(57)【要約】Ｔ細胞エピトープを組み入れており、ノロウイルスタンパク質ＶＰ１のＰドメインをディスプレイしている自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）が記載される。本発明のナノパーティクルは、リンカーセグメントによって連結された二つのコイルドコイルオリゴマー化ドメインを含む連続ペプチド鎖の凝集体から成り、ここで、一方または両方のオリゴマー化ドメインは、それらのペプチド配列内にＴ細胞エピトープを組み入れている。これらのナノパーティクルは、ノロウイルス感染の予防および治療のためのワクチンおよびアジュバントとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノロウイルスタンパク質ＶＰ１のペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ２、およびＰドメインまたはＰ２サブドメインを含む連続鎖から成る式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐ        （Ｉ）
［式中、Ｄ１は、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成するコイルドコイルペプチドであり、Ｄ２は、２個のサブユニットＤ２の二量体（Ｄ２）２を形成するコイルドコイルペプチドであり、ｍは、３または５のいずれかであり、Ｌは、結合または短いリンカーセグメントであり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方は、そのオリゴマー化ドメイン内に１個または複数のＴ細胞エピトープを組み入れており、ここで、Ｄ２は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰドメインまたはＰ２サブドメインを表すＰによって置換されている］
で示される複数の構成単位の凝集体から成る自己集合ペプチドナノパーティクル。
【請求項２】
置換基Ｐが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰドメインである、請求項１記載のペプチドナノパーティクル。
【請求項３】
置換基Ｐが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰ２サブドメインである、請求項１記載のペプチドナノパーティクル。
【請求項４】
オリゴマー化ドメインＤ１が、トリプトファンジッパーの五量体化ドメインまたはその誘導体である、請求項１〜３のいずれか記載のペプチドナノパーティクル。
【請求項５】
エピトープの少なくとも１個がＨＴＬエピトープである、請求項１〜４のいずれか記載のペプチドナノパーティクル。
【請求項６】
配列Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐが、一連の場合により重複するＴ細胞エピトープを含む、請求項１〜５のいずれか記載のペプチドナノパーティクル。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチドナノパーティクルを含む組成物。
【請求項８】
ヒトまたは非ヒト動物にワクチン接種する方法であって、そのようなワクチン接種を必要とする対象に請求項１〜７のいずれか記載のペプチドナノパーティクルの有効量を投与することを含む方法。
【請求項９】
ノロウイルスタンパク質ＶＰ１のペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ２、およびＰドメインまたはＰ２サブドメインを含む連続鎖から成る式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐ        （Ｉ）
［式中、Ｄ１は、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成するコイルドコイルペプチドであり、Ｄ２は、２個のサブユニットＤ２の二量体（Ｄ２）２を形成するコイルドコイルペプチドであり、ｍは、３または５のいずれかであり、Ｌは、結合または短いリンカーセグメントであり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方は、そのオリゴマー化ドメイン内に１個または複数のＴ細胞エピトープを組み入れており、ここで、Ｄ２は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰドメインまたはＰ２サブドメインを表すＰによって置換されている］
で示される単量体性構成単位。
【請求項１０】
配列番号１で示されるペプチドである、請求項９記載の単量体性構成単位。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ノロウイルスカプシドタンパク質およびＴ細胞エピトープを組み入れている自己集合ペプチドナノパーティクルに関する。さらに、本発明は、ノロウイルス感染に対するワクチン接種のためのそのようなナノパーティクルの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
「ノーウォーク様ウイルス」は、現在一般にノロウイルスとして知られており、おそらく、先進国および開発途上国に発生する流行性急性胃腸炎の最も重要なウイルス病原体である。ノロウイルスは、正二十面体の１本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、カリシウイルス科に属する。そのカプシドは、ただ１種の主要カプシドタンパク質の１８０個のコピーから構成される。従来、ヒトノロウイルスは細胞培養物中で成長抵抗性であり、ウイルス培養に適切な動物モデルがなかったので、このウイルスの生物学的分析は進まなかった。このウイルスの唯一の供給源は、ヒト志願者研究および大流行から得られたヒト糞便試料であったが、このウイルスの糞便中濃度は非常にわずかであったので、標準的な電子顕微鏡法でのウイルス検出は実行不可能であった。しかし、二本鎖ＤＮＡウイルスであるバキュロウイルスによる、昆虫細胞でのノロウイルスカプシドタンパク質のリコンビナント発現が、ノロウイルスの疫学、免疫および病原性を研究することを可能にした。ウイルスカプシドを形成するカプシドタンパク質は、いわゆるウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合する。これらのＶＬＰは、ヒト糞便中に見出される基準ウイルスと抗原的（antigenetically）および形態的に区別できず、したがってレセプター−ウイルス相互作用の研究のために、そしてまた免疫学的アッセイの開発のために有用なツールを提供している。
【０００３】
このカプシドタンパク質の構造は、Ｘ線結晶解析によって決定されており（Prasad BVV et al., Science 286, 287-290, 1999）、２個の主ドメイン、すなわちＳドメインおよびＰドメインを有すると説明することができる。正二十面体の外殻は、主としてＳドメイン（Ｎ末端の２２５個の残基）によって形成され、Ｐドメイン（残基２２５番からＣ末端まで）は、外殻から発する二量体性突出部を形成する。Ｎ末端Ｓドメインの残基５０〜２２５番は、古典的な８本の逆平行βサンドイッチにフォールディングする。これは、多くのウイルスカプシドタンパク質に見られる一般的なフォールドである。Ｐドメインは、２個のサブドメインからできており、Ｐ１サブドメインは残基２２６〜２７８番および４０６〜５２０番から成り、Ｐ２サブドメインは、残基２７９〜４０５番から成る。Ｐ２サブドメインは、残基２７８番から開始し残基４０６番で終止する大型の挿入部である。Ｐ２サブドメイン中のアミノ酸２８５〜３８０番の部分は、６本のβストランドから成るコンパクトな樽様構造にフォールディングする。
【０００４】
Ｐ１サブドメイン内で残基２２６〜２７８番はβストランドの３個の短いストレッチを含み、一方でＣ末端の１１４個の残基は６本のβストランドおよび詳細に明らかにされたαヘリックスを含む。Ｔ＝３の正二十面体構造を形成するには、カプシドタンパク質は、三つの準等価位置に適応しなければならない。カプシドタンパク質のモジュラー構造において、Ｓドメインは正二十面体の接触に関与し、Ｐドメインは、専ら二量体の接触に関与する。ＡサブユニットのＰドメインとＢサブユニットのＰドメインは、準２回回転軸を挟んで相互作用して、低温顕微鏡法での再構成で見られるような二量体性突出部を形成する。同様に、ＣサブユニットのＰドメイン同士は、正二十面体の２回回転軸を挟んで相互作用する。Ａ／Ｂ二量体およびＣ／Ｃ二量体は、主に、関与する単量体の側鎖同士の総接触面積約２０００Å２の相互作用によって安定化されている。
【０００５】
ＳドメインおよびＰ１ドメインとは対照的に、Ｐ２ドメインは高い配列変動性を有し、したがって、免疫認識およびレセプターの結合に重要と考えられる。ヒンジを有する（が、Ｓドメインを欠如する）単離されたＰドメインがin vitroで二量体を形成し、その二量体がＨＢＧＡレセプターへの結合性を維持することが示されている。ノロウイルスは、レセプターとしてヒト組織−血液型抗原を認識することが見出されている。組織−血液型抗原の中で、最もよく遭遇する血液型は、ＡＢＯ（ＡＢＨ）式およびルイス式である。血液型のＡＢＨ式、ルイス式、Ｐ式およびＩ式システムでの抗原形成に利用される生合成経路は、相互に関係がある。組織−血液型抗原は、いくつかの細菌病原体およびウイルス病原体による感染と関連づけられている。このことから、組織−血液型抗原が病原体にとっての認識ターゲットであって、抗原を発現し、抗原とのレセプター−リガンド結合を形成する細胞への侵入を促進しうることが示唆される。そのような相互作用の正確な性質は現在分かっていないが、抗原結合と共に起こる病原体の密接な関連は、感染過程での初期段階として病原体を細胞に繋ぎ止めることに役割を果たしうる。ヒト組織−血液型抗原は、赤血球および粘膜上皮細胞上に、または血液、唾液、腸内容物および乳汁などの生体液中の遊離抗原として存在する、糖タンパク質または糖脂質に結合している複合糖質である。これらの抗原は、遺伝的にコントロールされ、ＡＢＯ式型、ルイス式型、および分泌型遺伝子ファミリーとして知られているいくつかのグリコシルトランスフェラーゼによる抗原前駆体への単糖の連続付加によって合成される。
【０００６】
原型ノロウイルスであるノーウォークウイルス株は、これらの確認された結合パターンの一つを示し、ＡおよびＯ分泌型の組織−血液型抗原と結合するが非分泌型の抗原とは結合しない。その他の公知の結合パターンには、Ａ、ＢおよびＯ分泌型を認識するＶＡ３８７株、ならびにＡおよびＢ分泌型と結合するＭＯＨが挙げられる。ヒト志願者での研究から、臨床感染でノロウイルスがＨＢＧＡと結合することが示され、そのことから、例えば非分泌型である個体が攻撃後にＮＶ感染に自然抵抗性であったことが実証された。したがって、その他の結合パターンのそれぞれは血液型によって規定されるそれ自体の宿主範囲を持つと予想するのが理にかなうと思われるものの、この仮説の直接的な証拠は、まだ立証されていない。しかし、遺伝子型ＩＩ（三つの公知の遺伝子型のうちのＧＩＩ）のノロウイルス株であるスノーマウンテンウイルスを用いた最近のヒト被験者研究から、感染と血液型との間の明らかな相関が明らかとならなかったが、このことから、組織−血液型抗原以外の要因がこの株の感染に役割を果たしうることが示唆される。
【０００７】
上記に照らして、ノロウイルスカプシドのＰドメインへの免疫応答を包含する、ノロウイルスに対するワクチンを提供することが有利であろう。
【０００８】
Ｐドメイン自体（すなわち、Ｎ末端のＳドメインを欠如する）は、それ自体パーティクル、いわゆるＰパーティクルを形成することが示されている（Tan M, et al., Virology, 382, 115-132, 2008）。Ｐパーティクルは、ノロウイルス感染に対するワクチンを開発するために使用されており、Ｐパーティクルは、他の病原体関連ペプチドおよびタンパク質を表出させて多成分ワクチンを設計するためにも使用される（Tan M, et al., J. Virol, 85, 753-764, 2011）。
【０００９】
ペプチドナノパーティクルは、国際公開公報第２００４／０７１４９３号に記載されている。Ｔ細胞エピトープを組み入れているペプチドナノパーティクルは、国際公開公報第２００９／１０９４２８号に記載されている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ノロウイルスタンパク質ＶＰ１のペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ２、およびＰドメインまたはＰ２サブドメインを含む連続鎖から成る式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐ        （Ｉ）
［式中、Ｄ１は、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成するコイルドコイルペプチドであり、Ｄ２は、２個のサブユニットＤ２の二量体（Ｄ２）２を形成するコイルドコイルペプチドであり、ｍは、３または５のいずれかであり、Ｌは、結合または短いリンカーセグメントであり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方は、そのオリゴマー化ドメイン内に１個または複数のＴ細胞エピトープを組み入れており、ここで、Ｄ２は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰドメインまたはＰ２サブドメインを表すＰによって置換されている］
で示される複数の構成単位の凝集体から成る自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐＰＥＰ−Ｔのベクター地図である。サブクローニングのために使用された挿入部位をより大きな文字で示す。外部挿入部位ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩについて本来のベクターのヌクレオチド番号を示す。起点、プロモーターを有するアンピシリン耐性ならびにＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターを示す。サブクローニングのための制限部位（ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ）をｂｐ数で示す。
【図２】配列番号１で示される配列を含むＳＡＰＮ構築物のE coli ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞における発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示す図である。ｕｉ＝未誘導、ｉ＝誘導。レーンｉでは、配列番号１を含む構築物である分子量４４．３kDaのノロ−ＳＡＰＮに強いバンドが割り当てられる。最初のレーンおよび最後のレーン：分子量（kDa）マーカー、他のレーン：他の未誘導バッチ。
【図３】ニッケルアフィニティーカラムでのｐＨ８．０からｐＨ４．５への段階的ｐＨ勾配に続く高濃度イミダゾールによるノロ−ＳＡＰＮ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す図である。ＦＴ＝通過画分；Ｍ＝単量体；Ｄ＝分解物；ＩＥ＝２５０mMイミダゾール（ｐＨ８．０）でのイミダゾール溶出。
【図４Ａ】ｐＨ６．８、８０mM ＮａＣｌ、２０mM ＭＥＳ、５％グリセロール中で再フォールディングされたノロ−ＳＡＰＮの電子顕微鏡写真を示す図である。Ａ、Ｂ、およびＣは、異なる倍率である（棒線参照）。
【図４Ｂ】ｐＨ６．８、８０mM ＮａＣｌ、２０mM ＭＥＳ、５％グリセロール中で再フォールディングされたノロ−ＳＡＰＮの電子顕微鏡写真を示す図である。Ａ、Ｂ、およびＣは、異なる倍率である（棒線参照）。
【図４Ｃ】ｐＨ６．８、８０mM ＮａＣｌ、２０mM ＭＥＳ、５％グリセロール中で再フォールディングされたノロ−ＳＡＰＮの電子顕微鏡写真を示す図である。Ａ、Ｂ、およびＣは、異なる倍率である（棒線参照）。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ノロウイルスタンパク質ＶＰ１のペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ２、およびＰドメインまたはＰ２サブドメインを含む連続鎖から成る式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐ        （Ｉ）
［式中、Ｄ１は、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成するコイルドコイルペプチドであり、Ｄ２は、２個のサブユニットＤ２の二量体（Ｄ２）２を形成するコイルドコイルペプチドであり、ｍは、３または５のいずれかであり、Ｌは、結合または短鎖リンカーセグメントであり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方は、そのオリゴマー化ドメイン内に１個または複数のＴ細胞エピトープを組み入れており、ここで、Ｄ２は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰドメインまたはＰ２サブドメインを表すＰによって置換されている］
で示される複数の構成単位の凝集体から成る自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）に関する。
【００１３】
連続鎖Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐにおいて、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１は、さらに、そのＮ末端でペプチドによって、例えば１〜１００個のアミノ酸、特に１〜２０個のアミノ酸から成るペプチドによって置換されている場合がある。特定の一例は、精製目的のＨｉｓタグ配列である。
【００１４】
連続鎖Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐにおいて、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のペプチドオリゴマー化ドメインＤ２およびＰドメインまたはＰ２サブドメインは、結合によって直接結合していてもよく、またはその代わりに１〜２０個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸のペプチド鎖によって結合していてもよい。そのＣ末端で、ＰドメインまたはＰ２サブドメインは、さらに、ペプチドによって、例えば１〜１００個のアミノ酸、特に１〜２０個のアミノ酸から成るペプチドによって置換されている場合がある。
【００１５】
ペプチド（またはポリペプチド）は、アミド結合によって共有結合しているアミノ酸鎖またはアミノ酸配列である。ペプチドは、天然、改変天然、部分合成または完全合成でありうる。改変天然、部分合成または完全合成は、天然に存在しないことを意味すると理解される。アミノ酸という用語は、２０種の不可欠な天然α−Ｌ−アミノ酸より選択される天然アミノ酸、α−Ｄ−アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、ノルロイシン、ホモシステインなどの合成アミノ酸、および電荷などのある種の性質を変化させるために何らかの方法で改変された、ホスホセリンまたはホスホチロシンなどの天然アミノ酸のいずれをも包含する。アミノ酸という用語は、さらに、アミド結合を形成しているアミノ基がアルキル化されているか、または側鎖アミノ官能基、ヒドロキシ官能基もしくはチオ官能基がアルキル化もしくはアシル化されているか、または側鎖カルボキシ官能基がアミド化もしくはエステル化されているアミノ酸誘導体を包含する。
【００１６】
天然アミノ酸、およびアミド結合を形成しているアミノ基がアルキル化されているか、または側鎖アミノ官能基、ヒドロキシ官能基もしくはチオ官能基がアルキル化もしくはアシル化されているか、または側鎖カルボキシ官能基がアミド化もしくはエステル化されている、そのようなアミノ酸の誘導体から成るペプチドが好ましい。
【００１７】
短いリンカーセグメントＬは、好ましくは、ペプチド鎖、例えば１〜２０個のアミノ酸、特に１〜６個のアミノ酸から成るペプチド鎖である。
【００１８】
コイルドコイルは、３および４残基間隔の主に疎水性の残基の連続パターンを有するペプチド配列であって、本明細書下記により詳細に説明するように集合してヘリックスの多量体の束を形成するペプチド配列である。
【００１９】
「Ｔ細胞エピトープを組み入れているコイルドコイル」は、対応するエピトープがオリゴマー化ドメイン内に含まれることにより、そのエピトープにＮ末端およびＣ末端で隣接するコイルドコイルのアミノ酸配列が、そのエピトープを含むオリゴマー化ドメインのオリゴマー化性質に沿って依然としてコイルドコイルであるコンフォメーションをそのエピトープに強制的に取らせることを意味する。特に、「組み入れている」は、そのエピトープがコイルドコイルのオリゴマー化ドメインの一方の末端に結合している場合を除く。
【００２０】
本明細書に関連して、Ｔ細胞エピトープという用語を、ＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの両方を表すために使用するものとする。
【００２１】
Ｄ１、Ｄ２およびＰは、場合によりターゲティング実体、またはナノパーティクルのアジュバント性質を強化する、免疫刺激性核酸、好ましくはデオキシイノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、デオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、もしくはイノシンおよびシチジンを含む核酸分子などの置換基によってさらに置換されていてもよい。ナノパーティクルのアジュバント性質を強化している他の置換基は、適応免疫応答を促進および／または改善することができる免疫刺激性陽性荷電分子の一クラスである陽イオン性ペプチドなどの抗菌ペプチドである。免疫強化性質を有するそのようなペプチドの一例は、初回−追加免疫処置後に強力なタンパク質特異的２型推進適応免疫を誘導する、陽性荷電した人工抗菌ペプチドＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）である。
【００２２】
随意の置換基、例えば前節に記載された随意の置換基は、好ましくは、オリゴマー化ドメインＤ１のＮ末端近辺の適切なアミノ酸に、またはオリゴマー化ドメインＤ１のＮ末端で置換されたさらなるペプチドに、結合される。ペプチドナノパーティクルが自己集合すると、そのような置換基はＳＡＰＮ表面に提示される。
【００２３】
最も好ましい一態様では、その置換基は、結合された単一ペプチド配列を産生するための、Ｄ１のＮ末端でのペプチド鎖Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｐの単なる伸長を示す別のペプチド配列Ｓ１であって、その結合された単一のペプチド配列は、リコンビナントタンパク質発現系で単一分子として発現させることができる。
【００２４】
ペプチドオリゴマー化ドメインは、疎水性相互作用、親水性相互作用、またはイオン相互作用、特に水素結合を介した会合または凝集によってオリゴマーを形成する傾向を有するペプチドである。例えば、ペプチド二量体化ドメインＤは、通常、溶液中で、生理的条件で二量体Ｄ２を形成するペプチドである。ペプチド三量体化ドメインＤは溶液中で三量体Ｄ３を形成し、四量体化ドメインＤは四量体Ｄ４を形成し、五量体化ドメインＤは五量体Ｄ５を形成する。オリゴマーを形成する傾向は、そのようなペプチドが条件に応じてオリゴマーを形成できることを意味し、例えば変性条件でそのペプチドはモノマーであり、生理的条件でそのペプチドは対応するオリゴマーを形成しうる。予め規定された条件で、そのペプチドはナノパーティクルの形成に必要な単一のオリゴマー化状態を取る。しかし、条件を変化させるとそれらのオリゴマー化状態が変化する場合があり、例えば塩濃度を増加させると二量体から三量体に（Burkhard P. et al., Protein Science 2000, 9:2294-2301）、またはｐＨを低下させると五量体から単量体に変化する場合がある。
【００２５】
ペプチドオリゴマー化ドメインは、周知である（Burkhard P. et al., Trends Cell Biol 2001, 11:82-88）。本発明では、オリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２はコイルドコイルドメインである。コイルドコイルは、３および４残基間隔の主に疎水性の残基の連続パターンを有する、通常はアミノ酸７個（ヘプタドリピート）またはアミノ酸１１個（ウンデカドリピート）の配列のペプチド配列であって、集合（フォールディング）してヘリックスの多量体の束を形成するペプチド配列である。３および４残基間隔のいくつかの不規則な分布を含む配列を有するコイルドコイルも考えられている。疎水性残基は、特に、疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐである。主に疎水性は、残基の少なくとも５０％を既述の疎水性アミノ酸より選択しなければならないことを意味する。
【００２６】
例えば、式（Ｉ）で示される好ましい単量体性構成単位において、Ｄ１およびＤ２は、式
【化１】
2014530224.tif 000002
［式中、ａａは、アミノ酸またはその誘導体を意味し、ａａ（ａ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、ａａ（ｄ）、ａａ（ｅ）、ａａ（ｆ）、およびａａ（ｇ）は、同じまたは異なるアミノ酸またはその誘導体であり、好ましくは、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は、同じまたは異なる疎水性アミノ酸またはその誘導体であり、Ｘは、２から２０の間、好ましくは３から１０の間の数字であり、特に３、４、５、または６である］
のいずれかで示されるペプチドである。
【００２７】
疎水性アミノ酸は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐである。
【００２８】
ヘプタドは、式ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）（ＩＩａ）で示されるヘプタペプチドまたは任意の式（ＩＩｂ）〜（ＩＩｇ）で示されるその並べ替えである。
【００２９】
ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２の両方が、
（１）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）［式中、Ｘは３であり、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は、これらの６個のアミノ酸についての表１からのスコアの合計が少なくとも１４になるように、２０種の天然α−Ｌ−アミノ酸より選択される］のいずれかで示されるペプチド（このようなペプチドは、最大１７個のさらなるヘプタドを含む）；あるいは
（２）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）［式中、Ｘは３であり、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は、これらの６個のアミノ酸についての表１からのスコアの合計が少なくとも１２になるように、２０種の天然α−Ｌ−アミノ酸より選択されるが、但し、１個のアミノ酸ａａ（ａ）は、隣接ヘプタドのアミノ酸ａａ（ｄ）もしくはａａ（ｇ）にヘリックス間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であるか、または１個のアミノ酸ａａ（ｄ）は、隣接ヘプタドのアミノ酸ａａ（ａ）もしくはａａ（ｅ）にヘリックス間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸である］のいずれかで示されるペプチド（このようなペプチドは、最大２個のさらなるヘプタドを含む）
である、式（Ｉ）で示される単量体性構成単位が好ましい。隣接ヘプタドのアミノ酸にヘリックス間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸は、例えば、他方のアミノ酸がＬｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓならばＡｓｐもしくはＧｌｕであるか、またはその逆である。
【００３０】
【表１】
2014530224.tif 000003
【００３１】
一方または両方のペプチドオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２が、以下の好ましいペプチドより選択される式（Ｉ）で示される単量体性構成単位も好ましい：
（１１）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、ａａ（ａ）は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔ、ならびにその誘導体より選択され、
ａａ（ｄ）は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌおよびＩｌｅ、ならびにその誘導体より選択される］
のいずれかで示されるペプチド、
（１２）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、１個のａａ（ａ）はＡｓｎであり、残りのａａ（ａ）はＡｓｎ、ＩｌｅおよびＬｅｕより選択され、ａａ（ｄ）はＬｅｕである］のいずれかで示されるペプチド。
そのようなペプチドは、通常はＤ２に存在するような二量体化ドメインである。
（１３）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は両方ともＩｌｅである］のいずれかで示されるペプチド。そのようなペプチドは、通常はＤ１に存在するような三量体化ドメイン（ｍ＝３）である。
（１４）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は両方ともＴｒｐである］のいずれかで示されるペプチド。そのようなペプチドは、通常はＤ１に存在するような五量体化ドメイン（ｍ＝５）である。
（１５）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は両方ともＰｈｅである］のいずれかで示されるペプチド。そのようなペプチドは、通常はＤ１に存在するような四量体化ドメイン（ｍ＝４）である。
（１６）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は両方ともＴｒｐまたはＰｈｅのいずれかである］のいずれかで示されるペプチド。そのようなペプチドは、通常はＤ１に存在するような五量体化ドメイン（ｍ＝５）である。
（１７）式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）
［式中、ａａ（ａ）はＬｅｕまたはＩｌｅのいずれかであり、１個のａａ（ｄ）はＧｌｎであり、残りのａａ（ｄ）は、Ｇｌｎ、ＬｅｕおよびＭｅｔより選択される］のいずれかで示されるペプチド。そのようなペプチドは、Ｄ１に存在するような五量体化ドメイン（ｍ＝５）である可能性を有する。
【００３２】
他の好ましいペプチドは、本明細書上記に定義のペプチド（１）、（２）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）および（１７）であり、その際さらに、
（２１）少なくとも１個のａａ（ｇ）は、ＡｓｐおよびＧｌｕより選択され、次のヘプタド中のａａ（ｅ）は、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓであり、かつ／または
（２２）少なくとも１個のａａ（ｇ）は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓより選択され、次のヘプタド中のａａ（ｅ）は、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり、かつ／または
（２３）少なくとも１個のａａ（ａ〜ｇ）は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓより選択され、その配列中でアミノ酸３もしくは４個離れているａａ（ａ〜ｇ）はＡｓｐもしくはＧｌｕである。そのようなアミノ酸ａａ（ａ〜ｇ）の対は、例えばａａ（ｂ）およびａａ（ｅ）またはａａ（ｆ）である。
【００３３】
ＣＯＩＬＳ（http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html; Gruber M. et al., J. Struct. Biol. 2006, 155(2):140-5）またはＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi）などのコイルドコイル予測プログラムは、コイルドコイルを形成しているペプチド配列を予測することができる。したがって、式（Ｉ）で示される単量体性構成単位中のＤ１およびＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによってウインドウサイズ１４、２１、または２８の少なくとも一つでその配列の全アミノ酸について０．９よりも高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される少なくとも一つの２ヘプタドリピート長配列を含むペプチドである。
【００３４】
式（Ｉ）で示される、より好ましい単量体性構成単位中のＤ１およびＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによってウインドウサイズ１４、２１、または２８の少なくとも一つでその配列の全アミノ酸について０．９よりも高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される少なくとも一つの３ヘプタドリピート長配列を含むペプチドである。
【００３５】
式（Ｉ）で示される、別のより好ましい単量体性構成単位中のＤ１およびＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによってウインドウサイズ１４、２１、または２８の少なくとも一つでその配列の全アミノ酸について０．９よりも高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される少なくとも二つの２ヘプタドリピート長配列を含むペプチドである。
【００３６】
本明細書に記載されるコイルドコイル配列および単量体性構成単位が最も好ましい。
【００３７】
式（Ｉ）で示される構成単位の構造は、ウイルスカプシドタンパク質とはっきりと異なる。ウイルスカプシドは、例えばＢ型肝炎ウイルスパーティクルのように６０個もしくはその倍数のオリゴマーを形成する単一タンパク質（EP 1 262 555、EP 0 201 416）または同時集合してウイルスの種類に応じて正二十面体から逸脱した他の形状も取りうるウイルスカプシド構造を形成する１種よりも多いタンパク質のいずれかから構成される（Fender P. et al., Nature Biotechnology 1997, 15:52-56）。本発明の自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）も、ウイルス様粒子と明らかに異なる。それは、それらが、（ａ）ウイルスカプシドタンパク質以外から構築され、（ｂ）ナノパーティクル中央の空洞がウイルスゲノム全体のＤＮＡ／ＲＮＡを収容するには小さすぎるからである。
【００３８】
自己集合ペプチドナノパーティクル：ＬＣＭユニット
自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）は、式（Ｉ）で示される単量体性構成単位から形成される。そのような構成単位が集合すると、いわゆる「ＬＣＭユニット」を形成する。そのようなＬＣＭユニットに集合する単量体性構成単位の数は、最小公倍数（ＬＣＭ）によって定義される。したがって、例えば単量体性構成単位のオリゴマー化ドメインが五量体（Ｄ１）５（ｍ＝５）および二量体（Ｄ２）２（ｎ＝２）を形成するならば、１０個の単量体がＬＣＭユニットを形成する。リンカーセグメントＬが適切な長さを有するならば、このＬＣＭユニットは球状ペプチドナノパーティクルの形態に集合しうる。
【００３９】
自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）は、１個だけまたは１個よりも多いＬＣＭユニットの集合によって形成されうる（表２）。このようなＳＡＰＮは、位相的に閉じた構造を示す。
【００４０】
【表２】
2014530224.tif 000004
【００４１】
正多面体
５種類の正多面体、すなわち正四面体、立方体、正八面体、正十二面体および正二十面体が存在する。それらは、種々の内部回転対称要素を有する。正四面体は２回軸および二つの３回軸を有し、立方体および正八面体は２回、３回および４回回転対称軸を有し、正十二面体および正二十面体は、２回、３回および５回回転対称軸を有する。立方体では、これらの軸の空間配向は、正八面体と正確に同じであり、正十二面体および正二十面体でもこれらの軸の相互に対する空間配向は、正確に同じである。したがって、本発明のＳＡＰＮのために、正十二面体および正二十面体は同一と見なすことができる。正十二面体／正二十面体は、６０個の同一の三次元構成単位から構成される（表２）。これらの構成単位は、正多面体の非対称ユニット（ＡＵ）である。それらはトリピラミッドであり、ピラミッドの各稜が、回転対称軸の一つに相当することから、これらのＡＵは、それらの稜に２回、３回、および５回対称要素を有する。これらの対称要素がペプチドオリゴマー化ドメインから生成するならば、そのようなＡＵは、上記の単量体性構成単位から構築される。それは、ＡＵの対称軸の二つに沿って二つのオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２を整列させるのに十分である。これらの二つのオリゴマー化ドメインが安定なオリゴマーを形成するならば、３番目の対称軸に沿った対称界面が自動的に発生し、この界面に沿った相互作用、例えば疎水性、親水性もしくはイオン相互作用またはジスルフィド架橋などの共有結合を最適化することによってこの界面を安定化することができる。
【００４２】
正多面体の対称性を有する自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）への集合
規則的形状（正十二面体、正二十面体）を有する自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）を発生させるには、１個よりも多いＬＣＭユニットが必要である。例えば二量体および五量体性オリゴマー化ドメインを含む単量体から正二十面体を形成させるには、それぞれ１０個の単量体性構成単位から構成される６個のＬＣＭユニットが必要であり、すなわち、規則的形状を有するペプチドナノパーティクルは、６０個の単量体性構成単位から構成される。必要な二つのオリゴマー化ドメインのオリゴマー化状態と、二つの可能な多面体を形成するためのＬＣＭユニットの数との組み合わせを表２に挙げる。
【００４３】
ＬＣＭユニットがさらに集合して、１個よりも多いＬＣＭユニットから構成される正多面体を形成するかどうかは、二つのオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２の相互に対する幾何的整列に、特に二つのオリゴマー化ドメインの回転対称軸の間の角度に依存する。これは、ｉ）ナノパーティクル中の隣接ドメインの間の界面での相互作用、ｉｉ）リンカーセグメントＬの長さ、ｉｉｉ）個別のオリゴマー化ドメインの形状によって支配される。この角度は、正多面体での配置よりもＬＣＭユニットの方が大きい。また、正多面体とは対照的に、ＬＣＭユニットにおいてこの角度は同一でない。この角度が正多面体のより小さな値に（疎水性、親水性もしくはイオン相互作用、または共有ジスルフィド架橋によって）制限され、リンカーセグメントＬが十分に短いならば、それぞれ所定数の単量体性構成単位を含む所与の数の位相的に閉じたＬＣＭユニットが、さらにアニーリングして正多面体を形成するか（表２）、またはより多くの単量体性構成単位を囲んで多面体の厳密な内部対称性を欠如するナノパーティクルを形成する。
【００４４】
二つのオリゴマー化ドメイン間の角度が十分に小さい（正二十面体の対称性を有する正多面体よりもなお小さい）ならば、多数（数百）のペプチド鎖がペプチドナノパーティクルに集合しうる。２本のヘリックス間の角度がより小さいならば、結果として６０本よりも多いペプチド鎖がＳＡＰＮに集合しうる。そのような設計では、ＳＡＰＮは、「オール五量体」ウイルス構造のためのウイルスカプシドの準等価性理論およびタイル張り理論（tiling theory）によって説明されるように、６０本の複数倍のペプチド鎖に対応する分子量を有しうる。
【００４５】
Ｔ細胞エピトープ
Ｂ細胞エピトープとは対照的に、Ｔ細胞エピトープは免疫系を刺激するために担体表面にディスプレイされる必要がないので、ＳＡＰＮのコア足場、すなわちオリゴマー化ドメインのコイルドコイル配列にＴ細胞エピトープを組み入れることができる。本発明では、これらのエピトープが、ＳＡＰＮのコイルドコイル足場の一部であり、同時にそれぞれのＭＨＣ分子に結合できるように、ＭＨＣ結合のために伸長コンフォメーションを必要とするＴ細胞エピトープのＭＨＣ結合の特徴が、コイルドコイル形成のためにαヘリックスコンフォメーションを必要とするコイルドコイル形成の特徴とどのように組み合わせることができるかが示されている。全てのコイルドコイル配列がＭＨＣ分子と結合できるわけでなく、全てのＴ細胞エピトープをコイルドコイル構造に組み入れることができるわけでないことに留意されたい。
【００４６】
Ｔ細胞エピトープの供給源
Ｔ細胞エピトープをオリゴマー化ドメインに組み入れて最終的に自己集合ペプチドナノパーティクル（ＳＡＰＮ）をもたらすために、Ｔ細胞エピトープは、異なる起源から選択することができる。例えば、Ｔ細胞エピトープは、実験方法によって決定することができ、文献から公知であり、特定の病原体の既存のタンパク質配列に基づき予測アルゴリズムによって予測することができ、または新規に設計されたペプチドもしくはその組み合わせでありうる。
【００４７】
科学文献から入手できる公知のＴ細胞エピトープが豊富にある。これらのＴ細胞エピトープは、特定の病原体より選択することができ、または特定の特徴を有する新規に設計されたペプチド、例えば多数の異なるＭＨＣ ＩＩ分子と結合し、それをいわゆる乱交雑な（promiscuous）Ｔ細胞エピトープにするＰＡＤＲＥペプチド（米国特許第５，７３６，１４２号）でありうる。数千種の異なるＴ細胞エピトープを含む一般にアクセス可能なデータベース、例えばＭＨＣデータベース「MHCBN VERSION 4.0」（http://www. imtech.res.in/raghava/mhcbn/index.html）または免疫エピトープデータベースＩＥＤＢ（http://www.iedb.org/）他が存在する。
【００４８】
ＨＴＬエピトープをその他の点では免疫原性でないペプチド配列に組み入れることまたはそれを非ペプチド抗原に結合させることで、ＨＴＬエピトープをよりいっそう免疫原性にできることは周知であり、十分に文書化されている。汎ＤＲ結合性ペプチドＨＴＬエピトープであるＰＡＤＲＥは、マラリア、アルツハイマーおよび多数の他のワクチン用のワクチン設計に広く使用されている。
【００４９】
ＭＨＣＢＮデータベース（上記）の定義によると、Ｔ細胞エピトープは、対応するＭＨＣ分子に対して５０，０００nM未満の結合親和性（ＩＣ５０値）を有するペプチドである。そのようなペプチドは、ＭＨＣ結合因子と見なされる。この定義によると、２００６年８月現在でＭＨＣＢＮデータベース、バージョン４．０において以下のデータが入手可能である：２０７１７種のＭＨＣ結合因子および４０２２種のＭＨＣ非結合因子。
【００５０】
適切なＴ細胞エピトープは、予測アルゴリズムを使用することによっても得ることができる。これらの予測アルゴリズムは、推定上のＴ細胞エピトープについて病原体由来の既存のタンパク質配列をスキャンすることができるか、または新規に設計されたペプチドが特定のＭＨＣ分子と結合するかどうかを予測できるかのいずれかである。多数のそのような予測アルゴリズムは、一般にインターネット上でアクセス可能である。例は、ＳＶＲＭＨＣｄｂ（http://svrmhc.umn.edu/SVRMHCdb; J. Wan et al., BMC Bioinformatics 2006, 7:463）、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）、ＭＨＣＰｒｅｄ（http://www.jenner.ac.uk/MHCPred）、モチーフスキャナー（http://hcv.lanl.gov/content/immuno/motif_scan/motif_scan）またはＭＨＣ ＩＩ結合分子のためのＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan）およびＭＨＣ Ｉ結合エピトープのためのＮｅｔＭＨＣｐａｎ（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan）である。
【００５１】
本明細書に記載されるような設計に好ましいＨＴＬエピトープは、５００nMよりも良好な結合親和性（ＩＣ５０値）で任意のＭＨＣ ＩＩ分子に結合すると生物物理方法によって測定されるか、またはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎによって予測されるペプチド配列である。これらは、弱結合因子と見なされる。優先的に、これらのエピトープは、５０nMよりも良好なＩＣ５０値でＭＨＣ ＩＩ分子と結合すると生物物理法によって測定されるか、またはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎによって予測される。これらは、強結合因子と見なされる。
【００５２】
本明細書に記載されるような設計に好ましいＣＴＬエピトープは、５００nMよりも良好な結合親和性（ＩＣ５０値）で任意のＭＨＣ Ｉ分子と結合すると生物物理方法によって測定されるか、またはＮｅｔＭＨＣｐａｎによって予測されるペプチド配列である。これらは、弱結合因子と見なされる。優先的に、これらのエピトープは、５０nMよりも良好なＩＣ５０値でＭＨＣ Ｉ分子と結合すると生物物理方法によって測定されるか、またはＮｅｔＭＨＣｐａｎによって予測される。これらは、強結合因子と見なされる。
【００５３】
Ｔ細胞エピトープのための場所
Ｔ細胞エピトープは、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＤ１および／またはＤ２のペプチド配列内のいくつかの位置に組み入れることができる。これを果たすために、Ｔ細胞エピトープを有する特定配列は、コイルドコイル形成についての規則およびＭＨＣ結合についての規則に従わなければならない。コイルドコイル形成についての規則は、上記に詳細に概要されている。ＭＨＣ分子への結合についての規則は、ＭＨＣ結合ペプチドを予測するために洗練されたアルゴリズムを利用するＭＨＣ結合予測プログラムに組み入れられている。
【００５４】
多数の異なるＨＬＡ分子があり、それらのＨＬＡ分子のそれぞれが、それに最もよく結合する選択されたアミノ酸をその配列中に有する。例えば、対応する結合モチーフは、国際公開公報第２００９／１０９４２８号の表３および４に概要されている。
【００５５】
コイルドコイルへのＴ細胞エピトープの操作
ＳＡＰＮのコイルドコイルオリゴマー化ドメイン中にＴ細胞エピトープを組み入れているＳＡＰＮを設計するために、３段階を取らなければならない。第１段階では、文献もしくはデータベースから公知のＴ細胞エピトープまたは適切なエピトープ予測プログラムを使用することによって予測されたＴ細胞エピトープを使用することによって、候補Ｔ細胞エピトープを選択しなければならない。第２段階では、プロテアソーム切断部位をＣＴＬエピトープのＣ末端に挿入しなければならない。これは、プロテアソーム切断部位のための予測プログラムＰＡＰｒｏｃ（http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html; Hadeler K.P. et al., Math. Biosci. 2004, 188:63-79）を使用すること、および所望の切断部位直後の残基を改変することによって行うことができる。この第２段階はＨＴＬエピトープには必要ない。第３の最も重要な段階では、上記に概要したコイルドコイル形成についての規則と最もよく適合するようにＴ細胞エピトープの配列をコイルドコイル配列と整列させなければならない。組み入れられたＴ細胞エピトープを有する配列が実際にコイルドコイルを形成するかどうかは予測することができ、Ｔ細胞エピトープの配列とコイルドコイルリピート配列との間の最良の整列は、インターネット上で入手可能なＣＯＩＬＳ（http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html; Gruber M. et al., J. Struct. Biol. 2006, 155(2):140-5）またはＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi）などのコイルドコイル予測プログラムを使用することによって最適化することができる。
【００５６】
おそらくＴ細胞エピトープはコイルドコイル構造に非適合性のグリシンまたはさらにはプロリンを含んでいることから、たとえ適切な整列を見出すことが不可能であっても、Ｔ細胞エピトープをオリゴマー化ドメインに組み入れることができる。この場合、Ｔ細胞エピトープは、同一のオリゴマー化状態の配列を形成する強力なコイルドコイルに隣接しなければならない。このことは、コイルドコイル構造を十分な程度まで安定化させるか、またはコイルドコイルオリゴマー化ドメイン内にループ構造を発生させることができるかのいずれかである。
【００５７】
好ましい設計
所与の特定の適用のために最良の免疫学的プロファイルを有するＳＡＰＮを工学設計するために、以下の考慮を行わなければならない：
ＣＴＬエピトープは、Ｃ末端にプロテアソーム切断部位を必要とする。自己免疫応答を回避するために、このエピトープはヒト配列に類似であってはならない。したがって、Ｔ細胞エピトープの少なくとも１種がノロウイルス特異的ＣＴＬエピトープであるＳＡＰＮ、特にその配列がＣＴＬエピトープの後にさらにプロテアソーム切断部位を含むＳＡＰＮが好ましい。
【００５８】
同様に、少なくとも１種のＴ細胞エピトープがＨＴＬエピトープ、特に汎ＤＲ結合性ＨＴＬエピトープであるＳＡＰＮが好ましい。そのような汎ＤＲ結合性ＨＴＬエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の多くに結合し、したがって、大多数の健康個体において認識される。これは、良好なワクチンにとって重要なことである。
【００５９】
配列Ｄ１−Ｌ−Ｄ２が一連の重複するＴ細胞エピトープを含むＳＡＰＮも好ましい。
【００６０】
ノロウイルスワクチンは、好ましくはＨＴＬエピトープおよびＣＴＬエピトープの両方を含む。ＨＴＬエピトープは、できるだけ乱交雑であるべきである。それらのエピトープは、必ずしも病原体由来である必要はないが、強力なＴヘルプ免疫応答を誘起するペプチドでありうる。一例は、ＰＡＤＲＥペプチドであろう。好ましくは、これらは、ＳＡＰＮのＤ１−Ｌ−Ｄ２コア配列に組み入れられているＴ細胞エピトープである。ＣＴＬエピトープは、ノロウイルス特異的な必要があり、Ｃ末端プロテアソーム切断部位を有する必要がある。
【００６１】
本発明のＳＡＰＮは、公知のナノパーティクルに比べて本発明のＳＡＰＮを独特にする以下の局面を有する：
Ｔ細胞エピトープが組み入れられている二量体性コイルドコイルの設計は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質のＰドメインまたはＰ２サブドメインを結合させることができるＳＡＰＮをもたらす。
【００６２】
Ｐサブドメインのフラグメントは、ＳＡＰＮと結合できるが、それでもナノパーティクル形成することができるフラグメントである。このフラグメントは、（ナノパーティクルのコアを形成している１００個のアミノ酸に比べて）約３００個の追加的なアミノ酸に相当するので、ささいなものではない。
【００６３】
特に、ＳＡＰＮナノパーティクルへのＰサブドメインの結合成功は、ささいなものではなく、ＳＡＰＮナノパーティクルの形成成功は、以下の理由から容易には予想することができない：
１．  Ｐタンパク質自体は、開いたコンフォメーションと閉じたコンフォメーションの間で切り替えできる、Ｐ２サブドメインの表面のループにおける大幅な構造移動度によって特徴づけられる高度可動性タンパク質である（Taube S et al., J Virol. 84(11), 5695-705, 2010）。
２．  ウイルスカプシドの異なる成熟段階の間でタンパク質の１６Åの上昇および４０°の回転を示すＸ線結晶構造によって実証されるように、Ｐタンパク質は、最も可能性があることには、主要なコンフォメーション変化を伴ういわゆるウイルス成熟過程を経る（Katpally U et al., J Virol. 82(5), 2079-88, 2008）。これは、Ｐ２を含むＳＡＰＮの設計を困難なタンパク質設計課題にする。
３．  溶液中のＰ２サブドメインは、八量体性ナノパーティクルを形成する（Tan M et al., Virology, 382(1), 115-23, 2008）。ＳＡＰＮに対するこのＰ２サブドメインの八量体性ナノパーティクルとしての結合は、明らかに功を奏しないであろうから、それゆえにＰ２サブドメインは、適正なＳＡＰＮナノパーティクルの形成を妨害すると予想される。Ｐパーティクル自体が均一ではなく、むしろ１２量体、１８量体、２４量体および３６量体性複合体の種々の凝集状態を形成することから、これは、なおさらその通りである（Bereszczak JZ et al., J Struct Biol. 177(2), 273-82, 2012）。
４．  最終的に、Ｐ２サブドメインのタンパク質配列の改変は、改変の種類に応じて新規な凝集体をもたらす（Tan M et al., Virology, 382(1), 115-23, 2008）。単一のアミノ酸の挿入、ｆｌａｇタグの付加またはアルギニンクラスターの変化と同じほど小さな改変は、全てＰタンパク質の凝集状態を変化させる。したがって、ＳＡＰＮ配列全体の結合などの、かなりより大きな改変は、Ｐタンパク質の生物物理挙動およびＳＡＰＮナノパーティクルの形成成功に顕著な影響を及ぼすと予想され、したがって、タンパク質設計における大きなブレークスルーに相当する。
【００６４】
ワクチンとしてのノロウイルスＶＬＰよりも本発明のＳＡＰＮの方が、免疫応答の最適化のためのタンパク質設計およびワクチンの生物物理性質における大きな柔軟性を可能にする。例えば、国際公開公報第２００９／１０９４２８号に記載されたようなＳＡＰＮの主鎖にＨＴＬエピトープを操作導入することは、本発明のＳＡＰＮを高度に免疫原性にする。本発明のＳＡＰＮの生物物理的安定性も、最適なコイルドコイル配列をＳＡＰＮのコア内に操作導入することによって最適化することができる。これに加えて、ＳＡＰＮの最良の再フォールディング性質および最適な保存期間を可能にするように本明細書下記のコイルドコイルのフォールディング原理によりペプチド配列を調整することによって、本発明のＳＡＰＮの再フォールディング性質を最適化することができる。タンパク質工学についてのこのような柔軟性は、ノロウイルスＶＬＰについては与えられておらず、したがって、最良の再フォールディング性質および最適な保存期間は、ノロウイルスＶＬＰで果たすことの方がずっと難しい。
【００６５】
同じ考察が、本発明のＳＡＰＮをノロウイルスのＰドメインのみから構成されるいわゆるＰパーティクルよりも優れたものにする。特にこれらのＰパーティクルの生物物理的安定性は、どちらかと言えば不十分であり、コントロールおよび最適化が非常に困難である。安定性を増大させるためにシステインをＰパーティクルの配列の末端に操作導入する試みがなされている。
【００６６】
本明細書および国際公開公報第２００９／１０９４２８号に概要されたものと同じ方法によって、本発明のＳＡＰＮの免疫原性もまた、Ｐパーティクルよりも改善することができる。
【００６７】
ノロ−ＳＡＰＮの設計
本発明によるノロ−ＳＡＰＮの特定の一例は、以下の構築物である：
精製を容易にするためにノロ−ＳＡＰＮは、ニッケルアフィニティー精製のためのＨｉｓタグおよびＤＮＡレベルではさらなるサブクローニングのための制限部位を含む配列
【化２】
2014530224.tif 000005
で開始する。
【００６８】
Ｄ１について、五量体化ドメインが選択される（ｍ＝５）。特定の五量体性コイルドコイルは、トリプトファン−ジッパーの五量体化ドメインの新規な改変である（Liu J et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(46):16156-61, RCSB Protein Data Bank pdb-entry 1T8Z）。本来のトリプトファン−ジッパーの五量体化ドメインは、配列
【化３】
2014530224.tif 000006
を有する。
【００６９】
ノロ−ＳＡＰＮのために使用される五量体化ドメインの改変コイルドコイル配列（配列番号５）は、位置１３で開始し、位置４２で終止し、位置１４、１５、２２、２４、２９および３２に６個の追加的な電荷ならびに位置３８にリシンの代わりにバリンを含む。バリンは、さらなるサブクローニングのために配列への制限部位ＳａｌＩの操作導入を可能にする。
【００７０】
【化４】
2014530224.tif 000007
【００７１】
この配列を、コリシンＥ１のチャネル形成ドメインのヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ由来の８個のアミノ酸だけ伸長させる。
【００７２】
コリシンＥ１の本来のチャネル形成ドメインRCSB Protein Data Bank pdb-entry 2i88の残基２５〜４１番は、配列
【化５】
2014530224.tif 000008
を有する。
【００７３】
このヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ内に以下の改変を導入した。位置２６および３０の両方で本来の残基（グルタミンおよびグルタミン酸）をトリプトファン残基に置換し、位置３５および３９の両方で本来の残基（リシンおよびメチオニン）をロイシンに置換する。最初の二つの改変は、トリプトファンジッパーを含む配列全体に、以下の配列（配列番号７）を有する五量体性コイルドコイルドメインを形成させるものである。
【００７４】
【化６】
2014530224.tif 000009
【００７５】
２番目の二つの改変は、新規に設計されたＤ２の二量体性コイルドコイル配列と連結したときにその配列に二量体性コイルドコイルを形成させるものである。したがって、この改変ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフは、自然に五量体を二量体に連結し、したがって上記配列番号６のアミノ酸３２および３３番に相当する２個のアミノ酸であるチロシン−グリシンによってリンカーＬが形成される。
【００７６】
これは、以下の配列のＤ２をもたらす。
【００７７】
【化７】
2014530224.tif 000010
【００７８】
別の密接に関係する新規配列
【化８】
2014530224.tif 000011
について、たとえＳＤＳ−ＰＡＧＥの完全変性条件下であっても二量体が形成されることが示された。
【００７９】
コイルドコイルの少数の選ばれたａａ（ａ）位置にアスパラギン残基を操作導入することによって、その構造での二量体形成をなおいっそう強力に実現することができる。適正な二量体形成を保証するために配列番号８の位置１３および４１にアスパラギン残基を操作導入した。この二量体性コイルドコイル配列も乱交雑なＨＴＬエピトープ
【化９】
2014530224.tif 000012
を含み、このエピトープは、ＮｅｔＭＨＣＩＩによりこのコイルドコイル配列内で主要なヒトＭＨＣ ＩＩ分子の大部分と下記の結合親和性で強く結合すると予測される。
【００８０】
【表３】
2014530224.tif 000013
【００８１】
次に、任意の１株のノロウイルスのＰドメインまたはＰ２サブドメインのみを、残基ＧＳＧＳを有するフレキシブルリンカーによって二量体性コイルドコイルＤ２に結合させる。選択された特定のノロウイルス配列は、Ｘ線結晶構造について対応するｐｄｂエントリーコード１ＩＨＭを有するノロウイルスＨｕ／１９６８／ＵＳ（Jiang X et al., Virology 1993; 195(1):51-61）である。Prasad BVVら（Science 1999; 286:287-290）によって発表された命名に従い、この配列は、Ｐドメインである残基２２３〜５２０番（１０個のＣ末端残基５２１〜５３０番はＸ線結晶構造が無秩序であり、大きく陽性荷電していることから、これら１０個の残基を欠如する）にＳドメインＣ末端の３個のアミノ酸が加わったものを含む。残基トレオニン２２３がウイルスカプシドの結晶構造において２回軸を挟んだ鎖間の最も密接な接触であることから、コンピューター視覚化プログラムによってこの残基をノロ−ＳＡＰＮへの結合点に慎重に選択した。
【００８２】
すると、この設計の結果として以下の配列が生じ、この配列をタンパク質の発現、精製および生物物理分析に使用した。
【００８３】
【化１０】
2014530224.tif 000014
【００８４】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために有用であるが、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００８５】
クローニング
標準的な分子生物学手順を用いて、ナノパーティクル構築物をコードするＤＮＡを調製した。配列番号１で示されるタンパク質配列を含むプラスミドを、図１で示される基本ＳＡＰＮ発現構築物のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングすることによって構築し、ノロ−ＳＡＰＮを回収した。
【００８６】
発現
アンピシリン添加ルリアブロス中で３７℃で成長させたEscherichia coli ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞にプラスミドをトランスフォーメーションした。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシドで発現を誘導した。誘導の４時間後に、細胞を３７℃から取り出し、４，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって収集した。細胞ペレットを−２０℃で保存した。ペレットを氷上で解凍し、９Ｍ尿素、１００mM ＮａＨ２ＰＯ４、１０mMトリス（ｐＨ８）、２０mMイミダゾール、および０．２mMトリス−２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）から成る溶解緩衝液中に懸濁した。タンパク質発現レベルは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価し、それを図２に示す。
【００８７】
精製
細胞を超音波処理によって溶解させ、３０，５００×ｇで４５分間遠心分離することによってその溶解物を透明にした。透明にした溶解物をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Qiagen, Valencia, CA, USA）と共に少なくとも１時間インキュベーションした。カラムを溶解緩衝液で、次に９Ｍ尿素、５００mM ＮａＨ２ＰＯ４、１０mMトリス（ｐＨ８）、２０mMイミダゾール、および０．２mM ＴＣＥＰを含有する緩衝液で洗浄した。９Ｍ尿素、１００mM ＮａＨ２ＰＯ４、２０mMクエン酸塩、２０mMイミダゾール、および０．２mM ＴＣＥＰでｐＨ勾配を加えてタンパク質を溶離した。それに続く洗浄は、ｐＨ６．３、５．９、５．２および４．５で行った。ｐＨ勾配の後に、イミダゾール含量を増加させる溶解緩衝液の勾配を用いてタンパク質をさらに溶離した。図３に示すように、純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。
【００８８】
再フォールディング
ノロ−ＳＡＰＮの迅速再フォールディング。迅速再フォールディングのために、表４に示すように濃度１．８mg/mlの溶液４mlを緩衝溶液に添加して終濃度０．０５mg/mlとした。次に、この溶液を０．３mg/mlに濃縮し、次に０．１mg/mlの希釈で電子顕微鏡法（３７，０００×）によって分析した。
【００８９】
【表４】
2014530224.tif 000015
【００９０】
２回目プローブ５〜１０の電子顕微鏡法の結果：
５）パーティクルは大きさが様々である。未フォールディングのタンパク質（または非常に小型のパーティクル）のバックグラウンドは高い。パーティクルの平均径は３２nmである。
６）パーティクルの外観は良好であり、大きさは完全には均一でなく、バックグラウンドが低い。パーティクルの平均径は３２nmである。
７）パーティクルの外観は良好であり、低塩濃度よりも直径がわずかに大きい（３５nm）。バックグラウンドは低く、パーティクルの濃度は５０mM ＮａＣｌでのプローブ６よりも高く見える。図４参照。
【００９１】
還元条件下で再フォールディングしたパーティクル（８、９、１０番、５mM ＴＣＥＰ添加）は、形状が丸みに乏しい外観であり、非還元条件よりも大きな凝集およびバックグラウンドが観察された。
【図３】
2014530224.tif 000016
【図４Ａ】
2014530224.tif 000017
【図４Ｂ】
2014530224.tif 000018
【図４Ｃ】
2014530224.tif 000019
【図１】
2014530224.tif 000020
【図２】
2014530224.tif 000021
【配列表】
2014530224000001.app
【国際調査報告】
2014530224.tif 000022
2014530224.tif 000023
2014530224.tif 000024
2014530224.tif 000025