(57)【要約】  本発明は、生体試料において、細胞の腫瘍性に特徴的な少なくとも１つのマーカーを有する循環腫瘍細胞(CTC)の特徴を決定する方法であって、  上記マーカーが：-  CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)及び-  腫瘍マーカーから構成される群から選択される方法に関する。  また、本発明は、癌患者の治療の実行を決定するための該方法の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料、特に血液試料中において、細胞の腫瘍性に特徴的な少なくとも１つのマーカーを有する循環腫瘍細胞(CTC)を同定する方法であって、
前記マーカーが：
-  CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)及び
-  腫瘍マーカー
から構成される群より選択され、
前記方法が、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特にCTCの腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質(EML4-ALK 融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、再構成又は増幅に特異的なプローブを用いるFISHタイプの技術を用いて、細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子(EML4-ALK融合遺伝子を除く)の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、及び
c. 工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む方法。
【請求項２】
循環腫瘍細胞(CTC)が、上皮及び間葉由来である請求項１に記載の同定方法。
【請求項３】
CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルの同定及び細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子(EML4-ALK融合遺伝子を除く)の存在に関連付けられるシグナルの検出に供する生体試料に由来する細胞が、8μmから少なくとも40μmまで変化するそれらのサイズによって単離される請求項１又は２に記載の同定方法。
【請求項４】
以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、再構成又は増幅に特異的なプローブを用いるFISHタイプの技術を用いて、上記のタンパク質をコードする遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、及び
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項５】
以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に腫瘍マーカーの存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、再構成又は増幅に特異的なプローブを用いるFISHタイプの技術を用いて、CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)をコードする遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、及び
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項６】
異なるシグナルを同定する工程の前に又は該工程に内在して、CTCで生体試料を富化する工程を含み、CTCで細胞の富化因子が約1/100から約1/100,000までである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
患者の生体試料に由来する細胞が、蛍光顕微鏡又はスキャナタイプの装置を用いて分析することができる好適な支持体上に堆積され、前記支持体がフィルター又はスライドであり得る請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、濾過によって支持体上で回収されるか、又は、免疫磁気分離後に支持体上に堆積される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される少なくとも１つのマーカーを用いる蛍光免疫標識によって行われる請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が、少なくとも２つのマーカーを併用する蛍光免疫標識によって行われ、
各マーカーが：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が、少なくとも３つのマーカーの併用を含み、
各マーカーが：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が、４つのマーカーの併用を含み、
各マーカーが：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的なマーカーが、HER2、Erg及びc-Metから構成される群から選択される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
用いる核膜マーカーがエメリンマーカーである請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
用いる核マーカーが、DAPIマーカー、Syto59マーカー、Sytox Orangeマーカー、TOPRO 3マーカー、Hoechst 33342マーカーから構成される群から選択される請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
造血細胞マーカーが、CD45及びCD31から構成される群から選択される請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカーが、EpCAMマーカー、パンサイトケラチンマーカー、上皮カドヘリンマーカーから構成される群より選択される請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーが、ビメンチンマーカー及び神経カドヘリンマーカーから構成される群より選択される請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が、
i.  HER2によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核マーカーDAPI、
iii.  造血細胞マーカーCD45、
iv.  パンサイトケラチンマーカー
を用いる蛍光免疫標識によって行われる請求項９〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
FISHタイプの方法が、以下の連続工程：
-  バインディング後の支持体の酵素による処理、
-  少なくとも１つのプローブの存在下における支持体上でのハイブリダイゼーション、
-  支持体上におけるハイブリダイズしたプローブの位置決定
を含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
患者に由来する生体試料が、血液である請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
癌患者に由来する生体試料、特に血液試料を分析するための、CTC中の分子の異常、特に転座又は遺伝子増幅の存在を診断するための、及び、前記患者に個別的な治療の使用を決定するための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
分子の異常、特に転座又は遺伝子増幅を有する癌患者に由来する生体試料、特に血液試料を分析するための、腫瘍の進行をモニタリングするための、転移性のタイプの事象を予測するための、又は、抗癌剤治療の効能を測定するための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２４】
患者が、転移の存在をもたらし得る癌、特に非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌に罹患している、請求項２２又は２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、循環腫瘍細胞(Circulating Tumour Cells; CTC)の特徴を決定する新たな方法並びに抗腫瘍治療の実行を決定するための、癌の進行の状態を診断するための、及び患者における疾患の進展についての予後を得るための、該方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞は転移の過程において重要な役割を担い、それらを分析することで患者の予後に関する重要な情報を得ることができる。さらに、それらは、リアルタイムに転移性疾患を表す、非侵襲性の方法によって容易に入手可能な腫瘍状のものを構成する。個別化癌治療の開発との関連において、CTC中の抗腫瘍治療の分子標的マーカーの存在の検出によって、この治療が有効そうな患者を選択すること又は個体レベルでこれと同一の治療に対する反応若しくは耐性を評価することすら可能となり得る。現状、標的抗腫瘍治療が有効そうな患者の選択は、転移の生検における分子マーカーの探索に基づいている。本方法は、CTCでこの探索を行い、腫瘍生検の分析を補完すること又は該分析に取って代わることすら可能にする。
【０００３】
CTC検出における現在の困難性は、血中においてその数が少ないという事実に関連するものである。したがって、標的抗腫瘍治療との関連において、CTC中の分子マーカーの存在の診断は、非常に少数の細胞について行わなければならない。よって、この診断の正確性を担保するためには、一方で腫瘍形成に関係する表現型(腫瘍マーカー)、形態及び分子の異常に基づいてCTCの腫瘍性(例えば、ALK遺伝子再構成、HER2遺伝子増幅)を示すために、同じ細胞について異なる分析を併行して行わなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Lecharpentierら(2011)は、上皮細胞に特異的なマーカー及び間葉細胞に特異的なマーカーのCTC細胞による共発現に基づいて、血液試料中のCTCを検出する方法について記載している。この方法は、３つの蛍光マーカーを併用するものであり、経験豊富な細胞病理学者によって行われるさらなる形態-細胞分析を必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の方法は、真の形態分析、蛍光免疫標識による細胞の表現型の同定及び癌細胞に特徴的な再構成のようなゲノムレベルにおける特定のDNA配列の存在の検出を組み合わせるので、認証された細胞病理学者の存在を必要としないCTC検出の代替法を提供する。
【０００６】
１つの及び同一の生体試料について行われる２つの異なる検出技術及び２つの異なるレベルの分析の本発明の方法に従う組合せによって、この診断技術の感度及び信頼性は増大する。より具体的には、本発明の方法は、癌患者における発癌性タンパク質ALKを標的とする抗腫瘍治療の必要性を示唆することを可能にする診断アッセイを構成する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】転座したALKタンパク質に特異的なモノクローナル抗体(5A4又はD5F3)を用いて、(EML4-ALKの転座を有する)H2228株について得られた標識を示すISETフィルターの蛍光顕微鏡写真。1A.核染色剤DAPIを用いて得られた標識；1B. ALKタンパク質に特異的な抗体を用いて得られた標識；1C. ALKタンパク質に特異的な抗体及びDAPIを用いて得られた標識。
【図２】非小細胞気管支癌腫患者のCTCについて行われたISETフィルターを用いるFISH実験を示す蛍光顕微鏡写真。2A.フィルター上に保持された転座を有しない造血細胞の例；2B及び2C.転座を有する２つのCTCの例。2p23破断点に特異的なプローブを用いた。
【図３】３人の代表的患者(P2、P6、P11)のCTC及び同じ患者の腫瘍におけるALK再構成のFISHによる検出を示す蛍光顕微鏡写真。CTCの種々の例を示す：ALK再構成だけを有する個別のCTC (P2)、天然ALK遺伝子の増幅及びALK再構成の両方を有する個別のCTC (P6)、ALK再構成を有するクラスター状のCTC(P11)。
【図４】ALK再構成を有するCTCを検出するための、４色蛍光免疫標識(ビメンチン/サイトケラチン/CD45/DAPI及びN-カドヘリン/E-カドヘリン/CD45/DAPI)とFISHとを併用する方法を説明する顕微鏡写真。4A：ALK再構成を有するCTCの間葉性表現型を示す２人の患者の例；4B：A549気管支癌株の蛍光免疫標識の陽性対照。
【図５】ALK阻害剤治療の前後のALK陽性NSCBC患者におけるALK再構成を有するCTCの存在をモニタリングするためのFISHの使用可能性を説明する蛍光顕微鏡写真。クリゾチニブ治療前及び治療後30日目の患者において検出されたCTCの例。本方法の使用は、この患者におけるCTC(これらのうち、いくらかはALK再構成を有する)クラスターのサイズ及び数の相当な低減の立証を可能にする。
【図６】ISETフィルター上でのHER2増幅の検出を示す蛍光顕微鏡写真。6A．SKBR3細胞株についてのFISH実験例；6B．HER2増幅を有する女性患者由来のCTCについてのFISH実験例；6C：HER2増幅を有する患者のCTCについてのHER2タンパク質を指向するモノクローナル抗体を用いる蛍光免疫標識の例。
【図７】ISETフィルター上に回収された前立腺癌又は乳癌の細胞株及び患者における様々な分子の異常を検出するためのFISHの使用を示す蛍光顕微鏡写真。A：LnCAP細胞株におけるERG遺伝子増幅の検出；B：VCAP細胞株におけるERG遺伝子再構成の検出；C：LnCAP細胞株におけるAR遺伝子増幅の検出；D：SKBR3細胞株におけるHER2遺伝子増幅の検出；E：前立腺癌患者におけるERG遺伝子増幅の検出；F：前立腺癌患者におけるcMYC遺伝子増幅の検出；G：前立腺癌患者におけるAR遺伝子増幅の検出；H：乳癌患者におけるHER2遺伝子増幅の検出。
【図８】細胞株(図8A)及び前立腺癌患者のCTC(図8B)におけるERG、cMYC又はAR遺伝子増幅を有するCTCを検出するための、ISETフィルター上において４色蛍光免疫標識(ビメンチン/サイトケラチン/CD45/DAPI)及びFISHを併用する自動化方法を説明する顕微鏡写真。
【図９】ISETフィルター上におけるH1975気管支癌細胞株の蛍光免疫標識(cMet/CD45/DAPI)及びFISHを併用する方法を説明する顕微鏡写真；9A：３色蛍光免疫におけるcMETタンパク質の検出；9B：cMET増幅の検出；9C：蛍光免疫標識及びFISHの併用方法。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明による検出方法について以下詳細に記載する。
本発明は、生体試料において、特に血液試料において、細胞の腫瘍性に特徴的な少なくとも１つのマーカーを有する循環腫瘍細胞(CTC)を同定する方法であって、
前記マーカーが
- CTCに特徴的な発癌性タンパク質、及び
- 腫瘍マーカー
から構成される群から選択され、
前記方法が以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特にCTCの腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、FISHタイプの技術を用いて、細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む方法に関する。
【０００９】
本発明は、同一の支持体上で表現型の標識とFISHタイプの方法による分析とを組み合わせて、CTCの完全性を保存するという利点を有する。
生体試料、特に血液試料は、癌患者に由来する。
【００１０】
同定方法の具体的な実施態様によれば、循環腫瘍細胞(CTC)は、上皮由来のもの及び間葉由来のものである。
本発明が意味する範囲内において、CTCを同定する方法はCTC富化方法又はCTC特徴決定方法とも呼ぶ。３つの表現は等価であり、互換的に用いることができる。本発明に従って用いられる富化方法は、ISET法である。
【００１１】
同定方法の具体的な実施態様によれば、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルの同定及び細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子(EML4-ALK融合遺伝子を除く)の存在に関連付けられるシグナルの検出に供する生体試料に由来する細胞は、8μmから少なくとも40μmまで変化するそれらのサイズに従って単離される。
【００１２】
第１の具体的態様によれば、本発明は、患者に由来する生体試料において、EML4-ALK融合遺伝子を有する循環腫瘍細胞(CTC)を同定する方法であって、
前記方法が以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特にEML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、FISHタイプの技術を用いて、EML4-ALK融合遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明のこの第１の態様によれば、本方法は、EML4-ALK融合遺伝子の存在をFISH技術によって検出し、CTCを形態及び表現型の面から、特に前記融合遺伝子によってコードされるタンパク質の存在の面から同定する。
【００１４】
EML4-ALK融合タンパク質は、強力な発癌活性を有し、非小細胞肺癌(NSCBC、非小細胞気管支癌とも呼ばれる)患者の亜集団における発癌に重要な役割を担う。ALKを標的化する小分子、特にチロシンキナーゼインヒビターによってブロックすることができるこの活性は、これらの癌の治療における重要な標的分子である。
【００１５】
第２の具体的態様によれば、本発明は、患者に由来する生体試料において、細胞の腫瘍性に特徴的な少なくとも１つのマーカーを有する循環腫瘍細胞(CTC)を同定する方法であって、
前記マーカーが、
- CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子を除く)、及び
- 腫瘍マーカー
から構成される群から選択され、
前記方法が、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特にCTCの腫瘍性に特徴的な遺伝子によりコードされるタンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によりコードされるタンパク質を除く)の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、FISHタイプの技術を用いて、細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子(EML4-ALK融合遺伝子を除く)の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む方法に関する。
【００１６】
さらに、この第２の態様によれば、本発明は、生体試料、特に血液試料において、細胞の腫瘍性に特徴的な少なくとも１つのマーカーを有する循環腫瘍細胞(CTC)を同定する方法であって、
前記マーカーが、
- CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によりコードされるタンパク質を除く)、及び
- 腫瘍マーカー
から構成される群から選択され、
前記方法が、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特にCTCの腫瘍性に特徴的な遺伝子によりコードされるタンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によりコードされるタンパク質を除く)の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、再構成又は増幅に特異的なプローブを用いるFISHタイプの技術を用いて、細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子(EML4-ALK融合遺伝子を除く)の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む方法に関する。
【００１７】
Charpentierらの刊行物(2011)に記載されたCTCの検出方法は、一方で３つの蛍光マーカーの併用及び他方で経験豊富な細胞病理学者により行われる形態-細胞分析を含むCTCの検出方法である。この文献は、蛍光表現型マーカー及び細胞形態自動分析を組み合わせたCTCの検出方法について開示していないし、蛍光免疫標識による細胞の表現型の検出及び染色体レベルにおける特定のDNA配列の存在の検出を組み合わせる方法についても開示していない。最後に、この文献は、細胞形態自動検出、蛍光免疫標識による表現型の検出及びFISH(蛍光インサイチュハイブリダイゼーション)タイプの技術を用いる分子の検出を組み合わせる方法について開示していない。
【００１８】
別の態様によれば、本発明による同定方法は、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子(EML4-ALK融合タンパク質の遺伝子を除く)によってコードされるタンパク質の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、FISHタイプの技術を用いて、EML4-ALK融合遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む。
この態様によれば、本方法は、一方ではEML4-ALK融合遺伝子の存在を検出し、他方では前記融合遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質の存在を検出する。
【００１９】
別の態様によれば、本発明による同定方法は、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質(EML4-ALK 融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、再構成又は増幅に特異的なプローブを用いるFISHタイプの技術を用いて、前記タンパク質をコードする遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む。
【００２０】
別の態様によれば、本発明は、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に腫瘍マーカーの存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、FISHタイプの技術を用いて、CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)をコードする遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、及び
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む方法に関する。
【００２１】
さらに、その他の態様によれば、本発明による同定方法は、以下の工程：
a.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に腫瘍マーカーの存在を特徴付けるシグナルを同定する工程、
b.  生体試料に由来する細胞を含む支持体上で、再構成又は増幅に特異的なプローブを用いるFISHタイプの技術を用いて、CTCに特徴的な発癌性タンパク質(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質を除く)をコードする遺伝子の存在に関連付けられるシグナルを検出する工程、及び
c.  工程a及びbで得られたシグナルの支持体上での位置を比較し、CTCを同定する工程
を含む。
この態様によれば、本方法は、一方ではCTCに特徴的な発癌性タンパク質をコードする遺伝子の存在を検出し、他方では腫瘍マーカーの存在を検出する。
【００２２】
本方法の工程a及びbにおいて異なる性質のマーカーを組み合わせることは、細胞のより良い特徴決定を提供するので、より優れた診断の信頼性を提供するという特別な利点を有する。
【００２３】
具体的な態様によれば、本発明による方法は、異なるシグナルを同定する工程の前に又は該工程に内在して、CTCで生体試料を富化する工程であって、CTCで細胞の富化因子が約1/100から約1/100,000までである工程を含む。
【００２４】
生体試料に由来する細胞を含む支持体がフィルター、特に(Rarecell社又はScreencell社によって市販される)ISETフィルターであるとき、血液試料の濾過は、濾過に特有の方式で、CTCで細胞の富化をもたらす。一般的に、フィルターを用いるアプローチは、診断を確定するために、より多くの細胞を得ることを可能にする。フィルターはその他の支持体よりも非常に難度が高い(平坦でないこと、バックグラウンドノイズ及び孔の問題)。これらのフィルターの孔のサイズは、フィルター上に保持され得る細胞のサイズ(前記細胞のサイズは8μmから少なくとも40μmまで変化し得る)を決定する。
【００２５】
生体試料に由来する細胞を含む支持体がスライドであるとき、富化工程は、免疫磁気分離中に行われ、スライド上における堆積に先行する。
この富化は、用いる富化方法に依存して約1/100から約1/100,000までの因子のオーダーであり、患者によって変化する。
【００２６】
より具体的な態様によれば、本発明は、患者の生体試料に由来する細胞が蛍光顕微鏡又はスキャナタイプの装置を用いて分析することができる適切な支持体上に堆積され、前記支持体がフィルター又はスライドであり得る方法に関する。
【００２７】
生体試料を堆積させるために用いられる支持体は、顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡、スキャナ又は支持体を手動若しくは自動で読み取るその他の装置中で分析することができる。上記のとおり、支持体はフィルター、スライド又は試料を堆積し、適切な装置中でシグナルを読み取るのに適したその他の支持体であり得る。
【００２８】
かくして、本発明者らは、濾過後(又はネガティブ選択による富化後)に回収された細胞を２つのフラクション(一方はCD45(+)及び他方はCD45(-))にソーティングすることからなる、スライドスキャナ(具体的には、LEICAのARIOL(登録商標)システム)を用いる自動ストラテジを開発した。次いで、種々のCTC集団を含むCD45(-)フラクションを広範にわたって分析し、純粋な上皮CTC、間葉CTC、ハイブリッド(上皮及び間葉)並びにこれらマーカーを発現しないその他の集団を同定する。FISHの後、FISHシグナル(ALK/EML4再構成)のこれらの種々の集団における位置を再び決定する。したがって、これは、表現型及び遺伝子型の面から総合的にCTCを特徴決定することを可能にする。
【００２９】
本発明による方法において、患者の生体試料に由来する細胞は、フィルター上に堆積させるために濾過中に回収されるか、又は免疫磁気分離後に若しくは当業者に公知の適切な方法によってスライド上に堆積される。
【００３０】
以下、本発明による方法を工程a、すなわちCTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナル、特に腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を特徴付けるシグナルを同定する工程について、より具体的かつ詳細に記載する。
【００３１】
具体的な態様によれば、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が：
i.  EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される少なくとも１つのマーカーを用いる蛍光免疫標識によって行われる方法に関する。
【００３２】
より具体的には、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が少なくとも２つのマーカーを併用する蛍光免疫標識によって行われ、
各マーカーが：
i.  EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される方法に関する。
【００３３】
より一層具体的には、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が少なくとも３つのマーカーの併用を含み、
各マーカーが：
i.  EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される方法に関する。
【００３４】
より一層具体的な態様によれば、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が４つのマーカーの併用を含み、
各マーカーが：
i.  EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される方法に関する。
【００３５】
本発明の別の態様においては、工程aについて、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカーを除く)、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される少なくとも１つのマーカーを用いる蛍光免疫標識によって行われる方法に関する。
【００３６】
より具体的には、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が少なくとも２つのマーカーを併用する蛍光免疫標識によって行われ、
各マーカーが：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカーを除く)、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される方法に関する。
【００３７】
より一層具体的には、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が少なくとも３つのマーカーの併用を含み、
各マーカーが：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカーを除く)、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される方法に関する。
【００３８】
より一層具体的な態様によれば、本発明は、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程が４つのマーカーの併用を含み、
各マーカーが：
i.  細胞の腫瘍性に特徴的な遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー(EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカーを除く)、
ii.  核膜マーカー又は核マーカー、
iii.  造血細胞マーカー、
iv.  上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカー及び間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーから構成される群から選択されるタンパク質のマーカー
から構成される群の１つから選択される方法に関する。
【００３９】
別の具体的態様によれば、本発明は、EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的なマーカーがAbCam(登録商標)社、Cell Signaling Technology(登録商標)社によって市販されるクローン5A4又はD5F3である方法に関する。
別の具体的態様によれば、本発明は、CTCに特徴的な発癌性タンパク質に特異的なマーカーがHER2遺伝子、ERG遺伝子及びcMet遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカーから選択される方法に関する。
【００４０】
別の具体的態様によれば、本発明は、用いる核膜マーカーがエメリンマーカーである方法に関する。
かくして、エメリンは、CTCの腫瘍性を、それらを造血細胞及びその他の正常細胞とは区別することによって同定するためのCTCの核膜マーカーとして用いられる。それは、任意のタイプの腫瘍に由来するCTCに用いることができる。
【００４１】
形態の特徴決定工程は、４重蛍光標識における(エメリンのような)核膜マーカーの導入又はIF標識(これはIFとFISHとの間の洗浄工程において除去もされなければならない)後における核染色(例えば、ヘマトキシリン/エオシン)工程の実施のいずれかに基づく。
【００４２】
別の具体的態様によれば、本発明は、用いる核マーカーがDAPIマーカー、Syto59マーカー、Sytox Orangeマーカー、TOPRO 3マーカー、Hoechst 33342マーカーから構成される群から選択される方法に関する。
【００４３】
別の具体的態様によれば、本発明は、造血細胞マーカーがCD45及びCD31から構成される群から選択される方法に関する。用いるマーカーは、好ましくはCD45である。
非常に稀ではあるが、CTCは不均質であり、種々の亜集団からなることが公知である。本発明によるアプローチは、CTCの種々の亜集団、純粋な上皮、純粋な間葉、ハイブリッド(上皮及び間葉)並びにこれらマーカーを発現しないその他の集団を同定し、特徴決定することを可能にする。CTCの濾過又は造血細胞を除去することによるネガティブ選択のアプローチだけが、これらの細胞の入手を可能にする。
【００４４】
全てのCTCを分析し、特徴決定することは、臨床的応用の見地から、２つのレベルにおいて重要な要素である：
-  (数的に)より多くのCTCを同定することによって、分子の異常を診断するため及び標的治療を決定し、次いでその効能をモニタリングするためにそれらを用いることが可能となること；先行技術の方法は、CTC(上皮CTC)の小さなフラクションの回収を可能にするに過ぎず、このフラクションは非常に希薄すぎて、このような臨床状況で用いることができない
-  標的治療に対する耐性の保有者となる非常に少数派の亜集団の出現を検出することが可能となり、この耐性の早期検出のためにCTCにおけるモニタリングをすることができる；かくして、臨床医はより適切な治療を早期に提案できる。
【００４５】
別の具体的態様によれば、本発明は、上皮細胞に特徴的なタンパク質のマーカーがEpCAMマーカー、パンサイトケラチンマーカー及び上皮カドヘリンマーカーから構成される群から選択される方法に関する。
別の具体的態様によれば、本発明は、間葉細胞に特徴的なタンパク質のマーカーがビメンチンマーカー及び神経カドヘリンマーカーから構成される群から選択される方法に関する。
【００４６】
本発明の具体的な実施態様は、
i.  EML4-ALK融合遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー又はHER2遺伝子、ERG遺伝子及びcMet遺伝子から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質のマーカー、
ii.  核マーカーDAPI、
iii.  造血細胞マーカーCD45、
iv.  パンサイトケラチンマーカー
を用いる蛍光免疫標識によって行われる、CTCの存在を示唆する少なくとも１つのシグナルを同定する工程を含む。
【００４７】
本発明の別の具体的態様は、以下の一連の工程：
-  バインディング後における支持体の酵素による処理、
-  少なくとも１つのプローブの存在下における支持体上でのハイブリダイゼーション、
-  支持体上におけるハイブリダイズしたプローブの位置決定
を含むFISHタイプの方法に関する。
【００４８】
本発明による方法は、本発明者らが開発した特別な有利なプロトコルに従って、動原体プローブではなく再構成又は増幅に特異的なプローブを用いて行われるFISHアッセイを含む。したがって、この方法は、細胞内における再構成又は増幅された遺伝子の存在の特異的な検出を可能にする。
【００４９】
FISHアッセイが先行技術の標準的なプロトコルに従ってCTCについて行われるとき、非常に脆弱な細胞はアッセイに耐えることができないので、これらアッセイの結果は役に立たない。
免疫蛍光法(IF)及びFISHの併用は、実際上は、以下の理由のために非常に難しい：
-  CTCは、腫瘍からの分離に起因して、その性質として非常に脆弱であり、そのう
ち非常に多くの割合の細胞がアポトーシスに向かうと一般的に考えられている
こと。
-  一連のIF＋FISHは、FISH前における蛍光除去の中間工程を含み、IF及びFISHの
両方について非常に穏やかである方法を必要とすること。蛍光除去が十分でな
ければ、これは高レベルのバックグラウンドノイズをもたらし、FISHを読み取
ることが不可能となる。光脱色は細胞にとっては非常に激しく、FISH前の蛍光
除去において決して用いることはできない。さらに、FISHはそれ自体で既に非
常に難しいと認識されている。本発明者らは、CTCの脆弱性を許容し、細胞の損
失を回避する一連の穏やかな洗浄を開発した。
-  CTCの稀少性の観点から、それらを可能な限り数多く保存することが重要となる
こと。フィルターを用いるとき、当該フィルターを98℃で５分間熱し、当該
フィルターに細胞を固定することが必要である。さもなければ、細胞は損失す
る。
【００５０】
具体的な態様によれば、本発明による方法は、患者の血液試料を用いて行う。先行技術に従うアッセイにおいてALK遺伝子の再構成の存在を診断するため及び抗ALKを標的とする治療を決定するために必要な生体試料は、腫瘍生検でなければならないが、これは侵襲性であり、特にNSCBCのような特定の癌の患者では、しばしば低品質である。
【００５１】
別の態様は、腫瘍の進行をモニタリングするために、転移性のタイプの事象を予測するために、又は、抗癌剤治療の効能を測定するために、転座したALK遺伝子を有する癌患者に由来する生体試料を分析する本発明の方法の使用に関する。
【００５２】
別の態様は、ALKタンパク質に対する腫瘍治療の適応を診断するための、転座したALK遺伝子を有する癌患者に由来する生体試料を分析する本発明の方法の使用に関する。
【００５３】
より具体的には、本発明は、転移の存在をもたらしやすい癌、特に非小細胞気管支癌及びALK遺伝子の再構成を有するその他の癌を有する患者に関する、記載される方法の使用に関する。
したがって、本発明の方法は、標的抗腫瘍療法を用いる個別化医療のカテゴリの部類に入る。
【００５４】
具体的な態様によれば、本発明の方法は、患者の血液試料について行われる。先行技術によるアッセイにおいて転座又は遺伝子増幅のような分子の異常の存在を診断するために、及び、標的治療を決定するために必要な生体試料は、腫瘍生検でなければならないが、これは侵襲性であり、特にNSCBCのような特定の癌の患者では、しばしば低品質である。
【００５５】
別の態様は、腫瘍の進行をモニタリングするために、転移性の事象を予測するために、又は、抗癌剤治療の効能を測定するために、転座又は遺伝子増幅のような分子の異常を有する癌の患者に由来する生体試料、特に血液試料を分析する本発明の方法の使用に関する。
【００５６】
別の態様は、これらの遺伝子によってコードされる発癌性タンパク質を標的とする腫瘍治療の適応を診断するために、転座又は遺伝子増幅のような分子の異常を有する癌の患者に由来する生体試料を分析する本発明の方法の使用に関する。
【００５７】
より具体的には、本発明は、転移の存在をもたらしやすい癌、特に非小細胞肺癌及びALK遺伝子の再構成を有するその他の癌の患者に関して、記載される方法を使用することに関する。
したがって、本発明の方法は、標的抗腫瘍療法を用いる個別化医療のカテゴリの部類に入る。
【００５８】
以下、実施例及びそれらに付随する図を用いて、本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００５９】
実施例１：分析支持体の作製
ISET技術(上皮腫瘍細胞のサイズによる単離)に基づく濾過によりCTCで血液試料を富化する。フィルターは、ISET機器上で非常に低い圧力(7 mbar)での濾過に供し、次いで、加熱ステージ上で45℃にて２分間乾燥させる。
フィルターをアルミホイルで包み、次いで凍結させる。
【００６０】
実施例２：CTCの形態及び表現型の同定
細胞は、ISETフィルター上における核、サイトケラチン、CD45及びALKタンパク質の蛍光免疫標識によって同定する。
EDTA 1X pH9バッファーをEDTA 10Xから調製し、次いで98℃に昇温する。
【００６１】
抗体の作製：
TBS-Triton 0.2％に抗体を希釈し、全量100μlとする。種々の抗体溶液を個別に調製し、次いで混合する。
Zenon IGAF546キット(Invitrogen)のカップリングプロトコルに従って、抗サイトケラチン抗体(CK A1/A3 - DAKO)をAF546蛍光色素とカップリングさせる。
【００６２】
30μlの抗CD45 APC抗体(BD Biosciences)を取り、種々の抗体の混合物に加える。
Zenon IGAF488キット(Invitrogen)のカップリングプロトコルに従って、抗ALK抗体(Novo-Castra)をAF488蛍光色素とカップリングさせる。
【００６３】
以下のようにして調製される：Zenon IgAF488「マウス」カップリングキットを用いてカップリングされる4μlの抗体を5μlのIgAF488に加え、周囲温度で５分間インキュベートする。5μlのAF488遮断薬を加え、周囲温度で５分間インキュベートする。抗体溶液は30分間安定である。
種々の抗体溶液を合わせ、TBS-Triton 0.4％でそれらの容量を100μlとする。
【００６４】
フィルターの作製：
フィルターを冷凍庫から取り出し、約15分間周囲温度で維持する。耐熱性粘着テープ(フィルターを特定することも可能となる)を用いてフィルターをスライドに固定する。次いで、フィルターをTBS中で５分間再水和し、次いで排水する。
【００６５】
マスク除去及び免疫標識：
スライドを、ウォーターバスで98℃に昇温されたEDTA 1X pH 9バッファー中に５分間浸漬し、次いでTBS中で２分間及び蒸留水を用いて１分間リンスし、次いで排水する。DakoPen (油性)を用いて、フィルターに(直径8 mmの)スポットを描く。予め水道水に通した吸水紙を用いて湿潤チャンバを作製する。調製した抗体溶液100μlを各スポットに堆積し、次いで各スポットを直径12 mmのラウンドスリップで覆う。全体を湿潤チャンバ中で４℃、暗中にて一晩インキュベートする。
【００６６】
インキュベーション後、湿潤チャンバを周囲温度にて15分間維持し、次いでTBS-Tween (0.05％)中で２分間リンスし、排水し、蒸留水中でリンスし、次いで排水する。
【００６７】
100μlの予め希釈したDAPIマウンティング溶液を各スライドに堆積し、全体を暗中で周囲温度にて15分間インキュベートする。次いで、スライドをTBS-Tween (0.05％)中で２分間リンスし、次いで排水し、次いで蒸留水中でリンスし、排水する。
【００６８】
次いで、スライド及びカバースリップを蛍光マウントにマウントする；暗中で周囲温度にて１時間後、それらを密封し、４℃で保存する。
読取は翌日顕微鏡を用いて行う；CTCを同定し、それらの位置を記録する。
【００６９】
実施例３：FISH技術によるEML4-ALK融合遺伝子の検出アッセイ
このアッセイは、蛍光免疫標識後に行う。
【００７０】
A.  材料の固定
蛍光免疫の結果の分析後、スライド及びカバースリップの系を分解し、フィルターをPBS 1X溶液で洗浄し、メタノール/酢酸(9:1)溶液を用いて２時間周囲温度にて固定する。
【００７１】
B.  スライドに固定したフィルターの処理
10％ペプシンの調製：
三角フラスコ中に1 gを秤量し、10 mlのH2Oにマグネティックスターラーによる撹拌下に溶解させる。十分に溶解したら、三角フラスコを氷中に置く。100μlのアリコートを取り、−20℃で保存する。
0.01N (8 ml HCl 0.1 N + 72 ml H2O)のHCl溶液80 mlをウォーターバス中で37℃に予め昇温する。
＋4℃で保存したスライドを、4xSSCTのバス中で５分間インキュベートする。
【００７２】
１アリコートのペプシンを37℃の0.01 N HClに加える。このペプシン溶液中で、２分毎に撹拌しながら、数分間フィルターをインキュベートする。
固定化溶液としての終濃度１％のホルムアルデヒドを即席に調製する。
得られた溶液は１日間安定である。
【００７３】
スライドをPBS 1Xの容器中で５分間、粘着テープを濡らすことなく、かつ、撹拌することなく洗浄する。次いで、スライドを固定化溶液中に２分間、粘着テープを濡らすことなく浸漬させることによって固定する。次いで、スライドを２分間、70％、85％及び100％エタノールで連続的に、アルコール処理の間にスライドが乾かないように脱水する。スライドの背面を入念に拭き上げ、次いでフィルターを数分間、最大１時間プレート上で37℃にて乾かすか、又は周囲温度にて乾かす。
【００７４】
C.  スライドの変性及びハイブリダイゼーション(D1)
暗中において、密封した箱を37℃の加熱ステージに置く；この箱は、必要な場合のスライドの運搬を可能にする。ハイブリダイゼーション用の装置、すなわち「ハイブリダイザー」の電源を入れ、37℃の温度に達するようにプログラミングする。スライドをハイブリダイザー中の各々の位置に入れる。キャップ上の２つのストリップを水で湿らせ、次いでハイブリダイザーのカバー上に置き、プローブの蒸発を最小化する。スライドを37℃のステージ上に置く。10μlのALKプローブハイブリダイゼーション混合物(Vysis)を各スポット(直径8 mm)に堆積する(7μlのバッファー、2μlの水、1μlのプローブを各スポットに堆積する)。小さなラウンドスリップ (直径12 mm)をスポットに注意深く置く。興味ある区域を周囲に塗られた接着剤で密封し、この区域を完璧に隔離する。37℃で約５分間ステージ上でスライドを放置することによって接着剤を乾燥させる。次いで、プローブの温度が変わらないようにスライドを直ちにハイブリダイザー内に置く。
【００７５】
85℃10分間の変性プログラムを開始し、次いで、44℃で一晩(12時間)44℃で、慣用の方法でハイブリダイゼーションさせる。このハイブリダイゼーションは、44℃に設定したハイブリダイザー又はストーブ中で行うことができる。後者の場合、85℃の工程後に、ステージ上の既に37℃の箱にスライドを非常に素早く置き、次いで予め44℃のストーブ中に置かれた特製の黒色湿潤箱に移す。
37℃に冷却されたときにハイブリダイザーを停止させる。
【００７６】
D.  洗浄及びマウンティング(D2)
ウォーターバスの電源を65℃で入れ、プレートを37℃にする。ウォッシュバッファー1X Dakoを即席に調製する。
【００７７】
次いで、バッファーを予め昇温する。当該温度に達するまで(熱ショックを避けるために)65℃のウォーターバス中に置かれた磁器製の容器(当該温度には約30分後に達する)中にバッファーの半分を入れる。
もう半分のバッファーを周囲温度のスライド用容器中に置く。スライドをハイブリダイザー又はストーブから取り出し、必要な場合には、スライドを光から保護するため、特製の黒色の箱で運搬する。
【００７８】
遮光状態で、ピンセットを用いて、フィルターを傷付けることなく、非常に注意深く接着剤を除去する。ストリンジェントウォッシュバッファー中で周囲温度にて撹拌することなく約７分間スライドを洗浄する。予め65℃に昇温したバッファー中で５分間スライドを洗浄し、次いで、ウォッシュバッファー1X DAKO中で周囲温度にて５分間洗浄する。
【００７９】
スライドを２分間70％、85％及び100％エタノール中で連続的にアルコール処理の間に乾くことがないように脱水する。
スライドの背面を吸水紙で入念に拭き上げ、次いで37℃のプレート上で数分間乾燥させ、スライドとフィルターとの間にアルコールがないことを確認する。
【００８０】
バックグラウンドノイズがある場合には、スライドを70℃で１〜５分間再び洗浄してもよい。
15〜20μlの「antifFad+DAPI」溶液をフィルター上に堆積し、フィルターの表面に数個の滴として分配する。
スライドを22x22又は24x40のカバースリップで覆い、全体をカバースリップの片方の面(スポットの反対側の面)上で密封する。
【００８１】
スライドを加熱ステージ上で37℃にて約５分間乾燥させる。
スライドを黒色の箱内で顕微鏡に移し、x20の倍率を用い、次いで液浸油を用いるx100の倍率で連続的に観察してスポットの位置を決定する。
【００８２】
スライドは、暗中で１週間周囲温度にて又は１年間−20℃で保存することができる。
読取は蛍光顕微鏡又はスキャナを用いて行う。免疫標識中に既に決定した位置からCTCの位置を再び決定する。
【００８３】
実施例４：FISH技術によるHER-2遺伝子の検出アッセイ
このアッセイは、蛍光免疫標識後に行う。
【００８４】
A.  材料の固定
免疫蛍光の結果分析後、スライドとカバースリップの系を分解し、フィルターをPBS 1X溶液中で洗浄し、メタノール/酢酸(9:1)溶液を用いて２時間周囲温度にて固定する。
【００８５】
B.  スライド上に固定されたフィルターの処理
10％ペプシンの調製：
三角フラスコ中に1 gを秤量し、10 mlのH2Oにマグネティックスターラーによる撹拌下で溶解させる。十分に溶解したら、氷中に三角フラスコを置く。100μlのアリコートを取り、それらを−20℃で保存する。
【００８６】
80 mlの0.01N HCl溶液(8 ml HCl 0.1N + 72 ml H2O)を少なくとも30分間37℃のウォーターバス中で予め昇温する。
+4℃で保存したスライドを５分間4xSSCTのバス中で連続的にインキュベートし、カバースリップを分離する。必要な場合には、ピンセットを用いてカバースリップを分離してもよく、マウンティングミディアムを除去し、次いでPBS 1Xのバス中でフィルターをリンスする。
【００８７】
１アリコートのペプシンを37℃の0.01N HClに加え、全体を十分に撹拌する。ペプシン溶液中でフィルターを６分間、２分毎に撹拌しながらインキュベートする。
１％ホルムアルデヒドを含む固定化溶液を即席に調製する。
【００８８】
PBS1xの溶液中でスライドを５分間、粘着テープを濡らすことなく、かつ、撹拌することなく洗浄する。次いで、固定化溶液中に２分間、粘着テープを濡らすことなく浸漬することによってスライドを固定する。次いで、２分間70％、85％及び100％エタノールを用いて連続的に、アルコール処理の間にスライドが乾かないように、スライドを脱水する。スライドの背面を入念に拭き上げ、次いでフィルターを数分間、最大１時間、プレート上で37℃にて乾かすか、又は周囲温度で乾かす。
【００８９】
C.  スライドの変性及びハイブリダイゼーション(D1)
暗中にて、密封された箱を37℃の照射ステージに置く；この箱は、必要な場合にスライドを運搬することを可能にする。
ハイブリダイゼーション用装置、すなわち「ハイブリダイザー」の電源を入れ、37℃の温度に達するようにプログラミングする。ハイブリダイザー内のそれぞれの場所にスライドを入れる。キャップ上の２つのストリップを水で湿らせ、次いでハイブリダイザーのカバー上に再び配置し、プローブの蒸発を最小化する。37℃のステージ上にスライドを置く。6μlのHER-2プローブ(Dako)を各スポット(直径8 mm)に堆積する。
【００９０】
小さなラウンドスリップ (直径12 mm)を注意深くスポットに置く。例えば錐体状のものを用いて、カバースリップの表面から気泡を注意深く押し出す。周囲に塗られた接着剤、例えば「Rubber-cement」を用いて、興味ある区域を密封し、この区域を完璧に隔離する。ステージ上に37℃で約５分間スライドを置くことによって接着剤を確実に乾かし、縁の接着の質が完璧であることを確かめる。次いで、プローブの温度が変わらないように直ちにハイブリダイザー内にスライドを置く。
【００９１】
85℃10分間の変性プログラムを開始し、次いで44℃で一晩(12時間)、44℃でハイブリダイゼーションを起こさせる。このハイブリダイゼーションは、44℃に設定したハイブリダイザー内又はストーブ内で行うことができる。後者の場合、85℃の工程後、ステージ上の既に37℃の箱に非常に素早くスライドを置き、次いで44℃のストーブに予め置かれた特製の黒色湿潤箱に移す。
37℃まで冷却されたときハイブリダイザーを停止させる。
【００９２】
D.  洗浄及びマウンティング (D2)
ウォーターバスの電源を65℃で入れ、プレートを37℃にする。ウォッシュバッファー1X Dakoを即席に調製する。
次いで、バッファーを予め昇温する。当該温度に達するまで(熱ショックを避けるために)65℃のウォーターバスに置かれた磁器製ディッシュ(当該温度には約30分で達する)にバッファーの半分を置く。
【００９３】
もう半分のバッファーを周囲温度のスライド用容器中に置く。ハイブリダイザー又はストーブからスライドを取り出し、必要な場合には、光からスライドを保護するために特製の黒色ディッシュで運搬する。
遮光状態で、ピンセットを用いて、フィルターを傷付けることなく非常に穏やかに接着剤を除去する。ストリンジェントウォッシュバッファー中で周囲温度にて撹拌することなく約７分間スライドを洗浄する。予め65℃に昇温したバッファー中でスライドを５分間洗浄し、次いでウォッシュバッファー1X DAKO中で周囲温度にて５分間洗浄する。
【００９４】
70％、85％及び100％エタノールを用いて連続的に２分間、アルコール処理の間に乾くことがないようにスライドを脱水する。
吸水紙を用いてスライドの背面を入念に拭き上げ、次いで37℃のプレート上で数分間乾かし、スライドとフィルターとの間にアルコールがないことを確認する。
バックグラウンドノイズがある場合には、スライドを70℃で１〜５分間再洗浄してもよい。
【００９５】
カバースリップの面積に依存して、10〜15μLの「antifFad+DAPI」溶液をフィルター上に堆積させ、フィルターの表面に数個の滴として分配する。
22x22又は24x40のカバースリップを用いてスライドを覆い、全体をカバースリップの片方の面(スポットの反対側の面)上で密封する。
加熱ステージ上で、37℃で約５分間スライドを乾かす。
【００９６】
スライドを黒色ディッシュ中で顕微鏡に運び、x20の倍率を用い、次いで液浸油を用いるx100の倍率で連続的に観察してスポットの位置を決定する。
スライドは、暗中にて周囲温度で１週間又は−20℃で１年間保存することができる。
読取は、蛍光顕微鏡又はスキャナを用いて行われる。免疫標識中に既に決定した位置からCTCの位置を再び決定する。
【００９７】
実施例５：FISH技術によってc-TEM遺伝子を検出するためのアッセイ
c-TEMに特異的なプローブを用いて、実施例４に記載したことと同様にしてFISH技術を行う。
【００９８】
実施例６：FISH技術によってERG遺伝子を検出するためのアッセイ
Ergに特異的なプローブを用いて、実施例４に記載したことと同様にしてFISH技術を行う。
【００９９】
参照文献
A. Lecharpentierら、「転移性非小細胞肺癌患者におけるハイブリッド(上皮/間葉)表現型を有する循環腫瘍細胞の検出」 British Journal of Cancer, 2011, 1-4.
【図１Ａ】
2014533828.tif 000002
【図１Ｂ】
2014533828.tif 000003
【図１Ｃ】
2014533828.tif 000004
【図２Ａ】
2014533828.tif 000005
【図２Ｂ】
2014533828.tif 000006
【図２Ｃ】
2014533828.tif 000007
【図６−Ａ】
2014533828.tif 000008
【図６−Ｂ】
2014533828.tif 000009
【図６−Ｃ】
2014533828.tif 000010
【図３】
2014533828.tif 000011
【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５】
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【図７】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【図９−Ａ】
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【図９−Ｂ】
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【図９−Ｃ】
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【国際調査報告】
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