(57)【要約】  本開示は、セルロースおよびセルロース含有材料の分解に関連する組成物および方法を提供する。ＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチド、ならびに関連するポリヌクレオチドおよび組成物は、本明細書に示されている。ＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチド、ならびに関連するポリヌクレオチドおよび組成物に関連する方法は、さらに本明細書に示されている。
2014512181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のドメインおよび第２のドメインを含んでおり、当該第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、当該第２のドメインはセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる、天然に存在しないポリペプチド。
【請求項２】
デヒドロゲナーゼドメインを含んでいない、請求項１に記載の天然に存在しないポリペプチド。
【請求項３】
デヒドロゲナーゼドメインを含んでいる第３のドメインをさらに含んでいる、請求項１に記載の天然に存在しないポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の天然に存在しないポリペプチドをコードしている、組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
（Ａ）組換えＧＨ６１ポリペプチド；および
（Ｂ）ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド
を含んでいる、組成物。
【請求項６】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240/NCU01050クレードのポリペプチドを含んでいる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、Ｈ−Ｘ(4-8)−Ｑ−Ｘ−Ｙのモチーフを含んでいる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
ＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドであり、当該第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、当該第２のドメインはＣＢＭを含んでおり、上記ポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインを含んでいない、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドであり、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインを含んでおり、当該第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、当該第２のドメインはＣＢＭを含んでおり、当該第３のドメインはデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含んでおり、当該第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、安定に相互作用しており、共有結合的に連結されておらず、当該第１のポリペプチドはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、当該第２のポリペプチドはＣＢＭを含んでいる、組成物。
【請求項１４】
上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ロイシンジッパーモチーフを介して相互作用している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＧＨ６１ポリペプチドをさらに含んでいる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、および配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４（N. crassaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）または配列番号８４（M. thermophilaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）のアミノ酸配列を含んでいる、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
セルラーゼの１つ以上をさらに含んでいる、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ＧＨ６１ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、およびＣＢＭを含んでいるＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、宿主細胞。
【請求項１９】
セルロースを、セルラーゼの１つ以上および請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物と接触させて、分解されたセルロースを生じさせることを包含している、セルロースを分解する方法。
【請求項２０】
バイオマスを、セルラーゼの１つ以上および請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物と接触させて、分解されたバイオマスを生じさせることを包含している、バイオマスを分解する方法。
【請求項２１】
バイオマスを、セルラーゼの１つ以上および請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物と接触させて、糖溶液を生じさせること；ならびに発酵生成物を生成するための十分な条件において、当該糖溶液を発酵微生物とともに培養することを包含している、バイオマスを発酵生成物に変換する方法。
【請求項２２】
上記バイオマスは前処理ステップに供される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
セルロースおよびセルラーゼを含んでいる混合物におけるセルロースの分解速度を向上させる方法であって、セルロースおよびセルラーゼを含んでいる上記混合物を、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。
【請求項２４】
セルロースを分解する方法であって、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、ルイス酸、ならびにヘム基およびＣＢＭを含んでいる分子と接触させることを包含している、方法。
【請求項２５】
上記ルイス酸は組換えＧＨ６１ポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヘム基およびＣＢＭを含んでいる上記分子は、ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、前処理された上記バイオマス混合物を、セルラーゼの１つ以上および請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組成物と接触させて、低下した粘度を有している前処理されたバイオマス混合物を生じさせることを包含している、方法。
【請求項２８】
上記ＧＨポリペプチドの少なくとも５０％は銅原子と結合されている、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
上記ＧＨポリペプチドの少なくとも９０％は銅原子と結合されている、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでおり、当該ＧＨポリペプチドの少なくとも５０％は銅原子と結合されている、組成物。
【請求項３１】
上記ＧＨポリペプチドの少なくとも９０％は銅原子と結合されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドの少なくとも１つは、（ｉ）NCU2240/NCU01050クレードのポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号９０（NCU00836）、配列番号２６（NCU07898）、もしくは配列番号２８（NCU08760）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ＧＨ６１ポリペプチドを生成する方法であって、
０．１〜１０００μＭの銅を含んでいる培地において、ＧＨ６１ポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を培養すること；および
上記ＧＨ６１ポリペプチドをコードしている上記組換えポリヌクレオチドからＧＨ６１ポリペプチドを生成するための十分な条件に上記細胞を供することを包含している、方法。
【請求項３４】
上記細胞は１００〜８００μＭの銅を含んでいる培地において培養される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
セルロースを分解する方法であって、
反応混合物において、セルロースを、
（Ａ）セルラーゼの１つ以上、
（Ｂ）ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインタンパク質、および
（Ｃ）（ｉ）NCU2240/NCU01050クレードのポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号９０（NCU00836）、配列番号２６（NCU07898）、もしくは配列番号２８（NCU08760）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含しており、
上記反応混合物において０．１〜５００μＭの銅の濃度を有していることをさらに包含している、方法。
【請求項３６】
反応混合物における銅の濃度は１〜５０μＭである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
セルロース、セルラーゼ、ＣＭＢを含んでいるＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる混合物におけるセルロースの分解速度を向上させる方法であって、反応混合物に１〜５０μＭの銅を供給することを包含している、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本願は、参照によってその全体が本明細書に援用される米国仮出願第６１／４７１，６２７号（出願日：２０１１年４月４日）および米国仮出願第６１／５１０，４６３号（出願日：２０１１年７月２１日）の利益を主張する。
【０００２】
〔ASCIIテキストファイルとしての配列表の提出〕
ASCIIテキストファイルに基づく以下の提出物：配列表のコンピュータ読取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：677792001440SEQLIST.txt、記録日：２０１２年３月２９日、サイズ：１９４ＫＢ）の内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
〔技術分野〕
本開示は、セルロースおよびセルロース含有材料の分解のための方法および組成物に関する。特に、本開示は、セルロースの分解に関与するポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組成物、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
生体燃料は、エネルギー確保、環境維持および世界的な気候変動について増大する懸念に起因して、集中的に研究されている。植物に基づく材料の、生体燃料への生物変換は、化石燃料の化学製品に対する魅力的な代替物とみなされている。
【０００５】
地球上に最も豊富な有機化合物の１つであり、植物の主要な構成要素であるセルロースは、β（１−４）連結されたＤ−グルコース分子の長鎖から構成されている多糖である。セルロースは、糖に基づくその組成のために、生体燃料および糖に由来する他の生成物の生成にとって潜在的かつ豊富な原材料である。例えば、糖は生物燃料（例えばエタノール）に発酵され得る。生物燃料の生成に使用されるセルロース内の糖のために、セルロースはより小さい分子に切断される必要がある。
【０００６】
セルロースは、化学的または酵素的な手段によって分解され得る。セルロースを加水分解する酵素は“セルラーゼ”と呼ばれ、当該酵素としては、例えばエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβグルコシダーゼが挙げられる。
【０００７】
セルロースの分解のための手法は存在しているが、現在の手法は、相対的に非効率であり、高い費用を要し、セルロースに基づく手法の実現を制限している。したがって、セルロース分解の効率を向上させる試薬および手法の開発に大きな関心が寄せられている。セルロース分解の効率を向上させるアプローチの１つは、セルラーゼ酵素の触媒活性を向上させことである。代替的なアプローチ（セルラーゼの触媒活性を向上させることと共同して使用され得る）は、セルロースの分解を促進するためにセルラーゼとともに使用され得る組成物、およびそれらを使用する方法を開発することである。
【発明の概要】
【０００８】
セルロースの分解を促進するためのポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物および方法が、本明細書に開示されている。これらのポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物および方法は、従来のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物および方法を超えて、セルロースの分解の著しい向上をもたらす。
【０００９】
第１のドメインおよび第２のドメインを有している天然に存在しないポリペプチドが、本明細書に開示されている。ここで、上記第１のドメインは、ＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる。これらのポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメインを含んでおり、かつＣＢＭを欠いているポリペプチドより、セルロースの分解において有効である。
【００１０】
また、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭドメインを有している、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている天然に存在しないポリペプチドが、開示されている。そのようなポリペプチドを利用するセルラーゼ反応は、活性酸素種をより少なく生成するので、酸化的損傷を低減させる。そのような酸化的損傷は、セルラーゼの酵素活性を低下させ得るか、酵素の基質もしくは生成物を化学的に変質させ得るか、および／または所望されない副生成物を生成させ得る。
【００１１】
組換えＧＨ６１ポリペプチドおよびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる、組成物が開示されている。これらの組成物は、本明細書に示されている種々のＧＨ６１ポリペプチドおよびＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含み得る。これらの組成物は、セルロース含有材料の分解を促進するために、セルラーゼおよびセルロース含有材料を含んでいる混合物を含み得る。
【００１２】
種々の組換えＧＨ６１ポリペプチドが開示されている。これらのポリペプチドは、セルロース含有材料の分解を促進するために、セルラーゼおよびセルロース含有材料を含んでいる混合物に供給され得る。
【００１３】
銅原子と結合されている組換えＧＨ６１ポリペプチドが、本明細書に記載されている。これらのポリペプチドは、銅原子と結合されていないこと以外において対応するＧＨ６１ポリペプチドより、セルロースの分解において有効である。
【００１４】
また、ＣＢＭを含んでいる種々の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドが開示されている。いくつかの局面において、これらのポリペプチドは、好気性条件において、嫌気性条件より高い活性を有している。したがって、反応に対する追加の酸素の供給は反応を促進させ得る。そのような酸素は、反応における空気のバブリングまたは標準的な他の手段によって供給され得る。
【００１５】
また、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドが開示されている。ここで、上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる。一形態において、上記ポリペプチドはデヒドロゲナーゼドメインを含んでいない。また、そのようなポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドが開示されている。
【００１６】
また、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインを有している天然に存在しないポリペプチドが開示されている。上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含み得、上記第２のドメインはＣＢＭドメインを含み得、上記第３のドメインはデヒドロゲナーゼドメインを含み得る。また、開示されているのは、そのようなポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドである。
【００１７】
また、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が開示されている。ここで、上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドはＣＢＭを含んでいる。上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含み得る。他の形態において、上記ＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドを含み得る。他の形態において、上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記ＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。これらの組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００１８】
組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が開示されている。ここで、上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドはＣＢＭを含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。上記組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００１９】
（Ａ）組換えＧＨ６１ポリペプチド、ならびに（Ｂ）ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭドメインを含んでいる天然に存在しない組換えポリペプチドを含んでいる組成物が、示されている。上記天然に存在しないポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインを必要に応じて含んでいる。上記組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００２０】
また、（Ａ）ＣＤＨヘムドメインを含んでいる第１のポリペプチド、および（Ｂ）ＣＢＭを含んでいる第２のポリペプチドを含んでいる組成物が、開示されている。ここで、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、安定に相互作用しており、共有結合的に連結されていない。一形態において、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ロイシンジッパーモチーフを介して相互作用している。一形態において、上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、および配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４（N. crassaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）または配列番号８４（M. thermophilaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）のアミノ酸配列を含んでいる。他の形態において、これらの組成物はＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる。他の形態において、これらの組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００２１】
（Ａ）組換えＧＨ６１ポリペプチド、および（Ｂ）ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に開示されている。ここで、上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、および配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４（N. crassaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）または配列番号８４（M. thermophilaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）のアミノ酸配列を含んでいる。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドを含んでいる。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）または配列番号２８（NCU08760）を含んでいる。他の形態において、上記組成物のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。これらの組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００２２】
（Ａ）組換えＧＨ６１ポリペプチド、および（Ｂ）デヒドロゲナーゼドメインを欠いている、ＣＢＭを含んでいる天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に記載されている。ここで、上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、および配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４（N. crassaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）または配列番号８４（M. thermophilaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）のアミノ酸配列を含んでいる。上記組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００２３】
（Ａ）組換えＧＨ６１ポリペプチド、ならびに（Ｂ）デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを含んでいる天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に記載されている。ここで、上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、および配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４（N. crassaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）または配列番号８４（M. thermophilaのＣＤＨ−１  ＣＢＭドメイン）のアミノ酸配列を含んでいる。上記組成物はセルラーゼの１つ以上をさらに含み得る。
【００２４】
また、（Ａ）組換えＧＨ６１ポリペプチド、（Ｂ）ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、および（Ｃ）セルラーゼの１つ以上を含んでいる組成物が、記載されている。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドを含んでいる。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）または配列番号の配列２８（NCU08760）を含んでいる。他の形態において、上記組成物のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。他の形態において、ＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドである。
【００２５】
ＧＨ６１ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、およびＣＢＭを含んでいるＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる宿主細胞が、本明細書に示されている。一形態において、ＣＢＭを含んでいるＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、天然に存在しないポリペプチドをコードしている。
【００２６】
セルロースを分解する方法が開示されている。当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上および組成物と接触させて、分解されたセルロースを生じさせることを包含している。ここで、上記組成物は、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる。一形態において、上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいる。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドを含んでいる。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドであり、当該第１のドメインは、ＣＤＨヘムドメインを含んでおり、当該第２のドメインは、デヒドロゲナーゼドメインを含んでおらず、ＣＢＭを含んでいる。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメイン含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。ここで、上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはＣＢＭを含んでおり、上記第３のドメインはデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。上記方法において、上記セルロースはバイオマスに存在し得る。そのような方法において、バイオマスは上記方法によって分解される。バイオマスを用いる方法において、上記バイオマスは前処理ステップに供され得る。
【００２７】
セルロースを分解する方法が示されている。当該方法は、上記セルロースを、セルラーゼの１つ以上および組成物と接触させることを包含しており、ここで、当該組成物は、ＣＤＨヘムドメインを含んでいる第１のポリペプチドおよびＣＢＭを含んでいる第２のポリペプチドを含んでいる。上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、安定に相互作用しており、共有結合的に連結されていない。上記方法の一形態において、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ロイシンジッパーモチーフを介して相互作用している。上記方法の他の形態において、ＧＨ６１ポリペプチドは、上記セルラーゼおよび組成物とともに含まれ得る。上記方法において、上記セルロースはバイオマスに存在し得る。そのような方法において、バイオマスは上記方法によって分解される。バイオマスを用いる方法において、上記バイオマスは前処理ステップに供され得る。
【００２８】
また、バイオマスを発酵生成物に変換する方法が、本明細書に示されている。ここで、当該方法は、上記バイオマスを、セルラーゼの１つ以上および組成物と接触させて、糖溶液を生じさせること、ならびに発酵生成物を生成するための十分な条件において発酵微生物とともに上記糖溶液を培養することを包含しており、当該組成物は、ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる。この方法において、上記バイオマスは前処理ステップに供され得る。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。一形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。ここで、上記第１のドメインは、ＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインは、ＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを含んでいない。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。ここで、上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはＣＢＭを含んでおり、上記第３のドメインはデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。
【００２９】
バイオマスを発酵生成物に変換する方法がさらに示されている。当該方法は、上記バイオマスを、セルラーゼの１つ以上および組成物と接触させて、糖溶液を生じさせること、ならびに発酵生成物を生成するための十分な条件において発酵微生物とともに上記糖溶液を培養することを包含している。上記組成物は、ＣＤＨヘムドメインを含んでいる第１のポリペプチドおよびＣＢＭを含んでいる第２のポリペプチドを含んでおり、当該第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、安定に相互作用しており、共有結合的に連結されていない。この方法において、上記バイオマスは前処理ステップに供され得る。一形態において、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ロイシンジッパーモチーフを介して相互作用している。上記方法の他の形態において、ＧＨ６１ポリペプチドは、上記セルラーゼおよび組成物とともに含まれ得る。
【００３０】
セルロース、およびセルラーゼを含んでいる混合物におけるセルロースの分解速度を増加させる方法が、本明細書に示されている。当該方法は、セルロースおよびセルラーゼを含んでいる上記混合物を、組成物と接触させることを包含しており、当該組成物は、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。一形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインは、ＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを含んでいない。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはＣＢＭを含んでおり、上記第３のドメインはデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。
【００３１】
セルロースおよびセルラーゼを含んでいる混合物においてセルロースの分解速度を向上させる増加させる方法が、本明細書に示されている。当該方法は、セルロースおよびセルラーゼを含んでいる上記混合物を、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含んでいる組成物と接触させることを包含している。上記第１のポリペプチドはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、第２のポリペプチドはＣＢＭを含んでおり、当該第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、安定に相互作用しており、共有結合的に連結されていない。一形態において、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ロイシンジッパーモチーフを介して相互作用している。上記方法の他の形態において、ＧＨ６１ポリペプチドは上記セルラーゼおよび組成物とともに含まれ得る。
【００３２】
前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させる方法が、本明細書に示されている。当該方法は、上記混合物を、セルラーゼおよび組成物と接触させて、低下した粘性を有している前処理されたバイオマス混合物を生じさせることを包含しており、当該組成物は、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。一形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２（N. crassaのＣＤＨ−１）または配列番号４６（M. thermophilaのＣＤＨ−１）を含んでいる。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインは、ＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを含んでいない。他の形態において、上記方法のＣＢＭを含んでいる上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインを含んでいる天然に存在しないポリペプチドである。上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはＣＢＭを含んでおり、上記第３のドメインデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。
【００３３】
また、グルコース分子および４−ケトグルコース分子を生成する方法が、本明細書に開示されている。当該方法は、セルロースを、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、当該組換えＧＨ６１ポリペプチドは銅原子と結合されている。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。
【００３４】
また、セルロース重合体における１−４  グリコシド結合を切断する方法が、本明細書に開示されている。当該方法は、セルロースを、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、当該組換えＧＨ６１ポリペプチドは銅原子と結合されている。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。
【００３５】
また、グルコース分子における４位の炭素におけるＣ−Ｈ結合を切断する方法が、本明細書に開示されている。当該方法は、セルロースを、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、当該組換えＧＨ６１ポリペプチドは銅原子と結合されている。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記方法の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。
【００３６】
いくつかの局面において、上記方法または組成物における上記ＧＨ６１ポリペプチドの少なくとも５０％は、銅原子と結合されている。いくつかの局面において、上記方法または組成物における上記ＧＨ６１ポリペプチドの少なくとも９０％は、銅原子と結合されている。
【００３７】
また、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に開示されており、ここで、上記ＧＨ６１ポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、銅原子と結合されている。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４（NCU02240）または配列番号３０（NCU01050）を含んでいる。他の形態において、上記組成物の上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２６（NCU07898）、配列番号２８（NCU08760）、または配列番号９０（NCU00836）を含んでいる。
【００３８】
ＧＨ６１ポリペプチドを生成する方法が本明細書に示されている。当該方法は、ＧＨ６１ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を、０．１〜１０００μＭの銅を含んでいる培地において培養すること、および上記ＧＨ６１ポリペプチドをコードする上記組換えポリヌクレオチドからＧＨ６１ポリペプチドを生成するための十分な条件に上記細胞を供することを包含している。上記方法の一形態において、上記培地は１００〜８００μＭの銅を含んでいる。
【００３９】
また、セルロースを分解する方法が本明細書に開示されている。当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、ＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインタンパク質、および組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含している。上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、（ｉ）NCU2240／NCU01050クレードのポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号９０（NCU00836）、配列番号２６（NCU07898）もしくは配列番号２８（NCU08760）からなる群から選択されるアミノ酸配列を、０．１〜５００μＭの銅の濃度を有している混合物において含んでいる。上記方法の一形態において、上記反応混合物は１〜５０μＭの銅の濃度を有している。
【００４０】
また、セルロース、セルラーゼ、ＣＭＢを含んでいるＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる混合物におけるセルロースの分解速度を向上させる方法が、本明細書に開示されている。当該方法は、反応混合物に１〜５０μＭの銅を供給することを包含している。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】N. crassaのＣＤＨ−１の欠失。（Ａ）AVICEL（商標）による増殖の７日後における、N. crassaの野生型およびΔｃｄｈ−１株の培養ろ過物に存在するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＣＤＨ−１に対応する消失するタンパク質バンドは、四角によって強調されている。（Ｂ）ＤＣＰＩＰのセロビオース依存性還元によって評価されたときの、野生型およびΔｃｄｈ−１培養物の培養ろ過物におけるＣＤＨ活性。値は３つの生物学的な反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。（Ｃ）野生型およびΔｃｄｈ−１の培養ろ過物のAvicelase活性。値は、手法上の３つ１組において実施された３つの生物学的反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図２】Δｃｄｈ−１の培養ろ過物に対する、M. thermophilaのＣＤＨ−１の添加によるセルロース（AVICEL（商標））分解の刺激。（●）は、外来性のＣＤＨが添加されなかった実験を表し、（○）は、１グラムのAVICEL（商標）につき４００μｇのM. thermophilaのＣＤＨ−１が添加された実験を表す。（Ａ）Δｃｄｈ−１のN. crassaの培養ろ過物、（Ｂ）野生型N. crassaの培養ろ過物、または（Ｃ）N. crassaの由来の精製されたセルラーゼ（ＣＢＨ−１、ＧＨ６−２、ＧＨ５−１、ＧＨ３−４）の混合物に対する、M. thermophilaのＣＤＨ−１の添加ありまたはなしのAvicelaseアッセイ。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図３】ＣＤＨの他のアイソフォームによるセルロース分解の刺激。（Ａ）M. thermophilaのＣＤＨ−１およびM. thermophilaのＣＤＨ−２のドメイン構造。ＣＤＨ−１上にあるの赤いＣ末端ドメインは、真菌のセルロース結合ドメイン（ＣＢＭ１）である。（Ｂ）M. thermophilaのＣＤＨ−１およびＣＤＨ−２についてのAVICEL（商標）結合アッセイ。レーン１  M. thermophilaのＣＤＨ−１、レーン２  M. thermophilaのＣＤＨ−２、レーン３  AVICEL（商標）と結合したＣＤＨ−１、レーン４  AVICEL（商標）と結合したＣＤＨ−２。（Ｃ）ＣＤＨ−１（○）またはＣＤＨ−２（黒塗りの逆三角）の添加による、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のセルロース分解能（●）の刺激。（Ｄ）M. thermophilaのＣＤＨ−１およびM. thermophilaのＣＤＨ−２の濃度の、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のAvicelase活性に対する作用。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図４】ＣＤＨ−２のドメイン切断によるセルロース分解の刺激。ＣＤＨ−２（黒塗りの□）、ＣＤＨ−２フラビンドメイン（黒塗りの逆三角）、または組換えＣＤＨ−２ヘムドメイン（◆）の添加による、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のセルロース分解能（●）の刺激。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図５】M. thermophilaのＣＤＨ１によるAvicelase活性の刺激の金属および酸素依存性。（Ａ）１００００倍に緩衝液交換されたΔｃｄｈ−１の培養ろ過物を、１００μＭのＥＤＴＡを用いて処理し、それから種々の金属イオンを用いて再構成し、４５時間の反応後にAvicelase活性を分析した。最も左の２つのカラムを除いて、すべてのサンプルを、ＥＤＴＡを用いて処理し、それから１．０ｍＭの二価金属イオンを用いて１２時間にわたって再構成した。（Ｂ）ＣＤＨによるAvicelase活性の刺激の酸素依存性。（黒）嫌気的に実施した実験、（灰色）好気的に実施した実験。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図６】部分的に精製されたN. crassaのＣＤＨ１の、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物に対する添加によるセルロース分解の刺激。（Ａ）部分的に精製されたN. crassaのＣＤＨ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のAvicelase活性。（○）は、１グラムのAVICEL（商標）につき４００μｇのN. crassaのＣＤＨ１が加えられた実験を表す。（●）は、外来性のＣＤＨが加えられなかった実験を表す。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図７】本明細書を通して使用された精製されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。すべてのタンパク質は、以下の順：（１）M. thermophilaのＣＤＨ−１、（２）M. thermophilaのＣＤＨ−２、（３）M. thermophilaのＣＤＨ−２フラビンドメイン、（４）N. crassaのＣＢＨ−１、（５）N. crassaのＧＨ６−２、（６）N. crassaのＧＨ５−１、（７）N. crassaのＧＨ３−４に、レーン毎に５μｇにおいて添加された。
【図８】Pichia pastorisにおいて発現された組換えＣＤＨ−２ヘムドメインの純度およびスペクトル特性。（Ａ）精製された組換えＣＤＨ−２ヘムドメインのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）酸化されたＣＤＨ−２ヘムドメイン（黒色）および還元されたＣＤＨ−２ヘムドメイン（灰色）のＵＶ可視スペクトル。
【図９】１．０ｍＭのＥＤＴＡ存在下（○）におけるＷＴ  N. crassaの培養ブロスのAvicelase活性（●）。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図１０】M. thermophilaのＣＤＨ−１によるAvicelase活性の刺激の金属依存性。（Ａ）１００００倍に緩衝液交換されたΔｃｄｈ−１の培養ろ過物を、１００μＭのＥＤＴＡを用いて処理し、それから種々の金属イオンを用いて再構成し、４５時間の反応後にAvicelase活性を分析した。最も左の２つのカラムを除いて、すべてのサンプルを、ＥＤＴＡを用いて処理し、それから１．０ｍＭの二価金属イオンを用いて１２時間にわたって再構成した。値は３つの反復実験の平均値である。エラーバーはこれらの反復実験間の標準偏差である。
【図１１】ＧＨ６１タンパク質の精製手順。N. crassaのΔｃｄｈ−１を、２％のAVICEL（商標）を補ったフォーゲル塩に播いた。７日後に、培養物を、ろ過し、濃縮し、MonoQカラムに通して分離し、それから１．０ｍＭのＥＤＴＡを用いて処理し、MonoQカラムに通して再び精製した。ＣＤＨの存在に依存するセルラーゼ増強活性を含んでいる画分を、ゲルろ過カラムに通して最後に精製した。
【図１２】Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のMonoQ分画。Δｃｄｈ−１の培養ろ過物を、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に緩衝液交換し、ＮａＣｌ勾配を用いてMonoQアニオン交換カラムに通して分離した。負荷、流出分およびすべての画分を、精製されたN. crassaのセルラーゼおよびAVICEL（商標）の、混合物に対する添加によって、ＣＤＨの存在下においてセルラーゼ活性を刺激する能力について試験した。それから、ゲルにおけるトリプシン消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実施して、活性画分におけるすべてのタンパク質を同定した。NCU01050、NCU02240、NCU07898およびNCU08760が示されている。
【図１３】精製N. crassaのＧＨ６１タンパク質のゲル。天然の精製されたN. crassaのＧＨ６１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーンの見出しは以下の通り：Ｌ−ベンチマークタンパク質ラダー、１−NCU01050、２−NCU02240、３−NCU07898、４−NCU08760。
【図１４】亜鉛によって再構成されたN. crassaのＧＨ６１タンパク質のセルラーゼアッセイ。精製に続いて、上記ＧＨ６１タンパク質を１ｍＭの硫酸亜鉛とともに少なくとも１２時間にわたってインキュベートした。純粋なＧＨ６１タンパク質（０．０２ｍｇ／ｍＬ）を、M. thermophilaのＣＤＨ−１（０．００４ｍｇ／ｍＬ）の存在下において、N. crassaのセルラーゼ（０．０５ｍｇ／ｍＬのＣＢＨ−１、ＧＨ６−２およびＧＨ５−１；０．００５ｍｇ／ｍＬのＧＨ３−４）に加えて、セルラーゼ活性を刺激する能力について調べた。特に断りがない限り、すべてのアッセイを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および５００μＭの硫酸亜鉛における１０ｍｇ／ｍＬのAVICEL（商標）を用いて、４０℃において実施した。データは、ＣＤＨおよびＧＨ６１の両方を欠いているアッセイ分析物に対する、２４時間における分解のパーセントとして表されている。アッセイをすべて２つ１組において実施し、エラーバーは両者の範囲を表す。
【図１５】ＥＤＴＡを用いて処理されたN. crassaのＧＨ６１タンパク質のセルラーゼアッセイ。ＥＤＴＡを用いて処理された純粋なＧＨ６１タンパク質（０．０２ｍｇ／ｍＬ）を、M. thermophilaのＣＤＨ−１（０．００４ｍｇ／ｍＬ）存在下において、N. crassaのセルラーゼ（０．０５ｍｇ／ｍＬのＣＢＨ−１、ＧＨ６−２およびＧＨ５−１；０．００５ｍｇ／ｍＬのＧＨ３−４）に加えて、セルラーゼ活性を刺激する能力について調べた。すべてのアッセイを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および５００μＭの硫酸亜鉛における１０ｍｇ／ｍＬのAVICEL（商標）を用いて、４０℃において実施した。データは、ＣＤＨおよびＧＨ６１の両方を欠いているアッセイ分析物に対する、２４時間における分解のパーセントとして表されている。アッセイをすべて２つ１組において実施し、エラーバーは両者の範囲を表す。
【図１６】前処理されたトウモロコシ茎葉を用いた、N. crassaのＧＨ６１タンパク質のアッセイ。亜鉛によって再構成された純粋なＧＨ６１タンパク質（NCU01050、NCU02240、NCU07898、およびNCU08760、それぞれ０．０１ｍｇ／ｍＬ）を、M. thermophilaのＣＤＨ−１（０．００４ｍｇ／ｍＬ）の存在下（右のバー）または非存在下（左のバー）において、N. crassaのセルラーゼ（０．０４５ｍｇ／ｍＬのＣＢＨ−１およびＧＨ６−２；０．００５ｍｇ／ｍＬのＧＨ３−４）を加えて、セルラーゼ活性を刺激する能力について調べた。すべてのアッセイを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および５００μＭの硫酸亜鉛における１０ｍｇ／ｍＬのAVICEL（商標）を用いて、４０℃において実施した。データは、ＣＤＨおよびＧＨ６１の両方を欠いているアッセイ分析物に対する、２４時間における分解のパーセントとして表されている。すべてのアッセイは３つ１組で実施し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１７】NCU01050およびNCU02240に対して配列相同性を有しているＧＨ６１タンパク質の複数の配列アライメント。複数の配列アライメントを、T-COFFEE（Notredame C, et al., J. Mol. Biol. 302, pp. 205-217 (2000)）を用いて局所的に実施し、Jalviewマルチプルアライメントエディタ（Waterhouse, A.M., et al. Bioinformatics 25, pp. 1189-1191 (2009)）を用いて可視化した。アライメントにおける配列は、配列番号５２〜６９として示されている。ＧＨ６１タンパク質の複数の配列アライメントのすべてを、分泌のための天然のタンパク質を標的にするために、使用されたＮ末端シグナルペプチドを欠いている精選された（curated）ＧＨ６１配列に対して実施した。
【図１８】NCU02240およびNCU01050に対して配列相同性を示す、選択されたＧＨ６１タンパク質の最尤系統学。NCU02240およびNCU01050に対して相同性を有している種々のタンパク質の最尤系統学を、系統推定分析（Dereeper A, et al. Nucleic Acids Res. 36, pp. W465-W469 (2008)）によって評価した。複数の配列アライメントのためにT-COFFEEを用いた。アライメントの精選なしで、PhyMLを用いた最尤法を利用してツリーを生成した。TreeDynを用いてツリーを描出した。アライメントの配列は、配列番号５２〜５９として記載されている。
【図１９】ＧＨ６１タンパク質における天然の金属連結の同定。ＣＤＨ−１の欠失を含んでいるNeurospora crassaを、２％ｗ／ｖのAVICEL（商標） PH101および５μＭの硫酸銅（ＩＩ）を補ったフォーゲル塩培地によって、２５℃および２００ＲＰＭの振盪において、７日間にわたって増殖させた。０．２ミクロンのＰＥＳフィルタを通したろ過によって、培養物から真菌を取り除いた。培養ろ過物を、タンジェントフローフィルトレーションを用いて濃縮し、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に緩衝液交換した。濃縮され、緩衝液交換されたろ過物を、10/100 GL MonoQカラムに加えて、直線的な塩勾配を用いて５つの画分に分画した。それから、各画分を、銅または亜鉛の存在について分析した。Perkin Elmerの導結合プラズマ原子発光分光器を用いて金属分析を実施した。棒グラフは、MonoQカラムからの各画分における亜鉛および銅の量を示す。２つの棒の各組について、銅は左側にあり、亜鉛は右側にある。画像は各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ゲル状の四角は、既知のＧＨ６１タンパク質の周囲にある。これらの実験の結果は、ＧＨ６１タンパク質を含んでいる画分（流出分（ＦＴ）および画分Ａ２）に最大量の銅が認められることを示している。
【図２０】精製されたNCU01050の金属化学量論。２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムにおける分離NCU01050ストックを、総容積１ｍＬにおいて〜１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。硫酸銅、硫酸亜鉛、または銅および硫酸亜鉛の１：１混合物を、各金属の１００μＭの最終濃度までタンパク質に加え、サンプルを、室温において一晩（１２〜１６時間）にわたって放置した。それから、サンプルは、26/10脱塩カラムを用いて２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に緩衝液交換された。脱塩されたタンパク質を、3000 MWCOポリエーテルスルホンスピン濃縮器を用いて、２〜２．５ｍＬの最終容積まで濃縮した。それから、２８０ｎＭにおける吸光度を、総タンパク質濃度を算出するために、記録し、使用した、また、スピン濃縮器からの流出分をブランクとして残しておいた。Perkin Elmerの誘導結合プラズマ原子発光分光器を用いて金属分析を実施した。棒グラフは、銅、亜鉛または混合物（銅および亜鉛）とともにインキュベートしたNCU01050における亜鉛および銅の量を示す。２つの棒の各組について、銅は左側にあり、亜鉛は右側にある。この実験の結果は、銅および亜鉛の両方がNCU01050と結合し得るが、両金属の等モル量の存在下において銅が好ましい金属であることを支持している。
【図２１】精製されたNCU07898の金属化学量論。２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムにおける分離NCU07898ストックを、総体積１ｍＬにおいて〜１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。硫酸銅、硫酸亜鉛、または銅および硫酸亜鉛の１：１混合物を、各金属の１００μＭの最終濃度までタンパク質に加え、サンプルを、室温において一晩（１２〜１６時間）にわたって放置した。それから、サンプルは、26/10脱塩カラムを用いて２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に緩衝液交換された。脱塩されたタンパク質を、3000 MWCOポリエーテルスルホンスピン濃縮器を用いて、２〜２．５ｍＬの最終容積まで濃縮した。それから、２８０ｎＭにおける吸光度を、総タンパク質濃度を算出するために、記録し、使用した、また、スピン濃縮器からの流出分をブランクとして残しておいた。Perkin Elmerの誘導結合プラズマ原子発光分光器を用いて金属分析を実施した。棒グラフは、銅、亜鉛または混合物（銅および亜鉛）とともにインキュベートしたNCU07898における亜鉛および銅の量を示す。２つの棒の各組について、銅は左側にあり、亜鉛は右側にある。この実験の結果は、銅および亜鉛の両方がNCU07898と結合し得るが、両金属の等モル量の存在下において銅が好ましい金属であることを支持している。
【図２２】精製されたNCU08760の金属化学量論。２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムにおける分離NCU07898ストックを、総体積１ｍＬにおいて〜１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。硫酸銅、硫酸亜鉛、または銅および硫酸亜鉛の１：１混合物を、各金属の１００μＭの最終濃度までタンパク質に加え、サンプルを、室温において一晩（１２〜１６時間）にわたって放置した。それから、サンプルは、26/10脱塩カラムを用いて２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に緩衝液交換された。脱塩されたタンパク質を、3000 MWCOポリエーテルスルホンスピン濃縮器を用いて、２〜２．５ｍＬの最終容積まで濃縮した。それから、２８０ｎＭにおける吸光度を、総タンパク質濃度を算出するために、記録し、使用した、また、スピン濃縮器からの流出分をブランクとして残しておいた。Perkin Elmerの誘導結合プラズマ原子発光分光器を用いて金属分析を実施した。棒グラフは、銅、亜鉛または混合物（銅および亜鉛）とともにインキュベートしたNCU08760における亜鉛および銅の量を示す。２つの棒の各組について、銅は左側にあり、亜鉛は右側にある。この実験の結果は、銅および亜鉛の両方がNCU08760と結合し得るが、両金属の等モル量の存在下において銅が好ましい金属であることを支持している。
【図２３】M. thermophilaのＣＤＨ−２の活性は、NCU01050によって促進される。この実験において、０．０１ｍｇ／ｍＬのＭＴのＣＤＨ−２を、１．０ｍＭのセロビオースとともに３０分にわたってインキュベートし、反応の生成物であるセロビオン酸をＨＰＬＣ（ダイオネクス）によって分析した。ＣＤＨが１０μＭの銅およびセロビオースとともにインキュベートされると、０．２４（任意の単位）のセロビオン酸のみが生成される。NCU01050が加えられると、生成されるセロビオン酸の量は、〜３６倍の８．７４ユニットまで向上される。ＣＤＨ／NCU01050／銅の混合物に１．０ｍＭのＥＤＴＡが加えられると、０．５６ユニットのみが形成される。このデータは、NCU01050の存在がＣＤＨ−２によるセロビオースの酸化速度を向上させることを示している。
【図２４】酸化された生成物の銅依存性。NCU01050／ＧＨ６１−４を、N. crassaのから未変性のまま精製し、ＥＤＴＡを用いて十分に処理して、すべての金属を除去した。タンパク質は、ICP-AESによって＞９５％の分離（金属なし）と決定され、それから、１０倍モル過剰の硫酸亜鉛または硫酸第１銅を用いて１時間にわたって再構成された。ＧＨ６１反応物の金属依存性を決定するために、５ｍｇ／ｍＬのAVICEL（商標）に対してアッセイを実施した。すべてのアッセイを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）において４０℃において実施し、分析物は、N. crassaのＣＢＨ−１（０．０３５ｍｇ／ｍＬ）およびN. crassaのＣＢＨ−２（０．０１５ｍｇ／ｍＬ）を含んでいた。それから、ＣＤＨ（０．００５ｍｇ／ｍＬ）、NCU01050／ＧＨ６１−４（グラフに挙げられている濃度）、または２つの組合せを、セルラーゼに加えた。３０時間のインキュベート後に反応物を遠心分離し、分析物の上清を、５倍に希釈し、ダイオネクスのHPAECに加えた。ダイオネクス分析のために、３００ｍＭの酢酸ナトリウムにおける５分間の洗い流し、０ｍＭの酢酸ナトリウムにおける３分間の平衡の後に、CarboPac PA200 HPAECカラムを、０．１ＭのＮａＯＨにおいて使用し、勾配を、０〜１６０ｍＭの酢酸ナトリウムにおいて１６分にわたって実施した。ピークの明らかな組が２０〜２３分に溶出され、これらのピークは、ＣＤＨおよびＧＨ６１の両方を含んでいるサンプルにのみ存在する。滞留時間は、Ｃ１炭素におけるＣＤＨ酸化から生じるセルラーゼまたはそれらの酸生成物によって生成される任意のセロオリゴ糖より極めて長い。ダイオネクスによるこの新たな生成物は、亜鉛結合酵素と比べて銅結合酵素において非常に大きい。亜鉛の結合した１μＭのＧＨ６１によってＣＤＨの存在下において生成される新しいピークの面積は、銅の結合したＧＨ６１を４０倍少なく含んでいる類似の反応とおよそ同じ大きさであった。棒グラフは、ダイオネクスによる新しい生成物のピーク面積の相対的な大きさを示す。２つの棒の各組について、亜鉛を用いて再構成されたＧＨ６１タンパク質との反応からの生成物の量は左にあり、銅を用いて再構成されたＧＨ６１タンパク質との反応からの生成物の量は右側にある。このアッセイに使用されたすべての試薬は、Sigma Traceselectの品質等級であり、分析物からすべての金属の混入物を除去するために、酵素およびAVICEL（商標）を、十分にＥＤＴＡ処理し、洗浄した。
【図２５】ＧＨ６１ポリペプチドのＨ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−ＹモチーフのＨｉｓ残基、Ｇｌｎ残基およびＴｙｒ残基は、ＧＨ６１ポリペプチド活性にとって重要である。Ｈ１７９Ａ（“ＨＡ”）、Ｑ１８８Ａ（“ＱＡ”）およびＹ１９０Ｆ（“ＹＦ”）の変異を有しているN. crassaのNCU08760ポリペプチドを、それぞれ調製した。これらの異なる変異体NCU08760ポリペプチドおよび野生型（“ＷＴ”）NCU08760を、リン酸によって膨潤されたセルロース（“ＰＡＳＣ”）に対する活性についてアッセイした。Ｘ軸は酵素および濃度（単位μｍ）を示し、ｙ軸はＰｋ領域（酸）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本開示はセルロースを分解する組成物および方法に関する。これらの組成物および方法は、従来のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物および方法を超えて、セルロース分解の著しい向上をもたらす。いくつかの実施形態において、本開示は、新規のポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系を同定するための方法に関する。
【００４３】
セロビオースデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）ヘムドメインポリペプチドに関わる組成物および方法が、本明細書に開示されている。タンパク質ＣＤＨは、Phanerochaete chrysosporium（“P. chrysosporium”）において初めて同定され、ＣＤＨ相同分子種は、複数種の真菌（Neurospora crassa（“N. crassa”）が挙げられる）において同定されている。
【００４４】
ＣＤＨタンパク質は、Ｎ末端ヘムドメインおよびＣ末端デヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。また、ＣＤＨタンパク質のいくつかは、タンパク質のＣ末端にセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる。ＣＤＨヘムドメインの相同分子種は、真菌のタンパク質のみに見られ、デヒドロゲナーゼドメインの相同分子種は、生物のすべてのドメインの全体にわたるタンパク質に見られ、デヒドロゲナーゼドメインは、より大きなＧＭＣ酸化還元酵素スーパーファミリーの一部である。P. chrysosporiumのヘムおよびフラビンドメインの結晶構造は決定されている（Zamocky et al., Curr. Prot. Pept. Sci., Vol. 7, No. 3, pp. 255-280, (2006)）。
【００４５】
ＣＤＨヘムドメインを含んでいる第１のドメイン、およびセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる第２のドメインを有している天然に存在しないポリペプチドが、本明細書に示されている。これらのポリペプチドは、ＣＢＭを欠いていること以外において対応する、ＣＤＨヘムドメインを含んでいるポリペプチドより、セルロース分解において有効である。また、ＣＢＭを欠いていること以外において対応する、ＣＤＨヘムドメインを含んでいるポリペプチドより、少量のこれらのポリペプチドを用いてセルロースの分解を促進し得る。
【００４６】
また、第１のドメインおよび第２のドメインを有しており、デヒドロゲナーゼドメインを有していない天然に存在しないポリペプチドが、本明細書に示されている。上記第１のドメインはＣＤＨヘムドメインを含んでおり、上記第２のドメインはセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる。これらのポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインを有していること以外において対応する、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しているポリペプチドと比べて、セルラーゼ反応における分子への酸化的損傷を低減させ得、セルラーゼ反応における活性酸素種の形成を減少させ得る。セルラーゼ反応における分子への酸化的損傷は、例えば、酵素活性の低下、酵素基質もしくは生成物の化学的な変性、または所望されない副生物の生成の１つ以上を引き起こし得る。
【００４７】
本明細書に開示されているＣＤＨヘムポリペプチドは、好気性条件において、嫌気性条件より高い活性を有している。
【００４８】
本明細書に使用されるとき、“ＣＤＨタンパク質”は、N. crassaのＣＤＨ−１（配列番号３２）、N. crassaのＣＤＨ−２（配列番号４３）、M. thermophilaのＣＤＨ−１（配列番号４６）、M. thermophilaのＣＤＨ−２（配列番号４９）のアミノ酸配列を有しているポリペプチド、またはＣＤＨヘムドメイン（後述されている）およびを有している天然に存在する他のポリペプチドを指す。異なる生物におけるＣＤＨタンパク質は、既知のＣＤＨタンパク質に対する配列同一性／配列相同性によって同定され得、ＣＤＨタンパク質の例としては、アクセション番号：XM_411367、BAD32781、BAC20641、XM_389621、AF257654、AB187223、XM_360402、U46081、AF081574、AY187232、AF074951およびAF029668のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。また、“ＣＤＨタンパク質”は、天然に存在するＣＤＨタンパク質の保存的に改変されているバリアントを指す。また、“ＣＤＨタンパク質”は、天然のシグナルペプチドあり、またはなしのＣＤＨタンパク質を包含している。ＣＤＨタンパク質は、細胞によって分泌され得、ｃＤＮＡの翻訳産物のＮ末端における短い（約１５〜２５アミノ酸）シグナル配列を有しており、当該シグナル配列は、当該タンパク質を分泌の対象にし、成熟ＣＤＨタンパク質において切断されている。
【００４９】
また、本明細書において、グリコシド加水分解酵素ファミリー６１ポリペプチド（“ＧＨ６１”ポリペプチド）に関わる組成物および方法が、本明細書に開示されている。ＧＨ６１ポリペプチドは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl04076、NCBI名：glycol_hydro_61、およびPfamのタンパク質ファミリー番号：Pfam03443に示されているように分類されている配列を有しているポリペプチドの大きな集団である。
【００５０】
本明細書に開示されているＧＨ６１ポリペプチドは、セルラーゼおよびセルロース含有材料を含んでいる混合物に供給されて、ＧＨ６１ポリペプチドが加えられていないこと以外において対応する混合物におけるセルロース含有材料の分解と比べて、これらの混合物におけるセルロース含有材料の分解を向上させ得る。
【００５１】
また、銅原子と結合されている組換えＧＨ６１ポリペプチドが示されている。これらのＧＨ６１ポリペプチドは、銅原子と結合していないこと以外において対応するＧＨ６１ポリペプチドより、セルロース分解の促進に有効である。
【００５２】
また、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が示されている。これらの組成物は、本明細書に開示されている種々のＧＨ６１ポリペプチドおよびＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含み得る。これらの組成物は、セルラーゼおよびセルロース含有材料を含んでいる混合物とともに含まれて、これらの組成物が加えられていないこと以外において対応する混合物におけるセルロース含有材料の分解と比べて、セルロース含有材料の分解を向上させ得る。
【００５３】
（バリアント、配列同一性および配列類似性）
比較を目的とした配列のアライメントの方法は当該分野において周知である。例えば、任意の２つの配列間におけるパーセント配列同一性の決定は、数学的なアルゴリズムを用いて実施され得る。そのような数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所的な相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性検索法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877のように変更されているKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムである。
【００５４】
これらの数学的なアルゴリズムのコンピュータによる実行は、配列同一性を決定するための配列の比較に利用され得る。そのような実行としては、PC/Geneプログラム（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）；ALIGNプログラム（Version 2.0）におけるCLUSTAL、ならびにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）におけるGAP, BESTFIT, BLAST, FASTAおよびTFASTAが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプログラムを用いたアライメントは、初期設定のパラメータを用いて実施され得る。CLUSTALプログラムはHiggins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、およびPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によって、十分に説明されている。ALIGNプログラムは、上述のMyers and Miller (1988)のアルゴリズムに基づいている。PAM120置換残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティは、アミノ酸配列を比較する場合にALIGNプログラムとともに使用され得る。Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のBLASTプログラムは、上述のKarlin and Altschul (1990)のアルゴリズムに基づいている。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTのヌクレオチド検索は、BLASTプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTのタンパク質検索は、BLASTXプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され得る。比較を目的としてギャップのあるアライメントを得るために、（BLAST2.0における）Gapped BLASTは、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載の通りに利用され得る。代替的に、（BLAST2.0における）PSI-BLASTは、複数の分子間における隔たりの関係を検出する反復検索を実施するために使用され得る。上述のAltschul et al. (1997) を参照すればよい。BLAST、Gapped BLASTまたはPSI-BLASTを利用する場合に、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列用のBLASTN、タンパク質用のBLASTX）の初期設定のパラメータが使用され得る。またアライメントは検査によって手動で実施され得る。
【００５５】
２つの核酸配列またはポリペプチド配列に関して、本明細書に使用されるときの配列同一性または同一性は、指定された比較ウィンドウの全体にわたって最大の一致のために整列化されているときに、同じである２つの配列における残基に対する言及をなしている。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に対する言及に使用されている場合、アミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有している他のアミノ酸残基と置換されている保存的なアミノ酸置換によってしばしば異なる、同一ではない残基の位置は、分子の機能的な特性を変更しないと認識されている。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性のパーセントは、置換の保存的な性質について補正するために、上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、配列類似性または類似性を有しているといわれる。この調整を行う手段は当業者に周知である。典型的に、これは、保存的置換を完全なミスマッチというより部分的なミスマッチと記録し、配列同一性のパーセンテージ増加させることを含んでいる。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを付与され、非保存的な置換が０のスコアを付与される場合に、保存的な置換は０と１との間のスコアを付与される。保存的な置換の得点は、例えばPC/Geneプログラム（Intelligenetics, Mountain View, Calif.）のプログラムに実行される通りに、算出されている。
【００５６】
酵素バリアントの機能的な活性は、酵素生成物を分析するために、分子生物学の標準的な手法（薄層クロマトグラフィーおよび光束液体クロマトグラフィーが挙げられる）を用いて評価され得る。酵素活性は、基質（セロビオース、結晶セルロース（例えばAVICEL（商標））、およびリグノセルロース材料が挙げられる）を用いて決定され得る。
【００５７】
（ＣＤＨヘムドメイン）
ＣＤＨヘムドメインを含んでいるポリペプチドが、本明細書に示されている。本明細書に使用されるとき、“ＣＤＨヘムドメイン”は、ＣＤＨタンパク質のヘムドメインのアミノ酸配列と同一であるか、または相同性のアミノ酸配列を有しているポリペプチドを指す。ＣＤＨヘムドメインは、十分に性質決定されており、当業者にとって公知である。Phanerochaete chrysosporiumのＣＤＨタンパク質に由来するＣＤＨヘムドメインの結晶構造は、決定されており（Hallberg, B.M. et al. Structure(9), pp. 79-88 (2000)；および(Zamocky, M. et al., Curr. Prot. Pept. Sci., (7), 3, pp. 255-280, (2006))）、多くのＣＤＨヘムドメインの配列が同定されている。ＣＤＨヘムドメインのアミノ酸配列の例としては、配列番号１〜２３、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘム）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘム）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘム）、配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘム）が挙げられる。
【００５８】
ＣＤＨヘムドメインは、およそ１７５〜２２５アミノ酸の長さであり、メチオニンおよびヒスチジン残基を介して配位されるヘム補欠分子族を有している。さらに、ＣＤＨヘムドメインは、ヘム基の保存されているメチオニン／ヒスチジン配位に起因して、保存されているスペクトル特性を有している。ＣＤＨヘムドメインは、種々の手法（既知のＣＤＨヘムドメインに対するアミノ酸または核酸の配列相同性、既知のＣＤＨヘムドメインと比べたときのスペクトル特性、既知のＣＤＨヘムドメインと比べたときの３次元構造が挙げられる）によって同定され得る。当業者によって理解される通り、低いアミノ酸配列類似性を有しているポリペプチドは、非常に類似したスペクトル特性および／または３次元構造を依然として有し得る。
【００５９】
本明細書に示されているときの“ＣＤＨヘムドメイン”は、配列番号１〜２３、配列番号７０（N. crassaのＣＤＨ−１ヘム）、配列番号７６（N. crassaのＣＤＨ−２ヘム）、配列番号８０（M. thermophilaのＣＤＨ−１ヘム）、配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２ヘム）に示されているアミノ酸配列を有しているポリペプチドを包含している。また、“ＣＤＨヘムドメイン”は、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性／配列類似性を、配列番号１〜２３、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８６に示されているポリペプチドのいずれかに対して有しているポリペプチドを包含している。また、“ＣＤＨヘムドメイン”は、メチオニンおよびヒスチジン残基を介して配位されるヘム基を有しており、配列番号１〜２３、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８６に示されているポリペプチドのいずれかと相同性またはオルソロガスであると当業者に同定させるスペクトル特性および／または３次元特性を有しているポリペプチドを包含している。
【００６０】
（セルラーゼ結合モジュール（ＣＢＭ））
セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいるポリペプチドが、本明細書に示されている。ＣＢＭは、炭水化物結合活性を有している３次元構造を示しており、炭水化物と関連する酵素活性を有しているより巨大なタンパク質の一部であり得るアミノ酸配列である。本明細書に使用されるとき、“ＣＢＭ”は、炭水化物結合活性をともなった不連続なひだ（discrete fold）を有している任意のポリペプチドを指す。一局面において、本開示のＣＢＭはセルロースと結合し得る。
【００６１】
ＣＢＭは、アミノ酸配列、タンパク質の折り畳み構造、および／または結合特異性に基づいて種々のＣＢＭ“ファミリー”に整理されている。ＣＢＭについての情報は、例えば、Boraston A. et al., Biochem. J. 382, pp. 769-781 (2004)、およびShoseyov O. et al., Micro. Mol. Biol. Rev. (70) 2, pp.283-295 (2006)に与えられている。
【００６２】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー１”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー１のＣＢＭは、約４０アミノ酸の長さであり、ほぼ真菌にのみ天然に存在する。ＣＢＭファミリー１のＣＢＭは、十分に性質決定されているセルロース結合特性を有している。ＣＢＭファミリー１のＣＢＭは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）の保存されているドメインの識別子：cl02521、およびNCBI名：CBM_1を有している。また、ＣＢＭファミリー１のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR000254、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：pf00734を有している。
【００６３】
また、本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー２”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー２のＣＢＭは、約１００アミノ酸の長さであり、主に細菌において天然に存在する。ＣＢＭファミリー２のＣＢＭは、十分に性質決定されているセルロース結合特性を有している。ＣＢＭファミリー２のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl02709、およびNCBI名：CBM_2を有している。また、ＣＢＭファミリー２のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR001919、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：pf00553を有している。
【００６４】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー３”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー３のＣＢＭは、約１５０アミノ酸の長さであり、バクテリアにおいて天然に存在する。ＣＢＭファミリー３のＣＢＭは、十分に性質決定されているセルロース結合特性を有している。ＣＢＭファミリー３のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl03026、およびNCBI名：CBM_3および有している。また、ＣＢＭファミリー３のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR001956、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：Pfam00942を有している。
【００６５】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー８”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー８のＣＢＭは、粘菌Dictyostelium discoideumにおいて同定されている。例えば、GenBankアクセション番号：AAA52077.1のポリペプチドは、ＣＢＭファミリー８のＣＢＭを含んでいる。
【００６６】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー９”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー９のＣＢＭは、約１７０アミノ酸の長さであり、キシラナーゼにおいて同定されている。ＣＢＭファミリー９のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cd00005、CD09620およびCD09619、ならびにNCBI名：CBM9_like_1、CBM9_like_3およびCBM9_like_4を有している。また、ＣＢＭファミリー９のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR003305、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：pf02018を有している。
【００６７】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー１０”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー１０のＣＢＭは、約５０アミノ酸の長さである。ＣＢＭファミリー１０のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl07836、およびNCBI名：CBM_10を有している。ＣＢＭファミリー１０のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR002883、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：Pfam02013を有している。
【００６８】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー１１”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー１１のＣＢＭは、約１８０〜２００アミノ酸の長さである。ＣＢＭファミリー９のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl04062、およびNCBI名：CMB_11を有している。また、ＣＢＭファミリー９のＣＢＭは、Pfamタンパク質データベースのファミリー番号：Pfam03425を有している。
【００６９】
本開示のＣＢＭは、“ＣＢＭファミリー１６”、“ＣＢＭファミリー３０”、“ＣＢＭファミリー３７”、“ＣＢＭファミリー４４”、“ＣＢＭファミリー４６”、“ＣＢＭファミリー４９”、“ＣＢＭファミリー５９”、および“ＣＢＭファミリー２８”のＣＢＭを包含している。
【００７０】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー４”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー４のＣＢＭは、約１５０アミノ酸の長さであり、細菌において天然に存在する。ＣＢＭファミリー４のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl03406、およびNCBI名：CBM_4_9を有している。また、ＣＢＭファミリー４のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR003305、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：Pfam02018を有している。
【００７１】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー６”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー６のＣＢＭは、約１２０アミノ酸の長さである。ＣＢＭファミリー６のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl02697、およびNCBI名：CBM_6を有している。また、ＣＢＭファミリー６のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR005084、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：Pfam03422を有している。
【００７２】
本開示のＣＢＭは“ＣＢＭファミリー１７”のＣＢＭを包含している。ＣＢＭファミリー１７のＣＢＭは、約２００アミノ酸の長さである。ＣＢＭファミリー１７のＣＢＭは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl04061、およびNCBI名：CBM_17_28を有している。また、ＣＢＭファミリー１７のＣＢＭは、InterProタンパク質データベースのアクセション番号：IPR005086、およびPfamタンパク質データベースのファミリー番号：Pfam03424を有している。
【００７３】
本開示のＣＢＭは、N. crassaのＣＤＨ−１のＣＢＭまたはM. thermophilaのＣＤＨ−１のＣＢＭアミノ酸配列を有しているポリペプチドを包含している。N. crassaのＣＤＨ−１のＣＢＭアミノ酸配列は、配列番号７４に示されており、M. thermophilaのＣＤＨ−１のＣＢＭは、配列番号８４に示されている。
【００７４】
本開示のＣＢＭドメインは、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のか、または完全な（１００％の）配列同一性／配列類似性を、配列番号７４（N. crassaのＣＤＨ−１のＣＢＭ）または配列番号８４（M. thermophilaのＣＤＨ−１のＣＢＭ）のポリペプチドに対して有している組換えポリペプチドを包含している。
【００７５】
（デヒドロゲナーゼドメイン）
デヒドロゲナーゼドメインを含んでいるポリペプチドが、本明細書に示されている。また、デヒドロゲナーゼドメインは、本明細書において“酸化的ドメイン”と呼ばれる。また、デヒドロゲナーゼドメインを有しているポリペプチドは、本明細書において“デヒドロゲナーゼ”と呼ばれる。デヒドロゲナーゼは、基質を酸化し（例えば、基質に電子を減らさせ／酸化数を上昇させ）得、受容体を還元し（例えば、受容体に電子を得させ／酸化数を低下させ）得る。
【００７６】
本開示のデヒドロゲナーゼドメインは、ＧＭＣ酸化還元酵素スーパーファミリーのデヒドロゲナーゼドメインである。本開示のデヒドロゲナーゼドメインは、ＧＭＣ酸化還元酵素Ｎスーパーファミリーのデヒドロゲナーゼドメインを包含している。ＧＭＣ酸化還元酵素Ｎスーパーファミリーデヒドロゲナーゼドメインは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl02950、およびNCBI名：GMC_oxred_Nを有している。また、ＧＭＣ酸化還元酵素Ｎスーパーファミリーデヒドロゲナーゼドメインは、Pfamタンパク質データベースのファミリー番号：pf00732を有している。本開示のデヒドロゲナーゼドメインは、ＧＭＣ酸化還元酵素Ｃスーパーファミリーのデヒドロゲナーゼドメインを包含している。ＧＭＣ酸化還元酵素Ｃスーパーファミリーデヒドロゲナーゼドメインは、NCBIの保存されたドメイン識別子：cl08434、およびNCBI名：GMC_oxred_Cを有している。また、ＧＭＣ酸化還元酵素Ｎスーパーファミリーデヒドロゲナーゼドメインは、Pfamタンパク質データベースのファミリー番号：pf00732を有している。
【００７７】
本開示のデヒドロゲナーゼドメインは、N. crassaのＣＤＨ−１、N. crassaのＣＤＨ−２、M. thermophilaのＣＤＨ−１、M. thermophilaのＣＤＨ−２のデヒドロゲナーゼドメインを包含している。N. crassaのおよびM. thermophilaのＣＤＨデヒドロゲナーゼドメインの両方に、フラビン基が存在する。また、本明細書に使用されるとき、N. crassaのＣＤＨ−１、M. thermophilaのＣＤＨ−１、および相同なＣＤＨタンパク質のデヒドロゲナーゼドメインは、“フラビン”ドメインと呼ばれる。
【００７８】
本開示の他のデヒドロゲナーゼドメインは、ＣＤＨ様ヘムドメイン、グルコース／ソルボソンデヒドロゲナーゼドメインおよび真菌のセルロース結合ドメインを有している、Coprinopsis cinera（“C. cinera”）のポリペプチド  XP_001837973.1（配列番号５０）のグルコース／ソルボソンデヒドロゲナーゼドメインでである。
【００７９】
本開示のデヒドロゲナーゼドメインは、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のか、または完全な（１００％の）配列同一性／配列類似性を、配列番号７２（N. crassaのＣＤＨ−１のデヒドロゲナーゼドメイン）、配列番号７８（N. crassaのＣＤＨ−２のデヒドロゲナーゼドメイン）、配列番号８２（M. thermophilaのＣＤＨ−１のデヒドロゲナーゼドメイン）、配列番号８８（M. thermophilaのＣＤＨ−２のデヒドロゲナーゼドメイン）、または配列番号５１（C. cinera XP_001837973.1のデヒドロゲナーゼドメイン）のポリペプチドに対して有している組換えポリペプチドを包含している。
【００８０】
（本開示のポリペプチド）
本明細書に使用されるとき、“ポリペプチド”は、重合されている連続した複数のアミノ酸残基（例えば、重合されている連続した、少なくとも１５のアミノ酸残基）を含んでいるアミノ酸配列を指す。ポリペプチドは、修飾されているアミノ酸残基、コドンによってコードされていない天然に存在するアミノ酸残基、および天然に存在しないアミノ酸残基を必要に応じて含んでいる。
【００８１】
本明細書に使用されるとき、“タンパク質”は、天然に存在するか、または合成のアミノ酸配列、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはそれらの部分を指す。
【００８２】
本明細書に使用されるとき、“天然に存在しない”ポリペプチドは、天然にみられない全体としてのアミノ酸配列を有しているポリペプチド配列を指す（すなわち、ポリペプチドが天然にみられる部分配列を有してさえ、ポリペプチドの全体としてのアミノ酸配列が天然にみられない場合、当該ポリペプチドは、本明細書に使用されるとき“天然に存在しない”ポリペプチドとみなされる）。
【００８３】
本明細書に使用されるとき、“組換え”ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくともいずれか１つが真である場合のポリペプチド配列を指す。（ａ）ポリペプチドの配列は、所定の宿主細胞にとって外来性である（すなわち当該宿主に天然にみられない）か、（ｂ）ポリペプチドの配列は、所定の宿主細胞において天然にみられ得るが、異常な（例えば、予想を超えて多い）量であるか、または（ｃ）ポリペプチドの全体的な配列は天然に存在しない。
【００８４】
本明細書に使用されるとき、天然に存在する配列に“由来する”ポリペプチドは、天然に存在する配列と同一であり得るか、または天然に存在する配列と異なり得る。
【００８５】
（ＣＤＨヘムドメインポリペプチド）
ＣＤＨヘムドメインポリペプチドが、本明細書に記載されている。本明細書に使用されるとき、“ＣＤＨヘムドメインポリペプチド”は、ＣＤＨヘムドメインを有している任意のポリペプチドを包含している。
【００８６】
ＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、組換えＣＤＨタンパク質を包含している。また、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド（後述されている）を包含している。ＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを欠き得る。
【００８７】
（天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド）
天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドが、本明細書に記載されている。天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメインを含んでおり、全体としてのアミノ酸配列が天然にみられない任意のポリペプチドである。
【００８８】
天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在する関係と互いに異なる関係において、天然に存在しないＣＤＨヘムポリペプチド鎖に配置されている、ポリペプチドの２つ以上の天然に存在する部分配列および／またはドメインを含み得る。一形態において、天然に存在しないポリペプチドにおける部分配列および／またはドメインは、天然に存在しないＣＤＨヘムポリペプチド鎖において、天然に存在するポリペプチドに存在するアミノ酸より少ないアミノ酸によって隔てられている。他の形態において、天然に存在しないポリペプチドにおける部分配列および／またはドメインは、天然に存在するポリペプチドに存在するアミノ酸より多いアミノ酸によって、天然に存在しないＣＤＨヘムポリペプチド鎖において隔てられている。他の形態において、天然に存在しないポリペプチドにおける部分配列および／またはドメインは、天然に存在しないＣＤＨヘムポリペプチド鎖において、天然に存在するポリペプチドに存在する順序と異なる順序になっている。他の形態において、天然に存在しないポリペプチドにおける部分配列および／またはドメインは、天然に存在しないＣＤＨヘムポリペプチド鎖において、天然に存在するポリペプチドに存在する順序と異なる順序になっている。他の形態において、天然に存在しないポリペプチドにおける部分配列および／またはドメインは、天然に存在するポリペプチドにおいてともに存在していない。
【００８９】
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる天然に存在しないポリペプチド
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドが、本明細書に記載されている。ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインを必要に応じて含み得る。
【００９０】
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドにおいて、ＣＤＨヘムドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＢＭと直接的に連結され得る。他の形態において、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、１つ以上のアミノ酸によってポリペプチド鎖において隔てられ得る。いくつかの局面において、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００のアミノ酸によって、ポリペプチド鎖において隔てられ得る。
【００９１】
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドのポリペプチド鎖において、任意の順序に配置され得る。例えば、ＣＤＨヘムドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＢＭに対してＮ末端にあり得、ポリペプチド鎖においてＣＢＭに対してＣ末端にあり得る。
【００９２】
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドのＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、同じ種のＣＤＨタンパク質に由来し得る（例えば、同じＣＤＨ遺伝子から得られる）。例えば、ＣＤＨヘムドメインが配列番号７０の配列を有しており、かつＣＢＭが配列番号７４の配列を有しているように、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、N. crassaのＣＤＨ−１（配列番号３２）に由来し得る。他の例としては、ＣＤＨヘムドメインが配列番号８０の配列を有しており、かつＣＢＭが配列番号８４の配列を有しているように、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、M. thermophilaのＣＤＨ−１（配列番号４６）に由来し得る。
【００９３】
他の形態において、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドのＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、同じ種のＣＤＨタンパク質に由来しない。例えば、ＣＤＨヘムドメインはＣＤＨタンパク質に由来し得、ＣＢＭは非ＣＤＨタンパク質に由来し得る。他の例において、ＣＤＨヘムドメインは一方の種のＣＤＨタンパク質に由来し、ＣＢＭは他方の種のＣＤＨタンパク質に由来する（例えば、２つの異なるＣＤＨ遺伝子のＣＤＨから得られる）。
【００９４】
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドは、ＣＢＭを欠いている対応するポリペプチドまたは類似のポリペプチドより、セルロース分解の促進に有効であり得る。ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドは、ＣＢＭを欠いている対応するポリペプチドまたは類似のポリペプチドより、セルロース分解の促進において少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％有効であり得る。
【００９５】
第１のポリペプチドが第２のポリペプチドより“セルロース分解の促進において有効である”例としては、（ｉ）等しい数の第１および第２のポリペプチドの分子が、同じ反応条件をともなっている、セルラーゼを含んでいる２つの別の反応に供給され（第１のポリペプチドが一方の反応に加えられ、第２のポリペプチドが他方の反応に加えられるように）、かつ第２のポリペプチドがその反応におけるセルロース分解の速度を向上させるより、第１のポリペプチドは、その反応におけるセルロース分解の速度を向上させる場合；（ｉｉ）等しい数の第１および第２のポリペプチドの分子が、同じ反応条件をともなっている、セルラーゼを含んでいる２つの別の反応に供給され（第１のポリペプチドが一方の反応に加えられ、第２のポリペプチドが他方の反応に加えられるように）、かつ第２のポリペプチドがその反応におけるセルロース分解の程度を向上させるより、第１のポリペプチドは、その反応におけるセルロース分解の程度を向上させる場合；（ｉｉｉ）第２のポリペプチドより少ない第１のポリペプチドが、セルロースを含んでいる反応におけるセルロース分解の速度を、セルロース分解の目標の速度まで向上させるために必要である場合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
また、ＣＢＭを欠いている対応するポリペプチドまたは類似のポリペプチドよりセルロース分解を促進する、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドが示されている。例えば、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有している天然に存在しないポリペプチドは、同じ反応条件において、ＣＢＭを欠いている対応するポリペプチドまたは類似のポリペプチドより、セルロースの分解を、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％または１０００％向上させ得る。
【００９７】
ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しているがデヒドロゲナーゼドメインを欠いている天然に存在しないポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインを有していること以外において対応するポリペプチドより、セルラーゼ反応における分子に対する少ない酸化的損傷を生じ得る。
【００９８】
ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる、天然に存在しないポリペプチド
また、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドが、示されている。
【００９９】
これらのポリペプチドにおいて、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインは、ポリペプチド鎖において直接的に連結され得る。代替的に、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインの１つ以上は、１つ以上のアミノ酸によってポリペプチド鎖において隔てられ得る。例えば、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００のアミノ酸によって、ポリペプチド鎖において互いから隔てられ得る。
【０１００】
ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインは、ポリペプチド鎖において任意の順序に配置され得る。例えば、ＣＤＨヘムドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインの両方に対してＮ末端にあり得るか、またはＣＤＨヘムドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインの両方に対してＣ末端にあり得るか、またはＣＤＨヘムドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインの間にあり得る。同様に、ＣＢＭは、ポリペプチド鎖においてＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインの両方に対してＮ末端にあり得るか、またはＣＢＭは、ポリペプチド鎖においてＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインの両方に対してＣ末端にあり得るか、またはＣＢＭは、ポリペプチド鎖においてＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインの間にあり得る。同様に、デヒドロゲナーゼドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭの両方に対してＮ末端にあり得るか、またはデヒドロゲナーゼドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭの両方に対してＣ末端にあり得るか、またはデヒドロゲナーゼドメインは、ポリペプチド鎖においてＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭの間にあり得る。
【０１０１】
ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインは、同じ種のＣＤＨタンパク質（例えば、同じＣＤＨ遺伝子）に由来し得る。
【０１０２】
代替的に、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインは、同じ種のＣＤＨタンパク質に由来しない。一形態において、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、同じ種のＣＤＨタンパク質に由来し、ＣＢＭは、非ＣＤＨタンパク質に由来する。他の形態において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインのそれぞれは、異なる種のＣＤＨタンパク質に由来する（例えば、３つの異なるＣＤＨ遺伝子から得られる）。他の形態において、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、同じ種のＣＤＨタンパク質に由来し、デヒドロゲナーゼドメインは、非ＣＤＨタンパク質に由来する。
【０１０３】
ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、N. crassaのＣＤＨ−１（それぞれ配列番号７０および配列番号７４）に由来し、デヒドロゲナーゼドメインは、非ＣＤＨタンパク質に由来し得る。他の形態において、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭはN. crassaのＣＤＨ−１に由来し、デヒドロゲナーゼドメインは、C. cinereaから得られる推定のグルコース／ソルボースデヒドロゲナーゼ（配列番号５１）に由来する。
【０１０４】
他の形態において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、M. thermophilaのＣＤＨ−１（配列番号８０および配列番号８４）に由来し、デヒドロゲナーゼドメインは、非ＣＤＨタンパク質に由来し得る。他の形態において、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、M. thermophilaのＣＤＨ−１に由来し、デヒドロゲナーゼドメインは、C. cinereaから得られる推定のグルコース／ソルボースデヒドロゲナーゼ（配列番号５１）に由来する。
【０１０５】
ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、ＣＢＭを本来的に欠いている同じ種のＣＤＨタンパク質に由来し、ＣＢＭは、ＣＤＨまたは非ＣＤＨタンパク質に由来し得る。一局面において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、N. crassaのＣＤＨ−２に由来し、ＣＢＭは、ＣＤＨまたは非ＣＤＨタンパク質に由来する。他の局面において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、N. crassaのＣＤＨ−２に由来し、ＣＢＭは、ＣＤＨまたは非ＣＤＨタンパク質に由来する。さらなる他の局面において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、M. thermophilaのＣＤＨ−２に由来し、ＣＢＭは、N. crassaまたはM. thermophilaのＣＤＨ−１タンパク質に由来する。
【０１０６】
一形態において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、N. crassaのＣＤＨ−２（それぞれ配列番号７６および配列番号７８）に由来し、ＣＢＭは、N. crassaまたはM. thermophilaのＣＤＨ−１タンパク質（それぞれ配列番号７４または配列番号８４）に由来する。
【０１０７】
他の形態において、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを有している天然に存在しないポリペプチドにおける、ＣＤＨヘムドメインおよびデヒドロゲナーゼドメインは、M. thermophilaのＣＤＨ−２（それぞれ配列番号８６および配列番号８８）に由来し、ＣＢＭは、N. crassaまたはM. thermophilaのＣＤＨ−１タンパク質（それぞれ配列番号７４または配列番号８４）に由来する。
【０１０８】
本開示の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、さらなるポリペプチド配列をさらに含み得る。本開示の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、当該ポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドおよび／またはタンパク質精製のためのポリペプチド“タグ”を、特に限定されることなく、さらに含み得る。
【０１０９】
また、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる組成物が、示されている。ここで、当該ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、同じポリペプチド鎖の一部ではなく、共有結合的に連結されておらず、非共有的な相互作用を介して安定に相互作用している。同じポリペプチド鎖の一部ではないＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、例えばロイシンジッパーモチーフを介して、非共有結合的に安定に相互作用している２つの別のポリペプチドにあり得る。
【０１１０】
ロイシンジッパーモチーフは、当業者に周知であり、ポリペプチドの二量体化に関与する一般的な構造である。ロイシンジッパーモチーフは、モチーフにおける約７つのアミノ酸おきにロイシン残基を有しており、２つの二量体化パートナーが相互作用するアルファヘリックスを形成している。
【０１１１】
（ＧＨ６１ポリペプチド）
また、組換えＧＨ６１ポリペプチドが本明細書に示されている。本開示の組換えＧＨ６１ポリペプチドの例は、ＧＨ６１−１／NCU02240（配列番号２４）、ＧＨ６１-２／NCU07898（配列番号２６）、ＧＨ６１-４／NCU01050（配列番号３０）、ＧＨ６１−５／NCU08760（配列番号２８）、NCU02916（配列番号６４）、NCU00836（配列番号９０）のアミノ酸配列、またはそれらの部分配列を有しているポリペプチドである。
【０１１２】
本開示は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のか、または完全な（１００％の）配列同一性／配列類似性を、配列番号２４（ＧＨ６１−１／NCU02240）、配列番号２６（ＧＨ６１-２／NCU07898）、配列番号２８（ＧＨ６１−５／NCU08760）、配列番号３０（ＧＨ６１-４／NCU01050）、NCU00836（配列番号９０）、または配列番号６４（NCU02916）のポリペプチドに対して、有している組換えポリペプチドを提供する。
【０１１３】
また、本開示のＧＨ６１ポリペプチドとしては、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１-２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU00836、およびNCU02916のポリペプチドの保存的に改変されているバリアントである組換えポリペプチドが挙げられる。本明細書に使用されるときの“保存的に改変されているバリアント”は、化学的に類似のアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含んでいる。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的な置換の表は、当該分野において周知である。保存的に改変されているそのようなバリアントは、本開示の多型バリアント、種間相同物およびアリール（これらを除外していない）の他にある。以下の８つの群は、互いにとって保存的な置換であるアミノ酸の例を含んでいる。（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。
【０１１４】
本開示は、NCU02240またはNCU01050と相同またはオルソロガスなＧＨ６１ポリペプチドを提供する。NCU02240またはNCU01050と相同なポリペプチドの配列アラインメントは、図１７に示されており、図１８は、NCU02240またはNCU01050に対する選択されたＧＨ６１タンパク質の最尤系統樹を示す。
【０１１５】
NCU02240およびNCU01050のポリペプチドと、特徴的な特定のモチーフを共有しているタンパク質は、“NCU02240／NCU01050クレード”と呼ばれ得る。NCU02240／NCU01050クレードのメンバーであるタンパク質は、NCU02240またはNCU01050の基準の配列を第２の配列と比較（例えば、BLAST配列アラインメントによって）し、当該第２の配列におけるモチーフを同定することによって同定され得る。
【０１１６】
本明細書に示されているように、“NCU02240／NCU0150クレード”に属するＧＨ６１ポリペプチドは、以下のモチーフの、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つすべてを、ポリペプチド配列に有している。
【０１１７】
モチーフ１：ＨＴＩＦ（配列番号３４）；（シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基１〜４に対応する）。
【０１１８】
モチーフ２：Ｒ−Ｘ−Ｐ−［ＳＴ］−Ｙ−［ＮＤ］−Ｇ−Ｐ（配列番号３５）；（シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基２１〜２８に対応する）；Ｘは任意のアミノ酸であり、［ＳＴ］はＳまたはＴであり、［ＮＤ］はＮまたはＤである。
【０１１９】
モチーフ３：Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｘ−Ｐ−Ｎ−［ＰＴ］−［ＴＶ］（配列番号３６）；（シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基３９〜４６に対応）；Ｘは任意のアミノ酸であり、［ＰＴ］はＰまたはＴであり、［ＴＶ］はＴまたはＶである。
【０１２０】
モチーフ４：Ｄ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−［ＳＴ］−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−［ＴＶ］−Ｘ−Ａ−Ｙ−［ＬＭ］−Ｋ−Ｋ−Ｖ（配列番号３７）；（シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基７５〜９２に対応する）；Ｘは任意のアミノ酸であり、［ＳＴ］はＳまたはＴであり、［ＴＶ］はＴまたはＶであり、［ＬＭ］はＬまたはＭである。理論によって縛られることなく、このモチーフにおけるヒスチジンは、文献における構造的な性質決定から、必須の金属イオンを結合すると知られている。
【０１２１】
モチーフ５：Ｇ−Ｗ−［ＦＹ］−Ｋ−Ｉ−［ＱＳ］（配列番号３８）；（シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基１０４〜１０９に対応する）；［ＦＹ］はＦまたはＹであり、［ＱＳ］はＱまたはＳである。理論によって縛られることなく、これらの残基は、予想されている活性部位から遠く離れており、NCU02240／NCU01050クレードの構造的な安定性に重要と考えられている。
【０１２２】
モチーフ６：Ｉ−Ｐ−Ｘ−Ｃ−Ｉ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−［ＡＧ］−Ｅ−［ＭＬ］−［ＩＬ］−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｑ−［ＦＬ］−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｃ−Ａ−Ｑ−［ＩＬ］−Ｎ−［ＩＶ］−Ｖ−Ｇ−Ｇ（配列番号３９）；（シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基１３４〜１７７に対応する）；Ｘは任意のアミノ酸であり、［ＡＧ］はＡまたはＧであり、［ＭＬ］はＭまたはＬであり、［ＩＬ］はＩまたはＬであり、［ＦＬ］はＦまたはＬであり、［ＩＬ］はＩまたはＬであり、［ＩＶ］はＩまたはＶである。モチーフにおける最初のシステインはジスルフィド結合している。このモチーフにおけるヒスチジンは、予想された活性部位の近傍にあり、ほぼすべてのＧＨ６１において高度に保存されている。このモチーフにおける中ほどのグルタミンは、すべてのＧＨ６１タンパク質において完全に保存されており、文献から活性に重要と知られている。このモチーフにおける２番目のチロシンは、必須な活性部位の金属に非常に近く、多くのＧＨ６１クレードにわたって高度に保存されている。
【０１２３】
モチーフ７：Ｔ−［ＶＹ］−Ｓ−［ＦＩ］−Ｐ−Ｇ−［ＡＩ］−Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［ＩＬ］−Ｙ（配列番号４０）；（シグナル配列を切断した後のNCU02240ポリペプチドの残基１８５〜２０４に対応する）；Ｘは任意のアミノ酸であり、［ＶＹ］はＶまたはＹであり、［ＦＩ］はＦまたはＩであり、［ＡＩ］はＡまたはＩである。理論によって縛られることなく、このモチーフにおける（最終的な位置における）最後のチロシンは基質結合に重要と考えられている。
【０１２４】
上述のモチーフにおいて、一般に認められているＩＵＰＡＣのアミノ酸の一文字略号が採用されている。
【０１２５】
“NCU02240／NCU01050クレード”のメンバーであるＧＨ６１ポリペプチドの例としては、配列番号２４、３０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６０、６３、６６、６８および６９のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本開示は、NCU02240／NCU01050クレードのメンバーであるＧＨ６１ポリペプチドの保存的に改変されているバリアントをさらに提供する。
【０１２７】
本明細書に開示されているＧＨ６１ポリペプチドは、モチーフＨ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙ（配列番号９２）を含んでいるポリペプチド（Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（４−８）は４〜８の任意の数である）を包含している。このモチーフのＨは、シグナル配列が切断された後におけるNCU02240ポリペプチドの残基１５３に対応する。理論によって縛られることなく、このモチーフのＨ、ＱおよびＹ残基は、銅の結合、基質の結合／位置決め、および／または一般酸としての作用に重要であり得る。ＧＨ６１ポリペプチドにおけるこのモチーフのＨ、Ｑ、Ｙ残基のいずれかの変異は、ＧＨ６１ポリペプチドの機能を大きく低下させ得る。
【０１２８】
本開示のＧＨ６１ポリペプチドは、全長ｃＤＮＡの翻訳されたバージョンのＧＨ６１ポリペプチド配列、およびシグナルペプチドを欠いている対応するＧＨ６１ポリペプチド配列の両方を包含している。細胞において翻訳された当初に、本開示のすべてのＨＧ６１ポリペプチドは、ポリペプチドを細胞外分泌の対象にするＮ末端の短いシグナルペプチドを有している。このポリペプチドは、ＧＨ６１ポリペプチドが細胞から外へ輸送されるときに、翻訳された本来のＧＨ６１ポリペプチドから切断される。
【０１２９】
ＧＨ６１ポリペプチド上のシグナルペプチドの同定方法は、例えばSignalP予測ツールを用いることによって、当該分野に公知である。例えば、“Locating Proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools” Olof Emanuelsson, Soren Brunak, Gunnar von Heijne, Henrik Nielsen Nature Protocols 2, 953-971 (2007)を参照すればよい。
【０１３０】
予測されるシグナルペプチドの手動の確認は、すべての成熟ＧＨ６１ポリペプチドが、シグナルペプチドの切断後にＮ末端ヒスチジンを含んでいると示している。SignalPの予測されるＮ末端残基がヒスチジンではない場合、ＧＨ６１の手動の予測が実施され、これは、Ｎ末端から約１０〜３０アミノ酸、一般的にＮ末端から１５〜２５アミノ酸にヒスチジン残基によってなされ得る。
【０１３１】
このヒスチジンは、金属結合に必要であり、イミダゾール側鎖およびＮ末端アミンを介して触媒的に必要な金属を結合する。したがって、欠失（または不適切なシグナル切断現象よるＮ末端に対する余分の配列）のためにＮ末端ヒスチジンを欠失しているＧＨ６１配列は、非機能的になっている。
【０１３２】
シグナルペプチドは、配列番号２４（NCU02240）のアミノ酸番号１〜１５、配列番号２６（NCU07898）のアミノ酸番号１〜１５、配列番号２８（NCU08760）のアミノ酸番号１〜２０、配列番号３０（NCU01050）のアミノ酸番号１〜１５、配列番号６４（NCU02916）のアミノ酸番号１〜１６、および配列番号９０（NCU00836）のアミノ酸番号１〜１８を構成している。
【０１３３】
本明細書に示されているのは、NCU02240／NCU01050クレードのＧＨ６１ポリペプチド、ならびに完全なシグナルペプチドを有しているＧＨ６１ポリペプチドNCU02240、NCU07898、NCU08760、NCU01050、NCU02916およびNCU00836である。また、本明細書に示されているのは、NCU02240／NCU01050クレードのＧＨ６１ポリペプチド、ならびにシグナルペプチドを欠いているＧＨ６１ポリペプチドNCU02240、NCU07898、NCU08760、NCU01050、NCU02916およびNCU00836である。
【０１３４】
（銅と結合されているＧＨポリペプチド）
本明細書に示されているのは、銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドである。銅原子を結合し得るＧＨ６１ポリペプチドとしては、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１-２／NCU07898、ＧＨ６１-４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、ＧＨ６１-６／NCU02916、およびＧＨ６１-３／NCU00836挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
また、本明細書に示されているのは、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物である。ここで、ＧＨ６１タンパク質の５０％以上は、銅原子と結合されている。本明細書にさらに示されているのは、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物であり、ここで、ＧＨ６１タンパク質の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合されている。
【０１３６】
また、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物が示されており、ここで、当該組成物におけるＧＨ６１タンパク質に対する銅原子の比率は、１に対して０．５（すなわち、２つのＧＨ６１タンパク質につき１つの銅原子）以上である。一形態において、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物が示されており、ここで、当該組成物におけるＧＨ６１タンパク質に対する銅原子の比率は、１に対して、０．６、０．７、０．８、０．９、１（すなわち１つのＧＨ６１タンパク質につき１つの銅原子）、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０（すなわち１つのＧＨ６１タンパク質につき１０の銅原子）以上である。ＧＨ６１タンパク質に対する銅原子の比率が１を超える組成物において、当該組成物における少なくともいくつかの銅原子はＧＨ６１タンパク質と結合されていない。理論によって縛られることなく、単一の銅原子は、ＧＨ６１タンパク質のそれぞれによって安定に結合され得る。
【０１３７】
（本開示のポリヌクレオチド）
本明細書に使用されるとき、“ポリヌクレオチド”、“核酸配列”、“核酸の配列”という用語、およびこれらの変化形は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含んでいる）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含んでいる）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮグリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他の型、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対合および塩基スタッキングを可能にする構成において核酸塩基を含んでいるという条件の非ヌクレオチド骨格を含んでいる他の重合体の総称である。したがって、これらの用語は、核酸配列修飾（例えば、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上の、類似物を用いた置換）およびヌクレオチド間の修飾の、公知の型を包含している。本明細書に使用されている通り、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにとっての記号は、IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclatureによって推奨されている記号である。
【０１３８】
本開示のポリヌクレオチドは、当業者に公知の好適な任意の方法（例えば、直接の化学合成またはクローニングが挙げられる）によって調製される。直接の化学合成に関して、核酸の重合体の形成は、伸長しているヌクレオチド鎖の末端５ヒドロキシ基に対する、３’ブロックおよび５’ブロックされたヌクレオチド単量体の連続的な追加によって典型的に生じる。追加のそれぞれは、追加される単量体の３位に対する伸長している鎖の末端５’ヒドロキシ基の求核攻撃によってもたらされる。そのような方法論は、当業者に公知であり、適切な教科書および文献（例えば、Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Lett 21:719-722；米国特許第４，５００，７０７号明細書；米国特許第5,436,327号明細書；および米国特許第５，７００，６３７号明細書）に記載されている。ポリヌクレオチドのクローニング手法は、当該分野に公知であり、例えば、Sambrook, J. et al. 2000 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)に記載されている。ポリヌクレオチドのクローニング手法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるポリヌクレオチドの増幅、制限酵素によるポリヌクレオチドの酵素的な切断、およびリガーゼによるポリヌクレオチドの酵素的な連結が挙げられるが、これらに限定されない。本開示のポリヌクレオチドは、１つの技術または複数の手法の任意の組合せによって調製され得る。
【０１３９】
本開示のポリヌクレオチドのそれぞれは、発現ベクターに組み込まれ得る。“発現ベクター”または“ベクター”は、宿主細胞を形質導入するか、形質転換するか、または感染させ、これによって細胞にとって本来的ではないか、または細胞にとって本来的ではない様式において、核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させる化合物および／または組成物を指す。“発現ベクター”は、宿主細胞によって発現される核酸の配列（通常、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでいる。また、必要に応じて、発現ベクターは、宿主細胞への核酸の進入を補助する材料（例えば、ウイルス、リポソームまたはタンパク質被覆など）を含んでいる。本開示における使用について意図されている発現ベクターとしては、好ましいか、または必要な任意のオペレーショナルエレメントとともに核酸配列が挿入され得る発現ベクターが挙げられる。さらに、発現ベクターは、宿主細胞に移され、宿主細胞において複製され得る発現ベクターである必要がある。好ましい発現ベクターは、プラスミド（特に、核酸配列の転写に好ましいか、または求められるオペレーショナルエレメントを含んでおり、十分に立証されている制限酵素部位を有しているプラスミド）である。そのようなプラスミドおよび他の発現ベクターは、当業者にとって周知である。
【０１４０】
個々のポリヌクレオチドの、ベクターへの組込みは、例えば発現ベクター（例えばプラスミド）における特定の部位を切断するための制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩなど）の使用を含んでいる公知の方法を介して実施され得る。制限酵素は、切断された発現ベクターの末端に対して相補的な配列を有している終端を有しているポリヌクレオチド、または当該配列を有するために合成されているポリヌクレオチドとアニールされ得る１本鎖の末端を生成する。アニーリングは適切な酵素（例えばＤＮＡリガーゼ）を用いて行われる。当業者によって十分に理解される通り、発現ベクターおよび所望のポリヌクレオチドの両方は、多くの場合に同じ制限酵素を用いて切断され、これによって発現ベクターの末端およびポリヌクレオチドの端部が互いに相補的であることを保証する。さらに、ＤＮＡリンカーは、発現ベクターへの核酸配列の連結を容易にするために使用され得る。
【０１４１】
本開示は、ポリヌクレオチドが発現ベクターに組み込まれる過程に関して、限定されない。当業者は、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むために必要な手段に精通している。典型的な発現ベクターは、リボソーム結合部位（例えば、E. coliにおける開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に配置されている、長さ３〜９ヌクレオチドのヌクレオチド配列）とともに、１つ以上の制御領域が前に置かれている所望のポリヌクレオチドを含んでいる。Shine and Dalgarno (1975) Nature 254(5495):34-38およびSteitz (1979) Biological Regulation and Development (ed. Goldberger, R. F.), 1:349-399 (Plenum, New York)を参照すればよい。
【０１４２】
本明細書に使用されるとき、“作動可能に連結されている”という用語は、制御配列がコード配列の発現を進行させるように、ＤＮＡ配列またはポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列が配置されている構成を指す。
【０１４３】
調節領域としては、例えば、プロモータおよびオペレータを含んでいるそれらの領域が挙げられる。プロモータは、所望のポリヌクレオチドと作動可能に連結され、これによってＲＮＡポリメラーゼ酵素を介したポリヌクレオチドの転写を開始させる。オペレータは、プロモータに隣接する核酸の配列であり、リプレッサタンパク質が結合可能なタンパク質結合ドメインを含んでいる。リプレッサタンパク質の非存在下において、転写がプロモータを介して開始する。存在する場合、オペレータのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサタンパク質は、オペレータと結合し、これによって転写を阻害する。このように、転写の制御は、使用される特定の制御領域および対応するリプレッサタンパク質の存在もしくは非存在に基づいて、実現されている。例としては、ラクトースプロモータ（Ｌａｄリプレッサタンパク質は、ラクトースと接触したときに高次構造を変化させ、これによってオペレータに対するＬａｄリプレッサタンパク質の結合を妨げる）、トリプトファンプロモータ（トリプトファンと複合体化したとき、ＴｒｐＲリプレッサタンパク質はオペレータと結合する高次構造を有しており、トリプトファンび非存在下において、ＴｒｐＲリプレッサタンパク質はオペレータに結合しない高次構造を有している）が挙げられる。他の例は、ｔａｃプロモータ（de Boer et al., (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80(1):21-25を参照すればよい）である。当業者によって十分に理解される通り、これらおよび他の発現ベクターは、本発明に使用され得、本発明はこの点において限定されない。
【０１４４】
任意の好適な発現ベクターが、所望の配列を組み込むために使用され得るが、容易に入手可能な発現ベクターとしては、プラスミド（例えば、ｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲｌＯＯ、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９）；バクテリオファージ（例えば、Ｍｌ  ３ファージおよびλファージ）が挙げられるが、これらに限定されない。もちろん、そのような発現ベクターは、特定の宿主細胞に好適であるに過ぎない。しかし、当業者は、任意の特定の発現ベクターが任意の所定の宿主細胞に適しているか否かを、通常の実験を介して容易に決定し得る。例えば、発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それから当該ベクターに含まている配列の存続性および発現について観察される。さらに、発現ベクターおよび任意の特定の宿主細胞に対するそれらの適合性について記載している関連する教科書および文献に対して、参照がなされ得る。
【０１４５】
本明細書に使用されるとき、“組換え核酸”、“異種核酸”、“組換えポリヌクレオチド”、“組換えヌクレオチド”または“組換えＤＮＡ”は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つが真である核酸の重合体を指す。（ａ）核酸の配列は、所定の宿主細胞にとって外来性である（すなわち天然にみられない）か；（ｂ）配列は、所定の宿主細胞に天然にみられるが、異常な（例えば、予想を超えて多い）量であるか；または（ｃ）核酸の配列は、自然状態では互いに同じ関係においてみられない２つ以上の部分配列を含んでいる。一局面において、本開示は、宿主細胞への発現ベクターの導入について説明している。ここで、当該発現ベクターは、宿主細胞に通常みられないタンパク質をコードする核酸配列を含んでいるか、または細胞に通常みられるが、異なる調節配列の制御下にあるタンパク質をコードする核酸を含んでいる。したがって、宿主細胞のゲノムに関して、上記タンパク質をコードする核酸配列は組換え体である。
【０１４６】
ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列の関係は、当該分野において周知である。アミノ酸は、３つの核酸の“コドン”によってコードされている（それぞれの核酸をコードするコドンは、例えば、JM Berg, JL Tymoczko, and L Stryer, Biochemistry, 5th edition (2002)に記載されている）。したがって、所定のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を同定するか、または生成することは、当業者にとって通常のことである。一部のアミノ酸は、２つ以上のコドンによってコードされている。本開示のポリヌクレオチドにおいて、所望のアミノ酸をコードする任意の核酸の配列（任意のコドン）は、ポリヌクレオチド配列に使用され得る。いくつかの局面において、同じアミノ酸をコードする他のコドンより、宿主生物において好ましく利用される特定のコドンが使用される。
【０１４７】
（ＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列）
ＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドが、本明細書に示されている。本開示の組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているポリヌクレオチドの任意の調製方法によって調製され得る。
【０１４８】
本開示は、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードする任意の組換えポリヌクレオチドを包含している。一形態において、本開示は、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードする任意の組換えポリヌクレオチドを包含している。一形態において、本開示の組換えポリヌクレオチドは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを含んでいない、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードしている。一形態において、本開示の組換えポリヌクレオチドは、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードしている。
【０１４９】
ＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号３３（N. crassaのＣＤＨ−１）、配列番号４２（N. crassaのＣＤＨ−２）、配列番号４５（M. thermophilaのＣＤＨ−１）、配列番号４８（M. thermophilaのＣＤＨ−２）、配列番号７１（N. crassaのＣＤＨ−１ヘムドメイン）、配列番号７７（N. crassaのＣＤＨ−２ヘムドメイン）、配列番号８１（M. thermophilaのＣＤＨ−１）、および配列番号８６（M. thermophilaのＣＤＨ−２）が挙げられる。
【０１５０】
ＧＨ６１をコードするポリヌクレオチド
本開示は、ＧＨ６１ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示の組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＧＨ６１ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを含んでいる。ＧＨ６１ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているポリヌクレオチドの任意の調製方法によって調製され得る。
【０１５１】
本開示のポリヌクレオチドとしては、配列番号２４（ＧＨ６１−１／NCU02240）、配列番号２６（ＧＨ６１-２／NCU07898）、配列番号３０（ＧＨ６１-４／NCU01050）、配列番号２８（ＧＨ６１−５／NCU08760）、配列番号６４（NCU02916）または配列番号９０（NCU00836）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。また、本開示のポリヌクレオチドとしては、配列番号２５（ＧＨ６１−１／NCU02240ポリペプチドをコード）、配列番号２７（ＧＨ６１-２／NCU07898ポリペプチドをコード）、配列番号３１（ＧＨ６１-４／NCU01050ポリペプチドをコード）、配列番号２９（ＧＨ６１−５／NCU08760ポリペプチドをコード）、および配列番号９１（NCU00836ポリペプチドをコード）のポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１５２】
また、本開示の組換えポリヌクレオチドは、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のか、または完全な（１００％の）配列同一性／配列類似性を、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、配列番号２９、および配列番号９１のポリヌクレオチドに対して有しているポリヌクレオチドを包含している。
【０１５３】
本開示のポリヌクレオチドとしては、NCU02240／NCU01050クレードのメンバーであるＧＨ６１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがさらに挙げられる。また、本開示のポリヌクレオチドとしては、モチーフＨ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙを含んでいるＧＨ６１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１５４】
本開示のポリヌクレオチドとしては、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１-２／NCU07898、ＧＨ６１-４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916、NCU00836の保存的に改変されているバリアントをコードするポリヌクレオチド、およびNCU02240／NCU01050クレードのＧＨ６１タンパク質の保存的に改変されているバリアントをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１５５】
NCU02240／NCU01050クレードのＧＨ６１ポリペプチド、ならびに完全なシグナルペプチドを有しているＧＨ６１ポリペプチドNCU02240、NCU07898、NCU08760、NCU01050、NCU02916およびNCU00836をコードするポリヌクレオチドが、示されている。
【０１５６】
また、NCU02240／NCU01050クレードのＧＨ６１ポリペプチド、ならびにシグナルペプチドを欠いているＧＨ６１ポリペプチドNCU02240、NCU07898、NCU08760、NCU01050、NCU02916およびNCU00836をコードするポリヌクレオチドが、示されている。
【０１５７】
（本開示の組換えポリペプチドの発現および本開示の宿主細胞）
本開示は、本開示のポリペプチドの発現をさらにもたらす。本開示のポリペプチドは、標準的な分子生物学的な手法（例えば、Sambrook, J. et al. 2000 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)に記載されている手法）によって調製され得る。組換えポリペプチドは、トランスジェニックの発現系において発現され得、当該発現系から精製され得る。トランスジェニックの発現系は、原核生物または真核生物であり得る。いくつかの局面において、トランスジェニックの宿主細胞は、宿主細胞外にポリペプチドを分泌し得る。いくつかの他の局面において、トランスジェニック宿主細胞は、発現されたポリペプチドを宿主細胞に保持し得る。
【０１５８】
本開示の組換えポリペプチドは、宿主細胞または宿主細胞の増殖培地から、部分的または実質的に単離され得る。本開示の組換えポリペプチドは、タンパク質の精製を容易にするためのタンパク質“タグ”（例えば、ＧＳＴタグまたはポリＨｉｓタグ）をともなって調製され得る。また、本開示の組換えポリペプチドは、細胞外へのポリペプチドの輸送を導くシグナル配列をともなって調製され得る。組換えポリペプチドは、部分的にのみ精製され得る（例えば、＜８０％の純度、＜７０％の純度、＜６０％の純度、＜５０％の純度、＜４０％の純度、＜３０％の純度、＜２０％の純度、＜１０％の純度、＜５％の純度）か、または高純度まで精製され得る（例えば、＞９９％の純度、＞９８％の純度、＞９５％の純度、＞９０％の純度など）。組換えポリペプチドは、当業者にとって公知の種々の手法（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよび親和性クロマトグラフィが挙げられる）を用いて精製され得る。
【０１５９】
さらに、本開示は、本開示のポリペプチドの１つ以上をコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞にさらに関する。宿主細胞は、１つ以上のＣＤＨヘムドメインポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および／または１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１６０】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞が示されており、当該組換えポリヌクレオチドは、ＧＨ６１−１／NCU02240（配列番号２４）、ＧＨ６１−２／NCU07898（配列番号２６）、ＧＨ６１−４／NCU01050（配列番号３０）、ＧＨ６１−５／NCU08760（配列番号２８）、NCU02916（配列番号６４）、NCU00836（配列番号９０）、N. crassaのＣＤＨ−１（配列番号３２）、またはM. thermophilaのＣＤＨ−１（配列番号４６）のアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードしている。また、本明細書に示されているのは、２つ以上の組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であり、当該２つ以上の組換えポリヌクレオチドは、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有している１つ以上のポリペプチド、ならびにN. crassaのＣＤＨ−１またはM. thermophilaのＣＤＨ−１のアミノ酸配列を有している１つ以上のポリペプチドをコードしている。
【０１６１】
“宿主細胞”および“宿主微生物”は、組換えＤＮＡまたはＲＮＡの挿入によって形質転換され得る生物学的な生細胞を指すために、本明細書において交換可能に使用される。そのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡは、発現ベクターにあり得る。本明細書に記載のような宿主生物または宿主細胞は、原核生物または真核細胞であり得る。
【０１６２】
任意の原核宿主細胞または真核宿主細胞が、核酸配列を用いた形質変換後に生存可能である限り、本開示に使用され得る。宿主細胞は、必要な核酸配列の形質導入、タンパク質（例えばトランスポータ）の続く発現、または生じた中間体によって悪影響を受けないことが好ましい。好適な真核細胞としては、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
宿主細胞は真菌株であり得る。本明細書に使用されるとき、“真菌”としては、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門および接合菌門、ならびに卵菌門およびすべての栄養胞子の真菌が挙げられる。宿主細胞は、酵母細胞（Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Myceliophthora、Neurospora、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、TrichodermaまたはYarrowiaの菌株が挙げられる）であり得る。
【０１６４】
代替的に、上記宿主細胞は原核生物であり得、一部の局面において、原核生物は、E.coli、Bacillus subtilis、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum（Moorella thermoacetica）、Thermoanaerobacterium saccharolyticumまたはKlebsiella oxytocaである。
【０１６５】
本開示の宿主細胞は、組換え核酸が宿主細胞に導入されており、したがって遺伝的に改変されている宿主細胞は天然に存在しない点において、遺伝的に改変され得る。
適切な宿主細胞は、異なる機能にとっての１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸構築物を発現可能な細胞である。
【０１６６】
宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを天然に生成し得る。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞にとって異種であり得るか、または宿主細胞にとって内因性だが、当該宿主細胞においてポリヌクレオチドのより高い発現を生じさせる異種のプロモータおよび／または制御領域と作動可能に連結され得る。他の形態において、宿主細胞は、所望のポリペプチドを天然に生成せず、ポリペプチドの生成に必要な１つ以上のポリヌクレオチドを発現可能な異種の核酸構築物を含んでいる。
【０１６７】
（組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび／または組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物）
組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に示されている。また、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に示されている。組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドの両方を含んでいる組成物が、本明細書にさらに示されている。
【０１６８】
本開示の組成物は、ＧＨ６１ポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチドを含み得る。一形態において、上記組成物のＧＨ６１ポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチドは、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいる。一形態において、上記組成物のＧＨ６１ポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチドは、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドである。一形態において、上記組成物のＧＨ６１ポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチドは、ＧＨ６１−１／NCU02240またはＧＨ６１−４／NCU01050のアミノ酸配列を有している。一形態において、上記組成物のＧＨ６１ポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチドは、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有している。
【０１６９】
本開示の組成物は、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含み得る。一形態において、上記組成物の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＢＭを含み得る。一形態において、上記組成物の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを欠き得る。一形態において、上記組成物の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを含み得る。
【０１７０】
本開示の組成物は、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916、NCU00836のアミノ酸配列を有している組換えポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含み得る。
【０１７１】
ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916およびNCU00836のアミノ酸配列を有している２つ以上の組換えポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に示されている。
【０１７２】
組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に示されており、当該組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＢＭを含んでいる。一形態において、上記組成物の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在するＣＤＨタンパク質のアミノ酸配列を有している。一形態において、上記組成物の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、N. crassaのＣＤＨ−１またはM. thermophilaのＣＤＨ−１のアミノ酸配列を有している。他の形態において、上記組成物の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを欠いている。
【０１７３】
また、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび２つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物が、本明細書に示されている。ここで、２つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドの少なくとも１つは、デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを欠いている。
【０１７４】
本開示の他の組成物は、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる。いくつかの形態において、これらの組成物は、２つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる。
【０１７５】
また、本開示の組成物は、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物を包含しており、ここで、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている。
【０１７６】
また、本開示の組成物は、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物を包含しており、ここで、上記天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。
【０１７７】
組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物は、セルラーゼの１つ以上の酵素をさらに含み得る。
【０１７８】
また、本開示の組成物は、単一のポリペプチド鎖として共有結合的に連結されている組換えＧＨ６１ポリペプチドおよびＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物を含んでいる。そのような組成物は、セルラーゼの１つ以上の酵素をさらに含み得る。
【０１７９】
セルラーゼ
セルラーゼは、セルロースを加水分解し得る酵素である。セルラーゼとしては、エキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）、エンドグルカナーゼおよびβグルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。セルラーゼは、多くの異なる生物（主に真菌および細菌の種）によって天然に産生される。
【０１８０】
エンドグルカナーゼは、セルロース内の１−４  βグリコシド結合を加水分解し、これによってセルロース重合体の長さを短縮させ、セルロース重合体の露出された末端の総数を増加させる。エンドグルカナーゼの例としては、Trichoderma reesei（“T. ressei”）由来のＥＧＩ／Ｃｅｌ７Ｂ、ＥＧＩＩ／Ｃｅｌ５Ａ、ＥＧＩＩＩ／Ｃｅｌ１２Ａ、ＥＧＩＶ／Ｃｅｌ６１ＡおよびＥＧＶ／Ｃｅｌ４５Ａのポリペプチド、Phanerochaete chrysosporium（“P. chrysosporium”）由来のＥＧ２８、ＥＧ３４、およびＥＧ４４のポリペプチド、ならびにNeurospora crassa（“N. crassa”）由来のNCU00762、NCU05057およびNCU07190のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
エキソグルカナーゼは、セルロース重合体の末端付近の１−４  βグリコシド結合を加水分解し、これによってセルロース由来のグルコース重合体の短鎖（“セロデキストリン”と呼ばれる）生成する。最も一般に生成されるセロデキストリンは、“セロビオース”（２つのグルコース分子）であるが、より長いセロデキストリン（セロトリオース（３つのグルコース分子）、セロテトラオース（４つのグルコース分子）、セロペンタオース（５つのグルコース分子）、セロヘキサオース（６つのグルコース分子）、およびより長いセロデキストリンが挙げられる）が、同様に生成され得る。エキソグルカナーゼの例としては、T. resseiのＣＢＨＩＩ／Ｃｅｌ６ＡおよびＣＢＨＩ／Ｃｅｌ７ＡのポリペプチドおよびN. crassaのNCU07340およびNCU09680のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
βグルコシダーゼは、セロデキストリンをグルコースに加水分解する。βグルコシダーゼの例としては、T. resseiのＴＲＢＬＧ２、Clostridium cellulovoransのＣＣＢＧＬＡ、N. crassaのＧＨ３−４／NCU０４９５２およびNeotermes koshunensisのＮＫＢＬ１のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本開示のセルラーゼは、天然に存在するセルラーゼ、および向上された性質（例えば、向上された触媒作用率、向上された耐熱性など）を有するために改変されているセルラーゼの両方を包含している。一局面において、本明細書に示されているのは、少なくとも１つのエンドグルカナーゼ、少なくとも１つのエキソグルカナーゼ、および少なくとも１つのβグルコシダーゼを含んでいるセルラーゼの組成物である。
【０１８４】
セルラーゼが精製され得る生物および／またはセルラーゼをコードする遺伝子がクローン化され得る生物の例としては、真菌：Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Chaetomium globosum、Chaetomium thermophilum、Formitopsis palustris、Humicola insolens、Myceliophthora thermophila、N. crassa（Neurospora crassa）、Penicillium spp.、Phanerochaete chrysosporium、Pisolithus tinctorius、Pleurotus ostreatus、Podospora anserine）、Postia placenta、Saccharomyces cerevisiae、Sporotrichum thermophile、Sporobolomyces singularis、Talaromyces emersonii）、Thielavia terrestris、Trametes versicolor、Trichoderma reesei（テレオモルフ：Hypocrea jecorina）；および細菌：Acidothermus cellulolyticus、Anaerocellum thermophilum、Bacillus pumilis、Caldibacillus cellovorans、Caldicellulosiruptor saccharolyticum、Clostridium thermocellum、Halocella cellulolytica、Streptomyces reticule、Thermotoga neapolitanaが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび１つ以上のセルラーゼ酵素を含んでいる組成物が、本明細書に示されている。また、本明細書に示されているのは、NCU02240／NCU01050クレードの１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび１つ以上のセルラーゼ酵素を含んでいる組成物である。また、本明細書に示されているのは、NCU02240またはNCU01050のアミノ酸配列を有している組換えポリペプチドセルラーゼの１つ以上の酵素を含んでいる組成物である。
【０１８６】
また、本開示の組成物は、１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド、１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼ酵素を含んでいる組成物を包含している。
【０１８７】
また、１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有している１つ以上のポリペプチド、ならびにセルラーゼの１つ以上の酵素を含んでいる組成物が、本明細書に示されている。
【０１８８】
また、天然に存在しない１つ以上のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいる１つ以上のＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼ酵素を含んでいる組成物が、本明細書に示されている。
【０１８９】
１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド、１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびセルラーゼを含んでいる、本明細書に示されている組成物は、１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチドを欠いており、セルラーゼを含んでいること以外において対応する組成物より、セルロース含有材料の分解において有効である。
【０１９０】
さらなる成分
また、本開示の組成物は、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでおり、かつＧＨ６１ポリペプチドをさらに含んでいる組成物を包含しており、上記ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、共有結合的に連結されておらず、非共有結合の相互作用を介して安定に相互作用している。
【０１９１】
また、本明細書に開示されているのは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる組成物であり、ここで、上記ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、共有結合的に連結されておらず、ロイシンジッパーモチーフを介して安定に相互作用している２つのポリペプチドの一部である。上記組成物は、ＧＨ６１ポリペプチドをさらに含み得る。
【０１９２】
また、本明細書に開示されているのは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでおり、かつＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有している１つ以上のポリペプチドをさらに含んでいる組成物であり、ここで、上記ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、共有結合的に連結されておらず、非共有結合を介して安定に相互作用している。
【０１９３】
また、本明細書に開示されているのは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでおり、かつＧＨ６１ポリペプチドセルラーゼの１つ以上をさらに含んでいる組成物であり、ここで、上記ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭは、共有結合的に連結されておらず、非共有結合を介して安定に相互作用している。
【０１９４】
また、本明細書に開示されているのは、１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチド、１つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびセルラーゼを排出する真菌から得られた培養培地を含んでいる組成物である。そのような組成物において、１つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドであり得る。
【０１９５】
また、本明細書に開示されているのは、１つ以上の組換えＧＨ６１ポリペプチド、１つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびセルラーゼを排出する真菌によって分泌された１つ以上のタンパク質を含んでいる組成物を含んでいる組成物である。そのような組成物において、上記１つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、１つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドであり得る。
【０１９６】
セルラーゼを排出する真菌としては、Myceliophthora thermophila、N. crassa（Neurospora crassa）、Phanerochaete chrysosporiumおよびTrichoderma reeseiが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
（方法）
セルロースおよびセルロース含有材料（例えばバイオマス）を、単糖およびオリゴ糖に分解する方法が、本明細書に示されている。さらに、そのような目的の（例えば、例えばセルロースおよびセルロース含有材料を分解して可溶性の糖を生成する）ための、本開示のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組成物の方法および使用が、本明細書に開示されている。
【０１９８】
本明細書に使用されるとき、セルロースおよびセルロース含有材料の“分解（degrading）”および“分解（degradations）”は、セルロースの解重合および／または、セルロース多糖からの単糖もしくはオリゴ糖の放出を生じる任意の機序を指す。セルロースの分解としては、セルロースの加水分解およびセルロースの酸化的切断が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
（セルロースを分解する方法）
セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２００】
一局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有している組換えポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０１】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０２】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいる組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０３】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916およびNCU00836のアミノ酸配列を有している２つ以上の組換えポリペプチド、ならびに組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０４】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０５】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然のＣＤＨタンパク質のアミノ酸配列を有している組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０６】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびN. crassaのＣＤＨ−１もしくはM. thermophilaのＣＤＨ−１の組換えポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２０７】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを欠いている。
【０２０８】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および２つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、２つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを欠いている。
【０２０９】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２１０】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および２つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２１１】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでおり、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている。
【０２１２】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。
【０２１３】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。
【０２１４】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、ＧＨ６１ポリペプチドおよび１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。一局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているポリペプチド、ならびにセルラーゼの１つ以上と接触させることを包含している。一局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、NCU02240／NCU0105クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有しているポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。
【０２１５】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、ＧＨ６１ポリペプチド、ヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる分子、ならびにセルラーゼの１つ以上と接触させることを包含している。いくつかの局面において、ヘムドメインを含んでいる分子は、電子を伝達可能なヘム基を含んでいる分子であり得る。
【０２１６】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、ルイス酸、ヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる分子、ならびにセルラーゼの１つ以上と接触させることを包含している。いくつかの局面において、ヘムドメインを含んでいる分子は、電子を伝達可能なヘム基を含んでいる任意の分子であり得る。ルイス酸は電子対受容体である分子である。
【０２１７】
他の局面において、セルロースを分解する方法が示されており、当該方法は、セルロースを、ルイス酸、ＣＢＭを有しているＣＤＨタンパク質、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。ルイス酸は電子対受容体である分子である。
【０２１８】
（セルロースの分解を促進する方法）
セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１およびＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。一局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１ポリペプチドおよび天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、NCU02240／NCU0105クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいるＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。
【０２１９】
他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを有している天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。
【０２２０】
セルロース分解は、ＣＢＭを欠いている対応するか、または類似のＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することより、ＣＢＭを有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することによって、高い程度において促進され得る。そのような例において、ＣＢＭを有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在しなくてもよい。
【０２２１】
セルロースの分解を促進する例としては、セルロース分解の速度を向上させること；セルロース分解の程度を向上させること；特定の反応時間内におけるセルロース分解の程度を向上させること；セルロース分解の所定の程度を達成するために必要なセルラーゼの量を減少させること；および特定の反応時間内におけるセルロース分解の所定の程度を達成するために必要なセルラーゼの量を減少させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、２つ以上のＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有しているポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有しているポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、セルロースの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルロースおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいるＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含している。
【０２２３】
セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している、セルロースを分解する方法は、セルロースを、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび／または組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含していないこと以外において対応する方法より、セルロースの分解において有効であり得る。
【０２２４】
（セルロースの分解を促進するために必要なＣＤＨヘムドメインポリペプチド量を減少させる方法）
また、セルロースの分解を促進するために必要なＣＤＨヘムドメインポリペプチド量を減少させる方法が、本明細書に示されており、ここで、ＣＢＭを有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、セルロースの分解を促進するために、セルロース、セルラーゼ、およびＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる反応混合物に供給され、ＣＢＭを欠いている対応するか、または類似のＣＤＨヘムドメインポリペプチドに求められるより少ない量の、ＣＢＭを有しているＣＤＨヘムドメインポリペプチドが、促進されたセルロース分解に必要とされる。そのような方法において、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドであり得る。
【０２２５】
（セルラーゼ反応における分子に対する酸化的損傷を低減させる方法）
セルラーゼ反応における分子に対する酸化的損傷を低減させる方法およびセルラーゼ反応における活性酸素種を減少させる方法が示されている。セルラーゼ反応における分子としては、タンパク質および炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２６】
一局面において、セルラーゼ反応における分子への酸化的損傷を低減させる方法は、セルロース、セルラーゼおよびＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる反応混合物に、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しており、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含している。ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しており、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しているとともにデヒドロゲナーゼドメインを有している、対応するか、または類似の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドより、セルラーゼ反応において分子に対する酸化的損傷を、少なくもたらし得る。
【０２２７】
セルラーゼ反応における活性酸素種の形成を減少させる方法は、セルロース、セルラーゼおよびＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる反応混合物に、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しており、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを供給することを包含し得る。ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しており、デヒドロゲナーゼドメインを欠いている天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを有しているとともにデヒドロゲナーゼドメインを有している、対応するか、または類似の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドより、セルラーゼ反応における活性酸素種を、少なく生じさせ得る。
【０２２８】
（バイオマスを分解する方法）
バイオマスを分解する方法が示されている。本明細書に使用されるとき、“バイオマス”は、セルロースを含んでいる任意の材料を指す。また、本明細書に開示されているセルロースに関する方法は、バイオマスを含んでいる組成物に適用可能である。
【０２２９】
バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、本開示の１つ以上の組換えポリペプチドと接触させることを包含している。一局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含している。他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含している。他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドならびにＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916およびNCU00836のアミノ酸配列を有している１つ以上のポリペプチドと接触させることを包含している。他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびNCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有している１つ以上のポリペプチドと接触させることを包含している。他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＨ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいる１つ以上のＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３０】
本開示の方法をともなった使用に好適なバイオマスとしては、任意のセルロース含有材料（Miscanthus、スイッチグラス、スパルティナ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、一般的なヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、エンバク殻、サトウモロコシ、もみ殻、ライムギ殻、コムギ殻、サトウキビバガス、コプラのひき割り、コプラのペレット、パーム核のひき割り、トウモロコシ繊維、可溶性物質を有している乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、松材、カバ材、ヤナギ材、アスペン材、ポプラ材、エネルギーケイン、紙屑、おがくず、林業廃棄物、都市固形廃棄物、紙屑、作物残渣、他の草本および他の木材が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０２３１】
バイオマスを１つ以上の本開示のポリペプチドと接触させる前に、バイオマスは、１つ以上の前処理ステップに供され得る。前処理ステップは、当業者に公知であり、物理的処理および化学的処理を含んでいる。前処理ステップとしては、酸加水分解、アンモニア繊維爆砕（ＡＦＥＸ）、リグノセルロースの難分解性を解決するための亜硫酸前処理（ＳＰＯＲＬ）、水蒸気爆発およびオゾン前処理が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３３】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチドおよび組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる組成物と接触させることを包含している。
【０２３４】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有している組換えポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３５】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、NCU02240／NCU0105クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有している組換えポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３６】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいる組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３７】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有している２つ以上の組換えポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３８】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびＣＢＭを含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２３９】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然のＣＤＨタンパク質のアミノ酸配列を有している組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２４０】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびN. crassaのＣＤＨ−１もしくはM. thermophilaのＣＤＨ−１の組換えポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２４１】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを欠いている。
【０２４２】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスをセルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および２つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、２つ以上の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドの少なくとも１つは、デヒドロゲナーゼドメインおよびＣＢＭを欠いている。
【０２４３】
他の局面において、バイオマスを分解する方法であって、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している方法が示されている。
【０２４４】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および２つ以上の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含している。
【０２４５】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、デヒドロゲナーゼドメインを欠いており、ＣＤＨヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる。
【０２４６】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、ＣＤＨヘムドメイン、ＣＢＭおよびデヒドロゲナーゼドメインを含んでいる。
【０２４７】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。
【０２４８】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ＧＨ６１ポリペプチドおよび１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスをNCU02240／NCU0105クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有しているポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。
【０２４９】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ＧＨ６１ポリペプチド、ヘムドメインを含んでいる分子、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。ヘムドメインを含んでいる分子は、電子を伝達可能なヘム基を含んでいる任意の分子であり得る。
【０２５０】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ルイス酸、セルラーゼの１つ以上、ならびにヘムドメインおよびＣＢＭを含んでいる分子と接触させることを包含している。いくつかの局面において、ヘムドメインを含んでいる分子は、電子を伝達可能なヘム基を含んでいる任意の有機分子であり得る。ルイス酸は電子対受容体である分子である。
【０２５１】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、バイオマスを、ルイス酸、ＣＢＭを有しているＣＤＨタンパク質、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含している。ルイス酸は電子対受容体である分子である。
【０２５２】
他の局面において、バイオマスを分解する方法が示されており、当該方法は、第一に、バイオマスを、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドと接触させて、反応混合物を作製すること、ならびに続いて、セルラーゼの１つ以上を反応混合物に加えることを包含している。
【０２５３】
（バイオマスの分解の間における酸化的損傷を低減させる方法）
バイオマスの分解に関わる反応における分子に対する酸化的損傷を低減させる方法が示されており、当該方法は、ＣＤＨヘムドメインポリペプチド、ＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼが、バイオマスとともに反応混合物に対して同時に加えられたときに生じる、反応における分子に対する酸化的損傷に比べて、当該酸化的損傷を低減させるために、第１に、バイオマスを、ＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドと接触させて、反応混合物を作製すること、ならびに続いて、セルラーゼの１つ以上を反応化合物に加えることを包含している。
【０２５４】
（バイオマスの分解を促進する方法）
バイオマスの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、バイオマスおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含している。一局面において、バイオマスの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、バイオマスおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、２つ以上のＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、バイオマスの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、バイオマスおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有しているポリペプチドを供給することを包含している。他の局面において、バイオマスの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、バイオマスおよび１つ以上のセルラーゼを含んでいる反応混合物に、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドのアミノ酸配列を有しているポリペプチドを供給することを包含している。
【０２５５】
一局面において、バイオマスの分解を促進する方法が示されており、当該方法は、セルラーゼの１つ以上および天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチドを含んでいる反応混合物に、ＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含している。
【０２５６】
（セルロースおよびバイオマスを発酵生成物に変換する方法）
また、セルロースおよびバイオマスを発酵生成物に変換する方法が示されており、セルロースまたはバイオマスは、糖溶液（単糖、二糖およびオリゴ糖を含んでいる）を生じさせるために、セルラーゼおよび本開示の１つ以上のポリペプチドと接触させられ、かつ糖は発酵生成物に変換される。
【０２５７】
糖は、化学発酵または微生物発酵によって発酵生成物に変換され得る。発酵微生物としては、真菌および細菌の種が挙げられる。一例において、発酵微生物はSaccharomyces cerevisiaeである。
【０２５８】
本明細書に使用されるとき、“糖”としては、単糖、二糖およびオリゴ糖が挙げられる。いくつかの局面において、糖はグルコース単量体である。
【０２５９】
本開示の発酵生成物は、セルロースの分解によって得られた糖から生成され得る化学生成物を包含している。本開示の発酵生成物は生体燃料であり得る。本開示の発酵生成物は、アルコール（エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ペンタノールおよびオクタノールが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。本開示の発酵生成物はケトンまたはアルデヒドであり得る。
【０２６０】
（前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法）
また、本明細書に示されているＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドは、例えば生体燃料生成において、単糖およびオリゴ糖への分解の前に、バイオマス混合物を前処理するために使用され得る。
【０２６１】
例えば生体燃料生成における、供給原料として使用されるバイオマスは、バイオマスのセルロース性成分の加水分解を妨げる高レベルのリグニンを一般的に含んでいる。バイオマスは、加水分解に対するセルロース成分の接触性を向上させるために、例えば高温および／または高圧を用いて、典型的に前処理される。しかし、前処理は粘性の高いバイオマス混合物を一般的に生じさせる。また、前処理されたバイオマス混合物の高い粘性は、前処理されたバイオマス混合物の効率的な加水分解を妨げ得る。好都合なことに、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドは、バイオマスのさらなる分解の前に、前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させるために、セルラーゼとともに使用され得る。いくつかの局面において、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＧＨ６１ポリペプチドは、前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させるために使用される。いくつかの局面において、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、セルラーゼ、およびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＧＨ６１ポリペプチドは、前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させるために使用される。いくつかの局面において、本開示の天然に存在しないＣＤＨヘムドメインポリペプチド、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいるＧＨ６１ポリペプチド、およびセルラーゼは、前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させるために使用される。
【０２６２】
したがって、本開示の一局面は、初期の粘性を有している前処理されたバイオマス混合物を、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドと接触させること；ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘性を低下させるための十分な条件において、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させる方法に関する。また、本開示は、初期の粘性を有している前処理されたバイオマス混合物を、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１ポリペプチドおよびセルラーゼと接触させること；ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘性を低下させるための十分な条件において、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘性を低下させる方法を提供する。
【０２６３】
開示されれている上記方法は、前処理過程の一部として実施され得る。前処理過程は、バイオマスを前処理するステップの後に、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、本開示のＧＨ６１ポリペプチド、およびセルラーゼを前処理されたバイオマス混合物に加えること；ならびに混合物の粘性を低下させるための十分な条件において、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、本開示のＧＨ６１ポリペプチドおよびセルラーゼとともに、前処理されたバイオマスをインキュベートことをさらなるステップとして包含し得る。ポリペプチドまたは組成物は、混合物の温度が高い間、または混合物の温度が低下した後に、前処理されたバイオマス混合物に加えられ得る。いくつかの局面において、上記方法は、前処理が実施されたときと同じ容器（vessel）または容器（container）において実施される。他の局面において、上記方法は、前処理が実施されたときと別の容器または容器において実施される。
【０２６４】
いくつかの局面において、上記方法は、高濃度の塩の存在下、または１つ以上の界面活性剤、スルフィドリル試薬の存在下において実施される。高濃度の塩は、例えば、飽和濃度の塩を含んでいる溶液、少なくとももしくはおよそ以下の濃度：０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍもしくは４Ｍの塩化ナトリウムを含んでいる溶液、またはおよそか、もしくは以下の濃度：０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍもしくは３．２Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含んでいる溶液、および／またはイオン性の液体（例えば、１，３−ジメチルイミダゾリウムリン酸ジメチル（［ＤＭＩＭ］ＤＭＰ）または［ＥＭＩＭ］ＯＡｃ）である。界面活性剤は、例えば、イオン性の界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ）である。スルフィドリル試薬は、例えば、飽和している硫酸アンモニウムの試薬または約０〜１Ｍの硫酸アンモニウムの試薬である。他の局面において、上記方法は、広い温度範囲（例えば、約２０℃〜５０℃の間、２５℃〜５５℃の間、３０℃〜６０℃の間または６０℃〜１１０℃）にわたって実施される。いくつかの局面において、上記方法は、広いｐＨ範囲（例えば、約４．５〜８．７５のｐＨ、７を超えるｐＨもしくはｐＨ８．５、または少なくとも５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０もしくは８．５）にわたって実施され得る。
【０２６５】
（セルロース重合体を特定の生成物に切断する方法）
本明細書にさらに示されているのは、セルロース重合体を特定の切断生成物に切断する方法である。一局面において、本明細書に示されているのは、グルコース分子および４−ケトグルコース分子を生じさせるためにセルロース重合体を切断する方法である。セルロース重合体の切断から生じるグルコース分子および４−ケトグルコース分子は、より短いセルロース重合体の一部として残り得、より長いセルロース重合体の切断から生じる当該より短いセルロース重合体の両端に位置している。他の局面において、本明細書に示されているのは、セロデキストリンを得るためにセルロース重合体を切断する方法である。他の局面において、本明細書に示されているのは、４−ケトグルコースを含んでいる非還元糖末端を有しているセロデキストリンを生じさせるためにセルロース重合体を切断する方法である。
【０２６６】
グルコース分子および４−ケトグルコース分子にセルロース分子を切断する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチドよって接触させられ得る。いくつかの局面において、グルコース分子および４−ケトグルコース分子にセルロース分子を切断する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチドおよび本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドによって接触させられる。他の局面において、グルコース分子および４−ケトグルコース分子にセルロース分子を切断する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチド、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼによって接触させられる。他の局面において、グルコース分子および４−ケトグルコース分子にセルロース分子を切断する方法において、セルロースは、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＧＨ６１ポリペプチドによって接触させられる。他の局面において、セルロース分子をグルコース分子および４−ケトグルコース分子に切断する方法において、セルロースは、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、セルラーゼの１つ以上、およびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＧＨ６１ポリペプチドによって接触させられる。
【０２６７】
（セルロースにおける特定の結合を切断する方法）
本明細書にさらに示されているのは、セルロース重合体および関連分子における特定の結合を切断する方法である。一局面において、本明細書に示されているのは、セルロース重合体においてグルコース分子を連結している１−４  グリコシド結合を切断する方法である。他の局面において、本明細書に示されているのは、グルコース分子の４位のＣ−Ｈ結合を切断し、これによって４−ケトグルコース分子の生成を促進する方法である。
【０２６８】
いくつかの局面において、セルロース重合体におけるグルコース分子を結合する１−４  グリコシド結合を切断する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチドによって接触させられる。他の局面において、セルロース重合体におけるグルコース分子を結合する１−４  グリコシド結合を切断する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチドおよび本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドによって接触させられる。他の局面において、セルロース重合体におけるグルコース分子を結合する１−４  グリコシド結合を切断する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチド、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼによって接触させられる。他の局面において、セルロース重合体におけるグルコース分子を結合する１−４  グリコシド結合を切断する方法において、セルロースは、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＧＨ６１ポリペプチドによって接触させられる。
【０２６９】
グルコース分子の４位のＣ−Ｈ結合を切断し、これによって４−ケトグルコース分子の生成を促進する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチドと接触させられ得る。いくつかの局面において、グルコース分子の４位のＣ−Ｈ結合を切断し、これによって４−ケトグルコース分子の生成を促進する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチドおよび本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチドによって接触させられる。他の局面において、グルコース分子の４位のＣ−Ｈ結合を切断し、これによって４−ケトグルコース分子の生成を促進する方法において、セルロースは、本開示のＧＨ６１ポリペプチド、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼによって接触させられる。他の局面において、グルコース分子の４位のＣ−Ｈ結合を切断し、これによって４−ケトグルコース分子の生成を促進する方法において、セルロースは、本開示のＣＤＨヘムドメインポリペプチド、およびＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916もしくはNCU00836のアミノ酸配列を有しているＧＨ６１ポリペプチドによって接触させられる。
【０２７０】
（銅と結合されているＧＨ６１ポリペプチドを生成する方法）
本明細書に示されているのは、銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドを生成する方法である。一局面において、銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドは、銅原子を含んでいる培地において培養される細胞において生成される。他の局面において、銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドは、銅を含んでいる溶液においてＧＨ６１ポリペプチドをインキュベートすることによって生成される。銅原子と結合されている、生成され得るＧＨ６１ポリペプチドとしては、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、ＧＨ６１−６／NCU02916、およびＧＨ６１−３／NCU00836が挙げられるが、これらに限定されない。また、銅原子と結合されている、生成され得るＧＨ６１ポリペプチドとしては、NCU02240／NCU01050クレードのポリペプチドおよびＨ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフを含んでいるＧＨ６１ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドは、組換え体であり得るか、または天然に存在し得る。
【０２７１】
本明細書にさらに示されているのは、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物を生成する方法であり、ＧＨ６１タンパク質の５０％以上は、銅原子と結合されている。また、本明細書に示されているのは、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物を生成する方法であり、ＧＨ６１タンパク質の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合されている。銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドは、銅原子がＧＨ６１ポリペプチドにとって利用可能な状態にされる任意の方法によって生成され得る。
【０２７２】
銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドは、銅原子を含んでいる培地において培養される細胞において生成され得る。銅原子を含んでいる培地において培養される細胞は、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００μＭの銅を含んでいる培地において培養され得る。銅原子を含んでいる培地において培養される細胞は、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００μＭ以下の銅を含んでいる培地において培養され得る。いくつかの局面において、銅原子を含んでいる培地において培養される細胞は、０．１〜１０００μＭ、１００〜８００μＭ、０．１〜５００μＭ、または１〜５０μＭの銅を含んでいる培地において培養され得る。
【０２７３】
また、本明細書に開示されているのは、ＧＨ６１ポリペプチドを生成する方法であり、ＧＨ６１ポリペプチドは、銅を含んでいる溶液においてインキュベートされる。ＧＨ６１ポリペプチドは、あらかじめ結合している金属をＧＨ６１ポリペプチドから除去するために、銅を含んでいる溶液におけるインキュベーションの前に、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）にさらされ得る。
【０２７４】
銅を含んでいる溶液においてインキュベートされるＧＨ６１ポリペプチドは、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００μＭの銅を含んでいる溶液においてインキュベートされ得る。銅を含んでいる溶液においてインキュベートされるＧＨ６１ポリペプチドは、０．０５以下、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００μＭの銅を含んでいる溶液においてインキュベートされ得る。いくつかの局面において、銅を含んでいる溶液においてインキュベートされるＧＨ６１ポリペプチドは、０．１〜１０００μＭ、１００〜８００μＭ、０．１〜５００μＭ、または１〜５０μＭの銅を含んでいる溶液においてインキュベートされ得る。
【０２７５】
本明細書に示されている方法において、銅は、液体に銅の塩を溶解させることによって加えられ得る。
本明細書に開示されている方法とともに使用され得る銅の塩としては、水に溶解する任意の銅の塩（硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅および硝酸銅が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０２７６】
（銅と結合されているＧＨ６１ポリペプチドを用いて、セルロース含有材料を分解する方法）
本明細書に使用されるとき、“セルロース含有材料”は、バイオマスなどのセルロースを含んでいる任意の材料を包含している。本明細書に示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含しており、ＧＨ６１ポリペプチドは銅原子と結合されている。本明細書に示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の複数の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含しており、ＧＨ６１タンパク質の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合されている。本明細書に示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の複数の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含しており、ＧＨ６１タンパク質の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合しており、ＧＨ６１ポリペプチドの１つ以上がＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有している。
【０２７７】
また、本明細書に示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、本開示の組換えＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含しており、ＧＨ６１ポリペプチドは銅原子と結合されている。本明細書にさらに示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の複数の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、本開示の複数の組換えＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含しており、ＧＨ６１タンパク質の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合されている。本明細書にさらに示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の複数の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、本開示の複数の組換えＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含しており、ＧＨ６１タンパク質の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合しており、ＧＨ６１ポリペプチドの１つ以上は、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836のアミノ酸配列を有している。
【０２７８】
また、本明細書に示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび組換えＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを包含しており、銅原子が反応混合物に存在する。本開示のセルロース含有材料、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいるいくつかの反応混合物において、銅の濃度は、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００μＭである。本開示のセルロース含有材料、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいるいくつかの反応混合物において、銅の濃度は、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００μＭ以下である。本開示のセルロース含有材料、組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでいるいくつかの反応混合物において、銅の濃度は、０．１〜１０００μＭ、１００〜８００μＭ、０．１〜５００μＭまたは１〜５０μＭである。
【０２７９】
また、本明細書に示されているのは、セルロース含有材料を分解する方法であり、当該方法は、セルロース含有材料を、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド、本開示の組換えＧＨ６１ポリペプチド、および１つ以上のセルラーゼと接触させることを包含しており、銅原子が反応混合物に存在する。セルロース含有材料、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび本開示の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでおり、セルラーゼの１つ以上をさらに含んでいるいくつかの反応混合物において、銅の濃度は、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００μＭである。セルロース含有材料、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび本開示の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでおり、セルラーゼの１つ以上をさらに含んでいるいくつかの反応混合物において、銅の濃度は、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００μＭ以下である。セルロース含有材料、本開示の組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドおよび本開示の組換えＧＨ６１ポリペプチドを含んでおり、セルラーゼの１つ以上をさらに含んでいるいくつかの反応混合物において、銅の濃度は、０．１〜１０００μＭ、１００〜８００μＭ、０．１〜５００μＭまたは１〜５０μＭである。
【０２８０】
（ＧＨ６１ポリペプチドの銅含量を分析する方法）
本明細書にさらに示されているのは、ＧＨ６１ポリペプチドの銅含有量を分析する方法である。複数のＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物におけるＧＨ６１ポリペプチドの銅含有量を決定するために、種々の手法がを使用され得る。当該手法は、以下の（１）〜（４）のステップを一般的に包含している。（１）所定のＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物のサンプルを入手すること；（２）上記組成物におけるＧＨ６１ポリペプチドの濃度を決定すること；（３）上記組成物における銅原子の濃度を決定すること；および（４）サンプルに存在するＧＨ６１ポリペプチドおよび銅原子の量に基づいて、１つのＧＨ６１ポリペプチドについての銅原子の量を算出すること。
【０２８１】
サンプルにおけるＧＨ６１ポリペプチドの濃度は、組成物のタンパク質含量を測定するアッセイ（例えば、Bradfordアッセイ、Lowryアッセイまたはビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ）の使用を介して決定され得る。組成物におけるタンパク質含量の質量および所定のＧＨ６１ポリペプチドの分子量を考慮すれば、当業者は、サンプルにおけるＧＨ６１ポリペプチドの濃度を容易に決定し得る。
【０２８２】
サンプルにおける銅原子の濃度は、組成物における金属含有量の測定を行う任意の手法（例えば、誘導結合プラズマ原子発光分析または誘導結合プラズマ質量分析）の使用を介して決定され得る。
【０２８３】
組成物におけるＧＨ６１ポリペプチドの濃度および同じ組成物における銅原子の濃度を考慮すれば、当業者は、組成物における銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドのパーセンテージを容易に決定され得る。理論によって縛られることなく、ＧＨ６１ポリペプチドのそれぞれは１つの銅原子と結合している。例えば、精製されたＧＨ６１ポリペプチドを含んでいる組成物の分析は、１マイクロリットルのサンプルにつき約８００００のＧＨ６１ポリペプチドおよび１０００００の銅原子を組成物が含んでいることを示している場合、これは、サンプルにおける８０％のＧＨ６１ポリペプチドが銅原子と結合されていることを示している。
【０２８４】
（セルロース含有材料の分解に使用されるＧＨ６１ポリペプチドの量を減少させる方法）
本明細書に示されているのは、セルロース含有材料の分解に使用されるＧＨ６１ポリペプチドの量を減少させる方法である。いくつかの局面において、セルロース含有材料の分解に使用されるＧＨ６１ポリペプチドの量を減少させる方法は、複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含しており、ＧＨ６１ポリペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合されている。いくつかの局面において、セルロース含有材料の分解に使用されるＧＨ６１ポリペプチドの量を減少させる方法は、ＧＨ６１−１／NCU02240、ＧＨ６１−２／NCU07898、ＧＨ６１−４／NCU01050、ＧＨ６１−５／NCU08760、NCU02916またはNCU00836の配列を有している複数の組換えＧＨ６１ポリペプチドを供給することを包含しており、ＧＨ６１ポリペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％は、銅原子と結合されている。いくつかの局面において、銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドは、銅原子と結合されていないＧＨ６１ポリペプチドより、セルロースの分解を効率的に促進する。したがって、銅原子と結合されているＧＨ６１ポリペプチドが、セルロースの分解に使用される場合、銅原子と結合されていないＧＨ６１ポリペプチドと比べて、より少ないポリペプチドが、セルロースの分解を促進するために必要とされ得る。
【０２８５】
（ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系の同定）
他の実施形態において、本明細書に開示されているのは、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系を同定する方法である。本明細書に示されている通り、アクセサリセルラーゼ系は、セルロース、セルラーゼ、およびその他の分子を含んでいる反応においてセルロースの分解を促進する組成物である。ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系は、セルロースの分解を促進するためにＣＤＨヘムドメインポリペプチドの存在を典型的に必要とする組成物である。いくつかの局面において、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系は、１種類の分子によって構成されている。いくつかの局面において、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系は２種類以上の分子によって構成されている。
【０２８６】
一局面において、ＣＤＨ依存性のセルラーゼ系を同定する方法は、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系を同定するために、以下の（ｉ）〜（ｖ）のステップを包含している。（ｉ）セルラーゼを分泌する菌（“セクレトーム”）によって分泌されるタンパク質のサンプルを入手すること；（ｉｉ）サンプルの一部を、ＥＤＴＡまたはシアン化カリウムと接触させること；（ｉｉｉ）ＥＤＴＡ処理またはシアン化カリウム処理されたサンプルのセルラーゼ活性を測定すること；（ｉｖ）ＥＤＴＡ処理またはシアン化カリウム処理されていないサンプルのセルラーゼ活性を測定すること；（ｖ）ＥＤＴＡ処理またはシアン化カリウム処理されたサンプルのセルラーゼ活性と、ＥＤＴＡ処理またはシアン化カリウム処理されていないサンプルのセルラーゼ活性を比較すること。ＥＤＴＡ処理またはシアン化カリウム処理されたサンプルおよび対応する非処理サンプルの間におけるセルロース分解の程度における有意差の、この方法を用いた同定は、サンプルにおけるＣＤＨ依存性のセルラーゼ系の存在を示唆している。異なる濃度のＥＤＴＡまたはシアン化カリウム（０．００１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、および１００ｍＭのＥＤＴＡまたはシアン化カリウムが挙げられるが、これらに限定されない）は、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系についてアッセイするために使用され得る。
【０２８７】
一局面において、ＣＤＨ依存性のセルラーゼ系を同定する方法は、ＣＤＨ依存性の修飾セルラーゼ系を同定するために、以下の（ｉ）〜（ｖ）のステップを包含している。（ｉ）セルラーゼを分泌する菌（“セクレトーム”）によって分泌されるタンパク質のサンプルを入手すること；（ｉｉ）サンプルの一部を嫌気性条件にさらすこと；（ｉｉｉ）嫌気性条件におけるサンプルのセルラーゼ活性を測定すること；（ｉｖ）嫌気性条件にさらされていないサンプルのセルラーゼ活性を測定すること；（ｖ）嫌気性条件にさらされたサンプルのセルラーゼ活性と、嫌気性条件にさらされていないサンプルのセルラーゼ活性を比較すること。嫌気性条件にさらされたサンプルおよび嫌気性条件にさらされていない対応するサンプルの間におけるセルロース分解の程度における有意差の、この方法を用いた同定は、サンプルにおけるＣＤＨ依存性のセルラーゼ系の存在を示唆している。
【０２８８】
嫌気性条件は、嫌気容器（例えば、Coy Laboratory Products,Inc（Grass Lake, Michigan）から提供されている）の使用を介して、もたらされ得る。いくつかの局面において、緩衝液は、溶存酸素を除去するために、非酸素ガス（例えば窒素）を用いてスパージングされ得る。いくつかの局面において、緩衝液は、溶存酸素を除去するために、長時間にわたって嫌気性容器において激しく撹拌され得る。
【実施例】
【０２８９】
以下の実施例は、単なる例証であり、本開示の任意の局面をなんら限定するとは意図されていない。
【０２９０】
〔実施例１：NCU00206、cdh-1の欠失を含んでいるN. crassaの株の生成〕
Neurosporaの機能的なゲノミクスプロジェクトは、相同組換えを介した標的遺伝子の置換を用いて、N. crassaのゲノムにおけるほとんどの遺伝子についてのノックアウト株をもたらした。Δｃｄｈ−１のヘテロカリオン株は、Fungal Genetic Stock Center（ＦＧＳＣ）を介して入手可能であるが、多くの試みにも関わらず、子嚢胞子の致死性関連変異のためにホモカリオン株は、生成され得なかった。ｃｄｈ−１の完全な欠失を実現するために、組換えに関与する非類似性末端に欠損のあるN. crassaの株を、Neurosporaの機能的なゲノミクスプロジェクトによってもたらされたカセットを用いて形質転換した。ＰＣＲを用いてｃｄｈ−１の欠失を確認するために、抗生物質耐性を示すヘテロカリオン形質転換体の遺伝子型を、ＰＣＲによって特定した。形質転換体を、野生型のN. crassaと交雑させ、それからハイグロマイシン抵抗性の２０の子孫を、セルロースによる増殖の間におけるＣＤＨの産生についてスクリーニングした。Avicelによる最大の増殖を示し、培養ろ過物におけるＣＤＨ活性に欠損のある株の、遺伝子型を特定した。ｃｄｈ−１が欠失させられている複数のホモカリオン株をＰＣＲによって確認した。
【０２９１】
２％のスクロースを補ったフォーゲル塩による、液体培地におけるΔｃｄｈ−１株の増殖は、野生型株の増殖と同じであった。結晶性セルロースの純粋な形態であるAvicelによるわずかな増殖の欠陥のみがあった。野生型株およびΔｃｄｈ−１株の両方は、光学顕微鏡によって決定された通り、増殖の６〜７日後にすべてのAvicelを完全に分解した。培養ろ過物に存在するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（図１ａ）、Δｃｄｈ−１株によって分泌された細胞外タンパク質は、１００〜１２０ｋＤａのＣＤＨ−１バンドの減少を除いて、野生型株の細胞外タンパク質と非常に類似していた。Δｃｄｈ−１株において分泌されたタンパク質の総量は、野生型株より〜４０％少ない量から野生型株と等しい量まで、異なる形質転換体について変化する。Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物におけるＣＤＨ活性は、野生型の培養ろ過物より、平均して５００倍低かった（図１ｂ）。Δｃｄｈ−１株および野生型株の標準的なセルラーゼ比活性をそれから比較した。エンドグルカナーゼ活性およびセロビオヒドロラーゼ活性のそれぞれは、アゾ−ＣＭＣアッセイおよびＭＵＬＡＣアッセイによってそれぞれ評価された通り、等しい量の総タンパク質が加えられた場合、野生型株およびΔｃｄｈ−１株について類似であった。Avicelase活性は、等しいタンパク質の基準に基づいて加えらた場合に、Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物において、野生型株の培養ろ過物より３７〜４９％低かった（図１ｃ）。２４時間の反応時間後における加水分解生成物のＨＰＬＣによる分析は、Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物において、グルコースが生成された主な糖（＞９０％）であり、次にセロビオースであることを示した。野生型株の培養ろ過物において、グルコースは主な生成物（８０％）であり、続いてセロビオース、セロビオン酸、および微量のグルコン酸であった。クロマトグラムにさらなるピークはなかった。
【０２９２】
エンドグルカナーゼ活性を、製造者の指示にしたがって、適切に希釈した培養ろ過物をアゾ−ＣＭＣ試薬（Megazyme SCMCL）に対して混合することによって、決定した。４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ラクトシド（ＭＵＬＡＣ）の加水分解速度を、適切に希釈した培養ろ過物の、１．０ｍＭのＭＵＬＡＣに対する添加による、蛍光（励起  λ＝３６０ｎｍ；発光  λ＝４６５ｎｍ）の増大をモニタすることによって決定した。
【０２９３】
〔実施例２：ＣＤＨによるセルロース分解の刺激〕
セルロースの分解に対するＣＤＨ−１の寄与をより直接的に評価するために、精製されたＣＤＨを用いたインビトロ生体外相補性アッセイを実施した。ＣＤＨ−１は、N. crassaの培養上清から純粋な形態において単離することが困難であり、部分的に精製された形態のN. crassaのＣＤＨ−１のみが単離され得た（図６ａ）。近縁の好熱性真菌Myceliophthora thermophilaにおけるオルソロガスなタンパク質は、純粋な形態においてより容易に単離でき、相補性アッセイのほとんどのために使用された（図７）。M. thermophilaおよびN. crassaのＣＤＨ−１は、７０％の配列同一性および同じドメイン構造を共有している。両方の酵素は、真菌のＣ末端セルロース結合ドメインを含んでいる。M. thermophila由来のＣＤＨ−１は、Avicelに対する検出不能な活性を有し、部分的に精製されたN. crassaのＣＤＨ−１は、低レベルの混入物に起因してわずかな加水分解活性を有していた。
【０２９４】
M. thermophilaのＣＤＨ−１または部分的に精製されたN. crassaのＣＤＨ−１の、Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物に対する添加は、Avicelの加水分解を十分に刺激した（図２ａおよび図６ｂ）。Avicelase活性は、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物の単独より１．６〜２．０倍高かった。野生型の培養ろ過物に対するＣＤＨ−１の添加は、Avicelの加水分解に対する刺激作用を示さなかった（図２ｂ）。さらに、ＣＤＨ−１は、N. crassaの由来の精製されたセルラーゼ（２つのセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ−１およびＧＨ６−２）が挙げられる）（図２ｃ）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ５−１）、およびβ−グルコシダーゼ（ＧＨ３−４）（図７）の混合物を刺激できなかった。
【０２９５】
また、M. thermophilaは、セルロースによる増殖の間に、真菌のセルロース結合モジュールを含んでいない（図３ａ）、他のＣＤＨであるＣＤＨ−２を生成する。M. thermophilaのＣＤＨ−１およびＣＤＨ−２のセルロースと結合する性質を、Avicelを用いたプルダウン実験を用いて分析した（図３ｂ）。M. thermophilaのＣＤＨ−１は、Avicelと強固に結合し、M. thermophilaのＣＤＨ−２は非常に弱い親和性のみを有している。セルロースに対する親和性を除いて、M. thermophilaのＣＤＨ−１およびＣＤＨ−２は、非常に類似した定常状態の動態特性を有している。ＣＤＨを加えた０．４ｍｇ／ｇのAvicelにおいて、ＣＤＨ−２はＣＤＨ−１と同程度までAvicelの加水分解を刺激できた（図３ｃ）。
【０２９６】
Avicelの加水分解を刺激するＣＤＨの能力に対する、セルロース結合モジュールの役割をさらに調べるために、タイトレーション実験を実施した（図３ｄ）。ＣＤＨ−１は、ＣＤＨ−２より１０倍少ない添加量において、Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物の活性を刺激できた。Δｃｄｈ−１の培養ろ過物におけるAvicelase活性に対する刺激作用は、１グラムのAvicelにつき５μｇのＣＤＨ−１の添加において認められ、５０μｇのＣＤＨ−２が、同様の刺激に必要であった（図３ｄ）。また、４ｍｇ  ＣＤＨ／ｇ  Avicelにおいて、M. thermophilaのＣＤＨ−１およびＣＤＨ−２の両方は、より少ない添加量に対して、Avicelase活性に対する阻害作用を有している。
【０２９７】
M. thermophilaのＣＤＨ−２のフラビンドメインおよびヘムドメインは、パパインを用いた切断によって分離され得る。活性の刺激に対するヘムドメインの寄与を決定するために、パパインを用いてM. thermophilaのＣＤＨ−２を切断し、サイズ排除クロマトグラフィを用いてフラビンドメインを分画した（図７）。フラビンドメインは、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）が電子受容体として使用される場合に、全長酵素と同じ速度においてセロビオースを酸化し得るが、チトクロムｃが電子受容体として使用される場合に活性を有しておらず、１つの電子受容体への伝達にとってのヘムドメインの重要性を反映している。フラビンドメインは、全長ＣＤＨ−２と等しい活性の基準に基づいて加えられる場合に、セロビオン酸の生成にもかかわらず、Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物によるAvicelの加水分解を刺激し得ない（図４）。全長ＣＤＨ−２より１０倍多い添加量においてさえ、フラビンドメインはAvicelの加水分解を刺激し得ず（データを示さず）、ヘムドメインが刺激作用に必須なことを示唆している。
【０２９８】
M. thermophilaのＣＤＨ−２のヘムドメインは、全長タンパク質のパパイン消化に基づいて十分に精製され得ず、したがって、Pichia pastorisにおいて組換え発現された。ＣＤＨ−２由来のヘムドメインは、ニッケル金属親和性クロマトグラフィーによって精製され、全長ＣＤＨ−２と同じスペクトル特性を有している（図８）。それから、組換えヘムドメインを、Δｃｄｈ−１株の培養ろ過物のAvicel加水分解を刺激するその能力について試験した（図４）。最大の刺激に求められる全長ＣＤＨ−２と同じモル濃度において第２鉄のヘムドメインの添加は、刺激作用を有していなかった。しかし、１μＭの添加量において、第２鉄のヘムドメインは、２３ｎＭの全長酵素（２００μｇ／ｇ  Avicel）とほぼ同程度にAvicelase活性を刺激できた（図４）。
【０２９９】
１．０ｍＭのセロビオース、２００μＭのＤＣＰＩＰ、および１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含んでいる混合物に対する適量のＣＤＨまたは培養ろ過物の添加によって、ＣＤＨ活性アッセイを、室温において実施した。ＤＣＰＩＰの還元を、５３０ｎｍにおける吸光度の低下に基づいて、分光光度法によってモニタした。１ユニットは、１分間に還元されるＤＣＰＩＰのマイクロモル数に相当する。
【０３００】
すべてのAvicelaseアッセイを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）における１０ｍｇ／ｍＬのAvicel（商標） PH101（シグマ）を用いて３つ１組にして４０℃において実施した。アッセイを、総容量１．０ｍＬを有している１．７ｍＬのマイクロ遠心チューブにおいて実施し、分析物を、１分間に２０回にわたって反転させた。各分析物は、０．０５ｍｇ／ｍＬの培養上清、または６：２．５：１：０．５の比率において存在しているＣＢＨ−１、ＧＨ６−２、ＧＨ５−１およびＧＨ３−４を含んでいる０．０５ｍｇ／ｍＬの再構成されたセルラーゼ混合物を含んでいた。刺激アッセイに使用されたヘムドメインの濃度は、完全に還元されたタンパク質の４３０ｎＭにおける吸収によって決定されたとき、１．０μＭであった。
【０３０１】
分析物を、４０００ｒｐｍにおいて２分にわたって遠心分離して、残存するAvicelをペレット状にし、２０μＬのアッセイ混合物をウェルごとに取り出した。サンプルを、脱塩され、希釈された１００μＬのNovozymes 188（Sigma）とともに、２０分にわたって４０℃においてインキュベートして、セロビオースを加水分解し、それから、Novozymes 188処理された１０〜３０μＬのAvicelaseアッセイ上清を、（４）に記載されている通り、グルコースのオキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイに用いて、グルコースについて分析した。分解の割合を、１０ｍｇ／ｍＬのAvicelの理論上の最大変換について測定されたグルコースの量に基づいて算出した。
【０３０２】
〔実施例３：ＣＤＨによるセルロース分解の刺激に対する酸素イオンおよび金属イオンの依存性〕
ＣＤＨの生物学的機能についての主な仮説は、ＣＤＨのヘムドメインからの電子が、第２鉄の錯体、キノン、酸素分子またはその他の酸化還元媒介物に受け渡され、セルロースまたはリグニンを非特異的に分解し得るラジカル種の生成を導くことを前提としている。したがって、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物に対するＣＤＨの添加によって観察した活性の刺激は、セルロースとの直接的な反応、または金属もしくは小分子がＣＤＨによって還元状態になり、続いて分解に寄与する間接的な作用に起因するのかを検討するために実験を行った。
【０３０３】
Δｃｄｈ−１培養物における小分子の作用について調べるために、１００００ＭＷＣＯスピン濃縮器を用いて培養ろ過物を１００００倍に緩衝液交換した。緩衝液交換後に、ＣＤＨ−１は依然として、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物の活性を同程度まで刺激できた。刺激について金属依存性の有無を調べるために、Δｃｄｈ−１培養物から得た緩衝液交換した培養ろ過物を、１００μＭのＥＤＴＡとともに１時間にわたってインキュベートし、それからAvicelaseアッセイを実施した。ＥＤＴＡは、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のAvicelase活性に作用しなかったが、M. thermophilaのＣＤＨ１が、ＥＤＴＡ処理されたΔｃｄｈ−１の培養ろ過物に加えられた場合に、刺激作用は観察されなかった（図５ａ）。野生型株の培養ろ過物に対するＥＤＴＡの添加は、〜５０％までAvicelase活性を低下させた（図９）。まとめると、これらの結果は、ＣＤＨによるセルロース分解の刺激に必須な、タンパク結合金属イオンがあることを示唆している。１．０ｍＭのＥＤＴＡをともなったM. thermophilaのＣＤＨ−１の一晩のインキュベートは、ＤＣＰＩＰまたはチトクロムｃを電子受容体として用いてセロビオースを酸化するその能力に影響しなかった（データを示さず）。
【０３０４】
それから、ＣＤＨによるAvicelaseの刺激を担う金属の性質を、緩衝液交換され、ＥＤＴＡ処理された１．０ｍＭの濃度におけるΔｃｄｈ−１の培養ろ過物に対する種々の金属イオンの添加によって調べた（図５ａ）。硫酸コバルトまたは硫酸亜鉛の添加は、ＣＤＨ−１による活性の刺激を完全に回復させ得た。塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムは刺激作用を有していなかった。また、セルラーゼを阻害すると知られている酸化還元金属（Feng et al. AEM 2010）（硫酸第１鉄、硫酸マンガンおよび硫酸第１銅が挙げられる）を調べた。刺激作用は初期に観察され（１２時間）、これらの金属による阻害は、より長い時点（４５時間）において顕著であった（図１０）。
【０３０５】
最後に、Δｃｄｈ−１の培養ろ過物におけるＣＤＨ−１による活性の刺激に対する酸素分子の役割を調べた。Δｃｄｈ−１の培養ろ過物のAvicelase活性は、酸素分子の存在に影響されず、野生型の培養ろ過物において、活性は、酸素の非存在下において〜４０％低下する。精製されたM. thermophilaのＣＤＨ−１が嫌気性条件においてΔｃｄｈ−１の培養ろ過物に加えられた場合、Avicelase活性に対する刺激作用は観察されず、刺激作用は、好気性条件下において観察された（図５ｂ）。
【０３０６】
室温の嫌気容器（Coy）においてすべてのアッセイを実施したことを除いて、嫌気性のAvicelaseアッセイを上述の通りに実施した。緩衝液は、１時間にわたって窒素を用いてスパージングされ、嫌気容器への導入前に、培養ろ過物を３００μＬの容積まで２０倍を超えて濃縮した。使用前の７２時間にわたって、すべての溶液を解放状態において嫌気容器に放置して、溶存酸素を完全に除去した。好気性反応物を、嫌気容器において３ｍＬの反応バイアルに入れて調製し、それから、嫌気容器から取り出し、空気にさらし、密閉し、嫌気容器に戻した。特定の時点に分析物をグローブバッグにおいて遠心分離し、１００μＬのアッセイ混合物を取り出し、グルコース−オキシダーゼペルオキシダーゼアッセイによって、上述の通りに分析した。
【０３０７】
〔実施例４：N. crassaのにおけるセルラーゼの分解を促進する能力を有しているＧＨ６１タンパク質〕
AvicelおよびMiscanthusによる増殖におけるN. crassaの培養ろ過物の複数回のプロテオミクス分析は、N. crassaのセクレトームにおける少なくとも４つのＧＨ６１タンパク質：ＧＨ６１−４／NCU01050（配列番号３０）、ＧＨ６１−１／NCU02240（配列番号２４）、ＧＨ６１−２／NCU07898（配列番号２６）、およびＧＨ６１−５／NCU08760（配列番号２８）の一貫した同定をもたらした。
【０３０８】
（遺伝子欠失のＥＤＴＡ処理）
ＷＴ  N. crassaの培養ろ過物に対する１ｍＭのＥＤＴＡの添加は、ＧＨ６１の触媒活性に必要とされる表面に露出した二価金属の喪失をおそらく介して、セルラーゼ活性を約２倍阻害する。いくつかの二価金属（Ｚｎ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｕ）の添加は、ＥＤＴＡ処理後におけるセルラーゼ活性を回復させ得る。ＥＤＴＡは、ΔNCU01050ノックアウトおよびΔNCU02240ノックアウトのセルラーゼ活性を約２０〜３０％まで低下させ、ＥＤＴＡは、ＷＴ株、ΔNCU07898株およびΔNCU08760株のセルラーゼ活性を約５０％まで低下させることを確認した。
【０３０９】
（系統学的な分析）
N. crassaの培養ろ過物と異なり、Avicelによる増殖の間におけるM. thermophilaの培養ろ過物は、ＥＤＴＡを用いた処理によって阻害されない。Avicelによる増殖の間にこれらの真菌の両方が示す転写応答の比較分析は、M. thermophilaは、NCU08760およびNCU07898とオルソロガスな遺伝子を転写し、NCU01050およびNCU02240とオルソロガスな遺伝子を発現させないことを示している。
【０３１０】
（生化学的な分画）
Δｃｄｈ−１の培養ろ過物を、濃縮し、緩衝液交換し、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの手法を用いて分離した。基本的なセルラーゼ活性のＣＤＨ依存性刺激を示す能力について、画分をアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびトリプシン消化、続く液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって画分をさらにアッセイして、各画分に存在するタンパク質を同定した（図１１〜１３）。
【０３１１】
（セルラーゼアッセイ）
ＧＨ６１タンパク質、M. thermophilaのＣＤＨ−１およびセルラーゼを用いてセルラーゼアッセイを実施した。図１４の実験において、亜鉛によって再構成されたN. crassaのＧＨ６１ポリペプチドを、Avicel（商標）とともに使用した。図１５の実験において、ＥＤＴＡ処理されたN. crassaのＧＨ６１ポリペプチドを、Avicel（商標）とともに使用した。図１６の実験において、亜鉛によって再構成されたN. crassaのＧＨ６１ポリペプチドを、前処理されたトウモロコシ茎葉とともに用いた。NCU01050およびNCU02240は、Avicel（商標）の分解を向上させる最も優れた作用を有しており、NCU02240およびNCU08760は、トウモロコシの茎葉の分解を向上させる最も優れた作用を有していた。
【０３１２】
〔実施例５：ＧＨ６１ポリペプチドの変異による分析〕
Ｈｉｓ−１７９、Ｇｌｎ−１８８またはＴｙｒ−１９０（番号付与は、シグナルペプチドの最初のアミノ酸から開始することを基準とする）に変異を有しているN. crassaのNCU08760ポリペプチド（N. crassaの多糖モノキシゲナーゼ１（“ＰＭＯ−１”）としても知られる）を調製し、精製した。詳細には、Ｈ１７９Ａ、Ｑ１８８ＡまたはＹ１９０Ｆの変異を有しているNCU08760ポリペプチドを調製した。それから、これらの異なるNCU08760の変異体ポリペプチドを、リン酸によって膨潤されたセルロース（“ＰＡＳＣ”）に対する活性についてアッセイした。図２５は、Ｈ１７９Ａ（“ＨＡ”）、Ｑ１８８Ａ（“ＱＡ”）またはＹ１９０Ｆ（“ＹＦ”）の変異体のそれぞれの活性を、野生型（“ＷＴ”）のNCU08760の活性を比較するアッセイの結果を示している。アッセイ条件は、５ｍｇ／ｍＬのＰＡＳＣ、２ｍＭのアスコルビン酸、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）であり、混合することなく、１時間の終点まで４０℃においてアッセイを実施した。図２５に示すように、ＨＡ、ＱＡおよびＹのＦ変異体のそれぞれは、ＷＴのNCU08760と比べて１０倍を超える活性の低下を示し、ＱＡおよびＹＦの変異体は、ＷＴのNCU08760と比べて、５０倍を超える活性の低下を示した。したがって、これらの結果は、ＧＨ６１活性にとってのＨ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙモチーフのうちアミノ酸Ｈ、ＱおよびＹのそれぞれの重要性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月21日(2014.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＧＨ６１ポリペプチド；および
セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチド
を含んでいる、組成物。
【請求項２】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号３０、配列番号２６、配列番号２８、または配列番号９０のアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、Ｈ−Ｘ（４−８）−Ｑ−Ｘ−Ｙのモチーフを含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２または配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８０、および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４または配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
セルラーゼの１つ以上をさらに含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
セルロースを、セルラーゼの１つ以上、組換えＧＨ６１ポリペプチド、およびセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでいる組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドと接触させることを包含しており、
上記接触は、反応混合物において起こり、分解されたセルロースを生じさせるための十分な時間にわたって起こる、セルロースを分解する方法。
【請求項８】
上記ＧＨ６１ポリペプチドの少なくとも５０％は銅原子と結合されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号９０のアミノ酸配列を含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２または配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８０、および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４または配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
上記反応混合物において０．１〜５００μＭの銅の濃度を有していることをさらに包含している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
上記組換えＧＨ６１ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号９０のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
上記組換えＣＤＨヘムドメインポリペプチドは、配列番号３２または配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
上記ＣＤＨヘムドメインは、配列番号７０、配列番号７６、配列番号８０、および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでおり、上記ＣＢＭは、配列番号７４または配列番号８４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【国際調査報告】
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