(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、多機能性ヘテロマータンパク質である。特定の実施形態においては、各モノマータンパク質が輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記モノマータンパク質が会合してヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。これらの治療上新規な分子は、二特異的又は多価分子種の創出をもたらす治療分子実体のコンジュゲーション又は融合のための足場として機能するモノマーを含む。
2014512343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１の輸送体ポリペプチド；及び（ｉｉ）少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質並びに
（ｉｉｉ）第２の輸送体ポリペプチド及び（ｉｖ）少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質
を含み、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、ヘテロマルチマー。
【請求項２】
前記ヘテロマルチマーがヘテロダイマーである、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３】
少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが抗体に由来しない、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４】
各輸送体ポリペプチドがアルブミン誘導体である、請求項１又は２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５】
前記アルブミンが、配列番号１の配列を有するヒト血清アルブミンである、請求項３に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６】
前記第１の輸送体ポリペプチドが、配列番号２を含む配列を有し、前記第２の輸送体ポリペプチドが、配列番号３を含む配列を有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項７】
前記第１の輸送体ポリペプチドが、配列番号８を含む配列を有し、前記第２の輸送体ポリペプチドが、配列番号１０を含む配列を有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項８】
少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがアロアルブミン誘導体である、請求項１又は２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項９】
少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがアロアルブミン誘導体であり、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがアルブミン誘導体である、請求項７に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１０】
各輸送体ポリペプチドが、異なるアロアルブミンに由来する、請求項７に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１１】
各輸送体ポリペプチドが、表２から選択されるアロアルブミンに基づくアロアルブミン誘導体である、請求項７に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１２】
各輸送体ポリペプチドがアネキシン誘導体である、請求項１又は２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１３】
前記アネキシンが配列番号１４の配列を有するアネキシンＡ１である、請求項１２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１４】
前記第１の輸送体ポリペプチドが、配列番号１５を含む配列を有し、前記第２の輸送体ポリペプチドが配列番号１６を含む配列を有する、請求項１２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１５】
各輸送体ポリペプチドがトランスフェリン誘導体である、請求項１又は２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１６】
前記第１の輸送体ポリペプチドが、配列番号１７を含む配列を有し、前記第２の輸送体ポリペプチドが、配列番号１８を含む配列を有する、請求項１５に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１７】
輸送体ポリペプチドが、同じタンパク質に由来する、請求項１から８まで及び１１から１６までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１８】
前記カーゴポリペプチドが、表２に示すタンパク質又はその断片若しくは変異体、或いは表２に示すタンパク質又はその断片若しくは変異体に対する受容体、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体から選択される、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１９】
少なくとも１つのカーゴポリペプチドがＧＬＰ−１又はその断片若しくは変異体を含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２０】
少なくとも１つのカーゴポリペプチドがグルカゴン又はその断片若しくは変異体を含む、請求項１から１７まで及び１９のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２１】
少なくとも１つのカーゴポリペプチドがＥＧＦ−Ａ様ドメインを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２２】
少なくとも１つのカーゴポリペプチドが抗体又はその断片若しくは変異体である、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２３】
前記抗体断片が抗体Ｆｃ領域を含む、請求項２２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２４】
抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭから成る群より選択される免疫グロブリンである、請求項２２から２３までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２５】
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択されるサブタイプのＩｇＧである、請求項２４に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２６】
抗体が二特異的抗体である、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２７】
抗体が多特異的抗体である、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２８】
抗体が治療抗体である、請求項２２から２７までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２９】
治療抗体が癌抗原に結合する、請求項２８に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３０】
少なくとも１つの抗体が、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セルツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオザガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、マイコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トクリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム、レンカレックス、ウステキヌマブ、及びザルツムマブから選択される、請求項２２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３１】
前記第１のモノマータンパク質が標的抗原に結合し、前記第２のモノマータンパク質が毒素部分を含む、請求項１から３０までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３２】
前記標的抗原が、ＩＬ−２Ｒのａ鎖（ＣＤ２５）、アミロイドβ、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ３、ＣＤ１ｉａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＲＳＶのＦタンパク質、Ｇ２５０、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕＲ、ＨＳＰ９０、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ−Ａ、及び他の治療上有利な標的のうちの少なくとも１つである、請求項３１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３３】
少なくとも１つのカーゴポリペプチドが、酵素、ホルモン、治療ポリペプチド、抗原、ケモトキシン、放射性毒素、サイトカイン又はその変異体若しくは断片である、請求項１から３２までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３４】
前記第１のモノマータンパク質及び前記第２のモノマータンパク質が同じカーゴポリペプチドを含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３５】
それぞれが輸送体ポリペプチド、及び必要に応じて、前記輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子を含む少なくとも２つのモノマーを含み、各輸送体ポリペプチドが全タンパク質のセグメント化により得られ、前記輸送体ポリペプチドが自己集合して疑似天然全タンパク質を形成する、ヘテロマルチマー。
【請求項３６】
前記ヘテロマルチマーが多特異的である、請求項３５に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３７】
前記輸送体ポリペプチドが抗体に由来しない、請求項３５又は３６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３８】
各モノマーが、モノマー又はホモマルチマーと比較して、選択的にヘテロマルチマーを形成する、請求項３５から３７までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのカーゴ分子が治療剤又は生体分子である、請求項３５から３８までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのカーゴ分子が、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はＲＮＡから選択される生体分子である、請求項３５から３９までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４１】
各輸送体ポリペプチドが、アルブミン又はアロアルブミンの誘導体である、請求項３５から４０までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４２】
各輸送体ポリペプチドがアネキシンの誘導体である、請求項３５から４０までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４３】
各輸送体ポリペプチドがトランスフェリンの誘導体である、請求項３５から４０までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４４】
請求項１から４４までのいずれか一項に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸を含む宿主細胞。
【請求項４５】
第１のモノマータンパク質をコードする核酸及び第２のモノマータンパク質をコードする核酸が単一のベクター中に存在する、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
第１のモノマータンパク質をコードする核酸及び第２のモノマータンパク質をコードする核酸が別々のベクター中に存在する、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
ヘテロマルチマーを目的のタンパク質から、前記目的のタンパク質をセグメント化してポリペプチドを得ることにより作製する方法であって、前記ポリペプチドが自己集合して前記ヘテロマルチマーを形成する、上記方法。
【請求項４８】
目的のタンパク質がアルブミンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
目的のタンパク質がアネキシンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
目的のタンパク質がトランスフェリンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
セグメント化が、ヘテロマルチマーがポリペプチド間に共有結合を含まないように実施される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
セグメント化が、ヘテロマルチマーがポリペプチド間に少なくとも１つの共有結合を含むように実施される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４７から５２までのいずれか一項に記載の方法により設計されるヘテロマルチマー。
【請求項５４】
請求項４７から５２までのいずれか一項に記載の方法により設計されるヘテロマルチマーを含む治療用足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、生物治療剤のカスタム開発のための足場の合理的設計である。
【背景技術】
【０００２】
治療タンパク質の領域においては、多価の標的結合特性を有する抗体が、薬物候補の設計のための優れた足場である。これらの特性をさらに前進させて、設計された二特異的抗体及び他の融合の多特異的治療剤は二重又は多重標的特異性を示し、新しい作用様式を有する薬物を創出する機会を示す。好ましい薬物動態及び機能的活性を有するそのような多価及び多特異的治療タンパク質の開発が課題であった。
【０００３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、又はＨＡ）は、その成熟形態では５８５アミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧のかなりの割合を占め、内因性及び外因性リガンドの担体としても機能する。担体分子としてのアルブミンの役割及びその安定な性質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのポリペプチドの担体及び輸送体としての使用にとって望ましい特性である。
【０００４】
ヒト血清アルブミンは、多くの望ましい特徴を有する。ＨＳＡは体中に見出されるが、より具体的には、４０ｇ／Ｌの血清濃度で間質腔及び血液中に見出され、これは０．７ｍＭに等しい（Yehら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:1904-1908 (1992)）。ＨＳＡは、血清の最も豊富なタンパク質であると考えられ、浸透圧の維持を担う。ＨＳＡは好ましい薬物動態特性を有し、肝臓及び腎臓により非常にゆっくりと除去され、最大で数週間のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示す（Yehら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:1904-1908 (1992); Waldmann, T. A.、Albumin Structure, Function and Uses、 pp. 255-273 (1977); Saravら、J Am Soc Nephrol 20:1941-1952(2009)）。ＨＳＡは酵素活性及び抗原性を示さず、それによって潜在的に望ましくない副作用を排除する。ＨＳＡは内因性並びに外因性リガンドのための担体として作用する。組み合わせた場合、これらの特性は、少なくとも部分的には、アルブミンに基づく融合タンパク質上で拡張することができる。次いで、治療タンパク質により示される弱い薬物動態特性を回避することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書で提供されるのは、多機能性ヘテロマルチマー及びそれらを設計する方法である。特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴ分子、及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマー単位；並びに少なくとも１つのカーゴ分子及び第２の輸送体ポリペプチドを含む第２のモノマー単位を含み；少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、ヘテロマルチマーである。特的の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、薬物、又は治療剤である。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、生体分子である。一実施形態においては、少なくとも１つの生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はポリペプチドである。一実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、ポリペプチドである。特定の実施形態においては、それぞれのモノマー輸送体ポリペプチドは不安定であり、少なくとも１つの他の輸送体ポリペプチドとヘテロマルチマーを選択的に形成する。特定の実施形態においては、それぞれのモノマー輸送体ポリペプチドは安定であり、少なくとも１つの他の輸送体ポリペプチドとヘテロマルチマーを選択的に形成する。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマー化の接合部分は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマー化の接合部分は、ジスルフィド結合を含まない。
【０００６】
特定の実施形態においては、それぞれが、輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子を含む少なくとも２つのモノマーを含むヘテロマルチマーであって、前記モノマーが自己集合してヘテロマルチマーを形成する、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、各モノマータンパク質が輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、各モノマータンパク質が輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記モノマータンパク質（複数）が輸送体ポリペプチドを介して自己集合して、ヘテロマルチマーを形成し、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーはヘテロダイマーである。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは二特異的である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは多特異的である。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは二価である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは多価である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは多機能性である。特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドはアルブミンの誘導体である。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、配列番号１のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ又はＨＡ）に由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、アロアルブミン（ＨＡＡ）に由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、配列番号１のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ又はＨＡ）と相同な配列に由来する。
【０００７】
本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、アネキシンタンパク質の誘導体である。一実施形態においては、輸送体ポリペプチドは異なるアネキシンタンパク質に由来する。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは同じアネキシンタンパク質に由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ１又はリポコルチンＩに由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが、配列番号１４のアネキシンＡ１に由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが、配列番号１４と相同な配列に由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ２又はアネキシンＩＩに由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ２又はリポコルチンＩＩに由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが、アネキシン様タンパク質に由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドがアネキシン様タンパク質に由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ１〜アネキシンＡ７を含む群に由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの一実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ１〜アネキシンＡ７．１４を含む群に由来する。特定の実施形態においては、第１のアネキシンに基づく輸送体ポリペプチドは、配列番号１５を含む配列を有し、第２のアネキシンに基づく輸送体ポリペプチドは、配列番号１６を含む配列を有する。
【０００８】
本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドはトランスフェリンの誘導体である。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがトランスフェリンに由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが配列番号１９のトランスフェリン又はその類似体に由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはトランスフェリンと相同なポリペプチド配列に由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アポトランスフェリンに由来する。特定の実施形態においては、第１のトランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドは配列番号１５を含む配列を有し、第２のトランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドは配列番号１６を含む配列を有する。
【０００９】
ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、カーゴポリペプチドである。本明細書に記載のヘテロマルチマーの一実施形態においては、全てのカーゴ分子がカーゴポリペプチドである。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは治療タンパク質又はその断片若しくは変異体である。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、抗原又はその断片若しくは変異体である。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、抗原受容体又はその断片若しくは変異体である。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、標的ポリペプチドに結合する抗体、抗体ドメイン、リガンド又は受容体である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドに融合される。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは輸送体ポリペプチドのＮ末端に付けられる。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドのＣ末端に付けられる。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドに化学的に連結される。本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＧＬＰ−１又はその断片若しくは変異体を含む。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、グルカゴン又はその断片若しくは変異体を含む。一実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａ様ドメインを含む。
【００１０】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーはヘテロダイマーである。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは多特異的である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは二特異的である。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは同じタンパク質の誘導体である。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドはアルブミンの誘導体である。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは配列番号１のヒト血清アルブミンに由来する。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、アネキシンの誘導体である。一実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、アネキシンＡ２の誘導体である。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドはトランスフェリンの誘導体である。
【００１１】
特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及びヒト血清アルブミンの第１のセグメントを含む第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド、断片及びヒト血清アルブミンの第２のセグメントを含む第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み；前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、アルブミン又はその類似体の疑似天然構造を形成する、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヒト血清アルブミンの第１及び第２のセグメントは、タンパク質の非重複領域に由来する。特定の実施形態においては、ヒト血清アルブミンの第１及び第２のセグメントの配列の間に重複が存在する。いくつかの実施形態においては、重複は５％の重複である。一実施形態においては、重複は１０％の重複である。特定の実施形態においては、ヒト血清アルブミンの第１のセグメントは配列番号２の配列を含み、ヒト血清アルブミンの第２のセグメントは配列番号３の配列を含む。特定の実施形態においては、ヒト血清アルブミンの第１のセグメントは配列番号８の配列を含み、ヒト血清アルブミンの第２のセグメントは配列番号１０の配列を含む。
【００１２】
特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び配列番号２の配列を含む第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び配列番号３の配列を含む第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び配列番号８の配列を含む第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び配列番号１０の配列を含む第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアロアルブミンに由来する。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは両方ともアロアルブミンに由来する。特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが同じアロアルブミンの誘導体である。いくつかの他の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、異なるアロアルブミンの誘導体である。いくつかの実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、表２から選択されるアロアルブミンに基づくアロアルブミン誘導体である。特定の実施形態においては、第１のモノマータンパク質は、２つのカーゴポリペプチドを含む。いくつかの実施形態においては、第２のモノマータンパク質は、２つのカーゴポリペプチドを含む。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのモノマータンパク質は、突然変異を導入することにより遺伝子操作される。特定の実施形態においては、導入される突然変異は、天然の非突然変異形態のモノマーと比較してモノマータンパク質の官能性を改善する。特定の実施形態においては、導入される突然変異は、輸送体ポリペプチドの安定性、半減期及びヘテロマルチマー形成のうちの１つ又は複数を改善する。
【００１３】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含む、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、表２に列挙されるタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体から選択される。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、表２に列挙される１つ又は複数のタンパク質に対するリガンド、受容体、若しくは抗体、又は前記リガンド、受容体若しくは抗体の断片、変異体若しくは誘導体から選択される。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、Ｃｄ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、インテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４から成る群に由来する細胞表面抗原を標的とする。特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが抗体、又はその断片若しくは変異体である、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、全てのカーゴポリペプチドは、抗体又はその断片若しくは変異体である。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、表２に列挙されるタンパク質に結合する抗体である。いくつかの実施形態においては、抗体断片は、抗体Ｆｃ又はＦａｂ又はＦｖ領域を含む。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、ナノボディ、アフィボディ、マキシボディ、アドネクチン、ドメイン抗体、エビボディ、アンキリンリピートタンパク質、アンチカリン、カムリド又は治療上関連する標的に結合するリガンドタンパク質若しくはポリペプチドのような非抗体タンパク質である。いくつかの実施形態においては、抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭから成る群より選択される免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態においては、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択されるサブタイプのものである。特定の実施形態においては、抗体は多特異的である。
【００１４】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが治療抗体である、ヘテロマルチマーである。本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、抗体がアバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セルツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオザガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、マイコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トクリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム、レンカレックス、ウステキヌマブ、及びザルツムマブから選択される治療抗体又はその断片若しくは変異体である。特定の実施形態においては、治療抗体は、癌抗原、炎症性疾患抗原又は代謝疾患抗原などの疾患関連標的抗原に結合する。特定の実施形態においては、標的抗原は、細胞表面上のタンパク質であってよく、細胞はＢ細胞、Ｔ細胞、間質細胞、内皮細胞、血管細胞、骨髄細胞、造血細胞又は癌細胞の群に属するものであってよい。
【００１５】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴ分子、断片を含む少なくとも第１のモノマー；並びに少なくとも１つのカーゴ分子及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマーを含み、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが酵素、酵素阻害剤、ホルモン、治療ポリペプチド、抗原、放射性毒素並びに限定されるものではないが、神経毒、インターフェロン、サイトカイン融合毒素及びケモカイン融合毒素、サイトカイン、抗体融合タンパク質又はその変異体若しくは断片を含むケモトキシンである、ヘテロマルチマーである。本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＧＬＰ−１又はその断片若しくは変異体を含む。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、グルカゴン又はその断片若しくは変異体を含む。一実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａ様ドメインを含む。特定の実施形態においては、毒素は、デニロイキンジフチトクスなどの免疫毒素並びにＣＡＴ−３８８８及びＣＡＴ−８０１５などの抗ＣＤ２２免疫毒素である。特定の実施形態においては、毒素はサポニンである。いくつかの実施形態においては、毒素はマイトトキシンである。いくつかの実施形態においては、毒素はジフテリア毒素である。いくつかの実施形態においては、毒素はボツリヌス毒素Ａ型である。いくつかの実施形態においては、毒素はリシン又はその断片である。いくつかの実施形態においては、毒素はＲＴＸファミリーの毒素に由来する毒素である。
【００１６】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、カーゴポリペプチドが化学的コンジュゲーション、天然のライゲーション、化学的ライゲーション、ジスルフィド結合又は直接的融合若しくはリンカーを介する融合により輸送体ポリペプチドに付けられる、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドなどのカーゴ分子を輸送体ポリペプチドに付けるためのリンカーは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５４８２８５８、ＵＳ５２５８４９８及びＵＳ５８５６４５６、ＵＳ２００９０６０７２１、ＵＳ６４９２１２３、ＵＳ４９４６７７８、ＵＳ５８６９６２０、ＵＳ７３８５０３２、ＵＳ５０７３６２７、ＵＳ５１０８９１０、ＵＳ７９７７４５７、ＵＳ５８５６４５６、ＵＳ７１３８４９７、ＵＳ５８３７８４６、ＵＳ５９９０２７５、ＥＰ１０８８８８８に記載のリンカーから選択される。
【００１７】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸を含む宿主細胞である。特定の実施形態においては、第１のモノマータンパク質をコードする核酸及び第２のモノマータンパク質をコードする核酸が単一のベクター中に存在する。特定の実施形態においては、第１のモノマータンパク質をコードする核酸及び第２のモノマータンパク質をコードする核酸が別々のベクター中に存在する。
【００１８】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸が発現されるような本明細書に記載の宿主細胞を培養すること；及び細胞培養物からヘテロマルチマーを回収することを含む、ヘテロマルチマーを作製する方法である。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。特定の実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態においては、酵母はサッカロミセス・セレビジア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。いくつかの実施形態においては、酵母はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）である。特定の実施形態においては、酵母はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。いくつかの実施形態においては、酵母はグリコシル化欠損及び／又はプロテアーゼ欠損である。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーを発現する宿主細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態においては、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ細胞又はヒト細胞である。
【００１９】
本明細書に記載のヘテロマルチマー及び製薬上許容し得るアジュバントを含む医薬組成物が提供される。また、疾患又は障害に罹患する個体を治療する方法であって、該個体に有効量の本明細書に記載の製剤又は医薬組成物を投与することを含む前記方法も提供される。特定の実施形態においては、患者における癌を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法である。いくつかの実施形態においては、患者における免疫障害を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法である。また、患者における感染症を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法も提供される。特定の実施形態においては、患者における心血管障害を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法である。特定の実施形態においては、患者における呼吸器障害を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法である。特定の実施形態においては、患者における代謝障害を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法である。特定の実施形態においては、患者における先天性副腎過形成、ゴーシェ病、ハンター症候群、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、テイ・サックス病、及びウィルソン病のうちの１つ又は複数を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む前記方法である。
【００２０】
個体における目的のバイオマーカーの存在を検出するためのキットであって、（ａ）カーゴポリペプチドが目的のバイオマーカーに結合することができるような、少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む本明細書に記載のヘテロマルチマーの一定量；及び（ｂ）使用のための説明書を含む前記キットが提供される。
【００２１】
本明細書で提供されるのは、各モノマータンパク質が少なくとも１つのカーゴポリペプチド及びアルブミンに基づくポリペプチドを含み、前記モノマータンパク質が自己集合してヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質である。
【００２２】
特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、アルブミン又はアロアルブミンに基づく輸送体ポリペプチドに融合される。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、トランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドに融合される。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、アネキシンに基づく輸送体ポリペプチドに融合される。いくつかの実施形態においては、融合は輸送体ポリペプチドのＮ末端にある。特定の実施形態においては、融合は輸送体ポリペプチドのＣ末端にある。いくつかの実施形態においては、融合物は架橋リンカー又はスペーサー分子を含む。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは輸送体ポリペプチドに化学的にコンジュゲートされる。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、化学的ライゲーション又はジスルフィド結合を用いて輸送体ポリペプチドに付けられる。
【００２３】
本明細書で提供されるのは、各モノマータンパク質が少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び輸送体ポリペプチドを含み、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合してヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質である。いくつかの実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、アロアルブミンに基づくポリペプチドであり、前記アロアルブミンに基づくポリペプチドは自己集合してヘテロマルチマーを形成する。いくつかの実施形態においては、各輸送体ポリペプチドはトランスフェリンに基づくポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、各輸送体ポリペプチドはアネキシンに基づくポリペプチドである。特定の実施形態においては、各モノマー輸送体ポリペプチドは不安定であり、少なくとも１つの他の輸送体ポリペプチドとヘテロマルチマーを選択的に形成する。
【００２４】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーはヘテロダイマーである。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、抗体、酵素、ホルモン、治療ポリペプチド、抗原、ケモトキシン、放射性毒素、サイトカイン又はその変異体若しくは断片である。いくつかの実施形態においては、あるモノマータンパク質のカーゴポリペプチドは、別のモノマータンパク質のカーゴポリペプチドと相乗的に機能する。
【００２５】
本明細書で提供されるのは、各モノマータンパク質が少なくとも１つのカーゴポリペプチド及びアネキシンに基づくポリペプチドを含み、前記アネキシンに基づくポリペプチド（複数）が自己集合して、アネキシン又はその類似体の疑似天然構造とヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質である。いくつかの実施形態においては、アネキシンは、アネキシンＡ１である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、ヘテロダイマーである。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、抗体、酵素、ホルモン、治療ポリペプチド、抗原、ケモトキシン、放射性毒素、サイトカイン、受容体に対するリガンド、受容体又はその変異体若しくは断片である。いくつかの実施形態においては、あるモノマータンパク質のカーゴポリペプチドは、別のモノマータンパク質のカーゴポリペプチドと相乗的に機能する。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、別のモノマータンパク質のカーゴポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストであってよい。
【００２６】
本明細書で提供されるのは、各モノマー融合タンパク質がアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記アルブミン由来ポリペプチド（複数）が自己集合して多機能性ヘテロダイマーを形成する、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロダイマータンパク質である。特定の実施形態においては、アルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第１のモノマー；及びアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第２のモノマーを含むヘテロダイマータンパク質である。特定の実施形態においては、第１のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第２のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドとは異なる。特定の実施形態においては、第１のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第２のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドと同じである。
【００２７】
特定の実施形態においては、各モノマー融合タンパク質がアロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記アロアルブミン由来ポリペプチド（複数）が自己集合して多機能性ヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質である。特定の実施形態においては、各モノマー融合タンパク質がトランスフェリン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記トランスフェリン由来ポリペプチド（複数）が自己集合してヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質である。特定の実施形態においては、各モノマー融合タンパク質がアネキシン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記アネキシン由来ポリペプチド（複数）が自己集合してヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質である。特定の実施形態においては、アネキシンは、アネキシンＡ２である。
【００２８】
特定の実施形態においては、アロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第１のモノマー；及びアロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第２のモノマーを含むヘテロマルチマータンパク質である。特定の実施形態においては、第１のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第２のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドとは異なる。特定の実施形態においては、第１のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第２のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドと同じである。
【００２９】
本明細書で提供されるのは、それぞれが輸送体ポリペプチド、及び必要に応じて、前記輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む少なくとも２つのモノマーを含み、各輸送体ポリペプチドが全タンパク質のセグメント化により得られ、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して疑似天然全タンパク質を形成する、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは多特異的である。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、抗体に由来するものではない。いくつかの実施形態においては、各モノマーは、モノマー又はホモマルチマーと比較してヘテロマルチマーを選択的に形成する。ヘテロマルチマーの一実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、治療剤又は生体分子である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はＲＮＡから選択される生体分子である。いくつかの実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、アルブミン又はアロアルブミンの誘導体である。一実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、アネキシンの誘導体である。特定の実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、トランスフェリンの誘導体である。
【００３０】
特定の実施形態においては、アルブミンに基づく及び／又はアロアルブミンに基づく本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質並びに製薬上許容し得る希釈剤又は担体を含む医薬製剤である。特定の実施形態においては、トランスフェリンに基づく本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質及び製薬上許容し得る希釈剤又は担体を含む医薬製剤である。特定の実施形態においては、アネキシンに基づく本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質及び製薬上許容し得る希釈剤又は担体を含む医薬製剤である。特定の実施形態においては、アネキシン−Ａ２に基づく本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質及び製薬上許容し得る希釈剤又は担体を含む医薬製剤である。特定の実施形態においては、本明細書に記載の製剤は、キット又は容器の一部として提供される。特定の実施形態においては、キット又は容器は、治療タンパク質の保存可能期間の延長に関する説明書と共に包装される。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、前記製剤を個体に投与するステップを含む、個体における疾患又は疾患の症状を治療（例えば、改善）、予防、又は診断する方法において用いられる。
【００３１】
本明細書で提供されるのは、目的の任意の輸送タンパク質に基づく既知数のコンジュゲーション部位を有する融合タンパク質足場を得る方法である。
【００３２】
また、本明細書に記載のモノマー融合タンパク質をコードし、発現する本明細書に記載の核酸分子を含有するように改変されたトランスジェニック生物も提供される。
【００３３】
本発明の他の態様及び特徴は、添付の図面と共に以下の本発明の具体的な実施形態の説明を精査する際に当業者にとって明らかになる。
【００３４】
図面において、本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）分子の構造を示す図である。二次構造のαへリックスセクションを、棒で表される結合と共に概略的に示す。
【００３６】
【図２】２つのアルブミンに基づくポリペプチドの接合部分での埋没溶媒接近可能表面積のプロットである。
【００３７】
【図３】別々に発現された２つのアルブミンに基づくポリペプチドを示す図である。２つのポリペプチドはそれぞれ薄い灰色及び濃い灰色で示される。それぞれのポリペプチドは機能的カーゴタンパク質のための２つの融合部位を含み、これらの部位は球体で表される。構造中のジスルフィド残基は棒で示される。
【００３８】
【図４】本明細書に記載の多特異的ヘテロマルチマーに基づく二特異的及び他の多機能性治療剤の概略図である。アルブミンに基づく、又はアロアルブミンに基づくポリペプチドはＡ１及びＡ２で示される。多機能性ヘテロマルチマーは、抗原結合モチーフ、サイトカイン及び他の形態のシグナリング分子、ケモトキシン、放射性毒素又は他の機能的に関連するイムノコンジュゲートを、Ａ１及びＡ２上のＮ及び／又はＣ末端部位にコンジュゲートさせることにより得られ、これは＋記号により表される。
【００３９】
【図５】ヘテロダイマーＦｃドメインに由来する二特異的抗体の概略図である。アルブミン又はアロアルブミンに基づくポリペプチドはＦｃのＣ末端に接続され、ヘテロダイマーの形成を選択的に誘導する。
【００４０】
【図６Ａ】完全長ＨＳＡ並びにＨＳＡに基づく輸送体ポリペプチドの同時発現により形成されたヘテロダイマー足場であるアルブミンに基づくヘテロマルチマー−１（ＡＢＨ１）及びアルブミンに基づくヘテロマルチマー−２（ＡＢＨ２）の未変性ゲル電気泳動プロフィールを示す。
【図６Ｂ】完全長ＨＳＡ並びにＨＳＡに基づく輸送体ポリペプチドの同時発現により形成されたヘテロダイマー足場であるアルブミンに基づくヘテロマルチマー−１（ＡＢＨ１）及びアルブミンに基づくヘテロマルチマー−２（ＡＢＨ２）の未変性ゲル電気泳動プロフィールを示す。
【図６Ｃ】完全長ＨＳＡ並びにＨＳＡに基づく輸送体ポリペプチドの同時発現により形成されたヘテロダイマー足場であるアルブミンに基づくヘテロマルチマー−１（ＡＢＨ１）及びアルブミンに基づくヘテロマルチマー−２（ＡＢＨ２）の未変性ゲル電気泳動プロフィールを示す。
【００４１】
【図７】示差走査熱量測定を用いて試験された野生型ＨＳＡ並びにヘテロダイマー足場ＡＢＨ１及びＡＢＨ２の安定性を示す図である。
【００４２】
【図８Ａ】３０００ＲＵにわたる３０００ｎＭのＦｃＲＮ  ３ｘ希釈系列の平衡結合等温線を示す。図８Ａはアルブミンを示す。
【図８Ｂ】３０００ＲＵにわたる３０００ｎＭのＦｃＲＮ  ３ｘ希釈系列の平衡結合等温線を示す。図８Ｂはヘテロマルチマー足場ＡＢＨ１を示す。
【００４３】
【図９】抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ生物活性融合物を含む多価アルブミンに基づくヘテロマルチマーの概略図を示す。
【００４４】
【図１０Ａ】表８に記載のヘテロマルチマーＡＢＨ２融合物の非還元的ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を含む。ゲルは、全ての構築物が予想されたＭＷを有する正確な複合体を形成することを示す。
【図１０Ｂ】表８に記載のヘテロマルチマーＡＢＨ２の非還元的ＳＤＳＰＡＧＥ分析を含む。ゲルは、全ての構築物が予想されたＭＷを有する正確な複合体を形成することを示す。
【００４５】
【図１１】ＰＤＢ構造１ＭＣＸに基づくアネキシン分子の構造を示す。アネキシン分子を分割することにより誘導される２つのモノマーは薄い灰色及び濃い灰色の単位として色分けされる。カーゴタンパク質のための融合部位は球体で表される。
【００４６】
【図１２】アネキシンに基づく輸送体ポリペプチド−１とアネキシンに基づく輸送体ポリペプチド−２との接合部分での埋没溶媒接近可能表面積のプロットを示す。
【００４７】
【図１３】ＰＤＢ構造１Ｈ７６に基づくトランスフェリン分子の構造を示す。トランスフェリン分子を分割することにより誘導される２つのモノマーは薄い灰色及び濃い灰色の単位として色分けされる。カーゴタンパク質のための融合部位は球体で表される。
【００４８】
【図１４】本明細書に記載の２つのトランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドの接合部分での埋没溶媒接近可能表面積のプロットを示す。本明細書で設計された残基位置３３０の近くの分割トランスフェリンは、約１８００Å２の埋没表面積を有するヘテロダイマーを形成する。
【００４９】
【図１５】ヒト血清アルブミンに基づく輸送体ポリペプチドを含むマルチマーの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
治療タンパク質の領域では、二特異的分子は二重の標的特異性を示すか、又は薬物作用にとって必要な必須の時空組織化を提供することによって複数の機能的役割を同時に実施することができる。一態様においては、二特異的分子は、治療作用の様式が腫瘍細胞などの標的に対するエフェクター細胞又は分子の再標的化を含む場合に特に興味深い[Muller D.及びKontermann R.E. (2010) Biodrugs 24、 89-98]。安定で均一な条件において好ましい薬物動態及び機能的活性を有する二特異的治療タンパク質の開発は課題であった。いくつかの手法を用いて複数の抗原結合ドメインから二特異的単位を集合させるための試みが行われてきた。これらの技術は、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ対又は抗体中の可変ドメインの軽鎖及び重鎖の代替組織から集合させた他の足場などのロイシンジッパータンパク質を用いてヘテロダイマー抗体ＩｇＧ分子を使用することを含んでいた。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ及びＬｅ  Ｇａｌｌは、様々な二特異的構築物の設計を精査した[Kipriyanov S.M. & Le Gall F. (2004) Curr Opin Drug Discov Dev 7、 233-242]。ヘテロダイマーを達成し、従って１つの分子中に２つのユニークな抗原結合部位を導入するために抗体のＣＨ３ドメイン中に突然変異が導入されたヘテロダイマー抗体ＩｇＧ分子の使用は、この構築物の天然免疫グロブリン様構造のため非常に魅力的である。さらに、抗体のＦｃ部分は、エンドサイトーシス救出経路を媒介する新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用に関与し、これは抗体分子の血清半減期の改善に起因する[Roopenian D. & Akilesh S. (2007) Nature Rev Immunol 7、 715-725]。他方、抗体に基づく二特異的分子は、二特異的抗体のＦｃ部分により誘導される同時的エフェクター活性の結果としての強いサイトカイン応答のため、臨床試験においては問題が多かった[Weiner L.M.; Alpaugh R.K.ら(1996) Cancer Immunol Immunother 42、 141-150]。これは、二特異的及びイムノコンジュゲート分子の設計に役立ち得る新規足場の必要性を強調する。
【００５１】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質は、血液の最も豊富な成分であり、約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で血清中の総タンパク質の６０％近くを占める。アルブミンはまた、循環系において最も長い寿命のタンパク質の一つであり、約１９日の半減期を有する。興味深いことに、抗体分解を防止するＦｃＲｎ分子に依存する同じエンドサイトーシス救出経路は、同様にＨＳＡ分子と相互作用することが知られている[Chaudhary C.; Mehnaz S.ら(2003) J Exp Med 197、 315-322]。
【００５２】
ＨＳＡ（図１に示される）は、グリコシル化されていない５８５残基の単一ポリペプチドタンパク質であり、このタンパク質の３次元構造はＣａｒｔｅｒ及び共同研究者によってＸ線結晶学を用いて初めて観察された[Carter, D.C. & Ho, J.X. (1994) Adv Prot Chem 45、 153-203で概説されている]。ＨＳＡタンパク質は、他の種においても同様に血清アルブミンに共通の特徴である遺伝子複製に起因して、３つの相同なドメイン：ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩから成る[Gray J.E. & Doolittle R.F. (1992) Protein Sci 1、 289-302]。３つのドメインのそれぞれは別々に発現及び特性評価されており、独立して安定であることが示されている[Dockal M., Carter D.C. & Ruker F. (1999) J Biol Chem 274、 29303-29310]。それぞれのドメインは１０個のらせん状セグメントから構成され、らせん間組織に基づいて、それぞれのドメインは、それぞれらせん１〜６及び７〜１０を含む２つのサブドメインにさらに分類することができる。ＨＳＡは合計で１７個のジスルフィド結合を有し、結合を形成するこれらのシステイン対は全て、個々のドメイン内にある。一般に、ＨＳＡは多数のジスルフィド結合並びに主にらせん状の折畳みに起因して非常に安定である。いくつかの種にわたるアルブミン分子の配列同一性は非常に大きく、ヒト、ウマ、ウシ、ラットなどに由来するアルブミンｃＤＮＡ間で７０％を超える[Carter, D.C. & Ho, J.X. (1994) Adv Prot Chem 45、 153-203]。
【００５３】
分割タンパク質対は、機能的プロテオミクスの領域においてタンパク質間相互作用を理解するためのセンサとして用いられてきた。その手法は、活性な天然様タンパク質を形成するために再構成することができるタンパク質から好適なセグメントを同定することを含む。新しい分割タンパク質の生成は、技術的に要求が多い。タンパク質を機能的に有用な様式で分割するために、セグメンテーション部位は、互いに会合した場合、疑似天然タンパク質を効率的に再構成する２つのセグメントをもたらす必要がある。さらに、構成要素タンパク質セグメントは、溶液中に留まるのに十分な溶解性のものであり、製造収率及び精製が経済的であるようにパートナーセグメントと選択的に会合するべきである。疑似天然構造を形成するために再結合する分割タンパク質セグメントを誘導することは、非常に挑戦的である[Tafelmeyer P., Johnsson N. & Johnsson K. Chem & Biol 11、 681-689]。そのような分割タンパク質は、タンパク質治療剤の設計において、又はカーゴ送達ビヒクルとしては過去には用いられてこなかった。
【００５４】
定義
【００５５】
本発明は本明細書に記載の特定のプロトコル、細胞系、構築物、及び試薬に限定されず、それ自体は変化してもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００５６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指摘しない限り、複数の参照を含む。かくして、例えば、「ＨＳＡ」、「ＨＡ」、「アルブミン」、「ヒト血清アルブミン」並びに様々な大文字で表記された、ハイフンで繋がれた、及びハイフンの付いていない形態に対する参照は、１つ又は複数のそのようなタンパク質に対する参照であり、当業者には公知のその変異体、誘導体、断片、等価物などを含む。
【００５７】
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、又は等価である任意の方法、デバイス、及び材料を本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法、デバイス及び材料をここで説明する。
【００５８】
本明細書に記載の全ての刊行物及び特許は、例えば、その刊行物に記載される構築物及び方法を説明及び開示するために参照により本明細書に組み込まれ、説明される本発明に関連して用いることができる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示のために提供されるものに過ぎない。本発明者らが以前の発明であるという理由で、又は任意の他の理由でそのような開示に先行する権利を与えられないことの承諾として解釈されるべきものは本明細書には何もない。
【００５９】
「ヘテロマルチマー」又は「ヘテロマルチマーポリペプチド」は、第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマー及び第２の輸送体ポリペプチドを含む第２のモノマーを含む分子であり、第２のポリペプチドは少なくとも１個のアミノ酸残基によって第１のポリペプチドとはアミノ酸配列において異なる。ヘテロマルチマーは、第１及び第２の輸送体ポリペプチドによって形成される「ヘテロダイマー」を含んでもよい。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは、限定されるものではないが、トリマー及びテトラマーなどのより高次の三次構造を形成することができる。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、第１及び第２の輸送体ポリペプチドに加えて存在する。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーを形成する輸送体ポリペプチドの集合は、表面積埋没によって駆動される。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、ヘテロマルチマー形成を好み、及び／又はホモマルチマー形成を好まないことによってヘテロマルチマー形成を駆動する静電相互作用及び／又は塩架橋相互作用によって互いに相互作用する。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、ヘテロマルチマー形成を好み、及び／又はホモマルチマー形成を好まないことによってヘテロマルチマー形成を駆動する疎水性相互作用によって互いに相互作用する。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、共有結合形成によって互いに相互作用する。特定の実施形態においては、共有結合は、ヘテロマルチマー形成を駆動する天然に存在するか、又は導入されたシステインの間で形成される。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、モノマー間で共有結合は形成されない。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、ヘテロマルチマー形成を好み、及び／又はホモマルチマー形成を好まないことによってヘテロマルチマー形成を駆動するパッキング／サイズ相補性／ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）／突出部−空洞型相互作用によって互いに相互作用する。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、ヘテロマルチマー形成を好み、及び／又はホモマルチマー形成を好まないことによってヘテロマルチマー形成を駆動するカチオン−π相互作用によって互いに相互作用する。特定の実施形態においては、個々の輸送体ポリペプチドは溶液中では単離されたモノマーとして存在することができない。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは、モノマーと比較して個々の輸送体ポリペプチドの好ましい状態である。
【００６０】
用語「二特異的」は、２つの異なる結合特異性を有する、任意の薬剤、例えば、ヘテロマルチマー、モノマー、タンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図される。例えば、いくつかの実施形態においては、前記分子は、（ａ）細胞表面の標的分子及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合するか、又はそれと相互作用することができる。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つのモノマーは、同じ輸送体ポリペプチドに、異なる結合特異性を有する２つのカーゴ分子を付けることにより形成される二特異性である。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーはそれ自体、輸送体ポリペプチドに、異なる特異性を有する少なくとも２つのカーゴ分子を付けることにより形成される二特異性である。用語「多特異的分子」又は「ヘテロ特異的分子」は、２つを超える異なる結合特異性を有する任意の薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図される。例えば、前記分子は、（ａ）限定されるものではないが、細胞表面抗原などの細胞表面標的分子、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、及び（ｃ）少なくとも１つの他の構成要素に結合するか、又はそれと相互作用することができる。従って、本明細書に記載のヘテロマルチマーの実施形態は、限定されるものではないが、二特異的、三特異的、四特異的、及び他の多特異的分子を包含する。特定の実施形態においては、これらの分子は、ＣＤ３０などの細胞表面抗原、及びエフェクター細胞上のＦｃ受容体などの他の標的に対するものである。
【００６１】
別途指摘しない限り、表現「多価」は本明細書を通じて、標的分子が付くための少なくとも２つの部位を含むヘテロマルチマーを指すように用いられる。多価ヘテロマルチマーは、所望の標的のための複数の結合部位を有するように設計される。特定の実施形態においては、結合部位は、輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子上にある。特定の実施形態においては、少なくとも１つの結合部位は、輸送体ポリペプチド上にある。表現「二価」は、本明細書を通じて、２つの標的結合部位を含むヘテロマルチマーを指すように用いられる。二価ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、両方の結合部位が同じモノマー上にある。表現「三価」は、本明細書を通じて、３つの標的結合部位を含むヘテロマルチマーを指すように用いられる。表現「四価」は、本明細書を通じて、４つの標的結合部位を含むヘテロマルチマーを指すように用いられる。
【００６２】
「融合タンパク質」及びポリペプチドは、別々のポリペプチドを元々コードする２つ以上の遺伝子を連結することにより創出される。この融合遺伝子の翻訳は、元のポリペプチドの各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。本明細書に記載のヘテロマルチマーの実施形態においては、少なくとも１つのモノマーは、輸送体ポリペプチドのＮ又はＣ末端への少なくとも１つのカーゴポリペプチドの融合によって形成される融合タンパク質を含んでもよい。
【００６３】
用語「実質的に精製された」とは、その天然の環境、すなわち、天然の細胞、又は組換え産生されるヘテロマルチマーの場合は、宿主細胞中に見出されるような通常はタンパク質を伴うか、又はそれと相互作用する成分を実質的に、又は本質的に含まないものであってよい、特定の実施形態においては、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満（乾燥重量で）の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む細胞材料を実質的に含まない、本明細書に記載のヘテロマルチマー、又はその変異体を指す。ヘテロマルチマー又はその変異体を宿主細胞によって組換え産生する場合、特定の実施形態においては、タンパク質は細胞の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％以下の乾燥重量で存在する。ヘテロマルチマー又はその変異体を宿主細胞によって組換え産生する場合、タンパク質は、特定の実施形態においては、細胞の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、又は約１ｍｇ／Ｌ以下の乾燥重量で培養培地中に存在する。特定の実施形態においては、本明細書に記載の方法により製造される「実質的に精製された」ヘテロマルチマーは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動などの好適な方法により決定された場合、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、特に、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、及びより特には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルを有する。
【００６４】
「組換え宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、挿入に用いられる方法、例えば、直接的取込み、形質導入、ｆ交配、又は組換え宿主細胞を創出するために当技術分野で公知の他の方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、プラスミドとして維持するか、又は或いは、宿主ゲノム中に組み込むことができる。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「培地」又は「培地（複数形）」は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、大腸菌、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）宿主細胞などの任意の宿主細胞、及び細胞内容物を支持するか、又は含有し得る任意の培養培地、溶液、固体、半固体、又は固定支持体を含む。かくして、この用語は、宿主細胞が増殖された培地、例えば、精製ステップの前又は後のいずれかの培地などのタンパク質が分泌された培地を包含してもよい。この用語はまた、本明細書に記載のヘテロマルチマーを細胞内で産生させ、宿主細胞を溶解又は破壊してヘテロマルチマーを放出させる場合などに、宿主細胞溶解物を含有するバッファー又は試薬を包含してもよい。
【００６６】
本明細書で用いられる「再折畳み」は、ジスルフィド結合を含有するポリペプチドを、ジスルフィド結合に関して不適切に折畳まれたか、又は折畳まれていない状態から、天然のコンフォメーション又は適切に折畳まれたコンフォメーションに変換する任意のプロセス、反応又は方法を説明する。
【００６７】
本明細書で用いられる「コフォールディング」とは、特に、互いに相互作用する少なくとも２つのモノマーポリペプチドを使用し、折畳まれていないか、又は不適切に折畳まれたポリペプチドの、天然の適切に折畳まれたポリペプチドへの変換をもたらす再折畳みプロセス、反応、又は方法を指す。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「調節された血清半減期」は、その天然形態と比較した、本明細書に記載のヘテロマルチマーにより含まれるカーゴポリペプチドの循環半減期の正又は負の変化を意味する。血清半減期は、ヘテロマルチマーの投与後の様々な時点で血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間との相関により、血清半減期の算出が可能になる。血清半減期の増加は、望ましくは少なくとも約２倍を有するが、例えば、それが満足のいく投薬レジメンを可能にするか、又は毒性効果を回避する場合には、より小さい増加も有用であり得る。いくつかの実施形態においては、増加は少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍である。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「調節された治療半減期」は、その非改変形態と比較した、本明細書に記載のヘテロマルチマーにより含まれる治療上有効量のカーゴポリペプチドの半減期の正又は負の変化を意味する。治療半減期は、投与後の様々な時点で前記分子の薬物動態及び／又は薬力学的特性を測定することによって測定される。治療半減期の増加は、望ましくは特定の有益な投薬レジメン、特定の有益な総用量を可能にするか、又は望ましくない効果を回避する。いくつかの実施形態においては、治療半減期の増加は、効力の増加、改変された分子の標的へのその結合の増加若しくは減少、プロテアーゼなどの酵素による分子の破壊の増加若しくは減少、又は別のパラメータ若しくは非改変分子の作用機構の増加若しくは減少又は分子の受容体媒介性クリアランスの増加若しくは減少の結果生じる。
【００７０】
核酸又はタンパク質に適用される場合、用語「単離された」とは、核酸若しくはタンパク質が、それが天然の状態で会合する細胞成分の少なくともいくつかを含まないか、又は核酸若しくはタンパク質がそのｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生の濃度よりも高いレベルに濃縮されていることを指す。それは均一な状態にあってもよい。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態にあるか、又は限定されるものではないが、水性溶液などの溶液中にあってもよい。それは、さらなる製薬上許容し得る担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物の成分であってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」とは、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で実質的に１つのバンドを生じることを指す。特に、それは、核酸又はタンパク質が少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％以上純粋であることを意味してもよい。
【００７１】
用語「核酸」とは、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態にある、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、天然のヌクレオチドと類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別途具体的に限定しない限り、この用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などのオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術において用いられるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）も指す。別途指摘しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその変異体（限定されるものではないが、縮重コドン置換を含む）及び相補的配列並びに明示的に示された配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全部の）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより達成することができる（Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００７２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書では互換的に用いられる。すなわち、ポリペプチドに対する説明は、ペプチドの説明及びタンパク質の説明に同等に適用され、その逆も同様である。この用語は、天然のアミノ酸ポリマー並びに１つ又は複数のアミノ酸残基が天然にはコードされないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いられる場合、この用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合により連結された、完全長タンパク質などの任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００７３】
用語「アミノ酸」とは、天然及び非天然アミノ酸、並びに天然アミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０種の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）並びにピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合した炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（ノルロイシンなど）又は改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸に対する参照は、例えば、天然のタンパク質生成Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、アミノ酸変異体及び誘導体などの化学的に改変されたアミノ酸；β−アラニン、オルニチンなどの天然の非タンパク質生成アミノ酸；並びにアミノ酸に特徴的である当技術分野で公知の特性を有する化学合成された化合物を含む。非天然アミノ酸の例としては、限定されるものではないが、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖中に追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、並びに側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されたアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられる。合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、又は１つ若しくは複数のＤ−アミノ酸などの、非天然アミノ酸の本発明のタンパク質への組込みは、いくつかの異なる方法で有利であり得る。Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドなどは、Ｌ−アミノ酸を含有する対応物と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで高い安定性を示す。かくして、Ｄ−アミノ酸を組み込むペプチドなどの構築は、より高い細胞内安定性が望ましいか、又は要求される場合に特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチドなどは、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性であり、それによって、分子のバイオアベイラビリティの改善、及びそのような特性が望ましい場合にｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命の延長を提供する。さらに、Ｄ−ペプチドなどは、ヘルパーＴ細胞への主要組織適合複合体クラスＩＩ限定的提示のために効率的にプロセッシングされず、従って、全生物中で体液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
【００７４】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されるそれらの一般的に知られる３文字記号又は１文字記号のいずれかによって本明細書で参照することができる。同様に、ヌクレオチドは、その一般的に許容される１文字コードにより参照することができる。
【００７５】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」は、同一の、若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重性のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。かくして、あるコドンによってアラニンが特定される全ての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変される変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者であれば、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＣを除く）は機能的に同一の分子を得るために改変することができることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの記載される配列中に潜在する。
【００７６】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされる配列中の単一のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸を変化、付加又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加が、その変化がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者には公知である。そのような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に加えて、それらを排除しない。
【００７７】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当業者には公知である。以下の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：
【００７８】
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
【００７９】
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
【００８０】
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
【００８１】
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
【００８２】
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
【００８３】
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
【００８４】
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)を参照されたい）。
【００８５】
２個以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「同一」又は「同一性」％は、同じである２個以上の配列又はサブ配列を指す。配列は、それらが比較ウインドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つ（若しくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を用いて、若しくは手動でのアラインメント及び視覚的検査により測定される指定の領域にわたる最大一致について比較及び整列された場合、同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの割合（すなわち、特定の領域にわたる約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％の同一性）を有する場合、「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長若しくはヌクレオチド長である領域にわたって、又は７５〜１００アミノ酸長若しくはヌクレオチド長である領域にわたって、又は特定されない場合、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの配列全体にわたって存在してもよい。ヒト以外の種に由来する相同体などの本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチド配列又はその断片を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングするステップと、前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップとを含むプロセスによって取得することができる。そのようなハイブリダイゼーション技術は、当業者には周知である。
【００８６】
配列の比較のために、典型的には、ある配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、サブ配列を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定することができる。デフォルトのプログラムパラメータを用いるか、又は代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性％を算出する。
【００８７】
本明細書で用いられる「比較ウインドウ」は、配列を、２つの配列を最適に整列させた後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができる２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０から成る群より選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当業者には公知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、限定されるものではないが、Smith及びWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズムにより、Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性の検索方法により、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータ化された実装により、又は手動でのアラインメント及び視覚的検査（例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照されたい）により、行うことができる。
【００８８】
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの一例は、それぞれ、Altschulら、(1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されたＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブで利用可能なＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公共的に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖のための比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff及びHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖のための比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑度」フィルターのスイッチを切って実施される。
【００８９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の示唆を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．２未満、又は約０．０１未満、又は約０．００１未満である場合に、参照配列と類似すると考えられる。
【００９０】
語句「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」とは、ある分子が、その配列が複合混合物（限定されるものではないが、全細胞又はライブラリーＤＮＡ又はＲＮＡなど）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列に対してのみ結合する、二本鎖を形成する、又はハイブリダイズすることを指す。
【００９１】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、当技術分野で公知であるように、低イオン強度及び高温の条件下でのＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸、又はその組合せの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸（限定されるものではないが、全細胞若しくはライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡなど）の複合混合物中のその標的サブ配列にはハイブリダイズするが、複合混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境においては異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見出される。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「真核生物」とは、動物（限定されるものではないが、哺乳類、昆虫類、爬虫類、鳥類など）、繊毛虫類、植物（限定されるものではないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類など）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生動物などの真核生物系統ドメインに属する生物を指す。
【００９３】
本明細書で用いられる用語「原核生物」とは、原核生物を指す。例えば、非真核生物は、真正細菌（限定されるものではないが、大腸菌、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）など）系統ドメイン、又は古細菌（限定されるものではないが、メタノコッカス・ジャナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウム、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロピルム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）など）系統ドメインに属してもよい。
【００９４】
本明細書で用いられる用語「被験体」とは、治療、観察又は実験の対象である、動物、いくつかの実施形態においては、哺乳動物、及び他の実施形態においては、ヒトを指す。動物は、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）又は実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってよい。
【００９５】
本明細書で用いられる用語「有効量」とは、治療される疾患、症状又は障害の１つ又は複数の症状をある程度まで軽減する、投与されるヘテロマルチマーの量を指す。本明細書に記載のヘテロマルチマーを含有する組成物を、予防的処置、増強処置、及び／又は治療的処置のために投与することができる。
【００９６】
用語「増強する」又は「増強」は、効力又は期間のいずれかにおいて、所望の効果を増加又は延長することを意味する。かくして、治療剤の効果の増強に関して、用語「増強」とは、効力又は期間のいずれかにおいて、系に対する他の治療剤の効果を増加又は延長する能力を指す。本明細書で用いられる「増強有効量」とは、所望の系における別の治療剤の効果を増強するのに十分な量を指す。患者において用いられる場合、この使用にとって有効な量は、疾患、障害又は状態の重篤度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに治療する医師の判断に依存する。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「改変された」とは、ポリペプチド、アミノ酸配列、ポリペプチドの化学的構造、翻訳同時的改変、又は翻訳後改変の長さの変化などの、所与のポリペプチドに対して行われる任意の変化を指す。形態「（改変された）」用語は、議論されるポリペプチドが必要に応じて改変されること、すなわち、議論のポリペプチドが改変されたものであるか、又は改変されていないものであってよいことを意味する。
【００９８】
用語「翻訳後改変された」とは、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖中に組み込まれた後にそのようなアミノ酸に対して生じるその任意の改変を指す。この用語は、例示に過ぎないが、翻訳同時ｉｎ  ｖｉｖｏ改変、翻訳同時ｉｎ  ｖｉｔｒｏ改変（無細胞翻訳系などにおける）、翻訳後ｉｎ  ｖｉｖｏ改変、及び翻訳後ｉｎ  ｖｉｔｒｏ改変を包含する。
【００９９】
用語「セグメンテーション」とは、ヘテロマルチマーとして選択的に会合して疑似タンパク質を形成するタンパク質配列の「セグメント」をもたらす元のタンパク質配列の正確な内部スプライスを指す。
【０１００】
疑似天然構造：
【０１０１】
天然タンパク質又はその構造を参照する場合、疑似天然タンパク質及び／又は「疑似天然構造」は、天然タンパク質のような機能的及び構造的特性を提供する。タンパク質は、天然の力学分子であり、構造的配置の集合体を示すが、本発明者らは、天然の構造を、Ｘ線結晶学により得られたものなどに属するものと見なす。そのタンパク質の形状の集合体において観察される別の構造的配置は、互いに比較して、又は結晶中に観察される構造と比較して、疑似天然構造であると見なすことができる。異なる前面上で、共通の構造的ファミリーに属する相同なタンパク質配列又はタンパク質は、類似する構造的形状に折畳まれる傾向がある。このファミリーに属するメンバータンパク質は、互いに比較して疑似天然構造を達成すると見なすことができる。タンパク質ファミリー中のいくつかのユニークな配列は、類似する機能的属性を示すこともでき、従って、互いに比較して疑似天然タンパク質と呼ぶことができる。それぞれが輸送体ポリペプチド成分を有する２つ以上のモノマータンパク質を含む本明細書に記載のヘテロマルチマーの場合、輸送体ポリペプチドは集合して疑似天然構造を形成する。この場合の参照天然タンパク質は、輸送体ポリペプチドが誘導されるタンパク質であり、参照天然構造は、輸送体ポリペプチドが誘導されるタンパク質の構造である。本発明者らは、２つ以上の異なるポリペプチドが自己集合してヘテロマルチマー構造特性を形成し、それ自身、実体としてモノマーである天然タンパク質のような機能的特性を示す事例を説明する。特定の実施形態においては、本発明者らは、自己集合して、ＦｃＲｎ結合及び構造特性などの天然アルブミンのような機能的特性を示すヘテロマルチマーを形成するアルブミンに由来するポリペプチドセグメントを提供する。特定の実施形態においては、本発明者らは、自己集合して、天然のトランスフェリンのような構造的及び機能的特性を示すヘテロマルチマーを形成するトランスフェリンに由来するポリペプチドセグメントを提供する。特定の実施形態においては、本発明者らは、自己集合して、天然のアネキシンのような構造的及び機能的特性を示すヘテロマルチマーを形成するアネキシンに由来するポリペプチドセグメントを提供する。これらのヘテロマルチマーは疑似天然であると呼ばれる。
【０１０２】
輸送体ポリペプチド
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「輸送体ポリペプチド」又は「輸送体ポリペプチド」又は「輸送体ペプチド」又は「輸送体」とは、前記輸送体ポリペプチドが溶液中で他のそのような輸送体ポリペプチドとヘテロマルチマータンパク質を形成することができ、前記ヘテロマルチマータンパク質が、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが由来するモノマータンパク質の疑似天然構造を有するようなポリペプチドを指す。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドは、同じアルブミン又はアロアルブミンタンパク質に由来する。特定の他の実施形態においては、ヘテロマルチマーは、様々なアルブミン及びアロアルブミンタンパク質に由来する輸送体ポリペプチドにより形成される。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、トランスフェリンに由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドはアネキシンタンパク質に由来する。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは、同じアネキシンタンパク質に由来する輸送体ポリペプチドにより形成される。いくつかの実施形態においては、ヘテロマルチマーは、異なるアネキシンタンパク質に由来する輸送体ポリペプチドにより形成される。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは、アネキシンＡ２に由来する輸送体ポリペプチドにより形成される。
【０１０４】
特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、全タンパク質のセグメントであり、前記セグメントは集合して、ヘテロマルチマーを形成することができる。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、コイルドコイルタンパク質に由来するセグメントである。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、ロイシンジッパータンパク質に由来するセグメントである。一実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、β−バレルタンパク質に由来するセグメントである。一実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、β−プロペラタンパク質から得られたセグメントである。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、へリックス束タンパク質から得られたセグメントである。実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、例えば、限定されるものではないが、亜鉛フィンガーモチーフ、ヘリックスターンヘリックスモチーフ又はβ−ヘアピンモチーフを含むタンパク質から生成される。いくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、構造的に安定であり、好ましい生物学的特性を有する非免疫原性タンパク質から得られたセグメントである。
【０１０５】
アルブミン
【０１０６】
本明細書で用いられる「アルブミン」とは、アルブミンの１つ又は複数の機能的活性（例えば、生物活性）を有する、アルブミンタンパク質若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンセグメント若しくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミン又はそのセグメント（例えば、ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７を参照されたい）、特に、図１に示される成熟形態のヒトアルブミン、又は他の脊椎動物に由来するアルブミン、若しくはそのセグメント、又はこれらの分子若しくはその断片の類似体若しくは変異体を指す。特定の実施形態においては、アルブミンは、切断型のアルブミンである。
【０１０７】
用語「疑似アルブミン」とは、全アルブミンと類似する構造及び／又は機能を有するヘテロマルチマー分子を指し、前記ヘテロマルチマー分子は全アルブミンの配列に基づいて設計された２つ以上のモノマーポリペプチドの集合により形成される。特定の実施形態においては、モノマーポリペプチドは、ヘテロマルチマー対として選択的に会合して、疑似タンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは、全アルブミンの活性の９０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは全アルブミンの活性の７５％を有する。一実施形態においては、疑似アルブミンは全アルブミンの活性の５０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは全アルブミンの活性の５０〜７５％を有する。一実施形態においては、疑似アルブミンは全アルブミンの活性の８０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは分子モデリングにより決定された場合、全アルブミンの構造の９０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは分子モデリングにより決定された場合、全アルブミンの構造の８０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは分子モデリングにより決定された場合、全アルブミンの構造の７０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは分子モデリングにより決定された場合、全アルブミンの構造の５０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アルブミンは分子モデリングにより決定された場合、全アルブミンの構造の５０％〜７５％を有する。
【０１０８】
用語、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒトアルブミン（ＨＡ）は、本明細書では互換的に用いられる。用語「アルブミン及び血清アルブミン」はより広く、ヒト血清アルブミン（並びにその断片及び変異体）並びに他の種に由来するアルブミン（並びにその断片及び変異体）を包含する。
【０１０９】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質のそれぞれのアルブミンに基づくモノマーは、正常なＨＡの変異体に基づく。本発明のヘテロマルチマータンパク質のそれぞれのカーゴポリペプチド部分は、本明細書に記載の治療タンパク質の変異体であってもよい。用語「変異体」は、保存的又は非保存的いずれかの挿入、欠失及び置換を含み、そのような変化はアルブミンの膨張性の有用なリガンド結合特性及び非免疫原性特性、又は活性部位、又は治療タンパク質の治療活性を付与する活性ドメインのうちの１つ又は複数を実質的に変化させない。
【０１１０】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質は、ヒトアルブミンの天然の多型変異体及びヒトアルブミンの断片、例えば、ＥＰ３２２０９４に開示された断片（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）（ここでｎは３６９〜４１９である））を含む。
【０１１１】
特定の実施形態においては、アルブミンは、任意の脊椎動物、特に、限定されるものではないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、イヌ又はブタを含む任意の哺乳動物に由来する。特定の実施形態においては、アルブミンは、限定されるものではないが、ニワトリ及びサケなどの非哺乳動物アルブミンに由来する。
【０１１２】
ヒトアルブミンの配列は示される通りである：
【０１１３】
配列番号１
【０１１４】
【化１】
2014512343.tif 000003
【０１１５】
アロアルブミン
【０１１６】
アロアルブミンは、アルブミンの遺伝子変異体である。特定の実施形態においては、アロアルブミンはヒトアロアルブミン（ＨＡＡ）である。電気泳動移動度においてアルブミンと異なるアロアルブミンは、臨床電気泳動の過程において、又は血液ドナー調査において集団遺伝学調査を通じて同定された。突然変異及び移動のマーカーとして、アロアルブミンは遺伝学者、生化学者、及び人類学者にとって興味深いものであるが、これらのアロアルブミンの多くは疾患と関連しない（Minchiotiら、Human Mutations 29(8)、 1007-1016(2008)）。
【０１１７】
【表１−１】
2014512343.tif 000004
【表１−２】
2014512343.tif 000005
【０１１８】
アネキシン：
【０１１９】
本明細書で用いられる「アネキシン」は、真核生物に見出される細胞タンパク質の一群を指す。アネキシンは、リポコルチンとしても知られる。本明細書で用いられる「アネキシン」は、任意のアネキシンタンパク質、又は「アネキシンＡ１」、「アネキシンＡ２」及び「アネキシンＡ５」などの特定のアネキシンタンパク質を指してもよい。アネキシンは、負に荷電したリン脂質（すなわち、膜壁）に結合するそのカルシウム依存的能力を特徴とする。アネキシンは、かなり遍在する組織分布を有する３０〜５０ｋＤａのサイズに限定された反復タンパク質足場を特徴とする。アネキシンの基本構造は、２つのドメイン：構造的に保存されたＣ末端「コア」領域及び多様なＮ末端ドメインを含む。コア領域は、Ｃａ２＋依存的様式でリン脂質細胞膜に結合する。Ｎ末端領域は、細胞質タンパク質に結合する。アネキシンは様々な細胞及び生理学的プロセスにおいて重要であり、膜足場を提供する。Ｃ末端コアは、４つのアネキシン反復から構成される。アネキシンは、その固有の膜感知能力に影響するその可撓性反復様性質を特徴とする。例えば、特定の生体膜に対する親和性を、反復の数によって制御することができる。特徴的なリン脂質感知と共に、アネキシンは薬剤送達のための腸結合を感知／標的化するのに有用であり得る。アネキシンのための別の潜在的な適用は、腸の密着結合及び密着帯（Ｚｏｎｕｌａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）領域（ＺＯ−１）を標的化することであり、薬物吸収を有意に弱めるより大きいタンパク質治療剤を横断するのが特に難しいことが知られる。
【０１２０】
用語「疑似アネキシン」とは、全アネキシンと類似する構造及び／又は機能を有するヘテロマルチマー分子を指し、前記ヘテロマルチマー分子は、全アネキシンの配列に基づいて設計された２つ以上のモノマーポリペプチドの集合により形成される。特定の実施形態においては、モノマーポリペプチドは、ヘテロマルチマー対として選択的に会合して疑似タンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、全アネキシンの活性の９０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、全アネキシンの活性の７５％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、全アネキシンの活性の５０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、全アネキシンの活性の５０〜７５％を有する。一実施形態においては、疑似アネキシンは、全アネキシンの活性の８０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、分子モデリングにより決定された場合、全アネキシンの構造の９０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、分子モデリングにより決定された場合、全アネキシンの構造の８０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、分子モデリングにより決定された場合、全アネキシンの構造の７０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、分子モデリングにより決定された場合、全アネキシンの構造の５０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似アネキシンは、分子モデリングにより決定された場合、全アネキシンの構造の５０％〜７５％を有する。
【０１２１】
ヒト野生型アネキシンＡ２の配列は示される通りである：
【０１２２】
配列番号１４
【０１２３】
【化２】
2014512343.tif 000006
【０１２４】
トランスフェリン：
【０１２５】
トランスフェリンは、全ての脊椎動物に存在する約７６ｋＤａの分子量のモノマータンパク質であり、鉄結合タンパク質及び輸送タンパク質として機能する。組換えヒトトランスフェリン及びその融合物は、地中海貧血、無トランスフェリン血症、加齢黄斑変性症、２型糖尿病、幹細胞移植の間及び炭疽菌により引き起こされる急性感染症の治療におけるなど、様々な疾患の管理にとって考慮される。トランスフェリンは、胃腸環境中で安定であり、無傷のタンパク質−トランスフェリンコンジュゲートを経口送達することができ、それが生物活性を保持することがいくつかの研究により示されている。
【０１２６】
用語「疑似トランスフェリン」とは、全トランスフェリンと類似する構造及び／又は機能を有するヘテロマルチマー分子を指し、前記ヘテロマルチマー分子は全トランスフェリンの配列に基づいて設計された２つ以上のモノマーポリペプチドの集合により形成される。特定の実施形態においては、モノマーポリペプチドは、ヘテロマルチマー対として選択的に会合して疑似タンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、全トランスフェリンの活性の９０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、全トランスフェリンの活性の７５％を有する。一実施形態においては、疑似トランスフェリンは、全トランスフェリンの活性の５０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、全トランスフェリンの活性の５０〜７５％を有する。一実施形態においては、疑似トランスフェリンは、全トランスフェリンの活性の８０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、分子モデリングにより決定された場合、全トランスフェリンの構造の９０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、分子モデリングにより決定された場合、全トランスフェリンの構造の８０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、分子モデリングにより決定された場合、全トランスフェリンの構造の７０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、分子モデリングにより決定された場合、全トランスフェリンの構造の５０％を有する。いくつかの実施形態においては、疑似トランスフェリンは、分子モデリングにより決定された場合、全トランスフェリンの構造の５０％〜７５％を有する。
【０１２７】
野生型ヒトトランスフェリンの配列は示される通りである：
【０１２８】
配列番号１９
【０１２９】
【化３】
2014512343.tif 000007
【０１３０】
カーゴ分子：
【０１３１】
本明細書に記載のヘテロマルチマーは、少なくとも１つのカーゴ分子、及び少なくとも１つの輸送体ポリペプチドを含むモノマーであって、前記カーゴ分子及び輸送体ポリペプチドが、限定されるものではないが、遺伝子融合又は化学的コンジュゲーションを含む手段によって、互いに会合した上記モノマーを含む。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、治療剤である。特定の薬剤においては、カーゴ分子は毒素である。特定の実施形態においては、カーゴ分子は抗原、又はその類似体である。一実施形態においては、カーゴ分子は天然の生成物、その類似体、又はプロドラッグである。特定の実施形態においては、カーゴ分子は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤若しくは細胞破壊剤などの治療剤、治療剤又は放射性金属イオン、例えば、α−放射体、例えば、２１３Ｂｉなどである。細胞毒素又は細胞傷害剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにその類似体又は相同体が挙げられる。治療剤としては、限定されるものではないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
【０１３２】
特定の実施形態においては、カーゴ分子は、生体分子である。一実施形態においては、カーゴ分子は、天然又は合成の核酸である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、１つ又は複数のＤＮＡ、ＰＮＡ及び／又はＲＮＡオリゴマーである。特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、少なくとも１つのカーゴポリペプチド、又はその断片若しくは変異体、及び少なくとも１つの輸送体ポリペプチドを含むモノマータンパク質であって、前記カーゴポリペプチド及び輸送体ポリペプチドが、限定されるものではないが、遺伝子融合又は化学的コンジュゲーションを含む手段によって互いに会合した上記モノマータンパク質を含む。
【０１３３】
本明細書で用いられる「カーゴポリペプチド」とは、１つ又は複数の治療活性及び／又は生物活性を有する、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド又はその断片若しくは変異体を指す。本発明により包含されるカーゴポリペプチドとしては、限定されるものではないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、治療上関連する標的タンパク質及び生物製剤に対する基質又はリガンドが挙げられる（用語ペプチド、タンパク質及びポリペプチドは本明細書では互換的に用いられる）。具体的には、用語「カーゴポリペプチド」は、抗体並びにその断片及び変異体を包含する。かくして、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、カーゴポリペプチドの少なくとも断片若しくは変異体、及び／又は抗体の少なくとも断片若しくは変異体を含有してもよい。さらに、特定の実施形態においては、用語「カーゴポリペプチド」は、カーゴポリペプチドの内因性又は天然の相関物を指す。
【０１３４】
非限定例として、「カーゴ生体分子」は、限定されるものではないが、疾患、状態又は障害を治療、予防又は改善するのに有用であるタンパク質、ＤＮＡ、又はＲＮＡなどの生体分子である。非限定例として、「カーゴポリペプチド」は、特定の細胞型（正常な（例えば、リンパ球）又は異常な、例えば、（癌細胞））に特異的に結合するものであってよく、従って、その細胞型に特異的にある化合物（薬物、又は細胞傷害剤）を標的化するのに用いることができる。
【０１３５】
別の非限定例においては、「カーゴ分子」は、生物活性、特に、疾患を治療、予防又は改善するのに有用である生物活性を有する分子である。カーゴ分子、例えば、カーゴポリペプチドにより有され得る生物活性の非包括的一覧としては、免疫応答の増強、血管新生の促進、血管新生の阻害、造血機能の調節、神経増殖の刺激、免疫応答の増強、免疫応答の阻害、又は本明細書に記載の生物活性の任意の１つ若しくは複数が挙げられる。
【０１３６】
細胞表面及び分泌タンパク質などの、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質のカーゴポリペプチド部分に対応するカーゴポリペプチドは、１つ又は複数のオリゴ糖基の結合によって改変されることが多い。グリコシル化と呼ばれるこの改変は、タンパク質の物理特性に劇的に影響し、タンパク質の安定性、分泌、及び局在化において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置で生じる。通常は２つの主要な型のグリコシル化：セリン又はトレオニン残基に結合される、Ｏ結合オリゴ糖を特徴とするグリコシル化；及びＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸であってよい）中のアスパラギン残基に結合された、Ｎ結合オリゴ糖を特徴とするグリコシル化が存在する。Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸としても知られる）は、通常はＮ結合及びＢ結合オリゴ糖の両方の末端残基である。タンパク質構造及び細胞型などの変数が、異なるグリコシル化部位での鎖内の炭水化物単位の数及び性質に影響する。グリコシル化異性体はまた、所与の細胞型内の同じ部位で共通である。
【０１３７】
表２は、本明細書に記載のヘテロマルチマーのカーゴポリペプチド部分に対応するカーゴポリペプチドの非包括的一覧を提供する。「カーゴポリペプチド」の列は、カーゴポリペプチド分子を開示し、その後の括弧内に、そのカーゴポリペプチド分子又はその断片若しくは変異体を含むか、又は或いはそれから成る学名及び商標名を含む。一実施形態においては、カーゴ分子は、「カーゴポリペプチド」の列、若しくは参照により本明細書に組み込まれるZhuら(Nucleic Acids Res. 38(1)、 D787-D791 (2009)); Wishartら(Nucleic Acids Res 36、 D901-D906 (2008)); Ahmedら(Nucleic Acids Res 39、 D960-D967 (2011))に開示されたタンパク質、又は治療標的分子のクラスに属するタンパク質に結合する分子である。
【０１３８】
本明細書で用いられる「カーゴポリペプチド」は、個々のカーゴポリペプチド分子（ＣＡＳ及びＧｅｎｂａｎｋ受託番号から得られるアミノ酸配列により定義される）、又はこの列に開示される所与のカーゴポリペプチド分子と関連するカーゴポリペプチドの群全体、又はこの列に開示されるポリペプチド分子に結合するカーゴポリペプチドのいずれかを指してもよい。
【０１３９】
【表２−１】
2014512343.tif 000008
【表２−２】
2014512343.tif 000009
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
2014512343.tif 000028
【０１４０】
機能的活性：
【０１４１】
「機能的活性を有するポリペプチド」とは、完全長、プロタンパク質、及び／又は成熟形態のカーゴポリペプチドと関連する１つ又は複数の公知の機能的活性を示すことができるポリペプチドを指す。そのような機能的活性としては、限定されるものではないが、生物活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合する（又は結合についてポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（本明細書に記載の特定のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本明細書に記載のポリペプチドとマルチマーを形成する能力、及びポリペプチドのための受容体又はリガンドに結合する能力が挙げられる。特定の実施形態においては、機能的活性は、パートナータンパク質の発現及び安定性を改善する能力を含む。
【０１４２】
「生物活性を有するポリペプチド」とは、用量依存性を有するか、又は有さずに、特定の生物学的アッセイにおいて測定された場合、成熟形態を含む本明細書に記載の治療タンパク質の活性と類似するが、必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、それは本明細書に記載のポリペプチドと比較して、ポリペプチドのものと同一である必要はないが、所与の活性における用量依存性と実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、本明細書に記載されるか、又は表２に提示されたポリペプチドと比較して、より高い活性又は約２５倍以下、又は約１０倍以下の活性、又は約３倍以下の活性を示す）。
【０１４３】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、カーゴ分子が輸送体ポリペプチドに連結されていない場合、前記カーゴ分子と関連する少なくとも１つの生物活性及び／又は治療活性を有する。特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、カーゴポリペプチドが輸送体ポリペプチドに連結されていない場合、前記カーゴポリペプチドと関連する少なくとも１つの生物活性及び／又は治療活性を有する。特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質は、カーゴポリペプチドがアルブミン又はアロアルブミンに基づくポリペプチドに連結されていない場合、前記カーゴポリペプチド部分（又はその断片若しくは変異体）と関連する少なくとも１つの生物活性及び／又は治療活性を有する。
【０１４４】
本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質を、当技術分野で公知のアッセイ、並びに本明細書に記載のアッセイを用いて、又はそれを日常的に改変して、機能的活性（例えば、生物活性）についてアッセイすることができる。さらに、当業者であれば、表２の対応する行（例えば、表２の３列目の行）で参照されるアッセイを用いて、活性について、アルブミン又はアロアルブミンに基づくモノマーポリペプチドのカーゴタンパク質部分に対応するタンパク質の断片を日常的にアッセイすることができる。特定の実施形態においては、当技術分野で公知のアッセイ及び／又は以下の実施例の節に記載されるアッセイを用いる、活性についての、ヘテロマルチマーのアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質の断片のアッセイである。
【０１４５】
例えば、抗カーゴポリペプチド抗体及び／又は抗アルブミン抗体への結合についてカーゴポリペプチドに結合するか、又はそれと競合する本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質の能力についてアッセイする一実施形態においては、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素若しくは放射性アイソトープ標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの技法を用いた競合的アッセイ系及び非競合的アッセイ系を含めた、当技術分野で公知の様々な免疫アッセイを用いることができる。一実施形態においては、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態においては、一次抗体は、一次抗体への二次抗体又は試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態においては、二次抗体が標識される。免疫アッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当技術分野で公知であり、本発明の範囲内にある。
【０１４６】
本明細書に記載のヘテロマルチマーにより含まれるカーゴ分子のための結合パートナー（例えば、受容体又はリガンド）を同定する特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーによるその結合パートナーへの結合を、例えば、還元的及び非還元的ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティクロマトグラフィー、及びアフィニティブロッティングなどの当技術分野で周知の手段によりアッセイする。一般的には、Phizickyら、Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995)を参照されたい。別の実施形態においては、ヘテロマルチマーのカーゴタンパク質部分に対応するポリペプチドの基質（単数又は複数）に結合するヘテロマルチマータンパク質の生理的相関物の能力を、当技術分野で公知の技術を用いて日常的にアッセイすることができる。
【０１４７】
生物活性
【０１４８】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、１つ又は複数の生物活性について試験するためのアッセイにおいて用いられる。ヘテロマルチマーが特定のアッセイにおいて活性を示す場合、ヘテロマルチマーの１つ又は複数のモノマーにより含まれる少なくとも１つのカーゴタンパク質は、その生物活性と関連する疾患に関与する可能性がある。かくして、ヘテロマルチマーは、関連する疾患の治療において有用である。
【０１４９】
特定の実施形態においては、疾患又は障害を治療する方法であって、そのような治療、予防又は改善が望まれる患者に、該疾患又は障害を治療、予防又は改善するのに有効な量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む上記方法が提供される。
【０１５０】
本明細書で提供されるのは、細胞により産生されるモノマーアルブミン又はアロアルブミンに基づく融合タンパク質であって、前記タンパク質がポリヌクレオチドによりコードされ、前記モノマータンパク質が少なくとも１つのカーゴタンパク質、及びアルブミン又はアロアルブミン由来ポリペプチドを含み、前記モノマーが溶液中でヘテロマルチマーを形成する、上記タンパク質である。特定の実施形態においては、細胞からコードされるタンパク質を発現させるためにポリヌクレオチドを用いる場合、細胞の天然の分泌及びプロセッシングステップは、少なくとも１つのシグナル配列を欠くタンパク質を産生する。シグナル配列の特定のアミノ酸配列は、当技術分野で周知である。
【０１５１】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、内分泌系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、神経系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。
【０１５２】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、免疫系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、呼吸器系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。
【０１５３】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、心血管系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、生殖器系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。
【０１５４】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、消化器系の疾患及び／又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、血液に関連する疾患又は障害の診断、予後診断、予防及び／又は治療において用いられる。
【０１５５】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、少なくとも１つの目的の遺伝子が発現され、本明細書に記載のヘテロマルチマーが前記少なくとも１つの目的の遺伝子に結合するカーゴ分子を含む、少なくとも１つ又は複数の組織と関連する疾患及び／又は障害の診断及び／又は予後診断において用いられる。
【０１５６】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマー及び／又は会合して本明細書に記載のヘテロマルチマーを形成するアルブミン／アロアルブミンに基づくモノマーをコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、プロホルモン活性化、神経伝達因子活性、細胞シグナリング、細胞増殖、細胞分化、及び細胞移動などの活性と関連する疾患及び／又は障害の診断、検出及び／又は治療において用いられる。
【０１５７】
治療的使用：
【０１５８】
一態様においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、１つ又は複数の開示される疾患、障害、又は状態を治療するために、抗体、抗体の断片又は変異体であるカーゴポリペプチド（単数又は複数）を含む本明細書に記載のヘテロマルチマーを患者に投与することを含む、抗体に基づく療法を対象とする。本明細書に記載の治療化合物としては、限定されるものではないが、本明細書に記載のヘテロマルチマー、本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸が挙げられる。
【０１５９】
特定の実施形態においては、限定されるものではないが、神経障害、免疫系の障害、筋肉障害、生殖器障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、増殖障害、及び／若しくは癌疾患及び状態、並びに／又は本明細書の他の場所に記載のものなどの１つ又は複数の疾患、障害、又は状態を治療するために、抗体の少なくとも断片又は変異体を含む本明細書に記載のヘテロマルチマーを患者に投与することを含む抗体に基づく療法である。
【０１６０】
抗体の少なくとも断片又は変異体を含む本発明のヘテロマルチマータンパク質が治療的に用いられる方法の概要は、体内での局所的若しくは全身的結合又は、例えば、補体（ＣＤＣ）若しくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介される、抗体の直接的細胞傷害性によるものが挙げられる。これらの手法のいくつかを、以下でより詳細に説明する。本明細書で提供される教示で武装すれば、当業者は過度の実験を行うことなく、診断、モニタリング又は治療目的で本明細書に記載のヘテロマルチマーを使用する方法を知ることができる。
【０１６１】
抗体の少なくとも断片又は変異体を含む、本明細書に記載のヘテロマルチマーを、単独で、又は他の種類の治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び抗腫瘍剤）と組み合わせて投与することができる。一般に、患者と同じ種である種の起源又は種反応性（抗体の場合）の生成物の投与が好ましい。かくして、一実施形態においては、ヒト抗体、断片誘導体、類似体、又は核酸を、治療又は予防のためにヒト患者に投与する。
【０１６２】
遺伝子療法：
【０１６３】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質をコードする配列を含む核酸を、遺伝子療法により、タンパク質の異常な発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害を治療、阻害又は予防するために投与する。遺伝子療法とは、発現される、又は発現可能な核酸の被験者への投与により実施される療法を指す。本発明のこの実施形態においては、核酸は、治療効果を媒介するそのコードされたタンパク質を産生する。当技術分野で利用可能な遺伝子療法のための任意の方法を用いることができる。
【０１６４】
治療又は予防活性の実証：
【０１６５】
本明細書に記載のヘテロマルチマー又は医薬組成物を、ヒトにおいて使用する前に、所望の治療又は予防活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。例えば、化合物又は医薬組成物の治療的又は予防的利用性を実証するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞系又は患者の組織試料に対する化合物の効果を含む。細胞系及び／又は組織試料に対する化合物又は組成物の効果を、限定されるものではないが、ロゼット形成アッセイ及び細胞溶解アッセイなどの当業者には公知の技術を用いて決定することができる。本発明に従えば、特定の化合物の投与が指示されるかどうかを決定するために用いることができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、患者の組織試料を培養物中で増殖させ、ヘテロマルチマーに曝露するか、又はさもなければそれを投与し、組織試料の際にそのようなヘテロマルチマーの効果を観察するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを含む。
【０１６６】
治療的／予防的投与及び組成物
【０１６７】
提供されるのは、本明細書に記載の有効量のヘテロマルチマー又は医薬組成物の被験体への投与による治療、阻害及び予防の方法である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するか、又は望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。特定の実施形態においては、被験体は、ヒト、例えば、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり、特定の実施形態においては、哺乳動物、及び最も好ましくはヒトである。
【０１６８】
様々な送達系が公知であり、本明細書に記載のヘテロマルチマー製剤、例えば、リポソーム中の封入物、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Wu及びWu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築物などを投与するために用いることができる。導入の方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。化合物又は組成物を、任意の都合のよい経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮層又は皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介する吸収により投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的又は局所的であってよい。さらに、特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマー組成物を、脳室内及びくも膜下注射などの任意の好適な経路により中枢神経系に導入するのが望ましく；脳室内注射を、例えば、Ｏｍｍａｙａ容器などの容器に付けた脳室内カテーテルにより容易にすることができる。また、例えば、吸入器又は噴霧器、及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、肺投与を用いることもできる。
【０１６９】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマー、又は組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましい；これを、例えば、限定されるものではないが、手術中の局所点滴、例えば、手術後の創傷包帯と併用した局所適用により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、又は埋込剤により達成することができ、前記埋込剤は、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、又は繊維を含む多孔性、非多孔性、又はゼラチン質の材料のものである。好ましくは、本発明の抗体などのタンパク質を投与する場合、そのタンパク質が吸収しない材料を使用することに注意を払わなければならない。
【０１７０】
別の実施形態においては、ヘテロマルチマー又は組成物を、小胞、特に、リポソーム中で送達することができる（Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、 Lopez-Berestein及びFidler (編)、 Liss、 New York、 pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein、同書、pp. 317-327を参照されたい; 一般的には、同書を参照されたい）。
【０１７１】
さらに別の実施形態においては、ヘテロマルチマー又は組成物を、制御放出系で送達することができる。一実施形態においては、ポンプを用いることができる（Langer、上掲; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwaldら、Surgery 88:507 (1980); Saudekら、N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照されたい）。別の実施形態においては、ポリマー材料を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer及びWise (編)、 CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen及びBall (編)、Wiley、New York (1984); Ranger及びPeppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)を参照されたい；また、Levyら、Science 228:190 (1985); Duringら、Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howardら、J. Neurosurg. 71:105 (1989)も参照されたい）。さらに別の実施形態においては、制御放出系を治療標的、例えば、脳の近くに置くことができ、かくして、ほんのわずかな全身用量が必要になる（例えば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release、上掲、vol. 2、pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。
【０１７２】
他の制御放出系は、Langer (Science 249:1527-1533 (1990))による概説で考察されている。
【０１７３】
本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸を含む特定の実施形態においては、好適な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）の使用により、又は直接注射により、又は微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティングにより、又は核に進入することが知られるホメオボックス様ペプチドに連結してそれを投与することにより（例えば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)を参照されたい）、それが細胞内のものとなるようにそれを投与することによって、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、そのコードされるタンパク質の発現を促進することができる。或いは、相同組換えにより、核酸を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１７４】
また、本明細書で提供されるのは、医薬組成物である。そのような組成物は、治療上有効量の化合物、及び製薬上許容し得る担体を含む。特定の実施形態においては、用語「製薬上許容し得る」は、連邦若しくは州政府の規制当局によって認可されるか、又は米国薬局方若しくは動物、より具体的にはヒトでの使用のための他の一般に認識される薬局方に列挙されることを意味する。用語「担体」とは、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば、水及び油、例えば、石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであってよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。塩溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液を、液体担体として、特に、注射用溶液のために用いることもできる。好適な医薬賦形剤としては、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じて、前記組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態を取ってもよい。前記組成物を、伝統的な結合剤及び担体、例えば、トリグリセリドを用いて、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでもよい。好適な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、好適な量の担体と共に、好ましくは精製形態の、治療上有効量の化合物を含有する。製剤は投与様式に適合すべきである。
【０１７５】
特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーを含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として日常的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。また、必要に応じて、前記組成物は、可溶化剤及び注射部位での疼痛を軽減するためのリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、成分は個別に供給されるか、又は、例えば、活性剤の量を指示するアンプル若しくはサチェットなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末若しくは水を含まない濃縮物として、単位剤形中で一緒に混合される。組成物を点滴によって投与しようとする場合、それを滅菌された医薬等級の水又は塩水を含有する輸液ボトルに分注することができる。組成物を注射により投与する場合、成分を投与の前に混合することができるように、注射又は塩水のための滅菌水のアンプルを提供することができる。
【０１７６】
特定の実施形態においては、本明細書に記載の組成物は、中性形態又は塩形態として製剤化される。製薬上許容し得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの陰イオンを用いて形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの陽イオンを用いて形成されるものが挙げられる。
【０１７７】
治療タンパク質の異常な発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害の治療、阻害及び予防において有効である本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、最適な用量範囲を同定するのを助けることができる。製剤中で用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度に依存し、医師の判断及び各患者の環境に従って決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から外挿される。
【０１７８】
ヘテロマルチマータンパク質の組換え及び合成産生の方法：
【０１７９】
特定の実施形態においては、酵母、細菌などの微生物、又はヒト若しくは動物細胞系からの分泌により組換え分子として産生されるヘテロマルチマーである。実施形態においては、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
【０１８０】
実施形態は、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質を発現するように形質転換された酵母細胞などの細胞を含む。形質転換された宿主細胞自体に加えて、栄養培地中の、これらの細胞の培養物、好ましくは、モノクローナル（クローンとして均一な）培養物、又はモノクローナル培養物に由来する培養物が提供される。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞と共に、又はそれらが濾過されたか、若しくは遠心分離により除去された場合は細胞を含まずに、前記ポリペプチドを含有する。多くの発現系が公知であり、細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びピチア・パストリス）、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞並びに昆虫細胞などを用いることができる。
【０１８１】
本明細書に記載のヘテロマルチマーは、従来の方法で、例えば、宿主の染色体中に、又は遊離プラスミド上に挿入されたコード配列から産生される。酵母は通常の方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーションで所望のタンパク質のコード配列を用いて形質転換される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182に開示されている。
【０１８２】
上手く形質転換された細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞を、周知の技術によって同定することができる。例えば、発現構築物の導入から得られる細胞を増殖させて、所望のポリペプチドを産生させることができる。細胞を収穫し、溶解して、そのＤＮＡ含量を、Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503又はBerentら(1985) Biotech. 3, 208により記載されたものなどの方法を用いてＤＮＡの存在について試験することができる。或いは、上清中のタンパク質の存在を、抗体を用いて検出することができる。
【０１８３】
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６及びｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．９２０３７，ＵＳＡから一般に入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐ）である。
【０１８４】
相補的付着端を介してＤＮＡをベクターに機能し得る形で連結するための様々な方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー束を、ベクターＤＮＡに挿入しようとするＤＮＡセグメントに付加することができる。次いで、ベクター及びＤＮＡセグメントを、相補的ホモポリマー尾部間での水素結合により連結して、組換えＤＮＡ分子を形成させる。
【０１８５】
１つ又は複数の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替的な方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されたＤＮＡセグメントを、その３’５’−エキソヌクレアーゼ活性で突出する一本鎖末端を除去し、そのポリメラーゼ活性で凹んだ３’末端を充填する酵素である、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１で処理する。
【０１８６】
従って、これらの活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。次いで、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下でモル大過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。かくして、この反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を担持するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントを、好適な制限酵素で切断し、ＤＮＡセグメントのものと適合する末端をもたらす酵素で切断された発現ベクターにライゲートする。
【０１８７】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．，ＵＳＡなどのいくつかの供給源から市販されている。
【０１８８】
アルブミン、融合タンパク質を発現させるための宿主として本発明の実施において有用であると想定される酵母の属の例は、ピチュア（Ｐｉｃｈｕａ）（以前はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）として分類されていた）、サッカロミセス、クルイベロミセス、アスペルギルス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスカス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）などである。好ましい属は、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、クルイベロミセス、ピチア及びトルラスポラから成る群より選択されるものである。サッカロミセス種の例は、Ｓ．セレビジア、Ｓ．イタリクス（ｉｔａｌｉｃｕｓ）及びＳ．ロクシィ（ｒｏｕｘｉｉ）である。
【０１８９】
クルイベロミセス種の例は、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクティス及びＫ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。好適なトルラスポラ種は、Ｔ．デルブルッキィ（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピチア（ハンセヌラ）種の例は、Ｐ．アングスタ（ａｎｇｕｓｔａ）（以前は、Ｈ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、Ｐ．アノマラ（ａｎｏｍａｌａ）（以前は、Ｈ．アノマラ）及びＰ．パストリスである。Ｓ．セレビジアの形質転換のための方法は、ＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７及びＷＯ９０／０１０６３（全て参照により本明細書に組み込まれる）に一般的に教示されている。
【０１９０】
サッカロミセスの種の好ましい例としては、Ｓ．セレビジア、Ｓ．イタリクス、Ｓ．ジアスタティクス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、及びザイゴサッカロミセス・ロクシィが挙げられる。クルイベロミセスの種の好ましい例としては、Ｋ．フラギリス及びＫ．ラクティスが挙げられる。ハンセヌラの種の好ましい例としては、Ｈ．ポリモルファ（現在はピチア・アングスタ）、Ｈ．アノマラ（現在はピチア・アノマラ）、及びピチア・カプスラータ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｐｓｕｌａｔａ）が挙げられる。ピチアの種のさらに好ましい例としては、Ｐ．パストリスが挙げられる。アスペルギルスの種の好ましい例としては、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）及びＡ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。ヤロウイアの種の好ましい例としては、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。多くの好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、アルブミン融合タンパク質の発現において有用である：サッカロミセス・セレビジア、Ｈａｎｓｅｎ、有性世代（ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈ：完全世代）株ＢＹ４７４３ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）；サッカロミセス・セレビジア、Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ｈｓｐ１５０変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）；サッカロミセス・セレビジア、Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２３７９２）；サッカロミセス・セレビジア、Ｈａｎｓｅｎ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４；及び６２９９５）；サッカロミセス・ジアスタティクス、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｘ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）；クルイベロミセス・ラクティス（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）；ピチア・アングスタ、Ｍｏｒａｉｓ  ｅｔ  Ｍａｉａのハンセヌラ・ポリモルファの有性世代として預託された（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎら）Ｋｕｒｔｚｍａｎテレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）；アスペルギルス・ニガー、ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ａｎａｍｏｒｐｈ：不完全世代）（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）；アスペルギルス・ニガー、ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）；アスペルギルス・ニジュランス、（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）；及びヤロウイア・リポリティカ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ  ｅｔ  ｖｏｎ  Ａｒｘ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。
【０１９１】
Ｓ．セレビジアのための好適なプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１又はＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］の遺伝子と関連するもの、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、及び５’調節領域の一部と、他のプロモーターの５’調節領域の一部又は上流の活性化部位とのハイブリッドを含むハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプロモーター）が挙げられる。
【０１９２】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）における使用のための都合の良い調節可能なプロモーターは、Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265、10857-10864により記載されたｎｍｔ遺伝子に由来するチアミン抑制プロモーター及びHoffman & Winston (1990) Genetics 124、 807-816により記載されたグルコース抑制ｊｂｐ１遺伝子プロモーターである。
【０１９３】
外来遺伝子の発現のためにピチアを形質転換する方法は、例えば、Creggら(1993)、及び様々なＰｈｉｌｌｉｐｓの特許（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８５７，４６７号）に教示されており、ピチア発現キットが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，Ｌｅｅｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆから市販されている。好適なプロモーターとしては、ＡＯＸ１及びＡＯＸ２が挙げられる。Gleesonら(1986) J. Gen. Microbiol. 132、 3459-3465は、ハンセヌラベクター及び形質転換に関する情報を含み、好適なプロモーターはＭＯＸ１及びＦＭＤ１であるが、ＥＰ３６１９９１、Fleerら(1991)及びＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒからの他の刊行物は、クルイベロミセス種において外来タンパク質を発現させる方法を教示し、好適なプロモーターはＰＧＫＩである。
【０１９４】
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結及びポリアデニル化のための適切なシグナルを含有する真核遺伝子の３’フランキング配列である。好適な３’フランキング配列は、例えば、用いられる発現制御配列に天然で連結された遺伝子のものであってよい、すなわち、プロモーターに対応してもよい。或いは、それらは異なっていてもよく、その場合、サッカロミセス・セレビジアのＡＤＨＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい。
【０１９５】
特定の実施形態においては、所望のヘテロマルチマータンパク質を、選択した酵母中で有効な任意のリーダーであってよい分泌リーダー配列と共に最初に発現させる。サッカロミセス・セレビジアにおいて有用なリーダーとしては、接合因子αポリペプチド（ＭＦα−１）及びＥＰ−Ａ−３８７３１９のハイブリッドリーダーに由来するものが挙げられる。そのようなリーダー（又はシグナル）は、成熟アルブミンが周囲の培地中に放出される前に酵母によって切断される。さらなるそのようなリーダーとしては、ＪＰ６２−０９６０８６（９１１９３６５１６として特許された）に開示されたサッカロミセス・セレビジアのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）、ＭＦα−１，０グルカナーゼのプレ配列（ＢＧＬ２）及びキラー毒素；Ｓ．ジアスタティクスのグルコアルニラーゼＩ１；Ｓ．カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）のα−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；Ｋ．ラクティスのキラー毒素；並びにカンジダのグルコアルニラーゼのものが挙げられる。
【０１９６】
提供されるのは、本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞、合成及び組換え技術によるヘテロマルチマータンパク質の産生である。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント又は複製欠損であってよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、補完宿主細胞中でのみ起こる。
【０１９７】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のための選択マーカーを含有するベクターに連結される。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈降物などの沈降物中で、又は荷電した脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、好適なパッケージング細胞系を用いてそれをｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージした後、宿主細胞中に形質導入することができる。
【０１９８】
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチド挿入物は、ほんの数例を挙げると、λファージのＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｒａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの好適なプロモーターに機能し得る形で連結される。他の好適なプロモーターは、当業者には公知である。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び転写される領域中には、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物により発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドン及びその終わりに好適に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含む。
【０１９９】
示される通り、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーとしては、ジヒドロ葉酸リダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、又は真核細胞培養のためのネオマイシン耐性、並びに大腸菌及び他の細菌中での培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。好適な宿主の代表例としては、限定されるものではないが、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；菌類細胞、例えば、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビジア又はピチア・パストリス（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞；並びに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための好適な培養培地及び条件は、当技術分野で公知である。
【０２００】
細菌における使用にとって好ましいベクターとしては、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及びＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。好ましい真核ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬである。酵母系における使用のための好ましい発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、及びＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能）が挙げられる。他の好適なベクターは、当業者には容易に明らかとなる。
【０２０１】
一実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原核若しくは真核細胞の特定の区画への本発明のタンパク質の局在化を指令する、及び／又は原核若しくは真核細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指令するシグナル配列に融合される。例えば、大腸菌中では、ペリプラズム空間へのタンパク質の発現を指令することを望むことができる。細菌のペリプラズム空間へのポリペプチドの発現を指令するためにヘテロマルチマータンパク質が融合されるシグナル配列又はタンパク質（若しくはその断片）の例としては、限定されるものではないが、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、及びアルカリホスファターゼのシグナル配列が挙げられる。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−．ｒｈｏ．シリーズ）などの、いくつかのベクターが、タンパク質の局在化を指令する融合タンパク質の構築のために市販されている。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質を、ｐｅｌＢペクテートリアーゼシグナル配列に融合させて、グラム陰性細菌中でのそのようなポリペプチドの発現及び精製の効率を増加させることができる。その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５７６，１９５号及び第５，８４６，８１８号を参照されたい。
【０２０２】
哺乳動物細胞におけるその分泌を指令するためにヘテロマルチマータンパク質に融合されるシグナルペプチドの例としては、限定されるものではないが、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）、スタニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ）、及びコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ）が挙げられる。バキュロウイルス発現系と共に用いることができる好適なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）である。
【０２０３】
選択マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）又はＤＨＦＲを用いるベクターを、それぞれ、薬物メチオニンスルホキシミン又はメトトレキサートの存在下で増幅することができる。グルタミンシンターゼに基づくベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞系（例えば、マウスミエローマ細胞系、ＮＳＯ）の利用性である。グルタミンシンターゼ発現系はまた、内因性遺伝子の機能を防止するためのさらなる阻害剤を提供することにより、グルタミンシンターゼを発現する細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中でも機能することができる。グルタミンシンターゼ発現系及びその成分は、ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／１００３６；ＷＯ８９／１０４０４；及びＷＯ９１／０６６５７に詳述されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｓｔｓｍｏｕｔｈ、Ｎ．Ｈ．）から取得することができる。マウスミエローマ細胞中でのＧＳ発現系を用いるモノクローナル抗体の発現及び産生は、Bebbingtonら、Bio/technology 10:169(1992)及びBiblia and Robinson Biotechnol. Prog. 11:1(1995)に記載されており、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
また、提供されるのは、本明細書に記載のベクター構築物を含有する宿主細胞、及びさらに、当技術分野で公知の技術を用いて１つ又は複数の異種制御領域（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）と機能し得る形で会合したヌクレオチド配列を含有する宿主細胞である。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）などの高等真核細胞、若しくは酵母細胞などの下等真核細胞であってよく、又は宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞であってよい。挿入された遺伝子配列の発現を調節するか、又は望ましい特定の様式で遺伝子産物を改変及びプロセッシングする宿主株を選択することができる。特定のプロモーターからの発現を、特定の誘導因子の存在下で上昇させることができる；かくして、遺伝子操作されたポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後のプロセッシング及び改変（例えば、リン酸化、切断）のための特徴及び特定の機構を有する。好適な細胞系を選択して、発現される外来タンパク質の望ましい改変及びプロセッシングを確保することができる。
【０２０５】
宿主細胞中への本発明の核酸及び核酸構築物の導入を、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の方法により行うことができる。そのような方法は、Davisら、Basic Methods In Molecular Biology (1986)などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。本発明のポリペプチドは事実、組換えベクターを欠く宿主細胞により発現され得ることが特に想定される。
【０２０６】
本明細書で考察されるベクター構築物を含有する宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、内因性遺伝子材料（例えば、カーゴポリペプチドに対応するコード配列がカーゴポリペプチドに対応するヘテロマルチマータンパク質と置換される）を欠失若しくは置換する、及び／又は遺伝子材料を含むように遺伝子操作された、脊椎動物起源、特に、哺乳動物起源の、一次、二次、及び不死化宿主細胞も包含する。内因性ポリヌクレオチドと機能し得る形で会合した遺伝子材料は、内因性ポリヌクレオチドを活性化、変化、及び／又は増幅させることができる。
【０２０７】
さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド）並びに／又は異種制御領域（例えば、プロモーター及び／若しくはエンハンサー）を、相同組換えにより、治療タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と機能し得る形で会合させることができる（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；国際特許出願公開第ＷＯ９６／２９４１１号；国際特許出願公開第ＷＯ９４／１２６５０号；Kollerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989)；及びZijlstraら、Nature 342:435-438 (1989)（それぞれの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０２０８】
本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質を、硫酸アンモニウム又はエタノール沈降、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーなどの周知の方法により組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０２０９】
特定の実施形態においては、本発明のヘテロマルチマータンパク質は、限定されるものではないが、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ｐｏｒｏｓ  ＨＱ、ｐｏｒｏｓ  ＤＥＡＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ及びＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｑ及びＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィーなどの陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０２１０】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のタンパク質は、限定されるものではないが、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ｐｏｒｏｓ  ＨＱ、ｐｏｒｏｓ  ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ及びＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓ及びＣＭカラム並びにその等価物及び同等物などの陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０２１１】
さらに、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質は、当技術分野で公知の技術を用いて化学的に合成することができる（例えば、Creighton、 1983、Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y及びHunkapillerら、Nature、310:105-111 (1984)を参照されたい）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを、ペプチド合成装置の使用により合成することができる。さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を、置換又は付加としてポリペプチド配列中に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定されるものではないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）又はＬ（左旋性）であってよい。
【０２１２】
提供されるのは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質溶解的切断、抗体分子又は他の細胞リガンドへの連結などにより、翻訳の間又は後に示差的に改変されたヘテロマルチマーである。いくつかの化学的改変のいずれかを、限定されるものではないが、シアノゲンブロミド、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成などの公知の技術により実行することができる。
【０２１３】
本明細書に包含されるさらなる翻訳後改変としては、例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖、Ｎ末端又はＣ末端のプロセッシング、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学的改変、及び原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加又は欠失が挙げられる。ヘテロマルチマータンパク質は、タンパク質の検出及び単離を可能にするための酵素標識、蛍光標識、放射性標識又は親和性標識などの検出可能な標識を用いて改変される。
【０２１４】
好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体としては、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが挙げられる；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに好適な放射性材料の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
【０２１５】
特定の実施形態においては、ヘテロマルチマータンパク質又はその断片若しくは変異体は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に付けられる。
【０２１６】
記載の通り、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、翻訳後プロセッシングなどの天然のプロセスか、又は当技術分野で周知である化学的改変技術のいずれかにより改変される。所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同じか、又は異なる程度で同じ種類の改変が存在してもよいことが理解される。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝していてもよく、それらは分枝を含むか、又は含まない環状のものであってもよい。環状、分枝状、及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスの結果生じてもよく、又は合成方法により作製することができる。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質溶解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が挙げられる（例えば、PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２版、T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company、New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS、B. C. Johnson（編）、Academic Press、New York、pgs. 1-12 (1983); Seifterら、Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattanら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)を参照されたい）。
【０２１７】
特定の実施形態においては、ヘテロマルチマータンパク質を、本発明のアルブミン融合タンパク質により結合される、それに結合する、又はそれと会合するポリペプチドの免疫アッセイ又は精製にとって特に有用である、固相支持体に付けることもできる。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられる。
【０２１８】
ヘテロマルチマータンパク質が抗体のＶＨドメインのみを含む実施形態においては、ＶＨ−アルブミン融合タンパク質及びＶＬタンパク質が翻訳後に会合する（共有的又は非共有的に）ように、タンパク質と、同じ抗体のＶＬドメインとを同時発現させることが必要である、及び／又は望ましい。
【０２１９】
ヘテロマルチマータンパク質が抗体のＶＬドメインのみを含む実施形態においては、ＶＬ−アルブミン融合タンパク質及びＶＨタンパク質が翻訳後に会合する（共有的又は非共有的に）ように、融合タンパク質と、同じ抗体のＶＨドメインとを同時発現させることが必要である、及び／又は望ましい。
【０２２０】
また、本明細書で提供されるのは、ポリペプチドの溶解度、安定性及び循環時間の増加、又は免疫原性の低下などのさらなる利点を提供し得るヘテロマルチマータンパク質の化学的に改変された誘導体である（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）。誘導体化のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。タンパク質は、分子内の無作為の位置で、又は分子内の所定の位置で改変することができ、付けられた化学部分を１、２、３個以上含んでもよい。
【０２２１】
ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分枝していても、又は分枝していなくてもよい。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取り扱い及び製造を容易にするために、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくらかの分子が、記述される分子量より大きい、いくらか小さい重量であることを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、望ましい持続放出の期間、あるとすれば、生物活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如及び治療タンパク質又は類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に応じて、他のサイズを用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１０５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、又は１００，０００ｋＤａの平均分子量を有してもよい。
【０２２２】
本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質の存在及び量を、当技術分野で公知の周知の免疫アッセイであるＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。本明細書に記載のヘテロマルチマーを検出／定量するのに有用である１つのＥＬＩＳＡプロトコルにおいては、ＥＬＩＳＡプレートを抗ヒト血清アルブミン抗体で被覆するステップ、プレートをブロッキングして非特異的結合を防止するステップ、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄するステップ、本明細書に記載のタンパク質を含有する溶液（１つ又は複数の異なる濃度の）を添加するステップ、検出可能な標識（本明細書に記載のもの、又はさもなければ当技術分野で公知のもの）に結合させた二次抗カーゴポリペプチド特異的抗体を添加するステップ、及び二次抗体の存在を検出するステップを含む。このプロトコルの別の型においては、ＥＬＩＳＡプレートを、抗カーゴポリペプチド特異的抗体で被覆してもよく、標識された二次試薬は抗ヒトアルブミン特異的抗体であってもよい。
【０２２３】
本明細書で提供されるのは、少なくとも１つのモノマーが、輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子を含み、前記モノマーが会合してヘテロマルチマーを形成し、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、少なくとも２つのモノマーを含む多機能性ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、カーゴ分子は生体分子である。特定の実施形態においては、各モノマータンパク質が、輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記モノマータンパク質が自己集合してヘテロマルチマーを形成する、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーはヘテロダイマーである。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは二特異的である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは多特異的である。特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは多機能性である。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドはアルブミンの誘導体である。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、配列番号１のヒト血清アルブミンに由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドはアロアルブミンに由来する。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、本明細書に記載の治療タンパク質、又はその断片若しくは変異体である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドに融合される。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドのＮ末端に付けられる。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドのＣ末端に付けられる。
【０２２４】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴ分子、及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマー；並びに少なくとも１つのカーゴ分子及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマーを含み、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、本明細書に記載の治療剤である。特定の実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、本明細書に記載の生体分子である。本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーはヘテロダイマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは多価である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは二価である。いくつかの実施形態においては、ヘテロマルチマーは多特異的である。一実施形態においては、ヘテロマルチマーは二特異的である。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドはアルブミンの誘導体である。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、配列番号１のヒト血清アルブミンに由来する。
【０２２５】
特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び配列番号２の配列を含む第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び配列番号３の配列を含む第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含むヘテロマルチマーである。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアロアルブミンに由来する。特定の実施形態においては、両方の輸送体ポリペプチドがアロアルブミンに由来する。特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが同じアロアルブミンの誘導体である。いくつかの他の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは異なるアロアルブミンの誘導体である。いくつかの実施形態においては、それぞれの輸送体ポリペプチドは、表２から選択されるアロアルブミンに基づくアロアルブミン誘導体である。特定の実施形態においては、第１のモノマータンパク質は、２つのカーゴポリペプチドを含む。いくつかの実施形態においては、第２のモノマータンパク質は２つのカーゴポリペプチドを含む。
【０２２６】
本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドはアネキシンタンパク質の誘導体である。一実施形態においては、輸送体ポリペプチドは異なるアネキシンタンパク質に由来する。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは同じアネキシンタンパク質に由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アネキシンＡ１又はリポコルチンＩに由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが、配列番号１４のアネキシンＡ１に由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、配列番号１４と相同な配列に由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アネキシンＡ２又はアネキシンＩＩに由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ２又はリポコルチンＩＩに由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アネキシン様タンパク質に由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドがアネキシン様タンパク質に由来する。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アネキシンＡ１〜アネキシンＡ７を含む群に由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの一実施形態においては、全ての輸送体ポリペプチドが、アネキシンＡ１〜アネキシンＡ７．１４を含む群に由来する。特定の実施形態においては、第１のアネキシンに基づく輸送体ポリペプチドは配列番号１５を含む配列を有し、第２のアネキシンに基づく輸送体ポリペプチドは配列番号１６を含む配列を有する。
【０２２７】
本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、輸送体ポリペプチドは、トランスフェリンの誘導体である。一実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはトランスフェリンに由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは配列番号１９のトランスフェリン又はその類似体に由来する。ヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、トランスフェリンと相同なポリペプチド配列に由来する。本明細書に記載のヘテロマルチマーの特定の実施形態においては、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アポ−トランスフェリンに由来する。特定の実施形態においては、第１のトランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドは配列番号１５を含む配列を有し、第２のトランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドは配列番号１６を含む配列を有する。本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、前記カーゴポリペプチドが表２に列挙されたタンパク質から選択され、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがモノマータンパク質に由来し、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して、前記モノマータンパク質又はその類似体の疑似天然構造を形成する、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが抗体又はその断片若しくは変異体である、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、全てのカーゴポリペプチドが抗体又はその断片若しくは変異体である。特定の実施形態においては、第１の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子は、第２の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子と同じである。特定の実施形態においては、第１の輸送体ポリペプチドに付いたカーゴ分子は、第２の輸送体ポリペプチド上のカーゴ分子とは異なる。特定の実施形態においては、第１の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも２つのカーゴ分子及び第２の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも２つのカーゴ分子が存在する。特定の実施形態においては、第１の輸送体ポリペプチドに付いたカーゴ分子は同一である。特定の実施形態においては、第１の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも２つのカーゴ分子は、互いに異なる。特定の実施形態においては、第２の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも２つのカーゴ分子は同一である。特定の実施形態においては、第２の輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも２つのカーゴ分子は異なる。いくつかの実施形態においては、抗体断片は、抗体Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態においては、抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭから成る群より選択される免疫グロブリンである。特定の実施形態においては、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択されるサブタイプのものである。特定の実施形態においては、抗体は多特異的抗体である。いくつかの実施形態においては、多特異的抗体は、二特異的抗体である。
【０２２８】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが治療抗体である、ヘテロマルチマーである。本明細書に記載のヘテロマルチマーのいくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、治療抗体又はその断片若しくは変異体であり、抗体は、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セルツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオザガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、マイコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トクリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム、レンカレックス、ウステキヌマブ、及びザルツムマブから選択される。特定の実施形態においては、治療抗体は、癌抗原に結合する。
【０２２９】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが酵素、ホルモン、治療ポリペプチド、抗原、ケモトキシン、放射性毒素、サイトカイン又はその変異体若しくは断片であるヘテロマルチマーである。
【０２３０】
本明細書で提供されるのは、各ヘテロマルチマーが、少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第１の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第１のモノマータンパク質；並びに少なくとも１つのカーゴポリペプチド及び第２の輸送体ポリペプチドを含む少なくとも第２のモノマータンパク質を含み、カーゴポリペプチドが化学的コンジュゲーション、天然のライゲーション、化学的ライゲーション、ジスルフィド結合又は融合により輸送体ポリペプチドに付けられる、ヘテロマルチマーである。
【０２３１】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸を含む宿主細胞である。特定の実施形態においては、第１のモノマータンパク質をコードする核酸及び第２のモノマータンパク質をコードする核酸は、単一のベクター中に存在する。特定の実施形態においては、第１のモノマータンパク質をコードする核酸及び第２のモノマータンパク質をコードする核酸は、別々のベクター中に存在する。
【０２３２】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のヘテロマルチマーをコードする核酸が発現されるように本明細書に記載の宿主細胞を培養すること；及び細胞培養物からヘテロマルチマーを回収することを含む、ヘテロマルチマーを作製する方法である。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。特定の実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態においては、酵母はＳ．セレビジアである。いくつかの実施形態においては、酵母はグリコシル化欠損、及び／又はプロテアーゼ欠損である。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーを発現する宿主細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態においては、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ細胞又はヒト細胞である。
【０２３３】
提供されるのは、本明細書に記載のヘテロマルチマー及び製薬上許容し得るアジュバントを含む医薬組成物である。また、提供されるのは、疾患又は障害に罹患する個体を治療する方法であって、該個体に有効量の本明細書に記載の製剤又は医薬組成物を投与することを含む上記方法である。特定の実施形態においては、患者における癌を治療する方法であって、該患者に、治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む上記方法である。いくつかの実施形態においては、患者における免疫障害を治療する方法であって、該患者に、治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む上記方法である。また、提供されるのは、患者における感染症を治療する方法であって、該患者に、治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む上記方法である。特定の実施形態においては、患者における心血管障害を治療する方法であって、該患者に、治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む上記方法である。特定の実施形態においては、患者における呼吸器障害を治療する方法であって、該患者に、治療上有効量の本明細書に記載のヘテロマルチマーを投与することを含む上記方法である。
【０２３４】
提供されるのは、個体における目的のバイオマーカーの存在を検出するためのキットであって、（ａ）ヘテロマルチマーが少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記カーゴポリペプチドが目的のバイオマーカーに結合することができる、一定量の本明細書に記載のヘテロマルチマー；及び（ｂ）使用のための説明書を含む上記キットである。
【０２３５】
本明細書で提供されるのは、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質であって、各モノマータンパク質が少なくとも１つのカーゴポリペプチド、及びアルブミンに基づくポリペプチドを含み、前記モノマータンパク質（複数）が自己集合して、ヘテロマルチマーを形成する、上記タンパク質である。
【０２３６】
特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドはアルブミン又はアロアルブミンに基づくポリペプチドに融合される。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、アルブミン又はアロアルブミンに基づくポリペプチドに化学的にコンジュゲートされる。特定の実施形態においては、カーゴポリペプチドは、アルブミン又はアロアルブミンに基づくポリペプチドに化学的ライゲーション又はジスルフィド結合により付けられる。
【０２３７】
本明細書で提供されるのは、少なくとも２つのモノマータンパク質を含むヘテロマルチマータンパク質であって、各モノマータンパク質が、少なくとも１つのカーゴポリペプチド、及びアロアルブミンに基づくポリペプチドを含み、前記アロアルブミンに基づくポリペプチド（複数）が自己集合して、前記アロアルブミン又はその類似体の疑似天然構造を有するヘテロマルチマーを形成する、ヘテロマルチマータンパク質である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーはヘテロダイマーである。いくつかの実施形態においては、カーゴポリペプチドは、抗体、酵素、ホルモン、治療ポリペプチド、抗原、ケモトキシン、放射性毒素、サイトカイン又はその変異体若しくは断片である。いくつかの実施形態においては、あるモノマータンパク質のカーゴポリペプチドは、別のモノマータンパク質のカーゴポリペプチドと相乗的に機能する。
【０２３８】
本明細書に記載の一態様においては、効率的に折畳まれ、一緒に選択的に会合して活性な疑似天然タンパク質様構造を形成することができる目的のタンパク質からタンパク質セグメントを誘導する方法である。
【０２３９】
本明細書で提供されるのは、限定されるものではないが、疑似天然モノマータンパク質様構造をもたらし、互いに会合した場合に機能するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのモノマータンパク質に基づくポリペプチドを創出するための戦略である。本明細書に記載の実施形態においては、また、この戦略は、ＨＳＡ変異体の誘導体、アロアルブミン、他の種に由来する他の相同なアルブミン分子並びにまたアネキシン及びトランスフェリンである輸送体ポリペプチドを含むモノマーポリペプチドを含むヘテロマルチマーを設計するために用いられる。本明細書に記載のモノマーは、個々の輸送体ポリペプチド又はその会合した複合体の安定性などの生物物理学的特性を改善するための様々な戦略を用いて操作することができる。
【０２４０】
一実施形態においては、ＨＳＡに由来する断片に基づく二特異的又は他の多特異的又は多機能性タンパク質分子の開発のための足場である。
【０２４１】
提供されるのは、多特異的又は多機能性治療タンパク質を達成するための、抗原結合タンパク質単位、標的基質若しくは阻害剤又はケモトキシン、放射性毒素、サイトカインなどのペイロードなどの他の機能的ドメインなどのカーゴポリペプチドとコンジュゲート又は融合することができるＨＡＳ、ＨＡＡ、アネキシン又はトランスフェリン由来足場である輸送体ポリペプチドである。
【０２４２】
本明細書に記載されるのは、医薬適用のための十分な純度及び安定性を有する二特異的抗体に基づく治療剤を得るための、ヘテロダイマーＦｃとＨＳＡに基づく輸送体ポリペプチドとの融合物である。
【０２４３】
一態様において、本明細書に記載されるのは、ＨＳＡに基づく輸送体ポリペプチドを含む自己集合性モノマーを含む多特異的又は多機能性タンパク質を誘導して、該タンパク質が改善された半減期、改善された安定性、低い免疫原性などのいくつかの好ましい薬物動態特性を有するようにする方法である。
【０２４４】
本明細書で提供されるのは、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロダイマータンパク質であって、各モノマー融合タンパク質はアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記アルブミン由来ポリペプチド（複数）が自己集合して、アルブミン又はその類似体の疑似天然構造を有する多機能性ヘテロダイマーを形成する、ヘテロダイマータンパク質である。
【０２４５】
特定の実施形態においては、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロダイマーであって、各モノマー融合タンパク質がアロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記アロアルブミン由来ポリペプチド（複数）が自己集合して、多機能性ヘテロダイマーを形成する、ヘテロダイマータンパク質である。
【０２４６】
本明細書に記載の特定の実施形態においては、少なくとも２つのモノマー融合タンパク質を含むヘテロダイマーであって、各モノマー融合タンパク質がアロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、前記アロアルブミン由来ポリペプチド（複数）が自己集合して、多機能性ヘテロダイマーを形成する、ヘテロマルチマータンパク質である。特定の実施形態においては、アロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第１のモノマー；及びアロアルブミン由来ポリペプチドに融合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第２のモノマーを含むヘテロダイマータンパク質である。特定の実施形態においては、第１のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第２のモノマーの少なくとも１つのカーゴポリペプチドとは異なる。
【０２４７】
本明細書で提供されるのは、それぞれが、輸送体ポリペプチド及び必要に応じて、前記輸送体ポリペプチドに付いた少なくとも１つのカーゴ分子を含む少なくとも２つのモノマーを含むヘテロマルチマーであって、各輸送体ポリペプチドが全タンパク質のセグメント化により得られ、前記輸送体ポリペプチド（複数）が自己集合して疑似天然全タンパク質を形成する、ヘテロマルチマーである。特定の実施形態においては、ヘテロマルチマーは多特異的である。特定の実施形態においては、輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。いくつかの実施形態においては、各モノマーはモノマー又はホモマルチマーと比較して、ヘテロマルチマーを選択的に形成する。ヘテロマルチマーの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、治療剤、又は生体分子である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのカーゴ分子は、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はＲＮＡから選択される生体分子である。いくつかの実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、アルブミン又はアロアルブミンの誘導体である。一実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、アネキシンの誘導体である。特定の実施形態においては、各輸送体ポリペプチドは、トランスフェリンの誘導体である。
【０２４８】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のアルブミンに基づく及び／又はアロアルブミンに基づくヘテロマルチマータンパク質と、製薬上許容し得る希釈剤又は担体とを含む医薬製剤である。特定の実施形態においては、本明細書に記載の製剤は、キット又は容器の一部として提供される。特定の実施形態においては、キット又は容器は、治療タンパク質の保存可能期間の延長に関する説明書と共に包装される。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のヘテロマルチマーは、個体における疾患又は疾患症状を治療（例えば、改善）、予防、又は診断する方法であって、前記製剤を個体に投与するステップを含む上記方法において用いられる。
【０２４９】
また、提供されるのは、本明細書に記載のモノマー融合タンパク質をコードし、発現する本明細書に記載の核酸分子を含むように改変されたトランスジェニック生物である。
【０２５０】
様々な刊行物が本明細書で引用され、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２５１】
（例１：タンパク質の分割方法）
特異的タンパク質間会合は、相互作用パートナー間の強い表面相補性並びに付随する構造的及び熱力学的変化により駆動される。表面相補性は、好ましい静電気的及び疎水性相互作用の創出を支持する接触を形成する機会を提供する。静電気的相互作用は、塩架橋、水素結合の形成及び広範囲にわたる分散相互作用を含む。溶媒排除及び接合部分での非極性原子基周囲での再編成及びその関連するエントロピー効果は、結合熱力学の疎水性成分において役割を果たしている。互いの疎水性相互作用のために最適化された形状を有する残基は、接触（すなわち、タンパク質間接合部分を安定化させるのに好ましいスタッキング、π−π、カチオン−π接触）を形成する。同様の熱力学的効果は、二次構造単位及び三次ドメインの予備組織化を含む多段階タンパク質折畳みプロセスを制御し、次いで、折畳まれた四次状態のタンパク質を形成するそれらの会合を制御する。タンパク質折畳み及び結合の代替機構は、最終的には四次状態のタンパク質をもたらすカップリングしたタンパク質折畳み及び結合プロセスを含む。タンパク質会合の文脈では、個々のタンパク質成分は同じ培地中で同時発現されるか、又は存在する必要があり、それぞれの成分又はモノマーは、その絶対的なパートナーとの会合時にのみ、その最終的な構造状態に安定に折畳まれる（図６）。
【０２５２】
分割タンパク質の生成は、自己集合して一緒にヘテロマルチマーを形成することによって疑似天然タンパク質構造を効率的に形成する少なくとも２つの輸送体ポリペプチドをもたらす配列、二次構造及び折畳みに由来する情報を用いて、天然タンパク質中のセグメント化部位を認識することを含む。例えば、これらの分割タンパク質輸送体ポリペプチドは、同時発現された場合、選択的に自己集合し、疑似天然状態を形成する。輸送体ポリペプチドの分割タンパク質相補対を生成しながら、ある意味では、試みは、複合体としてその官能性を示すが、その非複合体化状態では非機能的であるいくつかの天然の絶対的なタンパク質間複合体を模倣することである。この戦略の実施の成功により、選択的に自己集合して互いにヘテロマルチマーを形成し、個々の実体として可溶性であり、機能的関連については、その環境中の他の成分の折畳み、結合及び活性を損なわないポリペプチドが得られる。互いに再構成するポリペプチドの固有の性質は、それ自身ではマルチマーの形成において効率的ではないカーゴ分子からヘテロマルチマー融合実体を創出する領域における適用を有する。分割タンパク質セグメントの機能的役割は、ヘテロマルチマー化を駆動する輸送体ポリペプチドとして作用することである。
【０２５３】
（例２：ＨＡ／アロアルブミンに基づくヘテロマルチマータンパク質の調製）
示されるのは、安定に折畳まれ、元のタンパク質の疑似天然四次構造を形成するように融合するモノマーポリペプチド鎖をもたらすＨＳＡの配列及び構造に沿ってセグメント化部位を決定するための方法である。そのような安定な会合のための重要な要件の１つは、ポリペプチド鎖間の接合部分での表面相補性の大きい埋没領域の形成である。元のタンパク質の天然の折畳みは、タンパク質内の領域の天然相補性の示唆を提供する。
【０２５４】
図２は、セグメント化点をタンパク質配列に沿って移動させた場合の、ＨＳＡの疑似天然構造に理想的に折畳まれる２つのアルブミンに基づくポリペプチドの接合部分に埋没した溶媒接近可能表面積を示す。この分析は、分割セグメント化が数個を除いて残基３０から５２０の間の任意の場所に導入された場合、約５０００Å２の規模の大きい表面積が埋没していることを示す。アルブミンは、天然タンパク質構造の安定性に寄与する例外的に多数のジスルフィド架橋を有する。残基１１０、１９０、３００、３９０及び５００の近くのタンパク質の部分は、２つの輸送体ポリペプチドにわたるジスルフィド結合に関与する残基を分割しないセグメント化のための部位を提供する。他の領域におけるセグメント化は、２つの輸送体ポリペプチド対の間の架橋ジスルフィド結合を有するヘテロダイマーをもたらす。図３は、ＨＳＡ配列中の残基２９３〜３１３からのループの除去により誘導された１つのそのような疑似天然アルブミン構造のモデル表示を提供する。本明細書に示される配列番号２及び配列番号３の２つのアルブミンに基づくポリペプチドの総埋没表面積は、約５５００Å２である。これは、いくつかのタンパク質間ヘテロダイマー及びホモダイマー同時複合体構造において観察される１９１０〜３８８０Å２の平均よりもかなり大きい[Bahadhur R.P. & Zacharias M. (2008) Cell Mol Life Sci 65、 1059-1072]。これは、２つのポリペプチドの折畳み経路が互いにかなり独立している場合、２つのポリペプチドが互いに選択的に会合する可能性が高いことを示唆する。
【０２５５】
本発明の一態様においては、２つのポリペプチド（配列番号２及び配列番号３により形成される対又は配列番号８及び配列番号１０により形成される輸送対）との安定な疑似天然構造の選択的形成により、我々は輸送体ポリペプチドとして用いられるアルブミンに基づくポリペプチドのＮ又はＣ末端に目的の好適なカーゴタンパク質を融合させた後に、二特異的又は他の多機能性分子の形成を駆動するこれらのポリペプチドを用いる機会が得られる。輸送体ポリペプチド対ヘテロダイマーをもたらすいくつかの他の代替的なセグメント化パターンを設計することができる。融合したカーゴタンパク質は、抗原結合ドメイン又はケモトキシン、放射性毒素若しくはサイトカインなどの他のペイロードであってよい（図４に示される）。得られるヘテロダイマーは、改善された半減期、安定性及び低い免疫原性などの特性を含む、ＨＳＡに固有の多くの好ましい特性を有する。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘなどの伝統的なリンカーを、カーゴポリペプチドと輸送体ポリペプチドとの会合に用いることができる。
【０２５６】
本発明の別の態様においては、それぞれのＨＳＡに基づく輸送体ポリペプチドを、二特異的Ｆｃ分子中の２つの重鎖のＣ末端に独立に融合させる（図５に示される）。２つの輸送体ポリペプチド（配列番号２及び配列番号３など）の強く選択的な対形成は、Ｆｃの選択的なヘテロダイマー化を駆動し、また、その安定性及び他の価値ある薬物動態特性に寄与する。
【０２５７】
ＮＭ＿０００４７７．５、コンセンサスＣＤＳ（ＣＣＤＳ）ＩＤ３５５５．１に由来する血清アルブミンプレタンパク質ＮＰ＿０００４６８．１  ＧＩ４５０２０２７  ｍＲＮＡ配列。
【０２５８】
配列番号４：残基１〜２４（ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧ）は、切断されるＮ末端輸出シグナル配列領域である。この配列は、天然のシグナル配列と同じ役割を果たすが、それは哺乳動物及びＣＨＯ細胞系のために最適化されている。
【０２５９】
配列番号１：ｇｉ｜４５０２０２７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００４６８．１｜血清アルブミンプレプロタンパク質［ヒト］
【化４】
2014512343.tif 000029
【０２６０】
配列番号５：ヒト血清アルブミンヌクレオチドＣＣＤＳ配列（１８５２ｎｔ）。
【０２６１】
【化５−１】
2014512343.tif 000030
【化５−２】
2014512343.tif 000031
【０２６２】
輸送体ポリペプチドとして有用なアルブミンに基づくポリペプチドのタンパク質及びヌクレオチド配列は以下の通りである：
【０２６３】
アルブミンに基づくヘテロマルチマー１：
【０２６４】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ１：配列番号２：
【０２６５】
【化６】
2014512343.tif 000032
【０２６６】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ１をコードするヌクレオチド配列：配列番号６：
【０２６７】
【化７】
2014512343.tif 000033
【０２６８】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ１：配列番号３：
【０２６９】
【化８】
2014512343.tif 000034
【０２７０】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ１をコードするヌクレオチド配列：配列番号７：
【０２７１】
【化９】
2014512343.tif 000035
【０２７２】
アルブミンに基づくヘテロマルチマー２：
【０２７３】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ２：配列番号８：
【０２７４】
【化１０】
2014512343.tif 000036
【０２７５】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ２をコードするヌクレオチド配列：配列番号９：
【０２７６】
【化１１】
2014512343.tif 000037
【０２７７】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ２：配列番号１０：
【０２７８】
【化１２】
2014512343.tif 000038
【０２７９】
アルブミンに基づく輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ２をコードするヌクレオチド配列：配列番号１１：
【０２８０】
【化１３】
2014512343.tif 000039
【０２８１】
ＨＡ又はＨＡＡに基づくヘテロマルチマーの生成及び発現
【０２８２】
完全長ＷＴ  ＨＡ及びＨＡに基づく輸送体ポリペプチドモノマーをコードする遺伝子を、ヒト／哺乳動物発現のために最適化されたコドンを用いる遺伝子合成により構築した。この構築物を、シグナル配列ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧの除去後、公知の完全長ヒト血清アルブミンプレタンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＮＰ＿０００４６８．１）から設計した。最終遺伝子産物を哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）（Durocherら）中にサブクローニングした。浮遊増殖するヒトＣＨＯ−３Ｅ７の一過的トランスフェクションによる高レベル及び高効率組換えタンパク質産生を実施した。本明細書に記載される２つの足場：アルブミンに基づくヘテロマルチマー１（ＡＢＨ１）及びアルブミンに基づくヘテロマルチマー２（ＡＢＨ２）の構築物の境界については、表３を参照されたい。アルブミンに基づくヘテロマルチマー２は、２つの輸送体ポリペプチド間に１つのジスルフィド結合を含むが、アルブミンに基づくヘテロマルチマー１は、全体として非共有相互作用により形成される。図６Ａは、同時発現後の２つのヘテロマルチマー構築物（ＡＢＨ１及びＡＢＨ２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元的）ゲル分析を提供する（異なるＤＮＡトランスフェクション比が示される）。ＷＴ完全長ＨＳＡを対照として示す。予想されるように、ＡＢＨ２は非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてジスルフィド結合を保持し、ＭＷはジスルフィド結合していないＡＢＨ１のおよそ２倍である。図６Ｂは、同時発現後（１：１のＤＮＡレベル）の２つのアルブミンに基づくヘテロマルチマー構築物（ＡＢＨ１及びＡＢＨ２）の天然ゲル分析を提供する。ＷＴ完全長ＨＳＡを対照として示す。ＡＢＨ１及びＡＢＨ２は両方とも、完全長ＷＴ  ＨＳＡと同等の、予想された質量の複合体を形成する。さらに、発現時に、ＡＢＨ１を形成する輸送体ポリペプチドも、ＡＢＨ２を形成するものも、ホモダイマー化せず、むしろそれらは好ましくは、安定なヘテロ複合体を形成する。詳細については以下の表３を参照されたい。
【０２８３】
【表３】
2014512343.tif 000040
【０２８４】
ＷＴ−ＨＳＡ及び２つのアルブミンに基づくヘテロマルチマー（ＡＢＨ１及びＡＢＨ２）を、０．１％ｗ／ｖのプルロニック及び４ｍＭグルタミンを添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の懸濁液中で増殖させたＣＨＯ−３Ｅ７細胞系中で発現させた。トランスフェクションの日の細胞密度は約１５０〜２００万個の細胞／ｍｌであるべきであり、生存率は９７％を超えなければならない。トランスフェクションは、５％のｐＴＴｏ−ＧＥＰプラスミド（トランスフェクション効率を決定するための緑色蛍光タンパク質、表４）、１５％のｐＴＴ２２−ＡＫＴプラスミド、２１％のＨＳＡプラスミド（それぞれ１０．６３％）、６８．３７％のサケ精子ＤＮＡから構成されるプラスミドＤＮＡの混合物を用いて、特許出願ＷＯ２００９／１３７９１１に従って行われる。トランスフェクション後、細胞を含有する振とうフラスコを、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベータ中、１２０ｒｐｍに設定された回転振とう器上に置く。トランスフェクションの２４時間後、１％ｗ／ｖのＴＮ１及び０．５ｍＭのＶＰＡ（バルプロ酸）を培養物に添加する。次いで、培養物を、３２℃に設定された５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中に入れた回転振とう器（１２０ｒｐｍ）に移す。２４〜４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞は、フローサイトメトリーにより決定された場合、３０〜６０％であるべきである。トランスフェクションの７日後に細胞を収穫し、４，０００ｒｐｍで２０分間スピンした。上清を、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過滅菌（清澄化）した。上清を、短期間の保存のためには４℃で、長期間の保存のためには−８０℃で保持する。精製の前に、凍結された上清を３７℃で解凍し、真空下で５〜１０分間、０．４５μｍの膜フィルターを介して再濾過及び脱気した。
【０２８５】
【表４】
2014512343.tif 000041
【０２８６】
ＨＳＡ並びにヘテロマルチマーＡＢＨ１及びＡＢＨ２の精製
【０２８７】
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したベンチトップＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００カラムを用いる重力流により、精製を実施した。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリックスを、２０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．２を用いて平衡化させた。試料を５ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードした後、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。１Ｍ  ＮａＣｌを添加した０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．２を用いてタンパク質を溶出させ、１ｍｌ画分（合計２０ｍｌ）中に収集した。ＨＳＡを含有する画分（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイの通り）をプールし、１ｍｌ／ｍｌの流速を用いて、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と結合させたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００調製等級ゲル濾過カラム上に印加した。８５％を超える純度を有するタンパク質を収集した；純粋な試料を含有する画分をプールし、１００００ＭＷＣＯのカットオフ重量を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ膜を用いる遠心分離により濃縮した。図６Ｃは、両方とも精製の最終段階後の、ＡＢＨ２ヘテロマルチマー及びＷＴ  ＨＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元的）分析を示す。両構築物は、予想されたＭＷを示す。
【０２８８】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いるアルブミンに基づくヘテロマルチマーの安定性の決定
【０２８９】
全てのＤＳＣ実験は、ＧＥ又はＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ装置を用いて実行された。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にバッファー交換し、０．１３７ｍＬを用いて０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬに希釈し、試料細胞中にロードし、２０〜１００℃で１℃／ｍｉｎの走査速度で測定した。ＰＢＳバッファーのバックグラウンドを差し引いて、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてデータを分析した。得られた決定された融点については表５及び図７を参照されたい。
【表５】
2014512343.tif 000042
【０２９０】
表面プラズモン共鳴を用いるＨＳＡ及びＡＢＨ２のＦｃＲｎ結合の評価
【０２９１】
図８Ａ〜Ｂに見られるように、ＨＳＡ及びＨＳＡに基づくヘテロマルチマーをＳＰＲ表面上に固定した場合、ＦｃＲｎに対する親和性は完全長ＷＴ  ＨＳＡ及びＡＢＨ２の間で同等であると考えられ、これはアルブミンのＦｃＲｎ結合官能性がアルブミンに基づく輸送体ポリペプチドの自己集合により形成されるヘテロマルチマーによって保持されることを示唆している。以下の表６は、ＦｃＲｎ結合データを例示する。括弧内の値は標準偏差を指す。
【０２９２】
【表６】
2014512343.tif 000043
【０２９３】
【０２９４】
（例３：抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ生物活性融合物を含む一価及び四価のアルブミンに基づくヘテロマルチマーの生成及び発現）
【０２９５】
多価ヘテロマルチマーＡＢＨ２を、抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ（４Ｄ５）及び／又は抗ＣＤ１６ｓｃＦｖ（ＮＭ３Ｅ）のいずれかであるカーゴポリペプチドに一方又は両方の末端で融合された、その単一のモノマー輸送体ポリペプチド、配列番号８及び配列番号１０を発現させることにより生成した。これらのものは、８塩基構築物モノマーに基づかない輸送体ポリペプチド１と８塩基構築物モノマーに基づかない輸送体ポリペプチド２とのセットを形成する。これらの塩基構築物の異なる組合せを同時発現時に組合せて、一価から四価までの範囲の、２つの輸送体ポリペプチドの４つの末端位値のいずれかでの２つのカーゴポリペプチドの全ての組合せを示すヘテロマルチマーを形成させた。
【０２９６】
図９に示されるように、生物活性カーゴポリペプチドを、一方のモノマーのＮ末端についてはＧＧＳＧリンカーを介して、他方のモノマー中の他の全ての末端についてはより長い（ＧＧＳ）４ＧＧリンカーを介してヘテロマルチマー輸送体ポリペプチドに融合した。
【０２９７】
【表７】
2014512343.tif 000044
【０２９８】
【０２９９】
多価構築物を、ヘテロマルチマーＡＢＨ２を用いて例２に概略されたように生成した。最終遺伝子産物を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）（Durocherら）中にサブクローニングした。浮遊増殖するヒトＣＨＯ−３Ｅ７の一過的トランスフェクションによる高レベル及び高効率の組換えタンパク質産生を実施した。１ｍｌ／ｍｌの流速を用いて、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と結合させたＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００カラムへの発現されたタンパク質の細胞上清の適用により、精製を実施した。カラムを、２０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌから構成される試料バッファーを用いて平衡化させた。試料を５ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードした後、試料バッファーで洗浄した。３００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲のＮａＣｌ勾配の適用により、タンパク質を溶出させた。より高い塩濃度中で溶出する画分が最も純粋であり、これをプールし、濃縮した後、１ｍｌ／ｍｌの流速を用いるＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００調製等級ゲル濾過カラムに印加した。８５％を超える純度を有するタンパク質を収集した；純粋な試料を含有する画分をプールし、１００００ＭＷＣＯのカットオフ重量を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ膜を用いる遠心分離により濃縮した。図１０Ａ〜１０Ｂは、様々なカーゴポリペプチドに融合させたＡＢＨ２ヘテロマルチマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元的）分析を示す。輸送体ポリペプチドと比較したヘテロマルチマー中のこれらのポリペプチドの位置を、以下の表８に概略する。全ての構築物は予想された分子量を示した。
【０３００】
【表８】
2014512343.tif 000045
【０３０１】
【０３０２】
【０３０３】
単一の抗ＣＤ１６ｓｃＦｖに融合させた一価ＡＢＨ２のＳＰＲ結合
【０３０４】
輸送体ポリペプチド配列番号２のＮ末端で単一の抗ＣＤ１６ｓｃＦｖに融合させた精製されたヘテロマルチマーＡＢＨ２（構築物ｖ５１５）を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる結合実験において用いた。可溶性ＣＤ１６をＣＭ５表面上に共有的に固定し、抗ＣＤ１６ｓｃＦｃに融合させたＡＢＨ２を捕捉し、結合反応速度を決定した。
【０３０５】
ＳＰＲ供給物。ＧＬＭセンサチップ、Ｂｉｏｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎアミドカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳ及びエタノールアミン）、並びに１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）から購入した。組換えＨｅｒ−２タンパク質を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＨＥＰＥＳバッファー、ＥＤＴＡ、及びＮａＣｌを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）から購入した。１０％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を、Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）から購入した。
【０３０６】
ＳＰＲバイオセンサアッセイ。全ての表面プラズモン共鳴アッセイを、２５℃の温度で、ＨＢＳＴ泳動バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．４）を用いるＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ））を用いて実行した。ＣＤ１６捕捉表面を、分析物（水平）方向に３０μＬ／ｍｉｎで３００ｓ注入された標準ＢｉｏＲａｄ  ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：５希釈液により活性化されたＧＬＭセンサチップを用いて生成した。活性化の直後、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．５中のＣＤ１６の４．０μｇ／ｍＬ溶液を、約３０００共鳴単位（ＲＵ）が固定されるまで、２５μＬ／ｍｉｎの流速でリガンド（垂直）方向に注入した。分析物方向に３０μＬ／ｍｉｎでの１Ｍエタノールアミンの３００ｓの注入により、残存する活性基をクエンチし、これはまたモック活性化されたインタースポットがブランク参照のために創出されることを確保するものである。
【０３０７】
５００ｎＭの３倍希釈系列のＶ５１５を、ブランク（Ｌ５）と比較して３０００ＲＵのＣＤ１６ａＷＴ（Ｌ６）上に注入した。流速は５０μＬ／ｍｉｎで１２０ｓ、２４０ｓの解離相であった。注入を、標準泳動バッファー（ＤＰＢＳ／３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）及びさらに３５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む泳動バッファー中で繰り返した。バッファーブランク注入及びインタースポットを用いてセンサーグラムを整列させ、二重参照し、得られたセンサーグラムをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．０を用いて分析した。典型的には、ＫＤ値を、平衡適合モデルを用いて結合等温線から決定した。遅い解離速度を有する高親和性相互作用については、反応速度値及び親和性値を、ローカルＲｍａｘを用いる１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに参照センサーグラムを適合させることによりさらに決定し、親和定数（ＫＤＭ）を得られた速度定数（Ｋｄｓ−１／ｋａＭ−１ｓ−１）から誘導した。全てのＫＤ値を、３つの独立した泳動からの平均及び標準偏差として報告する。
【０３０８】
表９に示されるように、単一の抗ＣＤ１６ｓｃＦｖに融合させたＡＢＨ２ヘテロマルチマーは、完全な活性を有し、良好な再現性及び遊離抗ＣＤ１６ｓｃＦｖ（ＮＭ３Ｅ）と類似するＫＤでその標的に結合する。
【０３０９】
【表９】
2014512343.tif 000046
【０３１０】
（例４：カーゴタンパク質（単数又は複数）が１又は複数のＥＧＦ−Ａ様ドメインを含むＨＡ又はＨＡＡに基づくヘテロマルチマータンパク質の調製）
ＰＣＳＫ９タンパク質中のＥＧＦ−Ａドメインのペプチド配列又は低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）に特異的に結合することができる、ＥＧＦ−Ａドメインと相同な別のポリペプチド配列を、配列決定により、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから誘導する。ＥＧＦ−Ａ様ドメインを含むカーゴポリペプチドのｃＤＮＡを、限定されるものではないが、全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにより、及び一連の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによるなどの様々な手段により単離する。特定の例においては、カーゴタンパク質を遺伝子操作して、安定性、標的結合特性又は他の生物物理的若しくは治療的に関連する特性を改善する。そのポリペプチドは高コレステロール血症の治療における適用と共にヘテロマルチマーの創出におけるカーゴタンパク質として用いられる。第１及び第２のモノマー融合ポリペプチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号８又は配列番号１０などのＨＡ又はＨＡＡに基づく輸送体ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に直接的に、又は中間リンカーペプチドを用いてカーゴタンパク質配列を融合させることにより誘導される。このモノマー融合タンパク質配列を、目的の特定の細胞系中での発現のために配列最適化された発現ベクター中に導入されるその対応するＤＮＡ配列に逆翻訳させる。第１及び第２のモノマー融合タンパク質を、目的の細胞系中にトランスフェクトし、同時発現させる。特定の事例においては、トランスフェクションは２つのベクターについて１：１の比である。いくつかの例においては、その比は、１．５：１、２：１、１：１．５、１：２などから選択される。
【０３１１】
（例５：カーゴタンパク質（単数又は複数）がＧＬＰ−１及び／又はグルカゴンである、ＨＡ又はＨＡＡに基づくヘテロマルチマータンパク質の調製）
ＧＬＰ−１のペプチド配列又はＧＬＰ−１受容体に特異的に結合するか、若しくはＧＬＰ−１アゴニストとして作用することができる、このペプチドと相同な別のポリペプチド配列を、配列決定により、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから誘導する。或いは、グルカゴンのペプチド配列又はグルカゴン受容体に特異的に結合するか、若しくはグルカゴン受容体アゴニストとして作用することができる、このペプチドと相同な別のポリペプチド配列を、配列決定により、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから誘導する。ＧＬＰ−１又はグルカゴンを含むそれぞれのカーゴポリペプチドのｃＤＮＡを、限定されるものではないが、全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにより、及び一連の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによるなどの様々な手段により単離する。特定の例においては、これらのＧＬＰ−１又はグルカゴンに基づくカーゴポリペプチドを遺伝子操作して、安定性、標的結合特性又は他の生物物理的若しくは治療的に関連する特性を改善する。これらのＧＬＰ−１及びグルカゴンに基づくポリペプチドは、２型糖尿病又はグルコース代謝と関連する別の疾患の治療における適用と共にヘテロマルチマーの創出における１つ又は複数のカーゴ分子として用いられる。第１及び第２のモノマー融合ポリペプチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号８又は配列番号１０などのＨＡ又はＨＡＡに基づく輸送体ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に直接的に、又は中間リンカーペプチドを用いてカーゴタンパク質配列を融合させることにより誘導される。この融合タンパク質は、ＧＬＰ−１若しくはグルカゴン様ポリペプチドのいずれかについて一特異的であってもよく、又はＧＬＰ−１及びグルカゴン様ポリペプチドの両方について二特異的（コアゴニスト）であってもよい。それぞれのモノマー融合タンパク質配列を、目的の特定の細胞系中での発現のために配列最適化された発現ベクター中に導入されるその対応するＤＮＡ配列に逆翻訳させる。第１及び第２のモノマー融合タンパク質を、目的の細胞系中にトランスフェクトし、同時発現させる。特定の事例においては、トランスフェクションは２つのベクターについて１：１の比である。いくつかの例においては、その比は、１．５：１、２：１、１：１．５、１：２などから選択される。
【０３１２】
カーゴ分子ＧＬＰ−１の配列
【０３１３】
配列番号１２：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ
【０３１４】
カーゴ分子グルカゴンの配列
【０３１５】
配列番号１３：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
【０３１６】
（例６：膜感知多価足場としてのアネキシンタンパク質リピート）
アネキシンは、２つの輸送体ポリペプチドを含む多価ヘテロマルチマー足場を生成するための広範囲の接合部分で分割される。アネキシンは３４６残基のタンパク質（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＭＣＸ）である。残基１８４と１９４との間の領域で分割されたアネキシンに基づく２つの輸送体ポリペプチドを含むヘテロマルチマーを、図９に示す。溶液中で同時発現された場合、２つの輸送体ポリペプチドの間の大きい界面面積は、ヘテロダイマーの自己集合をもたらす。２つの単位の自己集合は、アネキシンコアに基づく輸送体ポリペプチドとの多価構築物の設計を可能にする。２つの構造、Ｐｉｇ及びＨｕｍａｎが利用可能である。２つの構造は０．６Ａのｒｍｓｄで重なる。以下の配列ストレッチを、ヒトアネキシン配列ＤＲＳＥＤＦ（残基１６０から１６５まで）から除去することができる。トランケーションは任意の二次構造エレメントを破壊せず、任意のプロリン残基を導入又は除去することを含まない。
【０３１７】
ヒトアネキシンＷＴ配列
【０３１８】
配列番号１４：
【化１４】
2014512343.tif 000047
【０３１９】
アネキシンに基づく輸送体ポリペプチド−１の配列：
【０３２０】
配列番号１５：
【化１５】
2014512343.tif 000048
【０３２１】
アネキシンに基づく輸送体ポリペプチド−２の配列：
【０３２２】
配列番号１６：
【化１６】
2014512343.tif 000049
【０３２３】
図１０は、アネキシンに基づく輸送体ポリペプチド−１（ＡＢＴ−１）とアネキシンに基づく輸送体ポリペプチド−２（ＡＢＴ−２）との接合部分での埋没溶媒接近可能表面積のプロットを示す。残基位置１８６に近い分割アネキシンは、埋没表面積約３２００Å２のヘテロダイマーを形成する。アネキシンに基づくＡＢＴ−１及びＡＢＴ−２などの輸送体ポリペプチドを用いて、アルブミンに基づく輸送体ポリペプチドについて上記と同じ方法を用いてカーゴ生体分子を付けることができる。
【０３２４】
（例７：多価足場としてのトランスフェリン）
トランスフェリンの数多くの治療上関連する特性に基づいて、このタンパク質はそれ自身、自己集合するタンパク質及びその分割成分部分の創出後の多価タンパク質融合薬物の設計のための興味深い足場分子として存在する。トランスフェリンの構造を、タンパク質データバンクで利用可能な結晶構造（１Ｈ７６）に基づいて図１１に示す[Hall DRら、Acta Crystallogr D 2002、 58、 70-80]。トランスフェリン分子は、残基３３３と３４２との間で短いペプチドリンカーにより接続された、２つの構造的に類似するローブ（ｌｏｂｅ）であるＮ及びＣ末端ローブから構成される。
【０３２５】
ヘテロダイマーはトランスフェリンタンパク質に基づいて設計され、前記ヘテロダイマーはトランスフェリンの残基１〜３３３を含む第１の輸送体ポリペプチド及び元のトランスフェリン配列の残基３４２からＣ末端までから構成される第２の輸送体ポリペプチドを含む。同時発現される場合、２つの輸送体ポリペプチドは独立して折畳まれ、対形成して、その治療上関連する特性を維持することができる疑似トランスフェリン足場を形成する。さらに、そのようなトランスフェリン足場は、多価融合分子、例えば、トランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチドとの多価ＧＬＰ−１融合物の産生を可能にする。これらの融合物は、アルブミンに基づく輸送体ポリペプチドとのＧＬＰ−１融合ポリペプチドと類似していてもよい。
【０３２６】
図１１は、ＰＤＢ構造１Ｈ７６に基づくトランスフェリン分子の構造を提供する。トランスフェリン分子を分割することにより誘導される２つのモノマー輸送体ポリペプチドは、薄い灰色及び濃い灰色の単位として色分けされている。カーゴ分子のための融合部位を球体として表示する。図１２は、２つのトランスフェリンに基づくポリペプチドの接合部分での埋没溶媒接近可能表面積のプロットを示す。以下に示される２つの輸送体ポリペプチドなどの残基位置３３０の近くの分割トランスフェリンは、埋没表面積約１８００Å２のヘテロダイマーを形成する。
【０３２７】
トランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチド−１の配列：
【０３２８】
配列番号１７：
【化１７】
2014512343.tif 000050
【０３２９】
トランスフェリンに基づく輸送体ポリペプチド−２の配列：
【０３３０】
配列番号１８：
【化１８】
2014512343.tif 000051
【０３３１】
（例９：複数のカーゴタンパク質）
本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質（例えば、輸送アルブミンセグメント又はその変異体に融合されたカーゴポリペプチド（又はその断片若しくは変異体）を含有する）を、他のタンパク質にさらに融合させて、「多融合タンパク質」を生成することができる。これらの多融合タンパク質は、様々な用途に用いることができる。例えば、Ｈｉｓ−タグＩｇＧドメイン、及びマルトース結合タンパク質への本明細書に記載のタンパク質の融合は、精製を容易にする（例えば、ＥＰ  Ａ３９４，８２７；Trauneckerら、Nature 331:84-86 (1988)を参照されたい）。前記ポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、特定のサブ細胞内局在化にタンパク質を標的化することができる。さらに、本明細書に記載のタンパク質へのさらなるタンパク質配列の融合は、ヘテロマルチマーの溶解度及び／又は安定性をさらに増加させることができる。上記のヘテロマルチマータンパク質は、当技術分野で公知の技術を用いて、若しくはそれを日常的に改変して、及び／又はＩｇＧ分子へのポリペプチドの融合を概略する以下のプロトコルを改変することにより作製することができる。
【０３３２】
簡単に述べると、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分を、以下に記載の配列の５’及び３’末端に広がるプライマーを用いてＰＣＲ増幅することができる。これらのプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは、哺乳動物又は酵母発現ベクター中へのクローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０３３３】
例えば、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）を用いる場合、ヒトＦｃ部分をＢａｍＨＩクローニング部位にライゲートすることができる。３’ＢａｍＨＩ部位を破壊するべきであることに留意されたい。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターをＢａｍＨＩで再度制限処理し、ベクターを線状化し、本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質をコードするポリヌクレオチド（当技術分野で公知の技術を用いて生成及び単離される）を、このＢａｍＨＩ部位にライゲートする。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが停止コドンを用いずにクローニングされることに留意されたい；さもなければ、Ｆｃを含有する融合タンパク質は産生されない。
【０３３４】
天然のシグナル配列を用いて本明細書に記載のヘテロマルチマータンパク質を産生させる場合、ｐＣ４は第２のシグナルペプチドを必要としない。或いは、天然のシグナル配列を用いない場合、異種シグナル配列を含むようにベクターを改変することができる（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９６／３４８９１号を参照されたい）。
【図１】
2014512343.tif 000052
【図３】
2014512343.tif 000053
【図４】
2014512343.tif 000054
【図５】
2014512343.tif 000055
【図６Ｂ】
2014512343.tif 000056
【図１０Ａ】
2014512343.tif 000057
【図１０Ｂ】
2014512343.tif 000058
【図１３】
2014512343.tif 000059
【図１５−１】
2014512343.tif 000060
【図１５−２】
2014512343.tif 000061
【図１５−３】
2014512343.tif 000062
【図１５−４】
2014512343.tif 000063
【図１５−５】
2014512343.tif 000064
【図１５−６】
2014512343.tif 000065
【図１５−７】
2014512343.tif 000066
【図１５−８】
2014512343.tif 000067
【図１５−９】
2014512343.tif 000068
【図１５−１０】
2014512343.tif 000069
【図１５−１１】
2014512343.tif 000070
【図１５−１２】
2014512343.tif 000071
【図１５−１３】
2014512343.tif 000072
【図１５−１４】
2014512343.tif 000073
【図１５−１５】
2014512343.tif 000074
【図１５−１６】
2014512343.tif 000075
【図１５−１７】
2014512343.tif 000076
【図１５−１８】
2014512343.tif 000077
【図１５−１９】
2014512343.tif 000078
【図１５−２０】
2014512343.tif 000079
【図１５−２１】
2014512343.tif 000080
【図１５−２２】
2014512343.tif 000081
【図１５−２３】
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【図１５−２４】
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【図１５−２５】
2014512343.tif 000084
【図１５−２６】
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【図１５−２７】
2014512343.tif 000086
【図１５−２８】
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【図１５−２９】
2014512343.tif 000088
【図１５−３０】
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【図１５−３１】
2014512343.tif 000090
【図１５−３２】
2014512343.tif 000091
【図１５−３３】
2014512343.tif 000092
【図２】
2014512343.tif 000093
【図６Ａ】
2014512343.tif 000094
【図６Ｃ】
2014512343.tif 000095
【図７】
2014512343.tif 000096
【図８Ａ】
2014512343.tif 000097
【図８Ｂ】
2014512343.tif 000098
【図９】
2014512343.tif 000099
【図１１】
2014512343.tif 000100
【図１２】
2014512343.tif 000101
【図１４】
2014512343.tif 000102
【配列表】
2014512343000001.app
【国際調査報告】
2014512343.tif 000103
2014512343.tif 000104
2014512343.tif 000105