(57)【要約】生体サンプル中のグルコース−６−リン酸脱水素酵素（「Ｇ６ＰＤＨ」）の量を決定する方法が本明細書において提供される。また、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症を検出する方法ならびに急性溶血性貧血および子癇前症などのＧ６ＰＤＨ関連障害を診断する方法も、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、出願人の教示は、被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出する方法を提供する。この方法は、例えば、被験体から得た生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を質量分析によって決定することと、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を、適当な対照と比較することとを含み、ここで、サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が適当な対照より少ない場合に、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症が検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を検出するためのハイスループット法であって、
６−ホスホグルコン酸を形成するのに適した条件下、界面活性剤およびバッファーの存在下で、生体サンプルをＧ６ＰおよびＮＡＤＰと反応させるステップと、
前記生体サンプルをクエンチして、クエンチされたサンプルを形成するステップと、
前記クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の存在または量を、質量分析によって検出するステップと
を含み、
ここで、前記クエンチされたサンプル中の前記６−ホスホグルコン酸の量が、前記生体サンプル中の前記Ｇ６ＰＤＨの量と関連している、方法。
【請求項２】
前記クエンチするステップが、酵素変性剤を使用して達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記質量分析が、タンデム質量分析である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析が、熱アシストエレクトロスプレーイオン化プローブを備えた質量分析計を使用して達成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記質量分析が、逆相液体クロマトグラフィーカラムを備えた質量分析計を使用して達成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出するステップが、約５分未満で行われる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出するステップが、約３分未満で行われる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
約０．０１ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨの検出を可能にする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出するステップが、温度の変動によって実質的に影響を受けない、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出する方法であって、
被験体から得た生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を質量分析によって決定するステップと、
前記生体サンプル中の前記Ｇ６ＰＤＨの量を、適当な対照と比較するステップと
を含み、
ここで、前記サンプル中の前記Ｇ６ＰＤＨの量が前記適当な対照より少ない場合に、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症が検出される、方法。
【請求項１１】
前記被験体が、新生児または乳児である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が、妊婦である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対照より１０％少ない前記サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、前記被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症を示す、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対照より２５％少ない前記サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、前記被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症を示す、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対照より５０％少ない前記サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、前記被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症を示す、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
被験体において急性溶血性貧血を診断する方法であって、
請求項１０に記載の方法に従って、被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出するステップ
を含み、
ここで、前記被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症が、前記被験体における急性溶血性貧血を示す、方法。
【請求項１７】
前記対照より２５％少ない前記サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、前記被験体における急性溶血性貧血を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験体において子癇前症を診断する方法であって、
請求項１０に記載の方法に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出するステップ
を含み、
ここで、前記被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症が、前記被験体における子癇前症を示す、方法。
【請求項１９】
前記対照より２５％少ない前記サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、前記被験体における子癇前症を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験体における子癇前症または急性溶血性貧血に起因する死亡率および／または罹病率の増大に対する予後診断法であって、
請求項１０に記載の方法に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出するステップ
を含み、
ここで、前記対照の５０％以下である前記生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、前記被験体における死亡率および／または罹病率の増大の予後を示す、方法。
【請求項２１】
前記適当な対照が、正常集団中のＧ６ＰＤＨレベルに基づいた対照である、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
６−ホスホグルコン酸を形成するのに適した条件下、界面活性剤およびバッファーの存在下で、前記生体サンプルを、Ｇ６ＰおよびＮＡＤＰと反応させるステップと、
前記生体サンプルをクエンチして、クエンチされたサンプルを形成するステップと、
前記クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の存在または量を、質量分析によって検出するステップと
をさらに含み、
ここで、前記クエンチされたサンプル中の前記６−ホスホグルコン酸の量が、前記生体サンプル中の前記Ｇ６ＰＤＨの量と関連している、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体サンプルが、乾燥血液サンプルである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を検出するためのキットであって、
グルコース−６−ホスフェートと、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートと、
任意選択により、バッファーと、
任意選択により、界面活性剤と、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、グルコース−６−ホスフェートおよびＧ６ＰＤＨの反応を促進する反応混合物を調製するための使用説明書と
を含む、キット。
【請求項２５】
酵素変性剤をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
質量分析計で分析するためのサンプルを調製するための使用説明書をさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
［６−ホスホグルコン酸／グルコース−６−ホスフェート面積］対Ｇ６ＰＤＨのミリ単位のプロットを含む較正曲線をさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１０年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４１６，９５７号に関し、かつこの米国仮特許出願への優先権を主張する。この米国仮特許出願の全体の内容は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
グルコース−６−リン酸脱水素酵素（「Ｇ６ＰＤ」または「Ｇ６ＰＤＨ」）は、ペントースリン酸経路（ホスホグルコン酸経路とも呼ばれる）中の細胞質酵素である。この代謝経路は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）などの細胞において、ペントースおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（「ＮＡＤＰＨ」）を生成し、したがって、還元エネルギーを供給する。ＮＡＤＰＨはまた、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）を酸化的損傷から保護するのに役立つ細胞中のグルタチオンのレベルを維持する。グルコース−６−リン酸脱水素酵素は、その基質、グルコース−６−ホスフェート（「Ｇ６Ｐ」）によって、６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンを形成するよう刺激される。グルコース−６−リン酸脱水素酵素は、ペントースリン酸経路の律速酵素である。
【０００３】
ヒトにおけるＧ６ＰＤＨの遺伝的欠損は、非免疫性溶血性貧血などの特定の障害の素因となる。Ｇ６ＰＤＨおよび／またはＧ６ＰＤＨ活性の存在を決定するための本方法は、定性的または定量的蛍光スクリーニングを含む。しかし、このような方法は、主観的であることが多く、概して、多くの場合、Ｇ６ＰＤＨの部分欠乏症は検出できない。例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｅｃｌｏｓ  ＧＪら「Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎ、７巻：４６〜５１頁（２０００年）
【非特許文献２】Ｋａｐｌａｎ  Ｍら「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｐｅｒｉｏｄ」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４３巻（７号）：１２３６〜３７頁（１９９７年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
したがって、いくつかの実施形態では、本出願人の教示は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を検出するハイスループット法を提供する。この方法は、例えば、６−ホスホグルコン酸を形成するのに適した条件下、界面活性剤およびバッファーの存在下で、生体サンプルをＧ６ＰおよびＮＡＤＰと反応させることと、生体サンプルをクエンチして、クエンチされたサンプルを形成することと、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の存在または量を、質量分析によって検出することとを含み、ここで、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の量は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量と関連する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、クエンチングは、酵素変性剤を使用して達成される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、質量分析は、タンデム質量分析である。いくつかの実施形態では、質量分析は、熱アシストエレクトロスプレーイオン化プローブ、例えば、ＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）（ＴＩＳ）プローブを備えた質量分析計を使用して達成される。いくつかの実施形態では、質量分析は、逆相液体クロマトグラフィーカラムを備えた質量分析計を使用して達成される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、検出は、約５分未満で行われる。いくつかの実施形態では、検出は、約３分未満で行われる。いくつかの実施形態では、この方法は、約０．０１ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、検出は、温度の変動によって実質的に影響を受けない。
【０００９】
いくつかの実施形態では、出願人の教示は、被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出する方法を提供する。この方法は、例えば、被験体から得た生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を質量分析によって決定することと、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を、適当な対照と比較することとを含み、ここで、サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が適当な対照より少ない場合に、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症が検出される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、被験体は、新生児または乳児である。いくつかの実施形態では、被験体は、妊婦である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、対照より１０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症を示す。いくつかの実施形態では、対照より２５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症を示す。いくつかの実施形態では、対照より５０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症の検出は、６−ホスホグルコン酸を形成するのに適した条件下、界面活性剤およびバッファーの存在下で、生体サンプルを、Ｇ６ＰおよびＮＡＤＰと反応させることと、生体サンプルをクエンチして、クエンチされたサンプルを形成することと、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の存在または量を、質量分析によって検出することとをさらに含み、ここで、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の量は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量と関連する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、出願人の教示は、被験体において急性溶血性貧血を診断する方法を提供する。この方法は、例えば、出願人の教示に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出することを含み、ここで、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照より２５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、出願人の教示は、被験体において子癇前症を診断する方法を提供する。この方法は、例えば、出願人の教示に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出することを含み、ここで、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照より２５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。
【００１５】
いくつかの実施形態では、出願人の教示は、被験体における子癇前症または急性溶血性貧血に起因する死亡率および／または罹病率の増大に関する予後診断法を提供する。この方法は、例えば、出願人の教示に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出することを含み、ここで、対照の５０％以下である生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における死亡率および／または罹病率の増大の予後を示す。
【００１６】
いくつかの実施形態では、適当な対照とは、正常集団中のＧ６ＰＤＨレベルに基づいた対照である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、乾燥血液サンプルである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、出願人の教示は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を検出するためのキットを提供する。キットは、例えば、グルコース−６−ホスフェートと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートと、任意選択により、バッファーと、任意選択により、界面活性剤と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、グルコース−６−ホスフェートおよびＧ６ＰＤＨの反応を促進する反応混合物を調製するための使用説明書とを含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、酵素変性剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、質量分析計で分析するためのサンプルを調製するための使用説明書をさらに含む。さらなる実施形態では、キットはまた、［６−ホスホグルコン酸／グルコース−６−ホスフェート面積］対Ｇ６ＰＤＨのミリ単位のプロットを含む較正曲線を含む。
【００１８】
出願人の教示のこれらおよびその他の特徴は、本明細書に示される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、出願人の教示の例示的方法から得られたＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（多重反応モニタリング））での質量分析読み取りを表す。
【図２】図２は、出願人の教示の例示的方法から得られたＭＲＭでの比較質量分析読み取りを表す。
【図３】図３は、出願人の教示の種々の方法を使用して得られた例示的標準曲線を表す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、出願人の教示の例示的方法から得られたＭＲＭでの質量分析読み取りを表す。
【図５】図５は、出願人の教示の種々の方法を使用して得られた例示的標準曲線を表す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、出願人の教示の例示的方法から得られたＭＲＭでの質量分析読み取りを表す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、出願人の教示の例示的方法を市販のアッセイと比較する、相関プロットならびにブランドおよびアルトマン（Ｂｌａｎｄ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ）プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
説明
出願人の教示は、少なくとも幾分かは、質量分析法、例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を迅速かつ正確に決定することができるという知見に基づくものである。任意の特定の理論に拘束されようとは思わないが、Ｇ６ＰＤＨの量（例えば、単に、その存在または非存在ではなく）を決定する能力は、例えば、被験体における部分Ｇ６ＰＤＨ欠乏症の検出において有用であると考えられる。
【００２１】
Ｇ６ＰＤＨは、グルコース−６−ホスフェートを６−ホスホグルコノラクトンに変換し、同時に、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨへ還元する。次いで、６−ホスホグルコノラクトンは、グルコノラクトナーゼによって６−ホスホグルコン酸に変換される。ボイトラー（Ｂｅｕｔｌｅｒ）法を含めたＧ６ＰＤＨ活性を決定するためのこれまでの方法は、酵素反応の指標としてＮＡＤＰＨの形成を利用する。しかし、ＮＡＤＰのＣ１３同位体異性体が、ＮＡＤＰＨの第１のＣ１２同位体異性体と重複するので、ＮＡＤＰＨの量は、質量分析法によるようなアッセイでは決定することが困難であり得る。したがって、６−ホスホグルコン酸の量が本明細書において提供される方法においてモニタリングされる。
【００２２】
したがって、いくつかの実施形態では、出願人の教示は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を検出するハイスループット法を提供する。このような方法は、６−ホスホグルコン酸を形成するのに適した条件下、（例えば、界面活性剤およびバッファーの存在下で）生体サンプルをＧ６ＰおよびＮＡＤＰと反応させることと、生体サンプルをクエンチして、クエンチされたサンプルを形成することと、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の存在または量を質量分析によって検出することとを含む。このような方法では、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の量は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量と関連する。
【００２３】
本明細書において、用語「ハイスループット」とは、比較的短期間に多数のサンプルをアッセイするプロセスを指す。ハイスループットアッセイは、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートを使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ハイスループット法の目的は、週あたり約２５０サンプル、週あたり約３００サンプル、週あたり約３５０サンプル、週あたり約４００サンプル、週あたり約４５０サンプル、週あたり約５００サンプル、週あたり約５５０サンプル、週あたり約６００サンプル、週あたり約６５０サンプル、週あたり約７００サンプル、週あたり約７５０サンプル、週あたり約８００サンプル、週あたり約８５０サンプル、週あたり約９００サンプル、週あたり約９５０サンプル、週あたり約１０００サンプル、週あたり約１１００サンプル、週あたり約１２００サンプル、週あたり約１３００サンプル、週あたり約１４００サンプル、週あたり約１５００サンプルを超える速度でサンプルをスクリーニングすることである。いくつかの実施形態では、ハイスループット法の目的は、週あたり約１０００サンプルを超える速度でサンプルをスクリーニングすることである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって、低レベルのＧ６ＰＤＨの検出が可能となる。例えば、本明細書に記載された方法によって、約１．００ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．９０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．８０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．７０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．６０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．５０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．４５ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．４０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．３５ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．３０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．２５ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．２０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．１５ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．１０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．０５ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．０４ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．０３ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨ、約０．０２ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨまたは約０．０１ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨでさえの検出が可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって、約０．１０ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨの検出が可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって、約０．０５ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨの検出が可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって、約０．０１ミリ単位以下のＧ６ＰＤＨの検出が可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって、少なくとも約０．０１ミリ単位のＧ６ＰＤＨというＧ６ＰＤＨのレベルの検出が可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって、少なくとも０．０１ミリ単位のＧ６ＰＤＨというＧ６ＰＤＨのレベルの検出が可能となる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出が、温度、ｐＨおよび／または塩濃度の変動によって実質的に影響を受けない方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出が、温度の変動によって実質的に影響を受けない方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出が、検出の間の温度の変動によって実質的に影響を受けない方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出が、サンプルの保存の間の温度の変動によって実質的に影響を受けない方法が、本明細書において提供される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、サンプル中で検出される６−ホスホグルコン酸の量のより正確な測定をもたらすために、内部標準が使用される。いくつかの実施形態では、内部標準は、サンプル中のその他の物質と反応せず、したがって、一定値を提供する、サンプルに添加される化合物／物質である。いくつかの実施形態では、内部標準は、サンプル中に天然に存在するその他の化合物／物質のうちの１つのレベルである。いくつかの実施形態では、グルコース−６−ホスフェートを内部標準として使用できる。
【００２７】
本明細書において、用語「生体サンプル」とは、制限するものではないが、宿主身体のサンプルを指す。出願人の教示において有用な生体サンプルは、新鮮な（例えば、分析前の数時間内に採取された）ものである場合も、冷蔵または凍結された（例えば、採取され、分析まで冷蔵庫または冷凍庫に入れられた）ものである場合も、乾燥された（例えば、採取され、ワットマン紙上に置かれたか、もしくは、ワットマン紙上に直接スポットされた）ものである場合もある。例示的生体サンプルとして、例えば、血液、間質液、脊髄液、唾液、尿、涙、汗などが挙げられる。さらなる生体サンプルとして、それだけには限らないが、細胞もしくは組織またはその培養物（もしくは継代培養物）、粗製の細胞溶解物または処理された細胞溶解物（全細胞溶解物を含む）、体液、組織抽出物または細胞抽出物、糞便、脳脊髄液、羊水、リンパ液または腺分泌物由来の流体が挙げられる。サンプルは、本明細書に記載された基質との接触に先立って、当技術分野で公知の任意の方法によって処理してもよい。例えば、サンプルを、沈殿ステップ、カラムクロマトグラフィーステップ、加熱ステップなどに付してもよい。サンプルが、Ｇ６ＰＤＨの活性を妨害し得るその他の酵素を含有する場合には、サンプルに不活化剤（例えば、活性部位に向けられた不可逆性阻害剤）を添加して、望ましくない活性を不活化してもよい。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、血液サンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、乾燥血液サンプルである。
【００２８】
「検出する」および「検出」とは、Ｇ６ＰＤＨ酵素またはその酵素活性の検出、測定および／または特性決定を包含するものとする。例えば、酵素活性は、酵素活性のモジュレーターを検出または特性決定するためのスクリーニングの過程において検出され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約１０分未満で行われる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約７．５分未満で行われる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約５分未満で行われる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約４分未満で行われる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約３分未満で行われる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約２．５分未満で行われる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨの量の検出は、約２分未満で行われる。
【００３０】
本明細書において、用語「クエンチする」とは、試薬を不活化することまたは化学反応を停止することを指す。クエンチングとは、不活化または停止が達成される機序にかかわらず、不活化することまたは停止することを指すことは理解される。具体的な限定されない例として、クエンチングは、ｐＨの変化による場合も、Ｇ６ＰＤＨまたはＧ６Ｐと反応することができ、その結果、もはやＧ６ＰＤＨまたはＧ６Ｐが反応にとって利用可能ではなくなるクエンチング剤の添加による場合もある。したがって、クエンチされたサンプルとは、Ｇ６ＰＤＨまたはＧ６Ｐが、もはや反応を起こしていないサンプルを指す。本明細書において、用語「クエンチング試薬」とは、Ｇ６ＰＤＨまたはＧ６Ｐと相互作用でき、その結果、Ｇ６ＰＤＨまたはＧ６Ｐがクエンチされ、したがって、さらに反応することができない任意の試薬である。いくつかの実施形態では、クエンチング剤は、酵素変性剤である。例えば、いくつかの実施形態では、クエンチング剤は、Ｇ６ＰＤＨを変性させる。酵素変性剤は、通常、酵素の構造（例えば、二次、三次または四次構造）の非共有結合性変化を引き起こす。クエンチング試薬の例として、それだけには限らないが、アセトニトリル、メタノールおよびそれらの混合物が挙げられる。
【００３１】
用語「バッファー」とは、通常、弱酸およびその共役塩基または弱塩基およびその共役酸からなる溶液を指し、ここで、溶液のｐＨは、少量の酸または塩基の添加の際にほとんど変化しない。適したバッファーとして、Ｓｉｇｍａカタログの「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂｕｆｆｅｒｓ」の節ならびにｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ．でオンラインで記載されるものが挙げられる。例示的バッファーとして、それだけには限らないが、リン酸カリウムバッファー、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ）、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳなどが挙げられる。バッファーは、所望のｐＨを生成させ、維持するのに十分な量で存在する。例えば、ｐＨは、２〜１２、４〜１１または６〜１０であり得る。
【００３２】
用語「界面活性剤」とは、通常、水による溶媒和をエネルギー的に好む極性頭部と、通常、水によって十分に溶媒和されない疎水性尾部とを有する分子を指す。界面活性剤は、イオン性（すなわち、陰イオン性、陽イオン性）である場合も、非イオン性である場合もある。例示的界面活性剤として、それだけには限らないが、ポリソルベート／ツイーン（例えば、ツイーン２０およびツイーン８０）、プルロニック（例えば、Ｆ６８およびＦ８８）、トリトン（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｘ−１０２、Ｘ−４５、Ｘ−１５）、ポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）、ソルビタンエステルまたはスパン（Ｓｐａｎ）（例えば、スパン２０およびスパン８０）、脂質（例えば、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン）、アルコールエトキシレート（例えば、ＢＲＩＪ（登録商標）５６、Ｃ１６Ｈ３３（ＯＣＨ２ＣＨ２）１０ＯＨ、ＢＲＩＪ（登録商標）５８、Ｃ１６Ｈ３３（ＯＣＨ２ＣＨ２）２０ＯＨ）、脂肪酸および脂肪酸エステル、ステロイド（例えば、コレステロール）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、アミンエトキシレート、グルコシド、グルカミド（ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、ポリアルキレンオキシド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル（ｌａｕｒｅｌ）硫酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン  ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノレアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタイン、イソステアラミドプロピル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ジメチルアミン、パルミドプロピル−ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル−タウレート、二ナトリウムメチルオレイル−タウレート、ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマーが挙げられる。その他の界面活性剤は、例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、Ｍａｎｕｆ．  Ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ、Ｎ．Ｊ．、２０００年およびＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第２版、１９巻、５１２〜５６４頁に見出すことができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨをＧ６Ｐと少なくとも約１５秒、約３０秒、約４５秒、１分、２分、３分、４分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分または約６０分の反応時間接触させる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨをＧ６Ｐと少なくとも約１５分の反応時間接触させる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨをＧ６Ｐと少なくとも約３０分の反応時間接触させる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨをＧ６Ｐと少なくとも１５分の反応時間接触させる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨをＧ６Ｐと少なくとも３０分の反応時間接触させる。
【００３４】
出願人の教示の方法は、分子イオンを選択し、フラグメント化する能力を有するタンデム質量分析計およびその他の質量分析計を使用して実施できる。タンデム質量分析計（および、ある程度は、シングルステージ質量分析計）は、その質量対電荷（ｍ／ｚ）比に従って、分子イオンを選択し、フラグメント化する能力を有し、次いで、得られたフラグメント（娘）イオンスペクトルを記録する。より詳しくは、娘フラグメントイオンスペクトルは、選択されたイオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））に供することによって作製できる。例えば、第１の質量分析から特定のｍ／ｚ比の化合物に相当するイオンを選択し、フラグメント化し、第２の質量分析において再分析できる。このようなタンデム質量分析を実施できる代表的な機器として、それだけには限らないが、磁場４セクター型（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｏｕｒ  ｓｅｃｔｏｒ）、タンデム飛行時間型、三連四重極型、イオントラップ型およびハイブリッド四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計が挙げられる。
【００３５】
これらの種類の質量分析計を、それだけには限らないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を含めた種々のイオン化供給源と併せて使用できる。イオン化供給源を使用して、第１の質量分析のための荷電種を作製できるが、ここで、分析物は、固定電荷をすでに有するわけではない。さらなる質量分析機器およびフラグメント化法として、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ機器におけるポストソース分解およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ  ＭＳを使用する高エネルギーＣＩＤが挙げられる。タンデム質量分析計の総説は、例えば、Ｒ．  ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＤ．  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．１０１巻：２６９  ２９５頁（２００１年）に見出すことができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、質量分析は、タンデム質量分析である。いくつかの実施形態では、質量分析は、熱アシストエレクトロスプレーイオン化プローブ（例えば、ＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）（ＴＩＳ）、Ｔｕｒｂｏ−Ｖまたは同様のもの）を備えた質量分析計を使用して達成される。いくつかの実施形態では、質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を利用する。質量スペクトルを作製するための例示的方法は、例えば、米国特許第６，９３０，３０５号および同第７，１４５，１３３号に見出すことができ、これらは両方ともこの参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、質量分析は、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００（商標）タンデム質量分析計を利用する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、サンプルの処理は、例えば、質量分析の前の分離を含み得る。例えば、サンプルの構成成分を分離し、質量分析をサンプル混合物の画分のみで実施できる。このようにして、分離された分析物を個々に分析できるので、分析の複雑性を低減できる。分離は、クロマトグラフィーによって実施できる。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）または液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用して、このようなサンプル分離および質量分析を達成できる。さらに、対象とする分析物を分離するのに適した任意のクロマトグラフィー分離法を使用してよい。例えば、クロマトグラフィー分離は、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーであり得る。分離はまた、電気泳動的に実施できる。電気泳動分離技術の限定されない例として、それだけには限らないが、１Ｄ電気泳動、２Ｄ電気泳動および／またはキャピラリー電気泳動が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される質量分析は、逆相液体クロマトグラフィーカラムを備えた質量分析計を使用して達成される。
【００３８】
また、被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出する方法も、本明細書において提供される。このような方法は、被験体由来の生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を質量分析によって決定することと、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量を、適当な対照と比較することとを含み、ここで、サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が適当な対照より少ない場合に、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症が検出される。Ｇ６ＰＤＨ欠乏症は、一般に、Ｘ連鎖性の、通常、Ｇ６ＰＤＨ遺伝子中の変異による遺伝性の遺伝子欠陥である。この欠乏症は、よく見られ、世界中で４億人を超える人（通常、アフリカ、中東および南アジア系の人）に存在する。
【００３９】
Ｇ６ＰＤＨ遺伝子は、Ｘ染色体の長腕上に見出され（バンドＸｑ２８）、およそ１８．５キロ塩基に広がる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症は、Ｇ６ＰＤＨ遺伝子変異による。Ｇ６ＰＤＨ遺伝子変異は、例えば、Ｂｅｕｔｌｅｒ  Ｅ．、「Ｇ６ＰＤ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ」Ｂｌｏｏｄ、８４巻（１１号）：３６１３〜３６３６頁、（１９９４年）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症は、表１に列挙される遺伝子変異のうちの１種による。
【００４０】
【表１】
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いくつかの実施形態では、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、対照より約５％少ない、対照より約１０％少ない、対照より約１５％少ない、対照より約２０％少ない、対照より約２５％少ない、対照より約３０％少ない、対照より約３５％少ない、対照より約４０％少ない、対照より約４５％少ない、対照より約５０％少ない、対照より約５５％少ない、対照より約６０％少ない、対照より約６５％少ない、対照より約７０％少ない、対照より約７５％少ない、対照より約８０％少ない、対照より約８５％少ない、対照より約９０％少ない、対照より約９５％少ない、または対照より約１００％少ない、被験体由来の生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量によって示される。例えば、いくつかの実施形態では、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、対照より少なくとも約１０％少ない、被験体由来の生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量によって示される。いくつかの実施形態では、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、対照よりも少なくとも約２５％少ない、被験体由来の生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量によって示される。いくつかの実施形態では、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、対照よりも少なくとも約５０％少ない、被験体由来の生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量によって示される。例えば、いくつかの実施形態では、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２５％または少なくとも５０％少ない、被験体由来の生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量によって示される。
【００４１】
本明細書において、用語「被験体」とは、それだけには限らないが、ヒト、霊長類、牛（ｃｏｗ）、羊（ｓｈｅｅｐ）、山羊、馬（ｈｏｒｓｅ）、豚、犬（ｄｏｇ）、猫（ｃａｔ）、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたはその他のウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、げっ歯類もしくはネズミ科の種を含めた哺乳動物などの動物を指す。いくつかの実施形態では、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、被験体は、新生児または小児である。いくつかの実施形態では、被験体は、妊婦である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、出願人の教示は、Ｇ６ＰＤＨを調節する能力について化合物をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ活性のモジュレーター（例えば、エンハンサーまたは阻害剤）の効果を、本明細書において記載された方法を使用して調べることができる。さらに、Ｇ６ＰＤＨの基質特異性も、本明細書に記載された方法を使用して調べることができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害を診断する方法が、本明細書に記載される。本明細書において、用語「Ｇ６ＰＤＨ関連障害」とは、Ｇ６ＰＤＨの欠乏に少なくとも部分的に起因する疾患および／または障害を指す。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約１００％のＧ６ＰＤＨの欠乏に起因する疾患および／または障害を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害は、少なくとも２５％のＧ６ＰＤＨの欠乏に起因する疾患および／または障害を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害は、少なくとも５０％のＧ６ＰＤＨの欠乏に起因する疾患および／または障害を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害は、少なくとも７５％のＧ６ＰＤＨの欠乏に起因する疾患および／または障害を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害は、慢性溶血、急性溶血性貧血、ソラマメ症、新生児高ビリルビン血症および子癇前症から選択される。その他のＧ６ＰＤＨ関連障害として、例えば、血小板異常、有茎皮弁喪失（ｓｋｉｎ  ｐｅｄｉｃｌｅ  ｆｌａｐ  ｌｏｓｓ）、運動能力の機能障害、発作性疾患、白内障の頻度上昇、統合失調症または鬱病、レニン放出不全、糖尿病、異常なインスリン放出、心血管疾患、胆石症、ミオグロビン尿症（ｍｙｏｇｌｏｂｕｉｎｕｒｉａ）、感染に対する感受性の増大、異常な白血球機能、肝炎における黄疸の増大、精神遅滞または血清デヒドロエピアンドロステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｒｏｎｅ）サルフェートの増大を挙げることができる。例えば、Ｂｅｕｔｌｅｒ，  Ｅ．、「Ｇ６ＰＤ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ」Ｂｌｏｏｄ、８４巻（１１号）：３６１３〜３６３６頁、（１９９４年）を参照のこと。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｇ６ＰＤＨ関連障害は、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症を誘発できる物質によって引き起こされるか、または誘発される障害である。このような物質として、それだけには限らないが、ソラマメ、抗マラリア薬（例えば、プリマキン、パマキンおよびクロロキン）、スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファメトキサゾールおよびマフェニド）、ニトロフラントイン、アセチルサリチル酸、アセトフェネチジン、チアゾールスルホン、メチレンブルー、ナフタレン、鎮痛薬（例えば、アスピリン、フェナゾピリジンおよびアセトアニリド）ならびに数種の非サルファ抗生物質（例えば、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、イソニアジドおよびフラゾリドン）が挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、被験体において急性溶血性貧血を診断する方法が、本明細書において提供される。このような方法は、上記の方法に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出することを含み、ここで、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、被験体における急性溶血性貧血を示す。
【００４７】
いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約９０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約８０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約７０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約６０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約５０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約４０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約３０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約２０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約１０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。
【００４８】
いくつかの実施形態では、対照よりも７５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも５０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも２５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における急性溶血性貧血を示す。
【００４９】
いくつかの実施形態では、被験体において子癇前症を診断する方法が本明細書において提供される。このような方法は、上記の方法に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出することを含み、ここで、被験体におけるＧ６ＰＤＨ欠乏症は、被験体における子癇前症を示す。
【００５０】
いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約９０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約８０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約７０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約６０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約５０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約４０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約３０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約２０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも少なくとも約１０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。
【００５１】
いくつかの実施形態では、対照よりも７５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも５０％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。いくつかの実施形態では、対照よりも２５％少ないサンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における子癇前症を示す。
【００５２】
いくつかの実施形態では、被験体における子癇前症または急性溶血性貧血に起因する死亡率および／または罹病率の増大を予測するための予後診断法が、本明細書において提供される。このような方法は、上記の方法に従って被験体においてＧ６ＰＤＨ欠乏症を検出することを含み、ここで、対照の５０％以下である生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における死亡率および／または罹病率の増大の予後を示す。いくつかの実施形態では、対照の７５％以下である生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量が、被験体における死亡率および／または罹病率の増大の予後を示す。
【００５３】
本明細書において、用語「適当な対照」とは、正常集団中のＧ６ＰＤＨレベルに基づいた対照である。すなわち、いくつかの実施形態では、適当な対照は、所定の値である。いくつかの実施形態では、適当な対照は、正常なＧ６ＰＤＨ活性を有すると分かっている単一の個体において検出されたレベルである。いくつかの実施形態では、適当な対照は、正常なＧ６ＰＤＨ活性を有する個体の集団から得た平均レベルである。いくつかの実施形態では、適当な対照は、Ｇ６ＰＤＨ欠乏症を誘発できる物質の投与の前に、患者において検出されたレベルである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される診断法または予後診断法は、以下のステップのうち任意の１種を含む：６−ホスホグルコン酸を形成するのに適した条件下、界面活性剤およびバッファーの存在下で、生体サンプルをＧ６ＰおよびＮＡＤＰと反応させるステップ；生体サンプルをクエンチして、クエンチされたサンプルを形成するステップ；およびクエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の存在または量を、質量分析によって検出するステップ。このような方法では、クエンチされたサンプル中の６−ホスホグルコン酸の量は、生体サンプル中のＧ６ＰＤＨの量と関連する。
【００５５】
また、本明細書に記載された方法を実施するためのキットも提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、グルコース−６−ホスフェートおよびＧ６ＰＤＨの反応を促進する反応混合物を調製するための、グルコース−６−ホスフェートと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートと、界面活性剤と、バッファーとを含む。バッファーおよび／または界面活性剤は、容器中に、乾燥形態で提供されても、液体形態で提供されてもよい。例示的な適したバッファーおよび界面活性剤が、本明細書において上記で提供されている。バッファーは、通常、キット中に、少なくとも、混合物において特定のｐＨを生成させるのに十分な量で存在する。いくつかの実施形態では、バッファーは、予め選択されたｐＨおよびバッファー濃度を有する保存溶液として提供される。いくつかの実施形態では、酸および／または塩基も、反応混合物を所望のｐＨに調節するためにキット中に提供される。キットは、クエンチング溶液、例えば、アセトニトリル：メタノール混合物などの酵素変性剤をさらに含み得る。キットは、１種または複数の１種または複数の希釈剤、例えば、質量分析システムにおいて使用するのに適した溶媒をさらに含み得る。キットは、塩（例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌまたはＮａＯＡｃ）、金属塩（例えば、ＣａＣｌ２などのＣａ２＋塩、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＺｎ（ＯＡｃ）など）の酵素活性にとって有益であるその他の構成成分および／またはＧ６ＰＤＨ酵素にとって有用であり得るその他の構成成分をさらに含み得る。これらのその他の構成成分は、乾燥または液体形態で、互いに別個に、または一緒に混合されて提供され得る。
【００５６】
グルコース−６−ホスフェートおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートは、バッファーと一緒に、またはバッファーとは別個に乾燥または液体形態で提供され得る。グルコース−６−ホスフェートおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートは、反応混合物における溶解を促進するために、水溶液、部分水性溶液または反応混合物のその他の構成成分と混和性である非水性保存溶液中で提供されてもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、キットは、使用のための説明書をさらに含む。例えば、キットは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、グルコース−６−ホスフェートおよびＧ６ＰＤＨの反応を促進する反応混合物を調製するための使用説明書を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、質量分析計で分析するためのサンプルを準備するための使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、図３に示される曲線などの予め準備した較正曲線をさらに含み、これによって、使用者が、質量分析計を使用して決定された６−ホスホグルコン酸の量に基づいてサンプル中のＧ６ＰＤＨの量を決定することが可能となる。例えば、予め準備した較正曲線は、［６−ホスホグルコン酸／グルコース−６−ホスフェート面積］対Ｇ６ＰＤＨのミリ単位のプロットであり得る。いくつかの実施形態では、キットは、所定の量のＧ６ＰＤＨとともに標準サンプルを含み、その結果、使用者がそれ自身の較正曲線を作成することができる。いくつかの実施形態では、キットは、較正曲線を準備する方法に関する使用説明書をさらに含む。使用説明書は、
ａ．バッファーおよび／または界面活性剤の存在下で、グルコース−６−ホスフェートおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを、設定された期間（例えば、１５分、２０分、２５分、３０分など）混合すること；
ｂ．クエンチング溶液を使用してサンプルをクエンチすること；
ｃ．クエンチされたサンプルを、質量分析計を使用して分析すること；
ｄ．較正曲線を準備すること；
ｅ．クエンチされたサンプルの分析（例えば、質量スペクトル）を較正曲線と比較すること
の任意の組合せを含み得る。
【００５８】
種々の組成物および方法の操作は、以下の限定されない例を踏まえるとさらに理解され得るが、これらは、出願人の教示の範囲の制限とは決して解釈されてはならない。
【実施例】
【００５９】
例示
（実施例１）
ＤＢＳサンプル
新生児スクリーニングプログラムから得た乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を有する濾紙を、本実施例において利用した。濾紙から直径３ｍｍのディスクを取り出し、このディスク上の血液サンプルを、５０μＬの「試薬１」を使用して、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに加えた。「試薬１」は、３容量の再蒸留水、３容量の２５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２容量のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ用の１％サポニン、１容量の７．５ｍＭ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートおよび１容の１０ｍＭグルコース−６−ホスフェートを混合することによって配合した。エッペンドルフチューブを閉じ、穏やかに混合した後、チューブを３７℃のインキュベーションオーブン中に３０分間入れた。１００μＬの１：１アセトニトリル：メタノール（ＬＣ−ＭＳ等級）混合物を添加することによって反応をクエンチした。遠心分離した後、１０μＬの清澄な上清を、２０ｍＭブチル−ジメチル−重炭酸アンモニウム（ＢＤＭＡＢ）水溶液２４０μＬを用いて希釈した。
【００６０】
この溶液の２μＬを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入し、これは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＬＣシステムおよびＴＩＳプローブを備えたＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００（商標）タンデム質量分析計を含んでいた。液体クロマトグラフィーは、サンプルを５０℃で維持したカラムに注入し、３００μＬ／分のＬＣ−溶出剤（２０ｍＭ  ＢＤＭＡＢ＋３％  ＭｅｔＯＨ）をイソクラティックモードで２．５分間流すことによって実施した。質量分析計は、−４５００ボルトのＴＩＳを用い、３５０℃のＮｏｍｉｎａｌ  Ｇｕｎ温度を用い、ＭＲＭ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｍｏｄｅで操作した。利用された遷移は、以下のとおりである：
ＤＰ：−６０ＶおよびＣＥ：−７０ｅＶを用いてグルコース−６−ホスフェートの２５９．２＞７９．０
ＤＰ：−６０ＶおよびＣＥ：−７０ｅＶを用いて６−ホスホ−グルコン酸の２７５．２＞７９．０
ＤＰ：−８０ＶおよびＣＥ：−１３０ｅＶを用いてＮＡＤＰの７４２．１＞７９．０。
【００６１】
「Ｑｕａｎｔ」または「ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ」モードにおいて、遷移２７５．２＞７９．０および２５９．２＞７９．０に対応するトレースをそれぞれ、分析物（６−ホスホグルコン酸）、および内部標準（Ｇ６Ｐ）として処理した。得られた比を、実施例２に記載したように、市販のＧ６ＰＤＨを使用して得られた較正曲線と比較した。
【００６２】
酵素欠乏症は、ＮＡＤＰの高いシグナルを伴うので、ＮＡＤＰをモニタリングした遷移７４２．１＞７９．０を偽陽性結果の内部チェックとして使用した。したがって、６−ホスホグルコン酸およびＮＡＤＰ両方のトレースが低いか、存在しない場合には、結果は偽であると考えられる。
【００６３】
図１は、乾燥血液サンプルから得られたＭＲＭでの例示的質量分析読み取りを示し、Ｇ６Ｐ、６−ホスホグルコン酸およびＮＡＤＰのレベルを示す。図１は、Ｇ６ＰＤＨの正常レベルの代表的なものである。図２は、正常サンプルと、Ｇ６ＰＤＨ活性を有さないサンプルを比較する。
【００６４】
（実施例２）
酵素較正
市販の酵素標準（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｇ５８８５番）を、５０％の再蒸留水、３０％の２５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４および２０％のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ用１％サポニンの溶液を用いて溶解して、１００ミリ単位／ｍＬを得た。０、１、２、４、１０、２０および４０μＬのこの溶液（０、０．１、０．２、０．４、１．０、２．０および４．０ミリ単位の酵素に相当する）を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中の５０μＬの「試薬１」（実施例１に記載された）に添加した。エッペンドルフチューブを閉じ、穏やかに混合した後、チューブを３７℃のインキュベーションオーブン中に３０分間入れた。１００μＬの１：１アセトニトリル：メタノール（ＬＣ−ＭＳ等級）混合物を添加することによって反応をクエンチした。遠心分離した後、１０μＬの清澄な上清を、２０ｍＭブチル−ジメチル−重炭酸アンモニウム（ＢＤＭＡＢ）水溶液２４０μＬを用いて希釈した。実施例１におけるように、この溶液の２μＬを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。「Ｑｕａｎｔ」または「ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ」モードにおいて、遷移２７５．２＞７９．０および２５９．２＞７９．０に対応するトレースを、それぞれ、「分析物」および「内部標準」のものとして処理した。試料の定量的評価は、ミリ単位での絶対読み取りによって行われ、パンチされたディスク上の血液の量（３．１μＬ）に参照される。参照として、正常としておよそ３ミリ単位／ＤＢＳの酵素活性が保持された。結果は以下の表２に示されている。
【００６５】
【表２】
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サンプリングされた実際の血液容量に基づいて、これらの方法の検出性は、正常サンプルの平均酵素活性の約１／３００であると思われる。約３〜４ミリ単位／スポットまでの線形性が観察されたが（図３を参照のこと）、必要に応じて、インキュベーション時間を減少することによって拡張することができる。
【００６６】
（実施例３）
乾燥血液サンプルの分析
地方の倫理委員会のガイドラインに従って、これまでに集められ、使用される、病院における日常的な分析から得た匿名の過剰のサンプルを利用する相関研究を構築した。血液サンプルをガスリーカード上にスポットし、乾燥させ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定のために送った。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析は、実施例１について上記で記載したように実施した。参照として、サンプルは、日常的な病院検査室において実施されるように、Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎキット（Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、９８０  Ｌｉｎｄａ  Ｖｉｓｔａ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ  ９４０４３  ＵＳＡ製のカタログ番号Ｋ７５７−１００）を用いて先に測定した。
【００６７】
図４Ａおよび４Ｂは、Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎキット（ＢＶ）によって測定された、高および低Ｇ６ＰＤＨ活性に相当する、２種の乾燥血液サンプルから得たＭＲＭでの２種の例示的質量分析読み取りを示す。これらの図によって分かるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、高および低Ｇ６ＰＤＨ活性の両方を測定できる。両アッセイに利用可能な均一な較正はないので、極端な活性値に相当した上記のサンプルを使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの較正曲線を作成した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの標準として使用した較正が、図５に示されている。
【００６８】
サンプルの分析から得られた結果が、表３に提供されており、これはまた、ＢＶキットを使用して得られた値の一覧を提供する。Ｇ６ＰＤＨ活性は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＢＶキットの両方についてミリ単位／ｍＬ（ｍＵ／ｍＬ）で表されており、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳのヘモグロビンに対する正規化はない。
【００６９】
【表３】
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＊サンプルｎ８、ｎ１０およびｎ１７は、低活性サンプルと考えられる。
【００７０】
図６Ａおよび６Ｂは、未知として読み取られた２種の乾燥血液サンプルから得られたＭＲＭでの２種の例示的質量分析読み取りを表す。これらの読み取りは、低および高Ｇ６ＰＤＨ活性に相当し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳアッセイは、それぞれ、４０および１２０２ミリ単位／ｍＬの測定値を与え、ＢＶアッセイは、それぞれ、２０および１２３０ｍＵ／ｍＬの測定値を与える。さらに、図７Ａおよび７Ｂは、本研究において測定された値を使用して作製された相関プロットならびにブランドおよびアルトマンプロットである（臨床的測定の２つの方法間の一致を測定する）。上記のデータおよびプロットによって分かるように、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して得られた値とＢＶキットを使用して得られたものの間に、特に、低活性サンプルに関して良好な一致がある。
【００７１】
均等物
当業者ならば、単に通常の実験を使用して、本明細書に記載された教示の特定の実施形態の均等物を認識し、確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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