(57)【要約】  【解決手段】  本発明に従い、トロンビン生成を調節する第Ｖ因子ペプチドが提供される。特定の実施形態では、前記ペプチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、または４と少なくとも８０％の相同性を有する。前記ペプチドをコードする核酸分子も本発明に含まれる。少なくとも１つの本発明のペプチドおよび／または核酸および少なくとも１つ薬学的に許容される担体を有する組成物も提供される。前記組成物はさらに、少なくとも１つの他の抗血栓化合物を有する  【選択図】      図１
2014530613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ番号：１、２、３、または４と少なくとも８０％の相同性を有する単離ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の単離ペプチドにおいて、前記ペプチドは配列ＩＤ番号：１、２、３、または４と少なくとも９０％の相同性を有するものである単離ペプチド。
【請求項３】
請求項２記載の単離ペプチドにおいて、前記ペプチドは配列ＩＤ番号：１、２、３、または４である単離ペプチド。
【請求項４】
請求項１記載の単離ペプチドにおいて、前記ペプチドは配列ＩＤ番号：３を有するものである単離ペプチド。
【請求項５】
請求項１記載の単離ペプチドにおいて、前記ペプチドはアミド化およびアセチル化から成る群から選択される少なくとも１つの修飾を有するものである単離ペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する組成物。
【請求項７】
請求項６記載の組成物であって、さらに、少なくとも１つの抗血栓化合物を有する組成物。
【請求項８】
それを必要とする被験者の血栓形成を阻害する方法であって、請求項６記載の少なくとも１つの組成物を前記被験者に投与する工程を有する方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法であって、さらに、少なくとも１つの追加の抗血栓化合物の投与を有する方法。
【請求項１０】
請求項１記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターであって、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レトロウイルスベクター、プラスミド、およびレンチウイルスベクターから成る群から選択されるベクター。
【請求項１３】
請求項１０記載の少なくとも１つの核酸分子および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する薬学的組成物。
【請求項１４】
それを必要とする患者の止血異常を治療する方法であって、薬学的に許容される担体中の治療有効量の請求項１記載の少なくとも１つのペプチドを投与する工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願書類は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１１年１０月１３日に提出された米国仮特許出願第６１／５４６，７５２号の優先権を請求するものである。前述の出願書類は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所が与える助成金番号Ｒ０１  ＨＬ０８８０１０による政府支援を受けた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、医学および血液学の分野に関する。より具体的には、本発明は新規第Ｖ因子ペプチドと、それを必要とする患者の凝固カスケードを調節するため、同薬物を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
本発明が関与する技術の状況を説明するため、いくつかの文献および特許文書が本明細書の中で引用されている。これらの引用それぞれは、全文を説明するものとして、本明細書に参考文献により盛り込まれている。
【０００５】
切り傷などの血管損傷に反応し、凝固酵素が段階的に活性化し、最終的に損傷部位で血餅が形成する。トロンビンはこのカスケードの最終段階でその不活性な前駆体であるプロトロンビンから生成し、その後繊維性の血餅を生成する。トロンビンを活性化する酵素複合体のプロトロンビンは、プロテアーゼである第Ｘａ因子（ＦＸａ）および酵素ではない補因子の活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）から成り、損傷近くのリン脂質膜表面で会合する。ＦＶａがないとＦＸａの活性は非常に低いため、ＦＶａはトロンビン生成に重要である。凝固カスケードの他のタンパク質同様、活性化補因子ＦＶａは、不活性な補因子前駆体（ｐｒｏｃｏｆａｃｔｏｒ）である不活性前駆体第Ｖ因子（ＦＶ）から生成する。ＦＶを不活性な状態に維持している２つのフラグメント（約７１ｋＤａおよび約１５０ｋＤａ）として大きな抑制性「Ｂ」ドメインが外れることで、ＦＶが活性化する。従って、不活性な補因子前駆状態のＦＶ活性化または安定化を阻害することは、不適切または望まないトロンビン生成および血栓形成を抑制するために望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に従い、トロンビン生成を調節する第Ｖ因子ペプチドが提供される。特定の実施形態では、前記ペプチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、または４と少なくとも８０％の相同性を有する。前記ペプチドをコードする核酸分子も本発明に含まれる。本発明の少なくとも１つのペプチドおよび／または核酸および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物も提供される。前記組成物はさらに、少なくとも１つの他の抗血栓化合物を有することができる。
【０００７】
本発明の別の態様に沿って、それを必要とする被験者で血栓形成を阻害、治療、および／または予防する方法が提供される。それを必要とする患者で止血異常を阻害、治療、および／または予防する方法が提供される。特定の実施形態では、前記方法が前記被験者に少なくとも１つの本発明の組成物を投与する工程を有する。前記方法はさらに、少なくとも１つの追加抗血栓化合物を投与する工程を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、Ｂドメイン内に保存された塩基性領域のアミノ酸配列を持つ第Ｖ因子の略図を提供している。様々な種間で保存された塩基性領域の配列アラインメントも提供している。
【図２】図２は、ＦＶ塩基性領域のペプチドが複数の補因子様変異型ＦＶを阻害することを示したグラフを提供している。図２Ａは、ＦＸａ／ＦＶａではなくＦＸａ／ＦＶＤＴによるプロトロンビンの活性化を阻害するＦＶ塩基性ペプチド（ＦＶＢＲ）の滴定グラフである。図２Ｂは、ＦＶＢＲまたは対照ペプチド（ｓ４６）存在下で凝固アッセイを行った場合のＦＶＤＴおよび他の変異型の活性を示している。図２Ｃは、様々な変異型ＦＶ−８１０およびその開裂生成物の図を示している。また図２Ｃは、ＦＶＢＲ存在下または非存在下、およびトロンビン（ＩＩａ）存在下または非存在下での凝固アッセイにおけるＦＶＤＴとこれらの変異型の活性グラフを示している。図２Ｄは、ＦＶＢＲの量を増加した場合の正常ヒト血漿の凝固時間を示している。
【図３】図３は、ＦＶ塩基性領域のペプチドがＦＶＤＴに結合し、ＦＶＤＴに対するＦＸａの結合を開裂するが、ＦＶａに対する結合は開裂しないことを証明したグラフを提供している。図３Ａは、ＦＶＢＲ存在下および非存在下でのリポソーム上での蛍光標識ＦＸａのＦＶＤＴに対する結合を示している。図３Ｂは、様々な濃度のＦＶＢＲ存在下でのＦＸａのＦＶＤＴまたはＦＶａに対する結合を示している。図３Ｃは、蛍光標識ＦＶＢＲのＦＶＤＴに対する直接結合を示している。
【図４】図４は、ＦＶＢＲがトロンビンによるＦＶのタンパク質分解活性を遅延させることを示している。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＦＶＢＲ非存在下または存在下での経時的なＦＶの開裂を示した画像を示している。Ｂ＋ＬＣ＝Ｂドメインおよび軽鎖。ＨＣ＝重鎖。ＬＣ＝軽鎖。
【図５】図５は、Ｂドメイン内に保存された塩基性領域および保存された酸性領域のアミノ酸配列を持つ第Ｖ因子の略図を提供している。様々な種間で保存された酸性領域の配列アラインメントも示している。
【図６】図６は、様々な変異型ＦＶの活性に関するグラフを提供している。
【図７】図７Ａは、組織因子経路阻害剤（ＴＥＰＩ）Ｃ末端鎖およびＦＶＢＲの配列アラインメントを示している。図７Ｂは、ＦＶＢＲまたはＴＦＰＩペプチドによるＦＶＤＴの阻害に関するグラフを提供している。図７Ｃは、ＴＦＰＩのＦＶＤＴに対する直接結合を示している。図７Ｄは、ＦＶＤＴとの結合に対する非標識ＦＶＢＲまたはＴＦＰＩとＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８  ＦＶＢＲとの競合アッセイを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書では、前記凝固酵素トロンビンの生成を阻害するペプチドが提供される。具体的には、ＦＶを不活性の状態に保つために必要な、ＦＶ  Ｂドメイン内の約５０アミノ酸の領域（９６３〜１００８）が同定された。この領域は塩基性アミノ酸のアルギニンおよびリジンに富み、生理的ｐＨで強力な正の正味荷電を持っている。この領域（前記ＦＶ塩基性領域）が外れると、ＦＶは不活性な補因子前駆体から、トロンビン生成を助ける活性なＦＶａ様補因子に切り替わる。理論に縛られるわけではないが、本明細書で提供されるデータは、前記塩基性領域は少なくとも前記ＢドメインのＣ末端（１４９３〜１５３７）で酸性度の高い領域と相互作用することで機能し、この相互作用はＦＶを不活性な状態に保つことを示している。別のペプチドとして反応に加える場合、前記ＦＶ塩基性領域は前記酸性領域を含む補因子様の変異型ＦＶを阻害して、補因子前駆体様とし、トロンビン生成を阻害する。さらに、前記ＦＶ塩基性領域のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記凝固カスケードの重要なフィードバック段階である、トロンビンがタンパク分解によりＦＶをＦＶａに変換する能力を低下させる。これらのデータは、本発明の前記ＦＶ塩基性領域が不活性な補因子様の状態を維持することで効率的にＦＶを阻害し、それによってトロビン生成および血栓形成を抑制することを示している。
【００１０】
ペプチド
本発明のペプチドは、既知の方法に従い、様々な点で調整することができる。そのタンパク質は、例えば形質転換菌または動物培養細胞または組織などの適切な試料から精製することができる。本発明のペプチドをコードする核酸分子が利用できれば、当該分野で既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現法および無細胞発現系を利用し、前記タンパク質を産生することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系および翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）またはＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）から市販されている。
【００１１】
大量の本発明のペプチドは、適切な原核細胞または真核細胞系に発現させることで産生することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ分子の一部またはすべてを、大腸菌などの細菌性細胞の発現に合わせたプラスミドベクターに挿入することができる。そのようなベクターは、宿主細胞のＤＮＡ発現が可能となる位置に、前記宿主細胞のＤＮＡ発現に必要な制御要素を有する。そのような発現に必要な制御要素には、プロモーター配列、転写開始配列、および選択的にエンハンサー配列を含む。
【００１２】
遺伝子組み換え原核細胞または真核細胞系での遺伝子発現により作成した本発明のペプチドは、当該分野で既知の方法に従い精製することができる。市販の発現／分泌系を用いることで、遺伝子組み換えタンパク質が発現し、その後宿主細胞から分泌され、周りの培養液から簡単に精製される。前記遺伝子組み換えタンパク質は、前記遺伝子組み換えタンパク質、またはそのＮ末端またはＣ末端で６〜８ヒスチジン残基が標識された遺伝子組み換えタンパク質を単離するためのニッケルカラムに特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用など、アフィニティー分離により精製することもできる。代わりの標識は、ＦＬＡＧエピトープまたは赤血球凝集素エピトープを有する。そのような方法は、当業者によって一般的に使用されている。
【００１３】
本発明のペプチドはペプチド合成により作成することもできる。例えば、前記ペプチドは液相ペプチド合成または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により作成することができる。
【００１４】
前述の方法により調整された本発明のペプチドは、標準的な手順に従い分析することができる。例えば、そのようなタンパク質は、既知の方法によりアミノ酸配列分析を行うことができる。
【００１５】
本発明のペプチドのアミノ酸配列の例には、ＳＲＡＷＧＥＳＴＰＬＡＮＫＰＧＫＱＳＧＨＰＫＦＰＲＶＲＨＫＳＬＱＶＲＱＤＧＧＫＳＲＬＫＫＳＱＦＬＩＫＴＲＫＫＫＫＥＫ（配列ＩＤ番号：１）、ＫＰＧＫＱＳＧＨＰＫＦＰＲＶＲＨＫＳＬＱＶＲＱＤＧＧＫＳＲＬＫＫＳＱ  ＦＬＩＫＴＲＫＫＫＫＥＫ（配列ＩＤ番号：２）、ＲＱＤＧＧＫＳＲＬＫＫＳＱ  ＦＬＩＫＴＲＫＫＫＫＥＫ（配列ＩＤ番号：３）、およびＫＫＧＦＩＱＲＩＳＫＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫ（配列ＩＤ番号：４）を含む。本発明のペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：１、２、３、または４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性（同一性）、特に少なくとも９０％の相同性を有する。特定の実施形態では、前記ペプチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、または４のフラグメントである。例えば、前記ペプチドフラグメントは、配列ＩＤ番号：１、２、３、または４のうち少なくとも約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、または約５５個の隣接アミノ酸を有する。特定の実施形態では、前記ペプチドフラグメントが配列ＩＤ番号：１のフラグメントであるが、配列ＩＤ番号：２または３を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明のペプチドが約１０〜約１００、約２０〜約８０アミノ酸、約２０〜約６０、約２５〜約６０、約３０〜約７０アミノ酸、または約４０〜約６０アミノ酸の長さを有する。上文に述べたとおり、本発明のペプチドは、配列ＩＤ番号：１、２、３、または４またはそのフラグメントと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性（同一性）を有する配列を含む。本発明のペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端で配列ＩＤ番号：１、２、３、または４またはそのフラグメントから伸長することができる。いずれかの末端での配列伸長はどのような配列であってもよい。特定の実施形態では、前記伸長配列が塩基性アミノ酸を有する。特定の実施形態では、前記伸長配列が第Ｖ因子（例えば、配列ＩＤ番号：３）またはＴＥＰＩ（例えば、配列ＩＤ番号：４）のＢドメイン配列に一致する。例えば、前記配列が配列ＩＤ番号：１のＣ末端で３アミノ酸伸長する場合、前記３アミノ酸の伸長配列はＨＴＨである可能性があり、これは前記Ｂドメインのアミノ酸１００９〜１０１１に相当する。
【００１７】
本発明のペプチドは配列ＩＤ番号：１、２、３、または４のアミノ酸に少なくとも１つの置換、付加、または挿入を含む。これらの置換は保存的、つまり、配列ＩＤ番号：１、２、３、または４に存在するアミノ酸と同等（例えば、別の酸性アミノ酸の代わりに酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸の代わりにアミノ酸、大きな疎水性アミノ酸の代わりに大きな疎水性アミノ酸など）である。これらの置換には、アミノ酸類似体および模倣体を含む。特定の実施形態では、複数または単一の置換および／または付加が前記ペプチドに存在する塩基性アミノ酸の数を増加させる。特定の実施形態では、前記置換が前記Ｂドメインの保存された酸性領域のペプチドの親和性を上昇させる（図５参照）。
【００１８】
本発明のペプチドは、例えばＣ末端および／またはＮ末端で部分構造をキャッピング、保護、および／または安定化することができる。そのような部分構造は当該分野で周知であり、制限なく、前記カルボキシ末端のアミド化またはエステル化および前記アミノ末端のアシル化またはアセチル化を含む。前記ペプチドはＰＥＧ化されていてもよい。前記ペプチドはアミノ酸で脂質化またはグリコシル化されていてもよい（つまり、糖ペプチド）。本発明のペプチドは、天然のＬ−アミノ酸の代わりに、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含むこともある。前記ペプチドはＤ−アミノ酸のみを含むこともある。
【００１９】
本発明のペプチドはすべての種由来の第Ｖ因子を基にすることができ、特に哺乳類の第Ｖ因子、より詳しくはヒト第Ｖ因子を基にすることができる。図１は、様々な種の第Ｖ因子の塩基性ドメインの例を示している。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００１２１．２は、アミノ酸１〜２８は開裂し、ナンバリングが残基２９で始まる単一のペプチドであり、野生型ヒトＦＶ前駆タンパク質の例を提供している。本発明のペプチドはすべての種由来のＴＦＰＩを基にすることができ、特に哺乳類のＴＦＰＩ、より詳しくはヒトＴＦＰＩを基にすることができる。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００６２７８．１は、アミノ酸１〜２８は開裂し、ナンバリングが残基２９で始まる単一のペプチドであり、野生型ヒトＴＦＰＩ前駆タンパク質の例を提供している。
【００２０】
少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの担体を有する組成物も本発明に含まれる。従来の担体がすべて、投与するペプチドと適合しない場合を除き、前記薬学的組成物での使用が検討される。特定の実施形態では、前記担体が静脈内投与を目的とした薬学的に許容される担体である。
【００２１】
核酸分子
本発明のペプチドをコードする核酸分子は、（１）適切なヌクレオチド三リン酸からの合成、または（２）生物学的原料からの単離および／または増幅など、当該分野で既知の方法により調整することができる。ヌクレオチド配列の情報を利用し、オリゴヌクレオチド合成により本発明の単離核酸分子を調整することが可能である。実際、前記アミノ酸配列の知識はコードする核酸分子を決定するために十分である。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ合成装置または同様の装置で利用されているホスホラミダイト法により調整することができる。得られた前記構成物は、ゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、当該分野で既知の方法により精製することができる。
【００２２】
本発明の核酸は、従来のベクターまたはウイルスベクター、特に発現ベクターで管理することができる。核酸が発現される細胞に基づき、前記核酸配列の発現を導き出すために、様々なプロモーターを利用することができる。これらのベクターに抗生物質の耐性マーカーを含め、形質転換細胞を選択することができる。本発明の核酸分子をコードするペプチドには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのフラグメントを含み、これらは一本鎖または二本鎖とすることができる。従って、本発明は、少なくとも１つの本発明の核酸分子配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２３】
本発明の核酸分子をコードするペプチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブも、本発明の範囲に含まれる。本明細書で説明される核酸をコードするペプチドを特異的に増幅することができるプライマーも、本明細書で検討される。そのようなオリゴヌクレオチドは、核酸をコードするペプチドを検出、単離、または増幅するためのプローブおよびプライマーとして有用である。
【００２４】
例えばヒト集団には第Ｖ因子の変異型（例えば、対立遺伝子多型）が存在することは当業者の理解するところであり、本発明のオリゴヌクレオチドまたはペプチドをデザインおよび／または利用する際に考慮される。従って、本明細書で開示されたペプチド配列、またはそれぞれの遺伝子またはＲＮＡ転写物の特異的部位を標的とするオリゴヌクレオチドについて、そのような変異型を含むことも本発明の範囲内である。従って、前記「天然対立遺伝子多型」の用語は、本明細書において、本発明の様々な特異的ヌクレオチド配列およびヒト集団に発生するその変異型を指すために使用される。コードされたタンパク質内に保存的または天然のアミノ酸置換を引き起こす様々なゆらぎコドンおよび遺伝的多型は、そのような変異型の例である。そのような変異型では、活性またはタンパク質濃度が大幅に変化していることは示されないだろう。
【００２５】
少なくとも１つの本発明の核酸分子（例えば、ベクター）および少なくとも１つの担体を有する組成物も本発明に含まれる。本発明の組成物は、例えば血液凝固カスケードを調節する治療薬および／または予防薬（タンパク質または核酸）として使用することができる。本明細書では、前記ペプチドが血栓形成を抑制し、止血に作用できることが証明されている。
【００２６】
使用
本発明には、血栓形成を抑制および／または予防する方法を含む。本発明には、止血異常、特に異常、過剰、または不適切な凝固がみられる疾患を治療および／または予防する方法も含む。そのような止血異常の例には、制限なく、血栓症、深部静脈血栓症、循環器疾患に伴う血栓症、悪性腫瘍に伴う血栓症、侵襲的外科的装置（例えば、カテーテル、心臓カテーテル、血管内カテーテル、大動脈内バルーンポンプ、冠状動脈ステント、または心臓弁）により生じた血栓症、自己免疫疾患（例えば、紅斑性狼瘡）に伴う血栓症、血小板減少症（例えば、ヘパリン起因性）、脳卒中、（例えば、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中）、凝固障害を含む。前記ペプチドは、様々な疾患または疾患状態により生じる播種性血管内凝固症候群または消費性凝固障害患者に必要な抗凝固治療を提供することができる。前記ペプチドは、心筋梗塞に罹患した患者に必要な抗凝固治療も提供することができる。
【００２７】
本発明の特定の実施形態では、特に静脈内注射により、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体に入れて患者に投与することができる。本発明のペプチドは、選択的にリポソームに封入するか、他のリン脂質またはミセルと混合し、前記分子の安定性を向上させることができる。ペプチドは単独投与しても、止血を調節することが知られている他の薬物（例えば、血栓形成を抑制する薬物）と併用投与してもよい。例えば、本発明の組成物は他の抗血栓化合物と同時に投与することができる。抗血栓化合物の例には、制限なく、ビタミンＫ拮抗薬（例えば、ワルファリン、アセノクマロール、ジクマロール、フェンプロクーモン、関連４−ヒドロキシクマリン含有分子、フェニンジオン、およびビタミンＫエポキシド還元酵素阻害薬）、直接トロンビン阻害薬（ＤＴＩｓ；例えば、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、アルガトロバン、キシメラガトラン、メラガトラン、およびダビガトラン）、第Ｘａ因子阻害薬（例えば、ヘパリン、低分子量ヘパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、チンザパリン、レビパリン、パルナパリン、ベミパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリナックス、ヘパリン類似物質、ダナパロイド、スロデキシド、キサバン（ｘａｂａｎｓ）、アピキサバン、ベトリキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、およびリバーロキサバン）、デフィブロタイド、および抗血小板薬（例えば、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害薬（例えば、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン）、ＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害薬（例えば、チエノピリジン類（例えば、クロピドグレル、プラスグレル、およびチクロピジン）およびヌクレオチド／ヌクレオシド類似体（例えば、カングレロール、エリノグレル、およびチカグレロール）；プロスタグランジン類似体（例えば、ベラプロスト、プロスタサイクリン、イロプロスト、およびトレプロスチニル）；ＣＯＸ阻害薬（例えば、アセチルサリチル酸／アスピリン、カルバサラートカルシウム、インドブフェン、およびトリフルサル）；トロンボキサン阻害薬（例えば、ジピリダモールまたはピコタミドなどのトロンボキサン合成酵素阻害薬）およびテルトロバンなどの受容体拮抗薬）；ホスホジエステラーゼ阻害薬（例えば、シロスタゾール、ジピリダモール、およびトリフルサル）を含む。前記抗血栓化合物は、本発明のペプチドを有する同じ組成物に入れることができ、または別の組成物に入れることもできる。前記組成物は同時または連続的に投与することができる。本発明の少なくとも１つのペプチドを有する少なくとも１つの第１組成物および少なくとも１つの他の抗血栓化合物を有する少なくとも１つの第２組成物を有するキットも本発明に含まれる。
【００２８】
ペプチドを送達させるための適した組成物は、これに限定されるものではないが患者の状態および血行力学的状態を含む様々な生理的評価項目を考慮し、医師が決定することができる。異なる適応および投与経路に十分適した様々な組成物が当該分野で周知であり、以下に説明される。
【００２９】
精製ペプチドを含む製剤は生理的に許容される基質を含み、好ましくは薬学的製剤として製剤化される。前記製剤は明らかに知られている先行技術の方法により製剤化することができ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２などの塩、およびグリシンおよび／またはリジンなどのアミノ酸を含む緩衝液と、ｐＨ６〜８の範囲で混合することができる。必要となるまで、前記ペプチドを含む精製製剤は、最終溶液の形態または凍結乾燥または冷凍された形態で保存可能である。特定の実施形態では、前記製剤は凍結乾燥された形態で保存され、適切な再溶解溶液により、視覚的に透明な溶液に溶解される。代わりに、本発明に沿った前記製剤は、液体製剤または冷凍された液体として利用できるようにすることも可能である。本発明に沿った前記製剤は特に安定であり、つまり、適応前に長時間、溶解された形態で放置することが可能である。
【００３０】
前記精製タンパク質を薬学的製剤に加工する前に、前記精製ペプチドについて従来の品質管理を行い、治療用の製剤形態にすることができる。特に、組み換えによる製造中、前記精製製剤の細胞核酸、および前記発現ベクター由来の核酸の有無を検討することができる。
【００３１】
核酸をコードするペプチドは、本発明に従い、様々な目的で利用することができる。本発明の特定の実施形態では、血液凝固を調節する核酸の輸送媒体（つまり、発現ベクター）が提供され、前記発現ベクターが、本発明のペプチドをコードする核酸配列を有する。ペプチドをコードする発現ベクターを患者に投与すると、凝固カスケードを変化させるペプチドが発現される。
【００３２】
ペプチド核酸配列を有する発現ベクターは、単独投与または止血の調節に有用な他の分子と併用投与することができる。本発明に従い、発現ベクターまたは併用治療薬は、単独または薬学的に許容されるか生物学的に適合する組成物として患者に投与することができる。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、前記ペプチドをコードする核酸配列を有する発現ベクターがウイルスベクターである。本発明で利用できるウイルスベクターには、これに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター（組織特異的プロモーター／エンハンサーの有無によらない）、複数の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、およびＡＡＶ−８）およびハイブリッドＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターおよび偽型レンチウイルスベクター（例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、および猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。
【００３４】
本発明の特定の実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸配列を有するウイルスベクターの投与法が提供される。本発明の方法で有用なアデノウイルスベクターには、好ましくは、少なくともアデノウイルスベクターＤＮＡの主要部分を含む。本明細書に記載のとおり、そのようなアデノウイルスベクターを投与後にペプチドが発現することで、止血の調節に役立つ。遺伝子組み換えアデノウイルスベクターは、様々な遺伝子療法の応用で広範な有用性が認められてきた。そのような応用の有用性は、主にｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入の効率が高いことによる。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、生物学的に活性なペプチドを産生することができるように、被験者に送達することのできる薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の特定の実施形態では、被験者が治療有効量のペプチドを産生できる、十分な遺伝物質を有する薬学的組成物が、前記被験者の止血に影響することができる。代わりに、上記に考察したとおり、有効量の前記ペプチドを、それを必要とする患者に直接注入することができる。前記組成物は単独投与するか、または安定化化合物など、少なくとも１種類の他の薬物と併用投与することができ、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含む滅菌された生体適合性の薬学的担体に添加して投与することができる。前記組成物は患者に単独投与するか、または止血に影響する他の薬物と併用投与することができる。
【００３６】
特定の実施形態では、前記薬学的組成物が薬学的に許容される賦形剤／担体も含む。そのような賦形剤は、それ自体が前記組成物を投与する患者に有害な免疫反応を誘導せず、過度の毒性を生じることなく投与可能な薬物を含む。薬学的に許容される賦形剤には、これに限定されるものではないが、水、生理食塩水、グリセロール、糖、およびエタノールを含む。その中には、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩など、薬学的に許容される塩を含むことも可能である。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助剤がそのような媒体に存在することも可能である。薬学的に許容される賦形剤に関する詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に見ることができる。
【００３７】
本発明での使用に適した薬学的組成物には、前記活性成分が、意図する治療目的の達成に有効な量で含まれる組成物を含む。治療有効量は、本発明で提供される技術および指針を用い、熟練した医師の能力の範囲内で十分決定される。治療量は、他の因子の中では、前記被験者の年齢および全身状態、異常な血液凝固表現型の重症度、および前記ペプチドの発現レベルを制御する制御配列の強度に依存する。そのため、ヒトの治療有効量は比較的広範囲となり、ペプチド治療に対する個々の患者の反応に基づき、医師が決定することができる。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける前記薬学的組成物の直接送達は、従来のシリンジを用いた注入により達成できる。本発明の組成物は皮下、表皮、皮内、くも膜下腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、静脈内、動脈内、経口、肝内、または筋肉内に送達することができる。血液凝固疾患患者の治療を専門とする臨床医は、これに限定されるものではないが、前記患者の状態および前記治療の目的（例えば、血液凝固の抑制）を含む多数の基準に基づき、本発明の組成物の最適な投与経路を決定することができる。
【００３９】
定義
以上に、また当該明細書および請求項全体にも、本発明の生体分子に関連して様々な用語が使用されている。
【００４０】
本発明の核酸に関して、「単離核酸」の用語が使用されることもある。この用語はＤＮＡに当てはめた場合、由来する生物の天然型ゲノムに（５’および３’方向で）すぐ隣接した配列から単離されるＤＮＡ分子を指す。例えば、前記「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されるか、原核生物または真核生物のＤＮＡに組み込まれるＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を有することがある。
【００４１】
本発明のＲＮＡ分子に関して、前記「単離核酸」という用語は、主に、上記に定義した単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。代わりに、前記用語が、天然の状態で（つまり、細胞または組織中で）関連するだろうＲＮＡ分子から十分分離され、「実質的に純粋な」形態で存在するＲＮＡ分子を指すこともある。
【００４２】
本明細書に用いる「オリゴヌクレオチド」の用語は、本発明の配列、プライマーおよびプローブを指し、２若しくはそれ以上、好ましくは３つ以上のリボ−またはデオキシリボヌクレオチドから成る核酸として定義される。前記オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因によって、および前記オリゴヌクレオチドの特定の応用および使用によって決まる。
【００４３】
本明細書に用いられる「プライマー」の用語は、ＲＮＡかＤＮＡかであり、一本鎖か二本鎖であり、生態系に由来するか制限酵素消化で作成したか合成したオリゴヌクレオチドを指し、適切な環境に置いた場合、鋳型依存的核酸合成のイニシエーターとして機能することができる。適切な核酸の鋳型、適した核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適した補助因子、および適した温度およびｐＨなどの条件を提示した場合、ポリメラーゼの作用またはプライマーが伸長した生成物を生じる同等の活性により、ヌクレオチドを添加することで、前記プライマーをその３’末端で伸長することができる。前記プライマーの長さは、特定の条件および応用の要件によって変化する可能性がある。例えば、診断に応用する場合、前記オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドの長さは典型的には１０〜３０または１５〜２５、またはそれ以上となる。前記プライマーは、望みの伸長生成物の合成を開始するため、つまり、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成開始に利用する場合と適切に並べ、前記プライマーの３’ヒドロキシ部分を提供するのに十分な方法で望みの鋳型鎖とアニーニングできるように、望みの鋳型に十分相補的である必要がある。前記プライマー配列が望みの鋳型と正確に相補的である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、それ以外は相補的なプライマーの５’末端に結合することができる。代わりに、前記プライマー配列が望みの鋳型鎖の配列と十分相補的で、前記伸長生成物の合成に用いられる鋳型プライマー複合体を機能的に提供するという条件で、非相補的塩基が前記オリゴヌクレオチドプライマー配列に散在することも可能である。
【００４４】
本明細書に用いる「プローブ」の用語は、精製された制限酵素の消化で自然に発生するか、合成されたかによらず、前記プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか、特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの核酸を指す。プローブは一本鎖または二本鎖の可能性がある。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブ供給源、および前記方法の利用を含む多くの要素によって決まる。例えば、診断に応用する場合、標的配列の複雑さにより、前記オリゴヌクレオチドプローブは典型的に１０〜３０または１５〜２５、またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないヌクレオチドを含むこともある。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的となるように選択される。これは、一連の事前に決定された条件下、前記プローブがそれぞれの標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」またはアニーリングすることができるよう、十分相補的である必要があることを意味する。従って、前記プローブの配列は前記標的の厳密に相補的な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントが前記プローブの５’または３’末端に結合し、前記プローブ配列の残りの部分が前記標的鎖と相補的となることも考えられる。代わりに、前記プローブ配列が前記標的核酸の配列と十分相補的で、それと特異的にアニーリングするという条件で、非相補的塩基またはそれよりも長い配列が前記プローブに散在する可能性もある。
【００４５】
一本鎖核酸、特にオリゴリボヌクレオチドについて、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当該分野で利用される事前に決定された条件下、そのようなハイブリダイゼーションが可能となるような十分相補的な配列の一本鎖ヌクレオチド２分子間の関連性を指す（「実質的に相補的」と呼ばれることもある）。特に、前記用語は、事実上、非相補的配列の一本鎖核酸と前記オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを除き、本発明の一本鎖ＤＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを指す。相補性が様々な一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションが可能となる適切な条件も、当該分野で周知である。
【００４６】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密な条件を計算するための、１つの一般式を以下に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ（二本鎖）
上式の説明として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］およびホルムアミドを５０％とし、ＧＣの含有量を４２％、平均プローブサイズを２００塩基とすると、前記Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは相同性が１％低下するごとに１〜１．５℃低下する。従って、約７５％以上の配列同一性を有する標的は、ハイブリダイゼーション温度４２℃で観察されることになる。
【００４７】
前記ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳密性は、主に前記溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、前記プローブのその標的へのアニーリング速度を最大限とするため、前記ハイブリダイゼーションは通常、前記ハイブリッドについて計算したＴｍ未満の２０〜２５℃の塩および温度条件で行う。洗浄条件は、前記標的に対する前記プローブの同一性について、可能な限り厳密にする必要がある。一般に、洗浄条件は前記ハイブリッドのＴｍ未満の約１２〜２０℃になるように選択する。本発明の核酸について、中等度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、４２℃での６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％  ＳＤＳ、および変性したサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌにおけるハイブリダイゼーションと定義し、２Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳにおいて５５℃で１５分間洗浄した。高度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、４２℃での６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％  ＳＤＳ、および変性したサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌにおけるハイブリダイゼーションと定義し、１Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳにおいて６５℃で１５分間洗浄した。非常に高度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、４２℃での６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％  ＳＤＳ、および変性したサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌにおけるハイブリダイゼーションと定義し、０．１Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳにおいて６５℃で１５分間洗浄した。
【００４８】
「単離タンパク質」または「単離および精製タンパク質」の用語が本明細書で使用されることもある。この用語は主に、本発明の単離核酸分子が発現することで生成したタンパク質を指す。代わりに、この用語が、天然で関連するだろう他のタンパク質と十分分離され、「実質的に純粋な」形態で存在するタンパク質を指すこともできる。「単離」は、他の化合物または物質との人工または合成混合物、または、基本的活性に干渉せず、例えば、不完全な精製、または安定剤の追加のために存在する不純物の存在を排除することは意味しない。
【００４９】
「ベクター」の用語は、複製される宿主細胞に導入するために核酸配列を挿入できる、担体となる核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を指す。「発現ベクター」は、宿主細胞での発現が必要な必須制御領域内に遺伝子または核酸配列を含む、特殊なベクターである。
【００５０】
「操作により関連付ける」の用語は、コーディング配列の発現が行われるように、ＤＮＡ分子中の前記コーディング配列に対して適切な位置に、前記コーディング配列の発現に必要な制御配列を入れることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中のコーディング配列および転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終止因子）の配列にも当てはまることがある。この定義は、ハイブリッド核酸分子が作成される、第一および第二核酸分子の核酸配列の配置にも応用されることがある。
【００５１】
「実質的に純粋」の用語は、対象化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）の重量で少なくとも５０〜６０％、特に対象化合物の重量で少なくとも７５％、または少なくとも９０〜９９％若しくはそれ以上を有する製剤を指す。純度は前記対象化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析など）で測定される。
【００５２】
「薬学的に許容される」は、動物、より具体的にはヒトに使用するため、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを示す。
【００５３】
「担体」は、例えば、本発明の活性成分が一緒に投与される、希釈剤、補助剤、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリス塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤、または溶媒を指す。薬学的に許容される担体は、石油、動物、植物、または合成由来のものを含む、水および油などの滅菌液とすることができる。水または食塩水溶液および含水デキストロースおよびグリセロール溶液が担体、特に注射剤として利用するのに好ましい。適切な薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ著、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）；  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）；  Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；およびＫｉｂｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに説明されている。
【００５４】
本明細書で用いるとおり、「保存的な」アミノ酸置換／変異は、特定のアミノ酸を同様の性質の側鎖を有するアミノ酸と置き換える（つまり、１つのアミノ酸を同グループに属する別のアミノ酸と交換する）ことを指す。「非保存的な」アミノ酸置換／変異は、特定のアミノ酸を異なる性質の側鎖を有する別のアミノ酸と置き換える（つまり、１つのアミノ酸を異なるグループに属する別のアミノ酸と交換する）ことを指す。同じ性質の側鎖を有するアミノ酸群は当該分野で知られており、これに限定されるものではないが、塩基性アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；中性アミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）；ヒドロキシ基を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）などを含む。
【００５５】
本発明の様々な実施形態を図示するため、以下の例が提供される。例は図示するためのもので、いかなる方法でも本発明を制限する意図はない。
【実施例】
【００５６】
材料と方法
第Ｖ因子ペプチドの発現と精製
第Ｖ因子アミノ酸９５１〜１００８のｃＤＮＡは、ヒト第Ｖ因子ｃＤＮＡの全長から部位特異的プライマーを用いて増幅し、ｐＥ−ＳＵＭＯ細菌発現ベクター（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ、ペンシルバニア州Ｍａｌｖｅｒｎ）にサブクローニングした。ＳＵＭＯ−ＦＶ（９５１−１００８）融合タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌に発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。前記精製した融合タンパク質をＳＵＭＯプロテアーゼ（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）とインキュベートした後、前記ＦＶＢＲペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。対照のペプチドｓ４６（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  ＪＢＣ  ２８２：１５０３３−１５０３９に詳述されているｓ４６タンパク質構築物由来）およびＴＦＰＩ  Ｃ末端ペプチド（残基２４０〜２７６）も同様のアプローチにより作成した。
【００５７】
プロトロンビン活性化アッセイ
プロトロンビン開裂の定常状態の初期速度は、初期トロンビン形成速度を測定することで、２５℃で非連続的に決定した。反応混合物には、リポソーム（７５：２５、ＰＣ：ＰＳ）、プロトロンビン、指示された変異型第Ｖ因子、第Ｖ因子ペプチドＦＶＢＲまたはｓ４６が含まれる。前記反応は、第Ｘａ因子を加えると開始し、トロンビン生成は発色トロンビン物質Ｓ−２２３８の開裂をモニターすることで複数の時点で決定した。
【００５８】
凝固アッセイ
変異型第Ｖ因子の残留凝固活性は、プロトロンビン時間に基づく凝固アッセイにより決定した。変異型第Ｖ因子は前記ＦＶＢＲまたはＳ４６ペプチドとインキュベートし、この後、前記混合物を第Ｖ因子が欠乏した血漿と混合し、凝固時間を測定した。指示がある場合は、前記ペプチドを加える前に、事前にトロンビンをインキュベートして前記変異型第Ｖ因子を活性化した。
【００５９】
トロンビンによる第Ｖ因子のタンパク質分解活性
ＦＶＢＲペプチド存在下および非存在下、トロンビンと血漿由来の第Ｖ因子をインキュベートした。指示された時間にサンプル緩衝液中のサンプルを取り出し、クエンチし、開裂生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー染色により分析した。
【００６０】
直接結合の測定
ＦＶＢＲペプチド非存在下または存在下、蛍光標識し、活性部位がブロックされたＦＸａをＰＣＰＳリポソーム、およびＦＶ−ＤＴまたはｒＦＶａのいずれかとインキュベートした。前記ペプチドがＦＸａとＦＶＤＴまたはｒＦＶａとの結合を開裂する活性は、異方性の低下による変化（図３Ａ）またはＦＸａ／ＦＶａ複合体が開裂したことによる異方性の低下（図３Ｂ）をモニターすることで評価した。
【００６１】
結果
第Ｖ因子のアミノ酸９５１〜１００８に相当するＳＲＡＷＧＥＳＴＰＬＡＮＫＰＧＫＱＳＧＨＰＫＦＰＲＶＲＨＫＳＬＱＶＲＱＤＧＧＫＳＲＬＫＫＳＱＦＬＩＫＴＲＫＫＫＫＥＫの配列（配列ＩＤ番号：１）を有する第Ｖ因子塩基性ペプチド（ＦＶＢＲ）を合成した。前記塩基性ペプチドＦＶＢＲが存在しても、第Ｘａ／ＦＶａ因子によるプロトロンビンの活性化に影響はなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。しかし、ＦＶＢＲの滴定ではＦＸａ／ＦＶ−ＤＴによりプロトロンビンの活性化が阻害されたことが示された（ＦＶ−ＤＴはＢドメインのアミノ酸８１１〜１４９１が欠失した第Ｖ因子である（図２Ａおよび２Ｂ）。ＦＶ−ＤＴは、酸性アミノ酸が多い、短縮Ｂドメインの重要な領域（１４９３〜１５３７）を保存している（図５参照）。図２Ｂで分かるとおり、前記塩基性ペプチドＦＶＢＲは凝固アッセイにおいてＦＶ−ＤＴおよび同様の変異型を阻害したが、ＦＶａは阻害しなかった。検討した他の変異型には、ｓ４６（第Ｖ因子のアミノ酸９６３〜１００８が第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１０３２〜１０７７と置換されている）およびＦＶ−１０３３（アミノ酸１０３４〜１４９１が欠失した第Ｖ因子）を含む。さらに、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１０３２〜１０７７に相当する対照ペプチドのｓ４６は作用を持たなかった。様々なＦＶ−８１０開裂変異体も検討した（図２Ｃ）。具体的には、７０９位のアルギニン、１５４５位のアルギニン、またはその両方をグルタミンに変更し、トロンビンの開裂部位をなくした。ＦＶＢＲがこれらの開裂変異型を阻害する活性については、図２Ｃに示している。そのデータは、前記酸性領域を保存したＢドメインは、補因子の機能を効果的に阻害するために前記ＦＶＢＲの軽鎖に結合する必要があることを示している。図２Ｄは、ＦＶＢＲが正常血漿の凝固時間を濃度依存的に延長させることを示している。
【００６２】
ＦＶの塩基性領域ペプチドは、ＦＸａのＦＶ−ＤＴに対する結合を開裂すると判定されたが、ＦＶａは開裂しなかった。図３Ａに見られるとおり、リポソームにおける蛍光標識したＦＸａのＦＶ−ＤＴに対する結合は、ＦＶＢＲ存在下で阻害される。ＦＶＢＲとＦＸａとの相互作用の開裂は、ＦＶ−ＤＴのみで観察され、ＦＶａでは観察されなかった（図３Ｂ）。図３Ｃは、ＦＶＢＲがＦＶＤＴに直接結合することを示しているが、ＦＶａに直接結合することは示されていない。
【００６３】
ＦＶの塩基性ペプチドもトロンビンによるＦＶのタンパク質分解活性を遅延させると判断された。ＦＶＢＲ非存在下では、トロンビンがＡｒｇ７０９で第Ｖ因子を急速に開裂することで重鎖（ＨＣ）を生成し、Ａｒｇ１０１８およびＡｒｇ１５４５で急速に開裂することで軽鎖（ＬＣ）を生成した（図４Ａ）。ＦＶＢＲ存在下では、Ａｒｇ７０９での開裂が正常に進行した（図４Ｂ）。しかし、ＦＶＢＲがあるとＡｒｇ１５４５での開裂が遅くなり、Ｂドメイン＋軽鎖が蓄積して軽鎖の量が少なくなる。
【００６４】
保存された塩基性領域に加え、第Ｖ因子のＢドメインは酸性領域が保存されている（図５）。前記第Ｖ因子の酸性ドメインが前記塩基性領域と協力して第Ｖ因子を不活性な状態に安定化しているのか否かを判断するため、一連の変異型を作成した。具体的には、Ｂ１９９、Ｂ１０４、およびＢ１５２を合成した。Ｂ１９９はアミノ酸９６３〜１００８が残基８１０と１４９２の間に挿入された変異型ＦＶ−ＤＴであり、Ｂ１０４では、ＦＶ−ＤＴの残基７１６〜８１０が欠失し、残基９６３〜１００８と交換され、Ｂ１５２では、ＦＶ−ＤＴの残基１４９２〜１５３８が欠失し、残基９６３〜１００８と交換されていた。図６にみられるとおり、Ｂ１９９およびＢ１０４の特異的活性は劇的に低下したが、Ｂ１５２の活性はＦＶａおよびＦＶ−ＤＴで観察された値に近づいた。
【００６５】
本明細書に示したデータは、前記第Ｖ因子Ｂドメインの塩基性領域が前記Ｂドメインの酸性領域と機能的に相互作用し、第Ｖ因子を不活性状態に安定化することを証明している。阻害のメカニズムは、少なくとも部分的にはＦＸａと第Ｖ因子との結合の阻害および／または開裂を介しているようにみえる。
【００６６】
第Ｖ因子の塩基性領域ペプチドは変異型第Ｖ因子を効率的に阻害し、トロンビンによる第Ｖ因子の活性化を遅くする。これらの結果は、前記第Ｖ因子の塩基性領域ペプチドは、第Ｖ因子の活性化および補因子の活性を制限することで、トロンビン生成を制御するために利用できることを示している。
【００６７】
ＴＦＰＩのＣ末端領域はＦＶＢＲと相同的である。図７Ａは、ＦＶＢＲおよび組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のＣ末端（アミノ酸２４０〜２６５）の配列アラインメントを提供している。図７Ａに示したＴＦＰＩペプチドは、ＦＶＤＴの阻害活性を検討した。図７Ｂにみられるとおり、前記ＴＦＰＩペプチドはＦＶＢＲ同様、ＦＶＢＴを阻害した。図７Ｃは、ＴＥＰＩが直接ＦＶＤＴに結合することを示している。図７Ｄは、ＦＶＤＴに対する非標識ＦＶＢＲまたはＴＦＰＩとＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８標識ＦＶＢＲとの競合アッセイを示している。
【００６８】
本発明の好適な実施例のいくつかは上記に説明し、具体的に例示してきたが、本発明をそのような実施形態に限定する意図はない。以下の請求項に示すとおり、本発明の範囲と精神から離れずに、そこに様々な修正を加えることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【国際調査報告】
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