(57)【要約】本発明は、生体適合性を有する両親媒性環状ホスファゼン三量体およびその製造方法に関するものである。また、本発明は、該両親媒性環状ホスファゼン三量体でミセル化した疎水性薬物製剤およびその製造方法に関するものである。
2014507398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１:
［化学式１］
［Ｎ＝Ｐ（ＭＰＥＧ）（オリゴペプチドエステル）］３
（式中、
ＭＰＥＧは、エチレンオキシド（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均重合度（ｎ）が１７（平均分子量７８０）ないし４５（平均分子量２０００）のメトキシポリエチレングリコールであり、該オリゴペプチドエステルは、ヘキサペプチドまたはナノペプチドのＣ１−６のアルキルエステルまたはＣ７−１３のアリールアルキルエステルである）
で表される両親媒性環状ホスファゼン三量体。
【請求項２】
前記オリゴペプチドが、グリシン（Ｇｌｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される疎水性アミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１記載の両親媒性環状ホスファゼン三量体。
【請求項３】
前記オリゴペプチドエステルが、
グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）、
グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）、または
グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）
であることを特徴とする、請求項１記載の両親媒性環状ホスファゼン三量体。
【請求項４】
トリス（メトキシポリエチレングリコール７８０）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３）、
トリス（メトキシポリエチレングリコール７８０）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３）、
トリス（メトキシポリエチレングリコール１０００）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ１０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３）、および
トリス（メトキシポリエチレングリコール２０００）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ２０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３）
の中から選択される、請求項１記載の両親媒性環状ホスファゼン三量体。
【請求項５】
請求項１記載の両親媒性環状ホスファゼン三量体のミセル、および該ミセル中に封入された疎水性薬物を含む、疎水性薬物製剤。
【請求項６】
前記疎水性薬物が抗癌活性を有することを特徴とする請求項５記載の疎水性薬物製剤。
【請求項７】
前記疎水性薬物がドセタキセルまたはパクリタキセルであることを特徴とする請求項６記載の疎水性薬物製剤。
【請求項８】
前記疎水性薬物が麻酔剤であることを特徴とする請求項５記載疎水性薬物製剤。
【請求項９】
前記疎水性薬物がプロポフォールであることを特徴とする請求項８記載の疎水性薬物製剤。
【請求項１０】
請求項１記載の両親媒性環状ホスファゼン三量体１００重量部と疎水性薬物２〜３０重量部とを共通溶媒に溶解させるステップ;該共通溶媒を蒸発させるステップ;そして、残渣を乾燥させて疎水性薬物が封入された両親媒性環状ホスファゼン三量体のミセルを得るステップを含むことを特徴とする、疎水性薬物が封入されたミセル形態の製剤の製造方法。
【請求項１１】
前記共通溶媒が、アルコール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、クロロベンゼン、アセトニトリルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０記載の製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性を有し、静脈注射用薬物担体として使用される両親媒性環状ホスファゼン三量体およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
また、本発明は、前記両親媒性環状ホスファゼン三量体を用いたミセル封入による疎水性薬物製剤、およびその製造方法に関するものである。本出願は、２０１０年１２月２０日付で韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０−２０１０−０１３０９９８号および２０１１年９月９日付で韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０−２０１１−００９１７９６号の出願日の利益を主張し、その全般が引用により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
人体に薬物を投与する方法は、投与経路に応じて様々な方法があるが、とりわけ経口および注射投与が主流となっている。特に、注射投与は、経口投与に比べて胃腸での吸収過程が省略可能で、薬物の損失と吸収時間を低減できるため、効率的な薬物治療を必要とする癌や糖尿病といった難病の治療剤の投与に幅広く用いられている。
【０００４】
しかし、薬物を注射投与するには水溶性であるべきだが、難病用の治療薬の多くは水に溶けにくい。したがって、水に難溶性の薬物を可溶化するための添加剤として様々な種類の界面活性剤を使用するが、それらは様々な副作用を誘発するため、治療効果に大きな制約が伴っている。
【０００５】
例えば、現在、抗癌剤として世界的に最も幅広く使用されているドセタキセルは、水に対する溶解度が６〜７μｇ／ｍＬと低いため、界面活性剤のポリソルベート８０／１３％エタノール溶液を用いて製剤され、「タキソテール」（登録商標）という商品名で販売されている。しかし、タキソテール（登録商標）は、ドセタキセル自体に起因する神経毒性だけでなく、ポリソルベート８０によるアナフィラキシー、浮腫などの副作用ももたらす。また、ドセタキセルは、光および熱に対する安定性が低く、ポリソルベート８０にドセタキセルを溶かした溶液を入れたバイアルと、１３％エタノール溶液を入れたバイアルの、２バイアルのセットで販売されており、患者への使用時、これら２つの溶液を均一に混合した後、塩水で希釈し、該希釈液を調製後８時間以内に注入しなければならない。
【０００６】
世界的に幅広く使用されている催眠麻酔剤プロポフォールも、水に不溶性であるため、１％のプロポフォールを含むリピッドエマルションとして作られ、ディプリバン（登録商標）という商品名で１９８６年から販売されている。しかし、大豆油が主成分であるリピッドエマルション形態のプロポフォール製剤は、患者に激しい痛みとアレルギーを誘発するが、そのような副作用を回避するプロフォポール製剤の代替品はまだ開発されていない。
【０００７】
一方、最近では、分子量が比較的大きい高分子薬物担体として両親媒性線状ブロック共重合体を用いてミセルに封入された小分子の疎水性薬物を静脈内注射により投与すると、薬物の代謝、生体分布、薬効および毒性などを顕著に改善できることが知られており、このような高分子薬物担体を用いて小分子量薬物の治療効果を改善しようとする、いわゆる「高分子療法（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）」に関する研究が世界的に盛んに行われている（非特許文献１）。
【０００８】
高分子ミセルを用いたドセタキセル製剤研究の代表的な事例をみると、親水性のポリ（エチレンオキシド）と疎水性のポリ（スチレンオキシド）との共重合体（ＰＥＯ−ｂ−ＰＳＯ）、およびポリ（エチレンオキシド）とポリ（ブチレンオキシド）との共重合体（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＯ）を使用した場合（非特許文献２）、親水性のメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ７５０）と疎水性のオリゴ-カプロラクトンとの共重合体（ＭＰＥＧ７５０−ｂ−ＯＣＬ５）を使用した場合（非特許文献３）、ならびに親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と疎水性のポリラクチド（ＰＬＡ）とから構成された両親媒性高分子（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を使用した場合（非特許文献４）などが挙げられる。これらの研究結果をみると、両親媒性線状ブロック共重合体は、従来の界面活性剤ミセルに比べて部分的には向上した物性を示している。しかしながら、純粋な高分子自体のミセルは高い安定性であるけれども、ドセタキセルが積載された後ではそれらは不安定となり、積載された薬物のほとんどが２４時間内に沈殿してしまうという欠点が依然としてあることが分かった。
【０００９】
従来の有機系両親媒性高分子のほとんどは、線状の親水性および疎水性高分子部分で構成される線状ブロック共重合体であって、水溶液中で自己集合によってミセルを容易に形成する。しかしながら、ブロック共重合体ユニットの疎水性部分における分子間の疎水性相互作用の強さは強固なミセルコアを形成するのに十分でないので、これら高分子ミセルは安定性が低い。特に、該ミセルコアにドセタキセルが積載されている場合、該ミセルは不安定となって薬物分子を保持できないため、注射用薬物担体として適していない。また、静脈注射用薬物担体として両親媒性高分子を用いるために、前述したミセルの安定性のほかに満たすべき重要な物性がもう一つある。両親媒性高分子は、一般的に、水溶液中で均一なミセルの形態で存在するが、溶液の温度が上がると、該高分子は、特定の温度にて、ミセルの親水性シェルと溶媒の水分子の間の水素結合が弱められて高分子ミセルが互いに絡まり、固相として分離される。この相転移温度を「下限臨界溶液温度」（ＬＣＳＴ）という。静脈注射用薬物担体として安全に使用するには、高分子ミセルの相転移による血液凝固を防止するために、高分子は体温（３７℃）よりはるかに高いＬＣＳＴを有していなければならない。
【００１０】
したがって、理想的な静脈注射用薬物担体は、従来の界面活性剤ミセルや線状ブロック共重合体ミセルより、水溶液中においてより強力で安定したミセルを形成することにより、疎水性薬物を十分に可溶化して安定化させることができるだけでなく、安全な静脈注射が可能であるように体温よりはるかに高い（例えば、５０℃以上）ＬＣＳＴを有するべきであり、それにより薬効、毒性、および代謝などを改善が改善されるであろう。
【００１１】
本発明者らは、最近、等モルの親水性のポリエチレングリコール（Ｘ）と、疎水性のトリペプチドもしくはペンタペプチド（Ｙ）がcis-非ジェミナル法（ｃｉｓ−ｎｏｎｇｅｍｉｎａｌ  ｗａｙ）で環状ホスファゼンテンプレートにグラフトされた新規の両親媒性環状ホスファゼン三量体［Ｎ＝Ｐ（Ｘ）（Ｙ）］３を開発し、該ポリエチレングリコールは重合度（ｎ）が７（平均分子量３５０）ないし１６（平均分子量７５０）であるポリエチレンオキシド（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）から成る（特許文献１）。これら環状ホスファゼン三量体は、従来の線状両親媒性高分子とは異なり、１分子内に３個の疎水性ペプチド基を有し、それらは同じ方向に配列されていて分子内および分子間の疎水性相互作用をもたらし、その結果、水溶液中で自己集合によりポリエチレングリコールのシェルを有する強固なミセルコアを形成する（図１）。該両親媒性環状ホスファゼン三量体は、皮下注射において、体温でゲル（ｇｅｌ）または沈殿物を形成することにより運搬薬物の放出速度を調節できることから、局所的なドラッグデリバリーに適していることが見いだされた。しかし、これらのホスファゼン三量体は、前述したように、それらのＬＣＳＴが体温付近（３１−４２℃）であり、静脈注射すると血液凝固が引き起こされるため、静脈注射用薬物担体としては適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０５６７３９７号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｒ．Ｈａａｇ，Ｆ．Ｋｒａｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，（２００６）１１９８−１２１５
【非特許文献２】Ｅ．Ｍａｈｍｏｕｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００７，８，２２５０−２２５７
【非特許文献３】Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｓｔｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６８（２００８）５９６−６０６
【非特許文献４】Ｈ．−Ｃ．Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１４０（２００９）２９４−３００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の目的は、静脈注射用薬物担体として使用可能な両親媒性環状ホスファゼン三量体を提供することである。
【００１５】
また、本発明の別の目的は、前記両親媒性環状ホスファゼン三量体でミセル封入されている疎水性薬物製剤およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、下記化学式１により示される両親媒性環状ホスファゼン三量体を提供する。
［化学式１］
［Ｎ＝Ｐ（ＭＰＥＧ）（オリゴペプチドエステル）］３
式中、
ＭＰＥＧは、エチレンオキシド（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均重合度（ｎ）が１７（平均分子量７８０）ないし４５（平均分子量２０００）のメトキシポリエチレングリコールであり、オリゴペプチドエステルは、ヘキサペプチドまたはナノペプチドのＣ１−６のアルキルエステルまたはＣ７−１３のアリールアルキルエステルである。
【００１７】
また、本発明は、疎水性薬物を前記化学式１の両親媒性環状ホスファゼン三量体によりミセル封入された疎水性薬物の医薬製剤を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、両親媒性環状ホスファゼン三量体１００重量部と疎水性薬物２〜３０重量部とを共通溶媒に溶解させるステップと、前記共通溶媒を蒸発させて除去した後、残留溶媒を減圧下で乾燥させて両親媒性環状ホスファゼン三量体によりミセル封入された疎水性薬物を得るステップとを含むことを特徴とする両親媒性環状ホスファゼン三量体によりミセル封入された疎水性薬物の医薬製剤の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明による両親媒性が拡張された新規の環状ホスファゼン三量体は、上述の公知の環状ホスファゼン三量体が液相として製造されるのとは異なり、固相として得られる。加えて、これら新規の環状ホスファゼン三量体は、疎水性が強く、水に溶けにくい小分子量のドセタキセル抗癌剤などの疎水性薬物をミセル封入により効率的に可溶化させることができ、そのようなミセル封入された薬物は固相として得られる。薬物の物理化学的安定性と、薬効および毒性を顕著に改善することができる。特に、本発明の両親媒性環状ホスファゼン三量体によりミセル封入された製剤としてドセタキセルのような疎水性薬物を投与する場合、該薬物は持続的に放出されるとともに、生体利用率が顕著に向上し、毒性が緩和される。それだけでなく、ドセタキセルは、本発明の両親媒性環状ホスファゼン三量体を用いたミセル封入により固相に製剤化され得るので、その光安定性が従来の液相製剤とは異なって顕著に改善され、それにより長期間の保管が可能で、便利に用いることができることが見いだされている。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】環状ホスファゼン三量体ミセルと従来の線状高分子ミセルとの構造的差違を示す。
【図２】当モルの親水性基と疎水性基とを有する両親媒性環状ホスファゼン三量体の製造方法を示す反応スキームである。該反応スキームにおいて、ｎは、メトキシポリエチレングリコールの平均分子量が７８０ないし２，０００とする十分に大きい整数である。
【図３】疎水性のドセタキセルを封入している両親媒性環状ホスファゼン三量体ミセルの形成を示す概念図である。
【図４】乳癌株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する、ヌードマウス異種移植試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、下記化学式１の両親媒性環状ホスファゼン三量体に関する。
［化学式１］
［Ｎ＝Ｐ（ＭＰＥＧ）（オリゴペプチドエステル）］３
式中、
ＭＰＥＧは、エチレンオキシド（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの重合度（ｎ）が１７（平均分子量７８０）ないし４５（平均分子量２０００）のメトキシポリエチレングリコールであり、オリゴペプチドエステルは、ヘキサペプチドまたはナノペプチドのＣ１−６のアルキルエステルまたはＣ７−１３のアリールアルキルエステルである。
【００２２】
本発明者らが以前に報告した、親水性基として平均分子量が３５０ないし７５０のポリエチレングリコールと、疎水性基としてトリペプチドないしペンタペプチドとを導入した両親媒性環状ホスファゼン三量体は、上述の通りそれらのＬＣＳＴが体温付近（３１−４２℃）であるため、静脈注射用薬物担体としての使用には適しておらず、特に、これら三量体のミセルは、ドセタキセルを積載した場合、安定性が十分でない。
【００２３】
本発明者らは、静脈注射用薬物担体として用いるためには、ホスファゼン三量体ミセルの安定性が高くなければならないことに留意し、動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して多様なオリゴペプチドを含む環状ホスファゼン三量体に対して徹底した実験を行った。その結果、安定した低い臨界ミセル濃度（＜１０ｍｇ／Ｌ）を有する安定なミセルを得るためには、少なくともヘキサペプチドないしナノペプチド、すなわち、疎水性指数のｌｏｇ  Ｐ（Ｐ＝［溶質］ｎ−オクタノール／［溶質］水）が２以上のオリゴペプチドを、該三量体中の疎水性基として用いるべきであることを明らかにした。
【００２４】
また、静脈注射用薬物担体はＬＣＳＴが高くなければならないことを考慮して、本発明者らは、ポリエチレングリコールの親水性の変化によって、高温、好ましくは５０℃以上のＬＣＳＴを有する環状ホスファゼン三量体の最適化をさせようと努力した結果、疎水性基としてヘキサペプチドないしナノペプチドを環状ホスファゼン三量体に導入する場合、少なくとも、ポリエチレンオキシドの平均重合度が１７（平均分子量７８０）ないし４５（平均分子量２０００）であるポリエチレングリコール（ｌｏｇ  Ｐ＜−２．８）を疎水性基として有する場合にのみ、ホスファゼンミセルのＬＣＳＴを５０℃以上に維持できることを見いだした。
【００２５】
本発明の化学式１の両親媒性環状ホスファゼン三量体における使用に適したオリゴペプチドは、好ましくは、グリシン（Ｇｌｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択される１種以上の疎水性アミノ酸を含むヘキサペプチドまたはナノペプチドである。
【００２６】
前記アルキルエステルまたはアリールエステルの好ましい例として、メチルエステル、エチルエステルおよびベンジルエステルなどが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２７】
前記オリゴペプチドエステルの具体例としては、
グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）、
グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）、および
グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２８】
前記オリゴペプチドを含む前記化学式１の両親媒性環状ホスファゼン三量体の例としては、
トリス（メトキシポリエチレングリコール７８０）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３）、
トリス（メトキシポリエチレングリコール７８０）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３）、
トリス（メトキシポリエチレングリコール１０００）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ１０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３）、または
トリス（メトキシポリエチレングリコール２０００）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ２０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３）などが挙げられる。しかし、同様に、これらに制限されるものではない。
【００２９】
前記化学式１で表される両親媒性環状ホスファゼン三量体は、下記化学式２のヘキサクロロシクロトリホスファゼン［（Ｎ＝ＰＣｌ２）３］から製造できる。例えば、下記化学式２のヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルに対して、親水性基としてポリエチレングリコールの平均重合度（ｎ）が１７（平均分子量７８０）または４５（平均分子量２，０００）のメトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩またはカリウム塩３モルと、次いで疎水性基としてヘキサペプチドまたはナノペプチドのＣ１−６のアルキルエステルまたはベンジルエステル３モルとを段階的に置換させることにより得ることができる。
［化学式２］
【化１】
2014507398.tif 000003
【００３０】
以下、その製造過程をより具体的に説明する。
【００３１】
まず、ポリエチレングリコールの平均重合度（ｎ）が１７ないし４５のモノメトキシポリエチレングリコールを過剰量のナトリウムまたはカリウム金属片と共に反応させ、下記化学式３のメトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩、またはカリウム塩を製造する。この時、前記反応を行う溶媒は、任意の有機溶媒が使用可能であり、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ベンゼンまたはトルエンの中で行うことができる。前記反応は、不活性雰囲気（例：アルゴン気体）中で約５時間還流させることにより行うことができる。
［化学式３］
【化２】
2014507398.tif 000004
【００３２】
このように製造された前記メトキシポリエチレングリコールナトリウムまたはカリウム塩３当量を、前記化学式２の環状ヘキサクロロホスファゼン三量体１モル（６当量）と０℃以下で反応させ、メトキシポリエチレングリコールと塩素をそれぞれ３当量ずつ含むホスファゼン三量体の中間体を製造する。反応溶媒は、前記反応を阻害しない任意の溶媒が使用可能であり、好ましくは、テトラヒドロフラン、トルエン、クロロホルムまたはそれらの組み合わせから選択された溶媒を使用することができる。
【００３３】
その後、前記環状ホスファゼンの中間体を、ヘキサペプチドないしナノペプチドのＣ１−６のアルキルエステルまたはベンジルエステル３モルと反応させ、目的の生成物である化学式１の両親媒性ホスファゼン三量体を製造する。この時、該反応物間のモル比は特に制限されないが、典型的には、ヘキサペプチドないしナノペプチドのＣ１−６のアルキルエステルまたはベンジルエステルを、該環状ホスファゼンの中間体１モルに対して３ないし５当量反応させることができる。また、該反応は、求性置換反応を促進する塩基の存在下、例えば、トリエチルアミンなどの存在下で行ってよい。反応溶媒は、該反応を阻害しない任意の溶媒を用いてよく、好ましくは、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、クロロホルムおよびこれらの組み合わせから選択可能である。該反応は、室温ないし７０℃で約２４〜７２時間反応させた後、４０〜６０℃で約１〜４日間還流下で反応させることができる。
【００３４】
前記反応が完了した後、前記反応混合液から前記化学式１の生成物を分離し、精製する。まず、反応混合液を遠心分離または濾過により、副産物として生成された沈殿物を除去する。上清または濾液を減圧ロータリーエバポレーターで濃縮した後、水で３回以上洗浄する。有機層を乾燥剤（例：ＭｇＳＯ４）で乾燥させた後、再び減圧濾過する。該濾液を再び減圧濃縮し、最後に、クロマトグラフィーを用いて分離および精製して、純粋な化学式１のホスファゼン三量体を固形物として得る。
【００３５】
別の態様によると、本発明は、前記両親媒性環状ホスファゼン三量体を用いたミセル封入による疎水性薬物の医薬製剤を提供する。
【００３６】
本発明の前記疎水性薬物の医薬製剤に関連して用いられる「疎水性薬物」とは、水に難溶性である薬物を言う。水に難溶性の薬物であればいずれも使用可能であるが、好ましくは、静脈内投与用剤形として製剤化される必要がある薬物である。本発明で用いられる記疎水性薬物の例として、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などの抗癌剤、プロポフォール（ｐｒｏｐｏｆｏｌ）のような麻酔剤、ならびにペプチドおよびタンパク質薬物が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３７】
本発明の両親媒性環状ホスファゼン三量体を用いたミセル封入による疎水性薬物の医薬製剤は、薬品貯蔵および使用の簡便性を大きく改善し得る、物理化学的に安定した固体の生成物（例えば粉末）であってよい。
【００３８】
前記両親媒性環状ホスファゼン三量体を用いたミセル封入による疎水性薬物の医薬製剤は、両親媒性ホスファゼン三量体１００重量部と疎水性薬物２〜３０重量部とを共通溶媒（例えばエタノール）に溶解させるステップと、該共通溶媒を蒸発させて除去した後、残渣を乾燥させて、疎水性薬物を封入した両親媒性環状ホスファゼン三量体ミセルを得るステップとにより製造できる。
【００３９】
一般的に、水に難溶性の薬物を従来の両親媒性高分子を用いたミセル封入により水に溶解させる方法としては、透析法（ｄｉａｌｙｓｉｓ）が最も広く利用されている。すなわち、水難溶性の薬物と両親媒性高分子薬物担体とを共通の有機溶媒に完全に溶かし、該溶液を透析膜（dialysis bag）に入れ、水で透析すると、水性ミセル型薬物が得られる。しかし、この方法は、透析時間および薬物濃度を制御することが難しい点だけでなく、ミセル封入した薬物を溶液から回収する複雑な手順を経なければならない点において不利である。これに対し、本発明の方法は、工程が単純であるという利点がある。
【００４０】
本発明の両親媒性環状ホスファゼン三量体を用いたミセル封入による疎水性薬物の医薬製剤の製造方法に使用される共通溶媒としては特に制限はないが、例えば、エタノール、メタノールなどのアルコール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、クロロベンゼン、アセトニトリルまたはそれらの組み合わせを使用することができる。
【実施例】
【００４１】
説明のために記載される以下の実施例は、本発明をより良く理解するためのものであって本発明を制限するものではない。
【００４２】
実施例では、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣＨＮ分析装置で、炭素、水素および窒素の元素分析を行った。プロトンの核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−２５０ＮＭＲ  スペクトロメータを用いて得て、リン核磁気共鳴スペクトルはＶａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ−５００ＮＭＲ  スペクトロメータを用いて得た。水溶液中におけるナノ粒子の粒度分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ−ＺＳ）を用いて測定した。
【００４３】
実施例１：
トリス（メトキシポリエチレングリコール７８０）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３）の製造
平均分子量７８０のメトキシポリエチレングリコール（８．１１ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を、トルエン溶媒下、ディーン・スターク装置を用いて脱水した後、還流下、アルゴン雰囲気においてナトリウム片（０．２６ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）と１２時間反応させ、メトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩溶液を得た。氷浴（０℃）中のヘキサクロロシクロトリホスファゼン（１．００ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）／無水テトラヒドロフラン溶液に、該塩溶液を徐々に滴下した。氷浴を除去した後、クロロホルム（１００ｍｌ）中のトリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）およびヘキサペプチドエチルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ（８．０５ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）の溶液を加え、７０℃にて４８時間、シクロトリホスファゼン中間体と反応させた。反応溶液を遠心分離または濾過して副生成物である沈殿物（Ｅｔ３ＮＨＣｌまたはＮａＣｌ）を除去し、濾液を減圧濃縮した。この濃縮物をメタノールで再び溶かし、減圧濃縮した。この手順を２〜３回繰り返した。得られた濃縮物をメタノール１００ｍｌに溶解させてから、透析膜（カットオフ分子量：１０００）を用いて２４時間透析した後、さらに蒸溜水で２４時間透析した。他の少量の異性体を除去するために、カラムクロマトグラフィー（アルミナ、５０−２００メッシュ、中性、ＭＣ／ＭｅＯＨ＝９７：３）を用いて分離精製した。このように得られた化合物を減圧蒸溜し、最終ホスファゼン生成物［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３（収率、６４．０％）を得た。
組成式：Ｃ２１３Ｈ３６６Ｎ２１Ｏ７５Ｐ３．
分子量＝４４８３．９
元素分析の結果：理論値：Ｃ、５７．０６；Ｈ、７．５５；Ｎ、６．５６．実測値：Ｃ、５６．６；Ｈ、８．２１；Ｎ、６．３３．
1H NMR (CDCl3, δ(ppm)): 0.69-0.87 (m, 36H, 2(Leu-(CH3)2)), 1.14 (t, 9H,  Leu-OCH2CH3), 1.31-1.62 (m, 18H, 2(Leu-CHCH2)), 2.60-3.09 (b, 12H, 2(Phe-CH2)), 3.68-3.96 (b, 12H, 2(Gly-CH2)), 4.0-4.1 (m, 6H, Leu-OCH2CH3), 4.17-4.44 (m, 6H, 2(Leu-CH)), 4.5-4.8 (b, 6H, 2(Phe-CH)), 7.14-7.23 (m, 30H, Phe-C5H5), 7.9-8.54 (m, 18H, NHCO)
31P NMR(CDCl3, δ(ppm)): 22.4.
下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）：７２．０℃．
【００４４】
実施例２：
トリス（メトキシポリエチレングリコール７８０）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３）の製造
ヘキサペプチドエチルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔの代わりに、ヘキサペプチドベンジルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚを用いたことを除いて、実施例１と同様の方法で次のような物性の両親媒性環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３を合成した（収率：４５．７％）。
組成式：Ｃ２４３Ｈ４０２Ｎ２１Ｏ８１Ｐ３．
分子量：５００６．８
元素分析の結果：理論値：Ｃ、５８．２９；Ｈ、８．０９；Ｎ、５．８７．実測値：Ｃ、５８．７３；Ｈ、８．０９；Ｎ、６．２３．
1H NMR (250MHz, DMSO, 25℃): δ= 0.73-0.87 (m, 36H, 2(Leu-(CH3)2)), 1.2-1.56(m, 18H, 2(Leu-CH2CH)), 2.71-2.3 (m, 12H, 2(Phe-CH2)), 3.24 (s, 9H MPEG-OCH3), 3.79 (d, 12H, 2(Gly-CH2)), 4.3 (b, 6H, 2(Leu-CH)), 4.61 (b, 6H, 2(Phe-CH)), 5.11(d, 6H, C6H5-CH2), 7.22 (s, 30H, 2(Phe-C6H5)), 7.5 (s, 15H, O-CH2-C6H5), 7.9-8.54 (m, 18H; NHCO)
31P NMR(CDCl3, ppm): δ= 22.7
ＬＣＳＴ＝６６℃．
【００４５】
実施例３：
トリス（メトキシポリエチレングリコール１０００）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルベンジルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ１０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３）の製造
分子量７８０のメトキシポリエチレングリコールの代わりに分子量１０００のメトキシポリエチレングリコールを、そして、ヘキサペプチドエチルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔの代わりにヘキサペプチドベンジルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚを用いたことを除いて、実施例１と同様の方法で次のような物性の両親媒性環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ１０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３（収率：５０．７％）を製造した。
組成式：Ｃ２５８Ｈ４３２Ｎ２１Ｏ９０Ｐ３．
分子量：５３２２．２
元素分析の結果：理論値：Ｃ、５７．８０；Ｈ、８．１２；Ｎ、５．４９．実測値：Ｃ、５７．６３；Ｈ、８．１０；Ｎ、５．４３．
1H NMR (250MHz, DMSO, 25℃): δ= 0.73-0.87 (m, 36H, 2(Leu-(CH3)2)), 1.2-1.56(m, 18H, 2(Leu-CH2CH)), 2.71-2.3 (m, 12H, 2(Phe-CH2)), 3.24 (s, 9H, MPEG-OCH3), 3.37-3.5 (m, 264H, MPEG1000-OCH2CH2), 3.79 (d, 12H, 2(Gly-CH2)), 4.3 (b, 6H; 2(Leu-CH)), 4.61 (b, 6H; 2(Phe-CH)), 5.11(d, 6H; C6H5-CH2), 7.22 (s, 30H, 2(Phe-C6H5)), 7.5 (s, 15H, O-CH2-C6H5), 7.9-8.54 (m, 18H; NHCO) 
31P NMR(CDCl3, ppm): δ= 22.9
ＬＣＳＴ＝７０℃．
【００４６】
実施例４：
トリス（メトキシポリエチレングリコール２０００）トリス（グリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシルフェニルアラニルロイシルエチルエステル）シクロトリホスファゼン（［ＮＰ（ＭＰＥＧ２０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３）の製造
分子量７８０のメトキシポリエチレングリコールの代わりに分子量２，０００のメトキシポリエチレングリコールを、そして、ヘキサペプチドエチルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔの代わりにナノペプチドエチルエステルＨＣｌＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔを用いたことを除いて、実施例１と同様の方法で次のような物性の両親媒性環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ２０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３を合成した（収率：３９．７％）。
組成式：Ｃ４３２Ｈ７７１Ｎ３０Ｏ１６８Ｐ３．
分子量：９１６６．７７
元素分析の結果：理論値：Ｃ、５６．６０；Ｈ、８．４８；Ｎ、４．５８．実測値：Ｃ、５６．３３；Ｈ、８．７９；Ｎ、４．３７．
1H NMR (250MHz, DMSO, 25℃): δ= 0.73-0.87 (m, 54H 3(Leu-(CH3)2)), 1.10 (t, 9H, Leu-OCH2CH3) 1.2-1.56 (m, 27H, 3(Leu-CH2CH)), 2.71-2.3 (m, 18H,3(Phe-CH2)), 3.24 (s, 9H, MPEG2,000-OCH3), 3.37-3.5 (m, 540H, MPEG2,000-OCH2CH2), 3.79(d, 18H, 3(Gly-CH2)), 4.0-4.1 (m, 6H, Leu-OCH2CH3), 4.3 (b, 9H, 3(Leu-CH)), 4.61(b, 9H, 3(Phe-CH)), 7.22 (s, 45H, 3(Phe-C6H5)), 7.9-8.54 (m, 18H; NHCO)
31P NMR(CDCl3, ppm): δ= 22.6
ＬＣＳＴ＝９６℃．
【００４７】
実施例５：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３でミセル封入したドセタキセル抗癌剤の製造
実施例１で製造されたホスファゼン三量体１００ｍｇとドセタキセル２５ｍｇとを無水エタノール１０ｍｌに完全に溶解させた後、減圧ロータリーエバポレーターでエタノールを徐々に蒸発させてから、３０分ないし１時間減圧乾燥させて残留溶媒を完全に除去して、ドセタキセル抗癌剤が封入されたホスファゼン三量体ミセルを固相で得る。
【００４８】
実施例６および実施例７：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３でミセル封入したドセタキセル抗癌剤の製造
成分を下記表１に示す通りに用いたことを除いて、実施例５と同様の方法で、ドセタキセル抗癌剤が封入されたホスファゼン三量体ミセルを製造した。
［表１］
【表１】
2014507398.tif 000005
【００４９】
実施例８ないし実施例１０：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３でミセル封入したパクリタキセル抗癌剤の製造
成分を下記表２に示す通りに用いたことを除いて、実施例５と同様の方法で、パクリタキセル抗癌剤が封入されたホスファゼン三量体ミセルを製造した。
［表２］
【表２】
2014507398.tif 000006
【００５０】
実施例１１：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３を用いたミセル封入によるプロポフォール液剤の製造
実施例１で製造されたホスファゼン三量体４５ｍｇとプロポフォール５ｍｇとを無水エタノール１０ｍｌに溶解させた後、減圧ロータリーエバポレーターでエタノールを徐々に蒸発させてから、１０ないし２０分間減圧乾燥させて残留溶媒を完全に除去し、残渣を蒸溜水１ｍｌに溶かして透明な０．５％プロポフォール注射液を得た。
【００５１】
実施例１２ないし実施例１４：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３でミセル封入したドセタキセル抗癌剤の製造
成分を下記表３に示す通り用いたことを除いて、実施例５と同様の方法で、実施例２で製造したホスファゼン三量体でミセル封入したドセタキセルを得た。
［表３］
【表３】
2014507398.tif 000007
【００５２】
実施例１５ないし１７：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ１０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＢｚ）］３でミセル封入したドセタキセル抗癌剤の製造
成分を下記表４に示す通りに用いたことを除いて、実施例５と同様の方法で、実施例３で製造したホスファゼン三量体でミセル封入ドセタキセルを得る。
［表４］
【表４】
2014507398.tif 000008
【００５３】
実施例１８ないし２０：
［ＮＰ（ＭＰＥＧ２０００）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３でミセル封入したドセタキセル抗癌剤の製造
成分を下記表５に示す通りに用いたことを除いて、実施例５と同様の方法で、実施例４で製造したホスファゼン三量体でミセル封入したドセタキセルを得る。
［表５］
【表５】
2014507398.tif 000009
【００５４】
実施例２１：
本発明の［ＮＰ（ＭＰＥＧ７８０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）］３と公知の［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＥｔ）］３のドセタキセル製剤の比較実験
本発明の実施例１のホスファゼン三量体と、韓国登録特許第０５６７３９７号（ＳＯＨＮ  ＹＯＵＮ  ＳＯＯら）の実施例１のホスファゼン三量体とを用い、本発明の実施例５と同様の方法でドセタキセルを製剤化した後、該２つの製剤を、水溶液におけるミセルの安定性、マウスにおける注射剤としての能力（injectability）について比較した。まず、本発明の実施例１のホスファゼン三量体で製剤されたドセタキセル抗癌剤は粉末として得られたが、韓国登録特許第０５６７３９７号の実施例１のホスファゼン三量体で製剤されたドセタキセル抗癌剤は液体の油状物として得られた。これら２つの製剤の各々を水に溶解させて０．２％ドセタキセルを含む透明な水溶液を得た後、各新鮮な前記水溶液１０ｍｌずつを２０ｍｌの透明なバイアルに入れ、標準的な室内照明下、室温で観察した。韓国登録特許第０５６７３９７号の実施例１の溶液を含むバイアルにおいては、約３日後に、ほとんどのドセタキセルの沈殿が観察された（おそらく、テトラペプチドを有する三量体から形成されたミセルの不安定さに起因）が、本発明の実施例１の、ヘキサペプチドを有する三量体で製造された製剤を含むバイアルにおいては、３か月が経過してもドセタキセルの沈殿が全く観察されなかった。また、前記水溶液をそれぞれＩＣＲマウス３匹に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射を試みた結果、本発明の実施例１の溶液（ＬＣＳＴ＝７２℃）は、尻静脈を介して容易に投与可能であったが、韓国登録特許第０５６７３９７号の実施例１の溶液（ＬＣＳＴ＝３６℃）は、注入の開始から低いＬＣＳＴに起因して溶液の粘度が高くなり、注射液の注入を完了することができなかった。
【００５５】
実験例１：
ホスファゼンミセル封入したドセタキセルとタキソテール（登録商標）の血中代謝物（ｂｌｏｏｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）比較実験
雄スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット（２３０〜２５０ｇ）５匹を１群とし、実施例６のホスファゼンミセル封入したドセタキセルを３分間かけて５ｍｇ／ｋｇのドセタキセル用量にて静脈注射（静脈注入（ｉ．ｖ．ｉｎｆｕｓｉｏｎ））した。比較のため、タキソテール（登録商標）を同様の方法で投与した。薬物投与後、所定の時間（０、０．０８、０．２５、０．５、１、２、３、４、６、８、１２、２４、３６、４８時間）にて血液試料（１００μｌ）を採取し、遠心分離により各試料からプラズマを分離し、−２０℃で保管後、ＨＰＬＣで分析した。このように得られた時間に対するプラズマドセタキセル濃度プロファイルから、ウィンノンリン（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ）プログラムを用いて薬物動態パラメータを算出し、下記表６に示した。
［表６］
【表６】
2014507398.tif 000010
＊Ｃ０：初期濃度、ＡＵＣ：プラズマ−時間曲線下面積、ｔ１／２：半減期、Ｋｅ：除去定数、Ｖｚ：分布体積、Ｃｌ：クリアランス速度
表６のデータから分かるように、実施例６の高分子ミセル型ドセタキセル抗癌剤の体内半減期（ｔ１／２＝０．７１１時間）は、現在臨床で使用されているタキソテール（登録商標）（ｔ１／２＝０．３９６時間）に比べて約２倍程度長く、薬物の生体利用率を示すＡＵＣ（曲線下面積）値は、本発明のミセル型ドセタキセル抗癌剤（０．６６４）がタキソテール（登録商標）（０．３６０）の約２倍程度高いことが分かる。タキサン系の抗癌剤は、白金錯体のような他の抗癌剤とは異なり、疎水性が高く、血清輸送タンパク質によって速く除去されることを考慮すると、薬物の血清半減期と生体利用率が２倍に増加したのは大きな進歩である。
【００５６】
実験例２：
ホスファゼンミセル封入パクリタキセルとタキソールの血中代謝物比較実験
実施例８のミセル封入パクリタキセルとクレモフォールＥＬで製剤されたタキソール（Ｂｒｉｓｔｏｌｍｙｅｒ社製品）を代わりに用いたことを除いて、前記実験例１と同じ方法で、血中代謝物についての実験を行った結果、下記表７のような結果を得た。表７に示すように、本発明のミセル封入パクリタキセルは、血清半減期およびＡＵＣ値において、タキソールと比べて２倍増加した。
［表７］
【表７】
2014507398.tif 000011
＊Ｃ０：初期濃度、ＡＵＣ：プラズマ−時間曲線下面積、ｔ１／２：半減期、Ｋｅ：除去定数、Ｖｚ：分布体積、Ｃｌ：クリアランス速度
【００５７】
実験例３：
ヌードマウスモデルにおける、ホスファゼンミセル封入ドセタキセルとタキソテール（登録商標）の、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌活性比較実験
試験動物は、ヌードマウスＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌｊＯｒｉを、各々５匹から成るグループに分けた。該ヌードマウスに移植した後該乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、腫瘍が８０−１００ｍｍ３の大きさに増大するまで増殖させた。実施例６のホスファゼンミセル封入ドセタキセルを、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの用量で、移植後１、５、９日目に各々３回投与した後、癌細胞の増殖を５週間モニタリングし、図４に示した。比較のため、賦形剤をプラセボとして用い、陽性対照としてタキソテール（登録商標）を最適用量の１５ｍｇ／ｋｇで用いた。
図４からみると、タキソテール（登録商標）は、最適用量の１５ｍｇ／ｋｇにおいて予想どおりに癌組織の完全な退縮を示した一方、本発明のホスファゼンミセル封入ドセタキセル（ＤＴＸで表記）は、５ｍｇ／ｋｇならびに１５ｍｇ／ｋｇの用量で癌組織の完全な治癒効果を示した。このような動物実験の結果は、本ホスファゼンミセル封入ドセタキセルは、ドセタキセルの治療用量をタキソテール（登録商標）に比べて、１／３の濃度まで低減できる可能性を示唆するとともに、非常に優れた効果を示すものである。この結果は、生体利用率パラメータ（ＡＵＣ）が２倍増大した、血中代謝物の前記データと一致している。仮に、臨床でもドセタキセルの臨床用量を１／３に低減できれば、ドセタキセルによる副作用を大きく低減できるだけでなく、治療費用も大きく節減できるため、多くの波及効果が期待される。このような抗癌活性の実験結果は、次の実験例４の急性細胞毒性実験の結果においても一致している。
【００５８】
実験例４：
ミセル封入ドセタキセルとタキソテール（登録商標）の細胞毒性比較実験
本発明の高分子ミセル型ドセタキセル抗癌剤と現在臨床で使用されるタキソテールに対して抗癌治療の範囲と効能を比較するために、当分野で公知の方法（Ｒｉｔａ  Ｓｏｎｇら Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ１０５（２００５）１４２−１５０）に従って８種の異なるヒト癌細胞株に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗癌活性試験を実施し、その結果を下記表８に示した。表８からみると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性（ＩＣ５０）は、タキソテール（登録商標）に比べて、ホスファゼンミセル封入ドセタキセルがＰＥＧの分子量に関係なく全般的に低くなったが、その理由は、ドセタキセル薬物分子が強力なホスファゼンミセルコアの内部に閉じ込められていて、癌細胞との接触が遅延するからであると考えられる。しかし、全般的にホスファゼンミセル封入ドセタキセルとタキソテール（登録商標）の癌治療範囲はほぼ類似することが分かる。
［表８］
【表８】
2014507398.tif 000012
【００５９】
実験例５：
ホスファゼンミセル封入ドセタキセルとタキソテールの急性毒性比較実験
６週齢の体重２０−２２ｇの雄ＩＣＲマウスを、２０℃、湿度６０％で５日間順化させた後、ＯＥＣＤガイドライン４２３に従って試験を行った。すなわち、試験物質を生理塩水に溶かした後、タキソテール（登録商標）を５、３０、５０、１００ｍｇ／Ｋｇの用量で、そして、ドセタキセルを１０％含む実施例６のホスファゼンミセル封入ドセタキセルを５、５０、３００、５００、１０００、２，０００ｍｇ／Ｋｇの用量で、それぞれ３匹ずつのマウスに静脈投与した。２週間、個体ごとの体重変化、生存率を観察し、その後、組織検査を実施し、ＯＥＣＤガイドライン４２５に従ってＬＤ５０値を計算した。
実験の結果をみると、タキソテール（登録商標）を投与した場合、５ｍｇ／Ｋｇの用量では３匹全て生き残ったが、３０ｍｇ／Ｋｇでは３匹中２匹が死亡し、５０および１００ｍｇ／Ｋｇでは３匹全て死亡した。従って、タキソテール（登録商標）のＬＤ５０値を計算すると約２８ｍｇ／Ｋｇであった。次に、ドセタキセルを１０％含むホスファゼンミセル封入ドセタキセルについては、５００ｍｇ／Ｋｇまでは全てのマウスが生き残り、１，０００または２，０００ｍｇ／Ｋｇで投与された全てのマウスが死亡したというデータに基づいて、ＬＤ５０値は約７５０ｍｇ／Ｋｇであると算出された。従って、ホスファゼンミセル封入ドセタキセルのＬＤ５０値はドセタキセルに換算すると７５ｍｇ／Ｋｇと算出される。すなわち、ポリソルベート８０を用いて製剤化したタキソテール（登録商標）のドセタキセルＬＤ５０値が２８ｍｇ／Ｋｇであるのに対し、実施例６のホスファゼンミセル封入ドセタキセルはＬＤ５０値が７５ｍｇ／Ｋｇと約３倍増加した。このような急性毒性の顕著な改善には、タキソテール（登録商標）（界面活性剤ミセル）はドセタキセルが血中にすぐに放出されるように注射後すぐに崩壊するが、本ホスファゼンミセル封入ドセタキセルはドセタキセルが徐々に放出されるように血中において安定であることが寄与しており、それにより毒性が大きく改善されるとともに生体利用率および薬効が増大する。
【００６０】
実験例６：
ホスファゼンミセル封入プロポフォールとディプリバン（登録商標）の比較実験
スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット１６週齢（雌、３００〜３４０ｇ）を、３匹を１群としてグループに分け、頸静脈に薬物投与のためのＩＶカニューレ挿入を行い、マイクロプロセッサ制御方式シリンジポンプを用いて、試験物質を１０ｍｇ／Ｋｇ／分の速度で静脈経路を介して投与した。麻酔導入を以下の項目の順で評価し、エンドポイントまで注入されたプロポフォールの量を用量として決定した。
−観察行動の消失（意識消失（Ｓｔｕｎｎｅｄ））
−正向反射の消失
−睫毛反射の消失
−１０秒間隔での足指の刺激に応じた脚の反射作用の消失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｌｅｇ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）
実験の結果を下記表９にまとめた。表９のデータから分かる通り、実施例１１のホスファゼンミセル封入プロポフォールを用いた場合は、市販のプロポフォール製品であるディプリバン（登録商標）（注射用リピッドエマルション）を用いた場合より麻酔時間が若干遅延しているが、このような事実は、リピッドエマルション形態の従来のプロポフォールが血中において注射直後にエマルションから遊離して痛覚受容体と反応するのに対し、ホスファゼンミセルに封入されているプロポフォールは注射後血中に直ちに放出されないが、ミセルの形態で組織に吸収されることにより麻酔が遅延することを示唆している。従って、本発明のホスファゼンミセルに封入されているプロポフォールは、リピッドエマルション状態のプロポフォールよりも痛覚受容体との反応時間が短いことから、痛みの低減に大きく寄与している。
［表９］
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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