(57)【要約】  本発明は、分析物の存在、不存在または特性を決定する新規な方法に関する。分析物は、膜に結合されている。本発明は、核酸配列決定にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物の存在、不存在または特性を決定するための方法であって、（ａ）膜に前記分析物を結合させるステップと（ｂ）前記分析物を前記膜に存在する検出器と相互作用させ、それによって前記分析物の存在、不存在または特性を決定するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記膜が、両親媒性層または固体層である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜が、脂質二重層である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析物が、ポリペプチドまたは疎水性アンカーを介して前記膜に結合される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性アンカーが、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物が、リンカーを介して前記膜に結合される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分析物が、前記膜に一時的にまたは持続的に結合される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出器が、電気的な手段によって前記分析物を検出する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出器が、膜貫通細孔を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜貫通細孔が、膜貫通タンパク質細孔である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通タンパク質細孔が、Ｍｓｐまたはα−溶血素（α−ＨＬ）から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細孔が、前記分析物の検出を促進する分子アダプターを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出器が、ポリヌクレオチド結合タンパク質、場合によってはエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）前記分析物を前記検出器と相互作用させるステップと、
（ｂ）前記相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによって前記分析物の存在、不存在または特性を決定するステップと
を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物を同定するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標的ポリヌクレオチドの配列を推定するためまたは配列決定するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的ポリヌクレオチドを消化して断片を提供し、前記断片を検出するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定する方法であって、
（ａ）膜に前記標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、
（ｂ）エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の端から個々のヌクレオチドを消化するように、前記膜に存在する、膜貫通細孔およびエキソヌクレアーゼを含む検出器と、前記標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、
（ｃ）前記ヌクレオチドを前記細孔と相互作用させるステップと、
（ｄ）前記相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによって前記ヌクレオチドの種類を決定するステップと、
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドの同じ末端でステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、それによって前記標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定する方法であって、
（ａ）膜に前記標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドが膜貫通細孔を通って移動するように、前記膜に存在する、前記細孔を含む検出器と、前記標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドが前記細孔に関連して移動するときに前記細孔を通る電流を測定し、それによって前記標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
（ａ）膜に前記標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、
（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質が膜貫通細孔を通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、前記標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドが前記細孔と相互作用するように、前記膜に存在する、前記細孔および前記タンパク質を含む検出器と、前記標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドが前記細孔に関連して移動するときに前記細孔を通る電流を測定し、それによって前記標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）膜貫通細孔、（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質および（ｃ）膜に前記標的ポリヌクレオチドを結合させる手段を含む、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定するためのキット。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、エキソヌクレアーゼであり、前記キットが、前記細孔と前記標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドとの相互作用を促進する分子アダプターをさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
（ａ）膜、（ｂ）前記膜にある複数の膜貫通細孔、（ｃ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質および（ｄ）前記膜に結合している複数の標的ポリヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定するための装置
【請求項２４】
前記膜および複数の細孔を支持することができ、前記細孔を使用してポリヌクレオチドの配列決定を行うように操作できるセンサーデバイスと、前記配列決定を行うための材料保持用の少なくとも１つの貯蔵部とを含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記膜および複数の細孔を支持することができ、前記細孔を使用してポリヌクレオチドの配列決定を行うように操作できるセンサーデバイスと、
前記配列決定を行うための材料保持用の少なくとも１つの貯蔵部と、
前記少なくとも１つの貯蔵部から前記センサーデバイスへと材料を制御可能に供給するよう構成された流体系と、
それぞれのサンプルを受けるための１つまたは複数の容器とを含み、前記流体系が、前記１つまたは複数の容器から前記センサーデバイスへと選択的に前記サンプルを供給するよう構成されている、
請求項２３または２４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物の存在、不存在または特性を決定する新規な方法に関する。分析物は、膜に結合されている。本発明は、核酸配列決定にも関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、広範な用途にわたって迅速かつ安価に核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を配列決定する技術の必要性がある。既存の技術は、主に大量の核酸を作製するために増幅技術を利用し、シグナル検出用として多量の専用の蛍光化学物質を必要とするので、時間と費用がかかる。
【０００３】
ナノ細孔は、ポリマーおよび様々な小分子に対する直接的で電気的なバイオセンサーとしての潜在性が大きい。特に、最近の焦点は、潜在的なＤＮＡ配列決定技術としてのナノ細孔に当てられてきた。ＤＮＡ配列決定について２つの方法；塩基がポリヌクレオチドからエキソヌクレアーゼによって前進しながら切断され、次いでナノ細孔によって個別に同定される「エキソヌクレアーゼ配列決定法」およびまた、一本鎖ＤＮＡが細孔を通過し、ヌクレオチドが直接同定される「鎖配列決定法（strand sequencing）」が提唱された。鎖配列決定法は、ＤＮＡハンドリング酵素を使用してナノ細孔を通るポリヌクレオチドの移動を制御することができる。
【０００４】
ナノ細孔に電位が印加されるときに、ヌクレオチドなどの分析物がある一定時間一時的にバレル内に存在する場合、電流の流れが低下する。分析物のナノ細孔検出は、既知のシグネチャーおよび継続時間の電流遮断を生じる。次いで、単位時間当たりの単一細孔に対する遮断事象の数によって分析物の濃度を決定することができる。
【０００５】
ＤＮＡ配列決定などのナノ細孔用途の場合、溶液から分析物を効果的に捕捉する必要がある。例えば、ＤＮＡ配列決定において使用されるＤＮＡハンドリング酵素に、効果的に配列決定するのに十分高いデューティサイクルを与えるためには、現在のポリヌクレオチドが終了するとすぐに新しいそれが結合できるように、酵素とポリヌクレオチドとの相互作用の数を最大にする必要がある。したがって、ＤＮＡ配列決定において、酵素が１つの処理を終えるとすぐに、次が直ちに結合できるように、可能な限り高濃度でポリヌクレオチドを有することが好ましい。ＤＮＡなどのポリヌクレオチドの濃度に制限があるとき（例えばエピジェネティクス用の癌細胞サンプル由来ＤＮＡ）、これが特別な問題になる。サンプルを希釈すればするほど、配列決定動作の間隔が長くなり、最初のポリヌクレオチドを結合する時点までが非常に制限されるので、それは実現不可能である。
【０００６】
ナノ細孔検出の限界が、様々な分析物について推定された。タンパク質ナノ細孔（溶血素）による９２ヌクレオチド合成一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）片の捕捉が、３．０±０．２ｓ−１ｕＭ−１の頻度で決定された（Maglia, Restrepo et al. 2008, Proc Natl Acad Sci U S A 105(50): 19720-5）。捕捉は、溶血素バレルへの入口に正電荷の環を加えることによって約１０倍増大する可能性がある（２３．０±２ｓ−１ｕＭ−１）。この状況において、１ｕＭの９２ヌクレオチドｓｓＤＮＡは、シスチャンバ容積を１ｍＬとすると、単一チャネル記録当たりに必要とされるＤＮＡ３１ｕｇに相当する。現在、市場を先導しているヒト血液からのゲノムＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ'ｓ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  ｋｉｔ）は、ヒト全血８．５ｍＬからゲノムＤＮＡ１５０〜５００ｕｇの予想収量が得られる。したがって、分析物検出において開示されたこの増加は、超高感度検出および送達に必要となる段階の変化にはまだほど遠い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、適切な検出器が存在する膜に分析物を結合させることによる超低濃度分析物送達を実証した。これにより、検出に必要とされる分析物の量は数桁下がる。必要な分析物の量が減る程度は、予測できなかった。
【０００８】
具体的には、驚くべきことに、本発明者らは、以前に報告された一本鎖ＤＮＡの捕捉の増加を上回る約４桁の増加を報告する。ここで検出器と分析物の両方が同じ平面にあるとき、その場合両分子の拡散は三次元ではなく二次元なので、１秒につき約１０３Ｍ  ｓ−１より多い相互作用が起こる。これは、次世代配列決定システムなどの診断装置の主要な懸念事項であるサンプル調製要件において非常に大きな意味を持つ。
【０００９】
加えて、膜への分析物の結合は、様々なナノ細孔−酵素配列決定用途に対してさらなる利点がある。エキソヌクレアーゼ配列決定法にＤＮＡ分析物が導入されるとき、細孔が持続的または一時的に遮断され、個々のヌクレオチドの検出が妨げられる場合がある。ＤＮＡ分析物の一方の末端を、例えば膜に結合するまたは係留することによって細孔から離して局在させるとき、驚くべきことに、この一時的または持続的な遮断がもはや観察されなくなることが判明した。膜にＤＮＡの一方の末端を結合することによってそれを占有することにより、検出器上の分析物濃度を効果的に増加させ、それゆえ配列決定システムのデューティサイクルが増加するようにも作用する。これについては以下で詳述する。
【００１０】
したがって、本発明は、分析物の存在、不存在または特性を決定するための方法であって、（ａ）膜に分析物を結合させるステップと、（ｂ）分析物を膜に存在する検出器と相互作用させ、それによって分析物の存在、不存在または特性を決定するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明は、
−標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定する方法であって、
（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、
（ｂ）エキソヌクレアーゼが標的ポリヌクレオチドの一方の端から個々のヌクレオチドを消化するように、膜に存在する、膜貫通細孔およびエキソヌクレアーゼを含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、
（ｃ）ヌクレオチドを細孔と相互作用させるステップと、
（ｄ）相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってヌクレオチドの種類を決定するステップと、
（ｅ）標的ポリヌクレオチドの同じ末端でステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法；
−標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定する方法であって、
（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、
（ｂ）標的ポリヌクレオチドが膜貫通細孔を通って移動するように、膜に存在する、膜貫通細孔を含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、
（ｃ）標的ポリヌクレオチドが細孔に関連して移動するときに細孔を通る電流を測定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法；
−（ａ）膜貫通細孔、（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質および（ｃ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させる手段を含む、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定するためのキット；ならびに
−（ａ）膜、（ｂ）膜にある複数の膜貫通細孔、（ｃ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質、および（ｄ）膜に結合している複数の標的ポリヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定するための装置も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】分析物のナノ細孔検出を示す図である。Ａ）は、灰色の矢印によって表示される電流の流れの方向とともにナノ細孔を示す。予測される電流の波形が下に示される。Ｂ）は、細孔を通って移行する分析物があるナノ細孔が示される。分析物の移動方向が矢印１で、電流の流れの方向が灰色の矢印で表示される。分析物が細孔を通って移行するときに電流がどのように変化するかを示している予測される電流の波形が下に示される。
【図２】ＤＮＡナノ細孔相互作用を係留する方法を示す図である。セクションＡおよびＢは、一時的に係留されたｓｓＤＮＡ、およびｓｓＤＮＡが細孔を通って移行するときに電流波形がどのように変化するかを示している。セクションＣおよびＤは、安定的に係留されたｓｓＤＮＡ、およびｓｓＤＮＡが細孔によって捕捉されるときに電流波形がどのように変化するかを示している。
【図３】ＤＮＡ−酵素複合体の捕捉、それに続くＤＮＡと酵素の解離、およびその後のＤＮＡ脱ハイブリダイゼーションを示す図である。
【図４】実施例２の実験的構成を示す図である。（１）溶液中の材料濃度が高ナノモル範囲（４００ｎＭ  ＤＮＡが使用され、８００ｎＮ酵素が使用される）であるプライマー／鋳型ＤＮＡ分析物（Ａ−上）と、（２）材料の量がナノモル以下（１ｎＭ  ＤＮＡが使用され、５ｎＮ酵素が使用される）である係留された系（Ｂ−下）との比較。
【図５】ＫＦ非存在下において係留されていない分析物（ＤＮＡ）に対するナノ細孔上部でのＫＦ結合時間を示す図である（ＤＮＡ濃度＝４００ｎＭ）。
【図６】ＫＦ存在下において係留されていない分析物（ＤＮＡ）に対するナノ細孔上部でのＫＦ結合時間を示す図である（ＤＮＡ濃度＝４００ｎＭ、ＫＦ濃度＝８００ｎＭ）。ＫＦ結合は、１〜１００ｍｓであった。
【図７】ＫＦ非存在下において係留された分析物（ＤＮＡ）に対するナノ細孔上部でのＫＦ結合時間を示す図である（ＤＮＡ濃度＝１ｎＭ）。
【図８】ＫＦ存在下において係留された分析物（ＤＮＡ）に対するナノ細孔上部でのＫＦ結合時間を示す図である（ＤＮＡ濃度＝１ｎＭ、ＫＦ濃度＝５ｎＭ）。ＫＦ結合は、０．１〜１０ｓであった。
【図９】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼに媒介される、一時的に係留されているｄｓＤＮＡのアンジッピング事象の一例を示す図である。開孔レベルからの電流の低下は、ＤＮＡ：タンパク質複合体を捕捉することによって引き起こされる遮断であると考えられる。この捕捉された複合体は、約５秒間ナノ細孔に存在し、定電流レベルを生じた後にレベル間を急速に変化し、その後最終的に開孔レベルに戻る。これは、アンジッピングが開始され単一のＡが読取機上部を通って移動する前の停止であり、そのようにして電流に振動を与えると考えられる。二重鎖が完全にほどけたとき、標的鎖は移行してプライマーとポリメラーゼが解離するので電流は開孔レベルに戻る。
【図１０】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼに媒介される溶液ｄｓＤＮＡのアンジッピング事象の一例を示す図である。開孔レベルからの電流の低下は、ＤＮＡ：タンパク質複合体を捕捉することによって引き起こされる遮断であると考えられる。この捕捉された複合体は、約１２秒間ナノ細孔に存在し、定電流レベルを生じた後にレベル間を急速に変化し、その後最終的に開孔レベルに戻る。これは、アンジッピングが開始される前の停止であると考えられ、単一のＡが読取機上部を通って移動するときに電流に振動を与える。二本鎖が完全にほどけたとき、標的鎖は移行してプライマーとポリメラーゼが解離するので電流は開孔レベルに戻る。
【図１１】係留されていないｄｓＤＮＡ分析物に対する１回のアンジッピング動作からの事象シーケンスの一例を示す図である。観察されたレベルの数ならびにこれらのレベルおよび継続時間は、係留された実験と広く整合性がとれている。
【図１２】係留されているｄｓＤＮＡ分析物に対する１回のアンジッピング動作からの事象シーケンスの一例を示す図である。観察されたレベルの数ならびにこれらのレベルおよび継続時間は、溶液（係留されていない）ＤＮＡ実験と広く整合性がとれている。
【図１３】ゲノムＤＮＡに由来する、係留された鎖の配列決定分析物のプラスミド地図を示す図である。プライマーは、ＰｈｉＸ１７４ゲノムＤＮＡと相補的に設計された。同じセンスプライマーを全てに使用し、相補領域の前に５’−５０ポリＴ領域その後に４つの脱塩基部位を含有させた。アンチセンスプライマーに対するハイブリダイゼーション部位は、望ましい断片サイズによって変更された。各アンチセンスプライマーは、５’−コレステロール基を含有した。
【図１４】ゲノムＤＮＡに由来する、係留された鎖の配列決定分析物のＰＣＲ生成を示す図である。プライマーは、ＰｈｉＸ１７４ゲノムＤＮＡと相補的に設計された。同じセンスプライマーを全てに使用し、相補領域の前に５’−５０ポリＴ領域その後に４つの脱塩基部位を含有させた。アンチセンスプライマーのハイブリダイゼーション部位を、望ましい断片サイズによって変更した。各アンチセンスプライマーは、５’−コレステロール基を含有した。センス鎖の５’に５０ポリＴ領域が存在することを確認するために、断片を、５’−３’一本鎖特異的ＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で消化し、これをゲル上で分析した。レーン１は、５０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ、２３５ｂｐ  ｄｓＤＮＡだけを含有する。レーン２は、５’−３’一本鎖特異的ＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で消化した５０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ、２３５ｂｐ  ｄｓＤＮＡを含有する。レーン３は、５０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ、４００ｂｐ  ｄｓＤＮＡだけを含有する。レーン４は、５’−３’一本鎖特異的ＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で消化した５０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ、４００ｂｐ  ｄｓＤＮＡを含有する。レーン５は、５０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ、８３５ｂｐ  ｄｓＤＮＡだけを含有する。レーン６は、５’−３’一本鎖特異的ＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で消化した５０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ、８３５ｂｐ  ｄｓＤＮＡを含有する。
【図１５】８００ｂｐ  ＰｈｉＸ  １７４増幅断片のアンジッピング事象を示す図である。この８００ｂｐ配列は、示したプラスミド地図中の位置１と位置３の間の配列に対応する。
【図１６】２００ｂｐ  ＰｈｉＸ  １７４増幅断片のアンジッピング事象を示す図である。この２００ｂｐ配列は、示したプラスミド地図中の位置１と位置２の間の配列に対応する。先導および後続ギャップペナルティはゼロ（すなわち、どこから始まるかは自由であるが、「内部」ギャップにはペナルティが課される）で、２００ｍｅｒを図１５に示された８００ｍｅｒ配列に対して整列する。予想された通り、２００ｍｅｒセクションは８００ｍｅｒの前方に整列する。
【図１７】固体ナノ細孔に分析物を係留するスキームを示す図である。Ａ）修飾表面内への係留を示す（層内に係留する）。Ｂ）修飾表面への係留を示す（表面との相互作用）。Ｃ）修飾表面上の脂質単分子層への係留を示す。Ｄ）修飾表面上の脂質二重層への係留を示す。
【図１８】脂質膜に二本鎖ポリヌクレオチドを結合させる方法を示す図である。Ａ）ｄｓＤＮＡ分析物と相互作用している単一の係留されているｄｓＤＮＡ結合タンパク質を示す。Ｂ）単一のｄｓＤＮＡ分析物と相互作用している複数の係留されているｄｓＤＮＡ結合タンパク質を示す。Ｃ）ｄｓＤＮＡ分析物と相互作用している単一の係留されている化学基を示す。
【図１９】脂質膜に一本鎖ポリヌクレオチド分析物を結合させる方法を示す図である。Ａ）ｓｓＤＮＡと相互作用している単一の係留されているｓｓＤＮＡ結合タンパク質を示す。Ｂ）単一のｓｓＤＮＡと相互作用している複数の係留されているｓｓＤＮＡ結合タンパク質を示す。Ｃ）ｓｓＤＮＡと相互作用している単一の係留されている化学基を示す。
【図２０】ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用してナノ細孔を通るＤＮＡの移動を制御する一方法であり、ｄｓＤＮＡ結合タンパク質を利用して膜にＤＮＡを結合させる方法の概略を示す図である。Ａ）ＤＮＡ分析物（ｄｓＤＮＡ領域に付着しているｓｓＤＮＡリーダー（灰色領域）から成る）が、係留されているｄｓＤＮＡ結合タンパク質を使用して膜に結合され、膜表面における濃度の増大がもたらされる。ポリヌクレオチドの移動を制御可能なポリヌクレオチド結合タンパク質がシス区画に添加され、これは、４ｂｐ突出に結合する。Ｂ）印加電圧下で、ＤＮＡ分析物はＤＮＡ上の５’リーダーセクション（灰色領域）を介してナノ細孔によって捕捉される。Ｃ）印加電場の力の下で、結合しているポリヌクレオチド結合タンパク質が細孔上部に接触し、さらなる制御の効かない移行を妨げるまでＤＮＡは細孔中に引き込まれる。この工程において、アンチセンス鎖は、ＤＮＡ鎖から剥され、したがって、結果としてｄｓＤＮＡ結合タンパク質は鎖から分離する。Ｄ）適当な補因子の存在下で、細孔上部のポリヌクレオチド結合タンパク質はＤＮＡに沿って移動し、細孔を通るＤＮＡの移行を制御する。ポリヌクレオチド結合タンパク質が３’から５’方向へとＤＮＡに沿って移動することにより、通されたＤＮＡが印加電場に逆らって細孔からシス区画へと引き抜かれる。ナノ細孔を通過するＤＮＡの最後のセクションは、５’−リーダーである。矢印は、ＤＮＡの移動の方向を表示する。
【図２１】ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用してナノ細孔を通るＤＮＡの移動を制御する一方法であり、ハイブリダイズしている係留鎖を利用する方法の概略を示す図である。Ａ）ＤＮＡ分析物（ｄｓＤＮＡ領域に付着しているｓｓＤＮＡリーダー（灰色領域）から成る）が、ハイブリダイズしている係留鎖を使用して膜に結合され、膜表面における濃度の増大がもたらされる。ＤＮＡの移動を制御可能なポリヌクレオチド結合タンパク質がシス区画に添加され、これは、４ｂｐ突出に結合する。Ｂ）印加電圧下で、ＤＮＡ分析物はＤＮＡ上の５’リーダーセクション（灰色領域）を介してナノ細孔によって捕捉される。Ｃ）印加電場の力の下で、結合しているポリヌクレオチド結合タンパク質が細孔上部に接触し、さらなる制御の効かない移行を妨げるまでＤＮＡは細孔中に引き込まれる。この工程において、膜に係留されているポリヌクレオチド（点線）ははぎ取られて、配列決定される（灰色のリーダー領域を持つ黒い鎖）。Ｄ）適当な補因子の存在下で、細孔上部のポリヌクレオチド結合タンパク質はＤＮＡに沿って移動し、細孔を通るＤＮＡの移行を制御する。ポリヌクレオチド結合タンパク質が３’から５’方向へとＤＮＡに沿って移動することにより、通されたＤＮＡが印加電場に逆らって細孔からシス区画へと引き抜かれる。ナノ細孔を通過するＤＮＡの最後のセクションは、５’−リーダーである。矢印は、ＤＮＡの移動の方向を表示する。
【図２２】ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用してナノ細孔を通るＤＮＡの移動を制御する一方法であり、ハイブリダイズしている係留鎖を利用する方法の概略を示す図である。Ａ）ＤＮＡ析物（ｓｓＤＮＡ係留鎖（点線）にハイブリダイズしているｓｓＤＮＡ（灰色で示すリーダー配列を持つ黒線）から成る）が、ハイブリダイズしている係留鎖を使用して膜に結合され、膜表面における濃度の増大がもたらされる。ＤＮＡの移動を制御可能なポリヌクレオチド結合タンパク質がシス区画に添加され、これは、４ｂｐ突出に結合する。Ｂ）印加電圧下で、ＤＮＡ分析物は、ＤＮＡ上の５’リーダーセクション（灰色領域）を介してナノ細孔によって捕捉される。Ｃ）印加電場の力の下で、結合しているポリヌクレオチド結合タンパク質が細孔上部に接触し、さらなる制御の効かない移行を妨げるまでＤＮＡは細孔中に引き込まれる。この工程において、膜に係留されている鎖（点線）は、配列決定されるｓｓＤＮＡ鎖（灰色のリーダー領域を持つ黒い鎖）をはぎ取られる。Ｄ）適当な補因子の存在下で、細孔上部のポリヌクレオチド結合タンパク質はＤＮＡに沿って移動し、細孔を通るＤＮＡの移行を制御する。ポリヌクレオチド結合タンパク質が３’から５’方向へとＤＮＡに沿って移動することにより、通されたＤＮＡが印加電場に逆らって細孔からシス区画へと引き抜かれる。ナノ細孔を通過するＤＮＡの最後のセクションは、５’−リーダーである。矢印は、ＤＮＡの移動の方向を表示する。
【図２３】膜に、マイクロＲＮＡの検出に利用できるプローブを係留するいくつかの方法を示す図である。Ａ）プローブは、膜に持続的に係留できる。この実例において、マイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブの領域は、プローブの中央である。プローブのバーコード化されている領域（点線入りの領域）は、プローブを同定するために使用され、係留鎖に対して鎖の反対の末端に位置する。ＢｉおよびＢｉｉ）プローブは、内部ハイブリダイゼーションによって一時的に膜に係留できる。この例において、マイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブの領域は、鎖の一方の末端に付着する。バーコード化されている領域（点線入りの領域）は、プローブを同定するために使用され、係留鎖の直上でありマイクロＲＮＡハイブリダイゼーション領域の下に位置する。Ｂｉｉ）において、プローブに対する係留鎖のハイブリダイゼーション領域は、Ｂｉ）と比べてその結合方向が逆転している。ＣｉおよびＣｉｉ）プローブは、プローブの一方の末端へのハイブリダイゼーションによって、一時的に膜に係留できる。この例において、マイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブの領域は鎖の中央に位置する。マイクロＲＮＡの存在または不存在を検出するために使用されるバーコード化されている領域（点線入りの領域）は、係留鎖とは反対側のプローブ末端にあるマイクロＲＮＡハイブリダイゼーション領域の下に位置する。Ｃｉｉ）において、プローブに対する係留鎖のハイブリダイゼーション領域は、Ｃｉ）と比較してその結合方向が逆転している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
配列表の説明
配列番号１は、ＮＮＮ−ＲＲＫ変異体ＭｓｐＡモノマーをコードしているコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。
【００１４】
配列番号２（「Ｂ１」とも呼ばれる）は、ＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示している。変異体は、シグナル配列を欠いており、以下の変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。これらの変異により、ＤＮＡはＭｓｐＡ細孔を通って推移できる。
【００１５】
配列番号３は、α−溶血素−Ｍ１１１Ｒ（α−ＨＬ−Ｒ）のサブユニットの１つをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００１６】
配列番号４は、α−ＨＬ−Ｒのサブユニットの１つのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号５は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードしているコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。
【００１８】
配列番号６は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１９】
配列番号７は、大腸菌（E. coli）由来のｓｂｃＢ遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏＩ）をコードしている。
【００２０】
配列番号８は、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏＩ）のアミノ酸配列を示している。
【００２１】
配列番号９は、大腸菌（E. coli）由来のｘｔｈＡ遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードしている。
【００２２】
配列番号１０は、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示している。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖から３’−５’方向に、５’モノリン酸ヌクレオシドの分配消化を行う。鎖上における酵素開始にはおよそ４ヌクレオチドの５’突出が必要である。
【００２３】
配列番号１１は、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のｒｅｃＪ遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードしている。
【００２４】
配列番号１２は、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示している。この酵素は、ｓｓＤＮＡから５’−３’方向に、５’モノリン酸ヌクレオシドの前進性消化を行う。鎖上における酵素開始には少なくとも４ヌクレオチドが必要である。
【００２５】
配列番号１３は、バクテリオファージλｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼをコードしている。
【００２６】
配列番号１４は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示している。この配列は、三量体へと組織化する３つの同一サブユニットの１つである。この酵素は、ｄｓＤＮＡの一方の鎖から５’−３’方向に、ヌクレオチドの高前進性消化を行う（http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp）。鎖上における酵素開始には、選択的に５’リン酸を持つおよそ４ヌクレオチドの５’突出が必要である。
【００２７】
配列番号１５〜１７は、それぞれＭｓｐＢ、ＣおよびＤ変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示している。成熟形態は、シグナル配列を欠いている。
【００２８】
配列番号１８〜３２は、実施例において使用した配列を示している。
【００２９】
配列番号３３は、α−ＨＬ−Ｑのサブユニットの１つをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００３０】
配列番号３４は、α−ＨＬ−Ｑのサブユニットの１つのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号３５は、αーＨＬ−Ｅ２８７Ｃ−ＱＣ−Ｄ５ＦＬＡＧＨ６のサブユニットの１つをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
配列番号３６は、αーＨＬ−Ｅ２８７Ｃ−ＱＣ−Ｄ５ＦＬＡＧＨ６のサブユニットの１つのアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号３７は、α−溶血素−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707）のサブユニットの１つをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００３４】
配列番号３８は、α−ＨＬ−ＮＮのサブユニットの１つのアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号３９は、実施例５において使用した配列を示している。
【００３６】
配列番号４０および４１は、実施例６において使用される配列を示す。
【００３７】
開示された産物および方法の異なる適用が、当技術分野における特定の必要性に合わせられることは理解されよう。本明細書において使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を記載するためだけのものであり、制限することを意図しないことも理解されよう。
【００３８】
加えて、この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されているように、文脈に別段の明確な指図がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分析物」への言及は分析物を２個以上含み、「検出器」への言及はそのような検出器を２個以上含み、「細孔」への言及はそのような細孔を２個以上含み、「核酸配列」への言及はそのような配列を２個以上含む、などである。
【００３９】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前後を問わず、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００４０】
本発明は、分析物の存在、不存在または特性を決定する方法を提供する。本方法は、膜に分析物を結合させるステップと、分析物を膜に存在する検出器と相互作用させるステップとを含む。それによって分析物の存在、不存在または特性が決定される。一実施形態において、本発明は、分析物の存在または不存在を決定するための方法であって、（ａ）膜に分析物を結合させるステップと、（ｂ）分析物を膜に存在する検出器と相互作用させて、それによって分析物の存在または不存在を決定するステップとを含む方法を提供する。
【００４１】
前述の通り、検出器を含有する膜に分析物を結合させることにより、必要とされる分析物の量は数桁下がる。本方法は、当然ながら低濃度で存在する分析物の検出に有利である。好ましくは、本方法により、分析物が約０．００１ｐＭ〜約１ｎＭ（０．０１ｐＭ未満、０．１ｐＭ未満、１ｐＭ未満、１０ｐＭ未満または１００ｐＭ未満など）の濃度で存在するときに、分析物の存在または特性を決定できるようになる。
【００４２】
前述の通り、ヒト血液からは少量の精製核酸しか得られないので、本発明の方法は、核酸配列決定に特に有利である。好ましくは、本方法により、約０．００１ｐＭ〜約１ｎＭ（０．０１ｐＭ未満、０．１ｐＭ未満、１ｐＭ未満、１０ｐＭ未満または１００ｐＭ未満など）の濃度で存在する標的ポリヌクレオチドの配列の推定が可能になる、または配列決定が可能になる。
【００４３】
膜に（一時的にでも）ポリヌクレオチドの一方の末端を結合させることは、その末端がナノ細孔に基づく配列決定工程に干渉できなくなることも意味する。これについては、本発明のエキソヌクレアーゼ配列決定法を参照して以下で詳述する。
【００４４】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドなどの分析物の１つまたは複数の特性を決定または測定することを含むことができる。本方法は、ポリヌクレオチドなどの分析物の特性を２、３、４または５個以上決定するまたは測定することを含むことができる。ポリヌクレオチドの場合、１つまたは複数の特性は、好ましくは、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの種類、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）〜（ｖ）のどんな組合せも、本発明によって決定または測定することができる。好ましくは、本方法は、ポリヌクレオチドの配列を推定するまたは配列決定することを含む。
【００４５】
分析物
分析物は、どんな物質であることもできる。適切な分析物には、それだけには限らないが、金属イオン、無機塩、ポリマー（ポリマー酸または塩基など）、色素、漂白剤、医薬品、診断薬、娯楽薬、爆発物および環境汚染物質がある。
【００４６】
分析物は、細胞から分泌される分析物であり得る。あるいは、分析物は、本発明を実施できる前に分析物を細胞から抽出しなければならないような、細胞の内部に存在する分析物であり得る。
【００４７】
好ましくは、分析物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドである。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するまたは天然に存在しないものであり得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、その中に合成または修飾アミノ酸を含むことができる。アミノ酸に対するいくつかの異なる型の修飾が、当技術分野において公知である。本発明の目的のために、当技術分野で利用可能な任意の方法によって、分析物を修飾できることは理解されよう。
【００４８】
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、成長因子またはサイトカインなどの成長調節タンパク質であり得る。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはＩＦＮ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２またはＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくはＩＬ−γまたはＴＮＦ−αなど他のサイトカインから選択することができる。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質または寄生生物由来タンパク質であってよい。それを細孔またはチャネルと接触させる前に、タンパク質を展開してポリペプチド鎖を形成してもよい。
【００４９】
最も好ましくは、分析物は、核酸などのポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドについては以下で詳述する。ポリヌクレオチドは、その５’末端もしくは３’末端でまたは鎖上の１つもしくは複数の中間点で膜に結合することができる。ポリヌクレオチドは、後述するように一本鎖または二本鎖であることができる。ポリヌクレオチドは、環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、アプタマー、マイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブまたはマイクロＲＮＡ自体であってもよい（Wang, Y. et al, Nature Nanotechnology, 2011, 6, 668-674）。
【００５０】
分析物がマイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブであるとき、プローブを、膜に持続的に（図２３Ａ）または一時的に（図２３ＢおよびＣ）結合させることができる。プローブ自体は、膜に直接結合する様に適合されても、または膜に結合する様に適合された相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。分析物は、プローブにハイブリダイズしているマイクロＲＮＡの複合体であってよく、そのプローブは、それを明白に同定可能にする特徴的な配列またはバーコードを有する。
【００５１】
分析物がアプタマーであるとき、アプタマーは、膜に持続的にまたは一時的に結合されてもよい。アプタマー自体は、膜に直接結合する様に適合されても、または膜に結合する様に適合された相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。アプタマーをタンパク質分析物に結合させるまたは解離させることができ、アプタマーを検出する最終的な目的は、それが結合するタンパク質分析物の存在、不存在または特性を検出することであってよい。
【００５２】
分析物は、任意の適切なサンプル中に存在する。本発明は、通常、分析物を含有することが既知であるまたは含有すると推測されるサンプルに対して実施される。本発明は、何であるか（種類）が不明である１つまたは複数の分析物を含有するサンプルに対して実施されてもよい。あるいは、本発明は、サンプル中に存在することが既知であるまたは期待される１つまたは複数の分析物が何であるか（種類）を確認するためのサンプルに対して実施されてもよい。
【００５３】
サンプルは、生体サンプルであってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得たまたは抽出したサンプルに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。生物または微生物は通常、始生代生命体、原核生物または真核生物であり、通常は５界（植物界、動物界、真菌、モネラ界および原生生物界）のうちの１つに属している。本発明は、任意のウイルスから得たまたは抽出したサンプルに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。好ましくは、サンプルは液体サンプルである。サンプルは通常、患者の体液を含む。サンプルは、尿、リンパ、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。通常、サンプルはヒト起源であるが、あるいは例えばウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育された動物由来など別の哺乳動物由来でもよく、あるいはネコまたはイヌなどのペットでもよい。あるいは、植物起源のサンプルは通常、穀物、豆類、果物または野菜、例えば小麦、大麦、オート麦、カノーラ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、インゲン豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿などの商品作物から得られる。
【００５４】
サンプルは、非生体サンプルであってもよい。好ましくは、非生体サンプルは、液体サンプルである。非生体サンプルの例には、外科輸液、水（飲料水、海水または河川水など）、および実験室試験用の試薬がある。
【００５５】
サンプルは通常、アッセイされる前に、例えば遠心分離によってまたは不要な分子もしくは細胞（赤血球など）を除去する膜を通すことによって処理される。サンプルは、採取されると同時に直ちに測定されてもよい。サンプルは通常、アッセイ前に、好ましくは−７０℃より低い温度に貯蔵されてもよい。
【００５６】
膜
本発明に従って任意の膜を使用することができる。適切な膜は当技術分野において周知である。好ましくは、膜は両親媒性層である。両親媒性層とは、両親媒性分子（リン脂質など）から形成される層であり、親水性と親油性の両方の特性を有する。両親媒性分子は、合成または天然であってよい。非天然の両親媒性物質および単分子層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えばブロックコポリマーがある（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447〜10450頁）。ブロックコポリマーとは、２個以上のモノマーサブユニットが一緒に重合されて、単一のポリマー鎖が作製されるポリマー材料である。ブロックコポリマーは、通常、各モノマーサブユニットに因る特性を有する。しかし、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されるポリマーが備えていない特異的性質を有する場合がある。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であり、一方他のサブユニット（複数可）が水性媒体中にある間に親水性であるように加工することができる。この場合、ブロックコポリマーは両親媒性であり、生体膜を模倣する構造を形成することができる。ブロックコポリマーは、ジブロック（２種のモノマーサブユニットから成る）であってもよいが、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な構成を形成するために、３種以上のモノマーサブユニットから構築されてもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーであってもよい。
【００５７】
古細菌の両極性のテトラエーテル脂質は、脂質が単分子層膜を形成するように構築されている天然に存在する脂質である。これらの脂質は、一般に、厳しい生物学的環境に生存する極限環境微生物である、好熱性生物、好塩性生物および好酸性生物に見られる。それらの安定性は、最終的な二重層の融合した性質から得られると考えられている。一般的なモチーフである親水性−疎水性−親水性を有するトリブロックポリマーを作製することによって、これらの生物学的実体を模倣するブロックコポリマー材料を構築することが容易である。この材料は、脂質二重層と同様に振る舞う単量体膜を形成することができ、小胞から積層膜までの相挙動の範囲を包含する。これらのトリブロックコポリマーから形成される膜は、生体脂質膜に勝るいくつかの利点を保持する。トリブロックコポリマーは合成されるので、膜を形成し、細孔および他のタンパク質と相互作用するのに必要となる正確な鎖長および特性を得るために、厳密な構築を注意深く制御することができる。
【００５８】
ブロックコポリマーは、脂質下位材料に分類されないサブユニットから構築されてもよく；例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素性モノマーから作製することができる。ブロックコポリマーの親水性サブセクションは低タンパク質結合特性を備えることもでき、未精製の生体サンプルに曝露されたときに高い抵抗性がある膜を作製できるようになる。この頭部基ユニットは、非古典的な脂質頭部基から得ることもできる。
【００５９】
トリブロックコポリマー膜は、生体脂質膜と比較して、機械的および環境的（例えば、より高い操作温度またはｐＨ範囲）安定性も増加した。ブロックコポリマーの合成上の性質により、多様な用途にポリマー性膜をカスタマイズするためのプラットフォームが提供される。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明は、分析物の存在、不存在または特性を決定するための方法であって、（ａ）トリブロックコポリマーを含む膜に分析物を結合させ、場合によっては結合を促進するためにその膜を修飾するステップと、（ｂ）分析物を膜に存在する検出器と相互作用させ、それによって分析物の存在、不存在または特性を決定するステップとを含む方法を提供する。前述の通り、トリブロックコポリマーは、３種の異なるモノマーサブユニットから形成されるポリマーである。
【００６１】
両親媒性分子は、分析物の結合を促進するために化学修飾または官能化されてもよい。
【００６２】
両親媒性層は、単分子層または二重層であってよい。両親媒性層は、通常平面である。両親媒性層は、湾曲していてもよい。
【００６３】
通常、両親媒性膜は天然に流動性があり、脂質拡散速度がおよそ１０−８ｃｍ  ｓ−１の二次元の流体として基本的に作用する。これは、検出器および結合している分析物が、通常は、両親媒性膜内を移動できることを意味している。
【００６４】
好ましくは、膜は脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、様々な実証研究用の優れたプラットフォームとしての機能を果たす。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査に使用できる。あるいは、脂質二重層は、様々な物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使用できる。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。適切な脂質二重層には、それだけには限らないが、平面脂質二重層、支持されている二重層またはリポソームがある。好ましくは、脂質二重層は平面脂質二重層である。適切な脂質二重層については、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【００６５】
脂質二重層を形成する方法は、当技術分野において公知である。適切な方法については、実施例において開示する。脂質二重層は一般的に、ＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566）によって形成され、脂質単分子層は、液／気界面に垂直な開口部の両側の界面に載っている。通常、最初に脂質を有機溶剤に溶解し、次いで少量の溶剤を開口部の両側の水溶液表面上で蒸発させることによって、脂質を水性電解溶液の表面に添加する。有機溶剤が蒸発したら、開口部の両側にある液／気界面を、二重層が形成されるまで開口部を通り越して上下に物理的に移動させる。平面脂質二重層を、膜の開口部にわたってまたは開口から凹部にわたって形成できる。
【００６６】
ＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒの方法は、費用効率が高く、タンパク質細孔の挿入に適する高品質な脂質二重層を形成する比較的容易な方法なので普及している。二重層形成の他の一般的な方法には、ティップ−ディップ法（tip-dipping）、塗装二重層法（painting bilayers）およびリポソーム二重層のパッチクランプ法がある。
【００６７】
ティップ−ディップ法による二重層形成は、開口部表面（例えば、ピペットの先端）を脂質単分子層が載っている試験溶液の表面上に接触させることを伴う。さらにまた、有機溶剤に溶解している少量の脂質を溶液表面で蒸発させることによって、最初に脂質単分子層を液／気界面に生成させる。次いで、ラングミュア−シェファー工程によって二重層を形成し、開口部を溶液表面に対して移動させるための機械的自動化が必要になる。
【００６８】
塗装二重層法の場合、有機溶剤に溶解した少量の脂質を、試験水溶液に浸漬されている開口部に直接塗布する。塗料ばけまたは同等物を使用して脂質溶液を開口部の上に薄く広げる。溶媒を希釈することにより脂質二重層が形成される。しかし、二重層から溶剤を完全に除去することは困難であり、結果的に、この方法によって形成した二重層は安定性が低くなり、電気化学的測定中にノイズを発生しやすい。
【００６９】
パッチクランプ法は、生体細胞膜の試験において一般的に使用されている。吸引によって細胞膜をピペットの末端に固定し、膜のパッチを開口部に付着させる。本方法は、リポソームを固定し、次いでそれを破裂させて、ピペット開口部に脂質二重層を封着させておくことによる脂質二重層の作製に適合された。本方法は、安定で大きい単層リポソームを必要とし、および表面がガラスの材料に小さな開口部を製作する必要がある。
【００７０】
リポソームは、超音波処理、押出加工またはＭｏｚａｆａｒｉ法（Colas et al. (2007) Micron 38:841 -847）によって形成することができる。
【００７１】
好ましい実施形態において、脂質二重層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に説明されている通りに形成される。この方法にとって都合のよいことに、脂質二重層は、乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態において、脂質二重層は、ＷＯ２００９／０７７７３４（ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７）に説明されている通り、開口に形成される。
【００７２】
脂質二重層は、２枚の向かい合った脂質の層から形成される。２枚の脂質の層は、その疎水性尾部基が互いの方向を向いて、疎水性内部を形成するように配置される。脂質の親水性頭部基は、二重層の両側にある水性環境の方に向かって外側を向く。二重層は、液体無秩序相（流体薄層）、液体秩序相、固体秩序相（薄層ゲル相、中間ゲル相）および平面二重層の結晶（薄層下位ゲル相、薄層結晶相）を含むがこれに限らないいくつかの脂質相に存在することができる。
【００７３】
脂質二重層を形成する任意の脂質組成物を使用することができる。表面電荷、膜タンパク質を支持する能力、充填密度または機械的特性など必要な特性を有する脂質二重層が形成されるように、脂質組成物は選択される。脂質組成物は、１種類または複数種類の異なる脂質を含むこともできる。例えば、脂質組成物は、１００種類までの脂質を含有することができる。好ましくは、脂質組成物は、１〜１０種類の脂質を含有する。脂質組成物は、天然に存在する脂質および／または人工的な脂質を含むことができる。
【００７４】
脂質は、通常、界面部分である頭部基、および疎水性尾部基を２個含み、尾部基は同じであっても異なっていてもよい。適切な頭部基には、それだけには限らないが、ジアシルグリセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）などの中性頭部基；ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）などの双性イオンの頭部基；ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などの負に荷電する頭部基；ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）およびカルジオリピン（ＣＡ）；トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）などの正に荷電する頭部基がある。適切な界面部分には、それだけには限らないが、グリセリン性またはセラミド性部分など天然に存在する界面部分がある。適切な疎水性尾部基には、それだけには限らないが、ラウリン酸（ｎ−ドデカン酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデコン（tetradecononic）酸）、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン）およびアラキジン（ｎ−エイコサン）などの飽和炭化水素鎖；オレイン酸（シス−９−オクタデカン）などの不飽和炭化水素鎖；およびフィタノイルなどの分枝状炭化水素鎖がある。不飽和炭化水素鎖における鎖長ならびに二重結合の位置および数は、変更可能である。分枝状炭化水素鎖における鎖長ならびにメチル基などの分岐の位置および数は、変更可能である。疎水性尾部基は、エーテルまたはエステルとして界面部分に連結することができる。
【００７５】
脂質を化学修飾することもできる。脂質の頭部基または尾部基は化学修飾されてもよい。頭部基が化学修飾された適切な脂質には、それだけには限らないが、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］などのＰＥＧ修飾脂質；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］などの官能化ＰＥＧ脂質；ならびに１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）などコンジュゲーションのために修飾されている脂質がある。尾部基が化学修飾された適切な脂質には、それだけには限らないが、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル（tricosadiynoyl）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどの重合可能な脂質；１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどのフッ化脂質；１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどの重水素化された脂質；および１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどのエーテル結合脂質がある。脂質は、分析物の結合を促進するために化学修飾または官能化されてよい。
【００７６】
両親媒性層、例えば脂質組成物は、通常、層の特性に影響を及ぼすことになる１つまたは複数の添加物を含む。適切な添加物には、それだけには限らないが、パルミチン酸、ミリスチン酸およびオレイン酸などの脂肪酸；パルミチンアルコール、ミリスチンアルコールおよびオレインアルコールなどの脂肪アルコール；コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロールおよびスチグマステロールなどのステロール；１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどのリゾリン脂質ならびにセラミドがある。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、膜は固体層である。固体層は、生物起源ではないものである。換言すれば、固体層は、生物もしくは細胞などの生物学的環境、または生物学的に利用可能な構造を合成的に製造した変形からは得られず、単離されない。固体層は、マイクロエレクトロニクス材料、絶縁材料（Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなど）、有機および無機ポリマー（例えば、ポリアミド、テフロン（登録商標）などのプラスチックまたは２成分付加硬化シリコーンゴムなどのエラストマ）、ならびにガラスを含むがこれに限らない有機および無機材料から形成することができる。固体層は、グラフェンから形成することができる。適切なグラフェン層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
【００７８】
結合
分析物は、任意の公知の方法を使用して膜に結合されてよい。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合、好ましくは、分析物は、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に結合される。好ましくは、疎水性アンカーは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸、例えばコレステロール、パルミテートまたはトコフェロールである。好ましい実施形態において、分析物は検出器を介して膜に結合されない。
【００７９】
両親媒性分子または脂質などの膜成分は、直接または１個もしくは複数個のリンカーを介する膜への分析物の結合を促進するために、化学修飾または官能化されてもよい。適切な化学修飾および膜成分を官能化するのに適した方法の例については以下で詳述する。任意の比率の膜成分、例えば少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％が、官能化されてよい。
【００８０】
分析物は、膜に直接結合されてもよい。分析物は、２、３、４つ以上など、１つまたは複数の位置で膜に直接結合されてよい。
【００８１】
好ましくは、分析物は、リンカーを介して膜に結合される。分析物は、２、３、４個以上など、１個または複数個のリンカーを介して膜に結合されてよい。１個のリンカーは、２、３、４個以上など、１個より多い分析物を膜に結合してもよい。
【００８２】
分析物は、１つまたは複数の位置で直接、および１個または複数個のリンカーを介して膜に結合されてもよい。
【００８３】
好ましいリンカーには、それだけには限らないが、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖およびポリペプチドなどのポリマーがある。これらのリンカーは、直鎖状、分枝状または環状であってよい。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであってよい。分析物がそれ自身ポリヌクレオチドである場合、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補配列にハイブリダイズしてもよい。
【００８４】
官能化されているリンカーおよびそれらを分子に結合させることができる方法は、当技術分野において公知である。例えば、マレイミド基で官能化されているリンカーは、タンパク質中のシステイン残基と反応し、付着することになる。この発明の状況において、タンパク質は膜内に存在していてよく、分析物自体であってもよく、または分析物に結合するために使用されてもよい。これについては以下で詳述する。
【００８５】
分析物の架橋反応は、「鍵−鍵穴」構成を使用して避けることができる。各リンカーの一方の末端だけが一緒に反応してより長いリンカーを形成することができ、リンカーの他方の末端は各々分析物または膜とそれぞれ反応できる。そのようなリンカーは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されている。
【００８６】
以下で述べた配列決定の実施形態においては、リンカーの使用が好ましい。ポリヌクレオチド分析物が膜に持続的に直接結合する場合、膜と検出器の間の距離のせいで配列決定動作をポリヌクレオチドの末端まで続けることができないので、いくらかの配列データは失われることになる。リンカーを使用する場合、ポリヌクレオチド分析物を完全に処理できる。結合は、持続的または安定的であってもよい。換言すれば、結合は、本方法の間中、分析物が膜に結合した状態を維持するようなそれであってよい。結合は、一時的であってもよい。換言すれば、結合は、本方法の間に、分析物が膜から切り離されるようなそれであってよい。アプタマー検出などある特定の用途の場合、一時的な結合の性質が好ましい。持続的なまたは安定的なリンカーが、ポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに直接付着し、そのリンカーが、二重層とナノ細孔のチャネルまたはポリヌクレオチド結合タンパク質の活性部位との間の距離より短い場合、そのとき、配列決定動作をポリヌクレオチドの末端まで続けることができないので、いくらかの配列データは失われることになる。結合が一時的である場合、結合末端が、ランダムに二重層から遊離するとき、ポリヌクレオチドを完全に処理できる。膜と持続的／安定的または一時的な連結を形成する化学基については以下で詳述する。分析物を、コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して両親媒性層または脂質二重層に一時的に結合することができる。ヘキサデカン酸など、炭素原子６〜３０個の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を使用することができる。
【００８７】
好ましい実施形態において、核酸などのポリヌクレオチド分析物は、脂質二重層などの両親媒性層に結合される。合成脂質二重層に対する核酸の結合は、様々な異なる係留戦略で以前から実施されてきた。これらについては、下記の表１に要約される。
【００８８】
【表１】
2014519823.tif 000002
【００８９】
合成ポリヌクレオチド分析物またはリンカーは、合成反応中に修飾ホスホラミダイトを使用して官能化することができ、ホスホラミダイトは、コレステロール、トコフェロールまたはパルミテートなど適切な結合部分、ならびにチオール、コレステロール、脂質およびビオチン基などの反応基の直接付加に容易に適合する。これらの異なる付着化学は、標的ポリヌクレオチドへの付着に対して一連の選択肢を与える。異なる修飾基はそれぞれ少し異なる方法でポリヌクレオチドを係留し、結合は必ずしも持続的ではないため、分析物に対して異なる滞留時間を二重層にもたらす。一時的な結合の利点については、前述している。
【００９０】
相補的な反応基または係留鎖を標的ポリヌクレオチドに付加できるという条件で、いくつかの他の手段によりリンカーまたは官能化した膜にポリヌクレオチドを結合させることも実現可能である。ＤＮＡのいずれかの末端への反応基の付加は、以前に報告されている。チオール基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを使用してｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加することができる（Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77）。アジド基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用してｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５'−リン酸に付加することができる。チオールまたはクリック化学を使用して、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳもしくはマレイミド基（チオール反応性）またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオキシチン（dibenzocyclooxtyne））もしくはアルキン基（アジド反応性）のいずれかを含有する係留鎖を分析物に共有結合させることができる。末端転移酵素を使用してｓｓＤＮＡの３’に修飾オリゴヌクレオチドを組み込むことにより、ビオチン、チオールおよび発蛍光団などより多様な選択の化学基を付加することができる（Kumar, A., P. Tchen, et al. (1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82）。下記の実施例３には、ストレプトアビジン／ビオチンを使用して脂質二重層にＤＮＡを結合できる方法を記載している。ストレプトアビジン／ビオチン結合は、他のどの分析物にも使用できる。末端転移酵素を好適に修飾した（例えば、コレステロールまたはパルミテート）ヌクレオチドと共に使用して、標的ポリヌクレオチドに係留鎖を直接付加できる場合もある。
【００９１】
あるいは、反応基または係留鎖を、既に二重層に結合しているものに相補的な短い断片のポリヌクレオチド（ＤＮＡなど）の付加とみなすことができ、それによりハイブリダイゼーションによって付着を実現できる。この場合、反応基は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドであってよい。反応基は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分析物にライゲーションされてよい。Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを使用するｓｓＤＮＡの短い断片のライゲーションが報告されている（Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5）。あるいは、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかを、天然の分析物ｄｓＤＮＡにライゲーションし、次いで熱的または化学的変性によって２本の鎖を分離することができる。天然のｄｓＤＮＡに対しては二重鎖の末端の一方もしくは両方にｓｓＤＮＡの断片を、または末端の一方もしくは両方にｄｓＤＮＡの断片を付加することが可能になる。天然のＤＮＡに一本鎖核酸を付加する場合、一本鎖核酸の他の領域へのライゲーションに関しては、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを使用して実現することができる。天然の二重鎖ＤＮＡにｄｓＤＮＡを付加する場合、（コンカテマーまたはダイマー形成を妨げるために多くのサンプル調製用途で日常的に行われているように）天然のＤＮＡ上にある相補的な３’ｄＡ／ｄＴ尾部およびアダプターそれぞれを用いて、または天然のＤＮＡの制限消化によって生成する「付着末端」および適合するアダプターのライゲーションを使用して、ライゲーションを「平滑末端化」することができる。次いで二重鎖が融解されるとき、各一本鎖は、ｓｓＤＮＡがその５'末端でのライゲーションまたは修飾に使用された場合、５’または３’修飾のいずれかを有することになり、ｄｓＤＮＡがライゲーションに使用された場合、その３'末端または両末端に修飾を有することになる。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、結合化学はポリヌクレオチドの化学合成の間に組み込むことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、反応基が付着しているプライマーを使用して合成することができる。
【００９２】
アデニル化された核酸（ＡｐｐＤＮＡ）はライゲーション反応における中間生成物であり、アデノシン一リン酸が核酸の５’−リン酸に付着する。この中間生成物を生成するための様々なキット（ＮＥＢ製５’ＤＮＡアデニル化キットなど）が利用可能である。反応中のＡＴＰを修飾ヌクレオチド三リン酸と置き換えることによって、次に、ＤＮＡの５’に反応基（例えばチオール、アミン、ビオチン、アジド、など）を付加することが可能になるべきである。５’ＤＮＡアデニル化キットを、好適に修飾したヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミテート）と一緒に使用して、標的ポリヌクレオチドに係留鎖を直接付加できる可能性もある。
【００９３】
ゲノムＤＮＡセクションを増幅するための一般的な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。ここで、２本の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＤＮＡの同じセクションのコピーをいくつか生成することができ、各コピーについて二重鎖の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。アンチセンスプライマーを使用することにより、ポリメラーゼを利用することによって、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの３’末端に１つまたは複数のヌクレオチドを付加することができる。使用可能なポリメラーゼの例には、それだけには限らないが、末端転移酵素、クレノウおよび大腸菌（Escherichia coli）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）がある。反応中のＡＴＰを修飾ヌクレオチド三リン酸と置き換えることによって、次に、コレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチンまたは脂質などの反応基をＤＮＡに組み込むことができる。したがって、増幅された標的ＤＮＡの各コピーが、結合のための反応基を含有することになる。
【００９４】
理想的には、分析物は、分析物を官能化する必要がない膜に結合される。これは、ポリヌクレオチド結合タンパク質もしくは化学基などの結合基を膜に固定し、その結合基を分析物と相互作用させることによって、または膜を官能化することによって実現できる。本明細書に記載される方法のいずれかよって、結合基を膜に結合できる。具体的には、結合基は、マレイミドで官能化されたリンカーなど１個または複数個のリンカーを使用して膜に結合されてよい。
【００９５】
この実施形態において、分析物は通常、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡであり、二本鎖または一本鎖であってよい。この実施形態は、ゲノムＤＮＡ分析物に特に適している。
【００９６】
結合基は、一本鎖もしくは二本鎖核酸、分析物中の特定のヌクレオチド配列または分析物中の修飾ヌクレオチドのパターンあるいはポリヌクレオチド上に存在する他の任意のリガンドと相互作用する任意の基であることができる。
【００９７】
適切な結合タンパク質には、大腸菌（Escherichia coli）一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ  Ｖ  ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、大腸菌（Escherichia coli）ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質および以下に挙げたタンパク質を含めた、他の古細菌、原核生物または真核生物の一本鎖または二本鎖核酸結合タンパク質がある。
【００９８】
特定のヌクレオチド配列は、転写因子、リボゾーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼまたは複製開始因子によって認識される配列である可能性がある。修飾ヌクレオチドのパターンは、メチル化または損傷のパターンである可能性がある。
【００９９】
化学基は、ポリヌクレオチド分析物とインタカレートまたは相互作用する任意の基であることができる。その基は、静電的、水素結合またはファンデルワールス相互作用によって、ポリヌクレオチド分析物とインタカレートまたは相互作用してもよい。そのような基には、リシンモノマー、ポリリシン（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡと相互作用する）、臭化エチジウム（ｄｓＤＮＡとインタカレートする）、ユニバーサル塩基またはユニバーサルヌクレオチド（どんなポリヌクレオチド分析物ともハイブリダイズできる）およびオスミウム複合体（メチル化塩基と反応できる）がある。したがって、膜に付着した１つまたは複数のユニバーサルヌクレオチドを使用して、ポリヌクレオチド分析物を膜に結合することができる。各ユニバーサルヌクレオチド残基は、１つまたは複数のリンカーを使用して膜に付着できる。ユニバーサル塩基の例には、イノシン、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、３、４−ジヒドロ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（ｄＰ）、２−ジメチルアミノメチレンアミノ−６−メトキシアミノプリン（ｄＫ）、デオキシイノシン、デオキシネブラリンがある。
【０１００】
この実施形態において、膜成分の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％は、官能化されてよい。
【０１０１】
結合基がタンパク質である場合、例えばそのタンパク質が膜と親和性がある外部疎水性領域を既に有する場合、さらに官能化することなく膜内に直接固定できる可能性がある。そのようなタンパク質の例には、膜貫通タンパク質がある。あるいは、タンパク質は、膜と親和性がある、遺伝的に融合された疎水性領域を伴って発現されてもよい。そのような疎水性タンパク質領域は、当技術分野において公知である。
【０１０２】
好ましくは、結合基は膜と接触させる前に分析物と混合されるが、結合基を膜と接触させ、その後に分析物と接触させてもよい。
【０１０３】
別の態様において、分析物は、上述の方法を使用して官能化されてよく、その結果特定の結合基によって認識され得る。具体的には、分析物は、（ストレプトアビジンに結合するための）ビオチン、（マルトース結合タンパク質または融合タンパク質に結合するための）アミロース、（ポリヒスチジンまたはポリヒスチジンタグ付きタンパク質に結合するための）Ｎｉ−ＮＴＡまたは（抗原などの）ペプチドなどのリガンドで官能化されてよい。
【０１０４】
さらなる態様によると、分析物がポリヌクレオチドアダプターに結合したとき、結合基を使用して膜にポリヌクレオチド分析物を結合させることができる。具体的には、分析物は、ナノ細孔などの検出器の中に優先的に通るように設計されたリーダー配列を含むアダプターに結合する。そのようなリーダー配列は、ホモポリマー性ポリヌクレオチドまたは無塩基領域を含むことができる。アダプターは、通常、リンカーにハイブリダイズするようにおよび分析物にライゲーションまたはハイブリダイズするように設計される。これにより、分析物とアダプターとの間に、検出器に入るための競合が発生する。リンカーが結合基を含む場合、アダプターと比較して長い分析物の長さは、いくつかのリンカーが分析物に同時に結合できることを意味し、したがって、アダプターの濃度に対する分析物の濃度が増加する。
【０１０５】
脂質二重層などの両親媒性層にポリヌクレオチドを結合させるための上述した方法のいずれも、当然ながら他の分析物と膜との組合せに適用できる。いくつかの実施形態において、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、脂質二重層に結合される。そのような分析物を化学的に付着させる様々な方法論が利用可能である。化学的付着において使用される分子の例には、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）がある。市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．２２９８０）を使用して、ＤＮＡの５’に反応基を付加することもできる。適切な方法には、それだけには限らないが、ヒスチジン残基とＮｉ−ＮＴＡを使用する一時的な親和性付着、および反応性システイン、リシンまたは非天然アミノ酸によるより強固な共有結合がある。
【０１０６】
検出器
検出器は、分析物の存在、不存在または特性に応じて読み取り可能なシグナルを与える任意の構造であり得る。検出器は、分析物の存在または不存在に応じて読み取り可能なシグナルを与える任意の構造であり得る。適切な検出器は、当技術分野において公知である。それらには、それだけには限らないが、膜貫通細孔、トンネル効果電極、古典的な電極、ナノチューブ、ＦＥＴ（電界効果トランジスタ）ならびに原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）および走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）などの光学的検出器がある。
【０１０７】
好ましい実施形態において、検出器は、電気的な手段を使用して分析物を検出する。電気的な測定は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72、および国際出願ＷＯ−２０００／２８３１２に記載の通り、標準的な単一チャネル記録装置を使用して行うことができる。あるいは、電気的な測定は、例えば国際出願ＷＯ−２００９／０７７７３４および国際出願ＷＯ−２０１１／０６７５５９に記載の通り、マルチチャネルシステムを使用して行うことができる。
【０１０８】
他の好ましい実施形態において、検出器は蛍光手段を使用して分析物を検出しない。
【０１０９】
好ましくは、検出器は膜貫通細孔を含む。膜貫通細孔とは、印加電位によって駆動される水和イオンが膜の一方の側から膜の反対側へ流れることができる構造である。
【０１１０】
好ましくは、膜貫通細孔は膜貫通タンパク質細孔である。膜貫通タンパク質細孔とは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の反対側へ流れることができるポリペプチドまたはポリペプチドの集合体である。本発明において、膜貫通タンパク質細孔は、印加電位によって駆動される水和イオンが膜の一方の側から他方へ流れることができる細孔を形成する能力がある。好ましくは、膜貫通タンパク質細孔は、ヌクレオチドなどの分析物が脂質二重層などの膜の一方の側から他方へ流れることができるようにする。好ましくは、膜貫通タンパク質細孔は、ポリヌクレオチドまたは核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が細孔を通って移動できるようにする。
【０１１１】
膜貫通タンパク質細孔は、モノマーまたはオリゴマーであってよい。好ましくは、細孔は、６、７または８個のサブユニットなどいくつかの反復するサブユニットから構成される。より好ましくは、細孔は、七量体または八量体の細孔である。
【０１１２】
膜貫通タンパク質細孔は、通常、イオンが流れることができるバレルまたはチャネルを含む。細孔のサブユニットは通常、中心軸を囲んでおり、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通α−ヘリックス束もしくはチャネルに鎖を導く。
【０１１３】
膜貫通タンパク質細孔のバレルまたはチャネルは、通常、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を含む。好ましくは、これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭搾部の近傍に位置する。膜貫通タンパク質細孔は、通常、１つまたは複数の正に荷電するアミノ酸（アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなど）または芳香族アミノ酸（チロシンもしくはトリプトファンなど）を含む。これらのアミノ酸は、通常、細孔とヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との相互作用を促進する。ヌクレオチド検出は、アダプターを用いることにより促進できる。これについては以下で詳述する。
【０１１４】
本発明に従って使用する膜貫通タンパク質細孔は、β−バレル細孔またはα−ヘリックス束細孔から得られる。β−バレル細孔は、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なβ−バレル細孔には、それだけには限らないが、α−溶血素、炭疽菌毒素およびロイコシジンなどのβ−毒素、ならびにマイコバクテリウムスメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポーリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、外膜ポーリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポーリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア属（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）など細菌の外膜タンパク質／ポーリンがある。α−ヘリックス束細孔はα−ヘリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なα−ヘリックス束細孔には、それだけには限らないが、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素などの内膜タンパク質およびα外膜タンパク質がある。膜貫通細孔は、Ｍｓｐからまたはα−溶血素（α−ＨＬ）から得られてよい。
【０１１５】
鎖配列決定法の場合、好ましくは、膜貫通タンパク質細孔はＭｓｐから、好ましくはＭｓｐＡから得られる。そのような細孔は、オリゴマーになり、通常、Ｍｓｐから得られるモノマーを７、８、９または１０個含む。細孔は、同一のモノマーを含む、Ｍｓｐから得られるホモオリゴマーの細孔であってよい。あるいは、細孔は、他と異なるモノマーを少なくとも１個含む、Ｍｓｐから得られるヘテロオリゴマー細孔であってもよい。細孔は、Ｍｓｐから得られる、２個以上が共有結合したモノマーを含む構築物を１つまたは複数含んでもよい。適切な細孔については、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５０３０１（米国仮出願番号第６１／４４１，７１８号からの優先権を主張する）に開示されている。好ましくは、細孔はＭｓｐＡまたはその相同物もしくはパラログから得られる。
【０１１６】
Ｍｓｐから得られるモノマーは、配列番号２に示される配列またはそのバリアントを含む。配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体である。これは、以下の変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。配列番号２のバリアントは、配列番号２と異なるアミノ酸配列を有するが、細孔形成能を保持しているポリペプチドである。バリアントが細孔を形成する能力については、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイできる。例えば、バリアントを、他の適当なサブユニットと一緒に脂質二重層に挿入することができ、オリゴマー形成させて細孔を形成するその能力を決定することができる。脂質二重層などの膜にサブユニットを挿入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、サブユニットが脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合し機能状態へと組織化することによって挿入されるように、サブユニットを、脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁することができる。あるいは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am Chem. Soc. 2005, 127, 6502〜6503頁および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を使用して、サブユニットを膜に直接挿入することができる。
【０１１７】
好ましいバリアントについては、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５０３０１（米国仮出願番号第６１／４４１，７１８号からの優先権を主張する）に開示されている。特に好ましいバリアントには、それだけには限らないが、以下の置換（複数可）を含むものがある。Ｌ８８Ｎ；Ｌ８８Ｓ；Ｌ８８Ｑ；Ｌ８８Ｔ；Ｄ９０Ｓ；Ｄ９０Ｑ；Ｄ９０Ｙ；Ｉ１０５Ｌ；Ｉ１０５Ｓ；Ｑ１２６Ｒ；Ｇ７５Ｓ；Ｇ７７Ｓ；Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ｌ８８ＮおよびＱ１２６Ｒ；Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８ＳおよびＤ９０Ｑ；Ｌ８８ＮおよびＤ９０Ｑ；Ｅ５９Ｒ；Ｇ７５Ｑ；Ｇ７５Ｎ；Ｇ７５Ｓ；Ｇ７５Ｔ；Ｇ７７Ｑ；Ｇ７７Ｎ；Ｇ７７Ｓ；Ｇ７７Ｔ；Ｉ７８Ｌ；Ｓ８１Ｎ；Ｔ８３Ｎ；Ｎ８６Ｓ；Ｎ８６Ｔ；Ｉ８７Ｆ；Ｉ８７Ｖ；Ｉ８７Ｌ；Ｌ８８Ｎ；Ｌ８８Ｓ；Ｌ８８Ｙ；Ｌ８８Ｆ；Ｌ８８Ｖ；Ｌ８８Ｑ；Ｌ８８Ｔ；Ｉ８９Ｆ；Ｉ８９Ｖ；Ｉ８９Ｌ；Ｎ９０Ｓ；Ｎ９０Ｑ；Ｎ９０Ｌ；Ｎ９０Ｙ；Ｎ９１Ｓ；Ｎ９１Ｑ；Ｎ９１Ｌ；Ｎ９１Ｍ；Ｎ９１Ｉ；Ｎ９１Ａ；Ｎ９１Ｖ；Ｎ９１Ｇ；Ｇ９２Ａ；Ｇ９２Ｓ；Ｎ９３Ｓ；Ｎ９３Ａ；Ｎ９３Ｔ；Ｉ９４Ｌ；Ｔ９５Ｖ；Ａ９６Ｒ；Ａ９６Ｄ；Ａ９６Ｖ；Ａ９６Ｎ；Ａ９６Ｓ；Ａ９６Ｔ；Ｐ９７Ｓ；Ｐ９８Ｓ；Ｆ９９Ｓ；Ｇ１００Ｓ；Ｌ１０１Ｆ；Ｎ１０２Ｋ；Ｎ１０２Ｓ；Ｎ１０２Ｔ；Ｓ１０３Ａ；Ｓ１０３Ｑ；Ｓ１０３Ｎ；Ｓ１０３Ｇ；Ｓ１０３Ｔ；Ｖ１０４Ｉ；Ｉ１０５Ｙ；Ｉ１０５Ｌ；Ｉ１０５Ａ；Ｉ１０５Ｑ；Ｉ１０５Ｎ；Ｉ１０５Ｓ；Ｉ１０５Ｔ；Ｔ１０６Ｆ；Ｔ１０６Ｉ；Ｔ１０６Ｖ；Ｔ１０６Ｓ；Ｎ１０８Ｐ；Ｎ１０８Ｓ；Ｄ９０ＱおよびＩ１０５Ａ；Ｄ９０ＳおよびＧ９２Ｓ；Ｌ８８ＴおよびＤ９０Ｓ；Ｉ８７ＱおよびＤ９０Ｓ；Ｉ８９ＹおよびＤ９０Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ８９Ｆ；Ｌ８８ＮおよびＩ８９Ｙ；Ｄ９０ＳおよびＧ９２Ａ；Ｄ９０ＳおよびＩ９４Ｎ；Ｄ９０ＳおよびＶ１０４Ｉ；Ｌ８８ＤおよびＩ１０５Ｋ；Ｌ８８ＮおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＤ９１Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＤ９１Ｓ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＩ１０５Ｖ；Ｄ９０Ｑ、Ｄ９３ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９１Ｙ；Ｎ９０ＹおよびＮ９１Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｙ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｇ；Ｉ０５Ｇ；Ｎ９０Ｒ；Ｎ９１Ｒ；Ｎ９０ＲおよびＮ９１Ｒ；Ｎ９０Ｋ；Ｎ９１Ｋ；Ｎ９０ＫおよびＮ９１Ｋ；Ｎ９０ＱおよびＮ９１Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｑ；Ｎ９０ＱおよびＮ９１Ｑ；Ｒ１１８Ｎ；Ｎ９１Ｃ；Ｎ９０Ｃ；Ｎ９０Ｗ；Ｎ９１Ｗ；Ｎ９０Ｋ；Ｎ９１Ｋ；Ｎ９０Ｒ；Ｎ９１Ｒ；Ｎ９０ＳおよびＮ９１Ｓ；Ｎ９０ＹおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＧおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＱおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＡおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＳおよびＩ１０５Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ１０５Ｎ；Ｎ９０ＧおよびＮ９３Ｇ；Ｎ９０Ｇ；Ｎ９３Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ａ；Ｉ１０５Ｋ；Ｉ１０５Ｒ；Ｉ１０５Ｖ；Ｉ１０５Ｐ；Ｉ１０５Ｗ；Ｌ８８Ｒ；Ｌ８８Ａ；Ｌ８８Ｇ；Ｌ８８Ｎ；Ｎ９０ＲおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＡおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＳおよびＩ１０５Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ１０５Ｎ；Ｌ８８Ｃ；Ｓ１０３Ｃ；およびＩ１０５Ｃ。
【０１１８】
上述した特定の変異に加えて、バリアントは他の変異を含むことができる。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同になる。より好ましくは、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、全配列にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。１００以上（例えば１２５、１５０、１７５または２００以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性（hard homology）」）。
【０１１９】
当技術分野において標準的な方法を使用して相同性を決定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供しており、これを使用して（例えば初期設定で使用して）相同性を算出できる（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387〜395頁）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36：290〜300頁；Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215：403〜10頁に記載の通り、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を算出するまたは配列を整列させる（例えば等価な残基もしくは対応する配列を（通常は初期設定で）同定する）ことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって一般公開されている。
【０１２０】
配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体である。バリアントは、ＭｓｐＡと比較して、ＭｓｐＢ、ＣまたはＤモノマー中にどんな変異も含むことができる。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態を、配列番号１５〜１７に示す。具体的には、バリアントは、ＭｓｐＢに存在する以下の置換を含むことができる：Ａ１３８Ｐ。バリアントは、ＭｓｐＣに存在する以下の置換の１つまたは複数を含むことができる：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐ。バリアントは、ＭｓｐＤに存在する以下の変異の１つまたは複数を含むことができる：Ｇ１、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの欠失。バリアントは、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤに由来する１つまたは複数の変異と置換の組合せを含むことができる。
【０１２１】
上述のものに加えて、配列番号２のアミノ酸配列に対して、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までアミノ酸置換を行うことができる。保存的置換は、アミノ酸を類似の化学的構造、類似の化学的特性または類似の側鎖容積の他のアミノ酸と置き換える。導入されるアミノ酸は、それと置きかわるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有することができる。あるいは、保存的置換は、予め芳香族または脂肪族アミノ酸が存在している場所に芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することができる。保存的なアミノ酸変化は当技術分野において周知であり、以下の表４で定義される２０種の主要なアミノ酸の特性に従って選択できる。アミノ酸が類似の極性を有する場合、表５にあるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシー尺度を参照することによって、これを決定することもできる。
【０１２２】
【表２】
2014519823.tif 000003
【０１２３】
【表３】
2014519823.tif 000004
【０１２４】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基を、上記のポリペプチドからさらに欠失させることができる。１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までの残基を欠失させることができ、それ以上でもよい。
【０１２５】
バリアントは、配列番号２の断片を含むことができる。そのような断片は、細孔形成活性を保持している。断片は、少なくとも長さ５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片を使用して、細孔を作製することができる。断片は、好ましくは配列番号２の細孔形成ドメインを含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４のうちの１つを含まなければならない。通常、断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【０１２６】
あるいはまたはさらに、１つまたは複数のアミノ酸を、上記のポリペプチドに付加することができる。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもしくは断片のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に形成され得る。伸長は、例えば長さ１〜１０アミノ酸と非常に短くてよい。あるいは、伸長は、例えば５０または１００アミノ酸まで長くてもよい。本発明によるアミノ酸配列に担体タンパク質を融合させてもよい。他の融合タンパク質については、以下で詳述している。
【０１２７】
上述の通り、バリアントは、配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有するが、細孔形成能を保持しているポリペプチドである。バリアントは通常、細孔形成に関与する配列番号２の領域を含有する。Ｍｓｐ（β−バレルを含有する）の細孔形成能は、各サブユニット中にあるβ−シートによってもたらされる。配列番号２のバリアントは通常、β−シートを形成する配列番号２の領域を含む。得られたバリアントが細孔形成能を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に１つまたは複数の修飾を作ることができる。配列番号２のバリアントは、そのα−へリックスおよび／またはループ領域内に、好ましくは１つまたは複数の修飾（置換、付加または欠失など）を含む。
【０１２８】
Ｍｓｐから得られるモノマーを修飾して、例えばヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（Ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラグタグを付加することによって、またはポリペプチドがシグナル配列を天然に内包しない場合には、細胞からの分泌を促進するためにそのような配列を付加することによって、変異体モノマーの同定または精製を補助することができる。遺伝学的タグを導入するための別の手段は、細孔上の天然のまたは工作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、細孔の外側に工作されたシステインに対してゲルシフト試薬を反応させることである。これは、溶血素ヘテロオリゴマーを分離する方法として実証されている（Chem Biol. 1997 Jul；4(7)：497〜505頁）。
【０１２９】
Ｍｓｐから得られるモノマーを、明示用標識で標識することができる。明示用標識は、細孔を検出できるようにするどんな適切な標識であってもよい。適切な標識には、それだけには限らないが、蛍光分子、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ、３５Ｓ）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドがある。
【０１３０】
Ｍｓｐから得られるモノマーは、Ｄ−アミノ酸を使用して作製されてもよい。例えば、Ｍｓｐから得られるモノマーは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含んでもよい。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを作製する際に当技術分野で常用されている。
【０１３１】
Ｍｓｐから得られるモノマーは、ヌクレオチドの識別を促進するために１つまたは複数の特定の修飾を含有する。Ｍｓｐから得られるモノマーは、細孔形成を妨げない限り、他の非特異的な修飾を含有してもよい。いくつかの非特異的な側鎖修飾が、当技術分野において公知であり、Ｍｓｐから得られるモノマーの側鎖に作ることができる。そのような修飾には、例えば、アルデヒドと反応させ続いてＮａＢＨ４を用いて還元することによるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデートを用いるアミジン化または無水酢酸を用いるアシル化がある。
【０１３２】
変異体モノマーは、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して作製することができる。Ｍｓｐから得られるモノマーは、合成または組換え手段によって作成され得る。例えば、細孔は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。細孔を作製する適切な方法については、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）またはＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載されている。膜に細孔を挿入する方法については後述する。
【０１３３】
エキソヌクレアーゼ配列決定法の場合、好ましくは、膜貫通タンパク質細孔はα−溶血素（α−ＨＬ）から得られる。野生型α−ＨＬ細孔は、同一のモノマーまたはサブユニット７個（すなわち、七量体）の形状を成す。α−溶血素Ｍ１１３Ｒの１個のモノマーまたはサブユニットの配列が、配列番号４に示される。好ましくは、膜貫通タンパク質細孔は、各々配列番号４に示される配列またはそのバリアントを含むモノマーを７個含む。配列番号４のアミノ酸１、７〜２１、３１〜３４、４５〜５１、６３〜６６、７２、９２〜９７、１０４〜１１１、１２４〜１３６、１４９〜１５３、１６０〜１６４、１７３〜２０６、２１０〜２１３、２１７、２１８、２２３〜２２８、２３６〜２４２、２６２〜２６５、２７２〜２７４、２８７〜２９０および２９４は、ループ領域を形成する。配列番号４の１１３および１４７残基は、α−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭搾部分を形成する。
【０１３４】
そのような実施形態において、好ましくは、各々配列番号４に示される配列またはそのバリアントを含むタンパク質またはモノマーを７個含む細孔が、本発明の方法において使用される。７個のタンパク質は、同じであっても（ホモ七量体）異なっていても（ヘテロ七量体）よい。
【０１３５】
配列番号４のバリアントは、配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有し、細孔形成能を保持しているタンパク質である。バリアントが細孔を形成する能力については、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイできる。例えば、バリアントを、他の適当なサブユニットと一緒に脂質二重層に挿入することができ、オリゴマー形成させて細孔を形成するその能力を決定することができる。脂質二重層などの膜にサブユニットを挿入する方法は、当技術分野において公知である。適切な方法については、上述している。
【０１３６】
バリアントは、核酸結合タンパク質との共有結合またはそれとの相互作用を促進する修飾を含んでよい。好ましくは、バリアントは、核酸結合タンパク質への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を含む。例えば、バリアントは、配列番号４の１つまたは複数の位置、８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７位ならびに／またはアミノもしくはカルボキシ末端にシステインを含むことができる。好ましいバリアントは、配列番号４の８、９、１７、２３７、２３９および２８７位にシステインでの残基の置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。好ましくは、バリアントは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）またはＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載されるバリアントのいずれか１つである。
【０１３７】
バリアントは、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進するまたは後述するように分子アダプターの方向付けを促進する修飾を含むこともできる。バリアントは、分子アダプターの共有結合を促進する修飾を含有することもできる。
【０１３８】
具体的には、好ましくは、バリアントは配列番号４の１３９位にグルタミンを含有する。好ましくは、バリアントは、配列番号４の１１９、１２１または１３５位にシステインを有する。配列番号４のバリアントは、１１３位に再導入された野生型のメチオニンを有してよい。
【０１３９】
配列番号４の好ましいバリアントは、１１３位にメチオニン（Ｒ１１３Ｍ）、１３５位にシステイン（Ｌ１３５Ｃ）および１３９位にグルタミン（Ｎ１３９Ｑ）を有する。配列番号４の他の好ましいバリアントは、１１３位にメチオニン（Ｒ１１３Ｍ）および１３９位にグルタミン（Ｎ１３９Ｑ）を有する。そのようなバリアントの１つが配列番号３４に示される。エキソヌクレアーゼ配列決定法において使用する好ましい膜貫通タンパク質細孔は、（ａ）１１３位にメチオニン（Ｒ１１３Ｍ）、１３５位にシステイン（Ｌ１３５Ｃ）および１３９位にグルタミン（Ｎ１３９Ｑ）を有する配列番号４のバリアントを含むモノマー１個と（ｂ）各々、１１３位にメチオニン（Ｒ１１３Ｍ）および１３９位にグルタミン（Ｎ１３９Ｑ）を有する配列番号４のバリアントを含むモノマー６個とを含む。好ましくは、（ｂ）における６個のモノマーは各々、配列番号３４に示される配列を含む。
【０１４０】
バリアントは、生物によって、例えばブドウ球菌（Staphylococcus bacterium）によって天然に発現される天然に存在するバリアントであってもよい。あるいは、バリアントは、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。バリアントには、組換え技術によって作製される天然に存在しないバリアントも含まれる。好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同になる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、全配列にわたって配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。２００以上（例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性」（hard homology））。相同性は、前述の通りに決定することができる。
【０１４１】
アミノ酸置換は、上述した置換に加えて、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０個まで、配列番号４のアミノ酸配列に作製されてよい。保存的置換が、前述の通りに作製されてよい。
【０１４２】
加えて、配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が、上述のポリペプチドから欠失されてもよい。１、２、３、４、５、１０、２０もしくは３０残基まで欠失させてもよく、またはもっと欠失させてもよい。
【０１４３】
バリアントは、配列番号４の断片であってもよい。そのような断片は、細孔形成活性を保持する。断片は、長さが少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。好ましくは、断片は、配列番号４の細孔形成ドメインを含む。断片は、通常、配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
【０１４４】
あるいはまたはさらに、１つまたは複数のアミノ酸を、上記のポリペプチドに付加することができる。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に形成できる。伸長は、例えば長さ１〜１０アミノ酸と非常に短くてもよい。あるいは、伸長は、例えば長さ５０または１００アミノ酸まで長くてもよい。サブユニットまたはバリアントに担体タンパク質を融合させてもよい。
【０１４５】
あるいはまたはさらに、１つまたは複数のアミノ酸を、上記のポリペプチドに付加することができる。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはそのバリアントもしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に形成できる。伸長は、例えば長さ１〜１０アミノ酸と非常に短くてもよい。あるいは、伸長は、例えば長さ５０または１００アミノ酸まで長くてもよい。細孔またはバリアントに担体タンパク質を融合させてもよい。
【０１４６】
前述の通り、配列番号４のバリアントは、配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有し、細孔を形成する能力を保持しているサブユニットである。バリアントは、通常、細孔形成に関与する配列番号４の領域を含有する。α−ＨＬ（β−バレルを含有する）の細孔形成能は、各サブユニットのβ−鎖によって得られる。配列番号４のバリアントは、通常、β−鎖を形成する配列番号４内の領域を含む。β−鎖を形成する配列番号４のアミノ酸については、前述している。得られるバリアントが細孔を形成する能力を保持する限り、β−鎖を形成する配列番号４のその領域に１つまたは複数の修飾を作製することができる。配列番号４のβ−鎖領域に作製できる特定の修飾については、前述している。
【０１４７】
好ましくは、配列番号４のバリアントは、そのα−へリックスおよび／またはループ領域内に、１つまたは複数の修飾（置換、付加または欠失など）を含む。α−へリックスおよびループを形成するアミノ酸については、前述している。
【０１４８】
前述の通り、バリアントを修飾して、その同定または精製を補助することができる。
【０１４９】
エキソヌクレアーゼ配列決定法において使用する特に好ましい細孔は、配列番号３６に示されるサブユニット（すなわちα−ＨＬ−Ｅ２８７Ｃ−ＱＣ−Ｄ５ＦＬＡＧＨ６）を１個および配列番号３４に示されるサブユニット（すなわちα−ＨＬ−Ｑ）を６個含む。
【０１５０】
α−ＨＬから得られる細孔は、Ｍｓｐから得られる細孔を参照して前述の通り作製できる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、膜貫通タンパク質細孔は化学修飾されている。細孔は、任意の方法で任意の部位で化学修飾できる。好ましくは、膜貫通タンパク質細孔は、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン結合）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって化学修飾されている。そのような修飾を実施する適切な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質細孔は、任意の分子の付着によって化学修飾され得る。例えば、細孔は、色素または発蛍光団の付着によって化学修飾することができる。
【０１５２】
細孔内のモノマーはいくつでも、化学修飾されてよい。前述の通り、好ましくは、１個または複数個のモノマー（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）が、化学修飾される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、膜貫通タンパク質細孔は、分析物の検出を促進する分子アダプターを含む。エキソヌクレアーゼ配列決定法において使用する細孔は、通常、分子アダプターを含む。
【０１５４】
分子アダプターは、細孔と分析物との相互作用を媒介することによって、分析物の検出を直接促進することができる。そのような実施形態において、アダプターが存在することにより、細孔と分析物とのホスト−ゲスト化学が改善され、それによって分析物を検出する細孔の能力が改善される。ホスト−ゲスト化学の原理は、当技術分野において周知である。アダプターは、細孔と分析物との相互作用を改善する物理的または化学的特性に対して効果がある。アダプターは、細孔のバレルもしくはチャネルの電荷を改変することができ、または分析物と特異的に相互作用するもしくは結合することができ、それによって分析物と細孔との相互作用が促進される。
【０１５５】
他の実施形態において、分子アダプターは、細孔と産物（分析物の処理から形成された断片など）との相互作用を媒介することによって分析物の検出を間接的に促進する。例えば、エキソヌクレアーゼ配列決定法の場合、分子アダプターは細孔とポリヌクレオチド分析物から消化された個々のヌクレオチドとの相互作用を促進する。そのような実施形態において、アダプターが存在することにより細孔と個々のヌクレオチドとのホスト−ゲスト化学が改善され、それによって個々のヌクレオチドを検出する細孔の能力が改善される。アダプターは、個々のヌクレオチドとの相互作用を改善する、細孔の物理的もしくは化学的特性に対して効果がある。アダプターは、細孔のバレルもしくはチャネルの電荷を改変することができ、または個々のヌクレオチドと特異的に相互作用するもしくは結合することができ、それによって細孔との相互作用が促進される。
【０１５６】
好ましくは、分子アダプターは、環状分子、例えばシクロデキストリン、ハイブリダイゼーションできる種、ＤＮＡ結合剤もしくは相互キレート剤（interchelator）、ペプチドもしくはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正電荷小分子または水素結合が可能な小分子である。
【０１５７】
アダプターは環状であってよい。好ましくは、環状アダプターは細孔と同じ対称性を有する。細孔がＭｓｐから得られる場合、Ｍｓｐは通常、中心軸の周りにサブユニットを８個有するので、好ましくは、アダプターは８回対称性を有する。細孔がαーＨＬから得られる場合、α−ＨＬは通常、中心軸の周りにサブユニットを７個有するので、好ましくは、アダプターは７回対称性を有する。これについては、以下で詳述する。
【０１５８】
アダプターは通常、ホスト−ゲスト化学によって分析物と相互作用する。アダプターは通常、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用できる。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用できる１つまたは複数の化学基を含む。好ましくは、１つまたは複数の化学基は、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−陽イオン相互作用および／または静電力など非共有結合性相互作用によって分析物、ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと相互作用する。好ましくは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用できる１つまたは複数の化学基は正に荷電している。より好ましくは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用できる１つまたは複数の化学基はアミノ基を含む。アミノ基は、第一、第二または第三炭素原子に付着することができる。さらにより好ましくは、アダプターは、６、７または８アミノ基の環などのアミノ基の環を含む。最も好ましくは、アダプターは、７または８アミノ基の環を含む。プロトン化したアミノ基の環は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中にある負に荷電したリン酸基と相互作用することができる。
【０１５９】
細孔内部におけるアダプターの正しい位置決めは、アダプターと細孔とのホスト−ゲスト化学によって促進され得る。好ましくは、アダプターは、細孔中にある１つまたは複数のアミノ酸と相互作用可能な１つまたは複数の化学基を含む。より好ましくは、アダプターは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−陽イオン相互作用および／または静電力など非共有結合性相互作用によって細孔中にある１つまたは複数のアミノ酸と相互作用可能な１つまたは複数の化学基を含む。細孔中にある１つまたは複数のアミノ酸と相互作用可能な化学基は、通常、ヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基は、第一、第二または第三炭素原子に付着することができる。ヒドロキシル基は、細孔中の荷電していないアミノ酸と水素結合を形成することができる。細孔とヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの相互作用を促進するどんなアダプターも使用することができる。
【０１６０】
適切なアダプターには、それだけには限らないが、シクロデキストリン、環状ペプチドおよびククルビツリルがある。好ましくは、アダプターは、シクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081〜6088頁に開示されているもののいずれかである。より好ましくは、アダプターは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤ中のグアニジノ基は、ａｍ７−βＣＤ中の１級アミンよりかなり高いｐＫａを有し、したがってより強く正に荷電している。このｇｕ７−βＣＤアダプターを使用して、細孔中にあるヌクレオチドの滞留時間を高め、測定される残留電流の精度を高め、高温または低いデータ収集速度における塩基検出速度を高めることができる。
【０１６１】
スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）架橋剤を以下に詳述するように使用する場合、好ましくは、アダプターはヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
【０１６２】
より適切なアダプターは、８個の糖単位を含むγ−シクロデキストリンを含む（したがって、８倍の対称性を有する）。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含有することができ、または修飾されて、上記のβ−シクロデキストリンの例において使用した修飾された糖単位を全てもしくはそれ以上に含むことができる。
【０１６３】
好ましくは、分子アダプターは、細孔に共有結合している。アダプターは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細孔に共有結合できる。アダプターは通常、化学的結合によって付着している。分子アダプターがシステイン結合によって付着している場合、好ましくは、１つまたは複数のシステインが置換によって変異体に導入されている。上記したように、Ｍｓｐから得られるモノマーは、８８、９０、９１、１０３および１０５位の１つまたは複数にシステイン残基を含むことができる。細孔中の各モノマーは、１つまたは複数（２、３、４もしくは５個など）のこれらシステインに分子アダプターを付着させることによって化学修飾できる。あるいは、モノマーは、他の位置に導入した１つまたは複数のシステインに対する分子の付着によって化学修飾されてもよい。好ましくは、分子アダプターは、配列番号２の９０、９１および１０３位の１つまたは複数に付着している。
【０１６４】
αーＨＬから得られる細孔の場合、細孔のバレルまたはチャネル内におけるアダプターの正しい方向付けおよび細孔に対するアダプターの共有結合は、細孔に対する特定の修飾を使用して促進することができる。具体的には、好ましくは、細孔の全てサブユニットは、配列番号２の１３９位にグルタミンを有する。細孔の１個または複数個のサブユニットが、配列番号２の１１３位にアルギニンを有してよい。細孔の１個または複数個のサブユニットが、細孔に対する分子アダプターの付着を促進するために、配列番号２の１１９、１２１または１３５位にシステインを有してよい。
【０１６５】
システイン残基の反応性は、付近の残基を修飾することによって増強できる。例えば、隣接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性の高いＳ−基に変化させることがある。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護できる。これらを、細孔の１つまたは複数のシステイン残基と反応させて、その後にリンカーを付着させることができる。
【０１６６】
分子（細孔は化学修飾されている）は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または、ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されている通り、細孔に直接付着するまたはリンカーを介して付着することができる。
【０１６７】
好ましい実施形態において、検出器は、ポリヌクレオチド結合タンパク質を含む。これにより、本発明の方法を使用してポリヌクレオチドまたは核酸を配列決定することが可能になる。ポリヌクレオチドについては、以下で定義される。ポリヌクレオチド結合タンパク質の例には、それだけには限らないが、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼおよびヘリカーゼなどの核酸ハンドリング酵素、ならびにＳＣＯＰ（Structural Classification of Proteins）によって核酸結合タンパク質スーパーファミリー（５０２４９）に分類されるものなど非触媒性結合タンパク質がある。国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載される通り、好ましくは、ポリヌクレオチド結合タンパク質は修飾されて、システイン残基が取り除かれるおよび／または置き換えられる。好ましいポリヌクレオチド結合タンパク質は、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼから得られる。好ましくは、タンパク質は、配列番号６に示される配列またはそのバリアントを含む。これについては以下で詳述する。本発明で使用する他の好ましいポリヌクレオチド結合タンパク質には、大腸菌（Escherichia coli）由来エキソヌクレアーゼＩ（配列番号８）、大腸菌（Escherichia coli）由来エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号１０）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＪ（配列番号１２）およびバクテリオファージλ（bacteriophage lambda）エキソヌクレアーゼ（配列番号１４）ならびにそのバリアントがある。配列番号１４の同一のサブユニット３個が、相互作用して、三量体エキソヌクレアーゼを形成する。好ましくは、バリアントは、膜タンパク質への付着を促進するために修飾され、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）またはＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載されるそれらのいずれかであってよい。タンパク質は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載されている配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０またはその国際出願において記述されているそれらのバリアントのいずれかであってよい。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、任意の方法で細孔に付着してよく、好ましくは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）またはＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の通り付着する。
【０１６８】
好ましくは、検出器は、膜貫通タンパク質細孔に加えてポリヌクレオチド結合タンパク質を含む。そのような検出器は、本発明の配列決定方法において使用できるモジュラ配列決定システムを形成する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、細孔に付着できるが、付着する必要はない。
【０１６９】
エキソヌクレアーゼ配列決定法において、標的ポリヌクレオチドは、検出器内に存在するエキソヌクレアーゼと相互作用できる。エキソヌクレアーゼは、通常、検出器内の細孔に付着している。鎖配列決定法において、検出器は、通常、細孔に加えてポリメラーゼを含む。標的ポリヌクレオチドは、検出器内に存在するポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９ポリメラーゼなど）と相互作用できる。ポリメラーゼと細孔は、通常は一緒に付着しないが、一緒に検出器を形成する。
【０１７０】
エキソヌクレアーゼ配列決定法の場合、好ましくは、エキソヌクレアーゼは膜貫通タンパク質細孔と共有結合している。エキソヌクレアーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細孔に共有結合され得る。細孔とタンパク質は、化学的に融合されるかまたは遺伝学的に融合され得る。構築物全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、細孔とエキソヌクレアーゼは遺伝学的に融合されている。エキソヌクレアーゼと細孔との遺伝子融合については、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）に記述されている。
【０１７１】
エキソヌクレアーゼが、システイン結合によって細孔に付着している場合、好ましくは１つまたは複数のシステインが置換によって細孔に導入されている。Ｍｓｐから得られる細孔は当然ながら、１０〜１５、５１〜６０、１３６〜１３９および１６８〜１７２位の１つまたは複数にシステイン残基を含むことができる。これらの位置は、相同物の間で保存性が低いループ領域に存在しており、変異または挿入を許容できることを示している。したがってそれらは、エキソヌクレアーゼを付着するには適している。システイン残基の反応性は、上述のような修飾によって増強できる。
【０１７２】
エキソヌクレアーゼは、細孔に直接、または１つまたは複数のリンカーを介して付着することができる。エキソヌクレアーゼは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されているハイブリダイゼーションリンカーを使用して、細孔に付着させることができる。あるいは、ペプチドリンカーが使用されてよい。ペプチドリンカーは、アミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、柔軟性および親水性は通常、細孔およびエキソヌクレアーゼの機能を妨げないように設計される。好ましい柔軟性があるペプチドリンカーは、２〜２０個（例えば４、６、８、１０または１６個）の一続きのセリンおよび／またはグリシンアミノ酸である。より好ましい柔軟性があるリンカーには（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５および（ＳＧ）８があり、ここでＳはセリン、Ｇはグリシンである。好ましい剛直なリンカーは、２〜３０個（例えば４、６、８、１６または２４個）の一続きのプロリンアミノ酸である。より好ましい剛直なリンカーには、（Ｐ）１２があり、ここでＰはプロリンである。
【０１７３】
検出器は、分子アダプターで化学修飾された膜貫通タンパク質細孔およびエキソヌクレアーゼを含むことができる。そのような検出器は、エキソヌクレアーゼ配列決定法に有用である。
【０１７４】
エキソヌクレアーゼ配列決定法の場合、最も好ましい検出器は、（ａ）α−ＨＬから得られる細孔、（ｂ）細孔に共有結合しているエキソヌクレアーゼおよび（ｃ）シクロデキストリンまたはその誘導体を含む。この好ましい実施形態において、好ましくは、細孔は、配列番号３６に示されるサブユニット（すなわちα−ＨＬ−Ｅ２８７Ｃ−ＱＣ−Ｄ５ＦＬＡＧＨ６）を１個および配列番号３４に示されるサブユニット（すなわちα−ＨＬ−Ｑ）を６個含む。好ましくは、エキソヌクレアーゼは、大腸菌（Escherichia coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号８）またはそのバリアントである。好ましくは、シクロデキストリンの誘導体は、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、または、ヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
【０１７５】
鎖配列決定法の場合、好ましい検出器は、（ａ）Ｍｓｐから得られる細孔および（ｂ）Ｐｈｉ２９ポリメラーゼを含む。細孔とポリメラーゼは、一緒に付着していない。この好ましい実施形態については以下で詳述する。
【０１７６】
検出器は、個別のまたは単一の検出器として存在することができる。あるいは、検出器は、２個以上の検出器の同種または異種集団で存在することができる。
【０１７７】
ポリヌクレオチド
核酸などのポリヌクレオチドは、ヌクレオチドを２個以上含む高分子である。タンパク質に結合しているポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含むことができる。ヌクレオチドは、天然に存在するまたは人工的であり得る。ヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは損傷を受けている場合がある。例えば、ポリヌクレオチドはピリミジンダイマーを含む場合がある。そのようなダイマーは、通常、紫外線光による損傷に関連しており、皮膚黒色腫の主要因である。
【０１７８】
ヌクレオチドは通常、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は通常複素環である。核酸塩基には、それだけには限らないが、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンがある。糖は通常、ペントース糖である。ヌクレオチド糖には、それだけには限らないが、リボースおよびデオキシリボースがある。ヌクレオチドは通常、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは通常、一リン酸塩、二リン酸塩または三リン酸塩を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着してよい。
【０１７９】
ヌクレオチドには、それだけには限らないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）がある。好ましくは、ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。
【０１８０】
ヌクレオチドは、糖および少なくとも１個のリン酸基を含有してよい（すなわち、核酸塩基を欠いている）。
【０１８１】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の方法で互いに付着してよい。ヌクレオチドは、通常、核酸のように糖とリン酸基によって付着する。ヌクレオチドは、ピリミジンダイマーにおけるように核酸塩基を介して接続されてもよい。
【０１８２】
ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。好ましくは、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は二本鎖である。一本鎖ポリヌクレオチドは、それにハイブリダイズするプライマーを１つまたは複数有してよく、したがって二本鎖ポリヌクレオチドの短い領域を１つまたは複数含む。プライマーは、標的ポリヌクレオチドと同じ型のポリヌクレオチドであっても、異なる型のポリヌクレオチドであってもよい。
【０１８３】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセリン核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を持つ他の合成ポリマーなど当技術分野において公知の任意の合成核酸であってもよい。好ましくは、タンパク質に結合されるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡなどの一本鎖である。好ましくは、タンパク質に結合されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡなどの二本鎖である。二本鎖ＤＮＡが、タンパク質に結合される前に一本鎖へと解離していれば、一本鎖ポリヌクレオチドに結合するタンパク質を使用して、二本鎖ＤＮＡを配列決定することができる。
【０１８４】
本発明の鎖配列決定方法を使用する場合、ポリヌクレオチド分析物は、一般に一方の鎖しか配列決定されないが、通常二本鎖部分を含有する。プライマー／鋳型構成において、通常、鋳型鎖が配列決定される（すなわち５’が細孔を通る）。いずれにせよ、鎖配列決定法の場合、好ましくは、二本鎖ポリヌクレオチドは一本鎖リーダー配列を含む。リーダー配列は、任意の長さであってよいが、通常は、長さ５０〜１５０ヌクレオチドなど、長さ２７〜１５０ヌクレオチドである。二本鎖ポリヌクレオチドへの一本鎖ポリヌクレオチドセクションの付加は、様々な方法で行うことができる。化学的または酵素的ライゲーションを行うことができる。加えて、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅによるＮｅｘｔｅｒａ法が適切である。本発明者らは、通常通りゲノムＤＮＡの標的領域の先頭に相補的なセクションを含有するが、追加で５０ポリＴセクションが前に付いたセンスプライマーを使用するＰＣＲ法を開発した。ポリメラーゼが、ポリＴセクションの反対側の相補鎖を伸長し、それによって（通常通り）平滑末端化したＰＣＲ産物を作製することを妨げるために、ポリＴセクションと相補的なプライマーセクションとの間に脱塩基部位を４個付加した。これらの脱塩基部位により、ポリメラーゼがこの領域を越えて伸長できなくなり、したがってポリＴセクションは各増幅されたコピーで５’一本鎖ＤＮＡとして残ることになる。
【０１８５】
ナノ細孔検出
検出器が細孔を含む場合、好ましくは、本発明の方法は、分析物を検出器と相互作用させるステップと、相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって分析物の存在、不存在または特性を決定するステップとをさらに含む。電流が分析物に特異的な形で細孔を通って流れる場合（すなわち分析物と関連した特徴的な電流が細孔を通って流れているのが検出される場合）、その分析物は存在している。電流が分析物に特異的な形で細孔を通って流れない場合、分析物は存在しない。同様に、相互作用の間に細孔を通って流れている電流を使用して分析物の特性を決定することができる。
【０１８６】
したがって、本発明は、分析物のナノ細孔検出を含む。本発明を使用して、細孔を通る電流に影響する異なる効果に基づいて、類似構造の分析物を区別することができる。本発明を使用して、サンプル中の特定の分析物の濃度を測定することもできる。
【０１８７】
本発明は、バルク検知用途において多くのまたは数千もの細孔を使用するセンサーにも使用できる。
【０１８８】
本方法は、細孔が膜に挿入されている任意の適切な膜系（両親媒性層または脂質二重層など）を使用して実施できる。本方法は、通常、（ｉ）細孔を含む人工膜（両親媒性層または脂質二重層など）、（ｉｉ）単離された天然に存在する細孔を含む脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入された細孔を有する細胞を使用して実施される。好ましくは、本方法は人工膜（両親媒性層または脂質二重層など）を使用して実施される。膜は、細孔に加えて他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件については、本発明の配列決定実施形態を参照して以下で述べる。本発明の方法は、通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１８９】
分析物と細孔とが相互作用する間、分析物は、その分析物に特異的な形で細孔を通って流れている電流に影響を及ぼす。例えば、特定の分析物は、特定の平均時間および特定の程度で細孔を通って流れている電流を低下させる。換言すれば、細孔を通って流れている電流は、特定の分析物に対して特徴的である。特定の分析物が有する、細孔を通って流れる電流に対する影響を決定するために、対照実験を実施することができる。試験サンプルにおいて本発明の方法を実施した結果を、次いでこれらの対照実験から得られた結果と比較して、サンプル中にある特定の分析物を同定し、サンプル中に特定の分析物が存在するか否かを決定するまたは分析物の特性を決定することができる。細孔を通って流れる電流が特定の分析物を示す形で影響を受ける頻度を使用して、サンプル中にあるその分析物の濃度を決定することができる。
【０１９０】
ポリヌクレオチド配列決定方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドである分析物の配列を推定する方法も提供する。本発明は、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定する方法も提供する。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドを２個以上含む高分子である。ヌクレオチドは、メチル化されている、酸化されているおよび損傷しているヌクレオチドを含めた上述のいずれかであってよい。ポリヌクレオチドは、上述のそれのいずれかであり、好ましくは、核酸である。
【０１９１】
膜貫通タンパク質細孔を使用して、細孔を通る電流に影響する異なる効果に基づいて、類似構造のヌクレオチドを区別することができるので、これらの方法が可能である。ヌクレオチドが細孔と相互作用するときの電流振幅から、個々のヌクレオチドを単一分子レベルで同定することができる。電流が、ヌクレオチドに特異的な形で細孔を通って流れる場合（すなわちヌクレオチドと関連した特徴的な電流が、細孔を通って流れているのが検出される場合）、ヌクレオチドは（個別にまたはポリヌクレオチドの一部として）細孔中に存在している。標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドを連続して同定することにより、ポリヌクレオチドの配列を決定できる。
【０１９２】
一実施形態において、本方法は、（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、（ｂ）エキソヌクレアーゼが標的ポリヌクレオチドの一方の端から個々のヌクレオチドを消化するように、膜に存在する、膜貫通細孔およびエキソヌクレアーゼを含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、（ｃ）ヌクレオチドを細孔と相互作用させるステップと、（ｄ）相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってヌクレオチドの種類を決定するステップと、（ｅ）標的ポリヌクレオチドの同じ末端でステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、それによって標的ヌクレオチドの配列を決定するステップとを含む。別の実施形態において、本方法は、（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、（ｂ）エキソヌクレアーゼが標的ポリヌクレオチドの一方の端から個々のヌクレオチドを消化するように、膜に存在する、膜貫通タンパク質細孔、細孔と１つまたは複数のヌクレオチドとの相互作用を促進する分子アダプター、およびエキソヌクレアーゼを含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、（ｃ）ヌクレオチドをアダプターと相互作用させるステップと、（ｄ）相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってヌクレオチドの種類を決定するステップと、（ｅ）標的ポリヌクレオチドの同じ末端でステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、それによって標的ヌクレオチドの配列を決定するステップとを含む。したがって、本方法は、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部を連続してナノ細孔検出して、標的ポリヌクレオチドを配列決定することを含む。個々のヌクレオチドについては、上および下で述べている。これは、エキソヌクレアーゼ配列決定法である。
【０１９３】
別の実施形態において、本方法は、（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、（ｂ）標的ポリヌクレオチドが膜貫通細孔を通って移動するように、膜に存在する、細孔を含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、（ｃ）標的ポリヌクレオチドが細孔に関連して移動するときに細孔を通る電流を測定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとを含む。別の実施形態において、本方法は、（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質、好ましくはポリメラーゼが、膜貫通タンパク質細孔を通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中の一部のヌクレオチドが細孔と相互作用するように、膜に存在する、細孔およびタンパク質を含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、（ｃ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとを含む。したがって、本方法は、ヌクレオチドがバレルまたはチャネルを個別に通過するときに、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部をナノ細孔検出して、標的ポリヌクレオチドを配列決定することを含む。これは、鎖配列決定法である。
【０１９４】
膜に核酸配列を結合することにより、必要とされるポリヌクレオチドの量が数桁下がるので、本発明のこれらの方法は、標的ポリヌクレオチド（核酸など）の配列決定に特に適している。本発明を使用して配列決定できる標的ポリヌクレオチドの濃度については、前述している。
【０１９５】
この方法を使用して、標的ポリヌクレオチドの全部または部分だけを、配列決定することができる。ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または、少なくとも５００ヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドは、長さ１０００ヌクレオチド以上または５０００ヌクレオチド以上であってよい。ポリヌクレオチドは、天然または人工であってよい。例えば、本方法を使用して、製造したオリゴヌクレオチドの配列を検証することができる。本方法は通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１９６】
ヌクレオチド（標的ポリヌクレオチドから消化されたまたはポリヌクレオチド中に存在する）は、膜の両側で細孔と相互作用することができる。ヌクレオチドは、任意の様式でおよび任意の部位で細孔と相互作用することができる。上述の通り、好ましくは、ヌクレオチドは、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔に可逆的に結合する。最も好ましくは、ヌクレオチドは、膜を横切って細孔を通るときに、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔に可逆的に結合する。ヌクレオチドは、膜を横切って細孔を通るときに、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔のバレルまたはチャネルに可逆的に結合することもできる。
【０１９７】
ヌクレオチドと細孔とが相互作用している間に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドに特異的な形で、細孔を通る電流の流れに影響を及ぼす。例えば、特定のヌクレオチドは、特定の平均時間および特定の範囲で細孔を通る電流の流れを減少させることになる。換言すれば、細孔を通る電流の流れは、特定のヌクレオチドに対して特徴的である。対照実験を実施して、特定のヌクレオチドが細孔を通る電流の流れに及ぼす影響を決定することができる。試験サンプルにおいて本発明の方法を実施した結果を、次に、それらの対照実験から得た結果と比較して、標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。
【０１９８】
配列決定方法は、細孔が膜内に存在するまたは膜中に挿入されている任意の適切な膜／細孔系を使用して実施することができる。本方法は、通常、天然に存在するまたは合成の脂質を含む膜を使用して実施される。膜は、通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される。好ましくは、本方法は、単離された天然に存在する細孔を含む膜または細孔を発現している細胞を使用して実施されない。好ましくは、本方法は人工膜を使用して実施される。膜は、細孔に加えて、他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含むことができる。
【０１９９】
膜は、イオン、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの流れに対する障壁を形成する。好ましくは、膜は脂質二重層などの両親媒性層である。本発明による使用に適している脂質二重層については上述している。
【０２００】
本発明の配列決定方法は、通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０２０１】
配列決定方法は、細孔が膜内に存在するまたは膜中に挿入されている膜／細孔系を調査するのに適切ないずれかの装置を使用して実施することができる。本方法は、ナノ細孔検出に適切ないずれかの装置を使用して実施することができる。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバおよびチャンバを２つのセクションに分離する障壁を含む。障壁は、細孔を含有する膜が形成される開口部を有する。分析物は、チャンバの２つのセクションのいずれかの膜に結合することができる。
【０２０２】
配列決定方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２に記載の装置を使用して実施できる。
【０２０３】
本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用の間に、または標的ポリヌクレオチドが細孔に関連して移動するときに細孔を通る電流を測定することを含む。したがって、装置は、電位を印加し、膜および細孔の電気シグナルを測定可能な電気回路も含む。本方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施することができる。好ましくは、本方法は電圧クランプの使用を含む。
【０２０４】
本発明の配列決定方法は、ヌクレオチドとの相互作用の間に、または標的ポリヌクレオチドが細孔に関連して移動するときに細孔を通る電流を測定することを含む。膜貫通タンパク質細孔を通るイオン電流を測定するための適切な条件は、当技術分野において公知であり、実施例において開示されている。本方法は通常、膜および細孔に印加される電圧により実施される。使用される電圧は通常、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。好ましくは、使用される電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値、ならびに＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶからそれぞれ独立に選択される上限値の範囲にある。より好ましくは、使用される電圧は、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にある。印加電位を高めて使用することにより、細孔による異なるヌクレオチドの識別を高めることが可能である。
【０２０５】
配列決定方法は通常、任意のアルカリ金属塩化物塩の存在下で実施される。上述した例示的な装置において、塩は、チャンバ内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が、通常使用される。好ましくはＫＣｌである。塩濃度は通常、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。好ましくは、塩濃度は、１５０ｍＭ〜１Ｍである。高塩濃度は高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を、正常電流のバックグラウンド変動に対して同定することが可能になる。ヌクレオチドの検出が、ポリヌクレオチドを配列決定するときなど酵素の存在下で実施される場合、低塩濃度を使用できる。これについては、以下で詳述する。
【０２０６】
本方法は通常、緩衝液の存在下で実施される。上述した例示的な装置において、緩衝液は、チャンバ内の水溶液中に存在する。本発明の方法において、どんな緩衝液も使用することができる。１つの適切な緩衝液は、トリス−ＨＣｌ緩衝液である。本方法は通常、ｐＨ４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７または７．０〜８．８もしくは７．５〜８．５で実施される。好ましくは、使用されるｐＨは約７．５である。
【０２０７】
本方法は通常、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃または２０℃〜６０℃で実施される。本方法は、室温で実施されてよい。好ましくは、方法は、約３７℃など酵素機能を補助する温度で実施される。
【０２０８】
上述の通り、温度が上昇した場合、低塩濃度で、優れたヌクレオチド識別を得ることができる。溶液温度を上げることに加えて、酵素活性にとって適切な条件を維持しながら、溶液の伝導性を高めるために採用できるいくつかの他の戦略がある。そのような戦略の１つは、脂質二重層を使用して、塩溶液を異なる２つの濃度に分けることである（酵素側に低塩濃度、反対側に高濃度の塩）。この手法の１つの例は、膜のシス側に２００ｍＭのＫＣｌおよびトランスチャンバ中に５００ｍＭのＫＣｌを使用することである。これら条件において、細孔を通る伝導性は、通常の条件下で４００ｍＭのＫＣｌとおおよそ同等であると予想され、酵素は、シス側に配置された場合、２００ｍＭの影響しか受けない。非対称の塩条件を使用する別の考えられる利益は、細孔を横切って誘導される浸透圧勾配である。この正味の水の流れを使用して、検出用の細孔へとヌクレオチドを引き込める可能性がある。類似の効果は、スクロース、グリセリンまたはＰＥＧなど中性浸透圧調節物質を使用して得ることができる。別の可能性は、比較的低レベルのＫＣｌを含む溶液を使用し、酵素活性に対して破壊的でない追加的な電荷を担持している種を利用することである。
【０２０９】
分析される標的ポリヌクレオチドは、公知の保護化学物質と合わせて、バルク溶液中にある間に結合タンパク質またはエキソヌクレアーゼによって受ける作用からポリヌクレオチドを保護することができる。次いで細孔を使用して、保護化学物質を取り除くことができる。これは、印加電位のもとで細孔、結合タンパク質もしくは酵素にハイブリダイズされない保護基を使用することによって（ＷＯ２００８／１２４１０７）、または細孔に対して近接近に保持されているときに、結合タンパク質もしくは酵素によって取り除かれる保護化学物質を使用することによって得ることができる（J Am Chem Soc. 2010 Dec 22；132(50)：17961〜72頁）。
【０２１０】
エキソヌクレアーゼ配列決定
一実施形態において、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定する方法は、標的ポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ酵素と相互作用させることを含む。上述したエキソヌクレアーゼ酵素のいずれも、本方法で使用できる。エキソヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドの一方の端から個々のヌクレオチドを遊離させる。酵素は、上述の通り細孔に共有結合されてよい。
【０２１１】
個々のヌクレオチドは単一ヌクレオチドである。個々のヌクレオチドとは、ヌクレオチド結合によって別のヌクレオチドまたは核酸に結合していないものである。ヌクレオチド結合は、別のヌクレオチドの糖類に結合しているヌクレオチドのリン酸基のうちの１つを含む。個々のヌクレオチドとは、通常、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００ヌクレオチドの別のポリヌクレオチドに、ヌクレオチド結合によって結合していないものである。例えば、個々のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖など標的ポリヌクレオチドから消化されている。個々のヌクレオチドは、前述のそれのいずれかであってよい。
【０２１２】
エキソヌクレアーゼは、通常ポリヌクレオチドの一方の末端を掴み、その末端から一度に１ヌクレオチドずつポリヌクレオチドを消化する酵素である。エキソヌクレアーゼは、５’から３’方向にまたは３’から５’方向にポリヌクレオチドを消化することができる。エキソヌクレアーゼが結合するポリヌクレオチドの末端は通常、使用される酵素の選択によっておよび／または当技術分野において公知の方法を使用して決定される。通常、ポリヌクレオチドのいずれかの末端にあるヒドロキシル基またはキャップ構造を使用して、ポリヌクレオチドの特定の末端に対するエキソヌクレアーゼの結合を防止するまたは促進する。
【０２１３】
前述の通り、本方法は、一部のヌクレオチドの同定を可能にする速度で、ヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端から消化されるように、ポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼと相互作用させることを含む。これを行う方法は、当技術分野で周知である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して同定できるように、エドマン分解を使用してポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を連続的に消化する。本発明において相同な方法を使用することができる。
【０２１４】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は通常、野生型エキソヌクレアーゼの最適な速度より遅い。配列決定の方法におけるエキソヌクレアーゼの活性の適切な速度は、１秒につき０．５〜１０００ヌクレオチド、１秒につき０．６〜５００ヌクレオチド、１秒につき０．７〜２００ヌクレオチド、１秒につき０．８〜１００ヌクレオチド、１秒につき０．９〜５０ヌクレオチド、または１秒につき１〜２０もしくは１０ヌクレオチドの消化を含む。好ましくは、速度は１秒につき１、１０、１００、５００または１０００ヌクレオチドである。エキソヌクレアーゼ活性の適切な速度は、様々な方法で得ることができる。例えば、活性の最適速度が低下したバリアントエキソヌクレアーゼを、本発明に従って使用できる。
【０２１５】
本発明のエキソヌクレアーゼ配列決定方法は、必要なポリヌクレオチド量の削減の他に、さらなる利点がある。本発明者らは、電位下における、エキソヌクレアーゼ−ナノ細孔（「Ｘ−細孔」）／膜系に対する溶液中の一本鎖ＤＮＡの提示について研究した。ＤＮＡ分析物が系に導入されるとき、細孔が持続的または一時的に遮断され、個々のヌクレオチドの検出が妨げられる場合がある。ＤＮＡ分析物の一方の末端を、例えば膜に結合することによって細孔から離して局在させるとき、驚くべきことに、この遮断がもはや観察されなくなることが判明した。これは、分析物と同じ平面に存在する細孔の有効濃度を増加させることにより、酵素に対する潜在的なＤＮＡ通過事象の数も増加させる。これにより分析物との結合時間が短縮され、配列決定スループットが増加する。
【０２１６】
鎖配列決定
鎖配列決定は、細孔を通るポリヌクレオチドの段階的な移行の制御を含む。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドを２個以上含む高分子である。タンパク質に結合されるポリヌクレオチドは、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含むことができる。ヌクレオチドは、上述したそれらいずれであってもよい。
【０２１７】
本発明の鎖配列決定方法は、通常、ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用して、細孔を通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。そのようなタンパク質の例は、上で挙げている。好ましくは、ポリヌクレオチド結合タンパク質はポリヌクレオチドハンドリング酵素である。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドと相互作用でき、核酸の少なくとも１つの特性を修飾できるポリペプチドである。酵素は、ポリヌクレオチドを切断することによってこれを修飾し、個々のヌクレオチドまたは短いヌクレオチド鎖（ジ−もしくはトリヌクレオチドなど）を形成することができる。酵素は、ポリヌクレオチドを正しい向きに配向させるまたは特定の位置に移動させることによってこれを修飾できる。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、標的ポリヌクレオチドに結合する能力および細孔を通る移動を制御する能力がありさえすれば、酵素活性を示す必要はない。例えば、酵素は、修飾して酵素活性を取り除かれてもよく、または酵素として作用できない条件で使用されてもよい。そのような条件については、以下で詳述する。
【０２１８】
好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、核酸分解酵素から得られる。より好ましくは、酵素構築物において使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバーから得られる。酵素は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ  ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されているそれらのいずれかであってよい。
【０２１９】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、トランスロカーゼおよびトポイソメラーゼ（ジャイレースなど）である。適切な酵素には、それだけには限らないが、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号８）、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号１０）、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のＲｅｃＪ（配列番号１２）およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号１４）ならびにそれらのバリアントがある。配列番号１４に示される配列またはそのバリアントを含む３つのサブユニットが相互作用して、三量体エキソヌクレアーゼを形成する。最も好ましくは、酵素はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼから得られる。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼから得られる酵素は、配列番号６に示される配列またはそのバリアントを含む。
【０２２０】
一実施形態によると、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、膜に結合または係留されており、分析物ポリヌクレオチドに結合することと次に細孔を通る分析物の移行を制御することの両方ができる。この実施形態において、分析物ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質を介して膜に結合されてよい。分析物ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合タンパク質の両方が、好ましくは、異なる結合方法によって膜に結合されてよい。好ましくは、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ヘリカーゼである。
【０２２１】
配列番号６、８、１０、１２または１４のバリアントは、配列番号６、８、１０、１２または１４とは異なるアミノ酸配列を有するが、ポリヌクレオチド結合能を保持している酵素である。バリアントは、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含むことができる。
【０２２２】
好ましくは、バリアントは、配列番号６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列の全長にわたってアミノ酸同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同になる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号６、８、１０、１２もしくは１４のアミノ酸配列と全配列にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００以上（例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性」）。相同性は、上述の通りに決定される。バリアントは、配列番号２を参照して、上述した方法のいずれかで、野生型配列と異なることができる。酵素は、上述の通り細孔に共有結合されてよい。
【０２２３】
ヌクレオチドが細孔の検出部分に達する系列において障害の可能性が全くないので、酵素は、個々のヌクレオチド配列決定の場合ほど細孔内腔に近接近する必要がない。
【０２２４】
鎖ＤＮＡ配列決定のための２つの戦略は、ナノ細孔を通してＤＮＡをシスからトランスへ、およびトランスからシスへと印加電位に伴ってまたは反対に移行させることである。鎖配列決定に最も有利な機序の１つは、印加電位の下でナノ細孔を通る一本鎖ＤＮＡの移行を制御することである。二本鎖ＤＮＡ上で漸進的または進行的に作用するエキソヌクレアーゼを細孔のシス側で使用して、残った一本鎖を印加電位の下で送り込むことができ、またはトランス側で使用して、逆電位の下で送り込むことができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、類似の方式で使用できる。印加電位とは反対への鎖の移行を必要とする配列決定応用の可能性もあるが、ＤＮＡは最初に逆電位または無電位の下で酵素に「捕われ」なければならない。次いで結合した後に電位を切り替えて、鎖は細孔を通ってシスからトランスへと通過し、電流の流れによって伸びた立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存的ポリメラーゼが分子モーターとして作用して、移行したばかりの一本鎖を段階的に制御する方式で、印加電位とは反対方向にトランスからシスへと細孔を通して引き戻すことができる。あるいは、一本鎖ＤＮＡ依存的ポリメラーゼは、細孔を通るポリヌクレオチドの移動を減速する分子制動装置として作用することができる。
【０２２５】
最も好ましい実施形態において、鎖配列決定は、Ｍｓｐから得られる細孔およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。本方法は、（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが、Ｍｓｐから得られる細孔を通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、膜にある、細孔およびポリメラーゼを含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、（ｃ）標的ポリヌクレオチドが細孔に関連して移動するときに細孔を通る電流を測定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとを含んでよく、ステップ（ｂ）および（ｃ）は細孔に印加される電圧により実施される。本方法は、（ａ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させるステップと、（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが、Ｍｓｐから得られる細孔を通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中の一部のヌクレオチドが細孔と相互作用するように、膜にある、細孔およびポリメラーゼを含む検出器と、標的ポリヌクレオチドを相互作用させるステップと、（ｃ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとを含んでよく、ステップ（ｂ）および（ｃ）は細孔に印加される電圧により実施される。標的ポリヌクレオチドがＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｓｐから得られる細孔と接触されるとき、標的ポリヌクレオチドは最初にＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成する。電圧が細孔に印加されるとき、標的ポリヌクレオチド／Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ複合体は細孔と複合体を形成し、細孔を通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０２２６】
これらのＭｓｐ／Ｐｈｉ２９の実施形態には、予想外の利点が３つある。第１に、商業的に実現可能でありなおかつ有効な配列決定を可能にする速度で、標的ポリヌクレオチドが細孔を通って移動する。標的ポリヌクレオチドは、溶血素細孔を通って移動するより速くＭｓｐ細孔を通って移動する。第２に、ポリヌクレオチドが細孔を通って移動する際に、電流範囲の増加が観察され、より容易に配列を決定できるようになる。第３に、特異的細孔とポリメラーゼを一緒に使用する場合、電流変動の減少が観察され、それによってシグナル対ノイズ比が高まる。
【０２２７】
上述した任意のポリヌクレオチドを、配列決定することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は二本鎖である。
【０２２８】
細孔は、上述した細孔のいずれであってもよい。細孔は、配列番号２で示される配列またはそのバリアントを含む８個のモノマーを含むことができる。
【０２２９】
野生型Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を有する。これは、適当な条件下で二本鎖ポリヌクレオチドをほどくこともできる。したがって、本酵素は３つのモードで作動できる。これについては、以下で詳述する。
【０２３０】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示される配列またはそのバリアントを含むことができる。配列番号６のバリアントは、配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有するが、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。バリアントは、後述する３つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、バリアントは３つ全てのモードで作動する。バリアントは、ポリヌクレオチドの処理を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含むことができる。
【０２３１】
好ましくは、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号６のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも４０％相同になる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号４のアミノ酸配列と全配列にわたって少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００以上（例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性」）。相同性は、上述の通りに決定される。バリアントは、配列番号２を参照して、上述した方法のいずれかで、野生型配列と異なることができる。酵素は、上述のように細孔に共有結合されてよい。
【０２３２】
上述したシステム、装置または条件のいずれかを、この好ましい実施形態に従って使用できる。塩濃度は通常０．１５Ｍ〜０．６Ｍである。好ましくは、塩はＫＣｌである。
【０２３３】
本方法は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの３つのモードに基づいて、３つの好ましい方法の１つで実施され得る。各方法は、配列を校正する方法を含む。第１に、好ましくは、本方法はポリメラーゼとしてＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。この実施形態において、ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場とは反対方向に細孔を通して標的ポリヌクレオチドを移動させるように、ステップ（ｂ）および（ｃ）が遊離ヌクレオチドと酵素補因子の存在下で実施される。標的ポリヌクレオチドは、５’から３’の方向で移動する。遊離ヌクレオチドは、上述した個々のヌクレオチドのいずれか１つまたは複数であってよい。酵素補因子は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼがポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼとして機能できるようにする因子である。好ましくは、酵素補因子は二価金属陽イオンである。好ましくは、二価金属陽イオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。最も好ましくは、酵素補因子はＭｇ２＋である。好ましくは、本方法は（ｄ）ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場に伴って（すなわち３’から５’方向に）細孔を通して標的ポリヌクレオチドを移動させ、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、遊離ヌクレオチドを取り除くステップと、（ｅ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｃ）において得られた標的ポリヌクレオチドの配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｄ）および（ｅ）もまた細孔に印加される電圧により実施される。
【０２３４】
第２に、好ましくは、本方法はエキソヌクレアーゼとしてＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。この実施形態において、ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場に伴って細孔を通して標的ポリヌクレオチドを移動させるように、ステップ（ｂ）および（ｃ）が、遊離ヌクレオチドの非存在下および酵素補因子の存在下で実施される。標的ポリヌクレオチドは、３’から５’の方向に移動する。好ましくは、本方法は、（ｄ）ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場と反対方向に（すなわち５’から３’方向に）細孔を通して標的ポリヌクレオチドを移動させ、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、遊離ヌクレオチドを添加するステップと、（ｅ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｃ）において得られた標的ポリヌクレオチドの配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｄ）および（ｅ）もまた細孔に印加される電圧により実施される。
【０２３５】
第３に、好ましくは、本方法は、アンジッピングモードでＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。この実施形態において、ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場と共に細孔を通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように（ほどかれるように）、ステップ（ｂ）および（ｃ）が、遊離ヌクレオチドの非存在下および酵素補因子の非存在下で実施される。この実施形態において、ポリメラーゼは、印加電圧の影響下で標的ポリヌクレオチドがあまりに速く細孔を通って移動することを防止する制動装置のように作用する。好ましくは、本方法は、（ｄ）標的ポリヌクレオチドがステップ（ｂ）および（ｃ）における方向とは反対方向に細孔を通って移動し（すなわち、再アニールし）、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、細孔に印加される電圧を下げるステップと、（ｅ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｃ）において得られた標的ポリヌクレオチドの配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｄ）および（ｅ）もまた細孔に印加される電圧により実施される。
【０２３６】
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定するためのキットも提供する。キットは、（ａ）膜貫通タンパク質細孔などの膜貫通細孔、（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質および（ｃ）膜に標的ポリヌクレオチドを結合させる手段を含む。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド結合タンパク質はエキソヌクレアーゼであり、キットは、細孔と標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドとの相互作用を促進する分子アダプターをさらに含む。そのようなキットはエキソヌクレアーゼ配列決定法に使用できる。別の好ましい実施形態において、キットは、脂質二重層を形成するのに必要なリン脂質などの膜成分を含む。
【０２３７】
好ましくは、膜に標的ポリヌクレオチドを結合させる手段は反応基を含む。適切な基には、それだけには限らないが、チオール、コレステロール、脂質およびビオチン基がある。本発明の方法を参照して上述したどの実施形態も本発明のキットに同程度に適用できる。
【０２３８】
本発明のキットは、前述の実施形態のいずれかを実施可能にする１つまたは複数の他の試薬または機器を追加的に含むことができる。そのような試薬または機器には、以下の１つまたは複数が含まれる：適切な緩衝液（複数可）（水溶液）、対象からサンプルを採取する手段（注射針を備える容器または機器など）、ポリヌクレオチドを増幅および／または発現させる手段、上で定義した膜または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、液体サンプルで試薬を再懸濁するような乾燥状態でキット中に存在することができる。場合によっては、キットは、本発明の方法でキットを使用することが可能になる説明書、または本方法を使用できる患者に関する詳細を含むこともできる。キットは、場合によってはヌクレオチドを含むことができる。
【０２３９】
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドである分析物を配列決定するための装置も提供する。装置は、（ａ）膜、（ｂ）膜内にある複数の膜貫通細孔、（ｃ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質および（ｄ）膜に結合している複数の標的ポリヌクレオチドを含む。複数のポリヌクレオチド結合タンパク質は、膜内にあってよい。装置は、アレイまたはチップなど分析物の分析用として任意の従来の装置であってよい。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド結合タンパク質はエキソヌクレアーゼであり、装置は、細孔と標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドとの相互作用を促進する分子アダプターを含む。そのような装置はエキソヌクレアーゼ配列決定法に使用できる。本発明の方法を参照して上述した実施形態のいずれも、本発明のキットと同程度に適用できる。好ましくは、装置は、
膜および複数の細孔を支持することができ、細孔とタンパク質とを使用してポリヌクレオチドの配列決定を行うように操作できるセンサーデバイスと、
配列決定を行うための材料保持用の少なくとも１つの貯蔵部とを含む。
【０２４０】
好ましくは、装置は、
膜および複数の細孔を支持することができ、細孔およびタンパク質を使用してポリヌクレオチドの配列決定を行うように操作できるセンサーデバイス；
配列決定を行うための材料保持用の少なくとも１つの貯蔵部；
少なくとも１つの貯蔵部からセンサーデバイスへと制御可能に材料を供給するよう構成された流体系；
それぞれのサンプルを受けるための１つまたは複数の、例えば複数の容器を含み、流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスへと選択的にサンプルを供給するよう構成されている。装置は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（ＷＯ  ２００９／０７７７３４として公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９（ＷＯ  ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６（未公開）または国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９（ＷＯ  ００／２８３１２として公開）に記載される装置のいずれかであってよい。
【０２４１】
以下の実施例は、本発明を例示している：
【実施例１】
【０２４２】
エキソヌクレアーゼ配列決定法
１．１  材料および方法
１．１．１  材料およびオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、ＡＤＴＢｉｏまたはＩＤＴＤＮＡのいずれかより購入した。正確な配列および修飾の詳細は、以下の表中に見られる（配列番号１８〜２１）。
【０２４３】
【表４】
2014519823.tif 000005
【０２４４】
大腸菌（Escherichia coli）に発現させた組換えストレプトアビジンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ０６７７）から購入した。合成脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０  ４ＭＥ  ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップビオチニル（１６：０  Ｃａｐ  ビオチニル  ＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。
【０２４５】
１．１．２  単一置換ストレプトアビジンのＨＰＬＣ精製
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．５中で、１ｕＭ  ５’−ビオチン修飾ＤＮＡを１０ｕＭストレプトアビジンと混合し、２２℃で３０分間インキュベートした。バイナリポンプ、２３℃に維持したカラムオーブン、１３ｕｌのフローセルを有する紫外線検出器、４℃に維持したサンプル区画と画分の両方を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００分析ＬＣシステムを使用して、単一置換Ｓｔｒｅｐ：ＤＮＡコンジュゲートを分離した。カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＱＡであり、１ｍＬ  ｍｉｎ−１で流し、サンプルを、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５中で３０ｍＭ〜１．１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で分離した。精製した単一置換Ｓｔｒｅｐ：ＤＮＡコンジュゲートの定量を、一連のＤＮＡ標準を使用して標準曲線を作製し、ゲル電気泳動した後に密度計測を使用して実施した。
【０２４６】
１．１．３  平面脂質二重層からの単一チャネル記録
１００％  １６：０  ４ＭＥ  ＰＣまたは９５％  １６：０  ４ＭＥ  ＰＣ、５％  １６：０  ＣａｐビオチニルＰＥのいずれかより成る２つの単分子層を並置することによって二重層を形成した。テフロン（登録商標）薄膜（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ製、厚さ２５μｍ）内の直径６０〜１５０μｍの開口部に二重層を形成し、その二重層によりチャンバを各々１ｍｌ容積の２つの緩衝液区画（シスおよびトランス）に隔てた。高抵抗シール（≧１０ＧΩ）が観察されるまで各区画の緩衝液水位を連続的に上昇させることにより、二重層を開口部に形成した。特に明記しない限り、ＤＮＡおよびタンパク質を、アースに接続されているシス区画に添加した。増幅器のヘッドステージに接続したトランス区画には試薬を添加しなかった。特に明記しない限り、実験は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。
【０２４７】
１．２  結果
１．２．１  係留された分析物の単分子検出
１秒間にナノ細孔を通るＤＮＡ移行（事象）の回数を測定することによって、溶液中で遊離している一本鎖ＤＮＡのナノ細孔検出速度を決定できる。ＤＮＡ移行は、デジタル記録におけるシグネチャー一時的電流遮断によって同定できる。係留された分析物の場合、ＤＮＡが、コレステロール基を介してなど、二重層に一時的に係留されるだけであれば、相互作用の回数を同様に算出することができる。ＤＮＡの自由端がナノ細孔に入るとき、係留されている末端が二重層から遊離し、その結果分子が移行できるまで、それはバレル内に存在することになる（図２Ａおよび図２Ｂ）。係留が安定である場合、遮断は持続的になる（図２Ｃおよび図２Ｄ）。
【０２４８】
コレステロール修飾ポリＡおよびポリＣ（それぞれＯＮＬＡ０６８２およびＯＮＬＡ０６８３）の５０％混合物を、最終濃度１０、１００および１０００ｐＭでアッセイして、事象速度および滞留時間に対するＣｈｏｌ−ＤＮＡの効果を確立した（下表）。これを、遊離している一本鎖ＤＮＡの事象速度と比較した。
【０２４９】
【表５】
2014519823.tif 000006
【０２５０】
全ての濃度において、速度は電圧と共に高くなり（表上）、当然ながら事象速度は高濃度で高くなる。より低い濃度および電圧では、事象速度が低すぎて、実際に意義が無いとみなされる。すなわち、これら条件における事象の全てではないにしてもほとんどが、単なる偶然の偽陽性である可能性がある。しかし、高電流レベルにおいて著しい回数のＤＮＡ事象が１０ｐＭ  ＤＮＡだけで見られることはやや意外である。ＤＮＡ濃度が少なくとも１００倍低いにもかかわらず、事象速度はコレステロール修飾ＤＮＡでなお一層高い。高電流レベル（≧１６０ｍＶ）において、依然として著しい回数のＤＮＡ事象が１０ｐＭ  ＤＮＡだけで見られることはやや意外であり、これらのＤＮＡ事象は、１００ｎＭ無修飾ｓｓＤＮＡと同程度の頻度で起こる。ＤＮＡを係留することにより、ＤＮＡ分析物の検出が３〜４桁改善されると推定できる。ある特定の用途の場合、係留する一時的な性質が好ましい可能性がある。安定した係留分子が、ＤＮＡの５’または３’末端のいずれかに直接付着している場合、二重層と酵素活性部位との距離のせいで配列決定動作をＤＮＡの末端まで続けることができないので、いくらかの配列データは失われることになる。係留がより一時的である場合、係留されている末端がランダムに二重層から遊離するとき、酵素はＤＮＡを完全に処理できる。
【０２５１】
１．３  結論
分析物に対するナノ細孔検出器の検出効率をおよそ３〜４桁改善する潜在性をここで実証した。急激な細孔遮断は、この係留されている分析物が、溶液からのおよび二重層中にあるタンパク質の両方（それぞれ酵素またはナノ細孔構築物など）に依然として利用可能であり、細孔自体またはナノ細孔−酵素構築物いずれかへの送達機序としての潜在性を有することを示唆している。
【０２５２】
脂質二重層に分析物を付着させる様々な手段が利用可能であり、オリゴヌクレオチド合成の間に機能的化学を容易に組み込めるので、そのほとんどはｓｓＤＮＡの係留について報告されてきた。好ましい手段において、末端転移酵素を使用してビオチン修飾ｄｄＮＴＰをｓｓＤＮＡの３’−末端に組み込むことができる。次に、ストレプトアビジンと混合することによって、分析物ＤＮＡが係留されることになる１〜５％ビオチンＰＥを含有する脂質二重層中の単一細孔に、それを付加することができる。あるいは、配列が公知の場合、次いで、一方の末端が既に親油性に修飾されている相補的な合成ＤＮＡにＤＮＡをハイブリダイズさせることができる。
【０２５３】
分析物を係留する別の利点は、ＤＮＡの一方の末端の制御である。一方の末端を近接近した状態に保つ場合（上記の場合これは二重層である）、ＤＮＡは細孔を急速に遮断することが上記から分かる。エキソヌクレアーゼなどのＤＮＡハンドリング酵素がナノ細孔に付着する場合、次にそれはＤＮＡの一方の末端に結合し、再び細孔に局在化させるので、他方の末端が速やかに遮断することになる。しかしＤＮＡが固定されている場合、酵素が一方の末端に結合すると、このとき両端とも占有されてしまい、細孔に利用できない。
【０２５４】
分析物の必要量が少ないＤＮＡ配列決定法の必要性は、エピジェネティクスの単一細胞配列決定そしてまた少量の生体サンプルからのスクリーニングなどの用途のためである。現在のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ分析システムは、配列決定ライブラリの調製用として１００ｎｇ〜１ｕｇのＤＮＡを必要とする。ナノ細孔配列決定用の単一１２８チャネルチップは、増幅を必要とせずに約０．５ｎｇのＤＮＡを使用できる；１０ｐＭ濃度で１０００ｍｅｒ断片の生成およびリード長に基づく。
【実施例２】
【０２５５】
鎖配列決定法
エキソヌクレアーゼ配列決定法のために脂質膜にｓｓＤＮＡを付着させる行為に加えて、本技術は、鎖配列決定手法に適合することもできる。鎖配列決定法において、ポリヌクレオチド鎖の一部は印加電位下でナノ細孔に通される。通常、鎖はＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば一本鎖または二本鎖ＤＮＡである。好ましくは、鎖は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。鎖に含まれる塩基残基はナノ細孔と相互作用し、各残基の特性であるシグナルが生成する。鎖は細孔を通って移動し、シグナルに変化をもたらす。そのシグナルを使用して、ＤＮＡ鎖の配列を推定することができる。
【０２５６】
鎖配列決定法の一実施形態は、脂質膜に埋め込まれたタンパク質細孔を使用する。電極が電解質中にある脂質膜の両側に置かれ、系に電位が印加される。電位下で、ポリヌクレオチドは細孔を移行する。タンパク質細孔を通る電流を測定し、これを使用して、塩基が細孔の膜貫通バレルを通る際にそれらを認識できる。通常、タンパク質細孔はポーリンまたは毒素などの細菌膜タンパク質になる。好ましくは、細孔は、溶血素、グラミシジンまたはＭｓｐＡである。
【０２５７】
ＤＮＡが細孔を通って移行する速度が速すぎて、各塩基を正確に同定することができないので、移行を減速することが望ましい。ＤＮＡ鎖の移行を減速する方法の１つは、ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡハンドリングタンパク質を使用することである。例えば、直接にまたはリンカー基を介する共有結合によって、ＤＮＡハンドリングタンパク質を細孔に付着させることができる。通常、エキソヌクレアーゼ配列決定用途の場合、ＤＮＡハンドリングタンパク質は細孔に付着される。一般的に、鎖配列決定用途の場合、ＤＮＡハンドリングタンパク質は細孔に付着していない。
【０２５８】
鎖配列決定手法の場合、ナノ細孔上部で非常に長い結合時間を有するＤＮＡハンドリングタンパク質であることが望ましい。長い結合時間により、多くのヌクレオチドをＤＮＡハンドリングタンパク質によって、したがってナノ細孔によって処理することが可能になる。ポリメラーゼの場合、典型的な処理速度は、１秒につき約２０ヌクレオチドであり得る。１０分間の結合時間により、１２，０００ヌクレオチドが移動できることになる。１分間の結合時間により、１２０ヌクレオチドを処理できることになる。
【０２５９】
この手法を使用する場合、長い結合時間はリード長とも関連する。より長いリード長（例えば２００、５００または１，０００ヌクレオチドのリード長）が望ましいが、現在では、約１００ヌクレオチドのリード長があれば既存の技術に対抗するのに十分である。好ましいリード長は、少なくとも５０００ヌクレオチド、より好ましくは１００００または５００００ヌクレオチドである。長いリード長の１つの利点は、配列決定情報を分析するために必要なバイオインフォマティクスの複雑さを大幅に低減させることである。
【０２６０】
通常は、ＤＮＡハンドリングタンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼである。好ましいＤＮＡハンドリングタンパク質にはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼがある。
【０２６１】
２．１  材料および方法
１００％  ＤＰｈＰＣまたは９９％ＤＰｈＰＣ、１％  １６：０  ＣａｐビオチニルＰＥのいずれかより成る２つの単分子層を並置することによって二重層を形成した。テフロン（登録商標）薄膜（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ製、厚さ２５μｍ）内の直径６０〜１５０μｍの開口部に二重層を形成し、その二重層によりチャンバを各々１ｍｌ容積の２つの緩衝液区画（シスおよびトランス）に隔てた。高抵抗シール（≧１０ＧΩ）が観察されるまで各区画の緩衝液水位を連続的に上昇させることにより、二重層を開口部に形成した。特に明記しない限り、ＤＮＡおよびタンパク質を、アースに接続されているシス区画に添加した。増幅器のヘッドステージに接続したトランス区画には試薬を添加しなかった。実験は、４００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１０ｕＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．５で実施した。使用した溶血素変異体は、ＨＬ−（Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ）７（配列番号３８）であった。
【０２６２】
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．５中で、１ｕＭ  ５’−ビオチン修飾ＤＮＡ（ＳｔｒａｎｄＤＮＡ１）を１０ｕＭストレプトアビジンと混合し、２２℃で３０分間インキュベートした。バイナリポンプ、２３℃に維持したカラムオーブン、１３ｕｌのフローセルを有する紫外線検出器、４℃に維持したサンプル区画と画分の両方を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００分析ＬＣシステムを使用して、単一置換Ｓｔｒｅｐ：ＤＮＡコンジュゲートを分離した。カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＱＡであり、１ｍｌ  ｍｉｎ−１で流し、サンプルを、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５中で３０ｍＭ〜１．１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で分離した。精製した単一置換Ｓｔｒｅｐ：ＤＮＡコンジュゲートの定量を、一連のＤＮＡ標準を使用して標準曲線を作製し、ゲル電気泳動した後に密度計測を使用して実施した。ＳｔｒａｎｄＤＮＡ３を形成するために、ＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体をＰＣＲ加熱ブロック上で、５０℃に１０分間加熱することによって、５倍過剰のＳｔｒａｎｄＤＮＡ２とハイブリダイズさせた。１分間に２℃の速度で、温度を２３℃に下げた。
【０２６３】
膜に係留する実験の場合、９９％ＤＰｈＰＣ、１％  １６：０  ＣａｐビオチニルＰＥで二重層を形成した。二重層が形成されたら、１ｎＭ  ＳｔｒａｎｄＤＮＡ３をシスチャンバに添加し、よく混合した。制御セクションを、＋１８０ｍＶで５分間記録して、ナノ細孔に対するＤＮＡ結合事象を得た。制御セクションを記録した後、５ｎＭ  ＫＦ（ｅｘｏマイナス）（ＮＥＢ）を添加し、そのシグナルを＋１８０ｍＶで５分間記録した。
【０２６４】
分析物が溶液中にある実験の場合、１００％ＤＰｈＰＣで二重層を形成した。等モル濃度でＳｔｒａｎｄＤＮＡ４とＳｔｒａｎｄＤＮＡ５をハイブリダイズすることによって、ＳｔｒａｎｄＤＮＡ６を作製した。ＰＣＲブロック上で、５０℃に１０分間加熱することによってハイブリダイゼーションを行い、次いで２℃／分で２３℃に冷却した。二重層が形成されたら、４００ｎＭ  ＳｔｒａｎｄＤＮＡ６をシスチャンバに添加し、よく混合した。制御セクションを、＋１８０ｍＶで５分間記録して、ナノ細孔に対するＤＮＡ結合事象を得た。制御セクションを記録した後、８００ｎＭ  ＫＦ（ｅｘｏマイナス）（ＮＥＢ）を添加し、そのシグナルを＋１８０ｍＶで５分間記録した。
【０２６５】
開孔レベルを視覚的に推定し、データが、細孔レベルから約５シグマ（シグマはノイズの標準偏差）下に設定した閾値未満に低下したとき、ＤＮＡ移行事象が原因であると定義した。事象検出を行う前に、任意の明らかに不自然な値を手作業でデータから取り除いた。各事象の平均電流レベルがｐＡで（垂直軸）、事象の長さが秒で（水平軸）図に示される。事象の長さがミリ秒未満から１０秒程度の範囲なので、水平軸は対数目盛を使用して表示されていることに留意されたい。４つ全ての場合において、除外された非常に短い（１ｍｓ未満）事象も数多くあった。これは、その事象が短すぎて電流レベルを確実に推定できず、示された異なる条件を区別するのに役立たないからである。
StrandDNA1：5’-ビオチン-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTACGACCTGCATGAGAATGC-3’(配列番号22)
StrandDNA2：5’-CTCACCTATCCTTCCACTCACCCCCCAAAAAACCCCCCAAAAAACCCCCCAAAAAAGCA TTCTCATGCAGGTCGTAGCC-3’(配列番号23)
StrandDNA3：StrandDNA1とStrandDNA2とのハイブリッド(配列番号22および23)
StrandDNA4：5’-AACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAA AAACCCCCAAAAACCCCCATAGAGACAAGAATAACGAAGTA-3’(配列番号24)
StrandDNA5：5’-TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT-3(配列番号25)
StrandDNA6：StrandDNA4とStrandDNA5とのハイブリッド(配列番号24および25)
【０２６６】
２．２  結果
電位の印加下で、ＤＮＡハンドリングタンパク質がＤＮＡを保持する能力について評価できる実験を考案した。この実験において、ＤＮＡ−酵素複合体はナノ細孔中に引き込まれ、特徴的な電流レベルをもたらす。ＤＮＡ−酵素複合体が解離するとき、ＤＮＡはナノ細孔中に一層深く引き込まれ、第２の電流レベルをもたらす。次いで、ＤＮＡがナノ細孔通って完全に移行して空の細孔が得られ、系がその元々の状態にリセットされる。ＤＮＡ−酵素結合の速度論は、この工程を多重反復する間の酵素結合状態の継続時間を調べることによって評価できる（図３）。
【０２６７】
最近の研究では、ポリメラーゼを使用してＤＮＡ鎖の移行が制御された。そのような実験を行うには、ナノ細孔に捕捉しようとするＤＮＡの濃度は、理想的には、１００〜１０００ｎＭである。酵素がＤＮＡに結合するとき、酵素濃度はＤＮＡと同程度のモル濃度、またはＤＮＡに対して過剰であることが好ましい。ＤＮＡの大部分（好ましくは全て）が酵素−ＤＮＡ複合体を形成することを確実にするために、一般的に、酵素濃度はＤＮＡ濃度の２倍で使用される。これは必要とされる材料の要求量が多い。したがって、より少ないＤＮＡを使用し、それゆえより少ない酵素を使用する系であることが望ましい。
【０２６８】
これを実現する１つの方法は、脂質膜にＤＮＡを係留することである。示した通り、ＤＮＡと膜との相互作用を強化することによって、ＤＮＡ挿入の速度を大幅に増加させることができる。これにより、１，０００分の一〜１０，０００分の一の少ない材料しか使用しないが、溶液中にＤＮＡが遊離しているときの速度と同等の速度をもたらすことができる。より低濃度のＤＮＡを使用することにより、使用する酵素の濃度を、大幅に低減することができる（図４を参照のこと）。
【０２６９】
適切なＤＮＡハンドリングタンパク質は、クレノウ断片（ＫＦ）である（N. A. Wilson, R. Abu-Schmays, B. Gyarfas, H. Wang, K. R. Lieberman, M. Akeson and W. B. Dunbar (2009) Electronic Control of DNA Polymerase Binding and Unbinding to Single DNA Molecules. ACS Nano 3, 995-1003）。クレノウ断片は、大腸菌（Escherichia coli）由来ＤＮＡポリメラーゼＩがプロテアーゼサブチリシンによって酵素的に切断されるときに生じる大きなタンパク質断片である。それは、５’−３’ポリメラーゼ活性ならびにプレコーディング（precoding）ヌクレオチドの除去およびプルーフリーディングのための３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持しているが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失っている。残りの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を取り除くために、ＫＦを遺伝子操作することもできる。通常、このＤＮＡハンドリングタンパク質は、一本鎖と二本鎖ＤＮＡとの界面（プライマー／鋳型接合部）でＤＮＡに結合し、ヌクレオチドの付加よってＤＮＡ鎖の複製を触媒することができる。鎖配列決定手法のためにクレノウ断片を調査したが、電位の印加によってナノ細孔上部に引っ張られるとき、１〜１００ｍｓの結合時間を有することが判明した。
【０２７０】
上に示した通り、膜に係留されている分析物構成中のＫＦをスクリーニングした（図４）。ＤＮＡが溶液中にあるとき、ＫＦ−ＤＮＡ複合体の結合時間は１〜１００ｍｓである（図５および図６）（発表されている結果（Wilson/Akeson 2009を参照）と同程度）。１００ｍｓの継続時間では、数ヌクレオチドしか読めないので、これは短すぎて鎖配列決定方法には実用的でない。しかし、ＤＮＡが脂質膜に係留される場合、結合時間は０．１〜１０ｓに増加する（図７および図８）。
【０２７１】
２．３  結論
細孔上部の酵素−ＤＮＡ複合体の継続時間は、荷電ＤＮＡ鎖に作用する印加電場からの力の関数である。この力に抵抗するタンパク質の能力が、複合体が細孔上部で原形を保つ時間の長さを決定する。係留されたＤＮＡが脂質膜の全体に拡散するとき、可動性脂質分子が細孔内の鎖に別の力を加えることにより、その滞留時間が長くなる可能性がある。この力は、印加電場によって加えられた力を打ち消し、ＫＦが受ける正味の力を減少させる。この構成は、高電場が生じるが（例えばより高いシグナル対ノイズ比、より速いＤＮＡ捕捉）が、依然としてＤＮＡハンドリングタンパク質が細孔上部で長時間結合できるという利点によって有益である。
【０２７２】
係留する手法は、ナノ細孔上部で酵素の挙動を制御するための別の手段を提供する。この概念を調査するには多くの可能性がある。膜の組成物を変更する、または温度などの物理的なパラメータを変化させることによって、脂質二重層内に係留されている分子の拡散速度を変化させ、それゆえＤＮＡ−酵素複合体がナノ細孔で受ける力を変化させることが可能になる。エキソヌクレアーゼ配列決定法の実施形態において、膜流動性を高めることにより、エキソヌクレアーゼに対するポリヌクレオチドの利用可能性を高めることができる。膜流動性は、コレステロールなどの薬剤を添加することによって変化させることができる。加えて、係留する薬剤の性質を変化させて、係留される分析物の拡散速度を制御し、それによって類似の効果を生じることができる。タンパク質などの大きな種に係留することにより、脂質などの小分子に係留するのと比較して、より遅い拡散速度を得られる可能性がある。酵素がポリヌクレオチドと複合体を形成し、ナノ細孔に引き入れられるとき、酵素速度がナノ細孔に印加された電場の影響を受けることが示された。係留している分析物からの拡散力が、細孔上の酵素が受ける正味の力を減少させる可能性がある。印加電位からの力を係留している分析物からの拡散力と組み合わせることによって、ポリマー移動の速度を制御できると予想される。この効果の別の潜在的な使用法は、ＤＮＡハンドリングタンパク質を用いずに細孔を通る鎖の速度を制御することである。印加電位によって加えられる力を、膜の拡散力を用いて釣り合わせることができる。
【実施例３】
【０２７３】
さらなる鎖配列決定法
最近の研究では、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用してα−溶血素を通るＤＮＡ鎖の移行が制御された（Akeson et al., 2010, J Am Chem Soc. 2010 Dec 22;132(50):17961-72）。ナノ細孔を通るＤＮＡ鎖の移動を制御する２つのモードが、分子モーターとしてＰｈｉ２９を使用して報告され、両方法とも、５’突出している二重鎖上の二本鎖／一本鎖ＤＮＡ接続部におけるそれの作用を利用している。調べられる鎖と逆向きにハイブリダイズされるプライミング鎖からの重合、または調べられる鎖からプライミング鎖が順次非ハイブリダイズして、直前まで二重鎖ＤＮＡであった標的配列を次々と明らかにするアンジッピング法のいずれかによって、移動が起こり得る。
【０２７４】
３．１  材料および方法
一本鎖ＤＮＡについて示した通り、係留部分を変更して、二重層との一時的な相互作用または（例えばビオチン：ストレプトアビジンのコレステロールとの）より長い係留継続時間のいずれかを示す鎖をそれぞれ生成することができる。ｄｓＤＮＡ分析物の場合、酵素が分析物を完全にアンジッピングし、次の分析物の準備のためにナノ細孔を空にできるには、一時的な結合の挙動を示す二重鎖ＤＮＡ分析物の方が、鎖配列決定法に適している可能性があると考えてよい。
【０２７５】
標的鎖（ＯＮＬＡ１３４６）上の３’にコレステロール基および５’にＡを１個含有するポリＣ伸長を含む、相補的なオリゴ（ＯＮＬＡ１３４６およびＯＮＬＡ１３４７、それぞれ６５ｎｔおよび３１ｎｔ）を設計した。ハイブリダイズしたら、これらのオリゴは３４ｎｔの５’突出を持つ３１ｂｐのＤＮＡ二重鎖を与え、その結果、標的鎖は最初に５’がナノ細孔の中に通され、それに捕捉され得る。次いで、ナノ細孔の読取機上部を通る、ポリＣバックグラウンド中の単一のＡの移動を調べることによって、アンジッピングを追跡することができる。係留されていない分析物と比較するために、コレステロール基を欠くが、配列が標的鎖と同一の鎖を設計した（ＯＮＬＡ１０４９）。
【０２７６】
変異体ＭｓｐＡ−ＮＮＮＲＲＫ細孔（ＯＮＬＰ２７２６）をＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用して、単一チャネル記録を行った。単一チャネルを得て、シス緩衝液を新鮮な緩衝液（４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０）１０ｍｌで潅流して、単一チャネル挿入の機会を最小限に抑えた。５分後、係留されているおよび係留されていない実験のために、制御セクションＤＮＡをそれぞれ０．５ｎＭまたは１００ｎＭになるよう添加した。ナノ細孔に捕捉される二重鎖ＤＮＡおよび細孔の力によって鋳型からはぎ取られるプライマーであると計画されたＤＮＡを添加した後、いくつかの短時間事象（約１０ｍｓ）が観察された。５分後、再び、係留されているおよび係留されていない実験のために、それぞれ１０ｎＭまたは２００ｎＭになるように、シスチャンバにＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを添加した。
【０２７７】
使用したオリゴヌクレオチド：
ONLA1346
CCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCTATTCTGTTTATGTTTCTTGTTTG TTAGCC-Chol(配列番号26)
ONLA1347  GGCTAACAAACAAGAAACATAAACAGAATAG(配列番号27)
ONLA1049
CCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCTATTCTGTTTATGTTTCTTGTTTG TTAGCC(配列番号28)
PolyT-50mer_XXXX_センス
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXXXXGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGC(配列番号29)
PhiX 235bpアンチセンス  Chol-GTTAGACCAAACCATGAAACCAACATA(配列番号30)
PhiX 400bpアンチセンス  Chol-GACCGCCTCCAAACAATTTAGACA(配列番号31)
PhiX 822bpアンチセンス  Chol-GGCAATCTCTTTCTGATTGTCCAG(配列番号32)
【０２７８】
３．２  結果
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを添加した後、ＤＮＡ：タンパク質複合体の捕捉を計画した両方の実験において、いくつかの長時間事象が観察された。これらの事象は、状態間で振動する前に一定レベルの短い滞留時間を示し、これは、アンジッピングの開始とＡが細孔の読取機上部を通って移動し始めることに対して起こると考えられる。この例については、係留された（図９）および係留されていない（図１０）実験の両方について、図１２および図１１に示される。
【０２７９】
係留されている事象と溶液ＤＮＡ事象両方の全てのアンジッピング事象の分析から、観察された状態の数、各状態に対する平均対滞留時間および平均対各々の標準偏差について広い構成パターンが示される（図１１係留されていない、図１２係留されている）。
【０２８０】
コレステロールの位置は、標的鎖の３’にあると設定されることは無く、鋳型もしくはプライマー鎖の５’またはヘアピン内に変更することができる。酵素が一本鎖と二本鎖ＤＮＡとの接続部であるプライマー鎖の３’に位置する必要性により、ここは係留には適さない部位と思われるが、実験的には実証されなかった。
【０２８１】
係留する方法は、オリゴヌクレオチドを化学合成する間に付着化学を組み込める合成鎖に対してはよく機能するが、ゲノムＤＮＡから得られるサンプルにそれを適用することはより難しい。ゲノムＤＮＡセクションを増幅するための一般的な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応が使用される。ここで、２本の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＤＮＡの同じセクションのコピーをいくつか生成することができ、各コピーについて二重鎖中の各鎖の５’は合成オリゴである。５’コレステロール基を有するアンチセンスプライマーを使用することにより、増幅された標的ＤＮＡの各コピーは係留のためのコレステロール基を含有することになる。ＰＣＲによって生成した分析物の唯一の問題点は、それが平滑末端化しているまたは３’−Ａ突出を１個含有することであり、そのいずれも鎖配列決定法のためにナノ細孔に通すには適さない。二重鎖ＤＮＡの５’に対する一本鎖ＤＮＡのセクションの付加は、容易にはできない。化学的または酵素的ライゲーションを行うことができるが、そのいずれも効率が高くはなく、さらに下流の反応および精製ステップも必要となる。ＰＣＲ法は、通常通りゲノムＤＮＡの標的領域の先頭に対して相補的なセクションを含有するが、追加で５０ポリＴセクションが続けられる、センスプライマーを使用して開発された。ポリメラーゼが、ポリＴセクションの反対側の相補鎖を伸長して、通常通り平滑末端化したＰＣＲ産物を作製することを妨げるために、ポリＴセクションと相補的なプライマーセクションとの間に脱塩基部位を４個付加した。これらの脱塩基部位により、ポリメラーゼがこの領域を越えて伸長できなくなり、したがってポリＴセクションは、各増幅されたコピーで５’一本鎖ＤＮＡとして残ることになる。（図１３および図１４）。
【０２８２】
このＰＣＲ法は、５’リーダーポリＴセクションを付着するのに効果的な方法であるが、末端転移酵素を使用して３’に付加するまたはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰγＳによって５’に化学的結合用の反応性チオールを付加するなど、付着化学を組み込むための他の方法が考えられる。しかし、サイズ、よってリード長に関する唯一の制限がＰＣＲによるものである場合（約２０ｋｂ）、この方法は鎖配列決定法に適した形で係留された分析物を生成できる。
【０２８３】
単一チャネル記録を、上記の通りだがこれらのゲノムＤＮＡ増幅断片を使用して実施して、任意のアンジッピング事象を観察した（図１５および図１６）。進行し、次いでそれ自体の一致を終了させるいくつかのアンジッピング事象が観察され、二重鎖ＤＮＡの完全なアンジッピングを示唆していた。
【０２８４】
溶液からの鎖配列決定法のためのＤＮＡ：タンパク質複合体を捕捉するのに許容可能な事象速度を観察するために、次いで、１００ｎＭ  ＤＮＡと２００ｎＭ  Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが必要とされる。８００ｂｐ断片の場合、これは、上で使用した通りチャンバ容積を１ｍｌとすると、１実験当たり約５０ｕｇのｄｓＤＮＡに相当する。係留されたｄｓＤＮＡ分析物を使用する場合、同じ許容可能な事象速度は、０．１ｎＭ  ＤＮＡと１０ｎＭ  Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して満たされ、超えられる。８００ｂｐ断片の場合、これは、上で使用した通りチャンバ容積を１ｍｌとすると、１実験当たり約５０ｎｇのｄｓＤＮＡに相当する。
【実施例４】
【０２８５】
固体配列決定
脂質膜への係留について上で実証した利点は、固体ナノ細孔実験に拡張することもできる。ナノ細孔を固体材料中に作製し、生物学的ナノ細孔と同様の方式で利用することができる。それらの使用および製造については、他の場所によく記述されてきた（ＷＯ００／７９２５７；ＷＯ００／７８６６８；Dekker C, Nat Nanotechnol. 2007 Apr;2(4):209-15；およびSchloss JA, et al., Nat Biotechnol. 2008 Oct;26(10):1146-53）。
【０２８６】
窒化ケイ素などの固体材料中のナノ細孔は、細孔として生物学的チャネルに勝る利点を示す。固体材料は、脂質膜よりはるかに壊れにくい。固体材料中のナノ細孔は、しばしばｉｎ  ｓｉｔｕで形成される生体膜と異なり、工場において形成することができ、長い貯蔵寿命を有する。固体ナノ細孔に関する最近の進歩により、特異的性質を有するグラフェンなどの非常に薄い材料を使用できるようになる（Golovchenko J, et al., Nature. 2010 Sep 9;467(7312):190-3；Drndic- M, et al., Nano Lett. 2010 Aug 11;10(8):2915-21；およびDekker C, et al., Nano Lett. 2010 Aug 11;10(8):3163-7）。グラフェン中のナノギャップも、提唱されている（Postma, 2008, Rapid Sequencing of Individual DNA Molecules in Graphene Nanogaps）。
【０２８７】
固体膜のさらなる実施形態は、ナノ細孔に埋め込まれている２個以上の電極間のトンネル電流を使用することになる。分析物が細孔を通過する（トランス膜電位によって駆動される）とき、分析物は電極間のトンネル電流を促進する。この電流を使用して、分析物が何であるかを検出することができる（上記Schloss；米国特許第７，２５３，４３４号；およびＷＯ２００８／０９２７６０）。
【０２８８】
ナノ細孔に対する他の方法は、固体材料中のナノギャップをセンサーとして使用することになる（Chen et al., Materials Today, 2010, 13(11): 28-41）。
【０２８９】
脂質膜について上述した利点が、固体ナノ細孔実験の利益になり得る。２つの膜型の間にある重要な差異は、両親媒性膜がしばしば天然に可動性であり、本質的には、約１０−８ｃｍ  ｓ−１の脂質拡散速度を持つ二次元の流体として作用し、一方で窒化ケイ素の様な材料中の膜は固体であるということである。静的なやり方で表面に分析物を係留する利点があるが、複数の分析物分子が検出器と相互作用できるように、分析物は膜全体に移動できることが望ましい。
【０２９０】
固体膜に分析物を係留するために利用できるいくつかのスキームがある（図１７）。第１の手法は、分析物と、Ｓｉ３Ｎ４など修飾されていない膜との天然の相互作用を利用することになる。しかし、これは、表面上の分析物の拡散速度をほとんど制御しない。したがって、望ましい相互作用を得るために、表面、分析物または表面と分析物の両方を修飾することが好ましい。
【０２９１】
固体材料を化学的に修飾する方法は、当技術分野で周知である。溶液中での自己組織化よってまたは印加電位下でナノ細孔通して反応種を駆動させることによって、固体ナノ細孔も化学修飾された（ＷＯ２００９／０２０６８２）。
【０２９２】
最初の２つのスキームは、化学修飾した膜を使用して、分析物が層と一時的に相互作用できる表面を作製する（図１７Ａ、Ｂ）。
【０２９３】
第１のスキームにおいて、分析物を係留する基は、それ自体が修飾層に埋め込まれている（図１７Ａ）。長鎖アルカンは表面に付着でき、コレステロールなどの係留基またはアルカンが使用される。表面修飾は、クロロ−ヘキサデシル−ジメチルシラン（または、類似物質）とＷＯ２００９／０２０６８２に記載の方法を使用することにより実現できる。
【０２９４】
第２のスキームにおいて、係留する分析物は層中に埋め込まれていないが、表面に存在する。これは、第１スキームにあるような疎水性を使用して実現できる。加えて、表面への分析物の結合が、静電的、水素結合またはファンデルワールス相互作用によって媒介される同様の方法を想定することもできる。
【０２９５】
第３のスキームは、タンパク質ナノ細孔で使用される膜と最も類似している。この実施形態において、固体膜は、脂質単分子層を支持するために修飾される（図１７Ｃ）。この手法は、脂質膜に係留するために上で示した例の全ての利益を有する。係留は、コレステロールアンカーを使用することによって、または脂質頭部基を介してもしくは膜内の受容体を介して付着させることによって実現できる。固体表面上に二重層または単分子層を形成する方法は、当技術分野で周知である（Duran RS, et al., Langmuir. 2007 Mar 13;23(6):2924-7；およびCremer PS, et al., Surface Science Reports. 2006; 61:429-444）。表面を疎水性にすると、脂質単分子層は、溶液中の脂質小胞から自発的に形成され得る。表面は、プラズマ処理（ＣＨ４など）、またはクロロシラン化学（ＷＯ２００９／０２０６８２）などの化学的方法、および金チオール結合を含めたいくつかの方法で疎水性にできる（上記Duran；および上記Cremer）。
【０２９６】
膜に分析物を係留するための第４のスキームは、脂質二重層の支持体として固体膜を使用することである（図１７Ｄ）。この実施形態において、検出器素子は、固体膜中のナノ細孔である。この手法は、脂質膜に係留するために上で示した例の全ての利益を有する。表面を親水性にする場合、脂質二重層はその表面上に自己組織化することになる（ガラス表面に形成される二重層に一般的な効果）（上記Cremer）。上記の全ての例について、固体ナノ細孔をポリヌクレオチド結合タンパク質と組み合わせて、検出器を形成することができる。
【実施例５】
【０２９７】
この実施例は、トリブロックコポリマーに埋め込まれているＭｓｐＡナノ細孔に曝露したとき、係留されていないＤＮＡのヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動が観察されなかった方法について記載する。チップは、白金電極を備えた１２８個のウェルおよびキャップに付着して白金の共通電極を含む３０μｍの開口部を有する。
【０２９８】
油中で５０ｍｇ／ｍＬトリブロックコポリマー（ＴＢＣＰ  ６−３３−６、ＯＨ−ＰＭＯＸＡ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＤＭＳ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＭＯＸＡ−ＯＨ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ製品番号Ｐ３６９１Ｂ−ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ）の混合溶液を用いて単分子層を形成した。次いで、ナノ細孔（ＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８）を緩衝液中のチップに添加した。チップが形成されたらすぐに、試薬をチップ上部（シス側）にだけ添加した。
【０２９９】
実験は、６２５ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０（緩衝液１）で実施した。使用したＭｓｐＡ変異体は、ＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８であった。この実験において使用したＤＮＡ配列は、二本鎖４００ｍｅｒ鎖（配列番号３９はセンス鎖の配列を示す）であった。
配列番号39-
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCGCTCCACTAAAGGGCCGATTGACCCGGTGGTACCTTGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTGATGCCGACCCTAAATTTTTTGCCTGTTTGGTTCGCTTTGAGTCTTCTTCGGTTCCGACTACCCTCCCGACTGCCTATGATGTTTATCCTTTGGATGGTCGCCATGATGGTGGTTATTATACCGTCAAGGACTGTGTGACTATTGACGTCCTTCCCCGTACGCCGGGCAATAATGTTTATGTTGGTTTCATGGTTTGGTCTAACTTTACCGCTACTAAATGCCGCGGATTGGTTTCGCTGAATCAGGTTATTAAAGAGATTATTTGTCTCCAGCCACTTAAGTGAGGTGATTTATGTTTGGTGCTATTGCTGGCGGTATTGCTTCTGCTCTTGCTGGTGGCGCCATGTCTAAATTGTTTGGAGGCGGTCGAGCT
【０３００】
油中の５０ｍｇ／ｍｌトリブロックコポリマー（ＴＢＣＰ  ６−３３−６、ＯＨ−ＰＭＯＸＡ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＤＭＳ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＭＯＸＡ−ＯＨ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ製品番号Ｐ３６９１Ｂ−ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ）およびチップ上に予め挿入されたナノ細孔（ＭＳ−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８）から単分子層を形成した。次いでブレードにチップを挿入し、ピペットによって溶液を手作業で取り除き、元通りに挿入した。次に１．５ｎＭ  ＤＮＡ（配列番号３９のセンス鎖配列）、５００ｎＭヘリカーゼ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＡＴＰを、緩衝液１  １５０ｕｌに添加した。次いで、キャップの穴を通してチップに溶液をピペットで移し、ナノ細孔に拡散させた。ナノ細孔中でのヘリカーゼ事象を得るために、５分毎に０ｍＶ次いで−５０ｍＶへ電位を反転させながら、データを＋１２０ｍＶで１時間記録した。
【０３０１】
トリブロックコポリマー（ＴＢＣＰ  ６−３３−６、ＯＨ−ＰＭＯＸＡ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＤＭＳ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＭＯＸＡ−ＯＨ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ製品番号Ｐ３６９１Ｂ−ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ）に挿入されているＭＳ−（７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８ナノ細孔を通る、係留されていないＤＮＡ（配列番号３９のセンス鎖配列）のヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動は検出されなかった。試験した条件下で、細孔の遮断は観察されたが、ヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動は見られなかった。
【実施例６】
【０３０２】
この実施例は、トリブロックコポリマーに埋め込まれているＭｓｐＡナノ細孔に曝露したとき、係留されているＤＮＡのヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動が観察された方法について記載する。チップは、白金電極を備えた１２８個のウェルおよびキャップに付着して白金の共通電極を含む３０μｍの開口部を有する。
【０３０３】
油中で５０ｍｇ／ｍｌトリブロックコポリマー（ＴＢＣＰ  ６−３３−６、ＯＨ−ＰＭＯＸＡ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＤＭＳ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＭＯＸＡ−ＯＨ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ製品番号Ｐ３６９１Ｂ−ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ）の混合溶液を用いて単分子層を形成した。次いで、ナノ細孔（ＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８）を緩衝液中のチップに添加した。チップが形成されたらすぐに、試薬をチップ上部（シス側）にだけ添加した。
【０３０４】
実験は、６２５ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭフェリシアン化カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０（緩衝液１）で実施した。使用したＭｓｐＡ変異体は、ＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８であった。この実験において使用したＤＮＡ配列は、二本鎖４００ｍｅｒ  ＤＮＡ（配列番号４０はセンス鎖の配列を示す）と配列番号４０の一部にハイブリダイズでき、３'末端にコレステロールが付着した短い相補鎖ＤＮＡ（配列番号４１）とから成る。
配列番号40
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCGCTCCACTAAAGGGCCGATTGACGCTCCACTAAAGGGCCGATTGACCCGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTGATGCCGACCCTAAATTTTTTGCCTGTTTGGTTCGCTTTGAGTCTTCTTCGGTTCCGACTACCCTCCCGACTGCCTATGATGTTTATCCTTTGGATGGTCGCCATGATGGTGGTTATTATACCGTCAAGGACTGTGTGACTATTGACGTCCTTCCCCGTACGCCGGGCAATAATGTTTATGTTGGTTTCATGGTTTGGTCTAACTTTACCGCTACTAAATGCCGCGGATTGGTTTCGCTGAATCAGGTTATTAAAGAGATTATTTGTCTCCAGCCACTTAAGTGAGGTGATTTATGTTTGGTGCTATTGCTGGCGGTATTGCTTCTGCTCTTGCTGGTGGCGCCATGTCTAAATTGTTTGGAGGCGGTCGAGCT
配列番号41
AGCGACTAACAAACACAATCTGATGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3 CholTEG/
【０３０５】
油中の５０ｍｇ／ｍｌトリブロックコポリマー（ＴＢＣＰ  ６−３３−６、ＯＨ−ＰＭＯＸＡ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＤＭＳ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＭＯＸＡ−ＯＨ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ製品番号Ｐ３６９１Ｂ−ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ）およびチップ上に予め挿入されたナノ細孔から単分子層を形成した。次いでブレードにチップを挿入し、ピペットによって溶液を手作業で取り除き、元通りに挿入した。次に１．５ｎＭ  ＤＮＡ（配列番号４０のセンス鎖配列および配列番号４１の短い相補的な係留鎖）、５００ｎＭヘリカーゼ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＡＴＰを、緩衝液１  １５０ｕｌに添加した。次いで、キャップの穴を通してチップに溶液をピペットで移し、ナノ細孔に拡散させた。ナノ細孔中でのヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動を得るために、５分毎に０ｍＶ次いで−５０ｍＶへ電位を反転させながら、データを＋１２０ｍＶで１時間記録した。
【０３０６】
トリブロックコポリマー（ＴＢＣＰ  ６−３３−６、ＯＨ−ＰＭＯＸＡ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＤＭＳ−（ＰＥＧリンカー）−ＰＭＯＸＡ−ＯＨ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ製品番号Ｐ３６９１Ｂ−ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ）に挿入されているＭＳ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８ナノ細孔を通る、係留されたＤＮＡ（配列番号４０のセンス鎖配列および配列番号４１の短い相補的な係留鎖）のヘリカーゼに制御された移行が検出された。１２度のヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動が、５分間の正サイクル１回の間に検出された。ヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動間の時間の中央値は、０．５秒であった。したがって、トリブロックコポリマーにＤＮＡを係留することによって、係留されていないＤＮＡを使用する類似の実験（実施例５）において検出されなかったヘリカーゼに制御されたＤＮＡ移動を観察することが可能になる。
【図１】
2014519823.tif 000007
【図２】
2014519823.tif 000008
【図３】
2014519823.tif 000009
【図４】
2014519823.tif 000010
【図５】
2014519823.tif 000011
【図６】
2014519823.tif 000012
【図７】
2014519823.tif 000013
【図８】
2014519823.tif 000014
【図９】
2014519823.tif 000015
【図１０】
2014519823.tif 000016
【図１１】
2014519823.tif 000017
【図１２】
2014519823.tif 000018
【図１３】
2014519823.tif 000019
【図１４】
2014519823.tif 000020
【図１５】
2014519823.tif 000021
【図１６】
2014519823.tif 000022
【図１７】
2014519823.tif 000023
【図１８】
2014519823.tif 000024
【図１９】
2014519823.tif 000025
【図２０】
2014519823.tif 000026
【図２１】
2014519823.tif 000027
【図２２】
2014519823.tif 000028
【図２３】
2014519823.tif 000029
【配列表】
2014519823000001.app
【国際調査報告】
2014519823.tif 000030
2014519823.tif 000031
2014519823.tif 000032