(57)【要約】アッセイシステムは、患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するのに有用である。アッセイシステムは、結腸直腸がん再発に関係する予後遺伝的プロファイルの量的な発現について患者試料を分析するのに適合させられている。プロファイルは、配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列の発現を含む。本発明は、患者における結腸直腸がん再発および／または非再発の可能性を予測するのに有用な予後バイオマーカー遺伝子を提供する。
2014503222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するためのアッセイシステムであって、該アッセイシステムは、結腸直腸がん再発に関連する予後遺伝的プロファイルの量的な発現について患者試料を分析するように適合させられており、該プロファイルは、配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列の発現を含む、アッセイシステム。
【請求項２】
配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列の量的な発現を分析するように適合させられた、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】
配列番号６〜２３の核酸配列の少なくとも１つの発現を量的に分析するようにさらに適合させられた、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のアッセイシステムを含むデバイス。
【請求項５】
患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するための分析システムであって、アッセイシステムは、患者の試料から得られた遺伝子発現データを予後の基準：Ｉｆ  ［（（（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３）  Ｘ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ５）  −  （（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ４）  Ｘ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３））  ≧  −４．４７７７］  ｔｈｅｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅに適用するように設計されたコンピュータソフトウェアを含む、分析システム。
【請求項６】
請求項５に記載の分析システムを含むデバイス。
【請求項７】
請求項６に記載のアッセイシステムおよび請求項５に記載の分析システムを含むデバイス。
【請求項８】
患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するための分析システムであって、アッセイシステムは、患者の試料から得られた遺伝子発現データを予後の基準：Ｉｆ  ＲＵＬＥ  ＵＳＩＮＧ  ＳＥＱ  ＩＤＳ  １−２３  ｔｈｅｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅに適用するように設計されたコンピュータソフトウェアを含む、分析システム。
【請求項９】
デバイスまたはキットであって、
ａ）配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列のそれぞれの少なくともコード配列を表す、単離および精製されたポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列のそれぞれの単離ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｇＤＮＡ分子、
ｃ）ａ）もしくはｂ）の相補体もしくは部分、
ｄ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）を増幅するように設計された増幅プローブ、または
ｅ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）の発現を分析するように設計されたハイブリダイゼーションプローブ
を含み、結腸直腸がん再発の危険性を決定するように適合させられている、デバイスまたはキット。
【請求項１０】
配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列を含有する予後結腸直腸がん遺伝子プロファイルの発現の量的な分析に適合させられているプローブを含むマトリックス。
【請求項１１】
請求項１０に記載のマトリックスを含む結腸直腸がん予後核酸マイクロアレイ。
【請求項１２】
患者における結腸直腸がん再発の危険性を予測するための方法であって、
ａ）配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列を含有する予後結腸直腸がん遺伝子プロファイルのそれぞれの遺伝子について決定された患者の発現のレベルを請求項５に記載の分析システムに提供する工程、
ｂ）遺伝子発現について決定された患者のレベルを該分析システムにおける基準に適用する工程、ならびに
ｃ）基準に適用された分析患者の遺伝子発現レベルの結果が、−４．４７７７以上である場合に、該患者における結腸直腸がん再発の相対的に高い危険性を予測する工程
を含む、方法。
【請求項１３】
患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するための分析システムであって、アッセイシステムは、患者の試料から得られた量的な遺伝子発現データを、配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列のすべてまたはサブセットからなる結腸直腸がん予後遺伝子プロファイルから導き出された予後の基準に適用するように設計されたコンピュータソフトウェアを含む、分析システム。
【請求項１４】
患者における結腸直腸がん再発の危険性を予測するための方法であって、
ａ）配列番号１、２、３、４、および５の核酸配列を含有する予後結腸直腸がん遺伝子プロファイルのそれぞれの遺伝子について決定された患者の発現のレベルを、請求項１３に記載の分析システム、または導き出された基準のサブセットに提供する工程、
ｂ）遺伝子発現について決定された患者のレベルを該分析システムにおける該基準に適用する工程、ならびに
ｃ）基準に適用された分析患者の遺伝子発現レベルの結果が、−４．４７７７以上である場合に、該患者における結腸直腸がん再発の相対的に高い危険性を予測する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するためのアッセイシステムであって、該アッセイシステムは、結腸直腸がん再発に関連する予後遺伝的プロファイルの量的な発現について患者試料を分析するように適合させられており、該プロファイルは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１４、１８、および１９の核酸配列の発現を含む、アッセイシステム。
【請求項１６】
請求項１５に記載のアッセイシステムであって、該アッセイシステムは、患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するように適合させられており、該アッセイシステムは、患者の試料から得られた遺伝子発現データを１つ以上の予後の基準に適用するように設計されたコンピュータソフトウェアを含み、該予後の基準は、
１  ＩＦ  ［（（（ＳＥＱ  ＩＤ  １／ＳＥＱ  ＩＤ  ３）  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ５）−（（ＳＥＱ  ＩＤ  ２／ＳＥＱ  ＩＤ  ４）  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ３））≧−４．４７７７］  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
２  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  １）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １８））］  ＞＝  ９０．１６９５５６  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
３  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  １４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ８）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ３））］  ＞＝  ０．０８７２９７  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
４  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １９）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １０））］  ＞＝  ７．５００７１３  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
５  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ２）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １０））］  ＞＝  １４．３４５７８０  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
６  ＩＦ  ［（ＳＥＱ  ＩＤ  ７  ／  （ＳＥＱ  ＩＤ  １８  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １４）））］  ＞＝  ０．０４９０８２  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
７  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ３）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  １  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １４））］  ＞＝  ０．３０５０９７  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥおよび
８  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ４）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  １４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １８））］  ＞＝  １１０．７６９３１８  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
を含む、アッセイシステム。
【請求項１７】
デバイスであって、
ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１４、１８、および１９の核酸配列のそれぞれの少なくともコード配列を表す、単離および精製されたポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１４、１８、および１９の核酸配列のそれぞれの単離ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｇＤＮＡ分子、
ｃ）ａ）もしくはｂ）の相補体もしくは部分、
ｄ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）を増幅するように設計された増幅プローブ、または
ｅ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）の発現を分析するように設計されたハイブリダイゼーションプローブ
を含み、結腸直腸がん再発の危険性を決定するように適合させられている、デバイス。
【請求項１８】
キットであって、
ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１４、１８、および１９の核酸配列のそれぞれの少なくともコード配列を表す、単離および精製されたポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１４、１８、および１９の核酸配列のそれぞれの単離ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｇＤＮＡ分子、
ｃ）ａ）もしくはｂ）の相補体もしくは部分、
ｄ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）を増幅するように設計された増幅プローブ、または
ｅ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）の発現を分析するように設計されたハイブリダイゼーションプローブ
を含み、結腸直腸がん再発の危険性を決定するように適合させられている、キット。
【請求項１９】
患者における結腸直腸がん再発の危険性を予測するための方法であって、
ａ）患者における結腸直腸がんの再発および／または非再発を予測するための分析システムを提供する工程であって、アッセイシステムは、結腸直腸がん再発に関連する予後遺伝的プロファイルの量的な発現について患者試料を分析するように適合させられており、該プロファイルは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１４、１８、および１９の核酸配列の発現を含む、工程、
ｂ）遺伝子発現について決定された患者のレベルを１つ以上の予後の基準に適用する工程であって、該予後の基準は、
１  ＩＦ  ［（（（ＳＥＱ  ＩＤ  １／ＳＥＱ  ＩＤ  ３）  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ５）−（（ＳＥＱ  ＩＤ  ２／ＳＥＱ  ＩＤ  ４）  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ３））  ≧  −４．４７７７］  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
２  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  １）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １８））］  ＞＝  ９０．１６９５５６  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
３  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  １４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ８）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ３））］  ＞＝  ０．０８７２９７  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
４  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １９）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １０））］  ＞＝  ７．５００７１３  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
５  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ２）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １０））］  ＞＝  １４．３４５７８０  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
６  ＩＦ  ［（ＳＥＱ  ＩＤ  ７  ／  （ＳＥＱ  ＩＤ  １８  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １４）））］  ＞＝  ０．０４９０８２  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
７  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  ３）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  １  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １４））］  ＞＝  ０．３０５０９７  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥおよび
８  ＩＦ  ［（（ＳＥＱ  ＩＤ  ６  ＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ４）  ＊  （ＳＥＱ  ＩＤ  １４  ／  ＳＥＱ  ＩＤ  １８））］  ＞＝  １１０．７６９３１８  ＴＨＥＮ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ
を含む、工程、ならびに
ｃ）適用される１つ以上の予後の基準に応じて該患者における結腸直腸がん再発の危険性を予測する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／４３３，７９８号（発明の名称「５−ＧＥＮＥ  ＰＲＯＧＮＯＳＴＩＣ  ＳＩＧＮＡＴＵＲＥ  ＦＯＲ  ＣＯＬＯＲＥＣＴＡＬ  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＣＵＲＲＥＮＣＥ」）への優先権を主張し、上記米国仮特許出願の開示は、その全容が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に診断試験に関する。より詳細には、本発明は、結腸直腸がんに関連するサインについての診断試験に関する。
【背景技術】
【０００３】
結腸直腸がんは、米国において、３番目に一般的に診断されるがんであり、毎年およそ１５０，０００の症例が診断されており、また、がんに関係する死亡のうちで３番目に多い原因にもなっている。外科手術のみによってリンパ節転移陰性の結腸直腸がんが処置された患者の４分の１は、「治癒した」と考えられても、５年以内に再発を経験することとなる。現在、全米総合がんネットワーク（ＮＣＣＮ）の臨床実践ガイドラインが、結腸直腸がん患者における再発の危険性を予測するのに使用されている。がん再発の危険性がより高い患者を同定するための改善された技術が、ＮＣＣＮガイドラインによって提供されるものよりも良好に危険性を予測することによって、より良好な処置計画および患者の転帰を実現するのに必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前述の必要性は、本発明によって大いに満たされ、ある点において、少なくともある程度まで結腸直腸がん再発生の予測を改善する診断試験が開示される。
【０００５】
本発明は、患者における結腸直腸がん再発および／または非再発の可能性を予測するのに有用な予後バイオマーカー遺伝子を提供する。特に、特定の遺伝子が、結腸直腸がん再発および非再発の予測において重要であるとして、遺伝的プログラミング分析によって同定されている。これらの予後バイオマーカー遺伝子は、教師あり学習法を使用して予後の基準（アルゴリズム）を生成するための基礎を提供する。生成された予後の基準は、たとえば、予後の基準を含む機械読み取り可能なソフトウェアによって、個々の被験体における結腸直腸がんの再発の危険性および／または非再発の予測に適用される。
【０００６】
同定された予後バイオマーカー遺伝子ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡの発現のレベルに基づく例示的な予後の基準は、教師あり学習モードの遺伝的プログラミング使用して生成された。この基準、ならびに遺伝的プログラミング、ＣＡＲＴ分析、サポートベクターマシン、および線形判別分析などの種々の教師あり学習法のその後の適用によってこれらの同定された予後バイオマーカー遺伝子から生成されてもよい他の基準は、結腸直腸がん患者のがん再発の危険性または非再発を予測するための有用なツールを提供する。
【０００７】
本発明は、被験体の結腸直腸がん再発の危険性および／または非再発を予測するための、本発明の予後バイオマーカー遺伝子（ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡ）ならびに／または予後の基準（複数可）を利用するように適合させられたシステム、ツール、キット、核酸アレイ、マトリックス、ソフトウェア、コンピュータプログラムなどを提供する。たとえば、システム、アッセイ、キット、または表面は、遺伝子発現についての決定された被験体のレベルを予後の基準（複数可）に適用して、結腸直腸がん再発の危険性および／または非再発のアセスメントを生成するように適合および／または設計された、開示されているバイオマーカー遺伝子、増幅プローブ、ハイブリダイゼーションプローブ、アッセイ試薬、データ収集、計算、および出力モジュール、コンピュータソフトウェア、機械読み取り可能なメディアなどのうち１つ以上を含んでいてもよい。
【０００８】
本発明は、結腸直腸がん再発の危険性および／または非再発を予測するための方法であって、患者から得られた試料における予後バイオマーカー遺伝子（ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡ）の遺伝子発現の量を決定すること、ならびにそのような危険性を決定するために、バイオマーカー遺伝子について決定された発現の量を予後の基準に適用することを含む、方法をさらに提供する。予後の基準は、下記の実施例において同定された基準であってもよく、または再発もしくは非再発を実証するとして分類された、結腸直腸患者試料の集団におけるバイオマーカー遺伝子ＢＭＩ、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡの発現についての教師あり学習分析によって生成されてもよい。再発の危険性または非再発を予測するための好ましい基準は、下記に示される基準１である：
Ｉｆ  ［（（（ＢＭＩ１／Ｈ３Ｆ３Ｂ）  ＊  ＶＥＧＦＡ）  −  （（ＥＴＶ６／ＲＰＳ１０）  ＊  Ｈ３Ｆ３Ｂ））  ≧  −４．４７７７］  ｔｈｅｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ。
【０００９】
このように、本明細書におけるその詳細な説明がより理解されるように、また、当技術分野に対する本発明の寄与がより認識されるように、本発明のある一定の実施形態を少し広く概説している。当然のことながら、下記に記載され、本明細書に添付される請求項の主題を形成する本発明のさらなる実施形態が存在する。
【００１０】
この点で、本発明の少なくとも１つの実施形態について詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の説明において記載されるかまたは図面において示される構造の細部および構成成分の配置に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、記載される実施形態以外の実施形態が可能であり、また、様々な方法で実施され、実行され得る。さらに、本明細書において用いられる用語および術語、ならびに要約は、説明のためのものであり、限定的であるとして見なされるべきではないことが理解されるべきである。
【００１１】
そのため、当業者は、本開示が基礎を置く概念が、本発明のいくつかの目的を実行するために、他の構造、方法、およびシステムを設計するための基礎として容易に利用されてもよいことを認識するであろう。そのため、請求項は、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、そのような等価な構造を含むものと見なされることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、予後の基準１に従って、結腸直腸がんの再発について危険性が高いかまたは低いと実施例２において予測された患者試料について、３年の期間にわたって無再発の患者の割合を示す図である。
【図２】図２は、図１において上記に示される同じ患者試料についてのものであるが、結腸直腸がんの再発について危険性が高いかまたは低いかを予測するのにＮＣＣＮガイドラインを使用した生存曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
特に断りのない限り、本発明は、分子生物学および関係する分野についての従来の技術を用いる。そのような技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌおよびＡｕｓｕｂｅｌら、２００２、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）などの教科書を含む文献において記載されている。本明細書において挙げられる特許、特許出願、および刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【００１４】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者らによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するかまたはそれと等価である任意の方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および物質が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
【００１５】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）、冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「エレメント」は、１つ以上のエレメントを意味する。
【００１６】
本明細書において使用される用語「患者試料」は、患者または被験体から得られ得、バイオマーカー遺伝子発現についてアッセイされてもよい試料を指す。患者試料は、生体液、組織生検材料などを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、試料が、組織試料、たとえば腫瘍組織であり、新鮮な組織、凍結させた組織、および／または保存用のパラフィン包埋組織であってもよい。
【００１７】
本明細書において使用される用語「遺伝子」は、細胞のゲノムのありとあらゆる個別のコード領域ならびに関連する非コード領域および調節領域を指す。遺伝子はまた、特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、ならびに発現の調節に関与する隣接する５’および３’非コードヌクレオチド配列を意味するとも意図される。これに関して、遺伝子は、所与の遺伝子に天然で関連するプロモーター、エンハンサー、終結および／もしくはポリアデニル化シグナルなどの制御シグナル、または異種制御シグナルをさらに含んでいてもよい。ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはその断片であってもよい。
【００１８】
「予後遺伝子プロファイル」は、量的な発現レベルを、患者におけるがん再発の危険性および／または非再発を予測するための予後の基準において使用することができる、核酸配列の組み合わせを指す。本明細書において同定された予後遺伝子プロファイルは、下記の実施例において同定された以下のバイオマーカー遺伝子の組み合わせ：ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡを含む。
【００１９】
本発明の「予後バイオマーカー遺伝子」は、遺伝子：ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、ＶＥＧＦＡ、ＡＫＴ１、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＤＩＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ８２、ＤＩＡＢＬＯ、ＦＧＦＲ４、ＧＵＳＢ、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＢ１、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＸ、ＭＭＰ２、ＮＦＫＢ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＰＳＭＢ６、ＰＴＫ２、およびＵＢＣを指す。
【００２０】
「予後の基準」は、結腸直腸がん患者から得られた試料における予後バイオマーカー遺伝子の量的な発現をがん再発の危険性および／または非再発に関係づける１つ以上の数学的な表現またはアルゴリズムのセットを指す。
【００２１】
表１の予後バイオマーカー遺伝子からの、予後の基準の生成に適用される「教師あり学習」は、転帰、たとえば再発または非再発が定義されているデータのセットに適用される様々な数学的な学習法を指し、分析は、提供されるそれらの例から学習する。教師あり学習法は、たとえば、遺伝的プログラミング、ＣＡＲＴ分析、サポートベクターマシン、および線形判別分析などを含む。
【００２２】
「再発」は、処置の３６か月以内に患者に結腸直腸がんが再び起こることを指す。
【００２３】
「非再発」は、処置後の少なくとも３６か月間、患者に結腸直腸がんがないことが確認されたことを指す。
【００２４】
「核酸マイクロアレイ」は、一般的に基材上に位置し、非共有結合による相互作用を通して相補的な配列の試料に結合することができる、ポリヌクレオチドプローブなどのハイブリダイズ可能な核酸アレイエレメントの規則正しい配置を指す。
【００２５】
ペプチド「断片」または「部分」は、他のペプチドの配列の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０の連続するアミノ酸残基を含むペプチドを指す。
【００２６】
遺伝子またはポリヌクレオチド「断片」または「部分」は、他のポリヌクレオチドの配列の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０の連続する核酸残基を含む核酸分子を指す。
【００２７】
核酸配列に関して使用される用語「相補体」は、配列が第２の核酸配列の配列に対して相補的であり、そのため、第２の配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを指す。
【００２８】
「プローブ」は、ポリヌクレオチド標的配列を認識し、非共有結合による（たとえば水素結合）相互作用を通してハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはそのアナログである。プローブは、一般的に、少なくとも８ヌクレオチド長であるが、遺伝子の完全長未満である。プローブは、検出可能なタグおよび／または消光剤分子により修飾されていてもよい。
【００２９】
用語「単離」および／または「精製」は、その本来の状態において、通常一緒に存在している構成成分から分離された物質を指す。たとえば、本明細書において使用される「単離ポリヌクレオチド」は、その断片に通常隣接している配列から取り出されたＤＮＡ断片などの、天然に存在する状態でポリヌクレオチドの側面に位置する配列から精製されたポリヌクレオチドを指す。
【００３０】
語句「特異的にハイブリダイズする」などは、特定のヌクレオチド配列が、複合混合物、たとえば、全細胞ＤＮＡもしくは全細胞ＲＮＡまたはその混合ポリヌクレオチド抽出物中に存在する場合に、分子が、ストリンジェントな条件下で、その配列にのみ結合すること、二重化すること、またはハイブリダイズすることを指す。
【００３１】
バイオマーカーの同定
下記の実施例において記載されるように、特定の予後バイオマーカー遺伝子が、がん再発を示す患者および再発を示さなかった患者から得られた試料の間で、単独でまたは他の遺伝子と組み合わせて、有意に異なった発現を示すものとして遺伝的プログラミング分析によって同定された。特に、以下の５つのバイオマーカー遺伝子の発現レベルが、結腸直腸がん再発の危険性を予測するのに特に有用であるとして同定された：ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡ。
【００３２】
これらの５つの有意なバイオマーカー遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子の組み合わせ（予後遺伝的プロファイル）の量的な発現を結腸直腸がん再発および／または非再発の予測に適用する予後の基準を生成するために、下記の実施例において記載されるように、さらなる分析にかけられてもよい。結腸直腸がん再発を予測するのに有用な予後遺伝子プロファイルは、下記の実施例において同定されたバイオマーカー遺伝子の組み合わせ：ＢＭＩ１、ＥＴＶ６、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＲＰＳ１０、およびＶＥＧＦＡを含む。
【００３３】
同定された予後バイオマーカー遺伝子から、遺伝的プログラミング、線形回帰、ロジスティック回帰、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、クラスタリングモデル、ＣＡＲＴ分析などの様々なパターン認識技術および相関分析を使用して予後の基準を生成することができる。好ましい実施形態では、バイオマーカー遺伝子の遺伝的プログラミング分析が、予後の基準を生成するのに使用される。結果として生ずる予後の基準は、結腸直腸がん再発の危険性および／または非再発に予後バイオマーカー遺伝子の量的な発現を関係づける数学的な表現（アルゴリズム）である。下記の実施例において記載される遺伝的プログラミングを使用して開発された例示的な予後の基準は、以下の好ましい基準である。
【００３４】
Ｉｆ［（（（ＢＭＩ１／Ｈ３Ｆ３Ｂ）  ＊  ＶＥＧＦＡ）−（（ＥＴＶ６／ＲＰＳ１０）＊Ｈ３Ｆ３Ｂ））≧−４．４７７７］  ｔｈｅｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ。
【００３５】
「ハウスキーピング遺伝子」の発現は、分析において対照として使用することができる。そのようなハウスキーピング遺伝子は、たとえば、ＧＡＰＤＨ、ベータ−アクチン、Ｓ９リボソーム、ユビキチン、アルファ−チューブリン、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＧＵＳ、ＨＰＲＴ、Ｂ２Ｍ、ＴＢＰ、ＣＹＣ、ＨｕＰＯ、ＰＧＫ、ＨｕＴｆＲ、Ｇ６ＰＤＨ（Ｂｌａｎｑｕｉｃｅｔｔら、２００２、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３０３：２０９−１４）；ＲＰＬＰ０、ＧＡＰＤ、ＨＰＲＴ１、Ｂ２Ｍ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＲＰＳ１４、ＭＡＮ１Ｂ１、ＡＣＴＢ、ＭＴＲ（Ｄｙｄｅｎｓｂｏｒｇら、２００６、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９０：Ｇ１０６７−７４）；およびＨＰＲＴ、ＡＤＡ、ＴＡＦ２、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＣＥＴＮ２、ＡＣＴＢ、ＵＢＥ２Ｄ２、ＰＳＭＢ６、ＣＡＰＮ２、ＴＸＮＲＤ１、ＳＤＨＡ、ＧＵＳ、ＣＹＣＣ、ＰＭＭ１、ＡＧＰＡＴＩ、ＨＤＡＣ１０、Ｂ２Ｍ（Ｒｕｂｉｅら、２００５、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，１９：１０１−９）を含む。
【００３６】
遺伝子発現分析
遺伝子発現は、様々な公知の方法によって、たとえば、試料、たとえば組織試料における遺伝子発現によって生成されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質の量を決定することによって、量的に分析することができる。さらなる分析のために組織試料からｍＲＮＡを単離するための方法が知られており、たとえばＡｕｓｕｂｅｌら、２００２、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい。パラフィン包埋組織からｍＲＮＡを単離するための方法は、たとえばＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、１９９５、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４において議論されている。たとえばＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を含むＲＮＡ単離キットが、市販で入手可能である。
【００３７】
単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され得、および／またはたとえば配列決定もしくはハイブリダイゼーション分析によって増幅され、同定され、定量化され得る。遺伝子発現の量を決定するための他の方法は、たとえば、ノーザンブロッティング（Ｂｒｏｗｎ、２００１  Ｍａｙ、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０：Ｕｎｉｔ  １０．１２；Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｎｙｇａａｒｄら  ２００９、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  １４：５５２−６９；Ｗｅｉｓら、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−６４）、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｅｍｅｒｙ、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３６２：３４３−８；Ｈｏｄ、１９９２  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−５４）、大規模並行シグネチャ配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）（Ｋｕｔｌｕ、２００９、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，２：３；Ｂｒｅｎｎｅｒ、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：１０２１）、遺伝子発現のシリアル分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）（Ｂｏｏｎ  ２００９、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．４：ｅ５１３４；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：３６８−９、３７１）、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡ二重鎖に結合することができる抗体の使用、ＲＮＡ媒介性のアニーリング、選択、およびライゲーション（ＲＡＳＬ）アッセイ（Ｙｅａｋｌｅｙ、２００２、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；２０：３５３−８）、ｃＤＮＡ媒介性のアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（ＤＡＳＬ）アッセイ（Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ、２００８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４４：４１７−４２３；Ｆａｎ、２００４、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：８７８−８５）、マイクロアレイ技術（Ｒａｖｏら、２００８、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，８８：４３０−４０；Ｓｃｈｅｎａ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０６−１４９）、たとえば、Ｉｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術もしくはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎＣｈｉｐ技術；または４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）によって開発されたハイスループット配列決定技術（Ｍａｒｇｕｉｌｉｅｓ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ，４３７：３７６−８０）を含む。
【００３８】
一実施形態では、選択されたバイオマーカー遺伝子の量的な発現が、基準１の５つのバイオマーカーのそれぞれに対して利用可能である特定のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを含む、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳから入手可能なものなどの市販の試薬を使用して分析することができる。例示的なＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを下記に列挙する。これらは、下記に記載される実施例２において使用した。
【００３９】
【表１】
2014503222.tif 000003
【００４０】
ＤＡＳＬ
量的な遺伝子発現を決定するためのＤＡＳＬアッセイ方法は、ビオチン化プライマーを使用する、ｃＤＮＡへの全ＲＮＡの変換を含む。ビオチン化ＤＮＡを、ストレプトアビジン固体支持体に付着させ、その後、アッセイオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡにおけるそれらの標的配列にアニールする。１対のオリゴヌクレオチドは、一般的に遺伝子当たり３〜１０の標的部位で、所与の標的部位にアニールする。上流にアニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させ、下流の対応するヌクレオチドにライゲーションし、たとえばユニバーサルＰＣＲプライマーにより増幅されるＰＣＲ鋳型を作り出す。たとえば標識プライマーの組み込みによって標識されたＰＣＲ産物は、ハイブリダイズして固体支持体アレイ上の配列を捕捉し、蛍光強度をそれぞれのビーズについて測定する。
【００４１】
遺伝子当たり１〜３のプローブグループを含む１５３６遺伝子までの完全カスタム設計ＤＡＳＬアッセイパネルが、がんに関連した５０２遺伝子を標的にするプローブグループのセットを含む標準的なＤＡＳＬヒトがんパネルと同様に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販で入手可能である。
【００４２】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ
ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムは、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写するのに使用される。ｃＤＮＡは、増幅され、脱リン酸化され、プライマーにより伸長されて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を介しての量的な分析のためにチップアレイ上に配置される。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ分析を実行するためのハードウェアおよびソフトウェアは、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販で入手可能である。
【００４３】
ＳＡＧＥ
ＳＡＧＥでは、それぞれＲＮＡ転写物内の特有の位置に対応する、約１０〜１４塩基対の複数の配列タグが共に連結されて、複数のタグの配列を同時に配列決定し、同定するための伸長分子を形成する。転写物の発現パターンは、所与のタグの存在量を決定し、そのタグに対応する遺伝子を同定することによって定量化することができる。たとえばＩ−ＳＡＧＥ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＳＡＧＥを実行するためのキットおよびＳＡＧＥデータを分析するためのソフトウェアが、市販で入手可能である。ＳＡＧＥデータは、たとえば、インターネットを介して入手可能なＳＡＧＥｍａｐデータベースを検索するのに使用することができる。
【００４４】
遺伝的プログラミング
好ましい実施形態において、遺伝的プログラミングは、遺伝子発現データを分析して、結腸直腸がん再発についての被験体の危険性および／または非再発を示す予後遺伝的プロファイルおよび予後の基準において使用するのに十分な予測的能力を有するバイオマーカー遺伝子のグループを同定するのに使用される。
【００４５】
遺伝的プログラミングは、ユーザによって定義されたタスクを達成することができるコンピュータアルゴリズムを開発するための、生物進化の法則を使用する人工知能／機械学習法である（たとえばＢａｎｚｈａｆら、１９９８、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｋｏｚａ，Ｊ．Ｒ．、１９９２、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｍｅａｎｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００４６】
遺伝的プログラミングは、コンピュータプログラムを、反復するやり方で、それぞれのプログラムの適応度の尺度を使用して、プログラムの集団の「自然選択」を実施することによって進化させて、コンピュータプログラムのセットを最適化して所望のタスクを実施する。本発明の一実施形態では、タスクは、患者におけるがんの再発を予測するのに有用な１つ以上の予後の基準を生成することであり、適応度の尺度または「適応度関数」は、所与のコンピュータプログラムが、再発または非再発を経験する患者に属するものとして腫瘍組織試料を正確に分類する能力といった能力であった。
【００４７】
コンピュータプログラムの集団の進化は、様々な公知の方法において達成することができる。ある共通の方法は、交叉戦略を使用し、あるプログラムのノードが、その集団において存在する他のプログラムのノードと交換される。コンピュータプログラムを進化させるための他の方法は、変異によるものであり、プログラムに属するノード、すなわちノードに含有される情報が、集団における任意の他のプログラムに影響を及ぼすことなく交換される。これらの方法は、プログラム間のプログラミングエレメントの構成成分単位の交換を伴う他の方法でのように、個々にまたは共に使用することができる。各回の進化の後に、集団におけるそれぞれのコンピュータプログラムは、適応度の尺度を使用する試験に付される。
【００４８】
下記の実施例において記載されるように、遺伝的プログラミングシステムに、標的疾患組織および健康な組織の両方の既知の試料から取られた遺伝子発現データを提供し、結腸直腸がんの再発／非再発などの標的疾患分類のための述語ＩＦ−ＴＨＥＮ文節を進化させるのに使用することができる。一実施形態では、述語ＩＦ−ＴＨＥＮ文節は、腫瘍組織における種々の遺伝子の発現の量を患者におけるがん再発の可能性に関係づける数学的な表現である。進化した基準は、試料のトレーニングセットを使用して開発され、正確に分類された試料の数が、候補となる基準の適応度の尺度となる。
【００４９】
適応度の尺度は、より多くの重みが、より少数の偽陽性過誤を生じる基準に与えられるように、またはより多くの信頼を、より少数の偽「陰性」過誤を生じる基準に与えることによって、変えられてよい。適応度の尺度はまた、遺伝的プログラミングシステム自体の外側にあるが、より良好に所望の目標を反映する他の理由で変えられてもよい。たとえば、一実施形態では、選択された腫瘍組織を回避し、かつ血流を通して全身的に体内に侵入することが知られているタンパク質などの指定された分類のタンパク質をコードする遺伝子のみを組み込む基準を生じさせることが望ましくあり得る。
【００５０】
一旦、予後の基準が開発されたら、基準は、試料の試験セットに対してチェックされて、未知の試料に対して汎用化するためのその能力が評価される。各回の適応度アセスメントの後に、最も良好に機能するプログラムが、次の回におけるさらなる進化のために保持された。種々の方法が、進化の次の反復のためのコンピュータプログラム集団を選択するのに使用されてもよい。一実施形態では、２つの最適なプログラムが、たとえば交叉を使用して、互いに「交配され」、子孫プログラムは、次回の進化のためにプログラム集団に追加され、適応度アセスメントに従って、最も最適でないプログラムに取って代わる。進化および適応度試験のさらなる反復は、適切で有用な１つ以上の予後の基準があらかじめ選択された判定基準に従って得られるまで、または適応度におけるさらなる改善が観察されなくなるまで、継続することができる。
【００５１】
遺伝的プログラミングの注目すべき利点は、多くの場合予想外の方法で変数を組み合わせることによって、複数の変数および演算子を利用して、高い予測的能力を有するアルゴリズムを生じさせるその能力である。他のモデリング技術を超えるさらなる利点は、たとえば、階層的クラスタ分析を使用する場合に必要となり得るように、たとえば、研究下の疾患にとって有意であると考えられる生物学的プロセスとの関連に基づいて選択された遺伝子のふるい分けを必要とするであろういかなる演算子の入力も伴うことなく、予後の基準を自発的に生成することができるということである。
【００５２】
他の分析法でも同様に、最適以下の条件が存在する場合、遺伝的プログラミングの有用性は損なわれ得る。たとえば、理想的には、大きなデータセットが、大きなトレーニングセットおよび試験セットに区分するのに利用可能である。しかし、多くの場合では、入力データの合計量が少なく、これは、遺伝的プログラミングシステムが、潜在的に利用可能な最も一般的な分類概念を学習できないことを意味している。同様に、小さな試験では、学習した概念の一般性についての徹底したアセスメントが可能ではない。これらの場合では、遺伝的プログラミングシステム自体の外側にある、遺伝的プログラミングから得られた結果を評価するための方法が知られている。たとえば、ｎ−分割交差検証は、小さなデータセットに対処するのに使用することができる。当業者らは、全範囲の公知の検証方法から選択することができるであろう。
【００５３】
様々な遺伝的プログラミング技術を、本発明を実施するのに使用することができる。たとえば、遺伝的プログラミングは、米国特許第６，３２７，５８２号において記載される技術に従って行うことができる。
【００５４】
他の分析方法
一旦、高い予測的能力を有する予後バイオマーカー遺伝子のセットが同定されたら、予後バイオマーカー遺伝子の相対的な発現レベルをがん再発および／または非再発に関係づける１つ以上の予後の基準を生成するために、遺伝的プログラミング以外の分析法を使用することができることが認識されるであろう。たとえば、既知の回帰および他のパターン認識技術を、予測的基準を生成するのに使用することができる。ＣＡＲＴ分析、サポートベクターマシン、および線形または非線形判別分析などの教師あり学習法は、一旦、予後バイオマーカー遺伝子が分かると、予後の基準を開発するのに有用である。
【００５５】
予後の基準
患者における結腸直腸がん再発および／または非再発の可能性を予測するための予後の基準は、下記の実施例において同定され、また、同定された予後バイオマーカー遺伝子の分析によって生成することもできる。予後の基準は、一般的に、バイオマーカー遺伝子発現の量を結腸直腸がん再発の危険性および／または非再発に関係づける論理式である。
【００５６】
患者の結腸直腸がん再発の可能性は、バイオマーカー遺伝子発現について決定された患者のレベルを予後の基準に適用することによって予測される。一実施例では、コンピュータ化システムが、遺伝子発現値を受け取るための入力モジュール；遺伝子発現値を予後の基準に適用し、基準に従って危険性予測を計算するための分析モジュール；ならびにたとえばディスプレイまたは他の伝達メカニズムによって、基準によって計算された再発および／または非再発についての結果として生ずる危険性予測をユーザに伝えるための出力モジュールを含む。他の実施例では、２つ以上の基準が、分析モジュールに適用されてもよい。
【００５７】
ツール、キット、システム、および予後遺伝子プロファイル
本発明は、結腸直腸がん患者における再発の危険性および／または非再発についての重要なバイオマーカーとして同定された遺伝子のグループを提供する。これらの予後バイオマーカー遺伝子は、表１に列挙される。例示的な患者試料におけるこれらの予後バイオマーカー遺伝子の量的な発現の数学的分析によって導き出された予後遺伝的プロファイルおよび予後の基準は、これらの予後バイオマーカー遺伝子の発現についての個々の患者のレベルから、結腸直腸がんの再発の危険性および／または非再発が高い集団に属するその患者の確率についての予測を決定するためのアッセイ方法、システム、ツール、試薬、ソフトウェア、デバイスなどに、ならびに予測された予後に基づく結腸直腸がん患者の合理的な処置に適用される。
【００５８】
代表的なツールは、たとえば、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、増幅、ＰＣＲ、ＤＡＳＬ、ＳＡＧＥ、および同様のアッセイシステムなどの、予後バイオマーカー遺伝子、遺伝的プロファイル、および特定の予後の基準についての遺伝子の発現の量を決定するように適合させられたアッセイシステム、ならびに患者における結腸直腸がんの再発または非再発を予測するためにデバイス、システム、または方法において使用されるキット、チップ、カード、マルチウェルアッセイプレート、プローブ、プライマー、データ記憶システム、ソフトウェアプログラム、コンピュータシステムなどを含む。
【００５９】
核酸プローブおよび／またはプライマーのパネルは、予後バイオマーカー遺伝子のうちの１つ以上の発現レベルを増幅および検出するように設計される。そのようなプローブは、たとえば、単離遺伝子ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびその部分、遺伝子発現レベルの量的な決定のために有用である増幅核酸を含む。そのようなプライマーは、所望のアンプリコンの側面に位置し、遺伝子発現を定量化するために所望の遺伝子または遺伝子の部分を増幅するのに有用である核酸を含む。
【００６０】
ハイブリダイゼーションプレート、チップ、またはカードなどのアッセイ基材は、被験体から得られた試料において同定されたバイオマーカー遺伝子の発現を増幅および／または同定および／または配列決定し、それによって定量化するプライマー対および／またはプローブを含むように適合され、設計される。
【００６１】
キットは、本発明の予後の基準において、その存在により、結腸直腸がん再発に関連する同定されたバイオマーカー遺伝子の発現レベルを定量化するのに有用な試薬およびツールを含み、たとえば、表１に列挙されるバイオマーカー遺伝子の発現を定量化するために設計された核酸プローブおよび／またはプライマーを含む。
【００６２】
ツール、キット、およびシステムはまた、予後の基準を記録および適用して、結腸直腸がん再発および／または非再発について予測される危険性を計算するように適合させられたコンピュータシステム、ソフトウェア、およびモジュールをも含む。コンピュータシステムは、たとえば、量的なバイオマーカー遺伝子発現データを受け取るための入力モジュール、予後の基準およびバイオマーカー遺伝子発現レベルを適用して基準の数学的な転帰を計算する分析モジュール、および予測的な危険性の転帰を提供するための出力モジュールを含むことができる。
【００６３】
処置または予防の方法
本発明は、患者における結腸直腸がん再発の危険性および／または非再発を予測するための方法を含む。一般的に、該方法は、表１に列挙される同定された予後遺伝子プロファイルの遺伝子についての発現のレベルを患者の試料から定量的に決定すること、決定された発現値を予後の基準に適用すること、および予後の基準に従って遺伝子発現レベルを判断して患者の結腸直腸がん再発の危険性を決定することを含む。処置レジメンは、予後の基準に患者の遺伝子発現データを適用した転帰によって同定されるように、患者の予後に対して個別化される。一例では、患者の試料の分析が再発の可能性を示す場合には、より積極的な抗がんレジメンが、適用される。
【実施例】
【００６４】
本発明は、以下の非限定的な実施例において記載される特定の実施形態を参照して容易に理解および実施され得る。以下の実施例において、種々のアッセイは、発現した予測的遺伝子のセットを選択するために利用されるものとして記載される。特に、ｃＤＮＡ媒介性のアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（ＤＡＳＬ）アッセイならびに逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが記載される。しかしながら、本発明の種々の実施形態は、ＤＡＳＬおよびＲＴ−ＰＣＲに限定されず、むしろ、任意の好適なゲノム物質選択アッセイを含んでいてもよい。
【００６５】
実施例１：ＤＡＳＬ方法を使用するステージＩ／ＩＩ結腸直腸原発性腺がん組織の遺伝子発現プロファイルの生成
保存用のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発性腺がん組織は、ステージＩまたはステージＩＩ結腸直腸がんを有する１４５人の患者から治療的手術の間に得た（１０４の結腸、４１の直腸）。患者はすべて、３６か月（ｍｏ）までに再発（Ｒ）を有する（ｎ＝６７；５１人がステージＩＩ）か、または手術後≧３６ｍｏの間、非再発（ＮＲ）であることが確認され（ｎ＝７８；５６人がステージＩＩ）、だれも、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法を受けていなかった。患者は、Ｒステータス、最初の再発までの時間、右側対左側の腫瘍などによって層別化し、その後、トレーニングセット（ＴＳｅｔ）（ｎ＝７３；３４Ｒ、３９ＮＲ）または検証セット（ＶＳｅｔ）（ｎ＝７２；３３Ｒ、３９ＮＲ）に無作為に割り当てた。
【００６６】
トレーニングセットの腫瘍遺伝子発現は、カスタムの５１２遺伝子パネルを使用して、ＤＡＳＬアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ、２００８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４４：４１７−４２３；Ｆａｎら、２００４、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：８７８−８５）によって定量化した。ＲグループとＮＲグループとの間で差次的な発現レベルを示す、目的の遺伝子を同定した。これを、インターネットを介して入手可能なＵ．Ｃ．Ｓ．Ｃ．ゲノムブラウザにおいて列挙されるヒトゲノム上の参照配列位置およびインターネットを介して入手可能なＧｅｎＢａｎｋから得られる代表的な核酸配列と一緒に表２に示す。同定されるＵ．Ｃ．Ｓ．Ｃ．ブラウザおよびＧｅｎＢａｎｋの配列は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用するステージＩ／ＩＩ結腸直腸原発性腺がん組織の遺伝子発現プロファイルの生成
代替的にまたはＤＡＳＬ方法に加えて、遺伝子発現プロファイルは、ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して生成されてもよい。たとえば、治療目的の最初の外科的切除時に得られた７４（７４）の保存用の、臨床的注釈が付けられた、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発性がん腫組織（Ｒ０）は、１つの米国（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ；ｎ＝４５）地区および２つの別々の欧州（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）地区から、６０人の結腸がん（ＡＪＣＣ  ｐＴ１−４  ｐＮ０  ｃＭ０）患者および１４人の直腸がん（ＡＪＣＣ  ｐＴ２−３  ｐＮ０  ｃＭ０）患者について収集した。だれも、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法を受けていなかった。３６（３６）か月のＲおよびＮＲステータスを、地区職員によって調査された医療記録によってそれぞれの症例について確認した。インフォームドコンセントをすべての患者について得た。
【００６８】
再発ステータス、最初の再発までの時間、結腸対直腸がん、Ｒ側対Ｌ側の結腸、および組織供給源による階層化の後に、７４の症例を、トレーニングセット（ｎ＝３７；１６Ｒ、２１ＮＲ）および等しいサイズの試験セット（ｎ＝３７；１６Ｒ、２１ＮＲ）に無作為に分けた。
【００６９】
カスタムのフォーカスマイクロアレイを構築するために、腫瘍遺伝子発現を、カスタムの３８４ウェルＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって評価した。４１７のがんに関連する遺伝子のパネルは、以下の判定基準のうちの１つ以上をそれらが満たすことに基づいて、アレイ用にあらかじめ選択した：（１）腫瘍形成、腫瘍進行、または転移に関連する；（２）細胞周期進行、血管新生、生存、またはアポトーシスにおいて重要な調節タンパク質をコードする；（３）ＣＲＣの開始および進行に関与する；（４）ＣＲＣについて予後経過を示すことが報告されている；（５）ＣＲＣ化学療法に対する腫瘍応答を予測するかまたはそれに影響を及ぼす；（６）正常と悪性ＣＲＣ組織との間で異なって発現される。
【００７０】
適切なｍＲＮＡ参照配列（ＲＥＦＳＥＱ）受託番号を、それぞれの遺伝子について同定し、コンセンサス配列は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースを通して入手した。ＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって設計された。アンプリコンサイズを最小限に保ち、大部分を１００塩基長未満とした。
【００７１】
それぞれの症例について、無関係な胃腸の病理学者によるＨ＆Ｅ染色スライド上のＦＦＰＥ悪性組織の検証および位置確認の後に、別々のスライドガラスに付けられた対応する非染色腫瘍組織を、使い捨てのメスを使用して、ＲＮＡｓｅなしのｍｉｃｒｏｆｕｇｅチューブにこすり落とした。組織をキシレン中で脱パラフィンし、ＲＮＡを抽出し、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して精製した。ＲＮＡ溶液の純度および量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して、２６０／２８０ｎｍのＵＶ吸収比を測定することによって決定した。最低１００ｎｇのＲＮＡを、プライマーとしてランダムヘキサマーを用い、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、一本鎖ｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲに直ちに使用するか、または−８０℃で保存した。
【００７２】
リアルタイムＰＣＲを介しての遺伝子発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）カスタムアレイ３８４ウェルマイクロ流体カード（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）を使用してアッセイした。４８ウェル当たり１００μｌのｃＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ）をカードに適用した後に、アッセイはすべて、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、二連で実施した。出力データは、増幅曲線上で０．２に設定した一定の閾値、すなわちサイクル閾値（Ｃｔ）に到達するのに必要とされるＰＣＲサイクルの数とした。データを５つのハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子を使用して標準化し、可能性のある技術的な変動性ならびにＲＮＡの完全性および量における偏りをそれぞれのアッセイにおいて補正した。５つの選択したＨＫ遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＧＵＳＢ、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＰＳＭＢ６、ＵＢＣ）は、ＣＲＣおよび他の組織において恒常的に発現されることがよく知られている９つの候補遺伝子のうち、最低レベルの発現変動性を示した。それぞれの対の個々の遺伝子発現複製物を一致について調査し、相関係数をそれぞれについて生成した。複製物を平均し、結果として生じるデータを、５つのＨＫ遺伝子の平均値（Ａｖｅ．５ＨＫ  Ｃｔ）からそれぞれの基準遺伝子についてのＣｔ（ＲＧ  Ｃｔ）を減じることによって標準化した。Ｃｔ値は底２に対する対数の数として表現されるので、データは、真数を取ることによって直線化し、結果を１００の因数によって調整した。したがって、データの最終的な形は、
遺伝子発現値＝２（Ａｖｅ．５ＨＫ  Ｃｔ  −ＲＧ  Ｃｔ）×１００
となった。
【００７３】
研究の全体にわたって、以下を、抽出ＲＮＡおよびＲＴ−ＰＣＲ結果の承認についての最低の判定基準とした：（１）ＲＮＡ濃度：≧１０ｎｇ／μｌ；（２）ＲＮＡは、≧１．８の２６０／２８０ｎｍの比を有することが必要とされた；（３）５つのＨＫ遺伝子の平均的な発現：≦３２．０Ｃｔ；および（４）すべての個々のＣｔ値：≦３５。
【００７４】
【表２】
2014503222.tif 000004
【００７５】
実施例２：遺伝的プログラミングを介して結腸直腸がんの再発の危険性を決定するための基準の生成
実施例１において同定された予後バイオマーカー遺伝子を、トレーニングセットの遺伝子発現データの連続的遺伝的プログラミング（ＧＰ）分析を使用して分析し、バイオマーカー遺伝子の発現レベルに基づいて予後の基準を進化させた。下記に示される基準は、結腸直腸がん患者が再発を経験するかまたは非再発を経験するかを、検証データセットにおいて予測するのに有用であった。
【００７６】
同定された予後バイオマーカー遺伝子の遺伝的プログラミング分析において、表２の遺伝子の種々の組み合わせを含む、可能性のある基準の集団を、無作為に生成し、候補となる基準のセットを生じさせた。その後、候補となる基準をそれぞれ適応度について試験した。
【００７７】
「再発」対「非再発」として正確に分類された腫瘍組織試料の数は、候補となる基準についての適応度の尺度としての役割を果たした。他の実施例では、感度および特異度の合計または陽性の予測性および陰性の予測性の合計などを適応度の尺度として利用する。他の実施例では、受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｕｒｖｅ）（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を適応度の尺度として使用する。十分に高い適応度を有すると判断された候補となる基準を見つけた場合、遺伝的プログラミングを終結させ、最適の候補を予後の基準として選択した。終結基準を満たさなかった場合、最も高い適応度を有する候補となる基準を交配させて子孫の候補となる基準の新しい集団を生じさせ、より低い適応度を有することが分かった候補となる基準を廃棄した。
【００７８】
終結基準が満たされ、好適な適応度の１つ以上の基準が発見されるまで、遺伝的プログラミング方法のさらなる反復を実施した。表２の遺伝子の連続的ＧＰ分析の後に、入力データにより、再発を予測した予後のサイン基準が生じた（表３を参照されたい）。
【００７９】
【表３】
2014503222.tif 000005
【００８０】
実施例３：再発を予測するための予後のＧＰ基準の使用
表３の基準を、結腸直腸がん患者における再発を予測するのに使用した。治療目的の最初の外科的切除時に得られた保存用のホルマリン固定パラフィン包埋原発性腺がん組織（中央値  保存７年；範囲４〜１５）は、米国における２つの地区および２つの欧州地区から、８６人のステージＩ／ＩＩ（ｐＴ１−４  ｐＮ０  Ｍ０）結腸がん患者および２９人のステージＩ（ｐＴ１−２、ｐＮ０  Ｍ０）直腸がん患者について収集した。これらの地区および試料は、実施例１および２について上記に記載される分子試験を生成するのに使用した試料とは異なるものとした。
【００８１】
得られた試料は、外科手術の３６か月以内に腫瘍再発（Ｒ）を有する患者からの試料（ｎ＝４６）および手術後の少なくとも３６か月間に非再発（ＮＲ）として確認された患者からの試料（ｎ＝６９）を含んだ。患者のだれも、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法を受けていなかった。
【００８２】
腫瘍遺伝子発現は、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳから得られたカスタムの３８４ウェルＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙｓを使用し、厳しい品質管理パラメーターのセットを満たしたＲＮＡを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲによってこれらの試料において評価した。５つのクエリ遺伝子のそれぞれについてのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ番号およびプローブ長を、下記の表４に示す。
【００８３】
【表４】
2014503222.tif 000006
【００８４】
基準１の予測的感度および特異度を、この患者データセット（ＶＳｅｔ）において分析し、結腸直腸がんについての現在の全米総合がんネットワーク（ＮＣＣＮ）を使用して得られたものと比較した。ステージＩ／ＩＩ  ＣＲＣ（ｎ＝１１５）について、この二分する基準は、３２／４６Ｒおよび３８／６９ＮＲ  ＶＳｅｔ患者を７０％の感度および５５％の特異度で正確に分類した。「危険性が高い」と見なされたそれらの患者は、５１％の陽性適中率（ＰＰＶ）、７３％の陰性適中率、（ＮＰＶ）、および２．０６の相対的危険（ＨＲ）（９５％  ＣＩ：１．１〜３．８６；ｐ＝０．０２０）で、「危険性が低い」と標識された患者よりも３６か月以内の再発について著しく高い可能性を有した。
【００８５】
対照的に、ＮＣＣＮガイドライン（バージョン１．２０１１）は、この集団において同様に３６か月の再発対非再発を区別することができず、７２％の感度および４２％の特異度、４５％の陽性適中率および６９％の陰性適中率を有した。ハザード比は１．３８（９５％  ＣＩ：０．７３〜２．５３、ｐ＝０．３１５）であった。分子試験の特異度は、ＮＣＣＮよりも有意に大きかった（ｐ＝０．０５）。
【００８６】
ステージＩ直腸がん患者（ｎ＝２９；１３の再発）について、分子試験の予後の精度は、７９％の特異度（２３／２９）を示し、ＮＣＣＮガイドライン（１６／２９）の５５％の特異度（１６／２９）を超えた。
【００８７】
本実施例では、ＦＦＰＥ腫瘍組織における遺伝子発現レベルの遺伝的プログラミング分析による結腸直腸がん再発および／または非再発の決定にとって重要であるとして同定された予後バイオマーカー遺伝子から導き出された予後の基準は、３年以内の再発について、高い危険性と低い危険性の早期ＣＲＣ患者を、現在のＮＣＣＮガイドラインよりも良好に区別することができた。
【００８８】
実施例４：再発を予測するための予後のＧＰ基準の使用
上記に記載されるように、遺伝的プログラミングは、予後バイオマーカー遺伝子を同定し（実施例１）、結腸直腸がん再発の危険性を決定するための予後の基準を生成するのに使用した（実施例２および３）。表２において列挙される予後バイオマーカー遺伝子の発現レベルが、結腸直腸がん再発を高度に予測したので、発明者らは、これらの予後バイオマーカー遺伝子の発現に基づいた予後の基準を、非ＧＰ分析的方法を使用して生成することができると仮定した。
【００８９】
分析の他の方法の有用性を実証するために、表２において列挙される予後バイオマーカー遺伝子の発現から導き出された予後の基準を、分類および回帰ツリー（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）（ＣＡＲＴ）アルゴリズムを使用して生成することができる（Ｆｒｅｕｎｄら  １９９９、Ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）。
【００９０】
様々な分析技術によって生成された予後の基準における予後バイオマーカー遺伝子の使用をさらに実証するために、表２において列挙される遺伝子についての発現データならびに既知の再発および非再発Ｔｓｅｔデータを使用してサポートベクターマシンを作り出すことができる（たとえばＭｏｃｅｌｌｉｎら  ２００３  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  １３：１１１３−１１２２を参照されたい）。係数およびベクトルによって作り出されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、トレーニングデータ（Ｔｓｅｔ）に対して４−分割交差検証を実施して、分類指標の堅調性を試験するのに使用する。分類指標を３分割に対してトレーニングし、精度を第４番目のものについて試験する。分析を単一の精度（％）および全体の精度（４分割の平均値）（％）で報告する。ＳＶＭによって開発された基準による検証セット（Ｖｓｅｔ）の試験は、報告される精度（％）を生じさせる。
【００９１】
様々な分析技術によって生成された予後の基準における予後バイオマーカー遺伝子の使用をさらに実証するために、表２において列挙される遺伝子についての量的な発現データならびに既知の再発および非再発Ｔｓｅｔデータを使用してサポートベクターマシンを作り出すことができる（たとえばＭｏｃｅｌｌｉｎら  ２００３  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  １３：１１１３−１１２２を参照されたい）。係数およびベクトルによって作り出されたサポートベクターマシンは、トレーニングデータ（Ｔｓｅｔ）に対して４−分割交差検証を実施して、分類指標の堅調性を試験するのに使用する。分類指標を３分割に対してトレーニングし、精度を第４番目のものについて試験する。
【００９２】
表２において列挙される予後バイオマーカー遺伝子の高度な予測力をさらに実証するために、表２において列挙される遺伝子の量的な発現に基づく結腸直腸がんの再発の可能性を予測する予後の基準が、線形判別分析を使用して生成される（たとえばＭａｒｃｈｅｖｓｋｙら、２００４  ＪＭＤ，Ｖｏｌ．６：１  Ｅｓｔｅｖｅｚら、２００４、Ｅｕｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ５８：４４９−４５５を参照されたい）。
【００９３】
線形判別手段（ＬＤ）分析は、それぞれの遺伝子の個々の測定値および遺伝子のすべての組み合わせについて計算された測定値の両方を使用して、試料を２つのグループに分類する。それぞれの遺伝子について、重みは、グループ１およびグループ２のグループの平均および標準偏差から導き出す。すべての遺伝子に重みを掛け、これらの値の合計は、集合的な判別スコアを生ずる。次いで、この判別スコアを、グループ１およびグループ２のグループの集合的な重心と比較する。これらの重心は、それぞれ、グループ１およびグループ２の試料すべての平均値である。そのため、遺伝子はそれぞれ、全体的な予測に寄与する。この寄与は、その遺伝子についてのグループ１の試料とグループ２の試料との間の相対的な距離が大きい場合に大きな正または負の数となり、ならびに相対的な距離が小さい場合に小さな数となる重みに依存性である。それぞれの未知の試料についての判別スコアおよび重心値は、未知の試料がどのグループに属するかとして、０〜１の確率を計算するのに使用することができる。
【００９４】
本発明の他の実施形態では、表１において列挙される遺伝子以外の遺伝子が、遺伝子発現プロファイルを生成するのに利用される。
【００９５】
実施例５：ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用するステージＩ／ＩＩ結腸直腸原発性腺がん組織の遺伝子発現プロファイルの生成
治療目的の最初の外科的切除時に得られた７４（７４）の保存用の、臨床的注釈が付けられた、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発性がん腫組織（Ｒ０）は、１つの米国（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ；ｎ＝４５）地区および２つの別々の欧州（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）地区から、６０人の結腸がん（ＡＪＣＣ  ｐＴ１−４  ｐＮ０  ｃＭ０）患者および１４人の直腸がん（ＡＪＣＣ  ｐＴ２−３  ｐＮ０  ｃＭ０）患者について収集した。だれも、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法を受けていなかった。３６（３６）か月のＲおよびＮＲステータスを、地区職員によって調査された医療記録によってそれぞれの症例について確認した。インフォームドコンセントをすべての患者について得た。
【００９６】
再発ステータス、最初の再発までの時間、結腸対直腸がん、Ｒ側対Ｌ側の結腸、および組織供給源による階層化の後に、７４の症例を、トレーニングセット（ｎ＝３７；１６Ｒ、２１ＮＲ）および等しいサイズの試験セット（ｎ＝３７；１６Ｒ、２１ＮＲ）に無作為に分けた。
【００９７】
カスタムのフォーカスマイクロアレイを構築するために、腫瘍遺伝子発現を、カスタムの３８４ウェルＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって評価した。４１７のがんに関連する遺伝子のパネルは、それらが以下の判定基準のうちの１つ以上を満たすことに基づいて、アレイ用にあらかじめ選択した：（１）腫瘍形成、腫瘍進行、または転移に関連する；（２）細胞周期進行、血管新生、生存、またはアポトーシスにおいて重要な調節タンパク質をコードする；（３）ＣＲＣの開始および進行に関与する；（４）ＣＲＣについて予後経過を示すことが報告されている；（５）ＣＲＣ化学療法に対する腫瘍応答を予測するかまたはそれに影響を及ぼす；（６）正常と悪性ＣＲＣ組織との間で異なって発現される。
【００９８】
適切なｍＲＮＡ参照配列（ＲＥＦＳＥＱ）受託番号を、それぞれの遺伝子について同定し、コンセンサス配列は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースを通して入手した。ＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって設計された。アンプリコンサイズを最小限に保ち、大部分を１００塩基長未満とした。
【００９９】
それぞれの症例について、無関係な胃腸の病理学者によるＨ＆Ｅ染色スライド上のＦＦＰＥ悪性組織の検証および位置確認の後に、別々のスライドガラスに付けられた対応する非染色腫瘍組織を、使い捨てのメスを使用して、ＲＮＡｓｅなしのｍｉｃｒｏｆｕｇｅチューブにこすり落とした。組織をキシレン中で脱パラフィンし、ＲＮＡを抽出し、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して精製した。ＲＮＡ溶液の純度および量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して、２６０／２８０ｎｍのＵＶ吸収比を測定することによって決定した。最低１００ｎｇのＲＮＡを、プライマーとしてランダムヘキサマーを用い、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、一本鎖ｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲに直ちに使用するか、または−８０℃で保存した。
【０１００】
リアルタイムＰＣＲを介しての遺伝子発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）カスタムアレイ３８４ウェルマイクロ流体カード（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）を使用してアッセイした。４８ウェル当たり１００μｌのｃＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ）をカードに適用した後に、アッセイはすべて、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、二連で実施した。出力データは、増幅曲線上で０．２に設定した一定の閾値、すなわちサイクル閾値（Ｃｔ）に到達するのに必要とされるＰＣＲサイクルの数とした。データを５つのハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子を使用して標準化し、可能性のある技術的な変動性ならびにＲＮＡの完全性および量における偏りをそれぞれのアッセイにおいて補正した。５つの選択したＨＫ遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＧＵＳＢ、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＰＳＭＢ６、ＵＢＣ）は、ＣＲＣおよび他の組織において恒常的に発現されることがよく知られている９つの候補遺伝子のうち、最低レベルの発現変動性を示した。それぞれの対の個々の遺伝子発現複製物を一致について調査し、相関係数をそれぞれについて生成した。複製物を平均し、結果として生じるデータを、５つのＨＫ遺伝子の平均値（Ａｖｅ．５ＨＫ  Ｃｔ）からそれぞれの基準遺伝子についてのＣｔ（ＲＧ  Ｃｔ）を減じることによって標準化した。Ｃｔ値は底２に対する対数の数として表現されるので、データは、真数を取ることによって直線化し、結果を１００の因数によって調整した。したがって、データの最終的な形は、
遺伝子発現値＝２（Ａｖｅ．５ＨＫ  Ｃｔ−ＲＧ  Ｃｔ）×１００
となった。
【０１０１】
研究の全体にわたって、以下を、抽出ＲＮＡおよびＲＴ−ＰＣＲ結果の承認についての最低の判定基準とした：（１）ＲＮＡ濃度：≧１０ｎｇ／μｌ；（２）ＲＮＡは、≧１．８の２６０／２８０ｎｍの比を有することが必要とされた；（３）５つのＨＫ遺伝子の平均的な発現：≦３２．０Ｃｔ；および（４）すべての個々のＣｔ値：≦３５。
【０１０２】
ＲおよびＮＲグループの間で差次的な発現レベルを示す、目的の遺伝子を、本明細書において記載されるＲＴ−ＰＣＲアッセイによって同定した。これを、インターネットを介して入手可能なＵ．Ｃ．Ｓ．Ｃ．ゲノムブラウザにおいて列挙されるヒトゲノム上の参照配列位置およびインターネットを介して入手可能なＧｅｎＢａｎｋから得られる代表的な核酸配列と一緒に表５に示す。同定されるＵ．Ｃ．Ｓ．Ｃ．ブラウザおよびＧｅｎＢａｎｋの配列は、参照によって本明細書によって組み込まれる。
【０１０３】
【表５−１】
2014503222.tif 000007
【０１０４】
【表５−２】
2014503222.tif 000008
【０１０５】
実施例６：遺伝的プログラミングを介して結腸直腸がんの再発の危険性を決定するための基準の生成
実施例５において同定された予後バイオマーカー遺伝子を、トレーニングセットの遺伝子発現データの連続的遺伝的プログラミング（ＧＰ）分析を使用して分析し、バイオマーカー遺伝子の発現レベルに基づいて、予後の基準を進化させた。下記に示される基準は、結腸直腸がん患者が再発を経験するかまたは非再発を経験するかを、検証データセットにおいて予測するのに有用であった。
【０１０６】
同定された予後バイオマーカー遺伝子の遺伝的プログラミング分析において、表５の遺伝子の種々の組み合わせを含む、可能性のある基準の集団を、無作為に作成し、候補となる基準のセットを生じさせた。その後、候補となる基準をそれぞれ適応度について試験した。
【０１０７】
「再発」対「非再発」として正確に分類された腫瘍組織試料の数は、候補となる基準についての適応度の尺度としての役割を果たした。十分に高い適応度を有すると判断された候補となる基準を見つけた場合、遺伝的プログラミングを終結させ、最適の候補を予後の基準として選択した。終結基準を満たさなかった場合、最も高い適応度を有する候補となる基準を交配させて子孫の候補となる基準の新しい集団を生じさせ、より低い適応度を有することが分かった候補となる基準を廃棄した。
【０１０８】
終結基準が満たされ、好適な適応度の１つ以上の基準が発見されるまで、遺伝的プログラミング方法のさらなる反復を実施した。表５の遺伝子の連続的ＧＰ分析の後に、入力データにより、再発を予測した予後のサイン基準が生じた（表６を参照されたい）。
【０１０９】
【表６】
2014503222.tif 000009
【０１１０】
実施例７：再発を予測するための予後のＧＰ基準の使用
表６の基準を、結腸直腸がん患者における再発を予測するのに使用した。治療目的の最初の外科的切除時に得られた保存用のホルマリン固定パラフィン包埋原発性腺がん組織（中央値  保存７年；範囲４〜１５）は、米国における２つの地区および２つの欧州地区から、８６人のステージＩ／ＩＩ（ｐＴ１−４  ｐＮ０  Ｍ０）結腸がん患者および２９人のステージＩ（ｐＴ１−２、ｐＮ０  Ｍ０）直腸がん患者について収集した。これらの地区および試料は、実施例５および６について上記に記載される分子試験を生成するのに使用した試料とは異なるものとした。
【０１１１】
得られた試料は、外科手術の３６か月以内に腫瘍再発（Ｒ）を有する患者からの試料（ｎ＝４６）および手術後の少なくとも３６か月間に非再発（ＮＲ）として確認された患者からの試料（ｎ＝６９）を含んだ。患者のだれも、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法を受けていなかった。
【０１１２】
腫瘍遺伝子発現は、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳから得られたカスタムの３８４ウェルＴＡＱＭＡＮ（登録商標）  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙｓを使用し、厳しい品質管理パラメーターのセットを満たしたＲＮＡを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲによってこれらの試料において評価した。２３のクエリ遺伝子のそれぞれについてのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ番号およびプローブ長を、下記の表７に示す。
【０１１３】
【表７】
2014503222.tif 000010
【０１１４】
基準１〜８の予測的感度および特異度を、この患者データセット（ＶＳｅｔ）において分析し、結腸直腸がんについての現在の全米総合がんネットワーク（ＮＣＣＮ）ガイドラインを使用して得られたものと比較した。ステージＩ／ＩＩ  ＣＲＣ（ｎ＝１１５）について、この二分する基準は、３２／４６Ｒおよび３８／６９ＮＲ  ＶＳｅｔ患者を７０％の感度および５５％の特異度で正確に分類した。「危険性が高い」と見なされたそれらの患者は、５１％の陽性適中率（ＰＰＶ）、７３％の陰性適中率（ＮＰＶ）、および２．０６の相対的危険（ＨＲ）（９５％  ＣＩ：１．１〜３．８６；ｐ＝０．０２０）で、「危険性が低い」と標識された患者よりも３６か月以内の再発について著しく高い可能性を有した。
【０１１５】
対照的に、ＮＣＣＮガイドライン（バージョン１．２０１１）は、この集団において３６か月の再発対非再発を区別することができず、７２％の感度および４２％の特異度、４５％の陽性適中率および６９％の陰性適中率であった。ハザード比は１．３８（９５％  ＣＩ：０．７３〜２．５３、ｐ＝０．３１５）であった。分子試験の特異度は、ＮＣＣＮよりも有意に大きかった（ｐ＝０．０５）。
【０１１６】
ステージＩ直腸がん患者（ｎ＝２９；１３の再発）について、分子試験の予後の精度は、７９％の特異度（２３／２９）を示し、ＮＣＣＮガイドラインの５５％の特異度（１６／２９）を超えた。
【０１１７】
本実施例では、ＦＦＰＥ腫瘍組織における遺伝子発現レベルの遺伝的プログラミング分析による結腸直腸がん再発および／または非再発の決定にとって重要であるとして同定された予後バイオマーカー遺伝子から導き出された予後の基準は、３年以内の再発について、高い危険性と低い危険性の早期ＣＲＣ患者を、現在のＮＣＣＮガイドラインよりも良好に区別することができた。
【０１１８】
実施例８：再発を予測するための予後のＧＰ基準の使用
上記に記載されるように、遺伝的プログラミングは、予後バイオマーカー遺伝子を同定し（実施例５）、結腸直腸がん再発の危険性を決定するための予後の基準を生成するのに使用した（実施例６および７）。表５において列挙される予後バイオマーカー遺伝子の発現レベルが、結腸直腸がん再発を高度に予測したので、発明者らは、これらの予後バイオマーカー遺伝子の発現に基づいた予後の基準を、非ＧＰ分析的方法を使用して生成することができると仮定した。
【０１１９】
分析の他の方法の有用性を実証するために、表５において列挙される予後バイオマーカー遺伝子の発現から導き出された予後の基準を、分類および回帰ツリー（ＣＡＲＴ）アルゴリズムを使用して生成することができる（Ｆｒｅｕｎｄら  １９９９、Ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）。
【０１２０】
様々な分析技術によって生成された予後の基準における予後バイオマーカー遺伝子の使用をさらに実証するために、表５において列挙される遺伝子についての発現データならびに既知の再発および非再発Ｔｓｅｔデータを使用してサポートベクターマシンを作り出すことができる（たとえばＭｏｃｅｌｌｉｎら  ２００３  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００６  １３：１１１３−１１２２を参照されたい）。係数およびベクトルによって作り出されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、トレーニングデータ（Ｔｓｅｔ）に対して４−分割交差検証を実施して、分類指標の堅調性を試験するのに使用する。分類指標を３分割に対してトレーニングし、精度を第４番目のものについて試験する。分析を単一の精度（％）および全体の精度（４分割の平均値）（％）で報告する。ＳＶＭによって開発された基準による検証セット（Ｖｓｅｔ）の試験は、報告される精度（％）を生じさせる。
【０１２１】
様々な分析技術によって生成された予後の基準における予後バイオマーカー遺伝子の使用をさらに実証するために、表５において列挙される遺伝子についての量的な発現データならびに既知の再発および非再発Ｔｓｅｔデータを使用してサポートベクターマシンを作り出すことができる（たとえばＭｏｃｅｌｌｉｎら  ２００３  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００６  １３：１１１３−１１２２を参照されたい）。係数およびベクトルによって作り出されたサポートベクターマシンは、トレーニングデータ（Ｔｓｅｔ）に対して４−分割交差検証を実施して分類指標の堅調性を試験するのに使用する。分類指標を３分割に対してトレーニングし、精度を第４番目のものについて試験する。
【０１２２】
表５において列挙される予後バイオマーカー遺伝子の高度な予測力をさらに実証するために、表５において列挙される遺伝子の量的な発現に基づく結腸直腸がんの再発の可能性を予測する予後の基準が、線形判別分析を使用して生成される（たとえばＭａｒｃｈｅｖｓｋｙら、２００４  ＪＭＤ，Ｖｏｌ．６：１Ｅｓｔｅｖｅｚら、２００４、Ｅｕｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ５８：４４９−４５５を参照されたい）。
【０１２３】
線形判別手段（ＬＤ）分析は、それぞれの遺伝子の個々の測定値および遺伝子のすべての組み合わせについて計算された測定値の両方を使用して、試料を２つのグループに分類する。それぞれの遺伝子について、重みは、グループ１およびグループ２のグループの平均および標準偏差から導き出す。すべての遺伝子に重みを掛け、これらの値の合計は、集合的な判別スコアを生ずる。次いで、この判別スコアを、グループ１およびグループ２のグループの集合的な重心と比較する。これらの重心は、それぞれ、グループ１およびグループ２の試料すべての平均値である。そのため、遺伝子はそれぞれ、全体的な予測に寄与する。この寄与は、その遺伝子についてのグループ１の試料とグループ２の試料との間の相対的な距離が大きい場合に大きな正または負の数となり、ならびに相対的な距離が小さい場合に小さな数となる重みに依存性である。それぞれの未知の試料についての判別スコアおよび重心値は、未知の試料がどのグループに属するかとして、０〜１の確率を計算するのに使用することができる。
【０１２４】
本発明の多くの特徴および利点は、詳細な説明から明らかであり、したがって、本発明の真の精神および範囲内にある本発明の特徴および利点をすべて包含することが添付の請求項によって意図される。さらに、当業者らは、多数の修飾および変化を容易に考えつくので、本発明を、示され、記載されているまさにその構造および実施に限定することは望まれておらず、したがって、好適な修飾および等価物がすべて、本発明の範囲内にあると再分類されてもよい。
【０１２５】
【数１】
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【０１２６】
【数２】
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【０１２７】
【数３】
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【０１２８】
【数４】
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【０１２９】
【数５】
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【０１３０】
【数６】
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【０１３１】
【数７】
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【０１３２】
【数８】
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【０１３３】
【数９】
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【０１３４】
【数１０】
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【０１３５】
【数１１】
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【０１３６】
【数１２】
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【０１３７】
【数１３】
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【０１３８】
【数１４】
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【０１３９】
【数１５】
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【０１４０】
【数１６】
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【０１４１】
【数１７】
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【０１４２】
【数１８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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