(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドおよびポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞、ならびに、このポリペプチドを生成する方法およびこれを用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％および１００％の配列同一性を配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件またはきわめて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは３の前記成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１もしくは３の前記成熟型ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％および少なくとも９５％の配列同一性を配列番号１もしくは３の前記成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２もしくは４の前記成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドの断片；ならびに
（ｆ）プロテアーゼ活性を有し、および、モチーフ：
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）
（ここで、Ｘａａはいずれかの天然アミノ酸であり、および、（Ｘａａ）6は６つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得；
または、前記対応するモチーフは、配列番号１４〜配列番号４９から選択されたモチーフなど、前記モチーフ中の最後の８個のアミノ酸の中に１つもしくは２つの置換を含む）
をさらに含むポリペプチド
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を配列番号２もしくは４の前記成熟型ポリペプチドに対して有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
低度の緊縮条件、低度−中度の緊縮条件、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件またはきわめて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは３の前記成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１もしくは３の前記成熟型ポリペプチドコード配列を含む前記ゲノムＤＮＡ、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の前記完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされた請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を配列番号１もしくは３の前記成熟型ポリペプチドコード配列に対して有する、ポリヌクレオチドによりコードされた請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２もしくは４を含むか、これから構成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２もしくは４の前記成熟型ポリペプチドを含むか、これから構成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記成熟型ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１４４〜４１８または配列番号４のアミノ酸１〜２７５である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２もしくは４の断片であり、前記断片がプロテアーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｓ８セリンプロテアーゼドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を配列番号２、４または６の前記成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチドであって、モチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）を含むポリペプチド。
【請求項１１】
前記プロテアーゼが、低温で高い界面活性性能を有し、および、安定性が強キレート剤の存在によって影響されない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
触媒ドメインを含む単離されたポリペプチドであって：
（ａ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号２のアミノ酸１４３〜４１８に対して有する触媒ドメイン；
（ｂ）中度−高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド７１１〜１５３５、（ｉｉ）配列番号１の前記触媒ドメインを含むｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号１の前記触媒ドメインに対して有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン；
（ｄ）配列番号２の前記触媒ドメインの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む触媒ドメインの変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の触媒ドメインの断片
からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１４】
ランドリーまたは自動食器洗浄用組成物などの洗剤組成物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、マンナナーゼまたはいずれかのこれらの混合物から選択される１種または複数種の追加の酵素をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
界面活性剤、ビルダー等から選択される１種または複数種の成分を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
発現宿主において前記ポリペプチドを生成させる１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした、請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクター。
【請求項１９】
前記ポリペプチドを生成させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした、請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）前記ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、野生型形態で前記ポリペプチドを生成する細胞を培養するステップ；および
（ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法。
【請求項２１】
（ａ）前記ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、請求項１９に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
（ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞、ならびに、ポリペプチドを生成し、用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【０００３】
関連技術の説明
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００４】
洗剤産業においては、３０年間以上にわたって異なる酵素が洗剤配合物に利用されてきており、最も一般的に用いられている酵素としては、それぞれ種々のタイプの汚れの除去に適合しているプロテアーゼ、アミラーゼおよびリパーゼが挙げられる。酵素に追加して、洗剤組成物には、典型的には、処方成分の複雑な組み合わせが含まれる。例えば、大部分のクリーニング製品には、界面活性剤系、漂白薬剤またはビルダーが含まれる。現在の洗剤の複雑さに関わらず、新規の酵素および／または酵素ブレンドを含む新規の洗剤組成物を開発する必要性が未だ存在している。
【０００５】
伝統的に、洗濯は高温で行われており、周知の洗剤は、典型的には４０℃〜６０℃の範囲内のより高い温度で実施されるよう選択されている。
【０００６】
環境への負荷をさらに抑えるために洗浄プロセスの改善がますます重視されていることで、世界的に、環境に負荷を与え場合がある、洗浄時間、ｐＨおよび温度を低減し、洗剤成分の量を減らす傾向が見られている。
【０００７】
従って、より低い温度での洗濯に対する要望、従って、低温で高い性能を有する洗剤プロテアーゼに対する要請が存在している。
【０００８】
本発明は、これら、および、他の重要な目的に関連している。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は：
（ａ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）中度−高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明はまた：
（ａ）少なくとも６０％配列同一性を配列番号２のアミノ酸１５０〜４１３に対して有する触媒ドメイン；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド７２９〜１５２０、（ｉｉ）配列番号１の触媒ドメインをコードするｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号１の触媒ドメインに対して有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン；
（ｄ）配列番号２の触媒ドメインの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む触媒ドメインの変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の触媒ドメインの断片
からなる群から選択される触媒ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、以下のモチーフを含むプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）
（ここで、Ｘａａはいずれかの天然アミノ酸であり、および、（Ｘａａ）6は６つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得、
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の８個のアミノ酸の中に１つもしくは２つの置換を含む。）
【００１２】
本発明はまた、ランドリーまたは手洗いでの食器洗いまたは自動食器洗い用の洗剤組成物などの、特に本発明のプロテアーゼを含む洗剤組成物といった、本発明のポリペプチドを含む組成物に関する。
【００１３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いる生地の洗濯方法、および、硬質面をクリーニングする方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、各々がタンパク質をコードする遺伝子に作動可能にリンクしている、配列番号２のアミノ酸−２６〜−１もしくは配列番号４のアミノ酸−１６０〜−１３２を含むか、これから構成されるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２のアミノ酸１〜１４３もしくは配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１を含むか、これから構成されるプロペプチドをコードするポリヌクレオチド、または、それぞれ、配列番号２のアミノ酸−２６〜−１およびアミノ酸１〜１４３もしくは配列番号４のアミノ酸−１６０〜−１３２およびアミノ酸−１３１〜−１を含むか、これから構成されるシグナルペプチドおよびプロペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連し；ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、発現ベクターおよび組換え宿主細胞に関連し；ならびに、タンパク質を生成する方法に関連する。
【００１５】
定義
プロテアーゼ活性：「プロテアーゼ活性」という用語は、ポリペプチド鎖中でアミン酸を結合するペプチド結合の加水分解によって、アミド結合またはタンパク質の加水分解を触媒するタンパク質分解活性（ＥＣ３．４．２１．）を意味する。プロテアーゼ活性を判定するための数々のアッセイが技術分野において利用可能である。本発明の目的のために、プロテアーゼ活性は、Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠剤（架橋され、染色されたカゼイン；Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）を用いて、または、本出願の実施例の項において記載されているＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイにおいて判定され得る。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも１００％のプロテアーゼ活性を有する。
【００１７】
単離されたポリペプチド：「単離されたポリペプチド」という用語は、自然界において見出されるポリペプチドと相対的に人工的に修飾されたポリペプチドを意味し、これにより、これは、ポリペプチドが自然界において一緒に見出される少なくとも１種の他の化合物から完全にまたは部分的に分離されている。一態様において、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度および少なくとも９０％の純度である。
【００１８】
単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）特にこれらに限定されないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくはすべてが少なくとも部分的に除去されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補助因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質と相対的に人工的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界においては関連している他の成分に対する物質の量を増やすことにより修飾されたいずれかの物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連しているプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。
【００１９】
実質的に純粋なポリペプチド：「実質的に純粋なポリペプチド」という用語は、最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％の元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリペプチド材料を含有する調製物を意味する。好ましくは、このポリペプチドは、調製物中に存在するポリペプチド材料の総重量を基準として、少なくとも９２％の純度、例えば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度および１００％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え方法によって、または、古典的な精製方法によって変異体を調製することにより達成されることが可能である。
【００２０】
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。一態様において、成熟型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１４４〜４１８である。他の態様において、成熟型ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜２７５である。他の態様において、成熟型ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１〜２８３である。
【００２１】
プロペプチド：「プロペプチド」という用語は、成熟型ポリペプチドと一緒に翻訳され、および、成熟型ポリペプチドが遊離される前に切断されてプロテアーゼ活性が得られるポリペプチドを意味する。一態様において、プロペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１４３、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１または配列番号６のアミノ酸−１２８〜−１である。
【００２２】
シグナルペプチド：「シグナルペプチド」という用語は、成熟型ポリペプチドと一緒に翻訳されて、プロペプチドが存在する短鎖ポリペプチドを意味する。シグナルペプチドは、翻訳されたポリペプチドのＮ−末端に位置し、ポリペプチドの分泌に関与する。通常は、シグナルペプチドは、プラズマメンブランまたは小胞体のメンブランなどのメンブラン中のポリペプチドの転位の最中に除去される。
【００２３】
シグナルペプチドは当該技術分野において周知であり、例えば、配列番号２のアミノ酸−２６〜−１、配列番号４のアミノ酸−１６０〜−１３２および配列番号６のアミノ酸−１５８〜−１２９がシグナルペプチドであることを予測するＳｉｇｎａｌＰ  （Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）といった、シグナルペプチドを予測するための数々の方法が開発されている。
【００２４】
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、プロテアーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様において、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド７１１〜１５３５、配列番号３のヌクレオチド５８１〜１４０５もしくは配列番号５のヌクレオチド４７５〜１３２３である。
【００２５】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
【００２６】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２７】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２８】
断片：「断片」という用語は、成熟型ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで、断片はプロテアーゼ活性を有する。一態様において、断片は、少なくとも２００アミノ酸残基（例えば、配列番号２、４または６のアミノ酸１６０〜３６０）、少なくとも２３０アミノ酸残基（例えば、配列番号２、４または６のアミノ酸１５０〜３８０）、および、少なくとも２６０アミノ酸残基（例えば、配列番号２、４または６のアミノ酸１５０〜４１０）を含有する。
【００２９】
サブ配列：「サブ配列」という用語は、成熟型ポリペプチドコード配列の５’および／または３’末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し；ここで、サブ配列は、プロテアーゼ活性を有する断片をコードする。一態様において、サブ配列は、少なくとも６００ヌクレオチド（例えば、配列番号１、３または５のヌクレオチド７５９〜１３６１）、例えば、少なくとも７００ヌクレオチド（例えば、配列番号１、３または５のヌクレオチド７３１〜１４３１）、および、少なくとも７８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１、３または５のヌクレオチド７３１〜１５１４）を含有する。
【００３０】
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であることが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００３１】
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、自然界において見出されるポリヌクレオチドと相対的に人工的に修飾されたポリヌクレオチドを意味し、これにより、これは、ポリペプチドが自然界において一緒に見出される少なくとも１種の他の化合物から完全にまたは部分的に分離されている。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度および少なくとも９５％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、または、これらのいずれかの組み合わせであり得る。
【００３２】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、および、遺伝的に操作されたポリペプチド産生系における使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、元々または組換え的に関連している他のポリヌクレオチド材料を最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の５’−および３’−非翻訳領域を含み得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも９０％の純度、例えば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度および少なくとも９９．５％の純度である。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
【００３３】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、通常は、ＡＴＧ開始コドン、または、ＧＴＧおよびＴＴＧなどの代わりの開始コドンで開始され、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換えポリヌクレオチドであり得る。
【００３４】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
【００３５】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に要求される制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。
【００３６】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来もしくは外来のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
【００３７】
作動可能にリンク：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
【００３８】
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。
【００３９】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす追加のヌクレオチドに作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。
【００４０】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを包含する。
【００４１】
変異体：「変異体」という用語は、１種または複数種（いくつか）のアミノ酸残基の改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を１つまたは複数（いくつか）の位置で含むプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
【００４２】
低度の緊縮条件：「低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４３】
中度の緊縮条件：「中度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４４】
高度の緊縮条件：「高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４５】
クリーニング組成物：「クリーニング組成物」および「クリーニング配合物」という用語は、布地、カーペット、ガラス食器を含む食器類、コンタクトレンズ、タイル、亜鉛板、床およびテーブル面などの硬質面、髪（シャンプー）、皮膚（セッケンおよびクリーム）、歯（うがい薬、歯磨き粉）等などのクリーニングされるアイテムから望ましくない化合物を取り除くために用いられる組成物を指す。この用語は、組成物が、この組成物において用いられるメタロプロテアーゼおよび他の酵素と適合可能な限りにおいて、所望される特定のタイプのクリーニング組成物および生成物の形態（例えば、液体、ゲル、顆粒または噴霧組成物）のために選択されるいずれかの材料／化合物を包含する。クリーニング組成物材料の特定の選択はクリーニングされる表面、アイテムまたは布地、および、使用中のクリーニング条件について所望される組成物の形態を考慮することにより容易になされる。これらの用語は、いずれかの対象物および／または表面のクリーニング、漂白、消毒および／または殺菌に好適ないずれかの組成物をさらに指す。これらの用語は、これらに限定されないが、洗剤組成物（例えば、液体および／または固体ランドリー洗剤および目の細かい布地用の洗剤；ガラス、木材、セラミックおよび金属製カウンター面ならびに窓などのための硬質面クリーニング配合物；カーペットクリーナ；オーブンクリーナ；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；ならびに、生地およびランドリーの予備染み抜き、ならびに、食器用洗剤）を含むことが意図されている。
【００４６】
洗剤組成物：「洗剤組成物」という用語は、別段の定めがある場合を除き、特にクリーニング洗剤といった粒状または粉末形態の汎用または重質洗浄剤；特にいわゆる重質液体（ＨＤＬ）タイプの液体、ゲルまたはペースト形態の汎用洗浄剤；目の細かい布地用の液体洗剤；特に高発泡性タイプのものといった手洗い用食器洗い剤または軽質食器洗い薬剤；家庭用途および工業用途の種々の錠剤、粒状、液体およびすすぎ補助タイプを含む機械用食器洗い薬剤；抗菌性手洗いタイプ、クリーニングバー、うがい薬、義歯クリーナ、車またはカーペットシャンプー、浴室クリーナを含む液体クリーニングおよび消毒剤；髪用シャンプーおよび髪リンス；シャワーゲル、泡風呂；金属クリーナ；ならびに、漂白剤添加剤および「汚れ落としスティック（ｓｔａｉｎ−ｓｔｉｃｋ）」または前処理タイプなどのクリーニング助剤を含む。
【００４７】
「洗剤組成物」および「洗剤配合物」という用語は、汚染された対象物のクリーニング用の洗浄用媒体における使用が意図される混合物の言及において用いられる。いくつかの実施形態において、この用語は、布地および／または衣服の洗濯（例えば、「ランドリー洗剤」）に言及するために用いられる。代替的な実施形態において、この用語は、食器、カトラリー等をきれいにするために用いられるもの（例えば、「食器洗い洗剤」）などの他の洗剤を指す。本発明がいずれかの特定の洗剤配合物または組成物に限定されることは意図されていない。この用語は、本発明に係るサーモリシン様メタロプロテアーゼに追加して、例えば、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系もしくは漂白剤成分、ポリマー、布地コンディショナ、起泡増進剤、セッケン泡抑制剤、染料、芳香剤、色あせ防止剤、光学増白剤、殺菌剤、殺菌・殺カビ剤、汚染物懸濁剤、腐食防止剤、酵素抑制剤もしくは安定化剤、酵素活性化剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、青み付け剤および蛍光性染料、酸化防止剤、ならびに、溶解剤を含有する洗剤を包含することが意図されている。
【００４８】
布地：「布地」という用語はいずれかの生地材料を包含する。それ故、この用語は、衣服、ならびに、布地、ヤーン、繊維、不織材料、天然材料、合成材料、および、いずれかの他の生地材料を包含することが意図されている。
【００４９】
生地：「生地」という用語は、ヤーン、織布、ニット、ならびに、不織布への加工もしくはその使用に好適な織布地、ならびに、ステープル繊維およびフィラメントを指す。この用語は、天然ならびに合成（例えば、製造された）繊維製のヤーンを包含する。「生地材料」という用語は、繊維、ヤーン中間物、ヤーン、布地および布地から形成される製品（例えば、衣服および他の物品）に係る一般的な用語である。
【００５０】
非布地洗剤組成物：「非布地洗剤組成物」という用語は、特にこれらに限定されないが、食器洗い洗剤組成物、口腔用洗剤組成物、義歯洗剤組成物、および、パーソナルクレンジング組成物を含む非生地表面洗剤組成物を含む。
【００５１】
酵素の有効量：「酵素の有効量」という用語は、例えば、規定の洗剤組成物中といった特定の用途において要求される酵素活性に必要な酵素の量を指す。このような有効量は、技術分野における当業者によって容易に確定され、これは、用いられる特定の酵素、クリーニング用途、洗剤組成物の特定の組成、および、液体または乾燥（例えば、粒状、バー）組成物のどちらが要求されるか等の多くの要因に基づいている。メタロプロテアーゼの「有効量」という用語は、例えば、規定の洗剤組成物において所望のレベルの酵素活性を達成する本明細書に既述のメタロプロテアーゼの量を指す。
【００５２】
洗浄性能：酵素の「洗浄性能」という用語は、組成物に酵素を追加することなく洗剤に追加的なクリーニング性能をもたらす洗浄に対する酵素の寄与を指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。酵素の洗浄性能は、適切なテスト条件下で一定の代表的な汚れを除去する能力により簡便に計測される。これらのテスト系において、洗剤組成物、洗剤濃度、水硬度、洗浄器、時間、ｐＨ、および／または、温度などの他の関連する要因は、一定の市場セグメントにおける家庭用の用途に係る典型的な条件が模倣されるよう制御することが可能である。
【００５３】
水硬度：本明細書において用いられるところ、「水硬度」または「硬度」または「ｄＨ」または「°ｄＨ」という用語は、ドイツ式の硬度を指す。１度は、１リットルの水当たり１０ミリグラムの酸化カルシウムと定義される。
【００５４】
関連する洗浄条件：「関連する洗浄条件」という用語は、本明細書において、特に、洗剤市場セグメントにおける家庭において実際に用いられる洗浄温度、時間、洗浄器、洗剤濃度、洗剤のタイプおよび水硬度といった条件を示すために用いられる。
【００５５】
向上した特性：「向上した特性」という用語は、酵素を伴わずに実施した同一のプロセスと比して、特性においてより良好な最終結果が得られることを示すために用いられる。本発明の最終結果において好ましくは向上する例示的な特性としては、洗浄性能、酵素安定性、酵素活性および基質特異性が挙げられる。
【００５６】
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、酵素を用いない場合と比してもしくは基準酵素を用いる場合と比して、関連する洗浄条件下において洗浄したアイテム（例えば、布地または食器類および／またはカトラリー）からの汚れの除去においてより良好な最終結果が得られるか、または、酵素を用いない場合もしくは基準酵素を用いる場合と相対的に、同一の最終結果を得るために必要とされる酵素が重量基準で少ないことを示すために用いられる。向上した洗浄性能はまた、この文脈において、例えば汚れ除去効果といった同一の効果がより短い洗浄時間で得られ、例えば、酵素がテストを行った条件下でより迅速に効果を発揮するということであり得る。「洗浄性能の保持」という用語は、酵素の洗浄性能が、重量基準で、関連する洗浄条件下の他の酵素と比して、少なくとも８０パーセントであることを示すために用いられる。
【００５７】
酵素洗浄力：本明細書において、「酵素洗浄力」または「洗浄力」または「洗浄力効果」という用語は、酵素を伴わない同一の洗剤と比して、酵素が洗剤に追加し得る有利な効果として定義される。酵素によりもたらされることが可能である重要な洗浄力有益性は、洗浄および／またはクリーニング後に視認可能な汚染物がないかほとんどない汚れ除去；再付着防止とも呼ばれる効果である、洗浄プロセスで遊離した汚染物の再付着の防止または低減；白色化とも呼ばれる効果である、元々は白色であったが反復的な使用および洗浄の後に灰色がかったもしくは黄色がかった外観となってしまった生地の白色度の完全なまたは部分的な回復である。触媒による汚れ除去もしくは汚染物の再付着防止に直接関係はしない、生地の取り扱いによる有益性（ｔｅｘｔｉｌｅ  ｃａｒｅ  ｂｅｎｅｆｉｔ）もまた酵素洗浄力有益性に重要である。このような生地の取り扱いによる有益性の例は、移染防止または逆汚染防止とも呼ばれる、一の布地から他の布地へ、もしくは、同一の布地の他の部分への移染の防止もしくは低減；抗ピルとも呼ばれる、ピル性を低減するための布地表面からの突出繊維もしくは破断繊維の除去、または、既に存在しているピルもしくは毛羽の除去；布地柔軟性の向上；布地の色の清澄化；および、布地もしくは衣服の繊維中に詰まった粒状の汚染物の除去である。酵素漂白はさらなる酵素洗浄力有益性であり、ここで、触媒活性は、一般に、過酸化水素もしくは他の過酸化物などの漂白成分の形成を触媒するために用いられる。
【００５８】
再付着防止：「再付着防止」という用語は、本明細書において用いられるところ、洗浄液中に溶解もしくは懸濁した汚染物のクリーニングした対象物への再付着の低減または防止を説明する。再付着は、１回もしくは複数回の洗浄サイクル後に判明し得る（例えば、灰色化、黄色化、または他の変色として）。
【００５９】
補助材：「補助材」という用語は、所望される特定のタイプの洗剤組成物、および、生成物の形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、噴霧、錠剤、ゲルまたはフォーム組成物）に対して選択されるいずれかの液体、固体または気体材料を意味し、これらの材料はまた、組成物において用いられるメタロプロテアーゼ酵素と適合性であることが好ましい。いくつかの実施形態において、粒状組成物は「圧縮」形態にあり、一方で、他の実施形態においては、液体組成物は「濃縮」形態にある。
【００６０】
汚れ除去酵素：「汚れ除去酵素」という用語は、本明細書において用いられるところ、布地または硬質面からの汚れまたは汚染物の除去を補助する酵素を表している。汚れ除去酵素は、例えば、タンパク質のプロテアーゼ、デンプンのアミラーゼ、脂質（脂肪および脂）のリパーゼおよびクチナーゼ、ペクチンのペクチナーゼ、ならびに、ヘミセルロースのヘミセルラーゼといった特定の基質に作用する。汚れは、度々、異なる成分の複雑な混合物の付着であり、これは、単独で材料の局部的な変色をもたらすか、または、対象物に粘着性の表面を残し、これが、洗浄液中に溶解した汚染物を誘引し得、これにより、汚れた領域の変色がもたらされ得る。酵素が汚れに存在する特定の基質に作用すると、酵素は、その基質を分解するか部分的に分解し、これにより、洗浄プロセスの最中における基質に関連する汚染物および汚れ成分の除去を補助する。例えば、クロロフィラーゼが草の汚れに作用する場合、これは、草の中のクロロフィル成分を分解し、洗浄の最中に緑色／茶色を遊離させる。
【００６１】
低減された量：「低減された量」という用語は、この文脈においては、成分の量が、それ以外は同一の条件下での基準プロセスにおいて用いられるであろう量よりも少ないことを意味する。好ましい実施形態において、この量は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％などの少なくとも５％、または、そうでなければ本明細書において記載されている割合で低減される。
【００６２】
低洗剤濃度：「低洗剤濃度」という用語は、系が洗剤を含み、ここでは、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水中に存在する。例えば日本といったアジアの洗剤は、典型的には低洗剤濃度系であると考えられる。
【００６３】
中洗剤濃度：「中洗剤濃度」という用語は、系が洗剤を含み、ここでは、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する。北米の洗剤は、一般に、中洗剤濃度系であると考えられる。
【００６４】
高洗剤濃度：「高洗剤濃度」という用語は、系が洗剤を含み、ここでは、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在する。欧州の洗剤は、一般に、高洗剤濃度系であると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
本発明は、プロテアーゼが、低温で高い洗浄力性能を有し、および、安定性が強キレート剤の存在によって影響されないことを特徴とする、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００６６】
それ故、本発明の態様は：
（ａ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列を含むｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２の成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００６７】
本発明の他の態様は：
（ａ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列を含むｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号４の成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００６８】
本発明はまた：
（ａ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号２のアミノ酸１５０〜４１３に対して有する触媒ドメイン；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド７２９〜１５２０、（ｉｉ）配列番号１の触媒ドメインを含むゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号１の触媒ドメインに対して有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン；
（ｄ）配列番号２の触媒ドメインの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む触媒ドメインの変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の触媒ドメインの断片
からなる群から選択される触媒ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
【００６９】
本発明は、プロテアーゼ活性を有する、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドまたは触媒ドメインに関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号２の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【００７０】
本発明は、プロテアーゼ活性を有する、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号４の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列もしくはその対立遺伝子変異体を含むか、これから構成されることが好ましく；または、プロテアーゼ活性を有するその断片である。本発明のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列もしくはその対立遺伝子変異体を含むか、これから構成されることが好ましく；または、プロテアーゼ活性を有するその断片である。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号２の成熟型ポリペプチドを含むか、これから構成される。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号４の成熟型ポリペプチドを含むか、これから構成される。他の好ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１４４〜４１８を含むか、これから構成される。他の好ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜２７５を含むか、これから構成される。
【００７２】
本発明のプロテアーゼは、他のサブチリシンの大部分がＣａ２＋に対する高親和性結合部位を有する領域に位置されるモチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙを共有する。本発明のサブチリシンのループはＣａ２＋に対する高親和性結合部位を有するサブチリシンにおいて見出されるものよりも短く、これは、この部位がここに存在していないことを示している。以下のアラインメントを参照のこと。これはまた、実施例３、表６において実証されているとおり、ＥＤＴＡのようなキレート剤によっては性能は影響されないことを示すデータによっても表されている。このモチーフは、配列番号６を有するパエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｐ．デンドリティ（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉ））由来のプロテアーゼにおいても見出される。
【００７３】
３種の公知のサブチリシンと、配列番号２、４および６とのＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８３アラインメントにより見出されるモチーフ領域。
ＢＰＮ’  ＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬ
Ａｌｃａｌａｓｅ  ＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＤＮＴＴＧＶＬ
Ｓａｖｉｎａｓｅ  ＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬ
配列番号２        ＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧ−−−ＳＶＳ
配列番号４        ＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧ−−−ＳＶＳ
配列番号６        ＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧ−−−ＳＶＳ
【００７４】
それ故、一実施形態において、本発明は、モチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）を含むと共に、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対する、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００７５】
一実施形態において、本発明は、モチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）を含むと共に、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対する、少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００７６】
それ故、一実施形態において、本発明は、モチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）６Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）を含むと共に、配列番号６の成熟型ポリペプチドに対する、少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００７７】
本発明の一態様は、モチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）６Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）を含むと共に、配列番号２、４および６の成熟型ポリペプチドに対する、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００７８】
他の実施形態において、本発明は、以下のモチーフを含むプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）
ここで、Ｘａａはいずれかの天然アミノ酸であり、および、（Ｘａａ）6は６つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得、
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の８個のアミノ酸の中に１つもしくは２つの置換を含む。特に本発明は、プロテアーゼ活性を有し：
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１４）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１５）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１６）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１７）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１８）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号１９）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号２０）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２１）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２２）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２３）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２４）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号２５）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号２６）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２７）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２８）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号２９）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号３０）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号３１）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号３２）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号３３）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号３４）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号３５）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号３６）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号３７）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号３８）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号３９）：
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号４０）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｘａａ（配列番号４１）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号４２）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号４３）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号４４）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号４５）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号４６）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号４７）；
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｘａａ  Ｇｌｙ（配列番号４８）；または
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ−（Ｘａａ）6−Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘａａ（配列番号４９）
から選択されるモチーフを含む単離されたポリペプチドに関する。
【００７９】
好ましくは、本発明のプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは：
（ａ）例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも６０％の配列同一性を配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも６０％の配列同一性を配列番号２のアミノ酸１５０−４１３に対して有する触媒ドメインを含むポリペプチド；
（ｃ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列を含むｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｅ）配列番号２の成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；ならびに
（ｆ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択され；
ここで、単離されたポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、以下のモチーフを含む。
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）
ここで、Ｘａａはいずれかの天然アミノ酸であり、および、（Ｘａａ）6は６つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得る。
【００８０】
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の８個のアミノ酸の中に１つもしくは２つの置換を含む。
【００８１】
他の好ましい実施形態において、本発明のプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは：
（ａ）例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも６０％の配列同一性を配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列を含むｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号４の成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択され、ここで、単離されたポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、以下のモチーフを有する。
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）
ここで、Ｘａａはいずれかの天然アミノ酸であり、および、（Ｘａａ）6は６つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得る。
【００８２】
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の８個のアミノ酸の中に１つもしくは２つの置換を含む。
【００８３】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明のプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは：
（ａ）例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも６０％の配列同一性を配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号５の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号５の成熟型ポリペプチドコード配列を含むｃＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％の配列同一性を配列番号５の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号６の成熟型ポリペプチドの１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；ならびに
（ｅ）プロテアーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択され、ここで、単離されたポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、以下のモチーフを含む。
Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）
ここで、Ｘａａはいずれかの天然アミノ酸であり、および、（Ｘａａ）6は６つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得る。
【００８４】
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の８個のアミノ酸の中に１つもしくは２つの置換を含む。
【００８５】
モチーフＨｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ（Ｘａａ）6Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ（配列番号１３）または配列番号１４〜配列番号４９を有するモチーフのいずれかを共有する本発明のポリペプチドは、ＥＤＴＡなどの強キレート剤の存在下でも安定であるという利点を有し得る。それ故、強キレート剤の存在下での安定性は、好ましくはキレート剤を伴わない同一の条件下での安定性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、および、最も好ましくは少なくとも９７％である。
【００８６】
これは、本発明のポリペプチドの安定性を、１ｍＭのＥＤＴＡの存在下でアッセイし、また、１ｍＭのＣａＣｌ2の存在下であるがＥＤＴＡ不在下でアッセイして、このＥＤＴＡの有無に係る安定性を比較することにより判定され得る。このアッセイにより、ＥＤＴＡの存在下または不在下でのポリペプチドの安定性がほぼ同等であることが明らかである。これは、ＥＤＴＡの存在下では安定性が、同一の条件下であるがＥＤＴＡの不在下での安定性と比して顕著に低い、例えばＳａｖｉｎａｓｅ（バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来であり、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能であるアルカリ性プロテアーゼ）などの従来技術において商業的に入手可能であるプロテアーゼとは完全に対照的である。
【００８７】
本発明はまた、きわめて低度の緊縮条件、低度の緊縮条件、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件またはきわめて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列をコードするゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランド（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００８８】
配列番号１もしくは３のポリヌクレオチドまたはそのサブ配列、ならびに、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列またはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統からプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、標準的なサザンブロッティング法の後に、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、対象の属もしくは種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられることが可能である。このようなプローブは配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、例えば、長さが少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドと少なくとも１４ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
【００８９】
このような他の系統から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の系統由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得る。配列番号１もしくは３もしくはそのサブ配列と相同性であるクローンもしくはＤＮＡを同定するために、キャリア材料がサザンブロッティングに用いられることが好ましい。
【００９０】
本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、きわめて低度〜きわめて高度の緊縮条件下で、配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列；配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列；その完全長相補ストランド；または、そのサブ配列に対応する標識化核酸プローブにポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを表す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムを用いて検出可能である。
【００９１】
一態様において、核酸プローブは、配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列である。他の態様において、核酸プローブは配列番号１のヌクレオチド７１１〜１５３５であり、一態様において、核酸プローブは配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列である。他の態様において、核酸プローブは配列番号３のヌクレオチド５８１〜１４０５である。他の態様において、核酸プローブは、配列番号２もしくは４のポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドである。他の好ましい態様において、核酸プローブは配列番号１もしくは３である。
【００９２】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長鎖プローブに関して、きわめて低度〜きわめて高度の緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃での、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、きわめて低度および低度の緊縮性に対しては２５％ホルムアミド、中度および中度−高度の緊縮性に対しては３５％ホルムアミド、または、高度およびきわめて高度の緊縮性に対しては５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、４５℃（きわめて低度の緊縮性）、５０℃（低度の緊縮性）、５５℃（中度の緊縮性）、６０℃（中度−高度の緊縮性）、６５℃（高度の緊縮性）および７０℃（きわめて高度の緊縮性）で、１５分間、３回洗浄される。
【００９３】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短い短鎖プローブに関して、緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出したＴmよりも約５℃〜約１０℃低い温度で、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハート溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭナトリウム一塩基性リン酸、０．１ｍＭ  ＡＴＰおよび０．２ｍｇのイースト菌ＲＮＡ／ｍｌでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、６Ｘ  ＳＣＣ中で１度、また、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、および、算出したＴmより５℃〜１０℃低い温度で６×ＳＳＣを用いて１５分間ずつ２回洗浄される。
【００９４】
本発明は、配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００９５】
本発明はまた、配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００９６】
本発明はまた、配列番号２、４もしくは６の成熟型ポリペプチドのアミノ酸、または、その相同性配列の１つまたは複数（または数々）の置換、欠失および／または挿入を含む変異体に関する。好ましくは、アミノ酸変異は、副次的な性質のものであり、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／もしくは活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；典型的には１〜約３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ−端子メチオニン残基などの小さなアミノ−もしくはカルボキシル−末端伸長；約２０〜２５個以下の残基の小さなリンカーペプチド；または、ポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどの変異もしくは他の機能を変化させることによって精製を促進させる小さな伸長である。好ましくは、変異体は、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し；例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、１００％未満の同一性を配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して有する。
【００９７】
他の好ましい実施形態において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し；例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、１００％未満の同一性を配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して有する。
【００９８】
さらに他の好ましい実施形態において、変異体は、配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し；例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、１００％未満の同一性を配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して有する。
【００９９】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。最も頻繁に生じる置換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【０１００】
あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適ｐＨを変化させることであり得る。
【０１０１】
親ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにプロテアーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、親ポリペプチドに関連するポリペプチドによるアイデンティティの分析から推測されることも可能である。
【０１０２】
アミノ酸Ａｓｐ１７６、Ｈｉｓ２０９およびＳｅｒ３５９は、配列番号２のプロセアーゼの触媒三残基を形成し、従って、分子の活性に重要であると共に修飾されるべきではない。それ故、配列番号２中のＡｓｐ１７６、Ｈｉｓ２０９およびＳｅｒ３５９に対応するアミノ酸残基は本発明の変異体において修飾されるべきではない。
【０１０３】
アミノ酸Ａｓｐ３３、Ｈｉｓ６６およびＳｅｒ２１６は、配列番号４のプロセアーゼの触媒三残基を形成し、従って、分子の活性に重要であると共に修飾されるべきではない。それ故、配列番号２中のＡｓｐ３３、Ｈｉｓ６６およびＳｅｒ２１６に対応するアミノ酸残基は本発明の変異体において修飾されるべきではない。
【０１０４】
アミノ酸Ａｓｐ３４、Ｈｉｓ６７およびＳｅｒ２１７は、配列番号６のプロセアーゼの触媒三残基を形成し、従って、分子の活性に重要であると共に修飾されるべきではない。それ故、配列番号２中のＡｓｐ３４、Ｈｉｓ６７およびＳｅｒ２１７に対応するアミノ酸残基は本発明の変異体において修飾されるべきではない。
【０１０５】
触媒残基は公知のＳ８セリンプロテアーゼとのアラインメントにより判定されており、ここで、触媒残基は、このようなプロテアーゼのすべてにおいて保存されていることが見出された。
【０１０６】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１０７】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【０１０８】
配列番号２、４または６の成熟型ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失および／または挿入の総数は、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９である。
【０１０９】
ポリペプチドは、一のポリペプチドの一部分が、他のポリペプチドの一部分のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【０１１０】
ポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合タンパク質はまた、翻訳後に融合が形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０１１１】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
【０１１２】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドのソース
本発明のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドがソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味することとする。一態様において、所与のソースから入手されるポリペプチドは細胞外に分泌される。
【０１１３】
ポリペプチドは細菌性ポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、プロテアーゼ活性を有する、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチドなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）ポリペプチドなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
【０１１４】
一態様において、ポリペプチドは、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリペプチドである。
【０１１５】
他の態様において、ポリペプチドは、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ポリペプチドである。
【０１１６】
他の態様において、ポリペプチドは、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ポリペプチドである。
【０１１７】
ポリペプチドはまた、真菌性ポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチドなどのイースト菌ポリペプチド；または、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスペリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）もしくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）ポリペプチドなどの糸状真菌性ポリペプチドであり得る。
【０１１８】
他の態様において、ポリペプチドは、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）ポリペプチドである。
【０１１９】
他の態様において、ポリペプチドは、アクレモニウムセルロリチクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクスラクテウス（Ｉｒｐ��ｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムフニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビアアクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビアアルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビアアルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビアアウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビアフィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビアミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビアオビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビアペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビアセトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビアスペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビアスブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）ポリペプチドである。
【０１２０】
一態様において、ポリペプチドは、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ポリペプチド由来のプロテアーゼである。本発明の他の態様において、ポリペプチドは、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）由来のプロテアーゼである。
【０１２１】
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
【０１２２】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【０１２３】
ポリペプチドは、上記のプローブを用いて自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物を含む他のソースから同定され、また、得られ得る。微生物を自然環境から単離する技術は技術分野において周知である。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に周知である技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化されることが可能である。
【０１２４】
プロペプチド
本発明はまた、触媒ドメインに作動可能にリンクしたプロペプチド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関しており、ここで、結合ドメインは：
（ａ）少なくとも６０％の配列同一性を、配列番号２のアミノ酸１〜１４３、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１または配列番号６のアミノ酸−１２８〜−１に対して有するプロペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０または配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０もしくは配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０を含むゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるプロペプチド；
（ｃ）少なくとも６０％配列同一性を、配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０または配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるプロペプチド；ならびに
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１〜１４３、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１または配列番号６のアミノ酸−１２８〜−１の１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体
からなる群から選択される。
【０１２５】
プロペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１４３に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の配列同一性を有することが好ましい。一態様において、プロペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１４３から、１０アミノ酸、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
プロペプチドは、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の配列同一性を有することが好ましい。一態様において、プロペプチドは、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１から、１０アミノ酸、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
プロペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１４３またはその対立遺伝子変異体を含むか、これから構成されることが好ましい。
【０１２８】
プロペプチドは、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１またはその対立遺伝子変異体を含むか、これから構成されることが好ましい。
【０１２９】
プロペプチドは、きわめて低度の緊縮条件、低度の緊縮条件、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件およびきわめて高度の緊縮条件（上記に定義されているとおり）の下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０もしくは配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０、配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０を含むゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランド（前述のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０１３０】
プロペプチドは、配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０１３１】
プロペプチドは、配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０１３２】
他の態様において、プロペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０を含むか、これから構成される。
【０１３３】
他の態様において、プロペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０を含むか、これから構成される。
【０１３４】
プロペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１４３の１つまたは複数（または数々）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体であり得る。配列番号２のアミノ酸１〜１４３のアミノ酸置換、欠失および／または挿入の総数は、１０、例えば、１、２、３、４、５、６、８または９である。
【０１３５】
プロペプチドは、配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１の１つまたは複数（または数々）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体であり得る。配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１のアミノ酸置換、欠失および／または挿入の総数は、１０、例えば、１、２、３、４、５、６、８または９である。
【０１３６】
プロペプチドは、配列番号６のアミノ酸−１２８〜−１の１つまたは複数（または数々）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体であり得る。配列番号６のアミノ酸−１２８〜−１のアミノ酸置換、欠失および／または挿入の総数は、１０、例えば、１、２、３、４、５、６、８または９である。
【０１３７】
触媒ドメインは、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼ、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、他のリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼから得られ得る。好ましくは、触媒ドメインは、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、より好ましくはサブチリシンまたはＳ８−セリンプロテアーゼから得られる。
【０１３８】
触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドは、原核生物、真核生物、または、他のソースのいずれかから入手され得る。
【０１３９】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１４０】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、または、これらの組み合わせが含まれる。このようなゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたＤＮＡ断片を検出することにより実施されることが可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅法が用いられ得る。ポリヌクレオチドは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の系統、または、他のもしくは関連する生体からクローン化され得、それ故、例えば、ポリヌクレオチドの領域をコードするポリペプチドの対立形質もしくは種変異体であり得る。
【０１４１】
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、これから構成される単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、これから構成される単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１４２】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性、至適ｐＨ等が異なる変異体である。変異体は、配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列（例えば、そのサブ配列）として表されるポリヌクレオチドに基づいて構築され得、および／または、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応するヌクレオチド置換の導入により、または、異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照のこと。
【０１４３】
本発明はまた、きわめて低度の緊縮条件、低度の緊縮条件、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件またはきわめて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟型ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズする本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；または、本明細書において定義されるとおり、その対立遺伝子変異体およびサブ配列（前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）に関する。
【０１４４】
本発明はまた、きわめて低度の緊縮条件、低度の緊縮条件、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件またはきわめて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号３の成熟型ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補ストランドとハイブリダイズする本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；または、本明細書において定義されるとおり、その対立遺伝子変異体およびサブ配列（前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）に関する。
【０１４５】
一態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド７１１〜１５３５のポリヌクレオチドなどの、プロテアーゼ活性を有する配列番号２の断片をコードする、配列番号１、配列番号１または配列番号１のサブ配列の成熟型ポリペプチドコード配列を含むか、これらから構成されるものである。
【０１４６】
一態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド５８１〜１４０５のポリヌクレオチドなどの、プロテアーゼ活性を有する配列番号４の断片をコードする、配列番号３、配列番号３または配列番号３のサブ配列の成熟型ポリペプチドコード配列を含むか、これらから構成されるものである。
【０１４７】
他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド７２９〜１５２０の触媒ドメインを含むか、これから構成される。
【０１４８】
他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド２８２〜７１０のプロペプチドを含むか、これから構成される。
【０１４９】
他の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド１８８〜５８０のプロペプチドを含むか、これから構成される。
【０１５０】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【０１５１】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されてポリペプチドの発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
【０１５２】
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータ配列であり得る。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む選択される宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【０１５３】
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている。
【０１５４】
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ���ｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
【０１５５】
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８により記載されている。
【０１５６】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる好適な転写ターミネータ配列であり得る。ターミネータ配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、選択した宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【０１５７】
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
【０１５８】
イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２に記載されている。
【０１５９】
制御配列はまた、転写されるときの宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。選択した宿主細胞において機能するいずれかのリーダー配列が用いられ得る。
【０１６０】
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１６１】
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１６２】
制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。選択される宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。
【０１６３】
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様プロテアーゼおよびアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【０１６４】
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【０１６５】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、ポリペプチドを細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現ポリペプチドを選択した宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列がもちいられてもよい。
【０１６６】
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０１６７】
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０１６８】
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２により記載されている。
【０１６９】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【０１７０】
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方がポリペプチドのＮ−末端に存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端に隣接して位置されている。
【０１７１】
宿主細胞の増殖に対したポリペプチドの発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
【０１７２】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数（いくつか）の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたは配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【０１７３】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【０１７４】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【０１７５】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数（いくつか）の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【０１７６】
細菌性選択マーカーの例は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびに、ストレプトマイセスハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましい。
【０１７７】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【０１７８】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【０１７９】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【０１８０】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０１８１】
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、および、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
【０１８２】
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
【０１８３】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０１８４】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０１８５】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成をもたらす１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【０１８６】
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、本発明のポリペプチドの組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
【０１８７】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０１８８】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【０１８９】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０１９０】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０１９１】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換および電気穿孔法により（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合により（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、電気穿孔法により（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、天然コンピテンスにより（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いるこ��が可能である。
【０１９２】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
【０１９３】
宿主細胞は真菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）、ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ｐａｇｅ  １７１に引用されているとおり）およびすべての栄養胞子形成真菌（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を含む。
【０１９４】
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
【０１９５】
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイアリポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
【０１９６】
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
【０１９７】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
【０１９８】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシスアネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシスカレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシスギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシスパンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシスリブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシススブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシススブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌスシネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルスヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕ��）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビアラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツスエリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテスビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテスベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
【０１９９】
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書およびＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
【０２００】
生成方法
本発明はまた：（ａ）ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、野生型形態でポリペプチドを生成する細胞を培養するステップ；および、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む本発明のポリペプチドを生成する方法に関する。好ましい態様において、細胞はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のものである。
【０２０１】
本発明はまた：（ａ）ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養するステップ；および、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む本発明のポリペプチドを生成する方法に関する。
【０２０２】
宿主細胞は、技術分野において周知である方法を用いてポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、および、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
【０２０３】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を判定してもよい。
【０２０４】
ポリペプチドは技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、特にこれらに限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
【０２０５】
ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０２０６】
代替的な態様においては、ポリペプチドは回収されず、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチドのソースとして用いられ得る。
【０２０７】
組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、このようなポリペプチドが富化されている。「富化」という用語は、組成物のプロテアーゼ活性が、例えば少なくとも１．１の富化因子で高められることを示す。
【０２０８】
組成物は、主な酵素成分として本発明のポリペプチドを含み得る例えば単成分組成物である。または、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの複数の酵素活性を含み得る。追加の酵素が、例えば、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）といったアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；例えば、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｅｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）といったフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、例えば、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）もしくはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）；または、例えば、トリコデルマハルジ���ヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）といったトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する微生物によって例えば生成され得る。
【０２０９】
組成物は、技術分野において公知である方法に従って調製され得、また、液体または乾燥組成物の形態であり得る。例えば、組成物は、粒質物または微粒剤の形態であり得る。ポリペプチドは、技術分野において公知である方法に従って安定化され得る。
【０２１０】
洗剤組成物
一実施形態において、本発明は、本発明の酵素を１種または複数種の追加のクリーニング組成成分と共に含む洗剤組成物に関する。
【０２１１】
追加の成分の選択は、当業者の技能の範囲内であり、以下に記載される例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分が含まれる。成分の選択には、布地の取り扱いに関して、クリーニングされる布地の種類、汚染物の種類および／または程度、クリーニングを行う温度、ならびに、洗剤生成物の配合物の検討が含まれ得る。以下に記載の成分は特定の官能基に従う一般的なヘッダによって分類されるが、これは限定として解釈されるべきではなく、当業者に認識されるであろうとおり追加の官能基が成分中に含まれていてもよい。
【０２１２】
それ故、本発明の一実施形態は、プロテアーゼ活性、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む洗剤組成物に関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号２の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【０２１３】
他の実施形態は、プロテアーゼ活性、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む洗剤組成物に関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号４の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【０２１４】
さらに他の実施形態は、プロテアーゼ活性、配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む洗剤組成物に関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号６の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【０２１５】
好ましい実施形態において、組成物は、さらなるプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、マンナナーゼまたはいずれかのこれらの混合物の群から選択される少なくとも１種の他の酵素をさらに含む。
【０２１６】
本発明の酵素
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、洗浄液１リットル当たり、０．０１〜１００ｍｇのタンパク質、好ましくは０．００５〜５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．０５〜１０ｍｇのタンパク質、最も好ましくは０．０５〜５ｍｇのタンパク質、最も好ましくは０．０２〜２ｍｇのタンパク質、および、さらに最も好ましくは０．０１〜１ｍｇのタンパク質などの０．００１〜１００ｍｇのタンパク質に対応する量で洗剤組成物に添加され得る。
【０２１７】
本発明の洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖質もしくは糖質アルコール、乳酸、ホウ酸、もしくは、例えば芳香族ホウ酸エステルといったホウ酸誘導体、または、４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体といった従来の安定化剤を用いて安定化され得、および、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。
【０２１８】
本発明のポリペプチドはまた、参照により本明細書に援用される国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに開示の洗剤配合物に組み込まれてもよい。
【０２１９】
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／またはノニオン性および／または半極性および／または両イオン性またはこれらの混合物であり得る１種または複数種の界面活性剤を含んでいてもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１種または複数種のノニオン性界面活性剤および１種または複数種のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約１％〜約４０％または約３％〜約２０％または約３％〜約１０％などの約０．１％〜６０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、技術分野において公知であるいずれかの従来の界面活性剤を含む。ランドリー洗剤に用いられ得る技術分野において公知であるいずれかのランドリー界面活性剤が利用され得る。
【０２２０】
含まれる場合、洗剤は、通常は、約５％〜約１５％または約２０％〜約２５％を含む約５％〜約３０％などの約１％〜約４０重量％のアニオン性界面活性剤を含有するであろう。アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩およびスルホン酸塩、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキルスルフェート（ＡＳ）、脂肪族アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第１級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても公知であるＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ）、第２級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸またはセッケンのジエステルおよびモノエステル、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２１】
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約４０重量％のカチオン性界面活性剤を含むであろう。カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノール第４級アミン（ＡＤＭＥＡＱ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリル塩化アンモニウム（ＤＳＤＭＡＣ）およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ならびに、これらの組み合わせ、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルコキシル化第４級アンモニウム（ＡＱＡ）が挙げられる。
【０２２２】
含まれる場合、洗剤は、通常、約３％〜約５％または約８％〜約１２％などの、例えば約０．５％〜約３０％、特に約１％〜約２０％、約３％〜約１０％といった約０．２％〜約４０重量％のノニオン性界面活性剤を含有するであろう。ノニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール（ＰＦＡ）、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステルなどのアルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、または、グルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルコサミドＧＡまたは脂肪酸グルカミドＦＡＧＡ）、ならびに、商品名ＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮで入手可能な生成物、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２３】
含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０重量％の半極性界面活性剤を含有するであろう。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシドなどのアミンオキシド（ＡＯ）、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２４】
含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０重量％の両性イオン性界面活性剤を含有するであろう。両性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタインおよびスルホベタイン、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２５】
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液（または、反対に、極性物質を非極性環境）中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する（いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性）が；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１２１−１２８による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物（水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり）が可能となる。
【０２２６】
洗剤は、約０．５〜約５％または約３％〜約５％などの０〜５重量％のヒドロトロープを含有し得る。洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのヒドロトロープが利用され得る。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＴＳ）、キシレンスルホン酸ナトリウム（ＳＸＳ）、クメンスルホン酸ナトリウム（ＳＣＳ）、シメンスルホン酸ナトリウム、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ヒドロキシナフタレンナトリウム、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、エチルヘキシル硫酸ナトリウム、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２７】
ビルダーおよびコビルダー
洗剤組成物は、約５％〜約５０％などの約０〜６５重量％の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含有し得る。皿洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特に５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは特に、ＣａおよびＭｇと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリー洗剤に用いられる技術分野において公知であるいずれかのビルダーおよび／またはコビルダーが利用され得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩（ピロリン酸塩）、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫＳ−６）、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、イミノジエタノール（ＤＥＡ）および２，２’、２”−ニトリロトリエタノール（ＴＥＡ）などのエタノールアミン、および、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２８】
洗剤組成物はまた、約５％〜約４０％などの０〜６５重量％の洗剤コビルダーまたはこれらの混合物を含有し得る。洗剤組成物は、コビルダーを単独で含んでいても、または、例えばゼオライトビルダーといったビルダーと組み合わせて含んでいてもよい。コビルダーの非限定的な例としては、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）などのポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマーが挙げられる。さらに非限定的な例としては、クエン酸塩、アミノカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩およびホスホン酸塩などのキレート剤、ならびに、アルキル−またはアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の特定の例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン）テトラキス（ホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンエペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）（ＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびに、これらの組み合わせおよび塩が挙げられる。さらなる例示的なビルダーおよび／またはコビルダーは、例えば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に開示されている。ホスホン酸塩などの湯垢抑制剤。
【０２２９】
漂白系
洗剤は、約１％〜約５％などの０〜１０重量の漂白系を含有し得る。ランドリー洗剤において用いられるいずれかの技術分野において公知である漂白系が利用され得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白、漂白活性化剤、過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムなどの過酸化水素の供給源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン（Ｒ）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。本明細書において漂白活性化剤とは、ペルオキシド漂白剤様過酸化水素と反応して、過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含み、好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム３，５，５トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）安息香酸塩（ＤＯＢＳ）、４−（３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）および４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）、および／または、国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）が特に好ましいファミリーである。ＡＴＣまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、最終的にはクエン酸およびアルコールに分解されるために、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、保管に際して生成物中における良好な加水分解安定性を有しており、これは効果的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは、ランドリー添加剤に対して良好な補助能を提供する。または、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、６−（フタロイルアミノ）過カプロン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒：
【化１】
2014519834.tif 000002
（ｉｉｉ）およびこれらの混合物（式中、各Ｒ1は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは各Ｒ1は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、イソ−ノニル、イソ−デシル、イソ−トリデシルおよびイソ−ペンタデシルからなる群から選択される）からなる群から選択される有機触媒であり得る。他の例示的な漂白系は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白は、例えばスルホン化アエンフタロシアニンであり得る。
【０２３０】
ポリマー
洗剤は、０．５〜５％、２〜５％、０．５〜２％または０．２〜１％などの０〜１０重量％のポリマーを含有する。洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのポリマーが利用され得る。ポリマーは、上記のとおりコビルダーとして機能し得、または、再汚染防止、繊維保護、汚染物遊離、移染防止、油脂クリーニングおよび／または消泡特性をもたらし得る。いくつかのポリマーは、上記の特性を２つ以上および／または下記のモチーフを２つ以上有している場合がある。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、および、ＰＡＡなどのポリカルボキシレート、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリ−アスパラギン酸、および、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、疎水性修飾ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマー系グリコールとのコポリマー、ポリエチレンテレフタレートとポリオキシエテンテレフタレートとのコポリマー（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）、ならびに、ポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）およびジクアタニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーは、例えば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。上記のポリマーの塩もまた予期される。
【０２３１】
布地色調剤
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収／反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１８７６２２６号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ａｃｉｄ  Ｂｌｕｅ、Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ、Ａｃｉｄ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｂａｓｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｂａｓｉｃ  ＶｉｏｌｅｔおよびＢａｓｉｃ  Ｒｅｄ、または、これらの混合物の染料索引（Ｃ．Ｉ．）分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％またはさらには約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットに開示されている。
【０２３２】
（追加の）酵素
洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、例えばラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼといった、タンパク分解酵素、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼなどの１種または複数種［追加］の酵素を含み得る。
【０２３３】
普通、選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合性であるべきであり（すなわち、至適ｐＨ、他の酵素的および非酵素的処方成分等との親和性）、酵素は有効量で存在しているべきである。
【０２３４】
セルラーゼ：好適なセルラーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼといった、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼが挙げられる。
【０２３５】
特に好適なセルラーゼは、色の取り扱いに関する有益性を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０  ４９５  ２５７、欧州特許第０  ５３１  ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０  ５３１  ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよび国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
【０２３６】
市販されているセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）およびＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【０２３７】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは、動物、野菜または微生物性由来のものを含む。微生物性由来のものが好ましい。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。タンパク分解酵素は、セリンタンパク分解酵素またはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物性タンパク分解酵素またはトリプシン−様タンパク分解酵素であり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシンであって、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から誘導されたもの、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載のトリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）およびフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）タンパク分解酵素である。
【０２３８】
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレットおよび国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５および２７４。
【０２３９】
好ましい市販されているタンパク分解酵素としては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）およびＫａｎｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）およびＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０２４０】
リパーゼおよびクチナーゼ：好適なリパーゼおよびクチナーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。例としては、欧州特許第２５８  ０６８号明細書および欧州特許第３０５  ２１６号明細書に記載されている、テルモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来、例えば、Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（過去にはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）と命名されていた）由来のリパーゼ；国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載されている、例えばＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）といったフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のクチナーゼ；例えば、Ｐ．アルカリ（Ｐ．ａｌｃａｌｉ）遺伝子またはＰ．シュードアルカリ（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ）遺伝子（欧州特許第２１８  ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１  ３７６号明細書）、Ｐ．スツツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属の一種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＳＤ７０５株（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）といったシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ；例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭６４／７４４９９２号公報）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）といったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼが挙げられる。
【０２４１】
他の例は、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７  ２２５号明細書、欧州特許第２６０  １０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、国際公開第００／０６００６３号パンフレット、国際公開第２００７／０８７５０８号パンフレットおよび国際公開第２００９／１０９５００号パンフレットに記載のものなどのリパーゼ変異体である。
【０２４２】
好ましい市販されているリパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）およびＬｉｐｅｘ（商標）、Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）；Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）、Ｌｉｐｏｐｒｉｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。他の市販されているリパーゼとしては、Ｌｕｍａｆａｓｔ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ）；Ｌｉｐｏｍａｘ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ）およびＳｏｌｖａｙ製のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）リパーゼが挙げられる。
【０２４３】
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またがβ）は、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書により詳細に記載されているバチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特別な系統といった、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
【０２４４】
有用なアミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレットおよび国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８および４４４。
【０２４５】
市販されているアミラーゼは、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）、およびＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）である。
【０２４６】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、Ｃ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）といったコプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、および、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。
【０２４７】
市販されているペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０２４８】
洗剤酵素は、１種または複数種の酵素を含有する個別の添加剤を加えることにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含まれていてもよい。本発明の洗剤添加剤（すなわち、個別の添加剤または複合添加剤）は、例えば、粒質物、液体、スラリー等として配合されることが可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。
【０２４９】
非発塵性粒質物は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および米国特許第４，６６１，４５２号明細書に開示のとおり生成され得、任意により、技術分野において公知である方法によりコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、および、１５〜８０個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による用途に対して好適なフィルム形成性コーティング材の例は英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖質または糖質アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
【０２５０】
補助材
ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの洗剤成分もまた利用され得る。他の任意の洗剤成分としては、単独もしくは組み合わせで、耐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、腐食抑制剤、崩壊剤／分解剤、染料、酵素安定化剤（ホウ酸、ホウ酸塩、ＣＭＣ、および／または、プロピレングリコールなどのポリオールを含む）、クレイを含む布地コンディショナ、充填材／加工助剤、蛍光性白色化剤／光学増白剤、起泡増進剤、起泡（セッケンの泡）調節剤、香料、汚染物−懸濁剤、軟化剤、セッケン泡抑制剤、色あせ防止剤、および、ウィッキング剤が挙げられる。ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの処方成分が利用され得る。このような処方成分の選択は十分に当業者の技能の範囲内である。
【０２５１】
分散剤−本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含有することが可能である。特に粉末洗剤が分散剤を含んでいてもよい。好適な水溶性有機材料としては、ホモ−またはコポリマー酸またはその塩が挙げられ、ここで、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって相互に分離された少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０２５２】
移染防止剤−本発明の洗剤組成物はまた、１種または複数種の移染防止剤を含み得る。好適な高分子移染防止剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールまたはこれらの混合物が挙げられる。主題の組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または、さらには約０．１％〜約３重量％のレベルで存在し得る。
【０２５３】
蛍光性白色化剤−本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは、蛍光性白色化剤または光学増白剤などのクリーニングされる物品の色合いを変え得る追加の成分を含有するであろう。存在する場合、増白剤は、約０，０１％〜約０，５％のレベルであることが好ましい。ランドリー洗剤組成物における使用に好適ないずれかの蛍光性白色化剤が、本発明の組成物中に用いられ得る。最も一般的に用いられる蛍光性白色化剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビスフェニル−ジスチリル誘導体の分類に属するものである。ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体タイプの蛍光性白色化剤の例としては：４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネートおよび２−（スチビル−４”−ナフト−１．，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”スルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光性白色化剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能であるＴｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。また、好ましい蛍光性白色化剤は、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ製の市販のＰａｒａｗｈｉｔｅ  ＫＸである。本発明における使用に好適な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。
【０２５４】
好適な蛍光性増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１、または、さらには約０．２重量％の下限レベルから、０．５またはさらには０．７５重量％の上限レベルを含む。
【０２５５】
汚染物遊離ポリマー−本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステル系布地などの布地からの汚染物の除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚染物の除去を補助する１種または複数種の汚染物遊離ポリマーを含み得る。汚染物遊離ポリマーは、例えば、ノニオン性またはアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであり得る（例えばＣｈａｐｔｅｒ  ７，Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。他のタイプの汚染物遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）に詳述されているとおり、ポリアルキレンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚染物遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）により詳細に記載されている。他の汚染物遊離ポリマーは、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（共に本明細書において参照により援用されている）に記載されているものなどの変性セルロース誘導体などの特に置換セルロース系構造といった置換多糖類構造である。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、ノニオン性変性セルロース、カチオン性変性セルロース、両性イオン性変性セルロース、および、これらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロースおよびこれらの混合物が挙げられる。
【０２５６】
再汚染防止剤−本発明の洗剤組成物としてはまた、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、ならびに、エトキシル化ポリエチレンイミンなどの１種または複数種の再汚染防止剤が挙げられ得る。上記の汚染物遊離ポリマーに記載のセルロース系ポリマーは、再汚染防止剤としても機能し得る。
【０２５７】
他の好適な補助材としては、これらに限定されないが、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地軟化剤、充填材、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、セッケン泡抑制剤、溶剤、液体洗剤用構造化剤、および／または、構造弾性化剤が挙げられる。
【０２５８】
洗剤生成物の配合物
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、均質な錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の圧縮もしくは濃縮液体といったいずれかの簡便な形態であり得る。
【０２５９】
洗剤配合物形態：層（同一のまたは異なる相）、ポーチ、機械用量単位に対応した形態。
【０２６０】
ポーチは、単一または複数のコンパートメントとして構成されることが可能である。例えば水との接触に先だってポーチから組成物が漏れ出るような組成物の漏れが防止される、組成物の保持に好適であれば如何なる形態、形状および材料のものであることも可能である。ポーチは、内部容積を有する水溶性フィルム製のものである。前記内部容積は、ポーチのコンパートメントに分離されていることが可能である。好ましいフィルムは、フィルムまたはシートに形成される好ましくはポリマーである高分子材料である。好ましいポリマー、コポリマーまたはその誘導体は、ポリアクリレート、および、水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から選択される。好ましくは、フィルム中のポリマーのレベルは、例えばＰＶＡで少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は、典型的には約２０，０００〜約１５０，０００であろう。フィルムはまた、ポリアクチドおよびポリビニルアルコール（Ｃｈｒｉｓ  Ｃｒａｆｔ  Ｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｏｆ  Ｇａｒｙ，Ｉｎｄ．，ＵＳから市販されている商品名Ｍ８６３０で知られている）などの加水分解的に分解性および水溶性のポリマーブレンドと、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびこれらの混合物のような可塑剤とを含むブレンド組成物であることが可能である。ポーチは、水溶性フィルムにより分離された固体ランドリークリーニング組成物または部分成分および／または液体クリーニング組成物または部分成分を含んでいることが可能である。液体成分用のコンパートメントは、固形分を含有するコンパートメントとは組成が異なっていることが可能である。参照：（米国特許出願公開第２００９／００１１９７０  Ａ１号明細書）
【０２６１】
洗剤処方成分は、水溶性ポーチ中のコンパートメントにより、または、錠剤の異なる層中において相互に物理的に分離されていることが可能である。これにより、成分間の負の保管相互作用を防止することが可能である。コンパートメントの各々の異なる溶解プロファイルはまた、洗浄溶液中における選択された成分の溶解を遅延させることが可能である。
【０２６２】
形態の定義／特徴：
単位用量にない液体またはゲル洗剤は、水性であり得、典型的には、最大で約７０％の水、最大で約６５％の水、最大で約５５％の水、最大で約４５％の水、最大で約３５％の水などの少なくとも２０重量％および最大で９５％の水を含有し得る。特に限定されないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む他のタイプの液体が、水性液体またはゲル中に含まれていてもよい。水性液体またはゲル洗剤は０〜３０％の有機溶剤を含有していてもよい。
【０２６３】
液体またはゲル洗剤は非水性であり得、非水性という用語は、本文脈において、総体積の１５％未満、例えば１０％未満、または、さらには５％未満の含水量と定義される。
【０２６４】
粒状洗剤配合物
粒状洗剤は、国際公開第０９／０９２６９９号パンフレット、欧州特許第１７０５２４１号明細書、欧州特許第１３８２６６８号明細書、国際公開第０７／００１２６２号パンフレット、米国特許第６４７２３６４号明細書、国際公開第０４／０７４４１９号パンフレットまたは国際公開第０９／１０２８５４号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。他の有用な洗剤配合物が、国際公開第０９／１２４１６２号パンフレット、国際公開第０９／１２４１６３号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４０号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４１号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４２号パンフレット、国際公開第０９／０７２０６９号パンフレット、国際公開第０９／０６３３５５号パンフレット、国際公開第０９／１３２８７０号パンフレット、国際公開第０９／１２１７５７号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９６号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９８号パンフレット、国際公開第０９／１０３８２２号パンフレット、国際公開第０９／０８７０３３号パンフレット、国際公開第０９／０５００２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２５号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２７号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２８号パンフレット、国際公開第０９／０２１７８４号パンフレット、国際公開第０９／０１０３７５号パンフレット、国際公開第０９／０００６０５号パンフレット、国際公開第０９／１２２１２５号パンフレット、国際公開第０９／０９５６４５号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４４号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４５号パンフレット、国際公開第０９／０２４７８０号パンフレット、国際公開第０９／００４２９５号パンフレット、国際公開第０９／００４２９４号パンフレット、国際公開第０９／１２１７２５号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９１号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９２号パンフレット、国際公開第０９／０７４３９８号パンフレット、国際公開第０９／０７４４０３号パンフレット、国際公開第０９／０６８５０１号パンフレット、国際公開第０９／０６５７７０号パンフレット、国際公開第０９／０２１８１３号パンフレット、国際公開第０９／０３０６３２号パンフレット、および、国際公開第０９／０１５９５１号パンフレット、国際公開第２０１１０２５６１５号パンフレット、国際公開第２０１１０１６９５８号パンフレット、国際公開第２０１１００５８０３号パンフレット、国際公開第２０１１００５６２３号パンフレット、国際公開第２０１１００５７３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８４４号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０４号パンフレット、国際公開第２０１１００５６３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１２号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０５号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１３５２３８号パンフレット、国際公開第２０１０１２０８６３号パンフレット、国際公開第２０１０１０８００２号パンフレット、国際公開第２０１０１１１３６５号パンフレット、国際公開第２０１０１０８０００号パンフレット、国際公開第２０１０１０７６３５号パンフレット、国際公開第２０１００９０９１５号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４７号パンフレット、国際公開第２０１００３３８９７号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７９号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４１号パンフレット、国際公開第２０１００３０５３９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６７号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４７０号パンフレット、国際公開第２０１００２５１６１号パンフレット、国際公開第２０１００１４３９５号パンフレット、国際公開第２０１００４４９０５号パンフレット、国際公開第２０１０１４５８８７号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５０３号パンフレット、国際公開第２０１０１２２０５１号パンフレット、国際公開第２０１０１０２８６１号パンフレット、国際公開第２０１００９９９９７号パンフレット、国際公開第２０１００８４０３９号パンフレット、国際公開第２０１００７６２９２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７４２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７１８号パンフレット、国際公開第２０１００６９９５７号パンフレット、国際公開第２０１００５７７８４号パンフレット、国際公開第２０１００５４９８６号パンフレット、国際公開第２０１００１８０４３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７８３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７９２号パンフレット、国際公開第２０１１０２３７１６号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５３９号パンフレット、国際公開第２０１０１１８９５９号パンフレット、国際公開第２０１０１１５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９４２号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６１号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６２号パンフレット、国際公開第２０１００９４３５６号パンフレット、国際公開第２０１００８４２０３号パンフレット、国際公開第２０１００７８９７９号パンフレット、国際公開第２０１００７２４５６号パンフレット、国際公開第２０１００６９９０５号パンフレット、国際公開第２０１００７６１６５号パンフレット、国際公開第２０１００７２６０３号パンフレット、国際公開第２０１００６６４８６号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３１号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３２号パンフレット、国際公開第２０１００６３６８９号パンフレット、国際公開第２０１００６０８２１号パンフレット、国際公開第２０１００４９１８７号パンフレット、国際公開第２０１００３１６０７号パンフレット、国際公開第２０１００００６３６号パンフレットに記載されている。
【０２６５】
使用
本発明はまた、家庭用ランドリーの洗濯および産業用ランドリーの洗濯などの、生地および布地のランドリーにおいてその組成物を使用する方法に関する。
【０２６６】
本発明はまた、自動食器洗い（ＡＤＷ）、洗車および産業用表面のクリーニングなどの硬質面クリーニングにおいてその組成物を用いる方法に関する。
【０２６７】
洗剤における使用．本発明のポリペプチドは、添加されて、これにより、洗剤組成物の成分となり得る。
【０２６８】
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に好適なランドリー添加剤組成物を含む手洗い式もしくは機械式ランドリー洗剤組成物として、および、リンス添加布地柔軟剤組成物として配合され得、または、一般的な家庭における硬質面クリーニング作業において用いられる洗剤組成物として配合され得、または、手洗いもしくは機械による食器洗い作業用に配合され得る。
【０２６９】
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドを含む洗剤添加剤を提供する。
【０２７０】
洗剤における本発明のプロテアーゼの使用
洗剤配合剤に対して重要な汚染物および汚れは多くの異なる物質から組成されており、そのすべてが異なる基質特異性を有する一連の異なる酵素が、ランドリー、および、食器洗いなどの硬質面クリーニングの両方に関連する洗剤において用いられるよう開発されてきている。酵素を伴わない同一のプロセスと比して、適用されたクリーニングプロセスにおける汚れ除去性を特異的に改善するために、これらの酵素は酵素洗浄力有益性をもたらすと考えられる。技術分野において公知である汚れ除去酵素としては、カルボヒドラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼおよびペクチナーゼなどの酵素が挙げられる。
【０２７１】
一態様において、本発明は、洗剤組成物、ならびに、ランドリーおよび硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける本発明のプロテアーゼの使用に関する。それ故、一態様において、本発明は、種々の条件下における、種々の汚れに対する本発明の多様な例示的なプロテアーゼの洗浄力効果を実証する。本発明の特定の態様において、洗剤組成物およびクリーニングプロセスにおける使用は、少なくとも１種の上記の汚れ除去酵素を伴う本発明のプロテアーゼの使用に関する。
【０２７２】
本発明の好ましい態様において、本発明により有用である本発明のプロテアーゼは、少なくとも２種の酵素と組み合わされてもよい。これらの追加の酵素は、「他の酵素」の項において詳述されており、少なくとも３、４または５種の酵素がより好ましい。好ましくは、酵素は、例えば、カーボリティック（ｃａｒｂｏｌｙｔｉｃ）活性、タンパク質分解活性、デンプン分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロース分解活性またはペクチン分解活性といった異なる基質特異性を有する。酵素の組み合わせは、例えば、本発明のプロテアーゼおよびアミラーゼ、本発明のプロテアーゼおよびセルラーゼ、本発明のプロテアーゼおよびヘミセルラーゼ、本発明のプロテアーゼおよびリパーゼ、本発明のプロテアーゼおよびクチナーゼ、本発明のプロテアーゼおよびペクチナーゼ、または、本発明のプロテアーゼおよび再付着防止酵素といった、例えば本発明のプロテアーゼと他の汚れ除去酵素であり得る。より好ましくは、本発明のプロテアーゼは、少なくとも２種の他の汚れ除去酵素と組み合わされ、例えば、本発明のプロテアーゼ、リパーゼおよびアミラーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼおよびペクチナーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼおよびクチナーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼおよびヘミセルラーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、リパーゼおよびペクチナーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、リパーゼおよびクチナーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、リパーゼおよびセルラーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、リパーゼおよびヘミセルラーゼである。さらにより好ましくは、本発明のプロテアーゼは、少なくとも３種の他の汚れ除去酵素と組み合わされ得、例えば、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびペクチナーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびクチナーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびセルラーゼ；または、本発明のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびヘミセルラーゼである。本発明のプロテアーゼは：アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、キサンタナーゼまたはプルラナーゼなどのカルボヒドラーゼ、ペプチダーゼ、他のプロテアーゼまたはリパーゼを含む完全ではない列挙から選択される酵素のいずれかと組み合わされてもよい。
【０２７３】
本発明の他の実施形態において、本発明のプロテアーゼは、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（商標）またはサーモリシンを含むＭ４メタロプロテアーゼなどの１種または複数種のメタロプロテアーゼと組み合わされてもよい。このような組み合わせは、上記に概説した他の洗剤酵素の組み合わせをさらに含んでいてもよい。
【０２７４】
クリーニングプロセスもしくは生地の取り扱いプロセスは、例えば、ランドリープロセス、食器洗いプロセス、または、浴室タイル、床、テーブル表面、排水管、シンクおよび洗面器などの硬質面のクリーニングであり得る。ランドリープロセスは、例えば、家庭用洗濯であることが可能であるが、産業用洗濯であってもよい。しかも、本発明は、布地および／または衣服の洗濯プロセスに関し、ここで、このプロセスは、洗剤組成物および本発明の少なくとも１種のプロテアーゼを含有する洗浄溶液で布地を処理するステップを含む。クリーニングプロセスまたは生地取り扱いプロセスは、例えば、機械式洗浄プロセスまたは手動洗浄プロセスにおいて実施可能である。洗浄溶液は、例えば、洗剤組成物を含有する水性洗浄溶液であることが可能である。
【０２７５】
本発明の洗浄、クリーニングまたは生地取り扱いプロセスに供される布地および／または衣服は、例えば家庭ランドリーといった従来の可洗ランドリーであり得る。好ましくは、ランドリーの主な製品は、ニット、織布、デニム、不織布、フェルト、ヤーンおよびタオルを含む衣服および布地である。布地は、綿、亜麻、亜麻、ジュート、カラムシ、サイザルもしくはコイアを含む天然セルロース系材料、または、ビスコース／レーヨン、カラムシ、酢酸セルロース繊維（三細胞性）、リオセルもしくはこれらのブレンドを含む人工セルロース系材料（例えば、木材パルプ由来のもの）などのセルロース系材料であり得る。布地はまた、ウール、ラクダ、カシミヤ、モヘア、ウサギおよび絹を含む天然ポリアミドなどの非セルロース系材料、または、ナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレンおよびスパンデックス／エラスタンなどの合成ポリマー、または、これらのブレンド、ならびに、セルロース系および非セルロース系繊維のブレンドであり得る。ブレンドの例は、綿および／またはレーヨン／ビスコースと、ウール、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）およびセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、カラムシ、亜麻、亜麻、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）などの１種または複数種の随伴材料とのブレンドである。
【０２７６】
近年において、洗浄性能を犠牲にすることなく、酵素およびポリペプチドなどの再生可能な生物学的成分により石油化学製品に由来する洗剤中の成分を置き換えることに関心がますます集まっている。洗剤組成物の成分が変更されると、プロテアーゼ、リパーゼおよびアミラーゼなどの一般的に用いられる洗剤酵素と比して改変されたおよび／もしくは向上した特性を有する新たな酵素活性、または、新たな酵素が、従来の洗剤組成物と比して同様のまたは向上した洗浄性能を達成するために必要とされる。
【０２７７】
本発明は、タンパク質性の汚れ除去プロセスである、本発明のプロテアーゼの使用にさらに関する。タンパク質性の汚れは、例えば、ベビーフード、皮脂、カカオ、卵、血液、乳、インク、草またはこれらの組み合わせといった、食品汚れなどの汚れであり得る。
【０２７８】
典型的な洗剤組成物は酵素に追加して種々の成分を含み、これらの成分は異なる効果を有し、いくつかの成分は、界面活性剤のように、洗剤における表面張力を低下させ、これにより、クリーニングされる汚れを浮き上がらせ、分散させ、次いで、洗い流すことが可能であり、漂白剤系のような他の成分は、度々酸化により除去、退色させ、また、多くの漂白剤は強い殺菌特性をも有し、消毒および殺菌に用いられる。ビルダーおよびキレート剤のようなさらに他の成分は、液体から金属イオンを取り除くことにより例えば洗浄水を軟化させる。
【０２７９】
特定の実施形態において、本発明は本発明のプロテアーゼを含む組成物の使用に関し、ここで、前記酵素組成物は、少なくとも１種または複数種の以下の界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、ランドリーもしくは食器洗浄における漂白剤系もしくは漂白剤成分をさらに含む。
【０２８０】
本発明の好ましい実施形態において、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系および／もしくは漂白剤成分の量は、本発明のプロテアーゼが添加されずに用いられる界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系および／もしくは漂白剤成分の量と比して低減される。好ましくは、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系および／もしくは漂白剤成分である少なくとも１種の成分は、このような成分の従来の量などの本発明のプロテアーゼが添加されない系中の成分の量よりも、１％少ない、２％少ないなど、３％少ないなど、４％少ないなど、５％少ないなど、６％少ないなど、７％少ないなど、８％少ないなど、９％少ないなど、１０％少ないなど、１５％少ないなど、２０％少ないなど、２５％少ないなど、３０％少ないなど、３５％少ないなど、４０％少ないなど、４５％少ないなど、５０％少ないなどの量で存在する。一態様において、本発明のプロテアーゼは洗剤組成物中において用いられ、ここで、前記組成物は、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系もしくは漂白剤成分、および／または、ポリマーである少なくとも１種の成分を含まない。
【０２８１】
それ故、本発明の一実施形態は、洗剤における、または、クリーニングプロセスにおける、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対する、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号２の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【０２８２】
本発明の他の実施形態は、洗剤における、または、クリーニングプロセスにおける、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号４の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【０２８３】
本発明の第３の実施形態は、洗剤における、または、クリーニングプロセスにおける、配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する。一態様において、ポリペプチドは、配列番号６の成熟型ポリペプチドから、１０アミノ酸以下、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸および１アミノ酸だけ異なる。
【０２８４】
洗浄方法
本発明の洗剤組成物は、理想的には、ランドリー用途における使用に好適である。従って、本発明は布地を洗濯する方法を含む。この方法は、選択される布地に本発明による洗剤組成物を含むクリーニングランドリー溶液を接触させるステップを含む。布地は、通常の消費者が用いる条件において洗濯されることが可能であるいずれかの布地を含み得る。この溶液は、約５．５〜約８のｐＨを有することが好ましい。組成物は、溶液中で約１００ｐｐｍ、好ましくは５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で利用され得る。水温は、典型的には、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃および約９０℃を含む約５℃〜約９０℃の範囲である。水対布地の比は、典型的には約１：１〜約３０：１である。
【０２８５】
特定の実施形態において、洗浄方法は、約５．０〜約１１．５のｐＨ、または、代替的実施形態においては、約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５．５〜約１１、約５．５〜約１０、約５．５〜約９、約５．５〜約８、約５．５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約６．５〜約１１、約６．５〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９もしくは約７〜約８などのさらに約６〜約１０．５、好ましくは約５．５〜約９、および、より好ましくは約６〜約８で実施される。
【０２８６】
特定の実施形態において、洗浄方法は、約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨなどの約０°ｄＨ〜約３０°ｄＨの硬度で実施される。典型的な欧州洗浄条件下では、硬度は約１５°ｄＨであり、典型的なＵＳ洗浄条件下では約６°ｄＨであり、および、典型的なアジア洗浄条件下では、約３°ｄＨである。
【０２８７】
本発明は、布地、食器類または硬質面を、本発明のプロテアーゼを含む洗剤組成物（すなわち、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも６０％同一性を有するプロテアーゼ）でクリーニングする方法に関する。
【０２８８】
好ましい実施形態はクリーニング方法に関し、前記方法は：対象物に本発明のプロテアーゼを含むクリーニング組成物を前記対象物のクリーニングに好適な条件下で接触させるステップを含む。好ましい実施形態において、クリーニング組成物は洗剤組成物であり、プロセスはランドリーまたは食器洗浄プロセスである。
【０２８９】
さらに他の実施形態は布地から汚れを除去する方法に関し、これは、前記布地に本発明のプロテアーゼを含む組成物を前記対象物のクリーニングに好適な条件下で接触させるステップを含む。
【０２９０】
好ましい実施形態において、上記の方法において用いられる組成物は、カルボヒドラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼもしくはクチナーゼ、または、これらの組み合わせからなる群から選択される酵素などの、上記の「他の酵素」の項において記載されている少なくとも１種の追加の酵素をさらに含む。さらに他の好ましい実施形態において、組成物は、以下の、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系もしくは漂白剤成分、または、ポリマーの成分の少なくとも１種または複数種を低減された量で含む。
【０２９１】
また、本発明の１種または複数種のプロテアーゼを用いる、布地を処理する組成物および方法が予期される（例えば、生地からのり抜きするため）。プロテアーゼは、技術分野において周知であるいずれかの布地処理方法において用いられることが可能である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照のこと）。例えば、一態様においては、布地に溶液中のプロテアーゼを接触させるステップを含む方法によって、布地の触感および外観が向上する。一態様において、布地は加圧下で溶液で処理される。
【０２９２】
一実施形態において、プロテアーゼは、生地を織り上げる最中もしくはその後、または、糊抜きステージの最中、または、１つまたは複数の追加の布地加工ステップの最中に適用される。生地を編み上げる最中、糸はかなりの機械的応力にさらされる。機械式織機で編み上げる前に、縦糸ヤーンは、度々、これらの引張強度を高めて破断を防止するためにサイジング用のデンプンもしくはデンプン誘導体でコーティングされる。プロテアーゼは、これらのサイジング用のタンパク質もしくはタンパク質誘導体を除去するために適用可能である。生地が織り上げられた後、布地を糊抜きステージに進めることが可能である。これに続いて、１つまたは複数の追加の布地加工ステップが可能である。糊抜きは、生地からサイジングを除去する作業である。編み上げた後、サイジングコーティングは、均質で耐洗浄性の結果が確実に得られるよう、布地のさらなる加工の前に除去されるべきである。酵素の作用によるサイジングの酵素性加水分解を含む糊抜き方法もまた提供されている。
【０２９３】
低温での使用
本発明のプロテアーゼが、実際に、以下の実施例において記載されているＡＭＳＡにおけるテストで、例えば約６０℃以上といった高温よりも例えば約４０℃以下の温度といった低い温度で相対的に良好に機能することが意外にも見出された。
【０２９４】
しかも、特定の好ましい実施形態において、本発明のプロテアーゼは、本明細書に記載のとおりＡＭＳＡにおいてテストされた場合、約４０℃以下の洗浄温度では、Ｓａｖｉｎａｓｅなどの周知のサブチリシンプロテアーゼよりも比較的良好に機能した。
【０２９５】
それ故、本発明の一実施形態は、クリーニングされる表面に本発明のプロテアーゼを接触させるステップを含むランドリー、食器洗浄または産業用クリーニングを行う方法に関し、ここで、前記ランドリー、食器洗浄、産業用または組織的クリーニングは、約４０℃以下の温度で実施される。本発明の一実施形態は、ランドリー、食器洗浄またはクリーニングプロセスにおける本発明のプロテアーゼの使用に関し、ここで、ランドリー、食器洗浄、産業用クリーニングにおける温度は約４０℃以下である。
【０２９６】
他の実施形態において、本発明は、タンパク質除去プロセスにおける本発明のプロテアーゼの使用に関し、ここで、タンパク質除去プロセスにおける温度は約４０℃以下である。
【０２９７】
本発明はまた、ランドリー、食器洗浄または産業用クリーニングプロセスにおける、Ｓａｖｉｎａｓｅと比して少なくとも１つの向上した特性を有する本発明のプロテアーゼの使用に関し、ここで、ランドリー、食器洗浄またはクリーニングプロセスにおける温度は、約４０℃以下の温度で実施される。
【０２９８】
上記で認識された方法および使用の各々において、洗浄温度は、約４０℃以下、約３９℃以下など、約３８℃以下など、約３７℃以下など、約３６℃以下など、約３５℃以下など、約３４℃以下など、約３３℃以下など、約３２℃以下など、約３１℃以下など、約３０℃以下など、約２９℃以下など、約２８℃以下など、約２７℃以下など、約２６℃以下など、約２５℃以下など、約２４℃以下など、約２３℃以下など、約２２℃以下など、約２１℃以下など、約２０℃以下など、約１９℃以下など、約１８℃以下など、約１７℃以下など、約１６℃以下など、約１５℃以下など、約１４℃以下など、約１３℃以下など、約１２℃以下など、約１１℃以下など、約１０℃以下など、約９℃以下など、約８℃以下など、約７℃以下など、約６℃以下など、約５℃以下など、約４℃以下など、約３℃以下など、約２℃以下など、約１℃以下などである。
【０２９９】
他の好ましい実施形態において、洗浄温度は、約５〜３０℃、約５〜２０℃、約５〜１０℃、約１０〜４０℃、約１０〜３０℃、約１０〜２０℃、約１５〜４０℃、約１５〜３０℃、約１５〜２０℃、約２０〜４０℃、約２０〜３０℃、約２５〜４０℃、約２５〜３０℃または約３０〜４０℃などの約５〜４０℃の範囲である。特定の好ましい実施形態において、洗浄温度は約３０℃である。
【０３００】
特定の実施形態において、低温洗浄方法は、約５．０〜約１１．５のｐＨで、または、代替的な実施形態においては、さらには、約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５．５〜約１１、約５．５〜約１０、約を含む５．５〜約９、約５．５〜約８、約５．５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約６．５〜約１１、約６．５〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９または約７〜約８などの約６〜約１０．５、好ましくは約５．５〜約９、および、より好ましくは約６〜約８で実施される。
【０３０１】
特定の実施形態において、低温洗浄方法は、約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨなどの約０°ｄＨ〜約３０°ｄＨの硬度で実施される。典型的な欧州洗浄条件下では、硬度は約１５°ｄＨであり、典型的なＵＳ洗浄条件下では約６°ｄＨであり、および、典型的なアジア洗浄条件下では約３°ｄＨである。
【０３０２】
シグナルペプチドおよびプロペプチド
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸−２６〜−１または配列番号４のアミノ酸−１６０〜−１３２を含むか、これから構成されるシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸１〜１４３または配列番号４のアミノ酸−１３１〜−１を含むか、これから構成されるプロペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸−２６〜１４３または配列番号４のアミノ酸−１６０〜−１を含むか、これから構成されるシグナルペプチドおよびプロペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドに作動可能にリンクするタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。タンパク質は、シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドに対して外来性のものであることが好ましい。
【０３０３】
本発明はまた、このようなポリヌクレオチドを含む核酸構築物、発現ベクターおよび組換え宿主細胞に関する。
【０３０４】
本発明はまた：（ａ）このようなポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養するステップ；および、（ｂ）タンパク質を回収するステップを含むタンパク質を生成する方法に関する。
【０３０５】
タンパク質は、宿主細胞に対して固有または異種のものであり得る。「タンパク質」という用語は、本明細書において特定の長さのコード化物を指すことは意味しておらず、従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。「タンパク質」という用語はまた、組み合わされてコード化物を形成する２つ以上のポリペプチドを包含する。タンパク質はまた、ハイブリッドポリペプチドおよび融合ポリペプチドを含む。
【０３０６】
好ましくは、タンパク質は、ホルモンもしくはその変異体、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、または、レポーターである。例えば、タンパク質は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、または、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、他のリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼもしくはキシラナーゼなどのリガーゼであり得る。
【０３０７】
遺伝子は、いずれかの原核生物、真核性物または他のソースから得られ得る。
【０３０８】
本発明を、本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【０３０９】
系統
バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２を、米国で採集した環境中の砂サンプルから単離した。バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）を、インドの汚染物サンプルから単離した。公開配列パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）系統は、Ｇｅｒｍａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から系統ＤＳＭ１８８４４として入手した。
【０３１０】
酵素アッセイ
洗浄アッセイ
ランドリー用自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）
ランドリーにおける洗浄性能を評価するために、自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて洗濯実験を実施する。ＡＭＳＡでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。ＡＭＳＡプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄されるランドリーサンプルである生地をすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第０２／４２７４０号パンフレット、特に第２３〜２４頁の段落「Ｓｐｅｃｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照のこと。
【０３１１】
洗浄性能は、洗浄した生地の色の輝度として計測される。輝度はまた、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表されることが可能である。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
【０３１２】
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ  ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ、Ｍｉｄｔａｇｅｒ２９、ＤＫ−２６０５  Ｂｒｏｎｄｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で行われる。
【０３１３】
スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの２４ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
【０３１４】
【数１】
2014519834.tif 000003
【０３１５】
ランドリー用小型洗浄アッセイ
洗浄性能は、汚染された生地をテスト溶液に連続的に上げ下げし、その後にすすぐ試験法である、小型洗浄アッセイを用いてランドリー洗浄実験において評価する。
【０３１６】
洗浄し、すすいだ汚染された生地をその後空気乾燥し、洗浄性能をこれらの生地の色の輝度として計測する。輝度はレミッション（Ｒ）としても表すことが可能であり、これは、白色光を照射した際に、テスト材料から反射されて放射された光に係る尺度である。生地のレミッション（Ｒ）はＺｅｉｓｓ  ＭＣＳ  ５２１  ＶＩＳ分光測光計を用いて４６０ｎｍで計測される。計測は製造業者のプロトコルに従って行われる。
【０３１７】
【表１】
2014519834.tif 000004
【０３１８】
テスト材料は、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２０，３１３３  ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｍｏｅｖｅｎｓｔｒａｓｓｅ  １２，ＣＨ−９０１５  Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手される。
【０３１９】
プロテアーゼアッセイ
１）Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｌ−１４００）。
温度：室温（２５℃）
アッセイ緩衝剤：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ値２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０および１１．０に調節）。
以下を含むアッセイ緩衝剤
１ｍＭ  ＥＤＴＡ：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．０。
【０３２０】
２０μｌプロテアーゼ（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈）を１００μｌアッセイ緩衝剤と混合した。１００μｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解し、さらに０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を添加することによりアッセイを開始した。プロテアーゼ活性の尺度として、ＯＤ405の増加を監視した。
【０３２１】
２）Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫアッセイ：
基質：Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠剤（架橋され、染色されたカゼイン；Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）
温度：制御した（アッセイ温度）。
アッセイ緩衝剤：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．０。
【０３２２】
Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠剤を、２．０ｍｌの０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で穏やかに攪拌することにより懸濁させた。５００μｌのこの懸濁液および５００μｌアッセイ緩衝剤をエッペンドルフチューブに分取し、氷上に置いた。２０μｌプロテアーゼサンプル（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈）を添加した。アッセイを、エッペンドルフチューブを、アッセイ温度に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒに移すことにより開始した。チューブを、最大の振盪率（１４００ｒｐｍ）でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで１５分間インキュベートした。チューブを氷浴に戻すことによりインキュベーションを停止した。次いで、チューブを氷冷遠心分離で数分間遠心分離し、２００μｌの上澄みをマイクロタイタープレートに移した。ＯＤ650をプロテアーゼ活性の尺度として読み取った。アッセイには緩衝剤ブラインドを含めた（酵素の代わり）。
【０３２３】
実施例１：プロテアーゼの調製
遺伝子をコードするプロテアーゼの同定
好アルカリバクテリアであるバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２は、カゼインを基質として含有する寒天プレートで陽性の反応を示すことを見出した。プロテアーゼ遺伝子を発見するために、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２のゲノムＤＮＡを配列決定し、配列番号１の配列を有するセリンＳ８ファミリープロテアーゼ遺伝子を、当業者に公知である技術である公開タンパク質データベースにおける相同性サーチにより発見した。配列番号２を有するコード化したプロテアーゼは、受入番号ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｄ０ＥＶＤ２を有するパエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）由来の公開タンパク質配列に最も近く関連していることが見出された。パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼの酵素特性は現時点では未知であり、ここでは、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２の酵素特性を開示する。
【０３２４】
好アルカリバクテリアであるバチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ  Ｏ１８７８）は、カゼインを基質として含有する寒天プレートで陽性の反応を示すことを見出した。プロテアーゼ遺伝子を発見するために、バチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ  Ｏ１８７８）のゲノムＤＮＡを配列決定し、配列番号３の配列を有するセリンＳ８ファミリープロテアーゼ遺伝子を、当業者に公知である技術である公開タンパク質データベースにおける相同性サーチにより発見した。配列番号４を有するコード化したプロテアーゼは、受入番号ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｄ０ＥＶＤ２を有するパエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）由来の公開タンパク質配列に最も近く関連していることが見出された。パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼの酵素特性は現時点では未知であり、ここでは、バチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ  Ｏ１８７８）の酵素特性を開示する。
【０３２５】
系統パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ１８８４４）をＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、上記のプロテアーゼＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｄ０ＥＶＤ２のドナーとして用いた。
【０３２６】
プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２およびバチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）のクローン化および発現
国際公開第９９／４３８３５号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）に記載のＳＯＥ  ＰＣＲ融合により、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）（ａｐｒＨ）由来のアルカリ性プロテアーゼからのシグナルペプチドをフレーム中で、プロテアーゼをコードするＤＮＡに融合した。コードＤＮＡを増幅するために、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、オリゴマーＣ１５Ｕ１ｆおよびＣ１５Ｕ１ｒを用いて遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【０３２７】
Ｃ１５Ｕ１ｆ：
ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号７）
Ｃ６２２４ｆ：
ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＧＴＴ（配列番号８）
【０３２８】
コードＤＮＡを増幅するために、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、オリゴマーＣ５７Ｊ６ｆおよびＣ５７Ｊ６ｒを用いて遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【０３２９】
プライマーＣ５７Ｊ６ｆ：
ＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＣＴＴＣＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＧＴ（配列番号９）
プライマーＣ５７Ｊ６ｒ：
ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＣＴＣＧＴ（配列番号１０）
および、得られたＰＣＲ生成物を発現カセット要素に融合した。バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１８１３２およびバチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）由来のプロテアーゼ遺伝子を、安定化配列を含む、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡプロモータ由来のプロモータから構成される三重プロモータ系の制御により発現させた。発現カセットは国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに記載されている。しかも、発現カセットは、ターミネータ（用語）配列、および、選択マーカーとした用いたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｍ）をコードする遺伝子（（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｓｍｉｄ  ３０：３１２−３１５）において枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）について記載されているとおり）を含有していた。
【０３３０】
上記の完全発現カセットの一部であった融合した遺伝子断片（配列番号１１および配列番号１２）を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換し、プロテアーゼ遺伝子を、ペクチン酸リアーゼ遺伝子遺伝子座への相同性組換えにより古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体に統合した（国際公開第９９／４３８３５号パンフレット）。
【０３３１】
ＤＮＡ配列決定によりクロラムフェニコール耐性形質転換体を分析して、構築物の正確なＤＮＡ配列を検証した。翻訳したタンパク質配列は配列番号２および４に対応しており、ここで、アミノ酸１〜２７はＢ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ａｐｒＨシグナルペプチドに対応し、アミノ酸２８〜１７０はプロテアーゼのプロペプチドの一部であり、および、アミノ酸１７１〜４４５は成熟プロテアーゼＳ８ドメインに対応する。
【０３３２】
１つの発現クローンを選択し、これを回転式振動台上の３４ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを追加した１００ｍｌのカゼイン系培地を各々含有する５００ｍＬバッフル付エルレンマイヤーフラスコ中で培養した。クローンを３７℃で４日間培養した。
【０３３３】
実施例２：プロテアーゼの精製および特徴付け
バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２からのＳ８Ａプロテアーゼの精製
培養液体培地を遠心分離（２００００×ｇ、２０分間）し、上澄みを沈殿物から注意深く傾瀉した。上澄みをＮａｌｇｅｎｅ０．２μｍろ過ユニットを通してろ過して残りのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を除去した。固体硫酸アンモニウムを０．２μｍ濾液に添加して最終的に１．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の硫酸アンモニウム濃度とした。溶液はわずかに混濁し、これを再度Ｎａｌｇｅｎｅ０．２μｍろ過ユニットを通してろ過した。清透な濾液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、１．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．０で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、平衡緩衝剤および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．０、２５％（ｖ／ｖ）２−プロパノールのカラム体積の３倍量のリニア勾配で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析した（ｐＨ９でのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて）。プロテアーゼピークをプールし、プールを、Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）の１００ｍＭのＨ3ＢＯ3、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ６．０に移した。Ｇ２５  ｓｅｐｈａｄｅｘに移した酵素を、１００ｍＭのＨ3ＢＯ3、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ６．０で平衡化したＳＰ−セファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、同一の緩衝剤中のリニアＮａＣｌ勾配（０→０．５Ｍ）で、カラム体積の５倍量で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析し（ｐＨ９でのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて）、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析した。クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にバンドが１つしか見られなかった画分を精製調製物としてプールし、これをさらなる特徴づけに用いた。
【０３３４】
パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＳ８Ａプロテアーゼの精製
培養液体培地を遠心分離（２００００×ｇ、２０分間）し、上澄みを沈殿物から注意深く傾瀉した。上澄みをＮａｌｇｅｎｅ０．２μｍろ過ユニットを通してろ過して残りのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を除去した。固体硫酸アンモニウムを０．２μｍ濾液に添加して最終的に１．２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の硫酸アンモニウム濃度とした。溶液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、１．２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．０で平衡化したＳＯＵＲＣＥ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、平衡緩衝剤および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．０、２５％（ｖ／ｖ）２−プロパノールのカラム体積の８倍量のリニア勾配で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析した（ｐＨ９でのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて）。プロテアーゼピークをプールし、プールを、Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）の２０ｍＭのコハク酸／ＮａＯＨ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ５．０に移した。Ｇ２５  ｓｅｐｈａｄｅｘに移した酵素を２０ｍＭのコハク酸／ＮａＯＨ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ５．０で平衡化したＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、同一の緩衝剤中のリニアＮａＣｌ勾配（０→０．５Ｍ）で、カラム体積の５倍量で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析し（ｐＨ９でのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて）、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析した。クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１つの主に優勢なバンドが見られた画分をプールし、プールを、Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．０に移した。Ｇ２５  ｓｅｐｈａｄｅｘに移したプロテアーゼは精製調製物であり、これをさらなる特徴づけに用いた。
【０３３５】
バチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８Ａプロテアーゼの精製
培養液体培地を遠心分離（２００００×ｇ、２０分間）し、上澄みを沈殿物から注意深く傾瀉した。上澄みをＮａｌｇｅｎｅ０．２μｍろ過ユニットを通してろ過して残りのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を除去した。固体硫酸アンモニウムを０．２μｍ濾液に添加して最終的に２．０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の硫酸アンモニウム濃度とした。溶液はわずかに混濁し、これを再度Ｎａｌｇｅｎｅ０．２μｍろ過ユニットを通してろ過した。清透な濾液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、２．０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．０で平衡化したＳＯＵＲＣＥ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、平衡緩衝剤および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．０、２５％（ｖ／ｖ）２−プロパノールのカラム体積の８倍量のリニア勾配で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析した（ｐＨ９でのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて）。プロテアーゼピークをプールし、プールを、Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）の１００ｍＭのＨ3ＢＯ3、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ６．０に移した。Ｇ２５  ｓｅｐｈａｄｅｘに移した酵素を、１００ｍＭのＨ3ＢＯ3、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ６．０で平衡化したＳＰ−セファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、同一の緩衝剤中のリニアＮａＣｌ勾配（０→０．５Ｍ）で、カラム体積の５倍量で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析し（ｐＨ９でのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて）、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析した。クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１つの主に優勢なバンドが見られた画分をプールし、プールを、Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）の１００ｍＭのＨ3ＢＯ3、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ６．０に移した。Ｇ２５  ｓｅｐｈａｄｅｘに移したプロテアーゼは精製調製物であり、これをさらなる特徴づけに用いた。
【０３３６】
バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）およびパエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＳ８Ａプロテアーゼの特徴付け
Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて、ｐＨ−活性プロファイルおよびｐＨ−安定性プロファイル（明示したｐＨ値での２時間後の残存活性）を得た。ｐＨ−安定性プロファイルに関して、プロテアーゼを異なるアッセイ緩衝剤で２０倍に希釈してこれらの緩衝剤のｐＨ値とし、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ｐＨ９．０アッセイ緩衝剤での希釈により、残存活性に係るアッセイの前にプロテアーゼインキュベートのｐＨを同一のｐＨ値に移行させた。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫアッセイを用いて、ｐＨ７．０での温度−活性プロファイルを得た。Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて、アッセイ緩衝剤中に、ｐＨ７．０で、および、アッセイ緩衝剤中に、ｐＨ７．０での温度−安定性プロファイルを得、ここでは、１ｍＭのＣａＣｌ2を１ｍＭのＥＤＴＡで置き換えた。温度−安定性プロファイルに関して、プロテアーゼを、アッセイ緩衝剤で、ｐＨ７．０で、または、アッセイ緩衝剤と１ｍＭのＥＤＴＡで、ｐＨ７．０で１０倍に希釈し、次いで、明示の温度で１５分間インキュベーション後、サンプル中の残存活性を計測した（Ｓａｖｉｎａｓｅを温度−安定性実験における基準として含めた）。
【０３３７】
結果を以下の表２〜６に示す。表２に関して、活性は、酵素に係る至適ｐＨに対するものである。表３に関して、活性はサンプルに対する残存活性であり、これを安定な条件下（５℃、ｐＨ９．０）で維持した。表４に関して、活性は、酵素に係るｐＨ７．０での至適温度に対するものである。表５および６に関して、活性は、３７℃のサンプルに対する残存活性である。
【０３３８】
【表２】
2014519834.tif 000005
【０３３９】
【表３】
2014519834.tif 000006
【０３４０】
【表４】
2014519834.tif 000007
【０３４１】
【表５】
2014519834.tif 000008
【０３４２】
【表６】
2014519834.tif 000009
【０３４３】
他の特徴
バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２、パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８ＡプロテアーゼをＰＭＳＦにより阻害した。
【０３４４】
Ｎ末端
プロテアーゼを約１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌを３３μｌの５０％ＴＣＡ溶液と混合し、氷上で５分間インキュベートした。沈殿物を５分間の１４．０００ｇの遠心分離により収穫し、これを、１００μｌの２×サンプル緩衝剤、５０μｌの４×ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１２５μｌの水および２５μｌの１５％ＤＴＴの混合物中に再度懸濁させた。混合物を９５℃で５分間加熱し、２０μｌを４〜２０％トリス−グリシンゲル（ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％、ＭＥＳ緩衝剤、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に仕込み、ゲルを２００Ｖ、１００ｍＡで３５分間作動させ、Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染料を用いて展開させた。プロテアーゼはおよそ２８ｋＤａの分子量を有していることが見出された。プロテアーゼバンドをＰＶＤＦメンブランにブロットし、製造業者の説明書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてＮ末端配列を判定した。バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２由来のペプチドのＮ末端配列は：配列番号２中の位置１４４〜１５０におけるアミノ酸に対応するＭＨＮＮＱＲＷであると判定した。それ故、成熟型プロテアーゼのＮ末端は、配列番号２の位置１４４に対応する。
【０３４５】
バチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）由来のペプチドのＮ末端配列は、：配列番号４中の位置１〜７におけるアミノ酸に対応するＭＨＮＮＱＲＷであると判定した。それ故、成熟型プロテアーゼのＮ末端は、配列番号４の位置１に対応する。
【０３４６】
パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）由来のペプチドのＮ末端配列は：配列番号６中の位置１〜７におけるアミノ酸に対応するＡＩＨＮＮＱＲであると判定した。それ故、成熟型プロテアーゼのＮ末端は、配列番号６の位置１に対応する。
【０３４７】
分子量
分子量を、Ｂｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒｏＴＯＦ  ｆｏｃｕｓ質量分析器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣを用いて構成されるＬＣ−ＭＳによる質量分光法を用いてさらに判定した。製造業者の説明書に従ってＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉ−Ｓｐｉｎｈ  ６クロマトグラフィカラム、カタログ番号７３２−６２２１を用いてサンプルを脱塩し、７０μｌを、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＰＲＥＰ  Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ２．１×１０ｍｍカラム、部品番号１８６００２７８５に仕込んだ。サンプルを８０％Ｃａｎ  ０．０５％ＴＦＡのステップ溶出で溶出した。
【０３４８】
ＬＣ−法：ｍａｓｓｐｒｅｓＬＣ１０Ｍｉｎ２０６１２２１ＴＦＡ
Ａ−溶剤＝０．０５％ＴＦＡ
Ｂ−溶剤＝Ｃａｎ，０．０５％ＴＦＡ
ＭＳ取得法：ＭａｓｓＰｒｅｓＭＳ０７０５２９ｃｍｃ
データ経路：０７１１ａＥＳＩＭＳ
質量分析器は、Ｔｕｎｅｍｉｘ  ｆｒａ  Ａｇｉｌｅｎｔで較正した。
【０３４９】
バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２の計測された質量は、２８１１６．３Ｄａ（主なピーク）であり、配列番号２のアミノ酸１４４〜４１８（２８１１６．０Ｄａに計算した）に対応していた。それ故、成熟型タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１４４〜４１８に対応するアミノ酸配列を有する。
【０３５０】
バチルスボゴリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）の計測された質量は、２８３４１．２Ｄａ（主なピーク）であり、配列番号４のアミノ酸１〜２７５（２８３４１．１Ｄａに計算した）に対応していた。それ故、成熟型タンパク質は、配列番号４のアミノ酸１〜２７５に対応するアミノ酸配列を有する（ＬＵＮＡ：２０１２−１１８３４−０１）。
【０３５１】
パエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）の計測された質量は、２８６１９．２Ｄａ（主なピーク）であり、配列番号６のアミノ酸１〜２８３（２８６１９．３Ｄａに計算した）に対応していた。それ故、成熟型タンパク質は、配列番号６のアミノ酸１〜２８３に対応するアミノ酸配列を有する。
【０３５２】
実施例３：低温小型洗浄アッセイ
実施例２において調製したプロテアーゼの洗浄性能を、汚染された生地をテスト溶液に連続的に上げ下げし、その後にすすぐ試験法である、小型洗浄アッセイを用いるランドリー洗浄実験において評価する。
【０３５３】
実験を２種の洗濯された市販の洗剤組成物で実施した：ＵＬ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）Ｐｅｒｓｉｌ  Ｓｍａｌｌ＆ＭｉｇｈｔｙおよびＩｃｏｎｉｃ  Ｂａｓｅ。性能は、周知の洗剤プロテアーゼＳａｖｉｎａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）（バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）プロテアーゼ）と比較した。低温での洗浄性能を評価するために、テストを２０℃で実施した。
【０３５４】
洗浄実験は、以下の表７および表８において特定される実験条件下で実施される。
【０３５５】
【表７】
2014519834.tif 000010
【０３５６】
【表８】
2014519834.tif 000011
【０３５７】
テスト材料は、ＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ  Ｍｏｅｖｅｎｓｔｒａｓｓｅ  １２，ＣＨ−９０１５  Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２０，３１３３  ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手する。
【０３５８】
洗浄し、すすいだ汚染された生地をその後空気乾燥させ、洗浄性能をこれらの生地の色の輝度として計測する。輝度はレミッション（Ｒ）としても表現可能であり、これは、白色光を照射した際に、テスト材料から反射されて放射された光に係る尺度である。生地のレミッション（Ｒ）はＺｅｉｓｓ  ＭＣＳ  ５２１  ＶＩＳ分光測光計を用いて４６０ｎｍで計測される。計測は製造業者のプロトコルに従って行われる。
【０３５９】
布きれのレミッション；ＥＭＰＡ１１７ＥＨ、ＰＣ−０３およびＣ−１０、ＵＬ  Ｐｅｒｓｉｌ  Ｓｍａｌｌ＆Ｍｉｇｈｔｙ  ｎｏｎ−ｂｉｏ中に種々の濃度のＳａｖｉｎａｓｅまたはバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２Ｓ８Ａプロテアーゼ、１．３３ｇ／Ｌ、１５°ｄＨ、温度２０℃、小型洗浄、２０分間を使用。
【０３６０】
【表９】
2014519834.tif 000012
【０３６１】
布きれのレミッション；ＥＭＰＡ１１７ＥＨ、ＰＣ−０３およびＣ−１０、Ｉｃｏｎｉｃ  Ｂａｓｅ中に種々の濃度のＳａｖｉｎａｓｅまたはバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２Ｓ８Ａプロテアーゼ、３．５ｇ／Ｌ、１５°ｄＨ、温度２０℃小型洗浄、２０分間を使用。
【０３６２】
【表１０】
2014519834.tif 000013
【０３６３】
本発明のプロテアーゼは、洗浄実験において良好な洗浄性能を示し、２種のテストした洗剤組成物の一方において、市販のプロテアーゼＳａｖｉｎａｓｅと共に、低温（２０℃）で対性能を有する。
【０３６４】
実施例４：ＡＭＳＡを用いたＳ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２の液体洗剤中における安定性の評価：
洗剤中におけるバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２由来のＳ８の安定性を、２種の異なる洗浄温度で、自動機械式応力アッセイを用いてプロテアーゼによる洗剤の洗浄性能を試験することによりテストした。以下の３種の異なる安定性条件をテストした。
プロテアーゼは、洗浄直前に洗剤組成物に添加；
プロテアーゼは、洗剤と共に、２５℃で４８時間プレインキュベート；および
洗浄液は、洗浄の開始前に４０℃で３０分間プレインキュベート。
【０３６５】
単サイクル洗浄法を用いるランドリー法に係る自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）において記載のとおり、表１に記載の洗剤組成物および布きれと、以下の表１１中に特定した実験条件とで実験を行った。
【０３６６】
【表１１】
2014519834.tif 000014
【０３６７】
水硬度を、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ2+：Ｍｇ2+：ＣＯ32-＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより１５°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
【０３６８】
【表１２】
2014519834.tif 000015
【０３６９】
これらの結果より、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２を含有する洗剤は、液体洗剤において２５℃で４８時間保管した後においても、洗浄の直前に洗剤に加えられた新たな酵素と同一の洗浄性能を有することがわかる。これにより、これらの条件下においては、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２は良好な洗剤安定性を示すことがわかる。
【０３７０】
しかも、これらの結果より、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２を含有する洗剤は、洗浄の直前に洗剤に添加された新たな酵素と共に調製された洗浄液中での性能と比した場合に、４０℃での３０分間の洗浄液のプレインキュベーション後にいくらかの洗浄性能を喪失したことがわかる。これにより、これらの条件下においては、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２は良好な洗浄中の安定性を示すことがわかり、また、新たな酵素Ｓａｖｉｎａｓｅおよびバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２が同様に作用するため、酵素は、洗浄サイクルの最初に迅速に作用する必要があることがわかる。
【０３７１】
実施例５  液体洗剤を用いる異なる水硬度およびプロテアーゼ濃度におけるＳ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２のＡＭＳＡ洗浄性能
Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２の洗浄性能を、自動機械式応力アッセイを用い、３種の異なる工業的汚れについて、３種の異なる水硬度および２種の異なる酵素濃度での液体洗剤を用いてテストした。実験を、表１に記載の洗剤組成物および布きれ、ならびに、以下の表１３に記載されている実験条件を用いて、単サイクル洗浄法を用いるランドリー法に対するＡＭＳＡで記載のとおり実施した。
【０３７２】
【表１３】
2014519834.tif 000016
【０３７３】
水硬度を、ＣａＣｌ2およびＭｇＣｌ2、（Ｃａ2+：Ｍｇ2+＝５：１）をテスト系に添加することにより６、１６または２４°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
【０３７４】
【表１４】
2014519834.tif 000017
【０３７５】
これらの結果より、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２を含有する洗剤は、プロテアーゼを含まない洗剤およびＳａｖｉｎａｓｅを含有する洗剤の両方と比して、低〜中程度の水硬度における綿／ポリエステル上の血液／乳／インク汚れの除去に特に有効であることがわかる。
【０３７６】
【表１５】
2014519834.tif 000018
【０３７７】
これらの結果より、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２を含有する洗剤は、プロテアーゼを含まない洗剤およびＳａｖｉｎａｓｅを含有する洗剤の両方と比して、低〜中程度の水硬度における綿／ポリエステル上のチョコレート−乳／インク汚れの除去に特に有効であることがわかる。
【０３７８】
【表１６】
2014519834.tif 000019
【０３７９】
これらの結果より、Ｓ８プロテアーゼバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２を含有する洗剤は、プロテアーゼを含まない洗剤およびＳａｖｉｎａｓｅを含有する洗剤の両方と比して、低〜中程度の水硬度における油／乳／顔料汚れの除去に有効であることがわかる。
【０３８０】
実施例６：２種の異なる液体洗剤を用いるＰ．デンドリティ（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉ）のＡＭＳＡ洗浄性能
Ｐ．デンドリティ（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉ）由来のＳ８プロテアーゼの洗浄性能を、自動機械式応力アッセイを用い、２種の異なる工業的汚れについて、２種の異なる洗浄温度でモデル液体洗剤および市販の液体洗剤を用いてテストした。
【０３８１】
実験を、表１に記載の洗剤組成物および布きれ、ならびに、以下の表１７に記載されている実験条件を用いて、単サイクル洗浄法を用いるランドリー法に対するＡＭＳＡで記載のとおり実施した。
【０３８２】
【表１７】
2014519834.tif 000020
【０３８３】
水硬度を、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ2+：Ｍｇ2+：ＣＯ32-＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより１５°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
【０３８４】
【表１８】
2014519834.tif 000021
【０３８５】
これらの結果より、Ｐ．デンドリティ（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉ）由来のＳ８プロテアーゼを含有する洗剤は、いずれかのプロテアーゼを含まない洗剤と比して、汚れの除去により有効であることがわかる。Ｐ．デンドリティ（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉ）由来のＳ８プロテアーゼは、２０℃においても、血液／乳／インク汚れの除去に有効である。
【０３８６】
実施例７：２種の異なる液体洗剤を用いるバチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）のＡＭＳＡ洗浄性能
バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼの洗浄性能を、自動機械式応力アッセイを用い、２種の異なる工業的汚れについて、２種の異なる洗浄温度でモデル液体洗剤および市販の液体洗剤を用いてテストした。
【０３８７】
実験を、表１に記載の洗剤組成物および布きれ、ならびに、以下の表１５に記載されている実験条件を用いて、単サイクル洗浄法を用いるランドリー法に対するＡＭＳＡで記載のとおり実施した。
【０３８８】
【表１９】
2014519834.tif 000022
【０３８９】
水硬度を、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ2+：Ｍｇ2+：ＣＯ32-＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより１５°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
【０３９０】
【表２０】
2014519834.tif 000023
【０３９１】
これらの結果より、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼを含有する洗剤は、いずれかのプロテアーゼを含まない洗剤と比して汚れの除去により有効であることがわかる。バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＳ８プロテアーゼは、２０℃においても、血液／乳／インク汚れの除去に有効である。
【配列表フリーテキスト】
【０３９２】
配列表の概要
配列番号１は、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２から単離されたＳ８プロテアーゼのＤＮＡ配列である。
配列番号２は、配列番号１から推定されるアミノ酸配列である。
配列番号３は、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）から単離されたＳ８プロテアーゼのＤＮＡ配列である。
配列番号４は、配列番号３から推定されるアミノ酸配列である。
配列番号５は、受入番号ＥＭＢＬ：ＧＱ８９１９８６を有するパエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）のＳ８プロテアーゼのＤＮＡ配列である。
配列番号６は、受入番号ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｄ０ＥＶＤ２を有するパエニバチルスデンドリチホルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼの公共のアミノ酸配列である。
配列番号７および８は、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２を増幅するプライマーである。
配列番号９および１０は、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）を増幅するプライマーである。
配列番号１１は、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＮ０１８１３２の融合断片である。
配列番号１２は、バチルスボルゴウニエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｇｏｕｎｉｅｎｓｉｓ）の融合断片である。
配列番号１３〜配列番号４９はモチーフ配列である。
【配列表】
2014519834000001.app
【国際調査報告】
2014519834.tif 000024
2014519834.tif 000025
2014519834.tif 000026