(57)【要約】本発明は、結核菌群株由来のフラグメントを含むリポソーム製剤を提供する。本発明はまた、結核菌群株（そのフラグメントはリポソーム製剤の選択された態様に配合されうる）も提供する。本発明はさらに、リポソーム製剤を含む懸濁液及び医薬組成物も提供する。さらに、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の治療法に使用するため、特に結核の治療又は予防法、例えば潜伏性結核の予防において又は結核予防において、任意に併用療法において使用するためのリポソーム製剤の使用も開示する。本発明の製剤は、スクロースを含有し、そして／又は従来の結核療法のリポソーム系薬剤より小さい平均粒径を有しているため、より高いバイオアベイラビリティ及び効率をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム製剤であって、
（ａ）結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメント、
（ｂ）リポソーム形成剤、
１〜２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、好ましくは２〜１２％（ｗ／ｖ）のスクロース、さらに好ましくは３〜８％（ｗ／ｖ）のスクロース、最も好ましくは４〜６％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、粒子のｚ−平均粒径が１２０ｎｍ以下であるリポソーム製剤。
【請求項２】
粒子のｚ−平均粒径が４０〜１１０ｎｍ、さらに好ましくは５５〜９５ｎｍの範囲である、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
リポソーム製剤がエマルジョンであり、粒子のｚ−平均粒径が好ましくは４０ｎｍ未満である、請求項１又は２のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
粒子の多分散指数が０．４以下、好ましくは０．３である、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株が、毒性結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株、好ましくは２０１０年にロンドンのＮＣＴＣに寄託されたＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６である、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
さらに、
（ｄ）張力活性剤
及び／又は
（ｅ）一つ又は複数の非イオン界面活性剤
を含む、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
ＭＴＢ−Ｃ細胞のフラグメントが細胞壁フラグメントであるか又は細胞壁フラグメントを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項８】
（ａ）と（ｄ）の比率が０．０５：１〜１：５（ｗ／ｗ）である、請求項６に記載のリポソーム製剤。
【請求項９】
リポソーム形成剤が、水素化、部分水素化又は非水素化リン脂質、好ましくはレシチン、最も好ましくは大豆レシチンである、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
張力活性剤が、コール酸塩、デオキシコール酸塩、コレステロール及びコレステロールヘミスクシネートから選ばれる、請求項１０〜１２のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
ＭＴＢ−Ｃ細胞のフラグメントが細胞壁フラグメントであるか又は細胞壁フラグメントを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
２０１０年にロンドンのＮＣＴＣに寄託されたＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６のフラグメントを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
下記：
（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約７０ｋＤａの分子量を有する第一のポリペプチドであって、その第一のポリペプチドは、結核菌のＨＳＰ７０タンパク質（Ｒｖ０３５０）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する第一のポリペプチド、
（ii）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約３８ｋＤａの分子量を有する第二のポリペプチドであって、その第二のポリペプチドは、結核菌の３８ｋＤａタンパク質（Ｒｖ０９３４）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する第二のポリペプチド、
（iii）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約３０ｋＤａの分子量を有する第三のポリペプチドであって、その第三のポリペプチドは、結核菌のＡｇ８５Ｂタンパク質（Ｒｖ１８６６ｃ）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する第三のポリペプチド、及び
（iv）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約１０ｋＤａの分子量を有する第四のポリペプチドであって、その第四のポリペプチドは、結核菌のＣＦＰ１０タンパク質（Ｒｖ３８７４）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する第四のポリペプチド、及び
（ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約６ｋＤａの分子量を有する第五のポリペプチドであって、その第五のポリペプチドは、結核菌のＥＳＡＴ−６タンパク質（Ｒｖ３８７５）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する第五のポリペプチド
の少なくとも２つ、好ましくは３つ、さらに好ましくは４つ、最も好ましくはすべてを含む、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
下記の結核菌の抗原、すなわちＨＳＰ７０、３８ｋＤａタンパク質及びＡｇ８５Ｂ、又はそのフラグメントの少なくとも一つが存在する、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１５】
一つ又は複数のミコール酸及び／又は糖複合ミコール酸、好ましくはトレハロースジミコール酸及び／又は糖脂質、好ましくはリポアラビノマンナンを含む、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１６】
一つ又は複数の非イオン界面活性剤をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１７】
一つ又は複数の塩又はその溶液をさらに含有し、前記塩は好ましくは塩化ナトリウムである、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１８】
リポソーム製剤が凍結乾燥される、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤。
【請求項１９】
懸濁液であって、前記請求項のいずれかに記載のリポソーム製剤が溶媒中に再構成されており、前記溶媒は、好ましくは水性であり、さらに好ましくは生理的血清であるか又は生理的血清を含む懸濁液。
【請求項２０】
医薬組成物であって、請求項１〜１８のいずれかに記載の製剤又は請求項１９に記載の懸濁液と、製薬学的に許容しうる担体又は希釈剤、及び／又は製薬学的に許容しうるアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項２１】
療法によるヒト又は動物の身体の治療法に使用するための、請求項１〜１８のいずれか一つ又は複数に記載のリポソーム製剤、請求項１９に記載の懸濁液、又は請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
結核の治療又は予防法に使用するための、請求項２１に記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２３】
下記：
（ａ）潜伏結核感染を有する個人における活動性結核の予防法に使用するため；
（ｂ）疾患に暴露されているがまだ感染していない個人の感染を予防するための結核の一次予防法に使用するため、又は
（ｃ）潜伏性結核の治療又は予防法に使用するため
から選ばれる、請求項２２に記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２４】
１〜１０００、好ましくは３〜２５０、さらに好ましくは４〜８０、最も好ましくは約５、約２５又は約５０μｇ／用量のＦＣＭｔｂを含む用量で人体に投与するための、請求項２１〜２３のいずれかに記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２５】
２５μｇ  ＦＣＭｔｂの単回接種用量で人体に投与するための、請求項２１〜２３のいずれかに記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２６】
併用療法、好ましくは抗生物質、さらに好ましくはイソニアジド及びアンサマイシンの一つ又は複数を含み、ここでアンサマイシンは最も好ましくはリファンピシンである併用療法に使用するための、請求項２１〜２５のいずれかに記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２７】
補助療法に使用するための、請求項１２５に記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２８】
補助療法においてＨＩＶ陽性ヒト対象に投与するための、請求項２７に記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【請求項２９】
ＨＩＶ陰性ヒト対象に投与するための、請求項２５に記載のリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌群(Mycobacterium tuberculosis-complex)株由来のフラグメントを含むリポソーム製剤、これらの製剤を含む懸濁液及び医薬組成物、及び治療、特に結核を治療又は予防する方法におけるそれらのそれぞれの使用を提供する。本発明の製剤は、スクロースを含有し、そして／又は従来の結核療法のリポソーム系薬剤より小さい平均粒径を有しているため、より高いバイオアベイラビリティ及び効率をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
結核は、マイコバクテリウム種の（ヒト）型結核菌(M. tuberculosis)、ウシ型結核菌(M. bovis)、ネズミ型結核菌(M. microti)及びマイコバクテリウム・アフリカヌム(M. africanum)を含む結核菌群(Mycobacterium tuberculosis-complex)（ＭＴＢ−Ｃ）の桿菌(bacillus)によって引き起こされる慢性感染症である。マイコバクテリアの細胞エンベロープの主な独自特徴は、厚くてろう状の細胞壁である。この細胞壁バリアの性質は、宿主とＭＴＢ−Ｃ桿菌間の免疫反応の直接モジュレーターとして作用することにより、微生物の細胞内生存にも貢献している。エンベロープは、二つの異なる部分、すなわち細胞膜とその周囲の壁からなる。細胞壁は、ペプチドグリカンと、ホスホジエステル結合によって結合された分枝鎖多糖、アラビノガラクタンとの共有結合構造によって形成される骨格である。アラビノガラクタンの遠位端は、マイコバクテリアに特有のサイズ及び構造の高分子量脂肪酸であるミコール酸でエステル化されている。
【０００３】
世界保健機関によれば、世界中で毎年９，０００，０００人の新規発症例が記録され、約２，０００，０００人が死亡している。世界中に２，７００，０００，０００人を超える感染者がおり、毎年９千万人〜１億人を超える新規感染が発生していると考えられている。
【０００４】
マイコバクテリウムの毒性(virulent)又は非毒性(avirulent)株の細胞壁フラグメントを基にした様々な抗結核ワクチンが現状の技術に報告されている。結核に対する予防的治療で現在使用されているワクチンは、ウシ型結核菌の弱毒変異株であるＢＣＧ(カルメット−ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)）と呼ばれる株の細菌を基にしたものである。ワクチンの組成物に使用されるアジュバントはその有効性に大きく影響しうることも知られている。
【０００５】
トレハロースミコール酸、特にトレハロースジミコール酸は、結核菌抽出物の最も生物活性な脂質で、肉芽腫形成に影響する前炎症性カスケードを誘導する。結核菌の細胞壁に存在するこれらの化合物の量に関する書誌データがないことに注意すべきである。この種から抽出されるどのサンプルも高度な生物学的複雑さを有している。従って、定量分析を実施するには、積極的、複雑かつ長期の精製工程が必要とされる結果、あまりにも少量の精製化合物しか得られず、さらなる構造分析を実施することができない。これが結核菌の細胞壁中の各化合物の正確な割合に関する公表データが存在しない理由である。リポアラビノマンナンのようないくつかの糖脂質は、ＭＴＢ−Ｃ細胞の典型的な構成要素である。リポアラビノマンナンは、ＭＴＢ−Ｃの毒性(virulence)に関連している。
【０００６】
Ｅ．Ｒｉｂｉらは、Ｎａｔｕｒｅ  １９６３，１９８，１２１４〜１２１５ページに、非毒性カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）株の細胞壁フラグメントと鉱油を含む組成物を用いて実施した免疫付与アッセイについて記載している。前記フラグメントは、前記株の培養物を鉱油中でホモジナイズすることによって得られる。該組成物は、従来のワクチン（ＢＣＧ）よりも有効である。にもかかわらず、同じ論文中に、細胞壁フラグメントは、それらを水中でのホモジナイズにより鉱油の不在下で得た場合、何の免疫応答も誘導しないことが記載されている。
【０００７】
Ｄ．Ｐ．Ｐａｌらは、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．１９７７，６５，３４０〜３４５ページに、毒性Ｈ３７Ｒｖ株の細胞壁フラグメントと鉱油を用いて調製されたワクチンについて記載している。この場合、細胞壁フラグメントは、死細胞の水性相中ホモジナイズによって得られ、鉱油はその後組成物に加えられている。ここでも、水性相中でホモジナイズされた細胞壁フラグメントは免疫原性がないこと、ワクチンが有効であるためには鉱油の存在が必要であることが述べられている。
【０００８】
Ｇ．Ｋ．Ｋｈｕｌｌｅｒらは、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，３７，４０７〜４１２ページに、フロイント不完全アジュバントを用いて製剤化された結核菌の非毒性Ｈ３７Ｒａ株の細胞壁の様々な画分の保護効果を記載しているが、これも鉱油を含んでいる。
【０００９】
Ｅ．Ｍ．Ａｇｇｅｒらは、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，５６，４４３〜４４７ページに、毒性Ｈ３７Ｒｖ株の細胞壁フラグメントを含むワクチンは、カチオン界面活性剤のジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドをアジュバントとして含む場合、有効であることを記載している。また、上記アジュバントを含有していないホモジナイズされた結核桿菌を用いて実施されたアッセイは、マウスモデルの結核に対して抵抗レベルを生じないことも記載されている。
【００１０】
Ｉ．Ｍ．Ｏｒｍｅは、Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，２４，２〜１９ページ（対結核ワクチンの総説記事）に、従来のカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を基にしたワクチンは、本質的に成人を結核から保護するのに無効であると記載している。
【００１１】
結核に関連した治療又は予防から利益を受けられる個人は、以下の４つのサブグループに分けることができる。
【００１２】
（Ｉ）疾患に暴露されていない個人。予防接種はそのような個人の感染を防止することができる。
【００１３】
（II）疾患に暴露されてはいるが未感染の個人。皮膚ツベルクリン検査（ＴＳＴ）は陰性である。一次予防はそのような個人の感染を防止することができる。
【００１４】
（III）発病していない潜伏性結核を有する個人。発症のリスクが化学療法の適用によって低減できる。化学療法は、これらの個人が高リスク感染源となることを基本的に止めるという利益ももたらす。
【００１５】
（IV）病気である、すなわち疾患（通常、疾患の一次形態であるが、ほとんど又は全く感染力がない）を患っている個人。化学療法は、これらの個人が感染力を持つようになることを回避する。
【００１６】
感染が起きた場合、感染した個人、すなわち潜伏性結核を有する個人に活動性結核が発症するのを防御するための様々な治療法が現状の技術に記載されている。
【００１７】
例えば、特許出願ＥＰ２１９６４７３  Ａ１には、感染した個人（疾患をまだ発症していない人も疾患を既に発症した人も）の結核を治療するために、イソニアジドを含む様々な薬物を数ヶ月に及ぶ期間投与できることが記載されている。
【００１８】
特許出願ＥＳ２２３１０３７  Ａ１には、イソニアジド又はリファンピシンのような他の薬物と組み合わせて感染した個人の結核を治療するための医薬の製造に、結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）の毒性株の細胞フラグメントを含む免疫療法薬を使用することが記載されている。この特許出願は、ＭＴＢ−Ｃ株の細胞壁フラグメントを含む免疫療法薬の製造法も開示している。
【００１９】
ＷＯ２０１０／０３１８８３  Ａ１に概説されているように、潜伏結核感染の伝播は、主に結核菌に感染したエアゾールを呼吸することによって発生する。従って、肺結核に罹患している、従って感染エアゾールを撒き散らすことができる患者と直接接触する人、例えば同居人又は彼らと何らかのその他のタイプの緊密又は頻繁な接触を持つ人はリスク群と見なされる。
【００２０】
現在、Ｉ群の個人（上記）に通常投与される感染の一次予防は、５ｍｇ／ｋｇの用量のイソニアジドを３００ｍｇ／日を超えずに毎日投与することに基づく一次化学的予防である。この治療法は、感染個人と同居している及び／又は何らかのその他のタイプの緊密接触を持つＴＳＴ陰性のあらゆる年齢のすべての個人に適応される。この場合、化学的予防は、感染源との接触中止後、又は感染源が感染性でなくなった後３ヶ月間維持される必要がある。しかしながら、化学的予防は、Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ａｒｃｈ．Ｂｒｏｎｃｈｏｎｅｕｍｏｌ．，２００５，４１（１），２７−３３ページに記載されているように、場合によっては望まざる二次的影響をもたらすこともある。
【００２１】
毒性結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株のフラグメントを含む医薬が、例えば、ＥＰ１６９０５４９  Ｂ１、ＥＰ２０９０３１８  Ａ１及びＰＣＴ／ＥＳ２００９／０００４３６に記載されている。ＥＰ２０９０３１８  Ａ１及びＰＣＴ／ＥＳ２００９／０００４３６は、任意に他の薬物と組み合わせて、結核の予防に適切な医薬として使用するための毒性結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株のフラグメントを含む医薬組成物を開示している。他方、ＥＰ１６９０５４９  Ｂ１は、任意に他の薬物と組み合わせて、結核の治療に適切なＭＴＢ−Ｃフラグメントを含む医薬組成物を開示している。
【００２２】
特許出願ＥＰ２０９０３１８  Ａ１に、ＭＴＢ−Ｃの毒性株の細胞壁フラグメントを基にした薬剤を含む薬物の投与は、結核菌特異抗原に対してＴｈ１型インターフェロン−γ産生応答を誘導できると報告されている。前記抗原は、細胞壁の生合成に決定的役割を果たす低分子量タンパク質のファミリーからなる複合体Ａｇ８５の一部であるＡｇ８５Ｂ及びＡｇ８５Ａを含み、細菌培養が対数増殖（ｌｏｇ）期にあるときに相当量産生される。さらに、ＥＰ２０９０３１８  Ａ１には、従来のカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を基にしたワクチンは、複合体Ａｇ８５の抗原に対して免疫保護応答を生じないことも報告されている。特異的リンパ球によるインターフェロン−γの産生は重要な役割を持つ。すなわち、感染マクロファージが桿菌の増殖を停止させることができる（Ｎｏｒｔｈ  ＆  Ｙｏｕｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，２２：５９９−６２３）。
【００２３】
世界保健機関は、結核（ＴＢ）発症のリスクは、ＨＩＶ感染者ではＨＩＶ非感染者よりも２０〜３７倍高いと推定されるということを認識している。概説が“資源制約環境におけるＨＩＶ感染者のための結核症例発見の強化及びイソニアジド予防療法のためのガイドライン(Guidelines for intensified tuberculosis case-finding and isoniazid preventive therapy for people living with HIV in resource-constrained settings  )”  ＷＨＯ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１１，ＩＳＢＮ：９７８  ９２  ４  １５００７０  ８に示されている。しかしながら、イソニアジド予防療法は、ＨＩＶ陽性個人に対して長く持続する保護を提供するような予防接種ではない。それどころか、イソニアジドは定期的に投与される必要があり、イソニアジド耐性がこの療法を弱体化させている。従って、ＨＩＶ陽性ヒト対象のためにより強力な予防的及び療法的治療を提供することが依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】ＥＰ２１９６４７３  Ａ１
【特許文献２】ＥＳ２２３１０３７  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０３１８８３  Ａ１
【特許文献４】ＥＰ１６９０５４９  Ｂ１
【特許文献５】ＥＰ２０９０３１８  Ａ１
【特許文献６】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／０００４３６
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｅ．Ｒｉｂｉら，Ｎａｔｕｒｅ  １９６３，１９８，１２１４〜１２１５ページ
【非特許文献２】Ｄ．Ｐ．Ｐａｌら，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．１９７７，６５，３４０〜３４５ページ
【非特許文献３】Ｇ．Ｋ．Ｋｈｕｌｌｅｒら，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，３７，４０７〜４１２ページ
【非特許文献４】Ｅ．Ｍ．Ａｇｇｅｒら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，５６，４４３〜４４７ページ
【非特許文献５】Ｉ．Ｍ．Ｏｒｍｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，２４，２〜１９ページ
【非特許文献６】Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ａｒｃｈ．Ｂｒｏｎｃｈｏｎｅｕｍｏｌ．，２００５，４１（１），２７−３３ページ
【非特許文献７】Ｎｏｒｔｈ  ＆  Ｙｏｕｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，２２：５９９−６２３）
【非特許文献８】ＷＨＯ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１１，ＩＳＢＮ：９７８  ９２  ４  １５００７０  ８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の目的は、ＨＩＶ陽性及びＨＩＶ陰性ヒト対象における結核の予防又は治療、例えば潜伏性結核の予防、潜伏性又は活動性結核の一次予防、及び／又は治療に適切な、改良された薬剤を提供することである。更なる目的は、薬剤の製造に適切なＭＴＢ−Ｃ株の提供である。薬剤の製造法も本発明の更なる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
定義
“ＦＣＭｔｂ”は、結核菌群(Mycobacterium tuberculosis-complex)（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメントを表す。
【００２８】
“粒径”は、特に断りのない限り、粒子の直径のことである。粒径が正確に決定できない場合、およその粒径を意味する。
【００２９】
“ｚ−平均”は平均粒径であり、材料及び方法の部に記載の通りに決定できる。
【００３０】
略語
ＡＩＤＳ  後天性免疫不全症候群
ＢＣＧ  カルメット−ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)
ＣＦＵ  コロニー形成単位
ＤＰ  薬物製品
ＤＳ  薬物物質
ＥＬＩＳＡ  酵素免疫吸着アッセイ（エライザ法）
ＥＬＩＳＰＯＴ  酵素免疫スポットアッセイ（エリスポット法）
ＥＭＥＡ  欧州医薬品庁
ＦＣＭｔｂ  結核菌細胞のフラグメント
ＦＩＭ  ヒト初回投与
ＨＩＶ  ヒト免疫不全ウイルス
ＩＦＮ−γ  インターフェロンガンマ
ＩＧＴＩＰ  インスティトゥート・ペル・ア・ラ・レセルカ・エン・シエンサス・デ・ラ・サルート・ジェルマンス・トリアス・イ・プジョール(Institut per a la Recerca en Ciences de la Salut Germans Trias i Pujol)
ＩＭＰ  治験中医薬品
ＩＰＣ  工程内管理
ＬＣＳ  リポソーム濃縮物懸濁液
ＬＴＢＩ  潜伏結核感染
ＬＰＳ  リポ多糖
Ｍｔｂ  （ヒト型）結核菌(Mycobacterium tuberculosis)
Ｍｔｂ  結核菌群(Mycobacterium tuberculosis-complex)
ＮＺＢ  ニュージーランドブラック（マウス）
ＮＺＷ  ニュージーランドホワイト（マウス）
ＰＰＤ  タンパク質精製誘導体（精製ツベルクリンタンパク体）(Protein-purified derivative)
ｑ．ｓ．  足るだけ十分に(Quantum sufficit)
ＴＢ  結核
ＴＳＴ  結核に関する皮膚試験（ツベルクリン検査）
ＷＨＯ  世界保健機関
ｗ／ｖ  重量／体積
ｗ／ｗ  重量／重量
発明の概要
本発明は、結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメント（ＦＣＭｔｂ）とリポソーム形成剤とを含むリポソーム製剤を提供する。
【００３１】
特別な態様において、例えば動的光散乱によって測定可能な粒子のｚ−平均粒径は、１２０ｎｍ以下、好ましくは１１０ｎｍ以下、さらに好ましくは９５ｎｍ以下、最も好ましくは８０ｎｍ以下である。代替の態様において、リポソーム製剤は、１〜２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、好ましくは２〜１２％（ｗ／ｖ）のスクロース、さらに好ましくは３〜８％（ｗ／ｖ）のスクロース、最も好ましくは４〜６％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む。これら二つの態様はそれぞれ個別に実施されうるが、これらの態様は相互排他的と見なされるべきではなく、組み合わせて実施されてもよいことに注意することは重要である。
【００３２】
一つの特別な態様において、上記リポソーム製剤は、４０〜１２０ｎｍ、好ましくは５０〜１１０ｎｍ、さらに好ましくは５５〜９５ｎｍ、最も好ましくは５５〜８０ｎｍの範囲のｚ−平均粒径を有する。
【００３３】
代替の特別な態様において、上記リポソーム製剤の平均粒径は、リポソーム製剤がエマルジョンとなるようにさらに小さくてもよい。すなわち、この特別な態様において、粒子のｚ−平均粒径は好ましくは４０ｎｍ未満である。
【００３４】
上記態様のいずれか一つ又は複数の好適な態様において、リポソーム製剤は、粒子の多分散指数が０．４以下、好ましくは０．３以下であるリポソーム製剤である。
【００３５】
上記態様のいずれかのさらに好適な態様において、結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株は毒性結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株である。
【００３６】
上記態様のいずれかにおいて、（ａ）結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメントと（ｂ）リポソーム形成剤の比率は０．０１：１〜１：１、好ましくは０．０６：１〜０．１：１であることがさらに好適である。
【００３７】
上記いずれかのさらに好適な態様において、リポソーム製剤は、さらに（ｄ）張力活性剤(tensioactive agent)を含む。なおさらに好適な態様において、（ｄ）張力活性剤を含むリポソーム製剤は、（ａ）と（ｄ）の比率が０．１：１〜１０：１（ｗ／ｗ）、好ましくは０．５：１〜２：１（ｗ／ｗ）、最も好ましくは０．６：１〜０．８：１（ｗ／ｗ）であるリポソーム製剤である。
【００３８】
上記の特別な態様において、リポソーム製剤のリポソーム形成剤は、リン脂質、好ましくはレシチン、さらに好ましくは卵レシチン又は大豆レシチンからなる群から選ばれる一つ、最も好ましくは大豆レシチンであり、そのそれぞれは、水素化されていても、部分水素化されていても又は非水素化でもよい。
【００３９】
界面活性剤含有リポソーム製剤の好適な態様において、張力活性剤は、コール酸塩、デオキシコール酸塩、コレステロール及びコレステロールヘミスクシネートから選ばれる。
【００４０】
さらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、ＭＴＢ−Ｃ細胞のフラグメントが細胞壁フラグメントであるか又は細胞壁フラグメントを含むリポソーム製剤である。
【００４１】
別のさらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、２０１０年にロンドンのＮＣＴＣに寄託されたＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６のフラグメントを含む。この株は同義的に５１１とも呼ばれるので、ＮＣＴＣ  １３５３６と５１１の名称は互換的に使用できる。
【００４２】
なおさらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、以下の少なくとも２つ、好ましくは３つ、さらに好ましくは４つ、最も好ましくはすべてを含む。
【００４３】
（ｉ）結核菌のＨＳＰ７０タンパク質（Ｒｖ０３５０）の質量フィンガープリントに類似した約７０ｋＤａの分子量を有する第一のポリペプチド、
（ii）結核菌の３８ｋＤａタンパク質（Ｒｖ０９３４）の質量フィンガープリントに類似した約３８ｋＤａの分子量を有する第二のポリペプチド、
（iii）結核菌のＡｇ８５Ｂタンパク質（Ｒｖ１８６６ｃ）の質量フィンガープリントに類似した約３０ｋＤａの分子量を有する第三のポリペプチド、
（iv）結核菌のＣＦＰ１０タンパク質（Ｒｖ３８７４）の質量フィンガープリントに類似した約１０ｋＤａの分子量を有する第四のポリペプチド、及び
（ｖ）結核菌のＥＳＡＴ−６タンパク質（Ｒｖ３８７５）の質量フィンガープリントに類似した約６ｋＤａの分子量を有する第五のポリペプチド。
【００４４】
なおさらに好適な態様において、リポソーム製剤は、結核菌の１９ｋＤａリポタンパク質抗原前駆体ＬｐｑＨ（Ｒｖ３７６３）の質量フィンガープリントに類似した約１９ｋＤａの分子量を有するリポポリペプチドを含む。
【００４５】
なおさらに好ましくは、上記リポソーム製剤は、さらに、下記の結核菌の抗原、又はそのフラグメントの少なくとも一つが存在することを特徴とする。すなわち、ＨＳＰ７０、３８ｋＤａタンパク質及びＡｇ８５Ｂである。この意味におけるフラグメントは、これらのポリペプチドのいずれかの任意の部分、例えば分解産物である。
【００４６】
さらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、結核菌又はその誘導体に典型的に見出される脂質、例えば糖複合脂質のような複合生成物を含有する。好ましくはＩ、III又はIV型のいずれか一つ又は複数に属するミコール酸の一つ又は複数を含むのがさらに好適である。あるいは又はさらに、糖複合ミコール酸、好ましくはトレハロースジミコール酸が製剤に含まれてもよい。あるいは又はさらに、少なくとも一つのＭＴＢ−Ｃ由来の糖脂質が本発明によるリポソーム製剤中に存在するのがさらに好適であり、好適な糖脂質はリポアラビノマンナンである。
【００４７】
上記リポソーム製剤は、さらに、好ましくは非イオン界面活性剤の群からの一つ又は複数の界面活性剤を含みうる。
【００４８】
さらに好適な態様において、前記請求項のいずれかによるリポソーム製剤は、さらに一つ又は複数の塩又はその溶液を含み、好適な塩は塩化ナトリウムである。
【００４９】
上記いずれかのなおさらに好適な態様において、本発明のリポソーム製剤は凍結乾燥される。
【００５０】
本発明は懸濁液も提供し、その場合、前記請求項のいずれかのリポソーム製剤は溶媒中に再構成される。好適な態様において、この懸濁液の溶媒は水性であり、好ましくは生理的血清であるか又は生理的血清を含む。
【００５１】
本発明はまた、上記態様のいずれか一つ又は複数に記載のリポソーム製剤、又は上記態様のいずれか一つ又は複数に記載の懸濁液、及び製薬学的に許容しうる担体又は希釈剤又は賦形剤（担体、希釈剤又は賦形剤として適切な任意の物質が使用できる）を含む医薬組成物も提供する。その好適な態様において、この医薬組成物はさらに製薬学的に許容しうるアジュバントも含む。
【００５２】
本発明はまた、療法によってヒト又は動物の身体の治療法に使用するための製品も提供する。すなわち、療法によってヒト又は動物の身体の治療法に使用するための、上記態様のいずれか一つ又は複数によるリポソーム製剤、上記態様のいずれか一つ又は複数による懸濁液、又は上記態様のいずれか一つ又は複数による医薬組成物を提供する。特別な態様において、本発明は、このリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物を注射用として提供する。別の特別な態様において、本発明は、このリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物を結核の治療又は予防法に使用するために提供する。これらの特別な態様は、個別でも又は組み合わせても実施できる。
【００５３】
さらに特別な態様において、本発明は、療法による人体の治療法におけるその使用に関連して上記された事に従うリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物が、さらに、１〜１０００、好ましくは３〜２５０、さらに好ましくは４〜８０、最も好ましくは約５、約２５又は約５０μｇ／用量のＦＣＭｔｂを含む用量で人体に投与するためのものであることを特徴とするリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物を提供する。
【００５４】
（ａ）〜（ｃ）のさらに三つの特別な態様において、療法によるヒト又は動物の身体の治療法におけるその使用に関連して上記された事に従うリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物は、（ａ）潜伏結核感染を有する個人における活動性結核の予防法に使用するため、（ｂ）疾患に暴露されているがまだ感染していない個人の感染を予防するための結核の一次予防法に使用するため、又は（ｃ）潜伏性結核の治療又は予防法に使用するためのものである。
【００５５】
療法によるヒト又は動物の身体の治療法に使用するための上記リポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物の好適な態様において、その使用は併用療法又は補助療法における使用である。補助療法は、一次治療と組み合わせた追加療法又は二次療法で、状態の治療における効果を増大する。併用療法の特別な態様は、併用療法が抗生物質、好ましくはイソニアジド及びアンサマイシンの一つ又は複数を含むものであり、アンサマイシンは最も好ましくはリファンピシンである。本発明の特別な態様において、補助療法は、ＨＩＶ陽性ヒト対象に投与され、２５μｇのＦＣＭｔｂの単回投与が好適である。
【００５６】
本発明はまた、リポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物である薬剤のいずれかの製造法も提供する。
【００５７】
本発明はさらに、２０１０年にロンドンのＮＣＴＣに寄託されたＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、薬物物質ＦＣＭｔｂの上流工程を示すフローチャートである。工程に関与する材料及び試薬及び適切な工程内管理を含む。
【図２】図２は、薬物物質ＦＣＭｔｂの下流工程を示すフローチャートである。工程に関与する材料及び試薬及び適切な工程内管理を含む。
【図３】図３は、タンパク質特性分析のフローチャートを示す。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色方法論による抗原の同定。基準抗原ＥＳＡＴ６（６ｋＤａ）（７）；ＣＦＰ１０（１０ｋＤａ）（６）；Ａｇ８５Ｂ（３０ｋＤａ）（１）；３８ｋＤａ（２）；ＨＳＰ７０（７０ｋＤａ）（４）、ならびに分子量マーカーＭＷ（５）を示す。
【図５ａ】図５はタンパク質の特性分析を示す。図５ａは、タンパク質プロフィール：標準品ＦＣＭｔｂ−５２．１（１〜６）の、最終濃度１５．６μｇ  ＦＣＭｔｂ／ｍＬ（１、２）、６．２５μｇ  ＦＣＭｔｂ／ｍＬ（３、４）及び１．５６μｇ  ＦＣＭｔｂ／ｍＬ（５、６）におけるタンパク質プロフィールを示す。ＳＤＳ  ｐａｇｅの後、クーマシー染色。ＭＷの単位はｋＤａ。
【図５ｂ】図５はタンパク質の特性分析を示す。図５ｂは、１９ｋＤａバンドの同定を示す。ＳＤＳ  ｐａｇｅの後、銀染色。
【図５ｃ】図５はタンパク質の特性分析を示す。図５ｃは、タンパク質プロフィール：Ｌｉｏｎｅｘ社製ＥＳＡＴ−６標準と並行して実施された、示されたＦＣＭｔｂバッチ中のバンド（１０ｋＤａ及び６ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色方法論による同定を示す。様々なＦＣＭｔｂバッチ（１、２、３、９、１０、１１、（バッチＦＣＭｔｂ−５２．１はレーン９））、様々な濃度のＬｉｏｎｅｘ社製ＥＳＡＴ−６標準（４〜８）。
【図５ｄ】図５はタンパク質の特性分析を示す。図５ｄは、結核菌ＨＳＰ７０標準と並行して特異的抗体を用いるウェスタンブロットによるＦＣＭｔｂバッチ中の抗原、結核菌ＨＳＰ７０（Ｒｖ０３５０）のウェスタンブロット同定を示す。様々なＦＣＭｔｂバッチ（１、２、３、４、７、８、９）、ＨＳＰ７０標準（５、６）。
【図５ｅ】図５はタンパク質の特性分析を示す。図５ｅは、特異的抗体を用い、Ｌｉｏｎｅｘ社製結核菌３８ｋＤａ標準と並行して実施されたＦＣＭｔｂバッチ中の抗原、結核菌３８ｋＤａ（Ｒｖ０９３４）のウェスタンブロット方法論による同定を示す。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる蛍光検出。様々なＦＣＭｔｂバッチ（１、２、３、６、７）、３８ｋＤａ標準（４、５）。
【図５ｆ】図５はタンパク質の特性分析を示す。図５ｆは、特異的抗体を用い、Ｌｉｏｎｅｘ社製結核菌Ａｇ８５Ｂ標準と並行して実施されたＦＣＭｔｂバッチ中の抗原、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６ｃ）のウェスタンブロット方法論による同定を示す。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる蛍光検出。様々なＦＣＭｔｂバッチ（１、２、３、５、６、７）、Ａｇ８５Ｂ標準（４）。
【図６】図６は、様々なＦＣＭｔｂバッチ（５０μｇ／レーン）の示されたタンパク質バンドと、本発明によるリポソーム製剤を基にした医薬ワクチン組成物を２回接種された後の感染マウスから得た１／８０００希釈血清との相互作用を示す。ウェスタンブロット方法論を使用。
【図７ａ】図７は脂質分析を示す。図７ａは、基準株（Ｈ３７Ｒｖ（２）及びＮＣＴＣ  １３５３６（１））及び様々なＦＣＭｔｂバッチ（３〜９）、及びＴＤＭ標準（１０）中のポリアシルトレハロース（ＰＴ）、トレハロース６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）及びジアシルトレハロース（ＤＡＴ）のＴＬＣ方法論による同定を示す。
【図７ｂ】図７は脂質分析を示す。図７ｂは、ＦＣＭｔｂバッチ中のトレハロース６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）のＴＬＣ方法論による同定を示す。パネル（Ａ）及び（Ｂ）は二つの独立したアッセイを表す。（Ａ）ＴＤＭ標準（１１）及び（１２）、他のレーンは様々なＦＣＭｔｂバッチ。Ｂ：（１）ＴＤＭ標準（１）、他のレーンは様々なＦＣＭｔｂバッチ。
【図７ｃ】図７は脂質分析を示す。図７ｃは、ＴＬＣ方法論によるＦＣＭｔｂバッチ中のミコール酸Ｉ、III及びIVのパターンを示す。パネル（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は三つの独立したアッセイを表す。（Ａ）ＦＣＭｔｂバッチ（１〜６（ＦＣＭｔｂ−５１．２標準は６））、（Ｂ）例示／参照用、（Ｃ）ミコール酸標準（２）と比較したバッチＦＣＭｔｂ−４７ｂ（１）。
【図７ｄ】図７は脂質分析を示す。図７ｄは、ＬＡＭの同定を示す（左側レーンは基準、残りのレーンは本発明によるリポソーム由来のサンプル）。
【図８】図８は、注射用水（ＷＦＩ）で再懸濁されたＦＣＭｔｂ対リポソームを用いて製剤化されたＦＣＭｔｂ（ＲＵＴＩワクチン、バッチ１０ａと表示）の、同一用量（５０μｇ／用量）における細胞免疫効力の比較を示す。
【図９】図９は、リポソーム濃縮物（ＬＣＳ）バルクの凍結割断標本を示す（電子顕微鏡法）。
【図１０ａ】図１０ａは、効力試験において２種類のワクチン製剤を用いて試験されたバッチあたりの細胞免疫応答を示す（１回ワクチン接種）。
【図１０ｂ】図１０ｂは、ａと同様であるが、ただし２回のワクチン接種の場合を示す。“製剤II”は本文書の表１に従って５％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む。“製剤Ｉ”は、スクロースが存在しないことを除いて製剤IIと同様である。μｇはμｇ  ＦＣＭｔｂ／用量のことである。８５ＢはＡｇ８５Ｂである。
【図１１】図１１は、本発明を実施するための好適な様式による工程のフローチャートを示す。
【図１２】図１２は、実施例１２に記載の通り、ＲＵＴＩ  ２５μｇの１回接種の免疫学的プロフィールを示す。
【図１３】図１３は、実施例１２に記載の通り、免疫原性（ＨＩＶ−及びＨＩＶ＋）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメント（ＦＣＭｔｂ）とリポソーム形成剤とを含むリポソーム製剤を提供する。
【００６０】
特に明記しない限り、“含む(comprising)”という用語は、本願の文脈においては、“含む”によって導入されたリストのメンバーのほかに、更なるメンバーが存在してもよいことを示すために使用される。しかしながら、本発明の特定の態様として、“含む”という用語は、更なるメンバーは存在しない可能性を包含する、すなわちこの態様の目的のために“含む”は“からなる(consisting of)”の意味を有すると理解されることを想定している。
【００６１】
詳細な説明に、本発明の個々の特徴の特定の変形及び／又は好適な変形が開示されている。本発明はまた、特別に好適な態様として、本発明の特徴の二つ以上について記載された特定の変形及び／又は好適な変形の二つ以上を組み合わせることによって生じるような態様も想定している。
【００６２】
リポソーム化の工程は脂質環境を生じて溶解を促進し、ＦＣＭｔｂのような物質の懸濁液をもたらすことが一般に認められている。本発明の意味の範囲内にあるリポソームは、単層、多重層又はそれらの組合せでありうる。
【００６３】
ＦＣＭｔｂは、ＭＴＢ−Ｃ株由来の任意のタイプの物質であってよいが、タンパク質及び／又は脂質から誘導されたフラグメントが好適である。本願の意味の範囲内のＦＣＭｔｂは、典型的には、ＭＴＢ−Ｃ細胞由来の様々なタンパク質抗原と脂質の混合物である。
【００６４】
細胞フラグメントは、微生物細胞又は細菌細胞、例えば具体的にはＭＴＢ−Ｃ細胞をフラグメント化するのに適切な当業者に公知の任意の方法、例えばホモジナイズによって得ることができる。ホモジナイズは、超音波処理によって、又は直径約０．１ｍｍの小ビーズ、例えばシリカ又はジルコニア／シリカビーズを機械的ホモジナイザーと共に使用することによって実施できる。使用できる機械的ホモジナイザーは、例えばＢｉｏＳｐｅｃ  ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（登録商標）モデルである。ＭＴＢ−Ｃ細胞は、このホモジナイズ工程によって破壊され、その結果、典型的には小細胞壁フラグメントを含む小細胞フラグメントが得られる。細胞フラグメントの製造に通常関連する特徴は、脱脂による細胞壁フラグメントの“解毒”である。これは、当業者に周知の通り、エンドトキシン様分子の除去を可能にする工程である。従って、ＦＣＭｔｂは好ましくは解毒及び低温殺菌されるので、得られたリポソーム製剤は無菌であり、エンドトキシンを含まない。細胞フラグメントの緩衝液中分散物は、その貯蔵を容易にするために凍結乾燥されてもよい。そのためには、分散物をバイアルに分配し、−１５℃〜−１２０℃、例えば−４５℃の温度及び０．１〜０．５ｍｂａｒのような真空を用いて凍結乾燥すればよい。
【００６５】
本発明によるリポソームは、通常、少なくとも９９．９％（数による）が１μｍより小さいサイズ分布を有する。特別な態様において、動的光散乱によって測定可能な粒子のｚ−平均粒径は、１２０ｎｍ以下、好ましくは１１０ｎｍ以下、さらに好ましくは９５ｎｍ以下、最も好ましくは８０ｎｍ以下である。動的光散乱では、ｚ−平均パラメーターはその技術によって得られる安定で重要な数と見なされ、そのサイズ数は品質管理目的のために好適に使用される。好ましくは、本発明による製剤のリポソームは単峰性である、すなわち動的光散乱測定で単一のピークしか示さない。さらに好ましくは、本発明による製剤のリポソームは球形である。これは、実施例９に示されているように、リポソーム製剤の凍結割断標本の電子顕微鏡法によって検査することができる。球形とは、リポソーム粒子の少なくとも９０％（数による）について、個々の粒子のすべての表面点がリポソームの中心に対して類似又は同一の距離を有している、すなわちそのような粒子の最小半径は同じ粒子の最大半径の０．６以上、０．７以上、０．８以上又は０．９以上の割合となるような関係性にあることを意味する。本発明によるリポソーム製剤は、多重層又は単層リポソーム、又はそれらの混合物を含みうる。当業者に標準的知識に従って、動的光散乱測定は、適切な緩衝液中で実施されるべきである。すなわち、それ自体、リポソームの破壊、崩壊又は融合を起こさない、又は何らかのその他の様式で物理的にそれらを著しく不安定にしない緩衝液である。大まかに言えば、イオン強度とｐＨ値の両方がリポソームが形成された緩衝液に匹敵している限り、任意の緩衝液が適切でありうる。好ましくは、リポソームが形成された緩衝液に類似した又は同一の組成の緩衝液が使用される。
【００６６】
代替の態様において、リポソーム製剤はさらに、１〜２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、好ましくは２〜１２％（ｗ／ｖ）のスクロース、さらに好ましくは３〜８％（ｗ／ｖ）のスクロース、最も好ましくは４〜６％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む。約５％のスクロースが特に好適である。
【００６７】
これらの態様のそれぞれ（一つは特別な粒径に関し、もう一つはスクロースの存在に関する）は個別に実施されうるが、これらの態様は相互排他的と見なされるべきではなく、組み合わせて実施されてもよいことに注意することは重要である。
【００６８】
一つの特別な態様において、上記リポソーム製剤は、４０〜１２０ｎｍ、好ましくは５０〜１００ｎｍ、さらに好ましくは５５〜９５ｎｍ、最も好ましくは５５〜８０ｎｍの範囲のｚ−平均粒径を有する。ｚ−平均粒径は、上記一般的記載の通り及び“材料及び方法”の部で詳細に記載の通り、好ましくは動的光散乱によって測定される。
【００６９】
代替の特別な態様において、上記リポソーム製剤のｚ−平均粒径は、リポソーム製剤がエマルジョンとなるようにさらに小さくてもよい。すなわち、この特別な態様において、粒子のｚ−平均粒径は好ましくは４０ｎｍ未満である。
【００７０】
上記態様のいずれか一つ又は複数の好適な態様において、本発明による製剤のリポソームはさらに単分散である。つまり、サイズ分布の有意な幅が観察されないことを意味する。これは、技術的には、動的光散乱によって測定される低い多分散指数（ＰＤＩ）によって検査される。例えば、０．４以下、好ましくは０．３以下である。従って、リポソーム製剤は、動的光散乱によって測定可能な粒子の多分散指数が０．４以下、好ましくは０．３以下、最も好ましくは０．２５以下であるリポソーム製剤である。
【００７１】
結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメントは、上流工程及び下流工程を含む工程によって得ることができる。説明目的のために、５つの主な工程をここに簡単に記載する。工程を実施するための特別な形態は以下の実施例２及び３に示す。
【００７２】
上流工程（実施例２）：
工程１：結核菌の培養
工程２：結核菌の収穫及び粗抽出物の凍結
下流工程（実施例３）：
工程３：細胞のフラグメント化及び脱脂
工程４：低温殺菌
工程５：凍結乾燥（任意）
上記態様のいずれかのさらに好適な態様において、結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株は毒性結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株である。毒性とは、場合により病原性のこと及び／又は宿主の組織を侵襲する桿菌の能力のことを言う。毒性株はＭＴＢ−Ｃに属する種のいずれかの任意の毒性株でよいが、（ヒト型）結核菌(M. tuberculosis)に属する株が好適である。本発明によるＭＴＢ−Ｃ株は、当業者に周知の培地、例えばミドルブルック(Middlebrook) ７Ｈ１０又は７Ｈ１１寒天、ソートン培地(Sauton's medium)又はプロスカウアー−ベック培地(Proskauer-Beck medium)に播種することによって培養できる。毒性株の培養は、好ましくは長期間にわたって実施される。例えば、３週間に等しいか又はそれより長い期間、好ましくは３〜４週間を含む。培養温度は、好ましくは３４℃〜３８℃に維持される。培養が終了したら、細胞を収穫し、例えば特許出願ＥＳ２２３１０３７−Ａ１に記載されているような当該技術分野で周知の技術を用いて単離される。
【００７３】
リポソーム製剤のリポソーム剤は、好ましくは、水素化、部分水素化又は非水素化リン脂質である。使用されるリン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジル−イノシトールでありうるか又はそれらを含む。最も典型的なのはホスファチジルコリンで、様々な天然源から合成又は単離できる。好ましくは、リポソーム形成剤は、卵レシチン及び大豆レシチンからなる群から選ばれるレシチンであるか又はそれを含む。大豆レシチンは、とりわけホスファチジルコリンを含むリン脂質の複合混合物であり、特に好適である。リポソーム形成剤そのものとして又は更なる成分として製剤に含めてもよい典型的な脂質は、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰｃ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び／又はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、各脂質は、水素化されていても、部分水素化されていても、又は非水素化でもよい。リポソームは、従来の補助脂質と特許出願ＥＳ２２３１０３７−Ａ１に記載されているような当業者に周知の技術とを用いて形成できる。
【００７４】
上記態様のいずれかにおいて、（ａ）結核菌群（ＭＴＢ−Ｃ）株由来のフラグメントと（ｂ）リポソーム形成剤の比率は０．０１：１〜１：１、好ましくは０．０６：１〜０．１：１であることがさらに好適である。上記いずれかのさらに好適な態様において、リポソーム製剤は、さらに（ｄ）張力活性剤(tensioactive agent)を含む。一般的に、表面張力の値を変えることができるすべてのタイプの薬剤が本発明の意味における張力活性剤として使用できるが、除外されるのは、上記リポソーム形成剤の定義下に入る化合物である。様々なタイプの張力活性剤が当業者に知られており、本発明によるリポソーム製剤に使用できる。当業者には分かる通り、張力活性剤は、一般的に、極性−非極性構造を有する化学物質である。何らかの特定理論に限定したくはないが、張力活性剤は、一般的に、粒子の表面に位置する傾向があるため、界面に単分子層を生じ、それが表面張力値を低減する。張力活性剤は、界面活性剤又は活性表面剤とも呼ばれる。界面活性剤含有リポソーム製剤の好適な態様において、張力活性剤は、ステロール及びその誘導体、例えばコレステロール及び／又は胆汁塩又はその誘導体、例えばコール酸塩から選ばれる。特に好適な態様は、張力活性剤が、コール酸塩、デオキシコール酸塩、コレステロール及びコレステロールヘミスクシネートから選ばれる態様である。本発明を実施する好適な様式（しかし、これに限定されない）は、製剤のリポソームが大豆誘導レシチン及びコール酸ナトリウムの両方を含有する場合である。
【００７５】
なおさらに好適な態様において、（ｄ）張力活性剤を含むリポソーム製剤は、（ａ）と（ｄ）の比率が０．０５：１〜３：５（ｗ／ｗ）であるリポソーム製剤である。当業者に周知の通り、様々なタイプのリポソーム形成剤が使用できる。
【００７６】
リポソームは、それらの安定性を改良する添加剤を任意に含有することもできる。例えばビタミンＥなどで、これは脂質抗酸化剤として作用すると考えられている。
【００７７】
さらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、ＭＴＢ−Ｃ細胞のフラグメントが細胞壁フラグメントであるか又は細胞壁フラグメントを含むリポソーム製剤である。
【００７８】
ＭＴＢ−Ｃに属する任意の株、好ましくは（ヒト型）結核菌に属する任意の株が使用できる。別のさらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、ＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６のフラグメントを含む。これは２０１０年にロンドンのＮＣＴＣに寄託されたものである（実施例１）。使用できる別の株（従ってそのフラグメントがリポソーム製剤に含まれうる）は、Ｈ３７Ｒｖと呼ばれる。これは、例えば、英国ロンドンのナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー（National Collection of Type Cultures,ＮＣＴＣ）から入手することができ（寄託番号ＮＣ００７４１６）、この分野の研究者によく利用されている。２種以上の株を使用することも可能である。すなわち、リポソーム製剤は、様々な、例えば２種、３種、又はそれ以上の株のフラグメントを含む。
【００７９】
結核菌の約４０００もの推定抗原のことを考えると、これらすべてのタンパク質について薬物物質を分析することは不可能である。にもかかわらず、ある種のＭＴＢ−Ｃタンパク質は所望の免疫応答に関係していることが示されている。これらは、およそ６、１０、３０、３８、及び７０ｋＤａのサイズを有する５つのタンパク質である（Ｒｅｎｓｈａｗら，２００５，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２４，２４９１−２４９８；Ｓｉｎｇｈら，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２），３５４−３５８）。従って、なおさらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、以下の少なくとも２つ、好ましくは３つ、さらに好ましくは４つ、最も好ましくはすべてを含む。
【００８０】
（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約７０ｋＤａの分子量を有する第一のポリペプチド。この第一のポリペプチドは、結核菌のＨＳＰ７０タンパク質（Ｒｖ０３５０）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する。
【００８１】
（ii）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約３８ｋＤａの分子量を有する第二のポリペプチド。この第二のポリペプチドは、結核菌の３８ｋＤａタンパク質（Ｒｖ０９３４）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する。
【００８２】
（iii）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約３０ｋＤａの分子量を有する第三のポリペプチド。この第三のポリペプチドは、結核菌のＡｇ８５Ｂタンパク質（Ｒｖ１８６６ｃ）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する。及び
（iv）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約１０ｋＤａの分子量を有する第四のポリペプチド。この第四のポリペプチドは、結核菌のＣＦＰ１０タンパク質（Ｒｖ３８７４）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する。及び
（ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約６ｋＤａの分子量を有する第五のポリペプチド。この第五のポリペプチドは、結核菌のＥＳＡＴ−６タンパク質（Ｒｖ３８７５）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する。
【００８３】
そのなおさらに好適な態様において、リポソーム製剤は、さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による測定で約１９ｋＤａの分子量を有するリポポリペプチドを含み、そのリポポリペプチドは、結核菌の１９ｋＤａリポタンパク質抗原前駆体ＬｐｑＨ（Ｒｖ３７６３）の質量フィンガープリントに類似した質量フィンガープリントを有する。それぞれのバンドは、当該技術分野で公知の方法、例えば銀染色によって可視化できる。本発明の研究者らは、驚くべきことに、このポリペプチドは、高い総ＩｇＧ体液性応答を誘導することを見出した。これは、製剤中のすべての抗原の中で最も高い体液性応答でありうる。
【００８４】
ポリペプチド又はリポポリペプチドの同定法の例は実施例４に示す。
【００８５】
なおさらに好ましくは、上記リポソーム製剤は、さらに、下記の結核菌の抗原、又はそのフラグメントの少なくとも一つが存在することを特徴とする。すなわちＨＳＰ７０、３８ｋＤａタンパク質、Ａｇ８５Ｂ、最も好ましくはＨＳＰ７０、３８ｋＤａタンパク質及びＡｇ８５Ｂの少なくとも一つである。この意味におけるフラグメントは、これらのポリペプチドのいずれかの任意の部分、例えば分解産物である。そのようなフラグメントを得る様々な方法が可能である。例えば、化学的又は酵素的加水分解で、この場合、フラグメント化が意図的に起こされたか否か、リポソーム形成の前か後かは関係ない。各フラグメントは、例えば、アミノ酸配列の実質的オーバーラップ、例えば少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個の連続アミノ酸によって、そのそれぞれの起源に帰属させられるのが好適である。
【００８６】
本発明によるフラグメントは、飢餓、低酸素及び低ｐＨというストレス条件下で増殖させた桿菌から得るのが好ましい。低酸素は、増殖期間中、例えば２１日間、気密バッグに閉じ込めた（これによって微好気性微生物的(microaerobiotic)環境がもたらされる）プレート上で細菌を増殖させることによる。低ｐＨは次のように説明される。培養開始時、ｐＨ値は７．０〜６．８であり、終了時、典型的には培養２１日後、ｐＨ値は６．４〜６．５である。これらの条件下で、細菌の代謝は低下し、定常増殖がもたらされる。当然のことながら、これは桿菌をよりストレス耐性にする。そのような条件下で、培養桿菌はＬＴＢＩ（潜伏結核感染）におけるインビボ潜伏桿菌と同様の特徴を発現する。従って、ＦＣＭｔｂ中に存在する抗原は、潜伏桿菌の抗原、すなわち、いわゆる“構造”抗原ならびにストレス応答に関連する抗原に対して新しい免疫応答を引き起こすと期待される。
【００８７】
マイコバクテリアの糖脂質は、長い間、免疫調節活性（顕著には肉芽腫性応答の誘導）を有し、強力なアジュバント様効果を発揮すると認識されてきた。従って、さらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、結核菌又はその誘導体に典型的に見出される脂質、例えば糖複合脂質のような複合生成物を含有する。いくつかの免疫原性脂質成分が結核菌サンプルで確認されており（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ），２００３，８３（１−３），９１−９７）、それらの決定のための分析法が開発されている（電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、薄層クロマトグラフィー）。各脂質成分の単離は積極的な処理を必要とするので、ＭＴＢ−Ｃ抽出物中又はリポソーム製剤中に検出可能な各成分の定量的データ又はパーセンテージを得るのは難しいが、定性的な特徴付けは、本発明の更なる好適な態様を特徴付ける役割を果たしてくれるであろう。この更なる好適な態様に従って、好ましくはＩ、III又はIV型のいずれか一つ又は複数に属するミコール酸の一つ又は複数が含まれる。あるいは又はさらに、糖複合ミコール酸、好ましくはトレハロースジミコール酸が製剤中に含まれてもよい。あるいは又はさらに、糖脂質のリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）が製剤中に含まれてもよい。さらに、フラグメントの多抗原性（精製された抗原単独の代わりに、多抗原性タンパク質混合物＋脂質）は有益であると考えられているので、細胞フラグメント化法は最適な細胞抗原混合物が可能となるように当業者によって適応できる。
【００８８】
ＭＴＢ−Ｃ細胞のホモジナイズは、一つ又は複数の界面活性剤、好ましくは非イオン界面活性剤の存在下で実施される。従って、上記リポソーム製剤はさらに一つ又は複数のそのような界面活性剤を含みうる。多数のそのような界面活性剤が当業者の標準的知識の範囲内にある。好ましくは、使用される非イオン界面活性剤は、アルキルフェノールエトキシレート、及びソルビタンエステルエトキシレートからなる群から選ばれる。さらに好ましくは、非イオン界面活性剤はオクチルフェノールエトキシレートの群から選ばれる。なおさらに好ましくは、７〜８モルを含むエチレンオキシド含有量を有するオクチルフェノールエトキシレートが使用される。この界面活性剤は、市場ではトリトンＸ−１１４（登録商標）の名称で見つけることができる。細胞壁フラグメントを含有するホモジナイズ物(mass)を従来の処理に付して、非フラグメント化細胞及び可溶化成分を分離及び除去する。例えば、特許出願ＥＳ２２３１０３７−Ａ１に記載のように、異なる速度での遠心分離及び緩衝溶液による洗浄が使用できる。細胞壁フラグメントを含有する沈殿物は、前述の精製法の実施後に得られる。前記沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中に分散させ、従来の処理に付して、フラグメント化及び精製工程の後も生存し続けているかもしれないＭＴＢ−Ｃ細胞の完全不活化を確実にする。前述の処理法は、例えばホルムアルデヒドを用いた処理による化学的方法でも、又は例えば加圧滅菌（オートクレーブ）又は低温殺菌処理による物理的方法でもよい。脂質の特性分析の例は、以下の実施例５に示されている。
【００８９】
さらに好適な態様において、上記リポソーム製剤は、さらに一つ又は複数の塩又はその溶液を含み、好適な塩は塩化ナトリウムである。
【００９０】
上記いずれかのなおさらに好適な態様において、リポソーム製剤は凍結乾燥される。リポソームを凍結乾燥に付すことにより、凍結リポソームの形態の免疫療法薬を得ることができる。そのためには、分散物をバイアルに分配し、−１５℃〜−１２０℃、例えば−４５℃の低温及び０．１〜０．５ｍｂａｒのような真空で凍結乾燥すればよい。凍結乾燥後に得られたバイアルは、免疫療法薬として適切なリポソーム製剤を含有する。それらは好ましくは極低温、例えば−７０℃で貯蔵される。
【００９１】
本発明は懸濁液も提供し、その場合、前記請求項のいずれかのリポソーム製剤は溶媒中に再構成される。好適な態様において、この懸濁液の溶媒は水性であり、さらに好ましくは、及び最も好ましくは、生理的血清であるか又は生理的血清を含む。リポソーム製剤を溶媒中に懸濁させる方法は当業者に周知である。ＭＴＢ−Ｃフラグメントを含む従来のリポソーム製剤よりも速く懸濁化できるというのは、本発明による製剤の特に有利な性質である（実施例９参照）。
【００９２】
本発明の一つの目的は、医薬組成物の製造のためのＭＴＢ−Ｃ株の細胞壁フラグメントを含む薬剤を提供することであり、その薬剤は、記載された態様のいずれかにおける上記リポソーム製剤又はその組合せであるか又はそれを含む。薬物物質の医薬製剤／ガレヌス製剤(galenic formulation)の主目的は、細胞によく認識されるために十分効果的かつ安定な、そしてヒト又は動物の身体において関連細胞免疫応答を引き起こす可能性を有する懸濁液を得ることである。そのために、本発明は、上記態様のいずれか一つ又は複数に記載のようなリポソーム製剤、又は懸濁液と、製薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物も提供する。各種のそのような担体、賦形剤及び希釈剤は当業者に公知であり、それらは本開示によって決して制限されない。それどころか、担体、賦形剤又は希釈剤として適切な任意の物質が使用できる。好適な態様において、この医薬組成物はさらに、製薬学的に許容しうるアジュバントも含む。従って、アジュバントは、本発明のこの態様に含まれる物質と理解される。ここで、アジュバントは、ヒト又は動物の身体に適用された場合に、標的抗原に応答して免疫系を刺激できる物質であるが、アジュバント自体は免疫を与えない。何らかの特定のアジュバント物質に制限するつもりはないが、好適な態様は、アジュバントがアルミニウム塩、例えば塩化アルミニウム、又は鉱油又は鉱油を含む組成物、例えば不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）又は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、又はハロゲン化アンモニウム、例えばアルキル化臭化アンモニウム、例えばジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウムの場合である。
【００９３】
本発明はまた、療法によってヒト又は動物の身体の治療法に使用するための製品も提供する。すなわち、療法によってヒト又は動物の身体の治療法に使用するための、上記態様のいずれか一つ又は複数によるリポソーム製剤、上記態様のいずれか一つ又は複数による懸濁液、又は上記態様のいずれか一つ又は複数による医薬組成物を提供する。
【００９４】
薬物は、粘膜、例えば、眼、鼻腔内、口腔、胃、腸、膣、又は尿路の粘膜に、又は非経口的に、例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、又は腹腔内に投与できる。非経口投与が好適である。特別な態様において、本発明は、このリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物を注射用として提供する。
【００９５】
別の特別な態様において、本発明は、このリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物を結核の治療又は予防法に使用するために提供する。これらの特別な態様は、個別でも又は組み合わせても実施できる。本研究の発明者らは、本発明による製剤は、増殖する桿菌に対して免疫を高めることによって、及び非複製桿菌に対して免疫を誘導することによって、細胞免疫応答の増大をもたらすほか、潜伏結核感染においてさもなければ起こりうる持続再感染の過程も制御することを見出した。
【００９６】
療法による人体の治療法におけるその使用に関連して上記された事に従うリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物の適切な用量は、投与法及び治療される対象を含むいくつかのパラメーターに依存する。好適な態様において、それは人体への投与用である。その好適な態様において、これは、１〜１０００、好ましくは３〜２５０、さらに好ましくは４〜８０、最も好ましくは約５、約２５又は約５０μｇ／用量のＦＣＭｔｂを含む用量で投与される。２５μｇの用量が特に好適である。
【００９７】
（ａ）〜（ｃ）のさらに三つの特別な態様において、療法によるヒト又は動物の身体の治療法におけるその使用に関連して上記された事に従うリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物は、（ａ）潜伏結核感染を有する個人における活動性結核の予防法に使用するためのものである。代替のさらに特別な態様において、（ｂ）疾患に暴露されているがまだ感染していない個人の感染を予防するための結核の一次予防法に使用するため、又は（ｃ）潜伏性結核の治療又は予防法に使用するためのものである。
【００９８】
療法によるヒト又は動物の身体の治療法に使用するためのリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物は、単回投与又は数回投与、例えば、一定の時間間隔での反復によって２回、３回、４回、５回又は５回より多い用量の形態で投与できる。好ましくは、２回の用量を２〜５週間、好ましくは３〜４週間を含む期間を隔てて投与する。
【００９９】
実施例８、１０及び１２は、本発明によるリポソーム製剤をいかにヒト又は動物対象に適用できるかの例である。
【０１００】
上記物質の好適な態様は、併用療法又は補助療法に使用するためのリポソーム製剤、懸濁液又は医薬組成物である。医師は、より良好な治癒率又は一次治療に対するより迅速な応答を得るために補助療法をしばしば利用する。併用療法又は補助療法は、ヒト又は動物の身体を療法によって治療するために二つ以上の医薬を使用することを含む。併用療法の第一の特別な態様は、併用療法が抗生物質、好ましくはイソニアジド及びアンサマイシンの一つ又は複数を含むものであり、アンサマイシンは最も好ましくはリファンピシンである。その第二の特別な態様は、併用療法が結核に対する他の予防ワクチン、例えばＳ．Ｈ．Ｅ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６，６，６９９−７０４ページに記載されているようなもの、例えばカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、サブユニットワクチン又は組換えＢＣＧワクチンを含むものである。第一及び第二の特別な態様は組み合わせてもよい。
【０１０１】
併用療法又は補助療法では、これら二つ（又はそれ以上）の物質の投与は、同時であっても、又は時間を隔てて２回（又はそれ以上）の接種で実施されてもよい。接種間の期間は数年間の長さに及ぶことすらある。併用療法の場合、時間を隔てられた接種は、最初に結核に対する予防ワクチンが好ましくは投与され、次に、ＭＴＢ−Ｃの毒性株の細胞壁フラグメントを含む薬物（これは最初に接種されたワクチンの再刺激剤（ブースター）として作用する）が投与される。一態様では、１回量だけがヒト対象に投与され、この用量は好ましくは２５μｇのＦＣＭｔｂである。
【０１０２】
あるいは、補助療法においていくつかの異なる治療戦略又は治療タイプ又はケアが同時に使用される。本発明の特別な態様において、補助療法は、免疫系が障害されたヒト対象、例えばＨＩＶ患者、又はそれ以外に結核感染に罹りやすい及び／又はそのような療法を必要としている任意の個人に投与される。イソニアジドも補助療法で投与できる。さらに、補助療法は、障害された免疫系を治療するため、例えばＨＩＶ感染を治療するための何らかの薬物又は薬物の組合せの投与も含みうる。ＨＩＶ感染を治療するための典型的薬物は抗レトロウイルス薬で、非制限的概要を、“成人及び青年におけるＨＩＶ感染のための抗レトロウイルス療法  公衆衛生対策のための勧告：２０１０年版(Antiretroviral therapy for HIV infection in adults and adolescents   Recommendations for a public health approach: 2010 revision)”、著者：世界保健機関、ＩＳＢＮ：９７８９２４１５９９７６４に見出すことができる。このように、本発明は、ＨＩＶ陽性ヒト対象に対して、有効な結核予防、例えば予防接種を提供するというニーズのための解決策を提供している。
【０１０３】
個人がＨＩＶ陽性と見なされるか否か（すなわちＨＩＶ陰性）は、検査される個人の体液中におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、すなわち後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすウイルスの存在の検出を可能にする任意の試験によって検査できる。ここで、体液は、典型的には、血清、唾液、又は尿から選ばれるいずれか一つである。そのような試験は、抗体、抗原、又はＲＮＡを検出できる。適切なスクリーニング試験の概要は、Ｃｈｏｕら，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２００５  Ｊｕｌ  ５；１４３（１）：５５−７３に示されている。
【０１０４】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＨＩＶ陽性ヒト対象に投与された単回投与の２５μｇ  ＦＣＭｔｂは強力な応答を提供することを見出した。
【０１０５】
単回投与の２５μｇ  ＦＣＭｔｂは、ＨＩＶ陰性ヒト対象に投与した場合も強力であった。本発明者らは、これは、潜伏性結核を患っている対象において特に有用であることを示した（実施例１２）。従って、ＨＩＶ陽性又はＨＩＶ陰性の個人に投与される単回投与の２５μｇ  ＦＣＭｔｂは、本発明の好適な態様である。
【０１０６】
本発明は製造法も提供し、その方法は、上記態様のいずれか一つ又は複数によるリポソーム製剤、懸濁液、又は同じものを含む医薬組成物を得るのに適切であることを特徴とする。その一つの非制限的実施例を以下の実施例１１に示す。
【０１０７】
本発明はさらに、２０１０年にロンドンのＮＣＴＣに寄託されたＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６も提供する。この株は遺伝的多様性が低い。従って、ＮＣＴＣ  １３５３６のフラグメントを含む製剤は、その低い遺伝的多様性のために非常に高い再現性があるという利点を有する。
【０１０８】
発明の好適な実施様式
５０μｇ  ＦＣＭｔｂ／用量、又は２５μｇ  ＦＣＭｔｂ／用量又は５μｇ  ＦＣＭｔｂ／用量の特定用量を使用するのが好適である。例えば、用量が５０μｇ  ＦＣＭｔｂの場合、表１に示されている量／物質が製剤の１バイアル中に存在する。
【０１０９】
【表１】
2014501768.tif 000002
【０１１０】
２５μｇ／用量又は５μｇ／用量を適用する場合、他のバイアルを用意し、表１に示されているスクロース以外の全数値をそれぞれ２又は１０で割る。製剤（５０μｇ、２５μｇ及び５μｇ）中のスクロースの含有量は常に２０，０００μｇ単位／バイアルである。
【０１１１】
ホスファチジルコリン（９４．０％（ｗ／ｗ））で高富化された大豆レシチン（リポソーム形成剤）及びコール酸ナトリウム（張力活性剤）から製造されたリポソーム製剤は、製造中も再構成懸濁液中でも、薬物物質の高溶解度を保証するのに適切であることが示された。リポソーム製剤中のＦＣＭｔｂの安定性にとって一つの重要なパラメーターは、リポソームを構成する成分の割合である。ＦＣＭｔｂ／脂質成分の様々な比率を試験した結果、非常に良好な比率はおよそ０．０３：０．２：０．７（ＦＣＭｔｂ：コール酸ナトリウム：大豆レシチン、ｗ／ｗ／ｗ）であることが確立された。さらに、リポソーム形成は水性相中に塩が存在することによって増強されることも観察された。従って、塩化ナトリウムがこの特別な製剤中に含まれる。
【０１１２】
【表２】
2014501768.tif 000003
【０１１３】
好適な様式において、本発明は、本発明によるリポソーム製剤が表２の性質を有するように実施される。
【０１１４】
生存対象への投与の場合、バイアルは０．４ｍｌの注射用水で再構成でき、１６６．７μｇ／ｍｌのＦＣＭｔｂを含有する懸濁液となる。
【０１１５】
表３に、５０μｇ／用量における再構成後のバイアルあたりの各成分の濃度を示す。２５μｇ／用量又は５μｇ／用量を適用する場合、他のバイアルを使用し、表１で述べたように表３に示されているスクロース以外の全数値をそれぞれ２又は１０で割る。製剤（５０μｇ、２５μｇ及び５μｇ）中のスクロースの含有量は常に５０，０００ｕｇ／ｍＬである。
【０１１６】
【表３】
2014501768.tif 000004
【０１１７】
材料及び方法
標準物質
ａ）モノクローナル抗体：特異的モノクローナル抗体（抗−ＨＳＰ７０、抗−３８ｋＤａ、抗−Ａｇ８５Ｂ（ドイツ・ブラウンシュワイク(Braunschweig)のＬｉｏｎｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ社製））を、ＦＣＭｔｂバッチのタンパク質プロフィールの同定のために使用する。
【０１１８】
ｂ）アルブミン標準：タンパク質含有量の決定のために使用されるこの標準は、０．９％生理食塩水中ウシアルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）（保存剤：アジ化ナトリウム）で構成される（製造業者：Ｐｉｅｒｃｅ社）。
【０１１９】
ｃ）結核菌由来のトレハロース６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）標準：市販のＴＤＭ（Ｓｉｇｍａ社）をＦＣＭｔｂバッチのＴＤＭの同定のために使用する。
【０１２０】
ｄ）結核菌由来のミコール酸標準：市販のミコール酸（Ｓｉｇｍａ社）をＦＣＭｔｂバッチのミコール酸の同定のために使用する。
【０１２１】
ｅ）分子量マーカー：ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ予備染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）という名の市販分子量マーカーを使用する。
【０１２２】
パラメーターの測定
ａ）ｐＨ
ＦＣＭｔｂの再構成懸濁液（２０ｍｇ／ｍｌ）のｐＨは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．（欧州薬局方）２．２．３及びＵＳＰ（米国薬局方）＜７９１＞に従って電位差測定法によって測定する。
【０１２３】
ｂ）水分含有量
凍結乾燥ＦＣＭｔｂの残留水を測定するための試験は、電量式カール・フィッシャー(Coulometric Karl Fischer)装置を用い、Ｐｈ．Ｅｕｒ．，方法２．５．１２、及びＵＳＰ＜９２１＞水分の測定の一般的指示に従って実施される。
【０１２４】
ｃ）総タンパク質含有量の測定
ＦＣＭｔｂの総タンパク質含有量の測定試験は、市販キット（ＢＣＡキット、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用い、Ｐｈ．Ｅｕｒ．，方法２．５．３３，方法４（ビシンコニン酸又はＢＣＡアッセイ）及びＵＳＰ＜１０５７＞に従って実施される。
【０１２５】
ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるタンパク質プロフィールの同定
試験は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．，方法２．２．３１及びＵＳＰ＜７２６＞に従って実施される；ゲル中のタンパク質の検出は、適合クーマシー染色(adapted Coomassie staining)又は銀染色によって実施される。試験サンプル：精製水中に４０又は２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＦＣＭｔｂを再構成。標準液：分子量マーカー、精製抗原、ＦＣＭｔｂ標準品
【０１２６】
【表４】
2014501768.tif 000005
【０１２７】
クーマシー染色の場合、Ｇｅｌ−Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ試薬溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）を製造業者の使用説明書に従って使用する。銀染色の場合、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＰＲＯＴＳＩＬ１キットを製造業者の使用説明書に従って使用する。ウェスタンブロット分析の場合、タンパク質を当該技術分野で公知の標準法に従ってＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離し、次いでＰＶＤＦ膜に電気泳動的に転移し、特異的モノクローナル抗体を用いて免疫検出する。抗原−抗体相互作用は、化学発光反応を引き起こす抗抗体とのインキュベーションによって可視化される。Ｌｉｏｎｅｘ（ドイツ・ブラウンシュワイク）社製抗原（結核菌のＨＳＰ７０タンパク質（７０ｋＤａ）、結核菌の３８ｋＤａタンパク質、結核菌のＡｇ８５Ｂタンパク質（３０ｋＤａ）、及びＬｉｏｎｅｘ社製の特異的モノクローナル抗体、抗−ＨＳＰ７０、抗−３８ｋＤａ、及び抗−Ａｇ８５Ｂを使用する。
【０１２８】
ｅ）ミコール酸の同定
ＦＣＭｔｂ中のミコール酸は、一次元ＴＬＣにより、Ｐｈ．Ｅｕｒ．，方法２．２．２７に従って試験される。試験サンプル：凍結乾燥ＦＣＭｔｂ、４０ｍｇ。標準液：ミコール酸標準（Ｓｉｇｍａ社）。手順：
ａ）抽出工程：サンプルをクロロホルム：メタノール（１：１）で抽出し、その後一晩インキュベートする。上清画分を除去する。
【０１２９】
ｂ）ミコール酸のエステル化：２ｍＬのメタノール：トルエン：硫酸（３０：１５：１  ｖｏｌ／ｖｏｌ）を各管に加える。エステル化は一晩で達成される。次に、４ｍＬのｎ−ヘキサンを加える。それを窒素流下で乾燥させ、５００μｌのヘキサンで再懸濁させる。
【０１３０】
ｃ）ＴＬＣ：１０μｌの各サンプルをプレート（シリカゲル６０（２０×２０ｃｍ）（Ｍｅｒｃｋ社）の縁に平行な線上に適用する。クロマトグラフィー分離は、移動相（エチルエーテル(ethylic ether)：ｎ−ヘキサン（１５：８５、ｖｏｌ／ｖｏｌ））で飽和させたタンク中で３回実施する。次にプレートを空気中で乾燥させる。
【０１３１】
ｄ）ミコール酸は、リンモリブデン酸の９６°エタノール中溶液をプレートにスプレーし、１２０℃で１０分間加熱することによって現れる。
【０１３２】
ＦＣＭｔｂサンプル中のミコール酸は、ミコール酸の市販標準スポットとの比較によって決定される。結果は、評価されたミコール酸の定性的データとして表される（存在（陽性）／不在（陰性））。
【０１３３】
ｆ）トレハロース６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）の同定：試験サンプル：凍結乾燥ＦＣＭｔｂ、４０ｍｇ。標準液：ＴＤＭ標準（Ｓｉｇｍａ社）。手順：
（ｉ）抽出工程：サンプルをクロロホルム：メタノール（１：１；ｖｏｌ／ｖｏｌ）で抽出し、その後一晩インキュベートする。上清画分を窒素流下で乾燥させ、秤量する。最後に、乾燥サンプルをクロロホルム中に４０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁させる。
【０１３４】
（ii）ＴＬＣ：１０μｌの各サンプルをプレート（シリカゲル６０（２０×２０ｃｍ）（Ｍｅｒｃｋ社）の縁に平行な線上に適用する。クロマトグラフィー分離は、移動相（クロロホルム：メタノール：水（６０：１２：１；ｖｏｌ／ｖｏｌ））で飽和させたタンク中で実施する。次にプレートを空気中で乾燥させる。
【０１３５】
（iii）検出：ＴＤＭは、硫酸中アントロン(antrone)１％溶液をプレートにスプレーし、１２０℃で５分間加熱することによって現れる。
【０１３６】
（iv）同定：ＦＣＭｔｂサンプル中のＴＤＭは、標準スポットの生成用に使用される市販ＴＤＭとの比較によって決定される。結果は、評価されたＴＤＭの定性的データ、すなわち存在（陽性）／不在（陰性）として表される。
【０１３７】
ｇ）リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の同定：ＬＡＭのウェスタンブロット分析の場合、化合物を標準法に従ってＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離し、次いでニトロセルロース膜に電気泳動的に転移し、特異抗体ＣＳ３５を用いて免疫検出する。抗原−抗体相互作用は、蛍光反応を引き起こす抗抗体（ＩｇＧヤギ抗マウス  ＩＲ染料８００ＣＷ）とのインキュベーションによって可視化される。
【０１３８】
ｈ）無菌性
無菌であることを必要とするすべての工程は、当業者の知識に従って無菌条件下で実施される。これは、同じことを必要とする任意の所与の工程について無菌性が明記されていない場合も適用される。無菌試験は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．６．１（ＵＳＰ＜７１＞）に規定の通りに評価される。
【０１３９】
ｉ）マイコバクテリアの不活化
マイコバクテリアの不活化は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．６．２に従って評価される。
【０１４０】
ｊ）細菌性エンドトキシン
細菌性エンドトキシンの試験（ＬＡＬ試験、カブトガニ変形細胞溶解物（カブトガニ血球抽出物）(Limulus Amoebocyte Lysate)）は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．，方法２．６．１４の一般的指示に従い、方法Ｄ（発色速度論的方法(Chromogenic kinetic method)）ならびにＵＳＰ＜８５＞に従って実施される。
【０１４１】
桿菌のフラグメント化
桿菌のフラグメント化を選択すると、細胞抗原、特に細胞壁抗原の最適な提示を可能にすると考えられる。ＦＣＭｔｂのフラグメント化は、動的光散乱法（以下に記載の通り）及びレーザー回折方法論の両方によって測定される。
【０１４２】
レーザー回折は、０．０４μｍ〜２０００μｍの範囲のフラグメント化の測定を可能にする。アッセイは、スペイン・バルセロナ大学のＳｅｒｖｉｃｉｏｓ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ−Ｔｅｃｎｉｃｏｓで実施される。装置：ユニバーサル・リキッド・モジュール（ＵＬＭ）を備えたＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  １３３２０。溶媒：精製水／鉱油。結果：粒子直径（０．０４μｍ〜２０００μｍ）に対する粒子数の相対頻度（％）を表すヒストグラムとしてプロットされる。
【０１４３】
ｚ−平均粒径及び多分散指数の決定
本文書に記載の平均粒径は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定される。これはストークス−アインシュタイン式に定義された粒子のブラウン運動の物理的概念に基づいている。
【０１４４】
ｄ（Ｈ）＝（κＴ）／（３πηＤ）
式中、
ｄ（Ｈ）＝流体力学直径
Ｄ＝移動拡散係数
κ＝ボルツマン定数
Ｔ＝絶対温度
η＝粘度
何らかの特定理論に限定したくはないが、ストークス−アインシュタイン式は、液体媒体中に懸濁された粒子は絶えずランダムな運動をしており、速度はそれらのサイズに依存し、粒子が大きいほどブラウン運動は遅くなることを確立している。
【０１４５】
動的光散乱測定では、測定される粒子を含有するサンプルに単色光源、好ましくはレーザーを照射し、散乱光の強度が時間と共にいかに変動するかを相関関数にして分析する。例えば、大きな粒子を測定する場合、それらは動きが遅いので、散乱光強度のゆらぎは緩やかで、相関の減衰に時間がかかる。これに対し、小さな粒子を測定する場合、それらは動きが速いので、散乱光の強度は急激に変動し、信号の相関はより急速に減衰する。
【０１４６】
本発明によれば、粒子は好ましくは下記の装置を用いて測定される。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ナノ  ｚｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）、精製水／鉱油を溶媒として使用。
それと異なる指示がない限り、装置は、製造業者の使用説明書に従って使用され、調整及び校正も、該当する場合、製造業者の使用説明書に従う。
【０１４７】
サイズは、様々なアルゴリズムを用いて相関関数から計算される。本例では、ＩＳＯ１３３２１のパート８に定義されている‘キュムラント解析(cumulants analysis)’を適用する。相関関数は単一指数曲線となり、以下のパラメーターの計算が可能になる。
【０１４８】
−粒子分布の平均サイズ、又はｚ−平均直径。この平均サイズは強度平均である。
【０１４９】
−多分散指数（ｐｄｉ）、すなわち粒径分布の幅に相当する。
【０１５０】
結果は、典型的には、粒子直径（１ｎｍ〜３μｍの範囲を含む任意の直径でありうる）に対する粒子数の相対頻度（％）を表すヒストグラムとしてプロットされる。
【０１５１】
効力試験
特定病原体未感染、６〜７週齢、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ（スペイン）から入手する。試験サンプル：表３の製剤及びプラセボ（活性成分を含まないワクチン製剤）。
【０１５２】
ａ）ワクチン単回投与のインビボ結核菌感染マウスモデル：実験計画は次の通り：第０日：マウスの下腹部にＭｔｂ株Ｈ３７Ｒｖ  Ｐａｓｔｅｕｒ（４×１０４  ＣＦＵ）の皮下感染。第１４日：リファペンチン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びイソニアジド（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回経口投与による動物の化学予防的処置。これにより１週間の抗生物質効果がもたらされる。第２１日：頚部の皮下にワクチン／プラセボ及び／又はＨ２Ｏの単回投与によるワクチン接種。すべてのサンプルを入手し、個々のマウスについて分析する。各実験は、感染マウス＋プラセボの基本群及び感染マウス＋ワクチン接種の実験群を含む。各群は６〜７匹の動物からなり、実験は二重に実施される。第２８日：動物をイソフルオラン(isofluorane)で麻酔する。
【０１５３】
ｂ）ワクチン２回投与のインビボ結核菌感染マウスモデル：実験計画は次の通り：第０日：マウスの下腹部にＭｔｂ株Ｈ３７Ｒｖ  Ｐａｓｔｅｕｒ（４×１０４  ＣＦＵ）の皮下感染。第１４日：リファペンチン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びイソニアジド（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回経口投与による動物の化学予防的処置。これにより１週間の抗生物質効果がもたらされる。第２１日：頚部の皮下に第１回のワクチン／プラセボ及び／又はＨ２Ｏ接種。第３６日：頚部の皮下に第２回のワクチン／プラセボ及び／又はＨ２Ｏ接種。すべてのサンプルを入手し、個々のマウスについて分析する。各実験は、感染マウス＋プラセボの基本群及び感染マウス＋ワクチン接種の実験群を含む。各群は６〜７匹の動物からなり、実験は二重に実施される。第４２日：動物をイソフルオランで麻酔する。
【０１５４】
上記ａ）及びｂ）とも、犠死後、細胞免疫応答を調べるために、ＥＬＩＳＰＯＴによるインターフェロンγスポット形成単位（ＳＦＵ）パラメーターのエクスビボ分析を脾臓細胞懸濁液を用いて実施する。
【０１５５】
結核菌健常マウスモデルにおける免疫原性効力の決定。特定病原体未感染、６〜７週齢、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ（スペイン）から入手する。ワクチン２回投与のインビボ結核菌健常マウスモデル：実験計画は次の通り：第０日：頚部の皮下に本発明を実施するための好適な様式に従って第１回のワクチン、又はプラセボ及び／又はＨ２Ｏ接種。第２１日：頚部の皮下に第２回のワクチン／プラセボ及び／又はＨ２Ｏ接種。すべてのサンプルを入手し、個々のマウスについて分析する。各実験は、健常マウス＋プラセボの基本群及び健常マウス＋ワクチン接種の実験群を含む。第２８日：動物をイソフルオランで麻酔する。犠死後、体液性免疫応答を調べるために、ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗体の分析をマウス血清を用いて実施する。
【０１５６】
結核の診断
結核の診断法は当業者には周知である。クォンティフェロン試験及びＴＳＴは、信頼性のある結果を出すことで知られており、本発明の製品による療法を受けさせることの適切性について対象を分類するために、単独で又は組み合わせて使用できる。ＱＦＴとしても知られるクォンティフェロン(QuantiFERON)は、オーストリア・ビクトリア州・メルボルン・チャドストーンのＣｅｌｌｅｓｔｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社製の、結核感染又は潜伏性結核用の市販試験である。ＱＦＴは、結核診断に使用されるインターフェロンγ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）である。これは製造業者の使用説明書に従って使用される。マントー(Mantoux)試験（マントー・スクリーニング試験、ツベルクリン感受性試験（ＴＳＴ試験）、ピルケ(Pirquet)試験、又は精製ツベルクリン(Purified Protein Derivative)のためのＰＰＤ試験としても知られる）は、結核の診断ツールである。両試験の概要は、Ｆｒａｎｋｅｎら，Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，Ａｐｒｉｌ；１４（４）：４７７-４８０に見出すことができる。
【実施例】
【０１５７】
以下の実施例は、当業者に、本発明のいくつかの特定態様の実行可能な様式及び説明を提供するために示される。これらの実施例は説明を目的としたものであって、本発明の範囲の制限を意図したものでは決してない。
【０１５８】
実施例１：結核菌株ＮＣＴＣ  １３５３６の単離
ＦＣＭｔｂを製造するための出発材料は、スペインのバルセロナで肺結核と診断された免疫応答性(immunocompetent)患者から単離された結核菌株であるＮＣＴＣ  １３５３６株（同義的に５１１又は結核菌ＮＣＴＣ  １３５３６とも呼ばれる）の播種物(inoculum)である。これは、ブダペスト条約による公式寄託機関であるロンドンのＮＣＴＣに２０１０年に寄託されている。この株はさらに、スペイン・バルセロナのサン・パウ病院の微生物学部門(Service of Microbiology of the Hospital de Sant Pau)の株コレクションによっても寄託されている。
【０１５９】
原株の二つの継代がそれぞれ１９９５年及び１９９６年に実施された。ＭＳＬ  ＰＢ＃１は、結核菌ＮＣＴＣ  １３５３６の原株の第二の継代に相当する。これは、１９９６年１０月に実施され、１００バイアル（３ｍｌの無菌ガラスバイアル）を得て−７０±５℃で貯蔵された。株は、当該技術分野における標準法により、低い遺伝的多様性を有していることが確認された。
【０１６０】
実施例２：ＭＴＢ−Ｃ細胞を製造するための上流工程
この工程のフローチャートを図１に示す。ＦＣＭｔｂを製造するための出発材料は、結核菌株ＮＣＴＣ  １３５３６の播種物である（実施例１）。この出発材料の連続供給を確保するために、好ましくはシードロット・システム(seed lot system)を使用する。従って、マスターシードロット（ＭＳＬ）から誘導されたワーキングシードロット（ＷＳＬ）を使用してＦＣＭｔｂを製造する。結核菌ＮＣＴＣ  １３５３６（実施例１）を３〜５週間、ローウェンスタイン−ジェンセン(Lowenstein-Jensen)培地で培養する。次に、細菌増殖物をプロスカウアー−ベック培地中、３７±２℃、１００±５ｒｐｍで撹拌しながら継代培養する。最大細菌濃度（目視検査による）に達したら、プロスカウアー−ベック培地での継代培養を開始し、インキュベートする。類似の細菌濃度に達したら小分量を採取する。生菌数は、３７±２℃で３〜４週間のインキュベーション後、ミドルブルック(Middlebrook)寒天培地で得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数によって決定する。細菌数は２〜５×１０７ＣＦＵ／ｍｌでなければならない。
【０１６１】
（１）結核菌の培養
ＦＣＭｔｂの製造は、７Ｈ１１寒天プレートに０．２ｍｌのＷＳＬを播種し、３７±１℃で１５±２日間インキュベートすることによって始まる。次いで、コロニーを少量のガラスビーズ入り管に移す。混合後、約５ｍｌの注射用水（ＷＦＩ）を加えて細菌懸濁液を得る。この時点で、生菌数カウント及び無菌試験を実施する。約１００のミドルブルック７Ｈ１１寒天培地に、細菌懸濁液に浸した綿棒を用いて結核菌を播種し、集密的（コンフルエント）培養物を得る。プレートを３７±１℃で２１±２日間インキュベートする。
【０１６２】
工程内管理としての無菌試験は以下のように実施する：
無菌試験の目的は、真菌やマイコバクテリア以外の細菌が存在しないことを確かめることである。試験は、無菌試験のためのＰｈ．Ｅｕｒ  ２．６．１に記載の条件に従い、直接播種によって実施する。試験されるサンプルは無菌でなければならない。培地７Ｈ１１を７Ｈ１０の代わりに使用する（Ｐｈ．Ｅｕｒ  ２．６．２に記載の通り）。７Ｈ１１は、結核菌の株の増殖を増強するために、培地７Ｈ１０を基にして、カゼインの膵液消化物１グラムを加えたものである。
【０１６３】
（２）結核菌の収穫と粗抽出物の凍結
インキュベーション期間後、細菌培養物の純度は寒天プレートの目視検査と無菌試験の実施によって管理される。次に、細菌増殖物を寒天プレートから採取し、無菌管に移す。得られた粗抽出物を秤量する（２０〜２２ｇ）。混合物を−８０℃±５℃に保つ。
【０１６４】
実施例３：粗抽出物から得られたリポソームを製造するための下流工程
この工程のフローチャートを図２に示す。
【０１６５】
（３）細胞のフラグメント化及び脱脂
凍結粗抽出物（実施例２）を３７±１℃で解凍した後、４％（ｗ／ｗ）のトリトン−Ｘ１１４入り無菌ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）を４℃で加える。混合後、無菌シリカ／ジルコニアビーズ入り無菌ポリカーボネート容器に移す。次に、細胞のフラグメント化をビードビーター(Beadbeater)内で下記フラグメント化法の適用により実施する。すなわち、３サイクルで、各サイクルは５周期のオン／オフ＋１０分間の休止からなる。工程が終了したら、細胞フラグメント化画分を、４％トリトン−Ｘ１１４入り無菌ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７〜７．５）中でのその後の洗浄（振とうと沈降の繰り返し）によってビーズから分離する。次に、細胞フラグメント化画分の洗浄懸濁液の一定分量をｐＨ管理のために採取し、最終遠心分離を８４５ｇ、４℃で３０分間進行させる。
細胞質性画分を除去し、細胞フラグメントに富む懸濁液を得るために、高速遠心分離を２回、２００００ｇ、約６０分間、４℃で実施する。最初の遠心分離後、帯黄色上清（可溶性タンパク質及び脂質に富む）を廃棄し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、上記と同じ条件下でさらに遠心分離する。その後、廃棄上清の外観は無色透明でなければならない。最後に、得られたペレットを最終体積５０〜６０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁する（ＦＣＭｔｂ懸濁液）。
【０１６６】
（４）低温殺菌
次に、ＦＣＭｔｂ懸濁液を６５±２℃で６０分間低温殺菌する。低温殺菌が終了したら、低温殺菌ＦＣＭｔｂのｐＨをリトマス紙で測定する。ｐＨ６．５〜７．５の範囲であれば容認可能と考えられる。無菌及び発熱物質除去バイアルに０．５ｍｌの生成物懸濁液を充填し、無菌性に関するＩＰＣ（工程内管理）及びマイコバクテリアの不活化を実施する。最後に、充填バイアルを−８０±５℃で凍結する。材料を低温殺菌に付したら、未処理材料から物理的に分離される。すなわち、低温殺菌前に使用される空間は、その後の充填工程中に使用される空間から明らかに分離される。
【０１６７】
（５）凍結乾燥
次に、凍結された生成物を含有するすべてのバイアルを約−４５℃〜３０℃の温度及び０．３１０ｍｂａｒで約１８時間凍結乾燥する（バイアルあたり０．５ｍｌの体積）。無菌技術を使用し、Ｎ２雰囲気下で、バイアルに栓をし、標識する。包装された薬物物質はその後−２０±５℃で１２ヶ月間まで貯蔵される。
【０１６８】
実施例４：タンパク質の特性分析
図３に、タンパク質プロフィールに関する特性分析戦略の概観を示す。
【０１６９】
文献を基に（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．，１９９７，Ｓｃａｎｄ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；４５（２）：１１５−３１；Ｇｅｉｓｅｌら，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１７４（８）：５００７−１５；Ｓｔｅｗａｒｔら  ２００５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７３（１０）：６８３１−７．，Ｗａｎｇら，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６６（２）：３７５−８１）、６個のタンパク質バンドをタンパク質プロフィール評価の代表として選択した。すなわち、ＨＳＰ７０タンパク質（Ｒｖ０３５０）、３８ｋＤａタンパク質（Ｒｖ０９３４）、（Ｒｖ１８６６ｃ）、１９ｋＤａタンパク質（Ｒｖ３７６３）、ＣＦＰ１０タンパク質（Ｒｖ３８７４）、及びＥＳＡＴ−６タンパク質（Ｒｖ３８７５）。
【０１７０】
Ａ．総タンパク質含有量の測定：ＦＣＭｔｂ中の総タンパク質レベルはビシンコニン酸（ＢＣＡ）方法論によって定量化される。総タンパク質は、ＦＣＭｔｂ含有量の約１０％（ｗ／ｗ）に相当する。標準品ＦＣＭｔｂ−０４２９−１６及びＦＣＭｔｂ−５２．１は、それぞれ１６７μｇタンパク質／ｍｇ  ＦＣＭｔｂ及び１１５μｇタンパク質／ｍｇ  ＦＣＭｔｂを含有する。
【０１７１】
Ｂ．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるタンパク質プロフィールの同定：薬物物質ＦＣＭｔｂのタンパク質プロフィールを、ＥＳＡＴ６（６ｋＤａ）（７）；ＣＦＰ１０（１０ｋＤａ）（６）；Ａｇ８５Ｂ（３０ｋＤａ）（１）；３８ｋＤａ（２）；ＨＳＰ７０（７０ｋＤａ）（４）に相当する結核菌由来の基準抗原、ならびに分子量マーカーＭＷ（５）との比較によって決定した。これらを図４に示す。薬物物質ＦＣＭｔｂのタンパク質プロフィールの決定及びバンドの同定（およそ７０ｋＤａ、３８ｋＤａ、３０ｋＤａ、１０ｋＤａ及び６ｋＤａ）はクーマシー染色によって実施される。１９ｋＤａバンド（リポポリペプチド）の同定は銀染色によって実施される。
【０１７２】
Ｃ．特異的モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによるタンパク質プロフィールの同定：薬物物質ＦＣＭｔｂのタンパク質プロフィールを、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、すなわち抗−ＨＳＰ７０（７０ｋＤａ、図５ｃ）、抗−３８ｋＤａ（図５ｄ）、抗−Ａｇ８５Ｂ（３０ｋＤａ、図５ｅ）によるウェスタンブロット分析を用いて得られたパターンにより決定する。
【０１７３】
ＦＣＭｔｂ−５２．１は、本発明を実施するための好適な様式によるＦＣＭｔｂの基準バッチである。
【０１７４】
実施例５：脂質の特性分析
ＦＣＭｔｂの脂質プロフィールの特性分析は、クロロホルム：メタノール（１：１）抽出に基づく分画工程からなる。これらの研究で実施される分画工程は、Ｄｅｌｍａｓら，１９９７，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７（６），８１１−７に記載の手順に基づいている。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が、ＦＣＭｔｂ中に存在する脂質及び糖脂質の含有量を分析するために使用される方法である。具体的には、ポリアシルトレハロース（ＰＴ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、ジアシルトレハロース（ＤＡＴ）、ホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭｓ）及びその他のリン脂質、ならびにフチオセロールジミコセロシン酸（ＰＤＩＭ）及びミコール酸が、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、基準株Ｈ３７ｒｖ及びＮＣＴＣ  １３５３６でも、様々なＦＣＭｔｂバッチでも同定されている。図７ａ参照。トレハロース６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）の含有量は、上清のＴＬＣによって分析される。ミコール酸の測定はＴＬＣ法に従って沈殿物で実施される。ＭＴＢ−Ｃの脂質プロフィールに関する定量的データは知られていないが、この研究で確立された定性的な脂質プロフィールは現在の科学知識と一致しており、これまでに知られている免疫原性脂質の標準的な特性分析が可能である。ＦＣＭｔｂは、結核菌株ＮＣＴＣ  １３５３６及びＨ３７Ｒｖの全細胞脂質画分及びＴＤＭ市販標準と比較されている（図７ａ及び７ｂ参照）。概して、脂質含有量は、本発明によるＦＣＭｔｂを含むリポソームの様々なバッチで一致していることが示された。図７ｄはＬＡＭの同定を示す。
【０１７５】
実施例６：フラグメント化された細胞材料の特性分析
二つの方法論を用いた予備的結果から、ＦＣＭｔｂのフラグメントサイズは主に１μｍ未満（９９％  ＜１μｍ）であることが示されている。これは、ＦＣＭｔｂの電子顕微鏡法によって裏付けられている。すなわち、フラグメントサイズは主に１００〜３００ｎｍの範囲である。
【０１７６】
フェノール／クロロホルム混合物による抽出後の残留ＤＮＡのレベルを２６０ｎｍにおける吸光度によって調べた（検出限界：０．２μｇ  ＤＮＡ／ｍｇ  ＦＣＭｔｂ）。これまでに得られた典型的な結果は１５μｇ  ＤＮＡ／ｍｇ  ＦＣＭｔｂ未満である。
【０１７７】
薬物物質の製造工程の一貫性（ばらつきのなさ）は、様々なＦＣＭｔｂバッチで再現性がある脂質及びタンパク質プロフィールによって示されている。
【０１７８】
実施例７：マウスの免疫感作及び生物活性の可視化
ＦＣＭｔｂのタンパク質バンドとマウスの免疫血清(immunoserum)との相互作用：ウェスタンブロット方法論を用いて、本発明によるリポソーム製剤を基にしたワクチンを２回接種された感染マウスから得た血清中に存在するＩｇＧ抗体と相互作用するＦＣＭｔｂタンパク質バンドを可視化することは可能であった。これは、生物活性の指標と考えられる（図６）。
【０１７９】
実施例８：ＦＣＭｔｂを含むリポソーム製剤のインビボ活性
リポソームなしのＦＣＭｔｂ（注射用水、ＷＦＩで再構成された）及び本発明を実施するための最良の様式によるリポソーム製剤（５％スクロース、上記参照）中のＦＣＭｔｂの免疫原性効力を評価することによって、ワクチンの生物活性をインビボモデルで研究する（図８）。これらの結果は、スクロース入りリポソーム製剤の利益を示している。
【０１８０】
リポソームの凝集又は融合状態は、ワクチンの生物活性に重大な影響を及ぼすことが実証されているパラメーターである。そこで、本発明の研究者らは、ワクチンの製造中及びバッチ出荷時の粒径及び多分散指数の徹底的管理を実施している。
【０１８１】
実施例９：スクロースの効果
初期の試験で、下記賦形剤の一つ（ａ）１．５％グリシン及び（ｂ）５％スクロースをＭＴＢ−Ｃ株ＮＣＴＣ  １３５３６のフラグメントを含むリポソーム製剤にそれぞれ任意に配合した。その後、両製剤に関連する物理化学的性質及び生物活性に関する比較評価を実施する。
【０１８２】
凍結乾燥リポソーム組成物の再構成後、及び現行のバッチ出荷仕様パラメーターに従った試験後、測定によって得られた結果を表５に示す。
【０１８３】
【表５】
2014501768.tif 000006
【０１８４】
本研究の研究者らは、驚くべきことに、５％スクロース製剤は、水分含有量又は再構成までの時間など、それぞれ良好な物理化学的結果の利益を提供することを見出した。しかしながら、最も決定的な事実は、他の二つの製剤と比較した場合にスクロース含有製剤で示されたリポソーム凝集（粒径、ｚ−平均）の重要な低減である。動的光散乱による分析によれば、スクロース含有リポソームのｚ−平均は７５±２０ｎｍ（多分散指数  ≦０．３５０）であることが示された。スクロース含有リポソーム製剤の凍結割断標本の電子顕微鏡法は、４０〜１００ｎｍのサイズを有する多重層及び単層リポソームの混合物であることを示している（図９）。
【０１８５】
５％スクロース製剤に関するこの改良されたパラメーターと、観察された少ない水分含有量（≦２％）のために、この製剤には改良された安定性の結果が予想される。これは実際その通りである。本研究の研究者らの、１．５％グリシンを用いて製剤化され、室温で３ヶ月間貯蔵された実験バッチのデータは、ＰＰＤの生物活性（免疫原性効力）の劇的喪失を示していた。これに対し、５％スクロース含有製剤を室温で３ヶ月間貯蔵後に試験した場合、ＰＰＤの生物活性は基本的に不変のままである。従って、スクロースは生物活性の良好な維持という利益も提供する。
【０１８６】
実施例１０：スクロース含有製剤の生物学的性質
表３による製剤を生物学的研究のために使用した。結核菌感染マウスモデルにおいて、本発明を実施するための好適な様式によるワクチンの接種（単回接種）によって引き起こされた細胞免疫応答は、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定できる。結果を表６に示す。
【０１８７】
【表６】
2014501768.tif 000007
【０１８８】
リポソーム製剤を基にしたワクチンの接種は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて応答レベルを測定した場合、感染動物の基準値と比べて、インビボにおける細胞免疫応答の顕著な増大をもたらす。基準応答に対する比率はＰＰＤの場合４〜８倍、Ａｇ８５Ｂの場合８〜１４倍である。リポソーム製剤を基にしたワクチンは、多抗原性の体液性応答も誘導できるので、特に感染の高蔓延がある場合、保護効果を発揮する（Ｇｕｉｒａｄｏら，２００６，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．８，１２５２−１２５９）。
【０１８９】
スクロースなしの製剤とスクロースを主賦形剤として含有する製剤で得られた免疫原性効力のデータ間の比較を具体的に実施した。得られた結果は、単回ワクチン接種モデルにおいて、スクロース入り製剤の５０μｇ  ＦＣＭｔｂ用量によって発揮された細胞免疫応答は、スクロースなしの製剤の同一用量で得られたそれより約１．５倍高いことを明らかに示している。これらの細胞免疫応答のレベルの高さは二つの効力試験で得られている。すなわち、バッチ出荷仕様について実施された試験（単回ワクチン接種モデル）と同等性／同質性評価(comparability exercise)のために追加された試験（２回ワクチン接種モデル）の二つである。さらに、どちらの効力試験でも、スクロース入り製剤の５０μｇ  ＦＣＭｔｂ用量によって発揮された細胞免疫応答は、スクロースなし製剤の２００μｇ  ＦＣＭｔｂで得られたものと同等のレベルを示す。凍結乾燥リポソーム組成物の再構成後に測定された結果を図１０ａ及び１０ｂに示す。スクロース含有製剤はリポソーム凝集の顕著な低減を示す。これが免疫原性の増大の理由と考えられている。新規製剤の５０μｇ用量で達成された細胞免疫応答は、スクロースなし製剤で得られた２００μｇの用量で見られたそれにほぼ匹敵する。当該技術分野では、細胞応答は関連応答と見なされるということが知られている（Ｎｏｒｔｈ  ＲＪ，Ｊｕｎｇ  ＹＪ（２００４）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５９９−６２３）。
【０１９０】
実施例１１：凍結乾燥リポソーム製剤の製造法
本発明によるリポソーム製剤を含む医薬組成物の製造法の一つの態様を図１１ａ及び１１ｂに示す。手短に言うと、下記工程１〜５を含む。
【０１９１】
（１）ＬＣＳバルク成分の製造
ＬＣＳバルクの大豆レシチンをエタノールに溶解し（１：１；ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウムを水に溶解する（１：５；ｗ／ｗ）。溶液をろ過滅菌する。ナトリウムレシチン溶液とコール酸ナトリウム溶液の混合後、凍結乾燥ＦＣＭｔｂ（実施例１）を撹拌しながら加える。成分の比率は、０．０３：０．２：０．７（ＦＣＭｔｂ：コール酸ナトリウム：大豆レシチン；ｗ／ｗ／ｗ）。
【０１９２】
（２）ＬＣＳバルク製造
水性相を滅菌ステンレススチールミキサーに移す。大豆レシチン、コール酸ナトリウム、及びＦＣＭｔｂを含有する（１）の脂質相を０．７：０．３の比率（水性相：脂質層、ｗ／ｗ）で加える。相をホモジナイズ及びリポソーム形成のために２２００ｒａｄｓ／ｓで３分間混合する。ホモジナイズ後、バルクＬＣＳを別の容器に移し、少なくとも５分間放置する。粒径に関するＩＰＣをＬＣＳバルクに対して実施する。
【０１９３】
（３）ＬＣＳバルクの希釈、リポソーム懸濁液の最終製剤
スクロースの１０％（ｗ／ｗ）溶液を準備し、滅菌する。スクロース溶液を水及びＬＣＳバルクと適切な割合で混合し、５％スクロース溶液中２１ｍｇ  ＬＣＳ／ｍｌで構成される最終リポソーム懸濁液（ＬＳ）のバルクを得る。ｐＨ、無菌性、及び粒径は工程内管理として試験する。
【０１９４】
（４）充填
バイアルに０．４ｍｌのＬＳを充填し（連続撹拌下で）、凍結及び凍結乾燥のために部分的に閉じる。
【０１９５】
（５）凍結乾燥、包装、及び標識
バイアルは凍結乾燥が進行するまで−８０℃±５℃で凍結される。凍結乾燥工程は、−４５℃〜２５℃の範囲の温度及び０．１５０ｍｂａｒで実施される。この工程を２４時間続ける。凍結乾燥終了時、バイアルをＮ２雰囲気下で完全に栓をし、被包化し、標識して５℃±３℃で貯蔵する。
【０１９６】
実施例１２：ＬＴＢＩに対する補助療法は２５μｇのＦＣＭｔｂの単回注射しか必要としない
潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する（ＴＳＴ＋及びクォンティフェロン＋）９６人のＨＩＶ陽性（ＨＩＶ＋）及びＨＩＶ陰性（ＨＩＶ−）対象において、３種の用量のＦＣＭｔｂ（５、２５、５０μｇ、それぞれ本発明を実施するための好適な様式に記載の通りに製造された）とプラセボを評価するために第II相二重盲検無作為化臨床試験を設定した。対象は、１ヶ月のイソニアジド処置を受けた後、群(arm)当たりｎ＝１２のグループに無作為に割り振られた。対象に、イソニアジド化学療法直後及び４週間隔ててＦＣＭｔｂ（５、２５、５０μｇ、それぞれ本発明を実施するための好適な様式に記載の通りに製造された）を２回接種した。
【０１９７】
免疫学的プロフィール：ＦＣＭｔｂ（５、２５、５０μｇ、それぞれ本発明を実施するための好適な様式に記載の通りに製造された）は、すべての用量において刺激された分泌抗原（ＥＳＡＴ−６、Ａｇ８５Ｂ）及び構造抗原（１６ｋＤａ、３８ｋＤａ）に対し、釣鐘状の多抗原性応答を発揮した（図１２及び１３）。ＦＣＭｔｂ（５、２５、５０μｇ、それぞれ本発明を実施するための好適な様式に記載の通りに製造された）は、高用量で予防効果に対応する長期メモリー応答（ＷＨＯ試験）も発揮した。驚くべきことに、世界的に免疫応答はＨＩＶ＋よりＨＩＶ−においてより強力であるが、２５μｇのＦＣＭｔｂ（５、２５、５０μｇ、それぞれ本発明を実施するための好適な様式に記載の通りに製造された）の単回接種はどちらの集団でも最良の免疫応答を発揮した（図１２及び１３）。
【０１９８】
結論：２５μｇの単回接種は、ＨＩＶ陰性及びＨＩＶ陽性対象におけるＬＴＢＩに対する補助療法の最良の選択である。
【０１９９】
【数１】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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