(57)【要約】  本発明は、インフルエンザ菌のタンパク質EおよびピリンAを含む組成物に関する。より特には、本発明は、タンパク質EおよびPilAを含む融合タンパク質および免疫原性組成物、そのような免疫原性組成物を含むワクチンならびにその治療的使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p(式I)
[式中、
XはシグナルペプチドまたはMHHHHHH(配列番号2)であり；
mは0または1であり；
R1はアミノ酸であり；
nは0、1、2、3、4、5または6であり；
Aはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌に由来するPilAもしくはその免疫原性断片であり；
YはGG、SG、SS、GGGおよび(G)h(式中、hは4、5、6、7、8、9または10である)からなる群より選択され；
oは0または1であり；
Bはインフルエンザ菌に由来するPilAもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eもしくはその免疫原性断片であり；
ZはGGHHHHHH(配列番号3)であり；および
pは0または1である]
の融合タンパク質。
【請求項２】
XがFlgI、NadAおよびpelBからなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
mが0である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
nが0である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Aがタンパク質Eの免疫原性断片であり、タンパク質Eが配列番号4〜配列番号57のいずれか１つから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Aが配列番号124に記載のインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
YがGGである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
BがPilAの免疫原性断片であり、PilAが配列番号58〜配列番号121のいずれか1つから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Bが配列番号127に記載のインフルエンザ菌に由来するPilAの免疫原性断片である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202および配列番号204からなる群より選択される融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202または配列番号204のいずれかと約95%同一である融合タンパク質。
【請求項１２】
シグナルペプチドが除去された、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
シグナルペプチドが除去された配列番号148の融合タンパク質であって、配列番号177
2014512365.tif 000044
である、前記融合タンパク質。
【請求項１４】
シグナルペプチドが除去された配列番号194の融合タンパク質であって、配列番号219
2014512365.tif 000045
2014512365.tif 000046
である、前記融合タンパク質。
【請求項１５】
インフルエンザ菌に由来するタンパク質Eとインフルエンザ菌に由来するPilAとを含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
タンパク質Eが、配列番号4のポリペプチド、全長にわたって配列番号4に対して少なくとも75%、77%、80%、85%、90%、95%、97%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含むポリペプチド、または配列番号4の少なくとも7、10、15、20、25、30もしくは50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫原性断片が配列番号4のBおよび/またはT細胞エピトープを含む、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
タンパク質Eが、配列番号4を認識する免疫応答を惹起することができる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
PilAが、配列番号58のポリペプチド、全長にわたって配列番号58に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、97%もしくは100%の同一性を有する配列を含むポリペプチド、または配列番号58の少なくとも7、10、15、20、25、30もしくは50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
免疫原性断片が配列番号58のBおよび/またはT細胞エピトープを含む、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
PilAが配列番号58を認識する免疫応答を惹起することができる、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
インフルエンザ菌に由来するタンパク質Eおよびインフルエンザ菌に由来するPilAが請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質として含まれる、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
配列番号177
2014512365.tif 000047
の融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２４】
配列番号219
2014512365.tif 000048
の融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項２６】
治療上有効量の請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物または請求項２５に記載のワクチンを、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における中耳炎の治療または予防のための方法。
【請求項２７】
治療上有効量の請求項２３または２４に記載の免疫原性組成物を、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における中耳炎の治療または予防のための方法。
【請求項２８】
治療上有効量の請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物または請求項２５に記載のワクチンを、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における慢性閉塞性肺疾患の急性増悪(AECOPD)の治療または予防のための方法。
【請求項２９】
治療上有効量の請求項２３または２４に記載の免疫原性組成物を、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における慢性閉塞性肺疾患の急性増悪(AECOPD)の治療または予防のための方法。
【請求項３０】
治療上有効量の請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物または請求項２５に記載のワクチンを、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における肺炎の治療または予防のための方法。
【請求項３１】
治療上有効量の請求項２３または２４に記載の免疫原性組成物を、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における肺炎の治療または予防のための方法。
【請求項３２】
治療上有効量の請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物または請求項２５に記載のワクチンを、治療または予防を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体におけるインフルエンザ菌の感染または疾患の治療または予防のための方法。
【請求項３３】
治療上有効量の請求項２３または２４に記載の免疫原性組成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体におけるインフルエンザ菌の感染または疾患の治療のための方法。
【請求項３４】
インフルエンザ菌の感染または疾患がNTHi感染または疾患である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
中耳炎の治療または予防における使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または請求項２５に記載のワクチン。
【請求項３６】
慢性閉塞性肺疾患の急性増悪(AECOPD)の治療または予防における使用のための、請求項１〜２５及び３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、免疫原性組成物、またはワクチン。
【請求項３７】
肺炎の治療または予防における使用のための、請求項１〜２５及び３５〜３６のいずれか１項に記載の融合タンパク質、免疫原性組成物、またはワクチン。
【請求項３８】
インフルエンザ菌の感染または疾患の治療または予防における使用のための、請求項１〜２５及び３５〜３７のいずれか１項に記載の融合タンパク質、免疫原性組成物、またはワクチン。
【請求項３９】
NTHi感染または疾患の治療または予防における使用のための、請求項３８に記載の融合タンパク質、免疫原性組成物、またはワクチン。
【請求項４０】
シグナルペプチドを含有するタンパク質の発現を誘導することを含む、融合タンパク質のペリプラズム発現をもたらすための方法。
【請求項４１】
シグナルペプチドがFlgIに由来する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
シグナルペプチドがpelBに由来する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
融合タンパク質が式(I)の融合タンパク質または請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質である、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法を含むワクチンを作製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2011年4月13日に出願された米国特許出願第61/474779号および2011年9月13日に出願された米国特許出願第61/534012号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae：H.influenzae)タンパク質E(Protein E)およびピリンA(Pilin A)を含む組成物に関する。より具体的には、本出願は、タンパク質EおよびピリンAを含む融合タンパク質および免疫原性組成物、そのような免疫原性組成物を含むワクチンならびにその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質E(PE)は、接着特性を有する外膜リポタンパク質である。それは分類不能型インフルエンザ菌(NTHi)の上皮細胞への接着/侵襲において役割を果たしている(J.Immunology 183: 2593-2601(2009); The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes and Infection 10:87-96 (2008))。それは莢膜型インフルエンザ菌と分類不能型インフルエンザ菌の両方で高度に保存されており、保存された上皮結合ドメインを有する(The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010))。参照株としてのインフルエンザ菌Rdと比較した場合、異なるヘモフィルス種において13個の異なる点突然変異が記載されている。その発現は対数増殖期および定常期の細菌の両方で観察される(WO2007/084053)。
【０００４】
タンパク質Eは、ビトロネクチンへの結合を介してヒト補体耐性にも関与する(Immunology 183: 2593-2601 (2009))。PEは、結合ドメインPKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR(配列番号4のアミノ酸84〜108に対応する、配列番号1)により、終末補体経路の重要な阻害因子であるビトロネクチンに結合する(J. Immunology 183:2593-2601 (2009))。
【０００５】
ピリンA(PilA)は、同様に単収縮運動(twitching motility)に関与するインフルエンザ菌IV型線毛(Tfp)の主要なピリンサブユニットである(Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005))。NTHi PilAはin vivoで発現される保存された付着因子である。それはNTHi接着、定着およびバイオフィルム形成に関与することが示されている(Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007))。
【０００６】
分類不能型インフルエンザ菌は、幼児および小児において中耳炎を引き起こす重要かつ一般的な呼吸器病原体である。NTHiは、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に次いで、小児における急性中耳炎の最も一般的な原因である(J. Immunology 183: 2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004))。それは小児および成人における副鼻腔炎の重要な原因である(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。それは、成人における慢性閉塞性肺疾患(COPD)の高い増悪リスクと関連している(Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006))。さらに、分類不能型インフルエンザ菌は、成人においては市中感染型肺炎を引き起こし、発展途上国の小児においては肺炎を引き起こし得る(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。
【０００７】
NTHiのためのワクチンの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
第一の態様として、本発明は、式(I)：
(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p(式I)
(式中、
XはシグナルペプチドまたはMHHHHHH(配列番号2)であり；
mは0または1であり；
R1はアミノ酸であり；
nは0、1、2、3、4、5または6であり；
Aはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌に由来するPilAもしくはその免疫原性断片であり；
YはGG、SG、SS、GGGおよび(G)h(式中、hは4、5、6、7、8、9または10である)からなる群より選択され；
oは0または1であり；
Bはインフルエンザ菌に由来するPilAもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eもしくはその免疫原性断片であり；
ZはGGHHHHHH(配列番号3)であり；および
pは0または1である)
の融合タンパク質を提供する。
【０００９】
第二の態様として、本発明は、式(I)の融合タンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。この組成物は、製薬上許容し得るアジュバントをさらに含んでもよい。この組成物は、賦形剤を含んでもよい。
【００１０】
第三の態様において、本発明は、インフルエンザ菌により全体的または部分的に引き起こされる症状または疾患の治療または予防のための方法を提供する。この方法は、治療上有効量の式(I)の融合タンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００１１】
第四の態様において、本発明は、中耳炎の治療または予防のための方法を提供する。この方法は、治療上有効量の式(I)の融合タンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００１２】
第五の態様において、本発明は、慢性閉塞性肺疾患の増悪の治療または予防のための方法を提供する。この方法は、治療上有効量の式(I)の融合タンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００１３】
第六の態様において、本発明は、肺炎の治療または予防のための方法を提供する。この方法は、治療上有効量の式(I)の融合タンパク質を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００１４】
第七の態様において、本発明は、インフルエンザ菌により全体的または部分的に引き起こされる症状または疾患の治療または予防における使用のための式(I)の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、製薬上許容し得るアジュバントをさらに含んでもよい。
【００１５】
第八の態様において、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００１６】
第九の態様において、本発明は、本発明の核酸を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、以下の特定の実施形態の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】融合タンパク質構築物LVL291、LVL268およびLVL269に関する誘導細菌抽出物のSDS-PAGEである。不溶性画分(I)、可溶性画分(S)および培養培地画分(M)を、誘導(ind)の前後にLVL291、LVL268およびLVL269についてロードした。
【図２】融合タンパク質構築物LVL291、LVL268およびLVL269に関する精製抽出物に関するSDS-PAGEおよびウェスタンブロットである。流出液画分(Ft)、洗浄画分(W)および溶出画分(E)を、LVL291、LVL268およびLVL269の精製のためにロードした。抗hisタグを用いて抽出物を精査した。
【図３】融合タンパク質構築物LVL291およびLVL315に関する誘導細菌抽出物および精製抽出物のSDS-PAGEである。培養培地画分(M)、可溶性画分(Sol)、不溶性画分(Ins)、流出液画分(Ft)、洗浄画分#1(W1)、洗浄画分#2(W2)および溶出画分(E)を、LVL291およびLVL315についてロードした。
【図４】融合タンパク質構築物LVL312に関する誘導細菌抽出物および精製抽出物のSDS-PAGEである。培養培地画分(M)、可溶性画分(Sol)、不溶性画分(Ins)、流出液画分(Ft)、洗浄画分#1(W1)、洗浄画分#2(W2)および溶出画分(E)を、LVL312についてロードした。
【図５】融合タンパク質構築物LVL317に関する誘導(1mMおよび10μMのIPTG)細菌抽出物のSDS-PAGEである。誘導の前(NI)および後(In)に由来する抽出物、可溶性画分(S)、不溶性画分(I)。
【図６】融合タンパク質構築物LVL318に関する誘導(1mMおよび10μMのIPTG)細菌抽出物のSDS-PAGEである。誘導の前(NI)および後(In)に由来する抽出物、培養培地画分(M)、可溶性画分(S)、不溶性画分(I)。
【図７】PE、PilAおよびPE-PilA融合タンパク質のCDスペクトルである。
【図８】PEおよびPilAのCDスペクトルの組合せである。
【図９】PilAの熱変性曲線である。
【図１０】PEの変性曲線である。
【図１１】PE-PilA融合タンパク質の熱変性曲線である。
【図１２】典型的なSP Sepharose(商標)Fast Flowクロマトグラムである。
【図１３】典型的なQ Sepharose(商標)Fast Flowクロマトグラムである。
【図１４】PE-PilA融合タンパク質の精製プロセスからの製造過程のサンプルのSDS-PAGEである。
【図１５】PE-PilA融合タンパク質からの精製プロセスの製造過程のサンプルのウェスタンブロットである。ウサギポリクローナル抗PEを用いるブロットである。
【図１６】PE-PilA融合タンパク質からの精製プロセスの製造過程のサンプルのウェスタンブロットである。ウサギモノクローナル抗大腸菌(BLR)を用いるブロットである。
【図１７】PE-PilA融合タンパク質ならびにPEおよびPilAタンパク質の熱転移である。曲線：PilA(1)、タンパク質E(Prot E、PE)(2)、希釈しないPE-PilA精製バルク、737μg/ml(3)、および最終容器濃度60μg/mlに希釈されたPE-PilA精製バルク(4)。
【図１８】Balb/cマウスモデルにおけるLVL291 PE-PilA融合タンパク質ならびに一価PEおよびPilAに対する抗体応答である。
【図１９】マウス鼻咽頭におけるNTHi株86−028NP細菌クリアランスに対するPE-PilA融合タンパク質ワクチン接種の効果である。
【図２０】マウス鼻咽頭におけるNTHi株3224A細菌クリアランスに対するPE-PilA融合タンパク質ワクチン接種の効果である。
【図２１】マウス鼻咽頭における細菌クリアランスに対するPilAワクチン接種の効果である。
【図２２】マウス鼻咽頭における細菌クリアランスに対するPEワクチン接種の効果である。
【図２３】(a)ビトロネクチンに結合するLVL317 PE-PilA融合タンパク質および(b)ビトロネクチンに結合したLVL317およびLVL735 PE-PilA融合タンパク質である。
【図２４】PE-PilA融合タンパク質に対するポリクローナル抗体によるビトロネクチン結合の阻害である。
【図２５−１】融合タンパク質構築物LVL291、LVL702、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739、LVL740およびpET26bベクター(陰性対照)に関する誘導細菌抽出物の可溶性画分のSDS-PAGEである。(a)実験1、(b)実験2、(c)実験3。PE-PilA融合タンパク質を矢印で示す。
【図２５−２】図２５−１の続きである。
【図２５−３】図２５−２の続きである。
【図２６】実験1、2および3からの可溶性画分中の融合タンパク質の平均バンド％である。
【図２７】LVL317およびLVL735に対するPEおよびPilA抗体応答である。
【図２８】分類不能型インフルエンザ菌鼻咽頭定着のマウスモデルにおける細菌クリアランスに対するLVL735およびLVL317ワクチン接種の効果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で別途説明するか、または定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、分子生物学における一般的用語の定義を、Benjamin Lewin, Genes V、Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)により発行; Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.により発行、1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.により発行、1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。
【００２０】
単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に別途指摘しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または(or)」は、文脈が明確に別途指摘しない限り、「および(and)」を含むことが意図される。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して与えられる数値的限界は近似値であってよい。かくして、濃度が(例えば)約200pgであると示される場合、その濃度は200pgよりもわずかに大きいか、またはわずかに小さい(「約」または「〜」）値を含むことが意図される。
【００２１】
本明細書に記載のものと類似するか、または等価である方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。
【００２２】
用語「含む(comprise)」は「含む(include)」を意味する。かくして、文脈が別途必要としない限り、単語「含む(comprises)」および「含む(comprise)」および「含む(comprising)」などの変形は、その任意の他の化合物、組成物、ステップ、または群の排除だけでなく、記述される化合物もしくは組成物(例えば、核酸、ポリペプチド、抗原)またはステップ、または化合物もしくはステップの群の含有を暗示することが理解される。省略形「例えば(e.g.)」は、ラテン語の「exempli gratia」に由来するものであり、本明細書では非限定例を示すために用いられる。かくして、省略形「例えば(e.g.)」は、用語「例えば(for example)」と同義である。
【００２３】
本開示の様々な実施形態の精査を容易にするために、以下の用語説明が提供される。さらなる用語および説明は本開示の文脈中に提供される。
【００２４】
本明細書で用いられる「被験体」は、ヒト、非ヒト霊長類、ならびにげっ歯動物属のメンバー(限定されるものではないが、マウスおよびラットなど)およびウサギ目のメンバー(限定されるものではないが、ウサギなど)などの非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物である。
【００２５】
本明細書で用いられる「タンパク質E(Protein E)」、「タンパク質E(protein E)」、「Prot E」および「PE」は、インフルエンザ菌に由来するタンパク質Eを意味する。タンパク質Eは、配列番号4のアミノ酸配列(MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK)ならびに配列番号4の全長にわたって、少なくともまたは正確に75%、77%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する配列からなるか、またはそれを含んでもよい。インフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの53個の配列の比較(表1、配列番号5〜配列番号57)は、配列番号4に記載のタンパク質Eと約77%〜約100%の同一性を示した。例えば、タンパク質Eのアミノ酸配列において、アミノ酸#20は、イソロイシン(I)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#23はアラニン(A)またはバリン(V)であってよい；アミノ酸#24はリシン(K)またはグルタミン酸(E)であってよい；アミノ酸#31はアラニン(A)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#32はプロリン(P)またはアラニン(A)であってよい；アミノ酸#34はトレオニン(T)またはアラニン(A)であってよい；アミノ酸#37はアルギニン(R)またはグルタミン(Q)であってよい；アミノ酸#47はバリン(V)またはアラニン(A)であってよい。アミノ酸#57はトリプトファン(W)であるか、または存在しなくてもよい(-)；アミノ酸#70はアラニン(A)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#93はグルタミン(Q)であるか、または存在しなくてもよい(-)；アミノ酸#109はトレオニン(T)またはイソロイシン(I)であってよい；アミノ酸#119はグリシン(G)またはセリン(S)であってよい；アミノ酸#153はグルタミン酸(E)またはリシン(K)であってよい；アミノ酸#156はセリン(S)またはロイシン(L)であってよい；アミノ酸#160はリシン(K)またはアスパラギン(N)であってよい；アミノ酸#161はリシン(K)、イソロイシン(I)であるか、または存在しなくてもよい(-)；アミノ酸#162〜#195は存在しないか、または配列番号15に記載の通りである((-)はアミノ酸#166が存在しないことを示す)か、または配列番号16に記載の通りであってよい；またはその任意の組合せであってよい。
【００２６】
タンパク質Eは、アミノ酸#20、アミノ酸#23、アミノ酸#24、アミノ酸#31、アミノ酸#32、アミノ酸#34、アミノ酸#37、アミノ酸#47、アミノ酸#57、アミノ酸#70、アミノ酸#93、アミノ酸#109、アミノ酸#119、アミノ酸#153、アミノ酸#156、アミノ酸#160、アミノ酸#161およびアミノ酸#162〜#195からなる群より選択される任意の1個以上のアミノ酸で配列番号4と異なるアミノ酸配列からなるか、またはそれを含んでもよく、ここでアミノ酸#20はトレオニン(T)であり；アミノ酸#23はバリン(V)であり；アミノ酸#24はリシン(K)であり；アミノ酸#31はトレオニン(T)であり；アミノ酸#32はアラニン(A)であり；アミノ酸#34はアラニン(A)であり；アミノ酸#37はグルタミン(Q)であり；アミノ酸#47はアラニン(A)であり；アミノ酸#57は存在せず(-)；アミノ酸#70はトレオニン(T)であり；アミノ酸#93は存在せず(-)；アミノ酸#109はイソロイシン(I)であり；アミノ酸#119はセリン(S)であり；アミノ酸#153はリシン(K)であり；アミノ酸#156はロイシン(L)であり；アミノ酸#160はアスパラギン(N)であり；アミノ酸#161はリシン(K)もしくはイソロイシン(I)であり；またはアミノ酸#162〜#195は配列番号15に記載の通りである((-)はアミノ酸#166が存在しないことを示す)か、もしくは配列番号16に記載の通りである。
【表１】
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【００２７】
タンパク質Eは、インフルエンザ菌株3224A、RdKW20、86-028NP、R2846、R2866、3655、PittAA、PittEE、PittHH、PittII、R3021、22.4-21、3219C、3185、3241A、038144S1、810956、821246、840645、902550Z19、A840177、A860514、A950014、306543X4、A930105、901905U、A920030、3221B、27W116791N、N218、N163、N162、N107、N91、D211PG、D211PD、D201PG、D201PD、D198PG、D198PD、D195PD、D189PG、D189PD、D129CG、D124PG、D124PD、D58PG、D33OD、BS433、BS432、1714、1128またはBS430に由来するタンパク質Eであってもよい。タンパク質Eは、配列番号5〜配列番号57のいずれかに記載のタンパク質Eであってもよい。
【００２８】
タンパク質Eは、配列番号4〜配列番号57のいずれかに対して、全長にわたって、少なくとも95%の同一性を有する配列であってよい。タンパク質Eは、表1に記載の配列、配列番号5〜配列番号57のいずれかに対して、全長にわたって、少なくとも95%の同一性を有する配列であってよい。
【００２９】
タンパク質Eの免疫原性断片は、配列番号4の少なくとも7、10、15、20、25、30または50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含む。免疫原性断片は、配列番号4に結合することができる抗体を惹起してもよい。
【００３０】
タンパク質Eの免疫原性断片は、配列番号4〜配列番号57のいずれかの少なくとも7、10、15、20、25、30または50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含んでもよい。この免疫原性断片は、該断片が誘導される完全長配列に結合することができる抗体を惹起してもよい。
【００３１】
タンパク質Eの免疫原性断片は、配列番号5〜配列番号57のいずれかの少なくとも7、10、15、20、25、30または50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含んでもよい。この免疫原性断片は、該断片が誘導される完全長配列に結合することができる抗体を惹起してもよい。
【００３２】
本明細書で用いられる「PilA」は、インフルエンザ菌に由来するピリンAを意味する。PilAは、配列番号58(MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ)のタンパク質配列ならびに配列番号58に対して80%〜100%の同一性を有する配列からなるか、またはそれを含んでもよい。例えば、PilAは、配列番号58と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または100%同一であってよい。インフルエンザ菌に由来するPilAの64個の配列の全長比較(表2、配列番号58〜配列番号121)は、配列番号58に記載のPilAに対する約80%〜100%の同一性を示した。例えば、PilAのアミノ酸配列において、アミノ酸#6はグルタミン(Q)またはロイシン(L)であってよい；アミノ酸#7はグルタミン(Q)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#37はグルタミン(Q)またはリシン(K)であってよい；アミノ酸#44はアラニン(A)またはセリン(S)であってよい；アミノ酸#57はアラニン(A)またはセリン(S)であってよい；アミノ酸#67はアスパラギン(N)またはグリシン(G)であってよい；アミノ酸#68はグルタミン酸(E)またはリシン(K)であってよい；アミノ酸#69はトレオニン(T)またはプロリン(P)であってよい；アミノ酸#71はリシン(K)、アスパラギン(N)、セリン(S)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#73はトレオニン(T)、セリン(S)またはメチオニン(M)であってよい；アミノ酸#76はリシン(K)、セリン(S)またはアスパラギン(N)であってよい；アミノ酸#84はトレオニン(T)またはリシン(K)であってよい；アミノ酸#86はアラニン(A)またはバリン(V)であってよい；アミノ酸#91はリシン(K)またはアラニン(A)であってよい；アミノ酸#94はトレオニン(T)、イソロイシン(I)またはリシン(K)であってよい；アミノ酸#96はセリン(S)またはグルタミン(Q)であってよい；アミノ酸#97はアスパラギン(N)またはセリン(S)であってよい；アミノ酸#99はアラニン(A)またはグリシン(G)であってよい；アミノ酸#103はアラニン(A)またはリシン(K)であってよい；アミノ酸#109はアスパラギン酸(D)、アラニン(A)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#110はグリシン(G)、アスパラギン(N)、またはアルギニン(R)であってよい；アミノ酸#112はセリン(S)またはグルタミン酸(E)であってよい；アミノ酸#114はトレオニン(T)またはイソロイシン(I)であってよい；アミノ酸#116はトレオニン(T)またはグルタミン(Q)であってよい；アミノ酸#118はグルタミン酸(E)、トレオニン(T)、アラニン(A)、リシン(K)またはセリン(S)であってよい；アミノ酸#121はセリン(S)またはアラニン(A)であってよい；アミノ酸#122はアラニン(A)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#123はリシン(K)、トレオニン(T)またはアラニン(A)であってよい；アミノ酸#128はリシン(K)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#135はアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)であってよい；アミノ酸#136はアラニン(A)またはトレオニン(T)であってよい；アミノ酸#145はグリシン(G)またはアルギニン(R)であってよい；アミノ酸#149はグルタミン(Q)またはリシン(K)であってよい；またはその任意の組合せであってよい。
【００３３】
PilAは、アミノ酸#6、アミノ酸#7、アミノ酸#37、アミノ酸#44、アミノ酸#57、アミノ酸#67、アミノ酸#68、アミノ酸#69、アミノ酸#71、アミノ酸#73、アミノ酸#76、アミノ酸#84、アミノ酸#86、アミノ酸#91、アミノ酸#94、アミノ酸#96、アミノ酸#97、アミノ酸#99、アミノ酸#103、アミノ酸#109、アミノ酸#110、アミノ酸#112、アミノ酸#114、アミノ酸#116、アミノ酸#118、アミノ酸#121、アミノ酸#122、アミノ酸#123、アミノ酸#128、アミノ酸#135、アミノ酸#136、アミノ酸#145およびアミノ酸#149からなる群より選択される任意の1個以上のアミノ酸で配列番号58と異なるアミノ酸配列からなるか、またはそれを含んでもよく、ここでアミノ酸#6はロイシン(L)であり;アミノ酸#7はトレオニン(T)であり;アミノ酸#37はリシン(K)であり;アミノ酸#44はセリン(S)であり;アミノ酸#57はセリン(S)であり;アミノ酸#67はグリシン(G)であり;アミノ酸#68はリシン(K)であり;アミノ酸#69はプロリン(P)であり;アミノ酸#71はリシン(K)、セリン(S)またはトレオニン(T)であり;アミノ酸#73はセリン(S)またはメチオニン(M)であり;アミノ酸#76はセリン(S)またはアスパラギン(N)であり;アミノ酸#84はリシン(K)であり;アミノ酸#86はバリン(V)であり;アミノ酸#91はアラニン(A)であり;アミノ酸#94はイソロイシン(I)またはリシン(K)であり;アミノ酸#96はグルタミン(Q)であり;アミノ酸#97はセリン(S)であり;アミノ酸#99はグリシン(G)であり;アミノ酸#103はアラニン(A)であり;アミノ酸#109はアスパラギン酸(D)またはトレオニン(T)であり;アミノ酸#110はグリシン(G)またはアルギニン(R)であり;アミノ酸#112はセリン(S)であり;アミノ酸#114はトレオニン(T)であり;アミノ酸#116はトレオニン(T)であり;アミノ酸#118はグルタミン酸(E)、アラニン(A)、リシン(K)またはセリン(S)であり;アミノ酸#121はセリン(S)であり;アミノ酸#122はトレオニン(T)であり;アミノ酸#123はリシン(K)またはアラニン(A)であり;アミノ酸#128はリシン(K)であり;アミノ酸#135はグルタミン酸(E)であり;アミノ酸#136はトレオニン(T)であり;アミノ酸#145はアルギニン(R)であり;アミノ酸#149はリシン(K)である。
【表２】
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【００３４】
PilAはインフルエンザ菌株NTHi3219C、NTHi3224A、NTHi12、NTHi44、NTHi67、1054MEE、1729MEE、1728MEE、1885MEE、1060MEE、RdKW20、214NP、1236MEE、1714MEE、1128MEE、86-028NP、R2846、R2866、3655、PittAA、PittGG、PittII、R3021、22.4-21、3185A、3221B、3241A、038144S1、821246、840645、902550Z19、A840177、A920030、A950014、901905U、A920029、A930105、306543X4、N218、N163、N162、N120、N107、N92、N91、D219PG、D211PG、D211PD、D204CD、D198PG、D198PD、D195PD、D195CD、D189PG、D189PD、D124PG、D124PD、D124CG、D58PG、BS433、BS432、BS430、1714または1128に由来するPilAであってよい。インフルエンザ菌株D204CDに由来するPilAのアミノ酸配列は配列番号106に記載されており、ここで位置#116のXはグルタミン(Q)またはロイシン(L)であり；位置#116のアミノ酸に関する曖昧性はアミノ酸#116をコードする第2のヌクレオチドの技術的解決によって除去し、D204CD株のPilA配列を解明することができる。PilAは、配列番号58〜配列番号121のいずれかに記載のPilAであってよい。
【００３５】
PilAは、配列番号58〜配列番号121(表2に記載)のいずれかに対して、全長にわたって、少なくとも95%の同一性を有する配列であってよい。
【００３６】
PilAの免疫原性断片は、配列番号58〜配列番号121の少なくとも7、10、15、20、25、30または50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含む。この免疫原性断片は、断片が誘導される完全長配列に結合することができる抗体を惹起してもよい。
【００３７】
例えば、PilAの免疫原性断片は、配列番号58の少なくとも7、10、15、20、25、30または50個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含む。この免疫原性断片は、配列番号58に結合することができる抗体を惹起してもよい。
【００３８】
ポリペプチド間の同一性は様々なアルゴリズムにより算出することができる。例えば、EMBOSSパッケージからのNeedleプログラム(フリーソフトウェア；EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277)およびGCG(登録商標)パッケージからのGapプログラム(Accelrys Inc.)を用いることができる。このGapプログラムは、Needleman, S. B.およびWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453に記載のNeedleman-Wunschアルゴリズムの実施である。BLOSUM62スコアリングマトリックスが用いられ、ギャップオープンおよび伸長ペナルティはそれぞれ8および2であった。
【００３９】
コンピュータ計算されたアラインメントを見ると、2つの比較される配列間の同一の残基を観察することができる。同一性の百分率を、(1)同一性の数をアラインメントの長さで割り、100を掛けて算出すること(例えば、Needleプログラム分析のため)、(2)同一性の数を最長の配列の長さで割り、100を掛けて算出すること、(3)同一性の数を最短の配列の長さで割り、100を掛けて算出すること、または(4)同一性の数を整列された残基の数で割り、100を掛けて算出すること(残基が別の残基の前にある場合、残基を整列させる)(例えば、Gapプログラム分析のため)により計算することができる。
【００４０】
本明細書で用いられる「アジュバント」は、ワクチン、免疫治療剤、または他の抗原もしくは免疫原を含有する組成物と共に被験体に投与された場合、投与された抗原または免疫原に対する被験体の免疫応答を増加させるか、または増強する(アジュバントの非存在下で得られる免疫応答と比較して)化合物または物質を意味する。これは、癌が再発するリスクを低下させるために、一次治療の後に与えられる追加治療としての癌治療の意味においてNational Cancer Institute of the United States Institutes of Healthにより定義された「アジュバント療法」とは区別されるべきである。
【００４１】
保存的置換は周知であり、一般的には、配列アラインメントコンピュータプログラムにおけるデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムとしては、PAM250 (Dayhoft M.O.ら(1978)、「A model of evolutionary changes in proteins」、「Atlas of Protein sequence and structure」5(3) M.O. Dayhoft (編), 345-352)、National Biomedical Research Foundation, Washington、およびBlosum 62 (Steven HenikoftおよびJorja G. Henikoft (1992)、「Amino acid substitution matrices from protein blocks」)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919が挙げられる。本発明は、保存的アミノ酸置換を含有する式(I)の融合タンパク質をさらに提供する。例えば、式(I)の融合タンパク質は、本明細書に記載の配列のいずれかに記載されるインフルエンザ菌のPEまたはPilAに由来する任意のアミノ酸の保存的置換を含有してもよい(例えば、配列番号4〜配列番号57に記載の任意のPE配列および/または配列番号58〜配列番号121に記載の任意のPilA配列)。
【００４２】
本明細書で用いられる「シグナルペプチド」とは、前駆体タンパク質上に(典型的には、N末端に)存在し、典型的には、成熟タンパク質には存在しない、短い(60アミノ酸未満、例えば、3〜60アミノ酸)ポリペプチドを指す。シグナルペプチド(sp)は、典型的には、疎水性アミノ酸に富む。シグナルペプチドは膜を介する翻訳されたタンパク質の輸送および/または分泌を指令する。シグナルペプチドは、標的化シグナル、移行ペプチド、局在化シグナル、またはシグナル配列とも呼ばれる。例えば、シグナル配列は、同時翻訳または翻訳後シグナルペプチドであってよい。
【００４３】
異種シグナルペプチドを、タンパク質の輸送または分泌の間または後にシグナルペプチドペプチダーゼによって融合タンパク質構築物から切断することができる。例えば、シグナルペプチドペプチダーゼは、シグナルペプチドペプチダーゼIである。「異種」シグナルペプチドは、それが天然に存在する場合、タンパク質と会合しないものである。
【００４４】
本明細書で用いられる「治療」とは、被験体における症状または疾患の兆候の発生の防止、被験体における症状または疾患の兆候の再発の防止、被験体における症状または疾患の兆候の再発の遅延、被験体における症状または疾患の兆候の重篤度または頻度の低下、症状の進行の遅延または除去および被験体における疾患または症状の兆候の部分的または全体的除去を意味する。
【００４５】
本明細書で用いられる「必要に応じて」とは、その後に記載される事象が起こっても、または起こらなくてもよいことを意味し、起こる事象と起こらない事象の両方を含む。
【００４６】
NTHiにより引き起こされる疾患の発症は、鼻咽頭での定着から始まる。鼻咽頭微小環境に付着し、その中での長期滞留を維持する機構は、NTHiにとって「ビルレンス決定因子」であると考えられる(Vaccine 28: 279-289(2010))。
【００４７】
ヒト宿主の粘膜上皮表面に付着することができるNTHiの重要性は、NTHiにより発現される複数の付着因子に反映される。例えば、いくつかのNTHiは線毛を発現する。他の付着構造は、自己輸送ファミリーのタンパク質に属する；これらのものとしては、Hap、HMW1/HMW2およびHia/Hsfタンパク質が挙げられる。さらなる外膜タンパク質、例えば、P2タンパク質、P5タンパク質およびOapAが、インフルエンザ菌のための付着因子として記載されている(Cellular Microbiology 4:191-200 (2002)、Microbes and Infection 10: 87-96 (2008)、Vaccine 28: 279-289 (2010))。
【００４８】
中耳炎は、3歳未満の全ての小児の80%における主な死因である(Expert Rev. Vaccines 5:517-534 (2006))。90%を超える小児が、7歳より前に中耳炎を発症する(Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003))。2000年に、米国において中耳炎のために1600万人が開業医を訪れ、約1300万人が抗菌剤の処方を受けた(Pediatrics 113:1451-1465 (2004))。欧州各国では、報告された急性中耳炎の比率は小児1歳あたり0.125〜1.24である(Expert Review of Vaccines 8:1479-1500 (2009))。中耳炎は費用のかかる感染であり、小児が抗生物質を受ける最も一般的な理由である(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。細菌は、急性中耳炎の原因の約70%を占め、肺炎連鎖球菌、分類不能型インフルエンザ菌、およびモラクセラ・カタラリス(Moraxella catarrhalis)が原因因子として主流である(Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006))。一部の小児は再発および慢性中耳炎を経験し、これらの耳炎に罹りやすい小児は難聴と関連し、言語発達が遅延する長期中耳滲出液を有する(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。
【００４９】
多くの国で七価肺炎球菌ワクチンが導入された後、いくつかの研究が、インフルエンザ菌により引き起こされる急性中耳炎の割合の有意な増加を示し、インフルエンザ菌は主な病原菌になっている(Pediatric Infectious Disease Journal 23:824-828; Pediatric Infectious Disease Journal 23:829-833 (2004))。
【００５０】
中耳炎は多因子疾患であるため、ワクチン接種戦略を用いて中耳炎を予防する実現性には疑問があった(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。しかしながら、ある研究の結果は、抗原が分類不能型インフルエンザ菌に対して少なくとも部分的な防御を誘導することができることを示唆している(Lancet 367:740-748 (2006))。ワクチン抗原を開発する1つの手法は、遺伝子的に異種であるが、豊富に発現される表面分子の抗原的に保存された領域を用いることである。別の手法は、配列または機能的エピトープ保存を示す表面タンパク質を同定することである。ワクチン抗原のための第3の考慮は、ヒト宿主における感染および定着の間に発現される抗原を選択することである。Murphy(Curr. Infect. Disease Reports 11:177-182 (2009)は、いくつかの潜在的な分類不能型インフルエンザ菌候補抗原の存在にも拘らず、その候補抗原が有効であるかどうかを確信を持って予測することができないと述べている(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。潜在的なワクチン抗原として記載されたいくつかのタンパク質は、ヘモフィルス付着因子タンパク質(Hap)、高分子量(HMW)タンパク質1および2、インフルエンザ菌付着因子(Hia)、D15タンパク質、HtrA熱ショックタンパク質、P2表面タンパク質、リポタンパク質D、P5フィンブリン由来ペプチド、外膜タンパク質P4、外膜タンパク質(OMP)26(OMP26)、P6タンパク質、タンパク質E、IV型線毛、リポオリゴ糖およびホスホリルコリンである(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009); Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006))。
【００５１】
チンチラモデルは、中耳炎およびその予防の強固で有効な動物モデルである(Expert Review of Vaccines 8:1063-1082 (2009))。チンチラモデルはヒト感染の天然の過程を模倣することができるが、他者は、チンチラモデルにおける結果は研究室間で次々と変化し得ることを示唆してきた(Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003))。
【００５２】
中耳炎の誘導のために様々な他のげっ歯動物も用いられてきたが、それらはVaccine 26:1501-1524 (2008)にまとめられている。マウス動物モデルが中耳炎研究において試験されることが多い。
【００５３】
殺菌抗体の存在は、分類不能型インフルエンザ菌に起因する中耳炎からの防御と関連する(Current Opinion in Infectious Disease 16:129-134 (2003))。しかしながら、免疫応答はNTHiに対して有効である殺菌的である必要はない。NTHi表面付着因子と単に反応する抗体は、チンチラにおける中耳炎を軽減または消失させることができる(Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003))。
【００５４】
慢性閉塞性肺疾患は、肺の慢性炎症疾患であり、世界中で罹患と死亡の主因である。米国で2005年に20人の死者のうちおよそ1人が根本原因としてCOPDを有していた(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。2020年にCOPDは障害期間調整後の寿命、慢性無効化疾患の五番目の主因となり、三番目に最も重要な死因となると推定されている(Lancet 349:1498-1504 (1997))。
【００５５】
COPDの経過は、気流制限の進行的悪化および肺機能の減退を特徴とする。COPDは、頻繁で再発する急性増悪(AE)により悪化し、これは莫大な医療費および高い罹患率と関連する(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007))。ある研究は、COPDの兆候の急性増悪の約50%が分類不能型インフルエンザ菌、モラクセラ・カタラリス、肺炎連鎖球菌、およびシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)により引き起こされることを示唆する(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。インフルエンザ菌は、COPDの増悪の20〜30%に見出され；肺炎連鎖球菌はCOPDの増悪の10〜15%に見出され；およびモラクセラ・カタラリスはCOPDの増悪の10〜15%に見出される(New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008))。インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、およびモラクセラ・カタラリスは、香港、韓国、およびフィリピンにおける気管支炎の急性増悪における主要な病原体であることが示されているが、インドネシア、タイ、マレーシアおよび台湾などの他のアジア各国/地域においては、クレブシエラ種(Klebsiella)、シュードモナス・エルギノーサおよびアシネトバクター種(Acinetobacter)が病原体の高い割合を占める(Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。バングラデシュでは、COPDを有する患者の20%が、シュードモナス、クレブシエラ、肺炎連鎖球菌およびインフルエンザ菌の喀痰培養で陽性を示すが、AECOPDを有する患者の65%がシュードモナス、クレブシエラ、アシネトバクター、エンテロバクター(Enterobacter)、モラクセラ・カタラリスおよびその組合せの培養で陽性を示した(Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010))。しかしながら、COPDの増悪を予防するための2つの最も重要な手段は能動免疫化および薬物療法の慢性的維持であることが示唆されている(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007))。
【００５６】
NTHiに対して有効なワクチンの必要性が存在する。発症における異なる段階で作用することができる抗原の使用はワクチンの有効性を改善することができる。本発明者らは、PilAおよびPEを融合タンパク質として本発明の免疫原性組成物中に有益に存在させることができることを見出した。
【００５７】
本発明は、式(I)：
(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p(式I)
(式中、
XはシグナルペプチドまたはMHHHHHH(配列番号2)であり；
mは0または1であり；
R1はアミノ酸であり；
nは0、1、2、3、4、5または6であり；
Aはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌に由来するPilAもしくはその免疫原性断片であり；
YはGG、SG、SSおよび(G)h(式中、hは4、5、6、7、8、9または10である)からなる群より選択され；
oは0または1であり；
Bはインフルエンザ菌に由来するPilAもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eもしくはその免疫原性断片であり；
ZはGGHHHHHH(配列番号3)であり；および
pは0または1である)
の融合タンパク質に関する。
【００５８】
一実施形態においては、XがCcmH (シトクロムc膜タンパク質H)、DsbA (ペリプラズムタンパク質ジスルフィドイソメラーゼI)、DsbB (ジスルフィド結合膜タンパク質B)、FlgI (鞭毛ペプチドグリカン環タンパク質)、FocC (F1cシャペロンタンパク質)、MalE (マルトース輸送因子サブユニットE)、NadA (キノリネートシンターゼサブユニットA)、NikA (ニッケルABC輸送因子成分A)、NspA (ナイセリア表面タンパク質A)、Omp26 (外膜タンパク質26)、OmpA (外膜タンパク質A)、OspA (外表面タンパク質A)、pelB (ペクチン酸リアーゼB)、 PhoA (細菌アルカリホスファターゼ)、PhtD (肺炎球菌ヒスチジントライアドタンパク質D)、PhtE (肺炎球菌ヒスチジントライアドタンパク質E)、SfmC (ペリプラズムピリンシャペロン)、Sip1 (表面免疫原性タンパク質)、TolB (Tol-Pal細胞エンベロープ複合成分B)、TorA (トリメチルアミンN-オキシドリダクターゼ系サブユニットA)、TorT (トリメチルアミンN-オキシドリダクターゼ系ペリプラズムタンパク質T)およびYral (推定ペリプラズムピリンシャペロン); またはその任意のサブグループからなる群より選択される式(I)の融合タンパク質が定義される。一実施形態においては、Xは同時翻訳シグナルペプチドまたは翻訳後シグナルペプチドである。一実施形態においては、XはFlgI(flgI種)に由来するシグナル配列である。別の特定の実施形態においては、XはpelB(pelB種)に由来するシグナル配列である。別の実施形態においては、Xは翻訳後シグナルペプチドである。別の実施形態においては、XはFlgI、NadAおよびpelBに由来するシグナル配列からなる群より選択される。
【００５９】
一実施形態においては、mが1である式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、mは0である。
【００６０】
1つの特定の実施形態においては、(R1)nが小さい、通常は親水性アミノ酸に富む1〜6アミノ酸であるR1およびnが定義される。親水性アミノ酸としては、グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)およびアスパラギン(N)が挙げられる。
【００６１】
一実施形態においては、nが0、1、2および6である式(I)の融合タンパク質が定義される。1つの特定の実施形態においては、(R1)nがD、E、ATNDDD(配列番号178)およびMD、またはその任意のサブセットからなる群より選択されるR1およびnが定義される。
【００６２】
1つの特定の実施形態においては、nは1、2および6からなる群より選択される。1つの特定の実施形態においては、nは0である。
【００６３】
一実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eである式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43 配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56および配列番号57; または配列番号5〜配列番号57の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列によりコードされるタンパク質Eである式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aがタンパク質Eであり、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と約75%〜100%同一である式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と約90%〜100%同一であるタンパク質Eである。別の実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるタンパク質Eである。さらなる実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4〜配列番号57のいずれかに記載のタンパク質Eと少なくとも95%同一であるタンパク質Eである。特定の実施形態においては、Aは、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質Eである。
【００６４】
別の実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43 配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56および配列番号57; または配列番号5〜配列番号57の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質Eの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4に記載のアミノ酸配列と約75%〜100%同一であるタンパク質Eの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4に記載のアミノ酸配列と約90%〜100%同一であるタンパク質Eの免疫原性断片である。さらなる実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4〜配列番号57のいずれかと少なくとも95%同一であるタンパク質Eの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態において、Aは、タンパク質Eが配列番号124と93%〜100%同一であるタンパク質Eの免疫原性断片である。特定の実施形態においては、Aは、タンパク質Eが配列番号4であるタンパク質Eの免疫原性断片である。
【００６５】
別の実施形態においては、Aは、配列番号4のアミノ酸17〜160(配列番号122)、配列番号4のアミノ酸18〜160(配列番号123)、配列番号4のアミノ酸19〜160(配列番号124)、配列番号4のアミノ酸20〜160(配列番号125)および配列番号4のアミノ酸22〜160(配列番号126)からなる群より選択されるインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Aは、配列番号4のアミノ酸17〜160(配列番号122)、配列番号4のアミノ酸18〜160(配列番号123)、配列番号4のアミノ酸19〜160(配列番号124)、配列番号4のアミノ酸20〜160(配列番号125)、配列番号4のアミノ酸22〜160(配列番号126)、配列番号4のアミノ酸23〜160(配列番号179)および配列番号4のアミノ酸24〜160(配列番号180)からなる群より選択されるインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である。さらなる実施形態においては、Aは、配列番号4のアミノ酸17〜160(配列番号122)、配列番号4のアミノ酸18〜160(配列番号123)、配列番号4のアミノ酸20〜160(配列番号125)、配列番号4のアミノ酸22〜160(配列番号126)、配列番号4のアミノ酸23〜160(配列番号179)および配列番号4のアミノ酸24〜160(配列番号180)からなる群より選択されるインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態において、Aは配列番号124、配列番号4のアミノ酸19〜160である。さらなる実施形態においては、Aは、配列番号125、配列番号5のアミノ酸20〜160である。別の実施形態においては、Aは、配列番号4のアミノ酸23〜160(配列番号179)および配列番号4のアミノ酸24〜160(配列番号180)からなる群より選択されるインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である。
【００６６】
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【００６７】
別の実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するPilAである式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aが、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120および配列番号121;配列番号58〜配列番号121の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌に由来するPilAである、式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aは、PilAが配列番号58と約80%〜100%同一であるPilAである。別の実施形態においては、Aは、PilAが配列番号58〜配列番号121のいずれかと少なくとも95%同一であるPilAである。特定の実施形態においては、Aは、配列番号58のPilAである。
【００６８】
別の実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するPilAの免疫原性断片である式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Aは、PilAが配列番号58と約80%〜100%同一であるPilAの免疫原性断片である。例えば、Aは、PilAが配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120および配列番号121;配列番号58〜配列番号121の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するPilAの免疫原性断片である。さらなる実施形態においては、Aは、PilAが配列番号58〜配列番号121のいずれかと少なくとも95%同一であるPilAの免疫原性断片である。特定の実施形態においては、Aは、PilAが配列番号58であるインフルエンザ菌株86-028NPに由来するPilAの免疫原性断片である。
【００６９】
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【００７０】
別の実施形態においては、Aは、配列番号127と約75%〜100%同一であるPilAの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態において、Aは、配列番号58のアミノ酸40〜149からなる断片である配列番号127である。
【００７１】
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【００７２】
別の実施形態においては、Aは、配列番号58〜配列番号121のいずれかに由来するアミノ酸40〜149からなるPilAの免疫原性断片である。さらなる実施形態においては、Aは配列番号58〜配列番号121のいずれかに由来するアミノ酸40〜149と少なくとも95%同一である免疫原性断片である。
【００７３】
一実施形態においては、YがGG、SGおよびSSからなる群より選択される式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、YがGGまたはSGである式(I)の融合タンパク質が定義される。1つの特定の実施形態においては、YはGGである。
【００７４】
一実施形態においては、oが1である式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、oは0である。
【００７５】
一実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eまたはインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である場合に、Bがインフルエンザ菌に由来するPilAまたはインフルエンザ菌に由来するPilAの免疫原性断片である式(I)の融合タンパク質が定義される。例えば、Bはインフルエンザ菌株86-028NPに由来するPilAである。別の実施形態においては、Bは、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120および配列番号121;配列番号58〜配列番号121の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌に由来するPilAである。別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58と約80%〜100%同一であるPilAである。別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58〜配列番号121と少なくとも95%同一であるPilAである。特定の実施形態においては、Bは、配列番号58のPilAである。
【００７６】
別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58〜配列番号121のいずれかと少なくとも95%同一であるPilAであり、Aは、PEが配列番号4〜配列番号57のいずれかと少なくとも95%同一であるPEである。
【００７７】
別の実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eである場合に、Bがインフルエンザ菌に由来するPilAの免疫原性断片である、式(I)の融合タンパク質が定義される。例えば、Bは、インフルエンザ菌株86-028NPに由来するPilAの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58と約80%〜100%同一であるPilAの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120および配列番号121; または配列番号58〜配列番号121の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸を有する、PilAの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58〜配列番号121のいずれかと少なくとも95%同一である、PilAの免疫原性断片である。特定の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58に記載のアミノ酸配列を有する、インフルエンザ菌に由来するPilAの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Bは、配列番号58〜配列番号121のいずれかに由来するアミノ酸40〜149からなるPilAの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態においては、Bは、配列番号127に記載のPilAの断片である。さらなる実施形態においては、Bは、配列番号58〜配列番号121のいずれかに由来するアミノ酸40〜149と少なくとも95%同一である免疫原性断片である。
【００７８】
1つの特定の実施形態においては、Bは、配列番号127に記載のPilAの断片であり、Aは、配列番号122、配列番号124、配列番号125および配列番号126からなる群より選択されるタンパク質Eの免疫原性断片である。より具体的には、Bは、配列番号127に記載のPilAの断片であり、Aは、配列番号124に記載のタンパク質Eの断片、配列番号4に由来するタンパク質Eのアミノ酸19〜160である。別の実施形態においては、Bは、配列番号127に記載のPilAの断片であり、Aは、配列番号125に記載のタンパク質Eの断片である。
【００７９】
別の実施形態においては、Bは、PilAが配列番号58〜配列番号121のいずれかと少なくとも95%同一であるPilAの免疫原性断片であり、Aは、PEが配列番号4〜配列番号57のいずれかと少なくとも95%同一であるPEの免疫原性断片である。
【００８０】
別の実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するPilAである場合にBがインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eである、式(I)の融合タンパク質が定義される。例えば、Bは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43 配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56および配列番号57; または配列番号4〜配列番号57の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質Eである。別の実施形態においては、Bは、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と約75%〜100%同一である、式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Bは、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と約90%〜100%同一であるタンパク質Eである。例えば、Bは、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eと少なくとも95%同一である、タンパク質Eである。別の実施形態においては、Bは、タンパク質Eが配列番号4〜配列番号57のいずれかと少なくとも95%同一であるタンパク質Eである。特定の実施形態においては、Bは、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質Eである。
【００８１】
別の実施形態においては、Aがインフルエンザ菌に由来するPilAの免疫原性断片である場合にBがインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である、式(I)の融合タンパク質が定義される。例えば、Bは、タンパク質Eが配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56および配列番号57; または配列番号4〜配列番号57の任意のサブセットからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、タンパク質Eの免疫原性断片である。別の実施形態においては、Bが、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と約75%〜100%同一であるタンパク質Eの免疫原性断片である、式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、Bは、タンパク質Eが配列番号4に記載のタンパク質Eアミノ酸配列と約90%〜100%同一であるタンパク質Eの免疫原性断片である。特定の実施形態においては、Bは、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質Eの免疫原性断片である。さらなる実施形態においては、Bは、タンパク質Eが配列番号4〜配列番号57のいずれかと少なくとも95%同一である、タンパク質Eの免疫原性断片である。
【００８２】
別の実施形態においては、Bは、配列番号4のアミノ酸17〜160(配列番号122)、配列番号4のアミノ酸18〜160(配列番号123)、配列番号4のアミノ酸19〜160(配列番号124)、配列番号4のアミノ酸20〜160(配列番号125)および配列番号4のアミノ酸22〜160(配列番号126)からなる群より選択されるインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの断片である。別の実施形態においては、Bは、配列番号4のアミノ酸17〜160(配列番号122)、配列番号4のアミノ酸18〜160(配列番号123)、配列番号4のアミノ酸19〜160(配列番号124)、配列番号4のアミノ酸20〜160(配列番号125)、配列番号4のアミノ酸22〜160(配列番号126)、配列番号4のアミノ酸23〜160(配列番号179)および配列番号4のアミノ酸24〜160(配列番号180)からなる群より選択されるインフルエンザ菌に由来するタンパク質Eの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態において、Bは、配列番号4のアミノ酸18〜160である配列番号123に記載のタンパク質Eの断片である。
【００８３】
1つの特定の実施形態においては、Bは、Aが配列番号127に記載のPilAの免疫原性断片である場合に配列番号4のアミノ酸18〜160である配列番号123に記載のタンパク質Eの免疫原性断片である。
【００８４】
一実施形態においては、pが0である式(I)の融合タンパク質が定義される。別の実施形態においては、pが1である式(I)の融合タンパク質が定義される。
【００８５】
一実施形態においては、式(I)の融合タンパク質は、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202および配列番号204; またはその任意のサブセットからなる群より選択される。別の実施形態においては、式(I)の融合タンパク質は、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202または配列番号204のいずれかと約95%同一である。
【００８６】
式(I)の融合タンパク質は、哺乳動物、特にヒトなどの被験体における免疫原として有用である。特に、式(I)の融合タンパク質は、被験体、特に、ヒトにおいてインフルエンザ菌に対する免疫応答を誘導するのに有用である。より具体的には、式(I)の融合タンパク質は、中耳炎および/またはAECOPDおよび/または肺炎の治療または予防において有用である。
【００８７】
本発明は、インフルエンザ菌に由来するタンパク質E(またはその免疫原性断片)およびインフルエンザ菌に由来するPilA(またはその免疫原性断片)を含む免疫原性組成物、ならびにインフルエンザ菌に由来するタンパク質E(またはその免疫原性断片)と、インフルエンザ菌に由来するPilA(またはその免疫原性断片)との融合タンパク質を含む免疫原性組成物に関する。本発明はまた、そのような免疫原性組成物を含むワクチンおよびその治療的使用にも関する。
【００８８】
一実施形態においては、免疫原性組成物は、インフルエンザ菌に由来するタンパク質E(またはその免疫原性断片)およびインフルエンザ菌に由来するPilA(またはその免疫原性断片)を含む。タンパク質Eは配列番号4または配列番号4と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるタンパク質E配列であってよい。
【００８９】
タンパク質Eの免疫原性断片は、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125もしくは配列番号126、または配列番号123、配列番号124、配列番号125もしくは配列番号126のいずれか1つに対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有する配列であってよい。タンパク質Eの免疫原性断片は、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号179もしくは配列番号180、または配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号179もしくは配列番号180のいずれか1つに対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有する配列であってよい。アミノ酸の相違は、参照株としてインフルエンザ菌Rdに由来するタンパク質Eと比較した場合の様々なヘモフィルス種に由来するタンパク質Eにおいて記載されている。Microbes & Infection (「Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells」の誤植[Microbes Infect. 10 (2008) 87-97]、2010年7月6日にオンラインで入手可能、「論文印刷中」)は、インフルエンザ菌株772に由来するタンパク質Eの配列を提供する。WO2002/28889は、インフルエンザ菌株12085に由来するタンパク質Eの配列を提供する。
【００９０】
タンパク質Eは、100を超える臨床NTHi単離物、莢膜型インフルエンザ菌、および分析された培養収集株の間で保存されていることが報告された上皮細胞結合領域(PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR、配列番号128)を含有する(Singhら、J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010))。Singhらは、タンパク質EはNTHiと莢膜型インフルエンザ菌の両方で高度に保存されていると報告した(シグナルペプチドを含まずに96.9%〜100%)。一実施形態においては、タンパク質Eの断片は、配列番号128(PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR)の結合領域を含む。
【００９１】
PilAは、in vivoで発現される保存された付着因子である。インフルエンザ菌に由来するPilAの64個の配列の完全長比較は、約80%〜100%の同一性を示した。
【００９２】
別の実施形態においては、免疫原性組成物は、式(I)により定義される融合タンパク質を含む。
【００９３】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物を、インフルエンザ菌に由来する他の抗原と共に投与することができる。例えば、PEおよびPilAまたは式(I)の融合タンパク質を、インフルエンザ菌に由来するタンパク質Dと共に投与することができる。タンパク質Dは、WO91/18926に記載のものであってよい。別の実施形態においては、免疫原性組成物は、式(I)の融合タンパク質およびインフルエンザ菌に由来するタンパク質Dを含んでもよい。
【００９４】
別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物を、中耳炎、AECOPDまたは肺炎を引き起こすことも知られる他の細菌種に由来するさらなる抗原と共に投与することができる。
【００９５】
所望の治療効果または生物学的効果を達成するのに必要とされる免疫原性組成物の量は、それが意図される使用、投与の手段、レシピエントならびに治療される症状の種類および重篤度などのいくつかの因子に依存し、究極的には医師または獣医師の裁量で決まる。一般に、例えば、ヒトにおけるインフルエンザ菌により全体的または部分的に引き起こされる症状の治療のための典型的な用量は、約0.003mg〜約0.090mgの範囲にあると予想することができる。より具体的には、ヒトにおけるインフルエンザ菌により全体的または部分的に引き起こされる症状の治療のための典型的な用量は、約0.01mg〜約0.03mgの範囲の融合タンパク質であってよい。免疫原性組成物は、さらなる抗原を含んでもよい；ヒトにおけるインフルエンザ菌により全体的または部分的に引き起こされる症状の治療のための典型的な用量は、それぞれのさらなる抗原について約0.01mg〜約0.03mgの範囲にあってもよい。この用量は、単回用量として投与することができる。いくつかの別々の単位用量を投与してもよい。例えば、別々の単位用量を、人生の最初の年内に別々の初回用量として、または規則的な間隔(例えば、1、5もしくは10年毎)で与えられる別々の追加用量として投与することができる。
【００９６】
本発明の免疫原性組成物を含む製剤を、好適な経路、例えば、筋肉内、舌下、経皮、皮内または鼻内経路による投与のために適合させることができる。そのような製剤を、当業界で公知の任意の方法により調製することができる。
【００９７】
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。用語「アジュバント」を本明細書で用いる場合、それは免疫原性組成物の免疫原性成分に対する患者の免疫応答を追加させるために前記組成物と共に投与される物質を指す。
【００９８】
好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルもしくはリン酸アルミニウムもしくはミョウバンなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオンもしくは陰イオンで誘導体化された糖、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってよい。一実施形態においては、融合タンパク質、PEまたはPilAをリン酸アルミニウム上に吸着させることができる。別の実施形態においては、融合タンパク質、PEまたはPilAを水酸化アルミニウム上に吸着させることができる。第三の実施形態においては、ミョウバンをアジュバントとして用いることができる。
【００９９】
主にTh1応答を促進する好適なアジュバント系としては、リピドAの非毒性誘導体、モノホスホリルリピドA(MPL)またはその誘導体、特に、3-デ-O-アシル化モノホスホリルピリドA(3D-MPL)(その調製については、GB 2220211 Aを参照されたい)；およびモノホスホリルリピドA、好ましくは、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム)または水中油乳濁液との組合せが挙げられる。そのような組合せにおいては、抗原と3D-MPLは同じ粒子状構造中に含有され、抗原シグナルおよび免疫刺激シグナルのより効率的な送達を可能にする。研究により、3D-MPLはミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに増強することができることが示された(Thoelenら、Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1)。
【０１００】
AS01は、MPL(3-O-デスアシル-4'-モノホスホリルリピドA)、QS21(Quillaja saponaria Molina、画分21)Antigenics, New York, NY, USA)およびリポソームを含有するアジュバント系である。AS01Bは、MPL、QS21およびリポソーム(50μgのMPLおよび50μgのQS21)を含有するアジュバント系である。AS01Eは、MPL、QS21およびリポソーム(25μgのMPLおよび25μgのQS21)を含有するアジュバント系である。一実施形態においては、免疫原性組成物またはワクチンは、AS01を含む。別の実施形態においては、免疫原性組成物またはワクチンは、AS01BまたはAS01Eを含む。特定の実施形態においては、免疫原性組成物またはワクチンは、AS01Eを含む。
【０１０１】
AS03は、油/水(o/w)乳濁液中にα-トコフェロールおよびスクアレンを含有するアジュバント系である。AS03Aは、o/w乳濁液中にα-トコフェロールおよびスクアレン(11.86mgのトコフェロール)を含有するアジュバント系である。AS03Bは、o/w乳濁液中にα-トコフェロールおよびスクアレン(5.93mgのトコフェロール)を含有するアジュバント系である。AS03Cは、o/w乳濁液中にα-トコフェロールおよびスクアレン(2.97mgのトコフェロール)を含有するアジュバント系である。
【０１０２】
AS04は、アルミニウム塩(500μgのAl3+)上に吸着させたMPL(50μgのMPL)を含有するアジュバント系である。一実施形態においては、免疫原性組成物またはワクチンは、AS04を含む。
【０１０３】
QS21および3D-MPLの使用を含む系は、WO94/00153に開示されている。QS21がコレステロールでクエンチされた組成物は、WO96/33739に開示されている。水中油乳濁液中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含むさらなるアジュバント製剤は、WO95/17210に記載されている。一実施形態においては、免疫原性組成物は、QS21であってよいサポニンをさらに含む。この製剤はまた、水中油乳濁液およびトコフェロールを含んでもよい(WO95/17210)。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(WO96/02555)および他の免疫調節オリゴヌクレオチド(WO0226757およびWO03507822)もまた、TH1応答の優先的な誘導因子であり、本発明における使用にとって好適である。
【０１０４】
さらなるアジュバントは、金属塩、水中油乳濁液、Toll様受容体アゴニスト(特に、Toll様受容体2アゴニスト、Toll様受容体3アゴニスト、Toll様受容体4アゴニスト、Toll様受容体7アゴニスト、Toll様受容体8アゴニストおよびToll様受容体9アゴニスト)、サポニンまたはその組合せからなる群より選択されるものである。
【０１０５】
本発明は、式(I)の融合タンパク質とアジュバントとを組合わせることを含む免疫原性組成物の調製方法を提供する。
【０１０６】
本発明は、本発明の免疫原性組成物と製薬上許容し得る賦形剤とを含有するワクチンをさらに提供する。
【０１０７】
可能な賦形剤としては、アルギニン、プルロニック酸および/またはポリソルベートが挙げられる。好ましい実施形態においては、ポリソルベート80(例えば、TWEEN(登録商標)80)が用いられる。さらなる実施形態においては、約0.03%〜約0.06%の最終濃度が用いられる。具体的には、約0.03%、0.04%、0.05%または0.06%の最終濃度のポリソルベート80(w/v)を用いることができる。
【０１０８】
本発明は、式(I)の融合タンパク質と製薬上許容し得る賦形剤とを組合わせることを含む免疫原性組成物またはワクチンの調製方法を提供する。
【０１０９】
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする核酸も提供する。用語「核酸」とは、ポリマー型のヌクレオチドを指す。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または改変型のリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドであってよい。この用語は、一本鎖および二本鎖型のDNAを含む。核酸は、好ましくは他の核酸を実質的に含まない。
【０１１０】
本発明は、本発明の核酸を製造する方法を提供する。本発明の核酸を、当業者には公知の方法によって調製することができる。例えば、本発明の核酸を、部分的または全体的に合成することができる。核酸を、より長いアミノ酸を消化するか、またはより短いアミノ酸を連結することにより調製することができる。
【０１１１】
以下の実施例は、例示のみを意図するものであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１１２】
実施例において、以下の用語は指定された意味を有する：
6xhis = 6個のヒスチジン;
xg = 遠心力 (数重力)
ATP = アデノシン三リン酸;
BCA = ビシンコニン酸;
BSA = ウシ血清アルブミン;
℃ = 摂氏;
CaCl2 = 塩化ナトリウム;
CV = カラム容量;
DNA = デオキシリボ核酸;
DSC = 示差走査熱量測定;
DTT = ジチオトレイトール;
dNTP = デオキシヌクレオシド三リン酸;
EDTA = エチレンジアミン四酢酸;
FT = 流出液;
HCl = 塩酸;
His = his = ヒスチジン;
HEPES = 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸;
IMAC = 固定化金属アフィニティクロマトグラフィー;
IPTG = イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド;
KCl = 塩化カリウム;
K2HPO4 = リン酸水素二カリウム;
KH2PO4 = リン酸二水素カリウム;
LDS = ドデシル硫酸リチウム;
L = リットル;
MES = 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸;
MgCl2 = 塩化マグネシウム;
ml = ミリリットル;
RPM = 毎分回転数;
min = 分;
mM = ミリモル濃度; 
μL = マイクロリットル;
NaCl = 塩化ナトリウム;
Na2HPO4 = リン酸水素二ナトリウム;
NaH2PO4 = リン酸二水素ナトリウム;
ng = ナノグラム;
nm = ナノメートル;
O/N = 一晩;
PBS = リン酸緩衝生理食塩水;
PCR = ポリメラーゼ連鎖反応;
SB = サンプルバッファー;
sec = 秒;
w/v = 重量/体積。
【０１１３】
(実施例)
【実施例１】
【０１１４】
融合タンパク質
融合タンパク質を、様々なシグナルペプチドおよびアミノ酸リンカー配列を用いて製造した。これらの融合タンパク質は、単一の細菌株に限定されることなく、タンパク質EとPilA(またはその断片)の両方の分泌を可能にした。融合タンパク質は、シグナルペプチドペプチダーゼによる異種シグナルペプチドの除去後、ペリプラズム中に放出される。細菌から精製された融合タンパク質は、異種シグナルペプチドを含有しない。「精製された」タンパク質は、細菌から除去され、シグナルペプチドを欠く。
【０１１５】
以下の表は、作製された融合タンパク質構築物を記載する。
【表３】
2014512365.tif 000020
2014512365.tif 000021
【０１１６】
表3に列挙されたそれぞれのシグナルペプチドおよびプラスミドのDNAおよびアミノ酸配列を以下に記載する。
【０１１７】
シグナル配列：
2014512365.tif 000022
【０１１８】
融合タンパク質構築物配列：
アミノ酸配列の単一の下線部分は、インフルエンザ菌株86-028NPに由来するPilAに由来するものである。アミノ酸配列の太い下線部分は、インフルエンザ菌株772に由来するタンパク質Eから誘導されたものである。
【０１１９】
2014512365.tif 000023
2014512365.tif 000024
2014512365.tif 000025
2014512365.tif 000026
2014512365.tif 000027
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2014512365.tif 000029
2014512365.tif 000030
2014512365.tif 000031
2014512365.tif 000032
2014512365.tif 000033
2014512365.tif 000034
2014512365.tif 000035
2014512365.tif 000036
【０１２０】
上記配列が得られたPEおよびPilAの完全長配列は、それぞれ配列番号4(PE)および配列番号58(PilA)に記載される。
【実施例２】
【０１２１】
ベクター構築物および形質転換
インフルエンザ菌株772からPEを増幅するためのプライマーを、インフルエンザ菌株Hi Rdの配列に基づいて設計した。5'プライマー配列は、NTHi 772配列と比較して1個のヌクレオチドの差異を含み、現在報告されているNTHi 772ゲノム配列と比較した場合、位置24にアミノ酸の差異を導入する。融合タンパク質構築物中のアミノ酸#24は、NTHi 772に認められるようにK(リシン)の代わりにE(グルタミン酸)である。
【０１２２】
2014512365.tif 000037
2014512365.tif 000038
【０１２３】
ベクター構築物：
LVL312、LVL291、LVL268、LVL269、LVL270、LVL702、LVL735、LVL778、LVL779、LVL780、LVL781およびLVL782を作製するために、以下の成分のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)調製物を調製した(後に特異的成分を例示する)：36.6μlの脱イオン水、5μlのバッファー#1 10X、5μlのdNTP 2mM、2μlのMgCl2 25mM、0.4μlのプライマー#1(50μM)、0.4μlのプライマー#2(50μM)、0.5μlの鋳型(100ng/μl)および0.4μlのKOD HiFi DNAポリメラーゼ2.5ユニット/μl(NOVAGEN(登録商標))を調剤した。ポリメラーゼ連鎖反応は、98℃での15秒間の変性、55℃での2秒間のアニーリングおよび72℃での20秒間のプライマー伸長の25サイクルを含んでいた。PCR産物を、QIAQUICK(登録商標)PCR精製キット(QIAGEN(登録商標))を用いて精製した。この産物を、供給業者により推奨される条件下で用いた：それは、QIAQUICK(登録商標)PCR精製キット中に提供される、5倍量のバッファーPBの、1倍量のPCR調製物への添加であった。続いて、バッファーPBを含むPCR調製物を、ボルテックスにより混合した。QIAQUICK(登録商標)カラムを2mlの収集チューブに入れた。PCR調製物中のDNAをカラムに結合させるために、混合したサンプルをQIAQUICK(登録商標)カラムに印加し、14000RPMで30〜60秒間遠心分離した。流出液を廃棄し、QIAQUICK(登録商標)カラムを同じチューブに戻し入れた。結合したDNAを洗浄するために、QIAQUICK(登録商標)PCR精製キット中に提供される、0.75mlのバッファーPEを、QIAQUICK(登録商標)カラムに添加し、カラムを14000RPMで30〜60秒間遠心分離した。流出液を廃棄し、QIAQUICK(登録商標)カラムを同じチューブに戻し入れた。QIAQUICK(登録商標)カラムを2ml収集チューブ中で1分間、もう1回遠心分離して、残存する洗浄バッファーを除去した。それぞれのQIAQUICK(登録商標)カラムを、清潔な1.5mlのマイクロ遠心管に入れた。DNAを溶出させるために、33μlの水を、QIAQUICK(登録商標)膜の中心に添加し、カラムを14000RPMで1分間遠心分離した。制限酵素および関連するバッファーは、New England BioLabsから入手した。例えば、約5μlのpET26bベクター(100ng/μl)、2μlのNEバッファー2(New England Biolabs、1X NEバッファー2：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、pH7.9、25℃)、1μlのNdeI(20000ユニット/ml)、1μlのHindIII(20000ユニット/ml)および11μlの脱イオン水を混合し、DNA消化のために37℃で2時間インキュベートした。その後、精製の第2ステップを、上記の手順を用いるQIAQUICK(登録商標)PCR精製キット(QIAGEN(登録商標))を用いて実施した。
【０１２４】
ライゲーションを、New England BiolabsからのQuick T4 DNAリガーゼおよびQuick Ligation Reaction Bufferを用いて実施した。例えば、10μlの脱イオン水中の約10ngのベクターおよび30ngの挿入物を、10μlの2X Quick Ligation Reaction Buffer(New England Biolabs、132mM Tris-HCl、20mM MgCl2、2mMジチオトレイトール、2mM ATP、15%ポリエチレングリコール、pH7.6、25℃)および1μlのQuick T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)と混合した。酵素反応物を室温で5分間インキュベートした後、形質転換した。
【０１２５】
LVL315、LVL317、LVL318、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739およびLVL740を作製するために、以下の成分のPCR調製物を調製した：40μlの脱イオン水、5μlの反応バッファー10X、1μlのdNTPミックス、1μlのプライマー#1(10μM)、1μlのプライマー#2(10μM)、1μlの鋳型(25ng/μl)および1μlのPfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼ2.5ユニット/μl(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit、Agilent Technologies、Stratagene Division)を調剤した。ポリメラーゼ連鎖反応は、95℃で30secでの1サイクルの変性、95℃での30secの変性、55℃での1minのアニーリングおよび68℃での5min 30secのプライマー伸長の18サイクルを含んでいた。PCR産物を、37℃で1時間、1μlのDpnI制限酵素を用いて消化した後、形質転換した。
【０１２６】
増幅に用いたPCRプライマー配列の詳細な一覧を、表4に例示する。
【０１２７】
pRIT16711を作製するために、その対応する分泌シグナルをコードする配列を含まない、配列番号4のアミノ酸22〜160をコードするPE遺伝子断片を、NTHi株772のゲノムDNAからPCRによって増幅した。増幅プライマーを、利用可能な株Hi Rdの配列に基づいて設計した(その時点で、772配列は未知であった)。5'プライマー配列は、NTHi772配列(現在利用可能な配列)と比較して1個の突然変異を含み、位置24にPEコード配列の1個のアミノ酸の差異、リシン(K)の代わりにグルタミン酸(E)を導入する。PCR増幅の後、挿入物を、BamHIおよびXhoI制限部位を用いてpET-26(+)発現ベクター(NOVAGEN(登録商標))中にクローニングした。
【０１２８】
pRIT16671を作製するために、そのリーダーペプチドならびに予測される疎水性αへリックスの部分を含まない、PilA遺伝子断片をコードするDNA断片(配列番号58のアミノ酸40〜149、配列番号127)を、NTHi株86-028NPのゲノムDNAから増幅し、pET15発現ベクター中にクローニングした。ベクターpRIT16790(NTHi株86-028NPに由来するアミノ酸40〜149を含有する)を鋳型として用いて、ベクターpRIT16671を作製した。PilA遺伝子断片を、ベクターpRIT16790ならびにプライマーMDES PILA-3およびMDES PILA-4を用いるPCRにより増幅した。PilA断片を、NdeI/XhoI制限部位を用いてpET-26発現ベクター中にクローニングした。6個のヒスチジン(his)アミノ酸をコードするDNA配列を、5'プライマー中に組込み、PilA配列のN末端に6個のヒスチジン(6xhis)を付加した(MDES PILA-3)。
【０１２９】
LVL312(FlgIシグナルペプチド-E-PilA断片-GG-PE断片-GGHHHHHH)を作製するために、鋳型としてのpRIT16671ベクターならびにプライマーCAN534およびCAN537を用いてPilA遺伝子(アミノ酸40〜149/株86-028NP)を増幅するポリメラーゼ連鎖反応を実施した。FlgIシグナルペプチド(sp)およびグルタミン酸(E)アミノ酸に対応するDNA配列を、5'プライマー(CAN534)中に組込んだ。PilA配列をPE配列に連結するために、2個のグリシン(GG)アミノ酸リンカーおよびN末端PEアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN537)に組込んだ。鋳型としてのpRIT16711ベクターならびにプライマーCAN536およびCAN538を用いてPE遺伝子(アミノ酸18〜160)を増幅する別のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。C末端PilAアミノ酸およびGGアミノ酸に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込んで、pilAをPE配列に連結した(CAN536)。GGアミノ酸リンカーおよび6xhisアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN538)中に組込んだ。最後に、LVL312を作製するために、N末端のFlgIシグナルペプチド、FlgIとpilAとの間のグルタミン酸(E)アミノ酸、PilAとPE配列との間のGGリンカーおよびC末端のPEと6xhisアミノ酸との間のGGリンカーとの融合物中のPilAおよびPE遺伝子を増幅する第3のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この増幅を達成するために、上記の2つのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を鋳型として、プライマーCAN534およびCAN538と共に用いた。NdeI制限部位に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込み、HindIII制限部位を3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物を、pET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３０】
LVL291(pelBシグナルペプチド-PE断片-GG-PilA断片-GG-6xhis)を作製するために、鋳型としてのpRIT16711ベクターならびにプライマーCAN544およびCAN546を用いてPE遺伝子(アミノ酸19〜160)を増幅するポリメラーゼ連鎖反応を実施した。pelBシグナルペプチド(sp)アミノ酸に対応するDNA配列を、5'プライマー(CAN544)中に組込んだ。PilA配列をPE配列に連結するために、GGアミノ酸リンカーおよびN末端PilAアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN546)中に組込んだ。鋳型としてのpRIT16671ベクターとプライマーCAN545およびCAN535を用いてPilA遺伝子(配列番号58のアミノ酸40〜149、配列番号127)を増幅する別のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。C末端PEアミノ酸およびGGアミノ酸に対応するDNA配列を5'プライマー(CAN545)中に組込んで、PilA配列をPE配列に連結した。リンカーGGアミノ酸および6xhisアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN535)中に組込んだ。最後に、LVL291を作製するために、N末端のpelBシグナルペプチド、PEとPilA配列との間のGGリンカーおよびC末端のPilAと6xhisアミノ酸との間のGGリンカーとの融合物中のPEおよびPilA遺伝子を増幅する第3のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この増幅を達成するために、上記の2つのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を鋳型として、プライマーCAN544およびCAN535と共に用いた。NdeI制限部位に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込み、HindIII制限部位を3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３１】
LVL268(pelBシグナルペプチド-D-PE断片-GG-PilA断片-GG-6xhis)を作製するために、鋳型としてのpRIT16711ベクターならびにプライマーCAN547およびCAN546を用いてPE遺伝子(アミノ酸20〜160)を増幅するポリメラーゼ連鎖反応を実施した。pelBシグナルペプチド(sp)アミノ酸およびアスパラギン酸(D)アミノ酸に対応するDNA配列を、5'プライマー(CAN547)中に組込んだ。PilA配列をPE配列に連結するために、GGアミノ酸リンカーおよびN末端PilAアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN546)中に組込んだ。鋳型としてのpRIT16671ベクターとプライマーCAN545およびCAN535を用いてPilA遺伝子(アミノ酸40〜149/NTHi株86-028NP)を増幅する別のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。C末端PEアミノ酸およびGGアミノ酸に対応するDNA配列を5'プライマー(CAN545)中に組込んで、PilA配列をPE配列に連結した。リンカーGGアミノ酸および6xhisアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN535)中に組込んだ。最後に、LVL268を作製するために、N末端のpelBシグナルペプチド、pelBシグナルペプチドとPEとの間のDアミノ酸、PEとPilA配列との間のGGリンカーおよびC末端のPilAと6xhisアミノ酸との間のGGリンカーとの融合物中のPEおよびPilA遺伝子を増幅する第3のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この増幅を達成するために、上記の2つのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を鋳型として、プライマーCAN547およびCAN535と共に用いた。NdeI制限部位に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込み、HindIII制限部位を3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３２】
LVL269(NadAシグナルペプチド-ATNDDD-PE断片-GG-PilA断片-GG-6xhis)を作製するために、鋳型としてのpRIT16711ベクターならびにプライマーCAN548およびCAN546を用いてPE遺伝子(配列番号4のアミノ酸22〜160)を増幅するポリメラーゼ連鎖反応を実施した。pelBシグナルペプチド(sp)アミノ酸およびATNDDDアミノ酸に対応するDNA配列を、5'プライマー(CAN548)中に組込んだ。PilA配列をPE配列に連結するために、GGアミノ酸リンカーおよびN末端PilAアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN546)中に組込んだ。鋳型としてのpRIT16671ベクターとプライマーCAN545およびCAN535を用いてPilA遺伝子(配列番号58のアミノ酸40〜149、配列番号127)を増幅する別のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。C末端PEアミノ酸およびGGアミノ酸に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込んで、PilA配列をPE配列に連結した(CAN545)。リンカーGGアミノ酸および6xhisアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN535)中に組込んだ。最後に、LVL269を作製するために、N末端のNadAシグナルペプチド、pelBシグナルペプチドとPEとの間のATNDDDアミノ酸、PEとpilA配列との間のGGリンカーおよびC末端のPilAと6xhisアミノ酸との間のGGリンカーとの融合物中のPEおよびPilA遺伝子を増幅する第3のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この増幅を達成するために、上記の2つのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を鋳型として、プライマーCAN548およびCAN535と共に用いた。NdeI制限部位に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込み、HindIII制限部位を3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３３】
LVL270(M-6xHis-PE断片-GG-PilA断片)を作製するために、鋳型としてのpRIT16711ベクターならびにプライマーCAN540およびCAN542を用いてPE遺伝子(アミノ酸17〜160)を増幅するポリメラーゼ連鎖反応を実施した。6xhisアミノ酸に対応するDNA配列を、5'プライマー(CAN540)中に組込んだ。PilA配列をPE配列に連結するために、GGアミノ酸リンカーおよびN末端PilAアミノ酸に対応するDNA配列を、3'プライマー(CAN542)中に組込んだ。鋳型としてのpRIT16671ベクターとプライマーCAN541およびCAN543を用いてPilA遺伝子(アミノ酸40〜149/NTHi株86-028NP)を増幅する別のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。C末端PEアミノ酸およびGGアミノ酸に対応するDNA配列を5'プライマー(CAN541)中に組込んで、PilA配列をPE配列に連結した。最後に、LVL270を作製するために、融合物中の6-his-PE-GG-PilA遺伝子を増幅する第3のポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この増幅を達成するために、上記の2つのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を鋳型として、プライマーCAN540およびCAN543と共に用いた。NdeI制限部位に対応するDNA配列を5'プライマー中に組込み、HindIII制限部位を3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３４】
LVL315(pelBシグナルペプチド-MD-PE断片-GG-PilA断片-GG-6xhis)を作製するために、鋳型としてのLVL291とプライマーCAN670およびCAN671ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)を用いてN末端のPEアミノ酸配列をQIQからMDに変化させる部位特異的突然変異誘発を実施した。
【０１３５】
LVL317(pelBシグナルペプチド-PE断片-GG-PilA断片)を作製するために、鋳型としてのLVL291とプライマーCAN678およびCAN679ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)を用いてPilA遺伝子とGGHHHHHHアミノ酸残基に対応するDNA配列(配列番号3)との間に停止コドンを組込む部位特異的突然変異誘発を実施した。
【０１３６】
LVL318(pelBシグナルペプチド-MD-PE-GG-PilA)を作製するために、鋳型としてのLVL315とプライマーCAN678およびCAN679ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)を用いてPilA遺伝子とGGHHHHHHアミノ酸残基に対応するDNA配列(配列番号3)との間に停止コドンを組込む部位特異的突然変異誘発を実施した。
【０１３７】
LVL702(LVL291ΔQ)を作製するために、鋳型としてのLVL291ベクターならびにプライマーCAN1517およびCAN1518を用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施した。VLV291配列上の位置23のアミノ酸Qに対応する3個のヌクレオチドの欠失を5'プライマー中に組込んだ。LVL702とLVL291との唯一の差異は、LVL291配列上の位置23のアミノ酸Qの欠失である。NdeIおよびHindIII制限部位を、それぞれ5'および3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３８】
LVL735(LVL317ΔQ)を作製するために、鋳型としてのLVL317ベクターならびにプライマーCAN1517およびCAN1519を用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施した。VLV317配列上の位置23のアミノ酸Qに対応する3個のヌクレオチドの欠失を5'プライマー中に組込んだ。LVL735とLVL317との唯一の差異は、LV317配列上の位置23のアミノ酸Qの欠失である。NdeIおよびHindIII制限部位を、それぞれ5'および3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【０１３９】
LVL736(LVL291+SA)を作製するために、LVL291配列上のアミノ酸22と23との間にアミノ酸SおよびAを付加する部位特異的突然変異誘発を実施した。LVL291を鋳型として、プライマーCAN1531およびCAN1532ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)と共に用いた。
【０１４０】
LVL737(LVL291+A)を作製するために、LVL291配列上のアミノ酸22と23との間にアミノ酸Aを付加する部位特異的突然変異誘発を実施した。LVL291を鋳型として、プライマーCAN1529およびCAN1530ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)と共に用いた。
【０１４１】
LVL738(LVL291ΔQIQ)を作製するために、LVL291配列上のアミノ酸23〜25のアミノ酸Q、IおよびQを欠失させる部位特異的突然変異誘発を実施した。LVL291を鋳型として、プライマーCAN1523およびCAN1524ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)と共に用いた。
【０１４２】
LVL739(LVL291ΔQIQK)を作製するために、LVL291配列上のアミノ酸23〜26のアミノ酸Q、I、QおよびKを欠失させる部位特異的突然変異誘発を実施した。LVL291を鋳型として、プライマーCAN1525およびCAN1526ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)と共に用いた。
【０１４３】
LVL740(LVL291ΔQIQKA)を作製するために、LVL291配列上のアミノ酸23〜27のアミノ酸Q、I、Q、K、Aを欠失させる部位特異的突然変異誘発を実施した。LVL291を鋳型として、プライマーCAN1527およびCAN1528ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Stratagene Division)と共に用いた。
【０１４４】
LVL778 (LVL736 Δ6xHisタグ)、LVL779 (LVL737 Δ6xHisタグ)、LVL780 (LVL738 Δ6xHisタグ)、LVL781 (LVL739 Δ6xHisタグ)およびLVL782 (LVL740 Δ6xHisタグ)を作製するために、それぞれ、鋳型としてのLVL736、LVL737、LVL738、LVL739およびLVL740ベクターを、プライマーCAN1669およびCAN543と共に用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施した。6xHisタグの欠失は、C末端配列のアミノ酸配列GGHHHHHH(配列番号3)に対応する。この欠失を3'プライマーに組込んだ。NdeIおよびHindIII制限部位を、ぞれぞれ5'および3'プライマー中に組込んだ。次いで、作製されたPCR産物をpET-26b(+)クローニングベクター(NOVAGEN(登録商標))中に挿入した。
【表４】
2014512365.tif 000039
2014512365.tif 000040
2014512365.tif 000041
【０１４５】
形質転換
大腸菌BLR(DE3)または大腸菌HMS(DE3)細胞を、CaCl2で処理した細胞を用いる標準的な方法に従ってプラスミドDNAを用いて形質転換した(Hanahan D. << Plasmid transformation by Simanis. >> In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。簡単に述べると、BLR(DE3)またはHMS174(DE3)コンピテント細胞を、氷上で穏やかに解凍した。約4μlのプラスミド(10〜100ng)を、50〜100μlのコンピテント細胞を用いて混合した。その後、この処方物を氷上で30minインキュベートした。形質転換反応を実施するために、処方物を42℃で45秒間熱パルスした後、氷上で2分間インキュベートした。約0.5mlのSOC培地(異化代謝産物抑制超最適培地)を形質転換細胞に添加し、細胞培養液を37℃で1時間インキュベートした後、50μg/mlカナマイシンを含むLuria-Bertani(LB)寒天上に塗布した。約100μlの形質転換細胞培養液を塗布し、37℃で一晩インキュベートした。
【０１４６】
BLR(DE3)：BLRは、BL21のrecA-誘導体(F-ompT hsdSN(rB-mB-)gal dcm(DE3)である。組換えタンパク質の発現のために用いられたこの大腸菌株は、プラスミドモノマー収率を改善し、反復配列を含有する標的プラスミドの安定化を支援するか、またはその産物はDE3プロファージの喪失を引き起こし得る(Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44)。大腸菌BLR(DE3)の詳細な遺伝子型は、NOVAGEN(登録商標)により公開されている(F- ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcmΔ(srl-recA)306::Tn10(TetR)(DE3)。
【０１４７】
HMS174(DE3)：HMS174株は、K-12バックグラウンド中のrecA突然変異を提供する。BLRと同様、これらの株は、生成物がDE3プロファージの喪失を引き起こし得る特定の標的遺伝子を安定化させることができる。大腸菌HMS174(DE3)の詳細な遺伝子型は、NOVAGEN(登録商標)により公開されている(F-recA1 hsdR(rK12-mK12+)(DE3)(Rif R)。
【０１４８】
BLR(DE3)を用いる産生およびHisタグ付構築物の特性評価を、実施例3〜実施例6に記載する
【実施例３】
【０１４９】
振とうフラスコを用いるタンパク質発現
一般に、組換えプラスミドで形質転換された大腸菌BLR(DE3)を接種した1個の集密寒天プレートを剥ぎ取り、培養培地中に再懸濁し、これを用いて800mlのLBブロス(Becton, Dickinson and Company)±1%(重量/体積、w/v)グルコース(Laboratoire MAT、カタログ番号：GR-0101)および50μg/mlカナマイシン(Sigma)に接種して、0.1〜0.2のO.D.600nmを得た。培養液を250RPMで撹拌しながら37℃でインキュベートして、約0.8のO.D.600nmを達成した。
【０１５０】
次いで、1mlの各培養液を収集し、14000RPMで5分間遠心分離し、上清およびペレットを別々に-20℃で凍結した。
【０１５１】
約0.8のO.D.600nmで、BLR(DE3)培養液を冷却(-20℃、20分または4℃、1時間、好ましくは、4℃で1時間)した後、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG；EMD Chemicals Inc.、カタログ番号：5815)を添加し、250RPMで撹拌しながら37℃で16、22および30℃で一晩、好ましくは22℃で一晩インキュベートすることにより組換えタンパク質の発現を誘導した。誘導期間の後、培養液を14000RPMで5分間または6000RPMで15分間遠心分離し、上清(培地画分サンプル)およびペレット(可溶性および不溶性画分を含有する)を、-20℃で別々に凍結した。
【０１５２】
これらの条件をペリプラズムタンパク質発現のために用いる。
【実施例４】
【０１５３】
振とうフラスコ、細胞ペースト、Hisタグ付構築物を用いるタンパク質精製
誘導後に得られたそれぞれの細菌ペレットを、500mMのNaCl、10mMのイミダゾールおよびRoche COMPLETE(登録商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(1錠/500mMのNaClを含有する50mlのHEPESバッファー、Roche COMPLETE(登録商標)ULTRA錠、Roche Diagnostics Corporation)を含有する20mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー(pH8.0)中に再懸濁した。
【０１５４】
あるいは、20〜50mMのビシンバッファーを、NaClを含有するHEPESバッファーの代わりに用いることができる。例えば、20mMのビシンバッファーを用いることができる。細菌を、Constant System 1.1KW 2 x 30000PSI(ポンド/平方インチ)を用いて溶解した。可溶性(上清)および不溶性(ペレット)成分を、4℃で20min、20000gで遠心分離することにより分離した。
【０１５５】
6-Hisタグ付タンパク質を、PROFINA(商標)タンパク質精製プロトコル(Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いて固定金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)上で天然条件下で精製した。可溶性成分を、細菌再懸濁に用いられるのと同じバッファーで予め平衡化させた5mlのHis Trapカラム(Bio-Rad Laboratories, Inc.)上にロードした；可溶性成分を最大5ml/minで添加した(「流出液画分」をもたらす)。カラム上にロードした後、カラムを10倍カラム容量の同じバッファーで、10ml/minの速度で洗浄した(「洗浄画分#1」をもたらす)。500mM NaClおよび20mMイミダゾールを含有する20mMビシンバッファーまたは20mM HEPESバッファー(pH8.0)を用いる2回目の洗浄を行った(「洗浄画分#2」をもたらす)。500mM NaClおよび250mMイミダゾールを含有する2倍カラム容量の20mM HEPESバッファーまたは50mMビシンバッファー(pH8.0)を用いて10ml/minの速度で溶出を実施した(「溶出画分」をもたらす)。
【０１５６】
タンパク質の純度を改善するために、IMACからの陽性溶出画分をプールし、カルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(NaCl 137mM、KCl 2.7mM、Na2HPO4 8.1mM、KH2PO4 1.47mM、pH7.4)中で予め平衡化させたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(GE HealthcareからのHILOAD(商標)SUPERDEX(商標)200 26/60)上にロードした。溶出画分からのサンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分析した。サンプルをCentricon 10000MW(Millipore)を用いて濃縮した。
【０１５７】
タンパク質濃度を分光計を用いて決定した。
【実施例５】
【０１５８】
Hisタグ付構築物のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析ならびに非hisタグ付LVL317およびLVL318構築物のSDS-PAGE分析
可溶性および不溶性画分の調製
例えば、誘導後の1mlの培養液(例えば、上記の実施例3を参照されたい)を、14000RPMで2min遠心分離した。ペレットを40μlのBUGBUSTER(登録商標)タンパク質抽出試薬(NOVAGEN(登録商標)、EMD4 Biosciences, Merck)を用いて再溶解し、細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液を室温で10min、回転プラットフォーム上でインキュベートした。次いで、細胞懸濁液を14000RPMで2min遠心分離して、可溶性画分を分離した。得られたペレット(不溶性画分)を、70μlの脱イオン水、5μlのジチオトレイトール(DTT)1Mおよび25μlのNUPAGE(登録商標)LDS(ドデシル硫酸リチウム)サンプルバッファー4X(INVITROGEN(商標))を用いて再溶解した。可溶性画分(再溶解したペレットの細胞懸濁液に由来する上清)を30μlの脱イオン水、5μlのDTT 1Mおよび25μlのLDSサンプルバッファー4Xに添加した。
【０１５９】
培地画分の調製
例えば、培地画分を調製するために、遠心分離後の誘導された全細胞培養液からの100μlの上清(例えば、上記の実施例3を参照されたい)を、500μlのRC試薬I(Bio-Rad Laboratories, Inc.)を添加することにより濃縮した；サンプルを混合し、室温で1minインキュベートした。次いで、500μlの試薬II(Bio-Rad Laboratories, Inc.)をサンプルに添加し、混合した。この処方物を14000RPMで10min遠心分離した。ペレットを28μlの脱イオン水、2μlのDTT 1Mおよび10μlのLDS SB 4Xを用いて再溶解した。
【０１６０】
精製画分の調製
例えば、精製タンパク質(例えば、実施例4に記載のように得られた)を、70μlのサンプル、5μlのDTT 1Mおよび25μlのLDSサンプルバッファー4Xを添加することによりSDS-PAGE分析のために調製した。
【０１６１】
SDS-PAGE分析およびニトロセルロース膜への転移
SDS-PAGE分析およびニトロセルロース膜への転移を、NUPAGE(登録商標)Bis-Tris 4-12%ゲルを用いて製造業者の推奨(Invitrogen)に従って行った。サンプル、バッファーおよび移動条件の調製を、供給業者により推奨される条件下で行った。
【０１６２】
一例においては、ゲルに、70μlの精製タンパク質画分、5μlのDTT 1Mおよび25μlのLDS SB 4Xを含むマスターミックスからの20μlのサンプルをロードした。
【０１６３】
サンプルをNUPAGE(登録商標)Bis-Tris 4-12%ゲル上で泳動した後、タンパク質をニトロセルロース膜に転移した。
【０１６４】
ニトロセルロース膜を、3%ミルク/PBS1X新鮮溶液を用いて37℃、60RPMで30分間遮断した。遮断インキュベーションの後、3%ミルク/PBS 1X新鮮溶液中1:1000の希釈度で、37℃、60RPMで1時間、一次抗体(6X His Tag(登録商標)抗体、Abcam PLC、カタログ番号：ab9108)を添加した。その後、0.02%ポリソルベート20(例えば、TWEEN(商標)20)/PBS 1Xを用いて室温でそれぞれ5分間、膜を3回洗浄した。3%ミルク/PBS 1X新鮮溶液を用いて1:14000の希釈度で、二次抗体(アルカリホスファターゼ(AP)ウサギ抗IgG(H+L)ウサギ、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)を添加した。膜を37℃、60PRMで1時間インキュベートした。その後、0.02%ポリソルベート20(例えば、TWEEN(商標)20)/PBS 1Xを用いて室温で5分間、膜を3回洗浄した後、膜を5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム(例えば、Sigma-Aldrich(登録商標)からのBCIP(登録商標)/NBT、1錠/10ml水)に曝露した。
【０１６５】
融合タンパク質構築物LVL291、LVL268およびLVL269の誘導された細菌抽出物のSDS-PAGEについては図1を参照されたい。不溶性画分(I)、可溶性画分(S)および培養培地画分(M)を、LVL291、LVL268およびLVL269について、誘導(ind)の前後にロードした。
【０１６６】
融合タンパク質構築物LVL291、LVL268およびLVL269の精製抽出物に関するSDS-PAGEおよびウェスタンブロットについては図2を参照されたい。流出液画分(Ft)、洗浄画分(W)および溶出画分(E)を、LVL291、LVL268およびLVL269の精製のためにロードした。抗hisタグを用いて抽出物を精査した。
【０１６７】
融合タンパク質構築物LVL291およびLVL315の誘導された細菌抽出物および精製抽出物のSDS-PAGEについては図3を参照されたい。培養培地画分(M)、可溶性画分(Sol)、不溶性画分(Ins)、流出液画分(Ft)、洗浄画分#1(W1)、洗浄画分(W2)および溶出画分(E)を、LVL291およびLVL315についてロードした。
【０１６８】
融合タンパク質構築物LVL312の誘導された細菌抽出物および精製抽出物のSDS-PAGEについては図4を参照されたい。培養培地画分(M)、可溶性画分(Sol)、不溶性画分(Ins)、流出液画分(Ft)、洗浄画分#1(W1)、洗浄画分(W2)および溶出画分(E)を、LVL312についてロードした。
【０１６９】
融合タンパク質構築物LVL291、LVL702、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739、LVL740およびpET26bベクター(陰性対照)の誘導された細菌抽出物に由来する可溶性画分のSDS-PAGEについては図25を参照されたい。(a)実験1、(b)実験2、(c)実験3。PE-PilA融合タンパク質を矢印で示す。
【０１７０】
実験1、2および3に由来する可溶性画分中の融合タンパク質の平均バンドパーセンテージについては図26を参照されたい。
【０１７１】
ぞれぞれ図5および図6におけるSDS-PAGE分析で用いられたLVL317およびLVL318細菌抽出物を、一般的には上記のように調製した。
【０１７２】
図5。融合タンパク質構築物LVL317の誘導された(1mMおよび10μMのIPTG)細菌抽出物のSDS-PAGE。誘導の前(NI)および後(In)に由来する抽出物、可溶性画分(S)、不溶性画分(I)である。
【０１７３】
図6。融合タンパク質構築物LVL318の誘導された(1mMおよび10μMのIPTG)細菌抽出物のSDS-PAGE。誘導の前(NI)および後(In)に由来する抽出物、培養培地画分(M)、可溶性画分(S)、不溶性画分(I)である。
【０１７４】
SDS-PAGEにより分離されたタンパク質を、イモビリン-P膜に転移させた。クマシーブルー染色されたタンパク質バンドを切り出し、シークエネーターリアクタ中に入れた。Applied Biosystems PROCISE(登録商標)タンパク質配列決定装置、モデル494-cLCを用いて、製造業者のプロトコルに従って配列決定を実行した。
【表５】
2014512365.tif 000042
【実施例６】
【０１７５】
LVL291融合タンパク質特性評価
LVL291の物理特性：LVL291におけるPEおよびPilAの折畳みならびに融点
円偏光二色性：
二次構造の分析
円偏光二色性(CD)を用いて、構造非対称性に起因する左回り偏光対右回り偏光の吸収における差異を測定することによりタンパク質の二次構造組成を決定する。遠UV領域(190〜250nm)におけるCDスペクトルの形状および規模は、タンパク質がβシート、αへリックスまたはランダムコイル構造を示すかどうかによって異なる。所与のタンパク質サンプル中のそれぞれの二次構造型の相対量を、参照スペクトルとの比較によって算出することができる。
【０１７６】
遠UVスペクトルを、178から250nmまで0.01cmの光学経路を用いて、Jasco J-720分光偏光計上で1nmの解像度およびバンド幅で測定する。セルの温度を、Peltier thermostated RTE-111セルブロックにより23℃で維持する。測定の間、10L/minの窒素流を維持する。
【０１７７】
結果：
PE(構築物pRIT16762由来)、PilA(構築物pRIT16790由来)およびPE-PilAタンパク質について得られた遠UV CDスペクトルは、αおよびβ構造の混合物を含有する折畳まれたタンパク質に特徴的であるが、PEはPilAおよびPE-PilAよりもαへリックスが有意に多い(図7、PE、PilAおよびPE-PilA融合タンパク質のCDスペクトル)。
【０１７８】
キメラタンパク質中で一度一緒に結合したPEおよびPilAの個々のタンパク質の折畳みの完全性を評価した後、両方の間の可能な相互作用を検証するために、スペクトルの差異を算出した。
【０１７９】
・PEおよびPilA遠UVスペクトルを組合せた場合、得られるスペクトルはPE-PilAキメラ(chimer)のスペクトルと重なる(図8、PEおよびPilA CDスペクトルの組合せ)。この結果は、PE-PilAキメラが個々の成分中で検出される全ての二次構造を含有することを示唆する。それはまた、タンパク質の融合物が個々の成分の二次構造に対して大きな影響を有さず、その結果として、PEおよびPilAの折畳みが、タンパク質が分離しているにしろ、融合物中にあるにしろ、有意に異ならないことも示唆する。
【０１８０】
融点の評価：
融合物中での発現が個々のタンパク質の熱力学的特性に対する影響を有するかどうかを評価するために、PE、PilAおよびPE-PilAの融点を、円偏光二色性による温度と共にαへリックスのデフォールディングをモニターすることにより評価した。
【０１８１】
αへリックスの存在は、222nmでの円偏光二色性シグナルにおける最小値を特徴とし、温度上昇の間の222nmでのCDシグナルの有意な増加は、タンパク質変性を示唆するものである。タンパク質が二次構造の喪失を受ける温度の決定により、タンパク質の半分がその構造を喪失した温度に対応する融点(Tm)の決定が可能になる。
【０１８２】
温度対CD 222nmプロットから得られた熱変性曲線上での変曲点の同定により、融点を決定することができる。
【０１８３】
・遠UV CDにより決定されたPilAおよびPEの融点は、それぞれ52℃および68℃である(図9、PilAの熱変性曲線；図10、PEの熱変性曲線)。
【０１８４】
・PE-PilA融合タンパク質は、48℃および71℃での2つの異なるTmを示す(図11、PE-PilA融合タンパク質の熱変性曲線)。これらの値は、PEおよびPilAタンパク質はキメラ中に結合した場合、依然として独立して折畳まれることを示し、それらが分離しているにしろ、融合物中にあるにしろ、類似する温度でデフォールディングすることを示している。48℃でのPilA部分のデフォールディングが沈降を引き起こさないか、または71℃でのPEのTmに影響しないという観察は、融合物内のPEとPilAとの相互作用が最少であり、それらが互いに主な観察可能な影響を有さないことを強く示唆する。タンパク質の融点は、バッファー組成または相互作用分子の存在などの様々な外部条件に対して感受性である；PEとPilAとの融合時に観察される主要でない変化は、多くの構造の保存およびそれらが一緒に結合した場合にPEとPilAの両方の特性の保存を強く示唆する。
【実施例７】
【０１８５】
発酵プロセス
本発明の融合タンパク質は、当業者には公知の方法により調製することができる。
【実施例８】
【０１８６】
PE、PilAおよびLVL317のタンパク質精製
pRIT16762からのPEタンパク質精製：
pRIT16762発現ベクターを作製するために、シグナル配列(pelB)とPEの間の6個のアミノ酸残基を欠失させるためにBamHIおよびNcoI制限酵素を用いてpRIT16711ベクターを消化した。得られたベクターをpRIT16712と命名した。このベクター中には、シグナル配列pelBとPEとの間に3個のアミノ酸：MDPが存在する。第2のステップにおいて、部位特異的突然変異誘発を行って、プライマーMnoNTHi-44およびMnoNTHi-45(表4に記載)ならびにQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technokogies, Stratagene Division)と共に鋳型としてpRIT16712を用いてアミノ酸配列をMDPからQIQに変化させた。
【０１８７】
PE QIQ(pRIT16762構築物に由来する)を含有する大腸菌BLR(DE3)のワーキングシードを-80℃から解凍し、215RPMでの撹拌下、37℃で一晩インキュベートすることによりLBブロス中の100mlの前培養液を調製した。一晩インキュベートした後、800mlのLB APSを含有する8個のフラスコに、12.5mlの前培養液を接種し、OD600を約0.06で測定した。培養液を振とうしながら37℃で3hインキュベートした。約0.9のOD600で、1mMのIPTGを添加して、誘導を開始した。誘導の間に、培養液を振とうしながら22℃で19hインキュベートした。誘導後、OD600は約2.2であった。細胞培養液を、1Lのボトルの中に入れた1Lの遠心分離袋に移し、6,000xg、4℃で30分間遠心分離し、上清を廃棄した。1mlアリコートの誘導前後の培養液および上清をさらなる分析のために保持した。
【０１８８】
PE QIQで誘導されたBLR(DE3)の溶解
遠心分離袋を遠心分離ボトルから取り出し、開けて、ペレットを袋からビーカーに放出した。8つのペレットを一緒に引き出し、100mlの結合バッファー(20mM HEPES、10mMイミダゾール、500mM NaCl、pH8.01)中に再懸濁した。PE QIQ構築物を含有する大腸菌BLR(DE3)を、Constant Systems Ltd.からのTS Series Bench Top細胞破壊装置で破壊した(1x30kPsi；1x15kPsi)。溶解物を6000RPM、4℃で30分間遠心分離した。上清を保持し、IMACカラム上にロードした。
【０１８９】
PE QIQのIMAC精製
IMACカラム(BioRad, Bio-Scale Mini Profinity IMACカートリッジ5ml)を、5ml/minで5CVの結合バッファー(20mM HEPES、10mMイミダゾール、500mM NaCl、pH8.01)を用いて平衡化させた。100mlの溶解物上清を2.5mL/minでIMAC上にロードした。流出液を将来の分析のために50ml画分中に収集した。カラムを3CVの結合バッファーで洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。未結合のタンパク質を含有するサンプルを、50mlのチューブ中の15mlの1アリコートに収集した。カラムを2CVの洗浄バッファー(20mM HEPES、20mMイミダゾール、500mM NaCl、pH8.01)で洗浄し、96穴プレート中2ml画分に収集した。次いで、結合したタンパク質を、6CVの100%溶出バッファー(20mM HEPES、250mMイミダゾール、500mM NaCl、pH8.01)で溶出した。溶出したタンパク質を、96穴プレート中の2ml画分に収集した。洗浄と溶出を5ml/minで実施した。
【０１９０】
PE QIQのIMACプール上に対するサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
SECカラム(GE healthcare, HILOAD(商標)26/60 SUPERDEX(商標)75 prep grade, 60cm高、約319ml容量)を、3CVのSECバッファー(20mM HEPES、150mM NaCl、pH8.49)で平衡化させた。11mlのIMAC溶出液を、2.5ml/minの流速でカラム上にロードした。2ml画分を、0.3CVから0.9CVまで収集した。2回の泳動を実施した後、画分をSDS-PAGEにより分析した。Prot Eタンパク質を含有する2回の泳動からの画分を一緒にプールした(「SECプール」、約48mlの総量)。500mMのアルギニンをSECプールに添加した。
【０１９１】
上記のSECプロトコルで作製されたPE QIQプールされたサンプルの用量
SECプールを、製造業者のプロトコルに従ってBio-Rad RC DC(商標)キットからのRCDC(還元剤および界面活性剤互換)法を用いて投与した。
【０１９２】
それぞれの試験サンプルおよび標準物について、25μLをマイクロ遠心管に2回分配した。125μLのBio-Rad RC Reagent Iを各チューブに添加した；各チューブをボルテックスし、室温で1分間インキュベートした。125μLのBio-Rad RC Reagent IIを各チューブに添加する；各チューブをボルテックスした後、14,000xgで5分間遠心分離する。チューブを清潔な吸着ティッシュペーパー上に反転させることにより上清を廃棄し、チューブから液体を完全に排水させた。25.4μLの試薬A(1mlの試薬Aあたり20μLの試薬Sを混合することにより既に調製されたもの)を各チューブに添加する；各チューブをボルテックスし、室温で5分間、または沈殿が完全に溶解するまでインキュベートする。次のステップに進む前にボルテックスする。200μLのDC試薬Bを各チューブに添加し、すぐにボルテックスする。室温で15分間インキュベートする。96穴プレートに全てのサンプルを移し、750nmでの吸光度を読み取って、それぞれの未知のタンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定する。
【０１９３】
ProtE濃度は1.069mg/mlであった。
【０１９４】
PilA Hisタグ付タンパク質精製：
PilAを、以下の一般的手順に従って精製した：
PilAまたはその断片をコードする構築物を含有する大腸菌細胞を、BUGBUSTER(登録商標)およびBENZONASE(登録商標)ヌクレアーゼ(NOVAGEN(登録商標))、例えば、10mlのBUGBUSTER(登録商標)および10μlのBENZONASE(登録商標)ヌクレアーゼ中に懸濁する。細胞溶解物を回転プラットフォーム上で、例えば、15分間、室温で混合する。細胞溶解物を、4℃で、例えば、16,000gで20分間遠心分離する。タンパク質を含有する上清を、Ni NTA HIS BIND(登録商標)樹脂を含有するNi NTAカラムに添加し、4℃で、例えば、1時間混合する。カラムは、2mlのNi NTA HIS BIND(登録商標)樹脂(NOVAGEN(登録商標))および10mlの1X結合バッファー(NOVAGEN(登録商標)のNi-NTAバッファーキットから)からなってもよい。次いで、カラムの流出液を収集する。樹脂を、例えば、300mM NaCl、50mM NaH2PO4、25mMイミダゾン、pH8.0を含有する1X洗浄バッファーで2回洗浄する。洗浄液を重力流により収集する。タンパク質を、1X溶出バッファー、例えば、300mM NaCl、50mM NaH2PO4、250mMイミダゾン、pH8.0を用いてカラムから溶出させる。結合バッファーを用いる透析によりタンパク質をさらに精製し、上記のようにNi NTAカラム上で再泳動することができる。
【０１９５】
PilAのトロンビン切断
次いで、PilAを室温で16h、トロンビン(1/50希釈)と共にインキュベートして、ヒスチジンタグを除去する。
【０１９６】
トロンビンで切断されたPilA上に対するサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
SECカラム(GE healthcare, HILOAD(商標)26/60 SUPERDEX(商標)75 prep grade, 60cm高、約319ml容量)を、5CVのSECバッファー(20mM HEPES、150mM NaCl、pH8.52)で平衡化させた。約10mlの切断されたPilAを、2.5ml/minの流速でカラム上にロードした。2ml画分を0.3CVから0.9CVまで収集した。2回の泳動を実施した後、画分をSDS-PAGEにより分析した。切断されたPilAタンパク質を含有する2回の泳動に由来する画分を一緒にプールした(「SECプール」、約52mlの総量)。
【０１９７】
PilA、SECプールの用量
SECプールを、上記のRCDC法を用いて投与した。切断されたPilAの濃度は、5.37mg/mlであった。
【０１９８】
PBS 1x pH7.4を用いるPilA SECプールの透析(透析因子=1600)およびRCDCによる用量
RCDCにより決定された透析後の濃度は、3.0mg/mlであった。
【０１９９】
LVL317の精製
浸透圧ショック
LVL317融合タンパク質は細菌ペリプラズム中で発現およびプロセッシングされるため、タンパク質を浸透圧ショックにより抽出した。
【０２００】
4Lの発酵培養液からのLVL317を含有する凍結された(-20℃)収穫された大腸菌B2448細胞ペーストをプールし、24mM Tris-HCl、16%(w/v)スクロース、9.9%(w/v)グルコース、10mM EDTA、pH8.0からなる最終容量4Lの高張バッファー中に再懸濁した。懸濁液を、RW 16ベーシックスターラー上に設置された3刃プロペラを用いて、中速で、室温で30min穏やかに混合した。懸濁液を室温で30分間、15,900xgで遠心分離した。上清(SN1)をゲル分析のために保持した。
【０２０１】
得られたペレットを、高張溶液；38mM MgCl2中に再懸濁し、室温で30min混合した。混合物を室温で30分間、15,900xgで遠心分離し、抗原を上清(SN2)中に回収した。
【０２０２】
600ml/minの流速で、0.45/0.2μmのポリエーテルスルホンSartorius Sartopore 2 MidiCapフィルターを通す濾過により、SN2の清澄化を実施した。
【０２０３】
SN2を20mM NaH2PO4-Na2HPO4、pH7.0を用いて1:3に希釈し、pHを必要に応じて7.0に調整し、600ml/minの流速で、0.45/0.2μmのポリエーテルスルホンSartorius Sartopore 2 MidiCapフィルターを通す濾過により別の清澄化を実施した。
【０２０４】
SP SEPHAROSE(商標)Fast Flow(SP FF)クロマトグラフィー
希釈/濾過されたSN2を、2CVの20mM NaH2PO4/Na2HPO4バッファーpH7.0で平衡化させた14cm ID(内径)x 20cm長のカラム(カラム容量3100ml)中の強酸性カチオン交換樹脂(SP SEPHAROSE(商標)FF-GE Healthcare)上にロードし、捕捉した。5CVの20mM NaH2PO4/Na2HPO4バッファーpH7.0でカラムを洗浄した後、抗原(LVL317内に含まれる)を、同じ洗浄バッファー中、最大100mMまでNaClの濃度を増加させることにより溶出させた。
【０２０５】
典型的なSP SEPHAROSE(商標)Fast Flowクロマトグラムについては図12を参照されたい。
【０２０６】
Q SEPHAROSE(商標)Fast Flow(Q FF)クロマトグラフィー
SP FF溶出液中に存在する抗原を、20mM Tris pH8.5で1:4に希釈し、必要に応じてpHを8.5に調整し、2CVの20mM TrisバッファーpH8.5で平衡化させた114cm ID x 11.8cm長のカラム(カラム容量1800ml)中の強塩基性アニオン交換樹脂(Q SEPHAROSE(商標)FF-GE Healthcare)に通過させた。抗原を流出液画分中に回収した。
【０２０７】
典型的なQ SEPHAROSE(商標)Fast Flowクロマトグラムについては図13を参照されたい。
【０２０８】
濃縮、透析濾過、ポリソルベート80添加および滅菌濾過
抗原を含有するQ FF流出液を、クロマトグラムに基づいて0.7〜0.8mg/mlまで濃縮し、Pellicon-2(商標)10kDaカットオフ膜(Millipore)を用いて5DVの10mM KH2PO4/K2HPO4バッファーpH6.5で透析濾過した。
【０２０９】
5%保存溶液を用いて、ポリソルベート80(例えば、TWEEN(商標)80)を限外濾過保持液に添加し、4℃、130rpmで磁気撹拌装置を用いて30分間撹拌した。ポリソルベート80の最終濃度は0.04%であった。限外濾過保持液を、0.45/0.2μmの酢酸セルロース膜(Sartobran 300、Sartorius)を通す濾過により滅菌した。精製されたバルクを-20℃または-80℃で保存した。絶対タンパク質濃度を、0.737mg/mlでのAAA(アミノ酸分析)により測定した。
【実施例９】
【０２１０】
ポリソルベート80の使用
滴定実験により、滅菌濾過前に精製バルクに0.04%(w/v)の最終濃度でポリソルベート80、特に、TWEEN(商標)80を添加することにより、繊維状粒子形成および凝集が軽減されることが示された。
【０２１１】
DSC分析に従って、TWEEN(商標)80は、-20℃での保存後ならびに4℃、-20℃および-80℃および37℃で4日間の保存後の凍結/解凍サイクル後に見られる構造変化の程度(30〜45℃)を減少させた。
【実施例１０】
【０２１２】
LVL317のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析：
NUPAGE(登録商標)、Bis-Tris 4-12%ゲルを、95℃で5min加熱した50mM DTTを含有するNUPAGE(登録商標)LDサンプル中の10μgのサンプルを用いて以下に記載のようにロードした(20μLのサンプルを、低濃度を有するサンプルのためにロードした)。移動：NUPAGE(登録商標)MES泳動バッファー中、室温(RT)で200ボルトで35分間。インスタントブルー(Novexinカタログ番号ISB01L)中で2時間ゲル染色し、水中で一晩脱色した。
【０２１３】
レーン内容：
1: MW標準(10μL)
2: 開始(全画分)(10μg)
3: SN1濾過なし(10μg)
4: SN2濾過なし(10μg)
5: 抽出なし(10μg)
6: SP FFロード(10μg)
7: SP FF流出液(6.9μg)
8: SP FF洗浄(20μL)
9: SP FF溶出液 (10μg)
10: SP FFストリップ(10μg)
11: Q FFロード(8.9μg)
12: Q FF溶出液(9.8μg) 
13: Q FFストリップ(4.8μg)
14: 0.04% TWEEN(商標)80混合前のTFF保持液(10μg)
15: 0.04% TWEEN(商標)80混合した濾過しない精製バルク(10μg)
16: 0.04% TWEEN(商標)80混合した滅菌濾過した精製バルク(10μg)
17: 0.04% TWEEN(商標)80混合した滅菌濾過した精製バルク(20μg + 混合した大腸菌細胞溶解物Rix (1μg)) 
18: 大腸菌細胞溶解物Rix (2μg) 
19: 大腸菌細胞溶解物Rix (1μg) 
20: 大腸菌細胞溶解物Rix (0.5μg)。
【０２１４】
PE-PilA融合タンパク質の精製プロセスからの進行中サンプルのSDS-PAGEについては図14を参照されたい。
【０２１５】
ウェスタンブロットのために、タンパク質を、NUPAGE(登録商標)転移バッファー+20%メタノール、0.1%SDS中、30ボルトで4℃で一晩、ニトロセルロース膜上に移した。膜を50mM Tris、150mM NaCl pH7.4 + 5%無脂肪乾燥ミルクで1時間遮断し、ブロッキングバッファー中に希釈したウサギポリクローナル一次抗体(抗Prot-E 1/50000および抗大腸菌(BLR)1/1000)中で2時間インキュベートし、50mM Tris pH7.4 + 0.05%Tween20中で5分間、3回洗浄し、二次抗体(ブロッキングバッファー中で1/5000に希釈されたヤギ抗ウサギコンジュゲートアルカリホスファターゼ)中で1時間インキュベートし、洗浄バッファー中で5分間、3回洗浄し、BCIP/NBT基質(10mlあたり1錠)中で発色させた。全てのインキュベーションを、膜あたり25ml中で行った。
【０２１６】
PE-PilA融合タンパク質からの精製プロセスの進行中サンプルのウェスタンブロットについては図15を参照されたい。ウサギポリクローナル抗PEを用いてブロットした。
【０２１７】
レーン内容：
1: MW標準(10μL)
2: 開始(全画分)(10μg)
3: SN1濾過なし(10μg)
4: SN2濾過なし(10μg)
5: 抽出なし(10μg)
6: SP FFロード(10μg)
7: SP FF流出液(6.9μg)
8: SP FF洗浄(20μL)
9: SP FF溶出液 (10μg)
10: SP FFストリップ(10μg)
11: Q FFロード(8.9μg)
12: Q FF溶出液(9.8μg) 
13: Q FFストリップ(4.8μg)
14: 0.04% TWEEN(商標)80混合前のTFF保持液(10μg)
15: 0.04% TWEEN(商標)80混合した濾過しない精製バルク(10μg)
16: 0.04% TWEEN(商標)80混合した滅菌濾過した精製バルク(10μg)
17: 0.04% TWEEN(商標)80混合した滅菌濾過した精製バルク(20μg + 混合した大腸菌細胞溶解物Rix (1μg)) 
18: 大腸菌細胞溶解物Rix (2μg) 
19: 大腸菌細胞溶解物Rix (1μg) 
20: 大腸菌細胞溶解物Rix (0.5μg)。
【０２１８】
PE-PilA融合タンパク質からの精製プロセスの進行中サンプルのウェスタンブロットについては図16を参照されたい。ウサギポリクローナル抗大腸菌(BLR)を用いてブロットした。
【０２１９】
レーン内容：
1: MW標準(10μL)
2: 開始(全画分)(10μg)
3: SN1濾過なし(10μg)
4: SN2濾過なし(10μg)
5: 抽出なし(10μg)
6: SP FFロード(10μg)
7: SP FF流出液(6.9μg)
8: SP FF洗浄(20μL)
9: SP FF溶出液 (10μg)
10: SP FFストリップ(10μg)
11: Q FFロード(8.9μg)
12: Q FF溶出液(9.8μg) 
13: Q FFストリップ(4.8μg)
14: 0.04% TWEEN(商標)80混合前のTFF保持液(10μg)
15: 0.04% TWEEN(商標)80混合した濾過しない精製バルク(10μg)
16: 0.04% TWEEN(商標)80混合した滅菌濾過した精製バルク(10μg)
17: 0.04% TWEEN(商標)80混合した滅菌濾過した精製バルク(20μg + 混合した大腸菌細胞溶解物Rix (1μg)) 
18: 大腸菌細胞溶解物Rix (2μg) 
19: 大腸菌細胞溶解物Rix (1μg) 
20: 大腸菌細胞溶解物Rix (0.5μg)。
【０２２０】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロットの図面に関するコメント：PE-PilA融合タンパク質は30kDaに移動する。浸透圧ショックによる抽出は、細菌ペリプラズム中で発現およびプロセッシングされた融合タンパク質を抽出し、細菌からの汚染を減少させた。高張処理の間に少量の融合タンパク質が喪失する(レーン3)。高張処理によって少ない割合が抽出されず、細胞と結合したままである(レーン5)。SP FF流出液中(レーン7)および両カラムの細長い画分中(レーン10および13)で少量が喪失する。細長い画分の全量は少ないため、融合タンパク質の喪失は有意ではない。分解したバンドは細長い画分中では可視的であるが、最終生成物中では可視的ではない。大腸菌宿主細胞タンパク質からの有意な汚染は精製バルク中にはない(レーン16)。
【０２２１】
LVL735およびLVL778の分析により、LVL317と同様のプロフィールが得られた。
【実施例１１】
【０２２２】
PE、PilAおよびLVL317に関する融点データ
PE-PilA融合非Hisタグ付タンパク質（LVL317)の温度遷移を、上記のように精製された、PE hisタグ付(実施例8に記載のもの)および切断されたPilA(実施例8に記載のもの)の両方の温度遷移と比較した。
【０２２３】
DSCの前に、PEおよびPilAを10mM K2HPO4/KH2PO4 pH6.5 + 0.04%Tween80(1:250のサンプル:バッファー体積比)中で一晩透析して、それらを融合タンパク質と同じバッファー中に入れた。透析後、BCAによりタンパク質濃度を測定し、300μg/ml(PE)および500μg/ml(PilA)に調整した。
【０２２４】
分析はMicroCal, LLC(GE Healthcareの部門)からのVP(商標)-DSC上で行った。最後の透析バッファーを参照として用いて、走査から差し引いた。DSCの走査速度は90℃/hであった。製剤化後の最終容器(FC)中での温度遷移を測定する能力を評価するために、融合タンパク質をFC濃度(60μg/ml)に希釈した。最終容器のデータは示さない。
【０２２５】
結果:
PE-PilA融合タンパク質ならびにPEおよびPilAタンパク質の温度遷移については、図17を参照されたい。曲線：PilA(1)、タンパク質E(Prot E、PE)(2)、希釈しないPE-PilA PB 737μg/ml(3)、およびFC濃度60μg/mlで希釈されたPE-PilA PB(4)。
【０２２６】
1-PilA                                           Tm:53℃
2-タンパク質E                                    Tm:63
3-希釈しないPE-PilA PB(精製バルク)737μg/ml      Tm1:53.7℃およびTm2:66.1℃
4-FC濃度60μg/mlで希釈されたPE-PilA PB          Tm1:53.2℃およびTm2:67.6℃。
【０２２７】
精製された融合タンパク質(LVL317)において、2つの遷移が検出された(曲線3および4)。
【０２２８】
PE-PilA融合タンパク質のTm1(53.7℃)はPilA遷移(53℃)と類似する。
【０２２９】
PE遷移(63℃)と比較してPE-PilA(66.1℃)においてTm2の有意なシフトがあった。両ドメインの融合物はPE断片を安定化すると考えられる。
【０２３０】
希釈されないものと比較した希釈された融合タンパク質におけるTm2のシフトは、濃度依存的である凝集に典型的な急な負勾配から生じる人工濃度である。
【０２３１】
LVL735およびLVL778の抗原折畳み分析はLVL317のものと類似していた。
【実施例１２】
【０２３２】
Balb/cマウスにおけるPE-PilA融合タンパク質構築物LVL291抗PilA免疫原性応答
AS03A中で製剤化された精製LVL291 PE-PilA融合タンパク質(異種シグナルペプチドを含まないLVL291融合タンパク質)に対する免疫応答を、Balb/cマウスにおいて評価した。動物(20匹のマウス/群)を、それぞれAS03A中で製剤化された、10μgのPE(ベクターpRIT16762由来)、PilA(ベクターpRIT16790由来)またはPE-PilAを用いて0、14および28日目に筋肉内経路により免疫した。対照群にはAS03Aのみをワクチン接種した。それぞれの抗原に対する抗体応答を、42日目に採取された個々の血清中で決定した。陰性対照については抗体応答は観察されなかった。図18に示される通り、PilAに対する抗体応答は、一価PilAで免疫したマウスにおける抗体応答と比較してPE-PilA融合物で免疫したマウスにおいてより高かった。PEに対する抗体応答は、融合タンパク質で免疫したマウスと一価PEで免疫したマウスにおいて類似していた。GMT=幾何平均力価。データを捕捉し、WINDOWS(登録商標)(Microsoft)の下で実行するSOFTMAX(登録商標)Pro Software(Molecular Devices)を用いて分析した;4パラメータの論理対数関数を用いて、標準曲線を算出した。4パラメータ論理対数関数は、高い正確度で、光密度対濃度(log)スケールでプロットした場合、顕著なS字状を示す参照血清の曲線を記載する。抗体濃度を、標準曲線の内挿によりそれぞれの希釈率のマウス血清サンプルで算出した。品質対照血清および未知の血清サンプル中の抗体は、参照の希釈曲線の実行範囲(10〜80%)内にある全ての希釈率に由来する値を平均することにより得られる。
【０２３３】
結果を図18に示し、これはBalb/cマウスモデルにおけるLVL291 PE-PilA融合タンパク質ならびに一価PEおよびPilAに対する抗体応答をグラフ化したものである。
【実施例１３】
【０２３４】
マウス鼻咽頭定着モデル、PE-PilAを用いる免疫化、NTHi株86-028NPおよびNTHi株3224Aを用いるチャレンジ
Balb/c雌マウス(20匹/群)を、LT(大腸菌の熱不安定毒素)と共に製剤化された6μgの精製されたPE-PilA融合タンパク質(86-028NPを用いるチャレンジのためにはLVL291；3224A株を用いるチャレンジのためにはLVL317)で0および14日目に、ならびにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の6μgの精製されたPE-PilA融合タンパク質で28日目に鼻内的に免疫した。対照マウス(20匹/群)にはLTのみをワクチン接種した。続いて、マウスを、5 x 106CFU(コロニー形成単位)の同種のNTHi株86-028NPおよび異種のNTHi株3224Aで鼻内的にチャレンジした。同種性および異種性を、マウスを免疫したNTHi株に対する参照により決定する。チャレンジの1および2日後に取り出した鼻腔中の細菌コロニーを計数した。D1=1日目。D2=2日目。
【０２３５】
PE-PilAワクチン接種は、チャレンジ後1日目および2日目に鼻咽頭中のNTHi株86-028NPおよび株3224Aの消失を増加させた。
【０２３６】
NTHi株86-028NPを用いて行った実験について：二元配置固定分散分析を、応答としての計数のlog10値を用いて実施し、固定因子は群(4レベル)および日(2レベル)であった。分散不均一性の仮定を拒絶し、不均一分散に関するモデルをデータに適合させた。2つの因子間には有意な相互作用は検出されなかった。融合物PE-PilA(マウス1匹あたり6μg)の群は、対照群(LT)と比較してCFUを有意に低下させた；幾何平均比は0.06に等しく、95%信頼区間は0.01、0.25であった。
【０２３７】
NTHi株3224Aを用いて行った実験について：三元配置固定分散分析を、応答としてのlog10値を用いて実施し、固定因子は群、日、および実験であった。Shapiro-WilkおよびLeveneの検定は正常性および分散の均一性の仮定を拒絶しなかった。2つの因子のいずれかの間または3つの因子の間には有意な相互作用は検出されず、主因子のみが分析において保持された。PE-PilA/LTは、対照群と比較してCFUを有意に低下させた；幾何平均比は0.11に等しく、95%信頼区間は0.02、0.61であった。
【０２３８】
マウス鼻咽頭におけるNTHi株86-028NP細菌消失に対するPE-PilA融合タンパク質ワクチン接種の効果については、図19を参照されたい。
【０２３９】
マウス鼻咽頭におけるNTHi株3224A細菌消失に対するPE-PilA融合タンパク質ワクチン接種の効果については、図20を参照されたい。
【実施例１４】
【０２４０】
マウス鼻咽頭定着モデル、PilAを用いる免疫化、NHTi株3219Cを用いるチャレンジ
雌のOF1マウス(20匹のマウス/群)を、LTと共に製剤化された3μgのPilA(ベクター16790由来)で0および14日目に、ならびにPBS中の3μgのPilAで28日目に鼻内的に免疫した。対照マウスにはLTのみをワクチン接種した。続いて、マウスを、5x106CFUのNTHi株3219Cで鼻内的にチャレンジした。チャレンジの3および4日後に取り出した鼻腔中の細菌コロニーを計数した。D3=3日目。D4=4日目。
【０２４１】
マウス鼻咽頭における細菌消失に対するPilAワクチン接種の効果については、図21を参照されたい。
【実施例１５】
【０２４２】
マウス鼻咽頭定着モデル、PEを用いる免疫化、NTHi株3224Aを用いるチャレンジ
Balb/c雌マウス(20匹のマウス/群)を、LTと共に製剤化された3μgのPE(ベクターpRIT16762由来)で0および14日目に、並びにPBS中の3μgのPEで28日目に鼻内的に免疫した。対照マウスにはLTのみをワクチン接種した。続いて、マウスを、5x106CFUのNTHi株3224Aで鼻内的にチャレンジした。チャレンジの3および4日後に取り出した鼻腔中の細菌コロニーを計数した。10匹のマウスを3日目(D3)に検査した。10匹のマウスを4日目(D4)に検査した。PEワクチン接種は、統計分析のためにDunn検定を用いた場合、チャレンジの4日後に鼻咽頭におけるNTHiの消失を有意に増加させた(図22)。
【０２４３】
マウスの鼻咽頭における細菌消失に対するPEワクチン接種の効果については、図22を参照されたい。
【実施例１６】
【０２４４】
ビブロネクチン結合、LVL317およびLVL735 PE-PilA融合タンパク質によるビブロネクチン結合の阻害
ビトロネクチンに結合する精製されたLVL317 PE-PilA融合タンパク質構築物中のPEの能力を評価した。マイクロタイタープレート(POLYSORP(商標)、Nunc、Thermo Fisher Scientific)を、PE(ベクターpRIT16762由来)または精製されたLVL317 PE-PilA融合タンパク質(10μg/ml)で被覆した。プレートを、NaCl 150mM-ポリソルベート20、0.05%(例えば、TWEEN(商標)20)で4回洗浄し、PBS-BSA 1%で1〜2時間遮断した。4回の洗浄後、ビトロネクチン(ヒト血漿由来ビトロネクチン、SIGMA-ALDRICH(登録商標))を添加し(10μg/ml)、2倍希釈し(12の希釈物)、プレートを室温で1hインキュベートした。次いで、プレートをNaCl 150mM-ポリソルベート20、0.05%(例えば、TWEEN(商標)20)で4回洗浄した。洗浄後、結合したビトロネクチンを、ペルオキシダーゼヒツジ抗ヒトビトロネクチン(US Biological)、次いでオルト-フェニレンジアミン/H2O2基質の添加を用いて検出した。発色はビトロネクチンに固定された抗体の量に正比例する。
【０２４５】
(a)ビトロネクチンに結合したLVL317 PE-PilA融合タンパク質、PilA=NTHi株86-028NP(pRIT16790について記載されたもの)に由来するPilA；PE=タンパク質E(pRIT16762について記載されたもの)ならびに(b)ビトロネクチンに結合したLVL317およびLVL735 PE-PilA融合タンパク質については、図23を参照されたい。
【実施例１７】
【０２４６】
ビブロネクチン結合、LVL291 PE-PilA融合タンパク質に対する抗体によるビブロネクチン結合の阻害
マイクロタイタープレート(POLYSORP(商標)、Nunc、Thermo Fisher Scientific)を、PE(ベクターpRIT16762由来)または精製されたLVL317 PE-PilA融合タンパク質(10μg/ml)で被覆した。プレートを、NaCl 150mM-ポリソルベート20、0.05%(例えば、TWEEN(商標)20)で4回洗浄し、PBS-BSA 1%で2時間遮断した。洗浄後、50μg/mlのビトロネクチン(ヒト血漿由来ビトロネクチン、SIGMA-ALDRICH(登録商標))を添加し、精製抗体抗PE-PilA(社内で製造および精製)を2倍連続希釈し、室温で1hインキュベートした。次いで、プレートをNaCl 150mM-ポリソルベート20、0.05%(例えば、TWEEN(商標)20)で4回洗浄した。洗浄後、結合したビトロネクチンを、ペルオキシダーゼヒツジ抗ヒトビトロネクチン(US Biological)、次いでオルト-フェニレンジアミン/H2O2基質の添加を用いて検出した。発色はビトロネクチンに固定された抗体の量に正比例する。
【０２４７】
PE-PilAに対するポリクローナル抗体によるPEへのビトロネクチン結合の阻害を観察した。
【０２４８】
PE-PilA融合タンパク質に対するポリクローナル抗体によるビトロネクチン結合の阻害については、図24を参照されたい。
【実施例１８】
【０２４９】
LVL291 PE-PilA融合タンパク質の抗原性、ELISA
精製されたLVL291 PE-PilA融合タンパク質を、対照として一価タンパク質を用いる抗原性試験において検証した。融合タンパク質を、配列番号4のアミノ酸22〜160をコードするPE遺伝子断片(pRIT16711について記載されたもの)またはNTHi株86-028NPに由来するPilA(ベクターpRIT16790由来)に対して生成されたポリクローナル抗体(ウサギおよびモルモット)を用いて展開させたサンドイッチELISAにおいて試験した。
【０２５０】
PilAまたはPEを100ng/mlで添加し、連続的に2倍希釈した。30分間インキュベートし、洗浄した後、結合した抗原を、PEまたはPilAで免疫した後に得られたウサギポリクローナル血清により検出した。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抗ウサギIg(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)、次いでオルト-フェニレン-ジアミン/H2O2基質の添加を用いて検出した。発色は存在する抗原の量に正比例する。吸光度の読み取り値を、マイクロタイタープレートについて分光光度計を用いて測定した。サンプルの抗原性を、完全長PEまたは完全長PilA参照抗原の曲線との比較により決定し、μg/mlで表す。参照は100%の抗原性であった。
【０２５１】
表6に認められるように、一価PEおよびPilA抗原と比較して精製されたLVL291 PE-PilA融合タンパク質について抗原性が観察された。
【表６】
2014512365.tif 000043
【実施例１９】
【０２５２】
LVL735 PE-PilA融合タンパク質の免疫原性
雌のBalb/cマウス(n=34)を、AS01EまたはAlPO4(リン酸アルミニウム)と共に製剤化された、1、0.2または0.04μgのPE-PilA融合タンパク質LVL317またはLVL735を含有する50μlのワクチン製剤で0、14および28日目に筋肉内経路により免疫した。PEおよびPilAに対する抗体応答を、42日目に採取された個々の血清中で決定し、PEおよびPilAに対するIgGレベルを測定し、μg/mlで表した。
【０２５３】
LVL317およびLVL735に対するPEおよびPilA抗体応答については、図27を参照されたい。GMC=幾何平均濃度。GMT=幾何平均力価。IC=信頼区間。
【実施例２０】
【０２５４】
分類不能型インフルエンザ菌の鼻咽頭定着のマウスモデルにおけるLVL735およびLVL317融合タンパク質の保護効果
雌のBalb/cマウスを、0.5μgの大腸菌不安定毒素(LT)と混合した5.8μgのLVL735またはLVL317を含有する10μlのワクチン製剤で0および14日目に鼻内的に免疫した。5.8μgの非アジュバント化LVL735またはLVL317の追加用量を、28日目に投与した。対照マウスには、0日目にLTのみを、28日目にPBSをワクチン接種した。動物を42日目に5x106cfuのNTHi 3224A株で鼻内的にチャレンジした。チャレンジの1および2日後に取り出した鼻腔中の細菌コロニーを計数した(n=10/時点)。鼻腔を培地中でホモジェナイズし、細菌の定量を実施する。結果はCFU/mlで良好に表される。
【０２５５】
分類不能型インフルエンザ菌の鼻咽頭定着のマウスモデルにおいて、細菌クリアランスにおけるLVL735およびLVL317ワクチン接種の効果については、図28を参照されたい。
【図１】
2014512365.tif 000049
【図２】
2014512365.tif 000050
【図３】
2014512365.tif 000051
【図４】
2014512365.tif 000052
【図５】
2014512365.tif 000053
【図６】
2014512365.tif 000054
【図７】
2014512365.tif 000055
【図８】
2014512365.tif 000056
【図９】
2014512365.tif 000057
【図１０】
2014512365.tif 000058
【図１１】
2014512365.tif 000059
【図１２】
2014512365.tif 000060
【図１３】
2014512365.tif 000061
【図１４】
2014512365.tif 000062
【図１５】
2014512365.tif 000063
【図１６】
2014512365.tif 000064
【図１７】
2014512365.tif 000065
【図１８】
2014512365.tif 000066
【図１９】
2014512365.tif 000067
【図２０】
2014512365.tif 000068
【図２１】
2014512365.tif 000069
【図２２】
2014512365.tif 000070
【図２３】
2014512365.tif 000071
【図２４】
2014512365.tif 000072
【図２５−１】
2014512365.tif 000073
【図２５−２】
2014512365.tif 000074
【図２５−３】
2014512365.tif 000075
【図２６】
2014512365.tif 000076
【図２７】
2014512365.tif 000077
【図２８】
2014512365.tif 000078
【配列表】
2014512365000001.app
【国際調査報告】
2014512365.tif 000079
2014512365.tif 000080
2014512365.tif 000081