(57)【要約】  本発明は、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療における使用のための、ｍｉＲＮＡ−２１抑制剤、ならびに前記ｍｉＲＮＡ−２１抑制剤を医薬賦形剤および担体と共に含む医薬組成物を提供する。特に、ｍｉＲＮＡ−２１抑制剤、およびこれを含む医薬組成物は、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害患者の骨格筋の再生における使用のためのものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療における使用のためのｍｉＲＮＡ−２１（ｍｉＲ−２１）抑制剤。
【請求項２】
前記治療が骨格筋の再生を含む、請求項１に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項３】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、およびエメリー−ドライフス型筋ジストロフィーからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項４】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項３に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項５】
前記ｍｉＲ−２１抑制剤が、ｍｉＲ−２１転写を防止する、または低下させる薬剤である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項６】
前記ｍｉＲ−２１抑制剤が、ｍｉＲ−２１調節活性を防止する、または低下させる薬剤である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項７】
前記ｍｉＲ−２１抑制剤が、抑制オリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、小分子化学化合物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５または請求項６に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項８】
前記ｍｉＲ−２１抑制剤が、小さな一本鎖ＲＮＡ、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される抑制オリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項９】
前記ｍｉＲ−２１抑制剤が小さなヘアピンＲＮＡである、請求項８に記載の使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤。
【請求項１０】
筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療における使用のための医薬組成物であって、請求項５から請求項９のいずれか一項において規定されるｍｉＲ−２１抑制剤を、医薬的に許容可能な賦形剤および担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療が骨格筋の再生を含む、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、およびエメリー−ドライフス型筋ジストロフィーからなる群から選択される、請求項１０または請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
非経口投与用の、請求項１０から請求項１３のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
筋肉内投与用の、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療の分野、特に筋疾患または筋障害の分野に関する。より詳細には、本発明は筋ジストロフィーの治療用の新たな薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋ジストロフィー（以後「ＭＤ」と略す）は、ヒトの体を動かす筋肉を弱める一群の遺伝性筋障害を指す。ＭＤは、進行性の骨格筋弱化疾患、筋タンパク質の欠陥、ならびに筋肉細胞および組織の死によって特徴付けられる。デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性、眼球咽頭型、末梢型、およびエメリー−ドライフス型を含む疾患が常にＭＤと分類されるが、ＭＤに類似する疾患は合計して１００を超える。ほとんどのタイプのＭＤは、徴候が身体の系（心臓、胃腸、神経系、内分泌腺、皮膚、目および脳さえ挙げられる）に現れる多系疾患である。容体が気分変動および学習障害をもたらすこともある。
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（以後「ＤＭＤ」）は、出生男児の３，５００人に１人を襲う最も一般的な遺伝的筋疾患である。これは、ジストロフィン遺伝子欠陥によって引き起こされるＸ連鎖性の劣性疾患である。ジストロフィンは、筋線維鞘下に位置し、筋線維鞘にてジストロフィン−グリコプロテイン複合体をアセンブルし、細胞質内アクチンフィラメントネットワークおよび細胞外マトリックスを結び付け、筋線維に物理的強度を付与するものである。ＤＭＤ患者のジストロフィン損失により、筋肉の進行性の弱化、消耗および退化がもたらされる。
【０００４】
現時点で、いくつかの実験戦略が現在調査中であるが、ＭＤの致死的進行を止める有効な治療法はない。これらのほとんどの戦略は、ジストロフィンの代替または補償に焦点を合わせている。これらには、ベクター介在性の遺伝子送達およびエキソンスキッピングが挙げられる。
【０００５】
ベクター介在性の遺伝子送達は、患者のゲノム内の遺伝子座を修復することよりはむしろ、患者に機能的ジストロフィン遺伝子の代替コピーを提供することを目的とするものである。ＤＭＤの遺伝子代替の利点は、患者の遺伝子中の特定の突然変異に何ら依存しないことである。しかしながら、体筋に広く代替ジストロフィンまたはジストロフィン様遺伝子を送達する安全かつ有効な方法を明らかにすることは、困難な課題である。最近の研究結果によれば、ウイルスベクター介在性の遺伝子導入に関連した免疫学的合併症が目立っている。さらに、体中の筋肉におけるジストロフィンの長期の発現が、臨床成功への主な障壁となっている。
【０００６】
アンチセンス誘導エキソンスキッピング戦略は、リーディングフレームを修復するために、突然変異した、または付加的なエキソンを取り除くことを目的とするものであり、ジストロフィンタンパク質の「ベッカー型ＭＤ様」短縮形の発現を誘導することが示されている。しかしながら、いくつかの問題（細胞取込みが悪く、循環からのクリアランスが比較的早いことに加え、筋肉タイプ間でエキソン−スキッピング効率のばらつきが大きいことが挙げられる）がこのアプローチを制限している。動物モデル実験により、機能改善には数週間にわたる大用量が必要とされるが、ジストロフィンの均一な発現を達成するには十分でないことが証明された。その上、ＤＭＤを引き起こす異なる欠失には、異なるエキソンのスキッピングが必要となるであろうから、多くの特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および最適化が必要となるであろう。各アンチセンスオリゴヌクレオチドが、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって現在考えられるように、新たな薬剤として考えられるならば、各々が、費用のかかる長い臨床試験段階を通過しなければならない。費用および時間に関する克服できない障壁に加えて、臨床試験を実行するのに十分な患者を見つけることさえ非常に問題がある場合がある。その上、アンチセンス誘導エキソンスキッピング戦略治療法は、機能不全のジストロフィン分子を標的とすることによって、ＤＭＤの発症の予防または遅延に有効であるかもしれないが、進行型疾患に対してはほとんど有効でない。
【０００７】
他のアプローチは、ＤＭＤの顕著な病理学的特徴である筋線維症を改善することに向けられている。ヒトＤＭＤ患者は、進行性の筋線維退化を患い、ジストロフィー線維が線維性浸潤物によって徐々に置換される。この線維症プロセスは筋肉機能障害を増進し、致死的ＤＭＤ表現型の原因となる。フィブリン蓄積を減少させる薬剤の送達が、ＤＭＤ治療法の新規な代替治療法を構成するかもしれないと提唱されている。このアプローチは、特に疾患進行中の初期に適用されると、より多くの筋肉損傷を防止するのに有用であり得た。しかしながら、抗線維化治療法は、骨格筋線維退化を防止することができず、筋肉再生の誘導は言うまでもない。従って、筋肉機能障害は、一度起こると、どんな形であれ好転され得ない。
【０００８】
当該分野における進歩にもかかわらず、筋ジストロフィーの治療により有効な代替治療法がなお必要とされていることは明白である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
驚くべきことに、ＤＭＤのマウスモデル（ｍｄｘマウス）においてｍｉＲＮＡ−２１（ｍｉＲ−２１）発現を負に調節することで、骨格筋再生が促進され、かつ線維症が改善することがわかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の第１態様では、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療における使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤を提供する。本態様は、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療用の薬剤の製造のための、ｍｉＲ−２１抑制剤の使用として再構成されてよい。本発明はまた、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療方法であって、ｍｉＲ−２１抑制剤を必要としているヒトを含む動物に、ｍｉＲ−２１抑制剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明において、用語「治療」は、筋ジストロフィー疾患の原因または症状を改善し、またこのような症状の発症を回避することを意図する薬剤の投与を指す。従って、本発明の範囲に関して、用語「治療」は予防の概念も含む。
【００１２】
以下の実施例において示すように、ｍｉＲ−２１発現を低下させる薬剤の投与は、高齢のｍｄｘマウスにおいて線維症を予防するのに、そして筋線維再生の増進により筋損傷を好転するのにかなり有効である（図４および図５）。ｍｉＲ−２１抑制剤の筋肉再生効果は、高齢のマウスが筋肉機能を部分的に回復したという点で、特に注目すべきである（図５Ｂおよび図５Ｃ）。
【００１３】
本発明は、筋ジストロフィーの患者が、疾患の初期にて筋損傷を回避する、そして疾患の後期にて筋肉機能を回復するという治療の恩恵を受けることができる利点を有する。
【００１４】
本発明の第１態様で規定されるｍｉＲ−２１抑制剤は、有効量の前記ｍｉＲ−２１抑制剤を、医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体と共に含む医薬組成物の形態で投与されてよい。
【００１５】
従って、本発明の第２態様は、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療における使用のための医薬組成物であって、ｍｉＲ−２１抑制剤を医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体と共に含む医薬組成物に関するものである。本態様は、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療用の薬剤の製造のための、ｍｉＲ−２１抑制剤を医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体と共に含む医薬組成物の使用として再構成されてよい。本発明はまた、筋ジストロフィーおよび／または筋ジストロフィー様の筋障害の治療方法であって、ｍｉＲ−２１抑制剤を医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体と共に含む医薬組成物を必要としているヒトを含む動物に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、０．５、１、３、８、１２および２４ケ月齢のｍｄｘマウスの横隔膜筋における、ｑＰＣＲによって分析されたｍｉＲ−２１発現レベルである。ｍｄｘマウス値が、齢適合野生型マウスの値に対して正規化された（＊Ｐ＜０．００１（対０．５ケ月）；平均±ｓ．ｅ．ｍ；各群ｎ＝５）。図１Ｂは、上述の齢のｍｄｘマウス（黒色バー）および野生型マウス（白色バー）の横隔膜筋において分析されたコラーゲン量である（＊Ｐ＜０．００１；平均±ｓ．ｅ．ｍ；各群ｎ＝４）。図１Ｃは、横隔膜筋切片のＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色の代表例である：（ｗ）は３ケ月齢の野生型マウス対照、（３）は３ケ月齢のｍｄｘマウス、（８）は８ケ月齢、そして（２４）は２４ケ月齢である。スケールバー：２５μｍ。
【図２】ｍｉＲ−２１の比較ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍＲＮＡ分析である：（１）ｍｄｘおよび野生型マウス、（２）ＤＭＤ患者および健康な個体。野生型マウスおよび健康な個体が白色バーで表され、ｄｍｘマウスおよびＤＭＤ患者が黒色バーで表される（＊＊＊Ｐ＜０．０００１；平均±ｓ．ｅ．ｍ；マウスｎ＝５；患者ｎ＝７名（６から１２歳）、健康個体６名（９から１５歳））。
【図３】図３Ａは、筋肉バイオプシー切片のＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色の代表例である：（１）健康な対照被験体、および（２）ＤＭＤ患者。スケールバー：２５μｍ。図３Ｂは、健康な対照およびＤＭＤ患者の筋肉バイオプシーにおけるコラーゲン蓄積（μｇ／ｍｇタンパク質）である。健康な個体が白色バーで表され、ＤＭＤ患者が黒色バーで表される（＊Ｐ＜０．０１；平均±ｓ．ｅ．ｍ；患者ｎ＝７名（６から１２歳）、健康個体６名（９から１５歳））。
【図４】ｍｉＲ−２１サイレンシングの、筋ジストロフィー症状の治療有効性である。図４Ａは、（１）スクランブル対照オリゴｍｉＲ、または（２）ｍｉＲ−２１模倣体の１ケ月投与後の若齢ｍｄｘマウス（３ケ月齢）由来の腓腹筋切片のＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色である。スケールバー：２５μｍ。図４Ｂは、（３）スクランブル対照オリゴｍｉＲ、または（４）抗ｍｉＲ−２１の１ケ月投与後の２４ケ月齢ｍｄｘマウス由来の腓腹筋切片のＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色である。スケールバー：２５μｍ。図４Ｃは、抗ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１模倣体またはスクランブル対照オリゴｍｉＲの１ケ月投与後の腓腹筋における（ａ）コラーゲン蓄積、および（ｂ）ｍｉＲ−２１発現である：（Ｗ）は野生型、（１）は若齢ｍｄｘ＋スクランブル、（２）は若齢ｍｄｘ＋ｍｉＲ−２１模倣体、（３）は高齢ｍｄｘ＋スクランブル、そして（４）は高齢ｍｄｘ＋抗ｍｉＲ−２１である（＊Ｐ＜０．００１；平均±ｓ．ｅ．ｍ；各群ｎ＝５）。
【図５】ｍｉＲ−２１サイレンシングの、ジストロフィー筋の再生向上有効性である。図５Ａは、（１）スクランブル対照オリゴｍｉＲ、または（２）抗ｍｉＲ−２１により１ケ月間治療した２４ケ月齢ｍｄｘマウス由来の腓腹筋切片のＨ／Ｅ染色である。スケールバー：５０μｍ。図５Ｂは、スクランブル対照オリゴｍｉＲ（●）または抗ｍｉＲ−２１（■）による治療後の２４ケ月齢ｍｄｘマウスにおいて、１０日（ｔ）の間に測定したピーク握力（Ｎ）である。図５Ｃは、２４ケ月齢ｍｄｘマウスにおいて、スクランブル対照オリゴｍｉＲ（白色バー）または抗ｍｉＲ−２１（黒色バー）による治療１ケ月後に測定した平均ピーク握力（Ｎ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＭＤまたは関連筋障害の治療用のｍｉＲ−２１抑制剤を提供する。
【００１８】
骨格筋は横紋筋組織の形態であり、筋線維として知られる別個の構成要素で構成されている。本発明において、用語「筋肉」は、結合組織によってまとめて保持される骨格筋線維の複数の束を指し、用語「筋組織」は、骨格筋組織を指し、用語「線維」は、骨格筋線維を指す。
【００１９】
筋ジストロフィー（またはＭＤ）は、骨格筋の弱化および進行性の退化を引き起こす一群の疾患を指す。異なる形態の筋ジストロフィーが存在し、遺伝様式、発症年齢、重症度、および影響を受ける筋肉のパターンが異なっている。最も知られている筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性、眼球咽頭型、末梢型、三好筋障害、およびエメリー−ドライフス型であるが、筋ジストロフィーに類似する筋障害は１００を超え、これらは全て、用語「筋ジストロフィー様の筋障害」の下で本発明の範囲内に含まれる。用語「筋障害」は、骨格筋線維が、多くの理由のいずれかのために機能せず、筋弱化をもたらす筋疾患を指す。
【００２０】
ＤＭＤが多くの場合、筋ジストロフィーのモデルとして考えられてきた。ＤＭＤは、筋線維鞘の内面に集中するタンパク質ジストロフィンをコードする遺伝子の突然変異に由来する。ジストロフィンは、膜タンパク質の大きな複合体と結び付いて、ジストロフィン糖タンパク質複合体と呼ばれ、細胞膜の完全性にとって重要である。ジストロフィン複合体が筋細胞内部のアクチン細胞骨格を細胞外マトリックスに結び付けることがなければ、筋線維によって生じる力では筋線維鞘が断裂し、筋肉が損傷する。ｍｄｘマウス系統が、ＤＭＤについて最も広く使われている動物モデルであり、ジストロフィン発現をなくすエキソン２３のナンセンス変異を有する。ヒトＤＭＤ患者およびｍｄｘマウスは、進行性の骨格筋退化を患っている。
【００２１】
筋肉退化が、ＭＤ患者の一般的な特徴である。骨格線維の損失が最初に、サテライト細胞の既存の線維による増殖および融合によって補償されて、筋肉サイズが増大する。しかしながら、筋肉の退化および再生の反復的サイクル後、ジストロフィー筋損傷は最終的にもはや修復され得ず、ジストロフィー線維は、最初は線維性浸潤物によって、その後脂肪組織によって、徐々に置換される。実際、ＤＭＤ患者またはｍｄｘマウス、および他のＭＤ患者の筋肉は、高度な線維症を示す。全退行性プロセスにより、正常な筋肉機能が損失する。
【００２２】
本発明者らは、ＭＤの骨格筋組織機能障害がｍｉＲ−２１の調節不全に関連があることを突き止めた。また、驚くべきことに、ｍｉＲ−２１の下方調節により、組織再生が有効に増進し、かつ線維症が改善することもわかった。以下の実施例は、非常に高齢のｍｄｘジストロフィーマウスにおける１ケ月間のｍｉＲ−２１干渉により、筋肉衰退が好転したことを示す。結果は、線維症の減衰だけでなく骨格筋の驚くべき回復をも示している（図４および図５）。予想外なことに、高齢のｍｄｘジストロフィーマウスは、ｍｉＲ−２１抑制治療の後、筋肉機能を回復した（図５Ｂおよび図５Ｃ）。
【００２３】
従って、本発明の第１態様の特定の実施形態において、ＭＤまたは関連筋障害の治療における使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤が提供され、治療は骨格筋の再生を含む。ｍｉＲ−２１の機能は、ほとんどのヒト腫瘍におけるその高い発現に基づいて、古典的に癌と関連してきたが、筋肉修復におけるｍｉＲ−２１の役割はまだ開示されていない。
【００２４】
好ましくは、治療され得るＭＤは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、およびエメリー−ドライフス型筋ジストロフィーからなる群から選択される。特定の実施形態において、本発明によって提供される治療法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのためのものである。
【００２５】
上で規定される筋肉退化／再生メカニズムは、ＭＤまたはＭＤ様の筋障害の結果としてだけでなく、異なるタイプの疾患または怪我の結果としても起こると考えられている。従って、筋肉再生に関するｍｉＲ−２１抑制剤によるｍｉＲ−２１の抑制は、欠陥のある骨格筋再生に関連した筋疾患の治療に有効である。
【００２６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の双方に影響を及ぼすことによって、多細胞生物における遺伝子発現の転写後制御に関与する、短い（２０から２４ｎｔ）非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、タンパク質をコードしていてもコードしていなくてもよいキャップ化かつポリアデニル化一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一部として転写される。一次転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、およそ７０−ｎｔのステム−ループ前駆体ｍｉＲＮＡ（プレ−ｍｉＲＮＡ）を産生し、これがさらに、細胞質内Ｄｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ＊）産物を生成する。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、これが、ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対合により標的ｍＲＮＡを認識して、最も一般的には標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または不安定化をもたらす。最近の研究では、多数のｍｉＲＮＡの発現レベルが種々の癌と関連することが示されている。従って、これらのｍｉＲＮＡの（例えばＲＮＡ干渉技術による）調整が、癌治療の有望なアプローチを代表するものである。
【００２７】
ｍｉＲ−２１は、ＭＩＲ２１遺伝子によってコードされる哺乳類のｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ−２１は、確認された初めての哺乳類ｍｉＲＮＡの１つであった。成熟ｍｉＲ−２１配列は、進化を通して強く保存されている。ヒトｍｉＲＮＡ−２１遺伝子は、第１７染色体ｑ２３．２（５５２７３４０９−５５２７３４８０）のプラス鎖で、コード遺伝子ＴＭＥＭ４９（液胞膜タンパク質とも呼ばれる）内に位置する。コード遺伝子のイントロン領域内にて転写方向に位置するにもかかわらず、独自のプロモーター領域を有しており、独立して転写されて、約３４３３ヌクレオチドの長い一次転写産物であるｍｉＲ−２１（ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１として知られる）を形成する。ｍｉＲ−２１のステム−ループ前駆体（プレ−ｍｉＲ−２１）は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１のヌクレオチド２４４５と２５１６との間に存在する。ヒトｍｉＲ−２１の予測ステム−ループ前駆体は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＲ＿０２９４９３（２０１１年６月５日に更新）で指定されている。ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１は、核内のエンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによって切断されて、プレ−ｍｉＲ−２１を産生し、これが細胞質ゾル内へエクスポートされる。続いて、このプレ−ｍｉＲ−２１は、成熟ｍｉＲ−２１（配列番号１）に処理される。続いて、成熟ｍｉＲ−２１は、ｍｉＲＮＡリボ核タンパク質複合体ＲＩＳＣ内にロードされて、３’ＵＴＲのほぼ完全な相補性により標的ｍＲＮＡへ案内される。
【００２８】
癌との関連に加えて、ｍｉＲ−２１は、ＭＤにおいて異なる発現パターンを示す１０種の様々なｍｉＲＮＡの１つとして報告されている（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．「Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００７），ｖｏｌ．１０４，ｐ．１７０１６−１７０２１）。その上、欧州特許第２２５８８６３号明細書は、ＤＭＤの診断用のバイオマーカとして、ｍｉＲ−２１を開示している。
【００２９】
本発明に従うｍｉＲ−２１抑制剤は、ｍｉＲ−２１の転写を低下させるか、または防止することができる化合物である。ｍｉＲ−２１は調節マイクロＲＮＡであるので、本発明に従う有効なｍｉＲ−２１抑制剤として、ｍｉＲ−２１調節活性を部分的に、または、完全に防止することができる化合物が挙げられる。ｍｉＲ−２１調節活性の部分的または完全な抑制が、例えば、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体の形成を回避することによって、または標的遺伝子（すなわちｍｉＲ−２１によって調節される遺伝子）の調節部位を直接的にブロックすることによって、成功してよい。当該技術において知られているｍｉＲＮＡ抑制の他の任意のメカニズムが、本発明に含まれる。
【００３０】
本発明の特定の実施形態において、ｍｉＲ−２１抑制剤は、抑制オリゴヌクレオチド、タンパク質、リボザイム、小分子化学化合物、およびこれらの組合せからなる群から選択される。さらに、本発明は、ｍｉＲ−２１の任意の下流のシグナリング分子の発現または活性を抑制し得る化合物を意図している。
【００３１】
好ましくは、ｍｉＲ−２１の抑制は、抑制オリゴヌクレオチドを投与することによって達成される。用語「抑制オリゴヌクレオチド」は通常、ｍｉＲ−２１の転写または調節活性を低下させ得るオリゴヌクレオチドを指す。従って、一種のｍｉＲ−２１抑制剤である。オリゴヌクレオチドは、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似分子を有するポリマーである。さらに、本発明の抑制オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有してよい。抑制オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）により構成されてよく、これは、リボース糖部分の、２’炭素と４’炭素との間に追加の架橋を含む修飾リボヌクレオチドであり、ロックドコンフォメーションをもたらして、ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドの熱安定性を高める。あるいは、抑制オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでよく、これは、糖−ホスフェート骨格よりもむしろペプチドベースの骨格を含む。オリゴヌクレオチドが含んでよい他の化学修飾として、糖修飾（Ｔ−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾等）、および骨格修飾（１つまたは複数のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート結合等）が挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドの安定性を高め、かつ有効性を向上させる他の修飾（米国特許第６８３８２８３号明細書に記載されるもの等）が、当該技術において知られており、本発明の方法における使用に適している。
【００３２】
このようなオリゴヌクレオチド抑制剤は、当該技術において知られている技術によって設計および合成され得る。多くの場合、合成ｍｉＲＮＡ抑制剤の設計では、成熟ｍｉＲＮＡ（標的部位）の逆相補体が組み込まれ、かつ化学的修飾がなされて、結合親和性が高められ、かつ核酸分解に対する耐性が付与される。細胞に送達されると、内在性成熟ｍｉＲＮＡの、抑制剤の相補的合成標的部位への結合が不可逆的であると考えられるので、抑制剤は、内在性ｍｉＲＮＡを封鎖して、正常に機能させなくすると推定される。ｍｉＲ−２１の抑制オリゴヌクレオチドは市販されている。
【００３３】
好ましくは、本発明に従う抑制オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−２１配列（配列番号１）を標的としているが、プレ−ｍｉＲ−２１を標的としてもよい。
【００３４】
一部の実施形態において、抑制オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２１配列に少なくとも部分的に、または実質的に相補的である配列を含む。本発明において、ｍｉＲ−２１に「部分的に相補的」であるオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドが、前記ｍｉＲ−２１配列に、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であることを意味する。「実質的に相補的」とは、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２１配列に、約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であることを意味する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２１に１００％相補的である配列を含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に１００％相補的である配列を含む。
【００３５】
好ましくは、本発明において使用されるｍｉＲ−２１抑制オリゴヌクレオチドは、小さな一本鎖ＲＮＡ、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
【００３６】
特定の実施形態において、ｍｉＲ−２１抑制オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２１に対する小さな一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、好ましくは塩基が修飾されている（すなわち２’−ＯＨ−メチルリボース類似体である）（ｍｉｒｍａｓｋとしても知られている）。この小さな一本鎖ＲＮＡは、ｍｉＲ−２１配列に、少なくとも部分的に相補的であるが、好ましくは、実質的に相補的であり、または１００％相補的であり、多くの場合、Ａｇｏ２の開裂部位に誤対合し、またはある種の塩基修飾を有して、Ａｇｏ２開裂を抑制する。Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２（またはＡｇｏ２）は、ＲＩＳＣ機能に関与するタンパク質であり、ｍｉＲＮＡ誘導型サイレンシングにとって不可欠である。小さな一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含んで、部分的または全ホスホロチオエート骨格をもたらしてもよい。
【００３７】
別の特定の実施形態において、ｍｉＲ−２１抑制オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ、または部分的二本鎖ＲＮＡ（小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等）である。好ましい実施形態において、ｍｉＲ−２１抑制剤はｓｈＲＮＡである。ｍｉＲ−２１ヘアピン抑制剤は、両側面にヘアピン配列が位置する、成熟ｍｉＲ−２１（配列番号１）の逆相補体配列を含む完全な２’−Ｏ−メチル化分子である。特定のｍｉＲＮＡに対するｓｈＲＮＡの製造は、当該技術において知られている。ヘアピンは通常、ポリピリミジン（８Ｙｈｐ＋ＲＣ＋８Ｙｈｐ）配列によって形成され、テトラヌクレオチドループを伴う８塩基対（ｂｐ）ステムからなる（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．「Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＲＩＳＣ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」．ＲＮＡ，２００７，ｖｏｌ．１３，ｐ．７２３−３０．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」．Ｓｉｌｅｎｃｅ，２０１０，ｖｏｌ．１，ｐ．１０）。細胞に送達されると、内在性成熟ｍｉＲＮＡの、相補的合成標的部位への結合が不可逆的であるので、抑制剤は、内在性ｍｉＲＮＡを封鎖して、そのＲＩＳＣにおける機能をブロックする。ｍｉＲ−２１に対するｓｈＲＮＡは市販されている。
【００３８】
インビボ送達および安定性を促進するために、抑制オリゴヌクレオチドは、その３’末端にて、コレステロール、または他の安定化および／もしくは送達部分に結合してよい。
【００３９】
治療上の処置用のＲＮＡベースの化合物が、化学的に合成され、さらに生物体に投与されてよい。あるいは、発現ベクターとして投与されて、細胞がＲＮＡベースの化合物を合成してよい。本発明において、用語「ベクター」は、注目する核酸を細胞の内部に送達するために用いられ得る組成物を指す。ベクターの非限定的な例として、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが挙げられる。本発明の目的のために、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、および「ベクター」は、一般的な説明のための意味で、本発明の用途を示すために互換的に用いられるものであり、本発明を限定することを意図していない。
【００４０】
従って、別の実施形態において、発現ベクターが、ｍｉＲ−２１の抑制剤を対象の筋組織に送達するために用いられてよい。多数のベクターが当該技術において知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。発現構築物が、生細胞において複製されてよく、または、合成的に作られてよい。ｍｉＲ−２１の抑制剤を発現する発現ベクターは通常、抑制オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能なように結合されるプロモーターを含む。本明細書中で用いられるように、オリゴヌクレオチドを指していう用語「機能可能なように結合」、または「転写制御下で」は、プロモーターが、オリゴヌクレオチドに関して正しい位置および方向にあって、前記オリゴヌクレオチドの、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始および発現を制御することを意味する。用語「プロモーター」は、細胞の合成機構によって、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指し、オリゴヌクレオチドの特異的な転写を開始するのに必要とされるものである。
【００４１】
本発明の第２態様は、ＭＤおよび／またはＭＤ様の筋障害の治療における使用のための医薬組成物であって、上で開示されるｍｉＲ−２１抑制剤を含む医薬組成物を提供する。従って、本発明に従う医薬組成物は、有効量のｍｉＲ−２１抑制剤を、医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体と共に含む。本発明の医薬組成物はまた、１つまたは複数の付加的な活性成分を含んでもよい。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＭＤおよび／またはＭＤ様の筋障害の治療における使用のためのものであり、治療は、骨格筋の再生を含む。本発明の医薬組成物により治療され得る好ましいＭＤとして、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、およびエメリー−ドライフス型筋ジストロフィーがある。好ましい実施形態において、治療され得るＭＤはＤＭＤである。
【００４３】
本発明のｍｉＲ−２１抑制剤、およびこれを含む医薬組成物は、標的器官、組織または細胞型への送達に適した、当業者に知られている任意の方法によって投与されてよい。例えば、本発明のある実施形態において、組成物は、非経口投与（静脈内注射、動脈内注射、心膜内注射、または皮下注射等）によって、または組織内（例えば、筋肉内）への直接注射によって、投与されてよい。他の実施形態において、ｍｉＲ−２１抑制剤を含む医薬組成物は、経口、経皮、腹膜内、皮下、持続性放出、制御放出、遅延放出、坐薬、または舌下投与経路によって投与されてよい。本発明の組成物はまた、カテーテル系によって投与されてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、筋肉内に投与されるので、筋肉内投与に適した形態に製剤化されてよい。筋肉内投与に適した製剤形態として、溶液、懸濁液、分散系、エマルジョン、油剤等が挙げられる。
【００４５】
ｍｉＲ−２１抑制剤を含む医薬組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体と併せて製剤化される。本明細書中で用いられる用語「医薬的に許容可能な」は、堅実な医学判断の範囲内で、ヒトを含む動物に投与されるのに適しており、とりわけ、過度の毒性も、不和合性も、不安定性も、アレルギー反応もない、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。また、医薬的に許容可能な担体、賦形剤等もそれぞれ、医薬製剤の他の成分と和合性であるという意味において、許容可能でなければならない。
【００４６】
本発明の組成物において用いられる医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体は、遺伝子治療に特に適しており、好ましくは、ｍｉＲ−２１抑制剤の安定性および生体利用性を高めるように設計される。
【００４７】
一実施形態において、本発明の組成物は、非経口投与、好ましくは筋肉内投与に適した賦形剤および／またはビヒクルを含む。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、および固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとして、流体の栄養性補液、電解質補液（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等が挙げられる。例として、水および油等の滅菌した液体があり、界面活性剤および他の医薬的に許容可能なアジュバントが添加されたりされなかったりする。概して、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、ならびにグリコール（プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等）が、特に注射可能な溶液にとって、好ましい液体の担体である。
【００４８】
提供される医薬組成物は、制御放出組成物、すなわち、投与後の一定期間にわたって活性化合物が放出される組成物であってよい。例えば、薬剤は、静脈内注入、移植性浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与モードを用いて投与されてよい。あるいは、組成物は、即時放出組成物、すなわち、投与の直後に活性化合物が放出される組成物である。
【００４９】
組成物はまた、別の実施形態において、活性材料の、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等）の粒状調製物内または同粒状調製物上への、あるいはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への組込みを含む。このような組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を与えることになる。ｍｉＲ−２１抑制剤を含むリポソームは、本発明に従う使用のためのｍｉＲ−２１抑制剤の送達に特に適している。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、ＭＤおよび／またはＭＤ様の筋障害の治療用の、唯一の活性成分としてのｍｉＲ−２１抑制剤の使用を含む。しかしながら、本発明の範囲内に含まれるのはまた、１つまたは複数の付加的な治療剤と組み合わせたｍｉＲ−２１抑制剤の使用でもある。特定の実施形態において、これらの付加的な薬剤は、ＭＤまたはＭＤ様の筋障害を治療するのに適切である。好ましくは、付加的な薬剤は、ジストロフィンを代替もしくは補償するために、または線維症を改善するために、設計される。当業者にとっては明らかであろうが、ｍｉＲ−２１抑制剤の、１つまたは複数の付加的な活性成分との組合せは、活性成分が単一の医薬組成物において用いられる場合だけでなく、２つの異なる組成物において用いられる場合も有効であり得、ある期間の後に同時に、経時的に、または別々に投与されてよい。さらに、当業者であれば、ｍｉＲ−２１抑制剤は、ＭＤまたはＭＤ様の筋障害を治療するために、他の活性剤と共に用いられるよう処方されてよいことが理解されるであろう。
【００５１】
明細書および特許請求の範囲を通して、用語「含む」、およびこの用語の変形は、他の技術的特徴、付加物、構成要素またはステップを除外することを意図していない。さらに、用語「含む」およびその変形は、表現「からなる」を含む。本発明の付加的な目標、利点および特徴が、明細書を検討すれば当業者に明らかとなるであろうし、または本発明の実施によって知ることもできる。以下の実施例および図面は説明のために与えられるものであり、本発明を限定することを意図していない。さらに、本発明は、本明細書中で記載される特定の実施形態および好ましい実施形態の全ての可能な組合せを包含するものである。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は説明のために与えられるものであり、本発明を限定することを意図していない。
【００５３】
材料および方法
１．動物モデル
野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）およびｍｄｘ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ジャクソン研究所（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。マウスをバルセロナＰＲＢＢの動物施設に入れて、温湿度が一定であり、標準的な食餌を与える従来の条件下に置いた。最も広く使われている筋ジストロフィーのモデルの１つであるｍｄｘ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスで主に実験を行った。一部の実験において、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、さらなる内部対照として用いた。全動物実験は、カタロニア政府動物実験委員会の承認を得た。
【００５４】
２．ＤＭＤ患者の研究
組織病理学的調査のための試料調製を、ＤＭＤ患者（６から１２歳の７人の患者）および類似の年齢（９から１５歳）の健康なヒト対照で実行した。筋肉サンプルを、標準的な四頭筋バイオプシーによって得た。
【００５５】
３．インビボｍｉＲＮＡ治療
５μｇの抗ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１模倣体、またはスクランブル対照オリゴｍｉＲ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、１０μｌの生理食塩水中に溶解して、ｍｄｘマウスの前脛骨筋または腓腹筋内に筋肉内注射した。抗ｍｉＲ−２１は、ｍｉＲ−２１配列（配列番号１）を有するｍｉＲＮＡを抑制するように設計したｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドである。従って、抑制剤はこの配列の完全な相補体を含む。ｍｉＲ−２１模倣体は、ｍｉＲ−２１にかなり類似し、かつｍｉＲ−２１機能を実行するオリゴヌクレオチドである。スクランブル対照オリゴｍｉＲは、ｍｉＲ−２１も他の既知のいかなる配列も抑制しないように、ナンセンス配列を含むｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドである。注目すべきことに、マウスおよびヒトの成熟ｍｉＲ−２１配列は、１００％の同一性を有する。形態的調査を、損傷／治療後の指定日に実行した。
【００５６】
４．組織学
前脛骨筋、腓腹筋または横隔膜筋を単離して、液体窒素冷却イソペンタン中に凍結、またはパラフィン中に包埋した。凍結切片（１０μｍの厚さ）を、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ，ＳＩＧＭＡ）またはＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。免疫組織化学的カラー写真用のＤＦＣ３００ＦＸカメラを備え、Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏ  １０×／０．３および２０×／０．７５の対物レンズを用いる顕微鏡ＤＭＲ６０００Ｂ（Ｌｅｉｃａ）、ならびに最大光学切片により、デジタル画像を得た。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４（Ａｄｏｂｅ）で画像を構成および編集し、輝度およびコントラスト調節を全画像に適用することで、バックグラウンドを低減した。パブリックドメインコンピュータ支援画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）により、線維性組織の画像分析を実行した。線維サイズ測定を実行した（Ｓｕｅｌｖｅｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．「ｕＰＡ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ＭＤＸ  ｍｉｃｅ」．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７，ｖｏｌ．１７８，ｐ．１０３９−１０５１に記載されるようにした）。
【００５７】
５．ｍｉＲＮＡ発現の定量化
ｍｉＲＮＡフラクションを含む全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，ｒｅｆ．２１７００４）を用いて、メーカの使用説明書に従って単離した。ｍｉＲＮＡ−２１の定量化を、ｍｉＲＮＡ用のＴａｑｍａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｉｓｔｅｍｓ  ｍｍｕ−ｍｉＲ−２１，ｒｅｆ．００２４９３）およびＴａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｉｓｔｅｍｓ，ｒｅｆ．４３５２０４２）を用いる定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、メーカの使用説明書に従って実行した。ｍｉＲ−Ｕ６ＢをハウスキーピングｍｉＲＮＡとして用いて、ｍｉＲＮＡレベルを定量化した。
【００５８】
６．筋線維症の特性評価
筋肉中のコラーゲン量の生化学的定量化を実行した（Ｌｏｐｅｚ−Ｄｅ  Ｌｅｏｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｒｏｊｋｉｎｄ  Ｍ．「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ」．Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９８５，ｖｏｌ．３３，ｐ．７３７−７４３に従った）。また、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色後の筋線維症の組織学的特性評価も、前述の画像分析定量化によって行った。
【００５９】
７．握力アッセイ
２４ケ月齢のｍｄｘマウスの前肢握力を、スクランブル対照オリゴｍｉＲまたは抗ｍｉＲ−２１による１ケ月の治療後に、コンピュータ制御フォーストランスデューサー（Ｇｒｉｐ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｍｅｔｅｒ，Ｂｉｏｓｅｂ）を用いて、引張力（ニュートン，Ｎ）として測定した。各試験において、機械に連結した金属棒をマウスが握れるようにして、研究者は、発生したピーク引張力をデジタルゲージが記録するまで、マウスを尾部によりゆっくり引っ張った。各動物につき、試験あたり１０測定を３試験実行し、試験間に数分の休息期間を置いた。同じ測定を次の日も繰り返して１０日間行い、各実験で最も高い値を用いた。マウスの各群の平均引張力（ニュートン，Ｎ）を、トランスデューサーによって提供した。
【００６０】
８．統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを全統計分析に用いた。記述的統計量を計算するために、各群の対応する時点由来の結果を平均して用いた。一元配置ＡＮＯＶＡ、およびチューキー事後検定またはダネット事後検定を、各時点での群間の多重比較、および全ての可能なペアワイズ比較に用いた。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍである。有意性をＰ≦０．０５で認めた。
【００６１】
結果
以下の結果は、ｍｉＲ−２１が、ＭＤの発症および進行の間の筋肉退化／再生のプロセスの調節に関与することを証明している。また、干渉ＲＮＡ技術によるｍｉＲ−２１の抑制が、ＤＭＤの動物モデルにおいて、組織再生を導き、そして線維症プロセスを改善することもわかった。
【００６２】
１．ｍｉＲ−２１が、ＭＤ（ｍｄｘマウスおよびＤＭＤ患者）において上方調節されている
ｍｉＲ−２１の発現について、ヒトＤＭＤ患者の、およびｍｄｘマウス（ＤＭＤの動物モデルである）のジストロフィー筋において、調節不全がある（増大する）ことがわかった（図１Ａおよび図２参照）。その上、筋組織におけるｍｉＲ−２１発現の上昇が、ｍｄｘマウス、およびヒトＤＭＤ患者のジストロフィー筋におけるコラーゲン産生と対応することから（図１Ｂ、図１Ｃおよび図３）、進行型筋疾患が示される。
【００６３】
２．ｍｉＲ−２１の抑制により、ｍｄｘでの再生が向上し、線維症が和らぐ
広範な研究の結果として、本発明者らは、特に長期の重篤な筋障害において、ｍｉＲ−２１が、筋組織修復を増進させるための治療介入に良好な標的であることを見出した。従って、ｍｉＲ−２１の調整は、ＤＭＤ患者に有効な治療法であり得る。
【００６４】
このことと一貫して、抗ｍｉＲ−２１による治療により（スクランブルオリゴｍｉＲによる治療ではない）、２４ケ月齢ｍｄｘマウス（ｍｄｘ線維症が回復不能であると一般的に考えられる段階である）の肢筋肉の線維症が好転した（図４Ｂおよび図４Ｃ参照）。反対に、ｍｉＲ−２１模倣体の筋肉内投与によるｍｉＲ−２１の総過剰発現は、若齢ｍｄｘマウス（３ケ月齢）において線維症を早め、かつ悪化させた（図４Ａおよび図４Ｃ）。これらの結果は、ｍｉＲ−２１サイレンシングの、ＤＭＤの予防および治療有効性を示している。とりわけ、非常に高齢のｍｄｘジストロフィーマウスにおける１ケ月間のｍｉＲ−２１干渉によっても、筋肉退化が和らいだ（図５Ａ）。図は、線維症の減衰だけでなく、より重要なことに、筋線維適応度の予想外の回復を示している。
【００６５】
注目すべきことに、抗ｍｉＲ−２１による治療はまた、ｍｄｘマウスを機能的衰退から保護した。これは、握力試験で、肢の治療によって誘発された力が増強されていたことによって証明される（対照と比較して運動機能がより良好であったという指標となる（図５Ｂおよび図５Ｃ））。
【００６６】
ＤＭＤの進行型疾患段階で顕著な筋肉損傷を患う個体が、大多数の患者の代表であり、そして筋肉再生を有効に増進し、かつ筋線維症を和らげる治療法はこれまでに知られていないので、これらの結果は、疑う余地なく強い治療可能性を有するものである。
【図１Ａ】
2014519521.tif 000002
【図１Ｂ】
2014519521.tif 000003
【図１Ｃ】
2014519521.tif 000004
【図２】
2014519521.tif 000005
【図３Ａ】
2014519521.tif 000006
【図３Ｂ】
2014519521.tif 000007
【図４Ａ】
2014519521.tif 000008
【図４Ｂ】
2014519521.tif 000009
【図４Ｃ】
2014519521.tif 000010
【図５Ａ】
2014519521.tif 000011
【図５Ｂ】
2014519521.tif 000012
【図５Ｃ】
2014519521.tif 000013
【配列表】
2014519521000001.app
【国際調査報告】
2014519521.tif 000014
2014519521.tif 000015
2014519521.tif 000016
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