(57)【要約】  本発明は、微細藻類、藍藻類及び／又はそれらの代謝産物の産生のためのプロセスに関する。本明細書には、少なくとも１種の代謝産物の産生を増強するために微細藻類又は藍藻類の培養物に適用される刺激の使用を含むプロセスが記載される。また、本明細書には、微細藻類及び／又は藍藻類の産生のためのプロセスであって、藻類／藍藻類培養物をプロセス用水原料で及び／又は約４００ｎｍ〜７００ｎｍの光波長のスペクトル内の光を発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）の下で増殖させる適応段階と、微細藻類又は藍藻類を、適応段階で使用されたのと同じプロセス用水原料で及び／又は同じ光条件下で増殖させる産生期と、を含むプロセスが記載される。本発明は特定の微細藻類株にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類及び／又は藍藻類における少なくとも１種の代謝産物の産生増強のためのプロセスであって、
（ｉ）産生期を通じて微細藻類又は藍藻類株を培養するステップと、
（ｉｉ）（ａ）約ｐＨ６以下のｐＨへのｐＨ低下、その後の約ｐＨ７以上のｐＨへのｐＨ上昇、及び（ｂ）少なくとも４００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を含む刺激に微細藻類又は藍藻類の培養物を曝露するステップと、
を含むプロセス。
【請求項２】
前記刺激は、約ｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨから約ｐＨ５〜ｐＨ６のｐＨへのｐＨ低下を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記刺激は、約５０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒から約４００〜２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒へのＬＥＤ送達照射量の増加を含む、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
産生期は指数増殖期に対応する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
産生期は、指数増殖を可能にする条件下での微細藻類又は藍藻類株の増殖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
産生期は、光バイオリアクターにおける微細藻類又は藍藻類株の増殖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
産生期は、ＰＡＲスペクトル４００〜７００ｎｍ内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光するＬＥＤの下での微細藻類及び／又は藍藻類株の増殖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記培養物は天然の太陽光に曝露されない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
微細藻類又は藍藻類の培養物を、指数増殖のピークで及び／又は定常増殖期の開始時に前記刺激に曝露する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記刺激はさらに炭素源の添加を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
ｐＨ低下はＣＯ２の添加によって開始される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
ｐＨは約３０分間〜約２時間で約ｐＨ５〜ｐＨ６のｐＨに下がり、前記期間は光照射量の増加に先行する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
ｐＨはｐＨ低下後に約ｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨに増加する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
微細藻類又は藍藻類の前記刺激への曝露に続いて、微細藻類又は藍藻類を代謝産物の回収前に約４８時間のさらなる期間培養する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
脂質の産生増強のためである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記脂質はエイコサペンタエン酸である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
炭水化物の産生増強のためである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記炭水化物は菌体外多糖である、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記微細藻類／藍藻類は緑色微細藻類／藍藻類である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記微細藻類／藍藻類は淡水微細藻類／藍藻類である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
微細藻類株は緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
微細藻類株はプレウロクロリス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ）科から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
微細藻類株はトラキジスカス種（Ｔｒａｃｈｙｄｉｓｃｕｓ  ｓｐ．）及びクロロギッバ種（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ｓｐ．）から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
微細藻類株はディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
藍藻類株はクロオコッカス（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２６】
藍藻類株はシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属又はシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｏｃｕｓ）属から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
微細藻類株は、受託番号ＣＣＡＰ  ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイ（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ａｌｌｏｒｇｅｉ）の株又はそれに由来する変異株である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２８】
微細藻類株は、受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）の株又はそれに由来する変異株である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２９】
微細藻類及び／又は藍藻類の産生若しくは増殖又はそれらに由来する少なくとも１種の代謝産物の産生のためのプロセスであって、
（ｉ）（ａ）微細藻類又は藍藻類をプロセス用水原料において培養し、プロセス用水原料で増殖可能な微細藻類又は藍藻類を選択するステップ、及び／又は（ｂ）微細藻類又は藍藻類を、約４００〜７００ｎｍの光波長のスペクトル内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）の下で培養するステップを含む適応段階と、
（ｉｉ）選択された（ｉ）の微細藻類又は藍藻類を、適応段階で使用されたのと同じプロセス用水原料で及び／又は適応段階で使用されたのと同じ光条件下で培養するステップを含む産生期と、
を含むプロセス。
【請求項３０】
プロセス用水のｐＨは約ｐＨ７〜ｐＨ９である、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
適応段階において温度は約２０℃〜２９℃に維持される、請求項２９又は３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
微細藻類及び／又は藍藻類を約４００ｎｍ〜７００ｎｍの光波長に曝露する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３３】
微細藻類及び／又は藍藻類を、約５００〜６６５ｎｍ、好ましくは約６６０ｎｍの赤色光のピーク、及び約４４０〜５００ｎｍ、好ましくは約４６０ｎｍの青色光のピークを発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）に曝露する、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３４】
微細藻類及び／又は藍藻類を、約５０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照射量レベルを有する光に曝露する、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３５】
適応段階は、微細藻類又は藍藻類株を少なくとも約３カ月間培養するステップを含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３６】
適応段階は、微細藻類又は藍藻類株を少なくとも６世代にわたって培養するステップを含む、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３７】
適応段階は、微細藻類又は藍藻類株を複数回継代培養するステップを含む、請求項３５又は３６に記載のプロセス。
【請求項３８】
微細藻類又は藍藻類を１カ月に１回継代培養する、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
産生期は、微細藻類又は藍藻類の適応株の光バイオリアクターにおける増殖を含む、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４０】
産生期は、指数増殖を可能にする条件下での微細藻類及び／又は藍藻類の適応株の培養を含む、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記培養物は天然の太陽光に曝露されない、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４２】
産生期は、適応期の増殖のために使用されたのと同じ照明条件下での微細藻類及び／又は藍藻類の適応株の培養を含む、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４３】
光は、約４００〜７００ｎｍの光波長のスペクトル内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）によって生じる、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
産生期の後には、代謝産物の産生増強を誘導する刺激への微細藻類又は藍藻類培養物の曝露を含むステップが続く、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記刺激は、（ａ）約ｐＨ６以下のｐＨへのｐＨ低下、その後の約ｐＨ７以上のｐＨへのｐＨ上昇、及び（ｂ）少なくとも４００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を含む、請求項４４に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記刺激は、約ｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨから約ｐＨ５〜ｐＨ６のｐＨへのｐＨ低下を含む、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記刺激は、約５０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒から約４００〜２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒へのＬＥＤ送達照射量の増加を含む、請求項４５又は４６に記載のプロセス。
【請求項４８】
微細藻類又は藍藻類の培養物を、該培養物が指数増殖のピークに達した時点で及び／又は定常増殖期の開始時に前記刺激に曝露する、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４９】
前記刺激はさらに炭素源の添加を含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５０】
ｐＨ低下はＣＯ２の添加によって開始される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５１】
ｐＨは約３０分間〜約２時間で約ｐＨ５〜ｐＨ６に下がり、前記期間は光照射量の増加に先行する、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５２】
ｐＨはｐＨ低下後に約ｐＨ７〜ｐＨ９に増加する、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５３】
微細藻類又は藍藻類の前記刺激への曝露に続いて、微細藻類又は藍藻類を代謝産物の回収前に約４８時間のさらなる期間培養する、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５４】
脂質の産生増強のためである、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５５】
前記脂質はエイコサペンタエン酸である、請求項５４に記載のプロセス。
【請求項５６】
炭水化物の産生増強のためである、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５７】
前記炭水化物は菌体外多糖である、請求項５６に記載のプロセス。
【請求項５８】
前記微細藻類／藍藻類は緑色微細藻類／藍藻類である、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５９】
前記微細藻類／藍藻類は淡水微細藻類／藍藻類である、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６０】
微細藻類株は緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門から選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６１】
微細藻類株はプレウロクロリス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ）科から選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６２】
微細藻類株はトラキジスカス種（Ｔｒａｃｈｙｄｉｓｃｕｓ  ｓｐ．）及びクロロギッバ種（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ｓｐ．）から選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６３】
微細藻類株はディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）から選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６４】
藍藻類株はクロオコッカス（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目から選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６５】
藍藻類株はシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属又はシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｏｃｕｓ）属から選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６６】
微細藻類株は、受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイ（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ａｌｌｏｒｇｅｉ）の株又はそれに由来する変異株である、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６７】
微細藻類株は、受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）の株又はそれに由来する変異株である、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６８】
藻類及び／又は藍藻類のバイオマスの産生を増強するために使用される、請求項２９〜６７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６９】
藻類及び／又は藍藻類のバイオマスはバイオ燃料の産生のためである、請求項６８に記載のプロセス。
【請求項７０】
藻類及び／又は藍藻類のバイオマスは土壌改良剤又はバイオ肥料としての使用のためである、請求項６８に記載のプロセス。
【請求項７１】
受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイ（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ａｌｌｏｒｇｅｉ）の株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物。
【請求項７２】
受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）の株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物。
【請求項７３】
商業的に有用な生体タンパク質、脂質並びにエイコサペンタエン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸等の代謝産物を含有する、プレウロクロリス科の微細藻類の産生増強のためのプロセスであって、緑藻植物門内にあり、プレウロクロリス科から選択される脂質に富む微細藻類株の、好ましくは光バイオリアクターにおける培養及び産生のために、最適化された光波長が使用されるプロセス。
【請求項７４】
使用済みプロセス用水、ＣＯ２等の産業副産物は、栄養素及び炭素を用いた増殖増強のために藻類を調整し／適応させるための栄養素及び炭素の再生利用供給源として使用される、請求項７３に記載のプロセス。
【請求項７５】
最適化された波長の光、プロセス用水及び栄養素添加の使用を含む、請求項７３又は７４に記載のプロセス。
【請求項７６】
藻類を適応刺激（選択されたＰＡＲ光波長及び光源、プロセス用水原料及び他の増殖培地構成要素）下に維持して藻類細胞の適応選択を継続させる、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７７】
エイコサペンタエン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸等の脂肪酸の産生のためのプロセスであって、プレウロクロリス科の藻類バイオマス並びにクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類株を調製するステップと、商業的に有用な副産物を脂質から単離するステップと、を含むプロセス。
【請求項７８】
選択された継続的光ＰＡＲ波長の存在下で光合成効率を調整することによって脂質プロファイルにおける特定の脂肪酸の産生を得るための、請求項７７に記載のプロセス。
【請求項７９】
光照射と共に増殖培地における栄養素レベルを調整することによって脂質プロファイルにおける脂肪酸の特異的産生を得、食品若しくは化粧品分野のいずれかのため又はバイオ燃料の産生のための製品／原料を用意するための、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８０】
藻類細胞の増殖プロファイルを改善するため及び／又は藻類細胞の代謝産物産生プロファイル（例えば脂肪酸プロファイル）を変更若しくは調節するためのプロセスであって、藻類細胞から代謝産物を回収する前に特定の条件への曝露を伴う複数回の継代培養を行って藻類細胞を前記特定の条件に適応させるステップを含むプロセス。
【請求項８１】
前記特定の条件は非適応藻類の増殖のために準最適である、請求項８０に記載のプロセス。
【請求項８２】
藻類細胞を（任意選択で約４００〜７００ｎｍの波長の）ＬＥＤ照明に適応させる、請求項８０又は８１に記載のプロセス。
【請求項８３】
藻類細胞を処理済みプロセス用水に適応させる、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８４】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されているプロセス。
【請求項８５】
受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイ（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ａｌｌｏｒｇｅｉ）の株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物。
【請求項８６】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されている微生物。
【請求項８７】
溶解したＣＯ２とＬＥＤにより供給される調整済み入射光エネルギーとの存在下での水性栄養素改良培地における微細藻類の培養によるＥＰＳの二段階連続産生のためのプロセスであって、
細胞分裂に好都合な増殖期からＥＰＳ産生に好都合な静止期に培養物を移行させることによってＥＰＳ産生が増強され、該プロセスは、
（ａ）連続モードで行われる第一段階において増殖期を実施するステップであって、第一段階では、新鮮栄養培地又は二次プロセス用水を供給して培養物を増殖させ、指数細胞増殖が維持されるステップと、
（ｂ）第一段階への新鮮栄養培地及びＣＯ２の供給と共に、調整済みＬＥＤから設定照射量レベルで調整済みＰＡＲ光の供給を継続しながら、培養物の一部を第一段階から区別された第二段階に移すステップであって、第二段階では、ＥＰＳ産生を増強するような条件を作り出すようにＣＯ２及び栄養素の供給が制限され、また、任意選択で、増殖期を継続するために新鮮栄養培地又はプロセス用水が第一段階に（任意選択で同時に）添加されるステップと、
を含むプロセス。
【請求項８８】
入射光エネルギーの照明率が第二段階よりも第一段階において高い、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
第一段階は培養容器中で実施され、該培養容器は、任意選択で３〜１１センチメートルの厚さを有する、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項９０】
第一段階において細胞密度をモニターするステップと、新鮮栄養培地を第一段階に添加するステップと、所定レベルを上回る第一段階における細胞密度の増加に応じて、前記所定レベルに細胞密度を維持するために第一段階から第二段階に培養物を移すステップと、をさらに含む、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
ステップ（ｂ）は、第一段階から第二段階に連続的に培養物を移し、それにより第一段階での細胞増殖と同時に第二段階反応タンクにおいてＥＰＳ産生が生じることによって実施される、請求項８７〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
ディクチオスファエリウム・クロレロイデス（任意選択でＡＬＧ０３株）又は同じ科の他の種の培養によってＥＰＳが産生される、請求項８７〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
光源に最も近い細胞への入射光エネルギーの照射率が第一段階において５０〜５００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の範囲内、第二段階において３０〜２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の範囲内である、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
第二段階での入射光エネルギーが主に４００〜７００ナノメートルの領域にエネルギー量を有する、請求項８７〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
根土壌改良剤として藻類バイオマスを使用するステップをさらに含む、請求項８７〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
バイオマスは地下細流灌漑システムを介して送達される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
請求項８７〜９６のいずれか一項に記載の方法により産生された藻類バイオマスを含む土壌改良剤。
【請求項９８】
請求項９７に記載の土壌改良剤を含む地下細流灌漑システム。
【請求項９９】
藻類ＥＰＳの産生のためのシステムであって、
藻類細胞の培養物を含有するように適合し、栄養培地及びＣＯ２を導入するための入口及び培養物を除去するための出口を有する第一段階反応チャンバーと、
チャンバーにおける細胞密度を感知し、それに応じた制御機能を生成するための手段と、
栄養培地及びＣＯ２の前記入口への導入並びに前記出口からの培養物の除去を制御するための前記制御機能に応答性の手段と、
第一段階反応チャンバーから培養物を受けるように適合した複数の第二段階反応チャンバーと、
第一段階反応チャンバーの出口から第二段階反応チャンバーへ培養物を連続的に移すための手段と、
を含むシステム。
【請求項１００】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されている方法。
【請求項１０１】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されている土壌改良剤。
【請求項１０２】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されているシステム。
【請求項１０３】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されている地下細流灌漑システム。
【請求項１０４】
受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）の株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物。
【請求項１０５】
添付の図面を参照して実質的に本明細書に記載されている微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類、藍藻類及び／又はそれらの代謝産物の産生のためのプロセスに関する。排他的ではないが、本発明は特に、少なくとも１種の代謝産物の産生を増強するために微細藻類又は藍藻類の培養物を刺激に曝露するプロセスに関する。本明細書にはまた、微細藻類及び／又は藍藻類の産生のためのプロセスであって、藻類／藍藻類培養物をプロセス用水原料で及び／又は約４００ｎｍ〜７００ｎｍの光波長のスペクトル内の光を発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）の下で増殖させる適応段階と、微細藻類又は藍藻類を、適応段階で使用されたのと同じプロセス用水原料で及び／又は同じ光条件下で増殖させる産生期と、を含むプロセスが記載される。
【０００２】
本発明は、脂質形成微細藻類又は藍藻類を好ましくは光バイオリアクターシステム、開放池又は他の培養方法において培養する方法を統合する。それは、藻類バイオマスの産生及びＥＰＡ又はバイオ燃料などの高価値副産物への転換のための統合された連続的なプロセスを提供する。本発明での使用のための特定の株も提供され、本明細書においてＡＬＧ０２と称される。
【０００３】
本発明は、独特の微細藻類株（ディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＡＬＧ０３）の菌体外多糖（ＥＰＳ）産生を増強するためのプロセスであって、微細藻類株は、限定されたＬＥＤ照明スペクトルを、光バイオリアクター（ＰＢＲ）内での増殖のための栄養素及びエネルギーとしての産業排出ＣＯ２及び廃水と共に使用する大規模産生のための培養に予め調整され／適応したものである、プロセスを提供する。また、嫌気性消化ユニット若しくはバイオエタノールプラントのための又はバイオガス産生のためのバイオマスとして、他の下流の目的のため、例えば、地下細流灌漑で灌漑される植物の根域での栄養素利用性及び土壌接着性を増強するために使用できる、炭水化物抽出前／後の藻類バイオマス産生のための統合された連続的なプロセスを提供する。本発明での使用のための特定の株も提供され、本明細書においてＡＬＧ０３と称される。
【発明の背景】
【０００４】
藻類は、地球上で最も速く増殖する生物の１つである。それらは、数時間以内に複製（異常発生）できる。それらは、淡水、廃水又は海水において増殖するためにＣＯ２と光のみを必要とする。付加的に、他の増殖増強化合物を含む産業プロセス用水において見出される栄養素（主に窒素及びリン酸）のレベルの上昇は、藻類によるバイオマス増殖を増加させ得る（ａ）。
【０００５】
藻類は、世界中で進行している研究において将来の燃料及び廃水処理解決の両方に関する標的となっている。これは、藻類燃料産生のプロセスにおいて藻類が産業資源からＣＯ２を捕捉でき、部分的に処理されたプロセス用水に保持される栄養素（及びいくつかの重金属）の捕捉に役立つためである（ｂ、ｃ）。
【０００６】
藻類及び藍藻類は、代謝産物、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、α及びγリノレン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等の脂肪酸の貴重な資源でもある。さらに、微細藻類及び藍藻類細胞外高分子物質（天然では多糖性）は、それらを生物工学的な観点から興味深いものにする特有の生化学的特性を示す。藍藻類は複合菌体外多糖を産生し、それらの応用は、食品業界及び非食品業界での食品コーティング、乳化剤、ゲル化剤、凝集剤、増粘剤及び水和剤を含む。医療での軟部組織接着剤における新規化合物の材料としての使用についても可能性がある（ｄ）。バイオレメディエーションの分野では、細胞外多糖類（ＥＰＳ）は、汚染された土壌及び水から（ｅ、ｆ）あるいは栄養素及び他の成分の廃水リサイクルにおいて毒性重金属を除去できる。
【０００７】
藻類及び藍藻類が多様な分野の技術において貴重な材料であることは上記から明らかであり、それ故、本発明者らはそのような微生物の増殖及び産生のための新規プロセスの開発に努めた。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第一の態様において、
微細藻類及び／又は藍藻類における少なくとも１種の代謝産物の産生増強のためのプロセスであって、
（ｉ）産生期を通じて微細藻類又は藍藻類株を培養するステップと、
（ｉｉ）（ａ）約ｐＨ６以下のｐＨへのｐＨ低下、その後の約ｐＨ７以上のｐＨへのｐＨ上昇、及び（ｂ）少なくとも４００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を含む刺激に微細藻類又は藍藻類の培養物を曝露するステップと、
を含むプロセスが提供される。
【０００９】
本発明の第二の態様において、
微細藻類及び／又は藍藻類の産生若しくは増殖又はそれらに由来する少なくとも１種の代謝産物の産生のためのプロセスであって、
（ｉ）（ａ）微細藻類又は藍藻類をプロセス用水原料において培養し、プロセス用水原料で増殖可能な微細藻類又は藍藻類を選択するステップ、及び／又は（ｂ）微細藻類又は藍藻類を、約４００〜７００ｎｍの光波長のスペクトル内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）の下で培養するステップを含む適応段階と、
（ｉｉ）選択された（ｉ）の微細藻類又は藍藻類を、適応段階で使用されたのと同じプロセス用水原料で及び／又は適応段階で使用されたのと同じ光条件下で培養するステップを含む産生期と、
を含むプロセスが提供される。
【００１０】
また、受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイ（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ  ａｌｌｏｒｇｅｉ）の株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物が提供される。受託番号ＣＣＡＰ  ８１７／１で寄託されたクロロギッバ・アロルゲイの株は、本明細書においてＡＬＧ０２とも称される。
【００１１】
さらに、受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデス（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）の株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物が提供される。受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下に寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデスの株は、本明細書においてＡＬＧ０３とも称される。
【００１２】
ここで提供されるプロセスは、商業的に有用な生体タンパク質、脂質並びにエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸等の代謝産物を含有する微細藻類の産生増強のためであり得る。プロセスは、緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門内にあり、プレウロクロリス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ）科から選択されるものなどの脂質に富む微細藻類株の、好ましくは光バイオリアクターにおける培養及び産生のために最適化された光波長を使用する。使用済みプロセス用水、ＣＯ２等の産業副産物は、栄養素及び炭素を用いた増殖増強のために藻類を調整し／適応させるための栄養素及び炭素の再生利用供給源として使用される。
【００１３】
また、藻類（特にディクチオスファエリウム・クロレロイデス）での商業的に有用な菌体外多糖の産生の最適化のための独特な２段階プロセスが提供され、これは特定の微細藻類株に応用され得る。プロセスは光バイオリアクター（ＰＢＲ）システムにおいて実施される。プロセスは、藻類を培養するために産業プロセス用二酸化炭素（ＣＯ２）／水を利用し、大規模化したＰＢＲシステムにおいて同様の条件下で増殖速度を増大させる。プロセスは、プロセス用水／ＣＯ２及びＬＥＤ照明の大規模使用のために生物を調整するために藻類の予備適応培養を使用する。これは、藻類が商業的使用のための菌体外多糖をより高いレベルで産生できるようにする。炭水化物を多く含む藻類バイオマスは、作物の灌漑において富栄養及び高炭素の肥料として又は代替的に下流でのエネルギー産生（バイオエタノール産生又は他のエネルギーバイオマスシステム、例えば嫌気性消化装置若しくは発酵容器）において使用され得る。
【００１４】
本発明は、調整されたＬＥＤ光の下で二次処理廃水材料において高速で増殖するように変化しているディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の適応株から菌体外多糖を高い収量で産生する新規プロセスを提供する。この処理は、増殖の遅滞期で観察された菌体外多糖の収量を３８％から７７％へ倍加する。高い割合の産生された多糖は、ポリマーが種々の使用のために抽出され得る下流プロセスに移動され得る。炭水化物抽出後に残った使用済みバイオマスは、動物飼料（バイオリアクターで純水が使用された場合）又はエネルギー産生（例えば、嫌気性消化、発酵プロセス又は熱分解システム）のいずれかのために使用され得る。
【００１５】
すなわち、本発明はまた、ディクチオスファエリウム科、特にディクチオスファエリウム属の藻類の特定の（単離された）株、より具体的にはディクチオスファエリウム・クロレロイデスの株に関する。株は、受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託され、２０１１年１月２５日に受理された。この株は、特定の代謝産物の産生において有用であることが本明細書において示される。
【００１６】
本発明は、地下細流灌漑システム（ＳＤＩ）を用いて、産生された藻類バイオマスを特定の土壌改良剤として使用する新規プロセスをさらに提供する。バイオマスは、通常の灌漑水と他の適合性化学物質との混合のために用意された灌漑保持タンクに通じる再調整水路内で増殖した。廃水及びプロセス用水から他の栄養素と共にリン酸及び硝酸を吸収している藻類細胞の送達は、植物の根域への「天然のスローリリース」肥料の送達に役立つ。それは、土壌中の炭素も増加させ、植物の発育している根の周辺の土壌粒子の粒団化に役立ち、乾燥地帯では重要である土壌浸食を抑制する。
【００１７】
以下の詳細な記載において明らかになるこれら及び他の目的は、予備調整／適応がなされた藻類株による菌体外多糖形成は、藻類株の前培養の操作及びＰＢＲでの増殖中の管理によって炭水化物に富むバイオポリマーの収量を倍加できるという本発明者らの発見によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＬＥＤ照明適応−ＦＡＭＥプロファイル。６サイクルの継代培養を伴ってＰＡＲ  ＬＥＤ照明（４００〜７００ｎｍ）に６カ月間予備曝露したセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）種（ＡＬＧ０５）の、蛍光照明と比較した調整済みＬＥＤ光の下での増強されたＨＰＬＣ  ＦＡＭＥプロファイル。ＨＰＬＣ（ＦＡＭＥ）プロファイルは、２４時間サイクルで６カ月間（継代培養６回）ＬＥＤ  ＰＡＲ照明のみを用いて培養した藻類株から得た。同じ照射量の蛍光照明（上図）で増殖させた同じ株と比較して高分子量脂肪酸（下図の矢印）が出現していることに注意されたい。
【図２】前培養による、処理済みプロセス用水での増殖増強。処理済みプロセス用水及び調整済みＰＡＲ  ＬＥＤ光（２７℃、２４時間照明）への６カ月間（６サイクル）の曝露を伴う前培養による、トラキジスカス種（Ｔｒａｃｈｙｄｉｓｃｕｓ  ｓｐ．）（ＡＬＧ０１）、クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＡＬＧ０４）及びセネデスムス種（ＡＬＧ０５）の増殖増大。適応細胞は、プロセスプラントからの水（二次処理済み）の中で６カ月間増殖させ、淡水プロセス用水で４週間ごとに再培養した。非適応細胞は、標準１００％ＺＢＢ増殖培地で培養し、４週間ごとに新たなＺＢＢ培地で再培養した。次いで、両方の株を（定常期まで）９日間、新たなプロセス用水で増殖させた。結果は、予備適応細胞によるプロセス用水環境及びＬＥＤ照明への明らかな適応を示す。
【図３】種々の株の脂質含有量。指数増殖期の株による炭水化物／脂質／タンパク質産生及びバイオマスの発熱量の比較。培養物は指数増殖期に回収された。
【図４】クロロギッバ種の株（ＡＬＧ０２）におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の産生。準最適増殖条件（ＣＯ２非添加又はＰＡＲ非照射）下で産生され、キャピラリー電気泳動法により分析されたバイオマス試料中の主な脂肪酸の含有量（％）。ＰＡＲ光源を使用し、ＣＯ２を添加して増殖させた上記株及びトラキジスカス種ＡＬＧ０１についての他の分析は、総脂肪酸含有量の３０〜３８％のＥＰＡ含有量を示す。分析では、顕著なレベルのパルミチン酸及びミリスチン酸が、制御されたＰＡＲ照明下で検出された。
【図５Ａ】本発明に関して実施された実験の結果を示すグラフであり、栄養素濃度と藻類株ディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の増殖との関係を示している。低栄養要求量。ボールドの基本培地での藻類の４日間の増殖は、藻類が最適光照射量下、２７℃での最適増殖のために比較的低レベルの栄養素を必要とすることを示す。
【図５Ｂ】本発明に関して実施された実験の結果を示すグラフであり、光レベルと藻類株ディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の増殖との関係を示している。増殖のためのＬＥＤ光照射量レベル。グラフは、藻類が２７℃、２５％ＢＢ培地中、７日間、低光量で最も増殖することを示す。
【図６】灌漑での使用のための、本発明の藻類バイオポリマー産生のためのシステムの概略図である。
【図７】ディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の連続的回収を示すグラフである。バイオマスは、ＰＢＲにおける光学濃度（６８０ｎｍ）の測定値として示され、５０％の割合での毎日の回収は、新たな増殖培地を継ぎ足した場合にディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の２４時間以内での同量のバイオマスの再増殖を可能にすることを示す。
【図８】廃水及びＬＥＤ照明への株の適応が非適応株と比較して増殖速度の増大をもたらすことを示す。廃水及び調整済みＰＡＲ  ＬＥＤ光（２７℃、２４時間照明）への６カ月間（６サイクル）の曝露による生理学的適応によるディクチオスファエリウム・クロレロイデスの増殖増大。
【図９】第二段階培養終了後のＥＰＳの倍加を示す（右図）。
【図１０】３種の生物の細胞の炭水化物／脂質／タンパク質含有量及び発熱量の比較を示す。ｌｏｇ期のディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３株による炭水化物／脂質／タンパク質産生及びバイオマスの発熱量の比較。培養物は指数増殖期に回収された。
【図１１】１２週間にわたる温室試験において痩せた砂質土でニラを生育させるために細流灌漑を使用した結果を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
第一の態様において、本発明は、
微細藻類及び／又は藍藻類における少なくとも１種の代謝産物の産生増強のためのプロセスであって、
（ｉ）産生期を通じて微細藻類又は藍藻類株を培養するステップと、
（ｉｉ）（ａ）約ｐＨ６以下のｐＨへのｐＨ低下、その後の約ｐＨ７以上のｐＨへのｐＨ上昇、及び（ｂ）少なくとも４００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を含む刺激に微細藻類又は藍藻類の培養物を曝露するステップと、
を含むプロセスを提供する。
【００２０】
本発明において、「培養」という語は、任意の好適な培地における少なくとも１種の微細藻類又は藍藻類株の増殖を意味するものとして使用される。そのような培地は、当業者に周知である標準的増殖培地、例えばボールドの基本培地又は等価物を含む。好ましい実施形態において、微細藻類又は藍藻類株はプロセス用水において増殖させる。ここで、「プロセス用水」は、産業システム及び家庭廃水から出るプロセス用水を含む。プロセス用水は、使用の前に処理されてもよく（例えば滅菌又は非滅菌）、栄養素レベルが標準的増殖培地において認められる範囲になるように栄養素を添加されてもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、培養は、バッチ、添加バッチ又は少なくとも部分的に（定常期前の）連続培養であってもよい。
【００２２】
産生期：
産生期における微細藻類又は藍藻類株の増殖は、典型的には指数速度で生じる。すなわち、いくつかの実施形態において、産生期は培養物の指数増殖期に対応する。
【００２３】
「ｌｏｇ期」又は「対数期」としても周知の「指数増殖期」は、微細藻類及び藍藻類を含む微生物のバッチ培養において細胞倍加によって特徴付けられる時期と定義される。単位時間当たりに生じる新たな生物の数は、既存の集団に比例する。増殖が制限されない場合、倍加は一定速度で継続し、細胞数及び集団増加速度の両方が連続的な期間ごとに倍加する。実際の増殖速度は、使用される微生物の株及び／又は増殖条件に応じて変動し得る。
【００２４】
産生期で使用される環境的及び培養条件は、使用される微細藻類又は藍藻類株の指数増殖を可能にするように特異的に選択され得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、指数増殖が終わり始める時点、定常期が始まる前、指数増殖期の終了時での微細藻類又は藍藻類株の細胞密度は、培養培地１ｍｌ当たり細胞１０８個以上であるべきであり、好ましくは１ｍｌ当たり細胞１０７〜１０８個であるべきである。培養物の最適増殖又は培養物の指数増殖を達成するために使用される培養条件は、
約４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長の連続的人工光、及び／又は
約５０μｍｏｌ／ｍ２／秒〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒の連続的人工光、及び／又は
約２０℃〜４０℃の温度、及び／又は
約５００ｍＶ〜８００ｍＶの酸素レベル、及び／又は
約ｐＨ６〜ｐＨ９のｐＨ
から選択され得る。
【００２６】
培養条件は、増殖させる微細藻類又は藍藻類株に応じて変動し得ることは当業者に理解される。本発明の特定の株についての特定の条件が本明細書に記載され、当業者に理解されるように、そのような条件は他の株への応用のための指標として使用され得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、微細藻類又は藍藻類株の産生期における培養又は増殖は光バイオリアクター（ＰＢＲ）において行われる。本明細書において、光バイオリアクターとは、リアクター内への光エネルギー投入を可能にするための少なくとも１つの光源を組み込んだバイオリアクターを意味する。好ましい実施形態において、微細藻類又は藍藻類は（外部）環境に対して閉じたシステムにおいて増殖させる。好ましい光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）及び特にＰＡＲ（４００〜７００ｎｍの光合成有効放射）光を発光するＬＥＤを含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＲは、バイオリアクターの中心から３６０度角照明を可能にするように設計され、それにより種々の藻類又は藍藻類株の光源周辺での増殖を最大化する（高度に調整された）ＬＥＤ光源を含むように構成され得る。好ましい実施形態において、光は、ＰＡＲスペクトル４００〜７００ｎｍ内に赤色及び青色の光の２つのピークを発光するＬＥＤによって発せされる。好ましい実施形態において、光は、約５００〜６６５ｎｍ、好ましくは約６６０ｎｍに赤色光のピーク及び約４４０〜５００ｎｍ、好ましくは約４６０ｎｍに青色光のピークを発光するＬＥＤによって発せされる。
【００２８】
産生期がＰＢＲにおいて実施される場合、微細藻類又は藍藻類株の密度は、産生期の開始時にＰＢＲの容積の１０％（ｖ／ｖ）以上であるべきである。同じ又は代替的な実施形態において、微細藻類又は藍藻類培養物は天然の太陽光に曝露されない。
【００２９】
刺激：
本発明のプロセスの第二ステップでは、微細藻類又は藍藻類の培養物を刺激に曝露し、ここで、刺激は、（ａ）約ｐＨ６以下のｐＨへのｐＨ低下、その後の約ｐＨ７以上のｐＨへのｐＨ上昇、及び（ｂ）少なくとも約４００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。
【００３０】
産生期における培養物のｐＨは、典型的には約ｐＨ７〜９の範囲にあり、それ故、刺激は、約ｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨから約ｐＨ３〜ｐＨ６、好ましくは約ｐＨ５〜ｐＨ６のｐＨへのｐＨ低下を含み得る。培養物のｐＨは低下してもよく（培養物の生存率が危険にさらされない限り）次に当業者に周知の任意の好適な手段によって増加してもよい。好ましい実施形態において、ｐＨは二酸化炭素、ＣＯ２の添加によって低下する。
【００３１】
産生期において培養物に送られる光照射量は、典型的には５０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒であり、したがって刺激は約５０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒から約４００〜２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を含み得る。光源は、好ましくは少なくとも１つのＬＥＤを含む、本質的にそれからなる又はそれからなる。
【００３２】
微細藻類又は藍藻類の培養物は、典型的には培養物が指数増殖のピークに達した時点で刺激に曝露する。このピークは定常期の開始直前に生じる。定常期は、微細藻類及び藍藻類を含む微生物のバッチ培養中の特定の時期であり、培養物の増殖速度が、典型的には栄養素の枯渇及び毒性産物の蓄積の結果として遅くなる時期である。この時期において、微生物の増殖速度は典型的には微生物の死滅速度と等しい。任意の微細藻類又は藍藻類の培養物が指数増殖のピークから定常期への移行を経ることは当業者に理解される。培養物は、指数増殖のピークの間の任意の時期に又は指数期から定常期への移行の際の任意の時期に刺激に曝露し得る。
【００３３】
微細藻類又は藍藻類の増殖速度は、例えば、細胞の計数などの試料採取技術を用いて又は培養物中の葉緑素のレベルを測定することによって産生期全体にわたってモニターされ得る。細胞数は、培養物の分光光度的試料採取（例えばＯＤ６８０ｎｍ付近で読み取ることによる）を用いて決定され得る。これらの測定は、指数増殖期、指数増殖のピーク、及び培養物が定常増殖期に入り始める時点を同定するために使用され得る。任意の好適な技術が使用され得る。
【００３４】
刺激は、約ｐＨ６以下のｐＨへのｐＨ低下、その後の約ｐＨ７以上のｐＨへのｐＨ上昇、及び少なくとも４００μｍｏｌ／ｍ２／秒への光照射量の増加を最少として含む。刺激はさらに炭素源の添加を含むことができ、ここで炭素源は種々の形態でのＣＯ２である。
【００３５】
好ましい実施形態において、ｐＨの低下及び続いての増加は光照射量の増加に先行する。ｐＨは、約３０分間〜約２時間の期間で、約ｐＨ６以下の、好ましくは約ｐＨ５〜ｐＨ６のｐＨに下がり得る。続いてｐＨは、約ｐＨ６〜ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨに増加し得る。ｐＨは、培養物の生存率を危険にさらなさない限り任意の好適な手段によって上昇し得る。一般にｐＨは刺激以前のレベルに戻される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、微細藻類又は藍藻類の培養物は、刺激への曝露開始後に、少なくとも約１２、２４、３６、４８時間などのさらなる増殖期間培養する。ｐＨが約３０分間〜２時間の期間低下し、続いて例えば刺激前のレベルに上昇する実施形態では、刺激への曝露後の培養期間は、最初のｐＨ低下から、又はｐＨが戻され続いて照射量が増やされた時から算出され得る。
【００３７】
代謝産物の産生：
微細藻類又は藍藻類株の刺激への曝露の１つの効果は、微細藻類又は藍藻類での特定の代謝産物の産生を誘導又は促進することである。本明細書において定義する刺激への特定の微細藻類及び／又は藍藻類株の曝露が特定の代謝産物の大量の産生を導き、その特定の代謝産物が使用される微生物の株に依存的であることが本発明者らによって注目されている。したがって、上記の特許請求するプロセスを実施する目的は、微細藻類及び／又は藍藻類の細胞において少なくとも１種の代謝産物の産生を増強することである。そのような代謝産物は、典型的には、培養物を刺激に曝露した後のさらなる増殖期間の後に回収される。代謝産物は、当業者に周知の任意の好適な手段（例えば、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．  １９５９  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７に記載の手段）を用いて回収、精製及び／又は分析され得る。
【００３８】
脂質も、当業界の標準的手法（例えば、超臨界ＣＯ２、種々の溶媒抽出、分留及びクロマトグラフィー）により、又は下記プロトコールにより回収／分析され得る。
ＧＣ−ＭＳ測定を使用する場合は、藻類生成物の試料２５ｍｇを内部標準と培養試験管中で混合する。メタノール中の０．５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌを添加し、試験管に栓をして１００℃、５分間加熱する。冷却し、２ｍｌ  ＢＦ３／メタノール試薬を添加し、試験管に栓をして混合し、１００℃、３０分間加熱する。冷却し、イソ−ヘキサン＋ＢＨＴの２ｍｌ、次いで飽和塩化ナトリウム５ｍｌ、試験管に栓をして３０秒間強く撹拌。室温に冷却し、層に分離させる。上部のイソヘキサン層を無水硫酸ナトリウムの短いカラムに通し、回収。水層をイソ−ヘキサン＋（ブチルヒドロキシトルエン）ＢＨＴ  ２ｍｌで抽出し、上部のイソヘキサン層を無水硫酸ナトリウムのカラムに通し、他の試料と共に溶媒を回収。カラムをイソ−ヘキサン＋ＢＨＴ  ２ｍｌで洗浄し、同じ試料試験管に入れた。
【００３９】
多糖類は、当業者が利用可能なクロマトグラフィー技術によって分析され得る。炭水化物及び糖アルコールの分析は、微細藻類バイオ−マス抽出物において高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ）に続いて電気化学的検出（ＩＰＡＤ）及び平行する質量分析検出によって分析され得る。好ましい実施形態において、試料抽出物は、ＭＳＱプラス質量分析器と連結したモジュラーＩＣＳ−５０００システムを用いて分析される。分析物は、均一溶媒条件を用いてカルボパック（ＣａｒｂｏＰａｃ）ＭＡ１カラムで分離される。分析的カラムの後に、カラム溶出物は分割され、半分は統合及びパルス電流測定（ＩＰＡＤ）がなされる電流測定セル中を通り、他の半分は膜に基づく脱塩デバイス（ＡＳＲＳ）を用いて連続的に脱塩される。次いで中和された溶出物は、それらのリチウム付加物としてのＭＳにおける炭水化物検出を促進するために塩化リチウムの水性溶液と混合される。
【００４０】
また、使用済みバイオマスは、反芻動物飼料、ウシ飼料、水産養殖、家禽飼料、バイオマスのバイオエタノール産生炭水化物画分及びタンパク質からの有用アミノ酸の抽出を含む種々の応用のために利用され得る。
【００４１】
本明細書に記載のプロセスは、微細藻類及び／又は藍藻類株に見出される任意の代謝産物の産生を増強するため使用され得る。本発明のいくつかの実施形態において、プロセスは、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、α及びγリノレン酸、ステアリン酸、アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸から選択される脂肪酸を含む脂質の産生の増強のために使用される。好ましい実施形態において、本発明のプロセスはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の産生を増強するためである。本明細書に記載のプロセスは、培養された微細藻類又は藍藻類株において望まれる脂肪酸プロファイルを得るために、例えばＥＰＡ産生株においてＥＰＡ産生を最適化するために特に使用され得る。本明細書に記載のプロセスの手段によって産生される脂肪酸は、例えば食品部門において、液体バイオ燃料産生のために、化粧品成分のために使用され得る。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、プロセスは炭水化物産生の増強のために使用される。好ましい実施形態において、本発明のプロセスは菌体外多糖（ＥＰＳ）産生の増強のためである。
【００４３】
微細藻類／藍藻類：
本発明のプロセスと併せて使用するための微細藻類又は藍藻類は、任意の好適な藻類又は藍藻類株から選択され得る。好適な微細藻類株は、緑色微細藻類；淡水微細藻類；緑藻植物門；プレウロクロリス科；トラキジスカス種；クロロギッバ（Ｃｈｌｏｒｏｇｉｂｂａ）種；及びディクチオスファエリウム・クロレロイデスから選択され得る。好適な藍藻類株は、クロオコッカス（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目；シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属又はシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｏｃｕｓ）属から選択され得る。
【００４４】
プロセスがエイコサペンタエン酸産生の増強のために使用される実施形態では、微細藻類株は、トラキジスカス種及びクロロギッバ種から選択されること、特に受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイの株（本明細書ではＡＬＧ０２とも称する。）又はそれに由来する変異株であることが好ましい。
【００４５】
プロセスが菌体外多糖産生の増強のために使用される実施形態では、微細藻類株がディクチオスファエリウム・クロレロイデスから選択されること、特に受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデスの株（本明細書ではＡＬＧ０３とも称する。）又はそれに由来する変異株であることは好ましい。
【００４６】
本明細書において、「変異株」とは、元来の微細藻類及び／又は藍藻類株由来の株であって、上記の本発明のプロセスによる刺激に曝露した場合に産生される代謝産物プロファイルに関連する特徴の範囲で元の株の特徴を保持している株を意味する。
【００４７】
本発明のプロセスと併せて使用するための微細藻類及び／又は藍藻類は、例えば、産生期において使用されるのと同じ培養条件下での最適増殖に基づいて予備選択され得る。上述のプロセスのステップに先行してもよいこの予備選択又は適応段階は、以下に記載の本発明の第二の態様に関してより詳細に記載される。以下に記載のすべての実施形態は、本発明の他の態様に適用可能である。
【００４８】
すなわち、本発明の第二の態様において、
微細藻類及び／又は藍藻類の産生若しくは増殖又はそれらに由来する少なくとも１種の代謝産物の産生のためのプロセスであって、
（ｉ）（ａ）微細藻類又は藍藻類をプロセス用水原料において培養し、プロセス用水原料で増殖可能な微細藻類又は藍藻類を選択するステップ、及び／又は（ｂ）微細藻類又は藍藻類を、約４００〜７００ｎｍの光波長のスペクトル内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）の下で培養するステップを含む適応段階と、
（ｉｉ）選択された（ｉ）の微細藻類又は藍藻類を、適応段階で使用されたのと同じプロセス用水原料で及び／又は適応段階で使用されたのと同じ光条件下で培養するステップを含む産生期と、
を含むプロセスが提供される。
【００４９】
適応：
プロセス用水原料は、産業プロセスシステム又は家庭廃水システムから供給されてもよい。窒素及びリン酸などの重要な藻類増殖栄養素は典型的には前記原料中に存在する。微量元素及びビタミンなどの他の藻類賦活物質が存在してもよい。食品、清涼飲料及び醸造所の部門は、そのような好適な多量のプロセス用水流を有する。他の栄養素が豊富でない淡水源も、栄養素が標準的増殖培地において使用されるレベルと同等まで添加される場合は使用することができる。
【００５０】
微細藻類又は藍藻類は、典型的には適応段階においては、プロセス用水原料で、
約４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長の連続的人工光、及び／又は
約５０μｍｏｌ／ｍ２／秒〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒の連続的人工光、及び／又は
約２０℃〜２９℃の温度、及び／又は
約ｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨ
を含む最適培養条件下で培養する。
【００５１】
プロセス用水は、例えば粒子を減少させるために予備調整され得る。適応段階における微細藻類又は藍藻類の増殖は、三角フラスコ（１００〜５００ｍｌ）又は調製用光バイオリアクターを用いて実施され得る。光はＬＥＤ源又は他の非天然光から発せられてもよい。好ましい実施形態において、光は、ＰＡＲスペクトル４００〜７００ｎｍ内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光するＬＥＤによって発せられる。さらなる好ましい実施形態において、光は、約５００〜６６５ｎｍ、好ましくは約６６０ｎｍの赤色光のピーク及び約４４０〜５００ｎｍ、好ましくは約４６０ｎｍの青色光のピークを発光するＬＥＤによって発せられる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、適応段階の目的は、プロセスの産生期で使用されるプロセス用水原料で増殖できる微細藻類又は藍藻類株を同定することである。
【００５３】
代替的又は付加的に、光は、産生期で使用される条件に微細藻類又は藍藻類を適応させる又は「調整」するために、好ましくは産生期における増殖を最適化するために使用され得る。好ましい実施形態において、適応段階は、ＰＡＲスペクトル４００〜７００ｎｍ内の赤色光及び青色光の２つのピークを発光するＬＥＤ下での藻類及び／又は藍藻類の増殖を含む。さらなる好ましい実施形態において、光は、約５００〜６６５ｎｍ、好ましくは約６６０ｎｍの赤色光のピーク及び約４４０〜５００ｎｍ、好ましくは約４６０ｎｍの青色光のピークを発光するＬＥＤによって発せられる。
【００５４】
適応段階は、少なくとも約２、３、４、５、６カ月間、好ましくは少なくとも約３カ月間、微細藻類又は藍藻類株を培養するステップを含み得る。適応段階は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８世代、好ましくは少なくとも約６世代、微細藻類又は藍藻類株を培養するステップを含み得る。微細藻類又は藍藻類を数カ月間又は少なくとも２世代増殖させる実施形態では、微細藻類又は藍藻類は継代培養してもよく、ここで、継代培養とは、培養物の一部又はすべてを新たな培養培地に移すことを意味する。好ましい実施形態において、微細藻類又は藍藻類は１カ月に１回又は４週間ごとに１回継代培養する。
【００５５】
上記適応段階により微細藻類又は藍藻類株が選択されると、プロセスの第二段階は、選択された微細藻類又は藍藻類を、適応段階において使用されたのと同じプロセス用水原料及び／又は同じ光条件下で培養するステップを含む産生期である。
【００５６】
「同じ」プロセス用水原料とは、適応段階における細胞の増殖のために使用された厳密に同じ培地よりはむしろ、適応段階で使用されたのと同じバッチ由来の（すなわち同じ特徴を有する）プロセス用水を意味する。
【００５７】
本発明の第二の態様の産生期は、第一の態様のプロセスについて記載した産生期の任意の実施形態により実施され得る。例えば、微細藻類又は藍藻類の適応株の増殖は、指数増殖を可能にする条件下で実施され得る。また、産生期における増殖は、上記の定義による光バイオリアクターにおいて好ましくは実施される。産生期で使用される条件は、適応段階で使用される条件を反映したものであり得る。すなわち、原料としてプロセス用水を利用することに加えて、適応は上述の追加的環境条件（光波長、照射量レベル、温度、ｐＨなど）に及んでもよい。より具体的には、適応は、本明細書に記載のＬＥＤ照明の使用であってもよい。好ましい実施形態において、適応は、ＰＡＲスペクトル４００〜７００ｎｍ内の赤色光及び青色光の２つのピークを発するＬＥＤ照明に対するものである。さらなる好ましい実施形態において、光は、約５００〜６６５ｎｍ、好ましくは約６６０ｎｍの赤色光のピーク及び約４４０〜５００ｎｍ、好ましくは約４６０ｎｍの青色光のピークを発光するＬＥＤによって発せられる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、産生期の後には、代謝物の産生を増強するための刺激への微細藻類又は藍藻類の培養物の曝露を含むステップが続く。本発明の第一の態様の内容において上記の刺激のすべての実施形態は、適宜変更を加えて本発明の第二の態様のプロセスに適用される。さらに本発明の第二の態様のプロセスによる使用のための微細藻類及び／又は藍藻類株は、既に上記の任意の微細藻類及び／又は藍藻類の門、目、科及び／又は種から選択され得る。
【００５９】
本発明の第二の態様のプロセスは、微細藻類及び／又は藍藻類のバイオマスの産生を増強するために使用され得る。そのようなバイオマスは、バイオ燃料、バイオディーゼル、ガソリン、灯油の生産などの用途で、あるいは、以下に記載の（例えば地下灌漑システムにおける）土壌改良剤又はバイオ肥料として使用される用途において使用され得る。代替的又は付加的に、プロセスは、脂質及び／又は炭水化物の産生の増強を含む代謝産物の産生のために使用され得る。好ましい実施形態において、プロセスは、エイコサペンタエン酸の産生の増強のためである。さらなる好ましい実施形態において、プロセスは、菌体外多糖の産生の増強のためである。
【００６０】
本発明のさらなる態様では、受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたクロロギッバ・アロルゲイの株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物が提供される。
【００６１】
さらなる態様では、受託番号ＣＣＡＰ２２２／９８の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託されたディクチオスファエリウム・クロレロイデスの株若しくはそれに由来する変異株である又はその識別特徴を有する微生物が提供される。
【００６２】
本発明は、プレウロクロリス科（例えば、トラキジスカス種、クロロギッバ種）の藻類由来の脂質並びにエイコサペンタエン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸等の代謝産物の産生のためのプロセスを提供する。すなわち、本発明は、本明細書に記載の脂質及び代謝産物を含有する藻類バイオマス生成物を産生するために使用されるバイオリアクター及び／又は他の培養条件のために準備された藻類培養物の適応細胞を準備及び選択するためのプロセスを提供する。特に、本発明は、脂肪酸を含有するいくつかの脂質の産生及び／又は収量の増大のためのプロセスを提供する。方法は、バイオディーゼル、ガソリン、灯油及び他の高価値化学物質の下流での産生のために光合成効率、栄養調整及び代謝活性を増大させることによって、プレウロクロリス科に属し、前述の脂質及び脂肪酸を含有する藻類を調製する方法を含み得る。また、本発明は、エイコサペンタエン酸形成藻類株において望まれる脂肪酸プロファイルを得るためのプロセスを提供する。このプロセスは、光照射量レベルの変更と共に増殖培地中のいくつかの栄養素（窒素及び硫黄を含む）レベルを調整することによって食品部門のためのエイコサペンタエン酸産生又は液体バイオ燃料産生のため若しくは化粧品成分のための飽和脂肪酸若しくは脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸）のいずれかの最適化を可能にする。本発明はまた、光合成効率及び代謝活性を増大させることによって前述の脂質及び脂肪酸の一部又はすべてを含有するクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を調製するための方法を提供する。本発明はさらに、連続光を用いて光合成有効放射（ＰＡＲ）波長内の選択されたバンドの存在下で光合成効率を調整することによって脂質中の脂肪酸の特異的産生を得るためのプロセスを提供する。
【００６３】
本発明はまた、プレウロクロリス科、特にクロロギッバ属の藻類の特定の（単離された）株、より具体的にはクロロギッバ・アロルゲイの株に関する。株は、受託番号ＣＣＡＰ８１７／１の下にＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａに寄託され、２０１１年１月２５日に受理された。この株は、特定の代謝産物の産生において有用であることが本明細書において示される。
【００６４】
本発明は、バイオディーゼル、ガソリン、灯油並びに他のそのような液体バイオ燃料及び高価値産業用化学物質の下流での産生に好適なエイコサペンタエン酸並びに前述の脂質、脂肪酸及びその代謝産物を含有する藻類バイオマス生成物の産生のためのプロセスであって、下記ステップを含むプロセスをさらに提供する。
ａ）調整された連続光ＰＡＲ波長及びプロセス用水ストレスを用いて、ＥＰＡに富むプレウロクロリス科を含む緑藻植物門内の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に属する藻類並びにクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類を単離、継代培養及び調製するために使用される上流培養期。プレウロクロリス科の藻類及びクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類は、同様の光放出及び水源を使用するバイオリアクターにおける大規模化のために現状で準備が整っている。結果は、栄養素を添加した標準水で、日光又は蛍光照明で増殖させた同じ培養物と比較して２倍に及ぶ増殖速度の増大が種々の株にわたって予測されることを示す。
ｂ）緑藻植物門プレウロクロリス科の藻類又はクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類を産業プロセス用水、＋／−栄養素（ＮａＮＯ３（０．２５ｇ／Ｌ）；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０７５ｇ／Ｌ）；Ｋ２ＨＰＯ４（０．０７５ｇ／Ｌ）；ＮａＣｌ（０．０２５ｇ／Ｌ）；ＫＨ２ＰＯ４（０．１７５ｇ／Ｌ）；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０（４．９８ｍｇ／Ｌ）；Ｈ２ＳＯ４（０．０１μｌ／Ｌ）；Ｈ３ＢＯ３（０．１１４２ｇ／Ｌ）；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００８８２ｇ／Ｌ）；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．００１４４ｇ／Ｌ）；ＭｏＯ３（０．０００７１ｇ／Ｌ）；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．００１５７ｇ／Ｌ）；Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ（０．０００４９ｇ／Ｌ）；ＥＤＴＡ（０．００５ｇ／Ｌ）；ＫＯＨ（０．０３１ｇ／Ｌ）を含む１００％標準ＢＢ増殖培地）中で増殖させ、連続流システム中において特定のＰＡＲ光線波長及び照射量レベルが指数増殖期におけるバイオマス生成物の設定比率での連日回収を可能にするように維持される光バイオリアクター期。前述の脂質、脂肪酸及びそれらの代謝産物並びに生体タンパク質を含み、プレウロクロリス科の藻類又はクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類のバイオマス生成物。バイオリアクターには、プロセス用水、又は次の回収前に藻類細胞密度を指数増殖段階に回復させるように栄養素で改良したプロセス用水が補充される。
【００６５】
一般に、藻類は、乾燥藻類の総重量と比較して重量比約７〜６０％の脂質含有量を有する。プレウロクロリス科の藻類の場合、エイコサペンタエン酸は、脂質中の総脂肪酸の２５〜４０％を占め、残りの脂肪酸は主に前述の飽和又は不飽和脂肪酸である。そのためプレウロクロリス科の藻類は、魚油由来の伝統的な材料よりも多いＥＰＡを含む。
【００６６】
本発明の実施形態において、プレウロクロリス科に含まれる脂質並びにエイコサペンタエン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸等の代謝産物は、増殖培地中で遊離脂肪酸として及び／又は元の状態のままで存在することが見出される場合があり、及び／又は、湿潤藻類バイオマス生成物及び／又は藻類破砕物及び／又は藻類から、凍結乾燥後又は風乾後に、好適な有機溶媒の存在下で抽出して及び／又は超音波処理して又は超臨界ＣＯ２を用いて得ることができる。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態では、増殖培地（再調整のための水又は栄養改良水を使用して）が藻類を含むバイオリアクターを流れる際に、藻類株に応じて異なる波長で作動するように設定された固有のパターンの赤色及び青色の光を発光するダイオード（ＬＥＤ）を含む、バイオリアクターの内側又は外側の調整された調光可能なＬＥＤ光に曝露する。ＬＥＤのアンギュレーション（ａｎｇｕｌａｔｉｏｎ）は、藻類の指数増殖期を促進及び維持するためにＰＢＲ内で増殖する藻類の培養物への最大照射送達のために最適化される。藻類バイオマスは、細胞密度についてだけでなく脂質／脂肪酸含有量についても標的レベルに達しているかを調べるためにモニターされる。次いで、バイオマスは脱水され、バイオ燃料又は高価値脂肪酸が抽出されるように好適な下流プロセスに送られる。残った使用済みバイオマスは動物飼料（バイオリアクターで純水が使用された場合）又は嫌気性消化装置（ＡＤ）若しくは熱分解システムにおけるエネルギー産生のいずれかのために使用され得る。
【００６８】
バイオリアクター：
本発明は、ソーラー、風、水、地熱、熱及び／又は他の再生可能エネルギーなどの標準的又は再生可能なエネルギーの任意の組み合わせを用いて、光バイオリアクターに動力を供給し、連続的で高い収量の藻類バイオマスを産生する、統合されたプロセスを提供する。効率的で費用効率が良い方法を使用することによって、藻類バイオマスは、バイオディーゼル、バイオ灯油、ガソリン、エタノール及び他の有用な副産物を産生するためにさらに精製される。
【００６９】
システムは、種々の藻類株の増殖を最大化するために設計された高度に調整されたＬＥＤ光源を包含する。システムは、種々の藻類株の増殖（光源の周辺で増殖する）を最大化するためにバイオリアクターの中心からの３６０度照明を提供するように設計された、高度に調整されたＬＥＤ光源を包含する。
【００７０】
エネルギー源：
システムは、ソーラー、風、水、地熱、熱及び／又は他の再生可能エネルギーなどのエネルギーを用いる自家動力式のものとすることができる。これらの種々のエネルギー源は、エネルギーを保存及び供給するために拡張可能な貯蔵設備（例えば蓄電池群）を使用する商業的動力管理システムを通じて管理される。
【００７１】
プロセスの温度は、２つの手段：産業システム又は家庭排水から必然的に生じ、サーモスタット若しくは熱交換によって制御された又は自動プロセス制御ユニットを通じて管理されたプロセス用水の供給を通じた水の加熱によって調節される。
【００７２】
低エネルギー光源：
プロセスは、標準的及び／又は再生可能エネルギー源の組み合わせによって動力を供給される多様な低電圧光（例えばＬＥＤや他の発光源）を使用し、ここで、光は、脂質又は他の商業的に有用な副産物を損なうことなく藻類の増殖を最適化するために調整される。
【００７３】
好ましい実施形態では、光線を発光する正確な角度を有し、光合成有効放射（ＰＡＲ）波長４００〜７００ｎｍ内の波長を網羅する光を発光する光のセットがＰＢＲの内部又は外部に設置される。これは、費用効率的産生速度でバイオマス増殖を最大化するために藻類を刺激するために役立つ。
【００７４】
藻類は、低いエネルギー投入量で最適に増殖できる株を得るために特定の光源及び波長、プロセス用水、温度並びにｐＨ管理を用いた先行の環境適応順化から選択された。
【００７５】
一実施形態において、本発明は、任意の光バイオリアクターシステム内で藻類ディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の菌体外多糖（ＥＰＳ）を増強するための新規プロセスを提供する。該プロセスは、（ａ）光合成有効放射（ＰＡＲ）波長内に調整したＬＥＤ照明及び産業プロセス用水（例えば二次処理済みプロセス用水）条件に株を適応させるための前培養ステップと、（ｂ）藻類に各日１〜２４時間のいずれかにわたって継続的な照明が提供されるように調整済みＬＥＤ  ＰＡＲ（光合成有効放射４００〜７００ｎｍ）照明が補充されたＰＢＲ内でＥＰＳ形成株を増殖させるステップと、（ｃ）収量の約５０％などの部分を指数増殖のピーク後に、ＥＰＳ形成を増強するために３〜４日間穏やかに通気する（ＣＯ２を付加しない周囲空気）定常照明タンクシステムに移すステップと、（ｄ）バイオポリマーの抽出のため又は、上記の他の使用のため若しくはエタノール発酵又は他のプロセス（例えば嫌気性消化又はバイオマスガス化）を介するエネルギー産生のために藻類ペーストを脱水するステップと、を含む。
【００７６】
本発明での使用に好適な微細藻類のゼラチン質コート株（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃｏａｔｅｄ  ｓｔｒａｉｎｓ）は、例えば、緑藻植物内のものであり、ディクチオスファエリウム科から選択される。
【００７７】
藻類の適応株：
ＥＰＳ産生に使用される微細藻類株は、標準的フラスコ培養で産業プロセス用水の不均一な供給において維持され、調整された光線パターンを有する低エネルギーＬＥＤ設備を介してＰＡＲ照明を供給される。光は、ＰＢＲ内で内部から又は外部から供給され得る。培養物は、廃水成分及びＬＥＤ照明に適応した細胞を選択するために毎月継代培養する。この表現型選択プロセスは、各継代培養でのＥＰＳ産生について確認するための評価ステップを含む。母培養物は、適応プロセスを継続するためにこれらの増殖条件下で維持される。
【００７８】
光バイオリアクター（「ＰＢＲ」）における藻類増殖：
微細藻類の産生のための小規模ＰＢＲを開発するために非常に多くの作業がなされてきた（ｇ）。商用規模ＰＢＲ（＞１００，０００Ｌ）は、大容量を有さねばならず、専有する空間の観点から小さな専有面積を有するべきである。付加的に透明な表面、高い物質移動速度を有さねばならず、多量のバイオマス収量を産生できなければならない。さらにＰＢＲのすべての設計は、微細藻類の個々の株の固有の要求を考慮すべきであり、維持に手がかからず頑丈であるべきである。
【００７９】
ＰＢＲは、屋外池増殖システムのための培養容器としても作動できることが示唆されている。通常屋外ＰＢＲは太陽光を用いて天然に照らされることを考慮すると、バイオマス産生力はその地方の一般的な年間を通じた環境条件に依存する。検査したほとんどの地域（ほとんど砂漠環境）では年間を通じて温度及び太陽光における季節変動があり、そのためそのような地域で年間を通じた藻類の屋外多量培養を実施することは困難である。公有地にはＰＢＲについて多くの設計があり、商業的に販売されており、学術論文には設計があるが、決定的な「最良事例」標準モデルは存在しない。
【００８０】
実施形態の第一のセットでは、日常的に細胞を排出又は回収するためのデバイスを有し、ＬＥＤ照明（内部から又は外部から）のＰＡＲ波長で１日の一部又は２４時間連続的に照らされ得る任意のＰＢＲ装置（エアリフト管状設計又は平らなタンク）が使用され得る。事前の計数により細胞数に相関し、ＰＢＲ試運転からピーク指数増殖の決定を可能にするＯＤ６８０ｎｍを測定するための付属のプロセス制御デバイスによって藻類増殖はモニターされる。システムは、種々の藻類株の増殖（光源の周辺で増殖する）を最大化するためにバイオリアクターの中心から３６０度角照明を提供するように設計され、高度に調整されたＬＥＤ光源の含有を包含する。
【００８１】
ピーク指数増殖に達すると、細胞の５０％は、付属の通気（周囲空気混合）及びＬＥＤ照明２４／７を有する別のバッチ保持タンクに毎日回収される。藻類株は、所定の条件下で３〜４日間保持され、タンクからの試料はＥＰＳ産生について顕微鏡下で毎日視覚的にモニターされる。これらの細胞は、炭水化物抽出又は既に記載の使用のいずれかのために脱水を介して最終的に抽出される。
【００８２】
光源：
藻類培養システムは、人工光、ソーラー光又は両方によって照らされ得る。閉鎖ＰＢＲにおける高バイオマス微細藻類産生を調節するために最も重要な要因の１つは、光照射量及び発せられる光スペクトルの質である。ＰＢＲが屋外に設置される場合、日中及び夏季に見られる高い光レベルに限定され得るが、これは地理的に変動する。天然の太陽光中の紫外線（「ＵＶ」）のレベルは、日中のいくつかの時点で藻類の光阻害を生じる可能性もあり、このため、人工光を使用するＰＢＲの潜在的調節を欠いている。
【００８３】
特定の光波長を供給できる１つの主な光源は、いくつかの主な照明製造者によって現在開発されている発光ダイオード（「ＬＥＤ」）の領域のものである。ＬＥＤは、エネルギーを節約する能力があり、非常に長い寿命を有する。それらの電気効率は熱生成を最小化することに役立つ。この高効率及び鋭いスペクトルは、冷却システム及びフィルターの必要性を排除し、したがってエネルギー投入必要量を顕著に削減する。これらの要因は、特定の微細藻類株のために光到達量を最適化するための可能性を広げる（ｈ）。
【００８４】
光合成有効放射（ＰＡＲ）スペクトル（スペクトルの赤色から青色の端までを網羅する４００〜７００ｎｍ）のどの部分が一般に藻類の光合成効率の最大化に役立つかは知られているが、ＰＢＲ中の人工光下で増殖する種々の藻類株に関して、増殖の際のそのような光照射量とバイオ燃料前駆体（脂質／炭水化物）の生理学的状態との特異的相互作用についての（公開の）データはほとんど存在しない。本出願人は、種々の微細藻類のため及び本明細書のＥＰＳ産生の２段階プロセスのために発せられる正確な赤色／青色ＬＥＤ必要性及び照射量レベルを発見した。
【００８５】
ＰＢＲシステムのための「持続可能な」エネルギー投入：
浄化排煙がＣＯ２と共に、藻類増殖のための栄養培地として使用される改良プロセス用水を供給する「廃」流の潜在的使用は、文献において長期間議論されてきた。今日までに確立された重要で、成功した実証プロジェクトがいくつかある。ハイブリッドシステムを使用すると、藻類は産業用発電ＣＯ２排出の２０％を再利用するために使用され得ると推定されている。ＣＯ２を捕捉する新規の安価な材料が開発されると、これはＰＢＲの費用及びエネルギー必要量を低下させる。
【００８６】
産業プロセス用水での藻類増殖のプロセスは、栄養素レベルを、環境及び特定の水域への廃水について世界各地で厳しい立法標的に発展している潜在的要求レベルに低下させることができる。
【００８７】
本出願人は、本明細書に記載の藻類の費用効果的な増殖のために管理された温度及び光照射量レベルの下で要求される最適な栄養素レベルを発見した。
【００８８】
藻類バイオマス及びバイオポリマー：
藻類多糖類は、現在商業的に使用されている（ｄ）。土壌藻類は、種々の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）、特にそれらの生体機能に重要な役割を果たしている可能性のある多糖類を排出することが知られている（ｅ）。菌体外多糖（ＥＰＳ）形成藻類株は、バッチ期及びその前に形成されたＥＰＳ内に潜在的な毒性要素を捕捉することによって改善するために水中でも使用されるという利益を有する。銅などの元素がこれらの粘液質化合物によって結合され得るという明らかな証拠がある（ｉ）。このことは、下流での放出又は使用のために水質浄化が主な目的である場合に明らかな価値を有する。ＥＰＳ組成物について行われた炭水化物分析は、９４〜９５％中性単糖及び約５〜６％ウロン酸を示した。後者は、重金属の結合のために特に重要である。
【００８９】
土壌藻類が、土壌形成及び水分保持を増強し、土壌を安定化させ、付近の植物増殖の栄養素利用性を増大させ、土壌浸食を低下させることは周知である。土壌藻類は、多くの国で土壌改良剤として導入されており、バイオ肥料としての使用も示唆されている（ｊ）。
【００９０】
「作物に適した」水の供給の低下は、再利用水の使用についての必要性を増加させ、二次処理水は、イスラエルにおいて、灌漑システムを用いる生鮮市場野菜及び果実の生産のために使用されている。しかし、処理水の広範な使用のためには、（処理水が作物の可食部（地上部）に到達しないＳＤＩを使用するとしても）多くの国で規制が改正される必要がある。
【００９１】
伝統的な細流灌漑は地上で見られるが、近年、細流灌漑システムを製造する多くの企業が地下細流灌漑（ＳＤＩ）システムを発明及び実践している。ラインは、寿命を延ばすために地下に埋められる。地下灌漑は、水、栄養素及び他の農芸化学物質の植物の根域への的確な適用を可能にする。このことは、農業家が生育環境を最適化することを可能にし、より高い品質の作物生産高を導く。
【００９２】
適正に管理されるとＳＤＩは、＞９０％の効率を有する植物灌漑の最も効率的な方法の１つである。適用される水の節約は、他の方法と比較して５０％程度になり得る。灌漑から利用できる水の量は、今後１０年間に減少することが予測され、水の保全はより重要になる。この点でＳＤＩが帯水層の寿命を延長するために重要である。バイオ燃料作物のためのその使用は、大きな潜在力を有し、痩せた土地でＳＤＩの使用がサトウキビの生産量を倍加でき、水必要量の７０％を節水する一方で、その糖類含有量を増加させたことが示されている（ｋ）。
【００９３】
ディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３の適応株の菌体外多糖も抽出された炭水化物を用いるバイオエタノールの下流での産生のために使用され得る。残りの炭水化物及びタンパク質は、食品添加物及び動物飼料などの他の副産物のために使用され得る。
【００９４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することでさらに理解される。
【実施例】
【００９５】
実施例１：
プレウロクロリス科の藻類又はクロオコッカス目シネコシスティス属及びシネココッカス属の藍藻類を栄養改良水、継続的ＰＡＲ照明条件（波長４００〜７００ｎｍ内）で６カ月間プレインキュベートし、定期的に継代培養した。単離された培養物を、それらを指数増殖期にするためにさらに継代培養し、一連の５０Ｌバイオリアクターにおいて使用した。藻類接種物の開始細胞密度は、継代培養藻類から採取した１ミリリットル当たり細胞１０６個であり、栄養改良水を含む５０Ｌバイオリアクターに移し、連続的ＰＡＲ照明条件（波長４００〜７００ｎｍ）の存在下で指数増殖期に達するようにした。プロセスは、ｐＨ（６〜９に維持）；温度（２０〜４０℃に維持）；通気（０．０２〜１．０ｖ／ｖ／ｍ−１分間当たり液体体積当たりの空気体積）；及び／又はＣＯ２（始動の終了時に０％、初回回収時に少なくとも０．７％だが、経時的にはシステム内で５％に達する場合がある）；Ｏ２５００〜８００ｍＶに維持）；ＰＢＲ通気での初回細胞での最大光照射量（６００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）、通気、ＣＯ２（開始時０％添加ＣＯ２、回収時までに０．７％に上昇）；細胞密度、温度（平均２７℃）及び光到達量（１日２４時間）を含む種々のパラメーターについて調節した。最大指数増殖の近くに達したときに、５００ｇ湿潤藻類バイオマス生成物をリアクターから取り出した。メタノール／塩化アセチル／ヘキサンを含有する溶媒混合物を添加し、天然脂肪酸（ｌｉｐｉｄ  ａｃｉｄ）のメチルエステルを産生した。メチルエステルは、ヘキサン及びアセトン溶液を用いるクロマトグラフィーによって分離し、次に蒸発させてエイコサペンタエン酸１．６ｇを得た。クロマトグラフィーは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ラウリン酸、リノール酸、αリノレン酸、ステアリン酸などの純粋な試料ももたらした。
【００９６】
実施例２：
バイオマス５０．０８ｇを６時間、１０５℃で乾燥させた。エクシケーター（ｅｘｉｃａｔｏｒ）で冷却後、試料を１時間、１０５℃のオーブン内に置き、再度秤量した。ソックスレー抽出器内で乾燥バイオマスを２６０ｍｌ石油エーテル中で８時間、抽出カプセル内で抽出した。真空回転蒸発器での溶媒の蒸発後、試料に窒素の細流を通すことによって試料をさらに乾燥させ、冷却後に再度秤量した。脂質を得るために、試料をヘキサン５０ｍｌに溶解し、半分に分けた。活性炭１０グラムを第一試料に添加し、溶液をろ過し、再度蒸発させ、窒素を通し、秤量した。まだ少し着色していたことから、第二試料については活性炭２０を使用した。
【００９７】
試料を、アジレントテクノロジー６８９０Ｎ及びカラムＨＰ  ８８シアノプロピル、長さ：１００ｍ−直径：０．２５ｍｍ、層の幅０．２０μｍを用いて分析した。
【００９８】
【表１】
2014509188.tif 000002
【００９９】
結果は、藻類株が増殖し、次いで上記刺激後に定常期に入るように誘導される際の、ＡＲＡを介するＧＬＡからＥＰＡへの転換を明らかに示唆する。これは、本明細書に記載のプロセスが、淡水微細藻類中のアラキドン酸を介するγリノレン酸とエイコサペンタエン酸との転換を可能にする既知の代謝経路を直接管理している証拠である（ｌ）。
【０１００】
実施例３：
ディクチオスファエリウム・クロレロイデス（ＡＬＧ０３）をボールド基本培地中で４日間増殖させた。図５ａは、藻類が２７℃、最適光照射量での最適増殖のために比較的低いレベルの栄養素を必要とすることを示す。図５ｂは、藻類が２７℃、２５％ＢＢ培地中、７日間、低光量で最も増殖することを示す。
【０１０１】
連続産生プロセスにおいて、ディクチオスファエリウム・クロレロイデス（ＡＬＧ０３）は毎日回収される。図７では、バイオマスはＰＢＲにおける光学濃度（６８０ｎｍ）の測定値として示されているが、比率５０％での毎日の回収は、新たな増殖培地を補充する場合にディクチオスファエリウム・クロレロイデス（ＡＬＧ０３）の同じバイオマスの２４時間以内での再増殖を可能にすることを示す。
【０１０２】
生理学的に適応した細胞を自治体プラント（二次処理）由来の廃水において６カ月間増殖させ、４週間ごとに新たな廃水で再培養した。非適応細胞は標準ＺＢＢ増殖培地で培養し、４週間ごとに新たなＺＢＢ培地で再培養した。次いで、両方の株を９日間（定常期まで）新たな廃水中で増殖させた。結果（図８）は、予備適応細胞による廃水環境及びＬＥＤ照明への明らかな適応を示す。図９は、２段階ＰＢＲプロセス後のＥＰＳ産生の倍加を示す。
【０１０３】
次いで、ＥＰＳの精製、単離、及びメタノールＨＣｌに続いてトリフルオロ酢酸を用いる試料の加水分解を行った。
【０１０４】
菌体外多糖は、９４〜９５％中性単糖を５〜６％ウロン酸と共に含む。いくつかの中性単糖は部分的にメチル化される。主な糖は下記の通りである。
ガラクトース（約２０〜２１％）
グルコース（約２０〜２１％）
未同定ヘキソース（約１２〜１３％）
ラムノース（約１２％）
未同定メチル化ヘキソース（約９〜１０％）
未同定メチル化ヘキソース（約７〜８％）
マンノース（約６〜７％）
キシロース（約３〜４％）
アラビノース（約１〜２％）
不明単糖（約０．５％まで）
不明単糖（約０．５〜１．０％まで）
ウロン酸（約５〜６％）
【０１０５】
乾燥ゲル及び加水分解ＥＰＳの凍結乾燥試料における糖のモル比を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
2014509188.tif 000003
【０１０７】
実施例３：
１２週間にわたる温室試験において痩せた砂質土でニラを育てるために細流灌漑を使用した結果は、図１１の画像で見ることができる。左から右へ；藻類を含まない対照；植栽で使用される菌根真菌共生生物（グロムス菌種の混合物）；毎週使用される藻類；藻類及び菌根真菌共生生物。結果は、ニラの生育及び栄養において１週間に２回添加されたディクチオスファエリウム・クロレロイデスＡＬＧ０３細胞の増殖促進効果を明らかに示す。適応した菌根真菌共生生物混合物と共に使用した藻類細胞の相乗効果が観察された。
【０１０８】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態の範囲に限定されない。実際、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の改変が以上の記載及び添付の図から当業者に明らかになる。そのような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。さらに、本明細書に記載の本発明のすべての態様及び実施形態は、任意の及びすべての他の整合する実施形態（本発明の他の態様（単独であってもよい）から適宜取り込まれるものを含む。）に広く適用可能であり、また、組み合わされ得る。
【０１０９】
種々の文献が本明細書で引用されているが、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
参考文献：
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ｉ．  Ｇａｒｃｉａ−Ｍｅｚａ  ＪＶ，Ｂａｒｒａｎｇｕｅ  Ｃ  ＆  Ａｄｍｉｒａａｌ  Ｗ−  ２００５  Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｇａｅ  ａｓ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｏｎ  ｍｉｎｅ  ｔａｉｌｉｎｇｓ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃ．＆  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：  ５７３−５８１．
ｊ．  Ｐａｉｎｔｅｒ  ＴＪ−  １９９３  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｅｓｅｒｔ  ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ−  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｂｉｏｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０，  ７７−８６．
ｋ．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔａｆｉｍ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｓｕｇａｒｃａｎｅ−−ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ．
ｌ．  Ｋｈｏｚｉｎ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｉ．，Ｄｉｄｉ−Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｚ．，  ２００２  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  （ＥＰＡ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ  Ｍｏｎｏｄｕｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ．  Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．  ３８，  ７４５−７５６
【図１】
2014509188.tif 000004
【図２】
2014509188.tif 000005
【図３】
2014509188.tif 000006
【図４】
2014509188.tif 000007
【図５Ａ】
2014509188.tif 000008
【図５Ｂ】
2014509188.tif 000009
【図６】
2014509188.tif 000010
【図７】
2014509188.tif 000011
【図８】
2014509188.tif 000012
【図９】
2014509188.tif 000013
【図１０】
2014509188.tif 000014
【図１１】
2014509188.tif 000015
【国際調査報告】
2014509188.tif 000016
2014509188.tif 000017
2014509188.tif 000018
2014509188.tif 000019
2014509188.tif 000020
2014509188.tif 000021
2014509188.tif 000022
2014509188.tif 000023
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