(57)【要約】  結腸ガンの遺伝子発現シグネチャー、それらを含むマイクロアレイ、および結腸遺伝子発現シグネチャーの使用方法が提供される。遺伝子発現シグネチャーは、結腸ガン、例えばステージII結腸ガンと診断された患者の予後を判断するために、特に有用である。本明細書に記載される遺伝子シグネチャーはまた、アジュバント化学療法を併用したまたは併用しない外科的切除の有効性を判断するため、および結腸ガンを有する患者におけるガン再発の可能性を判断するためにも有用である。
2014509189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の試料において、結腸ガンを診断する方法であって、前記方法が：
対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および
前記少なくとも２つの結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベル、またはそれから導出される判定スコアを、結腸ガンの診断を示す対照閾値と比較すること；を含み、ここで前記閾値の同じ側の、前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、結腸ガンの診断を示し、それにより対象由来の試料において結腸ガンを診断する、方法。
【請求項２】
前記対照閾値が、１つまたは複数の既知の結腸ガン試料中の、表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子からの対応する転写産物から導出される閾値を含み、ここで既知の結腸ガン群と、前記閾値の同じ側の前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、結腸ガンの診断を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結腸ガン試料の分類方法であって、前記方法が：
対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および
前記少なくとも２つの結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベル、またはそれから導出される判定スコアを、既知の分類を示す対照閾値と比較すること；を含み、ここで前記閾値の同じ側の、前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、前記結腸ガン試料の分類を可能にする、方法。
【請求項４】
前記対照閾値が、既知の分類の１つまたは複数の結腸ガン試料中の、表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子からの対応する転写産物から導出される閾値を含み、ここで既知の分類の１つまたは複数の結腸ガン試料と、前記閾値の同じ側の前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、前記結腸ガン試料の分類を可能にする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記結腸ガン試料がステージI、ステージII、ステージIIIおよびステージIVとして分類される、請求項３または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分類された結腸ガンに対して効果的であろう治療計画を選択することをさらに含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記治療が、外科的切除、化学療法、放射線療法、またはそれらのいずれかの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
結腸ガンの治療に対する応答を予測する方法であって、前記方法が：
対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および
前記少なくとも２つの結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベル、またはそれから導出される判定スコアを、治療に対する既知の応答を示す対照閾値と比較すること；を含み、ここで前記閾値の同じ側の、前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、治療に対する同様の応答を示し、それにより治療に対する応答を予測する、方法。
【請求項９】
前記対照閾値が、治療に対する既知の応答を有する１つまたは複数の結腸ガン試料中の、表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子からの対応する転写産物から導出される閾値を含み、ここで治療に対する既知の応答を有する１つまたは複数の結腸ガン試料と、前記閾値の同じ側の前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、治療に対する同様の応答を示し、それにより治療に対する応答を予測する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療が外科的切除である、請求項８または９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が化学療法および／または放射線療法である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
結腸ガンを有する対象の長期生存を予測する方法であって、前記方法が：
対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および
前記少なくとも２つの結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベル、またはそれから導出される判定スコアを、長期生存の前歴を有することを示す対照閾値と比較すること；を含み、ここで前記閾値の同じ側の、前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、前記対象の長期生存を示し、それにより対象の長期生存を予測する、方法。
【請求項１３】
前記対照閾値が、長期生存の前歴を有する１または複数の対象由来の１つまたは複数の結腸ガン試料中の、表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子からの対応する転写産物から導出される閾値を含み；ここで長期生存の前歴を有する１または複数の対象由来の１つまたは複数の結腸ガン試料と、前記閾値の同じ側の前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、前記対象の長期生存を示し、それにより対象の長期生存を予測する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
長期生存が少なくとも５年の生存を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象において結腸ガンの再発を予測する方法であって、前記方法が：
対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および
前記少なくとも２つの結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベル、またはそれから導出される判定スコアを、再発の前歴を示す対照閾値と比較すること；を含み、ここで前記閾値の同じ側の、前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、前記対象における再発を示す、方法。
【請求項１６】
前記対照閾値が、再発の前歴を有する１つまたは複数の結腸ガン試料中の、表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子からの対応する転写産物から導出される閾値を含み、ここで再発の前歴が既知である１つまたは複数の結腸ガン試料と、前記閾値の同じ側の前記発現レベルまたはそれから導出される判定スコアが、前記対象における再発を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象のための、個別化された結腸ガンのゲノミクスプロファイルを作製する方法であって：
対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および
遺伝子発現解析により得たデータを要約した報告書を作成すること；を含む、方法。
【請求項１８】
前記対象由来の核酸が、前記対象由来の結腸直腸組織の試料から抽出したＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が生検試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、固定試料および／またはパラフィン包埋試料である、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現レベルが、１つまたは複数の対照遺伝子に対して正規化される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現レベルが、ＰＣＲおよび／またはマイクロアレイベースの方法により測定される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出することが、ＭＵＭ１およびＳＩＧＭＡＲ１転写産物の発現レベルを検出することを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出することが、ＭＵＭ１、ＳＩＧＭＡＲ１、ＡＲＳＤ、ＳＵＬＴ１Ｃ２およびＰＰＦＩＢＰ１転写産物の発現レベルを検出することを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出することが、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌ、ならびにアンチセンス配列であるＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４、およびＲＮＦ３９転写産物の発現レベルを検出することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出することが、表１に記載される転写産物の発現レベルを検出することを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出することが、表２に記載される転写産物の発現レベルを検出することを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
結腸ガンの遺伝子発現シグネチャーを検出するための核酸プローブであって、配列番号１〜６３６に記載の核酸配列またはその相補配列うちの１つと特異的にハイブリダイズ可能な、２０〜４０ヌクレオチド長の核酸分子を含むかまたは前記核酸分子から実質的に成る、プローブ。
【請求項２９】
前記プローブが標識されている、請求項２８に記載の核酸プローブ。
【請求項３０】
前記プローブが、放射性標識、蛍光標識、ビオチン標識、酵素的標識、または化学的標識で標識されている、請求項２９に記載の核酸プローブ。
【請求項３１】
結腸ガンの遺伝子発現シグネチャーを検出するためのプローブのセットであって、２つ以上プローブを含み、各プローブが、配列番号１〜６３６に記載の核酸配列またはその相補配列のうちの１つと特異的にハイブリダイズ可能な、２０〜４０ヌクレオチド長の核酸分子を含むかまたは前記核酸分子から実質的に成る、プローブのセット。
【請求項３２】
前記プローブが標識されている、請求項３１に記載のプローブのセット。
【請求項３３】
前記プローブが、放射性標識、蛍光標識、ビオチン標識、酵素的標識、または化学的標識で標識されている、請求項３２に記載のプローブのセット。
【請求項３４】
前記セットが、前記表６に記載される転写産物の各々に相補的な、少なくとも１つのプローブを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のプローブのセット。
【請求項３５】
前記表６に記載される転写産物のサブセット中の各転写産物に相補的な少なくとも１つのプローブを含み、前記サブセットが、前記表６の転写産物の少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９５％を含む、請求項３４に記載のプローブのセット。
【請求項３６】
結腸ガンの遺伝子発現シグネチャーを検出するためのデバイスであって、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のプローブのセットを含む核酸アレイを含む、デバイス。
【請求項３７】
結腸ガン核酸の遺伝子発現シグネチャーを増幅するためのプライマー対であって、前記プライマー対が：
配列番号１〜６３６に記載の核酸配列またはその相補配列のうちのいずれか１つと特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、１５〜４０ヌクレオチド長のフォワードプライマー；および
配列番号１〜６３６に記載の核酸配列またはその相補配列のうちのいずれか１つと特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、１５〜４０ヌクレオチド長のリバースプライマー；を含み、
ここで前記プライマーのセットが前記核酸の増幅を誘導することが出来る、プライマー対。
【請求項３８】
結腸ガン核酸の遺伝子発現シグネチャーを増幅するためのプライマー対のセットであって、配列番号１〜６３６に記載の核酸配列のうちのいずれか１つの増幅における使用に好適な、少なくとも２つのプライマー対を含む、プライマー対のセット。
【請求項３９】
前記プライマー対のセットが、配列番号１〜６３６に記載の核酸配列のサブセットの増幅における使用に好適なプライマー対を含み、前記サブセットが、前記配列番号１〜６３６に記載の核酸配列の少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９５％を含む、請求項３８に記載のプライマー対のセット。
【請求項４０】
結腸ガンの予後を示す遺伝子発現プロファイルを作成する方法であって、前記方法が：
結腸ガン検体から単離されたＲＮＡを含む試料中、１０００未満の転写産物の発現レベルを検出することを含み、ここで少なくとも５０の表６に記載される転写産物が検出される、方法。
【請求項４１】
４００〜８００の転写産物の発現レベルが検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
５００〜７００の転写産物の発現レベルが検出される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１００の表６の転写産物が検出される、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも２００の表６の転写産物が検出される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも３００の表６の転写産物が検出される、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも４００の表６の転写産物が検出される、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも５００の表６の転写産物が検出される、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも６００の表６の転写産物が検出される、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
表６に記載されるすべての転写産物が検出される、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記表６に記載される転写産物が、前記表１に記載される転写産物を含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記結腸ガン検体が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料である、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記表６に記載される転写産物の発現レベルまたはそれから導出される判定スコアを、高リスクおよび低リスク患者集団の、対応するレベルまたはスコアに対して点数化することをさらに含む、請求項４０〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記患者が高リスク群であると判断された場合、アジュバント化学療法を選択することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
結腸ガンの予後診断方法であって、前記方法が：
単離したＲＮＡを含む、結腸ガン検体の遺伝子発現プロファイルを作製すること；および
低リスクまたは高リスク群において、少なくとも５０の表６に記載される転写産物の発現レベルまたはそれから導出される判定スコアに基づいて検体を分類すること；
を含む方法。
【請求項５５】
前記遺伝子発現プロファイルにおいて、１０００未満の転写産物のレベルが検出される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子発現プロファイルにおいて、８００未満の転写産物のレベルが検出される、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子発現プロファイルにおいて、７００未満の転写産物のレベルが検出される、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記検体が、少なくとも１００の表６の転写産物の発現レベルに基づいて分類される、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記検体が、少なくとも２００の表６の転写産物の発現レベルに基づいて分類される、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記検体が、少なくとも３００の表６の転写産物の発現レベルに基づいて分類される、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記検体が、少なくとも４００の表６の転写産物の発現レベルに基づいて分類される、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記検体が、少なくとも５００の表６の転写産物の発現レベルに基づいて分類される、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記検体が、少なくとも６００の表６の転写産物の発現レベルに基づいて分類される、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
表６に記載されるすべての転写産物の前記発現レベルが、前記検体を分類するために使用される、請求項５４〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記表６に記載される転写産物が、前記表１に記載される転写産物を含む、請求項５４〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記結腸ガン検体が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料である、請求項５４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が高リスク群であると判断された場合、アジュバント化学療法を選択することをさらに含む、請求項５４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年、１月２５日に出願された、米国特許仮出願第６１／４３５，９２２号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示は、結腸組織、例えば結腸ガン組織における遺伝子発現プロファイリングに関する。より詳細には、本開示は、アーカイブされたパラフィン包埋生検材料を含む、結腸腫瘍の生検組織中のｍＲＮＡレベルを測定するための高感度法に関する。さらに、本開示は、結腸ガンの予後、診断および治療のための遺伝子発現シグネチャーを形成する、発現した転写産物のセットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
すべての結腸ガン患者のうちの約３０％がステージIIの疾患と診断されている（Jemal et al., CA Cancer J. Clin., 2004）。手術による治療を受けたステージII結腸ガンを有する患者の５年生存率は約７５〜８０％であり、大部分の患者が手術のみにより治癒することを示す。（Benson, The Oncologist, 2006; Nauta et al., Arch. Surg., 1989）。それにもかかわらず、これらの患者のうち約２０〜２５％が、その人生のうちに疾患を再発する（Benson, The Oncologist, 2006; Gill et al., J. Clin. Oncol., 2004）。理論的には、これらの患者は、アジュバント化学療法により利益を得るはずである。しかしながら、ステージII結腸ガンにおいて、アジュバント化学療法の使用により、５年目の生存率で絶対的な改善を有するのは、患者のうちのわずか３〜４％のみである。（Benson, The Oncologist, 2006; Andre et al., Annals of Surgical Oncology 2006）。結果として、米国臨床腫瘍学会のガイドラインは、これらの患者を、日常的にアジュバント化学療法で治療すべきではないと推奨している（Benson et al., J. Clin. Oncol., 2004）。これにもかかわらず、高い再発の恐れがある、ステージII結腸ガン患者のうちの約２０％は、アジュバント治療の候補となり得ることは明らかである。（Benson, The Oncologist, 2006; Nauta et al., Arch. Surg., 1989; Gill et al., J. Clin. Oncol., 2004; Andre et al., Annals of Surgical Oncology 2006）。
【０００４】
例えば結腸ガンのような疾患において、しばしば最初の治療が最も重要であり、かつ成功の最大の機会を提供するため、患者の結腸ガンの特定のステージに対して最も効果的な治療を、最初の治療法として使用する必要がある。これは、従来不可能であった。なぜならば、どの薬剤による治療法が、特定の個人の生理機能において最も効果的であるかを予測する方法がなかったからである。患者は何度も、不必要に毒性のある薬剤療法を受けなければならなかった。例えば、ステージIIの腫瘍節転移（ＴＮＭ）結腸ガンにおいて、どの患者が、手術後のアジュバント化学療法に応答するかを判断する方法はなかった。化学療法によるいずれかの恩恵を受けるのは、手術後に再発リスクを有する、ステージII患者の２０％のうちの、わずか３分の１のみである。これは、アジュバント化学療法を処方することが、一部の患者を不必要な治療に晒すということを意味する。代わりに、このステージにおいてアジュバント化学療法を行わないという判断は、一部の患者をガン再発のより高い危険に晒すことになる。
【０００５】
現在、臨床診療において使用される診断検査は、単一分析物の試験に基づいており、従って、何十もの異なるマーカー間の関係を知るという潜在的な価値を捉えることは無い。さらに、診断検査はしばしば、免疫組織化学に依存し、定量的でないことがある。この方法は、たびたび、異なる試験所において異なる結果をもたらすが、その原因の一部は、試薬が標準化されていないことにあり、また一部は、解釈が主観的であり得、容易に定量化出来ない可能性があることにある。時間経過に伴うＲＮＡ分解の問題と、分析のために患者から新鮮な組織試料を得ることが難しいという事実に因り、ＲＮＡベースの検査はあまり使用されていない。固定されたパラフィン包埋組織は、より容易に入手可能であり、固定された組織中でＲＮＡを検出する方法は確立されている。しかしながら、これらの方法では、一般に、少量の材料から得た多数の遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検査することができない。そのため、従来、固定された組織は、タンパク質の免疫組織化学的な検出のため以外には、滅多に使用されていない。
【０００６】
近年、いくつかの団体が、マイクロアレイ遺伝子発現解析による、種々のガン種の分類に関する研究を発表している（例えばGolub et al., Science 286:531 537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:13790 13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Suppl. 1):S316 S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149 15154 (2001), Salazar et al., Journal of Clinical Oncology 29: 17-24 (2010), O'Conneell et al., Journal of Clinical Oncology 28: 3937-3944 (2010) and Kerr et al., Journal of Clinical Oncology 27 (suppl) 15s (2009)を参照のこと）。しかしながら、これらの研究は、多くが、既に確立された種々の種類のガンの分類を改善および洗練することに注力しており、一般的に、発現量の異なる遺伝子（differentially expressed genes）の関係に関する新たな洞察を提供することは無く、ガン治療の臨床成績を改善するために、研究成果を治療方針に結び付けることもない。さらに、ガンの治療および結腸ガンの臨床治験は、腫瘍の遺伝子構造および患者の遺伝子型を利用して個別化された投薬計画を確立する、薬理ゲノミクスによる統合的手法ではなく、今だに、新たな活性化合物の入手可能性に基づいて進められている。
【０００７】
現代の分子生物学および生化学により、その活性が、腫瘍細胞の行動、それらの分化の状態、およびある特定の治療薬に対するそれらの感受性または耐性に影響を及ぼす、１００を超える遺伝子が明らかにされているが、少数の例外を除き、これらの遺伝子の現状は、薬剤治療に関する臨床判断を日常的に下す目的のために、十分生かされてはいない。
【発明の概要】
【０００８】
結腸ガンを有する患者の予後を予測するために有用な、バイオマーカーを特定する必要がある。患者を、高リスク（予後不良）または低リスク（予後良好）として、分類することが出来れば、これらの患者のための適切な治療を選択することができるであろう。例えば、高リスクの患者は、積極的治療により利益を得る可能性が高いが、低リスクの患者にとっては、有意な利点がない可能性がある。しかしながら、この必要にもかかわらず、この課題に対する解決策は存在しなかった。
【０００９】
従って、特定の治療計画、例えば、化学療法を併用するかまたは併用しない切除の実施後における、回復または再発の可能性に関する情報を医師に提供する、マイクロアレイベースの予後診断技術が必要とされている。結腸疾患の正確な診断、特に結腸ガンの特定のステージの診断が可能な技術、または特定の治療法に対する結腸疾患患者の応答を予測することが出来る技術もまた、必要とされている。ガン患者の腫瘍に関する特定の知識は、緩解期を延長し、患者の人生の質を向上させ、および医療費を減少させる上で、非常に有用となるであろう。そのような技術を、新規な治療用化合物および治療方法のための臨床治験候補の患者を選別するために使用して、規制承認プロセスを促進することも可能である。
【００１０】
これらの必要を満たす、結腸ガン由来の発現シグネチャーが開示される。開示されるシグネチャーは、結腸ガンの予後診断、結腸ガンの診断および患者群の分類における用途のために使用することが出来る。いくつかの実施形態において、これらの結果は、結腸ガンの治療における、手術単独の、または手術とアジュバント化学療法との組み合わせの有効性のゲノム的証拠の評価を可能にする。本明細書に記載されるシグネチャーは、２つの診断または予後の結果を区別する上で重要であり得、またその識別が出来る可能性がある。本開示の重要な態様は、患者に最も適切な治療を行うため、および、予後情報を提供するために、結腸ガン組織中のある特定の遺伝子の測定された発現を使用することである。従って、そのような結腸ガンシグネチャーの使用方法が開示される。開示される方法は、対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること；および前記少なくとも２つの結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベル、またはそれから導出される判定スコアを、対照閾値と比較すること；を含む。要求される予測に応じて、対照閾値は、結腸ガンの診断、結腸ガンの既知の分類、治療に対する既知の応答、長期生存の前歴、再発の前歴等を示し得る。
【００１１】
種々の実施形態において、ＲＮＡは、結腸組織試料から単離され、遺伝子発現プロファイルの作成のために使用される。ガンの予後診断を含むある実施形態において、試料は直腸結腸腫瘍検体、例えば結腸ガン試料である。ある実施形態において、遺伝子発現プロファイリングは、少なくとも５０の、表６に記載され、ならびに表１および／または表２にも記載されている可能性のある転写産物の発現を検出することを含む。遺伝子発現プロファイリングで検出される転写産物の総数は、変動し得る。例えば、いくつかの実施形態において、プロファイリングで検出される転写産物の総数は、約２００〜約１０００もしくは約４００〜約８００であり、または他の実施形態において、転写産物の総数は、約５００〜約７００もしくは約５５０〜約６５０である。種々の実施形態において、表６に記載される、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、または全ての転写産物が、転写産物総数のうちの一部として検出される。追加の転写産物が検出される場合（表６に記載されるものに加えて）、それらは所望により、信号または発現レベルの対照から選択されてもよく、およびいくつかの実施形態において、それらは、結腸ガンにおいて発現されることが知られる、例えばＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）により測定されるものなどである。ある実施形態において、追加の転写産物は、結腸ガンの予後を示し得る。
【００１２】
患者の発現プロファイルは、高リスクおよび低リスクの患者群、例えば臨床的再発の高リスクまたは低リスクを有する患者における、表６に記載される転写産物の発現レベルに基いて、発現シグネチャーに対して点数化され、その結果を治療方針の決定のために使用することが出来る。例えば、高リスク患者であると判断された患者を、手術後、アジュバント化学療法で治療することができる。低リスク患者であるとみなされる患者に対しては、手術後、アジュバント化学療法を差し控えることが出来る。従って、本発明は、ある態様において、再発のリスクを示す、結腸ガン腫瘍の遺伝子発現プロファイルの作成方法を提供する。
【００１３】
本開示はさらに、結腸ガンの予後診断方法を提供する。この態様の方法は、結腸ガン検体（例えば、本明細書に記載される）の遺伝子発現プロファイルを作製することを含む。遺伝子発現プロファイルは、次いで分類されるか、または本明細書に記載される遺伝子発現シグネチャーに対して点数化される。種々の実施形態において、遺伝子発現シグネチャーは、少なくとも５０の、表６に記載され、ならびに表１および／または表２にも記載されている可能性のある、転写産物の発現レベルに基づく。いくつかの実施形態において、シグネチャーがベースとする転写産物の総数は、約８００未満、約７００未満、約６００未満、約５００未満、４００未満約、約３００未満、約２００未満、または約１００未満の転写産物であり、それには表６の転写産物も含まれる。例えば、シグネチャーは、少なくとも約４００、少なくとも約５００、または少なくとも約６００の表６の転写産物の発現レベルに基づき得る。表６の転写産物は、所望により表１に記載される転写産物を含む。
【００１４】
対象のための、個別化された結腸ガンのゲノミクスプロファイルを作製する方法もまた開示される。前記方法には、対象由来の核酸を含む試料において、少なくとも２つの表６に記載される結腸ガンに関連する核酸分子の発現レベルを検出すること、および遺伝子発現解析により得たデータを要約する報告書を作成することが含まれる。
【００１５】
開示される方法のいくつかの例において、発現レベルは、対象由来の結腸直腸組織、例えば結腸ガン試料から抽出したＲＮＡ、および／または該ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを含む、前記対象由来の核酸から測定される。
【００１６】
結腸ガンの遺伝子発現シグネチャーを検出するための、核酸プローブおよびプライマー（ならびにそのようなプローブおよびプライマーのセット）もまた、開示される。いくつかの例において、プローブは、結腸ガンシグネチャーの検出において使用するためのアレイの一部である。
【００１７】
本開示の、前述ならびに他の特徴および優位性は、添付の図面を参照しつつ進行する、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明により明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、結腸ガン転写産物の発現シグネチャーを得るために使用される、例示的な手順を示すフローチャートである。
【図２】図２は、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）を使用した、ステージII結腸ガンの予後シグネチャーの生成および検証の、例示的な概要を示すフローチャートである。
【図３】図３Ａは、訓練事例における、６３６の転写産物の予後シグネチャーの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線のグラフである。図３Ｂ  は、候補モデル由来の訓練データから得た、再発のカプラン・マイヤープロットを示す図である。
【図４】図４Ａは、検証事例における、６３６の転写産物の予後シグネチャーの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線のグラフである。図４Ｂは、候補モデル由来の検証データから得た、再発のカプラン・マイヤープロットである。
【図５】図５は、候補モデル由来の検証データから得た、全生存のカプラン・マイヤープロットである。
【図６】図６は、以下に記載される表３である。
【図７】図７は、以下に記載される表６である。
【００１９】
表の簡単な説明
表１は、中核となる結腸シグネチャーに含まれる、１０の候補転写産物のリストである。これらの転写産物は、不良および良好な予後群への試料の分類において、最も高い影響を有すると特定されている。
表２は、結腸シグネチャーに含まれる、１７８の固有の転写産物のリストである。この表には、６３６の転写産物シグネチャー中の転写産物の加重ランク、ならびに結腸組織中に発現された転写産物の配向性が含まれる。
表３は、６３６の転写産物シグネチャーを特定するための研究における、主要な患者および腫瘍特性を示す表である。
表４は、転写産物シグネチャーを特定するために使用した、交差検定された訓練事例および検証事例のための、性能測定基準を示す表である。
表５は、患者の年齢、患者の性別、ｐＴ−ステージ、腫瘍グレード、腫瘍の位置および粘液性／非粘液性サブタイプの状態に対するハザード比を示す、統計解析の結果を示す表である。
表６は、６３６の転写産物結腸シグネチャーに含まれる転写産物のリストである。
【００２０】
配列表
添付の配列表に記載される核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義される、ヌクレオチド塩基の標準の文字略語を使用して示される。各核酸配列のうちの１つの鎖のみが示されているが、表示される鎖に対するいずれの参照によっても、その相補鎖が含まれると理解される。添付の配列表において：
配列番号１〜６３６は、ヒト結腸ガン由来のオリゴヌクレオチド転写産物である。
配列表は、２３２，１５４バイトの、２０１２年、１月２５日に作成された、ＡＤＬ−０３１１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前のファイルの形で、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み入れられる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
Ｉ．用語の概要
別段の定めがない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)で見出すことができる。
【００２２】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解釈すべき場合を除いて、複数の指示対象を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という語は、文脈上明らかに他の意味に解釈すべき場合を除いて、「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。
【００２３】
本開示の様々な実施形態の再検討を助けるために、以下の用語の説明を提供する：
【００２４】
核酸分子の増幅：例えば、たとえば表６で示される転写産物などの遺伝子または遺伝子断片などの核酸分子のコピー数を増大させること。結果として得られる産物は増幅産物と呼ばれる。
【００２５】
インビトロ増幅の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。インビトロ増幅技術の他の例としては、定量的リアルタイムＰＣＲ、ストランド置換増幅（米国特許第５，７４４，３１１号を参照のこと）；無転写（transcription-free）等温増幅（米国特許第６，０３３，８８１号を参照のこと）；修復連鎖反応増幅（国際公開第９０／０１０６９号を参照のこと）；リガーゼ連鎖反応増幅（ＥＰ−Ａ−３２０３０８を参照のこと）；間隙充填リガーゼ連鎖反応増幅（米国特許第５，４２７，９３０号を参照のこと）；結合型リガーゼ検出およびＰＣＲ（米国特許第６，０２７，８８９号を参照のこと）；ならびにＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ無転写増幅（米国特許第６，０２５，１３４号を参照のこと）が挙げられる。
【００２６】
アレイ：基体上または基体中のアドレス可能な位置での生体高分子（そのような核酸分子）または生体試料（例えば組織切片）などの分子の配列。数例では、アレイは、ハイブリダイゼーション手順の間で実質的に除去されないように固体基体に結合された、ポリヌクレオチドプローブ（例えば、表６で示される核酸配列、またはそれらの相補配列にハイブリダイズするプローブ）のアレイである。「マイクロアレイ」は、小型化されて、評価または分析のために顕微鏡検査を必要とするか、または顕微鏡検査により支援されるようなアレイである。アレイはＤＮＡチップまたはバイオチップと呼ばれる場合もある。
【００２７】
分子（「フィーチャー」）のアレイにより、１つの試料に対して一度に非常に多数の分析を行うことが可能になる。ある例示的アレイでは、１以上の分子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）が、アレイ上に複数回（例えば２回）出現して、例えば内部標準を提供する。
【００２８】
特定の例において、アレイは、オリゴヌクレオチド配列などの核酸分子を含む。アレイ上で使用されるポリヌクレオチドはｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡアレイ」）であってよく、これは典型的には約５００〜５０００塩基長であるが、さらに短いｃＤＮＡまたはさらに長いｃＤＮＡも使用することができる。別法として、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドであってもよく、これは典型的には約２０〜８０塩基長であるが、さらに短いオリゴヌクレオチドおよびさらに長いオリゴヌクレオチドも好適である。一例において、これらの分子は、その５’末端または３’末端にてアレイに結合したオリゴヌクレオチドを含む。
【００２９】
アレイ内で、配置されたそれぞれの試料は、アレイの少なくとも二次元内で確実かつ一貫してその位置を決定することができるという点で、アドレス可能である。アレイ上のアドレス可能な位置の数は、例えば少なくとも４から、少なくとも９まで、少なくとも１０まで、少なくとも１４まで、少なくとも１５まで、少なくとも２０まで、少なくとも３０まで、少なくとも５０まで、少なくとも７５まで、少なくとも１００まで、少なくとも１５０まで、少なくとも２００まで、少なくとも３００まで、少なくとも５００まで、少なくとも５５０まで、少なくとも６００まで、少なくとも８００まで、少なくとも１０００まで、少なくとも１０，０００またはそれ以上まで変わり得る。アレイ上のフィーチャー適用位置は異なる形状をとり得る。例えば、アレイは規則的（均一な行および列に配置されるなど）または不規則的であってもよい。したがって、規則的アレイでは、各試料の位置は、アレイに適用された時点で試料に割り当てられ、各位置を適切な標的またはフィーチャーの場所と相関させるための手掛かりを提供することができる。多くの場合、規則的アレイは対称的な格子パターンで配置されるが、試料を他のパターン（例えば、放射状に配列した線、螺旋状の線、または規則的なクラスター）で配置することができる。アレイ上の特定のアドレスをその場所での試料についての情報（例えばシグナル強度を含むハイブリダイゼーションまたは結合データなど）と相関させるようにコンピュータをプログラムすることができるので、アドレス可能なアレイは、通常、コンピュータで読み込み可能である。コンピュータで読み込み可能なフォーマットの数例では、アレイにおける個々のフィーチャーは、例えば、コンピュータによってアドレス情報に相関させることができるデカルト格子パターンで規則的に配置される。
【００３０】
結合または安定な結合：２つの物質もしくは分子間の会合、例えば核酸と別の核酸の会合（例えば、表６で示される転写産物もしくはその相補鎖に対するプローブの結合）、またはタンパク質の別のタンパク質もしくは核酸分子との会合。結合は、当業者に公知の任意の手順によって、例えば核酸の場合では、標的：オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的特性によって、検出することができる。
【００３１】
核酸分子の相補鎖の結合を検出する物理的方法としては、限定されないが、ＤＮａｓｅ  Ｉまたは化学フットプリンティング、ゲルシフトおよびアフィニティー切断アッセイ、ノーザンブロッティング、ドットブロッティングならびに光吸収検出手順などの方法が挙げられる。例えば、１つの方法は、温度がゆっくりと上昇する際の、オリゴヌクレオチド（またはアナログ）および標的核酸を含有する溶液の２２０〜３００ｎｍでの光吸収の変化を観察することを含む。オリゴヌクレオチドまたはアナログがその標的と結合した場合、オリゴヌクレオチド（またはアナログ）および標的が互いに分離するか、または融解する際に、特徴的な温度にて吸収が突然増加する。別の例では、方法は、１つもしくは両方の核酸分子（または必要に応じて、抗体もしくはタンパク質）上に存在する、検出可能な標識などのシグナルを検出することを含む。
【００３２】
オリゴマーとその標的核酸との間の結合は、しばしば、オリゴマーの５０％がその標的から融解する温度（Ｔｍ）によって特徴付けられる。高い（Ｔｍ）は、低い（Ｔｍ）を有する複合体よりも強力または安定な複合体を意味する。
【００３３】
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）：内部非コーディングセグメント（イントロン）および転写を決定する調節配列のないＤＮＡ。ｃＤＮＡは、細胞および／または組織試料、例えば結腸ガン試料を含む結腸試料から抽出されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの逆転写によって合成することができる。
【００３４】
臨床転帰：疾患もしくは障害の治療後、または治療の非存在下での患者の健康状態を指す。臨床転帰としては、限定されないが、死亡までの時間の延長、死亡までの時間の短縮、生存の可能性の増加、死亡リスクの増加、生存、無病生存率、慢性疾患、転移、進行もしくは侵攻性疾患、疾患再発率、死、および療法に対する有利もしくは不良な応答が挙げられる。
【００３５】
結腸ガン：結腸（大腸の最も長い部分）の組織で形成するガン。ほとんどの結腸ガンは腺ガン（線状内部器官を形成し、腺様特性を有する細胞で発生するガン）である。ガンの進行は、病期、すなわち身体でのガンの程度によって特徴付けられる。病期分類は、通常、腫瘍のサイズ、リンパ節がガンを含むかどうか、そしてガンが最初に発生した部位から身体の別の部分へと広がっているかどうかに基づく。結腸ガンの病期には、病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩおよび病期ＩＶが含まれる。特に明記しない限り、結腸ガンという用語は、病期０、病期Ｉ、病期ＩＩ（病期ＩＩＡもしくはＩＩＢを含む）、病期ＩＩＩ（病期ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢもしくはＩＩＩＣを含む）、または病期ＩＶの結腸ガンを指す。本明細書中のいくつかの実施形態では、結腸ガンは任意の病期からのものである。他の実施形態では、結腸ガンは病期ＩＩの結腸ガンである。
【００３６】
化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の治療において治療有用性を有する任意の化学薬剤。そのような疾患としては、腫瘍、新生物、およびガンならびに乾癬などの肥厚成長によって特徴付けられる疾患が挙げられる。１つの実施形態では、化学療法剤は結腸ガンの治療で有用な薬剤である。１つの実施形態では、化学療法剤は放射性化合物である。当業者は有用な化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer and Berkery. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer Knobf, and Durivage (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993を参照のこと）。結腸ガンを治療するために用いられる化学療法剤としては、５−フルオロウラシルフルオロウラシル（urcil）、ロイボコリン（leuvocorin）、イリノテカン、オキサリプラチン、およびカペシタビンなどの小分子、ならびにそのようなベバクジマブ（bevacuzimab）およびセツキシマブなどの抗体が挙げられる。併用化学療法は、ガンを治療するための複数の薬剤の投与である。
【００３７】
接触：直接、物理的に結合した配置；固体および液体形態の両方を含む。接触は、１つの分子と別の分子との間の接触、例えば；試料を表６で示される配列のいずれかのプローブなどの核酸プローブを接触させることを含む。
【００３８】
対照：「対照」とは、結腸ガンの患者から得られる腫瘍試料などの実験試料と比較するために用いられる試料または基準を指す。いくつかの実施形態において、対照は、健常な患者または結腸ガンと診断された患者から得られる非ガン性組織試料、例えば腫瘍が存在する同じ臓器由来の非ガン性組織試料である（例えば、非ガン性結腸組織は結腸ガンの対照としての機能を果たすことができる）。いくつかの実施形態において、対照は履歴的対照または基準値（すなわち、ベースラインもしくは正常値を表すあらかじめ試験された対照試料または試料群）である。
【００３９】
試料との比較のため、差次的発現の決定のための対照または基準は、（それらが望ましい特性について変更されていない、例えば結腸ガンを有しない対象由来の試料であるという点で）正常であると考えられる試料、ならびに、恣意的なセットとなる可能性はあるが、実験室で定める値をも含む。実験室基準および値は、既知もしくは決定された集団値に基づいて設定することができ、そして測定され実験で決定された値の比較を可能にするグラフまたは表のフォーマットで提供することができる。
【００４０】
発現の検出：定性的または定量的のいずれかでレベル発現を測定することによって、核酸を検出することができる。例示的方法としては、マイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ、およびノーザンブロットが挙げられる。数例では、発現の検出は、表６における１以上の転写産物の発現を検出することを含む。
【００４１】
差次的発現または変化した発現：遺伝子（例えば、表１、２からの遺伝子のいずれか、および／または表６における核酸転写産物）でコードされた情報のメッセンジャーＲＮＡへの変換、ｍＲＮＡのタンパク質への変換、または両者における増加もしくは減少などの差異。数例では、差異は、同じ対象由来の、結腸ガンなどの疾患による影響を受けていない組織における核酸転写産物の発現の量、または結腸ガンを有しない異なる対象で予想される量などの、対照もしくは基準値に対して相対的である。差異は、結腸ガンを患っていない別の対象由来の組織と比較した、対象（同じ臓器中にガンを有するもの）由来の非ガン性組織におけるものでもあり得る。差次的発現の検出は、遺伝子またはタンパク質発現における変化、例えば表１、２で記載されている１以上の遺伝子の発現、および／または表６で示される１以上の転写産物の発現における変化を測定することを含む。
【００４２】
下方調節または減少：核酸分子の発現に関連して使用される場合、核酸の産生の減少をもたらす任意のプロセスを指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および構造ＲＮＡ）またはタンパク質であり得る。したがって、遺伝子下方制御または不活性化は、遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を減少させるプロセスを含む。
【００４３】
遺伝子下方制御は、遺伝子産物の産生における任意の検出可能な減少を含む。ある例では、遺伝子産物の産生は、対照（正常細胞における正規化された遺伝子発現などの遺伝子発現の量）と比較して少なくとも１．２倍、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも４倍減少する。いくつかの例では、対照は、結腸ガンを有しない１以上の対象における遺伝子発現またはタンパク質発現の相対的な量、例えば、任意の既知のガンを有しない「無ガン状態の」対象における遺伝子発現またはタンパク質発現の相対的な量である。
【００４４】
エクソン：理論上は、メッセンジャーＲＮＡ産物において表れる分断された遺伝子のセグメント。理論上、「イントロン」という用語は、転写されるが、その両側のエクソンをスプライシングすることによって転写産物内から除去されるＤＮＡの任意のセグメントを指す。操作上、エクソン配列は、参照配列番号（Ref. Seq ID number）によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列中に存在する。操作上、イントロン配列は、エクソン配列によって挟まれ、そしてそれらの５’および３’境界でＧＴおよびＡＧスプライスコンセンサス配列を有する、遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
【００４５】
発現：遺伝子のコードされた情報が細胞の操作的、非操作的、または構造的部分に変換されるプロセス、例えば核酸またはタンパク質の合成。遺伝子発現は外部シグナルによって影響を受ける可能性がある。例えば、細胞のホルモンへの暴露は、ホルモン誘発性遺伝子の発現を刺激する可能性がある。異なる種類の細胞は、同じシグナルに対して異なって応答する可能性がある。遺伝子の発現はさらに、ＤＮＡからＲＮＡからタンパク質までの経路のどこでも調節することができる。調節は、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に関する制御、または特定のタンパク質分子が産生された後のそれらの活性化、不活性化、区画化もしくは分解による制御を含む可能性がある。
【００４６】
核酸分子の発現は、例えば、正常な（例えば、非ガン性）試料における発現に対して変更される可能性がある。差次的発現などの遺伝子発現における変更には、限定されないが：（１）過剰発現；（２）過少発現；または（３）発現の抑制が含まれる。核酸分子の発現における変更は、対応するタンパク質の発現における変化と関連する可能性があり、実際にその原因となる可能性がある。「発現」および／または「相対的発現」は、結腸ガン発現シグネチャーなどの発現シグネチャーにおける全ての他の転写産物の発現に関連して定義される閾値に関して特定の転写産物の正規化後の発現値と見なすことができる。所定の試料についての全発現データは、出発物質の様々な量、抽出および増幅反応の様々な効率などについて修正するために当業者に公知の方法を用いて正規化される。診断または予後判定（例えば、良好または不良な予後）を下すために正規化データに関して線形分類器を使用することは、事実上、データ領域、すなわち、シグネチャーにおける全遺伝子の発現値の全ての可能な組み合わせを、分離超平面によって互いに素なもの同士に二分することを意味する。この分割は、例えば良好および不良な予後の患者からの大きな訓練例のセットに関して経験的に誘導される。一般性を失うことなく、１つを除く全ての遺伝子についてある一定の値のセットを仮定することができ、これにより、この残されたの１つの遺伝子について、判定が例えば良好な予後から不良な予後へ変わる閾値が自動的に定義される。この動的閾値より高い発現値はしたがって、良好（負の加重を有する遺伝子について）または不良な予後（正の加重を有する遺伝子について）のいずれかを示す。この閾値の正確な値は、シグネチャー内の全ての他の遺伝子の実際に測定された発現プロフィールによって変わるが、特定遺伝子の一般的な示唆は固定されたままであり、すなわち、高い値あるいは「相対的過剰発現」は常に不良な予後の判定（正の加重を有する遺伝子）または良好な予後の判定（負の加重を有する遺伝子）のいずれかに寄与する。したがって、全体的な遺伝子発現シグネチャーとの関係で、相対的発現は、ある転写産物の上方調節または下方調節のいずれが良好または不良な予後を表すかを示し得る。
【００４７】
遺伝子増幅：遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞または細胞系で形成されるプロセス。重複領域（一続きの増幅されたＤＮＡ）は、多くの場合、「アンプリコン」と称される。通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルも、発現される特定の遺伝子から構成されるコピー数に比例して増加する。
【００４８】
発現プロフィール（またはフィンガープリントもしくはシグネチャー）：特定の病期または特定の予後結果に特徴的であるか、または関連する遺伝子発現のパターン。遺伝子発現シグネチャーは、情報価値のある遺伝子、またはそれらの転写産物（コーディングもしくは非コーディングまたは両者）のセットによって表すことができる。シグネチャー内の転写産物の発現レベルを評価して、限定されないが、本明細書中で提供される方法で予後判定を下すことができる。遺伝子発現レベルを使用して、診断については正常組織および病変組織、または予後方法については非応答性と比較した応答性、そして予測手法については非再発と比較した再発など、２つの臨床症状または転帰を区別することができる。差次的遺伝子発現または遺伝子発現変化は、遺伝子発現（例えばｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の検出可能な量における変化によるか、またはそれらの遺伝子によって発現されるタンパク質の検出可能な量における変化によって検出することができる。遺伝子発現の明確なまたは同定可能なパターン、例えば、遺伝子またはＥＳＴなどの遺伝子標示核酸の所定のセットの高および低発現のパターン；数例では、１または２程度の少ない遺伝子でプロフィールが提供されるが、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１１などのさらに多くの遺伝子をプロフィールで用いることができる。いくつかの実施形態において、プロフィールは、少なくとも約２００の遺伝子（または「転写産物」）および約１０００までの転写産物、例えば約４００転写産物〜約８００転写産物、または約５００転写産物〜約７００転写産物を含む。プロフィールは表６からの転写産物を含み（例えば、表６からの少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、または少なくとも６００の転写産物）、いくつかの実施形態では表６に記載される６３６の転写産物を含む。本明細書中で用いられる場合、「遺伝子」という用語は、発現された転写産物を指し、これは特徴付けがなされた遺伝子であり得るか、またはＥＳＴなどの発現された転写産物で有り得る。いくつかの実施形態において、検出プラットフォームはマイクロアレイであり、各プローブは別個の「遺伝子」または「転写産物」の発現を決定すると見なされる。
【００４９】
遺伝子発現プロフィール（フィンガープリントまたはシグネチャーとも称される）は、組織もしくは細胞型（例えば結腸組織）、正常な組織成長または疾患進行（例えば結腸ガン）の特定の段階、または遺伝子発現に予測可能な方法で影響を及ぼす任意の他の明確なもしくは同定可能な状態と関連付けることができる。遺伝子発現プロフィールは特定の遺伝子の相対的ならびに絶対的発現レベルを含むことができ、そしてベースラインまたは対照試料プロフィール（例えば結腸ガンを有しない対象由来の試料）と比較した試験試料という観点で検討することができる。一例において、対象における遺伝子発現プロフィールはアレイ（例えば、核酸アレイ）上で読み取られる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡの２本鎖の相補領域間、またはＤＮＡとＲＮＡとの間に塩基対を形成し、それによって２本鎖分子、例えば、プローブと表６に示される核酸配列のいずれかまたはそれらの相補鎖との間に形成された２本鎖を形成すること。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに依存して変わるであろう。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えば、Ｎａ＋濃度）はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するであろう。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (chapters 9 and 11)で検討されている。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定するものではない：
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
２回洗浄：２×ＳＳＣ、室温（ＲＴ）でそれぞれ１５分間
２回洗浄：０．５×ＳＳＣ、６５℃でそれぞれ２０分間
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、６５℃〜７０℃で１６〜２０時間
２回洗浄：２×ＳＳＣ、ＲＴでそれぞれ５〜２０分間
２回洗浄：１×ＳＳＣ、５５℃〜７０℃でそれぞれ３０分間
低いストリンジェンシー（少なくとも６０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃で１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：２×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間
【００５１】
単離：「単離された」生物学的要素（例えば、核酸分子、タンパク質、または細胞）は、他の染色体ＤＮＡと染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞などの、生物の細胞中の他の生物学的要素、またはその要素が自然に存在する生物自体から実質的に分離または精製される。この用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸分子、ならびに化学的に合成された核酸分子も包含する。例えば、単離された細胞、例えば結腸ガン細胞は、他の種類の細胞から実質的に分離されたものである。
【００５２】
標識：例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、または顕微鏡検査もしくは他の視覚的技術により検出することができる薬剤。例えば、標識を核酸分子またはタンパク質に結合させることができ、それによってその核酸分子またはタンパク質の検出が可能になる。例えば、核酸分子または標的分子、例えば標的核酸分子と特異的に結合する抗体。標識の例としては、限定されないが、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤、フルオロフォア、ハプテン、酵素、およびそれらの組み合わせが挙げられる。標識するための方法および様々な目的に適切な標識の選択におけるガイダンスは、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) and Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)で考察されている。
【００５３】
長期生存：結腸ガンのための外科手術または他の治療（例えば、化学療法）後、少なくとも３年間、さらに好ましくは少なくとも５年間、なお一層好ましくは少なくとも８年間の無病生存すること。
【００５４】
より侵攻性：本明細書中で用いられる場合、結腸ガンの「より侵攻性」の形態とは、（例えば、腫瘍の外科的切除後の）転移または再発の危険性が相対的に増加した結腸ガンである。「より侵攻性」の結腸ガンは、結腸ガンを有する対象に対して、死亡の可能性を増大させる可能性がある、または死亡までの時間を減少させる可能性がある、結腸ガンを指す可能性もある。結腸ガンの「より侵攻性」の形態を有する対象は、ハイリスク（不良予後）と見なされる。
【００５５】
遺伝子を表す核酸分子：任意の核酸、例えば、プローブまたは他の指標分子としての使用に適した任意の長さのＤＮＡ（イントロンもしくはエクソンまたは両者）、ｃＤＮＡ、あるいはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であって、対応する遺伝子についての情報を含むもの、例えば、表１、もしくは２に記載するもの、例えば表６に記載する転写産物。
【００５６】
オリゴヌクレオチド：限定されないが、１本鎖デオキシリボヌクレオチド、１本鎖もしくは２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮＡをはじめとする比較的短いポリヌクレオチド。オリゴヌクレオチド、例えば１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、多くの場合、例えば、商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学的方法によって合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術をはじめとする様々な他の方法により、そして細胞および生物におけるＤＮＡの発現により、作製することができる。
【００５７】
患者：本明細書中で用いられる場合、「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。治療に関して好ましい患者はヒトである。「患者」および「対象」は、本明細書中では互換的に用いられる。
【００５８】
患者応答：限定されないが、（１）腫瘍成長のある程度の阻害（減速および完全な成長停止を含む）；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）隣接する末梢器官および／または組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、減少、減速もしくは完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）；（６）腫瘍の退縮または拒絶をもたらす可能性があるが、必ずしもその必要は無い抗腫瘍免疫応答の増強；（７）腫瘍に関連する１以上の症状のある程度の軽減；（８）治療後の生存の延長；および／または（９）治療後の所定の時点での死亡率の減少をはじめとする、患者の利益を示す任意の終点を用いて評価することができる。
【００５９】
ポリヌクレオチド：単数または複数で用いられる場合、一般的に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得るか、あるいはそれらの組み合わせでさえあり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドとしては、限定されないが、１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡ、１本鎖領域と２本鎖領域を含むＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖領域と２本鎖領域を含むＲＮＡ、ならびに、１本鎖もしくはより典型的には２本鎖であり、または１本鎖領域と２本鎖領域を含む、ＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子が挙げられる。「ポリヌクレオチド」という用語はさらに、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。したがって、安定性または他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書においてこの用語で意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、非通常塩基（unusual base）、例えばイノシン、または修飾塩基、例えばトリチウム化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡが、本明細書中で定義されるような「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、非修飾ポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的および／または代謝的に修飾された形態、ならびに、ウイルスおよび細胞（単純細胞および複雑型細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。
【００６０】
プローブおよびプライマー：プローブは、標的核酸（表６で示される核酸配列の１つまたはその相補配列）とハイブリダイズすることができる単離された核酸を含む。検出可能な標識またはレポーター分子をプローブに結合させることができる。典型的な標識としては、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光または蛍光剤、ハプテン、および酵素が挙げられる。核酸プローブおよびプライマーの調製法および使用法は、例えば、Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989), Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)、およびInnis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990)で記載されている。標識法および様々な目的のために適切な標識の選択におけるガイダンスは、例えば、Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989) and Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)で考察されている。
【００６１】
プローブは、一般的に、少なくとも１２ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上の、標的核酸分子に相補的である切れ目ないヌクレオチド、例えば１５〜５０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、または１５〜３０ヌクレオチドのプライマーである。数例では、プローブはさらに長く、例えばｃＤＮＡプローブであり、これは約５００から５０００ヌクレオチド超までの長さである可能性がある。
【００６２】
プライマーは短い核酸分子、例えば１０ヌクレオチド以上の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的核酸分子にアニールして、プライマーと標的核酸鎖との間にハイブリッドを形成することができる。プライマーは、ポリメラーゼ酵素によって標的核酸分子にそって伸長することができる。したがって、プライマーを用いて標的核酸分子（例えば表６に示される核酸配列）を増幅することができる。
【００６３】
プライマーおよび／またはプローブの特異性は、その長さとともに増大する。したがって、例えば、３０の切れ目ないヌクレオチドを含むプライマーは、対応するわずか１５ヌクレオチドのプライマーよりも高い特異性で標的配列にアニールする。したがって、より高い特異性を得るために、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の切れ目ないヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。特定の例において、プライマーは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、例えば標的核酸分子に対して相補的な少なくとも１５の隣接ヌクレオチドの長さである。本開示の方法を実施するために用いることができる特定の長さのプライマーは、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上の、増幅される標的核酸分子に対して相補的な切れ目ないヌクレオチドを有するプライマー、例えば１５〜５０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、または１５〜３０ヌクレオチドのプライマーを含む。ＰＣＲプライマー設計で考慮される最も重要な因子のうちの１つは、プライマー長さ、融解温度（Ｔｍ）、およびＧＣ含有量、特異性、相補的プライマー配列、および３’末端配列を含む。一般に、最適ＰＣＲプライマーは通常１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０℃から８０℃の間、例えば約５０℃〜７０℃のＴｍが典型的には好ましい。
【００６４】
プライマー対を、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、または当該技術分野で公知の他の核酸増幅法による核酸配列の増幅のために用いることができる。「上流」または「順」プライマーは、核酸配列上の基準点に対し５’側にあるプライマーである。「下流」または「逆」プライマーは、核酸配列上の基準点に対し３’側にあるプライマーである。一般的に、少なくとも１つの順プライマーおよび１つの逆プライマーが増幅反応に含まれる。
【００６５】
核酸プローブおよびプライマーは、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ(Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)またはＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ソフトウェア(Applied Biosystems, AB, Foster City, CA)など、この目的に意図されるコンピュータプログラムを用いることによって、例えば本明細書中で提供される核酸分子に基づいて容易に調製することができる。
【００６６】
ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計のためのさらなるガイドラインは、Dieffenbach et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133 155; Innis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5 11; and Plasterer, Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520 527, 1997で見出すことができる。
【００６７】
予後：特定の疾患または障害に罹っている対象についての臨床転帰の可能性。ガンに関して、予後は、対象が（例えば、１、２、３、４または５年間）生存する可能性（確率）および／または腫瘍が転移する可能性（確率）の表示である。「予想」という用語は、本明細書中で用いられる場合、患者が薬物または薬物のセットに対して有利または不利のいずれかで反応する可能性、そしてさらにそれらの応答の程度を指す。本発明の予測手法を臨床的に使用して、任意の特定の患者についての最も適切な治療法を選択することによって治療法の決定を下すことができる。本開示の予測手法は、患者が外科的介入、所与の薬物もしくは薬物組み合わせでの化学療法、および／または放射線療法などの治療計画に対して有利に反応する可能性が高いか否かを予測する上で有益な手段である。
【００６８】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的純度を要求しない；むしろ、相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたオリゴヌクレオチド調製物は、オリゴヌクレオチドの複合混合物を含む環境中よりも純度が高いものである。
【００６９】
試料：対象から得られる、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含む）、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含有する生物試料。例としては、限定されないが、末梢血、尿、唾液、組織生検、吸引物、外科標本、および剖検材料が挙げられ、固定および／またはパラフィン包埋試料を含む。一例において、試料は、結腸の生検（例えば、結腸ガン腫瘍）、非ガン性組織の試料、または正常な組織の試料（既知疾患もしくは障害に罹っていない対象、例えば無ガン状態の対象由来）を含む。
【００７０】
配列同一性／類似性：２以上の核酸配列、または２以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、配列間の同一性または類似性の点で表現される。配列同一性は、同一性パーセンテージに関して測定することができる；パーセンテージが高いほど、配列の同一性は高い。配列類似性は、パーセンテージ類似性（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）に関して測定することができる；パーセンテージが高いほど、配列の類似性は高い。
【００７１】
比較のための配列のアラインメント法は、当該技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992;およびPearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994で記載されている。Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討を提供する。
【００７２】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するためにNational Center for Biotechnology (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)をはじめとするいくつかのソースから、そしてインターネット上で入手可能である。さらなる情報はＮＣＢＩウェブサイトで見出すことができる。
【００７３】
ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用され、一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、整列された配列として相同性領域を示す。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列された配列を示さない。
【００７４】
一旦配列させたら、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列で示される位置の数を計数することによってマッチ数を測定する。パーセント配列同一性は、同定された配列により提示される配列の長さ、または明確化された長さ（例えば、同定された配列により提示される配列からの１００の切れ目ないヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかでマッチ数を割り、続いて結果として得られる値に１００をかけることによって決定される。例えば、１５５４のヌクレオチドを有する試験配列と整列させた場合に１１６６のマッチを有する核酸配列は、試験配列に対して７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。パーセント配列同一性値は小数第１位で丸める。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は四捨五入して７５．１とし、一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は四捨五入して７５．２とする。長さの値は常に整数である。別の例では、同定された配列からの２０の切れ目ないヌクレオチドと合致する２０ヌクレオチド領域を含む標的配列は、次のように、同定された配列と７５％配列同一性を共有する領域を含む（すなわち、１５÷２０＊１００＝７５）。
【００７５】
２つの核酸分子が密接に関連することの１つの徴候は、２分子が前述のようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。高度の同一性を示さない核酸配列であっても、遺伝コードの縮重のために、同一または類似した（保存された）アミノ酸配列をコードする可能性がある。この縮重を用いて核酸配列を変化させ、すべて実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を産生することができる。そのような相同的核酸配列は、例えば、表６に記載された分子に対して、この方法によって決定される配列同一性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％であり得る。
【００７６】
特定の配列同一性範囲は単にガイダンスのために提示されるものであり、強い有意性を有するホモログその提示された範囲外で得られる可能性があることを当業者は理解するであろう。
【００７７】
スプライシングまたはＲＮＡスプライシング：イントロンを除去し、エクソンを連結して、真核細胞の細胞質中へ移動する切れ目ないコーディング配列を有する成熟ｍＲＮＡを産生するＲＮＡプロセシング。
【００７８】
転写産物または遺伝子産物：その対応するＤＮＡまたはｃＤＮＡテンプレートから転写プロセスによって生成または誘導されるＲＮＡ分子。転写産物はコーディングおよび非コーディングＲＮＡ分子を含み、例えば、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、選択的にスプライスされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に加え、タンパク質に翻訳されない広範な他の転写産物、例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのアンチセンス分子、ならびに機能が未知の他のＲＮＡ転写産物が含まれる。いくつかの実施形態において、転写産物は表６に示される核酸配列である。
【００７９】
療法：診断および治療の療法を含む総称。
【００８０】
治療：治療的処置および予防的または防止的手段の両方を含み、この場合、目的は、標的とされる病的状態または障害を防止または減速（軽減）することである。治療を必要とするものには、すでに障害にかかっているものならびに障害に罹りやすいものまたは障害が予防されるものが含まれる。腫瘍（例えば、ガン）治療では、外科手術、化学療法または放射線などの治療は、腫瘍細胞の病変を直接低減することができるか、または腫瘍細胞をさらなる治療に対してより感受性にすることができる。
【００８１】
腫瘍、新形成、悪性腫瘍またはガン：悪性であるかまたは良性であるかを問わず、新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前ガン性およびガン性細胞および組織ならびに細胞の異常かつ無制御の成長の結果。「ガン」および「ガン性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長によって特徴づけられるほ乳動物における生理学的状態を指すかまたは記述する。新形成、悪性腫瘍、ガンおよび腫瘍は、多くの場合、互換的に使用され、過度の細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長を指す。個体中の腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は「良性」と称される。周囲組織に浸潤する、および／または転移する可能性がある腫瘍は「悪性」と称される。「非ガン性組織」は、悪性新生物が形成される同じ臓器由来の組織であるが、新生物の特徴的な病状を有しない。一般的に、非ガン性組織は組織学的に正常であるように見える。「正常な組織」は、ガンまたはその臓器の別の疾患もしくは障害によって影響を受けていない臓器由来の組織である。「無ガン状態の」対象は、その臓器の癌と診断されておらず、検出可能なガンを有しない。
【００８２】
ガンの「病変」は、患者の健康な状態を損ねる全ての現象を含む。これには、限定されないが、異常または制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症または免疫学的応答の抑制または増悪、新形成、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周囲または遠位の組織または臓器（リンパ節など）の浸潤などが含まれる。
【００８３】
腫瘍−節−転移（ＴＮＭ）：悪性腫瘍のＴＮＭ分類は、患者の体内のガンの程度を説明するためのガン病期分類システムである。Ｔは原発腫瘍のサイズおよび近隣の組織に浸潤しているかどうかを記載する；Ｎは関与する任意のリンパ節を記載する；そしてＭは転移を記載する。ＴＮＭは、International Union Against Cancerによって、ガンの転移の程度を分類するための世界基準についてコンセンサスを達成するために開発され、維持されている。
【００８４】
上方調節または活性化：核酸分子の発現に関して使用される場合、遺伝子産物の産生の増加をもたらす任意のプロセスを指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および構造ＲＮＡ）またはタンパク質であり得る。したがって、遺伝子上方調節または活性化は、炎症遺伝子などの遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を増加させるプロセスを含む。
【００８５】
転写を増加させるプロセスの例としては、転写開始複合体の形成を促進するもの、転写開始速度を増加させるもの、転写延長速度を増加させるもの、転写の処理能力を増加させるもの、および転写抑制を軽減するもの（例えば、転写リプレッサーの結合をブロックすることによる）が挙げられる。遺伝子上方調節としては、抑制の阻害ならびに既存のレベルを上回る発現の刺激を挙げることができる。翻訳を増大させるプロセスの例としては、翻訳開始を増加させるもの、翻訳伸長を増加させるもの、およびｍＲＮＡ安定性を増加させるものが挙げられる。
【００８６】
遺伝子上方調節は、炎症遺伝子などの遺伝子産物の産生における任意の検出可能な増加を含む。ある例では、遺伝子産物の産生は、対照（例えば正常細胞における遺伝子発現および／または正規化された遺伝子発現の量）と比較して、少なくとも１．２倍、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍増加する。
【００８７】
加重：本明細書中で開示される遺伝子シグネチャーに関して、統計的計算における項目の相対的重要性、たとえば表６中の転写産物の相対的重要性を指す。遺伝子発現シグネチャーにおける各転写産物の加重は、当該技術分野で公知の分析法を用いて患者試料のデータセットに関して決定することができる。例示的手順を後述する。
【００８８】
本開示の実施または試験に好適な方法および材料を後述する。そのような方法および材料は単に例示的であり、限定することを目的とするものではない。本明細書中で記載されるものと類似または同等の他の方法および材料を使用することができる。例えば、本開示が関連する技術分野で周知の通常の方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture, Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, 4.sup.th ed., D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987);およびPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994をはじめとする様々な一般的およびより具体的な文献で記載されている。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定を目的とするものではない。
【００８９】
ＩＩ．いくつかの実施形態の記載
Ａ．結腸ガン発現シグネチャーおよび使用方法
本明細書中で開示されているのは、結腸ガンからの発現シグネチャーである。開示されたシグネチャーを、結腸ガンの予後、結腸ガンの診断および患者群の分類で適用するために使用することができる。いくつかの実施形態において、患者などの対象から得られる試料を処理して、組織試料で発現される転写産物を表すポリヌクレオチド結合標的のセットにする。ポリヌクレオチド結合標的を、転写産物の発現レベルに関する情報を得るために、本明細書中で記載されるシグネチャーを表すかまたはそのシグネチャーに対応する相補的ポリヌクレオチドプローブで調べる。シグネチャーにおける転写産物の発現レベルを表す判定スコアを場合によって計算する。判定スコアを次いで患者集団などの対照と比較し、そして遺伝学的に類似する試料を既知の患者応答または臨床転帰と関連付ける。例えば、外科的切除および／または化学療法などの結腸ガンの治療に対する患者応答、および結腸ガンの治療後の予後を予想するための高感度法も提供される。一般的に、履歴的な患者集団データおよび組織試料を分析して、結腸ガンの既往歴を有する患者について遺伝子プロフィールを作製する。いくつかの実施形態において、患者試料の遺伝子プロフィールを判定スコアに変換する。各患者の臨床転帰を遺伝子プロフィール、または各患者のそれぞれのガンについての遺伝子プロフィールから数学的に導かれる判定スコアに関連付ける。
【００９０】
いくつかの実施形態において、数学アルゴリズムを、既知患者の病歴データを用いて生成させ、結腸ガンの新規患者のための予測手法に適用する。いくつかの実施形態において、アルゴリズムは、選択基準、例えば患者転帰、療法および再発に対する応答などに応じて２群の患者に分ける閾値を作製する。数例では、数学アルゴリズムまたは閾値は、本明細書中で記載される予測手法で使用される前に、さらなる患者集団の病歴データを用いて検証される。数学アルゴリズムまたは閾値を次いで、参照、例えば対照として使用して、結腸ガンの予測手法を希望する患者の遺伝子プロファイリングから誘導される判定スコアを比較することができる。いくつかの実施形態において、これらの結果により、結腸ガンの治療のための外科手術単独、または外科手術と補助化学療法との組合せの有効性についてのゲノム的証拠の評価が可能になる。
【００９１】
本明細書中で記載されるシグネチャーは、２つの診断または予後結果を区別することができるか、または区別する上で重要となり得る。本開示の重要な態様は、結腸ガン組織中のある遺伝子の測定された発現を使用して、患者を最も適切な治療とマッチさせ、そして予後情報を提供することである。
【００９２】
いくつかの実施形態において、シグネチャーは、結腸直腸ガンに焦点を合わせたマイクロアレイ研究手段を用いて開発される。特定の実施形態において、この研究手段は、正確な発現データを送達することができる、Almac Diagnostics, Ltd. (Almac Diagnostics, Ltd., N. Ireland)によって開発された、結腸直腸ガントランスクリプトームに焦点を合わせた研究アレイである。
【００９３】
Colorectal Cancer DSA（商標）研究手段は、６１，５２８プローブセットを含み、結腸ガンおよび正常な組織で発現されることが確認された５２，３０６の転写産物をコードする。ＢＬＡＳＴ分析を用いてColorectal Cancer DSA（商標）研究手段をNational Center for Biotechnology Information (NCBI) human Reference Sequence (RefSeq)ＲＮＡデータベース（ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/にてワールドワイドウェブで入手可能）に対して比較すると、２１，９６８（４２％）の転写産物が存在し、２６，６７６（５１％）の転写産物はヒトＲｅｆＳｅｑデータベースには存在しない。さらに内容の７％は、注釈が付されている遺伝子についての発現されたアンチセンス転写産物である（Johnston et al., J. Clin. Oncol. 24: 3519, 2006; Pruitt et al., Nucleic Acids Research 33: D501-D504, 2005）。加えて、主要な汎用アレイと比較したColorectal Cancer DSA（商標）のプローブ−レベル分析により、約２０，０００（４０％）の転写産物が、主要な汎用マイクロアレイプラットフォーム（Affymetrix）上には含まれておらず、Colorectal Cancer DSA（商標）に特有であることが明らかとなった。したがって、Colorectal Cancer DSA（商標）研究手段は、これまで実施された遺伝子発現研究では利用できなかった転写産物を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、遺伝子発現シグネチャーにおける転写産物の発現は、関心のある条件間で発現レベルが増加または減少する場合に情報価値があると見なされる。遺伝子発現の増加または減少は、限定されないが、倍率変化（fold change）、ｔ試験、Ｆ試験、ウィルコクスン順位和検定、ＡＮＯＶＡを含む当業者に公知の方法（Cui et al., Genome Biology 4:210, 2003)）または差次的発現を検出するための専用の方法、例えばマイクロアレイの有意性分析（Tusher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5116-21, 2001)））またはＬＩＭＭＡ（Smyth, Stat. Appl. Genet. Mol. Biol., 3:Art.3, 2004)）の使用によって評価することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、シグネチャー中の転写産物を用いてそれらのシグナルの加重和を形成し、この場合、個々の加重は正または負であり得る。結果として得られる和（「決定関数（decisive function）」）をあらかじめ決められた基準点と比較する。基準点との比較を用いて、臨床症状または転帰を診断、または予想することができる。
【００９６】
当業者は、表１、２、および／または６で提供されるシグネチャーに含まれる転写産物が、結腸ガンの診断または予後のためのシグネチャーにおいて同等でない加重を有することを理解するであろう。したがって、転帰を診断または予測するためにわずか１配列が使用され得る一方で、特異度および感度、または診断もしくは予測の精度は、より多くの配列を使用すると増大する可能性がある。表６は、シグネチャーにおける加重が減少する順で転写産物をランク付けしており、これは交差検定下で測定される複合判定スコア関数における平均加重のランクとして定義される。加重ランクはさらに、添付の配列リスト中の配列番号に対応し、したがって、最大加重の転写産物は配列番号１である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、シグネチャーは、表６中の転写産物のうち最も加重の大きい少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６３４、またはさらには６３６全てさえも含み、これは、交差検定下で測定される複合判定スコア関数における平均加重のランクとして定義され、依然として予後的意義を有するものである。いくつかの実施形態において、シグネチャーは、表６で記載される上位１位〜１０位の加重転写産物、上位１１〜２０位の加重転写産物、上位２１位〜３０位の加重転写産物、上位３１〜４０位の加重転写産物、上位４１位から５０位の加重転写産物、上位５１位〜６０位の加重転写産物、上位６１位〜７０位の加重転写産物、上位７１位〜８０位の加重転写産物、上位８１位〜９０位のの加重転写産物、または上位９１位〜１００位の加重転写産物を含む。さらなる実施形態において、シグネチャーは、表６に記載される最大加重を有する６３６、６３４、６２０、６１０、６００、５９０、５８０、５７０、５６０、５５０、５４０、５３０、５２０、５１０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の転写産物を含む。いくつかの実施形態において、シグネチャーは、前述のように表６からのものを含む（例えば、表６からの転写産物の少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、もしくは少なくとも約６００、または全て）、約２００から約１０００までの転写産物、例えば約４００から約８００までの転写産物、例えば約５００から約７００までの転写産物、またはいくつかの実施形態では、約５５０から約６５０までの転写産物の発現レベルに基づく。１つの実施形態において、ＭＵＭ１およびＳＩＧＭＡＲ１の転写産物を含む特定のシグネチャーを本明細書中で開示される方法のために使用することができる。別の実施形態において、ＭＵＭ１、ＳＩＧＭＡＲ１、ＡＲＳＤ、ＳＵＬＴ１Ｃ２およびＰＰＦＩＢＰ１の転写産物を含むシグネチャーを本明細書中で開示される方法のために使用することができる。さらに別の実施形態において、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌの転写産物ならびにＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９のアンチセンス配列を含むシグネチャーを、本明細書中で開示される方法のために使用することができる。このシグネチャーを下記表１によって表す。
【００９８】
【表１】
2014509189.tif 000003
【００９９】
いくつかの実施形態では、６３６プローブセットのそれぞれがそのシグネチャーの性能に寄与する貢献度を決定するための別個の研究によって特定された、結腸ガンシグネチャー中の遺伝子転写産物のコアセットが提供される。この実施形態では、６３６のプローブセットのシグネチャーのうち１０のプローブセットを除去し、訓練データセットを用いて６３６のプローブセットに基づいて新規シグネチャーを作製した。新規シグネチャーを次いで使用して、検証データセット（閾値なし）を予測し、ＡＵＣを測定した。６３６プローブセットシグネチャーからのＡＵＣの差を記録した。このプロセスを５０００００回繰り返し、前記プローブセットのないシグネチャーに関して得られるＡＵＣの平均差を記録した。最大の負のΔＡＵＣを有するプローブセットを表１に記録する。この実施形態において、１０の転写産物のこのセットは、シグネチャーに存在しないとシグネチャーの予想される性能を著しく損なう遺伝子の候補コアセットである。したがってある実施形態では、表１中の遺伝子を表す転写産物が結腸ガンシグネチャーに含まれる。表１中、ＤＡＵＣは、この転写産物がシグネチャーから省略される場合の検証ＡＵＣにおける降下を表す。配向性は結腸組織で発現される転写産物の配向性を記載する。このシグネチャー中の３つの転写産物はＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９のアンチセンス転写産物として発現される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、シグネチャーは表６からの６２６〜６３６転写産物の組み合わせを含み、これは、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌ、ＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９を含む。さらに別の実施形態において、シグネチャーは、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌ、ＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９を含む、表６に記載される転写産物１０〜６３６、１０〜５０、５０〜６３６、１００〜６３６を含み、ここで転写産物配向性は表６に記載される。
【０１０１】
特に、プローブ−レベル分析によって、１７６の転写産物は主要な汎用アレイ上には存在しないことが特定されている（すなわち、それらは前述のColorectal Cancer DSA（商標）手段に「特有」である）。表２で記載される１７６の転写産物のこの群は、本明細書中で結腸遺伝子シグネチャーおよび本明細書中での使用方法に特有の転写産物として記載されている。プローブ−配列−レベル相同性検索は、これらの転写産物が主要な汎用アレイ（Affymetrix）上に含まれないことを特定した（すなわち、それらは前述のColorectal Cancer DSA（商標）研究手段において「特有」である）。複数のこれらの転写産物は、発現されると以前に報告されていないアンチセンス転写産物である。これらの１７６の転写産物を下記表２で提供し、表中、加重ランクは表６で示す数値に対応する。したがって、これらの独自の転写産物の配列は表６で見出すことができる。
【０１０２】
【表２】
2014509189.tif 000004
2014509189.tif 000005
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【０１０３】
いくつかの実施形態において、シグネチャーは、表２で記載される転写産物の、少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、またはさらには１７６全て、たとえば交差検定下で測定される複合判定スコア関数において平均加重のランクとして定義される最大加重を有し、そして依然として予後的意義を有するものを含む。いくつかの実施形態において、シグネチャーは、表２に記載される、上位１位〜１０位の加重転写産物、上位１１位〜２０位の加重転写産物、上位２１位〜３０位の加重転写産物、上位３１位〜４０位の加重転写産物、上位４１位〜５０位の加重転写産物、上位５１位〜６０位の加重転写産物、上位６１位〜７０位の加重転写産物、上位７１位〜８０位の加重転写産物、上位８１位〜９０位の加重転写産物、または上位９１位〜１００位の加重転写産物を含む。さらなる実施形態において、シグネチャーは、表２に記載される最も大きい加重を有する１７６、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の転写産物を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本明細書中で記載される方法は、遺伝子発現プロファイリングに患者から単離されたＲＮＡを供することを含む。したがって、遺伝子発現プロフィールは、表６に記載される転写産物のうちの少なくとも２つを含む遺伝子のセットについて完成される可能性があり、これは数例では後述するように正規化される。本明細書中で開示される方法の特定の実施形態では、表６中の転写産物の、少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７４、少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６３４、もしくはさらには６３６全て、またはそれらの発現産物、および／または相補鎖、たとえば交差検定下で測定される複合判定スコア関数において平均加重のランクとして定義される最大加重を有し、そして依然として予後的意義を有する表６中の転写産物の発現レベルが測定される。この方法のいくつかの実施形態において、表２中の転写産物の少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、もしくはさらには１７６全部またはそれらの発現産物、および／あるいは相補鎖、例えば交差検定下で測定される複合判定スコア関数で平均加重のランクとして定義される最大加重を有し、そして依然として予後的意義を有するものの発現レベルが測定される。本明細書中で記載される方法において、転写産物の組み合わせはシグネチャーまたは発現シグネチャーと称され得る。
【０１０５】
結腸組織中の転写産物の相対的発現レベルを測定して、遺伝子発現プロフィールを形成する。１つの実施形態では、患者組織試料由来の転写産物のセットの遺伝子発現プロフィールを複合判定スコアの形態でまとめ、対照閾値、患者データの訓練事例から数学的に誘導される閾値と比較する。閾値は、限定されないが、良好／不良予後、治療に対する応答性／非応答性、ガン検出／診断およびガン分類などの異なる特徴に基づいて患者群を分ける。患者訓練事例データは、好ましくは、予後、再発の可能性、または長期生存、診断、ガン分類、個別化ゲノムプロフィール、臨床転帰、治療応答によって特徴づけられた結腸組織試料から誘導される。発現プロフィール、および患者試料からの対応する判定スコアは、数学的に誘導される決定閾値の同じ側にある訓練事例中の患者試料の特徴と相関する可能性がある。この実施形態において、線形分類器複合判定スコアの閾値を最適化して、訓練データセット内で適用された交差検定下、感度および特異度の合計を最大化した。これらの方法は、結腸ガン、そして特定の実施形態では病期ＩＩの結腸ガンを有する患者の予後を決定するためにも有用である。数例では、開示された方法は、不良な臨床転帰を予測するものであり、これは例えばガンの外科的切除後、または補助化学療法と組み合わせたガンの外科的切除後の、例えば生存の短縮またはガン再発の危険性の増大に関して測定することができる。
【０１０６】
対象から得られる試料において結腸ガンを診断するための方法が提供される。そのような方法は、対象から得られた核酸を含む試料において表６で記載された少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベルを検出し、そして少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアを、結腸ガンの診断を示す対照閾値と比較することを含み、ここで、閾値の同じ側の、発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアは、結腸ガンの診断を示す。数例では、対照閾値は、既知結腸ガン試料（複数可）における表６中に記載された結腸関連核酸分子からの対応する転写産物から誘導される閾値である。
【０１０７】
結腸ガン試料を分類するための方法が提供される。そのような方法は、表６で記載される少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の対象から得られる核酸を含む試料における発現レベルを検出し、そして少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアを、既知分類を示す対照閾値と比較することを含み、ここで、閾値の同じ側の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアは、結腸ガン試料の分類を可能にする。数例では、対照閾値は、既知分類の結腸ガン試料（複数可）における表６中に記載される結腸ガン関連核酸分子からの対応する転写産物から誘導される閾値である。数例では、結腸ガン試料は、病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩおよび病期ＩＶに分類される。数例では、方法は、分類された結腸ガンに有効な治療プラン、例えば外科的切除、化学療法、放射線またはそれらの任意の組み合わせを選択することをさらに含む。
【０１０８】
病期ＩＩの結腸ガンを有する対象などの結腸ガンのための治療に対する応答を予測するための方法が提供される。そのような方法は、対象から得られる核酸を含む試料において表６で記載される少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベルを検出し、そして少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアを、治療に対する既知応答を示す対照閾値と比較することを含み、ここで、閾値の同じ側の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアは、治療に対して類似した応答を示し、それによって治療に対する応答を予測する。数例では、対照閾値は、治療に対して既知応答を有する結腸ガン試料（複数可）において表６中に記載される結腸ガン関連核酸分子由来の対応する転写産物から誘導される閾値である。いくつかの実施形態において、方法は、外科的切除、化学療法、放射線またはそれらの任意の組み合わせからの応答を予測する方法である。
【０１０９】
結腸ガンを有する対照、例えば病期ＩＩの結腸ガンを有すると診断された対象の長期生存を予測するための方法が提供される。これらの方法は対象から得られる核酸を含む試料において表６中に記載される少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベルを検出し、そして少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアを、長期生存の経歴を有することを示す対照閾値と比較することを含み、ここで、閾値の同じ側の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアは対象の長期生存を示し、それによって対象の長期生存を予測する。数例では、対照閾値は、長期生存の経歴を有する対象（複数可）から得られる結腸ガン試料（複数可）における表６中に記載される結腸ガン関連核酸分子からの対応する転写産物から誘導される閾値である。
【０１１０】
病期ＩＩの結腸ガンを有すると診断された対象などの対象における結腸ガンの再発を予測するための方法も提供される。これらの方法は、対象から得られる核酸を含む試料において表６で記載される少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベルを検出し、そして少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアを、再発の経歴を示す対照閾値と比較することを含み、この場合、閾値の同じ側の、発現レベル、またはそれから誘導される判定スコアは、対象における再発を示す。数例では、対照閾値は、再発の経歴を有する結腸ガン試料（複数可）における表６中に記載される結腸ガン関連核酸分子からの対応する転写産物から誘導される閾値である。
【０１１１】
対象の個別化結腸ガンゲノムプロフィールを調製するための方法が提供される。方法は、表６で記載される少なくとも２つの結腸ガン関連核酸分子の、対象から得られる核酸を含む試料における発現レベルを検出し、遺伝子発現分析によって得られるデータをまとめた報告を作製することを含む。
【０１１２】
本明細書中で開示される方法の特定の実施形態において、表６中の転写産物の少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７４、少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６３４、もしくは６３６全てまたはそれらの発現産物の発現レベルを測定し、そして対照閾値と比較する。これらの方法の他の実施形態では、ＭＵＭ１およびＳＩＧＭＡＲ１またはそれらの発現産物の発現レベルを測定し、そして対照閾値と比較する。別の実施形態では、ＭＵＭ１、ＳＩＧＭＡＲ１、ＡＲＳＤ、ＳＵＬＴ１Ｃ２およびＰＰＦＩＢＰ１またはそれらの発現産物の発現レベルを測定し、そして対照閾値と比較する。さらなる実施形態において、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌ、ならびに、ＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９のアンチセンス配列、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定し、そして対照閾値と比較する。さらに他の実施形態において、表１、２，および／または６の１つに記載される転写産物の実質的に全ての発現レベルをステップで測定し、そして対照閾値と比較する。
【０１１３】
開示された方法のいくつかの実施形態において、ＲＮＡレベルを、分析したＲＮＡの量における差および使用したＲＮＡの質の変動の両方について補正（正規化）する。対照転写産物は、正または負の対照としてアッセイに含ませることができ、そして読み出しを正規化し信頼できる測定データが得られることを確実にするが、実際の予後を実施するためには好ましくは省略される。前者の正確なアイデンティティーは通常は重要ではなく、非常に多様な転写産物を本明細書中で開示される目的の全てについて想定することができる。正規化対照については、幅広い転写産物を想定することができるが、それらは幅広い対象または関心のある標的組織の条件間、特に検討中の予後群間でほぼ一定かつ安定な発現を有するという基本的な要件を満たさなければならない。同様に、ＲＮＡ分解対照は、（過度に）分解したＲＮＡを示すために好適な強度挙動を示さなければならない。これは、正の対照として試料の全体的なＲＮＡ分解に関係なく安定な強度を示すＲＮＡ対照を含んでも、含まなくてもよい。これらの対照に関連して、ＲＮＡ分解段階に対する強度依存性が観察される好適な他のＲＮＡ対照の強度パターンを分析する。これは、転写産物の３’末端に関して様々な位置にあるプローブ配列に依存する特定の分析を含んでも、含まなくてもよい。
【０１１４】
遺伝子発現を定量化するためにマイクロアレイが使用される、開示された方法のいくつかの実施形態において、以下の対照の１以上を使用することができる：
（ａ）標識された形態でスパイクされた特定の転写産物であり、アレイ上の特定の位置に結合し、そしてスキャンしたアレイの画像処理で適切な格子整列を確実にする、アラインメント対照。
（ｂ）増幅が実施される前にスパイクされ、したがって試料ｍＲＮＡと同じ処理を受けて、ｃＤＮＡ合成およびそれに続く増幅反応の適切な性能を確実にする特定の非標識転写産物、例えばポリ−Ａ対照転写産物である、増幅対照
（ｃ）先行する増幅反応とは別に、標識とハイブリダイゼーションという２つのステップの効率を制御するためのものであり、チップの標識およびハイブリダイゼーションの前にスパイクされる特定の対照である、標識およびハイブリダイゼーション対照。
（ｄ）マイクロアレイ上のプローブ配列であって、対応する標的配列が試料中には存在しないはずのものである、バックグラウンド対照。したがって、原則として、特異的標的結合は起こらない。これらの対照を使用して、バックグラウンドまたはクロスハイブリダイゼーション強度を確立する。それらは場合によっては、異なるＧＣ含有量、およびマイクロアレイ全体にわたる好適な空間分布によって特徴付けられ得る。
（ｅ）様々なインプットｍＲＮＡ量、増幅反応の様々な収率および測定装置の様々な全般的感度について修正するために使用される、試料から特異的に選択された標的配列を検出するプローブ配列である、正規化対照。それらを用いて、測定された強度値を補正し、かくして準備的実験室ステップを含む測定装置全体の分析精度の増大を確実にする。
（ｆ）ＲＮＡの質を示し、ＲＮＡ分解を検出するために設計された、それらの各遺伝子の３’位に関して様々な位置に対応するプローブ配列である、ＲＮＡ品質および分解対照。複数の遺伝子由来の対応するプローブまたはプローブセットは、異なるＲＮＡ種における異なるＲＮＡ分解挙動を表す可能性がある。
【０１１５】
対照ａ）〜ｄ）は純粋に配列検討事項に基づいて誘導することができ、関心のある組織および状態で自然に存在しないはずであるが、対照ｅ）およびｆ）は以前の患者データの好適な分析によって選択することができる。これは、予後遺伝子シグネチャーが誘導されたものと同じ訓練データであっても、なくてもよい。
【０１１６】
上記対照は例示のためだけに提供され、類似した機能性を有する異なる対照が使用される本開示の他の実施形態（例えば、ｑＰＣＲ）を想定できることは理解されるべきである。
【０１１７】
Ｂ．プローブ、プライマーおよびアレイ
開示された結腸ガン遺伝子シグネチャーに特異的なプローブおよびプライマーが開示される。開示された結腸ガンシグネチャーのプローブを含むアレイも開示される。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガン遺伝子シグネチャーに特異的なプローブは、配列番号１〜６３６の１つまたはその相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、交差検定下で測定される複合判定スコア関数において平均加重のランクとして定義される最も大きい加重を有し、依然として予後的意義を有する、表６中の転写産物の、少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７４、少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６３４、もしくは６３６全てと特異的にハイブリダイズするプローブ、たとえば配列番号１〜６３６のいずれか１つまたはその相補配列と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、表６に記載される上位１位〜１０位の加重転写産物、上位１１位〜２０位の加重転写産物、上位２１位〜３０位の加重転写産物、上位３１位〜４０位の加重転写産物、上位４１位〜５０位の加重転写産物、上位５１位〜６０位の加重転写産物、上位６１位〜７０位の加重転写産物、上位７１位〜８０位の加重転写産物、上位８１位〜９０位の加重転写産物、または上位９１位〜１００位の加重転写産物と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。さらなる実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、６３６、６３４、６２０、６１０、６００、５９０、５８０、５７０、５６０、５５０、５４０、５３０、５２０、５１０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の、表６に記載された最も大きい加重を有する転写産物またはそれらの相補鎖と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。いくつかの実施形態において、開示されたガンシグネチャーのプローブセットは、約２００〜約１０００プローブ、例えば約４００〜約８００プローブ、例えば約５００〜約７００プローブ、例えば約５５０〜約６５０プローブを含み、ここで、プローブは表６からの転写産物を検出する。さらなるプローブは、場合によって、結腸ガンで発現される転写産物を検出するもの、またはシグナル対照もしくは発現レベル対照として機能するものから選択され得る。そのような任意のプローブは、Colorectal Cancer DSA（商標）手段上に含まれるものから選択することができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、ＭＵＭ１およびＳＩＧＭＡＲ１の転写産物と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。他の実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、ＭＵＭ１、ＳＩＧＭＡＲ１、ＡＲＳＤ、ＳＵＬＴ１Ｃ２およびＰＰＦＩＢＰ１の転写産物と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。さらに他の実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌ、ならびにＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９のアンチセンス配列の転写産物と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。遺伝子発現シグネチャーを実質的に表すプローブまたはプライマーのセットを調製することができる。「遺伝子発現シグネチャーを実質的に表す」とは、遺伝子発現シグネチャー中のコーディングまたは非コーディング転写産物の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％、例えば表１、２、もしくは６に示される遺伝子発現シグネチャー中のコーディングもしくは非コーディング転写産物またはそれらの相補鎖の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％と特異的にハイブリダイズするプローブセットを指す。
【０１１９】
特に遺伝子発現について分析される患者組織がパラフィン包埋組織から抽出されたＲＮＡである場合、遺伝子発現シグネチャー中の転写産物の３’領域と結合するプローブを使用することが有利である。典型的には、各プローブは各転写産物中の相補的配列とハイブリダイズすることができ、これは、転写産物の３’末端の１ｋｂ、または５００ｂｐ、または３００ｂｐ、または２００ｂｐ、または１００ｂｐ以内で起こる。ｍＲＮＡの場合、「転写産物の３’末端」は、本明細書中では、ポリ（Ａ）テールを含まないポリアデニル化部位と定義される。
【０１２０】
１つの実施形態において、シグネチャーの全絶対加重の３０％を構成するプローブのプールを使用する。別の実施形態において、シグネチャーの全絶対加重の４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を構成するプローブのプールを本明細書中で記載される方法において使用する。マーカーを含めること、ならびに参照セットに対するｍＲＮＡレベル変動の臨床的有意性の基盤を以下で示す。いくつかの実施形態において、開示されたプローブはアレイの一部であり、例えばプローブは固体基体に結合される。例示的核酸アレイおよびかかるアレイの作製方法は下記セクションＤで検討する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、開示された結腸ガン遺伝子シグネチャーに特異的なプローブは、マイクロアレイなどの核酸アレイの一部である。数例では、そのようなアレイは、配列番号１〜６３６の１つまたはその相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸アレイ、例えばマイクロアレイは、表６中の転写産物の少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７４、少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６３４、またはさらには６３６全部と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーの核酸アレイは、表６で記載された上位１位〜１０位の加重転写産物、上位１１位〜２０位の加重転写産物、上位２１位〜３０位の加重転写産物、上位３１位〜４０位の加重転写産物、上位４１位〜５０位の加重転写産物、上位５１位〜６０位の加重転写産物、上位６１位〜７０位の加重転写産物、上位７１位〜８０位の加重転写産物、上位８１位〜９０位の加重転写産物、または上位９１位〜１００位の加重転写産物と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。さらなる実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーの核酸アレイは、６３６、６３４、６２０、６１０、６００、５９０、５８０、５７０、５６０、５５０、５４０、５３０、５２０、５１０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の表６に記載された最も大きい加重を有する転写産物またはそれらの相補鎖と特異的に結合するプローブを含む。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーの核酸アレイは、約２００〜約１０００プローブ、例えば約４００〜約８００プローブ、例えば約５００〜約７００プローブ、例えば約５５０〜約６５０プローブを含み、ここでプローブは表６からの転写産物を検出する。さらなるプローブは、場合によって、結腸ガンで発現される転写産物を検出するもの、またはシグナル対照もしくは発現レベル対照として機能するものから選択することができる。そのような任意のプローブを、Colorectal Cancer DSA（商標）手段上に含まれるものから選択することができる。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーの核酸アレイは約１０００を超えるプローブを含む。
【０１２２】
結腸ガン核酸の遺伝子発現シグネチャーの増幅のためのプライマー対も開示される。数例では、プライマー対は、配列番号１〜６３６として記載される核酸配列のいずれか１つまたはその相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む１５〜４０ヌクレオチドの長さの順プライマーおよび配列番号１〜６３６として記載される核酸配列のいずれか１つまたはその相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む１５〜４０ヌクレオチドの長さの逆プライマーを含み、この場合、プライマーのセットは核酸を増幅させることができる。
【０１２３】
結腸ガン核酸の遺伝子発現シグネチャーの増幅のためのプライマー対のセットも開示される。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプライマーセットは、交差検定下で測定された複合判定スコア関数において平均加重のランクとして定義される最も大きい加重を有し、依然として予後的意義を有する表６中の転写産物の、少なくとも２、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７４、少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６３４、またはさらには６３６全部と特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマー、例えば配列番号１〜６３６のいずれか１つまたはその相補配列と特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプライマーセットは、表６に記載される上位１位〜１０位の加重転写産物、上位１１位〜２０位の加重転写産物、上位２１位〜３０位の加重転写産物、上位３１位〜４０位の加重転写産物、上位４１位〜５０位の加重転写産物、上位５１位〜６０位の加重転写産物、上位６１位〜７０位の加重転写産物、上位７１位〜８０位の加重転写産物、上位８１位〜９０位の加重転写産物、または上位９１位〜１００位の加重転写産物を特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマーを含む。さらなる実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプライマーは、表６で記載される最も大きい加重を有する６３６、６３４、６２０、６１０、６００、５９０、５８０、５７０、５６０、５５０、５４０、５３０、５２０、５１０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の転写産物またはそれらの相補鎖と特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマーを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプライマーセットは、ＭＵＭ１およびＳＩＧＭＡＲ１の転写産物と特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマーを含む。別の実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプライマーセットは、ＭＵＭ１、ＳＩＧＭＡＲ１、ＡＲＳＤ、ＳＵＬＴ１Ｃ２およびＰＰＦＩＢＰ１の転写産物と特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマーを含む。さらに別の実施形態において、開示された結腸ガンシグネチャーのプローブセットは、ＡＲＳＤ、ＣＸＣＬ９、ＰＣＬＯ、ＳＬＣ２Ａ３、ＦＣＧＢＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＣＬ９Ｌの転写産物ならびにＭＵＣ３Ａ、ＯＬＦＭ４およびＲＮＦ３９のアンチセンス配列と特異的にハイブリダイズするプローブを含む。遺伝子発現シグネチャーを実質的に表すプローブまたはプライマーのセットを調製することができる。「実質的に遺伝子発現シグネチャーを表す」とは、遺伝子発現シグネチャー中のコーディングまたは非コーディング転写産物の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％、例えば、表１、２、もしくは６に示される遺伝子発現シグネチャー中のコーディングもしくは非コーディング転写産物またはそれらの相補鎖の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％と特異的にハイブリダイズするプローブセットを指す。
【０１２５】
Ｃ．結腸ガンシグネチャーの統計的測定
開示された結腸ガンシグネチャーを統計的方法によって評価することができる。いくつかの実施形態において、患者組織試料の遺伝子発現プロフィールを線形分類器によって評価する。本明細書中で用いられる場合、線形分類器は、複合判定スコアを得る個々の遺伝子強度の加重和（「決定関数」）を指す。判定スコアを次いで、感度および特異度に関してあるセットポイントに対応する所定のカットオフ閾値と比較し、これは閾値より上（正の決定関数）であるかまたは下（負の決定関数）であるかを示す。
【０１２６】
事実上、これは、データ領域、すなわち遺伝子発現値のあらゆる可能な組み合わせのセットを、２つの相互に排他的な異なる臨床的分類または予想に対応するもの、例えば、良好な予後に相当する一方と不良な予後に対応する他方に二分することを意味する。全体的なシグネチャーに関連して、ある遺伝子の相対的過剰発現は、判定スコアを増大させる（正の加重）可能性があるか、またはそれを減少させる（負の加重）可能性があり、かくして、例えば、不良または良好な予後のいずれかの全体的な決定に貢献し得る。
【０１２７】
この量、すなわち良好な予後対不良な予後のカットオフ閾値の解釈は、転帰が既知である患者のセットに基づく開発段階（「訓練」）で誘導される。判定スコアについての対応する加重および良好／不良予後カットオフ閾値は、当業者に公知の方法によって訓練データに基づいて事前に固定される。本発明の方法の好ましい実施形態において、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）が加重を決定するために使用される。（Stahle, J. Chemom. 1 185-196, 1987; Nguyen and Rocke, Bioinformatics 18 39-50, 2002）。当業者に公知の、分類を実施するための他の方法も、結腸ガンシグネチャーの転写産物セットに適用される場合に一緒に使用される可能性がある。
【０１２８】
これらの遺伝子またはそれらの産物に関して測定された定量的データは、異なる方法を使用して、予後または他の予測的使用に変換することができる。これらの方法としては、限定されないが、パターン認識（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）、機械学習（Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995）、統計（Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001）、バイオインフォマティクス（Dudoit et al., J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, 2002; Tibshirani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572, 2002）またはケモメトリクス（Vandeginste, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998）が挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、訓練ステップでは、良好および不良な予後の事例の両方についての患者試料のセットを測定し、この訓練データからの固有の情報を用いて予想法を最適化して、訓練事例またはさらなる試料セットを最適に予測する。この訓練ステップにおいて、使用される方法を訓練またはパラメータ化して、特定の強度パターンから特定の予後判定までを予想する。測定されたデータは、予後方法またはアルゴリズムに供する前に、好適な変換または前処理工程に付することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、転写産物についての前処理した強度値の加重和を形成し、訓練事例に対して最適化された閾値と比較する（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）。加重は、限定されないが、部分最小二乗法（ＰＬＳ、(Nguyen et al., 2002, Bioinformatics 18 (2002) 39-50)）またはサポートベクターマシーン（ＳＶＭ、（SVM, (Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)）をはじめとする多数の線形分類法によって誘導することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、例えば前述のように加重和を適用する前に、データを非線形的に変換する。この非線形変換は、データの次元を増加させることを含み得る。非線形変換および加重和は、非明示的に、例えば、核関数の使用により実施することもできる。（Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002）。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、新規データ試料を、実際に測定された訓練試料または人工的に作製されたプロトタイプのいずれかである２種以上のプロトタイプと比較する。この比較は、例えば限定されないが、ユークリッド距離（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）、相関係数（van’t Veer, et al., Nature 415:530, 2002）などの好適な類似性測定値を使用して実施する。新しい試料は次いで最近接プロトタイプまたは周辺において最多数のプロトタイプを有する予後群に割り当てられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、決定木（Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001）またはランダムフォレスト（Breiman, 2001Random Forests, Machine Learning 45:5）を使用して、転写産物セットまたはそれらの産物について測定された強度データから予後判定を下す。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、神経回路網（Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995）を使用して、転写産物セットまたはそれらの産物について測定された強度データからの予後判定を下す。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、限定されないが、線形、対角線形、二次およびロジスティック判別分析を含む判別分析（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）を使用して、転写産物セットまたはそれらの産物について測定された強度データから予後判定を下す。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、マイクロアレイの予想分析（ＰＡＭ、（Tibshirani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572, 2002)）を使用して、転写産物セットまたはそれらの産物の測定された強度データから予後判定を下す。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、Soft Independent Modelling of Class Analogy (SIMCA, (Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139)）を使用して、転写産物セットまたはそれらの産物について測定された強度データから予後を作製する。
【０１３８】
Ｄ．ｍＲＮＡの検出のための方法
関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡを検出することによって遺伝子発現を評価することができる。したがって、開示された方法はｍＲＮＡを評価することを含む可能性がある。ＲＮＡは、対象由来の腫瘍（例えば、結腸ガン腫瘍）の試料、対象由来の隣接する非腫瘍組織の試料、正常（健常）な対象由来の腫瘍のない組織の試料、またはそれらの組み合わせから、市販のキットを含む当業者に周知の方法を用いて単離することができる。
【０１３９】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は当該技術分野で周知であり、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)をはじめとする分子生物学の標準的教科書で開示される。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Biotechniques 6:56-60, 1988、およびDe Andres et al., Biotechniques 18:42-44, 1995で開示される。一例において、ＲＮＡ単離は、QIAGEN（登録商標）（Valencia, CA）などの商業的製造業者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを使用し、製造業者の指示にしたがって実施することができる。例えば、培養中の細胞（例えば、対象から得られるもの）からの全ＲＮＡは、QIAGEN（登録商標）RNeasy（登録商標）ミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットには、MASTERPURE（登録商標）Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE（登録商標） Madison, Wis.)、およびParaffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.)が含まれる。組織試料からの全ＲＮＡは、RNA Stat-60 (Tel-Test)を用いて単離することができる。腫瘍または他の生体試料から調製されるＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。
【０１４０】
本明細書中で記載される本発明のシグネチャーおよび方法は、セット中の全てのマーカーのアッセイをする上で、保管されたパラフィン包埋生検の使用にも対応可能であり、したがって、最も広く利用可能な種類の生検材料に適合している。結腸組織試料中の転写産物の発現レベルは、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織試料、新鮮な凍結組織またはRNAlater（登録商標）などの溶液中で保存された新鮮な組織から得られるＲＮＡを用いて決定することができる。ＲＮＡの単離は、例えば、前述または本出願全体にわたって記載される手順のいずれかにしたがって、または当該技術分野で公知の任意の他の方法により実施することができる。遺伝子発現プロファイリングの全ての技術、ならびにプロテオミクス技術は、本明細書中で記載される方法の実施で使用するために好適であるが、遺伝子発現レベルは多くの場合、ＤＮＡマイクロアレイ技術によって決定される。
【０１４１】
組織源がホルマリン固定されたパラフィン包埋組織試料である場合、ＲＮＡは断片化されている可能性があり、その結果、情報が失われる。本明細書中で提供されるシグネチャーは、それらの３’末端から配列決定された転写産物のプールから誘導され、それによって組織のトランスクリプトームの正確な表現が提供される。したがって、本明細書中で提供されるシグネチャーは、新鮮な凍結組織および固定されたパラフィン包埋組織の両方に有用である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書中で記載される方法で使用されるＲＮＡ試料は、固定されたワックス包埋結腸組織標本から、以下のステップの１以上、例えば以下のステップの全部を用いることによって調製することができる：
（ａ）通常の方法を使用し、有機溶媒中で複数の洗浄ステップを伴って脱パラフィン化する；
（ｂ）空気乾燥およびプロテアーゼ処理をして、細胞間および細胞内結合を切断し、その結果、組織からＲＮＡを放出させる；
（ｃ）混入したゲノムＤＮＡを除去する；
（ｄ）有機溶媒中で洗浄し；そして好適な無ＲＮａｓｅ溶出緩衝液中で溶出する。
【０１４３】
ＲＮＡ抽出方法はさらに、このようにして保存された組織で起こるホルマリン架橋のほとんどを逆転させて、下流アッセイでの性能のためにＲＮＡの収率および質を改善させるというさらなる機能を有する、高変性溶解緩衝液中で組織をインキュベーションすることを含む可能性がある。
【０１４４】
ＲＮＡ回収後、ＲＮＡを場合によってさらに精製して、混入ＤＮＡまたはタンパク質が実質的にないＲＮＡを得ることができる。さらなるＲＮＡ精製は、前述のＲＮＡ回収技術のいずれかによるか、または市販のＲＮＡクリーンアップキット、例えばRNeasy（登録商標）MinElute（登録商標）Cleanup Kit (QIAGEN（登録商標））を使用して達成することができる。組織標本は、例えば腫瘍から得ることができ、そしてＲＮＡは、組織標本の腫瘍細胞を多く含む顕微解剖部分から得ることができる。
【０１４５】
遺伝子発現プロファイリングの方法には、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法が含まれる。数例では、試料中のｍＲＮＡ発現を、ノーザンブロッティングまたはインサイチュハイブリダイゼーション（Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283, 1999）；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Hod, Biotechniques 13:852-4, 1992）；およびＰＣＲベースの方法、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weis et al., Trends in Genetics 8:263-4, 1992）を用いて定量化する。別法として、ＤＮＡ２本鎖、ＲＮＡ２本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖またはＤＮＡ−タンパク質２本鎖を含む特定の２本鎖を認識することができる抗体を用いることができる。配列決定ベースの遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、および超並列シグネチャー配列決定による遺伝子発現分析（ＭＰＳＳ）が挙げられる。一例において、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、異なる試料中のｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現のパターンを特性化し、密接に関連したｍＲＮＡを区別し、そしてＲＮＡ構造を分析することができる。特定の例では、開示された結腸ガンシグネチャーを核酸マイクロアレイ技術、ＰＣＲ技術またはそれらの組み合わせによって分析する。
【０１４６】
１．マイクロアレイ法での遺伝子発現プロファイリング
いくつかの実施形態において、表６に示すものなどの結腸ガン関連遺伝子および／または転写産物の発現プロフィールを、新鮮またはパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかで、マイクロアレイ技術を用いて測定することができる。この方法では、関心のあるポリヌクレオチド配列、例えば表６に示される核酸配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を、マイクロチップ基体上に覆わせるか、または整列させる。整列させた配列を次いで、関心のある細胞または組織由来の核酸とハイブリダイズさせる。
【０１４７】
ＲＴ−ＰＣＲ法（下記参照）におけるのとちょうど同じように、ｍＲＮＡ源は典型的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞系、および対応する正常な組織または細胞系から単離された全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、様々な原発腫瘍または腫瘍細胞系から単離することができる。ｍＲＮＡ源が原発腫瘍である場合、ｍＲＮＡを、例えば、日常的な臨床業務で慣例的に調製され保存される、凍結または保管されたパラフィン包埋および／もしくは固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【０１４８】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入物またはオリゴヌクレオチドを高密度アレイとして基体に適用する。短鎖オリゴヌクレオチドはさらに、例えば、半導体ベースのフォトリソグラフィーおよび固相化学的合成技術の組み合わせ（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA）を使用して基体上で直接合成することができる。１つの実施形態において、少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列が基体上に存在する。基体上に固定されたマイクロアレイ化転写産物は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに好適である。蛍光標識されたヌクレオチドプローブは、関心のある組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み入れにより生成させることができる。アレイに適用された、標識されたプローブは、アレイ上の各ヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを洗浄して除去した後、共焦点レーザー顕微鏡検査または別の検出法、例えばＣＣＤカメラによってアレイをスキャンする。各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションの定量化によって、対応する転写産物量の評価が可能になる。
【０１４９】
二色蛍光により、２つの源から生成され別々に標識されたヌクレオチドプローブを対ごとにアレイとハイブリダイズさせることができる。小型化ハイブリダイゼーションによって、多数の遺伝子に関する発現パターンの便利かつ迅速な評価がもたらされる。そのような方法は、細胞あたり数コピーしか発現されない希少な転写産物を検出するために必要な感受性を有すること、および発現レベルで少なくともほぼ２倍の差を再現可能に検出することが示されている（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106 149 (1996)）。マイクロアレイ分析はさらに、市販の設備により、製造業者のプロトコルにしたがって、たとえば、Affymetrix GeneChip（登録商標）技術（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA）、またはAgilentマイクロアレイ技術（Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA）を使用することによっても、実施することができる。
【０１５０】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発により、ガン分類の分子マーカーおよび結腸ガン腫瘍などの様々な腫瘍タイプにおける転帰予想を系統的に探索することが可能になる。
【０１５１】
本明細書中で提供される特定の実施形態において、アレイを用いて結腸ガン遺伝子発現プロフィールを評価し、例えば結腸ガンを有する患者を予知または診断することができる。表１、表２中に記載される遺伝子および／または表６中に記載される転写産物に特異的なプローブまたはプライマーから本質的に構成されるアレイを記載する場合、そのようなアレイは、これらの結腸ガン関連遺伝子について特異的なプローブまたはプライマーを含み、（例えば、インキュベーション条件が十分であることを確認するために）対照プローブをさらに含む可能性がある。例示的対照プローブとしては、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、および１８Ｓ  ＲＮＡが挙げられる。
【０１５２】
ｉ．アレイ基質
アレイの固体支持体は、無機材料（例えば、ガラス）または有機ポリマーから形成することができる。固体支持体に好適な材料としては、限定されないが：ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、ヒドロキシル化二軸延伸ポリプロピレン、アミノ化二軸延伸ポリプロピレン、チオール化二軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレンメタクリル酸、およびそれらのコポリマーのブレンド（米国特許第５，９８５，５６７号を参照のこと）が挙げられる。
【０１５３】
一般に、固体支持体表面を形成するために使用することができる材料の好適な特徴としては：活性化によって、オリゴヌクレオチドなどの生体分子を支持体の表面に共有結合させることができるように、表面活性化を受けやすいこと；生体分子の「インサイチュ」合成を受けやすいこと；化学的に不活性であって、オリゴヌクレオチドによって占有されない支持体上の領域が非特異的結合を受けにくいようになっているか、または非特異的結合が起こる場合、そのような非特異的結合物が、オリゴヌクレオチドを除去することなく表面から容易に除去され得ること、が挙げられる。
【０１５４】
別の例では、表面活性化有機ポリマーが固体支持体表面として使用される。表面活性化有機ポリマーの一例は、高周波数プラズマ放電によってアミノ化されたポリプロピレン材料である。カルボキシル化、ヒドロキシル化、チオール化、または活性エステル基などの他の反応性基も用いることができる。
【０１５５】
ｉｉ．アレイフォーマット
多種多様のアレイフォーマットを本開示にしたがって用いることができる。一例には、一般的に当該技術分野において計量棒と称されるオリゴヌクレオチドバンドの直線的アレイが含まれる。別の好適なフォーマットには、個別のセルの二次元パターン（例えば、６４×６４アレイ中に４０９６の正方形）が含まれる。当業者には理解されるように、限定されないが、スロット（長方形）および円形アレイを含む他のアレイフォーマットは等しく使用に好適である（米国特許第５，９８１，１８５号を参照のこと）。数例では、アレイはマルチウェルプレートである。一例において、アレイを、スレッド、膜またはフィルムであるポリマー媒体上に形成する。有機ポリマー媒体の一例は、約１ｍｉｌ（０．００１インチ）〜約２０ｍｉｌ程度の厚さを有するポリプロピレンシートであるが、フィルムの厚さは重要ではなく、かなり広範囲にわたって変化する可能性がある。アレイは二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムを含むことができ、これは、耐久性に加えて、バックグラウンド蛍光の低さを示す。
【０１５６】
本開示のアレイフォーマットを様々な異なる種類のフォーマットに含めることができる。「フォーマット」は、マイクロタイタープレート（例えば、マルチウェルプレート）、試験管、無機シート、計量棒など、固体支持体を取り付けることができる任意のフォーマットを含む。例えば、固体支持体がポリプロピレンスレッドである場合、１以上のポリプロピレンスレッドをプラスチック計量棒型デバイスに取り付けることができ；ポリプロピレン膜をスライドガラスに取り付けることができる。特定のフォーマットそれ自体は重要ではない。固体支持体またはその上に吸着された任意のバイオポリマーの機能的挙動に影響を及ぼすことなく、その固体支持体を固定することができること、および、デバイスが導入される物質（例えば、臨床試料およびハイブリダイゼーション溶液）に対してそのフォーマット（例えば、計量棒またはスライド）が安定であることだけが必要である。
【０１５７】
本開示のアレイを様々なアプローチによって調製することができる。一例において、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質配列を別々に合成し、その後、固体支持体に取り付ける（米国特許第６，０１３，７８９号を参照のこと）。別の例では、配列を支持体上で直接合成して、所望のアレイを提供する（米国特許第５，５５４，５０１号を参照のこと）。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を固体支持体に共有結合させるため、および支持体上でオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を直接合成するための好適な方法は当業者に公知である；好適な方法の概要は、Matson et al., Anal. Biochem. 217:306-10, 1994で見出すことができる。一例において、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを調製するための通常の化学的技術を用いてオリゴヌクレオチドを合成する（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第８５／０１０５１号および国際公開第８９／１０９７７号、または米国特許第５，５５４，５０１号）。
【０１５８】
好適なアレイは、あらかじめ決められたパターンで４つの塩基の前駆体を配置することによって、アレイのセル中でオリゴヌクレオチドを合成するための自動手段を用いて産生することができる。手短に言うと、多重チャンネル自動化学的デリバリーシステムを用いて、基体全体にわたって平行な列（数がデリバリーシステム中のチャンネルの数に相当する）でオリゴヌクレオチドプローブ集団を作製する。第１方向でのオリゴヌクレオチド合成の完了後、基質を次いで９０°回転させて、第１セットに対して垂直になった列の第２セット内で合成を進行させることができる。このプロセスは、その交点が複数の別個のセルを生成させる多重チャンネルアレイを作製する。
【０１５９】
オリゴヌクレオチドを、その３’末端または５’末端のいずれかによってポリプロピレン支持体に結合させることができる。一例において、オリゴヌクレオチドを３’末端により固体支持体に結合させる。しかしながら、当業者は、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の使用が固体支持体に対する結合に好適であるかどうかを判定することができる。一般に、３’末端および５’末端の領域におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性は、支持体に対する結合を決定する。
【０１６０】
特定の例において、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ：標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする１以上の標識を含む。
【０１６１】
２．マイクロアレイ法での遺伝子発現プロファイリング
最も感受性が高く、最も柔軟性のある定量法の１つはＲＴ−ＰＣＲであり、これを使用して、様々な試料集団において、薬物治療の存在下または非存在下で、正常および腫瘍組織中のｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現のパターンを特性化し、密接に関連したｍＲＮＡを識別し、そしてＲＮＡ構造を分析することができる。
【０１６２】
第１ステップは、それぞれ、ヒト腫瘍または腫瘍細胞系などの標的試料、および対応する正常な組織または細胞系からのＲＮＡの単離である。ＲＮＡ源が原発腫瘍である場合、ＲＮＡを、例えば凍結組織試料または保存されたパラフィン包埋および／もしくは固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【０１６３】
ＲＴ−ＰＣＲの変法は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲであり、これは二重標識蛍光発生プローブ（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ）によりＰＣＲ産物蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列の内部コンペティターを正規化のために使用する定量的競合ＰＣＲ、および、ＲＴ−ＰＣＲのために試料内に含まれる正規化遺伝子またはハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲのどちらとも適合性である（Heid et al., Genome Research 6:986-994, 1996を参照のこと）。定量的ＰＣＲは米国特許第５，５３８，８４８号でも記載されている。関連したプローブおよび定量的増幅手順は米国特許第５，７１６，７８４号および米国特許第５，７２３，５９１号で記載されている。マイクロタイタープレート中で定量的ＰＣＲを実施するための機器は、PE Applied Biosystems (Foster City, CA)から入手可能である。
【０１６４】
他の例では、TaqMan（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてｍＲＮＡレベルを測定する。TaqMan（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の設備を用いて実施することができる。システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、およびコンピュータを含み得る。数例では、システムは、サーモサイクラー上の９６ウェルフォーマット中で試料を増幅する。増幅中、レーザー誘起蛍光シグナルを全９６ウェルについて光ケーブルファイバーによりリアルタイムで集め、ＣＣＤで検出する。システムは、機器を稼働させるため、およびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【０１６５】
誤差および試料間の変動の影響を最小限に抑えるために、内部標準を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施することができる。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定レベルにて発現され、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために一般的に用いられるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、および１８ＳリボソームＲＮＡのｍＲＮＡである。
【０１６６】
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む、固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ源として使用する遺伝子発現を定量化するための代表的なプロトコルのステップは、様々な発表された学術論文で記載されている（Godfrey et al., J. Mol. Diag. 2:84 91, 2000; Specht et al., Am. J. Pathol. 158:419-29, 2001を参照のこと）。手短に言うと、代表的なプロセスは、厚さ約１０μｍのパラフィン包埋腫瘍組織試料の切片を切り出すことから開始する。ＲＮＡを次いで抽出し、そしてタンパク質およびＤＮＡを除去する。別法として、ＲＮＡを腫瘍試料または他の組織試料から直接単離する。ＲＮＡ濃度の分析後、必要ならばＲＮＡ修復および／または増幅ステップを含めることができ、そして遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、続いてＲＴ−ＰＣＲおよび／または核酸アレイへのハイブリダイゼーションをおこなう。
【０１６７】
別の実施形態において、試料におけるｍＲＮＡ発現の定量化のために当該技術分野で公知の通常使用される方法を、本明細書中で提供される結腸シグネチャーとともに使用することができる。そのような方法としては、限定されないが、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247 283 (1999)）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Hod, Biotechniques 13:852 854 (1992)）が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ２本鎖、ＲＮＡ２本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖またはＤＮＡ−タンパク質２本鎖を含む特異的２本鎖を認識することができる抗体を用いることができる。
【０１６８】
さらなるＰＣＲ系技術としては、例えば、差次的発現（Liang and Pardee, Science 257:967 971 (1992)）；増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）（Kawamoto et al., Genome Res. 12:1305 1312 (1999)）；BeadArray（商標）技術（Illumina, San Diego, Calif.; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)）；遺伝子発現のための迅速アッセイ（Yang et al., Genome Res. 11:1888 1898 (2001)）において市販のLuminex100 LabMAPシステムおよび複数の色分けされた微小球（Luminex Corp., Austin, Tex.）を使用する、遺伝子発現の検出のためのBeadsArray（ＢＡＤＧＥ）；競合ＰＣＲおよびMassARRAY（Oeth et al., 2004, SEQUONOME Application Note）；ならびに高精度遺伝子発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）分析（Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003)）が挙げられる。
【０１６９】
増幅のために使用されるプライマーは、関心のある遺伝子（例えば、表１、表および表６で記載される遺伝子の独自のセグメントを増幅するように選択される。これらに対して使用することができるプライマーは、市販のものであるか、または例えばGENBANK（登録商標）で入手可能であるようなこれらの遺伝子の配列を用いて、周知方法にしたがって、設計し、合成することができる。
【０１７０】
別の定量的核酸増幅手順は、米国特許第５，２１９，７２７号で記載されている。この手順において、試料中の標的配列の量は、標的配列および内部標準核酸セグメントを同時に増幅することによって測定される。各セグメントから増幅されたＤＮＡの量を測定し、標準曲線と比較して、増幅前に試料中に存在していた標的核酸セグメントの量を決定する。
【０１７１】
数例では、マイクロアレイ技術を用いて遺伝子発現を同定または確認する。したがって、発現プロフィールを、新鮮な腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかで、マイクロアレイ技術を用いて測定することができる。この方法では、関心のある結腸ガンシグネチャー核酸配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）をマイクロチップ基体上にプレートするか、または整列させる。整列させた配列を次いで、関心のある細胞または組織由来の単離された核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）とハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲ方法とちょうど同じように、ｍＲＮＡ源は、典型的にはヒト腫瘍から、そして場合によって対応する非ガン性組織および正常な組織または細胞系から単離された全ＲＮＡである。
【０１７２】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入物を高密度アレイとして基体に適用する。数例では、アレイは、表１、２、および６で示される結腸ガンシグネチャー遺伝子の少なくとも２つに特異的なプローブを含む。マイクロアレイ化核酸は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに好適である。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、関心のある組織から抽出されるＲＮＡの逆転写における蛍光ヌクレオチドの組込によって生成させることができる。チップに適用された、標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットと特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡検査によるかまたはＣＣＤカメラなどの別の検出法によってチップをスキャンする。各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションの定量化によって、対応するｍＲＮＡの量の評価が可能になる。二色蛍光で、２つのＲＮＡ源から生成させ別々に標識されたｃＤＮＡプローブを、対ごとにアレイとハイブリダイズさせる。それぞれの特定された遺伝子に対応する２つの源由来の転写産物の相対的量をこのようにして同時に測定する。小型化されたスケールのハイブリダイゼーションは、表１、２、および６中の結腸ガンシグネチャー遺伝子の発現パターンの便利かつ迅速な評価をもたらす。マイクロアレイ分析は、市販の設備によって、Affymetrix GeneChip（登録商標）技術（Affymetrix, Santa Clara, CA）、またはAgilentのマイクロアレイ技術（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）で供給されるものなどを製造業者のプロトコルにしたがって実施することができる。
【０１７３】
３．遺伝子発現分析のさらなる方法
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写産物についての個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに多数の遺伝子転写産物の同時的かつ定量的な分析を可能にする別の方法である。まず、転写産物を独自に同定するために十分な情報を含む短配列タグ（約１０〜１４塩基対）を生成させる。ただし、このタグは各転写産物内の独自の位置から得られるものとする。次いで、多くの転写産物を連結させて、配列決定することができる長い連続分子を形成し、複数のタグのアイデンティティーを同時に明らかにする。個々のタグの量を測定し、各タグに対応する遺伝子を特定することによって、転写産物の任意の集団の発現パターンを定量的に評価することができる（例えば、Velculescu et al., Science 270:484-7, 1995; and Velculescu et al., Cell 88:243-51, 1997を参照のこと）。
【０１７４】
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、関心のある遺伝子の発現を検出し、比較するための別の方法である。ＩＳＨは、核酸ハイブリダイゼーションの技術を単一細胞レベルに適用し、外挿し、そして細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学の技術分野と組み合わせて、形態の維持および細胞マーカーが維持され同定されることを許容し、そして配列の、例えば組織および血液試料などの集団内の特定の細胞への位置特定を可能にする。ＩＳＨは、相補的核酸を使用して、組織の一部もしくはセクションに（インサイチュ）、または組織が十分小さい場合は全組織に（全載ＩＳＨ）、１以上の特異的核酸配列の位置を決定する、ハイブリダイゼーションの１種である。ＲＮＡ  ＩＳＨを用いて、組織における発現パターン、例えばガン生存因子関連遺伝子の発現を分析することができる。
【０１７５】
試料細胞または組織を処理して、それらの浸透性を増大させて、ガン生存因子関連遺伝子特異的プローブなどのプローブを細胞に侵入させる。処理された細胞にプローブを添加し、適切な温度でハイブリダイズさせ、そして過剰のプローブを洗い流す。組織中のプローブの位置および量を、例えば、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡検査またはイムノアッセイを用いて測定することができるように、相補性プローブは標識されている。試料は、例えば非腫瘍試料または乳ガンもしくは肺腫瘍試料などの本明細書中で記載される任意の試料であり得る。関心のあるガン生存因子関連遺伝子の配列は知られているので、プローブが関心のある遺伝子と特異的に結合するようにプローブを設計することができる。
【０１７６】
インサイチュＰＣＲは、ＩＳＨ前の標的核酸配列のＰＣＲベースの増幅である。ＲＮＡの検出のために、細胞内逆転写ステップを導入して、インサイチュＰＣＲ前にＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡを生成させる。これによって、低コピーＲＮＡ配列の検出が可能になる。
【０１７７】
インサイチュＰＣＲの前に、細胞または組織試料を固定し、透過処理して、形態を保存し、ＰＣＲ試薬が増幅される細胞内配列へアクセスすることを可能にする。次に、懸濁液中に保持された無傷細胞中またはスライドガラス上の集細胞遠心調製物もしくは組織切片中で、標的配列のＰＣＲ増幅を直接実施する。前者のアプローチでは、通常のサーマルサイクラーを使用して、ＰＣＲ反応混合物中に懸濁された固定細胞を熱サイクルに付す。ＰＣＲ後、細胞をスライドガラス上に集細胞遠心し、ＩＳＨもしくは免疫組織化学によって細胞内ＰＣＲ産物を可視化する。インサイチュＰＣＲは、カバーガラス下で試料にＰＣＲ混合物を重ね、次いでこれを密封して反応混合物の蒸発を防止することによって、スライドガラス上で実施する。熱サイクルは、従来型の、もしくは特別に設計されたサーマルサイクラーの加熱ブロックの上に直接スライドガラスを置くことによるか、または熱サイクルオーブンを使用することによって、達成される。
【０１７８】
細胞内ＰＣＲ産物の検出は、一般的に、ＰＣＲ産物特異的プローブでのＩＳＨによる間接的インサイチュＰＣＲ、または、熱サイクル中にＰＣＲ産物中に組み込まれた標識されたヌクレオチド（例えば、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰ）の直接的検出を通した、ＩＳＨを伴わない直接的インサイチュＰＣＲという２つの異なる技術のいずれかによって達成される。
【０１７９】
検出法のいくつかの実施形態で、１以上の「ハウスキーピング」遺伝子または「内部標準」の発現も評価することができる。これらの用語は、構成的にまたは全体的に発現された任意の遺伝子（または後述するタンパク質）であって、その存在がガン生存因子関連遺伝子（またはタンパク質）レベルの評価を可能にする遺伝子を含む。そのような評価は、遺伝子転写の全体的な構成レベルの測定およびＲＮＡ（またはタンパク質）回収における変動の制御を含む。
【０１８０】
本開示を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【０１８１】
実施例１
本実施例は、本明細書に開示される方法および試薬を使用した、結腸ガン試料の分類のための例示的な予測ツールの作製および検証を記載する。本実施例は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる、Kennedy et al, J. Clin. Oncol., 29(35) 4620-4626, 2011において、本主題の技術の発明者らにより公開された素材を含む。
【０１８２】
ＦＦＰＥ由来のＲＮＡから正確な発現データを提供することが出来る、結腸直腸ガントランスクリプトームに焦点を当てた研究用アレイが開発された（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）（アルマック・ダイアグノスティック社（Almac Diagnostics）、北アイルランド;ワールドワイドウェブ上、almac-diagnostics.comにて見い出すことが出来る））（Johnston et al., J Clin. Oncol. 24: 3519, 2006）。
【０１８３】
Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究ツールは、６１,５２８のプローブセットを含み、結腸ガン組織および正常組織において発現することが確認された５２,３０６の転写産物をコードする。ＢＬＡＳＴ解析を使用して、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究ツールを、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ヒト参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＲＮＡデータベース（ワールドワイドウェブ上、ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/にて見い出すことが出来る）と比較すると、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベースには、２１,９６８（４２％）の転写産物が存在し、および２６,６７６（５１％）の転写産物が存在しない。さらにその内容物の７％が、アノテーションされた遺伝子に対する、発現されたアンチセンス転写産物を表す（Johnston et al., J Clin. Oncol. 24: 3519, 2006; Pruitt et al., Nucleic Acids Research 33: D501-D504, 2005）。さらに、主要な汎用アレイと比較した、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）のプローブレベルの解析は、約２０，０００（４０％）の転写産物が、主要な汎用マイクロアレイプラットフォーム（アフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））には含まれず、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）に独自のものであることが強調された。このように、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究ツールは、今までに実施された遺伝子発現研究において入手可能ではなかった転写産物を含む。最後に、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）の設計のために使用された転写産物情報の一部が、ハイスループットシークエンシング手法により生成されたため、他の汎用マイクロアレイに含まれるものよりも、転写産物の３’末端により近いプローブの作成が可能であった。適切な疾患特異的コンテンツおよび３’末端ベースのプローブデザインの組み合わせは、ＦＦＰＥ由来のＲＮＡから堅固なプロファイリングが可能な、独自の製品を生み出した。
【０１８４】
本研究の目的は、ステージII結腸ガン患者を、手術後、再発の低リスクまたは高リスクにあるとして正確に分類することが出来る予後診断用遺伝子シグネチャーを作成し、かつ該シグネチャーを独立して検証するために、ＦＦＰＥ由来の腫瘍材料を使用して、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究アレイの使用を評価することである。本実施例において使用されるステージII結腸ガンは、ＡＪＣＣ  Ｔ３またはＴ４リンパ節転移陰性（ＮＯ）非転移性（ＭＯ）結腸ガンである。
【０１８５】
方法
試料の選択。
以下の適格条件に従って、試料を遡及的に収集した：残存病変の証拠の無い、ステージII結腸腺癌のみ；第一次的な手術時に年齢４５才以上の患者；６か所以上の所属リンパ節が評価された；組織切片中、最少５０％の腫瘍細胞が存在する；結腸ガンの家族歴無し；手術の１年以内に、手術前または手術後のガン治療無し（しかし、再発後に受けた治療は許容可能）；および低リスクの患者に対する最短５年間の患者の経過観察。低リスクの患者とは、第一次的な手術の５年以内にガンの再発がない者と定義される。高リスクの患者とは、第一次的な手術の５年以内に、転移性のガン再発を有する者と定義される。局所的な疾患再発を有する患者は除外された。なぜならこの再発が、転移性の腫瘍ではなく、手術後の局所的残存病変の結果である可能性があるからである。１２か所の研究所から、試料を収集した。全ての試料は、病理学者により、独立して病理組織学的に検査された。データセットが、ステージII結腸ガンを有する母集団を表すことを確実にするために、それをＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、およびＥｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓデータベースと比較した。主要な患者および腫瘍特性を、表３（図６を参照）に示す。
【０１８６】
ＦＦＰＥ組織からの遺伝子発現プロファイリング。
Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（ロシュ社（Roche）、スイス、バーゼル）を使用して、ＦＦＰＥ腫瘍試料から全ＲＮＡを抽出した。Ｎｕｇｅｎ  ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２とＮｕｇｅｎ  ＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  ｖ２を組み合わせて使用し、製造者の指示に従って、増幅されたｃＤＮＡ標的を作製した。断片化され、標識されたｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、洗浄、染色および走査を、標準のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って実施した。３．０〜３．５μｇの間の、断片化され、標識されたｃＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ７Ｇスキャナー（アフィメトリックス社（Affymetrix）、カリフォルニア州、サンタクララ）上で、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）マイクロアレイ（アルマック社（Almac）、イギリス、クレイガボン）にハイブリダイズした。オペレーター、試薬、および材料ロットに加え、標的とする臨床的特性および試料特性の因子に対してランダム化されたバッチに、試料を層別化することを含む、試料のスケジューリング戦略を使用した。品質管理基準を適用し、低リスクおよび高リスク試料間で、生物学的および技術的因子を平衡化した。これは、系統的バイアスを最小化させ、いかなる残存する技術的バイアスをも技術的変動へと拡散させるために実施される。
【０１８７】
分類指標モデルの特定。
プローブセットの差次的分解の問題を回避するために、ＦＦＰＥ固定下で安定であるおよび／または競合する長期的安定性を有すると特定された、５，０１４のプローブセットを用いて、モデル開発を開始した。その後、５分割交差検定を１０回反復する間、再帰的特徴排除（ＲＦＥ）に基づく重要な特徴の選択とともに、部分最小自乗分類法を使用して、シグネチャーの作成を実施した。最も低い分散および強度を有する５０％のプローブセットを除去するための最初のフィルタリング、参照ベースの堅固なマルチチップ平均化（reference-based robust multichip averaging）（ＲｅｆＲＭＡ）の基準化および要約、ならびに各反復でプローブセットの最も重要でない１０％を廃棄するＲＦＥを含む、モデル開発のすべての態様を、交差検定内に適切に組み込んだ。最終モデルに含有する特徴の総数は、交差検定下、最大の平均受信者動作特性曲線（ＡＵＣ）下面積を有する特徴の長さにより決定した。各モデルから得た予測を二分化するための閾値は、交差検定された訓練データから得た感度および特異度の合計の最大値に基づいて選択された（ヨーデンのＪ統計（Youden J statistic）の最小値（Youden, Cancer 3:32-35, 1950））。ほとんど同一の性能を有する多数の閾値がある場合は、Ｃｏｘ比例ハザード回帰から得たハザード比（ＨＲ）をタイブレーカーとして使用して、より高いＨＲ値を優先した。
【０１８８】
予測の精度は、臨床試料と同時にプロファイリングされた、ＦＦＰＥ中に埋め込まれた結腸直腸ガン細胞株（ＨＣＴ１１６）の技術的複写物を予測することにより評価した。この試料を反復して技術的に測定することはモデル開発には含まれなかったが、高い繰り返し性および再現性を有するモデルを選定することを目的として、すべての５０の交差検定の訓練副事例（training subsets）により、独立したテスト事例として予測された。さらに、真のクラスの標識をランダムに１００回再シャッフルしたところで、並べかえ検定を実施し、その後、全モデル開発を行った。これは、これらの特徴を有するデータセットから、どんな分類性能を偶然に期待し得るかを評価するため、およびこのシグネチャー作製手順におけるいかなるバイアスをも明らかにするために実施された。
【０１８９】
既知の臨床的因子に照らした最終モデルの独立性を、一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード回帰を使用して評価した。使用されたインプットは、予測された二分化されたクラス、ならびに、標識腫瘍ステージ、患者の腫瘍グレード、腫瘍の位置、患者の年齢、患者の性別、粘液性／非粘液性サブタイプ、および回収されたリンパ節の数であった。マイクロサテライト不安定性は、因子として含まれていなかったが、これはこの情報が大多数の試料において入手可能でないためであった。最終シグネチャー中の遺伝子に基づき、社内で開発したツールを使用して、遺伝子オントロジーアノテーションならびに遺伝子オントロジーの生物学的プロセスおよび分子機能の強化を実施した。偽発見率（false discovery rate）多重検定補正を用いる超幾何分布を使用して、有意に強化された遺伝子の機能的クラスを決定した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（インジェニュイティ・システム社（Ingenuity Systems）、カリフォルニア州、レッドウッドシティ）を使用して、経路解析を実施した。
【０１９０】
試料の平衡化、ランダム化および品質管理（ＱＣ）。
標的集団：アッセイの訓練に使用された集団を、ＳＥＥＲおよびＣＲＵＫデータベース由来の一般的集団の特性を反映するように一致させた。以下の特性が考慮された：
・性別。ステージII集団における性別有病率は、男性が約５０〜６０％（英国では５６％、および米国では５７％）である。
・腫瘍の位置（遠位／近位）。ステージII集団における有病率は、近位が約５５％〜６５％、および遠位が３５％〜４５％である。
・患者の年齢。２００１〜２００５年の、ＮＣＩのSEER Cancer Statistics Review Colon and Rectum Sectionによれば、患者の０．１％が２０才未満で診断され；１．０％が２０〜３４才；３．７％が３５〜４４才；１１．６％が４５〜５４才；１８．３％が５５〜６４才；２５．１％が６５〜７４才；２８．２％が７５〜８４才、および１２．２％が８５才以上で診断された。
・無再発生存率。ステージII集団における無再発生存率は、１３％〜２２％（Gattaj et al, European Journal of Cancer, 2006）であると報告されており、ＳＥＥＲデータベースに因れば約３０％であると報告されている。
【０１９１】
予備平衡化：ハイブリダイゼーションのために提供された試料セットを、上述された一般的な人口統計を維持しながら、選択された臨床的共変量に関して平衡化するために、予備平衡化を実施した。これにより、バイオマーカー探索の能力を増加させるために意図的に強化された、無再発の生存が除外される。訓練事例は５年以降の事象を有するいかなる試料をも含まなかったが、検証事例においては、この制限はなかった。シグネチャー作製のために、５年以降に再発する試料を使用しないこと（すなわち、訓練事例において）の理論的根拠は、バイオマーカー探索を実施する際、試料集団中に追加の不均一性をもたらすことを回避するためである。
【０１９２】
平衡化手順の主な目的は、エンドポイント（２値変数として表される、高／低リスク）および以下に記載する因子のうちのいずれかの間の連関（存在する場合）を減少させることである。これらの因子および高／低リスクのエンドポイント間のいかなる連関も、本アッセイの臨床的有用性を限定し得る交絡をもたらしかねない。予後および以下の因子のうちのいずれかとの間の強力な連関を減少させるために、６０３の結腸直腸試料を予備平衡化に付した：性別；腸内の腫瘍の位置；患者の年齢；寄与した研究所；ＦＦＰＥブロックの経年（手術日時）；腫瘍内容物；およびＲＮＡの品質。
【０１９３】
連続パラメータは、コルモゴロフ−スミルノフ検定を使用して試験し、分類パラメータは、カイ二乗検定を使用して試験した。平衡化を達成するには、全てのパラメータに対してｐ−値≧０．４が必要とされた。平衡化の後、５０４の試料（３３５の低リスクおよび１６９高リスク試料）が残り、それらをアレイプロファイリングに提供した。
【０１９４】
アレイプロファイリング間の試料のランダム化：既知の技術的および生物学的因子、主に目的のエンドポイント（予後）間の交絡を回避するために、試料のランダム化を実施した。この実験において、オペレーター、ハイブリダイゼーション−洗浄−染色（ＨＷＳ）キットのロット、アレイのロットおよびアレイバッチ、ならびに寄与した研究所および予後が考慮された。各アレイバッチの、予後および寄与した研究所の比率が同じになるように、試料をまず、アレイバッチにランダム化した。次いでオペレーターを、利用可能性に応じて、各アレイバッチに割り当てた。次いで各アレイバッチに、ＨＷＳキットを割り当て、各オペレーターが、確実に同じ割合の各キットを使用するようにした。アレイロットを各アレイバッチに割り当て、それらがアレイバッチ間で確実に平等に分配されているようにした。
【０１９５】
訓練データの品質管理：主に、種々の品質関連のパラメータを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＲＰＴファイル中の値に基づいて、得られたアレイにＱＣ手順を適用した。すべての試料に対する各パラメータの分布の目視検査に基づいて、限界値を算出した：存在コールの割合（％）（present calls）（≧２０％が必要とされた）；画像の人工的効果を特定し、顕著な汚斑を有するアレイを除去した；Ｑ残差（Q residuals）およびホテリングのＴ２乗統計量に基づき、主成分分析（ＰＣＡ）によって外れ値を検出した。
【０１９６】
性別遺伝子の評価を使用して、観察された発現レベルが、臨床情報における既知の性別と一致するかどうかを判断した。
【０１９７】
分布の目視検査の間、以下のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ品質パラメータもまた考慮された；大まかには以下のとおり分類される：ＲＮＡ品質；信号品質、および検出コール；バックグラウンドおよびノイズ；ならびにバックグラウンドの均一性。
【０１９８】
合計３１９の結腸直腸試料がＱＣ手順を通過した。予備結果により、直腸試料が不均一性を導入したことが示唆されたため、直腸試料を除去して２４９の結腸のみのセットを形成し、それを最終的（ＱＣ後）平衡化に提供した。
【０１９９】
最終的なＱＣ後の平衡化：最初の予備平衡化と同一の原理に、存在コールの割合（％）の分布が低リスクおよび高リスクの両群において類似しているという基準を追加したものを使用して、ＱＣを通過した２４９の結腸試料を平衡化した（この情報は、ハイブリダイゼーション後にのみ入手可能である）。ＱＣおよび平衡化後、最終の２１５試料のセットが残った。
【０２００】
２１５の試料を含む最終の結腸セットは、既知の集団分布と比較して、以下のような特性を有する：性別：５３％が男性（集団中５０〜６０％）；腫瘍の位置（遠位／近位）：６２％が近位（集団中５５〜６５％が近位）；患者の年齢：集団の連続分布に近似する；および無再発生存率：３４％が予後不良（高リスク）。約１５〜２０％が母集団に比べて意図的に強化されている。
【０２０１】
検証事例および未来試料セットの品質管理：訓練事例に、目的に合わせて作られたＱＣ手順を使用することは、高品質のデータセットからのバイオマーカー特定を促進させるために、重要なステップである。しかしながら、未来試料の予測のためには、１回に１試料を基本として、ＱＣを適用しなければならない。また、ＱＣ手順は、データセットおよびデータが作成されたシステムに、特有でありすぎてはいけない。この目的のために、２つのシステムおよびスキャナーを使用して複製された４０試料を使用して、個別の評価を実施し、システムを超えて安定であるＱＣパラメータを特定した。ＡｖｇＳｉｇＡパラメータ（不在のプローブセットの平均信号）が、異なるシステムに渡って、最も安定したパラメータであり、従ってシステムに依存しないＱＣ手順の最良の候補であると判定された。このパラメータにおいては、より高い値はより低い品質を意味し、より低い値はより高い品質を意味する。ＡｖｇＳｉｇＡ値は、存在コールの割合（％）パラメータと強力な負の相関にあり、存在コールの割合（％）は、一般に使用されるＱＣパラメータでありかつ訓練事例において使用された主要なＱＣパラメータであった。訓練事例からの、存在コールの割合（％）の低い方の合格判定値を２０％に設定したが、これはこのデータセットのＡｖｇＳｉｇＡパラメータに対する高い方の合格判定値の４３にほぼ相当する。より新しいＦＦＰＥ試料を受け入れるため、ＡｖｇＳｉｇＡに、より低い閾値を導入しないことを決定した（これにより高品質の試料の含有が可能になる）。従って、この実験から誘導される最終的な含有範囲はＡｖｇＳｉｇＡ≦４３であり、これは独立した検証事例に適用されたＱＣ測定基準であり、かつ未来試料に適用されるＱＣである。
【０２０２】
ＦＦＰＥブロックの経年を経ても安定であるプローブセットの特定：ＦＦＰＥ試料中、ｍＲＮＡ転写産物は異なる速度で、および異なるレベルまで分解する可能性があり、古い材料から作製されたシグネチャーが、新しいＦＦＰＥ材料に期待されるほどの性能をもたないという結果をもたらし得る、ということが認識された。従って２つの独立した長期的研究を実施して、ＦＦＰＥブロックの経年に渡って安定であるプローブセットを特定した。最初の研究において、９のＦＦＰＥブロックを連続的に区分し、固定後１６週の時間枠において、７つの時点で、ＤＮＡマイクロアレイにより分析した。これらの試料を、一年の時間枠で、３回の６か月間の間欠期を有する第２の長期的研究によって補い、その第２の研究においては、６か月から４年の経年範囲の８つのＦＦＰＥブロックを連続的に区分し、ＤＮＡマイクロアレイにより解析し、結果として、解析のための１１３の個別の試料を得た。固定後、時間とともにさらに分解しなかったか、または同等の速度で壊変したかのどちらかである、５０１４の転写産物を特定した。このプローブセットのリストを、その後のシグネチャー作成のために使用した。この実験から得た詳細を提示するための別個の原稿は、準備中である。
【０２０３】
モデル開発の間の分類指標の精度を推定する：テスト設定において使用される場合、技術的複製物から一貫して同じアウトプットを生成する分類指標の能力は、アッセイの重要な態様である。この目的のために、同じ結腸直腸ガン細胞株（ＨＣＴ１１４）の技術的複製物である、３９の参照試料のセットを、臨床試料と一緒にハイブリダイズした。モデル開発の間、この事例は、モデル開発プロセスにおける各ステップで相対分散を推測するために、交差検定の間、外部テスト事例として予測された。交差検定の間、訓練事例および３９の試料参照事例間で、情報は共有されなかった。予測されたシグネチャースコアから標準偏差を算出し、９５％の信頼限界を有する平均値として可視化した。可変性は、より長いシグネチャーにおいては低く、その後、特徴選択手順に渡って次第に増加し、より短いシグネチャーのより低い正確性（ＡＵＣ）にも反映される。選択されたシグネチャー長（プローブセット６３４）において、このモデルは、高い精度および正確性の両方を示した。
【０２０４】
分類性能の置換解析：類似する特性を有するデータセットから、どのような分類性能が偶然に期待され得るかを評価するために、置換解析を実施した。解析は、真のクラスの標識（すなわち、真の予後）をランダムに再シャッフルし、その後、全モデル開発プロセス（フィルタリング、基準化、特徴選択、および分類を含む）を繰り返すことにより実施した。シグネチャーの性能は、より長いシグネチャー長において、特にプローブセットの数が６３４である選択された１か所において、偶然よりも有意に良好である。さらに、並べ替え検定は、データセットにおけるいかなる基礎となるバイアスおよび／または分類指標を開発するために使用された方法論をも、明らかにする。ランダムな標識に渡るＡＵＣ中央値は、偶然を表す０．５であり、これにより、使用された手順において、明白なバイアスがないことが確認される。
【０２０５】
結果
ＦＦＰＥ組織からの、ステージII結腸ガン予後シグネチャーの開発。５年目の無疾患生存率を、この研究の主要なエンドポイントとして使用した。臨床的因子を平衡化し、最初のデータセットに品質管理基準を適用した後、２１５人の患者の訓練事例（１４２人の低リスクおよび７３人の高リスク患者）を特定した。分類性能を推測するために、５０％の分散−強度フィルタリング、ＲｅｆＲＭＡ基準化、ＲＦＥ特徴選択、および部分最小自乗分類法を、５分割交差検定の１０回反復下で実施した。交差検定は、６３４の転写産物シグネチャーが、予後の分類のために最適であることを示した。０．６８（Ｐ＜０．００１）のＡＵＣを有する受信者動作特性曲線が生成され、シグネチャースコアおよび予後の間の有意な連関が示された（図３Ａ）。観察されたＡＵＣは、置換解析において、ランダムよりも有意により高く、技術的複製物の精度の評価において、低い分散を示した。シグネチャー予測スコアの二分化のための閾値、０．４６５を、ヨーデンのＪ統計から確立し、２．６２（Ｐ＜０．００１；図３Ｂ）のＨＲを得た。表４は、交差検定間のシグネチャー作成に渡る、分類性能の概要を含む。
【０２０６】
【表４】
2014509189.tif 000026
９５％のＣＩは、交差検定（訓練事例）からの±２の標準偏差、または１，０００回反復（検証事例）によるブートストラッピングであり；ＮＰＶおよびＰＰＶを算出する際には、それぞれ、８０％および２０％の事前確率を使用した。閾値ｔ＝０．４６５を、シグネチャースコアの２分化のために使用した。略語：ＡＵＣ、受信者動作特性曲線下面積；ＨＲ、ハザード比；ＮＰＶ、陰性適中率（陰性は低リスク）；ＰＰＶ、陽性的中率（陽性は高リスク）
【０２０７】
ステージII結腸ガンの予後シグネチャーの独立した検証：訓練事例で特定された閾値スコアを使用して、予後シグネチャーを、再発に対して強化された１４４人の患者（８５人の低リスクおよび５９人の高リスクの患者）の独立した検証事例に適用した。試料解析は、個別に、訓練事例よりも後に実施した。シグネチャーは、高リスク群における疾患再発を２．５３（Ｐ＜０．００１）のＨＲで予測した（図４および表４）。シグネチャーはまた、高リスク群におけるガンに関連する死を、２．２１（Ｐ＜０．００８４）のＨＲで予測した（図５）。
【０２０８】
本明細書に記載のシグネチャーがＦＦＰＥ由来の腫瘍材料から開発されたという事実は、既存のＦＦＰＥ腫瘍バンクのレトロスペクティブ解析に基づく、大規模な検証戦略を容易にする。
【０２０９】
ハザード比とは、分類指標によって低リスクと特定された患者において発生する事象の危険（hazard）の比率と同じくらい高リスクであると、分類指標により特定されたステージII結腸ガン患者において発生する、危険（hazard）の発現または事象の可能性である。手術後５年以内において、予後不良を有すると予測された患者と比較して、良好な予後を有すると予測された群にける再発の確率は、有意により低かった。陰性適中率とは、正確に診断された、陰性の試験結果を有する患者（陰性と予測された）の割合である。予後診断設定において、ＮＰＶは、疾患再発の有病率に依存する。陽性適中率とは、正確に診断された、陽性の試験結果を有する患者（陽性と予測された）の割合である。予後診断設定において、ＰＰＶは、疾患再発の有病率に依存する。２０％が予後不良である試料の集団有病率に基づけば、これは、５年以内に、予後不良と予測された患者は３３％の再発の確率を有し、一方予後良好と予測された患者は１３％の再発の確率を有する、ということを意味する。
【０２１０】
既知の予後因子からのシグネチャーの独立性の評価：予後診断アッセイが有用であるためには、それは、診療所で使用される既知の予後因子から、独立して機能しなければならない。従ってアッセイの独立性を、一変量のおよび多変量解析の両方において評価した（表５）。
【０２１１】
【表５】
2014509189.tif 000027
一変量および多変量解析の両方を、対数尤度検定により得たＰ値を用いるＣｏｘ比例ハザード回帰を使用して、実施した。腫瘍グレードに関しては、グレード１を、ＨＲを算出するための参照ポイントとして使用した。患者の年齢および回収された節の数は、連続因子として解析された。患者の年齢のＨＲの解釈は、年齢１年間の変化において増加するリスクであり、対応して、回収された節の数のＨＲは、回収された節が１つ増加した場合において増加するリスクである。略語：ＨＲ、ハザード比。
【０２１２】
予後の予測は、一変量（Ｐ＜０．００１）および多変量（Ｐ＜０．００１）解析の両方において有意であり、シグネチャーが従来の危険因子に加えて予後の情報を提供したことを示した。さらに、シグネチャーの独立性を、試料にリンパ管浸潤を追加して評価し、これを記録した（検証事例における１４４試料のうち１００試料）。一変量（Ｐ＜０．００１）および多変量解析（Ｐ＜０．００１）において、シグネチャーは、独立して機能した。
【０２１３】
予後シグネチャーにおける遺伝子の機能解析：次に、結腸ガンの再発に関連すると知られている生物学的プロセスを、アッセイが検出したかどうかが問われた。６３４のプローブセットをＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して解析し、統計的に有意な一連の経路を特定した。その中で最も重要なものはＩＧＦ−１シグナル伝達であった。
【０２１４】
考察
本明細書に開示されるとおり、ステージII結腸ガンの手術後に、再発のより高いリスクを有する患者を特定する、ＤＮＡマイクロアレイ・ベースのアッセイを開発した。具体的には、シグネチャーは、独立した検証事例において、再発のＨＲが２．５３であり、およびガンに関連する死のＨＲが２．２１である、高リスクのコホートを特定した。訓練事例から得たシグネチャーの性能の過大評価を回避するために、完全に別個の事例を使用した予後アッセイの検証が必要である。診療所において判断を行うために現在使用されており、典型的に約１．５以下のＨＲを有する組織学的因子と比べても、再発に対する２．５３のＨＲは遜色がない。さらに、シグネチャーは、個別の解釈を必要とせず、従来の病理組織学的因子よりも、より標準化された手法を提供し得る。重要なことに、本アッセイはＦＦＰＥ組織において実施され、従って、現在の医療行為に容易に適用できる。
【０２１５】
いくつかのガンの種類におけるいくつかのＤＮＡマイクロアレイベースの予後検査が公表されているが、臨床診療に導入されたのは１つのみであり、今日に至っても、結腸ガンにおいて使用されたものは１つもない。これは、２つの主要な因子の結果であり得る。第一に、シグネチャーのうちの多くが、新鮮な組織または凍結組織から開発されている。第２に、不適切な研究方法論が、独立のデータセットにおける試験の検証の失敗をもたらしている。
【０２１６】
凍結組織試料の使用に関しては、この組織型は優れたマイクロアレイデータを提供するが、この組織から生成される試験は、ＦＦＰＥ組織において適切に機能する可能性が低い。これは、予後試験を開発しかつ独立して検証するための、十分な試料の収集を困難にし得る。さらに、新鮮な組織ベースのアッセイの実施は、臨床診療の変更を必要とする。なぜならば、試料を手術時に採取する必要があるからである。
【０２１７】
ＦＦＰＥは、腫瘍アーカイビングにおける標準であり、アッセイ開発のために、多くの腫瘍バンクが既に存在する。重要なことに、ＦＦＰＥベースのアッセイの開発および臨床実施のための、試料採取および処理における変更は必要ない。
【０２１８】
開示される方法は、ＦＦＰＥ組織を使用し、しかもＤＮＡマイクロアレイプラットフォームを使用するために、そしてそれにより、定量的ポリメラーゼ連鎖反応技術と比較して、検出可能なｍＲＮＡ転写産物および生物学的プロセスの数を大幅に増加させるために、開発された。マイクロアレイプラットフォームとともにＦＦＰＥ材料を使用する結果として、いくつかの方法論的な問題を考慮する必要がある。ホルマリン固定は、ＲＮＡのタンパク質への架橋結合による、ｍＲＮＡ転写産物の分解をもたらす。この分解のほとんどは直ちに発生するが、いくつかの転写産物は、時間とともに分解し続ける。この研究に使用されるＤＮＡマイクロアレイプラットフォームは、分解した転写産物を検出する能力を強化するための、ｍＲＮＡ転写産物の３’末端に合わせて設計されたプローブセットを有する。さらに、個別の結腸ガン試料のセットを時間経過に渡って解析し、シグネチャーの一部として、不安定なまたは差次的に安定なｍＲＮＡ転写産物を組み入れていないことを確実にした。
【０２１９】
シグネチャーの的中率は、既知の予後の臨床的共変量をはるかに超えている。この性能は、主に、好適な訓練事例を確立するための一部として実施された、最初の、生物学的および技術的因子に対する予後診断の平衡化の結果であると考えられる。考慮される生物学的因子には、既知の予後因子、例えばｐＴステージおよびグレード、ならびに、腫瘍の位置、患者の年齢、および性別を含む、遺伝子発現に影響を与えていたかもしれない他の非予後因子が含まれる。技術的因子、例えばＦＦＰＥブロックの経年および寄与した研究所もまた、訓練事例における高リスクおよび低リスク試料間で平衡化した。さらに、技術的因子および既知の臨床的因子間の交絡を回避するために、オペレーターおよび試薬キットのランダム化を実施した。これにより、アッセイがオペレーターに依存していたか、または特定の研究所から得た試料の使用もしくは特定の試薬のバッチの使用に依存していたというリスクを最小化した。このアッセイは、既知の予後因子に依存しないように開発されたため、我々は、いくつかの因子を組み入れた多様性解析を開発し、さらにより正確な予後の指標を得ることが可能であり得ると信じている。
【０２２０】
遺伝子シグネチャーの機能解析により、ＩＧＦ−１シグナル伝達、ＴＧＦ−βシグナル伝達、およびＨＭＧＢ１シグナル伝達が、特定された最も重要な経路のうちの一部であることが明らかになった。これらのすべてが、腫瘍の成長、浸潤、および転移の促進、ならびにアポトーシスの阻止を介して、結腸ガンにおける予後不良を招くことが、先に報告されている。結論として、ＦＦＰＥ保存腫瘍組織から得た、ステージII結腸ガンのための、有効かつ堅固な予後のＤＮＡマイクロアレイシグネチャーが、本明細書において開示される。
【０２２１】
開示されるシグネチャーは、医師が、再発のリスクおよびアジュバント化学療法から利益を得る可能性に関する、より見識のある臨床判断を下すための助けとなり得る（Andre et al., Annals of Surgical Oncology 13:887-898, 2006; Diaz-Rubio et al., Clin. Transl. Oncol. 7: 3-11, 2005; Monga et al., Ann. Surg. Oncol. 13: 1021-1134, 2006; Sobrero, Lancet Oncol. 7: 515-516, 2006）。さらに、多くの患者が、彼らの治癒および治療のリスク／利益の可能性を知ることを望んでいる（Gill et al., J. Clin. Oncol. 22: 1797-1806, 2004; Kinney et al., Cancer 91: 57-65, 2001; Carney et al, Ann. R. Coll. Surg. Engl. 88: 447-449, 2006; Salkeld, Health Expect 7: 104-1014, 2004）。患者の予後の予測が可能であるということは、医師および患者に、より良い、リスク／利益の評価および治療法の選択を提供する。個別化した患者管理を提供する能力は、希望的には、これらの患者のための生存および生活の質の改善をもたらすであろう。
【０２２２】
過去において、多くの研究が、説得力のある統計的証拠を欠く主要な理由は試料のサイズであると暗示しており、およびアジュバント治療の利益を証明するために、より大規模な治験の必要性を挙げている。有効な予後のマーカー、例えば本研究で作製された遺伝子シグネチャーを使用して、ステージIIの患者を高リスクおよび低リスク亜集団に層別化することが出来る。この手法は、再発の高リスクを有する患者に焦点をあてることにより、臨床治験デザインの改善を補助し得、従ってアジュバント療法から利益を導き出す可能性がより高い。このように、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）は、臨床治験への患者の包含のための患者の層別化、アジュバントおよびネオアジュバント療法に関する意思決定、ならびにさらなる薬剤開発のための新規な経路または分子標的の特定のための、有用な研究ツールとなり得る。
【０２２３】
表６に報告される予後シグネチャーは、ステージII結腸ガンの再発を正確に予測しており、独立したＦＦＰＥ検証事例で評価される。再発の予測に対する全体的な正確さは、この不均一な疾患に対して、実質的なものである。２０％が予後不良である試料の集団有病率に基づくと、これは、５年以内に、予後不良と予測された患者は３３％の再発の確率を有し、一方予後良好と予測された患者は１３％の再発の確率を有する、ということを意味する。現在の手法の主要な優位性のうちの１つは、利用可能な組織バンクの大多数が好ましいとする保管方法である、ＦＦＰＥ組織からの発現プロファイリングに基づいているということである。（Abramovitz Proteome Sci. 4:5, 2006）。ＦＦＰＥ組織試料から抽出されたＲＮＡは、分解およびホルマリンに誘導される修飾により、より短い長さ中央値を有する傾向にあり、それが一般的なアレイによる検出を難しくする。結腸ガントランスクリプトームを定義する際、各転写産物の３’末端へのプローブセットのデザインをしやすくする、３’末端ベースのシークエンシング手法を用いた。この手法は、さらにより高い検出率を確実にし、このように、新鮮凍結組織およびＦＦＰＥ組織試料の両方からＲＮＡ転写産物を検出するために、最適に設計される。本研究から得た結果は、アルマック・ダイアグノスティック社（Almac Diagnostics）のＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究ツールが、ＦＦＰＥ由来の組織から、生物学的に有意義でありかつ再現性のあるデータを生成することが可能であるということを示した。
【０２２４】
実施例２
ガンの予後診断
この実施例は、結腸ガンと診断された対象の予後診断のために使用することが出来る、特定の方法を記載する。しかしながら、当業者は、これらの特定の方法から逸脱する方法もまた、結腸ガンを有する対象の予後を首尾よく提供するために使用し得るということを理解するであろう。
【０２２５】
腫瘍試料および隣接する非腫瘍試料を対象から得る。例えば、微細針吸引を使用して、約１〜１００μｇの組織を、各試料の種類ごとに得る。腫瘍および非腫瘍組織化から、定法を使用して（例えば市販のキットを使用して）ＲＮＡおよび／またはタンパク質を単離する。
【０２２６】
１つの例においては、対象から得た腫瘍試料中の、２つ以上の表１、２、および／または６の転写産物の発現レベルを、マイクロアレイ解析またはリアルタイム定量的ＰＣＲにより検出することにより、結腸ガン腫瘍の予後を判断する。例えば、開示される遺伝子シグネチャーを利用することもできる。腫瘍試料中の相対的な発現レベルを、対照（例えば、この対象の隣接する非腫瘍組織から単離したＲＮＡ）と比較する。他の場合においては、対照は基準値、例えば健康な対象群またはガンの対象群由来の非腫瘍試料中に存在する、そのような分子の相対的な量である。
【０２２７】
本開示の原理を適用し得る、多数の可能性のある実施形態を考慮して、例示される実施形態であることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−１００】
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【図７−１０１】
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【図７−１６８】
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【図７−１６９】
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【図７−１７０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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