(57)【要約】  生体適合性で生物活性を有する、合成ポリマーおよびセラミックの複合材料繊維状および非繊維状マトリックスが記載される。前記複合材料マトリックスは骨細胞分化を支持し、単独で、または全骨髄、単離された間葉系幹細胞および／もしくは骨移植片と共に、骨修復および骨再生に使用することができる。【選択図】図７
2014527435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の電界紡糸または溶媒キャスト合成ポリマーを含み、前記ポリマー全体に均一に分散されたナノセラミックを含む、細胞および組織の成長を支持することが可能な生体適合性および生物分解性複合材料骨マトリックス。
【請求項２】
ナノセラミックが50〜200ナノメーターの直径を有する、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項３】
マトリックスの空隙率が60〜90パーセントである、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項４】
マトリックスの空隙率が80〜85パーセントである、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項５】
マトリックスが、複数の電界紡糸繊維を形成する少なくとも1種の電界紡糸ポリマーを含み、前記繊維が100ナノメーターから100マイクロメーターの範囲の直径を有する、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項６】
複合材料骨マトリックスが少なくとも1種の電界紡糸合成ポリマーを含み、マトリックスが150〜400マイクロメーターの繊維間間隔を有する、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項７】
マトリックスが150〜250マイクロメーターの繊維間間隔を有する、請求項6に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項８】
マトリックスが少なくとも1種の溶媒キャスト合成ポリマーを含み、マトリックスが150〜400マイクロメーターの孔径を有する、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項９】
マトリックスが150〜250マイクロメーターの孔径を有する、請求項8に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項１０】
少なくとも1種の合成ポリマーがポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーである、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項１１】
ポリ(α-ヒドロキシ酸)が、ポリ乳酸、ポリL-乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-コ-グリコール酸、ポリε-カプロラクトン、ポリメタクリレート-コ-n-ブチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、およびポリエチレンオキシドからなる群より選択される、請求項10に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項１２】
少なくとも1種のセラミックが、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、生体活性ガラス、および二相性バイオセラミックからなる群より選択される、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項１３】
セラミックが二相性バイオセラミックのヒドロキシアパタイト/β-リン酸三カルシウムである、請求項8に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項１４】
(a) ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーを電界紡糸のための溶媒である塩化メチレンまたは溶媒キャストのための溶媒である1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールと混合して、ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーの濃度が5〜30%の範囲である溶液を形成すること；
(b) (a)の溶液に、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、生体活性ガラス、および二相性バイオセラミックからなる群より選択されるセラミックを、セラミックの濃度が5〜70%の範囲となるように加えること；および
(c) (b)の溶液を電界紡糸して繊維状マトリックスを形成すること、または
(d) (b)の溶液を鋳型に適用して非繊維状マトリックスを形成すること；および
(e) 工程(c)または工程(d)のマトリックスを凍結乾燥して乾燥したマトリックスを提供すること
の工程を含み、ここで、前記マトリックスが細胞および組織の成長を支持することが可能である、請求項1に記載の複合材料骨マトリックスを調製する方法。
【請求項１５】
工程(b)の溶液にポロゲンを加えること、および工程(e)の乾燥したマトリックスから浸出によりポロゲンを除去することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
(a) 請求項1に記載の複合材料骨マトリックスを脊椎動物被験体における骨欠損の中に導入すること；および
(b) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む、脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法。
【請求項１７】
さらに、複合材料骨マトリックスを骨欠損の中に導入する前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
(a) 請求項1に記載の複合材料骨マトリックスを骨移植片の切片の内部に導入すること；
(b) 工程(a)の骨移植片を骨欠損の中に挿入すること；および
(c) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む、脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法。
【請求項１９】
さらに、複合材料骨マトリックスをドナーの骨の切片の中に導入する前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
(a) 骨移植片の切片の外側周囲を請求項1に記載の複合材料骨マトリックスで包むこと；
(b) 工程(a)の骨移植片を骨欠損の中に挿入すること；および
(c) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む、脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法。
【請求項２１】
さらに、複合材料骨マトリックスでドナーの骨の切片の周囲を包む前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含む、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、骨修復適用において使用するための複合材料マトリックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
米国において毎年100万件以上の整形外科手術が、再建手術、外傷、または異常骨格欠損のためにおこなわれている(Pramer, A., et al., (eds):  Musculoskeletal Conditions in the United States, Rosemont, IL:  American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1999, p. 34-39)。関節固定の過程を促進するために利用される標準的技術は自家骨移植の適用である。腸骨稜移植片の採取は、それが骨形成活性、骨誘導および骨再生特性の3つの必須の形成要素を含む唯一の材料であるために、現在における理想的な選択である(Salgado, A.J., Macromolecules Bioscience 4:  743-765, 2004)。毎年およそ340,000人の患者が腸骨稜移植片採取法を受ける。しかしながら、自家骨移植は大きなコストがかかる。骨移植片採取は、痛み、瘢痕化、手術時間の増加、入院の長期化、リハビリテーションの遅れ、失血の増加、感染リスクの増加、および外科合併症（すなわち、骨折、血腫、神経腫等）に関してかなり高い臨床的罹患率を伴う。文献の総説により、該方法の31%において合併症が発生し、患者の27%が手術後24か月の時点で痛みを感じ続けていることが明らかにされた(Gupta, A.R., Int’l. Medical Journal 8:  163-166, 2001)。しばしば利用可能な移植片の量が最適以下であり、同種移植片による増強が必要になる。
【０００３】
別の方法として、再建の必要性に対して大きい固まりの同種移植片が利用されており、同等の代替法が存在しないために、これは現在のゴールドスタンダードとなっている(Aro, H.T., et al., Annals of Medicine 25:  403-412, 1993)。同種移植片は免疫拒絶反応を回避するために加工または失活されなければならないが、これは、自家移植と比較して細胞活性および治癒能力の損失をもたらす(Stevenson, S., et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 324:  66-74, 1996)。同種移植骨の方法は、移植片の取り込みの欠除、接合部位の合体の遅延、炎症性免疫現象、および感染症の可能性に起因する高い合併症率を伴う(Norman-Taylor, F.H. and Villar, R.N.,, Journal of Bone and Joint Surgery, Series B 79:  178-180, 1997)。主として骨腫瘍の治療のための一連の1100の非骨盤塊状死体同種移植片(non-pelvic massive cadaveric allografts)において、成功したのは61%のみであった(Mankin, H.J., Chir. Organi Mov. 88:  101-113, 2003)。構造同種移植片の新生骨形成および血管新生が限定的であるために、骨折および偽関節の合併症が主要な問題であった。骨折または移植片偽関節を修復する手術法の後に53例で二次感染が起こり、成功率が30%未満に減少した(Id.)。
【０００４】
これらの理由から、骨の再生および修復を提供する一方で、付随する罹患率および合併症を排除することが可能な代替法を開発および検証する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pramer, A., et al., (eds):  Musculoskeletal Conditions in the United States, Rosemont, IL:  American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1999, p. 34-39
【非特許文献２】Salgado, A.J., Macromolecules Bioscience 4:  743-765, 2004
【非特許文献３】Gupta, A.R., Int’l. Medical Journal 8:  163-166, 2001
【非特許文献４】Aro, H.T., et al., Annals of Medicine 25:  403-412, 1993
【非特許文献５】Stevenson, S., et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 324:  66-74, 1996
【非特許文献６】Norman-Taylor, F.H. and Villar, R.N.,, Journal of Bone and Joint Surgery, Series B 79:  178-180, 1997
【非特許文献７】Mankin, H.J., Chir. Organi Mov. 88:  101-113, 2003
【発明の概要】
【０００６】
少なくとも1種の電界紡糸(electrospun)または溶媒キャスト合成ポリマーを有し、前記ポリマー全体に均一に分散されたナノセラミックを有する、細胞および組織の成長を支持することが可能な生体適合性および生物分解性複合材料骨マトリックス(composite bone matrix)、ならびに前記骨マトリックスを製造する方法が提供される。
【０００７】
複合材料骨マトリックスは、
(a) ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーを電界紡糸のための溶媒である塩化メチレンまたは溶媒キャストのための溶媒である1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールと混合して、ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーの濃度が5〜30%の範囲である溶液を形成すること；
(b) ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーを電界紡糸法のための溶媒である塩化メチレンまたは溶媒キャスト法のための1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールと混合して、ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーの濃度が5〜30%の範囲である溶液を形成すること；
(c) (b)の溶液を電界紡糸して繊維状マトリックスを形成すること、または
(d) (b)の溶液を鋳型に適用して非繊維状マトリックスを形成すること；および
(e) 工程(c)または工程(d)のマトリックスを凍結乾燥して乾燥したマトリックスを提供すること
の工程により調製され、ここで、前記マトリックスは細胞および組織の成長を支持することが可能である。
【０００８】
脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法も提供される。第1の方法は、
(a) 脊椎動物被験体における骨欠損の中に複合材料骨マトリックスを導入すること；および
(b) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む。
【０００９】
第2の方法は、
(a) 移植骨の切片の内部に複合材料骨マトリックスを導入すること；
(b) 工程(a)の骨移植片を骨欠損の中に挿入すること；および
(c) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む。
【００１０】
第3の方法は、
(a) 移植骨の切片の外側周囲を複合材料骨マトリックスで包むこと；
(b) 工程(a)の骨移植片を骨欠損の中に挿入すること、および
(c) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む。
【００１１】
これらの方法のそれぞれは、さらに、複合材料骨マトリックスを骨欠損または移植骨に適用する前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】浸出後の電界紡糸および溶媒キャストPCL複合材料マトリックスの形態を示す図である。A. 肉眼形態を示す図である。B. 光学顕微鏡形態（バー = 50μm）を示す図である。
【図２】A. 電界紡糸PCL複合材料繊維の断面図である。B. カルシウムをターゲットとするエネルギー分散型X線分析(EDXA)により画像化された、Aの繊維内のセラミックの均一な分布を示すAの電界紡糸繊維を示す図である。C. カリウムをターゲットとするEDXAにより画像化された電界紡糸PCL複合材料繊維を示す図である。D. カリウムをターゲットとするEDXAにより画像化された溶媒キャストPCL複合材料繊維を示す図である。
【図３】溶媒キャストマトリックスの走査電子顕微鏡写真を示す図である。A. 倍率400xのPCL単独を示す図である。B. 倍率15,000xのPCL単独を示す図である。C. 400xのPCL複合材料を示す図である。D. 倍率15,000xのPCL複合材料を示す図である。
【図４】溶媒キャストマトリックスの走査電子顕微鏡写真を示す図である。A. 倍率400xのPCL単独 + ポロゲン浸出を示す図である。B. 倍率15,000xのPCL単独 + ポロゲン浸出を示す図である。C. 400xのPCL複合材料 + ポロゲン浸出を示す図である。D. 倍率15,000xのPCL複合材料 + ポロゲン浸出を示す図である。
【図５】PCLマトリックス上で培養したMSCの共焦点像（培養第7日、バー = 50μm）を示す図である。A. 電界紡糸、ポロゲン浸出、PCL単独マトリックスを示す図である。B. 溶媒キャスト、ポロゲン浸出、PCL単独マトリックスを示す図である。C. 電界紡糸PCL複合材料マトリックスを示す図である。D. 溶媒キャスト、ポロゲン浸出、PCL複合材料マトリックスを示す図である。
【図６】PCLマトリックス上で培養したMSCの共焦点像（培養第14日、バー = 50μm）を示す図である。A. 電界紡糸、ポロゲン浸出、PCL単独マトリックスを示す図である。B. 溶媒キャスト、ポロゲン浸出、PCL単独マトリックスを示す図である。C. 電界紡糸PCL複合材料マトリックスを示す図である。D. 溶媒キャスト、ポロゲン浸出、PCL複合材料マトリックスを示す図である。
【図７】標準成長培地中でのPCLマトリックス上のヒトMSCの骨および幹細胞マーカーの定量分析を示す図である。無充填PCL = PCL単独；複合材料MC + DMF =平均孔径<10μmを有するPCL複材料マトリックス；複合材料MC =孔径約150〜250μmを有するPCL複合材料マトリックス。A. 軟骨形成のマーカーであるアルカリホスファターゼの活性を示す図である。B. 骨形成マーカーであるオステオカルシンタンパク質レベルを示す図である。C. 多能性細胞マーカーであるSox-2の発現を示す図である。D. 骨形成原細胞マーカーであるRunx-2の発現を示す図である。E. 骨形成原細胞マーカーであるオステオカルシンの発現を示す図である。
【図８】移植の8週間後の電界紡糸PCLおよびPLGA複合材料マトリックス上のin vivo血管新生および骨形成を示す図である。A. PCL複合材料上の組織による血管（赤）の形成を示す図である。B. PLGA複合材料上の骨および軟骨組織（ピンク）の形成を示す図である。
【図９】in vivoのラット部分欠損における新しい骨の成長を示す図である。A. 空の未処理の欠損を示す図である。B. 欠損中のPLGA複合材料マトリックスを示す図である。C. 欠損中のPLGA複合材料マトリックスプラス全骨髄を示す図である。
【図１０】ラットの部分欠損中への移植の8週間後の、単離されたMSCを導入されたPCLおよびPLGA複合材料マトリックスと組み合わせた同種移植片上のin vivoの新しい骨の成長を示す図である。A. 同種移植片の内側のPLGA複合材料を示す図である。新しい骨はピンクである。B. 同種移植片の外側周囲を包むPLGA複合材料を示す図である。C. 同種移植片の内側のPCL複合材料を示す図である。D. 同種移植片の外側周囲を包むPCL複合材料を示す図である。E. 空の欠損（同種移植片およびマトリックスがない）を示す図である。宿主の骨は橙色である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
骨膜および骨内膜組織工学構築物に利用することができる骨再生のための生体適合性、生物分解性のマトリックスが開発された。マトリックスは、間葉系前駆細胞を収容し、骨組織の形成を促進するように設計される。複合材料マトリックスは、生物活性ナノセラミックを含有する合成ポリマーから構成され、機械的に柔軟である。用語「生物活性」は、移植されると生物組織と界面結合を形成し、間質液に曝された場合に表面の改変の結果として骨組織形成を増大させる合成材料を指す。マトリックスは完全に合成であり、宿主被験体中で炎症反応を誘導しない。マトリックスは単独で、または骨移植片と組み合わせて使用することができる。
【００１４】
複合材料マトリックスは単一のポリマーまたは混合ポリマーにより調製することができる。好適なポリマーとしては、ポリエステル、ポリ乳酸(PLA)、ポリL-乳酸(PLLA)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)、ポリε-カプロラクトン(PCL)、ポリメタクリレート-コ-n-ブチルメタクリレート(PMMA)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、およびポリエチレンオキシド(PEO)などのポリ(α-ヒドロキシ酸)が挙げられる。マトリックスの分解時間を増加または減少させるためにポリマーを混合して使用することができる。例えば、PCL(1〜1.5年)はPGA(3か月)よりもゆっくりと分解するので、これらのポリマーの混合された組み合わせを用いてマトリックスを形成することにより分解速度を調節することができる。マトリックスは5〜30 wt%、好ましくは10〜25 wt%の範囲の最終総ポリマー濃度を有する。
【００１５】
ナノ粒子セラミック（ナノセラミック）は、5〜70 wt%、好ましくは30〜50 wt%の最終総濃度でマトリックス中に存在し、直径50〜200 nmの範囲である。好適なナノセラミックとしては、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、生体活性ガラス、および二相性バイオセラミックが挙げられるが、これらに限定されない。マトリックスは1種以上のナノセラミックを含有し得る。好ましいナノセラミックは、二相性セラミックであるヒドロキシアパタイト/β-リン酸三カルシウム(HA/βTCP)であり、好ましくは20 HA/80βTCP重量パーセントのものである。ナノセラミックは購入可能であり、または公知の方法、例えば、Santos, G., et al., J. R. Soc. Interface, July 18, 2012, Epublicationに従って調製することができる。
【００１６】
マトリックスは、Patlolla, A., et al., Acta Biomaterialia 6:  90-101, 2010（この文献全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されるものなどの従来の方法を用いて、好ましくは、実施例1Aに記載される通りの電界紡糸により、または実施例1Bに記載される通りの溶媒キャストにより、マトリックス溶液から製造される。ポリマー（1種または複数種）を適切な溶媒に加えた後、ナノセラミック（1種または複数種）を加えてマトリックス溶液を形成する。特定のポリマーに対する適切な溶媒は当業者に公知であり、塩化メチレン(MC)、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)、アセトン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、および酢酸エチルが挙げられる。マトリックス溶液の好ましい実施形態としては、(1)MC溶媒中17 wt% PCLおよび30 wt% HA/βTCP(20/80 wt%)；(2)MC溶媒中22 wt% PLGA(75%ポリラクチド/25%グリコール酸)および30 wt% HA/βTCP(20/80 wt%)；(3)HFIP溶媒中17 wt% PCLおよび30 wt% HA/βTCP(20/80 wt%)；ならびに(4)HFIP溶媒中22 wt% PLGA(75/25)および30 wt% HA/βTCP(20/80 wt%)が挙げられるが、これらに限定されない。また、マトリックス溶液は、非イオン性界面活性剤、例えばSpan(登録商標)80、またはカチオン性界面活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)を含有してもよい。
【００１７】
マトリックスは、マトリックス溶液から電界紡糸または溶媒キャストにより調製される。図1に示される通り、電界紡糸マトリックスは繊維状であるが、溶媒キャストマトリックスはスポンジ様である。形成されたマトリックスは、残留する溶媒を除去するために空気乾燥または凍結乾燥することができる。凍結乾燥がより効果的な方法である。乾燥されたマトリックスは減圧下室温で少なくとも2年間保存した後も機能を保持する。
【００１８】
マトリックスの孔径およびマトリックスの空隙率は、実施例1に記載されるように、電界紡糸または溶媒キャストの前にマトリックス溶液に微粒子ポロゲンを加えた後、形成されたマトリックスからポロゲンを浸出させることにより増大させることができる。孔径およびマトリックス空隙率は使用するポロゲンの大きさおよび濃度を調節することにより修正することができる。好適なポロゲンとしては、CaCO3およびNaClなどの無機塩、ショ糖などの糖結晶、ゼラチン球およびパラフィン球が挙げられる。
【００１９】
電界紡糸複合材料マトリックスは、直径100ナノメーターから100マイクロメーターの範囲の繊維の形状を示す。繊維は図2に示される通りナノセラミックの均一な分散を示し、それが細胞の付着、浸潤および骨生物活性を増大させる。マトリックスの繊維間間隔は150〜400μm、好ましくは150〜250μmの範囲である。繊維間間隔は、部分的に、ポリマー濃度により決定される。マトリックス空隙率は60〜90%、好ましくは80〜85%の範囲である。複合材料マトリックスのヤング(Young)係数は海綿骨と同様であり、マトリックスはおよそ30%の最終引っ張り歪み(ultimate tensile strain)を有し、機械的柔軟性を示す。電界紡糸PCLおよびPCL複合材料マトリックスを図3に示す。
【００２０】
ポロゲン浸出をおこなった溶媒キャストマトリックスもナノセラミック（1種または複数種）の均一な分散および電界紡糸マトリックスのそれと同様のヤング係数を示す。溶媒キャストマトリックスの空隙率も60〜90%、好ましくは80〜85%であり、孔径は150〜400μm、好ましくは150〜250μmの範囲である。溶媒キャスト、ポロゲン浸出(SC/PL)PCLおよびPCL複合材料マトリックスを図4に示す。
【００２１】
マトリックスは骨組織の再生の刺激および骨欠損の修復に有用であり、単独で、または全骨髄もしくは単離された間葉系幹細胞(MSC)と組み合わせて使用することができる。骨髄およびMSCは宿主被験体から単離しても、ドナーから得てもよい。MSCを単離する方法は実施例2に記載されている。実施例3に記載され、図5〜7に示される通り、マトリックスに全骨髄または単離されたMSCを加えて適切な条件で培養することにより、in vitroで骨細胞分化を刺激することができる。
【００２２】
また、マトリックスは、in vivoでの骨分化の刺激および骨欠損の修復に有用である。実施例4に記載される通り、複合材料マトリックスは、単独で、または全骨髄もしくは単離されたMSCと組み合わせて、欠損部位に移植することができる。図8および9に示される通り、マトリックスはin vivoで血管形成、骨および軟骨の分化を刺激する。
【００２３】
一実施形態において、マトリックスはin vivoで骨欠損を修復するために骨同種移植片と組み合わせて使用される。実施例5に記載される通り、複合材料マトリックスは、適切な大きさに切り、同種移植片の内側表面を覆う髄管の内側に合わせた形状とすること、または骨同種移植片の外側周囲を包むための形状とすることができる。複合材料マトリックスは、材料の骨への結合を促進するナノセラミックの能力のために、同種移植片と接触界面を形成し、それにより骨再生および同種移植片の宿主骨との統合が改善され得る。複合材料マトリックスは、単独で、または全骨髄もしくは単離されたMSCと組み合わせて使用することができる。マトリックスは間葉系前駆細胞を収容し、骨組織形成を促進するが、これは天然の骨膜および骨内膜の主要な特質である。同種移植片の外側周囲を包んだ場合、複合材料マトリックスは代用骨膜として作用するように見え、同種移植片の内側に挿入された場合には代用骨内膜として作用するように見える。図10に示される通り、複合材料マトリックスは、両方の位置で、骨欠損内ならびに宿主骨の骨内膜および骨膜領域における骨分化および組織の形成を促進する。
【００２４】
上に記載された複合材料マトリックスは、細胞浸潤および骨組織内殖を可能にする孔径および／または繊維間間隔、生物活性を改善するためのセラミックの最大濃度、ならびに分子相互作用および機械的特性を改善するための繊維中のセラミックの均質な分散を特徴とする。合成ポリマーとセラミックの組み合わせが、骨欠損内で使用するためおよび骨移植片と組み合わせて使用するために容易に大きさおよび形状を変えることができる機械的に柔軟なマトリックスを提供し、それにより骨欠損の完全な修復および修復された骨の機能の完全な回復が提供される。
【００２５】
この開示の組成物および方法を以下の実施例を参照して記載するが、これらの実施例は説明の目的のみのために提供されるものであり、限定を目的とするものではない。これらの組成物および方法に対する変更、修正、増強および改良は、開示の趣旨または範囲を逸脱することなく実施可能であり、本発明に包含される。
【実施例】
【００２６】
1. マトリックスの調製
A. 複合材料電界紡糸繊維マトリックス
複合材料電界紡糸繊維を、Patlolla, A., et al., Acta Biomaterialia 6:  90-101, 2010の方法により調製した。簡単に述べると、ポリε-カプロラクトン(PCL)またはポリラクチド-コ-グリコール酸(PLGA、75%ポリラクチド/25%グリコール酸)を、溶媒の塩化メチレン中でセラミックのヒドロキシアパタイト/β-リン酸三カルシウム(HA/βTCP、20/80 wt%)と混合した。得られた溶液中にポリマーは17 wt%存在し、HA/βTCPは30 wt%存在した。溶液を短時間音波処理し、電界紡糸をおこなって繊維マトリックス（マット）を形成した。電界紡糸マトリックスの形態を図1に示す。図2は、紡糸繊維内のセラミックの分布が均一であることを示している。
【００２７】
比較のために、PCLを単独で含む電解防止マトリックスを、PCL複合材料と同様の空隙率および孔径／繊維間間隔を有するように調製した。PCL単独の溶液を調製した。このPCL溶液に、マトリックスの空隙率および孔径／繊維間間隔を増大させるための微粒子ポロゲンとして粒径20 nmのCaCO3を加えた。PCLマトリックスの形成後にマトリックスを3M HClにより数時間処理することにより、マトリックスからCaCO3を浸出させた。浸出の後、マトリックスを脱イオン水により洗浄して過剰の酸を除去し、空気乾燥した。
【００２８】
図3に、電界紡糸された、PCL-浸出(A、B)およびPCL複合材料(C、D)マトリックスの走査電子顕微鏡写真を示す。PCL-浸出マトリックスおよびPCL複合材料マトリックスの両方がミクロンおよびサブミクロン寸法の両方の繊維の二峰性分布を示したが、これは細胞浸潤に有利である。両方のタイプのマトリックスにおいて、繊維間間隔は約200〜250μMであり、空隙率は約79%であった。
【００２９】
B. 複合材料溶媒キャストマトリックス
溶媒キャストの通常法、例えば、Kim, et al., S.S., Biomaterials 27:  1399-1409, 2006に記載される方法を用いてマトリックスを調製した。簡単に述べると、PCLを溶媒の1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)中でHA/βTCPと、10% v/v PCLおよび30 wt% HA/βTCPで混合した。粒径200〜500μMのNaCl(90% v/v)を微粒子ポロゲンとして溶液に加えた。溶液を撹拌することにより混合し、ガラス／アルミニウム鋳型上に注いだ。-40℃で一晩凍結乾燥することにより溶媒を除去した。次に、得られたマトリックスから水によりNaCLを浸出させた。浸出の後、マトリックスをエタノールにより、エタノール濃度を100%まで増加させながら処理した後、空気乾燥した。
【００３０】
図4に、溶媒キャスト、ポロゲン-浸出、PCL(A、B)およびPCL複合材料(C、D)マトリックスの走査電子顕微鏡写真を示す。両方のタイプのマトリックスにおいて、孔径の平均は約300μmであり、空隙率は約84%であった。
【００３１】
2. 間葉系幹細胞の調製
MSCを、Lonza, Incより購入したヒト全骨髄（健康な男性ドナー、18〜35歳）から得た。ラットおよびヒトMSCを、以前に出版されたプロトコール(Arinzeh, T.L., et al., Biomaterials 26:  3631-3638, 2005; Breitbart, E.A.,  et al., J. Orthopaedic Research 28:  942-949, 2010; Livingston, T., et al., J Biomed. Mat. Res. 62:  1-13, 2002; Haynesworth, S., et al., J. Cell Physiology 138:  8-16, 1992)に従って骨髄から単離し、加工した。簡単に述べると、種あたり2個体のドナーをin vitro研究に使用した。両方の種からMSCを単離し、標準成長培地(10%ウシ胎仔血清および1%ヒト用抗生物質を含むDulbecco変法イーグル培地(DMEM)ならびに15%ウシ胎仔血清および1%ラット用抗生物質を含むアルファ-MEM)中で培養した。骨形成、軟骨形成および脂肪生成アッセイをおこなうことにより、MSCを多分化能について特徴付けた。MSCを、MSC表面抗原に対するフローサイトメトリーにより特徴付けて（CD44およびCD29に対して陽性であり、CD14、CD45、およびCD34に対して陰性であった）、すべてのin vitro分化研究に対してpassage 2で使用した。
【００３２】
3. in vitroにおける複合材料マトリクス上のMSCの骨形成および軟骨形成分化
厚さ0.3 mm、直径6 mmの円板を、実施例1に記載された通りに調製された複合材料電界紡糸または溶媒キャストマトリックスから調製し、100%エタノールにより殺菌し、空気乾燥した。円板を96ウェルプレートの中に置き、実施例2に記載された通りに調製されたMSCを、以前にArinzeh, T.T., et al., Biomaterials 26:  3631-3638, 2005に記載された通りに、それぞれの円板上に約10,000細胞/ウェルで播種した。細胞を加湿した37℃/5% CO2のインキュベーター中で培養した。7日または14日の培養後に、円板を4%ホルムアルデヒドにより固定し、洗浄し、細胞骨格アクチンフィラメントをALEXA FLUOR(登録商標)488ファロイドン(phalloidon)(Invitrogen Molecular Probes)により染色し、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Invitrogen Molecular Probes)により細胞核を染色した。
【００３３】
第7日および第14日の細胞の共焦点顕微鏡写真をぞれぞれ図5および6に示す。電界紡糸複合材料繊維マトリックス（図5C）は、最初に、溶媒キャストマトリックス（図5B、D）または電界紡糸、浸出PCLマトリックス（図5A）よりも急速な付着および成長を提供したように見えたが、14日後には電界紡糸および溶媒キャスト複合材料マトリックス上の細胞密度は同様であった（図6）。電界紡糸、浸出、PCLのみのマトリックスは、第7日および第14日の両方で低い細胞付着および成長を示した。電界紡糸および溶媒キャストマトリックスの両方で、細胞はマトリックスの深さ全体に浸潤した（データは示さない）。
【００３４】
骨分化に伴う遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRにより定量的に試験した。約150〜250μmの平均孔径を有する電界紡糸PCL複合材料マトリックス（複合材料-MC）、ポロゲンを使用せずに調製したPCL単独（無充填PCL）、または10μm未満の孔径を有するPCL複合材料マトリクス（複合材料-MC+DMF)上でヒトMSCを培養した。Weber, N., et al., Acta Biomaterialia 6:  3550-3556, 2010により記載された方法に従って、One Step QUANTITECT(登録商標)SYBR(登録商標)Green RT-PCR Kit(それぞれ、Qiagen and Life Technologies)により、MX4000(商標)検出システム(Stratagene)を用いて、定量的RT-PCR分析をおこなった。簡単に述べると、均質化(QIAshredder)およびDNA消化工程(RNase Free DNase Set)を含むRNEASY(登録商標)Mini Kit(Qiagen)を用いて、細胞試料から全RNAを単離した。逆転写を50℃で30分間おこなった後、95℃で15分間PCR活性化をおこなった。94℃で15秒間の変性、55℃で39秒間のアニーリング、および72℃で30秒間の伸長からなる40回の増幅サイクルを実施した。
【００３５】
結果を図7に示す。より大きい孔径を有する複合材料マトリックスは優れた骨細胞分化の誘導をもたらした。未分化MSCのマーカーであるSox-2はオステオカルシンの遺伝子発現と共に低下し、骨細胞マーカーであるRunx-2は、培地に加えた骨誘導因子が存在しない場合に培養時間と共に増加した（図7C、D、E）。これらの結果は、複合材料マトリックスがin vitroで骨細胞分化を刺激することを示している。また、複合材料マトリックス上の細胞は、それぞれ誘導因子が存在しない標準培地中での11日および14日の培養の後、高レベルのアルカリホスファターゼ活性（図7A）、軟骨細胞肥大マーカー(chondrocyte hypertrophic marker)、およびオステオカルシンの生産（図7B）を示した。これらの結果は、複合材料マトリックスが骨形成を促進することが可能であることをさらに裏付けるものである。
【００３６】
4. in vivoにおける複合材料マトリックス上での骨修復
ヒトおよびラットMSCを上記のマトリックスに導入し、以前に報告されたプロトコール(Arinzeh, T.T., et al., Biomaterials 26:  3631-3638, 2005)に従って、重症複合免疫不全(SCID)マウスの背部皮下にマトリックスを移植することにより骨分化および組織形成を評価した。簡単に述べると、動物の背中の背部に沿って1 cmの横切開を作った。鈍的切開をおこなって皮下結合組織から皮膚を分離して、皮膚の下に数個のポケットを形成し、その中に移植片を挿入した。移植の8週間後に、マトリックス単独で移植されたもの（MSCを含まない）と比較した。
【００３７】
結果を図8および9に示す。複合材料マトリックスは、hMSCを導入された場合、異所において移植の8週間後に広範な骨および血管形成を示した（図8B、PLGA複合材料）。血管形成はhMSCを導入されなかったマトリックスにおいても検出された（図8A、PCL複合材料）。図9は、移植の8週間後のラット部分欠損におけるPLGA複合材料マトリックスの連続切片を示す。マトリックスが存在しない場合、欠損内に新しい骨の成長はほとんどまたは全く観察されなかった（図9A）。PLGA複合材料単独は欠損内の新しい骨の成長を刺激した（図9B）。全骨髄と組み合わせたPLGA複合材料マトリックスは、8週間以内に欠損全体を横切る新しい骨の成長を刺激した（図9C）。これらの結果は、複合材料マトリックスが、単独でも、骨髄もしくは単離されたMSCと組み合わせても、骨欠損の修復に有用であり、骨移植片の代替として使用することが可能であることを証明している。
【００３８】
5. in vivoにおける複合材料マトリックスと組み合わせた移植骨上の骨修復
ラットの大腿骨部分欠損を、同種移植片と組み合わせたMSCの存在下または不在下の複合材料マトリックスにより治療した。この欠損モデルは確立されており、Azad, V., et al., J. Orthopaedic Trauma 23:  267-276, 2009; およびBreitbart, E.A.,  et al., J. Orthopaedic Research 28:  942-949, 2010に記載されている。このモデルは、荷重負荷の、臨界サイズの欠損であり、治療せずに放置すると偽関節(non-union)をもたらすので選択された。およそ80日齢の雄のFisher 344ラットをこれらの実験に利用した。同種移植骨は治療されるFisher 344ラットの大腿骨から得た。右大腿骨の骨幹から5 mmの骨切片を取り出して、洗浄、加工およびγ線照射をおこなった後に使用した。
【００３９】
大腿骨部分欠損を一側性に作り、単離されたMSCを導入した電界紡糸PCL複合材料およびPLGA複合材料マトリックスと組み合わせたバルク同種移植片により治療した。欠損部位への挿入のために、複合材料マトリックスで移植片の外側表面の周囲を包むか（骨膜）、または複合材料マトリックスを移植片の内側に内側表面に隣接して置いた（骨内膜）。8週間後に、移植した領域の横断連続切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色し、光学顕微鏡により観察した。連続切片を分析して、欠損内に形成された新しい骨の面積を測定した。
【００４０】
結果を図10に示す。PCL複合材料（図10A、B）およびPLGA複合材料（図10C、D）マトリックスの両方が、同種移植片内に挿入された場合（図10A、C）または同種移植片の周囲を包んだ場合（図10B、D）に骨分化および骨欠損の修復を増大させた。すべての複合材料マトリックスについて、宿主骨の骨内膜および骨膜領域ならびに欠損内において骨形成が起こった。最大量の新骨は、PLGA複合材料マトリックスにより包まれた同種移植片により製造された(骨面積4.24 mm2；それに対して、同種移植片内側のPLGA複合材料では面積2.55 mm2；同種移植片内側のPCL複合材料では面積2.95 mm2；同種移植片の周囲を包んだPCL複合材料では面積2.71 mm2)。
【００４１】
未処理の、空の欠損（図10E）は新骨形成を示さなかった。これらの結果は、複合材料マトリックスが新骨形成を刺激し、in vivoで同種移植片の取り込みを増大することを証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月11日(2014.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の電界紡糸または溶媒キャスト合成ポリマーを含み、前記ポリマー全体に均一に分散されたナノセラミックを含む、細胞および組織の成長を支持することが可能な生体適合性および生物分解性複合材料骨マトリックス。
【請求項２】
ナノセラミックが50〜200ナノメーターの直径を有し、マトリックスの空隙率が60〜90パーセントである、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項３】
マトリックスが、複数の電界紡糸繊維を形成する少なくとも1種の電界紡糸ポリマーを含み、前記繊維が100ナノメーターから100マイクロメーターの範囲の直径を有する、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項４】
複合材料骨マトリックスが少なくとも1種の電界紡糸合成ポリマーを含み、マトリックスが150〜400マイクロメーターの繊維間間隔を有する、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項５】
マトリックスが少なくとも1種の溶媒キャスト合成ポリマーを含み、マトリックスが150〜400マイクロメーターの孔径を有し、セラミックが二相性バイオセラミックのヒドロキシアパタイト/β-リン酸三カルシウムである、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項６】
少なくとも1種の合成ポリマーがポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーであり、ポリ(α-ヒドロキシ酸)が、ポリ乳酸、ポリL-乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-コ-グリコール酸、ポリε-カプロラクトン、ポリメタクリレート-コ-n-ブチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、およびポリエチレンオキシドからなる群より選択される、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項７】
少なくとも1種のセラミックが、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、生体活性ガラス、および二相性バイオセラミックからなる群より選択される、請求項1に記載の複合材料骨マトリックス。
【請求項８】
(a) ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーを電界紡糸のための溶媒である塩化メチレンまたは溶媒キャストのための溶媒である1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールと混合して、ポリ(α-ヒドロキシ酸)ポリマーの濃度が5〜30%の範囲である溶液を形成すること；
(b) (a)の溶液に、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、生体活性ガラス、および二相性バイオセラミックからなる群より選択されるセラミックを、セラミックの濃度が5〜70%の範囲となるように加えること；および
(c) (b)の溶液を電界紡糸して繊維状マトリックスを形成すること、または
(d) (b)の溶液を鋳型に適用して非繊維状マトリックスを形成すること；および
(e) 工程(c)または工程(d)のマトリックスを凍結乾燥して乾燥したマトリックスを提供すること
の工程を含み、ここで、前記マトリックスが細胞および組織の成長を支持することが可能である、請求項1に記載の複合材料骨マトリックスを調製する方法。
【請求項９】
工程(b)の溶液にポロゲンを加えること、および工程(e)の乾燥したマトリックスから浸出によりポロゲンを除去することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
(a) 請求項1に記載の複合材料骨マトリックスを脊椎動物被験体における骨欠損の中に導入すること；および
(b) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む、脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法。
【請求項１１】
さらに、複合材料骨マトリックスを骨欠損の中に導入する前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
(a) 請求項1に記載の複合材料骨マトリックスを骨移植片の切片の内部に導入すること；
(b) 工程(a)の骨移植片を骨欠損の中に挿入すること；および
(c) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む、脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法。
【請求項１３】
さらに、複合材料骨マトリックスをドナーの骨の切片の中に導入する前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
(a) 骨移植片の切片の外側周囲を請求項1に記載の複合材料骨マトリックスで包むこと；
(b) 工程(a)の骨移植片を骨欠損の中に挿入すること；および
(c) 骨欠損内で骨を再生させること
の工程を含む、脊椎動物被験体における骨欠損を修復する方法。
【請求項１５】
さらに、複合材料骨マトリックスでドナーの骨の切片の周囲を包む前に、複合材料骨マトリックスの中に全骨髄または単離された間葉系幹細胞を導入することを含む、請求項14に記載の方法。
【国際調査報告】
2014527435.tif 000013
2014527435.tif 000014
2014527435.tif 000015