(57)【要約】  【解決手段】  薬学的製剤が、Ｂ１０位に酸性側鎖を含むアミノ酸置換と組み合わせ、Ｂ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニンを含む変異型インスリンＢ鎖ポリペプチドを有し、前記インスリンは０．６ｍＭ〜３．０ｍＭの濃度で存在することができる。前記製剤は、選択的に亜鉛がなくてもよい。さらに、Ｂ３、Ｂ２８、およびＢ２９位に１またはそれ以上のアミノ酸置換が存在してもよい。前記変異型Ｂ鎖ポリペプチドは、プロインスリン類似体または短鎖インスリン類似体の一部であってもよい。前記インスリン類似体は、ヒトインスリンなどの哺乳類インスリンの類似体とすることもできる。患者の血糖値を低下させる方法は、生理学的に有効な量の前記インスリン類似体またはその生理学的に許容される塩を前記患者に投与する工程を有する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択されるヒトインスリン配列に関してＢ１０位に酸性側鎖を含むアミノ酸置換と組み合わせて、ヒトインスリン配列に関してＢ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン置換を含む変異型インスリンＢ鎖ポリペプチドを有するインスリンを有する薬学的製剤であって、前記インスリンが０．６ｍＭ〜３．０ｍＭの濃度で存在する薬学的製剤。
【請求項２】
請求項１記載の薬学的製剤において、前記インスリンは少なくとも２ｍＭの濃度で存在するものである薬学的製剤。
【請求項３】
請求項２記載の薬学的製剤において、前記変異型Ｂ鎖ポリペプチドがヒトインスリン配列に関してＢ２９位に非標準的アミノ酸置換を含み、前記置換はノルロイシン、アミノ酪酸、アミノプロピオン酸、オルニチン、ジアミノ絡酸、およびジアミノプロピオン酸から成る群から選択されるものである薬学的製剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の薬学的製剤において、前記変異型Ｂ鎖がさらに、アスパラギン酸、プロリン、およびリジンから成る群から選択されるヒトインスリンの配列に関してＢ２８位に置換を含むものである薬学的製剤。
【請求項５】
請求項１、２、または４のいずれか１つに記載の薬学的製剤において、前記変異型Ｂ鎖がさらに、ヒトインスリンの配列に関してＢ２８位に置換を含み、前記置換はリジン、プロリン、およびアラニンから成る群から選択されるものである薬学的製剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の薬学的製剤において、前記変異型Ｂ鎖がヒトインスリンの配列に関してＢ３位にリジン置換を含むものである薬学的製剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の薬学的製剤において、この薬学的製剤は、Ｂ２８位のリジン置換とＢ２９位のプロリン置換、またはＢ２８位のアスパラギン酸置換とＢ２９位プロリン置換から選択される１組の置換を有し、前記置換の位置はヒトインスリンの配列と関連しているものである薬学的製剤。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１つに記載の薬学的製剤において、前記インスリンが哺乳類インスリンの類似体である薬学的製剤。
【請求項９】
請求項８記載の薬学的製剤において、前記哺乳類インスリンがヒトインスリンの類似体である薬学的製剤。
【請求項１０】
請求項１記載の薬学的製剤において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号：４〜８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに配列ＩＤ番号：８のアミノ酸配列を有するＡ鎖ポリペプチド配列を有するものである薬学的製剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載の薬学的製剤において、Ａ８位にグルタミン酸置換を含むインスリンＡ鎖ポリペプチド配列を有するものである薬学的製剤。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載の薬学的製剤において、Ａ８位にヒスチジン酸置換を含むインスリンＡ鎖ポリペプチド配列を有するものである薬学的製剤。
【請求項１３】
患者の血糖値を低下させる方法であって、前記方法は、前記患者に生理学的に有効な量のインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を投与する工程を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩はＢ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン、およびＢ１０位にアスパラギン酸またはグルタミン酸置換を組み込んだ変異型Ｂ鎖ポリペプチドを含み、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩が０．６ｍＭ〜３．０ｍＭの濃度で存在するものである方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、少なくとも２ｍＭの濃度で存在するものである方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の方法において、前記変異型Ｂ鎖ポリペプチドはさらに、ヒトインスリン配列に関してＢ２９位に非標準的アミノ酸置換を有し、前記置換はノルロイシン、アミノ酪酸、アミノプロピオン酸、オルニチン、ジアミノ絡酸、およびジアミノプロピオン酸から成る群から選択されるものである方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法において、前記変異型Ｂ鎖がさらに、アスパラギン酸、プロリン、およびリジンから成る群から選択されるヒトインスリンの配列に関してＢ２８位に置換を含むものである方法。
【請求項１７】
変異型インスリンＢ鎖ポリペプチド配列を有するポリペプチドであって、ヒトインスリン配列に関してＢ１０位に酸性側鎖を含むアミノ酸置換と、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、ノルロイシン、アミノ酪酸、およびアミノプロピオン酸から成る群から選択されるヒトインスリン配列に関してＢ２９位の非標準的アミノ酸置換と組み合わせて、ヒトインスリン配列に関してＢ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン置換を含むポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１７記載のポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドはプロインスリン類似体または単鎖インスリン類似体であるポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１７または請求項１８記載のポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドがさらに、アスパラギン酸、プロリン、およびリジンから成る群から選択されるヒトインスリンの配列に関してＢ２８位に置換を含むものであるポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１つに記載のポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドがさらに、ヒトインスリンの配列に関してＢ３位にリジン置換を含むものであるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、助成金番号ＤＫ４０９４９およびＤＫ０７４１７６として米国国立衛生研究所から与えられた共同合意の下、政府支援により行われた。米国政府は当該発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、通常、薬学的製剤に利用されるよりも高いポリペプチド濃度で、より速い薬物動態などの薬学的特徴の向上を示す、ポリペプチドホルモン類似体に関する。また本発明は、（ｉ）１００単位／ｍｌ（Ｕ−１００）の濃度で野生型ヒトインスリンと比較して速効型の薬物動態学的（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）特徴が保持されている、（ｉｉ）細胞分裂促進性が野生型ヒトインスリンと比較して上昇していないなど、非標準的アミノ酸を組み込んで修飾し、Ｕ−１００以上の濃度で製剤化することができるインスリン類似体に関する。そのような非標準的配列は、選択的に、インスリン類似体Ａ鎖またはＢ鎖の他の部位に標準的アミノ酸置換を含むことができる。
【０００３】
治療薬およびワクチンを含む非標準的タンパク質の技術は、広範な医学的および社会的利益を有する可能性がある。医学的利益の例は、タンパク質の薬物速度論的特性が最適化されることであろう。さらに社会的利益の例は、高いタンパク質濃度で製剤化が可能なタンパク質の技術であり、前記製剤のＰＫ／ＰＤ特性は悪化する。治療用タンパク質の例はインスリンにより提供される。非標準的アミノ酸置換を含むインスリンの類似体は、原則として、前記製剤のインスリン濃度でＰＫ／ＰＤまたはＰＫ／ＰＤ依存性について優れた特徴を示す。皮下注射後のインスリン吸収の薬物動態に提示される課題は、糖尿病（ＤＭ）患者が厳しい血糖管理を達成できるかに影響し、インスリンポンプの安全性および性能を制限する。
【０００４】
特有の医学的需要は、肥満を伴う特定のＤＭ患者、インスリン抵抗性に対する遺伝的素因を伴う特定のＤＭ患者、およびリポジストロフィー、コルチコステロイド投与、または内因性コルチコステロイドの過剰分泌（クッシング症候群）に続発したＤＭ患者により示される、著しいインスリン抵抗性により提示される。先進国および発展途上世界で肥満が流行している（「糖尿肥満」症候群につながっている）ため、またインスリン抵抗性が異常に重度で、ミトコンドリアＤＮＡの変異により生じるＤＭの単一遺伝子型の認識が高まっているため、著しいインスリン抵抗性を有する患者数は増加している（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｕｗｅｌａｎｄ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｌｅｍｋｅｓ，  Ｈ．Ｈ．，  Ｒｕｉｔｅｎｂｅｅｋ，  Ｗ．，  Ｓａｎｄｋｕｉｊｌ，  Ｌ．Ａ．，  ｄｅ  Ｖｉｊｌｄｅｒ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｓｔｒｕｙｖｅｎｂｅｒｇ，  Ｐ．Ａ．，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｋａｍｐ，  Ｊ．Ｊ．，  &  Ｍａａｓｓｅｎ，  Ｊ．Ａ．  （１９９２）  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔＲＮＡ（Ｌｅｕ）（ＵＵＲ）  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｐｅｄｉｇｒｅｅ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ａｎｄ  ｄｅａｆｎｅｓｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １，  ３６８−７１）。このようにそれ以外は多様な患者サブセットを治療するためには、典型的には大量のレギュラーインスリン製剤の皮下注射が必要である（強度Ｕ−１００、インスリンまたはインスリン類似体、通常０．６ｍＭ）。このように大量の注射では痛みが発生し、インスリン作用の発現速度および持続時間が変動する可能性がある。臨床で使用される野生型インスリンのＵ−５００製剤は市販されているが（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ  Ｕ−５００；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ  Ｕ−５００、または同様のそのような製剤のＰＫ／ＰＤ特性はプロタミン−亜鉛含有インスリン六量体の微結晶懸濁液の特性と似ているなど、インスリン濃度が０．６ｍＭから３ｍＭに上昇すると、インスリン作用の発現の遅れ、および延長につながり、この製剤は昔から天然型プロタミンＨａｇａｄｏｒｎ（ＮＰＨ）と命名されてきた。そのため、皮下注射による野生型インスリンＵ−５００製剤の食事による使用は、血糖管理の効率を低下させ、低血糖エピソードのリスクを上昇させると予想される。インスリン皮下持続注入用の装置（ＣＳＩＩ、「インスリンポンプ」）でＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ  Ｕ−５００、または同様の製剤を使用すると、現在または過去の血糖濃度測定に基づき、同様に、インスリンの注入速度を効果的に調節する患者の能力または制御アルゴリズムに緩衝することが予想され、血糖管理が最適とはならず、低血糖事象の発生リスクが上昇する。
【０００５】
インスリンの薬理に関する確立した原則は、沈着物から毛細血管、従って全身の血液循環への吸収の時間経過に対する、注入したインスリン分子の凝集状態に関連する。一般に、インスリン分子が高分子量錯体に凝集するほど、吸収が遅くなり、インスリン作用が延長する。インスリン分子中のその自己組織化を弱めるアミノ酸置換は、当該分野において、野生型ヒトインスリンと比較して吸収がより速いことと関連していることが知られており、例は、ＰｒｏＢ２８→Ａｓｐの置換（インスリンアスパルト、Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標）、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ，  Ｌｔｄ）およびＰｒｏＢ２８→ＬｙｓおよびＬｙｓＢ２９→Ｐｒｏの２置換（インスリンリスプロ、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の有効成分、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）により提供される。逆に、等電点（ｐＩ）をｐＨ約５からｐＨ約７にシフトさせるインスリン分子のアミノ酸伸長または化学的修飾は、当該分野において皮下沈着物に修飾インスリンを等電沈殿させることが知られており、そのような高分子量錯体は基礎インスリン製剤として持続的吸収を提供する。例は、ＮｏｖｏＳｏｌ  Ｂａｓａｌ（登録商標）（ＴｈｒＢ２７がＡｒｇに置換され、ＴｈｒＢ３０のＣ末端カルボン酸基がアミド化された、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋの製造中止になった製品）およびインスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）の有効成分であり、Ｂ鎖がジペプチドＡｒｇＢ３１−ＡｒｇＢ３２により伸長された基礎製剤、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，  Ｌｔｄ．）により提供される。（ＮｏｖｏＳｏｌ  Ｂａｓａｌ（登録商標）およびＬａｎｔｕｓ（登録商標）はそれぞれ、さらにＡｓｎＡ２１→Ｇｌｙの置換を含み、ＡｓｎＡ２１の脱アミド化による化学分解を起こさずに、酸性条件下（それぞれｐＨ  ３およびｐＨ  ４）で安定な製剤とすることができる。）古典的微結晶インスリン懸濁（ＮＰＨ、セミレンテ、レンテ、およびウルトラレンテ）の延長は、これらの微結晶の物理化学的性質およびその相対的溶解率を反映し、中時間〜長時間作用型のＰＫ／ＰＤ特性を示す。
【０００６】
現在および過去の野生型ヒトインスリンまたは動物インスリン製剤を含む上記のインスリン製剤は、化学的安定性を達成する手段として、線維形成を回避する手段として、ＰＫ／ＰＤ特性を調節する手段として、またはこれらの目的を組み合わせて達成する手段として、インスリン分子の自己組織化を利用しているか、または利用した。しかし、インスリンの自己組織化は好ましくないまたは望ましくない特性も導入する可能性がある。Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ  Ｕ−５００（または同様の製剤）の最適ではない持続的ＰＫ／ＰＤ特性は、例えば、前記製剤および皮下沈着物中の六量体−六量体会合の結果である可能性がある。実際、レーザー光散乱によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの野生型ウシインスリン亜鉛六量体の研究は、０．３〜３ｍＭの濃度範囲で段階的に六量体−六量体相互作用を示すという根拠を提示した。そのため、インスリン製剤組成物の現在および過去の戦略およびインスリン類似体のデザインは、長時間作用型超濃縮インスリン製剤の開発における解決できない障害に、過去も現在も直面しているが、自己組織化には化学的および物理的安定性を得ることが必要である一方、０．６ｍＭを超えた場合のその進行性の性質により、好ましくないＰＫ／ＰＤの延長に至る。
【０００７】
過去１０年間で、前記インスリン分子に対する特異的化学修飾は、前記タンパク質の１つまたは別の特定の性質を選択的に変更し、対象とする応用を促すと説明されてきた。組み換えＤＮＡ時代（１９８０）の始め、野生型ヒトインスリンは多様な治療内容で使用するのに最適であると考えられたが、過去１０年間でインスリン類似体が広範に臨床において使用され、それぞれが具体的な満たされていない需要を満たすために用意された非標準的類似体一式が、大きな医学的および社会的利益を提供するだろうことを示唆している。タンパク質中の特異的部位での１つの天然型アミノ酸と別の天然型アミノ酸との置換は当該分野で周知であり、本明細書では標準的置換と命名されている。インスリンの非標準的置換は、０．６〜３．０ｍＭの範囲のインスリン類似体濃度の関数として、ＰＫ／ＰＤを悪化させずに吸収を加速させる可能性を提供する。
【０００８】
インスリンの投与は、糖尿病の治療として長い歴史を持つ。インスリンは、脊椎動物の代謝で中心的役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンには、２１残基を含むＡ鎖と３０残基を含むＢ鎖の２つの鎖が含まれる。ホルモンはＺｎ２＋−安定化六量体として膵臓β細胞に貯蔵されるが、血流中ではＺｎ２＋なしの単量体として機能する。インスリンは単鎖前駆体であるプロインスリンの生成物であり、プロインスリン内では、連結部位（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）とＡ鎖のＮ末端残基を結合している。成熟貯蔵顆粒中の亜鉛インスリン六量体の結晶が、電子顕微鏡（ＥＭ）により観察された。インスリンの配列は図１に略図で示している。個々の残基は、（多くは標準的な３文字のコードを用いた）アミノ酸の固有記号、鎖および（多くは上付き文字とした）配列の位置で示している。
【０００９】
インスリン、一般に球状タンパク質としての芳香族側鎖は、様々な疎水性および弱極性相互作用に関与している可能性があり、隣接する芳香環だけでなく、他の陽電荷または負電荷の供給源も関与している。例には、ペプチド結合の主鎖カルボニルおよびアミド基を含む。疎水性の芳香族側鎖パッキングは、タンパク質の中心およびタンパク質間の非極性接触面で起こると考えられている。そのような芳香族側鎖は脊椎動物のタンパク質に保存されている可能性があり、構造または機能に対する重要な寄与を反映している。天然型芳香族アミノ酸の例はフェニルアラニンである。その芳香環系には平面六角形に配置された６個の炭素が含まれる。芳香族性は６個の炭素の結合配置の集合的性質であり、前記環平面の上下にπ電子軌道ができる。これらの面は部分的に負電荷を示すが、５つのＣ−Ｈ基を含む環の端は部分的に陽電荷を示す。この部分的電荷の非対称分布は四重極静電モーメントを生じ、タンパク質中の他の形式電荷または部分的電荷との弱い極性相互作用に関与している可能性がある。芳香族側鎖のさらなる特性はその容積である。この容積を決定するのは、平面環の端にある５つのＣ−Ｈ基の位置特異的輪郭などである。Ｃ−Ｈ基をＣ−Ｆ基で置換してもその芳香属性が保存されると予想されるが、フッ素原子の電気陰性度のため、前記環には大きな双極子モーメントが導入され、結果として前記環の上下でπ電子軌道が歪む。Ｃ−Ｆ基の大きさは本来のＣ−Ｈ基の大きさと同様であるが（そのため、原則として多様なタンパク質環境に対応することができるが）、その局所電気陰性度および環特異的にフッ素が導入された静電双極子モーメントは、タンパク質内の隣接する基との好ましい、または好ましくない静電相互作用を導入する可能性がある。そのような隣接する基の例には、これに限定されるものではないが、ＣＯ−ＮＨペプチド結合単位、ジスルフィド架橋の硫黄原子の孤立電子対、側鎖カルボキサミド基（ＡｓｎおよびＧｌｎ）、他の芳香環（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、およびＨｉｓ）、およびインスリン構造（Ｈｉｓ）、滴定Ｎ−およびＣ−末端鎖末端、結合金属イオン（Ｚｎ２＋またはＣａ２＋など）、およびタンパク質に結合した水分子に利用される範囲の電位ｐＫａを有する酸性側鎖（ＡｓｐおよびＧｌｕ）、塩基性側鎖（ＬｙｓおよびＡｒｇ）、滴定側鎖の形式正電荷および負電荷を含む。
【００１０】
治療用タンパク質で保存された芳香族残基の例は、インスリンＢ鎖のＢ２４位にあるフェニルアラニンにより提供される（ＰｈｅＢ２４と命名する）。これはインスリンの３つのフェニルアラニン残基のうちの１つである（Ｂ１、Ｂ２４、およびＢ２５位）。構造が似ているチロシンはＢ２６位にある。インスリン単量体内のＰｈｅＢ２４の構造環境は、リボンモデル（図２Ａ）および空間充填モデル（図２Ｂ）で示される。脊椎動物のインスリンおよびインスリン様増殖因子に保存され、ＰｈｅＢ２４の芳香環は（疎水性中心の中ではなく）疎水性中心の反対にパッキングし、Ｂ鎖の超二次構造を安定化する。ＰｈｅＢ２４は古典的受容体結合表面にあり、受容体結合の配座を変化させると提案されてきた。ＰｈｅＢ２４はインスリンの二量体接触面およびインスリン六量体の３つの接触面でパッキングしている。インスリン単量体の構造環境はこれらの接触面の構造環境とは異なる。特に、ＰｈｅＢ２４の側鎖が利用できる周囲容積は二量体または六量体よりも単量体で大きい。
【００１１】
ＤＭ患者におけるインスリン置換療法の主な目標は、健常なヒト被験者の正常範囲の上下への逸脱を予防するための、血糖濃度の厳格な管理である。正常範囲未満への逸脱は、即時型アレルギーまたは神経糖ペプチド症候群と関連しており、重度のエピソードでは痙攣、昏睡、および死亡につながる。正常範囲以上への逸脱は、網膜症、失明、腎不全を含む微小血管疾患の長期的リスク上昇と関連している。Ｕ−１００以上の強度で製剤化した場合、野生型ヒトインスリンまたはヒトインスリン吸収の薬物動態は、食後の代謝恒常性の生理的要求に対して遅すぎる、長すぎる、および不安定すぎることが多いため、著しいインスリン抵抗性がみられるＤＭ患者は最適な血糖目標を達成できないことが多く、そのため即時性および長期的合併症のリスクがいずれも上昇する。そのため、レギュラーおよび長時間作用型インスリン製剤の安全性、有効性、および現実世界の利便性は、自己組織化インスリンまたはインスリン類似体の濃度が約０．６ｍＭ以上になるため、ＰＫ／ＰＤが延長することで制限されてきた。
【００１２】
本発明は、規制基準を満たすか、または超えるのに十分な化学的安定性および十分な物理的安定性を持つ製剤を達成する機序として、インスリン自己組織化の必要性を回避する。化学分解はＡｓｎの脱アミド化、ｉｓｏ−Ａｓｐの形成、およびジスルフィド架橋の分解など、インスリン分子の原子配列の変化を指す。（化学変性実験から証明されるとおり）インスリンの化学分解感受性はその熱力学的安定性と関連しており、最も化学分解されやすい種は単量体であるため、その速度は自己組織化構造内の単量体の金属イオン封鎖により低下する。物理的分解は線維形成（フィブリル化）を指し、これはベータシートが多い配座に数千（以上）ものインスリンプロトマーが含まれる線形構造となる、非天然型の自己組織化である。フィブリル化は、室温を超えるインスリンおよびインスリン類似体の製造、貯蔵、および使用において重大な懸案事項である。フィブリル化の速度は高温、低ｐＨ、撹拌、または尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、または疎水性表面の存在により速くなる。現在の米国の薬物規制では、１％以上の濃度でフィブリル化が発生した場合はインスリンを廃棄するように定めている。フィブリル化は高温で亢進するため、ＤＭ患者は最も望ましくはインスリンを使用前に冷蔵しておく必要がある。インスリンまたはインスリン類似体のフィブリル化は、少量のインスリンまたはインスリン類似体を一定間隔で患者の体内に注入する外部インスリンポンプを利用している患者では特に懸案事項となる可能性がある。このような使用法では、前記インスリンまたはインスリン類似体が前記ポンプ装置内で冷蔵されたままとなっているわけではなく、インスリンのフィブリル化が体内にインスリンまたはインスリン類似体を注入するために使用されるカテーテルを遮断し、予測不可能な血糖値の変動またはさらに危険な高血糖が生じる可能性がある。少なくとも１％の報告が、インスリンリスプロ（ＫＰ−インスリン、残基Ｂ２８とＢ２９が野生型ヒトインスリンの位置と比較して置き換えられた類似体、商標名Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））は特にフィブリル化を受けやすく、インスリンポンプカテーテルが閉塞する可能性がある、と示している。インスリンは、２５℃以上の温度で１０℃上昇すると分解速度が１０倍以上の上昇示し、その結果、ガイドラインでは３０℃未満の温度、好ましくは冷蔵で保存することを求めている。そのような製剤では、典型的には天然型インスリンの自己組織化が優位となる。
【００１３】
タンパク質フィブリル化に関する現在の理論は、フィブリル化のメカニズムは部分的に折り畳まれた中間状態を経て進行し、これが凝集してアミロイド形成の核を形成すると断定している。この理論では、天然状態を安定化するアミノ酸置換は、部分的に折り畳まれた中間状態を安定化することもあれば、安定化しないこともあり、天然状態と中間体状態の間の自由エネルギー障壁を増加（または低下）することもあれば、しないこともある。従って、現在の理論では、前記インスリン分子中の特定のアミノ酸置換がフィブリル化のリスクを上昇または低下させる傾向は非常に予測しにくいことを示しており、特に、（化学変性実験で証明されるとおり、）検出可能なフィブリル化発生前に観察された時間のずれは、天然状態の単量体の熱力学的安定性の測定とは関連していない。特定の置換は全体的な天然状態およびアミロイド形成の部分的折り畳み構造をいずれも安定化し、そのためフィブリル化の発生を遅らせる可能性があるが、別の置換は天然状態を安定化するがアミロイド形成の部分的折り畳み構造を安定化せず、そのため時間のずれにはほとんどまたは全く影響がない。さらに他の置換は天然状態を不安定化するがアミロイド形成の部分的折り畳み構造を安定化するため、見かけ上は安定化の性質を示すにもかかわらず、フィブリル化を加速することがある。
【００１４】
従って、対応する野生型インスリンの活性の少なくとも一部を示し、その化学的および／または物理的安定性の少なくとも一部を維持しながら、（典型的にはＵ−１００〜Ｕ−５００の製剤強度に対応する）０．６ｍＭ〜３．０ｍＭの広範なインスリン濃度でＤＭの治療に急速なＰＫ／ＰＤを示すインスリン類似体の需要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
十分な化学安定性および物理的安定性を示す無亜鉛単量体および二量体種を提供するインスリン類似体を提供し、一定範囲のタンパク質濃度で、皮下注射後に急速に吸収される形態での製剤化を可能とすることが本発明の観点である。本発明は、つまり、まだあまり急速には作用せず、食後の血糖管理を最適化する、またはインスリンポンプで使用することができる超濃縮インスリン製剤およびインスリン類似体製剤に関するこれまでの制限を取り上げている。請求される発明は、Ｂ２４位に非標準的アミノ酸置換を組み込むことで、ＰｈｅＢ２４の置換に関する制限を含む、これまでのデザイン制限を回避する。Ｂ２４位の非標準的アミノ酸側鎖（２Ｆ−ＰｈｅＢ２４、オルト−モノフルオロ−ＰｈｅＢ２４とも命名されている）は、単離インスリン単量体を顕著に安定化する。これは、芳香族アミノ酸側鎖を、フェニルアラニンとサイズおよび形状が同等のハロゲン修飾した芳香族類似体で置換することで達成され、前記類似体は天然のアミノ酸側鎖を含む、対応するインスリンまたはインスリン類似体の生物活性を少なくとも部分的に維持する。さらに、前記修飾された側鎖はインスリンからＩ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）への交差結合を抑制し、前記インスリン受容体への結合を調節し、ＨｉｓＢ１０→Ａｓｐの置換を安定化することで、異常な有糸分裂誘発性を回避する。２−Ｆ−ＰｈｅＢ２４の修飾をＢ１０位の酸性側鎖（ＡｓｐまたはＧｌｕ）と組み合わせて行い、得られた類似体が野生型ヒトインスリンと同様のＩＧＦ−ＩＲに対する親和性を有するようにすることも、本発明の別の観点である。インスリン類似体をｐＨ  ７〜８、Ｕ−１００〜Ｕ−５００（約０．６〜３．０ｍＭ）の強度で、選択的に無亜鉛製剤に製剤化し、強度Ｕ−１００の野生型ヒトインスリンレギュラー製剤と同様、またはより速効型で短時間型のＰＫ／ＰＤ特性を保存することも本発明の別の観点である。１つの特定の実施形態では、前記製剤中のインスリン濃度が少なくとも２ｍＭである。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４およびＢ１０位の酸性側鎖を含むインスリン類似体が、さらに化学的または物理的安定性を高め、またはさらに自己組織化を損なうＡ鎖またはＢ鎖での追加置換を含むものも、本発明のさらに別の観点である。
【００１６】
一般に、本発明は、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択されたヒトインスリン配列に関してＢ１０位に酸性側鎖を含むアミノ酸置換と組み合わせ、ヒトインスリン配列に関してＢ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン置換を含む変異型インスリンＢ鎖ポリペプチドを有する薬学的製剤を提供し、前記インスリンが０．６ｍＭ〜３．０ｍＭの濃度で存在するものである。一部の特定の実施形態では、前記薬学的製剤が少なくとも２ｍＭの濃度でインスリンを含む。１つの特定の実施形態では、前記薬学的製剤が少なくとも２．４ｍＭ以上の濃度でインスリンを含む。
【００１７】
さらに、または選択的に、前記インスリン類似体はヒトインスリン類似体などの哺乳類インスリン類似体である。１つの実施形態では、前記Ｂ鎖ポリペプチドが配列ＩＤ番号４〜７から成る群から選択されるアミノ酸配列、およびさらに３箇所以下のその追加アミノ酸置換を有するポリペプチドを有する。さらに別の実施形態では、前記Ａ鎖が（Ｂ鎖の修飾に加えて）配列ＩＤ番号４〜７から成る群から選択されるＡ８位の置換（配列ＩＤ番号８）を含む。
【００１８】
別の実施形態では、前記インスリン類似体が、選択的に前記Ｂ鎖の２９位に非標準的アミノ酸置換を含む。１つの実施例では、前記Ｂ２９の非標準的アミノ酸がノルロイシン（Ｎｌｅ）である。別の実施例では、前記Ｂ２９の非標準的アミノ酸がオルニチン（Ｏｒｎ）である。さらに他の実施例では、前記非標準的アミノ酸がアミノブチル酸、アミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、またはジアミノイソプロピオン酸である。
【００１９】
Ｂ２４位に非標準的アミノ酸を組み込み、Ｂ鎖ポリペプチドを有するインスリン類似体をコードする核酸も提供される。１つの実施例では、前記非標準アミノ酸が核酸配列ＴＡＧなどのストップコドンによりコードされる。発現ベクターはこのような核酸を有し、宿主細胞はこのような発現ベクターを含む。
【００２０】
本発明は患者の血糖値を低下させる方法も提供する。前記方法は前記患者に生理学的に有効な量のインスリン類似体または生理的に許容されるその塩を前記患者に投与する工程を有し、前記インスリン類似体または生理的に許容されるその塩は、Ｂ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（２Ｆ−Ｐｈｅ）およびＢ１０位にＡｓｐまたはＧｌｕ置換を組み込んだＢ鎖ポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、前記インスリン類似体がヒトインスリン類似体などの哺乳類インスリン類似体である。一部の実施形態では、前記Ｂ鎖ポリペプチドが配列ＩＤ番号４〜７から成る群から選択されるアミノ酸配列、およびさらに３箇所以下のそのアミノ酸置換を有するポリペプチドを有する。他の実施形態では、前記Ａ鎖ポリペプチドが、配列ＩＤ番号４〜７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＢ鎖ポリペプチドと組み合わせ、配列ＩＤ番号８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
ヒトインスリン配列に関してＢ１０位に酸性側鎖を含むアミノ酸置換、およびオルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、ノルロイシン、アミノ酪酸、およびアミノプロピオン酸から成る群から選択されるヒトインスリン配列に関してＢ２９位に非標準的アミノ酸置換と組み合わせ、ヒトインスリン配列に対してＢ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン置換を含む変異型インスリンＢ鎖ポリペプチド配列を有するポリペプチドを提供することも、本発明のさらなる観点である。一部の実施形態では、前記ポリペプチドがプロインスリン類似体または短鎖インスリン類似体である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｂ鎖の残基Ｂ２４の位置を示したヒトインスリン配列の略図である。
【図２】図２Ａは、３つのジスルフィド架橋に関して、ＰｈｅＢ２４の芳香族残基を示したインスリン単量体のリボンモデルである。ＬｅｕＢ１５（矢印）およびＰｈｅＢ２４の隣接する側鎖が示されている。それ以外のＡ鎖およびＢ鎖はそれぞれ薄灰色および暗灰色で示されており、システインの硫黄原子が丸で示されている。
【００２３】
図２Ｂは疎水性コアの端にあるポケットにＰｈｅＢ２４側鎖を示したインスリンの空間充填模型である。
【図３】図３Ａはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の球棒模型（上）および空間充填模型（下）である。
【００２４】
図３Ｂは２Ｆ−Ｐｈｅの球棒模型（上）および空間充填模型（下）である。
【図４】図４は、インスリン類似体の受容体結合研究の結果を示したグラフである。インスリン受容体（ＩＲ−Ｂ）のＢイソ型の相対活性は、ヒトインスリン（●）またはその類似体であるＤＫＰ−インスリン（▲）および２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（▼）の濃度を上昇させて、受容体結合１２５Ｉ−標識ヒトインスリンを置換した競合結合アッセイにより決定し、曲線を当てはめた結果を表２および３にまとめている。
【図５】図５はリガンドをシミュレーションしたＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化の程度を示したヒストグラムである。ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を安定して発現したＩＧＦ−Ｉ受容体欠乏マウス胚線維芽細胞を一晩血清飢餓培養してから、５分間１０ｎＭのリガンドを処理し、細胞溶解物を調整し、ＥＬＩＳＡによりリン酸化ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）を分析した。２Ｆ−ＤＫＰによる自己リン酸化はＨＩと同様である。
【図６】図６は、分裂促進性に関する乳癌関連ＭＣＦ−７コロニー形成アッセイの結果を示している。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞のコロニー形成を、１週間増殖後、１０ｎＭのリガンド存在下、（腫瘍形成能を反映した）軟寒天中で分析した。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰの腫瘍形成能は野生型ヒトインスリンおよび未処理細胞と同等であった。
【図７】図７は、ＣＤで検出されたグアニジン変性のグラフを提供している。ヒトインスリン（ＨＩ、●）、インスリンリスプロ（ＫＰ、□）、ＡｓｐＢ１０−ＫＰ−インスリン（ＤＫＰ、◆）、および２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（▲）インスリン類似体の化学変性。スペクトルはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）において、２５℃で収集した。アンフォールディングは２２２ｎｍでＣＤによりモニターした。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ類似体の安定性は、ＤＫＰ−インスリンおよびヒトインスリンと比較し、安定性（ΔΔＧｕ）はそれぞれ０．６（±０．２）および１．６（±０．２）ｋｃａｌ／ｍｏｌの上昇を示した（表４を参照）。
【図８】図８は、インスリン類似体のフィブリル化時間のずれを比較したヒストグラムである。チオフラビンＴ蛍光発光によりフィブリル化時間のずれをモニターした。サンプルは無亜鉛リン酸緩衝食塩水中、３７℃、ｐＨ７．４でゆっくりと攪拌した。（時間のずれによって証明されるとおり）２Ｆ−ＤＫＰ−インスリンは、インスリンリスプロおよび野生型ヒトインスリンと比較し、それぞれ３．７倍および２．４倍フィブリル化に対して抵抗性を示した。
【図９】図９は、現在のインスリン製剤Ｈｕｍａｌｏｇ（強度Ｕ−１００、上の棒グラフ）およびＨｕｍｕｌｉｎ  Ｒ  Ｕ−５００（下の棒グラフ）と関連させ、麻酔豚における強度Ｕ−４００の２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの薬力学（５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む無亜鉛Ｌｉｌｌｙ希釈液、ｐＨ７．４、中央の棒グラフ）をまとめたグラフを提供している。
【図１０】図１０は、亜鉛ＫＰ−インスリン六量体との関連で２Ｆ−ＰｈｅＢ２４の結晶構造を示した構造図を提供している。（Ａ）Ｔ３Ｒｆ３亜鉛六量体としての野生型ヒトインスリンのリボンモデル。（Ｂ）同じ結晶形の２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの対応するリボンモデル。変異型Ｔ３Ｒｆ３構造は親六量体と同様であり、長期的な構造摂動がなく、天然様二量体の接触面にフッ素原子が入っていることを証明している。
【図１１】図１１は、２．５Åの解像度で決定した２Ｆ−ＰｈｅＢ２４の結晶構造における２Ｆ−ＰｈｅＢ２４周辺の電子密度を示している。（Ａ）Ｔ状態プロトマーにおける２Ｆ−ＰｈｅＢ２４および周辺の電子密度。（Ｂ）Ｒｆ状態プロトマーにおける２Ｆ−ＰｈｅＢ２４および周辺の電子密度。Ｂ２４環の向きおよびフッ素基の相互作用は２つの立体配座状態で異なる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、急速なＰＫおよびＰＤをＵ−１００〜Ｕ−５００という幅広いインスリン濃度で維持することのできるインスリン類似体に関する。前記類似体は、対応する未修飾インスリンまたはインスリン類似体の生物活性を少なくとも一部維持し、同様または向上した熱力学的安定性およびフィブリル形成抵抗性を維持している。我々は、強度Ｕ−１００で野生型ヒトインスリンのレギュラー製剤（例えば、ヒューマリン（登録商標）Ｕ−１００、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）と同等か、またはそれよりも速いＰＫ／ＰＤ特性を有するインスリン類似体を発明し、これらのＰＫ／ＰＤ特性が０．６Ｍｍ〜３．０ｍＭの範囲でインスリン類似体濃度の影響をあまり受けないようにしている。
【００２６】
本発明は、皮下注射後の吸収速度について超濃縮インスリン製剤の特性を改善するためのＢ２４位の非標準的フッ素修飾に関する。１つの事例では、前記インスリン類似体がＢ１０位に酸性置換基（ＧｌｕまたはＡｓｐ）を含む人工二量体であり、これらの置換基は天然型ＨｉｓＢ１０残基と亜鉛イオンとの結合を妨げ、亜鉛インスリン六量体の分子構造で明確なように、インスリン三量体の接触面を不安定化するために導入されたものである。別の事例では、前記類似体が上記のＢ１０位の酸性置換基に加え、さらにＢ２８および／またはＢ２９位に置換基を含む人工単量体であり、これらの置換基は亜鉛インスリン六量体および無亜鉛二量体の分子構造で明確なように、インスリンの古典的二量体の接触面を不安定化するために導入されたものである。さらに別の事例では、上記の二量体および単量体類似体がＡ８位にさらに置換基を含む。
【００２７】
２つの特定の実施形態のいずれかにおいて（２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（ＤＫＰはＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９を表す）、および２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−［ＡｓｐＢ１０，ＯｒｎＢ２９］−インスリン（Ｏｒｎはオルニチンを指す））、本発明は、野生型ヒトインスリンと同等か、またはこれよりも低いＩ型ＩＧＦ受容体の親和性、野生型ヒトインスリンと同等か、またはこれよりも低いＩ型ＩＧＦ受容体の自己リン酸化刺激活性、および野生型ヒトインスリンと同等か、またはこれよりも低いヒト乳癌細胞由来細胞株の増殖刺激活性を示すインスリン類似体を提供する。ただし、本発明はヒトインスリンおよびその類似体の２Ｆ−ＰｈｅＢ２４誘導体に制限されない。また、これらの置換は、限定されない例により、ブタ、ウシ、ウマ、およびイヌインスリンなどの動物インスリン由来の二量体および単量体類似体でも行われると想定される。
【００２８】
Ｌｉｌｌｙ希釈液において、皮下注射後、ストレプトゾトシンにより糖尿病とした雄Ｌｅｗｉｓラットで製剤化した場合、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンおよび２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−［ＡｓｐＢ１０，ＯｒｎＢ２９］−インスリンは血糖濃度を直接低下させ、その効力は同じ製剤の野生型ヒトインスリンと同等であることが発見された。Ｌｉｌｌｙ希釈液において、皮下注射後、内因性のＢ細胞によるインスリン分泌がオクトレオチドの静脈内投与により抑制されている麻酔ヨークシャー豚で製剤化した場合、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンおよび２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−［ＡｓｐＢ１０，ＯｒｎＢ２９］−インスリンは血糖濃度を直接低下させ、その効力は同じ製剤の野生型ヒトインスリンと同等であることが発見された。
【００２９】
さらに、または選択的に、本発明のインスリン類似体は前記Ｂ鎖の２９位に標準的または非標準的アミノ酸置換を含み、これは野生型インスリンではリジン（Ｌｙｓ）である。１つの実施例では、前記Ｂ２９の非標準的アミノ酸がノルロイシン（Ｎｌｅ）である。別の実施例では、前記Ｂ２９の非標準的アミノ酸がオルニチン（Ｏｒｎ）である。
【００３０】
さらに、ヒトと動物インスリンの類似点、およびヒト糖尿病患者における過去の動物インスリンの使用状況を考慮し、インスリンの配列中に他のわずかな修飾、特に「保存的」と考えられる置換基を導入することができる。例えば、アミノ酸のさらなる置換基は、本発明から逸脱せずに、類似の側鎖を持つアミノ酸群とすることができる。これには、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）およびメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）などの中性疎水性アミノ酸が含まれる。同様に、中性極性アミノ酸はグリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、およびアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群内で互いに置換することができる。塩基性アミノ酸はリジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸はアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。他に記載がない限り、または内容から明らかであれば、本明細書で示すアミノ酸はＬアミノ酸とみなす。標準的アミノ酸は、同じ化学的分類に属する非標準的アミノ酸と置換することもできる。限定されない例として、前記塩基性側鎖のＬｙｓは側鎖の長さが短い塩基性アミノ酸（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）と交換することができる。Ｌｙｓは天然型脂肪族で等量のノルロイシン（Ｎｌｅ）と交換することができ、これはより短い脂肪族側鎖を含む類似体（アミノ酪酸またはアミノプロピオン酸）と交換することができる。
【００３１】
１つの実施例では、本発明のインスリン類似体が、本発明の２Ｆ−ＰｈｅＢ２４およびＢ１０置換以外に４つ以下の保存的置換を含む。特定の実施例では、変異型Ｂ鎖ポリペプチド配列を含む製剤が、ヒトインスリンに対してＢ３位にＡｓｎまたはＬｙｓ置換基も含む。さらに、または選択的に、前記製剤はさらに、Ａ８位にグルタミン酸置換またはヒスチジン置換を含むインスリンＡ鎖ポリペプチド配列を含む。
【００３２】
本明細書およびその請求項で使用されているとおり、インスリンまたはインスリン類似体の様々なアミノ酸は、問題となるアミノ酸残基、続いて選択的に上付き文字で示す前記アミノ酸の位置により記すことができる。問題となる前記アミノ酸の位置情報には、置換があるインスリンがＡ鎖か、またはＢ鎖かを含む。そのため、ＰｈｅＢ２４は、インスリンＢ鎖の２４番目のアミノ酸がフェニルアラニンであることを示す。芳香族環のフッ素誘導体は平面性を保持しているが、π電子の分布が異なり、２Ｆ−フェニルアラニン（図３Ｂ）と比較したフェニルアラニン（図３Ａ）の正面図および側面図で図示したとおり、静電電位が変化している。本明細書に用いるとおり、議論している特定の実施形態に利用されている特定の種にかかわらず、特定の置換について列挙された位置は、野生型ヒトインスリンに対する位置であると理解される。このようにして、置換の位置は、特定のポリペプチドの挿入、伸長、または欠失にかかわらず同一である。
【００３３】
本発明では、ＰｈｅＢ２４の２Ｆ修飾が電気陰性原子および静電双極子モーメントを導入し、これにより（ｉ）インスリン単量体が熱力学的に安定化し、（ｉｉ）受容体結合表面の機能的特徴が変化すると想定している。当該分野では、受容体結合の増強と関連してインスリンの安定性を向上させる置換が知られているが、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４は受容体結合を抑制しながらインスリンを安定化する。特に、この変更はＢ１０位の酸性置換基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）の影響を弱め、Ｉ型ＩＧＦ受容体への結合およびそこからのシグナル伝達を増強するために機能し、この変更は、おそらく、前記類似体の前記受容体での滞留時間を短縮することで、そのようなＢ１０置換の影響を弱め、インスリン受容体に対する結合を高めるために機能し、このような考えられるメカニズムにより、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４は野生型ヒトインスリンと比較して過剰な分裂促進性を発生させずに、Ｂ１０の酸性残基を組み込むことができる。
【００３４】
Ｂ２４のフェニルアラニンは機能的インスリンの不変アミノ酸であり、芳香族側鎖を含む。インスリンＰｈｅＢ２４の生物学的重要性は、ヒト糖尿病を引き起こす臨床的変異（ＳｅｒＢ２４）により示される。理論に縛られることは望まないが、ＰｈｅＢ２４は古典的受容体結合表面の疎水性コアの端でパッキングされると考えられる。前記モデルは結晶学的プロトマーに基づいている（２−Ｚｎ分子１、タンパク質データバンクの識別記号４ＩＮＳ）。ＰｈｅＢ２４は前記Ｂ鎖のＣ末端βストランド（残基Ｂ２４〜Ｂ２８）にあり、中心のαへリックス（残基Ｂ９〜Ｂ１９）に隣接している。インスリン単量体において、芳香族環の１つの面および端はＬｅｕＢ１５とＣｙｓＢ１９によって決まる浅いポケットに入り、もう１つの面および端は溶媒と接触する（図２Ｂ）。このポケットは、一部、主鎖のカルボニル基およびアミド基に囲まれているため、不規則な緩い立体的境界を持つ、複雑で非対称の静電気環境を作る。このインスリン二量体、およびインスリン六量体の３つの二量体の各接触面において、ＰｈｅＢ２４の側鎖は、二量体の接触面にある８個の芳香族環グループ（ＴｙｒＢ１６、ＰｈｅＢ２４、ＰｈｅＢ２５、ＴｙｒＢ２６、およびその二量体結合基）の一部として、より隙間なく充填された空間環境にパッキングされている。理論と関係なく、２Ｆ誘導体によるＰｈｅＢ２４の芳香環の置換は、前記インスリン単量体内に好ましい非対称静電相互作用を導入しつつ、前記二量体接触面で全体的に疎水性のパッキングを保存している。
【００３５】
本発明は、物理的安定性、化学的安定性、および分裂促進性について、二量体または単量体インスリン類似体の超濃縮製剤の特性を改善する、Ｂ２４位での非標準的修飾に関する。これらの改善のため、前記インスリン類似体はＵ−１００以上Ｕ−５００以下の強度で製剤化することができ、インスリン類似体の濃度と関係なく、前記製剤はレギュラー野生型ヒトインスリンＵ−１００製剤と同様の皮下注射後の吸収速度および薬理活性を維持するようになっており、後者の例はヒューマリン（登録商標）Ｒ  Ｕ−１００（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ）またはノバリン（登録商標）Ｒ  Ｕ−１００（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）である。１つの事例では、前記インスリン類似体が、Ｂ１０位の酸性置換基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）と関連して２Ｆ−ＰｈｅＢ２４を含む。さらに他の事例では、Ｂ２４の非標準的アミノ酸置換にＢ１０の酸性置換およびＢ２９位の非標準的置換、またはＡ鎖またはＢ鎖のどこかに３箇所以下の標準的置換が伴う。
【００３６】
本発明の置換は、どのような数の既存のインスリン類似体でも作ることができると予測される。例えば、本明細書で提供されるＢ２４位のフェニルアラニンのオルト−フルオロ誘導体（２Ｆ−ＰｈｅＢ２４）は、インスリンリスプロ（［ＬｙｓＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インスリン、本明細書ではＫＰ−インスリンと略す）、インスリンアスパルト（ＡｓｐＢ２８−インスリン）、インスリングルリジン（［ＬｙｓＢ３，ＧｌｕＢ２９］−インスリン）、または他の修飾インスリンまたはインスリン類似体との関連で、Ｂ１０位に酸性残基を含むインスリン類似体、またはヒトインスリンに加え、レギュラーインスリン、ＮＰＨインスリン、レンテインスリン、またはウルトラレンテインスリンなどの様々な製剤処方内に作成することができる。インスリンアスパルトはＡｓｐＢ２８置換を含み、Ｎｏｖａｌｏｇ（登録商標）として販売されているが、インスリンリスプロはＬｙｓＢ２８およびＰｒｏＢ２９置換を含み、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の名称で知られ、販売されており、インスリングルリジンは置換基ＬｙｓＢ２８およびＰｒｏＢ２９を含み、Ａｐｉｄｒａ（登録商標）の名称で知られ、販売されている。これらの類似体は米国特許第５，１４９，７７７号、第５，４７４，９７８号、および第７，４５２，８６０号明細書で報告されている。これらの類似体はそれぞれ速効型インスリンとしても知られている。
【００３７】
比較のため、配列ＩＤ番号１として、ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を提供する。  
配列ＩＤ番号：１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００３８】
配列ＩＤ番号２としてヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を提供する。  
配列ＩＤ番号：２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００３９】
配列ＩＤ番号３としてヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を提供する。  
配列ＩＤ番号：３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００４０】
ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列は、Ｂ２４位のオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（２Ｆ−Ｐｈｅ）を置換して修飾することができる。そのような配列の例を配列ＩＤ番号４として提供する。  
配列ＩＤ番号：４
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ５−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｒｙ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ、Ｘａａ３はＬｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｌａ、Ｘａａ４はＡｓｐまたはＧｌｕ、およびＸａａ５はＡｓｎまたはＬｙｓである］
【００４１】
配列ＩＤ番号５で提供されるとおり、Ｂ２４位の２Ｆ−Ｐｈｅの置換は、選択的に、Ｂ２９位の非標準的置換と組み合わせることができる。  
配列ＩＤ番号：５
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｒｙ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏ、Ｘａａ３はオルニチン、ジアミノ絡酸、ジアミノプロピオン酸、ノルロイシン、アミノ絡酸、またはアミノプロピオン酸、およびＸａａ４はＡｓｐまたはＧｌｕである］
【００４２】
さらに、他の置換の組み合わせも本発明の範囲内である。本発明の置換および／または付加は、すでに既知のインスリン類似体の置換と組み合わせることもできる。例えば、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換も導入することができ、インスリンリスプロのＬｙｓＢ２８およびＰｒｏＢ２９置換を含むヒトインスリンＢ鎖類似体のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号：６として提供する。  
配列ＩＤ番号：６
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ２−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕである］
【００４３】
同様に、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換も導入することができ、インスリンアスパルトのＡｓｐＢ２８置換を含むヒトインスリンＢ鎖類似体のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号：７として提供する。  
配列ＩＤ番号：７
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ２−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ．
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕである］
【００４４】
さらに別の実施形態では、配列ＩＤ番号：８として提供されるとおり、前記Ｂ鎖インスリン類似体ポリペプチドがＢ３位にリジン、Ｂ２９位にグルタミン酸、Ｂ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニンを含む。  
配列ＩＤ番号：８
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ２−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ．
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕである］
【００４５】
２Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換は、同時係属の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００３２０号および米国特許第１２／１６０，１８７号明細書でより完全に説明されているとおり、残基Ａ８の置換を含むヒトインスリン類似体など、他のインスリン類似体置換と組み合わせて導入することもできる。例えば、前記２Ｆ−ＰｈｅＢ２４の置換はＨｉｓＡ８またはＧｌｕＡ８と存在することができ、前記変異型Ａ鎖は配列ＩＤ番号：９で提供される。  
配列ＩＤ番号：９
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ；
式中、Ｘａａ１はＨｉｓまたはＧｌｕである。
【００４６】
配列ＩＤ番号：４〜８で提供されるインスリン類似体は、トリプシンを触媒とした半合成により調整することができ、ＡｓｐＢ１０−インスリン、ＧｌｕＢ１０−インスリン、またはその変異型のデス−オクタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］フラグメントはＡ８位にさらに置換を含み、前記Ａ鎖およびＢ鎖がシステインＡ７−Ｂ７およびＡ２０−Ｂ１９と結合し、前記Ａ鎖がシステインＡ６−Ａ１１を含む、配列ＩＤ番号：１０および１１で提供される。
【００４７】
配列ＩＤ番号：１０
（Ａ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
式中、ＸａａはＴｈｒ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである。  
配列ＩＤ番号：１１
（Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
式中、ＸａａはＨｉｓまたはＧｌｕである。  
【００４８】
トリプシンを介した半合成も、配列ＩＤ番号：１２〜１４で提供されるオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（２Ｆ−Ｐｈｅ）を含む合成オクタペプチドを利用している。
【００４９】
配列ＩＤ番号：１２
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＬｙｓであり、そのε−アミノ官能基に結合した、外すことのできる保護基を含む］
配列ＩＤ番号：１３
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＧｌｕである］
配列ＩＤ番号：１４
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はノルロイシン、オルニチン、ジアミノ絡酸、またはジアミノプロピオン酸である］
配列ＩＤ番号：１５
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕである］
配列ＩＤ番号：１６
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｘａａ２はＬｙｓであり、ε−アミノ官能基に結合した、外すことのできる保護基を含む］
配列ＩＤ番号：１７
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１は２Ｆ−Ｐｈｅである］
【００５０】
例えば米国特許第８，１９２，９５７号明細書で開示されているとおり、短鎖インスリン類似体へのさらなる置換として、Ｂ２４のオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン置換も導入することができる。
【００５１】
オルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（２Ｆ−Ｐｈｅ）は、ＤＫＰ−インスリンと命名され、ＡｓｐＢ１０（Ｄ）、ＬｙｓＢ２８（Ｋ）、およびＰｒｏＢ２９（Ｐ）の置換を含む、天然活性を持つ人工インスリン単量体に導入された。前記Ｂ鎖表面のこれら３つの置換は、二量体および六量体の形成を妨げ、亜鉛イオンの有無にかかわらず、またフェノール系保存剤の有無にかかわらず、六量体の集合と適合しないと考えられている。ＫＰ−インスリン（ＤＫＰインスリンのＡｓｐＢ１０置換がない）はＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）（インスリンリスプロとも命名されている）の有効成分であり、現在、速効型インスリン類似体製剤として臨床的に使用されている。ＤＫＰインスリンのこの変異型のＢ鎖ポリペプチド配列は、配列ＩＤ番号：６として提供される。オルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（２Ｆ−Ｐｈｅ）は、ＤＤＰ−インスリンと命名され、活性が向上した人工インスリン単量体のＢ２４位にも導入され、配列ＩＤ番号４で提供した一般式に従うＤＰの置換ＡｓｐＢ２８（Ｋ）およびＰｒｏＢ２９（Ｐ）に加え、ＡｓｐＢ１０（Ｄ）の置換を含む。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４は、配列ＩＤ番号５で提供した一般式に従うＢ２９位のオルニチンを含む、非標準的インスリン類似体にも導入された。
【００５２】
上記のＡｓｐＢ１０−インスリン類似体はトリプシン触媒による半合成で作成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した（Ｍｉｒｍｉｒａ，  Ｒ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔａｇｅｒ，  Ｈ．Ｓ．，  １９８９．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  ６３４９−６３５４）。このプロトコールでは、（ｉ）残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴ（修飾残基（Ｆ＊）および「ＫＰ」置換（下線）を含む、配列ＩＤ番号：１５）を表す合成オクタペプチド、および（ｉｉ）短縮型類似体のデス−オクタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリン、またはＤＫＰ−インスリン類似体の場合は、ＡｓｐＢ１０−デス−オクタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリン（配列ＩＤ番号：１１）を利用している。ＰｒｏＢ２８とＬｙｓＢ２９が交換されている点が（イタリック）前記オクタペプチドは野生型Ｂ２３−Ｂ３０配列（ＧＦ＊ＦＹＴＰＫＴ、配列ＩＤ番号：１２）とは異なるため、トリプシン処理中、リジンε−アミノ基の保護は必要ない。簡単に説明すれば、デス−オクタペプチド（１５ｍｇ）およびオクタペプチド（１５ｍｇ）を、１０ｍＭの酢酸カルシウムおよび１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、０．４ｍＬ）を含むジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍ  Ｔｒｉｓアセテート（ｐＨ  ８）の混合物に溶解した。最終的なｐＨは１０μＬのＮ−メチルモルホリンにより７．０に調節した。前記溶液は１２℃に冷却し、ＴＰＣＫ−トリプシン１．５ｍｇを追加し、１２℃で２日間インキュベートした。２４時間後、さらに１．５ｍｇのトリプシンを加えた。前記反応は０．１％トリフルオロ酢酸により酸性化し、予備逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）により精製した。各ケースでマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）により予想値を出した（図示せず）。固相合成の一般的プロトコールは報告されているとおりである（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：  ５０２０−５０３１）。９−フルオレン−９−イル−メトキシ−カルボニル（Ｆ−ｍｏｃ）保護されたフェニルアラニン類似体はＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ）から購入した。
【００５３】
上記のプロトコールを利用し、ＰｈｅＢ２４が２−Ｆ−Ｐｈｅにより置換され、ＰｒｏＢ２８がＡｓｐ（Ｄ）により置換され、ＬｙｓＢ２９がＰｒｏ（Ｐ）により置換されたＡｓｐＢ１０−ヒトインスリンの類似体を調整した。この類似体は２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＤＰ−インスリンと命名され、頭字語ＤＤＰはそれぞれＢ１０位、Ｂ２８位、およびＢ２９位のアミノ酸残基が同一であることを指す。
【００５４】
上記のプロトコールを利用し、Ｂ２９位にオルニチン（Ｏ）を含むＡｓｐＢ１０ヒトインスリン類似体を調整し、この状況で２Ｆ−ＰｈｅＢ２４を導入した。この類似体の調製法では、２９位の非標準的アミノ酸置換を利用し、２８位のプロリン（Ｐ）を維持しながらＢ鎖のＣ末端オクタペプチド（つまり、ＬｙｓＢ２９〜ＴｈｒＢ３０）に通常存在するトリプシン部位を取り除いた。ＰｒｏＢ２８はインスリン六量体内の二量体接触面の安定性に寄与すると考えられるため、この調製法は、面倒な側鎖の保護が必要なく、他の修飾を都合よく組み込むことのできる、ほぼ等比体積の野生型インスリンモデルを提供する。この類似体は２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＤＰ−インスリンと命名され、上記のとおり、頭字語ＤＤＰはそれぞれＢ１０位、Ｂ２８位、およびＢ２９位のアミノ酸残基が同一であることを指す。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−修飾インスリン類似体は、以下のアッセイの一部またはすべての対象であった。生物学的効力は、糖尿病ラットモデル、および麻酔をかけたヨークシャー豚における正常血糖クランプ法により評価し；示された受容体結合活性値はヒトインスリンに対するホルモン受容体解離定数の比に基づいており（従って、ヒトインスリンの活性は、一般に２５％未満である活性値の標準誤差により定義すると１．０である）；Ｉ型ＩＧＦ受容体のホルモン刺激自己リン酸化アッセイは、ヒトＩＧＦ−ＩＲを発現したマウス胎児線維芽細胞で行い（ミネソタ大学のＤｅｅｐａｌｉ  Ｓａｃｈｄｅｖ博士およびＤｏｕｇｌａｓ  Ｙｅｅ博士の寄贈）；ヒト細胞株における分裂促進性アッセイでは、報告されたとおり、乳癌由来細胞株ＭＣＦ−７を利用し（Ｍｉｌａｚｚｏ  Ｇ，  Ｓｃｉａｃｃａ  Ｌ，  Ｐａｐａ  Ｖ，  Ｇｏｌｄｆｉｎｅ  ＩＤ，  Ｖｉｇｎｅｒｉ  Ｒ．  （１９９７）  ＡｓｐＢ１０−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．  １８，  １９−２５）；熱力学的安定性の値（アンフォールディングの自由エネルギーΔＧｕ）は、変性濃度ゼロに外挿した２状態モデルを基に２５℃で評価し；線維形成抵抗性は、報告されているとおり、３０℃で無亜鉛リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中、ゆっくりと攪拌し、タンパク質のフィブリル化開始に必要な時間のずれ（日）を測定することで評価した（Ｙａｎｇ，  Ｙ．，  Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ａ．Ｔ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｋ．，  Ｘｕ，  Ｂ．，  Ｈｕａ，  Ｑ．Ｘ．，  Ｙ，  Ｉ．Ｊ．，  Ｃｈｕ，  Ｙ．Ｃ．，  Ｈｕ，  Ｓ．Ｑ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｎ．Ｂ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｊ．，  Ｉｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ，  Ｆ．，  Ｍａｃｋｉｎ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｔｙｃｋｏ，  Ｒ．，  &  Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．  （２０１０）  Ａｎ  Ａｃｈｉｌｌｅｓｆ  Ｈｅｅｌ  ｉｎ  ａｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ���ｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８５，  １０８０６−１０８２１）。曲線を当てはめた結果は表４にまとめ、図８に図示している。
【００５５】
円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、Ａｖｉｖ分光偏光計により４℃および／または２５℃で取得した（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：  １５４２９−１５４４０）。サンプルには５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ７．４）中、約２５μＭのＤＫＰ−インスリンまたは類似体が含まれ、サンプルは２５℃でグアニジン誘導変性試験を行うため、５μＭに希釈した。アンフォールディングの自由エネルギーを抽出するため、Ｓｏｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１７：  ３９３−４０９に報告されているとおり、変性転移を非線形最小二乗法により２状態モデルに当てはめた。簡単に述べると、ｘが変性濃度を示すＣＤデータθ（ｘ）を下記式に従い、非線形最小二乗法により当てはめる。
【００５６】
【数１】
2014533241.tif 000002
【００５７】
式中、ｘはグアニジン濃度、θＡおよびθＢは天然状態およびアンフォールディング状態でのベースライン値である。ベースラインは以下の遷移線の前後で概算した。
【００５８】
【数２】
2014533241.tif 000003
【００５９】
変異型のアンフォールディング遷移を当てはめて得られたｍ値は、野生型のアンフォールディング曲線を当てはめて得られたｍ値よりも低かった。この差およびΔＧｕの明らかな変化が、完全にアンフォールディングした状態のＣＤシグナルを測定することができないことによるのか否かを検証するため、グアニジンを高濃度とした水平域のＣＤ値にデータを外挿したシミュレーションを行い、特に一致するΔＧｕおよびｍの推定値を得た。代表的なデータを図７に示している。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン類似体の遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、親類似体ＣＫＰ−インスリンと同等である。
【００６０】
２５℃での変性の２状態モデルから推測されるＫＰ−インスリンのベースラインの熱力学的安定性は３．０±０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅである。ＣＤ検出によるグアニジン変性研究からは、ＫＰ−インスリン（ΔΔＧｕ  １．１±０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）およびＤＫＰ−インスリン（ΔΔＧｕ  ０．６０±０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）の場合の熱力学的安定性上昇と関連していることが示される。さらに、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの物理的安定性は、インキュベーション中の３回反復実験で評価したとおり、ＫＰ−インスリンよりも著しく高いことが分かり、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、ｐＨ  ７．４、３０℃でゆっくりと攪拌しながら、前記タンパク質を３００μＭとした。前記サンプルは２０日間、またはガラスバイアルの沈殿または霜降りの徴候が見られるまで観察した。結果は図８に示している（表４も参照）。
【００６１】
相対的な受容体結合活性は、１２５Ｉ−ヒトインスリンを用いた競合置換アッセイにより測定したとおり、類似体と野生型ヒトインスリンのホルモン受容体解離定数の比として定義する。マイクロタイターストリッププレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）は、ＡＵ５  ＩｇＧ（リン酸緩衝生理食塩水中、４０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）を用いて４℃で一晩インキュベートした。結合データは２部位連続モデルにより分析した。データは非特異的結合（１μＭヒトインスリン存在下、放射能が残った関連膜量）について補正した。すべてのアッセイについて、競合するリガンドがない状態で結合したトレーサーの割合は、リガンドのない人工物を回避するため、１５％未満とした。代表的なデータは図４に提供する。
【００６２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＫＰ−インスリンまたは野生型ヒトインスリンと比較し、ＤＫＰ−インスリン類似体、ＤＤＰ−インスリン類似体、およびＤＰＯインスリン類似体またはその２Ｆ−ＰｈｅＢ２４誘導体の血糖降下特性を評価するため、ストレプトゾトシン処理により雄Ｌｅｗｉｓラット（平均体重約３００グラム）を糖尿病とした。（（ｉ）野生型インスリン、ＫＰ−インスリン、およびＡｓｐＢ２８−インスリンは同様の血糖濃度の作用パターンを示すため、および（ｉｉ）これらのパターンは、インスリン六量体が確実に集合するのに十分な化学量論量で前記製剤中の亜鉛イオンの有無の影響を受けないため、このモデルは効力を調査することができるが、薬物動態の加速度は示さない。）野生型インスリン、インスリン類似体、または緩衝液のみ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．から入手した無タンパク質滅菌希釈液、ｐＨ７．４でグリセリン１６ｍｇ、メタクレゾール１．６ｍｇ、フェノール０．６５ｍｇ、およびリン酸ナトリウム３．８ｍｇから成る）を含むタンパク質溶液を皮下注射し、得られた血糖値の変化は臨床用グルコメーター（Ｈｙｐｏｇｕａｒｄ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメーター）を用い、連続測定によりモニターした。製剤の均一性を確保するため、インスリン類似体を逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）によりあらかじめ精製しておき、粉末に乾燥し、同じ最大タンパク質濃度（３００μｇ／ｍＬ）で希釈液に溶解し、分析用Ｃ４  ｒｐ−ＨＰＬＣにより再定量し、上記緩衝液を用いて希釈した。時間ｔ＝０で、ラット３００ｇにつき緩衝液１００μＬに溶解したインスリン２０μｌを皮下注射した。この用量は体重約６７μｇ／ｋｇに相当し、国際単位（ＩＵ）では２ＩＵ／ｋｇ体重に相当する。ＫＰ−インスリンの用量反応研究は、この用量では、注射後最初の１時間でほぼ最高のグルコース除去速度となることを示していた。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＤＰ−インスリン、または２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＰＯを投与する群では５匹のラットを研究し、ＫＰ−インスリンまたは野生型ヒトインスリンを投与する対照群では、別の５匹のラットを研究した。実験開始時、２つの群は同様の血糖濃度を示した。時間０分および９０分まで１０分ごとにクリップを止めた尾の先端から採血し、一部の研究では時間を１８０分のまたは２４０分に延長した。インスリンの作用により血糖濃度が低下する効果は、注入したインスリンの濃度で分け、（最小二乗平均および最初に線が降下した領域を用い、）経時的な濃度変化により計算した。従って、これらのデータは、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの生物学的効力は亜鉛六量体製剤のＫＰ−インスリンと等しいことを示唆しているが、他の２Ｆ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体はラットモデルで検討されていない。
【００６３】
ヒトにおける薬理学的特性を予測する動物モデルにおいてインスリン類似体のＰＫ、ＰＤ、および効力を評価するため、思春期の農業用ヨークシャー豚（体重３５〜４５ｋｇ）においてＡｓｐＢ１０含有ヒトインスリンの２Ｆ−ＰｈｅＢ２４誘導体を検討した。試験日、各動物をテラゾールで麻酔導入し、イソフルランで全身麻酔した。各動物の気管内に挿管し、酸素飽和度および呼気終末呼気ＣＯ２を連続的にモニターした。前記動物は糖尿病ではなかったが、クランプ試験開始の約３０分前およびその後２時間ごとに酢酸オクトレオチド（４４ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射したため、膵島機能はＯＲで抑制されていた。ＩＶカテーテルを挿入し１０％デキストロースの注入によりベースラインの正常血糖値が確定した後、前記カテーテルからインスリンを皮下注射した。末梢のインスリンが介在したグルコースの取り込みを定量化するため、様々な速度でグルコースを注入し、血糖濃度を約８５ｍｇ／ｄｌに維持した。このグルコース注入は典型的には５〜６時間、つまり、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）の対照試験では、典型的にはグルコース注入速度がインスリン注入前のベースライン値に戻ったことが観察されるまで必要である。グルコース濃度はＨｅｍｏｃｕｅ  ２０１携帯用グルコース分析装置で１０分ごとに測定した（標準誤差１．９％）。
【００６４】
グルコースクランプ法のコンピューター制御によるプロトコールは報告されているとおりとした（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｄ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈｏｓｋｅｒ，  Ｊ．  Ｐ．  （１９８９）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １２，  １５６−１５９）。簡単に述べると、インスリンアッセイ用の血液サンプル２ｍｌは、インスリン注入後０〜４０分は５分間隔、５０〜１４０分は１０分間隔、１６０分以降、ＧＩＲがベースライン値に戻る時点までは２０分間隔のスケジュールで採取した。ＰＫ／ＰＤについては、２０分の移動平均曲線を当てはめ、フィルターをかけている。ＰＤは、ベースラインの効果最大半値到達時間（前半）、効果最大半値到達時間（後半）、効果最大値到達時間、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として測定した。これらの分析それぞれについて、その後の分析では、生データではなく、当てはめた曲線を利用した。３匹の豚それぞれに２回試験を行い、１回はＣｈｌｏｒｏｌｏｇ、１回は同量で（最高用量０．５）、比較用Ｕ−５００Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ  Ｕ−５００（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）および比較用Ｕ−１００  Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）および対照Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）（Ｌｉｌｌｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を用いて行った。結果は、強度Ｕ−４００（２．４ｍＭ、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰインスリン）または強度Ｕ−５００（３．０ｍＭ、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＤＰ−インスリン）に濃縮しても、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンおよび２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＤＰ−インスリンは速効型ＰＤを保持していることを示している。ＰＤパラメーターは表１にまとめ、図９にグラフとして示している。
【００６５】
【表１】
2014533241.tif 000004
【００６６】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける過剰の乳癌形成と関連して、非修飾ヒトインスリンの場合のＡｓｐＢ１０置換（ＡｓｐＢ１０−インスリン）は、野生型インスリンと比較して分裂促進性の亢進を示すことが観察されたため（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ，  Ｍ．Ｂ．，  Ｂｏｎｎｅｓｅｎ，  Ｃ．，  Ｈｅｇｅｌｕｎｄ，  Ａ．Ｃ．，  Ｌｕｎｄｂｙ，  Ａ．，  Ｈｏｌｍ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｍ．Ｂ．，  &  Ｋｒａｂｂｅ，  Ｊ．Ｓ．  （２０１１）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ＡｓｐＢ１０  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３１，  ３２９−４１およびその参考文献）、我々は、内因性ＩＧＦ受容体がなく、ヒトＩＧＦ−ＩＲを発現させるため、安定形質転換したマウス胚線維芽細胞において、Ｉ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）のホルモン刺激自己リン酸化に関する哺乳類細胞を基本とした研究を行った。結果は図５に図示している。前記細胞は７５％コフルエンスまで増殖させ、血清を一晩飢餓培養し、１０ｎＭのホルモン（野生型インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＡｓｐＢ１０−インスリン、ＡｓｐＢ１０−ＯｒｎＢ２９−インスリン、ＤＫＰ−インスリン、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン、または２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＰＯ−インスリン）を処理した各ケースについて細胞溶解物を調整し、供給メーカー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）が報告したとおり、抗リン酸ＧＦ−ＩＲ  ＥＬＩＳＡによりリン酸化ＩＧＦ−Ｉ受容体を分析した。試験は３回行った。結果は、ＡｓｐＢ１０−インスリンはヒトインスリンと比較してより顕著な自己リン酸化を示すが、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４を修飾すると自己リン酸化のレベルが野生型ヒトインスリンと区別できない程度まで回復することを示している。さらに、報告されているとおり、ホルモンと類似体のヒト乳癌細胞株の増殖を刺激する活性を検査した（Ｍｉｌａｚｚｏ  Ｇ，  Ｓｃｉａｃｃａ  Ｌ，  Ｐａｐａ  Ｖ，  Ｇｏｌｄｆｉｎｅ  ＩＤ，  Ｖｉｇｎｅｒｉ  Ｒ．  （１９９７）  ＡｓｐＢ１０−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．  １８，  １９−２５）。前記癌細胞は、リガンド１０ｎＭ存在下、軟寒天（腫瘍形成能を反映）におけるコロニー形成を分析し、結果を図６に図示している。ＡｓｐＢ１０−インスリンは野生型ヒトインスリンよりも増殖を刺激するが、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾をさらに追加すると、野生型インスリンと区別できないレベルまで分裂促進性が低下した。
【００６７】
２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾の構造適応は、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの２Ｄ−ＮＭＲ研究で単量体について分析した。１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトおよび核オーバーハウザー効果（ＮＯＥｓ）は天然型様のパターンが観察され、距離−配置に基づく分子モデルおよびアニーリングのシミュレーションはＤＫＰ−インスリンの２Ｄ−ＮＭＲ研究で得られたものと同等であった。単結晶のＸ線結晶学によりさらに構造研究を行った。亜鉛ＫＰ−インスリン六量体に基づく結晶は報告されたとおり成長させた（Ｌｉｕ，  Ｍ．，  Ｗａｎ，  Ｚ．，  Ｃｈｕ，  Ｙ．Ｃ．，  Ａｌａｄｄｉｎ，  Ｈ．，  Ｋｌａｐｒｏｔｈ，  Ｂ．，  Ｃｈｏｇｕｅｔｔｅ，  Ｍ．，  Ｈｕａ，  Ｑ．Ｘ．，  Ｍａｃｋｉｎ，  Ｒ．，  Ｒａｏ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ，  Ｐ．，  Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，  Ｐ．Ｇ．，  Ａｒｖａｎ，  Ｐ．  &  Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．  （２００９）  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  "ｎｏｎｆｏｌｄａｂｌｅ"  ｉｎｓｕｌｉｎ：  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４，  ３５２５９−３５２７２）。簡単に述べると、１：２．５の比のＺｎ２＋とタンパク質単量体および３．７：１の比のフェノールとタンパク質単量体存在下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で懸滴蒸気拡散により結晶を成長させた。液滴の構成は、１μｌのタンパク質溶液（０．０２Ｍ  ＨＣｌ中１０ｍｇ／ｍｌ）と１μｌの貯留液（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、５％アセトン、０．０３％フェノール、および０．０１％酢酸亜鉛、ｐＨ  ８．１）を混合したものであった。各液滴は１ｍｌの貯留液に懸濁した。結晶（空間群Ｒ３）は室温で２週間後に得られた。データはレーヨンループに付いた単結晶から収集し、１００Ｋに急速冷凍した。２４．９８〜２．５０Åの反射は、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｈｉｃａｇｏ）の先端放射光施設（ＡＰＳ）において、シンクロトロン放射のＣＣＤ検出システムで測定した。データはプログラムＨＫＬ２０００で処理した（Ｚ．  Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍｉｎｏｒ  （１９９７）  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅ  "，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２７６：  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ［Ｃ．Ｗ．  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｊｒ．  &  Ｒ．  Ｍ．  Ｓｗｅｅｔ，  Ｅｄｓ．］，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐａｒｔ  Ａ，  ｐｐ．  ３０７−２６．）。前記結晶は、単位格子のパラメーターａ＝ｂ＝７７．９８Å、ｃ＝３７．１４Å、α＝β＝９０Å、γ＝１２０Åを示した。前記構造は、ＣＮＳを利用した分子置換により決定した。従って、天然型ＴＲ二量体を用いてモデルを得た（水分子、亜鉛および塩化物イオンをすべて除いた後のタンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ：ＰＤＢ）の識別コード１ＲＷＥ）。１５．０〜４．０Åの解像度でデータを解析後、回転関数の最適な解の座標を用い、並進関数検索を行った。全体の異方性温度因子およびバルク溶媒の補正により、ＣＮＳを利用した剛体の微調整では、解像度２５．０〜３．０ÅのデータでＲおよびＲｆｒｅｅの値はそれぞれ０．２９および０．３３となった。精製サイクルの間に、２．５０Åの解像度までのデータを使用して２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃマップを計算し、亜鉛および塩化物イオンとフェノール分子から、プログラムＯを用いて構造を構築した。前記配置はＰＲＯＣＨＥＣＫを用いて連続的にモニターし、精製が進むと、亜鉛イオンおよび水分子から異なるマップが構築された。（特に、各単量体のＢ鎖Ｎ末端の最初の８残基に関する）ｏｍｉｔ  ｍａｐの計算、さらに微調整はＣＮＳを利用して行い、最大尤度でのねじれ角の動態および共役勾配の微調整を行った。
【００６８】
前記構造は、図１０に図示されるとおり、親類似体と同様である。芳香環の位置は野生型インスリンの未修飾残基と同様であるが、ＴおよびＲｆ状態のプロトマーは、図１１に示される電子密度マップに図示されているとおり、特徴のある配座を示す。各ケースで、個々のインスリンプロモーターについて２Ｆ−ＰｈｅＢ２４芳香環の配向のため、天然型様の二量体化では外側接触面が残る。理論とは関係なく、単量体２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン類似体の２Ｄ−ＮＭＲ研究においてＴ字状の配向性が観察され、好ましい静電相互作用を生じる可能性が高いため、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体の熱力学的安定性向上を理論的に説明している。この配座では、電気陰性フルオロ置換は２つのアミド窒素（ＰｈｅＢ２５およびＴｙｒＢ２６の主鎖ペプチドＮＨ基）の部分正電荷の近くにある。
【００６９】
（残基Ｂ２８およびＢ２９が二量体化を阻害しない２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＰＯ−インスリンおよび関連類似体に関して）二量体化と２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾の互換性を検証するため、修飾されていなければ六量体を形成することのできる骨格に２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾を導入し、コバルト（Ｃｏ２＋）六量体集合の分光学的分析および六量体分解の動力学的分析ができるようにした。インスリン類似体六量体の動力学的安定性は、５０ｍＭフェノールと１０  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌから成る緩衝液（ｐＨ  ７．４）中、コバルトイオン：六量体＝２．２：１で存在するＣｏ２＋複合体として、２５℃で野生型ヒトインスリン六量体と比較評価した。Ｂｅａｌｓらの手順（Ｂｉｒｎｂａｕｍ，  Ｄ．Ｔ．，  Ｋｉｌｃｏｍｏｎｓ，  Ｍ．Ａ．，  ＤｅＦｅｌｉｐｐｉｓ，  Ｍ．Ｒ．，  &  Ｂｅａｌｓ，  Ｊ．Ｍ．    Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＬｙｓＢ２８，  ＰｒｏＢ２９−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｈｅｘａｍｅｒｓ：  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｓｔｕｄｙ．  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  １４，  ２５−３６  （１９９７））を変更したアッセイでは、５００〜７００ｎｍの光学的吸収を利用し４面体コバルトイオン配位に特徴的なＲ６−六量体特異的ｄ−ｄ遷移をモニターしている。平衡状態の溶液はコバルトインスリン六量体またはコバルトインスリン類似体六量体が優位に含まれるが、この平衡状態はインスリンの集合速度と分解速度が相対することで特徴付けられる。前記アッセイを開始するため、金属イオン封鎖剤に結合していないコバルトイオンに対して、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）中の溶液濃度を２ｍＭとする。ＥＤＴＡを追加し、Ｒ６特異的吸収バンド遅延の時間経過により、六量体の分解速度を推定できる。野生型インスリンの時定数は４１９±５１秒であるが、ＫＰ−インスリンの時定数は、薬物動態の加速と一致し、１１４±１３秒を示した。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＰＯ−インスリンのベースライン吸収スペクトルは、驚くほど野生型ヒトインスリンと類似しており、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾は天然型様二量体接触面の形成を阻害しなかった。
【００７０】
２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾の構造適応は、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの２Ｄ−ＮＭＲ研究で単量体について分析した。１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトおよび核オーバーハウザー効果（ＮＯＥｓ）は天然型様のパターンが観察され、距離−配置に基づく分子モデルおよびアニーリングのシミュレーションはＤＫＰ−インスリンの２Ｄ−ＮＭＲ研究で得られたものと同等であった。単結晶のＸ線結晶学によりさらに構造研究を行った。亜鉛ＫＰ−インスリン六量体に基づく結晶は報告されたとおり成長させた（Ｌｉｕ，  Ｍ．，  Ｗａｎ，  Ｚ．，  Ｃｈｕ，  Ｙ．Ｃ．，  Ａｌａｄｄｉｎ，  Ｈ．，  Ｋｌａｐｒｏｔｈ，  Ｂ．，  Ｃｈｏｇｕｅｔｔｅ，  Ｍ．，  Ｈｕａ，  Ｑ．Ｘ．，  Ｍａｃｋｉｎ，  Ｒ．，  Ｒａｏ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ，  Ｐ．，  Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，  Ｐ．Ｇ．，  Ａｒｖａｎ，  Ｐ．  &  Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．  （２００９）  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎｆｏｌｄａｂｌｅ灯  ｉｎｓｕｌｉｎ：  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４，  ３５２５９−３５２７２）。前記構造は、図１０に図示されるとおり、親類似体と同様である。特に、個々のインスリンプロモーターについて２Ｆ−ＰｈｅＢ２４芳香環が内側に配向しているため、天然型様の二量体化では外側接触面が残る。理論とは関係なく、単量体２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン類似体の２Ｄ−ＮＭＲ研究においてもこの内側への配向が観察され、好ましい静電相互作用を生じる可能性が高いため、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体の熱力学的安定性向上を理論的に説明している。
【００７１】
解離定数（Ｋｄ）は、ＷｈｉｔｔａｋｅｒおよびＷｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２０９３２−２０９３６）の報告通り、マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイをわずかに変更し、１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４−インスリン（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ寄贈）および精製した可溶化インスリン受容体（ＢまたはＡイソ型）を用いた競合置換アッセイにより決定し、形質移入した受容体のＣ末端を３回連続ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）により標識し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）によりマイクロタイタープレートをコーティングした。競合するリガンドがない状態で結合したトレーサーの割合は、リガンドのない人工物を回避するため、１５％未満とした。結合データ（図５に図示）は、異種間競合モデル（Ｗａｎｇ，  １９９５，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０：  １１１−１１４）を用いて非線形回帰により分析し、解離定数を求めた。結果は表２（２Ｆ−ＰｈｅＢ２４  ＫＰ−インスリン類似体とＫＰ−インスリンの比較）および表３（鋳型ＤＫＰ、ＤＤＰ、およびＤＰＯ、表３の脚注参照）に示し、解離定数はナノモル単位で示している。（前記２試験は、別の日にインスリン受容体（ＩＲイソ型Ｂ、ＩＲ−Ｂ）およびＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）が異なる調合液を用いて行ったため、独立して表にしている。）ＫＰ−インスリンの２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾は、ＩＲ−Ｂ受容体結合親和性を２〜３倍低下させるが、このようなわずかな低下は、本明細書で糖尿病Ｌｅｗｉｓラットにおいて証明されたとおり、天然型または天然型に近い低血糖力価と関連していることが多い。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのＩＧＦ−ＩＲに対する交差結合に有意な増加は観察されなかった。ＤＫＰ−インスリンの２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾はＩＲ−Ｂ受容体結合親和性を２倍未満低下させ、ＩＧＦ−ＩＲに対する交差結合は統計学的有意性の限界値付近で観察された。
【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
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【００７４】
Ｂ２４位に２Ｆ−Ｐｈｅ置換がある場合とない場合で、Ｂ２９位に非標準的アミノ酸のオルニチンを含む類似体の結合親和性を同様に検討した。結果は、ヒトインスリン受容体イソ型Ｂ（ｈＩＲ−Ｂ）およびヒトＩＧＦ受容体（ｈＩＧＦＲ）と比較した解離定数として、表３に示している。ＯｒｎＢ２９は各受容体に対する結合親和性が野生型インスリンと同様であるが、ＮｌｅＢ２９はｈＩＲ−ＢおよびＩＧＦＲに対する親和性が野生型インスリンよりも低下している。ただし、ＯｒｎＢ２９と２Ｆ−ＰｈｅＢ２４をいずれも含む類似体は、インスリン受容体の両方のイソ型に対する結合親和性が低下しており、ｈＩＧＦＲに対する親和性はわずかに上昇していた。ＮｌｅＢ２９類似体である２Ｆ−ＰｈｅＢ２４は、ｈＩＧＦＲに対する結合親和性がＮｌｅＢ２９のみの類似体と同等であったが、ｈＩＲ−Ｂに対する結合親和性は低下していた。
【００７５】
【表４】
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【００７６】
患者を治療する方法は、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４修飾を含むインスリン類似体および当該分野で既知または本明細書で知られているＡ鎖またはＢ鎖のさらなるアミノ酸置換を含むインスリン類似体を投与する工程を有する。１つの実施例では、前記２Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換インスリン類似体は、ＤＫＰ−インスリンのＢ２４位に２Ｆ−Ｐｈｅを含むインスリン類似体である。別の実施例では、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４はＡｓｐＢ１０−ヒトインスリン類似体内の置換であり、Ｂ２９位に非標準的修飾を含む（オルニチンまたはノルロイシン）。非標準的アミノ酸置換を利用することにより、保護されていないオクタペプチドを使用し、トリプシンを介した半合成によりインスリン類似体の急速で効率的な調整方法を可能とすることも、本発明のさらに別の観点である。
【００７７】
さらに別の実施例では、前記インスリン類似体が外部または埋め込み型インスリンポンプにより投与される。本発明のインスリン類似体は、米国特許第８，１９２，９５７号明細書でより詳細に報告されている前記Ｂ鎖のＣ末端と前記Ａ鎖のＮ末端との結合など、他の修飾も含む。
【００７８】
薬学的組成物には、そのようなインスリン類似体を有し、選択的に亜鉛を有することもある。亜鉛イオンは、前記インスリン類似体の六量体１個につき２．２〜３．０のモル比のレベルで、そのような組成物に含まれることもある。そのような製剤では、前記インスリン類似体の濃度が典型的には約０．１〜約３ｍＭであり、最高３ｍＭの濃度をインスリンポンプの容器に入れて使用することができる。食事時間のインスリン類似体の修飾は、（ａ）Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｎｏｖａｌｉｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＮｏｖａｌｏｇ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）の「レギュラー」製剤、および現在ヒトでの使用が承認されている他の速効型インスリン製剤、（ｂ）上記および他のインスリン類似体の「ＮＰＨ」製剤、および（ｃ）そのような製剤の混合物について報告されているとおり、考案することができる。
【００７９】
添加物には、グリセロール、グリシン、アルギニン、Ｔｒｉｓ、他の緩衝剤および塩、およびフェノールおよびメタクレゾールなどの抗菌性保存剤を含むことができ、この抗菌性保存剤は前記インスリン六量体の安定性を高めることが知られている。そのような薬学的組成物を用い、前記組成物の生理的有効量を糖尿病または他の病状を有する患者に投与することで、前記患者を治療することができる。本発明のインスリン類似体は、亜鉛イオン非存在下、および５〜１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）存在下、製剤化することができる。後者のキレート剤はクエン酸イオン非存在下で使用される。
【００８０】
インスリン類似体をコードするポリペプチドをコードする配列を有する核酸も想定され、このインスリン類似体は、少なくともインスリンのＢ鎖とＢ２４位のオルト−モノフルオロ−フェニルアラニンをコードする配列を含む。これは、サプレッサーｔＲＮＡ（アンバーコドンが使用されている場合はアンバーサプレッサー）および対応するｔＲＮＡ合成酵素と合わせてＢ２４位にストップコドン（アンバーコドンのＴＡＧなど）を導入することで達成することができ、ｔＲＮＡ合成酵素は、すでに報告されているとおり、前記ストップコドンに反応してポリペプチドに非標準的アミノ酸を組み込む（Ｆｕｒｔｅｒ，  １９９８，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ７：４１９−４２６；  Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３６：  ２２７−２３８）。特定の配列は、核酸配列が導入される種に好ましいコドンを使用しているかによって変化する可能性がある。前記核酸は、野生型インスリンの他の修飾もコードする。前記核酸配列は、前記ポリペプチドまたは修飾プロインスリン類似体の別の位置に関連のない置換または伸長を含む修飾Ａ鎖またはＢ鎖配列をコードすることもある。前記核酸は発現ベクターの一部でもあり、このベクターは大腸菌細胞株などの原核宿主細胞、または出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）またはメタノール資化酵母（Ｐｉｓｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株または細胞株などの真核細胞株のような宿主細胞に挿入される可能性がある。
【００８１】
例えば、合成遺伝子はメタノール資化酵母および他の微生物でＢ鎖ポリペプチドを発現させるために合成できると想定される。Ｂ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニンを組み込む目的で、その位置にストップコドンを利用したＢ鎖ポリペプチドの核酸配列は、以下の配列またはその変異型とすることができる。
【００８２】
（ａ）ヒトコドンを優先：
ＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣ  （配列ＩＤ番号：１８）
【００８３】
（ｂ）メタノール資化酵母コドンを優先：
ＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＴ  （配列ＩＤ番号：１９）
【００８４】
同様に、ヒトコドンを優先し、Ｂ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニンを組み込む目的で、その位置にストップコドンを利用した全長プロインスリンｃＤＮＡは配列ＩＤ番号：２０を有する。
ＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣ  ＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧ  ＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣ  ＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧ  ＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴ  ＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧ  ＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴ  ＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣ  ＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣ  ＣＧＣＣＧＧＧＡＧＧ  ＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴ  ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ  ＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣ  ＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧ  ＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡ  ＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣ  ＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣ  ＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧ  ＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡ  ＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴ  ＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡ  ＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡ  ＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧ  ＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴ  ＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡ  Ｇ  （配列ＩＤ番号：２０）
【００８５】
同様に、Ｂ２４位にオルト−モノフルオロ−フェニルアラニンを組み込む目的で、その位置にストップコドンを利用し、メタノール資化酵母に好ましいコドンを有する全長ヒトプロインスリンｃＤＮＡは配列ＩＤ番号：２１を有する。
ＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣ  ＡＡＣＡＴＴＴＧＴＧ  ＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴ  ＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧ  ＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴ  ＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴ  ＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴ  ＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣ  ＴＣＣＡＡＡＧＡＣＴ  ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧ  ＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴ  ＧＣＡＡＧＴＴＧＧＴ  ＣＡＡＧＴＴＧＡＡＴ  ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧ  ＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴ  ＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣ  ＡＡＣＣＡＴＴＧＧＣ  ＴＴＴＧＧＡＡＧＧＴ  ＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡ  ＡＧＡＧＡＧＧＴＡＴ  ＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡ  ＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴ  ＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣ  ＴＴＴＧＴＡＣＣＡＡ  ＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴ  ＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡ  Ａ  （配列ＩＤ番号：２１）
【００８６】
遺伝暗号は同義であることを考えると、同じポリペプチド配列をコードするこれらの配列の他の変異型も可能である。
【００８７】
前述の開示に基づき、提供されたインスリン類似体は以上に示した目的を実行することは、今や明らかである。すなわち、これらのインスリン類似体は０．６〜３．０ｍＭ（野生型インスリンおよび食事中のインスリン類似体の場合は強度Ｕ−１００〜Ｕ−５００に対応することが多い）の広範なタンパク質濃度で製剤化した場合、皮下沈着物からの吸収速度および血糖濃度の制御における薬理活性が向上するが、同時に、野生型インスリンの生物活性を少なくとも部分的に維持する。さらに、インスリン類似体が３．０ｍＭ（強度Ｕ−５００）の高強度で速効型の薬物動態学的および薬力学的特性が維持される製剤は、著しいインスリン抵抗性に直面した場合、糖尿病の安全で効果的な治療における有用性が向上する。従って、あらゆる変形形態が請求された発明の範囲に入るため、本明細書で開示および説明された本発明の精神から離れずに、特定の成分要素の選択を決定できることは理解されるものとする。
【００８８】
以下の文献は、本明細書で説明された検査およびアッセイ方法は、当業者の１人に理解されるだろうことを証明するために引用している。
Ｆｕｒｔｅｒ，  Ｒ．，  １９９８．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐ−ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ７：４１９−４２６．
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｖｉｚｉｏｌｉ，  Ｌ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｂｏｍａｎ，  Ｈ．Ｇ．  １９８２．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ａ  （１−３３）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：  ５０２０−５０３１．
Ｍｉｒｍｉｒａ，  Ｒ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔａｇｅｒ，  Ｈ．Ｓ．  １９８９．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ｂ２４  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  ６３４９−６３５４．
Ｓｏｓｎｉｃｋ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｆａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｔｏｎ，  Ｖ．Ｍ．  ２０００．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ＲＮＡ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１７：  ３９３−４０９．
Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｘ．  １９９５．  Ａｎ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０：  １１１−１１４．
Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．，  Ｈｕａ，  Ｑ．Ｘ．，  Ｊｉａ，  Ｗ．，  Ｃｈｕ，  Ｙ．Ｃ．，  Ｗａｎｇ，  Ｒ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，  Ｐ．Ｇ．  ２０００．  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  "ｕｎ−ｄｅｓｉｇｎ"：  ｉｎｓｕｌｉｎ‘ｓ  ｉｎｔｒａｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｔｅｔｈｅｒｓ  ａ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  α−ｈｅｌｉｘ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：  １５４２９−１５４４０．
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｌ．  ２００５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２０９３２−２０９３６．
Ｘｉｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  ２００５．  Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３６：  ２２７−２３８．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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