(57)【要約】本開示は、とりわけ、スラウストキトリウムならびに関連方法および試薬を提供し、これらは、スラウストキトリドもしくはスラウストキトリウム由来の操作された調節配列、および／またはそれにおいて動作可能な操作された調節配列、スラウストキトリド等の微生物の操作に有用な選択可能なマーカー、微生物を変異誘発するための手段、変異誘発によって産生される新規の株、ならびに微生物における特定の化合物の産生に関連する方法および組成物を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラウストキトリウム遺伝子プロモーターを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記プロモーターは、チューブリンプロモーターである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号６と少なくとも８０％同一である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１０と少なくとも８０％同一である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記プロモーターは、△５エロンガーゼプロモーターである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１９と少なくとも８０％同一である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記プロモーターは、△４デサチュラーゼプロモーターである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号２４と少なくとも８０％同一である、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
スラウストキトリウム遺伝子ターミネーターを含む、単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記ターミネーターは、チューブリンターミネーターである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ターミネーターのヌクレオチド配列は、配列番号１４と少なくとも８０％同一である、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記ターミネーターのヌクレオチド配列は、配列番号１６と少なくとも８０％同一である、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１３】
スラウストキトリウム遺伝子プロモーターおよびスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターに動作可能に結合される異種配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１４】
前記異種配列は、ポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
ゼオシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかの核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１７】
以下を含む微生物の細胞を変異誘発する方法：
前記微生物の細胞を、前記細胞の６０〜８０％を死滅させる濃度のゼオシンを含む培地上で培養することと、
培養に耐え抜く細胞の亜集団を単離し、それによって、微生物の細胞を変異誘発すること。
【請求項１８】
スラウストキトリウムのＰＵＦＡ生合成経路に関与する酵素ポリペプチドまたは酵素ポリペプチド複合体の一部をコードする１つ以上の遺伝子に対して１つ以上の修飾を含有する、スラウストキトリウム細胞。
【請求項１９】
前記１つ以上の修飾は、参照スラウストキトリウム細胞と比較して前記修飾された細胞による１つ以上のＰＵＦＡの産生を、前記修飾された細胞および参照細胞が同等の条件下で培養されるときに、増加させる、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記酵素ポリペプチドまたは酵素ポリペプチド複合体は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、△５エロンガーゼ、△１２エロンガーゼ、△４デサチュラーゼ、およびポリケチドＰＵＦＡシンターゼ（ＰＫＳ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記１つ以上のＰＵＦＡは、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、リノール酸（ＬＡ）、およびリノレン酸からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
前記酵素または酵素複合体は、ポリケチドＰＵＦＡシンターゼ（ＰＫＳ）、△９デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびω−３デサチュラーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２３】
以下のステップを含むスラウストキトリウム細胞を形質転換するための方法：
（ａ）コンピテントスラウストキトリウム細胞を提供するステップと、
（ｂ）選択可能なマーカーを含む組換え核酸を、前記コンピテントスラウストキトリウム細胞内に送達するステップと、
（ｃ）前記コンピテントスラウストキトリウム細胞を、前記選択可能なマーカーを用いることなく、細胞の増殖を減少させる選択剤を含有する培養培地中で培養するステップ。
【請求項２４】
選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
選択剤は、抗生物質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗生物質は、ゼオシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゼオシンは、５０μｇ／ｍＬを超える濃度で存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ゼオシンは、約１００ｕｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換え核酸は、前記選択可能なマーカーとは異なる遺伝子発現カセットをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
（ｄ）前記選択可能なマーカーを含有するコンピテントスラウストキトリウム細胞を単離するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記送達するステップは、前記組換え核酸でコーティングされた粒子の微粒子銃送達を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記粒子は、金粒子を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養培地は、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの塩（例えば、約１５ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの塩、または約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの塩）を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子形質転換にコンピテントなスラウストキトリウム細胞。
【請求項３５】
組換え核酸で形質転換されるスラウストキトリウム細胞。
【請求項３６】
以下を含むスラウストキトリウム細胞を培養する方法：
バイオマスが増加する第１の組の条件下で、スラウストキトリウム細胞を含む培養物を成長させることと、
前記第１の組の培養条件を、脂質生産性が増加する第２の組の条件に移行することと、を含み、前記移行することは、
（ａ）酸素濃度を第１の酸素濃度から第２の酸素濃度まで低減させることと、
（ｂ）Ｃ：Ｎ比を第１のＣ：Ｎ比から第２のＣ：Ｎ比まで増加させることと、
（ｃ）温度を第１の温度から第２の温度まで低減させることと、それらの組み合わせと、のうちの１つ以上を含む。
【請求項３７】
以下を含むＰＵＦＡを提供する方法：
参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞であって、前記修飾された細胞および参照細胞が同等の条件下で培養されるときに、前記修飾された細胞が、前記参照細胞と比較して前記修飾された細胞による１つ以上のＰＵＦＡの産生を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を含有するという点において、参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞を提供することと、
前記１つ以上のＰＵＦＡの産生を達成するのに十分な条件下で、それを達成するのに十分な時間、前記修飾されたスラウストキトリウム細胞を培養すること。
【請求項３８】
前記提供するステップは、少なくとも１つの操作されたスラウストキトリウムプロモーターを含有するスラウストキトリウム細胞を提供することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記提供するステップは、少なくとも１つの操作されたスラウストキトリウムターミネーターを含有するスラウストキトリウム細胞を提供することを含む、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記提供するステップは、参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞であって、前記修飾されたスラウストキトリウム細胞が少なくとも１つの発現異種ポリペプチドを含有するという点において、参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞を提供することを含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの異種タンパク質は、操作されたスラウストキトリウム遺伝子プロモーター、操作されたスラウストキトリウムターミネーター、またはそれらの両方に動作可能に結合される遺伝子から発現される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの異種ポリペプチドは、少なくとも１つの異種ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝子修飾は、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドの発現または活性を増加させる少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
発現または活性が増加する前記ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、内在性ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
発現または活性が増加する前記ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、異種ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
異種ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドを発現する操作されたスラウストキトリウム細胞。
【請求項４７】
操作された細胞および操作されていない細胞が同等の条件下で培養されるときに、前記操作されていないスラウストキトリウム細胞よりも少なくとも３６％高いレベルで少なくとも１つのＰＵＦＡを産生する、前記操作されたスラウストキトリウム細胞。
【請求項４８】
以下を含む組成物：
少なくとも１つのＰＵＦＡと、
抗生物質耐性遺伝子を含有するか、または抗生物質耐性遺伝子を含有するスラウストキトリウム細胞の子孫であるスラウストキトリウム細胞の１つ以上の構成成分。
【請求項４９】
前記抗生物質耐性遺伝子は、ゼオシン耐性遺伝子である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
以下を含む組成物：
少なくとも１つのＰＵＦＡと、
以下のうちの１つ以上の構成成分：
（ａ）スラウストキトリウム細胞であって、ゼオシンが前記細胞の６０〜８０％を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地中もしくは上で培養されたスラウストキトリウム細胞、または
（ｂ）スラウストキトリウム細胞の子孫であって、ゼオシンが前記細胞の６０〜８０％を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地中もしくは上で培養されたスラウストキトリウム細胞の子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年３月７日出願の米国仮特許出願第６１／４４９，８４８号の利益、およびそれに対する優先権を主張するものであり、その全内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本明細書は、出願時に国際出願において開示された配列表（２０１２年３月７日作成の表題「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、１０８キロバイト）について言及する。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、化合物および作用物質の有用な供給源を提供することができる遺伝子改変されたスラウストキトリドに関する。
【背景技術】
【０００４】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、長い間、健康に有益な影響を与えると認識されている。栄養補給剤の主な供給源は、カタクチイワシ、イワシ、サケ、メンハーデン、ニシン、およびマグロ等の高濃度のＰＵＦＡを有する魚種由来の油である。しかしながら、供給源の信頼性の欠如、ならびに魚から単離されるＰＵＦＡの質および／または量の変動は、ＰＵＦＡの代替供給源の必要性が未だ存在することを意味している。
【０００５】
スラウストキトリドは、ＰＵＦＡおよび抗酸化物質を含む有用な生成物を産生する能力を有する水中の真核微生物である（非特許文献１（Ｃａｒｍｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（４）：８８４−８８８，２００３））。これらの生物は、世界中の海洋および河口で見つけられる。スラウストキトリドは、増殖のために様々な炭素および窒素源を使用することができ、安価な栄養素を用いた工業的培養の可能性を示唆する。
改善されたＰＵＦＡ供給源および他の有用な化合物の必要性が未だ存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｒｍｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（４）：８８４−８８８，２００３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、利用可能なＰＵＦＡ供給源ならびに他の有用な化合物および作用物質に関連するある特定の問題の認識を包含する。本発明は、古典的な変異誘発またはその他の方法で遺伝子改変されたスラウストキトリドが、有用なＰＵＦＡ供給源ならびに他の化合物および作用物質を提供することができるという認識を包含する。
【０００８】
本発明は、様々な実施形態において、スラウストキトリドを遺伝子操作するシステム、ならびに様々な用途（例えば、ＰＵＦＡ産生および／またはバイオ燃料産生）を見出す遺伝子操作されたスラウストキトリドを提供する。
【０００９】
ある特定の実施形態において、本発明は、スラウストキトリドもしくはスラウストキトリウムプロモーターまたはターミネーター等のスラウストキトリドもしくはスラウストキトリウム遺伝子素を含む単離された核酸分子を提供する。提供される単離された核酸分子中の例示のプロモーターには、チューブリンプロモーター（例えば、配列番号６または配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列）、△５エロンガーゼプロモーター（例えば、配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列）、および△４デサチュラーゼプロモーター（例えば、配列番号２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列）が含まれるが、これらに限定されない。提供される単離された核酸分子中の例示のターミネーターには、チューブリンターミネーター（例えば、配列番号１４または配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子プロモーターおよびスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターに動作可能に結合される異種配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、異種配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、提供される単離された核酸分子は、ゼオシン耐性遺伝子をさらに含む。
【００１１】
ある特定の実施形態において、１つ以上の提供される単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。
【００１２】
ある特定の実施形態において、微生物（例えば、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム）の細胞を変異誘発する方法が提供され、該方法は、微生物の細胞を、ゼオシンが細胞の６０〜８０％を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地上で培養するステップと、培養に耐え抜く細胞の亜集団を単離し、それによって、微生物の細胞を変異誘発するステップとを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態において、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウムのＰＵＦＡ生合成経路に関与する酵素ポリペプチドまたは酵素ポリペプチド複合体の一部をコードする１つ以上の遺伝子に対して１つ以上の修飾を含有するスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、修飾された細胞および参照細胞が同等の条件下で培養されるときに、参照スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞と比較して修飾された細胞による１つ以上のＰＵＦＡの産生を増加させる。いくつかの実施形態において、酵素ポリペプチドまたは酵素ポリペプチド複合体は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、△５エロンガーゼ、△１２エロンガーゼ、△４デサチュラーゼ、およびポリケチドＰＵＦＡシンターゼ（ＰＫＳ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＵＦＡは、α−リノレン酸（「ＡＬＡ」）、アラキドン酸（「ＡＲＡ」）、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）、ドコサペンタエン酸（「ＤＰＡ」）、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）、γ−リノレン酸（「ＧＬＡ」）、およびリノール酸（「ＬＡ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、酵素または酵素複合体は、ポリケチドＰＵＦＡシンターゼ（ＰＫＳ）、△９デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびω−３デサチュラーゼからなる群から選択される。
【００１４】
ある特定の実施形態において、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を形質転換するための方法が提供され、該方法は、（ａ）コンピテントスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を提供するステップと、（ｂ）選択可能なマーカーを含む組換え核酸を、コンピテントスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞に送達するステップと、（ｃ）コンピテントスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を、選択可能なマーカーを用いることなく、細胞の増殖を減少させる選択剤を含有する培養培地中で培養するステップとを含む。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択剤は、抗生物質である。例えば、抗生物質は、ゼオシンであり得る。いくつかの実施形態において、ゼオシンは、５０μｇ／ｍＬを超える濃度（例えば、約１００μｇ／ｍＬ）で存在する。
【００１５】
スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を形質転換するための提供される方法のいくつかの実施形態において、組換え核酸は、選択可能なマーカーとは異なる遺伝子発現カセットをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を形質転換するための提供される方法は、選択可能なマーカーを含有するコンピテントスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を単離するステップをさらに含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、送達するステップは、組換え核酸でコーティングされた粒子の微粒子銃送達を含む。例えば、金粒子を含む粒子が微粒子銃送達において使用されてもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態において、培養培地は、低塩濃度と高塩濃度との間の塩濃度を含有する。いくつかの実施形態において、低濃度は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１５、約１７、約１８、約１９、または約２０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、高塩濃度は、約２０、約２２、約２５、約２７、約３０、約３２、約３５、約３７、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、または約７０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、塩濃度は、約３ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの塩（例えば、約１５ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの塩、または約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの塩、または約９ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ）である。いくつかの実施形態において、塩は、ナトリウム塩（例えば、海塩、塩化ナトリウム、食卓塩、硫酸ナトリウム等）、カリウム塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される塩であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、塩は、非塩化物塩であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、塩は、非塩化ナトリウム塩であるか、またはそれを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、遺伝子形質転換にコンピテントなスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞が提供される。
【００２０】
ある特定の実施形態において、組換え核酸で形質転換されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞が提供される。
【００２１】
ある特定の実施形態において、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を培養する方法が提供され、該方法は、バイオマスが増加する（かつ任意に他の特性も同様に増加または減少する）第１の組の条件下で、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を含む培養物を成長させることと、第１の組の培養条件を、脂質生産性が増加する第２の組の条件に移行することとを含み、該移行することは、（ａ）酸素濃度を第１の酸素濃度から第２の酸素濃度まで低減させること、（ｂ）Ｃ：Ｎ比を第１のＣ：Ｎ比から第２のＣ：Ｎ比まで増加させること、（ｃ）温度を第１の温度から第２の温度まで低減させること、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態において、ＰＵＦＡを提供する方法が提供され、該方法は、修飾された細胞および参照細胞が同等の条件下で培養されるときに、修飾された細胞が、参照細胞と比較して修飾された細胞による１つ以上のＰＵＦＡの産生を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を含有するという点において、参照スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を提供することと、１つ以上のＰＵＦＡの産生を達成するのに十分な条件下で、それを達成するのに十分な時間、修飾されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を培養することとを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、提供するステップは、少なくとも１つの操作されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムプロモーターを含有するスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を提供することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、提供するステップは、少なくとも１つの操作されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムターミネーターを含有するスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を提供することを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、提供するステップは、修飾されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞が、少なくとも１つの発現異種ポリペプチドを含有するという点において、参照スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞を提供することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの異種タンパク質は、操作されたスラウストキトリドもしくはスラウストキトリウムプロモーター、操作されたスラウストキトリドもしくはスラウストキトリウムターミネーター、またはそれらの両方に動作可能に結合される遺伝子から発現される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの異種ポリペプチドは、少なくとも１つの異種ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドの発現または活性を増加させる少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む。いくつかの実施形態において、発現または活性が増加するＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、内在性ＰＵＦＡ産生ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、発現または活性が増加するＰＵＦＡ産生ポリペプチドは、異種ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドである。
【００２７】
ある特定の実施形態において、異種ＰＵＦＡ産生ポリペプチドを発現する操作されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞が提供される。
【００２８】
ある特定の実施形態において、操作された細胞および操作されていない細胞が同等の条件下で培養されるときに、操作されていないスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞よりも少なくとも３６％高いレベルで少なくとも１つのＰＵＦＡを産生する操作されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞が提供される。
【００２９】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡと、抗生物質耐性遺伝子を含有するか、または抗生物質耐性遺伝子を含有するスラウストキトリドもしくはスラウストキトリウム細胞の子孫であるスラウストキトリドもしくはスラウストキトリウム細胞の１つ以上の構成成分とを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ゼオシン耐性遺伝子である。
【００３０】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡと、（ａ）ゼオシンが細胞の６０〜８０％を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地中もしくは上で培養されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞、あるいは（ｂ）ゼオシンが細胞の６０〜８０％を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地中もしくは上で培養されたスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞の子孫のうちの１つ以上の構成成分を含む組成物が提供される。
【００３１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の図面および説明において説明される。本発明の他の特性、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。すべての引用される特許、特許出願、および参考文献（公開配列データベースエントリーの参照を含む）は、参照によりそれらの全体がすべての目的のために組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８（「ＯＮＣ−Ｔ１８」、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６２４５、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３９７７号（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる））におけるＰＵＦＡの推定上の生合成経路の描写を示す。
【数１】
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【図２】遺伝子発現ベクターｐｄ４ＤＰＺ１の生成の概略図である。
【図３】遺伝子発現ベクターｐｄ５ＥＰＺ１の生成の概略図である。
【図４】遺伝子発現ベクターｐｄ５ＥＰｒｓＧＦＰ１の生成、ならびに該プロセスによって産生された中間体プラスミドの構築物の概略図である。
【図５】遺伝子発現ベクターｐ３４１ＰＺ４０Ｔの生成の略図である。
【図６】遺伝子発現ベクターｐ３４１ＰＺ３４７Ｔの生成の略図である。
【図７】遺伝子発現ベクターｐ３４１ＰＺ７１３Ｔの生成の略図である。
【図８】遺伝子発現ベクターｐ７０１ＰＺ４０Ｔの生成の略図である。
【図９】遺伝子発現ベクターｐ３４１ＰｓｍＲｓＧＦＰ４０Ｔの生成の略図である。
【図１０】遺伝子発現ベクターｐＤ４ＤＰＺ１８Ｓの生成、ならびに該プロセスによって産生された中間体プラスミドの構築物の略図である。
【図１１】遺伝子発現ベクターｐ３４１ＰＺ５ＥｐＥｘの生成、および該プロセスによって産生された中間体プラスミドの構築物の概略図である。
【図１２】成長培地ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０プレートにおける様々な塩分でのＯＮＣ−Ｔ１８の成長およびコロニー数への抗生物質ゼオシンの影響を説明する。結果は、ＯＮＣ−Ｔ１８がＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中で、低塩分（例えば、８．５ｇ／Ｌの人工海塩）下よりも、高塩分（例えば、３５ｇ／Ｌの人工海塩）下において速く成長し、多くのコロニーを産生したことを示す。塩分の中央値（例えば、１８ｇ／Ｌの人工海塩）で、３０μｇ／ｍＬの濃度のゼオシンは、ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレートにおけるＯＮＣ−Ｔ１８の成長を完全に阻害することができた。
【図１３】成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）の寒天プレートにおける、ゼオシン耐性遺伝子が様々なＯＮＣ−Ｔ１８遺伝子プロモーターおよびターミネーター下で駆動されるプラスミドＤＮＡで形質転換されるＯＮＣ−Ｔ１８株のゼオシン耐性を説明する。結果は、ＯＮＣ−Ｔ１８形質転換細胞株のすべてが抗生物質ゼオシンに耐性を示すが、野生型ＯＮＣ−Ｔ１８株は抗生物質ゼオシンに耐性を示さないことを示す。いくつかの形質転換細胞株は、ゼオシンに高度に耐性を示す（例えば、５０００μｇ／ｍＬ）。
【図１４】形質転換したゼオシン耐性株におけるゼオシン耐性遺伝子の導入遺伝子の検出を説明する。ゼオシン遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを、ゼオシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ技法で、それぞれの形質転換細胞株のゲノムＤＮＡから増幅した。
【図１４Ａ】図１４。形質転換したゼオシン耐性株におけるゼオシン耐性遺伝子の導入遺伝子の検出を説明する。ゼオシン遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを、ゼオシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ技法で、それぞれの形質転換細胞株のゲノムＤＮＡから増幅した。
【図１４Ｂ】図１４。形質転換したゼオシン耐性株におけるゼオシン耐性遺伝子の導入遺伝子の検出を説明する。ゼオシン遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを、ゼオシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ技法で、それぞれの形質転換細胞株のゲノムＤＮＡから増幅した。
【図１５】１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌの濃度の海塩を含有する成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）の寒天プレートにおける、野生型および様々な形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株の成長速度を説明する。その細胞懸濁液の１μＬをＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上にスポットし、コロニーの直径を毎日測定した。
【図１６】１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌの濃度の人工海塩を含有する液体成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）における、野生型および様々な形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株のバイオマス生産性を説明する。結果は、高塩分よりも低塩分で、試験したすべての株がより多くのバイオマスを産生したことを示す。
【図１７Ａ】図１７。１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌの濃度の人工海塩を含有する液体成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）における、野生型および様々な形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株のＤＨＡ生産性を説明する。結果は、形質転換株のＤＨＡ生産性が広範囲にわたって異なり、ほとんどの株が、高塩分よりも低塩分で高いＤＨＡ収量をもたらし、高いＤＨＡ収量をもたらした株を、単一コロニー培養物をスクリーニングすることによって単離することができることを示す。
【図１７Ｂ】図１７。１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌの濃度の人工海塩を含有する液体成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）における、野生型および様々な形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株のＤＨＡ生産性を説明する。結果は、形質転換株のＤＨＡ生産性が広範囲にわたって異なり、ほとんどの株が、高塩分よりも低塩分で高いＤＨＡ収量をもたらし、高いＤＨＡ収量をもたらした株を、単一コロニー培養物をスクリーニングすることによって単離することができることを示す。
【図１７Ｃ】図１７。１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌの濃度の人工海塩を含有する液体成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）における、野生型および様々な形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株のＤＨＡ生産性を説明する。結果は、形質転換株のＤＨＡ生産性が広範囲にわたって異なり、ほとんどの株が、高塩分よりも低塩分で高いＤＨＡ収量をもたらし、高いＤＨＡ収量をもたらした株を、単一コロニー培養物をスクリーニングすることによって単離することができることを示す。
【図１７Ｄ】図１７。１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌの濃度の人工海塩を含有する液体成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）における、野生型および様々な形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株のＤＨＡ生産性を説明する。結果は、形質転換株のＤＨＡ生産性が広範囲にわたって異なり、ほとんどの株が、高塩分よりも低塩分で高いＤＨＡ収量をもたらし、高いＤＨＡ収量をもたらした株を、単一コロニー培養物をスクリーニングすることによって単離することができることを示す。
【図１８Ａ】図１８。様々な塩分を有する液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中で成長した形質転換株の脂肪酸プロフィールおよび全体の脂質生産性を説明する。この図は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株におけるｂｌｅ導入遺伝子の安定性を説明する。
【図１８Ｂ】図１８。様々な塩分を有する液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中で成長した形質転換株の脂肪酸プロフィールおよび全体の脂質生産性を説明する。この図は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株におけるｂｌｅ導入遺伝子の安定性を説明する。
【図１８Ｃ】図１８。様々な塩分を有する液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中で成長した形質転換株の脂肪酸プロフィールおよび全体の脂質生産性を説明する。この図は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株におけるｂｌｅ導入遺伝子の安定性を説明する。
【図１８Ｄ】図１８。様々な塩分を有する液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中で成長した形質転換株の脂肪酸プロフィールおよび全体の脂質生産性を説明する。この図は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株におけるｂｌｅ導入遺伝子の安定性を説明する。
【図１９】変異誘発されたＯＮＣ−Ｔ１８株および親株のバイオマス、脂質、およびＤＨＡ生産性の比較を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
コンピテント：細胞に関して本明細書において使用される「コンピテント」という用語は、細胞外遺伝物質を取り込む細胞の能力を指す。細胞は、天然でコンピテントであり得、かつ／または人工的に（例えば、実験室内で）誘導されて、コンピテントになり得る。いくつかの実施形態において、コンピテント細胞は、細胞外遺伝物質が特定の方法、例えば、形質転換の特定の方法によって導入されるときに、細胞外遺伝物質を取り込むことができる。例えば、細胞は、形質転換の１つの方法に対してコンピテントであるが、別の方法に対してはコンピテントでない場合がある。あるいは、またはさらに、細胞は、２つ以上の形質転換方法に対してコンピテントであり得る。コンピテント細胞を、様々な供給源のうちのいずれかから得ることができる。例えば、それらを、自然界から単離し、実験室で調製し、かつ／または商業的に購入することができる。いくつかの実施形態において、細胞のコンピテンスは、一時的である。いくつかの実施形態において、細胞のコンピテンスは、永久的である。
【００３４】
構成成分：「構成成分」という用語は、細胞に関して本明細書において使用されるとき、細胞膜、細胞壁、細胞核、細胞質ゾル、遺伝物質（例えば、染色体）、細胞小器官、または前述の構成成分のうちのいずれかに含有される生体分子の任意の部分を含むが、これらに限定されない、細胞の任意の部分、例えば、構造、構造の一部、高分子複合体、および／または細胞に含有される分子を意味する。典型的に細胞に含有される小器官は、細胞型によって異なり得る。例えば、いくつかの小器官は、真核細胞にのみ存在する。いくつかの小器官は、植物細胞にのみ存在し、いくつかの小器官は、動物細胞にのみ存在する。小器官の種類の非限定的な例には、細胞核、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、リソソーム、空胞、ゴルジ体、小胞体、リボソーム、および中心体がある。細胞に含有される生体分子の非限定的な例には、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、核タンパク質複合体、脂質、ならびにリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの細胞は、外来性遺伝物質（例えば、人の手によって細胞に導入された物質）を含有し得る。そのような外来性物質は、本定義に包含される。いくつかの細胞は、細胞外被膜、鞭毛、または線毛（ｆｉｍｂｒｉａ）（線毛（ｐｉｌｉ））等の細胞外構成成分を有し得る。これらの細胞外構成成分も、本定義に包含される。
【００３５】
操作された：概して、「操作された」という用語は、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、自然界においてその順序で一緒に結合されない２つ以上の配列が、人の手によって操作されて、操作されたポリヌクレオチドにおいて相互に直接結合されるときに、「操作された」と見なされる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、自然界において、第１のコード配列と動作可能に会合しているが、第２のコード配列とは動作可能に会合しておらず、それが第２のコード配列と動作可能に会合されるように人の手によって結合される調節配列を含む。本明細書に記載の１つの特定の実施例のみを挙げると、本発明のいくつかの実施形態において、スラウストキトリウム△４デサチュラーゼプロモーターは、スラウストキトリウム△４デサチュラーゼポリペプチド以外のポリペプチドをコードする核酸に結合される。同等に、細胞もしくは生物は、それが、その遺伝情報が改変されるように操作された（例えば、以前に存在しなかった新たな遺伝物質が、例えば、形質転換、接合、もしくは他の機構によって導入されたか、または以前に存在した遺伝物質が、例えば、置換もしくは欠失変異によって改変もしくは除去される）場合、「操作された」と見なされる。一般的な慣行にあるように、かつ当業者によって理解されるように、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、実際の操作がそれより前の実体上で行われたにもかかわらず、典型的には、依然として、「操作された」と称される。
【００３６】
遺伝子修飾：本明細書において使用される「遺伝子修飾」という用語は、遺伝子操作を用いた人の手による操作を指す。「遺伝子修飾」という用語は、細胞の遺伝物質のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列への変化、および細胞の遺伝物質への化学修飾（例えば、遺伝子座の発現に影響を及ぼし得るメチル化等の修飾）を含む、細胞の遺伝物質への任意の種類の変化を包含する。そのような様式で操作される細胞または生物は、「遺伝子修飾された」か、または「トランスジェニック」であるといわれている。例えば、本明細書において使用される「トランスジェニック細胞」という用語は、そのＤＮＡが非トランスジェニック細胞において本来存在しない外来性核酸を含有する細胞を指す。トランスジェニック細胞は、形質転換した細胞から得られるか、または再生されるか、あるいはトランスジェニック細胞から得られ得る。本発明の文脈における例示のトランスジェニック細胞には、トランスジェニックスラウストキトリド細胞またはスラウストキトリウム細胞が含まれるが、これらに限定されない。トランスジェニック細胞は、典型的には、同一の株の天然の非トランスジェニック細胞の細胞特性とは異なる細胞特性を付与するＤＮＡ配列を発現する。トランスジェニック細胞の子孫は、典型的には、同様にトランスジェニックと見なされる。
【００３７】
異種：核酸（例えば、調節配列および／もしくは遺伝子を含む核酸）またはポリペプチドを指すために本明細書において使用される「異種」という用語は、細胞内に人工的に導入され、かつ／またはそれが存在する細胞内で天然に生じない核酸またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、異種核酸は、細胞内に天然に存在する核酸のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、スラウストキトリド宿主細胞は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム調節配列を有する核酸を含むように操作される。スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム調節配列が宿主細胞内で天然に生じ得るが、導入された核酸は、本開示に従って異種である。多くの実施形態において、異種核酸は、細胞内に天然に存在する任意の核酸のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、特定の細胞に異種の核酸は、異種核酸が導入される細胞とは異なる供給源生物において天然に見られる核酸の核酸配列と同一の核酸配列を有する。
【００３８】
宿主細胞：本明細書において使用される「宿主細胞」は、本開示に従って操作される細胞である。例えば、いくつかの実施形態において、宿主細胞は、（例えば、ＰＵＦＡを増加させる修飾を介して）１つ以上のＰＵＦＡのその産生が増加するように操作される。本明細書において使用される「修飾宿主細胞」は、その他の点では同一の親細胞と比較して、かつ／または特定の参照細胞（例えば、野生型細胞）と比較して、本開示に従って修飾されたか、操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）されたか、あるいは操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）された任意の宿主細胞である。いくつかの実施形態において、修飾された宿主細胞は、親または参照細胞と比較して、修飾された宿主細胞によるＰＵＦＡまたは他の細胞物質の産生の増加をもたらす少なくとも１つの（任意に２つ以上の）修飾（例えば、少なくとも１つのＰＵＦＡを増加させる修飾）を有する。
【００３９】
導入：細胞または生物内への核酸の導入に関して本明細書において使用される「導入」という用語は、その最大範囲の意味を有し、例えば、形質転換方法（例えば、塩化カルシウム媒介形質転換、電気穿孔、粒子衝突）による導入を包含し、かつ形質導入、抱合、および接合を含む他の方法による導入も包含するよう意図されている。いくつかの実施形態において、ベクターは、核酸を細胞または生物内に導入するために利用される。
【００４０】
単離される：本明細書において使用される「単離される」という用語は、単離された実体が、それが以前に会合されていた少なくとも１つの構成成分から分離されたことを意味する。他のほとんどの構成成分が除去されたときに、単離された実体は、「精製される」か、または「濃縮される」。単離および／または精製および／または濃縮を、例えば、分画、抽出、沈殿、または他の分離を含む当技術分野において既知の任意の技法を用いて行うことができる。
【００４１】
動作可能に結合される：本明細書において使用される「動作可能に結合される」という用語は、２つの核酸配列の間の関係を指し、それらの核酸配列のうちの一方の発現は、もう一方の核酸配列によって制御されるか、調節されるか、または調整される。いくつかの実施形態において、任意の有効な三次元会合が許容されるが、第２の核酸配列に動作可能に結合される核酸配列は、直接的または間接的にのいずれかで、そのような第２の配列に共有結合される。単一の核酸配列を、複数の他の配列に動作可能に結合することができる。例えば、単一のプロモーターは、複数のＲＮＡ種の転写を指向することができる。
【００４２】
ポリペプチド：本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、概して、少なくとも３個のアミノ酸のポリマーであるという当技術分野で認識されている意味を有する。しかしながら、この用語は、ポリペプチドの特定の機能クラス、例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ等を指すためにも使用される。それぞれのそのようなクラスのために、本明細書は、そのようなポリペプチドの既知の配列のいくつかの例を提供する。しかしながら、当業者であれば、「ポリペプチド」という用語が、本明細書（または本明細書において具体的に言及される参考文献もしくはデータベース）において列挙される完全な配列を有するポリペプチドを包含するだけでなく、そのような完全なポリペプチドの機能的なフラグメント（すなわち、少なくとも１つの活性を保持するフラグメント）を表すポリペプチドも包含するように、十分に大まかであるよう意図されていることを認識する。さらに、当業者であれば、タンパク質配列が、概して、活性を破壊することなくいくつかの置換に耐えることを理解する。したがって、活性を保持し、かつ通常、少なくとも３〜４個、多くの場合、最大２０個以上のアミノ酸を包含する１つ以上の高度に保存された領域において、少なくとも約３０〜４０％、多くの場合、約５０％、６０％、７０％、または８０％を超える全体配列同一性を、同一のクラスの別のポリペプチドと共有し、かつ通常、はるかにより高い同一性、多くの場合、９０％、さらには９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を有する少なくとも１つの領域をさらに含む任意のポリペプチドが、本明細書において使用される「ポリペプチド」という関連用語に包含される。類似性および／または同一性を有する他の領域を、本明細書に記載の様々なポリペプチドの配列の分析により、当業者が決定することができる。当業者に既知であるように、様々な戦略が知られており、同一性および／または類似性の程度を評価するために、アミノ酸またはヌクレオチド配列の比較を行うための手段が利用可能である。これらの戦略には、例えば、手動アラインメント、コンピュータによる配列アラインメント、およびそれらの組み合わせが挙げられる。配列アラインメントを行うためのいくつかのアルゴリズム（それらは、概して、コンピュータで実現される）は広く利用可能であるか、いろいろな場所で入手することができるか、または当業者によって作り出され得る。代表的なアルゴリズムには、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２：４８２）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，４８：４４３）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似法の検索（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８８，８５：２４４４）、ならびに／またはこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実現（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子ソフトウェアパッケージリリース７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａ���ｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）が挙げられる。そのようなアルゴリズムを組み込む容易に入手可能なコンピュータプログラムには、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＩＬＥＵＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、各プログラムのデフォルトパラメータを使用してもよい。あるいは、実践者は、自身の実験および／または他の要件に応じて非デフォルトパラメータを使用してもよい（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＵＲＬを有するウェブサイトを参照のこと）。
【００４３】
ＰＵＦＡ生合成経路：「ＰＵＦＡ生合成経路」は、ＰＵＦＡおよび／またはＰＵＦＡ前駆体を産生する生合成経路である。
【００４４】
ＰＵＦＡ生合成ポリペプチド：本明細書において使用される「ＰＵＦＡ生合成ポリペプチド」という用語は、αリノレン酸（「ＡＬＡ」）、アラキドン酸（「ＡＲＡ」）、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）、ドコサペンタエン酸（「ＤＰＡ」）、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）、γ−リノレン酸（「ＧＬＡ」）、リノール酸（「ＬＡ」）、および／またはリノレン酸等であるが、これらに限定されないＰＵＦＡの産生に関与するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、最終的にＰＵＦＡを産生する合成経路における特定のステップを触媒する酵素である。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、脂肪酸シンターゼである。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、脂肪酸の伸長を触媒する。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドは、脂肪酸の脱飽和を触媒する。いくつかの実施形態において、「ＰＵＦＡ生合成ポリペプチド」という用語は、自らは合成反応を触媒しないが、合成反応を触媒する他のポリペプチドの発現および／または活性を調節するポリペプチドも包含し得る。ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドには、例えば、脂肪酸シンターゼポリペプチド、エロンガーゼポリペプチド、△９デサチュラーゼポリペプチド、△１２デサチュラーゼポリペプチド、△６デサチュラーゼポリペプチド、△８デサチュラーゼポリペプチド、△５デサチュラーゼポリペプチド、△４デサチュラーゼポリペプチド、およびω３デサチュラーゼポリペプチドが挙げられる。
【００４５】
ＰＵＦＡを増加させる修飾：本明細書において使用される「ＰＵＦＡを増加させる修飾」は、その少なくとも１つのＰＵＦＡの産生を増加させる宿主細胞の修飾を指す。いくつかの実施形態において、そのような増加した産生は、野生型よりも少なくとも１％〜１０００％高いＰＵＦＡの濃度、例えば、修飾が導入された親細胞のＰＵＦＡの濃度、および／または特定の参照細胞（例えば、野生型細胞）のＰＵＦＡの濃度よりも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０、１０００％高いＰＵＦＡの濃度をもたらす。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを増加させる修飾は、１つ以上のＰＵＦＡ生合成ポリペプチドの発現または活性を増加させる。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを増加させる修飾は、例えば、基質へのアクセスのためにＰＵＦＡ生合成ポリペプチドと競合することによって、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドの発現または活性を妨害する１つ以上のポリペプチドの発現または活性を低下させる。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを増加させる修飾は、宿主細胞への異種核酸の導入を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを増加させる修飾は、細胞中の脂肪酸の全濃度を増加させる。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを増加させる修飾は、細胞中の脂肪酸の全濃度の増加の有無にかかわらず、細胞中の１つ以上の特定のＰＵＦＡの全濃度を増加させる。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを増加させる修飾は、ＡＬＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ、および／またはＬＡを含むが、これらに限定されないＰＵＦＡの濃度を増加させる。
【００４６】
子孫：「子孫」という用語は、細胞に関して本明細書において使用されるとき、「子孫細胞」が親細胞の遺伝物質のうちの少なくともいくつかを含有するように、（例えば、細胞分裂または出芽によって）別の細胞（「親細胞」）から生じる細胞を意味する。いくつかの実施形態において、子孫細胞は、親細胞の遺伝物質のすべてを含有する。いくつかの実施形態において、子孫細胞は、親細胞の遺伝物質のすべてを含有しない。いくつかの実施形態において、子孫細胞は、親細胞の遺伝物質に加えて、いくつかの遺伝物質を含有する。いくつかのそのような実施形態において、さらなる遺伝物質は、細胞株または細胞種と異種である。「子孫」という用語は、親細胞の直接子孫（例えば、親細胞の１回の分裂または親細胞からの１回の出芽から生じる細胞）のみならず、親細胞のすべての間接子孫（例えば、２サイクル以上の親細胞の分裂または親細胞からの出芽から生じる細胞）も包含するよう意図されている。したがって、所与の親細胞が、分裂または出芽の各サイクルにおいて、限定された数（例えば、２つ）のみの細胞を生成し得るにもかかわらず、その所与の親細胞は、多くの細胞子孫を有し得る。「子孫」という用語は、人の手によって１つ以上の操作を経た（例えば、遺伝子操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）または遺伝子操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）された）細胞を包含することも意図されている。したがって、例えば、親細胞株が遺伝子操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）または遺伝子操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）されるとき、それから生じる細胞はすべて、その細胞株の子孫であると見なされる。それらの子孫の子孫もすべて、親細胞株の子孫であると見なされ、それ以降も同様である。
【００４７】
プロモーターまたはプロモーター要素：本明細書において使用される「プロモーター」および「プロモーター要素」という用語は、プロモーターに動作可能に結合される選択されたポリヌクレオチド配列の発現を調節し、かつその選択されたポリヌクレオチド配列の細胞内での発現をもたらすポリヌクレオチドを指す。本明細書において使用される「スラウストキトリウムプロモーター」という用語は、スラウストキトリウム細胞中で機能するプロモーターを指す。本明細書において使用される「スラウストキトリドプロモーター」という用語は、スラウストキトリド細胞中で機能するプロモーターを指す。
【００４８】
参照細胞：本明細書において使用される「参照細胞」という語句は、比較目的のために少なくとも１つの特性に対して正常である細胞を指す。例えば、遺伝子操作された細胞と比較される参照細胞は、遺伝子操作されていない細胞であり得る。いくつかの実施形態において、参照細胞は、遺伝子修飾を含有しない。いくつかの実施形態において、参照細胞は、野生型株の細胞である。いくつかの実施形態において、参照細胞は、それが比較される特定の株のある遺伝子修飾特性を含有するが、それが比較される特定の株の１つ以上の遺伝子修飾特性を含有しない。例えば、そのような参照細胞は、それが含有しない１つ以上の遺伝子修飾の影響を評価するのに有用であろう。したがって、例えば、それが比較される細胞と同一または類似の株の「参照スラウストキトリウム細胞」（または「参照スラウストキトリド細胞」）という用語は、参照スラウストキトリウム細胞（または参照スラウストキトリド細胞）が、参照スラウストキトリウム細胞（または参照スラウストキトリド細胞）が比較されるスラウストキトリウム細胞（またはスラウストキトリド細胞）の１つ以上の特性（例えば、１つ以上の遺伝子修飾）を欠くことを除いて、スラウストキトリウム細胞（またはスラウストキトリド細胞）を意味する。
【００４９】
選択可能なマーカー：本明細書において使用される「選択可能なマーカー」という語句は、選択を可能にする生成物（タンパク質）をコードするヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、または遺伝子産物（例えば、タンパク質）自体のいずれかを指す。「選択可能なマーカー」という用語は、一般的に当技術分野で理解されるように本明細書において使用され、細胞もしくは生物におけるその存在が、ある特定の定義された培養条件（選択的条件）下で、細胞もしくは生物に有意な成長または生存利益または不利益を付与するマーカーを指す。例えば、それらの条件は、特定の化合物の存在もしくは不在であり得るか、または温度の増加、放射線の増加、マーカーの不在下では毒性である化合物の存在等の特定の環境条件であり得る。そのような化合物（複数を含む）の存在もしくは不在、または環境条件（複数を含む）は、「１つの選択的条件」または「複数の選択的条件」と称される。「成長利益」とは、その他の点では同一の細胞もしくは生物と比較して、強化された生存能力（例えば、成長利益を有する細胞もしくは生物は、その他の点では同一の細胞と比較して、平均して増加した寿命期間を有する）、増加した増殖速度（本明細書において「成長速度」とも称される）のうちのいずれか、またはそれらの両方を意味する。概して、成長利益を有する細胞の集団は、成長利益を欠くその他の点では同一の細胞の集団よりも少ない死細胞もしくは生育不能な細胞および／または高い細胞増殖速度を呈する。典型的には、選択可能なマーカーが細胞に成長利益を付与するが、ある特定の選択可能なマーカーは、細胞に成長不利益を与え、例えば、それらは、マーカーを発現しないその他の点では同一の細胞よりもこれらの細胞をある特定の化合物または環境条件の悪影響を受けやすくする。抗生物質耐性マーカーは、マーカーを発現する細胞を選択するために使用することができる選択可能なマーカーのクラスの非限定的な例である。適切な濃度の抗生物質の存在下（選択的条件下）において、そのようなマーカーは、マーカーを発現する細胞に成長利益を付与する。したがって、抗生物質耐性マーカーを発現する細胞は、抗生物質の存在下で生き残り、かつ／または増殖することができるが、抗生物質耐性マーカーを発現しない細胞は、抗生物質の存在下で生き残ることができず、かつ／または増殖することができない。例えば、植物細胞において一般に使用されるこの種類の選択可能なマーカーは、抗生物質カナマイシンに対する耐性を提供するタンパク質をコードするＮＰＴＩＩタンパク質である。選択可能なマーカーには、カルベニシリンに対する耐性を付与するタンパク質（例えば、β−ラクタマーゼ）、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン等に対する耐性を付与するタンパク質がさらに含まれる。選択可能なマーカーの第２の非限定的なクラスは、栄養マーカーである。そのようなマーカーは、概して、細胞増殖または生存に必要とされる化合物を産生するように生合成経路において機能する酵素である。概して、非選択的条件下で、必要とされる化合物は、その環境下において存在するか、または代替経路によって細胞中に産生される。選択的条件下で、マーカーが関与する生合成経路を機能させることは、化合物���産生するために必要とされる。
【００５０】
選択剤：本明細書において使用される「選択剤」という語句は、選択可能なマーカーを担持する細胞もしくは細胞集団に有利に、またはそれに不利に、細胞もしくは細胞集団に選択圧を導入する作用物質を指す。例えば、ある特定の実施形態において、選択剤は、抗生物質であり、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。ある特定の例示の実施形態において、ゼオシンは、選択剤として使用される。
【００５１】
供給源生物：本明細書において使用される「供給源生物」は、本発明に従って受容細胞または宿主細胞内に導入されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは他の化合物（例えば、異種核酸）を天然に含有するか、または産生する生物である。いくつかの実施形態において、選択される特定の供給源生物は、本開示の実践に必須ではない。関連性のある考慮すべき事柄には、例えば、潜在的な供給源および宿主生物が、進化の点でどの程度密接に関連しているか、または供給源生物が、他の関連核酸および／もしくはポリペプチドの配列が選択された他の供給源生物とどのように関連しているかが含まれ得る。複数の異なる異種核酸が宿主細胞内に導入され、かつ／または宿主細胞によって発現される場合、異なる配列は、異なる供給源生物由来であるか、または同一の供給源生物由来であり得る。一例のみを挙げると、ある場合には、個々のポリペプチドは、個々のサブユニットの複合タンパク質活性を表し得、かつ／または本開示の目標を達成するために、他のポリペプチドと協働するよう要求され得る。いくつかの実施形態において、多くの場合、そのようなポリペプチドが同一の供給源生物由来であること、および／または宿主細胞中で一緒に発現されるときに適切に機能することに十分に関連することが望ましい。いくつかの実施形態において、そのようなポリペプチドは、異なる供給源生物、さらには非関連の供給源生物由来であり得る。異種ポリペプチドが宿主細胞中で発現される場合、多くの場合、宿主細胞のコドン嗜好性を受け入れ、かつ／またはコード配列を宿主細胞中で活性の調節要素と結合させるように調整されたポリペプチドをコードする核酸配列を利用することが望ましいことがさらに理解される。例えば、宿主細胞がスラウストキトリウム細胞である場合、それがそのような細胞のコドン嗜好性とより密接に一致するように、多くの場合、所与のポリペプチドをコードする遺伝子配列を改変することが望ましい。ある特定の実施形態において、所与のポリペプチドをコードする遺伝子配列は、そのような遺伝子配列が宿主細胞自体に由来する（したがって、異種ではない）場合でさえも最適化される。例えば、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子配列が宿主細胞株から単離されるにもかかわらず、そのような遺伝子配列を、所与の宿主細胞中での発現のためにコドン最適化されない可能性がある。そのような実施形態において、その遺伝子配列をさらに最適化して、宿主細胞のコドン嗜好性を説明することができる。当業者であれば、宿主細胞のコドン嗜好性を認識し、本明細書に開示の方法および組成物を用いて、宿主細胞中での所与のポリペプチドの発現を最適化することができる。
【００５２】
基質：酵素の基質を説明するために本明細書において使用される「基質」は、酵素の活性により修飾され得る任意の実体を指す。
【００５３】
ターミネーター：本明細書において使用される「ターミネーター」という用語は、細胞におけるターミネーターに動作可能に結合される選択されたポリヌクレオチド配列の発現を抑止するポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、ターミネーター配列は、遺伝子中の終止コドンの下流にある。本明細書において使用される「スラウストキトリウムターミネーター」という用語は、スラウストキトリウム細胞中で機能するターミネーターを指す。本明細書において使用される「スラウストキトリドターミネーター」という用語は、スラウストキトリド細胞中で機能するターミネーターを指す。
【００５４】
形質転換：本明細書において使用される「形質転換」という用語は、外来性核酸分子（例えば、ベクターまたは組換え核酸分子）が受容細胞または微生物内に導入されるプロセスを指す。外来性核酸分子は、宿主細胞または微生物のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に組み込まれる（すなわち、それに共有結合される）場合もあり、組み込まれない場合もある。例えば、外来性ポリヌクレオチドは、プラスミド等のエピソーム要素上で維持され得る。あるいは、またはさらに、外来性ポリヌクレオチドは、染色体複製を介して娘細胞によって継承されるように、染色体内に組み込まれ得る。形質転換のための方法には、リン酸カルシウム沈殿、Ｃａ２＋処理、受容細胞と組換え核酸を含有する細菌プロトプラストとの融合、組換え核酸を含有するリポソームでの受容細胞の処理、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた融合、電気穿孔、磁気穿孔、微粒子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、および細胞へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されない。ある状況において、外来性核酸は、別の細胞との接合により細胞内に導入される。例えば、Ｓ．セレビジエにおいて、細胞は、相互に接合する。
【００５５】
形質転換される：細胞に関して使用される「形質転換される」という用語は、細胞が外来性遺伝物質（例えば、組換え核酸）を担持するように、本明細書に記載の「形質転換」を経た細胞を指す。「形質転換される」という用語を用いて、微生物、微生物の株、組織、生物等を指すこともできるか、またはそれらを代替的に指すことができる。
【００５６】
ある特定の実施形態の詳細な説明
本明細書に記載されるように、本発明は、ＰＵＦＡの産生および／またはスラウストキトリドの修飾に関連する様々な試薬および方法を提供する。概して、本発明は、スラウストキトリド宿主細胞の修飾、具体的には、特に目的とする化合物（例えば、ＰＵＦＡ）の産生を増加させるためのスラウストキトリドの操作に関する。本発明は、ある特定のスラウストキトリウム種遺伝子調節要素の識別、ならびにスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムの変異誘発についての方法論の開発を包含する。ある特定の実施形態において、本発明は、操作されたスラウストキトリウム種株、およびそれらから産生され、かつそれらとともに産生される生成物をさらに提供する。本発明のこれらおよび他の態様の特定の実施形態のある特定の詳細は、以下でより詳細に論じられる。
宿主細胞
【００５７】
言及されるように、本発明は、宿主細胞の操作のための試薬および方法論を提供する。
【００５８】
概して、識別された試薬（例えば、調節要素、ベクター、選択可能なマーカー、変異誘発剤等）および方法論（例えば、変異誘発する方法を含む）を、任意の適切な宿主細胞とともに利用してもよい。本開示を解読し、その結果、そのような試薬を理解した当業者であれば、そのような要素が活性である適切な宿主細胞を容易に識別することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明に従って使用される宿主細胞は、スラウストキトリド細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、トラウストチトリアレス目のメンバーである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、トラウストチトリアシエサブクラスのメンバーである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、スラウストキトリウム、ウルケニア、シゾキトリウム、オーランチオキトリウム、アプラノキトリウム、ボトリオキトリウム、ジャポノキトリウム、オブロンギキトリウム、パリエチキトリウム、およびサイコイドキトリウムからなる群から選択される属のメンバーである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、シゾキトリウム属ではない。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明に従って利用される宿主細胞は、スラウストキトリウム属のメンバーである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、以下の種：スラウストキトリウムアグレガツム、スラウストキトリウムアウレウム、スラウストキトリウムゲルトネリウム、スラウストキトリウムキネイ、スラウストキトリウムモチバム、スラウストキトリウムムルチルジメンタレ、スラウストキトリウムパキデルマム、スラウストキトリウムロゼウム、スラウストキトリウム種１．３Ａ４．１、スラウストキトリウム種ＡＴＣＣ２６１８５、スラウストキトリウム種ＢＬ１３、スラウストキトリウム種ＢＬ１４、スラウストキトリウム種ＢＬ２、スラウストキトリウム種ＢＬ３、スラウストキトリウム種ＢＬ４、スラウストキトリウム種ＢＬ５、スラウストキトリウム種ＢＬ６、スラウストキトリウム種ＢＬ７、スラウストキトリウム種ＢＬ８、スラウストキトリウム種ＢＬ９、スラウストキトリウム種ＢＰ３．２．２、スラウストキトリウム種ＢＰ３．３．３、スラウストキトリウム種カウジボラム、スラウストキトリウム種ＣＨＮ−１、スラウストキトリウム種ＦＪＮ−１０、スラウストキトリウム種ＨＫ１、スラウストキトリウム種ＨＫ１０、スラウストキトリウム種ＨＫ５、スラウストキトリウム種ＨＫ８、スラウストキトリウム種ＨＫ８ａ、スラウストキトリウム種ＫＫ１７−３、スラウストキトリウム種ＫＬ１、スラウストキトリウム種ＫＬ２、スラウストキトリウム種ＫＬ２ａ、スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８、スラウストキトリウム種ＰＪＡ１０．２、スラウストキトリウム種ＴＲ１．４、スラウストキトリウム種ＴＲＲ２、スラウストキトリウムストリアタム、またはスラウストキトリウムヴィサージェンスのうちの１つに由来するスラウストキトリウム細胞である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明に従って使用される宿主細胞は、シゾキトリウム属のメンバーである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、以下の種：シゾキトリウムリマシナム、シゾキトリウムマングロベイ、シゾキトリウムミヌツム、シゾキトリウム種（ＡＴＣＣ２０１１１）、シゾキトリウム種（ＡＴＣＣ２０８８８）、シゾキトリウム種ＢＲ２．１．２、シゾキトリウム種ＢＵＣＡＡＡ０３２、シゾキトリウム種ＢＵＣＡＡＡ０９３、シゾキトリウム種ＢＵＣＡＣＤ１５２、シゾキトリウム種ＢＵＣＡＲＡ０２１、シゾキトリウム種ＢＵＣＨＡＯ１１３、シゾキトリウム種ＢＵＲＡＢＱ１３３、シゾキトリウム種ＢＵＲＡＲＭ８０１、シゾキトリウム種ＢＵＲＡＲＭ８０２、シゾキトリウム種ＦＪＵ−５１２、シゾキトリウム種ＫＨ１０５、シゾキトリウム種ＫＲ−５、シゾキトリウム種ＰＪ１０．４、シゾキトリウム種ＳＥＫ２１０、シゾキトリウム種ＳＥＫ３４５、シゾキトリウム種ＳＥＫ３４６、シゾキトリウム種ＳＲ２１、またはシゾキトリウム種ＴＩＯ０１のうちの１つに由来するスラウストキトリウム細胞である。
【００６２】
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８細胞である。ＯＮＣ−Ｔ１８は、Ａｄｖｏｃａｔｅ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｂａｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｄｙ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，Ｃａｎａｄａの塩性湿地草の葉から本来単離された海洋スラウストキトリウムである。ＯＮＣ−Ｔ１８は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１１７１９４号において説明されている。いくつかの実施形態において、スラウストキトリウム細胞は、配列番号６８と少なくとも９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上（例えば、１００％を含む）同一の１８ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＡＴＣＣ株受託番号ＰＴＡ−６２４５で寄託される細胞由来のスラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８細胞である。
微生物の操作
【００６３】
本開示は、とりわけ、調節要素、選択可能なマーカー、変異誘発方法、およびスラウストキトリド等の微生物の操作のための形質転換方法を提供する。本開示を考慮した上で当業者によって認識されるように、本明細書に提供される手段を単独で、かつ様々な組み合わせで用いて、任意の所望の遺伝子修飾を実現することができる。例えば、ある特定の実施形態において、提供される形質転換方法を用いて、１つ以上の遺伝子をコードする核酸分子を導入する。核酸分子は、本明細書に提供されるプロモーター、ターミネーター、もしくは選択可能なマーカー配列、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ある特定の実施形態において、提供される変異誘発方法を用いて、所望の特性を有する株（例えば、スラウストキトリド株）を生成する。そのような株を、（例えば、本明細書に提供される１つ以上の調節要素を含む核酸を用いて）形質転換することもできる。
遺伝子発現
【００６４】
本開示は、微生物を操作するための組成物および方法を包含する。ある特定の実施形態において、本開示は、スラウストキトリド（例えば、スラウストキトリウム）を操作するための組成物および方法を提供する。「操作された」細胞には、（例えば、外来性核酸の導入によって）修飾された細胞および修飾を保持するそれらの子孫が含まれる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本開示は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム由来の調節配列を含む核酸を提供する。真核生物における遺伝子発現は、多くの場合、種特異的であるか、または密接に関連する生物において機能する調節配列を必要とする。スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム由来の調節配列の可用性は、目的とする遺伝子がスラウストキトリド内で発現することを可能にする。いくつかの実施形態において、調節配列には、プロモーター配列が含まれる。いくつかの実施形態において、調節配列には、ターミネーター配列が含まれる。
【００６６】
本開示は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウムプロモーターを含む単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される核酸は、スラウストキトリウム△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターを含む。例示の△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの配列は、配列番号２４で示される。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される核酸は、スラウストキトリウム△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターを含む。例示の△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターの配列は、配列番号１９に示される。スラウストキトリウム△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターは、スラウストキトリド（例えば、スラウストキトリウム）において強力なプロモーターである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される核酸は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウムチューブリン遺伝子プロモーターを含む。例示のスラウストキトリウムチューブリン遺伝子プロモーターの配列は、配列番号６および１０に示される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムプロモーターを含む単離された核酸は、カセット、例えば、発現カセットである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムプロモーターを含む単離された核酸は、ベクター、例えば、発現ベクターである。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本開示は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子プロモーターを含むように操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態において、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウムプロモーター、例えば、スラウストキトリウム△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、スラウストキトリウム△５エロンガーゼ遺伝子プロモーター、またはスラウストキトリウムチューブリン遺伝子プロモーターを含むように操作される。
【００６９】
本開示は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターを含む単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される核酸は、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウムチューブリン遺伝子ターミネーターを含む。例示のスラウストキトリウムチューブリン遺伝子ターミネーターの配列は、配列番号１４および１８に示される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターを含む単離された核酸は、カセット、例えば、発現カセットである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターを含む単離された核酸は、ベクター、例えば、発現ベクターである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、提供される単離された核酸は、１つ以上の遺伝子調節要素を含む。いくつかのそのような実施形態において、含まれる遺伝子調節要素は、誘導性遺伝子調節を促進する。提供される核酸と組み合わせて用いることのできる誘導性システムの非限定的な例には、テトラサイクリン誘導システム、エタノール誘導システム、および化学誘導遺伝子発現システムが挙げられる（例えば、Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｍｏｒｓｃｈｈaｕｓｅｒ（２００５）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、およびＪｅｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）を参照されたく、それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７２】
本明細書に提供される調節配列を有する核酸を、異種ポリペプチドをコードする遺伝子等の異種配列に動作可能に結合し得る。例えば、いくつかの実施形態において、典型的には、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターに動作可能に結合される異種核酸配列に動作可能に結合されるスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。いくつかの実施形態において、異種核酸配列は、遺伝子中のコード配列の少なくとも一部を含み、例えば、異種核酸配列は、ポリペプチドまたはＲＮＡ等の遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態において、提供される遺伝子発現カセットは、選択マーカー（例えば、Ｓｈ  ｂｌｅ等のゼオシン耐性遺伝子、または本明細書で論じられる任意の他の選択マーカー）をさらに含む。
【００７３】
分子生物学およびＤＮＡ操作手順を、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ  Ｆ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ  Ｍ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｒ  Ｅ，Ｍｏｏｒｅ  Ｄ  Ｄ，Ｓｅｉｄｍａｎ  Ｊ  Ｇ，Ｓｍｉｔｈ  Ｊ  Ａ，Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ（ｅｄｓ）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って行うことができる。
変異誘発
【００７４】
別の態様では、本開示は、微生物を変異誘発するための作用物質および／または方法、ならびに変異誘発によって産生される株および／または細胞を提供する。例えば、本明細書に記載されるように、ブレオマイシン、フレオマイシン、および／またはタリソマイシン等の抗生物質を用いて微生物を変異誘発することができることが見出されている。スラウストキトリド（例えば、スラウストキトリウム）等の微生物に有効なそのような変異誘発物質の可用性は、所望の特性を有する株の開発を可能にする。具体的には、本開示は、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）を用いてスラウストキトリド（例えば、スラウストキトリウム）等の微生物を変異誘発することができることを実証する。
【００７５】
抗生物質ゼオシンは、ストレプトマイセスバーチシラス変異体（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の培養ブロス由来の塩基性で水溶性の銅キレート化された糖ペプチドである。ゼオシンは、抗生物質のフレオマイシン群のメンバーであり、これは、リンパ腫、頭部癌および頸部癌、ならびに精巣癌に対する強力な抗癌剤として広く使用されている糖ペプチドである（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，（１９６６）１９：２００−２０９、Ｓｉｋｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，（１９８５））。概して、これらの抗生物質の作用の分子モードが、それらの平面のビチアゾール含有部分のインターカレーションによってＤＮＡを結合し、かつＤＮＡを切断して、細胞死を引き起こす一本鎖切断または二本鎖切断をもたらす能力に関連すると考えられる（Ｐｏｖｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９７７）４：３５７３−３５８０）。それらの抗生物質が広範囲の細胞型に対して毒性であるため、抗生物質のこの群は、陽性選択のための薬物として用いられる。本開示は、ゼオシンが、工業的な微生物株の改良に有用な変異誘発物質であるという発見を包含する。さらに、ゼオシンが処理された細胞の大半を死滅させるある特定の濃度で、生き残った細胞が変異頻度を増加させたことが本明細書に示される。増加した変異頻度を有する細胞を産生する能力は、変異誘発された株のより容易な選択および単離を可能にする。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本開示は、スラウストキトリド細胞を変異誘発するためのシステムおよび／または方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、スラウストキトリウム細胞、ウルケニア細胞、シゾキトリウム細胞、オーランチオキトリウム細胞、アプラノキトリウム細胞、ボトリオキトリウム細胞、ジャポノキトリウム細胞、オブロンギキトリウム細胞、パリエチキトリウム細胞、サイコイドキトリウム細胞、モルティエレラ糸状菌、従属栄養的に成長した藻類（例えば、クリプテコディニウム属の種）からなる群から選択される細胞を変異誘発するためのシステムおよび方法を提供する。いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＯＮＣ−Ｔ１８の変異誘発のためのシステムおよび／または試薬を提供する。
【００７７】
ある特定の例示の実施形態において、微生物は、関連抗生物質（例えば、ゼオシン）を含む好適な固体培地（例えば、寒天培地）への適用によって変異誘発され、その抗生物質は、それが細胞増殖の完全またはほぼ完全な阻害を呈する濃度未満の濃度で存在する。これらの方法のために使用される微生物は、ゼオシン耐性遺伝子（例えば、Ｓｈ  ｂｌｅ）を担持しない。いくつかの実施形態において、抗生物質（例えば、ゼオシン）は、変異誘発のために、それがその細胞型の少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％を死滅させる濃度未満の濃度で使用される。いくつかの実施形態において、抗生物質（例えば、ゼオシン）は、変異誘発のために、それがその細胞型の３０％、４０％、５０％、または６０％を死滅させる濃度を超える濃度で使用される。いくつかの実施形態において、抗生物質（例えば、ゼオシン）は、変異のために使用される。いくつかの実施形態において、抗生物質は、それが、細胞において観察される自然変異の頻度を超えて、その抗生物質に曝露される細胞における変異頻度を増加させる濃度および条件下で使用される。いくつかの実施形態において、抗生物質は、それがその細胞型の増殖を阻害するか、またはその細胞型の６０〜８０％を死滅させる濃度および条件下で使用される。
【００７８】
ＯＮＣ−Ｔ１８細胞は、１００ｇ／ｍＬの濃度のゼオシンに対する感受性が高い（実施例３を参照のこと）。したがって、いくつかの実施形態において、ゼオシンは、変異誘発のために、１００ｇ／ｍＬ未満（例えば、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、または３０ｇ／ｍＬ）の濃度で使用される。いくつかの実施形態において、ゼオシンは、変異誘発のために、約５０ｇ／ｍＬの濃度で使用される。いくつかの実施形態において、細胞がゼオシンで変異誘発される培地は、１８ｇ／Ｌ以下の塩濃度を有する。変異誘発された細胞は、変異誘発物質のより低い濃度で、または変異誘発物質の不在下で増殖した細胞と比較して、形態変化を示し得る。数例のみを挙げると、いくつかの実施形態において、変異誘発された細胞は、変化した成長速度、色、および／または総脂質量もしくは特定の脂質量を示す。
【００７９】
変異誘発のある特定の例示の方法において、細胞（例えば、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞）は、４０〜６０ｇ／ｍＬの濃度の抗生物質（例えば、ゼオシン）を含有する固体培地上に拡散される。少なくとも４日（例えば、５、６、７、８、９、または１０日）後にこれらの条件下で出現するコロニーは、単離される。単離された細胞を、変異誘発から生じた所望の特性について試験することができる。例えば、変異誘発されたコロニー由来の細胞を参照細胞（例えば、親細胞）と比較して、バイオマスおよび／または脂質生産性等の特性の変化を検出することができる。
【００８０】
本開示は、抗生物質（例えば、ゼオシン）の変異誘発によって単離される微生物（例えば、スラウストキトリドまたはスラウストキトリウムを提供する。いくつかの実施形態において、抗生物質（例えば、ゼオシン）の変異誘発によって単離される微生物株（例えば、スラウストキトリウム株）は、親または参照株よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％多い総脂質を産生する。いくつかの実施形態において、ゼオシンの変異誘発によって単離されるスラウストキトリド株は、親株よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％多いＡＬＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ、および／もしくはＬＡ、またはそれらの組み合わせを産生する。いくつかの実施形態において、ゼオシンの変異誘発によって単離されるスラウストキトリド株は、親株よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％多いＡＲＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、またはそれらの組み合わせを産生する。
【００８１】
ゼオシンの変異誘発によって単離されるＯＮＣ−Ｔ１８のある特定の株は、親株よりも約３６％多いＤＨＡを産生する。
選択
【００８２】
本開示は、スラウストキトリド（例えば、スラウストキトリウム）等の微生物を選択するための方法を提供する。そのような方法を、微生物を遺伝子操作するために、例えば、本明細書に記載の形質転換方法と併せて、かつ／またはその一環として用いてもよい。
【００８３】
概して、提供される選択方法において、選択剤は、選択可能なマーカーを担持しない微生物よりも選択剤に好適な選択可能なマーカーを担持する微生物の成長を支持するために使用される。典型的には、選択剤は、選択マーカーを担持しない微生物の成長を阻害し、減少させ、かつ／または遅延させる。選択中、微生物は、成長培地が選択剤（「選択培地」）で補充されることを除いて、典型的には、本明細書に記載の成長培地中で培養される。
【００８４】
本開示のある特定の選択方法において、微生物は、培養物が主に選択マーカーを担持する細胞から成ることを可能にするのに十分な期間、選択培地中で培養される。すなわち、選択培地中での成長期間中、選択マーカーを担持しない細胞は、成長せず、培養物において選択マーカーを担持する細胞によって支配される。いくつかの実施形態において、微生物は、１〜１５日間、１〜１２日間、または１〜９日間、選択培地中で培養される。ある特定の実施形態において、微生物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間以上、および／または５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、もしくは１０日間以下の期間、選択培地中で培養される。ある特定の例示の実施形態において、微生物は、約３〜約５日間、または約５〜約１０日間等の期間、選択培地中で培養される。いくつかの実施形態において、微生物は、選択後に選択培地中に保存される。いくつかの実施形態において、微生物は、少なくともある期間、例えば、回復期間中、選択剤を有しない培地に移される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、細胞がある期間選択培地中で増殖した後に除去される。選択可能なマーカーの除去を、細胞を選択培地中で増殖させる期間の直後に、細胞を選択剤を有しない培地中で増殖させる「回復期間」後に、またはそれより後に（例えば、細胞がある期間保存された後に、細胞が凍結し、その後、解凍された後に）行ってもよい。導入された遺伝要素（例えば、選択可能なマーカー）を後に除去することができるように細胞を遺伝子操作する方法は、当技術分野において周知である。そのような方法は、典型的には、リコンビナーゼポリペプチドの使用を採用し、それは、典型的には、特定のヌクレオチド配列（「認識部位」または「認識配列」）を認識する。例えば、選択可能なマーカーを操作して、選択可能なマーカーに隣接する特定のリコンビナーゼのための認識部位を有するスラウストキトリドまたはスラウストキトリウム細胞内に入れることができる。選択可能なマーカーの欠失が所望されるとき、その細胞を適切なリコンビナーゼ（すなわち、選択可能なマーカーに隣接する認識部位を認識するリコンビナーゼ）に暴露することができ、それは、認識部位上で相同組換え反応を行い、結果的に、それらの認識部位間での核酸配列の欠失または反転をもたらす。
【００８６】
いくつかの実施形態において、選択剤は、抗生物質であるか、またはそれを含み、選択マーカーは、抗生物質に対する耐性遺伝子であるか、またはそれを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、選択剤の組み合わせが使用され、かつ／または選択マーカーの組み合わせが使用される。
【００８８】
ある特定の例示の実施形態において、微生物は、ゼオシンを含む好適な培地への適用による選択を受け、そのゼオシンは、閾値濃度を超える濃度で存在する。
【００８９】
閾値濃度は、ゼオシンがゼオシン耐性遺伝子を含有しない細胞の増殖の完全またはほぼ完全な阻害を呈する濃度におおよそ相当し得る。いくつかの実施形態において、閾値濃度は、ゼオシンがゼオシン耐性遺伝子を含有しない細胞型の少なくとも８５％、９０％、もしくは１００％を死滅させる濃度であるか、またはその濃度を超える。いくつかの実施形態において、閾値濃度は、培養条件（例えば、塩濃度、培養培地の種類、培養温度、液体または固体培養物等）によって異なり得る。多くの実施形態において、閾値濃度は、５０μｇ／ｍＬを超える。いくつかの実施形態において、閾値濃度は、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００μｇ／ｍＬであるか、またはそれを超える。いくつかの実施形態において、閾値濃度は、１００μｇ／ｍＬであるか、または約１００μｇ／ｍＬである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、フレオマイシン、ブレオマイシン、および／またはタリソマイシン耐性遺伝子であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、Ｓ．ヒンズスタヌス（Ｓ．ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）由来の遺伝子（例えば、ｂｌｅ遺伝子）であるか、またはそれを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、選択中に使用される培地の塩濃度は、選択なしで微生物の培養のために使用される培地で典型的に使用される塩濃度とは異なる。いくつかの実施形態において、選択中に使用される培地の塩濃度は、選択なしで培地微生物の培養のために使用される培地で典型的に使用される塩濃度とほぼ同一である。ある特定の例示の実施形態において、塩濃度は、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ、および／または約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、塩濃度は、約１８ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、塩濃度は、約３５ｇ／Ｌである。
【００９２】
いくつかの実施形態において、培養培地が約１８ｇ／Ｌの塩濃度を有するとき、３０μｇ／ｍＬ以上のゼオシン濃度が使用される。いくつかの実施形態において、培養培地が約３５ｇ／Ｌの塩濃度を有するとき、１００μｇ／ｍＬ以上のゼオシン濃度が使用される。
【００９３】
ある特定の例示の実施形態において、選択中に使用される好適な培地は、固体培地である。固体培地が使用されるとき、微生物は、単一細胞コロニーが成長することができるように、（例えば、接種白金耳、細胞拡散器、ビーズ、または拡散するための他の機構を用いて）固体培地の平面上に拡散され得る。
【００９４】
単一細胞コロニーを採取および培養して、本明細書に記載の化合物の分析（例えば、導入遺伝子分析、成長特性の分析、脂質プロフィールの分析等）ならびに／または産生のために、大量および／もしくは十分な量を得ることができる。あるいは、またはさらに、それらから得られる単一細胞コロニーおよび／または培養物を、（例えば、適切な凍結培地中での凍結によって）後の使用のために保存することができる。
形質転換
【００９５】
本開示は、スラウストキトリド（例えば、スラウストキトリウム）細胞を形質転換するための方法を提供する。そのような方法は、概して、コンピテントスラウストキトリド細胞を提供するステップと、異種（例えば、組換えまたは操作された）核酸をコンピテント細胞中に送達するステップ（組換え核酸は、選択可能なマーカーを含む）と、選択可能なマーカーを用いることなく、細胞の増殖を減少させる選択剤を含有する培養培地中でコンピテント細胞を培養するステップとを含む。
【００９６】
遺伝子形質転換にコンピテントなスラウストキトリド細胞が本開示によって提供される。ある特定の例示の実施形態において、コンピテント細胞は、株ＯＮＣ−Ｔ１８のものである。そのようなコンピテント細胞は、様々な方法のうちのいずれかによって提供され得、その非限定的な例は、実施例５でより詳細に記載される。実施例５に記載されるもの等のコンピテント細胞を調製する方法において、コンピテント細胞は、固体または液体培地にスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムの所望される株由来の接種材料を接種し、かつ細胞を増殖させることによって得られ、必要に応じて新鮮な培養培地を提供する。コンピテント細胞の調製は、典型的には、液体培地中での増殖において１つ以上の段階を含み、その後、細胞の遠心分離および滅菌液中での細胞再懸濁が続き、所望の細胞密度を得る。コンピテント細胞を実験のために必要に応じて新鮮に調製することができ、かつ／またはそれらを調製し、その後、後の使用のために保存（例えば、凍結）することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、細胞は、（例えば、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、または１Ｌの体積の）フラスコ内で増殖する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、細胞は、窒素源豊富な培地中で増殖する。一例のみを挙げると、いくつかの実施形態において、細胞は、高濃度のペプトンを有する培地中で増殖する。いくつかのそのような実施形態において、細胞は、少なくとも５〜２５ｇ／Ｌのペプトン（または他の窒素源）を含む培地中で増殖する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、細胞は、高濃度の溶解酸素中で増殖する。いくつかの実施形態において、細胞は、増殖中に、例えば、約１００〜約５００、または約１２５〜約４００、または約１５０〜約３００ｒｐｍで撹拌される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、細胞は、栄養繁殖中に変異誘発される。いくつかの実施形態において、細胞は、活発な栄養繁殖中に変異誘発される。いくつかの実施形態において、細胞は、遊走子段階中に変異誘発されない。
【０１０１】
異種（例えば、組換えであり、合成され（化学的であるか、生物学的であるかにかかわらず）、かつ／またはその核酸配列が人の手によって選択されたという点で操作された）核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはそれらの任意の好適な誘導体であり得る。多くの実施形態において、組換え核酸は、ベクターの一部として送達される。プラスミド、コスミド、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、およびウイルスベクターを含むが、これらに限定されない様々なベクターのうちのいずれかは、本開示の方法に従う使用に好適であり得る。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡは、化学的に合成されたポリヌクレオチドであり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡは、酵素的に合成されたポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）生成物であるか、またはそれを含む。
【０１０２】
組換え核酸または操作された核酸は、典型的には、本明細書に記載の選択方法で用いる選択マーカーを含む。典型的には、選択マーカーは、細胞中に存在するときに、本明細書に記載される閾値濃度以上の選択剤を含有する選択培地中での細胞の増殖を可能にする遺伝子産物の発現を可能にする遺伝子発現カセットを含む。例えば、抗生物質が選択剤として使用される実施形態において、選択マーカーは、対応する抗生物質耐性遺伝子を発現させるために、遺伝子発現カセットを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、組換え核酸または操作された核酸は、１つ以上の望ましい遺伝子産物を発現させるために、１つ以上のさらなる遺伝子発現カセットをさらに含む。代表的な１つ以上の望ましい遺伝子産物は、例えば、商業的価値を有するポリペプチドを含み、かつ／または商業的価値を有する１つ以上の下流生成物（例えば、ＰＵＦＡ等の化合物）の合成に重要なポリペプチド（例えば、酵素ポリペプチドまたは他の生合成経路構成成分）であり得る。あるいは、またはさらに、望ましい遺伝子産物は、ある特定の望ましい特性を微生物に付与し得る（例えば、特定の組の条件下での成長適合性、大量生産方法における成長適合性等）。あるいは、またはさらに、望ましい遺伝子産物は、形質転換した細胞の標識化を可能にするものであり得る。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態において、細胞は、上昇したレベルの１つ以上のバイオ燃料、薬物、ワクチン、抗体、脂質、レゾルビン、ニューロプロテクチン、薬学的化合物、ポリペプチド等を産生するように操作される。
【０１０４】
典型的に遺伝子発現カセット内に含有される要素、例えば、遺伝子の発現を駆動するプロモーターまたは他の遺伝子調節要素、発現する遺伝子、および形質転換される微生物において機能するターミネーター配列が、本明細書に記載されている。発現する遺伝子は、「導入遺伝子」と称され得る。導入遺伝子は、いくつかの実施形態において、異種遺伝子、例えば、微生物中に通常は存在しない異種遺伝子であり得る。選択マーカーもしくはさらなる遺伝子発現カセットのいずれか、またはそれらの両方は、そのような異種遺伝子を含み得る。
【０１０５】
したがって、本開示の方法に従う使用に好適なベクターは、遺伝子発現ベクターを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、１つの組換え核酸は、微生物内に送達される。例えば、微生物は、組換え核酸を含む１つのプラスミド構築物で形質転換され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、２つ以上の組換え核酸は、微生物内に送達される。例えば、（それぞれのプラスミド構築物が組換え核酸を含む）プラスミド構築物の組み合わせは、微生物内に送達され得る。いくつかのそのような実施形態において、選択剤と選択マーカーとの組み合わせを使用して、所望の組換え核酸の組み合わせの存在について選択する。
【０１０８】
遺伝物質（例えば、組換え核酸を含む遺伝物質）を細胞内に導入するための様々な方法のうちのいずれかは、本開示の形質転換方法に従う使用に好適であり得る。導入方法には、リン酸カルシウム沈殿、Ｃａ２＋処理、組換え核酸を含有する細菌プロトプラストとの受容細胞の融合、組換え核酸を含有するリポソームでの受容細胞の処理、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた融合、電気穿孔、磁気穿孔、微粒子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、および細胞へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
ある特定の例示の実施形態において、（「遺伝子砲」、「粒子衝突」、および「微粒子発射」方法としても既知の）微粒子銃送達方法が使用される。そのような実施形態において、微粒子銃デバイスは、組換え核酸でコーティングされた粒子を、細胞膜（および／または存在する場合、細胞壁）を透過するのに十分な速度に加速する。いくつかの実施形態において、粒子は、金粒子を含むか、またはそれから成る。遺伝物質の微粒子銃送達のための方法は、当技術分野において既知であり、そのような微粒子銃送達を行うための機器および試薬は、市販されている。例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７（１９８７）、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：２９９（１９８８）、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ７９：２０６（１９９０）、およびＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８（１９９２）を参照されたく、それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、核酸は、当業者に知られており、かつ理解される、アグロバクテリウム媒介形質転換、プロトプラスト形質転換等の方法を用いて送達される。
【０１１１】
異種（例えば、組換えまたは操作された）核酸の送達後、細胞は、本明細書の「選択」の項に記載されるように、選択可能なマーカーを用いることなく、細胞の増殖を減少させる選択剤を含有する培地中で培養される。選択される（例えば、選択可能なマーカーの存在、ひいては組換え核酸の存在を呈する）細胞を保存し、分析し、かつ／または所望に応じてより大量に増殖させることができる。
【０１１２】
ある特定の例示の実施形態において、形質転換した細胞は、組換え核酸の存在を確認するために１つ以上の分析に供される。例えば、ＰＣＲ分析を用いて、組換え核酸の一部である遺伝要素、例えば、導入遺伝子および／または選択可能なマーカーの存在を確認することができる。
操作された株
【０１１３】
本開示は、とりわけ、調節配列、形質転換方法、変異誘発方法、およびスラウストキトリド等のある特定の微生物の操作を可能にする遺伝子選択方法を提供する。本明細書に提供される組成物および方法を用いて、いくつかの適用のうちのいずれにも、微生物（例えば、スラウストキトリド）を操作することができる。上述のように、本明細書に提供される調節配列および選択可能なマーカーを用いて、配列および／または選択可能なマーカーが動作可能な生物（例えば、スラウストキトリド）において、目的とする任意のポリペプチドを発現させることができる。いくつかの実施形態において、異なる生物由来のポリペプチドが発現する。いくつかの実施形態において、宿主細胞由来のポリペプチドが発現する（例えば、過剰発現する）。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、微生物は、目的とする化合物の増産を有するように操作される。いくつかの実施形態において、微生物は、脂肪酸、抗酸化物質、レゾルビンおよび／またはプロテクチンの増産を有するように操作される。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態において、細胞は、上昇したレベルの１つ以上のバイオ燃料、薬物、ワクチン、抗体、脂質、レゾルビン、ニューロプロテクチン、薬学的化合物、ポリペプチド等を産生するように操作される。
【０１１５】
本開示は、ＰＵＦＡの増産を有するように操作されるスラウストキトリド微生物（例えば、スラウストキトリウム）を提供する。すなわち、本開示は、ＰＵＦＡを増加させる修飾を含む操作されたスラウストキトリド細胞を提供する。いくつかの実施形態において、そのような微生物は、ＰＵＦＡ生合成ポリペプチドの改変された（例えば、増加または減少した）発現を有するように操作される。
【０１１６】
図１に示されるように、ＯＮＣ−Ｔ１８におけるＰＵＦＡ生合成は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）酵素複合体によるミリスチン酸（Ｃ１４：０）およびステアリン酸（Ｃ１８：０）等の脂肪酸の生成、その後、そのような脂肪酸上での一連の酵素反応を伴う。これらの反応はそれぞれ、典型的には、（水素原子を除去して炭素−炭素二重結合を作成する）デサチュラーゼ、または（２個の炭素原子を脂肪酸のカルボン酸末端に付加することによって脂肪酸を長くする）エロンガーゼのいずれかによって触媒される。ポリケチドＰＵＦＡシンターゼ（ＰＫＳ）複合体もＯＮＣ−Ｔ１８中でＤＨＡを生成する。ＯＮＣ−Ｔ１８中のＰＵＦＡ生合成は、少なくとも２つの交差する生合成経路、すなわち、ω−６およびω−３ＰＵＦＡ生合成経路を有するように見える。ω−６脂肪酸のω−３脂肪酸への変換は、ω−３デサチュラーゼによって触媒され得る。したがって、図１に示されるように、様々な脂肪酸は、経路中の様々な地点で産生される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、経路中での酵素ポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の発現は、所望に応じて特定のＰＵＦＡおよび／または他の脂肪酸の産生を増加させるように調節される。例えば、ＦＡＳ遺伝子の発現を下方調節して、ＰＵＦＡ産生を増加させることができる。△５エロンガーゼ、△４デサチュラーゼ、および／またはＰＫＳ遺伝子のうちのいずれかの発現の下方調節は、ＥＰＡ産生および／またはＰＵＦＡ産生を増加させ得る。ＰＫＳ遺伝子のうちのいずれか１つの発現の下方調節は、ＡＲＡ産生を増加させ得る。ＰＫＳ遺伝子のうちのいずれかの発現の上方調節は、ＤＨＡ産生を増加させ得る。△１２エロンガーゼ遺伝子の発現の上方調節は、ＡＲＡおよびＥＰＡ産生を増加させ得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、経路中での酵素ポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の発現は、バイオ燃料を産生するように調節される。例えば、ＰＫＳ、△９デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびω−３デサチュラーゼ遺伝子のうちのいずれかの発現の下方調節、ならびに／またはＦＡＳ遺伝子発現の上方調節は、バイオ燃料ストックとして用いるために短鎖脂質の産生を増加させ得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、経路構成成分の遺伝子発現の改変（例えば、下方調節または上方調節）は、遺伝子ノックアウトを生成することによって、例えば、相同的組換えによって達成される。典型的には、線形化ＤＮＡ構築物は、微粒子銃発射ＤＮＡ送達を含むが、これらに限定されない様々な技法のうちのいずれかを用いて細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、ＯＮＣ−Ｔ１８における相同的組換えの頻度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を超える。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、経路構成成分の遺伝子発現の改変（例えば、下方調節または上方調節）は、１つ以上の遺伝子標的の変異誘発によって達成される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される操作された微生物は、培地の約４．０ｇ／Ｌを超える濃度でｎ−３  ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびｎ−６  ＤＰＡを含む脂質画分を産生することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される微生物は、培地の約２０．０ｇ／Ｌを超える濃度でｎ−３  ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびｎ−６  ＤＰＡを含む脂質組成物を産生することができる。いくつかの実施形態において、微生物は、培地の約１４．０ｇ／Ｌを超える濃度でｎ−３  ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびｎ−６  ＤＰＡを含む脂質組成物を産生することができる。いくつかの実施形態において、微生物は、約１．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ（例えば、約４．６ｇ／Ｌ）のｎ−３  ＤＨＡ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ（例えば、約０．２２ｇ／Ｌ）のｎ−３  ＥＰＡ、および約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌのｎ−６  ＤＰＡを産生することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される操作された微生物は、最大約１２０ｇ／Ｌの収量でｎ−３  ＤＨＡ、ＥＰＡ、ｎ−６  ＤＰＡ、またはＡＲＡを含む脂質組成物を産生することができ、これは、約７５％を超える総脂質に相当する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される操作された微生物は、最大約１２８ｇ／Ｌの収量で短鎖脂肪酸（典型的には、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸）を含む脂質組成物を産生することができ、これは、約８０％を超える総脂質に相当する。さらに、微生物は、３００ｍｇ／ｇを超えるか、またはさらには８００ｍｇ／ｇの細胞バイオマスの、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、およびドコサペンタエン酸を含む脂質画分を産生することができる。いくつかの実施形態において、微生物は、４４．３〜５７ｍｇ／ｇのミリスチン酸（１１３４．５〜１４５８．１ｍｇ／Ｌに等しい）、０．５〜０．６５ｍｇ／ｇのミリストレイン酸（１３．３〜１６．６３ｍｇ／Ｌに等しい）、３３．５〜３４．６ｍｇ／ｇのペンタデカン酸（８５６．９〜８８５．１ｍｇ／Ｌに等しい）、１２１．９〜１６５．１ｍｇ／ｇのパルミチン酸（３１１８．２〜４９２３．３ｍｇ／Ｌに等しい）、７．９〜２８．５ｍｇ／ｇのパルミトレイン酸（２０２．１〜７２９ｍｇ／Ｌに等しい）、４．３８〜５．９ｍｇ／ｇのステアリン酸（１１２〜１５１ｍｇ／Ｌに等しい）、６．９４〜９．９ｍｇ／ｇのオレイン酸（１７７．５〜２５３．２ｍｇ／Ｌに等しい）、０．４〜１．３ｍｇ／ｇのリノール酸（１１．２６〜３３．３ｍｇ／Ｌに等しい）、０．５〜１．０ｍｇ／ｇのエイコサジエン酸（１２．８〜２５．６ｍｇ／Ｌに等しい）、０．４〜０．５ｍｇ／ｇのアラキドン酸（１０．２〜１３ｍｇ／Ｌに等しい）、７５〜１００ｍｇ／ｇのドコサヘキサエン酸（１９１８〜２５６０ｍｇ／Ｌに等しい）、１．９〜６ｍｇ／ｇのエイコサペンタエン酸（４８．６〜１５３．５ｍｇ／Ｌに等しい）、および１７．１〜３３．７ｍｇ／ｇのドコサペンタエン酸（４３７．４〜８６２．１ｍｇ／Ｌに等しい）を含む画分を産生することも���き、これは、３０１〜８００ｍｇ／ｇ（７７００〜２０，２０９ｍｇ／Ｌに等しい）の細胞バイオマス内の全脂肪酸含量を有する。
発酵および産生
【０１２２】
本発明のある特定の方法は、微生物（例えば、スラウストキトリド、例えば、スラウストキトリウム種）を培養するステップを含むか、またはそれらのステップと併せて使用され得る。スラウストキトリドの培養方法は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１７１９４Ａ１号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、微生物は、（「培養培地」としても既知の）成長培地中で成長する。様々な培地のうちのいずれかは、本発明の選択方法に従う使用に好適であり得る。典型的には、培地は、炭素源および窒素源を含む様々な栄養構成成分を微生物に供給する。
【０１２３】
本明細書に提供される微生物は、バイオマスおよび／または目的とする化合物の産生を増加させる条件下で培養され得る。スラウストキトリドは、典型的には、生理食塩水培地中で培養される。例えば、スラウストキトリドは、約２．０〜５０．０ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養され得る。いくつかの実施形態において、スラウストキトリドは、約２〜３５ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養される。いくつかの実施形態において、スラウストキトリドは、約１８〜３５ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養される。ある特定の状況下において、スラウストキトリドが低塩条件下でよく成長することが見出されている。いくつかの実施形態において、スラウストキトリドは、約５〜２０ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養される。いくつかの実施形態において、スラウストキトリドは、約５〜１５ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養される。培養培地は、ＮａＣｌを含んでも含まなくてもよい。培養培地は、ＮａＣｌの添加を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、培地は、人工海塩、例えば、ＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ（商標），Ａｑｕａｒｉａ，Ｉｎｃを含有する。培養培地は、天然海水または人工海水を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、培地は、天然海水または人工海水、例えば、約２％〜１００％の海水を含有する。
【０１２４】
塩化物イオンは、発酵器または他の下流処理装置の腐食を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、培養培地中の塩化物濃度が低下する。いくつかの実施形態において、培養培地は、ナトリウム源として非塩化物含有ナトリウム塩（例えば、硫酸ナトリウム）を含む。例えば、全ナトリウムのかなりの分量が非塩化物塩によって供給され、したがって、培養培地中の全ナトリウムの約１００％、７５％、５０％、または２５％未満が塩化ナトリウムによって供給され得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、培養培地は、約３ｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、または１２０ｍｇ／Ｌ未満の塩化物濃度を有する。いくつかの実施形態において、培養培地は、約６０ｍｇ／Ｌおよび１２０ｍｇ／Ｌの塩化物濃度を有する。
【０１２６】
本発明に従う使用に好適な非塩化ナトリウム塩の例には、ソーダ灰（炭酸ナトリウムおよび酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，３４０，７４２号および同第６，６０７，９００号を参照されたく、それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
スラウストキトリド培養用の培地は、様々な炭素源のうちのいずれかを含み得る。炭素源の例として、脂肪酸；脂質；グリセロール；トリグリセロール；炭水化物、例えば、グルコース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、デキストロース、キシロース、ラクツロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、デンプン（トウモロコシまたは小麦）、酢酸塩、ｍ−イノシトール（トウモロコシ浸出液に由来）、ガラクツロン酸（ペクチンに由来）、Ｌ−フコース（ガラクトースに由来）、ゲンチオビオース、グルコサミン、α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェート（グルコースに由来）、セロビオース、デキストリン、およびα−シクロデキストリン（デンプンに由来）；スクロース（糖蜜に由来）；ポリオール、例えば、マルチトール、エリトリトール、アドニトール、ならびにオレイン酸、例えば、グリセロールおよびＴｗｅｅｎ８０；アミノ糖、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、およびＮ−アセチル−β−Ｄ−マンノサミン；ならびに任意の種類のバイオマスまたは廃液流が挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、培地は、約５ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの濃度で炭素源を含む。いくつかの実施形態において、培地は、約１：１〜約４０：１のＣ：Ｎ比（炭素：窒素の比率）を有する。２段階培養が使用されるいくつかの実施形態において、培地は、第１の段階では約１：１〜約５：１、その後、第２の段階では約１：１〜約１：約０（すなわち、窒素を全く有しないか、またはほとんど有しない）のＣ：Ｎ比を有する。
【０１２９】
スラウストキトリド培養用の培地は、様々な窒素源のうちのいずれかを含み得る。例示の窒素源には、アンモニウム溶液（例えば、Ｈ２Ｏ中ＮＨ４）、アンモニウムまたはアミン塩（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、（ＮＨ４）３ＰＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＯＯＣＨ２ＣＨ３（ＮＨ４Ａｃ）、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、大豆抽出物、カザミノ酸、および蒸留粕が挙げられる。好適な培地中の窒素源の濃度は、典型的には、約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌである。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、培地は、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム等のリン酸塩を含む。培地中の無機塩および微量栄養素は、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジウム酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン、塩化カルシウム、およびＥＤＴＡを含み得る。塩酸ピリドキシン、塩酸チアミン、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸、およびビタミンＢ１２等のビタミンを含んでもよい。
【０１３１】
例えば、好適な培地は、約１１〜約１３ｇ／Ｌ（例えば、約１２ｇ／Ｌ）の硫酸ナトリウム、約０．４５〜約０．５５ｇ／Ｌ（例えば、約０．５ｇ／Ｌ）のＫＣｌ、約１．８〜約２．２ｇ／Ｌ（例えば、約２ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約０．３〜約０．４ｇ／Ｌ（例えば、約０．３５ｇ／Ｌ）のＨｏｄａｇ  Ｋ−６０消泡剤、約０．６０〜約０．７０ｇ／Ｌ（例えば、約０．６５ｇ／Ｌ）のＫ２ＳＯ４、約０．９〜約１．１ｇ／Ｌ（例えば、約１．０ｇ／Ｌ）のＫＨ２ＰＯ４、約０．９５〜約１．１ｇ／Ｌ（例えば、約１ｇ／Ｌ）の（ＮＨ４）２ＳＯ４、約０．１５〜約０．１９（例えば、約０．１７ｇ／Ｌ）のＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、約２〜約１０ｇ／Ｌ（例えば、約４．５ｇ／Ｌ）の９５ＤＥトウモロコシシロップ（固形ベース）、約２．７〜約３．３ｍｇ／Ｌ（例えば、約３ｍｇ／ｍＬ）のＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、約２．７〜約３．３ｍｇ／Ｌ（例えば、約３ｍｇ／ｍＬ）のＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約０．０３５〜約０．０４５ｍｇ／Ｌ（例えば、約０．０４ｍｇ／Ｌ）のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、約０〜約０．０４５ｍｇ／Ｌ（例えば、約０．０４ｍｇ／Ｌ）のＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）、約１．８〜約２．２ｍｇ／Ｌ（例えば、約２ｍｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、約１．８〜約２．２ｍｇ／Ｌ（例えば、約２ｍｇ／Ｌ）のＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、約９〜約１１ｍｇ／Ｌ（例えば、約１０ｍｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約４〜約１５ｍｇ／Ｌ（例えば、約９．５ｍｇ／Ｌ）のチアミン、約０．０５〜約０．２５ｍｇ／Ｌ（例えば、約０．１５ｍｇ／Ｌ）のビタミンＢ１２、約１．３〜約５．１（例えば、約３．２ｍｇ／Ｌ）のパントテン酸カルシウム、および約２８％のＮＨ４ＯＨ溶液から成り得る。
【０１３２】
培地のｐＨは、適切な場合に酸もしくは塩基を用いて、かつ／または窒素源を用いて、３．０〜１０．０になるように調整される。いくつかの実施形態において、培地は、ｐＨ４．０〜６．５を有するように調整される。培地は、滅菌され得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、微生物の培養に使用される培地は、液体培地である。いくつかの実施形態において、微生物の培養に使用される培地は、固体培地である。本明細書で論じられる炭素源および窒素源に加えて、固体培地は、構造支持体を提供し、かつ／または培地を固体形態にすることができる１つ以上の構成成分（例えば、寒天またはアガロース）を含有し得る。
【０１３４】
細胞は、１〜６０日間培養され得る。いくつかの実施形態において、培養は、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１日間、またはそれ以下の期間、実行される。いくつかの実施形態において、培養は、４〜３０℃、例えば、１８〜２８℃の温度で実行される。いくつかの実施形態において、培養は、通気振盪培養、振盪培養、静置培養、バッチ培養、半連続培養、連続培養、ローリングバッチ培養、または波動培養等を含む。培養は、従来の撹拌発酵槽、気泡塔発酵槽（バッチまたは連続培養）、波動発酵器等を用いて実行されてもよい。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、培養物は、振盪によって通気される。いくつかの実施形態において、振盪は、１００〜１０００ｒｐｍ、例えば、３５０〜６００ｒｐｍ、１０００および４５０ｒｐｍである。いくつかの実施形態において、培養物は、それらが脂質産生段階中であるように、（例えば、異なる振盪速度を用いて）バイオマス産生段階中に別様に通気される。例えば、いくつかの実施形態において、培養物は、バイオマス段階中、約１５０〜約３５０ｒｐｍの速度の振盪、脂質産生段階中、約３０〜約１２０ｒｐｍの速度の振盪によって通気される。あるいは、またはさらに、振盪速度は、培養容器の種類（例えば、フラスコの形状または大きさ）によって異なり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、バイオマス産生段階中の溶解酸素（ＤＯ）レベルは、脂質産生段階中よりも高く、例えば、ＤＯレベルは、脂質産生段階中に低下する。いくつかの実施形態において、溶解酸素レベルは、飽和未満まで低下し、いくつかの実施形態において、溶解酸素レベルは、非常に低いレベル、または検出不可能なレベルまで低下する。
【０１３７】
より多くの量の望ましい化合物を得るために１つ以上の培養条件の移行を含む方法に従って細胞を培養することによって、望ましい脂質の産生を高めることができることが見出されている。いくつかの実施形態において、細胞は、最初に、バイオマスを最大化する条件下で培養され、その後、１つ以上の培養条件を、脂質生産性を好む条件に移行する。移行される条件は、酸素濃度、Ｃ：Ｎ比、温度、およびそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態において、第１の段階がバイオマス産生を好み（例えば、高酸素（例えば、概して、または第２の段階と比較して）、低Ｃ：Ｎ比、および周囲温度という条件を用いて）、その後、脂質産生を好む第２の段階（例えば、酸素が低下し、Ｃ：Ｎ比が増加し、温度が低下する）が続く、２段階培養が行われる。すなわち、いくつかの実施形態において、本発明は、第１の酸素濃度、第１のＣ：Ｎ比、第１の温度、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の条件を含む第１の組の条件下で細胞を培養することを含む方法を提供する。該第１の組の条件下での培養は第１の期間続き、この期間は異なり得る。第１の期間の最後に（これは必ずしも離散時点ではない）、１つ以上の条件は、細胞が、第２の酸素濃度、第２のＣ：Ｎ比、第２の温度、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の条件を含む第２の組の条件下で培養されるように改変される。いくつかの実施形態において、いくつかの条件は、第１の期間の最後に変化し、いくつかの条件は、第２の期間の最後まで維持され、この期間には、１つ以上の条件が再度変化してもよく、かつ／または１つ以上の条件が初めて変化し得る。いくつかの実施形態において、第１のＣ：Ｎ比は、約２：１〜約１：１であり、第１の温度は、約１０〜約３０℃である。いくつかの実施形態において、第２のＣ：Ｎ比は、約１：約０であり、第２の温度は、約１５〜約３０℃である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、第１の条件から第２の条件への移行は、徐々に行われ、かつ／または生じ、いくつかの実施形態において、第１の条件から第２の条件への移行は、突然行われ、かつ／または生じる。
【０１３９】
本明細書に提供される培養方法のいくつかの実施形態において、酸素濃度は、例えば、通気の強度を移行することによって等、いくつかの可能な方法で、培養中に移行される（例えば、低減する）。
【０１４０】
本明細書に提供される培養方法のいくつかの実施形態において、温度は、培養中に少なくとも２℃移行される（例えば、低減する）。いくつかの実施形態において、温度は、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃移行される。いくつかの実施形態において、温度は、約２５℃から約２０℃に移行される。
【０１４１】
目的とする化合物に対する細胞の生産性を、任意の利用可能な方法（複数を含む）によって評価することができる。
生成物
【０１４２】
本開示に従って産生されるＰＵＦＡおよび他の化合物を、例えば、それらの生物学的特性または栄養特性を活用することによって、様々な適用のうちのいずれかにおいて利用することができる。本開示のいくつかの実施形態において、化合物は、薬剤、食品補助剤、動物飼料添加物、化粧品等において使用される。本開示に従って産生される化合物を、他の化合物の産生時に中間体として使用することもできる。
【０１４３】
本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された細胞によって産生されるＰＵＦＡおよび／または他の化合物が、宿主細胞に関連して、最終生成物（例えば、食品または飼料補助剤、調製粉乳、薬剤等）に組み込まれることが認識される。例えば、宿主細胞は、凍結乾燥される（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）か、凍結乾燥される（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ）か、凍結されるか、低温殺菌されるか、またはその他の方法で不活性化されてもよく、その後、全細胞は、最終生成物に組み込まれるか、あるいは最終生成物として使用され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞（乾燥しているか否かにかかわらず）は、生成物に組み込む前にさらに処理されてもよい（例えば、構成成分を分離するために、溶解、超音波処理、ビーズミリング、加圧処理、凍結融解、パルスフィールド電気泳動（ＰＦＥ）を介して、かつ／または酵素処理を介して、あるいはそれらの組み合わせを介して処理され、いくつかの実施形態において、少なくとも２つ以上のそのようなプロセスが利用される）。溶解した細胞は、適切な溶媒を用いて油中に抽出され、周知のプロセスを用いて精製され得る。いくつかの実施形態において、最終生成物は、全体物から分離された（例えば、寸法、溶解度によって分画された）宿主細胞の一部のみを組み込む。例えば、本開示のいくつかの実施形態において、脂質は、宿主細胞から単離され、最終生成物に組み込まれるか、または最終生成物として使用される。ＰＵＦＡを含有する脂質は、超臨界流体抽出法、または１つ以上の溶媒（例えば、アセトン、クロロホルム、イソプロパノール、ヘキサン、塩化メチレン、もしくはメタノール）での抽出法を用いて抽出され得る。いくつかの実施形態において、脂質は、尿素錯体化、カラムクロマトグラフィー、および／または超臨界流体分画等の様々な方法のうちのいずれかによって濃縮される。溶媒で抽出された脂質の濃縮技法は、加水分解（例えば、塩基、酸、または酵素加水分解を用いて）、さらなる抽出、酸性化、結晶化、濾過、およびそれらの組み合わせを含む（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１７１９４号を参照のこと）。
【０１４４】
本開示のいくつかの実施形態において、１つ以上の産生されたＰＵＦＡおよび／または他の化合物は、食物または飼料（例えば、食品補助剤）の構成成分に組み込まれる。本開示に従って化合物を組み込むことができる食品の種類は、特に限定されておらず、飲料、例えば、牛乳、水、スポーツドリンク、栄養ドリンク、茶、およびジュース；糖菓、例えば、ゼリーおよびビスケット；脂肪含有食物および飲料、例えば、乳製品；加工食品、例えば、お粥（またはポリッジ）；調製粉乳；朝食用シリアル等を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の産生された化合物は、例えば、マルチビタミン等の栄養補助剤に組み込まれる。ある特定の実施形態において、本開示に従って産生されるＰＵＦＡ化合物は、栄養補助剤に包含され、食物または飼料（例えば、食品補助剤）の構成成分に直接組み込まれる。
【０１４５】
本開示に従って産生される化合物を組み込むことのできる飼料の例には、例えば、キャットフード、ドッグフード等のペットフード、観賞魚用の飼料、培養された魚または甲殻類等用の飼料、農場で飼育された動物（家畜、および養殖された魚または甲殻類を含む）用の飼料が挙げられる。本開示に従って産生された化合物（複数を含む）が組み込まれる食物または飼料材料は、好ましくは、対象とする受容者である生物の口に合う。この食物または飼料材料は、食物材料で現在知られている任意の物理的特性（例えば、固体、液体、軟性）を有し得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の産生された化合物（例えば、ＰＵＦＡ）は、薬剤に組み込まれる。そのような薬剤の例には、例えば、様々な種類の錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等が挙げられる。いくつかの実施形態において、薬剤は、局所適用に好適である。剤形は、特に限定されておらず、カプセル剤、油剤、顆粒剤、細顆粒剤、散剤、錠剤、丸薬、トローチ剤等を含む。油剤および油充填カプセル剤は、製造中の成分分解がないだけでなく、ＰＵＦＡ含有脂質液滴が油ベースの製剤に容易に組み込まれ得るため、さらなる利点を提供し得る。
【０１４７】
例えば、本開示に従う薬剤は、例えば、米国薬局方に記載される一般手順を含む当技術分野において確立された技法に従って調製され得る。
【０１４８】
本開示に従って産生された化合物（単離された化合物か、または細胞関連の化合物かにかかわらず）を、様々な作用物質のうちのいずれかと組み合わて、本明細書に記載の生成物に組み込むことができる。例えば、そのような化合物を、１つ以上の結合剤または充填剤と合わせてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の生成物は、１つ以上のキレート剤、色素、塩、界面活性剤、保湿剤、粘度調整剤、増粘剤、軟化剤、香料、防腐剤等、およびそれらの組み合わせを含む。
実施例
【実施例１】
【０１４９】
プロモーターおよびターミネーター配列の単離ならびに識別
本実施例は、ＯＮＣ−Ｔ１８由来のある特定の例示の遺伝子発現プロモーターおよびターミネーター核酸配列の識別ならびに単離を説明する。
【０１５０】
Ｏｃｅａｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｉｍｉｔｅｄは、ショットガン配列決定およびピロシーケンス（ＧＳ−２０、４５４）技法の両方を用いて、ＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムを大部分配列決定した。とりわけ、本開示は、例えば、公的に利用可能なＥＳＴ（発現配列タグ）収集情報（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、機能的アノテーション、ならびに／またはバイオインフォマティクスソフトウェア（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓから入手可能なＫｏｄｏｎパッケージおよび／もしくはＢＬＡＳＴ等の１つ以上のアルゴリズム）を利用することによって、そのような配列情報の分析を提供する。相同遺伝子および異種遺伝子（例えば、スラウストキトリド微生物内での脂質および脂肪酸生合成に関与する遺伝子）の発現の手段を提供するために、ハウスキーピングチューブリン遺伝子プロモーターおよびターミネーターならびにデサチュラーゼおよびエロンガーゼプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡからクローニングした。
【０１５１】
１．チューブリン遺伝子プロモーター７０１番の単離および識別
オリゴヌクレオチドプライマー５２番（配列番号１）および５３番（配列番号２）を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いたスラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８ゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成され、そこから購入したものであった。
【０１５２】
ＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡを、２５℃で３６時間、１５０ｒｐｍで一定撹拌された振盪インキュベーター内の成長培地（ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０）中で培養された細胞から抽出した。５０ｍＬの培養物の細胞を、アダプタＳｏｒｖａｌｌ００４３６番を有する回転子ＳＴ−Ｈ７５０を備えるＳｏｒｖａｌｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｔ２１遠心分離機内で、室温で５分間、４３００ｒｐｍで遠心分離して収集した。ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ微生物ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、細胞から単離した。
【０１５３】
成長培地ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０の構成成分は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物（ＲＭ６６８、ＨｉＭｅｄｉａ  ｌａｂｓ）、５ｇ／Ｌの大豆ペプトン（ＲＭ００７、ＨｉＭｅｄｉａ  ｌａｂｓ）、１０ｇ／ＬのＤ（＋）−グルコース（ＣＥＲＥＬＯＳＥ（商標）デキストロース０２００１０、Ｃｏｒｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、３５ｇ／Ｌの人工海塩（ＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ（商標）、Ａｑｕａｒｉａ，Ｉｎｃ．）、１．２５ｍｇ／Ｌの微量要素（５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、３．１５ｇ／ＬのＦｅＣ１３・６Ｈ２Ｏ、４．３６ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．６１２５ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０５９７ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０ｌｇ／ＬのＣｏＣ１２・６Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ／ＬのＭｎＣ１２・４Ｈ２Ｏ、１３μｇ／ＬのＨ２ＳｅＯ３、２．７ｍｇ／ＬのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、１．８４ｍｇ／ＬのＮａ３ＶＯ４、および１．９４ｍｇ／ＬのＫ２ＣｒＯ４）、ならびに１．２５ｍｇ／Ｌのビタミン（１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、１ｍｇ／Ｌのビオチン、０．２０ｇ／ＬのチアミンＨＣｌ）である。
【０１５４】
部分的オープンリーディングフレーム配列を含むチューブリン遺伝子プロモーター７０１番を、９４℃で１分間、９４℃で３０秒間、および６８℃で６分間を３０サイクル繰り返し、７２℃で１０分間というＰＣＲ条件を用いて、ＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲを、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、１倍ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、ｄＮＴＰ混合物（各０．４０ｍＭ）、２２５ηｇの鋳型ゲノムＤＮＡ、０．２０μＭのプライマー５２番、および０．２０μＭのプライマー５３番を含有する５０μＬの反応混合物中で実行した。
【０１５５】
ＰＣＲ生成物を０．８％のアガロースゲル中で分解し、６５電圧で６０分間の電気泳動を行った。予想された大きさを有するバンドをかみそりの刃で切り取り、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ＤＮＡを抽出および精製した。
【０１５６】
精製されたＤＮＡフラグメントを、製造業者のプロトコル通りに、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３ベクター中にクローニングした。陽性クローンを、直接コロニーＰＣＲ法を用いてスクリーニングした。手短に、形質転換した大腸菌コロニーを爪楊枝で採取し、それぞれ、以下の構成成分：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、１倍ＰＲＣ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物（各０．２０ｍＭ）、２００μＬのＰＣＲ管中、０．２５μＭのプライマー６２番（配列番号３）、および０．２５μＭのプライマー６３番（配列番号４）を含有する２０μＬのＰＣＲ反応混合物内で回転させた。一方で、コロニーを、プラスミドＤＮＡの単離のために、参照プレート上で画線した。
【０１５７】
ＰＣＲを、９４℃で３分間を１サイクル、９４℃で１分間、５３℃で２分間、および７２℃で４分間を繰り返し３０サイクル、７２℃で１０分間という条件下で実行した。ＰＣＲ生成物を０．８％のアガロースゲル中で分化させた。予想した大きさのＰＣＲ生成物を増幅したコロニーを陽性コロニーと見なした。
【０１５８】
陽性クローンＪＺ２−１７−１０のプラスミドＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ（商標）プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、３ｍＬの培養物の細菌性大腸菌細胞から単離した。その挿入物を、順方向プライマー６２番（配列番号３）および逆方向プライマー６３番（配列番号４）を用いて配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）およびアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて分析した。クローンＪＺ２−１７−１０由来の挿入物のヌクレオチド配列は、７２４塩基対長（配列番号５）である。部分的な推定上のチューブリン遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の推定上の翻訳開始コードＡＴＧの４９８ヌクレオチド上流を、様々なバイオインフォマティクスソフトウェアを用いた分析に基づいて、推定上の遺伝子発現プロモーター（配列７０１番、配列番号６）であると決定した。典型的な遺伝子プロモーター要素をこの配列内で識別した。この推定上のプロモーター配列７０１番（配列番号６）に対して相同的な配列の検索を、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて、特許配列のデータベースを含むＧｅｎＢａｎｋの様々なデータベースで行った。この一意のプロモーター配列７０１番に相同的な配列は発見されなかった。ＯＲＦの５’末端の部分配列は、ＢＬＡＳＴ検索において、緑藻クラミドモナスβチューブリン２（ＴＵＢ２）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００１６９３９４５）に対して最も高い相同性を有する。
【０１５９】
識別されたプロモーター配列は、４９８ヌクレオチド長であり、４４４位で−１０Ｐｒｉｂｎｏｗ−Ｓｃｈａｌｌｅｒボックス（ＡＧＧＡＡＧＡＣＴ）、および４２４位で−３５ボックス（ＣＴＧＡＣＧ）、４５９位で推定上の転写開始部位、ならびに４６８位で推定上の転写因子結合部位ＡＡＧＧＴＡＧＡを含有する。
【０１６０】
２．チューブリン遺伝子プロモーター３４１番の単離および識別
オリゴヌクレオチドプライマー５４番（配列番号７）および５５番（配列番号８）を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いてスラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８ゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成され、そこから購入したものであった。
【０１６１】
下流部分的オープンリーディング配列を含むチューブリン遺伝子プロモーター３４１番を、チューブリン遺伝子プロモーター７０１番の単離について説明した条件と同一の条件を用いて、ＰＣＲによってＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅した精製ＤＮＡフラグメントを、製造業者のプロトコル通りに、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３ベクター中にクローニングした。陽性クローンＪＺ２−１７−１４のプラスミドＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ（商標）プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、３ｍＬの培養物の大腸菌細胞から単離した。
【０１６２】
組換えプラスミドＤＮＡの挿入物を、順方向プライマー６２番（配列番号３）および逆方向プライマー６３番（配列番号４）を用いて配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）およびアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて分析した。クローンＪＺ２−１７−１４のヌクレオチド配列挿入物は、１１１５塩基対長（配列番号９）である。その挿入物の３’末端配列に位置するチューブリン遺伝子の部分的ＯＲＦが識別されている。ＯＲＦの推定上の翻訳開始コードＡＴＧの上流配列は、推定上のプロモーター３４１番（配列番号１０）と見なされる。
【０１６３】
チューブリン遺伝子プロモーター３４１番（配列番号１０）に相同的な配列の検索を、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて、特許配列のデータベースを含む様々なＧｅｎｂａｎｋデータベースで行った。この一意のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番の配列に相同的な配列は発見されなかった。推定上の部分的ＯＲＦの５’末端配列は、ＢＬＡＳＴ検索において、緑藻クラミドモナスαチューブリン２（ＴＵＡ２）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：５７２８６４１）に対して最も高い相同性を有する。
【０１６４】
この１１０４ヌクレオチド長のプロモーター配列は、５４２位で−１０ボックス（ＣＧＣＴＡＡＡＡＴ）、および５１８位で−３５ボックス（ＴＴＣＡＣＧ）、５５７位で推定上の転写開始部位、および５４３位で推定上の転写因子結合部位ＧＣＴＡＡＡＡＴ、ならびに１４３位で−１０ボックス（ＴＡＧＴＡＧＡＴＴ）、および１２５位で−３５ボックス（ＴＴＧＣＴＣ）、１５８位で推定上の転写開始部位、および１４９位で推定上の転写因子結合部位ＡＴＴＴＴＧＴＡ、および１５０位でＴＴＴＴＧＴＡＡを含有する。
【０１６５】
３．チューブリン遺伝子ターミネーター３４７番の単離および識別
オリゴヌクレオチドプライマー５８番（配列番号１１）および５９番（配列番号１２）を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いたＯＮＣ−Ｔ１８のゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成され、そこから購入したものであった。
【０１６６】
チューブリン遺伝子ターミネーター３４７番を、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番の単離について説明した条件と同一の条件を用いて、ＰＣＲによってＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡから増幅した。精製ＤＮＡフラグメントを、製造業者のプロトコル通りに、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３ベクター中にクローニングした。陽性クローンＪＺ２−１７−２２のプラスミドＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ（商標）プラスミドミニプレップキット（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＲＰ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、３ｍＬの培養物の細菌性大腸菌細胞から単離した。
【０１６７】
組換えプラスミドＤＮＡの挿入物を、順方向プライマー６２番（配列番号３）および逆方向プライマー６３番（配列番号４）を用いて配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）およびアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて分析した。クローンＪＺ２−１７−２２のヌクレオチド配列の挿入物は、７２７塩基対長（配列番号１３）である。その挿入物の５’末端配列は、推定上の遺伝子翻訳終止コドンＴＡＡを含有する推定上の部分的ＯＲＦとして識別されている。終止コドンＴＡＡの下流配列は、推定上のチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番（配列番号１４）と見なされる。
【０１６８】
チューブリン遺伝子ターミネーター３４７番の配列（配列番号１４）に相同的な配列の検索を、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて、特許配列のデータベースを含むＧｅｎｂａｎｋの様々なデータベースで行った。この一意のチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番の配列の相同配列は発見されなかった。推定上のＯＲＦの部分配列は、ＢＬＡＳＴ検索において、セラトプリテスリカルジイ（Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ  ｒｉｃｈａｒｄｉｉ）αチューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００１６９１８２４）に対して最も高い相同性を有する。
【０１６９】
５９０ヌクレオチド長のターミネーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写終結のために機能する推定上のポリアデニル化シグナル配列ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡを含有する。
【０１７０】
４．チューブリン遺伝子ターミネーター７１３番の単離および識別
オリゴヌクレオチドプライマー６０番（配列番号１５）および６１番（配列番号１６）を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いたＯＮＣ−Ｔ１８のゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成され、そこから購入したものであった。
【０１７１】
チューブリン遺伝子ターミネーター７１３番を、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番の単離について説明した条件と同一の条件を用いて、ＰＣＲによってＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡから増幅した。精製ＤＮＡフラグメントを、製造業者のプロトコル通りに、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３ベクター中にクローニングした。陽性クローンＪＺ２−２２−９のプラスミドＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ（商標）プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、３ｍＬの培養物の細菌性大腸菌細胞から単離した。
【０１７２】
組換えプラスミドＤＮＡの挿入物を、順方向プライマー６２番（配列番号３）および逆方向プライマー６３番（配列番号４）を用いて配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）およびアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて分析した。クローンＪＺ２−２２−９のヌクレオチド配列の挿入物は、８６９塩基対長（配列番号１７）である。その挿入物の５’末端配列は、推定上の遺伝子翻訳終止コドンＴＡＡを含有する推定上の部分的ＯＲＦとして識別されている。終止コドンＴＡＡの下流配列は、推定上のチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番（配列番号１８）と見なされる。
【０１７３】
チューブリン遺伝子ターミネーター７１３番の配列（配列番号１８）に相同的な配列の検索を、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて、特許配列のデータベースを含むＧｅｎｂａｎｋの様々なデータベースで行った。この一意のチューブリン遺伝子ターミネーター７１３番の配列に相同的な配列は発見されなかった。推定上のＯＲＦの部分配列は、ＢＬＡＳＴ検索において、灰色藻（Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ  ｐａｒａｄｏｘａ）β１チューブリン（ｔｕｂＢ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０９２９５２）に対して最も高い相同性を有する。
【０１７４】
６４０ヌクレオチド長のターミネーター配列（配列番号１４）は、メッセージＲＮＡポリメラーゼによる転写終結のために機能する推定上のポリアデニル化シグナル配列ＣＡＴＡＡＡを含有する。
【０１７５】
５．△５エロンガーゼ遺伝子（国際特許出願ＰＣＴ／１Ｂ２００７／００４５５３号）プロモーター配列（配列番号１９）の単離および識別。バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いたＯＮＣ−Ｔ１８のゲノム配列データに基づいて、下流分子クローニングの便宜のために、制限酵素部位ＸｂａＩをその５’末端に付加したオリゴヌクレオチドプライマー３番（配列番号２０）、および制限酵素部位ＮｃｏＩをその５’末端に付加したプライマー４番（配列番号２１）を設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成され、そこから購入したものであった。△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターを、ＰＣＲによりＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡから増幅し、沈殿させ、制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで消化し、アガロースゲル精製し、ベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の対応する制限部位中にクローニングした。陽性クローンＪＺ１−５７−７の挿入物を、プライマー１４番（配列番号２２）およびプライマー１５番（配列番号２３）を用いて配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）およびアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて分析した。クローンＪＺ１−５７−７のヌクレオチド配列の挿入物は、９５０塩基対長（配列番号１９）であり、ＯＮＣ−Ｔ１８の△５エロンガーゼ遺伝子プロモーター（配列番号１９）として識別されている。
【０１７６】
この９５０ヌクレオチド長のプロモーター配列（配列番号１９）は、１１３位で−１０ボックス（ＴＧＣＣＡＧＡＣＴ）、９１位で−３５ボックス（ＴＴＴＴＣＴ）、１２８位で推定上の転写開始部位、ならびに８７位、９２位、９３位、および１３１位で推定上の転写因子結合部位ＣＴＣＣＴＴＴＴ、ＴＴＴＣＴＴＴＴ、ＴＴＣＴＴＴＴＴ、およびＴＴＧＣＴＣＣＴ、ならびに４４４位で−１０ボックス（ＡＧＴＴＣＴＧＡＴ）、４１９位で−３５ボックス（ＴＴＴＣＣＧ）、および４５９位で推定上の転写開始部位を含有する。
【０１７７】
△５エロンガーゼ遺伝子プロモーター配列（配列番号１９）に相同的な配列の検索を、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて、特許配列のデータベースを含むＧｅｎｂａｎｋの様々なデータベースで行った。△５エロンガーゼ遺伝子プロモーター配列（配列番号１９）に相同的な配列は発見されなかった。
【０１７８】
６．△４デサチュラーゼ遺伝子（国際特許出願ＰＣＴ／１Ｂ２００７／００４５５３号）プロモーター配列（配列番号２４）の単離および識別。下流分子クローニングの便宜のために、制限酵素部位ＸｈｏＩをその５’末端に付加したオリゴヌクレオチドプライマー１番（配列番号２５）、および制限酵素部位ＮｃｏＩをその５’末端に付加したプライマー２番（配列番号２６）を用いて、△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター配列（配列番号２４）を単離した。△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターのＤＮＡフラグメントをＰＣＲを用いて増幅し、沈殿させ、制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで消化し、アガロースゲル精製し、ベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の対応する制限部位中にクローニングし、同一の制限酵素で消化し、ゲル精製した。陽性クローンＪＺ１−５７−１の挿入物を、プライマー１４番（配列番号２２）およびプライマー１５番（配列番号２３）を用いて配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）およびアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて分析した。クローンＪＺ１−５７−１のヌクレオチド配列の挿入物は、１２１６塩基対長（配列番号２４）であり、ＯＮＣ−Ｔ１８の△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター（配列番号２４）として識別されている。
【０１７９】
この１２１６ヌクレオチド長のプロモーター配列（配列番号２４）は、５８位で−１０ボックス（ＧＣＧＴＡＴＴＡＴ）、３４位で−３５ボックス（ＣＴＡＣＡＧ）、７３位で推定上の転写開始部位、ならびに６３位および６９位で推定上の転写因子結合部位ＴＴＡＴＡＴＴＴおよびＴＴＴＴＣＧＣＡ、ならびに１０３８位で−１０ボックス（ＣＧＴＣＡＴＣＣＴ）、１０１４位で−３５ボックス（ＴＧＧＡＣＧ）、および１０５３位で推定上の転写開始部位を含有する。
【０１８０】
△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター配列（配列番号２４）に相同的な配列の検索を、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて、特許配列のデータベースを含むＧｅｎｂａｎｋの様々なデータベースで行った。△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター（配列番号１５）に相同的な配列は発見されなかった。
【実施例２】
【０１８１】
核酸構築物
本実施例は、スラウストキトリド特異的遺伝子発現ベクターの構築を説明する。
【０１８２】
１．組換えプラスミドベクターｐＤ４ＤＰＺ１（配列番号３０、図２）およびｐＥ５ＰＺ１（配列番号３１、図３）の生成。ＯＮＣ−Ｔ１８の△４デサチュラーゼおよび△５エロンガーゼ遺伝子のプロモーターＤＮＡフラグメントを、ＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡを鋳型としておよびＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。その５’末端に制限酵素部位ＸｈｏＩを担持するプライマー１番（配列番号２５）、およびその５’末端に制限酵素部位ＮｃｏＩを包含するプライマー２番（配列番号２６）を、△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター（配列番号２４）の増幅のために利用した。その５’末端に制限酵素部位ＸｂａＩを担持するプライマー３番（配列番号２０）およびその５’末端に制限酵素部位ＮｃｏＩを含有するプライマー４番（配列番号２１）を、△５エロンガーゼプロモーター（配列番号１９）の増幅のために用いた。ＰＣＲ反応を、９４℃で３０秒間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で２分間を３０サイクルという条件下で、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、１倍ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、ｄＮＴＰ混合物（各０．４０ｍＭ）、２２５ηｇのゲノムＤＮＡ鋳型、０．２０μＭのプライマー［△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター増幅用のプライマー対１番（配列番号２５）および２番（配列番号２６）、ならびに△５エロンガーゼプロモーター増幅用の３番（配列番号２０）および４番（配列番号２１）］を含有する５０μＬの体積の反応混合物中で実行した。
【０１８３】
ＰＣＲ生成物を、以下の手順に従って沈殿させた：ヌクレアーゼを含まないｄｄＨ２Ｏを全体積２００μＬに添加し、その後、２０μＬの３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）および４４０μＬの１００％エタノールを添加し、短時間ボルテックスして混合し、氷中で１時間インキュベートし、卓上型遠心分離機を用いて最高速度で１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、５００μＬの７５％エタノールを添加し、最高速度で２分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、ＤＮＡペレットを約１０分間真空乾燥させた。△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターのＰＣＲ生成物を、１倍ＮＥ緩衝液２および１倍ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含有する２５μＬ体積の反応混合物中の制限酵素ＮｃｏＩ（１０単位）およびＸｈｏＩ（１０単位）で、３７℃で２時間消化した。△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターのＰＣＲ生成物を、同一の条件下で、制限酵素ＮｃｏＩ（１０単位）およびＸｂａＩ（１０単位）で消化した。消化されたＰＣＲ生成物を０．８％アガロースゲル中で分解し、８８電圧で４５分間の電気泳動を行った。ＰＣＲ生成物のＤＮＡバンドをアガロースゲルからかみそりの刃で切り取り、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ＤＮＡを抽出および精製した。結果として生じた酵素特異的付着末端を有する△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターＤＮＡフラグメントを、同一の制限酵素で消化したベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２の対応する制限部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩにライゲートし、アガロースゲル精製して、ベクターｐＤ４ＤＰＺ１（配列番号３０、図２）を得た。結果として生じた酵素特異的付着末端を有する△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化したベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の制限部位にライゲートし、アガロースゲル精製して、ベクターｐＥ５ＰＺ１（配列番号３１、図３）を得た。ライゲーション反応を、１倍ライゲーション緩衝液、挿入物およびベクターＤＮＡ（３：１のモル比）、ならびに０．５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有する１０μＬ体積の反応混合物中で、周囲温度で１２時間実行した。その後、ライゲートされたＤＮＡを、大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に形質転換した。形質転換細胞の３つのコロニーのプラスミドＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ（商標）プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、３ｍＬの細菌培養物から単離した。クローンの完全性を、△５エロンガーゼ遺伝子プロモーター構築物に対して酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて、かつ△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーター構築物に対して酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを用いて、制限酵素消化で事前に試験した。事前に識別された陽性クローンである、△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターベクターのＪＺ１−５７−��、および△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターベクターのＪＺ１−５７−７の挿入物を、プライマー１４番（配列番号２２）およびプライマー１５番（配列番号２３）を用いて、完全に配列決定した。結果として生じたベクターｐＤ４ＤＰＺ１（配列番号３０、図２）は、ＯＮＣ−Ｔ１８の△４デサチュラーゼ遺伝子プロモーターおよびＳＶ４０ターミネーターに隣接したストレプトアロテイカスヒンズスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）由来のｂｌｅ遺伝子を含有する。結果として生じたベクターｐＥ５ＰＺ１（配列番号３１、図３）も、ＯＮＣ−Ｔ１８の△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターおよびＳＶ４０ターミネーターに隣接したｂｌｅ遺伝子を含有する。
【０１８４】
したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合されるスラウストキトリウムプロモーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、ターミネーター、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。
【０１８５】
２．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子発現ベクター（配列番号３２、図４）の生成。ＧＦＰ遺伝子の鋳型プラスミドＤＮＡを調製するために、プラスミドｐＣＤ３−３２７［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７０４９６、（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｖｉｅｒｓｔｒａ，１９９８）］を含有する大腸菌の細菌ストックを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）から購入した。その細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で画線した。単一コロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地中に接種し、一晩成長させた。培養した細菌由来のプラスミドＤＮＡを、製造業者のプロトコル通りに、Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて単離した。
【０１８６】
ＧＦＰ遺伝子ＤＮＡフラグメントを、ＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、鋳型プラスミドｐＣＤ３−３２７  ＤＮＡ、ならびにその５’末端に制限酵素部位ＸｈｏＩを担持するプライマー対５番（配列番号３３）および６番（配列番号３４）を用いて、ＰＣＲで増幅した。その後、ＰＣＲ生成物を、エタノールで沈殿させ、制限酵素ＸｈｏＩで消化し、ゲル精製した。ゲル精製したＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＢｓａＡＩ酵素で消化したベクターｐＥ５ＰＺ１プラスミドＤＮＡ（配列番号３１、図３）の骨格の制限酵素部位ＸｈｏＩおよびＢｓａＡＩにライゲートし、ゲル精製して、ｂｌｅ遺伝子を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子に置換して、ＧＦＰ遺伝子がＯＮＣ−Ｔ１８の△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターおよびＳＶ４０ターミネーターに隣接する発現ベクターｐＥ５ＰＲｓＧＦＰ１（配列番号３２、図４）を得た。
【０１８７】
したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合されるスラウストキトリウムプロモーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、ターミネーター、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。複数のそのようなベクターの本明細書に提供される説明、ならびにそのような配列を有する因子（例えば、プロモーター、ターミネーター）の他の因子への結合を可能にするのに十分なプロモーターおよび／またはターミネーター等のある特定の因子に関する配列情報の観点から、本開示を解読する当業者であれば、例えば、多くの場合、既知の技法に従って、提供される配列を様々な既知の他の要素のうちのいずれかと合わせることによって、様々な異なる個々のベクター構築物の作製および使用を十分に可能にするであろう。
【０１８８】
３．組換えプラスミドベクターｐ３４１ＰＺ４０Ｔ（配列番号３５、図５）の生成。ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接する、ストレプトアロテイカスヒンズスタヌス由来のｂｌｅ遺伝子を含有するベクターｐ３４１ＰＺ４０Ｔ（配列番号３５、図５）を構築するために、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対６６番（配列番号３６）および６７番（配列番号３７）、ならびに実施例１に記載のクローンＪＺ２−１７−１４の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー６６番（配列番号３６）の５’末端配列は、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に由来する中間ベクターの小領域に対して相補的であり、その３’末端は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番の５’末端のマイナス鎖に対して相補的である。プライマー６７番（配列番号３７）の５’末端配列は、ｂｌｅ遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端配列のプラス鎖に対して相補的であり、その３’末端は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番の３’末端のプラス鎖に対して相補的である。
【０１８９】
その３’末端に位置するＳＶ４０ターミネーターを含むｂｌｅ遺伝子ＯＲＦのＤＮＡフラグメントも、プライマー対６８番（配列番号３８）および７１番（配列番号３９）、ならびにベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のプラスミド鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー６８番（配列番号３８）の５’末端配列は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番の３’末端配列のマイナス鎖に対して相補的であり、その３’末端配列は、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦの５’末端のマイナス鎖に対して相補的である。プライマー７１番（配列番号３９）の５’末端配列は、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３に由来する中間ベクターの小領域に対して相補的であり、その３’末端配列は、ＳＶ４０ターミネーターの３’末端配列のプラス鎖に対して相補的である。
【０１９０】
ＰＣＲ反応を、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、１倍ＰｒｉｍｅｒＳｔａｒ  ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ混合物（各０．４０ｍＭ）、１ηｇの鋳型プラスミドＤＮＡ、プライマー対の各プライマー０．２０μＭを含有する５０μＬ体積の反応混合物中で実行した。９８℃で１０秒間および５５℃で５秒間および７２℃で２分間を３０サイクルというＰＣＲ条件を用いた。チューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびｂｌｅ遺伝子ＯＲＦのＰＣＲ生成物を０．８％アガロースゲル中で分解し、６５電圧で６０分間の電気泳動を行った。正しい大きさのバンドをかみそりの刃で切り取り、それらのＤＮＡを、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、抽出および精製した。その後、ゲル精製したＰＣＲ生成物を類似のモル比で混合し、これを、伸長ＰＣＲのためのＤＮＡ鋳型として使用して、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番、ＳＶ４０ターミネーターを含むｂｌｅ遺伝子ＯＲＦをともに融合した（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋｒｕｍｍｅｌ，ａｎｄ  Ｓａｉｋｉ，１９８８、Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｇｅ，ａｎｄ  Ｊｅｓｋｅ，２００１）。伸長ＰＣＲを、ＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、混合したＰＣＲ生成物の鋳型ＤＮＡ約１００ｎｇ、ならびにプライマー対６６番（配列番号３６）および７１番（配列番号３９）（各０．２０μＭ）を用いて、５０μＬ体積の反応混合物中で実行した。９８℃で１０秒間、５０℃で５分間、および７２℃で３分間を６サイクル、ならびに９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、および７２℃で３分３０秒間を２５サイクルというＰＣＲ条件を用いた。ＯＮＣ−Ｔ１８特異的ｂｌｅ遺伝子発現カセットを含有するＰＣＲ生成物を、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製し、伸長ＰＣＲ（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋｒｕｍｍｅｌ，ａｎｄ  Ｓａｉｋｉ，１９８８、Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｇｅ，ａｎｄ  Ｊｅｓｋｅ，２００１）を用いて、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に由来する中間ベクター中にクローニングした。伸長ＰＣＲを、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、１倍ＰｒｉｍｅｒＳｔａｒ  ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ混合物（各０．４０ｍＭ）、ＯＮＣ−Ｔ１８特異的ｂｌｅ遺伝子発現カセットを含有するゲル精製したＰＣＲ生成物のＤＮＡ２００ｎｇ、および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで線形化された中間ベクターのプラスミドＤＮＡ６００ｎｇを含有する５０μＬ体積のＰＣＲ反応混合物中で実行した。９８℃で１０秒間、６０℃で５秒間、および７２℃で５分３０秒間を３０サイクルというＰＣＲ条件を用いた。その後、鋳型プラスミドＤＮＡを、いくつかの細菌株から単離したメチル化プラスミドＤＮＡを特異的に消化したＤｐｎＩの制限酵素消化によって破壊した。この消化を、５０μＬの伸長ＰＣＲ生成物、３０単位のＤｐｎＩ、および１倍制限酵素反応緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬ体積の反応物中で、３７℃で２時間実行した。消化後、ＤｐｎＩ酵素を、８０℃で２０分間のインキュベーションによって不活性化した。その後、滅菌水を消化混合物中に最大３５０μＬになるまで添加し、さらに脱塩し、カラムＭｉｃｒｏｃｏｎ（ＹＭ−１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、約１００ｎｇ／μＬになるまでＤＮＡを濃縮した。１μＬの脱塩されたＤＮＡを、１８９０電圧に設定した電気穿孔機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５２１０）、ならびに１ｍｍのギャップを有する電気穿孔キュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いたＴｏｐ１０大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の形質転換のために使用した。陽性コロニーを、プライマー対６４番（配列番号４０）および６５番（配列番号４１）を用いて、実施例１に記載の直接コロニーＰＣＲで事前にスクリーニングした。陽性クローンＪＺ２−５３−１０の挿入物を、順方向および逆方向プライマー、ならびに内部プライマー１５番（配列番号２３）、１６番（配列番号４２）、５４番（配列番号７）、６４番（配列番号４０）、６５番（配列番号４１）、および８５番（配列番号４３）を用いて完全に配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いて分析し、クローニングされた挿入物の完全性を確認した。結果として生じたｂｌｅ遺伝子発現ベクターを、ｂｌｅ遺伝子がＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接するｐ３４１ＰＺＳＴ（配列番号３５、図５）と命名した。
【０１９１】
したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合されるスラウストキトリウムプロモーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、ターミネーター、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。複数のそのようなベクターの本明細書に提供される説明、ならびにそのような配列を有する因子（例えば、プロモーター、ターミネーター）の他の因子への結合を可能にするのに十分なプロモーターおよび／またはターミネーター等のある特定の因子に関する配列情報の観点から、本開示を解読する当業者であれば、例えば、多くの場合、既知の技法に従って、提供される配列を様々な既知の他の要素のうちのいずれかと合わせることによって、様々な異なる個々のベクター構築物の作製および使用を十分に可能にするであろう。
【０１９２】
４．組換えプラスミドベクターｐ３４１ＰＺ３４７Ｔ（配列番号４４、図６）の生成。ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番に隣接する、ストレプトアロテイカスヒンズスタヌス由来のｂｌｅ遺伝子を含有するベクターｐ３４１ＰＺ３４７Ｔ（配列番号４４、図６）を構築するために、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対６６番（配列番号３６）および６７番（配列番号３７）、ならびに実施例１に記載のクローンＪＺ２−１７−１４の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。
【０１９３】
ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦのＤＮＡフラグメントも、プライマー対６８番（配列番号３８）および７２番（配列番号４５）、ならびにベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のプラスミド鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー７２番（配列番号４５）の５’末端配列は、チューブリン遺伝子ターミネーター３４７番の５’末端配列のプラス鎖に対して相補的である。
【０１９４】
チューブリン遺伝子ターミネーター３４７番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対７３番（配列番号４６）および７４番（配列番号４７）、ならびに実施例１に記載のクローンＪＺ２−１７−２２の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー７３番（配列番号４６）の５’末端配列は、ｂｌｅ遺伝子のオープンリーディングフレームの３’末端配列のマイナス鎖に対して相補的であり、その３’末端は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番の５’末端のマイナス鎖に対して相補的である。プライマー７４番（配列番号４７）の５’末端配列は、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３に由来する中間ベクターの小領域に対して相補的であり、その３’末端は、スラウストキトリウム種チューブリン遺伝子ターミネーター３４７番の３’末端のプラス鎖に対して相補的である。
【０１９５】
ＰＣＲを、実施例２の第３節に記載される通りに実行した。ＰＣＲ生成物を、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製した。チューブリン遺伝子プロモーター３４１番のゲル精製したＰＣＲ生成物、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦ、およびチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番を類似のモル比で混合し、これを伸長ＰＣＲのためのＤＮＡ鋳型として使用して、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦ、およびチューブリン遺伝子ターミネーター３４７番をともに融合した。伸長ＰＣＲを、実施例２の第３節に記載されるように、それぞれ０．２０μＭのプライマー対６６番（配列番号３６）および７４番（配列番号４７）を用いて実行した。融合ＰＣＲ生成物を、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製し、実施例２の第３節に記載の伸長ＰＣＲを用いて、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３に由来する中間ベクター中にクローニングした。伸長ＰＣＲ生成物を、電気穿孔でＴｏｐ１０大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に形質転換した。陽性コロニーを、プライマー対６４番（配列番号４０）および６５番（配列番号４１）、プライマー対１６番（配列番号４２）および５９番（配列番号１２）、ならびにプライマー対５４番（配列番号７）および１５番（配列番号２３）を用いたコロニーＰＣＲ法で最初にスクリーニングした。陽性クローンＪＺ２−６９−２ａの挿入物を、順方向および逆方向プライマー、ならびに内部プライマー１５番（配列番号２３）、１６番（配列番号４２）、５４番（配列番号７）、５９番（配列番号１２）、６３番（配列番号４）、６４番（配列番号４０）、６５番（配列番号４１）、および８５番（配列番号４３）を用いて完全に配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いて分析し、クローニングされた挿入物の完全性を確認した。結果として生じたｂｌｅ遺伝子発現ベクターを、ｂｌｅ遺伝子がＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびターミネーター３４７番に隣接するｐ３４１ＰＺ３４７Ｔ（配列番号４４、図６）と命名した。
【０１９６】
したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合される（例えば、プロモーターが遺伝子の上流にあり、ターミネーターが下流にあるように）スラウストキトリウムプロモーターおよびターミネーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合されるスラウストキトリウムプロモーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、ターミネーター、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。
【０１９７】
５．組換えプラスミドベクターｐ３４１Ｐ７１３Ｔ（配列番号４８、図７）の生成。ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびチューブリン遺伝子ターミネーター７１３番に隣接する、Ｓ．ヒンズスタヌス由来のｂｌｅ遺伝子を含有するベクターｐ３４１ＰＺ７１３Ｔ（配列番号４８、図７）を構築するために、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対６６番（配列番号３６）および６７番（配列番号３７）、ならびに実施例１に記載のクローンＪＺ２−１７−１４の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。
【０１９８】
ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦのＤＮＡフラグメントを、プライマー対６８番（配列番号３８）および７５番（配列番号４９）、ならびにベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のプラスミド鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー７５番（配列番号４９）の５’末端配列は、チューブリン遺伝子ターミネーター７１３番の５’末端配列のプラス鎖に対して相補的である。
【０１９９】
チューブリン遺伝子ターミネーター７１３番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対７６番（配列番号５０）および７７番（配列番号５１）、および実施例１に記載のクローンＪＺ２−２２−９の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー７６番（配列番号５０）の５’末端配列は、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦの３’末端配列のマイナス鎖に対して相補的であり、その３’末端は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子ターミネーター７１３番の５’末端のマイナス鎖に対して相補的である。プライマー７７番（配列番号５１）の５’末端配列は、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３に由来する中間ベクターの小領域に対して相補的であり、その３’末端は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子ターミネーター７１３番の３’末端のプラス鎖に対して相補的である。
【０２００】
チューブリン遺伝子プロモーター３４１番、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦ、およびチューブリン遺伝子ターミネーター７１３番のＰＣＲ生成物をゲル精製し、類似のモル比で混合し、プライマー対６６番（配列番号３６）および７７番（配列番号５１）を用いた伸長ＰＣＲのためのＤＮＡ鋳型として使用して、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦ、およびチューブリン遺伝子ターミネーター７１３番をともに融合した。融合したＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製し、第２の伸長ＰＣＲを用いて、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３に由来するＨｉｎｄＩＩＩ−線形化中間ベクター中にクローニングした。１マイクロリットル（約１００ηｇ）の伸長ＰＣＲ生成物ＤＮＡを、電気穿孔でＴｏｐ１０大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を形質転換するために使用した。陽性コロニーを、プライマー対６４番（配列番号４０）および６５番（配列番号４１）、プライマー対１６番（配列番号４２）および７７番（配列番号５１）、ならびにプライマー対５４番（配列番号７）および１５番（配列番号２３）を用いたコロニーＰＣＲで最初にスクリーニングした。陽性クローンＪＺ２−６９−２ｂの挿入物を、順方向および逆方向プライマー、ならびに内部プライマー１５番（配列番号２３）、１６番（配列番号４２）、５４番（配列番号７）、６３番（配列番号４）、６４番（配列番号４０）、６５番（配列番号４１）、および８５番（配列番号４３）を用いて完全に配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いて分析し、クローニングされた挿入物の完全性を確認した。結果として生じたｂｌｅ遺伝子発現ベクターを、ｂｌｅ遺伝子がＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびターミネーター７１３番に隣接するｐ３４１ＰＺ７１３Ｔ（配列番号４８、図７）と命名した。
【０２０１】
したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合される（例えば、プロモーターが遺伝子の上流にあり、ターミネーターが下流にあるように）スラウストキトリウムプロモーターおよびターミネーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。したがって、本発明は、とりわけ、異種遺伝子に動作可能に結合されるスラウストキトリウムプロモーターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、そのようなベクターには、例えば、ターミネーター、１つ以上の複製起点、および１つ以上の検出可能または選択可能なマーカーが挙げられる。複数のそのようなベクターの本明細書に提供される説明、ならびにそのような配列を有する因子（例えば、プロモーター、ターミネーター）の他の因子への結合を可能にするのに十分なプロモーターおよび／またはターミネーター等のある特定の因子に関する配列情報の観点から、本開示を解読する当業者であれば、例えば、多くの場合、既知の技法に従って、提供される配列を様々な既知の他の要素のうちのいずれかと合わせることによって、様々な異なる個々のベクター構築物の作製および使用を十分に可能にするであろう。
【０２０２】
６．組換えプラスミドベクターｐ７０１ＰＺ４０Ｔ（配列番号５２、図８）の生成。ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター７０１番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接する、Ｓ．ヒンズスタヌス由来のｂｌｅ遺伝子を含有するベクターｐ７０１ＰＺ４０Ｔ（配列番号５２、図８）を構築するために、チューブリン遺伝子プロモーター７０１番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対８７番（配列番号５３）および８８番（配列番号５４）、ならびに実施例１に記載のクローンＪＺ２−１７−１０の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー８７番（配列番号４８）の５’末端配列は、ベクターｐ３４１ＰＺ４０Ｔの小領域に対して相補的であり、その３’末端は、チューブリン遺伝子プロモーター７０１番の５’末端配列のマイナス鎖に対する相補体である。プライマー８８番（配列番号５４）の５’末端配列は、ｂｌｅ遺伝子ＯＲＦの５’末端配列のプラス鎖に対して相補的であり、その３’末端は、チューブリン遺伝子ターミネーター７０１番の３’末端のプラス鎖と一致する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、伸長ＰＣＲを用いてチューブリン遺伝子プロモーター３４１番を置換するために、ｐ３４１ＰＺ４０Ｔのベクター中にクローニングした（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ゲル精製したＰＣＲ生成物のＤＮＡ２００ηｇ、およびベクターｐ３４１ＰＺ４０ＴのＢｇｌＩＩ線形化プラスミドＤＮＡ６００ｎｇを、伸長ＰＣＲで使用した。１マイクロリットル（約１００ηｇ）の伸長ＰＣＲ生成物ＤＮＡを、電気穿孔でＴｏｐ１０大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を形質転換するために使用した。陽性コロニーを、プライマー対５２番（配列番号５１）および５３番（配列番号５２）を用いたコロニーＰＣＲ法で最初にスクリーニングした。陽性クローンの挿入物を、順方向および逆方向プライマー、ならびに内部プライマー５２番（配列番号１）および５３番（配列番号２）、１５番（配列番号２３）、１６番（配列番号４２）、６３番（配列番号４）、６４番（配列番号４０）、６５番（配列番号４１）、および８５番（配列番号４３）を用いて、完全に配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いて分析し、クローニングされた挿入物の完全性を確認した。結果として生じたｂｌｅ遺伝子発現ベクターを、ｂｌｅ遺伝子がＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター７０１番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接するｐ７０１ＰＺ４０Ｔ（配列番号５２、図７）と命名した。
【０２０３】
７．組換えプラスミドベクターｐ３４１ＰＲｓＧＰ４０Ｔ（配列番号５５、図９）の生成。ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接する、オワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子を含有するベクターｐ３４１ＰＲｓＧＦＰ４０Ｔ（配列番号５５、図９）を構築するために、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番のＤＮＡフラグメントを、プライマー対６６番（配列番号３６）および７８番（配列番号５６）、ならびに実施例１に記載のクローンＪＺ２−１７−１４の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー７８番（配列番号５６）の５’末端配列は、ＧＦＰ遺伝子ＯＲＦの５’末端配列のプラス鎖に対して相補的であり、その３’末端は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番の３’末端のプラス鎖と一致する。
【０２０４】
ＧＦＰ遺伝子ＯＲＦのＤＮＡフラグメントも、プライマー対７９番（配列番号５７）および８０番（配列番号５８）、ならびにベクターｐＣＤ３−３２７の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー７９番（配列番号５７）の５’末端配列は、ＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番の３’末端配列のプラス鎖に対して相補的であり、その３’末端配列は、ＧＦＰ遺伝子ＯＲＦの５’末端のマイナス鎖と一致する。プライマー８０番（配列番号５８）の５’末端配列は、ＳＶ４０ターミネーターの５’末端配列のプラス鎖に対して相補的であり、その３’末端は、ＧＦＰ遺伝子ＯＲＦの３’末端配列のプラス鎖と一致する。
【０２０５】
ＳＶ４０ターミネーターのＤＮＡフラグメントも、プライマー対８１番（配列番号５９）および７１番（配列番号３９）、ならびにベクターｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の鋳型プラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲで増幅した。プライマー８１番（配列番号５９）の５’末端配列は、ＧＦＰ遺伝子ＯＲＦの３’末端配列のマイナス鎖に対して相補的であり、その３’末端配列は、ＳＶ４０ターミネーターの５’末端と一致する。
【０２０６】
上述の３つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、類似のモル比で混合し、プライマー対６６番（配列番号３６）および７１番（配列番号３９）を用いた伸長ＰＣＲのためのＤＮＡ鋳型として使用して、チューブリン遺伝子プロモーター３４１番、ＧＦＰ遺伝子ＯＲＦ、およびＳＶ４０ターミネーターをともに融合した（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋｒｕｍｍｅｌ，ａｎｄ  Ｓａｉｋｉ，１９８８）。ＯＮＣ−Ｔ１８特異的ＧＦＰ遺伝子発現カセットを含有する伸長ＰＣＲ生成物をゲル精製し、伸長ＰＣＲの第２ラウンドで制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで線形化したベクターｐ３４１ＰＺ４０Ｔ中にクローニングした。第２ラウンドのＰＣＲ生成物を洗浄し、脱塩し、電気穿孔でＴｏｐ１０大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。陽性コロニーを、直接コロニーＰＣＲならびにプライマー対５４番（配列番号７）および８６番（配列番号６０）を用いてスクリーニングした。陽性クローンＪＺ２−５３−２０の挿入物を、順方向および逆方向プライマー、ならびに内部プライマー１５番（配列番号２３）、１６番（配列番号４２）、５４番（配列番号７）、６３番（配列番号４）、６４番（配列番号４０）、６５番（配列番号４１）、８５番（配列番号４３）、および８６番（配列番号６０）を用いて、完全に配列決定した。結果として生じた配列を組み立て、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＫｏｄｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ）を用いて分析し、クローニングされた挿入物の完全性を確認した。結果として生じたＧＦＰ遺伝子発現ベクターを、ＧＦＰ遺伝子がＯＮＣ−Ｔ１８のチューブリン遺伝子プロモーター３４１番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接するｐ３４１ＰＲｓＧＦＰ４０Ｔ（配列番号５５、図８）と命名した。
【０２０７】
８．組換えプラスミドベクターｐＤ４ＤＰＺ１１８Ｓ（配列番号６１、図１０）の生成。ｐＤ４ＤＰＺ１８Ｓ（配列番号６１、図１０）ベクターを構築するために、ベクターｐＤ４ＤＰＺ１のプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで消化してベクターを線形化し、その後、製造業者のプロトコル通りに、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製した。プライマー対、１８ＳｒＲＮＡｆ（配列番号２７）および１８ＳｒＲＮＡｒ（配列番号２８）を用いたＰＣＲでＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡから増幅され、かつベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−３中にクローニングされた１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント（配列番号２９）を、酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｈＩでの制限消化によってクローンＪＺ２−３−１のプラスミドＤＮＡから遊離し、その後、ゲル精製し、ｐＤ４ＤＰＺ１の線形化ベクターの制限部位ＳａｌＩおよびＳｐｈＩにライゲートして、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡフラグメントを担持するｐＤ４ＤＰＺ１８Ｓ（配列番号６１、図１０）を得た。
【０２０８】
９．組換えプラスミドベクターｐ３４１ＰＺ５ｐＥｘ（配列番号６２、図１１）の生成。スラウストキトリド原生微生物中の相同遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするための相同遺伝子および異種遺伝子を過剰発現させる構築物ｐ３４１ＰＺ５ｐＥｘを構築するために、ゼオシン耐性遺伝子発現ベクターｐｄ５ＥＰＰＺ１を、プライマーＬｉｎｋｅｒＦ（配列番号６３）およびＬｉｎｋｅｒＲ（配列番号６４）を用いたＰＣＲで修飾して、ゼオシン耐性遺伝子ＯＲＦを、エンドヌクレアーゼ制限部位（ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩ、ＮｒｕＩ、ＢｓｔＢＩ、およびＢａｍＨＩ）を含む複数のクローニング部位で置換した。ＰＣＲ後、鋳型プラスミドＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ制限酵素ＤｐｎＩを用いて破壊した。ＰＣＲ生成物を沈殿させ、エンドヌクレアーゼ制限酵素ＭｌｕＩで消化し、ゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とともに再ライゲートし、その後、Ｔｏｐ１０大腸菌細胞に形質転換した。陽性クローンの予備スクリーニングを、制限消化を用いて実行した。陽性クローンの完全性をＤＮＡ配列決定で確認し、プラスミドｐ５ｅＥＰ４０Ｔ（配列番号６５）と命名した。その陽性クローンのプラスミドＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、骨格プラスミドＤＮＡをゲル精製した。ゼオシン遺伝子ＯＲＦがチューブリン遺伝子プロモーター３４１Ｐ番およびＳＶ４０ターミネーターに隣接するゼオシン耐性遺伝子発現カセットも、同一のエンドヌクレアーゼ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐ１８Ｓ３４１ＰＺ４０ｔから単離およびゲル精製した。その後、ゼオシン耐性遺伝子発現カセットを、プラスミドｐ５ｅＥＰ４０Ｔの対応するエンドヌクレアーゼ制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにライゲートし、遺伝子発現ベクターｐ３４１ＰＺ５ｐＥｘを得た。
【実施例３】
【０２０９】
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の遺伝子操作に使用することができる抗生物質の識別
本実施例は、抗生物質であって、その耐性をＯＮＣ−Ｔ１８の遺伝子操作のための選択可能なマーカーとして使用することができる抗生物質を識別する実験を説明する。
【０２１０】
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８を寒天プレート（１リットルのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０当たり２０ｇの寒天）上で成長させた。１白金耳のＯＮＣ−Ｔ１８の接種材料を５０ｍＬの液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中に接種し、培養物を２５℃および２５０ｒｐｍの振盪インキュベーター内で３６時間インキュベートした。その培養物の０．５ミリリットルを１．５ｍＬの管に移し、最高速度で３０秒間ボルテックスして細胞集塊を分解し、その後、５０ｍＬの滅菌水中に希釈した。結果として生じた溶液の１００マイクロリットルを、それぞれのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地プレート上に広げた。それぞれのプレートは、様々な抗生物質の１つを様々な濃度の１つで含有した。プレートを２５℃でインキュベートし、コロニーの出現および成長を毎日観察した。表１で見ることができるように、ＯＮＣ−Ｔ１８の成長は、試験した抗生物質の大半に対して感受性が無かった。しかしながら、ゼオシンは、ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート中でのＯＮＣ−Ｔ１８の成長を著しく阻害した。
【０２１１】
したがって、本実施例は、ゼオシンを、遺伝子操作実験における選択に使用することができる抗生物質と見なす。
【０２１２】
【表１】
2014507952.tif 000003
【実施例４】
【０２１３】
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８形質転換細胞の有効な選択のためのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中の塩分の最適化
当技術分野において既知のように、ゼオシンは、高塩濃度では不安定である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ＯＮＣ−Ｔ１８の本来の生息環境のため、ＯＮＣ−Ｔ１８が比較的高い塩分の条件下で成長することを好むことも示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３９７７号）。本実施例は、ゼオシン耐性遺伝子を選択可能なマーカーとして用いた、ＯＮＣ−Ｔ１８形質転換細胞の効率的な選択に最適なゼオシン濃度および塩分の決定を説明する。
【０２１４】
２日齢の培養物由来の１：５００で希釈した１００μＬのＯＮＣ−Ｔ１８細胞懸濁液を、様々な濃度の抗生物質ゼオシンおよび海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０プレート上に広げた。接種したプレートを、２５℃のインキュベーター内で１０日間インキュベートした。それぞれのプレート上のコロニーの数を数えた。２つの複製プレートのコロニーの数の平均が、表２に提示される。接種の１０日後、５ｇ／Ｌの海塩および様々な濃度のゼオシンを含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート内で、コロニーは観察されなかった。８．５ｇ／Ｌの海塩を含有し、ゼオシンを含まないプレート内で、１つのコロニーのみが観察された。１８ｇ／Ｌの海塩を含有し、ゼオシンを含まないプレートにおいて、コロニーの数は、３５ｇ／Ｌの海塩を含有し、ゼオシンを含まないプレートのコロニーの数に類似した。しかしながら、３０μｇ／ｍＬの濃度のゼオシンは、１８ｇ／Ｌの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート内でのＯＮＣ−Ｔ１８の成長を完全に阻害した一方で、１００μｇ／ｍＬのゼオシンが、３５ｇ／Ｌの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート内でのＯＮＣ−Ｔ１８の完全な阻害に必要であった。２つの複製プレート内の単一コロニーの直径を測定し、それらの平均は、表３に示される。１８ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌの塩分は、コロニーの大きさには著しく影響を及ぼさなかった（図１２）。したがって、本実施例は、とりわけ、より良好な成長が、約８．５ｇ／Ｌを超える海塩濃度の存在下で観察されたことを実証する。本発明に従って、８．５ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌ超（例えば、〜約３６ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、またはそれ以上、さらに５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌと同程度であるか、またはそれ以上）の範囲の濃度が、成長に好適であり得る。ゼオシンを用いた形質転換細胞の選択のために、言うまでもなく、ゼオシンに対する感受性を維持しつつ力強い成長を達成することが望ましい。したがって、この作業において、１８ｇ／Ｌの海塩を用いて、ゼオシン耐性遺伝子発現カセットを担持する構築物で形質転換されるＯＮＣ−Ｔ１８形質転換細胞の選択用のＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０を作製した。
【０２１５】
【表２】
2014507952.tif 000004
【０２１６】
【表３】
2014507952.tif 000005
形質転換の効率性を、様々な圧力条件で試験した。本実施例において、約１１００ｐｓｉの圧力条件が、試験した他の圧力条件よりも高い形質転換の効率性をもたらしたことが見出された。
【実施例５】
【０２１７】
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の形質転換
この実施例は、ＯＮＣ−Ｔ１８の微粒子銃形質転換方法を説明する。
【０２１８】
材料および方法
【０２１９】
コンピテント細胞を生成する。ＯＮＣ−Ｔ１８を、２５℃のインキュベーター内のＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で維持し、３〜４週間毎に新鮮なプレートに移した。勢いよく増殖した細胞から採取した１白金耳のＯＮＣ−Ｔ１８の接種材料を、２５０ｍＬの三角フラスコ内の５０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中に接種し、その後、２５℃および１５０ｒｐｍの振盪インキュベーター内で約４６時間培養した。０．５ミリリットルの培養物を、滅菌条件下で層流フード内の滅菌した１．５ｍＬの遠心分離管に移し、その後、３，０００ｒｐｍの卓上型遠心分離機内で１分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを０．５ｍＬの滅菌水中に再懸濁し、その細胞懸濁液の１００μＬをＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレートの中心領域（約２８ｃｍ２）上に広げた。ペトリ皿を、滅菌条件下で、層流フード内で１０〜１５分間開放したままにし、細胞を沈下させ、液体水を蒸発させた。
【０２２０】
微粒子銃形質転換。プラスミドｐｄ５ＥＰＺ１、ｐ３４１ＰＺ４０Ｔ、ｐ３４１ＰＺ３４７Ｔ、ｐ３４１ＰＺ７１３Ｔ、およびｐＤ４ＤＰＺ１８Ｓ（実施例２に記載されるように構築されたもの。図３、５、６、７、および１０も参照のこと）を、製造業者のプロトコル通りに、ＺＹＰＰＹ（商標）プラスミドマキシプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、各プラスミドを含有する株の細菌培養物から単離した。実施例２で論じられるように、これらのプラスミドはそれぞれ、ゼオシン、フレオマイシン、およびブレオマイシンへの耐性を付与するｂｌｅ導入遺伝子を含有する（例えば、Ｇａｔｉｇｎｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）およびＤｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）を参照されたく、それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。本実施例において、Ｓｈ  ｂｌｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ：ストレプトアロテイカスヒンズスタヌス）導入遺伝子を用いた。Ｔｎ５  ｂｌｅおよびＳａ  ｂｌｅ（黄色ブドウ球菌）導入遺伝子等の他のｂｌｅ導入遺伝子も好適である。
【０２２１】
それぞれのプラスミドについて、５μＬ（約１μｇ／μＬ）のプラスミドＤＮＡを、３分間ボルテックスし、かつ氷上で１０分間インキュベートすることによって、２５μＬの金粒子懸濁液（５０％グリセロール中６０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。１０μＬの０．１Ｍスペルミジンおよび２５μＬの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２をその混合物に添加し、即座に４分間ボルテックスし、その後、最高速度で１０秒間、卓上型遠心分離機内で遠心分離した。上澄みを廃棄した。プラスミドＤＮＡ被覆金粒子を、７０％エタノールで２回洗浄し、３６μＬの９８％エタノール中に再懸濁した。６μＬの金粒子懸濁液をそれぞれのマクロキャリアディスク上に広げ、ディスクを空気乾燥させた（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０２２２】
ＰＳＤ−１０００／Ｈｅ粒子送達系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、製造業者のプロトコルに従って、層流フード内の滅菌条件下でのゼオシン耐性遺伝子発現カセットを担持するプラスミドＤＮＡのＯＮＣ−Ｔ１８コンピテント細胞への送達に使用した。マクロキャリアホルダー、マクロキャリア、遮断スクリーンを含む粒子送達系の部品をオートクレーブした。粒子送達系のチャンバを、７０％エタノールで拭いて消毒した。粒子衝突後、形質転換した細胞を含有するペトリ皿を、２５℃の暗所のインキュベーター内で６時間インキュベートした。その後、形質転換した細胞を１ｍＬの滅菌水を用いて皿から洗い流し、１．５ｍＬのオートクレーブした微小遠心分離管に移し、３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを０．５ｍＬのオートクレーブした水中に再懸濁した。その細胞懸濁液の１５０μＬを、約１５０〜２００μｇ／ｍＬのゼオシンを含有する寒天ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０プレート上に広げた。プレート内の液体が蒸発した後、プレートをＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）Ｍで密封し、２５℃のインキュベーター内で６〜１０日間インキュベートした。ゼオシン耐性コロニーを、１０μＬのピペット先端を用いて採取し、２００μＬのＰＣＲ管中の５０μＬの滅菌水中に懸濁した。その細胞懸濁液の１μＬを、１５０〜２００μｇ／ｍＬのゼオシンを含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上にスポットした。２５℃で３〜５日間インキュベートした後、勢いよく成長したコロニーをさらなる分析のために選択した。
【０２２３】
ゼオシン耐性コロニーを、微粒子銃形質転換の４〜６日後に、１５０〜２００μｇ／ｍＬのゼオシンを含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で成長させた。ゼオシン耐性株を、ＯＮＣ−Ｔ１８から単離した様々なプロモーターおよびターミネーターの組み合わせに由来する様々な構築物で生成した。異なる構築物を用いて生成された１回の形質転換当たりの形質転換細胞の数は、様々であった（表４を参照のこと）。
【０２２４】
【表４】
2014507952.tif 000006
【実施例６】
【０２２５】
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の形質転換細胞のＰＣＲ分析
この実施例は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８における導入遺伝子の存在の確認を説明する。ＰＣＲアッセイを用いて、ＯＮＣ−Ｔ１８を形質転換するために使用されたプラスミド構築物のそれぞれに存在するｂｌｅ導入遺伝子の存在を評価した。
【０２２６】
ゼオシン−ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で成長した形質転換した可能性のあるそれぞれの株の１白金耳の接種材料を、５０ｍＬのフラスコ内の１０ｍＬの液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地中に接種し、２５℃および２５０ｒｐｍの振盪インキュベーター内で２日間成長させた。２ｍＬの培養物を、製造業者のプロトコルに従って、Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、それぞれの株のゲノムＤＮＡを単離するために使用した。ゲノムＤＮＡ濃度を、スペクトル光度計Ｓｐｅｃｔｒｏ２０００ＲＳＰ（Ｌｅｂｏｍｅｄ，Ｉｎｃ．，Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて測定した。０．５μＬのゲノムＤＮＡを、２００μＬのＰＣＲ管中に、以下の構成成分：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、１倍ＰＲＣ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物（各０．２０ｍＭ）、０．２５μＭプライマー６４番（配列番号６６）、および０．２５μＭプライマー６５番（配列番号６７）を含有する２０μＬのＰＣＲ反応物に使用した。ＰＣＲ反応を、以下の熱サイクルプログラム：９４℃で３分間、９４℃で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で２分間を３０サイクルを用いて実行した。プライマー６４番は、ＯＮＣ−Ｔ１８を形質転換するために使用されるそれぞれのプラスミドのｂｌｅ遺伝子の５’末端にアニールし、プライマー６５番は、その３’末端にアニールする。約３５０塩基対のＤＮＡフラグメントを、陽性形質転換細胞のゲノムＤＮＡおよび陽性対照のプラスミドＤＮＡから増幅したが、野生型ＯＮＣ−Ｔ１８の細胞から単離した陰性対照のゲノムＤＮＡからは増幅しなかった。これらの結果は、大半のゼオシン耐性株が真の形質転換細胞であることを裏付ける（図１３）。
【実施例７】
【０２２７】
形質転換細胞の成長速度
この実施例は、形質転換した単一細胞由来の株の成長速度の決定を説明する。ゼオシンＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上に３回移されたゼオシン耐性株の接種材料を、１０μＬのピペット先端を用いてそれぞれのコロニーから採取し、２００μＬＰＣＲ管内の５０μＬの滅菌水中に再懸濁した。その細胞懸濁液の１μＬを、１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌのいずれかの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート（１５ｇ／Ｌの寒天）上にスポットした。スポットされたコロニーの直径を、接種後１日目、３日目、５日目、７日目、および８日目に測定した。
【０２２８】
試験した株の大半は、１８ｇ／Ｌの海塩を含有するプレート上で成長させた場合でも、３５ｇ／Ｌの海塩を含有するプレート上で成長させた場合でも、ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で、野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８よりも早く成長した。試験した株のうちの大半が、３５ｇ／Ｌの海塩を含有するプレート上よりも、１８ｇ／Ｌの海塩を含有するプレート上で早く成長した。１８ｇ／Ｌの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で最も早く成長したいくつかの株（株５−３等）は、３５ｇ／Ｌの海塩を含有するプレート上では他の株よりも成長が遅かった。大半の形質転換株が、より低い塩分、例えば、１８ｇ／Ｌの海塩を含有する培地上での成長を好むようである（図１４）。
【実施例８】
【０２２９】
形質転換株のゼオシン感受性
この実施例は、単一細胞由来の形質転換株のゼオシン感受性のアッセイを説明する。
【０２３０】
コロニー継代を介してゼオシン／ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上に３回移されたゼオシン耐性株（ならびにそれらの親株または野生型株）の非常に少量の接種材料を、１０μＬのピペット先端を用いてコロニーから採取し、２００μＬのＰＣＲ管内の５０μＬの滅菌水中に再懸濁した。その細胞懸濁液の１μＬを、１８ｇ／Ｌの海塩（１５ｇ／Ｌの寒天）および０〜５０００μｇ／ｍＬの濃度のゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上にスポットした。スポットされたコロニーの直径を、１日目、３日目、５日目、７日目、および８日目に測定した。
【０２３１】
試験したすべての株は、ゼオシンの不在下で、ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で順調に成長したが、それらの成長速度は異なった。親株（野生型株）ＯＮＣ−Ｔ１８は、３０μｇ／ｍＬ以下のゼオシンを有したＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上でのみ成長した。５つの異なるプラスミド構築物のすべてにおいて、ゼオシン耐性遺伝子（Ｓ．ヒンズスタヌス由来）発現カセットを担持するすべての形質転換株は、３０〜１０００μｇ／ｍＬの濃度のゼオシンを有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で順調に成長した（図１５）。しかしながら、５０００μｇ／ｍＬのゼオシン濃度で、大半の株の成長は、１０００μｇ／ｍＬ以下のゼオシンを有する培地上での成長よりも著しく遅く、それらの株のうちのいくつかは、５０００μｇ／ｍＬのゼオシン上では全く成長することができなかった（図１５）。しかしながら、いくつかの株、特に、△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターによって駆動されるゼオシン耐性遺伝子発現カセットを担持するプラスミド構築物で形質転換した株は、非常に順調に成長し（図１５）、このことは、△５エロンガーゼ遺伝子プロモーターが、非常に強力な遺伝子発現プロモーターであることを実証した。
【０２３２】
これらの結果は、ＤＨＡ（Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７）がスラウストキトリド微細藻類の群における主なエネルギー貯蔵脂肪酸であること、および△５エロンガーゼ伸長ステップがＤＨＡω−３脂肪酸産生微生物におけるＤＨＡ生合成中の律速ステップである（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４）ことと一致する。同一のプラスミド構築物で形質転換した株間の成長速度の変動は、ｂｌｅ導入遺伝子のコピー数の変動または宿主株ＯＮＣ−Ｔ１８の染色体におけるｂｌｅ導入遺伝子の挿入位置の変動のいずれかを反映する。
【０２３３】
これらの結果は、ＯＮＣ−Ｔ１８から単離した様々なプロモーターおよびターミネーター配列が、ＰＵＦＡ産生微生物における導入遺伝子発現を有効に駆動することができることを示す。加えて、これらの結果は、Ｓ．ヒンズスタヌス由来のｂｌｅ導入遺伝子が、スラウストキトリウム種株の工業的な株改良プログラムおよび遺伝子操作に非常に有効な選択マーカー遺伝子であることを示す。
【実施例９】
【０２３４】
形質転換株と野生型株スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８との間のバイオマス生産性の比較
本実施例は、形質転換細胞のバイオマス生産性と野生型株スラウストキトリウム種のバイオマス生産性との比較を説明し、とりわけ、ある特定の形質転換株が、上昇した（例えば、野生型と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、またはそれ以上上昇した）バイオマスレベルをもたらすことを実証する。
【０２３５】
ＯＮＣ−Ｔ１８、１０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０（１８ｇ／Ｌの海塩）培養物を、それぞれ形質転換株または野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８で接種した。形質転換株で接種した培養物は、培地中に２００μｇ／ｍＬのゼオシンを含有した。培養物を、ＯＤ６００が約１．９７９〜２．３６９に達するまで、２５０ｒｐｍに設定した振盪インキュベーター内で２５℃で３日間成長させた。その後、２５０ｍＬのフラスコ内に１８ｇ／Ｌまたは３５ｇ／Ｌのいずれかの海塩を含有する５０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培養物を、野生型株を含むそれぞれの株の６のＯＤ６００で接種した（１ｍＬの培養物のＯＤ６００を測定し、その後、ＯＤ６００値が６に相当するように培養物の体積を増加させた；例えば、ＯＤ６００測定結果が２であった場合、（１ｍＬ×（６／２．０））＝３ｍＬを接種材料として使用した）。培養物を、２５０ｒｐｍおよび２５℃に設定した振盪インキュベーター内で２日間成長させた。その後、５ｍＬのオートクレーブした５０％グルコースをそれぞれの培養フラスコに添加した。培養物を、１５０ｒｐｍおよび２０℃に設定した振盪インキュベーター内でさらに２日間継続的に成長させた。その後、６ｍＬのオートクレーブした５０％グルコースを、それぞれの培養フラスコに添加し、培養物を、１５０ｒｐｍおよび２０℃に設定した振盪インキュベーター内でさらに３日間成長させ続けた。２種類のＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地（１８ｇ／Ｌの海塩または３５ｇ／Ｌの海塩を有する）中のそれぞれの株の培養物のバイオマスを、細胞培養物を５０ｍＬのファルコン管に移し、かつＳＯＲＶＡＬＬ  ＬＥＧＥＮＤ  ＲＴ＋遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて４０００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。バイオマスは、圧縮層として液体培地の表面に浮かんだ。液体培地を、１８Ｇ  １  １／２の注射針を用いてファルコン管の底部に非常に小さい穴を穿孔することによって放出した。管内のバイオマスのペレットを、−８０℃の冷凍庫で一晩凍結させ、その後、凍結乾燥機を用いて３日間凍結乾燥させた。それぞれの試料のバイオマスを秤量した。野生型を含む９個の株を試験した。
【０２３６】
大半の形質転換細胞は、３５ｇ／Ｌの人工海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中で成長したときの野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８の乾燥細胞バイオマスと類似した量の乾燥細胞バイオマスを産生した。８個中１個の形質転換株が、同一の条件下で成長したときの野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８の乾燥細胞バイオマスよりも約２２％多い乾燥細胞バイオマスを産生した（図１６）。１８ｇ／Ｌの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０において、８個中７個の形質転換株が、野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８のバイオマスに類似した量またはそれよりも多くのバイオマスを産生した。８個の試験した株のうち１個が、野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８のバイオマスよりも１９．５％多いバイオマスを産生した（図１６）。
【実施例１０】
【０２３７】
形質転換株と野生型株スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８との間のＤＨＡ生産性の比較
本実施例は、様々な形質転換株のＤＨＡ生産性を説明し、野生型と比較して上昇したレベルを実証する。本実施例は、とりわけ、野生型よりも少なくとも１％〜３６％高い（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％等）レベルが達成されたことを実証する。これらの所見に基づいて、当業者であれば、さらなる上昇が達成可能であることを認識する（例えば、野生型よりも１％〜１０００％高い、例えば、野生型よりも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０、１０００％、またはそれ以上高い範囲まで）。本実施例は、約１：４〜約１：２のＤＨＡ：バイオマス比、野生型株で典型的に観察されるＤＨＡ：バイオマス比よりも少なくとも約４０％高いＤＨＡ：バイオマス比の達成をさらに実証する（例えば、Ｒａｇｈｕｋｕｍａｒ（２００８）の表２を参照されたく、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの所見に基づいて、当業者であれば、少なくとも約１：５の比率が達成可能であることを認識する。我々は、約１：８〜１：４のＤＨＡ：バイオマス比（ＤＨＡ：バイオマス）を達成し、約１：３の比率を達成する見込みである。文献（Ｒａｇｈｕｋｕｍａｒ，２００８によって公開された総説等）内の実施例は、この比率を１：５未満には低下させていないという功績を示す。
【０２３８】
８個の形質転換株およびそれらの親株（野生型）の培養物を成長させ、バイオマスを収集し、実施例９に記載の条件と同一の条件下で凍結乾燥させた。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、直接エステル交換法を介して抽出した。約２０ｍｇの凍結乾燥した細胞バイオマスおよび３ｍＬのエステル交換反応緩衝液（メタノール：塩酸：クロロホルム）を、１０秒間ボルテックスして混合し、その後、９０℃の水浴中で２時間インキュベートした。エステル交換完了後、試料を除去し、周囲温度になるまで冷却した。１ｍＬの水を添加し、１０秒間ボルテックスして混合した。その後、ＦＡＭＥを、３×２ｍＬのヘキサン：クロロホルム（ｖ／ｖ、４：１）溶媒を添加し、かつ１０秒間ボルテックスすることによって抽出し、その後、試料を相分離が完了するまで静置させた。
【０２３９】
ＦＡＭＥのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を、２つの内部標準物（２００μＬ）を用いて実行した。一方のヘキサコサン酸（Ｃ２３：０）をエステル交換前に添加し、もう一方のノナデカン酸（Ｃ１９：０）を分析直前に添加した。分析を、内径３０ｍ×０．３２ｍｍ（フィルム厚０．２５μｍ）のＯＭＥＧＡＷＡＸ３２０融合シリカキャピラリーカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および２５０℃に設定した炎イオン化検出器を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）内で行い、２７５℃のＦＩＤ検出器に対する分割比は、５０：１であった。注入量は、１μＬであった。キャリヤガスは、Ｈ２であり、１分間当たり５．０ｍＬの一定流量を有した。ＦＡＭＥ同一性の確認を、Ｔｒａｃｅ  ＧＣ−ＤＳＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）および実験室基準の保持時間の比較を用いて実行した。
【０２４０】
８個の形質転換株のうち１個が、約６．３３７ｇ／ＬのＤＨＡを産生した。この収量は、３５ｇ／Ｌの人工海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中で成長したときの野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８の収量よりも約１６％多い。８個の形質転換株のうち３個が、同一の条件下において１８ｇ／Ｌの人工海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中で成長したときの野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８のＤＨＡよりも１〜１３％多いＤＨＡを産生した（図１７ＡおよびＢ）。
【０２４１】
８個の形質転換株のうち２個が、７．４４５ｇ／Ｌおよび７．８７１ｇ／ＬのＤＨＡを産生し、これは、３５ｇ／Ｌの人工海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中で成長したそれらの親株（５．９３５ｇ／Ｌ）よりも、それぞれ、２５％および３６％多いことを表す（図１７Ｂ）。より低い塩分のＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０の使用は、ＤＨＡ産生費用を直接減少させるだけでなく、スラウストキトリド微生物の培養用の成長培地中の高濃度の塩化ナトリウム塩に起因する発酵器の腐食も遅延させる。
高レベルのＤＨＡ産生形質転換株由来の総脂質に対するＤＨＡの比率は、それらの親株の比率よりも高い（図１７Ｃ）。ＤＨＡ：総脂質の因子は、形質転換株の細胞から抽出されるＤＨＡの下流処理に影響を与え得る。本発明の株および方法で達成されるＤＨＡ：総脂質比は、発酵条件によって異なり得る。例えば、フラスコ内で成長させた培養物の場合、総脂質の約１５％〜約２５％であるＤＨＡ割合（約０．１５：１〜約０．２５：１のＤＨＡ：総脂質比に相当する）が、典型的には、形質転換株で達成され得る。発酵器内で成長させた培養物の場合、総脂質の約３０％〜約６０％であるＤＨＡ割合（約０．３：１〜約０．６：１のＤＨＡ：総脂質に相当する）が、典型的には、形質転換株で達成され得る。野生型株で得ることができるＤＨＡ収量よりもはるかに多いＤＨＡ収量が、本明細書に開示の形質転換株から得られる。例えば、形質転換株からのＤＨＡ収量が、典型的には、約１０〜約４０ｇ／Ｌ（培地１リットル当たりのグラム単位のＤＨＡ）である一方で、野生型株からのＤＨＡ収量は、典型的には、約０．５〜約１．６ｇ／Ｌである（例えば、Ｒａｇｈｕｋｕｍａｒ（２００８）の表２を参照のこと）。高レベルのＤＨＡ産生形質転換株のＤＨＡ：バイオマスの比率も、それらの親株の比率よりも高い。このより高い比率のＤＨＡ：バイオマスは、形質転換株の細胞バイオマスからのＤＨＡの下流抽出に役立つ（図１７Ｄ）。
【０２４２】
この実施例における培養物をすべて、同一の条件下で成長させた。形質転換株によるより高いレベルのＤＨＡ産生は、それらの株が、より効率的に炭素源をＤＨＡに変換し、それらの形質転換株のＤＨＡ産生費用を減少させることができることを示す。
【実施例１１】
【０２４３】
形質転換株と野生型株スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８との間の総脂質生産性の比較
本明細書において十分に説明および実証されるように、ＯＮＣ−Ｔ１８は、薬剤生体分子産生物および薬剤によって栄養価を高めた生体分子産生物のＰＵＦＡならびにその誘導体だけでなく、バイオ燃料産生にも効率的なバイオファクトリーとしての使用に有望である。本発明に従ってバイオ燃料産生に用いるＯＮＣ−Ｔ１８の能力を評価および特性化するために、ＯＮＣ−Ｔ１８の形質転換株の総脂質生産性および脂肪酸プロフィールを、専門的な製品適用のために脂肪酸プロフィールを変化させる方法に使用できる可能性について分析した。
【０２４４】
８個の形質転換株およびそれらの親株（野生型）の培養物を成長させ、バイオマスを収集し、実施例９に記載の条件と同一の条件下で凍結乾燥させた。ＦＡＭＥ抽出およびＧＣ分析を実施例１０に記載されるように実行した。
【０２４５】
我々は、形質転換株の脂肪酸プロフィールが、３５ｇ／Ｌの人工海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中で成長したときのそれらの親株の脂肪酸プロフィールと非常に類似していることを見出した。８個の形質転換株のうち４個が、それらの親株の総脂質よりも多くの総脂質を産生し、形質転換プロセス自体ならびに導入遺伝子の存在および／または発現が、脂肪酸プロフィールに著しく影響を及ぼすことも、大半の誘導体株の脂質代謝経路に関与する可能性のある遺伝子を妨害することもなかったことをさらに実証した。したがって、株は、形質転換プロセス後に親株の遺伝的完全性を保持するようである（図１８Ａ）。
【０２４６】
スラウストキトリウム株を形質転換する能力は、これらの微生物を遺伝子改変し、かつ代謝経路を作る絶大な機会を提供する。注目すべきことに、形質転換株を１８ｇ／Ｌの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０中で成長させたとき、２つの株は、それらの親株よりも著しく高いレベルのＣ１６脂肪酸産生を示した。これらの結果は、この株ＯＮＣ−Ｔ１８を開発して短鎖脂肪酸バイオ燃料産生の基盤にするのに有用である。これらの結果は、ゼオシン耐性形質転換細胞の選択プロセス中に、変異誘発が比較的高い頻度で細胞内で生じたことを実証する。この変異誘発の高頻度を、株改良プログラムで使用することができる（図１８Ｂ）。
【０２４７】
総脂質：バイオマスの比率は、低レベルの産生株よりも高濃度の短鎖脂肪酸を産生する株において高く（図１８Ｃ）、そのようなより高い比率は、終了時点での油抽出および加工費の減少に有益であり得る。
【０２４８】
低海塩ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０（１８ｇ／Ｌ）中での成長は、試験した大半の株の全体的な総脂質生産性を高めた（図１８Ｄ）。
【０２４９】
例えば、ＰＵＦＡ生合成経路の考察において本明細書で言及されるように、短鎖脂肪酸（すなわち、１６個未満の炭素を有する脂肪酸）の産生または特定のＰＵＦＡの産生を増加させることが望ましくあり得る。例えば、ＥＰＡの産生を増加させる（例えば、ＰＫＳ遺伝子および△５エロンガーゼ遺伝子を変異させるか、もしくはノックアウトすることによって）か、またはＡＲＡの産生を増加させる（例えば、ＰＫＳ遺伝子のうちのいずれかを下方調節し、かつ／もしくは△１２エロンガーゼ遺伝子を上方調節することによって）ことが望ましくあり得る。
【実施例１２】
【０２５０】
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の形質転換株におけるｂｌｅ導入遺伝子の安定性
本実施例は、本明細書に記載の形質転換したスラウストキトリウム種株における導入遺伝子の安定性を確認する。
【０２５１】
導入遺伝子の安定性は、微生物が製剤プロセスまたは工業的プロセスにおいて使用され、かつ生成物の量および質が最優先事項である工業的な微生物株改良プログラムにおける遺伝子操作のある特定の適用にとって重要である。したがって、我々は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株の導入遺伝子安定性推定アッセイを実行した。実施例７に記載の成長速度アッセイに関して、それぞれ形質転換した４つの株、ならびにそれらの原種野生型株の接種材料を、ゼオシンの不在下でＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上にスポットし、２５℃で７日間インキュベートした。（５つの異なるプラスミド構築物であって、それぞれの形質転換を、それぞれが異なるプロモーターおよびターミネーターの組み合わせによって駆動される様々なゼオシン耐性遺伝子発現カセットを担持する５つの異なるプラスミド構築物のうちの１つを用いて行った）。その後、同一の方法を用いて、株を新たな新鮮なＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上に移し、２５℃で７日間インキュベートし、コロニー継代を６回実行した。最後に、株を、２００μｇ／ｍＬ培地のゼオシン濃度を含むか、または含まないＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上に戻した。
【０２５２】
結果は、６回のコロニー継代後、すべての株が、ゼオシンを含むか、または含まないＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上で順調に成長することができることを示す（図１９Ａ）。しかしながら、２００μｇ／ｍＬ培地のゼオシン濃度を有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０寒天プレート上では、形質転換株のみ順調に成長したが、野生型株はいずれも成長することができなかった（図１９Ｂ）。
【０２５３】
これらの結果は、試験した株における導入遺伝子の喪失が観察されなかったことを実証する。さらに、野生型株において耐性が観察されず、このことは、これらの形質には自然変異は存在せず、検出可能な汚染も存在しなかったことを示す。６回のコロニー継代後の形質転換株におけるｂｌｅ導入遺伝子の存在を、実施例６に記載のＰＣＲを用いてさらに確認した。すべての形質転換株が、６回のコロニー継代後でもｂｌｅ導入遺伝子を保持した。したがって、ｂｌｅ導入遺伝子は、形質転換したＯＮＣ−Ｔ１８株における安定性を示した。
【実施例１３】
【０２５４】
変異誘発剤
この実施例は、とりわけ、有効な変異誘発剤の発見を説明する。この作用物質は、スラウストキトリドにおける変異誘発に特に有用である。
【０２５５】
ゼオシンは、細胞内の染色体ＤＮＡを切断する抗生物質である。抗生物質ゼオシンが、株改良に有用なスラウストキトリド株の変異誘発剤であろうと仮定された。ある特定の濃度で、ゼオシンは、大半の処理された細胞を死滅させることができるが、いくつかの細胞は、依然として生き残った。高濃度での細胞処理は、変異頻度を増加させ、変異株の選択および単離を促進することができる。
【０２５６】
ＯＮＣ−Ｔ１８の海洋原生生物野生型株を、ゼオシンがこの株における変異誘発を誘導するのに有用であるかを試験するモデルシステムとして選択した。ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地［５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／ＬのＤ（＋）−グルコース、３５ｇ／Ｌの人工海塩、１．２５ｍｇ／Ｌの微量要素（５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、３．１５ｇ／ＬのＦｅＣ１３・６Ｈ２Ｏ、４．３６ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．６１２５ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０５９７ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０ｌｇ／ＬのＣｏＣ１２・６Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ／ＬのＭｎＣ１２・４Ｈ２Ｏ、１３μｇ／ＬのＨ２ＳｅＯ３、２．７ｍｇ／ＬのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、１．８４ｍｇ／ＬのＮａ３ＶＯ４、および１．９４ｍｇ／ＬのＫ２ＣｒＯ４）、１．２５ｍｇ／Ｌのビタミン（１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、１ｍｇ／Ｌのビオチン、０．２０ｇ／ＬのチアミンＨＣｌ）、ならびに２０ｇ／Ｌの寒天］を含有する寒天プレート内で成長したちょうど１白金耳のＯＮＣ−Ｔ１８の接種材料を、５０ｍＬの液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地に接種し、２５℃および２５０ｒｐｍの振盪インキュベーター内で３６時間インキュベートした。０．５ミリリットルの培養物を１．５ｍＬの管に移し、最高速度で３０秒間ボルテックスし、その後、５０ｍＬの滅菌水中に希釈した。希釈した接種材料の１００マイクロリットルを、様々な濃度のゼオシン（０、１０、３０、５０、および１００μｇ／ｍＬ）を含有する寒天プレート上にそれぞれ広げた。プレートを２５℃のインキュベーター内でインキュベートした。コロニーの出現および成長を毎日観察した。接種の６日後、１０μｇ／ｍＬのゼオシンで成長したコロニーの大きさは、０μｇ／ｍＬのゼオシンで成長したコロニーの大きさに類似し、３０〜５０μｇ／ｍＬのゼオシンで徐々に低下した。プレート毎のコロニーの数も、１０、３０、および５０μｇ／ｍＬのゼオシンで徐々に減少した。数個のコロニーのみ、５０μｇ／ｍＬのゼオシンで観察された。注目すべきことに、様々な可視的なコロニー形態変化を有するコロニーセクターが、５０μｇ／ｍＬのゼオシンで成長したコロニーのうちのいくつかにおいて観察されたが、より低い濃度またはゼオシンなしで成長したコロニーにおいては観察されず、このことは、ゼオシンは、実に、スラウストキトリド株にとって有効な変異誘発剤であることを示す。これらの条件下で、ゼオシンは、少なくとも１０〜２００μｇ／ｍＬで有効であり、より高い濃度も十分に有効であり得る。例えば、２００〜５００μｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度が功を奏し得る。ある場合には、塩濃度を増加させて、塩に起因するゼオシンの可能性のある劣化に対抗する場合にも、より高いゼオシン濃度が使用される。本実施例で利用される特定の条件下で、ゼオシンは、５０μｇ／ｍＬで最も良好に機能した。
【実施例１４】
【０２５７】
新規の発酵手順
この実施例は、スラウストキトリド株において高いバイオマス、総脂質、およびＰＵＦＡ産生を得るための２段階発酵方法を説明する。
【０２５８】
株ＯＮＣ−Ｔ１８のライフサイクルを、Ｃ：Ｎ源の比率、溶解酸素レベル、および温度等の様々な条件下で成長した培養物由来の細胞の顕微鏡観察を介して詳細に研究した。低酸素濃度、高炭素：窒素比（Ｃ：Ｎ）（例えば、４０：１〜１：約０、特に１：１〜１：約０）、および周囲温度で、株ＯＮＣ−Ｔ１８は、勢いよく成長し、主に遊走子の産生を介して増殖し、結果的に、比較的小さく、かつ少ない細胞内油体を含有する多数の小さい栄養細胞をもたらしたことが見出された。対照的に、高Ｃ：Ｎ比、低酸素濃度、および比較的低い温度（例えば、１０〜３０℃、特に２０〜２５℃）で、株ＯＮＣ−Ｔ１８は、主に直接栄養細胞分裂を介して増殖し、結果的に、著しく大量の細胞内油体を含有する多数の巨細胞をもたらした。したがって、２段階発酵方法を、バイオマス、総脂質、およびＰＵＦＡ産生性を最大化するために開発した。これは、高脂質およびＰＵＦＡスラウストキトリド株を成長させ、かつそれをスクリーニングするための最適な方法の１つである。以下の３つのアッセイを行った。
【０２５９】
アッセイＩ：野生型株ＯＮＣ−Ｔ１８を１０ｍＬの液体ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地に接種した。培養物を、２５０ｒｐｍに設定した振盪インキュベーター内で、２５℃で２日間成長させた。その後、接種材料（ＯＤ６６０＝１２）を、２５０ｍＬのフラスコ内の１００ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地に接種した。３つの培養物を株毎に接種した。培養物を、２５０ｒｐｍおよび２５℃に設定した振盪インキュベーター内で２日間成長させ、その後、１５０ｒｐｍおよび２０℃に切り替えて、さらに４日間成長させた。細胞培養物を５０ｍＬのファルコン管に移して培養物のバイオマスを収集し、ＳＯＲＶＡＬＬ  ＬＥＧＥＮＤ  ＲＴ＋遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて４０００ｒｐｍで遠心分離した。バイオマスは、圧縮層として液体培地の表面上に浮かんだ。液体培地を、１８Ｇ  １  １／２の注射針を用いてファルコン管の底部に非常に小さい穴を穿孔することによって放出した。管内のバイオマスのペレットを、−８０℃の冷凍庫で一晩凍結させ、その後、凍結乾燥機を用いて３日間凍結乾燥させた。それぞれの試料のバイオマスを秤量した。
【０２６０】
アッセイＩＩ：接種材料をアッセイＩに記載されるように調製した。次に、接種材料（ＯＤ６６０＝６）を、２５０ｍＬのフラスコ内の５０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地に接種した。３つの培養物を株毎に接種した。培養物を、２５０ｒｐｍおよび２５℃に設定した振盪インキュベーター内で２日間成長させ、その後、１５０ｒｐｍおよび２０℃に切り替えた。接種後２日目に、５ｍＬのオートクレーブした５０％グルコースをそれぞれの培養フラスコに添加し、その後、接種後４日目に、６ｍＬのグルコースを添加した。接種の６日後、培養物のバイオマスをアッセイＩに記載されるように収集した。
【０２６１】
アッセイＩＩＩ：接種材料をアッセイＩに記載されるように調製した。その後、接種材料（ＯＤ６６０＝６）を、２５０ｍＬのバッフルフラスコ内の５０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地に接種した。培養物を、２５０ｒｐｍおよび２５℃に設定した振盪インキュベーター内で成長させた。接種後２日目および４日目に、５ｍＬおよび６ｍＬのオートクレーブした５０％グルコースを、それぞれ、アッセイＩＩＩで行ったようにそれぞれの培養フラスコに添加した。接種後６日目に、培養物のバイオマスをアッセイＩＩに記載されるように収集した。
【０２６２】
それぞれの試料の総脂質およびＤＨＡ含有量を、直接エステル交換法を用いて分析した。約２０ｍｇの凍結乾燥した細胞バイオマスおよび３ｍＬのエステル交換反応緩衝液（メタノール：塩酸：クロロホルム）を、１０秒間ボルテックスして混合し、その後、９０℃の水浴中で２時間インキュベートした。エステル交換完了後、試料を除去し、周囲温度になるまで冷却した。１ｍＬの水を添加し、１０秒間ボルテックスして混合した。その後、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、３×２ｍＬのヘキサン：クロロホルム（ｖ／ｖ、４：１）の溶媒を添加し、かつ１０秒間ボルテックスすることによって抽出し、相分離が完了するまで静置させた。
【０２６３】
ＦＡＭＥのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を、２つの内部標準物（２００μＬ）を用いて実行した。一方のヘキサコサン酸（Ｃ２３：０）をエステル交換前に添加し、もう一方のノナデカン酸（Ｃ１９：０）を分析直前に添加した。分析を、内径３０ｍ×０．３２ｍｍ（フィルム厚０．２５μｍ）のＯＭＥＧＡＷＡＸ３２０融合シリカキャピラリーカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および２５０℃に設定した炎イオン化検出器を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）内で行い、２７５℃のＦＩＤ検出器に対する分割比は、５０：１であった。注入量は、１μＬであった。キャリヤガスは、Ｈ２であり、１分間当たり５．０ｍＬの一定流量を有した。ＦＡＭＥ同一性の確認を、Ｔｒａｃｅ  ＧＣ−ＤＳＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）および実験室基準の保持時間の比較を用いて実行した。
【０２６４】
結果（表５）は、アッセイＩＩで使用した発酵条件が、ＯＮＣ−Ｔ１８における高い脂質およびＤＨＡ産生に最善であり、約５０〜約７０％の乾燥バイオマスが観察され、これらの所見に基づいて、約７０％〜約９０％ものレベルを予想することができることを示した。観察されたＤＨＡ収量は、約５〜約７．５ｇ／Ｌの培養物であった。これらの所見に基づいて、約４５〜約９５ｇ／ＬものＤＨＡ収量を予想することができる。
【０２６５】
例えば、アッセイＩＩＩにおいてバッフルフラスコおよび高速振盪を用いて溶解酸素を増加させることによって、バイオマス生産性を著しく高めることができるが、ＤＨＡ生産性は、アッセイＩＩのＤＨＡ生産性よりも著しく低かった。したがって、Ｃ：Ｎ比、グルコース濃度、溶解酸素、および温度等の発酵パラメータ最適化、ならびに発酵プロセス中のこれらのパラメータの動態は、スラウストキトリド株中の脂質およびＰＵＦＡの費用効果的な産生に影響を与える。任意の特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者は、アッセイＩと比較してアッセイＩＩにおいて観察された収量の増加が、少なくともある程度、アッセイＩＩにおけるより高いグルコース濃度および／またはより低いレベルの溶解酸素に起因し得ることを提唱する。
【０２６６】
【表５】
2014507952.tif 000007
【実施例１５】
【０２６７】
変異誘発剤の適用
この実施例は、スラウストキトリドの株改良のための変異誘発剤、ゼオシンの適用を説明する。
【０２６８】
コロニーセクター由来の接種材料を新たな新鮮なプレートに移し、新たな株に成長させた。４つの新たな株、１ａ、１ｂ、３ａ、および３ｂを、さらなる研究のために選択した（結果は表２に示される）。これらの４つの株およびそれらの野生型親株ＯＮＣ−Ｔ１８を、ＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０の１０ｍＬの液体培地に接種した。培養物を、ＯＤ６６０が２を超えるまで、２５０ｒｐｍに設定した振盪インキュベーター内で２５℃で３日間成長させた。その後、野生型株を含むそれぞれの株の接種材料（ＯＤ６６０＝６）を、２５０ｍＬのフラスコ内の５０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地にそれぞれ接種した。使用した以下の実験条件および手順は、実施例１４のアッセイＩＩと同一であった。
【０２６９】
【表６】
2014507952.tif 000008
【０２７０】
実験結果は、４つの選択された株のうち３つが、それらの野生型親株と比較して、著しく低いバイオマス、総脂質、およびＤＨＡを産生したことを示した（表６）。しかしながら、株３ａは、その野生型株よりも多くのバイオマス、脂質、およびＤＨＡを産生した。株３ａのＤＨＡ生産性の高さは、そのバイオマス生産性の高さだけでなく、ＤＨＡ：バイオマス比の高さにも起因する。この結果は、見出された変異誘発剤を用いて、微生物株の適応度（例えば、廃液流、グリセロール、デンプン、セルロース、およびヘミセルロース等のより安い炭素源を使用する能力等）、生成物の質および量、例えば、ＰＵＦＡのＡＲＡ、ＤＨＡ、および／またはＥＰＡ生産性、ならびにバイオ燃料適用に好ましい脂肪酸および／または脂質プロフィールを改善することができることを示した。
【０２７１】
産生した物質を、様々な手段のうちのいずれかを用いて、産生株および／または培地構成成分から分離することができる。いくつかの実施形態において、産生した物質の抽出は、例えば、脂肪酸の分泌を変化させ、かつ／または細胞壁を弱体化させる１つ以上のステップを行うことによって促進される。
【実施例１６】
【０２７２】
スラウストキトリウム種の新規の株
この実施例は、脂質およびＤＨＡの高レベルの生産性を有するスラウストキトリウム種の新規の株の発見を説明する。
【０２７３】
ＯＮＣ−Ｔ１８の単一細胞をＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地および５０μｇ／ｍＬのゼオシンを含有する寒天プレート上に広げた。接種の１０〜１５日後、コロニーを視覚的にスクリーニングした。可視的な形態変化を有しない大きなコロニーをランダムに単離し、新たな株に成長させた。新たな株のバイオマス、総脂質、およびＤＨＡ生産性を比較した。１つの株ＯＮＣ−Ｔ１８／３５／Ｚ５０が、著しく多くのバイオマス、総脂質、およびＤＨＡを産生することができることが最初に見出され、実施例１４のアッセイＩＩに記載の最適化発酵条件、方法、および手順を用いて繰り返し確認された。３５ｇ／Ｌの海塩を含有するＯＮＣ−Ｔ１８−ＧＭ０培地を用いた２段階発酵アッセイにおいて、新たな株ＯＮＣ−Ｔ１８／３５／Ｚ５０は、その親株ＯＮＣ−Ｔ１８よりも５％多くのバイオマス、７％多くの総脂質、および１４％多くのＤＨＡを産生した。同一であるが、１８ｇ／Ｌの海塩を含有する培地を用いて、新たな株ＯＮＣ−Ｔ１８／３５／Ｚ５０は、その親株ＯＮＣ−Ｔ１８よりも約１０％多くのバイオマス、２０％多くの総脂質、および３６％多くのＤＨＡを産生した（図１９）。さらに、バイオマスに対するＤＨＡおよび総脂質の比率は、高レベルのＤＨＡを産生する新たな株ＯＮＣ−Ｔ１８／３５／Ｚ５０において、その親株よりも高く、この新たな株が、グルコース等の炭素源を脂質およびＤＨＡに変換するより強い能力を有することを実証する。この新規の株は、微細藻類由来のＤＨＡ等の生体脂質およびＰＵＦＡ産生物の収量の改良のみならず、その発酵および下流処理費用の減少においても有用である。
参考文献
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等価物
【０２７４】
当業者であれば、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の等価物を認識するか、または解明することができる。本発明の範囲は、上述の説明を制限するようには意図されていない。代替方法および物質ならびにさらなる適用は、当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲内に包含されるよう意図されている。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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