(57)【要約】本発明は、核酸配列を遺伝子導入で保有する根茎を含む第一の植物と、該第一の植物の根茎上に接ぎ木された第二の植物からの接ぎ穂を組み合わせ、それにより、該トランスジェニック核酸配列が、第一の根茎中に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞を導入するために接合面を超えて浸透性で輸送され、少なくとも部分的に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞で発現される転写産物と相補的であるポリヌクレオチド分子を生成することにより、植物の雄性減数分裂細胞におけるプロセスに干渉する方法に関する。
2014527406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列を遺伝子導入で保有する根茎を含む第一の植物と、該第一の植物の根茎上に接ぎ木された第二の植物からの接ぎ穂を組み合わせ、それにより、該トランスジェニック核酸配列が、第一の根茎中に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞を導入するために接合面を超えて浸透性で輸送され、少なくとも部分的に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞で発現される転写産物と相補的であるポリヌクレオチド分子を生成することにより、植物の雄性減数分裂細胞におけるプロセスに干渉する方法。
【請求項２】
第一の植物のトランスジェニック核酸配列の発現が、該核酸配列を、該トランスジェニック核酸配列に遍在的発現プロフィールまたは組織−または細胞型−特異的発生プロフィールを与えるプロモーター配列と動作可能に結合することにより達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロモーター配列が該トランスジェニック核酸配列へ根を含む発現プロフィールを与える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
雄性減数分裂細胞のプロセスへの干渉が、雄性減数分裂細胞のプロセスの抑制または遮断からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
雄性減数分裂細胞のプロセスの抑制または遮断が、少なくとも部分的に標的遺伝子ｍＲＮＡまたは転写産物と相補的であり、トランスジェニック核酸配列から生成したポリヌクレオチド分子によって標的遺伝子ｍＲＮＡを不安定化することにより達成できる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド分子が、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ウイルス導入遺伝子サイレンシング分子（ＶＩＧＳ）、コサプレッサー分子またはＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
植物の雄性減数分裂細胞のプロセスへの干渉が、植物の雄性減数分裂細胞のプロセスの増進からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド分子が、第一の植物で一時的に発現する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第一の植物のポリヌクレオチド分子の一時的発現が、熱誘導プロモーター、化学誘導プロモーター、ステロイド誘導プロモーター、およびアルコール誘導プロモーターを含む群から選択される、誘導プロモーターの使用で達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド分子の一時的発現が、根茎細胞のゲノムにおいて統合されていないポリヌクレオチド分子をコードする構築物からの発現により達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
構築物が、アグロバクテリウムでの根茎上の葉の浸潤により、根茎に送達される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド分子が、染色体組換えにかかわる遺伝子の転写産物と少なくとも部分的に相補的である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子が、ＳＰＯ１１、ＭＥＲ１、ＭＥＲ２、ＭＲＥ２、ＭＥＩ４、ＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４、ＭＥＫ１／ＭＲＥ４、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＰＲＤ３、ＰＨＳ１、ＮＢＳ１、ＣＯＭ１、ＲＨＤ５４／ＴＩＤ１、ＤＭＣ１、ＳＡＥ３、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＨＯＰ２、ＭＮＤ１、ＲＥＣ８、ＭＥＩ５、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＰＡ１、ＳＭＣ３、ＳＣＣ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＳＯＬＯＤＡＮＣＥＲＳ、ＨＩＭ６、ＣＨＫ２、ＳＧＳ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＭＥＲ３／ＲＣＫ、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ３、ＺＩＰ４、ＰＴＤ、ＳＨＯＣ１、ＺＹＰ１、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、またはそれらの機能的ホモログを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸配列を遺伝子導入で保有する根茎を含む第一の植物と、該第一の植物の根茎上に接ぎ木された第二の植物からの接ぎ穂を組み合わせ、それにより、該トランスジェニック核酸配列が、第一の植物の根茎中に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞を導入するために接合面を超えて浸透性で輸送され、少なくとも部分的に、第二の植物のゲノムに含まれるＤＮＡ断片と相同であるポリヌクレオチド分子を生成することにより、植物の雄性減数分裂細胞のゲノム配列を特異的に改変するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は植物の雄性減数分裂細胞のプロセスに干渉するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
有性生殖は顕花植物のライフサイクルにおいて間違いなく最も基本的な過程である。それは生物の次世代を提供し、父母生物の遺伝子の特徴の組換え（入れ替え）を通じて、遺伝的多様性の創造を許容する。次世代におけるこの多様性が、植物が、例えばよりよく、およびより容易に生物的および非生物的な環境変化に適合することを許容する。
【０００３】
生物学の研究は、被子植物における有性生殖において重要な役割を果たすプロセスおよび因子の詳細な理解に通じた。本質的な段階は：
−２倍体減数分裂細胞からの雄性配偶子（小胞子、花粉粒）および雌性配偶子（胚珠内の胚嚢内の卵細胞）の形成と成熟。配偶子の形成は、配偶子生産生物の２個の親ゲノムが組換えられる間、２回の有糸分裂を経て起こる；
−例えば、風、昆虫または他の特殊な送粉者に仲介されるか、または自家受粉種に関する単に重力、近接または活性受粉機構による受粉（雌性生殖器官／柱頭への雄性配偶子の沈着）；
−花粉粒子の発芽およびそれに続く雄核（精細胞）の受容器官への転送および花粉管を通じた卵細胞への化学的な付着
−一の精細胞が卵細胞と融合して二倍体胚を生じ、他の精細胞が二倍体中心細胞と融合する、二重受精を導き、三倍体胚乳を生じる、受容胚嚢中への精核の放出；
−胚の形成に通じる接合子の有糸分裂および成長上のパターン形成、
である。
【０００４】
この発明の目的のために、第一段階：減数分裂細胞からの配偶子、特に雄性配偶子の形成、は最も重要である。被子植物において、雄性配偶子または小胞子が葯の中で形成される。それらは２回の有糸分裂を含む、減数分裂を受ける二倍体花粉母細胞（一種の減数分裂細胞）から発生する。減数分裂の最終的な結果は各花粉母細胞あたり４個の半数体小胞子の組であり、これらの小胞子は、２回の有糸分裂を受けることによってそれぞれ成長する。これらの分裂の第一は非対称であり、栄養細胞および生殖細胞をもたらし、第二の有糸分裂は生殖細胞の分裂に関する。結果は、精細胞がともに栄養細胞の細胞質内に位置するような特徴的な配置である、２つの精細胞を含む花粉粒である。
【０００５】
第二の有糸分裂のタイミングは植物界において大いに異なり、第二の花粉有糸分裂は開花の前（例えば、シロイヌナズナおよびイネの場合）、または花粉管成長の間の開花後（例えば、トマトまたはタバコにおいて）のいずれかで起こることができる。種によって、被子植物の花はそれゆえ、三細胞性（１個の栄養核および２個の生殖核を含む）、または二細胞性（１個の栄養核および１個の生殖核を含む）の花粉粒のいずれかを排出できる。
【０００６】
細胞減数分裂は配偶子形成の間、新しい遺伝子の組み合わせをもたらす親の遺伝情報の入れ替えの手段を提供するものとして、および半数体配偶子のゲノムの「非二倍化（ｕｎｄｏｕｂｌｉｎｇ）」の手段として、基本的に重要である。遺伝物質の次世代、および進化への伝達について、もし減数分裂細胞内で起こる分子の、生理学の、および／または発生上のプロセスに影響を与えることができるならば、それは有性生殖に非常に大きな影響を与え得るので、減数分裂細胞はかなりの研究上の注目を受けた。
【０００７】
植物では、ＲＮＡベースのサイレンシングシグナルが、離れた器官に伝播することが知られている。そのようなＲＮＡベースのシグナルの長距離の輸送のために、顕花植物は篩部という専門化している維管束系を使用する。篩部は、ソース（生産）組織からシンク（消費）組織にイオン、糖、ヌクレオチド、ホルモン、アミノ酸、およびタンパク質などの小分子の方向性のある転送を容易にする。多くの植物種では、特異的遺伝子産物由来の小ポリヌクレオチド分子（通常１８〜２７のヌクレオチドサイズをもつＲＮＡ分子）は、篩管液に存在しているように見え、それに続くソース−シンク流動に移転することが示唆された。
【０００８】
文献から、長距離の輸送経路が、植物が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関連する浸透性の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を誘導することを許容することが知られている。
【０００９】
ＰＴＧＳ−ｓｉＲＮＡに関連している−は未知のメカニズムによりリセットされ、続く世代で回復される。ＰＴＧＳ−リセットは、雄性配偶体のトランスポゾン活性に関する研究で示されるように、減数分裂の間に起こり、配偶子で再度確証できると考えられる。
【００１０】
転移因子転写を標的とするｓｉＲＮＡは、栄養核内で活性化され、受精精細胞に移動し、ここでトランスポゾン活性を下方制御する。したがって、花粉粒および受精花粉管中で、ｓｉＲＮＡによって仲介されたサイレンシング機構は活性である。ＰＴＧＳ機構もまた、葯特異的遺伝子がサイレンシングされるように、ＰＴＧＳ機構も胞子体組織で機能的である。サイレンシングのｓｉＲＮＡ関連の伝播がＧＦＰ配列を含む転写の過剰発現で誘導される、トランスジェニックＧＦＰ−発現系で行われた研究は、新規な葉の形成などの強いシンク組織へのｓｉＲＮＡシグナルの浸透性の伝播を示唆した。
【００１１】
しかしながら、全てのシンク組織がＰＴＧＳシグナルを受診できるわけではないように見える。浸透性ｓｉＲＮＡ仲介ＧＦＰサイレンシングは成長している花芽で非常に限定的に報告され、葯または心皮の減数分裂（胞子形成）組織におけるＧＦＰのサイレンシングは全く観察されていない。
【００１２】
それゆえ、従来技術において、減数分裂細胞は長距離のモバイルシグナルに到達し難く、成長の初期段階において将来の小胞子を保護するバリアが存在することが推定される。
【００１３】
しかしながら、本発明につながる研究では、減数分裂細胞がどのように、トランスジェニック台木からの浸透性のポリヌクレオチドシグナルから、その上に接ぎ木した新芽（接ぎ穂）、または接ぎ穂により産生した減数分裂細胞または小胞子、またはこれらの小胞子由来の植物で、トランスジェニックとすることなく、標的化されるかを見出した。
【００１４】
本発明者らは、浸透性シグナルとして雄性減数分裂細胞に輸送される該ポリヌクレオチドシグナルを通じて、どのように雄性減数分裂細胞における（分子）プロセスに干渉するかを見出した。
【００１５】
従来技術において、構成的プロモーターをもつＲＮＡｉ構築物の過剰発現が雄性減数分裂細胞において遺伝子発現のサイレンシングをもたらすことができることも知られている（Ｄｉｒｋｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９，  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ７：  ８３７−８４５；  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ：  ＷＯ０３／０１７７５３）。しかしながら、このアプローチの明白な欠点は、雄性減数分裂細胞を生産する生物、および減数分裂の後に生産された小胞子の少なくとも５０％がトランスジェニックであるという事実である。規定的、効率的および実際的な理由のため、分子組換えプロセスが干渉された減数分裂細胞から生じた小胞子から、導入遺伝子のない植物を生産する方法を提供することが非常に望まれている。そのような小胞子は、例えば、導入遺伝子のない倍加半数体植物（ＤＨ）の生産に使用される。
【００１６】
従来技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ小胞子培養（小胞子からの半数体胚の再生、およびそれに続く、例えばコルヒチンでの、ゲノム倍加）、および、受粉および受精に用いられる小胞子と遺伝学的に同一な半数性胚を含む生育し得る種子の形成を導く、受精後に接合子から母系染色体を排除する、半数体誘導株の受粉に関わるＷＯ２０１１０４４１３２に開示された方法、などの小胞子からの半数体植物生産のための様々な方法を開示する。
【００１７】
本発明につながる研究において、成熟台木で発生するｓｉＲＮＡシグナルが全身的に浸透し、頂芽胞子形成細胞（ａｐｉｃａｌ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）、特に減数分裂細胞において活性であることが驚くべきことに見出された。これは、ＲＮＡｉ構築物を内部に含むトランスジェニック台木上に、非トランスジェニック接ぎ穂を接ぎ木すること、およびｓｉＲＮＡ分子を生産すること、および非トランスジェニック接ぎ穂により形成された雄性減数分裂細胞中の遺伝子の表現型のサイレンシングを観察することにより示された。減数分裂組織を標的とするそのような浸透性ｓｉＲＮＡ分子は、それゆえ、子孫の遺伝子発現に影響できる。
【００１８】
トランスジェニック台木におけるＲＮＡｉ構築物から生成されたｓｉＲＮＡ分子は、それゆえ、接着面を超える長距離輸送を通して、接ぎ穂全体にわたって伝播されることができる。最近の研究は、これらの構築物から生成されたポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）分子が続いて、雄性減数分裂細胞に入り込み、そこでの遺伝子サイレンシングに影響するかまたはこれらの減数分裂細胞中の転写産物またはゲノム材料に他の方法で干渉できることを示した。現在まで、長距離輸送を通じて初期成長段階の減数分裂細胞または小胞子に、分子を運び込むことが不可能であると考えられていた。驚くべきことに、雌性減数分裂細胞（子房に含まれる大胞子母細胞）がｓｉＲＮＡシグナルを受容しない一方で、花の中で、ｓｉＲＮＡ分子は優先的に葯およびその減数分裂細胞に向かって標的化された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
減数分裂、染色体組換え、相同組換えなどの雄性減数分裂細胞で行われるすべての分子プロセスに干渉するため、または、例えば、これらの減数分裂細胞から得られた小胞子のアンドロゲン性刺激への反応性などの、小胞子の生理機能に干渉するために本発明を適用できる。「干渉」はこれらのプロセスを抑制または阻止すること、またはその増進のいずれの意味でも用いることができる。それはまた、次世代に移動する遺伝物質の特異的改変、例えば、遺伝子および／また調整（シス作用）配列における部位特異的変異（相同組換えが減数分裂細胞で自然に起こる段階の間）を許容する。
【００２０】
重要なことに、本発明の適用は、雄性減数分裂細胞、そこから成長した小胞子または接ぎ穂遺伝子組換えを、根茎だけが導入遺伝子を有する状態にするものではない。小胞子と接ぎ穂は、次世代に引き継がれない、一時的に発現した導入遺伝子由来誘導分子を含むのみである。導入遺伝子誘導分子によってもたらされた分子効果のみが、次世代に伝えられる。導入遺伝子無しの材料へ、接合面を超えて浸透性で移動できる、優性阻害因子を発現する導入遺伝子の使用は、それらを安定な遺伝子組換えの状態にすることなしに、研究者が新規な特色を作物に導入するための遺伝子導入技術を最大限に利用することを許容する。
【００２１】
相同組換えを通じて（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：  ４０２１−４０２６；  Ｍｅｎｇｉｓｔｅ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  Ｊ，  １９９９，  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８０：  ７４９−７５８；  Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ＡＣ  ａｎｄ  Ｈｏｏｙｋａａｓ  ＰＪＪ，  １９９９，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １８：  １−３１）、またはオリゴヌクレオチドベースの変異導入を通じて（Ｏｈ  ＴＪ  ａｎｄ  Ｍａｙ  ＧＤ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：  １６９−１７２；  ＫｅｙＢａｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＷＯ２０１００７４５６２，ＥＰ２１６７６６０，ＷＯ２００７０７３１４９）、植物ゲノムに特定の変異を導入できる。
【００２２】
品種改良の目的にこの発明の方法を使用できる。現在の育種方法は、遅く、栽培品種開発に＞５−１０年もかかる。欠点の１つは、初期の世代における形質選択の非能率性である。この問題は、非トランスジェニック接ぎ穂において、それらを下記の実施例３に示すように、適合するトランスジェニック根茎に接ぎ木することにより、倍加半数体生産を引き起こすことによって、克服できる。
【００２３】
本発明の方法は、接ぎ木および形質転換が可能な全ての植物種に適用できる。本発明を実施できる作物種は、例えばタバコ、ポプラ、トウモロコシ、小麦、大麦、米、モロコシ、砂糖ダイコン、アブラナ、ホソムギ、ヒマワリ、大豆、トマト、キュウリ、ガーキン、コーンサラダ、ホウレンソウ、コショウ、ペチュニア、じゃがいも、なす、メロン、にんじん、ラディッシュ、レタス、アブラナ科野菜（キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、コールラビ、芽キャベツ）、にら、豆、えんどう、アンディーブ、チコリ、たまねぎ、いちご、フェンネル、食用ビート、セロリ、セルリアク、アスパラガス、ヒマワリ、およびブドウ植物を含む。
【００２４】
本発明はそれゆえ、核酸配列を遺伝子導入で保有する根茎を含む第一の植物と、該第一の植物の根茎上に接ぎ木された第二の植物からの接ぎ穂を組み合わせ、それにより、該トランスジェニック核酸配列が、第一の根茎中に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞を導入するために接合面を超えて浸透性で輸送され、少なくとも部分的に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞で発現される転写産物と相補的であるポリヌクレオチド分子を生成することにより、植物の雄性減数分裂細胞におけるプロセスに干渉する方法に関する。
【００２５】
第一の植物のトランスジェニック核酸配列の発現は、該核酸配列を、該トランスジェニック核酸配列に遍在的または浸透性発現プロフィールまたは組織−または細胞型−特異的発生プロフィールを与えるプロモーター配列と動作可能に結合することにより達成される。この目的のために、トランスジェニック核酸配列は、植物での該核酸配列の発現を駆動する能力を有するプロモーター配列の下流（３’末端）において、トランスジェニック構築物にクローニングされる。プロモーター配列は植物組織中でそれらの発現パターンにおいて異なり、いくつかは全ての組織で遺伝子発現を駆動できる能力を有し（遍在的発現）、一方で他のものは（時空的に）より狭い発現パターン、または特定の組織型または細胞型に限定される特異的発現パターンを有する。
【００２６】
遍在的発現プロフィールをトランスジェニック核酸配列に与えるプロモーター配列の例は、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、選択されたユビキチンプロモーター、選択されたアクチンプロモーター、および多くの他のものである。また、組織または細胞型特異的プロモーターの例は当業者に知られている。
【００２７】
本発明の目的のために、プロモーター配列は該トランスジェニック核酸配列へ根茎を含む発現プロフィールを与える。根茎のみが、トランスジェニック核酸配列を有する該第一の植物から使用され、したがって、該核酸配列が少なくとも該第一の植物の根茎で発現するはずであるので、これは望ましい。根茎は、篩管液がシンク組織、より具体的に接ぎ穂のシンク組織を含む。根茎は、根を含み、さらに、茎およびいくつかの（成熟）葉の一部を含み得る。本発明によると、トランスジェニック核酸配列の発現産物は、完全な根茎またはその一部分において、例えば根−、葉−、または茎−特異的プロモーター、を使用することにより生産できる。
【００２８】
一の実施形態において、第一の植物の根茎のトランスジェニック核酸配列の発現は構成的である。他の実施形態において、第一の植物の根茎のトランスジェニック核酸配列の発現は一時的である。一時的発現は、例えば熱誘導プロモーター、化学誘導プロモーター、ステロイド誘導プロモーター、およびアルコール誘導プロモーターを含む群から選択される誘導プロモーターの使用により達成される。一時的発現は、根茎ゲノムに、導入遺伝子を安定して統合する代わりに、誘導プロモーターを使用するか、またはトランスジェニック構築物を（強いプロモーターで）一時的に導入することにより達成できる。そのような一時的な変化は、例えば、根茎への接ぎ穂の接ぎ木の後に残って付着している葉の気孔を通して、アグロバクテリウム浸潤により達成できる。
【００２９】
一の実施形態において、雄性減数分裂細胞のプロセスへの干渉は、雄性減数分裂細胞のプロセスの抑制または遮断からなる。他の実施形態において、雄性減数分裂細胞のプロセスへの干渉は、雄性減数分裂細胞のプロセスの増進からなる。干渉が雄性減数分裂細胞のプロセスの抑制または遮断からなる場合、これは少なくとも部分的に標的遺伝子ｍＲＮＡまたは転写産物と相補的であり、トランスジェニック核酸配列から生成したポリヌクレオチド分子によって標的遺伝子ｍＲＮＡを不安定化することにより達成できる。ポリヌクレオチド分子は、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ウイルス導入遺伝子サイレンシング分子（ＶＩＧＳ）、コサプレッサー分子またはＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む群から選択できる。
【００３０】
一の実施形態において、該トランスジェニック核酸配列は第一の植物のゲノムに安定して統合される。他の実施形態において、該トランスジェニック核酸配列は、一時的に第一の植物の根茎に存在する。
【００３１】
一の実施形態において、該ポリヌクレオチド分子は、第一の植物で、好ましくは根を含む発現ドメインで構成的に生成され、発現される。これは、外部処理がポリヌクレオチド分子の生成および発現に全く必要でないことを意味する。トランスジェニック核酸配列が動作可能に結合されるプロモーター配列の特性はポリヌクレオチド分子の生成および発現の一時的および空間的なパターンを決定する。
【００３２】
他の実施形態において、該ポリヌクレオチド分子は、第一の植物で、好ましくは根を含む発現ドメインで一時的に生成され、発現される。これは、外部因子または処理が、これらの外部因子または処理がトランスジェニック核酸配列が動作可能に結合しているプロモーター配列の活性を有する効果により、ポリヌクレオチド分子の生成および発現の一時的および／または空間的なパターンを誘導および／または調節するために使用できることを意味する。
【００３３】
この実施形態において、第一の植物のポリヌクレオチド分子の一時的発現は熱誘導プロモーター、化学誘導プロモーター、ステロイド誘導プロモーター、およびアルコール誘導プロモーターを含む群から選択される、誘導プロモーターの使用で達成される。誘導可能なプロモーター（例えば熱ショックまたは熱処理、特定の化学物質、デキサメタゾンなどの特定のステロイド、またはアルコール）の活性を誘導する薬剤および／または条件での根茎の処理は、第一の植物、好ましくは根を含む発現ドメインでのポリヌクレオチド分子の一時的発現をもたらす誘導プロモーターを活性化する。
【００３４】
トランスジェニック核酸配列から得られたポリヌクレオチド分子は、少なくとも第二の植物の接ぎ穂によって生産された雄性減数分裂細胞で発現された転写産物と部分的に相補的である。一の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は染色体組換えにかかわる遺伝子の転写産物（核酸配列またはｍＲＮＡを転写した）と少なくとも部分的に相補的である。この実施形態において、遺伝子はＳＰＯ１１、ＭＥＲ１、ＭＥＲ２、ＭＲＥ２、ＭＥＩ４、ＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４、ＭＥＫ１／ＭＲＥ４、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＰＲＤ３、ＰＨＳ１、ＮＢＳ１、ＣＯＭ１、ＲＨＤ５４／ＴＩＤ１、ＤＭＣ１、ＳＡＥ３、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＨＯＰ２、ＭＮＤ１、ＲＥＣ８、ＭＥＩ５、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＰＡ１、ＳＭＣ３、ＳＣＣ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＳＯＬＯＤＡＮＣＥＲＳ、ＨＩＭ６、ＣＨＫ２、ＳＧＳ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＭＥＲ３／ＲＣＫ、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ３、ＺＩＰ４、ＰＴＤ、ＳＨＯＣ１、ＺＹＰ１、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、またはそれらの機能的ホモログを含む群から適当に選択される。
【００３５】
他の実施形態において、第一の植物の根茎においてトランスジェニック核酸配列により生成され、第二の植物の接ぎ穂によって生産された雄性減数分裂細胞へ、接合面を超えて浸透性で輸送されたポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡポリヌクレオチドは、典型的には、以前の実施形態のＲＮＡポリヌクレオチドと同じサイズ、すなわち、約１８ヌクレオチドと約２７ヌクレオチドの間、のサイズを有する。これらのＤＮＡポリヌクレオチドは核ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または他のＤＮＡ分子から得ることができる。
【００３６】
本発明はさらに、核酸配列を遺伝子導入で保有する根茎を含む第一の植物と、該第一の植物の根茎上に接ぎ木された第二の植物からの接ぎ穂を組み合わせ、それにより、該トランスジェニック核酸配列が、第一の植物の根茎中に、第二の植物の接ぎ穂により生産される雄性減数分裂細胞を導入するために接合面を超えて浸透性で輸送され、少なくとも部分的に、第二の植物のゲノムに含まれるＤＮＡ断片と相同であるポリヌクレオチド分子を生成することにより、植物の雄性減数分裂細胞のゲノム配列を特異的に改変するための方法に関する。
【００３７】
この実施形態において、雄性減数分裂細胞のゲノム配列における標的化ヌクレオチド交換を実行するために、雄性減数分裂細胞における相同組換えの利点を活用する。これは、例えば染色体組換えが起こる段階、または染色体が容易に利用しやすい段階の間に、雄性減数分裂細胞において小ＤＮＡポリヌクレオチドの存在により達成できる。
相同組換えを通じて（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：  ４０２１−４０２６；  Ｍｅｎｇｉｓｔｅ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  Ｊ，  １９９９，  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８０：  ７４９−７５８；  Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ＡＣ  ａｎｄ  Ｈｏｏｙｋａａｓ  ＰＪＪ，  １９９９，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １８：  １−３１）、またはオリゴヌクレオチドベースの変異導入を通じて（Ｏｈ  ＴＪ  ａｎｄ  Ｍａｙ  ＧＤ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：  １６９−１７２；  ＫｅｙＢａｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＷＯ２０１００７４５６２，ＥＰ２１６７６６０，ＷＯ２００７０７３１４９）、植物ゲノムに特定の変異を導入できる。このために使用されるポリヌクレオチドは、ゲノムにおける標的化されたヌクレオチド交換または点変異を起こすことを意図するゲノムの標的化配列の中央に本質的に位置する１以上のミスマッチを除いて、本質的に遺伝子配列と相同である。
【００３８】
本発明は続いて、本発明のいかなる方法でも限定する意図ではない実施例でさらに例証されるであろう。実施例では、以下の図面への参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】接ぎ木されたタバコ植物の代表的な写真。非トランスジェニック接ぎ穂はトランスジェニック根茎に接ぎ木され、すべての葉が、接ぎ穂の先端領域（シンク組織）へのソース組織（根茎）からの篩部移動性（ｐｈｌｏｅｍ−ｍｏｂｉｌｅ）サイレンシングシグナルを強いるため、接ぎ穂から除去された。
【図１Ｂ】接ぎ木された植物から採取された花粉のサイトメトリ分析（ＦＡＣＳ）で使用された接ぎ木の組み合わせの概要図。ヒストグラムはよう化プロピジウムによって染色された花粉コートおよび核の、サイズ（散光）および蛍光強度を示す。コントロール接ぎ木（野生型／野生型）で得られた数は、高度に再現可能である。対照的に、ＤＭＣ１  ｓｉＲＮＡトランスジェニック接ぎ穂（逆接ぎ木）またはＤＭＣ１  ｓｉＲＮＡ系上で接ぎ木された野生型接ぎ穂（真の接ぎ木）からの花粉に関するサイズとＤＮＡ含量は有意に改変される。数は、無または低量の異常花粉を生産する雄性不稔性花（番号１および２）、および通常の花粉生産の葯（番号３）を形成する接ぎ穂の葯の代表的な画像を示す。
【図２】（上欄）接ぎ穂の花から分離された小胞子４分子のＤＡＰＩ染色（青）の顕微鏡画像。ＤＭＣ１  ｓｉＲＮＡ生産接ぎ穂（中央画像）上、およびＤＭＣ１サイレンシング系に接ぎ木された野生型植物（右画像）におけるアンバランスな４分子（矢印）の外観に注目。（下欄）接ぎ穂の花から採取された花粉の走査電子顕微鏡画像。コントロール接ぎ木（野生型／野生型）からの花粉粒は標準の形およびサイズであった。対照的に、ＤＭＣ１サイレンシング系に接ぎ木された野生型接ぎ穂は、大小の差がある歪んだ花粉粒を生産した。１個のシュートあたりの歪んだ花粉の数が、一次花において、遅咲きの花より多いことに注目。この観測は、ＤＭＣ１  ｓｉＲＮＡ系上に接ぎ木された野生型接ぎ穂上で形成された第一の花に現れる不稔性葯表現型と関連づけられた。
【図３】カラー（左）および白黒（右の）の両方での、３５Ｓ：：ＹＦＰ−ΔＮ  ＤＭＣ１花芽におけるＤＭＣ１サイレンシングシグナルの観察された拡散の概要図。緑色または点は、ＹＦＰレポーター構築物のサイレンシングが全く観察されなかった植物の部分を示す。青または縞の部分は、ＤＭＣ１サイレンシング（＝ＹＦＰシグナルの消滅）の存在を示す。ＤＭＣ１サイレンシング（青または点）はがく片および心皮、および葯の胞子形成組織で観察された。ＹＦＰレポーター構築物のサイレンシングは、雌しべ、心皮または胚珠などの雌性器官（緑色／縞）、または花序上で遅れて形成された花芽で観測されなかった。ＤＭＣ１サイレンシングの観察された拡散が、二番目のシュートから現れる花序において現れる第一の花芽の中で繰り返されたことに注目。
【実施例】
【００４０】
実施例１
タバコ植物の安定な形質転換
トランスジェニックタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｖａｒ．  ＳＰ１）植物を、Ｈｏｒｓｃｈ  ＲＢ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：  １２２９−１２３１に記載される方法により、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウムツメファシエンスＬＢ４００４株との葉片形質転換で得た。
【００４１】
実施例２
タバコにおける接合面を超えるｓｉＲＮＡの長距離輸送を通じたｉｎ  ｖｉｖｏでの染色体組換えの抑制
典型的に、植物の雄性減数分裂細胞に起こるプロセスの重要な例は減数分裂を行う染色体組換えである。本発明はトランスジェニック根茎の上に接ぎ木された接ぎ穂によって生産される雄性減数分裂細胞に送達される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を生成する根茎における導入遺伝子によって減数分裂を行う染色体組換えの干渉を許容する。
【００４２】
この証拠を提供するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＴＡＩＲ：ＡＴ３Ｇ２２８８０；構成的プロモーターによって駆動される発現）からのＤＭＣ１遺伝子（ＤＩＳＲＵＰＴＥＤ  ＭＥＩＯＴＩＣ  ｃＤＮＡ１）の異所的に発現したＲＮＡｉヘアピン構築物を有するトランスジェニックタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｖａｒ．  ＳＲ１）が、実施例１の方法により、生産された。ＤＭＣ１は減数分裂細胞サイクル特異的因子、および減数分裂細胞に存在する高度に保存されたＲｅｃＡ−タイプリコンビナーゼファミリー（ＤＮＡ依存ＡＴＰ−アーゼ）のメンバーであり、例えば、葯の花粉母細胞および胚珠の大胞子母細胞である（Ｄｏｕｔｒｉａｕｘ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５７：  ２８３−２９１）。ＤＭＣ１は、その結果インターホモログ組換えおよび二価形成、およびその結果としての適切な花粉、および胚珠発育に重要であることが示された。機能的なＤＭＣ１遺伝子産物の不足は、異常な数の染色体を含む変則的な花粉粒の形成をもたらす、非キアズマ型減数分裂を誘導する。胞子の染色体数は、第二の減数期に起こる姉妹染色分体の規則的な減数分裂分離に依存する。
【００４３】
植物は温室条件（１６時間の光、２５℃の日中温度、および２０℃の夜間温度）で土壌で育てられ、明確にＤＭＣ１のサイレンシング表現型を示している３個の形質転換系統が、追加実験のために選択された。このサイレンシング表現型は、雄性減数分裂細胞でＤＭＣ１転写産物を標的化するｓｉＲＮＡ分子の存在によって引き起こされた、機能不全の減数分裂を示す状態である、連続して低レベルの内因性ＤＭＣ１  ｍＲＮＡ、減数分裂の後のアンバランスな小胞子４分子の構成、少なくとも部分的な雄性不稔、および不規則に形成された（異数体）花粉を含む。
【００４４】
野生型植物からの接ぎ穂はこれらの選択された形質転換系統（長さが約１０ｃｍである第一葉）からの３〜４週間目の植物に接ぎ木された。１の植物の底部（トランスジェニック根茎）が他の植物の上部（野生型接ぎ穂）を支持する、この２つの植物が、それゆえ組み合わせられる。通常３番目と４番目の葉の間で、４５°の角度でかみそりの刃で接ぎ木に切込みを入れた。移動の間、接合面が整列するまでに、接ぎ穂の茎はすぐに、水の中に沈められた。ようじを、接合面からのいくらかの蒸発を促進するために、パラフィルムと包まれた茎の間の空間保持のために用いた。
【００４５】
篩部仲介分子（ｐｈｌｏｅｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の輸送を接ぎ穂の先端領域に向かって強制するために、接ぎ木の後に、接ぎ穂上に現れた新たな葉および根茎上に現れた第二のシュートを切除した。すなわち、成功している接ぎ木は根茎と接ぎ穂との間の管の接続の形成をもたらし、篩部輸送はシンク組織（例えば、分裂組織部位および新たに現れている葉など）に向けられる。接ぎ穂の先端領域が植物で地面の上に唯一残っているシンク組織であることを確実にすることによって、事実上、その先端領域に篩部輸送を向けることができ、ここで、花が形成されるであろう。コントロール接ぎ木、すなわち、野生型接ぎ穂が野生型根茎に接ぎ木されている、は実験に含められ、トランスジェニック接ぎ穂はトランスジェニックまたは野生型根茎に接ぎ木された。
【００４６】
接ぎ穂のとう立ちは接ぎ木の約３週間後に起こった。葯の予備試験は接ぎ穂か根茎のどちらかがトランスジェニックであるすべての接ぎ木における花粉の生成における欠乏を明らかにした（図１Ｂ）。この表現型はＤＭＣ１のサイレンシング表現型と一致していた。全体の接ぎ穂がトランスジェニックである、前者の場合は、これは驚くべきものではなく、ＤＭＣ１に対して向けられた減数分裂細胞ｓｉＲＮＡ分子の中に、このようにして作り出された。しかしながら、後者の場合では、現在の発明で教えられるように、−ＤＭＣ１に対して向けられたＲＮＡｉヘアピン構築物により生成されるｓｉＲＮＡ分子が、トランスジェニック根茎から動員され、師管液で接ぎ穂に浸透性で輸送され、接ぎ穂の花芽の胞子形成組織の中で生産された雄性減数分裂細胞に送達された−ことを暗示する。
【００４７】
接ぎ穂自体がトランスジェニックであったコントロール接ぎ木では、この雄性不稔はすべての花で観測され、一方で、接ぎ穂が野生型（トランスジェニック根茎に接ぎ木される）であった接ぎ木は、効果が第一の花に制限された。第一の花はほぼ不稔であったが、後の花は完全に繁殖力を有した。篩部仲介ｓｉＲＮＡシグナルは、それゆえ、優先的に、篩管液が接ぎ穂の頂点に向かった途中で遭遇した最初のシンク組織である、最初に生産された花に入った。また、雄性不稔表現型は第二のシュートで発生した最初の花で観測された。
【００４８】
トランスジェニック根茎に移植された野生型接ぎ穂からの第一の花のより詳細な試験を実施し、−野生型花粉からのサイズ分布および蛍光放出との高度に再現可能な関係に基づいて−蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析は、野生型花からの花粉と比較して、花粉のサイズにおけるより高い可変性（不規則な分布）を明らかにした。
【００４９】
この観察は走査電子顕微鏡で確認され、ＤＭＣ１  ｓｉＲＮＡ−産生トランスジェニック根茎によって支持された野生型接ぎ穂の第一の花によって生産された花粉は、奇形でより小さい外観を有した。後の花からの花粉は正常であった（図２）。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
この表現型をさらに説明するために、花粉の発育における初期段階が調査された。コントロール接ぎ木（野生型根茎上の野生型接ぎ穂）では、小胞子４分子は、全て標準的外観で、均衡であった（ｎ＝１００）。しかしながら、トランスジェニック根茎に移植された野生型接ぎ穂では、４分子の総合的な数は第一の（初期の）花で少なく、これらの４分子の有意な数が、１つの４分子細胞における小核の外観で示されるように、不均衡（ｎ＞１００で最大１０％）であった（図２）。不均衡な４分子形成は、減数分裂の間、ＤＭＣ１活性欠失に関連する典型的な表現型の１つである。
【００５２】
ＤＭＣ１もまた雌性生殖器官で活性である一方で、トランスジェニック根茎に接ぎ木された野生型接ぎ穂の雌性生殖器官におけるＤＭＣ１サイレンシングのいかなる証拠も明らかにならなかった。野生型花粉で受粉すると、正常な雌性繁殖力を示し、正常数の生育能力のある種子を生産した。
【００５３】
ＲＮＡｉシグナルの浸透性輸送を通じた雄性減数分裂細胞でのＤＭＣ１サイレンシングをさらに調査するために、実施例１に記載の方法を用いて、もう１セットのトランスジェニックタバコ植物を生成した。これらの植物は構成的カリフラワーモザイク３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）によって駆動される、可視レポーターとして機能する黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）と融合した、最初の２７６ｂｐ（すなわち、Ｎ−末端における９２アミノ酸の削除に至る）を欠くシロイヌナズナの機能不全で、不完全なＤＭＣ１  ｃＤＮＡを含む３５Ｓ：：ＹＦＰ：ΔＮ−ＤＭＣ１トランスジェニックレポーター構築物を有した。
【００５４】
これらのトランスジェニック植物−融合タンパク質の過剰発現による遍在的な蛍光シグナルを通常示す−からのシュートは、続いてＤＭＣ１サイレンシング構築物を有するトランスジェニック根茎上に接ぎ木された。接ぎ穂上に新たに発生した花芽が試験され、第一の（初期の）花芽において、ＹＦＰ蛍光シグナルは心皮および柱頭で強いが、葯の中では無かった。これは、最初の花芽において、浸透性サイレンシングシグナルが好ましくは葯に送達されることを示した（図３）。
【００５５】
それゆえ、この実施例はタバコの雄性減数分裂細胞で、これらの減数分裂細胞または雄性配偶子をそれらがトランスジェニックとなること無しに、どのように染色体組換えを効率的に抑制できるかを教示する。本発明は、好ましい実施形態において、例えば非トランスジェニック子孫との、逆育種（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）（ＷＯ０３０１７７５３）の適用を許容する。この概念は実施例３でさらに説明される。
【００５６】
ＤＭＣ１遺伝子がこの実施例で標的化される一方で、減数分裂を行う染色体組換えのいずれかの段階に機能的にかかわるいかなる他の遺伝子も、同様の結果で標的化できた。
【００５７】
実施例３
浸透性サイレンシングシグナルにより仲介されるブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物における非トランスジェニック逆育種
実施例２で概説された実験的アプローチがブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）に適用され、異所的に発現する、ＳＤＳ（ＳＯＬＯ  ＤＡＮＣＥＲＳ）遺伝子に対するヘアピンＲＮＡｉサイレンシング構築物を有するトランスジェニック根茎をもたらした。これらのトランスジェニック根茎に、種間Ｆ１ハイブリッド（ラファヌス・サティバス（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）×ブラシカ・オレラセア）からの野生型ハイブリッド接ぎ穂は移植され、サイレンシングシグナルは、実施例２に記載のように、すべての接ぎ穂の葉を除去することによって、雄性減数分裂細胞に向かって強制された。接ぎ穂によって生成された第一の花芽は、有意な割合の異常な小胞子４分子を含み、これらの花は主に雄性不稔性であった。
【００５８】
接ぎ穂上に生成された第一の花芽が約３ｍｍのサイズであったときに、そこに発生した小胞子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの小胞子再生のための最適の段階（雄性発生）に達した。これらの芽から小胞子を回収し、半数体胞子の胞子体発生を誘導するために最適な、３２℃で２日間のストレス処理を与えた。均衡な（正倍数体）小胞子が当業者に知られている方法（例えば、Ｓｗａｎｓｏｎ  ＥＢ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ６：  ９４−９７；  Ｔａｋａｈａｔａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  ＷＡ，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７４：  ２３５−２４２）を使用することで半数体小植物に再生され、次いでコルヒチン処理が、半数体または染色体の完全な相補体との倍加半数体（ＤＨ）植物体をもたらす、ゲノム倍加のために用いられた。
【００５９】
雄性減数分裂細胞のＤＭＣ１サイレンシングによる染色体組換えの抑制により、この方法で得られたＤＨ植物の染色体は組み替えられておらず、接ぎ木のための接ぎ穂として用いられたハイブリッド植物の親系統の染色体としての正確な遺伝子構成を有した。これは、接ぎ木の接ぎ穂として用いられたＦ１ハイブリッドの親であるラファヌス・サティバスおよびブラシカ・オレラセア間の多形である分子マーカー（染色体あたり２つ、すなわち、染色体腕あたり１つ）で確認された。
【００６０】
同じ組の分子マーカーを用いて、接ぎ穂の葯から回収された小胞子から再生されたＤＨ植物は、遺伝学的に相補的である、すなわち接ぎ木の接ぎ穂として使用されたハイブリッドに存在する染色体の正確な組に相当するＦ１で組み合わせられた時に親染色体の組みを含む、個体を特定するためにスクリーニングされた。これらの相補的な個体の交雑は、ハイブリッド遺伝子型（ラファヌス・サティバス×ブラシカ・オレラセア）の正確な再構成をもたらした。
【００６１】
この実施例はそれゆえ、本発明がどのようにハイブリッド遺伝子型を正確に再構成できるかを説明する。重要なことに、これはＤＨ生産が雄性減数分裂細胞の一時的なｓｉＲＮＡシグナルを通じて達成されるのに先だつ染色体組換えの抑制として、再構成されたハイブリッド植物をトランスジェニックとすることなしに達成された。
【００６２】
これまでの実施例で概説されたアプローチは、他の植物種にも適用できる。それはまた、木（例えば、ポプラ、およびりんご、洋梨、チェリー、モモ、プラム、バナナ、柑橘類、パパイア、イチジクなどの果樹、など）およびブドウ植物などの、長期のライフサイクルをもつ作物種にも特に有用である。本発明は、そのような作物の種子繁殖特異的形質に使用でき、導入遺伝子なしの有望系統がより早く作出でき、数年間もの伝統的な繁殖の努力を避けることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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