(57)【要約】本発明は癌幹細胞（ＣＳＣ）の排除及び（または）癌予防のための抗精神病性フェノチアジン誘導体の使用に関し、また、トリフルオペラジンと、ゲフィチニブまたはシスプラチンなどの抗癌剤を含む、癌を治療するため及び（または）癌再発を予防または遅延するための医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014530885.tif 000009
（式中、
ＡはＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。）
の構造を有する化合物の、癌幹細胞（ＣＳＣ）を排除する薬剤の製造のための化合物の使用。
【請求項２】
前記化合物がトリフルオペラジン、クロルプロマジン、チオリダジン、ペルフェナジン、トリフルプロマジン、プロマジンまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物がトリフルオペラジンである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＣＳＣが肺ＣＳＣである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記肺ＣＳＣが非小細胞肺癌幹細胞である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
癌を処置するための医薬組成物であって、治療有効量の式（Ｉ）：
【化２】
2014530885.tif 000010
（式中、
ＡがＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。）
で表される構造を有する化合物と抗癌剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
前記化合物がトリフルオペラジンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物と前記抗癌剤が２つの個別の処方の形式、または１つの処方の形式である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗癌剤がゲフィチニブまたはシスプラチンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＳＣの排除に有効である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記癌が肺癌である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌再発を予防または遅延するための医薬組成物であって、前記化合物が治療有効量の式（Ｉ）：
【化３】
2014530885.tif 000011
（式中、
ＡがＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。）
で表される構造を有する化合物と、抗癌剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
前記化合物がトリフルオペラジンである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記化合物と前記抗癌剤が２つの個別の処方の形式、または１つの処方の形式である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗癌剤がゲフィチニブまたはシスプラチンである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＳＣに有効である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記癌が肺癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
初期癌治療後に、必要とする個体に対して投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記初期癌治療が、外科手術、放射線治療、化学療法、またはその組み合わせであるる、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
癌を予防するための薬剤の製造のための化合物の使用であって、前記化合物が式（Ｉ）：
【化４】
2014530885.tif 000012
（式中、
ＡがＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。）
で表される構造を有する、使用。
【請求項２３】
前記化合物が、トリフルオペラジン、クロルプロマジン、チオリダジン、ペルフェナジン、トリフルプロマジン、プロマジンまたはその組み合わせである、請求項２２に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
前記化合物がトリフルオペラジンである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記癌が肺癌である、請求項２２に記載の化合物の使用。
【請求項２６】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞を排除するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌幹細胞様細胞（ＣＳＣ）仮説がかなり注目を集めている。ＣＳＣは自己複製、ストレス／薬剤耐性及び増進された移動を含む幹細胞の特質を備えており、これらが腫瘍の再発、転移、抗がん剤に対する耐性の一因となっている可能性がある。推定される肺ＣＳＣはまずＣＤ１３３＋／Ｏｃｔ４＋／Ｎａｎｏｇ＋細胞として同定され（Ｅｒａｍｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ． Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２００８；１５：５０４〜５１４）、かつ確立されたＮＳＣＬＣ細胞株中で分離される（Ｐｉｒｏｚｚｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ２１５４８；Ｌｅｕｎｇ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ． ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１０；５：ｅ１４０６２）。肺ＣＳＣは肺前駆細胞と同じ機能特性を持つことができ、フローサイトメトリーアッセイでこれらの細胞がサイドポピュレーション細胞として定義される、染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を能動的に排除する能力を含み（Ｓｔｏｒｍｓ  ＲＷ  ｅｔ  ａｌ． Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６：２１２５〜２１３３）、高いアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）活性を示す（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ． Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７；１：５５５〜５６７）。ＣＳＣは高レベルの多剤トランスポーター、ＡＢＣＧ２を発現し、細胞内ＴＫＩ濃度を調整することによるＴＫＩ処置への耐性を示す（Ｏｚｖｅｇｙ−Ｌａｃｚｋａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ． Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００４；６５：１４８５〜１４９５）。このため、癌細胞中のＣＳＣを標的とすることは薬剤耐性の克服において重要である可能性がある。例えば、フロントライン化学療法を受けたほとんどの進行した肺癌患者が病状の悪化を経験している（Ｐｆｉｓｔｅｒ  ＤＧ  ｅｔ  ａｌ． Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；２２：３３０〜３５３）。このような悪い結果は、手術や化学治療または放射線治療などの単独または組み合わせによる現在の処置方式は、この疾病を効果的に治療または制御さえもできないことを示唆している。進行した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）で特定のＥＧＦＲ変異を有する患者におけるゲフィチニブなどＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）での処置効果は、従来の化学療法薬よりも明らかに優れている（Ｍａｅｍｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ． Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６２：２３８０〜２３８８、２０１０；Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ． Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：９４７〜９５７、２００９）。しかしながら、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの処置後、ほとんどすべての患者が数ヵ月後には最終的には薬剤耐性を形成し、原発巣に腫瘍が再発したり、遠隔器官に転移したりしている。これらの患者のうち、約２５％に最終的に脳転移が起こっている（Ｃｅｒｅｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ． Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５：１０４２〜１０４７、２００４；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ． Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ６５：３５１〜３５４、２００９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ． Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５９〜３６４、２００７；Ｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ． Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：５８７３〜５８８２、２０１０）。今日まで、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性と転移が発生すると有効な阻止手段がない。この満たされていない臨床的ニーズに対応する新しい薬剤を見つけることは切迫��た課題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｅｒａｍｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ． Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２００８；１５：５０４〜５１４
【非特許文献２】Ｐｉｒｏｚｚｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ２１５４８
【非特許文献３】Ｌｅｕｎｇ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ． ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１０；５：ｅ１４０６２
【非特許文献４】Ｓｔｏｒｍｓ  ＲＷ  ｅｔ  ａｌ． Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６：２１２５〜２１３３
【非特許文献５】Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ． Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７；１：５５５〜５６７
【非特許文献６】Ｏｚｖｅｇｙ−Ｌａｃｚｋａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ． Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００４；６５：１４８５〜１４９５
【非特許文献７】Ｐｆｉｓｔｅｒ  ＤＧ  ｅｔ  ａｌ． Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；２２：３３０〜３５３
【非特許文献８】Ｍａｅｍｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ． Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６２：２３８０〜２３８８、２０１０
【非特許文献９】Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ． Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：９４７〜９５７、２００９
【非特許文献１０】Ｃｅｒｅｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ． Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５：１０４２〜１０４７、２００４
【非特許文献１１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ． Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ６５：３５１〜３５４、２００９
【非特許文献１２】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ． Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５９〜３６４、２００７
【非特許文献１３】Ｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ． Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：５８７３〜５８８２、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明では、腫瘍スフェロイド形成を抑制し、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達を下方制御する能力によって示されるように、いくつかの抗精神病性フェノチアジン誘導体が、抗ＣＳＣ効果を有することが予期せず判明した。より重要なことに、ゲフィチニブまたはシスプラチンと組み合わせたとき、本発明で使用される抗精神病薬は処置応答を向上させ、薬剤耐性を克服することができた。これは、さまざまな癌の処置において素晴らしい潜在性を示唆している。抗精神病性フェノチアジンは血液脳関門を介して脳に届くため、本発明は、ＥＧＦＲ変異を有する肺癌患者の２５％がＥＧＦＲ−ＴＫＩ処置後最終的に脳転移を生じる状況をはじめ、脳に転移する癌の処置に特に有益であるはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は癌幹細胞（ＣＳＣ）を排除する薬剤の製造のための式（Ｉ）
【化１】
2014530885.tif 000002
で表される構造を有する化合物の使用を提供し、ここで、１０Ｈ−フェノチアジン誘導体がアルキル置換基を有し、ＡがＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。上述の方法は必要とする個体において癌を予防することもできる。
【０００６】
別の一態様において、本発明は治療有効量のトリフルオペラジンと抗癌剤を含む、癌を処置するための医薬組成物も提供する。
【０００７】
さらに別の一態様において、本発明は治療有効量のトリフルオペラジンと抗癌剤を含む、癌再発を予防または遅延するための医薬組成物も提供する。
【０００８】
さらに別の一態様において、癌を予防する薬剤の製造のための前記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物の使用も提供する。
【０００９】
前述の発明の概要、及び以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面を併せて参照するとより理解しやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１にゲフィチニブ耐性ＮＳＣＬＣ細胞の増殖阻害及びアポトーシス誘導におけるトリフルオペラジンの効果を示す。そのうち、図１Ａはトリフルオペラジンで４８時間処理した、９６ウェルプレート内の各種ＮＳＣＬＣ細胞の結果を示し、細胞生存性がＭＴＴアッセイにより測定された。図１Ｂは、ＤＭＳＯまたは示された濃度のトリフルオペラジンで４８時間インキュベーションされたＣＬ１４１細胞株の結果を示し、数字は対応する象限における全細胞の割合を示す。右下の象限は初期アポトーシス細胞であり、右上の象限は進行アポトーシス細胞である。図１Ｃはサイドポピュレーションアッセイの結果を示し、そのうち、癌幹細胞様サイドポピュレーションがトリフルオペラジン（５μＭ）によって、ＣＬ１４１細胞で２．１３％から０．１１％に、ＣＬ１５２細胞で１．９５％から０．０６％に大幅に減少した。図１Ｄは癌幹細胞様細胞のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）陽性亜集団が、トリフルオペラジン（５μＭ）によって、ＣＬ１４１細胞で４．３１％から０．８４％に、ＣＬ１５２細胞で３．７３％から１．０８％に減少したことを示す。図１Ｅは、トリフルオペラジンが用量依存的に、Ｂａｘ、Ｂａｋ、切断型ＰＡＲＰ、カスパーゼ３、カスパーゼ９を含み、ＣＬ９７スフェロイドでアポトーシスシグナル伝達を活性化させ、一方で抗アポトーシスタンパク質のＢｃｌ−２、ＸＩＡＰ、Ｍｃｌ−１は下方制御されたことを示す。すべての値はトリプリケート実験の平均で、標準偏差をエラーバーで示しており、例えば、トリフルオペラジンのあり／なしの間には統計上有意な差異がある（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図２】図２に肺癌スフェロイド自己複製の能力阻害におけるトリフルオペラジンの効果を示す。そのうち図２Ａと図２Ｂはトリフルオペラジンで４８時間処理した後のＣＬ８３、ＣＬ１４１、ＣＬ９７スフェロイドの大きさと数をそれぞれ示す（ｎ＝３；＊＊、Ｐ＜０．０１）。図２Ｃは位相顕微鏡で撮影したＣＬ１４１コロニーの画像（上パネル）とトリフルオペラジンでの２週間の処理後に算出されたコロニー数（下パネル）を示し、そのうち＞５０細胞を含むコロニーがカウントされ、対照群のコロニー数が１００％に設定された（ｎ＝３；＊＊、Ｐ＜０．０１）。図２Ｄは異なる用量のトリフルオペラジンで４８時間処理された後のＣＬ１４１及びＣＬ９７癌スフェロイドにおけるＣＤ４４とＣＤ１３３の発現を示し、そのうち発現はウェスタンブロット分析で評価され、β-アクチンが内部標準として使用された。図２ＥはＣＤ１３３の免疫染色画像及びトリフルオペラジン（ＴＦＰ）処理４８時間後の各種スフェロイドの核対比染色（ＤＡＰＩ）を示し、そのうち、顕微鏡写真は４０倍の倍率で撮影された。図２Ｆは異なる用量のトリフルオペラジンで４８時間処理した後のｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ｃ−ＭｅｔのＣＬ９７癌スフェロイドにおける発現を示す。そのうち発現はウェスタンブロット分析で評価され、β-アクチンが内部標準として使用された。図２Ｇは異なる濃度のトリフルオペラジンでＣＬ１４１癌スフェロイドを２４時間処理した後のＴＣＦ／ＬＥＦ転写を示し、そのうち細胞は光度計でＴＯＰｆｌａｓｈ活性とＦＯＰｆｌａｓｈ活性を記録する前に溶解された（ｎ＝３；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図３】図３にシスプラチンまたはゲフィチニブとの併用療法におけるトリフルオペラジンの効果を示す。そのうち、図３Ａは、各種ＮＳＣＬＣスフェロイド（ＳＰ）及びそれらの対応する母細胞に対する従来の化学療法薬シスプラチンの半数阻害濃度を示す。図３Ｂ及び図３Ｃは、シスプラチン（１０μＭ）で２４時間処理された各種ＮＳＣＬＣスフェロイドの細胞生存性アッセイとカスパーゼ−３活性アッセイの結果をそれぞれ示す。図３Ｄはトリフルオペラジンとシスプラチンを組み合わせた処理後のＣＬ８３及びＣＬ１４１癌スフェロイドの細胞数測定結果を示す。図３Ｅはイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）解析によるトリフルオペラジンとゲフィチニブの組み合わせの評価を示す。そのうち、トリフルオペラジン（０．５、２．５、５μＭ）とゲフィチニブ（２．５、５、１０μＭ）のあらゆる可能な薬剤の組み合わせに４８時間暴露されたＥＧＦＲ野生型（ＣＬ１４１）とＥＧＦＲ変異細胞（ＣＬ９７及びＣＬ２５）の標準化イソボログラムが示されている。符号は影響を受ける各割合に対する組み合わせの指標値を表す。曲線は実験目的に合わせてＣａｌｃｕｓｙｎソフトウェアにより生成された。データは３つの独立した実験の代表である。線より下の値は相乗的で、線付近の値は相加的で、線より上の値は拮抗的であることを表す。図３Ｆにトリフルオペラジン（１０μＭ）、ゲフィチニブ（５μＭ）、または両方（ＴＦＰ＋Ｇｅｆ）でそれぞれ４８時間処理されたＣＬ１４１、ＣＬ９７、ＣＬ２５スフェロイドの細胞数測定結果を示す。図３Ｇにフローサイトメトリーで分析されたＣＬ１４１細胞におけるＡＬＤＨ＋細胞の割合を示す。図３Ｈにトリフルオペラジン増進ゲフィチニブのＣＬ１４１自己複製阻害を示す。二次癌スフェロイド形成のため分解したＣＬ１４１スフェロイドが低付着性プレート上に繁殖密度で播種された。すべての値はトリプリケート実験の平均で、標準偏差をエラーバーで示している（＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図４】図４にトリフルオペラジンが仲介する抗腫瘍効果の生体内モニタリングを示す。そのうち、図４Ａは４週間にわたるＣＬ９７含有マウスの代表的な生体発光画像を示し（上パネル）、かつ生物発光強度（ＢＬＩ）における変化が測定され、ＢＬＩにおける時間経過に伴う倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）としてプロットされ（下パネル）、そのうちＣＬ９７大量腫瘍細胞が静脈注射によりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射され、その後マウスは異なる処置、すなわちビヒクル（対照群）、トリフルオペラジン（ＴＦＰ）（５ｍｇ／ｋｇ／日）、ゲフィチニブ（１５０ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与）、ゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与）とトリフルオペラジン（５ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）の組み合わせによる処置を受けた。腫瘍組織量が生体発光での倍率変化により測定かつ判定され、ビヒクル対照＞ゲフィチニブ＞トリフルオペラジン＞併用処置の順に少なくなった。注意すべきは、ビヒクルとゲフィチニブの処置を受けたマウス間の腫瘍組織量は有意な差がなく、併用処置を受けたマウスの腫瘍組織量は、トリフルオペラジン処置を受けたマウス（＊Ｐ＜０．０５）腫瘍組織量と、ビヒクルまたはゲフィチニブの処置を受けたマウス（＊＊Ｐ＜０．０１）の腫瘍組織量よりも有意に低かった。図４ＢにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの代表的生体発光画像を示す（上パネル）。そのうち、ビヒクル及びトリフルオペラジン事前処理（５μＭ＜ＩＣ５０、一夜処理）ＣＬ９７腫瘍スフェロイドが腫瘍形成能力試験のためＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肺に同所的に注射された。原位置（ｉｎ−ｓｉｔｕ）腫瘍成長はトリフルオペラジン事前処理動物において大幅に遅延且つ抑制され（上パネル）、またＢＬＩで倍率変化としてプロットされた腫瘍組織量の測定（下パネル）は２つの群の間で有意差を示している（＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｃは、トリフルオペラジンとゲフィチニブを組み合わせた処理（Ｃｏｍｂ）からの試料が、トリフルオペラジン単独、ゲフィチニブ単独、ビヒクル対照の処理からの試料と比較して、β−カテニン、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１発現を最も有意に抑制し、一方アポトーシス促進分子のカスパーゼ−３の発現レベルは、ビヒクル対照群を除くすべての処理群で増加したことを示す。同じように、β−カテニン、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１発現レベルはトリフルオペラジン事前処理腫瘍スフェロイドで抑制され、一方活性化したカスパーゼ−３発現が増加した。異なる処置を受けたマウスの腫瘍組織片から全細胞溶解産物が採取され、それらのタンパク質プロファイルが検査された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
別途定義されている場合を除き、ここで使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の分野に属する当業者が通常理解する意味を持つ。
【００１２】
ここで使用される「１つの」、「当該」などの単数形は、複数の指示物を含むが、上下の文から明確にそうではないと判断できる場合を除く。したがって、例えば、「１つの試料」とは、複数のそのような試料及び当業者の知る同等物を含む。
【００１３】
ここで使用される「癌幹細胞を排除する」という文句は、腫瘍形成能力が抑制される程度まで、ＣＳＣのコロニー形成能力及び幹細胞性関連マーカーの数を減少する、及び（または）阻害するプロセスを指す。
【００１４】
ここで使用される用語「抗癌剤」とは、あらゆる抗癌効果を提供する薬物を指し、ゲフィチニブ、シスプラチン、タルセバ、抗ＥＧＦＲ抗体を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、前記抗癌剤はゲフィチニブまたはシスプラチンが好ましい。
【００１５】
ここで使用される用語「抗精神病性フェノチアジン誘導体」、「抗精神病薬」または「抗精神病薬剤」は、式（Ｉ）
【化２】
2014530885.tif 000003
の構造を有する化合物群を指し、ここで、１０Ｈ−フェノチアジン誘導体がアルキル置換基を有し、ＡがＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。
【００１６】
本発明によれば、式（Ｉ）の構造を有する化合物の例には、表１に示される抗精神病薬が含まれが、これらに限定されない。
【００１７】
【表１】
2014530885.tif 000004
【００１８】
本発明に基づき、いくつかの既知の抗精神病性フェノチアジン誘導体が抗ＣＳＣ効果を有することが予期せず判明した。
【００１９】
本発明では、サイドポピュレーション法を使用してＣＬ１４１細胞株から分離したＣＳＣ様細胞を用いて、いくつかの既知の抗精神病薬の潜在的抗ＣＳＣ効果を調べた。表２にＭＴＴ、サイドポピュレーション、コロニー形成アッセイの結果をまとめる。試験されたトリフルオペラジン、チオリダジン、クロルプロマジン、ペルフェナジン、トリフルプロマジン、プロマジンを含む６つの抗精神病薬が、ＣＬ１４１細胞中のサイドポピュレーション細胞の割合を減少する（＞５０％）ことが分かった（表２）。
【００２０】
【表２】
2014530885.tif 000005
【００２１】
このため、本発明に基づく癌幹細胞阻害剤としての抗精神病薬は、トリフルオペラジン、チオリダジン、クロルプロマジン、ペルフェナジン、トリフルプロマジン、プロマジンとすることができる。
【００２２】
さらに生体外および生体内実験では、それら化合物、特にトリフルオペラジンは、肺ＣＳＣなどの癌幹細胞を排除できることが示されている（実施例を参照）。
【００２３】
したがって、本発明は癌幹細胞（ＣＳＣ）を排除する薬剤の製造のための化合物の使用を提供し、前記化合物が式（Ｉ）：
【化３】
2014530885.tif 000006
（式中、
ＡがＮ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルあるいはＮ−エチルピペラジニル基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジニル基、Ｎ−メチルピペリジニル基のいずれかであり、ＢがＳＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３、Ｈのいずれかである。）
で表される構造を有する、癌幹細胞（ＣＳＣ）を排除する薬剤の製造のための化合物の使用を提供する。例えば、前記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物は、トリフルオペラジン、クロルプロマジン、チオリダジン、ペルフェナジン、トリフルプロマジン、プロマジンまたはそれらの組み合わせとすることができる。
【００２４】
本発明の一実施態様において、前記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物はトリフルオペラジンであり、次の構造を有する。
【化４】
2014530885.tif 000007
【００２５】
予期せぬことに、予防実験において、ビヒクル処理対照群と比較して、トリフルオペラジン単独で原位置（ｉｎ−ｓｉｔｕ）腫瘍成長が大幅に減少することが判明した。この実験ではＣＬ９７−Ｌ２Ｇ細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに同所的に移植する前にトリフルオペラジンで事前処理された（図４Ｂ）。
【００２６】
このため、本発明はまた、癌を予防する薬剤の製造のための上述の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物の使用も提供する。
【００２７】
さらに、本発明では抗癌剤と組み合わせたトリフルオペラジンがＣＳＣの成長及び（または）分化の阻害、及び薬剤耐性の減少において相乗的効果を提供することが確認された。本発明の一実施態様において、有効量の式（Ｉ）で表される化合物は抗癌剤と組み合わせて投与して、癌幹細胞の排除及び癌の薬剤耐性の減少で相乗的効果を提供する。
【００２８】
本発明ではさらに、トリフルオペラジン処置が肺癌動物モデルにおいてゲフィチニブ耐性腫瘍細胞の腫瘍形成を抑制したことが示されている（実施例を参照）。
【００２９】
したがって、本発明はさらに、癌を処置する方法であって、標準的な化学療法的処置に耐性を持つ個体において、治療有効量のトリフルオペラジンを抗癌剤と組み合わせて投与することを含み、そのうち、前記抗癌剤がトリフルオペラジンの投与の前、同時、または後に個体に対して投与される、癌を処置する方法を提供する。本発明の実施態様において、前記方法は、標準的な化学療法的処置に対する耐性を低下させ、かつＣＳＣの成長及び（または）分化を阻害することができる。また本発明は、標準的な化学療法的処置に耐性を持つ個体において、癌を処置するための医薬組成物も提供する。
【００３０】
本発明に基づき、同時に投与される前記抗癌剤と前記トリフルオペラジンは２つの個別の医薬組成物または１つの医薬組成物に調製することができる。
【００３１】
ここで使用される用語「有効量」または「治療有効量」とは、癌幹細胞の排除または癌の薬剤耐性の減少に充分な量を指し、これは投与方法及び年齢、体重、症状、治療効果、投与経路、処置時間を含む処置対象の条件に依存する。例えば、トリフルオペラジンの有効量は１０〜６０ｍｇ／日、好ましくは２０〜５０ｍｇ／日、またはより好ましくは３５〜４５ｍｇ／日とすることができる。
【００３２】
手術、放射線治療、及び（または）化学療法での初期処置後に癌が進行したまたは再び現れたとき、これを再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔまたはｒｅｌａｐｓｅｄ）という。例えば、手術、放射線治療、及び（または）化学療法での初期処置を受けた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者のうち、約３分の１の患者が再発性ＮＳＣＬＣと診断される。非小細胞肺癌の患者にとって、やはり外科的切除が主な処置である。しかしながら報告によると、ステージＩのＮＳＣＬＣにおける失敗率は２７％〜３８％であり、約９０％の癌による死亡が腫瘍の再発または転移と関係がある。本発明では、処置の３〜４週間後ＣＬ９７の大量腫瘍細胞を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルで、トリフルオペラジン単独またはトリフルオペラジンとゲフィチニブの組み合わせの両方がマウスにおける腫瘍組織量を大幅に減少し、一方ゲフィチニブ単独では腫瘍再発の抑制に効果がなかったことが示された（図４Ａ）。
【００３３】
このため、本発明はまた、治療有効量の前記式（Ｉ）で表される化合物、特にトリフルオペラジンと、ゲフィチニブまたはシスプラチンなどの抗癌剤を含む、癌再発を予防または遅延するための医薬組成物を提供する。具体的に、前記医薬組成物は、手術、放射線治療、及び（または）化学療法などの初期処置を受けた後の癌患者に投与される。
【００３４】
本発明では、非経口または経口投与を含むがこれらに限定されない、任意の適切な経路で有効成分を投与することができる。非経口投与用の組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、及び投与の直前に溶媒中に溶解または懸濁される固体の注射可能な組成物を含む。注射剤は１つ以上の前記有効成分を希釈剤中で溶解、懸濁、または乳化させることにより調製することができる。前記希釈剤の例は、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、アルコール、及びその組み合わせである。さらに、前記注射剤は安定剤、可溶化剤、懸濁剤、乳化剤、緩和剤、緩衝剤、防腐剤等を含むことができる。前記注射剤は最終製剤工程で滅菌されるか、滅菌手順で調製される。また、本発明の医薬組成物は、例えば冷凍乾燥によって、滅菌固体に調製することもでき、かつ滅菌後、または使用する直前に滅菌注射水またはその他滅菌希釈剤中に溶解後使用することができる。
【００３５】
以下、本発明についてさらに次の実施例に基づき説明する。これらの実施例は限定ではなく例示を目的として提供されている。
【実施例１】
【００３６】
１.材料及び方法
細胞培養、化学試験、コロニー形成アッセイ
ＮＳＣＬＣ癌細胞株、Ａ５４９、Ｈ１９７５、ＣＬ２５、ＣＬ８３、ＣＬ９７、ＣＬ１４１、ＣＬ１５２がＲＰＭＩ培地中で培養された。試験された細胞がそれぞれ１ウェル当たり１０４細胞１４日間６ウェルプレートに播種された。各ウェルにはＮＳＣＬＣ細胞の培養環境として１０ｍｌのＲＰＭＩ培地が入れられた。トリフルオペラジン、クロルプロマジン、チオリダジン、トリフルプロマジン、プロマジンがＳｉｇｍａより購入され、ペルフェナジンがｐｒｅｓｔｗｉｃｋより購入された。トリフルオペラジン及びその他試験された薬物が細胞の播種の２４時間後に添加された。培地とトリフルオペラジンは４日目に一度交換された。処理を経た後、細胞がＰＢＳで洗浄され、コロニーが固定液（酢酸：メタノール＝１：３）で固定され、メタノール中で０．５％のクリスタルバイオレットにより染色された。慎重にクリスタルバイオレットを除去し、水道水で洗浄した後、コロニーが手動でカウントされた。
【００３７】
サイドポピュレーション分析とフローサイトメトリーを使用した純化
細胞の単細胞懸濁液がトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養皿から分離され、３％のウシ胎児血清と１０ｍＭのＨｅｐｅｓを補充したハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で１×１０６細胞／ｍＬで懸濁された。その後これらの細胞は、単独または５０μmｏｌ／Ｌのベラパミル（Ｓｉｇｍａ、ベラパミル感受性ＡＢＣトランスポーターの阻害剤）の存在下で、２０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）で、３７℃で９０分間インキュベーションされた。９０分のインキュベーション後、細胞が３００ｇと４℃ですぐに５分間遠心分離され、氷冷（ｉｃｅ−ｃｏｌｄ）ＨＢＳＳで再懸濁された。細胞はＨｏｅｃｈｓｔ染色剤の流出を防止するために氷上で保存され、死亡細胞を区別するために１μｇ／ｍＬのよう化プロピジウム（ＢＤ）が添加された。最後に、これらの細胞が４０μＭの細胞濾過器（ＢＤ）でフィルタリングされ、シングル懸濁細胞（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）が取得された。細胞二波長分光分析と純化がデュアルレーザーＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤ）で実行された。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２が３５５ｎｍ紫外光で励起され、４５０／２０バンドパス（ＢＰ）フィルターで青色蛍光を発し、６７５ｎｍエッジフィルターロングパス（ＥＦＬＰ）で赤色蛍光を発した。６１０ｎｍダイクロイックミラーショートパス（ＤＭＳＰ）を使用して発光波長を分離した。ＰＩ陽性（死亡）細胞は分析から除外された。
【００３８】
軟寒天アッセイ
分類したばかりのＣＬ１４１サイドポピュレーション（ＳＰ）と非サイドポピュレーション（ＮＳＰ）細胞がカウントされ、１％アガロースでコーティングされた６ウェルプレート中に、１ウェル当たり２００細胞でトリプリケート固定された。トリフルオペラジン（０、５、１０μＭ）を含む培地と含まない培地（４日ごとに交換）でインキュベーションを行い、１０〜１４日後に足場非依存性増殖が評価された。プレートが０．００５％クリスタルバイオレットで染色され、顕微鏡でコロニーが手動でカウントされ、写真撮影された。
【００３９】
腫瘍スフェロイドアッセイ
腫瘍スフェロイド形成のため、２０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮細胞成長因子（Ｈｅｇｆ）、１０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ｈＦＧＦ−ｂ）及びＮｅｕｒｏＣｕｌｔ  ＮＳ−Ａ増殖サプリメントが補充されたＨＥＳｃＧＲＯ無血清培地（ヒト）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で細胞が培養された。細胞が１２ウェル低接着性プレート中に１ウェル当たり１ｍＬで低密度（１０００細胞／ｍＬ）播種された。スフェロイド（緊密、球状、非接着性の塊、直径＞９０μＭ）がカウントされ、少なくとも１群あたり５０のスフェロイドが接眼マイクロメータで測定された。二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）スフェロイド形成アッセイのため、一次（ｐｒｉｍａｒｙ）スフェロイドが機械で分離され、プライマリアッセイと同じように処理された。スフェロイド形成細胞の割合を数量化するため、細胞が１ウェル当たり１細胞で９６ウェルプレートに播種された。
【００４０】
レポーターアッセイ
スフェロイド細胞が６ウェルプレートに入れられ、８０％〜９０％コンフルエンスまで増殖されて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して１．８μｇのＴＯＰｆｌａｓｈまたはＦＯＰｆｌａｓｈプラスミドで一過的にトランスフェクションされた。ＴＯＰｆｌａｓｈはチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子の川上に３コピーのＴｃｆ／Ｌｅｆ結合部位を含む。ＦＯＰｆｌａｓｈはＴｃｆ／Ｌｅｆ部位の変異コピーを含み、レポーターの非特異的な活性化測定のための対照として使用される。トランスフェクション効率の標準化のため、細胞はＴＫプロモーターにより駆動される、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼをエンコードする０．２μｇの内部標準レポーターが共導入された。トランスフェクションの後、細胞はトリフルオペラジン（０〜１０μＭ）ありまたはなしの培地で４８時間インキュベーションされた後、採取してレポーター溶解緩衝液で溶解された。ルシフェラーゼ活性がマイクロプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用してルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定された。実験はトリプリケートで行われ、結果はトランスフェクション効率標準化後対照群と比較した誘発倍率で表された。
【００４１】
Ａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ
この研究では、高アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）酵素活性が肺ＣＳＣポピュレーション検出に使用された。Ａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイは製造元（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指針に従って実施された。簡単に説明すると、細胞培養から取得された単細胞がＡＬＤＨ基質（ｂｏｄｉｐｙ−アミノアセトアルデヒド、ＢＡＡＡ）を含むＡｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ緩衝液において５０分間３７℃でインキュベーションされた。陰性対照として、同一条件下でＡＬＤＨ阻害剤（ジエチルアミノベンズアルデヒド、ＤＥＡＢ）を加えて各試料からの細胞の一部がインキュベーションされた。フローサイトメトリーを使用してＡＬＤＨ−陽性細胞ポピュレーションが測定された。
【００４２】
ウェスタンブロット分析
細胞が溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）で溶解された。全タンパク質が分離され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動が行われ、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気的に転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）された。一次抗体Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−２、ＸＩＡＰ、Ｍｃｌ−１、切断型カスパーゼ９、カスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ｃ−Ｍｙｃ、ＣＤ４４、サイクリンＤ１がＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから取得され、ＭｅｔがＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入され、ＣＤ１３３がＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから、及び抗マウスおよび抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合用二次抗体がＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから取得された。タンパク質の検出がエンハンスドケミルミネッセンス（ＥＣＬＴＭ）法で行われ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＡＳ−４０００ＴＭ、Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ）により撮影された。
【００４３】
安定的な二重レポーター発現肺癌細胞株の作成
二重光学レポーターシステムＬ２Ｇ融合構築物（ホタルルシフェラーゼ２及びｅＧＦＰ）がスタンフォード大学Ｇａｍｂｈｉｒ博士より寛大に供与された。これに基づき安定的なＬ２Ｇ発現ＣＬ９７細胞が作製された。簡単に説明すると、Ｌ２Ｇレポーターを安定的に統合したＣＬ９７細胞がレンチウイルス媒介遺伝子導入によって作製された。２９３ＦＴ細胞がレンチウイルスベクターＬ２Ｇ、パッケージングプラスミドｐＣＭＶΔ８．７４とエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７；１５：８７１〜８７５）でトランスフェクションされた。標的のＣＬ９７細胞がウイルス粒子で感染され、ゼオシンを使用して選択された。Ｌ２Ｇレポーターシステム（ＣＬ９７−Ｌ２Ｇ）を備えたＣＬ９７細胞が取得され、さらなる実験に用いられた。
【００４４】
非侵襲性生体発光イメージングを使用したトリフルオペラジンンの抗CSC効果の評価
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが国立台湾大学より購入され、機構の方針に従って維持された。すべての動物手順が台北医学大学ＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、国家動物実験中心）より認証された。
【００４５】
大量の肺腫瘍モデルについては、ＣＬ９７−Ｌ２Ｇ細胞が１×１０６細胞／１００μｌ  ＰＢＳの濃度で尾の静脈から動物の体内に注射投与された。腫瘍注射の１週間後、異なる処置計画が開始された。４つの計画が実行され、トリフルオペラジン（５ｍｇ／ｋｇ／日）、ゲフィチニブ（１５０ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与）、及びトリフルオペラジン（５ｍｇ／ｋｇ／日腹腔注射）＋ゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与）の組み合わせを４週間実施した。
【００４６】
トリフルオペラジンの予防及び抗ＣＳＣ効果を調べるため、ＣＬ９７−Ｌ２Ｇスフェロイドがトリフルオペラジン（５μＭ、＜ＩＣ５０、一夜処理）で事前処理され、それらのスフェロイドの形式から再懸濁され、かつＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肺に同所的に注射された（１ｘ１０４細胞／５０μＬ基底膜／接種）。動物はこの実験の期間中さらなる処置は受けなかった。ＣＬ９７−Ｌ２Ｇを有するマウス（大量肺腫瘍モデルとＣＳＣモデル両方）の画像がＩＶＩＳ２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して毎週取得された。データは全光子束／初期全光子束の倍率変化として表され、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  １．０ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析された。マウスは実験の終わりに人道的に犠牲にされ、肺腫瘍の生検がさらなる分析のために取得された。
【００４７】
２、結果
トリフルオペラジンがゲフィチニブ耐性ＮＳＣＬＣ細胞の増殖と誘導されるアポトーシスを阻害した
トリフルオペラジンが抗ＣＳＣ効果を発揮して腫瘍の成長を阻害して薬剤耐性を克服すると仮説を立てた。一般的に使用される細胞株（Ａ５４９及びＨ１９７５）に加え、ＣＬ８３、ＣＬ１４１、ＣＬ１５２、ＣＬ２５、ＣＬ９７細胞株を含む、国立台湾大学付属医院のＮＳＣＬＣ患者の胸水から分離されたいくつかの細胞株も確立した。この研究は国立台湾大学付属医院の機構審査委員会による認可を得ている。胸水の収集に先立ち、インフォームドコンセントが取得された。組織学的及び変異の特性、及びＥＧＦＲ  ＴＫＩに対して先天的または後天的な耐性を備えているのかを含む、これら細胞株の主な機能の概要を表３に示す。トリフルオペラジンは容量依存的にＮＳＣＬＣ細胞成長を阻害し、ＣＬ８３、ＣＬ１４１、ＣＬ１５２、ＣＬ２５、ＣＬ９７、Ｈ１９７５についてのそれぞれのＩＣ５０値（４８時間のインキュベーション）が１４、８．５、１２、１３、７．２、１５μＭである（表３と図１）ことが示された。
【００４８】
【表３】
2014530885.tif 000008
【００４９】
これらの細胞株のうち、ゲフィチニブ耐性を示す野生型ＥＧＦＲ状態の腺癌ＣＬ１４１をアポトーシス分析用の代表的標的細胞株として選択した。異なる用量でのトリフルオペラジンの処理後にアネキシンＶ／ＰＩ染色が実施された。早期及び進行アポトーシス細胞の両方がカウントされた。４８時間後、対照細胞と比較したとき、トリフルオペラジン処理済ＣＬ１４１細胞はアネキシンＶ陽性細胞において用量依存的な増加を示した（図１Ｂ）。この結果は、トリフルオペラジンがゲフィチニブ耐性ＮＳＣＬＣ細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導したことを示唆している。
【００５０】
トリフルオペラジンが肺ＣＳＣの割合を減少し、アポトーシスを誘導した
ゲフィチニブ耐性細胞株ＣＬ８３、ＣＬ１４１、ＣＬ１５２（野生型ＥＧＦＲあり）、ＣＬ９７（ＥＧＦＲ−Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異あり）を選択し、サイドポピュレーション法を使用して（それぞれ１．５４％、２．１３％、１．９５％、１．９％のサイドポピュレーション細胞）それらのＣＳＣを分離した。５μＭトリフルオペラジンでの処理後、サイドポピュレーション細胞の割合が大幅に減少した（図１Ｃ）。
【００５１】
さらに明確にするため、トリフルオペラジン処理が造血及びＮＳＣＬＣ  ＣＳＣ両方の確立済みマーカーであるＡＬＤＨ発現細胞の割合を減少できるか調べた。ＣＬ１４１（腺癌）及びＣＬ１５２（扁平上皮癌）が代表的標的ＮＳＣＬＣ細胞株として選択された。トリフルオペラジン処理はＡＬＤＨ＋ＣＬ１４１細胞数を４．３１％から０．８４％に、そしてＣＬ１５２細胞では３．７３％から１．０８％に減少した（図１Ｄ）。
【００５２】
トリフルオペラジン処理後の肺ＣＳＣにおけるアポトーシス関連のシグナル伝達を調査するため、ＣＬ９７（腺癌、ＥＧＦＲ−Ｔ７９０Ｍ後天的耐性変異あり）が標的細胞株として選択された。ＣＬ９７癌スフェロイドのトリフルオペラジン処理後、Ｂａｘ、Ｂａｋ、切断型ＰＡＲＰ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９が用量依存的に増加し、一方で抗アポトーシスＢｃｌ−２、ＸＩＡＰ、Ｍｃｌ−１が減少した（図１Ｅ）。
【００５３】
トリフルオペラジンが肺ＣＳＣのコロニー形成能及び幹細胞性関連マーカーを阻害した
トリフルオペラジンの腫瘍スフェロイド形成に対する影響を調べるため、ＣＬ１４１（野生型ＥＧＦＲ）、ＣＬ８３（野生型ＥＧＦＲ）、ＣＬ９７（ＥＧＦＲ−Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ後天的耐性変異）の３つの異なるゲフィチニブ耐性肺ＣＳＣがトリフルオペラジンで処理された。トリフルオペラジンはすべてのスフェロイドで用量依存的に大きさと数を減少した（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ）。軟寒天でのＣＬ１４１スフェロイドの平均コロニー形成は５または１０μＭのトリフルオペラジンでの処理１２日後に減少した（図２Ｃ、平均コロニー数、対照：９２、５μＭ：３２、１０μＭ：８）。ＣＬ１４１及びＣＬ９７スフェロイドがトリフルオペラジンの用量を増加して（０、２．５、５、１０μＭ）４８時間処理された。２つの確立された肺ＣＳＣマーカー、ＣＤ４４とＣＤ１３３は、ウェスタンブロットと免疫組織化学染色により測定されたように、トリフルオペラジンによって用量依存的に下方制御された（図２Ｄと図２Ｅ）。
【００５４】
トリフルオペラジンにより媒介される分子メカニズムを調べるため、ＣＬ９７スフェロイドがトリフルオペラジンで処理され、ウェスタンブロットで分析された。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達下流の標的、サイクリンＤ１とｃ−Ｍｙｃ、及びｃ−Ｍｅｔがトリフルオペラジンにより減少した（図２Ｆ）。さらに、トリフルオペラジン（低濃度、２．５μＭ）はＣＬ１４１スフェロイドにおいてＴＣＦが媒介する転写を阻害し、スフェロイド形成を妨げた（図２Ｇ）。
【００５５】
トリフルオペラジンはシスプラチンまたはゲフィチニブとの組み合わせで肺ＣＳＣを生体外で相乗的に阻害する
ＣＬ１４１（野生型ＥＧＦＲ）、ＣＬ８３（野生型ＥＧＦＲ）、ＣＬ９７（ＥＧＦＲ−Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ後天的耐性変異）の３つのゲフィチニブ耐性ＮＳＣＬＣ細胞株を選択して、トリフルオペラジンがこれら細胞を科学治療薬物に対して感作できるか否かを調べた。１０μＭのシスプラチンで２４時間処理すると、ＣＬ１４１、ＣＬ８３、ＣＬ９７スフェロイドのすべてが母細胞よりも大幅に高いＩＣ５０を示した（図３Ａ）。同一条件下で、すべてのスフェロイドがそれらの母細胞よりも高い生存能力とより低いカスパーゼ−３活性を示した（図３Ｂと図３Ｃ）。
【００５６】
次に、トリフルオペラジンがシスプラチンまたはゲフィチニブの細胞毒性効果を増進できるか否かを調べた。トリフルオペラジンとシスプラチンの併用処理はＣＬ８３及びＣＬ１４１スフェロイドの両方で、トリフルオペラジンまたはシスプラチン単独処理よりも大幅に高い細胞毒性効果を示した（図３Ｄ）。
【００５７】
イソボログラフ（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ）法を使用して、トリフルオペラジンとゲフィチニブの組み合わせ活性の評価が行われた（Ｃｈｏｕ  ＴＣ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ  Ｐ．Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ  １９８４；２２：２７〜５５）。線より下の値は相乗的で、線付近の値は相加的で、線より上の値は拮抗的であることを表す。両薬剤の相乗的活性がＥＧＦＲ野生型細胞（ＣＬ１４１）、ＥＧＦＲ−Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異細胞（ＣＬ９７）及びＥＧＦＲ−エクソン１９除去細胞（ＣＬ２５）から取得された標準化イソボログラム解析より示された（図３Ｅ）。増強された細胞毒性もＣＬ１４１、ＣＬ９７、ＣＬ２５スフェロイドのすべてで観察された。ゲフィチニブ治療に対するトリフルオペラジンの効果を調べるため、ＣＬ２５（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ感作細胞株）スフェロイド成長阻害アッセイが陽性対照として実施された。ＣＬ２５スフェロイドは個別の薬剤またはトリフルオペラジンとゲフィチニブの組み合わせに暴露され、ＣＬ１４１とＣＬ９７細胞株も同様とした（図３Ｆ）。ゲフィチニブ単独ではＣＬ２５におけるスフェロイド形成を効果的に抑制したが、ＣＬ１４１とＣＬ９７細胞では大幅に低かった。トリフルオペラジンとゲフィチニブの組み合わせはＣＬ１４１とＣＬ９７のスフェロイド形成を大幅に抑制した。これらの観察は、トリフルオペラジンの追加がゲフィチニブ耐性肺癌細胞を感作することを示した。さらに、ＡＬＤＨ＋ＣＬ１４１細胞の割合がトリフルオペラジン１０μＭでやや減少した。しかしながら、トリフルオペラジンがゲフィチニブ５μＭと組み合わされたとき阻害効果の増強が観察された（図３Ｇ）。類似の増強効果がＣＬ１４１スフェロイド形成において観察された（図３Ｈ）。
【００５８】
トリフルオペラジン処置がマウス肺癌モデルにおいてゲフィチニブ耐性ＣＬ９７−Ｌ２Ｇの腫瘍形成を抑制した
ゲフィチニブ耐性ＣＬ９７−Ｌ２Ｇ（Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ後天的耐性変異）細胞を持つＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用してトリフルオペラジンの抗腫瘍効果が評価された。まず、ＣＬ９７大量腫瘍細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に注射され、続いてビヒクルとトリフルオペラジン単独（５ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）、ゲフィチニブ単独（１５０ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与）、またはトリフルオペラジン（５ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）とゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与）併用の処置を受けた。比較すると、トリフルオペラジン単独の投与を受けたマウスはビヒクル及びゲフィチニブ投与の処置を受けたマウスよりも大幅に低い腫瘍組織量を示した（図４Ａ）。予期された通り、ゲフィチニブ処置マウスはビヒクル対照群と同レベルの腫瘍組織量を示した。ゲフィチニブ／トリフルオペラジン併用処置を受けたマウスは最低の腫瘍組織量を示した。腫瘍組織量は生物発光強度における倍率変化に基づいて測定かつ数量化された。
【００５９】
予防実験において、ＣＬ９７−Ｌ２Ｇ細胞がビヒクルまたはトリフルオペラジン（５μＭ、＜ＩＣ５０）で事前処理され、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに同所的に移植された。トリフルオペラジンで事前処理されたＣＬ９７−Ｌ２Ｇ細胞の移植を受けたマウスは、ビヒクル処理の対照群と比較して、原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）腫瘍成長が遅延し、かつ大幅に減少した（図４Ｂ）。トリフルオペラジンにより媒介される分子メカニズムを探るため、腫瘍試料から全タンパク質溶解物が採取された。ｃ−Ｍｙｃとβ−カテニンを含む幹細胞性分子の発現レベルは減少したことが分かった。サイクリンＤ１発現もトリフルオペラジンと併用処置の両方によって抑制され、一方カスパーゼ３の活性化（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）形態がトリフルオペラジンと併用処置の両方によって増加された（図４Ｃ）。ゲフィチニブ処理はｃ−Ｍｙｃまたはβ−カテニンの発現レベルに大きな影響を与えなかった。
【００６０】
本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、さらなる例示の必要なく、ここに開示された説明に基づき、本発明を最大限の範囲で利用することができるはずである。したがって、本発明の明細書及び特許請求の範囲は本発明の範囲を制限するものではなく、例示目的として理解されるべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
2014530885.tif 000014
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2014530885.tif 000021
2014530885.tif 000022