(57)【要約】  スクロースインベルターゼ活性があるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を本明細書に開示する。さらに、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を使用する方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であって、
（ａ）上記ポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含み；かつ
（ｂ）該シグナル配列が、
（ｉ）Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片；および
（ｉｉ）スクロースインベルターゼシグナル配列の２番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよい、スクロースインベルターゼシグナル配列；
からなる群から選択され；かつ
（ｃ）成熟スクロースインベルターゼをコードする上記ポリペプチド配列が、配列番号４と比較すると、ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、
上記形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項２】
スクロースインベルターゼシグナル配列の前記２番目のアミノ酸が、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンからなる群から選択される、請求項１に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項３】
成熟スクロースインベルターゼをコードする前記ポリペプチド配列が配列番号４で示される、請求項１に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項４】
前記Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片が、ヤロウィア・リポリティカに由来し、かつ前記スクロースインベルターゼシグナル配列が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、請求項１に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項５】
前記Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片が、
（ａ）アルカリ細胞外プロテアーゼ前駆体のＮ末端１５７個のアミノ酸を含むＸｐｒ２プレ／プロ領域；および
（ｂ）成熟アルカリ細胞外プロテアーゼのＮ末端１３個のアミノ酸を含むＮ末端Ｘｐｒ２断片
を含む、請求項４に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項６】
前記Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片が配列番号１０で示される、請求項５に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項７】
前記スクロースインベルターゼシグナル配列が配列番号８で示される、請求項４に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項８】
スクロースインベルターゼコード配列に融合したシグナル配列を含む前記ポリペプチドが、配列番号１２および配列番号２０からなる群から選択される、請求項１に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項９】
前記形質転換ヤロウィア・リポリティカが、スクロースを唯一の炭素源とする条件下で増殖することができる、請求項１に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項１０】
前記形質転換ヤロウィア・リポリティカが、少なくとも１つの目的の非天然生成物を産生することができる、請求項１に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの目的の非天然生成物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導化合物、ならびにレスベラトロールからなる群から選択される、請求項１０に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項１２】
前記形質転換ヤロウィア・リポリティカが、少なくとも８０％のスクロースインベルターゼを細胞外に分泌することができ、炭素源として少なくともスクロースを含有する培地中で増殖する、請求項１または請求項１０に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカ。
【請求項１３】
少なくとも１つの非天然生成物を生産する方法であって、
ａ）スクロース；および
ｂ）グルコース；
からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源を含有する培地中で請求項１０に記載の形質転換ヤロウィア・リポリティカを増殖させ、それによって、少なくとも１つの目的の非天然生成物を産生させるステップ、および場合によっては、少なくとも１つの目的の非天然生成物を回収するステップ、を含む上記方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの目的の非天然生成物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導化合物、ならびにレスベラトロールからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質転換ヤロウィア・リポリティカが、少なくとも８０％のスクロースインベルターゼを細胞外に分泌することができる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２８，５９０号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明はバイオテクノロジーの分野に入る。より具体的には、本発明は、炭素源としてスクロースを使用する能力を有する形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に関し、ここで、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、場合によっては、多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）など、目的の非天然生成物を産生するように操作することもできる。
【背景技術】
【０００３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの油性酵母には、それらの唯一の炭素源としてグルコースを使用する天然の能力がある；しかしながら、この基質は必ずしも最もコスト効率の良い炭素源であるとは限らない。グルコースの代わりに炭素源として（単独でも他の炭素源と組み合わせても）炭素源としてスクロースを使用することは、そのコストから有利となりうる。
【０００４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、単糖のグルコースおよびフルクトースへのスクロース（二糖）の変換を触媒するインベルターゼをコードする遺伝子を有しないので、炭素源としてスクロースを利用することができない。数人の研究者がこれまでに、インベルターゼ（例えば、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子）をコードする異種遺伝子にシグナル配列を融合させて、周辺培地に成熟インベルターゼタンパク質を分泌するように酵母を操作している。これにより周辺培地中でスクロースは加水分解されるようになる。
【０００５】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離された周知のシグナル配列の１つは、誘導性のアルカリ性細胞外プロテアーゼ（「ＡＥＰ」）のシグナル配列である（特許文献１；非特許文献１；非特許文献２）。ＡＥＰはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＸＰＲ２遺伝子によりコードされる。さらに、天然において細胞外に大量に分泌される。
【０００６】
Ｎｉｃａｕｄら（非特許文献３；特許文献２）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＸＰＲ２プロモーターおよびそのシグナル配列とＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２のキメラ発現を報告し、それによりＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）にスクロース利用（ＳＵＣ＋）表現型をもたらした。具体的には、ＸＰＲ２から２３個のＮ末端アミノ酸が短縮ＳＵＣ２に融合された（ここで、短縮は、完全長タンパク質の最初の４個のアミノ酸の除去である）。インベルターゼ活性の約１０％が培養液中に観察され（すなわち、細胞外分泌を介して）、一方活性の９０％が全細胞を使用して回収される（すなわち、インベルターゼは周辺質に分泌された）ことが報告された。したがって、細胞外スクロース加水分解の効率は比較的低いものであった。
【０００７】
Ｎｉｃａｕｄらが記載した方法論は、炭素源としてスクロースを使用してクエン酸を産生する形質転換体Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を開発する努力において、他研究者により利用されている（非特許文献４〜６）。上記のＦｏｓｔｅｒらは、インベルターゼ活性の大多数（６０〜７０％）は、細胞表面上で見出されるが（すなわち、全細胞において検出される細胞結合性の活性）、インベルターゼの３０〜４０％は、無細胞の培地中で検出されることを報告した；バイオマスからの最大インベルターゼ生成量は、１１０Ｕ／ｇ乾燥重量バイオマスであった。ごく最近では、上記のＬａｚａｒらは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＸＰＲ２プロモーターおよびそのシグナル配列とＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２を含む融合物を２コピー含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を同定し、インベルターゼ活性の大部分が細胞と結合し（２５６８〜３７３６Ｕ／ｇ細胞）、一方約２３２〜５８９Ｕ／ｇが細胞外である（すなわち、活性の５〜２０％のみが細胞外である）ことを実証した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第０２２０８６４Ｂ１号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０４０２２２６Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：４６２１−４６２９（１９８７）
【非特許文献２】Ｍａｔｏｂａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：４９０４−４９１６（１９８８）
【非特許文献３】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：２５３−２６０（１９８９）
【非特許文献４】Ｗｏｊｔａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．，６／４７（４）：４９−５４（１９９７）
【非特許文献５】Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７５：１４０９−１４１７（２００７）
【非特許文献６】Ｌａｚａｒ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２：６９８２−６９８９（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、細胞外インベルターゼ活性を改善するためにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を操作することが、炭素源としてスクロースをより良く利用するために望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態では、本発明は、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であって、
ａ）前記ポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含み；かつ
ｂ）前記シグナル配列が、
（ｉ）Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片；ならびに
（ｉｉ）スクロースインベルターゼシグナル配列の２番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸になりうるスクロースインベルターゼシグナル配列
からなる群から選択され；かつ
ｃ）成熟スクロースインベルターゼをコードする前記ポリペプチド配列が、配列番号４（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）と比較されるとき、ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する
形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に関する。
【００１２】
好ましくは、上記のスクロースインベルターゼシグナル配列の２番目のアミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンからなる群から選択される。
【００１３】
第２の実施形態では、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列は、配列番号４（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）で示される。
【００１４】
第３の実施形態では、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来し、かつ前記スクロースインベルターゼシグナル配列は、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する。好ましくは、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片は、
（ｉ）アルカリ性細胞外プロテアーゼ前駆体のＮ末端１５７個のアミノ酸を含むＸｐｒ２プレ／プロ領域；および
（ｉｉ）成熟アルカリ性細胞外プロテアーゼのＮ末端１３個のアミノ酸を含むＮ末端Ｘｐｒ２断片
を含む。
【００１５】
好ましくは、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片は、配列番号１０［「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３」］で示される。
【００１６】
第４の実施形態では、スクロースインベルターゼシグナル配列は、配列番号８［「Ｓｕｃ２ＳＳ」］で示される。
【００１７】
第５の実施形態では、スクロースインベルターゼのコード配列に融合したシグナル配列を含むポリペプチドは、配列番号１２［「Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２」］および配列番号２０［「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２」］からなる群から選択される。
【００１８】
第６の実施形態では、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、スクロースが唯一の炭素源である条件下で増殖することができる。
【００１９】
第７の実施形態では、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、目的の少なくとも１つの非天然生成物を産生することができる。好ましくは、目的の少なくとも１つの非天然生成物は、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールからなる群から選択される。
【００２０】
第８の実施形態では、炭素源として少なくともスクロースを含有する培地中で増殖させた、本明細書で発明の形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）はいずれも、スクロースインベルターゼの少なくとも８０％を細胞外に分泌することができる。
【００２１】
第９の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの非天然生成物を産生する方法であって、
ａ）スクロース；および
ｂ）グルコース；
からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源を含有する培地中で本発明の形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を増殖させ、それによって、目的の少なくとも１つの非天然生成物を産生させるステップ、および場合によっては、目的の少なくとも１つの非天然生成物を回収するステップを含む方法に関する。
【００２２】
好ましくは、目的の少なくとも１つの非天然生成物は、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールからなる群から選択される。
【００２３】
第１０の実施形態では、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、スクロースインベルターゼの少なくとも８０％を細胞外に分泌することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】細胞外インベルターゼ発現コンストラクトであるｐＹＲＨ６８（配列番号１３）、ｐＹＲＨ７４（配列番号２１）、ｐＹＲＨ６９（配列番号１８）、およびｐＹＲＨ７３（配列番号１５）、ならびにこれらのコンストラクトがＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で発現されるときに得られる表現型（すなわち、スクロースを利用する（ＳＵＣ＋）またはスクロースを利用しない（ＳＵＣ−））の概略図を示す。
【図２Ａ】サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ（「ＳｃＳＵＣ２」）のＮ末端部分のヌクレオチドおよび翻訳アミノ酸配列を示す。より具体的には、配列番号２のアミノ酸１〜３２を示す；最初の１９個のアミノ酸は、Ｓｕｃ２ＳＳ（配列番号８）として本明細書で示されるインベルターゼシグナル配列に相当し、枠内に示された残りのアミノ酸は、本明細書でｍ−ＳｃＳＵＣ２（配列番号４）と命名した成熟インベルターゼタンパク質のＮ末端を表す。
【図２Ｂ】ＸＰＲ２遺伝子によりコードされたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アルカリ性細胞外プロテアーゼの一部のヌクレオチドおよび翻訳アミノ酸配列を示す。具体的には、アルカリ性細胞外プロテアーゼ前駆体（配列番号６）のアミノ酸１４５〜１９２を示す。これらのうち、点線の枠内に示されるアミノ酸１４５〜１５７は、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域のＣ末端に相当し、アミノ酸１５８〜１９２は、成熟タンパク質のＮ末端Ｘｐｒ２断片に相当する。下線のアミノ酸は、ＸＰＲ２ＰＰ＋１３（配列番号１０）と本明細書で称されるＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片の中に存在する、Ｎ末端Ｘｐｒ２断片の１３個のアミノ酸に相当する。
【図３】ｐＺＳＵＣのプラスミドマップを示す。
【図４Ａ】ｐＹＲＨ６８のプラスミドマップを示す。
【図４Ｂ】ｐＹＲＨ７０のプラスミドマップを示す。
【図５Ａ】ｐＹＲＨ７３のプラスミドマップを示す。
【図５Ｂ】ｐＹＲＨ６９のプラスミドマップを示す。
【図６】ｐＹＲＨ７４のプラスミドマップを示す。
【図７】グルコース培地およびスクロース培地の両方における、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株およびＹ４１８４株（対照）の増殖のグラフを示す。
【図８Ａ】グルコースを含む培地上でのＺ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８株（対照）の増殖のグラフを示す。
【図８Ｂ】スクロースを含む培地上でのＺ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８株（対照）の増殖のグラフを示す。
【図９】ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎのプラスミドマップを示す。
【００２５】
配列説明
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１条〜第１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則第５．２条および第４９．５条（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則第２０８条および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に準拠する。
【００２６】
配列番号１〜４１は、表１に記載の遺伝子、タンパク質（もしくはその一部）、プライマー、またはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００２７】
【表１】
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【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、それら全体を参照により組み込むものとする。
【００２９】
本開示では、いくつの用語および略語を使用する。以下に定義を示す。
「翻訳領域」は「ＯＲＦ」と略す。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略す。
「米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は「ＡＴＣＣ」と略す。
「多価不飽和脂肪酸（類）」は「ＰＵＦＡ（類）」と略す。
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略す。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略す。
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略す。
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略す。
「重量パーセント」は「重量％」と略す。
【００３０】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、文脈上他に明示されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」と言及する場合、１つまたは複数の細胞および当業者に公知の等価物等が含まれる。
【００３１】
用語「分泌経路」は、分泌過程において、細胞がタンパク質を細胞外に輸送する経路を指す。一般に、分泌されるタンパク質は、粗面小胞体［「ＥＲ」］に移行し、ゴルジ装置を介して輸送され、次いでエキソサイトーシスの過程で細胞膜と最終的に融合し、それによってタンパク質を放出する小胞に組み込まれる。分泌は、構成的または調節形式で起こりうる。
【００３２】
「シグナル配列」（当技術分野では、「プレ」配列領域、「シグナルペプチド」、「ターゲティングシグナル」、「輸送ペプチド」、または「移行シグナル」とも呼ばれる）は、一般に、細胞内部におけるまたは細胞外環境へのポリペプチドの残りの部分の輸送および局在化を指示する短いペプチド配列（すなわち、ポリペプチドの最もＮ末端の部分で長さが約３〜６０個のアミノ酸）である。真核生物での平均長は２２．６個のアミノ酸である。シグナル配列は、一般に、膜、例えばＥＲ膜を横切る移行を介してタンパク質をその機能部位にターゲティングするための定義されたペプチドモチーフを含む。移行後、続けて、シグナル配列は内因性シグナルペプチターゼにより通常切断される。シグナル配列を含むタンパク質は「プレタンパク質」と呼ばれる。
【００３３】
コンセンサス配列は存在しないが、ほとんどすべてのシグナルペプチドは共通の構造、すなわち、短く、正に荷電したアミノ領域（ｎ−領域）；中央の疎水性領域（ｈ−領域）；およびシグナルペプチターゼにより切断される部位を含有するより極性な領域（ｃ−領域）（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１−６（１９９７））を有する。
【００３４】
用語「プロタンパク質」および「タンパク質前駆体」は、本明細書において互換的に使用し、Ｎ末端「プロ」配列領域の切断により改変されうるポリペプチドを指す。通常はエンドプロテアーゼによるこの「プロ」配列領域の除去により、「成熟タンパク質」の形成がもたらされる。この「プロ」配列領域は、種々の翻訳後修飾を促進する原因となることも、成熟タンパク質の適切なフォールディングための必要条件となることも、またはそれが翻訳後に除去されるまで、成熟タンパク質の活性を阻害するように作用することもある。
【００３５】
「プレ／プロタンパク質」は、「プレ／プロ」領域が除去されたときに成熟タンパク質になるものに結合した「プレ／プロ」領域を含有する。「プレ／プロタンパク質」は、「プレ」配列領域（すなわち、Ｎ末端シグナル配列）および「プロ」配列領域（すなわち、「プレ」配列とプレ／プロ領域が除去されたときに成熟タンパク質になるものとの間に並置された領域）の両方を含む。
【００３６】
用語「インベルターゼ」および「β−フルクトフラノシダーゼ」は、加水分解反応を介してスクロース（すなわち、アルファ−１、４−グリコシド結合により連結された、アルファ−Ｄ−グルコース分子およびベータ−Ｄ−フルクトース分子からなる二糖）をグルコースおよびフルクトースに変換する能力を有するタンパク質（ＥＣ  ３．２．１．２６）を指す。サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、インベルターゼをコードする遺伝子はＳｕｃ２である。
【００３７】
用語「細胞外インベルターゼ」は、微生物細胞が増殖する培地に分泌されるインベルターゼを指す。したがって、細胞外インベルターゼ活性は、典型的には、培地自体のみで測定される。これに対して、「全細胞インベルターゼ」は、細胞外に分泌されないが、その代りに細胞内部の細胞膜周辺腔に分泌されるインベルターゼを指す。典型的には、全細胞インベルターゼ活性は、全細胞のみで測定される。細胞外インベルターゼ活性対全細胞活性の相対量（すなわち、パーセント）は、以下のように決定される：１００＊培地中のインベルターゼ活性／［（全細胞のインベルターゼ活性）＋（培地中のインベルターゼ活性）］。
【００３８】
用語「アルカリ性細胞外プロテアーゼ」または「ＡＥＰ」は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＸＰＲ２遺伝子によりコードされるタンパク質（ＥＣ  ３．４．２１．−）を指す。ＡＥＰは、この酵母により分泌される主要な細胞外タンパク質（培地１リットル当たり１グラム超）であり、無細胞培地上清に存在するタンパク質の９９％を占める。完全長プロテアーゼのＮ末端は、成熟タンパク質のプロセシングおよび分泌に関与する「プレ／プロ」領域を含有する。
【００３９】
用語「目的の非天然生成物」は、野生型微生物内で天然には産生されない任意の生成物を指す。典型的には、目的の生成物である異種タンパク質の発現を可能にするために、宿主微生物へ適切な異種遺伝子を導入する組換え手段によって、目的の非天然生成物は産生される。好ましい目的の非天然生成物の非限定例としては、これらに限定されないが、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールが挙げられる。
【００４０】
用語「目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子」は、それが導入される宿主微生物とは異なる起源に由来する遺伝子を指す。異種遺伝子は、宿主微生物における目的の非天然生成物の産生を促進する。一部の場合では、中間段階または経路中間体をまったく経ずに、所望する目的の生成物への基質の直接変換を触媒する単一の異種遺伝子のみが、目的の生成物の産生を可能にするために必要となり得る。あるいは、所望する目的の非天然生成物を産生するための一連の反応が起こるように、新しい生合成経路をコードする一連の遺伝子を微生物へ導入することが望ましい場合もある。
【００４１】
一般に、用語「油性」は、エネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。この過程の間、油性微生物の細胞油含量は一般にシグモイド曲線に従い、脂質濃度は、後期対数増殖期または初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次いで、後期定常期および死滅期の間に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。本出願の目的のためには、用語「油性」は、油としてそれらの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の少なくとも約２５％を蓄積することができる微生物を指す。
【００４２】
用語「油性酵母」は、油を製造することができる酵母として分類される油性微生物を指す。すなわち、この酵母では、それらのＤＣＷの約２５％を上回る油を蓄積することができる。油性酵母の例としては、これらに限定する意図はないが、以下の属、すなわちヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。酵母のＤＣＷの約２５％を上回る油を蓄積する能力は、組換え工学の努力を介するものでも、または生物の天然の能力を介するものでもよい。
【００４３】
用語「炭素源」は、エネルギーを得るために微生物が代謝する炭素を含む栄養素を指す。例えば、野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、グルコース、フルクトース、グリセロール、酢酸、アルコール、アルカン、脂肪酸、およびトリグリセリドを含む種々の炭素源を使用することができる；しかしながら、それは唯一の炭素源としてスクロースを使用することができない（Ｂａｒｔｈ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃ．Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９：２１９−２３７（１９９７））。これに対して、本発明の組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、唯一の発酵性炭素源として、または他の適切な炭素源と組み合わせてスクロースを使用することができる。
【００４４】
用語「微生物宿主細胞」および「微生物宿主生物」は、本明細書で互換的に使用し、外来または異種遺伝子を受け入れることができ、それらの遺伝子を発現することができる微生物を指す。「組換え微生物宿主細胞」は、組換え操作された（例えば、微生物宿主細胞が外因性ポリヌクレオチドで形質転換されたように）微生物宿主細胞を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「単離核酸断片」は、合成、非天然、または改変のヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成されてもよい。
【００４６】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」とは、当業者による配列のマニュアル評価またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いる、コンピュータによる自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、公知のタンパク質または遺伝子に相同なものとしてポリペプチド配列または核酸配列を推定的に同定するためには、１０個以上の連続したアミノ酸配列または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の連続したヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子の同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）の配列依存的方法に使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、１２〜１５個の塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）の増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。
【００４７】
用語「相補的」は、逆平行の配向で並列したときにワトソン‐クリック型塩基対が可能なヌクレオチド塩基の２つの配列間の関係を述べる。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと塩基対が可能であり、シトシンはグアニンと塩基対が可能である。
【００４８】
「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号の性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」について十分承知している。したがって、宿主細胞における発現の改善を目的として遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。
【００４９】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を用いて、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを連結しアニールして遺伝子セグメントを形成した後、酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築する。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のための遺伝子を構築することができる。当業者は、宿主が好むコドンの方向へコドン使用をバイアスすると、遺伝子発現が成功する可能性が高まることを認識している。好ましいコドンは、配列情報が利用可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて決定することができる。例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロフィールは、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供されている。
【００５０】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域のみを指すことも、またはコード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）に調節配列を含むこともある。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然では一緒に見出されることがない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。「内因性遺伝子」は、生物ゲノム内のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子（または「外因性」遺伝子）は、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計された遺伝子である。
【００５１】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００５２】
「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を挙げることができる。
【００５３】
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することも、または天然に見出される様々なプロモーターに由来した様々なエレメントから構成されていることも、または合成ＤＮＡセグメントをさらに含んでいることもある。異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示しうることを当業者は理解している。ほとんどの細胞型でほとんど常に遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般に呼ばれる。ほとんどの場合で、調節配列の正確な境界が完全には画定されていないので、様々な長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を示しうることもまた認識されている。
【００５４】
用語「３’非コード配列」および「転写ターミネーター」は、本明細書で互換的に使用し、コード配列の３’側下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節配列をコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことを通常特徴とする。３’領域は、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすことができる。
【００５５】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一核酸断片上で核酸配列が関連していることを指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を及ぶすことができる場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。すなわち、そのコード配列はそのプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【００５６】
本明細書で使用する用語「発現」は、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００５７】
「形質転換」は、宿主生物への核酸分子の移入を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく、宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」もしくは「組換え」もしくは「形質転換された」生物、または「形質転換体」と呼ばれる。
【００５８】
「安定な形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、核および細胞小器官のゲノムを含む、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指す（すなわち、この核酸断片は「安定に組み込まれる」）。これに対して、「一時的な形質転換」は、組込みまたは安定な遺伝を伴わない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。
【００５９】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ、またはヌクレオチド配列であってよく、かつ線状であっても環状であってもよい。そこでは、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組み換えられて、細胞に発現カセットを導入することができるユニークな構成になっている。
【００６０】
用語「発現カセット」は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子生成物の発現に必要とされる、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列とを含むＤＮＡの断片を指す。したがって、発現カセットは、典型的には、１）プロモーター配列、２）コード配列（すなわち、翻訳領域［「ＯＲＦ」］）、および３）真核生物ではポリアデニル化部位を通常含有する３’非翻訳領域（すなわち、ターミネーター）から構成される。発現カセットは、クローニングおよび形質転換を容易にするためにベクター内に通常含まれる。それぞれの宿主のために適正な調節配列を使用する限り、種々の発現カセットを、細菌、酵母、植物、および哺乳類の細胞を含む種々の生物に形質転換することができる。
【００６１】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでも、独自に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５）スミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合は、別段の定めがない限り、分析の結果は、参照プログラムの「デフォルト値」に基づくものであることを理解されたい。本明細書で使用する「デフォルト値」は、ソフトウェアを最初に初期化したときに、初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【００６２】
核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大の一致を得るようにアライメントすると同じになる、２つの配列内の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって、「配列同一性パーセント」または「パーセント同一性」は、比較ウィンドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較して決定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）との比較で付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。パーセントは、両方の配列内で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を判定してマッチした位置の数を得て、比較ウィンドウ内の位置の総数でマッチした位置の数を除し、配列同一性パーセントを得るためにその結果に１００を乗じることにより計算することができる。
【００６３】
「パーセント同一性」および「パーセント類似性」を決定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。パーセント同一性およびパーセント類似性は、これらに限定されないが、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）を含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００６４】
配列アラインメントおよびパーセント同一性またはパーセント類似性の計算は、相同配列を検出するように設計された種々の比較法を使用して求めることができる。
【００６５】
配列の多重アライメントは、（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載され）、上記ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラムに見出される、「ＣｌｕｓｔａｌＶアライメント法」および「ＣｌｕｓｔａｌアライメントＷ法」を含む、いくつかの種類のアルゴリズムを包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法」を使用して実施することができる。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを用いて配列アライメントをした後、プログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。
【００６６】
本明細書で使用する標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（これ以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）により記載されている。
【００６７】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、炭素源としてスクロースを使用するように組換え操作することができる。これには、グルコースおよびフルクトースへのスクロースの変換を触媒するインベルターゼをコードする遺伝子を発現するように生物を操作することが含まれた。しかしながら、スクロースは酵母が増殖する培地中に存在するので、細胞内インベルターゼによる加水分解に先だってスクロースを細胞内に輸送する必要がある、または培地中のスクロースを、その後細胞に輸送することができるグルコースおよびフルクトースに加水分解できる細胞外にインベルターゼを発現すべきである。インベルターゼが周辺培地中、細胞外に分泌されるように、シグナル配列を異種インベルターゼ遺伝子に融合することが好ましい。
【００６８】
グルコースおよびフルクトースへのスクロースの変換を触媒する機能的インベルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．２６；「β−フルクトフラノシダーゼ」とも呼ばれる）の発現により、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はスクロースを発酵させる。Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の同じＳＵＣ２対立遺伝子から発現されるインベルターゼには２つの形態、すなわちグルコース抑制により調節される分泌型グリコシル化形態および構成的に産生する細胞内非グリコシル化形態がある。これらの２つの形態間の差は、分泌型グリコシル化インベルターゼの合成に必要な５’−シグナル配列の有無に起因する。このシグナル配列は、インベルターゼタンパク質の最初の１９個のアミノ酸として定義されている（Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９：７８１−７８５（１９８２）；Ｃａｒｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，２８（１）：１４５−５４（１９８２）；Ｔａｕｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：１９４３−５４（１９８３））。
【００６９】
したがって、完全長Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２［「ＳｃＳＵＣ２」］遺伝子（配列番号１）は、グリコシル化形態でＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の周辺質に分泌される、５３２個のアミノ酸の完全長インベルターゼ（配列番号２）をコードする、長さが１５９９個のヌクレオチドである。これに対して、「成熟」ＳｃＳＵＣ２遺伝子［「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」］は、配列番号１のヌクレオチド１〜５７によりコードされた、アミノ酸長が１９個の５’シグナル配列を欠損しており、したがって、細胞内非グリコシル化形態のｍ−ＳｃＳＵＣ２は、配列番号３（配列番号１のヌクレオチド５８〜１５９９に相当する）として示される、１５４２ｂｐのヌクレオチド配列によりコードされ、この配列が翻訳されて、５１３個のアミノ酸の短縮ｍ−ＳｃＳＵＣ２タンパク質（配列番号４）が生成する。
【００７０】
細胞の膜を介して分泌されるタンパク質は、一般に、「プレ」タンパク質として細胞内で生成される。その形態では、タンパク質は、その分泌および局在化をおそらく支援するが、分泌過程の間に分泌型「成熟」タンパク質から最終的に切断される付加的な「シグナル」ポリペプチド配列に融合している。プレタンパク質のシグナルペプチドは、ある種の類似性を共有するものの、それらの一次構造は相当異なっている。これは、それぞれのタンパク質が、細胞膜を介して特定のそのタンパク質が移行するのに特によく適したシグナル配列と共に進化してきたことを示唆する。
【００７１】
上記のように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、培地中に大量のＡＥＰを天然に分泌する。配列番号６（長さが４５４個のアミノ酸）の完全長Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＥＰは、１３６５ｂｐのＸＰＲ２遺伝子（配列番号５）によりコードされる。このプロテアーゼのＮ末端１５７個のアミノ酸残基は、成熟タンパク質のプロセシングおよび分泌に関与するシグナル配列およびプレ／プロ領域を含有する。
【００７２】
詳細な研究により、ＡＥＰは、プレプロＩ−プロＩＩ−プロＩＩＩのＮ末端領域を伴って合成されることが示され、ＡＥＰの４つの異なる前駆体が検出された。アミノ酸位置１〜１３は、分泌に関与するシグナル配列を含有し、その後の位置１４〜３３には、典型的なジペプチジルアミノペプチターゼ認識部位である一連の−Ｘａａ−Ａｌａ−および−Ｘａａ−Ｐｒｏ−がある。アミノ酸位置５４または６０は、プロＩおよびプロＩＩの領域間の切断部位と思われるが、位置１２９または１３１は、プロＩＩおよびプロＩＩＩの領域間の別の切断部位である。最後に配列番号６のアミノ酸位置１５７は、プロＩＩＩおよび成熟ＡＥＰの間の切断部位である（Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８（１１）：４９０４−４９１６（１９８８）；米国特許第４，９３７，１８９号明細書および欧州特許第０２２０８６４Ｂ１号明細書も参照のこと）。アミノ酸１〜１５７に相当するプレ／プロ領域は、タンパク質フォールディング、効率的な分泌、早期活性化の防止等に関与することが示唆されている；プレ／プロ領域が切断されないと、ＡＥＰタンパク質は機能的にならない。
【００７３】
Ｘｐｒ２プレプロ領域は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における種々の異種タンパク質の分泌に使用されてきた；しかしながら、タンパク質分泌のためのＸｐｒ２プレプロ領域の使用では、様々な結果が得られている（Ｍａｄｚａｋ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５（１）：７５−８７（１９９９））。不満足なタンパク質発現の理由としては、不完全なタンパク質プロセシング（Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：６８７６−６８８１（１９９７）；Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８７：１−１５（２０００）；Ｓｗｅｎｎｅｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４８：４１−５０（２００２））および細胞外発現の欠如（Ｈａｍｓａ，Ｐ．Ｖ．ａｎｄ  Ｂ．Ｂ．Ｃｈａｔｔｏｏ，Ｇｅｎｅ，１４３：１６５−７０（１９９４）；Ｔｈａｒａｕｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２１：１１１−１１９（１９９２））が挙げられる。したがって、プロ配列は、異種タンパク質の分泌には必要がない可能性またはむしろ有害である可能性が示唆された（Ｍａｄｚａｋ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０９：６３−８１（２００４）；Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（上記）；Ｔｈａｒａｕｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，上記）。これは、Ｔａｂｕｃｈｉ，Ｍ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４１７９−４１８９（１９９７））により示され、そこではカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）のプレプロ領域がシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来のＳｕｃ２の分泌に効果がなかった。
【００７４】
ＳｃＳｕｃ２シグナル配列（配列番号１のヌクレオチド１〜５７［すなわち、ＳｃＳＵＣ２のアミノ酸１〜１９］に相当する）を発現するコンストラクトにＰｃｉＩ制限酵素部位を導入するために、アミノ酸位置２を変異させた。その結果、野生型Ｌｅｕ２残基がＰｈｅ２（別の疎水性残基）に変異し、それによりＳｃＳｕｃ２の分泌過程に影響を及ぼさずに、シグナル配列の疎水性が維持された（Ｋａｉｓｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：３１２−３１７（１９８７））。したがって、本発明の適切なＳｃＳｕｃ２シグナル配列の１つ（すなわち「Ｓｕｃ２ＳＳ」）を、配列番号７および８として本明細書に示す。
【００７５】
Ｘｐｒ２プレ／プロ領域を含むコンストラクトは、配列番号１０のアミノ酸１〜１７０をコードするように設計した。Ｘｐｒ２プレ／プロ領域は、配列番号６のアミノ酸１〜１５７のみを包含するとして本明細書に記載したが、融合物連結部の不正確なプロセシングが推定上の二次構造によるものとあらかじめ留意されていたので（Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：６８７６−６８８１（１９９７））、Ｌｙｓ１５６−Ａｒｇ１５７切断部位にＸｐｒ６エンドペプチダーゼが確実に到達するように、プレ／プロ領域の後に、プロテアーゼの追加の１３個のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端Ｘｐｒ２断片）を「リンカー」として含めた。したがって、本発明の適切なＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片の１つ（すなわち「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３」）を、配列番号９および１０として本明細書に示す。
【００７６】
下記の表２に要約し、図１に示す発現カセットについて、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるインベルターゼ発現を評価した。より具体的には、発現プラスミドｐＹＲＨ６８は、成熟ＳＵＣ２をコードする遺伝子（すなわち、配列番号３；「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）に融合したＳｕｃ２ＳＳシグナル配列を含み、発現プラスミドｐＹＲＨ７０は、配列番号３に融合したＳｕｃ２ＳＳシグナル配列を２コピー含み、発現プラスミドｐＹＲＨ６９は、配列番号３に融合したＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片とＳｕｃ２ＳＳシグナル配列の両方を含み、発現プラスミドｐＹＲＨ７３は、配列番号３のみを含み（かつＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片も、分泌に関与するシグナル配列としてのＳｕｃ２ＳＳシグナル配列も含まない）、そして発現プラスミドｐＹＲＨ７４は、配列番号３に融合したＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片を含んだ。「ＦＢＡＩＮｍプロモーター領域」（すなわち、ｆｂａ１遺伝子［米国特許第７，２０２，３５６号明細書］によりコードされたフルクトース二リン酸アルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の５’側上流にある非翻訳領域に由来）を、インベルターゼ遺伝子コンストラクトに機能的に連結した。
【００７７】
【表２】
2014503216.tif 000004
【００７８】
上記プラスミドコンストラクトのそれぞれを発現するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を、スクロースを唯一の炭素源とする培地上で増殖させた。成熟ＳＵＣ２（ＳｃＳｕｃ２［すなわち、配列番号２］をコードする完全長遺伝子に事実上相当する）をコードする遺伝子に融合したＳｕｃ２ＳＳシグナル配列（すなわち、ｐＹＲＨ６８およびｐＹＲＨ７０）または成熟ＳＵＣ２をコードする遺伝子に融合したＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片（すなわち、ｐＹＲＨ７４）を発現する形質転換体のみがインベルターゼを発現した、すなわち、ＳＵＣ＋表現型であった。したがって、これは、それらの融合物がＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）にＳｃＳＵＣ２の機能的な発現をもたらすことを示す。
【００７９】
一態様では、本発明は、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であって、
（ａ）前記ポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含み；かつ
（ｂ）前記シグナル配列が、
（ｉ）Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片；および
（ｉｉ）スクロースインベルターゼシグナル配列の２番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよい、スクロースインベルターゼシグナル配列
からなる群から選択され；かつ
（ｃ）成熟スクロースインベルターゼをコードする前記ポリペプチド配列が、配列番号４（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）と比較されるとき、ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント法に基づくと少なくとも８０％の配列同一性を有する
形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に関する。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明の形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、炭素源として少なくともスクロースを含有する培地中で増殖させると、スクロースインベルターゼの少なくとも８０％を細胞外に分泌することができる（細胞内［または周辺質］のインベルターゼ活性は、全インベルターゼ活性の２０％以下である）。より好ましくは、細胞外インベルターゼ活性は、全インベルターゼ活性の少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【００８１】
上記に記載のように、配列番号４として本明細書に示す「成熟」ＳｃＳＵＣ２タンパク質［「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」］は、配列番号１のヌクレオチド１〜５７によりコードされる、１９個のアミノ酸長の５’シグナル配列を欠如している。好ましくは、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列は、配列番号４（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）で示される。代替実施形態では、成熟スクロースインベルターゼは、配列番号４と比較されるとき、ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント法に基づくと少なくとも８０％の配列同一性を有する、すなわち、配列番号４と比較されるとき、このポリペプチドは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有しうる。
【００８２】
一実施形態では、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために、配列番号４をコドン最適化することが望ましいことがある。これは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロフィールに関する以前の決定、好まれるコドンの同定、および「ＡＴＧ」開始コドン周辺のコンセンサス配列の決定（米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照のこと）に基づいて可能である。
【００８３】
別の実施形態では、表１４（実施例８）のインベルターゼ配列またはそれらの一部を本発明で使用することができる。あるいは、これらのいずれも、配列分析ソフトウェアを使用して、同種または他種のインベルターゼホモログを探索するために使用することができる。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、種々の置換、欠失、およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。低複雑性フィルターおよび以下のパラメーター：期待値＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いるＢＬＡＳＴＰアライメント法などのソフトウェアアルゴリズムの使用は、核酸配列またはタンパク質配列のデータベースに対して、表１４の任意のインベルターゼタンパク質を比較し、それによって好ましい生物の範囲内で類似の公知配列を同定するための手段として周知である。
【００８４】
公知配列のデータベースを詳細に検索するためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表１４に記載のものなど、公的に入手可能なインベルターゼ配列に対して比較的低いパーセント同一性を有するホモログの単離に特に適している。公的に利用可能なインベルターゼ配列に対して少なくとも約８０％〜８５％同一であるインベルターゼホモログの単離は比較的容易であると予測できる。さらに、少なくとも約８５％〜９０％同一の配列は、単離に特に適しており、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列は、最も容易に単離されよう。
【００８５】
一部のインベルターゼホモログは、インベルターゼ酵素にユニークなモチーフの使用によっても単離されている。モチーフは、タンパク質ホモログファミリーのアライメントされた配列が高度に保存されていることにより同定される。ユニークな「サイン」としてのモチーフにより、新しく決定された配列が以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するものか否かを決定することができる。これらのモチーフは、新規インベルターゼ遺伝子を迅速に同定するための診断ツールとして有用である。
【００８６】
本明細書または公開文献に記載されているインベルターゼの任意の核酸断片または同定された任意のホモログを使用して、同種または他種由来のホモログタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコールを用いるホモログ遺伝子の単離は当技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては、これらに限定されないが、１）核酸ハイブリダイゼーション法；２）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５））、または鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））などの核酸増幅技術の種々の使用により例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法；ならびに３）相補性によるライブラリ構築およびスクリーニングの方法が挙げられる。
【００８７】
本発明の形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドであって、このポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードする外因性ポリヌクレオチドに融合したシグナル配列を含み、前記シグナル配列が、１）Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片、ならびに２）２番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよい、スクロースインベルターゼシグナル配列からなる群から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む。
【００８８】
Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片を含むシグナル配列に関して、当業者は、アルカリ性細胞外プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．−）をコードする適切なＸＰＲ２遺伝子を分析して、成熟タンパク質をコードする配列に対してプレ／プロ領域をコードする配列を同定することができよう。例えば、ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０サーバー（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ，ＤＫ−２８００  Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、種々の生物に由来するアミノ酸配列におけるシグナルペプチド切断部位の存在および位置を予測するのに有用である（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１−６（１９９７）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６（２０１１））。この同定に続いて、完全長Ｘｐｒ２プレ／プロ領域および成熟Ｘｐｒ２タンパク質（すなわち、ＡＥＰ）の追加のＮ末端断片をコードする適切な配列を単離することが容易に可能である。
【００８９】
このＮ末端Ｘｐｒ２断片は、プレ／プロ領域と成熟タンパク質の間の切断部位にＸｐｒ６エンドペプチダーゼが確実に到達するように、少なくとも成熟プロテアーゼのほぼアミノ酸１〜１０から最大で成熟プロテアーゼのほぼアミノ酸１〜２５をコードする（ただし、Ｎ末端断片の正確な長さは、利用した各ＸＰＲ２遺伝子ごとに実験的に決定される必要があろう）。
【００９０】
より好ましくは、成熟プロテアーゼのＮ末端Ｘｐｒ２断片は、成熟プロテアーゼのアミノ酸１〜１１、アミノ酸１〜１２、アミノ酸１〜１３、アミノ酸１〜１４、アミノ酸１〜１５、アミノ酸１〜１６、アミノ酸１〜１７、アミノ酸１〜１８、アミノ酸１〜１９、アミノ酸１〜２０、アミノ酸１〜２１、アミノ酸１〜２２、アミノ酸１〜２３、または成熟プロテアーゼのアミノ酸１〜２４をコードすることになる。
【００９１】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片は、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域の少なくとも１５７個のアミノ酸（すなわち、配列番号６のアミノ酸１〜１５７）および成熟プロテアーゼをコードする追加のＮ末端Ｘｐｒ２断片（すなわち、配列番号６のアミノ酸１５８〜１６７、またはアミノ酸１５８〜１６８、またはアミノ酸１５８〜１６９、またはアミノ酸１５８〜１７０、またはアミノ酸１５８〜１７１、またはアミノ酸１５８〜１７２、またはアミノ酸１５８〜１７３、またはアミノ酸１５８〜１７４、またはアミノ酸１５８〜１７５、またはアミノ酸１５８〜１７６、またはアミノ酸１５８〜１７７、またはアミノ酸１５８〜１７８、またはアミノ酸１５８〜１７９、またはアミノ酸１５８〜１８０、またはアミノ酸１５８〜１８１、またはアミノ酸１５８〜１８２）を含むことになる。
【００９２】
好ましいＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片（すなわち、配列番号１０で示す「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３」）は、配列番号６のアミノ酸１〜１７０を含み、この断片は、Ｘｐｒ６エンドペプチダーゼがＬｙｓ１５６−Ａｒｇ１５７切断部位に確実に到達するように、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域の後に追加の１３個のアミノ酸（すなわち、成熟プロテアーゼのアミノ酸１〜１３）を含むものに相当した。したがって、Ｘｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片は、
（ａ）ＡＥＰ前駆体のＮ末端１５７個のアミノ酸を含むＸｐｒ２プレ／プロ領域；および
（ｂ）成熟ＡＥＰのＮ末端１３個のアミノ酸を含むＮ末端Ｘｐｒ２断片
を含む。
【００９３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に形質転換することができる、スクロースインベルターゼ活性を有するポリヌクレチドをコードする好ましい外因性ポリヌクレオチドの１つは、配列番号４（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）の成熟スクロースインベルターゼに融合した、配列番号１０のＸｐｒ２プレ／プロ領域およびＮ末端Ｘｐｒ２断片のシグナル配列を含むもので、それによって、配列番号１９として示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号２０のタンパク質をコードするＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２融合物が生成する。
【００９４】
スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチドに融合したシグナル配列を含む外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、スクロースインベルターゼシグナル配列の２番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよいスクロースインベルターゼシグナル配列を代替的に利用することができる。
【００９５】
当業者は、上記と同様の方法論を利用して、成熟インベルターゼタンパク質をコードする配列に対するインベルターゼシグナル配列をコードする配列を同定することができよう。いったん同定されれば、本明細書に記載のように、インベルターゼシグナル配列を単離して、スクロースインベルターゼ活性を有する融合ポリペプチドを構築することが容易に可能になる。明確さのために、スクロースインベルターゼシグナル配列および成熟スクロースインベルターゼを、単一種から単離することができ（それによって、その種の完全長インベルターゼプレタンパク質と事実上同等である）、あるいはスクロースインベルターゼシグナル配列を種「Ａ」から単離し、成熟スクロースインベルターゼを種「Ｂ」から単離することができる。スクロースインベルターゼシグナル配列の２番目のアミノ酸は、任意の疎水性アミノ酸、例えば、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、またはメチオニンであってよい。
【００９６】
インベルターゼシグナルペプチドを調べるこれまでの幾つかの研究では、本質的にランダムなアミノ酸配列の少なくとも２０％が、少なくとも部分的に、インベルターゼの排出シグナルとして機能しうることが示されてきた。排出シグナルの機能は、シグナルペプチドの定義された構造または長さではなく疎水性と関連する（例えば、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：３１２−３１７（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２３８２−２３９１（１９８６）を参照のこと）。さらに、天然のＳｃＳＵＣ２シグナル配列と成熟ＳｃＳＵＣ２との間の連結部配列は、シグナルペプチドの適切な切断にとって重要であることが知られている。例えば、配列番号２の残基Ａｌａ１９がＶａｌに変異すると、ＳｃＳＵＣ２は不完全になる（Ｓｃｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１００：１６６４−１０７５（１９８５））。ＳＵＣ２シグナル配列の改変に関するさらなる情報については、Ｎｇｓｅｅら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３４００−３４１０（１９８９））を参照されたい。
【００９７】
一実施形態では、スクロースインベルターゼシグナル配列はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の生物に由来するものであってよい。より好ましくは、スクロースインベルターゼシグナル配列は、例えば、配列番号８［「Ｓｕｃ２ＳＳ」］で示されるスクロースインベルターゼシグナル配列など、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離される。配列番号８の２番目のアミノ酸を代替の疎水性アミノ酸に置換することができ（すなわち、Ｐｈｅ２をＬｅｕ２、Ｉｌｅ２、Ｖａｌ２、またはＭｅｔ２に変異させることができる）、それによってインベルターゼの分泌過程に影響を及ぼさずに、シグナル配列の疎水性を維持するこができる。より具体的には、本明細書において、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用されるスクロースインベルターゼシグナル配列は、分泌活性が実質的に維持される限り、配列番号８と比較されるとき、少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有することができる（例えば、Ｋａｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２３８２−２３９１（１９８６）を参照のこと）。
【００９８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）への形質転換を目的とする、スクロースインベルターゼ活性を有するポリヌクレチドをコードする好ましい外因性ポリヌクレオチドの１つは、配列番号４（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」）の成熟スクロースインベルターゼに融合した、配列番号８のスクロースインベルターゼシグナル配列を含むもので、それによって、配列番号１１として示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号１２のタンパク質をコードするＳｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２融合物が生成する。
【００９９】
配列番号１２のＳｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２融合物は、例えば、Ｓｕｃ２ＳＳシグナル配列が配列番号２のアミノ酸１〜１９に相当し、ｍ−ＳｃＳＵＣ２がアミノ酸２０〜５３２に相当する以上、配列番号２（アミノ酸２の変異を例外として）で示される完全長インベルターゼプレタンパク質に事実上同等であると認識されるべきである。したがって、例えば、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性（ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント法に基づいて）を有することができる。ただし、このポリペプチドは、配列番号２と比較されるとき、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有することがより好ましい。
【０１００】
当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミド等の高分子の構築、操作、および単離のための特定の条件および手順；２）組換えＤＮＡ断片および組換え発現コンストラクトの生成；ならびに３）クローンのスクリーニングおよび単離を記載する標準の資料教材を承知している。Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｓｉｌｈａｖｙ、およびＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。
【０１０１】
一般に、コンストラクトに含む配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離する提案された手段に依存する。典型的には、ベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択可能マーカー、自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切な発現カセットは、典型的には、プロモーター、選択遺伝子のコード配列、およびターミネーターを含む（すなわち、キメラ遺伝子）。両方の制御領域は形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが好ましい。
【０１０２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の転写および翻訳領域が具体的には有用であるが、実際は、スクロースインベルターゼ活性があるポリペプチドをコードするＯＲＦの発現を指示することができるいずれのプロモーター（すなわち、天然、合成、またはキメラ）も適切であろう。発現の実行は誘導様式であっても構成様式であってもよい。誘導発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節可能プロモーターの活性を誘導することにより達成することができ、一方構成的発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターの使用により達成することができる。
【０１０３】
ターミネーターは、プロモーターが得られた遺伝子の３’領域に由来しても異なる遺伝子に由来してもよい。多数のターミネーターが公知であり、それらが由来した属および種が同じおよび異なるいずれの場合にも、利用に際して種々の宿主で十分に機能する。ターミネーターは、通常、何らかの特定の性質のためではなく便宜上で選択されることが多い。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子由来である。当業者はターミネーターを設計および合成するために入手可能な情報を利用することができるので、ターミネーターは合成であってもよい。ターミネーターは不必要なこともあるが、高度に好ましいものである。
【０１０４】
限定を意図するものではないが、組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用される好ましいプロモーターおよびターミネーターは、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１０−００６８７８９−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１１−００５９４９６−Ａ１号明細書、米国仮特許出願第６１／４６９，９３３号明細書（代理人整理番号（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ）ＣＬ４７３６ＵＳＰＲＶ、２０１１年３月３１日に出願）、米国仮特許出願第６１／４７０，５３９号明細書（代理人整理番号ＣＬ５３８０ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月１日に出願）、米国仮特許出願第６１／４７１，７３６号明細書（代理人整理番号ＣＬ５３８１ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月５日に出願）、および米国仮特許出願第６１／４７２，７４２号明細書（代理人整理番号ＣＬ５３８２ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月７日に出願）に教示のものであり、これらそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込むものとする。より具体的には、好ましいプロモーターとして、ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＭ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１、ＥＸＰ１、ＤＧＡＴ２、ＥＬ１、ＡＬＫ２、およびＳＰＳ１９が挙げられる。
【０１０５】
多くの特殊化した発現ベクターが高い発現率を得るために作製されている。そのようなベクターは、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質の安定性および局在、ならびに宿主細胞からの分泌を統制する幾つかの性質を調整することにより作製される。これらの性質には、関係する転写プロモーター配列およびターミネーター配列の性質；クローン化遺伝子のコピー数（そこでは、追加のコピーは単一発現コンストラクト内にクローニングされてもよく、かつ／または追加のコピーは、プラスミドコピー数の増加によりもしくはゲノムへのクローン化遺伝子の多重組込みにより宿主細胞に導入されてもよい）；遺伝子がプラスミド担持であるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるか；宿主生物におけるタンパク質の翻訳および正確なフォールディングの効率；宿主細胞内でのクローン化遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；ならびに宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近い頻度でのクローン化遺伝子内のコドン使用が含まれる。
【０１０６】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に適したＤＮＡカセット（例えば、プロモーター、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＯＲＦ、およびターミネーターを含むキメラ遺伝子を含む）がいったん得られれば、宿主細胞において自律複製が可能なプラスミドベクターに配置するか、またはキメラ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をゲノムに直接組み込む。発現カセットの組込みは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム内でランダムに起こさせてもよく、または特定の遺伝子座との組換えを目的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトを使用することにより標的設定してもよい。コンストラクトの標的を内因性遺伝子座にする場合、転写および翻訳の制御領域の全部または一部を内因性遺伝子座から得ることができる。
【０１０７】
目的のキメラスクロースインベルターゼ遺伝子を含むコンストラクトを、任意の標準手法によりＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入することができる。これらの手法には、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］）、遺伝子銃衝撃（ｂｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法が含まれる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用可能なより具体的な教示として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、ならびにＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））が挙げられる。好ましくは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞の形質転換では、宿主ゲノムへの線状ＤＮＡ断片の組込みが推奨される。高レベルの遺伝子発現が望ましい場合には、ゲノム内の複数の位置に組み込むことが具体的には有用となりうる。好ましい遺伝子座は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に教示のものを含む。
【０１０８】
用語「形質転換された」、「形質転換体」、および「組換え」は、本明細書において互換的に使用する。形質転換された宿主は、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、発現カセットがゲノムに組み込まれて増幅されるか否か、または複数のコピー数を有する染色体外エレメント上に存在するか否かに応じて２つ以上を有することになる。形質転換された宿主細胞は、導入コンストラクト上に含有されるマーカーに対する選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換手法が多くのＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと同時形質転換することができる。典型的には、形質転換された宿主は、選択培地上での増殖能力に対して選択され、選択培地は、抗生物質が組み込まれていることも、または栄養素（例えば、スクロース）もしくは増殖因子など、形質転換されていない宿主の増殖に必要な要素が欠損していることもある。導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を付与するか、または必須増殖因子もしくは酵素をコードし、そのため形質転換された宿主で発現されたとき選択培地上での増殖を可能にする。発現されたマーカータンパク質を直接的または間接的に検出することができる場合も、形質転換された宿主の選択が可能になる。さらなる選択手法については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている。
【０１０９】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における組込みＤＮＡ断片の安定性は、個々の形質転換体、受容株、および使用されるターゲティングプラットフォームに依存する。したがって、特定の組換え微生物宿主の複数の形質転換体を、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るためにスクリーニングすべきである。ＤＮＡブロットのサザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノザン解析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウエスタン解析、表現型解析、またはＧＣ分析が適切なスクリーニング方法である。
【０１１０】
任意のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を、本発明による、成熟スクロースインベルターゼをコードする適切なポリペプチド配列で形質転換して、炭素源としてスクロースを利用することができる形質転換された株を生成することができる米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）［「ＡＴＣＣ」］を通して得ることができる、容易に入手可能なＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の例としては、例えば、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９または＃２０１８４７が挙げられる。同様に、Ｈｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｐｈａｆｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｄａｖｉｓ（Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）から、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の以下の株を入手することができる：Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）４９−１４、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）４９−４９、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）５０−１４０、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）５０−４６、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）５０−４７、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）５１−３０、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）６０−２６、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７０−１７、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７０−１８、Ｙ．リポリティカ（Ｙ���ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７０−１９、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７０−２０、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７４−７８、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７４−８７、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７４−８８、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７４−８９、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７６−７２、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７６−９３、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７７−１２Ｔ、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）７７−１７。あるいは、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｅｔ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｏｆ  Ｄｒ．Ｊｅａｎ−Ｍａｒｃ  Ｎｉｃａｕｄ，ＩＮＲＡ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｇｒｉｇｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅから、例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＪＭＹ７９８（Ｍｌｉｃｋｏｖａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７０（７）：３９１８−２４（２００４）），Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＪＭＹ３９９（Ｂａｒｔｈ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ．Ｉｎ，Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｗｏｌｆ，Ｗ．Ｋ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９６；ｐｐ３１３−３８８）およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＪＭＹ１５４（Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１（１７）：５１４０−８（１９９９））を含む株を入手することができる。
【０１１１】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞は油性、すなわち、油の合成および蓄積ができることが好ましく、そこでは、総油含有量は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の約２５％超、より好ましくはＤＣＷの約３０％超、および最も好ましくはＤＣＷの約４０％超含むことができる。一実施形態では、ＡＴＣＣ番号２０３６２、ＡＴＣＣ番号８８６２、ＡＴＣＣ番号１８９４４、ＡＴＣＣ番号７６９８２、および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））として指定されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が具体的に適している。
【０１１２】
本発明はまた、スクロースインベルターゼ活性があるポリペプチド（前記ポリペプチドは、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含む）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であって、さらに、目的の少なくとも１つの非天然生成物を産生することができる形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に関する。炭素源としてスクロース（またはその混合物）を使用して、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を増殖させる場合、目的のこの少なくとも１つの非天然生成物を産生させることが好ましい。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を異種遺伝子で形質転換する順序は重要ではない。そのような形質転換はまた、同時であってもよい。
【０１１３】
目的の適切な非天然生成物の例としては、これは本明細書において限定することを意図するものではないが、例えば、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールが挙げられる。
【０１１４】
「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）（特にオメガ−３およびオメガ−６  ＰＵＦＡ）に関連した健康有益性は、十分実証されている。より具体的には、ＰＵＦＡは、本明細書では、少なくとも１８個の炭素原子および２つ以上の二重結合を有する脂肪酸を指す。用語「脂肪酸」は、より長い鎖長の酸およびより短い鎖長の酸の両方が知られているが、約Ｃ１２〜Ｃ２２の種々の鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指す。主な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法で表し、ここで、Ｘは、特定の脂肪酸における炭素［「Ｃ」］原子の総数、Ｙは二重結合の数である。
【０１１５】
「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「オメガ−６脂肪酸」［「ｎ−６」］対「オメガ−３脂肪酸」［「ｎ−３」］の間の差異に関するさらなる詳細は、参照によって本明細書に組み込む米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書（表３）には、オメガ−３およびオメガ−６  ＰＵＦＡとそれらの前駆体の化学名および一般名、ならびに一般に使用される略語について詳細にまとめられている。
【０１１６】
しかしながら、ＰＵＦＡ例の一部として、これらに限定されないが、リノール酸［「ＬＡ」、１８：２  ω−６］、ガンマ−リノレン酸［「ＧＬＡ」、１８：３  ω−６］、エイコサジエン酸［「ＥＤＡ」、２０：２  ω−６］、ジホモ−ガンマ−リノレン酸［「ＧＬＡ」、２０：３  ω−６］、アラキドン酸［「ＡＲＡ」、２０：４  ω−６］、ドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」、２２：４  ω−６］、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」、２２：５  ω−６］、アルファ−リノレン酸［「ＡＬＡ」、１８：３  ω−３］、ステアリドン酸［「ＳＴＡ」、１８：４  ω−３］、エイコサトリエン酸［「ＥＴＡ」、２０：３  ω−３］、エイコサテトラエン酸［「ＥＴｒＡ」、２０：４  ω−３］、エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」、２０：５  ω−３］、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−３」、２２：５  ω−３］、およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」、２２：６  ω−３］が挙げられる。
【０１１７】
ＰＵＦＡ産生のためのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の操作に向けて、多大な努力が捧げられてきた。例えば、米国特許第７，２３８，４８２号明細書では、酵母におけるオメガ−６およびオメガ−３脂肪酸産生の実現可能性が実証された。米国特許第７，９３２，０７７号明細書では、総脂肪酸の２８．１％のＥＰＡの組換え産生が実証された；米国特許第７，５８８，９３１号明細書では、総脂肪酸の１４％のＡＲＡの組換え産生が実証された；米国特許第７，５５０，２８６号明細書では、総脂肪酸の５％のＤＨＡの組換え産生が実証された；そして米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書では、ＥＰＡ産生のために最適化された組換え株が記載され、総脂肪酸の最大５５．６％のＥＰＡの産生が実証された。米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書では、ＴＦＡの最大５０％のＥＰＡを含み、かつＴＦＡの重量パーセントとして測定されたＥＰＡとＴＦＡの重量パーセントとして測定されたリノール酸との比が少なくとも３．１である微生物油を産生する、さらに最適化された組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株について記載されている。形質転換体のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、ＰＵＦＡ産生を目的とした、デサチュラーゼ（すなわち、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ）遺伝子とエロンゲース（すなわち、Ｃ１４／１６エロンゲース、Ｃ１６／１８エロンゲース、Ｃ１８／２０エロンゲース、Ｃ２０／２２エロンゲース、およびデルタ−９エロンゲース）遺伝子との種々の組合せを発現する。しかしながら、これらの方法すべてにおいて、ＰＵＦＡ産生は炭素源としてグルコースを使用して増殖させた油性酵母を使用して実証された。
【０１１８】
表３に、デサチュラーゼとエロンゲースの種々の組合せを有する、上記に引用の参考文献に記載された特定のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の一部について情報を提供する。ただし、特定の株および産生される特定のＰＵＦＡが、本明細書の発明を限定するものでは決してないことは認識されるべきである。
【０１１９】
【表３】
2014503216.tif 000005
【０１２０】
【表４】
2014503216.tif 000006
【０１２１】
炭素源としてスクロースを用いて増殖させる場合、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で産生することができる目的の適切な非天然生成物としてカ
ロテノイドも考えられる。本明細書で使用する用語「カロテノイド」は、イソプレンから形式的に誘導される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスを指す。このクラスの分子は、トリテルペン［「Ｃ３０ジアポカルテノイド」（ｄｉａｐｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）］およびテトラテルペン［「Ｃ４０カロテノイド」］ならびにそれらの酸化誘導体から構成され、典型的には、これらの分子は強い光吸収特性を有し、長さがＣ２００を超えることもある。長さが、例えばＣ３５、Ｃ５０、Ｃ６０、Ｃ７０、およびＣ８０である他の「カロテノイド化合物」が知られている。用語「カロテノイド」には、カロテンおよびキサントフィルの両方が含まれうる。「カロテン」は、炭化水素カロテノイド（例えば、フィトエン、β−カロテン、およびリコペン）を指す。これに対して、用語「キサントフィル」は、１つまたは複数の酸素原子を、ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒドの官能基形態で含有するＣ４０カロテノイドを指す。キサントフィルはカロテンより極性であり、この性質により、脂肪および脂質へのそれらの溶解性が劇的に低下する。したがって、カロテノイドの適切な例として、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン（すなわち、３，３’−ジヒドロキシ−β、β−カロテン−４、４’−ジオン）、カンタキサンチン（すなわちβ，β−カロテン−４、４’−ジオン）、カプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β，ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、β−カロテンケト−γ−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、ζ−カロテン、ゼアキサンチン、アドニルビン、テトラヒドロキシ−β、β’−カロテン−４、４’−ジオン、テトラヒドロキシ−β、β’−４−オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、３−ヒドロキシ−γ−カロテン、３−ヒドロキシ−４−ケト−γ−カロテン、バクテリオルビキサンチン、バクテリオルビキサンチナール、４−ケト−γ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１２２】
野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、通常カロテン産生性ではない。しかしながら、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットおよび国際公開第２００９／１２６８９０号パンフレットは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ、フィトエンデサチュラーゼをコードするｃｒｔＩ、リコペンシクラーゼをコードするｃｒｔＹ、カロテノイドヒドロキシラーゼをコードするｃｒｔＺ、および／またはカロテノイドケトラーゼをコードするｃｒｔＷなどのカロテノイド生合成経路遺伝子の導入による、組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の一連のカロテノイド産生について記載している。
【０１２３】
炭素源としてスクロースを用いて増殖させた場合に、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で産生されうる目的の他の非天然生成物としては、例えば、キニーネ誘導体化合物、ステロール、およびリスベラトロールが挙げられる。用語「少なくとも１つのキノン誘導体化合物」は、酸化還元活性のあるキノン環構造を有する化合物を指し、ＣｏＱ系列（すなわち、Ｑ６、Ｑ７、Ｑ８、Ｑ９、およびＱ１０）のキノン、ビタミンＫ化合物、ビタミンＥ化合物、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される化合物を含む。例えば、補酵素Ｑ１０［「ＣｏＱ１０」］という用語は、ユビキノン１０としても知られる２，３−ジメトキシ−ジメチル−６−デカプレニル−１，４−ベンゾキノン（ＣＡＳ登録番号３０３−９８−０）を指す。ＣｏＱ１０のベンゾキノン部分はチロシンから合成されるが、イソプレン側鎖はメバロン酸経路を介してアセチルＣｏＡから合成される。したがって、ＣｏＱ１０などのＣｏＱ化合物の生合成はＮＡＤＰＨを必要とする。「ビタミンＫ化合物」には、例えばメナキノンまたはフィロキノンが含まれるが、「ビタミンＥ化合物」には、例えばトコフェロール、トコトリエノール、またはα−トコフェロールが含まれる。用語「リスベラトロール」は、３’，４，５−トリヒドロキシスチルベンを指す。
【０１２４】
米国特許出願公開第２００９／０１４２３２２−Ａ１号明細書および国際公開第２００７／１２０４２３号パンフレットは、補酵素Ｑ１０を産生するためのデカプレニルピロリン酸シンターゼをコードするｄｄｓＡ、ビタミンＫ化合物を産生するためのＭｅｎＦ、ＭｅｎＤ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＥ、ＭｅｎＢ、ＭｅｎＡ、ＵｂｉＥ、および／またはＭｅｎＧのポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにビタミンＥ化合物を産生するためのｔｙｒＡ、ｐｄｓｌ（ｈｐｐｄ）、ＶＴＥｌ、ＨＰＴ１（ＶＴＥ２）、ＶＴＥ３、ＶＴＥ４、および／またはＧＧＨのポリペプチドをコードする遺伝子などの異種のキノン生合成経路遺伝子の導入による、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における種々のキノン誘導体化合物の産生について記載している。国際公開第２００８／１３０３７２号パンフレットは、スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９／ＳＱＳ１およびスクアレンエポキシダーゼをコードするＥＲＧｌの導入による、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のステロール産生について記載している。また、米国特許第７，７７２，４４４号明細書は、リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子の導入による、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のリスベラトロール産生について記載している。
【０１２５】
形質転換された宿主細胞は、キメラ遺伝子（例えば、インベルターゼをコードする遺伝子、目的の非天然生成物の生合成を可能にする遺伝子等）の発現を最適にする条件下で増殖させる。一般に、最適化可能な培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産段階の期間、油蓄積段階の期間、ならびに細胞採取の時期および方法が挙げられる。油性酵母は、複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］）、または増殖に必要な成分を欠損し、それによって所望の発現カセットの選択を引き出す合成最少培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））の中で増殖させることが多い。
【０１２６】
本発明における発酵培地は発酵性の炭素源を含む。発酵性の炭素源は、例えば、スクロース、転化スクロース、グルコース、フルクトース、およびこれらの組合せとすることができる。転化スクロースは、本明細書では、スクロースの加水分解から生じるフルクトースとグルコースをほぼ等量含む混合物を指す。転化スクロースは、加水分解度にその量が依存するスクロースを含むこともあるが、２５〜５０％のグルコースと２５〜５０％のフルクトースを含む混合物とすることができる。転化スクロースは、サトウキビまたはサトウダイコンなどの種々の供給源から入手可能なスクロースの加水分解により得ることができる。当技術分野で公知のように、グルコースおよびフルクトースへのスクロースの加水分解は、酸（例えば、クエン酸またはアスコルビン酸の添加）により、または酵素（例えば、インベルターゼまたはβ−フルクトフラノシダーゼ）により触媒することができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、本明細書で開示のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、他の糖の存在下（「混合糖」）、スクロース含有培地中で増殖させる。混合糖は、スクロースに加えて少なくとも１つの追加の糖を含む。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の代謝のためにエネルギー源を提供することができる任意の糖、またはスクロースを含有する混合物中に存在する任意の糖が含まれてもよい。しかしながら、野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞のように、本明細書で開示された、スクロースを利用するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、依然として唯一の炭素源としてグルコースを使用することができる。
【０１２８】
さらに、発酵培地は適切な窒素源を含む。窒素は、無機（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば、尿素、グルタミン酸、または酵母抽出物）の供給源から補充することができる。スクロースおよび窒素源に加えて、発酵培地はまた、微生物の増殖に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ビタミン、および他の成分を含有する。
【０１２９】
本発明における好ましい増殖培地は、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般の商業的調製培地である。他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）増殖培地または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知である。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的には、約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、その中では初期増殖条件の範囲としてｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で行うことができ、その中では微好気条件が好ましい。
【０１３０】
典型的には、増殖と脂肪の合成／貯蔵との間で代謝状態の「バランス」を取らなければならないため、油性酵母細胞における高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、二段階発酵工程が必要である。したがって、二段階発酵工程を油性酵母におけるＰＵＦＡの産生に使用することが最も好ましい。この方法は米国特許第７，２３８，４８２号明細書に種々の適切な発酵工程設計（すなわち、バッチ、フェドバッチおよび連続）および増殖中の検討事項として記載されている。
【実施例】
【０１３１】
本発明を以下の実施例の中でさらに詳細に説明する。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方、例示としてのみ示されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修正をなして、様々な使用および条件に本発明を適合させることができる。
【０１３２】
略語の意味は以下のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１３３】
発現カセットの命名法
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により表され、ここでＸはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、これらはすべて互いに作動可能に連結されている。
【０１３４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２株は米国培養細胞系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、下記の処方に従った数種の培地中で２８〜３０℃にてルーチン的に増殖させた。
【０１３５】
高グルコース培地［「ＨＧＭ」］（１リットル当たり）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４、および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整不要）。
【０１３６】
高スクロース培地［「ＨＳＭ」］（１リットル当たり）：８０スクロース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４、および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整不要）。
【０１３７】
合成デキストロース培地［「ＳＤ」］（１リットル当たり）：硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有の６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ；２０ｇのグルコース。
【０１３８】
合成スクロース培地［「ＳＳ」］（１リットル当たり）：硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有の６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ；２０ｇのスクロース。
【０１３９】
発酵培地［「ＦＭ」］（１リットル当たり）：アミノ酸非含有の６．７ｇ／ＬのＹＮＢ；６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４−ヘプタハイドレード；５ｇ／Ｌの酵母抽出物；２％の炭素源（炭素源はグルコースまたはスクロースのいずれかである）。
【０１４０】
参照によって本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載のように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換を実施した。
【０１４１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のために、細胞を遠心分離により回収し、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載のように脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル転移反応により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、次いで、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）のＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）から１８５℃とした。
【０１４２】
直接の塩基エステル転移反応のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで５〜１０分間真空乾燥した。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）および既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０  ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５，Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に加え、次いで試料を５０℃で３０分間、攪拌揺動した。１Ｍ  ＮａＣｌを３滴およびヘキサンを４００μｌ添加した後、試料を攪拌回転した。上層を取り出し、ＧＣにより分析した。
【０１４３】
代替的に、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載の塩基触媒エステル転移反応法を修正して、発酵またはフラスコ試料のいずれかに由来するブロス試料のルーチン分析に使用した。具体的には、ブロス試料を室温水で迅速に解凍し、次いで０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心管フィルター（カタログ番号８１６１）を備えた、タール被覆の２ｍＬ微量遠心チューブに秤量した（０．１ｍｇ）。試料（７５〜８００μｌ）は、あらかじめ測定したＤＣＷに応じて使用した。エッペンドルフ５４３０遠心分離機を使用して、試料を１４，０００ｒｐｍで５〜７分間またはブロスを除去するのに必要な限り、遠心分離した。フィルターを取り出し、液体を排水し、試料を洗浄するために約５００μｌの脱イオン水をフィルターに加えた。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再び取り出し、液体を排水し、フィルターを再挿入した。次いで、チューブを遠心分離機に再挿入し、今度は乾燥させるために約３〜５分間上部を開けた状態にした。次いで、フィルターをチューブのほぼ中段で切断し、新たな２ｍＬ丸底エッペンドルフチューブ（カタログ番号２２  ３６  ３３５−２）に挿入した。
【０１４４】
カットフィルター容器の縁に接触するのみで、試料またはフィルター材料には接触しない適切な道具を用いてチューブの底にフィルターを押しつけた。トルエン中の既知量のＣ１５：０  ＴＡＧ（上記）を加え、新たに調製した１％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液５００μｌを加えた。試料ペレットを、適切な道具で強く粉砕し、チューブを閉じて、５０℃加熱ブロック（ＶＷＲカタログ番号１２６２１−０８８）中に３０分間静置した。次いで、チューブを少なくとも５分間放冷した。次いで、４００μｌのヘキサンおよび５００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を加え、チューブを２×６秒間攪拌し、１分間遠心分離した。約１５０μｌの上部（有機）層を、インサートを備えたＧＣバイアルに入れ、ＧＣにより分析した。
【０１４５】
ＧＣ分析により記録されたＦＡＭＥピークは、それらの保持時間を既知脂肪酸の保持時間と比較して同定し、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部標準（Ｃ１５：０  ＴＡＧ）と比較して定量した。したがって、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの概算量（μｇ）［「μｇ  ＦＡＭＥ」］は以下の式に従って計算し：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）、一方任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇ  ＦＡ」］は、１μｇのＣ１５：０  ＴＡＧが０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいので、以下の式に従って計算する：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３。０．９５０３の変換係数は、大部分の脂肪酸について決定された値（０．９５〜０．９６の範囲にある）の近似であることに留意されたい。
【０１４６】
ＴＦＡの重量％としてそれぞれ個々の脂肪酸の量をまとめた脂質プロフィールは、すべてのＦＡＭＥピーク面積の合計で個々のＦＡＭＥピーク面積を除し、そして１００を乗じて決定した。
【０１４７】
フラスコアッセイによる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における総脂質含量および組成の分析
特定のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における全脂質含量及び組成を詳細に分析するために、以下のようにフラスコアッセイを実施した。具体的には、新たに画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖させた。ＯＤ６００ｎｍを測定し、１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＦＭ培地に０．３の最終ＯＤ６００ｎｍまで細胞のアリコートを加えた。２５０ｒｐｍで３０℃の振盪インキュベーター中で２日後、遠心分離により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。２５０ｒｐｍで３０℃の振盪インキュベーター中で５日後、１ｍＬのアリコートを用いて脂肪酸分析（上記）を行い、１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を測定した。
【０１４８】
ＤＣＷを決定するために、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータにおいて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、１０ｍＬの培養物を回収した。ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁し、上記のとおりに再度回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水に再懸濁し、あらかじめ秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブン中、８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を測定した。
【０１４９】
細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を計算し、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］および乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を表にしたデータと併せて検討する。
【０１５０】
実施例１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外インベルターゼ発現プラスミドｐＺＳＵＣの構築および発現
本実施例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１６：２５３−２６０（１９８９））におけるＮｉｃａｕｄらの報告と同様の方法による、ＸＰＲ２プロモーターおよびシグナル配列とインベルターゼをコードするサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２［「ｍ−ＳｃＳｕｃ２」］遺伝子の短縮変異体との融合物を含むプラスミドｐＺＳＵＣ（配列番号２２）の構築について記載する。
【０１５１】
より具体的には、Ｎｉｃａｕｄらは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＸＰＲ２遺伝子のプロモーターおよびＮ末端アミノ酸シグナル配列の制御下でＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子を発現する場合における、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の周辺質へのインベルターゼの分泌を報告した。その中（２５７頁）には、「融合物では、アミノ酸１１から開始するインベルターゼの前に、ＸＰＲ２遺伝子由来の２３個のＮ末端アミノ酸を配置する」ことが記載されている（すなわち、このようにして、完全長インベルターゼの最初の１０個のアミノ酸が短縮される一方、シグナル配列のアミノ酸１１〜１９が、発現される成熟タンパク質と共に含まれた）。しかしながら、Ｎｉｃａｕｄらの図１Ｂ（２５５頁）によると、そうではなくて、融合コンストラクトは、アミノ酸５から開始するインベルターゼに融合した、シグナル配列としてのＸＰＲ２遺伝子由来の２３個のＮ末端アミノ酸を含んでいたように見える（すなわち、このようにして、完全長インベルターゼの最初の４個のアミノ酸が短縮される一方、シグナル配列のアミノ酸５〜１９が、発現される成熟タンパク質と共に含まれた）。融合物に関して明瞭さが欠けてはいるものの、Ｎｉｃａｕｄらは、インベルターゼの発現が、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）にスクロース利用（Ｓｕｃ＋）表現型を付与すると報告した。
【０１５２】
上記のＮｉｃａｕｄらと同様の方法で、ＸＰＲ２：：ＳＵＣ２融合コンストラクトを作製した（「ｐＺＳＵＣ」；図２）。最初に、３６９ｂｐのＸＰＲプロモーター（−３６９〜−１）および６３ｂｐのコード領域（＋１〜＋６３）を含有する４３２ｂｐのＤＮＡ断片を、鋳型としてヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡを、またプライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ４２７およびＹＬ４２８（配列番号：３６および３７）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。設計したＰＣＲ断片（配列番号３８）の５’末端にＣｌａＩ部位を加え、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を加えた。ＰＣＲ増幅は、以下のものを含む全容積５０μｌで実施した；ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、５０ｎｇのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ番号７６９８２）ゲノムＤＮＡ、および１μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。サーモサイクラー条件は、９５℃で１分間を３５サイクル、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間の後、最終伸長を７２℃で１０分間に設定した。
【０１５３】
ＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製し、次いでＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した；消化生成物は、１％（ｗ／ｖ）アガロース中でゲル電気泳動法により分離し、ＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＺＳＵＣ（下記）の構築に使用した。
【０１５４】
最初の１０個のアミノ酸以外のＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２コード領域を含有する１５６９ｂｐのＤＮＡ断片を、鋳型としてＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを、またプライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ４２９およびＹＬ４３０（配列番号：３９および４０）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。ＳＵＣ２コード領域と同じ読み枠で５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を加え、ＳＵＣ２コード領域（配列番号４１）の停止コドンの後にＢｓｉＷＩ部位を加えた。ＰＣＲ増幅は、５０ｎｇのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号７６９８２）の代わりに、５０ｎｇのＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを使用したことを除いて、上記に示す成分を含む全容積５０μｌで実施した。サーモサイクラー条件は、９５℃で１分間を３５サイクル、５６℃で３０秒間、および７２℃で２分間の後、最終伸長を７２℃で１０分間に設定した。
【０１５５】
ＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製し、次いでＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化した；消化生成物は、１％（ｗ／ｖ）アガロース中でゲル電気泳動法により分離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ断片をｐＺＳＵＣ（下記）の構築に使用した。
【０１５６】
したがって、プラスミドｐＺＳＵＣ２は下記の構成要素を含有する。
【０１５７】
【表５】
2014503216.tif 000007
【０１５８】
次いで、発現プラスミドｐＺＳＵＣ（配列番号２２）をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２に形質転換して、インベルターゼ発現について試験した。形質転換体を合成スクロース培地［「ＳＳ」］上で増殖させた。しかしながら、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、スクロース培地上で増殖することができなかった。
【０１５９】
ｐＺＳＵＣ内のＸＰＲ２：：ＳＵＣ２融合コンストラクトでは、ＸＰＲ２コード配列の最初の６３ｂｐ（すなわち、プレ／プロ領域）は、「シグナル配列」として使用され、ＳＵＣ２遺伝子には最初の３０個のヌクレオチドがなかった（すなわち、ＳＵＣ２シグナル配列の最初の１０個のアミノ酸が除去されている）。Ｎｉｃａｕｄらによる記載を注意深く調査したところ、操作された株の増殖を試験するために、高圧蒸気滅菌されたスクロース培地が使用されたことが判明した。高圧蒸気滅菌工程により、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が炭素源として使用することができるフルクトースおよびグルコースに、スクロースの一部が加水分解される可能性がある（データを示さず）。
【０１６０】
本実施例において示されたデータにより、Ｎｉｃａｕｄらが記載のような、ＳｃＳｕｃ２の短縮変異体と融合したＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＸＰＲ２のＮ末端２１個のアミノ酸の融合物を発現する形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、炭素源としてスクロースを使用することができないことが実証された。Ｓｕｃ２シグナル配列の疎水性コアは、適切な分泌過程と関連しており、その破壊はインベルターゼの細胞内蓄積をもたらすことが報告された（Ｋａｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６；２３８２−２３９１（１９８６）；Ｐｅｒｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：５０３３−５０３７（１９８６））。
【０１６１】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外インベルターゼ発現プラスミド：ｐＹＲＨ６８、ｐＹＲＨ６９、ｐＹＲＨ７０、ｐＹＲＨ７３、およびｐＹＲＨ７４の構築
本実施例は、インベルターゼをコードする「成熟」サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２［「ｍ−ＳｃＳｕｃ２］」遺伝子に融合した、ＸＰＲ２プレプロ領域［「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３」］および／またはＳＵＣ２シグナル配列［「Ｓｕｃ２ＳＳ」］の種々異なる組合せを含む一連のプラスミドの構築について記載する。各コンストラクト中の異種遺伝子は、強力なＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーター（ＦＢＡＩＮｍ；米国特許第７，２０２，３５６号明細書を参照のこと）およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ２０ターミネーター配列により挟まれた。
【０１６２】
ＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２を含むｐＹＲＨ６８の構築
プラスミドｐＹＲＨ６８は、インベルターゼをコードする「成熟」ＳｃＳＵＣ２遺伝子（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」；配列番号４）に融合したＳｕｃ２シグナル配列（「ＳｕｃＳＳ」；配列番号８）を高発現させるために構築した。しかしながら、ＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２として本明細書に記載のこの人為的な融合物は、５’−シグナル配列を天然に含有する野生型完全長ＳｃＳＵＣ２遺伝子に事実上相当する。
【０１６３】
ＳｃＳＵＣ２  ＯＲＦをコードする１．６ｋＢ断片を、プライマーＳｃ．ＳＵＣ２−５’（配列番号２３）およびＳｃ．ＳＵＣ２−３’（配列番号２４）を使用して、Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）のゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは、アミノ酸位置２でＰｃｉＩ制限酵素部位を導入するように設計した（それによって、野生型Ｌｅｕ２残基がＰｈｅ２に変更されるが、Ｓｕｃ２の分泌過程に影響を及ぼさずにシグナル配列の疎水性が維持される）［Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：３１２−３１７（１９８７）］。反応混合物には、１μｌのゲノムＤＮＡ、１μｌの各プライマー、２μｌの水、および４５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれた。増幅は以下のように実施した：９４℃で５分間の初期変性、続いて９４℃で１５秒間の変性を３５サイクル、５５℃で３０秒間のアニーリング、および６８℃で２分間の伸長。６８℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後、４℃で反応を終了させた。次いで、ＳｃＳＵＣ２  ＯＲＦをＰｃｉＩＩ／ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、下記の構成要素（ＮｃｏＩおよびＰｃｉＩはイソ制限酵素である）を含有するプラスミドｐＹＲＨ６８（図３Ａ；配列番号１３）を作製するために利用した：
【０１６４】
【表６】
2014503216.tif 000008
【０１６５】
２コピーのＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２を含むｐＹＲＨ７０の構築
プラスミドｐＹＲＨ７０は、５’−シグナル配列を天然に含有する、２コピーの野生型完全長ＳｃＳＵＣ２遺伝子に相当する、２コピーのＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２（配列番号１２）を高発現させるために構築した。プラスミドｐＹＲＨ６８（配列番号１３）をＳａｌＩ／ＳｗａＩで切断して、第２のコピーとなる１．６ｋＢのＰｃｉＩＩ／ＮｏｔＩ  ＳｃＳＵＣ２断片を挿入した。具体的には、以下のものを含む４方向連結反応を準備した：１）ｐＹＲＨ６８ベクター骨格；２）ＰｃｉＩＩ／ＮｏｔＩ消化ＳｃＳＵＣ２断片；３）プラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２（配列番号２５；米国特許出願公開第２０１１−０２４４５１２−Ａ１号明細書に記載）から切り取られたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡプロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）を含む５３３ｂｐのＳａｌＩ／ＮｃｏＩ断片；および４）さらにｐＺＫＬＹ−ＰＰ２（配列番号２５）から切り取られた、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｌｉｐ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）由来のＬｉｐ１ターミネーター配列を含む３２２ｂｐのＮｏｔＩ／ＳｗａＩ断片。これにより、ｐＹＲＨ７０（図３Ｂ；配列番号１４）の合成物が得られた。
【０１６６】
ＸＰＲ２ＰＰ＋１３もＳＵＣ２ＳＳも含有しないｍ−ＳｃＳＵＣ２を含むｐＹＲＨ７３の構築
プラスミドｐＹＲＨ７３は、Ｓｕｃ２シグナル配列（「ＳｕｃＳＳ」；配列番号８）を欠損する、インベルターゼをコードする「成熟」ＳｃＳＵＣ２遺伝子（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」；配列番号４）を高発現させるために構築した。したがって、５’−シグナル配列を天然に含有する野生型完全長ＳｃＳＵＣ２遺伝子からＳｕｃＳＳの５’−シグナル配列（配列番号２のヌクレオチド１〜５７に相当する）を切断した。成熟ＳｃＳＵＣ２遺伝子にまたがる１．５５ｋＢ断片を、プライマーＳｃ．ＳＵＣ２−５’（配列番号２３）およびｎＳｃ．ＳＵＣ２−３’（配列番号２６）を使用して、Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３のゲノムＤＮＡから増幅した。次いで、この断片をＰｃｉＩＩ／ＮｏｔＩで切断し、上記と同じ方法でＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ベクターにクローニングしてプラスミドｐＹＲＨ７３（図４Ａ；配列番号１５）を作製した。
【０１６７】
ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２を含むｐＹＲＨ６９の構築
プラスミドｐＹＲＨ６９は、インベルターゼをコードする「成熟」ＳｃＳＵＣ２遺伝子（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」配列番号４）に融合したＳＵＣ２シグナル配列［「Ｓｕｃ２ＳＳ」；配列番号８］に融合したＸＰＲ２プレプロ領域［「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３」；配列番号１０］を高発現させるために構築した。しかしながら、ｐＹＲＨ６８に関し上記したように、ＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２として本明細書に記載の人為的な融合物は、５’−シグナル配列を天然に含有する野生型完全長ＳｃＳＵＣ２遺伝子に相当する。したがって、ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ＳｕｃＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２として本明細書に記載し、また配列番号１６および１７として示した、この特定のコンストラクトは、事実上、完全長ＳｃＳＵＣ２遺伝子にＸＰＲ２ＰＰ＋１３を融合したものである。
【０１６８】
上記に論述したように、配列番号１０のＸＰＲ２ＰＰ＋１３領域は、配列番号６のアミノ酸１〜１７０をコードするように設計されており、そのためＬｙｓ１５６−Ａｒｇ１５７切断部位にＸｐｒ６エンドペプチダーゼが確実に到達するように、プレプロ領域の後にＸｐｒ２の追加の１３個のアミノ酸をコードしている。
【０１６９】
最初に、完全長ＳｃＳＵＣ２  ＯＲＦをコードする１．６ｋＢ断片を増幅し、上記のプラスミドｐＹＲＨ６８構築中に利用した同一の方法でＰｃｉＩ／ＮｏｔＩを用いて切断した。次いで、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＸＰＲ２遺伝子のＮ末端１７０個のアミノ酸（すなわち、１５７個のアミノ酸のプレプロ領域および成熟ＡＥＰタンパク質のＮ末端１３個のアミノ酸を含む）（すなわち、配列番号９およびＮｃｏＩおよびＰｃｉＩ制限酵素に対応するフランキング配列）をコードする断片を、プライマーＹｌ．ＸＰＲ２−５’（配列番号２７）およびＹｌ．ＸＰＲ２−３’（配列番号２８）を使用してＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２のゲノムＤＮＡから増幅した。消化に続いて、ＰｃｉＩ／ＮｃｏＩ消化による５１３ｂｐのＸＰＲ２ＰＰ＋１３断片が生成した。
【０１７０】
ＰｃｉＩおよびＮｃｏＩ消化末端が適合するので、ＰｃｉＩ／ＮｃｏＩ消化による５１３ｂｐのＸＰＲ２ＰＰ＋１３断片およびＰｃｉＩ／ＮｏｔＩ消化による１．６ｋＢのＳｃＳＵＣ２断片を、ＰｃｉＩ／ＮｏｔＩ消化によるｐＹＲＨ６８骨格に挿入して、ｐＹＲＨ６９（図４Ｂ；配列番号１８）を作製した。ＰｃｉＩ／ＮｃｏＩ消化による５１３ｂｐのＸＰＲ２ＰＰ＋１３断片の配向を確認した。
【０１７１】
プライマーＹｌ．ＸＰＲ２−５’（配列番号２７）およびＹｌ．ＸＰＲ２−３’（配列番号２８）によるｐＹＲＨ６９の配列決定により、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２の配列番号９で示されるＸＰＲ２ＰＰ＋１３配列が公表されたＸＰＲ２配列（Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：４９０４−４９１６（１９８８））に１００％同一であることが確認された。
【０１７２】
ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２を含むｐＹＲＨ７４の構築
プラスミドｐＹＲＨ７４は、インベルターゼをコードする「成熟」ＳｃＳＵＣ２遺伝子（「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」；配列番号４）に融合したＸＰＲ２プレプロ領域［「ＸＰＲ２ＰＰ＋１３」；配列番号１０］を高発現させるために構築した。
【０１７３】
成熟ＳｃＳＵＣ２遺伝子にまたがる１．５５ｋＢ断片を、プライマーＳｃ．ＳＵＣ２−５’（配列番号２３）およびｎＳｃ．ＳＵＣ２−３’（配列番号２４）を使用して、Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３のゲノムＤＮＡから増幅した。
【０１７４】
具体的には、成熟ＳｃＳＵＣ２遺伝子を含む１．５５ｋＢのＰｃｉＩ／ＮｏｔＩ断片および５１３ｂｐのＰｃｉＩ／ＮｃｏＩ  ＸＰＲ２ＰＰ＋１３断片を、それぞれプラスミドｐＹＲＨ７３およびプラスミドｐＹＲＨ６９のために上記のように調製した。これらの断片をｐＹＲＨ６８骨格と連結して、プラスミドｐＹＲＨ７４（図５；配列番号２１）を作製した。
【０１７５】
実施例３
唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかを用いて増殖させたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における、プラスミドｐＹＲＨ６８、ｐＹＲＨ６９、ｐＹＲＨ７０、ｐＹＲＨ７３、およびｐＹＲＨ７４の形質転換および発現
プラスミドｐＹＲＨ６８、ｐＹＲＨ６９、ｐＹＲＨ７０、ｐＹＲＨ７３、およびｐＹＲＨ７４を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株（実施例５）およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８Ｕ株（実施例６）（両方とも大量のＥＰＡ％ＴＦＡを産生させるために遺伝子操作された株）に形質転換するためにＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで別々に消化した。形質転換体は、唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかを含む種々の培地上で増殖させた。
【０１７６】
具体的には、形質転換体を、ウラシルを欠損するＳＤ培地プレート上で最初に選択した（全般的方法）。下記の表６に記載のように、種々のＹ４１８４ＵおよびＺ１９７８Ｕの形質転換体株が生成した。
【０１７７】
【表７】
2014503216.tif 000009
【０１７８】
Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株およびＹ４１８４株（対照）の増殖を、ＳＤ（すなわち、グルコース）およびＳＳ（すなわち、スクロース）培地で比較した。スクロースの加水分解を回避するために、培地は高圧蒸気滅菌の代わりに濾過により滅菌した。具体的には、細胞を０．０３のＯＤ６００で接種し、３０℃で増殖させた。図６に示すように、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株はスクロースで極めて良好に増殖したが、対照Ｙ４１８４株は唯一の炭素源としてのスクロース上で増殖しなかった。唯一の炭素源としてグルコースが供給された場合には、両株とも同様に増殖した。Ｙ４１８４Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株もスクロースで増殖しなかった（データを示さず）；２つの異なるシグナル配列が互いに干渉し、分泌過程を妨害しうることが仮定される。
【０１７９】
次に、Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８株（対照）の増殖を、唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかを含むＦＭで比較した。スクロースの加水分解を回避するために、培地は高圧蒸気滅菌の代わりに濾過により滅菌した。細胞を０．０３のＯＤ６００で接種し、３０℃で増殖させた。すべての株が、唯一の炭素源としてグルコースを含有するＦＭでは同等に増殖した（図７Ａ）。唯一の炭素源としてスクロースを含有するＦＭでは（図７Ｂ）、Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株は極めて良好に増殖したが、Ｚ１９７８Ｕ＋ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８株（対照）はほとんど増殖しなかった；実際、残存する増殖は炭素源として酵母抽出物を使用する細胞の能力による可能性がある。
【０１８０】
したがって、Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２（配列番号１２）およびＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２（配列番号２０）の両方の高発現は、唯一の炭素源としてスクロースを含有する培地で増殖することができる、形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株をもたらした。
【０１８１】
実施例４
唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかで増殖させた形質転換体ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における脂質含量および組成
本実施例は、唯一の炭素源としてスクロースを含有する培地で増殖させる場合における、Ｓ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞外インベルターゼを高発現するＺ１９７８株（すなわち、Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株）の脂質含量および組成について検討する。これらの株で蓄積された脂質のレベルおよび組成は、グルコースを唯一の炭素源として増殖させた対照株と同等であった。
【０１８２】
Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株における総脂質含量および脂肪組成に対するスクロース利用の影響を評価するために、全般的方法に記載のように、株の重複培養物を、ＨＳＭ（唯一の炭素源としてスクロース）中の同等油性条件下で増殖させた。したがって、ＨＧＭ（唯一の炭素源としてグルコース）中の同等油性条件下で増殖させて、Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２の２つの培養物（それぞれ培養物ＲＨＹ２４３およびＲＨＹ２４４と命名）を対照Ｚ１９７８株の二つ組試料と比較した。より具体的には、最初に２５ｍＬのＳＤまたはＳＳ培地中にて３０℃で４８時間、好気的に培養物を増殖させることにより油性条件を達成し、次いで遠心分離により回収した。次いで、ペレットを２５ｍＬのＨＧＭまたはＨＳＭのいずれかに再懸濁し、これらの培養物を振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍおよび３０℃で５日間さらにインキュベートした。
【０１８３】
これらの株についての乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡ生産性（すなわち、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］）を下記の表７に示す。ここでは、平均を灰色で強調し、「平均」として示す。脂肪酸の略語は以下のとおりである：オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、およびエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」、２０：５）。
【０１８４】
【表８】
2014503216.tif 000010
【０１８５】
表７の結果より、スクロース上で増殖させたＺ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株におけるＴＦＡ％ＤＣＷがグルコース上で増殖させたＺ１９７８株と同様であることが示された。しかしながら、スクロースを唯一の炭素源とした場合、平均のＥＰＡ％ＤＣＷが約１０％減少することが観察された。
【０１８６】
Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株における株性能に何らかの変化があるか否かを判定するために、グルコースまたはスクロースのいずれかを唯一の炭素源として、ＲＨＹ２４３（表７）を二つ組で増殖させた。表８に、表７で使用したのと同様のフォーマットで、ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、％ＴＦＡとしての各脂肪酸の濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０１８７】
【表９】
2014503216.tif 000011
【０１８８】
表８の結果より、スクロース上で増殖させたＺ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株のＴＦＡ％ＤＣＷが、グルコース上で増殖させた場合の同株の脂質含量と同様であることが示された。しかしながら、スクロースを唯一の炭素源とした場合、平均のＥＰＡ％ＤＣＷが約１０％減少することが観察された。
【０１８９】
さらに、全般的方法に記載のように、ＨＳＭ（唯一の炭素源としてスクロース）中の同等油性条件下で増殖させたときの、Ｚ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２の２つの培養物（すなわち、ＲＨＹ２４３およびＲＨＹ２４４）、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２の３つの培養物（ＲＨＹ２４８、ＲＨＹ２４９、およびＲＨＹ２５０と命名）、およびＺ１９７８＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２の３つの培養物（ＲＨＹ２５７、ＲＨＹ２５８、およびＲＨＹ２５９と命名）の総脂質含量および脂肪酸組成を比較した。これらの株を、ＨＧＭ（唯一の炭素源としてグルコース）中の同等油性条件下で増殖させた対照Ｚ１９７８株の二つ組試料と比較した。
【０１９０】
表９に、表７で使用したのと同様のフォーマットで、ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、％ＴＦＡとしての各脂肪酸の濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０１９１】
【表１０】
2014503216.tif 000012
【０１９２】
上記の結果より、スクロースを唯一の炭素源として増殖させたＺ１９７８Ｕ＋Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、Ｚ１９７８Ｕ＋２＿Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株、およびＺ１９７８＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株のＴＦＡ％ＤＣＷおよびＥＰＡ％ＤＣＷは、グルコースで増殖させた対照株Ｚ１９７８のＴＦＡ％ＤＣＷおよびＥＰＡ％ＤＣＷとの差が１０％未満であることが示された。３つのＳＵＣ２操作株のうち、Ｚ１９７８＋ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２株がＥＰＡ％ＤＣＷについて最良の性能を示した。３つのＳＵＣ２発現株はすべて、対照Ｚ１９７８株よりも、最大１４％高い最終ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）を一貫して示した。したがって、ＥＰＡの容積生産性は、対照Ｚ１９７８株と操作されたスクロース利用株との間で同様である。
【０１９３】
実施例５
高ＥＰＡ生産性のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４株およびＹ４１８４Ｕ株の生成
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株は、上記の実施例３で宿主として使用した。Ｙ４１８４Ｕ株は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来し、デルタ−９エロンゲース／デルタ−８デサチュラーゼ経路の発現により、総脂質に対してＥＰＡを高く産生することができる。この株はＵｒａ−表現型を示し、その構築は、参照により本明細書に組み込むＰＣＴ国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載されている。
【０１９４】
Ｙ４１８４Ｕ株の開発は、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株、Ｙ４０６９株、Ｙ４０８４株、Ｙ４０８４Ｕ１株、Ｙ４１２７株（２００７年１１月２９日に受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８８０２で米国培養細胞系統保存機関に寄託された）、Ｙ４１２７Ｕ２株、Ｙ４１５８株、Ｙ４１５８Ｕ１株、およびＹ４１８４株の構築を必要とした。
【０１９５】
野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ４１８４株（総脂質の３０．７％のＥＰＡを産生する）の最終的な遺伝子型は、未知１−、未知２−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：Ｒｄ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった。
【０１９６】
上記略語は以下のとおりである：ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンゲース遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）デルタ−９エロンゲース遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来する、コドン最適化デルタ−９エロンゲース遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成変異体デルタ−８デサチュラーゼ［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デルタ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化デルタ−１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ５は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）デルタ−５デサチュラーゼ［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＥｇＤ５Ｓは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来するコドン最適化デルタ−５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＲＤ５Ｓは、ペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６［米国特許第６，２５５，４９７号明細書］に由来するコドン最適化デルタ−５デサチュラーゼであり；ＰａＤ１７は、ピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）デルタ−１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化デルタ−１７デサチュラーゼであり；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］である。
【０１９７】
最終的に、Ｙ４１８４株におけるＵｒａ３遺伝子を破壊するために、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（ＰＣＴ国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットおよびその中の配列番号７８）を使用して、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ４１８４株のＵｒａ３遺伝子に組み込み、Ｙ４１８４Ｕ１株（総脂質の１１．２％のＥＰＡ）、Ｙ４１８４Ｕ２株（総脂質の１０．６％のＥＰＡ）、およびＹ４１８４Ｕ４株（総脂質の１５．５％のＥＰＡ）（まとめてＹ４１８４Ｕ）をそれぞれ得た。
【０１９８】
国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットが、異なる増殖条件による、Ｙ４１８４（３０．７％）対Ｙ４１８４Ｕ（平均１２．４％）における、定量化されたＥＰＡ％ＴＦＡの差異について記載していることに留意されたい。
【０１９９】
実施例６
高ＥＰＡ生産性のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株およびＺ１９７８Ｕ株の生成
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８Ｕ株は、上記の実施例３で宿主として使用した。Ｚ１９７８Ｕ株は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来し、デルタ−９エロンゲース／デルタ−８デサチュラーゼ経路の発現により、総脂質に対してＥＰＡを高く産生することができる。この株はＵｒａ−表現型を示し、その構築は、参照により本明細書に組み込む米国特許出願第１３／２１８，７０８号明細書（２０１１年８月２６日に出願されたＥ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，代理人整理番号ＣＬ５４１１ＵＳＮＡ）の実施例２に記載されている。
【０２００】
Ｚ１９７８Ｕ株の開発は、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株、Ｌ１３５株、Ｌ１３５Ｕ９株、Ｙ８００２株、Ｙ８００６株、Ｙ８００６Ｕ株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５４Ｕ株、Ｙ８２６９株、Ｙ８２６９Ｕ株、Ｙ８４１２株（２００９年５月１４日に受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１００２６で米国培養細胞系統保存機関に寄託された）、Ｙ８４１２Ｕ株、Ｙ８６４７株、Ｙ８４６７Ｕ株、Ｙ９０２８株、Ｙ９０２８Ｕ株、Ｙ９５０２株、Ｙ９５０２Ｕ株、およびＺ１９７８株の構築を必要とした。
【０２０１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の遺伝子型
Ｙ９５０２株の生成は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。Ｙ９５０２株は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来し、デルタ−９エロンゲース／デルタ−８デサチュラーゼ経路の発現により、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを産生することができた。
【０２０２】
野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ９５０２株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、未知９−、未知１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐ
ｅｘ１６であった。
【０２０３】
上記で使用され、実施例５で記載されなかった略語は以下のとおりである：ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナアナベーナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化デルタ−８デサチュラーゼ遺伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化デルタ−９エロンゲース遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）を、デルタ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（上記）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］に連結することにより作製されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、デルタ−９エロンゲース「ＥｇＤ９ｅＳ」（上記）を、デルタ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（上記）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］に連結することにより作製されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、Ｅ．アナベーナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化デルタ−９エロンゲース遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）を、デルタ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（上記）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］に連結することにより作製されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する、変異ＨＰＧモチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含む合成変異体デルタ−５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＥａＤ５ＳＭは、Ｅ．アナベーナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］に由来する、変異ＨａＧＧモチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含む合成変異体デルタ−５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来する、コドン最適化マロニルＣｏＡ合成酵素遺伝子であり、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【０２０４】
Ｙ９５０２株における総脂質含量および組成の詳細な分析のために、細胞を合計７日間、２段階で増殖させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づくと、Ｙ９５０２株は、３．８ｇ／ＬのＤＣＷ、３７．１のＴＦＡ％ＤＣＷ、２１．３のＥＰＡ％ＤＣＷを産生し、脂質プロフィールは以下のとおりであった（各脂肪酸の濃度はＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］として示す）：１６：０（パルミチン酸）−２．５、１６：１（パルミトレイン酸）――０．５、１８：０（ステアリン酸）――２．９、１８：１（オレイン酸）――５．０、１８：２（ＬＡ）−１２．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−３．５、ＤＧＬＡ−３．３、ＡＲＡ−−０．８、ＥＴｒＡ−−０．７、ＥＴＡ−２．４、ＥＰＡ−５７．０、その他−７．５。
【０２０５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の生成
Ｙ９５０２株からのＺ１９７８株の開発は、参照により本明細書で組み込む米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書（米国特許出願第１３／２１８，５９１号明細書に対応する）および米国仮特許出願第６１／４２８，２７７号明細書（米国特許出願第１３／２１８，６７３号明細書に対応する）に最初に記載された。
【０２０６】
具体的には、Ｙ９５０２株におけるＵｒａ３遺伝子を破壊するために、全般的方法に従って、ＳａｌＩ／ＰａｃＩ消化コンストラクトｐＺＫＵＭ（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、その中の表１５、配列番号１３３、および図８Ａを参照のこと）を使用して、Ｕｒａ３変異遺伝子をＹ９５０２株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計２７の形質転換体（８つの形質転換体を含む第１群、８つの形質転換体を含む第２群、および１１の形質転換体を含む第３群から選択された）を、最少培地＋５−フルオロオロチン酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］選択プレート上で増殖させ、３０℃で２〜５日間維持した。ＭＭ＋５−ＦＯＡは以下のものを含む（１リットル当たり）：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素基礎培地、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジン、および１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づいた（供給業者から入手した各バッチ内で変動があるので）適正量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）。
【０２０７】
さらなる実験により、第３群の形質転換体のみが実際のＵｒａ−表現型を示すことが決定された。
【０２０８】
全般的方法に従って、Ｕｒａ−細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取り、脂肪酸分析に付した。このようにして、ＧＣ分析より、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖させた第３群のｐＺＫＵＭ−形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０、および＃１１において、それぞれＴＦＡの２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％、および２９．６％のＥＰＡが存在することが示された。これら７株はそれぞれ、Ｙ９５０２Ｕ１２株、Ｙ９５０２Ｕ１４株、Ｙ９５０２Ｕ１７株、Ｙ９５０２Ｕ１８株、Ｙ９５０２Ｕ１９株、Ｙ９５０２Ｕ２１株、およびＹ９５０２Ｕ２２株（まとめてＹ９５０２Ｕ）と命名した。
【０２０９】
次いで、コンストラクトｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ（図９；配列番号２９）を生成して、１つのデルタ−９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ遺伝子、および１つのデルタ−９エロンゲース変異遺伝子を、Ｙ９５０２Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２１）に組み込んだ。したがって、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎプラスミドは下記の構成要素を含有した：
【０２１０】
【表１１】
2014503216.tif 000013
【０２１１】
ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いでＹ９５０２Ｕ１７株の形質転換に使用した。形質転換細胞を最少培地［「ＭＭ」］プレート上に播種し、３０℃で３〜４日間維持した。ＭＭプレートは以下のものを含んだ（１リットル当たり）：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸非含有ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、１．０ｇのプロリン、およびｐＨ６．１（調整不要）。単一コロニーをＭＭプレート上に再画線し、次いで３０℃で液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離により回収してＨＧＭに再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。細胞を上記の脂肪酸分析に付した。
【０２１２】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎを含有するＹ９５０２Ｕ１７から選択された９６株の大部分がＴＦＡの５０〜５６％のＥＰＡを産生することが示された。ＴＦＡの約５９．０％、５６．６％、５８．９％、５６．５％、および５７．６％のＥＰＡを産生する５株（すなわち、＃３１、＃３２、＃３５、＃７０、および＃８０）を、それぞれＺ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株、およびＺ１９８１株と命名した。
【０２１３】
野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対して、これらのｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ形質転換株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、未知９−、未知１０−、未知１１−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０２１４】
Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株、およびＺ１９８１株におけるＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２）のノックアウトは、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎによる形質転換により生成した、これらのＥＰＡ株のいずれにも確認されなかった。
【０２１５】
Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株、およびＺ１９８１株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖させて、総脂質含量および組成について分析した。具体的には、全般的方法に記載のように、フラスコアッセイを実施した。下記の表１１に、これらの株のそれぞれにおける総脂質含量および組成を要約する（すなわち、総ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］の重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷ）。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（リノール酸）、ＡＬＡ（アルファ−リノレン酸）、ＥＤＡ（エイコサジエン酸）、ＤＧＬＡ（ジホモ−ガンマ−リノレン酸）、ＡＲＡ（アラキドン酸）、ＥＴｒＡ（エイコサトリエン酸）、ＥＴＡ（エイコサテトラエン酸）、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、およびその他である。
【０２１６】
【表１２】
2014503216.tif 000014
【０２１７】
Ｚ１９７８株は、続いて部分的なゲノム配列決定に付された。この研究により、米国特許出願第１３／２１８，６７３号明細書に記載のように、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに組み込まれた６つのデルタ−５デサチュラーゼ遺伝子（すなわち、キメラ遺伝子ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ）の代わりに、実際には４つのデルタ−５デサチュラーゼ遺伝子（すなわち、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、およびＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ）のみを操作された株が含有していることが判明した。
【０２１８】
Ｚ１９７８株におけるＵｒａ３遺伝子を破壊するために、コンストラクトｐＺＫＵＭ（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、その中の表１５、配列番号１３３、および図８Ａを参照のこと）を使用して、Ｙ９５０２株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法で、Ｕｒａ３変異遺伝子をＺ１９７８株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計１６の形質転換体（８つの形質転換体を含む第１の「Ｂ」群および８つの形質転換体を含む第２の「Ｃ」群から選択された）を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２１９】
ＧＣ分析により、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖させたＢ群ｐＺＫＵＭ−形質転換体株＃１、＃２、＃３、および＃４に、それぞれＴＦＡの３０．８％、３１％、３０．９％、および３１．３％のＥＰＡが存在することが示された。これらの４株を、それぞれＺ１９７８ＢＵ１株、Ｚ１９７８ＢＵ２株、Ｚ１９７８ＢＵ３株、およびＺ１９７８ＢＵ４株と命名した。
【０２２０】
ＧＣ分析により、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖させたＣ群ｐＺＫＵＭ−形質転換体株＃１、＃２、＃５、および＃６に、それぞれＴＦＡの３４．４％、３１．９％、３１．２％、および３１％のＥＰＡが存在することが示された。これらの４株を、それぞれＺ１９７８ＣＵ１株、Ｚ１９７８ＣＵ２株、Ｚ１９７８ＣＵ３株、およびＺ１９７８ＣＵ４株と命名した。
【０２２１】
Ｚ１９７８ＢＵ１株、Ｚ１９７８ＢＵ２株、Ｚ１９７８ＢＵ３株、Ｚ１９７８ＢＵ４株、Ｚ１９７８ＣＵ１株、Ｚ１９７８ＣＵ２株、Ｚ１９７８ＣＵ３株、およびＺ１９７８ＣＵ４株を、まとめてＺ１９７８Ｕ株と命名した。
【０２２２】
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体における分泌されたインベルターゼの局在
プラスミドｐＹＲＨ６８（配列番号１３、Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２融合物を含む）、ｐＹＲＨ７３（配列番号１５、ｍ−ＳｃＳＵＣ２のみを含む）、ｐＹＲＨ６９（配列番号１８、ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／Ｓｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳＵＣ２融合物を含む）、および／またはｐＹＲＨ７４（配列番号２１、ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳＵＣ２融合物を含む）を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４Ｕ株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律変異からの５−フルオロオロチン酸［「ＦＯＡ」］抵抗性変異体）またはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８Ｕ株（実施例６）のいずれかへの形質転換のために、ＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで別々に消化した。インベルターゼ活性は、形質転換体全細胞およびその培地で測定した。
【０２２３】
インベルターゼ活性のアッセイ
インビボでのインベルターゼ活性を、Ｓｉｌｖｅｉｒａら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３８：２６−２８（１９９６））の記載を若干修正して、全細胞を使用して測定した。手短に言えば、ＳＤまたはＳＳ培地中で指数関数的に増殖している細胞（１．４〜１．８のＯＤ６００）４０ｍｇ（乾燥細胞重量）を４℃で遠心分離して回収し、冷酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）で３回洗浄した。細胞を３０℃で１５分間、１００ｍＭ  ＮａＦ８ｍＬ中で撹拌しながらインキュベートした。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中の３００ｍＭスクロース溶液を４ｍＬ添加した後、１０分までの種々の時間間隔でインベルターゼ活性を、Ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦ  ０．２μ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を使用して濾過した後にグルコースアナライザー（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。酵素活性の１単位（Ｕ）を１分当たりに生成されるグルコースのμｍｏｌと定義し、生成量を計算してＤＣＷ１グラム当たりのインベルターゼ活性単位を得た。
【０２２４】
培地からのインベルターゼ活性は、濾過した培地１．５ｍＬで測定した。試料中の残存した糖をすべて除去するために、試料を４℃で一晩、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析した。透析試料（２００μｌ）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の３００ｍＭスクロース溶液１００μｌと共に最大３０分間インキュベートした。５０μｌのＫ２ＨＰＯ４を加え、直ちに９５℃加熱ブロックに１０分間置いて反応を停止した。インベルターゼ活性をグルコースアナライザー（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により測定した。培地１リットル当たりのインベルターゼ活性単位として活性を計算し、タンパク質１ｍｇ当たりの単位として比活性を計算した。生成量を計算して、培養物のＤＣＷ１グラム当たりのインベルターゼ活性単位を得た。
【０２２５】
形質転換体Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４Ｕ  ＳＵＣ＋株における細胞外および全細胞のインベルターゼ活性
細胞外および全細胞のインベルターゼ活性は、それぞれ培養上清および全細胞を使用して、指数関数的に増殖する細胞で測定した。下記の表１２に示すように、２つの独立した実験から少なくとも４つのアッセイを実施して、平均値を報告する。
【０２２６】
【表１３】
2014503216.tif 000015
【０２２７】
増殖研究の結果と一致して、インベルターゼ活性は、ｐＹＲＨ６８またはｐＹＲＨ７４で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の培養上清および全細胞で観察された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体のｐＲＨ６９およびｐＲＨ７３はスクロース培地上で増殖せず、グルコース培地で増殖させた細胞培養物には、検出可能な細胞外または全細胞のインベルターゼ活性はなかった。
【０２２８】
インベルターゼ活性は、ＸＰＲ２ＰＰ＋１３／ｍ−ＳｃＳｕｃ２に対してＳｕｃ２ＳＳ／ｍ−ＳｃＳｕｃ２の形質転換体において若干高くなった。成熟Ｘｐｒ２の１３個のアミノ酸を追加しても、分泌シグナルプロセシングに必要なエンドペプチダーゼへの到達には依然として何らかの二次構造上の障害が存在した可能性がある。しかしながら、両方のＳＵＣ＋株について９８％超のインベルターゼ活性が培地に検出され、培養上清中のバイオマス当たりの細胞外インベルターゼ活性が、以前の報告よりも高いことが観察された。
【０２２９】
形質転換体Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ１９７８Ｕ  ＳＵＣ＋株における細胞外および全細胞のインベルターゼ活性
インベルターゼ活性は、形質転換体の全細胞およびその培地で測定した。唯一の炭素源としてグルコースまたはスクロースを含有するＹＰ（１０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ酵母抽出物および２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏペプトン）培地で培養物を増殖させた。下記の表１３に示すように、２つの異なる形質転換体についてＳＵＣ２コンストラクトのそれぞれを試験し、平均値を報告する。
【０２３０】
【表１４】
2014503216.tif 000016
【０２３１】
ＹＰベースの培地のタンパク質濃度は、合成ベースの培地よりも顕著に高く（表１２）、インベルターゼ比活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）を低下させた。これにもかかわらず、ｐＲＨＹ６８形質転換体は、グルコースとスクロースの培養物間で同様のインベルターゼ活性を示し、９０％超のインベルターゼ活性が培地中に検出された。ｐＹＲＨ７４形質転換体については、一方の形質転換体が、他方の形質転換体よりも、すべての試験条件において、はるかに高いインベルターゼ活性を示した。したがって、平均インベルターゼ活性は大きな標準誤差を伴って上昇した。それでも、９０％超のインベルターゼ活性が、唯一の炭素源としてグルコースまたはスクロースのいずれかを含有した培地中で検出された。
【０２３２】
実施例８
インベルターゼをコードする公的に入手可能な遺伝子の同定
サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼは、配列番号１として本明細書に示すＳＵＣ２遺伝子によりコードされる。この１５９９ｂｐの遺伝子は、グリコシル化形態でＳ．セルビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の周辺質に分泌される、５３２個のアミノ酸の完全長インベルターゼ（配列番号２）をコードする。これに対して、１９個のアミノ酸長の５’シグナル配列（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１〜５７によりコードされる）を欠損する「成熟」ＳｃＳＵＣ２遺伝子［「ｍ−ＳｃＳＵＣ２」］は、配列番号３として示され、配列番号４のタンパク質をコードする。
【０２３３】
ｍ−ＳｃＳＵＣ２をコードするタンパク質配列（配列番号４）を使用して、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ゲノムショットガン（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ）「［ＷＧＳ」］プロジェクトからの環境試料を除く、非重複性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、プロテインデータバンク「［ＰＤＢ」］タンパク質配列データベース、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ「［ＰＩＲ」］タンパク質配列データベース、および蛋白質研究奨励会「［ＰＲＦ」］タンパク質配列データベースをすべて含む）内の類似性を有する配列を同定するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）「［ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２６＋（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１−５１０９（２００５））検索を実施した。
【０２３４】
配列番号４が最大の類似性を有する配列を要約したＢＬＡＳＴＰ比較の結果を、％同一性、％類似性、および期待値に従って報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸のパーセントとして定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一または保存のアミノ酸のパーセントとして定義される。「期待値」は、このサイズのデータベース検索においてまったく偶然に期待されるマッチの数を特定し、所与のスコアを用いてマッチの統計的有意性を評価する。
【０２３５】
多くのタンパク質が、ｍ−ＳｃＳＵＣ２（配列番号４）と有意な類似性を共有するとして同定された。表１４に、期待値が「４ｅ−９０」以上で、「インベルターゼ」または「ベータ−フルクトフラノシダーゼ」のいずれかとして具体的にタンパク質を同定したアノテーションを有するヒットの部分的な要約を示す。ただし、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するヒットはすべて、以下に報告の結果から除外した。表１４のタンパク質は、配列番号４と９１％〜９９％の間のクエリーカバレッジ（ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を共有した。
【０２３６】
【表１５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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