(57)【要約】  発明者らは、現在、自己採取によって得られた細胞物質内における、浸潤性子宮頸癌の前癌子宮頸部病変などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発性高度前癌病変を特定するために、マーカーであるＭＡＬおよびｈｓａ−ｍｉＲ１２４、特にプロモータの高メチル化における変化の検出に基づく（分子）診断アッセイを開発中である。特に、本発明は、ＨＰＶ誘発性高度前癌病変のマーカーとして、ＭＡＬ遺伝子（そのプロモータを含む）およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４遺伝子の使用に関し、個々の患者について、早期検出とより良い治療の選択肢とをもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ誘発性高度前癌病変および／またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の発生を、検出または予測する方法であって、
Ｔ−リンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）のメチル化における変化の存在について自己採取頸膣試料を分析することを含み、
前記変化は、浸潤可能性を有するＨＰＶ誘発性前駆病変、および／またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の、存在または将来の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ誘発性高度前癌病変、またはＨＰＶ誘発性浸潤癌は、高度前癌子宮頸部病変、または浸潤性子宮頸部癌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＰＶ誘発性浸潤癌は、高リスクＨＰＶ誘発性浸潤癌であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記変化は、正常対照試料と比較した、メチル化の増加であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化は、ＭＡＬポリペプチドとその調節領域とｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列とをコードする核酸について分析されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分析は、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬は、前記核酸に結合する、核酸プローブまたはプライマーであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸プローブ、またはプライマーは、検出可能な標識を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸プローブは、表１に示される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ誘発性高度前癌病変、またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の検出のための分子診断マーカーの使用であって、
前記マーカーは、ＭＡＬ遺伝子もしくはプロモータのメチル化、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列のメチル化を示すことを特徴とする使用。
【請求項１２】
被験者の試験細胞における、ＨＰＶ誘発性高度前癌病変またはＨＰＶ誘発性浸潤癌を検出する方法において使用するための部品キットであって、
ＭＡＬ遺伝子またはプロモータのメチル化を検出するための手段であって、ＭＡＬに特異的な、または図１のＭＡＬヌクレオチド配列に特異的な、プローブ、プライマーおよび／またはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを含む手段と、
ｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化を検出するための手段であって、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４に特異的な、プローブ、プライマー、および／またはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを含む手段と、
任意に、ＨＰＶ感染を検出するための手段であって、ＨＰＶに特異的な、プローブおよびプライマーを含む手段と、
任意に、自己採取頸膣試料を採取するための手段であって、好ましくはＶｉｂａＢｒｕｓｈ（Rovers Medical Devices、オッス、オランダ）およびＰａｎｔａｒｈｅｉ  ｓａｍｐｌｅｒ（Pantarhei Devices、ザイスト、オランダ）の群から選択される手段と、
を含むことを特徴とする部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防および医療診断の分野に関し、浸潤性子宮頸癌および前癌子宮頸部病変などの、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発性浸潤癌と、それの、高度の前癌病変との分子診断検査に関する。特に、本発明は、浸潤能を有するｈｒＨＰＶ誘発性前癌病変およびｈｒＨＰＶ誘発性浸潤癌についての検査における（ｈｒＨＰＶ陽性の）自己採取披検物の、ＭＡＬおよびｈｓａ−ｍｉＲ１２４プロモータのメチル化の組み合わせ分析の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、女性にとって世界で２番目に一般的な癌であり、年間約２５０，０００人の癌による死亡の原因である。
【０００３】
子宮頸部扁平上皮癌の発達は、前癌病変、いわゆる一連の子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を特徴とする。前記ＣＩＮの進行は、１から３に段階分けされ、それぞれ、軽度の異形成（ＣＩＮ１）、中等度の異形成（ＣＩＮ２）、および高悪性の異形成／上皮内癌（ＣＩＮ３）と表わされる。ＣＩＮ１は、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）とも表わされ、ＣＩＮ２およびＣＩＮ３は、共に高悪性扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）と表わされる。子宮頸部腺癌については、上皮内腺癌（ＡＣＩＳ）が確立された前癌病変である。原則としてこれらの前癌病変は可逆的であるが、より重度の病変では、自然退縮の可能性が低くなる。前癌状態は、擦過細胞診によって検出することができ、必要に応じてわずかな副作用で比較的容易に治療できるので、子宮頸癌は、予防可能な病気であると考えられる。子宮頸部スクリーニングは、高悪性前癌（すなわち、ＣＩＮ２／３、および上皮内腺癌）、ならびに治療可能な癌病変を早期に診断することによって浸潤性子宮頸癌の死亡率を減少させることを目的とする。一般的な医療行為は、子宮頸癌の発達を予防するために、形態的に確認されたＣＩＮ２、ＣＩＮ３および上皮腺癌を有する全ての女性の処置を含む。
【０００４】
過去１０年間で、子宮頸部発癌は、高リスクヒトパピローマウイルス感染（ｈｒＨＰＶ）によって開始することが立証された。ｐ５３およびＲｂ腫瘍抑制経路を妨げるウイルス性癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の発現は、それぞれ、発癌、および悪性形質の維持の両方に必須であることが示された。したがって、ｈｒＨＰＶ検査は、魅力的な一次スクリーニングツールとして登場した。しかしながら、ｈｒＨＰＶ感染細胞が浸潤癌細胞に進行するためには、発癌の多段階プロセスに合致する宿主細胞ゲノムのさらなる変化が必要である。高リスクＨＰＶに感染した女性のごく少数は、高悪性前癌子宮頸部病変（ＣＩＮ２／３）を発症し、もし未処置のままにすれば浸潤癌を発症するであろう。前癌子宮頸部病変を有するほとんどの女性では、病変は自然退縮する。オランダにおけるスクリーニングに基づく集団に参加する女性の約５〜６％がｈｒＨＰＶ検査に陽性である（Bulkmans et al., Int J Cancer 2004, 110:94-101）。しかしながら、彼女らの最大２０％（参加女性の１％）のみが≧ＣＩＮ２／３となる。したがって、≧ＣＩＮ２／３、および≧上皮腺癌のリスクのｈｒＨＰＶ陽性である女性の層別化を可能にする子宮頸部スメアにマーカーを適用することができなければ、ｈｒＨＰＶ検査による一次スクリーニングは、相当な数の余分なフォローアップ手続きと、女性の間に不要な不安とを伴うであろう。
【０００５】
大規模な集団ベースのスクリーニングプログラムが、医師採取スメアに基づいて様々な国で設立された。しかしながら、召集された全ての女性が、子宮頸部スメアを採取するわけではない。多くの非提示は、看護婦または医師によって子宮頸部スメアを取得してもらうことへの女性の嫌気によってもたらされる。いくつかの研究は、このことが、これらの女性に自宅で膣（頸部）材料を自己採取するための器具を薦めることによって克服することができることを示した。このように、自己採取は、無回答者の現行スクリーニングプログラムへの参加を増加させる（Goek et al.2010 Brit. Medical J.;340:c1040）。自己採取は、安価であり、子宮頸部スクリーニングの広く受け入れられている方法である。さらに、ＨＰＶ分析は、ＣＩＮ２＋／３＋の検出について医師採取試料と同様に自己採取試料においても良好であるので、自己採取は、将来の初期子宮頸癌スクリーニングの代替方法になるかもしれない。したがって、今後数年で膣（頸部）材料の自己採取は、子宮頸癌スクリーニングにおける重要なツールになるであろう。
【０００６】
主要な課題は、臨床的に意味のある病変を有するｈｒＨＰＶ陽性の女性の割合を減少させることである。細胞診は、従来の掻爬検体においてｈｒＨＰＶ陽性の女性のための２次（いわゆるトリアージ）検査として使用することができるのに対し、細胞診は、自宅で取得することができる自己採取頸膣被検物の選択肢ではない。なぜなら、これらは、子宮頸部の細胞学的状態を表すものではないからである（Brink et al., 2006, J. Clin. Microbiol. 44:2518-2523）。したがって、ｈｒＨＰＶ陽性の女性を≧ＣＩＮ２／３および≧上皮腺癌の有無で階層化するための、補助的または代替的トリアージツールが必要とされている。
【０００７】
Ｔリンパ球成熟関連タンパク質、Ｔ細胞分化タンパク質としても知られる（さらに、ＭＡＬと表わされる。Genbank Accession NM_002371.2）をコードする遺伝子、および細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）をコードする遺伝子のプロモータのメチル化のための組み合わせ検査は、細胞診と同様に良好に行われる医師採取子宮頸部掻爬検体に適用される場合に、魅力的な代替的分子トリアージツールであると考えられることが以前に（ＷＯ２００９／１２８７１４）示された（Hesselink et al. 2011 Clin Cancer Res. 17(8):2459-65）。しかしながら、このパネル（panel）は、自己採取頸膣被検物にはあまりうまく実行されない。主な理由は、ＣＩＮ２／３を有する女性の自己採取試料におけるＣＡＤＭ１メチル化のシグナルは、医師採取子宮頸部試料の場合よりも頻繁に分析閾値を下回ったからである。
【０００８】
したがって、自己採取試料において行うことができ、子宮頸部病変を発症する危険性の存在について一層信頼性のある指標をもたらすことができる検査が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
驚くべきことに、Ｔ細胞分化タンパク質としても知られるＴリンパ球成熟関連タンパク質（さらに、ＭＡＬと表わされる。Genbank Accession NM_002371.2）、ならびに３つの異なるゲノム領域に位置する３つの別の未成熟マイクロＲＮＡ配列、すなわち染色体８ｐ２３．１におけるＨＳＡ−ＭＩＲ１２４−１（受入番号MI0000443）と、染色体８ｑ１２．３におけるＨＳＡ−ＭＩＲ１２４−２（受入番号MI0000444）と、染色体２０ｑ１２．３３におけるＨＳＡ−ＭＩＲ１２４−３（受入番号MI0000445）とによってコードされるマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ１２４（受入番号MIMAT0000422）であって、両方とも子宮頸癌細胞における腫瘍抑制特性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモータのメチル化についての組み合わせ検査が、ｈｒＨＰＶについて検査陽性の自己採取被検物に適用される場合、浸潤性子宮頸癌と、その高度前癌病変とを診断するために有益な検査をもたらすことが見出された（ｍｉＲＮＡデータベースであるmiRBase（www.mirbase.org）, Faculty of Life Science, University of Manchesterにおいて示された受入番号）。したがって、本発明は、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）および／またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化の変化の存在について頸膣自己採取試料を検査することを含み、ＨＰＶ誘発性高度前癌病変、および／またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の存在を、検出または予測する方法に関し、前記変化は、浸潤能を有するＨＰＶ誘発性前駆病変および／またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の、存在または将来の存在を示す。好ましくは、前記方法において、前記ＨＰＶ誘発性高度前癌病変、またはＨＰＶ誘発性浸潤癌は、高度前癌子宮頸部病変、または浸潤性子宮頸部癌である。また、前記方法において、好ましくは、ＨＰＶ誘発性浸潤癌は高リスクＨＰＶ誘発性浸潤癌である。前記方法における別の実施形態において、前記変化は、通常のコントロール試料と比較したメチル化の増加である。好ましくは、本発明の方法において、メチル化は、ＭＡＬポリペプチドとその調節領域とｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列とをコードする核酸について検査され、前記核酸は、好ましくはＤＮＡである。さらに好ましい実施形態において、検査は、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われ、好ましくは、前記試薬は、前記核酸に結合する核酸プローブまたはプライマーであり、好ましくは前記核酸プローブまたはプライマーは、検出可能な標識を有する。表１に示される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸プローブが、特に好ましい。
【００１０】
また、本発明の一部は、ＨＰＶ誘発性高度前癌病変またはＨＰＶ誘発性浸潤癌を検出するための分子診断マーカーの使用であり、前記マーカーは、ＭＡＬ遺伝子もしくはプロモータのメチル化、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列のメチル化を示す。さらに、本発明に含まれるものは、被験者の試験細胞における、ＨＰＶ誘発性高度前癌病変またはＨＰＶ誘発性浸潤癌を検出する方法において使用するための部品キットであって、ＭＡＬ遺伝子またはプロモータのメチル化を検出するための手段であって、ＭＡＬに特異的な、または図１のＭＡＬヌクレオチド配列に特異的な、プローブ、プライマーおよび／またはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを含む手段と、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化を検出するための手段であって、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４に特異的な、プローブ、プライマー、および／またはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを含む手段と、任意に、ＨＰＶ感染を検出するための手段であって、ＨＰＶに特異的な、プローブおよびプライマーを含む手段と、任意に、自己採取頸膣試料を採取するための手段であって、好ましくはＶｉｂａＢｒｕｓｈ（Rovers Medical Devices、オッス、オランダ）およびＰａｎｔａｒｈｅｉ  ｓａｍｐｌｅｒ（Pantarhei Devices、ザイスト、オランダ）の群から選択される手段とを含む部品キットである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＭＡＬ５’調節領域、コード配列、最初のイントロン配列のＣｐＧリッチ部分、および転写された３’非コード配列を示す。
【図２】５’調節領域と、３つのｍｉＲ１２４ゲノム領域のコード配列、図２Ａ：ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１、図２Ｂ：ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２、図２Ｃ：ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３とを示す。イタリック／太字の配列は、未成熟マイクロＲＮＡのコード配列である。下線の配列は、成熟マイクロＲＮＡ配列を含む。ＣｐＧリッチ領域は、灰色で印を付されている。野生型配列（上段）だけでなく、重亜硫酸塩処理後の修飾配列（下段）も示される。＋＋は、ＣｐＧ部位を表し、::::は、「Ｃ」が「Ｔ」に変換された非ＣｐＧを示す。
【図３】ＣＩＮ３＋を有する女性（黒四角を有する点線）、および最大でＣＩＮ２を有する女性（十字を有する点線）の自己採取試料と、ＣＩＮ３＋を有する女性（黒四角を有する実線）、および最大ＣＩＮ２を有する女性（十字を有する実線）の医師採取子宮頸部掻爬検体とにおけるＭＡＬ（ａ）およびＣＡＤＭ１（ｂ）メチル化分析の十分位数（deciles）のＣｔ比の値の比較を示す。この図は、自己採取被検物におけるＣＩＮ３＋を有する女性のＭＡＬシグナルは、医師採取スメアにおけるものに等しいが、ＣＩＮ３＋を有する女性の自己採取被検物におけるＣＡＤＭ１のものは、医師採取スメアにおけるものと比較して低く、大部分が子宮頸部疾患のない女性で得られたレベルと同じ範囲にある。
【図４】それぞれＣＩＮ３＋を有する女性（ＣＡＤＭ１：十字、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２：菱形）、および≦ＣＩＮ１を有する女性（ＣＡＤＭ１：三角；ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２：四角）の自己採取被検物における、ＣＡＤＭ１（点線）およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２（実線）のメチル化の十分位数のＣｔ比の値の比較を示す。この図は、ＣＩＮ３＋を有する女性の自己採取被検物におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のシグナルが、ＣＡＤＭ１についてのものよりもはるかに高いことを示す。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のメチル化は、ＣＡＤＭ１と比較して、ＣＩＮ３＋を有する女性の自己採取被検物と、≦ＣＩＮ１を有する女性の自己採取被検物との間の良好な識別を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
子宮頸癌は、ほぼヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染にのみ関連する。ＤＮＡ配列の変化によって識別されるように、ヒトパピローマウイルスは、ウイルスの１００種類以上の群を構成する。様々なＨＰＶは、皮膚および粘膜の種々の疾患の原因になる。ＨＰＶは、感染細胞における悪性の変化を誘導する能力に基づいて、低リスク型と高リスク型とに一般的に分類される。たとえば、１、２、４、６、１１、１３および３２などの低リスク型ＨＰＶは、主に良性病変または尋常性疣贅に関連付けられるが、たとえば１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８のような高リスク型ＨＰＶは、主に前癌および悪性上皮病変に関連付けられる。これらの高リスク型ＨＰＶは、たとえばＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１などの低リスク型によってもたらされる疣贅と比較して、通常平坦でほぼ見ることができない増殖をもたらす。
【００１３】
用語「ＨＰＶ誘発性浸潤癌」は、高リスクＨＰＶによって誘発され、周囲の組織に侵入する癌を表す。これは、全てのＨＰＶ誘発性癌ヒストタイプ（histotype）、すなわち、子宮頸部における、扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌および神経内分泌癌が含まれる。
【００１４】
用語「浸潤性子宮頸癌」は、周囲の組織に浸潤する子宮頸癌を表す。これは、全ての癌ヒストタイプ、すなわち、子宮頸部における、扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌および神経内分泌癌を含む。
【００１５】
用語「前癌病変」および「前駆病変」は、癌腫に進行する大幅に増加した可能性を有する、癌への多段階細胞進化における段階を表す。古典形態学において、病理学者は、これらの病変のどれが進行するか、または退行するか個々の患者において予測することはできない。本特許出願は、浸潤癌またはその高悪性前駆病変を予測することができる方法に言及する。
【００１６】
用語「高悪性前癌子宮頸部病変」は、子宮頸癌に進行する大幅に増加した可能性を有する、子宮頸癌への多段階細胞進化段階を表す。高悪性前癌頸部病変は、ＣＩＮ２／３以上（つまり≧ＣＩＮ２）である。
【００１７】
用語「特異的にハイブリダイズすることができる」は、相補的な核酸配列に特異的に塩基対形成することができ、それに結合し、核酸二重鎖を形成することができる核酸配列を表す。
【００１８】
「相補」または「相補配列」は、ワトソン−クリック塩基対法則に従って別のヌクレオチド配列に水素結合二重鎖を形成するヌクレオチドの配列である。たとえば、5'-AAGGCT-3'の相補的な塩基配列は、3'-TTCCGA-5'である。
【００１９】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、たとえば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などのハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件を表す。これらの条件は、その標的核酸配列に対するプライマーまたはプローブの、特異的結合を最大にし、非特異的結合を最小にするように経験的に最適化される。使用される用語は、プローブまたはプライマーが、他の配列よりも（たとえば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超えて）検出可能に高い程度までその標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況においては異なるであろう。配列が長くなれば、特異的にハイブリダイズする温度はより高くなる。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブまたはプライマーにハイブリダイズする（所定のイオン強度およびｐＨにおける）温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０ＭのＮａイオンよりも低く、典型的にはｐＨ７．０〜８．３において約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、前記温度が短いプローブまたはプライマー（たとえば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（たとえば、５０ヌクレオチドよりも長い）について少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。例示的な低ストリンジェント条件、または「減少したストリンジェンシー条件」は、３７℃の、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの緩衝溶液によるハイブリダイゼーションと、４０℃における２×ＳＳＣ中での洗浄とを含む。ハイブリダイゼーション法は、当該技術分野で周知であり、たとえば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994に記載されている。
【００２０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、リン結合（たとえば、ホスホジエステル、アルキル、およびアリール−ホスフェート、ホスホロチオエートなど）、または非リン結合（たとえば、ペプチド、スルファミン酸など）によって結合したヌクレオチドモノマーの短い配列（通常、６〜１００ヌクレオチド）を表す。オリゴヌクレオチドは、修飾塩基（たとえば、５−メチルシトシン）、および修飾糖基（たとえば、２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）を有する修飾ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、天然に生じた、または合成された、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに環状、分枝状または直鎖状の一本鎖ＲＮＡであってもよく、安定な二次構造を形成することができるドメイン（たとえば、ステム−ループ構造、およびループ−ステム−ループ構造など）を任意に含む。
【００２１】
本明細書において使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニーリングすることができ、ＤＮＡポリメラーゼを付着させ、それによって核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤との存在下に置かれたとき、適切な温度およびｐＨにおいてＤＮＡ合成の開始点として機能するオリゴヌクレオチドを表す。（増幅）プライマーは、増幅における最大効率のため、好ましくは一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を刺激するために十分に長くなければならない。プライマーの的確な長さは、温度、およびプライマー供給源を含む多くの要因に依存するであろう。本明細書で使用される「双方向性プライマー対」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のようなＤＮＡ増幅の技術分野で一般的に使用されるような１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーとを表す。
【００２２】
用語「プローブ」は、標的核酸配列分析物、またはそのｃＤＮＡ誘導体における相補配列を認識し、水素結合二本鎖を形成する一本鎖オリゴヌクレオチド配列を表す。
【００２３】
「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡまたはＭＩＲ）は、平均してわずか２２ヌクレオチドの長さの短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり、ほぼ全ての真核細胞において見出される。ＭＩＲは、それらの標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへの不完全な塩基対形成によって遺伝子活性を調節し、ｍＲＮＡの分解、または翻訳の抑制を導く。１つのＭＩＲは、２００もの異なる遺伝子標的の発現を調節することができ、このことは、ヒトｍＲＮＡの約３分の１の発現がＭＩＲによって制御されているかもしれないことを意味する。したがって、ＭＩＲの発現の変化は、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の発現を、増加または減少させることによって、悪性形質転換の一因になることがある（Calin and Croce, Nat Rev Cancer 2006, 6, 857-866によって調査された）。ＭＩＲの限られた量の発現プロファイリングが腫瘍集団の非常に正確な分類指標をもたらし、ゲノム全体でのｍＲＮＡ発現プロファイリングに基づく分類指標よりも良い結果が得られるという事実は、一般的な発癌におけるｍＲＮＡの重要性を強調する（Lu et al., Nature 2005;435:834-8）。興味深いことに、腫瘍におけるｍｉＲＮＡの発現レベルは、正常組織と比較して全体的に低い。腫瘍抑制遺伝子をコードするタンパク質についても同様に、ｍｉＲＮＡのサイレンシングは、調節配列のＤＮＡメチル化などのエピジェネティックな変化をもたらすであろう。
【００２４】
ほとんどのマイクロＲＮＡ遺伝子は、遺伝子間領域、または遺伝子へのアンチセンス方向で見出され、独自のｍｉＲＮＡ遺伝子プロモータおよび調節ユニットを含む。
【００２５】
ＭＡＬ（Ｔリンパ球成熟関連タンパク質）遺伝子（GenBank Accession NM_002371.2）は、当初、Ｔ細胞発生の間に差次的に発現される遺伝子として同定された（Alonso and Weisman 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 1997-2001）。ＭＡＬは、１７ｋＤａの内在性膜タンパク質をコードし、脂質に富む膜ミクロドメインまたはラフトの成分である（Kim et al. 1995, J.Neurosci.Res.,42, 413-422）。ＭＡＬは、極性上皮細胞における、膜および分泌タンパク質の極性輸送の構成要素として重要な役割を有する（Cheong et al., 1999, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 6241-6248）。
【００２６】
低下したＭＡＬ発現は、食道癌、胃癌および結腸直腸癌などの多数のヒトの癌において検出された（Mimori et al., 2003, Oncogene, 22, 3463-3471; Mimori 2007 et al., Ann. Surg. Oncol.,14, 1670-1677）。
【００２７】
結腸直腸癌におけるＭＡＬの下方制御は、プロモータの高メチル化に関連する（Mori et al, 2006, Gastroenterology, 131,797-808;  Lind et al., 2007 Gastroenterology, 132, 1631-1632）。
【００２８】
腫瘍抑制遺伝子として作用するＭＡＬの機能的役割は、食道癌細胞におけるＭＡＬ遺伝子の再発現によって実証され、運動性、浸潤および腫瘍形成の抑制をもたらすが、アポトーシスを促進する（Mimori et al., 2003, Oncogene, 22, 3463-3471）。
【００２９】
ＭＡＬプロモータのメチル化の変化が、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腺癌および神経内分泌癌のヒストタイプと、それらの高度前駆病変との両方の子宮頸癌において頻繁に観察されることがＷＯ２００９／１２８７１４において証明された。in vitroにおける研究は、子宮頸癌の発達におけるＭＡＬ不活性化の機能的関与を、ＳｉＨａ子宮頸癌細胞株を含むＨＰＶ１６の細胞におけるＭＡＬ過剰発現が増殖を減少させ、足場非依存性増殖を抑制するとして明らかにした。最も興味深いことに、本発明者らは、ＭＡＬプロモータの高メチル化が、自己採取によって集められた子宮頸部膣被検物において検出することができることを示し、高悪性ＣＩＮ病変または浸潤性子宮頸癌の存在に関連することを見出した。
【００３０】
興味深いことに、本発明の実験の部に示されるように、ＭＡＬのメチル化分析をマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ１２４−２プロモータ領域のメチル化分析に組み合わせることによって≧ＣＩＮ２について高い感度がもたらされる。これらの結果は、自己採取された子宮頸部膣被検物におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１２４プロモータのメチル化に組み合わせたＭＡＬプロモータのメチル化の検出が、高度ＣＩＮ疾患または子宮頸癌を予測することができることを示す。
【００３１】
成熟ｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列（受入番号MIMAT0000422）は、３つの異なるゲノム領域に位置する３つの未成熟マイクロＲＮＡ配列、すなわち、染色体８ｐ２３．１におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１（受入番号MI0000443）、染色体８ｑ１２．３におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２（受入番号MI0000444）、および染色体２０ｑ１２．３３におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３（受入番号MI0000445）によってコードされる（受入番号は、ｍｉＲＮＡデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ(www.mirbase.org), Faculty of Life Sciences, University of Manchesterに示される）。成熟配列は正確に同一であるが、未成熟配列および調節配列は異なる（図２参照）。本願において用語ｈｓａ−ｍｉＲ１２４が使用される場合、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４の任意の形態が含まれる。
【００３２】
ｈｓａ−ｍｉＲ１２４発現のエピジェネティックな下方制御は、胃癌、結腸癌、乳癌および肺癌、ならびに急性リンパ芽球性白血病などのいくつかのヒトの癌において既に述べられている（Lujambio et al., Cancer Res 2007, 67, 1424-1429; Andro IntJ Cancer 2009; 124: 2367-2374, Agirre et al. Cancer Res 2009;69:4443-4453）。Lujambioら、およびAgirreらによる以前の研究は、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４の推定される腫瘍抑制機能を既に指摘していた。両方の試験において、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４発現のエピジェネティックなサイレンシングは、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４の予測ターゲットの１つであるサイクリンＤキナーゼ６（ＣＤＫ６）の上方制御を媒介することが示された。ＣＤＫ６は、細胞周期の進行および分化に関与することが知られており、細胞増殖を促進するために、周知の腫瘍抑制因子である網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）を不活性化することができる。
【００３３】
したがって、本発明は、ＨＰＶ誘発性高度前癌病変および／またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の発生を、検出または予測する方法であって、Ｔ−リンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）のメチル化における変化の存在について自己採取頸膣試料を分析することを含み、前記変化は、浸潤可能性を有するＨＰＶ誘発性前駆病変、および／またはＨＰＶ誘発性浸潤癌の、存在または将来の存在を示す方法を提供する。前記高悪性前駆病変および／または浸潤性癌の現在または将来の存在は、ＭＡＬ遺伝子、および特にそのプロモータ領域と、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４プロモータ領域との増加したメチル化（高メチル化とも称される）によって示される。
【００３４】
被験体の自己試料は、子宮頸部細胞などの粘膜細胞を含み、ＨＰＶに関連する前駆病変または癌が検出される。
【００３５】
本発明の方法は、高リスクＨＰＶによって誘導される高悪性前癌病変および浸潤性癌の検出に特に好適である。好ましくは、本発明のアッセイ方法は、既にｈｒＨＰＶ陽性として分類された試料について行われる。
【００３６】
図1は、ＭＡＬ遺伝子の、ＣｐＧリッチプロモータ領域およびＣｐＧリッチ第１イントロン配列、ならびにコード配列、および転写された３’非コード配列を示す。特にプロモータ領域におけるＣｐＧリッチ配列のメチル化は、転写を急激に減少させるか、または転写の完全な阻害さえももたらすであろう。同様の現象は、配列が図２に示されるｈｓａ−ｍｉＲ１２４に影響を与える。ここでもＣｐＧリッチ領域が示され、これらのメチル化がｈｓａ−ｍｉＲ１２４分子の、急激に減少した転写、または転写の完全な阻害さえももたらすであろう。アッセイは、好ましくは試料の核酸含有物について行われ、試薬は典型的には核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）プローブまたは（ＰＣＲ）プライマーである。このようなプローブまたはプライマーを用いることによって、ｍＲＮＡのような遺伝子発現産物を検出することができる。また、試薬は、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくは試料核酸上のメチル基の存在の検出のためのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであってもよく、試料核酸は、好ましくはＤＮＡである。
【００３７】
試料核酸は、試薬に接触する前に、in situで直接検出されてもよく、または当業者に公知の一般的な方法によって他の細胞成分から単離されてもよい（たとえば、「Current Protocols in Molecular Biology」, Ausubel et al. 1995. 4th edition, John Wiley and Sons； 「A Laboratoty Guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis」, Krieg (ed.), 1996, Wiley-Liss； 「Molecular Cloning: A laboratory manual」, J. Sambrook, E.F. Fritsch. 1989. 3 Vols, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００３８】
ＭＡＬおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４いずれかのメチル化状態は、高悪性前駆子宮頸部病変または子宮頸部浸潤癌の存在または素因の予測になると考えられる。高メチル化は、主に遺伝子の５’調節領域に位置し、通常はメチル化されていない「ＣｐＧ島」と称されるシトシンリッチな領域で特に生じる。用語「高メチル化」は、ＭＡＬ遺伝子配列（たとえば、ＭＡＬプロモータ、第１エキソン、および第１イントロン配列など、図１を参照）、またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列（図２）において通常メチル化されない位置のシトシンの任意のメチル化を含む。高メチル化は、たとえば、ＭＡＬおよびｈｓａ−ｍｉＲ１２４ポリヌクレオチド（遺伝子）の制限エンドヌクレアーゼ処理と、サザンブロット分析とによって検出することができる。したがって、本発明の方法の一実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ分析は、ＭＡＬ遺伝子またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列の高メチル化を検出することが好ましい。任意の制限エンドヌクレアーゼであって、その認識部位の一部としてＣＧを含み、Ｃがメチル化されたときに抑制される制限エンドヌクレアーゼを利用することができる。単独で、または組み合わせて使用される、ＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩ、ＮｏｔＩ、またはＨｐａＩＩなどのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、そのようなエンドヌクレアーゼの例である。他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、当業者に公知であろう。
【００３９】
ＭＡＬ遺伝子またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列の高メチル化の検出のための他の方法は、非メチル化シトシンがウラシルに変換されるのに対しメチル化シトシンは化学修飾から保護されるＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾に関する。その後のＰＣＲ増幅およびピロシーケンシングなどの配列決定は、メチル化の場合にはＣｐＧ島内のシトシンが維持されるか、または非メチル化状態の場合にはウラシルに置換されるかどうかを明らかにするであろう。別の方法は、その認識部位の一部としてＣＧを含む制限エンドヌクレアーゼによって重亜硫酸塩修飾ＤＮＡから生成されたＰＣＲ増幅産物の処理を含む。
【００４０】
メチル化配列を調べるための代替的手段は、ＣｐＧリッチ配列を標的にする特異的ＰＣＲ反応に続く、ＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾に基づくメチル化特異的ＰＣＲである。
【００４１】
本発明のために、ＭＡＬまたはｈｓａ−ｍｉＲ１２４に特異的な核酸プローブが、生物学的流体または組織中の、ＭＡＬまたはｈｓａ−ｍｉＲ１２４ポリヌクレオチドの存在を（核酸プローブを用いて）検出するために使用されてもよい。ＭＡＬまたはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列中の、任意のコード配列領域および調節配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、たとえばＰＣＲなどによってＤＮＡを増幅するために有用である。
【００４２】
ＰＣＲプライマー、核酸プローブ、または制限エンドヌクレアーゼを使用するとき、ＭＡＬ配列（図１に特定される）またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列（図２に特定される）の、５’調節領域、第１イントロン配列、およびコード配列が分析される。
【００４３】
本発明の方法の一実施形態において、試験細胞中の、ＭＡＬ遺伝子（プロモータ領域を含む）および／またはｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列の増加したメチル化は、同等の正常細胞と比較して検出される。
【００４４】
また、本発明は、浸潤能を有するＨＰＶ誘発性前駆病変およびＨＰＶ誘発性浸潤性癌を検出する本発明の方法において使用するための部品のキットを提供する。このようなキットは、試験細胞を収集するための収集媒体を充填した容器とともに（膣）掻爬検体を採取するためのブラシまたはヘラを好適に含んでもよい。また、潅注シリンジと、使い捨て女性尿カテーテルと、潅注流体を充填した容器とからなる採取機器が、頸膣細胞を洗浄によって収集するために含まれるであろう。本発明に係るキットは、ＭＡＬおよびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のメチル化の検出のためのプライマーおよびプローブを含んでもよい。本発明に使用されるプライマーおよびプローブは、表１および表２に示される。
【表１】
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【００４５】
本発明に係る部品のキットは、メチル化感受性制限酵素、または図１および図２のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるプローブもしくはプライマーなどの、ＭＡＬおよびｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化の検出のための手段を含む。
【００４６】
本発明のキットのさらに別の代替的実施形態では、ＭＡＬおよびｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化を検出するための手段は、ＨＰＶ感染の検出のための手段、好ましくは、高リスク型のＨＰＶ感染の検出のための手段に組み合わせることができる。このような手段は、ＨＰＶ特異的プライマーまたはプローブ、ＨＰＶ感染のタンパク質マーカー、または当技術分野で知られているようなＨＰＶ感染症のための代用マーカーを含んでもよい。
【実施例】
【００４７】
実施例１  ＨＰＶ-不死化ケラチノサイト細胞株、および子宮頸部癌細胞株におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４メチル化
成熟ｈｓａ−ｍｉＲ１２４配列は、３つの異なるゲノム位置（ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１［８ｐ２３．１］、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２［８ｑ１２．３］およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３［２０ｑ１３．３３］）においてコード化されているので、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化状態は、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によって３つ全ての遺伝子座で決定された。以下の増幅産物が検出された：ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１：ｎｔ  ８１１〜９０４;  ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２：ｎｔ  ７０１〜８３８；  ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３：ｎｔ  ８９７〜９９１、それぞれ図２に示される配列を参照のこと。ハウスキーピング遺伝子のＢ−アクチンを内部標準として使用した（Harden et al., J Urology 2003;169:1138-1142）。これらのアッセイを使用して、本発明者らは、３人の異なるドナー（ＥＫ）から単離された初代ケラチノサイトにおけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化を認めなかったが、３つ全ての遺伝子座の対応するＣｐＧ島は、３つのｈｒＨＰＶ含有子宮頸部癌細胞株（ＳｉＨａ、ＨｅＬａおよびＣａＳｋｉ細胞）においてメチル化された。ＨＰＶ誘発性悪性形質転換の連続した段階を表す４つのｈｒＨＰＶ不死化ケラチノサイト細胞株（ＦＫ１６Ａ、ＦＫ１６Ｂ、ＦＫ１８ＡおよびＦＫ１８Ｂ）の初期および後期継代において、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２の両方は頻繁にメチル化されたが、メチル化レベルは後期継代（継代７０〜９６）における高いメチル化レベルと比較して初期継代（継代２３〜４３）において比較的低かった。第３の遺伝子であるｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３は、ＨＰＶ不死化細胞株のいずれにおいてもメチル化されなかった。ｈｓａ−ｍｉＲ１２４のＲＮＡ発現はＳｉＨａ子宮頸癌細胞において検出できなかったが、本発明者らは、ＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ、５μＭ）を用いて処理されたＳｉＨａ細胞内におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４の再発現を実際に検出した。このことは、ＳｉＨａ細胞において、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４遺伝子サイレンシングがメチルエピジェネティック修飾、主にＤＮＡのメチル化によって直接的（間接的）に媒介されることを示す。
【００４８】
実施例２  ＳｉＨａ細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４の過剰発現は、抗増殖性および抗遊走効果を有する。
子宮頸部発癌における低下したｈｓａ−ｍｉＲ１２４発現の考え得る機能的関連性を決定するために、２つの子宮頸癌細胞株ＳｉＨａおよびＣａＳｋｉをｈｓａ−ｍｉＲ１２４の安定発現をもたらす遺伝子構築を含むレトロウイルスベクターを用いて形質導入した。ＲＴ−ＰＣＲを用いる発現分析は、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４形質導入体におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４の異所性発現と、空のレトロウイルスベクターを用いて形質導入された細胞における発現の欠如とを裏付けた。ＳｉＨａおよびＣａＳｋｉ形質導入細胞の両方におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４の異所性発現は、培養の６日後、ｈｓａ−ｍｉＲ−ｃｔｒｌ形質導入体と比較して有意な細胞増殖の減少（ｐ＜０．０５）をもたらした。また、創傷治癒アッセイを使用して、ＳｉＨａ  ｈｓａ−ｍｉＲ１２４形質導入体は、ＳｉＨａ  ｈｓａ−ｍｉＲ−ｃｔｒｌ細胞と比較して遊走能力が低下することが判明した。
【００４９】
実施例３  子宮頸部組織被検物におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４プロモータのメチル化
３つの全てのｈｓａ−ｍｉＲ１２４調節領域のＤＮＡ高メチル化が、in vivoにおける子宮頸部発癌の進行の間に発生するかどうか、およびいつ発生するかを決定するために、本発明者らは、正常な子宮頸部、低度ＣＩＮ病変（ＣＩＮ１）、高度ＣＩＮ病変（ＣＩＮ３）、ならびに子宮頸癌（ＳＣＣおよびＡｄＣａｓ）から得られた子宮頸部組織被検物において表２に定義されたようなプライマーおよびプローブを使用して定量的ＭＳＰ分析を行った。通常の子宮頸部において、６％（１／１８）の試料はｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３でのメチル化に陽性とされたが、他の２つの遺伝子調節領域（ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２）における正常試料のメチル化は検出されなかった。ＣＩＮ１病変において、２８％（１０／３６）がｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１でメチル化を示し、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２で６％（２／３６）、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３で１１％（４／３６）であった。ＣＩＮ３病変におけるメチル化陽性は、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１の４６％（１９／４１）から、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２の２０％（８／４１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３の１０％（４／４１）まで変化した。ＳＣＣにおいて検出された、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２、およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３の検出頻度は、それぞれ８６％（２５／２９）、８３％（２４／２９）、および７２％（２１／２９）であった。ＡｄＣａの場合、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２、およびｈｓａ−ｍｉＲ１２３−３のメチル化は、これらの腫瘍の、それぞれ９３％（１４／１５）、８０％（１２／１５）および７３％（１１／１５）であった。３種のＭＳＰアッセイを組み合わせる場合には、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２の組み合わせが、≧ＣＩＮ３に対する最も高い組み合わせ感度および特異性を有することが見出された。なぜなら、全ての正常子宮頸部上皮試料は、陰性であり、ＣＩＮ３病変の５９％、ＳＣＣの９３％およびＡｄＣａの９３％が陽性であったからである。上述の検出頻度は、１００％の特異性に設定された閾値のみを用いる組織標本からなることに留意すべきである。閾値を下げると、ＣＩＮ３の感度が高まるが、特異性が低下する。
【表２】
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【００５０】
実施例４  子宮頸部掻爬検体におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４メチル化
臨床診療におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４のメチル化の推定マーカーの値を評価するために、本発明者らは、子宮頸部掻爬検体におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４を評価した。集団ベースのスクリーニング試験に参加した女性の症例対照デザインを使用し、本発明者らは、１８月のフォローアップ期間内に最大でＣＩＮ１と診断されたｈｒＨＰＶ陽性女性に対して１８月のフォローアップ期間内に≧ＣＩＮ２（１つの癌を含む）と診断された女性（すなわち、症例）の子宮頸部掻爬検体を調べた。ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１のメチル化は、コントロールの５％、症例の４８％において検出された。ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のメチル化は、コントロールには存在せず、症例の４８％において検出され、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３のメチル化は、コントロールの５％、症例の２４％において検出された。ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１とｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２とを組み合わせた分析では、コントロール５％と症例７１％とを検出した。さらに、閾値設定の調整は、ＣＩＮ３の感度率を＞８０％に増加させ、特異率は依然として許容可能であった（＞５０％）。
【００５１】
実施例５  自己採取被検物におけるｈｓａ−ｍｉＲ１２４メチル化
その後、本発明者らは、合計４５，０００自己採取パッケージが、２度目のリマインダーの後も定期的な子宮頸部スクリーニングへの誘いに応答しなかった女性に送られた計画的研究の間にVibaBrush（Rovers Medical Devices, Oss, the Netherlands）またはPantarhei sampler（Pantarhei Devices, Zeist, The Netherlands）のいずれかを使用して集められた自己採取された頸膣被検物を分析した（www.trialregister.nl, Trial no.NTR962 (PROHTECT trial）を参照）。これらの女性の約３分の１は、自己採取した被検物を研究室に返した。これらの試料は、ＨＰＶ  ＰＣＲ分析に好適（つまり、β−グロビンＰＣＲ陽性）であり、ｈｒＨＰＶ  ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによる検査は、応答した女性の対応集団における定期スクリーニングによって見出されるようなこの集団における少なくとも≧ＣＩＮ２病変をもたらす（Goek et al.2010 Brit. Medical J.;340:c1040）。
【００５２】
フォローアップにおいて臨床的に意味のある疾患の徴候がない女性のわずか２５％と比較して、後に≧ＣＩＮ３と診断された女性の自己採取試料の５５％は、ＭＩＲ１２４マーカーのいずれかについて陽性とされた。これらのデータは、自己採取された材料におけるＭＩＲ１２４のメチル化分析が、首尾よく実行可能であり、内在する高悪性子宮頸部疾患の検出を向上させることを示す。
【００５３】
実施例６  医師採取子宮頸部掻爬検体に対する自己採取頸膣洗浄被検物における、ＣＡＤＭ１およびＭＡＬメチル化分析の性能の比較
Ｔ細胞分化タンパク質として知られるＴリンパ球成熟関連タンパク質（また、ＭＡＬとも称される。Genbank Accession NM_002371）をコードする遺伝子と、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）をコードする遺伝子とのプロモータのメチル化のための組み合わせ試験は、細胞診と同様に良好に行われる医師採取子宮頸部掻爬検体に適用された場合、魅力的な代替的分子トリアージツールであると考えられる（Hesselink et al. 2011, Clin Cancer Res; 17(8):2459-65）。次に、本発明者らは、ＰＲＯＨＴＥＣＴコホート研究（Goek et al. 2010Brit.Medical J.;340:c1040）に参加した非出席者から得たｈｒＨＰＶＤＮＡ陽性の自己採取頸膣洗浄被検物におけるＭＡＬおよびＣＡＤＭ１プロモータのメチル化を評価し、その性能をHesselinkら（Hesselink et al. 2011, Clin Cancer Res; 17(8):2459-65）に記載されたような医師採取子宮頸部掻爬検体（ｎ＝２３６）において得られた結果と比較した。
【００５４】
ＰＲＯＨＴＥＣＴ１試験における自己採取頸膣洗浄被検物においてｈｒＨＰＶ陽性であった７５７人の女性のうち、３５５人の女性が有効な調査のエンドポイントを有していた。これらには、４種の扁平上皮癌および１種の腺癌を含むＣＩＮ３＋と診断された７４人、ＣＩＮ２と診断された２０人、ＣＩＮ２＋の兆候がない（すなわち、最大でＣＩＮ１）２６１人の女性が含まれていた。後者の群は、以下では≦ＣＩＮ１と称される。全ての試料は、ＭＡＬ（領域Ｍ１）およびＣＡＤＭ１（領域Ｍ１８）のメチル化の両方について、医師採取子宮頸部掻爬検体について以前に記載されたのと同じ基準に従って定量的メチル化特異的ＰＣＲを使用して試験された（Hesselink et al. 2011, Clin Cancer Res; 17(8):2459-65）。ＭＡＬのメチル化分析は、ＣＩＮ２＋病変とＣＩＮ３＋検出の両方に関して、医師採取子宮頸部掻爬検体と比較して自己採取頸膣洗浄被検物において同様に良好に機能することを見出した（図３Ａ）。これに対して、自己採取頸膣洗浄被検物のＣＡＤＭ１メチル化分析の際に得られるシグナルは、医師採取子宮頸部掻爬検体において得られたものと比較して顕著に減少し、特に自己採取頸膣洗浄被検物におけるＣＩＮ３＋の検出は、不十分であった（図３Ｂ）。
【００５５】
この不一致は、自己採取被検物が、医師によって取得された頸部塗抹スメアとは異なる細胞組成を有する（すなわち、膣細胞と比較した子宮頸部細胞の相対的欠乏）という事実を反映している可能性が高い。したがって、ｈｒＨＰＶ陽性の医師採取子宮頸部掻爬検体のための最適なトリアージマーカーは、必ずしも自己試料に直接的に置き換えられないであろう。最適な臨床性能のためには、メチル化マーカーの様々なパネルが必要とされる可能性が高い。
【００５６】
実施例７  自己採取頸膣洗浄被検物における、ＭＡＬのメチル化に組み合わせたｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のメチル化の分析
実施例１に記載されたように、自己採取被検物におけるメチル化分析の臨床性能を向上させるために、代替的なメチル化マーカーが必要である。ＭＡＬおよびＣＡＤＭ１を用いる本発明者らの以前の研究は、子宮頸部発癌の多段階プロセスにおいて異なる機能的事象を示すマーカーがＣＩＮ３＋検出の点においてお互いに相補的であることを示した（Overmeer et al., Int J Cancer 2010 Epub Dec 28,; Hesselink et al. 2011, Clin Cancer Res; 17(8):2459-65）。したがって、本発明者らは、自己採取被検物の分析のためには、ＣＡＤＭ１と同じ形質転換の段階に現れる代替的マーカーが好ましいと仮定した。ＭＡＬのメチル化は形質転換の初期に生じ（すなわちＨＰＶ不死化細胞の初期継代における高いメチル化レベル）、ＣＡＤＭ１のメチル化は足場非依存性増殖および腫瘍形成などの形質転換の後期段階に関連するが、本発明者らは、メチル化事象が形質転換の後期段階に機能的に関連すると考えた。このような事象の１つは、ヒトマイクロＲＮＡ１２４のメチル化媒介性サイレンシングである。これらのマイクロＲＮＡをコードする遺伝子の高メチル化レベルは、足場非依存性増殖特性を獲得したＨＰＶ−形質移入ケラチノサイトの後期継代で明らかになった。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４の過剰発現は、子宮頸部発癌における機能的役割を補助し、子宮頸癌細胞の発癌増殖特性を抑制することが見出された。実施例２を参照のこと。
【００５７】
したがって、メチル化マーカーのｈｓａ−ｍｉＲ１２４は、ＣＡＤＭ１およびＭＡＬの試験と同じ一連のｈｒＨＰＶ陽性自己採取被検物におけるＣＩＮ３＋の検出のための、ＭＡＬマーカーを補完する能力について評価された（実施例１を参照のこと）。興味深いことに、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２の分析は、ＣＡＤＭ１と比較してＣＩＮ３＋病変の一層良好な識別を明らかにした（図４）。最も重要なことは、ｈｓａ−ｍｉＲ１４２−２／ＭＡＬの組み合わせは、自己採取被検物において非常に優れた臨床成績（すなわち、５２．５％の特異性で８６．５％のＣＩＮ３＋感度）を有し、医師採取試料におけるＣＡＤＭ１／ＭＡＬ（すなわち、５０％の特異性で８３．３％のＣＩＮ３＋感度）に等しいことが見出されたことである。
【００５８】
自己採取頸膣被検物におけるｑＭＳＰ分析に使用される全てのプライマーおよびプローブの組み合わせは、表１および表２に挙げられる。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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