(57)【要約】  本発明は、対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドなどの化合物または薬学的に許容できるその塩をその対象に投与するステップを含む方法に関する。本発明はまた、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドなどの化合物または薬学的に許容できるその塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物を前記対象に投与するステップを含み、前記化合物がＮ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である、方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドである化合物または薬学的に許容できるその塩を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４】
前記対象がヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物を前記対象に投与するステップを含み、前記化合物がＮ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である、方法。
【請求項６】
前記対象がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物であって、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である化合物と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、対象の慢性骨髄性白血病を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドなどの化合物または薬学的に許容できるその塩をその対象に投与するステップを含む方法に関する。本発明はまた、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドなどの化合物または薬学的に許容できるその塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、骨髄の骨髄系細胞の増加および無調節成長ならびに過剰な白血球の蓄積によって引き起こされる血液幹細胞障害である。エーベルソンチロシンキナーゼ（ＡＢＬ）は、細胞成長および増殖に関与する非受容体型チロシンキナーゼであり、通常厳密な制御下にある。しかし、ＣＭＬ患者の９５％は、２２番染色体の切断点クラスター（ＢＣＲ）遺伝子と融合した９番染色体のＡＢＬ遺伝子を有し、その結果、フィラデルフィア染色体として知られている短い染色体が生じる。このフィラデルフィア染色体は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質、すなわち、無制御細胞増殖を引き起こす構成的活性型チロシンキナーゼの産生に関与している。ＡＢＬ阻害剤のイマチニブは、ＣＭＬ治療用にＦＤＡから承認されており、第一選択療法として現在使用されている。ＣＭＬ患者の８０％がイマチニブに応答し、３％未満が５年以内に進行疾患に進むと報告されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｐ．Ａ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ３９：１９２（２０１１））。しかし、臨床的応答の持続性は、薬物療法に耐性が生じることで有害な影響を受ける。２００１年には、最初のイマチニブ耐性突然変異体が、Ｔ３１５Ｉ  ＢＣＲ−ＡＢＬ「ゲートキーパー」突然変異として報告された。後の分析により、再発が起こり、５５個超の実証された点突然変異が触媒ドメインおよび調節ドメインの至る所で生じ、大部分がＧループおよびゲートキーパー位にあることが明らかにされた（同上文献）。ほとんどの突然変異に対して臨床上の成功がなされたが、ゲートキーパーＴ３１５Ｉ突然変異に対して承認された薬剤はない（Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：２１２（２０１１））。
【０００３】
化合物、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールは、以下の構造であり：
【０００４】
【化１】
2014533262.tif 000002
アキシチニブまたはＡＧ−０１３７３６として知られている。
【０００５】
アキシチニブは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体１、２、および３の強力な選択的阻害剤である。これらの受容体は、がんの病的血管新生、腫瘍成長、および転移性進行に関与する。アキシチニブは、ＶＥＧＦ媒介性の内皮細胞増殖および生存を強力に阻害することが示されている（Ｈｕ−Ｌｏｗｅ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：７２７２〜７２８３（２００８）；Ｓｏｌｏｗｉｅｊ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８：７０１９〜３１（２００９））。肝臓がん、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺がん、前立腺がん、腎細胞癌、軟部組織肉腫、および固形腫瘍を含む様々ながんの治療へのアキシチニブの使用を研究する臨床試験が現在進行中である。Ｉｎｌｙｔａ（登録商標）（アキシチニブ）は、腎細胞癌の治療用に米国、ヨーロッパ、日本、および他の管轄において承認されている。
【０００６】
アキシチニブならびに薬学的に許容できるその塩は、米国特許第６，５３４，５２４号に記載されている。アキシチニブを作製する方法は、米国特許第６，８８４，８９０号および同第７，２３２，９１０号、米国公開第２００６−００９１０６７号および同第２００７−０２０３１９６号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６／０４８７４５号に記載されている。アキシチニブの剤形は、米国公開第２００４−０２２４９８８号に記載されている。また、アキシチニブの多形形態および医薬組成物が、米国公開第２００６−００９４７６３号、同第２００８−０２７４１９２号、および同第２０１０−０１７９３２９号に記載されている。上に列挙した特許および特許出願を参照により本明細書に組み込む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下に記載の実施形態の各々は、組み合わせる実施形態と矛盾しない本明細書に記載の他のいずれの実施形態とも組み合わせることができる。
【０００８】
いくつかの実施形態は、対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物または薬学的に許容できるその塩をその対象に投与するステップを含む方法に関する。
【０００９】
別の実施形態は、対象がＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する上述の方法に関する。
【００１０】
さらなる実施形態は、化合物がＮ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である上述の方法に関する。
【００１１】
さらなる実施形態は、対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物をその対象に投与するステップを含み、その化合物がＮ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である、方法に関する。
【００１２】
別の実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物または薬学的に許容できるその塩をその対象に投与するステップを含む方法に関する。
【００１３】
さらなる実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドである化合物または薬学的に許容できるその塩をその対象に投与するステップを含む方法に関する。
【００１４】
別の実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する対象の慢性骨髄性白血病を治療する方法であって、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物をその対象に投与するステップを含み、その化合物がＮ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である、方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物または薬学的に許容できるその塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
さらなる実施形態は、化合物がＮ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である、上述の医薬組成物に関する。
【００１７】
別の実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物であって、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である化合物と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
さらなる実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物であって、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である化合物と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、対象の慢性骨髄性白血病を治療するための医薬組成物に関する。
【００１９】
別の実施形態は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を阻害する化合物であって、Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容できるその塩である化合物と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼにおけるＴ３１５Ｉ突然変異を有する対象の慢性骨髄性白血病を治療するための医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書では、以下の略語を使用することがある：ＡＢＬｔｉｄｅ（ＡＢＬのＣ末端に基づく合成ペプチド配列（［５−カルボキシフルオレセイン］−ＥＡＩＹＡＡＰＦＡＫＫＫ−ＣＯＨＮ２））；ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）；ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）；ＢＲＩＪ−３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ジチオトレイトール（ＤＴＴ）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）；ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）；ＦＢＳ（ウシ胎児血清）；ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸またはＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸））；ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋水素）；ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｙｒ（チロシン）；Ｔｙｒ０２ペプチド（ペプチド配列（ＥＡＩＹＡＡＰＦ））；およびＷＴ（野生型）。
【００２１】
本明細書で使用する語句「薬学的に許容できる塩（複数可）」は、別段の指示がない限り、本明細書に記載の化合物中に存在し得る酸性または塩基性の基の塩を包含する。性質が塩基性である本明細書に記載の化合物は、様々な無機酸および有機酸と共に多種多様な塩を形成することができる。本明細書に記載のこのような塩基性化合物の薬学的に許容できる酸付加塩の調製に使用することができる酸は、非毒性の酸付加塩、例えば、薬理学的に許容できるアニオンを含有する塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸）塩］などを形成する酸である。アミノ基などの塩基性部分を包含する本明細書に記載の化合物は、上で言及した酸に加えて、様々なアミノ酸とも薬学的に許容できる塩を形成することができる。
【００２２】
本明細書で使用する用語「治療する」は、別段の指示がない限り、このような用語が適用される障害もしくは病態、またはこのような障害もしくは病態の１種もしくは複数の症状を逆転させ、軽減し、その進行を阻害し、または阻止することを意味する。本明細書で使用する用語「治療」は、別段の指示がない限り、「治療する」を直前に定義したように治療する行為を指す。
【００２３】
本明細書で使用する用語「対象」は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、サル、他の低次霊長類など）であり得る。一実施形態では、用語「対象」は、ヒトを指す。
【００２４】
本明細書に記載の化合物の投与は、作用部位への化合物の送達を可能にする任意の方法または経路によって実施することができる。これらの方法には、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内、または注入を含む）、局所、および直腸投与が含まれる。
【００２５】
投与される投与量は、使用する化合物、投与様式、所望の治療、および示された障害に応じて当然ながら変わるであろう。投与量は、単回用量として、または複数回用量レジメンに従って、単独で、または他の化合物、薬剤、もしくは物質と組み合わせてもよい。当業者なら、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択した特定の組成物または投与経路のような要因に基づいて、こうした量を決定することができよう。化合物または薬学的に許容できるその塩の１日投与量は、０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、アキシチニブまたは薬学的に許容できるその塩が、場合により１日当たり２〜４回の分割用量で投与される、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約０．４ｍｇの１日投与量で投与されるとき、満足な結果が得られる。１日の全投与量は、約０．１〜約２５ｍｇ、好ましくは１日当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇを２回、より好ましくは１日当たり約２〜約１０ｍｇを２回と計画される。このレジメンは、最適な治療応答を与えるように調整することができる。例えば、数回の分割用量を１日で投与してもよく、または治療の状況の緊急性が示すように用量を比例的に減少もしくは増加させてもよい。
【００２７】
医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、持続放出製剤、液剤、もしくは懸濁剤として経口投与に適した形態でも、滅菌液剤、懸濁剤、もしくは乳剤として非経口注射に適した形態でも、軟膏剤もしくはクリーム剤として局所投与に適した形態でも、または坐剤として直腸投与に適した形態でもよい。医薬組成物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形でもよい。医薬組成物は、従来の薬学的に許容できる担体または賦形剤と、有効成分として本明細書に記載の化合物とを含む。さらに、医薬組成物は、他の薬剤または医薬剤、担体または補助剤を含むことができる。
【００２８】
例示的な非経口投与形態には、有効化合物の、滅菌水溶液、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液中の液剤または懸濁剤が含まれる。このような剤形は、所望により、適切に緩衝化することができる。
【００２９】
適切な医薬担体として、不活性希釈剤または充填剤、水、および様々な有機溶媒が挙げられる。医薬組成物は、所望により、香味剤、結合剤、賦形剤などの追加成分を含有することができる。したがって、経口投与では、クエン酸などの様々な賦形剤を含有する錠剤を、デンプン、アルギン酸、およびある種の複合ケイ酸塩などの様々な崩壊剤と共に、ならびにスクロース、ゼラチン、およびアラビアゴムなどの結合剤と共に使用することができる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの滑沢剤が、多くの場合、錠剤化のために有用である。また、同様の種類の固体組成物を軟および硬充填ゼラチンカプセルに使用することができる。したがって、好ましい材料として、ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。経口投与に水性懸濁剤またはエリキシル剤を所望する場合、その中の有効化合物を、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、またはそれらの組合せなどの希釈剤と共に、様々な甘味剤または香味剤、着色料または染料、および、所望により、乳化剤または懸濁化剤と組み合わせることができる。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
ＡＢＬ１キナーゼ分光光度法連結酵素アッセイ
アキシチニブを、ＡＢＬ１およびＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］酵素活性の測定に使用する分光光度法連結酵素アッセイにおいて試験した。これは以前に記載されている（Ｓｏｌｏｗｉｅｊ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８：７０１９〜７０３１（２００９））。キナーゼに触媒されるＡＤＰの生成は、ヒトミニガストリン１のペプチド（ＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２）におけるＡＴＰのγ−リン酸塩のチロシン残基へのリン酸基転移に付随して起こるものであり、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性によるＮＡＤＨの酸化と対になっていた。ＡＤＰの生成と同時に、β−ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化型）へのβ−ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型）転化が起こり、これを、２５℃でＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ８００分光光度計を使用して、３４０ｎｍ（ε＝６２２０ｃｍ−１Ｍ−１）の吸光度の減少によりモニターした。典型的な反応溶液は、２ｍＭのホスホエノールピルビン酸塩、０．２８ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、ＡＴＰ、ミニガストリン、１５単位／ｍＬのＰＫ、１５単位／ｍＬのＬＤＨを溶解させた２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を含有していた。速度論的パラメーターを決定するために、ＡＴＰを５から１０００μＭまで変化させた。アッセイは、２０ｎＭの完全長ＡＢＬ１または１００ｎＭのＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］を添加して、開始させた。同じ連結酵素アッセイフォーマットを、阻害パーセントおよびＫｉ決定に使用した。アキシチニブを１００％ＤＭＳＯで調製した。アッセイでのＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。ＡＴＰの濃度は、３×ｋｍ（１６５μＭのＡＢＬ１および４０μＭのＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］であった。ミニガストリンの濃度は、５００μＭであった。Ｋｉ決定は、変数として酵素濃度を用いて、競合阻害に関する二次方程式「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ式」に当てはめた阻害剤濃度の関数として速度比（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）をプロットして行った（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ、１８５：２６９〜２８６（１９６９））。
【００３１】
表１に示すように、アキシチニブに関して作成した阻害％データから、ＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］突然変異に対する効力の変化が示された。
【００３２】
【表１】
2014533262.tif 000003
【００３３】
（実施例２）
ＡＢＬ１キナーゼ移動度シフトアッセイ
アキシチニブを、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ３０００アッセイ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて試験した。これは、マイクロ流体環境におけるキャピラリー電気泳動法の基本原理を組み合わせた移動度シフトアッセイ（ＭＳＡ）である。アキシチニブを１００％ＤＭＳＯで調製し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を用いて２５％ＤＭＳＯに希釈し、最終ＤＭＳＯ濃度が６％になるように反応物に添加した。阻害剤濃度は、１．０μＭから０．００００３μＭに変化した。典型的な反応物は、２０μＬであり、ＡＢＬ１またはＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］、ＡＴＰ（ＡＢＬ１；２５μＭおよびＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］；５μＭ）、１．０μＭのＡＢＬｔｉｄｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、６％ＤＭＳＯを溶解させた２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を含有していた。混合物を３８４ウェルポリプロピレンプレートにおいて室温で１時間インキュベートし、ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓｉｓｔ  ＭＳＡ緩衝液（Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、神戸、日本）６０μＬを添加して、終了させた。反応混合物をＬａｂＣｈｉｐ３０００システムにかけ、生成物／基質ペプチドピークを分離した。キナーゼ反応を、生成物（Ｐ）および基質（Ｓ）ペプチドのピーク高さから計算した生成物比（Ｐ／（Ｐ＋Ｓ））によって定量した。
【００３４】
表２に示すように、アキシチニブに関して作成したデータから、野生型酵素に対してゲートキーパー突然変異の効力が１４倍変化したことが実証された。
【００３５】
【表２】
2014533262.tif 000004
【００３６】
（実施例３）
ＡＢＬ１キナーゼＺ’−ＬＹＴＥ（登録商標）スクリーニングアッセイ
アキシチニブを、Ｚ’−ＬＹＴＥ（登録商標）スクリーニングプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して試験した。アキシチニブを１００％ＤＭＳＯで調製し、最終ＤＭＳＯ濃度が１％になるように反応物に添加した。阻害剤濃度は、１．０μＭから０．００００３μＭに変化した。典型的な反応物は、１０μＬであり、ＡＢＬ１またはＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］、ＡＴＰ（ＡＢＬ１；１０μＭおよびＡＢＬ１［Ｔ３１５Ｉ］；５μＭ）、２．０μＭのＴｙｒ０２ペプチド、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０ｍＭのＥＧＴＡ、０．０１％ＢＲＩＪ−３５、１％ＤＭＳＯを溶解させた５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を含有していた。混合物を３８４ウェルポリプロピレンプレートにおいて室温で１時間インキュベートし、Ｚ’−ＬＹＴＥ（登録商標）スクリーニングプロトコールで利用される１：６４希釈の展開試薬５μＬを添加し、続いて３０秒振盪させて、終了させた。展開反応物を室温で１時間インキュベートした。生じた蛍光を蛍光プレートリーダーで読み取り、データを分析した。
【００３７】
表３に示すように、アキシチニブに関して作成したデータから、野生型酵素に対してゲートキーパー突然変異の効力が６．２倍変化したことが実証された。
【００３８】
【表３】
2014533262.tif 000005
【００３９】
（実施例４）
ＢＣＲ−ＡＢＬ改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＢａＦ３細胞自己リン酸化ＥＬＩＳＡ
ＢａＦ３  ＷＴ  ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＢａＦ３−Ｔ３１５Ｉ突然変異体ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞株をＯｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地において成長させた（１００×ストック＝１ｍＬ当たりペニシリン５０００単位およびストレプトマイシン５０００μｇ）。ｃ−ＡＢＬホスホ−Ｔｙｒ  ＥＬＩＳＡでは、細胞を５０ｍＬ容のチューブにピペットで入れ、１０００ＲＰＭで遠心分離機にかけ、細胞ペレットをアッセイ培地に再懸濁させた（０．１％ＦＢＳ、０．０５％ＢＳＡ（ｗｔ／ｖｏｌ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）。細胞をＩｎｎｏｖａｔｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントし、９６ウェル平底プレートのアッセイ培地に４０，０００細胞／ウェルで播種し、アッセイ培地と共に３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気で２時間インキュベートした。アキシチニブを１００％ＤＭＳＯに溶解させて、１０ｍＭのストックを作製した。次いで、ポリプロピレン９６ウェルプレートにおいて、３倍段階希釈法を使用して、アキシチニブを１００％ＤＭＳＯで希釈した。対照ウェルは、試験化合物を含まない１００％ＤＭＳＯを入れた（非阻害対照）。ＤＭＳＯ薬物希釈プレートをアッセイ培地（０．１％ＦＢＳ、０．０５％ＢＳＡ（ｗｔ／ｖｏｌ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）で４０倍希釈して、アッセイ用の５×薬物ソースプレートを得た。２５μＬを５×ソースプレートから細胞アッセイプレートに移動させ、アッセイプレートをアキシチニブと共に３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気でさらに２時間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離機にかけ、上澄液８０μＬを除去した。１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８３４０）、および脱リン酸化酵素阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｐ００４４およびＳｉｇｍａ  Ｐ５７２６）を補充したＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ溶解緩衝液（＃９８０３）を新たに調製し、それを１ウェル当たり１００μＬ添加して、細胞を溶解させた。溶解緩衝液を含む細胞アッセイプレートを４℃で１０分間振盪させ、次いで、ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ）で１：２００希釈したウサギ抗ｃ−ＡＢＬ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃２８６２）と共に予めインキュベートした、ヤギ抗ウサギ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ＃１５１３５）に、各ウェルから細胞溶解物１００μＬを移動させた。細胞溶解物を、抗ｃ−ＡＢＬをコートしたＥＬＩＳＡプレートと共に室温で１時間インキュベートし、次いで、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（キット＃７９０３から）で４回洗浄した。プレートを逆さにして、最終洗浄液を除去し、１：５０００希釈したマウスモノクローナル（ＩｇＧ２ｂ）抗ホスホ−Ｔｙｒ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＳＣ５０８  ＨＲＰ）１００μＬを各ウェルに添加した。次いで、ＥＬＩ���Ａプレートを、１ウェル当たり１００μＬで室温で４５分間インキュベートした。プレートを上述のように４回洗浄し、最終洗浄液を除去し、ＴＭＢ基質（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＳＣ２８６９６７）１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを発色中６５５ｎｍで読み取り、または１ウェルにつき０．１６Ｍの硫酸停止液５０〜１００μＬを添加して停止させ、４５０ｎｍで読み取った。
【００４０】
表４に示すように、アキシチニブに関して作成したデータから、野生型酵素に対してゲートキーパー突然変異の効力が８．６倍変化したことが実証された。
【００４１】
【表４】
2014533262.tif 000006
【００４２】
（実施例５）
ＢＣＲ−ＡＢＬ改変ＢａＦ３細胞増殖アッセイ（方法Ａ）
上述のように、ＢａＦ３  ＷＴ  ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＢａＦ３−Ｔ３１５Ｉ突然変異体ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞株をＯｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０において成長させた。増殖アッセイでは、細胞を５０ｍＬ容のチューブにピペットで入れ、１０００ＲＰＭで遠心分離機にかけ、細胞ペレットを、１％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁させた。細胞はＩｎｎｏｖａｔｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントし、９６ウェル平底プレートに１，５００細胞／ウェルで播種した。上述のようにアキシチニブを１００％ＤＭＳＯで段階希釈し、次いで、１％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０で４０倍希釈して、５×ソースプレートを得た。２５μＬを５×ソースプレートから細胞アッセイプレートに移動させ、細胞をアキシチニブと共に３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気で４日間インキュベートした。薬物添加の４日後、細胞アッセイプレートを１０００ＲＰＭで２分間遠心分離機にかけ、上澄液８０μＬを各ウェルから除去し、新鮮な培地１００μＬを各ウェルに添加した。次いで、１ｍｇ／ｍＬのＲｅｓａｚｕｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ７０１７）１５μＬを各ウェルに添加し、細胞アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気で６時間インキュベートした。励起波長５３０ｎｍおよび発光波長５９５ｎｍを使用して、蛍光シグナルを読み取った。
【００４３】
表５に示すように、アキシチニブに関して作成したデータから、野生型酵素に対してゲートキーパー突然変異の効力が１０倍変化したことが実証された。
【００４４】
【表５】
2014533262.tif 000007
【００４５】
（実施例６）
野生型ＢＣＲ−ＡＢＬのＣＭＬ細胞増殖アッセイ
実施例５の方法を使用し、表６は、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬのＣＭＬ細胞株におけるアキシチニブに関して作成したデータを示している。
【００４６】
【表６】
2014533262.tif 000008
【００４７】
（実施例７）
ＢＣＲ−ＡＢＬ改変ＢａＦ３細胞増殖アッセイ（方法Ｂ）
以前に公表された方法（ｌｅ  Ｃｏｕｔｒｅ  Ｐ、Ｍｏｌｏｇｎｉ  Ｌ、Ｃｌｅｒｉｓ  Ｌ、Ｍａｒｃｈｅｓｉ  Ｅ、Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ  Ｅ、Ｇｉａｒｄｉｎｉ  Ｒ、Ｆｏｒｍｅｌｌｉ  Ｆ、Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ  Ｃ．、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＢＣＲ／ＡＢＬ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．」Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９  Ｊａｎ  ２０；９１（２）：１６３〜８）を使用して、完全培地を含み、漸増濃度の阻害剤（１０〜０μＭの範囲）が存在する９６ウェル丸底細胞培養プレートに、細胞を１０４細胞／ウェル（１０％ＦＢＳ）の濃度で播種した。先述のように、トリチウム化チミジン取込みアッセイを使用して、細胞増殖を７２時間で測定した。先に開示された方法との唯一の違いは、標識時間が８時間ということであった（播種の６４時間後、細胞を３Ｈチミジン（ｔｈｙｉｍｉｄｉｎｅ）で標識付けし、８時間インキュベートし、採取した）。各試験を４連で行い、少なくとも２回繰り返した。ＩＣ５０値の計算は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。
【００４８】
表７に示すように、アキシチニブに関して作成したデータから、野生型酵素に対してゲートキーパー突然変異の効力が８．４倍変化したことが実証された。
【００４９】
【表７】
2014533262.tif 000009
【国際調査報告】
2014533262.tif 000010
2014533262.tif 000011