(57)【要約】  本発明は、膜結合ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）またはビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。本発明はまた、目的のタンパク質を分泌する高産生細胞の選択方法に関する。
2014507121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）そのＣ末端で（ｂ）に連結されたシグナルペプチドをコードする第１の核酸配列
（ｂ）そのＣ末端で（ｃ）に連結された、ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）またはビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）をコードする第２の核酸配列
（ｃ）細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第３の核酸配列
を含む核酸分子。
【請求項２】
第１および第２の核酸配列および／または第２および第３の核酸配列が、リンカーペプチドをコードする核酸配列により連結されている請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチが、配列番号９のＣＤ５９ａである請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチが、ＣＤ４８−ＧＰＩに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチドである請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項５】
細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチが、膜貫通ペプチドに連結された配列番号１の合成キャリアペプチドである請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項６】
膜貫通ペプチドが配列番号２のＩＧＦ−１Ｒ−ＴＭである請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
シグナルペプチドが、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチドまたはＣＤ５９のシグナルペプチドである請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチが、選択耐性を付与するポリペプチドにそのＣ末端で連結される請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項９】
選択耐性を付与するポリペプチドが、抗生物質加水分解酵素、抗生物質捕捉タンパク質、代謝酵素および抗生物質修飾酵素からなる群より選択される請求項８記載の核酸分子。
【請求項１０】
細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチが、リンカーペプチドを介して選択耐性を付与するポリペプチドに連結している請求項８記載の核酸分子。
【請求項１１】
抗生物質加水分解酵素が、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）などのピューロマイシン加水分解酵素、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼなどのアミノグリコシド加水分解酵素からなる群より選択され、抗生物質捕捉タンパク質がＳｈ  ｂｌｅ遺伝子産物であり、抗生物質修飾酵素がハイグロマイシンキナーゼである請求項９記載の核酸分子。
【請求項１２】
リンカーペプチドが、イソロイシンおよびプロリンのアミノ酸配列からなる、または配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項２記載の核酸分子。
【請求項１３】
核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターに作動可能に連結され、かつ任意にはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列の上流に作動可能に連結されている請求項１記載の核酸分子。
【請求項１４】
プロモーターがｈＣＭＶである請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１５】
第２の核酸配列がＢＭＰをコードする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ＢＭＰが配列番号５のアミノ酸配列を含む請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１７】
核酸分子がさらに、配列番号２のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチド、および配列番号７のアミノ酸配列のＰＡＣをコードする核酸配列を含む請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１８】
配列番号８の核酸配列を含む請求項１７記載の核酸分子。
【請求項１９】
核酸分子がさらに、配列番号９のアミノ酸配列のマウスＣＤ５９ａ、および配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む請求項１５記載の核酸分子。
【請求項２０】
核酸配列が配列番号１０のものである請求項１８記載の核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子がさらに、配列番号２のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む請求項１４記載の核酸分子。
【請求項２２】
核酸分子が配列番号１１のものである請求項２０記載の核酸分子。
【請求項２３】
核酸分子がさらに、配列番号３のアミノ酸配列のＣＤ４８−ＧＰＩアンカーペプチドに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む請求項１４記載の核酸分子。
【請求項２４】
核酸配列が配列番号１２のものである請求項２２記載の核酸分子。
【請求項２５】
さらにＰＯＩコード核酸配列を含む請求項１記載の核酸分子。
【請求項２６】
ＰＯＩコード核酸配列が、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列の上流に作動可能に連結されているか、または核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターの下流に作動可能に連結されているか、またはその両方である請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２７】
ＰＯＩコード核酸配列が、シグナルポリペプチドをコードするＰＯＩコード核酸配列である請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２８】
ＰＯＩコード核酸配列が、ＰＯＩの異なるサブユニットをコードする２つのＰＯＩコード核酸配列を含む請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２９】
サブユニットが、抗体の軽鎖および重鎖である請求項２８記載の核酸分子。
【請求項３０】
目的のタンパク質が、そのアミノ末端でシグナルペプチドに、任意にはリンカーペプチドを介して、連結されている請求項２５記載の核酸分子。
【請求項３１】
ＰＯＩが、Ｆｃ−融合産物、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、シアロムチン、核タンパク質、調節タンパク質および毒素、またはそれらの機能的画分からなる群より選択される請求項２６記載の核酸分子。
【請求項３２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
細胞表面にＢＭＰを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるＢＭＰ提示のレベルが分泌されたＰＯＩの量と相関し、
（ｄ）第２の核酸配列がＢＭＰをコードし、第２のベクターがＰＯＩコード核酸配列を含む請求項３２記載のベクターで細胞をトランスフェクトするか、
または第２の核酸配列がＢＭＰをコードする請求項２５記載の核酸分子を含むベクターで細胞をトランスフェクトし、
それによりＢＭＰトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程；
（ｅ）ＢＭＰトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程；および
（ｆ）検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程
を含む方法。
【請求項３４】
細胞表面にビオチンを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるビオチン提示のレベルが分泌されたＰＯＩの量と相関し、
（ａ）第２の核酸配列がＢＡＰをコードし、第２のベクターがＰＯＩコード核酸配列を含む請求項３２記載のベクターで細胞をトランスフェクトするか、
または第２の核酸配列がＢＡＰをコードする請求項２５記載の核酸分子を含むベクターで細胞をトランスフェクトし、
それによりＢＡＰトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程；
（ｂ）ＢｉｒＡおよびビオチンを追加する工程；
（ｃ）ＢＡＰトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程；および
（ｄ）検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程
を含む方法。
【請求項３５】
さらに、単離された細胞を増殖させ、かつ（ｂ）〜（ｄ）工程を繰り返す請求項３３または３４記載の方法。
【請求項３６】
さらに、検出可能なビオチン結合部分で標識化された単一細胞を単離し、かつその細胞を増殖させてクローンを形成することを含む請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
さらに、分泌された目的のタンパク質を検出および定量し、それにより目的のタンパク質を分泌する真核細胞を選択することを含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞がＢＭＰをその細胞表面に提示する請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が哺乳類、植物、昆虫および酵母細胞から選択される真核細胞である請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳類の細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーマウス骨肉腫ＮＳ０細胞、ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト網膜細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣＳ細胞およびＰｅｒ．Ｃ６細胞から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
細胞が、蛍光アビジンおよび蛍光ストレプトアビジンからなる群より選択される検出可能なビオチン結合部分に接触させることによって標識化される請求項３３または３４記載の方法。
【請求項４２】
標識化された細胞が、ＦＡＣＳまたは電磁ビーズの手段により同定および単離される請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
選択された真核細胞が、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりも、より高い量のＢＭＰをその表面に提示し、かつより多い量の目的のタンパク質を分泌する請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
選択された真核細胞の表面上のＢＭＰの量および選択された真核細胞により分泌される目的のタンパク質の量が、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５倍大きく、最高３０倍まで大きい請求項４３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜結合ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）またはビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。本発明はまた、目的のタンパク質を分泌する高産生細胞の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の製造のための産生細胞の開発における主な課題の１つは、クローン開発の過程で作製された、種々の生産性レベルを有する非常に多くの細胞集団の中にある高産生細胞の選択である。高産生細胞の選択は、通常、集中力と時間のかかるものである。手動でスクリーニングできる細胞の数は限られ、そのため必要な生産性レベルのクローンを単離する確率も限定される。
【０００３】
高産生細胞のスクリーニングには伝統的な方法が用いられている。普及している手動単一細胞クローニング技術の１つが、「限界希釈法」の手法である。手作業ピッキングやこの手法によるクローンの選択は、面倒で、労働集約的であり、また時間のかかる仕事である。ロボットシステムにより行われたとしてもスクリーニングできるクローンの数は限られている［１〜３］。また、統計的分析は、許容されるレベルにクローンを確保するためにクローニングサイクルの繰り返しが要求されることを示している［４、５］。したがって、細胞株選択とクローニングのより効率的な方法が必要とされている。
【０００４】
フローサイトメトリー［６］は、蛍光レポーターで標識された細胞の選択に用いられている。あるフローサイトメトリー機器では、数秒以内に何千もの細胞をソーティングすることができ、全体の集団中において非常に低頻度（１０-6程低い）の希少な細胞を選択することができる［７］。フローサイトメトリーのもう１つの利点は、いくつかの機器における、マイクロタイタープレートの個別のウェルに単一細胞を播く（細胞のクローンを作製する）その能力である［６、８］。
【０００５】
しかしながら、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングには蛍光シグナルが必要である。目的のタンパク質生成物はほとんどの場合蛍光を発しないので、蛍光性のレポーター遺伝子産物であって、その発現が目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現に緊密にリンクされている蛍光性のレポーター遺伝子産物が必要である。
【０００６】
レポーター遺伝子産物は、細胞質で発現するかもしれないし、または細胞表面に指向することもできる［８、９］。
【０００７】
レポーター遺伝子は、ＧＦＰのように自然に蛍光を発するものでもよい［１０］。あるいは、レポーター遺伝子は、蛍光メトトレキサート（Ｆ−ＭＴＸ）［１１］などの細胞に浸透する蛍光マーカーで特に染色することもでき、また細胞表面でそれに結合する蛍光マーカーで染色することもできる［８、９］。
【０００８】
細胞培養において産生された抗体について興味深いケースが報告されている。分泌された抗体自身がレポーターとして使用でき、ハイブリドーマ細胞［１２、１３］およびＣＨＯ細胞［１４］の膜上で検出できることが観察されている。蛍光標識された抗−抗体での染色が、細胞表面上の抗体を検出するために使用された。
【０００９】
特定の所望の細胞の単離のための、さらなる既知の方法に、電磁ビーズに基づくものがある。細胞表面上の標的タンパク質に特異的に結合するタンパク質で被覆した電磁ビーズが既に報告されている［９］。
【００１０】
分泌されたＰＯＩの直接検出に基づく他の方法も発表された。これらの方法には、ゲルマイクロドロップ技術［１５〜１７］やマトリックスベースの分泌アッセイ［１８、１９］などがある。
【００１１】
さらに、細胞選択のための自動化されたシステムも存在し、所望でない細胞を破壊するレーザー対応解析処理（ＬＥＡＰ）［２０、２１］および、ジェネティクス（Genetix）社のＣｌｏｎｅＰｉｘやアビソ（Aviso）社のＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ（商標）などの分泌レベルに応じて高産生細胞を直接選択する自動コロニーピッカーなどがある。
【００１２】
それぞれの方法についての様々な賛否両論に加えて、スクリーニングできる細胞数に関するそれらの能力は限られており、たとえば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により得られるものよりも有意に低い。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）発現をビオチン模倣ペプチドまたはビオチンアクセプタペプチドで標識された細胞表面膜タンパク質／ペプチドマーカーの発現に結び付けることを含む。蛍光標識されたビオチン結合タンパク質による染色に続き、細胞を以下に述べるように適切な技術によってソートする。
【００１４】
本発明は、１つの態様において、
（ａ）そのＣ末端で（ｂ）に連結される、シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列
（ｂ）そのＣ末端で（ｃ）に連結される、ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）またはビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）をコードする第２の核酸配列
（ｃ）細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第３の核酸配列
を含む核酸分子に関する。
【００１５】
関連する態様で、本発明は、前記で定義された核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記核酸分子によりコードされるタンパク質に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、細胞表面にＢＭＰを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるＢＭＰ提示のレベルが分泌されたＰＯＩの量と相関し、
（ａ）ｉ．前述の第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸分子およびＰＯＩコード核酸配列を含む第２の核酸分子；または
ii．同じベクター上に両方の核酸分子を含む核酸分子
のいずれかを含むベクターで細胞をトランスフェクトし、それによりＢＭＰトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程；
（ｂ）ＢＭＰトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程；および
（ｃ）検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程
を含む方法に関する。
【００１８】
別の態様においては、ＢＡＰがＢＭＰの代りに用いられる。この場合、ＢｉｒＡおよびビオチンが、細胞の標識化の前に加えられる必要がある。
【００１９】
上記システムの改良は、ＢＭＰレポーターを固定させるポリペプチドストレッチに選択耐性を付与するポリペプチドを融合することにより得られる。トランスフェクション後に選択圧をかけることは、耐性遺伝子を発現するトランスフェクト細胞を選択することとなる。選択耐性遺伝子は、ＢＭＰレポーター遺伝子と融合されるので、そのような選択の適用は、ソーティングがなされる前の初期段階での高ＢＭＰ発現細胞に有効であり、集団における最も高いＰＯＩ産生細胞の選択についても同様に有効である場合がある。
【００２０】
したがって、特定の実施態様において、ＢＭＰまたはＢＡＰを細胞膜に固定させるポリペプチドストレッチは、そのカルボキシ末端で選択耐性を付与するポリペプチドに連結される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＦＡＣＳクローン開発のための新規なレポーター遺伝子を含むベクターを示す。ベクターは、ＦＡＣＳ技術による新規なレポーター遺伝子の評価のために構築された。ＢＭＰ  −ビオチン模倣ペプチド；ＳＰ  −シグナルペプチド；ＴＭ  −膜貫通ドメイン；ＰＡＣ  −ピューロマイシン耐性遺伝子；Ｃ  −ペプチドキャリアモチーフ；ＣＤ４８−グリコシルホスファチジルイノシトール  −ＣＤ４８由来のＧＰＩ配列；ｈＧＨ  −ヒト成長ホルモン；ｍＣＤ５９ａ  −マウスＣＤ５９ａ由来のＧＰＩ配列；ｈＣＭＶ  −ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーター；ＳＶ４０  −シミアン空胞化ウイルス４０プロモーター；ＩＧＦ−１Ｒ  −インスリン様成長因子−１受容体；ＥＭＣＶ  −脳心筋炎ウイルス；ＩＲＥＳ  −内部リボソーム侵入部位；ＣＤ１６４−Ｆｃ  −ｓＣＤ１６４のＦｃ融合；ＧＣＳＦ  −顆粒球コロニー刺激因子；ＩＬ６  −インターロイキン６。
【図２】細胞表面上のレポーター分子の構造を示す。細胞表面上の膜固定キャリアに融合されたビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ、パネルＡ）およびビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ、パネルＢ）の説明図。膜への固定は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介して、または膜貫通ペプチド（ＴＭ）により得られる。ＢＭＰは、蛍光ストレプトアビジン（Ｆ−ＳＡ）により直接染色されている。ＢＡＰは、まず、ビオチンタンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ）によりビオチン化され、ついでＦ−ＳＡにより染色されている。Ｃは、ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）とピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）融合タンパク質（ＢＭＰ−ＰＡＣ）を示す。膜への固定は、膜貫通ペプチド（ＴＭ）により得られている。ＰＡＣは、ピューロマイシン選択のために用いられ、ＢＭＰは、ＦＡＣＳ選択および解析のために蛍光ストレプトアビジン（Ｆ−ＳＡ）で直接染色されている。
【図３】ＢＭＰ−ＰＡＣレポーター遺伝子（Ｂ）を含むＢＭＰ−ＰＡＣ発現ベクター（Ａ）の説明図である。ベクターは、ＦＡＣＳ技術によるＢＭＰ−ＰＡＣレポーター遺伝子の評価のために構築された。ｍＣＤ５９ａＳＰ  −マウスＣＤ５９ａ由来のシグナルペプチド；ＢＭＰ  −ビオチン模倣ペプチド；合成キャリア  −６０アミノ酸のキャリアペプチド；ＩＧＦ１−Ｒ−ＴＭドメイン  −ＩＧＦ１受容体由来の膜貫通ドメイン；ＰＡＣ  −ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ；ｍＡｂ  −モノクローナル抗体；ＬＣ  −軽鎖；ＨＣ  −重鎖；ｍＣＭＶｐｒ  −マウス即時型ＣＭＶ初期遺伝子プロモーター。
【図４】ＦＡＣＳによる、蛍光ストレプトアビジン（Ｆ−ＳＡ）を有する細胞表面上のＢＡＰの検出を示す。ＣＨＯ−Ｓ細胞、非トランスフェクトおよび非染色（───、ＭＦＩ−６６）。ＣＨＯ−Ｓ細胞、非トランスフェクト、ＢｉｒＡとインキュベート、およびＦ−ＳＡで染色（・・・、ＭＦＩ−６９）。ＢＡＰ−ＣＤ５９ａレポーター遺伝子を発現するプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ、ＢｉｒＡでインキュベートせず、およびＦ−ＳＡで染色（−−−、ＭＦＩ−１３９）。ＢＡＰ−ＣＤ５９ａレポーター遺伝子を発現するプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ、ＢｉｒＡでインキュベート、およびＦ−ＳＡで染色（−・−、ＭＦＩ−２４３６４）。
【図５】ＦＡＣＳによるＦ−ＳＡを有する細胞表面上のＢＭＰの検出を示す。ＣＨＯ−Ｓ細胞、非トランスフェクト（・・・、ＭＦＩ−２７）またはｈＣＭＶプロモーターの下流に直接ＢＭＰ−ＣＤ５９ａを含むプラスミドでトランスフェクト（−・−、ＭＦＩ−１０５１６）およびＦ−ＳＡで染色（Ａ）。ＣＨＯ−Ｓ細胞、非トランスフェクトおよび非染色（───、ＭＦＩ−６６）、非トランスフェクトおよびＦ−ＳＡで染色（・・・、ＭＦＩ−３６）、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流にＢＭＰ−ＣＤ５９ａを含むプラスミドでトランスフェクトおよび非染色（−−−、ＭＦＩ−６３）もしくはＦ−ＳＡで染色（−・−、ＭＦＩ−１５８３）のいずれか（Ｂ）。
【図６】ＢＭＰ−ＣＤ５９／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ｓＣＤ１６４−Ｆｃ（ＰＯＩ）およびＢＭＰ−ＣＤ５９ａ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）、ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−１０２）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−１７３４、ＰＣＤ−１．５９）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−８８０４、ＰＣＤ−４．６０）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−１６６９１、ＰＣＤ−５．７９）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−１８９９５、ＰＣＤ−７．３４）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度；ＰＣＤ（比生産性）：ピコグラム／細胞／日；ＥＭＣＶ：脳心筋炎ウイルス；ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位；ＣＤ１６４−Ｆｃ、Ｆｃ領域に融合したＣＤ１６４。
【図７】ＢＭＰ−ＣＤ５９／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＧＣＳＦ（ＰＯＩ）およびＢＭＰ−ＣＤ５９ａ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰラベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）。ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−１０４）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−１０４０６、ＰＣＤ−３．８３）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−１６６６１、ＰＣＤ−６．０３）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−１６９８３、ＰＣＤ−６．６７）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−１７６７６、ＰＣＤ−６．６３）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。ＧＣＳＦ  −顆粒球コロニー刺激因子（目的の遺伝子）。
【図８】ＢＭＰ−ＣＤ５９／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＩＬ−６（ＰＯＩ）遺伝子およびＢＭＰ−ＣＤ５９ａ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）。ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−３３）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−２４６、ＰＣＤ−０．４）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−１４７３、ＰＣＤ−１．２）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−２８１２、ＰＣＤ−１．７）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−３６４２、ＰＣＤ−１．８）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。ＩＬ−６−インターロイキン−６（目的の遺伝子）。
【図９】ＢＭＰ−Ｐ−ＧＰＩ／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＣＤ１６４−Ｆｃ（ＰＯＩ）およびＢＭＰ−ペプチドキャリア（Ｃ）−ＧＰＩ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）。ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−３３）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−７７３、ＰＣＤ−０．８）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−９７４８、ＰＣＤ−５．７）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−１５４９２、ＰＣＤ−９．５）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−２０９０８、ＰＣＤ−１０．８）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。
【図１０】ＢＭＰ−Ｐ−ＧＰＩ／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＧＣＳＦ（ＰＯＩ）およびＢＭＰ−ペプチドキャリア（Ｃ）−ＧＰＩ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）。ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−１１３）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−２３２６、ＰＣＤ−３．０）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−７８６６、ＰＣＤ−７．１）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−１７４９７、ＰＣＤ−９．２）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−２８６７９、ＰＣＤ−１３．０）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。
【図１１】ＢＭＰ−Ｐ−ＩＧＦ−ＩＲ−ＴＭ／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＣＤ１６４−Ｆｃ（ＰＯＩ）およびＢＭＰ−ペプチドキャリア（Ｃ）−ＴＭ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）。ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−３３）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−６８０、ＰＣＤ−１．１）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−４７１９、ＰＣＤ−７．０）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−７５２２、ＰＣＤ−９．９）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−９１１３、ＰＣＤ−１２．０）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。ＴＭ−膜貫通ペプチド。
【図１２】ＢＭＰ−Ｐ−ＩＧＦ−ＩＲ−ＴＭ／Ｆ−ＳＡシステムによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＧＣＳＦ（ＰＯＩ）およびＢＭＰ−ペプチドキャリア（Ｃ）−ＴＭ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクター（Ａ）でトランスフェクトした安定細胞は、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた（Ｂ）。ラベルされておらずかつソートもされていない（───、ＭＦＩ−１１３）、ソーティングの前にラベルされた（・・・、ＭＦＩ−４４４９、ＰＣＤ−３．１）、１回目のソートの後にラベルされた（−−−、ＭＦＩ−１５７６４、ＰＣＤ−７．１）、２回目のソートの後にラベルされた（−・−、ＭＦＩ−２６２８９、ＰＣＤ−８．５）、および３回目のソートの後にラベルされた（−‥−、ＭＦＩ−１７３６７、ＰＣＤ−１２．０）。蛍光と生産性の相関は（Ｃ）に示す。ＴＭ−膜貫通ペプチド。
【図１３】ＢＭＰ−ＰＡＣ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）および抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂ（ＰＯＩ）を含むプラスミドでトランスフェクトされたプールの生産性を示す。ＰｒｏＣＨＯ５においてＢＭＰ−ＰＡＣおよび抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂを含むベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞は、２０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび２５μＭ  ＭＳＸで選択された。サンプルを生産性測定のために採取した。
【図１４】ＢＭＰ−ＰＡＣによるＣＨＯ−Ｓ産生細胞ソーティングを示す。ＰｒｏＣＨＯ５において抗−ＩＬ２２ＲＡ（ＰＯＩ）ｍＡｂおよびＢＭＰ−ＰＡＣ（ＦＡＣＳソーティング用のレポーター遺伝子）を含むベクターでトランスフェクトした安定細胞（３反復実験（replicates））は、２０μｇ／ｍｌピューロマイシンと２５ｍＭ  ＭＳＸで選択され、統一プールに一緒にされた。統一プールは、Ｆ−ＳＡによって示されるそれらのＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートされた。ラベルされておらずかつソートもされていないプール（───、ＭＦＩ−６７）、ソーティングの前にラベルされたプール（・・・、ＭＦＩ−４４４９、ＰＣＤ−３．１）、１回目のソートの後にラベルされたプール（−−−、ＭＦＩ−１５７６４、ＰＣＤ−７．１）、２回目のソートの後にラベルされたプール（−・−、ＭＦＩ−２６２８９、ＰＣＤ−８．５）、および３回目のソートの後にラベルされたプール（−‥−、ＭＦＩ−１７３６７、ＰＣＤ−１２．０）。
【図１５】ＰｒｏＣＨＯ５含有培地においてＢＭＰ−ＰＡＣ含有ベクターでトランスフェクトされたクローンにおいて得られる力価を示す。９６ウェルプレートにクローニングした後の抗−ＩＬ２２ＲＡ  ＭＡｂ（ＰＯＩ）の累積力価。クローニングは、８０％  Ｃ６３６６＋２０％  ＰｒｏＣＨＯ５でなされ、サンプルは、クローニング後１３〜１５日間力価測定のために採取された。
【図１６】ＰｒｏＣＨＯ５培地においてＢＭＰ−ＰＡＣ含有ベクターでトランスフェクトされたクローンの比生産性を示す。細胞を０．５×１０6細胞／ｍｌ（１０×１０6細胞）で、ＥＬＩＳＡによる生産性測定用５０ｍｌチューブのＰｒｏＣＨＯ５培地に播いた。ＰＣＤ−ｐｇ／細胞／日。
【図１７】２５μＭ  ＭＳＸの存在下、ＰｒｏＣＨＯ５培地においてＢＭＰ−ＰＡＣ含有ベクターでトランスフェクトされたクローンの比生産性を示す。細胞を０．５×１０6細胞／ｍｌ（１０×１０6細胞）で、ＥＬＩＳＡによる生産性測定用５０ｍｌチューブの２５μＭ  ＭＳＸ含有ＰｒｏＣＨＯ５培地に播いた。
【図１８】粗細胞培養ＰｒｏＣＨＯ−５培地において候補クローンにより分泌されたｍＡｂの、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットを示す。候補クローンの粗サンプル（ＥＬＩＳＡによるレーンごとに１００ｎｇのｍＡｂ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ビストリス（BisTris））により分離し、ニトロセルロース膜に移した。検出を、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ａ）、およびヤギ抗−ヒトκ軽鎖（Ｂ）でおこなった。ＥＣＬをＨＲＰの基質とした。マーカーの分子量（ｋＤａ）を左に示す。ゲル上でのサンプルの同定はつぎのとおりである。１．ＭＷマーカー；２．抗−ＩＬ２２ＲＡ参照サンプル  ＭＳＢ００１００７４／Ｃ１２；３．クローン２４１８−１１；４．クローン２４１８−１４；５．クローン２４１８−１５；６．クローン２４１８−３９；７．クローン２４１８−４５。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリーによる細胞ソーティングは、蛍光シグナルを必要とする。目的のタンパク質（ＰＯＩ）は、通常蛍光性ではないため、その発現が目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現に関連付けられる蛍光性レポーター遺伝子産物が必要とされる。
【００２３】
標識化細胞表面マーカーのビオチン−ストレプトアビジンシステムは、いくつかの理由、すなわち１）システムが  低いバックグラウンドで多くの細胞種に適用可能である；２）ストレプトアビジンへのビオチンの結合の親和性と特異性が非常に高い；および３）システムが動物成分不含条件に適合するという理由により有益であり、規制当局に個別のファイルが必要とされる抗体の使用が要求されない。
【００２４】
ビオチンはタンパク質やペプチドではなく、特定のＤＮＡ配列によりコードさせることができないので、１）ビオチンをそのストレプトアビジンへの結合能力の点において模倣するペプチド（ＢＭＰ）の利用［２２、２３］、および２）細菌起源由来のＢｉｒＡなどのビオチンタンパク質リガーゼ（ＢＰＬ）により特異的にビオチン化できる［２５、２６］合成ビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）［２４］を、コーディングＤＮＡ［２７〜２９］として細胞中にトランスフェクトするか、酵素混合物［２４、３０、３１］にタンパク質として添加するかのいずれかによる採用、という２つの戦略がとられる。合成ＢＡＰ配列［２４］は、酵素ＢＰＬ［２６］により、長い天然配列［２６］と同様に特異的にビオチン化される。
【００２５】
細胞表面上のＦ−ＳＡによるレポーターの検出を可能にするためには、ＰＯＩのプロセッシングおよび分泌のために細胞により使用されるのと同じ分泌機構により処理された後、レポーターが細胞膜タンパク質に結合し、ＥＲおよびゴルジ系において分泌経路により処理されるように設計された。ＢＭＰおよびＢＡＰは、膜固定配列をもたないため、本発明によれば、相対的に短く、容易に発現でき、通常ＣＨＯ細胞上には発現されない、細胞毒性であると知られておらず、かつ細胞に対する悪影響が知られていない膜結合配列が用いられる。
【００２６】
膜貫通ドメイン配列の予測は、当技術分野において良く知られている。たとえば、ＴＭＨＭＭサーバーｖ．２．０［３２］を用いて実行することができる。またはＧＰＩ修飾部位予測［３３〜３６］を用いることによってＧＰＩ固定配列についても行うことができる。
【００２７】
例示のみの目的で、２つの膜アンカーが選択された。１つは、マウス膜タンパク質ＣＤ５９ａであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を含み、ＣＨＯ細胞において良好に発現すること、およびＦＡＣＳにより検出される［３８］ことが報告されている１２４アミノ酸の小さなタンパク質である［３７］。補体溶解効果から細胞を保護するその生物活性についての文献における追加的な報告［３９］では、細胞毒性のリスクは指摘されていない。ＧＰＩにより細胞膜の外側に固定され［４０］、シグナル伝達プロセスを誘発する可能性のある内部細胞質ドメインは有していない。
【００２８】
さらなる膜固定タンパク質は、６０アミノ酸の合成ペプチド配列およびそのＣ末端に近接した２つの潜在的Ｎ−グルコシル化部位、およびＧＰＩ固定配列または膜貫通（ＴＭ）配列のいずれかにもとづくものである。
【００２９】
前述のように、ある態様においては、本発明は、（ａ）そのＣ末端で（ｂ）に連結されたシグナルペプチドをコードする第１の核酸配列、（ｂ）そのＣ末端で（ｃ）連結された、ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）またはビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）をコードする第２の核酸配列、（ｃ）細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第３の核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００３０】
ある実施態様においては、（ａ）および（ｂ）および／または（ｂ）および（ｃ）の核酸配列は、それぞれペプチドリンカーをコードする核酸配列により連結されている。
【００３１】
別の実施態様においては、細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチは、そのＧＰＩを含むＣＤ５９ａである。
【００３２】
また別の実施態様においては、細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチは、ＣＤ４８−ＧＰＩに直接連結された配列番号１のアミノ酸の合成キャリアペプチドである。
【００３３】
また別の実施態様においては、細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチは、膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号１の合成キャリアペプチドである。
【００３４】
好ましい実施態様においては、膜貫通ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列のＩＧＦ−１Ｒの膜貫通ペプチドである。
【００３５】
前述したように、ＢＭＰまたはＢＡＰは、そのＮ−末端で、任意にはペプチドリンカーを介して、シグナルペプチドに連結される。シグナルペプチドは、レポーターを細胞膜、細胞小器官膜、または細胞の外側に指向させる任意のアミノ酸配列であればよい。その配列は、たとえば文献に教示されているアルゴリズム［４１、４２］を用いて容易に予測可能である。
【００３６】
したがって、ある実施態様においては、ＢＭＰまたはＢＡＰは、そのＮ−末端でリンカーペプチドを介してシグナルペプチドに連結され、シグナルペプチドは、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、毒素またはそれらの機能的画分からなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、目的のタンパク質の、またはヒト成長ホルモンのもしくはＣＤ５９の、天然または内因性のシグナルペプチドであってもよい。
【００３７】
トランスフェクトされた細胞に対する生物学的選択の能力、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現細胞をソートする能力、およびそれにより目的のタンパク質の最も高いレベルの産生細胞を選択する能力は、選択された選択試薬に対する細胞の耐性と、レポーターの発現および目的のタンパク質の発現との間の相関が増加するような方法で、選択耐性を付与するポリペプチドをレポーターに融合させることにより改善することができる。さらに、生物学的選択は、トランスフェクション後でソーティング前の短時間に適用され、そして耐性集団の大部分が選択耐性遺伝子、レポーター遺伝子およびＧＯＩを発現することを確実にする。
【００３８】
したがって、さらなる実施態様においては、細胞膜にＢＭＰを固定させるポリペプチドストレッチは、そのカルボキシ末端で選択耐性を付与するポリペプチドに連結される。このポリペプチドは、抗生物質加水分解酵素、抗生物質捕捉タンパク質、たとえばゼオシンに結合してその活性を阻害するＳｈ  ｂｌｅ遺伝子産物、およびキナーゼなどの抗生物質修飾酵素からなる群より選択される。あるいは、選択は、細胞に存在しないか、または非常に低レベルで存在する代謝酵素の導入と、増殖培地からのこれらの代謝物または代謝物の源の除去とによりなすこともできる。２つの既知の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）［４３］およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）［４４］系である。選択圧力の増加と過剰生産をもたらす増幅は、上述の例では、ＤＨＦＲ系に関してはメトトレキサート［４５］またはＧＳ系についてはメチオニンスルホキシミン［４６］の増殖培地中への添加により得られる。
【００３９】
ある実施態様においては、細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチは、リンカーペプチドを介して抗生物質加水分解酵素に連結される。
【００４０】
もう１つの実施態様においては、抗生物質加水分解酵素は、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）などのピューロマイシン不活性化酵素、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼなどのアミノグリコシド（たとえばジェネティシン）加水分解酵素からなる群より選択され、抗生物質捕捉タンパク質はＳｈ  ｂｌｅ遺伝子産物であり、そして抗生物質修飾酵素はハイグロマイシンキナーゼである。
【００４１】
ＢＭＰまたはＢＡＰと細胞膜にそれらを固定させるポリペプチドストレッチとの連結、ＭＢＰまたはＭＡＰとそれらのシグナル配列との連結およびポリペプチドストレッチと選択耐性を付与するポリペプチドとの連結は、直接的であっても、リンカーペプチドを介したものであってもよい。
【００４２】
好ましい実施態様においては、リンカーペプチドが、イソロイシンおよびプロリンのアミノ酸配列からなる、または配列番号４のアミノ酸配列（（Ｇ4Ｓ）n（Ｇ4）m）（式中、ｎは１、２、３、４または５から選択される整数、特に２または４であり、そしてｍはゼロまたは１から選択される整数である）からなる。
【００４３】
別の実施態様においては、本発明の核酸分子は、ｈＣＭＶなどの核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターに作動可能に連結され、かつ任意にはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列の下流に作動可能に連結されている。
【００４４】
本明細書の以下、実施例において示されるように、いくつかのプラスミドが種々の目的の遺伝子（ＧＯＩｓ）と構築され、ＢＭＰまたはＢＡＰレポーターの遺伝子のいずれかは、膜固定キャリアに融合された。ＧＯＩｓおよびレポーター遺伝子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結された。これらのプラスミドにおいて、ＧＯＩ発現は、強力なヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターにより駆動され、レポーター遺伝子は、ＩＲＥＳの下流に配置される。ＧＯＩ発現は、ｈＣＭＶとは別の任意の強いプロモーター、たとえば、非限定的に、ＩｇＧ抗体の軽鎖および重鎖の発現を駆動するために本明細書の下記で使用されたマウスＣＭＶ  ＩＥ１またはマウスＣＭＶ  ＩＥ２によっても駆動されることができる。この２シストロン性構造は、同じｍＲＮＡ上の両方の遺伝子の転写を決定づける［４７］。
【００４５】
ＢＡＰ配列をビオチニル化するためには、細胞を、細菌性ＢｉｒＡ発現ベクター［２７］で同時トランスフェクトしてトランスフェクト細胞自身によるビオチニル化を得るか［２７〜２９、３１、４８］、または特異的反応バッファーにおけるビオチンとＢｉｒＡとの添加により外部でＢＡＰをビオチニル化するかのいずれかである［３０、４９］。
【００４６】
ＣＨＯ−Ｓ細胞などの真核細胞は、プラスミドでトランスフェクトされ、そして安定なプールが選択された。蛍光ストレプトアビジン（Ｆ−ＳＡ）で検出されたトランスフェクトされた細胞におけるＢＡＰおよびＢＭＰの特異的な発現は、有意なバックグラウンドなしで証明された。さらに、レポーターとしてＢＭＰで、高発現に関するＦＡＣＳによる３回の連続したソートがなされ、ＧＯＩｓの発現レベルにおける有意な改善が得られた。
【００４７】
好ましい実施態様においては、プラスミド、すなわち本発明の核酸分子は、ＢＭＰをコードする核酸配列、特に配列番号５のアミノ酸配列を含むＢＭＰ、および特に配列番号５のＢＭＰをコードする核酸配列を含む。
【００４８】
ある実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号２のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチド、および配列番号７のアミノ酸配列のＰＡＣをコードする核酸配列（プラスミドＭＢ−０９８）を含む。特に、この核酸分子は、配列番号８の核酸配列を含み、これは、そのカルボキシ末端で合成キャリアペプチドに直接連結されたＢＭＰをコードし、この合成キャリアペプチドはそのカルボキシ末端で膜貫通ペプチドに直接連結され、この膜貫通ペプチドは、そのカルボキシ末端でＰＡＣに（Ｇ4Ｓ）4配列を介して連結されており、該ＢＭＰは、マウスＣＤ５９ａシグナルペプチドにイソロイシン−プロリンリンカーペプチドを介してそのアミノ末端で連結されている。
【００４９】
もう１つの実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号９のアミノ酸配列のマウスＣＤ５９ａ、および配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチドを、配列番号５のアミノ酸配列のＢＭＰに加えてコードする核酸配列（プラスミドＭＢ−０７０−ＭＢ−０７２）を含む。特に、この核酸分子は、配列番号１０の核酸配列を含み、これは、そのカルボキシ末端で（Ｇ4Ｓ）2Ｇ4配列（配列番号４）を介してマウスＣＤ５９ａに連結され、そのアミノ末端で同族のＣＤ５９ａシグナルペプチドにイソロイシン−プロリンリンカーペプチドを介して連結されているＢＭＰをコードする。
【００５０】
また別の実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号２のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチドを、配列番号５のアミノ酸配列のＢＭＰに加えて、コードする核酸配列（プラスミドＭＢ−０７３およびＭＢ−０７５）を含む。特に、この核酸分子は、配列番号１１の核酸配列を含み、これは、そのカルボキシ末端で合成キャリアペプチドに直接連結され、この合成キャリアペプチドはそのカルボキシ末端で膜貫通ペプチドに直接連結されているＢＭＰをコードし、該ＢＭＰは、マウスＣＤ５９ａシグナルペプチドにイソロイシン−プロリンリンカーペプチドを介してそのアミノ末端で連結されている。
【００５１】
さらに別の実施態様においては、核酸分子はさらに、（配列番号５のアミノ酸配列のＢＭＰに加えて）配列番号３のアミノ酸配列のＣＤ４８−ＧＰＩアンカーペプチドに直接連結された配列番号１のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列のＣＤ５９ａのシグナルペプチドをコードする核酸配列（プラスミドＭＢ−０７４および０７６）を含む。特に、この核酸分子は、配列番号１２の核酸配列を含み、この核酸配列は、そのカルボキシ末端で合成キャリアペプチドに直接連結されているＢＭＰをコードし、この合成キャリアペプチドはそのカルボキシ末端でＣＤ４８−ＧＰＩアンカーペプチドに直接連結されている。そして該ＢＭＰは、そのアミノ末端でマウスＣＤ５９ａシグナルペプチドにイソロイシン−プロリンリンカーペプチドを介して連結されている。
【００５２】
本発明によれば、レポーター遺伝子産物および目的のタンパク質は、別個のプラスミド上の核酸によってコードされていてもよく、またはそれらが同じプラスミド上の核酸によってコードされていてもよい。
【００５３】
レポーター遺伝子産物およびＰＯＩは、別個のプラスミド上の核酸によりコードされる場合、細胞は、レポーター遺伝子を含むプラスミドおよびＰＯＩをコードする遺伝子を含む第２のプラスミドの両方で同時トランスフェクトされる。
【００５４】
１つのプラスミドが用いられる場合、本発明は、（ａ）シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列；（ｂ）ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）またはビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）をコードする第２の核酸；（ｃ）細胞膜にＢＭＰまたはＢＡＰを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第３の核酸；および（ｄ）ＰＯＩ−コード核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００５５】
ある実施態様においては、ＰＯＩ−コード核酸配列は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列の上流に作動可能に連結されているか、または核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターの下流に作動可能に連結されているか、またはその両方である。
【００５６】
もう１つの実施態様においては、いくつかのＰＯＩ−コード核酸配列が、マルチサブユニットタンパク質のいくつかの異なるサブユニットをコードするように存在してもよい。したがって、たとえば目的のサイトカインが、単一のＰＯＩ−コード核酸配列によりコードされ、一方、ＩｇＧまたはＩｇＭは、２つまたは３つのＰＯＩ−コード核酸配列にそれぞれコードされ得る。
【００５７】
１つの実施態様においては、ＰＯＩ−コード核酸配列は、単一のポリペプチドをコードする１つのＰＯＩ−コード核酸配列であり、一方、別の実施態様においては、ＰＯＩ−コード核酸配列は、抗体の異なるサブユニットをコードする２つの核酸配列を含む。多くの場合、目的のタンパク質は、培地へ分泌され、したがって、その場合、そのアミノ末端で、任意にはリンカーペプチドを介して、シグナルペプチドに連結され得る。
【００５８】
目的のタンパク質は、真核細胞において発現されるものであればいかなるタンパク質であってもよい。非限定的な例として、また単にどのようなタンパク質が目的のタンパク質として考えられるかについて明らかにするために、目的のタンパク質は、Ｆｃ−融合産物、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、シアロムチン、核タンパク質、調節タンパク質および毒素からなる群、またはそれらの機能的画分、すなわちそれ自体が抗体（たとえばＦａｂ）、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、シアロムチンもしくは毒素であるタンパク質の画分より選択される。Ｆｃ−融合産物は、シグナルペプチドとＮ−末端またはＣ末端融合パートナーとしてのイムノグロブリンのＦｃ断片との融合物として発現されるタンパク質であり、上述のように、多種多様なＰＯＩｓの高レベルでの発現および分泌を促進する。Ｆｃドメインは、疎水性タンパク質の溶解性の改善に役立ち、融合タンパク質の容易な検出および精製に関する情報を提供し、そして所望の場合、プロテアーゼによる処理により切断できる。
【００５９】
Ｆｃ−融合産物（ｓＣＤ１６４−Ｆｃ）、抗体（抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂ）、成長ホルモン（顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ））またはサイトカイン（ＩＬ６）などの様々な目的のタンパク質を発現し、これらのタンパク質を高レベルで発現する高産生細胞が、それらの表面上のＢＭＰを高レベルで発現する細胞を選択することにより効率的に単離できることが、本発明により見いだされた。
【００６０】
また別の態様においては、本発明は細胞表面にＢＭＰを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるＢＭＰ提示のレベルが分泌されたＰＯＩの量と相関し、
（ａ）（ｉ）前述の第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸分子およびＰＯＩコード核酸配列を含む第２の核酸分子；または
（ii）上記（ｉ）に規定する両方の核酸分子を含む核酸分子
のいずれかを含むベクターで細胞をトランスフェクトし、それによりＢＭＰトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程；
（ｂ）ＢＭＰトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程；および
（ｃ）検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程
を含む方法を提供する。
【００６１】
いくつかの実施態様においては、それぞれ前記少なくとも１つのＰＯＩ−コード核酸配列が、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列の上流に作動可能に連結され、核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターの下流に作動可能に連結されているか、またはその両方である。
【００６２】
目的のタンパク質の産生に使用される細胞は、哺乳類、植物、昆虫または酵母細胞などの遺伝子操作に適している任意の真核細胞であればよい。哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーマウス骨肉腫ＮＳ０細胞、ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト網膜細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣＳ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞であってよい。植物細胞は、タバコ、ニンジンおよびコメ細胞が使用できる。ある実施態様においては、細胞はＣＨＯ細胞である。
【００６３】
いくつかの実施態様においては、細胞は、蛍光アビジンおよび蛍光ストレプトアビジンからなる群より選択される検出可能なビオチン結合タンパク質または部分に接触させることによって標識化され、標識化された細胞は、その後ＦＡＣＳの手段により同定および単離される。しかしながら、標識化された細胞を同定および単離するためには、任意の方法、例えば非限定的に、ビオチン結合部分で被覆されたビーズを用いる方法などが使用できる。
【００６４】
本発明の方法は、細胞の表面上に発現されたリポーター遺伝子産物の量と、発現および分泌された目的のタンパク質の量との間の高い相関を提供し、したがって、高レベルのレポーター遺伝子産物を提示する細胞を単離することにより高産生細胞の選択を可能とする。特に、選択された真核細胞は、より高い量のＢＭＰをそれらの表面に提示し、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりもより多くの量の目的のタンパク質を分泌する。いくつかの実施態様においては、選択された真核細胞の表面上のＢＭＰの量および選択された真核細胞により分泌される目的のタンパク質の量は、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりも２倍と３０倍の間の範囲で多く、すなわち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５倍多く、そして３０倍まで多い。
【００６５】
本発明の膜結合レポーター分子は、本明細書中に後述されるように、ＦＡＣＳにより高産生細胞をソーティングするために効率的なものであることが見いだされた。その結果からいくつかの重要な結論が導かれる。ＢＭＰおよびＢＡＰレポータータンパク質は、トランスフェクトされた細胞において特異的に検出できる；標識された非トランスフェクト細胞のバックグラウンド染色は、無視できるものとわかり、それによりこれらのレポーターは、求められる細胞の選択に適している（実施例３）。本発明は、最も高いレベルのレポーター遺伝子を発現する細胞をソートし、それにより最も高いレベルのＰＯＩを産生する細胞を選択する能力を提供する。その方法は、いくつかの膜固定スキャフォールドおよびいくつかのＧＯＩｓで実証された。生産性は、プールステージからソーティングサイクルの３回り後のプールまでで、種々のタンパク質および種々のレポーター構造物で１．７〜１３．５倍（表１参照）増加した。同じレポーター発現レベルによるＦＡＣＳによってなされるクローニング工程を伴う追加のソーティングサイクルは、さらに、選択されたクローンのＰＯＩ生産性レベルを増加させ得る。これらの結果は、システムの有効性を高めるものである。レポーター構造は、蛍光−ストレプトアビジンによる便利な染色を容易にする。これらの実験において使用される蛍光−ストレプトアビジンは、非動物由来起源のものであることが確認されているため、クローン開発プロセスにおいてこの試薬は円滑に使用される。基本的な基盤の重要な開発は、膜結合レポーター分子のＰＡＣ選択遺伝子への融合であり、この構築物は、ＦＡＣＳによる高産生細胞の生物学的選択とソーティングに非常に効率的であることが見いだされた。以下の点を指摘することが重要である。天然ではその酵素は細胞質に局在化しているにもかかわらず、ＰＡＣ選択耐性遺伝子は、膜結合タンパク質として活性であることが見いだされたこと。生産性は、ソーティングサイクルの開始時と比較してプール（〜１１ＰＣＤ）で〜３倍までソーティングサイクルのあいだに増加すること。さらなる増加が、ＰｒｏＣＨＯ５培地（２６ＰＣＤ）では、６倍までの値でクローンにおいて得られた。これらの結果は、レポーターの発現がＰＯＩの発現と緊密に関連付けられていることを示す。
【００６６】
本発明は、ここで以下の非限定的な実施例により説明される。
【実施例】
【００６７】
材料および方法
細胞：ＣＨＯ−Ｓ（ギブコＢＲＬ、カタログ番号１１６１９）細胞  ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-培地粉末、ＳＡＦＣ（バイオサイエンス、カタログ番号Ｃ６６１４）に適応
【００６８】
試薬
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  インビトロジェンＤＮＡポリメラーゼ  カタログ番号１２３４４−０２４
氷酢酸  メルク  カタログ番号Ｋ２８３５１５５６（独国）
アクリルアミドゲル  −ＮｕＰＡＧＥ；１０％トリスゲル、カタログ番号ＮＰ０３０１ＢＯＸ、インビトロジェン（米国）
アガロース  ＩＢＩ  カタログ番号ＩＢ７００４２
アンピシリン  −シグマ  カタログ番号Ａ９５１８
ＥＬＩＳＡ用抗体：捕捉：ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、カタログ番号１０９−００５−０８８  ジャクソンイムノリサーチ（米国）。検出：ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ  ＨＲＰ、カタログ番号１０９−０３６−０９８  ジャクソンイムノリサーチ（米国）。
ウェスタンブロット用抗体：染色：Ａ）ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ、ジャクソン、カタログ番号１０９−０３６−０９８；Ｂ）ヤギ抗−ヒトκ軽鎖、サザンバイオテック、カタログ番号２０６０−０１、続いてロバ抗−ヤギ  ＨＲＰ、ジャクソン、カタログ番号７０５−０１５−１４７。
ブロッティング紙  ＧＢ００２  カタログ番号４２６６７７、シュライヒャー・アンド・シュエル（Schleicher and Schuell）（米国）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂｏｖｏｓｔａｒ、ボボジェン（Bovogen）、カタログ番号ＢＳＡＳ．０１
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、シグマ、カタログ番号Ａ−４５０３
ブロモフェノールブルー、メルク、カタログ番号２１２６１６９
デキストラン硫酸塩（シグマ、カタログ番号Ｄ４９１１）
ＤＨ５αコンピテントバクテリア、ライフ−テクノロジーズ、カタログ番号１８２６３−０１２
ＤＭＳＯ、メルク、カタログ番号Ｋ３１６３０９３１
ＤＮＡラダー：ＤＮＡ用１ｋｂラダー、バイオラボ、カタログ番号３２３２Ｌ
ＤＮＡラダー：ＤＮＡ用１００ｂｐラダー、バイオラボ、カタログ番号３２３１Ｌ
電気泳動サンプルバッファーＬＤＳ、インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０００７、（米国）
エタノール、メルク、カタログ番号００９８３．１０００
ＦＡＣＳ  Ａｃｃｕｄｒｏｐ  Ｂｅａｄｓ、ＢＤ、カタログ番号ＭＡＢ３４５２４９
グルコース、シグマ、カタログ番号Ｇ７０２１
グルタミン、シグマ、カタログ番号Ｇ５９７２
Ｈｉｓｐｅｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ、キアゲン社、独国、カタログ番号１２６６３
ＨＴ  バイオロジカルインダストリー、カタログ番号０３−０８５−１Ｃ
３７％塩酸、メルク、カタログ番号１．００３１４
塩酸、メルク、カタログ番号ＵＮ−１７８９ １．００３１４．２５００
ＬＢ＋アンピシリンプレート−Ｈｙ−Ｌａｂｓ、カタログ番号ＰＤ１７８
細菌生育用ＬＢ培地−Ｈｙ−Ｌａｂｓ、カタログ番号ＢＰ３０２／４００Ｓ
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ試薬、ギブコＢＲＬ、カタログ番号１８３２４−０２０
Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）、シグマ、カタログ番号Ｍ５３７９
発光性基質：ＥＣＬアマシャムキット、カタログ番号ＲＰＮ２１０９
メタノール、メルク、カタログ番号１．０６００９．２５００
Ｍｇｃｌ２−１Ｍ、シグマ、カタログ番号Ｍ１０２８
ＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ランニングバッファー、Ｘ２０、インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０００１
ＮｕＰａｇｅ  トランスファーバッファー、インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０００６−１
ＮｕＰＡＧＥ  Ｔｒｉｓグリシン  ランニングバッファー、Ｘ１０、インビトロジェン、カタログ番号ＬＣ２６７５
フェノールレッド、シグマ、カタログ番号Ｐ０２９０
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８、シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、シグマ、カタログ番号Ｐ−１３７９
事前染色マーカータンパク質標準品、カタログ番号、ＬＣ５９２５、インビトロジェン
プロテアーゼ阻害剤カクテル、シグマ、カタログ番号Ｐ８３４０
純粋ニトロセルロースメンブレン  ＢＡ−８５、シュライヒャー・アンド・シュエル、７８×９０ｍｍ、カタログ番号４０１１８４
ピューロマイシン、インビボジェン、カタログ番号ａｎｔ−ｐｒ−１
参照試料  抗−ＩＬ２２ＲＡ（ＭＳＢ００１００７４／Ｃ１２）を、ＰＢＳ、ｐＨ６．０中のＥＭＤ（ＧＶＡ）５．９ｍｇ／ｍｌから得た。
制限酵素は、ニューイングランドバイオラボから購入した。
Ｒ−フィコエリトリン−共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）、０．２ｍｇ／ｍｌ、バイオレジェンド（BioLegend）、カタログ番号４０５２０３（９．３のＣｏＯおよび９．４のＣｏＡ参照）
スキムミルクパウダー、フルカ、カタログ番号７０１６６
重炭酸ナトリウム、メルク、カタログ番号６３２９
炭酸ナトリウム、メルク、カタログ番号６３９２
リン酸ナトリウム、シグマ、カタログ番号Ｓ−３２６４
ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ゲル染色、インビトロジェン、カタログ番号Ｓ３３１０２、３Ｄｌ／ゲル
ＴＭＢ  Ｓａｖｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１９２８
Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン−ソルビタン  モノラウレート）−シグマ、カタログ番号Ｐ−１３７９
水、Ｒ．Ｏ．（ＩＴＬ）
ワットマン３ｍｍ、ワットマン、カタログ番号３０３０９１７
【００６９】
溶液
１％漂白剤  −ＦＡＣＳＣｌｅａｎ、ベクトン  デッキンソン、カタログ番号３４０３４５
ＰＢＳ（ＩＴＬ製造、ＢＲ  Ｒ０４５０Ｖ０１）
０．１％プロニック酸含有ＰＢＳ
【００７０】
培地
ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−クローニング培地、ＳＡＦＣ  バイオサイエンス、カタログ番号Ｃ６３６６、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５ｍｇ／Ｌ  フェノールレッド、シグマ、カタログ番号Ｐ０２９０を補足
ＰｒｏＣＨＯ５培地、ロンザ（Lonza）、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５ｍｇ／Ｌ  フェノールレッド、シグマ、カタログ番号Ｐ０２９０を補足
イーグル最小必須培地、シグマ、カタログ番号Ｍ２２７９
【００７１】
方法
ＤＮＡ発現ベクターの構築
全てのベクターは、たとえばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら［F. M. Ausbel, 2009 #132］に教示されているような標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。
【００７２】
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  Ｈｉｓｐｅｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて製造業者により説明された手順にしたがって単離した。
【００７３】
ＤＮＡ配列決定
契約企業（ジーンアート（GeneArt）、独国）により製造され、標準的な手法によりベクターにクローン化されたＤＮＡフラグメントは、Ｈｙ−Ｌａｂｓ、イスラエル国で配列決定された。ＤＮＡ配列決定は、完全に自動化された１６  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより行われた。配列は、Ｓｃｉ−Ｅｄ  Ｇｅｎｅｒａｌソフトウェア（Ｃｌｏｎｅ  ｍａｎａｇｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン７．０１およびＡｌｉｇｎ  ｐｌｕｓ５、バージョン５．０１）を用いて社内で分析した。
【００７４】
ＣＨＯ−Ｓ細胞のトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｓ細胞を溶かし、ＰｒｏＣＨＯ５血清不含培地（ロンザ、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ）にヒポキサンチン１３．６１ｍｇ／Ｌおよびチミジン３．８８ｍｇ／Ｌ（ＨＴｘ１、バイオロジカルインダストリー、カタログ番号０３−０８５−１Ｂ）を補足した培地で培養した。細胞を、フィルターチューブ５０ｍｌバイオリアクター（ＴＰＰ、カタログ番号８７０５０）において、３７℃、加湿、および３２０ＲＰＭで振とうして浮遊状態で増殖させた。トランスフェクションの２日前、細胞を、５００ｍｌの蓋付き三角フラスコ（コーニング、カタログ番号４３１１４５）に０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播いた。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（ギブコＢＲＬ、カタログ番号１８３２４−０２０）によりトランスフェクトした。トランスフェクションの日に、細胞を洗浄して再懸濁し、１０×１０6細胞を、１２５ｍｌのフィルターキャップ付き三角フラスコ（コーニング、カタログ番号４３１１４３）の４ｍｌ  ＭＥＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ２２７９）中に播いた。各単一のプラスミドによるトランスフェクションに対し、２０μｇ線状化ベクター（ＭＢ−０９８）を使用した。最終ＤＮＡ容量は、ＭＥＭ中で１００μｌに調整した。その後、１００μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを添加し、４５分間室温でインキュベートした。次に、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ混合物を、細胞に添加し、４時間、３７℃、５％ＣＯ2で４５ＲＰＭで振とうするインキュベーターにおいてインキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、細胞を遠沈し、培地を、１２５ｍｌのフィルターキャップ付き三角フラスコ（コーニング、カタログ番号４３１１４３）において、２０ｍｌの新しいＰｒｏＣＨＯ５（ロンザ、カタログ番号ＢＥ１２−７６６Ｑ）にヒポキサンチン２７．２２ｍｇ／Ｌおよびチミジン７．７６ｍｇ／Ｌ（ＨＴｘ２、バイオロジカルインダストリー、カタログ番号０３−０８５−１Ｂ）を補足した培地に置換した。フラスコを３７℃で振とうインキュベーターにおいて１２５ＲＰＭで７２時間インキュベートした。
【００７５】
トランスフェクションから７２時間後、細胞を回収し、遠心分離にかけ、そして２０ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５培地にピューロマイシン２０μｇ／ｍｌ（インビボジェン、カタログ番号ａｎｔ−ｐｒ−１）、ＭＳＸ  ２５μＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ５３７９）およびデキストラン硫酸塩  １００μｇ／ｍｌ（シグマ、カタログ番号Ｄ４９１１）を補足した培地に再懸濁した。これらの選択条件下では、ＰＡＣ遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができた。
【００７６】
インビトロビオチン化
動物成分不含培地（ＡＣＦＭ）で培養された細胞を、プルロニック酸Ｆ−６８  ０．１％（シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６）およびＭｇＣｌ2  ５ｍＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ１０２８）を含むＰＢＳ（リン酸バッファー食塩水）中で洗浄し、その後２×１０6細胞を、プルロニック酸Ｆ−６８  ０．１％（シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６）、ＭｇＣｌ2  ５ｍＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ１０２８）、ＢｉｒＡ  ０．０６ｍＭ（アビディティー（Avidity）、カタログ番号ＢｉｒＡ５００）、ＡＴＰ  １ｍＭ（シグマ、カタログ番号Ａ６４１９）およびビオチン  １０ｍＭ（シグマ、カタログ番号Ｂ４６３９）を含むＰＢＳで、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、プルロニック酸Ｆ−６８  ０．１％（シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６）およびＭｇＣｌ2  ５ｍＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ１０２８）を含むＰＢＳで洗浄した。
【００７７】
蛍光ストレプトアビジン（Ｆ−ＳＡ）による標識化
インビボもしくはインビトロのいずれかにおいてビオチン化されたＢＡＰを発現する細胞（２×１０6）、またはＢＭＰを発現する細胞を、プルロニック酸Ｆ−６８  ０．１％（シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６）を含むＰＢＳで洗浄し、その後、プルロニック酸Ｆ−６８  ０．１％および１：１００に希釈したＲ−フィコエリトリン共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）（ジャクソン、カタログ番号０１６−１１０−０８４）（Ｆ−ＳＡ）を含むＰＢＳでインキュベートし、３７℃で３０分間、８０ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。その後、細胞を、０．１％プルロニック酸Ｆ−６８を含むＰＢＳで洗浄し、解析のためにＦＡＣＳＡｒｉａにかけた。
【００７８】
ＦＡＣＳによる分析
ＢＭＰを発現する細胞（２×１０6）を、０．１％プルロニック酸Ｆ−６８（シグマ、カタログ番号Ｐ５５５６）を含むＰＢＳで洗浄し、その後、０．１％プルロニック酸Ｆ−６８および１：１００に希釈したＲ−フィコエリトリン共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５２０３）（Ｆ−ＳＡ）を含むＰＢＳでインキュベートし、３７℃で３０分間、８０ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。その後、細胞を、０．１％プルロニック酸Ｆ−６８を含むＰＢＳで洗浄し、解析のためにＦＡＣＳＡｒｉａにかけた。
【００７９】
細胞増殖
細胞培養物を、つぎのようにＡＣＦＭに維持した。細胞を、５０ｍｌチューブに、２５ｍｌの容量で０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播き、φ２５ｍｍのオービタルシェーカー上で、３２０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。週に２回、細胞数と生存率を測定した。培養物を、４℃で５分間、１００ｇで遠心分離することにより継代させ、その後、細胞ペレットを新鮮な事前に温めたＡＣＦＭに再懸濁した。
【００８０】
細胞増殖およびＡＣＦＭにおける生産性
細胞培養物の維持
細胞培養物をつぎのようにＡＣＦＭにおいて維持した。細胞を、Ｔ−８０フラスコに、０．２×１０6細胞／ｍｌの濃度で播き、４５ｒｐｍでオービタルシェーカー上で３７℃でインキュベートした。週に２回、細胞数と生存率とを測定した。培養物を、４℃で５分間、１００ｇで遠心分離することにより継代させ、その後、細胞ペレットを新鮮な事前に温めたＡＣＦＭに再懸濁した。
【００８１】
組織培養フラスコ２５ｃｍ2を８〜１０ｍｌの培地で播種し、ｆ２５ｍｍのオービタルシェーカー上、５５ｒｐｍでインキュベートした。組織培養フラスコ８０ｃｍ2を２０〜３０ｍｌ培地で播種し、ｆ２５ｍｍのオービタルシェーカー上、４５ｒｐｍでインキュベートした。
【００８２】
ＡＣＦＭにおける細胞の生産性
ＡＣＦＭにおける比生産性（ＰＣＤ）について、細胞を、５０ｍｌチューブに入れた特定のＡＣＦＭに０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で播き、オービタルシェーカー（３２０ｒｐｍ）上、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培地を試料に取り、生成物濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。計算は、２４時間力価を播種時の細胞の平均濃度と、２４時間実験後での細胞の平均濃度により割ることで行った。
2014507121.tif 000003
【００８３】
細胞ソーティング    ＦＡＣＳソーティングについては、２０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよびＭＳＸ  ２５μＭを補足したＰｒｏＣＨＯ５培地の統一プールから、トランスフェクトされた細胞が使用された。各ソートについて、約６０×１０6細胞を培養し、Ｆ−ＳＡで標識化した。ソートされるべき細胞を、０．１％プルロニック酸Ｆ−６８および１：１００に希釈したＦ−ＳＡを含むＰＢＳ中で、Ｔ８０フラスコの４×１０6細胞／ｍｌの濃度で標識化し、８０ｒｐｍで振とうインキュベーターにおいて３７℃で１時間インキュベートした。標識化後、細胞を回収し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸Ｆ−６８で２回洗浄し、バルクソーティングのためにＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸Ｆ−６８に、最終濃度１０×１０6で再懸濁した。最も高い蛍光細胞４％を「単一細胞」精密モードにおけるＦＡＣＤＡｒｉａフローサイトメーターによるソーティングのために、ＦＳＣ／ＰＥドットプロット上でゲーティングした。ソートされた細胞を、２０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよびＭＳＸ  ２５μＭを補足したＰｒｏＣＨＯ５培地に播き、細胞生存率が＞＝９０％で生存細胞数が≧７０×１０6まで増殖させた。この段階で、蛍光が解析およびつぎのソーティングサイクルがなされた。全部で、３回の連続したソートがなされた。
【００８４】
ＦＡＣＳ  ＡＣＤＵによるクローニング
クローニングは、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞ソーターの自動細胞捕集装置（ＡＣＤＵ）デバイスにより、２０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよびＭＳＸ  ２５μＭを含むＰｒｏＣＨＯ５において増殖する細胞になされた。２×１０6細胞を回収し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニック酸Ｆ−６８で２回洗浄し、２μｇ／ｍｌ（希釈１：１００）濃度のＳＡ−ＰＥ（BioLegend）０．５ｍｌで標識化した。細胞を２４ウェルプレートで３０分間、８０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。標識化後、細胞を回収し、ＰＢＳ＋０．１％プルロニックで２回洗浄し、４ｍｌのＰＢＳ＋０．１プルロニック酸に再懸濁した（細胞濃度、約０．１〜０．２細胞／ｍｌ）。最も高い蛍光細胞２．５％を、「単一細胞」精密モードにおいて、ＡＣＤＵにより、ＰｒｏＣＨＯ５において培養された細胞用の８０％シグマＣ６３６６および２０％ＰｒｏＣＨＯ５  ＡＣＦＭ混合物１８０μｌ／ウェルを含む９６ウェルプレート中にクローン化した。プレートをＣｅｌｌａｖｉｓｔａにより、０日目、その後２〜３日周期で、単一コロニーを有するウェルの検出のために解析した。クローニングの２週間後、コロニー増殖が検出されたウェルからの上清をサンプリングし、ＥＬＩＳＡにより分析した。ウェルにつき１より多いコロニーを含むウェルは、除外した。細胞を、最も高い力価を有するウェルから採取し、まず、４ｍｌの５０％シグマＣ６３６６および５０％ＰｒｏＣＨＯ５培地混合物を含む振とうなしのＴ２５フラスコに移した。３〜５日後、２〜４ｍｌの１００％ＰｒｏＣＨＯ５培地をＴ２５フラスコに添加し、細胞を、振とうしながらインキュベートした。１〜３日後、８ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５を添加し、懸濁液をＴ８０フラスコに移した（全体で、８７．５％のＰｒｏＣＨＯ５と１２．５％のＣ６３６６）。１〜２日後、１０ｍｌの新鮮な培地を細胞に添加した。その後、細胞を２５ｍｌの新鮮な培地に０．２×１０6細胞／ｍｌで別の増殖サイクルのために播種した。比生産性を決定するために、細胞を０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で、２４時間、３７℃、３２０ｒｐｍで５０フィルターチューブに播いた。
【００８５】
ｓＣＤ１６４−Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ      以下の手法を用いた。
１．マイクロタイタープレートを０．５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中ＣＤ１６４に対するモノクローナル抗体で被覆し、〜４℃で一晩インキュベートした。
２．プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。
３．プレートをブロッキングバッファー（０．５％Ｉ−Ｂｌｏｃｋを含むＰＢＳ）２００μｌ／ウェルで、３７℃、振とう下で１時間ブロッキングした。
４．ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、アッセイバッファー（０．２５％Ｉ−Ｂｌｏｃｋおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中の試験試料、検量線（０．７８〜５０ｎｇ／ｍｌ）およびチェック試料の１００ｍｌアリコートをプレートに添加し、振とう下、３７℃で６０分インキュベートした。
５．プレートを再び洗浄バッファーで３回洗浄し、そして１００ｍｌのＦｃ部分への二次抗体（アッセイバッファー中に１：４０，０００に希釈されたＨＲＰ共役Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒト）を各ウェルに添加した。
６．プレートを振とう下、３７℃で６０分インキュベートした。
７．プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ）１００ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを室温で（振とうなしで）２０分間インキュベートした。
８．反応を停止溶液（４Ｎ  ＨＣｌ）５０μｌ／ウェルを添加することにより止めた。
９．吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにおいてＡ４９２ｎｍで測定した。
１０．検量溶液を、２９３ＨＥＫ細胞由来のＳｔｄ．ＳＣＤ１６４−Ｆｃの段階希釈により調製し、アッセイバッファーにおける０．７８〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲（線形範囲は０．７８〜１２．５ｎｇ／ｍｌの間であった。）で検量線を得た。ＳＣＤ１６４−Ｆｃプールからの粗収穫物の試料を、アッセイバッファーで希釈し、〜１０ｎｇ／ｍｌを得て、チェック試料として用いた。
１１．光学密度データ結果を処理し、結果をＭａｇｅｌａｎソフトウェアにより計算した。
１２．試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。
【００８６】
ＧＣＳＦに対するＥＬＩＳＡ      以下の手順を用いた。
１．マイクロタイタープレートを１μｇ／ｍｌのＰＢＳ中ＧＣＳＦに対するモノクローナル抗体で被覆し、〜４℃で一晩インキュベートした。
２．プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。
３．プレートをブロッキングバッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）、２００μｌ／ウェルで、３７℃、振とう下で１時間ブロッキングした。
４．ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、試験試料、検量線試料およびチェック試料の１００ｍｌアリコートをプレートに添加し、振とう下、３７℃で６０分インキュベートした。
５．プレートを再び洗浄バッファーで３回洗浄し、そして１００ｍｌの検出ビオチニル化抗体抗−ヒトＧＣＳＦ溶液を各ウェルに添加した。
６．プレートを振とう下、３７℃で６０分インキュベートした。
７．プレートを、二次抗体、ストレプトアビジンＨＲＰでインキュベートし、上記工程５〜６に記載されたのと同じ手順を行った。
８．プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。
９．基質溶液（ＴＭＢ）１００ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを室温で（振とうなしで）２０分間インキュベートした。
１０．反応を停止溶液（３Ｎ  ＨＣｌ）５０μｌ／ウェルを添加することにより止めた。
１１．吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにおいて４９２ｎｍで測定した。
１２．検量溶液を、標準組換えヒトＧＣＳＦの段階希釈により調製し、１．５６〜１００ｎｇ／ｍｌ（線形範囲は３〜５０ｎｇ／ｍｌの間であった。）の検量線を得た。
１３．光学密度データ結果を処理し、結果をＭａｇｅｌａｎソフトウェアにより計算した。
１４．試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。
【００８７】
ＩＬ−６に対するＥＬＩＳＡ      以下の手順を用いた。
１．マイクロタイタープレートを１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中ＩＬ６に対するモノクローナル抗体で被覆し、〜４℃で一晩インキュベートした。
２．プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。
３．プレートをブロッキングバッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）、２００μｌ／ウェルで、３７℃、振とう下で１時間ブロッキングした。
４．ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、試験試料、検量線試料およびチェック試料の１００ｍｌアリコートをプレートに添加し、振とう下、３７℃で６０分インキュベートした。
５．プレートを再び洗浄バッファーで３回洗浄し、そして１００ｍｌの検出抗体：ビオチニル化抗−ＩＬ６を各ウェルに添加した。
６．プレートを振とう下、３７℃で６０分間インキュベートした。
７．プレートを、二次抗体、アビジン−ＨＲＰでインキュベートし、続いて上記工程５〜６に記載されたのと同じ手順を行った。
８．プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。
９．基質溶液（ＴＭＢ）１００ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを室温で（振とうなしで）２０分間インキュベートした。
１０．反応を停止溶液（３Ｎ  ＨＣｌ）５０μｌ／ウェルを添加することにより止めた。
１１．吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。
１２．検量溶液を、ＩＬ６参照標準の段階希釈により調製し、３１．７５〜２０００ｐｇ／ｍｌ（線形範囲は３１．７５〜５００ｐｇ／ｍｌの間であった。）の検量線を得た。
１３．光学密度データ結果を処理し、結果をＭａｇｅｌａｎソフトウェアにより計算した。試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。
【００８８】
分析用抗−ＩＬ２２ＲＡ細胞培養収穫物の回収
産生細胞（０．５×１０6）を、フィルターチューブ５０の２０ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５培地に播き、３２０ｒｐｍのシェーカー上で、３７℃で、２４時間培養した。収穫物を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通してろ過した。透明な上清をＥＬＩＳＡアッセイ、ついでウェスタンブロットアッセイにて解析した。
【００８９】
抗−ＩＬ２２に対するＥＬＩＳＡ      以下の手順を用いた。
１．マイクロタイタープレートを、コーティングバッファー中、２．０μｇ／ｍｌのヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で１ウェルにつき１００μｌでコートし、湿潤箱において〜４℃で一晩インキュベートした。プレートは、Ｏ／Ｎインキュベーションの後、３ヵ月間−２０℃で保管できる。
２．プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄した。
３．プレートをブロッキングバッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ０．０５％）２００μｌ／ウェルで、室温で１時間ブロッキングした。
４．ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで４回洗浄し、アッセイバッファー（ＰＢＳ×１中ミルク１％）中の試験試料、検量線試料（１．５６〜１００ｎｇ／ｍｌ）およびチェック試料の１００ｍｌアリコート。プレートを、プレートシーラーで覆い、振とうなしで、３７℃で６０分間インキュベートした。
５．プレートを再び洗浄バッファーで４回洗浄し、そしてアッセイバッファーに１：１００，０００で希釈した二次抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ  ＨＲＰ  １００μｌを各ウェルに添加した。
６．プレートを、３７℃で６０分間インキュベートした。
７．プレートを洗浄バッファーで４回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ）１００ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを室温で（振とうなしで）１５〜２０分間インキュベートした。
８．反応を停止溶液（１Ｎ  ＨＣｌ）１００μｌ／ウェルを添加することにより止めた。
９．吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにおいてＡ４５０ｎｍで測定した。
１０．検量溶液を、標準抗ＩＬ２２ＲＡ  ＭＳＢ００１００７４／Ｃ１２のＰＢＳでの段階希釈により調製し、ｐＨ６．０、アッセイバッファーにおける１．５６〜１００ｎｇ／ｍｌ（線形範囲は１．５６〜５０ｎｇ／ｍｌの間であった。）の検量線を得た。関連するプールからの粗収穫物のサンプルを、アッセイバッファーで希釈して、〜２５ｎｇ／ｍｌを得て、チェック試料として使用した。
１１．光学密度データ結果を処理し、結果をＭａｇｅｌａｎソフトウェアにより計算した。
１２．試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット解析
ＰｒｏＣＨＯ５培地中の抗−ＩＬ２２ＲＡクローンの透明な上清試料をＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料バッファーに希釈した。抗−ＩＬ２２ＲＡクローンの試料（ＥＬＩＳＡによりレーンにつき０．１μｇ）を、非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％ビス・トリス・ゲル上で分離した。事前に染色したＭＷタンパク質標準（１５ｍｃｌ）を、同様にゲル上に載せた。電気泳動を定電圧（１００Ｖ）で、〜２時間、Ｎｏｖｅｘ  Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ電気泳動システムにより行った。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ実行の終わりに、１時間で３５ボルトに調整された電源を用いる移行バッファーを備えたブロッティングモジュールにおいて、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移した。膜をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分間洗浄し、ブロッキングバッファーで４℃で一晩インキュベートした。膜をワーキングバッファーに希釈した以下の抗体と共に、振とう下、２時間室温でインキュベートした。ａ）ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ、ｂ）ヤギ抗−ヒトκ軽鎖、そしてロバ抗−ヤギ  ＨＲＰに続く。その後、膜をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回、各回５分間洗浄した。バンドをＥＣＬ試薬中で１分間インキュベーションし、フィルムをＡＦＰ  Ｘ−線フィルムプロセッサー「Ｍｉｎｉ−Ｍｅｄｉｃａｌ」現像液に曝すことにより可視化した。現像後、フィルムを詳細に調べた。
【００９１】
実施例１：仕様設計
細胞表面上のＢＭＰおよびＢＡＰ発現レベルの評価のための仕様設計は、当初、充分な発現を保証し、発現評価を可能とするために個々の発現カセット上に位置するレポータータンパク質により作製された（図１；ベクターＭＢ−０６５、ＭＢ−０６６およびＭＢ−０６７）。レポータータンパク質発現の検証とＦＡＣＳによる細胞表面上の検出の後、新規なＢＭＰ含有ベクターを、ＢＭＰに基づくレポーター遺伝子と２シストロン性ｍＲＮＡにおけるＧＯＩｓとの間の固い結合により構築した。プラスミドは、強力なヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターにより駆動されるＧＯＩｓからなり、レポーター遺伝子は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流に配置した。この構造は、同じｍＲＮＡ上での両遺伝子の転写を決定している［４７］（図１；ベクターＭＢ−０７０−ＭＢ−０７６）。
【００９２】
レポーター分子は、膜結合タンパク質またはペプチドとレポーター部分を含有した（ＢＭＰまたはＢＡＰ）。最初の膜結合タンパク質は、１０１アミノ酸［３７］の小さなタンパク質で、そのＣ末端を介してグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）［４０］により細胞膜の外側に固定されたマウス由来のＣＤ５９ａからなっていた（図１のベクターＭＢ０６５、ＭＢ０６６、ＭＢ−０７０−ＭＢ−０７２）。ＢＭＰ−ＣＤ５９ａ構築物の核酸配列は、配列番号１０に規定されているものである。あるいは、６０アミノ酸の合成ペプチドが作製され（配列番号１）、これは２つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有し、マウスＩＧＦ−Ｉレセプター由来のＴＭドメイン（配列番号２；ベクターＭＢ−０７３およびＭＢ−０７５；図１）か、またはＣＤ４８のＧＰＩ固定ドメイン（Ｃｙｓ残基がＳｅｒにより置き換えられていた；配列番号３；ベクターＭＢ−０７４およびＭＢ−０７６；図１）のいずれかを介して細胞膜に固定された。ＴＭドメイン配列の予測は、ＴＭＨＭＭ  ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．０によりなされ［３２］、そしてＧＰＩ固定配列は、ＧＰＩ修飾部位推定によりなされた［３３〜３６］。膜タンパク質またはペプチドのＮ末端またはＧＰＩ固定シグナルは、リンカーを介して、ＣＨＰＱＧＰＰＣ［２２、２３］（配列番号５）のアミノ酸配列に対するＢＭＰコーディング配列、またはＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ［２４］（配列番号１３）のアミノ酸配列に対するＢＡＰコーディング配列のいずれかに結合される。
【００９３】
ＢＭＰ含有ベクターによりトランスフェクトされた細胞は、蛍光標識ストレプトアビジンにより直接染色された（Ｆ−ＳＡ、図２Ａ）。ＢＡＰ発現細胞の染色は、このレポーターペプチドのビオチニル化よりも前に必要とされる。これは、細胞自身によるインビボ  ビオチニル化を得るためのＣＨＯ最適化ＢｉｒＡ配列［２７］による同時トランスフェクションによるか（データは示さず）［２７〜２９、３１、４８］、または細菌性酵素ＢｉｒＡを外から加えることによる細胞表面でのＢＡＰのインビトロビオチニル化によるか［３０、４９］（図２Ｂ）のいずれかで達成された。
【００９４】
仕様は、ＢＭＰをＰＡＣ耐性遺伝子と融合させることにより目的の遺伝子を高レベルに産生する細胞をストリンジェントに選択するために拡張された。ＢＭＰ−ＰＡＣは、トランスフェクション後のピューロマイシン選択と、それに続くＢＭＰレベルによるＦＡＣＳ選択を可能とする。２つの発現カセット、重鎖に対するものと軽鎖に対するものからなるモデル抗体の発現のためにプラスミドを構築した。重鎖発現は強力なマウスＣＭＶ  ＩＥ２（ｍＣＭＶ  ＩＥ２）プロモーターにより駆動され、レポーター遺伝子はＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流に配置される。軽鎖発現は、マウスＣＭＶ  ＩＥ１（ｍＣＭＶ  ＩＥ１）プロモーターにより駆動され、ＱＳｙ（グルタミンシンセターゼ）選択マーカーは、別のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流に配置される。この構造は、単一ｍＲＮＡ上での重鎖およびＢＭＰ−ＰＡＣ遺伝子の転写と、別のｍＲＮＡ上での軽鎖およびＱＳｙの転写を決定している［４７］（図３；ベクターＭＢ９８）。
【００９５】
レポーター選択分子は、マウスＣＤ５９ａ分子由来のシグナルペプチドの前に置かれたＢＭＰを含む。ＢＭＰは、そのＣ末端で６０アミノ酸の合成ペプチドに融合し、この合成ペプチドは２つの潜在的なＮ−グルコシル化部位を有する。この合成キャリアは、マウスＩＧＦ−Ｉレセプター由来のＴＭドメインに連結される。ＴＭドメインは、ＰＡＣ選択耐性遺伝子に、短いリンカーを介して連結される（図２Ｃ、図３；ベクターＭＢ−０９８）。ＴＭドメイン配列の予測は、ＴＭＨＭＭ  ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．０によりなされた。ＢＭＰは、配列番号５のアミノ酸配列によりコードされる。
【００９６】
この特定の構築物におけるＰＡＣは、細胞膜に付着される。したがって、ＰＡＣは、膜結合タンパク質として有効なＮアセチル化活性を含まなければならず、その天然の細胞質状態とは異なる。
【００９７】
実施例２：発現ベクターの構築
この研究課題のため、３つのセットのベクターが研究課題の種々のステージで構築された。
【００９８】
第１のセットでは、ビオチン模倣ペプチド（ＢＭＰ）、ビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）およびＢｉｒＡ遺伝子を、ｈＣＭＶプロモーターの直接下流でベクターにクローン化した。これらのベクターは、当初は、細胞表面上のＢＭＰおよびＢＡＰ発現レベルおよびＦＡＣＳによる蛍光ストレプトアビジン（Ｆ−ＳＡ）でのこれらのマーカーの検出能力のテストのために使用され、実験の後期には対照ベクターとして使用された。ベクターの第２のセットは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流にＢＭＰ−ＣＤ５９−ＧＰＩカセットを含有し、したがって、前に使用されたベクターにおいてよりも強固に直接的な方法でＧＯＩにＦＡＣＳ選択マーカーを連結した。第３のセットは、マウスＣＤ５９ａの代りに合成ペプチドキャリア（ＧＰＩを含む）を含み、ＧＰＩまたはＴＭドメインを介して細胞膜に固定された（図１）。選択マーカーとして、ＰＡＣ遺伝子をＳＶ４０プロモーターの下流でベクターに挿入し、トランスフェクトされた細胞で細胞質ＰＡＣを生じた。
【００９９】
すべてのベクターは、既知の手法、たとえばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌらに教示されているような手法にしたがって構築された［５０］。
【０１００】
実施例３：高ＰＯＩ産生細胞のソーティングに対するレポーター分子の評価
３．１  細胞表面上のレポーター分子の発現と検出
ＧＯＩおよびＢＭＰ、またはＧＯＩおよびＢＡＰ、またはＧＯＩおよびＢＡＰおよびＢｉｒＡを発現する細胞の作製は、ＣＨＯ−Ｓ細胞へのプラスミドのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅトランスフェクションによりなされ、その後、ピューロマイシンにより、またはＢｉｒＡ含有プラスミドで同時トランスフェクトされた細胞においてピューロマイシンおよびゼオシンにより選択された。
【０１０１】
安定なプールをレポーター遺伝子の発現レベルについて解析した。ＢＡＰレベルは、外から添加されたＢｉｒＡによるビオチニル化、その後Ｆ−ＳＡでの標識化後に解析された（図４）、またはＢｉｒＡにより同時トランスフェクトされたそれらの細胞における細胞内でのビオチニル化、その後Ｆ−ＳＡで標識化後に解析された（データは示さず）。
【０１０２】
ＢＭＰレベルは、Ｆ−ＳＡの結合により直接的に解析された。結果は、非トランスフェクト細胞および非標識化細胞に関する有意なバックグラウンドなしでトランスフェクトされた細胞上のレポーター分子の特定の蛍光シグナルを示す（図５Ａ）。
【０１０３】
図５において、非トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞、およびＢＭＰ−ＣＤ５９ａをｈＣＭＶプロモーターの下流に直接（Ａ）、またはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流に直接（Ｂ）含むプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞を、Ｆ−ＳＡで染色するかまたは染色せず、ＦＡＣＳによるそれらの蛍光標識レベルを解析した。ストレプトアビジン−染色ＢＭＰの蛍光レベル（図５）は、ストレプトアビジン−染色ＢＡＰの蛍光レベル（図４）よりも低かった。
【０１０４】
ＢＭＰとＢＡＰで染色した細胞の蛍光標識強度における違いについての理由は、ＢＡＰの場合には天然のビオチンであるのに対して、ストレプトアビジンに対するビオチン模倣ペプチドの有意に低い親和性にあると考えられる（数桁分）。この違いにもかかわらず、ＦＡＣＳにより標識された細胞のソーティングを可能とするバックグラウンドよりも有意にＢＭＰ発現細胞の高い染色強度が得られた。
【０１０５】
低い蛍光と高い蛍光の２つのピークが、トランスフェクトされ標識化された細胞に見られる（図５Ａ−Ｂ；曲線−・・−）。これらの２つのピークは、おそらく低いＢＭＰ発現細胞と高いＢＭＰ発現細胞を示す。低い発現細胞は、また、ＰＡＣが標準的な発現カセットに配置されていてもなおＰＡＣの発現も低いことが推測される。ＰＡＣレベルは、それでも細胞がピューロマイシン選択圧力下で生存するのに充分であった。
【０１０６】
３．２  高産生細胞のソーティングと作製
細胞を、３つの異なるＧＯＩｓ（ｓＣＤ１６４−Ｆｃ、ＧＣＤＦ、ＩＬ−６）および、ＢＭＰ−ＣＤ５９ａ（ベクターＭＢ−０７０、ＭＢ−０７１、ＭＢ−０７２）、ＢＭＰ−ペプチドキャリア−ＧＰＩ（ベクターＭＢ−０７４およびＭＢ−０７６）またはＢＭＰ−ペプチドキャリア−ＴＭ（ベクターＭＢ−０７３およびＭＢ−０７５）のキメラを含み、ＧＯＩおよびＢＭＰが、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより分けられた同じ２シストロン発現カセット上に配置されているベクター（図６〜１２）でトランスフェクトした。（異なるカセット上で発現される）ピューロマイシンでの生物学的な選択により作製された安定なプールについて、ＦＡＣＳによりレポーター分子の発現レベルを、そして特異的ＥＬＩＳＡによりＧＯＩｓの発現レベルを解析した。
【０１０７】
低い蛍光と高い蛍光を有する２つのピークが、トランスフェクトされ標識化された細胞に見られた（図６〜１２；曲線−・・−）。それらの２つのピークは、低いＢＭＰ発現細胞と高いＢＭＰ発現細胞とを示す。低い発現細胞はＰＡＣの発現も低いことが推測される。ＰＡＣレベルは、細胞がピューロマイシン選択圧力下で生存するのに充分であるが、それらの細胞のＢＭＰ発現および、もしかするとＰＯＩレベルも低いと思われる。
【０１０８】
全てのケースにおいて（図６〜１２）有意なレベルのＢＭＰならびにＧＯＩｓが検出された。細胞をＦ−ＳＡで標識化し、最も高い蛍光細胞４％をソートした。その後、ソートした細胞を増殖させ、ＢＭＰおよびＧＯＩｓレベルを解析した。ソーティング手順と分析は、連続的に３回繰り返した。各ソーティングにおいて、最も高いＢＭＰ発現集団を富化し、結果として、ＧＯＩの生産性レベルを高めた。（ＧＯＩおよびＢＭＰ発現レベルの間の正相関が見られた（図６〜１２）。）
【０１０９】
実施例４：レポーターＰＡＣ融合産物をコードする発現ベクターの構築
４．１  ベクターＭＢ−０９８（図３）の構築−ベクターＭＢ−０９８は、たとえばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら［５０］に教示されているように既知の手法にしたがって構築した。
【０１１０】
４．２  ＢＭＰ−ＰＡＣレポーターを含む安定なプールの作製、ＰＡＣ活性の評価および生産性の解析
ＰｒｏＣＨＯ５においてＢＭＰ−ＰＡＣ含有ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞は、２０μｇ／ｍｌピューロマイシン（インビトロジェン、カタログ番号ａｎｔ−ｐｒ−１）およびＭＳＸ  ２５μＭ（シグマ、カタログ番号Ｍ５３７９）による選択に付された。これらの条件下、浮上した安定な細胞は、ＰＡＣが膜結合型で活性であることを示す。安定なプールは、抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂを、比生産性８．５〜９．４ＰＣＤで発現する（図１３）。
【０１１１】
４．３  ＢＭＰ−ＰＡＣレポーターを含有する高産生プールのソーティングおよび作製
安定な細胞を、ＰｒｏＣＨＯ５培地においてＦＡＣＳにより分析、およびソートした（図１４）。分析は、ＢＭＰがトランスフェクトされたプールで検出されることを示す。２つの亜集団がソートの前に見られ、高いＢＭＰレベルと低いＢＭＰレベルとを発現する。最も高いＢＭＰ発現細胞４％の選択により行われた連続的なソートは、ＢＭＰレベルと相関するＰＣＤ上昇との結果を示した。結果のまとめを表１に示す。
【０１１２】
【表１】
2014507121.tif 000004
【０１１３】
ＰｒｏＣＨＯ５において、抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂおよびＢＭＰ−ＰＡＣを含むベクターでトランスフェクトされた安定な細胞（３反復実験）（図１４）を、２０μｇ／ｍｌピューロマイシンおよびＭＳＸ  ２５μＭで選択し、統一のプールに一緒にした。細胞をＢＭＰレベル（赤線）について解析した。プールを、それらのＦ−ＳＡで標識されたＢＭＰレベルにより連続的に３回ソートした。各ソーティングサイクル後、細胞を回収し、蛍光ならびに生産性を測定した。蛍光レベルと生産性の値は、図１４の簡単な説明に示す。
【０１１４】
３．５  ＦＡＣＳ  ＡＣＤＵ装置によるソートされたプールのクローニング−クローンの単離
３回の連続的なソーティングサイクルの後、ＰｒｏＣＨＯ５中の抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂ産生プール＃２４１８ＵＮ−Ｈｘ３の上から４％の蛍光細胞を、９６ウェルプレートへの単細胞クローニングを可能とする、ＦＡＣＳＡｒｉａの自動細胞捕集装置（ＡＣＤＵ）によりクローン化した。ＰｒｏＣＨＯ５＋２０ｍｇ／ｍｌピューロマイシンおよび２５μＭ／ｍｌ  ＭＳＸ中で培養されている細胞のクローニングを、８０％培地Ｃ６３６６および２０％Ｃ６６１４を含む９６ウェルプレートにおいて行った。コロニーを、播種日とその後２〜３日毎にＣｅｌｌａｖｉｓｔａにより検出した。１つより多くのコロニーを有するウェルを廃棄した。クローニング以降、培地にはピューロマイシンは含まれていなかった。
【０１１５】
３５８ウェルからの上清を試料とし、ＥＬＩＳＡにより生産性（力価）についてアッセイした（図１５）。プールから誘導した最も高い力価を有する４０個のクローンをまずＴ２５フラスコに移し、その後、比生産率を評価するために５０ｍｌ試験管に移した（図１６）。両プール由来の最も優秀な１５個のクローンを、５０ｍｌ試験管において生産性の評価のために、２５μＭ  ＭＳＸと培養した（図１７）。
【０１１６】
３．６  ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによる粗細胞培養培地におけるタンパク質生成物の同定
候補のクローンをＰｒｏＣＨＯ−５培地において培養した。これらのクローンにより粗細胞培養培地中に産生された生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングにより解析した（図１８）。生成物の検出は、ヒトＦｃおよび抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂのκ軽鎖サブユニットに対する抗体により行った（それぞれＡおよびＢ）。
【０１１７】
結果は、見掛けの分子量〜１５０ｋＤａを有するインタクトな生成物（ヘテロダイマー）が、両抗体により同定されたことを示す。さらに、全ての候補クローンにより分泌された自由な軽鎖（見掛けのＭＷによるとモノマーおよびダイマー）が、抗−ＬＣで染色されたウェスタンブロットにおいて認められた（図１８Ｂおよび１９Ｂ）。
【０１１８】
全てのクローン由来の粗細胞培養培地におけるヘテロダイマーの分子量は、抗−ＩＬ２２ＲＡ  ｍＡｂ参照サンプル由来の精製された生成物のものと一致する。異なるクローンの生成物の見掛けのＭＷにおいて有意差は見られなかった。多重バンドは、グリコシル化の微小不均一性（micro-heterogeneity）を表す。
【０１１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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