(57)【要約】本発明は、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）に特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、ポリクローナル抗体は、ｈＴＮＦまたはその免疫原性部分で免疫化されたウシ動物の血清、乳または初乳に由来する、組成物を提供する。本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体の抗原特異性分析は独特であり、独特であり、先行技術の抗ｈＴＮＦポリクローナルまたはモノクローナル抗体に対し、前に記載されていない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍壊死α（ｈＴＮＦ）に特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、前記ポリクローナル抗体は、ｈＴＮＦまたはその免疫原性部分で免疫化されたウシ動物の血清、乳または初乳に由来し、前記ポリクローナル抗体は、下記特徴のうちの１つ以上を含む、組成物：
ａ）ヒトＴＮＦならびにアカゲザルサルＴＮＦおよびカニクイザルＴＮＦから選択される少なくとも１つの非ヒト霊長類ＴＮＦの活性を中和する；
ｂ）ｈＴＮＦ上の少なくとも１つのエピトープに結合し、ここで、少なくとも１つのエピトープは、配列番号：２；配列番号：３；配列番号：４；配列番号：５；および配列番号：６のアミノ酸配列の全てまたは一部から選択されるアミノ酸配列を含む；ならびに
ｃ）膜貫通ＴＮＦを発現する末梢血単核球において、インビトロでアポトーシスを誘導する。
【請求項２】
前記ポリクローナル抗体はまた、イヌＴＮＦに結合し、これを中和する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリクローナル抗体は、ｈＴＮＦと比べて、マウスＴＮＦと約２％以下の交差反応性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリクローナル抗体は、カニクイザルＴＮＦよりも大きな程度までイヌＴＮＦに結合し、イヌＴＮＦよりも大きな程度までカニクイザルＴＮＦを中和する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
標準インビトロＬ９２９アッセイにおいてヒトＴＮＦ細胞毒性を中和し、ＥＣ５０は０．０３ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウシ動物は組換えｈＴＮＦまたはその免疫原性断片で免疫化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ウシ動物はｈＴＮＦまたはその免疫原性断片で、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２５、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ−ＤおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ−ＢＣＬから選択されるアジュバントと組み合わせて免疫化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項９】
さらに少なくとも１つの追加の治療薬を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
患者に治療的有効量の請求項８に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者において炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法。
【請求項１１】
患者に治療的有効量の請求項８に記載の組成物を投与することを含む、患者において口腔または腸粘膜炎を治療する方法。
【請求項１２】
前記口腔または腸粘膜炎は化学療法または放射線療法により誘導される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記口腔または腸粘膜炎は放射線への非治療的曝露により引き起こされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
患者に治療的有効量の請求項８に記載の組成物を投与することを含む、患者において胃腸急性放射線症候群（ＧＩ−ＡＲＳ）を治療する方法。
【請求項１５】
前記組成物は経口または直腸投与される、請求項１０、１１または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の組成物をＧＩ−ＡＲＳのための非ヒト動物モデルに投与する工程を含む、ＧＩ−ＡＲＳの非ヒト動物モデルにおいてＧＩ−ＡＲＳを治療する方法。
【請求項１７】
前記非ヒト動物モデルは非ヒト霊長類、イヌおよびブタから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ヒト霊長類はカニクイザルおよびアカゲザルから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約１ｍｇ未満のラクトフェリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物の調製は下記工程を含む、請求項１に記載の組成物：
（ａ）ウシの初乳に由来する乳清をアニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムを通して濾過する工程；
（ｂ）工程（ａ）におけるカラムのフロースルーを収集する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）のフロースルーを限外濾過により濃縮する工程。
【請求項２１】
前記組成物の調製は下記工程を含む、請求項１に記載の組成物：
（ａ）ウシの初乳に由来する乳清のｐＨをｐＨ６．６〜７．０に調整する工程；
（ｂ）前記乳清をカチオン交換カラムと連続して連結されたアニオン交換カラムを通して濾過する工程であって、前記乳清は連続して、塩濃度またはｐＨを変化させる材料の添加なしに連続して連結された両方のカラムを流れる工程；
（ｃ）収集が起こる前に塩濃度またはｐＨを変化させる材料の添加なしに、工程（ｂ）の両方のカラムを通過した後、フロースルーを収集する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｂ）のフロースルーを限外濾過により濃縮する工程。
【請求項２２】
前記乳清中に存在する前記ポリクローナル抗体の特異活性は、工程（ｄ）の濃縮フロースルーにおいて約２倍増加する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物の調製はさらに、工程（ｄ）の濃縮物をｈＴＮＦに結合されたアフィニティーマトリクスを用いて親和性精製する工程（ｅ）を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
工程（ｅ）の前記親和性精製された材料の標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて測定されるｈＴＮＦ細胞毒性の中和活性は、工程（ｄ）の濃縮フロースルーの中和活性と比べて少なくとも１００倍増加する、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、全体として、または一部、ＮＩＨ認可番号１Ｒ４３ＤＥ０１９７３５−０１、１Ｒ４３ＤＫ０８３８１０−０１Ａ１、および２Ｒ４４ＤＫ０８３８１０−０２により、ＨＨＳ契約ＨＨＳＯ１００２０１１０００２７Ｃにより支援された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は重要なクラスの医薬品である。標的抗原に特異的な抗体は、癌および自己免疫疾患を治療するのに著しく有効な治療薬であることが証明されており、それらの使用は罹患患者に非常に有益であった。抗体は一般に、特定の標的に非常に特異的であり、よって、小分子治療薬で見られるものよりオフターゲット毒性が低い傾向がある。
【０００３】
ＷＯ２００９／０４６１６８号、ＷＯ２００９／０２０７４８号およびＵＳ２００７０１８４０４９Ａ１号は、１つ以上の疾患の発病を調節する抗原を標的にするために、消化管に局所的に送達される治療薬として使用するための、免疫化哺乳類の乳に由来するポリクローナル抗体の使用を記載する。特にウシ源由来の初乳および乳は、ヒト患者への経口送達のための一意的に安全なポリクローナル抗体源である。通常の乳はおよそ１．５ｇ／ＬのＩｇＧを含むので、すでに大規模なヒトのウシ免疫グロブリンへの曝露が存在する。しかしながら、乳および初乳はそれらだけで治療的使用を有する他の成分を含み、それらは、乳源に由来するポリクローナル抗体を使用してある一定の疾患を治療することとの関連で理想的でない可能性がある。ドナー動物の免疫化により誘導される特異抗体に加えて、乳および初乳は、他の特異性を有する抗体および多くの他の生物活性非免疫グロブリン因子、例えば、限定はされないがタンパク質、ペプチド、および小分子を含む（Ｋｏｒｈｎｏｎｅｎ  ｛Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｈｌａｎｔｏ，  ２００７，  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，  １３，  ８２９−４３｝  およびＬｉａｎｇ  ｛Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｒｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，  ８，  ３７６４−７６｝に掲載）。
【０００４】
乳および初乳中の特定の非免疫グロブリン成分（それらの多くは単独でまたは組み合わされて生物活性を有する）としては、下記が挙げられる：ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、トランスフェリン、リゾチーム、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＣＴＧＦ、インスリン、プロテアーゼ、ＰＲＰ、グルタミン、ポリアミン、ヌクレオチド、プロラクチン、ソマトスタチン、オキシトシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ＴＳＨ、チロキシン、カルシトニン、エストロゲン、プロゲステロン、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ３、Ｃ４、乳房由来増殖因子ＩＩ、ヒト乳増殖因子ＩＩＩ；成長ホルモンおよび成長ホルモン放出因子、カゼイン、カゼイン由来ペプチド、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｅ、Ａ、Ｃ、葉酸、パントテン酸、βカロチン、グリコーゲン、レチノイン酸、カルシウム、クロム、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、亜鉛、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、アラニン、チロシン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、β−２ミクログロブリン、ヘモペキシン、ハプトグロビン、オロト酸、ペルオキシダーゼ、およびキサンチンオキシダーゼ。
【０００５】
初乳は、栄養補助食品として広く使用され、治療薬として研究されている｛Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １６，  １９１７−２２｝。大腸炎の動物モデルにおいて有効であることもまた、示されている｛Ｂｏｄａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｊ  Ｎｕｔｒ，  １４１，  １０５６−６１｝。
【０００６】
多くの研究者が、１つ以上の上記で列挙される非免疫グロブリン成分を濃縮し、免疫グロブリンおよびカゼインなどの他の成分を枯渇させることにより、初乳および乳のそのような非免疫グロブリン成分の治療的使用を活用してきた。そのような濃縮増殖因子のための潜在的な治療的使用としては、消化系疾患の治療および消化管炎症の治療が挙げられる。初乳は、様々な腸疾患のための有益な治療として考えられてきた。乳または初乳由来の増殖因子は、化学療法誘発性粘膜炎におけるそれらの使用が考慮されてきた。乳由来増殖因子および他の生理活性成分のための濃縮するための方法は当技術分野で知られている。当技術は、疾患、特に病原体の感染に起因する胃腸疾患の治療の経口投与のためのウシ由来抗体の組成物を開示する。しかしながら、当技術は、特に経口送達された場合、乳または初乳で見られる非免疫グロブリン成分から単離したそのような抗体の使用を企図していない。実際、初乳のそのような非免疫グロブリン成分は、経口投与のための抗体を安定化させると、以前は考えられていた。
【０００７】
抗体医薬品中の複数の活性非免疫グロブリン因子の存在が問題となる場合があることは以前は認識されていない。非免疫グロブリン生理活性物の存在によりもたらされる問題のいくつかは、ここで列挙される。第１に、これらの非免疫グロブリン因子のいくつかのレベルは、雌ウシの健康、農業経営実践、および収集が起こる泌乳の段階により影響される。例えば、５５の雌ウシ由来の初乳の１つの調査では｛Ｋｅｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ，  ９０，  ４１０８−１６｝、ラクトフェリンの平均レベルは０．８ｍｇ／ｍｌであったが、個々の雌ウシに由来する範囲は、０．１ｍｇ／ｍｌ−２．２ｍｇ／ｍｌであった。これは、変動原因を製品に導入し、これは、認可された生物製剤のために要求される製造の一貫性を達成するのを困難にし得る。
【０００８】
これらの非免疫グロブリン因子の発現の変動は特に困難であり、というのも、初乳の生物活性に関与する単一成分または成分混合物を明確に同定することが可能ではなかったからである。一方、これにより、製品均一性を達成することが非常に困難になる。他方、製品についての仕様を設定することが困難になる。
【０００９】
第２に、これらの非免疫グロブリン因子のいくつかは、治療薬中の特異抗体により標的にされる同じ経路または疾患過程に作用し得る。これにより、特異抗体の投与により得られる治療効果を評価するのが困難になる。
【００１０】
第３に、これらの非免疫グロブリン因子のいくつかは、特に胃腸疾患を有する患者に与えられた場合、安全に対する懸念と関連する可能性がある。これは特に抗体製品が慢性的に投与されることが意図される場合、真実となる。例えば、増殖因子への長期曝露は、悪性腫瘍のリスクを増加させ得る。
【００１１】
よって、非免疫グロブリン因子不純物の存在を含む、潜在的に治療的に混乱させる活性を有さない一貫した抗体製品の製造を可能にする組成物および方法を開発することが必要である。
【００１２】
抗体は一般に、特定の標的に非常に特異的であり、よって、小分子治療薬で見られるものよりオフターゲット毒性が低い傾向がある。本明細書では「ＴＮＦ」と呼ばれる、腫瘍壊死因子αに特異的なモノクローナル抗体はＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）、ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）として知られている治療モノクローナル抗体を含み、炎症性腸疾患の治療において有効である。しかしながら、それらの使用は、おそらく全身免疫抑制のために、悪性腫瘍のリスクの増加および重篤な感染のリスクの増加と関連する（Ｂｏｎｇａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  ＪＡＭＡ，  ２９５，  ２２７５−８５）。そのため、抗体を臨床的有益性が最大となる位置へ向かわせることができ、一方、他の部位での抗体の活性を最小に抑える抗ＴＮＦ抗体の方法および医薬組成物を生成させることが必要である。
【００１３】
抗ＴＮＦ抗体治療薬の使用はまた、投与された抗体の免疫原性によりしばしば制限される。治療薬に対する抗体の誘導は、活性の損失および注入有害反応の可能性と関連する。免疫原性は、抗体が非ヒト種に由来する場合に最も明確に見られる。しかしながら、ヒト抗ヒト抗体応答（ＨＡＨＡ）の存在はまた、記載されており、重大な臨床的問題の原因である（Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６１，  ６８５１−９；  Ｔｒａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １１７，  ２４４−７９）。炎症性腸疾患の治療では、全身投与された抗ＴＮＦ抗体で治療された患者はしばしば、中和抗体の誘導のために、抗体療法に対し非応答性となる（Ｔｒａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １１７，  ２４４−７９）。よって、免疫原性を最小に抑えることができ、一方、効力を維持する抗体治療薬の方法および医薬組成物を生成させることが必要であり、既存の抗ＴＮＦ抗体治療薬に無応答性となった患者を治療するために使用することができる方法および医薬組成物を生成させることが必要である。
【００１４】
ポリクローナル抗体の使用は、抗原性標的に対する、ポリクローナル抗体における複数の反応性の存在のために、モノクローナル抗体の使用と比べ潜在的な臨床的利点を有する。抗原性標的、例えばヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）上の全てのまたは複数のエピトープに対して反応性を有するポリクローナル抗体は生成され得る。多くのエピトープ特異性を含む組成物のポリクローナル特性のために、ポリクローナル抗体を使用した場合に標的抗原で達成することができる機能的抗体密度は、モノクローナル抗体よりも著しく高い。これにより、標的抗原のより効率的なブロッキングまたはクリアランスが得られる。加えて、組成物のポリクローナル特性のために、標的抗原上のいくつかのエピトープは、同時にブロックすることができ、生物活性のより効率的なブロッキングが得られる。生物活性ＴＮＦは、個々のエピトープの複数のコピーを提示する三量体として存在し（Ｓａｎｔｏｒａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２９９：１１９−２９）、ポリクローナル抗体は複数の反復エピトープを介して三量体ＴＮＦ分子を架橋することにより免疫複合体を形成するのにより有効である。そのような免疫複合体は細網内皮系による生物活性ＴＮＦのより効率的なクリアランスを促進する。
【００１５】
モノクローナル抗体と対照的に、ポリクローナル抗体調製物は、特異性混合物を含み、そのため任意の単一のおよび個々の、交差反応する、特定の特異性を有する抗体が、非常に低い濃度で送達され、よって、交差反応性による有害な副作用の可能性が著しく低減される。ポリクローナル抗体調製物のいずれの望まれない交差反応性も、抗体組成物のさらなる精製により除去することができる。モノクローナル抗体により望まれない交差反応性が生じた場合、存在する単一の抗体に固有のものであり、調製物の活性を破壊せずに除去することはできない。
【００１６】
交差反応性の可能性の減少の観点から、ポリクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体よりも中和抗イディオタイプ免疫応答を誘導する可能性がずっと低く、というのも、投与されたポリクローナル抗体調製物の各単一のエピトープ特異的なイディオタイプは非常に低い量または濃度で存在し、おそらく、抗イディオタイプ応答の生成に対する閾値より低いからである。
【００１７】
ポリクローナル抗体は標的抗原上の複数のエピトープに結合するが、特定のポリクローナル抗体は全ての可能なエピトープを認識するわけではない。ある一定のエピトープは免疫原性であるが、他のエピトープは非免疫原性である。ある一定の免疫原性エピトープは他の免疫原性エピトープよりも高い免疫優性度を有する。特定の免疫原性エピトープの相対的免疫優性は、そのエピトープと、ポリクローナル抗体が生成される宿主動物中に自然に存在する相同エピトープの間の相同性度により影響される。相対的免疫優性はさらにそのエピトープの宿主免疫応答への曝露により影響され、免疫化前に抗原をアンフォールディングする、または別の方法で変性させることにより、意図的に、あるいは特定のアジュバントとの相互作用のいずれかにより、操作することができる。相対的免疫優性はさらに使用される特定の免疫化レジメンにより影響され、というのも、免疫原の用量ならびにブースターの数およびタイミングは、親和性成熟として知られるプロセスによる特定の抗体特異性の選択により特定のエピトープの相対認識を変化させる可能性があるからである。
【００１８】
ポリクローナル抗体の特異性は、その機能に重要である。ポリクローナル抗体中のいくつかの個々の抗体分子は標的抗原に生物活性を妨害しない部位で結合し得る。他の個々の抗体分子は標的抗原に、いくつかの生物活性を妨害するが、他のものは妨害しない部位で結合し得る。これは特に複雑な作用メカニズムを有する抗原で真実である。ＴＮＦは、例えば、三量体分子であり、これは、可溶および膜結合型の両方において活性であり、少なくとも２つの別のクラスの受容体に結合する。そのため、ポリクローナル抗体の特異性を機能的に規定することが重要である。
【００１９】
インビボの治療抗ＴＮＦ抗体の作用メカニズムは、特にインビトロで規定されている多くの可能なメカニズムの相対的寄与および関係する特異的ＴＮＦエピトープに関して、よく理解されていない。ＴＮＦの可溶型の阻害の可能なメカニズムとしては、多種多様の細胞型上での、ＴＮＦ受容体のクラス、ＴＮＦＲ１よびＴＮＦＲ２のいずれかまたは両方へのその結合のブロッキング、ならびに免疫複合体のクリアランスメカニズムが挙げられる。膜結合型のＴＮＦは、ＴＮＦＲ２のためのリガンドとして、または逆シグナル伝達メカニズムを開始するための「受容体」として作用することができ、そのため、抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦＲ２との相互作用をブロッキングすることにより、または逆シグナル伝達メカニズムを活性化することにより、膜結合型ＴＮＦに作用することができる。そのため、多くのポリクローナル抗体、特に臨床治療薬として使用されるものの間の再現性を確保するために、ポリクローナル抗体の特定の特異性を規定するアッセイを有することが重要である。
【００２０】
ポリクローナル抗体の特異性を規定する１つの方法は、ポリクローナル抗体の相同抗原、例えば異なる種由来の同じ抗原に結合する、および／またはこれを機能的に阻害する能力を評価するものである。抗体の種特異性は、ポリクローナル抗体により認識されるエピトープの特定のバランスのフィンガープリントを提供し、そのため、特定のポリクローナル抗体を規定し、同定する際の重要な要素となる。結合は、イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを用いて、あるいは直接結合アッセイ、例えば平衡透析またはＢＩＡｃｏｒｅ機器を使用する表面プラズモン共鳴を用いて評価することができる。ＴＮＦ中和機能は、可溶性ＴＮＦまたは膜結合型ＴＮＦためのアッセイにおいて、例えば標準インビトロＬ９２９アッセイにより評価することができる。
【００２１】
ポリクローナル抗体の特異性を規定する別の方法は、ｈＴＮＦの組換えバリアント、ＴＮＦに関連する分子、例えば他のサイトカイン（例えば、リンホトキシン）の結合および阻害、およびｈＴＮＦのペプチド断片への結合を評価するものである。
【００２２】
ポリクローナル抗体の特異性を規定する別の方法はエピトープマッピングによる。ポリクローナル抗体のエピトープマッピングは、ポリクローナル抗体と相互作用する、および結合する標的抗原の部分に関する情報を提供する。
【００２３】
臨床設定において使用された場合、先行技術の薬剤よりも、有する潜在的な副作用が少ない新しい抗ＴＮＦ剤が必要である。
【発明の概要】
【００２４】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトｈＴＮＦまたはその抗原部分で免疫化されたウシ動物の血清、乳または初乳に由来するｈＴＮＦに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物を提供する。そのようなポリクローナル抗体はまた、本明細書では「抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体」または「ウシ由来抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体」と呼ばれる。「ｈＴＮＦに特異的に結合する」または「ｈＴＮＦに特異的である」という用語は、本明細書では、本発明のポリクローナル抗体はｈＴＮＦに結合することができることを意味する。
【００２５】
様々な種のＴＮＦとの交差反応性度は、ポリクローナル抗体が、ｈＴＮＦにおいてどのエピトープに優先的に結合するかを効果的に規定し、というのもいくらかのエピトープは高度に保存され、他のエピトープは種間で異なるからである。異なる種由来のＴＮＦの交差反応性により規定されるエピトーププロファイルは、様々な種のＴＮＦの配列相同性からも、免疫化において使用されるアジュバントからも予測することができない；そのため、抗ヒトＴＮＦポリクローナル抗体のＴＮＦ種特異性プロファイルは予想外であり、本発明の独特な組成物を規定する。本発明によれば、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体の抗原特異性分析は独特であり、先行技術の抗ｈＴＮＦポリクローナルまたはモノクローナル抗体に対し、前に記載されていない。
【００２６】
齧歯類〜霊長類の種にわたるＴＮＦの一次構造の高い相同性度（＞７５％）のために、ウシポリクローナル抗体により認識されるヒトＴＮＦ上の抗原エピトープのいくつかは、他の種由来のＴＮＦ分子と共有されるであろうことが予測される。しかしながら、ポリクローナル抗体の様々な種のＴＮＦとの交差反応性度は、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体の独特な抗原特異性を表す。さらに、様々な種のＴＮＦにわたる、ＴＮＦ−結合抗体およびＴＮＦ−中和抗体の両方に対する交差反応性のパターンは、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体の抗原特異性の独特なフィンガープリントである。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトＴＮＦに結合し、これを中和する。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体はまた、カニクイザルＴＮＦおよびアカゲザルＴＮＦから選択される非ヒト霊長類由来のＴＮＦに結合し、および／またはこれを中和する。１つの実施形態では、ｈＴＮＦに結合することに加えて、ポリクローナル抗体はまた、イヌＴＮＦに結合する。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体はカニクイザルよりも大きな程度までイヌＴＮＦに結合し、イヌＴＮＦよりも大きな程度までカニクイザルＴＮＦを中和する。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は、抗体のｈＴＮＦとの交差反応性と比べて、約２％未満、好ましくは約１％未満のマウスＴＮＦとの交差反応性を有する。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は、マウスＴＮＦの中和では、無視できる活性を有する。
【００２８】
１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は下記から選択されるおよそのアミノ酸位置内のｈＴＮＦ上の少なくとも１つのエピトープに結合する：配列番号：１のアミノ酸１−１５；配列番号：１のアミノ酸２１−３５；配列番号：１のアミノ酸６１−６５；配列番号：１のアミノ酸９１−９５；配列番号：１のアミノ酸１３１−１４０；およびそれらの任意の組み合わせ。１つの実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は、ｈＴＮＦの少なくとも１つのエピトープに結合し、ここで、ｈＴＮＦエピトープは、下記から選択されるアミノ酸配列を含む：配列番号：２；配列番号：３；配列番号：４；配列番号：５；および配列番号：６。
【００２９】
１つの実施形態では、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体は、膜貫通ＴＮＦを発現する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてアポトーシスを誘導する。
【００３０】
１つの実施形態では、ｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体の効力はＥＬＩＳＡにより試験した場合少なくとも１ｍｇ／ｍｌであり（ここで、効力は最大半量応答を生成させる抗体の濃度として規定され、ここで濃度は、ＢＣＡアッセイにおけるタンパク質濃度により規定される）。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は、細胞毒性アッセイにおいてｈＴＮＦを阻害し、好ましくは、ＥＣ５０として計算した場合、アッセイにおけるｈＴＮＦ阻害の効力は約０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０３ｍｇ／ｍｌ以上である（ここで、ＥＣ５０は、ｈＴＮＦの最大半量の阻害を生成させる抗体の濃度として規定され、濃度は、ＢＣＡアッセイにおけるタンパク質濃度により規定される）。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は、上記で特徴付けられた実施形態の任意の２つ以上の組み合わせを有する。
【００３２】
本発明はまた、疾患の治療において本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体医薬組成物を使用するための医薬組成物および方法を提供し、ここで、ＴＮＦは疾患の病態に関係する。１つの好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、消化管の患部に局所的に送達され、例えば消化管へ経口または直腸送達される。
【００３３】
１つの好ましい実施形態では、炎症疾患、例えば消化管の炎症疾患、例として炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病の治療において有用な本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体組成物を含む医薬組成物。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体組成物を含む医薬組成物は、放射線療法または化学療法により引き起こされる粘膜炎を含む、口腔または胃腸粘膜炎の治療において有用である。
【００３５】
１つの実施形態では、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル組成物を含む医薬組成物は、放射線への治療的曝露および放射線への非治療的曝露を含む放射線への曝露に起因する消化管の炎症および損傷、例えば胃腸急性放射線症候群（ＧＩ−ＡＲＳ）の治療において有用である。
【００３６】
１つの実施形態では、本発明は、前臨床または臨床データを集めるために本発明のポリクローナル抗体を非ヒト動物に投与することを含む。非ヒト動物は健康であってもよく（例えば毒性研究）、または本発明のｈＴＮＦポリクローナル抗体で治療される障害を患っていてもよく、例えば標的疾患のための非ヒト動物モデルである。１つの実施形態では試験される非ヒト哺乳類は、粘膜炎または炎症性腸疾患のための動物モデル、例えば下記で記載されるそれらの動物モデルである：Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｕｐｐｏｒｔ．  Ｏｎｃｏｌ  （２０１１）  ９：１６１−１６８；  Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，  （２００８）  Ｊ．  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒａｏｌ  （２００８）  ４３：１−１７；  およびＷａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｇｕｔ  ４０：６２８−６３３。１つの実施形態では、試験される非ヒト哺乳類は、胃腸急性放射線症候群（ＧＩ−ＡＲＳ）のための動物モデル、例えば下記において記載される動物モデルの１つである：  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２０１０）  １７３：５５７−５７８。１つの実施形態では、非ヒト動物は、本発明のｈＴＮＦポリクローナル抗体と交差反応性であるＴＮＦの相同体を発現する動物、例えばイヌ、サル、ミニブタまたはモルモットである。
【００３７】
本発明はまた、下記工程を含む、ｈＴＮＦに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物を調製するための方法を提供する：ウシ動物にｈＴＮＦまたはその抗原部分およびアジュバントを接種する工程であって、好ましくはアジュバントはＱｕｉｌＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０１ＶＧ、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＤまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＢＣＬである工程；ならびに、動物がｈＴＮＦに対し免疫応答を有した後、ウシ動物から血清、乳または初乳を回収する工程。
【００３８】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、非免疫グロブリン因子が枯渇している。１つの実施形態では、生物源は乳または初乳である。１つの好ましい実施形態では、生物源は、標的抗原またはその免疫原性部分で免疫化させた動物由来の乳または初乳である。１つの実施形態では、組成物は、ラクトフェリンが枯渇している。１つの実施形態では、組成物は低分子量増殖因子が枯渇している。１つの実施形態では、組成物は非免疫グロブリン因子が枯渇しており、さらに標的抗原に特異的でない免疫グロブリンが枯渇している。
【００３９】
本発明のポリクローナル抗ｈＴＮＦ抗体は、標準細胞毒性バイオアッセイにおいて試験されると、ｈＴＮＦの中和に対し、先行技術のモノクローナル抗ｈＴＮＦ抗体と同じくらい強力であるが、臨床設定で使用された場合、より少ない副作用を有することが予想される。本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体ならびにそれらを製造する、および使用する、ならびに任意でそれらを精製するためのプロセスの特徴付けが本明細書で記載される。
【００４０】
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面において示される、本発明の好ましい実施形態の下記のより詳細な説明から明らかになるであろう。図面では、異なる図を通して、同様の参照文字は同じ部分を示す。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本発明の原理の説明が強調されている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】抗ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡデータを示す線グラフである。ＥＬＩＳＡプレートを、ｒｈＴＮＦでコートし、３倍希釈系列のウシ抗ＴＮＦ血清（Ｓｅｒｕｍ−４７０）試料をプレートに添加した。比色分析を実施し、光学密度を４５０ｎｍで決定した。４つの異なるアジュバントを用いて生成されたヒトＴＮＦへの抗血清中に存在する抗体の曲線を示す。
【図２】抗ウシＩｇ  ＥＬＩＳＡデータを示す線グラフである。ＥＬＩＳＡプレートを、抗ウシＩｇＧでコートした。Ｓｅｒｕｍ−４７０のプールを連続的に希釈し、プレートに添加し、洗浄した。結合を、ペルオキシダーゼ結合抗ウシＩｇＧ抗体を用いて検出した。４つの異なるアジュバントを用いて生成されたヒトＴＮＦへの抗血清中に存在する抗体の結合曲線を示す。
【図３】異なる動物種由来のＴＮＦに対するＳｅｒｕｍ−４７０（ＱｕｉｌＡアジュバント）の相対的ＥＬＩＳＡ力価を示す棒グラフである。
【図４】異なる動物種由来のＴＮＦに対するＳｅｒｕｍ−４７０（ＱｕｉｌＡアジュバント）の相対的ＥＬＩＳＡ力価およびＬ９２９  ＩＣ５０を示す棒グラフである。
【図５】抗ウシＩｇ  ＥＬＩＳＡデータを示す線グラフである。
【図６】異なる動物種由来のＴＮＦに対するＬ９２９  ＩＣ５０を示す線グラフである。
【図７】競合ＥＬＩＳＡにより測定されたＴＮＦに対する親和性精製されたヒトＡＶＸ−４７０（ＡＶＸ−４７０Ａ）に対する親和性を示す線グラフである。
【図８】ＥＬＩＳＡにより測定された親和性精製されたヒトＡＶＸ−４７０（ＡＶＸ−４７０Ａ）の効力を示す線グラフである。
【図９】標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて中和により評価された、親和性精製されたＡＶＸ−４７０（ＡＶＸ−４７０Ａ）の効力を示す線グラフである。
【図１０】ＡＶＸ−４７０またはインフリキシマブで処理されたヒト細胞のアポトーシスの誘導を示すＦＡＣＳ分析の読み取りを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
「免疫グロブリン（Ｉｇ）およびそれらの複数形態」と言う用語は、本明細書では、抗原に特異的に結合し、これを認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを示す。免疫グロブリン遺伝子はκ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常部遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変部遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらはひいては、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ（ウシでは見られない）およびＩｇＥを規定する。典型的には、免疫グロブリンの抗原結合領域は、標的受容体への結合の特異性および親和性において最も重要である。例示的な免疫グロブリン構造単位は四量体を含み、本明細書では「抗体」または「抗体（複数形）」とも呼ばれ、ポリクローナル抗体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変部を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）と言う用語は、それぞれ、これらの軽および重鎖を示す。
【００４３】
免疫グロブリンは、例えば、無傷の抗体または様々なペプチダーゼによる分解により生成される多くのよく特徴付けられた抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｃ）として存在する。免疫グロブリンはまた、例えば、自然分解または乳または初乳の加工と関連する分解に起因する、生物源、例えば乳または初乳中に存在し得る断片として存在する。本明細書では、免疫グロブリンという用語は、免疫グロブリンと関連するポリペプチド、例えば、ＩｇＡおよびＩｇＭと関連する分泌成分およびＪ鎖成分を含む。そのため、本明細書では、免疫グロブリン（Ｉｇ）組成物という用語は、無傷の抗体（ポリクローナル抗体を含む）またはその断片あるいは全ての免疫グロブリンアイソタイプに由来するそれらと関連するタンパク質成分の組成物を示す。
【００４４】
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体（複数形）」という用語は本明細書では、同じまたは異なる抗原上のいくつかの異なる特異抗原決定基（本明細書では「エピトープ」とも呼ばれる）に結合する、またはこれと反応することができる異なる抗体分子を含む組成物を示す。ポリクローナル抗体の抗原特異性の可変性は、ポリクローナル抗体を構成する個々の抗体分子の可変部およびポリクローナル抗体を構成する抗体分子の特定の混合物中に存在する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体を含む組成物は、動物を、下記で特定される標的抗原またはその一部で免疫化することにより調製され、免疫化動物から得られる血液、乳または初乳に由来する。
【００４５】
免疫化動物の血清（血液）、乳または初乳に由来するポリクローナル抗体を含む組成物は典型的には、標的抗原に特異的な抗体に加えて、免疫原に特異的でない抗体を含む。１つの好ましい実施形態によれば、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体組成物は少なくとも０．３％以上の、ｈＴＮＦを特異的に中和する抗体を含む。
【００４６】
他の非免疫グロブリン因子もまた、動物の血液、乳または初乳に由来する本発明のポリクローナル抗体組成物に存在し得る。標的抗原（例えば、ｈＴＮＦ）に特異的なポリクローナル抗体はさらに、ポリクローナル抗体調製物から精製することができ、またはポリクローナル抗体調製物は、さらなる精製なしに使用され得る。しかしながら、好ましい実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は、本明細書で記載されるように、実質的に非免疫グロブリン因子が枯渇している。
【００４７】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体（複数形）」という用語は、本明細書では、単一分子組成物の抗体の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、標的抗原の特定のエピトープに対し単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体の混合物はそのようなものとして、ポリクローナル抗体と考えられない。しかしながら、モノクローナル抗体の混合物が本発明のポリクローナル抗体の同じ独特な特徴を提供する場合、そのようなモノクローナル抗体は本発明のポリクローナル抗体の等価物と考えられる。
【００４８】
「エピトープ」は、抗体により結合される分子の一部である。エピトープはまた、決定基または抗原決定基と呼ばれる。同じ抗原上の異なるエピトープに結合するポリクローナル抗体は、エピトープの位置によって、それらが結合する抗原の活性に様々な効果を有することができる。抗原の活性側にあるエピトープに結合する抗体は、抗原の機能を完全にブロックし、一方、異なるエピトープで結合する別のポリクローナル抗体は、単独では抗原活性には全くまたはほとんど効果を有し得ない。しかしながら、そのような抗体は、依然として、補体または他のエフェクター機能を活性化し、よって、抗原の排除が得られ、同じ抗原上の異なるエピトープに結合するポリクローナル抗体の相乗効果が得られ得る。
【００４９】
抗原または免疫原の「免疫原性部分」または「免疫原性断片」は、抗原または免疫原で免疫化される宿主動物において免疫応答を誘導することができる、および、好ましくは動物に、標的抗原に対するポリクローナル抗体を生成させる、抗原免疫原の任意の部分である。好ましい実施形態では、免疫原はｈＴＮＦまたはその免疫原性断片である。
【００５０】
本発明の目的のために、「消化管」は口、咽頭、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結腸、直腸）および肛門から構成される。本発明の目的のために、「口腔」は口、咽頭および食道を含むと理解される。本発明の目的のために、「胃腸管」、または「ＧＩ管」は胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結腸、直腸）および肛門を含むと理解される。
【００５１】
ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）は、炎症疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）を含む多くの疾患の発病に関係するサイトカインである。ＴＮＦの阻害はまた、粘膜炎、例えば、化学療法または放射線療法に起因する粘膜炎、ならびに治療源、例えば癌および他の疾患を治療するための放射線療法および非治療源からの放射線への曝露による損傷、例えばＧＩ急性放射線症候群を治療することが示されている（ＧＩ−ＡＲＳ）（ＷＯ２００９／０４６１６８号）。
【００５２】
ヒトおよび動物種において、ＴＮＦは、その細胞表面結合前駆体、膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）、２６ｋＤａモノマのホモ三量体から酵素的に切断された後に、成熟／可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）、１７−ｋＤａモノマのホモ三量体として細胞から放出される。組換えヒＴＮＦおよび様々な動物種由来の組換えＴＮＦは、ｃＤＮＡがトランスフェクトされた細菌細胞により発現され、均質となるまで精製されたｓＴＮＦの遺伝的に誘導された相同体である。ＴＮＦの生物学的機能は、ＴＮＦ三量体の、多種多様の細胞型の表面上の２つの別個のＴＮＦ受容体、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２のいずれかへの結合により開始される。受容体−結合アミノ酸上またはその近くにあるＴＮＦ上のエピトープに対する抗体は、ＴＮＦのその受容体への結合をブロックし、その生物活性を中和することができることが予想されるであろう。加えて、いくつかの抗ＴＮＦ抗体は、受容体結合を妨害せず、ＴＮＦ活性を中和しないＴＮＦ上のエピトープに結合する可能性がある。ヒトＴＮＦモノマは１５７アミノ酸長であり、本明細書では、配列番号：１のアミノ酸１−１５７により表されるが、前駆体形態のアミノ酸７６−２３３によっても表すことができ、グリコシル化されない。
【００５３】
「非免疫グロブリン因子」という用語は本明細書では、非免疫グロブリンタンパク質およびペプチド、非免疫グロブリン巨大分子および小分子を含む。標的抗原に特異的でない生物源、例えば初乳、乳または血清中に存在する抗体は、本明細書では「非特異抗体」と呼ばれる。「標的抗原」という用語は組成物のポリクローナル抗体が結合するよう意図されている抗原を示す。
【００５４】
当技術分野において理解されるように、標的抗原は、最終的に、標的抗原に特異的である本発明のポリクローナル抗体組成物で治療される患者中に存在する抗原である。そのようなものとして、本発明によるポリクローナル抗体は患者に投与されると、標的抗原に結合する。例えば、ＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体では、患者がヒト患者である場合、標的抗原は好ましくはヒトＴＮＦ（本明細書では「ｈＴＮＦ」とも呼ばれる）である。
【００５５】
好ましい実施形態では、ウシ、好ましくは免疫化雌ウシの乳または初乳から単離されたｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体を含む組成物。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体はウシＩｇＧ抗体である。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧを含む乳または初乳中に存在する混合Ｉｇアイソタイプのウシ抗体である。
【００５６】
ウシ初乳（初期乳）はこの発明のための好ましいポリクローナル抗体組成物源である。雌ウシでは、抗体は胎盤を通過せず、よって全ての受動免疫は新生仔ウシに初乳を介して移行される。その結果、雌ウシは、出産後直ちに大量の抗体を初乳中に分泌し、初乳中のタンパク質のおよそ５０％が免疫グロブリンである。出生後最初の４時間に、５０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン濃度が、初乳中で典型的に見られ（Ｂｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｅｈｒｌｉ，  ２００５，  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １７６３−１７９３）、２４時間後、２５−３０ｍｇ／ｍｌまで降下する（Ｏｎｔｓｏｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ，  ８６，  ２００５−１１）。本明細書では、「初乳」という用語は、出産後最初の３〜４日以内に雌ウシにより生成される乳汁分泌物を示す。場合によっては、初乳は出産後特定の時間枠から単離されることが指定されるであろう（例えば初めての搾乳初乳、第１日初乳または出産後最初の３〜４日からの初乳）。
【００５７】
本発明の抗原を特異的に標的にするポリクローナル抗体を生成する一般的方法は当業者に知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９１）；  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）；  Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （２ｄ  ｅｄ．  １９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５−４９７  （１９７５）を参照されたい。そのような技術は、好適な動物を免疫化することによるポリクローナル抗体の調製を含む（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：  １２７５−１２８１  （１９８９）；  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：  ５４４−５４６  （１９８９）を参照されたい）。本発明は、本発明のポリクローナル抗体を得るための最適化方法を提供し、そのような方法は本明細書で記載される。
【００５８】
ｈＴＮＦまたはその抗原もしくは免疫原性断片または部分を含む多くの免疫原を使用して、ｈＴＮＦと特異的に反応する抗体を生成させることができる。例えば、ｈＴＮＦの抗原もしくは免疫原性断片またはタンパク質部分は、適切な源、例えば組織培養物から公知の手順を用いて単離することができる。好ましい実施形態では、免疫原は組換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）である。組換えｈＴＮＦは、当技術分野で知られているように、真核生物または原核生物細胞において発現させ、精製させることができる。また、ｒｈＴＮＦに由来する合成ペプチドは免疫原として使用することができる。合成ペプチドは、免疫化前に担体タンパク質に結合され得る。自然発生ｈＴＮＦもまた、純粋または不純形態のいずれかで使用され得る。生成物はその後、抗体を生成することができる動物、好ましくはウシ動物に注射される。動物はまた、ｈＴＮＦでトランスフェクトされた細胞で免疫化することができ、あるいは、ｈＴＮＦをコードするＤＮＡで免疫化され得る。
【００５９】
好ましい実施形態では、動物の接種のために使用される免疫原はまた、動物における抗体応答を増強させるためにアジュバントを含む。適切なアジュバントの選択は非常に重要であり、というのも、アジュバントは、力価、アイソタイプ、結合活性および細胞性免疫の特性、ならびに、本明細書で実施例において証明されるように、本発明の抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体の抗原種特異性プロファイルに影響する能力を有するからである。アジュバントとしては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：油中水エマルジョン、例えば完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧ（不完全セピックアジュバント、水中油中水二重エマルジョン）、Ｓｅｐｐｉｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２５；水中油エマルジョン、例えばＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＤおよびＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ、ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｍａｈａ  Ｎｅｂｒａｓｋａから入手可能；アルミニウム塩アジュバント；免疫調節物質ＧＭＤＰ、Ｌ．ブルガリクスの細胞壁由来の糖ペプチドに基づくＧｅｒｂｕアジュバント（ＧＥＲＢＵ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ、Ｇａｉｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ならびにサポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ。
【００６０】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、下記工程を含む、ｈＴＮＦに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物を調製するための方法を提供する：ウシ動物にｈＴＮＦおよびアジュバントを接種する工程であって、好ましくは、アジュバントはＱｕｉｌ  Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧ、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＤまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＢＣＬである工程；ならびに、動物がｈＴＮＦに対し免疫応答を有した後、ウシ動物から血清、乳、および／または初乳を回収する工程。別の好ましい実施形態では、アジュバントはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２５である。
【００６１】
１つの実施形態では、動物はｈＴＮＦ抗原およびアジュバントの組み合わせで、２−３週空けて、３回の免疫化を受ける。１つの実施形態では、動物はｈＴＮＦ抗原およびアジュバントの組み合わせで、２−３週空けて、４回の免疫化を受ける。
【００６２】
１つの実施形態では、本発明は、安全性毒性研究を実施するのに好適な種由来のＴＮＦに結合し、および／またはこれを中和するの両方であるポリクローナル抗体の組成物を提供する。医薬製品の開発では、ヒト臨床試験の開始前に動物において新規薬物物質または医薬品を試験する必要がある。いくつかの医薬製品、例えばＧＩ急性放射線症候群の治療のためのものの開発では、ヒト臨床試験において効力を評価することができず、薬物を市場に出す認可は、動物モデルにおける効力研究に基づく。薬物物質または医薬品は動物種において関連する反応性を示すことが好ましい。カニクイザルおよびアカゲザルは２つの好ましい種である。イヌおよびブタは他の好ましい種である。
【００６３】
本明細書では、「ＴＮＦ活性を中和する」本発明のポリクローナル抗体は、そのＴＮＦへの結合により、ＴＮＦの生物活性の阻害が得られる抗体を示す。このＴＮＦの生物活性の阻害は、ＴＮＦ生物活性の１つ以上の指標、例えばＴＮＦ誘導細胞毒性（インビトロまたはインビボのいずれか）を測定することにより評価することができる。ＴＮＦ生物活性のこれらの指標は、当技術分野で知られており、実施例で記載される１つ以上のいくつかの標準インビトロまたはインビボアッセイにより評価することができる。
【００６４】
好ましくは、抗体のＴＮＦ活性を中和する能力は、実施例で記載されるように、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ誘導細胞毒性の阻害により評価される。１つの好ましい実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は、標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて、４．０ｐＭ以下のＫｉで、ヒトＴＮＦ細胞毒性を中和する。
【００６５】
阻害定数、Ｋｉは阻害剤の効力の測度である。リガンドの抗体阻害に対するＫｉは、異なるリガンド濃度での抗体のＩＣ５０値から、元々、酵素阻害剤の動力学パラメータを測定するために開発された、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式の適合を用いて、計算することができる（Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｏｆｆ，  （１９７３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２：  ３０９９−１０８）。
Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（Ａ／ＥＣ５０）］；
ここで：  
ＩＣ５０＝ＴＮＦ活性を５０％低減させるのに必要とされる血清の希釈
Ａ＝アッセイにおいて使用されるＴＮＦの濃度（通常ＥＣ９０）
ＥＣ５０＝Ｌ９２９細胞の増殖を５０％阻害するのに必要とされるＴＮＦの濃度。
【００６６】
１つの好ましい実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は標準インビトロＬ９２９アッセイでヒトＴＮＦ細胞毒性を中和し、ＥＣ５０は少なくとも約０．０３ｍｇ／ｍｌである。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明は、カニクイザルまたはアカゲザルから選択される少なくとも１つの非ヒト霊長類由来のＴＮＦにも結合し、これを中和するポリクローナル抗体を提供する。例えば、本発明のポリクローナル抗体はカニクイザルＴＮＦおよびアカゲザルＴＮＦに結合し、ＥＣ５０はｈＴＮＦとのＥＣ５０の２倍以内である（実施例２７を参照されたい）。
【００６８】
１つの実施形態では、本発明はイヌＴＮＦにも結合するポリクローナル抗体を提供する。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は、イヌＴＮＦの中和よりも大きな程度まで、カニクイザルＴＮＦを中和する。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体は、カニクイザルＴＮＦよりも大きな程度までイヌＴＮＦに結合する。
【００６９】
１つの実施形態では、方法はマウスＴＮＦと約２％未満、好ましくは約１％未満の交差反応性を有するポリクローナル抗体を提供する。この低いマウスＴＮＦとの交差反応性は、ヒトＴＮＦとマウスＴＮＦの間の高レベルのアミノ酸同一性は、ヒトＴＮＦに対して産生されるポリクローナル抗体の集団はまた、宿主種の（ウシ）ＴＮＦにより共有されないＴＮＦのヒトおよびマウス型の両方上の保存されたエピトープに特異的なポリクローナル抗体を含むという予想を生じさせるであろうことを考えれば、驚くべきである。この驚くべきポリクローナル抗体の特徴は、本発明の独特な特異性および組成物を一部規定する。
【００７０】
本発明者らは、さらに、ポリクローナル抗体の抗原種特異性プロファイルは、ポリクローナル抗体を調製するプロセス中に、例えば、ウシ動物に接種するために標的抗原と共に使用されるアジュバントの選択、免疫原の用量、免疫原の型（例えば、断片または全タンパク質）、および／または免疫化スケジュールにより調節することができることを発見した。これは、本発明の独特な抗原特異性および組成物に寄与する因子をさらに規定するのに有用である。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明のポリクローナル抗体のＴＮＦ活性を中和する能力は、免疫エフェクター細胞、例えば活性化リンパ球で、膜貫通ＴＮＦを発現する細胞において、アポトーシスを誘導する抗体の能力により評価される（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２４：１７７４−１７８５）。これは、実施例３１において記載されるように、関連細胞、例えば、膜貫通ＴＮＦを発現するヒトＰＢＭＣにおけるアポトーシスのためのアッセイより評価することができる。
【００７２】
本発明のポリクローナル抗体は、好ましくは他のサイトカイン、例えばリンホトキシン（ＬＴα／ＴＮＦβ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮγおよびＴＧＦβに特異的に結合しない。
【００７３】
１つの実施形態では、ｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体の力価は、ＥＬＩＳＡにより試験した場合、少なくとも１００である。１つの実施形態では、ｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体の力価はＥＬＩＳＡにより試験した場合少なくとも３００である。１つの実施形態では、ｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体のＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡにより試験した場合少なくとも１ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態では、ｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体のＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡにより試験した場合少なくとも０．３ｍｇ／ｍｌである。
【００７４】
ドナー動物の免疫化により誘導される標的抗原に特異的なポリクローナル抗体に加えて、乳および初乳は他の特異性を有する抗体（本明細書では「非特異的免疫グロブリン」と呼ばれる）ならびに多くの他のタンパク質、ペプチド、および小分子（本明細書では「非免疫グロブリン因子」と呼ばれる）を含む。これらの非免疫グロブリン因子は様々な生物活性を有し、一般に良性または有益のいずれかであると考えられてきた。
【００７５】
この発明の１つの態様では、非免疫グロブリン因子は製造プロセス中に本発明のポリクローナル抗体組成物から枯渇させられる。この枯渇は、不純物または免疫グロブリンのアフィニティーカラム上への吸収により実施され得る。また、この枯渇は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは同様の技術を用いて実施することができる。また、この枯渇は、限外濾過／ダイアフィルトレーションまたは同様の技術を用いて実施することができる。また、この枯渇は不純物または免疫グロブリンのアニオン交換カラム上への吸収により実施することができる。本発明による免疫グロブリンを精製および単離するための上記で記載される方法の組み合わせを使用してもよい。
【００７６】
この発明の１つの態様では、特定の非免疫グロブリン因子のレベルが、インプロセス試験中に、特定の標的抗原に対するポリクローナル抗体を含む組成物の放出試験の一部としてモニタされる。１つの実施形態では、全ての非免疫グロブリン因子のレベルは初乳中の平均レベルより少なくとも５倍低く低減される。１つの実施形態では、全ての非免疫グロブリン因子のレベルは初乳中の平均レベルより少なくとも１０倍低く低減される。１つの実施形態では、本発明のポリクローナル組成物は実質的に非免疫グロブリン因子を含まない。
【００７７】
１つの好ましい実施形態では、本発明のポリクローナル抗体組成物から枯渇される非免疫グロブリン因子はラクトフェリンである。１つの好ましい実施形態では、本発明のポリクローナル抗体組成物から枯渇される非免疫グロブリン因子は１つ以上の特定の増殖因子である。１つの実施形態では、１つ以上の特定の増殖因子は、初乳中のそれらの天然レベルより少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍低く枯渇され、好ましくは本発明の組成物は実質的に増殖因子を含まない。
【００７８】
増殖因子としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、成長ホルモンおよびインスリン。
【００７９】
表１は乳および初乳において自然に見られる様々な非免疫グロブリン因子の一般レベルを示すデータを提供する（Ｏｎｔｓｏｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  ８６：２００５−２０１１）。
【表１】
2014527957.tif 000002
【００８０】
表２は乳および初乳において自然に見られる様々な非免疫グロブリン因子の一般レベルを示す追加のデータを提供する（Ｓｕ，  Ｃ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｈ．  Ｃｈｉａｎｇ  （２００３）  Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ８６：１６３９−１６４５）。
【表２】
2014527957.tif 000003
【００８１】
表３は乳および初乳で見られる様々な非免疫グロブリン因子の正常レベルを示すデータを提供する（Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ７２：５−１４）。
【表３】
2014527957.tif 000004
【００８２】
本発明による乳または初乳由来の本発明のポリクローナル抗体組成物から枯渇され得る増殖因子を含む非免疫グロブリン因子としては、表４で列挙されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【表４】
2014527957.tif 000005
2014527957.tif 000006
キー：（−）＝負の調節、ＴＧＦ＝トランスフォーミング増殖因子、ＭＣＰ＝マクロファージ走化性タンパク質、ＭＩＰ＝マクロファージ炎症性タンパク質、ＧＲＯ＝増殖関連癌遺伝子、ＩＬ＝インターロイキン、ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子、ＰＬＧＦ＝胎盤増殖因子、ＦＧＦ＝線維芽細胞増殖因子、ＨＧＦ＝肝細胞増殖因子、Ｃｙｒ６１＝システインリッチ６１、ＧＭ−ＣＳＦ＝顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ＩＰ＝インターフェロン−γ−誘導性タンパク質−１０、ＰＤＧＦ＝血小板由来増殖因子、ＣＴＧＦ＝結合組織増殖因子、ＩＧＦ＝インスリン様増殖因子、ＮＧＦ＝神経成長因子、ＥＧＦ＝上皮増殖因子、ＨＢ−ＥＧＦ＝ヘパリン−結合上皮増殖因子、ＮＤＦ＝Ｎｅｕ分化因子、ＢＭＰ＝骨形成タンパク質、Ｉｇ＝免疫グロブリン、ＰＲＰ＝プロリンリッチポリペプチド、Ｃ＝補体、ＩＦ＝インターフェロン−γ。
【００８３】
非免疫グロブリン因子が枯渇した本発明のポリクローナル抗体組成物は時として、本明細書では「非Ｉｇ因子枯渇ポリクローナル抗体組成物」と呼ばれる。本発明のそのような非Ｉｇ因子枯渇ポリクローナル抗体組成物は、疾患の治療において使用するのに好適であり、この場合、疾患の発病は、ポリクローナル抗体が作られる標的抗原により調節される。そのような治療はまた、治療が急性疾患または慢性疾患のためかに関係なく、疾患の治療における、生物源に由来するポリクローナル抗体組成物の使用と関連する潜在的な副作用の緩和を含む。
【００８４】
本発明の非Ｉｇ因子枯渇ポリクローナル抗体組成物は、さらに、標的抗原に特異的なポリクローナル抗体の存在に対し濃縮するように加工することができ、ここで、非特異的免疫グロブリンは、ポリクローナル抗体組成物から選択的に枯渇され、または除去されている。ポリクローナル抗体を、特定の標的抗原に対する抗体に対し、濃縮するための多くの技術が当業者に知られている。１つの実施形態では、本発明の組成物中に存在する免疫グロブリンの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、および好ましくは少なくとも９５％が標的抗原に特異的なポリクローナル抗体である。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体組成物は、標的抗原に結合する抗体に対し濃縮され、そのため組成物は実質的に非特異的免疫グロブリンを含まない。標的抗原への結合に対し濃縮された非Ｉｇ因子枯渇ポリクローナル抗体組成物は時として、本明細書では「濃縮非Ｉｇ因子枯渇ポリクローナル抗体組成物」と呼ばれる。１つの実施形態では、本発明は非特異的抗原が枯渇し、非免疫グロブリン因子が任意で枯渇したポリクローナル組成物を含む。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明は標的抗原の全てまたは一部で免疫化されたウシの初乳に由来する、単離および精製された免疫グロブリンを含む組成物を提供し、ここで、組成物は、当技術分野で知られている標準アッセイにおいて、標的抗原に結合するおよび／または標的抗原を中和するおよび／または標的抗原の機能を修飾することができるポリクローナル抗体を含む。そのようなアッセイとしては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫拡散法、フローサイトメトリー、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング、凝集、免疫電気泳動、表面プラズモン共鳴、および標的抗原の機能の中和または調節、例えばＬ９２９細胞に基づくアッセイにおけるＴＮＦの中和に基づくアッセイ。１つの実施形態では、組成物は、還元ＳＤＳＰＡＧＥ／デンシトメトリーにより測定されると、少なくとも９０％の免疫グロブリンである。好ましい実施形態では、組成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／デンシトメトリーにより測定されると、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％および好ましくは少なくとも９９％の免疫グロブリンである。
【００８６】
１つの実施形態ではラクトフェリン（ＬＦ）、α−ラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）、β−ラクトグロブリン（ｂ−Ｌａｃ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の少なくとも１つが初乳中のその正常レベルより少なくとも１０倍低く枯渇される。
【００８７】
１つの好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、ウシの初乳に由来する免疫グロブリン組成物中に、組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約１０ｍｇ以下のレベルで存在し、ここで、組成物の総タンパク質量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され（Ｓｍｉｔｈ，  Ｐ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５０，  ７６−８５，  （１９８５））、ラクトフェリンのレベルはＥＬＩＳＡにより測定される。より好ましくは、ラクトフェリンのレベルは約３ｍｇ／ｇ総タンパク質以下、より好ましくは約１ｍｇ／ｇ総タンパク質以下、最も好ましくは１ｍｇ／ｇ総タンパク質未満、例えば０．３ｍｇ／ｇ以下である。
【００８８】
１つの好ましい実施形態では、α−ラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）は、ウシの初乳に由来するＩｇ組成物中に、約７５ｍｇ／グラム総タンパク質以下、好ましくは組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約２０ｍｇ以下で存在し、ここで、組成物の総タンパク質量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ａ−ＬａｃのレベルはＥＬＩＳＡにより測定される。より好ましくは、ａ−Ｌａｃのレベルは約３ｍｇ／ｇ（ｗ／ｗ）総タンパク質以下、より好ましくは約１ｍｇ／１ｇ以下の総タンパク質、最も好ましくは１ｍｇ／ｇ総タンパク質未満である。
【００８９】
１つの好ましい実施形態では、β−ラクトグロブリン（ｂ−Ｌａｃ）はＩｇ組成物中に約２０ｍｇ／ｇ以下、好ましくは組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約１０ｍｇ以下で存在し、ここで、組成物の総タンパク質量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ｂ−ＬａｃのレベルはＥＬＩＳＡにより測定される。より好ましくはｂ−Ｌａｃのレベルは総タンパク質の約５ｍｇ／ｇ以下、より好ましくは総タンパク質の約３ｍｇ以下、より好ましくは約１ｍｇ／ｇ総タンパク質以下、最も好ましくは１ｍｇ／ｇ総タンパク質未満である。
【００９０】
１つの実施形態では、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）はＩｇ組成物中に、組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約１０ｍｇ以下で存在し、ここで、組成物の総タンパク質量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ＬＰＯのレベルはＥＬＩＳＡにより測定される。より好ましくはＬＰＯのレベルは約２ｍｇ／ｇ（ｗ／ｗ）総タンパク質以下、より好ましくは約１ｍｇ／ｇ総タンパク質、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｇ総タンパク質以下、最も好ましくは０．２ｍｇ／ｇ総タンパク質未満である。
【００９１】
１つの実施形態では、インスリン様増殖因子−１（ＩＦＧ−１）はウシの初乳に由来するＩｇ組成物中に、組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約１０ｍｇ以下で存在し、ここで、組成物の総タンパク質量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ＩＧＦ−１のレベルはＥＬＩＳＡにより測定される。より好ましくはＩＦＧ−１のレベルは約１ｍｇ／ｇ総タンパク質以下、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｇ総タンパク質以下、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｇ総タンパク質未満である。
【００９２】
１つの実施形態では、本発明は、標的抗原の全てまたは一部で免疫化されたウシの初乳に由来する、単離および精製された免疫グロブリンを含む組成物を調製するためのプロセスを提供し、ここで、組成物は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／デンシトメトリーにより決定されると少なくとも９０％の免疫グロブリンであり、実質的に、ラクトフェリン（ＬＦ）、α−ラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）、β−ラクトグロブリン（ｂ−Ｌａｃ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含むがそれらに限定されない非免疫グロブリン因子が枯渇しており、組成物は標準抗体結合アッセイにおいて標的抗原に結合し、組成物の調製は下記工程を含む：当技術分野で知られている標準手順により脂肪およびカゼインを枯渇させるように加工された、標的抗原で免疫化されたウシの初乳に由来する乳清を提供する工程；加工された乳清のｐＨを６．６〜７．０のｐＨに調整する工程；カチオン交換カラムと連続して連結されたアニオン交換カラムを通して乳清を濾過する工程であって、乳清は塩濃度またはｐＨを変化させる材料の添加なしに連続して連結された両方のカラムを通して連続して流れる工程；収集が起こる前に、塩濃度またはｐＨを変化させる材料の添加なしに連続して連結された両方のカラムを連続して通過した後フロースルーを収集する工程；ならびに限外濾過によりフロースルーを濃縮する工程。プロセスはさらに、限外濾過により濃縮されたフロースルー材料の、例えば、標的抗原、例えばｈＴＮＦに結合されたアフィニティーマトリクスを用いた親和性精製を含み得る。プロセスはさらに濃縮フロースルー生成物を標準技術を用いて凍結乾燥または噴霧乾燥することを含み得る。プロセスはさらに、実施例で記載されるアッセイを含む標準手段による噴霧乾燥または凍結乾燥前に、濃縮フロースルー生成物を試験して、不純物が所望のレベルにあることを決定することを含み得る。
【００９３】
１つの実施形態では、乳清中に存在する抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体の特異活性は、フロースルーが限外濾過工程により濃縮された後約２倍増加する。１つの実施形態では、親和性精製された材料の標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて測定されるようにｈＴＮＦ細胞毒性の中和活性は、限外濾過後の濃縮フロースルーのｈＴＮＦ中和活性と比べて、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは約３００倍以上増加する。ここで、中和活性は１ｍｇのタンパク質あたりの活性に基づき表される。
【００９４】
１つの実施形態では、アニオン交換カラムは強いアニオン交換体であり、カチオン交換カラムは強いカチオン交換体カラムである。この発明において使用するのに好適な強いカチオン交換体としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：Ｃａｐｔｏ  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ−６５０  Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。この発明において使用するのに好適な強いアニオン交換体としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：Ｃａｐｔｏ−Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０  Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＱＡＥ−２５ＳＷ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【００９５】
弱いカチオンおよびアニオン交換体もまた、この発明において使用するのに好適であろう。この発明において使用するのに好適な弱いカチオン交換体としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＣＭ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。この発明において使用するのに好適な弱いアニオン交換体としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ５ＮＰＲ（Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、Ｃａｐｔｏ−ＤＥＡＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＤＥＡＥ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ−Ｄ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）、ＰＯＲＯＳ  Ｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【００９６】
１つの実施形態では、カラムに入る乳清溶液の導電率は約４＋／−１ミリジーメンス／ｃｍである。１つの実施形態では、両方のカラムのフロースルーの導電率は約４＋／−１ミリジーメンス／ｃｍである。１つの実施形態では、カラムに入る乳清溶液のｐＨは、両方のカラムのフロースルーのｐＨと同じである。
【００９７】
この方法は特に、上記で記載される非Ｉｇ因子が実質的に枯渇した、大規模量の精製および単離された、本発明のＩｇ組成物の調製において有用である。イオン交換クロマトグラフィーを用いた、ポリクローナル抗体を含むＩｇ組成物からの非免疫グロブリン因子の枯渇は、従来、ポリクローナル組成物内の様々な抗体クローンのｐＩの範囲のために困難であった。従来の方法は、様々な条件の複数のカラムおよび、免疫グロブリンをポリクローナル抗体種よりも高いまたは低いｐＩを有する非免疫グロブリン因子から分離する溶離工程を使用することを要求していた。連続して連結された連続フロースルーアニオンおよびカチオンイオン交換カラムの使用は、ポリクローナル抗体の大規模精製を提供し、一方、同時に実質的に、非Ｉｇ因子を最終組成物から枯渇させる。この方法は、複数のカラム、分別溶離およびプロセス条件例えばｐＨ、塩および温度の複数の変更を必要としない、Ｉｇ組成物の精製および単離を可能にする。本明細書では、大規模精製は少なくとも３０Ｌリットルの開始材料（初乳）を意味する。
【００９８】
１つの好ましい実施形態では、本発明は本明細書で詳細に記載される任意的な、薬学的に許容される賦形剤ならびに標的抗原の全てまたは一部で免疫化されたウシの初乳に由来する、単離および精製された免疫グロブリンから本質的に構成される組成物を含む医薬製剤を提供し、ここで、組成物は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／デンシトメトリーにより決定されると少なくとも９０％の免疫グロブリンであり、組成物中に存在する総タンパク質１グラムあたり約１０ｍｇ未満のラクトフェリンを含み、組成物の総タンパク質量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルはＥＬＩＳＡにより測定され、組成物はアッセイにおいて標的抗原に結合し、またはこれを調節する。本発明の医薬組成物は、上記で記載される追加の非免疫グロブリン因子が枯渇している可能性があり、α−ラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）、βラクトグロブリン（ｂ−Ｌａｃ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の本明細書で記載されるレベルまでの枯渇が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９９】
任意で非Ｉｇ因子が枯渇した、ウシ動物に由来するｈＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体を含む本発明の組成物はいくつかの治療および診断用途および競合結合アッセイにおける使用を有する。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明のポリクローナル抗ｈＴＮＦ抗体を含む組成物は、ＴＮＦ産生が疾患病態の一因となる様々な疾患の治療のための医薬組成物として有用である。
【０１０１】
１つの実施形態では疾患は、炎症疾患、例えば炎症性腸疾患または消化管の他の炎症疾患である。１つの実施形態では、本発明のポリクローナル抗ｈＴＮＦ抗体を含む組成物は、消化管の疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、粘膜炎および治療または非治療放射線への曝露に起因する消化管への損傷の治療において使用するための医薬組成物として製剤化される。
【０１０２】
１つの実施形態では、本発明のポリクローナル抗ｈＴＮＦ抗体を含む組成物は口腔または腸粘膜炎の治療において使用するのに好適である。粘膜炎は、例えば、放射線療法、化学療法またはそれらの任意の組み合わせにより引き起こされ得る。１つの実施形態では、粘膜炎は、放射線療法の状況外での、高線量の放射線への曝露、例えば全身照射により引き起こされ得る。１つの実施形態では、本発明の非Ｉｇ因子枯渇抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物は、再発性アフタ性口内炎の治療において使用するのに好適である。別の実施形態では、本発明の非Ｉｇ因子枯渇抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物は、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、および胃腸管の一部における過好酸性活性が関与する他の状態の治療において使用するのに好適である。本発明の組成物は、例えば口腔粘膜炎およびアフタ性口内炎を治療するために口腔に局所投与され得、または、例えば腸粘膜炎を治療するために、消化管に経口または直腸投与され得る。
【０１０３】
消化管のいくつかの疾患では、治療はすでに使用可能である。例えば、小分子および生物学的療法のどちらもクローン病および潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患の２つの形態の治療に使用可能である。現在使用中のほとんどの抗体療法は、全身に送達されるように設計されたモノクローナル抗体であり、患者に注射により投与される。注射された抗体は、炎症性腸疾患の治療において有用であることが示されており、消化管の他の疾患の治療においても有用であり得る。しかしながら、抗体の全身投与は消化管内だけでなく、身体全体の生理的プロセスに影響する可能性があり、これはいくつかの疾患では不利となり得る。
【０１０４】
例えば、炎症性腸疾患の治療のために使用される抗ＴＮＦ抗体は重篤な副作用と関連する。例えば、臨床的有益性と関連する抗ＴＮＦ抗体の血清レベルは０．５ｕｇ／ｍｌを超える濃度である（Ｎｅｓｔｏｒｏｖ，  ２００５，  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｓｕｐｐｌ，  ７４，  １３−８；  Ｔｒａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １１７，  ２４４−７９）。有害事象と関連する抗ＴＮＦ抗体の血清レベルは、正確には知られていないが、臨床的有益性に必要とされるレベルより大きいと考えられる（Ｎｅｓｔｏｒｏｖ，  ２００５，  ＪＲｈｅｕｍａｔｏｌＳｕｐｐｌ，  ７４，  １３−８）。よって、既存の非経口ＴＮＦアンタゴニストと比べて、本発明の治療組成物および組成物および方法は、全身免疫抑制の低減、全身分布の低減、免疫原性の低減、タキフィラキシーの低減（中和抗体の誘導により引き起こされるか、別のメカニズムによるかに関係なく）および即時副作用の低減（例えば、注入反応）と関連する。
【０１０５】
例えば、経口または直腸送達により、消化管に局所送達される場合、本発明のウシ由来ポリクローナル抗ｈＴＮＦ組成物は消化管の外側での治療抗体の活性を最小に抑え、さらに、治療薬抗体に対する中和免疫応答の誘導を最小に抑える。抗体は消化管の粘膜バリアを通過し、粘膜下空間に入り、それらの標的と相互作用することができるが、実質的に体循環に入らない。
【０１０６】
１つの態様では、本発明は、本発明のポリクローナル抗体組成物を使用して患者を治療する方法を提供する。「患者」という用語は本明細書では、動物を示す。好ましくは動物は哺乳類である。より好ましくは、哺乳類はヒトである。「患者」はまた、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、モルモット、魚、トリ  などを示す。
【０１０７】
「治療」、「治療する」および「治療すること」という用語は、障害、疾患、疾病または他の状態（集合的に本明細書では「状態」と呼ばれる）の少なくとも１つの症状または他の側面の軽減、治癒または防止、または状態の重症度の低減、などを含む。本発明の組成物は、実行可能な治療薬を構成するために、根治に影響する、または疾患の全ての症状または徴候を根絶する必要はない。関連する分野で認識されるように、治療薬として使用される薬物は、ある疾患状態の重症度を低減させることができるが、有用な治療薬と見なされるために、疾患の全ての徴候を消失させる必要はない。同様に、予防的に投与される治療は、実行可能な予防薬を構成するために、状態の発症を防止するのに完全に有効である必要はない。疾患の影響を単純に低減させる（例えば、その症状の数または重症度を低減させることにより、または別の治療の有効性を増加させることにより、または別の有益な効果を生成させることにより）、または疾患が対象において起こるまたは悪化する可能性を低減させることで十分である。１つの実施形態では、治療的有効量の組成物が患者に投与され、患者が特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続的改善を経験するという徴候は、その障害のための治療を構成する。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と製剤化される本発明のウシ由来抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体を含む、治療的有効量の組成物を含む。本発明の抗体の「治療的有効量」により、いずれの医学的処置にも適用可能な合理的な利益／リスク比で、治療される対象への治療効果を与える組成物の量が意味される。治療効果は、その用語が本明細書で使用される患者を「治療する」のに十分である。
【０１０９】
口腔の障害では、本発明のウシ由来ポリクローナル抗ｈＴＮＦ組成物は、口腔洗浄薬、リンス、ペースト、ゲル、または他の好適な製剤中で送達させることができる。本発明の抗体は、活性抗体と粘膜表面の間の接触を増加させるように設計された製剤、例えば頬側パッチ、頬側テープ、粘膜付着性フィルム、舌下錠、ロゼンジ、ウエハ、チュアブル錠、急もしくは速溶性錠剤、発泡錠、または頬側もしくは舌下固体を用いて送達させることができる。消化管の障害では、抗体はカプセル、錠剤、液体製剤または薬物を消化管に導入するように設計された同様の形態での経口摂取により送達させることができる。また、抗体は下部消化管への送達のための坐薬または浣腸により投与され得る。そのような製剤は当業者によく知られている。
【０１１０】
本明細書では、「薬学的に許容される担体または賦形剤」という用語は、無毒性不活性固体、半固体または液体フィラー、希釈剤、封入材料または任意の型の製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの例は、糖類例えばラクトース、ブドウ糖およびスクロース；デンプン例えばトウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝溶液、ならびに他の無毒性適合性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味、香味および芳香剤、保存剤ならびに抗酸化剤もまた、調合者の判断によって組成物中に存在させることができる。
【０１１１】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般に使用される不活性希釈液、例えば、例として、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物を含み得る。不活性希釈液に加えて、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味、香味、および芳香剤を含むことができる。
【０１１２】
直腸投与のための組成物は好ましくは、この発明の化合物を好適な非刺激性賦形剤または担体、例えばカカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックス（周囲温度で固体であるが、体温で液体となり、そのため直腸または膣腔で溶融し、活性化合物を放出する）と混合することにより調製することができる坐薬である。１つの実施形態では、直腸投与のための組成物は浣腸の形態である。
【０１１３】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が挙げられる。そのような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性な、薬学的に許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび／または：ａ）フィラーまたは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、ブドウ糖、マンニトール、およびケイ酸；ｂ）バインダー、例えば、例として、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアラビアゴム；ｃ）保水剤、例えばグリセロール；ｄ）崩壊剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある一定のシリケート、および炭酸ナトリウム；ｅ）溶液遅延剤、例えばパラフィン；ｆ）吸収促進剤、例えば４級アンモニウム化合物；ｇ）湿潤剤、例えば、例として、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；ｈ）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレイ；ならびにｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸薬の場合、剤形はまた緩衝剤を含み得る。同様の型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、ソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中のフィラーとして使用され得る。
【０１１４】
いくつかの条件下では、経口または直腸投与された本発明の組成物の胃分解に対する追加のレベルの保護を提供することが望ましい場合がある。これが望ましい場合、腸溶コーティングの多くの選択肢がある。１つの実施形態では、腸溶コーティングは胃後のｐＨ変化を利用し、フィルムコーティングを溶解し、活性成分を放出する。コーティングおよび製剤は、タンパク質治療薬を小腸に送達するために開発されており、これらのアプローチは発明の抗体の送達のために適合させることができる。例えば、インスリンの腸溶コート形態が経口送達のために開発されている｛Ｔｏｏｒｉｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １０７，  ９１−６｝。
【０１１５】
加えて、錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、医薬製剤分野においてよく知られた他のコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。それらは任意で不透明化剤を含むことができ、活性成分（複数可）をそれだけで、または優先的に、腸管のある一定の部分において、任意で、遅延様式で放出する組成物とすることもできる。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマ物質およびワックスが挙げられる。
【０１１６】
有効用量は、投与経路、ならびに他の薬剤との共使用の可能性によって変動するであろう。しかしながら、本発明の化合物および組成物の毎日の全使用は、主治医により健全な医学的判断の範囲内で決定されることことが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特定の治療的有効用量レベルは、様々な因子、例えば下記に依存する：治療される障害および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；食糧摂取に対する化合物の送達のタイミング；治療期間；使用される特定の化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬物；ならびに医学分野においてよく知られた同様の因子。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態は、本発明の抗体を含む医薬組成物を、約１ｍｇ／日〜約１ｇ／日、より好ましくは約１０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、最も好ましくは約２０ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日の用量で、対象に投与することを含む。１つの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、約１００ｍｇ〜約５０ｇ／日、より好ましくは約５００ｍｇ／日〜約１０ｇ／日、最も好ましくは約１ｇ／日〜約５ｇ／日の抗体の用量で、対象に投与され、ここで、ポリクローナル抗体調製物は、標的抗原に特異的な抗体に対し濃縮されていない。
【０１１８】
治療レジメンは、本明細書で開示される医学的障害を治療するために本発明の抗体組成物を１回／日、２回／日、または３回以上／日投与することを含む。１つの実施形態では、本発明の抗体組成物は、本明細書で開示される医学的障害を治療するために、４回／日、６回／日または８回／日投与される。１つの実施形態では、本発明の抗体組成物は、本明細書で開示される医学的障害を治療するために、１回／週、２回／週、または３回以上／週投与される。
【０１１９】
本発明の方法および組成物は、本発明の抗体を、患者を苦しめる状態を治療するのに有用な１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて使用することを含む。そのような追加の薬剤の例としては、タンパク質性および非タンパク質性薬物の両方が挙げられる。本発明の抗体と組み合わせることができる、例えば、炎症性腸疾患のためのそのような追加の治療薬の非限定的な例としては、下記が挙げられる：経口ステロイド、ＩＦＮ−β、ブデノシド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン、スルファサラジン；アミノサリチレート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦ抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；７５ｋｄ  ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  （１９９４）  Ｖｏｌ．  ３７，  Ｓ２９５；  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｍｅｄ．  （１９９６）  Ｖｏｌ．  ４４，  ２３５Ａを参照されたい）；５５ｋｄ  ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；インターロイキン−１０（ＳＣＨ５２０００；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）；ＩＬ−４；ＩＬ−１０および／またはＩＬ−４アゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）；インターロイキン−１１；プレドニゾロン、デキサメタゾンまたはブデソニドのグルクロニドまたはデキストラン結合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）；徐放メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）のアンタゴニスト；シプロフロキサシン；およびリグノカイン。
【０１２０】
ＴＮＦに調節される疾患（例えば、ＩＢＤ）を治療するのに好適な多くの潜在的な共治療薬は市販されまたは現在臨床開発であり、下記を含む：５−ＡＳＡ（ジェネリック）；ＭＭＸメサラジン（Ｃｏｓｍｏ）；ＭＭＸブデソニド（Ｃｏｓｍｏ）；ＭＭＸ  ＬＭＷヘパリン（Ｃｏｓｍｏ）；ＥＲメサラジン（Ｓａｌｉｘ）；アザチオプリン（ジェネリック）；６−メルカプトプリン；インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｊ＆Ｊ）；アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ）；セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ）；アトロサブ（Ａｔｒｏｓａｂ）（ＢａｌｉｏＰｈａｒｍａ）；ナタリズマブ（Ｅｌａｎ）；ゴリムマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｊ＆Ｊ）；デルサラジン（Ｐａｌａｕ）；ＨＭＰＬ−００４（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉ  Ｐｈａｒｍａ）；オゾラリズマブ（Ａｂｌｙｎｘ）；ＴＮＦ−ａ  Ｋｉｎｏｉｄ（Ｎｅｏｖａｃｓ）；アピリモド（Ｓｙｎｔａ）；ウステキヌマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｊ＆Ｊ）；ブリアキヌマブ（Ａｂｂｏｔｔ）；ＳＣＨ−９００２２２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）；ＦＭ２０２およびＦＭ３０３（）；ＭＰ−１９６；バシリキシマブ（Ｃｅｒｉｍｏｎ）；ダクリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）；フォントリズマブ（ＰＤＬ）；Ｃ３２６（Ａｖｉｄｉａ）；シルクマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｊ＆Ｊ）；オロキズマブ（ＵＣＢ）；サリルマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｊ＆Ｊ）；ＢＭＳ−９４５４２９（Ａｌｄｅｒ）；トシリズマブ（Ｃｈｕｇａｉ）；アンルキンズマブ（Ｗｙｅｔｈ）；ＱＡＸ５６７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＳＫ１０７０８０６（ＧＳＫ）；ＰＦ−０５２３０９００（Ｐｆｉｚｅｒ）ビドフルジムス（Ｖｉｄｏｆｌｕｄｉｍｕｓ）（４ＳＣ）；トファクチニブ（Ｔｏｆａｃｔｉｎｉｂ）（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ０１４（Ａｃｔｏｇｅｎｉｘ）；ＩＬ−２７アクトビオチック（ＡｃｔｏＢｉｏｔｉｃ）（Ａｃｔｏｇｅｎｉｘ）；ビジリズマブ（ＰＤＬ）；リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；アバタセプト（ＢＭＳ）；フィルグラスチム（Ａｍｇｅｎ）；サルグラモスチム（Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ａｍｇｅｎ）；ヴィドリズマブ（Ｖｉｄｏｌｉｚｕｍａｂ）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）；エトロリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＡＪＭ−３００（Ａｊｉｎｉｍｏｔｏ）；ＡＳＰ−２００２（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；アリカホルセン（Ｉｓｉｓ）；ＰＦ−５４７６５９（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＣＸ２８２（ＧＳＫ１６０５７８６）；ＣＣＸ５０７（ＣｈｅｍｏＣｅｎｔｒｙｘ）；ＣＮＤＯ−２０１（Ｃｏｒｏｎａｄｏ）；レメステムセル−Ｌ（Ｏｓｉｒｉｓ）；ＰＤＡ−００１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）；オヴァセーブ（ＯｖａＳａｖｅ）（ＴｘＣｅｌｌ）；セクキヌマブ；ＭＤＸ−１１００（Ｍｅｄａｒｅｘ）；テトミラスト（Ｏｔｓｕｋａ）；ＬＴ−０２（Ｌｉｐｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；ＶＴ−３０１（ＶｉＴｈｅｒａ）。
【０１２１】
複数の治療薬が共投与される場合、関連する技術分野で認識されるように、それに応じて用量が調整される。「共投与」および「併用療法」は同時投与に制限されず、少なくとも１つの他の治療薬を患者に投与することを含む治療過程中に、本発明の抗体が少なくとも１回投与される治療レジメンをも含む。
【０１２２】
下記実施例は、本発明の特定の実施形態または特徴を説明する目的で提供され、その範囲を制限することを意図しない。
【０１２３】
実施例
実施例１．ウシ初乳抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物およびプロセス
免疫初乳を監査済みの認定された動物施設で生成させる。妊娠したホルスタイン乳牛は、ＦＤＡ低温殺菌乳条例（ＰＭＯ）下で規制されるＵＳにおける商業Ａグレード酪農場から供給される。ＰＭＯはハウジング要件、建物および機器標準、許容される洗浄および駆除薬材料の使用、搾乳手順、衛生設備要件、などを特定する。
【０１２４】
動物を免疫化の開始前最低２週間隔離し、必要に応じて拭き取る。認定された雌ウシを収容し、他の動物とは別に維持し、毎日観察する。飼料源を制御して未承認動物源タンパク質の導入を防止する。源乳牛群を試験し、ブルセラ症およびＴＢを有さない状態により認可する。雌ウシは、下記に対し、（死滅または不活化）ルーチン免疫化を受け、またはスクリーニングされる：
ウシ白血病ウイルス      大腸菌
ウシウイルス性下痢ウイルス      ロタウイルス
パラインフルエンザウイルス  （ＰＩ３）      ビブリオ症
ウシ感染性鼻気管炎    レプトスピラ症
ウシ呼吸器多核体ウイルス    クロストリジウム病
ヨーネ菌    コクシエラ・ブルネッティ
ウシ狂犬病
【０１２５】
認定された雌ウシを、３回（３）用量のｒｈＴＮＦで、乳牛における使用がＵＳＤＡ認可された市販の獣医アジュバントを使用して免疫化する。獣医師の直接監督の下で、確立されたＳＯＰに従い、２〜３週の間隔で最終調製ワクチンを投与する。血清試料を各注射の時間におよび分娩時に収集する。
【０１２６】
免疫化された雌ウシを個々に搾乳する。動物は、分娩時に見かけ上良好な健康状態になければならず、臨床乳腺炎の証拠がない。雌ウシの乳房を搾乳のために、標準酪農洗浄実践およびＦＤＡ低温殺菌乳条例下で使用が認可された材料を用いて準備する。初乳を１日２回出産後３日間収集する。各個々の初乳搾乳試料を分析のために収集し、試料およびバルク初乳の両方を−２０℃で直ちに凍結させる。全ての入ってくる生初乳は使用前に認定する。
【０１２７】
初乳を解凍し、脂肪成分を１２００〜３６００ｌｂ／ｈｒの流速および２４〜４３．５℃の温度での連続フロー遠心分離により低減させる。スキムを１．５体積の逆浸透（ＲＯ）水で希釈し、ｐＨを測定、記録し、その後４．６±０．１に酸で調整する。酸性化させた脱脂初乳を、２５−４５分、２１〜３５℃の温度で静止状態のままとする。酸性化工程により沈殿したカゼインをデカント遠心分離により除去する。澄まし上清およびカゼインスラッジを別々に収集し、測定、記録し、カゼイン画分を廃棄する。
【０１２８】
免疫グロブリンを澄まし上清から、タンパク質Ｇクロマトグラフィーにより閉鎖系において単離する。タンパク質Ｇ樹脂（例えば  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗゲル、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をカラムに充填し、製造者に推奨される結合緩衝液で平衡化させる。適正なイオン強度およびｐＨが最適結合のために維持されることを確保するために、澄まし上清を、結合緩衝液に対し透析し、その後、ベッド体積に２０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質対ベッド体積の比で適用する。流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎである。カラムを１０ベッド体積の結合緩衝液で洗浄する。結合されたウシＩｇＧを、１０ベッド体積の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）で溶離する。溶離された画分を中和するために、１００μｌ／ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を溶離前に収集管に添加する。精製プロファイルを２８０ｎｍでモニタし、標的画分を収集し、プールし、ＰＢＳに対し４℃で透析する。収集した生成物溶離液を限外濾過により濃縮する。
【０１２９】
実施例２．ウシ初乳抗ＴＮＦ抗体：炎症性腸疾患のマウスモデルにおける精製抗体の免疫初乳乳清との比較
免疫初乳をＳｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｌａｓ  Ｃｒｕｃｅｓ、Ｎｅｗ  ＭｅｘｉｃｏにあるＵＳＤＡ登録研究施設で生成させた。６匹のホルスタイン雌ウシを妊娠の最後の三半期中に購入し、施設に輸送し、免疫化前に１週間順化させた。動物は３回の抗原の皮下注射を、２つのアジュバントのうちの１つと、２−３週空けて受け、最後の注射を計算された出産日の３週間前に受けた。初乳を全ての動物から最初の８搾乳の間収集した（分娩後最初の４日間）。１匹の動物が十分な乳房発達が起こる前に早産し、そのため初乳中の免疫グロブリンのレベルが低くなり、この動物由来の初乳は廃棄した。
【０１３０】
プールを出産後１−４日に収集した初乳から調製し、乳清を標準方法を使用して調製した（Ｓｕ  ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，  ２００３）。初乳を１：３に蒸留水で希釈し、ｐＨ４．６に氷酢酸で酸性化しカゼインを沈殿させ、遠心分離した。上清を除去し、ｐＨを７．４に調整し、免疫乳清を生成させた。
【０１３１】
免疫グロブリン画分をチオフィリック吸着剤を用いて精製させた。チオフィリック吸着剤（Ｔ−ｇｅｌ）をＰｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。クロマトグラフィーカラムを５０ｍｌの樹脂で充填し、１５０ｍｌの結合緩衝液（０．５Ｍ硫酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で平衡化させた。免疫乳清を水浴中で解凍し、固体硫酸ナトリウムを添加し、最終濃度を０．５Ｍとした。溶液を３７００ｒｐｍで１５分間回転させ、微粒子物質を除去し、結合緩衝液で１：１希釈し、Ｔ−ｇｅｌカラム上に室温でロードした。カラムを５カラム体積（１５０ｍｌ）の結合緩衝液で洗浄した。免疫グロブリンを低塩（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０）で溶離し、タンパク質を含むカラム画分を溶離し、プールした。溶離した材料をＡｍｉｃｏｎ攪拌式セル上で、１００，０００分子量カットオフを有するＹＭフィルタを用いて濃縮し、フィルタを滅菌した。
【０１３２】
対照免疫グロブリンを並行して精製させた。抗ＴＮＦ活性を含む両方の免疫グロブリン（本明細書では「マウスＡＶＸ−４７０」または「ＡＶＸ−４７０ｍ」と同じ意味で呼ばれる）および対照初乳免疫グロブリンをそれらのマウスＴＮＦに結合する、およびこれを中和するの両方の能力に対してアッセイした。免疫免疫グロブリンは特異的ＥＬＩＳＡにおいてＴＮＦに結合したが、対照免疫グロブリンでは結合は見られなかった。
【０１３３】
ウシ抗体のＴＮＦ誘導細胞毒性を中和する能力を、標準の細胞に基づくＴＮＦ−アッセイを用いて、マウスＬ９２９細胞を使用して決定した。様々な濃度の抗体をマウスＴＮＦと２時間３７℃で、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてプレインキュベートした。抗体−抗原混合物をＬ９２９細胞のコンフルエント培養物に、１ｕｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤと共に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞生存率をＷＳＴアッセイを使用して評価した。抗ＴＮＦ抗体は、この細胞に基づくアッセイにおいてＴＮＦを中和したが、対照抗体は効果を有さなかった。
【０１３４】
精製したＡＶＸ−４７０ｍおよび対照免疫グロブリンを、マウスＴＮＦで免疫化した雌ウシ由来の乳清（ＡＶＸ−４７０ｍ−乳清）および対照乳清と共にマウスＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルにおいて評価した。研究は、Ｂｉｏｍｏｄｅｌｓ、ＬＬＣで実施した。２１．０ｇの平均開始体重を有する雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。マウスを試験開始前に５日間順化させた。大腸炎を４ｍｇのＴＮＢＳを含む５０％エタノールビヒクルの第０日での直腸内投与により誘導した。
【０１３５】
大腸炎を第０日でのイソフルラン麻酔下での１００μＬのＴＮＢＳ（４ｍｇ）を含む５０％エタノールの直腸内投与により誘導した。８匹の追加の動物は未処置対照として機能し、１００μＬの５０％エタノールを直腸内投与した。動物に、被験物質またはビヒクルを１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）、０．１ｍＬ／回、第−１日〜第３日に口腔経管栄養により（ｐ．ｏ．）投与した。第５日に、大腸炎重症度を全ての動物でビデオ内視鏡検査を用いて評価した。内視鏡検査を盲検様式で、小動物内視鏡（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ  Ｅｎｄｏｓｋｏｐｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。大腸炎重症度を評価するために、動物をイソフルランで麻酔し、下部結腸のビデオ内視鏡検査に供した。大腸炎を正常では０〜重篤な潰瘍では４の範囲のスケールに基づき、視覚によりスコア化した。記述用語では、このスケールは下記の通りに規定される：
【０１３６】
内視鏡検査大腸炎スコア化スケール
スコア：説明
０：正常
１：血管分布の損失
２：血管分布の損失および破砕性
３：破砕性およびびらん
４：潰瘍および出血
試験群とビヒクル対照の間の統計学的差をスチューデントｔ検定（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１．２，  Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．）を用いて決定した。内視鏡検査スコアを下記で、表５において示す。
【表５】
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【０１３７】
大腸炎スコアは、ＴＮＢＳで処置した群では、エタノールで処置した対照群に比べて著しく上昇した。５ｍｇ  ＡＶＸ−４７０ｍまたはＡＶＸ−４７０ｍ−乳清による経口治療を受けた群はどちらも、第５日に大腸炎重症度スコアの著しい低減を示した。大腸炎重症度において他の著しい差は観察されなかった。
【０１３８】
驚いたことに、これらのデータは、活性は、ＡＶＸ−４７０ｍ−乳清および精製したＡＶＸ−４７０ｍの両方で見られること；免疫グロブリンを、他の乳清成分から精製させても活性の減少は見られないことを証明する。
【０１３９】
実施例３．免疫初乳の生成
免疫初乳を、監査済みの認定された動物施設で生成させた。妊娠したホルスタイン乳牛は、ＵＳＦＤＡＡグレード低温殺菌乳条例（ＰＭＯ）下で規制される商業酪農場から供給した。動物を隔離し、拭き取った。源乳牛群を試験し、ブルセラ症およびＴＢを有さない状態により認可した。雌ウシは下記に対し、（死滅または不活化）ルーチン免疫化を受け、またはスクリーニングされた：
ウシ白血病ウイルス      大腸菌
ウシウイルス性下痢ウイルス      ロタウイルス
パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）      ビブリオ症
ウシ感染性鼻気管炎    レプトスピラ症
ウシ呼吸器多核体ウイルス    クロストリジウム病
ヨーネ菌    コクシエラ・ブルネッティ
ウシ狂犬病
【０１４０】
認定された雌ウシを３回（３）用量のｒｈＴＮＦでＱｕｉｌ  Ａアジュバントを使用して、２〜３週の間隔で免疫化し、最後の注射を計算された出産日の３週間前に受けさせた。初乳を全ての動物から最初の８搾乳の間収集した（分娩後最初の４日間）。各個々の初乳搾乳試料を分析のために収集し、試料およびバルク初乳の両方を−２０℃で直ちに凍結させた。全ての雌ウシは、ＥＬＩＳＡによる組換えヒトＴＮＦへの特異的結合およびＬ９２９細胞アッセイにおける組換えヒトＴＮＦの中和により判断されるように特異抗体を産生した。
【０１４１】
実施例４．硫酸アンモニウム沈殿によるウシ初乳からの免疫グロブリンの精製
組換えマウスＴＮＦで免疫化した雌ウシ由来の初乳試料を解凍し、合わせて７５０ｍＬの初乳のプールを生成させた。脂肪を除去するために、初乳を２９５４ｘｇで２０分間室温で遠心分離した。脂肪除去後、初乳を水（１部の初乳；２部の水）中で希釈し、ｐＨを酢酸を用いて４．６に調整し、その後２０分間撹拌した。懸濁液を３４８８ｘｇで３０分間室温で遠心分離し、カゼインペレットを乳清から除去した。乳清のｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整した。５０％飽和硫酸アンモニウム溶液（３１３ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム）を乳清に徐々に添加し、１．５時間４℃で撹拌した。懸濁液を３４８８ｘｇで３０分間４℃で遠心分離した。上清をゆっくりとデカントした。免疫グロブリンペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に再懸濁させ、ペレットを溶解させた。試料を、８交換の２ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対し、４℃で３６時間の間透析した。ウシ免疫グロブリンを、４℃で管の上部にポリビニルピロリドン粉末（ＰＶＰ−４０、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加することにより濃縮した。濃縮免疫グロブリン溶液を透析管から除去した。
【０１４２】
実施例５．ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓカラム上での初乳からの不純物の除去
凍結初乳（１．８９Ｌ）を４５℃の水浴中で解凍した。酢酸による酸性化工程でカゼインを沈殿させた後、初乳調製物を一晩中４℃で維持した。酸性化させた材料を４３℃まで温め、２，７３０ＲＣＦで遠心分離した。上清を保持し、水酸化ナトリウムで中和しｐＨ６．４とした。中和した調製物を等体積の逆浸透水を添加することにより希釈し、２．８Ｌの脱脂、カゼイン低減初乳または初乳乳清を生成させた。乳清調製物のアリコートを試験し、様々なクロマトグラフィーカラムの有効性を評価した。
【０１４３】
この実施例では、乳清のアリコート（３０ｍＬ）をアニオン交換カラム（５ｍＬＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｑ充填カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから購入）またはカチオン交換カラム（５ｍＬＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓ、これもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）に適用した。各カラムを１Ｍ  ＮａＣｌで溶離し、フロースルーおよび溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下で分析した。マーカーレーンにデュアルカラー分子量マーカー（Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をロードした。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、タンパク質を可視化した。５０ｋＤａおよび２５ｋＤａの２つのバンドは、それぞれ、免疫グロブリンの重および軽鎖を示した。ゲルからのデータは、乳清の調製中、この方法により判断される免疫グロブリンの著しい収量損失はなかったことを示した。免疫グロブリンは、Ｃａｐｔｏ−ＱおよびＣａｐｔｏ−Ｓカラムの両方のフロースルーにおいて可視化される。この初乳乳清調製物のために使用される条件下では、Ｃａｐｔｏ−Ｑマトリクスは、乳清調製物中のいずれの豊富なタンパク質にも有意に結合しなかったが、さらなる実施例において見られるように、豊富でないタンパク質不純物の除去において重要な役割を有し得る。対照的に、Ｃａｐｔｏ−Ｓは、初乳乳清から、およそ７５ｋＤａの低分子量を有するタンパク質に結合し、よってこれを濃縮することが知られていた。
【０１４４】
実施例６．メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）クロマトグラフィーによる非免疫グロブリン因子が枯渇したポリクローナル抗体組成物の調製
免疫グロブリンの精製に有用なＭＥＰマトリクス（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を、そのポリクローナル抗体調製物を乳清から精製する能力に対し試験した。この実施例では、Ｃａｐｔｏ−Ｓフロースルーからの２５ｍｇの試料を０．１５Ｍ  ＮａＣｌの最終濃度に調整し、０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐａｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で濾過した。試料をその後、ＭＥＰマトリクスの１ｍＬカラムに２ｍＬ／ｍｉｎの流速で適用した。２８０ｎｍでの吸光度をモニタし、カラムを吸光度単位がベースラインレベルに到達するまで洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、ｐＨを減少させるクエン酸の勾配で溶離した。免疫グロブリン画分はおよそｐＨ５．０で溶離した。ゲルを下記の通りに調製した：レーン１はＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒマーカーであり、レーン２はＣａｐｔｏ−Ｓフロースルー（ＭＥＰカラムロード）であり、レーン３−１２は溶離ピークからの画分３６−４３含有画分である。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて定量されたデンシトメトリー走査は、重および軽鎖が総タンパク質のおよそ９５％を占めたことを明らかにした。
【０１４５】
これらのデータは、ＭＥＰが不純物を除去するための有効な樹脂であり得ることを示唆する。しかしながら、後の実施例は、ＭＥＰは好ましい方法ではないことを証明するであろう。
【０１４６】
実施例７．分析的サイズ排除クロマトグラフィーによるＭＥＰ精製させた乳清タンパク質抗体調製物の組成の研究
サイズ排除クロマトグラフィーは精製させたタンパク質調製物の組成を評価するために有用な技術である。より高い自然分子量を有するタンパク質複合体またはタンパク質は、より低い自然分子量を有するタンパク質よりも早く溶離する。乳清タンパク質（０．５ｍＬの総体積中０．５ｍｇ）のクロマトグラフィーからプールしたＭＥＰ溶離液を、ＡＫＴＡＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）ＦＰＬＣシステムでの、高分解能ＴＲＩＣＯＲＮ（登録商標）Ｓ２００カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ製）上での分析的サイズ排除クロマトグラフィー分析に供した。カラムはリン酸緩衝生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）（これはまた、溶離緩衝液であった）中で予め平衡化した。吸光度を２８０ｎｍでモニタした。ピーク下面積をＵｎｉｃｏｒｎソフトウェアパッケージを使用して測定した。これらの条件下で、免疫グロブリンは自然高次構造を維持すると予想された。データは１３．５ｍＬの溶離体積を有する主ピークは計算すると、球状タンパク質に対するおよそ１４９ｋＤａの保持時間を表すことを示し、これは、免疫グロブリンに対する理論分子量１５０ｋＤａ分子量に非常に近接した。この実施例ではデータは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致し、ＭＥＰマトリクスはポリクローナル抗体組成物に結合し、精製したことを示す。
【０１４７】
実施例８．１５Ｌ初乳および２Ｌ  ＭＥＰカラムを使用した大規模プロセスへの拡大の研究
この実施例では、パラメータをＭＥＰカラムプロセスを拡大するために研究した。脱脂乳清をパイロット規模で調製した：最初に、脱脂初乳（１５Ｌ）を連続フロー遠心分離により調製し、続いて１０％乳酸で酸性化しｐＨ４．６とした。一晩中維持した後、カゼインを遠心分離により除去し、上清を保持し、０．５Ｍ  ＮａＯＨで中和し、ｐＨ６．４とした。乳清をその後、パイロット規模フィルタトレイン、デプスフィルタ（ＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓフィルタカートリッジ）、続いて０．２μｍフィルタを通して濾過し、２０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ６．８で予め平衡化させたＩＮｄＥＸカラム中に充填させたＭＥＰ樹脂の２Ｌカラム上にロードした。カラムをおよそ１０Ｌの同じ緩衝液で十分に洗浄し、その後、２０ｍＭクエン酸−リン酸、ｐＨ２．８で溶離した。溶離させた試料を１Ｍトリスで中和した。溶離液をその後、５体積の逆浸透水に対してダイアフィルタし、緩衝液を交換し、その後、パイロット規模接線流濾過装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を用いて限外濾過により濃縮した。粘度は問題ないことが観察された。
【０１４８】
還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析からの結果はベンチ規模で見られる結果を大体繰り返した。２つの主な不純物が免疫グロブリン重および軽鎖に加えて存在することが注目された。
【０１４９】
実施例９．噴霧乾燥実施例
ウシ免疫グロブリンのＭＥＰクロマトグラフ分離からの溶離液を限外濾過／ダイアフィルトレーションにより濃縮し、およそ８０ｍｇ／ｍｌタンパク質とし、ベンチ規模噴霧乾燥実験のための供給流を生成させた。全ての噴霧乾燥開発研究はＰｈａｒｍａ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹにより、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０ベンチトップラボ噴霧乾燥機を用いて実施された。
【０１５０】
これらの最初の実験の目的は、サイクロン内で収集可能な粉末を形成し、固着および生成物妨害が最小に抑えられた噴霧乾燥条件を同定することであった。噴霧乾燥前に、賦形剤を濃縮初乳免疫グロブリンに添加しなかった。各試験のためのパラメータを表６に示す。
表６−Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０試験研究
【表６】
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これらの試験粉末の各々を、ゼラチンカプセル（Ｓｉｚｅ  ００、Ｃａｐｓｕｇｅｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に手で充填し、プロトタイプの経口剤形を生成させた。
【０１５１】
実施例１０．ＭＥＰ精製プロセスとＣａｐｔｏ−Ｓ精製プロセスの比較
ＭＥＰ樹脂を用いて得られた結果の評価において、溶離液中の不純物の存在についての懸念、ならびに結合能についての懸念が存在した。加えて、薬理組成物の調製のためのプロセスでは、スケーラビリティ、高速スループット、および体積変化の回避は重要な因子である。活性薬剤成分がカラム樹脂に結合しないが、望ましくない汚染物質が結合するプロセスは、好ましいプロセスを表し得る。そのため、フロースルー方法を再検査した。
【０１５２】
この実施例では、初期工程を（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ａ．Ｇ．，米国特許５，７０７，６７８号）に記載されるように実施する：脱脂初乳を逆浸透水で２Ｘ希釈し、酸性化し、中和し、その後連続流遠心分離機で加工した。一晩中維持する工程後、珪藻土（ＵＳＰ／ＮＦグレード、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を４／ｇＬまで添加し、材料を１０ｍｉｎ間撹拌し、１０％水酸化ナトリウムで中和し、Ｃｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＢｉｏＣａｐデプスフィルタ（６０２Ａ０５Ａ、３Ｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）および０．２μｍフィルタ（ＭｉｌｌｉＰＡＫ  ＭＰＧＬ  ０２ＧＨ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して濾過した。
【０１５３】
乳清をＭＥＰカラムまたはＣａｐｔｏ−Ｓカラムのいずれかに適用した。クロマトグラフィー後、比較の各アームからの適切な画分（保持画分、ＭＥＰではｐＨ勾配で溶離；Ｃａｐｔｏ−Ｓではフロースルー、１００ｍＭ  ＮａＣｌに調整）をその後、Ｐａｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌシリーズ装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）およびＴＭＰ−Ｆｌｕｘ  ５０ｋＤ名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）膜を用いて５０ｇ／Ｌの推定濃度まで限外濾過した。膜間圧（ＴＭＰ）を１５ｐｓｉに近いレベルを維持するように調整した。材料を３〜５体積の逆浸透水に対しダイアフィルタし、続いて、第２の限外濾過工程を実施し、タンパク質濃度を１００ｇ／Ｌとした。タンパク質濃度を、供給者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により記載されるように実施する、ビシンコニン酸方法により、ＢＣＡ（商標）アッセイキットを用いて決定した。試料を還元４−１２％Ｂｉｓ−トリスＮＯＶＥＸゲル（ＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、ＮＵＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液を用いて移動させた。マーカーレーンはＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ着色タンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とした。ゲルをＥＺブルー染色試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  Ｇ１０４１）で染色した。ゲルをデスクトップスキャナ（ＨＰ  ＳｃａｎＪｅｔモデルＧ３０１０）上で走査させ、撮像データをＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）により分析した。
【０１５４】
ゲルの分析は、ＭＥＰプロセスおよびＣａｐｔｏ−Ｓ−ＴＦＦプロセスは異なるプロファイルを生成させたことを示し、例えば、ＭＥＰプロセスは、可能性のある汚染物質として圧倒的多数のラクトフェリンを有し、Ｃａｐｔｏ−Ｓプロセスは可能性のある汚染物質としてラクトグロブリンを有した。汚染物質のアイデンティティを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた標準、等電点の検討、および質量分析からの結果との比較により決定した。その後、適切な最適化およびポリッシング工程を適用し、ポリクローナル抗体組成物の異なる好ましい実施形態を達成することができる。
【０１５５】
実施例１１．ポリクローナル組成物中のＩｇＭおよびＩｇＡの定量
市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ番号Ｅ１１−１０１および番号Ｅ１１−１２１、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を使用して、異なる調製物において、それぞれ、ＩｇＭおよびＩｇＡのレベルを決定した。抗ウシＩｇＭまたはＩｇＡ抗体を提供された９６ウェルストリッププレート上にプリコートする。プレートを洗浄し、ブロックし、試料の段階希釈を添加し、洗浄し、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ結合、親和性精製ヤギ抗ウシＩｇＭまたはヤギ抗ウシＩｇＡのいずれかおよび基質としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて結合を検出した。ＭＥＰクロマトグラフィーにより精製した材料を、Ｃａｐｔｏ−Ｓクロマトグラフィーからのフロースルー材料と比較した。表７のデータは、ＢＣＡアッセイを用いたタンパク質濃度に基づく、１グラムの生成物あたりのアイソタイプのｍｇとして表される。
表７
【表７】
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【０１５６】
ＩｇＡレベルは両方の精製調製物において増加し、不純物（特にカゼイン）が除去されるにつれ、免疫グロブリンが濃縮されたことを反映した。ＩｇＭはＣａｐｔｏ−Ｓ調製物中でわずかに濃縮されているが、ＭＥＰ調製物で著しく枯渇している。これはさらにＣａｐｔｏ−Ｓ方法がＭＥＰよりも優れていることを証明する。Ｃａｐｔｏ−Ｓ調製物中では、タンパク質の１３％がＩｇＡであり、７％がＩｇＭであり、初乳中のこれらのアイソタイプの典型的なレベルに基づき、全てのＩｇＡの保持およびおよそ５０％のＩｇＭの損失を反映した。
【０１５７】
実施例１２．ラクトフェリンを除去するための選択的沈殿
選択的沈殿は対象となるタンパク質を濃縮し、または汚染タンパク質を除去することができる技術である。この実験では、酸性化、脱脂、脱カゼイン化させた初乳の二塩基性リン酸塩による中和は、ラクトフェリンを選択的に沈殿させたことが見出された。脱脂初乳を解凍し、４２℃まで加熱し、１．５Ｘ体積の水で希釈した。溶液を５％乳酸で酸性化し、４．６の最終ｐＨとした。カゼインを粗濾過、続いて連続フロー遠心分離により除去し、酸性化させた材料を一晩中２−８℃で維持した。朝、４ｇ／Ｌの珪藻土を添加し、材料を、ＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓカプセルフィルタを通して濾過した。異なる中和状態をその後、温度、中和速度、ＮａＯＨまたは二塩基性Ｎａ（Ｐ）の使用を変動させて、比較した。全ての場合において、いくらかの濁度が観察され、沈殿材料を遠心分離により除去し、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５８】
この実験では、ラクトフェリンの同じ相対移動度の７５ｋＤａタンパク質（市販の標準と比較）は、二塩基性リン酸ナトリウムをカゼイン後初乳由来の乳清の調製物におけるｐＨを中和するために使用した場合、水酸化ナトリウムと比較して、ペレット画分において濃縮されたことが見出された。推定ラクトフェリンの相対的濃縮は白色沈殿（リン酸カルシウムである可能性がある）を伴った。
【０１５９】
この結果に基づき、パイロット規模の実行を、ナトリウム二塩基性リン酸塩を中和剤として使用し、沈殿材料を除去するために連続流遠心分離機を使用して、実施した。しかしながら、リン酸カルシウム沈殿は加工装置から除去するのが非常に困難であることが証明された。そのため、この方法はベンチ規模では有用であり得るが、パイロットまたは生産規模に対しては好ましい方法ではない。
【０１６０】
実施例１３．連続フロースルー戦略の利点−ベンチ規模研究
ここで記載される実験は、パイロットおよびプロセス規模に確実に拡大する樹脂を用いたベンチ規模クロマトグラフィー、続いて、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いたタンパク質プロファイルの分析を示す。初乳乳清をパイロット規模で調製し、試料を下記で示されるように５ｍｌカラム上にロードし、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【０１６１】
実施例１０におけるデータと共に、この実験は、Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑを用いた連続フロースルークロマトグラフィープロセスは、ＭＥＰカラムクロマトグラフィーと比べた場合、改善されたプロセスを提供することができることを示唆する。特に、フロースルーＣａｐｔｏ−Ｓと連続したフロースルーＣａｐｔｏ−Ｑの新規戦略による結果は、特に有望に見える。
【０１６２】
実施例１４．３０Ｌ初乳および３Ｌカラムに拡大された連続Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑクロマトグラフィー
脂肪を３０Ｌの初乳から、Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ装置（ＳＡ−１−０２−１７５、ＧＥＡ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＵＳ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈｖａｌｅ、ＮＪ）における連続フロー遠心分離、４２℃でのラクテート添加による酸沈殿（ＤＬ−乳酸、８５％溶液、（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および粗濾過により除去した。粗濾過後、材料を一晩中、２−８℃で維持し、その後、トロメタミン添加（Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）により中和した。中和した乳清を連続フロー遠心分離により浄化した。次に、綿状沈殿工程で、珪藻土濾過剤（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）を４ｇ／ｍＬとなるまで、第１のフィルタカプセル（Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ａ．Ｇ．、米国特許５，７０７，６７８）前に、１０ｍｉｎ間撹拌しながら添加した。浄化フィルタトレインは２０μｍα繊維状ポリプロピレン（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）／０．４５μｍポリプロピレンフィルタＣＬＭＦＯ４５−２２２（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）／０．２μｍフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）から構成された。
【０１６３】
Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂（３Ｌベッド体積）およびＣａｐｔｏ−Ｑ樹脂（３Ｌベッド体積）を２つのＩＮｄＥＸ１４０／５００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に充填し、連続して連結させた。試料をロードする前に、カラムを１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、その後６０Ｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８で連続して洗浄した。乳清（３０Ｌ）をカラム上に０．５Ｌ／ｍｉｎの流速でポンピングし、カラムを２．５カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。２８０ｎｍでの吸光度を、インラインフローセル（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を用いてモニタした。Ａ２８０がベースラインレベルに到達した時にフロースルーの収集を中止した。クロマトグラフィー後、生成物を限外濾過（５０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯフィルタ）により、Ｐａｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ装置、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を使用して濃縮し、その後、５体積の逆浸透水に対してダイアフィルタした。生成物を＞７５ｍｇ／ｍＬまで、限外濾過により濃縮した。終末熱処理を６０℃で１０時間実施した。
【０１６４】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を実施し、連続して連結されたＣａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑ上での、この３０Ｌパイロット規模カラムクロマトグラフィーからの結果を集めた。Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑカラムに結合したタンパク質を、カラムを１ＭＮａＣｌでストリッピングすることにより評価した。ゲルを下記の通りに調製した：レーン１、タンパク質分子量マーカー、レーン２−４、免疫グロブリン量を定量するために対照として使用されるＩｇＧＬ−鎖標準のロードの増加（電気泳動、＞９９％純粋、ヒト骨髄腫血漿由来、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手）レーン５、連続クロマトグラフィー前のロード、レーン６、Ｃａｐｔｏ−Ｓ／３Ｌ  Ｃａｐｔｏ−Ｑ連続カラムからのフロースルー、レーン７、連続カラムの溶離液（１ＭＮａＣｌ）。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、ＭＦＣ−９１２０ＣＮスキャナ（Ｂｒｏｔｈｅｒ）を用いて電子的に画像化した。ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｈｏｖ／ｉｊ／ｄｏｃｓ）を使用して、デンシトメトリープロットを生成させた。半ピーク高さ間のベースライン減算面積を統合することによりピーク面積を測定した。
【０１６５】
レーン５および６のデンシトメトリートレースの比較は、非Ｉｇタンパク質の減少ならびにＩｇタンパク質、重および軽鎖の濃縮を示す。レーン６で示される組成物では、生成物の８１％は免疫グロブリン重および軽鎖で存在する。高分子量バンドは凝集Ｉｇ重鎖（実施例１４を参照されたい）であり、７０−８０ｋＤａセクションに存在する材料の大部分はまた、生成物関連である（ＩｇＭおよび分泌成分−実施例１４を参照されたい）。そのため生成物の９５％は免疫グロブリンである。
【０１６６】
レーン７のトレースは、多くの非Ｉｇタンパク質は好ましくは樹脂に結合することを示した。レーン５および６からのトレースおよび他のデータと統合すると、連続フロースルークロマトグラフィーは初乳からのポリクローナル抗体組成物の調製のための強力な方法であると結論づけた。フロースルーおよび溶離液中のタンパク質のアイデンティティを、さらに下記実施例で調べた。このプロセスまたはその変更は、経口投与に好適なポリクローナル抗体組成物の適切な収率を提供するであろうことが容易に認識されるであろう。
【０１６７】
実施例１５．８０Ｌ初乳に拡大された連続Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑクロマトグラフィー（予言的）
３０Ｌ規模で抗体組成物を調製するための方法を例示してきたが、手順は、大規模な実験なしで８０Ｌまで拡大することができることは当業者により認識されるであろう。８０Ｌの初乳からの抗体組成物の調製は下記の通り、以下で記載されるように実施されるであろう。
【０１６８】
脂肪を初乳（８０Ｌ）からＷｅｓｔｐｈａｌｉａ装置（ＳＡ−１−０２−１７５、ＧＥＡ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＵＳ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈｖａｌｅ、ＮＪ）における連続フロー遠心分離により除去する。得られた脱脂初乳を、２体積の逆浸透水で希釈し、４２℃で乳酸を添加して、４．６の最終ｐＨとし（ＤＬ−乳酸、８５％溶液、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、幅広ブレード垂直羽根車または等価の混合装置により混合しながら、カゼインを沈殿させた。カゼインを除去するための粗濾過または等価の工程、例えばチーズプレス後、材料を一晩中２−８℃で維持し、その後、トロメタミン添加（Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）により中和した。珪藻土濾過剤（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、４ｇ／ｍＬとなるまで、第１のフィルタカプセル前に、１０ｍｉｎ間撹拌しながら添加した。浄化フィルタトレインは、２０μｍα繊維状ポリプロピレン（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）／０．４５μｍポリプロピレンフィルタＣＬＭＦＯ．４５−２２２（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）／０．２μｍフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）から構成された。これらのまたは他の製造者からの他のフィルタトレインもまた、同等にクロマトグラフィーのための試料を調製するであろうことが認識されるであろう。
【０１６９】
この実施例では、規模拡大は試料を３つのアリコートに分割し、各部分を連続クロマトグラフィーに供し、カラム設定を試料間で洗浄することにより達成される。Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂（３Ｌベッド体積）およびＣａｐｔｏ−Ｑ樹脂（３Ｌベッド体積）を連続して連結された２つのＩＮｄＥＸ１４０／５００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に充填する。各試料ロード前に、続カラム設定を１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、その後１Ｍのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８（ｐＨが６．８で安定化されるまで）で洗浄する。洗浄工程後、カラムを１８Ｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８で平衡化させる。乳清のｐＨおよび導電率を測定し、乳清をカラム上に０．５Ｌ／ｍｉｎの流速でポンピングし、カラム設定を２．５カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄する。２８０ｎｍでの吸光度およびｐＨを、インラインフローセル（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を用いてモニタする。Ａ２８０がベースラインレベルに到達した時に、フロースルーの収集を中止する。クロマトグラフィー後、ｐＨおよび導電率を測定し、ｐＨは、ロード材料のｐＨの０．２ｐＨ単位内にあることが見出され、導電率は、ロード材料の１ミリジーメンス／ｃｍ内にあることが見出される。生成物を限外濾過により（５０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯフィルタ）、Ｐａｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌシリーズ装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を使用して濃縮し、その後、５体積の逆浸透水に対してダイアフィルタする。生成物を＞７５ｍｇ／ｍＬまで限外濾過により濃縮する。終末熱処理を６０℃で１０時間実施する。
【０１７０】
実施例１６．ポリクローナル抗体調製物におけるタンパク質のアイデンティティの質量分析による調査
５２ｋｇの初乳乳清を、連続するＣａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑの２つの３Ｌカラム上に、実施例１４に記載されるようにロードした。フロースルーおよびストリップ画分を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、関連バンドをゲルから切除した。試料を質量分析に供した。分析をＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ大学にてＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置（Ｆｉｓｈｅｒ  ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で実施した。得られたペプチド配列を使用して、ＮＣＢＩｎｒデータベースを検索した。表８は各バンドに対して最も多く見られる配列をまとめたものである。
【表８】
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【０１７１】
フロースルー材料の分析は、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上の主バンド（バンド４および５）はＩｇＧ重および軽鎖を表すことを確認した。バンド４上方のスミアリング（バンド３）はまた、ＩｇＧ重鎖であり、おそらく異なるグリコフォームを表す。ウシ免疫グロブリンの全ての分析で見られる高分子量バンド（バンド１）は、ＩｇＧ重鎖凝集物である。バンドのトリプレットは、バンド２と標識された試料で見られる。このトリプレットは、主に分泌成分（７９ｋＤａ）、ＩｇＭ（７６ｋＤａ）およびトランスフェリン（７３ｋＤａ）から構成される。分泌成分およびＩｇＭはどちらも、組成物の望ましい成分であるが、トランスフェリンは不純物である。残りの低分子量バンドは、不純物α−ラクトアルブミンおよびケラチンを含む。これらの不純物は限外濾過ダイアフィルトレーション上での下流ポリッシング中に除去される。
【０１７２】
カラムからストリッピングさせた材料の分析は、プロセスは、ラクトフェリン、ウシ血清アルブミン、β−ラクトグロブリン、およびα−ラクトアルブミン、ならびにいくらかの免疫グロブリンおよびいくらかの微量不純物を除去したことを確認した。
【０１７３】
この分析は薬理学的に活性なポリクローナル抗体調製物の生成を混乱させ得る外来性タンパク質は、この戦略を用いて除去することができ、さらにポリッシング工程を胃腸系不全のものを含む患者集団に好適な組成物を生成させるために適用することができることを示した。
【０１７４】
実施例１７．異なる方法を用いて精製させた組成物の直接比較
４つの異なる方法を用いて精製させた初乳の組成物の直接比較を実施した：チオエステルＴゲルクロマトグラフィー（実施例２）、硫酸アンモニウム沈殿（実施例４）、ＭＥＰクロマトグラフィー（実施例８）およびＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑ連続クロマトグラフ（実施例１４）。各調製物の試料を、還元ＳＤＳＰＡＧＥにより、およびＥＬＩＳＡにより分析し、ラクトフェリン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンのレベルを定量した。試料はまた、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、ラクトペルオキシダーゼおよびＩＧＦ−１のレベルを定量した。
【０１７５】
これらの異なる組成物の還元ＳＤＳＰＡＧＥ分析を下記の通り準備した：レーン１：分子量マーカー；レーン２：脱脂プール初乳；レーン３：脱脂、脱カゼイン化乳清；レーン４、フロースルーＣａｐｔｏ−Ｓのみ；レーン５、フロースルーＣａｐｔｏ−Ｑのみ；レーン６、フロースルーＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑ；レーン７、ＭＥＰクロマトグラフィー；レーン８、硫酸アンモニウム精製抗体調製物；レーン９、Ｔゲル精製抗体調製物；レーン１０、親和性精製された、マウスＴＮＦに特異的な抗体。ゲルのデンシトメトリー分析を実施した。これらのデータは、上記実施例で提示した結果を確認し、調査下の４つの方法により、この方法により判断されるように大体同等レベルの純度が得られることを示す（Ｔゲルおよび硫酸アンモニウム生成物はベンチ規模で精製させたが、ＭＥＰおよびＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑ生成物は、パイロット規模で生成させたことに注意されたい）。
【０１７６】
アッセイを特定の不純物のレベルを定量するために実施した場合に、より著しい差が見られた。
【０１７７】
試料を、総タンパク質を定量するためにＢＣＡアッセイにおいて、特定の不純物のレベルを定量するためにＥＬＩＳＡにより分析した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ番号Ｅ１０−１２６、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を使用して、ラクトフェリンを定量した。製造者の推奨によって、ＥＬＩＳＡプレートを、提供された１：１００希釈のヤギ−抗ウシラクトフェリンコーティング抗体試薬でコートした。プレートを洗浄し、ブロックし、段階希釈の試料を添加し、洗浄し、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ結合、親和性精製ヤギ抗ウシラクトフェリンおよび基質としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて結合を検出した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ番号Ｅ１０−１２５および番号Ｅ１０−１２８、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を使用して、β−ラクトグロブリンおよびα−ラクトアルブミンをそれぞれ定量した。製造者の推奨によって、ＥＬＩＳＡプレートを、提供された１：１００希釈のヤギ−抗ウシβ−ラクトグロブリンまたはα−ラクトアルブミンコーティング抗体試薬でコートした。プレートを洗浄し、ブロックし、段階希釈の試料を添加し、洗浄し、それぞれ、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ結合、親和性精製ヤギ抗ウシβ−ラクトグロブリンまたはα−ラクトアルブミンおよび基質としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて結合を検出した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ番号ＫＴ−２０２８３および番号ＫＴ−１８２７８、Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して、異なる調製物において、それぞれウシラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルを決定した。抗ウシＬＰＯまたはＩＧＦ−Ｉ抗体を、提供された９６ウェルストリッププレート上にプリコートした。段階希釈の試料およびキャリブレーター標準を添加し、インキュベートし、その後、検出試薬Ａを添加した。追加のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、検出試薬Ｂを添加し、インキュベートした。最後に、ウェルを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液とインキュベートし、続いて、停止液を添加し、その後４５０ｎｍで読み取った。表９および１０は結果をまとめて示す。
【表９】
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【表１０】
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【０１７８】
実施例１８．Ｃａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑクロマトグラフィー上で精製させ、続いて限外濾過に供した組成物の還元ＳＤＳＰＡＧＥ分析
免疫グロブリンを初乳乳清から実施例１４に記載されるように精製させた。連続Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑカラムを通って流れた材料を３０，０００分子量カットオフ膜上での限外濾過に供し、残余分を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルのデンシトメトリー分析により分析した。
【０１７９】
この実施例でのデータの実施例１７のものとの比較は、限外濾過工程の付加がＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑフロースルー中に残っているα−ラクトアルブミンを明らかに除去することを証明する。実施例１７で分析した材料は、デンシトメトリー分析において１％のα−ラクトアルブミンのピーク面積を有し、これは、ＥＬＩＳＡによる７５ｍｇ／ｇのα−ラクトアルブミンの濃度に対応した（実施例１７を参照されたい）。限外濾過後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で検出可能なα−ラクトアルブミンはなく、α−ラクトアルブミンのレベルは＜１５ｍｇ／ｇであることが示された。
【０１８０】
デンシトメトリーに基づき、この組成物は９７％免疫グロブリン：５５％Ｉｇ重鎖（ＩｇＧおよびＩｇＡ）、３３％Ｉｇ軽鎖（κおよびλ）、３％分泌ＩｇＭ重鎖および３％のトランスフェリンの不純物である。
【０１８１】
Ｃａｐｔｏ−Ｑは強いアニオン交換体であり、Ｃａｐｔｏ−Ｓは強いカチオン交換体である。典型的には、タンパク質のｐＩに基づき、１つの樹脂または他の樹脂に結合するようにｐＨを最適化する。しかしながら、ポリクローナル抗体は、広いｐＩ範囲を有し、このアプローチを複雑にする。精製および単離免疫グロブリンの最も高い収率が達成されるようにこれらのカラムを使用する新規アプローチは、表１１に示されるように、ポリクローナル免疫グロブリンのための予測されるｐＩ範囲の中央にあるｐＨ、例えば６．６〜７．０の範囲のｐＨを選択することであった。
【表１１】
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【０１８２】
本明細書で記載される実験は、フロースルーはより迅速なスループット、高価な緩衝液の使用の低さを提供するので、結合および溶離よりもフロースルーアプローチを使用することが好ましいことを決定し、より高精製調製物が得られた。条件が正確でない場合、いくらかの免疫グロブリンが樹脂に結合し、収率が低減する。本明細書で記載される新規アプローチは、免疫グロブリン組成物の最も高い純度を伴う最も高い収率が得られる条件を最適化した。
【０１８３】
実施１９．免疫グロブリンの精製による効力の増加
Ａ）本発明によるポリクローナル抗ｈＴＮＦ抗体はまた、本明細書では「ＡＶＸ−４７０」と呼ばれ、実施例３および１４で記載されるものと同様の方法を用いて調製および精製させた。初乳は遠心分離により脱脂し、抗ＴＮＦ抗体の存在に対しＥＬＩＳＡによりアッセイした。タンパク質濃度をＢＣＡにより決定し、脱脂初乳の活性をＡＵ／ｍｇのタンパク質として表した。２つの別々の実行では、脱脂初乳は３３８ＡＵ／ｍｇおよび２７７ＡＵ／ｍｇを有することを見出した。脱脂初乳をカゼインの酸沈殿、濾過、連続アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過ならびに熱処理によりさらに精製させた。最終試料を、ＥＬＩＳＡにより抗ＴＮＦ活性およびＢＣＡによりタンパク質濃度に対し再アッセイした。最終薬物物質ロットは６３４および５２６ＡＵ／ｍｇタンパク質を有することが見出された。そのため、精製工程を通して、効力は各ロットで１．９倍増加し、免疫グロブリンの濃縮と一致した。
【０１８４】
Ｂ）ＡＶＸ−４７０の親和性精製
アフィニティーマトリクスを組換えヒトＴＮＦをＡｆｆｉｇｅｌ−１０に結合させることにより調製した。簡単に言うと、製造者の指示に従い、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）由来の凍結乾燥粉末として調製された、３ｍｇのヒトＴＮＦ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＲＴ１００Ｃ、ロット３１０５８１６）を、再構成し、０．５ｍＬのＡｆｆｉｇｅｌ−１０（ＢｉｏＲａｄ）と結合のために組み合わせ、続いて洗浄し、ブロッキングし、貯蔵した。上記（Ａ）で調製されたＡＶＸ−４７０をＰＢＳ中で希釈し、カラム上を通過させた。マトリクスを、２０カラム体積のＰＢＳで洗浄し、２．５体積の５０ｍＭクエン酸／１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ２．０で溶離し、十分な１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ塩基溶液を含む容器内に収集し、効果的に即時中和を提供した。試料を２８０ｎｍでの吸光度により分析し、１．４ｍｇ／ｍＬ−Ａ２８０ｎｍのおよその変換因子に基づき、最初に評価した。ＴＮＦ誘導細胞毒性のための標準インビトロＬ９２９アッセイは、「ＡＶＸ−４７０Ａ」として指定された親和性精製された材料のＴＮＦ中和活性の３１１倍精製を示した。データは、０．３％のＡＶＸ−４７０ＡがＴＮＦに特異的であることを示す。親和性精製された抗体の効力は、表１２に示されるように、インフリキシマブに非常に類似する（ＥＣ５０＝５１ｎｇ／ｍｌ、対してインフリキシマブでは７６ｎｇ／ｍｌ）。
【表１２】
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【０１８５】
実施例２０．組換えヒトＴＮＦによる雌ウシの免疫化
１２匹の雄乳用子ウシ、３〜５月齢を免疫化研究のために選択した。３週間の隔離期間後、各子ウシを４回、０．０５ｍｇ組換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）で４つ可能なアジュバントのうちの１つと組み合わせて免疫化した：Ｑｕｉｌ  Ａ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧ（５０％溶液）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−Ｄ（２０％溶液）またはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ（２０％溶液）。
【０１８６】
ｒｈＴＮＦは凍結乾燥粉末としてＣｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより供給され、使用の２日前までに、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン中の０．０５ｍｇ／ｍＬ溶液として調製した。Ｑｕｉｌ  Ａアジュバントは凍結乾燥粉末としてＡｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐにより供給され、１ｍｇ／ｍｌ溶液を、使用日に調製した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧは、すぐに使える液体としてＳｅｐｐｉｃ、Ｉｎｃにより供給された。ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＤおよびＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬアジュバントは、すぐに使える液体としてＭＶＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃにより供給された。
【０１８７】
１つのアジュバント群あたり３匹の子ウシとした。各免疫化は体積２ｃｃであり、全て首または肩領域で皮下投与した。第１の免疫化の日は、研究第０日と指定した；その後の免疫化は第２１、３５および５６日に投与した。動物を各免疫化後７２時間の間観察し、いずれの異常なまたは普通でない所見も報告した。免疫分析のために、５０ｍＬの血清試料を第０日（予備免疫化出血）、２１、３５、および５６日に収集し、最終大量体積（３００−５００ｍＬ）試料を第７０日（最終免疫化後２週間）に収集した。
【０１８８】
血清試料を頸静脈からの全血の収集により取得した。最終大量体積出血を２５０ｍＬ滅菌収集バッグ中に収集した。
【０１８９】
子ウシの免疫化により生成した血清由来材料をＳｅｒｕｍ−４７０と命名した。
【０１９０】
実施例２１．ＥＬＩＳＡによるヒトＴＮＦへの結合
Ｓｅｒｕｍ−４７０がヒトＴＮＦに結合することができるかどうか決定するために、血清試料をＥＬＩＳＡによりアッセイした。プールをあるアジュバントで免疫化した動物群の各々から、第４の出血試料を用いて生成させた。組換えヒトＴＮＦ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で希釈し、９６ウェルプレート上に、０．１ｍＬ／ウェル、１ｕｇ／ｍｌの濃度でコートした。１時間室温でのインキュベーション後、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含む０．０１Ｍトリス−緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ）で５回洗浄した。血清試料をＴＴＢＳ中で希釈し、０．１ｍＬを添加し、１：１０−１：５９０，４９０の３倍希釈系列でウェルを複製した。１時間室温後、プレートをＴＴＢＳで５回洗浄し、０．１ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ウシＩｇＧ（ｈ＋ｌ）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＴＸ）を、各ウェルに１：１００，０００の希釈で添加した。
【０１９１】
１時間室温後、プレートをＴＴＢＳで５回洗浄し、５０μｌ／ウェルの３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加し、３０分間暗闇でインキュベートし、続いて０．０５ｍＬ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４停止液を添加した後、比色分析を実施した。
【０１９２】
光学密度を４５０ｎｍで決定した。血清なしのウェルから決定されたバックグラウンド吸光度を、実験ＯＤ４５０値から減算した。
【０１９３】
図１は抗ＴＮＦ  ＥＬＩＳＡデータを示す。免疫化動物の４つの群全ては、ヒトＴＮＦに結合する抗体を有したが、抗ＴＮＦ抗体の力価は群間で異なり、Ｑｕｉｌ  Ａが最も有効なアジュバントであった。出血前血清試料では抗体はほとんど検出されなかった。
【０１９４】
力価の差が、異なる群における総免疫グロブリン濃度の変化によるものであるかどうかを決定するために、血清試料を総免疫グロブリン濃度に対してＥＬＩＳＡによりアッセイした。マイクロタイタープレートを上記のように抗ウシＩｇＧ（ｈ＋ｌ）抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で５ｕｇ／ｍｌにて、コートした。Ｓｅｒｕｍ−４７０のプールを連続的に希釈し、プレートに添加し、洗浄した。結合を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ウシＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【０１９５】
図２は抗Ｉｇ  ＥＬＩＳＡデータを示す。４つの群全ておよび出血前は、同等の濃度の免疫グロブリンを有した。そのため、図１で見られる群間の抗ＴＮＦ力価の差は、ヒトＴＮＦに特異的である免疫グロブリンのパーセンテージの差を表した。
【０１９６】
実施例２２．Ｓｅｒｕｍ−４７０によるヒトＴＮＦの中和
Ｓｅｒｕｍ−４７０試料（出血４由来のプール試料）のヒトＴＮＦを中和する能力を、標準ＴＮＦ細胞毒性バイオアッセイ（Ｍａｔｈｅｗｓ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ  １９８７，  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）を使用して、マウスＬ９２９線維芽細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ；Ｃａｔ番号ＣＣＬ−１）を用いて決定した。Ｌ９２９細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）から構成される培地中で連続継代により維持した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。アッセイの前日、Ｌ９２９細胞を、組織培養フラスコから、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による短時間トリプシン処理により収穫した。細胞を培地中で洗浄し、６Ｘ１０４細胞／ウェルを０．１ｍＬアリコート中で９６ウェルプレートに分注し、３７℃  ＣＯ２インキュベーターで一晩中インキュベートした。２ｕｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む培地中での、連続３倍希釈（０．０６ｍＬ／ウェル）のＳｅｒｕｍ−４７０試料を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて二つ組のウェルで調製した。
【０１９７】
組換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ；Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎ．、Ｃａｎｔｏｎ；ＭＡ；Ｃａｔ番号ＣＲＴ−１００Ｃ）（０．０６μＬ／ウェル、２ｕｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含む培地中４ｎｇ／ｍｌにて）を各ウェルに添加し、混合物を１ｈｒ、３７℃でプレインキュベートした。Ｓｅｒｕｍ−４７０／ｒｈＴＮＦ混合物（０．０１ｍＬ／ウェル）をＬ９２９細胞のコンフルエント培養物に添加し、３７℃で２０ｈｒ、インキュベートした。１ウェルあたりの最終体積は、１ｎｇ／ｍｌｒｈＴＮＦ、１ｕｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ、１：３０で始まる８つの３倍希釈のＳｅｒｕｍ−４７０試料を含む０．２ｍＬである。
【０１９８】
対照ウェルは、培地＋細胞またはｒｈＴＮＦ＋細胞を含んだ。Ｌ９２９細胞の生存率を、０．０２ｍＬのＰｒｏｍｅｇａ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を各ウェルに添加し、プレートを６時間３７℃  ＣＯ２インキュベーターでインキュベートし、各ウェルにおけるＯＤを４９０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取ることにより評価した。ＴＮＦ中和の効力を、定量（１ｎｇ／ｍｌ）のＴＮＦの存在下での段階希釈のＳｅｒｕｍ−４７０試料のＩＣ５０値として計算した。データをＴＮＦ活性の最大半量阻害に至らしめる希釈の逆数として表す。
【０１９９】
表１３に示されるように、４つ全てのアジュバントは、ヒトＴＮＦを中和することができる抗体を誘導したが、活性は出血前には見られなかった。量的差がアジュバント間で見られ、Ｑｕｉｌ  Ａ  およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２９１  ＶＧは、強い中和抗体応答を誘導するのに最も有効であった。
【表１３】
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【０２００】
実施例２３．Ｓｅｒｕｍ−４７０（Ｑｕｉｌ  Ａ）の種特異性
Ｓｅｒｕｍ−４７０のＴＮＦ種特異性をＴＮＦ  ＥＬＩＳＡを使用して決定した。９種由来の組換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）を試験した（ヒト、イヌ、カニクイザル、アカゲザル、モルモット、ブタ、マウス、ラット、ウシ）。ＴＮＦ試料をＣｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ヒト、マウス）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（イヌ、アカゲザル、モルモット、ブタ、ラット、ウシ）またはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．（カニクイザル）から購入した。マイクロタイタープレートを、異なる種由来のｒＴＮＦでコートし、実施例２に記載されるようにアッセイした。血清試料をｒｈＴＮＦおよびＱｕｉｌ  Ａアジュバントで免疫化した子ウシ由来のプールとした。ＥＬＩＳＡ力価を非線形回帰分析を用いて決定した。
【０２０１】
図３は、Ｓｅｒｕｍ−４７０（ＱｕｉｌＡ）の異なる動物種由来のＴＮＦに対する相対的力価を示す。
【０２０２】
実施例２４．抗原特異性に対するアジュバントの効果
免疫化で使用したアジュバントが誘導抗体の特異性に影響するかどうかを決定するために、子ウシの群の各々由来のプールをそれらのヒトまたはイヌＴＮＦに結合する能力に対してＥＬＩＳＡによりアッセイした。アッセイは実施例２１および２３のように実行した。
【０２０３】
表１４は、ＥＬＩＳＡによるヒトおよびイヌＴＮＦへの相対的結合を示す。４つ全ての血清プールはイヌＴＮＦに対してアッセイした場合よりもヒトＴＮＦに対してアッセイした場合により高い力価を有した。しかしながら、相対的力価はアジュバント間で変動した。Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧ、またはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ  ＢＣＬで免疫化した動物由来の血清は全て、２．２−２．５の相対的力価を有した。しかしながら、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄで免疫化した動物由来の血清は、より大きな種特異性度を示し、イヌＴＮＦよりもヒトＴＮＦに対し５．５倍の優先度を有した。
【０２０４】
これらのデータは、アジュバントを含む免疫化条件の選択は、抗体の特異性プロファイに影響することを証明する。
【表１４】
2014527957.tif 000017
【０２０５】
実施例２５．Ｓｅｒｕｍ−４７０の種特異性プロファイル：ＥＬＩＳＡ結合データおよびＬ９２９中和データの比較
ＥＬＩＳＡによるＳｅｒｕｍ−４７０（ＱｕｉｌＡ）の種特異性プロファイルを実施例２４に記載されるように決定し、図４に示されるデータは実施例２４で記載されるものと同一である。Ｌ９２９中和アッセイを用いたＳｅｒｕｍ−４７０の種特異性プロファイルを、異なる種由来のＴＮＦをアッセイで使用したことを除き、実施例２２に示されるデータと同様に決定した。各種のＴＮＦを近似ＥＤ９０（Ｌ９２９読み取りが９０％低減した濃度）でアッセイした。Ｋｉを式Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（Ａ／ＥＤ５０）］を用いて計算した。ここで、ＩＣ５０＝応答の５０％阻害を与えるＡＶＸ−４７０の希釈；Ａ＝アッセイにおいて使用したＴＮＦの濃度；およびＥＤ５０＝Ｌ９２９細胞を阻害するのに必要とされる特定の種由来のＴＮＦの最大半量濃度。
【０２０６】
また、各ＴＮＦに対する濃度に基づくＩＣ５０を計算するために、Ｓｅｒｕｍ−４７０（Ｑｕｉｌ  Ａ）に対する総免疫グロブリン濃度（８ｍｇ／ｍＬ；図１２）の１％がＴＮＦ特異的（すなわち０．０８ｍｇ／ｍＬの未希釈血清）であることを仮定した。ＴＮＦ−特異抗体の未希釈濃度（０．０８ｍｇ／ｍＬ）をその後、希釈ＩＣ５０により割り、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式に代入し、ｍｇ／ｍＬおよびｐＭの両方として表されたＫｉを得た（表１５）。ヒトＴＮＦに対する３．４７ｐＭのＫｉはＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｎｅｗｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）により報告されたヒツジ抗ヒトＴＮＦ抗体断片ＡＺＤ９７７３に対して報告された４ｐＭのＫｉに相当する。
【０２０７】
表１５および図４で示されるデータは、血清由来ＡＶＸ−４７０ポリクローナル抗体の種特異性プロファイルを証明する。
表１５
【表１５】
2014527957.tif 000018
【０２０８】
様々な種のＴＮＦに対するＫｉ値は、逆Ｋｉ比較（より小さなＫｉはより高い阻害効力を示すので）に基づき、ヒトＴＮＦに対するＫｉと比較することができる。この分析は、ヒトＴＮＦと比較した異なる種由来のＴＮＦに対するＳｅｒｕｍ−４７０の交差反応性度の定量的測度を提供する。ヒトＴＮＦと比較すると、Ｓｅｒｕｍ−４７０はアカゲザルＴＮＦ（７３％）およびカニクイザルＴＮＦ（４８％）に対し最も大きな中和交差反応性を示す。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡ（倍減少）およびＬ９２９Ｋｉ（倍増加）から得られた相対的倍差に関する概要を表１６に示す。
表１６ＥＬＩＳＡ力価およびＬ９２９Ｋｉの概要（相対的倍活性）
【表１６】
2014527957.tif 000019
【０２１０】
Ｓｅｒｕｍ−４７０を使用する効力アッセイは、ＡＶＸ−４７０の最も高い程度の結合および中和交差反応性は、おそらく、非ヒト霊長類、本研究で評価した１０種の中ではアカゲザルおよびカニクイザルと起こるであろうことを示唆する。
【０２１１】
図４で強調されるように、データはさらに、結合および中和データは、相関しないこと、両方を測定することが重要であることを証明する。
【０２１２】
実施例２６−初乳由来ＡＶＸ−４７０抗体はＳｅｒｕｍ−４７０と同じ種特異性を示す
ａ）初乳から実施例３および１４において調製したＡＶＸ−４７０の種特異性の差を、抗ＴＮＦ  ＥＬＩＳＡ（結合）において測定した。
様々な種由来のＴＮＦを商業的供給者から購入した。ヒトおよびマウスＴＮＦはＣｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓからであり、アカゲザル、イヌ、およびウシはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからであり、カニクイザルはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃからとした。ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を、様々な種由来のＴＮＦで、１μｇ／ｍＬを含む０．１ｍＬ炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６（ＳＩＧＭＡ番号Ｃ３０４１）にてコートし、洗浄し、０．０５％ＴＷＥＥＮを含むトリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ）でブロックした。段階希釈のＡＶＸ−４７０を添加し、１時間室温でインキュベートした。プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ抗ウシ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発色させ、１％Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。血清なしでインキュベートした各ＴＮＦ種に対するバックグラウンド値を、各血清含有ウェルから減算した。データを図６に示す。データによれば、初乳由来のＡＶＸ−４７０抗体の種特異性は血清に由来するＡＶＸ−４７０抗体からのものに類似し、実施例３に記載されるプロセスにしたがい免疫化させたウシの初乳または血清のいずれかに由来する抗体は同じであることを示す。
【０２１３】
ｂ）Ｌ９２９アッセイ（中和）において測定されるＡＶＸ−４７０の種特異性
実施例３および１４にしたがい調製したＡＶＸ−４７０抗体のＴＮＦを中和する能力をマウス線維芽細胞株を使用して決定した。９０％のＬ９２９細胞を死滅させた有効なＴＮＦ濃度（ＥＣ９０）を、シグモイド用量反応曲線の直線部分の上部で抗ＴＮＦ抗体中和実験を開始するために、最初に各種のＴＮＦに対して計算した。様々な種由来のＴＮＦを商業的供給者から購入した。ヒトおよびマウスＴＮＦはＣｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから、アカゲザル、イヌ、およびウシはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、カニクイザルはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃからとした。Ｌ９２９細胞を一晩中、３．５ｘ１０４細胞／ウェルで、９６ウェルプレートにて培養し、その後、２０ｈｒ、段階希釈のＴＮＦを含む１μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤと共にインキュベートした。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）との４時間培養により評価した。各種のＴＮＦに対するＥＣ９０を４９０ｎｍでの０．７２ＯＤを用いて計算した。というのも、これは、ほとんどの種のＴＮＦにより引き起こされる約９０％の細胞死と相関したからである。ＡＶＸ−４７０による中和を評価するために、Ｌ９２９細胞を上記のように播種した。段階希釈のＡＶＸ−４７０を、組換えＴＮＦ（ＥＣ９０）と１時間３７℃でプレインキュベートし、その後、Ｌ９２９細胞にアクチノマイシンＤと共に添加した。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用してＴＮＦ滴定アッセイによって評価した。ＥＣ５０はＬ９２９細胞のＴＮＦ媒介死滅の５０％阻害が得られるＡＶＸ−４７０の濃度であり、表１７に示される。
【表１７】
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上記実施例２６（ａ）で示されるように、血清由来Ｓｅｒｕｍ−４７０に対するＴＮＦ中和プロファイルは、初乳由来ＡＶＸ−４７０と同じである。データはまた、種交差反応性に対する優れた特異性を確認する。
【０２１４】
実施例２７．エピトープマッピング
ａ）概要
実施例３の免疫化スキームにしたがい、ｒｈＴＮＦで免疫化した雌ウシの初乳に由来する抗ｈＴＮＦポリクローナル抗体を含む、実施例３および１４で記載されるものと同様の方法により調製したＡＶＸ−４７０の試料を取得した。Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，  ２０：２８３−９９に記載されるＣＬＩＰＳ技術に基づき、合計２６２５の異なるペプチドを、ヒトＴＮＦの可能な高次構造不連続エピトープを再構築するように設計した。ここで、エピトープマッピングのために使用したＴＮＦの配列は、配列番号：１のアミノ酸１−１５７のアミノ酸配列を有する：
ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶ
ＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰ
ＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥ  ＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶ
ＹＦＧＩＩＡＬ    （配列番号：  １）
配列番号：１はｈＴＮＦの細胞質および膜貫通領域を含まないことに注意すべきである。アミノ酸番号はｈＴＮＦに対する全長配列では異なり得ることが理解される。
【０２１５】
試料ＡＶＸ−４７０の抗体の各合成ペプチドへの結合をＥＬＩＳＡを用いて試験した。異なる濃度の試料およびブロッキング条件の複数のバリエーションを使用した、試料ＡＶＸ−４７０のｈＴＮＦのペプチド上へのＥＬＩＳＡ分析により、ＴＮＦの５つの別個の結合領域（エピトープ）を同定した：
１ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ１５                  （配列番号：２）
２１ＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡ３５                （配列番号：３）
６１ＱＶＬＦＫ６５                                    （配列番号：４）
９１ＶＮＬＬＳ９５                                    （配列番号：５）
１３１ＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤ１４０                      （配列番号：６）
【０２１６】
エピトープのｈＴＮＦの関連する結晶構造上への突出は、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：５のエピトープが表面に露出したことを示す。配列番号：６のエピトープは表面に露出したが、ほとんど、三量体中の別のＴＮＦモノマと接触している。配列番号：４のエピトープはほとんどＴＮＦモノマ内部に埋もれている。
【０２１７】
ｂ）方法−ペプチドの合成およびスクリーニング手順
標的分子の不連続エピトープを再構築するために、構造化ペプチドのライブラリを合成した。これは、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２０：２８３−９９に記載される、足場上で化学的に結合されたペプチド技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（ＣＬＩＰＳ）を用いて実施した。ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドをシングルループ、ダブルループ、トリプルループ、シート様折り畳み、ヘリックス様折り畳みおよびそれらの組み合わせに構造化することが可能である。ＣＬＩＰＳテンプレートをシステイン残基に結合させる。ペプチド中の複数のシステインの側鎖を、１つまたは２つのＣＬＩＰＳテンプレートに結合させる。例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳテンプレート１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ）に溶解する。この溶液をペプチドアレイ上に添加する。ＣＬＩＰＳテンプレートはペプチドアレイ（Ｓｌｏｏｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：８７−９６に記載される３ｕｌウェルを有する４５５ウェルプレート）の固相結合ペプチド中に存在する２つのシステインの側鎖に結合する。ペプチドアレイを、溶液中で３０〜６０分間、完全に溶液で覆って穏やかに振盪させる。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで十分洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１パーセントのＳＤＳ／０．１パーセントのβ−メルカプトエタノールを含む破壊緩衝液中で、７０℃にて３０分間超音波処理し、続いて、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分超音波処理した。Ｔ３  ＣＬＩＰＳ保有ペプチドを、同様に、しかし、今度は３つのシステインを使用して生成させた。
【０２１８】
抗体の各合成ペプチドへの結合をＥＬＩＳＡにおいて試験した。ペプチドアレイを３０分間室温で、５％ブロッキング溶液（ブロッキング溶液は４％卵白アルブミン、５％ウマ試料、１％Ｔｗｅｅｎ８０から構成される）を用いてプレインキュベートした。ペプチドアレイを、一次抗体溶液（１〜１００ｕｇ／ｍｌを含むＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ８０、一晩中４℃にて）とインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイをウサギ−抗ヒツジ抗体とインキュベートし（１／１０００、１時間２５℃にて）、洗浄後、ブタ−抗ウサギ抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートとインキュベートした（１／１０００、１時間２５℃にて）。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアキソリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２マイクロリットル／ミリリットルの３パーセントＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、色の発色を測定した。色の発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。
【０２１９】
ｃ）結果
１．網羅的結果およびシグナル・ノイズ比
全てのペプチドの結合活性を４つの異なる濃度のＡＶＸ−４７０を用いて分析した。２５ｕｇ／ｍｌ濃度について、４つの異なるブロッキング条件を適用した。合わせてこれらの７つのスクリーニングを最適化し、標的タンパク質上の結合領域を同定し、より強いおよびより弱い結合領域を識別する。
【０２２０】
２．エピトープの同定
この分析のために作成した全てのデータセットを、直線プロットにおいて「セグメント」プロットとして、またはヒートマップとして可視化した。適用した試料の最低実験濃度では、優性な結合が、標的タンパク質のＮ末端領域のペプチド（ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ）（配列番号：１）、グラフの最も左側の約１０００の５つの高い棒により観察された。この所見は全ての実験ペプチド群にわたって一貫していた。試料の操作レベルまたは実験ブロッキング条件のいずれかにより、結合条件を変化させると、複数の独立した結合領域が同定され得ることが観察することができる。ヒートマップ可視化は、下記への結合を示した
ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ                （配列番号：２）
ＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡ                （配列番号：３）
ＱＶＬＦＫ                                    （配列番号：４）
ＶＮＬＬＳ                                    （配列番号：５）
高濃度の試料および低ブロッキング強度では、いくらかのシグナルがまた、残基（ＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤ）（配列番号：６）に対して観察される。
【０２２１】
考察：
ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ（配列番号：  ２）は優性エピトープであり、ポリクローナル抗体結合に関与するが、必ずしも活性の中和には関与しない。このエピトープの本発明のポリクローナル抗体による結合により中和が得られる可能性は低く、というのも、イヌおよびネコＴＮＦの残基３−１５の配列は、ヒトＴＮＦとほとんど同一であるからであり（イヌ：ＶＫＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ（配列番号：７）；ネコ：ＬＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ（配列番号：８））、イヌおよびネコＴＮＦの本発明のポリクローナル抗体による中和は、図４のように２０％未満である。しかしながら、Ｄｏｎｇらは最近、配列８０−９１（ＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨ（配列番号：９））に特異的な抗体は、動物モデルにおいてコラーゲン関節炎を阻害することができることを証明し、これを、新規中和エピトープとして指定した（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  （２０１０）  ５：ｅ８９２０）。
【０２２２】
ＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡ（配列番号：３）は表面に露出し、エタネルセプト（配列番号：１のアミノ酸２９−３６）、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１のＦＣ部分に連結することにより生成された二量体融合タンパク質である組換えヒト可溶性ＴＮＦ受容体アンタゴニスト（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡによりＥｎｂｒｅｌ（登録商標）として販売されている）の結合部位の１つと部分的にオーバーラップする。このエピトープは、ｈＴＮＦの本発明のポリクローナル抗体による結合および中和に関与する可能性がある。
【０２２３】
ＱＶＬＦＫ（配列番号：４）はモノマ中に埋もれ、結合または中和に関与する可能性がない。
【０２２４】
ＶＮＬＬＳ（配列番号：５）は表面に露出し、配列番号：１のアミノ酸８３−９１に等価であるエタネルセプトの結合部位の１つと部分的にオーバーラップする。しかしながら、この領域は高度に保存され（イヌ、ネコ、ブタ、マウス、およびウサギで見られる同一配列）、ｈＴＮＦの本発明のポリクローナル抗体による中和に関与する可能性がない。
【０２２５】
ＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤ（配列番号：６）は弱いバインダであると思われる。エピトープは、表面に露出し、ｈＴＮＦモノマは、ｈＴＮＦ三量体中の別のモノマと接触する。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）として米国においてＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．により販売されるキメラモノクローナル抗ｈＴＮＦ抗体）のエピトープと部分的なオーバーラップが存在する。このエピトープのいくつかの驚くべき局面が存在する。第１に、エピトープはヒトＴＮＦとウシＴＮＦの間の高度に保存された領域内にある。よって、本発明のポリクローナル抗体の源動物であるウシにおいて免疫原性であると予想されないであろう。しかしながら、ポリクローナル抗体ＡＶＸ−４７０が中和アッセイにおいてｈＴＮＦを中和するのにインフリキシマブと同じくらい強力であることを示す実施例３０のように、結合および中和においてある役割を果たす可能性がある。
【０２２６】
動物のヒトＴＮＦおよび適切なアジュバントでの免疫化により誘導されるポリクローナル抗血清はマウス（Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９２）  ２９：４７１−４７９、ウサギ  （Ｃｏｒｔｉ  ，１９９２）およびヤギ（Ｙｏｎｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９５）  ２７０：１９５０９−１９５１５）を用いて説明されている。Ｃｏｒｔｉ（１９９２）は、マウス血清に由来する抗ｈＴＮＦ抗体は配列番号：１で示されるｈＴＮＦのエピトープ１−２３、９５−１１６、１１７〜１３６および１３７−１５７を認識したことを示した。Ｃｏｒｔｉ（１９９２）はまた、ウサギに由来する抗ｈＴＮＦ抗体は配列番号：１で示されるｈＴＮＦのエピトープ１−２３、５６−７５、９５−１１６、１３７−１５７を認識したことを示した。これらのうち、エピトープ１−２３が最も免疫原性であった。Ｙｏｎｅｉ（１９９５）は、ヤギに由来する抗ｈＴＮＦ抗体は、配列番号：１で示されるｈＴＮＦのエピトープ７−１１、１７−２３、３０−３９、４２−４９、１０６−１１２、１３５−１４２を認識したことを示した。
【０２２７】
この実施例で開示されるＡＶＸ−４７０ウシ由来抗体と比較すると、雌ウシをｈＴＮＦで、ここで記載される条件下にて免疫化すると、独特な免疫優性フットプリントが得られることが明確になる。異なる技術がこれらの研究の各々で使用されて、免疫原性エピトープが規定されたが、ＡＶＸ−４７０において見られるパターンは、他の報告で見られるものとは異なることが明確になる。特に、ＡＶＸ−４７０の６１−６５および９１−９５に対する抗体応答は、他の種のいずれにおいても報告されていない。加えて、マウス血清（１０４−１１２）で報告されている免疫優性部位はまた、ウサギ血清（９５−１１６）およびヤギ血清（１０６−１１２）でも検出されたが、ＡＶＸ−４７０では見られなかった。
【０２２８】
実施例２８．競合ＥＬＩＳＡより測定されたＴＮＦに対するＡＶＸ−４７０の親和性
９６ウェル平底ＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートを、一晩中３５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＴＮＦ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む炭酸塩コーティング緩衝液でコートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔでブロックした。ＡＶＸ−４７０Ａ（実施例１９（ｂ）に記載されるように精製させた、親和性精製ＡＶＸ−４７０）およびインフリキシマブ（陽性対照として使用されるヒト化抗ＴＮＦモノクローナル抗体）を１時間室温で、様々な濃度のＴＮＦと共にインキュベートした。ＡＶＸ−４７０Ａおよびインフリキシマブの濃度は、それぞれ３５ｎｇ／ｍｌおよび２ｎｇ／ｍｌであり；これらの濃度は、それらが直接結合ＥＬＩＳＡにおける抗体用量反応曲線の直線部分にあったという理由で選択した。ＴＮＦ−抗体混合物をＴＮＦコートプレートに移し、２時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、抗体結合を、ＡＶＸ−４７０試料ではＨＲＰ標識ヒツジ抗ウシ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ）、またはインフリキシマブ試料ではＨＲＰ標識マウス抗ヒト抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて検出した。プレートをＴＭＢ基質で発色させ、１％  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。
【０２２９】
図７に示されるように、ＡＶＸ−４７０Ａおよびインフリキシマブはどちらも、２ｘ１０−１０Ｍの測定された親和性を有した。しかしながら、滴定曲線の形状は２つの薬剤に対し、非常に異なっていた。インフリキシマブ、ＴＮＦ上の単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体は非常に鋭い阻害曲線を示し、曲線上のたった１点のみ（１ｅ−１０Ｍ）が結合なしと飽和結合の間にあった。対照的に、ＡＶＸ−４７０、ＴＮＦ上の複数のエピトープに結合するポリクローナル抗体は、ずっと浅い阻害曲線を示し、曲線上の４点（１ｅ−１１〜１ｅ−８）が結合と飽和結合の間にあった。
【０２３０】
実施例２９．ＥＬＩＳＡにおける結合により評価される親和性精製されたＡＶＸ−４７０Ａの効力
実施例３、１４および１９（ｂ）で調製された親和性精製されたＡＶＸ−４７０を、ＴＮＦ−特異的ＥＬＩＳＡにおいて、実施例２６（ａ）に記載されるプロトコルを用いてアッセイした。ヒト化抗ＴＮＦモノクローナル抗体インフリキシマブを、コンパレータとして使用した。図８に示されるように、ＡＶＸ−４７０Ａの効力は、ＥＬＩＳＡにより測定されたＴＮＦ結合により規定されるインフリキシマブのものより１０倍低かった。
【０２３１】
実施例３０．Ｌ９２９アッセイにおける中和により評価された親和性精製されたＡＶＸ−４７０Ａの効力
実施例３、１４および１９（ｂ）で調製された、親和性精製されたＡＶＸ−４７０をＬ９２９アッセイにおいてアッセイし、ＴＮＦ中和を、実施例２６（ｂ）に記載されプロトコルを使用して測定した。ヒト化抗ＴＮＦモノクローナル抗体インフリキシマブを、コンパレータとして使用した。図９に示されるように、ＡＶＸ−４７０Ａの効力は、ＴＮＦ中和により規定されるように、インフリキシマブのものより１．５倍高かった。
【０２３２】
合わせて、実施例２９および３０は、ＥＬＩＳＡにより測定されるＴＮＦ結合とＬ９２９アッセイにおいて測定されるＴＮＦ中和の間には相関が欠如していることを証明する。メカニズムを暗示することにより本発明の範囲を制限することを意図しないが、ＡＶＸ−４７０は、ＴＮＦ上の複数のエピトープへ結合するポリクローナル抗体の相乗効果のために、結合データだけに基づいて予想されるものよりも強力であり得るであろう。
【０２３３】
実施例３１．アポトーシスの誘導
アポトーシスの誘導をＮｅｓｂｉｔｔ，  Ａ．  （２００７）  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  １３，  １３２３；    Ａｔｒｅｙａ，  Ｒ．  （２０１１）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ．  １４１，  ２０２６；およびＫａｙｍａｋｃａｌａｎ，  Ｚ．  （２００６）  Ｐｏｓｔｅｒ  ａｔ  ＦＯＣＩＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｅｔｉｎｇに記載されるプロトコルの適合を用いて実施した。簡単に言うと、健康なドナー由来のヒト全血をＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。全血をＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ−ヘパリン管中に収集し、これは密度遠心分離による末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の分離のためのＦＩＣＯＬＬ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度流体およびポリエステルゲルバリアを含む。ＰＢＭＣを３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度で培養した。ＩＭＤＭ培地に、１０％ウシ胎仔血清、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した。細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌで播種し、５ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡおよび１μＭイオノマイシンで４８時間刺激した。細胞を収穫し、３回完全培地で洗浄し、１ｘ１０６細胞／ｍｌで単独で、１０ｍｇ／ｍｌＡＶＸ−４７０と共に、または１００μｇ／ｍｌインフリキシマブと共に再播種した。２４時間後、細胞をアポトーシスに対して、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色することにより評価し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上での蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析に供した。
【０２３４】
図１０に示されるように、ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶの両方を高レベルに発現する細胞（右上象限）は後期アポトーシス細胞であり、高レベルのアネキシンＶを発現するが、低レベルのヨウ化プロピジウムを発現する細胞（右下象限）は初期アポトーシス細胞である。データを表１８でまとめて示す。
【表１８】
2014527957.tif 000021
よって、ＡＶＸ−４７０は膜貫通ＴＮＦを認識し、膜貫通ＴＮＦ発現細胞のアポトーシスを誘導する。抗体結合膜貫通ＴＮＦによるアポトーシスに関与する１つのメカニズムは、抗体が膜結合型ＴＮＦを介して逆シグナル伝達を誘導し、および／または膜貫通ＴＮＦの生物活性を中和し、よって抗アポトーシス性シグナル伝達が低減し、アポトーシスが増加するものである（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２４：１７７４−１７８５）。
【０２３５】
実施例３２．ＡＶＸ−４７０のヒトＩＬ−６に結合する能力の評価
ＡＶＸ−４７０のｒｈＴＮＦおよびｒｈＩＬ−６への結合をサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットで評価した。この場合、サイトカイン（ＴＮＦまたはＩＬ−６）は、特異的ＥＬＩＳＡキットを使用してプレートに結合された標準抗体により捕捉される。ヒトＴＮＦ−α  ＤｕｏＳｅｔキットおよびヒトインターロイキン−６  ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットをＲ＆Ｄシステムから購入した。ＩＬ−６キットはプリコートされ、およびプレブロックされされたキャプチャー抗ＩＬ−６を伴う。ＴＮＦキットでは、プレートを４ｕｇ／ｍＬキャプチャー抗ＴＮＦ抗体でコートし、一晩中室温でインキュベートし、１時間、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳでブロックし、洗浄した。２倍希釈のヒトＴＮＦ（１０００−１８．７５ｐｇ／ｍｌ）またはＩＬ−６（３００−３．１２ｐｇ／ｍｌ）標準を添加し、２時間室温でインキュベートし、プレートを再び洗浄した。キットからの検出抗体（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＡＶＸ−４７０（１．５ｍｇ／ｍｌ）、対照ウシＩｇ（１．５ｍｇ／ｍｌ）またはインフリキシマブ（１２．５ｎｇ／ｍｌ）を添加し、２時間室温でインキュベートし、洗浄した。ＡＶＸ−４７０の結合をＨＲＰ標識抗ウシＩｇを使用して検出し；インフリキシマブの結合をＨＲＰ標識抗ヒトＩｇ使用して検出した；キットと共に提供されたビオチン化標準の結合をＨＲＰ標識ストレプトアビジンを使用して検出した。全てのプレートをＴＭＢ基質を用いて発色させた。データを、サイトカインなしで見られるバックグラウンドを各値から減算した、４５０ｎｍでの吸光度として表す。データを表１９でまとめて示す。
【表１９】
2014527957.tif 000022
2014527957.tif 000023
【０２３６】
データは、ＡＶＸ−４７０は組換えヒトＴＮＦに結合したが、組換えヒトＩＬ−６には結合しなかったことを証明する。対照ウシ免疫グロブリンは、いずれのサイトカインにも結合しなかった。インフリキシマブはＴＮＦには結合したが、ＩＬ−６には結合しなかった。
【０２３７】
実施例３３．ＡＶＸ−４７０ウシ抗ＴＮＦ抗体の安全性試験
ＡＶＸ−４７０の安全性をインビボで評価するために、ラットおよびカニクイザルにおける、ＧＬＰ毒性研究をＣａｌｖｅｒｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｓｃｏｔｔ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＰＡ）で実施した。精製抗体薬物物質を、口腔経管栄養により１日２回、２８日間、雄および雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、２５０、１０００、および４０００ｍｇ／ｋｇ／日（１群あたり１性別あたり１０匹の動物）の用量で投与した。予定外の死は、群のいずれにおいても起こらなかった。異常な臨床観察は対照生理食塩水群およびＡＶＸ−４７０−低および中および高用量群の動物のいずれにおいても注目されなかった。体重に対する被験物質関連効果はいずれの用量レベルでも注目されなかった。ＡＶＸ−４７０は試験した用量のいずれでも有意の臨床病理効果を有さなかった。用量群のいずれにおいても臨床化学または血液学パラメータの顕著な変化はなかった。リンパおよび胃腸器官を、第２９日に安楽死させた雄および雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、対照／生理食塩水およびＡＶＸ−４７０−高用量群から顕微鏡的に検査した。この研究の条件下、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて試験した最高用量レベル（４０００ｍｇ／ｋｇ／日）では、リンパおよび胃腸器官に対するＡＶＸ−４７０に関連する顕微鏡的毒性効果はなかった。
【０２３８】
ＡＶＸ−４７０を口腔経管栄養により、１日２回２８日間、雄および雌カニクイザル（１群あたり１性別あたり３匹）に、１２５、５００、および２０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与した。予定外の死は、群のいずれにおいても起こらなかった。顕著な臨床観察は対照生理食塩水群およびＡＶＸ−４７０−低および中および高用量群の動物のいずれにおいても注目されなかった。体重に対する被験物質関連効果はいずれの用量レベルでも注目されなかった。ＡＶＸ−４７０は試験した用量のいずれでも有意の臨床病理効果を有さなかった。用量群のいずれにおいても臨床化学または血液学パラメータの顕著な変化はなかった。リンパおよび胃腸器官を、第２９日に安楽死させた雄および雌カニクイザルから顕微鏡的に検査した。この研究の条件下、カニクイザルにおいて試験した最高用量レベル（２０００ｍｇ／ｋｇ／日）では、リンパおよび胃腸器官に対するＡＶＸ−４７０に関連する顕微鏡的毒性効果はなかった。
【０２３９】
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される全ての米国特許ならびに公開または未公開米国特許出願は参照により組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、本明細書で参照により組み込まれる。本明細書で引用される全ての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は本明細書で参照により組み込まれる。
【０２４０】
この発明について、その好ましい実施形態を参照して図示し、記載してきたが、当業者であれば、形態および詳細における様々な変更は、添付の特許請求の範囲により含まれる本発明の範囲から逸脱せずに、本発明において可能であることは理解されるであろう。本明細書で記載される実施形態は、相互排他的ではなく、様々な実施形態からの特徴は、本発明にしたがい全体または一部において組み合わせられ得ることもまた理解されるべきである。
配列表
＜１１０＞  Ｆｏｘ、Ｂａｒｂａｒａ  Ｓ
Ｂｏｓｔｗｉｃｋ、Ｅｉｌｅｅｎ  Ｆ
Ｔｒａｃｅｙ、Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ
Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ、Ｌｉｓａ  Ｄ
Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ
＜１２０＞ヒトＴＮＦに特異的なウシポリクローナル抗体
＜１３０＞４０４４．３０１１  ＵＳ１
＜１５０＞  ＵＳ  １３／４０２，５２７              
＜１５１＞  ２０１２−０２−２２    
＜１５０＞  ＵＳ  ６１／５１３，８７２              
＜１５１＞  ２０１１−０８−０１    
＜１６０＞  ９
＜１７０＞Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０のためのＦａｓｔＳＥＱ
＜２１０＞  １
＜２１１＞  １５７
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞ヒト
＜４００＞  １
Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ
１            ５            １０            １５            
Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ
２０            ２５            ３０                    
Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ
３５            ４０            ４５                            
Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ
５０            ５５            ６０                                    
Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ
６５            ７０            ７５            ８０    
Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ
８５            ９０            ９５            
Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ
１００            １０５            １１０                  
Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ
１１５            １２０            １２５                          
Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
１３０            １３５            １４０                                  
Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｅｕ
１４５            １５０            １５５                  
＜２１０＞  ２
＜２１１＞  １５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  ヒト
＜４００＞  ２
Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ
１            ５            １０            １５    
＜２１０＞  ３
＜２１１＞  １５
＜２１２＞ＰＲＴ
＜２１３＞ヒト
＜４００＞  ３
Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ
１            ５            １０            １５    
＜２１０＞  ４
＜２１１＞  ５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞ヒト
＜４００＞  ４
Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ
１            ５    
＜２１０＞  ５
＜２１１＞  ５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  ヒト
＜４００＞  ５
Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ
１            ５    
＜２１０＞  ６
＜２１１＞  １０
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞ヒト
＜４００＞  ６
Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ
１            ５            １０    
＜２１０＞  ７
＜２１１＞  １５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞イヌ
＜４００＞  ７
Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ
１            ５            １０            １５    
＜２１０＞  ８
＜２１１＞  １５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞ネコ
＜４００＞  ８
Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ
１            ５            １０            １５    
＜２１０＞  ９
＜２１１＞  １２
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞ヒト
＜４００＞  ９
Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ
１            ５            １０                    
【図１】
2014527957.tif 000024
【図２】
2014527957.tif 000025
【図３】
2014527957.tif 000026
【図４】
2014527957.tif 000027
【図５】
2014527957.tif 000028
【図６】
2014527957.tif 000029
【図７】
2014527957.tif 000030
【図８】
2014527957.tif 000031
【図９】
2014527957.tif 000032
【図１０】
2014527957.tif 000033
【配列表】
2014527957000001.xml
【国際調査報告】
2014527957.tif 000036
2014527957.tif 000037
2014527957.tif 000038
2014527957.tif 000039
2014527957.tif 000040