(57)【要約】  同時または連続発酵の発酵抽出物を含有する局所組成物が、ここで開示される。皮膚に局所適用する場合、本発明の組成物は、皮膚細胞におけるヒアルロン酸、ＣＤ４４およびカスパーゼ１４タンパク質の産生を刺激するのに有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の生物の同時または連続発酵から取り出される発酵抽出物を含む、局所組成物。
【請求項２】
前記発酵抽出物が、第１の生物の代謝産物の存在下で増殖する第２の生物の代謝産物を含む、請求項１に記載の局所組成物。
【請求項３】
前記第２の生物の前記代謝産物が、前記第１の生物の前記代謝産物と同時に増殖する、請求項２に記載の局所組成物。
【請求項４】
前記発酵抽出物において殺菌または制生効果を提供するのに十分な量の防腐剤および皮膚科学的に許容される媒体をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の局所組成物。
【請求項５】
各生物が、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍｅｌｌａ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ、Ｘｙｌａｒｉａ、Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ、Ｈｅｌｏｔｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｔｕｌｏｓｔｏｍａ、Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ、Ｔｒｕｎｃｏｃｏｌｕｍｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｄｉｃｔｏｓｔｙｌｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉａ、Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ａｌｂｕｇｏ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｃｒａｔｅｒｅｌｌｕｓ、Ｐｔｅｒｙｇｅｌｌｕｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ、Ｔｕｂｅｒ、Ｈｙｄｎｕｍ、Ｌｅｃａｎｏｒａ、Ｒｏｃｃｅｌｌａ、Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａ、Ｕｓｎｅａ、Ｅｖｅｒｎｉａ、Ｒａｍａｌｉｎａ、Ａｌｅｃｔｏｒｉａ、Ｃｌａｄｏｎｉａ、Ｐａｒｍｅｌｉａ、Ｃｅｔｒａｒｉａ、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ｍａｒａｓｍｉｕｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｐｈｏｌｉｏｔａ、Ｒｕｓｓｕｌａ、Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ、Ｅｎｔｏｌｏｍａ、Ｌｅｐｉｏｔａｃｅａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ、Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ、Ｖｏｌｖａｒｉａ、Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｐｅｚｉｚａ、Ｐｌｅｃｔａｎｉａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ、Ｗｙｎｎｅａ、Ｈｅｌｖｅｌｌａ、Ｇｙｒｏｍｉｔｒａ、Ｐｈａｌｌａｌｅｓ、Ｄｉｃｔｙｏｐｈｅｒａ、Ｍｕｔｉｎｕｓ、Ｃｌａｔｈｒｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ、Ｃａｌｖａｔｉａ、Ｇｅａｓｔｒｕｍ、Ｒａｄｉｉｇｅｒａ、Ａｓｔｒｅｕｓ、Ｎｉｄｕｌａｒｉａ、Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ、Ｍａｃｏｗａｎｉｔｅｓ、Ｇａｓｔｒｏｂｏｌｅｔｕｓ、Ａｌｂａｔｒｅｌｌｕｓ、Ｎｅｏｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｎｉｇｒｏｐｏｒｕｓ、Ｏｌｉｇｏｐｏｒｕｓ、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ、Ｆｉｓｔｕｌｉｎａ、Ｆｏｍｅｓ、Ｂｏｌｅｔｕｓ、Ｆｕｓｃｏｂｏｌｅｔｉｎｕｓ、Ｌｅｃｃｉｎｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｕｓ、Ｓｕｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｏｂｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ、Ｔｒｅｍｅｌｌａ、Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｅｐｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｈｙｇｒｏｃｙｂｅ、Ｈｙｇｒｏｐｈｏｒｕｓ、Ｈｙｇｒｏｔｒａｍａ、Ｎｅｏｈｙｇｒｏｐｈｏｒｕｓ、Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｏｎｉｌｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ、Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｉｎｉａ、Ｏｚｏｎｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｇｅｏｇｌｏｓｓｕｍ、またはＡｒｍｉｌｌａｒｉａ；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ、Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ、Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ；Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ、Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍａｓｐｏｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｏｏｋｌａｗｎｉａ、Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｈａｒｐｅａ、Ａｍｂｉｓｐｏｒａ、Ａｃａｕｌｏｓｐｏｒａ、Ｅｎｔｈｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ、Ａｂｏｒｔｉｐｏｒｕｓ、Ａｍｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎｔｒｏｄｉａ、Ａｎｔｒｏｄｉｅｌｌａ、Ａｕｒａｎｔｉｐｏｒｕｓ、Ａｕｒｉｐｏｒｉａ、Ｂｕｇｌｏｓｓｏｐｏｒｕｓ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｒｒｅｎａ、Ｃｒｉｏｌｏｐｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｐｏｒｕｓ、Ｄａｅｄａｌｅａ、Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ、Ｄａｎｔｒｏｎｉａ、Ｄｉｐｌｏｍｉｔｏｐｏｒｕｓ、Ｄｏｎｋｉｏｐｏｒｉａ、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ、Ｈａｐａｌｏｐｉｌｕｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌａｅｐｔｏｐｏｒｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｏｒｏｐｏｒｉａ、Ｍｅｌａｎｏｐｏｒｉａ、Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ、Ｎｉｇｒｏｐｏｒｕｓ、Ｏｌｉｇｏｐｏｒｕｓ、Ｏｓｓｉｃａｕｌｉｓ、Ｏｘｙｐｏｒｕｓ、Ｐａｒｍａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｌａｔｏｐｏｒｕｓ、Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ、Ｐｏｒｉａ、Ｐｏｓｔｉａ、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ、Ｔａｉｗａｎｏｆｕｎｇｕｓ、Ｔｉｎｃｔｏｐｏｒｅｌｌｕｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｙｒｏｍｙｃｅｓ、Ｗｏｌｆｉｐｏｒｉａ、Ｐａｌａｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ、Ｃｈａｅｔｏｓａｒｔｏｒｙａ、Ｃｈｒｏｍｏｃｌｅｉｓｔａ、Ｄｉｃｈｏｔｏｍｏｍｙｃｅｓ、Ｅｄｙｕｉｌｌｉａ、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ、Ｅｒｙｔｈｒｏｇｙｍｎｏｔｈｅｃａ、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ、Ｆｅｎｎｅｌｌｉａ、Ｈａｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ、Ｎｅｏｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｇｅｎｏｍａ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｒｉｃｈｏｃｏｍａ、Ｗａｒｃｕｐｉｅｌｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｍｅｒｉｍｂｌａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈｉａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ、Ｓａｇｅｎｏｍｅｌｌａ、Ｓｅｐｔｏｆｕｓｉｄｉｕｍ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｈｏｒａ、Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｍａｌａｓｅｚｚｉａ、および微細藻類からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
各生物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍａｓｐｏｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｈａｐａｌｏｐｉｌｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌａｃｅａｅ、Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ  Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓおよび微細藻類からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１の生物が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉであり、前記第２の生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである、請求項２〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記第１の生物が、微細藻類であり、前記第２の生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである、請求項２〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
サリチル酸、ソルビン酸、フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、エタノール、クオタニウム−１５、グルコースオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼと基質との組み合わせ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される防腐剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記防腐剤がフェノキシエタノールを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記防腐剤が、組成物の全重量に基づいて少なくとも０．１重量％の量で存在する、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、皮膚軟化剤、ワックス、油、ポリマー、増粘剤、定着剤、着色剤、湿潤剤、保湿剤、安定剤、希釈剤、溶剤、芳香剤、植物性剤、機能性食品、薬用化粧品、治療薬、調合薬、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイド性ホルモン、フケ防止剤、抗ざ瘡構成成分、日焼け防止剤、防腐剤およびその組合せを含む群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記発酵抽出物を０．１重量％〜１０重量％、前記防腐剤を０．１重量％〜１０重量％、前記皮膚科学的に許容される媒体を５０重量％〜９５重量％含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記発酵抽出物を９０．０重量％〜９９．９重量％、防腐剤を０．１重量％〜１０．０重量％含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記発酵抽出物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの代謝産物の存在下で同時に増殖するＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉの代謝産物を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
構成成分（ａ）が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの代謝産物の存在下で同時に増殖する微細藻類の代謝産物を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記発酵抽出物が、
（ｉ）第１の化学的に定義された栄養培地を使用して後期対数増殖期になるまで第１の生物を増殖させて、前記第１の生物および前記第１の生物の二次代謝産物発現物を含有する第２の栄養培地を産生する工程と、
（ｉｉ）前記第２の栄養培地と第２の生物とを接触させる工程と、
（ｉｉｉ）第２の栄養培地中で前記第１の生物および前記第２の生物を同時発酵させて、水溶性部分および水不溶性部分を含有する発酵混合物を産生する工程と、
（ｉｖ）前記発酵混合物から前記水不溶性部分を分離し、それによって前記水溶性部分を単離し、複式発酵抽出物を産生する工程と
を含むプロセスによって産生される、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
同時発酵物から発酵抽出物を調製するプロセスであって、
（ｉ）第１の化学的に定義された栄養培地を使用して後期対数増殖期になるまで第１の生物を増殖させて、前記第１の生物および前記第１の生物の二次代謝産物発現物を含有する第２の栄養培地を産生することと、
（ｉｉ）前記第２の栄養培地と第２の生物とを接触させることと、
（ｉｉｉ）第２の栄養培地中で前記第１の生物および前記第２の生物を同時発酵させて、水溶性部分および水不溶性部分を含有する発酵混合物を産生することと、
（ｉｖ）前記発酵混合物から前記水不溶性部分を分離し、それによって前記水溶性部分を単離し、複式発酵抽出物を産生することと
を含むプロセス。
【請求項１９】
前記第１の生物が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉであり、前記第２の生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記第１の生物が、微細藻類ウルケニアであり、前記第２の生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第１の生物および前記第２の生物が好気性、嫌気性または複合条件下で増殖する、請求項１８〜２０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２２】
利用者の皮膚を、請求項１〜１７のいずれかに記載の局所組成物と接触させることを含む、皮膚細胞におけるヒアルロン酸およびＣＤ４４の産生を刺激する方法。
【請求項２３】
利用者の皮膚を、請求項１〜１７のいずれかに記載の局所組成物と接触させることを含む、皮膚細胞におけるヒアルロン酸およびカスパーゼ−１４の産生を刺激する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明はパーソナルケアおよび治療適用に適切な組成物、より具体的には複式発酵抽出物を含有するそのような組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
単一の生物、たとえばサッカロミセス種（Saccharomyces sp.）または乳酸桿菌種（Lactobacillus sp.）の発酵から得られる抽出物は公知であり、局所組成物に使用されてきた。近年では、皮膚に有益な効果を有する代謝産物を産生する方法として植物由来ポリフェノールと合わせた生物の発酵が開示されたことが、米国特許出願公開番号第２０１０／００２１５３２号において示唆された。
【０００３】
マルチスタータ培養生物の使用および複数の微生物を共培養する概念は、食品産業において、特にワイン作製のプロセスにおいて探究されてきた、たとえば、Ｔｏｒｏ  Ｍ．Ｅら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４７〜３５４．（２００２）およびＨｅｒｒｅｒｏ  Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：４８〜５１（１９９９）を参照のこと。マルチスタータ微生物ワインを作製する間の微生物相互作用は、風味の増強に影響を与えるために重要なので、マルチスタータワインの味および生化学的プロファイルは、単一の培養接種より優れていてもよいことが示唆される、Ｃｉａｎｉ  Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０８：２３９〜２４５（２００６）。しかし、パーソナルケア用品に対するマルチスタータ培養物の使用については示唆されていない。
【０００４】
近年では、酵母およびその誘導体の使用が、化粧用途において広く一般に普及してきた。これは、酵母は、真核生物なので、ヒト細胞に類似の細胞生物学的プロセスを有し、ストレス下で有益なタンパク質の産生を引き起こすことが公知であるという事実に後押しされている。酵母誘導体の使用、および酸素摂取量の増加による局所皮膚適用の利点に関する多くの歴史的証拠もある。たとえば、米国特許第４，５４０，５７１号は、皮膚呼吸を改善する酵母誘導体を開示している。酵母細胞誘導体は、皮膚細胞におけるコラーゲンおよびエラスチンの産生を刺激することも報告されている。
【０００５】
最近の研究は、酵母細胞抽出物が、創傷治癒を刺激する「成長因子」を促進する能力を有することを示唆している。たとえば、米国特許第７，２１７，４１７号は、創傷治癒用としてゲル性処方に酵母細胞誘導体を組み込む方法を開示している。
【０００６】
新たな活性物質を得るための同時または連続発酵抽出物の使用は、当技術分野において示唆されていない。
【発明の概要】
【０００７】
一側面において、本発明は、少なくとも２種の生物の同時または連続発酵から取り出される発酵抽出物を含有する局所組成物を提供する。
【０００８】
別の側面において、少なくとも２種の生物の同時または連続発酵から取り出される発酵抽出物、発酵抽出物における殺菌または制生効果を提供するのに十分な量の防腐剤および皮膚科学的に許容される媒体を含有する局所組成物が提供される。
【０００９】
本発明によって得られる典型的な局所組成物は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉである第１の生物とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである第２の生物との複式発酵抽出物を含有する。
【００１０】
本発明によって得られる別の典型的な局所組成物は、微細藻類である第１の生物とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである第２の生物と複式発酵抽出物を含有する。
【００１１】
発酵抽出物を調製する方法であって、第１の化学的に定義された栄養培地を使用して後期対数増殖期になるまで第１の生物を増殖させて、第１の生物および第１の生物の二次代謝産物発現物を含有する第２の栄養培地を産生することと；第２の栄養培地と第２の生物とを接触させることと、第２の栄養培地中で第１の生物および第２の生物を同時発酵させて、水溶性部分および水不溶性部分を含有する発酵混合物を産生することと、発酵混合物から水不溶性部分を分離し、それによって水溶性部分を単離し、複式発酵抽出物を産生するプロセス工程を含有する方法も提供される。
【００１２】
本発明の別の側面は、複式発酵抽出物を含有する局所組成物を用いる治療を必要とする利用者の皮膚に局所組成物を適用することにより、皮膚細胞におけるヒアルロン酸およびＣＤ４４の産生を刺激する方法である。
【００１３】
本発明の別の側面は、複式発酵抽出物を含有する局所組成物を用いる治療を必要とする利用者の皮膚に局所組成物を適用することにより、皮膚細胞におけるヒアルロン酸およびカスパーゼ−１４の産生を刺激する方法である。
【００１４】
本発明の詳細な説明を読めば、これらのおよび他の側面は明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、比較目的の乳酸桿菌発酵抽出物のＧＣ−ＭＳスペクトルである。
【図２】図２は、比較目的のプロピオン酸菌発酵抽出物のＧＣ−ＭＳスペクトルである。
【図３】図３は、乳酸桿菌とプロピオン酸菌との同時発酵から得られる複式発酵抽出物のＧＣ−ＭＳスペクトルである。
【図４】図４は、乳酸桿菌発酵抽出物、プロピオン酸菌発酵抽出物および乳酸桿菌とプロピオン酸菌との同時発酵から得られる複式発酵抽出物で処理した全層組織からのＨＡＳ１発現を図示する。
【図５】図５は、乳酸桿菌発酵抽出物、プロピオン酸菌発酵抽出物および乳酸桿菌とプロピオン酸菌との同時発酵から得られる複式発酵抽出物で処理した全層組織からのＣＤ４４発現を図示する。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、無処理のインビトロでの角質層破壊モデルのヒアルロン酸発現を各々図示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、レチノールで処理したインビトロでの角質層破壊モデルのヒアルロン酸発現を図示する。
【図６Ｃ】図６Ｃは、乳酸桿菌と微細藻類との同時発酵から得られる複式発酵抽出物で処理したインビトロでの角質層破壊モデルのヒアルロン酸発現を図示する。
【図７Ａ】図７Ａは、無処理のインビトロでの角質層破壊モデルのカスパーゼ−１４発現を図示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、レチノールで処理したインビトロでの角質層破壊モデルのカスパーゼ−１４発現を図示する。
【図７Ｃ】図７Ｃは、乳酸桿菌と微細藻類との同時発酵から得られる複式発酵抽出物で処理したインビトロでの角質層破壊モデルのカスパーゼ−１４発現を図示する。
【図８Ａ】図８Ａは、微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物の適用による、キュートメータ（cutometer）を用いる皮膚弾力性のインビボでの評価を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物の適用による、キュートメータを用いる皮膚弾力性のインビボでの評価を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物の適用による、小じわおよびしわのインビボでの評価を示す。
【図９Ｂ】９Ｂは、微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物の適用による、小じわおよびしわのインビボでの評価を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物の適用による、眼周囲領域におけるしわのインビボでのシルフロ評価を示す。
【図１０Ｂ】１０Ｂは、微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物の適用による、眼周囲領域における小じわのインビボでのシルフロ評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
少なくとも２種の生物の同時または連続発酵から取り出される発酵抽出物を含有する局所組成物は、パーソナルケアおよび治療適用のための局所組成物に有益な特性を有するということが、驚くべきことにここで判明した。有益な特性には、たとえば、発酵抽出物を含有する組成物が皮膚に局所適用される場合に、その組成物が、皮膚細胞におけるヒアルロン酸、ＣＤ４４およびカスパーゼ１４タンパク質の産生を刺激するのに有効であることが発見されたことが挙げられる。
【００１７】
どんな原理に束縛されるものでもないが、同時または連続発酵は、一方の生物と他方の生物との競合を引き起こすと考えられる。第１の生物由来代謝産物の存在下における第２の生物に対する競合の環境により、第２の生物は、競合環境における隆盛を可能にする代謝産物の発現を開始する。特に、第２の生物は、第１の生物由来の二次代謝産物およびサイトカインを代謝してもよく、逆もまた同じである。このようにして、発酵抽出物は、それらの生物が個別に発酵される場合には得られない固有の代謝活性物質を含有する新規な組成物になる。
【００１８】
本発明の発酵抽出物を作製するために、一態様において、化学的に定義された栄養培地中で第１の生物を増殖させる。ここで、「化学的に定義された栄養培地」は、生物増殖のための特定の化学的栄養源、たとえば窒素、炭素、などに対する化学的源を含有する培地と定義される。化学的に定義された栄養培地は一般に、生物学的栄養源、たとえば酵母または動物／植物組織栄養分を含有しない。第１の生物は、二次代謝産物の発現によって栄養培地を改変する。二次代謝産物には、タンパク質、サイトカイン、多糖、核酸などがある。次いで、第１の生物および第１の生物由来代謝産物を含有する改変栄養培地に第２の生物を植菌できる。次いで、第１の生物と第２の生物は、改変栄養培地中で同時発酵されて、発酵混合物を産生する。別法として、第２の生物は、第１の生物の発酵後の改変栄養培地中で発酵される。一般に、発酵は、水溶性部分および水不溶性部分を含有することになる。水不溶性部分が発酵混合物から除去され、それによって水溶性部分を単離することができ、それが本発明の発酵抽出物である。ここで、「水溶性」は、１グラムの水に溶解する１グラムの複式発酵抽出物と定義される。抽出物は、水／有機溶剤混合物、限定的ではないが、たとえば水性グリコールおよび水性グリセロールに可溶性であってもよい。
【００１９】
ここで、「発酵抽出物」とは、２種以上の生物の発酵から得られる組成物のことを指す。本発明の発酵抽出物は、普通ブイヨン培地、細胞タンパク質材料、細胞核材料、細胞原形質材料および／または細胞壁構成成分などを含むがそれだけには限らない、両方の生物由来の細胞質内および細胞外構成成分を含有する。
【００２０】
２種の生物が同時にまたは順次増殖する場合、そのプロセスは、ここで「複式発酵」と称される。複式発酵の発酵抽出物は、ここで「複式発酵抽出物」と称される。ここで記載の通り、例は、複式発酵抽出物を調製するための複式発酵を目的とし、しかし、追加される生物は、同時にまたは順次発酵されてもよいと考えられる。
【００２１】
一般に、複式発酵抽出物を産生するには、増殖培地中で後期対数期になるまで第１の生物を増殖させる。ここで、「後期対数期」は、生物培養物の指数増殖の最終期と定義される。指数増殖は、指数細胞増殖または倍加によって特徴づけられる。指数増殖の継続時間は、所与の時間に存在する生物の個体数および培地中の栄養分の利用可能度によって決まる。通常、６００ｎｍでの光学密度が少なくとも約６になるまで第１の生物を増殖させる。第１の生物を、設定温度範囲で設定期間増殖させる。得られた改変栄養培地は、無菌の輸送タンクに溜められる。改変栄養培地をさらに精製して、第１の微生物を取り除くことができる。別法として、第２の生物、たとえば乳酸桿菌種を追加する間に、改変培地中に第１の生物を残しておくこともできる。第２の生物の増殖は、光学密度および生菌数の変化によって観察される（６００ｎｍでの光学密度は少なくとも６、または生菌数約１０9コロニー形成単位／ｍＬ）。
【００２２】
基本的に、本発明においてどんな栄養培地が使用されてもよく、特に制限されない。栄養培地は当業者に公知であり、本発明に有用な栄養培地の構成は特に制限されない。典型的な栄養培地は、たとえば、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）によって発行されている「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ」に見ることができる。たとえば、本発明の発酵プロセスで使用するのに適切な栄養培地は、どんな動物由来産物も含まず、明確に定義され、適切な炭素、窒素およびリン源を含む化学的に定義された培地である。
【００２３】
発酵の間、半バッチ培養物は、炭素源（グリセロール、ラクトース）、窒素源（ペプチドおよびアミノ酸）およびリンを補充した栄養培地中で、およそ２０〜３０℃で通常は増殖する。ｐＨは、２Ｍ  ＮＨ4ＯＨを用いる滴定によって５．０±１．５で通常一定に保たれる。発酵酸素条件を、滅菌可能な酸素プローブによって絶えず観察し、発酵環境を、１００〜１５０ｒｐｍの最大速度で発酵槽を最低限かき混ぜることによって通常維持する。窒素供給速度を０．０１〜０．５ＶＶＭ（空気容積／容器容積／分）に通常設定する。他のガスが、利用されてもまたはされなくてもよく、追加の外部ストレス、たとえば酸化的ストレス増強技術（たとえばオゾンもしくは紫外線の追加）またはストレス関連技術（たとえば加熱など）の使用などが適用されてもまたはされなくてもよい。
【００２４】
発酵プロセスは、任意の撹拌型またはウェーブ型バイオリアクタで実施できる。本発明に有用なバイオリアクタの例には、それだけには限らないが、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）またはＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能なバッチ供給リアクタがある。
【００２５】
第１および第２の生物の両方は、好気性もしくは嫌気性条件でまたは好気性と嫌気性条件の組合せで増殖されて、二次代謝産物を刺激することができる。任意で、発酵プロセスの間に、生物は、ストレス要因、たとえば化学物質（たとえば過酸化水素およびオゾン）、エネルギー（たとえば超音波、紫外線、赤外線放射または熱）に曝露することができる。
【００２６】
二次代謝産物の測定は、当業者に公知の技術を使用して実行できる。１つの特に有効な技術には、質量分析と組み合わせたクロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＭＳ）がある。二次代謝産物を測定する別の有効な方法は、市販の生物ゲノムアレイを用いることである。そのようなアレイは当業者に周知であり、生物、たとえばサッカロミセスおよび乳酸桿菌用のアレイは市販されている。二次代謝産物発現を測定する他の方法は、フローサイトメトリを含んでもよい。二次代謝産物発現は、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析（ＧＣ／ＭＳ）を使用して測定されてもよい。そのような機器の例には、Ｓｋｙｒａｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．およびＴｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．の機器がある。
【００２７】
発酵抽出物は、バイオマスを分離し、第１および第２の生物の細胞外分泌物から有効成分を抽出することによって得ることができる。別法として、当業者に公知のプロセスによって細胞を溶解して、複式発酵抽出物溶解物を得ることができる。これらのプロセスにおいて、細胞壁は、化学的、酵素的もしくは物理的な手段によってまたはこれらの組合せによって破壊される。複式発酵抽出物は、クロマトグラフィー、溶剤抽出、遠心分離、傾瀉法、濾過または活性炭処理を含むがこれに限定されない当業者に公知の多数の手段によってさらに精製されてもよい。複式発酵抽出物は、蒸発、スプレー乾燥、凍結乾燥、ベルトまたはドラム乾燥を含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の手段によってさらに濃縮できる。
【００２８】
本発明の同時または連続発酵に適切な微生物／生物は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍｅｌｌａ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ、Ｘｙｌａｒｉａ、Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ、Ｈｅｌｏｔｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｔｕｌｏｓｔｏｍａ、Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ、Ｔｒｕｎｃｏｃｏｌｕｍｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｄｉｃｔｏｓｔｙｌｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉａ、Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ａｌｂｕｇｏ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｃｒａｔｅｒｅｌｌｕｓ、Ｐｔｅｒｙｇｅｌｌｕｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ、Ｔｕｂｅｒ、Ｈｙｄｎｕｍ、Ｌｅｃａｎｏｒａ、Ｒｏｃｃｅｌｌａ、Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａ、Ｕｓｎｅａ、Ｅｖｅｒｎｉａ、Ｒａｍａｌｉｎａ、Ａｌｅｃｔｏｒｉａ、Ｃｌａｄｏｎｉａ、Ｐａｒｍｅｌｉａ、Ｃｅｔｒａｒｉａ、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ｍａｒａｓｍｉｕｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｐｈｏｌｉｏｔａ、Ｒｕｓｓｕｌａ、Ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ、Ｅｎｔｏｌｏｍａ、Ｌｅｐｉｏｔａｃｅａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ、Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ、Ｖｏｌｖａｒｉａ、Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｐｅｚｉｚａ、Ｐｌｅｃｔａｎｉａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ、Ｗｙｎｎｅａ、Ｈｅｌｖｅｌｌａ、Ｇｙｒｏｍｉｔｒａ、Ｐｈａｌｌａｌｅｓ、Ｄｉｃｔｙｏｐｈｅｒａ、Ｍｕｔｉｎｕｓ、Ｃｌａｔｈｒｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ、Ｃａｌｖａｔｉａ、Ｇｅａｓｔｒｕｍ、Ｒａｄｉｉｇｅｒａ、Ａｓｔｒｅｕｓ、Ｎｉｄｕｌａｒｉａ、Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ、Ｍａｃｏｗａｎｉｔｅｓ、Ｇａｓｔｒｏｂｏｌｅｔｕｓ、Ａｌｂａｔｒｅｌｌｕｓ、Ｎｅｏｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｎｉｇｒｏｐｏｒｕｓ、Ｏｌｉｇｏｐｏｒｕｓ、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ、Ｆｉｓｔｕｌｉｎａ、Ｆｏｍｅｓ、Ｂｏｌｅｔｕｓ、Ｆｕｓｃｏｂｏｌｅｔｉｎｕｓ、Ｌｅｃｃｉｎｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｕｓ、Ｓｕｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｏｂｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ、Ｔｒｅｍｅｌｌａ、Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｅｐｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｈｙｇｒｏｃｙｂｅ、Ｈｙｇｒｏｐｈｏｒｕｓ、Ｈｙｇｒｏｔｒａｍａ、Ｎｅｏｈｙｇｒｏｐｈｏｒｕｓ、Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｏｎｉｌｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ、Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｉｎｉａ、Ｏｚｏｎｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｇｅｏｇｌｏｓｓｕｍ、またはＡｒｍｉｌｌａｒｉａ；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ、Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ、Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ；Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ、Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍａｓｐｏｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｏｏｋｌａｗｎｉａ、Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｈａｒｐｅａ、Ａｍｂｉｓｐｏｒａ、Ａｃａｕｌｏｓｐｏｒａ、Ｅｎｔｈｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ、Ａｂｏｒｔｉｐｏｒｕｓ、Ａｍｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎｔｒｏｄｉａ、Ａｎｔｒｏｄｉｅｌｌａ、Ａｕｒａｎｔｉｐｏｒｕｓ、Ａｕｒｉｐｏｒｉａ、Ｂｕｇｌｏｓｓｏｐｏｒｕｓ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｒｒｅｎａ、Ｃｒｉｏｌｏｐｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｐｏｒｕｓ、Ｄａｅｄａｌｅａ、Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ、Ｄａｎｔｒｏｎｉａ、Ｄｉｐｌｏｍｉｔｏｐｏｒｕｓ、Ｄｏｎｋｉｏｐｏｒｉａ、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ、Ｈａｐａｌｏｐｉｌｕｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌａｅｐｔｏｐｏｒｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｏｒｏｐｏｒｉａ、Ｍｅｌａｎｏｐｏｒｉａ、Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ、Ｎｉｇｒｏｐｏｒｕｓ、Ｏｌｉｇｏｐｏｒｕｓ、Ｏｓｓｉｃａｕｌｉｓ、Ｏｘｙｐｏｒｕｓ、Ｐａｒｍａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｌａｔｏｐｏｒｕｓ、Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ、Ｐｏｒｉａ、Ｐｏｓｔｉａ、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ、Ｔａｉｗａｎｏｆｕｎｇｕｓ、Ｔｉｎｃｔｏｐｏｒｅｌｌｕｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｙｒｏｍｙｃｅｓ、Ｗｏｌｆｉｐｏｒｉａ、Ｐａｌａｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ、Ｃｈａｅｔｏｓａｒｔｏｒｙａ、Ｃｈｒｏｍｏｃｌｅｉｓｔａ、Ｄｉｃｈｏｔｏｍｏｍｙｃｅｓ、Ｅｄｙｕｉｌｌｉａ、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ、Ｅｒｙｔｈｒｏｇｙｍｎｏｔｈｅｃａ、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ、Ｆｅｎｎｅｌｌｉａ、Ｈａｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ、Ｎｅｏｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｇｅｎｏｍａ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｒｉｃｈｏｃｏｍａ、Ｗａｒｃｕｐｉｅｌｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｍｅｒｉｍｂｌａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈｉａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ、Ｓａｇｅｎｏｍｅｌｌａ、Ｓｅｐｔｏｆｕｓｉｄｉｕｍ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｈｏｒａ、Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｍａｌａｓｅｚｚｉａ、微細藻類および他の類似の種を含むがそれだけには限らない、当業者に公知の様々な微生物の属および科を含み得る。原核生物、藻細胞、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞が、１種以上の前述の微生物と共発酵されてもよいことも認識されよう。上記のうち、微生物／生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍａｓｐｏｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｈａｐａｌｏｐｉｌｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌａｃｅａｅ、Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ  Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓおよび微細藻類は、特定の対象である。
【００２９】
一態様において、乳酸桿菌およびプロピオニバクテリウムの科に属している微生物の培養物を使用して、複式発酵抽出物を産生する。乳酸桿菌およびプロピオン酸菌を個別に増殖させる方法は、当業者に公知である。通常、乳酸桿菌およびプロピオニバクテリウムの門に属している細菌は、偏性嫌気性菌または微好気性菌のいずれかであり、すなわち、それらは酸素非存在での増殖を好む。いくつかの種は、少量の酸素の存在を許容することができる。
【００３０】
複式発酵抽出物を産生するために、増殖培地中で後期対数期になるまで第１の生物、たとえばプロピオニバクテリウム種を増殖させる。有利には、６００ｎｍでの光学密度が少なくとも６になるまで第１の生物を増殖させる。一態様において、第１の生物を、２５℃〜３０℃で約１６〜約１８時間増殖させる。得られた改変栄養培地は、無菌の輸送タンクに溜められた。改変栄養培地をさらに精製して、第１の微生物を取り除くことができる。別法として、第２の生物、たとえば乳酸桿菌種を追加する間に、改変培地中に第１の生物を残しておくこともできる。第２の生物の増殖は、光学密度および生菌数の変化によって観察される（６００ｎｍでの光学密度は少なくとも６、または生菌数１０9コロニー形成単位／ｍＬ）。
【００３１】
別の態様において、微細藻類ウルケニア種（Ulkenia sp.）および乳酸桿菌の科に属している培養物を使用して、複式発酵抽出物を産生する。ウルケニアおよび乳酸桿菌を個別に増殖させる方法は、当業者に公知である。通常、ウルケニアおよび乳酸桿菌の門に属している細菌は、偏性好気性菌または微好気性菌のいずれかであり、ミネラル塩を含む栄養分に富んだ培地での増殖を好む。
【００３２】
複式発酵抽出物を産生するために、第１の生物、たとえば増殖培地中で後期対数期になるまで微細藻類種を増殖させる。一態様において、第１の生物を、２０℃〜２４℃で約９６〜約３８８時間増殖させる。得られた改変栄養培地は、無菌の輸送タンクに溜められる。改変栄養培地をさらに精製して、第１の生物を取り除くことができる。別法として、第２の生物、たとえば乳酸桿菌種を追加する間に、改変培地中に第１の生物を残しておくこともできる。第２の生物の増殖は、光学密度および生菌数の変化によって観察される（６００ｎｍでの光学密度は少なくとも６、または生菌数１０9コロニー形成単位／ｍＬ）。
【００３３】
リポソームまたは他の脂質カプセル材料を形成する、複式発酵抽出物をスプレー乾燥する、ポリマーカプセルに複式発酵抽出物を封入する、不活性基質に複式発酵抽出物を吸収または吸着させるなどを含むがそれだけには限らない当業者に公知の技術を使用して、複式発酵抽出物を封入できる。
【００３４】
複式発酵抽出物は、局所組成物に使用されてもよい。個々の生物の微生物発酵中には発現しない二次代謝産物発現により、そのような局所組成物は皮膚細胞を保護してもよい。複式発酵抽出物を含有する局所組成物の適用によって、抗加齢、美白、皮膚細胞代謝回転、皮膚細胞保護、皮膚障壁保護、皮膚保水および他の治療的利点が得られる可能性がある。
【００３５】
本発明の局所組成物は、局所組成物の重量に基づいて約０．０１重量％〜約１０重量％までの量で発酵抽出物を含有してもよい。一般に、局所組成物は、局所組成物の重量に基づいて約０．１重量％〜５重量％、通常は約０．５重量％〜約２重量％の発酵抽出物を含有してよい。
【００３６】
発酵抽出物の他に、局所組成物は防腐剤を有利に含有してもよい。発酵抽出物または局所組成物に防腐剤を添加して発酵抽出物の環境を維持し、望ましくない風媒性生物による汚染から発酵抽出物を保護してもよい。ここで、「防腐剤」は、望ましくない生物に対して発酵抽出物を無菌にまたは制生する成分と定義される。防腐剤には、酸、アルコール、グリコール、パラベン、第四級窒素含有化合物、イソチアゾリノン、アルデヒド放出化合物およびハロゲン化合物ならびに酵素がある。例示的なアルコールには、フェノキシエタノール、イソプロピルアルコールおよびベンジルアルコールがあり；例示的なグリコールには、プロピレン、ブチレンおよびペンチレングリコールがあり；例示的なパラベン（パラオキシ安息香酸としても公知である）には、メチル、プロピルおよびブチルパラベンがあり；例示的な第四級窒素含有化合物には、塩化ベンザルコニウム、クオタニウム１５があり；例示的なイソチアゾールには、メチルイソチアゾリン、メチルクロルオールイソチアゾリンがあり；例示的なアルデヒド放出薬剤には、ＤＭＤＭヒダントイン、イミダゾリジニル尿素およびジアゾリジニル尿素があり；例示的な酸化防止剤には、ブチルヒドロキシトルエン、トコフェロールがあり、例示的なハロゲン化合物には、トリクロサンおよびクロルヘキシジンジグルコネートがある。例示的な酵素には、グルコースオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼがある。本発明の目的で有用な防腐剤の例は、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ  ２００７」Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔ．１１７、４１〜４４（２００２）、および「Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔ．１１７、８０〜９６（２００２）に見出すことができる。加えて、酵素防腐剤系、たとえば「Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｏｒｔｈ ＤＳ編、Ｆｒａｎｃｉｓ  ＆  Ｔａｙｌｏｒ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎで、Ｆｌａ．（２００６）の中にあるＣｉｃｃｏｇｎａｎｉ  Ｄ．Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓによる論文に記載のものも、局所組成物用として有効であり得る。
【００３７】
一般に、防腐剤は、局所組成物の合計重量の少なくとも約０．０１重量％、有利には少なくとも約０．１重量％、最大で約１０重量％までの量で存在することになる。通常、必要最少量の防腐剤が使用され、防腐剤は局所組成物の重量に基づいて、通常約５重量％未満、より通常は約０．１重量％〜約２．０重量％の範囲の量で存在する。
【００３８】
局所組成物は、皮膚科学的に許容される担体を含有してもよい。ここで、フレーズ「皮膚科学的に許容される担体」とは、担体が、優れた美的特性を有する皮膚、毛髪、爪などへの局所適用に適しており、発酵抽出物およびその他の構成成分と親和性が有り、いかなる厄介な安全性または毒性に対する懸念ももたらさないことを意味する。皮膚科学的に許容される担体は、一般に美容的にもおよび／または薬学的にも同様に許容される。
【００３９】
皮膚科学的に許容される担体または「担体」は、様々な形態であり得る。たとえば水中油型、油中水型、水中油中水型およびシリコーン中水中油型乳剤を含むがそれだけには限らない乳剤担体が、ここでは有用である。これらの乳剤は、幅広い範囲の粘度、たとえば約１００ｃｐｓ〜約２００，０００ｃｐｓに及ぶことができる。これらの乳剤は、機械式ポンプ容器または通常の推進体を使用する加圧エアロゾル容器を使用して、スプレー形態で送達することもできる。これらの担体は、ムース形態でも送達できる。他の適切な局所担体には、無水液体溶剤たとえば油、アルコールおよびシリコーン（たとえば、鉱油、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチコン、シクロメチコンなど）；水性単相液体溶剤（たとえば、水アルコール溶剤系）；ならびにこれら無水および水性単相溶剤の高粘度変形（たとえば、適切なゴム、樹脂、ワックス、ポリマー、塩、などの添加によって溶剤の粘度を増加させて、固体または半固体を形成する場合）がある。本発明において有用な局所担体系の例については、以下の４つの参考文献に記載されている：「Ｓｕｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ」Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ、ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．１２２〜１３９（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９０）；「Ｓｕｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ」、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ、ｖｏｌ．１０２、ｐｐ．１１７〜１３６（Ｍａｒｃｈ  １９８７）；米国特許第４，９６０，７６４号；および米国特許第４，２５４，１０５号。
【００４０】
担体は、局所組成物の重量によって約５０重量％〜約９９重量％含むことができ、一般に、局所組成物の合計重量に基づいて、約７５重量％〜約９９重量％の量で存在することになる。通常、担体は、組成物の合計重量の約８５重量％〜約９５重量％を構成することになる。
【００４１】
典型的な担体には、水アルコール系および水中油型乳剤がある。担体が水アルコール系の場合、担体は、約０％〜約９９％のエタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物および約１％〜約９９％の水を含むことができる。約５％〜約６０％のエタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物、および約４０％〜約９５％の水を含有する担体がより好ましい。約２０％〜約５０％のエタノール、イソプロピルアルコールまたはそれらの混合物、および約５０％〜約８０％の水を含有する担体が特に好ましい。担体が水中油型乳剤の場合、担体は、これらの乳剤を調製するのに一般的な賦形剤成分のいずれかを含むことができる。適切な担体についてのより詳細な考察は、米国特許第５，６０５，８９４号および米国特許第５，６８１，８５２号に見られる。
【００４２】
局所組成物は、他の機能性成分、たとえば水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、皮膚軟化剤、ワックス、油、ポリマー、増粘剤、定着剤、着色剤、湿潤剤、保湿剤、安定剤、希釈剤、溶剤および芳香剤を任意に含有してもよい。加えて、パーソナルケア組成物は、有効成分、たとえば植物性剤、機能性食品、薬用化粧品、治療薬、調合薬、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ざ瘡構成成分、日焼け防止剤、防腐剤などを含有してもよい。
【００４３】
発酵抽出物を含有する局所組成物には、ローション、軟膏、クリーム、スプレー、噴霧、水性または水性アルコール混合ゲル、ムース、パッチ、パッド、マスク、ウェットクロス、ワイプ、固体スティック、透明スティック、リップスティック、エアロゾルクリーム、無水粉末、タルク、トニック、油、乳剤およびバスソルトを含むがそれだけには限らない様々な型の化粧品処方を使用できる。そのような化粧品処方は、皮膚に対する局所適用として使用されてもよい。
【００４４】
本発明の別の態様によると、（ａ）発酵抽出物；（ｂ）成分（ａ）における殺菌および制生効果を得るのに十分な量で存在する防腐剤、を含有する組成物濃縮物も提供され、構成成分（ａ）は、組成物重量の約９０％〜約９９．９％の量で存在し、構成成分（ｂ）は、組成物重量の０．１％〜１０％の量で存在する。一般に、発酵抽出物は組成物重量の約９８％〜約９９．５％であり、構成成分（ｂ）は組成物重量の０．５％〜２％の量で存在する。他の追加成分、たとえば溶剤または担体も、濃縮物中に存在してよい。
【００４５】
以下の例は、例示することを目的とし、本発明の範囲を全く制限しない。別段に明記されていない限り、部およびパーセンテージは全て重量により、温度は全て℃による。
【００４６】
［実施例］
例１
生物および培地
細菌細胞培養物を、乳漿粉末抽出物から単離した。本発明には、乳酸桿菌およびプロピオニバクテリウムの科に属している微生物の培養物が特に好まれる。第１の微生物の選択（乳酸桿菌に対してプロピオニバクテリウム）は、増殖速度に厳しく依存する。培地中のほとんどの主成分を代謝し、濃縮することが望ましいので、より速い増殖速度の理由でプロピオニバクテリウムを選択した。この発明の目的の場合、２種の微生物を嫌気性でまたは微好気性条件（無酸素または限定された酸素）下で増殖させた。保存培養を、トリプトン、酵母抽出物、濾過乳漿抽出物（ｐＨ７．０）、および寒天（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する培地で維持した。元の保存培養を、１０％酵母抽出物、５％トリプシン大豆培養液、２．５％リン酸二水素カリウム、１．５％リン酸水素二カリウム、１０％ラクトース、５％グリセロール（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む培地を用いて振盪フラスコ中で増殖させた。培地成分に加えて、補足増殖因子、たとえばアミノ酸、ビタミン混合物およびミネラルが、増殖培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に添加された。消泡剤シグマ乳剤Ｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプロセスの全体を通して使用した。
【００４７】
バイオリアクタ
振盪フラスコ試験による処理の最適化の後、プロセスを２Ｌおよび１５Ｌ発酵段階に拡大した（２Ｌ：Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪおよび１５Ｌ：Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）。両方の微生物を嫌気性条件で増殖させ、溶存酸素量モニタによって酸素濃度を観察した。酸素のレベルを制御し、二次代謝産物の発現のために、バイオリアクタに窒素ガスを散布した。嫌気性条件を、滅菌可能なＤＯプローブによって絶えず観察し、嫌気環境を、１００〜１５０ｒｐｍの最大速度で発酵槽を最低限かき混ぜることによって維持した。窒素速度を０．０１〜０．５ＶＶＭ（空気容積／容器容積／分）に設定した。本発明の複式発酵抽出物を産生するために、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ細胞培養物を、２５℃〜３０℃、最も好ましくは２７℃で増殖させた。この発明の目的のために、発酵槽中で２種の微生物を同時に増殖させた（第２の微生物Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを、第１の微生物の存在下で増殖させた）。栄養培地が制限されている場合、発酵プロセス中の特定の時点でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを植菌し（第１の微生物を接種後１６〜１８時間、光学密度６００ｎｍ≧５）、それによって、閉鎖環境における栄養分の競合を引き起こさせた。第２の微生物Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを導入する影響は、特に閉鎖系、たとえばバイオリアクタで増殖する場合、栄養制限段階において２種の微生物の間に競合的な「生存型」応答を誘発する。増殖および栄養分の枯渇について連続的に培地を観察した（オンライン観察による、光学的密度測定）。栄養制限および酸素欠乏によって第１の微生物にストレスを誘導し、その後に第２の微生物を導入した。
【００４８】
最終的な複式発酵抽出物は、バイオマスを分離し、２種の微生物の細胞外分泌物から有効成分を抽出することによって得られた。複式発酵抽出物は、濾過によってさらに精製できる。複式発酵抽出物は、当業者に公知の選択的分子量膜濾過によってさらに濃縮できる。水性媒体中の複式発酵物抽出物の最終濃度は、少なくとも０．０１％である。より好ましくは、複式発酵抽出物の濃度は、少なくとも０．１％である。フェノキシエタノールを、０．５〜１．１％の濃度で防腐剤として使用した（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【００４９】
２種の個々の生物の対照（乳酸桿菌に対するプロピオニバクテリウム）を、上記の通り同一条件下で増殖させた。微生物対照サンプルに特徴的なパラメータは、第２の微生物の不在および二次代謝産物の誘発の欠如である。個々の生物抽出物を、上述の選択的分子量膜濾過技術を使用して精製した。
【００５０】
例２：ＧＣ／ＭＳによる代謝産物分析
例１の複式発酵を完了後、ＧＣ−ＭＳを実行して異なる代謝産物の発現を分析した。以下に示すように３つのサンプルを分析した：
発酵対照１−乳酸桿菌
発酵対照２−プロピオニバクテリウム
複式発酵抽出物
水性サンプル（１、２および３）を、酸特異的抽出に供し、酸性画分を単離し、ジアゾメタン試薬でメチル化し、対応するメチルエステルとして有機酸をＧＣ−ＭＳで分析した。ＧＣに試験サンプルを直接注入し、揮発性成分ヘッドスペース分析（ヘッドスペースＧＣ−ＭＳ）によって低分子量の酸も分析した。図１および２は、対照サンプルである微生物１および微生物２のＧＣ−ＭＳ分析である。図３は、複式発酵抽出物のＧＣ−ＭＳ分析を表し、２種の微生物の競合が、別の方法（微生物を個別に増殖する場合）では発現しない新たな代謝産物の発現を誘導することを示している。
【００５１】
例３  ヒト皮膚細胞のマイクロアレイ分析
ヒトゲノムマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２つの皮膚細胞系、線維芽細胞およびケラチノサイトに対する影響について、例１に記載の通り作製した複式発酵産物を検査した。細胞を、例１の１％複式発酵物で２４時間処理した。得られた処理した皮膚細胞を遠心分離し、核材料を含有するペレットをＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁し、４℃に保管した。ＲｉｂｏＰｕｒｅＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してヒト細胞由来の全ＲＮＡを抽出し、その後、Ｍｅｓｓａｇｅ  ＡＭＰ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してｍＲＮＡを増幅した。アレイ用として、ＭｉｃｒｏＭａｘアレイ標識キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ａＲＮＡのサンプルをＣｙ−３またはＣｙ−５のいずれかで蛍光標識した。次いで、表皮線維芽細胞およびケラチノサイト用の皮膚細胞ＤＮＡマイクロアレイチップに標識したａＲＮＡを適用し、終夜ハイブリダイズさせた（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。翌日、チップを洗浄し、Ａｘｏｎ  ４１００Ａ  ＤＮＡマイクロアレイスキャナを用いてスキャンし、Ａｘｏｎ  Ｇｅｎｅｐｉｘ−Ｐｒｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。遺伝子マイクロアレイ分析に利用した方法は、米国特許出願公開第２００６／０１１０８１５号に見ることができる。
【００５２】
ヒト表皮ケラチノサイトおよびヒト真皮線維芽細胞の遺伝子マイクロアレイから得た対象の遺伝子を、特に重要な皮膚機能に関連した遺伝子に対してスクリーニングした。様々な皮膚代謝機能に含まれるいくつかの遺伝子の上方制御（中央値の比＞１．３）または下方制御（中央値の比＜０．７）を分析した。遺伝子マイクロアレイ分析の目的では、「上方制御」はまたは「上方制御されている」という用語は、その遺伝子がＲＮＡを過剰発現していることを意味する。「下方制御」はまたは「下方制御されている」という用語は、ＲＮＡが低発現していることを意味する。その結果を表１に表す。
【表１−１】
2014530890.tif 000002
【表１−２】
2014530890.tif 000003
【表１−３】
2014530890.tif 000004
【表１−４】
2014530890.tif 000005
【００５３】
例４  例１の複式発酵物に対して個々の生物の発酵抽出物を比較する全層評価。
【００５４】
ＭａｔＴｅｋ（登録商標）全層皮膚組織モデルで例１の微生物対照（ＳＮＡ１３８０ＡおよびＳＮＡ−１３８０Ｂ）に対して例１の複式発酵抽出物を試験した。この皮膚モデルは、線維芽細胞に埋め込まれたコラーゲン基質上で増殖した高度に分化したケラチノサイトからなる。到着したらすぐに、使用するまで組織を４℃で保管した。使用する場合、組織をアガロース−輸送トレイから取り出し、アッセイ培地４ｍＬを含有する６ウエルプレートに入れ、３７±２℃および５±１％ＣＯ2で終夜平衡化した。終夜平衡化した後、培地を新鮮な培地４ｍＬと置きかえ、次いで、試験材料５０μＬを組織に局所的に適用した。次いで、組織を３７±２℃および５±１％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。以下の例１のサンプルを、ＭａｔＴｅｋ（登録商標）全層皮膚組織で評価した：
１．無処理
２．ＳＮＡ１３８０Ａ−発酵対照１−乳酸桿菌（処理１％および２％）
３．ＳＮＡ１３８０Ｂ−発酵対照１−プロピオニバクテリウム（処理１％および２％）
４．ＳＮＡ１３８０Ｃ−複式発酵抽出物（処理１％および２％）
ＣＤ４４およびＨＡＳ１アッセイ
膜を、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ：２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化し、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ微量濾過装置に組み付けた。組み付けた後、ＴＢＳ  ２００μＬをＢｉｏ−Ｄｏｔにおいて使用する各ウェルに添加し、真空を適用して、全てのウェルに適切な通過画分があることを確実にした。次に、各組織ホモジェネートサンプル（およそ１０μｇ）を装置内のウェルに割り当て、適切なウェルに適用した。低真空下でサンプルを濾過した。サンプルを割り当てていないウェルにＴＢＳを添加して、手順の間に膜が乾燥しないことを確実にした。ブロッティング手順の最後に、追加でＴＢＳ  ２００μＬを適用し、各ウェルを通して濾過した。次いで、膜をＢｉｏ−Ｄｏｔ装置から取り外し、ＴＢＳで５〜１０分間洗浄し、次いで、ブロッキング溶液（トリス緩衝食塩水［２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％脱脂粉乳）に入れ、振盪台上で、室温で少なくとも１時間インキュベートした。アッセイの結果は、図４および５に示される。
【００５５】
無処理の対照と比較して、１％および２％における例１の複式発酵物（ＳＮＡ−１３８０Ｃ）がＨＡＳ１タンパク質の統計的に有意な上方制御を示すことを、全層組織評価の結果は示している。個々の対照サンプルは、無処理の対照と比較して統計的有意性を示さなかった。結果は、図４にグラフで示される。
【００５６】
無処理の対照と比較して、１％および２％における例１の発酵物（ＳＮＡ−１３８０Ｃ）がＣＤ４４タンパク質の統計的に有意な上方制御を示すことを全層組織評価の結果は示している。個々の対照サンプルは、無処理の対照と比較して統計的有意性を示さなかった。結果は、図５にグラフで示される。
【００５７】
例５−微細藻類と乳酸桿菌との複式発酵物
複式発酵プロセスは、微細藻類と細菌細胞培養物との競合発酵を開始させた。微細藻類および細菌培養物は、Ｌｏｎｚａが独占所有権を持つ株である。本発明では、微生物は、スラウストキトリッド（Thraustochytrids）の科に属している微細藻類培養物および乳酸桿菌科に属している細菌であることが特に好まれる。第１の微生物の選択（微細藻類に対して乳酸桿菌）は、増殖速度に厳しく依存した。培地中のほとんどの主成分を代謝し、濃縮することが望ましいので、より遅い増殖速度の理由で微細藻類を選択した。この発明の目的の場合、２種の生物を好気的に増殖させた。保存培養を、トリプトン、酵母抽出物、濾過乳漿抽出物（ｐＨ７．０）、および寒天（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する培地で維持した。元の保存培養を、ＮａＮＯ3（２５％）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（２．５％）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（７．５％）、Ｋ2ＨＰＯ4（７．５％）、ＫＨ2ＰＯ4（１７．５％）、ＮａＣｌ（２．５％）、ＫＯＨ（３１％）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（４．９８％）、Ｈ2ＳＯ4（１％）およびＨ3ＢＯ3（１１．４２％）を含む培地を用いて振盪フラスコ中で増殖させた。培地成分に加えて、補足増殖因子、たとえばアミノ酸、ビタミン混合物およびミネラルが、増殖培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に添加された。消泡剤シグマ乳剤Ｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をプロセスの全体を通して使用した。
【００５８】
バイオリアクタ
振盪フラスコ試験による処理の最適化の後、プロセスを２Ｌおよび１５Ｌ発酵段階に拡大した（２Ｌ：Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪおよび１５Ｌ：Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）。微細藻類を、二酸化炭素に富んだ環境で増殖させた。二酸化炭素のレベルを制御し、二次代謝産物の発現のために、バイオリアクタに空気を散布した。状態を、滅菌可能なＤＯプローブによって絶えず観察し、環境を、２５０〜６００ｒｐｍの最大速度で細胞および培地を撹拌することによって維持した。空気速度を１．０〜２．０ＶＶＭ（空気容積／容器容積／分）に設定した。本発明の複式発酵抽出物を産生するために、ウルケニア種培養物を、２０℃〜２４℃、最も好ましくは２１℃で増殖させた。この発明の目的のために、発酵槽中で２種の生物を同時に増殖させた（第２の微生物Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを、第１の微生物の存在下で増殖させた）。栄養培地が制限されている場合、発酵プロセス中の特定の時点でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを植菌し（第１の生物を接種後９６〜３８８時間）、それによって、閉鎖環境における栄養分の競合を引き起こさせた。特に閉鎖系、たとえばバイオリアクタで増殖する場合、栄養制限段階で第２の微生物Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを導入する影響は、２つの生物の間に競合的な「生存型」応答を誘発する。増殖および栄養分の枯渇について連続的に培地を観察した（オンライン観察による、光学的密度測定）。栄養制限および二酸化炭素欠乏によって第１の生物にストレスを誘導し、その後に第２の微生物を導入した。
【００５９】
最終的な複式発酵抽出物は、バイオマスを分離し、２種の生物の細胞外分泌物から有効成分を抽出することによって得られた。複式発酵抽出物は、濾過によってさらに精製されてもよい。複式発酵抽出物は、当業者に公知の選択的分子量膜濾過によってさらに濃縮できる。水性媒体中の複式発酵物抽出物の最終濃度は、少なくとも０．０１％である。より好ましくは、複式発酵抽出物の濃度は、少なくとも０．１％である。フェノキシエタノールを、０．５〜１．１％の濃度で防腐剤として使用した（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【００６０】
例６−インビトロでの角質層破壊モデルにおいて例５の複式発酵物に対する個々の生物の発酵抽出物を比較するインビトロ評価。
【００６１】
例５のＭａｔＴｅｋ（登録商標）全層皮膚組織モデル上で組織学的変化について例５の複式発酵抽出物を評価した。この皮膚モデルは、線維芽細胞に埋め込まれたコラーゲン基質上で増殖した高度に分化したケラチノサイトからなり、例４に記載の通り維持された。次の日に、４ｍｍ生検パンチを使用して組織の表皮層だけを除去することによって組織を傷つけた。組織を傷つけた後、朝および午後に２日間連続で組織に新鮮な試験材料１００μＬを適用した。古い試験材料を除去し、組織をＰＢＳ  １００μＬで一度すすいだ後に、新たな試験物質を適用した。組織を傷つけた後、朝および午後に７日間連続で組織に新鮮な試験材料１００μＬを適用した。古い試験材料を除去し、組織をＰＢＳ  １００μＬで一度すすいだ後に、新たな試験物質を適用し、適用の間組織をインキュベートした。
【００６２】
処理時間の最後に、組織をＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ  ＭＢ中で３時間固定した。次いで、組織を処理して固形パラフィンに包埋し、５μｍに切片化し、固定した。次いで、一次抗体またはビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク質のいずれかを使用してスライドをプローブし、特異的タンパク質活性に対して染色した。ＱｉＣｌｉｃｋ撮像カメラを備えている蛍光顕微鏡を使用して組織を見た。次いで、ＱＣａｐｔｕｒｅソフトウェアを使用して、顕微鏡画像を取り込んだ。
【００６３】
以下の例５のサンプルを、インビトロでの角質層破壊モデルで評価した：
１．無処理
２．レチノール５０ｎｍ
３．例５の複式発酵物２％
カスパーゼ１４およびヒアルロン酸アッセイ
以下のような処理についての解説および説明と共に、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃならびに図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに組織学的画像を提示する。ヒアルロン酸評価の画像が、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示される（ヒアルロン酸は選択的に染色され、明領域として図に示す）。一方で、カスパーゼ−１４研究の画像が、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示される（カスパーゼ−１４は選択的に染色され、明領域として示される）。損傷部位における表皮の端、損傷の開口部および下の皮層の全てが見えるように、損傷の端で画像を得た。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃにおけるヒアルロン酸ならびに図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃにおけるカスパーゼ−１４が、損傷表皮の前縁に沿って明領域として示される。小さい白い点は、細胞である。
【００６４】
図６Ａに示す無処理の対照および図６Ｂに示すレチノール陽性対照と比較して、例５の複式発酵物が図６Ｃに示すヒアルロン酸タンパク質の統計的に有意な上方制御を示すことをインビトロでの角質層破壊モデルの結果は示している。図７Ａに示す無処理の対照および図７Ｃに示すレチノール陽性対照と比較して、例５の複式発酵物が図７Ａに示すカスパーゼ−１４タンパク質の統計的に有意な上方制御を示すことをインビトロでの角質層破壊モデルの結果は示している。両方の研究において、個々の対照サンプルは、無処理の対照と比較して統計的有意性を示さなかった。
【００６５】
例７−抗加齢の利点に対する例５の複式発酵物抽出物のインビボでの評価
顔面スキンケア産物において、単純盲検臨床評価および例５の複式発酵物の有効性の比較をプラセボと対比して評価した。顔面産物を１日に２回適用しながら６０日間研究を実行した。７日間のウオッシュアウト期間の後に研究を開始し、０日目、３０日目および６０日目に結果を取り込んだ。処理群は、以下の通りに示される：
ａ．試験産物Ａ：プラセボ（例Ａ）
ｂ．試験産物Ｂ：例５の複式発酵物２％
皮膚弾力性の定量的測定のためのキュートメータ、小じわおよびしわならびに皮膚障壁機能の保護の定量的評価のためのシリコーン複製を含めたいくつかの基準をインビボで評価した。図８に示すように、重量で２％の例５の複式発酵物は、プラセボと比較して、皮膚弾力性において統計的に有意な改善を示した。加えて、図９Ａおよび９Ｂに示すように、例５の複式発酵物は、小じわおよびしわにおいて統計的に有意な改善を示した。図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、例５の複式発酵物の局所適用が、小じわおよびしわにおいて統計的に有意な改善を示すことを、眼周囲領域におけるシリコーン複製も示している。
【００６６】
次に、例１を使用して調製される複式発酵抽出物を用いて本発明に従って調製可能なスキンケア組成物の例を挙げる。
【００６７】
例示的組成物Ａ
下記例は、例１に開示の通り調製される複式発酵抽出物を組み込んだ、高内相油中水型乳剤を有する、表Ａの構成成分を混合することにより作製可能な組成物を示す。
【表２】
2014530890.tif 000006
【００６８】
例示的組成物Ｂ
下記例は、表Ｂの構成成分を混合することにより例１に開示の通り調製される複式発酵抽出物を組み込んだ、水中油型クリーム粘稠性を有する作製可能な組成物を示す。
【表３】
2014530890.tif 000007
【００６９】
例示的組成物Ｃ
下記例は、表Ｃの構成成分を混合することにより調製可能な、例１に開示の通り調製される複式発酵抽出物を組み込んだ、アルコールローションになる組成物を示す。
【表４】
2014530890.tif 000008
【００７０】
例Ｄ
下記例は、表Ｄの構成成分を混合することにより調製可能な、例１に開示の通り調製される複式発酵抽出物を含有する、ミクロン以下の乳剤濃縮物になる組成物を示す。
【表５】
2014530890.tif 000009
【００７１】
例Ｅ
下記例は、表Ｅの構成成分を混合することにより調製可能な、例１に開示の通り調製される複式発酵抽出物を含有する、水性組成物を示す。
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014530890.tif 000015
【図６Ａ】
2014530890.tif 000016
【図６Ｂ】
2014530890.tif 000017
【図６Ｃ】
2014530890.tif 000018
【図７Ａ】
2014530890.tif 000019
【図７Ｂ】
2014530890.tif 000020
【図７Ｃ】
2014530890.tif 000021
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2014530890.tif 000025
【図１０Ａ】
2014530890.tif 000026
【図１０Ｂ】
2014530890.tif 000027
【国際調査報告】
2014530890.tif 000028
2014530890.tif 000029
2014530890.tif 000030
2014530890.tif 000031