓの発現の脱制御が、欠失、増幅、またはｍｉＲＮＡ遺伝子座に関する変異、エピジェネティックサイレンシング、特定のｍｉＲＮＡを標的とする転写因子の異常調節、またはプロセッシングの阻害など種々の種類の機序によりがんの発達に寄与していることが示されている。ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングは、有用な診断および予測ツールとしての重要性が増しており、多くの研究が、ｍｉＲＮＡｓはがん遺伝子または腫瘍抑制因子のいずれかとして作用するということを指摘している。
【０００７】
ヒトｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３ａは、同じ染色体領域に、１つにかたまって位置する。筋肉が強化される場合、前駆細胞の増殖を阻害し、ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）および血清応答因子（ＳＲＦ）それぞれを標的とすることにより筋形成を促進するのがｍＲＮＡｓである。ｍｉＲ−１は、冠動脈疾患の個体において過剰発現されることが報告されており、一方これらのｍｉＲＮＡｓは両方とも心臓肥大において低レベルで発現されていることが報告されている。多くの研究にもかかわらず、筋肉の生理学および疾患におけるそれらの重要性はなお不明なままである。最近は、ｍｉＲ−１３３ａ（この名前はＣＤ１３３と何の関係もない）は、骨格筋の正常な発達と機能に重要でないとみなされている。しかしながら、これらのｍｉＲＮＡｓおよびＣＳＣｓとの間の関係は、これまで知られていない。
【０００８】
ヒトｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１０ｂは、高悪性度の悪性腫瘍と正に関連付けられることが見出された。この関係は、様々な種類のがんに当てはまる。ｍｉＲ−１０ｂは、高度の転移性のがんおよび／または浸潤性がんの２つのタイプの、ヒト膵臓腺がんおよびグリア芽腫において最も有意に上方調節されたｍｉＲＮＡｓの１つである。このｍｉＲＮＡは、細胞株として増殖されている転移性がん細胞、ならびに患者由来の転移性の乳房の腫瘍において高度に発現され、転移性ではないものと比較して転移性肝細胞がんにおいても上方調節されている。肉腫の発達におけるｍｉＲ−１０ｂの重要性はこれまで報告されていない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の１つの実施態様は、骨肉腫を治療する方法である。その方法は、それを必要とする対象に、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａから選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に特異的なアンチセンス分子を有効量投与する工程を含む。
【００１０】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、安定化ＲＮＡである。
【００１１】
１つの実施形態においては、安定化ＲＮＡは、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドである。
【００１２】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子はＤＮＡである。
【００１３】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、２０〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、２１〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子の配列は、
５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
である。
【００１６】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、２０〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、２１〜３０ヌクレオチド長であり、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子の配列は、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
である。
【００１９】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は核酸送達ビヒクルと関連付けられる。
【００２０】
１つの実施形態においては、骨肉腫は転移性骨肉腫である。
【００２１】
本発明の１つの実施態様は、５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む２０〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子である。
【００２２】
１つの実施形態においては、単離された核酸分子は、２１〜３０ヌクレオチド長であり、５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
１つの実施形態においては、単離された核酸分子の配列は、５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）、
５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）
である。
【００２４】
本発明の１つの実施態様は、５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む２０〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子である。
【００２５】
１つの実施形態においては、単離された核酸分子は、２１〜３０ヌクレオチド長であり、５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
１つの実施形態においては、単離された核酸分子の配列は、
５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）、
５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）、
５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）、
５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）、
５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）または
５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）
である。
【００２７】
１つの実施形態においては、核酸分子は核酸送達ビヒクルと関連付けられる。
【００２８】
本発明の１つの実施態様は、抗がん治療に対する骨肉腫の抵抗性を評価する方法である。その方法は、
骨肉腫細胞を含む組織試料を得る工程；
試料からＣＤ１３３を発現する細胞を単離する工程；
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のＣＤ１３３発現細胞による第１の発現レベルを測定する工程；
そのＣＤ１３３発現細胞を抗がん療法と接触させる工程；ならびに
その少なくとも１つのｍｉＲＮＡのＣＤ１３３発現細胞による第２の発現レベルを測定する工程であって、第１の発現レベルよりも高い第２の発現レベルが、その骨肉腫が抗がん療法に抵抗性であることを示す工程
を含む。
【００２９】
１つの実施形態においては、抗がん療法は、シスプラチン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００３０】
本発明の１つの実施態様は、骨肉腫のスクリーニング方法である。その方法は、対象由来の組織試料において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を特異的に検出できるアッセイを行う工程を含み、アッセイによる、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの試料中における存在の検出が、対象が骨肉腫を有する危険性があることを示す。
【００３１】
１つの実施形態においては、組織は血液である。
【００３２】
１つの実施形態においては、組織は血清である。
【００３３】
本発明の実施態様は、骨肉腫をモニタリングする方法である。その方法は、
（ａ）骨肉腫を有する対象または骨肉腫の治療をしている対象から得られた組織試料において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを特異的に定量することができるアッセイを行う工程；ならびに
（ｂ）対象由来の後に得られた組織試料において工程（ａ）を繰り返す工程を含み、先に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い後に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、その骨肉腫が進行性であることを示し、そして先に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルよりも低い後に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、その骨肉腫が退行性（regressive）であることを示す。
【００３４】
１つの実施形態においては、組織は血液である。
【００３５】
１つの実施形態においては、組織は血清である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＣＤ１３３（Ｘ軸）およびＣＤ４４（Ｙ軸）のそれらの発現に基づく、種々の示されたヒト骨肉腫細胞株の７つの代表的なＦＡＣＳ分析である。
【図２】ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞の選択を示すＦＡＣＳ分析（上パネル）；ＣＤ１３３高集団における１日目および８日目の非対称細胞分裂を示す４枚の顕微鏡写真（中央パネル）；および１４日目の各集団に対するＰＫＨ染色による２つのＦＡＣＳ分析（下パネル）を含むコラージュである。スケールバー、５０ｍｍ。
【図３】新しく単離したＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＨＯＳ−ＧＦＰ細胞におけるスフェア形成アッセイを示す４枚の顕微鏡写真と棒グラフである。写真は、５日目に撮影し、各ウェルにおけるスフェアの数を計数した（ｎ＝３／群、**Ｐ＜０．０１）。スケールバー、２００μｍ。
【図４】ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞集団の薬物感受性を示す棒グラフである。ドキソルビシン（ＤＯＸ、０．０３μＭ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ、２．５μＭ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ、０．３２μＭ）への相対生存細胞を分析した（ｎ＝３／群、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１）。
【図５】ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞集団における浸潤アッセイを示す１対の顕微鏡写真および棒グラフである（ｎ＝３／群、**Ｐ＜０．０１）。スケールバー、２００μｍ。
【図６】ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞集団の、幹細胞関連、多剤耐性トランスポーターおよび転移関連遺伝子の定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析を示すグラフである。βアクチンを内部対照として使用した。
【図７】ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＨＯＳ−ｌｕｃ細胞集団のマウスにおける腫瘍原性を示す８枚の写真画像である。ＣＤ１３３高（動物の右大腿部）およびＣＤ１３３低（動物の左大腿部）ＨＯＳ−ｌｕｃ細胞で異種移植された腫瘍の発光を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）により同定した。ＣＤ１３３高集団は、わずかに１００個の細胞で腫瘍を形成した（ｎ＝５／群）。
【図８】臨床骨肉腫標本におけるＣＤ１３３高細胞集団を示す１対のＦＡＣＳ分析である。
【図９】ＣＤ１３３発現に基づく骨肉腫患者に対する無転移生存率を示すグラフである。ＣＤ１３３の発現の高い患者は、６０ヵ月よりも短い平均無転移生存率であった（ｎ＝３５、ログランク検定、Ｐ＝０．０２６２）。
【図１０】ＳａＯＳ２およびＨＯＳのＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低細胞における上方調節および下方調節されたｍｉＲＮＡｓを示すベン図である。
【図１１】ＳａＯＳ２およびＨＯＳ細胞のＣＤ１３３高集団においてＣＤ１３３低集団と比較して上方調節されたｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａを示す棒グラフである（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）。
【図１２】ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞におけるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの発現を、ｍｉＲ−ＮＣ（陰性対照）オリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞と比較して示すグラフである（ログスケール、ｎ＝３／群、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）。
【図１３】ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａ、またはＮＣオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした精製ＣＤ１３３低細胞における浸潤アッセイを示すグラフである（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）。
【図１４】ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａ、またはｍｉＲ−ＮＣオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＣＤ１３３低細胞における薬物耐性を示すグラフである（ＭＴＸ、メトトレキサート０．２２ｍＭ、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１）。
【図１５】ＣＤ１３３低細胞におけるｍｉＲ−１３３ａの安定な過剰発現に用いられるプラスミドベクターの略図である。ＮｒｕＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ：制限エンドヌクレアーゼ部位；ＰCMV：サイトメガロウイルスプロモータ；ＭＣＳ：多重クローニング部位；ＩＶＳ：介在配列；ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位；Ｈｙｇr：ハイグロマイシン耐性遺伝子；ＳＶ４０ポリＡ：ＳＶ４０ポリＡ尾部。
【図１６】ｍｉＲ−１３３ａを安定に発現するＣＤ１３３低ＨＯＳ−ｌｕｃ細胞（右足）の腫瘍原性を、対照のＣＤ１３３低ＨＯＳ−ｌｕｃ細胞（左足）と比較して示す４対の写真画像である。各部位は、示された細胞数（１０2〜１０5）を注射され、発光評価は注射後９０日で行った。
【図１７】ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞におけるＣＤ１３３メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を示すグラフである。これらのｍｉＲＮＡの変化は、ＣＤ１３３発現レベルを変化させなかった。比較は、ｍｉＲ−ＮＣ（陰性対照）オリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＣＤ１３３高細胞に対して行った（ｎ＝３／群）。
【図１８】新たに切除した患者の生検のＣＤ１３３高集団におけるｍｉＲ−１３３ａの発現を示すグラフである。
【図１９】個々のｍｉＲＮＡｓおよびｍｉＲＮＡｓの種々の組み合わせの、示されたｍｉＲＮＡｓでトランスフェクトしたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞の浸潤性に対する効果を示す一連の顕微鏡写真および関連棒グラフである。比較のために、ＣＤ１３３高ＳａＯＳ２細胞についてのデータも提示する。ＮＣ：陰性対照。
【図２０】個々のｍｉＲＮＡｓおよびｍｉＲＮＡｓの種々の組み合わせの、示されたｍｉＲＮＡｓでトランスフェクトしたＣＤ１３３低ＭＮＮＧ／ＨＯＳ細胞の浸潤性に対する効果を示す一連の顕微鏡写真および関連棒グラフである。ＮＣ：陰性対照。
【図２１】非トランスフェクトＣＤ１３３高ＳａＯＳ２細胞および示されたｍｉＲＮＡｓでトランスフェクトしたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞の増殖を示す棒グラフである。ＮＣ：陰性対照。細胞は計数前４日間培養で維持された。
【図２２】（左）１４３Ｂ細胞におけるドキソルビシン（ＤＯＸ）およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）によるＣＤ１３３に関するｍＲＮＡの誘導；（中央）１４３Ｂ細胞におけるＤＯＸによるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの誘導；（右）１４３Ｂ細胞におけるＣＤＤＰによるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの誘導を示す３つのグラフである（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）。
【図２３】シスプラチン（ＣＤＤＰ）処置ＣＤ１３３低ＨＯＳ−ｌｕｃ細胞のマウスにおける腫瘍原性を示す１対の並べた写真画像である。ＣＤＤＰ−処置細胞（動物の右大腿部）および生理食塩水処置対照細胞（動物の左大腿部）で異種移植された腫瘍の発光を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）により同定した。ＣＤＤＰ−処置ＣＤ１３３低細胞は、わずかに１００細胞で腫瘍を形成した（ｎ＝５／群）。
【図２４】ロックド核酸（ＬＮＡ）−１、ＬＮＡ−１０ｂ、ＬＮＡ−１３３ａおよびＬＮＡ−ＮＣオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＣＤ１３３高ＳａＯＳ２細胞におけるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３発現のノックダウンを示すグラフである。
【図２５】ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低細胞におけるＬＮＡ−１３３ａおよびＬＮＡ−ＮＣ（陰性対照）オリゴヌクレオチドのトランスフェクション後４日目の細胞増殖を示すグラフである（ｎ＝３／群、***Ｐ＜０．００１）。
【図２６】（左）ＬＮＡ−１３３ａまたはＬＮＡ−ＮＣでのトランスフェクション２４時間後に測定された、ドキソルビシン（ＤＯＸ、０．４μＭ、４８ｈ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ、５μＭ、４８ｈ）の存在下で培養された示した細胞種の細胞生存率；および（右）ＬＮＡ−１３３ａまたはＬＮＡ−ＮＣでのトランスフェクション２４時間後に測定された、シスプラチン（ＣＤＤＰ、５μＭ、４８ｈ）の存在下（＋）または非存在下（−）で培養された示した細胞種におけるアポトーシスを起こした細胞の割合を示す対のグラフである。
【図２７】示したＬＮＡ処置ＳａＯＳ２ ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低集団（ｎ＝３／群、**Ｐ＜０．０１）における浸潤アッセイを示すグラフである。
【図２８】ＬＮＡ−１３３ａおよびＬＮＡ−ＮＣオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたＣＤ１３３高細胞における骨肉腫の幹細胞性、薬物耐性および転移と関連した遺伝子の定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析を示すグラフである。βアクチンを内部対照として使用した。
【図２９】１４３Ｂ−ｌｕｃ−保持マウスに対するＬＮＡ−１３３ａ（ＬＮＡ）およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）投与スケジュールを示す図である。ＩＶＩＳ：インビボイメージングシステム。
【図３０】ＬＮＡ−１３３ａの用量による１４３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍におけるｍｉＲ−１３３ａの発現を示すグラフである（ｎ＝３／群）。
【図３１】１４３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍を保持し、生理食塩水単独、ＬＮＡ−１３３ａ単独、シスプラチン（ＣＤＤＰ）単独またはＬＮＡ−１３３＋ＣＤＤＰで処置したマウスにおけるｍｉＲ−１３３ａの相対発現を示すグラフである。（*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１）。
【図３２】１４３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍を保持し、生理食塩水単独、ＬＮＡ−１３３ａ単独、シスプラチン（ＣＤＤＰ）単独またはＬＮＡ−１３３＋ＣＤＤＰで処置したマウスの、３６日目の顕微鏡像を示す４枚の写真画像である。スケールバー、１０ｍｍ。
【図３３】示した各処置群由来の、３６日目での１４３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍の重量を示すグラフである（**Ｐ＜０．０１）。
【図３４】１４３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍を保持し、生理食塩水単独、ＬＮＡ−１３３ａ単独、シスプラチン（ＣＤＤＰ）単独またはＬＮＡ−１３３＋ＣＤＤＰで処置したマウスの生存率を示すグラフである。カプラン−マイヤー分析およびログランク検定（ｎ＝５／群、Ｐ＝０．００１３）。
【図３５】ｍｉＲ−１３３ａの標的遺伝子を同定するために使用される戦略を示す図である。抗−Ａｇｏ２ＩＰ：抗−Ａｇｏ２抗体免疫沈降。
【図３６】相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）マイクロアレイおよびコンピュータのデータベース分析による、ｍｉＲ−１３３ａの候補標的メッセンジャーＲＮＡｓ（ｍＲＮＡｓ）を示すベン図である。
【図３７】１０種類のｓｉＲＮＡｓによる、トランスフェクション７２時間後のシスプラチンの存在下、細胞トランスフェクションアレイにおける細胞増殖の阻害を示すグラフである（ｎ＝３／群；ＮＣ：陰性対照；**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）。
【図３８】１０種類のｓｉＲＮＡｓによる、トランスフェクション７２時間後の細胞トランスフェクションアレイにおける浸潤アッセイを示すグラフである（ｎ＝３／群；ＮＣ：陰性対照；*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）。
【図３９】示した推定ｍｉＲ−１３３ａ標的遺伝子について、ｍｉＲ−１３３ａオリゴヌクレオチドおよびルシフェラーゼレポーターで同時トランスフェクトされたＳａＯＳ２細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図４０】定量的逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による測定での、ｍｉＲ−１３３ａの示した標的について、ＣＤ１３３（ＣＤ１３３高対ＣＤ１３３低）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現間の逆相関を示すグラフである。
【図４１】定量的逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による測定での、ｍｉＲ−１３３ａオリゴヌクレオチドのトランスフェクション４８時間後のＣＳ１３３低ＳａＯＳ２細胞における示したｍｉＲ−１３３ａ標的遺伝子に関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現の減少を、ｍｉＲ−ＮＣ（陰性対照）オリゴヌクレオチドと比較して示すグラフである。
【図４２】ＬＮＡ−１３３ａで処置したマウス由来の１４３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍におけるＳＧＭＳ２についてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現の増加を示すグラフである。
【図４３】ｍｉＲ−１３３ａ標的遺伝子、ＳＧＭＳ２、ＵＢＡ２、ＳＮＸ３０、ＤＵＳＰ１１、ＭＡＳＴ４およびＡＮＸＡ２それぞれについてのセンサ付骨肉腫患者の無転移生存率を示す一連の６つのグラフである。ｍｉＲ−１３３ａの直接標的（ＤＵＳＰ１１以外）の低い発現は、予後不良と有意に相関した（カプラン−マイヤー分析およびログランク検定；Ｐ値は示す通り）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
がん幹細胞（ＣＳＣ）仮説の提唱以来、骨肉腫のがん幹細胞を同定するためのいくつかの研究が行われている。これらの細胞は、足場非依存性、血清飢餓培養条件下スフェロイド状クローンで、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素の排出に基づくサイド・ポピュレーション（ＳＰ）細胞として、または細胞表面マーカーを用いてソートされるＣＤ１１７およびｓｔｒｏ−１細胞として検出されている。これらの方法を考慮し、本発明者らは、ごく一部の骨肉種細胞において高度に発現されるヒトＣＤ１３３のマウスホモログのプロミニン−１を同定した。このＣＤ１３３高画分由来の細胞は、足場非依存性環境においてクラスタースフェアを形成し、自己複製能および分化能を示し、幹細胞関連マーカーを発現し、そしてＣＤ１３３低画分と比較してより浸潤性を示した。
【００３８】
骨肉腫ＣＳＣｓの表現型の特徴を受けて、本発明者らは、ＣＤ１３３高画分の細胞とそれらのより分化した子孫とを区別するいくつかのｍｉＲＮＡｓの発現をプロファイルした。これらのｍｉＲＮＡｓのうち、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３３ａは、骨肉腫細胞のＣＤ１３３低画分と比較してＣＤ１３３高画分において上方調節されることが見出された。驚くべきことに、本発明者らは、これらのｍｉＲＮＡｓが骨肉腫細胞の化学抵抗性および浸潤性を促進することを発見した。これらの所見は、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａが骨肉腫のがん幹細胞のレギュレーターであることを示唆する。特に、テイラード薬物送達システムとの組み合わせで、ｍｉＲＮＡｓを標的とする新規治療剤（たとえば、アンチセンスヌクレオチド）は、メトトレキサート、シスプラチンおよびドキソルビシンなどの従来の化学療法剤に加えて、骨肉腫に対してかなり有望であることを示す。
【００３９】
ｍｉＲＮＡｓは、がんの治療剤としてまたはがん治療剤の有効な標的として現在は使用されていないが、成功したインビボにおける研究は、それらが、まだ満たされていないニーズに対処するための革新的な治療剤として使用できるという意見を支持するものである。乳がんの同所性マウスモデルにおける抗−ｍｉＲ−１０ｂの全身送達は、原発性腫瘍に対しては明らかな効果はないが、肺転移の数と大きさに有意な減少を示した。Ma et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 341-7。さらに、ｍｉＲＮＡｓの血清または血漿中の新規バイオマーカーとしての最近の発見は、血液での診断的スクリーニングの新しいアプローチを示している。Brase et al. (2010) Mol Cancer 9: 306。本願発明により同定されたｍｉＲＮＡｓはまた、すべて骨肉腫の患者の予後に影響を及ぼす因子である、化学療法剤に対する感受性の素早い評価、局所再発または遠隔転移の早期検出に使用され得るバイオマーカーとしての可能性を有する。
【００４０】
本発明の１つの実施態様は、骨肉腫を治療する方法である。この方法は、それを必要とする対象に、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａから選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に特異的なアンチセンス分子を有効量投与する工程を含む。あるいはまたはさらに、この方法は、ｍｉＲＮＡの発現をノックダウンする任意の薬剤を対象に投与する工程を含み得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「治療すること（treating）」および「治療すること（to treat）」は、疾患または望まれない症状を、改善するまたは治すことを意味する。たとえば、骨肉腫を治療することは、骨肉腫を患う対象における骨肉腫細胞という負担を減少するまたは取り除くことを意味する。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「対象」は、哺乳類を意味する。１つの実施形態においては、対象はヒトである。
【００４３】
マイクロＲＮＡに特異的なアンチセンス分子の有効量が治療を必要とする対象に投与される。本明細書において使用される場合、「有効量」は、所望の生物学的結果をもたらすのに十分な量である。たとえば、骨肉腫を治療するための有効量は、骨肉腫を患う対象において、骨肉腫細胞のポピュレーションを減少させるまたは取り除くのに十分な量である。有効量は、腫瘍の大きさ、対象のサイズ、対象の全身状態、投与経路、活性薬剤の正体、活性薬剤の組成または処方などの因子、その他医学および薬学の分野における周知の因子により変化し得る。
【００４４】
いかなる特定の投薬量にも限定されることを意味するものではないが、有効量は、一般的に、非経口投与経路により投与される場合、１日につき、活性薬剤０．０１マイクログラム（μｇ）／ｋｇ体重〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで変化する。経口または経腸投与については、有効量は、一般的に、１日につき、活性薬剤０．１μｇ／ｋｇ体重〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ体重まで変化する。有効量は、たとえば、インビトロ試験およびインビボ動物試験、ならびに臨床試験にもとづき決定することができる。
【００４５】
マイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）は、ｍＲＮＡｓの安定性および翻訳の両方に影響を与えることにより多細胞生物における遺伝子発現の転写後制御に関与する、短い（２０〜２４ｎｔ）非コードＲＮＡｓである。ｍｉＲＮＡｓは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより、タンパク質をコードしていてもコードしていなくてもよい、キャップ付加されポリアデニル化された一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓ）の一部として転写される。一次転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素により切断され、おおよそ７０ｎｔステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生じる。このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、さらに細胞質Ｄｉｃｅｒリボヌクレアーゼにより切断され、成熟したｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ*）産物を生じる。成熟したｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成により標的メッセンジャーＲＮＡｓ（ｍＲＮＡｓ）を認識し、通常、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または不安定化を生じる。
【００４６】
ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａから選択することができる。１つの実施形態においては、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１である。１つの実施形態においては、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１０ｂである。１つの実施形態においては、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１３３ａである。これらのｍｉＲＮＡｓは、本技術分野において説明されてきているが、本発明の前には、これらの特定のｍｉＲＮＡｓが骨肉腫、特に骨肉腫の薬物耐性、および／または積極的な浸潤または転移表現型と関係する、または関係し得ることは、全く認識も予想もされていなかった。
【００４７】
ｍｉＲ−１は、配列５’−UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU−３’（配列番号１）を有する２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡとされている。
【００４８】
ｍｉＲ−１０ｂは、配列５’−UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG−３’（配列番号２）を有する２３ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡとされている。
【００４９】
ｍｉＲ−１３３ａは、配列５’−UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG−３’（配列番号３）を有する２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡとされている。
【００５０】
アンチセンスは、文献において十分に説明されている。一般的に、アンチセンス試薬は、標的核酸分子の配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸ベースの分子であり、それにより、アンチセンス分子とその標的分子とのあいだの会合が、標的核酸分子の発現量を減少させる。
【００５１】
１つの実施形態において、アンチセンス分子（抗−ｍｉＲＮＡ）は、安定化ＲＮＡ、すなわち、天然に生じるＲＮＡと比較して、インビトロまたはインビボでヌクレアーゼ介在性分解に相対的に耐性を示すＲＮＡである。様々な形態の安定化された核酸が、ＲＮＡを含めて知られている。いくつかの安定化されたＲＮＡｓは、ポリＡ３’−末端を含む。核酸の化学的に修飾された形態は、たとえば、限定的なものではないが、ロックド核酸（ＬＮＡｓ）、ホスホロチオエート骨格修飾核酸および２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）核酸などであって、十分に説明されており、本明細書においてさらなる説明を必要とするものではない。Kruetzfeldt et al. (2005) Nature 438:685-9; Ma et al. (2010) Nat Biotechnol 28:341-7.
【００５２】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドである。ロックド核酸ヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素と４’炭素とを結合する特別ブリッジ（extra bridge）で修飾されている。ブリッジは、リボースを３’−エンドコンホメーションに「ロックする」。ＬＮＡヌクレオチドは、イマニシとその仲間ならびにウェンゲルとその仲間により最初に開発された。Obika et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38: 8735-8; Koshkin et al. (1998) Tetrahedron 54: 3607-30.
【００５３】
ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのポリマーであり、そのヌクレオチドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡオリゴヌクレオチドにおける非−ＬＮＡヌクレオチドはいずれも、ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、その対象とする標的に関してアンチセンス分子として機能的であるならば、天然に存在するまたは修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであっても、またはそれらのアナログであってもよい。１つの実施形態においては、ＬＮＡオリゴヌクレオチドにおける非−ＬＮＡヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオチドであり、そして少なくとも３’−末端ヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである。１つの実施形態においては、ＬＮＡオリゴヌクレオチドにおける非−ＬＮＡヌクレオチドはいずれも、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドであり、そして少なくとも３’−末端の２つのヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである。１つの実施形態においては、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、もっぱらＬＮＡヌクレオチドのみから構成される。
【００５４】
１つの実施形態においては、アンチセンス分子はＤＮＡである。
【００５５】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１に特異的なアンチセンス分子は、配列５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）を含む。
【００５６】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１に特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−ACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号４）である。
【００５７】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１０ｂに特異的なアンチセンス分子は、配列５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）を含む。
【００５８】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１０ｂに特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−ACAAATTCGGTTCTACAGGGT−３’（配列番号５）である。
【００５９】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１３３ａに特異的なアンチセンス分子は、配列５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）を含む。
【００６０】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１３３ａに特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA−３’（配列番号６）である。
【００６１】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１に特異的なアンチセンス分子は、配列５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）を含む。
【００６２】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１に特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−AUACAUACUUCUUUACAUUCCA−３’（配列番号７）である。
【００６３】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１０ｂに特異的なアンチセンス分子は、配列５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）を含む。
【００６４】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１０ｂに特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA−３’（配列番号８）である。
【００６５】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１３３ａに特異的なアンチセンス分子は、配列５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）を含む。
【００６６】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１３３ａに特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号９）である。
【００６７】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１に特異的なアンチセンス分子は、配列５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）を含む。
【００６８】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１に特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−ATACATACTTCTTTACATTCCA−３’（配列番号１０）である。
【００６９】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１０ｂに特異的なアンチセンス分子は、配列５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）を含む。
【００７０】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１０ｂに特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA−３’（配列番号１１）である。
【００７１】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１３３ａに特異的なアンチセンス分子は、配列５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）を含む。
【００７２】
１つの実施形態においては、ｍｉＲ−１３３ａに特異的なアンチセンス分子の配列は、５’−CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA−３’（配列番号１２）である。
【００７３】
本発明はさらに、上述のアンチセンス分子配列のいずれか１つと少なくとも９０パーセント同一である連続した配列を含む２０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス分子を包含する。そのようなアンチセンス分子は、標的とされるｍｉＲＮＡｓと特異的にハイブリダイズすることができるか、またはその発現をノックダウンすることができるということは理解されるべきである。
【００７４】
本発明はさらに、上述のアンチセンス分子配列のいずれか１つと少なくとも９５パーセント同一である連続した配列を含む２１〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス分子を包含する。そのようなアンチセンス分子は、標的とされるｍｉＲＮＡｓと特異的にハイブリダイズすることができるか、またはその発現をノックダウンすることができるということは理解されるべきである。
【００７５】
上述の各実施形態において、１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。さらに、１つの実施形態においては、アンチセンス分子は、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドのみから構成される。
【００７６】
１つの実施形態においては、特定のマイクロＲＮＡに特異的なアンチセンス分子は、核酸送達ビヒクルと関連付けられる。本明細書において使用される場合、「核酸送達ビヒクル」は、細胞の細胞質に核酸分子を送達するために有用な生物学的に適合するベクターを意味する。アンチセンス分子は、核酸送達ビヒクルに結合され得る。あるいはまたはさらに、アンチセンス分子は核酸送達ビヒクルによりカプセル化され得る。好適な核酸送達ビヒクルの例としては、リポソーム、脂質、コレステロール、ホルモンおよびその他の標的化分子が挙げられる。リポソームについては、アンチセンス分子は、リポソームの外表面、リポソームの内側、またはリポソームの外側と内側の両方と関連付けることができる。
【００７７】
１つの実施形態においては、骨肉腫は、限局性骨肉腫、たとえば１つの肢または１つの骨に限局している骨肉腫である。
【００７８】
１つの実施形態においては、骨肉腫は、転移性骨肉腫である。
【００７９】
本発明の１つの実施態様は、抗がん治療に対する骨肉腫の抵抗性を評価する方法である。この方法は、以下の工程、
骨肉腫細胞を含む組織試料を得る工程；
試料からＣＤ１３３発現細胞を単離する工程；
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の、ＣＤ１３３発現細胞による第１の発現レベルを測定する工程；
ＣＤ−１３３発現細胞を抗がん治療と接触させる工程；および
その少なくとも１つのｍｉＲＮＡの、ＣＤ１３３発現細胞による第２の発現レベルを測定する工程を含み、第１の発現レベルよりも高い第２の発現レベルが、骨肉腫が抗がん治療に抵抗性であることを示す。
【００８０】
ＣＤ１３３発現細胞は、組織試料から任意の適切な手段を用いて単離され得る。たとえば、細胞懸濁液をその組織から調製し得、その後細胞を、たとえば抗ＣＤ１３３抗体を負荷した磁気ビーズなどと免疫クロマトグラフィーに付するか、または適切に標識された抗ＣＤ１３３抗体を用いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）する。モノクローナル抗ヒトＣＤ１３３抗体は、多くのサプライヤーから市販されている。
【００８１】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、任意の好適な方法を用いて行うことができる。たとえば、発現レベルは、適切に選択されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定され得る。あるいはまたはさらに、発現レベルは、適切に選択、標識化されたハイブリダイゼーションプローブでのノーザンブロット法を用いて決定され得る。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「抗がん治療」は、がんを治療するために有用な任意の治療の様式を意味する。そのような様式には、一般的に、化学療法、外照射療法、免疫療法、ホルモン療法およびそれらの組み合わせが挙げられる。化学療法剤は、低分子（分子量約１ｋＤａ未満）であり、医学分野において周知である。骨肉腫に使用される一般的な化学療法剤としては、シスプラチン（シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＤＤＰやシスプラチン（cisplatinum）としても公知、プラチノールおよびプラチノール−ＡＱとして市販されている）、ドキソルビシン（ヒドロキシダウノルビシンとしても公知、アドリアマイシンとして市販されている）およびメトトレキサート（アメトプテリンとしても公知）が挙げられる。１つの実施形態においては、抗がん治療は、シスプラチン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。これらの薬剤は２つ以上を組み合わせて、同時にまたは連続して使用してもよい。加えて、そのような抗がん治療の任意の１つまたは組み合せは、他の抗がん様式、たとえば外照射療法と組み合わせて使用することもできる。
【００８３】
種々の実施形態においては、骨肉腫は、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの少なくとも１つの第２の発現レベルが第１の発現レベルよりも客観的に高い場合に抗がん治療に抵抗性であると同定される。種々の実施形態においては、骨肉腫は、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの少なくとも１つの第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも１００パーセント高い場合に抗がん治療に抵抗性であると同定される。
【００８４】
１つの実施形態においては、その方法はさらに、骨肉腫が抗がん治療に抵抗性であることが判明した場合、抗がん治療の用量を調整するまたは抗がん治療を変更する工程を含む。たとえば、骨肉腫が抗がん治療に抵抗性であることが判明した場合、その抗がん治療は、他の好適な抗がん治療で補充されるか、または他の好適な抗がん治療に変更され得る。
【００８５】
本発明の１つの実施態様は、骨肉腫のスクリーニング方法である。この方法は、対象から得られた組織試料に、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を特異的に検出可能なアッセイを行う工程を含み、アッセイによる、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの試料中の存在の検出が、対象が骨肉腫を有する危険性があるということを示す。１つの実施形態においては、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１である。１つの実施形態においては、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１０ｂである。１つの実施形態においては、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１３３ａである。１つの実施形態においては、少なくとも１つのｍｉ−ＲＮＡはｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの任意の組み合わせである。
【００８６】
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を特異的に検出することが可能なアッセイは、たとえば、適切に選択されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲであり得る。あるいはまたはさらに、アッセイは、適切に選択、標識されたハイブリダイゼーションプローブでのノーザンブロット法であり得る。
【００８７】
１つの実施形態においては、組織は血液である。１つの実施形態においては、組織は血清である。１つの実施形態においては、組織は血漿である。
【００８８】
１つの実施形態においては、この方法はさらに、対象が骨肉腫を有する危険性があると決定された場合、骨肉腫の存在を、任意の好適な方法を用いて検証する工程を含む。たとえば、骨肉腫の存在の検証には、Ｘ線を使用する骨検索または特異的骨造影分析または他の好適な骨画像技術、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、生検、およびそれらの任意の組み合わせを行うことが含まれる。
【００８９】
１つの実施形態においては、この方法はさらに、対象を骨肉腫について治療する工程を含む。
【００９０】
本発明の１つの実施態様は、骨肉腫をモニタリングする方法である。その方法は、
（ａ）骨肉腫を有する対象または骨肉腫の治療をしている対象から得られた組織試料において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを特異的に定量することができるアッセイを行う工程；ならびに
（ｂ）対象由来の後に得られた組織試料において工程（ａ）を繰り返す工程を含み、先に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い後に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、その骨肉腫が進行性であることを示し、そして先に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルよりも低い後に得られた試料におけるその少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、その骨肉腫が退行性であることを示す。
【００９１】
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａからなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを特異的に定量することができるアッセイは、たとえば適切に選択されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲであり得る。
【００９２】
１つの実施形態においては、組織は血液である。１つの実施形態においては、組織は血清である。１つの実施形態においては、組織は血漿である。
【００９３】
１つの実施形態においては、その方法はさらに、骨肉腫が進行性であると判明した場合、抗がん治療の用量を調整するかまたは抗がん治療を変更する工程を含む。たとえば、骨肉腫が進行性であると判明した場合、その抗がん治療は、他の好適な抗がん治療で補充されるか、または他の好適な抗がん治療に変更され得る。
【００９４】
１つの実施形態においては、その方法はさらに、骨肉腫が退行性であると判明した場合、抗がん治療の用量を調整するかまたは抗がん治療を変更する工程を含む。たとえば、骨肉腫が退行性であると判明した場合、その抗がん治療は減少されるかまたは一時中断さえされ得、または抗がん治療は、他の好適な抗がん治療に変更され得る。
【００９５】
本発明を、これまで一般的に開示したが、以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００９６】
全般的な方法
新鮮な臨床試料からの骨肉腫細胞の精製
新鮮なヒト骨肉腫試料は、人体実験に関する規制委員会の倫理規範にしたがって、２０１０年１０月〜２０１１年６月の間に日本の国立がんセンター病院で診断的切開生検を受けた２人の患者から、ネオアジュバント化学療法の前に骨肉腫の原発部位から得た。骨肉腫および組織学的亜型の診断は、有資格病理学者により決定された。外科的標本は、手術時に得られ、１０分以内に研究室に受け入れられ、直ちに機械的にバラバラにされ、コラゲナーゼ（新田ゼラチン（株））で消化され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄された。単細胞懸濁液は、７０μｍフィルター（ＢＤバイオサイエンス）を用いるろ過により得た。細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ギブコＢＲＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（インビトロジェン）で、５％ＣＯ2下で加湿インキュベータにおいて３７℃で培養した。
【００９７】
細胞および細胞培養物
ヒト骨肉腫ＨｕＯ９細胞株は、出願人の研究室にて以前に確立された。ヒト骨肉腫細胞株ＳａＯＳ２、Ｕ２ＯＳ、ＭＧ６３、ＨＯＳ、ＭＮＮＧ／ＨＯＳおよび１４３Ｂを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。形質転換胚性腎細胞株２９３もＡＴＣＣから得た。ＳａＯＳ２およびＨｕＯ９細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地（ギブコＢＲＬ）において培養した。Ｕ２ＯＳ、ＭＧ６３、ＨＯＳ、ＭＮＮＧ／ＨＯＳ、１４３Ｂおよび２９３細胞は、ＤＭＥＭ（インビトロジェン）において培養した。すべての培地には、１０％熱不活化ＦＢＳ（ギブコＢＲＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充した。細胞は、５％ＣＯ2下で加湿インキュベータにおいて３７℃で維持した。
【００９８】
細胞ソーティングおよびフローサイトメトリー
フローサイトメトリーによる細胞ソーティングを、フィコエリトリン（ＰＥ）結合モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３、ミルテニーバイオテク）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ４４（eBioscience）を用いて骨肉腫細胞株および臨床試料に行った。アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１κ−ＰＥ（eBioscience）を対照とした。試料をＪＳＡＮ細胞ソーター（ベイバイオサイエンス）およびＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）で分析および選別した。生存率は、トリパンブルー色素排除法を用いて評価した。結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star）で解析した。
【００９９】
細胞増殖および細胞毒性アッセイ
細胞増殖率および細胞生存率を細胞のドキソルビシン、シスプラチンおよびメトトレキサートへの相対感受性に関する指標として、製造者の取扱説明書にしたがい、TetraColor ONE Cell proliferation Assay System（生化学）を用いて決定した。対数期で増殖する細胞を９６ウェルプレート（５×１０3／ウェル）に播種し、一晩接着させ、その後、ドキソルビシン（シグマ）、シスプラチン（アレクシス（Alexis））およびメトトレキサート（シグマ）の様々な用量で７２時間処理した。三重のウェルを各処置群について使用した。吸光度は、EnVision（ワラック）において参照波長６５０ｎｍを用いて４５０ｎｍで測定した。生細胞の相対数を細胞生存率のパーセントとして表した。
【０１００】
スフェア形成
骨肉腫細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのヒト組換え表皮増殖因子（ＥＧＦ）（シグマ−アルドリッチ）、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（インビトロジェン）、４μｇ／ｍＬのインスリン（シグマ−アルドリッチ）、Ｂ−２７（登録商標）（１：５０、インビトロジェン）、５００単位／ｍＬのペニシリン（インビトロジェン）および５００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（インビトロジェン）を補充した３００μＬの血清不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）中、５，０００〜１０，０００細胞／ウェルで置いた。細胞を２４ウェルの超低接着表面プレート（コーニング）において懸濁培養した。細胞に１日おきに３０μＬの補充培地を補充した。三重のウェルにおいて５日目にスフェアを計数した。細胞培養は、５％ＣＯ2加湿インキュベータにおいて３７℃で行った。
【０１０１】
浸潤アッセイ
浸潤アッセイは、マトリゲルを備えた２４ウェルＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ベクトン−デッキンソン）を用いて行った。５００μＬのＦＢＳ不含ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した１×１０5細胞を上部チャンバーに加え、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０培地を下部チャンバーに加えた。２４時間または３６時間のインキュベーション後、フィルターの上部表面上の細胞を、綿棒でそれらをふき取ることにより完全に取り除いた。フィルターをメタノールで固定し、１％四ホウ酸ナトリウム中１％トルイジンブルー（シスメックス）で染色した。その後、フィルターをスライド上に載せ、下部表面上の細胞を計数した。各アッセイは、三重で行った。
【０１０２】
ｍｉＲＮＡプロファイリング
ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングは、アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）（サンタクララ、ＣＡ）により製造され、いずれも８６６ヒトｍｉＲＮＡｓを含むｍｉＲＮＡマイクロアレイを用いて行った（Agilent Technologies [http://www.chem.agilent.com/scripts/PHome.asp]）。単離直後のＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低細胞の３つの独立して抽出されたＲＮＡ試料を、各細胞株におけるアレイ分析のために用いた。全ＲＮＡ試料の標識化およびハイブリダイゼーションは、製造者のプロトコルにしたがって行った。マイクロアレイの結果は、Agilent Feature Extractionソフトウェア(ｖ１０．７．３．１)を用いて抽出され、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ １１．０．２ソフトウェア（アジレントテクノロジーズ）を用いて分析した。
【０１０３】
ＣＤ１３３、ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−１３３ａの標的の生存相関研究のための臨床試料
骨肉腫組織試料は、診断的切開生検により、１９９７年６月〜２０１０年９月の間に日本の国立がんセンター病院で、ネオアジュバント化学療法の前に骨肉腫の原発部位から得た。４０歳より年を取っていて、四肢の外側に位置する原発性腫瘍を有する患者は除外した。各新鮮な腫瘍試料を２つに切断し、その１つを直ちに液体窒素中に凍結保存し、そしてもう１つをホルマリンで固定した。骨肉腫および組織学的亜型の診断は、有資格病理学者により決定された。骨芽細胞組織学的亜型、軟骨芽細胞組織学的亜型、線維芽細胞組織学的亜型および血管拡張性組織学的亜型を有する骨肉腫試料のみが含められた。化学療法への応答は、腫瘍壊死の範囲が９０％以上であった場合に良好として分類された。ＣＤ１３３およびｍｉＲ−１３３ａの標的の生存相関研究のために、ｃＤＮＡライブラリーから利用可能な３５個のｃＤＮＡ試料を用い、一方、利用可能な４８個のホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料由来のＲＮＡをｍｉＲ−１３３ａの相関研究に用いた。患者の臨床情報は、表７および１０（下記）に記載している。すべての患者は、研究目的のそれらの試料の採取および使用を容認する書面のインフォームドコンセントを提供した。臨床情報を得るため、および試料を採取するための研究プロトコルは、日本の国立がん研究センターの施設内倫理委員会により承認された。
【０１０４】
ＲＮＡの単離とｍＲＮＡｓおよびｍｉＲＮＡｓの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、細胞および腫瘍組織から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＫｉｔおよびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（キアゲン）により精製した。ｍＲＮＡｓの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）のため、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いてｃＤＮＡを合成した。各ｑＰＣＲ反応について、等量のｃＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（インビトロジェン）および特異的プライマー（表１）と混合した。遺伝子発現レベルをベータアクチン（ＡＣＴＢ）またはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）により正規化した。ｍｉＲＮＡｓのｑＰＣＲのために、ｍｉＲＮＡをＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＲＮＵ６Ｂ核内低分子ＲＮＡを内部対照として増幅した。ｑＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲシステム７３００のＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＡｓｓａｙおよびＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）に含まれる各ｍｉＲＮＡ−特異的プローブを用いて行った。
【０１０５】
【表１】
2014527807.tif 000002
2014527807.tif 000003
【０１０６】
合成ｍｉＲＮＡｓ、ＬＮＡｓおよびｓｉＲＮＡｓでのトランスフェクション
合成ｈｓａ−ｍｉＲｓ（Ｐｒｅ−ｍｉＲ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１、−１０ｂ、−１３３ａおよび陰性対照（ＮＣ；アプライドバイオシステムズ、表２）およびロックド核酸（ＬＮＡｓ）（ＬＮＡ−１、−１０ｂ、−１３３ａおよび陰性対照、Ｅｘｉｑｏｎ、表３）を、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ １（ＧＥヘルスケア）を用いてそれぞれ３０ｎＭ（最終濃度）で各種の細胞にトランスフェクトした。合成ｓｉＲＮＡｓ（（株）ボナック、表４）を、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ １（ＧＥヘルスケア）を用いてそれぞれ１００ｎＭ（最終濃度）で各種の細胞にトランスフェクトした。２４時間インキュベーション後、細胞を、細胞毒性アッセイのために化学療法剤で処置するか、浸潤アッセイのために浸潤チャンバーに再び播種した。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
ｍｉＲ−１３３ａ安定発現細胞株の確立
ｍｉＲ−１３３ａベクターは、ｐＩＲＥＳ−ｈｙｇベクター（クローンテック）に成熟マイクロＲＮＡ配列の全長を含むクローニング配列を挿入することにより構築した。マイクロＲＮＡおよび対照ベクターを、新たに単離した骨肉腫ＣＤ１３３低ＨＯＳ細胞にリン酸カルシウム共沈殿法によりトランスフェクトした。形質転換体は分けられ、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む選択培地において培養された。ハイグロマイシン耐性コロニーが選択され、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する培地で拡張された。ｍｉＲ−１３３ａ構築物の配列は、ＤＮＡ配列決定法（ＡＢＩ ３１３０シーケンサー、アプライドバイオシステムズ）により確認され、マイクロＲＮＡ過剰発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより確認された。ＲＮＵ６Ｂを内因性の対照として供した。
【０１１１】
腫瘍移植実験
動物実験は、国立がんセンター研究所の動物実験のための施設の指針に従って行った。無胸腺ヌードマウスまたはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＣＬＥＡ、日本）を４週齢で購入し、腫瘍移植前に少なくとも１週間新しい環境に適合させた。０日目、マウスを３％イソフルランで麻酔し、右足を７０％エタノールで消毒した。細胞を、２７−Ｇ針で１ｍＬのツベルクリン注射器に吸引した。針は、皮質の破壊を避けるために回転運動をさせながら、脛骨の前結節の皮質を経て挿入した。一旦骨を越えると、針はさらに挿入され、脛骨の後部皮質を破壊する。１００μＬ容量の新しく単離されたＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＨＯＳ−Ｌｕｃ（部位につき１０2、１０3、１０4、１０5細胞）または１４３Ｂ−Ｌｕｃ（１．５×１０6）を含む溶液を、ゆっくりと針を後退させながら注射した。
【０１１２】
ＬＮＡ−抗−ｍｉＲ−１３３ａあり／なしでの腫瘍成長、肺転移および毒性のモニタリング
ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低ＨＯＳ−Ｌｕｃ細胞の間の腫瘍原性の評価のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射によりＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ、プロメガ）を注射した。１０分後、蛍ルシフェラーゼ由来の光子を、製造業者の取扱説明書にしたがいＩＶＩＳイメージングシステム（キセノゲン（Xenogen）社）を用いて計数した。各実験条件は１群５匹であり、１週間に１回モニタリングした。骨肉腫モデルマウスの自発肺転移へのＬＮＡ−抗−ｍｉＲ−１３３ａ投与の評価のため、個々のマウスに尾静脈より１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−抗−ｍｉＲ−１３３ａまたは生理食塩水を注射した。ＬＮＡは、１４３Ｂ−Ｌｕｃ細胞の接種後４、１１、１８、２５、３２日目に注射した。各実験条件は、各群１０匹とした。後の肺転移の発達は、１週間に１回で５週間、上述の生物発光イメージングによりインビボでモニタリングした。すべてのデータは、LivingImageソフトウェア（バージョン２．５０、キセノゲン）を用いて分析した。３６日目に、各群５匹のマウスにおいて、原発性腫瘍および肺を、それらの重量、生物発光および組織学的分析のために剖検で切除した。血液検査、体重、および心臓、肝臓および骨格筋の重量、および病理組織学的検査を毒性の評価のために行った。残りのマウスについては、それらの生存期間を観察した。
【０１１３】
ｍｉＲ−１３３ａ標的ｍＲＮＡｓの包括的収集と同定
ｍｉＲ−１３３ａの包括的な下流の標的を収集するために、２つの実験的アプローチからｃＤＮＡマイクロアレイプロファイリングを行った。１つ目は、候補遺伝子を、ｍｉＲ−１３３ａまたは陰性対照（ＮＣ）を形質導入したＳａＯＳ２ ＣＤ１３３低細胞の回収された全ＲＮＡから行われたｃＤＮＡマイクロアレイ分析から収集した。２つ目は、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析を、ｍｉＲ−１３３ａまたはＮＣを形質導入したＣＤ１３３低細胞における抗−Ａｇｏ２抗体免疫沈降（Ａｇｏ２−ＩＰ）から回収された全ＲＮＡから行った。前者の方法において１．５倍減少（fold decrease）で下方調節された遺伝子と、後者の方法において２．０倍増加で上方調節された遺伝子をコンピュータデータベース、TargetScanHuman 6.0（http://www.targetscan.org/）を参照して候補として定義した。
【０１１４】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＳＧＭＳ２の３’ＵＴＲ（ＮＭ＿１５２６２１のｎｔ １６５６−１８７９（結合部位））、ＵＢＡ２の３’ＵＴＲ（ＮＭ＿００５４９９のｎｔ ２５２７−２６５４（結合部位））、ＤＵＳＰ１１の３’ＵＴＲ（ＮＭ＿００３５８４のｎｔ １１８０−１５７２（結合部位））、ＭＡＳＴ４の３’ＵＴＲ（ＮＭ＿００１１６４６６４のｎｔ ８０１７−８０９６（結合部位））、ＳＮＸ３０の３’ＵＴＲ（ＮＭ＿００１０１２９４４のｎｔ６６５９−７６１１（結合部位））およびＡＮＸＡ２のＣＤＳ（ＮＭ＿００１００２８５７のｎｔ ２４４−７４３（結合部位））の各フラグメントを増幅し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクター（プロメガ）の蛍ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングした。プラスミドにクローン化されたすべてのＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定により検証し、それらが変異をもたず、正しいクローニング方向であることを確認した。プライマー配列を表５に挙げる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、ＨＯＳ細胞を１００ｎｇのルシフェラーゼ構築物と１００ｎＭの合成ｍｉＲ−１３３ａ分子または対照（非標的化ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、キアゲン）と同時トランスフェクトした。蛍ルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いてトランスフェクションの４８時間後に測定した。結果は相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性（ウミシイタケルシフェラーゼ／蛍ルシフェラーゼ）として示した。
【０１１５】
【表５】
2014527807.tif 000007
【０１１６】
免疫組織化学
ＣＤ１３３およびｍｉＲ−１３３ａの標的の染色については、骨肉腫臨床試料および異種移植腫瘍のスライドを作製した。内因性ペルオキシダーゼを１％のＨ2Ｏ2（３０分）で阻害した。スライドを、抗原回復のために１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）において加熱した。その後、スライドを、モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ１３３／２（１：１０希釈、ミルテニーバイオテク）、モノクローナルマウス抗−ヒトＳＧＭＳ２（１：５０希釈、Abcam）またはアイソタイプを適合させた対照抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。免疫検出は、製造業者の取扱説明書にしたがい、ＩｍｍＰＲＥＳＳペルオキシダーゼポリマー検出試薬（ベクターラボラトリーズ）およびＭｅｔａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（サーモ フィッシャー サイエンティフィック）を用いて行った。染色は、ヘマトキシリンによる対比染色により示した。
【０１１７】
統計的分析
棒グラフにおける有意差を除き、すべての統計的分析は、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ社、シカゴ、ＩＬ）を用いて行い、その場合、分析は、スチューデントのｔ検定を適用することにより行った。異なる臨床病理データの間のＣＤ１３３発現の差異は、キー二乗（χ2）検定により分析した。平均値よりも低いΔＣｔの場合は、高ＣＤ１３３発現を示すとして分類し、一方、平均値よりも高いΔＣｔの場合は、低ＣＤ１３３発現を示すとして分類した。ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低原発性腫瘍の患者の生存を比較するために、カプラン−マイヤー法およびログランク検定を用いた。生存期間は、診断から死までの時間として規定したが、生きている患者については、最後の経過観察の時点で打ち切りとした。ｍｉＲ−１３３ａおよびその標的の発現における差異の計算について、同じ手法を適用した。これらの分析すべてにおいて、０．０５以下のＰ値を有意差であるとみなした。
【０１１８】
実施例１
骨肉腫細胞株の細胞のごく一部がＣＤ１３３を発現する。
骨肉種細胞株ＳａＯＳ２、ＨＯＳ、Ｕ２ＯＳ、ＭＮＮＧ／ＨＯＳ、ＭＧ６３、１４３ＢおよびＨｕＯ９を、肉腫の起源とみなされている間葉系幹細胞または神経幹細胞のマーカーについてスクリーニングした。Basu-Roy, U et al. (2011) Oncogene 31: 2270-82; Kuhn, NZ et al. (2010) J. Cell. Physiol. 222: 268-77。結果として、ＣＤ１３３、すなわちプロミニン−１の構造的ホモログは、全ての細胞株において、０．０４％〜８．４７％というごく一部に見出されたが、ＣＤ４４は、大部分で見出された（図１）。ＳａＯＳ２、ＭＮＮＧ／ＨＯＳおよびＨＯＳは、ＣＤ１３３のそれらの発現が特に強いことが分かった（それぞれ８．４７、８．１３および７．６９％）。
【０１１９】
新たに単離された細胞集団の単細胞増殖は、ＰＫＨ染料を用いて観察された。ＰＫＨ染料は、細胞膜に結合し、各細胞分裂後に娘細胞に分離される蛍光色素である。通常、ＰＫＨ濃度は細胞分裂ごとに減少する、そのため静止細胞はＰＫＨ高のままで、分裂細胞は徐々にＰＫＨ低となる。さらに、通常、ＰＫＨ６７染料は、娘細胞の間に均等に分配されるが、急速に分裂する細胞、たとえばがん細胞では、均等でない分割を示す。
【０１２０】
ＣＤ１３３高細胞集団は、異なる増殖結果を有するＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低の両集団を生じた。１つは静止（ＰＫＨ高）で、もう１つは活発に分裂（ＰＫＨ低）である。ＣＤ１３３高画分の単一のＰＫＨ２６高細胞は、均等でない分裂を示した。休眠細胞として提示する少数のＰＫＨ２６高細胞が、８日目にＰＫＨ２６低細胞に取り囲まれて観察され、ＦＡＣＳ分析ではＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低の両細胞を有する画分として同定された。他方、ＣＤ１３３低ＳａＯＳ２画分の単一のＰＫＨ６７高細胞は、対称分裂を示し、すなわちＰＫＨ６７低細胞を有するコロニーが観察された。これは、単離２週間後のＦＡＣＳ分析において、ＣＤ１３３低画分として同定された（図２）。ＣＤ４４の発現による細胞分裂における差異は観察されなかった。
【０１２１】
さらなる実験は、ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低集団の他の表現型を同定するために行った。合計５×１０3のＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低細胞をソートし、直ちに血清不含で、成長因子が補充された足場非依存性環境の条件下で培養した。培養２週間以内に、より多くの骨肉腫スフェアがＣＤ１３３低細胞よりもＣＤ１３３高細胞から観察された（図３）。
【０１２２】
実施例２
ＣＤ１３３高細胞は、増強された薬物抵抗性、浸潤性および腫瘍原性を示す。
薬物抵抗性は、ＴＩＣｓの重要な性質の１つであるため、ＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低細胞の集団を、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ）での治療条件において観察した。これらは骨肉腫に対する標準的な化学療法剤である。ＣＤ１３３高細胞は、ＣＤ１３３低細胞よりもこれらの化学療法剤により抵抗性であった（図４）。さらに、ＣＤ１３３高細胞は、ＣＤ１３３低細胞よりもより高い浸潤能を示した（図５）。新しく単離したＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低細胞由来のｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲは、ＣＤ１３３高ＳａＯＳ２細胞は、増強されたレベルの、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ−２（これらは、胚性幹細胞やＣＳＣｓまたはＴＩＣｓの自己複製能の維持および分化万能性の維持において重要な役割を果たす転写因子である（Levings, PP et al. (2009) Cancer Res. 69: 5648-55; Basu-Roy U et al. (2011) Oncogene 31: 2270-82））；多剤耐性トランスポーター遺伝子ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＧ２；ならびに転移関連遺伝子、β４−インテグリン、エズリン、ＭＭＰ−１３およびＣＸＣＲ４（Tang, N et al. (2008) Clin. Orthop. Relat. Res. 466: 2114-30; Osaki, M et al. (2011) Mol. Ther. 19: 1123-30）を発現したことを明らかにした（図６）。最も重要なことは、ＣＤ１３３高ＨＯＳ画分は、インビボにおいてＣＤ１３３低ＨＯＳ画分よりも強い腫瘍原性を示し、ＣＤ１３３高細胞は、わずかに１００個の細胞から腫瘍を形成し得るが、ＣＤ１３３低細胞は、形成できないということである（図７）。結果は表６にも示す。
【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
実施例３
ＣＤ１３３メッセンジャーＲＮＡの高度な発現は、骨肉腫患者の不良な生存率についてのマーカーである。
ＣＤ１３３の臨床的な重要性を評価するために、新しいヒト骨肉腫生検から確立された細胞株を、フローサイトメトリーにより分析し、ごく稀な頻度＜１０％でＣＤ１３３高集団を含有することを見出した（図８）。さらに、３５人の骨肉腫患者の臨床試験は、ＣＤ１３３メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の高い発現レベルが、骨肉腫患者のかなり悪い全生存率と相関したことを明らかにした（ログランク検定、Ｐ＝０．０２６２）。結果を図９および表７に示す。
【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
実施例４
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａは、ＣＤ１３３低細胞と比較してＣＤ１３３高細胞において上方調節される。
ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングは、有用な診断および予測ツールとなることが報告されており、多くの研究が、特定のｍｉＲＮＡｓが、がん遺伝子または腫瘍抑制因子のいずれかとして作用することを示している。Croce, CM (2009) Nat. Rev. Genet. 10:704-10。さらにＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低表現型の基礎にある分子機構を特徴付けるため、単離したＣＤ１３３高およびＣＤ１３３低骨肉腫ＳａＯＳ２およびＨＯＳ細胞のｍｉＲＮＡプロファイリングを、８６６種類の配列確認済ヒトｍｉＲＮＡｓを含むマイクロアレイ分析を用いて行った。図１０および表８に示す結果は、３種類のｍｉＲＮＡｓが、ＣＤ１３３高細胞においてＣＤ１３３低細胞と比較して変動比（Fold change）＞２で上方調節されたことを明らかにした。２回目のｑＰＣＲの有効性確認試験では、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａがマイクロアレイのデータと一致することが明らかとなった（図１１）。
【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*は、ステムループ前駆体ｍｉＲＮＡのＤｉｃｅｒプロセッシングによる二本鎖ＲＮＡ産物の２つの鎖である。ｍｉＲＮＡは、最終的にＲＩＳＣに入る「ガイド」鎖であり、ｍｉＲＮＡ*は、他の「パッセンジャー」鎖である。細胞内に存在するｍｉＲＮＡ*のレベルは低い（対応するｍｉＲＮＡに対して≦１５％）。細胞内に存在するパッセンジャー鎖の割合がより高い場合は、ｍｉＲＮＡ−３ｐ／ｍｉＲＮＡ−５ｐの命名がｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ*の代わりに使用される。ｍｉＲＮＡ−３ｐは、前駆体ｍｉＲＮＡの３’アームから誘導されたｍｉＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ−５ｐは、前駆体ｍｉＲＮＡの５’アームから誘導されたｍｉＲＮＡである。
【０１２９】
実施例５
ｍｉＲ−１３３でのＣＤ１３３低細胞のトランスフェクションは、ＣＤ１３３高細胞と関連付けられる性質を与え、ｍｉＲ−１３３ａの高い発現は、臨床的予後の不良と相関する
これらのｍｉＲＮＡｓが、骨肉腫腫瘍開始細胞のこれらの表現型を阻害できるかどうかを決定するために、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａの発現レベルをＣＤ１３３低細胞において操作した（図１２）。これらのｍｉＲＮＡｓ、特にｍｉＲ−１３３ａは、ｍｉＲ−ＮＣ（陰性対照）オリゴヌクレオチドと比較して、ＣＤ１３３低細胞の浸潤性を増強した（図１３）。興味深いことに、これらすべてのｍｉＲＮＡｓのトランスフェクションは、ＣＤ１３３低細胞の浸潤を劇的に増強した（図１３）。細胞増殖および薬物抵抗性は、ｍｉＲ−１３３トランスフェクションによりＣＤ１３３低細胞においてわずかに強められた（図１４）。安定に過剰発現するｍｉＲ−１３３ａＨＯＳ ＣＤ１３３低細胞（図１５）は、足場血清不含環境下で対照ＣＤ１３３低細胞よりもスフェア形成に強い（＞２倍）能力を示し、インビボでわずか１００個の細胞で腫瘍を発達させた一方、対照ＣＤ１３３低細胞ではできなかった（図１６および表９）。
【０１３０】
【表９】
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【０１３１】
ｍｉＲ−１３３ａのトランスフェクションは、ＣＤ１３３高細胞において上方調節された分子（図６参照）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルも増加させたが、ＣＤ１３３ｍＲＮＡは増加させず、ｍｉＲ−１３３ａは、ＣＤ１３３の上流経路における分子の発現には影響しないことが示唆された（図１７）。これらの結果は、ｍｉＲ−１３３ａが、骨肉腫ＴＩＣｓの表現型を調節できる候補ｍｉＲＮＡであることを明らかにした。実際、ｍｉＲ−１３３ａの発現も骨肉腫生検のＣＤ１３３高画分において高く（図１８）、ｍｉＲ−１３３ａの高い発現は、患者の芳しくない予後と有意に相関した（表１０）。
【０１３２】
【表１０】
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【０１３３】
実施例６
ｍｉＲＮＡｓでのＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞のトランスフェクションは、増殖の増加をもたらす。
ＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞は、細胞ソーティングにより単離され、その後、陰性対照（ＮＣ）ＲＮＡ、ｍｉＲ−１単独、ｍｉＲ−１０ｂ単独、ｍｉＲ−１３３ａ単独、ｍｉＲ−１＋ｍｉｒＲ−１０ｂ、ｍｉｒＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａでトランスフェクトされた。ＣＤ１３３高細胞も細胞ソーティングにより単離され、その後、陰性対照（ＮＣ）ＲＮＡでトランスフェクトされた。細胞の各集団は、３〜７日間組織培養で別々に維持し、その後、細胞増殖を評価するために光学顕微鏡で調べた。結果を図１９に示す。図１９から明らかなように、ｍｉＲ−１単独、ｍｉＲ−１０ｂ単独、ｍｉＲ−１３３ａ単独、ｍｉＲ−１＋ｍｉｒＲ−１０ｂ、ｍｉｒＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａでトランスフェクトされたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞は、陰性対照ＲＮＡでトランスフェクトされたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞よりもより高い程度まで増殖した。ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａでトランスフェクトされたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞は、陰性対照ＲＮＡでトランスフェクトされたＣＤ１３３高ＳａＯＳ２細胞と同程度付近まで増殖した。組み合わせのこの効果は、少なくとも相加効果であった。
【０１３４】
同様の結果が、ＳａＯＳ２細胞の代わりにＭＮＮＧ／ＨＯＳ細胞での実験において得られた（図２０）。
【０１３５】
実施例７
ｍｉＲＮＡｓでのＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞のトランスフェクションは、薬物抵抗性をもたらす
ＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞は、細胞ソーティングにより単離され、その後、実施例１と同様に陰性対照（ＮＣ）ＲＮＡ、ｍｉＲ−１単独、ｍｉＲ−１０ｂ単独、ｍｉＲ−１３３ａ単独、またはｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａでトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞の各集団は、その後、３０ｎＭのドキソルビシン、２．５μＭのシスプラチンまたは３２０ｎＭのメトトレキサートの存在下、４日間組織培養で別々に維持し、その後、細胞を計数した。結果を図２１に示す。図２１から明らかなように、ｍｉＲ−１３３ａ単独またはｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−１０ｂ＋ｍｉＲ−１３３ａでトランスフェクトされたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞は、シスプラチン存在下、およびメトトレキサート存在下での陰性対照よりも高い程度まで増殖した。したがって、ｍｉＲ−１３３ａの添加は、シスプラチンおよびメトトレキサートに対する抵抗性の増加と関連していた。
【０１３６】
実施例８
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａは、シスプラチン処置により誘導される
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａならびにＣＤ１３３の発現は、シスプラチン処置により誘導された。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＤＯＸ−処置またはＣＤＤＰ−処置（３日間）１４３Ｂ細胞が、未処置１４３Ｂ細胞に対して増加したレベルのｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１３３ａを発現したことを示した（図２２）。また、ｍｉＲ−１３３ａの発現は、ＣＤ１３３低ＨＯＳ細胞において、シスプラチンにより増強された。さらに、ＣＤＤＰへの暴露は、ＣＤ１３３低ＨＯＳ集団のインビボでの腫瘍原性を増加した。ＣＤＤＰ−処置ＣＤ１３３低ＨＯＳ細胞は、わずか１００細胞／注射で腫瘍を形成できたが、未処置ＣＤ１３３低ＨＯＳ細胞はできなかった（図２３および表９）。これらのデータは、ＴＩＣ表現型、ならびにＣＤ１３３ｍＲＮＡおよびｍｉＲ−１３３ａの発現は、化学療法剤により増強され得るということを示す。したがって、本発明者らは、化学療法前または化学療法中のｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングが、ＴＩＣ表現型を増強しかつ化学療法剤により誘導されるｍｉＲ−１３３ａの発現の増加を防ぐと結論付けた。
【０１３７】
実施例９
ｍｉＲ−１３３ａに対するアンチセンスは、ＣＤ１３３高細胞の増殖を減少する
ｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングが、骨肉腫の悪性表現型を抑制するかどうかを評価するために、実施例８の実験と反対の実験を、ロックド核酸（ＬＮＡ）抗−ｍｉＲ−１３３ａを導入することにより行った。ＬＮＡは、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡに対する非常に高い親和性と優れた特異性を有する核酸アナログの１分類であり、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、インビトロおよびインビボの両方でアンチセンス分子として適用されている。Elmeen, J et al. (2008) Nature 452: 896-9; Obad, S et al. (2011) Nat. Genet. 43: 371-8。ＳａＯＳ２およびＨＯＳ細胞のＣＤ１３３高集団は、細胞ソーティングにより単離され、ＬＮＡ−抗−ｍｉＲ−１３３ａ（ＬＮＡ−１３３ａ）およびＬＮＡ−陰性対照（ＬＮＡ−ＮＣ）でトランスフェクトした。対照として、単離されたＣＤ１３３低ＳａＯＳ２およびＨＯＳ細胞も、ＬＮＡ−ＮＣでトランスフェクトした。ＬＮＡ−１３３ａのｍｉＲ−１３３のサイレンシングに対する有効性は、リアル−タイムＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した（図２４）。ＬＮＡ−１３３ａでトランスフェクトされたＣＤ１３３高ＳａＯＳ２およびＨＯＳ細胞は、ＬＮＡ−ＮＣでトランスフェクトされたＣＤ１３３低細胞と同レベルの増殖率に抑制された（図２５）。
【０１３８】
実施例１０
ＬＮＡ−１３３ａ−形質導入ＣＤ１３３高細胞は、増強された薬物感受性および減少された浸潤性を示す
ＬＮＡ−１３３ａ−形質導入ＣＤ１３３高細胞は、ＤＯＸおよびＣＤＤＰに対して、ＬＮＡ−ＮＣ形質導入ＣＤ１３３低細胞のレベルで増強された感受性を示した。これらの結果は、ＣＤ１３３高細胞において、アポトーシス性の核凝集および断片化を示すヘキスト染色細胞を計数することにより正しいことが確認された。対照ＣＤ１３３高細胞と比較して、ＬＮＡ−１３３ａ−形質導入ＣＤ１３３高細胞において、アポトーシス細胞死率は有意に高かった（図２６）。さらに、ＬＮＡ−１３３ａは、ＣＤ１３３高ＳａＯＳ２およびＨＯＳ集団の浸潤性（図２７）およびＣＤ１３３高表現型に関連する分子の発現（図２８）を減少させた。まとめると、これらの結果は、ＣＤ１３３高細胞におけるｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングが、薬物抵抗性および浸潤などの骨肉腫ＴＩＣｓの悪性表現型を減少させることができるということを示唆する。
【０１３９】
実施例１１
ｍｉＲ−１３３ａのインビボでのサイレンシングは、骨肉腫の治療に有効であり、ＣＤＤＰとの組み合わせで相乗効果を示す。
インビトロでの知見を拡大し、ｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングが骨肉腫治療のための有効な治療の選択肢となり得るかどうかを決定するために、骨肉腫の自発的な肺転移モデルに対するＬＮＡ−１３３ａの効果を調べた。実験的に、蛍ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた１４３Ｂ（１４３Ｂ−ｌｕｃ）の１．５×１０6細胞を無胸腺ヌードマウスの右脛骨近位端に同所的に移植した。移植した腫瘍の成長および遠隔転移の存在を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いてルシフェラーゼ生物発光について毎週分析した。新しい治療プロトコルは、インビトロ実験において見られた、化学療法による薬物抵抗性を減少し、かつＴＩＣ表現型の誘導を阻害するために、ＣＤＤＰ（２．５ｍｇｋｇ-1）（図２９）の腹腔内（i.p.）注射の２４時間前のＬＮＡ−１３３ａ静脈内（i.v.）投与（１０ｍｇｋｇ-1）とした。このプロトコルの動物実験の前に、本発明者らは、生理食塩水−処置マウス由来のものと比較してＬＮＡ−１３３ａ−処置マウス由来の骨肉腫組織におけるｍｉＲ−１３３ａレベルの減少を確認した（図３０）。この新しい治療プロトコルの有効性を評価するために、結果を３つの対照群（ｎ＝各１０）：生理食塩水対照群、ＬＮＡ群およびＣＤＤＰ群と比較した。５週間で、各群の半数のマウスをさらなる分析のために安楽死させ、残りのマウスを生存についてモニターした。
【０１４０】
結果
腫瘍のｍｉＲ−１３３ａの発現は、ＬＮＡ−１３３ａの存在下で減少した（図３１）。ＬＮＡ−１３３ａ（１０ｍｇｋｇ-1i.v.）およびＣＤＤＰ（２ｍｇｋｇ-1i.p.）を投与したマウスは、他の群と比較して有意に小さい腫瘍成長を示した（図３２および３３）。ＣＤＤＰ単独の存在下または非存在下での腫瘍の成長における有意差は観察されなかった。さらに、肺の転移は、３５日目で生理食塩水群で１０／１０（１００％）、ＬＮＡ群で７／１０（７０％）、ＣＤＤＰ群で８／１０（８０％）、そして組み合わせ群（ＬＮＡ−１３３ａ＋ＣＤＤＰ）ではたった３／１０（３０％）が観察された（表１１）。
【０１４１】
【表１１】
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【０１４２】
胸部領域での平均発光は、ＬＮＡ−１３３ａおよびＣＤＤＰの組み合わせで処置されたマウスにおいて有意に減少した。すべての肺葉での肺転移の数と大きさの両方は、ルシフェラーゼアッセイおよび組織病理学検査において確認された。
【０１４３】
とりわけ、併用療法（ＬＮＡ−１３３ａ＋ＣＤＤＰ）の効果は、肺転移の相乗的な阻害を示すことが分かった。
【０１４４】
さらに、併用療法（ＬＮＡ−１３３ａ＋ＣＤＤＰ）は、腫瘍保持マウスの生存期間を有意に延長した（ログランク検定、Ｐ＝０．００８４、図３４）。成熟したヒトｍｉＲ−１３３ａおよびマウスｍｉＲ−１３３ａの高度に保存された配列にもかかわらず（たとえば、ジーンバンク受入番号ＮＲ＿０２９６７６：５’−UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG−３’；配列番号３）、全てのマウスは、観察期間中、心臓、肝臓および骨格筋などの種々の組織について最小限の毒作用を示した。したがって、ＬＮＡ−１３３ａの全身投与は、シスプラチン存在下で、高転移性骨肉腫の異種移植片モデルにおいて腫瘍の成長および肺転移の抑制に対して有効である。
【０１４５】
実施例１２
ｍｉＲ−１３３ａの遺伝子標的の同定
上述の実施例は、ｍｉＲ−１３３ａがＣＤ１３３高骨肉腫ＴＩＣｓの悪性度を調節し、骨肉腫細胞におけるｍｉＲ−１３３ａ発現の阻害が腫瘍の発達を阻害するということを確立するものである。ＣＤ１３３高骨肉腫ＴＩＣｓにおいてｍｉＲ−１３３ａにより調節される機序を理解するために、候補ｍＲＮＡ発現プロファイリングを、コンピュータ予測と共に、２つの異なるマイクロアレイ分析により行った（図３５）。本発明者らは、１８１２種類の少なくとも１．２倍減少（fold decrease）で下方調節された遺伝子を、ｍｉＲ−１３３ａまたはＮＣを形質導入したＳａＯＳ２ ＣＤ１３３低細胞から回収された全ＲＮＡの最初のマイクロアレイ分析において検出した一方、ｍｉＲ−１３３ａまたはＮＣを形質導入したＣＤ１３３低細胞において抗−Ａｇｏ２抗体免疫沈降から回収されたＲＮＡにおけるｍＲＮＡ発現の２回目のマイクロアレイ分析において、少なくとも２．０倍増加（fold increase）で４９７６種類の上方調節された遺伝子を検出した（図３６）。その後、２２６個の遺伝子を両方法により回収し（表１２）、２０種類の遺伝子を、コンピュータデータベースで公に利用可能なものの１つであるＴａｒｇｅｔＳｃａｎＨｕｍａｎ６．０において同定した（図３６）。
【０１４６】
【表１２】
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【０１４７】
全体として、ｍｉＲ−１３３ａ標的遺伝子の推定候補は、これらのデータの併用で選択された。つぎに、これらの分子の発現は、これらの候補が骨肉腫細胞におけるｍｉＲ−１３３ａの機能的に重要な標的かどうかを調査するためにｓｉＲＮＡ−誘導遺伝子ノックダウンシステムを用いて減少された。結果として、ＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞における４つの候補（ＡＮＸＡ２、ＤＵＳＰ１１、ＭＡＳＴ４およびＲＯＤ１）のノックダウンが、薬物抵抗性を増強し（図３７）、５つの候補（ＡＮＸＡ２、ＤＵＳＰ１１、ＳＧＭＳ２、ＳＮＸ３０およびＵＢＡ２）のノックダウンが、ＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞の浸潤性を増強した（図３８）。
【０１４８】
もちろん、これらの推定標的遺伝子のノックダウンの効果は、これらの同じ遺伝子に対するｍｉＲ−１３３ａによってもたらされる効果と同様であり、その結果、薬物抵抗性の増強およびＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞の浸潤性の増強がもたらされるであろう。逆に、ＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞におけるｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングは、推定標的遺伝子の発現を許容し、それにより薬物抵抗性およびＣＤ１３３低ＳａＯＳ２細胞の浸潤性が減少されることが期待されるであろう。
【０１４９】
これらの分子がｍｉＲ−１３３ａにより調節されるかどうかを確認するために、推定ｍｉＲ−１３３ａ結合部位を含む３’ＵＴＲ（非翻訳領域）フラグメントを、ルシフェラーゼコード配列の下流にクローニングし、ルシフェラーゼレポーターおよびｍｉＲ−１３３ａオリゴヌクレオチドをＳａＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。対照として、ルシフェラーゼレポーターおよびＮＣオリゴヌクレオチドを、ＳａＯＳ２細胞に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、ＮＣオリゴヌクレオチドで同時トランスフェクトされた細胞と比較して、ｍｉＲ−１３３ａで同時トランスフェクトされた細胞において、おおよそ３９〜７３％減少した（図３９）。このアッセイの結果から、ＡＮＸＡ２、ＤＵＳＰ１１、ＭＡＳＴ４、ＳＧＭＳ２、ＳＮＸ３０およびＵＢＡ２は、ｍｉＲ−１３３ａの直接的な標的として機能することが分かった。
【０１５０】
実際、これらの標的遺伝子またはそれらのファミリー遺伝子は、ある他のがんにおいて腫瘍抑制因子として機能することが以前に示唆された。Gostissa, M et al. (1999) EMBO J. 18:6462-71; Caprara, G et al. (2009) J. Cell. Mol. Med. 13: 2158-70; Nguyen, LN et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12: 6952-9。ＡＮＸＡ２は、骨肉腫における腫瘍抑制機能と関連付けられることが報告されているが（Gillette, JM (2004) J. Cell Biochem. 92: 820-32）、ＭＡＳＴ４は、腫瘍生物学においては知られていない（Garland, P (2008) Brain Res. 21: 12-19）。
【０１５１】
実際、本発明により開示されているように、これらすべての標的の発現は、ＣＤ１３３高細胞においてｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングにより増加し（図４０）、ＣＤ１３３低細胞におけるｍｉＲ−１３３ａの上方調節により減少し（図４１）、異種移植腫瘍と臨床試料（結果は示さず）との両方でのＣＤ１３３およびｍｉＲ−１３３ａの発現の観察された逆相関（図４２）と一致した。ｍｉＲ−１３３ａのサイレンシングによる標的の発現の増加は、ＬＮＡ−処置腫瘍のｑＲＴ−ＰＣＲ（結果は示さず）および免疫組織化学（結果は示さず）により確認した。最後に、これらの標的の発現と骨肉腫患者の予後との間の関係の研究において、ｍｉＲ−１３３ａ標的のｍＲＮＡ発現と患者の予後との間に際立って密接な相関関係が見出された（図４３）。これらの標的を高いレベルで発現している患者は、より低いレベルで発現している患者よりもより長く生存した。これは、これらの標的が骨肉腫における新規な腫瘍抑制因子として機能し得ることを示す。
【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２３】
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【図３２】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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