(57)【要約】  本発明は血管バリアー機能を制御し、新血管形成を調節し、関連疾患を治療するためにＲＡＳＩＰ１アゴニスト及びアンタゴニストを使用する方法を提供する。
2014507483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血管バリアー機能変化を伴う疾患の治療方法において、被験者にＲＡＳＩＰ１モジュレーターを投与することを含む方法。
【請求項２】
疾患が血管バリアー機能低下を伴い、ＲＡＳＩＰ１モジュレーターがＲＡＳＩＰ１アゴニストである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患が、敗血症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、浮腫、虚血性脳卒中及び出血からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
疾患が血管バリヤー機能増加を伴い、ＲＡＳＩＰ１モジュレーターがＲＡＳＩＰ１アンタゴニストである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
疾患が高血圧症である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＲＡＳＩＰ１モジュレーターが小分子である請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
必要とする被験者において血管バリアー機能を低減し又は抑制する方法において、被験者にＲＡＳＩＰ１アゴニストを投与することを含む方法。
【請求項８】
必要とする被験者において血管バリアー機能を増大させ又は亢進する方法において、被験者にＲＡＳＩＰ１アンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項９】
被験者において新血管形成を必要とする疾患を治療する方法において、被験者にＲＡＳＩＰ１阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１０】
疾患が癌又は増殖性網膜症である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、出典明示により全体が援用される２０１１年３月１０日出願の米国仮出願第６１／４５１５４０号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に血管バリヤー機能変化を伴う症状及び疾患の治療に有用である組成物と方法に関する。詳細には、本発明はＲａｓ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ１（Ｒａｓｉｐ１）のモジュレーター及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マウスの胎仔において、循環の発生（Ji等, Circ. Res. 92:133-35, (2003)）は背側大動脈のような主要血管の活発な発達（Walls等, PLoS One 3:e2853, (2008)；Strilic等, Dev. Cell 17:505-15, (2009)）と一致する。ついで、脈管形成、血管形成、及びリモデリング−広範な細胞移動及び細胞間の位置交換を含む動的なプロセスを経た速やかな血管増殖の途中に激しい循環が続く（Carmeliet, Nat. Med. 6:389-95, (2000)；Coultas等, Nature 438:937-45, (2005)；Jakobsson等, Nat. Cell. Biol. 12:943-53, (2010)）途中に激しい循環が続いて起こる。これらの同時の事象は発生中の脈管構造に対して特有の課題を提起する：新生内皮細胞間結合は管腔形成、循環を許容し、増大する剪断応力に耐えるのに十分に安定で、しかも動的成長及びリモデリング中における細胞移動を許容するのに十分にフレキシブルでなければならない。また、増加した血管透過性は出血、浮腫、虚血性脳卒中、炎症、及び敗血症を含む病理症状に寄与するので（Dejana等, Dev. Cell 16:209-21, (2009)；Spindler等, Cardiovascular Research 87:243-53, (2010)）、細胞間結合の調節を通して血管透過性が調節される。内皮細胞間の密着及び接着結合における重要な構成要素が血管発達及び管腔安定化に決定的に影響を及ぼすことが示されているが（Dejana, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 5:261-70, (2004)；Crosby等, Blood 105:2771-76 (2005)；Dejana等 (2009; supra)）、発達中の内皮細胞間結合を調節する分子アンサンブルに関して学ぶべき多くのことが残っている。
【０００４】
上皮及び内皮細胞双方における細胞間結合形成の重要な調節因子は低分子量Ｇタンパク質Ｒａｐ１である（Kooistra等, J. Cell Science 120:17-22, (2007)）。多くの状況で、細胞膜におけるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化は、グアニン交換因子（ＧＥＦ）Ｅｐａｃ１に結合し、Ｒａｐ１上でＧＴＰへのＧＤＰの交換を惹起させ、タンパク質を活性化し、分子相互作用カスケードを惹起させて安定化と接着及び密着接合複合体のタンパク質への皮質アクチンの結合を生じせしめるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の形成を促進する（Kooistra等, FEBS Letters 579:4966-72, (2005)）。Ｒａｐ１活性の調節は内皮バリアー機能に影響を及ぼす（Spindler等 (2010; 上掲)）。このネットワークにおいて、低分子量Ｇタンパク質の調節因子、例えばEPAC1がまた重要な役割を担っている（Pannekoek等, Biochim. Biophys. Acta 1788:790-96, (2009)）。ここ数年で、Ｒａｓ及びＲＡＰ１のエフェクター、例えばＭＬＬＴ４／ＡＦＡＤＩＮ−６、ＲＡＤＩＬ、及びＫＲＩＴ１が同定され、細胞間接着及び遊走の媒介において重要な役割を果たしていることが示された（Boettner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9064-69, (2000)；Glading等, J. Cell Biol. 161:1163-77, (2007)；Mitin等, J. Biol. Chem. 279:22353-61, (2004)；Smolen等, Genes Dev. 21:2131-36, (2007)；Xu等, Dev. Biol. 329:269-79, (2009)）。また、Ｒａｓｉｐ１は過剰発現したＲａｓ及びＲａｐ１に結合することが示されており（Mitin等, (2004; 上掲)）、Rａｓｉｐ１のノックダウンはアフリカツメガエルの血管形成を消失させる（Mitin等, (2004; 上掲)）；Xu等, （2009;上掲)）。
【０００５】
清浄なまた病理的脈管構造の発生及び維持の理解における多くの進歩にもかかわらず、標的を同定し、この領域における既存の治療法の効果を補充し又は亢進させることができ手段を開発する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｒａｓ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ１（Ｒａｓｉｐ１）が内皮結合安定性を維持するのに必須であるとの発見に少なくとも部分的に基づいている。従って、Ｒａｓｉｐ１をその活性化薬剤で標的化すること又はそれが存在するシグナル伝達カスケードは敗血症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、浮腫、及び出血を含む減少した血管バリアー機能を伴う疾患の治療に有用である。従って、本発明は、Ｒａｓｉｐ１活性を活性化させる薬剤を使用してかかる疾患を治療するための新規な方法を提供する。また、本発明は、Ｒａｓｉｐ１が安定な管（血管、脈管）の形成に必要とされるとの発見に少なくとも部分的に基づいている。従って、Ｒａｓｉｐ１をその阻害薬剤で標的化すること又はそれが存在するシグナル伝達カスケードは、癌及び増殖性糖尿病性網膜症を含む新しい管形成が必要とされる疾患の治療に有用である。従って、本発明はＲａｓｉｐ１活性を阻害する薬剤を使用してかかる疾患を治療する新規方法を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、被験者の血管バリアー機能変化を伴う疾患の治療方法において、被験者に、ＲＡＳＩＰ１モジュレーターを投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、疾患は血管バリアー機能低下を伴い、ＲＡＳＩＰ１モジュレーターがＲＡＳＩＰ１アゴニストであり、疾患が、例えば敗血症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、浮腫、虚血性脳卒中又は出血である場合を含む。ある実施態様では、疾患は血管バリヤー機能増加を伴い、ＲＡＳＩＰ１モジュレーターはＲＡＳＩＰ１アンタゴニストであり、疾患が例えば高血圧症である場合を含む。
【０００８】
他の態様では、本発明は、必要とする被験者において血管バリアー機能を低減し又は抑制する方法において、被験者に、ＲＡＳＩＰ１アゴニストを投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、必要とする被験者において血管バリアー機能を増大させ又は亢進する方法において、被験者に、ＲＡＳＩＰ１アンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
更に他の態様では、本発明は、被験者において新血管形成を必要とする疾患を治療する方法において、被験者にＲＡＳＩＰ１阻害剤を投与することを含む方法を提供し、疾患が例えば癌又は増殖性網膜症、例えば糖尿病性網膜症である場合を含む。
【００１１】
ある実施態様では、ＲＡＳＩＰ１モジュレーターは小分子である。ＲＡＳＩＰ１モジュレーターがアンタゴニストであるある実施態様では、それはアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はリボザイムである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｒａｓｉｐ１ノックアウトマウスは血管性欠陥で妊娠中期に死亡。（Ａ）Ｅ９．０のヘテロ接合性コントロール（＋／−）胎仔の明視野像。（Ｂ）小さいサイズの心膜浮腫及び出血を示すＥ９．０のＲａｓｉｐ１−／−胎仔の明視野像。（Ｃ，Ｄ）Ｒａｓｉｐ１＋／−（Ｃ）及び−／−（Ｄ）Ｅ８．５胎仔における全載ＣＤ３１プラスＣＤ１０５免疫蛍光（赤）。頭側が左の腹側視。（Ｅ，Ｆ）Ｒａｓｉｐ１＋／−（Ｅ）及び−／−（Ｆ）Ｅ９．０胎仔の胴体脈管構造の全載免疫蛍光。頭側から左向きの側方視。赤：ＣＤ３１＋ＣＤ１０５，緑：ＲＢＣ自己蛍光；青：ＤＡＰＩ。矢印：背側大動脈。星印：心原基。ｓｏ：体節。
【図２】Ｒａｓｉｐ１ノックアウトマウスの軸血管欠陥。１−２体節期（ｓｓ）（Ａ，Ｅ）、３−６ｓｓ（Ｂ，Ｆ）、及び７−１０ｓｓ（Ｃ，Ｄ，Ｇ，Ｈ）のＲａｓｉｐ１＋／−（Ａ−Ｄ）及び−／−（Ｅ−Ｈ）胎仔からの尾側背側大動脈の横断面。（Ｃ）及び（Ｄ）、並びに（Ｇ）及び（Ｈ）の割面は隣接割面からのものであり、７−１０ｓｓでのＲａｓｉｐ１−／−胎仔における大動脈の局所化された崩壊を示していることに留意。（Ｉ）７−１０ｓｓでのＲａｓｉｐ１＋／−（ｎ＝５）及び−／−（ｎ＝５）胎仔からの背側大動脈管腔の散布図。２０μｍ２切り取り線（赤）は機能的毛細血管直径を示している。Ｒａｓｉｐ１−／−大動脈は管腔領域の広い変動を示す。各ポイントは大動脈の個々の領域測定を表す。
【図３】ゼブラフィッシュにおけるｒａｓｉｐ１及びｒａｆａｄｉｌ発現の破壊は異常なＥＣ−ＥＣ対合及び血管漏出を引き起こす。（Ａ）受精後２６時間（ｈｐｆ）のコントロールモルホリノオリゴ（ｃｔｒｌ）注射Ｔｇ（ｋｄｒｌ：ＥＧＦＰ）ｓ８４３ゼブラフィッシュ胎仔の側方視。頭側から左に向けてである。（Ｂ）２６ｈｐｆのｒａｓｉｐ１及びｒａｆａｄｉｌモルホリノオリゴ（ＭＯ）注射胎仔。体節間血管（ＩＳＶ）が発育阻止され、軸血管が形態学的に異常である。（Ｃ）背側大動脈（小角括弧）を示す２７ｈｐｆ胎仔と腹側に遊走して後主静脈（大きな角括弧）を形成する細胞の側方視。（Ｄ）２７ｈｐｆ二重モルファントの側方視。血管芽細胞の軸方向位置決めは正常であるが（角括弧）、血管合体は異常で、無数の間隙が見える（矢印）。（Ｅ）脈管構造（緑）内の蛍光マイクロビーズ（赤）を示すコントロール５４ｈｐｆ胎仔の蛍光血管造影。（Ｆ）漏出血管外マイクロビーズを示すｒａｓｉｐ１及びｒａｆａｄｉｌＭＯ胎仔の血管造影。
【図４】ＲＡＳＩＰ１の喪失は細胞間結合性を変化させる。（Ａ）２４時間でのコントロール（Ｃｔｒｌ）ＨＵＶＥＣ血管形成発芽形成。（Ｂ）ＲＡＳＩＰ１低分子ヘアピン型ＲＮＡを安定に発現するＨＵＶＥＣにより形成された出芽。ＲＡＳＩＰ１ノックダウン（ＫＤ）試料における脱離細胞／出芽の増加に留意。（Ｃ）２４及び４８時間でのＣｔｒｌ及びＫＤ試料中における脱離出芽の定量。２回の実験からの１条件当たり全４０ビーズを定量し、平均値＋／−ＳＥＭとして表した。（＊はＰ＜０．０００１，独立Ｗｅｌｃｈ修正ｔ検定によって決定）。（Ｄ）２次元（２Ｄ）創傷治癒アッセイにおけるＣｔｒｌ及びＲＡＳＩＰ１ ＫＤ ＨＵＶＥＣの遊走速度（μｍ／分）。（Ｅ）２Ｄ遊走アッセイにおける波面から一過性に脱離する細胞の定量。１条件当たり２１−２３の動画を定量した。エラーバーはＳＥＭである。（Ｆ）透過性はコントロールに対して基準化したＲＡＳＩＰ１ ＫＤ ＨＵＶＥＣにおいて増加する。傍細胞流を、４０ｋＤａ ＦＩＴＣ−デキストランを使用して測定した。値は４つの独立した複製対の平均である。エラーバーはＳＤである。（＊＊は対応ｔ−検定により決定されたＰ＜０．０２を示す）。
【図５】ＲＡＳＩＰ１はＲＡＰ１のＧＴＰ負荷を通して接合部緻密化を制御する。コントロール（Ａ−Ｃ）又はＲＡＳＩＰ１ ＫＤ （Ｄ−Ｆ）ＨＵＶＥＣをＥＧＴＡと続いてｃＢｉＭＰＳによって処理し、ファロイジン（Ａ，Ｄ；Ｃ，Ｆで緑）及びＶＥ−カドヘリン（Ｂ，Ｅ；Ｅ，Ｆで赤）で染色した。Ｅ及びＦの青は核（ＤＡＰＩ）を示している。（Ｇ）コントロールＨＵＶＥＣに対するＲＡＳＩＰ１抗体の染色。広範な細胞質／核周囲並びに接合部染色（矢印）が観察される。（Ｈ）ＲａｓＩＰ１ ｐＡｂ染色からの細胞質及び接合部シグナルがＲＡＳＩＰ１ ＫＤ ＨＵＶＥＣにおいて顕著に減少している。（Ｉ）コントロール及びＫＤ ＨＵＶＥＣにおけるＲＡＰ１のＧＴＰ負荷。ＧＴＰ結合ＲＡＰ１はコントロールと比較してＫＤ ＨＵＶＥＣにおいて減少している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（定義）
別段の定義がない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語はこの発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有している。例えば、Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)；Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照のこと。本発明の目的に対して、ある用語は以下に定義する。
【００１４】
ここで使用される場合、「ＲＡＳＩＰ１」又は「ＲＡＳＩＰ１ポリペプチド」なる用語は、その調製態様又は種にかかわらず、天然から誘導されたＲＡＳＩＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。よって、そのようなポリペプチド、ヒト、マウス又は任意の他の種からの天然に生じるＲＡＳＩＰ１のアミノ酸配列を有しうる。全長ヒトＲＡＳＩＰ１アミノ酸配列は、
MLSGERKEGGSPRFGKLHLPVGLWINSPRKQLAKLGRRWPSAASVKSSSSDTGSRSSEPLPPPPPHVELRRVGAVKAAGGASGSRAKRISQLFRGSGTGTTGSSGAGGPGTPGGAQRWASEKKLPELAAGVAPEPPLATRATAPPGVLKIFGAGLASGANYKSVLATARSTARELVAEALERYGLAGSPGGGPGESSCVDAFALCDALGRPAAAGVGSGEWRAEHLRVLGDSERPLLVQELWRARPGWARRFELRGREEARRLEQEAFGAADSEGTGAPSWRPQKNRSRAASGGAALASPGPGTGSGAPAGSGGKERSENLSLRRSVSELSLQGRRRRQQERRQQALSMAPGAADAQIGTADPGDFDQLTQCLIQAPSNRPYFLLLQGYQDAQDFVVYVMTREQHVFGRGGNSSGRGGSPAPYVDTFLNAPDILPRHCTVRAGPEHPAMVRPSRGAPVTHNGCLLLREAELHPGDLLGLGEHFLFMYKDPRTGGSGPARPPWLPARPGATPPGPGWAFSCRLCGRGLQERGEALAAYLDGREPVLRFRPREEEALLGEIVRAAAAGSGDLPPLGPATLLALCVQHSARELELGHLPRLLGRLARLIKEAVWEKIKEIGDRQPENHPEGVPEVPLTPEAVSVELRPLMLWMANTTELLSFVQEKVLEMEKEADQEDPQLCNDLELCDEAMALLDEVIMCTFQQSVYYLTKTLYSTLPALLDSNPFTAGAELPGPGAELGAMPPGLRPTLGVFQAALELTSQCELHPDLVSQTFGYLFFFSNASLLNSLMERGQGRPFYQWSRAVQIRTNLDLVLDWLQGAGLGDIATEFFRKLSMAVNLLCVPRTSLLKASWSSLRTDHPTLTPAQLHHLLSHYQLGPGRGPPAAWDPPPAEREAVDTGDIFESFSSHPPLILPLGSSRLRLTGPVTDDALHRELRRLRRLLWDLEQQELPANYRHGPPVATSP (配列番号１)。
全長マウスＲＡＳＩＰ１アミノ酸配列は、
MLSGERKEGGSPRFGKLHLPVGLWINSPRKQLAKLGRRWPSAASVKSSSSDTGSRSSEPLPPPPPPPHVELRRVGAVKAAGGASGSRAKRISQLFRGSGAGGAGGPGTPGGAQRWASEKKLPELAAGVAPEPPLPTRAAVPPGVLKIFASGLASGANYKSVLATERSTARELVAEALERYGLTGGRGAGDSGCVDAYALCDALGRPAVGVGGGEWRAEHLRVLADAERPLLVQDLWRARPGWARRFELRGREEARRLEQEAFGAADADGTNAPSWRTQKNRSRAASGGAALASPGPGSGSGTPTGSGGKERSENLSLRRSVSELSLQGRRRRQQERRQQALSMAPGAADAQMVPTDPGDFDQLTQCLIQAPSNRPYFLLLQGYQDAQDFVVYVMTREQHVFGRGGPSSSRGGSPAPYVDTFLNAPDILPRHCTVRAGPEPPAMVRPSRGAPVTHNGCLLLREAELHPGDLLGLGEHFLFMYKDPRSGGSGPARPSWLPARPGAAPPGPGWAFSCRLCGRGLQERGEALAAYLDGREPVLRFRPREEEALLGEIVRAAASGAGDLPPLGPATLLALCVQHSARELELGHLPRLLGRLARLIKEAVWEKIKEIGDRQPENHPEGVPEVPLTPEAVSVELRPLILWMANTTELLSFVQEKVLEMEKEADQEGLSSDPQLCNDLELCDEALALLDEVIMCTFQQSVYYLTKTLYSTLPALLDSNPFTAGAELPGPGAELEAMPPGLRPTLGVFQAALELTSQCELHPDLVSQTFGYLFFFSNASLLNSLMERGQGRPFYQWSRAVQIRTNLDLVLDWLQGAGLGDIATEFFRKLSIAVNLLCVPRTSLLKASWSSLRTDYPTLTPAQLHHLLSHYQLGPGRGPPPAWDPPPAERDAVDTGDIFESFSSHPPLILPLGSSRLRLTGPVTDDALHRELRRLRRLLWDLEQQELPANHRHGPPVASTP (配列番号２)。
【００１５】
このようなＲＡＳＩＰ１ポリペプチドは天然から単離され得、又は組換え及び／又は合成手段によって産生されうる。
【００１６】
ポリペプチドに関連して「単離された」は、それが天然源から精製されたか又は組換えもしくは合成手段により調製され精製されたことを意味する。「精製された」ポリペプチドは他のポリペプチド又はペプチドを実質的に含まない。ここで「実質的に含まない」とは約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、更により好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満の他の供給源のタンパク質での汚染を意味する。
【００１７】
「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に活性化する任意の分子を含む。例えば、ＲＡＳＩＰ１のアゴニストはＲａｐ１のＧＴＰ負荷に影響を及ぼすか、又は細胞−細胞接合安定性を増大させ、又は内皮細胞バリアー機能を増大させるＲＡＳＩＰ１の能力を増大させるであろう。ＲＡＳＩＰ１ポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、ＲＡＳＩＰ１ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させ、通常そのポリペプチドに関連する一又は複数の生物活性における適切な検出可能な変化を測定することを含みうる。
【００１８】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロックし、阻害し、又は中和する任意の分子を含む。例えば、ＲＡＳＩＰ１のアンタゴニストはＲＡＰ１−ＧＴＰ負荷を調節し、安定な内皮細胞−細胞結合を制御するＲＡＳＩＰ１の能力を部分的又は完全にブロックし、阻害し、又は中和するであろう。適切なアンタゴニスト分子は、特にアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ、小有機分子等を含む。ＲＡＳＩＰ１ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、ＲＡＳＩＰ１ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させ、通常そのポリペプチドに関連する一又は複数の生物活性における検出可能な変化を測定することを含みうる。
【００１９】
「モジュレーター」なる用語はアゴニスト及び／又はアゴニストを集合的に指すために使用される。
【００２０】
ここでの目的に対して「活性な」又は「活性」とは、生物学的及び／又は免疫学的活性を保持しているＲＡＳＩＰ１の形態を指し、ここで「生物学的」活性とは、抗体の産生を誘発する能力以外のＲＡＳＩＰ１によって引き起こされる生物学的機能を指し、「免疫学的」活性とは、ＲＡＳＩＰ１が有する抗原性エピトープに対して抗体の産生を誘導する能力を指す。ＲＡＳＩＰ１の主要な生物学的活性は、Ｒａｐ１誘導性シグナル伝達の伝達又は開始と、脈管構造における細胞接合の精密化である。
【００２１】
ここで使用される場合、「治療」は有益な又は所望される臨床結果を得るためのアプローチである。この発明の目的では、有益な又は所望される臨床結果は、限定しないが、検出できても検出できなくても、症状の軽減、疾患又は疾病の程度の減弱、疾患の安定した（つまり悪化しない）状態、疾患進行の遅延化又は速度低減、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解（部分的であろうと全体的であろうと）を含む。「治療」は、疾患の病理の進行防止又は変更を意図して実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置又は予防的もしくは防止的手段を指しうる。治療が必要な者は、既に疾患に罹患している者並びに疾患が防止されるべき者を含む。すなわち、治療は、癌治療における腫瘍細胞の病理のような細胞変性又は損傷の病理を直接防止し、遅延させ又はその他減少させうるか、又は細胞を他の治療剤による治療に対してより敏感にし得る。
【００２２】
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる治療である。
【００２３】
「血管バリヤー機能変化を伴う疾患」は増加した又は減少した血管バリアー機能によって特徴づけられる疾患である。増大した血管バリアー機能を伴う疾患は、限定しないが高血圧症を含む。減少した血管バリアー機能を伴う疾患は、限定しないが、敗血症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、浮腫、及び出血を含む。
【００２４】
「新血管形成を必要とする疾患」は機能的な新血管の形成に依存することを特徴とする。このような疾患が、限定しないが、癌及び増殖性糖尿病性網膜症を含む。
疾患の「病理」は患者の満足できる状態を損なうあらゆる現象を含む。
一又は複数の更なる治療剤と「組み合わせて」の投与は同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００２５】
ここで使用される「担体」は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤で、用いられる用量及び濃度でそれに暴露されている細胞又は哺乳動物に非毒性であるものを含む。しばしば、生理学的に許容可能な担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容可能な担体の例は、バッファー、例えばホスフェート、シトレート、及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びプルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（登録商標）を含む。
「小分子」は約５００ダルトン以下の分子量を有するとここで定義される。
【００２６】
（発明を実施するための方法）
ＲＡＳＩＰ１活性のアンタゴニストの調製と同定
アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ＴＲＡＳＩＰ１ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又はそれらの活性及び／又は他の細胞性タンパク質との相互作用に干渉等する化合物を同定するために設計される。
【００２７】
小分子は、ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストとして作用する能力を有し得、よって治療的に有用である。このような小分子は、天然に生じる小分子、合成の有機又は無機化合物及びペプチドを含む。しかしながら、本発明における小分子は、これらの形態に限定されるものではない。小分子の広範なライブラリーが商業的に入手可能であり、所望の活性についてこれらの分子をスクリーニングするために、多様なアッセイがここで教示され、又は当該技術分野でよく知られている。
【００２８】
ある実施態様では、小分子ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストは、ＲＡＳＩＰ１の一又は複数の生物活性を活性化又は阻害するそれらの能力によって同定される。よって、候補化合物をＲＡＳＩＰ１と接触させ、ついでＲＡＳＩＰ１の生物学的活性を評価する。一実施態様では、ＲＡＰ１ ＧＴＰ負荷を調節するＲＡＳＩＰ１の能力が評価される。ＲＡＳＩＰ１の生物活性が刺激される場合には化合物はアゴニストとして同定され、ＲＡＳＩＰ１の生物活性が阻害される場合には化合物はアンタゴニストとして同定される。
【００２９】
他の潜在的なＲＡＳＩＰ１アンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、ここで、例えばアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的とされるｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を予防することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンス技術は、三重らせん体の形成、又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを介した遺伝子発現をコントロールするのに使用可能であり、その双方の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、ここでの成熟したＲＡＳＩＰ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的となるように設計され（三重らせん体−例えば、Lee等, Nucl. Acids Res. 6:3073(1979); Cooney等, Science 241:456(1988); Dervan等, Science 251:1360(1991)を参照）、よって、ＲＡＳＩＰ１の転写及び生産が防止される。ＲＮＡの部分に対して「相補的な」配列は、ここで言及される場合、ＲＮＡとハイブリダイズ可能な程に十分な相補性を有し、安定した二本鎖を形成する配列を意味し；二重鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本の鎖がよって試験されるか、又は三重らせん体形成がアッセイされうる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の度合いと長さの双方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含み得、なおも安定した二本鎖（又は場合によっては三本鎖）を形成するＲＮＡとの塩基のミスマッチが多くなる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するために、標準的な手順を使用することにより、ミスマッチの許容度を確定することができる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＲＡＳＩＰ１への翻訳がブロックされる（antisense - Okano, Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988）。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はキメラ混合物又はその誘導体又は修飾体、単鎖又は二本鎖とすることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、他の付加群、例えばペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的とするため）、又は細胞膜を通っての輸送を容易にする薬剤（例えば、Letsinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556(1989)； Lemaitre等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652(1987)；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０，１９８８年１２月１５日公開を参照）、又は血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４，１９８８年４月２５日公開を参照）、ハイブリダイゼーション誘導開裂剤（例えば、Krol等, BioTechniques 6:958-976(1988)を参照）、又は挿入剤（例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539-549(1988)を参照）を含みうる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤等にコンジュゲートされうる。
【００３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、擬似ウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも一の修飾された塩基部分を含みうる。
【００３２】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群から選択される少なくとも一の修飾された糖部分を含みうる。
【００３３】
更に他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチエアート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール又はそのアナログからなる群から選択される少なくとも一の修飾されたリン酸骨格を含む。
【００３４】
更に他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアノマーオリゴヌクレオチドである。アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のユニットに反して、ストランドが互いに平行に走っている相補ＲＮＡと特定の二重鎖ハイブリッドを形成する（Gautier等, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641(1987)）。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Inoue等, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148(1987)）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoue等, FEBS Lett. 215:327-330(1987)）である。
ある実施態様では、アンタゴニストは、抑制二本鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等である。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成器（例えば、Biosearch, Applied Biosystems等から商業的に入手可能）を使用し、当該技術分野で知られている標準的な方法により合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein等（Nucl. Acids Res. 16:3209(1988)）の方法により合成することができ、ホスホン酸メチルオリゴヌクレオチドは、制御孔質ガラスポリマー担体の使用により調製することができる（Sarin等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451(1988)）。
【００３６】
また、上述したオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボで発現して、ＲＡＳＩＰ１の生成を阻害しうるように、細胞に送達させることができる。アンチセンスＤＮＡが使用される場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０〜＋１０の位置から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００３７】
潜在的なアンタゴニストは、ＲＡＳＩＰ１に結合し、よってその活性をブロックする小分子を更に含む。小分子の例は、限定されるものではないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成の非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
【００３８】
付加的な潜在的アンタゴニストはリボザイムであり、これは、ＲＮＡの特異的切断を触媒可能な酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは配列特異的ハイブリダイゼーションにより相補標的ＲＮＡに対して作用し、続いてヌクレオチド鎖を切断する。潜在的なＲＮＡ標的の範囲内の特定のリボザイム切断部位は、既知の技術により同定することができる。更なる詳細は、Rossi, Current Biology 4:469-471(1994)、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照のこと。
【００３９】
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムは、標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊するのに使用可能であるが、ハンマーヘッド型リボザイムを使用するのが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成する隣接領域により決定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが、２つの塩基の次の配列：５’−ＵＧ−３’を有していることである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び生成は当該技術分野でよく知られており、その全体が出典明示によりここに援用されるMyers,Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York(1995)，（特に、図４，８３３頁を参照）、及びHaseloff 及び Gerlach, Nature, 334:585-591(1988)に更に詳細に記載されている。
【００４０】
好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５'末端近傍に位置するように、すなわち効率を増加させ、無機能ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小とするように操作される。
【００４１】
本発明のリボザイムは、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）、例えばテトラヒメナ・サーモフィアにおいて天然に生じ（ＩＶＳ、又はＬ-１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られている）、Thomas Cech及び共同研究者（Zaug等, Science, 224:574-578(1984); Zaug 及び Cech, Science, 231:470-475(1986); Zaug等, Nature, 324:429-433(1986); University Patents Incによる国際特許出願番号ＷＯ８８／０４３００； Been 及び Cech, Cell, 47:207-216(1986)）に広範に記載されているものをまた含む。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの切断が生じる８つの塩基対活性部位を有している。本発明は、標的遺伝子中に存在する８つの塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【００４２】
アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的性等を改善するため）からなり、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達法は、形質移入された細胞が十分量のリボザイムを生成し、内在性の標的遺伝子のメッセージを破壊し、翻訳を阻害するように、強い構成的ｐｏｌ ＩＩＩ又はｐｏｌ ＩＩプロモーターのコントロール下で、リボザイムを「コード化」するＤＮＡコンストラクトを使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒的であるために、効率のためには、細胞内濃度が低いことが要求される。
【００４３】
転写の阻害に使用される三重らせん体形成における核酸分子は、単鎖であるべきであり、デオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に、二本鎖の一本の鎖におけるプリン又はピリミジンのかなり大きな伸長を必要とする、フーグスティーン塩基対則を介して三重らせん体の形成が促進されるように設計される。更なる詳細は、例えば上掲のＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１を参照のこと。
【００４４】
投与プロトコル、スケジュール、用量、及び製剤
ＲＡＳＩＰ１アゴニスト及びアンタゴニストは、上に記載した様々な疾患及び疾病に対する予防剤及び治療剤として、薬学的に有用である。
アゴニスト又はアンタゴニストの治療用組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、任意成分の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、適切な純度を有する所望の分子を混合することにより、保存用に調製される（Ｒemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, A. Osol, A.編(1980)）。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；及び／又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）ＴＭ、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）ＴＭ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００４５】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びポリエチレングリコールを含む。アンタゴニストの局所用又はゲルベースの形態用の担体は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与に対して、一般的なデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。ＲＡＳＩＰ１アンタゴニストは、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、このようなビヒクルで製剤化されるであろう。
【００４６】
他の処方は、成形品にＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストを導入することを含む。このような成形品は、内皮細胞の増殖及び血管新生の調節に使用することができる。また、腫瘍の浸潤及び転移を、これらの成形品で調節することができる。
【００４７】
インビボ投与に使用されるＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストは滅菌されていなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。凍結乾燥形態にある場合、ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストは、典型的には使用時に適当な希釈剤と再構成するために他の成分と組み合わせて製剤化される。ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストの液体製剤の例は、皮下注射用の１回投与バイアルに充填された無菌の無色透明な保存料未添加溶液である。繰り返し使用に適した保存料添加薬学的組成物は、例えば、主として徴候及びポリペプチドの種類に応じて：
ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニスト；
溶液中におけるポリペプチド又は他の分子の最大安定の範囲、好ましくは約４−８にｐＨを維持することができるバッファー；
攪拌誘発性凝集に対して、ポリペプチド又は分子を主として安定化させる洗浄剤／界面活性剤；
等張剤；
フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物の群から選択される保存料；及び
水
を含みうる。
【００４８】
使用される洗浄剤が非イオン性である場合、それは、例えばポリソルベート（例えば、ポリソルベートＴＭ（トゥイーンＴＭ）２０、８０等）、又はポロキサマー（例えば、ポロキサマーＴＭ１８８）でありうる。非イオン性界面活性剤の使用は、ポリペプチドの変性を生じさせないで剪断表面応力に製剤を暴露することを可能にする。更に、このような界面活性剤を含有する製剤は、エアゾール装置、例えば肺投薬に使用されるものや、針のないジェット注射ガンに使用することができる（例えば、欧州特許出願公開第２５７９５６号を参照）。
【００４９】
等張剤は、ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストの液体組成物を確実に等張にするために存在し得、多価糖アルコール、好ましくは三価又はより高級の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールを含む。これらの糖アルコールは、単独で又は組合せて使用することができる。あるいは、塩化ナトリウム又は他の適切な無機塩を、溶液を等張にするのに使用することもできる。
【００５０】
バッファーは、所望されるｐＨに応じて、例えばアセテート、シトレート、スクシネート、又はホスフェートバッファーでありうる。この発明の一つのタイプの液体製剤のｐＨは、約４〜８の範囲、好ましくはおよそ生理学的ｐＨに緩衝される。
【００５１】
保存料であるフェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物は、使用できる既知の抗菌剤である。
ここに記載の治療用ポリペプチド組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。製剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射剤として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与されうる（肺内送達については、例えば欧州特許出願公開第２５７９５６号参照）。製剤は、好ましくは硝子体内（ＩＶＴ）又は結膜下送達として投与される。
【００５２】
また、治療用ポリペプチドは、徐放性調製物の形態で投与することができる。徐放性調製物の適切な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res. 15：167-277(1981)及びLanger, Chem. Tech. 12：98-105(1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号、欧州特許出願公開第58481号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー(Sidman等,Biopolymers 22：547-556(1983))、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer等, 上掲)、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３９８８号）を含む。
【００５３】
エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化されたタンパク質が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の喪失及び免疫原性の起こりうる変化をもたらす。合理的な方策を、関連する機構に応じてタンパク質安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【００５４】
徐放性ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニスト組成物は、リポソームに捕捉されたアンタゴニストをまた含む。このようなリポソームはそれ自体既知の方法で調製される：独国特許出願公開第3218121号; Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034(1980)；欧州特許出願公開第５２３２２号；欧州特許出願公開第３６６７６号；欧州特許出願公開第８８０４６号；欧州特許出願公開第１４３９４９号；欧州特許出願公開第１４２６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び欧州特許出願公開第１０２３２４号。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％コレステロールを越える単層型の小体(約２００−８００オングストローム)のものであり、選択された割合は最適な治療がなされるように調節される。
【００５５】
もちろん、ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストの治療的に有効な用量は、治療(予防を含む)される病状、投与方法、治療に使用される化合物の種類、関与する任意の併用療法、患者の年齢、体重、一般的な病状、病歴等のような因子に応じて変化するであろうし、その決定は主治医の技量の範囲内である。従って、治療専門者が、最大の治療効果を得るのに必要な場合は、用量を滴定し、投与経路を変更する必要もあるであろう。
【００５６】
上の指針では、効果的な用量は、一般的には、約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１−１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１−０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００５７】
ＲＡＳＩＰ１アゴニスト又はアンタゴニストの投与経路は、既知の方法、例えば注射又は注入で、静脈内、筋肉内、大脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼球内(硝子体内を含む)、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、口腔、局所、又は吸入経路により、又は記載したような徐放系に合致したものである。
【００５８】
塩を形成し、以下で有用である分子の薬理学的に許容可能な塩の例は、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えば、ピリジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩)、及び有機酸の塩(例えば、酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩)を含む。
【００５９】
次の実施例は、例証目的のためだけに提供されるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書に引用された全ての特許及び参考文献の開示は、それらの全体が出典明示によりここに援用される。
【実施例】
【００６０】
実施例において言及した市販の試薬は別段の記載がない限り製造者の説明書に従って使用した。ここで引用した全ての文献は出典明示によりここに援用する。
【００６１】
実施例１  Ｒａｓｉｐ１−／−マウスは異常な心血管の発生を示す
その発現が脈管構造において増強されている遺伝子のバイオインフォマティクススクリーニングにおいて、我々はＲＡＳＩＰ１が内皮細胞（ＥＣ）において高度に発現していることを特定し、マウス胎仔においてインサイツハイブリダイゼーションにより血管選択的発現を確認した。Ｒａｓｉｐ１のインビボでの役割を研究するために、我々はマウスＲａｓｉｐ１遺伝子座のエキソン３を標的とする一般的なノックアウトを産生させ、およそ４０アミノ酸の短縮タンパク質を作製することを予測した。簡潔に述べると、ＢＡＣベースの標的化ベクターをマウスＲａｓｉｐ１遺伝子座のエキソン３に隣接するｌｏｘＰ部位を用いて設計した。このコンストラクトをＣ５７ＢＬ／６ ＥＳ細胞に導入し、組換え事象をＰＣＲによりスクリーニングしシーケンシングした。一般的なノックアウトを産生するために、標的化ＥＳ細胞を、エキソン３を除去するためにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスに感染させた。戻し交配し純粋なＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに維持された２種の樹立系統を分析に選択し、同一の表現型を生じた。遺伝子型判定は、ＲＥＤ Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐキット（Ｓｉｇｍａ）を使用してＰＣＲによって実施した。
【００６２】
ホモ変異体子孫がヘテロ接合性親から得られなかったので、我々はＲａｓｉｐ１変異体胎子を調べた。胎生期（Ｅ）９．０の野生型及びヘテロ接合性の同腹仔と対照的に、Ｒａｓｉｐ１−／−動物はサイズが僅かに小さく、蒼白で、心臓血管系の欠陥を示す多源性の出血及び心膜浮腫を示した（図１Ａ，Ｂ）。Ｒａｓｉｐ１−／−胎仔の卵黄嚢は蒼白で、異常な血管形態を示した（データは示さず）。Ｅ１０．５では、Ｒａｓｉｐ１−／−変異体胎仔は増悪した浮腫及び出血を伴うコントロール同腹仔より顕著に小さかった。Ｒａｓｉｐ１−／−胎仔はＥ１２．５を過ぎると検出されず、顕性の形態学的欠陥はＥ８．７５より早い段階では見られなかった。我々は、ＲＡＳＩＰ１の極端なＣ末端に対して産生されたウサギポリクローナル抗体を使用してＥ９．０のヌル胎仔における全長ＲＡＳＩＰ１タンパク質の喪失を確認した。予想された分子量に対応する全長タンパク質はＲａｓｉｐ１−／−全胎仔ライセートには観察されなかった。総括すると、これらのデータは、マウスＲａｓｉｐ１の標的破壊が異常な心臓血管発生及び妊娠中期の致死に至ることを証明している。
【００６３】
我々はついでＲａｓｉｐ１ノックアウトマウスの脈管構造をより詳細に分析した。ＥＣマーカーで染色した７−１０体節期（ｓｓ）の全載胎仔は、Ｒａｓｉｐ１−／−胎仔の対の背側大動脈（ＤＡ）が適切な側方位置に形成されたことを明らかにした（図１Ｃ，１Ｄ）。しかしながら、ＤＡの幅は頭−尾軸に沿って不規則であり、貧弱に形成された又は微細にされた細胞間接着の外観を伴っている。１８ｓｓまでに、Ｒａｓｉｐ１−／−胎仔において主静脈（ＣＶ）及びＤＡが崩壊するか又は膨張するように見え、出血を伴った。ＥＣはまた散らかるか又は分散して見えた（図１Ｅ，Ｆ）。赤血球（ＲＢＣ）は血管の残遺物内に集まるように見え、又は血管外スペースに見出された。
【００６４】
マウスＤＡの形成はＥＣのクラスターが帯中に伸長するときに開始し、ＥＣ間の５μｍより大きい間隙として定義される細胞外管腔が伴う（Strilic等, Dev. Cell 17:505-15 (2009)）。このプロセスは、６ｓｓまでに大部分は完了するが、ＤＡの径が拡大し続け、管の血管新生新芽形成が生じる（Strilic等, 上掲(2009)）。血管腔がＲａｓｉｐ１−／−胎仔において形成されたかどうかを厳密に決定するために、我々は１−２ｓｓ、３−６ｓｓ、及び７−１０ｓｓの変異体及び同腹仔コントロール胎仔からのＤＡの横断面を分析した。１−２ｓｓでは、Ｒａｓｉｐ１＋／−及び−／−胎仔双方において小さな空間（スリット）がＥＣクラスター間に検出され（図２）、それは一般におよそ２０μｍ２の管腔断面積を有していた。３−６ｓｓまでに、ＤＡは遺伝子型にかかわらず、２０μｍ２より大きい管腔スペースを発生させたが、このスペースの度合いはＲａｓｉｐ１−／−胎仔においてかなり変動していた（図２，データは示さず）。７−１０ｓｓからは、Ｒａｓｉｐ１−／−胎仔は、２０μｍ離れている隣接部分間でさせ、頭−尾軸に沿ったＤＡ管腔スペースのサイズに広範な変動を示し、正常に見える管腔を伴うものと隣接した部分での血管崩壊の顕著な徴候である（図２Ｇ，Ｈ）。この現象は対のＤＡを対側性に調べるときにまた観察され、胚形成の後の段階を通して持続していた。我々は、Ｒａｓｉｐ１の喪失は血管腔の初期の樹立を妨げないが、管腔膨張の僅かな遅れを生じ、主要軸の管の局所化された拡張又は崩壊が続くと結論付ける。更に、変異脈管構造は部分的に機能的であると思われ、出血の発症前の期間における原始的な赤血球の循環を許容する。
【００６５】
実施例２  ゼブラフィッシュにおけるＲａｓｉｐ１の役割の調査
我々は次にゼブラフィッシュを使用して、細胞レベルでの血管発生におけるＲａｓｉｐ１の役割を調べた。クエリー配列としてヒトＲＡＳＩＰ１ Ｒａｓ関連及びフォークヘッド関連ドメインを使用して、我々は潜在的なＲＡＳＩＰ１オルソログとしてＥｎｓｅｍｂｌデータベース（www.ensembl.org）において２つの発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンを同定した。ｒａｓｉｐ１及びｒａｆａｄｉｌの部分配列を持つＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＭ０３６３３，ＥＢ７８１６１８．１）はＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのものであった。更なるｃＤＮＡを、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（EMD Biosciences）を使用し、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech）を用いて５’及び３’ＲＡＣＥによってクローニングした。ＲＡＣＥクローンの配列を使用し、受精後３０時間のゼブラフィッシュ  胎仔からの全ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲによって全長ｃＤＮＡを得た。ｒａｓｉｐ１及びｒａｆａｄｉｌ ｃＤＮＡは、Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｓｐ６キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用した５’キャッピングｍＲＮＡのインビトロ合成のために、ＴｏｐｏＸＬ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＳ２＋にサブクローニングした。ＥＳＴを完全に配列決定し、双方の全長ｃＤＮＡをクローニングするために使用した。最初のものはマウス及びヒトＲａｓｉｐ１／ＲＡＳＩＰ１と高い配列類似性を有するタンパク質をコードし、我々はこれがゼブラフィッシュオルソログであると推測する。第二の遺伝子はゼブラフィッシュｒａｓｉｐ１及びＲＡＤＩＬ、つまりａｆａｄｉｎ−６ファミリーの関連メンバー（Smolen等, Genes Dev. 21:2131-36 (2007)）の双方と類似性を有していた。我々はこの遺伝子をｒａｆａｄｉｌと命名した（Ｒａｓ関連、フォークヘッド関連ＤＩＬｕｔｅドメインタンパク質）。系統発生解析は、ｒａｆａｄｉｌが先祖遺伝子複製事象を通じて生じたと思われる魚種特異的遺伝子であることを示している。ｒａｓｉｐ１とｒａｆａｄｉｌの双方とも発生脈管構造に高度に発現している。
【００６６】
ゼブラフィッシュでは、主要軸血管の発生及び管腔化は循環とは独立しており（Isogai等 2003）、我々は樹立されたＴｇ（ｋｄｒｌ：ＥＧＦＰ）ｓ８４３株（Beis等, Development 132:4193-204 (2005)）を使用して血管発生を可視化することを追求した。Ｔｇ（ｋｄｒｌ：ＥＧＦＰ）ｓ８４３胎仔へのモルホリノオリゴヌクレオチド注射を介してゼブラフィッシュｒａｓｉｐ１をノックダウンすると、異常で漏出性の体節間血管の（ＩＳＶｓ）を生じる一方、ｒａｆａｄｉｌのノックダウンは明らかな効果はなかった。ｒａｓｉｐ１とｒａｆａｄｉｌの双方の組み合わせたノックダウンは軸血管及び発達阻止ＩＳＶにおいて顕著な形態学的変化を生じた（図３Ａ，Ｂ）。段階化された発生シリーズで、我々は、過去に報告されているように（Parker等, Nature 428:754-58 (2004)；Jin等, Development 132:5199-209 (2005)）、コントロール及び２２ｓｓの二重モルファント胎仔において脊索の腹側に血管芽細胞凝集体の正常な形成を観察した。２４ｓｓで、血管芽細胞のサブセットが正中凝集体から解離し腹側に遊走／出芽し（Herbert等, Science 326:294-98 (2009)）、続いて２６ｓｓの頃にＰＣＶに合体する。モルファント中の血管芽細胞は正中凝集体から解離し適切に移動したが、異常な細胞間結合を示す間隙が見え持続したのでＰＣＶ中への合体では欠陥があった（図３Ｃ，Ｄ）。これらの欠陥は、ミクロ血管造影によって評価されるように、最終的には機能障害性の漏出性脈管構造に至る（図３Ｅ，Ｆ）。血管欠陥はｒａｓｉｐ１及びｒａｆａｄｉｌをコードするインビトロ転写ＲＮＡの注射により救出した。
【００６７】
総括すると、ゼブラフィッシュにおける我々のデータは、ｒａｓｉｐ１／ｒａｆａｄｉｌ発現の喪失が、漏出し、妥協したＥＣ−ＥＣコヒーレンスの結果として崩壊する不安定な脈管構造の形成に至ることを示している。
【００６８】
実施例３  培養ヒト細胞におけるＲａｓｉｐ１の役割の調査
Ｒａｓｉｐ１変異体胎仔における血管欠陥の根底にある細胞性変化をよりよく理解するために、我々は有意なＲＡＳＩＰ１発現を欠くヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の一連のインビトロ分析を行った。ｓｉＲＮＡとレンチウイルス送達ｓｈＲＮＡの双方でのＲＡＳＩＰ１タンパク質のノックダウンをｑＰＣＲ及びウェスタンブロットにより確認したが、増殖し、遊走し、ストレス下で生存するＨＵＶＥＣの能力に対して有意な効果はなかった。我々は、記載されたようにして（Nakatsu等, Microvasc. Res. 66:102-12 (2003)）、３次元血管形成新芽形成アッセイを実施した。出芽のＤＩＣ画像を、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋソフトウェア（Intelligent Imaging Innovations）を使用して１０Ｘ Ｆｌｕａｒ対物レンズ，ＮＡ０．５を備えたＺｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ．１で獲得した。３次元血管形成新芽形成アッセイでは、我々は、ＲＡＳＩＰ１の喪失が出芽の断片化を生じたことを観察したが（図４Ａ，Ｂ）、これは細胞間結合維持における欠陥を示唆している。出芽の全数に対しての断片化した出芽の数を測定する「脱離比」は、ＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣ対コントロールにおける有意な増加を示した（図４Ｃ）。コントロール出芽が管腔を樹立した後の時点（３−５日）で、ＲＡＳＩＰ１ノックダウン出芽は、コントロールＨＵＶＥＣに対するブレイクポイント数の増加と共に一過性の管腔  形成を示した。而して、マウス及び魚種におけるように、我々のインビトロ血管形成系は、ＲＡＳＩＰ１発現の喪失から生じる破壊された細胞間接着及び一過性で不安定な管腔形成の強い証拠を提供する。
【００６９】
我々は、次の理由のどれがＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣにおける細胞間接着の欠如を説明するのかを決定することを試みた：細胞の遊走能の変化、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への接着の変化、又は細胞間結合組成又は安定性の変化。形質転換  ＭＳ１細胞を利用した以前の報告（Xu等, Dev. Biol. 329:269-79 (2009)）とは異なり、我々は、２４ウェルプレート中のコンフルエントなＨＵＶＥＣ単層がピペット先端で引っ掻かれ、Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステム（Essen BioScience）を使用してＥＧＭ−２（Lonza）で２４時間モニターされるスクラッチ傷アッセイにおいて、遊走するコントロール及びＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣの能力に有意差を観察しなかった（図４Ｄ）。しかしながら、短時間に脱離し遊走波面と再結合した細胞数の増加が見られた（図４Ｅ）。我々は、Ｉ型コラーゲン又はフィブロネクチンの何れかに接着するコントロール及びノックダウンＨＵＶＥＣの能力に有意差を検出しなかった（Parker等, Nature 428:754-58 (2004)）。ついで、我々は結合の完全性を測定するために傍細胞流動アッセイを使用し（Zhao等, J. Cell. Biol. 189:955-65 (2010)）、４０ｋＤａ ＦＩＴＣ−デキストランの通過が、コントロールと比較してＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣにおいておよそ５０−６０％増加したことを見出した（図４Ｆ）。総括すると、我々のデータは、ＲＡＳＩＰ１の喪失は共通のＥＣＭ基質まで移動し又は接着するＥＣの能力に有意には影響しないが、代わりに細胞間結合性を損なうことを示している。
【００７０】
次に、我々は、ＲＡＳＩＰ１のノックダウンが密着又は接着結合を形成する能力に影響を及ぼすかどうかを研究した。定常状態のコンフルエントな血清不足ＨＵＶＥＣ培養において、ＲＡＳＩＰ１の喪失は、この培養条件下で形成された不連続な接合部において、密着結合（ＣＬＡＵＤＩＮ−５，ＯＣＣＬＵＤＩＮ，ＺＯ−１）、接着結合（α−ＣＡＴＥＮＩＮ，β−ＣＡＴＥＮＩＮ，ｐ１２０−ＣＡＴＥＮＩＮ，ＶＥ−カドヘリンＣＡＤＨＥＲＩＮ）、接着点（活性型β１−ＩＮＴＥＧＲＩＮ，ＦＡＫ，ＰＡＸＩＬＩＮ，ビンキュリンＶＩＮＣＵＬＩＮ）又はアクチン細胞骨格関連タンパク質（α−ＡＣＴＩＮＩＮ，非筋細胞ミオシンＩＩＡ）の局在化又はタンパク質レベルを変化させなかった（Millan等, BMC Biology 8:11 (2010)）。新しい連続のＥＣ−ＥＣ接合部の開始及び形成をモニターするために、我々はＥＧＴＡを使用してカルシウム依存性接着結合を破壊（Sakurai等, Molec. Biol. Cell. 17:966-76 (2006)）した後、小ＧＴＰａｓｅ ＲＡＰ１を活性化させることが予想されるＥＰＡＣ１選択的ｃＡＭＰアナログであるＳｐ−５，６−ｄｉＣｌ−ｃＢｉＭＰＳで処理し、よって結合の再構築を促進した（Christensen等, J. Biol. Chem. 278:35394-402 (2003)）。これらの条件下で、結合は、ＶＥ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、β−ＣＡＴＥＮＩＮ、ＣＬＡＵＤＩＮ−５及びＺＯ−１染色によって決定したところ（図５Ｃ）、ｃＢｉＭＰＳへの曝露後３０−６０分で密着複合体に再構築され、接合部マーカーを密に平行化した薄い帯の皮質アクチン集合を伴う（図５Ａ）。顕著なことに、皮質ＡＣＴＩＮ、ＶＥ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、β−ＣＡＴＥＮＩＮ及びＺＯ−１の染色は、このアッセイにおけるＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣにおいて不規則か及び／又は不連続であった（図５Ｄ−Ｆ）。数多くの「スパイク」又は短いアクチン線維が細胞間接着に直交して現れ、ＶＥ−カドヘリン及びファロイジン染色は、コントロール細胞において形成された精密でコンパクトな接合部とは対照的にＲＡＳＩＰ１ノックダウン細胞において不規則でギザギザであった（図５Ａ−Ｆ）。密着及び接着結合マーカー双方並びにＡＣＴＩＮの緻密化の欠如は、ＲＡＳＩＰ１の喪失が膜下アクチンの接合タンパク質への結合を調和させるプロセスに影響を及ぼすことを示唆している。
【００７１】
バリアー形成のＲＡＰ１刺激を必要とするモデルにおいて連続で緻密な結合を形成するＲａｓｉｐ１ノックダウン細胞の無能性は、直ぐに我々をしてＲＡＳＩＰ１，結合、及びＲＡＰ１の間の直接的関係を調査せしめた。最初に、我々は我々のＲＡＳＩＰ１抗体を使用してＲＡＳＩＰ１局在化を調べた。バリアー再形成モデルにおいて、ＲＡＳＩＰ１シグナルは新たに形成された細胞間結合において顕著であり、β−ＣＡＴＥＮＩＮ染色とオーバーラップしており、接合又は膜下の局在化を示している（図５Ｇ，データは示さず）。このシグナルはＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣにおいては見られず（図５Ｈ）、抗体特異性が確認される。ついで、我々は、Ｅｐａｃ１特異的ｃＡＭＰアナログ８−ｐＣＰＴ−２’−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰを使用してｃＢｉＭＰＳでの我々の結果を確認することによりＥＰＡＣ１／ＲＡＰ１への機能的関連を補強した。最後に、ＲＡＳＩＰ１とＲＡＰ１Ａの間に報告された関連性があるので（Mitin等, J. Biol. Chem. 279:22353-61, (2004)）、我々は、ＲＡＰ１のＧＴＰ負荷がＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣにおいて損なわれたかどうかを調べた。有意なレベルのＲＡＰ１−ＧＴＰが、ｃＢｉＭＰＳで処理されたＨＵＶＥＣにおいて見られ、このレベルはＲＡＳＩＰ１ノックダウンＨＵＶＥＣにおいて顕著に減少している。よって、ＲＡＳＩＰ１の喪失はＲＡＰ１のＧＴＰ負荷に影響を及ぼし、これが新生結合の緻密化の欠如を説明しうる。ＲＡＳＩＰ１はＧＡＰ又はＧＥＦドメインを有していないので、我々は、それがその局在化の制御又はＥＰＡＣ１のような因子への接近可能性によってＲＡＰ１機能に影響を及ぼしうると推測する。我々は、バリアー再形成アッセイにおいて観察された未緻密化結合が、細胞が収縮又は引っ張り力に曝されるときに生じるＥＣ−ＥＣ結合の脆弱性増加の特徴であることを提案する。影響を受けた新生血管が血管拡張によりもたらされる引っ張り力増加に常に耐え、また循環の流体力学的力に耐えることはありそうにないので、結合安定性におけるこの根底にある欠陥がＲａｓｉｐ１マウス変異体及び魚種モルファントの安定な管腔形成における無能性を説明する。
【００７２】
我々の研究は脊椎動物の血管発生におけるＲａｓｉｐ１の本質的役割を証明し、Ｒａｓｉｐ１が活発な血管増殖中における新しい細胞間結合の安定化に重要であることを示している。これらの研究は、損なわれた血管結合完全性によって影響を受ける病理症状におけるＲａｓｉｐ１の役割の研究に対する基礎を構築するもので、我々は、ＲＡＳＩＰ１又はそれが存在するシグナル伝達カスケードの活性化が、血管バリヤー機能変化を伴う疾患、例えば敗血症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、浮腫、及び出血において保護的効果を有していると予測する。
【００７３】
上の文書による明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。しかしながら、ここに示され記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、上の明細書から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に入る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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