(57)【要約】  本開示は、特定的には急性骨髄性白血病などの白血病の治療における、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＨ配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＬ配列、
（ｃ）配列番号３、配列番号４、および配列番号５にそれぞれ対応するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３の配列に対して同一である、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、および／またはＶＨ  ＣＤＲ３の配列、
（ｄ）配列番号６、配列番号７、および配列番号８にそれぞれ対応するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３の配列に対して同一である、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３の配列、または
（ｅ）配列番号３、配列番号４、および配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８にそれぞれ対応するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３の配列に対して同一である、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３の配列、
を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞上での内因性表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５の半減期が約５分間未満、約４分間未満、または約３分間未満である速度で、前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスを誘発する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞上での内因性表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５の半減期が約５分間未満である速度で、抗体またはその抗原結合フラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスを誘発する、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、約４分間未満の半減期速度でＫ５６２細胞上でＳｉｇｌｅｃ−１５をエンドサイトーシスする、請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞上での内因性表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５の半減期が約３分間未満である速度で、前記抗体がＳｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスを誘発する、請求項３または４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
（ａ）配列番号１の参照ＶＨ配列に対して少なくとも９０％の同一性であるＶＨ配列および／または（ｂ）配列番号２の参照ＶＬ配列に対して少なくとも９０％の同一性であるＶＬ配列を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記ＶＨおよび／またはＶＬ配列が前記参照ＶＨおよびＶＬ配列に対して少なくとも９５％の同一性である、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
前記ＶＨおよび／またはＶＬ配列が前記参照ＶＨおよびＶＬ配列に対して少なくとも９９％の同一性である、請求項８に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
配列番号１および／または配列番号２を含む、請求項９に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントと同一のＳｉｇｌｅｃ−１５エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
Ａ９Ｅ８のＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントと同一のＳｉｇｌｅｃ−１５エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する、かつＡ９Ｅ８のＶＨおよび／またはＶＬを含む抗体またはその抗原結合フラグメントによるＳｉｇｌｅｃ−１５結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒト化、キメラ、完全ヒト、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＶＨおよび／またはＶＬ配列を含むポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントまたはポリペプチドを産生する単離された細胞。
【請求項１７】
（ａ）請求項１６に記載の細胞を培養するステップ、および（ｂ）前記抗体またはそのフラグメントまたはポリペプチドを前記培養細胞から単離するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントまたはポリペプチドを作製する方法。
【請求項１８】
前記細胞が真核細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）または（Ｃ）−（Ｌ）−（Ａ）
（式中、
（Ａ）は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、
（Ｌ）は、リンカーであり、かつ
（Ｃ）は、細胞傷害剤であり、
ここで、前記リンカー（Ｌ）は、（Ａ）を（Ｃ）に連結する）
を有する免疫コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１〜１５または１９のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント、ポリペプチド、または免疫コンジュゲートと、担体とを含む組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＶＨまたはＶＬをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む抗体をコードする、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２１または請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４】
有効量の抗体またはそのフラグメントを被験体に投与するステップを含み、前記抗体またはそのフラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する、それを必要とする被験体において急性骨髄性白血病を治療する方法。
【請求項２５】
有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント、請求項１５に記載のポリペプチド、請求項１９に記載の免疫コンジュゲート、または請求項２０に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体において急性骨髄性白血病を治療する方法。
【請求項２６】
前記投与が白血病幹細胞の数を低減する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
有効量の抗体またはそのフラグメントを被験体に投与するステップを含み、前記抗体またはそのフラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する、それを必要とする被験体において急性骨髄性白血病の治療に伴う副作用を低減する方法。
【請求項２８】
有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント、請求項１５に記載のポリペプチド、請求項１９に記載の免疫コンジュゲート、または請求項２０に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体において急性骨髄性白血病の治療に伴う副作用を低減する方法。
【請求項２９】
前記副作用が骨髄抑制または肝毒性である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
有効量の抗体またはそのフラグメントを被験体に投与するステップを含み、前記抗体またはそのフラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する、ＡＭＬ患者において芽球の数を低減する方法。
【請求項３１】
有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント、請求項１５に記載のポリペプチド、請求項１９に記載の免疫コンジュゲート、または請求項２０に記載の組成物を患者に投与するステップを含む、ＡＭＬ患者において芽球の数を低減する方法。
【請求項３２】
前記被験体がヒトである、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体のＡＭＬ芽球がＣＤ３３＋である、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体のＡＭＬ芽球がＣＤ３３−である、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
有効量の抗体またはそのフラグメントを被験体に投与するステップを含み、前記抗体またはそのフラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する、ＣＤ３３の低発現を有するかまたはＣＤ３３−であるかのいずれかである被験体において急性骨髄性白血病を治療する方法。
【請求項３６】
有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント、請求項１５に記載のポリペプチド、請求項１９に記載の免疫コンジュゲート、または請求項２０に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、ＣＤ３３の低発現を有するかまたはＣＤ３３−であるかのいずれかである被験体において急性骨髄性白血病を治療する方法。
【請求項３７】
前記低発現が、ＣＤ３３を標的とする療法による治療が原因である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体を産生するステップを含み、療法剤が、正常末梢血白血球よりも優先的にＡＭＬ芽球を標的とする、急性骨髄性白血病療法剤を作製する方法。
【請求項３９】
前記抗体が組換え体である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、およびそれらの使用、とくに急性骨髄性白血病の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、正常造血が未成熟芽細胞の悪性増殖で置き換えられた致命的疾病である。感染、出血、および貧血などの症状は、この骨髄不全に関連付けられ、未治療のまま放置すれば、患者の死をもたらすであろう。ＡＭＬは、英国では毎年約２，０００人が罹患し、発生率は、人口の高齢化に伴って増加している。治癒的治療は、きわめて集中的で患者にとって耐えがたく、高額であり、しかも長期の入院を必要とするので、国民保健制度にかなりの負担となる。それに加えて、アップフロント療法またはサルベージ療法のいずれでも、同種異系骨髄移植の使用は、それが適切な患者におけるさらなる出費を意味する。これにもかかわらず、ＡＭＬの患者の大多数は、依然として、この疾患が原因で死亡する。
【０００３】
ＡＭＬを治療するために、多くの薬剤が開発されてきた。従来の化学療法剤に加えて、ＡＭＬ芽球を選択的に標的とするために、治療用抗体が開発されてきた。シアル酸結合免疫グロブリン様Ｓｉｇｌｅｃタンパク質ＣＤ３３を標的とするゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）は、年齢６０歳を超える患者に対して認可されている（Ｂｒｏｓｓ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（６）：１４９０−６（２００１））。
【０００４】
ＣＤ３３は、多くのＡＭＬ芽球上に見いだされる抗原であり、ＧＯは、ＣＤ３３に結合する毒素コンジュゲート抗体である。最近、ランダム化試験（ＡＭＬ１５）により、ＧＯで治療された患者に対して、主に再発の発生率の低下に関連付けられる無病生存優位性が報告された（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（４）：３６９−７７（２０１１））。しかしながら、ＡＭＬの症例の約１０％は、ＣＤ３３を発現せず、また、ＧＯは、おそらくＣＤ３３が健常造血幹細胞上で発現されることが原因で、比較的稀ではあるが命にかかわる可能性のある骨髄抑制を含む副作用に関連付けられる（Ｔａｕｓｓｉｇ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６（１３）：４０８６−９２（２００５））。ＡＭＬ１５試験では、この副作用は、ＧＯで治療された患者がより多くの血小板輸血およびＩＶ抗生物質を必要としたという事実により顕在化したものと思われた。他の研究では、ＧＯによる治療はまた、用量制限副作用として肝毒性をもたらした（Ｍｕｌｆｏｒｄ  Ｄ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４５（２）：１０４−９（２００８））。
【０００５】
すべての悪性疾患に対する癌幹細胞の存在は、かなり議論されたトピックであるが、白血病に存在することは、広く認められている。癌幹細胞の存在の最初の証拠は、急性骨髄性白血病で実証された。ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋは、白血病細胞のＣＤ３４＋ＣＤ３８−サブ集団を単離し、この細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍を再増殖可能であることを示した（Ｂｈａｔｉａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１０）：５３２０−５（１９９７））。また、最近の研究では、白血病幹細胞能がＣＤ３８＋区画に存在することが示唆された（Ｔａｕｓｓｉｇ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１２（３）：５６８−７５（２００８））。その生態および特異な特性に関する知識の増大に伴って、白血病幹細胞を標的とする研究が始まっている（Ｃｈａｎ  ＷＩ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｌｙ  ＢＪ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５（４）：３２６−３５（２００８））。白血病療法では、白血病幹細胞サブ集団を標的として積極的な研究がなされているが、この細胞を特異的に標的とする薬剤は、これまで得られていない。
【０００６】
Ｓｉｇｌｅｃは、シアル酸に結合する免疫グロブリンスーパーファミリー受容体のファミリーである（Ｖａｒｋｉ  Ａ  ａｎｄ  Ａｎｇａｔａ  Ｔ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（１）：１Ｒ−２７Ｒ（２００６））。それは、免疫細胞上で、とくに骨髄系列の免疫細胞上で一般に発現される。ほとんどのＳｉｇｌｅｃは、阻害性であるが、最近、新規な活性化Ｓｉｇｌｅｃ、すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ−１４、１５、および１６が見いだされた（Ａｎｇａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：１９６４−１９７３（２００６）、Ａｎｇａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １７：８３８−８４６（２００７）、Ｃａｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：２３０３−２３１５（２００８））。異なるＳｉｇｌｅｃは、ほとんどの哺乳動物細胞表面の外縁に見いだされる九炭素系の糖であるシアル酸の個別の結合に対して異なる親和性を有する。Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、種間でよく保存された新たに記載されたＳｉｇｌｅｃであり、ゼブラフィッシュにおいてヒト配列の認識可能オルソログを有する。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の初期特性解析では、そのリガンドとしてα−２，６結合のシアル酸が明らかにされ、それへの結合は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のＮ末端Ｖセット免疫グロブリンドメイン中の必須アルギニン残基に依存した（Ａｎｇａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５はまた、さまざまな腫瘍中で高度に発現されるシアリルＴｎ抗原に結合することが示されている（Ａｎｇａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、負および正の両方のシグナル伝達モチーフを備えているという点で普通でない。膜貫通ドメインでは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体共通γ鎖などの正のシグナル伝達アダプター分子と会合可能であり、同時に、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、一般に阻害シグナルを媒介する免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）として知られる細胞質内ＩＴＩＭ様モチーフをコードする（Ｓｈｌａｐａｔｓｋａ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（９）：５４８０−７（２００１））。二重シグナル伝達モチーフをコードする免疫受容体の唯一の他の例は、ＫＩＲ２ＤＬ４であり、これは、ＩＴＡＭをコードするアダプターであるＦｃ受容体共通γ鎖と会合し（Ｍｉａｈ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０（５）：２９２２−３２（２００８））、Ｋｉｋｕｃｈｉ−Ｍａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４（７）：３８５９−６３（２００５））、さらにはそれ自体の細胞質内テールに阻害ＩＴＩＭモチーフを含有する（Ｆａｕｒｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ  ＥＯ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８（１２）：６２０８−１４（２００２））。
【０００７】
白血病治療の標的としてＳｉｇｌｅｃに対する関心が高まっている。Ｎｇｕｙｅｎらは、ＡＭＬ細胞上での発現に関して公知のＣＤ３３ｒＳｉｇｌｅｃ（Ｓｉｇｌｅｃの主要サブファミリー）の大多数のプロファイルを調べた（Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＨ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３４（６）：７２８−３５（２００６））。彼らは、ＡＭＬの各主要サブグループに特徴的なＳｉｇｌｅｃ発現プロファイル、さらには患者特異的なＣＤ３３ｒＳｉｇｌｅｃフィンガープリントを同定した。Ｓｉｇｌｅｃの組合せを標的とすることにより患者のＳｉｇｌｅｃ発現の全プロファイリングを追跡する白血病治療にカスタマイズされた手法が提案されてきた。Ｓｉｇｌｅｃを標的とする利点は、それらのほとんどが迅速なエンドサイトーシスを呈することである。Ｕ９３７細胞表面上でのＳｉｇｌｅｃ−５およびＳｉｇｌｅｃ−９の抗体誘発エンドサイトーシスは、約１００分間の類似の半減期を有する。しかしながら、ＡＭＬを治療するためのＳｉｇｌｅｃベースの療法は、開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｒｏｓｓ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（６）：１４９０−６（２００１）
【非特許文献２】Ｂｕｒｎｅｔｔ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（４）：３６９−７７（２０１１）
【非特許文献３】Ｔａｕｓｓｉｇ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６（１３）：４０８６−９２（２００５）
【非特許文献４】Ｍｕｌｆｏｒｄ  Ｄ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４５（２）：１０４−９（２００８）
【非特許文献５】Ｂｈａｔｉａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１０）：５３２０−５（１９９７）
【非特許文献６】Ｔａｕｓｓｉｇ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１２（３）：５６８−７５（２００８）
【非特許文献７】Ｃｈａｎ  ＷＩ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｌｙ  ＢＪ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５（４）：３２６−３５（２００８）
【非特許文献８】Ｖａｒｋｉ  Ａ  ａｎｄ  Ａｎｇａｔａ  Ｔ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（１）：１Ｒ−２７Ｒ（２００６）
【非特許文献９】Ａｎｇａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：１９６４−１９７３（２００６）
【非特許文献１０】Ａｎｇａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １７：８３８−８４６（２００７）
【非特許文献１１】Ｃａｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：２３０３−２３１５（２００８）
【非特許文献１２】Ｓｈｌａｐａｔｓｋａ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（９）：５４８０−７（２００１
【非特許文献１３】Ｍｉａｈ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０（５）：２９２２−３２（２００８））
【非特許文献１４】Ｋｉｋｕｃｈｉ−Ｍａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４（７）：３８５９−６３（２００５）
【非特許文献１５】Ｆａｕｒｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ  ＥＯ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８（１２）：６２０８−１４（２００２）
【非特許文献１６】Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＨ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３４（６）：７２８−３５（２００６）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５発現と白血病との間の関連性を同定する。本発明はまた、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、およびそれらの抗原結合フラグメント、ならびにＡＭＬなどの白血病を治療するためのそのような分子の使用方法を提供する。重要なこととして、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、および抗原結合フラグメントは、ＣＤ３３を標的とするＡＭＬ療法に伴う副作用を回避する療法剤を提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＨ配列；配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＬ配列；配列番号３、配列番号４、および配列番号５にそれぞれ対応するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３の配列に対して同一である、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、および／またはＶＨ  ＣＤＲ３の配列；配列番号６、配列番号７、および配列番号８にそれぞれ対応するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３の配列に対して同一である、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３の配列；または配列番号３、配列番号４、および配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８にそれぞれ対応するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３の配列に対して同一である、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３の配列と、を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＨ配列と、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＬ配列と、を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明に係る免疫コンジュゲート、単離された抗体、または抗原結合フラグメントは、ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞上での内因性表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５の半減期が約５分間未満、約４分間未満、または約３分間未満である速度でＳｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスを誘発する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明に係る単離された抗体または抗原結合フラグメントは、上記の抗体または抗原結合フラグメントと同一のＳｉｇｌｅｃ−１５エピトープに特異的に結合するかまたは競合する。さらなる実施形態では、本発明に係る単離された抗体または抗原結合フラグメントは、Ａ９Ｅ８のＶＨおよび／もしくはＶＬの領域または１つ以上のＣＤＲ領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントと同一のＳｉｇｌｅｃ−１５エピトープに特異的に結合するか、またはＡ９Ｅ８のＶＨおよび／もしくはＶＬの領域または１つ以上のＣＤＲ領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントによるＳｉｇｌｅｃ−１５結合を競合的に阻害する。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト化、キメラ、完全ヒト、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。
【００１５】
また、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントのＶＨおよび／もしくはＶＬの配列または１つ以上のＣＤＲ配列を含むポリペプチドが提供される。他の実施形態では、本発明に係る抗体、抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを産生する単離された細胞、ならびに（ａ）抗体または抗原結合フラグメントを産生する単離された細胞を培養するステップ、および（ｂ）培養された細胞から抗体、抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを単離するステップを含む、本発明に係る抗体、抗原結合フラグメント、またはポリペプチドの作製方法が提供される。
【００１６】
また、式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）または（Ｃ）−（Ｌ）−（Ａ）（式中、（Ａ）は、本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、（Ｌ）は、リンカーであり、かつ（Ｃ）は、細胞傷害剤であり、ここで、リンカー（Ｌ）は、（Ａ）を（Ｃ）に連結する）を有する免疫コンジュゲートが提供される。
【００１７】
本発明はさらに、本発明に係る免疫コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、またはポリペプチドと、担体とを含む組成物を提供する。
【００１８】
また、上記のＶＨまたはＶＬをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む抗体をコードする。さらなる実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００１９】
また、有効量の本発明に係る免疫コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、または組成物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体において急性骨髄性白血病を治療する方法が提供される。追加の実施形態では、急性骨髄性白血病を治療する方法は、白血病幹細胞の数を低減する。
【００２０】
また、有効量の本発明に係る免疫コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、または組成物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体において急性骨髄性白血病の治療に伴う副作用を低減する方法が提供される。特定の実施形態では、副作用は、骨髄抑制および／または肝毒性である。
【００２１】
また、有効量の本発明に係る免疫コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、または組成物を患者に投与するステップを含む、ＡＭＬ患者において芽球の数を低減する方法が提供される。追加の実施形態では、芽球は、ＣＤ３３＋またはＣＤ３３−である。
【００２２】
また、有効量の本発明に係る免疫コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、または組成物を被験体に投与するステップを含む、ＣＤ３３の低発現を有するかまたはＣＤ３３−であるかのいずれかである被験体において急性骨髄性白血病を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、この低発現は、ＣＤ３３を標的とする療法による治療が原因である。
【００２３】
また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体を産生するステップを含む、急性骨髄性白血病療法剤の作製方法が提供され、ここでこの療法剤は、正常末梢血白血球よりも優先的にＡＭＬ芽球を標的とする。特定の実施形態では、この方法に係る抗体は、組換え体である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｓｉｇｌｅｃ−１５転写物発現。（Ａ）特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより４つのヒトＳｉｇｌｅｃ−１５スプライス変異体を同定した。ＤＡＭＩ（巨核球細胞系）、ＨＥＬ（赤白血病細胞系）、およびＫ５６２（赤白血病細胞系）からのＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動を示す（左側）。転写物のエキソン地図を配列決定後に作成した（右側）。表示は、たとえば、「２Ｄ」が２つのドメインを意味するなど、各スプライス変異体中に含有される細胞外免疫グロブリン様ドメインの数を反映する。１つのドメイン「１Ｄ」のスプライス変異体では、２つのアイソフォームが同定された。「１Ｄ−Ａ」は、「１Ｄ−Ｂ」では欠如しているエキソン２からの追加の短いペプチドをコードする。（Ｂ）試験した７つの異なる細胞系のうちの６つでＳｉｇｌｅｃ−１５転写物を同定するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果。ＹＴ（ナチュラルキラー様白血病細胞系）のみ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５転写物を示さなかった。４８時間にわたるＰＭＡまたはＬＰＳの刺激により、転写物の発現がアップレギュレートされた。等負荷の対照（０．４ｋｂ）に対するＧＡＰＤＨ  ＲＴ−ＰＣＲを各パネルの下側に示す。２９３Ｔ細胞を陰性対照として使用した。
【図２】Ｓｉｇｌｅｃ−１５特異的モノクローナル抗体。（Ａ）ファージディスプレイ技術を利用して、精製Ｓｉｇｌｅｃ−１５さらには細胞表面トランスフェクトＳｉｇｌｅｃ−１５に対する一本鎖フラグメント可変（ＳｃＦｖ）結合剤を発現するクローンを選択した。２つの選択されたファージＳｃＦｖの可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）をマウスＩｇＧ１抗体骨格中にクローニングし、完全マウスＩｇＧ１抗体として発現した。得られたモノクローナル抗体は、フローサイトメトリーにより親ＣＨＯ細胞系（塗りつぶされたヒストグラム）よりもＣＨＯ−ｐＤｉｓｐｌａｙ  Ｓｉｇｌｅｃ−１５安定細胞系（塗りつぶされていないヒストグラム）に強い結合を示した。ＨＡ染色を陽性対照として使用した。ｐＤｉｓｐｌａｙ構築物は、Ｎ末端ＨＡタグとＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインとを有するＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメインのみをコードする。（Ｂ）モノクローナル抗体Ａ９Ｅ８およびＡ４Ｃ９（赤色）を用いて共焦点顕微鏡法により検出するために、ＨＥＫ−２９３  ＤＡＰ１０安定細胞系を全長ＦＬＡＧ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５で一過的にトランスフェクトした。細胞境界を画定するために、細胞表面マーカーＣＤ４４（ラット抗体、青色）およびエンドソームマーカーＥＥＡ１（ウサギ抗体、緑色）を使用した。両方の抗体は、陽性対照（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体）と比較して同様に染色した。細胞膜アダプター分子ＤＡＰ１０がＳｉｇｌｅｃ−１５の表面発現を促進したので、ＤＡＰ１０を発現するＨＥＫ−２９３安定細胞系を使用した（図３）。（Ｃ）異なるＳｉｇｌｅｃをコードするＣＨＯ安定細胞系を比較したＦＭＡＴによるＳｉｇｌｅｃ−１５に対するＡ９Ｅ８およびＡ４Ｃ９の特異性（共焦点顕微鏡法に類似）。Ａ９Ｅ８およびＡ４Ｃ９のＳｃＦｖ体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５  ＣＨＯ安定細胞系に特異的に結合した。（Ｄ）Ａ４Ｃ９抗体を用いたウェスタンブロッティング。ゲル上のレーンは、非トランスフェクト（ＵＴ）２９３Ｔ細胞および全長ＦＬＡＧ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５でトランスフェクトした（Ｔ）２９３Ｔ細胞（右側）の溶解物を含有する。約４３ｋＤａで検出された主要バンドは、完全グリコシル化Ｓｉｇｌｅｃ−１５のサイズに一致し、エンド−Ｈ消化に敏感である。弱いバックグラウンドバンドが約５０ｋＤａで観測された。
【図３】Ｓｉｇｌｅｃ−１５の細胞内発現。Ａ９Ｅ８モノクローナル抗体を用いてＳｉｇｌｅｃ−１５発現を調べるために、Ｄａｕｄｉ細胞およびＫ５６２細胞をＦＡＣＳ分析に付した。ＦＡＣＳプロットは、ｘ軸上に前方散乱（ＦＳＣ）およびｙ軸上にアイソタイプまたはＳｉｇｌｅｃ−１５（Ａ９Ｅ８）のいずれかの染色を示す。パーセントは、バックグラウンドを超える陽性抗体染色レベルを有する生細胞集団の割合を表す（長方形のゲート）。非固定染色は、表面発現を示し（左側）、一方、固定透過化染色は、追加の細胞内発現を明らかにする（右側）。細胞内染色では、最初に、細胞をパラホルムアルデヒド中で固定し（室温で３０分間）、ＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−１００中で透過化し（室温で１０分間）、そしてＰＢＳ中でさらに３回洗浄した。マウスＩｇＧ１モノクローナルアイソタイプ対照抗体（Ｄａｋｏ）を併行して使用した。非固定細胞では、ＳｙＴｏｘ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を用いて生細胞ゲート処理を行った。
【図４】Ｓｉｇｌｅｃ−１５のアダプター会合。異なる細胞膜アダプター分子を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞の表面上でのＦＬＡＧタグ付き全長Ｓｉｇｌｅｃ−１５および１６発現のＦＡＣＳ分析を評価した。それぞれ、Ｎ末端ＨＡタグを発現する。ＨＡおよびＦｌａｇのタグを共染色した。ｘ軸は、表面アダプター発現レベルを示し（ＨＡ−ＦＩＴＣ染色）、ｙ軸は、表面Ｓｉｇｌｅｃ発現（Ｆｌａｇ−ｃｙ３）を示す。二重陽性細胞のパーセント（四分区画の右上に示される）は、アダプター依存性Ｓｉｇｌｅｃ表面発現を反映する。空のＦＬＡＧ−ＣＭＶベクターを用いて、モックトランスフェクションを行った。また、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞を陰性対照として使用した。表面Ｓｉｇｌｅｃ検出の増加を示したアダプターとＳｉｇｌｅｃとの対合は、四角で囲まれている。
【図５】白血病細胞系上での内因性Ｓｉｇｌｅｃ−１５表面発現。（Ａ）白血病細胞系上での表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５タンパク質発現のＦＡＣＳプロット。ｘ軸は、前方散乱（ＦＳＣ）を示し、ｙ軸は、アイソタイプ対照またはＳｉｇｌｅｃ−１５の染色に一致した。Ａ９Ｅ８をＳｉｇｌｅｃ−１５染色に使用し、マウスＩｇＧ１モノクローナル対照抗体（Ｄａｋｏ）をアイソタイプ対照として使用した。ＳｙＴｏｘ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を用いて生細胞ゲート処理を行った。パーセントは、バックグラウンドを超えるレベルの陽性生細胞集団染色の割合を表す。骨髄系列の白血病細胞系を最初の２行に示す。第１行：単球（Ｕ９３７およびＳＫＭ−１）および前単球（ＮＯＭＯ−１）の細胞系。第２行：赤白血病（Ｋ５６２およびＨＥＬ）および巨核球（ＤＡＭＩ）の細胞系。第３行：Ｂ細胞リンパ腫由来（ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ）およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｊｕｒｋａｔ）の細胞系。（Ｂ）非トランスフェクト２９３Ｔ細胞の溶解物および全長ＦＬＡＧ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５構築物でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の溶解物の、Ｓｉｇｌｅｃ−１５細胞質内テール特異的ウサギ抗血清（左側）およびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体の染色のウェスタンブロット分析。完全グリコシル化Ｓｉｇｌｅｃ−１５バンドは、４３ｋＤａに見いだされた。（Ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメインを認識するＡ４Ｃ９モノクローナル抗体および細胞質内テール部分に特異的なＴａｉｌ  １Ａ抗血清の両方を用いた、４つの白血病細胞系（Ｋ５６２、Ｒａｊｉ、Ｊｕｒｋａｔ、およびＨＥＬ）の溶解物のウェスタンブロット分析。矢印は、完全グリコシル化Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する予想サイズ約４３ｋＤａに一致する両ブロットのバンドを表す。
【図６】Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、健常末梢血白血球のサブセットの少数でのみ発現される。（Ａ）健常ドナーから取得した末梢血白血球を用いて、異なる白血球細胞型の細胞表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５発現を分析した。ネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｄａｋｏ）をアイソタイプ対照として使用し、細胞系列を区別するために異なる細胞マーカー、すなわち、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、およびＣＤ１４（単球）を使用した。低い前方散乱値および側方散乱値の細胞を除去することにより、生細胞をゲート処理した。パーセントは、各四分区画内の生細胞の割合を表す。Ｘ軸は、ＦＩＴＣ標識系列マーカー染色に対応し、ｙ軸は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５染色の対応付けられたアイソタイプ対照に対応する。ＣＤ１４＋単球（ＣＤ１４）の＜４％以外は、表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５に関して染色された系列はなかった。（Ｂ）マクロファージおよび樹状細胞を末梢血単球から分化させ、細胞表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５検出に使用した。マーカー（マクロファージに対してはＣＤ１４およびＣＤ８６）を用いて、成功した分化を確証した。ヒストグラムは、非染色（透明）およびマーカー染色（赤色）のマクロファージおよび樹状細胞を示す。ＦＡＣＳプロットは、ｘ軸上に前方散乱を示し、ｙ軸上にアイソタイプまたはＳｉｇｌｅｃ−１５（Ａ９Ｅ８）の染色を示す。パーセントは、バックグラウンドレベルを超える陽性染色を有する集団のパーセントを表す。ＬＰＳを用いてまたは用いずに２４時間処理されたマクロファージおよび樹状細胞をラベル付きで表示する。
【図７】ＡＭＬ患者の芽球上での高いＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現。ＡＭＬ患者の芽球を用いて表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５発現を調べた。１０名の患者のうちの８名は、健常ＰＢＬと比較して有意なＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現を示した。次の４つの例を示す。（Ａ）高レベルのＳｉｇｌｅｃ−１５発現（集団の３５．７％）ならびにＣＤ１４およびＨＬＡ−ＤＲとの共発現を示す個別ＡＭＬ患者（患者Ａ）の細胞のＦＡＣＳ分析。マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照を比較のために加えた。（Ｂ）ＣＤ３３に関して細胞が陰性であることを示すが細胞団の２０．２％で高いＳｉｇｌｅｃ−１５発現を呈する第２のＡＭＬ患者（患者Ｂ）の細胞のＦＡＣＳ分析。ヒストグラムは、同一サンプルでＣＤ３３発現（非染色−赤色、染色−透明）およびＳｉｇｌｅｃ−１５発現（非染色−赤色、染色−透明）を比較する。（Ｃ）１０％のＳｉｇｌｅｃ−１５発現芽球を呈しそのほとんどがＣＤ３３＋ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−であった第３の患者（患者Ｃ）の細胞のＦＡＣＳ分析。（Ｄ）１４％のＳｉｇｌｅｃ−１５陽性芽球を有していた第４の患者（患者Ｄ）の細胞のＦＡＣＳ分析。ヒストグラムは、より大きい（より高い前方散乱）芽球およびより小さい（より低い前方散乱）芽球に対するＳｉｇｌｅｃ−１５表面染色の差を示す（アイソタイプ−透明、Ｓｉｇｌｅｃ−１５−赤色）。（Ｅ）ＡＭＬ患者（点）または健常ドナー（×印）のいずれかの全循環細胞に対するＳｉｇｌｅｃ−１５発現のパーセントのまとめ。水平線は、平均値を表す。
【図８】表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシス。３７℃でインキュベートして表面Ａ９Ｅ８結合の減少を追跡することにより、Ｋ５６２細胞上での内因的発現表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスの速度を測定した。Ａ９Ｅ８染色は、３０分間にわたり氷上で行った。次いで、細胞を３７℃に予備加温された無血清培地中に再懸濁し、３７℃でさまざまな時間にわたりインキュベートした。時間点を３０秒間から１５分間まで変化させた。アイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ１対照、Ｄａｋｏ）を用いてバックグラウンド染色／蛍光を測定した。アイソタイプ染色を超える平均蛍光をさまざまな時間点で計算し、３７℃でのインキュベーションなしの最大表面染色に対するパーセントとして表した。プロット（上）は、１５分間にわたるＳｉｇｌｅｃ−１５の表面染色の減少を示し、ｘ軸は、秒単位で測定された時間であり、ｙ軸は、初期蛍光に対するパーセントである。指数関数的減衰曲線は、データ点に良好に当てはまり、１７４秒間の半減期に対応する。天然Ｓｉｇｌｅｃ−１５膜貫通ドメインおよび細胞質内テールが欠如している代わりにＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインをコードするｐＤｉｓｐｌａｙ構築物で表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５を安定に発現するＣＨＯ細胞を用いて、並行実験を行った。ＣＨＯ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５安定細胞系での表面染色の定常レベル（最良当てはめ線により示される）は、３７℃でのインキュベーションの最初の１５分間ではＡ９Ｅ８が細胞表面から有意に解離しなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．  定義
単数形の用語は、１つ以上のその要素を意味することに留意されたい。たとえば、「Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体」は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する１つ以上の抗体を表すものと理解される。したがって、単数形の用語、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義的に使用可能である。
【００２６】
「Ｓｉｇｌｅｃ−１５」は、２つの免疫グロブリン様ドメインと、リシン残基を含有する膜貫通ドメインと、短い細胞質内テールとを含むＩ型膜貫通タンパク質である。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメインは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃα構造を優先的に認識し、免疫系活性化活性を有する。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」さらには複数形の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により直線連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の任意の鎖を意味し、産物の特異的長さを意味しない。したがって、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を意味すべく用いられるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用いられる用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に包含され、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと同義的に使用可能である。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾をはじめとするポリペプチドの発現後修飾の産物を意味することが意図される。ポリペプチドは、天然生物源から誘導可能であるか、または組換え技術により産生能であるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるというわけではない。それは、化学合成をはじめとする任意の方法で生成可能である。
【００２８】
本明細書に開示されるポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸サイズでありうる。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有しうるが、必ずしもそのような構造を有するというわけではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、フォールドとして言及され、規定の三次元構造を有しておらず多数の異なるコンフォメーションをとりうるポリペプチドは、アンフォールドとして言及される。本明細書で用いられる場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、たとえば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合された少なくとも１つの炭水化物部分に結合されたタンパク質を意味する。
【００２９】
「単離された」ポリペプチドまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルは必要とされない。たとえば、単離されたポリペプチドは、その元の環境または天然環境から取り出すことが可能である。宿主細胞内で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書に開示されるように単離されたとみなされ、任意の好適な技術により分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された元のポリペプチドまたは組換えポリペプチドの場合も同様である。
【００３０】
本明細書に開示された他のポリペプチドは、上記のポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ、もしくは変異体、またはそれらの任意の組合せである。本明細書に開示されたＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体を参照するときの「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「アナログ」という用語は、対応する元の抗体またはポリペプチドの抗原結合性の少なくともいくつかを維持する任意のポリペプチドを包含する。ポリペプチドのフラグメントとしては、本明細書の他の箇所で考察した特異的抗体フラグメントに加えて、たとえば、タンパク質分解フラグメントさらには欠失フラグメントが挙げられる。本明細書に開示されたＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体の変異体としては、上記のフラグメント、さらにはアミノ酸の置換、欠失、または挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。変異体は、天然に存在するものまたは天然に存在しないものでありうる。天然に存在しない変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて産生されうる。変異ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含みうる。本明細書に開示されたＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントの誘導体は、元のポリペプチド上に見いだされない追加の特徴を呈するように変化させたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドはまた、本明細書では「ポリペプチドアナログ」としても参照されうる。本明細書で用いられる場合、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントの「誘導体」は、官能性側基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを意味する。また、「誘導体」として、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。たとえば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに置換可能であり、５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに置換可能であり、３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに置換可能であり、ホモセリンをセリンの代わりに置換可能であり、そしてオルニチンをリシンの代わりに置換可能である。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形の核酸さらには複数形の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築物、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来にない結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片を意味する。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その元の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図される。たとえば、ベクター中に含有されるＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるように単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持された組換えポリヌクレオチドまたは溶解状態の（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写物が挙げられる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成的に生成されたそのような分子が挙げられる。それに加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどの調節エレメントでありうるか、またはそれらを含みうる。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンで構成された核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、それは、コード領域の一部であるとみなされる。ただし、フランキング配列、たとえば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはいずれも、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中に、たとえば、単一のベクター上に、または個別のポリヌクレオチド構築物中に、たとえば、個別の（異なる）ベクター上に、存在しうる。さらに、ベクターはいずれも、１つのコード領域を含有しうるか、または２つ以上のコード領域を含みうる。たとえば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を個別にコードしうる。それに加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合されたまたは融合されていない異種コード領域をコードしうる。異種コード領域としては、限定されるものではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特定のエレメントまたはモチーフが挙げられる。
【００３３】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域に機能可能に関連付けられたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含みうる。機能可能な関連付けとは、遺伝子産物たとえばポリペプチドに対するコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に配置するような形で１つ以上の調節配列に関連付けられる場合をいう。プロモーター機能の誘発が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡフラグメント間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を誘導する発現調節配列の能力を妨害したり転写されるＤＮＡ鋳型が能力を妨害したりしない場合、２つのＤＮＡフラグメント（たとえば、ポリペプチドコード領域およびそれに関連付けられたプロモーター）は、「機能可能に関連付けられている」。したがって、プロモーターがその核酸の転写を行えるならば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸に機能可能に関連付けられているであろう。プロモーターは、所定の細胞内でのみＤＮＡの実質的転写を誘導する細胞特異的プロモーターでありうる。細胞特異的転写を誘導するために、プロモーター以外の他の転写制御エレメント、たとえば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終止シグナルを、ポリヌクレオチドに機能可能に関連付けることが可能である。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。
【００３４】
さまざまな転写制御領域が当業者に公知である。こうしたものとしては、限定されるものではないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、たとえば、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａと組み合わされた前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）に由来するプロモーターおよびエンハンサーのセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、さらには真核細胞内で遺伝子発現を制御しうる他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、さらにはリンホカイン誘導プロモーター（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００３５】
同様に、さまざまな翻訳制御エレメントが当業者に公知である。こうしたものとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特定的には、ＣＩＴＥ配列としても参照される内部リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のものでありうる。
【００３７】
ポリヌクレオチドおよび核酸のコード領域は、本明細書に開示されたポリヌクレオチド、たとえば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域に関連付け可能である。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されたタンパク質は、粗面小胞体を横切って増殖タンパク質鎖の輸出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。脊椎動物細胞により分泌されたポリペプチドが、一般的には、ポリペプチドのＮ末端に融合されシグナルペプチドを有し、これが、完全ポリペプチドまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌形態または「成熟」形態のポリペプチドを産生することは、当業者であればわかる。特定の実施形態では、元のシグナルペプチド、たとえば、免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド、または機能可能に関連付けられたポリペプチドの分泌を誘導する能力を維持するその配列の機能性誘導体が、使用される。他の選択肢として、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能性誘導体を使用することが可能である。たとえば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することが可能である。
【００３８】
本明細書には、記載の抗体分子と同様に抗原に結合する工学操作された抗体分子またはフラグメントを含めて、特定の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、アナログ、もしくは誘導体が開示されている。また、そのような抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、アナログ、もしくは誘導体を含む免疫コンジュゲートが開示されている。
【００３９】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では同義的に使用可能である。本明細書に開示された抗体（またはそのフラグメント、変異体もしくは誘導体は、重鎖の少なくとも可変ドメインならびに重鎖および軽鎖の少なくとも可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照されたい。
【００４０】
以下でより詳細に考察されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別可能な種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラス（たとえば、γ１〜γ４）が含まれることは、当業者であればわかるであろう。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「クラス」をそれぞれ決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、よく特徴付けられており、機能分化を付与することが知られている。これらの各クラスの修飾体およびアイソタイプは、本開示を考慮して当業者に容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内にある。
【００４１】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダの軽鎖のいずれかを結合可能である。一般的には、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合され、２本の重鎖の「テール」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子工学操作された宿主細胞のいずれかにより産生される時、ジスルフィド共有結合または非共有結合により互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構成のフォークエンドのＮ末端から各鎖の底部のＣ末端までにわたる。
【００４２】
軽鎖および重鎖は両方とも、構造および機能の相同性を有する領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に用いられる。これに関連して、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することは、わかるであろう。反対に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を付与する。慣例によれば、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は、定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬのドメインは、実際に、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４３】
以上に示されたように、可変領域は、抗体または抗原結合フラグメントが抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体または抗原結合フラグメントのＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、一緒になって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次の抗体または抗原結合フラグメントの構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より特定的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲにより規定される。
【００４４】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメイン中に存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境中でその三次元構成をとるように抗原結合ドメインを形成すべく特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域として参照される抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残りの部分は、より少ない分子間変動を示す。フレームワーク領域は、主にβシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続する、いくつかの場合にはその一部を形成する、ループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合相互作用により正しい向きのＣＤＲ配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、そのコグネイトエピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、それぞれ、正確に規定されてきたので、当業者であれば、任意の所与の重鎖または軽鎖の可変領域に関して、容易に同定可能である（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００４５】
当技術の範囲内で用いられるおよび／または許容される用語の２つ以上の定義が存在する場合、相反する明記がないかぎり、本明細書で用いられる用語の定義は、すべてのそのような意味を包含することが意図される。特定例は、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見いだされる非隣接抗原結合部位を記述する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）（参照により本明細書に組み込まれる）により記載されており、その定義は、互いに比較した時、アミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを意味するいずれの定義の適用も、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることが意図される。以上の引用文献のそれぞれで定義されるＣＤＲを構成する適切なアミノ酸残基を比較して以下の表Ｉに示す。特定のＣＤＲを構成する厳密な残基の番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して異なるであろう。抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかは、当業者であれば慣例に従って決定可能である。
【表１】
2014527804.tif 000003
【００４６】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列に対する番号付け体系を定義した。当業者であれば、配列そのもの以外のいかなる実験データにも頼ることなく、この系の「Ｋａｂａｔ番号付け」を任意の可変ドメイン配列に一義的に帰属することが可能である。本明細書で用いられる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により示された番号付け体系を意味する。とくに明記されていないかぎり、本明細書に開示されたＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは変異体もしくは誘導体中の特異的アミノ酸残基位置の番号付けの参照は、Ｋａｂａｔ番号付け体系に準拠する。
【００４７】
抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨのドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。本開示に包含される免疫グロブリンまたは抗体の分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスでありうる。
【００４８】
「特異的に結合する」とは、一般的には、抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、しかもその結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間でいくらかの相補性を必要とすること、を意味する。この定義によれば、抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、その抗原結合ドメインを介してランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われている。「特異性」という用語は、本明細書では、特定の抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が特定のエピトープに結合する相対親和性を認定するために用いられる。たとえば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなされこともあれば、抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われることもある。
【００４９】
「優先的に結合する。」とは、抗体が、関連、同様、相同、または類似のエピトープに結合するよりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、たとえそのような抗体が関連エピトープと交差反応しうるとしても、おそらく関連エピトープよりもそのエピトープに結合するであろう。
【００５０】
抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、または抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む免疫コンジュゲートは、エピトープへの参照の抗体または抗原結合フラグメントの結合をある程度ブロックするという範囲内でそのエピトープに優先的に結合するのであれば、所与のエピトープへの参照の抗体または抗原結合フラグメントの結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、たとえば競合ＥＬＩＳＡアッセイにより、決定可能である。抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、所与のエピトープへの参照の抗体または抗原結合フラグメントの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言われることもある。
【００５１】
本明細書に開示された抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記述または特定することも可能である。本明細書で用いられる場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が第２の抗原と反応する能力、すなわち、２つの異なる抗原物質間での関連性の尺度を意味する。したがって、抗体は、その形成を誘発した以外のエピトープに結合するのであれば、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般的には、と同一の相補的構造特性の多くを含有する。
【００５２】
一本鎖抗体を含む抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または次の部分、すなわち、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部または一部との組合せで含みうる。このほかに、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインと、の任意の組合せを含む抗体または抗原結合フラグメントが含まれる。本明細書に開示された抗体またはその抗原結合フラグメントは、トリおよび哺乳動物をはじめとする任意の動物起源でありうる。抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体でありうる。他の実施形態では、可変領域は、軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源でありうる（たとえばサメ由来）。本明細書で用いられる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、さらにたとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されるように、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンが導入されたかつ内因性免疫グロブリンを発現しないトランスジェニック動物から単離された抗体を包含する。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。重鎖部分を含む抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば、上側、中間、および／もしくは下側のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくはフラグメントの少なくとも１つを含む。たとえば、抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部とＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部とＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部とＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含みうる。他の実施形態では、抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠如しうる。以上に示されるように、これらのドメイン（たとえば、重鎖部分）が、天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾可能であることは、当業者であればわかるであろう。
【００５４】
本明細書に開示された抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来しうる。たとえば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含みうる。他の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子および部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含みうる。他の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子および部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含みうる。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
【００５６】
本明細書に開示された抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、認識または特異的に結合される抗原のエピトープまたは一部に関して記述または特定することが可能である。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原たとえばポリサッカリドは、単一のエピトープを含みうるが、典型的には、少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、コンフォメーション、およびタイプに依存して、任意の数のエピトープを含みうる。
【００５７】
以上に示されたように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構成は、周知である。本明細書で用いられる場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを包含し、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインを包含する。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに近接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、延在する重鎖分子の部分、たとえば、従来の番号付け方式を用いて抗体のほぼ残基２４４〜残基３６０（Ｋａｂａｔ番号付け体系では残基２４４〜３６０およびＥＵ番号付け体系では残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．ｏｐ．ｃｉｔ．を参照されたい）に延在する部分を包含する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと強く対合しないという点で特異である。もっと正確に言えば、２本のＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の元のＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。また、ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端方向に延在し、約１０８残基を含むことは、十分に実証されている。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域または部位が、第１の種から取得されるまたはそれに由来し、かつ定常領域（無傷でありうるか、一部でありうるか、または修飾されうる）が、第２の種から取得される、任意の抗体を意味するとみなされるであろう。いくつかの実施形態では、標的結合の領域または部位は、非ヒト源（たとえば、マウスまたは霊長動物）に由来するであろう。また、定常領域は、ヒト由来である。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「工学操作された抗体」という用語は、既知の特異性の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な交換より、必要であれば、部分的なフレームワーク領域交換および配列変化により、重鎖および軽鎖の一方または両方の可変ドメインが改変された抗体を意味する。ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来源の抗体と同一のクラスさらにはサブクラスの抗体に由来しうるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種の抗体に由来することが想定されるであろう。既知の特異性の非ヒト抗体の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域内にグラフトされた、工学操作された抗体は、本明細書では、「ヒト化抗体」として参照される。一方の可変ドメインの抗原結合能を他方の可変ドメインに移動するために、ＣＤＲのすべてをドナー可変領域の完全ＣＤＲに交換する必要がないこともある。もっと正確に言えば、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移動することのみが必要であることもある。たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同５，６９３，７６２号明細書、および同６，１８０，３７０号明細書に示される説明を考慮すれば、通常の実験を行うことによりまたは試行錯誤の試験により、工学操作またはヒト化された機能性抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「工学操作された」という用語は、合成手段による（たとえば、組換え技術による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的な結合による、またはこれらの技術のいくつかの組合せによる）核酸分子またはポリペプチド分子の操作を包含する。
【００６２】
「融合タンパク質」もしくは「キメラタンパク質」という用語または「融合」された２つの部分を含むタンパク質もしくはポリペプチドという記述は、天然では自然に連結されない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を意味する。これらのアミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド中で一体化される個別のタンパク質中に存在しうるか、または通常は同一のタンパク質中に存在しうるが、融合ポリペプチド中では新しい構成で配置される。融合タンパク質は、たとえば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされたポリヌクレオチドを形成して翻訳することにより、形成可能である。本明細書で用いられる場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、同義的に用いられる。
【００６３】
本明細書で用いられる「免疫コンジュゲート」または「コンジュゲート」という用語は、細胞結合剤（すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント）に融合または連結された化合物またはその誘導体を意味し、一般式：Ｃ−Ｌ−Ａ（式中、Ｃ＝サイトトキシン、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合剤または抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の抗体もしくは抗体フラグメント）により定義される。免疫コンジュゲートは、逆順の一般式すなわちＡ−Ｌ−Ｃにより定義することも可能である。「免疫コンジュゲート」は、標的化部分、たとえば、抗体または抗原認識能を維持するそのフラグメント、およびエフェクター分子、たとえば、治療用部分または検出可能標識を含む。
【００６４】
「イムノトキシン」とは、治療用部分がサイトトキシンである免疫コンジュゲートのことである。「標的化部分」とは、免疫コンジュゲートが対象の細胞を標的とするように意図された免疫コンジュゲートの部分、たとえば、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントである。典型的には、標的化部分は、抗体、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２である。標的化部分はまた、たとえば、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディー、トリアボディー、ダイアボディー、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含みうる。
【００６５】
「毒性部分」とは、イムノトキシンに対象の細胞に対する細胞傷害性を付与するイムノトキシンの部分である。
【００６６】
「治療用部分」とは、療法剤として作用することが意図された免疫コンジュゲートの部分であり、いくつかの実施形態では「毒性部分」でありうる。
【００６７】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質たとえばポリペプチドを産生する過程を意味する。この過程は、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンさらには一過性発現および安定発現の両方を含めて、細胞内の遺伝子機能の存在の任意の出現を包含する。限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写およびポリペプチドへのそのようなｍＲＮＡの翻訳を包含する。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の形成を包含する。遺伝子の発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書で用いられる場合、遺伝子産物とは、いずれかの核酸、たとえば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのことでありうる。本明細書に記載の遺伝子産物はさらに、ポリアデニル化などの翻訳後修飾を受けた核酸、またはメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの会合、タンパク質分解切断などの翻訳後修飾を受けたポリペプチドを包含する。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「治療する」または「治療」という用語は、望ましくない生理学的変化または疾患を予防または遅延（軽減）することが目的である治療手段を意味する。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能か検出不能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善もしくは一時的軽減、および寛解（部分的または全体的）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することを意味しうる。
【００６９】
「被験体」または「個人」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後判定、または治療が望まれる任意の被験体とくに哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては、ヒト、家畜、農場動物、および動物園用、競技用、またはペット用の動物、たとえば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛、クマなどが挙げられる。
【００７０】
ＩＩ．  抗体または抗原結合フラグメント
Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、２つの免疫グロブリン様ドメインと、リシン残基を含有する膜貫通ドメインと、短い細胞質内テールとを含むＩ型膜貫通タンパク質である。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメインは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃα構造を優先的に認識し、免疫系活性化活性を有する。樹状細胞およびマクロファージ上ではすでに同定されたが、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、本明細書では、ＡＭＬ芽球の表面上に高レベルでかつ末梢血白血球上に低レベルで発現されることが示される。
【００７１】
一実施形態は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ９Ｅ８である。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ９Ｅ８などのＳｉｇｌｅｃ−１５の抗体または抗原結合フラグメントを含む免疫コンジュゲートである。
【００７２】
本開示はさらに、Ａ９Ｅ８の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントとして同一のＳｉｇｌｅｃ−１５エピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合し、かつＡ９Ｅ８  ＶＨおよび／またはＶＬ；Ａ９Ｅ８  ＶＨ−ＣＤＲ３および／またはＡ９Ｅ８  ＶＬ−ＣＤＲ３；Ａ９Ｅ８  ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３；Ａ９Ｅ８  ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３；またはＡ９Ｅ８  ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合フラグメントによるＳｉｇｌｅｃ−１５結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれる。抗体は、エピトープへの参照抗体の結合をある程度ブロックするという範囲内でそのエピトープに優先的に結合するのであれば、所与のエピトープへの参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、たとえば競合ＥＬＩＳＡアッセイにより、決定しうる。抗体は、所与のエピトープへの参照の抗体または抗原結合フラグメントの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言われることもある。
【００７３】
正常末梢血白血球とは対照的にＡＭＬ芽球上ではＳｉｇｌｅｃ−１５の差次的発現が起こるので、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、追加の療法剤、たとえば、ＡＭＬ芽球を優先的に標的し、かつ正常末梢血白血球に最小限の影響を及ぼすＳｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体および抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む免疫コンジュゲートをスクリーニングするために使用可能である。一実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５療法剤は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の抗体または抗原結合フラグメントである。他の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５療法剤は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５標的化部分を含む免疫コンジュゲートである。さらなる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５療法剤は、小分子である。
【００７４】
抗体の作製方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される。シグナル配列を含まない全長Ｓｉｇｌｅｃ−１５の種々のフラグメントに対するまたはその全長Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体を産生した後、抗体または抗原結合フラグメントが結合するＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸またはエピトープがどれかは、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコルさらには当技術分野で公知の方法（たとえば、“Ｃｈａｐｔｅｒ  １１−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｖ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）により決定可能である。追加のエピトープマッピングプロトコルは、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（いずれも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。エピトープマッピングはまた、市販の手段（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））により行うことが可能である。
【００７５】
特定の態様では、本開示は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合してＳｉｇｌｅｃ−１５エンドサイトーシスの速度増大を誘発する、抗体もしくはフラグメント、変異体、誘導体、またはそれらの免疫コンジュゲートに関する。特定の実施形態では、本発明に係る抗体もしくはフラグメント、変異体、誘導体、またはそれらの免疫コンジュゲートは、ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞上での表面内因性Ｓｉｇｌｅｃ−１５の半減期が約５分間、約４分間、約３分間、約２分間、約１分間、または約３０秒間よりも短い速度で、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスを誘発する。
【００７６】
とくに記載がないかぎり、本明細書で用いられる場合、抗体に関して「そのフラグメント」とは、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体の部分を意味する。
【００７７】
したがって、本明細書に開示された特定の実施形態は、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が、ほぼ同一の免疫原性の全非改変抗体と比較して、エフェクター機能の低減、非共有結合二量化能、腫瘍部位への局在化能の増大、血清中半減期の低減、血清中半減期の増大などの所望の生化学的特性を提供するように欠失しているかまたは他の形で改変されている、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む。たとえば、本明細書に記載の特定の抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン重鎖に類似した、ただし１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部が欠如した、ポリペプチド鎖を含むドメイン欠失抗体である。たとえば、特定の抗体では、修飾抗体の定常領域の１つの全ドメインが欠失するであろう。たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失するであろう。
【００７８】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体の改変形は、当技術分野で公知の技術を用いて全前駆体または親抗体から作製可能である。例示的な技術は、本明細書の他の箇所で考察される。
【００７９】
特定の実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の抗体または抗原結合フラグメントの可変領域および定常領域は両方とも、完全ヒト由来である。完全ヒト抗体は、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の技術を用いて作製可能である。たとえば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原チャレンジに反応してそのような抗体を産生するように修飾された、ただしその内因性遺伝子座が無効になった、トランスジェニック動物に抗原を投与することにより、作製可能である。そのような抗体の作製に使用可能な例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、同第６，４５８，５９２号明細書、同第６，４２０，１４０号明細書に記載されている。他の技術は、当技術分野で公知である。完全ヒト抗体は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されるように、種々のディスプレイ技術、たとえば、ファージディスプレイ系または他のウイルスディスプレイ系により同様に産生可能である。
【００８０】
本明細書に開示された抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントは、当技術分野で公知の技術を用いて作製または製造が可能である。特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、「組換え産生される」。すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。抗体分子またはそのフラグメントを作製するための例示的な技術は、本明細書の他の箇所でより詳細に考察される。
【００８１】
特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体では、当技術分野で公知の技術を用いて、エフェクター機能を低減するようにＦｃ部分を突然変異させることが可能である。たとえば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異または他の手段により）を行って循環修飾抗体のＦｃ受容体結合を低減することにより、腫瘍局在化を増大させることが可能である。他の場合には、定常領域修飾により補体結合を軽減することにより、コンジュゲートサイトトキシンの血清中半減期および非特異的会合を低減することが可能である。定常領域のさらに他の修飾を用いて、抗原特異性または抗体可撓性の増大により局在化の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴサッカリド部分を修飾することが可能である。修飾により得られた生理学的プロファイル、生物学的利用能、および他の生化学的効果、たとえば、局在化、生体内分布、および血清中半減期は、過度の実験を行わなくとも周知の免疫学的方法を用いて容易に測定および定量が可能である。
【００８２】
特定の実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、免疫コンジュゲート、もしくは誘導体は、治療される動物体において、たとえばヒトにおいて、有害な免疫反応を誘発しないであろう。一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、免疫コンジュゲート、もしくは誘導体は、当技術分野で認められた技術を用いて、それらの免疫原性を低減するように修飾される。たとえば、抗体をヒト化、脱免疫化することが可能であるか、またはキメラ抗体を作製することが可能である。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合性を維持または実質的に維持するが、ヒトにおいてより低い免疫原性である、非ヒト抗体、典型的には、ネズミまたは霊長動物の抗体に由来する。これは、（ａ）全非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上にグラフトしてキメラ抗体を形成する方法、（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持してまたは保持せずに１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトフレームワーク領域および定常領域にグラフトする方法、または（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、ただし、表面残基の交換によりヒト様セクションでそれを「遮蔽」しない方法をはじめとする種々の方法により達成可能である。そのような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、および同第６，１９０，３７０号明細書（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００８３】
また、脱免疫化を用いて、抗体の免疫原性を低減することが可能である。本明細書で用いられる場合、「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾する抗体の改変を包含する（たとえば、国際公開第９８５２９７６Ａ１号パンフレット、国際公開第００３４３１７Ａ２号パンフレットを参照されたい）。たとえば、出発抗体のＶＨおよびＶＬ配列を分析し、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の主要な残基と対比してエピトープの位置を示す各Ｖ領域のヒトＴ細胞エピトープ「地図」。最終抗体の活性を変化させるリスクが低い代替アミノ酸置換を同定するために、Ｔ細胞エピトープ地図の個々のＴ細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組合せを含む一連の代替ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、続いて、これらの配列を一連の結合ポリペプチド、たとえば、本明細書に開示されたＳｉｇｌｅｃ−１５特異的抗体またはその抗原結合フラグメントに組み込み、次いで、機能に関して試験する。次いで、修飾Ｖ領域とヒトＣ領域とを含む完全重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクター中にクローニングし、その後のプラスミドを全抗体の産生のために細胞系に導入する。次いで、適切な生化学的および生物学的アッセイで抗体を比較し、最適変異体を同定する。
【００８４】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、免疫コンジュゲート、もしくは誘導体は、当技術分野で公知の任意の好適な方法により産生可能である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用をはじめとする当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて、調製可能である。たとえば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の技術およびたとえばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）に教示される技術をはじめとするハイブリドーマ技術を用いて、産生可能である。
【００８５】
また、抗体または抗体フラグメント（たとえば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡをファージディスプレイライブラリーなどの抗体ライブラリーから誘導可能である。特定的には、そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（たとえば、ヒトまたはネズミ）から発現される抗原結合性ドメインを提示することが可能である。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、たとえば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を用いて、選択または同定が可能である。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合されたｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖もしくは重鎖の個々のＦｖ領域）またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを用いてファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。例示的な方法は、たとえば、欧州特許第３６８  ６８４Ｂ１明細書、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）、Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：２６８２（２００１）、Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３１５：１０６３  （２００２）（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に示される。いくつかの出版物（たとえば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には、大きいファージライブラリーを構築するための戦略として鎖シャフリングさらにはコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによる高親和性ヒト抗体の産生が記載されている。他の実施形態では、リボソームディスプレイを用いて、ディスプレイプラットフォームとしてのバクテリオファージを交換することが可能である（たとえば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）、またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照されたい）。さらに他の実施形態では、抗体に関して細胞表面ライブラリーをスクリーニングすることが可能である（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離および後続のクローニングのための伝統的ハイブリドーマ技術の代替手段を提供する。
【００８６】
ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示される。たとえば、ＶＨおよびＶＬの領域をコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（たとえば、リンパ組織のヒトまたはネズミｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬの領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲを用いてｓｃＦｖリンカーにより連結一体化され、ファージミドベクター（たとえば、ｐＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）中にクローニングされる。ベクターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に電気穿孔され、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ヘルパーファージを用いて感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージであり、ＶＨまたはＶＬの領域は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに通常は組換え融合される。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、たとえば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を用いて、選択または同定が可能である。
【００８７】
抗体の作製に使用可能なファージディスプレイ法の追加の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８  （１９９７）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号パンフレット、国際公開第９０／０２８０９号パンフレット、国際公開第９１／１０７３７号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９３／１１２３６号パンフレット、国際公開第９５／１５９８２号パンフレット、国際公開第９５／２０４０１号パンフレット、ならびに同第５，６９８，４２６号明細書、同第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，７５０，７５３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５１６，６３７号明細書、同第５，７８０，２２５号明細書、同第５，６５８，７２７号明細書、同第５，７３３，７４３号明細書、および同第５，９６９，１０８号明細書（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが挙げられる。
【００８８】
以上の参照文献および以下の実施例に記載されるように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、これを用いてヒト抗体を含む全抗体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌をはじめとする任意の所望の宿主内で発現させることが可能である。また、たとえば、当技術分野で公知の方法、たとえば、国際公開第９２／２２３２４号パンフレット、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）、およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）、およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記参照文献はそれらの全体が参照により組み込まれる）に開示される方法を用いたＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントの組換え産生技術を利用することも可能である。一本鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために使用可能な技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および同第５，２５８，４９８号明細書、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）、およびＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが挙げられる。
【００８９】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置にとくに望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法をはじめとする当技術分野で公知のさまざまな方法により作製可能である。また、米国特許第４，４４４，８８７号明細書および同第４，７１６，１１１号明細書、ならびに国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開第９１／１０７４１号パンフレット（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【００９０】
機能性内因性免疫グロブリンを発現可能でない、ただしヒト免疫グロブリン遺伝子を発現可能である、トランスジェニックマウスを用いて、ヒト抗体を産生することも可能である。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス胚性幹細胞にランダムにまたは相同的組換えにより導入可能である。それに加えて、種々の会社は、上記の技術と類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体をトランスジェニックマウスにおいて産生するような取組みを行うことが可能である。
【００９１】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」として参照される技術を用いて産生可能である。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、たとえば、マウス抗体を用いて、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８）。また、米国特許第５，５６５，３３２号明細書も参照されたい。）
他の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（たとえば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離および配列決定が可能である。たとえば、単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞または単離されたファージは、そのようなＤＮＡ源として機能しうる。単離後、ＤＮＡを発現ベクター中に配置可能であり、次いで、それを、それ以外には免疫グロブリンを産生しないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの原核宿主または真核宿主の細胞にトランスフェクトする。より特定的には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載されるように合成したものでありうる）は、１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように製造抗体用に定常領域および可変領域の配列をクローニングすべく使用可能である。所望の抗体を発現するトランスフォーム細胞は、免疫グロブリンの臨床用および商業用の供給を提供すべく、比較的大量に増殖可能である。
【００９２】
一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体分子たとえばＡ９Ｅ８の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを含む。他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗体分子たとえばＡ９Ｅ８の少なくとも２つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗体分子たとえばＡ９Ｅ８の少なくとも３つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗体分子たとえばＡ９Ｅ８の少なくとも４つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗体分子たとえばＡ９Ｅ８の少なくとも５つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、本説明の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗体分子たとえばＡ９Ｅ８の少なくとも６つのＣＤＲを含む。
【００９３】
特定の実施形態では、当技術分野で周知の方法により、たとえば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較して配列の超可変性の領域を決定することにより、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を検査して相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定することが可能である。慣例的な組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲの１つ以上をフレームワーク領域内に、たとえば、ヒトフレームワーク領域内に挿入して、非ヒト抗体をヒト化することが可能である。フレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域でありうる（たとえば、ヒトフレームワーク領域のリストに関しては、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）。フレームワーク領域とＣＤＲとの組合せにより産生されたポリヌクレオチドは、所望の抗原たとえばＳｉｇｌｅｃ−１５の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。フレームワーク領域内で１つ以上のアミノ酸置換を行うことが可能であり、アミノ酸置換によりその抗原への抗体の結合が改善される。そのほかに、そのような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失により１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を産生したりすることが可能である。ポリヌクレオチドの他の改変は、本開示に包含され、当業者の能力の範囲内である。
【００９４】
また、抗体または抗原結合フラグメントがＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する本明細書に記載の抗体分子（たとえば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、それで本質的に構成される、またはそれで構成される抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。限定されるものではないが、アミノ酸置換をもたらす部位指向突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発をはじめとする当業者に公知の標準的技術を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することが可能である。変異体（誘導体を含む）は、参照のＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と対比して、５０アミノ酸未満の置換、４０アミノ酸未満の置換、３０アミノ酸未満の置換、２５アミノ酸未満の置換、２０アミノ酸未満の置換、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換、または２アミノ酸未満の置換を含むポリペプチドをコードする。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換のことである。類似の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されてきた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（たとえば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。他の選択肢として、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全部または一部に沿って突然変異をランダムに導入することが可能であり、得られた突然変異体を生物学的活性に関してスクリーニングして、活性（たとえば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を結合する能力）を維持する突然変異体を同定することが可能である。
【００９５】
たとえば、抗体分子のフレームワーク領域のみまたはＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することが可能である。導入される突然変異は、サイレント突然変異または中立ミスセンス突然変異、すなわち、抗原に結合する抗体の能力にまったくまたはほとんど影響を及ぼさない。これらのタイプの突然変異は、コドン使用頻度を最適化したりまたはハイブリドーマの抗体産生を改善したりするのに有用でありうる。他の選択肢として、非中立ミスセンス突然変異により、抗原に結合する抗体の能力を改変することが可能である。ほとんどのサイレント突然変異および中立ミスセンス突然変異の位置は、おそらくフレームワーク領域中に存在し、一方、ほとんどの非中立ミスセンス突然変異の位置は、おそらくＣＤＲ中に存在するが、これは絶対条件ではない。当業者であれば、抗原結合活性が改変されなかったりまたは結合活性が改変されたりするなど（たとえば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）の所望の性質を有する突然変異分子を設計し試験することが可能であろう。突然変異誘発後、慣例に従ってコードタンパク質を発現されることが可能であり、本明細書に記載の技術を用いてまたは慣例に従って当技術分野で公知の技術に変更を加えることにより、コードタンパク質の機能活性および／または生物学的活性（たとえば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の少なくとも１つのエピトープに結合する能力）を決定することが可能である。
【００９６】
ＩＩＩ．  抗体ポリペプチドおよび免疫コンジュゲート
本開示はさらに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを構成する単離されたポリペプチドと、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとに関する。本明細書に開示された単離された抗体またはそのフラグメントは、たとえば、免疫グロブリン分子に由来するＳｉｇｌｅｃ−１５特異的抗原結合性領域をコードするポリペプチドたとえばアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、ポリペプチドの起源を意味する。特定の場合、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に本質的に同一であるアミノ酸配列またはその一部分を有し、この部分は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸で構成されるか、または当業者であれば出発配列に起源を有するものとして他の形で同定可能である。
【００９７】
また、表１に示される配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％  ９５％、または１００％の同一性である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。
【００９８】
さらに、表１に示される配列番号１に対して同一であるまたは１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＨアミノ酸配列を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。
【００９９】
また、表１に示される配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％  ９５％、または１００％の同一性である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。
【０１００】
いくつかの実施形態は、表１に示される配列番号２に対して同一であるまたは１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＬアミノ酸配列を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。
【０１０１】
また、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、および／またはＶＨ−ＣＤＲ３を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。ただし、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対応する。さらなる実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、および／またはＶＬ−ＣＤＲ３を含む。ただし、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に対応する。特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２  ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、および／またはＶＬ−ＣＤＲ３を含む。ただし、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２  ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に対応する。
【０１０２】
また、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、および／もしくはＶＨ−ＣＤＲ３；ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、および／もしくはＶＬ−ＣＤＲ３；またはＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、および／もしくはＶＬ−ＣＤＲ３を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。ただし、各ＣＤＲの配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８にそれぞれ対応するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３の配列に対して同一であるか、または各ＣＤＲ中の１、２、もしくは３つの置換以外は同一である。
【０１０３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合して、受容体のエンドサイトーシスの速度の増大を引き起こす。いくつかの実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５エンドサイトーシスの半減期は、ヒト骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２では、約５分間、約４分間、約３分間、約２分間、約１分間、または約３０秒間よりも短い。
【表２】
2014527804.tif 000004
【０１０４】
本明細書に記載の任意の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体はさらに、追加のポリペプチド、たとえば、コードポリペプチドの分泌を誘導するシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書に記載の他の異種ポリペプチドを含みうる。そのほかに、本説明の抗体またはそのフラグメントは、他の箇所に記載のポリペプチドフラグメントを含む。そのほかに、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、本明細書に記載されるように、融合ポリペプチド、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、または他の誘導体でありうる。
【０１０５】
また、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されるように、本開示は、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む組成物を包含する。
【０１０６】
また、由来源の天然に存在する結合ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を修飾しうることは、当業者であればわかるであろう。たとえば、指定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、類似のものでありうる。たとえば、出発配列に対して特定の同一性パーセントを有する、たとえば、出発配列に対して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性でありうる。
【０１０７】
当技術分野で公知のように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本明細書で考察される場合、任意の特定のポリペプチドが他のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性であるかは、当技術分野で公知の方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア、たとえば、限定されるものではないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ(登録商標)，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）を用いて、決定可能である。ＢＥＳＴＦＩＴでは、２つの配列間の相同性の最良セグメントを見いだすために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用する。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が、たとえば、参照配列に対して９５％の同一性であるかを決定する場合、パラメーターは、当然ながら、同一性パーセントが参照ポリペプチド配列の全長にわたり計算されるように、かつ参照配列中のアミノ酸の全数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、設定される。
【０１０８】
さらに、「非必須」アミノ酸領域の保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失、または挿入を行うことが可能である。たとえば、指定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１つ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、または欠失、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、または欠失以外は、出発配列と同一でありうる。特定の実施形態では、指定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に対して１〜５、１〜１０、１〜１５、または１〜２０の個々のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する。
【０１０９】
本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、融合タンパク質を含みうるか、それで本質的に構成されうるか、またはそれで構成されうる。融合タンパク質は、たとえば、少なくとも１つの標的結合部位を有する免疫グロブリン抗原結合性ドメインと、少なくとも１つの異種部分、すなわち、天然では自然に連結されない部分と、を含むキメラ分子である。これらのアミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド中で一体化される個別のタンパク質中に存在可能であるか、または通常は同一のタンパク質中に存在可能であるが、融合ポリペプチド中では新しい構成で配置される。融合タンパク質は、たとえば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされたポリヌクレオチドを形成して翻訳することにより、形成可能である。
【０１１０】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分に適用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分が、比較される要素の残りの部分と異なる要素に由来することを意味する。限定されるものではないが、例として、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体に融合される「異種ポリペプチド」は、同一の種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンのポリペプチドに由来する。
【０１１１】
本発明に係る抗体またはポリペプチドと共に毒素を利用して、免疫コンジュゲートを得ることが可能である。例示的な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、およびそれらのサブユニットさらにはボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は、供給業者（たとえば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から容易に入手可能である。ジフテリア毒素は、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）から単離される。リシンは、リシナス・コムネス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｅｓ）（トウゴマ）に由来するレクチンＲＣＡ６０である。この用語はまた、その毒性変異体を意味する。米国特許第５，０７９，１６３号明細書および同第４，６８９，４０１号明細書を参照されたい。リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）は、約６５，０００および１２０，０００のそれらの分子量に基づいてそれぞれＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される２つの形態で存在する。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２６６：５４３（１９７２）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅に関与する。Ｂ鎖は、リシンを細胞表面ガラクトース残基に結合して、サイトゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９７４；２４９：６２７−６３１）。米国特許第３，０６０，１６５号明細書を参照されたい。
【０１１２】
一実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素である。シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により分泌されるきわめて活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、そのＡＤＰリボシル化を触媒する（ＥＦ−２上への酸化ＮＡＤのＡＤＰリボシル部分の移動を触媒する）ことにより伸長因子２（ＥＦ−２）の不活性化を介して真核細胞内のタンパク質合成を阻害する。
【０１１３】
シュードモナス外毒素（ＰＥ）は、元の配列、元の配列の細胞傷害性フラグメント、ならびに元のＰＥの保存的修飾変異体およびその細胞傷害性フラグメントを含みうる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントとしては、標的細胞内での後続のタンパク質分解または他のプロセシング（たとえば、タンパク質またはプレタンパク質として）を受けるまたは受けない細胞傷害性のものが挙げられる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントとしては、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５が挙げられる。ＰＥ４０は、当技術分野ですでに記載のＰＥのトランケート誘導体である。Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３３５８−６２（１９９１）、Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５（１９８８）を参照されたい。ＰＥ３８は、アミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３で構成されるトランケートＰＥである。ＰＥ３５は、ＰＥの３５ｋＤカルボキシル末端フラグメントであり、位置２８０のＭｅｔおよびそれに続く元のＰＥのアミノ酸２８１〜３６４および３８１〜６１３で構成される。好ましい実施形態では、細胞傷害性フラグメントＰＥ３８が利用される。ＰＥ３８は、細胞内でプロセシングを受けるとその細胞傷害性形態に活性化されうるプロタンパク質である。
【０１１４】
本明細書に提供されるシュードモナス外毒素および抗体を用いて、当業者であれば、機能的に等価な核酸、たとえば、配列は異なるが同一のＰＥまたは抗体配列をコードする核酸を含有するさまざまなクローンを容易に構築することが可能である。したがって、本発明は、抗体またはそのコンジュゲートもしくは融合体をコードする核酸を提供する。
【０１１５】
他の実施形態では、毒素は、ホロ毒素（たとえば、リボソーム不活性化タンパク質ＩＩ型）またはヘミ毒素（たとえば、サポリン、ゲロニン）である。さらなる実施形態では、毒素は、細胞傷害剤または細胞傷害化合物であり、その例としては、タキサン、ＤＮＡアルキル化剤、アントラサイクリン、微小管阻害剤（たとえば、ツブリシン）、デュオカルマイシン、メイタンシノイド、ドキソルビシン、およびアウリスタチンが挙げられる。
【０１１６】
ＩＶ．  抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド
また、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸分子が本明細書に提供される。
【０１１７】
一実施形態は、表１に示される配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％  ９５％、または１００％の同一性である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列をコードする核酸を含む、それで本質的に構成される、またはそれで構成される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１１８】
他の実施形態は、表１に示される配列番号１に対して同一であるまたは１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＨアミノ酸配列をコードする核酸を含む、それで本質的に構成される、またはそれで構成される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１１９】
さらなる実施形態は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的にまたは優先的に結合する、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む単離された抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
【０１２０】
他の実施形態は、表１に示される配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％  ９５％、または１００％の同一性である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列をコードする核酸を含む、それで本質的に構成される、またはそれで構成される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１２１】
さらなる実施形態は、表１に示される配列番号２に対して同一であるまたは１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上のアミノ酸置換以外は同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする核酸を含む、それで本質的に構成される、またはそれで構成される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１２２】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む単離された抗体または抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的にまたは優先的に結合する。
【０１２３】
一実施形態では、表２に示される配列番号３または配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％  ９５％、または１００％の同一性である核酸を含む、それで本質的に構成される、またはそれで構成される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【表３】
2014527804.tif 000005
【０１２４】
いくつかの実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する、上記のポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性であるＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を含むか、それで本質的に構成されるか、またはそれで構成される。
【０１２５】
本開示はまた、本明細書の他の箇所に記載されるポリヌクレオチドのフラグメントを包含する。そのほかに、本明細書に記載の融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【０１２６】
ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法により産生または製造が可能である。たとえば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから集合させることが可能であり（たとえば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載のとおり）、これは、簡潔に述べると、抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成するステップ、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションを行うステップ、次いで、ライゲートされたオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するステップを含む。
【０１２７】
他の選択肢として、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源の核酸から産生可能である。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンを入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合、抗体をコードする核酸は、化学合成可能であるか、または配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングし、たとえば、抗体をコードするｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡライブラリーから同定することにより、好適な供給源（たとえば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞またはたとえば抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリー）から取得可能である。次いで、当技術分野で周知の任意の方法を用いて、ＰＣＲにより産生された増幅された核酸を複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることが可能である。
【０１２８】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を決定したら、ヌクレオチド配列を操作するための当技術分野で周知の方法、たとえば、組換えＤＮＡ技術、部位指向突然変異誘発、ＰＣＲなど（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）（いずれもそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の技術を参照されたい）を用いて、そのヌクレオチド配列を操作し、異なるアミノ酸配列を有する抗体を産生することすること、たとえば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を形成することが可能である。
【０１２９】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されうる。たとえば、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物でありうるＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子で構成されうる。それに加えて、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域で構成されうる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性または他の理由のために修飾された１つ以上の修飾塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有可能である。「修飾」塩基としては、たとえば、トリチル化塩基およびイノシンなどの特殊塩基が挙げられる。さまざまな修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うが可能であり、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態をとる。
【０１３０】
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（たとえば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非天然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失がコードタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列中への導入することにより、形成可能である。突然変異は、部位指向突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的技術により導入可能である。保存的アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０１３１】
Ｖ．  抗体ポリペプチドの発現
周知のように、ＲＮＡは、標準的技術により、たとえば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿およびそれに続く遠心分離またはクロマトグラフィーにより、独自のハイブリドーマ細胞からまたは他のトランスフォーム細胞から単離可能である。所望により、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーなどの標準的技術により、全ＲＮＡから単離可能である。好適な技術は、当技術分野でよく知られている。
【０１３２】
一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時または個別のいずれかで作製可能である。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーにより、または発表された重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づいてより特異的なプライマーにより、開始可能である。以上で考察したように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用可能である。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはより大きい相同プローブにより、たとえば、マウス定常領域プローブにより、スクリーニング可能である。
【０１３３】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当技術分野で公知の技術を用いて、細胞から単離可能であり、たとえば、組換えＤＮＡ技術に関する上記の参照文献に詳細に示される標準的な周知の技術により、制限マッピングおよび配列決定を行うことが可能である。当然ながら、単離プロセス中または後続の分析中の任意の時点の本開示に係るＤＮＡは、合成したものでありうる。
【０１３４】
単離された遺伝物質を操作して本開示に係る抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を提供した後、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するために使用可能な宿主細胞内に導入するための発現ベクターに挿入される。
【０１３５】
抗体またはそのフラグメント、誘導体、もしくはアナログ、たとえば、本明細書に記載の標的分子たとえばＳｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本開示に係る抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖またはそれらの一部（重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドを取得した後、当技術分野で周知の技術を用いて、組換えＤＮＡ技術により、抗体分子を産生するためのベクターを産生することが可能である。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法を本明細書に記載する。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列と適切な転写および翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法としては、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本開示は、プロモーターに機能可能に連結された本開示に係る抗体分子またはその重鎖もしくは軽鎖または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含みうるし（たとえば、国際公開第８６／０５８０７号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレット、および米国特許第５，１２２，４６４号明細書を参照されたい）、抗体の可変ドメインは、全重鎖または軽鎖を発現するためのそのようなベクター中にクローニングしうる。
【０１３６】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書では、宿主細胞内に導入して所望の遺伝子を発現するための媒体として本開示に従って使用されるベクターを意味すべく用いられる。当業者に公知のように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択可能である。一般的には、本開示に適合可能なベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進する適切な制限部位、および真核細胞または原核細胞に進入するおよび／またはそこで複製する能力を含むであろう。
【０１３７】
本開示の目的では、多数の発現ベクター系を利用することが可能である。たとえば、一クラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、ＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他のものは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン性の系の使用を含む。そのほかに、トランスフェクト宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより、ＤＮＡを染色体内に組み込んだ細胞を選択することが可能である。マーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性を提供したり、殺生物剤耐性（たとえば、抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を提供したりすることが可能である。選択可能マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結することが可能であるか、またはコトランスフォーメーションにより同一細胞内に導入することが可能である。また、ｍＲＮＡの最適合成のために、追加のエレメントが必要とされることもある。こうしたエレメントとしては、シグナル配列、スプライスシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルが挙げられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、クローン化可変領域遺伝子は、以上で考察したように合成された重鎖および軽鎖の定常領域遺伝子（たとえば、ヒト）と共に発現ベクターに挿入される。当然ながら、真核細胞中で発現を誘発可能な任意の発現ベクターを本開示で使用することが可能である。好適なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５  Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖であれば好適に高レベルを発現するものを得るべく多数のトランスフォーム細胞をスクリーニングすることは、たとえば、ロボットシステムにより実施可能な慣例的実験である。
【０１３９】
より一般的には、本開示に係る抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を作製した後、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入することが可能である。宿主細胞内へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術により達成可能である。こうしたものとしては、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡを用いた細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスの感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）を参照されたい。典型的には、宿主内へのプラスミドの導入は、エレクトロポレーションを介する。発現構築物を保有する宿主細胞を軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成に関してアッセイする。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光標示式細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学法などが挙げられる。
【０１４０】
発現ベクターは、従来技術により宿主細胞内に移送され、次いで、トランスフェクト細胞は、従来技術により培養され、本明細書で説明した方法で使用するための抗体を産生する。したがって、本開示は、異種プロモーターに機能可能に連結された、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。二本鎖抗体を発現するためのいくつかの実施形態では、以下に詳述されるように、全免疫グロブリン分子を発現するために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞内で共発現することが可能である。
【０１４１】
特定の実施形態は、上記のＶＨおよびＶＬをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。ただし、このポリヌクレオチドにより発現された抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、記載のポリヌクレオチドは、表２に示される配列番号３または配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％  ９５％、または１００％の同一性であるＶＨとＶＬとを含むｓｃＦｖ分子をコードする。
【０１４２】
いくつかの実施形態は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結される。追加の実施形態では、本開示は、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドが機能可能にプロモーターに連結されたベクターを提供する。このベクターは、好適な宿主細胞内で、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを発現可能である。
【０１４３】
また、上記のポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を培養するステップ、および前記抗体またはそのフラグメントを回収するステップを含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの産生方法が提供される。さらなる実施形態では、本開示は、上記の方法により産生された単離された抗体またはそのフラグメントを提供する。
【０１４４】
本明細書で用いられる場合、「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたかつ少なくとも１つ異種遺伝子をコードするベクターを保有する細胞を意味する。組換え宿主からの抗体の単離のプロセスの説明では、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、とくに明確な指定がないかぎり、抗体源を表すべく同義的に用いられる。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈降された全細胞からまたは培地と懸濁細胞との両方を含有する細胞培養物からのいずれかから、を意味しうる。
【０１４５】
本明細書で説明した方法で使用するための抗体分子を発現するために、さまざまな宿主発現ベクター系を利用することが可能である。そのような宿主発現系は、対象コード配列の産生および後続の精製が可能な媒体を呈するだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列でトランスフォームまたはトランスフェクトした場合、本開示に係る抗体分子をｉｎ  ｓｉｔｕで発現する細胞をも呈する。こうしたものとしては、微生物、たとえば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフォームされた細菌（たとえば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターでトランスフォームされた酵母（たとえば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）でトランスフォームされた、植物細胞系、または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌細胞または真核細胞、とくに全組換え抗体分子を発現するための細胞が、組換え抗体分子を発現させるために使用される。たとえば、ヒトサイトメガロウイルスの主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、抗体に有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１４６】
タンパク質発現に使用される宿主細胞系は、多くの場合、哺乳動物起源であり、当業者であれば、所望の遺伝子産物を発現させるのに最も適した特定の宿主細胞系を決定できると考えられる。例示的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞系は、典型的には、商用サービスの米国組織培養株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からまたは発表文献から入手可能である。
【０１４７】
それに加えて、挿入配列の発現を変調するまたは所望の特定の方式で遺伝子産物の修飾およびプロセシングを行う宿主細胞株を選択することが可能である。タンパク質産物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）およびプロセシング（たとえば、切断）は、タンパク質の機能に重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関して特徴的および特異的な機序を有する。適切な細胞系または宿主系は、発現された外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングが確実に行われるように選択可能である。この目的のために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化の細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することが可能である。
【０１４８】
組換えタンパク質を長期間にわたり高収率で産生するために、安定発現が好ましい。たとえば、抗体分子を安定に発現する細胞系を工学的に作製することが可能である。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡおよび選択可能マーカーで宿主細胞をトランスフォームすることが可能である。外来ＤＮＡの導入後、工学操作された細胞を富化培地で１〜２日間増殖させることが可能であり、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択耐性を付与し、細胞がその染色体中にプラスミドを安定に組み込んで増殖しフォーカスを形成できるようにする。次に、これをクローニングして細胞系に拡大培養することが可能である。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞系を工学的に作製するために有利に使用可能である。
【０１４９】
いくつかの選択系を使用することが可能である。たとえば、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）の遺伝子を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞中で利用することが可能である。また、次の遺伝子、すなわち、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）、およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３））、およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））に対する選定基準として、抗代謝剤耐性を使用することが可能である。組換えＤＮＡ技術分野で一般に知られる使用可能な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、およびｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５０】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増大させることが可能である（レビューについては、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増大させると、マーカー遺伝子のコピー数が増大するであろう。増幅領域は抗体遺伝子に関連付けられるので、抗体の産生もまた、増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生は、多量の所望のポリペプチドが得られるようにスケールアップが可能である。組織培養条件下の哺乳動物細胞培養技術は、当技術分野で公知であり、均一懸濁培養、たとえば、エアリフト反応器もしくは連続撹拌反応器によるもの、または固定化細胞培養もしくはトラップ細胞培養、たとえば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、もしくはセラミックカートリッジによるものが挙げられる。所要および／または所望により、たとえば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成の後、または、本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー工程の前もしくは後、慣用的クロマトグラフィー法、たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、または（免疫）アフィニティークロマトグラフィーにより、ポリペプチドの溶液を精製することが可能である。
【０１５２】
また、本明細書に開示された抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする構築物は、細菌、酵母、または植物細胞などの非哺乳動物細胞で発現可能である。核酸を容易に取り込む細菌としては、腸内細菌科のメンバー、たとえば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の株、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、たとえば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、肺炎球菌、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が挙げられる。さらに、細菌で発現する場合、異種ポリペプチドが典型的には封入体の一部になることは、わかるであろう。異種ポリペプチドは、単離精製され、次いで、機能性分子に集合させなければならない。四価形態の抗体が望まれる場合、サブユニットは、四価抗体に自己集合するであろう（国際公開第０２／０９６９４８Ａ２号パンフレット）。
【０１５３】
細菌系では、発現される抗体分子に対して意図される使用に依存して、いくつかの発現ベクターを有利に選択することが可能である。たとえば、抗体分子の医薬組成物を作製するために大量のそのようなタンパク質を産生する場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を誘導するベクターが望ましいこともある。そのようなベクターとしては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））（この場合、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列をｌａｃＺコード領域と共にインフレームでベクター中に個別にライゲートすることが可能である）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現するために、ｐＧＥＸベクターを使用することが可能である。一般的には、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することが可能である。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１５４】
原核生物に加えて、真核微生物を使用することも可能である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または通常のパン酵母は、真核微生物のなかで最も一般的に使用されるが、いくつかの他の株、たとえば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、一般に入手可能である。
【０１５５】
サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現では、たとえば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が一般に使用される。このプラスミド、たとえば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７）））は、トリプトファン中での増殖能が欠如した酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子をすでに含有する。従って、酵母宿主細胞ゲノムに特徴的なｔｒｐ１病変の存在は、トリプトファンの不在下での増殖によりトランスフォーメーションを検出するのに有効な環境を提供する。
【０１５６】
昆虫系では、外来遺伝子を発現するベクターとして、典型的には、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）中に個別にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置されうる。
【０１５７】
本明細書に開示された抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を組換え発現した後、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野で公知の任意の方法により、たとえば、クロマトグラフィーにより（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特定的には、プロテインＡクロマトグラフィー後の特異的抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィーにより）、遠心分離により、溶解度差により、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的技術により、精製することが可能である。
【０１５８】
ＶＩ．  抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物
本開示で使用される医薬組成物は、当業者に周知の薬学的に許容可能な担体を含む。非経口投与製剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、サスペンジョン剤、およびエマルジョン剤が挙げられる。本明細書に開示された特定の医薬組成物は、たとえば、カプセル剤、錠剤、水性サスペンジョン剤、または溶液剤をはじめとする許容可能な剤形で、経口投与することが可能である。また、特定の医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入により投与することが可能である。また、保存剤および他の添加剤、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどが存在することが可能である。本明細書に開示された治療方法で使用するのに好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０１５９】
単回用量製剤を作製するために担体材料と組合せ可能な抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体または免疫コンジュゲートの量は、治療される宿主および特定の投与形態に依存して異なるであろう。また、最適な所望の反応を提供するように、投与レジメンを調整することが可能である。組成物はまた、化合物に好適な送達系または支持系として機能する生体適合性担体材料中に分散されたＳｉｇｌｅｃ−１５免疫コンジュゲート、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含みうる。
【０１６０】
ＶＩＩ．  治療用の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントを用いた治療方法
本明細書に開示されたＳｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を作製し、それを必要とする被験体に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者により容易に決定される。
【０１６１】
本発明に係るＳｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＡＭＬなどの白血病の治療に有用である。特定の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、従来の白血病治療に伴う副作用を有利に低減する。
【０１６２】
白血病は、悪性細胞が白血球細胞（白血球）である骨髄に由来する癌である。急性骨髄性白血病（急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球性白血病、および急性非リンパ球性白血病とも呼ばれる）は、顆粒球または単球のいずれかで生じる悪性疾患である。ＡＭＬは、白血病芽球と呼ばれる細胞の無制御な過度の増殖および蓄積により特徴付けられ、この芽球は、正常血液細胞として機能せず、骨髄細胞の産生をブロックし、血中の正常赤血球の欠損（貧血）、および血小板の欠損（血小板減少症）、および正常白血球の欠損（特定的には好中球、すなわち、好中球減少症）をもたらす。
【０１６３】
ＣＤ３３を標的とする療法剤は、ＡＭＬ患者に投与した時に注入症候群をはじめとする有意な副作用を生じる。したがって、治療のためにＳｉｇｌｅｃ−１５を標的とする能力は、ＣＤ３３ベースの治療の代替手段を提供する。さらに、白血病芽球はＣＤ３３＋およびＣＤ３３−の両方であるので、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＡＭＬに対する追加の治療の選択肢を提供する。これは、いくつかの理由で重要である。改善された細胞死滅は、完全寛解のパーセントを増加し、寛解期間を増大し、かつ再発の可能性を低減することが可能である。第２に、改善された細胞死滅は、毒素療法に必要な全要件を低減し、非特異的細胞死滅および副作用の低減をもたらしうる。第３に、ＣＤ３３の比較的低い発現を有するＡＭＬ患者では、天然の状態またはＣＤ３３−細胞の増殖に起因してＣＤ３３治療を受けた後のいずれでも、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントは、価値ある代替または組合せの療法剤である。
【０１６４】
さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の表面発現は、正常対照ドナーの末梢血白血球上では低く、ＡＭＬ患者の芽球上では高いので、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントの投与による副作用は、従来の白血病療法と比較して低減されるであろう。
【０１６５】
ＡＭＬのサブタイプはすべて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントによる治療に適している。ＡＭＬのサブタイプは、診断時に骨髄芽球が達する発生段階に基づいて分類される。カテゴリーおよびサブセットにより、医師は、どんな治療が細胞型に最もよく奏効するか、およびその疾患がどれくらい速く進行しうるかを決定することが可能である。サブセットは、次のとおりである。すなわち、Ｍ０、骨髄芽球性、特殊分析による；Ｍ１、骨髄芽球性、成熟を伴わない；Ｍ２、骨髄芽球性、成熟を伴う；Ｍ３、前骨髄球性；Ｍ４、骨髄単球性；Ｍ５、単球性；Ｍ６、赤白血病性；およびＭ７、巨核球性。Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＡＭＬのサブタイプにとくに適して第２の作用剤と共に投与することが可能である。たとえば、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）および急性単球性白血病は、ＡＭＬの他のサブタイプと異なる治療を必要とするＡＭＬのサブタイプである。ＡＰＬの治療の第２の作用剤としては、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（ＡＴＲＡ）または抗代謝剤たとえばシタラビンが挙げられる。急性単球性白血病の治療の第２の作用剤としては、デオキシアデノシンアナログたとえば２−クロロ−２’−デオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）が挙げられる。
【０１６６】
ＡＭＬのリスク因子としては、特定の遺伝障害の存在、たとえば、ダウン症候群、ファンコニ貧血、シュワヒマン・ダイアモンド症候群などが挙げられる。ＡＭＬおよび遺伝障害を有する患者には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントと、遺伝障害の症状を治療する第２の作用剤と、を投与することが可能である。たとえば、ＡＭＬおよびファンコニ貧血を有する患者には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体またはその抗原結合フラグメントと抗生物質とを投与することが可能である。
【０１６７】
ＡＭＬの他のリスク因子としては、異なる癌の治療のための化学療法または放射線療法、喫煙、および多量のベンゼンへの暴露が挙げられる。
【０１６８】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、治療効果を生むのに十分な量で以上に挙げた治療方法に従ってヒトまたは他の動物に投与することが可能である。ＡＭＬに関して、血流中または骨髄中の悪性細胞の速度または割合に統計学的有意差が存在するのであれば、療法は、有効であるとみなすことが可能である。たとえば、悪性細胞の徴候が存在しない寛解が達成された場合、治療は、有効であるとみなされる。
【０１６９】
また、第１の作用剤および任意選択で第２の作用剤を投与する有効性は、たとえば、血流中に見いだされる悪性細胞の数の減少、細菌またはウイルスの感染の頻度または重症度の減少、創傷治癒の速度の増大、患者の一般的な感覚、たとえば、エネルギーレベルの増加ならびに骨および関節の痛みの低減に基づいて評価することが可能である。
【０１７０】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の投与経路は、たとえば、経口、非経口、吸入、または外用でありうる。本明細書で用いられる非経口という用語は、たとえば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下の投与を包含する。投与に好適な形態は、注射、特定的には静脈内注射もしくは動脈内注射または点滴のための溶液剤であろう。
【０１７１】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、当業者に公知の種々の因子に依存して、種々の頻度で複数回投与することが可能である。他の選択肢として、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の免疫コンジュゲート、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、持続放出性製剤として投与することが可能であり、その場合、それほど頻繁な投与は必要でない。投与量および頻度は、患者における免疫コンジュゲート、抗体、または抗原結合フラグメントの半減期に依存して異なる。
【０１７２】
本開示に係る実施では、とくに指定がないかぎり、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養物、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術が利用されるであろう。そのような技術は、文献中に十分に説明されている。たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）、ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【０１７３】
抗体工学の一般的原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に示される。タンパク質工学の一般的原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に示される。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）、およびＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に示される。そのほかに、当技術分野で公知のおよび具体的な説明がない免疫学の標準的方法は、一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に従う。
【０１７４】
免疫学の一般的原理を示す標準的参照文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）、Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４），Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｋｉｎｄｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｒａ  Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．（２０００）、Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）、Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ（２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）が挙げられる。
【実施例】
【０１７５】
実施例１：  白血病細胞系でのＳｉｇｌｅｃ−１５の多重スプライシングおよび転写誘発
特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより４つのヒトＳｉｇｌｅｃ−１５スプライス変異体を同定した。ＤＡＭＩ（巨核球細胞系）、ＨＥＬ（赤白血病細胞系）、およびＫ５６２（赤白血病細胞系）のＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動を、配列決定後に作成されたエキソン地図（図１Ａ−右側パネル）と共に、図１Ａに示す。白血病細胞系のｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲからＳｉｇｌｅｃ−１５の異なる４つのスプライス変異体を同定した。最大転写物（２Ｄ）は、すべてのエキソンを含み、さらなる実験で使用された。
【０１７６】
また、試験した７つの異なる細胞系のうち６つで、Ｓｉｇｌｅｃ−１５転写物が見いだされた（図１Ｂ）。ＹＴ（ナチュラルキラー様白血病細胞系）のみ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５転写物を示さなかった。４８時間にわたる、ホルボメリスチルアセテート（ＰＭＡ）またはリポポリサッカリド（ＬＰＳ）の刺激は、転写物の発現をアップレギュレートした。等負荷の対照（０．４ｋｂ）に対するＧＡＰＤＨ  ＲＴ−ＰＣＲを各パネルの下側に示す。２９３Ｔ細胞を陰性対照として使用した。
【０１７７】
また、ＲＴ−ＰＣＲを行って白血病患者に由来する７つの細胞系でＳｉｇｌｅｃ−１５全長転写物を同定した（図１Ｂ）。また、これらの細胞系をＬＰＳまたはＰＭＡのいずれかで４８時間刺激した。Ｓｉｇｌｅｃ−１５転写物発現は、７つの細胞系のうち６つで見いだされ、刺激後のアップレギュレーションは、ＣＨＲＦ−２８８−１１細胞系以外のすべての場合で観測された。全長転写物のみは、一貫してアップレギュレートされた。ＨＬ６０細胞系では、ＰＭＡにより全長転写物のアップレギュレーションが誘発されたが、ＬＰＳ刺激によりこの転写物が完全消失した。これらの結果から、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、多重スプライス変異体で存在し、全長転写物は、多くの白血病細胞系でＬＰＳおよびＰＭＡにより誘導されることが示される。
【０１７８】
実施例２：  Ｓｉｇｌｅｃ−１５の抗体またはその抗原結合フラグメント
ファージディスプレイを利用して、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する試薬を選択した。ファージディスプレイ技術を用いて、精製されたＦｌａｇ−Ｈｉｓタグ付きＳｉｇｌｅｃ−１５に対する一本鎖フラグメント可変（ＳｃＦｖ）結合剤を増幅し、さらに、ｐＤｉｓｐｌａｙ構築物中にクローニングされたＨＡタグ付きＳｉｇｌｅｃ−１５を安定に発現するＣＨＯ細胞の表面上で選択した。Ａ９Ｅ８およびＡ４Ｃ９は、ネズミＩｇＧ１形式に変換された、これらの２つのラウンドの２つのＳｃＦｖ結合剤であった。ＦＡＣＳ（図２Ａ）および共焦点顕微鏡法（図２Ｂ）によれば、両方ともＳｉｇｌｅｃ−１５に結合し、ウェスタンブロット（図２Ｄ）では、Ａ４Ｃ９が結合した。
【０１７９】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５と他のＳｉｇｌｅｃとの間の類似性が非常に低いので（３５％未満の同一性）、これらの２つの抗体は、おそらく他のＳｉｇｌｅｃと交差反応しない。Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対するＡ９Ｅ８およびＡ４Ｃ９の特異性を確認するために、ＨＡタグ付きＳｉｇｌｅｃ−１５、Ｓｉｇｌｅｃ−１１、Ｓｉｇｌｅｃ−１６で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞または非トランスフェクトＣＨＯ細胞への結合に関して、２つの抗体のＳｃＦｖ体を比較した。これらの２つの抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５には強く結合したが、Ｓｉｇｌｅｃ−１１および１６のトランスフェクタントでは、結合は観測されなかった（図２Ｃ）。Ｕ９３７は、ＣＤ３３、Ｓｉｇｌｅｃ−５、およびＳｉｇｌｅｃ−９をはじめとする多くのＳｉｇｌｅｃをその細胞表面上の内因的に発現する十分に特徴付けられた細胞系である（Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＨら、２００６）。Ａ９Ｅ８は、Ｕ９３７細胞表面に結合しなかった（図５Ａ）。これは、他のＳｉｇｌｅｃとの交差反応性がないことと一致する。
【０１８０】
実施例３：  Ｓｉｇｌｅｃ−１５の発現パターン
内因性Ｓｉｇｌｅｃ−１５が主に細胞内にあることは、免疫組織化学によりすでに示されている（Ａｎｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）。この知見は、非固定さらには固定透過化の白血病細胞系のＦＡＣＳ分析により確認されたが、これらの系は、表面および細胞内の発現の相対レベルが異なった（図３）。低い表面発現は、ＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０などの膜アダプタータンパク質の要件により説明されうる（Ａｎｇａｔａら、２００７）。細胞膜アダプタータンパク質の要件を試験するために、異なるアダプター分子、すなわち、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはＦｃＲγで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞系にＦｌａｇタグ付きＳｉｇｌｅｃ−１５を一過的にトランスフェクトした。これらのアダプターの内因性発現が欠如しているので、ＨＥＫ−２９３細胞を選択した。抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体を用いて、表面Ｆｌａｇ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５発現をＦＡＣＳにより検出した。表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５の増加は、ＤＡＰ１０の存在下で最も顕著であったが、ＤＡＰ１２およびＦｃＲγの存在下では有意な発現が観測されなかった（図４）。Ｓｉｇｌｅｃ−１６を用いた並行実験では、より特異的なＤＡＰ１２依存表面発現を示した（図４）。これらの結果から、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、通常増殖条件下では顕著に細胞内の抗原であるが、アダプターと組み合わせると一部が細胞表面に接近することが示される。表面発現でのＳｉｇｌｅｃ−１５のアダプター依存性の明確な無差別性は、１つのアダプターに他のアダプターよりも結合する他の活性化受容体と異なる。
【０１８１】
抗体Ａ９Ｅ８を用いて白血病細胞系上でのＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現を調べた。ＦＡＣＳにより、赤血球（Ｋ５６２およびＨＥＬ）ならびに巨核球（ＤＡＭＩ）の系列（図５Ａ）の白血病細胞系の細胞表面上でＳｉｇｌｅｃ−１５を同定した。単球性（Ｕ９３７およびＳＫＭ−１）および前単球性（ＮＯＭＯ−１）白血病細胞系は、細胞表面発現を示さなかった（図５Ａ）。リンパ系列の白血病細胞系も試験した。Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）のみ、比較的弱い表面発現を示した（図５Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞リンパ芽球性白血病（図５Ａ）では発現は存在しなかった。
【０１８２】
モノクローナル抗体Ａ４Ｃ９による選択された細胞系のウェスタンブロット分析は、２９３Ｔ細胞でトランスフェクタントＦｌａｇタグ付きＳｉｇｌｅｃ−１５に結合した、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の細胞質内テールに特異的なウサギ抗血清１Ａに対して、類似の発現パターンを示した（図５Ｂおよび５Ｃ）。ウェスタンブロットは、Ｊｕｒｋａｔ細胞で有意なＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質発現を示し（単一矢印により表されたバンド）、Ｋ５６２およびＨＥＬの細胞系ではより弱い発現を示した（図５Ｃ）。
【０１８３】
実施例４：  健常ドナーの末梢血白血球上でのＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現
健常ドナー末梢血細胞を用いてＳｉｇｌｅｃ−１５発現を調べた。Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、試験したほとんどの成熟白血球すなわち、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、およびＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）の表面上で不在であったが、単球（ＣＤ１４＋）のわずかな集団（＜１％）は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５表面発現を示した（図６Ａ）。この発現パターンは、試験した６人の健常ドナーで類似していた。
【０１８４】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、免疫組織化学によりマクロファージおよび樹状細胞で細胞内にあることが、すでに報告された。ＦＡＣＳ分析は、末梢血単球に由来する培養マクロファージの７％で非常に弱いレベルのＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現を示した（図６Ｂ）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５染色は、弱い前方散乱の細胞でより顕著であった。これは、おそらくマクロファージの成熟サブ集団がより少ないことに対応する。マクロファージの表面染色は、２４時間のＬＰＳ処理の後、失われた（図６Ｂ）。樹状細胞は、ＬＰＳ刺激前の全集団の約４％できわめて低いＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現を示した（図６Ｂ）。この発現は、２４時間のＬＰＳ刺激の後失われた（図６Ｂ）。これらの結果は、健常ドナーでは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ほとんどの血中循環白血球の細胞表面上に少量あるかまたは不在であることを示しており、単球に由来するマクロファージおよび樹状細胞でも同様であった。
【０１８５】
実施例５：  循環ＡＭＬ芽球上でのＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現
健常ドナーとは対照的に、試験した１０名のＡＭＬ患者のうち８名で、有意に高いＳｉｇｌｅｃ−１５表面発現が芽球上に見いだされた（図７Ａ〜Ｄ）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５陽性の芽球サブ集団の平均サイズは、２０％であり、健常ドナーの循環末梢血白血球の約２％とは対照的である（図７Ｅ）。試験したＡＭＬドナーのグループの代表的な４つの例を図７にまとめる。患者Ａ（図７Ａ）、Ｂ（図７Ｂ）、およびＣ（図７Ｃ）は、一貫してＳｉｇｌｅｃ−１５とＣＤ１４との共発現を示した。
【０１８６】
ＣＤ３３は、ＡＭＬ骨髄芽球の９０％で発現される。一症例では、すなわち、ＣＤ３３陰性患者Ｃ（図７Ｃ）では、高レベルのＳｉｇｌｅｃ−１５が芽球の２０％で発現された。他の症例では、低パーセント（７％）のＣＤ３３＋芽球を示した患者Ｄは、より高い割合のＳｉｇｌｅｃ−１５＋芽球（１５％）を示した（データは示されていない）。ＨＬＡ−ＤＲは、Ａなどの特定の患者以外では、一貫してＳｉｇｌｅｃ−１５との共発現はなかった。患者Ｄは、より大きい前方散乱により規定されるより大きい芽球上により多くのＳｉｇｌｅｃ−１５を発現した。これらのデータから、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ＡＭＬ患者の循環白血球上で健常ドナーよりも有意に高い発現を呈することが示唆される。
【０１８７】
実施例６：  Ａ９Ｅ８は、きわめて迅速な表面Ｓｉｇｌｅｃ−１５のエンドサイトーシスを誘発する
高速のＳｉｇｌｅｃ−１５エンドサイトーシスは、とくに毒素コンジュゲート抗体を用いてＳｉｇｌｅｃ−１５陽性ＡＭＬ芽球を標的とする場合、有利である。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の迅速なエンドサイトーシスは、配列ＳＮＹＥＮＬのＩＴＳＭモチーフをコードするその細胞質内テール配列から予想され、したがって、古典的なエンドサイトーシスＹｘｘФモチーフに合致する。ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Фは、疎水性残基である。ＹｘｘФモチーフは、ＡＰ２クラスリンアダプター複合体（Ａｇｕｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００１、Ｂｏｅｈｍ  ａｎｄ  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，２００１）への結合により、膜タンパク質のクラスリン依存エンドサイトーシスを誘導する（Ｃｏｌｌａｗｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）。内因性Ｓｉｇｌｅｃ−１５エンドサイトーシスの速度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べるために、顕著な表面発現を示すことからＫ５６２細胞株を選択した。Ａ９Ｅ８抗体を氷上でＫ５６２に結合し、３７℃に予備加温した培地中に細胞を再懸濁した。ただちに、加温細胞を３７℃で種々の時間にわたりインキュベートし、その後、５ｍｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で冷却した。二次抗体を用いて残存表面抗体を検出し、エンドサイトーシスの半減期を測定したところ、１７４秒であった。Ｓｉｇｌｅｃ−１５からのＡ９Ｅ８抗体の天然解離を制御するために、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメインのみをコードするｐＤｉｓｐｌａｙ構築物を同一アッセイに付した。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の天然膜貫通部および細胞質内テールが欠如しているので、この構築物は、３７℃でのインキュベーションの最初の１５分間、明確な表面エンドサイトーシスを示さなかった。この結果は、Ｋ５６２細胞上での表面Ａ９Ｅ８染色の消失がエンドサイトーシスによる可能性が最も高いことを示している。
【０１８８】
本開示の範囲は、本開示の個別の態様の一例であることを意図して記載した特定の実施形態により限定されるものではなく、機能的に等価な組成物または方法はいずれも、本開示の範囲内である。実際に、以上の説明および添付の図面から、本明細書に提示および説明した実施形態に加えて本開示のさまざまな変更形態が当業者に自明なものとなるであろう。そのような変更態様は添付の特許請求の範囲内に包含されるものとみなされる。
【０１８９】
本明細書に挙げられた出版物および特許出願はすべて、あたかもそれぞれ個々の出版物または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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