(57)【要約】本発明は、漢方薬組成物の抗HEV71薬剤調製における用途を公開した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根から構成され、
前記4種類漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜70.0重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％及び山豆根1.2重量％〜35.0重量％であることを特徴とする抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病予防用の漢方薬組成物。
【請求項２】
前記漢方薬組成物は、その他の清熱解毒類漢方薬として、貫衆、鎧草、狐の孫、蒲公英、青黛、大血藤、重楼、木立蓬、イチハツ、鴉胆子、薄荷、桔梗と甘草から選ばれる何れか1種を含むことを特徴とする請求項1記載の漢方薬組成物。
【請求項３】
前記漢方薬組成物が次の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆、鎧草から構成され、
前記6種類漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜58.4重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％、山豆根1.2重量%〜35.0重量％、貫衆1.9重量%〜37.3重量％及び鎧草1.2重量％〜35.0重量％であることを特徴とする抗HEV71或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための漢方薬組成物。
【請求項４】
前記漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆、鎧草、重楼、木立蓬及びイチハツから構成され、
前記9種類漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草9.3 重量％〜46.7重量％、忍冬藤9.3重量％〜37.3重量％、板藍根4.7重量％〜35.0 重量％、貫衆2.3重量％〜28.0重量％、山豆根2.3重量％〜23.3重量％、鎧草 2.3重量％〜23.3重量％、重楼2.3重量％〜23.3重量％、木立蓬2.3重量％〜23.3 重量％及びイチハツ 2.3重量％〜23.3重量％であることが好ましく、
前記9種類漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草14.0 重量％〜35.0重量％、忍冬藤11.7重量％〜23.3重量％、板藍根9.3重量％〜21.0 重量％、貫衆7.0重量%〜18.7重量％、山豆根4.7重量%〜11.7重量％、鎧草4.7重量%〜11.7 重量%、木立蓬 4.7 重量%〜11.7 重量%、木立蓬4.7 重量%〜11.7 重量％及びイチハツ 4.7重量％〜11.7重量％であることが更に好ましく、
前記９種類漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草21.4 重量％〜58.4重量％、忍冬藤17.9重量％、板藍根14.3重量％、貫衆10.7重量％、山豆根7.1重量%、鎧草7.1重量％、重楼7.1重量％、木立蓬7.2重量％、イチハツ7.2重量％であることが最も好ましいことを特徴とする抗HEV71或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防する漢方薬組成物。
【請求項５】
請求項1乃至４の何れかに記載の漢方薬組成物の抗HEV71又は７１型エンテロウイルスによる疾病の治療及び/又は予防用の薬物としての用途。
【請求項６】
請求項1乃至４の何れかに記載の漢方薬組成物の抗HEV71又は７１型エンテロウイルスによる疾病の治療及び/又は予防用の薬物の調製における用途。
【請求項７】
前記７１型エンテロウイルスによる疾病が手足口病、ヘルパンギナ、無菌性髄膜炎や脳炎の中の一種又は幾つかの種類であり、
前記漢方薬組成物が顆粒であることを特徴とする請求項５又は６記載の用途。
【請求項８】
ニーズのある患者に請求項１乃至4の何れかに記載の漢方薬組成物を有効な量を提供することを特徴とする抗HEV71又は７１型エンテロウイルスによる疾病の治療及び/又は予防方法。
【請求項９】
前記７１型エンテロウイルスによる疾病が手足口病、ヘルパンギナ、無菌性髄膜炎又は脳炎の中の一種又は幾つかの種類であり、
前記漢方薬組成物が顆粒であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、漢方薬組成物の抗HEV71薬剤調製での用途に係り、具体的には、魚腥草、忍冬藤、板藍根及び山豆根などを含む漢方薬組成物の抗HEV71薬剤調製での用途に係る。
【背景技術】
【０００２】
1969年、米国は中枢神経システム疾病のある乳児の糞便検体で71型エンテロウイルス（EV71)を分離した。国際ウイルス分類委員会（ICTV)の最新分類によれば、人間のエンテロウイルスはA、B、C、D及び新エンテロウイルスという五種類に分けられる。それから、エンテロウイルス血清型が再分類されて、その中で、７１型エンテロウイルス（EV71)がエンテロウイルスAに分類されている。
【０００３】
EV71は、消化管や呼吸器を介して広がることができ、伝染性と毒性が強く、神経毒性がポリオウイルスに次ぐ。一部分の患者は毒素の排出に数週間掛かり、ウイルスが汚水の中で長時間生存できる。すべての年齢グループはこのウイルスに感染する可能性があり、大人と年長の子供には主に潜伏感染であり、未就学児がよく発病する。重篤な感染症は多くの乳児の中でよく見られる。一部分の地区では感染がよく発生し、原因はまだ不明である。EV71によって引き起こされる臨床症状は多様であり、手足口病とヘルパンギナ症状がよく見られ、少数の無菌性髄膜炎や脳炎、重度小児患者の死亡率は10％〜25％である。
【０００４】
現在、EV71感染に有効な抗ウイルス薬はまだ存在せず、これによる疾病の予防と治療の力点は有効的な予防ワクチンの研究開発中である。今まで不活化ワクチン、弱毒化生ワクチン、ポリペプチド又はタンパク質ワクチン、DNAワクチンなどが既に開発されているものの、EV71ワクチンはまだ発売していない。そのため、71型エンテロウイルスに対する安全且つ有効な薬剤を早急に開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのため、本発明の目的は、71型エンテロウイルスを効果的に抑制することができる薬剤を提供し、さらに当該ウイルスによる様々な疾病を確実に予防及び/或は治療することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一方、抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための漢方薬組成物を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根と山豆根から構成される。
【０００７】
前記4種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜70.0重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％及び山豆根1.2重量％〜35.0重量％であることが望ましい。
【０００８】
前記漢方薬組成物がその他の清熱解毒類漢方薬を含むことが望ましい。前記その他の清熱解毒類漢方薬が、貫衆、鎧草、狐の孫、蒲公英、青黛、大血藤、重楼、木立蓬、イチハツ、鴉胆子、薄荷、桔梗と甘草から選ばれることが更に望ましい。
【０００９】
一方、本発明は抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための漢方薬組成物を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆と鎧草から構成される。
【００１０】
前記6種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜58.4重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％、山豆根1.2重量%〜35.0重量％、貫衆1.9重量%〜37.3重量％及び鎧草1.2重量％〜35.0重量％であることが望ましい。
【００１１】
また、本発明は抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための漢方薬組成物を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆、鎧草、重楼、木立蓬とイチハツ（Iris tectorum Maxim）から構成される。
【００１２】
前記9種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草9.3 重量％〜46.7重量％、忍冬藤9.3重量％〜37.3重量％、板藍根4.7重量％〜35.0 重量％、貫衆2.3重量％〜28.0重量％、山豆根2.3重量％〜23.3重量％、鎧草 2.3重量％〜23.3重量％、重楼2.3重量％〜23.3重量％、木立蓬2.3重量％〜23.3 重量％及びイチハツ2.3重量％〜23.3重量％であることが望ましい。
【００１３】
前記9種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草14.0 重量％〜35.0重量％、忍冬藤11.7重量％〜23.3重量％、板藍根9.3重量％〜21.0 重量％、貫衆7.0重量%〜18.7重量％、山豆根4.7重量%〜11.7重量％、鎧草4.7重量%〜11.7 重量%、重楼4.7 重量%〜11.7 重量%、木立蓬4.7 重量%〜11.7 重量％、イチハツ4.7重量％〜11.7重量％であることが更に望ましい。
【００１４】
最優先的に、上記漢方薬組成物の９種類の原材料の重量比が、魚腥草21.4重量％、忍冬藤17.9重量％、板藍根14.3重量％、貫衆10.7重量％、山豆根7.1重量％、鎧草7.1重量％、重楼7.1重量％、木立蓬7.2重量％及びイチハツ7.2重量％であることが一番望ましい。
【００１５】
一方、本発明は、抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための薬物の調製における漢方薬組成物の用途を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根と山豆根から構成される。
【００１６】
前記4種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜70.0重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％及び山豆根1.2重量％〜35.0重量％であることが望ましい。
【００１７】
前記の漢方薬組成物がその他の清熱解毒類漢方薬を含むことが望ましい。前記その他の清熱解毒類漢方薬が貫衆、鎧草、狐の孫、蒲公英、青黛、大血藤、 重楼、木立蓬、イチハツ、鴉胆子、薄荷と桔梗と甘草から選ばれることが望ましい。
【００１８】
また、本発明は抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防ための薬物の調製での一種の漢方薬組成物の用途を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆と鎧草から構成される。
【００１９】
優先的に、上記6種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が魚腥草4.7 重量％〜58.4重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％、山豆根1.2重量%〜35.0重量％、貫衆1.9重量%〜37.3重量％及び鎧草1.2重量％〜35.0重量％であることが望ましい。
【００２０】
また、本発明は抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための薬物の調製における漢方薬組成物の用途を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆、鎧草、重楼、木立蓬とイチハツから構成される。
【００２１】
前記9種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草9.3 重量％〜46.7重量％、忍冬藤9.3重量％〜37.3重量％、板藍根4.7重量％〜35.0 重量％、貫衆2.3重量％〜28.0重量％、山豆根2.3重量％〜23.3重量％、鎧草 2.3重量％〜23.3重量％、重楼2.3重量％〜23.3重量％、木立蓬2.3重量％〜23.3 重量％及びイチハツ 2.3重量％〜23.3重量％であることが望ましい。
【００２２】
前記9種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草14.0 重量％〜重量35.0％、忍冬藤11.7重量％〜23.3重量％、板藍根9.3重量％〜21.0 重量％、貫衆7.0重量%〜18.7重量％、山豆根4.7重量%〜11.7重量％、鎧草4.7重量%〜11.7重量%、重楼4.7重量%〜11.7重量%、木立蓬4.7重量%〜11.7 重量％及びイチハツ 4.7重量％〜11.7重量％であることが更に望ましい。
【００２３】
前記９種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草21.4 重量％〜58.4重量％、忍冬藤17.9重量％、板藍根14.3重量％、貫衆10.7重量％、山豆根7.1重量%、鎧草7.1重量％、重楼7.1重量％、木立蓬7.2重量％及びイチハツ7.2重量％であることが一番望ましい。
上記の用途では、漢方薬の組成物が顆粒剤であることが望ましい。
【００２４】
一方、本発明は抗HEV71薬剤或は抗71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための薬物の調製における漢方薬組成物の用途を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根と山豆根から構成される。
【００２５】
前記4種類漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜70.0重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％及び山豆根1.2重量％〜35.0重量％であることが望ましい。
【００２６】
前記の漢方薬組成物がその他の清熱解毒類漢方薬を含むことが望ましい。前記他の清熱解毒類漢方薬が貫衆、鎧草、狐の孫、蒲公英、青黛、大血藤、重楼、木立蓬、イチハツ、鴉胆子、薄荷、桔梗と甘草から選ばれることが望ましい。
【００２７】
また、本発明は抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための薬物の調製における漢方薬組成物の用途を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆と鎧草から構成される。
【００２８】
前記4種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が、魚腥草4.7 重量％〜58.4重量％、忍冬藤4.7重量％〜46.7重量％、板藍根2.3重量％〜42.0 重量％、山豆根1.2重量％。O〜35.0重量％、貫衆1.9重量%〜37.3重量％及び鎧草 1.2重量％〜35.0重量％であることが望ましい。
【００２９】
また、本発明は抗HEV71薬剤或は71型エンテロウイルスによる疾病を治療及び/或は予防するための漢方薬組成物を提供する。その漢方薬組成物は以下の生薬、即ち、魚腥草、忍冬藤、板藍根、山豆根、貫衆、鎧草、重楼、木立蓬、イチハツから構成される。
【００３０】
前記9種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が魚腥草9.3 重量％〜46.7重量％、忍冬藤9.3重量％〜37.3重量％、板藍根4.7重量％〜35.0 重量％、貫衆2.3重量％〜28.0重量％、山豆根2.3重量％〜23.3重量％、鎧草 2.3重量％〜23.3重量％、重楼2.3重量％〜23.3重量％、木立蓬2.3重量％〜23.3 重量％及びイチハツ 2.3重量％〜23.3重量％であることが望ましい。
【００３１】
前記9種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が魚腥草14.0 重量％〜35.0重量％、忍冬藤11.7重量％〜23.3重量％、板藍根9.3重量％〜21.0 重量％、貫衆7.0重量%〜18.7重量％、山豆根4.7重量%〜11.7重量％、鎧草4.7重量%〜11.7 重量%、重楼4.7 重量%〜11.7 重量%、木立蓬4.7 重量%〜11.7 重量％及びイチハツ4.7重量％〜11.7重量％であることが更に望ましい。  
【００３２】
前記９種類の漢方薬組成物の生薬の重量比が魚腥草21.4 重量％〜58.4重量％、忍冬藤17.9重量％、板藍根14.3重量％、貫衆10.7重量％、山豆根7.1重量%、鎧草7.1重量％、重楼7.1重量％、木立蓬7.2重量％及びイチハツ7.2重量％であることが一番望ましい。
前記71型エンテロウイルスによる疾病は手足口病、ヘルパンギナ、無菌性髄膜炎や脳炎のような疾病の一つ又は幾つかの種類である。
【００３３】
一方、本発明は抗HEV71或は71型エンテロウイルスによる疾病の治療及び/或は予防方法を提供する。前記方法は、ニーズのある患者に治療に有効な前記漢方薬の組成物を提供することを含む。
【００３４】
前記71型エンテロウイルスによる疾病が手足口病、ヘルパンギナ、無菌性髄膜炎や脳炎のような疾病の一つ又は幾つかの種類であることが望ましい。前記の漢方薬組成物は顆粒剤であることが望ましい。
【００３５】
大量の実験によって、魚腥草、忍冬藤、板藍根と山豆根を原材料として調製された漢方薬の組成物が明らかな抗HEV71の役割を果たし、手足口病、ヘルパンギナ、無菌性髄膜炎や脳炎のような疾病を含む当該ウイルスによる多種類の疾病を順調に予防及び/又は治療することができることを発見した。
【００３６】
その上、本発明は、下記の原材料、即ち、板藍根14.0重量％〜37.3重量％、連翹4.7重量 %〜25.7重量％、広かっ香3.7重量％〜11.7重量％、石膏3.3重量％〜25.7重量 %、芦根3.7重量％〜25.7重量％、地黄3.7重量％〜14.0重量％、石菖蒲3.7 重量％〜14.0重量％、郁金3.7重量％〜14.0重量％及び知母3.7重量％〜14.0 重量％で調製された漢方薬組成物が一定な抗HEV71の役割を有するのを発見した。
【発明の効果】
【００３７】
本発明が提供する漢方薬組成物は、天然な植物を生薬としており、71型エンテロウイルスに対する著しい抑制効果があり、調製された薬物又は添加剤は低毒性、安全かつ効果的であるという特徴がある。71型エンテロウイルスによる疾病の予防及び治療に新しい道が発見でき、重要な社会価値と経済価値及び広い応用の見通しがある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1はSCのVero細胞活力に対する影響を表す。
【図２】図2はGBのVero細胞活力に対する影響を表す。
【図３】図３は四川処方の抗HEV71薬剤を入れる時の顕微鏡下の細胞の変化を表す。
【図４】図4は中国国家標準処方の抗HEV71薬剤を入れる時の顕微鏡下の細胞の変化を表す。
【図５】図５は四川処方を入れた後のウイルス繁殖のアガロースゲル電気泳動図である。
【図６】図6は中国国家標準処方を入れた後のウイルス繁殖のアガロースゲル電気泳動図である。
【図７】図７は四川処方を入れた後のウイルス繁殖のReal-time PCRの検査結果を表す（２０倍でTCID5Q EV71ウイルス検査を実施する）。
【図８】図８は中国国家標準処方を入れた後のウイルス繁殖のReal-time PCRの検査結果を表す（２０倍でTCID5Q EV71ウイルス検査を実施する）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、図面を参照して本発明の実施案を詳細に説明する。ここで、
SC：四川処方、GB：中国国家標準処方、negative:陰性対照、positive:陽性対照、d２、d３又はd４( D2、D3又は D4 ):第 2 日、第 3 日又は第 4 日、sc5: 5mg/ml SC、 sclO: lOmg/ml SC、 sc20: 20mg/ml SC、 gblO: lOmg/ml GB、 gb20: 20mg/ml GB、 gb40: 40mg/ml GB、
を表す。
【００４０】
以下、具体的な実施例を参照して本発明に対してさらに詳細に説明する。ここで、実施形態は単なる本発明を説明するものであり、本説明の範囲を制限するものではない。
【００４１】
＜実施例１＞
本実施例は以下のような漢方薬組成物（四川処方）の生薬処方と調製方法を提供する。
生薬：魚腥草21.4重量％、忍冬藤17.9重量％、板藍根14.3重量％、貫衆10.7重量％、山豆根7.1重量％、鎧草7.1重量％、重楼7.1重量％、木立蓬7.2重量％及びイチハツ7.2重量％。
【００４２】
以上の9種類の生薬を処方量で取る。まず、魚腥草に水を加え、10〜40分間煎じ、濾過し、濾液を相対密度1.05〜1.20のクリアペーストに濃縮し、冷やし、エタノール含有量が50〜80％になるようにエタノールを加え、24〜48時間置いて、濾過し、濾液でエタノールを回収し、相対密度1.05〜1.25のクリアペーストに濃縮し、必要に備える。忍冬藤等の8種類の漢方薬は、お湯で2時間１回で２回煎じ、濾過し、濾液を相対密度1.40のクリアペーストに濃縮する時、濾過し、濾液をさらに相対密度1.45のクリアペーストに濃縮する。前記魚腥草のクリアペーストを加え、均一に混合し、相対密度1.10以上の濃厚なペーストになるまで継続的に濃縮し、ペーストと蔗糖粉末を1:3〜8の割合で、造粒・包装した後完成する。
【００４３】
＜実施例2＞
本実施例は以下のような漢方薬組成物（中国国家標準処方）の生薬と製剤方法を提供する。
生薬：板藍根30.1重量％、連翹10.8重量％、石膏13.4重量％、知母5.8重量％、芦根14.2重量％、地黄7.5重量％に、広かっ香6.6重量％、石菖蒲5.8重量％と郁金5.8重量％。
【００４４】
以上の9種類の生薬を処方量で取る。まず、知母を最も粗い粉末に粉砕し、80〜90％のエタノールを入れ、加熱還流し、3時間1回で3回抽出し、濾過、濾過を減圧、エタノールを回収し、相対密度1.10（50℃）のクリアペーストに濃縮、必要に備える。板藍根等の8種類は、一番目が1時間、2番目と3番目が０.５時間となるようにお湯で3回煎じ（同時に揮発油を収集する）、濾過し、濾液を相対密度1.16（50℃）のクリアペーストに濃縮する。前記の知母クリアペーストを加え、混合し、相対密度1.28〜1.30 ( 55〜60℃)のクリアペーストに濃縮する。クリアペーストに適量な蔗糖をいれ、造粒、乾燥、収集した揮発油と食用香料を添加し、混合、造粒、包装することで完成される。
【００４５】
＜実施例３＞
抗HEV71ウイルスの体外実験
本実施例は、実施例１と２で調製した漢方薬組成物の抗HEV71ウイルスの効果を体外実験でテストした。
【００４６】
一、材料と方法
１.材料
1.1実験薬物：
中国国家標準処方KBD-GB (国薬準字Z20010127): 4.3g生薬/mlエキス剤
四川処方KBD-SC (国薬準字Z51020073): 4.7g生薬/mlエキス剤
1.2細胞：Vero細胞（アフリカミドリザル腎細胞）香港大学新発伝染病国家重点実験室により提供。
1.3ウイルス：EV71 /120F1 /Shenzhen/2009、香港大学新発伝染病国家重点実験室により提供。
1.4実験室の基本条件：実験の全プロセスは生物安全二級の実験室で完成された。
【００４７】
二、実験方法
２.１細胞変性効果（CPE）を観察し、ウイルスのVero細胞に対する半数感染用量（TCID50）を測定した。
Vero細胞を96ウェルプレートに接種し、穴毎に100μl、37℃、5%C02で24時間培養し、細胞が単層に成長する。一連の10倍希釈された9つ濃度のウイルス培養液を添加し、濃度毎に8つの穴にして、細胞対照を設定し、37℃、5%C02培養器で培養する。72時間後CPEを観察する。Read-Muench法でウイルスの半数感染用量（TCID50）を計算する。
【００４８】
2.2MTT法でテストする薬物が細胞に対する毒性反応を測定する。
Vero細胞を96ウェルプレートに接種し、穴毎に100μl、37℃、5%C02で24時間培養し、細胞が単層に成長する。上澄みを吸引し、テストする薬物の各濃度希釈液を添加し、濃度毎に8つの穴、細胞対照を設定する。37℃、5%C02培養器で培養し、72時間後でMTTをいれ、3時間染色する。液体を吸い、DMSO入れて30分間溶解して、酵素結合検出器でOD570nm吸収値を測定する。細胞活力で薬物の最大無毒濃度を確定する。
【００４９】
２.３顕微鏡環境で細胞変化を撮影する。
Vero細胞を24ウェルプレートに接種し、穴毎に1ml、37°C、5%C02で24時間培養し、細胞が単層に成長した後で、最大無毒濃度の薬物を10倍希釈し、共に3つの濃度で、濃度毎に2つの穴にして、１つの穴は1ml、37°C、5%C02で24時間培養し、薬物を吸収し、TCID50より20倍のウイルス120μlを加え、1時間後にウイルスを吸引し、1ml薬物を添加して、37°C、5%C02培養器で培養する。それぞれ培養してから第2日、第3日、第4日に顕微鏡で細胞形態を観察、撮影して、中に陰性は生理食塩水に対照し、陽性はタミフルに対照する。
2.4 PCRとReal-time PCRでウイルスの繁殖量を検出する。
【００５０】
Vero細胞を24ウェルプレートに接種し、穴毎に1ml、37°C、5%C02で24時間培養し、細胞が単層に成長した後で、最大無毒濃度の薬物を10倍希釈し、共に3つの濃度で、濃度毎に2つの穴にして、１つの穴は1ml、37°C、5%C02で24時間培養し、薬物を吸収し、TCID50より20倍のウイルス120μlを加え、1時間後にウイルスを吸引し、1ml薬物を添加して、37°C、5%C02培養器で培養する。24、48、72時間にそれぞれ上澄み液を取って、RNAを抽出して、PCRとReal-time PCRでウイルスの繁殖量を検出する。
【００５１】
三、実験の結果
3.1  ウイルスTCID50の測定：ウイルスEV71/120Fl/Shenzhen/2009 的の TCID50は105.125/mlである。
【００５２】
3.2薬物毒性の測定：
四川処方KBD-SC(Z51020073 )の最大の無毒濃度は20mg/mlであり（図１を参照）、中国国家標準処方KBD-GB(Z20010127)の最大の無毒濃度は40mg/mlである（図2を参照）。
【００５３】
3.3顕微鏡で観察した細胞の変化
四川処方抗EV71ウイルスの顕微鏡での細胞変化は図3の通りである。顕微鏡で薬物濃度が5mg/ml、1Omg/mlと20mg/mlの時、ウイルス感染してから３日目にまだ生きた細胞が多数一種のと見える。薬物は濃度が20mg/mlの時、状態異常な生きた細胞が一部分見えて、薬物が細胞に与える毒性効果である可能性がある。
中国国家標準処方抗EV71ウイルスの顕微鏡で観察した細胞変化は図4の通りである。顕微鏡で観察した薬物は、濃度が1Omg/mlと20mg/mlの時、ウイルス感染した３日目にまだ生きた細胞が多数あると見える。薬物濃度が40mg/mlである時、生きた細胞がない。これは、薬物の細胞に対する毒性効果である。
【００５４】
3.4 PCRで24、48及び７２時間に渡ってウイルスの繁殖量を検出する。
アガロースゲル電気泳動法で四川処方を入れた時のウイルス繁殖量を検出し、結果は図５のように、四川処方がEV71ウイルスの繁殖に一種の程度の抑制効果が一種のと分かれる。中では、PCRの産物電気泳動バンドは濃度が濃ければ濃いほどウイルスの繁殖量が多い。本実験の結果によると、薬物濃度が5mg/ml、1Omg/mlと20mg/mlの時、ウイルス感染した３日目と4日目にウイルスの繁殖を抑制されることがわかる。
【００５５】
アガロースゲル電気泳動法で中国国家標準処方を入れた時のウイルス繁殖量を検出し、結果は図6の通りである。写真から分かるように、中国国家標準処方がEV71ウイルスの繁殖にある程度の抑制効果がある。中では、PCRの産物電気泳動バンドは濃度が濃ければ濃いほどウイルスの繁殖量が多い。本実験の結果によると、薬物濃度が1Omg/mlと20mg/mlの時、ウイルス感染した３日目と4日目にウイルスの繁殖を抑制されることが分かる。濃度が40mg/mlの時、薬物が細胞に対する毒性効果でウイルスの繁殖を抑制した。
【００５６】
3.5  Real-time PCR定量でウイルスの繁殖量を検出する。
Real-time PCRで四川処方を入れた時、ウイルスの繁殖を検出する。Real-time PCRの結果（図１と表１を参照）によると、各濃度の四川処方はEV71ウイルスの繁殖に抑制さることが分かる。濃度が5mg/ml、1Omg/mlと20mg/mlの場合、薬物はウイルス感染した4日目にも同様にウイルス繁殖抑制能力を持っている。
【００５７】
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【００５８】
Real-time PCRは、中国国家標準処方を入れた時のウイルス繁殖を検定する。Real-time PCRの結果（図８と表２を参照）から分かるように、異なる濃度の中国国家標準処方が早期ではEV７１ウイルスの繁殖を抑制することができる。10mg/mlと20mg/ml濃度の薬物はウイルス感染後の第４日に明らかに同じウイルス繁殖を抑制する能力があることが分かる。40mg/mlの濃度の時、薬物が細胞に対する毒性効果でウイルスの繁殖を抑制した。
【００５９】
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【００６０】
四、結論
前記の実験結果によれば、四川処方KBD-SCと中国国家標準処方KBD-GBは、EV71ウイルス初期感染にウイルス繁殖を効果的に抑制できる。四川処方KBD-SCは中国国家標準処方KBD-GBに比べ毒性反応が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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