(57)【要約】  【解決手段】  ヒト多能性幹細胞から生じる自己複製する内胚葉前駆株とその使用方法が開示される。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆（ＥＰ）細胞を生成する方法であって、
ａ）無血清分化培地で幹細胞をアクチビンＡに接触させる工程であって、それにより胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の形成を誘導するものである、前記接触させる工程と、
ｂ）基質および選択的に繊維芽細胞フィーダー層で覆われたプレート上で、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＥＧＦ、あるいはそれらのホモログとともに低酸素でＤＥ細胞を培養する工程であって、それによりＥＰ細胞を生成するものである、前記培養する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記細胞はＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＨＮＦ４Ａを発現し、且つＯＣＴ４あるいはＮＡＮＯＧを欠損しているものである、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記細胞は内胚葉組織に分化するように誘導されるものである、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記組織は、肝組織、膵臓組織あるいは腸組織から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記組織は膵臓組織であり、且つ前記組織中の細胞はＫＣＩでの化学的脱分極に機能的に応答するものである、方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記組織は膵臓組織であり、且つ前記組織中の細胞はＤ−グルコースによる刺激に機能的に応答するものである、方法。
【請求項７】
請求項４記載の方法において、前記組織は腸の組織であり、且つ前記細胞はＣＤＸ２、ＫＬＦ５、およびＬＹＺを発現するものである、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記幹細胞は、胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞である、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記ＥＰ細胞は、免疫欠損マウスの中に移植される場合、ＥＳＣあるいはｉＰＳＣの腫瘍形成能力をもたないものである、方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記細胞は、繊維芽細胞フィーダー細胞層上に培養されるものである、方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法によって生成される、機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆（ＥＰ）細胞。
【請求項１２】
機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆（ＥＰ）細胞を生成する方法であって、
ａ）無血清分化培地で幹細胞をアクチビンＡに接触させる工程であって、それにより胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の形成を誘導するものである、前記接触させる工程と、
ｂ）基質および選択的に繊維芽細胞フィーダー層で覆われたプレート上で、ＴＧＦ−ベータ誘導剤の存在下でＤＥ細胞を培養する工程であって、それによりＥＰ細胞を生成するものである、前記培養する工程と
を有する方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記細胞はＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＨＮＦ４Ａを発現し、且つＯＣＴ４あるいはＮＡＮＯＧを欠損しているものである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、前記細胞は内胚葉組織に分化するように誘導されるものである、方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法によって生成される、機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆（ＥＰ）細胞。
【請求項１６】
請求項１記載の方法において、ＢＭＰ４のホモログあるいはファミリーメンバーは、ＢＭＰ４と代替するものである、方法。
【請求項１７】
請求項１記載の方法において、ｂＦＧＦのホモログあるいはファミリーメンバーは、ｂＦＧＦと代替するものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年６月２３日付けで出願された米国仮特許出願第６１／５００，４２２号に基づく優先権を主張するものである。この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
この発明は、細胞に基づくおよび移植治療の分野に関連する。より具体的には、本発明は、ヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から取得した内胚葉前駆細胞の発生のための最適な増殖条件を提供する。
【背景技術】
【０００３】
一部の公報および特許文献は、本発明が関連する最先端の技術を説明するために本明細書全体において引用される。夫々のそれらの引用は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）を含むヒト多能性幹細胞（ＰＳＣｓ）は、それらの無制限のインビトロでの増殖能力および全ての組織型を作製する潜在力のため、基礎生物学および細胞に基づいた治療の両方において極めて見込みがある（Ｍｕｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  ２００８；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。インビトロでの分化に際して、それらの幹細胞集団は、様々な成熟細胞型を生じさせながら初期胚発生を反復する（Ｍｕｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  ２００８）。
【０００５】
胚形成中、胚盤胞内部細胞集団は、胚盤葉上層として知られる上皮集団を生じる。これらの細胞は、中胚葉や胚体内胚葉（ＤＥ）を生じさせて、原腸形成中に原始線条を妨害する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。発生期のＤＥの上皮層は、それから折り重なり、前後軸に沿った３つの主要な領域（前腸、中腸、後腸）から成る初期の腸管を形成する。これらの領域はさらに、さまざまな内胚葉器官の原基が発芽する特別な部分に洗練される（Ｚｏｒｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，２００９）。前記前腸は、最終的には食道、気管、肺、甲状腺、副甲状腺、胸腺、胃、肝臓、胆管系、および膵臓を生じさせ、中腸および後腸が小腸および大腸を形成する。
【０００６】
肝臓および膵臓を含む内胚葉由来の細胞は、細胞置換療法に使用される可能性がある。胚形態形成を模倣するサイトカインに順次暴露して、ＤＥとＰＳＣｓから派生した系統とをインビトロで作製することが可能である。このように、肝臓、腸、および膵臓の細胞は、ＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓから作り出され得る（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｂａｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらの研究が移植療法のためのＰＳＣ由来の内胚葉組織の有望さを注目させる一方で、いくつかの障害は残されたままである。ＰＳＣｓから作製された内胚葉細胞は、未熟な表現型を示し、多くの例において完全には機能しない傾向がある。例えば、ヒトＥＳＣｓからインビトロで現在のところ作製されるほとんどの膵臓ベータ細胞は、ポリホルモンであり、グルコース反応はない（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。加えて、ＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓの多能性の性質は、たいていの分化プロトコルにおいて、異なった胚葉からの多細胞を作り出す結果となる（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。従って、ＰＳＣｓから理想的な細胞型の純粋な単系統の培養を作り出すことは困難である（Ｍｕｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，２００８）。最後に、未分化のＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓは発癌性があり、そのため移植で使用される派生した組織から完全に取り除かなければならない（Ｈｅｎｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００７】
これらの制限を回避する培養および単離方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、機能的な、非腫瘍形成性の、自己複製する内胚葉前駆（ＥＰ）細胞を作製する方法が提供される。例示的な方法は、無血清分化培地中で幹細胞をアクチビンＡに接触させる工程であって、それによって胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の形成を誘発するものである、前記接触させる工程を有する。前記幹細胞は、胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞であってもよい。そのように作り出された前記ＤＥ細胞は、それから適当な期間にわたって、基質と選択的に繊維芽細胞フィーダー層とで覆われたプレート上で、ＢＭＰ４，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，およびＥＧＦの存在下で、低酸素状態で既知培地で培養され、これによりＥＰ細胞を作り出す。代替的アプローチでは、そのように処理された前記細胞は、ＴＧＦ−ベータ誘導剤で培養され、これによりＥＰ細胞を作り出す。そのように作成された前記ＥＰ細胞は、ＳＯＸ１７，ＦＯＸＡ２、およびＨＮＦ４Ａを発現し、ＯＣＴ４あるいはＮＡＮＯＧの発現が欠損している。
【０００９】
本発明のさらなる他の実施形態では、前記ＥＰ細胞は、例えば肝臓細胞、膵臓細胞あるいは腸細胞を含む内胚葉組織に分化するために誘導される。
【００１０】
本発明の方法を使って作り出された膵臓組織は、ＫＣＬでの化学的脱分極に機能的に応答し、またＤ−グルコースによる刺激に応答する。作成された腸組織は、ＣＤＸ２，ＫＬＦ５、およびＬＹＺの発現を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１．ヒトＥＳＣｓ由来の分化培地で特定される推定胚体内胚葉前駆集団。前記ヒトＥＳＣ株Ｈ９は、肝臓系統に分化した。（Ａ）４週間維持された培養の位相差画像は、二つの異なった型の集団を示す（分化  対  前駆）。尺度図は１００ｎｍを示す。画像は２０Ｘのオブジェクティブで取り込まれた。（Ｂ）Ａに示されたコロニー型は手動で選ばれ、集団の中に入れ、そして遺伝子発現は未分化ＥＳＣｓと比較して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した（省略−ＥＳ：胚幹細胞；Ｄｉｆｆ：分化細胞；Ｐｒｏｇ：前駆細胞コロニー）。示された遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子サイクロフィリンで標準化して示した。値は、それぞれの集団の３つの個々のプールの平均を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。（Ｃ）培養は、３つの別々の染色剤においてフローサイトメトリーによって、ＣＤ１１７（ＫＩＴ）対ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７対ＦＯＸＡ１、およびＳＯＸ１７対ＣＸＣＲ４の測定を行った。
【図２】図２．内胚葉前駆細胞の精製および維持。（Ａ）図１で示すように、内胚葉前駆細胞を含む培養は、ＣＸＣＲ４発現に基づいて分類された。遺伝子発現は、ＱＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＣＸＣＲ４＋細胞は、図１で示すように培養され、１あるいは３継代後、培養は、細胞内フローサイトメトリーによって、ＳＯＸ１７対ＦＯＸＡ１発現の測定を行われた。（Ｂ）ＥＰ細胞株は、高レベルのアクチビンＡによって誘発された５日目のヒトＥＳＣ分化培養から胚体内胚葉（ＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７高）細胞を分類することによって、および細胞を最適な状態（テキスト参照）で培養することによって確立された。画像は、１０Ｘおよび２０Ｘオブジェクティブを使用して取り込まれ、ＥＰ細胞コロニー（Ｈ９−ＥＰ）の典型的形態を示す。（Ｃ）Ｈ９  ＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓから由来されるＥＰ細胞株は培養され、細胞増殖は各継代での細胞カウントによって分析される。左のパネル：グラフは、経時的に相対細胞増殖を示す（正方形：ｉＰＳＣ２由来のＥＰ細胞株；円形：Ｈ９由来のＥＰ細胞株）。右のパネル：２４（Ｈ９−ＥＰ）あるいは２０継代（ｉＰＳＣ２−ＥＰ）後の細胞内フローサイトメトリーによるＳＯＸ１７対ＦＯＸＡ１表現。
【図３】図３．ＥＰ細胞の核型。（Ａ−Ｂ）Ｈ９−ＥＰ細胞株の核型、継代３および１８。（Ｃ−Ｄ）ｉＰＳ２−由来のＥＰ細胞株の核型、継代７および１４。
【図４】図４．ＥＰ細胞の維持と分化のためのサイトカイン条件とクリティカルシグナル伝達経路。（Ａ−Ｂ）ＥＰ細胞の維持において、ＢＭＰ４，ｂＦＧＦ，ＶＥＧＦおよびＦＧＦの条件を確立するために、４ｘ１０４細胞を、示したようなさまざまな培地条件で一週間１２ウェルプレートの中のＭＦＦのフィーダー層を持つマトリゲル上で培養した。それぞれの条件において、４つのサイトカインのうちの一つを除外し、またはシグナル経路の阻害剤を加えた。前記Ｈ９−ＥＰ細胞株は、最適なＥＰ基本培地（ＢＡＳＩＣ）で、またはＢＭＰ４，あるいはｂＦＧＦ、あるいはＶＥＧＦの非存在下で１週間培養した。（Ａ）ＳＯＸ１７対ＰＤＸ１、あるいはＳＯＸ１７対ＦＯＸＡ１のフローサイトメトリー分析を示す。（Ｂ）グラフは、示されたようなさまざまな培地条件下で７日間の増殖後の細胞の総細胞数を示す。−は、除外したものを示し、＋は追加したものを示す。（Ｃ−Ｄ）ＥＰ細胞の維持および分化におけるＴＧＦシグナルの役割を評価するために、小分子阻害剤ＳＢ４３１５４２がＥＰ培地に加えられる。（Ｃ）Ｈ９−ＥＰ細胞は、標準のＥＰ培地（ＢＡＳＩＣ）あるいはＳＢ４３１５４２（６Ｍ）が補充されたＥＰ培地で、ＢＭＰ４（−ＢＭＰ＋ＳＢ）の存在下（＋ＳＢ）あるいは非存在下で培養した。細胞は６日目で採取した。ＳＯＸ１７対ＦＯＸＡ１のフローサイトメトリック分析を示す。（Ｄ）Ｈ９−ＥＰ細胞は、ＳＢ４３１５４２の存在（ＳＢ、赤い丸）あるいは非存在（ＢＡＳＩＣ，青い四角）で３継代の間培養され、細胞増加はそれぞれの継代ごとに細胞カウントすることによって分析される。グラフは、時間経過による相対的な細胞増加を示す。（Ｅ）膵臓分化の際のＥＰ細胞におけるＴＧＦ阻害剤の影響を評価するために、Ｈ９−ＥＰおよびｉＰＳ２−ＥＰ細胞は５日間でＳＢ４３１５４２の存在下で培養され、それから膵臓の中に分化された。細胞は分化の１４日目で採取し、ＳＢ未処理群（ＢＡＳＩＣ）から派生した細胞と比較した。Ｃ−ペプチド対グルカゴンのフローサイメトリック分析を示す。
【図５】図５．ＥＳＣｓおよび一過性胚体内胚葉と比較したＥＰ細胞の遺伝子発現マイクロアレイ解析。（Ａ−Ｃ）浄化されたＥＳＣｓ（ＳＳＥＡ３ｈｉｇｈ  ＳＳＥＡ４ｈｉｇｈで分類される）、一過性内胚葉（５日目に高アクチビンで処理され、分類済みのＣＸＣＲ４ｈｉｇｈ  ＣＤ１１７ｈｉｇｈ）およびＥＰ細胞（分類済みのＣＸＣＲ４ｈｉｇｈ  ＣＤ１１７ｈｉｇｈ）は遺伝子発現マイクロアレイを使って分析した。省略−Ｔ０：ＥＳＣｓ；Ｔ５；一過性内胚葉；ＥＰＣ：ＥＰ細胞）（Ａ）電泥グラムによってクラスター化した、ＥＳＣ，一過性内胚葉細胞およびＥＰ細胞グローバル発現プロファイル。（Ｂ）Ａにおける集団の主成分分析。（Ｃ）多能性、原始線条／中内胚葉、胚体内胚葉および細胞表面マーカーに関連する遺伝子の発現レベルのヒートマップ。（Ｄ）Ｃで検査された遺伝子の一部の量的なＲＴ−ＰＣＲ確認。発現レベルは、多能性遺伝子、原始線条遺伝子の一過性内胚葉、および胚体内胚葉遺伝子のＥＰ細胞それぞれがＥＳＣにおいて１に標準化される。
【図６】図６．インビトロでの内胚葉前駆細胞の肝臓の分化。（Ａ−Ｃ）前記Ｈ９−ＥＰ細胞株からおよび単一細胞由来のサブクローン（クローン２）からの細胞は、記載されたように肝細胞に分化され、１４、２０、および２７日目（Ｔ１４、Ｔ２０およびＴ２７）で分析のために採取された。（Ａ）遺伝子発現は、非分化のＥＰ細胞（Ｔ０）と比較して、Ｈ９−ＥＰおよびクローン２細胞株から３時点で採取されたサンプル上でＱＲＴ−ＰＣＲによって解析された。示された遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子であるサイクロフィリンに標準化される。値は、３つの独立した分化実験の平均をあらわす。エラーバーは、標準誤差を示す。（Ｂ）非分化のＥＰ細胞（Ｔ０  ＥＰＣ）と比較して、分化の２０日目でＡＦＰ対ＦＯＸＡ１，ＡＡＴ対ＦＯＸＡ１あるいはＡＳＧＰＲ１対ＣＸＣＲ４のフローサイトメトリー解析を示す。それぞれの四分円内の細胞の割合が示される。Ｈ９−ＥＰ（継代１０）およびクローン２ＥＰ（継代６）細胞からの代表的データを示す。（Ｃ）ＥＰ細胞由来の肝細胞のＣＹＰ３Ａ４活性化を評価するために、Ｈ９−ＥＰ細胞（継代１５）は、２４日間肝細胞に分化され、それからリファンピシンの存在（リファンピシン）あるいは非存在（ＤＭＳＯ）で培養され、ＨｅｐＧ２細胞と比較される。値は、６Ｘ１０４に標準化された一定量の発光単位の平均を示し、エラーバーは、ＳＥ（ｎ＝３）を表す。
【図７】図７．インビトロでの内胚葉前駆細胞の膵臓の分化。前記Ｈ９−ＥＰ細胞株（継代６−１２）からの（Ａ−Ｄ）細胞と一つの単細胞由来のサブクローン（クローン２）（継代５−１１）からの細胞は、前記テキストで示されたように膵臓細胞の中に分化された。細胞は、１２日目（Ｔ１２）から１８日目で分析のため採取された。（Ａ）ヒト膵島細胞（膵島）の免疫蛍光染色およびｃ−ペプチド（赤）およびグルカゴン（緑）あるいはＰＤＸ１（緑）のための１４日目ＥＰ細胞由来膵臓培養（ＥＰ）。縮尺バーは１００μｍを示す。（Ｂ）は、Ｃ−ペプチド対グルカゴンおよびｃ−ペプチド対ソマトスタチンの分化の１２日目の細胞内フローサイトメトリー分析である。（Ｃ）遺伝子発現は、分化の１８日目で採取したサンプル上でＱＲＴ−ＰＣＲによって、成熟した膵島細胞と比較して、分析される。示された遺伝子の発現は、膵島の中に１に正常化される。数値は３つの独立した分化実験あるいは成熟した膵島２つの群の平均を示す。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｄ）ＳＳＴあるいはＧＣＧのどちらかを共発現させるｃ−ペプチド＋細胞の割合は、定量化される。データは、ＥＰ細胞（Ｈ９−ＥＰ，ｎ＝１２；およびｉＰＳ２−ＥＰ，ｎ＝５）あるいはＨ９  ＥＳＣｓ（ＥＳＣ，ｎ＝４）から直接作り出された内分泌細胞を示す。（Ｅ）１２日目のＥＰ細胞由来の膵臓培地（青ヒストグラム）およびヒト膵島（赤で満たされたヒストグラム）からＣペプチド＋細胞でゲートされた、Ｃペプチド発現の内細胞フローサイトメトリック分析である。示された値は、Ｈ９−ＥＰ由来の細胞（青、ｎ＝６）およびヒト膵島（赤、ｎ＝２）におけるｃ−ペプチド平均的な染色明度である。（Ｆ）前記Ｈ９−ＥＰ細胞は、ベータ細胞の中に分化され、Ｄ−グルコースと２ｍＭ（基礎）あるいは２０ｍＭ（グルコース）を用いて１４日目で活性化され、成熟された膵島と比較される。Ｃ−ペプチドの放出は、さまざまな時点（５，１０，１５，２０および４０分）で測定された（Ｈ９−ＥＰ，ｎ＝３；膵島，ｎ＝２；エラーは標準誤差を示す）。アスタリスクはｔ−テスト、Ｐ＝０．０２２によって決められた統計的有意性を示す。
【図８】図８．さまざまなＥＰ細胞株の肝臓の分化。（Ａ）２０Ｘのオブジェクト、スケールバー＝１００ｍを用いて取り入れられた２０日目のＨ９−ＥＰ細胞の肝臓分化培地の位相差画像を示す。（Ｂ）遺伝子発現は、２つのＥＰ細胞株（Ｈ９−ＥＰおよびクローン１）から３時点で採取されたサンプルの上でＱＲＴ−ＰＣＲによって、非分化のＥＰ細胞（Ｔ０）と比較して分析された。示された遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＧに標準化される。値は、３つの独立した分化実験の平均を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。（Ｃ）非分化のＥＰ細胞（Ｔ０  ＥＰＣ）と比較して、Ｈ９−ＥＰクローン１から、および２つのｉＰＳ−ＥＰ（ｉＰＥＳ１およびｉＰＳ２）および肝臓由来のＥＰ細胞株（継代８、継代７、継代１５、および継代１０各々）から分化の２０日目でＡＦＰ対ＦＯＸＡ１、およびＡＡＴ対ＦＯＸＡ１のフローサイトメトリー分析。４分円内の細胞の割合が示される。（Ｄ）ＥＰ細胞由来の肝細胞のＣＹＰ３Ａ４活動を評価するために、ｉＰＳ−ＥＰ細胞（継代１２）は、２４日間肝細胞の中に分化され、それから３日間リファンピシンの存在（リファンピシン）で、あるいは非存在（ＤＭＳＯ）で培養され、そしてＨｅｐＧ２細胞と比較された。値は、６ｘ１０４細胞に標準化された発行単位測定の平均を示し、エラーバーはＳＥ（ｎ＝３単独の実験）を示す。
【図９】図９．インビトロでのさまざまなＥＰ細胞の膵臓の分化。Ｈ９  クローン１、ｉＰＳ１−ＥＰ、ｉＰＳ２−ＥＰからの細胞および肝臓由来のＥＰ細胞株（継代８、継代７、継代１２および継代１０各々）は、テキストに記載されたように膵臓の細胞の中に分化された。細胞は、１０日目（Ｔ１０）と１４日目（Ｔ１８）の間で分析の為に採取された。（Ａ）非分化のＥＰ細胞（Ｔ０  ＥＰＣ）と比較して、ＰＤＸ１対ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１対ＦＯＸＡ１、ｃ−ペプチド対グルカゴンおよびｃ−ペプチド対ソマトスタチンの分化の１０日目から１４日目での細胞内フローサイトメトリー分析。４分円内の細胞の割合が示される。（Ｂ）Ｃ−ペプチド対グルカゴンおよびアイソタイプのコントロール抗体の成熟膵島の細胞内フローサイトメトリー分析。（Ｃ）遺伝子発現の反応速度を示す。遺伝子発現は、非分化のＥＰ細胞（Ｔ０）と比較して、１０日目および１４日目で採取されたＨ９−ＥＰ、クローン１およびクローン２のサンプル上でＱＲＴ−ＰＣＲによって分析された。示された遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＧに標準化される。値は、４つの独立した分化実験の平均を示す。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｄ）はベータ細胞の中に分化され１４日目に２ｍＭ（基礎）あるいは２０ｍＭ（グルコース）でＤ−グルコースで活性化され、それから成熟膵島と比較された。Ｃ−ペプチド放出は、さまざまな時点（５、１０、１５、２０および４０分）（ｉＰＳ２−ＥＰ，ｎ＝３；成熟膵島，ｎ＝２；エラーバーは標準誤差を示す）で測定された。アスタリスクはｔ−テスト、Ｐ＝０．０２３によって決められたように統計的な有意性を示す。
【図１０】図１０．インビトロでの内胚葉前駆細胞の腸の分化。ＥＰ９−ＥＰ細胞株（継代６、９および１２）から、および２つの単一細胞由来のサブクローン（クローン１、継代６，７、および９；クローン２、継代５，６および８）からの細胞が、３０日目で腸のオルガノイドに分化され３０日目で採取された。（Ａ）２０Ｘのオブジェクトを用いて取り入れられ、培養の３０日目で典型的な腸のオルガノイドの形態を示す位相差画像。（Ｂ）遺伝子発現は、非分化のＥＰ細胞（Ｔ０  ＥＰＣ）および成体の腸のｃＤＮＡｓと比較して、（Ｈ９−ＥＰ、クローン１およびクローン２）上で、ＱＲＴ−ＰＣＲによって分析された。示された遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＧに標準化される。値は、３つの独立した分化実験の平均を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。（Ｃ）非分化のＥＰ細胞（Ｔ０  ＥＰＣ）およびヒトの腸腫瘍細胞株ＣＡＣＯ２と比較して、分化の３０日目でのＣＤＸ２の細胞内フローサイトメトリー分析。陽性細胞の割合が示される。
【図１１】図１１．ＥＰ細胞の神経外胚葉と中胚葉誘導。神経外胚葉と中胚葉の中に分化するＥＰ細胞の潜在性を評価するために、Ｈ９−ＥＰ細胞（継代５）およびＨ９  ＥＳＣｓは、神経外胚葉か中胚葉に対するｈＥＳＣ分化を促進するために設定された状態で誘導された。遺伝子発現は（神経外胚葉分化の４および８日目；中胚葉文化の１および４日目の）２つの時点で採取されたサンプル上でＱＲＴ−ＰＣＲによって分析され、非分化ＥＳ（ＥＳ）およびＥＰ（ＥＰ）細胞と比較された。示された遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＧに標準化される。値は、３つの独立した分化実験の平均を示す。エラーバーは標準誤差を表す。
【図１２】図１２．インビボで内胚葉前駆細胞の腫瘍潜在性および自発性分化。（Ａ）ＥＰ細胞が奇形腫形成可能性を保有するかどうかを決定するために、５０万個のＨ９ＥＳＣｓあるいはＨ９−ＥＰ細胞は、免疫力が低下したマウスに筋肉注射で移植された。イメージは、ＥＳＣｓ（ＥＳ，左パネル）を注入されたマウスの奇形種形成およびＥＰ細胞を注入されたマウスの奇形腫形成の不在（ＥＰ、右パネル）を示す。（Ｂ）多能性幹細胞（ＥＳ／ｉＰＳＣ）、５日目（Ｔ５）一過性内胚葉、ＥＳＣ由来の２０日目肝細胞培養（ＥＳ−由来の肝細胞；ＥＰ細胞（ＥＰＣ）およびＥＰ細由来の９日目肝細胞培養（ＥＰＣ由来の肝細胞）の奇形腫形成能力の概要。一過性内胚葉のため、両方のバルク培養およびＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７高に分類された細胞は、移植のために使用された。（Ｃ−Ｆ）ＥＰ細胞移植の分析。マトリゲルで混合された８００から１０００万個のＥＰ細胞は、免疫欠損マウスに皮下に中注され、そして結果として起こるマトリゲルプラグは、３−１２週間の移植後に分離された。スケールバーは、１００μｍを示す。（Ｃ）マトリゲルプラグの部分は、ヘマトキシリンとエオシンで染色された。内胚葉のような構造をより低い倍率で（１０Ｘ、左パネル）、およびより高い倍率（２０Ｘ、右パネル）で示す。（Ｄ）抗ヒト抗体を使う免疫組織化学は、ヒト以外の間充組織および含脂肪細胞によって囲まれたヒト細胞由来の内胚葉構造をあらわす。（Ｅ）腸のマーカーのための免疫組織化学は、マトリゲルプラグにおいて胃腸／腸の構造を示す。（Ｅ）マトリゲルプラグにおいて膵臓マーカーの免疫組織化学を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
臨床検査や細胞に基づく療法のためのヒト多能性幹細胞の使用は、インビトロで分化された細胞型の純粋集団を発生させる腫瘍形成の可能性や限定能力によって妨げられる。これらの課題に取り組むために、私たちはヒトの胚からの内胚葉前駆（ＥＰ）細胞株を確率させ、多能性幹細胞を誘導した。最適成長条件として、成体型内胚葉の形態と遺伝子発現パターン形成特性を表示している間、ほぼ制限なく（>１０１６）ＥＰ細胞の自己複製が可能であることが確立された。インビトロで培養条件の操作あるいはマウスに移植すると、クローン性ＥＰ細胞は、単一ホルモンのグルコに敏感な膵臓のベータ細胞、幹細胞、および腸管上皮を含む多数の内皮血統に分化する。重要なことは、ＥＰ細胞は、インビボで非腫瘍形成性である。
【００１３】
ヒト胚幹細胞（ＥＳＣｓ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）は、身体のあらゆる細胞型に分化するという潜在性に伴ってインビトロに拡張するそれらの能力により、基礎生物学および多様に広がる病気のための細胞に基づく治療の両方において、非常に大きな可能性をもたらす。ＥＳ／ｉＰＳ細胞の分化は、胚形成中に起こる進行の過程を模倣するように見える。これらの幹細胞群は、成熟細胞型が発生するまで連続した制限の可能性をもって発育過程を続行させる。最初に、第一の胚葉が形成され、さらに派生的な細胞型に成長する中胚葉、内胚葉、および外胚葉が形成される。幹細胞置換療法に特に魅力的である２つの内胚葉由来の組織型は、１型糖尿病および肝臓病をそれぞれ治療する膵臓膵島および肝細胞のベータ細胞である。現在、移植セッティングにおいて使用する膵島および肝臓の両方が深刻な不足状態にある。細胞療法のために使用されるヒトＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓのために、２つの障害を克服する必要がある：（１）ＥＳＣｓ／ｉＰＳＣｓからの腫瘍形成のため、安全性が問題視される。移植組織における非分化のＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓのわずかな汚染でさえ、腫瘍形成のリスクを負う。（２）移植のための成熟した機能的組織型を発生させる能力は、成長の全ての段階でＥＳＣｓを分化する必要性があるため、現在制限されている。
【００１４】
これらの両方の問題に対処するために、ヒトＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓから自己複製する内胚葉前駆（ＥＰ）細胞株を発生させる培養条件を定義してきた。最初に、ＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓは、規定の無血清培地でアクチビンＡを使った治療を通して成体型内胚葉を形成することを誘導される。前記成体型内胚葉は、それから無血清培地でマトリゲルで覆われたプレートでＢＭＰ４、ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，およびＥＧＦでの低酸素条件で培養される。これらの条件を使って、ＥＰ細胞は、１０００万倍増殖能で、少なくとも数カ月間の間培地で定着され、維持される。これらの株は、インビトロに拡張され、内胚葉細胞型に分化されるという点でＥＳＣｓに似ている。これらの株は、ＯＣＴ４あるいはＮＡＮＯＧのようなＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓで典型的に見つけられる遺伝子を発現させないけれども、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＨＮＦ４Ａのような枚胚葉分化を表示するメーカーを発現させる。加えて、ＥＰ細胞は、免疫欠損マウスに移植される際に、ＥＳＣｓあるいはｉＰＳＣｓが持つような腫瘍形成能力を持たない。ＥＰ細胞から成熟した内胚葉組織の誘導は、ＥＰ細胞がすでに内胚葉の胚葉に規定されているように、より効果的であるはずであり、そして、膵臓や肝臓のような内胚葉由来の組織型を成長させるのに、発生的に近いはずである。ＥＰ細胞は、インビトロで肝細胞および膵臓細胞を発生させる能力を持つことを示してきた。これらの細胞株は、内胚葉由来の細胞型の詳述に必要な誘導シグナルを研究する出発材料の優れた源としての目的を果たすだろう。
【００１５】
要約すると、先行文献の方法を使用して得られたＥＳあるいはｉＰＳＣ細胞の腫瘍形成の潜在性を欠く一方で、ＥＳ細胞あるいはｉＰＳ細胞が培養で拡張し、内胚葉由来の細胞型に分化できるという利点をもつＥＰ細胞を発生させる培養条件を発見してきた。ＥＰ細胞は、あらゆるＥＳＣあるいはｉＰＳＣ細胞株から作製されるように、患者の世代あるいは病気の特別なＥＰ細胞株は、薬物検査に対するより強固な基盤および細胞治療のための組織源としての提案に直接的でなければならない。
【００１６】
次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
【００１７】
"多様性"の用語は、一つの細胞が、成体動物に見られるいくつかの異なった細胞型を、その子孫細胞を通して引き起こすことが可能であることを意味する。
【００１８】
"多能性"の用語は、一つの細胞が、胚細胞を含む成体動物を構成する全ての細胞型を、その子孫細胞を通して引き起こすことが可能であることを意味する。胚幹細胞および胚性生殖細胞の両方は、この定義の元で多能性細胞である。
【００１９】
本願に用いられる"自己細胞"の用語は、移植者に遺伝子的に適合するドナー細胞を指す。
【００２０】
本願に用いられる"全能性"の用語は、生産動物を引き起こす細胞を指す。"全能性"の用語はまた、特定の動物におけるすべての細胞を引き起こす細胞を指す。全能性細胞は、１あるいはそれ以上の核の伝達段階から胚を発生するための方法で利用される時、動物の全ての細胞を引き起こす。全能性細胞は、移植用臓器の摘出、例えば、臓器あるいはホメオティック遺伝子の操作による付属器官の成長を除外するために遺伝子組み換え持つために使用する細胞のように、不完全動物を作製するためにも使用される。加えて、子宮内で成長が不可能である、ＥＳ細胞から由来した細胞のような、卵母細胞を表す遺伝子組み換えは、ヒト由来のＥＳ細胞が、複製のため、ヒト卵母細胞を派生させるために使用されず、治療目的のクローニングのような活用のためだけに使用されるということを確実にする。
【００２１】
細胞に関して本願に用いられる"培養された"の用語は、細胞分裂を行う、あるいはインビトロ環境で細胞分裂を行わない、１あるいはそれ以上の細胞を指す。インビトロ環境では、例えば、適した液体培地あるいはアガーのような、インビトロで細胞を維持するのに適している先行文献で既知のあらゆる培養基である。細胞培養のためのインビトロ環境に適している特別な例は、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），１９９４，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｌｌｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ．１），１９９８，Ｄ．Ｌ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａ，  １９９４，Ｄ．Ｃ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．に記載されている。
【００２２】
本願に用いられる"細胞株"の用語は、終了することなしに少なくとも一度は受け継がれ培養された細胞を指す。本発明は、無制限に受け継がれる細胞株に関係する。細胞継代は、後ほど定義される。
【００２３】
本願で用いられる"サスペンション"の用語は、細胞が固定担体に付着しない細胞培養条件を指す。サスペンションの中の細胞増殖は、当業者においては既知の器具を用いて増殖している間、かき回される。
【００２４】
本願で用いられる"単一層"の用語は、適当な培養条件で増殖している間、固定担体に付着している細胞を指す。適当な成長条件下で単一層で増殖している細胞のわずかな部分は、単一層での細胞に付着し、個体担体には付着しない。
【００２５】
細胞に関して本願で用いられる"プレートされた"あるいは"プレーティングする"の用語は、インビトロで細胞培養を確立することを指す。例えば、細胞は細胞培養基の中で薄められ、それから細胞培養プレート、デッシュ、あるいはフラスコに加えられる。細胞培養プレートは、当業者に周知とされている。細胞は、様々な濃度でおよび／あるいは細胞密度でプレートされる。
【００２６】
"細胞プレーティング"の用語はまた"細胞パッセージング"の用語に及ぶ。本発明の細胞は、当業者に周知の細胞培養技術を用いて受け継がれる。"細胞パッセージング"の用語は、（１）個体担体あるいは基質から細胞を解放し、それらの細胞を解離する、および（２）さらなる細胞増殖の為に適しているメディアの中で細胞を薄めるという段階を含む技術を指す。細胞継代はまた、培養された細胞を含む液体培地の部分を取り除き、細胞を薄め、さらなる細胞増殖をさせるために元の培養容器に液体メディアを追加することを指す。加えて、細胞はまた、さらなる細胞増殖のために適当なメディアが補充される新しい培養容器に加えられる。
【００２７】
細胞に関して本願に用いられる"増殖"は、一定の時間にわたって数が増加する細胞群を指す。
【００２８】
細胞に関して本願で用いられる"永久の"あるいは"不死化の"の用語は、細胞が終了するまでインビトロ環境で数倍の細胞を培養される間に、細胞分裂をし、細胞の数が２倍になる細胞を指す。永久細胞株は、かなりの数の細胞が培養で終了する前に１０倍を超える倍数になる。望ましくは、かなりの数の細胞が培養で終了する前に２０倍あるいは３０倍を超える倍数になることである。より好ましくは、永久細胞株がかなりの数の細胞が培養で終了する前に４０倍あるいは５０倍を超える倍数になることである。もっとも望ましくは、永久細胞株がかなりの数の細胞が培養で終了する前に６０倍を超える倍数になることである。
【００２９】
本願で用いられる"再プログラミング"あるいは"再プログラム化された"の用語は、細胞を少なくとも一つの異なる性質を持つ他の細胞の中に変換させる器具や方法を指す。
【００３０】
本願で用いられる"単離された"の用語は、他の細胞群から機械的に分離される細胞を指す。細胞群の例は、成長過程の細胞塊、細胞培養、細胞株、および動物である。
【００３１】
本願で用いられる"胚幹細胞"の用語は、インビトロ細胞培養で維持される胚から分離された多能性細胞を指す。そのような細胞は、急激に分裂する培養細胞であり、その培養細胞は、成獣を成し、胚細胞を含むすべての細胞型をインビボで引き起こす能力を培地で保有する培養された胚から分離された細胞である。胚幹細胞は、フィーダー細胞あり、あるいはなしで培養される。胚幹細胞は、胚盤胞期胚および前胚盤胞期胚を含む、成長のどの段階でも胚から分離された胚細胞から確立される。胚幹細胞は、丸みを帯びた細胞形態であり、フィーダー層上で丸みを帯びた細胞集塊で成長する。胚幹細胞は、当業者に周知の細胞である。例えば、ＷＯ  ９７／３７００９，ｅｎｔｉｔｌｅｄ"Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｅｌｌ−Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｕｎｇｕｌａｔｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，"Ｓｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｅｋｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｃｔ．９，１９９７，ａｎｄ  Ｙａｎｇ  &  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３８：３１５−３３５．Ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：１３２１−１３２９；Ｗｉａｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：７５６−７６４；Ｍｏｏｒｅ  &  Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ（１９９７）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３３：６２−７１；Ｍｏｏｒｅ，&  Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４５：１３９−１４４；Ｗｈｅｅｌｅｒ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖ．６：５６３−５６８；Ｈｏｃｈｅｒｅａｕ−ｄｅ  Ｒｅｖｉｅｒｓ  &  Ｐｅｒｒｅａｕ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３３：４７５−４９３；Ｓｔｒｏｊｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３３：９０１−９０３；Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３４：８７９−９０１；ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３３：１２５−１２９．を参照。
【００３２】
本願で用いられる"分化の細胞"は、未分化の表現型から分化の表現型に成長した前駆細胞を指す。例えば、胚細胞は、腸の内側を覆う上皮細胞に分化する。本発明の器具と方法は、分化細胞を全能性細胞に再プログラム化させる。文化の細胞は、例えば胎児や生産動物から分離される。
【００３３】
本願で用いられる"未分化の細胞"は、未分化表現型をもち、分化の可能性のある前駆細胞を指す。未分化細胞の例は、幹細胞である。
【００３４】
本願で用いられる"レポーター"、"レポーターシステム"、"レポーター遺伝子"、あるいは"レポーター遺伝子物資"の用語は、核酸が、例えば、生物学的検定法、免疫学的検定、放射免疫測定、あるいは比色分析法、蛍光性法、化学発光法あるいは他の方法によって、迅速に測定できるレポーターシグナルを作り出す物質をコード化する遺伝子を含むという有効な遺伝子システムを指す。前記核酸は、ＲＮＡあるいはＤＮＡ、線形あるいは円形、一本鎖あるいは二本鎖、アンチセンスあるいは極性感知であり、またレポーター遺伝子プロダクトの表現の為の必要不可欠な制御要素に有効的に関連している。所要の制御要素は、レポーターシステムの性質および前記レポーター遺伝子がＤＮＡあるいはＲＮＡの形式であるかどうかによって変わり、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加信号、転写終止コドンおよびその類似のものに制限されないが、それらを含む。
【００３５】
本願で用いられる"選択マーカー"の用語は、選択剤に耐性を示す細胞を表示する分子が細胞の中に現れる時の分子を指す。選択マーカーをコード化する核酸はまた、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加信号、転写終止コドンおよびその類似のもののような要素から成る。適当な選択剤は、カナマイシン、ネオミシン、およびハイグロマイシンのような抗生物質を含む。
【００３６】
以下の材料及び方法は、本発明の実施を促進するために提供される。
【００３７】
ヒトＰＳＣ培養および分化
ヒトＥＳＣ細胞株Ｈ９およびＣＨＢ８は、それぞれ国立幹細胞バンクおよびマサチューセッツヒト幹細胞バンクから得た。ヒトｉＰＳＣ細胞株、ｉＰＳＣ１（ＣＨＯＰ＿ＷＴ１．２）およびｉＰＳＣ２（ＣＨＯＰ＿ＷＴ２．２）は、下記のように野生型ヒト線維芽細胞由来である。ヒトＰＳＣｓは既述の通り維持した（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。５日目の一過性内胚葉細胞を生み出すため、ヒトＰＳＣｓを胚様細胞塊（ＥＢ）（Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）または単層培養（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）として、無血清分化（ＳＦＤ）培地（Ｇａｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）において分化させた。さらなる詳細は以下に記述する。成長因子を含まない１リットルのＳＦＤは、以下の構成要素を含む。
【００３８】
７５０ｍｌのＩＭＤＭ（ｈｏｍｅａｄｅ）粉末−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、水−Ｃｅｌｌｇｒｏ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：１２２００−０３６、Ｃｅｌｌｇｒｏ社ｃａｔ＃：２５−０５５−ＣＭ）、２５０ｍｌのＦ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ社ｃａｔ＃：１０−０８０−ＣＶ）、５ｍｌのＮ２−サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社ｃａｔ＃：１７５０２−０４８）、１０ｍｌのＢ２７−レチノイン酸（Ｇｉｂｃｏ社ｃａｔ＃：１２５８７−０１０）、５ｍｌ  １０％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）（組織培養グレード（低エンドトキシン）要試験）。ＳＦＤは１５０ｍｌビンに保管し、分化の日数に応じ示されるようにサプリメントを添加した。
【００３９】
単層内胚葉分化のために、ＰＳＣｓを８０％集密度でマトリゲルで被覆した培養皿上に播いた。細胞を１日間１０％ＳＦＤ、マウスＷｎｔ３ａ（４０ｎｇ／ｍｌ）およびアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩベースの無血清培地において培養することにより分化を誘導した。次の２日間、培地をＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩに交換した。最後に、次の２日間、細胞を、ＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳＦＤで分化させた。ヒトＥＳＣの肝臓分化のために、細胞を、先述したように胚体内胚葉を生み出すため５日間単層培養として分化させ、アスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４．５ｘ１０−４Ｍ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１ｘ１０−７Ｍ）および１％ＤＭＳＯを添加したＳＦＤベースの肝臓誘導培地において、さらに４週間分化させた。全てのサイトカインはヒトであり、特に明記しない限り、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。全ての分化培養は５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２環境において維持したが、ヒトＰＳＣｓは５％ＣＯ２空気環境で維持した。
【００４０】
ＥＰ細胞株の樹立および維持
ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞をソーティングし、マウス線維芽細胞フィーダー（ＭＥＦ）細胞（０．５×１０６／５８ｃｍ２）と共にマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で肝臓誘導培地においてそれらを培養することにより、ＥＰ細胞を最初にＨ９  ＥＳＣｓの２７日目の肝細胞分化培養から精製した。ＥＰ細胞を維持するための至適培養条件は、先述したようにマトリゲルおよびＭＥＦｓ上で細胞を培養し、肝細胞分化を促進するサイトカインを除去することにより確立した。この培地はＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳＦＤベースの培地から成り、ＥＰ基礎培地と呼んだ。他のＰＣＳ細胞株からのＥＰ細胞は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞をソーティングし、先述したようにそれらを５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２環境において維持することにより５日目の一過性内胚葉から樹立した。細胞には２日おきに供給し、６日おきにトリプシン処理により１×１０６／５８ｃｍ２でスプリットした。低分子阻害剤ＰＤ０３２５９０１（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ＰＤ１７３０７４（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、およびＳＢ４３１５４２（Ｌａｐｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）は、それぞれ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から購入した。
【００４１】
上記のように、ＳＦＤ無血清培地は、７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１２２００−０３６）、２５％ハムＦ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）、０．５ｘＮ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社）、レチノイン酸（Ｇｉｂｃｏ社）を含まない０．５ｘＢ２７、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ１４７０）、５０ｇ／ｍｌのアスコルビン酸リン酸塩マグネシウム（Ｗａｋｏ）、および４．５×１０−４Ｍのモノチオグリセロールから成る。５８ｃｍ２（１００ｍｍ）の培養皿につき１．５ｍｌの不希釈の成長因子を低減したマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２３０）を塗抹することによりマトリゲルで被覆したプレートを準備し、３０分間の３７℃インキュベーターに静置し固化させた。２つのｉＰＳＣ細胞株は、４つのリプログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＣＭＹＣ）を含むＳＴＥＭＣＣＡ−ｌｏｘｐベクターを用いヒト皮膚線維芽細胞から作製した。その後、リプログラミング因子を用いずに細胞株を得るため、これまでに報告のある通り（Ｓｏｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、単一のウィルス組み込み体を用いｉＰＳＣ細胞株にＣＲＥ発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした。これらの細胞株は典型的なｉＰＳＣ表現型を示す（投稿準備中）。肝臓由来のＥＰ細胞株は、Ｈ９  ＥＳＣｓの２４日目の肝細胞分化培養からＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞をソーティングすることにより樹立し、先に述べたように維持した。
【００４２】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング
３〜５分間３７℃で０．２５％トリプシンを用い５日目の一過性内胚葉、ＥＰ細胞培養またはＥＰ細胞分化培養組織を剥がすことにより単一細胞懸濁液を得た。細胞表面抗原染色は１０％ウシ胎児血清を添加したＩＭＤＭにおいて行った。細胞内染色のため、細胞を２０分間３７℃で１．６％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で固定し、その後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで二度洗浄した。固定した細胞は、１ｘ透過性洗浄バッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、４２１００２）で透過し、染色した。染色した細胞はＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析し、データはＦｌｏｗｊｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）を用い分析した。一次、二次抗体およびアイソタイプコントロールの起源および濃度は、以下に記載する。
【００４３】
マイクロアレイおよびバイオインフォマティクス分析
Ｈ９  ＥＳＣｓ（Ｔ０、ＥＳ）、Ｈ９  ＥＳＣ由来のＤＥ（Ｔ５、ＤＥ）およびＥＰ細胞（ＥＰＣ）をＳＳＥＡ３ｈｉｇｈ／ＳＳＥＡ４ｈｉｇｈの未分化細胞またはＣＸＣＲ４ｈｉｇｈ／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ集団を（Ｔ５  ＤＥおよびＥＰＣのために）ソーティングすることにより精製した。各々のサンプルにおいておよそ１×１０５細胞を得た。各々の細胞型（ＥＳ、ＤＥおよびＥＰＣ）の３つの生物学的複製を準備し、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い抽出した。品質評価したＲＮＡサンプルを、アフィメトリクスＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨｕｍａｎＧｅｎｅ１．０ＳＴアレイにハイブリダイズした。アフィメトリクススキャナで得た９つの生データファイルは、アフィメトリクス発現コンソールによるＲＮＡ標準化に先立つデータのクオリティー確認工程を通過した。マイクロアレイデータには、ＮＣＢＩ遺伝子発現オムニバス、登録番号ＧＳＥ３５４６１、でアクセスすることが可能である。
【００４４】
ＥＰ細胞の内胚葉分化
肝臓分化のため、ＥＰ細胞を０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がし、マトリゲル（１：６希釈）被覆またはゼラチン被覆した１２ウェル組織培養プレート（ＢＤ社）に付着性培養としてウェルにつき１×１０５細胞を再度播いた。ＥＰ細胞の肝臓分化培地はアスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４．５×１０−４Ｍ）、および様々なサイトカインを添加したＳＦＤベースのものである。分化の最初の６日間の間に、以下のサイトカインおよび成長因子を添加した。ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびデキサメタゾン（１ｘ１０−７Ｍ）。次の６日間、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（２ｘ１０−７Ｍ）、ビタミンＫ１（６ｇ／ｍｌ）、およびγ−セクレターゼ阻害剤Ｘ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、５６５７７１、２Ｍ）を加えた。分化の最初の１２日間の間、１％ＤＭＳＯを培地に添加したが、最後の２週において除外した。１２日目から以後、培地はＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（２ｘ１０−７Ｍ）、ビタミンＫ１（６ｇ／ｍｌ）、および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含んだ。培地は３日おきに交換した。薬剤誘導性解析は、Ｐ４５０−ＧｌｏＴＭ  ＣＹＰ３Ａ４ルシフェリンＩＰＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｖ９００２）を用い行った。簡潔に言うと、Ｈ９−ＥＰ細胞（継代１５）を２４日間肝細胞に分化させ、それから３日間、リファンピシン（Ｓｉｇｍａ社、２５μＭ）存在下（リファンピシン）またはリファンピシンの非存在下（ＤＭＳＯ）で培養し、ＨｅｐＧ２細胞と比較した。誘導された活性がＣＹＰ３Ａ４酵素に特異的であったことを確認するため、抑制のコントロールには、リファンピシン（２５μＭ）の存在下において、選択的な阻害剤ケトコナゾール（Ｓｉｇｍａ社、１μＭ）を含有させた。ネットシグナルは、バックグラウンドの発光値（非細胞存在のコントロール）をリファンピシンまたはＤＭＳＯの値から差し引くことにより計算した。
【００４５】
ＥＰ細胞の膵臓分化のために、工程１を省略し、分化の８日目から１２日目までセクレターゼ阻害剤Ｘ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、２Ｍ）を添加することのみならず、１０日目以降、ヒトインシュリン（Ｓｉｇｍａ社、８００ｐＭ）およびニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ社、１０ｍＭ）を添加することにより、Ｎｏｓｔｒｏ他により記述されるプロトコル（２０１１）を改良した。分化を開始するため、１００ｍｍの組織培養皿において５日間増殖させたＥＰ細胞を直接工程２の培地で培養または収集し、１ウェルにつき３〜４×１０５細胞で（不希釈）マトリゲルで被覆した１２ウェル培養皿上に再度播いた。マウスＷｎｔ３ａを３ｎｇ／ｍｌで工程２の培地に添加した。１０日目以降、高デキストロース（６０ｍＭ）と低デキストロース（２０ｍＭ）との間で毎日培地の交替を行った。継代６から２０のＥＰ細胞を膵臓分化のために用いた。１４〜１８日目のＥＰ細胞分化培養をｃ−ペプチド放出分析のために用いた。Ｃ−ペプチド放出分析は、メルコディアウルトラセンシティブＣ−ペプチドエリサキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社）を用いこれまでに報告のあるとおり行った（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。簡潔にいうと、ＫＲＢＨ培地において１時間洗浄の後、２ｍＭ  Ｄ‐グルコース（Ｓｉｇｍａ社）および１８ｍＭ  Ｌ−グルコース（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社）を含む３００リットルの基礎培地を、１２ウェル培養皿の各々のウェルに添加した。１時間のインキュベーションの後、基礎培地を取り除き、３００リットルのの刺激培地（Ｄ‐グルコース２０ｍＭ）を加えた。培養物を、示されるように様々な時間、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２環境において３７℃でインキュベートした。各々の実験ごとに、６つのウェルの上清を共にプールした。サイズ平均が３００細胞／膵島となるおよそ３０のヒト成人膵島を各々の分析に用いた。インシュリン分泌を各々の実験のｃ−ペプチド＋細胞の総細胞数およびパーセンテージに基づき計算した。一次ヒト膵島はＰｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社から購入し、Ｐｒｏｄｏ膵島培地（Ｇｌｕ）／ＰＩＭ（Ｇ）ＴＭおよびＰｒｏｄｏ膵島培地（ヒトＡＢ血清）／ＰＩＭ（ＡＢＳ）ＴＭを添加したＰｒｏｄｏ膵島培地（標準）／ＰＩＭ（Ｓ）ＴＭで維持した。ヒト膵島は、それらが到着した後２日目（膵島を処理した４日後）、ｃ−ペプチド放出のため分析した。
【００４６】
ＥＰ細胞の腸の分化のために、Ｓｐｅｎｃｅ他により記述されたプロトコル（２０１１）の改良を用いた。正常ＥＰ細胞コロニーを２日間ＢＭＰ４（５００ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ４（５００ｎｇ／ｍｌ）により処理し、１時間３７℃でコラゲナーゼＢ処理しマトリゲルを消化することにより収集した。結果として生じるコロニーはＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｒ−スポンジン１（５００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した不希釈のマトリゲル（ＢＤ社）を混合し、１ウェルにつき１．５〜２×１０６細胞で、１２ウェル培養皿上へ再度播いた。アスコルビン酸リン酸塩マグネシウム（Ｗａｋｏ、５０ｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４．５×１０−４Ｍ）、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｒ−スポンジン１（５００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むＳＦＤベースの分化培地を用いた。ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）を２１日目以降に追加したが、分化５日目から培地の構成からＦＧＦ４およびＷｎｔ３ａを除いた。細胞には２〜３日おきに供給した。ヒト結腸腫瘍細胞株ＣＡＣＯ−２はＳｉｇｍａ社から購入した。
【００４７】
ＥＰ細胞の分化培養の全ては、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２環境で維持した。全てのサイトカインはＲ&Ｄ社から購入した。ドルソモルフィン、ＫＡＡＤシクロパミンおよび低分子阻害剤ＳＢ４３１５４２はＳｔｅｍｇｅｎｔ社から、オールトランス型レチノイン酸はＳｉｇｍａ社から購入した。
【００４８】
ヒトＥＳおよびＥＰ細胞の神経外胚葉および中胚葉分化
神経外胚葉または中胚葉に分化するＥＰ細胞の可能性を評価すべく、Ｈ９−ＥＰ細胞（継代５）およびＨ９  ＥＳＣを神経外胚葉（Ｇｒｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）または中胚葉に、ｈＥＳＣ分化を促進するために確立された条件で誘導した。未分化Ｈ９  ＥＳまたはＥＰ細胞を小さな細胞集塊に解離させ、その後、１ウェルにつき４．５×１０５細胞で、マトリゲルで被覆した１２ウェルプレート上へ再度播いた。
【００４９】
神経外胚葉分化のために、培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社）、レチノイン酸（Ｇｉｂｃｏ社）を含まない１％Ｂ２７サプリメント、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から成り、阻害剤であるＮｏｇｇｉｎ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２（１５μＭ）およびＰＤ０３２５９０１（１μＭ）を添加する。細胞をトリプシン処理により４日目および８日目に収集した。
【００５０】
中胚葉分化のために、最初の３日の培地は、アスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４．５×１０−４Ｍ）、および１％Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩベースであり、０日目および１日目にＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｙｍａｎ社、２ｍＭ）を添加し、２日目にＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および塩基性ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。３および４日目の中胚葉分化のための培地は、アスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）、モノチオグリセロール（４．５×１０−４Ｍ）、および１％グルタミンを含むＳｔｅｍＰｒｏ３４ベース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であり、３日目にＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および塩基性ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、４日目にＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および塩基性ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。細胞はトリプシン処理により１日目および４日目に収集した。
【００５１】
免疫組織化学
サンプルをパラフィンに包埋し、６〜１０ｕｍで切片にした。クエン酸ナトリウムバッファーで３０分間スライドを蒸し、補足の表で示す抗原のサブセットの抗原回復を行った。切片を３０分間適切な血清中（１ｘＤＰＢＳ＋０．５％トリトン−Ｘ中の５％血清）でブロッキングした。一次抗体をブロッキングバッファーで希釈し、４℃で３時間または一晩、切片の上でインキュベートした。スライドを洗浄し、室温で２時間ブロッキングバッファーで二次抗体をインキュベートした。使用した抗体および希釈剤のリストについては、表を参照のこと。染色画像は、三相画像化ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ社）でニコンエクリプスＥ８００蛍光顕微鏡を用い得た。
【００５２】
免疫蛍光
既述の通り、Ｈ９−ＥＰ細胞を１８日間マトリゲルで被覆した１２ウェル培養皿上で分化させた。ヒト膵島はマトリゲルで被覆した１２ウェル培養皿に付着させた。細胞を１０分間３７℃で４％ＰＦＡでウェルに固定し、それから冷却した（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を加えた）ＤＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（洗浄バッファー）で二度洗浄し、２０分間０．２％トリトン−Ｘ１００を加えた洗浄バッファー中で透過した。二度洗浄した後、細胞を室温で（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を加えた）ＤＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中の１０％ヤギ血清で３０分ブロッキングした。これまでに報告のある通り（Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、以下の抗体を用い免疫蛍光を行った。４℃にて、マウス抗ＰＤＸ１、ウサギ抗ヒトＣ−ペプチドおよびマウス抗Ｇｌｕｃａｇｏｎで一晩。アイソタイプコントロールの濃度は、一次抗体に同じである。用いた二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａ４８８およびヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ−Ａｌｅｘａ４８８である。細胞を室温で１時間二次抗体と共にインキュベートした。一次および二次抗体は、（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を加えた）ＤＰＢ＋２％ＢＳＡ＋０．０５％トリトン−Ｘ１００で希釈した。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えたＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬は核を対比染色するのに用いた。染色された細胞は蛍光顕微鏡（ライカＤＭＩ４０００Ｂ）を用い可視化し、画像はライカＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを用い取り込んだ。
【００５３】
奇形腫／移植解析
ＥＰ細胞（８〜１０ｘ１０６）をサイトカインの組合せを添加した冷却した高濃度マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の３００μｌ中に再懸濁した。インビボ消化管様の内胚葉分化にはＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはインビボ肝細胞分化にはＦＧＦ１０（４００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＢＭＰＲ１Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）。細胞をＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスの首に皮下注射した。同様に、Ｈ９  ＥＳＣの５日目内胚葉培養由来の１ｘ１０７個の細胞、またはＨ９  ＥＳＣの５日目内胚葉培養からソーティングした５ｘ１０６個のＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞を注射し、既述の通り解析した。また、２０日目のＨ９  ＥＳＣｓ細胞の肝細胞分化培養由来、または９日目のＨ９−ＥＰ細胞の肝細胞分化培養由来の１ｘ１０７個の細胞をＦＧＦ１０（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）のサイトカイン組合せと共に注射した。結果として生じるマトリゲルプラグ／移植を記述の通り解析した。
【００５４】
定量的ＲＴ  ＰＣＲ
全ＲＮＡはＲＮＡｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い調製し、ＲＮａｓｅを含まないデオキシリボヌクレアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社）で処理した。ＲＮＡ（１ｕｇから５００ｎｇ）はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でランダムヘキサマーおよびオリゴ（ｄＴ）を用いｃＤＮＡに逆転写した。これまでに報告のある通り（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ＱＰＣＲはライトサイクラー４８０ＳＹＢＲグリーンＩマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、ライトサイクラー４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社）で行った。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＧ（サイクロフィリン）により標準化した。オリゴヌクレオチド配列は、表にリストした。全ヒト腸ＲＮＡは、Ｂｉｏｃｈａｉｎ社から購入した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
以下の実施例は、本発明の特定の実施例を例示するため提供されるものである。それは決して本発明を制限することを目的とするものではない。
【実施例１】
【００６０】
現在のプロトコルの欠点に対処するため、我々はヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣｓから自己再生するＤＥ前駆細胞株を作製した。内皮前駆細胞のためのＥＰ細胞と呼ばれるこれらの細胞は、ＥＳＣに類似した増殖能を示すが、奇形腫形成能を欠く。これに加え、ＥＰ細胞株は、インビトロおよびインビボ両方で、肝臓、膵臓および腸を意味する内皮組織を生み出す。このように、ＥＰ細胞株は、どのように異なる腸組織が共通の多様性内皮前駆から分化決定されるのかを研究し、単一系列分化を最適化するために、強力な材料を提供するものである。さらに、ＥＳＣｓ／ｉＰＳＣｓからのＥＰ細胞の作出は、組織補充療法のための純粋で非腫瘍形成性の細胞の生産を最適化する戦略を差し示す可能性がある。
【００６１】
ヒトＰＳＣｓ由来の胚体内胚葉前駆集団の同定
我々は、これまでにマウスおよびヒトＥＳＣｓからＤＥおよびその肝臓系列派生物を誘導することが示された無血清培地において段階的分化プロトコルを適応させた（Ｇａｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。このプロトコルは、胚形成を模倣するプロセスにおいて、ＤＥを誘導するためアクチビンＡを用い、その後ＤＥから肝臓運命を決定するためＢＭＰ４およびｂＦＧＦ作動薬の他の因子を用いる。このプロトコルのバリエーションを用い（実験手順を参照）、我々は誘導の２週後、肝細胞を生み出すことが可能であった（データ図示せず）。興味深いことに、３〜４週後に、これらの培養は異なった形態を持つ２つの細胞集団を含んだ（図１Ａ）。一方の集団は大きく非常に空胞化されており未成熟肝細胞に似ていた（図１Ａ、「分化した細胞」）が、他方の集団は未分化ＥＳＣコロニーの様であった（図１Ａ、「前駆コロニー」）。これらの混合した培養を、９ヵ月以上の間継代した後、両方のコロニータイプを維持した（データ図示せず）。我々は手作業で所定の形態のコロニーを単離するためピペットを用い、ＱＲＴ−ＰＣＲを用い遺伝子発現解析を行った（図１Ｂ）。ＥＳＣマーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４はどちらの細胞型においても発現しておらず、これらのコロニーが培養中、ＥＳＣのコンタミネーションによるものでなかったことを示唆する。初期の汎内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７が推定上の前駆コロニーで亢進されるが、初期の肝細胞マーカーであるＡＦＰは分化したコロニーで亢進された。初期の内胚葉／肝臓／膵臓マーカーであるＨＮＦ４Ａ（（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は、両方において認められた。これらの解析結果に基づき、我々は、未分化コロニーが内胚葉前駆（ＥＰ）細胞が培養において自己再生および肝細胞への分化の両方を経ていることを表す可能性があるものと仮定した。
【００６２】
それから大量の分化培養を用いフローサイトメトリーにより、初期の内胚葉で発現するＫＩＴ（ＣＤ１１７）およびＣＸＣＲ４（Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）の発現を解析した。ＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋細胞（３％〜６０％）の亜集団は、培養において一貫して存在した（図１Ｃおよびデータ図示せず）。これらの二重陽性の細胞はまた、汎内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ１（Ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）およびインビボで未成熟な内胚葉で一過性に発現する（Ｋａｎａｉ−Ａｚｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）ＳＯＸ１７を発現する。ＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋ＦＯＸＡ１＋ＳＯＸ１７＋集団は未分化コロニーからの推定上のＥＰ細胞をおそらく示し、我々はＳＯＸ１７  ｍＲＮＡが亢進されることを示した（図１Ｂ）。これをテストするため、我々は更なる研究のためＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−細胞を単離すべくＦＡＣＳを用いた。初期の肝細胞マーカーであるＡＦＰはＣＸＣＲ４−細胞で亢進されたが、ＣＸＣＲ４＋集団は未成熟内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７を発現し、ＡＦＰ発現は陰性であった（図２Ａ）。精製したＣＸＣＲ４＋細胞は培養において増殖可能であったが、継代３回以内で、ＳＯＸ１７＋およびＳＯＸ１７−細胞の両方を含む混合集団に戻り、培養において分化を示す（図２Ａ、右パネル）。これとは対照的に、ＣＸＣＲ４−集団はほとんど増殖能を持たず、インビトロで分化した肝細胞のより成熟した表現型と一致していた（データ図示せず）。
【００６３】
我々のデータは、自己複製ＥＰ細胞をヒトＥＳＣのインビトロの操作を通し生産することが可能であることを示す。培養条件が肝細胞分化を促進させることがまず最初に明確に説明されているため（Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、我々の最初の実験（図１）によりＡＦＰを発現する肝細胞へのＣＸＣＲ４＋ＥＰ細胞の分化が予想された。これらの細胞がＦＯＸＡ１＋ＳＯＸ１７＋表現型を維持している間、よりＥＰ細胞集団を増殖させるため、我々は、ＢＭＰ４、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＥＧＦおよびＶＥＧＦを含む無血清培地から成り、マトリゲルおよびＭＥＦフィーダー上に播く培養条件を同定した（方法を参照）。懸濁培養ではＥＰ細胞を維持することが不可能であったため、マトリゲルの利用は重要であった（データ図示せず）。
【００６４】
これらの最適化した培養条件を用い、我々はＥＰ細胞製造のために簡素化したプロトコルを開発した。ヒトＥＳＣｓまたはｉＰＳＣｓは高いアクチビンＡが存在する場合、分化が誘導され、内胚葉形成を促進する（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。胚体内胚葉細胞（ＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋）は、細胞ソーティングにより精製し、直接ＥＰ細胞培地（図２Ｂ、左のパネル）で培養した。最適化した条件で培養する場合、特により高い細胞密度で、大多数の細胞は腸上皮を連想させる上皮構造を作り、セントラルルーメンであるように見えるものを含む（図２Ｂ、右パネル）。ＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来の両方のＥＰ細胞株は広範囲に増殖し、同質のＥＰ細胞表現型（ＦＯＸＡ１＋ＳＯＸ１７＋ＦＯＸＡ２＋）を示した（図２Ｃおよびデータ図示せず）。最適化した培養条件はまた、図１（肝臓由来のＥＰ細胞）において既述の通り３〜４週目の肝臓分化培養から発生したＥＰ細胞株を維持することが可能であった。ＥＰ細胞は直接胚体内胚葉から由来したため、これらの細胞は類似した特徴を示した（データ図示せず）。
【００６５】
我々は、ヒトＥＳＣ細胞株Ｈ９およびＣＨＢ８から、および２つのヒトｉＰＳＣ細胞株からＥＰ細胞株（Ｈ９−ＥＰ、ＣＨＢ８−ＥＰ、ｉＰＳ１−ＥＰおよびｉＰＳ２−ＥＰ。方法を参照）を得ることに成功した。これらのＰＳＣ細胞株の全てから発生する内胚葉前駆集団は前駆体の表現型を維持していたが、１０１６個以上増殖し、２０継代以上維持した（図２Ｃおよびデータ図示せず）。このように、自己複製するＥＰ細胞株は、ヒトＰＳＣｓから再現的に発生させることが可能である。ＥＰ細胞の増殖は、成長曲線の一過性の平坦化により示されるように、細胞が高率で老化する「危機」と関与しない（図２Ｃ）。さらに、Ｈ９  ＥＳＣｓおよび１つのｉＰＳＣ細胞株に由来するＥＰ細胞に対して核型分析を行い、正常であることを確認した（図３）。これらのデータは、高速であるＥＰの増殖は獲得した遺伝的不安定性または染色体再配置に起因しないことを示す。凍結保存したＥＰ細胞は高い生存性を持ち融解することが可能である（データ図示せず）。用いられるサイトカインの中で、ＢＭＰ４およびＦＧＦシグナリングは、ＥＰ細胞の維持のため最も重要であった。ＢＭＰ４の除去は、１週以内のＳＯＸ１７発現のほぼ完全な消失をもたらし、膵臓分化を示すＰＤＸ１の上方制御を誘導した（図４Ａ）。ｂＦＧＦの除去または低分子阻害剤ＰＤ１７３０７４およびＰＤ０３２５９０１によるＦＧＦ／Ｒａｓ／ＭＥＫ経路の崩壊は著しく増殖を低下させ（図４Ｂ）、ＦＧＦシグナリングがＤＥ増殖にとり不可欠であるというこれまでの報告と一致した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＶＥＧＦまたはＥＧＦの除去はまた、有意な増殖の減少を誘導した（図４Ｂ）。ＴＧＦ−βシグナリングの低分子阻害剤、ＳＢ４３１５４２、による処理が完全にこれらの細胞のＳＯＸ１７発現をなくし、著しく増殖を抑制したため、ＴＧＦ−βシグナリングはまたＥＰ細胞の維持にとり不可欠であることが明らかとなった（図４Ｃおよび４Ｄ）。ＥＰ細胞におけるＴＧＦ−βシグナリングの抑制はまた、おそらく膵臓誘導に先立つ自然発生的な分化により膵臓β細胞への分化を阻害した（図４Ｅ）。
【００６６】
Ｈ９−ＥＰ細胞株からの９つのサブクローンは、増殖させるため９６穴プレートへ単一のＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋細胞を播くことにより樹立した。これらのクローンは親細胞株と同じ増殖能およびマーカーの発現を示した（データ図示せず）。このように、我々は広範囲に及ぶ増殖能を示し、初期の多能性内胚葉のマーカーを発現するＥＰ細胞株のクローン性集団を樹立した。
【００６７】
ＥＰ細胞の特性評価
我々は、精製したＨ９  ＥＳＣｓ、アクチビンＡにより誘発した５日目一過性内胚葉、およびＨ９−ＥＰ細胞のトランスクリプトームを比較するため、遺伝子発現マイクロアレイを用いた（図２Ａ）（方法を参照）。マイクロアレイデータのクラスター解析によりＥＰ細胞がＥＳＣｓより５日目の一過性内胚葉と類似することが明らかとなった（図５Ａ）。主成分分析法は、ＥＰ細胞がＥＳＣｓより一過性内胚葉と類似するが、それらはまた一過性の内胚葉とは異なることを明らかにした（図５Ｂ）。予想されるように、多能性マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＤＮＭＴ３Ｂの高レベルの発現はＥＳＣに限られていた（図５Ｃおよび５Ｄ）。興味深いことに、プロトオンコジーンＭＹＣＮはＥＳＣｓおよびＥＰ細胞両方において発現した。ＭＹＣＮはマウスＥＳＣｓの多能性および自己再生に必須であり（Ｖａｒｌａｋｈａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＥＰ細胞において類似した役割を持つ可能性がある。ＥＯＭＥＳおよびＬＨＸ１を含む遺伝子のサブセットは両方の細胞型において維持されるが、ＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ８、ＧＳＣおよびＭＩＸＬ１を含む原始線条または中内胚葉において発現した遺伝子は、ＥＰ細胞でなく５日目一過性内胚葉において発現する（図５Ｃおよび５Ｄ）。予想されたように、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４およびＳＯＸ１７を含む大部分の内皮遺伝子の発現は５日目内胚葉およびＥＰ細胞に限られた（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【００６８】
マイクロアレイデータは、ＥＳＣおよび５日目一過性内胚葉からＥＰ細胞を識別するのに用いられる可能性のある表面マーカーを予測した（図５Ｃ）。例えば、ＥＳＣマーカーであるＣＤ９は、ＥＰ細胞において減少した。内皮マーカーであるＣＸＣＲ４およびＣＤ１１７をコードするメッセンジャーＲＮＡはＥＰ細胞および一過性内胚葉両方において発現し（図５Ｃ）、我々のフローサイトメトリー研究を追認した（図１および２）。これとは対照的に、活性化した白血球接着分子ＡＬＣＡＭ／ＣＤ１６６（Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）は、好中球により発現するグリコプロテイン（Ｓｔｒｏｎｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＣＤ１７７／ＮＢ１は５日目内胚葉と比較しＥＰ細胞において減少するが、５日目一過性内胚葉でなくＥＰ細胞のみにより発現した（図５Ｃ）。幹細胞／前駆マーカーであるＣＤ１３３、ＣＤ３４およびＬＧＲ５（Ｍｉｚｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）はまた、ＥＰ細胞において比較的高いレベルで発現した。マイクロアレイ研究により予測した細胞表面マーカーのサブセットの異なる発現はＥＳＣｓ、ＥＰ細胞および５日目内胚葉においてフローサイトメトリーにより追認され、ＡＬＣＡＭおよびＬＧＲ５がＥＰ細胞において亢進されることを証明した（図５Ｅ）。
【００６９】
我々のデータは、ＥＰ細胞は発生期の内胚葉に酷似しているが、遺伝子発現における重要な違いを持つことを示す。マイクロアレイデータより、ＥＰ細胞で亢進され、その結果この集団に固有の生物学的特性を与える可能性のある転写制御因子を解析した。トップ１３のヒットを、５日目の一過性内胚葉間と比較した発現における増加の倍数とともに表１に示す。マウスＤＥにおいて亢進されるＧＡＴＡファミリーであるＧＡＴＡ３は（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、リストにおいて最初に位置する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の標的であるＨＥＹ２はＥＰ細胞で亢進され、ＥＰ細胞維持においてＮｏｔｃｈシグナル伝達の果たしうる役割を示唆する。興味深いことに、初期の肝臓（ＴＢＸ３）（Ｌｕｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、膵臓（ＩＳＬ１およびＲＦＸ６）（Ａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、肺（ＦＯＸＰ２）（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、および腸（ＩＳＸ１）（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）の重要な調節因子であることが知られている転写制御因子はＥＰ細胞で亢進され、これらの複数の内皮系列を形成する能力を示唆する。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
ＥＰ細胞はインビトロで多系列内皮分化を示す
次に我々は、培養条件を操作すると増殖したＥＰ細胞は多能性内皮分化能を保持するかどうかをテストした。ＥＰ細胞株はインビトロでの肝細胞、膵臓または腸への分化決定を促進する既知の条件下で分化させた（Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。全ての誘導プロトコルにより、ＥＰ細胞はＤＥ段階にあるものと推測され、そのように刺激した。多クローン性Ｈ９−ＥＰ細胞株および２つの単一細胞由来のサブクローンにおける代表的なデータを示す（図６、７、８、９、および１０）。これに加え、２つのｉＰＳＣ由来のＥＰ細胞株（ｉＰＳ１−ＥＰおよびｉＰＳ２−ＥＰ）からの肝細胞および膵臓分化を解析し、類似した結果となった（図８および９）。
【００７２】
肝細胞分化決定を誘導するため、これまでに発表された研究より適応させた段階的プロトコルを用いＥＰ細胞を刺激した（方法を参照）（Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｂａｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。肝細胞分化決定は、ＱＲＴ−ＰＣＲによる誘導から１４、２０および２７日目およびフローサイトメトリーによる誘導から２０日目をモニターした。２０日目までに、ほとんどの細胞が、多角性の形状および多核性を含む肝細胞形態の特徴を示した（図８Ａ）。ＱＲＴ−ＰＣＲ解析により、肝臓マーカーであるアルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７およびグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）の上方制御を確認した（図６Ａおよび８Ｂ）。分化２０日目の細胞内フローサイトメトリーは細胞の９０％以上がＡＦＰ＋であることを示し、細胞の８０％以上はＡＡＴを発現し、肝細胞の運命に深く関与することを示した（図６Ｂおよび８Ｃ）。ＥＰ細胞マーカーであるＣＸＣＲ４の発現は認められなかったが、成熟肝細胞マーカーであるＡＳＧＰＲ１（Ｂａｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）は細胞の約２０％において発現した（図６Ｂ）。２つのｉＰＳＣ細胞株から発生したＥＰ細胞はまた、肝細胞に分化した（図８Ｂ）。リファンピシンで処理した場合、ＥＰ細胞由来の肝細胞はＨｅｐＧ２細胞に相当する誘導可能なＣＹＰ３Ａ４活性を示した（図６Ｃおよび８Ｄ）。このように、ＥＰ細胞は肝細胞への可能性を一貫して示す。
【００７３】
肝臓および膵臓の内胚葉構成要素は、推定上の共通の前腸前駆から生じるものと考えられる（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＥＰ細胞の膵臓への分化の可能性を解析するため、我々は、Ｎｏｓｔｒｏ他により報告されたプロトコル（２０１１）を改良した（方法を参照）。分化したＥＰ培養の免疫蛍光分析は、これらの両ホルモンを発現する一次ヒト膵島と比較し、ｃ−ペプチド＋を含むがＧｌｕｃａｇｏｎ＋（ＧＣＧ＋）細胞を含まないコロニーを示した（図７Ａ）。ＥＰ細胞から発生したコロニーはまた膵臓分化決定を示すＰＤＸ１＋であった（図７Ａ）。ＰＤＸ１発現は、分化の１０〜１１日目でＨ９−ＥＰ細胞株（図示せず）、単細胞由来のサブクローン、および２つのｉＰＳＣ由来のＥＰ細胞株（図９Ａ）両方においてフローサイトメトリー分析により確認された。これに加え、分化した（Ｈ９およびｉＰＳＣ由来の）ＥＰ細胞の約５〜３０％は、膵臓誘導の１４日目までに、ｃ−ペプチドを発現した（図７Ｂおよび９Ａ）。ｃ−ペプチド＋細胞発生の効率は、細胞株の遺伝的背景に従い変化した（図７Ｂおよび９Ａ）。しかしながら、遺伝的背景に関係なく、全てのＥＰ細胞株から発生したｃ−ペプチド＋細胞はＧＣＧおよびＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（ＳＳＴ）発現が陰性／低かった（図７Ａ、７Ｂおよび９Ａ）。我々はまたＱＲＴ−ＰＣＲにより分化培養を解析した。膵臓分化と一致し、ＥＰ細胞マーカーであるＳＯＸ１７の発現は低下するが（図９Ｃ）、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１およびＮＥＵＲＯＤ１の発現は強く誘導された（図７Ｃおよび９Ｃ）。ＥＰ細胞分化培養におけるＮＥＵＲＯＧ３（ＮＧＮ３）の一過性発現は、内分泌分化決定を示すものであった（図９Ｃ）。インシュリン（ＩＮＳ）ＲＮＡは成人膵島で認められた発現量の約２０％のレベルで強く誘導された。これらのデータをサンプルにおいてｃ−ペプチド＋細胞のパーセンテージに対し補正した場合（膵島〜６０％、Ｈ９−ＥＰ  １５±３％、Ｈ９−ＥＰクローン２  ２２±４％）（図７Ｃ）、ＥＰ由来のβ細胞中のＩＮＳ  ＲＮＡのレベルは一次β細胞で認められた発現量の〜７０％であると推定される。これは、細胞内フローサイトメトリーにより同定したように、一次β細胞およびＥＰ由来の膵臓細胞と比較して、ｃ−ペプチドのタンパク質レベルと一致する（図７Ｅ）。特に、成熟β細胞で発現する重要な転写制御因子であるＭＡＦＡはＥＰ細胞分化培養において、成人膵島で認められたＲＮＡレベルの３０％にまで上方制御された（図７Ｃ）。ＩＮＳ発現において同じ補正が行われるのであれば、ＭＡＦＡおよびＮＫＸ６−１はＥＰ由来のｃ−ペプチド＋細胞において成人β細胞に相当するレベルで発現する可能性がある。
【００７４】
重要なことに、ＥＰ細胞から誘導されるｃ−ペプチド＋細胞は、ＧＣＧの最小の発現およびＳＳＴの比較的低い発現を示す（図７Ｂおよび７Ｃ）。これはヒトＰＳＣｓからｃ−ペプチド＋細胞の産生を既述する大多数の報告と対照をなし、大部分の膵臓内分泌の子孫細胞は、ポリホルモーナルの表現型を示す（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ポリホルモーナル膵臓細胞はマウス発生の間、認められるが、成体マウスにおけるβ細胞集団には寄与しない（Ｈｅｒｒｅｒａ，２０００）。それと一致して、同じ膵臓分化プロトコルで処理したＨ９  ＥＳＣｓは、ＥＰ細胞由来の膵臓内分泌細胞と比較して、より多くのポリホルモーナルの細胞集団を産生した（図７Ｄ）。ＥＰ細胞は、ＧＣＧを共発現する２％未満の細胞およびＳＳＴを共発現する〜５％の細胞のｃ−ペプチド＋集団を産生した。これとは対照的に、ＥＳＣｓから直接発生したｃ−ペプチド＋細胞は、３８±９％ＧＣＧ＋および２０±１％ＳＳＴ＋であった（図７Ｄ）。このように、複数のＥＰ細胞株から発生したｃ−ペプチド＋細胞は、ＰＳＣｓから直接発生した集団より成熟したβ細胞と類似している。
【００７５】
これまでの報告では、ＥＳＣｓに由来するポリホルモーナルの細胞が完全には機能的でなく、インシュリン放出によるグルコース刺激に対し効率的に応答することが不可能であることが示されていた（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。グルコースにより誘導されたｃ−ペプチド放出の経時的解析を行い、一次ヒト膵島とＥＰ細胞（Ｈ９−ＥＰおよびｉＰＳ２−ＥＰ）由来の膵臓分化培養とを比較した（図７Ｆおよび９Ｄ）。データは２０ｍＭグルコースによる刺激を行った４０分間集積し標準化し、培養ごとに５分の基礎刺激時点を１として設定した。基礎（低グルコース）条件と比較し高グルコースグループにおいて３倍となった刺激インデックスが一致し、ｃ−ペプチド放出の動力学は、ＥＰ由来の培養と一次ヒト膵島との間で類似していた。１０分の時点を除き、ＥＰ由来の培養は一次膵島と統計学的に識別不可能であった。細胞を３または１８時間後に再度刺激した場合、それらは最初の刺激と同様の様態でありグルコース刺激に対する反応性を維持し（データ図示せず）、これらの細胞がグルコース反応性の機能を維持することを示した。全てのプロインシュリンが１：１のモル比でｃ−ペプチドおよびインシュリンに処理される場合、ｃ−ペプチド放出分析により１０５個のＥＰ細胞由来のｃ−ペプチド＋細胞（ｎ＝３）につきおよそ９±１．７ｎｇのインシュリンの分泌が明らかとなり、それは成人膵島β細胞の分泌の〜２０％である（３７ｎｇ／１０５細胞、ｎ＝２、と推定される。Ｌｕｋｏｗｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これらの解析結果は、ＥＰ細胞由来のβ細胞がインビトロで成人膵島のそれに類似した様態でインシュリン放出のために生理刺激（Ｄ‐グルコース）に対し機能的に応答することを証明するものである。
【００７６】
５日目の一過性内胚葉由来のＥＰ細胞とＥＳＣの肝臓分化培養由来のＥＰ細胞の分化能を比較するため、肝臓由来のＥＰ細胞を前記の肝臓または膵臓の条件において分化させた。これらの細胞は、一過性内胚葉に由来するＥＰ細胞に類似した効率で、ＡＦＰおよびＡＡＴを発現した肝細胞前駆（図８Ｃ）およびＰＤＸ１およびｃ−ペプチドを発現したがグルカゴンを発現しない膵臓細胞（図９Ａ、下部パネル）を生み出した。これらのデータは、ＥＰ細胞が、多分化能を維持しているが、分化の複数の段階から発生させることが可能である強固な幹細胞集団であることを示唆する。
【００７７】
肝臓および膵臓は、前腸起源である。次に我々はＥＰ細胞が中腸／後腸領域から発生する腸管上皮を生産することが可能かどうか判定した。Ｓｐｅｎｃｅほか（２０１１）のそれに類似したプロトコルを用い、我々は、腸への分化を行うために、ＥＰ細胞を誘導した（方法を参照）。腸への分化を示す典型的な「オルガノイド」を誘導の３０日目に同定した（図１０Ａ）。これらの培養物は、中腸―後腸系列において亢進される転写制御因子、ＣＤＸ２およびＫＬＦ５（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、およびパネート細胞マーカーであるリゾチーム（ＬＹＺ）（図Ｓ６Ｂ）を発現した。これとは対照的に、ＥＰ細胞においてまた発現する腸の幹細胞マーカーであるＬＧＲ５は、誘導の３０日間後に成人の腸に類似したレベルまで下方制御された。細胞内フローサイトメトリー分析で細胞の８５〜９０％が分化の３０日目にＣＤＸ２を発現することが明らかとなり、腸の腫瘍細胞株ＣＡＣＯ−２と類似していた（図１０Ｃ）。これらのデータはＥＰ細胞は腸となる可能性があることを示す。
【００７８】
ＥＰ細胞の発生能が内皮系列に限定されるかどうかを判定するため、ＥＳＣを神経外胚葉（Ｇｒｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）または中胚葉へ導くために確立された条件で培養を誘導した。神経外胚葉マーカーであるＺＩＣ１、ＳＯＸ１、またはＰＡＸ４（図１１Ａ）および中胚葉マーカーであるＭＩＸＬ１、Ｔ、またはＰＥＣＡＭ（図１１Ｂ）の上方制御は認められず、ＥＰ細胞は内胚葉に分化決定済みであることを示唆する。
【００７９】
ＥＰ細胞は腫瘍形成性を持たず、インビボで内皮組織を形成する
奇形腫を形成するというＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓの傾向は、移植研究にとり大きな障害を意味する。ＥＰ細胞が腫瘍形成能を保持するかどうか判定するため、５０万個のＨ９  ＥＳＣｓまたはＨ９−ＥＰ細胞を、免疫不全マウスに筋内注射で移植した。４〜６週後、同数のＥＰ細胞を注射したマウスでは発生しなかったが、Ｈ９  ＥＳＣｓを注射した全てのマウスは腫瘍を発生した（図１２Ａ）。実際、これらの条件下において任意の注射したＥＰ細胞を検出することは困難であった。したがって、より大量のＥＰ細胞（８〜１０ｘ１０６）を、細胞生存を促進させ、ホスト血管を補充するため成長因子を含む濃縮マトリゲル中に移植した（方法を参照）。こうした条件下にて、ＥＰ細胞由来の腫瘍は、３〜６０週間にわたり３５件の移植（図１２Ｂ）において発生しなかった。これとは対照的に、ＥＳＣｓの５日目の一過性内胚葉分化培養由来の細胞をこの系において移植した場合、全ての動物が奇形腫を発生した。驚くべきことに、５日目のＥＳＣ分化培養から細胞ソーティングにより単離した精製ＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋ＤＥ細胞でさえ、移植６週以内で腫瘍を発生した（図１２Ｂ）。ＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋ＤＥ細胞が完全には内胚葉に分化することが決定されず、まだ奇形腫形成能を維持する可能性、または細胞ソーティング後でさえ少数のコンタミネーションしているＥＳＣｓが存在し、腫瘍形成を誘導する可能性がある。これに加え、ＥＳＣｓの肝臓分化２０日目の培養からの細胞を移植した場合、５匹中４匹の動物はそれでもまだ奇形腫を発生した（図１２Ｂ）。これらのデータはＥＰ細胞がＥＳＣｓ、ｉＰＳＣｓ、一過性内胚葉およびＥＳＣ由来の肝臓培養より腫瘍形成性を持たないないことを示す。
【００８０】
次に、我々は移植したマトリゲル−ＥＰ細胞プラグに細胞分化の証拠の有無を解析した。移植後３〜８週までには、細胞は様々な内皮組織を形成し、初期の腸管内胚葉と類似しているように見える上皮形成嚢胞および管（図１２Ｃ、上部パネル）から、分化した細胞を含む、より大きなもの、より複雑な構造まで多岐にわたった（図１２Ｃ、下部パネル、およびデータ図示せず）。これらには、セントラルルーメンを囲む上皮細胞による腸様の構造（図１２Ｃ、下部パネル）および肝芽細胞様の構造（データ図示せず）が含まれる。汎組織ヒト特異抗体による染色により、これらの内皮構造は、マウス宿主由来の脂肪および間充織を囲むことと対照的に、移植したＥＰ細胞から生じることが証明された（図１２Ｄ）。
【００８１】
移植したＥＰ細胞の発生能をさらに明らかにするためヒト特異抗体による免疫組織化学法を用いた。全てのＥＰ細胞由来の形態学的な内皮構造はＦＯＸＡ１およびＦＯＸＡ２を発現し、内皮起源と一致した（図１２Ｅおよびデータ図示せず）。腸管上皮に類似している構造は、腸のホメオスタシスに重要な調節因子である転写制御因子ＨＮＦ４ＡおよびＣＤＸ２（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を発現した。これらの細胞はまた、腸管上皮のマーカーであるヒト脂肪酸結合タンパク質（ＩＦＡＢＰ）、ＶＩＬＬＩＮ１およびＭＵＣＩＮ２により染色された（図１２Ｅ）。これに加え、免疫組織化学法により肝芽細胞／肝細胞様の構造がＡＦＰおよびＡＡＴ陽性の細胞をかくまうことが明らかとなった（図１２Ｆ）。これらのデータは、ＥＰ細胞がインビボで腸管上皮および肝臓に分化することが可能であることを明らかに証明する。
【００８２】
考察
インビトロで自己複製し、培養条件または動物への移植操作の後、様々な成熟組織に分化する幹細胞株を生み出す能力は、生物学に革命をもたらし、医学的応用に対し極めて有望なものを提供する。この点において、異なる発生能を持つ異なる幹細胞株がユニークな応用に利用される可能性が高い。例えば、マウス胚盤胞の３つの異なった細胞型から発生する、ＥＳＣｓ、栄養外胚葉幹（ＴＳ）細胞、および胚体外内胚葉幹（ＸＥＮ）細胞は、それらのそれぞれの前駆に類似した発生能を示す（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋｕｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。本明細書において、我々はヒトＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓから連続的に複製を行うクローン性の内胚葉系幹細胞株の樹立を解説する。ＥＰ細胞と呼ばれるこれらの細胞は、後述するとおり、自己複製し、特に前腸および中腸―後腸の両方から内皮系列を生み出す事が可能な最初の幹細胞集団である。
【００８３】
ＥＰ細胞は、これまでに報告された他の内皮前駆と比較し、いくつかのユニークな特徴を示す。肝細胞幹細胞集団は、成人肝臓に由来することがあり得る（Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これに加え、可能性がある肝臓幹細胞集団をヒトＥＳＣｓから発生させた（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＥＰ細胞により示されるより広範囲の発生能と対照的に、これらの２つの細胞型は肝臓系列のみに分化する。別の報告は、ヒトＥＳＣｓにおけるＳＯＸ１７過剰発現がＥＳＣおよび内胚葉両方を示す遺伝子を発現し、内胚葉派生物に分化することが可能な前駆集団を生み出すことを示す（Ｓｅｇｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これらの細胞はＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧのようなＥＳＣマーカーを発現し、それらは中胚葉を含む奇形腫を発生するため、内胚葉系ではない。ＥＰ細胞に類似しているが、マウスＥＳＣｓ由来でない細胞集団が報告された（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。おそらく、本明細書において記述されるヒトＥＰ細胞で最も際立った特徴は、それらの広範囲に及ぶ増殖能である。ヒトＥＰ細胞は実質的に無限の自己複製（１０１６細胞以上）を示すが（図２およびデータ図示せず）、マウス内胚葉前駆は培養において〜２０００倍までのみ増殖することが報告された（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。最新の研究とは対照的に、マウス内胚葉前駆細胞はクローンレベルでの解析はなされず、肝臓および膵臓発生においてのみテストがなされ、したがって、発生能において制限がある可能性がある。これに加え、ＥＰ細胞は、均質なＳＯＸ１７＋ＦＯＸＡ１＋未分化細胞集団として維持することが可能である。部分的に分化したＥＰ細胞培養（図１および２Ａを参照）は、本明細書において報告する効率で肝細胞またはβ細胞に再現的に分化させることが不可能であるため、純粋な未分化ＥＰ培養組織から開始することが重要な点である（不掲載データおよび図７および１２）。これは分化誘導したＥＳＣｓにおいてもまた認められる既知の現象であり、異なる発生経路の下流に部分的に分化した細胞は再度分化決定する能力を持たないことに起因する可能性がある。
【００８４】
インビトロでグルコースに反応性モノホルモーナルインシュリンを発現する細胞を生み出すＥＰ細胞の能力は有望である（図７）。培養においてヒトＰＳＣｓから機能的なβ細胞を生み出す大部分の試みでは、グルコース反応性細胞を生み出すことができなかった（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。グルコース反応性を報告したそれらの研究では、ｃ−ペプチド＋細胞が低レベルであった、および／または、異常なポリホルモンーナルの表現型を持つ集団において細胞のパーセンテージを慎重に解析されなかった（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｔｈａｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。どちらが最も強力な機能的な細胞型を生み出すかを判定するため、異なる方法論を用い発生させたβ細胞を比較することが将来重要である。これらの先行研究と一致し、我々はまた、膵臓分化を経るよう刺激されたヒトＥＳＣがポリホルモーナルβ細胞を生産することを明らかにした（不掲載データおよび図７Ｄ）。ＥＰ細胞由来の機能的に優れたβ細胞の産生は、インビボで膵性内胚葉産生の発生のタイミングに関連した生物学的特徴を反映する可能性がある。通常のヒト胚形成の間、ＥＳＣ分化培養においてはこれが通常２週間の内に生じるが（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、β細胞は内胚葉分化決定の後１０週間まで発生しない（Ｓｐｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，２００７）。ＥＳＣ分化培養におけるこの短縮された時間枠が、重要な転写ネットワーク、および／または適当なβ細胞形成に必須である後成的な修飾の構築を不可能にする可能性がある。ＥＳＣ内胚葉およびＥＰ細胞分化培養の更なる解析および比較により、機能的なβ細胞の最適な形成を制御する特定の遺伝子および後成的な修飾因子が明らかとなる可能性がある。
【００８５】
我々の実験はＥＰ細胞は内因性の中胚葉および外胚葉への分化能が欠如していることを示す。中胚葉または外胚葉のために開発した誘導分化プロトコルは、ＥＰ細胞に応用した場合、これらの系列に特異的な遺伝子発現プロファイルを誘導することができず、内胚葉に限定したプログラムを示唆した（図１１）。さらに、インビボ移植したＥＰ細胞は、ヒト特異抗体で染色される内皮構造を独占的に生み出す（図１２Ｄ）。これに加え、２４件の独立した移植の病理分析では、任意の形態学的な外胚葉組織を検出しなかった（データ図示せず）。この系列制限は、ＥＰ細胞を内皮細胞型への分化決定に必要なシグナルを詳細に解析するための強力な基本骨格とするものである。
【００８６】
フローサイトメトリーおよびマイクロアレイ分析は、、未分化ＥＳＣｓまたはＣＸＣＲ４＋ＣＤ１１７＋一過性内胚葉とは異なるヒトＥＰ細胞の特有の遺伝子発現パターンを明らかにした。ＬＨＸ１およびＥＯＭＥＳは成熟腸管マーカーとして一般的に定義されないが、ＥＰ細胞で維持される（図５）。これは、これらの転写制御因子がＥＰ細胞の運命または自己複製において役割を果たす可能性を呈するものである。様々な内皮系列の分化決定を経ている細胞に特有のマーカーの発現（表１）と同様に、これらのデータは、ＥＰ細胞が「やがて止まってしまう」腸管内胚葉でなく、異なったインビトロの幹細胞集団であることを示唆する。これらの相違点の解析により、内胚葉維持および発生の重要な調節因子を特定することが可能であった。
【００８７】
要約すると、我々は再現的かつ効率的にヒトＰＳＣｓから内胚葉幹細胞株を生み出するための簡便な培養方法を解説する。結果として生じるＥＰ細胞は速やかに自己複製し、肝臓、膵臓、腸組織を形成するよう刺激することが可能である。さらに、ＥＰ細胞は非腫瘍形成性であり、組織補充療法におけるそれらの潜在的有用性を示す。我々の研究は、組織分化誘導の研究の出発点としてＥＳＣｓ／ｉＰＳＣｓが用いられるべきであるという概念に疑問を呈するものである。むしろ、ＥＰ細胞は、ｉＰＳＣｓ／ＥＳＣｓと成熟した内皮派生物との間の中間物として用いられる。ｉＰＳＣｓから機能的なモノホルモーナルβ細胞を生み出す能力により、糖尿病および高インスリン血症の複数の遺伝型を含むベータ細胞の疾患のインビトロのモデリングが可能となる。これらの細胞株は内皮分化のメカニズムを解析するための革新的な実験的基本骨格を提供し、肝不全および糖尿病を含む一般的なヒト疾患を対象とした組織補充療法のより安全で、より効果的な出発点を提供するものである。
【００８８】
文献
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Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．，Ｈｕｃｈ，Ｍ．，Ｋｕｊａｌａ，Ｐ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｓｎｉｐｐｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｅｓ，Ｊ．Ｈ．，Ｓａｔｏ，Ｔ．，  Ｓｔａｎｇｅ，Ｄ．Ｅ．，Ｂｅｇｔｈｅｌ，Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｌｇｒ５（＋ｖｅ）ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｒｉｖｅ  ｓｅｌｆ  ｒｅｎｅｗａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ａｎｄ  ｂｕｉｌｄ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，２５−３６．
Ｂａｓｍａ，Ｈ．，Ｓｏｔｏ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ａ．，Ｙａｎｎａｍ，Ｇ．Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｉｔｏ，Ｒ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｅ．，Ｃａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３６，９９０−９９９．
Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｄ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｍｏｄｒｅｌｌ，Ｂ．，Ｍａｌａｃｋｏ，Ａ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｃ．，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｈ．，Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｓａｎｄｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒａｎｃｋｅ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＬＣＡＭ），ａ  ＣＤ６  ｌｉｇａｎｄ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８１，２２１３−２２２０．
Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｙ．，Ｒｏｍｅｒ，Ａ．Ｉ．，Ｈｕ，Ｍ．，Ｌｅｐｏｕｒｃｅｌｅｔ，Ｍ．，Ｍｅｃｈｏｏｒ，Ａ．，Ｙｅｓｉｌａｌｔａｙ，Ａ．，Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｍ．，Ｇｒａｙ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｒ．Ａ．（２００６）．Ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｒｖｅｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｔｒａｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３，４１１９−４１２９．
Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．，Ａｇｕｌｎｉｃｋ，Ａ．Ｄ．，Ｅｌｉａｚｅｒ，Ｓ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｏ．Ｇ．，Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｂａｅｔｇｅ，Ｅ．Ｅ．（２００５）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，１５３４−１５４１．
Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．，Ｂａｎｇ，Ａ．Ｇ．，Ｅｌｉａｚｅｒ，Ｓ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｏ．Ｇ．，Ａｇｕｌｎｉｃｋ，Ａ．Ｄ．，Ｓｍａｒｔ，Ｎ．Ｇ．，Ｍｏｏｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｂａｅｔｇｅ，Ｅ．Ｅ．（２００６）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，１３９２−１４０１．
Ｄｕｎｃａｎ，Ｓ．Ａ．，Ｎａｇｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎ，Ｗ．（１９９７）．Ｍｕｒｉｎｅ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＨＮＦ−４  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ：ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  Ｈｎｆ−４（−／−）ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，２７９−２８７．
Ｇａｄｕｅ，Ｐ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．（２００６）．Ｗｎｔ  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，１６８０６−１６８１１．
Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ，Ｖ．，Ｂｏｕｓｓｅｍａｒｔ，Ｌ．，Ｇａｄｕｅ，Ｐ．，Ｎｉｅｒｈｏｆｆ，Ｄ．，Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．Ｉ．，Ｋｕｂｏ，Ａ．，Ｓｈａｆｒｉｔｚ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．（２００６）．ＢＭＰ−４  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，１４０２−１４１１．
Ｇｒｅｂｅｒ，Ｂ．，Ｃｏｕｌｏｎ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ｓ．，Ｆｒａｎｋ，Ｓ．，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．Ｊ．，Ａｒａｕｚｏ−Ｂｒａｖｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｐａｐｅ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ３０，４８７４−４８８４．
Ｈｅｎｔｚｅ，Ｈ．，Ｓｏｏｎｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｔ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｐｕｔｔｉ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，Ｎ．Ｒ．（２００９）．Ｔｅｒａｔｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２，１９８−２１０．
Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｐ．Ｌ．（２０００）．Ａｄｕｌｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，２３１７−２３２２．
Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，Ａｕ，Ｍ．，Ｌｕ，Ｋ．，Ｅｓｈｐｅｔｅｒ，Ａ．，Ｋｏｒｂｕｔｔ，Ｇ．，Ｆｉｓｋ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ａ．Ｓ．（２００７）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｌｉｋｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，１９４０−１９５３．
Ｋａｎａｉ−Ａｚｕｍａ，Ｍ．，Ｋａｎａｉ，Ｙ．，Ｇａｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｊｉｍａ，Ｙ．，Ｔａｙａ，Ｃ．，Ｋｕｒｏｈｍａｒｕ，Ｍ．，Ｓａｎａｉ，Ｙ．，Ｙｏｎｅｋａｗａ，Ｈ．，Ｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｔａｍ，Ｐ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｎ  Ｓｏｘ１７−ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，２３６７−２３７９．
Ｋｕｎａｔｈ，Ｔ．，Ａｒｎａｕｄ，Ｄ．，Ｕｙ，Ｇ．Ｄ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｃｈｕｒｅａｕ，Ｃ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｙ．，Ｈｅａｒｄ，Ｅ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ａｖｎｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（２００５）．Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｘ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｔｒａ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２，１６４９−１６６１．
Ｌｕ，Ｃ．Ｃ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｊ．，  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．（２００１）．Ｆｒｏｍ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ：ａｘｉｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １１，３８４−３９２．
Ｌｕｄｔｋｅ，Ｔ．Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓ，Ｖ．Ｍ．，Ｐｅｔｒｙ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．（２００９）．Ｔｂｘ３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｂｕｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４９，９６９−９７８．
Ｌｕｋｏｗｉａｋ，Ｂ．，Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ，Ｂ．，Ｒｉａｃｈｙ，Ｒ．，Ｋｅｒｒ−Ｃｏｎｔｅ，Ｊ．，Ｇｍｙｒ，Ｖ．，Ｂｅｌａｉｃｈ，Ｓ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｐａｔｔｏｕ，Ｆ．（２００１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｚｉｎｃ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ．Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４９，５１９−５２８．
Ｍｉｚｒａｋ，Ｄ．，Ｂｒｉｔｔａｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（２００８）．ＣＤ１３３：ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｍｅｎｔ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１４，３−９．
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｏｉｋｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ，Ｉ．，Ｍｉｇｕｅｌｅｓ，Ｒ．Ｐ．，Ｓｏｎｅｊｉ，Ｓ．，Ｌｉｖｉｇｎｉ，Ａ．，Ｅｎｖｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｂｒｉｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｍ．（２００８）．Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ＥＳＣｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３，４０２−４１５．
Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．（２００８）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  １３２，６６１−６８０．
Ｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｓａｒａｎｇｉ，Ｆ．，Ｏｇａｗａ，Ｓ．，Ｈｏｌｔｚｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｃｏｒｎｅｏ，Ｂ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｍｉｃａｌｌｅｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．，Ｂａｓｆｏｒｄ，Ｃ．，Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ＷＮＴ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８，８６１−８７１．
Ｒｅｚａｎｉａ，Ａ．，Ｒｉｅｄｅｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｉｄｅｍａｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｋａｒａｎｕ，Ｆ．，Ａｏ，Ｚ．，Ｗａｒｎｏｃｋ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｉｅｆｆｅｒ，Ｔ．Ｊ．（２０１１）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，２３９−２４７．
Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ，Ｅ．，Ｗａｕｔｈｉｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｄ，Ｌ．Ｍ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，１８５２−１８５８．
Ｓｅｇｕｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｄｒａｐｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｎａｇｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（２００８）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ＳＯＸ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３，１８２−１９５．
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｊｉｔｉａｎｕ，Ｃ．，Ｃｌｅａｖｅｒ，Ｏ．，Ｓｈａｙｗｉｔｚ，Ｄ．Ａ．，Ｌａｍｅｎｚｏ，Ｊ．Ｏ．，Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｅ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．（２００７）．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０４，５４１−５５５．
Ｓｈｕ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｌｕ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．（２００１）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｗｉｎｇｅｄ−ｈｅｌｉｘ／ｆｏｒｋｈｅａｄ（Ｆｏｘ）ｇｅｎｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔ  ａｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，２７４８８−２７４９７．
Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｂ．，Ｑｕ，Ｈ．Ｑ．，Ｔａｌｅｂ，Ｎ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．Ｙ．，Ｓｃｈｅｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｐａｔｃｈ，Ａ．Ｍ．，Ｇｒａｂｓ，Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｌｙｎｎ，Ｆ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｒｆｘ６  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｉｓｌｅｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，７７５−７８０．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００７）．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：ｕｓｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２３６，３２１８−３２２７．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｌａｎｇｅ，Ａ．Ｗ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｋａｅｓｔｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｌｏｗｙ，Ａ．Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｉ．，Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００９）．Ｓｏｘ１７  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｏｒｇａｎ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １７，６２−７４．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｋｕｈａｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｏｌｌｅ，Ｋ．，Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｉ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７０，１０５−１０９．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，  Ｌａｕｆ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｎ．Ｆ．（２０１１）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２４０，５０１−５２０．
Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．（２０１０）．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２４，２２３９−２２６３．
Ｓｔｒｏｎｃｅｋ，Ｄ．Ｆ．（２００７）．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＨＮＡ−２ａ，ＮＢ１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ  ＣＤ１７７．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １４，６８８−６９３．
Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，Ｋｕｎａｔｈ，Ｔ．，Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．，Ｎａｇｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（１９９８）．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＦＧＦ４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０７２−２０７５．
Ｔｈａｔａｖａ，Ｔ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｅｄｕｋｕｌｌａ，Ｒ．，Ｓａｋｕｍａ，Ｔ．，Ｏｈｍｉｎｅ，Ｓ．，Ｔｏｎｎｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，Ｋｕｄｖａ，Ｙ．，Ｔｅｒｚｉｃ，Ａ．，ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ，Ｙ．（２０１０）．Ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ  Ｖ／ＧＬＰ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８，２８３−２９３．
Ｖａｒｌａｋｈａｎｏｖａ，Ｎ．Ｖ．，Ｃｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｆ．，ｄｅＶｒｉｅｓ，  Ｗ．Ｎ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．，Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｌ．Ｒ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｓ．，Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｂ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．（２０１０）Ｍｙｃ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８０，９−１９．
Ｚａｒｅｔ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ．（２００８）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１４９０−１４９４．
Ｚｈａｎｇ，Ｄ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，Ｓｕｉ，Ｘ．，Ｙｉｎ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｈ．（２００９）．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｔｕｒｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９，４２９−４３８．
Ｚｈａｏ，Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｃａｉ，Ｊ．，Ｇｕｏ，Ｙ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，Ｃｈｅ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｄｉｎｇ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｈ．（２００９）．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ６４６８．
Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００９）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５，２２１−２５１．
【００８９】
本願発明の望ましい実施形態が開示され、明確に上記に例示されていると確信するが、本願発明はそのような実施形態に限定されると意図するものではない。以下の請求項に記載される本願発明の範囲および意図から逸脱しない限り様々な修正が可能である。
【図１】
2014519854.tif 000007
【図２】
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【図３】
2014519854.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
2014519854.tif 000019