(57)【要約】  本発明は、とりわけ、鉄を含む組成物を細胞培養物に加えるステップを含む、細胞培養物における細胞密度、生存度および／または力価を増加させる方法を提供する。【図８】2014530620.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞培養工程を開始させるための細胞培養培地中の細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞培養工程の期間にわたって細胞培養培地中の鉄の濃度が増加するように、細胞培養工程中に、鉄を含む組成物を前記細胞培養培地に加えるステップと
を含む、細胞培養培地における細胞密度、生存度、および／または力価を増加させる方法。
【請求項２】
鉄を含む組成物が、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
鉄を含む組成物を細胞培養工程の０日目より後に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
鉄を含む組成物を細胞培養工程の１日目またはそれより後に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
鉄を含む組成物を細胞培養工程の３日目またはそれより後に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
鉄を含む組成物を細胞培養工程の６日目またはそれより後に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
鉄を含む組成物を細胞培養工程中の複数の時点で加える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
鉄を含む組成物の添加後の細胞培養培地中の鉄の濃度が１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
鉄を含む組成物の添加後の細胞培養培地中の鉄の濃度が３００μＭ〜１ｍＭの間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
鉄を含む組成物の添加後の細胞培養培地中の鉄の濃度が１ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、サル腎細胞、ヒト胚性腎臓系（２９３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ科動物腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、またはヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養工程が流加培養工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養工程が再流加培養工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養工程が灌流培養工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養工程が大スケール生産培養工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養培地の体積が少なくとも約５００Ｌである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養培地が加水分解物を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養培地が加水分解物を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が組換えタンパク質をコードしている遺伝子を保有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
組換えタンパク質が抗体またはその断片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体が抗ＩＬ−２２抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が抗ＧＤＦ−８抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗体がＭｙｏ２９である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
抗体が単一ドメイン抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
単一ドメイン抗体が抗ＴＮＦナノボディである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
組換えタンパク質が糖タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
組換えタンパク質が治療タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
治療タンパク質が、成長因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬品原体、ワクチン、酵素、またはＳｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（商標）（ＳＭＩＰ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組換えタンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項２１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２１から３１のいずれか一項に記載の方法に従って培養された細胞から産生された組換えタンパク質。
【請求項３３】
細胞培養工程の開始に続く１つまたは複数の時点で鉄を含む組成物を加えるステップを含む、細胞培養物において細胞死を防止または遅延させる方法。
【請求項３４】
細胞培養工程の開始に続く１つまたは複数の時点で鉄を含む組成物を加えるステップを含む、細胞培養物においてアポトーシスを阻害する方法。
【請求項３５】
鉄を含む組成物を０日目より後に加える、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
鉄を含む組成物を３日目より後に加える、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３７】
鉄を含む組成物を６日目に加える、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３８】
鉄を、細胞培養培地中の濃度が１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲となるような量で加える、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３９】
鉄を、細胞培養培地中の濃度が３００μＭ〜１ｍＭの間の範囲となるような量で加える、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４０】
鉄を、細胞培養培地中の濃度が１ｍＭとなるような量で加える、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４１】
細胞培養工程が流加培養工程である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４２】
細胞培養が再流加培養である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４３】
細胞培養が灌流培養である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４４】
細胞培養が大スケール生産培養である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４５】
細胞培養の体積が少なくとも約５００Ｌである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
鉄を含む組成物が、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せからなる群から選択される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）初期細胞培養培地を作製するための１つまたは複数の試薬と、
（ｂ）鉄を含む別個の組成物と、
（ｃ）細胞密度、生存度、および／または力価を増加させるために、細胞培養工程の期間中の１つまたは複数の時点で鉄を含む別個の組成物を初期細胞培養培地に加える指示と
を含む、細胞培養培地を作製するためのキット。
【請求項４８】
別個の組成物が、鉄濃度が初期細胞培養培地中で１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲となるような量である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
別個の組成物が、鉄濃度が少なくとも５００Ｌの細胞培養物中で１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲となるような量である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
別個の組成物が、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せからなる群から選択される、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
流加培養のための補助構成成分をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
再流加培養のための補助構成成分をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５３】
灌流培養のための補助構成成分をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５４】
補助構成成分が、ホルモンおよび／または他の成長因子、無機イオン、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素、アミノ酸、脂質、グルコースまたは他のエネルギー源、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項５１から５３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容が全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１１年１０月２１日に出願の米国仮出願第６１／５５０，０５８号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞培養における一般的な問題は培養終了時での細胞死であり、これは、とりわけ栄養素の枯渇、阻害剤の蓄積、および／または酸化的ストレスなどの様々な傷害によって引き起こされる場合がある。一般的に、および特に薬学的に関連性のあるタンパク質産物を発現させるために哺乳動物培養系を利用する者にとって、細胞培養工程の期間にわたって細胞生存度を維持するおよび／または細胞死を遅延させることは、大きな関心である。培地添加剤の使用および抗アポトーシス遺伝子の過剰発現など、いくつかの方法が細胞培養物の生存度を増加させるために用いられている。たとえば、Ａｒｄｅｎら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｉｔｅｒ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．、２００７年３月〜４月、２３（２）：５０６〜５１１、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、「Ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｐｏｎ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９９年１１月５日、６５（３）：２９８〜３０５、Ｂａｌｃａｒｃｅｌら、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１、第７６巻、１〜１０、Ｚａｎｇｈｉら、「Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｕｒａｍｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２０００、１６、３１９〜３２５、Ｓｉｍｐｓｏｎら、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｂｃｌ−２  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、１９９７、５４：１〜１６、Ｓｉｎｇｈら、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｂｃｌ−２．」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９６、５２：１６６〜１７５、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｕｌｔｓ．」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０００、第６７巻、５５５〜５６４、Ａｒｄｅｎら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ｕｓｉｎｇ  ＭＤＭ２  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔ���ｒｅｓ．」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００７、第９７巻、６０１〜６１４を参照されたい）。しかし、一部の事例では、培地添加剤の使用は細胞周期の進行を遅延させ、その結果、より低い細胞密度、したがってより低い生産性をもたらす場合がある。一部の培地添加剤は、増殖期中に細胞をアポトーシスから保護し得るが、死滅期中には有効ではない。さらに、ほとんどの培地添加剤は高価であり、大スケールの医薬品製造には実用的でない場合がある。抗アポトーシス遺伝子の過剰発現では、遺伝子の形質移入は難題であり、その効果は状況依存的であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、細胞生存度、密度および／または力価を増加させるために細胞培養を改善する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、鉄、特に高濃度の鉄を細胞培養培地に加えることで、他の利点の中でもとりわけ培養物の細胞密度、生存度および／または力価を顕著に改善することができるという予想外の発見を包含する。したがって、本発明は、細胞培養を改善するための有効であるが安価かつ容易な解決策を提供する。本発明は、長期細胞培養の終了時における生存度を改善するために特に有用である。
【０００５】
一態様では、本発明は、細胞培養工程を開始させるための細胞培養培地中の細胞（たとえば細胞培養工程の産物）を提供するステップと、細胞培養工程の期間にわたって細胞培養培地中の鉄の濃度が増加するように、細胞培養工程中に、鉄を含む組成物を前記細胞培養培地に加えるステップとを含む、細胞培養物における細胞密度、生存度、および／または力価を増加させる方法を提供する。
【０００６】
本発明によれば、鉄を含む組成物は様々な鉄含有化合物から選択され得る。一部の実施形態では、鉄を含有する組成物は、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せからなる群から選択される。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明による本発明の方法には、細胞培養工程の全体にわたる様々な時点で鉄を含む組成物を加えることが含まれる。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は０日目より後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は１日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は３日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は６日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は９日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は細胞培養工程中の複数の時点で加える。
【０００８】
一部の実施形態では、細胞培養培地中の鉄の濃度（たとえば鉄を含む組成物の１回または複数回の添加の後）は、１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲である。一部の実施形態では、細胞培養培地中の鉄の濃度は３００μＭ〜１ｍＭの間の範囲である。一部の実施形態では、細胞培養培地中の鉄の濃度は１ｍＭである。
【０００９】
様々な細胞種を本発明に従って使用し得る。たとえば、一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、サル腎細胞、ヒト胚性腎臓系（２９３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ科動物腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、またはヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）から選択される。一部の実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
一部の実施形態では、細胞培養工程は流加培養工程である。一部の実施形態では、細胞培養工程は再流加（ｂａｔｃｈ−ｒｅｆｅｅｄ）培養工程である。一部の実施形態では、細胞培養工程は灌流培養工程である。一部の実施形態では、細胞培養工程は大スケール生産培養工程である。一部の実施形態では、細胞培養培地の体積は少なくとも約５００Ｌである。一部の実施形態では、細胞培養は振盪フラスコ中で実施する。
【００１１】
一部の実施形態では、細胞培養物の密度、生存度および／または力価を改善するために補助タンパク質を加える。一部の実施形態では、細胞培養培地は加水分解物を含有しない。一部の実施形態では、細胞培養培地は加水分解物を含有する。
【００１２】
一部の実施形態では、細胞は、組換えタンパク質をコードしている遺伝子を保有する。一部の実施形態では、組換えタンパク質は抗体またはその断片である。一部の実施形態では、抗体は抗ＩＬ−２２抗体である。一部の実施形態では、抗体は抗ＧＤＦ８抗体である。一部の実施形態では、抗体はＭｙｏ２９抗体である。一部の実施形態では、抗体は単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は抗ＴＮＦナノボディである。一部の実施形態では、組換えタンパク質は糖タンパク質である。一部の実施形態では、組換えタンパク質は治療タンパク質である。一部の実施形態では、治療タンパク質は、抗体、成長因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬品原体、ワクチン、酵素、またはＳｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（商標）（ＳＭＩＰ）である。一部の実施形態では、本明細書中に記載の本発明の方法は、組換えタンパク質を精製するステップをさらに含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の本発明の方法に従って培養した細胞から産生された組換えタンパク質を提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、細胞培養工程の開始に続く１つまたは複数の時点で鉄を含む組成物を加えることによって、細胞培養物において細胞死を防止または遅延させる方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、細胞培養工程の開始に続く１つまたは複数の時点で鉄を含む組成物を加えることによって、細胞培養物においてアポトーシスを阻害する方法を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、鉄を含む組成物は０日目より後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は３日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は６日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は９日目またはそれより後に加える。
【００１７】
一部の実施形態では、鉄は、細胞培養培地中の濃度が１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲となるような量で加える。一部の実施形態では、鉄は、細胞培養培地中の濃度が３００μＭ〜１ｍＭの間の範囲となるような量で加える。一部の実施形態では、鉄は、細胞培養培地中の濃度が１ｍＭとなるような量で加える。
【００１８】
一部の実施形態では、細胞培養は流加培養である。一部の実施形態では、細胞培養は再流加培養である。一部の実施形態では、細胞培養は灌流培養である。一部の実施形態では、細胞培養は大スケール生産培養である。一部の実施形態では、細胞培養の体積は少なくとも約５００Ｌである。一部の実施形態では、細胞培養は振盪フラスコ中で実施する。
【００１９】
一部の実施形態では、鉄を含む組成物は、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せからなる群から選択される。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、とりわけ、初期細胞培養培地を作製するための１つまたは複数の試薬と、鉄を含む別個の組成物とを含む、細胞培養培地を作製するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、たとえば細胞密度、生存度、および／または力価を増加させるために、細胞培養工程の期間中の１つまたは複数の時点で鉄を含む別個の組成物を初期細胞培養培地に加える指示を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、鉄を含む別個の組成物は、鉄濃度が初期細胞培養培地中で１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲となるような量である。一部の実施形態では、別個の組成物は、鉄濃度が少なくとも５００Ｌ細胞培養物中で１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲となるような量である。
【００２２】
一部の実施形態では、別個の組成物は、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せからなる群から選択される。
【００２３】
一部の実施形態では、キットは、流加培養のための補助構成成分をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、再流加培養のための補助構成成分をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、灌流培養のための補助構成成分をさらに含む。一部の実施形態では、補助構成成分は、ホルモンおよび／または他の成長因子、無機イオン、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素、アミノ酸、脂質、グルコースまたは他のエネルギー源、ならびにその組合せからなる群から選択される。
【００２４】
本出願中では、「または」の使用は、別段に記述しない限りは「および／または」を意味する。本出願中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのこの用語の変形は、他の添加剤、構成成分、整数またはステップを排除することを意図しない。本明細書中で使用する用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、均等物として使用する。約（ａｂｏｕｔ／ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）を伴ってまたは伴わずに本出願中で使用されているすべての数字は、関連分野技術者によって理解される任意の正常変動をカバーすることを意味する。特定の実施形態では、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、別段に記述しない限りは、または他の様式で内容から明白でない限りは（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記述した参照値から両方向に（それよりも大きいまたは小さい）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内にある値の範囲をいう。
【００２５】
本発明の他の特長、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかである。しかし、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えるものであり、限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変化および改変は当業者に明らかになるであろう。
【００２６】
図面は例示目的のみのものであり、限定するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】振盪フラスコ中のＣＨＯ細胞の細胞成長に対する、３日目より後の様々な用量の鉄添加の効果を例示する例示的なデータである。細胞成長は、所定の時点における生細胞密度（ＶＣＤ）（生細胞の総数×１０６個の細胞／ｍｌ）に関して測定する。
【図２】振盪フラスコ中のＣＨＯ細胞の生存度に対する、３日目より後の様々な用量の鉄添加の効果を例示する例示的なデータである。生存度は、所定の時点における培養中の（生細胞数）／（全細胞数）のパーセンテージとして測定する。
【図３】１６日目の振盪フラスコ中のＣＨＯ細胞の生存度に対する、３日目より後の様々な用量の鉄添加の効果を例示する例示的なデータである。生存度は、所定の時点における培養中の（生細胞数）／（全細胞数）のパーセンテージとして測定する。
【図４】振盪フラスコ中のＣＨＯ細胞の１６日目の抗体価に対する、３日目より後の様々な用量の鉄添加の効果を例示する例示的なデータである。抗体価は抗体のグラム数／１リットルの培養培地で測定する。抗体価の変化は、所定の時点における［抗体］鉄あり／［抗体］鉄なしの比として測定する。
【図５】細胞系２の培養工程に１ｍＭの鉄を加えた際の、１４日目の細胞密度、生存度、および力価の対照を超える改善を例示する例示的なデータである。細胞密度は、所定の時点における生細胞の総数×１０６個の細胞／ｍｌとして測定する。細胞密度の改善は、細胞密度鉄あり／細胞密度鉄なしの比として表す。生存度は、所定の時点における培養中の（生細胞数）／（全細胞数）のパーセンテージとして測定する。生存度の改善は、％生存度鉄あり／％生存度鉄なしの比として測定する。抗体価は抗体のグラム数／１リットルの培養培地で測定する。抗体価の変化は、所定の時点における［抗体］鉄あり／［抗体］鉄なしの比として測定する。
【図６】振盪フラスコ中での細胞系１の流加培養の１４日目の生存度および生細胞密度に対する、３日目より後のＦｅＳＯ４またはクエン酸Ｆｅの添加（６００μＭ）の効果を例示する例示的なデータである。生細胞密度は、所定の時点における生細胞の総数×１０６個の細胞／ｍｌとして測定する。生細胞密度の改善は、細胞密度鉄あり／細胞密度鉄なしの比として表す。
【図７】振盪フラスコ中での流加培養にて成長させた、ナノボディを産生するＣＨＯ細胞の細胞生存度に対する、６日目でのＦｅＳＯ４添加（１ｍＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図８】振盪フラスコ中での流加培養にて成長させた、ナノボディを産生するＣＨＯ細胞の力価に対する、６日目でのＦｅＳＯ４添加（１ｍＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図９】振盪フラスコ中での流加培養にて成長させた、ナノボディを産生するＣＨＯ細胞の全体的な生産性に対する、６日目でのＦｅＳＯ４添加（１ｍＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図１０】振盪フラスコ中での流加培養にて成長させた、ナノボディを産生するＣＨＯ細胞による乳酸産生に対する、６日目でのＦｅＳＯ４添加（１ｍＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図１１】クローン２．８の振盪フラスコ中での流加培養の細胞密度に対する、ＦｅＳＯ４またはクエン酸Ｆｅの添加（６００μＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図１２】クローン２．８の振盪フラスコ中での流加培養の生存度に対する、ＦｅＳＯ４またはクエン酸Ｆｅの添加（６００μＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図１３】クローン２．８の振盪フラスコ中での流加培養の全体的な生産性に対する、ＦｅＳＯ４またはクエン酸Ｆｅの添加（６００μＭ）の効果を例示する例示的なデータである。
【図１４】振盪フラスコ中の細胞系１の３日目の生存度に対する、０日目での様々な用量の鉄添加の効果を例示する例示的なデータである。生存度は、所定の時点における培養中の（生細胞数）／（全細胞数）のパーセンテージとして測定する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、とりわけ、細胞培養工程の期間にわたる１つまたは複数の時点で鉄を含む組成物を加えることによって、生成物の細胞密度、生存度、および／または力価を増加させる方法および組成物を提供する。本発明には、細胞培養物に鉄を加えることで、細胞培養の終了時における細胞死を遅延させるおよび／または防止することができるという驚くべき発見が包含される。一部の実施形態では、細胞培養物に鉄を加えることで、細胞培養物中のアポトーシスを阻害することができる。
【００２９】
鉄は、哺乳動物細胞の成長のために重要な細胞培養培地の構成成分である。しかし、本発明より前では、低レベルの鉄は鉄が枯渇した際に細胞成長を阻害し得る一方で、高レベルの鉄は毒性（たとえば酸化的ストレスおよびフリーラジカルの形成）が原因で細胞成長を阻害し得ると考えられている。したがって、鉄の有益な性質と毒性の性質とのバランスが哺乳動物細胞の培養に重要であると考えられていた。本発明より前では、慣用の培地配合物は、細胞成長を十分に支持する一方で毒性がある鉄濃度レベル未満に保つために、低濃度の鉄を使用する。実施例セクションに記載されているように、本発明者らは、高いとみなされる濃度の鉄を含めた鉄を細胞培養物に加えることで、細胞培養物の細胞成長の改善および細胞死の遅延がもたらされ、その結果、他の利点のなかでもとりわけ、有意に増加した細胞密度、生存度および力価がもたらされることを予想外に発見した。そのような効果は、細胞系、スケール、生成物およびＦｅ源に依存しない。さらに、生成物の品質は高いＦｅ濃度によって影響を受けなかった。したがって、本発明は、改善された細胞培養のための、新しく対費用効果の高い手法を提供する。
【００３０】
本発明の様々な態様は以下のセクションに詳述されている。セクションの使用は本発明を限定することを意味しない。それぞれのセクションは本発明の任意の態様に適用することができる。しかし、当業者には、これらの実施形態への様々な改変は添付の特許請求の範囲内にあることが理解されよう。本発明の範囲を定義するのは特許請求の範囲およびその均等物であり、本発明の範囲は、特定の実施形態またはその説明によって限定されるものではなく、また限定されるべきではない。
【００３１】
鉄組成物
様々な鉄含有組成物を本発明に従って使用し得る。特定の実施形態では、鉄を含む組成物は、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびその組合せを含む群から選択される。
【００３２】
様々な濃度の鉄を本発明に従って使用し得る。典型的には、鉄は、「微量濃度」よりも高い濃度で培地中に提供する。本明細書中で使用する用語「微量濃度」とは、通常または容易に測定されるレベル未満であり得る濃度をいう。たとえば、化合物の微量レベルは、＜１０−５、＜１０−６、＜１０−７または＜１０−８Ｍであり得る。特定の実施形態では、鉄は、約１００μＭ〜５ｍＭの濃度（たとえば、約１００μＭ〜４．５ｍＭ、１００μＭ〜３．０ｍＭ、１００μＭ〜２．５ｍＭ、１００μＭ〜１．０ｍＭ、１００μＭ〜１．０ｍＭ、２００μＭ〜２．０ｍＭ、２００μＭ〜１．５ｍＭ、２００μＭ〜１．０ｍＭ、１５０μＭ〜４．５ｍＭ、１５０μＭ〜３．５ｍＭ、１５０μＭ〜２．５ｍＭ、１５０μＭ〜１．５ｍＭ、１５０μＭ〜１．０ｍＭ、２００μＭ〜１．５ｍＭ、２００μＭ〜１．０ｍＭ、２００μＭ〜２．５ｍＭ、３００μＭ〜２．５ｍＭ、３００μＭ〜１．５ｍＭ、３００μＭ〜２．０ｍＭ）で培地中に提供される。特定の実施形態では、鉄は、約１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ、８００μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、９５０μＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、もしくは５ｍＭの濃度、またはこれらの濃度内の任意の範囲で培地中に提供される。特定の実施形態では、鉄は約３００μＭ〜１ｍＭの間の濃度で培地中に提供される。一部の実施形態では、細胞培養培地中の鉄の濃度は細胞培養工程の期間にわたって増加させる。
【００３３】
また、本発明には、鉄を含む組成物は細胞培養工程中の任意の時点で培地中に提供し得るという発見も包含される。鉄を含む組成物は、培養培地中で所望の鉄濃度となるように、定期間にわたる１つまたは複数の時点で組成物を加えることによって加え得る。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は細胞培養工程の０日目またはそれより後に加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は０日目より後に加える。特定の実施形態では、鉄を含む組成物は、細胞培養工程（たとえば産生細胞培養工程）の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日目もしくはそれより後、または上記時点の任意の組合せで加える。一部の実施形態では、鉄を含む組成物は３日目またはそれより後に加える。
【００３４】
当業者は、培養する細胞の特徴、培養中の細胞によって産生される任意の生成物（たとえば抗体または組換えタンパク質）の特徴、細胞を成長させる培地中の他の構成成分の存在または非存在、および成長条件を含めた、その実験設計の特定の属性に基づいて、これらの本発明の範囲内の正確な鉄濃度および添加時間を選択できるであろう。たとえば、静置培養にて成長させた細胞は、撹拌培養にて成長させた細胞よりも多少至適に鉄を利用でき得る（たとえばＷＯ９４／０２５９２号を参照）。
【００３５】
細胞培養培地
本明細書中で使用する用語「培地」、「細胞培養培地」および「培養培地」とは、成長中の哺乳動物細胞を養う栄養素を含有する溶液をいう。典型的には、そのような溶液は、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに最小限の成長および／または生存のために細胞によって必要とされる微量元素を提供する。また、そのような溶液は、それだけには限定されないが、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、特定のイオン（ナトリウム、クロライド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物（たとえば鉄）、アミノ酸、脂質、ならびに／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含めた、成長および／または生存を最小限の割合を超えて増強させる補助構成成分も含有し得る。特定の実施形態では、培地は、細胞の生存および増殖に至適なｐＨおよび塩濃度に有利に配合されている。特定の実施形態では、培地は、細胞培養の開始後に添加される流加培地である。
【００３６】
様々な哺乳動物増殖培地を本発明に従って使用し得る。特定の実施形態では、細胞は、培地の構成成分が既知であり、かつ制御されている、様々な既知組成培地のうちの１つ中で成長させ得る。特定の実施形態では、細胞は、培地のすべての構成成分が既知であるわけではなく、かつ／または制御されているわけではない複合培地中で成長させ得る。
【００３７】
哺乳動物細胞培養用の既知組成増殖培地は、過去数十年間にわたって大規模に開発かつ公開されている。既知（ｄｅｆｉｎｅｄ）培地のすべての構成成分は十分に特徴づけられており、したがって、既知培地は血清または加水分解物などの複合添加剤を含有しない。初期の培地配合物は、タンパク質産生の懸念が少ないまたは懸念がない、細胞成長および生存度の維持を可能にするために開発された。より最近では、培地配合物は、生産性の高い組換えタンパク質産生細胞培養物を支持するという明白な目的をもって開発されている。
【００３８】
複合培地のすべての構成成分は十分に特徴づけられているわけではなく、したがって、複合培地は、とりわけ単純および／または複合炭素源、単純および／または複合窒素源、ならびに血清などの添加剤を含有し得る。一部の実施形態では、本発明に適した複合培地は、本明細書中に記載の既知培地の他の構成成分に加えて加水分解物などの添加剤を含有する。
【００３９】
一部の実施形態では、既知培地には、典型的にはおよそ５０個の化学物質が水中に既知の濃度で含まれる。そのほとんどはインスリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリンまたはＢＳＡなどの１つまたは複数の十分に特徴づけられたタンパク質も含有するが、他のものはタンパク質構成成分を全く必要とせず、したがって無タンパク質既知培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は以下の５つの広範な分類に分けられる：アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および整頓された分類に従わない雑分類。
【００４０】
細胞培養培地には、補助構成成分を補充してもよい。本明細書中で使用する用語「補助構成成分」とは、それだけには限定されないが、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、特定のイオン（ナトリウム、クロライド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、ならびに／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含めた、成長および／または生存を最小限の割合を超えて増強させる構成成分をいう。特定の実施形態では、補助構成成分は初期細胞培養物に加え得る。特定の実施形態では、補助構成成分は細胞培養の開始後に加え得る。
【００４１】
典型的には、微量元素とは、マイクロモル濃度以下のレベルで含まれる様々な無機塩をいう。たとえば、一般的に含まれる微量元素は亜鉛、セレン、銅などである。一部の実施形態では、鉄（二価鉄または三価鉄の塩）を微量元素として初期細胞培養培地中にマイクロモル濃度で含めることができる。上述のように、本発明は、細胞培養培地中の鉄濃度が微量よりも多くなる（たとえば、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、または１ｍＭよりも多くなる）ように、初期細胞培養培地中に存在する微量の鉄に追加で鉄を加えることを含む方法を提供する。また、マンガンもしばしば、二価陽イオン（ＭｎＣｌ２またはＭｎＳＯ４）としてナノモル濃度からマイクロモル濃度の範囲で微量元素のうちに含まれる。数々のより一般的でない微量元素は、通常はナノモル濃度で加える。
【００４２】
細胞
細胞培養しやすい任意の宿主細胞を本発明に従って利用し得る。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物である。本発明に従って使用し得る哺乳動物細胞の非限定的な例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ＃８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、オランダＬｅｉｄｅｎ）、ＳＶ４０によって形質転換させたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚性腎臓系（成長のために懸濁培養中でサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１、１９８０）、サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ科動物腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ならびにヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）が含まれる。
【００４３】
さらに、任意数の市販されているおよび市販されていないハイブリドーマ細胞系を本発明に従って利用し得る。本明細書中で使用する用語「ハイブリドーマ」とは、不死化細胞と抗体産生細胞との融合から生じる細胞または細胞の子孫をいう。生じるそのようなハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作製するために使用する個々の細胞は、それだけには限定されないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、およびヒトを含めた任意の哺乳動物源からのものであることができる。特定の実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト細胞とネズミ骨髄腫細胞系との間の融合の生成物である異種ハイブリッド骨髄腫融合の子孫を、続いて形質細胞と融合させた場合に生じる、トリオーマ細胞系である。特定の実施形態では、ハイブリドーマは、たとえばクアドローマなどの、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞系である（たとえばＭｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３０５３、１９８３を参照）。当業者は、ハイブリドーマ細胞系は異なる栄養要件を有し得るおよび／または至適な成長のために異なる培養条件を必要とし得ることを理解し、必要に応じて条件を改変できるであろう。
【００４４】
細胞培養方法
本明細書中で使用する用語「培養物」および「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および／または成長に適した条件下で培地中に懸濁された細胞集団をいう。当業者には明らかとなるように、特定の実施形態では、本明細書中で使用するこれらの用語とは、細胞集団と集団が懸濁された培地とを含む組合せをいう。特定の実施形態では、細胞培養物の細胞は哺乳動物細胞を含む。
【００４５】
本発明は、所望の工程（たとえば組換えタンパク質（たとえば抗体）の産生）に従順な任意の細胞培養方法と共に使用し得る。非限定的な例として、細胞はバッチまたは流加培養にて成長させてよく、その場合、組換えタンパク質（たとえば抗体）が十分に発現された後に培養を停止し、その後、発現されたタンパク質（たとえば抗体）を収穫する。あるいは、別の非限定的な例として、細胞は再流加または灌流培養にて成長させてよく、その場合、培養を停止せずに新しい栄養素および他の構成成分を定期的または連続的に培養に加え、その間に発現された組換えタンパク質（たとえば抗体）を定期的または連続的に収穫する。他の適切な方法（たとえばスピンチューブ培養）が当分野で知られており、本発明を実施するために使用することができる。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明に適した細胞培養は流加培養である。本明細書中で使用する用語「流加培養」とは、培養工程の開始に続く１つまたは複数の時点で追加の構成成分を培養物に提供する細胞培養方法をいう。そのような提供される構成成分は、典型的には、培養工程中に枯渇した、細胞のための栄養構成成分を含む。それに加えてまたはそれに代わって、そのような追加の構成成分には本明細書中に記載の補助構成成分が含まれ得る。特定の実施形態では、追加の構成成分は本明細書中に記載の流加培地中で提供する。流加培養は典型的にはある時点で停止し、培地中の細胞および／または構成成分を収穫し、任意選択で精製する。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明に適した細胞培養は再流加培養である。本明細書中で使用する用語「再流加培養」とは、接種後に細胞の一部分（たとえば、細胞の約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれより多く）を細胞培養物から取り出し、特定の期間（たとえば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間など）成長させる細胞培養方法をいう。典型的には、再流加培養物から取り出される細胞含有培地は等体積の新鮮な培地で置き換える。特定の実施形態では、追加の構成成分は本明細書中に記載の再供給培地中で提供する。再流加培養は、典型的には、培養容器（たとえばバイオリアクター）内での細胞培養物の拡大および維持を含む連続的な工程である。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明に適した細胞培養は灌流培養である。典型的には、灌流培養は、細胞保持システムの使用を介した連続的な新鮮な培養培地の導入および消費された培地の除去による、稼働体積の細胞培養培地の維持を含む。一部の実施形態では、細胞は、任意の利用可能な方法、たとえば、濾過、沈降、遠心分離、およびその組合せを使用して培養中に保ち得る。一部の実施形態では、灌流培養は長期間（たとえば、２週間、３週間、４週間、５週間、またはそれより長く）成長させることができる。
【００４９】
細胞は、従事者によって選択される任意の好都合な体積にて成長させ得る。たとえば、細胞は、数（ｆｅｗ）ミリリットルから数（ｓｅｖｅｒａｌ）リットルの体積範囲の小スケール反応器にて成長させ得る。あるいは、細胞は、少なくとも約１リットルから１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットルもしくはそれより多く、またはその間の任意の体積の体積範囲の市販の大スケールバイオリアクターにて成長させ得る。
【００５０】
細胞培養の温度は、細胞培養物が生存可能に保たれる温度範囲および高レベルの所望の生成物（たとえば組換えタンパク質または抗体）が産生される範囲に主に基づいて選択される。たとえば、細胞系１は約３７℃で良好に成長し、高力価の抗体を産生することができる。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は約２５℃〜４２℃の範囲内で良好に成長し、所望の生成物（たとえば組換えタンパク質または抗体）を産生することができるが、本開示によって教示される方法はこれらの温度に限定されない。特定の哺乳動物細胞は約３５℃〜４０℃の範囲内で良好に成長し、所望の生成物（たとえば組換えタンパク質または抗体）を産生することができる。特定の実施形態では、細胞培養物は、細胞培養工程中の１つまたは複数の時点で、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５℃の温度で成長させる。当業者は、細胞の特定の要求および従事者の特定の生成要件に応じて、細胞を成長させる適切な１つまたは複数の温度を選択できるであろう。細胞は、従事者の要求および細胞自体の要件に応じて、任意の期間の間成長させ得る。
【００５１】
培養物は、培養の期間にわたって１つまたは複数の温度シフトに供し得る。培養の温度をシフトさせる場合、温度シフトは比較的ゆるやかであり得る。たとえば、温度変化を完了するために数時間または数日間かかり得る。あるいは、温度シフトは比較的急激であり得る。温度は培養工程中に徐々に増加または減少させ得る。あるいは、温度は、培養工程中の様々な時点で、不連続な量で増加または減少させ得る。続く温度（または複数の温度）または温度範囲（または複数の温度範囲）は、最初または以前の温度（または複数の温度）または温度範囲（または複数の温度範囲）よりも低くても高くてもよい。当業者には、複数の不連続な温度シフトが本実施形態内に包含されることを理解されよう。たとえば、温度を（より高いまたは低い温度または温度範囲のどちらかに）１回シフトさせてよく、細胞をこの温度または温度範囲にて一定期間維持し、その後、温度を、以前の温度または温度範囲の温度または温度範囲よりも高いまたは低いもののどちらかであり得る新しい温度または温度範囲へと再度シフトさせてよい。それぞれの不連続なシフト後の培養物の温度は一定であり得るか、または特定の温度範囲内に維持され得る。
【００５２】
特定の実施形態では、細胞培養物の細胞密度、生存度、および／または力価を決定する。本明細書中で使用する用語「細胞密度」とは、所定体積の培地中に存在する細胞数をいう。本明細書中で使用する用語「細胞生存度」とは、所定の培養条件または実験変動の組の下で生存する培養中の細胞の能力をいう。また、本明細書中で使用するこの用語は、特定の時点における培養物中の生死細胞の総数との関連で、その時点で生きている細胞の部分もいう。当業者には、細胞生存度を決定するための多くの方法のうちの１つが本発明に包含されていることを理解されよう。たとえば、細胞生存度を決定するために、生細胞の膜は通過しないが、死滅したまたは瀕死の細胞の破壊された膜は通過することができる色素（たとえばトリパンブルー）を使用し得る。様々な培養条件（たとえば鉄濃度または培養期間）に供された培養物の細胞生存度を決定し、互いに比較して、そのような培養物の至適な成長条件を決定し得る。本明細書中で使用する用語「力価」とは、たとえば、所定の量の培地体積中の哺乳動物細胞培養物によって産生された、組換え発現させたタンパク質または抗体の総量をいう。力価は、典型的には、１ミリリットルの培地あたりのタンパク質、たとえば抗体のミリグラム数の単位で表す。
【００５３】
特定の実施形態では、従事者の要求によって決定される所望の細胞密度、生存度、および／または力価に達した際、バッチおよび流加反応を停止させる。非限定的な例として、細胞が最大生細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントに達した際に培養を停止させ得る。それに加えてまたはそれに代わって、バッチおよび流加反応は、乳酸およびアンモニウムなどの代謝老廃物が過剰に蓄積される前に停止させ得る。一部の実施形態では、バッチおよび流加反応は、老廃物の蓄積（たとえば乳酸および／またはアンモニウム）が培養培地１Ｌあたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｇまたはそれよりも高くに達した際に停止させ得る。
【００５４】
特定の事例では、続く産生期中において、細胞によって枯渇または代謝された栄養素または他の培地構成成分を細胞培養物に補充することが有益であり得る。非限定的な例として、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、無機イオン（たとえば、ナトリウム、クロライド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素、微量濃度よりも高いレベルの無機化合物（たとえば鉄）、アミノ酸、脂質、またはグルコースもしくは他のエネルギー源を細胞培養物に補充することが有益であり得る。そのような補助構成成分は細胞培養物に一度に加えてもよく、またはこれらを一連の添加にて細胞培養物に提供してもよい。
【００５５】
当業者は、それだけには限定されないが、成長速度、細胞生存度、細胞培養物の最終細胞密度、乳酸およびアンモニウムなどの有害な代謝副産物の最終濃度、所望の生成物（たとえば組換えタンパク質もしくは抗体）の最終力価、またはこれらの任意の組合せを含めた細胞培養物の特定の特徴を最適化するための特定の細胞培養条件、あるいは従事者によって重要とみなされる他の条件をあつらえることができるであろう。
【００５６】
タンパク質の発現
上述のように、多くの場合において、高レベルの所望の生成物（たとえば組換えタンパク質または抗体）を産生させるために細胞を選択または操作する。しばしば、高レベルの組換えタンパク質を産生させるために、たとえば、目的タンパク質をコードしている遺伝子の導入によって、および／またはその遺伝子（内在性のものであれ導入されたものであれ）の発現を調節する遺伝子制御因子の導入によって、細胞を人の手によって操作する。
【００５７】
特定のタンパク質は、細胞成長、細胞生存度、または、最終的に目的タンパク質の産生を何らかの様式で制限する細胞の他の何らかの特徴に対して有害な効果を有し得る。特定のタンパク質を発現するように操作された１つの特定の種類の細胞の集団の中でさえも、細胞集団内のばらつきが存在して、特定の個々の細胞がより良好に成長する、目的タンパク質をより多く産生する、またはより高い活性レベル（たとえば酵素活性）のタンパク質を産生する。特定の実施形態では、細胞系は、細胞を培養するために選択された特定の条件下での頑強な成長のために、従事者によって経験的に選択される。一部の実施形態では、特定のタンパク質を発現するように操作された個々の細胞は、細胞成長、最終細胞密度、パーセント細胞生存度、発現されたタンパク質の力価もしくはこれらの任意の組合せ、または従事者によって重要とみなされる任意の他の条件に基づいて、大スケール生産のために選択される。
【００５８】
宿主細胞中で発現可能な任意のタンパク質を本教示に従って産生させ得る。本明細書中で使用する用語「宿主細胞」とは、本明細書中に記載の目的タンパク質を産生するように本発明に従って操作されている細胞をいう。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。タンパク質は、宿主細胞に内在性の遺伝子から、または宿主細胞内に導入した異種遺伝子から発現させ得る。タンパク質は、自然に存在するものであり得るか、または人の手によって操作または選択された配列を有し得る。
【００５９】
本発明に従って望ましく発現させ得るタンパク質は、多くの場合は興味深いまたは有用な生物学的または化学的活性に基づいて選択される。たとえば、本発明は、任意の薬学的または商業的に関連性のある酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現させるために用い得る。一部の実施形態では、培養中の細胞によって発現されるタンパク質は、抗体もしくはその断片、ナノボディ、単一ドメイン抗体、糖タンパク質、治療タンパク質、成長因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬品原体、ワクチン、酵素、またはＳｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（商標）（ＳＭＩＰ）から選択される。本発明に従って産生させることができるタンパク質のリストは単に例示的な性質のものであり、限定する列挙であることを意図しない。当業者は、任意のタンパク質を本発明に従って発現させ得ることを理解し、また、産生させる特定のタンパク質を自身の特定の要求に基づいて選択することができるであろう。
【００６０】
抗体
医薬品または他の市販の薬剤として現在使用されているまたは調査下にある抗体が多数あることを鑑みて、抗体の産生は本発明に従って特に興味深いものである。抗体は、特定の抗原と特異的に結合する能力を有するタンパク質である。宿主細胞中で発現させることができる任意の抗体を本発明に従って産生させ得る。一部の実施形態では、発現させる抗体はモノクローナル抗体である。
【００６１】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は複数の生物に由来するアミノ酸断片を含有する。キメラ抗体分子には、たとえば、マウス、ラット、または他の種の抗体からの抗原結合ドメインを、ヒト定常領域と共に含めることができる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１、６８５１（１９８５）、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、４５２（１９８５）、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。
【００６２】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、たとえば、リボソームディスプレイもしくはファージディスプレイライブラリの使用（たとえばＷｉｎｔｅｒら、米国特許第６，２９１，１５９号およびＫａｗａｓａｋｉ、米国特許第５，６５８，７５４号を参照）、またはネイティブ抗体遺伝子を失活させてヒト抗体遺伝子で機能的に置き換える一方で、ネイティブ免疫系の他の構成成分を無傷なまま残す、異種移植種の使用（たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、米国特許第６，６５７，１０３号を参照）によって誘導したヒト抗体である。
【００６３】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、アミノ酸残基の大多数がヒト抗体に由来しており、したがってヒト対象に送達した場合のすべての潜在的な免疫反応を最小限にする、キメラ抗体である。ヒト化抗体では、相補性決定領域中のアミノ酸残基は、少なくとも部分的に、所望の抗原特異性または親和性を与える非ヒト種からの残基で置き換えられている。そのような変更された免疫グロブリン分子は、当分野で知られているいくつかの技法のうちの任意のものによって作製することができ（たとえば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、７３０８〜７３１２（１９８３）、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４、７２７９（１９８３）、Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２、３〜１６（１９８２））、好ましくは、すべて本明細書中に参考として組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００号の教示）に従って作製する。ヒト化抗体は、たとえば、Ｓｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、２  Ｈｏｌｌｙ  Ｒｏａｄ、Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、英国によって商業的に生成することができる。さらなる参照には、すべて本明細書中に参考として組み込まれているＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。
【００６４】
一部の実施形態では、上述のモノクローナル、キメラ、またはヒト化抗体は、自然界ではどの種のどの抗体中においても自然に存在しないアミノ酸残基を含有し得る。これらの外来残基は、たとえば、モノクローナル、キメラまたはヒト化抗体に新規または改変された特異性、親和性またはエフェクター機能を与えるために利用することができる。一部の実施形態では、上述の抗体は、毒素、低分子量の細胞毒性薬物、生物学的応答調節物質、および放射性核種などの、全身性薬物療法のための薬物とコンジュゲートさせ得る（たとえばＫｕｎｚら、Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＵＳ２００４００８２７６４  Ａ１号を参照）。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明を使用して、アミロイド前駆体タンパク質のＡβ断片またはアミロイド溶菌斑の他の構成成分と特異的に結合し、アルツハイマー病を特徴づける脳におけるアミロイド溶菌斑の蓄積と闘うために有用な抗体を産生させる。（たとえば米国仮出願６０／６３６，６８４号を参照）。一部の実施形態では、本発明を使用して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体と特異的に結合する抗体を産生させる。一部の実施形態では、本発明を使用して抗ＣＤ２０抗体を産生させる。一部の実施形態では、本発明を使用して、ＴＮＦα、ＣＤ５２、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ３３、ＣＤ３、ＩＬ−２２、アルファ−４インテグリン、および／またはＩｇＥに対する抗体を産生させる。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の抗体は、標的細胞および／または癌などの増殖性障害内の組織上に発現される細胞表面抗原に向けられている。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体である。ルイスＹは、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４［Ｆｕｃα１→３］ＧｌｃＮａｃβ１→３Ｒの構造を有する炭水化物抗原である（Ａｂｅら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８、１１７９３〜１１７９７）。ルイスＹ抗原はヒト上皮腫瘍（乳房、結腸、肺、および前立腺のものを含む）の６０％〜９０％の表面上で発現され、その少なくとも４０％はこの抗原を過剰発現し、正常組織中では発現が制限されている。
【００６７】
Ｌｅｙを標的とし、腫瘍を有効に標的とするためには、抗原に対して排他的な特異性を有する抗体が理想的には必要である。したがって、好ましくは、本発明の抗ルイスＹ抗体は、１型構造（すなわち血液型のラクトシリーズ（ＬｅａおよびＬｅｂ））と交差反応せず、好ましくはＬｅｘおよびＨ−２型構造などの他の２型エピトープ（すなわちネオラクト構造）と結合しない。好ましい抗ルイスＹ抗体の一例はｈｕ３Ｓ１９３と命名されている（その全体で本明細書中に組み込まれている米国特許第６，３１０，１８５号、第６，５１８，４１５号、第５，８７４，０６０号を参照）。ヒト化抗体ｈｕ３Ｓ１９３（Ａｔｔｉａ，Ｍ．Ａ．ら、１７８７〜１８００）は、Ｌｅｙに対して並外れた特異性を有する、腺癌細胞に対して産生させたネズミモノクローナル抗体である３Ｓ１９３からのＣＤＲ移植によって作製された（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．、１２９５７〜１２９６１）。ｈｕ３Ｓ１９３は、Ｌｅｙに対する３Ｓ１９３の特異性を保持しているだけでなく、補体依存性細胞傷害（本明細書中で以降ＣＤＣと呼ぶ）および抗体依存性細胞性細胞傷害（本明細書中で以降ＡＤＣＣと呼ぶ）を媒介する能力も獲得している（Ａｔｔｉａ，Ｍ．Ａ．ら、１７８７〜１８００）。この抗体は、ヌードマウスにおいてＬｅｙを発現している異種移植片を標的とし、これは１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、または１８Ｆで標識したｈｕ３Ｓ１９３、および１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、または９０Ｙなどのキレート化剤を必要とする他の放射標識を用いた体内分布研究によって実証されている（Ｃｌａｒｋら、４８０４〜４８１１）。
【００６８】
一部の実施形態では、抗体は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２と称されるヒト抗ＧＤＦ−８抗体、ならびにそれに由来する抗体および抗原結合断片のうちの１つである。これらの抗体は、高い親和性で成熟ＧＤＦ−８と結合することができ、たとえばＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイによって実証されるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を阻害し、また、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害し得る。たとえばＶｅｌｄｍａｎら、米国特許出願第２００４０１４２３８２号を参照されたい。
【００６９】
受容体
医薬品および／または市販の薬剤として有効であると示されている別のポリペプチドクラスには受容体が含まれる。受容体は、典型的には、細胞外シグナル伝達リガンドを認識することによって機能する膜貫通糖タンパク質である。受容体は、典型的には、リガンド認識ドメインに加えてプロテインキナーゼドメインを有しており、これがリガンドと結合した際に標的細胞内分子をリン酸化することによってシグナル伝達経路を開始させ、これが細胞内での発生または代謝の変化をもたらす。一実施形態では、目的受容体は膜貫通および／または細胞内ドメイン（または複数のドメイン）を除去するために改変されており、その代わりにはＩｇ−ドメインが付着していてもよい。好ましい実施形態では、本発明に従って産生させる受容体は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＲＴＫファミリーには、数々の細胞種における様々な機能に重要な受容体が含まれる（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７：４３３〜４７８、１９８８、ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ、６１：２４３〜２５４、１９９０を参照）。ＲＴＫの非限定的な例には、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーのメンバー、表皮成長因子受容体（ＥＧＦ）ファミリーのメンバー、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、免疫グロブリンおよびＥＧＦ相同性ドメイン−１（ＴＩＥ−１）およびＴＩＥ−２受容体を有するチロシンキナーゼ（参考として本明細書中に組み込まれているＳａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３７６（６５３５）：７０〜７４（１９９５））、ならびにｃ−Ｍｅｔ受容体が含まれ、その一部は直接または間接的に血管形成を促進することが示唆されている（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２９：８９５〜８９８、１９９５）。ＲＴＫの他の非限定的な例には、胎児肝臓キナーゼ１（ＦＬＫ−１）（キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）（Ｔｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６：１６７７〜８３、１９９１）または血管内皮細胞成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）と呼ばれる場合がある）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）（ＤｅＶｒｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５、９８９〜９９１、１９９２、Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５：５１９〜５２４、１９９０）（血管内皮細胞成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）と呼ばれることがある）、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、およびＡｘｌが含まれる。当業者は、本発明に従って好ましく発現させることができる他の受容体を認識しているであろう。
【００７０】
一部の実施形態では、腫瘍壊死因子阻害剤を、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ受容体（ＴＮＦＲ−１、１９９１年３月２０日公開のＥＰ４１７，５６３号、およびＴＮＦＲ−２、１９９１年３月２０日公開のＥＰ４１７，０１４号）の形態で、本発明に従って発現させる（総説には、本明細書中に参考として組み込まれているＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、４７（１〜２）：１〜７（１９９５〜９６）を参照）。一実施形態によれば、腫瘍壊死因子阻害剤は可溶性ＴＮＦ受容体および好ましくはＴＮＦＲ−Ｉｇを含む。一部の実施形態では、本発明の好ましいＴＮＦ阻害剤はＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩの可溶形ならびに可溶性ＴＮＦ結合タンパク質である。別の実施形態では、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合はＴＮＦＲ：Ｆｃであり、この用語は本明細書中で使用した場合に「エタネルセプト」をいう。これは、ｐ７５ＴＮＦ−α受容体の細胞外部分の２つの分子の二量体であり、それぞれ分子はヒトＩｇＧ１の２３５個のアミノ酸のＦｃ部分からなる。
【００７１】
成長因子および他のシグナル伝達分子
医薬品および／または市販の薬剤として有効であると示されている別のポリペプチドクラスには、成長因子および他のシグナル伝達分子が含まれる。成長因子には、細胞によって分泌され、他の細胞上の受容体と結合してそれを活性化させ、レセプター細胞において代謝または発生の変化を開始させる糖タンパク質が含まれる。一実施形態では、目的タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインと抗体のＦｃ部分とを含むＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドである（たとえばＷｏｌｆｍａｎら、ＡｃｔＲＩＩＢ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｆｏｒ、ＵＳ２００４／０２２３９６６  Ａ１号を参照）。別の実施形態では、成長因子は改変ＧＤＦ−８プロペプチドであり得る（たとえばＷｏｌｆｍａｎら、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ＧＤＦ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ、ＵＳ２００３／０１０４４０６  Ａ１号を参照）。あるいは、目的タンパク質はフォリスタチン−ドメイン含有タンパク質であることができる（たとえばＨｉｌｌら、ＧＡＳＰ１：ａ  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＵＳ２００３／０１６２７１４  Ａ１号、Ｈｉｌｌら、ＧＡＳＰ１：ａ  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＵＳ２００５／０１０６１５４  Ａ１号、Ｈｉｌｌら、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＵＳ２００３／０１８０３０６  Ａ１号を参照）。
【００７２】
哺乳動物成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例には、サイトカイン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、またはＴＧＦ−ベータ５を含めたＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９などのＣＤタンパク質、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＴＬ）、たとえばＩＬ−１からＩＬ−１０、ＩＬ−１０スーパーファミリーサイトカイン（たとえば、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子などの凝固因子、タンパク質Ｃなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性剤、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化剤、ボンベシン、トロンビン、造血性成長因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）、ミュラー管抑制因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、あるいはＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子が含まれる。当業者は、本発明に従って発現させることができる他の成長因子またはシグナル伝達分子を認識しているであろう。
【００７３】
Ｇ−タンパク質共役型受容体
医薬品および／または市販の薬剤として有効であると示されている別のポリペプチドクラスには、成長因子および他のシグナル伝達分子が含まれる。Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、７つの膜貫通ドメインを有するタンパク質である。リガンドとＧＰＣＲとが結合した際、細胞内でシグナルが伝達され、この結果、細胞の生物学的または生理的特性の変化がもたらされる。
【００７４】
ＧＰＣＲは、Ｇ−タンパク質およびエフェクター（Ｇ−タンパク質によって変調される細胞内酵素およびチャネル）と共に、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力と連結させるモジュラーシグナル伝達系の構成成分である。これらの遺伝子および遺伝子産物は疾患の潜在的な原因物質である。
【００７５】
ロドプシン遺伝子およびＶ２バソプレシン受容体遺伝子中の特定の欠損は、様々な形態の常染色体優性および常染色体劣勢の網膜色素変性症、腎性尿崩症を引き起こすことが示されている。これらの受容体は、中枢神経系および末梢のどちらの生理的プロセスにおいても決定的な重要性をもつ。ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、現在２５０種類を超えるパラログ（異なる種からの同じ受容体であるオーソログに対して、遺伝子複製（または他の工程）によって生じる変異体を表す受容体）を含有する。このスーパーファミリーは以下の５つのファミリーへと分けることができる：ファミリーＩ：ロドプシンおよびベータ２−アドレナリン作動性受容体を典型とする受容体であり、現在２００個を超えるユニークなメンバーによって表されている、ファミリーＩＩ：最近特徴づけられた副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー、ファミリーＩＩＩ：哺乳動物における代謝型グルタミン酸受容体ファミリー、ファミリーＩＶ：ｃＡＭＰ受容体ファミリー、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の化学走性および発生に重要、ならびにファミリーＶ：ＳＴＥ２などの真菌接合フェロモン受容体。
【００７６】
ＧＰＣＲには、生体アミン、炎症の脂質メディエーター、ペプチドホルモン、および知覚シグナルメディエーターの受容体が含まれる。ＧＰＣＲは、受容体がその細胞外リガンドと結合した際に活性化される。リガンド−受容体の相互作用から生じるＧＰＣＲ中のコンホメーション変化は、ＧＰＣＲ細胞内ドメインに対するＧタンパク質の結合親和性に影響を与える。これにより、ＧＴＰが増強された親和性でＧタンパク質と結合することが可能となる。
【００７７】
ＧＴＰによるＧタンパク質の活性化は、Ｇタンパク質αサブユニットとアデニル酸シクラーゼまたは他の二次メッセンジャー分子ジェネレーターとの相互作用をもたらす。この相互作用はアデニル酸シクラーゼの活性、したがって二次メッセンジャー分子ｃＡＭＰの産生を調節する。ｃＡＭＰは他の細胞内タンパク質のリン酸化および活性化を調節する。あるいは、ｃＧＭＰまたはエイコサノイドなどの他の二次メッセンジャー分子の細胞レベルがＧＰＣＲの活性によって上方調節または下方調節され得る。Ｇタンパク質ａサブユニットはＧＴＰａｓｅによるＧＴＰの加水分解によって失活化され、α、β、およびγサブユニットが再会合する。その後、このヘテロ三量体Ｇタンパク質はアデニル酸シクラーゼまたは他の二次メッセンジャー分子ジェネレーターから解離する。また、ＧＰＣＲの活性は細胞内および細胞外のドメインまたはループのリン酸化によっても調節され得る。
【００７８】
グルタミン酸受容体は神経伝達において重要なＧＰＣＲ群である。グルタミン酸はＣＮＳにおける主要な神経伝達物質であり、神経可塑性、認知、記憶、学習ならびに癲癇、脳卒中、および神経変性などの一部の神経障害において重要な役割を有すると考えられている（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およびＳ．  Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｇ−  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、１３０〜１３２ページ）。グルタミン酸のこれらの効果は、向イオン性および向代謝性と称される２つの異なる受容体クラスによって媒介されている。向イオン性受容体は内因性の陽イオンチャネルを含有しており、グルタミン酸の高速な興奮作用を媒介する。代謝型受容体は調節性であり、カルシウム依存性カリウムコンダクタンスを阻害し、向イオン性受容体の興奮性伝達を阻害および増強させることによって、ニューロンの膜興奮性を増加させる。代謝型受容体はアゴニスト薬理学およびシグナル伝達経路に基づいて５つの亜型に分類されており、脳組織中に広く分布している。
【００７９】
血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）ファミリーは、その作用がやはりＧＰＣＲによって媒介される関連ポリペプチド群である。このファミリーの主要なメンバーは、ＶＩＰ自体、セクレチン、および成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）である。ＶＩＰは、平滑筋の弛緩、様々な組織における分泌の刺激または阻害、様々な免疫細胞活性の変調、ならびにＣＮＳにおける様々な興奮および阻害活性を含めた、幅広い生理作用プロフィールを有する。セクレチンは膵臓および腸管における酵素およびイオンの分泌を刺激し、また、脳内に少量で存在する。ＧＲＦは、下垂体前葉からの成長ホルモンの合成および放出を調節する重要な神経内分泌物質である（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およびＳ．  Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ、上記、２７８〜２８３ページ）。
【００８０】
ＧＰＣＲとのリガンド結合の後、コンホメーション変化がＧタンパク質へと伝達され、これにより、α−サブユニットが、結合しているＧＤＰ分子をＧＴＰ分子へと交換し、βγ−サブユニットから解離することが引き起こされる。ＧＴＰと結合した形態のα−サブユニットは、典型的にはエフェクター変調部分として機能し、環状ＡＭＰ（たとえばアデニル酸シクラーゼの活性化による）、ジアシルグリセロールまたはイノシトールリン酸などの二次メッセンジャーの産生をもたらす。２０種を超える異なる種類のα−サブユニットがヒトにおいて知られており、これらはβおよびγサブユニットのより小さなプールと会合する。哺乳動物Ｇタンパク質の例にはＧｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが含まれる。Ｇタンパク質は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＬｏｄｉｓｈ  Ｈ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、１９９５）に広く記載されている。
【００８１】
ＧＰＣＲは薬物作用および開発の主要な標的である。実際、受容体は現在知られている薬物の半数以上をもたらしており（Ｄｒｅｗｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６、１４：１５１６）、ＧＰＣＲは治療行為の最も重要な標的を表し、臨床的に処方された薬物の３０％はＧＰＣＲを拮抗または刺激のどちらかを行う（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．およびＲｅｅｓ，Ｓ．、（１９９９）ＴＩＰＳ、２０：１１８〜１２４）。このことは、これらの受容体が治療標的として確立かつ証明された歴史を有することを実証している。
【００８２】
一般に、本発明の従事者はその目的ポリペプチドを選択し、その正確なアミノ酸配列を知っているであろう。本発明に従って発現させる任意の所定のタンパク質はそれ自身の特異体質特徴を有しており、培養細胞の細胞密度または生存度に影響を与える場合があり、同一の培養条件下で成長させた別のポリペプチドまたはタンパク質よりも低いレベルで発現される場合がある。当業者は、細胞成長および／または任意の所定の発現されたポリペプチドもしくはタンパク質の産生を最適化するために、本発明のステップおよび組成物を適切に改変することができるであろう。
【００８３】
酵素
医薬品および／または市販の薬剤として有効であると示されている別のタンパク質クラスには酵素が含まれる。酵素は、その酵素活性がそれらを産生させた細胞培養条件によって影響を受け得るタンパク質であり得る。したがって、本発明に従って望ましい酵素活性を有する酵素を産生させることも、特に関心がもたれている。当業者は、培養中の細胞によって発現させ得る多くの既知の酵素を認識しているであろう。
【００８４】
酵素の非限定的な例には、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンギナーゼ、ペクチナーゼおよびプルラナーゼなどのカルボヒドラーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、フィシン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ（たとえばアミノペプチダーゼやカルボキシペプチダーゼ）、レンネット、レンニン、キモシン、サブチリシン、サーモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびトリプシンなどのプロテアーゼ、トリグリセリダーゼ、ホスホリパーゼ、前胃エステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、およびペニシリンアシラーゼなどのリパーゼまたはエステラーゼ、グルコースイソメラーゼなどのイソメラーゼ、アミノ酸酸化酵素、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼまたはペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素、アセト乳酸脱炭酸酵素、アスパラギン酸脱炭酸酵素、フマラーゼまたはヒスタダーゼなどの脱離酵素、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼなどのトランスフェラーゼ、リガーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ペクチン分解酵素、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼならびにトランスグルタミナーゼが含まれる。
【００８５】
一般に、本発明の従事者は目的タンパク質を選択し、その正確なアミノ酸配列を知っているであろう。本発明に従って発現させる任意の所定のタンパク質はそれ自身の特定の特徴を有する場合があり、培養細胞の細胞密度または生存度に影響を与える場合があり、同一の培養条件下で成長させた別のタンパク質よりも低いレベルで発現される場合があり、正確な培養条件および行ったステップ次第で異なる生物活性を有する場合がある。当業者は、細胞成長ならびに任意の所定の発現されたタンパク質の産生および／または活性レベルを最適化するために、本発明の教示に従って特定のタンパク質を産生させるために使用するステップおよび組成物を適切に改変することができるであろう。
【００８６】
タンパク質発現のための遺伝子の宿主細胞内への導入
一般に、細胞内に導入される核酸分子は、本発明に従って発現されることが望まれるタンパク質をコードしている。あるいは、核酸分子は細胞による所望のタンパク質の発現を誘導する遺伝子産物をコードし得る。たとえば、導入された遺伝物質は、内在性または異種タンパク質の転写を活性化させる転写因子をコードし得る。その代わりにまたはそれに加えて、導入された核酸分子は、細胞によって発現されたタンパク質の翻訳または安定性を増加させ得る。
【００８７】
目的タンパク質の発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞内に導入するために適した方法は、当分野で知られている。たとえば、そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれているＧｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０〜６２５、１９８１、Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０〜４６、１９７９、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ１１７，０６０号、およびＥＰ１１７，０５８号を参照されたい。哺乳動物細胞では、遺伝物質を哺乳動物細胞内に導入する一般的な方法には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂのリン酸カルシウム沈殿方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４５７、１９７８）またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）方法（Ｆｏｃｕｓ、１５：７３、１９９３）が含まれる。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な側面は、Ａｘｅｌによって１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号中に記載されている。遺伝物質を哺乳動物細胞内に導入するための様々な技法には、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７〜５３７、１９９０、およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２、１９８８を参照されたい。
【００８８】
一部の実施形態では、導入する核酸は裸核酸分子の形態である。たとえば、細胞内に導入された核酸分子はタンパク質をコードしている核酸および必要な遺伝子制御因子のみからなり得る。あるいは、タンパク質をコードしている核酸（必要な調節要素が含まれる）をプラスミドベクター内に含有させ得る。哺乳動物細胞においてタンパク質を発現させるための適切なベクターの非限定的な代表例には、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：１１３６〜１１４２、１９８５を参照）、ｐＭＣｌｎｅｏポリ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ、５１：５０３〜５１２、１９８７を参照）、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０などのバキュロウイルスベクター、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０、１９８７を参照）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１８７〜１９５、１９８７を参照）が含まれる（そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている）。一部の実施形態では、細胞内に導入する核酸分子をウイルスベクター内に含有させる。たとえば、タンパク質をコードしている核酸をウイルスゲノム（または部分ウイルスゲノム）内に挿入し得る。タンパク質の発現を指揮する調節要素は、ウイルスゲノム内に挿入された核酸と共に含めるか（すなわち、ウイルスゲノム内に挿入された遺伝子と連結させる）、またはウイルスゲノム自体によって提供することができる。
【００８９】
裸ＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含有する沈殿物を形成することによって細胞内に導入することができる。あるいは、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストランの混合物を形成し、混合物を細胞と共にインキュベートすることによって、または細胞およびＤＮＡを適切な緩衝液中で一緒にインキュベートし、細胞を高電圧の電気パルスに供することによって（たとえば電気穿孔による）も、裸ＤＮＡを細胞内に導入することができる。裸ＤＮＡを細胞内に導入するためのさらなる方法は、ＤＮＡを、カチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合することによるものである。その後、ＤＮＡ／リポソームの複合体を細胞と共にインキュベートする。また、たとえば微量注入によって、裸ＤＮＡを細胞内に直接注入することもできる。
【００９０】
あるいは、ＤＮＡを細胞表面受容体用のリガンドとカップリングしているポリリシンなどの陽イオンと複合体形成させることによっても、裸ＤＮＡを細胞内に導入することができる（たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれているＷｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１４６２１、１９８８、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：９６３〜９６７、１９９２、および米国特許第５，１６６，３２０号を参照）。ＤＮＡ−リガンドの複合体と受容体との結合は受容体媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを容易にする。
【００９１】
特定の核酸配列、たとえばタンパク質をコードしているｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用は、核酸配列を細胞内に導入するための一般的な手法である。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、細胞の大部分が核酸を受け取るという利点を有しており、これは、核酸を受け取った細胞の選択の必要性を不要にすることができる。さらに、ウイルスベクター内に、たとえばウイルスベクター中に含有されているｃＤＮＡによってコードされている分子は、一般に、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
【００９２】
欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子移入における使用について十分に特徴づけられている（総説にはＭｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ、７６：２７１、１９９０を参照）。目的タンパク質をコードしている核酸がレトロウイルスゲノム内に挿入されている組換えレトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスを複製欠損にするためにレトロウイルスゲノムの一部分を除去することができる。その後、そのような複製欠損レトロウイルスをビリオン内にパッケージングし、これを使用して、標準の技法によってヘルパーウイルスを使用することで標的細胞を感染させることができる。
【００９３】
アデノウイルスのゲノムは、目的タンパク質をコードしておりそれを発現するが、正常な溶解性のウイルス生活環において複製するその能力に関して失活しているように操作することができる。たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６、１９８８、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４、１９９１、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５、１９９２を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株（たとえば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に知られている。組換えアデノウイルスは、有効な遺伝子送達ビヒクルであるために分裂中の細胞を必要とせず、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、上記引用）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６４８２〜６４８６、１９９２）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２８１２〜２８１６、１９９３）、ならびに筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１〜２５８４、１９９２）を含めた様々な細胞種を感染させるために使用できるという点で有利である。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含有される外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム内に組み込まれずにエピソームのまま保たれ、それにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム内に組み込まれる状況（たとえばレトロウイルスＤＮＡ）における挿入突然変異の結果として起こる可能性がある潜在的な問題が回避される。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡの保有能力は他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（８キロ塩基まで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記引用、Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５７：２６７、１９８６）。現在使用されているほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターはウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子が全体的または部分的に欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％も保持している。
【００９４】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および生産的な生活環のためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。（総説にはＭｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９、１９９２を参照）。また、これはそのＤＮＡを非分裂細胞内に組み込み得る数少ないウイルスのうちの１つでもあり、高い頻度の安定な組込みを示す（たとえば、Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９〜３５６、１９９２、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８、１９８９、およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３〜１９７３、１９８９を参照）。少なければＡＡＶの３００塩基対を含有するベクターをパッケージングすることができ、組み込むことができる。外因性ＤＮＡのための空間は約４．５ｋｂに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３２５１〜３２６０、１９８５）に記載されているものなどのＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞内に導入することができる。ＡＡＶベクターを使用して様々な核酸が様々な細胞種内に導入されている（たとえば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６〜６４７０、１９８４、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２０７２〜２０８１、１９８５、Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２：３２〜３９、１９８８、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１：６１１〜６１９、１９８４、およびＦｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：３７８１〜３７９０、１９９３を参照）。
【００９５】
核酸分子を細胞集団内に導入するために使用する方法が大部分の細胞の改変および細胞によるタンパク質の効率的な発現をもたらす場合、改変された細胞集団は、集団内の個々の細胞のさらなる単離またはサブクローニングを行わずに使用し得る。すなわち、さらなる細胞単離が必要ないほどに細胞集団によるタンパク質の産生が十分に存在し、タンパク質産生のために細胞培養物に播種するために集団をすぐに使用することができる場合がある。あるいは、タンパク質を効率的に産生する細胞群または単一の細胞を単離し、それから均一な細胞集団を拡大することが望ましい場合がある。
【００９６】
細胞内に目的タンパク質をコードしている核酸分子を導入する代わりに、導入された核酸は、細胞によって内在的に産生されるタンパク質の発現を誘導するまたはそのレベルを増加させる、別のポリペプチドまたはタンパク質をコードしていてもよい。たとえば、細胞は、特定のタンパク質を発現することができるが、細胞の追加の処理なしでは発現できない場合がある。同様に、細胞は、所望の目的のためには不十分な量のタンパク質しか発現しない場合がある。したがって、目的タンパク質の発現を刺激する薬剤を使用して、細胞によるそのタンパク質の発現を誘導または増加させることができる。たとえば、導入された核酸分子は、目的タンパク質の転写を活性化または上方調節する転写因子をコードしていてもよい。そのような転写因子の発現は、ひいては目的タンパク質の発現、またはより頑強な発現をもたらす。
【００９７】
特定の実施形態では、タンパク質の発現を指揮する核酸を宿主細胞内に安定に導入する。特定の実施形態では、タンパク質の発現を指揮する核酸を宿主細胞内に一過的に導入する。当業者は、自身の実験上の要求に基づいて、核酸を細胞内に安定に導入するか一過的に導入するかを選択することができる。
【００９８】
目的タンパク質をコードしている遺伝子は、１つまたは複数の調節性遺伝子制御因子と連結されていてもよい。特定の実施形態では、遺伝子制御因子はタンパク質の構成的発現を指揮する。特定の実施形態では、目的タンパク質をコードしている遺伝子の誘導性発現をもたらす遺伝子制御因子を使用することができる。誘導性遺伝子制御因子（たとえば誘導性プロモーター）の使用により、細胞中におけるタンパク質の産生の変調が可能となる。真核細胞中での使用において潜在的に有用な誘導性遺伝子制御因子の非限定的な例には、ホルモン調節性因子（たとえばＭａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５６０３〜５６０７、１９９３を参照）、合成リガンド調節性因子（たとえばＳｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１０１９〜１０２４、１９９３を参照）、ならびに電離放射線調節因子（たとえば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：１０６０７〜１０６１３、１９９３、Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０１４９〜１０１５３、１９９２を参照）が含まれる。当分野で知られているさらなる細胞特異的または他の調節系を本発明に従って使用し得る。
【００９９】
当業者は、本発明の教示に従って細胞が目的タンパク質を発現することを引き起こす、遺伝子を導入する方法を選択し、任意選択で適切に改変することができるであろう。
【０１００】
発現されたタンパク質の単離
一般に、本発明に従って発現されたタンパク質を単離および／または精製することが典型的には望ましいであろう。特定の実施形態では、発現されたタンパク質は培地内に分泌され、したがって、細胞および他の固形物は、精製工程の最初のステップとしてたとえば遠心分離または濾過によって除去し得る。
【０１０１】
あるいは、発現されたタンパク質は宿主細胞の表面に結合している場合がある。たとえば、培地を除去し、精製工程の最初のステップとしてタンパク質を発現している宿主細胞を溶解し得る。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高いｐＨ条件への曝露を含めた、当業者に周知の任意数の手段によって達成することができる。
【０１０２】
発現されたタンパク質は、それだけには限定されないが、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは示差的溶解度、エタノール沈殿ならびに／あるいはタンパク質を精製するための任意の他の利用可能な技法によるものを含めた標準の方法によって単離および精製し得る（たとえば、そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれているＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９、ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照）。特にイムノアフィニティークロマトグラフィーでは、タンパク質は、そのタンパク質に対して産生させ、固定された支持体に固定された抗体を含むアフィニティーカラムと結合させることによって単離し得る。あるいは、適切なアフィニティーカラムに通すことによって容易な精製を可能にするために、標準の組換え技法によってインフルエンザコート配列、ポリ−ヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に付着させることができる。精製工程中のタンパク質の分解を低下させるまたは排除するために、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を任意またはすべての段階で加え得る。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたタンパク質を単離および精製するために細胞を溶解しなければならない場合に、特に有利である。
【０１０３】
当業者には、正確な精製技法は精製するタンパク質の特徴、タンパク質を発現させる細胞の特徴、および／または細胞を成長させた培地の組成に応じて変動することが理解されよう。
【０１０４】
医薬品配合物
本発明の特定の好ましい実施形態では、産生されたポリペプチドまたはタンパク質は薬理学的活性を有し、医薬品の調製において有用である。上述の本発明の組成物は、対象に投与し得るか、まず最初に、それだけには限定されないが、非経口（たとえば静脈内）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、眼、経皮（外用）、経粘膜、直腸、および経膣の経路を含めた任意の利用可能な経路による送達のために配合し得る。本発明の医薬組成物には、典型的には、哺乳動物細胞系から発現させた精製ポリペプチドまたはタンパク質、送達剤（すなわち、上述のように、陽イオンポリマー、ペプチド分子トランスポーター、界面活性剤など）が、薬学的に許容できる担体と組み合わせて含まれる。本明細書中で使用する言葉「薬学的に許容できる担体」には、医薬品の投与に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。また、補助活性化合物も組成物内に取り込ませることができる。
【０１０５】
医薬組成物は、その意図する投与経路に適合性があるように配合される。非経口、皮内、または皮下の施用に使用する溶液または懸濁液には、以下の構成成分を含めることができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌的な希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整する薬剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入することができる。
【０１０６】
注射使用に適した医薬組成物には、典型的には、無菌的な注射用溶液または分散液の即時調製のための、無菌的な水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌的な粉末が含まれる。静脈内投与には、適切な担体には生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての事例において、組成物は無菌的であるべきであり、容易な注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。好ましい医薬品配合物は製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。一般に、関連する担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１０７】
無菌的な注射用溶液は、精製ポリペプチドまたはタンパク質を所要量で、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に適切な溶媒中に取り込ませ、次いで滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、哺乳動物細胞系から発現させた精製ポリペプチドまたはタンパク質を、基本分散媒および上記列挙したものからの必要な他の成分を含有する無菌的なビヒクル内に取り込ませることによって調製する。無菌的な注射用溶液を調製するための無菌的な粉末の場合は、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および以前に滅菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１０８】
経口組成物には、一般に不活性な希釈剤または食用担体が含まれる。経口的な治療投与の目的には、精製ポリペプチドまたはタンパク質を賦形剤と共に取り込ませ、錠剤、トローチ、またはカプセル、たとえばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。また、経口組成物は、洗口液として使用するための流体の担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のうちの任意のものを含有することができる：結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｊｅｌ（登録商標）、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。経口送達用の配合物は、胃腸管内での安定性を改善するおよび／または吸収を増強させる薬剤を有利に取り込み得る。
【０１０９】
吸入による投与には、哺乳動物細胞系から発現させた精製ポリペプチドまたはタンパク質および送達剤を含む本発明の組成物は、好ましくは、適切な噴霧剤、たとえば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達する。本発明は、鼻腔スプレー、吸入器、または上気道および／もしくは下気道への他の直接送達を使用した組成物の送達を特に企図する。インフルエンザウイルスに向けられたＤＮＡワクチンの鼻腔内投与はＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することが示されており、これは、この経路によって送達した場合に気道中の少なくとも一部の細胞がＤＮＡを取り込むことができることを示しており、本発明の送達剤が細胞取り込みを増強させる。本発明の特定の実施形態によれば、哺乳動物細胞系から発現させた精製ポリペプチドおよび送達剤を含む組成物は、エアロゾル投与のための大きな多孔性粒子として配合する。
【０１１０】
また、全身投与は経粘膜または経皮手段によるものであることもできる。経粘膜または経皮投与には、透過する障壁に適した浸透剤を配合物中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分野で知られており、たとえば、経粘膜投与には、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は鼻腔スプレーまたは坐薬の使用によって達成することができる。経皮投与には、精製ポリペプチドまたはタンパク質および送達剤を当分野で一般に知られている軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム内に配合する。
【０１１１】
また、組成物は、直腸送達のための坐薬（たとえばカカオ脂および他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を用いる）または保留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１１２】
一実施形態では、組成物は、移植片およびミクロカプセル封入送達系を含めた徐放性配合物など、ポリペプチドまたはタンパク質を体内からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような配合物の調製方法は当業者に明らかであろう。材料はＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的としたリポソームが含まれる）も薬学的に許容できる担体として使用することができる。これらは、当業者に知られている方法に従って、たとえば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように調製することができる。
【０１１３】
投与の容易性および用量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で配合することが有利である。本明細書中で使用する単位剤形とは、処置する対象のための単位用量として適した、物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、所要の薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性ポリペプチドまたはタンパク質を含有する。
【０１１４】
本発明に従って発現させたポリペプチドまたはタンパク質は、必要に応じて様々な間隔および様々な期間にわたって、たとえば、週に１回を約１〜１０週間、２〜８週間、約３〜７週間、約４、５、または６週間などで投与することができる。当業者は、それだけには限定されないが、疾患または障害の重篤度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含めた特定の要因が、対象を有効に処置するために必要な用量およびタイミングに影響を与える可能性があることを理解されたい。一般に、本明細書中に記載のポリペプチドまたはタンパク質を用いた対象の処置には単一の処置が含まれる場合があり、または多くの場合は一連の処置が含まれる場合がある。さらに、適切な用量はポリペプチドまたはタンパク質の効力に依存する場合があり、たとえば事前に選択された所望の応答が達成されるまで漸増用量を投与することによって特定のレシピエントにあつらえてもよい場合があることは理解される。任意の特定の動物対象のための特定の用量レベルは、用いる具体的なポリペプチドまたはタンパク質の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに変調する発現または活性の度合を含めた様々な要因に依存し得ることは理解される。
【０１１５】
本発明には、非ヒト動物を処置するための本発明の組成物の使用が含まれる。したがって、投与の用量および方法は獣医学の薬理学および医学の既知の原理に従って選択し得る。指針はたとえばＡｄａｍｓ，Ｒ．（編）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ：０８１３８１７４３９、２００１中に見つけ得る。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与の指示と共に含めることができる。
【０１１７】
キット
また、本発明は、本明細書中に記載の鉄を含む組成物が含まれる細胞培養培地の作製に有用な構成成分が含まれるキットも提供する。そのようなキットは、細胞培養物における細胞密度、生存度、および／または力価を増加させるために特に有用であり得る。
【０１１８】
一部の実施形態では、本発明のそのようなキットには、初期細胞培養培地を作製するための１つまたは複数の試薬が含まれる。そのようなキットには、既知細胞培養培地に補充するために有用な１つまたは複数の試薬が含まれ得る（たとえば、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、無機イオンのナトリウム、クロライド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素、アミノ酸、脂質、またはグルコースもしくは他のエネルギー源）。本発明のキットには鉄を含む別個の組成物が含まれ得る（たとえば、ＦｅＳＯ４、クエン酸Ｆｅ、Ｆｅ−トランスフェリン、塩化Ｆｅ、硝酸Ｆｅ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ２、またはＦｅＣｌ３）。一部の実施形態では、本発明のキットには、本明細書中に記載の細胞培養培地中で適切な濃度（たとえば１００μＭ〜５ｍＭの間の範囲）をもたらす、鉄を含む別個の組成物が含まれる。また、本発明のキットは、本明細書中に記載の細胞培養工程の期間中の１つまたは複数の時点で鉄の別個の組成物を初期細胞培養培地に加える指示（たとえば取扱説明書）も含有し得る。
【０１１９】
本発明のキットの構成成分は個々の容器中で提供してよく、複数のそのような容器を一般的なハウジング中に一緒に提供してもよい。
【０１２０】
本発明を以下の非限定的な例によってさらに詳細に例示する。実施例は例示のためのみに提供し、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１）
３日目より後の流加培養へのＦｅの添加
本実験は、治療タンパク質を産生する細胞の流加培養の３日目より後にＦｅを加えることで細胞密度、生存度および力価の有意な増加がもたらされることを実証する。
【０１２２】
ＣＨＯ細胞、細胞系１を、既知組成強化培地中で流加培養工程を使用して培養した。高濃度のＦｅ（たとえば１００μＭ〜５ｍＭ）を３日目より後に細胞培養に加え、様々なＦｅ濃度（たとえば、０ｍＭ、０．１ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、または５．０ｍＭ）をもたらした。本実験では、クエン酸第二鉄を使用し、細胞は振盪フラスコ中で培養した。細胞培養工程全体にわたる様々な時点で細胞を細胞密度、生存度、および力価分析に供した。
【０１２３】
生細胞密度は、ＣＥＤＥＸによってデジタル画像認識方法を使用して決定した。例示的な細胞系１の細胞成長に対する、３日目より後の様々な用量のＦｅ添加の効果を図１に示す。図１から見られるように、３日目より後のＦｅの添加は、鉄の非存在下にて成長させた細胞と比較して生細胞密度を増加させた。
【０１２４】
細胞生存度はトリパンブルー排除方法によるＣＥＤＥＸによって決定した。例示的な細胞系１の細胞生存度に対する、３日目より後の様々な用量のＦｅ添加の効果を図２に示す。図２に示すように、３日目より後のＦｅの添加は、鉄の非存在下にて成長させた細胞と比較して細胞生存度を増加させた。
【０１２５】
さらに、細胞培養の後期での細胞の生存度に対するＦｅ添加の効果も決定した。具体的には、鉄の存在下または非存在下にて成長させた細胞について細胞生存度を１６日目に決定した。図３に示すように、Ｆｅの添加は１６日目での細胞生存度を増加させた。
【０１２６】
また、抗体価に対する３日目より後の様々な用量のＦｅ添加の効果も決定した。抗体価は、様々な濃度の鉄の存在下または非存在下にて成長させた細胞について１６日目にタンパク質ＡアフィニティーＨＰＬＣ方法によって決定した。図４に示すように、Ｆｅの添加は１６日目の抗体価を増加させた。
【０１２７】
また、最適な３日目後のＦｅ添加の濃度は０．３ｍＭ〜１ｍＭである可能性が高いことも観察された。３日目より後の任意の日でのＦｅ添加が有効である。Ｆｅを複数に分けて供給することが、１回のまとまった添加よりも良い可能性がある。
【０１２８】
同様の実験を第２の例示的な細胞系、細胞系２で行い、例示的な結果を図５に示す。図５に示すように、Ｆｅの添加は特に後期で細胞密度、生存度および力価を改善した。
【０１２９】
クエン酸Ｆｅに加えて、ＦｅＳＯ４またはＦｅ−トランスフェリンなどの他のＦｅ複合体の効果も試験した。図６は、流加培養の細胞系１の１４日目の生細胞密度および生存度に対する、３日目より後のＦｅＳＯ４およびクエン酸Ｆｅ添加の効果を示す例示的な結果を要約している。
【０１３０】
また、同様の実験を振盪フラスコおよびバイオリアクター実験のどちらでも行い、効果は同じであった。この効果は様々な生成物（様々なモノクローナル抗体など）でも観察された。
【０１３１】
したがって、Ｆｅ添加の有益な効果は細胞系、細胞培養スケール、Ｆｅ源および生成物に依存しない。また、生成物の品質は高いＦｅ濃度によって影響を受けなかったことも決定された。
【０１３２】
（実施例２）
６日目でのＦｅの添加
ナノボディを発現するＣＨＯ細胞を振盪フラスコ中での流加培養によって成長させた。細胞を最初は７％のＣＯ２インキュベーター内、３７℃で０〜４日間培養し、４日目より後に３１℃へとシフトさせた。６日目にＦｅＳＯ４を、鉄の濃度が細胞培養培地中で１ｍＭとなるように加えた。実施例１に記載のように細胞培養工程全体にわたる様々な時点で細胞を細胞密度、生存度、力価、乳酸レベルおよびＱｐ分析に供した。例示的な結果を図７〜１０に示す。図７〜１０に示すように、Ｆｅの添加は、生存度の改善（たとえば図７に示すように１５日目に９６％対７０％）、力価の改善（たとえば図８に示すように１５日目に３．２ｇ／Ｌ対１．５ｇ／Ｌ）、Ｑｐの改善（たとえば図９に示すように２０μｇ／ｅ６／日対１０μｇ／ｅ６／日）、および乳酸レベルの低下（たとえば、図１０に示すように、乳酸はＦｅ添加した細胞培養物では０近くに保たれたが、Ｆｅ添加なしの対照培養物ではそうではなく、１５日目に２．２４ｇ／Ｌまで増加した）を含めた細胞培養中の顕著な利点を示した。
【０１３３】
（実施例３）
０日目でのＦｅ添加
本実験は、０日目に加えた高濃度のＦｅが有利な効果を有するかどうかを試験するために設計されている。モノクローナル抗体（クローン２．８）を産生する細胞系の細胞を、ｐＨ制御した振盪フラスコ中、７％のＣＯ２を用いて約１２０ｒｐｍで、軌道振盪器を使用して培養した。播種密度は１．５×１０６個の細胞／ｍＬであった。細胞を１４日間培養した。基本培地は、４ｍＭのグルタミンを含めたアミノ酸を補充した既知組成基本培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）であった。流加培地は既知組成の濃縮流加培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｆｅｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）である。０日目または９日目にクエン酸ＦｅまたはＦｅＳＯ４を、鉄の濃度が細胞培養培地中で６００μＭとなるように加えた。以前の実施例に記載のように細胞培養工程全体にわたる様々な時点で細胞を細胞密度、生存度、力価およびＱｐ分析に供した。例示的な結果を図１１〜１３に示す。
【０１３４】
０日目でのクエン酸Ｆｅの添加は細胞培養の初期に増加した細胞成長をもたらした一方で、９日目でのＦｅ添加は細胞培養の後期に改善された細胞密度を示した（図１１）。しかし、０日目でのクエン酸Ｆｅ添加は、細胞培養の終了時におけるより高い生存度の維持を助けるようには思われない。たとえば、図１２に示すように、０日目に６００μＭのクエン酸Ｆｅを添加した細胞培養物の１４日目の生存度は約７５％であり、これは、Ｆｅ添加なしの対照培養物の１４日目の７４〜８０％の生存度に匹敵する。対照的に、９日目にＦｅ添加した細胞培養物の細胞生存度は８５〜９０％である。
【０１３５】
さらに、図１３に示すように、０日目にクエン酸Ｆｅ添加した細胞培養物のＱｐは培養全体にわたってすべての他の条件よりも低かった。
【０１３６】
一部の事例では、Ｆｅを細胞培養の開始時に加えた場合、高いＦｅ濃度で毒性が観察された。たとえば、Ｆｅを０日目に細胞系１に加え、振盪フラスコ中の３日目の細胞生存度に対する例示的な効果を図１４に示す。図１４から見られるように、１００μＭよりも高いＦｅ濃度で毒性が観察された。実施例１および２に示した結果と比較して、０日目より後に加えた高濃度のＦｅは毒性がなかっただけでなく、細胞生存度および細胞成長を含めた細胞培養に対する利点も実証したことは、驚くべきである。
【０１３７】
均等物
当業者は、日常的な実験以上のことを使用せずに、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を理解されるまたは確認できるであろう。本発明の範囲は上記説明を限定することを意図するのではなく、添付の特許請求の範囲に記載のとおりのものである。
【０１３８】
特許請求の範囲中において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、そうではないと示されていない限り、または他の様式で内容から明らかである場合以外は、１つまたは複数を意味し得る。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または（ｏｒ）」が含まれるクレームまたは説明は、そうではないと示されていない限り、または他の様式で内容から明らかである場合以外は、群のメンバーの１つ、複数、またはすべてが所定の生成物または工程中に存在する、用いられている、または他の様式で関連している場合に、充足しているとみなされる。本発明には、群の厳密に１つのメンバーが所定の生成物または工程中に存在する、用いられている、または他の様式で関連している実施形態が含まれる。本発明には、群の複数またはすべてのメンバーが所定の生成物または工程中に存在する、用いられている、または他の様式で関連している実施形態が含まれる。さらに、本発明には、記載したクレームのうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の制限、要素、条項、記述用語などが別のクレーム内に導入されるすべての変形、組合せ、および順列が包含されることを理解されよう。たとえば、別のクレームに従属する任意のクレームは、同じ基礎クレームに従属する任意の他のクレーム中に見つかる１つまたは複数の制限が含まれるように改変することができる。
【０１３９】
要素がリストとして、たとえばマーカッシュ群様式で示される場合、要素のそれぞれの部分群も開示されており、任意の要素（または複数の要素）を群から除去できることを理解されたい。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特長などを含むと言及する場合は、特定の本発明の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特長などからなる、または本質的にそれからなることを理解されたい。簡素化の目的のために、それらの実施形態は、本明細書中でこのとおりの言葉で具体的に記載されていない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とはオープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を許容することに注意されたい。
【０１４０】
範囲を与えた場合は、端点が含まれる。さらに、別段に指定しない限り、または他の様式で内容または当業者の理解から明らかである場合以外は、範囲として表す値は、本発明の異なる実施形態において、内容からそうでないと明確に指示される場合以外は、範囲の下限の単位の１０分の１まで、記述した範囲内の任意の具体的な値または部分範囲をとることができることを理解されたい。
【０１４１】
さらに、従来技術の範囲内にある本発明の任意の特定の実施形態は、クレームのうちの任意の１つまたは複数から明確に排除され得ることを理解されたい。そのような実施形態は当業者に知られているとみなされるため、排除が本明細書中に明確に記載されていない場合でも、これらは排除され得る。従来技術の存在に関係しているかどうかにかかわらず、いかなる理由でも、本発明の組成物の任意の特定の実施形態（たとえば、任意の標的化部分、任意の疾患、障害、および／または状態、任意の連結剤、任意の投与方法、任意の治療応用など）を任意の１つまたは複数のクレームから排除することができる。
【０１４２】
上記および本文全体にわたって記述されている出版物は、本出願の出願日より前のその開示についてのみ提供する。本明細書中のいかなるものも、本発明者らが事前開示の権限によってそのような開示に先行する権利を有さないという承認であると解釈されるべきでない。
【０１４３】
参考文献の組込み
本出願中に引用されているすべての出版物および特許文書は、それぞれの個々の出版物または特許文書の内容が本明細書中に組み込まれている場合と同程度まで、その全体で参考として組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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