(57)【要約】  前立腺癌に罹患した哺乳動物対象を治療するための方法であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）構造（Ｉ）を有するアンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩を、各々もう一方と併用するときに前記哺乳動物対象を治療するのに有効な量で前記哺乳動物対象に投与することを含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌に罹患した哺乳動物対象を治療するための方法であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）次の構造を有するアンドロゲン受容体アンタゴニスト
【化１】
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または薬学的に許容されるその塩を、各々もう一方と併用するときに前記哺乳動物対象を治療するのに有効な量で前記哺乳動物対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記癌が、アンドロゲン非依存的前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
合わせて投与したときの前記オリゴヌクレオチドの前記量と前記アンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の前記量が、各薬剤を単独投与したときよりも、前記対象を治療するのに有効である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の前記量と併用する前記オリゴヌクレオチドの前記量が、単独投与時に臨床的に有効な量より少ない、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドの前記量と併用する前記アンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の前記量が、単独投与時に臨床的に有効な量より少ない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
合わせて投与したときの前記オリゴヌクレオチドの前記量と前記アンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の前記量が、前記対象における前立腺癌の臨床症状を軽減するのに有効である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、クラステリンをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位または終結部位のいずれかにまたがっている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜１１に記載の配列のヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３に記載の配列のヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを改変して、同じ配列の無改変のオリゴヌクレオチドと比較してｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を強化する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、クストリセンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記クストリセンの前記量が、６４０ｍｇ未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記クストリセンの前記量が、４８０ｍｇ未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記クストリセンの前記量が、７日間に１回、静脈内投与される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの前記量が、２４０ｍｇ未満である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの前記量が、１５０ｍｇ〜２４０ｍｇである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの前記量が、３０ｍｇ〜１５０ｍｇである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの前記量が、８０ｍｇである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの前記量が、１日に１回経口投与される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療方法であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）アンドロゲン受容体アンタゴニストを、各々もう一方と併用するときに前記哺乳動物対象を治療するのに有効な量で前記対象に投与することからなる方法。
【請求項２３】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストが、非ステロイド性抗アンドロゲンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アンドロゲン受容体アンタゴニストが、ＡＲ１である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドと前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの併用が、腫瘍細胞の細胞質から核へのアンドロゲン受容体の移行を減少させるのに有効である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドと前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの併用が、腫瘍細胞においてアンドロゲン受容体タンパク質のプロテアソーム分解を高めるのに有効である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドと前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの併用が、前記腫瘍細胞においてアンドロゲン受容体の転写活性を低下させるのに有効である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドと前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの併用が、前記腫瘍細胞においてリン酸化ＡＫＴ量を低下させるのに有効である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドと前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの併用が、前記腫瘍細胞においてリン酸化ＥＲＫ量を低下させるのに有効である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドと前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの併用が、前立腺癌細胞の増殖を阻害するのに有効である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
クストリセンを用いてＡＲ１抵抗性前立腺癌細胞を治療することを含む、ＡＲ１に対するＡＲ１抵抗性前立腺癌細胞の感受性を高める方法。
【請求項３２】
クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチド、およびアンドロゲン受容体アンタゴニストを、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療に使用する量で含む、医薬組成物。
【請求項３３】
アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療において、アンドロゲン受容体アンタゴニストと併用して使用する、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前立腺癌に罹病した哺乳動物対象を治療するための組成物であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）次の構造を有するアンドロゲン受容体アンタゴニスト
【化２】
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または薬学的に許容されるその塩を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、２０１１年３月１４日に出願の米国特許仮出願第６１／４５２，５８３号、２０１１年３月１６日に出願の米国特許仮出願第６１／４５３，３０９号、２０１１年３月１７日に出願の米国特許仮出願第６１／４５３，８８５号、および２０１１年６月３日に出願の米国特許仮出願第６１／４９３，３３６号の優先権を主張し、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本出願の全体にわたり、括弧内に参照したものを含めて様々な刊行物が参照される。括弧内に参照した刊行物のすべての引用は、明細書の末尾、請求項の直前にアルファベット順に列挙されている。この発明に関連する技術水準についてより完全に記載するために、参照したすべての刊行物の開示をその全体として、参照により本出願中の本明細書に組み込む。
【発明の分野】
【０００３】
主たる発明は、前立腺癌を治療するための併用療法に関する。
【発明の背景】
【０００４】
前立腺癌は、男性が罹患する最も一般的な癌であり、西欧諸国男性では癌死亡の２番目の主要因である。前立腺癌はアンドロゲン感受性腫瘍なので、アンドロゲン除去（たとえば去勢による）が、進行性前立腺癌患者のいくつかの治療レジメンに利用される。アンドロゲン除去により、前立腺腫瘍に大量のアポトーシスが起こり、このため疾患の退行が起こる。しかし、去勢誘発性アポトーシスは完全ではなく、最終的には、生存している腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性へと進行する。この進行は、生存および生活の質を改善するのに主な障壁となり、アンドロゲン非依存性に変化する前と後の両方で、前立腺癌を治療できる療法が必要とされている。
【０００５】
アンドロゲン除去後に、前立腺腫瘍細胞により、多数のタンパク質が多量に発現されることが観察されてきた。これらのタンパク質の少なくともいくつかは、アポトーシス細胞死（アンドロゲン除去により観察される）に関連すると考えられる（Ｒａｆｆｏら、１９９５；Ｋｒａｊｅｗｓｋａら、１９９６；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、１９９２）。しかし、多くのタンパク質の機能は、十分に理解されていない。クラステリン（別名硫酸化糖タンパク質−２（ＳＧＰ−２）またはＴＲＰＭ−２）は、この後者の範疇にある。
【０００６】
クラステリン
クラステリンは、細胞の生存を促進し、癌治療に対して広域スペクトル抵抗性を付与する細胞保護性シャペロンタンパク質である（Ｃｈｉら２００５）。Ｓｅｎｓｉｂａｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：２４３１〜２４３７頁、１９９５において、著者は、クラステリンをコードする遺伝子でトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞を報告しており、このタンパク質の発現が、クラステリンに対して非常に感受性がある腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の効果を変更するかどうか確かめるために観察した。トランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞をＴＮＦαで処理することにより、数時間にわたってクラステリンレベルの一過的な上昇がもたらされることが示されたが、このレベルは細胞死に先立つＤＮＡの断片化が観察される時間までに消失した。
【０００７】
米国特許第７，５３４，７７３号に記載のとおり（その内容を参照により組み込む）、去勢誘導性腫瘍の細胞死の増大および、アンドロゲン感受性癌細胞のアンドロゲン非依存性への進行の遅延は、細胞によるクラステリン発現を阻害することによって実現できる。
【０００８】
クストリセン
クストリセンは、クラステリン発現を阻害する第二世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。クストリセンはクラステリンｍＲＮＡの一部に結合して、クラステリンタンパク質の産生を阻害するように特異的に設計されている。クストリセンの構造は、たとえば、米国特許第６，９００，１８７号（その内容を参照により本明細書に組み込む）にて入手可能である。広範な研究により、クストリセンは強力に、クラステリンの発現を調節し、アポトーシスを助長し、癌性ヒト前立腺、乳腺、卵巣、肺、腎臓、膀胱、および黒色腫細胞の化学療法に対する感受性を高めることが明らかにされた（Ｍｉｙａｋｅら、２００５）、米国特許出願公開第２００８／０１１９４２５号Ａ１も参照のこと。アンドロゲン依存的前立腺癌に対する臨床試験において、薬物であるフルタミドおよびブセレリンはクストリセンと併用すると、前立腺癌細胞のアポトーシスを増加させた（Ｃｈｉら、２００４；Ｃｈｉら、２００５）。
【０００９】
アンドロゲン受容体アンタゴニスト
アンドロゲン受容体（ＡＲ）アンタゴニストは、アンドロゲン−ＡＲ結合、ＡＲの転写活性、またはＡＲの細胞輸送（たとえば、細胞質から核への移行）を含めたＡＲの機能を撹乱または低下させることによって、アンドロゲンによる前立腺癌細胞の刺激を減少させる。クストリセンは、ＡＲアンタゴニストではない。クストリセンは、クラステリンの抗アポトーシス効果を低下させることによって、前立腺癌のアンドロゲン非依存性への進行を阻害するが、アンドロゲンシグナル伝達経路には影響を及ぼさないと考えられている。
【００１０】
併用療法
特定の状態、たとえば前立腺癌を治療するための２種の薬物の投与は、いくつか潜在的な問題を引き起こす。２種の薬物間のｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用は複雑である。どの単剤の効果も、その吸収、分布および排出と関係している。２種の薬物が身体に導入された場合、各薬物はもう一方の薬物の吸収、分布および排出に影響を及ぼす可能性があり、したがって、もう一方の薬物の効果を変更する可能性がある。たとえば、一方の薬物が、もう一方の薬物の排出に関する代謝経路に関連する酵素の産生を阻害、活性化、または誘導する場合がある（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ−ｓｔｕｄｙ  ｄｅｓｉｇｎ、ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ、ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）。したがって、同じ状態を治療するために２種の薬物が投与されたときに、各々が、ヒト対象においてもう一方の薬物の治療活性を補足するのか、影響が無いのか、または妨害するのかを予測できない。
【００１１】
２種の薬物間の相互作用は、各薬物の意図した治療活性に影響を及ぼす可能性があるだけでなく、その相互作用が、毒性代謝物のレベルを増加させる可能性もある（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ−ｓｔｕｄｙ  ｄｅｓｉｇｎ、ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ、ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）。相互作用は、各薬物の副作用を強めるまたは弱める可能性もある。したがって、疾患を治療するために２種の薬物を投与することによって各薬物のプロファイルにどんな変化が起こるかは予測できない。
【００１２】
加えて、２種の薬物間の相互作用の影響がいつ現れるかを正確に予測することは困難である。たとえば、薬物間の代謝的相互作用は、第２の薬物の初回投与時、２種が定常状態の濃度に達した後、または薬物の一方を中断したときに明らかになる場合がある（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ−ｓｔｕｄｙ  ｄｅｓｉｇｎ、ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ、ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）。
【００１３】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、動物モデル、またはヒトにおける１種の薬物もしくは各薬物単独での成功は、両方の薬物がヒトに投与される際の有効性とは相関しない場合がある。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、前立腺癌に罹患した哺乳動物対象を治療するための方法であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）次の構造を有するアンドロゲン受容体アンタゴニスト
【化１】
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【００１５】
または薬学的に許容されるその塩を、各々もう一方と併用するときに哺乳動物対象を治療するのに有効な量で哺乳動物対象に投与することを含む方法に関する。
【００１６】
本発明のいくつかの態様は、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療方法であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチド、およびｉｉ）アンドロゲン受容体アンタゴニストを、各々もう一方と併用するときに哺乳動物対象を治療するのに有効な量で対象に投与することからなる方法を提供する。
【００１７】
本発明の一局面は、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチド、およびアンドロゲン受容体アンタゴニストを、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療に使用する量で含む、医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明の一局面は、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹患した哺乳動物対象の治療において、アンドロゲン受容体アンタゴニストと併用して使用する、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１９】
本発明の一局面は、前立腺癌に罹患した哺乳動物対象を治療するための組成物であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）次の構造を有するアンドロゲン受容体アンタゴニスト
【化２】
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【００２０】
または薬学的に許容されるその塩を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】１μＭのＡＲ１およびクラステリン（ＣＬＵ）を標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳＣＲを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞増殖の抑制を示す図。ＳＣＲは、スクランブル配列ｓｉＲＮＡ対照である。（Ａ）、ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。（Ｂ）、ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図２】１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞増殖の抑制を示す図。ＳＣＲＢは、スクランブル配列アンチセンスオリゴヌクレオチド対照である。（Ａ）、ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。（Ｂ）、ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図３】１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＣ４−２細胞増殖の抑制を示す図。（Ａ）、ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。（Ｂ）、ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図４】１μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳＣＲを用いた処理によるＰＣ−３（ＡＲ陰性）細胞増殖を示す図（Ａ）。１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＰＣ−３（ＡＲ陰性）細胞増殖を示す図（Ｂ）。
【図５】ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳＣＲを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞における細胞毒性を示す図（Ａ）。１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞における細胞毒性を示す図（Ｂ）。細胞は、ＦＢＳを添加した培地中で成長した。Ｘ軸は、ＡＲ１濃度である。
【図６】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ１およびクスチルセン併用療法の有効性を示す図。（Ａ）、クリスタルバイオレットアッセイによる各薬物または併用療法の後の細胞成長阻害を示す図。Ｘ軸は、［ＡＲ１／クスチルセン］である。Ｐ値はフリードマン検定により算出した。（Ｂ）、各療法の用量効果曲線を示す図。（Ｃ）、いくつかの有効量における併用指数（ＣＩ）を示す図。ＣＩ＝１、相加効果；ＣＩ＜１、併用効果；ＣＩ＜１、拮抗効果。
【図７】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ１、クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡ、またはそれらの併用の投与後の細胞周期分布を示す図。ＯＴＲは、クスチルセンまたはｓｉＲＮＡの非存在下において、オリゴフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で処理した細胞を意味する。
【図８】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ１、クスチルセン、またはそれらの併用の投与後の細胞周期分布のＦＡＣＳ解析を示す図。
【図９】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲおよびクラステリンタンパク質発現に対するＡＲ１投与の効果を示す図。（Ａ）、１０μＭ  ＡＲ１。（Ｂ）、表示濃度でのＡＲ１投与の４８時間後。
【図１０−１】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化およびタンパク質レベルに対するＡＲ１処理の効果を示す図。（Ａ）、１０μＭ  ＡＲ１。（Ｂ）、表示濃度でのＡＲ１投与の４８時間後。（Ｃ）、ＡＲ１による処理後のＡＫＴまたはＥＲＫの発現レベルの用量依存的変化を示す図。（Ｄ）、ＡＲ１による処理後のＡＫＴまたはＥＲＫの発現レベルの用量依存的変化を示す図。
【図１０−２】（続葉）
【図１１】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲおよびクラステリンｍＲＮＡ発現に対するＡＲ１処理の効果を示す図。（Ａ）、各濃度のＡＲ１の添加の４８時間後のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を示す図。（Ｂ）、１０μＭ  ＡＲ１の添加後の表示時点におけるＡＲ  ｍＲＮＡ発現を示す図。（Ｃ）、各濃度のＡＲ１の添加の４８時間後のクラステリンｍＲＮＡ発現を示す図。（Ｄ）、１０μＭ  ＡＲ１の添加後の表示時点におけるクラステリンｍＲＮＡ発現を示す図。
【図１２−１】クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡ、クスチルセンまたは表示対照の処理後のＬＮＣａＰ細胞におけるタンパク質発現の変化を示す図（ＡおよびＣ）。（Ｂ）、ビカルタミドおよびＡＲ１によるクラステリン上方制御の比較を示す図。（Ｄ）、ＡＲ１およびクスチルセン（ＡＳＯ）を用いた処理によるＡＲコシャペロンの発現を示す図。
【図１２−２】（続葉）
【図１２−３】（続葉）
【図１２−４】（続葉）
【図１３】ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＳＡ（Ａ）またはＡＲ  ｍＲＮＡ発現（Ｂ）に対する１０μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡの効果を示す図。
【図１４】ＡＲ（Ａ）またはＰＳＡ  ｍＲＮＡ発現（Ｂ）に対する１０μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンの併用療法の効果を示す図。
【図１５】ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡによるＬＮＣａＰ細胞の処理後のタンパク質発現およびＰＡＲＰ切断のウェスタンブロット分析を示す図。ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図１６】ＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲン刺激時のタンパク質レベルに対する、ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０μＭのｓｉＲＮＡの効果を示す図。Ｒ１８８１は、メトリボロンとしても公知である強力なアンドロゲンである。
【図１７】ＡＲ１およびクスチルセンまたは対照によるＬＮＣａＰ細胞の処理によるタンパク質発現およびＰＡＲＰ切断のウェスタンブロット分析を示す図。細胞（１Ｘ１０6）は、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を含む１０ｃｍ皿に播種した。翌日、細胞に５００ｎＭクスチルセンまたは対照を４８時間にわたってトランスフェクトした。次いで、ウェスタンブロット分析のために採取する前に、１０μＭのＡＲ１を細胞に４８時間にわたって加えた。ＡＲおよびＰＳＡ発現は、クスチルセンおよびＡＲ１併用療法により高度に抑制された。
【図１８】ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは対照を用いたＬＮＣａＰ細胞の処理による、タンパク質発現およびリン酸化のウェスタンブロット分析を示す図。ホスホ−ＡＫＴおよびホスホ−ＥＲＫはＡＲ１の投与により活性化される。しかし、ＡＲ１およびＣｌｕ  ｓｉＲＮＡ併用療法は、リン酸化ＡＫＴおよびＥＲＫタンパク質のレベルを低下させる。併用療法は、単独療法より強力にＡＫＴ−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を抑制する。
【図１９】ＡＲ１およびクスチルセンまたはクラステリンを標的とするｓｉＲＮＡを併用して用いたＬＮＣａＰ細胞の処理によるＡＲプロテアソーム分解のウェスタンブロット分析を示す図。ＭＧ１３２は、プロテアソーム阻害剤であり、ＣＨＸは、タンパク質生合成の阻害剤であるシクロヘキシミドである。ＡＲタンパク質の分解は、ＡＲ１およびクスチルセン併用療法により強力に増加する。
【図２０】ＡＲ転写活性に対するＡＲ１およびクスチルセン併用療法の影響を示す図。デュアルルシフェラーゼアッセイ：ＬＮＣａＰ細胞にＣＳＳ中５００ｎＭクスチルセンを２日間トランスフェクトした。次いで、分析のために採取する前に、Ｒ１８８１（１ｎＭ）の存在下または非存在下でＡＲ１（１μＭ）またはＤＭＳＯを２４時間にわたって加えた。
【図２１】単独療法と比較した、クラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡと１０μＭのＡＲ１との併用による、細胞質から核へのＡＲ転位の阻害の増大を示す図。ＬＮＣａＰ細胞を用いた。
【図２２】単独療法と比較した、クラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡと１０μＭのＡＲ１との併用による、細胞質から核へのＡＲ転位の阻害の増大を示す図。ＬＮＣａＰ細胞を用いた。
【図２３】単独療法と比較した、１０μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡの併用療法による、ＡＲとユビキチンとの結合の増大を示す図（Ａ）。ＭＧ１３２の存在下での１０μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは対照の併用療法による、ＡＲとユビキチンとの結合を示す図（Ｂ）。ＬＮＣａＰ細胞を用いた。
【図２４】ＬＮＣａＰ細胞における、クスチルセン（ＡＳＯ）または対照と併用したビカルタミドまたはＡＲ１の処理間のクラステリンノックダウンの比較を示す図。
【図２５】ＬＮＣａＰ細胞における、ＡＲ分解およびクラステリンノックダウンに対する（ＦＫＢＰ５２）過剰発現の影響を示す図。
【図２６】マウスにおけるＡＲ１およびクスチルセンの併用投与による、去勢抵抗性前立腺癌腫瘍成長の低下および生存率の増加を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図２７】マウスにおける、ＡＲ１およびクスチルセンの併用投与による生存率の増加を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図２８】マウスにおける、ＡＲ１およびクスチルセンの併用投与によるＰＳＡタンパク質発現の低下を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図２９】マウスにおける、ＡＲ１およびクスチルセンの併用投与によるＰＳＡタンパク質発現の低下を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図３０】クラステリン発現が、ＡＲ１抵抗性腫瘍において誘導されることを示す図。（Ａ）ＡＲ１の投与後のクラステリン発現の増大を示す図。（Ｂ）ＡＲ１抵抗性腫瘍におけるＡＲ１の投与後のクラステリン発現の増大を示す図。（Ｃ）ウェスタンブロット分析により測定されたときに、ＡＲ１投与後にクラステリン発現が時間および用量依存的に上方制御されることを示す図。
【図３１】クスチルセンおよびＡＲ１の併用療法が、ＣＲＰＣ  ＬＮＣａＰ異種移植片においてクスチルセンまたはＡＲ１単独療法より有効であることを示す図。ＡＲ１＋クスチルセン療法がＣＲＰＣ異種移植片におけるＡＲおよびＰＳＡ発現を低下させた。
【図３２】クラステリンノックダウンがＡＲ転写活性およびＡＲ依存性遺伝子の発現を低下させることを示す図。貫膜プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ｍＲＮＡレベルは、ＡＲ１投与、クラステリンノックダウン、およびＡＲ１投与＋クラステリンノックダウンの後に低下した。
【図３３】クラステリンノックダウンが、ＡＲ１と併用したときＡＲタンパク質レベルを低下させることを示す図。熱ショックタンパク質２７（Ｈｓｐ２７）とＡＲとの可能な相互作用がＡＲ転写活性、ＰＳＡ発現および細胞の生存に寄与することが示されている。
【図３４】クラステリンノックダウンが、熱ショック因子タンパク質１（ＨＳＦ−１）転写活性および熱ショックタンパク質の発現を低下させることを示す図。
【図３５】クラステリン過剰発現が、ＨＳＦ−１活性を増大させることを示す図。
【図３６】腫瘍細胞における、ＡＲ１療法＋クスチルセン療法の可能な作用機序を示す図。
【図３７】クラステリンおよび自食作用が、ストレスおよび癌において役割を果たし得ることを示す図。小胞体（ＥＲ）ストレス、化学ストレスおよびアンドロゲン除去後のクラステリン発現の増大が示されている。
【図３８】ＡＲ１療法が、ＬＮＣａＰ細胞における自食作用を誘導することを示す図。
【図３９】治療ストレッサーが、アグリソーム中にＬＣ３Ｂと共局在するクラステリンを誘導することを示す図。
【図４０】ＥＲストレス誘導性自食作用が、クラステリンサイレンシングによって抑制されることを示す図。
【図４１−１】ＣＬＵがＡＲ１抵抗性細胞においてＡＲ１により誘導され、高度に発現することを示す図。Ｃ、ＣＬＵの用量および時間依存的誘導を示す図。Ｄ、ＣＬＵがＡＲノックダウンによってもＡＲ１抵抗性細胞において誘導されることを示す図。ＡＲ  ＡＳＯもいくつかのＡＲ１抵抗性ＭＲ４９Ｆ細胞においてＣＬＵを誘導する。ＣＬＵは、ＡＲ１抵抗性細胞、たとえば、ＭＲ４９Ｆにおいて高い。
【図４１−２】（続葉）
【図４１−３】（続葉）
【図４２−１】ストレス応答（ＥＲ、ＵＢ−１）ならびにｐＡＫＴとＭＡＰＫのクロストークの誘導を示す図。
【図４２−２】（続葉）
【図４２−３】（続葉）
【図４２−４】（続葉）
【図４３−１】
【図４３−２】
【図４４】
【図４５】ＡＲトランス活性化および転位に対する併用療法の効果を示す図。Ａ、ＡＲ１の投与と併用したクスチルセンが、クスチルセンまたはＡＲ１単独療法よりもＡＲトランス活性化を低下させることを示す図。ＬＮＣａＰ細胞に５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照を２日間、連日トランスフェクトし、２日目に１μｇのＰＳＡ−ルシフェラーゼおよびレニラ−ルシフェラーゼを一過性にコトランスフェクトした。翌日、細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、次いで、１ｎｍｏｌ／ＬのＲ１８８１または媒体を２４時間にわたって加えた。細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性を測定した。カラムは、３連で行った少なくとも３回の独立した実験の平均を表す。ＰＳＡ活性化は、標準化されたレニラ−ルシフェラーゼ活性であった。Ｂ、併用療法によるＡＲ転位への効果を示す図。１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照によるトランスフェクションの２４時間後に、ＬＮＣａＰ細胞をＤＭＳＯ、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１および１ｎｍｏｌ／ＬのＲ１８８１で３０分間処理し、抗ＡＲ抗体による免疫蛍光染色のためにメタノール／アセトン中で固定した。核をＤＡＰＩで染色した。ＡＲ１は、細胞質から核へのＡＲの転位を阻害した。ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンは、ＡＲ転位の阻害の効果の増大を示している。
【図４６】
【図４７】
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本発明は、前立腺癌に罹患した哺乳動物対象を治療するための方法であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）次の構造を有するアンドロゲン受容体アンタゴニスト
【化３】
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【００２３】
または薬学的に許容されるその塩を、各々もう一方と併用するときに哺乳動物対象を治療するのに有効な量で哺乳動物対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明のいくつかの態様において、癌は、アンドロゲン非依存的前立腺癌である。
【００２５】
いくつかの態様において、合わせて投与したときのオリゴヌクレオチドの量とアンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の量は、各薬剤を単独投与したときよりも対象を治療するのに有効である。
【００２６】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の量と併用するオリゴヌクレオチドの量は、単独投与時に臨床的に有効な量より少ない。
【００２７】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの量と併用するアンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の量は、単独投与時に臨床的に有効な量より少ない。
【００２８】
いくつかの態様において、合わせて投与したときのオリゴヌクレオチドの量とアンドロゲン受容体アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩の量は、対象において前立腺癌の臨床症状を軽減させるのに有効である。
【００２９】
いくつかの態様において、哺乳動物対象は、ヒトである。
【００３０】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、クラステリンをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位または終結部位のいずれかにまたがっている。
【００３２】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを改変して、同じ配列の無改変のオリゴヌクレオチドと比較してｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を強化する。
【００３３】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に、配列番号１〜１１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドからなる。
【００３４】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に、配列番号３からなるオリゴヌクレオチドからなる。
【００３５】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、クストリセンである。
【００３６】
いくつかの態様において、クストリセンの量は、６４０ｍｇ未満である。
【００３７】
いくつかの態様において、クストリセンの量は、４８０ｍｇ未満である。
【００３８】
いくつかの態様において、クストリセンの量は、７日間に１回、静脈内投与される。
【００３９】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストの量は、２４０ｍｇ未満である。
【００４０】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストの量は、１５０ｍｇ〜２４０ｍｇである。
【００４１】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストの量は、３０ｍｇ〜１５０ｍｇである。
【００４２】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストの量は、８０ｍｇである。
【００４３】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストの量は、１日に１回経口投与される。
【００４４】
本発明のいくつかの態様は、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療方法であって、ｉ）アンドロゲン受容体アンタゴニストおよびｉｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドを、各々もう一方と併用するときに哺乳動物対象を治療するのに有効な量で対象に投与することからなる方法を提供する。
【００４５】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストは、非ステロイド性抗アンドロゲンである。
【００４６】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストは、ＡＲ１である。
【００４７】
いくつかの態様において、アンドロゲン非依存的前立腺癌は、ＡＲ１抵抗性である。
【００４８】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストとオリゴヌクレオチドの併用は、腫瘍細胞の細胞質から核へのアンドロゲン受容体の移行を減少させるのに有効である。
【００４９】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストとオリゴヌクレオチドの併用は、腫瘍細胞においてアンドロゲン受容体タンパク質のプロテアソーム分解を高めるのに有効である。
【００５０】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストとオリゴヌクレオチドの併用は、腫瘍細胞においてアンドロゲン受容体の転写活性を低下させるのに有効である。
【００５１】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストとオリゴヌクレオチドの併用は、腫瘍細胞においてリン酸化ＡＫＴの量を低下させるのに有効である。
【００５２】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストとオリゴヌクレオチドの併用は、腫瘍細胞においてリン酸化ＥＲＫの量を低下させるのに有効である。
【００５３】
いくつかの態様において、アンドロゲン受容体アンタゴニストとオリゴヌクレオチドの併用は、前立腺癌細胞の増殖を阻害するのに有効である。
【００５４】
本発明のいくつかの態様は、クストリセンとの併用治療によって、ＡＲ１抵抗性前立腺癌細胞がＡＲ１に感作される方法を提供する。
【００５５】
本発明のいくつかの態様は、クストリセンを用いてＡＲ１抵抗性前立腺癌細胞を治療することを含む、ＡＲ１に対するＡＲ１抵抗性前立腺癌細胞の感受性を高める方法を提供する。
【００５６】
本発明のいくつかの態様は、ＡＲ１に抵抗性がある前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療方法であって、ｉ）ＡＲ１およびｉｉ）クストリセンを、各々もう一方と併用するときに哺乳動物対象を治療するのに有効な量で対象に投与することを含む方法を提供し、クストリセンは、ＡＲ１に対する前立腺癌の感受性を高める。
【００５７】
本発明の一局面は、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびアンドロゲン受容体アンタゴニストを、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療に使用する量で含む医薬組成物を提供する。
【００５８】
本発明の一局面は、アンドロゲン非依存的前立腺癌に罹病した哺乳動物対象の治療において、アンドロゲン受容体アンタゴニストと併用して使用する、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００５９】
本発明の一局面は、前立腺癌に罹病した哺乳動物対象を治療するための組成物であって、ｉ）クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびｉｉ）次の構造を有するアンドロゲン受容体アンタゴニスト
【化４】
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【００６０】
または薬学的に許容されるその塩を含む組成物を提供する。
【００６１】
本発明の局面は、前立腺癌の治療において、オリゴヌクレオチドまたはＡＲアンタゴニストの単独療法と比較して、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドとＡＲアンタゴニストの併用が増大させる効力に関する。効力の増大には、それだけには限らないが、前立腺癌細胞の増殖低下、癌細胞のアポトーシスの増加、細胞質から核へのＡＲの移行の減少、ＡＲの転写活性の低下、ＰＡＲＰ切断の増加、ＡＫＴのリン酸化の低下、ＥＲＫのリン酸化の低下、およびＡＲタンパク質の分解の増加が含まれる。ＡＫＴおよび／またはＥＲＫのリン酸化が低下する態様において、ＡＫＴおよびＥＲＫのすべてのアイソフォームが想定される。これには、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＥＲＫ１、およびＥＲＫ２が含まれるが、これに限定されない。いくつかの態様において、ＡＲのプロテアソーム分解の増加は、ＡＲとユビキチンとの結合の増加と関係する。
【００６２】
本明細書に開示された各態様は、他の開示された態様の各々に適用できるように意図されている。したがって、本明細書に記載の様々な要素の組合せのすべてが、本発明の範囲内にある。
【００６３】
パラメータ範囲が提供されている場合、その範囲内のすべての整数およびその１０分の１も本発明によって提供されることを理解されたい。たとえば、「０．２〜５ｍｇ／ｋｇ／日」は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．６ｍｇ／ｋｇ／日など５．０ｍｇ／ｋｇ／日までを含む。
【００６４】
用語
本明細書では、特に明記しない限り、次の用語の各々は以下に述べる定義を有するものとする。
【００６５】
本明細書では、数値または範囲の文脈において「約」とは、詳述または請求される数値または範囲の±１０％を意味する。
【００６６】
本出願の明細書および特許請求の範囲では、用語「クラステリン」とは、ヒトを含めた哺乳動物に存在する糖タンパク質のことを指し、ヒトにおいてそのように命名された。数多くのクラステリン種の配列が知られている。たとえば、ヒトクラステリンの配列は、Ｗｏｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１（３）９１７〜９２５頁（１９９４）、およびＮＣＢＩ配列受託番号ＮＭ＿００１８３１（配列番号４３）に記載されている。このヒト配列において、コード配列は、塩基４８〜１３９７にまたがっている。
【００６７】
本明細書では、「クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチド」とは、細胞においてクラステリン発現を低下させるのに有効な配列を持つオリゴヌクレオチドである。クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドは、たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉誘導分子であってよい。
【００６８】
本明細書では、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、クラステリン発現を低下させ、クラステリンｍＲＮＡに相補的な配列を有する非ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのことを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であってよい。本発明においてアンチセンス分子として使用し得る典型的な配列は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４９９３７、米国特許公開ＵＳ−２００２−０１２８２２０Ａ１および米国特許第６，３８３，８０８号に開示されており、そのすべてを参照により本明細書に組み込む。具体的なアンチセンス配列は、配列番号１〜１８として本出願に記載されており、表１に見ることができる。
【表１】
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【００６９】
使用されるＯＤＮは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＯＤＮの安定性を高めるために改変させてよい。たとえば、ＯＤＮは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を高めたホスホロチオエート誘導体（非架橋ホスホリル酸素原子を硫黄原子と置きかえた）として使用されてよい。ＭＯＥ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））修飾（ＩＳＩＳ主鎖）も、有効である。そのような改変ＯＤＮの構築については、米国特許第６，９００，１８７号Ｂ２に詳述されており、その内容を参照により組み込む。いくつかの態様において、ＯＤＮは、クストリセンである。
【００７０】
本明細書では、「クストリセン」とは、配列ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号３）を有し、クラステリン発現を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドのことを差し、この抗クラステリンオリゴヌクレオチドは、全体にわたってホスホロチオエート主鎖を有し、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を持つヌクレオチド１〜４および１８〜２１の糖部分を有し、２’デオキシヌクレオチドであるヌクレオチド５〜１７を有し、またヌクレオチド１、４および１９に５−メチルシトシンを有する。クストリセンは、別名ＴＶ−１０１１、ＯＧＸ−０１１、ＩＳＩＳ  １１２９８９およびクストリセンナトリウムとして知られている。
【００７１】
本明細書では、「ＲＮＡ干渉誘導分子」とは、クラステリン発現のＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」を誘導可能な分子のことを差す。ＲＮＡｉはｍＲＮＡ分解に関係するが、この干渉の根底にある生化学的機序の多くは不明である。ＲＮＡｉの使用は、Ｆｉｒｅら、１９９８、Ｃａｒｔｈｅｗら、２００１、およびＥｌｂａｓｈｉｒら、２００１に記載されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【００７２】
単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介することができる。すなわち、本発明の単離されたＲＮＡ分子は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ（標的遺伝子とも呼ばれる）の分解を媒介し、または発現を抑止する。便宜上、本明細書において、そのようなｍＲＮＡを分解されるｍＲＮＡと称することもできる。用語ＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＲＮＡセグメントおよびＲＮＡ断片は、ＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡのことを指して互換的に使用できる。これらの用語は、二本鎖ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離したＲＮＡ（部分精製したＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え的に作製したＲＮＡ）、ならびに１個以上のヌクレオチドの付加、削除、置換および／または変更により天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含む。そのような変更は、たとえばＲＮＡの末端（複数可）または内部（そのＲＮＡの１か所以上のヌクレオチドで）への非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含めた標準的ではないヌクレオチドを含むこともできる。全体として、そのような変更されたＲＮＡｉ分子のすべては、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体のことを指す。本発明のＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然のＲＮＡに十分に類似していさえすれば十分である。
【００７３】
本明細書では、成句「ＲＮＡｉを媒介する」とは、どのｍＲＮＡ分子がＲＮＡｉ機構または工程による影響を受けることになるかを区別する能力のことを差し、また示している。ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡは、機構を特定のｍＲＮＡを分解、さもなければ標的タンパク質の発現を低下に導くように、ＲＮＡｉ機構と相互作用する。一態様において、本発明は、その配列に一致する特定のｍＲＮＡの切断を指示するＲＮＡ分子に関する。配列の完全一致が必要とは限らないが、その一致は、ＲＮＡが標的ｍＲＮＡの切断または発現の抑止によってＲＮＡｉ阻害を指示できるのに十分でなければならない。
【００７４】
上記したように、本発明のＲＮＡ分子は一般に、ＲＮＡ部分といくつかの付加的な部分、たとえばデオキシリボヌクレオチド部分を含む。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの総数は、最適には、ＲＮＡｉの有効な媒体であるための数より少ない。好ましいＲＮＡ分子において、ヌクレオチドの数は、１６〜２９個、より好ましくは１８〜２３個、および最も好ましくは２１〜２３個である。適切な配列は、配列番号１９〜４２として本出願に記載されている（表２）。
【表２】
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【００７５】
本発明のｓｉＲＮＡ分子を、ヒト患者を含めた癌または標的タンパク質の発現の阻害によって治療的有用性が得られる他の種類の疾患を有する患者を治療するための療法において使用する。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的とされるｍＲＮＡおよびタンパク質の調節に適切な血漿および組織濃度に達するように、１回以上の連日注射（静脈内、皮下または髄腔内）によって、または１回以上の治療サイクルでの連続的な静脈内もしくは髄腔内投与によって患者に投与される。
【００７６】
本明細書では、「前立腺癌に罹患した哺乳動物対象」とは、前立腺癌を有すると肯定的に診断された哺乳動物対象を意味する。
【００７７】
本明細書では、「アンドロゲン非依存的前立腺癌」とは、アンドロゲン依存的でない（アンドロゲン感受性でない）細胞、およびアンドロゲン依存的でない（アンドロゲン感受性でない）細胞を主に含有する腫瘍を包含する。アンドロゲン依存的な細胞はしばしば、アンドロゲン依存的からアンドロゲン非依存的に変化する。加えて、いくつかの態様において、アンドロゲン非依存的前立腺癌は、その全体が増殖に関してアンドロゲン依存的とは限らない（アンドロゲン感受性とは限らない）腫瘍を包含してよい。いくつかの態様において、アンドロゲン非依存的前立腺癌は、ホルモン除去療法の投与および／またはＡＲアンタゴニストの投与（ホルモン遮断療法として）後に進行した。いくつかの態様において、アンドロゲン非依存的でない前立腺癌と比較して、アンドロゲン非依存的前立腺癌においてＡＲ発現は増加している。
【００７８】
本明細書では、「去勢抵抗性前立腺癌」とは、ホルモン除去療法またはホルモン遮断療法に抵抗性がある任意のアンドロゲン非依存的前立腺癌を包含する。いくつかの態様において、去勢抵抗性前立腺癌は、ホルモン除去および／またはホルモン遮断療法の投与後に変化した。いくつかの態様において、去勢抵抗性でない前立腺癌と比較して、去勢抵抗性前立腺癌においてＡＲ発現は増加している。
【００７９】
本明細書では、「アンドロゲン除去」とは、前立腺癌に罹病した患者におけるアンドロゲンレベルの低減を包含する。
【００８０】
本明細書では、「ホルモン遮断療法」とは、アンドロゲンに応答する受容体または細胞経路の機能低下を意味する。ホルモン遮断療法の非限定的な例は、ＡＲアンタゴニストである。
【００８１】
本明細書では、「アンドロゲン除去療法」とは、前立腺癌に罹病した哺乳動物対象においてアンドロゲン除去をもたらすことが可能な任意の療法である。アンドロゲン除去療法と同義である本明細書において使用される用語は、「アンドロゲン除去」および「ホルモン除去療法」である。アンドロゲン除去療法の非限定的な例としては、外科的（両方の睾丸の除去）去勢と内科的（テストステロンまたはテストステロン誘導性シグナル伝達の薬物誘発抑制）去勢の両方がある。内科的去勢は、ＬＨＲＨ薬剤、および腺（たとえば副腎）からのアンドロゲン発現を低下させる薬剤を含むがこれに限らない様々な治療レジメンによって達成できる（Ｇｌｅａｖｅら、１９９９；Ｇｌｅａｖｅら、１９９８）。
【００８２】
本明細書では、「ＡＲアンタゴニスト」とは、アンドロゲン結合、ＡＲシグナル伝達、ＡＲの細胞輸送（たとえば、細胞質から核への移行）、ＡＲタンパク質レベル、またはＡＲタンパク質発現を含めたＡＲの機能を撹乱または低下させる薬剤のことを指す。
【００８３】
ＡＲアンタゴニストには、それだけには限らないが、ＡＲ特異的モノクロナール抗体、ＡＲ発現標的オリゴヌクレオチド（たとえば、ＡＲ標的アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ誘導分子）、ＡＲに特異的なペプチド薬剤、およびＡＲに特異的な小分子阻害剤が含まれる。ＡＲアンタゴニストは、非ステロイド性の抗アンドロゲン、たとえばＡＲ１、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、ＲＤ１６２、およびＺＤ４０５４でよい。
【００８４】
ＡＲ１は、次の構造を有する本発明のＡＲアンタゴニストである。
【化５】
2014509607.tif 000009
【００８５】
ＡＲ１の合成方法は、米国特許第７，７０９，５１７号Ｂ２に記載されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。その代りに、ＡＲ１は、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手できる。ＡＲ１のＣＡＳ登録番号は、９１５０８７−３３−１であり、そのＰｕｂＣｈｅｍ番号は１５９５１５２９である。ＡＲ１は、化学式Ｃ21Ｈ16Ｆ4Ｎ4Ｏ2Ｓを有し、別名ＭＤＶ３１００および４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−メチルベンズアミドである。ＡＲ１は、ＡＲに対するアンドロゲンの結合を遮断し、細胞質からのＡＲの核移行を妨げ、ＡＲ−ＤＮＡ結合を阻害することによって作用する第二世代の経口投与可能なＡＲアンタゴニストである（Ｔｒａｎら、２００９）。ＡＲ１は、進行性前立腺癌の治療用として臨床試験において現在評価されている（Ｓｃｈｅｒら、２０１０）。
【００８６】
本明細書では、「転写活性」とは、細胞内のＤＮＡ部分に結合するまたは別の方法で直接的または間接的に関連し、１個以上の遺伝子の発現レベルに影響をもたらすタンパク質の能力のことを指す。
【００８７】
クラステリン発現の阻害は、一過性であってよく、アンドロゲン除去療法またはＡＲアンタゴニストの投与との併用で起こってもよい。アンドロゲン非依存的でない前立腺癌のヒトにおいて、このことは、発現の阻害が、アンドロゲン除去もしくはＡＲアンタゴニストを投与して１日または２日以内に有効になるべきであり、その後約３〜６ヵ月に及んで有効であるべきことを意味している。これを達成するには、複数回投与を必要とする場合がある。しかし、その時間帯はさらに引き延ばされてもよく、本発明の範囲から逸脱することなく、去勢の前に開始し、その後に実質的な時間を延長してよいことは言うまでもない。
【００８８】
本発明の局面は、アンドロゲン非依存的前立腺癌の治療に、または前立腺癌がアンドロゲン非依存的になることを防止するために適用できる。
【００８９】
本発明の局面は、去勢抵抗性前立腺癌の治療に、または前立腺癌が去勢抵抗性になることを防止するために適用できる。
【００９０】
「併用」とは、１回の治療計画の一環として、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドと同じ時点および頻度、またはより一般的には、異なる時間および頻度のいずれかであることを意味する。本発明の局面は、ＡＲアンタゴニストを投与する前、後、および／またはその間にオリゴヌクレオチドを投与することを含む。したがって、ＡＲアンタゴニストは、本発明によるオリゴヌクレオチドと併用して使用されてよいが、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドとは異なる時間、異なる用量および異なる頻度で投与されてもよい。
【００９１】
本明細書では、ミリグラムで測定されるオリゴヌクレオチドの「量」または「用量」とは、製剤の形に関係なく製剤中に存在するオリゴヌクレオチドのミリグラムのことを指す。
【００９２】
本明細書では、クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチド、ＡＲアンタゴニストまたはその任意の組合せの量のことを指す場合、「有効」とは、本発明の方法で使用した際に、合理的な利益／危険比に相応した過度の副作用（たとえば毒性、刺激またはアレルギー反応）無しに所望の治療的応答を得るのに十分なオリゴヌクレオチド、ＡＲアンタゴニストまたはそれらの任意の組合せの分量のことを指す。
【００９３】
本明細書では、「治療する」とは、たとえば、前立腺癌の進行の阻害、退縮または停止を包含する。治療するとは、任意の症状もしくは前立腺癌の症状の予防または改善も包含する。
【００９４】
本明細書では、対象における疾患の進行または合併症の「阻害」とは、対象における疾患の進行および／または合併症を防ぐまたは減少させることを意味する。
【００９５】
本明細書では、前立腺癌と関連した「症状」とは、前立腺癌と関連した任意の臨床的または臨床検査的徴候を含み、対象が感知するまたは気づくものに限られない。
【００９６】
本明細書では、「薬学的に許容される担体」とは、合理的な利益／危険比に相応した過度の副作用（たとえば毒性、刺激およびアレルギー反応）が無い、ヒトおよび／または動物での使用に適切な担体もしくは賦形剤のことを指す。それは、本化合物および／または組合せを対象に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または賦形剤であってよい。
【００９７】
単位用量
クラステリン発現を標的にするオリゴヌクレオチドの投与は、むき出しでの投与および薬学的に許容される脂質担体中での投与を含めた当技術分野において公知の様々な機序を使用して実施できる。たとえば、アンチセンス送達用の脂質担体は、米国特許第５，８５５，９１１号および第５，４１７，９７８号に開示されており、これを参照により本明細書に組み込む。一般に、オリゴヌクレオチドは、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）もしくは経口経路、または直接的な局所腫瘍注入によって投与される。好ましい態様において、クラステリン発現を標的にしているオリゴヌクレオチドは、静脈内（ｉ．ｖ．）注入によって投与される。いくつかの態様において、投与されるオリゴヌクレオチドの量は、６４０ｍｇである。
【００９８】
オリゴヌクレオチドの投与量は、前立腺細胞においてクラステリンの発現を阻害するのに有効な量である。この量が、使用されるオリゴヌクレオチドの有効性と、使用される任意の担体の性質の両方によって変化することは言うまでもない。
【００９９】
クラステリン発現を標的にしているアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、４０〜６４０ｍｇまたは３００〜６４０ｍｇであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、７日間に１回、１週間に３回、より具体的には、７日間のうちの１、３、５日目もしくは３、５、７日目であってよい。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、７日間に１回より低頻度である。用量は、患者の体重によって算出されてよく、したがって、約１〜２０ｍｇ／ｋｇ、もしくは約２〜１０ｍｇ／ｋｇ、または約３〜７ｍｇ／ｋｇ、もしくは約３〜４ｍｇ／ｋｇの用量範囲が使用され得る。この用量は、必要に応じて間隔をおいて繰り返される。１つの臨床的概念は、治療の第１週中に、１週間に１回、３回の初期用量で投与することである。投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、ヒト患者において癌細胞中のクラステリンの発現を阻害するのに有効であることが実証された量である。
【０１００】
本発明のいくつかの態様において、前立腺癌の治療に必要とされるクラステリンの発現を標的にしているオリゴヌクレオチドの量は、オリゴヌクレオチド単独療法で必要となる量より、ＡＲアンタゴニストとの併用において少なくなる。
【０１０１】
クストリセンは、ＩＶ投与用として等張のリン酸塩緩衝食塩水溶液として２０ｍｇ／ｍＬの濃度で処方されてよく、１本のバイアル中にクストリセンナトリウム１６０ｍｇを含有する８ｍＬの溶液として提供され得る。
【０１０２】
クストリセンは、０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水）２５０ｍＬに加えることができる。投薬は、２時間以上の点滴として、末梢または中心留置カテーテルのいずれかを使用して静脈内に投与されてよい。追加的に、点滴ポンプを使用してよい。
【０１０３】
ＡＲアンタゴニストの投与は、経口、経鼻、肺、非経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、関節内、経皮、皮内、皮下（ｓ．ｃ．）、局所、筋肉内、直腸、髄腔内、眼内および口腔内であってよい。ＡＲ１の好ましい投与経路は経口である。ＡＲアンタゴニストの経口投与では静脈内（ｉ．ｖ．）注入より高用量が必要になる可能性があることは、当業者は認識する。
【０１０４】
ＡＲアンタゴニストの用量は、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２４０ｍｇ、３６０ｍｇ、４８０ｍｇまたは６００ｍｇでよい。いくつかの態様において、ＡＲアンタゴニストの用量は、３０ｍｇ未満である。これらの態様において、用量は、２５ｍｇ、２０ｍｇ、１５ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ以下まで低くてよい。いくつかの態様において、ＡＲアンタゴニストの用量は、毎日投与される。いくつかの態様において、その用量は経口投与される。
【０１０５】
クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよびＡＲアンタゴニストの単位用量は、各々単独の用量またはそれらの混合物を含んでよい。クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドとＡＲ１との併用は、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ、懸濁剤、シロップ剤および乳剤として経口剤形で投与することができる。クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよび／またはＡＲアンタゴニストは、静脈内（急速投与（bolus）または点滴）、腹膜内、皮下もしくは筋肉内の形で投与されても、またはたとえば注入もしくは他の方法によって前立腺癌病変の中にもしくは上に直接導入されてもよく、使用するすべての剤形は製薬の当業者に周知である。
【０１０６】
クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよび／または本発明のＡＲアンタゴニストは、意図する投与形態に関しておよび従来の医薬慣行と整合するように最適に選択された適切な医薬希釈剤、増量剤、賦形剤または担体（本明細書において一括して薬学的に許容される担体と称する）との混合物で投与することができる。単位は、経口、直腸、局所、静脈もしくは直接注入、または非経口投与に適した形態になる。クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよび／またはＡＲアンタゴニストは、単独で投与されても薬学的に許容される担体と混合されてもよい。この担体は固体または液体であってもよく、担体の種類は一般に、使用する投与の種類に基づいて選択される。カプセル剤または錠剤は、容易に処方でき、嚥下または咀嚼しやすくすることができる。他の固形剤としては、顆粒剤、およびバルク散剤がある。錠剤は、適当な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、賦香剤、流動化剤および融解剤を含有してよい。適当な液状剤形の例としては、水溶液もしくは水懸濁液、薬学的に許容される油脂、アルコールもしくはエステルを含めた他の有機溶媒、乳液、シロップまたはエリキシル剤、懸濁液、非発泡性顆粒から再溶解した液剤および／または懸濁剤、および発泡性顆粒から再溶解した発泡性処方が含まれる。そのような液状剤形は、たとえば、適切な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味剤、増粘剤および融解剤を含有してよい。経口剤形は、任意に賦香剤および着色剤を含有する。非経口および静脈内の形は、注入の種類または選択した送達システムに適合させるために、ミネラルおよび他の材料を含んでもよい。
【０１０７】
クラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドおよび／またはＡＲアンタゴニストは、リポソーム送達システムの形態、たとえば小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞で投与することもできる。リポソームは、様々なリン脂質、たとえばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成することができる。化合物は、組織標的乳液の成分として投与されてよい。
【０１０８】
液体剤形で経口投与するには、ＡＲ１は、任意の経口用の無毒性で薬学的に許容される不活性担体、たとえばエタノール、グリセリン、水、などと組み合わせられてよい。適当な液状剤形の例には、水溶液もしくは水懸濁液、薬学的に許容される油脂、アルコールもしくはエステルを含めた他の有機溶媒、乳液、シロップまたはエリキシル剤、懸濁液、非発泡性顆粒から再溶解した液剤および／または懸濁剤、および発泡性顆粒から再溶解した発泡性処方が含まれる。そのような液状剤形は、たとえば、適切な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味剤、増粘剤および融解剤を含有してよい。
【０１０９】
本発明のいくつかの態様において、前立腺癌の治療に必要とされるＡＲアンタゴニストの量は、ＡＲアンタゴニスト単独療法で必要となる量より、クラステリンの発現を標的にしているオリゴヌクレオチドとの併用において少なくなる。
【０１１０】
単位用量は、単一化合物または化合物の混合物を含んでよい。単位用量は、経口または注入剤形として調製することができる。
【０１１１】
本発明の一局面によると、単位用量形に包装されたクラステリン発現を低下させるオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物が提供され、各単位用量中のオリゴヌクレオチドの量は６４０ｍｇ以下である。前記医薬組成物はＡＲアンタゴニストを含んでよく、注射可能な溶液または懸濁液であってよく、さらにナトリウムイオンを含有していてもよい。
【０１１２】
本発明の別の局面では、クラステリン発現を標的にしているオリゴヌクレオチドおよびＡＲアンタゴニストの使用を提供し、癌治療用の薬剤の製造において、薬剤は６４０ｍｇ以下の用量のオリゴヌクレオチドが患者に送達されるように処方される。薬剤は、ナトリウムイオンを含有してよく、および／または注射可能な溶液の形態でもよい。
【０１１３】
本発明において有用な剤形を作製するための一般的な技術および組成物は、以下の参照文献に記載されている：７  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第９章および第１０章（ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編、１９７９）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、１９８１）；Ａｎｓｅｌ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ第２版（１９７６）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５）；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄａｖｉｄ  Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ、Ｔｒｅｖｏｒ  Ｊｏｎｅｓ編、１９９２）；Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第７巻（Ｄａｖｉｄ  Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ、Ｔｒｅｖｏｒ  Ｊｏｎｅｓ、Ｊａｍｅｓ  ＭｃＧｉｎｉｔｙ編、１９９５）；Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅｒｉｅｓ３６（Ｊａｍｅｓ  ＭｃＧｉｎｉｔｙ編、１９８９）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６１巻（Ａｌａｉｎ  Ｒｏｌｌａｎｄ編、１９９３）；Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ（Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｂｏｏｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｙ、Ｓ．Ｓ．Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｉｖｅ  Ｇ．Ｗｉｌｓｏｎ編）；Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４０巻（Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編）。これらの参照はその全体を、本出願に参照により本明細書に組み込む。
【０１１４】
この発明は、以下の実験の詳細を参照することによってよりよく理解されることになるが、その後に続く特許請求の範囲においてより完全に記載されるように、詳述した具体的な実験は本発明の単なる例示であるということを、当業者なら容易に理解されよう。
【０１１５】
実験の詳細
例１．クラステリン阻害剤クスチルセンならびにＡＲアンタゴニストＡＲ１は去勢抵抗性前立腺癌モデルにおける強力な併用療法である。
【０１１６】
序および目的
ＡＲおよび腫瘍内アンドロゲン合成は、腫瘍細胞の生存の促進および去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の発生に関与している。ＡＲ１は、前臨床および臨床試験において活性を示した。以前の試験で、アンドロゲン除去療法がクラステリンの上方制御および去勢抵抗性と関連づけられている。アンチセンス阻害剤であるクスチルセンは、前立腺癌（ＣａＰ）モデルにおいて去勢または化学療法と併用するとき、細胞死を増加させる。以下において、去勢抵抗性ＬＮＣａＰモデルにおける進行を遅延させる、クスチルセンおよびＡＲ１併用療法の能力を試験した。
【０１１７】
方法
ＡＲ陽性ＬＮＣａＰ細胞増殖（図１〜４および６〜７）および生存率（図５）ならびにタンパク質（図９、１１および１３〜１５）および遺伝子発現（図１３および１４）に対する個別対併用ＡＲ１およびクスチルセン療法の効果は、それぞれクリスタルバイオレットアッセイ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。ＡＲ転写活性は、ＰＳＡ−ルシフェラーゼリポーターアッセイにより測定し、一方、ＡＲ分解は、シクロヘキシミド追跡アッセイにより評価した。実験に用いたＬＮＣａＰ細胞系は、ＡＲ陽性であった。
【０１１８】
去勢抵抗性ＬＮＣａＰ腫瘍成長に対する併用療法の効果は、去勢雄無胸腺ヌードマウスにおいて評価した。雄無胸腺ヌードマウスのマウス側腹部病変の２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を播種した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセン治療群のそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。腫瘍体積は、週１回測定した。血清ＰＳＡは、週１回測定した。ＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡｄｔ）および速度は、対数勾配法（ＰＳＡt−ＰＳＡinitialｘｅmt）により計算した。すべての動物に対する処置は、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）のガイドラインおよび適切な施設認証に従って実施した。
【０１１９】
結果
クスチルセンおよびＡＲ１の併用は、クスチルセンまたはＡＲ１単独療法と比較してＬＮＣａＰ細胞成長速度を、用量および時間依存的に、より強力に抑制した（図１〜８）。驚くべきことに、ＰＡＲＰ切断（図１５）、サブＧ０／Ｇ１アポトーシスの割合（図７および８）およびＡＫＴリン酸化の抑制（図１０および１８）が、併用療法によって最も増加した。さらに、クスチルセンは、ＡＲ１との併用でＡＲの分解を促進し（図１５〜１９および２２）、ＡＲ転写活性を抑制した（図２０〜２２）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、クスチルセンおよびＡＲ１の併用は、スクランブルオリゴヌクレオチド対照およびＡＲ１と比較して、去勢抵抗性ＬＮＣａＰ腫瘍の進行およびＰＳＡの進行を有意に遅延させた（図２６〜２９、それぞれ１２週目にｐ＜０．０５およびｐ＜０．０５）。
【０１２０】
結論
ＡＲ１と併用したクスチルセンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＡＲレベルおよび活性を下方制御し、去勢抵抗性ＬＮＣａＰ細胞成長を抑制したことから、これが、ＣＲＰＣにおけるＡＲ標的療法に対する有望なアプローチとしての、前臨床段階での原理の実証となっている。
【０１２１】
例２．  材料および方法
前立腺癌細胞系および試薬
ＬＮＣａＰ細胞は、Ｄｒ．  Ｌｅｌａｎｄ  Ｗ．Ｋ．  Ｃｈｕｎｇ（１９９２、ＭＤＡＣＣ、Ｈｏｕｓｔｏｎ  Ｔｘ）により好意により提供されたものであり、２００９年７月にＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘプラットフォームで全ゲノムおよび全トランスクリプトーム配列決定によって試験され、認証された。ＬＮＣａｐ細胞は、５％ウシ胎児血清および２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンを添加した、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で維持した。細胞を加湿５％ＣＯ2／空気雰囲気中で３７℃で培養した。シクロヘキシミドおよびＭＧ−１３２は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、Ｒ１８８１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＡＲ１（ＭＤＶ−３１００；Ｈａｏｙｕａｎ  Ｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｉｍｉｔｅｄ）。抗体：抗ＧＲＰ７８、抗ＣＲＥＢ２（ＡＴＦ４）、ＣＬＵ  Ｃ−１８、ＡＲ  Ｎ−２０、ＡＲ４４１、ＰＳＡ  Ｃ−１９、ユビキチン、ｐＥＲＫ、β−チューブリンおよびビンクリンは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、抗ホスホ−ｅＩＦ２αは、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、抗ＡＴＦ６は、Ｉｍｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐから、Ａｔｇ３、ＬＣ３、ｐＡｋｔ／Ａｋｔ、ｐｍＴＯＲ／ｍＴＯＲ、ｐｐ７０Ｓ６Ｋ／ｐ７０Ｓ６Ｋ、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、抗ビンクリンおよび抗β−アクチンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１２２】
ＣＬＵ  ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス処理
ｓｉＲＮＡｓは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から購入し、以前に述べたように（Ｌａｍｏｕｒｅｘら、２０１１）、エクソン２におけるヒトＣＬＵ開始部位に対応するｓｉＲＮＡ配列およびスクランブル対照を用いた。第二世代アンチセンス（クスチルセン）および２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル修飾を有するスクランブル（ＳｃｒＢ）オリゴヌクレオチドは、ＯｎｃｏＧｅｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより供給された。クスチルセン配列（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴ−３；配列番号３）は、ヒトＣＬＵのエクソンＩＩにおける開始部位に対応する。ＳｃｒＢ対照配列は、５’−ＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴ−３’（配列番号４４）である。前立腺細胞は、以前に記載されたプロトコール（Ｌａｍｏｕｒｅｘら、２０１１）を用いてｓｉＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドで処理した。
【０１２３】
ウェスタンブロッティング分析および免疫沈降
総タンパク質は、我々が以前に記載したように（Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２００７）、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｎＭトリス、ｐＨ７．２、１％ＮＰ−４０、０．１％デオキシコール酸塩、０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｒｏｃｈｅ完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて抽出し、ウェスタンブロットにかけた。免疫沈降のために、総タンパク質（５００μｇ）をプロテインＧセファロース（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４℃で１時間、前浄化し、２μｇの抗ＡＲまたは対照としての免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で４℃で一夜沈降させた。免疫複合体をプロテインＧセファロースで２時間にわたって回収し、次いで、放射免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ）で少なくとも３回洗浄し、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに、続いてウェスタンブロッティングにかけた。
【０１２４】
定量的逆転写ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた４８時間の処理後に、培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。２μｇの全ＲＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて逆転写した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のＰＣＲ増幅の実時間モニタリングは、ＳＹＢＲ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、ＤＮＡプライマー（追加の表）を用いて実施した。標的遺伝子発現５’−ＴＡＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴ−３’（フォワード；配列番号４５）または５’−ＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴ−３’（リバース；配列番号４６）（ヒトＡＲを標的とする）、５’−ＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡ−３’（フォワード；配列番号４７）または５’−ＡＧＧＴＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣ−３’（リバース；配列番号４８）（ヒトＰＳＡを標的とする）は、内部標準としての５’−ＡＡＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣ−３’（フォワード；配列番号４９）または５’−ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧ−３’（リバース；配列番号５０）を用いてｂ−アクチンレベルに対して標準化し、比較サイクル閾値（Ｃｔ）法を用いて、標的ｍＲＮＡｓの相対的定量化を計算した。各アッセイは、３連で行った。
【０１２５】
免疫蛍光
ＬＮＣａＰ細胞をカバーガラス上で増殖させ、ＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたは対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１０μＭのＡＲ１±１ｎＭ  Ｒ１８８１で６時間処理した。処理後、細胞を氷冷メタノールで固定し、−２０℃で１０分間かけて３％アセトンで完結した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳとともに１０分間インキュベートし、その後洗浄し、ＡＲ（１：２５０）を検出するために抗体を一夜加える前に３％無脂肪乳中で３０分ブロッキングした。抗原は、ＦＩＴＣと結合させた抗マウス抗体（１：５００；３０分）を用いて視覚化した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ＩＩ蛍光顕微鏡を用いて光学顕微鏡写真を２０倍の拡大倍率で撮影した後、イメージングソフトウエア（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｅｍｐｉｘ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。
【０１２６】
ＡＲ転写活性
ＬＮＣａＰ細胞を５×１０4の密度で１２ウェルプレートに播種し、翌日クスチルセンまたはＳＣＲＢでトランスフェクトした。翌日、以前に記載されたように（Ｓｏｗｅｒｙら、２００８）、リポフェクチン試薬（ウェル当たり１．５μＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞にクスチルセンまたはＳＣＲＢならびにＰＳＡ−ルシフェラーゼ（ＰＳＡ−Ｌｕｃ）リポーター（−６，１００〜＋１２）およびレニラルシフェラーゼプラスミドをトランスフェクトした。２４時間後に、培地を、１ｎｍｏｌ／ＬのＲ１８８１またはエタノール媒体および１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１またはＤＭＳＯを添加した５％活性炭ストリップ血清（ＣＳＳ）を含むＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、４８時間かけて置換した。細胞を採取し、前のように（Ｓｏｗｅｒｙら、２００８）、ルシフェラーゼ活性を測定した。リポーターアッセイをレニラに対して標準化し、ルシフェラーゼ活性を任意光単位のホタル対レニラ比により表した。すべての実験は、三連ウェルで行い、プラスミドの異なる調製物を用いて５回反復した。
【０１２７】
細胞増殖および細胞周期アッセイ
培養細胞にＣＬＵまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ、クスチルセンまたはＳＣＲＢをトランスフェクトし、次いで、トランスフェクションの２４時間後にＡＲ１またはＤＭＳＯで処理した。経時的曝露の後、以前に記載されたように（Ｇｌｅａｖｅら、２００５）、クリスタルバイオレットアッセイにより細胞増殖を測定した。アポトーシス細胞周期集団の検出および定量は、以前に記載されたように（Ｌａｍｏｕｒｅｕｘら、２０１１）、２Ｎおよび４Ｎ  ＤＮＡ含量に基づいてフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ；Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｉｎｃ．）により分析した。ＣＳＳ条件については、ＬＮＣａＰ細胞を５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で平板培養し、翌日ＣＳＳに切り替え、ＦＢＳ条件と同じ処理を開始した。各アッセイは、三連で３回行った。
【０１２８】
タンパク質の安定性および分解
ＡＲタンパク質の安定性に対する併用療法の影響を評価するために、クスチルセンまたはＳＣＲＢで処理したＬＮＣａＰ細胞を、４８時間後に１０μｍｏｌ／Ｌのシクロヘキシミドおよび１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１を含むＲＰＭＩ＋５％血清に交換して３７℃で２〜６または１６時間インキュベートし、ＡＲおよびビンクリン抗体を用いてウェスタンブロットを行った。分解は、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯトランスフェクションの２４時間後に１０μｍｏｌ／ＬのＭＧ１３２および１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１を含むＲＰＭＩ＋５％血清培地とともに６時間インキュベートすることによってＬＮＣａＰ細胞において試験した。ＡＲおよびビンクリン抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
【０１２９】
併用療法の有効性の増大の判断
各単一薬物またはそれらの併用の細胞増殖阻害を分析するために、クリスタルバイオレットアッセイを適用した。ＬＮＣａＰ細胞を、漸増用量のＡＲ１および５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢとも併用して１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡで処理した。次に、細胞を用量漸増クスチルセンまたはオリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｍｅ）のみで２日間連日処理し、１日後に表示濃度のＡＲ１またはＤＭＳＯで４８時間処理した。データをＣａｌｃｕＳｙｎ（商標）ソフトウエアにインプットし、用量効果曲線を各処理ごとに描いて、いくつかの有効量における併用指数（ＣＩ）を計算した（ＣＩ＝１：相加効果、ＣＩ＜１：併用効果、ＣＩ＞１：拮抗効果）。
【０１３０】
動物の治療
雄無胸腺マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．）に１×１０6個のＬＮＣａＰ細胞を皮下（）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に成長し、血清ＰＳＡが＞５０ｎｇ／ｍＬとなったとき、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した時点で、マウスをＡＲ１＋１０ｍｇ／ｋｇクスチルセンまたはＳＣＲＢに無作為に割り付けた。投与は腹腔内（ｉ．ｐ．）に７日間にわたり１日１回、その後週３回行われた。各実験群は、１３匹のマウスからなっていた。同時に、マウスにＡＲ１を１日１回経口（ｐ．ｏ．）で１０ｍｇ／ｋｇ／各投与で週７日投与した。腫瘍体積および血清ＰＳＡを以前に記載されたように（Ｓｏｗｅｒｙら、２００８）測定した。すべての動物に対する処置は、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）のガイドラインに従って実施した。異種移植片を有する３匹のマウスを治療開始後７日目に屠殺し、試験の終了時に残りを採取し、液体窒素で急速冷凍した。プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液中で腫瘍を固化すること（ｓｏｌｉｃｉｔｉｎｇ）により、タンパク質の抽出を行い、全細胞溶解物を用いて、異種移植片内のＡＲおよびクラステリン発現を評価し、ウェスタンブロッティングに関する項で述べたようにβ−チューブリンを参照した。
【０１３１】
統計解析
すべての結果を平均値±ＳＥとして表す。両側ｔ検定、一元配置ＡＮＯＶＡまたはＷｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア検定を統計解析に用いた。併用効果は、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウエアにより計算した。単独療法と併用療法との差は、フリードマン（Ｆｒｅｉｄｍａｎ）検定により解析され、ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４を用いて行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１を有意とした。
【０１３２】
例３．  ＣＬＵはＡＲ１抵抗性細胞および異種移植片において高度に発現する
ＡＲ１は、ＡＲ  ＬＢＤに結合し、去勢抵抗性異種移植片の成長を抑制する新規な抗アンドロゲンである（Ｔｒａｎら、２００９）。第ＩＩおよびＩＩＩ相試験からのデータは、ＡＲ１が、化学療法による治療前および治療後の両方の患者において活性であり、ＰＳＡのレベルおよび循環腫瘍細胞を減少させることを示している（Ｓｃｈｅｒら、２０１０）（Ｓｃｈｅｒ、ＧＵ−ＡＳＣＯ、２０１２）。残念なことに、第一選択ホルモン療法と同様に、ＣＲＰＣ−ＬＮＣａＰ異種移植片は、去勢へのＡＲ１の追加の後に抵抗性のメカニズムを発生する。ＣＬＵは、媒体処理腫瘍と比較してＡＲ１抵抗性腫瘍において上方制御されることがウェスタンブロット（図４１Ａ、左パネル）および免疫組織化学（図４１Ａ、右パネル、図３０Ａ）によって見いだされた。これにより、ＡＲ１療法が、去勢感受性腫瘍において去勢によって認められるものと同様な、ＣＲＰＣ腫瘍におけるストレス活性化分子シャペロンＣＬＵを誘導することが示唆される。ＡＲ１再発のメカニズムの研究を促進するために、ＡＲ１に対して抵抗性であったＡＲ１療法のもとで維持された異種移植片腫瘍から異なる細胞系を創製したところ、これらのＡＲ１抵抗性細胞もＣＲＰＣ腫瘍と比較してより高いレベルのＣＬＵを発現したことが認められた（図３０Ｂ）．これらのデータから、ＣＬＵの増加がＡＲ１再発表現型の発生に関連していることがわかる。
【０１３３】
例４．  ＡＲ経路阻害がＣＬＵを誘導する
両ＡＲ１アンチセンスアプローチを用いて、ＣＬＵがＡＲ経路阻害によって誘導されるかどうかを確認した。ビカルタミドおよびＣＳＳを用いたアンドロゲン除去と比較して、ＰＳＡ発現の低下によって示されるＡＲの活性化の低下と並行して、ＡＲ１が時間および用量依存的にＣＬＵを誘導する。ＣＬＵのＡＲ１誘導がＡＲ依存的であるかどうかをさらに評価したところ、ＣＬＵの誘導と並行して、ＡＲにおける第１エクソンを標的とする２種のアンチセンス配列がＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲを用量依存的かつ配列特異的に強力に下方制御した（図４１Ｃ）。総合すると、これらのデータから、アンドロゲン除去、ＡＲ  ＬＢＤ拮抗作用またはアンチセンスノックダウンによるＡＲ経路阻害が、おそらく適応ストレス応答の一部として、ＣＬＵを誘導することが示唆される。
【０１３４】
クラステリン発現は、ＡＲ１の投与によって上方制御される。クラステリン発現は、ＡＲ１の投与後に時間および用量依存的に上方制御される。ＬＮＣａＰ細胞を、各種継続時間にわたり、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中各種濃度のＡＲ１で処理する。細胞を採取し、ウェスタンブロット分析を実施する。クラステリンタンパク質発現は、時間および用量依存的に上方制御される。アンドロゲン除去処理は、とりわけＡＲ１でクラステリン発現を増大させる。ＬＮＣａＰ細胞を、５％ＦＢＳまたは５％ＣＳＳ（活性炭ストリップ血清；テストステロン欠乏培地）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、１０μｍｏｌ／ＬのビカルタミドまたはＡＲ１で、４８時間かけて処理する。クラステリン発現は、抗アンドロゲン療法またはＣＳＳ条件により高度に誘導される。さらに、クラステリンタンパク質発現は、ウェスタンブロット分析において、ビカルタミド療法と比較してＡＲ１療法で高度に増大する。ＡＲ１およびクスチルセンの併用は、ビカルタミドおよびクスチルセンの併用より、前立腺癌細胞増殖を減少させるのに有効である。
【０１３５】
例５．  ＡＲ１はＥＲストレスを誘発する
ＣＬＵのような分子シャペロンは、誤って折りたたまれたタンパク質および小胞体（ＥＲ）ストレス応答を調節するのに重要であり（Ｎｉｚａｒｄら、２００７）、多くの抗癌薬は、ＥＲストレスを誘発することが公知であるので、ＡＲ１がＣＬＵの増加によりＥＲストレスを誘発するかどうかを評価した。ＥＲストレスは、ユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）によりタンパク質の翻訳を阻害し、ＥＲ関連タンパク質分解を促進することによりタンパク質恒常性（プロテオスタシス）を再確立するように調整される、小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）と呼ばれる複雑細胞内シグナル伝達経路を活性化する。ＡＲ１は、ＥＲストレスおよびＵＰＲ活性化と一致して、ＧＲＰ７８、ＡＴＦ４、ＩＲＥ１、ＣＨＯＰおよび切断ＡＴＦ６などのＥＲストレスマーカーの上方制御と同時に、ＣＬＵ発現を誘導することがわかる。
【０１３６】
例６．  ＡＲ１誘導性ＣＬＵはｐ９０Ｒｓｋ−ＹＢ−１シグナル伝達経路によって媒介される
ＹＢ−１は、ＣＬＵプロモーターに結合して、ＥＲストレス後のＣＬＵ発現の増大をもたらす（Ｓｈｉｏｔａら、２０１１）。ＡＲ１は、ＡｔｋおよびＥｒｋシグナル伝達を活性化することができる（Ｃａｒｖｅｒら、２０１１）ので、Ａｋｔ（Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖａら、２００６）およびＥｒｋ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄら、２００８）経路のＡＲ１媒介性活性化は、ＣＬＵの上方制御およびストレス誘導性アポトーシスの抑制により、ＹＢ−１のホスホ活性化および核転位をもたらす（Ｅｖｄｉｌｏｍｏｖａら、２００６）と推測された。図４２Ｂは、ＡＲ１投与が、ホスホ−ＹＢ−１レベルの増加とともに、Ａｋｔおよびｐ９０Ｒｓｋリン酸化を増加させることを確認するものである（図４２Ｂ）。ＡＲ１投与と併用したｓｉＲＮＡを用いたＹＢ−１ノックダウンによって、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方でＣＬＵがＡＲ１により誘導されず（図４２Ｃ）、ＡＲ１誘導ＣＬＵがＹＢ−１によって媒介されることが示唆される。
【０１３７】
ＹＢ−１は、Ａｋｔおよびｐ９０Ｒｓｋの両方によりリン酸化することができる（Ｅｖｄｉｌｏｍｏｖａら、２００６）（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄら、２００８）ので、ＣＬＵのＡＲ１誘導性上方制御を媒介する主要な経路をさらに明らかにするために、ＬＹ２９４００２を用いてＡｋｔを阻害し、ＳＬ０１０１を用いてｐ９０Ｒｓｋを阻害した。Ａｋｔの阻害は、ＣＬＵのＡＲ１誘導性上方制御に影響を及ぼさなかった（図４２Ｄ）。これと対照的に、ＳＬ１０１を用いたｐ９０Ｒｓｋの阻害は、ＡＲ１によるＣＬＵの誘導を抑制した（図４２Ｅ）。科学的理論に拘束されることを望むものではないが、総合すると、これらのデータは、ＡＲ１がＣＬＵ発現を誘導するにはｐ９０Ｒｓｋ−ＹＢ−１経路が必要であることを示すものである。
【０１３８】
例７．  ＣＬＵ阻害とＡＲ１の併用はＣＬＵ阻害またはＡＲ１単独療法と比較してＬＮＣａＰ細胞増殖の抑制を増大させる
ＡＲ１（図３０および４１）のような抗ＡＲ薬物（Ｊｕｌｙら、２００２）が治療抵抗性のメディエーターとしてＣＬＵおよびＣＬＵ機能の上方制御を誘導する（Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２０１０ｂ、Ｇｌｅａｖｅら、２００５）ことから、ＣＬＵノックダウンがＡＲ１の抗癌活性を増強するかどうかを評価した。ＬＮＣａＰ細胞をクスチルセンで処理し、その後、表示濃度のＡＲ１で処理した。クスチルセンは、対照ＳｃｒＢ＋ＡＲ１と比較して、時間（図４３Ａ左パネル）および用量（図４３Ａ右パネル）依存的にＡＲ１活性を有意に増大させ、細胞の生存率を低下させた。この効果が相加的であったか、または併用効果であったかを判断するために、一定比率デザインによる用量依存的効果およびＣＩ値をＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙのメディアンエフェクトプリンシパル（ｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）（Ｃｈｏｕら、１９８４）に従って計算した。図６Ｂに用量反応曲線（クスチルセンまたはＡＲ１による併用または単独療法）をＣＩプロットとともに示す。これにより、クスチルセンとＡＲ１との併用が腫瘍細胞増殖に対する高い効果を有する（図６Ｃ、右パネル）ことがわかる。クスチルセンおよびＡＲ１の併用は、ＡＲ１またはクスチルセン単独療法と比較して、ＡＲ陽性去勢抵抗性Ｃ４−２およびクスチルセン抵抗性細胞の生存率を低下させる高い効果も有していたが、ＡＲ陰性ＰＣ３細胞においてはそうでなかった。
【０１３９】
フローサイトメトリー分析で、クスチルセンは、ＡＲ１（３０％）と併用したとき、対照ＳＣｒＢ（１５．２％）、クスチルセン（２０％）、対照ＳＣｒＢ＋ＡＲ１（１８．３％）と比較してＡＲ１誘導性アポトーシス（サブＧ１画分）を有意に増加させる（Ｐ＜０．００１）ことが示されている（図４３Ｃ）。さらに、クスチルセン＋ＡＲ１の併用は、切断ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３活性によって示されるように、ＡＲ１またはクスチルセン単独療法と比較してカスパーゼ依存性アポトーシスを増加させる。総合すると、これらのデータから、クスチルセンおよびＡＲ１の併用は、クスチルセンまたはＡＲ１単独療法よりアポトーシスを高度に誘導したことがわかる。
【０１４０】
例８．  ＡＲ１療法と併用したクラステリンノックダウンはＡＲ陽性ＬＮＣａＰ細胞における細胞増殖阻害およびアポトーシスを概して増大させる
ＬＮＣａＰ細胞を５％ＦＢＳまたは５％ＣＳＳ含有ＲＰＭＩ培地とともに、ウェル当たり５ｘ１０4細胞で１２ウェル培養プレートに播種する。翌日、細胞に１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照を直ちに、また５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照を２日間にわたり毎日トランスフェクトする。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴによるトランスフェクト後の翌日、ＬＮＣａＰ細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、０、１、２、３、４日目にクリスタルバイオレットアッセイにより細胞増殖アッセイを実施する（ＡＲ１処理当日を１００％と定義する）。ＣＬＵノックダウン＋ＡＲ１併用処理が細胞増殖を最も有意に抑制する。１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１を１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡと併用し、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１を５００ｎｍｏｌ／Ｌのクスチルセンと併用する。
【０１４１】
併用処理は、フローサイトメトリー分析においてＬＮＣａＰアポトーシスを増加させる。細胞を１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照で直ちに、また５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照で５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地中で２日間にわたり毎日処理する。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴのトランスフェクト後の翌日、ＬＮＣａＰ細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、４８時間の処理の後にＦＡＣＳ分析を実施する。サブＧ０、Ｇ０〜Ｇ１、Ｓ、Ｇ２〜Ｍにある細胞の割合をヨウ化プロピジウム染色により決定する。併用処理により、ＬＮＣａＰ細胞のサブＧ０／１アポトーシス画分のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が増加する。オリゴフェクタミンおよびＤＭＳＯと比較して、ＣＬＵ  ｓｉＲＮＡとＡＲ１の併用でｐ＜０．０１、クスチルセンとＡＲ１の併用でｐ＜０．００１である。Ｐ値は、処理群とそれらの各対照との間の＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎのマッチドペア検定）を表す。
【０１４２】
併用処理は、アポトーシスを促進する。ＬＮＣａＰ細胞は、ＣＬＵまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡおよびクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照による処理の前に１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で４８時間、前処理する。ＰＡＲＰ切断発現レベルは、ウェスタンブロットにより測定する。すべての実験を少なくとも３回反復する。
【０１４３】
例９．  クスチルセンとＡＲ１療法の併用は、クスチルセンまたはＡＲ１単独療法と比較して高い有効性を示す
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＲ１と併用してＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはクスチルセンで処理したＬＮＣａＰ細胞に、増殖の抑制が認められる。細胞に１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照を直ちに、また５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照を５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地中で２日間にわたり毎日トランスフェクトする。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴによるトランスフェクト後の翌日、ＬＮＣａＰ細胞を種々の濃度のＡＲ１で処理する。処理の３日後に、クリスタルバイオレットアッセイにより細胞生存率を測定する。生存細胞密度をＤＭＳＯ対照で処理した細胞の密度に対して標準化する（ＡＲ１化合物をＤＭＳＯに溶解し、表示濃度に調整する）。クスチルセンとＡＲ１との併用は、クスチルセンまたはＡＲ１単独療法と比較して細胞生存率を低下させる高い効果を示す。テータポイントは、３連分析の平均値である。Ｐ値は、処理群とそれらの各対照との間の＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）を表す。
【０１４４】
細胞増殖の抑制は、各単一薬物またはそれらの併用について、クリスタルバイオレットアッセイにより評価する。ＬＮＣａＰ細胞を可変濃度のＡＲ１またはクスチルセンで処理する。各単剤処理と併用処理との間に有意な差がある。Ｐ値は、フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）検定により計算する。データを入力し、ＣａｌｃｕＳｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）によりいくつかの有効量における下図の併用指数（ＣＩ）を計算する。ＣＩ＝１；相加効果、ＣＩ＜１；併用効果、ＣＩ＞１；拮抗効果。これらのデータは、併用療法における併用効果を示している。
【０１４５】
例１０．  併用療法におけるＡＲおよびＰＳＡ発現
ＡＲタンパク質発現は、ＡＲ１とクスチルセンを併用して用いたＣＬＵノックダウンの後に低下する。ＬＮＣａＰ細胞に１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照を直ちに、また５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照を５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地中で２日間にわたり毎日トランスフェクトする。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴによるトランスフェクト後の翌日、ＬＮＣａＰ細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理する。４８時間後に、細胞をタンパク質およびｍＲＮＡを得るために採取する。タンパク質発現は、ウェスタンブロットにより分析する。ＡＲ１療法と併用したＣＬＵノックダウンは、単独療法と比較してＡＲ発現を低下させる高い効果を有する。ＡＲ発現は、ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンにより高度に抑制される。細胞は、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１またはビカルタミドと併用して１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡで処理する。ＡＲ発現は、ウェスタンブロットにより検出する。併用療法は、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさない。ｍＲＮＡ発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析し、ＡＲおよびＰＳＡレベルをβ−アクチンｍＲＮＡのレベルに対して標準化し、平均値±ＳＥとして表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎのマッチドペア検定）。「ＯＴＲ」は、オリゴフェクタミンのみで処理した細胞を意味する。ＯＴＲおよびＤＭＳＯ処理細胞を１００％と定義した。
【０１４６】
例１１．  ＡＲ１とクスチルセンの併用はＣＲＰＣ  ＬＮＣａＰ腫瘍の成長を遅延させる高い効果を有する
クスチルセンとＡＲ１を併用して用いてＡＲおよびストレス応答を同時標的とするｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価した。ＬＮＣａＰ異種移植片を有する雄ヌードマウスを、血清ＰＳＡが７５ｎｇ／ｍｌに達したときに去勢し、血清ＰＳＡおよび腫瘍成長速度が増加して、去勢抵抗性への進行を示す、去勢前のレベルに戻るまで追跡した。次いで、マウスをＡＲ１＋対照ＳｃｒＢ（ｎ＝１０）またはクスチルセン（ｎ＝１０）による治療に無作為に割り付けた。ベースラインにおいて、平均ＬＮＣａＰ腫瘍体積および血清ＰＳＡレベルは、両群で同様であった。クスチルセンは、対照ＳｃｒＢと比較してＡＲ１の抗腫瘍効果を有意に増強し、１２週目までに平均腫瘍体積を１６００ｍｍ3から６５０ｍｍ3に低下させた（＊＊；ｐ≦０．０５）（図４４Ａ）。全生存期間（体重の１０％を超える腫瘍体積のための安楽死と定義される）は、ＡＲ１＋クスチルセンの併用によりＡＲ１＋ＳｃｒＢ対照と比較して有意に延長した（それぞれ１６週目に９０％対３０％；＊；ｐ≦０．０５）。ＡＲ１対照群と比較してクスチルセン＋ＡＲ１群（＊＊＊、ｐ＜０．００１）において血清ＰＳＡレベルも有意に低く（〜４倍）（図４４Ｃ）、ＰＡＳ倍加時間は、有意に延長する（＊、ｐ＜０．０５）。標的タンパク質レベルに対する併用療法の薬力学効果を評価するために、腫瘍組織（それぞれ３匹の動物）のウェスタンブロット分析をＡＲ、ＰＳＡおよびＣＬＵについて実施した。図４４ＤはＡＲおよびＣＬＵ発現レベルが、ＡＲ１対照と比較して併用療法腫瘍組織において低下したことを示す。総合すると、これらのデータは、ＡＲおよび結果として起こるＣＬＵ調節ストレス応答を同時標的とすることによって、ヒトＣＲＰＣ異種移植片モデルにおけるＡＲ１の効果が増強されることを示すものである。
【０１４７】
ＣＲＰＣ異種移植片モデルにおけるクスチルセンおよびＡＲ１併用療法の有効性は、ＡＲ１またはクスチルセン単独療法と比較して向上している。図４４Ａ〜Ｂに、併用療法による腫瘍体積および血清ＰＳＡレベルに対する効果を示す。
【０１４８】
例１２．  ＡＲ１＋クスチルセン併用はＣＲＰＣ異種移植片モデルにおいて高い有効性を有する
ＬＮＣａＰ細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下（ｓ．ｃ．）播種する。異種移植片が約５００ｍｍ3に成長するか、またはＰＳＡが＞５０ｎｇ／ｍｌとなったとき、マウスを去勢する。ＰＳＡレベルが去勢前のレベルに増加したとき、治療を開始する。クスチルセンまたはＳＣＲＢを１週間にわたり１日１回、その後は３回／週で腹腔（ｉ．ｐ．）注射する。ＡＲ１は、１日１回投与する。ＡＲ１と併用したクスチルセンまたはＳＣＲＢの投与の後に（群当たり３匹のマウス）総ＬＮＣａＰ異種移植片タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液で抽出し、ＡＲ、ＰＳＡおよびＣＬＵ抗体を用いてウェスタンブロットを行う。ビンクリンを負荷対照として用いる。ＡＲ／チューブリン比を計算する。ＡＲ１＋クスチルセンの併用は、ＣＲＰＣ異種移植片モデルにおける生存期間を延長する高い効果を有する。
【０１４９】
例１３．  ＡＲ１とＣＬＵサイレンシングの併用は、ＡＲ１またはＣＬＵサイレンシング単独療法より効果的にＡＲ核転位および転写活性を低下させる
図４４におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験で、ＡＲ１と併用したクスチルセンは、腫瘍の体積の変化が明らかになる前にＰＳＡの速やかな低下をもたらすことが示されている。さらに、ＡＲタンパク質レベルは、ＡＲ１単独で治療した腫瘍と比較して併用治療腫瘍において低いと思われ、ＣＬＵノックダウンがＡＲ標的化を強化し、ＡＲシグナル伝達経路を調節する可能性があることが示唆される。アンドロゲン誘導性ＡＲ媒介性遺伝子活性化に対する併用療法の効果を評価した。ＬＮＣａＰ細胞をＡＲ１もしくはクスチルセン単独で、または併用で処理し、Ｒ１８８１刺激性ＰＳＡトランス活性化の変化について評価した（図４５Ａ）。予想通り、ＡＲ１は、ＰＳＡルシフェラーゼトランス活性化アッセイにより測定したとき、Ｒ１８８１誘導性ＡＲ転写活性を９５％低下させた。興味深いことに、クスチルセンもＡＲ活性化を９０％低下させ、この効果は、ＡＲ１との併用で増大したことから、ＣＬＵノックダウンがＡＲ活性のＡＲ１阻害を増強することが示唆される。ＣＬＵがＡＲ転写活性にどのように作用することができるかを明らかにするために、リガンド誘導性ＡＲ核転位に対するＣＬＵノックダウン±ＡＲ１の効果を評価した。予想通り、ＡＲ核転位がＡＲ１により低下したが、ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンは、Ｒ１８８１誘導性ＡＲ核転位を最大限に阻害した（図４５Ｂ）。この同時標的化阻害効果も、ＡＲ１と併用したＣＬＵの標的化がＲ１８８１誘導性核ＡＲレベルを抑制する（図４５Ｃ）ことを示す画分アッセイによって確認された。
【０１５０】
例１４．  ＡＲ１療法と併用したＣＬＵノックダウンは、プロテアソーム経路によるＡＲ分解を促進する
併用療法後のＡＲの運命を検討するために、ＡＲの発現に対するＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンの効果をタンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方で評価した。ｓｉＲＮＡ（図４６Ａ右上パネル）またはクスチルセン（図４６Ａ左上パネル）を用いたＣＬＵサイレンシングは、ＡＲタンパク質の減少をもたらしたが、ＡＲ１との併用においてのみｍＲＮＡレベルはそうでなく（図４６下パネル）、ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンがＡＲの安定性に影響を及ぼし得ることが示唆される。次にＡＲタンパク質の安定性を、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミドを用いて評価した。ＡＲタンパク質レベルは、ＡＲ１と併用したクスチルセン誘導性ＣＬＵノックダウンの後の速やかな分解により有意に低下し（図４６Ｂ）、ＣＬＵノックダウンが、ＡＲ１と複合させた場合にＡＲの不安定性をもたらすことが示唆される。
【０１５１】
ＡＲは、Ｈｓｐ９０とヘテロ二量体複合体を形成して、リガンド非結合ＡＲに安定性をもたらす。実際、Ｈｓｐ９０結合がない場合、折りたたみ不正タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ユビキチン−プロテアソームシステムにより認識され、分解される（Ｓｏｌｉｔら、２００３；Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２０１０ｃ）。ＡＲ１がＨｓｐ９０へのＡＲの結合に影響を及ぼすかどうか、およびＣＬＵサイレンシングと併用した場合の後の効果を最初に評価した。ＡＲ１療法は、実際にＡＲ−Ｈｓｐ９０相互作用を増大させる。これは、ＡＲ１がＡＲを細胞質内に隔離するという以前の報告と一致する。興味深いことに、ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンは、図４６Ｃに示すように、ＡＲとＨｓｐ９０との間の結合を減弱させる。科学的理論により拘束されることを望むものでないが、これらのデータは、ＡＲ１−ＡＲ−Ｈｓｐ９０ヘテロ複合体がＣＬＵサイレンシングの条件下で分解をより受けやすい状態になるという見解と一致している。これらの条件下でのＡＲの分解がユビキチン−プロテアソームシステムに関係するかどうかを評価するために、ユビキチン化ＡＲのレベルを単独療法または併用療法後の条件下で測定したところ、図４６Ｄに示すように、ＡＲのユビキチン化レベルは、同時標的併用条件下で最も高かった。次に、プロテアソームの役割を明らかにするためにプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）の存在下または非存在下でＡＲタンパク質レベルを評価したところ、ＭＧ１３２がＣＬＵノックダウン＋ＡＲ１の条件下でＡＲ分解を無効にすることが見いだされ、これは、プロテアソームによるＡＲの分解を意味するものであった（図４６Ｅ）。科学的理論に拘束されることを望むものではないが、総合すると、これらのデータは、ＡＲをＡＲ１に結合させるとき、ＣＬＵノックダウンがプロテアソーム媒介性経路を介してＡＲ分解を優先的に促進することを示唆するものである。
【０１５２】
例１５．  ＡＲ分解速度は併用療法により加速される
併用療法により、ＡＲ発現が速やかに低下する。ＬＮＣａＰ細胞を５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照で処理し、次いで、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１および１０μｍｏｌ／Ｌのシクロヘキシミドで種々の時間にわたり処理する。ＡＲタンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析により測定する。ＤＭＳＯを対照として用いる。ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンは、ＡＲのプロテアソーム分解を促進する。ＬＮＣａＰ細胞をＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡおよびクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照で処理し、次いで、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１および１０μｍｏｌ／ＬのＭＧ−１３２で６時間、処理する。ＤＭＳＯを対照として用いる。ＡＲタンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析により測定する。
【０１５３】
例１６．  併用治療は、ＡＲのユビキチン化に影響を与える。
【０１５４】
ＬＮＣａＰ細胞を、ＦＢＳ存在下で、１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照で処理し、次いで１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１および１０μｍｏｌ／ＬのＭＧ−１３２で処理する。抗ＡＲ抗体（Ｎ−２０）を使用して免疫沈降を行い、抗ＡＲ抗体（４４１）または抗ユビキチン抗体を使用してウェスタンブロット分析を行う。投入物を、ＡＲ（Ｎ−２０）抗体でブロットする。いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、併用治療は、ＡＲのユビキチン化によるＡＲのプロテアソーム分解を促進する。
【０１５５】
例１７．  ＣＬＵノックダウンは、ＡＲ安定性に関係するコシャペロン分子のレベルを低下させる
いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、本明細書のデータは、ＡＲ１単独療法が細胞質中のＡＲ−Ｈｓｐ９０複合体を分離するが、ＣＬＵノックダウンと組み合わせたとき、ＡＲ−Ｈｓｐ９０−ＡＲ１ヘテロ複合体が不安定になり、ＡＲのユビキチン化および分解がもたらされ、ＡＲの核輸送および活性が低下することを示している。１つの説明は、ＣＬＵの阻害が、ＨＳＦ−１調節に及ぼす影響によって、Ｈｓｐ９０レベルが低下する可能性があるということである（Ｌａｍｏｕｒｅａｘら、２０１１）；しかし、併用療法は、Ｈｓｐ９０レベルを有意に低下させず、図４２に例示したデータは、ＡＲ１を媒介する重要なストレス活性化型転写因子であるＹＢ−１がＣＬＵの増加に関わっていることを意味している。Ｈｓｐ９０は、コシャペロンと協同で機能して、クライアントタンパク質に安定性を付与するので、先入観を伴わない手法を最初に使用して、ＣＬＵ発現に影響を及ぼすＨｓｐ９０コシャペロンを同定した。対照および本明細書に開示したＣＬＵ  ｓｉＲＮＡで処理したＬＮＣａＰ細胞ならびにＰＣ−３の遺伝子プロファイリング分析は、ＣＬＵ発現がＨｓｐ９０コシャペロンＦＫＢＰ５２（Ｈｓｐ５６）と相関することを示す。ＣＬＵノックダウンによりＦＫＢＰ５２は低下するが、ＦＫＢＰ５１またはＨｓｐ９０タンパク質のレベルは低下しないことを、ウェスタンブロッティングを使用して確認した（図４７Ａ）。ＡＲ１処理およびＣＬＵサイレンシング条件でのＡＲ安定性に対するＦＫＢＰ５２の役割を確認するために、ＣＬＵノックダウン後にＦＫＢＰ５２を過剰発現させ、ＡＲ発現を評価した。図７Ｂは、ＦＫＢＰ５２が、ＣＬＵノックダウンおよびＡＲ１処理によって誘導される分解からＡＲを救済することを示している。ＦＫＢＰ５２の過剰発現が、ＰＳＡの発現も部分的に回復させることは、ＣＬＵノックダウン条件下でＦＫＢＰ５２レベルが回復されるとき、ＡＲ活性が増加することを示している。これらのデータは、ＡＲ１との併用でＣＬＵノックダウンが、ＦＫＢＰ５２レベルおよびＡＲ−コシャペロン複合体の安定性に影響を及ぼすことによってＡＲの分解を誘導することを示唆している。
【０１５６】
さらに、ＡＲ１誘導ストレス条件で、ＣＬＵがどのようにＦＫＢＰ５２レベルを調節するかを明らかにするために公開データベースを調査し、高密度タイリングアレイ（ＣｈＩＰ  ｏｎ  ＣｈＩＰ）分析において、１２の高ストリンジェンシー（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｏｆ  １２）でＹＢ−１がＦＫＢＰ５２に結合することを支持する情報を得た。ＹＢ−１ノックダウンは、ＦＫＢＰ５２発現レベルを低下させることをウェスタンブロッティングで確認した（図４７Ｃ）。ＡＲ１処理は、ＹＢ−１によるＣＬＵのトランス活性化、ならびにＡｋｔおよびｐ９０ｒｓｋ活性の増大を含めたストレス応答を活性化する（図４２）。ＹＢ−１ノックダウンは、ＣＬＵとＦＫＢＰ５２両方のレベルを低下させ、ＣＬＵは、ｐ−ＡＫＴ活性を増進することもできるので、ＡＲ１処理条件で、ＣＬＵノックダウンがどのようにＹＢ−１、ＡＫＴおよびｐ９０ｒｓｋ間の相互作用に作用して、ＦＫＢＰ５２レベルに影響を及ぼすかを次に調査した。興味深いことに、これまでの報告と同様に、ＣＬＵはＡＫＴのリン酸化を増進することができ、ＣＬＵノックダウンが、ＹＢ−１およびｐ９０ＲｓｋのＡＲ１誘導性リン酸化を排除することもわかった（図４７Ｄ）。いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、ｐ９０Ｒｓｋ−ＹＢ−１経路は、ＡＲ１誘導性ＣＬＵ発現に重要な調節因子なので（図４２）、総合すると、これらのデータは、ＡＲ安定性、核移行および活性化に対して、ｐＹＢ−１、ｐ９０ｒｓｋ、ＣＬＵおよびＡＲコシャペロンＦＫＢＰ５２を含むＡＲ１処理誘導性フィードフォワードループを同定する。
【０１５７】
例１８．  併用治療は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を阻害する。
【０１５８】
ＡＲ１は、ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化を活性化する。５％ＦＢＳを含む培地中で、様々な時間および用量で、ＬＮＣａＰ細胞をＡＲ１で処理する。リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ、ＡｋｔおよびＥＲＫ抗体を使用して、ウェスタンブロット分析を行う。ＣＬＵノックダウンは、ＡＲ１処理によりリン酸化Ａｋｔの活性化を阻害することによって、Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を減衰させる。ＬＮＣａＰ細胞を、ＦＢＳ存在下で１０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照で処理し、次いで１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理する。処理４８時間後に、リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ｍＴＯＲ、リン酸化Ｐ７０Ｓ６Ｋ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲおよびＰ７０Ｓ６Ｋ抗体を使用してウェスタンブロット解析を行う。
【０１５９】
例１９．  ＡＲ陽性状態に対するクラステリンノックダウンとＡＲ１間の併用効果の考え得る説明
ＡＲに結合したアンドロゲンは、細胞質から核への迅速に移行し、これがＡＲ調節遺伝子の活性化を増進する。クラステリンは、ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を上方制御し、これが細胞生存、細胞増殖および細胞成長をもたらす。クストリセン誘導性クラステリンノックダウンは、ＡＫＴのリン酸化を抑制し、メガリン発現を抑制することによって細胞表面からのアンドロゲン輸送を減衰させる。ＡＲ１は、ＡＲと強固に結合し、ＡＲの核への移行を阻害する。いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、これらの結果によれば、ＡＲのプロテアソーム分解を加速し、ｍＴＯＲシグナル伝達経路を下方制御することになる。
【０１６０】
例２０．  クラステリンノックダウンとＡＲ１処理との併用は、殆どの場合、Ｃ４−２細胞において細胞成長の阻害およびアポトーシスを増進するが、ＡＲ陰性ＰＣ−３細胞においては併用効果がない。
【０１６１】
併用処理によって、Ｃ４−２細胞成長を評価する。Ｃ４−２細胞を、１２ウェル培養プレート中の５％ＦＢＳまたは５％ＣＳＳを含有するＲＰＭＩ培地にウェル当たり３ｘ１０4個の細胞を播種する。翌日、細胞に、１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照をトランスフェクトする。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした翌日、Ｃ４−２細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、０、１、２、３、４日目にクリスタルバイオレットアッセイによって細胞成長アッセイを実施した。（ＡＲ１で処理した日を１００％と規定した）。ＣＬＵノックダウンとＡＲ１の併用処理が、最も有意に細胞成長を抑制する。併用処理によって、ＰＣ−３細胞成長を評価する。ＰＣ−３細胞を、１２ウェル培養プレート中の５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地にウェル当たり３ｘ１０4個の細胞を播種する。翌日、細胞に、１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照を、同時にまた毎日、５００ｎｍｏｌ／ＬのクストリセンまたはＳＣＲＢ対照を２日間トランスフェクトする。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴでトランスフェクトした翌日、ＰＣ−３細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、０、１、２、３日目にクリスタルバイオレットアッセイによって細胞成長アッセイを実施する。（ＡＲ１で処理した日を１００％と規定した）。フローサイトメトリ分析では、併用処理はＬＮＣａＰアポトーシスを増進する。細胞を、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地中で、１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照で、同時にまた毎日、５００ｎｍｏｌ／ＬのクストリセンまたはＳＣＲＢ対照で２日間処理する。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴでトランスフェクトした翌日、ＬＮＣａＰ細胞を、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、処理の４８時間後に、ＦＡＣＳ分析を実施した。ｓｕｂ−Ｇ０、Ｇ０−Ｇ１、Ｓ、Ｇ２−Ｍ期にある細胞の比率を、ヨウ化プロピジウム染色によって決定した。併用処理は、ＬＮＣａＰ細胞においてＳｕｂ−Ｇ０／１アポトーシス画分のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を増加させる。１Ｃａ：ＣＬＵ  ｓｉＲＮＡと併用、１Ｃｂ：クストリセンと併用。
【０１６２】
例２１．  クラステリンおよびＡＲ  ｍＲＮＡの発現は、ＡＲ１処理後に時間および用量依存的様式で上方制御される
ＬＮＣａＰ細胞を、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、異なる時間および異なる濃度のＡＲ１で処理する。ＡＲ１は、様々な濃度および曝露時間で処理される。細胞を回収し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを分析する。ＡＲおよびＣＬＵレベルを、β−アクチンｍＲＮＡレベルに対して標準化し、平均±ＳＤとして表示する。ＡＲ１曝露時間０時間および用量０μｍｏｌ／Ｌを、１００％と規定した。＊Ｐ＜０．０５  ＊＊Ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１（ウィルコクソンの符号付順位和検定）。
【０１６３】
アンドロゲン枯渇した細胞とアンドロゲン刺激した細胞の両方において、ＣＬＵノックダウンとＡＲ１との併用後にＡＲタンパク質の発現は低下する。５％ＣＳＳ含有ＲＰＭＩ培地中に１ｎｍｏｌ／ＬのＲ１８８１の有り無しで、ＬＮＣａＰ細胞に１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照をトランスフェクトする。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした翌日、ＬＮＣａＰ細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理する。４８時間後、タンパク質用として細胞を回収する。ウェスタンブロットによって、タンパク質発現を分析する。ＣＬＵノックダウンとＡＲ１処理との併用は、ＣＬＵノックダウン単独またはＡＲ１単独療法より高い有効性でＡＲ発現を低下させる。
【０１６４】
考察
前立腺癌において、アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、去勢後も去勢抵抗性進行を推進し続ける。新しいＡＲ経路阻害剤、たとえばＡＲ１は、ＣＲＰＣにおける生存を延長する一方、抵抗性は速やかに生じ、しばしばＡＲシグナル伝達の再活性化および細胞保護性シャペロン（クラステリン（ＣＬＵ））の誘導を伴う。治療によって活性化されるストレス適応経路は、獲得した治療抵抗性の発症を促進できるので、ＡＲ阻害によって活性化され、ＣＬＵによって媒介されるストレス応答を共標的化することによって、条件致死性を生じ、結果を改善する可能性がある。本明細書のデータは、ＡＲ１とクストリセンを併用することによってＡＲとストレス誘導性ＣＬＵを共標的化し、去勢抵抗性ＬＮＣａＰモデルを使用して併用活性の機序を明らかにしたことを示している。
【０１６５】
ＡＲ１は、ＥＲストレスマーカーおよびＣＬＵならびにＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナロソームを含めたシャペロンタンパク質のマーカーを誘導した。このストレス応答は、ｐ−ＹＢ−１、ｐ９０ｒｓｋおよびＣＬＵを含むフィードフォワードループによって協調された。ＡＲ１を加えたＣＬＵノックダウンの併用は、ＡＲ１またはクストリセン単独療法で見られる速度を超えてアポトーシスの速度を増進することにより、ＬＮＣａＰ細胞の成長速度を抑制した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、併用したクストリセン＋ＡＲ１は、去勢抵抗性ＬＮＣａＰ腫瘍の進行およびＰＳＡの進行を有意に遅延させた。機構的に、ＡＲ１誘導性のＡＫＴおよびＭＡＰＫ経路のＡＲクロストークの活性化は、併用療法で抑制された。興味深いことに、ＡＲ１と併用したとき、ＨＳＦ−１およびＹＢ−１に調節されたＡＲコシャペロンＦＫＢＰ５２の発現を含む機序によって、ＣＬＵノックダウンはＡＲ分解を加速させ、ＡＲ転写活性を抑制した。
【０１６６】
ＡＲ経路阻害剤によって活性化され、ＣＬＵによって媒介されるストレス適応性経路を共標的化することによって条件致死性が生じ、生物学的に合理的な組合せ臨床試験設計を導くための、機構的で前臨床的な原理証明が得られる。
【０１６７】
前立腺癌は、最も一般的な固形悪性腫瘍であり、西欧諸国男性に共通する癌死亡の２番目の主要因である（Ｓｉｅｇｅｌら、２０１１）。疾患の初期の段階は、治療的外科手術または放射線療法で治療されるが、局所進行性、再発性または転移性前立腺癌に対する治療の中心はアンドロゲン除去療法であり、この療法は血清テストステロンを去勢レベルに低下させ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を抑制する。アンドロゲン除去後の速い初期応答速度にも関わらず、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）への進行は、３年以内に起こる（Ｇｌｅａｖｅら、２００１；Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙら、２０００；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９９９；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９９６；Ｇｌｅａｖｅら、１９９８；Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙら、２００６）。８０％以上のＣＲＰＣ標本がＡＲおよびアンドロゲン応答性遺伝子を発現していることは（Ｃｈｅｎら、２００４）、去勢したにもかかわらず、ＡＲ軸が活性化状態を維持していることを示している。したがって、ＡＲはＣＲＰＣの重要な駆動力であり、治療活性化型成長因子シグナル伝達経路（Ｍｉｙａｋｅら、２０００）、生存遺伝子（Ｍｉｙａｋｅら、１９９９）および細胞保護性シャペロンネットワーク（Ｒｏｃｃｈｉら、２００４）によって支持されている。ドセタキセル化学療法（Ｐｅｔｒｙｌａｋら、２００４）はＣＲＰＣにおける生存を引き延ばすための最初の療法であり、化学療法前後の段階に治療の展望を重層化した。最近では、２つの新しいＡＲ経路阻害剤である、ＣＹＰ１７阻害剤アビラテロン（ｄｅ  Ｂｏｎｏら、２０１１）およびＡＲアンタゴニストＡＲ１（Ｔｒａｎら、２００９）が有望な延命をもたらし、ＣＲＰＣの展望を急速に変えている。有意な応答にもかかわらず（Ｔｒａｎら、２００９；Ｈａｒｒｉｓら、２００９；Ｓｃｈｅｒら、２０１０）、アビラテロンおよびＡＲ１は、治療抵抗性および再発性ＣＲＰＣの進行を適応的に推進する冗長生存経路を活性化する。これら新規なＡＲ経路阻害剤の可能性を最大限に実現するには、これらのストレス活性化型生存応答の特徴づけ、およびそれらを排除するように設計された合理的な組合せ共標的化戦略が必要になる。
【０１６８】
分子シャペロンは、タンパク質ホメオスタシスを維持することによってストレス応答における中心的役割を果たし、シグナル伝達および転写調節ネットワークにおいて大きな役割を果たす。クラステリン（ＣＬＵ）は、「テストステロン抑制前立腺メッセージ２」（ＴＲＰＭ−２）（Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔら、１９８６）として、去勢後退行しているラット前立腺から最初にクローニングされたストレス活性化型シャペロンであるが、その後、アンドロゲン抑制遺伝子ではなくストレス活性化型アポトーシス関連遺伝子と規定された（Ｃｏｃｈｒａｎｅら、２００７）。ＣＬＵは、ＨＳＦ１（Ｌａｍｏｕｒｅｕｘら、２０１１）およびＹＢ−１（Ｓｈｉｏｔａら、２０１１）によって転写調節されており、タンパク質凝集、（Ｐｏｏｎら、２００２）、ｐ５３活性化ストレスシグナル（Ｔｒｏｕｇａｋｏｓら、２００９）、および高次構造が変化したＢａｘ（Ｚｈａｎｇら、２００５；Ｔｒｏｕｇａｋｏｓら、２００９）を抑制することによってストレス誘導性アポトーシスを阻害し、一方でＡｋｔのリン酸化（Ａｍｍａｒら、２００８）ならびにＮＦ−κＢおよびＨＳＦ−１のトランス活性化（Ｌａｍｏｕｒｅｕｘら、２０１１；Ｓｈｉｏｔａら、２０１１；Ｐｏｏｎら、２００２；Ｔｒｏｕｇａｋｏｓら、２００９；Ｚｈａｎｇら、２００５；Ａｍｍａｒら、２００８；Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２０１０ａ）を増進する。ＣＬＵは、前立腺を含めた多くのヒト癌において発現され（Ｙｏｍら、２００９；Ｋｒｕｇｅｒら、２００７；Ｚｈａｎｇら、２００６）、前立腺では去勢後に増加し、ＣＲＰＣにおいて高発現するようになる（Ｊｕｌｙら、２００２）。ＣＬＵ過剰発現は、治療抵抗性を付与し（Ｍｉｙａｋｅら、２０００）、一方ＣＬＵ阻害は、多くの臨床前モデルにおいて大部分の抗癌療法の活性を増強する（Ｍｉｙａｋｅら、２００５；Ｓｏｗｅｒｙら、２００８；Ｇｌｅａｖｅら、２００５；Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２０１０ｂ）。ドセタキセル化学療法と併用したとき、全生存が７カ月増加し、死亡率が５０％低下した（ＨＲ＝０．５０）と報告されたＣＲＰＣにおけるランダム化第２相試験の後、ＣＬＵ阻害剤であるＯＧＸ−０１１（クストリセン、ＯｎｃｏＧｅｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、現在第３相臨床試験にある（Ｃｈｉら、２０１０）。
【０１６９】
ＣＬＵは、去勢を含めた治療ストレスによって誘導され、ストレス応答の重要な媒介物質として機能するので、ＡＲ１治療がストレス応答およびＣＬＵを誘導するという本明細書の仮説、ならびにＡＲと、ＣＬＵによって媒介されるストレス応答経路とを共標的化することによって条件致死性が生じ、癌管理を改善できるという仮説が試験された。本明細書に記載のデータは、ＡＲ１治療ストレスとＣＬＵ誘導を伴う抵抗性とを相関させ、ＣＬＵの活性化を調節している経路を同定し、ＣＲＰＣにおいてＣＬＵ阻害が抗ＡＲ療法を増強する機序を明らかにすることを目指す。
【０１７０】
癌細胞を殺すために使用される多くの戦略は、生存および治療抵抗性の出現を助長するストレス性および冗長性生存応答を誘導し、それが大部分の癌死亡の根本原理である。この治療的抵抗性は、治療の選択圧によって活性化される自然および獲得生存経路のダーウィン相互作用に起因する。前立腺癌において、アンドロゲン除去は、大部分の患者において腫瘍細胞のアポトーシスおよび臨床応答を誘導するが、２〜３年以内に去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）への変化も引き起こす（Ｇｌｅａｖｅら、２００１；Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙら、２０００；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９９９；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９９６；Ｇｌｅａｖｅら、１９９８）。実験的に、ＣＲＰＣ進行は、ＡＲ軸の再活性化に起因しており（Ｍｉｙａｋｅら、２０００；Ｍｉｙａｋｅら、１９９９）増殖因子（Ｍｉｙａｋｅら、２０００；Ｃｕｌｉｇら、２００４；Ｃｒａｆｔら、１９９９）および生存遺伝子（Ｍｉｙａｋｅら、１９９９；Ｇｌｅａｖｅら、１９９９；Ｍｉａｙａｋｅら、２０００；Ｒｏｃｃｈｉら、２００４；Ｍｉｙａｋｅら、２０００）のネットワークによって支持されている。最近、新しいＡＲ経路阻害剤、たとえばアビラテロンおよびＡＲ１（Ｒｏｃｃｈｉら、２００４）が、生存を引き延ばすことが示され、ＡＲをＣＲＰＣの主要な駆動力であると臨床的に実証した（Ｍｉｙａｋｅら、２０００；Ｍｉｙａｋｅら、１９９９）。すべての患者がこれらの阻害剤に応答するとは限らず、多くの初期応答者において抵抗性が発症し（Ｐｅｔｒｙｌａｋら、２００４）；さらに、疾患進行頻度はＰＳＡレベルの上昇と相関しているので、継続的なＡＲシグナル伝達を示しており、ＣＲＰＣにおける治療抵抗性の分子基盤を標的にする新たな療法の必要性を強調している。ＡＲと冗長生存経路との相互作用を明らかにすることによって変化を管理し、予後を改善する新しい組合せ戦略を構築できるようになる。
【０１７１】
ＡＲの増幅ならびに低レベルのＤＨＴおよび他のステロイドに対する感受性を高める変異（Ｍｉｙａｋｅら、２０００；Ｍｉｙａｋｅら、１９９９；Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２００７）、または構成的に活性があり、ＬＢＤを欠いている不完全な受容体を駆動するＡＲスプライスバリアント（Ｎｉｚａｒｄら、２００７；Ｃａｒｖｅｒら、２０１１；Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖａら、２００６）によって、ＣＲＰＣにおける持続的なＡＲシグナル伝達が起こると仮定される。他のＡＲ関連機序としては、ＡＲ活性化補助因子もしくはコシャペロン（ｈｓｐ２７）のレベル変化、活性型ｓｒｃによるＡＲのリン酸化またはチロシンキナーゼ受容体（たとえばＥＧＦＲ）がある（Ｃｈｉら、２０１０）。より動的な別の機序は、ＡＲとＰＩ３Ｋ経路間の相互的なフィードバック調節を含み、その際、ＡＫＴホスファターゼＰＨＬＰＰのレベルを低下させることによってＡＲ阻害はＡＫＴシグナル伝達を活性化し、ＨＥＲキナーゼのフィードバック阻害を軽減することによってＰＩ３Ｋ阻害はＡＲシグナル伝達を活性化し；一方の阻害が他方を活性化し、それによって生存を増進する。これらの機構的見識は、ヒストン脱アセチル化酵素（ｄｅ  Ｂｏｎｏら、２０１１）、ｓｒｃ、ＡＫＴ、ならびにＡＲシャペロン熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）−９０およびＨｓｐ２７に対する阻害剤を用いて、ＡＲ経路を共標的化する組合せ治療レジメンの設計の指針になっている。
【０１７２】
ＡＲ経路阻害剤によって活性化されるストレス応答の阻害は、別の組合せ共標的化戦略である。多くの抗癌薬は、ＥＲストレスを誘導し（Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉら、２００７）、このストレスは複雑な細胞内シグナル伝達経路を活性化する。この経路は小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）と呼ばれ、タンパク質翻訳を阻害しユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）を刺激してＥＲ関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）を増進することによってタンパク質ホメオスタシスを回復するように調整されている（Ｈａｒｄｉｎｇら、２００２）。シャペロン、たとえばＣＬＵは、ＥＲストレス応答の重要な媒介物質である。ＡＲ経路阻害が、ＡＫＴの相互的な経路活性化と共にＥＲストレスおよびＣＬＵを誘導することは公知であり、そのすべてが去勢抵抗性に関わる。これら従来の報告と整合して、本明細書のデータは、ＡＲ１がＥＲストレスおよびＵＰＲを誘導することを示し、続いて増進されたＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達と並行して、ストレス誘導性ＹＢ−１活性からＣＬＵ活性化の間のフィードフォワードリンクを明確にしている。総合すると、これは、ＡＲ１治療条件下でＡＲの安定性および活性を支持している。ＹＢ−１とＣＬＵは両方とも、抗癌治療抵抗性と機能的に関連するストレス活性化型の生存シャペロンタンパク質である（Ｐｏｏｎら、２００２）（Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２００７）。ストレス条件下で、ＹＢ−１は、ＡＫＴ（Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖａら、２００６）およびｐ９０ＲＳＫ（Ｇｌｅａｖｅら、２００５）によってリン酸化活性化され、その核移行を刺激し、標的プロモーターと結合する。ＣＬＵは、ストレス誘導性ＹＢ−１活性およびパクリタキセル抵抗性の重要な下流媒介物質によって転写され、それとして機能を果たす（Ｓｈｉｏｔａ）。ＹＢ−１は、特定のストレス関連転写産物の翻訳を調節するｍＲＮＡシャペロンタンパク質として機能することもできる（Ｌａｗら、２０１０；Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖａら、２００９）。異なるプラットフォーム技術を用いたマイクロアレイにハイブリダイズしたＹＢ１  ＲＮＡ−ＩＰを使用して、ＹＢ１が、ＣＬＵ  ｍＲＮＡに結合することが判明した。本明細書に開示したデータは、ＹＢ１が、ＡＲ１誘導性ＥＲストレスの後にＣＬＵ  ｍＲＮＡに優先的に結合することを示しており、異なるポリソーム画分においてＹＢ１がＣＬＵ  ｍＲＮＡと結合することが判明した。ポリソーム画分は、リボソームまたは翻訳機構の他の要素に結合された翻訳活性があるｍＲＮＡを表し、ポリソーム後のｍＲＮＡはリボソームを使い果たし、したがって翻訳的に不活性なので（Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖａら、２００９；Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖａら、２００６ａ）、これらの画分からＣＬＵ  ｍＲＮＡを増幅できる。これらのデータは、ＹＢ−１が、ＡＲ１誘導性ＥＲストレスに応じてＣＬＵの転写だけでなく翻訳誘導も媒介することを示す。
【０１７３】
ＣＬＵは、治療抵抗性および癌の進行と密接に連関したストレス活性化型分子シャペロンであり（Ｍｉｙａｋｅら、２０００；ＧｌｅａｖｅおよびＭｉｙａｋｅ、２００５；ＴｒｏｕｇａｋｏｓおよびＧｏｎｏｓ、２００９ｂ）、その過剰発現は、広域スペクトル治療抵抗性を付与する（Ｔｒａｎら、２００９；Ｙｏｍら、２００９）。去勢および他の治療ストレス要因と同様に、ＡＲ１は、ＣＬＵ発現レベルを増加させ；さらに、ＣＲＰＣにおいて未去勢癌と比較したように、ＣＬＵレベルはＡＲ１抵抗性腫瘍において高い。ＣＬＵは、ＨＳＦ−１によって転写調節されるだけでなく、フィードフォワード様式で、ＨＳＦ−１媒介転写活性も増進する（Ｌａｍｏｕｒｅａｘら、２０１１）。ＣＬＵは、ＡＲを含めた生存促進経路、ならびにＩＬ−６（ＪＡＫ／ｓｔａｔを介する）およびＩＧＦ−１Ｒ（Ｓｒｃ−ＭＥＫ−ＥＲＫ−Ｅｒｇ−１を介する）シグナル伝達経路の下流によっても活性化される。ＣＬＵは、タンパク質凝集、ｐ５３活性化ストレスシグナルおよび高次構造が変化したＢａｘを阻害することによって、ストレス誘導性アポトーシスを抑制し（Ｚｈａｎｇら、２００５；Ｔｒｏｕｇａｋｏｓら、２００９）一方でＡｋｔのリン酸化（Ｓｏｗｅｒｙら、２００８；Ｃｈｏｕら、１９８４）ならびにＮＦ−κＢおよびＨＳＦ−１のトランス活性化を増進する。
【０１７４】
ＣＬＵに対するこのストレス活性化型抗アポトーシス機能は、多くの抗癌療法に対して広域スペクトル抵抗性をもたらし、潜在的な抗癌標的としてこれを同定する。多くの癌前臨床モデルにおいて、ＣＬＵアンチセンス阻害剤（クストリセン）は、治療的ストレス要因との併用で癌細胞死を増進する。実際、クストリセンをドセタキセルに添加したときに、有意な延命効果が報告されたランダム化第２相試験の後、クストリセンを加えたドセタキセル併用第３相臨床試験がＣＲＰＣにおいて進行中である（Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２０１０ｂ；Ｃｕｌｉｇら、２００４）。ＣＬＵ阻害は、アンドロゲン依存的異種移植片において去勢を増進し、ＣＲＰＣへの時間を遅延させることが報告されてきたが、ＣＲＰＣモデルにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ治療応答において、純粋なＡＲアンタゴニストであるＡＲ１によって、ＡＲ経路阻害およびＣＬＵの効果の検査が直ちに可能になる。本明細書に開示したデータは、ＡＲ１感受性および抵抗性ＬＮＣａＰ細胞において、ＣＬＵがそれぞれＡＲ１およびＡＲノックダウンの後に誘導され、大部分のＡＲ１抵抗性ＬＮＣａＰ異種移植片および細胞系において、ＣＬＵが高発現状態を維持することを立証した。クストリセンを加えたＡＲ１を使用するＡＲとＣＬＵの共標的化は、単独療法を超えてアポトーシス速度を増進した。機構的に、ＡＲ１誘導性の、ＡＫＴおよびＭＡＰＫ経路のクロストークの活性化は併用療法で抑制された。予想外にも、ＡＲ１をＣＬＵノックダウンと併用したとき、ＡＲのユビキチン化およびプロテアソーム媒介性分解の速度が加速されることが判明した。ＡＲ１単独ではＡＲ安定性を変化させないが、ＣＬＵが阻害されるとき、ＹＢ−１およびＭＡＰＫのストレス活性化は鈍化し、ＹＢ−１に活性化される、ＡＲコシャペロンＨｓｐ５６（ＦＫＢＰ５２）およびＨｓｐ９０の発現が低下し、これがＡＲのユビキチン化およびプロテアソーム分解をもたらすので、ＡＲ１抵抗性細胞系においてさえ、ＡＲ１単独療法で観察された以上にＡＲ転写活性が低下する。
【０１７５】
Ｈｓｐ９０阻害後にＨｓｐ７０およびＨｓｐ２７のＨＳＦ−１媒介性トランス活性化を増進する能力と同様に、これらの結果は、状況依存的ストレス条件下でＣＬＵが他の分子シャペロンのＹＢ−１媒介性発現の支持に果たす役割を強調している（Ｌａｍｏｕｒｅａｘら、２０１１）。ＣＬＵに加えて、ＨＳＦ−１およびＹＢ−１は、ＡＲおよび他のステロイド受容体の折りたたみ、輸送ならびに転写活性化工程に関係する他の分子シャペロンの発現を統制する。リガンドが存在しないとき、ＡＲは主に細胞質内にあり不活性だが、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０からなる大きな動的ヘテロ複合体ならびにコシャペロン、たとえばＨｓｐ５６によって高応答性状態に維持されている。これらのＨｓｐ  ＡＲコシャペロンは、ＡＲの安定性および活性化に重要な役割を果たす（Ｃｈｅｕｎｇ−Ｆｌｙｎｎら、２００５；Ｙａｎｇら、２００６）。リガンド結合により、ＡＲに立体構造変化が起こり、巨大Ｈｓｐ複合体から解離して、Ｈｓｐ２７と結合し、それによって核輸送および標的遺伝子の転写活性化がもたらされる（Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２００６；Ａｂｄｕｌら、２００１）。第１の世代ＡＲアンタゴニストであるビカルタミド（これはＡＲの核輸送を阻害しない）と比較して、ＡＲ１に結合したＡＲは細胞質内に残り、ＨｓｐシャペロンであるＨｓｐ９０およびＦＫＢＰ５２と複合体形成することが示される。Ｈｓｐコシャペロンと複合したＡＲのこの細胞質内での限局は、ＥＲストレスおよびシャペロン抑制の条件下で、分解に対する感受性を高めることができる。
【０１７６】
いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、本明細書のデータは、ＡＲ経路阻害の後に活性化されるＭＡＰＫおよびＡｋｔシグナル伝達経路の抑制を通して、ＣＬＵ阻害が抗ＡＲ療法を増強する別の機序を同定する。本明細書のデータは、ＡＲ１がＡｋｔリン酸化を誘導するというこれまでの報告を確認し、ＭＡＰＫおよびｐ９０ｒｓｋがＡＲ１によって活性化されて、ＹＢ−１のリン酸化を媒介することも示している。本明細書の結果は、ＣＬＵノックダウンとＡＲ１との併用が、Ａｋｔとｐ９０ｒｓｋ両方の活性化を抑制することを実証している。
【０１７７】
いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、本明細書のデータは、ＣＬＵが、生存促進性ＡＫＴおよびｐ９０ｒｓｋシグナル伝達、ＹＢ−１のリン酸化活性化、ならびにＡＲ１治療条件下でＡＲを安定化するＡＲコシャペロンの発現を促進する状態で、ＣＬＵのＡＲ１誘導性ＹＢ−１トランス活性化を含むストレス誘導性フィードフォワードループを明らかにする。ＡＲ経路阻害剤によって活性化され、ＣＬＵを通じて媒介されるストレス適応性経路を共標的化することによって、ＡＲの発現レベルおよび活性、ならびにＡＲ１に誘導されるＡｋｔおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を低下させることにより、抗ＡＲ活性が増強される。これらの結果から、ＡＲ１とクストリセンとの組合せ臨床試験を支持する機構的で前臨床的な原理証明が得られる。
【０１７８】
本発明の局面は、クラステリン発現を標的にするオリゴヌクレオチド、たとえばクストリセンを、併用剤としてＡＲアンタゴニストと合わせるとき、前立腺癌治療用のいずれかの薬剤の単独療法よりも強力であるという予想外の発見に関する。この有効性の増加は、癌細胞死の増加に加えて、癌細胞の増殖低下、細胞質から核へのＡＲの移行の減少、ＡＲの転写活性の低下、ＰＡＲＰ切断の増加、ＡＫＴリン酸化の低下、ＥＲＫリン酸化の低下、およびＡＲタンパク質分解の増加を含む。図３０は、ＡＲ１抵抗性前立腺癌腫瘍が、クラステリン発現を増加させたことを示す。いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、本明細書のデータは、ＡＲ１に対するこれら腫瘍の抵抗性がクラステリン発現の増加による可能性があり、したがって、クラステリン発現の低下がＡＲ１治療に対するＡＲ１抵抗性腫瘍の感受性を高めることを反映している可能性がある。したがって、ＡＲ１抵抗性前立腺癌細胞は、クストリセンとの併用治療によってＡＲ１に感作される。
【０１７９】
ＡＲ１は、前立腺癌細胞において自己消化を誘導し（図３８）、クラステリンサイレンシングは、ＥＲストレス誘導性自己消化を阻害することができる。自己消化は、ストレス耐性を付与し、有害条件下でも細胞生存率を持続することを可能にする細胞内消化のためのよく保存されたリソソーム分解経路である。いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、ＡＲ１治療後に続く自己消化の増大は前立腺癌細胞の生存を増進することができ、クラステリン発現の阻害はこの自己消化の増大を阻害し、それによって、癌細胞生存の低下およびＡＲ１活性の増進がもたらされ得る。
【０１８０】
いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、クラステリン発現の低下は、ＡＲコシャペロン（たとえばＦＫＢＰ５２およびＨｓｐ２７）のＨＳＦ−１媒介性調節の抑制を介してＡＲ安定性を低下させることにより、ＡＲ１の活性を増進することができる。
【０１８１】
いかなる科学理論に束縛されるものでもないが、クラステリン発現の低下は、ＡＲ１治療の後に続くＡＫＴレベルおよび／またはリン酸化の誘導を低下させることにより、ＡＲ１の活性を増進することができる。
【０１８２】
ＡＲ１単独療法は、ヒト去勢抵抗性前立腺癌を治療することができる；しかし、どのモデル系においても、アンドロゲン非依存に進行した後では、クストリセン単独療法が前立腺癌の進行を阻害することは示されなかった。したがって、ＡＲ１とクストリセンの併用治療が、ＡＲ１単独での治療より強力になったことは意外である。さらに、ＡＲ１とクストリセンの併用療法は驚くほど強力であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前立腺癌細胞の成長を停止できるが、いずれかの薬剤を単独で投与した細胞は、４日間に２００％以上増殖する（図２Ｂ）。また驚くべきことに、クストリセンとＡＲ１の併用は、ＡＲタンパク質の発現を８０％以上低下させることができるが、クストリセン単独では効果が無く、ＡＲ１単独ではわずか約４０％しか発現を低下させない（図１７）。最終的に、クストリセンとＡＲ１の併用は、去勢抵抗性前立腺癌に罹病し治療されたマウスの生存を、ＡＲ１単独の約４０％と比較して、治療開始から１６週間で約９０％に高める。
【０１８３】
加えて、哺乳動物における腫瘍成長を低下させるには、ビカルタミドとクストリセンの併用より、ＡＲ１とクストリセンの併用が有効である。哺乳動物における腫瘍成長を低下させるには、フルタミドとクストリセンの併用より、ＡＲ１とクストリセンの併用が有効である。癌細胞増殖を低下させるには、ビカルタミドとクストリセンの併用より、ＡＲ１とクストリセンの併用が有効である。癌細胞増殖を低下させるには、フルタミドとクストリセンの併用より、ＡＲ１とクストリセンの併用が有効である。癌細胞のアポトーシスを増大させるには、ビカルタミドとクストリセンの併用より、ＡＲ１とクストリセンの併用が有効である。癌細胞のアポトーシスを増大させるには、フルタミドとクストリセンの併用より、ＡＲ１とクストリセンの併用が有効である。
【０１８４】
抗腫瘍効力の増大に加えて、併用療法は、毒性を減らすための用量減少戦略を可能にする場合もある。たとえば、ＡＲ１は、副作用（たとえば疲労）を誘導することが公知であり、２４０ｍｇ／日の最大耐量が有る（Ｓｃｈｅｒら、２０１０）。しかし、本発明は、マウスにおいてクストリセンとの併用で１０ｍｇ／ｋｇ／日という少ないＡＲ１用量が、腫瘍サイズを減少させ生存を引き伸ばすのに有効であることを開示する。ＮＩＨは、マウス試験において使用した用量をヒトでの使用に適当な用量に変換する指針を、Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓに基づいて提供している（ＮＩＨ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ、２００７年８月掲載；Ｆｒｅｉｄｒｅｉｃｈら、１９６６）。ＮＩＨ変換率表によれば、本明細書に記載のマウスで使用する１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量は、６０ｋｇのヒトなら．８３ｍｇ／ｋｇ／日に相当し、６０ｋｇのヒトに対しては約４９．８ｍｇ／日、または１００ｋｇのヒトに対しては約８３ｍｇ／日の用量に等しい。これらの用量は、ヒトにおける第３相臨床試験に推奨される２４０ｍｇ／ｋｇの用量よりかなり低い（Ｓｃｈｅｒら、２００９）。したがって、本発明の一局面は、抗クラステリンオリゴヌクレオチドと前立腺癌を治療するのに有効なＡＲアンタゴニストとの併用を提供し、この併用におけるＡＲアンタゴニストの量は、単独療法において使用される有効量より少ない。クラステリンレベルを低下させるオリゴヌクレオチドとＡＲアンタゴニストを含む併用療法の驚くべき効力を使用して、ヒトにおいて一方または両方の薬剤の用量を低減することができ、より少ない副作用での治療的利益を可能にする。
【０１８５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月5日(2013.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】１μＭのＡＲ１およびクラステリン（ＣＬＵ）を標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳＣＲを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞増殖の抑制を示す図。ＳＣＲは、スクランブル配列ｓｉＲＮＡ対照である。（Ａ）、ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。（Ｂ）、ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図２】１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞増殖の抑制を示す図。ＳＣＲＢは、スクランブル配列アンチセンスオリゴヌクレオチド対照である。（Ａ）、ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。（Ｂ）、ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図３】１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＣ４−２細胞増殖の抑制を示す図。（Ａ）、ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。（Ｂ）、ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図４】１μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳＣＲを用いた処理によるＰＣ−３（ＡＲ陰性）細胞増殖を示す図（Ａ）。１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＰＣ−３（ＡＲ陰性）細胞増殖を示す図（Ｂ）。
【図５】ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳＣＲを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞における細胞毒性を示す図（Ａ）。１μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンまたは５００ｎＭのＳＣＲＢを用いた処理によるＬＮＣａＰ細胞における細胞毒性を示す図（Ｂ）。細胞は、ＦＢＳを添加した培地中で成長した。Ｘ軸は、ＡＲ１濃度である。
【図６】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ１およびクスチルセン併用療法の有効性を示す図。（Ａ）、クリスタルバイオレットアッセイによる各薬物または併用療法の後の細胞成長阻害を示す図。Ｘ軸は、［ＡＲ１／クスチルセン］である。Ｐ値はフリードマン検定により算出した。（Ｂ）、各療法の用量効果曲線を示す図。（Ｃ）、いくつかの有効量における併用指数（ＣＩ）を示す図。ＣＩ＝１、相加効果；ＣＩ＜１、併用効果；ＣＩ＜１、拮抗効果。
【図７】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ１、クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡ、またはそれらの併用の投与後の細胞周期分布を示す図。ＯＴＲは、クスチルセンまたはｓｉＲＮＡの非存在下において、オリゴフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で処理した細胞を意味する。
【図８】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ１、クスチルセン、またはそれらの併用の投与後の細胞周期分布のＦＡＣＳ解析を示す図。
【図９】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲおよびクラステリンタンパク質発現に対するＡＲ１投与の効果を示す図。（Ａ）、１０μＭ  ＡＲ１。（Ｂ）、表示濃度でのＡＲ１投与の４８時間後。
【図１０−１】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化およびタンパク質レベルに対するＡＲ１処理の効果を示す図。（Ａ）、１０μＭ  ＡＲ１。（Ｂ）、表示濃度でのＡＲ１投与の４８時間後。（Ｃ）、ＡＲ１による処理後のＡＫＴまたはＥＲＫの発現レベルの用量依存的変化を示す図。（Ｄ）、ＡＲ１による処理後のＡＫＴまたはＥＲＫの発現レベルの用量依存的変化を示す図。
【図１０−２】（続葉）
【図１１】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲおよびクラステリンｍＲＮＡ発現に対するＡＲ１処理の効果を示す図。（Ａ）、各濃度のＡＲ１の添加の４８時間後のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を示す図。（Ｂ）、１０μＭ  ＡＲ１の添加後の表示時点におけるＡＲ  ｍＲＮＡ発現を示す図。（Ｃ）、各濃度のＡＲ１の添加の４８時間後のクラステリンｍＲＮＡ発現を示す図。（Ｄ）、１０μＭ  ＡＲ１の添加後の表示時点におけるクラステリンｍＲＮＡ発現を示す図。
【図１２−１】クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡ、クスチルセンまたは表示対照の処理後のＬＮＣａＰ細胞におけるタンパク質発現の変化を示す図（ＡおよびＣ）。（Ｂ）、ビカルタミドおよびＡＲ１によるクラステリン上方制御の比較を示す図。（Ｄ）、ＡＲ１およびクスチルセン（ＡＳＯ）を用いた処理によるＡＲコシャペロンの発現を示す図。
【図１２−２】（続葉）
【図１２−３】（続葉）
【図１２−４】（続葉）
【図１３】ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＳＡ（Ａ）またはＡＲ  ｍＲＮＡ発現（Ｂ）に対する１０μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡの効果を示す図。
【図１４】ＡＲ（Ａ）またはＰＳＡ  ｍＲＮＡ発現（Ｂ）に対する１０μＭのＡＲ１および５００ｎＭのクスチルセンの併用療法の効果を示す図。
【図１５】ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡによるＬＮＣａＰ細胞の処理後のタンパク質発現およびＰＡＲＰ切断のウェスタンブロット分析を示す図。ＦＢＳ条件は、ＦＢＳを添加した培地である。ＣＳＳ条件は、活性炭血清ストリップ培地である。
【図１６】ＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲン刺激時のタンパク質レベルに対する、ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０μＭのｓｉＲＮＡの効果を示す図。Ｒ１８８１は、メトリボロンとしても公知である強力なアンドロゲンである。
【図１７】ＡＲ１およびクスチルセンまたは対照によるＬＮＣａＰ細胞の処理によるタンパク質発現およびＰＡＲＰ切断のウェスタンブロット分析を示す図。細胞（１Ｘ１０6）は、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を含む１０ｃｍ皿に播種した。翌日、細胞に５００ｎＭクスチルセンまたは対照を４８時間にわたってトランスフェクトした。次いで、ウェスタンブロット分析のために採取する前に、１０μＭのＡＲ１を細胞に４８時間にわたって加えた。ＡＲおよびＰＳＡ発現は、クスチルセンおよびＡＲ１併用療法により高度に抑制された。
【図１８】ＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは対照を用いたＬＮＣａＰ細胞の処理による、タンパク質発現およびリン酸化のウェスタンブロット分析を示す図。ホスホ−ＡＫＴおよびホスホ−ＥＲＫはＡＲ１の投与により活性化される。しかし、ＡＲ１およびＣｌｕ  ｓｉＲＮＡ併用療法は、リン酸化ＡＫＴおよびＥＲＫタンパク質のレベルを低下させる。併用療法は、単独療法より強力にＡＫＴ−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を抑制する。
【図１９】ＡＲ１およびクスチルセンまたはクラステリンを標的とするｓｉＲＮＡを併用して用いたＬＮＣａＰ細胞の処理によるＡＲプロテアソーム分解のウェスタンブロット分析を示す図。ＭＧ１３２は、プロテアソーム阻害剤であり、ＣＨＸは、タンパク質生合成の阻害剤であるシクロヘキシミドである。ＡＲタンパク質の分解は、ＡＲ１およびクスチルセン併用療法により強力に増加する。
【図２０】ＡＲ転写活性に対するＡＲ１およびクスチルセン併用療法の影響を示す図。デュアルルシフェラーゼアッセイ：ＬＮＣａＰ細胞にＣＳＳ中５００ｎＭクスチルセンを２日間トランスフェクトした。次いで、分析のために採取する前に、Ｒ１８８１（１ｎＭ）の存在下または非存在下でＡＲ１（１μＭ）またはＤＭＳＯを２４時間にわたって加えた。
【図２１】単独療法と比較した、クラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡと１０μＭのＡＲ１との併用による、細胞質から核へのＡＲ転位の阻害の増大を示す図。ＬＮＣａＰ細胞を用いた。
【図２２】単独療法と比較した、クラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡと１０μＭのＡＲ１との併用による、細胞質から核へのＡＲ転位の阻害の増大を示す図。ＬＮＣａＰ細胞を用いた。
【図２３】単独療法と比較した、１０μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡの併用療法による、ＡＲとユビキチンとの結合の増大を示す図（Ａ）。ＭＧ１３２の存在下での１０μＭのＡＲ１およびクラステリンを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたは対照の併用療法による、ＡＲとユビキチンとの結合を示す図（Ｂ）。ＬＮＣａＰ細胞を用いた。
【図２４】ＬＮＣａＰ細胞における、クスチルセン（ＡＳＯ）または対照と併用したビカルタミドまたはＡＲ１の処理間のクラステリンノックダウンの比較を示す図。
【図２５】ＬＮＣａＰ細胞における、ＡＲ分解およびクラステリンノックダウンに対する（ＦＫＢＰ５２）過剰発現の影響を示す図。
【図２６】マウスにおけるＡＲ１およびクスチルセンの併用投与による、去勢抵抗性前立腺癌腫瘍成長の低下および生存率の増加を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図２７】マウスにおける、ＡＲ１およびクスチルセンの併用投与による生存率の増加を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図２８】マウスにおける、ＡＲ１およびクスチルセンの併用投与によるＰＳＡタンパク質発現の低下を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図２９】マウスにおける、ＡＲ１およびクスチルセンの併用投与によるＰＳＡタンパク質発現の低下を示す図。雄無胸腺ヌードマウスの２部位に、マトリゲル中ＬＮＣａＰ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が１５０ｍｍ3に達するか、またはＰＳＡレベルが５０ｎｇ／ｍＬ超まで増加した時点に、マウスを去勢した。腫瘍が去勢抵抗性に進行した（ＰＳＡレベルが去勢前と同じレベルに増加）ら、１０匹のマウスをＡＲ１＋スクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＣＲＢ）またはＡＲ１＋クスチルセンのそれぞれに、無作為に割り付けた。クスチルセン（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）またはＳＣＲＢ（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）を最初の週は１日１回、その後は週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡＲ１（１０ｍｇ／ｋｇ／各投与）は、８〜１２週間にわたり週７日、１日１回（朝）経口投与した。
【図３０】クラステリン発現が、ＡＲ１抵抗性腫瘍において誘導されることを示す図。（Ａ）ＡＲ１の投与後のクラステリン発現の増大を示す図。（Ｂ）ＡＲ１抵抗性腫瘍におけるＡＲ１の投与後のクラステリン発現の増大を示す図。（Ｃ）ウェスタンブロット分析により測定されたときに、ＡＲ１投与後にクラステリン発現が時間および用量依存的に上方制御されることを示す図。
【図３１】クスチルセンおよびＡＲ１の併用療法が、ＣＲＰＣ  ＬＮＣａＰ異種移植片においてクスチルセンまたはＡＲ１単独療法より有効であることを示す図。ＡＲ１＋クスチルセン療法がＣＲＰＣ異種移植片におけるＡＲおよびＰＳＡ発現を低下させた。
【図３２】クラステリンノックダウンがＡＲ転写活性およびＡＲ依存性遺伝子の発現を低下させることを示す図。貫膜プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ｍＲＮＡレベルは、ＡＲ１投与、クラステリンノックダウン、およびＡＲ１投与＋クラステリンノックダウンの後に低下した。
【図３３】クラステリンノックダウンが、ＡＲ１と併用したときＡＲタンパク質レベルを低下させることを示す図。熱ショックタンパク質２７（Ｈｓｐ２７）とＡＲとの可能な相互作用がＡＲ転写活性、ＰＳＡ発現および細胞の生存に寄与することが示されている。
【図３４】クラステリンノックダウンが、熱ショック因子タンパク質１（ＨＳＦ−１）転写活性および熱ショックタンパク質の発現を低下させることを示す図。
【図３５】クラステリン過剰発現が、ＨＳＦ−１活性を増大させることを示す図。
【図３６】腫瘍細胞における、ＡＲ１療法＋クスチルセン療法の可能な作用機序を示す図。
【図３７】クラステリンおよび自食作用が、ストレスおよび癌において役割を果たし得ることを示す図。小胞体（ＥＲ）ストレス、化学ストレスおよびアンドロゲン除去後のクラステリン発現の増大が示されている。
【図３８】ＡＲ１療法が、ＬＮＣａＰ細胞における自食作用を誘導することを示す図。
【図３９】治療ストレッサーが、アグリソーム中にＬＣ３Ｂと共局在するクラステリンを誘導することを示す図。
【図４０】ＥＲストレス誘導性自食作用が、クラステリンサイレンシングによって抑制されることを示す図。
【図４１−１】ＣＬＵがＡＲ１抵抗性細胞においてＡＲ１により誘導され、高度に発現することを示す図。Ｃ、ＣＬＵの用量および時間依存的誘導を示す図。Ｄ、ＣＬＵがＡＲノックダウンによってもＡＲ１抵抗性細胞において誘導されることを示す図。ＡＲ  ＡＳＯもいくつかのＡＲ１抵抗性ＭＲ４９Ｆ細胞においてＣＬＵを誘導する。ＣＬＵは、ＡＲ１抵抗性細胞、たとえば、ＭＲ４９Ｆにおいて高い。
【図４１−２】（続葉）
【図４１−３】（続葉）
【図４２−１】ストレス応答（ＥＲ、ＵＢ−１）ならびにｐＡＫＴとＭＡＰＫのクロストークの誘導を示す図。
【図４２−２】（続葉）
【図４２−３】（続葉）
【図４２−４】（続葉）
【図４３−１】ＣＬＵ阻害とＡＲ１の併用がＣＬＵ阻害またはＡＲ１単独療法と比較してＬＮＣａＰ細胞増殖の抑制を増大させることを示す図。
【図４３−２】（続葉）
【図４４】腫瘍体積および血清ＰＳＡレベルに対する併用療法の効果を示す図。
【図４５】ＡＲトランス活性化および転位に対する併用療法の効果を示す図。Ａ、ＡＲ１の投与と併用したクスチルセンが、クスチルセンまたはＡＲ１単独療法よりもＡＲトランス活性化を低下させることを示す図。ＬＮＣａＰ細胞に５００ｎｍｏｌ／ＬのクスチルセンまたはＳＣＲＢ対照を２日間、連日トランスフェクトし、２日目に１μｇのＰＳＡ−ルシフェラーゼおよびレニラ−ルシフェラーゼを一過性にコトランスフェクトした。翌日、細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１で処理し、次いで、１ｎｍｏｌ／ＬのＲ１８８１または媒体を２４時間にわたって加えた。細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性を測定した。カラムは、３連で行った少なくとも３回の独立した実験の平均を表す。ＰＳＡ活性化は、標準化されたレニラ−ルシフェラーゼ活性であった。Ｂ、併用療法によるＡＲ転位への効果を示す図。１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＬＵ  ｓｉＲＮＡまたはＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ対照によるトランスフェクションの２４時間後に、ＬＮＣａＰ細胞をＤＭＳＯ、１０μｍｏｌ／ＬのＡＲ１および１ｎｍｏｌ／ＬのＲ１８８１で３０分間処理し、抗ＡＲ抗体による免疫蛍光染色のためにメタノール／アセトン中で固定した。核をＤＡＰＩで染色した。ＡＲ１は、細胞質から核へのＡＲの転位を阻害した。ＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンは、ＡＲ転位の阻害の効果の増大を示している。
【図４６】ＡＲの発現に対するＡＲ１と併用したＣＬＵノックダウンの効果を示す図。
【図４７】ＣＬＵノックダウン後のウェスタンブロット解析を示す図。
【国際調査報告】
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