(57)【要約】  本発明の主題は、敗血症患者における治療フォローアップのためインビトロ方法であって、ここで、該敗血症患者の体液サンプル中の成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの濃度がアッセイを用いて測定され、該アッセイは、配列番号１のアミノ酸２１−５２−ａｍｉｄまたは配列番号２のアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙである、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、該領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含む。本発明の主題は、さらなるアッセイおよび較正方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症を有する疑いのある患者における治療フォローアップのためのインビトロの方法であって、ここで、前記敗血症患者の体液サンプル中の成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの濃度がアッセイを用いて測定され、前記アッセイは、アミノ酸２１−５２−ａｍｉｄ（配列番号１）またはアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙ（配列番号２）である、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、前記領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含む、前記方法。
【請求項２】
前記結合剤のうちの１つが、成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの以下の配列（配列番号４）内に含まれる領域に結合し、さらにここで、これらの結合剤のうちの第２のものが、成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの以下の配列（配列番号５）内に含まれる領域に結合する、請求項１に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項３】
前記アッセイのアッセイ感度が、健康な対象のＡＤＭを定量することができ、１０ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは、４０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは７０ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項１または２に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項４】
前記結合剤が、少なくとも１０7Ｍ-1の成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙに対する結合親和性を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項５】
前記結合剤が、抗アドレノメジュリン抗体またはＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体断片またはアドレノメジュリンに結合する非Ｉｇスカフォールドを含む群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項６】
前記アッセイが、サンドイッチアッセイ、好ましくは完全自動化アッセイである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項７】
前記２つの結合剤のうちの少なくとも１つが、検出されるために標識される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項８】
前記２つの結合剤のうちの少なくとも１つが固相に結合される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項９】
前記標識が、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される、請求項７に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１０】
前記サンプル中で測定される成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの濃度が、１０〜５００ｐｇ／ｍｌの間の範囲にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１１】
閾値が適用され、それによって閾値を超える値は、治療に対して反応しないかまたは反応が悪い患者の指標であり、一方、前記閾値未満の値は、治療に反応する患者の指標である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１２】
６０〜８０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｐｇ／ｍｌの閾値が適用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、ヒトクエン酸血漿、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、全血を含む群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１４】
採取された前記サンプルが、さらにいかなるサンプル調製もせずに直接測定される、請求項１３に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１５】
前記方法が、完全に自動化された装置において実施される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１６】
成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙが、少なくとも２つのサンプルにおいて測定され、ここで、前記サンプルが、前記敗血症患者から異なる時点で採取される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１７】
測定されるサンプル体積が、５０μｌ以下である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロ方法。
【請求項１８】
サンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイであって、配列番号１のアミノ酸２１−５２−ａｍｉｄまたは配列番号２の成熟アドレノメジュリンのアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙである、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、前記領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含み、さらにここで、前記アッセイが手動のコーテッド・チューブ・アクリジニウムエステル・サンドイッチアッセイではない、前記アッセイ。
【請求項１９】
サンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイであって、アミノ酸２１−５２−ａｍｉｄ（配列番号１）または成熟アドレノメジュリンのアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙ（配列番号２）である、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、前記領域のそれぞれが少なくとも４または５個を含み、さらにここで、前記アッセイが手動のコーテッド・チューブ・アクリジニウムエステル・サンドイッチアッセイであり、さらにここで、前記結合剤のうちの１つが配列番号６のＣＴＶＱＫＬＡＨＱＩＹＱに結合する抗体であり、さらにここで、前記結合剤のうちの第２のものが配列番号７のＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＣＯ−ＮＨ２に結合する抗体である、前記アッセイ。
【請求項２０】
前記結合剤のうちの１つが、成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの以下の配列（配列番号４）内に含まれる領域に結合し、さらにここで、これらの結合剤のうちの第２のものが成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの以下の配列（配列番号５）内に含まれる領域に結合する、請求項１８に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２１】
前記アッセイのアッセイ感度が、健康な対象のＡＤＭを定量することができ、１０ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは７０ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２２】
前記結合剤が、少なくとも１０7Ｍ-1のアドレノメジュリンへの結合親和性を示す、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２３】
前記結合剤が、抗アドレノメジュリン抗体またはＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体断片またはアドレノメジュリンに結合する非Ｉｇスカフォールドを含む群から選択される、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２４】
前記アッセイが、サンドイッチアッセイ、好ましくは完全自動化アッセイである、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２５】
前記２つの結合剤のうちの少なくとも１つが、検出されるために標識される、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２６】
前記２つの結合剤のうちの少なくとも１つが、固相に結合される、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２７】
前記標識が、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載のサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイ。
【請求項２８】
前記アッセイの構成要素が１つまたは複数の容器に含まれることができる、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載のアッセイを含むキット。
【請求項２９】
成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの１位〜１６位のアミノ酸（配列番号８）内の少なくとも５個のアミノ酸の領域に結合する結合剤が使用される、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載のアッセイの較正方法。
【請求項３０】
結合剤が、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−ＧｌｙのＮ末端を認識して結合する、請求項２９に記載のアッセイの較正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロの方法であって、ここで、該敗血症患者の体液サンプル中の成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの濃度がアッセイを用いて測定され、該アッセイは、配列番号１のアミノ酸２１−５２−ａｍｉｄまたは配列番号２のアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙである、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、該領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含む。本発明の主題は、さらなるアッセイおよび較正方法である。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドアドレノメジュリン（ＡＤＭ）は、ヒト褐色細胞腫から単離された５２個のアミノ酸を含む新規降圧ペプチドとして、Ｋｉｔａｍｕｒａら（参照１；数字データは、参考文献の添付リストに基づく）中で最初に記載された。同年、１８５個のアミノ酸を含む前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡおよびこの前駆体ペプチドの完全なアミノ酸配列も記載された。中でもＮ末端に２１個のアミノ酸のシグナル配列を含む前駆体ペプチドは、「プレプロアドレノメジュリン」（プレ−プロＡＤＭ）と呼ばれる。プレ−プロＡＤＭは、１８５個のアミノ酸を含み、配列番号３のとおりの配列を有する。成熟ＡＤＭは、配列番号４に示され、成熟ＡＤＭ−Ｇｌｙは、配列番号５に示される。
【０００３】
ペプチドアドレノメジュリン（ＡＤＭ）は、５２個のアミノ酸を含むペプチドであり（配列番号２）、プレ−プロＡＤＭの９５位〜１４６位のアミノ酸を含み、タンパク質切断によってそれから形成される。これまで、プレ−プロＡＤＭの切断において形成されるペプチド断片のうちの実質的に少数の断片、特に、生理活性ペプチドアドレノメジュリン（ＡＤＭ）および「ＰＡＭＰ」、プレ−プロＡＤＭ中のシグナルペプチドの２１個のアミノ酸に続く２０個のアミノ酸（２２位〜４１位）を含むペプチド、しか正確に特徴づけされていない。ＡＤＭおよびＰＡＭＰの両方については、生理活性を有するサブフラグメントがさらに発見され、より詳細に研究された。１９９３年におけるＡＤＭの発見と特徴づけは、集中的な研究活動および大量の論文のきっかけとなり、その結果は最近、様々な総説において要約されており、本明細書の関係においては、ＡＤＭに当てられた「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」の号（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２（２００１））、特に（２）および（３）中の論文が特に参照される。さらなる総説は、（４）である。これまでの科学的研究においては、中でも、ＡＤＭが多機能性調節ペプチドと見なされうることが分かっている。それは、グリシンによって伸長された不活性形態で循環中に放出される（５）。ＡＤＭに特異的な結合タンパク質（６）もあり、おそらく同様にＡＤＭの作用を調節する。
【０００４】
これまでの研究において最も重要なＡＤＭ並びにＰＡＭＰの生理作用は、血圧に影響を及ぼす作用であった。したがって、ＡＤＭは有効な血管拡張因子であり、特にＡＤＭのＣ末端部中のペプチド部分と血圧降下作用を関連づけることができる。
【０００５】
さらに、プレ−プロＡＤＭから形成される上記のさらなる生理活性ペプチドＰＡＭＰが、ＡＤＭとは異なる作用メカニズムを有するようであるとしても、同様に血圧降下作用を示すことが発見された（上記の総説（３）および（４）に加えて、（７）、（８）または（９）および（１０）も参照のこと）。
【０００６】
多数の病理学的状態において、循環および他の体液中で測定可能なＡＤＭの濃度が健康な対照人における濃度よりも顕著に高いことがさらに発見された。したがって、うっ血性心不全、心筋梗塞、腎臓病、高血圧性障害、糖尿病を有する患者、ショックの急性相および敗血症および敗血症性ショックにおけるＡＤＭレベルは、程度は様々であっても顕著に増加している。ＰＡＭＰ濃度も、上記病理学的状態のいくつかにおいて増加するが、血漿レベルはＡＤＭに比べて減少している（（３）；１７０２頁）。
【０００７】
さらに、敗血症または敗血症性ショックにおいて異常に高濃度のＡＤＭが観察されることが知られている（（３）および（１１）、（１２）、（１３）、（１４）および（１５）を参照のこと）。この知見は、敗血症およびＳＩＲＳなどの他の重篤な症候群を有する患者における病気の経過の典型的な現象として知られている典型的な血行動態変化に関連する。
【０００８】
ＡＤＭおよびＰＡＭＰは、これらのペプチドに対応するアミノ酸配列が等モル量の部分ペプチドとしてその中に存在する同じ前駆体ペプチド、プレ−プロＡＤＭ（配列番号３）から形成されると推測されるが、体液中で測定可能なＡＤＭまたはＰＡＭＰの濃度は明らかに異なる。これは珍しいことではない。
【０００９】
したがって、1つの同じ前駆体ペプチドの異なる分解産物の測定可能な濃度は異なる可能性があり、それは例えば、それらが異なる病理学的状態の場合などの、前駆体ペプチドの異なる断片化、したがって、異なる分解産物をもたらす異なる競合分解経路の結果だからである。前駆体ペプチド中に含有されるある部分ペプチドは、遊離ペプチドとして形成されるかもしくは形成されないかもしれず、および／または異なるペプチドは異なる方法で異なる量で形成されうる。前駆体ペプチドをプロセシングするために単一の分解経路のみが用いられ、したがって、すべての分解産物が1つの同じ前駆体ペプチドに由来し、本来それら自体が等モル量で形成されなければならないとしても、体液中で測定可能な異なる部分ペプチドおよび断片の定常状態濃度は非常に異なる可能性があり、それはすなわち、それらの個々のものが異なる速度で形成され、および／または各体液中での異なる個々の安定性（寿命）を有する場合、あるいは、それらが異なるクリアランスメカニズムに基づいて、および／または異なるクリアランス速度で循環から除去される場合などである。
【００１０】
アドレノメジュリンは、敗血症発症の間（（１６）、（１７））、ならびに多くの急性および慢性疾患（（１８）、（４））において重要な役割を演じる。
【００１１】
ＡＤＭは敗血症において上昇し、敗血症の転帰を予後予測する（（１９）、（１４）、（１１））。治療の成功または失敗の早期モニタリングのための敗血症治療のフォローアップは、実質的に満たされない臨床ニーズのままである。
【００１２】
現在、日常的診断に好適なＡＤＭアッセイはない。成熟ＡＤＭを測定するために現在利用可能な試験の感度は低すぎる。したがって、分析のためには多量の血漿が必要とされる。さらに、現在利用可能なアッセイは安定性に関連した分析前の制約を示し、例えば、サンプルがアプロチニンによって安定化される必要がある。（（２０）、（２１））。その上、いくつかのＡＤＭアッセイは測定前に大規模なサンプル調製を必要とする（（１１））。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、標準的な自動化された検査室およびポイント・オブ・ケア技術（point of care technologies）に適した、成熟ＡＤＭの直接測定のための日常的方法に適したアッセイを提供することである。
【００１４】
驚くべきことに、そのようなアッセイは敗血症患者における治療フォローアップのために使用可能であることがわかった。
【００１５】
本発明の主題は、敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロの方法であって、ここで、該敗血症患者の体液サンプル中の成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの濃度がアッセイを用いて測定され、該アッセイは、配列番号１のアミノ酸２１−５２−ａｍｉｄまたは配列番号２のアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙである、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、該領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含む。
【００１６】
本発明の一実施態様において、主題は、敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロの方法であって、ここで、上記結合剤のうちの1つが成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの以下の配列内に含まれる領域に結合し：
【００１７】
【化１】
2014533827.tif 000002
【００１８】
さらにここで、これらの結合剤のうちの第２のものが成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの以下の配列内に含まれる領域に結合する：
【００１９】
【化２】
2014533827.tif 000003
【００２０】
本発明の一実施態様において、上記アッセイのアッセイ感度は、健康な対象のＡＤＭを定量することができ、１０ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは、４０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは７０ｐｇ／ｍｌ未満である。
【００２１】
本発明の一実施態様において、上記結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、１０8Ｍ-1の成熟ＡＤＭおよび／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙに対する結合親和性を示し、好ましい親和性は、１０9Ｍ-1超、最も好ましくは、１０10Ｍ-1超である。当業者は、より高用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を補うことが考えられ、この手段が本発明の範囲を逸脱するものではないと知っている。
【００２２】
アドレノメジュリンへの抗体の親和性を決定するために、固定化抗体へのアドレノメジュリンの結合のキネティクスが、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる無標識の表面プラズモン共鳴によって測定された。抗体の可逆的固定化は、高密度でＣＭ５センサー表面に共有結合した抗マウスＦｃ抗体を用いて、製造者の指示に従って実施された（マウス抗体捕捉キット；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、（２２）。
【００２３】
本発明の一実施態様において、上記結合剤は、抗アドレノメジュリン抗体またはＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体断片またはアドレノメジュリンに結合する非Ｉｇスカフォールドを含む群から選ばれる。
【００２４】
治療フォローアップは、ＡＤＭ成熟１−５２（配列番号４）および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙ（配列番号５）の濃度が、治療開始後に少なくとも１回、好ましくは１回よりも多く、好ましくは１日に２回または１回、サンプル中で測定されることを意味する。
【００２５】
本発明の一実施態様において、それは、完全自動化アッセイシステムを必要とせずに、患者の近くで１時間未満内で試験を実施することを可能とする試験技術である、所謂ＰＯＣ−試験（ポイント・オブ・ケア）であることができる。この技術の一例は、免疫クロマトグラフィー試験技術である。
【００２６】
本発明の一実施態様において、そのようなアッセイは、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識を含むが、それらに限定されない任意の種類の検出技術を用いるサンドイッチイムノアッセイ、好ましくは完全自動化アッセイである。本発明の一実施態様において、そのようなアッセイは、酵素標識サンドイッチアッセイである。自動化または完全自動化アッセイの例は、以下のシステム：Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ  Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ  Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）のうちの１つのために使用されうるアッセイを含む。
【００２７】
多様なイムノアッセイが知られており、本発明のアッセイおよび方法のために使用されることができ、これらは、以下の：ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）、均一酵素増殖イムノアッセイ（「ＥＭＩＴ」）、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）、アポ酵素再活性化イムノアッセイ（「ＡＲＩＳ」）、ディップスティックイムノアッセイおよび免疫クロマトグラフィーアッセイを含む。
【００２８】
本発明の一実施態様において、上記２つの結合剤のうちの少なくとも１つが、検出されるために標識される。
【００２９】
好ましい検出方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光発光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づくビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイなどの多様なフォーマット、および例えば、免疫クロマトグラフィーストリップテスト（immunochromatographic strip test）などの迅速試験フォーマットのイムノアッセイを含む。
【００３０】
好ましい実施態様において、上記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選ばれる。
【００３１】
アッセイは、均一または不均一アッセイ、競合的および非競合的アッセイであることができる。一実施態様において、アッセイは、サンドイッチアッセイの形態であり、これは、検出および／または定量される分子が第一抗体および第二抗体に結合される、非競合的イムノアッセイである。第一抗体は、ビーズ、ウエルまたは他の容器の表面、チップまたはストリップなどの固相に結合されることができ、第二抗体は、色素、放射性同位体または反応性もしくは触媒活性を有する部分で標識された抗体である。次いで、分析物に結合した標識抗体の量が適切な方法で測定される。「サンドイッチアッセイ」にかかわる一般的な組成物および手順は、よく確立されており、当業者に知られている（２３）。
【００３２】
別の実施態様において、アッセイは、２つの捕捉分子、好ましくはどちらも液体反応混合物中に分散体として存在する抗体、を含み、ここで、分析物への両捕捉分子の結合に際して、サンプルを含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能とする測定可能なシグナルが生成されるように、第一標識構成要素が第一捕捉分子に結合され、ここで、該第一標識構成要素は蛍光または化学発光の消光または増幅に基づく標識システムの一部であり、そして、上記マーキングシステムの第二標識構成要素が第二捕捉分子に結合される。
【００３３】
別の実施態様において、上記標識システムは、レアアースクリプテートまたはレアアースキレートを、蛍光色素または化学発光色素、特にシアニンタイプの色素とともに含む。
【００３４】
本発明の関係において、蛍光に基づくアッセイは色素の使用を含み、それは例えば、ＦＡＭ（５−または６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン（Fluorescein）、フルオレセインイソチオシアネート（Fluoresceinisothiocyanate）（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７などのシアニン（Cyanine）色素、キサンテン（Xanthen）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトジフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン（Rhodamine）、ローダミングリーン（Rhodamine Green）、ローダミンレッド（Rhodamine Red）、ローダミン１１０（Rhodamine 110）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、オレゴン・グリーン（Oregon Green）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅなどのクマリン（Coumarines）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８などのベンズイミド（Benzimides）；テキサス・レッド（Texas Red）、ヤキマ・イエロー（Yakima Yellow）、アレクサ・フルオル（Alexa Fluor）などのフェナントリジン（Phenanthridines）、ＰＥＴ、臭化エチジウム（Ethidiumbromide）、アクリジニウム（Acridinium）色素、カルバゾール（Carbazol）色素、フェノキサジン（Phenoxadine）色素、ポルフィリン（Porphyrine）色素、ポリメチン（Polymethin）色素などを含む群から選ばれる。
【００３５】
本発明の関係において、化学発光に基づくアッセイは、化学発光材料について（２４）に記載された物理的原理に基づく色素の使用を含む。好ましい化学発光色素は、アクリジニウムエステルである。
【００３６】
本明細書中で言及されるとおり、「アッセイ」または「診断アッセイ」は、診断の分野において適用される任意のタイプのものであることができる。そのようなアッセイは、検出される分析物の１つまたは複数の捕捉プローブへの一定の親和性による結合に基づくことができる。捕捉分子と標的分子または着目の分子の間の相互作用に関しては、結合定数が１０8Ｍ-1超であることが好ましい。
【００３７】
本発明の関係において、「結合剤分子」は、標的分子または着目の分子、すなわち、サンプル由来の分析物（すなわち、本発明の関係においては、ＰＣＴおよびその断片）を結合するために使用されることができる分子である。したがって、結合剤分子は、標的分子または着目の分子を特異的に結合するために、空間的にならびに表面電荷、疎水性、親水性、ルイスドナーおよび／またはアクセプターの存在または不存在などの表面の特徴に関して適切に形作られなければならない。これによって、結合は、例えば、イオン性、ファン・デル・ワールス、ｐｉ−ｐｉ、シグマ−ｐｉ、疎水性または水素結合相互作用、あるいは捕捉分子と標的分子または着目の分子の間の上記相互作用のうちの２つ以上の組合せによって仲介されることができる。本発明の関係において、結合剤分子は、例えば、核酸分子、炭化水素分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチドまたは糖たんぱく質を含む群から選ばれることができる。好ましくは、結合剤分子は、標的または着目の分子への十分な親和性を有するその断片を含む抗体であり、組換え抗体または組換え抗体断片、ならびに少なくともその１２個のアミノ酸の長さを有する、該変異鎖由来の上記抗体または断片の化学的および／または生化学的に修飾された誘導体を含む。
【００３８】
化学発光標識は、アクリジニウムエステル標識、イソルミノール標識を含むステロイド標識などであることができる。
【００３９】
酵素標識は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、酸ホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどであることができる。
【００４０】
本発明の一実施態様において、上記２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、磁性粒子としての固相、およびポリスチレン表面に結合される。
【００４１】
本発明の一実施態様において、サンプル中で測定される成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙの濃度は、血漿または血液中で１０〜５００ｐｇ／ｍｌの間の範囲にある。
【００４２】
本発明のＡＤＭレベルは、記載されたＡＤＭアッセイによって測定された。上記値は、その較正方法によって検出される分析物の検出される分析物の検出される分析物の他のＡＤＭアッセイにおいては異なるかもしれない。上記値は、較正における相違を考慮し、それに応じてそのような異なる方法で較正されたＡＤＭアッセイに適用されなければならない。ＡＤＭアッセイは、それらの正常範囲（健康な集団）を介する相関および調整によって較正可能である。或いは、異なる較正の調整のために、市販の対照サンプルが使用されうる（ＩＣＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。記載されたＡＤＭアッセイによって、正常な集団の中央値は２４．７ｐｇ／ｍＬと測定された。
【００４３】
本発明の一実施態様において、閾値が適用され、それによって閾値を超える値は、治療に対して反応しないかまたは反応が悪い患者の指標であり、一方、該閾値未満の値は、治療に反応する患者の指標である。
【００４４】
本発明の一実施態様において、６０〜８０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｐｇ／ｍｌの閾値が適用される。
【００４５】
本発明の一実施態様において、上記サンプルは、ヒトクエン酸血漿、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、全血を含む群から選ばれる。
【００４６】
本発明の一実施態様において、採取された上記サンプルは、さらにいかなるサンプル調製もせずに直接測定される。
【００４７】
本発明の一実施態様において、上記方法は、完全に自動化された装置において実施される。Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ  Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ  Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）。
【００４８】
本発明の一実施態様において、成熟ＡＤＭ  １−５２および／または成熟ＡＤＭ  １−５２−Ｇｌｙは、少なくとも２つのサンプルにおいて測定され、ここで、該サンプルは、上記敗血症患者から異なる時点で採取される。該サンプルは、治療期間中に１日１回採取されることができる。例えば、（２５）そして（２６）にも記載された他のバイオマーカーについての診断レジメンが適用されることができる。
【００４９】
本発明の一実施態様において、測定されるサンプル体積は、５０μｌ以下である。
【００５０】
本発明による敗血症患者における治療フォローアップのためのインビトロの方法は、さらなる臨床および／または検査室パラメータおよび／またはＡｐａｃｈｅ  ２スコア、ＳＯＦＡスコアもしくは他のものなどの臨床スコア、または該スコア中に含まれる１つ以上のパラメータと組合せられることができる。変数／パラメータは、標準的統計ツールを用いて、連続的または不連続的に組合せられうる。
【００５１】
本発明の主題は、さらに、サンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイであって、該アッセイは、配列番号１のアミノ酸２１−５２−ａｍｉｄまたは配列番号２の成熟アドレノメジュリンのアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙである、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、該領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含み、さらにここで、上記アッセイが手動のコーテッド・チューブ・アクリジニウムエステル・サンドイッチアッセイ（coated-tube-Akridiniumester sandwich assay）ではない。
【００５２】
本発明の主題は、さらに、サンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイであって、配列番号１のアミノ酸２１−５２−ａｍｉｄまたは配列番号２の成熟アドレノメジュリンのアミノ酸２１−５２−Ｇｌｙである、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、該領域のそれぞれが少なくとも４または５個のアミノ酸を含み、さらにここで、上記アッセイが手動のコーテッド・チューブ・アクリジニウムエステル・サンドイッチアッセイであり、さらにここで、上記結合剤のうちの１つが配列番号４に結合する抗体であり、さらにここで、上記結合剤のうちの第２のものが配列番号７（ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＣＯ−ＮＨ２）に結合する抗体である。
【００５３】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、上記結合剤のうちの１つは、成熟ＡＤＭの以下の配列内に含まれる領域に結合し：
【００５４】
【化３】
2014533827.tif 000004
【００５５】
さらにここで、これらの結合剤のうちの第２のものが成熟ＡＤＭの以下の配列内に含まれる領域に結合する：
【００５６】
【化４】
2014533827.tif 000005
【００５７】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、該アッセイのアッセイ感度は健康な対象のＡＤＭを定量することができ、１０ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは７０ｐｇ／ｍｌ未満である。
【００５８】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、上記結合剤は、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは１０8Ｍ-1のアドレノメジュリンへの結合親和性を示し、好ましい結合定数は、１０9Ｍ-1超、最も好ましくは１０10Ｍ-1超である。当業者は、より高用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を補うことが考慮でき、この手段が本発明の範囲を逸脱するものではないと知っている。結合親和性は、上記のとおりに決定されることができる。
【００５９】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、上記結合剤は、抗アドレノメジュリン抗体またはＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体断片またはアドレノメジュリンに結合する非Ｉｇスカフォールドを含む群から選ばれる。
【００６０】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、そのようなアッセイは、サンドイッチアッセイ、好ましくは完全自動化アッセイである。それは、完全自動化または手動のＥＬＩＳＡであることができる。それは、所謂ＰＣＴ−試験（ポイント−オブ−ケア）であることができる。自動化または完全自動化アッセイの例は、以下のシステム：Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ  Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ  Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）のうちの１つのために使用されうる。試験フォーマットの例は上記に提供される。
【００６１】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、上記２つの結合剤のうちの少なくとも１つが、検出されるために標識される。標識の例は上記に提供される。
【００６２】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、上記２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、固相に結合される。固相の例は上記に提供される。
【００６３】
本発明によるサンプル中の成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙを測定するためのアッセイの一実施態様において、上記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選ばれる。
【００６４】
本発明のさらなる主題は、本発明によるアッセイを含むキットであって、ここで、該アッセイの構成要素は１つまたは複数の容器中に含まれることができる。
【００６５】
本発明のさらなる主題は、本発明によるアッセイの較正方法であって、ここで、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの１位〜１６位のアミノ酸（配列番号８）内の少なくとも５個のアミノ酸の領域に結合する結合剤、好ましくは抗体が使用される。該結合剤は、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−Ｇｌｙの１位〜１６位のアミノ酸（配列番号８）内の少なくとも５個のアミノ酸の領域に結合する、抗体または抗体断片または非Ｉｇスカフォールドであることができる。
【００６６】
本発明によるアッセイの較正方法の一実施態様において、上記Ｎ末端抗体または断片またはスカフォールドは、成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−ＧｌｙのＮ−末端終端（ａａｌ）を認識して結合する成熟アドレノメジュリンおよび／またはアドレノメジュリン−ＧｌｙのＮ−末端終端（ａａｌ）を認識して結合する。これは、別の好ましい実施態様において、ＡＤＭのＮ末端終端が自由である場合、上記抗ＡＤＭ抗体または抗アドレノメジュリン抗体断片または非Ｉｇスカフォールドが成熟ＡＤＭ配列内の領域のみに結合することを意味する。該実施態様において、上記配列がプロ−ＡＤＭ内に含まれる場合、抗ＡＤＭ抗体または抗アドレノメジュリン抗体断片または非Ｉｇスカフォールドは、成熟ＡＤＭ配列内の領域に結合しないだろう。
【００６７】
本発明によるアッセイを較正するために好適な抗体は、ＡＤＭの吸着特性を緩和するような結合剤である。さらに、そのような結合剤は、検出アッセイにおいて使用される結合剤に適合性でなければならず、例えば、ＥＬＩＳＡの場合、該結合剤は、標識された結合剤と固相結合剤の結合を妨害してはならない。
【００６８】
本方法およびアッセイは、日常的応用に好適である。日常的応用は、ほとんどの場合、必要なサンプル体積が５０μｌを超えてはならないことを必要とする。日常的応用はまた、分析前の処理（ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿などのルーチンサンプルの使用）が最小またはゼロに維持されることを必要とする。分析前の必要条件は、臨床ルーチン：最小限の分析物安定性（９０％超の回収率）が室温において少なくとも２時間とする、に適合しなければならない。
【００６９】
本発明による抗体は、イムノグロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含む、抗原に特異的に結合するタンパク質である。認識されたイムノグロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ）、ガンマ（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4）、デルタ（ＩｇＤ）、イプシロン（ＩｇＥ）、およびミュー（ＩｇＭ）定常領域遺伝子、ならびにミリアッドイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。一般に、完全長イムノグロブリン軽鎖は約２５Ｋｄまたは２１４個のアミノ酸の長さである。一般に、完全長イムノグロブリン重鎖は約５０Ｋｄまたは４４６個のアミノ酸の長さである。軽鎖は、ＮＨ２末端では可変領域遺伝子（約１１０個のアミノ酸の長さ）およびＣＯＯＨ末端ではカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。重鎖は同様に、可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸の長さ）および他の定常領域遺伝子のうちの１つによってコードされる。
【００７０】
一般に、抗体の基本構造単位は、各対が１つの軽鎖と１つの重鎖を有する２つの同じイムノグロブリン鎖の対から成るテトラマーである。各対において、軽鎖および重鎖の可変領域が抗原に結合し、定常領域はエフェクター機能を仲介する。イムノグロブリンはまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）2、ならびに二機能性ハイブリッド抗体および一本鎖などを含む他の形態としても存在する（（２７）、（２８）、（２９）、（３０）、（３１））。イムノグロブリン軽鎖または重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）とも呼ばれる３つの超可変領域により中断されるフレームワーク領域を含む。（３２）を参照のこと。上記のとおり、ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。免疫複合体は、抗原に特異的に結合する、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体などの抗体または機能的抗体断片である。
【００７１】
キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的に遺伝子工学によって異なる種に属するイムノグロブリン可変および定常領域遺伝子から構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変部分が、カッパおよびガンマ１またはガンマ３などのヒト定常部分と結合されることができる。一例において、治療用キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変または抗原結合ドメインとヒト抗体由来の定常またはエフェクタードメインから成るこうしたハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種も使用可能であり、または可変領域は分子技術によって作り出されることもできる。キメラ抗体の作製方法は、本分野において周知であり、例えば、（３３）を参照のこと。「ヒト化」イムノグロブリンは、ヒトフレームワーク領域と（マウス、ラット、または合成などの）非ヒトイムノグロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含むイムノグロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒトイムノグロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒトイムノグロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施態様において、ヒト化イムノグロブリン中で、すべてのＣＤＲはドナーイムノグロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、それらはヒトイムノグロブリン定常領域に実質的に同一、すなわち、約９５％以上同一など、少なくとも約８５〜９０％同一でなければならない。したがって、ヒト化イムノグロブリンのおそらくＣＤＲ以外のすべての部分は、自然のヒトイムノグロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖イムノグロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化イムノグロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから取り込まれたアミノ酸による限られた数の置換を有することができる。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他のイムノグロブリン機能に実質的な影響を及ぼさない、追加の保存的アミノ酸置換を有しうる。代表的な保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒなどである。ヒト化イムノグロブリンは、遺伝子工学によって構築可能である（例えば、（３４）を参照のこと）。ヒト抗体は、軽鎖および重鎖遺伝子がヒト起源の抗体である。ヒト抗体は、本分野で知られた方法を用いて作り出すことが可能である。ヒト抗体は、着目の抗体を分泌するヒトＢ細胞を不死化することによって作製可能である。不死化は、例えば、ＥＢＶ感染またはヒトＢ細胞を骨髄腫またはハイブリドーマ細胞と融合してトリオーマ細胞を作製することによって達成可能である。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法によっても作製可能であるか（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる（３５）、（３６）、（３７）を参照のこと）、またはヒトコンビナトリアルモノクローナル抗体ライブラリー（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓウェブサイトを参照のこと）から選択可能である。ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を担持するトランスジェニック動物を用いても調製可能である（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる（３８）および（３９）を参照のこと）。
【００７２】
したがって、ＡＤＭ抗体は、本分野で知られたフォーマットを有することができる。例は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体である。好ましい実施態様において、本発明による抗体は、例えば、典型的な完全長イムノグロブリンであるＩｇＧ、またはＦａｂミニボディを含むＦａｂ断片、一本鎖Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ−Ｖ５Ｓｘ２などのエピトープタグを有する一価Ｆａｂ抗体を含むがこれらに限定されない化学結合抗体（抗原結合断片）などの、重鎖および／または軽鎖のＦ可変ドメインを少なくとも含む抗体断片；ＣＨ３ドメインと二量体化された二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂまたは例えば、ｄＨＬＸドメインの二量体化を介するなどの異種ドメインの助けによる多量体化を介して形成された、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２などの多価Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化多価または／および多選択性ｓｃＦｖ断片、二価および／または二選択性二特異性抗体、ＢＩＴＥ（登録商標）（二選択性Ｔ細胞エンゲージャー（engager））、三機能性抗体、Ｇ以外の異なるクラスに由来するなどの多価抗体；ラクダ類または魚類イムノグロブリン由来のナノボディーなどの単一ドメイン抗体および多くの他のものなどの組換え産生された抗体である。
【００７３】
標的分子を複合化するために、抗ＡＤＭ抗体に加えて他のバイオポリマースカフォールドが本分野で周知であり、高度に標的特異的なバイオポリマーの製造のために使用されてきた。例は、アプタマー、シュピーゲルマー（spiegelmers）、アンチカリン（anticalins）およびコノトキシン（conotoxins）である。
【００７４】
好ましい実施態様において、ＡＤＭ抗体フォーマットは、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片およびｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を含む群から選ばれる。別の好ましい実施態様において、抗体フォーマットは、ｓｃＦａｂ断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片およびＰＥＧペグ化断片などのバイオアベイラビリティーが最適化されたそのコンジュゲートを含む群から選ばれる。最も好ましいフォーマットの１つは、ｓｃＦａｂフォーマットである。
【００７５】
非Ｉｇスカフォールドは、タンパク質スカフォールドであることができ、それらがリガンドまたは抗原に結合可能であるために抗体模倣体として使用されることができる。非Ｉｇスカフォールドは、（例えば、（４０）に記載された）テトラネクチンに基づく非Ｉｇスカフォールド、（例えば、（４１）に記載された）フィブロネクチンスカフォールド；（例えば、（４２）に記載された）リポカリン（lipocalin）に基づくスカフォールド；（例えば、（４３）に記載された）ユビキチンスカフォールド；（例えば、（４４）に記載された）トランスファーリング・スカフォールド（transferring scaffold）；（例えば、（４５）に記載された）プロテインＡスカフォールド、（例えば、（４６）に記載された）アンキリンリピートに基づくスカフォールド、（例えば、（４７）に記載された）マイクロプロテイン（好ましくはシスチンノット形成性マイクロプロテイン）スカフォールド、（例えば、（４８）に記載された）Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインに基づくスカフォールド、（例えば、（４９）に記載された）ＥＧＦＲ−Ａ−ドメインに基づくスカフォールドおよび（例えば、（５９）に記載された）Ｋｕｎｉｔｚドメインに基づくスカフォールド）を含む群から選ばれる。
【００７６】
別の好ましい実施態様において、抗ＡＤＭ抗体またはＡＤＭに結合する抗体断片は、単一特異性抗体である。単一特異性抗体は、すべてが同じ抗原に対する親和性を有する抗体である。モノクローナル抗体は単一特異性であるが、単一特異性抗体は共通の細菌細胞からそれらを作製する以外の手段によっても作製されうる。
【００７７】
本発明の好ましい一実施態様において、本発明による抗体は、以下のように作製されうる：
Ｂａｌｂ／ｃマウスが、０日目および１４日目に（１００μｌの完全フロイントアジュバントに乳化された）１００μｇのＡＤＭ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートで、２１日目および２８日目に（１００μｌの不完全フロイントアジュバント中の）５０μｇで免疫化された。融合実験が実施される３日前に、動物は、１００μｌの生理食塩水に溶解した５０μｇのコンジュゲートを、１回は腹腔内、１回は静脈内注射として受容した。
【００７８】
免疫化マウスからの脾細胞および骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、３７℃で３０秒間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールにより融合させた。洗浄後、細胞を９６ウエルの細胞培養プレートに播いた。ＨＡＴ培地［２０％のウシ胎仔血清およびＨＡＴ−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地］中で培養することによって、ハイブリッドクローンが選択された。２週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に替えて３回継代し、続いて、ノーマル細胞培地に戻した。
【００７９】
細胞培養上清は、融合の３週間後、最初に抗原特異的ＩｇＧ抗体についてスクリーニングされた。陽性の被験ミクロ培養が、増殖のために２４ウエルプレートに移された。再検査後、選ばれた培養がクローニングされ、限界希釈技術を用いて再クローニングされ、アイソタイプが決定された（（５１）および（５２）も参照のこと）。
【００８０】
抗体は、以下の手順によるファージディスプレイによって作製されることができる：
アドレノメジュリンペプチドに対する組換え一本鎖Ｆ−可変ドメイン（ｓｃＦｖ）の単離のために、ヒトナイーブ抗体遺伝子ライブラリーＨＡＬ７／８が使用された。２つの異なるスペーサーを介してアドレノメジュリンペプチド配列に連結されたビオチンタグを含むペプチドの使用を含むパニングストラテジーにより、抗体遺伝子ライブラリーがスクリーニングされた。非特異的結合剤のバックグラウンドを最小限にするために、非特異的に結合された抗原とストレプトアビジンに結合された抗原を使用するパニングラウンドが組み合せて使用された。パニングの第３のラウンドから溶離されたファージが、モノクローナルｓｃＦｖを発現するＥ．コリ（E.coli）菌株の作製のために使用された。これらのクローン株の培養からの上清は、抗原ＥＬＩＳＡ試験のために直接使用された。（５３）および（５４）。
【００８１】
マウス抗体のヒト化は、以下の手順により実施されることができる：
マウス起源の抗体のヒト化のためには、相補性決定領域（ＣＤＲ）を伴うフレームワーク領域（ＦＲ）および抗原の構造的相互作用に関して抗体配列が分析される。構造的モデリングに基づいて、ヒト起源の適切なＦＲが選択され、マウスＣＤＲ配列がヒトＦＲ中に移植される。ＣＤＲまたはＦＲのアミノ酸配列の変化が、種の転換によりＦＲ配列に関して消滅した構造的相互作用を回復するために導入されることができる。構造的相互作用のこの回復は、ファージディスプレイライブラリーを用いるランダムアプローチまたは分子モデリングにより導かれる直接的アプローチを介して達成されうる（５５）。
【００８２】
抗体の開発
本発明者等は、ｈＡＤＭのＮ末端、中間領域およびＣ末端部分に結合するマウスモノクローナル抗体を開発し、それらの結合定数が決定された（表１）。
【００８３】
免疫化のためのペプチド
ペプチドは、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって供給された。ペプチドは、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ架橋法を用いてＢＳＡに結合された。架橋手順は、製造者の指示に従って実施された（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ／Ｐｉｅｒｃｅ）。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ＭＲ−ＡＤＭを固相抗体、ＣＴ−ＡＤＭを標識抗体として使用する、典型的なｈＡＤＭ用量／応答曲線を示す。
【図２】ＡＤＭアッセイを用いて健康な対象（ｎ＝１００、平均年齢５６歳）を測定した。中央値は２４．７ｐｇ／ｍｌ、最低値は１１ｐｇ／ｍｌ、９９パーセンタイル値は４３ｐｇ／ｍｌであった。アッセイ感度が２ｐｇ／ｍｌであったため、すべての健康な対象の１００％が記載されたＡＤＭアッセイを用いて検出可能であった。
【図３】院内死亡率の予測−ロジスティック回帰からの結果
【図４】院内死亡率の予測−ＡＤＭはＡｐａｃｈｅから独立して、追加の予後予測情報を提供する。
【図５】個々の患者のＡＤＭキネティクス。生存者、ＥＤ症状提示（１日目）および入院中、ＡＤＭは７０ｐｇ／ｍｌ未満である。ＡＤＭはよく治療された患者を示す。
【図６】個々の患者のＡＤＭキネティクス。生存者、ＥＤ症状提示（１日目）および入院中、ＡＤＭは７０ｐｇ／ｍｌ未満である。ＡＤＭはよく治療された患者を示す。
【図７】個々の患者のＡＤＭキネティクス。生存者、ＥＤ症状提示（１日目）においてＡＤＭは７０ｐｇ／ｍｌ超であり、院内治療中に７０ｐｇ／ｍｌ未満の値まで低下する（治療応答者）。
【図８】個々の患者のＡＤＭキネティクス。生存者、ＥＤ症状提示（１日目）においてＡＤＭは７０ｐｇ／ｍｌ超であり、院内治療中に７０ｐｇ／ｍｌ未満の値まで低下する（治療応答者）。
【図９】個々の患者のＡＤＭキネティクス。死亡患者、ＥＤ症状提示（１日目）においてＡＤＭは７０ｐｇ／ｍｌ超であり、入院治療中に７０ｐｇ／ｍｌ未満の値まで低下しない（治療非応答者）。
【図１０】個々の患者のＡＤＭキネティクス。死亡患者、ＥＤ症状提示（１日目）においてＡＤＭは７０ｐｇ／ｍｌ超であり、入院治療中に７０ｐｇ／ｍｌ未満の値まで低下しない（治療非応答者）。
【図１１】Ｎ末端抗体の存在下および非存在下におけるＡＤＭアッセイ。ＡＤＭアッセイを上記のように実施した。Ａ）参照曲線Ｂ）ＮＴ−ＡＤＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ、３．３３μｇ／試験）の存在下。ＮＴ−ＡＤＭ抗体の添加はＡＤＭアッセイに影響しなかった。
【００８５】
【化５】
2014533827.tif 000006
【００８６】
【化６】
2014533827.tif 000007
【００８７】
【化７】
2014533827.tif 000008
【００８８】
【化８】
2014533827.tif 000009
【００８９】
【化９】
2014533827.tif 000010
【００９０】
【化１０】
2014533827.tif 000011
【実施例】
【００９１】
実施例１
抗体の作製およびそれらの結合定数の測定
以下の方法によってマウス抗体を作製した：
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目および１４日目に（１００μｌの完全フロイントアジュバントに乳化した）１００μｇのペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲート、２１日目および２５日目に（１００μｌの不完全フロイントアジュバント中の）５０μｇにより免疫化した。融合実験実施の３日前に、動物は、１００μｌの生理食塩水に溶解したコンジュゲートを、１回は腹腔内、１回は静脈内注射として受容した。
【００９２】
免疫化マウスからの脾細胞および骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、３７℃で３０秒間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールにより融合させた。洗浄後、細胞を９６ウエルの細胞培養プレートに播いた。ＨＡＴ培地［２０％のウシ胎仔血清およびＨＡＴ−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地］中で培養することによって、ハイブリッドクローンを選択した。２週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に替えて３回継代し、続いて、ノーマル細胞培地に戻した。
【００９３】
細胞培養上清を、融合の３週間後、最初に抗原特異的ＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。陽性の被験ミクロ培養を、増殖のために２４ウエルプレートに移した。再検査後、選ばれた培養をクローニングし、限界希釈技術を用いて再クローニングし、アイソタイプを決定した（（５１）および（５２））。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
モノクローナル抗体作製
標準的な抗体作製法（５６）によって抗体を作製し、プロテインＡを介して精製した。ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づいて、抗体の純度は９５％超であった。
【００９６】
結合定数
アドレノメジュリンへの抗体の親和性を決定するために、固定化抗体へのアドレノメジュリンの結合のキネティクスを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる無標識の表面プラズモン共鳴によって測定した。抗体の可逆的固定化は、高密度でＣＭ５センサー表面に共有結合した抗マウスＦｃ抗体を用いて、製造者の指示に従って実施した（マウス抗体捕捉キット；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、（２２）。
【００９７】
標識手順（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）の抗体（ＰＢＳ，ｐＨ７．４中、１ｍｇ／ｍｌ）を、１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ−エステル（アクリロニトリル中、１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎ  Ｖｅｎｔ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し（５７）、室温で２０分間インキュベートした。標識ＣＴ−Ｈを、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ（登録商標）ＳＥＣ  ４００−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）におけるゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製した標識抗体を（３００ミリモル／Ｌ  リン酸カリウム、１００ミリモル／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ミリモル／Ｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）で希釈した。最終濃度は、２００μＬあたり約８００．０００相対発光量（ＲＬＵ）の標識化合物（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光は、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  ＫＧ）を用いることにより測定した。
【００９８】
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を、抗体（１．５μｇの抗体／０．３ｍＬの１００ミリモル／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ミリモル／Ｌ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）でコーティングした（室温で１８時間）。５％のウシ血清アルブミンでブロッキング後、チューブをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、真空乾燥した。
【００９９】
標準物質：
合成ヒトＡＤＭ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％  ＢＳＡ、２０錠／Ｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ）；  ｐＨ７．８を用いて直線的に希釈した。標準物質は、使用前、−２０℃で保存した。
【０１００】
実施例２
高いシグナル／ノイズ比をもたらす抗体の組合せの決定
ｈＡＤＭイムノアッセイ：
５０μｌのサンプル（または標準物質）をコーティング済みのチューブにピペットで移し、標識第二抗体（２００μｌ）を加えた後、チューブを室温で２時間インキュベートした。洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で５回洗浄する（各１ｍｌ）ことによって未結合のトレーサーを除去した。ＬＢ  ９５３を使用することによって、チューブに結合した化学発光を測定した。
【０１０１】
すべての抗体をサンドイッチイムノアッセイにおいてコーティング済みチューブおよび標識抗体として使用し、以下のバリエーションで組み合わせた（表２）：
【０１０２】
ｈＡＤＭイムノアッセイに記載したとおりにインキュベーションを実施した。結果は、（１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＭにおける）特異的シグナル／バックグラウンド（ＡＤＭを含まないサンプル）シグナルの比として得る。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
驚くべきことに、本発明者等は、ＭＲ−ＡＤＭとＣＴ−ＡＤＭの組合せが最も高いシグナル／ノイズ比のための組合せであることを発見した。続いて、本発明等は、この抗体の組合せをさらなる研究のために使用した。本発明者等は、ＭＲ−ＡＤＭを固相抗体、ＣＴ−ＡＤＭを標識抗体として使用した。典型的な用量／シグナル曲線を図１に示す。アッセイの分析感度（１０回の実行の平均、ＡＤＭを含まないサンプル＋２ＳＤ）は、２ｐｇ  ＡＤＭ／ｍｌであった。
【０１０５】
実施例３
ヒトアドレノメジュリンの安定性：
ヒトＡＤＭをヒトクエン酸血漿で希釈し（ｎ＝５、最終濃度１０ｍｇ  ＡＤＭ／ｍｌ）、２４℃でインキュベートした。選択した時点で、アリコートを−２０℃で凍結した。サンプルを融解直後に、上記のｈＡＤＭイムノアッセイを用いてｈＡＤＭを定量した。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
驚くべきことに、サンドイッチイムノアッセイにおいてＭＲ−ＡＤＭとＣＴ−ＡＤＭの抗体の組合せを用いると、分析物の分析前の安定性が高い（わずかに０，９％／時間の免疫反応性の平均損失）。対照的に、他のアッセイ方法を用いると、わずかに２２分の血漿半減期を報告した（Ｈｉｎｓｏｎ  ２０００）。病院の日常業務では、サンプル採取から分析までの時間は２時間未満であるため、使用したＡＤＭ検出方法は、日常的診断に適している。（アプロチニンなどの（２０））サンプルへのいかなる常用添加物も、ＡＤＭ−免疫反応性の許容可能な安定性に到達するために必要でないのは驚くべきことである。
【０１０８】
実施例４
標準物質調製物の再現性
本発明者等は、ＡＤＭアッセイのための標準物質の調製に際して結果の大きな変動を見出した（平均ＣＶ８，５％、表４を参照のこと）。これは、プラスチックおよびガラス表面へのｈＡＤＭの高い吸着によるかもしれない（（５８）も参照のこと）。この効果は、界面活性剤（１％以下のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００または１％のＴｗｅｅｎ  ２０）、タンパク質（５％以下のＢＳＡ）および高いイオン強度（１Ｍ以下のＮａＣｌ）またはそれらの組合せを加えることによってわずかにのみ減少した。驚くべきことに、過剰の抗ＡＤＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を標準物質希釈用バッファーに添加すると、１％未満の調製物間のＣＶまで、ＡＤＭアッセイ標準物質調製物の回収率および再現性が実質的に改善した（表４）。幸いに、Ｎ末端抗体の存在は、ＭＲ−およびＣ末端抗体の組合せによって生成されるＡＤＭシグナルに影響を及ぼさなかった（図１１）。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
１０μｇ／ｍｌのＮＴ−ＡＤＭ抗体を含むおよび含まないＡＤＭアッセイの標準物質を上記のとおりに調製した。変動係数を、独立した５回の調製の実行から得る。上記のＡＤＭアッセイを用いて標準物質を測定した。ｓ／ｎ−ｒ＝シグナル対ノイズ比。
【０１１１】
以下のすべての試験に関して、本発明者等は、１０μｇ／ｍｌのＮＴ−ＡＤＭ抗体の存在下で調製した標準物質およびトレーサーバッファー中の添加物としての１０μｇ／ｍｌのＮＴ−ＡＤＭ抗体に基づいてＡＤＭアッセイを使用した。
【０１１２】
実施例５
感度
アッセイ感度の目標は、健康な対象のＡＤＭ濃度を完全にカバーすることであった。
【０１１３】
健康な対象におけるＡＤＭ濃度：
ＡＤＭアッセイを用いて健康な対象（ｎ＝１００、平均年齢５６歳）を測定した。中央値は２４．７ｐｇ／ｍｌ、最低値は１１ｐｇ／ｍｌ、９９パーセンタイル値は４３ｐｇ／ｍｌであった。アッセイ感度が２ｐｇ／ｍｌであったため、すべての健康な対象の１００％が記載されたＡＤＭアッセイを用いて検出可能であった（図２を参照のこと）。
【０１１４】
実施例６
臨床試験
敗血症の定義（５９）を満たす１０１人のＥＤ患者をその後入院させ（平均５日間の入院）、標準的なケア処置を受けた。入院中、１日目（ＥＤ症状提示）から毎日１サンプルのＥＤＴＡ血漿を作製した。後のＡＤＭ測定のためのサンプル凍結までの時間は４時間未満であった。患者の特徴を表５に要約する。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
【表６】
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【０１１７】
全患者の２６．７％が入院中に死亡し、治療不応答者としてカウントされ、全患者の７３．３％は敗血症から生き延びて治療応答者としてカウントされる。
【０１１８】
敗血症を呈する全患者の６６％は、４３ｐｇ／ｍｌ（９９パーセンタイル値）超の非正常なＡＤＭ値を有し、ＡＤＭが感染のマーカーでないことを示している。
【０１１９】
臨床試験の結果
初期のＡＤＭは高度な予後予測因子である。
本発明者等は、初期のＡＤＭ値と院内死亡率を関係付け、ＡＤＭをＡＰＡＣＨＥ  ２敗血症スコア（（６０）を参照のこと）と比較した。ＡＤＭは敗血症の転帰に関して高度な予後予測因子であり（図３を参照のこと）、ＡＰＡＣＨＥ  ２敗血症スコアに匹敵する。ＡＤＭとＡＰＡＣＨＥ  ２を組み合せると、情報が著しく加えられる（図４）。
【０１２０】
治療のモニタリングにおけるＡＤＭ
ケア処置の標準に基づいて患者を処置した（表５）。平均入院時間は５日であった。病院内で毎日ＡＤＭを測定し（１日目＝入院）、院内死亡率と関係付けた（表６）。入院中にＡＤＭは変化し、その間の変化は、予後値を最初の１９，２のＣｈｉ2から５日目の２９，２まで改善した。
【０１２１】
７０ｐｇ／ｍｌのＡＤＭにおける単純なカットオフモデルを用いて、７０ｐｇ／ｍｌ超のＡＤＭ濃度で開始して、すべての入院日で７０ｐｇ／ｍｌ超のままの患者（治療不応答者）についての６８％の死亡リスクを示した。７０ｐｇ／ｍｌ未満のＡＤＭをずっと有したかまたは７０ｐｇ／ｍｌ超から７０ｐｇ／ｍｌ未満となった患者は、わずかに１１％の死亡率を有し（よく治療された／治療応答者）、７０ｐｇ／ｍｌ超のＡＤＭ値を呈し、入院治療中にそのＡＤＭ濃度が７０ｐｇ／ｍｌ未満まで減少した患者は、死亡率０％であった。入院治療中にＡＤＭ濃度が７０ｐｇ／ｍｌ未満から７０ｐｇ／ｍｌ超となった患者はいなかった。すべての患者について応答者／不応答者情報を作成するのに必要な平均時間は、約１日であった。入院中に治療に応答する７０ｐｇ／ｍｌ超の患者は、ＡＤＭによって治療の成功を示すのに約２日を要した。
【０１２２】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月7日(2014.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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