(57)【要約】本願は、特に、骨折治癒障害の予測、診断、予後診断、及び／又はモニタリングのための新規バイオマーカーとしてのインターロイキン８（ＩＬ−８）；ならびに関連する方法、使用、及びキットを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨折治癒障害についてのバイオマーカーとしてのインターロイキン８（ＩＬ−８）の使用。
【請求項２】
骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのＩＬ−８の使用。
【請求項３】
骨折治癒障害が、変形癒合骨折、癒合遅延骨折、及び癒合不能骨折からなる群より選択される、請求項１又は２のいずれか一項記載の使用。
【請求項４】
被験者からのサンプル中のＩＬ−８のレベルを測定することを含む、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための方法。
【請求項５】
被験者における骨折治癒障害の診断、予測、及び／又は予後診断のための請求項４記載の方法であって、以下の工程：（ｉ）被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す参照値と比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、参照値からの偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；ならびに、（ｉｖ）前記の偏差を見出すこと又は偏差を見出さないことを、被験者における骨折治癒障害の特定の診断、予測、及び／又は予後診断に帰することを含む、方法。
【請求項６】
被験者における骨折治癒障害をモニタリングするための又は骨折治癒障害を発生するリスクをモニタリングするための請求項４記載の方法であって、以下の工程：（ｉ）被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を、２つ又はそれ以上の連続的な時間点で測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間で比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間での偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；（ｉｖ）前記の偏差を見出すこと又は偏差を見出さないことを、被験者における２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間での骨折治癒障害における変化又は骨折治癒障害を発生するリスクにおける変化に帰することを含む、方法。
【請求項７】
被験者が、被験者からのサンプル中のＩＬ−８のレベルを測定することを含む、骨折治癒障害の治療的又は予防的処置の必要があるか又はないかを決定するための方法であって、好ましくは、以下の工程：（ｉ）被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す参照値と比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、参照値からの偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；（ｉｖ）骨折治癒障害の治療的又は予防的処置についての必要性の存在又は非存在を見出すことから推論することを含む、方法。
【請求項８】
骨折治癒障害が、変形癒合骨折、癒合遅延骨折、及び癒合不能骨折からなる群より選択される、請求項４〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、及びＢＭＰの任意の１つ又は複数のレベルを測定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用又は請求項４〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ−８についての参照値を確立するための方法であって、該参照値が：
（ａ）骨折治癒障害の非存在の予測もしくは診断又は骨折治癒障害についての良好な予後診断、あるいは
（ｂ）骨折治癒障害の予測もしくは診断又は骨折治癒障害についての不良な予後診断
を表し、
（ｉ）以下：
（ｉａ）骨折治癒障害を有さない又は骨折治癒障害を有するリスクのない又は骨折治癒障害についての良好な予後診断を有する１つ又は複数の被験者、あるいは
（ｉｂ）骨折治癒障害を有する又は骨折治癒障害を有するリスクのある又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を有する１つ又は複数の被験者
からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定すること、及び
（ｉｉａ）（ｉａ）において測定されたＩＬ−８の量から、骨折治癒障害の非存在の予測もしくは診断を表す又は骨折治癒障害についての良好な予後診断を表す参照値を確立すること、あるいは
（ｉｉｂ）（ｉｂ）において測定されたＩＬ−８の量から、骨折治癒障害の予測もしくは診断を表す又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を表す参照値を確立すること
を含む、方法。
【請求項１１】
ＩＬ−８の全身量を測定することを含み、ここで、サンプルが、好ましくは全血又はその分画成分、より好ましくは血漿又は血清を含む、それから実質的になる又それからなる、請求項１〜３もしくは９のいずれか一項記載の使用又は請求項４〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
細胞中又は被験者から得られ、その後にインビトロで培養された細胞の上清中のＩＬ−８の量を測定することを含む、請求項１〜３もしくは９のいずれか一項記載の使用又は請求項４〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、骨芽細胞（ＯＢ）又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項１２記載の使用又は方法。
【請求項１４】
キットが、（ｉ）特に被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定するための手段、ならびに（ｉｉ）場合により及び好ましくは、１つ又は複数の参照値あるいは１つ又は複数の参照値を確立するための手段を含み、それにおいて、１つ又は複数の参照値が、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのキットの使用。
【請求項１５】
被験者からサンプルを採取するための手段が、キットとは別に提供されるか、又はその中に含まれる、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
アレイ又はマイクロアレイが、ＩＬ−８をコードする核酸を含むか又はＩＬ−８を含む、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための核酸のアレイもしくはマイクロアレイ又はタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのアレイもしくはマイクロアレイの使用。
【請求項１７】
アレイ又はマイクロアレイが、ＩＬ−８に特異的に結合することが可能な１つ又は複数の結合薬剤を含み、好ましくは、１つ又は複数の結合薬剤の公知の量又は濃度を含む、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための結合薬剤のアレイ又はマイクロアレイの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、被験者における疾患及び状態、特に、骨折治癒障害（例えば、しかし、限定しないが、癒合不能骨折、変形癒合骨折、又は癒合遅延骨折など）における診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための有用なバイオマーカー及びパラメーター；ならびに、関連する方法、使用、キット、及び装置に関する。
【０００２】
発明の背景
処置の選択肢を通知し、案内するために、被験者における疾患及び状態の正確な予測、診断、予後診断、及び／又はモニタリングを得るための追加の、好ましくは改善された方法についての継続的な必要性が存在する。
【０００３】
骨折治癒障害は、骨折治癒の任意の異常及び欠陥、例えば不適当な、遅延した、又は非存在の骨折治癒など（限定を伴わず、変形癒合、癒合遅延、及び癒合不能を含む）を包含する。癒合不能骨折は、また、癒合不能（ＮＵ）として公知であり、とりわけ、堅固な癒合不能及び不安定な癒合不能（偽関節）を含み、自然治癒の希望を伴わない、骨折修復過程の不全により特徴付けられる。報告された癒合不能率は、著者に依存し、全骨折の２%〜１０%の間で変動する（Gaston et al. J. Bone Joint Surg. Br., 2007, vol. 89(12), 1553-1560; Tzioupis and Giannoudis. Injury, 2007, vol. 38 Suppl 2, S3-S9）。癒合不能は、骨断片部位が血管である場合、肥大性又は貧栄養性として分類されうる。肥大性癒合不能は、通常、骨折部位での不安定性により説明される。貧栄養性癒合不能は、典型的には、骨折部位の主要な変位後に生じ、不適当な治癒反応を提示する（仮骨の非存在により示される通り）。萎縮性として分類される癒合不能において、骨断片は、無血管性、低回転性であり、生物学的反応が不可能である（Frolke et al. Injury, 2007, vol. 38 Suppl 2, S19-S22）。
【０００４】
変形癒合は、以前に断片化された骨の不完全な癒合により特徴付けられる。癒合遅延は、治癒が予定時間中に生じていない、転帰が不確かなままである骨折として定義することができる。
【０００５】
正常な治癒過程において、骨折は、損傷した骨をその本来の状態に回復することができる、一連の炎症、修復、及び再造形を惹起する。ヒトにおいて、炎症段階は、約５〜７日続き、血腫の発生を伴い開始し、炎症細胞の浸潤が続く。これらの細胞は、局所細胞との関連において、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子を分泌し、修復過程を惹起するために必須である、骨形成前駆細胞及び内皮前駆細胞の動員を促進する（Einhorn. Clin. Orthop. Relat. Res., 1998, vol. 355 Suppl: S7-21）。前駆細胞の動員は４段階に分けられる：骨折部位への細胞の移行、移動、浸潤、及び生着。とりわけ、上の過程の任意の１つ又は複数の障害は、骨折治癒障害をもたらしうる。
【０００６】
診断は、現在、放射線学的であり、骨折の部位及び型に依存し、癒合遅延についての硬化を伴わず３〜４ヶ月後に、及び、癒合不能についての硬化を伴わず６〜９ヶ月後に作られる（Frolke et al.、上記）。骨折治癒障害についての臨床的に有用なバイオマーカーベースのスクリーニングテストは、我々の知る限り、利用可能ではない。実際には、骨折治癒障害についてのバイオマーカーとしての生物学的分子の使用は、癒合不能患者（ＮＵ）において研究されていない。病態生理学的試験において、著者らは、インサイツのＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、及びＢＭＰ２／４レベルが、ＮＵ及び健常被験者において外傷から１週間後に同じであったが、しかし、８週間後にＮＵ患者において減少したことを実証している（Brownlow et al. Injury, 2001, vol. 32(7), 519-524）。他の著者は、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＦＧＦの血清レベルが、外傷から２及び４週間後にＮＵ患者においてより低かったことを示している。ＴＧＦ−β１及びＰＤＧＦ−ＡＢは、ＮＵ患者において外傷から１２週間後に依然としてより低かった（Weiss et al. Arch. Orthop. Trauma Surg., 2009, vol. 129, 989-997; Zimmermann et al. Bone, 2005, vol. 36(5), 779-785）。
【０００７】
なぜなら、被験者における骨折が、損なわれた治癒を示す（例えば、癒合不能に向かって進行するなど）増加した可能性である又はそれを有するとの知識、示唆、又は警告が、被験者における治療的介入を助けうるため、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための、さらなる、代替の及び好ましくは改善された方法及び手段の提供が最も重要であり続ける。
【０００８】
発明の概要
広範な実験及びテストを行ってきたため、本発明者らは、そのレベルが、骨折の損なわれた治癒を密接に予測及び／又は示唆しており、このように、骨折治癒障害についての有用で有望なバイオマーカーを構成する生物学的分子を同定した。同義の語句「骨折治癒障害(impaired bone fracture healing)」又は「骨折治癒障害(impaired fracture healing)」は、本明細書において使用する通り、骨折治癒の任意の奇形、異常、及び欠陥（例えば不適当な、遅延した、又は非存在の骨折治癒など）を包含する。語句は、具体的には、変形癒合、癒合遅延、及び癒合不能を含み、好ましくは、それらを表示し、より好ましくは、癒合不全（とりわけ、堅固な癒合不能及び不安定な癒合不能（偽関節）を含む）を表示することを意図する。
【０００９】
本発明に従い、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための追加の顕著に改善された方法が、骨折治癒障害についてのバイオマーカーとしてのストローマ由来因子１（ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、インターロイキン８（ＩＬ−８又はＣＸＣＬ８）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）の任意の１つ又は複数の提供を通じて実現される。
【００１０】
故に、本明細書において提供するのは、バイオマーカーとしての、特に、骨折治癒障害についてのバイオマーカーとしての、さらに特に、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのバイオマーカーとしてのＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数の使用である。好ましくは、本明細書において提供するのは、バイオマーカーとしての、特に、骨折治癒障害についてのバイオマーカーとしての、さらに特に、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのバイオマーカーとしてのＩＬ−８の使用である。
【００１１】
また、提供するのは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数の使用である。好ましくは、本明細書において提供するのは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのＩＬ−８の使用である。
【００１２】
本使用の好ましい実施態様において、骨折治癒障害は、変形癒合骨折、癒合遅延骨折、及び癒合不能骨折からなる群より選択されうる。
【００１３】
本明細書において提供するのは、被験者からのサンプル中でのＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数のレベルを測定することを含む、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための方法でもある。好ましくは、本明細書において提供するのは、被験者からのサンプル中でのＩＬ−８のレベルを測定することを含む、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための方法である。１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定するために、本方法、及び、特に、そのような方法の検証段階（それにおいて、データが被験者から及び／又はそれに関して回収される）は、典型的には、被験者からのサンプル中の前記の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（即ち、量、量）を測定又は決定することを含む。
【００１４】
被験者における骨折治癒障害の診断、予測、及び／又は予後診断のための方法は、本明細書において教示する通り、好ましい実施態様において、以下の工程を含みうる：（ｉ）被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数の量を測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す参照値と比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、参照値からの偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；ならびに、（ｉｖ）前記の偏差を見出すこと又は偏差を見出さないことを、被験者における骨折治癒障害の特定の診断、予測、及び／又は予後診断に帰すること。好ましくは、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、及び／又は予後診断のための、本明細書において教示する通りの方法は、以下の工程を含みうる：（ｉ）被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す参照値と比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、参照値からの偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；ならびに、（ｉｖ）前記の偏差を見出すこと又は偏差を見出さないことを、被験者における骨折治癒障害の特定の診断、予測、及び／又は予後診断に帰すること。この方法は、また、被験者について、２つ又はそれ以上の連続的な時間点で実施されうる。前記の連続的な時間点でのそれぞれの転帰を比較することができ、それにより、前記の連続的な時間点での骨折治癒障害の診断、予測、及び／又は予後診断の間での変化の存在又は非存在を決定する。そのように適用した場合、この方法によって、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、及び／又は予後診断における変化を経時的にモニタリングすることができる。
【００１５】
例えば、骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す、あるいは、骨折治癒障害についての良好な予後診断を表す参照値と比較した、被験者からのサンプル中でのＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数の量、好ましくはＩＬ−８の量の偏差は、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることをそれぞれ示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての不良な予後診断を示しうる。別の例において、骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す、あるいは、骨折治癒障害についての良好な予後診断を表す参照値からのそのような偏差の非存在は、被験者が骨折治癒障害を有さないこと又は骨折治癒障害を有するリスクがないことをそれぞれ示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての良好な予後診断を示しうる。さらに別の例において、骨折治癒障害の予測又は診断を表す、あるいは、骨折治癒障害についての不良な予後診断を表す参照値からのそのような偏差の非存在は、被験者が骨折治癒障害を有する又は骨折治癒障害を発生するリスクがあることをそれぞれ示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての不良な予後診断を示しうる。骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す参照値は、例えば、健常状態、即ち、骨折を伴わない状態を表しうる、又は、骨折治癒障害ではない骨折を伴う状態を表しうる。骨折治癒障害の予測又は診断を表す参照値は、例えば、疾患状態、即ち、骨折治癒障害を伴う状態を表しうる。
【００１６】
好ましくは、しかし、限定を伴わず、本発明者らは、骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す、より好ましくは、健常状態又は正常に治癒する骨折を表す、あるいは、骨折治癒障害についての良好な予後診断を表すそれぞれの参照値と比較した、被験者からのサンプル中での、特に、被験者からの血清又は血漿中でのＳＤＦ−１の低下量、ＰＤＧＦ−ＢＢの低下量、ＩＬ−８の上昇量、及び／又はＩＬ−６の上昇量が、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒についての不良な予後診断を示しうることを理解している。
【００１７】
好ましくは、しかし、限定を伴わず、本発明者らは、骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す、より好ましくは、健常状態又は正常に治癒する骨折を表す、あるいは、骨折治癒障害についての良好な予後診断を表すそれぞれの参照値と比較した、被験者からのサンプル中での、特に、被験者から得られた培養骨芽細胞又は間葉系幹細胞の上清中でのＳＤＦ−１の低下量及び／又はＩＬ−６の低下量が、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒についての不良な予後診断を示しうることを理解している。
【００１８】
本明細書において教示する通りに、被験者において骨折治癒障害をモニタリングするための又は骨折治癒障害を発生する確率をモニタリングするための方法は、好ましい実施態様において、以下の工程を含む：（ｉ）被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数の量を、２つ又はそれ以上の連続的な時間点で測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間で比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間での偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；（ｉｖ）前記の偏差を見出すこと又は偏差を見出さないことを、被験者における２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間での骨折治癒障害における変化又は骨折治癒障害を発生する確率における変化に帰すること。好ましくは、本明細書において教示する通りに、被験者において骨折治癒障害をモニタリングするための又は骨折治癒障害を発生するリスクをモニタリングするための方法は、以下の工程を含みうる：（ｉ）被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を、２つ又はそれ以上の連続的な時間点で測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間で比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間での偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；（ｉｖ）前記の偏差を見出すこと又は偏差を見出さないことを、被験者における２つ又はそれ以上の連続的な時間点の間での骨折治癒障害における変化又は骨折治癒障害を発生するリスクにおける変化に帰すること。
【００１９】
好ましくは、しかし、限定を伴わず、本発明者らは、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点のより遅い点で、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点のより早期の点でのそれぞれの量と比較し、被験者からのサンプル中での、特に、被験者からの血清又は血漿中でのＳＤＦ−１の低下量、ＰＤＧＦ−ＢＢの低下量、ＩＬ−８の上昇量、及び／又はＩＬ−６の上昇量が、骨折治癒障害を発生する被験者のリスクが増加していることを示しうることを理解している。
【００２０】
好ましくは、しかし、限定を伴わず、本発明者らは、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点のより遅い点で、前記の２つ又はそれ以上の連続的な時間点のより早期の点でのそれぞれの量と比較し、被験者からのサンプル中での、特に、被験者から得られた培養骨芽細胞又は間葉系幹細胞の上清中でのＳＤＦ−１の低下量及び／又はＩＬ−６の低下量が、骨折治癒障害を発生する被験者のリスクが増加していることを示しうることを理解している。
【００２１】
また、開示するのは、被験者が、前記被験者からのサンプル中でのＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数のレベルを測定することを含む、骨折治癒障害の治療的又は予防的（防止的）処置の必要があるか又はないか（例えば、例、依然としてある、又は、もはやないか）を決定するための方法である。好ましい実施態様において、この方法は、以下の工程を含みうる：（ｉ）被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数の量を測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す参照値と比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、参照値からの偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；（ｉｖ）骨折治癒障害の治療的又は予防的処置についての必要性の存在又は非存在を見出すことから推論すること。好ましくは、骨折治癒障害の治療的又は予防的処置の必要があるか又はないかを決定するための方法は、前記被験者からのサンプル中でのＩＬ−８のレベルを測定することを含みうるが、好ましくは、以下の工程を含みうる：（ｉ）被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定すること；（ｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量を、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す参照値と比較すること；（ｉｉｉ）（ｉ）において測定された通りの量の、参照値からの偏差を見出すこと又は偏差を見出さないこと；（ｉｖ）骨折治癒障害の治療的又は予防的処置についての必要性の存在又は非存在を見出すことから推論すること。処置は、特に、この方法が、被験者が骨折治癒障害を有する又は骨折治癒障害を有するリスクがある又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を有するとの結論を許す場合に示されうる。
【００２２】
この文脈において、さらに開示するのは、被験者において骨折治癒障害の治療的又は予防的処置の転帰を決定するための方法であって、前記被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６の任意の１つ又は複数のレベル、好ましくはＩＬ−８のレベルを測定することを含む。
【００２３】
本方法の好ましい実施態様において、骨折治癒障害は、変形癒合骨折、癒合遅延骨折、及び癒合不能骨折からなる群より選択されうる。
【００２４】
骨折治癒障害の処置は、とりわけ、非侵襲的な処置、例えば、例、電気刺激、超音波、又は特殊ブレースなど）、及び侵襲的な措置、例えば、例、壊死組織の外科的切除、内部ブレース（例、ロッド、プレート、又はスクリュー）の挿入、骨移植片の挿入、１つ又は複数の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の注入、あるいは、さらなる傷害を防止するための切断術を含む。
【００２５】
好ましくは、しかし、限定を伴わず、本発明者らは、骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す、より好ましくは、健常状態を表す、あるいは、骨折治癒障害についての良好な予後診断を表すそれぞれの参照値と比較した、被験者からのサンプル中での、特に、被験者からの血清又は血漿中でのＳＤＦ−１の低下量、ＰＤＧＦ−ＢＢの低下量、ＩＬ−８の上昇量、及び／又はＩＬ−６の上昇量が、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要とすることを示しうることを理解している。
【００２６】
好ましくは、しかし、限定を伴わず、本発明者らは、骨折治癒障害無しの予測又は診断を表す、より好ましくは、健常状態を表す、あるいは、骨折治癒障害についての良好な予後診断を表すそれぞれの参照値と比較した、被験者からのサンプル中での、特に、被験者から得られた培養骨芽細胞又は間葉系幹細胞の上清中でのＳＤＦ−１の低下量及び／又はＩＬ−６の低下量が、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要とすることを示しうることを理解している。
【００２７】
ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の任意の１つ又は複数は、骨折治癒障害（骨折前及び／又は骨折後）におけるそれらの診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリング値を呈しうる。非限定的な実施態様において、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の任意の１つ又は複数は、特に、骨折時と骨折後約４０ヶ月の間、例えば、骨折後約１、２、３、及び／又は４週間目、ならびに／あるいは骨折後約１〜４ヶ月、約５〜８ヶ月、約９〜１２ヶ月、約１３〜１６ヶ月、約１７〜２０ヶ月、約２１〜２４ヶ月、約２５〜２８ヶ月、約２９〜３２ヶ月、約３３〜３６ヶ月、及び／又は約３７〜４０ヶ月目などに、被験者において評価されうる。
【００２８】
本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つを、好ましくは、骨折治癒障害のための１つ又は複数の他の診断措置、例えば、限定を伴わず、従来の放射線学的技術及び撮像技術（Ｘ線、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、超音波撮像を含む）と組み合わせてもよく、又はそれを補完してもよく、又はそれと同じ時間に予定してもよい。
【００２９】
本明細書において開示するバイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つ又は複数は、特に、骨折治癒障害を発生するリスクがある（例えば、骨折治癒障害についての１つ又は複数のリスク因子を有する）ことが公知である又は予測される被験者において有用でありうる。限定を伴わず、骨折治癒障害に関連付けられるリスク因子は、骨治癒に干渉しうる生活習慣及び健康因子、例えば、とりわけ、喫煙、過度のアルコール使用、不良な栄養状態、不良な一般的健康、運動不足、及び糖尿病など；骨強度の喪失に寄与しうる因子、例えば、とりわけ、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）の使用、免疫抑制薬物の使用、他の薬物、例えば抗痙攣薬など、及び甲状腺ホルモン補充、チロキシン；骨折の型及び部位、例えば不良な血管部位における骨折、骨折部位での不安定性、高エネルギー外傷、及び骨周囲の軟組織の不良な状態；祖先、例えば骨粗鬆症についての増加リスクを有する欧州又はアジアの祖先の個人など；年齢、例えば不良な骨治癒についての増加リスクにある高齢個人など；早期閉経、遅い初潮、又は卵巣の喪失を経験している、及び、骨虚弱についての増加リスクにある女性などを含む。
【００３０】
実施態様において、本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つ又は複数を、被験者における骨折治癒障害についての１つ又は複数のリスク因子の存在もしくは非存在及び／又はレベルの決定を用いて補完しうる又はそれと組み合わせうる。
【００３１】
本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つは、好ましくは、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、又は少なくとも８０%、例、≧８５%又は≧９０%又は≧９５%、例、約８０%〜１００%の間又は約８５%〜９５%の間の感度及び／又は特異性（好ましくは、感度及び特異性）を許しうる。
【００３２】
本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つは、骨折治癒障害を有するとしてまだ診断されていない（例えば、防止的スクリーニング）、又は骨折に供されている、又は骨折治癒障害を有するとして診断されている、又は骨折治癒障害を有することが疑われる（例えば、１つ又は複数の特徴的な徴候及び／又は症状を呈する）、又は骨折治癒障害を発生するリスクにある（例えば、遺伝的素因；１つ又は複数の発生的、環境的、又は行動的なリスク因子の存在）被験者に適用されうる。本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つを、また、使用し、骨折治癒障害の進行又は重症度の種々の段階を検出し；予防的もしくは治療的処置又は他の介入への骨折治癒の反応を検出し；医療従事者が、骨折治癒障害からの被験者の悪化、現状維持、部分的回復、又は完全回復を決定する際に助け、さらなる処置又は観察又は医療センターからの被験者の退院のいずれかをもたらしうる。また、本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つを、集団スクリーニング、例えば、例、一般的集団における、あるいは１つ又は複数の基準（例、年齢、祖先、職業、骨折治癒障害のリスク因子の存在又は非存在など）に基づいて階層化された集団におけるスクリーニングなどのために用いてもよい。
【００３３】
本バイオマーカー、使用、及び方法の任意の１つは、また、骨折治癒障害について関連する１つ又は複数の他のバイオマーカー、徴候、症状、及び／又は臨床パラメーターの評価を用いてさらに補完される又はそれと組み合わされることから利益を得うる。例及び非限定によって、骨折治癒障害を評価する際に潜在的に有用であり、その量が、有利には、本使用及び方法において測定されうるバイオマーカーは、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の他のアイソフォーム（他のアイソフォーム）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の任意の１つ又は複数を含み、それらのレベルは、骨折治癒障害の患者において減少していることが報告されている（Brownlow et al.2001;Weiss S et al. 2009; Zimmermann et al.2005；全て上記）。
【００３４】
故に、特定の実施態様において提供するのは、被験者からのサンプル中のＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、及びＢＭＰの任意の１つ又は複数のレベルを測定することをさらに含む、本明細書において定義する通りの使用及び方法である。
【００３５】
また、特定の実施態様において意図するのは、被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、及びＢＭＰの任意の１つ又は複数のレベルを測定することをさらに含む、本明細書において定義する通りの使用及び方法である。
【００３６】
本バイオマーカーの任意の１つ又は複数のそれぞれの量を、別々に及び個々に評価してもよく、即ち、各々の量を、その対応する参照値と比較する。そうでなければ、本バイオマーカーの任意の２つ又はそれ以上の量を使用し、バイオマーカープロファイルを確立してもよく、それは、対応するマルチパラメーター参照値と適切に比較することができる。あるいは、任意の２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量は、各々、適当な重み係数により調節し、加算し、単一の値をもたらしうるが、それは、次に、それに従って得られた対応する参照値と適切に比較することができる。人は、そのような重み係数が、バイオマーカーを定量するために使用される方法論に依存しうること、及び、各々について、特定の実験設定が決定され、骨折治癒障害の診断、予測、及び／又は予後診断についての適切なモデル中に含まれることを認めるはずである。
【００３７】
参照値は、本明細書において用いる通り、他のバイオマーカーについて以前に用いられた公知の手順に従って確立されうる。参照値は、本明細書において教示する使用及び方法内（即ち、その工程を構成する）又は外（即ち、その工程を構成しない）のいずれかで確立されうる。したがって、本明細書において教示する使用又は方法の任意の１つは、必須の参照値を確立する工程を含みうる。
【００３８】
故に、また、提供するのは、本明細書において教示する通りの任意の１つ又は複数のバイオマーカーについての参照値を確立するための方法であって、前記参照値は、
（ａ）骨折治癒障害の非存在の予測もしくは診断又は骨折治癒障害についての良好な予後診断、あるいは
（ｂ）骨折治癒障害の予測もしくは診断又は骨折治癒障害についての不良な予後診断
を表し、
（ｉ）以下：
（ｉａ）骨折治癒障害を有さない又は骨折治癒障害を有するリスクのない又は骨折治癒障害についての良好な予後診断を有する１つ又は複数の被験者、あるいは
（ｉｂ）骨折治癒障害を有する又は骨折治癒障害を有するリスクのある又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を有する１つ又は複数の被験者
からのサンプル中の１つ又は複数のバイオマーカーの量を測定すること、及び
（ｉｉａ）（ｉａ）において測定された１つ又は複数のバイオマーカーの量から、骨折治癒障害の非存在の予測もしくは診断を表す又は骨折治癒障害についての良好な予後診断を表す参照値を確立すること、あるいは
（ｉｉｂ）（ｉｂ）において測定された１つ又は複数のバイオマーカーの量から、骨折治癒障害の予測もしくは診断を表す又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を表す参照値を確立することを含む、方法。
【００３９】
好ましくは、また、本明細書において提供するのは、ＩＬ−８についての参照値を確立するための方法であって、前記参照値は、
（ａ）骨折治癒障害の非存在の予測もしくは診断又は骨折治癒障害についての良好な予後診断、あるいは
（ｂ）骨折治癒障害の予測もしくは診断又は骨折治癒障害についての不良な予後診断
を表し、
（ｉ）以下：
（ｉａ）骨折治癒障害を有さない又は骨折治癒障害を有するリスクのない又は骨折治癒障害についての良好な予後診断を有する１つ又は複数の被験者、あるいは
（ｉｂ）骨折治癒障害を有する又は骨折治癒障害を有するリスクのある又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を有する１つ又は複数の被験者
からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定すること、及び
（ｉｉａ）（ｉａ）において測定されたＩＬ−８の量から、骨折治癒障害の非存在の予測もしくは診断を表す又は骨折治癒障害についての良好な予後診断を表す参照値を確立すること、あるいは
（ｉｉｂ）（ｉｂ）において測定されたＩＬ−８の量から、骨折治癒障害の予測もしくは診断を表す又は骨折治癒障害についての不良な予後診断を表す参照値を確立することを含む、方法。
【００４０】
好ましい実施態様において、本使用及び方法は、本明細書において教示する通りの１つ又は複数のバイオマーカーの全身量を測定しうる。好ましくは、本使用及び方法は、ＩＬ−８の全身量を測定することを含みうる。１つ又は複数のバイオマーカー、好ましくはＩＬ−８の全身量を、全血又はその分画成分（例えば、好ましくは、血漿又は血清など）を含む、それから本質的になる又はなるサンプル中で適切に評価しうる。
【００４１】
他の実施態様において、本使用及び方法は、本明細書において教示する通りの１つ又は複数のバイオマーカーの局所量を、損なわれた治癒骨折の部位で測定しうる。好ましくは、本使用及び方法は、損なわれた治癒骨折の部位で、ＩＬ−８の局所量を測定しうる。１つ又は複数のバイオマーカー、好ましくはＩＬ−８の局所量を、骨折治癒障害の部位から除去された組織（例えば、生検又は他の組織回収技術により得られた組織など）を含む、それから本質的になる又はなるサンプル中で適切に決定しうる。
【００４２】
他の実施態様において、本使用及び方法は、本明細書において教示する通りの１つ又は複数のバイオマーカーの骨髄量を、骨髄収集の異なる部位で測定しうる。好ましくは、本使用及び方法は、骨髄収集の異なる部位でＩＬ−８の骨髄量を測定しうる。骨髄は、被験者における損なわれた治癒骨折を有する骨から、又は前記の損なわれた治癒骨折から離れた部位から得られうる。
【００４３】
さらなる実施態様において、本使用及び方法は、本明細書において教示する通りの１つ又は複数のバイオマーカーの量を、細胞中で又は被験者から得られ、その後にインビトロで培養された細胞の上清中で測定しうる。好ましくは、本使用及び方法は、細胞中又は被験者から得られ、その後にインビトロで培養された細胞の上清中のＩＬ−８の量を測定することを含みうる。好ましくは、細胞は、骨組織細胞又は前駆細胞、より好ましくは、骨芽細胞（ＯＢ）又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）でありうる。好ましくは、バイオマーカーは、細胞の一次及び／又はさらなる（例、二次、三次など）培養中で測定されうる。細胞は、被験者における損なわれた治癒骨折の部位から、又は前記の損なわれた治癒骨折から離れた部位から得られうる。
【００４４】
さらに開示するのは、キット、特に、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのキットであって、このキットは、（ｉ）特に被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の任意の１つ又は複数の量を測定するための手段、ならびに（ｉｉ）場合により及び好ましくは、１つ又は複数の参照値あるいは前記の１つ又は複数の参照値を確立するための手段を含み、それにおいて、前記の１つ又は複数の参照値は、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す。
【００４５】
バイオマーカーの量を測定するための手段は、前記バイオマーカーに特異的に結合することが可能な１つ又は複数の結合薬剤を含みうる。例示的な結合薬剤は、ハイブリダイゼーション（オリゴヌクレオチド）プローブ、増幅プライマー、抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、又は小分子を含みうる。結合薬剤は、有利には、固相又は支持体上に固定化されうる。
【００４６】
開示するのは、このように、また、キット、特に、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのキットであって、このキットは、（ｉ）特に被験者からのサンプル中のＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の任意の１つ又は複数の量に特異的に結合することが可能である１つ又は複数の結合薬剤、（ｉｉ）好ましくは、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の前記の任意の１つ又は複数の公知の量又は濃度（例えば、コントロール、スタンダード、及び／又はキャリブレーターとしての使用のためなど）、（ｉｉｉ）場合により及び好ましくは、１つ又は複数の参照値あるいは前記の１つ又は複数の参照値を確立するための手段を含み、それにおいて、前記の１つ又は複数の参照値は、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す。（ｉ）及び／又は（ｉｉ）下の前記成分は、本明細書において他に教示する通りに、適切に標識されうる。
【００４７】
好ましい実施態様において、このキットは、家庭で又は臨床現場における使用のための、ポータブルデバイス（例えばベッドサイドデバイスなど）として構成されうる。
【００４８】
被験者からサンプルを採取するための手段又はツール、例えば、抗凝固薬剤を含む従来の血液採取チューブなどが、本明細書において開示するキットから別々に提供されうる又はその中に含まれうることが認められるはずである。
【００４９】
さらに開示するのは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングについて本明細書において記載する通りの、任意の１つのキットの使用である。
【００５０】
好ましくは、提供するのは、被験者における骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのためのキットの使用であって、このキットは、（ｉ）特に被験者からのサンプル中のＩＬ−８の量を測定するための手段、ならびに（ｉｉ）場合により及び好ましくは、１つ又は複数の参照値あるいは前記の１つ又は複数の参照値を確立するための手段を含み、それにおいて、前記の１つ又は複数の参照値は、骨折治癒障害の公知の診断、予測、及び／又は予後診断を表す。さらに提供するのは、本明細書において教示する通りの使用であって、それにおいて、被験者からサンプルを採取するための手段は、キットから別々に提供される又はその中に含まれる。
【００５１】
また、開示するのは、本明細書において教示する通りの任意の１つ又は複数のバイオマーカーを測定するために有用な試薬及びツールである。故に、開示するのは、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の任意の１つ、好ましくは任意の２つ、好ましくは任意の３つ、より好ましくは全て４つを含む、核酸のアレイもしくはマイクロアレイ又はタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのアレイもしくはマイクロアレイである。また、開示するのは、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６の任意の１つ、好ましくは任意の２つ、好ましくは３つ、より好ましくは全て４つに特異的に結合することが可能な１つ又は複数の結合薬剤を含む、好ましくは、前記の１つ又は複数の結合薬剤の公知の量又は濃度を含む、結合薬剤のアレイ又はマイクロアレイである。
【００５２】
さらに開示するのは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングについて本明細書において記載する通りの、任意の１つのアレイ又はマイクロアレイの使用である。
【００５３】
好ましくは、提供するのは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための核酸のアレイもしくはマイクロアレイ又はタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのアレイもしくはマイクロアレイの使用であって、前記のアレイ又はマイクロアレイは、ＩＬ−８をコードする又はＩＬ−８を含む核酸を含む。好ましくは、また、提供するのは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための結合薬剤のアレイ又はマイクロアレイの使用であって、前記のアレイ又はマイクロアレイは、ＩＬ−８に特異的に結合することが可能な１つ又は複数の結合薬剤を含み、好ましくは、前記の１つ又は複数の結合薬剤の公知の量又は濃度を含む。
【００５４】
本発明の上記の及びさらなる側面ならびに好ましい実施態様を、以下のセクション中に及び添付の請求項において記載する。添付の請求項の対象物が、本明細書により、本明細書中に具体的に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】図１は、癒合不能患者（ＮＵ）の群を健常コントロール（ＨＶ）と比較する実験におけるＳＤＦ−１の血漿レベルを例示する、（Ａ）全てのサンプル（ＨＶ、ｎ＝４９；ＮＵ、ｎ＝１５）、（Ｂ）血漿がヘパリンチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝２６；ＮＵ、ｎ＝１１）、（Ｃ）血漿がＥＤＴＡチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝４０；ＮＵ、ｎ＝５）。
【図１Ｂ】図１は、癒合不能患者（ＮＵ）の群を健常コントロール（ＨＶ）と比較する実験におけるＳＤＦ−１の血漿レベルを例示する、（Ａ）全てのサンプル（ＨＶ、ｎ＝４９；ＮＵ、ｎ＝１５）、（Ｂ）血漿がヘパリンチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝２６；ＮＵ、ｎ＝１１）、（Ｃ）血漿がＥＤＴＡチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝４０；ＮＵ、ｎ＝５）。
【図１Ｃ】図１は、癒合不能患者（ＮＵ）の群を健常コントロール（ＨＶ）と比較する実験におけるＳＤＦ−１の血漿レベルを例示する、（Ａ）全てのサンプル（ＨＶ、ｎ＝４９；ＮＵ、ｎ＝１５）、（Ｂ）血漿がヘパリンチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝２６；ＮＵ、ｎ＝１１）、（Ｃ）血漿がＥＤＴＡチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝４０；ＮＵ、ｎ＝５）。
【図２】図２は、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝９）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝２０）と比較する実験におけるＰＤＧＦ−ＢＢの血清レベルを例示する。
【図３】図３は、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝４）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝１８）と比較する実験におけるＩＬ−８の血清レベルを例示する。
【図４】図４は、癒合不能患者（ＮＵ；ｎ＝１３）の群を健常コントロール（ＨＶ；ｎ＝２９）と比較する実験におけるＩＬ−６の血清レベルを例示する。
【図５Ａ】図５Ａは、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝６）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝９）と比較する骨芽細胞（ＯＢ）培養の上清中でのＳＤＦ−１のレベルを例示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝６）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝９）と比較する間葉細胞（ＭＳＣ）培養の上清中でのＳＤＦ−１のレベルを例示する。
【図６】図６は、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝６）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝１０）と比較する骨芽細胞（ＯＢ）培養の上清中でのＩＬ−６のレベルを例示する。
【００５６】
発明の詳細な説明
本明細書において使用する通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別を指示しない場合、単数形及び複数形の両方の参照を含む。
【００５７】
用語「含んでいる(comprising)」、「含む(comprises)」、及び「からなる(comprised of)」は、本明細書において使用する通り、「含んでいる(including)」、「含む(includes)」又は「含んでいる(containing)」、「含む(contains)」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の非列挙部材、要素、又は方法工程を除外しない。この用語は、また、「からなる(consisting of)」及び「から実質的になる(consisting essentially of)」を包含する。
【００５８】
エンドポイントによる数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含される全ての数字及び分数、ならびに列挙エンドポイントを含む。
【００５９】
用語「約」は、本明細書において使用する通り、測定可能な値（例えばパラメーター、量、時間的期間など）に言及する場合、特定値の及びそれからの変動、特に、特定値の及びそれからの＋／−１０%又はそれ以下、好ましくは＋／−５%又はそれ以下、より好ましくは＋／−１%又はそれ以下、及びさらにより好ましくは＋／−０．１%又はそれ以下の変動を包含することを意味する（そのような変動が、開示する発明において実施することが適当である限りにおいて）。修飾語「約」が言及する値は、それ自体が、また、具体的に、及び好ましくは、開示されると理解すべきである。
【００６０】
用語「１つ又は複数の」、例えば要素の群の１つ又は複数の要素などは、さらなる例証によって、それ自体が明かであるのに対し、この用語は、とりわけ、前記要素の任意の１つ又は前記要素の任意の２つ又はそれ以上、例えば、前記要素の任意の≧３、≧４、≧５、≧６、又は≧７など、及び全ての前記要素までを包含する。
【００６１】
本明細書において引用する全ての文書は、それにより、それらの全体において参照により組み入れられる。
【００６２】
他に特定しない限り、本発明を開示する際に使用する全ての用語（技術的及び科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野における当業者により一般に理解される通りの意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより良く認めるために含まれうる。
【００６３】
本発明者らは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための新規の有用なバイオマーカーとして、ストローマ由来因子１（ＳＤＦ−１）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）を同定した。特に、本発明者らは、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングのための新規の有用なバイオマーカーとしてＩＬ−８を同定した。
【００６４】
用語「バイオマーカー」は、当技術分野において広く用いられており、被験者における定性的及び／又は定量的な評価が、単独、あるいは、被験者の表現型及び／又は遺伝子型の１つ又は複数の側面に関して、例えば、所与の疾患又は状態に関する被験者の状態に関して予測的及び／又は情報的（例、予測的、診断的、及び／又は予後診断的）な他のデータと組み合わされて、生物学的分子及び／又はその検出可能な部分を広く表示しうる。特に、バイオマーカーは、本明細書において意図する通り、ＲＮＡベース（特にｍＲＮＡベース）でありうる、又は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドベースでありうる。
【００６５】
用語「癒合不能骨折」、「骨折癒合不能」、「癒合不能」、又は「ＮＵ」は、互換的に、種々の因子に起因し、正常な期間において治癒しない骨折に関する。ＮＵは、とりわけ、堅固な癒合不能及び不安定な癒合不能又は偽関節を含む。用語「変形癒合骨折」、「骨折変形癒合」、又は「変形癒合」は、互換的に、先に断片化した骨の不完全な癒合に関する。用語「癒合遅延骨折」又は「癒合遅延」は、互換的に、治癒が予定時間中に生じていない、転帰が不確かなままである骨折に関する。癒合不能骨折、変形癒合骨折、及び癒合遅延骨折は、本明細書において、用語「骨折治癒障害(impaired bone fracture healing)」又は「骨折治癒障害(impaired fracture healing)」により包含される。骨折治癒障害は、故に、治癒を刺激するための治療介入の特定の形態を要求する。
【００６６】
骨折治癒障害が診療において結論付けられる期間は、特定の骨折に依存して変動するが、しかし、傷害後６ヶ月までに治癒しない骨折は、治療介入なしで治癒しないことが一般的に受け入れられている。また、骨折が傷害後３ヶ月までに治癒に向かって進行する徴候を示さない場合、又は、単純に、骨折が、経験豊富な骨折外科医がそれが治癒すると予測しうる時間内に治癒しなかった場合、骨折治癒障害となると結論付けられることが示唆されている。
【００６７】
本明細書を通した疾患又は状態への参照は、本明細書において開示する通りの任意のそのような疾患又は状態を包含し（特定の列挙の文脈と一致する限りにおいて）、より具体的には、骨折治癒障害を包含する。
【００６８】
用語「予測する」又は「予測」、「診断する」又は「診断」、及び「予後診断する」又は「予後診断」は、医学的及び臨床的診療においてありきたりな語であり、十分に理解される。所与の疾患又は状態の語句「診断、予測、及び／又は予後診断のための方法」は、また、用語、例えば、前記の疾患又は状態の「診断する、予測する、及び／又は予測診断するための方法」あるいは前記の疾患又は状態の「診断、予測、及び／又は予後診断を作成する（又は決定するもしくは確立する）ための方法」などと交換してもよいことを理解すべきである。
【００６９】
さらなる説明によって、及び、限定を伴わず、「予測する」又は「予測」は、一般的に、疾患又は状態を（まだ）有さない被験者における疾患又は状態の事前の宣告、表示、又は予知を指す。例えば、被験者における疾患又は状態の予測は、被験者が前記の疾患又は状態を、例えば、特定の期間内に又は特定の年齢までに発生する確率、可能性、又はリスクを示しうる。前記の確率、可能性、又はリスクは、とりわけ、絶対値、範囲、又は統計値として示されうる、あるいは、適切なコントロール被験者又は被験者集団と比べて（例えば、例、一般的で、正常又は健常な被験者もしくは被験者集団と比べて）示されうる。故に、被験者が疾患又は状態を発生する確率、可能性、又はリスクは、有利には、適切なコントロール被験者又は被験者集団と比べて、増加したもしくは減少したとして、又は倍増加したもしくは倍減少したとして示されうる。本明細書において使用する通り、被験者における本明細書において教示する通りの用語状態又は疾患の「予測」は、また、特に、被験者が、そのようなものの「陽性」予測を有すること、即ち、被験者がそのようなものを有するリスクにあること（例、リスクが、コントロール被験者又は被験者集団に対して有意に増加している）を意味しうる。被験者における本明細書において教示する通りの用語疾患又は状態の「無しの予測」は、本明細書において記載する通り、特に、被験者が、そのようなものの「陰性」予測を有すること、即ち、そのようなものを有する被験者のリスクが、コントロール被験者又は被験者集団に対して有意に増加していないことを意味しうる。
【００７０】
用語「診断する」又は「診断」は、一般的に、症状及び徴候に基づき、及び／又は種々の診断手順の結果から（例えば、診断された疾患又は状態に特徴的な１つ又は複数のバイオマーカーの存在、非存在、及び／又は量を知ることから、など）、被験者における疾患又は状態を認識し、それを決める、又は結論付ける過程又は行為を指す。本明細書において使用する通り、被験者における本明細書において教示する通りの疾患又は状態「の診断」は、特に、被験者がそのようなものを有する、故に、そのようなものを有するとして診断されることを意味しうる。被験者における本明細書において教示する通りの疾患又は状態「の無の診断」は、特に、被験者がそのようなものを有さない、故に、そのようなものを有さないとして診断されることを意味しうる。被験者は、１つ又は複数の従来の症状あるいはそのようなものを連想させる徴候を呈するにもかかわらず、そのようなものを有していないと診断されうる。
【００７１】
用語「予後診断する」又は「予後診断」は、一般的に、疾患又は状態の進行に関する予測及び回復の見込み（例、確率、持続、及び／又は程度）を指す。本明細書において教示する疾患又は状態の良好な予後診断は、一般的に、好ましくは許容可能な期間内での、疾患又は状態からの満足な部分的又は完全回復の予測を包含しうる。そのようなものの良好な予後診断は、一般に、好ましくは所与の期間内での、そのようなもののさらなる悪化又は憎悪がないことの予測を包含しうる。本明細書において教示する通りの疾患又は状態の不良な予後診断は、一般的に、標準以下の回復及び／又は不満足な遅い回復、あるいはそのようなものの実質的な無回復又はさらなる悪化さえの予測を包含しうる。
【００７２】
故に、疾患又は状態の予測又は予後診断は、とりわけ、疾患もしくは状態の出現の予後診断を予測する又は作成する、あるいは疾患もしくは状態の進行、憎悪、軽減、もしくは再発又は処置もしくは他の外的もしくは内的因子、状況、もしくはストレッサーなどへの反応の予後診断を予測する又は作成することを許すことができる。
【００７３】
さらに、疾患又は状態をモニタリングすることは、とりわけ、疾患もしくは状態の出現を予測する、あるいは疾患もしくは状態の進行、憎悪、軽減、もしくは再発又は処置もしくは他の外的もしくは内的因子、状況、もしくはストレッサーなどへの反応をモニタリングすることを許すことができる。有利には、モニタリングを、被験者の医学的処置、好ましくは、そのようにモニタリングされた疾患又は状態を軽減することを目的とした医学的処置の経過において適用しうる。そのようなモニタリングは、例えば、患者が、退院してもよいか、処置における変化を必要とするか、又はさらなる入院を必要とするかの意志決定において含まれうる。本明細書において意図する通り、疾患又は状態のモニタリングへの参照は、また、具体的には、疾患又は状態を発生する被験者の確率、リスク、又は可能性のモニタリング、即ち、前記の確率、リスク、又は可能性における変化を経時的にモニタリングすることを含む。
【００７４】
用語「被験者」又は「患者」は、本明細書において使用する通り、典型的には及び好ましくは、ヒトを表示するが、しかし、また、非ヒト動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物（例えば、例、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）への参照を包含しうる。特に意図されるのは、骨折に苦しんできたことが公知である又は疑われる被験者であって、より特に、それにおいて、骨折は治癒されていない（例、放射線学的研究により確立されている通り）。適切な被験者は、治癒していない骨折又は骨折の損なわれた治癒を示している症状及び徴候を医師に提示する者を含みうる。
【００７５】
用語「サンプル」又は「生物学的サンプル」は、本明細書において使用する通り、被験者から得られた任意の生物学的標本を含む。例示的な生物学的標本は、限定を伴わず、全血、血漿、血清、赤血球、白血球細胞（例、末梢血単核細胞）、全骨髄、骨髄由来の血清及び幹細胞、唾液、尿、便（即ち、糞便）、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、乳管洗浄液、腫瘍滲出液、関節液、脳脊髄液、リンパ液、穿刺吸引液、羊水、任意の他の体液、切り落とした爪、細胞溶解物、細胞分泌産物、炎症液、膣分泌物、生検、骨生検、骨組織、組織ホモジネートなどを含む。好ましいサンプルは、本明細書において教示する通りの任意の１つ又は複数のバイオマーカーを検出可能な量で含むものを含みうる。より好ましいサンプル（特にバイオマーカーの全身レベルの決定のため）は、全血又はその分画成分（例えば、特に好ましくは、血漿又は血清など）を含む。一部の実施態様において、サンプルは、細胞又は細胞上清を含みうる又はそれにより表されうるが、前記細胞（好ましくは、ＭＳＣ又はＯＢ）は、被験者から得られ、その後にインビトロで培養されている。好ましくは、細胞は、一次及び／又は二次培養の間に評価されうる。好ましくは、サンプルは、最小限に侵襲的な方法により容易に入手可能であり、前記サンプルを被験者から除去又は単離することを許す。
【００７６】
分子又は分析物（例えば代謝物、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドなど）は、前記分子もしくは分析物の又は分子もしくは分析物の前記群の存在又は非存在及び／又は量を、サンプル中で検出又は決定する場合（好ましくは、実質的に、他の分子及び分析物の排除まで）、サンプル中で「測定」される。例えば、バイオマーカーは、それをコードするｍＲＮＡを測定することにより、あるいは、コードされたタンパク質もしくはポリペプチド又はそのペプチドを測定することにより測定されうる。
【００７７】
用語「量(quantity)」、「量(amount)」、及び「レベル」は同義であり、一般的に当技術分野において十分に理解されている。分子又は分析物に関して、これらの用語は、特に、サンプル中の分子又は分析物の絶対的定量を、あるいはサンプル中の分子又は分析物の相対的定量（即ち、他の値と比べて、例えば本明細書において教示する通りの参照値と比べて）、あるいはバイオマーカーのベースライン発現を示している値の範囲を指しうる。これらの値又は範囲は、単一の患者から、又は患者の群から得ることができる。
【００７８】
サンプル中の分子又は分析物の絶対量は、有利には重量として又はモル、あるいは、より一般に濃度（例、容積当たりの重量又は容積当たりのモル）として表現されうる。
【００７９】
サンプル中の分子又は分析物の相対量は、有利には前記の別の値と比べた、例えば本明細書において教示する通りの参照値と比べて、増加もしくは減少として又は倍増加もしくは倍減少として表現されうる。第１と第２の変量（例、第１と第２の量）の間の相対的な比較を実施することは、しかし、前記の第１と第２の変量の絶対値を最初に決定することを要求する必要はないであろう。例えば、測定方法は、前記の第１及び第２の変量についての定量可能な読み出し（例えば、例、シグナル強度など）を産生することができ、それにおいて、前記の読み出しは、前記変量の値の関数であり、及び、それにおいて、前記の読み出しを直接的に比較し、第１変量対第２変量についての相対値を、最初に読み出しを、それぞれの変量の絶対値に変換する実際の必要を伴わず、産生することができる。
【００８０】
本明細書において使用する通り、任意の１つのバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドへの参照は、当技術分野におけるそれぞれの命名の下で一般に公知のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに対応する。これらの用語は、任意の生物の（見出される場合）、特に動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む）、さらにより好ましくはヒトのそのようなバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを包含する。これらの用語は、特に、天然配列を伴うそのようなバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを包含し、即ち、それらのものは、一次配列が、自然において見出される又はそれに由来するバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドのものと同じである。当業者は、天然配列が、そのような種の間での遺伝的多様性に起因する、異なる種の間で異なりうることを理解する。さらに、天然配列は、所与の種内の正常な遺伝的多様性（変動）に起因する、同じ種の異なる個体の間で又はその内で異なりうる。また、天然配列は、転写後又は翻訳後修飾に起因する、同じ種の異なる個体の間で又はさらにはその内で異なりうる。バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの任意のそのような変異体又はアイソフォームを本明細書において意図する。したがって、天然において見出される又はそれに由来するバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの全配列を「天然」と考える。これらの用語は、生きた生物、器官、組織、又は細胞の部分を形成する場合、生物学的サンプルの部分を形成する場合、ならびに、そのような供給源から少なくとも部分的に単離される場合、バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを包含する。これらの用語は、また、組換え又は合成手段により産生される場合、バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを包含する。
【００８１】
本明細書において教示する通りの例示的なヒトバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、下に与えるＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）受入番号の下で注釈付きとされうる。当業者は、また、一部の例において、前記配列が、本明細書において教示する通りのバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの前駆体（例、プレタンパク質）のものでありうる、及び、成熟バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドから離れてプロセシングされる部分を含みうることを認めることができる。当業者は、さらに、１つだけ又は複数のアイソフォームが以下に列挙されうるが、全てのアイソフォームが意図されることを認めることができる。他に特定しない限り、下のエントリーを以下の形態において提示する：名称（コード；１つ又は複数の代表的なｍＲＮＡ配列（例、アイソフォーム）についてのＧｅｎｂａｎｋ受入番号、時期及びＧｅｎｂａｎｋ配列バージョンが続く；１つ又は複数の対応する代表的なｍＲＮＡ配列（例、アイソフォーム）についてのＧｅｎｂａｎｋ受入番号、時期及びＧｅｎｂａｎｋ配列バージョンが続く）：
【００８２】
ストローマ由来因子１ならびにアイソフォームα、β、γ、φ、及びε（ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２；ＮＭ＿１９９１６８．３、ＮＭ＿０００６０９．５、ＮＭ＿００１０３３８８６．２、ＮＭ＿００１１７８１３４．１；  ＮＰ＿９５４６３７．１、ＮＰ＿０００６００．１、ＮＰ＿００１０２９０５８．１、ＮＰ＿００１１７１６０５．１）
【００８３】
血小板由来成長因子ＢＢ、即ち、ＰＤＧＦＢベータポリペプチドのホモ二量体（ＰＤＧＦＢ；ＮＭ＿００２６０８．２、ＮＭ＿０３３０１６．２；ＮＰ＿００２５９９．１、ＮＰ＿１４８９３７．１）
【００８４】
インターロイキン８（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ８、ＧＣＰ−１、ＬＥＣＴ、ＬＵＣＴ、ＬＹＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、ＭＯＮＡＰ、ＮＡＦ、ＮＡＰ−１、又はＮＡＰ１；ＮＭ＿０００５８４．２；ＮＰ＿０００５７５．１）
【００８５】
インターロイキン６（ＩＬ−６、ＨＳＦ、ＨＧＦ、ＣＤＦ、ＢＳＦ２、又はＩＦＮＢ２；ＮＭ＿０００６００．３、ＮＰ＿０００５９１．１）
【００８６】
好ましくは、サンプルが全血又はその分画成分（例えば血漿又は血清など）である場合、任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは循環形態（即ち、非細胞又は膜結合形態）でありうる。
【００８７】
他に文脈から明らかでない限り、任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドへの本明細書における参照は、一般的に、また、前記のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの修飾形態を包含し、例えば発現後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化、メチル化、システイン化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンスルホキシド又はメチオニンスルホンへのメチオニンの酸化などを含む）を有する。
【００８８】
実施態様において、任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、ヒト、即ちそれらの一次配列が、自然発生するヒトバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの又はその中に存在する対応する一次配列と同じでありうる。故に、修飾語「ヒト」は、この関連において、その起源又は供給源よりもむしろ、それぞれのバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの一次配列に関する。例えば、そのようなバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、ヒト被験者のサンプル中に存在しうる又はそれから単離されうる、あるいは他の手段により（例、組換え発現、無細胞翻訳又は非生物学的ペプチド合成により）得られうる。
【００８９】
好ましくは、バイオマーカーは、本明細書において意図する通り、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドベースである。
【００９０】
任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドへの本明細書における参照は、また、それらのフラグメントを包含しうる。故に、任意の１つのバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを測定すること（又はその量を測定すること）への本明細書における参照は、バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを測定すること及び／又はそれらの１つ又は複数のフラグメントを測定することを包含しうる。例えば、任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド及び／又はその１つ又は複数のフラグメントを集合的に測定してもよく、測定量は、集合的に測定された種の合計量に対応するようにする。別の例において、任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド及び／又はそれらの１つもしくは複数のフラグメントは、各々、個々に測定されうる。
【００９１】
核酸の用語「フラグメント」は、一般的に、前記核酸の５’及び／又は３’末端欠失もしくは切断形態を指す。タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの用語「フラグメント」は、一般的に、前記タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端欠失もしくは切断形態を指す。限定を伴わず、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドのフラグメントは、前記核酸のヌクレオチド配列の又は前記タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５%、又は少なくとも約１０%、例、≧２０%、≧３０%、又は≧４０%、例えば、好ましくは≧５０%、例、≧６０%、≧７０%、又は≧８０%、あるいは、より好ましくは≧９０%又は≧９５%を表しうる。
【００９２】
一部の実施態様において、本明細書において開示するバイオマーカー又は他の試薬は、検出可能な標識を含みうる。用語「標識」は、検出可能な、及び、好ましくは、定量可能な読み出し又は特性を提供するために使用することができる、ならびに、目的の実体（例えばペプチドもしくはポリペプチド又は特異的結合薬剤）の部分に付着させることができる又はその部分を作ることができる任意の原子、分子、部分、又は生体分子を指す。標識は、質量分析的、分光学的、光学的、比色的、磁気的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により適切に検出可能でありうる。標識は、限定を伴わず、色素；放射標識、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど；電子密度試薬；酵素（例、イムノアッセイにおいて一般に使用される通りの西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）；結合部分、例えばビオチン、マルトースなど；ハプテン、例えばジゴキシゲニン、ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグなど；発光性、リン光、又は蛍光部分；質量タグ、及び、単独で又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により発光スペクトルを抑制又はシフトすることができる部分と組み合わせた蛍光色素を含む。標識：結合パートナー配置において利用することができる会合の例は、例えば、ビオチン：ストレプトアビジン、ｈｉｓタグ：金属イオン（例、Ｎｉ２＋）、マルトース：マルトース結合タンパク質を含みうる。
【００９３】
また、本明細書において熟慮されるのは、本明細書において教示する通りの任意のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの使用であって、場合により、（陽性）コントロールとしての検出可能な標識、スタンダード、又はキャリブレーター（ｃａｌｉｂａｔｏｒｓ）を、前記のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの定性的又は定量的検出アッセイ（測定方法）において、及び、特に、被験者において本明細書において教示する通りの疾患又は状態を診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングするためのそのような方法において含む。バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを、任意の形態において、とりわけ、沈殿物、真空乾燥、凍結乾燥物として、溶液中で、液体又は凍結として、又は共有結合的もしくは非共有結合的に固相、例えば、固体クロマトグラフィーマトリックス上又はガラスもしくはプラスチック又は他の適切な表面上（例、ペプチドアレイ及びマイクロアレイの一部として）などに固定化して、提供されうる。バイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、容易に調製されうるが、例えば、天然供給源から単離されうる、又は組換え的にもしくは合成的に調製されうる。
【００９４】
さらに開示するのは、本明細書において開示する通りのバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに特異的に結合することが可能である結合薬剤である。結合薬剤は、本明細書を通して意図する通り、とりわけ、ハイブリダイゼーションプローブ、増幅プライマー、抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、又は小分子を含みうる。結合薬剤は、適切に標識されうる。
【００９５】
用語「特異的に結合する」は、本明細書を通して使用する通り、薬剤（本明細書において「特異的結合薬剤としても表示される）が、１つ又は複数の所望の分子又は分析物に、無作為である又は無関係である他の分子の実質的な排除まで、場合により、構造的に関係する他の分子の実質的な排除まで結合することを意味する。用語「特異的に結合する」は、薬剤が、その意図した標的に排他的に結合することを必ずしも要求しない。例えば、薬剤は、結合の条件下でのそのような意図される標的についてのその親和性が、非標的分子についてのその親和性よりも少なくとも約２倍大きい、好ましくは少なくとも約５倍大きい、より好ましくは少なくとも約１０倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約２５倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約１００倍又はそれより大きい場合、目的の標的に特異的に結合すると言ってもよい。ハイブリダイゼーションプローブについては、特異的結合が、当技術分野において公知の通りに、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で評価されうる。増幅プライマーについては、特異的結合が、意図された標的の選択的増幅により証明されうる。
【００９６】
好ましくは、薬剤は、その意図する標的に、そのような結合の親和性定数（ＫＡ）ＫＡ≧１×１０６Ｍ−１、より好ましくはＫＡ≧１×１０７Ｍ−１、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０８Ｍ−１、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０９Ｍ−１、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０１０Ｍ−１又はＫＡ≧１×１０１１Ｍ−１を伴い結合しうるが、それにおいて、ＫＡ  ＝  ［ＳＢＡ＿Ｔ］／［ＳＢＡ］［Ｔ］、ＳＢＡは特異的結合薬剤を表示し、Ｔは意図する標的を表示する。ＫＡの決定は、当技術分野において公知の方法により、例えば、平衡透析及びスキャッチャードプロット分析などを使用して行うことができる。
【００９７】
本明細書において使用する通り、用語「抗体」は、その最も広い意味において使用され、一般的に、任意の免疫学的結合薬剤を指す。用語「特異的に」は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価（例、２、３、又はそれ以上の価）及び／又は少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異的抗体（例、二又はそれ以上の特異的抗体）、ならびに抗体フラグメント（それらが、所望の生物学的活性（特に、目的の抗原に特異的に結合する能力）を示す限りにおいて）、ならびにそのようなフラグメントの多価及び／又は多特異的複合体を包含する。用語「抗体」は、免疫化を含む方法により生成される抗体を含んでいるだけでなく、しかし、また、任意のポリペプチド、例、組換え発現されたポリペプチドを含み、それは、目的の抗原上のエピトープに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するように作られる。故に、この用語は、それらがインビトロ又はインビボで産生されるかにかかわらず、そのような分子に適用される。
【００９８】
抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭクラスのいずれか、好ましくはＩｇＧクラス抗体でありうる。抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、抗血清又はそれから精製された（例、親和性精製された）免疫グロブリンでありうる。抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物でありうる。モノクローナル抗体は、特定の抗原又は抗原内の特定のエピトープを、より大きな選択性及び再現性を伴い標的とすることができる。例及び非限定によって、モノクローナル抗体は、Kohler et al.1975（Nature 256: 495）により最初に記載されたハイブリドーマ方法により作られうるか、又は組換えＤＮＡ方法（例、ＵＳ  ４，８１６，５６７における通り）により作られうる。モノクローナル抗体は、また、例えば、Clackson et al.1991（Nature 352: 624-628）及びMarks et al. 1991（J Mol Biol 222: 581-597）により記載される通りの技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【００９９】
抗体結合薬剤は抗体フラグメントでありうる。「抗体フラグメント」は、抗原結合領域又はその可変領域を含む、インタクトな抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多価及び／又は多特異的抗体（例、ジボディ、トリボディ、及びマルチボディ）を含む。上の命名、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどは、それらの技術分野で確立された意味を有することが意図される。
【０１００】
用語「抗体」は、任意の動物種、好ましくは脊椎動物種（例、鳥及び哺乳動物を含む）に由来する１つ又は複数の部分から生じる又はそれを含む抗体を含む。限定を伴わず、抗体は、鶏、七面鳥、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラ、又はキジでありうる。また、限定を伴わず、抗体は、ヒト、マウス（例、マウス、ラットなど）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ（例、Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ及びＣａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ）、ラマ（例、Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ、又はＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）、又はウマでありうる。
【０１０１】
当業者は、抗体が、１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換（例、保存的置換）を含みうる（そのような変化が、それぞれの抗原のその結合を保存する限りにおいて）ことを理解するであろう。抗体は、また、その構成アミノ酸残基の１つ又は複数の天然又は人工修飾（例、グリコシル化など）を含みうる。
【０１０２】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを産生する方法は、当技術分野において周知であるが、組換え抗体又はそれらのフラグメントを産生するための方法の通りである（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", ColdSpring HarbourLaboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol.248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照のこと）。
【０１０３】
用語「アプタマー」は、一本鎖もしくは二本鎖オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、又はオリゴＤＮＡ／ＲＮＡあるいはそれらの任意の類似体を指し、それらは、標的分子（例えばペプチドなど）に特異的に結合することができる。有利には、アプタマーは、それらの標的についてかなり高い特異性及び親和性（例、１×１０９Ｍ−１程度のＫＡ）を呈しうる。アプタマー産生は、とりわけ、ＵＳ  ５，２７０，１６３；Ellington & Szostak 1990（Nature 346: 818-822）；Tuerk & Gold 1990  （Science 249: 505-510）；又は“The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications”, by Klussmann, ed., Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592において記載されており、参照により本明細書において組み入れられる。用語「フォトアプタマー」は、標的分子に共有結合的に結合する又はそれと架橋することができる１つ又は複数の光反応性官能基を含むアプタマーを指す。用語「ペプチド模倣体」は、対応するペプチドのトポロジー類似体である非ペプチド薬剤を指す。ペプチドのペプチド模倣体を合理的に設計する方法は、当技術分野において公知である。例えば、硫酸化８−ｍｅｒペプチドＣＣＫ２６−３３に基づく３つのペプチド模倣体、及び１１−ｍｅｒペプチドサブスタンスＰに基づく２つのペプチド模倣体の合理的な設計、ならびに関連するペプチド模倣体設計原理が、Horwell 1995（Trends Biotechnol 13: 132-134）において記載されている。
【０１０４】
用語「低分子」は、化合物、好ましくは、有機化合物を指し、医薬品において一般的に使用されるそれらの有機分子と同程度のサイズを伴う。この用語は、生物学的巨大分子（例、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい有機低分子は、サイズにおいて、約５０００Daまで、例えば、約４０００まで、好ましくは３０００Daまで、より好ましくは２０００Daまで、さらにより好ましくは約１０００Daまで、例えば、約９００、８００、７００、６００まで又は約５００Daまでの範囲である。
【０１０５】
任意の既存の、利用可能な又は従来の分離、検出、及び定量方法を本明細書において使用し、サンプル中のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はそれらのペプチドの存在もしくは非存在（例、読み出しは、存在対非存在；又は検出可能な量対検出不可能な量である）及び／又は量（例、読み出しは、絶対的な又は相対的な量、例えば、絶対的な又は相対的な濃度である）を測定することができる（サンプル中のそのように測定されるべき目的の任意の分子又は分析物は、本明細書において教示される通りの任意の１つ又は複数のバイオマーカー、核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、本明細書において、下に、集合的にバイオマーカーとして言及されうる）。
【０１０６】
例えば、そのような方法は、生化学的アッセイ方法、イムノアッセイ方法、質量分析方法、もしくはクロマトグラフィー方法、又はそれらの組み合わせを含みうる。
【０１０７】
用語「イムノアッセイ」は、一般的に、サンプル中の目的の１つ又は複数の分子又は分析物を検出するためのそのようなものとして公知の方法を指し、それにおいて、目的の分子又は分析物についてのイムノアッセイの特異性は、特異的結合薬剤（一般に抗体）と目的の分子又は分析物の間の特異的結合により付与される。イムノアッセイ技術は、限定を伴わず、直接的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、間接的ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、マルチプレックスＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ技術、及び当技術分野において公知の他の同様の技術を含む。これらのイムノアッセイ方法の原理は、当技術分野において公知である（例えば、John R. Crowther, "The ELISA Guidebook", 1st ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282）。
【０１０８】
さらなる説明及び非限定によって、直接的ＥＬＩＳＡでは、固体支持体（例えばマイクロウェルプレートなど）上に固定化したサンプル中の標的抗原に結合し、それにより、それを定量するための標識一次抗体を用いる。間接的ＥＬＩＳＡでは、標的抗原に結合する非標識一次抗体及び抗原結合一次抗体を認識し、それを定量することを許す二次標識抗体を使用する。サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、標的抗原は、抗原内の１つの抗原部位に結合する固定化「捕捉」抗体を使用してサンプルから捕捉され、非結合分析物の除去に続き、そのようにして捕捉された抗原を、前記抗原内の別の抗原部位に結合する「検出」抗体を使用して検出し、そこでは、検出抗体は、上の通りに直接的に標識されうる又は間接的に検出可能でありうる。競合ＥＬＩＳＡでは、一次抗体又は標的抗原のいずれかでありうる標識「競合相手」を使用する。例において、非標識固定化一次抗体をサンプルとインキュベートし、この反応が平衡に達することを許し、次に、標識標的抗原を加える。後者は一次抗体に結合する（どこでも、その結合部位が、サンプルからの非標識標的抗原によりまだ占められていない場合）。このように、結合標識抗原の検出量は、サンプル中の非標識抗原の量と逆相関する。マルチプレックスＥＬＩＳＡは、通常は複数のアレイアドレスで、単一コンパートメント（例、マイクロプレートウェル）内の２つ又はそれ以上の分析物の同時検出を許す（例えば、さらなるガイダンスについては、Nielsen & Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107-20及びLing et al. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98を参照のこと）。認められる通り、ＥＬＩＳＡ技術における標識は、通常、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）共役により、エンドポイントは、典型的には、比色、化学発光又は蛍光、磁気、圧電、焦電、及びその他である。
【０１０９】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、競合ベースの技術であり、公知の量の放射活性標識（例、１２５Ｉ又は１３１Ｉ標識）標的抗原を、前記抗原への抗体と混合し、次に、サンプルからの非標識又は「コールド」抗原を加え、置換された標識抗原の量を測定することを含む（ガイダンスについては、例えば"An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", by Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198を参照のこと）。
【０１１０】
一般的に、ペプチドの質量に関する、ならびに、好ましくは、また、選択されたペプチドの断片化及び／又は（部分的）アミノ酸配列に関する正確な情報を得ることができる任意の質量分析（ＭＳ）技術（例えば、タンデム質量分析における、ＭＳ／ＭＳ；又はポストソース分解における、ＴＯＦ  ＭＳ）が、本明細書において有用である。適切なペプチドＭＳ及びＭＳ／ＭＳ技術ならびにシステムは、それ自体が周知であり（例えば、Methods in Molecular Biology, vol. 146: “Mass Spectrometry of Proteins and Peptides”, by Chapman, ed., Humana Press 2000, ISBN 089603609x；Biemann 1990.Methods Enzymol 193: 455-79；又は、Methods in Enzymology, vol. 402: “Biological Mass Spectrometry”, by Burlingame, ed., Academic Press 2005, ISBN 9780121828073を参照のこと）、本明細書において使用されうる。タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）配置におけるペプチドイオン断片化は、当技術分野において確立された様式（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）など）を使用して達成されうる。質量分析によるバイオマーカーの検出及び定量は、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）を含みうる（例えば、とりわけ、Kuhn et al.2004（Proteomics 4: 1175-86）などにより記載される通り）。ＭＳペプチド分析方法は、有利には、上流のペプチド又はタンパク質の分離又は分画方法と（例えば、クロマトグラフィー方法などと）組み合わせてもよい。
【０１１１】
クロマトグラフィーは、また、バイオマーカーを測定するために使用することができる。本明細書において使用する通り、用語「クロマトグラフィー」は、化学物質（当技術分野において、そのようなものとして言及され、広く利用可能である）を分離するための方法を包含する。好ましいアプローチにおいて、クロマトグラフィーは、液体又はガスの移動流（「移動相」）により運ばれる化学物質（分析物）の混合物を、分析物の差動分布の結果として、それらが、前記の移動相と前記の固定相の間の固定液相又は固相（「固定相」）の周囲を又はその上を流れる際に成分に分離する過程を指す。固定相は、通常、細かく分割された固体、フィルター材料のシート、又は固体の表面上の液体の薄膜などでありうる。クロマトグラフィーは、また、生物学的由来の化学的化合物（例えば、例、アミノ酸、タンパク質、タンパク質のフラグメント、又はペプチドなど）の分離のために広く適用可能である。
【０１１２】
クロマトグラフィーは、本明細書において使用する通り、好ましくは、円柱状（即ち、それにおいて、固定相をカラム中に沈着又は充填する）、好ましくは、液体クロマトグラフィー、及び、さらにより好ましくはＨＰＬＣでありうる。クロマトグラフィーの細目は当技術分野において周知であり、さらなるガイダンスについては、例えば、Meyer M., 1998, ISBN:047198373X及び"Practical HPLC Methodology and Applications", Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993を参照のこと。クロマトグラフィーの例示的な型は、限定を伴わず、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相ＨＰＬＣ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）（例えば陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィーなど）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ゲルろ過クロマトグラフィー又はゲル浸透クロマトグラフィーを含む）、クロマトフォーカシング、親和性クロマトグラフィー（例えば免疫親和性、固定化金属親和性クロマトグラフィーなど）などを含む。
【０１１３】
さらなるペプチド又はポリペプチド分離、同定、又は定量方法を、場合により、上に記載する分析方法のいずれかと併せて、本開示におけるバイオマーカーを測定するために使用してもよい。そのような方法は、限定を伴わず、化学的抽出分割、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）などを含む）、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）などを含む。
【０１１４】
ＲＮＡレベルでのバイオマーカーのレベルを、当技術分野において公知の標準的な定量的ＲＮＡ測定ツールを使用して検出することができる。非限定的な例は、ハイブリダイゼーションベース分析、マイクロアレイ発現分析、デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＩＳＨ）、ノーザンブロット分析など；ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、デジタルＰＣＲなど；担持オリゴヌクレオチド検出、パイロシークエンシング、合成によるポロニーサイクリックシークエンシング、同時双方向シークエンシング、単一分子シークエンシング、単一分子リアルタイムシークエンシング、真の単一分子シークエンシング、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング、及び合成によるシークエンシングを含む。
【０１１５】
本明細書において教示する種々の側面及び実施態様は、さらに、患者からのサンプル中で測定されたバイオマーカーの量を参照値と比較することに依存しうるが、それにおいて、前記参照値は、本明細書において教示する通りの疾患又は状態の公知の予測、診断、及び／又は予後診断を表す。
【０１１６】
例えば、別個の参照値は、本明細書において教示する通りの所与の疾患又は状態を有するリスク（例、異常に上昇したリスク）の予測に対する前記疾患又は状態を有する無又は正常リスクの予測を表しうる。別の例において、別個の参照値は、そのような疾患又は状態を有する異なる程度のリスクの予測を表しうる。
【０１１７】
さらなる例において、別個の参照値は、本明細書において教示する通りの所与の疾患又は状態の診断に対するそのような疾患又は状態無しの診断（例えば、例、健常な、あるいは、前記疾患又は状態などからの回復など）を表すことができる。別の例において、別個の参照値は、変動する重症度のそのような疾患又は状態の診断を表しうる。
【０１１８】
さらに別の例において、別個の参照値は、本明細書において教示する通りの所与の疾患又は状態についての良好な予後診断に対する前記疾患又は状態についての不良な予後診断を表しうる。さらなる例において、別個の参照値は、そのような疾患又は状態についての多様に好ましい又は好ましくない予後診断を表しうる。
【０１１９】
そのような比較は、一般的に、少なくとも１つの差の存在又は非存在及び、場合により、比較されている値の間のそのような差のサイズを決定するための任意の手段を含みうる。比較は、外観検査、測定値の算術的又は統計的な比較を含みうる。そのような統計的な比較は、しかし、限定しないが、ルールを適用することを含む。
【０１２０】
参照値は、他のバイオマーカー及びパラメーターについて以前に用いられた公知の手順に従って確立されうる。例えば、参照値は、前記疾患又は状態の特定の診断、予測、及び／又は予後診断により特徴付けられる個人又は個人の集団（即ち、それらについて、疾患又は状態の前記診断、予測、及び／又は予後診断が当てはまる）において確立されうる。そのような集団は、限定を伴わず、≧２、≧１０、≧１００、又はさらに数百もしくはそれ以上の個人を含みうる。
【０１２１】
第２の値からの第１の値の「偏差」は、一般的に、変化の任意の方向（例、増加：第１の値＞第２の値；又は減少：第１の値＜第２の値）及び任意の程度を包含する。
【０１２２】
例えば、偏差は、限定を伴わず、比較が作られている第２の値と比べた、少なくとも約１０%（約０．９倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約２０%（約０．８倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約３０%（約０．７倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約４０%（約０．６倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約５０%（約０．５倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約６０%（約０．４倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約７０%（約０．３倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約８０%（約０．２倍又はそれ以下）だけ、又は少なくとも約９０%（約０．１倍又はそれ以下）だけの第１の値における減少を包含しうる。
【０１２３】
例えば、偏差は、限定を伴わず、比較が作られている第２の値と比べた、少なくとも約１０%（約１．１倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約２０%（約１．２倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約３０%（約１．３倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約４０%（約１．４倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約５０%（約１．５倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約６０%（約１．６倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約７０%（約１．７倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約８０%（約１．８倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約９０%（約１．９倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約１００%（約２倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約１５０%（約２．５倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約２００%（約３倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約５００%（約６倍又はそれ以上）だけ、又は少なくとも約７００%（約８倍又はそれ以上）などだけの第１の値の増加を包含しうる。
【０１２４】
好ましくは、偏差は、統計的に有意な、観察された変化を指しうる。例えば、偏差は、所与の集団における参照値の誤差マージンから外れた、観察された変化を指しうる（例えば、標準偏差又は標準誤差により、又は、それらの所定の倍数、例、±１×ＳＤもしくは±２×ＳＤ、又は±１×ＳＥもしくは±２×ＳＥにより表現される通り）。偏差は、また、所与の集団における値により定義された参照範囲から外れている値を指しうる（例えば、前記集団における値の≧４０%、≧５０%、≧６０%、≧７０%、≧７５%又は≧８０%又は≧８５%又は≧９０%又は≧９５%又はさらに≧１００%を含む範囲から外れる）。
【０１２５】
さらなる実施態様において、偏差は、観察された変化が所与の閾値又はカットオフを超えている場合、結論付けられうる。そのような閾値又はカットオフは、当技術分野において一般的に公知である通りに選択され、診断、予測、及び／又は予後診断方法の選ばれた感度及び／又は特異性、例えば、少なくとも５０%、又は少なくとも６０%、又は少なくとも７０%、又は少なくとも８０%、又は少なくとも８５%、又は少なくとも９０%、又は少なくとも９５%の感度及び／又は特異性を提供しうる。
【０１２６】
このように、本発明に従って、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断、及び／又はモニタリングにおいて実質的な利点を提供するバイオマーカー、使用、及び方法が提供されていることが明らかにされる。本発明は、その具体的な実施態様と併せて記載されており、多くの代替物、修飾、及び変動が、先行する記載に照らして、当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、全てのそのような代替物、修飾、及び変動を、以下の通りに、添付の請求項の精神及び広い範囲において包含することを意図する。
【０１２７】
本発明の側面及び実施態様は、さらに、以下の非限定的な実施例により支持される。
【０１２８】
実施例
実施例１：血清／血漿中のバイオマーカーレベルの測定
被験者の２群が試験に入った：（１）健常ボランティア（ＨＶ）、（２）骨折治癒障害を伴う、特に癒合不能骨折（ＮＵ）を伴う患者。患者集団は以下の通りに分布した：
【０１２９】
【表１】
2014519610.tif 000002
【０１３０】
２群における平均年齢は、３０〜４０歳の間で変動した。癒合不能患者はより高齢で（Ｐ＝０．０１２）、大半が男性であった。しかし、結果は、性別及び年齢に非依存的に不変のままであった。骨部位は、中足骨の２つの骨折及び踵骨の２つの骨折を除き、長骨（橈骨、上腕骨、腓骨、脛骨、及び肘）にあった。骨折とサンプル収集の間の遅延は、２５ヶ月前後変動し、１５ヶ月の標準偏差を伴った。
【０１３１】
癒合不能の全身的な生物学的マーカーを同定するために、血清を乾燥チューブ中に採取し、血漿をヘパリン又はＥＤＴＡチューブ中に採取し、遠心し、分注し、使用まで−２０℃で凍結した。これらを使用し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、成長因子及びタンパク質のレベルを決定した。
【０１３２】
ストローマ由来因子１を血漿中で測定した（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２，Duoset, R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）。以下のバイオマーカーを、血清中で測定した：血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ，Quantikine（商標），R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）、インターロイキン８（ＩＬ８／ＣＸＣＬ８，Quantikine（商標），R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６，Quantikine（商標），R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）。
【０１３３】
全ての連続値を中央値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表現し、全ての報告されたＰ値は片側であり、統計的有意性を１０%レベルで評価する。分布の正規性を、コルモゴロフ−スミルノフ検定を用いてテストした。コルモゴロフ−スミルノフ検定が失敗した場合、群間の差を、マン−ホイットニー検定により分析した。
【０１３４】
ＨＶと比較した場合、ＮＵ患者において、ＳＤＦ−１の血漿レベルは減少した（図１Ａ）。減少は、ＥＤＴＡチューブ中に採取した血漿と比較し、ヘパリンチューブ中に採取した血漿中でより顕著であった（図１Ｂ及び１Ｃ）。故に、ヘパリンは、ＳＤＦ−１の測定のための血液又は血漿サンプルの採取のための、好ましい血液採取薬剤、具体的には、抗凝固薬剤でありうる。この特定の例の精査に基づき、及び、例示だけによって、及び、本明細書において広く開示する通りの本発明への任意の限定を伴わず、ヘパリンを使用して採取されたヒト被験者の血漿中のＳＤＦ−１の量は、その量が約２００pg/ml未満、好ましくは約１５０pg/ml未満、より好ましくは約１００pg/ml未満、例えば約２０〜約１５０pg/mlの間又は約５０〜約１００pg/mlの間であって、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての不良な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要とすることを示しうる；ならびに、ヘパリンを使用して採取されたヒト被験者の血漿中のＳＤＦ−１の量は、その量が約２００pg/mlを上回っており、被験者が骨折治癒障害を有さないこと又は骨折治癒障害を有するリスクがないことを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての良好な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要としないことを示しうる。
【０１３５】
ＰＤＧＦ−ＢＢの血清レベルが、健常コントロール（ＨＶ）と比較した場合、ＮＵ患者において減少した（図２）。この特定の例の精査に基づき、及び、例示だけによって、及び、本明細書において広く開示する通りの本発明への任意の限定を伴わず、ヒト被験者の血清中のＰＤＧＦ−ＢＢの量は、それが約２．５０ng/ml未満、好ましくは約２．２５ng/ml未満、より好ましくは約２．００ng/ml未満、例えば約１．５〜約２．５ng/mlの間又は約１．７５〜約２．２５ng/mlの間などであって、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての不良な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要とすることを示しうる；ならびに、ヒト被験者の血清中のＰＤＧＦ−ＢＢの量は、それが２．５０ng/mlを上回り、好ましくは約２．７０ng/mlを上回り、例えば約２．５０〜約３．００ng/mlの間などであり、被験者が骨折治癒障害を有さないこと又は骨折治癒障害を有するリスクがないことを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての良好な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要としないことを示しうる。
【０１３６】
健常ボランティア（ＨＶ）と比較した場合、ＩＬ−８の血清レベルがＮＵ患者において増加した（図３）。この特定の例の精査に基づき、及び、例示だけによって、及び、本明細書において広く開示する通りの本発明への任意の限定を伴わず、ヒト被験者の血清中のＩＬ−８の量は、それが約１５pg/mlを上回り、好ましくは約２０pg/mlを上回り、より好ましくは約２５pg/mlを上回り、さらにより好ましくは約３０pg/mlを上回り、例えば約１５〜約４５pg/mlの間又は約２０〜約４０pg/mlの間又は約３０〜約３５pg/mlの間などであって、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての不良な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要とすることを示しうる；ならびに、ヒト被験者の血清中のＩＬ−８の量は、それが約１５pg/ml未満、好ましくは約１２．５pg/ml未満、例えば約５〜約１５pg/mlの間又は約７．５〜約１２．５pg/mlの間など、あるいは約１０pg/mlなどであり、被験者が骨折治癒障害を有さないこと又は骨折治癒障害を有するリスクがないことを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての良好な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要としないことを示しうる。
【０１３７】
健常ボランティア（ＨＶ）と比較した場合、ＩＬ−６の血清レベルがＮＵ患者において増加する傾向にあった（図４Ａ及び４Ｂ）。この特定の例の精査に基づき、及び、例示だけによって、及び、本明細書において広く開示する通りの本発明への任意の限定を伴わず、ヒト被験者の血清中のＩＬ−６の量は、それが約１．０pg/mlを上回り、好ましくは約１．２pg/mlを上回り、より好ましくは約１．５pg/mlを上回り、さらにより好ましくは約２pg/mlを上回り、例えば約１．３〜約２．５pg/mlの間又は約１．５〜約２．５pg/mlの間などであって、被験者が骨折治癒障害を有すること又は骨折治癒障害を有するリスクがあることを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての不良な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要とすることを示しうる；ならびに、ヒト被験者の血清中のＩＬ−６の量は、それが約１．０pg/ml未満であり、被験者が骨折治癒障害を有さないこと又は骨折治癒障害を有するリスクがないことを示しうる、あるいは、被験者における骨折治癒障害についての良好な予後診断を示しうる、及び、被験者が骨折治癒障害の治療的又は予防的処置を必要としないことを示しうる。
【０１３８】
実施例２：被験者からの細胞の培養
述べた通り、バイオマーカーの量は、また、細胞中、又は被験者から得られ、インビトロで培養された細胞の上清中で、好ましくは骨芽細胞（ＯＢ）又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から測定してもよい。以下は、そのような細胞の単離、分化、及び培養のための適切なプロトコールを提供する。
【０１３９】
ヘパリン化骨髄（ＢＭ）の２０〜６０mlを、骨折部位から離れた腸骨稜から得た。ＢＭを、リン酸緩衝生理食塩水と混合し（ＰＢＳ：ＢＭ比率（ｖ：ｖ）：２）、密度勾配フィコール溶液上に重層した。遠心後、単核細胞を界面から収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、１．４３×１０６個細胞／２５cm2フラスコで、２つの異なる培地中に播種した；（１）ＤＭＥＭ、１０%ウシ胎児血清、１%Ｌグルタミン、１%ペニシリン、及び１%ストレプトマイシンからなる間葉系培地；（２）骨形成培地。細胞を、５%ＣＯ２を含む３７℃の加湿雰囲気中で維持した。培地の変化を２〜３日毎に行った。コンフルエント時、一次培養の細胞を剥離し、二次培養のために再播種した。これらの２つの培養継代の上清を採取し、使用まで凍結した。
【０１４０】
血液サンプルのために使用するＥＬＩＳＡ試薬プロトコールは、ルーチンな適応を伴う細胞上清に適用する。
【０１４１】
実施例３：骨芽細胞又は間葉系幹細胞のオートクライン／パラクライン活性
骨折治癒障害における骨前駆細胞のオートクライン／パラクライン活性を試験するために、骨芽細胞（ＯＢ）又は間葉細胞培養（ＭＳＣ）の上清中に分泌された成長因子のレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。以下の成長因子を測定した：ストローマ由来因子１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２，Duoset, R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）及びインターロイキン６（ＩＬ−６，Duoset, R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）。値は、上清のpg/mlで表した。
【０１４２】
健常ボランティア（ＨＶ）と比較した場合、ＳＤＦ−１は、癒合不能患者（ＮＵ）のＯＢ及びＭＳＣ培養の上清中に、一次細胞培養の終了時に、より少なく分泌された（図５Ａ及び５Ｂ）。
【０１４３】
さらに、ＩＬ−６は、ＮＵ患者のＯＢ培養の上清中に、一次及び二次細胞培養の終了時に、ＨＶと比較し、より少なく分泌された（図６）。
【図１Ａ】
2014519610.tif 000003
【図１Ｂ】
2014519610.tif 000004
【図１Ｃ】
2014519610.tif 000005
【図２】
2014519610.tif 000006
【図３】
2014519610.tif 000007
【図４】
2014519610.tif 000008
【図５Ａ】
2014519610.tif 000009
【図５Ｂ】
2014519610.tif 000010
【図６】
2014519610.tif 000011
【国際調査報告】
2014519610.tif 000012
2014519610.tif 000013