(57)【要約】  本発明は、膀胱癌を罹患しているかまたは罹患するリスクにある被検体を検出する方法であって、i）被検体から単離された体液試料を提供する、ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、ことを含む方法を提供する。【選択図】図１
2014501929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌を罹患しているかまたは罹患するリスクにある被検体を検出する方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記決定工程（vi）が閾値数と比較したＭＣＭ標識細胞の測定に基づき、このとき該閾値より上または該閾値と同じ測定値が膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被検体が膀胱癌と関連する症状を呈する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
膀胱癌の症状が血尿を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
閾値数が少なくともおよそ１０細胞である、請求項１から４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
閾値数が少なくともおよそ３０細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
閾値数が少なくともおよそ５０細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
閾値数がおよそ５０から４００である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被検体が膀胱癌を以前に発症したことがある、または再発した、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
閾値数が少なくともおよそ１０細胞である、請求項１から９のいずれか一に記載の方法。
【請求項１１】
閾値数が少なくともおよそ３０細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
閾値数が少なくともおよそ５０細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
閾値数が少なくともおよそ２００細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
閾値数がおよそ２００から４００である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
膀胱癌に罹患している、または罹患するリスクにある被検体の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、該決定工程（vi）が閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値が膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、方法。
【請求項１６】
閾値数が少なくともおよそ５０細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
閾値数がおよそ５０から４００細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
閾値数がおよそ５０細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
膀胱癌の既往を有するかまたは再発している被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、該決定工程（vi）が閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値が膀胱癌もしくは膀胱癌の再発のリスクを表す、方法。
【請求項２０】
閾値数が少なくともおよそ２００細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
閾値数がおよそ２００から４００細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
閾値数がおよそ２００細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
体液が尿である、請求項１から２２のいずれか一に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＣＭがＭＣＭ２、３、４、５、６および７からなる群から選択される、請求項１から２３のいずれか一に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＣＭがＭＣＭ２、５および７からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＣＭがＭＣＭ２および７からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＭＣＭがＭＣＭ２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＣＭがＭＣＭ７である、請求項１から２７のいずれか一に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が、体液試料の濾過により体液試料から単離される、請求項１から２８のいずれか一に記載の方法。
【請求項３０】
特異的結合メンバーが、抗体またはその断片である、請求項１から２９のいずれか一に記載の方法。
【請求項３１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞数がフローサイトメトリーにより測定される、請求項１から３１のいずれか一に記載の方法。
【請求項３３】
細胞数が自動細胞計数機を用いて測定される、請求項１から３１のいずれか一に記載の方法。
【請求項３４】
膀胱癌に罹患しているか、または罹患すると思われる被検体を診断および治療する方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する工程、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する工程、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる工程、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する工程、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める工程、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する工程、
vii）被検体の予期される膀胱癌／膀胱癌それぞれを予防および／または治療するための治療処方計画を決定する工程、および、
viii）該治療処方計画を投与して、被検体の予期される膀胱癌／膀胱癌それぞれを予防および／または治療する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膀胱癌のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は、毎年世界中で推定１００万例が診断される一般的な疾患である。発生率は先進国が最も多く、膀胱癌の９０％以上が移行性起源である。最初に移行上皮癌と診断された患者の約７５％が、経尿道的切除術によって治療することができる表在性腫瘍を呈する。表在性疾患の再発率は６０％を超え、表在性疾患患者の約４０％は経尿道的切除のみによって治療した場合に５年以内に腫瘍の再発があるので、移行上皮癌患者の臨床管理は困難である（Ozono et al., Jpn J Clin Oncol 2001; 31: 536-540）。また、再発性膀胱腫瘍の３０％以下は侵襲性疾患に進行する（Zieger et al., BJU Int 2000; 85: 824-828）。よって、膀胱癌を有する、または有する疑いがある患者の早期発見とモニタリングは治療の成功のために重要である。
【０００３】
膀胱癌を診断するための現在の臨床ゴールドスタンダードは、局所または全身麻酔下での膀胱鏡検査と、適する場合にはその後に固形組織生検を行う。膀胱鏡検査は、日常的に血尿や刺激性排尿障害を呈する患者を試験するために用いられ、これら早期移行上皮癌の両症状は尿路感染症や前立腺肥大などのさほど深刻でない疾患に関連していることが多い。これら非特異的症状を有する患者は、たとえ実際に悪性腫瘍を持っているのがわずかな割合だとしても、広域の泌尿器検査を受ける可能性がある。膀胱鏡検査は侵襲的で高価であるため、患者および臨床医の両方が膀胱癌の診断および調査のための費用対効果が高く非侵襲的なツールの開発の恩恵を受けるであろう。したがって、膀胱癌の診断のための信頼性のある、非侵襲的スクリーニングツールが至急求められている。
【０００４】
排尿の尿細胞診分析は移行上皮癌を検出するための最も一般的に使用される非侵襲的方法であるが、その有用性は、高グレード悪性腫瘍の症例以外では低感度であるため制約がある（グレード２やグレード３）。
【０００５】
これまでの研究では、上皮組織の細胞周期プロセスにおける重要な調節因子としてミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭ）を同定している（Baldwin et al., Nature Reviews Cancer 2003; 3:217-26、Chatrath et al., British Journal of Cancer 2003; 89:1048-54、Sirieix et al., Clinical Cancer Research 2003; 9:2560-6；Davies et al., Lancet 2002; 359: 1917-19；Freeman et al., Clinical Cancer Research 1999; 5: 2121-2132；Stoeber et al., Lancet 1999; 354: 1524-1525；Williams et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 14932-14937）。複数の保存されたメカニズムは、ＤＮＡ複製を細胞周期ごとに１回に限定する。ＭＣＭおよびそれらの調節因子の増殖における重要な役割により、これらが癌検出と予後における日常的な臨床使用のための潜在的に重要なバイオマーカーとなる。
【０００６】
本発明は、個体の尿中のＭＣＭ陽性細胞の数と膀胱癌を有するかまたは発症のリスクとの間に関連があるという知見に基づくものである。具体的には、本発明者等は、健康な個体の尿中に見つけることが期待されるＭＣＭ陽性細胞の数に正常範囲があり、この正常範囲より上の陽性細胞数を有する患者は膀胱癌を有するか、または膀胱癌を発症するリスクが有意に高いことを示した。さらに、本発明者等は、この発見を、すでに癌を有する患者および再発のリスクが高い患者にも応用した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第一態様によると、膀胱癌を罹患しているかまたは罹患するリスクにある被検体を検出する方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含む方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、前記決定工程（vi）は、閾値数と比較したＭＣＭ結合／標識細胞の測定に基づき、このとき該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す。
【０００９】
閾値数は少なくともおよそ１０細胞であってもよく、例えば、閾値数は少なくともおよそ１０細胞であるがおよそ４０細胞未満であってよい。例えば、閾値数は少なくとも３０細胞、例えば、少なくとも４０または５０細胞であってよい。閾値数は、少なくとも１００細胞、例えば少なくとも２００細胞であってよい。ここで用いる「およそ」なる用語は、示した値からの理解されうる変動値を指す。特記しているか否かにかかわらず、このような変動値は常にここで示す任意の所定値に包含されると理解されるものである。この変動値の例には＋または−１０が含まれる。
【００１０】
被検体は、血尿または下部尿路症状（例えば頻尿、排尿障害、排尿の緊急性、または夜間頻尿）を含む膀胱癌と関連しうる症状を呈しうる。よって、本発明は、膀胱癌と関連する症状、例えば血尿を呈する被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、前記決定工程（vi）は、閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、
方法を提供する。閾値数は、少なくともおよそ１０細胞、例えばおよそ３０または５０細胞であってよい。好ましくは、閾値数は、少なくともおよそ５０細胞、例えばおよそ５０から４００細胞、例としておよそ５０から２００、または５０から１００細胞である。好ましくはまた、閾値数はおよそ５０細胞である。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、肉眼的血尿（尿中の血液）を呈する被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、前記決定工程（vi）は、閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、
方法を提供する。閾値数は、少なくともおよそ１０細胞、例えばおよそ３０または５０細胞であってよい。好ましくは、閾値数は、少なくともおよそ５０細胞、例えばおよそ５０から２００細胞、または５０から１００細胞である。好ましくはまた、閾値数はおよそ５０細胞である。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、下部尿路症状（例えば頻尿、排尿障害、排尿の緊急性、または夜間頻尿）および／または微小血尿を含む膀胱癌と関連し得る症状を呈する被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、前記決定工程（vi）は、閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、
方法を提供する。閾値数は、少なくともおよそ１０細胞、例えばおよそ３０または５０細胞であってよい。好ましくは、閾値数は、少なくともおよそ３０細胞、例えばおよそ５０から４００細胞、例としておよそ５０から２００細胞、または５０から１００細胞である。好ましくはまた、閾値数はおよそ３０細胞である。典型的に、被検体は肉眼的血尿を呈していない。
【００１３】
被検体は、膀胱癌陽性の生検の既往歴があり得る、および／または、症状（特に血尿）を呈するかまたは腫瘍の再発を表す外来患者の膀胱鏡検査後に腫瘍が回復して再発したかもしれない。よって、本発明は、膀胱癌の既往を有するかまたは再発した被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、前記決定工程は、閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、
方法を提供する。閾値数は、少なくともおよそ１０細胞であってよい。好ましくは、閾値数は、少なくともおよそ２００細胞、例えばおよそ２００から４００細胞である。好ましくはまた、閾値数はおよそ２００細胞である。
【００１４】
被検体は、血尿を含む膀胱癌と関連しうる症状を呈するか、または膀胱癌陽性の生検の既往があるかもしれない。よって、本発明は、膀胱癌と関連する症状、例えば血尿を呈する被検体、または膀胱癌の既往がある被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、前記決定工程（vi）は、閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、
方法を提供する。閾値数は、少なくともおよそ１０細胞であってよい。好ましくは、閾値数は、少なくともおよそ５０細胞、例えばおよそ５０から４００細胞、例としておよそ５０から２００、または５０から１００細胞である。好ましくはまた、閾値数はおよそ５０から１００細胞、例えばおよそ７０から８０細胞である。
【００１５】
被検体は膀胱癌の症状を呈さないかもしれない。よって、本発明は、膀胱癌の症状を呈さない被検体における膀胱癌の検出方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、そして、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含み、
このとき、前記決定工程（vi）は、閾値数と比較したＭＣＭ結合細胞の測定に基づくものであり、該閾値より上または該閾値と同じ測定値は膀胱癌もしくは膀胱癌のリスクを表す、
方法を提供する。閾値数は、少なくともおよそ１０細胞、例えばおよそ１０から５０細胞である。好ましくは、閾値数はおよそ１０以下、例えば５から１０細胞である。
【００１６】
典型的には、体液は、血液または脳脊髄液ではない。体液は尿または精液であってよい。あるいは体液は糞便であってよい。好ましくは、体液は尿である。
【００１７】
好ましくは、本発明の方法は、被検体、好ましくはヒトの尿などの体液の試料における膀胱癌細胞の存在を検出又は測定するのに有用である。
【００１８】
細胞は、当業者に公知な任意の手段によって体液試料から単離してよい。典型的には、細胞は体液試料の遠心分離または濾過のいずれかによって単離される。好ましくは、細胞は体液試料の濾過により単離される。本発明の好ましい方法では、試料は抗原検索の対象となる。抗原検索は当分野での標準手法である（Hiraiwa et alは例示的アプローチを示すShin et al (1991) Lab. Invest. 64, 693-702を参照している）。抗原検索条件は、水浴またはマイクロ波で４５分間、９５℃のｐＨ７．８  ＥＤＴＡ緩衝液に細胞試料を接触させることを含んでよい。
【００１９】
本発明の方法では、ＭＣＭは、ＭＣＭ２、３、４、５、６および７からなる群から選択される。ＭＣＭは、２つ以上の異なるＭＣＭの組み合わせ、例えば、ＭＣＭ２、３、４、５、６および７からなる群から選択される２つの異なるＭＣＭであってよい。例えば、ＭＣＭは、ＭＣＭ２とＭＣＭ３、４、５、６、７から選択される１つの他のＭＣＭとを含みうる。さらなる例として、ＭＣＭは、ＭＣＭ５とＭＣＭ２、３、４、６、および７から選択される１つの他のＭＣＭとを含みうる。本発明の好ましい方法では、ＭＣＭはＭＣＭ２、５及び７からなる群から選択される。本発明のさらに好ましい方法では、ＭＣＭはＭＣＭ２および７からなる群から選択される。
【００２０】
本発明の好ましい方法では、ＭＣＭはＭＣＭ２である。
【００２１】
本発明の他の方法では、ＭＣＭはＭＣＭ７である。
【００２２】
本発明の方法では、ＭＣＭはＭＣＭ２とＭＣＭ５を含んでよい。本発明の別の方法では、ＭＣＭはＭＣＭ２とＭＣＭ７を含んでよい。本発明のさらに別の方法では、ＭＣＭはＭＣＭ５とＭＣＭ７を含んでよい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ここで用いる「特異的結合メンバー」は、互いに結合特異性を有する一対の分子のメンバーである。特異的結合対のメンバーは、天然に生じるか、または全体ないしは部分的に合成して生成されてよい。分子の対の一メンバーはその表面上に突出ないしは窪みであって、そこに特異的に結合し、ゆえに分子対の他のメンバーの特定の空間および極性有機体に相補的である領域を有する。よって、対のメンバーは互いに結合特異性の性質を有する。
【００２４】
特異的結合対の種類の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡ（例えばオリゴヌクレオチド）である。本発明は、概して、抗原−抗体タイプの反応に関するが、ここで定義する抗原に結合する小分子も指す。
【００２５】
ここで用いる「抗体」なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち天然でまたは部分的もしくは全体的に合成により生成されたいずれかの抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子のことをいう。この用語は、抗体結合ドメインであるかもしくはそれに相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。これらは、天然の供給源に由来できるか、またはこれらは、部分的もしくは全体的に合成により生成できる。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；ならびに二重特異性抗体である。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。
【００２６】
抗体は、いくつかの方法で改変できるので、「抗体」なる用語は、要求される特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈される。よって、この用語は、天然または全体的もしくは部分的に合成の免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物および相同体、ヒト化抗体を包含する。
【００２７】
対象の標的に特異的である抗体は、当分野において標準的な技術を用いて得ることができる。抗体を生成する方法は、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ）を、タンパク質もしくはその断片あるいはタンパク質もしくは断片を発現する細胞またはウイルスで免疫することを含む。抗体は、免疫された動物から、当分野において知られる様々な技術のいずれかを用いて得て、例えば対象の抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングできる。
【００２８】
「抗原結合ドメイン」は、抗原の部分もしくは全体に特異的に結合し相補的である領域を含む抗体の一部分である。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にだけ結合し、この部分をエピトープと称する。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗体可変ドメインによりもたらされてよい。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域とを含んでよい。
【００２９】
「特異的」は、概して、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（一または複数）以外の分子といずれの著しい結合を示さない、例えば任意の他の分子と約３０％、好ましくは２０％、１０％または１％未満の交差反応性を有する状況のことをいうために、用いられる。
【００３０】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、本発明に従って「単離」形である。メンバーは、概して、それらがそれらの天然の環境またはそれらが調製される環境（例えば細胞培養物）（そのような調製がインビトロまたはインビボで実施される組換えＤＮＡ技術による場合に）で見出されるその他のポリペプチドなどの、それらが天然で関連する物質を含まないかまたは実質的に含まない。
【００３１】
よって、本発明の特異的結合メンバーは、抗体ないしは抗体の断片であるのが好ましい。よって、例えば、（ii）での特異的結合パートナーメンバーは、前立腺組織に特異的な抗原結合ドメインを有する抗体ないしは抗体断片であってよい。例えば、（iii）での特異的結合メンバーは、ＭＣＭに特異的な抗原結合ドメインを有する抗体ないしは抗体断片であってよい。
【００３２】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、ないしは前記のいずれかの断片であってよい。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＭＣＭに特異的な抗原結合ドメインを有するモノクローナル抗体である。ＭＣＭに特異的なモノクローナル抗体は当分野で知られており、例えば、MRC Cancer Cell Unit（Hutchison/MRC Research Centre, Hills Road, Cambridge CB2 0XZ）にて創出されるクローンＤ１１２Ａ３に由来する、本研究で用いる抗ＭＣＭ２抗体である。
【００３３】
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の生成は当分野でよく知られている。モノクローナル抗体を生成するために用いた方法は、Kohler and Milstein in Nature 256, 495-497 (1975)、およびSchwartz, 1981編, Compendium of Immunology V.II, のDonillard and Hoffman, “Basic Facts about Hybridomas”（出典明記によりここに援用する）に開示されている。
【００３４】
本発明の方法では、本発明の特異的結合メンバーは、抗体画像法の分野で知られる従来の化学を用いて、本発明の特異的結合メンバーに接着しうる検出可能な標識、例えばＩ１２５、Ｉ１３１または９９Ｔｃなどの放射能標識にて標識されてよい。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素標識も含む。さらに、標識は、特定の同族検出可能部分、例えばアビジンへの結合により検出されうるビオチンなどの化学部分も含む。
【００３５】
正常試料および試験試料に対する抗体などの特異的結合メンバーの反応度は、任意の適当な手段により決定してよい。他の標識には、蛍光色素、燐光体、または分光的に単離した吸収もしくは放出特徴を有するレーザ色素が含まれる。適切な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドが含まれる。適切な色素産生性色素にはジアミノベンジジンが含まれる。その他の標識には、巨大分子コロイド粒子または着色、磁性もしくは常磁性であるラテックスビーズなどの微粒子物質、および視覚的に観察されるか、電気的に検出されるかもしくはそうでなければ記録される検出可能な信号を直接的または間接的に引き起こすことができる生物学的あるいは化学的に活性な物質が含まれる。これらの分子は、例えば、色を発生するかもしくは変化させるか、または電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってよい。これらは、分子的に励起して、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的な分光的吸収または放出をもたらすことができる。これらには、バイオセンサに関連して用いられる化学的実体が含まれうる。以下に記載する実施例では、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼを採用している。
【００３６】
細胞数は、限定するものではないが、免疫細胞化学的手段、フローサイトメトリーおよび細胞画像解析を含む適切な任意の手段によって決定されうる。好ましくは、細胞数はフローサイトメトリーまたは自動細胞計数機によって決定される。
【００３７】
本発明の方法は、Ｐａｐ（パパニコロウ）染色と組み合わせて用い、マルチクロマチン染色を用いた細胞の組織学的染色を提供しうる。細胞のＰａｐ染色の方法は当分野で知られており、Coleman and Chapman 1989 (Coleman Dulcie; Chapman, Patricia (1989), Clinical Cytotechnology, Butterworth & Co. pp 80-82)、およびCarson and Hladik 2009 (Carson Freida L; Hladik, Christa (2009), Histotechnology: A Self-Instructional Text (3 ed.), Hong Kong: American Society for Clinical Pathology Press. pp. 361-3363)などがある。
【００３８】
よって、本発明は、膀胱癌を罹患しているかまたは罹患するリスクにある被検体を検出する方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させ、場合によって該細胞をＰａｐ染色と接触させる、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する、
ことを含む方法を提供する。
【００３９】
本発明は、膀胱癌に罹患しているか、または罹患すると思われる被検体を診断および治療する方法であって、
i）被検体から単離された体液試料を提供する工程、
ii）該試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する工程、
iii）該試料を、ミニ染色体維持（ＭＣＭ）ポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーと接触させる工程、
iv）該細胞試料への該特異的結合メンバーの結合を測定する工程、
v）該特異的結合メンバーに結合した該細胞試料中の細胞を計数して、細胞数を求める工程、
vi）該細胞数に基づいて、該被検体が膀胱癌を有するかまたは有するリスクにあるか否かを決定する工程、
vii）被検体の予期される膀胱癌／膀胱癌それぞれを予防および／または治療するための治療処方計画を決定する工程、および、
viii）該治療処方計画を投与して、被検体の予期される膀胱癌／膀胱癌それぞれを予防および／または治療する工程
を含む方法を提供する。
【００４０】
本発明の更なる態様は、被検体の体液試料における膀胱癌細胞の存在を検出または測定するための方法であって、
（i）試料から細胞を単離して、細胞試料を提供する、
（ii）該細胞試料を、ミニ染色体維持２（ＭＣＭ２）ポリペプチドおよび／またはミニ染色体維持７（ＭＣＭ７）ポリペプチドを結合することができる特異的結合メンバーと接触させる、そして、
（iii）該特異的結合メンバーの細胞試料への結合を決定する、
ことを含む方法を提供する。
【００４１】
ミニ染色体維持７（ＭＣＭ７）ポリペプチドおよび／またはミニ染色体維持２（ＭＣＭ２）ポリペプチドを結合することができる特異的結合メンバー、例えば抗ＭＣＭ７および／または抗ＭＣＭ２抗体が試料に結合したと決定される場合、被検体における膀胱癌が示される。ゆえに、本発明は、被検体における膀胱癌の進行の早期予後を決定するための方法であって、本発明の第一態様の方法に従って被検体の体液、例えば尿試料における胱癌細胞の存在を検出または決定することを含む方法を提供する。被検体は、（i）膀胱癌の症状を呈さない患者、（ii）血尿または下部尿路症状（例えば感染症）を呈する患者、または（iii）尿路上被腫瘍について膀胱鏡分析による追跡調査を受けている患者から選択される患者のコホートであってよい。
【００４２】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する」ならびにこれらの語句の変形、例えば「含み」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」なる語句は、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、その他の部分、添加物、成分、整数または工程を除外することを意図しない（かつ除外しない）。
【００４３】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈がそうでないことを必要としない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞を用いる場合、本明細書は、文脈がそうでないことを必要としない限り、単数形とともに複数形を企図すると理解される。
【００４４】
本発明の具体的な態様、実施形態または実施例と関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、本明細書に記載する任意のその他の態様、実施形態または実施例に、それと非適合性でない限り、適合できると理解される。
【００４５】
本発明は、以下の図を参照して例示としてのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】総血尿クリニックに参加した患者から得られたデータを、１０、３０、５０、１００、２００及び４００それぞれの個々のＭＣＭ閾値数をとともに示すドットプロット。
【図２】総血尿クリニックに参加した患者から得られたデータを、１０、３０、５０、１００、２００及び４００それぞれの個々のＭＣＭ閾値数をとともに示すドットプロット。
【図３】総血尿クリニックに参加した患者から得られたデータを、１０、３０、５０、１００、２００及び４００それぞれの個々のＭＣＭ閾値数をとともに示すドットプロット。
【図４】総血尿クリニックに参加した患者から得られたデータを、１０、３０、５０、１００、２００及び４００それぞれの個々のＭＣＭ閾値数をとともに示すドットプロット。
【図５】総血尿クリニックに参加した患者から得られたデータを、１０、３０、５０、１００、２００及び４００それぞれの個々のＭＣＭ閾値数をとともに示すドットプロット。
【図６】総血尿クリニックに参加した患者から得られたデータを、１０、３０、５０、１００、２００及び４００それぞれの個々のＭＣＭ閾値数をとともに示すドットプロット。
【図７】膀胱鏡調査クリニックに参加した患者から入手したデータを示すドットプロットである。ここで参加した患者はすべて新鮮排尿検体と、１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーするＭＣＭ閾値とに基づいて尿検査を行った。
【図８】膀胱鏡調査クリニックに参加した患者から入手したデータを示すドットプロットである。ここで参加した患者はすべて新鮮排尿検体と、１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーするＭＣＭ閾値とに基づいて尿検査を行った。
【図９】膀胱鏡調査クリニックに参加した患者から入手したデータを示すドットプロットである。ここで参加した患者はすべて新鮮排尿検体と、１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーするＭＣＭ閾値とに基づいて尿検査を行った。
【図１０】膀胱鏡調査クリニックに参加した患者から入手したデータを示すドットプロットである。ここで参加した患者はすべて新鮮排尿検体と、１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーするＭＣＭ閾値とに基づいて尿検査を行った。
【図１１】膀胱鏡調査クリニックに参加した患者から入手したデータを示すドットプロットである。ここで参加した患者はすべて新鮮排尿検体と、１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーするＭＣＭ閾値とに基づいて尿検査を行った。
【図１２】膀胱鏡調査クリニックに参加した患者から入手したデータを示すドットプロットである。ここで参加した患者はすべて新鮮排尿検体と、１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーするＭＣＭ閾値とに基づいて尿検査を行った。
【図１３】肉眼的血尿を呈するかまたは過去に生検陽性疾患を有して膀胱鏡調査に訪れた患者の集団ベースのコントロールとして用いた、５０歳以上の健康被検体から入手したデータを示すドットプロットである。
【図１４】肉眼的血尿を呈するかまたは過去に生検陽性疾患を有して膀胱鏡調査に訪れた患者の集団ベースのコントロールとして用いた、５０歳以上の健康被検体から入手したデータを示すドットプロットである。
【図１５】肉眼的血尿を呈するかまたは過去に生検陽性疾患を有して膀胱鏡調査に訪れた患者の集団ベースのコントロールとして用いた、５０歳以上の健康被検体から入手したデータを示すドットプロットである。
【図１６】肉眼的血尿を呈するかまたは過去に生検陽性疾患を有して膀胱鏡調査に訪れた患者の集団ベースのコントロールとして用いた、５０歳以上の健康被検体から入手したデータを示すドットプロットである。
【図１７】肉眼的血尿を呈するかまたは過去に生検陽性疾患を有して膀胱鏡調査に訪れた患者の集団ベースのコントロールとして用いた、５０歳以上の健康被検体から入手したデータを示すドットプロットである。
【図１８】肉眼的血尿を呈するかまたは過去に生検陽性疾患を有して膀胱鏡調査に訪れた患者の集団ベースのコントロールとして用いた、５０歳以上の健康被検体から入手したデータを示すドットプロットである。
【図１９】１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーする、腎路疾患の所見がない患者（特に、過去または現在に膀胱癌の既往がなく、最近の尿路感染の所見がない）から入手したデータを示すドットプロットである。
【図２０】１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーする、腎路疾患の所見がない患者（特に、過去または現在に膀胱癌の既往がなく、最近の尿路感染の所見がない）から入手したデータを示すドットプロットである。
【図２１】１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーする、腎路疾患の所見がない患者（特に、過去または現在に膀胱癌の既往がなく、最近の尿路感染の所見がない）から入手したデータを示すドットプロットである。
【図２２】１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーする、腎路疾患の所見がない患者（特に、過去または現在に膀胱癌の既往がなく、最近の尿路感染の所見がない）から入手したデータを示すドットプロットである。
【図２３】１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーする、腎路疾患の所見がない患者（特に、過去または現在に膀胱癌の既往がなく、最近の尿路感染の所見がない）から入手したデータを示すドットプロットである。
【図２４】１０、３０、５０、１００、２００および４００それぞれの染色ＭＣＭ細胞の同じ範囲をカバーする、腎路疾患の所見がない患者（特に、過去または現在に膀胱癌の既往がなく、最近の尿路感染の所見がない）から入手したデータを示すドットプロットである。
【図２５】ＧＨクリニック患者の７０％以下を表す、ＧＨクリニックを訪れ、顕微鏡的血尿（ＭＨ）があることが明らかとなった患者から入手したデータを示すドットプロットである。これらの患者は、ＴＣＣの発生が非常に低く、標準的膀胱鏡検査では通常クリニックで生検が行われない。これは、ＴＣＣ調査の下での患者の管理における付加的な診断補助としてのＭＣＭの価値を示し、慣例的な膀胱鏡検査の必要性をなくすかもしれない。
【図２６】ＧＨクリニック患者の７０％以下を表す、ＧＨクリニックを訪れ、顕微鏡的血尿（ＭＨ）があることが明らかとなった患者から入手したデータを示すドットプロットである。これらの患者は、ＴＣＣの発生が非常に低く、標準的膀胱鏡検査では通常クリニックで生検が行われない。これは、ＴＣＣ調査の下での患者の管理における付加的な診断補助としてのＭＣＭの価値を示し、慣例的な膀胱鏡検査の必要性をなくすかもしれない。
【図２７】ＧＨクリニック患者の７０％以下を表す、ＧＨクリニックを訪れ、顕微鏡的血尿（ＭＨ）があることが明らかとなった患者から入手したデータを示すドットプロットである。これらの患者は、ＴＣＣの発生が非常に低く、標準的膀胱鏡検査では通常クリニックで生検が行われない。これは、ＴＣＣ調査の下での患者の管理における付加的な診断補助としてのＭＣＭの価値を示し、慣例的な膀胱鏡検査の必要性をなくすかもしれない。
【図２８】ＧＨクリニック患者の７０％以下を表す、ＧＨクリニックを訪れ、顕微鏡的血尿（ＭＨ）があることが明らかとなった患者から入手したデータを示すドットプロットである。これらの患者は、ＴＣＣの発生が非常に低く、標準的膀胱鏡検査では通常クリニックで生検が行われない。これは、ＴＣＣ調査の下での患者の管理における付加的な診断補助としてのＭＣＭの価値を示し、慣例的な膀胱鏡検査の必要性をなくすかもしれない。
【図２９】ＧＨクリニック患者の７０％以下を表す、ＧＨクリニックを訪れ、顕微鏡的血尿（ＭＨ）があることが明らかとなった患者から入手したデータを示すドットプロットである。これらの患者は、ＴＣＣの発生が非常に低く、標準的膀胱鏡検査では通常クリニックで生検が行われない。これは、ＴＣＣ調査の下での患者の管理における付加的な診断補助としてのＭＣＭの価値を示し、慣例的な膀胱鏡検査の必要性をなくすかもしれない。
【図３０】ＧＨクリニック患者の７０％以下を表す、ＧＨクリニックを訪れ、顕微鏡的血尿（ＭＨ）があることが明らかとなった患者から入手したデータを示すドットプロットである。これらの患者は、ＴＣＣの発生が非常に低く、標準的膀胱鏡検査では通常クリニックで生検が行われない。これは、ＴＣＣ調査の下での患者の管理における付加的な診断補助としてのＭＣＭの価値を示し、慣例的な膀胱鏡検査の必要性をなくすかもしれない。
【実施例】
【００４７】
実施例１
材料および方法
アデンブルックズ病院で行った本試験では、定期的に外科外来（アデンブルックズ病院泌尿器科、ケンブリッジ）を訪問した合計２４６人の患者を、膀胱癌の可能性または再発について試験した。以前の試験では、移行上皮癌（ＴＣＣ）を持つすべての患者の生態は便宜上２つの主なグループに分けることができたことを示した。
１．肉眼的血尿、すなわち、尿中の明らかな血液所見を呈して、膀胱癌の可能性の早急な検査のために初めてクリニックを訪れた患者（ＧＨ患者）、および、
２．過去のある時期に膀胱癌の陽性生検診断を下され、腫瘍の性質および悪性度に応じた治療を受け、現在膀胱鏡検査のために来ていた患者（ＣＳ患者）。
【００４８】
これらの患者は、クリニックでの成功事例と一致する定期的な詳細調査を行って追跡調査した。この調査には、定期的な尿細胞診（ここではＭＣＭ抗体検査）のための全量尿採取とともに、特に記載がない限り、詳細な体系的調査、詳細な身体検査、静脈性尿路造影、心電図（ＥＣＧ）および胸部Ｘ線、並びに、最初の発現時または膀胱鏡追跡調査時の外来患者として定期的膀胱スキャンおよび／またはフレキシブル膀胱鏡検査を行った。
【００４９】
その科への受付時または外科外来への受付後科内で尿試料を収集し（８３０〜１２３０）、その後全尿試料を排尿から１〜２時間以内に試験室へ移し、試験室の５０ｍｌ試料から収集した全試料中の十分な数の膀胱上皮細胞を生成した。
【００５０】
次いで、試験室内の指定実施者によって尿を遠心分離（２５００ｒｐｍ×１０分）するという所定の試験手順を実施した。排尿の全量から５０ｍｌを試験室へ運び、異なる実験のためにファルコンチューブに分注した。遠心分離後、上清をビルコンに移し、集めた細胞材料をＣｙｔｏｌｙｔを用いて１つのファルコンチューブに洗い入れた。次いで、チューブをＣｙｔｏｌｙｔで満たし、５分間ボルテックスにかけ、再び遠心分離し、再度上清をビルコンに移した。次いで、細胞ペレットを懸濁し、２つのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔバイアル（１つはＰＡＰ染色用、１つはＩＣＣ染色用）を調製した後、細胞堆積物のすべてを使い切るまで１回に１滴、バイアルを交互に、細胞堆積物を、調製したバイアルに分注した。次いで、２つのＴｈｉｎＰｒｅｐスライド（１つはＰＡＰ染色用、１つはＩＣＣ染色用）を調製し、ＴｈｉｎＰｒｅｐ２０００機器にて処理した。ＰＡＰ染色用のスライドは酢酸アルコール中に置き、ＩＣＣ用のスライドはＴＰ２０００浴槽中に酒精にて固定し、排水した後Ｓｕｒｇｉｐａｔｈコートスプレーを用いて固定し、平らに置いて自然乾燥させた。液体ベースの細胞診培地（ＬＢＣ）中の尿路上皮細胞の処理標本と染色をＤａｋｏ自動染色機にて行った。標本は４つの区分がある。
ａ．前染色プロトコール組織像スライド。スライドは、酒精および水を順に用いてキシレンから再水和し、マイクロ波中でｐＨ６のクエン酸緩衝液中で１０＋１０分間抗原検索を行った。次いでスライドを水で洗浄し、自動染色機にかけた。
ｂ．前染色プロトコール細胞診スライド。まず、スライドを５０％エタノールに５分間浸し、蒸留水にてすすぎ、ＴＢＳに置いた。ｐＨ７．８のＥＤＴＡ緩衝液中で抗原検索を行い、次いでスライドを２０分間室温で冷ました。スライドを水、その後緩衝液ですすぎ、自動染色機にかけた。
ｃ．自動染色機染色プロトコール（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ＨＲＰ）  Ｄａｋｏ  Ｋｉｔ  ５００７。一連の染色は、ペルオキシダーゼブロックと５分間のＨ２Ｏ２とさらに５分間のＨ２Ｏ２を伴う。次いでスライドをＴＢＳ緩衝液にて３回すすぎ、抗体とコントロールを加えて６０分おき、ＴＢＳ緩衝液にて２回すすぎ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ＨＲＰを加えて３０分置いた。最後に、スライドをＴＢＳ緩衝液にて２回すすぎ、ＤＡＢ基質を加えて５分置いた。
ｄ．後染色プロトコール。初回の自動染色機染色プロトコールの後、スライドを水ですすぎ、ＣｕＳＯ４に３分間浸し、水ですすぎ、ヘマトキシリンにて１０秒間対比染色した。次いで、スライドを水、その後スコット水道水にて４０秒間すすぎ、水ですすぎ、酒精、つまりアルコールおよびキシレンにて２回脱水した。最後に、スライドにＤＰＸにてカバーガラスをかけた。
【００５１】
詳細な方法論は以下の通りである。
１．尿中の膀胱癌細胞の検出に用いる本プロトコールは、ＭＣＭ２／ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）組み合わせによる臨床上皮ＢＣ細胞の染色に基づく。
２．核内のＭＣＭ２抗体（The MRC Cancer Cell Unit, Hutchison MRC Research Centre, Hills Road, Cambridge, CB2 OXZ）の結合と発色団ＤＡＢの効果は、白色顕微鏡下での暗褐色核染色によって可視化することができる。
３．上皮膀胱細胞にＩＣＣ染色を応用するための方法論は以下の通りである。
Ａ．前染色プロトコールは、５０％メタノールにスライドを５分間浸し、蒸留水にてすすぎ、抗原検索のためにｐＨ７．８のＥＤＴＡ緩衝液に９５℃、４５分間置く。
Ｂ．４５分後、容器を室温で２０分間冷まし、蒸留水にてすすぎ、その後スライドを自動染色機に置く。
Ｃ．染色手順には、ＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎキット５００７を用い、スライドに５分間Ｈ２Ｏ２を添加し、ＴＢＳ緩衝液にて３回すすぐペルオキシダーゼブロックを行う。
Ｄ．ブロック手順の後、４００分の１に希釈したＭＣＭ抗体にてスライドを処理し、６０分間インキュベートし、次いで再度ＴＢＳ緩衝液にて３回すすぐ。
Ｅ．この手順の後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ＨＲＰをスライドに３０分間添加する。
Ｆ．次いで、スライドを緩衝液にて２回すすいだ後、ＤＡＢを１０分間添加する。
Ｇ．スライドを再度緩衝液にて１回、蒸留水にて１回すすぎ、硫化銅溶液を５分間スライドに添加し、次いで蒸留水にてすすぐ。
Ｈ．染色が完了した後、スライドを標準的なｎｏｎ−ｇｙｎａｅ  ＳＯＰに従ってＰＡＰにて対比染色する。
【００５２】
本試験の詳細な統計は、記載するように、液体ベースの細胞診スライド調製とＭＣＭ２抗体を用いて評価した。主分析は最適な統計パッケージとしてＳＰＳＳを用いて実行した。各患者群（ＧＨクリニックの１６陽性生検およびＣＳクリニックの２４陽性生検）における年齢分布、性別分布および生検結果に関するデータに注釈を付けた。
【００５３】
データを５つの項目、つまり、肉眼的血尿クリニックに来たが腫瘍は見つからなかった患者；肉眼的血尿クリニックに来て、膀胱のＴＣＣが見つかった患者；顕微鏡血尿の仮診断を受けて肉眼的血尿クリニックに来たが、腫瘍が見つからなかった患者；膀胱鏡検査クリニックに来たが、腫瘍が見つからなかった患者；および、膀胱鏡検査クリニックの訪問により腫瘍が見つかった第５群、にまとめた。
【００５４】
結果
肉眼的血尿（ＧＨ）患者
肉眼的血尿（クリニックに来た患者の尿中の可視的鮮血）を初めて呈する患者において、１０〜４００のＭＣＭ染色細胞の範囲に対する６つのＭＣＭ閾値を実証した。各症例において、感度割合、すなわち既知の膀胱癌陽性組織を有する患者と、特異度割合、すなわち膀胱悪性腫瘍に基づく組織所見を示さない患者を、生検データに対して測定した。
【００５５】
ＭＣＭ閾値＝１０    これは、１０ＭＣＭ陽性細胞のＭＣＭ染色細胞閾値を用いたとき、陽性生検に対して１００％の感度が達成され、その患者群では５１％の特異度であることが実証される。
ＭＣＭ閾値＝３０    陽性生検に対して常法の液体ベースの細胞診スライドに３０以上の染色ＭＣＭ細胞が存在する患者では、その１００％すべての患者が本試験を用いて検出されるであろう。同時に、陰性生検情報を得た患者では、ＭＣＭ試験によって７２％の特異度の結果が検出される。
ＭＣＭ閾値＝５０    膀胱癌陽性生検患者において５０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有する患者では、その悪性腫瘍検出について９２％の感度がある。同時に、５０未満の染色細胞のＭＣＭ閾値を有する陰性生検患者では、この陰性所見の定義について８３％の偶発（チャンス）がある。
ＭＣＭ閾値＝１００    ＭＣＭ閾値が陽性生検組織に対して１００以上の染色細胞であるとき、その陽性結果の検出について７５％の感度がある。それに応じて、陰性生検結果を有する同じ患者群では、腫瘍が存在しないことを示す８９％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００    ２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値がある患者では、この患者における悪性腫瘍検出について陽性生検組織に対して６７％の感度がある。それに応じて、２００未満の染色ＭＣＭ細胞がある患者では悪性腫瘍が存在しないことを示す９８％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００    ＭＣＭ閾値が４００以上であるとき、その患者における悪性腫瘍検出について陽性生検に対して４２％の感度がある。同時に、４００未満のＭＣＭ染色細胞を有する患者では示した陰性生検に対して９８％の特異度が記録される。
【００５６】
膀胱鏡調査（ＣＳ）患者
本グループの患者では、膀胱癌陽性生検の既往があり、これは通常最も一般的なタイプの移行上皮癌（ＴＣＣ）である。存在するとしても、悪性細胞が尿中に排出される場合には他のタイプの癌も検出されるであろう。
【００５７】
ＭＣＭ閾値＝１０    ＭＣＭ染色閾値が１０染色細胞である場合、本グループでは生検陽性である患者の検出について１００％の感度がある。同様に、生検陰性群では膀胱癌の再発を有さない患者の検出について４１％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝３０    ３０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値では、これらの患者での悪性腫瘍を検出する生検陽性組織に対して９５％の感度がある。同時に、生検陰性患者では膀胱腫瘍の再発がないことを示す５４％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝５０    これら患者では、ＭＣＭ閾値が５０以上の染色細胞である場合、生検陽性組織とＭＣＭ染色細胞との間に９０％の感度がある。同時に、膀胱腫瘍の所見がないことを示す患者における生検陰性組織に対して６９％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝１００    ＭＣＭ閾値が１００以上の染色細胞である本患者群では、これらの患者での悪性腫瘍を検出する生検陽性材料に対して９０％の感度がある。同時に、膀胱腫瘍の再発が存在しないことを示す生検陰性個体では８１％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００    ２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有するこれら患者では、組織試料では生検陽性悪性腫瘍を有する患者を検出する９０％の感度がある。同時に、生検陰性個体において再発が起こっていないことを示す９６％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００    本患者群では、生検陽性患者において膀胱腫瘍の再発が生じていることを示す５３％の感度がある。同時に、生検陰性患者において再発が起こっていない患者を検出する９８％の特異度がある。
【００５８】
正常被検体
第三の被検体群には、標準５０ｍｌの尿試料を採取するよう依頼した（アバディーンロイヤル診療所およびアデンブルックズ病院（ケンブリッジ）の両泌尿器外来科で患者が行った通りに）。ここでは、個体が泌尿器疾患および特に感染の所見または既往がないことを要件とした。本グループを、一連の膀胱癌試験にあるすべての患者、肉眼的血尿を呈する患者（初診）および膀胱鏡検査のためにクリニックに戻ってきた患者両方の正常コントロールとした。すべての該被検体の尿は、全く同じように、同じ染料（ＭＣＭ２）を用いた同じ方法によって、そして同じ時間軸内（４時間未満）に分析した。
【００５９】
ＭＣＭ閾値＝１０    本正常被検体群では膀胱腫瘍の非存在の生検検証は行われず、膀胱鏡検査も行われなかった。よって、データは、様々な異なるＭＣＭ閾値での感度および特異度を示すＭＣＭ細胞数を表す。１０のＭＣＭ閾値では、５８％の正常成人は所定の尿試料において感染または悪性腫瘍の可能性を示す染色ＭＣＭ細胞数を持っていた。同時に、この異常が存在しないことを示す４２％の特異度読み取り値があった。
ＭＣＭ閾値＝３０    正常な尿において３０染色ＭＣＭ細胞の閾値では、その正常値の３３％の感度と６７％の特異度があった。これは比較データの増加が重要であることを示し、異常所見がないことを示す特異度が増加するにつれて、悪性腫瘍の可能性を示す感度が低減する。
ＭＣＭ閾値＝５０    ５０以上のＭＣＭ染色細胞数を有するこれら尿試料では、２３％の試料がいくらかの染色と適度な感度を示したのに対して、７７％が悪性腫瘍の転帰がないとする特異度を示した。
ＭＣＭ閾値＝１００    正常な尿において１００以上の染色ＭＣＭ細胞が見られた場合、更なる調査について陽性の転帰を示す１５％の感度があるのに対して、同時に、その心配がないことを示す８５％の特異度があった。
ＭＣＭ閾値＝２００    ２００以上のＭＣＭ染色細胞が見られた場合、炎症または悪性腫瘍の可能性の４％の感度と、その心配または障害の所見がないことを示す９６％の特異度があった。
ＭＣＭ閾値＝４００    正常被検体の尿において４００以上の染色ＭＣＭ細胞が見られた場合、懸念の所見、特に悪性腫瘍がないことを示す０％の感度と、そのような障害または懸念が存在しないことを示す１００％の特異度があった。
【００６０】
説明として、感度の割合、つまり膀胱癌の存在を決定する能力は、生検材料における陽性の組織学的転帰の存在に対して評価した。同様に、これら患者において、特異度、つまり膀胱癌所見の非存在は、生検陰性組織像の所見に対して評価した。正常、つまり泌尿器疾患の所見がないと見られたこれら被検体において得られたこの状況に対する例外は、同じ計数方法による同様な尿評価を行ったが、疾患の膀胱鏡または生検の所見がない場合である。
【００６１】
肉眼的血尿および膀胱鏡調査患者群のデータは、感度が増加するにつれて特異度が低減することを示した。逆に、過去に膀胱癌生検所見があった患者では、特異度が増加するにつれて感度が低減する。
【００６２】
データは、個々の患者および分析群ごとに、クリニックおよび転帰（生検分析）に対するＭＣＭ数のドットプロットにまとめた（データは示さない）。閾値線は、１スライドあたり５０以上の染色細胞のＭＣＭ細胞数で描く。各の区分は、ＧＨクリニックまたはＣＳクリニックまたは正常被検体いずれかにおける生検転帰に関して分析し、５０染色ＭＣＭ細胞の適切な区分スライドにおいてのＭＣＭ染色細胞数と関連づける。
【００６３】
ＧＨクリニックにおける７４％の陰性生検は５０未満のＭＣＭにより正確に同定され、２６％は偽陽性となる。
ＧＨクリニックにおける９４％の陽性生検は５０以上のＭＣＭにより正確に同定され、６％が偽陰性となる。
ＣＳクリニックにおける６７％の陰性生検は５０未満のＭＣＭにより正確に同定され、３３％が偽陽性となる。
ＣＳクリニックにおける８３％の陽性生検が５０以上のＭＣＭにより正確に同定され、１７％が偽陰性となる。
７７％の正常な尿が異常を示すＭＣＭ染色特徴の所見を示さなかったのに対して、２３％の正常な尿が５０以上のＭＣＭ染色細胞の割合であったことを示した。
【００６４】
１０染色ＭＣＭ細胞から４００ＭＣＭ染色細胞までの様々なＭＣＭ細胞数を評価し、５０より多いＭＣＭ染色細胞が１スライド上に存在した場合には悪性腫瘍の頻度が増加したことが明らかとなった。驚くべきことに、５０のＭＣＭ閾値では、肉眼的血尿により外科外来に初めて訪れた患者では転帰陽性がＭＣＭとＰＡＰ（慣例的な細胞診）との間で完全に一致していたことが明らかとなった。さらに、２００のＭＣＭ閾値では、膀胱癌陽性生検の既往があった患者では転帰陽性がＭＣＭとＰＡＰ（慣例的な細胞診）との間で完全に一致していたことが明らかとなった。
【００６５】
さらに、試験の初めには、全細胞数が１０００以上である症例（「細胞適正１０００」と称する）のみ分析し、ＭＣＭ陽性か否かを決定した。これにより細胞診の質の向上が見られ、個々の細胞病理学者により承認され、調製された。
【００６６】
本明細書中の分析を繰り返し、結果を実施例２に示す。
【００６７】
実施例２
材料および方法
ブラッドフォールドロイヤル診療所、アデンブルックズ病院（ケンブリッジ）、ホーマートン病院（ロンドン）およびウェスタン総合病院（エディンバラ）の英国全域の４つの異なる病院で行った本試験では、定期的に各病院の泌尿器外科外来を訪問した合計１０７人の患者を、膀胱癌の可能性または再発について試験した。以前の試験では、移行上皮癌（ＴＣＣ）について調査されたか、またはＴＣＣ陽性生検の膀胱鏡調査のために戻ってきたすべての患者の生態は便宜上２つの主なグループに分けることができたことを示した。
１．肉眼的血尿、すなわち、尿中の明らかな血液所見を呈して、膀胱癌の可能性の早急な検査のために初めてクリニックを訪れた患者（ＧＨ患者）であり、このグループには顕微鏡的血尿、すなわち視覚的診断でなく尿中での生化学的血液所見を呈して初めて訪れた患者も含まれる、および、
２．過去のある時期に膀胱癌の陽性生検診断を下され、腫瘍の性質および悪性度に応じた治療を受け、現在膀胱鏡検査のために来ていた患者（ＣＳ患者）。
【００６８】
これらの患者は、クリニックでの成功事例と一致する定期的な詳細調査を行って追跡調査した。この調査には、定期的な尿細胞診（ここではＭＣＭ抗体検査）のための全量尿採取とともに、特に記載がない限り、詳細な体系的調査、詳細な身体検査、静脈性尿路造影、心電図（ＥＣＧ）および胸部Ｘ線、並びに、最初の発現時または膀胱鏡追跡調査時の外来患者として定期的膀胱スキャンおよび／またはフレキシブル膀胱鏡検査を行った。
【００６９】
関連病院の外科外来科への受付時（８３０〜１２３０）または受付後科内で尿試料を収集した。その後全尿試料を排尿から１時間以内に試験室へ移し、試験室の５０ｍｌ試料から収集した全試料中の十分な数の膀胱上皮細胞を生成した。
【００７０】
次いで、試験室内の指定実施者によって尿を遠心分離（２５００ｒｐｍ×１０分）するという所定の試験手順を実施した。上清液を注ぎ出し、細胞ペレットをＳｕｒｅＰａｔｈ固定液に添加した。試料を１５分間放置し、その後２５００ｒｐｍで１０分間再遠心分離した。再度、上清液を注ぎ出し、残りの細胞ペレットを密閉した試料チューブに入れボルテックスをかけた。次いで、試料チューブをＴｒｉｐａｔｈ機の桶に入れ、スライドと設定チャンバーを組み入れ、ＥＡ／ＯＧについて標識したチューブをＤＩ水から除き、対応する試薬ボトルに置いた。「Ｈｅｍａ」と標識した細いチューブもＤＩ水の外に出し、ヘマトキシリンのボトルに置いた。次いで、操作者はＳｕｒｅＰａｔｈ機上のピペット先端ボックスが平らなままであり、廃棄物桶ポンプが作動し、コンピューターが接続され、ＳｕｒｅＰａｔｈ尿細胞診分析に特異的なプログラムが実行されたことを確認した。その後、Ｔｒｉｐａｔｈ（ＳｕｒｅＰａｔｈ）システムのための残りのプロトコールは標準非婦人科プログラムＳＯＰを用いて実施された。Ｔｒｉｐａｔｈ非婦人科プログラムＳＯＰが完了した後、スライド調製のためのＴｒｉｐａｔｈアプローチの標準清浄システムが実施された。
【００７１】
本試験の詳細な統計は、記載するように、液体ベースの細胞診スライド調製とＭＣＭ２抗体を用いて評価した。主分析は最適な統計パッケージとしてＳＰＳＳを用いて実行した。各患者群における年齢分布、性別分布および生検結果に関するデータに注釈を付けた。
【００７２】
データを６つの項目、つまり、肉眼的血尿クリニックに来たが腫瘍は見つからなかった患者；肉眼的血尿クリニックに来て、膀胱のＴＣＣが見つかった患者；顕微鏡血尿の仮診断を受けて肉眼的血尿クリニックに来たが、腫瘍が見つからなかった患者；膀胱鏡検査クリニックに来たが、腫瘍が見つからなかった患者；膀胱鏡検査クリニックに来て、膀胱のＴＣＣが見つかった患者；および、尿路感染および尿路疾患のいずれの症状もない５０歳以上の健康なボランティア群も同じクリニックから選択し、本一連の評価にわたって正常コントロール被検体として用いた第６群、にまとめた。
【００７３】
結果
肉眼的血尿（ＧＨ）患者
肉眼的血尿（クリニックに来た患者の尿中の可視的鮮血）を初めて呈する患者において、１０〜４００のＭＣＭ染色細胞の範囲に対する６つのＭＣＭ閾値を実証した。各症例において、感度割合、すなわち既知の膀胱癌陽性組織を有する患者と、特異度割合、すなわち膀胱悪性腫瘍に基づく組織所見を示さない患者を、生検データに対して測定した。
【００７４】
ＭＣＭ閾値＝１０（図１）
これは、１０ＭＣＭ陽性細胞のＭＣＭ染色細胞閾値を用いたとき、陽性生検に対して１００％の感度が達成され、その患者群では３１％の特異度であることが実証される。
ＭＣＭ閾値＝３０（図２）
陽性生検に対して常法の液体ベースの細胞診スライドに３０以上の染色ＭＣＭ細胞が存在する患者では、その１００％すべての患者が本試験を用いて検出されるであろう。同時に、陰性生検情報を得た患者では、ＭＣＭ試験によって６３％の特異度の結果が検出される。
ＭＣＭ閾値＝５０（図３）
膀胱癌陽性生検患者において５０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有する患者では、その悪性腫瘍検出について８３％の感度がある。同時に、５０未満の染色細胞のＭＣＭ閾値を有する陰性生検患者では、この陰性所見の定義について８１％の偶発（チャンス）、すなわち特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝１００（図４）
ＭＣＭ閾値が陽性生検組織に対して１００以上の染色細胞であるとき、その陽性結果の検出について８３％の感度がある。それに応じて、陰性生検結果を有する同じ患者群では、腫瘍が存在しないことを示す８１％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００（図５）
２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値がある患者では、この患者における悪性腫瘍検出について陽性生検組織に対して８３％の感度がある。それに応じて、２００未満の染色ＭＣＭ細胞がある患者では悪性腫瘍が存在しないことを示す８８％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００（図６）
ＭＣＭ閾値が４００以上であるとき、その患者における悪性腫瘍検出について陽性生検に対して８３％の感度がある。同時に、４００未満のＭＣＭ染色細胞を有する患者では示した陰性生検に対して８７％の特異度が記録される。
【００７５】
膀胱鏡調査（ＣＳ）患者
本グループの患者では、膀胱癌陽性生検の既往があり、これは通常最も一般的なタイプの移行上皮癌（ＴＣＣ）である。存在するとしても、悪性細胞が尿中に排出される場合には他のタイプの癌も検出されるであろう。
【００７６】
ＭＣＭ閾値＝１０（図７）
ＭＣＭ染色閾値が１０染色細胞である場合、本グループでは生検陽性である患者の検出について１００％の感度がある。同様に、生検陰性群では膀胱癌の再発を有さない患者の検出について３９％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝３０（図８）
３０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値では、これらの患者での悪性腫瘍を検出する生検陽性組織に対して１００％の感度がある。同時に、生検陰性患者では膀胱腫瘍の再発がないことを示す６４％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝５０（図９）
これら患者では、ＭＣＭ閾値が５０以上の染色細胞である場合、生検陽性組織とＭＣＭ染色細胞との間に１００％の感度がある。同時に、膀胱腫瘍の所見がないことを示す患者における生検陰性組織に対して８２％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝１００（図１０）
ＭＣＭ閾値が１００以上の染色細胞である本患者群では、これらの患者での悪性腫瘍を検出する生検陽性材料に対して９１％の感度がある。同時に、膀胱腫瘍の再発が存在しないことを示す生検陰性個体では９１％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００（図１１）
２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有するこれら患者では、組織試料では生検陽性悪性腫瘍を有する患者を検出する９１％の感度がある。同時に、生検陰性個体において再発が起こっていないことを示す９３％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００（図１２）
本患者群では、生検陽性患者において膀胱腫瘍の再発が生じていることを示す８２％の感度がある。同時に、生検陰性患者において再発が起こっていない患者を検出する９３％の特異度がある。
【００７７】
併用クリニック（ＧＨ＋ＣＳ）
本患者群では、肉眼的血尿、すなわちクリニックに来た患者の尿中に可視的鮮血を初めて呈する患者と、加えて以前の治療およびその後の治療の腫瘍について生検陽性であり膀胱鏡検査（ＣＳ）のためにクリニックに戻ってきた患者からのデータであり、これらの症例を、移行上皮細胞生検陽性腫瘍を有する単一群の患者として表す。
【００７８】
ＭＣＭ閾値＝１０（図１３）
ＭＣＭ染色閾値が１０染色細胞である場合、本グループでは生検陽性である患者の検出について１００％の感度がある。同様に、生検陰性群では膀胱癌の再発を有さない患者の検出について３７％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝３０（図１４）
３０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値では、これらの患者での悪性腫瘍を検出する生検陽性組織に対して１００％の感度がある。同時に、生検陰性患者では膀胱腫瘍の再発がないことを示す６３％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝５０（図１５）
ＭＣＭ閾値が５０以上の染色細胞である本患者群では、生検陽性組織とＭＣＭ染色細胞との間に９４％の感度がある。同時に、膀胱腫瘍の所見がないことを示す患者における生検陰性組織に対して８２％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝１００（図１６）
ＭＣＭ閾値が１００以上の染色細胞である本患者群では、これらの患者での悪性腫瘍を検出する生検陽性材料に対して８８％の感度がある。同時に、膀胱腫瘍の再発が存在しないことを示す生検陰性個体では８８％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００（図１７）
２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有するこれら患者では、組織試料では生検陽性悪性腫瘍を有する患者を検出する８８％の感度がある。同時に、生検陰性個体において再発が起こっていないことを示す９２％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００（図１８）
本患者群では、生検陽性患者において膀胱腫瘍の再発が生じていることを示す８２％の感度がある。同時に、生検陰性患者において再発が起こっていない患者を検出する９２％の特異度がある。
【００７９】
正常被検体（膀胱腫瘍の所見なし）
５０歳以上の正常被検体のグループを、肉眼的血尿または過去に生検陽性疾患を有していた膀胱鏡検査のいずれかを呈する患者の集団ベースのコントロールとして用いた。この被検体のデータ（正常クリニックという）は感度以外全く同じように注釈を付けた。つまり、生検上の陽性腫瘍の所見は記録しなかった。これは、これら被検体が正常コントロールのメカニズムとして膀胱鏡も生検も受けていないことと関連する。
【００８０】
ＭＣＭ閾値＝１０（図１９）
ＭＣＭ染色細胞閾値に１０のＭＣＭ陽性細胞を用いている本被検体群では、疾患が存在しないことを裏付ける１８％の特異度がある。本群の残りの被検体は、ここで取り上げた症状が否定されたとしても、泌尿器感染または一ないしは他の臨床分類の混同と関連していたかもしれない。
ＭＣＭ閾値＝３０（図２０）
３０以上の染色ＭＣＭ細胞が存在するこれら被検体では、慣例的な液体ベースの細胞診スライドにおいて、３６％の被検体が膀胱腫瘍の所見がないことを示す特異度を示した。
ＭＣＭ閾値＝５０（図２１）
５０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有する被検体では、腫瘍発生の所見がないことを示す５５％の特異度があった。
ＭＣＭ閾値＝１００（図２２）
尿中に１００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値を有する本被検体群では、膀胱癌の所見がないことを示す９１％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００（図２３）
２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本被検体群では、悪性膀胱疾患の所見がないことを示す９１％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００（図２４）
この例では、ＭＣＭ閾値が４００以上である場合、これら被検体に膀胱癌の所見がないことを示す９１％の特異度がある。
【００８１】
顕微鏡的血尿（ＭＨ）患者
本患者群では、たとえこれら患者がＧＨクリニックへの紹介の７０％以下を構成するとしても、特にＴＣＣ頻度が低い。ゆえに、彼らは、患者の膀胱鏡が共通して陰性である、つまり腫瘍が見られないのでほとんどが生検を受けていない重要な患者群を含む。更なる診断試験としてＭＣＭを使用することは、膀胱癌がないことを確認する上で非常に有益である。
【００８２】
ＭＣＭ閾値＝１０（図２５）
１０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本患者群では、膀胱癌の所見が存在しないことを示す８０％の特異度がある。生検所見がない場合には感度は求められない。
ＭＣＭ閾値＝３０（図２６）
３０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本患者群では、膀胱癌の所見が存在しないことを示す９０％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝５０（図２７）
５０以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本患者群では、膀胱癌の所見が存在しないことを示す９０％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝１００（図２８）
１００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本患者群では、膀胱癌の所見が存在しないことを示す９０％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝２００（図２９）
２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本患者群では、膀胱癌の所見が存在しないことを示す９３％の特異度がある。
ＭＣＭ閾値＝４００（図３０）
４００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値が存在する本患者群では、膀胱癌の所見が存在しないことを示す９７％の特異度がある。
【００８３】
図１から１２の説明として、感度の割合、つまり膀胱癌の存在を決定する能力は、生検材料における陽性の組織学的転帰の存在に対して評価した。同様に、これら患者において、特異度、つまり膀胱癌所見の非存在は、生検陰性組織像の所見に対して評価した。図１３から１８では、全体の感度と特異度の割合を、生検陽性ＴＣＣの所見を有する患者または膀胱鏡調査のために戻ってくる患者すべてにおいて注釈する。さらに、図１９から２４では、特に過去も現在も泌尿器疾患の既往がない５０歳＋の正常被検体群を比較群として用いる。図２５から３０では、ＧＨクリニックに受診し、顕微鏡的血尿が見られた患者群は、公知のＴＣＣ低発症率を示し、陰性膀胱鏡に基づいて生検材料が無い場合には、ＭＣＭ細胞数を増やして対応する高い特異度を示す。
【００８４】
肉眼的血尿および膀胱鏡調査患者群のデータは、感度が増加するにつれて特異度が低減することを示した。逆に、過去に膀胱癌生検所見があった患者では、特異度が増加するにつれて感度が低減する。
【００８５】
データは、個々の患者および分析群ごとに、クリニックおよび転帰（生検分析）に対するＭＣＭ数のドットプロットにまとめた。
【００８６】
ＧＨクリニックにおける８１％の陰性生検は５０未満のＭＣＭにより正確に同定され、１９％は偽陽性となる。
ＧＨクリニックにおける８３％の陽性生検は５０以上のＭＣＭにより正確に同定され、１７％が偽陰性となる。
ＣＳクリニックにおける８２％の陰性生検は５０未満のＭＣＭにより正確に同定され、１８％が偽陽性となる。
ＣＳクリニックにおける１００％の陽性生検が５０以上のＭＣＭにより正確に同定され、０％が偽陰性となる。
５５％の正常な尿は異常を示すＭＣＭ染色特徴の所見を示さなかったのに対して、４５％の正常な尿は５０以上のＭＣＭ染色細胞の割合であったことを示した。
ＭＨクリニックでの９０％の尿は異常を示すＭＣＭ染色特徴の所見を示さなかったのに対して、１０％は５０以上のＭＣＭ染色細胞の割合であったことを示した。
【００８７】
１０染色ＭＣＭ細胞から４００ＭＣＭ染色細胞までの様々なＭＣＭ細胞数を評価し、５０より多いＭＣＭ染色細胞が１スライド上に存在した場合には疾患の起源、つまり初診か膀胱鏡検査かにかかわらず悪性腫瘍の頻度が増加したことが明らかとなった。ＧＨクリニックでの５０以上の染色細胞の閾値でＭＣＭをＰＡＰ評価と比較した場合、７７．８％のＴＣＣが同定され、９１．７％が腫瘍の所見がない特異度を示した。
加えて、ＣＳクリニックでの２００以上の染色細胞のＭＣＭ閾値では、ＭＣＭとＰＡＰ（慣例的細胞診）との間で８４．６％のＴＣＣが同定され、重要なことに、本患者群では、９７．２％は膀胱腫瘍の再発がないことが認められた。
【００８８】
併用クリニック（ＧＨおよびＣＳ）では、ＭＣＭとＰＡＰとの併用は、悪性腫瘍の変化を決定するのに８１．８％の相関を示し、悪性腫瘍の所見がないことの決定について９５．８％の特異度であった。
【００８９】
重要なことには、試験の初めには、全細胞数が５０００以上である症例（「細胞適正５０００」と称する）のみ分析し、ＭＣＭ陽性か否かを決定した。これにより細胞診の質の向上が見られ、個々の細胞病理学者により承認され、調製された。
【００９０】
膀胱癌におけるＭＣＭの予後の指標
泌尿器クリニックで再調査した患者の慣例的な追跡調査の一部として、過去に膀胱癌陽性生検があった患者に追跡調査を実施した。このような患者への追跡調査のパターンは、繰り返しの調査および膀胱鏡検査のための一連の来院を初めの２年間は平均年に４回、３年目および４年目は年に２回、それ以降腫瘍再発の所見が見られなければ年に１回が最良の方法であることを示した。しかしながら、いずれのセンターでも多くの症例において、組織学的に膀胱癌の根拠はなく実際に癌の再発はないが、尿試験において顕著にＭＣＭ陽性であった患者がいたことは興味深いことであった。あるセンターでは、５人の患者が最後の１８か月に再検討されたが、すべての患者はＣＳクリニックのもので、そのセンターでの偶発的定期調査で退院した。しかしながら、１８か月から２年の期間内での症例の再発に基づいて、この５人の患者は急性調査のために来院し、再生検を行ったところ、すべてが悪性膀胱疾患を持っていた（表１）。発明者等は、ＭＣＭは、過去に生検陰性であったがＭＣＭ陽性であった患者の予後の指標となり、このような患者の膀胱癌転帰および患者管理の点で価値があると考える。
【表１】
2014501929.tif 000003
【図１】
2014501929.tif 000004
【図２】
2014501929.tif 000005
【図３】
2014501929.tif 000006
【図４】
2014501929.tif 000007
【図５】
2014501929.tif 000008
【図６】
2014501929.tif 000009
【図７】
2014501929.tif 000010
【図８】
2014501929.tif 000011
【図９】
2014501929.tif 000012
【図１０】
2014501929.tif 000013
【図１１】
2014501929.tif 000014
【図１２】
2014501929.tif 000015
【図１３】
2014501929.tif 000016
【図１４】
2014501929.tif 000017
【図１５】
2014501929.tif 000018
【図１６】
2014501929.tif 000019
【図１７】
2014501929.tif 000020
【図１８】
2014501929.tif 000021
【図１９】
2014501929.tif 000022
【図２０】
2014501929.tif 000023
【図２１】
2014501929.tif 000024
【図２２】
2014501929.tif 000025
【図２３】
2014501929.tif 000026
【図２４】
2014501929.tif 000027
【図２５】
2014501929.tif 000028
【図２６】
2014501929.tif 000029
【図２７】
2014501929.tif 000030
【図２８】
2014501929.tif 000031
【図２９】
2014501929.tif 000032
【図３０】
2014501929.tif 000033
【国際調査報告】
2014501929.tif 000034
2014501929.tif 000035
2014501929.tif 000036
2014501929.tif 000037