(57)【要約】  本発明は、特に、自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、アレルギー性喘息及び炎症性腸疾患の予防又は治療のための薬剤として使用される、改善された結合タンパク質に関する。本発明は、より具体的には、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；並びに（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域を含む、第一の単鎖ポリペプチド；並びに（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；並びに（ｄ）ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域を含む、第二の単鎖ポリペプチドから本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質に関する。本発明はさらに、図１に示すような可溶性ＳＩＲＰα結合抗体様タンパク質に関する。
2014519338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）該ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）該ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質。
【請求項２】
１つ、２つ、又は３つの結合パートナーに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３】
前記第一及び第二の単鎖ポリペプチド内に含まれる前記哺乳動物結合分子の領域が同じである、請求項１又は請求項２に記載の可溶性タンパク質。
【請求項４】
前記哺乳動物結合分子の各々の一価領域並びにＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、同じ単一の抗原に対する結合特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項５】
前記哺乳動物結合分子の領域が、前記抗原上の第一のエピトープに結合することができ、かつＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、同じ抗原上の第二のエピトープに結合することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項６】
前記哺乳動物結合分子の領域並びにＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、同じ抗原上の同じエピトープに結合することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項７】
２つの抗原に対する結合特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質であって、前記哺乳動物結合分子の各々の領域が、第一の抗原に対する結合特異性を有し、かつＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、第二の抗原に対する結合特異性を有する、可溶性タンパク質。
【請求項８】
前記第一及び第二の単鎖ポリペプチド内に含まれる前記哺乳動物結合分子が異なる、請求項１又は請求項２に記載の可溶性タンパク質。
【請求項９】
２つの抗原に対する結合特異性を有する請求項８に記載の可溶性タンパク質であって、前記第一の単一ポリペプチド鎖内に含まれる前記哺乳動物結合分子の領域が、第一の抗原に対する結合特異性を有し、かつ前記第二の単一ポリペプチド鎖内に含まれる前記哺乳動物結合分子の領域が、第二の抗原に対する結合特異性を有し、かつＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該第一の抗原又は該第二の抗原のいずれかに対する結合特異性を有する、可溶性タンパク質。
【請求項１０】
３つの抗原に対する結合特異性を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質であって、前記第一の単一ポリペプチド鎖内に含まれる前記哺乳動物結合分子の領域が、第一の抗原に対する結合特異性を有し、かつ前記第二の単一ポリペプチド鎖内に含まれる前記哺乳動物結合分子の領域が、第二の抗原に対する結合特異性を有し、かつＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、第三の抗原に対する結合特異性を有する、可溶性タンパク質。
【請求項１１】
前記哺乳動物結合分子が、タンパク質、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、低分子量化合物、リガンド、細胞表面受容体、又はこれらの断片である、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１２】
前記哺乳動物結合分子が、モノマー状又はホモポリマー状細胞表面受容体の細胞外ドメインである、請求項１１に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１３】
前記哺乳動物のモノマー状又はホモポリマー状細胞表面受容体がＩｇＳＦドメインを含む、請求項１２に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１４】
前記哺乳動物結合分子がＳＩＲＰα結合ドメインを含む、請求項１２又は請求項１３に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１５】
前記ＳＩＲＰα結合ドメインが：
（ｉ）ヒト細胞表面受容体ＣＤ４７の細胞外ドメイン；
（ｉｉ）配列番号：２に由来する細胞外ドメイン；
（ｉｉｉ）ＳＩＲＰα結合特性を保持している、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：５７のポリペプチド、又はこれらの断片；及び
（ｉｖ）少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセントの配列同一性を有し、かつＳＩＲＰα結合特性を保持している、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：５７の変異体ポリペプチド、又は該断片
からなる群から選択される、請求項１４に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１６】
前記第一及び第二の単一ポリペプチド鎖内に含まれる２以上のＳＩＲＰα結合ドメインが、互いに少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５％パーセントの配列同一性を共有する、請求項１４又は請求項１５に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１７】
２以上のＳＩＲＰα結合ドメインが同一のアミノ酸配列を有する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１８】
各々のヘテロダイマー内の前記ＳＩＲＰα結合ドメインが同一のアミノ酸配列を有する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項１９】
前記ＳＩＲＰα結合ドメインが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒト細胞表面受容体ＣＤ４７の細胞外ドメインである、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２０】
２つのヘテロダイマーの複合体を含む、請求項１５に記載の可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；並びに
（ｂ）ＣＤ４７の細胞外ドメインの一価領域であって、該ＣＤ４７領域のカルボキシル末端が該ＶＨ領域のＮ末端に融合している、一価領域
を含む、第一の単鎖ポリペプチド；並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；並びに
（ｄ）ＣＤ４７の細胞外ドメインの一価領域であって、該ＣＤ４７領域のカルボキシル末端が該ＶＬ領域のＮ末端に融合している、一価領域
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になる、可溶性タンパク質。
【請求項２１】
前記ＣＤ４７の細胞外ドメインの領域が、配列番号：３又は配列番号：５７である、請求項２０に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２２】
前記ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列が、ＴＮＦα、シクロスポリンＡ、又はこれらに由来するエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２３】
二価動力学的フィッティングモデルを適用して、ＢｉａＣＯＲＥアッセイで測定したとき、０．０５［１／ｓ］以下のｋｏｆｆ（ｋｄ１）で、ヒトＳＩＲＰαに対する結合から解離する、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２４】
インビトロで作製された単球由来樹状細胞の炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出を阻害する、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２５】
樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定したとき、インビトロで作製された単球由来樹状細胞の樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出を０．１ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項２４に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２６】
各々のヘテロダイマーの前記第一及び第二の単鎖ポリペプチドが、ジスルフィド架橋によって共有結合している、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２７】
各々のヘテロダイマーの前記第一の単鎖ポリペプチドが、免疫グロブリン定常部分のヒンジ領域を含み、かつ前記２つのヘテロダイマーが、該ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって互いに安定に会合している、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２８】
前記哺乳動物結合分子の各々の領域が、ペプチドリンカーの非存在下で、そのそれぞれのＶＨ又はＶＬ配列に融合している、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項２９】
前記哺乳動物結合分子の各々の領域が、ペプチドリンカーを介して、そのそれぞれのＶＨ又はＶＬ配列に融合している、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３０】
前記ペプチドリンカーが、５〜２０個のアミノ酸を含む、請求項２９に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３１】
前記ペプチドリンカーが、グリシン及びセリンアミノ酸の、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、１〜４の任意の整数、好ましくは、２である）のポリマーである、請求項２９又は請求項３０に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３２】
前記抗体のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域が、低下したＡＤＣＣエフェクター機能を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４対応領域のサイレント突然変異体に由来する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３３】
前記ヘテロダイマーが：
（ｉ）配列番号：２０の第一の単鎖ポリペプチド及び配列番号：２１の第二の単鎖ポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号：２２の第一の単鎖ポリペプチド及び配列番号：２３の第二の単鎖ポリペプチド；又は
（ｉｉ）配列番号：４０の第一の単鎖ポリペプチド及び配列番号：４１の第二の単鎖ポリペプチド
のいずれかを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３４】
前記第一及び前記第二の単鎖ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号：２０及び配列番号：２１；
（ｉｉ）配列番号：２２及び配列番号：２３；又は
（ｉｉ）配列番号：４０及び配列番号：４１
の対応する第一及び第二の単鎖ポリペプチドに対する少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３５】
（ｉ）配列番号：７７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖；及び配列番号：７８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖；又は
（ｉｉ）配列番号：７９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖；及び配列番号：８０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖；又は
（ｉｉｉ）配列番号：９７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖；及び配列番号：９８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖
を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質。
【請求項３６】
前記請求項のいずれか一項に記載の２以上の可溶性タンパク質を含む、多価可溶性タンパク質複合体であって、該タンパク質複合体が、Ｎ個の可溶性タンパク質を含む場合、価数はＮ×６である、多価可溶性タンパク質複合体。
【請求項３７】
薬物又は診断ツールとして使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項３８】
自己免疫疾患並びに／又は急性及び慢性炎症性疾患の治療又は診断において使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項３９】
Ｔｈ２媒介性気道炎症、アレルギー性疾患、喘息、炎症性腸疾患、及び関節炎からなる群から選択される治療において使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項４０】
虚血性疾患、白血病、又は他の癌障害の治療において使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項４１】
造血幹細胞生着をそれを必要とする対象で増大させる際に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項４２】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体を、１以上の医薬として許容し得るビヒクルと組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの他の活性成分をさらに含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質の１つのヘテロダイマーの少なくとも１つの単鎖ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項４５】
請求項４４に記載の単離された核酸、又は配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：９７、及び配列番号：９８からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含む、クローニングもしくは発現ベクター。
【請求項４６】
前記タンパク質の前記ヘテロダイマーの前記第一及び第二の単鎖ポリペプチド、並びに任意に、分泌シグナルをコードする核酸を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体の産生に好適な組換え宿主細胞。
【請求項４７】
ゲノム中に安定に組み込まれた、配列番号：７７及び配列番号：７８；又は配列番号：７９及び配列番号：８０；又は配列番号：９７及び配列番号：９８の核酸を含む、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞株である、請求項４６又は請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４９】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体の産生方法であって、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の宿主細胞を、該可溶性タンパク質又はタンパク質複合体の産生のための適切な条件下で培養すること、及び該タンパク質を単離することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、アレルギー性喘息及び炎症性腸疾患の予防又は治療のための薬剤として使用される、可溶性で、多重特異的な、多価結合タンパク質に関する。本発明の可溶性タンパク質は、２つのヘテロダイマーの複合体を含み、ここで、各々のヘテロダイマーは：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする。
【０００２】
本発明は、より具体的には、ＳＩＲＰαに対する特異性を有する可溶性結合タンパク質に関する。本発明の具体的な一実施形態は、図１によってさらに説明される。
【背景技術】
【０００３】
ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）は、マクロファージ、顆粒球、及び定常型樹状細胞（ＤＣ）を含む骨髄系列細胞によって、並びに神経細胞上に発現される免疫受容体である（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら．２００８，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９（５）：２０３−６）。ＳＩＲＰαは、ＣＤ４７に対する低親和性リガンドであり（Ｒｅｂｒｅｓら．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７６（３７）：３４６０７−１６；Ｈａｔｈｅｒｌｅｙら．２００７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２８２（１９）：１４５６７−７５；Ｈａｔｈｅｒｌｅｙら．２００８；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ；３１（２）２６６−７７）、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用は、免疫系及び神経系における多数の細胞機能を調節する接着及び双方向シグナル伝達制御に基づく細胞情報伝達系を構成する。これらの機能には、遊走、細胞成熟、マクロファージ食作用、及び骨髄樹状細胞のサイトカイン産生が含まれる（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら．２００８  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：２０３−６；Ｓａｒｆａｔｉ  ２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，９（１０）：８５２−５０）。
【０００４】
動物モデルからのデータは、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７相互作用が、自己免疫疾患、炎症性疾患（Ｏｋｕｚａｗａら．２００８，ＢＢＲＣ；３７１（３）：５６１−６；Ｔｏｍｉｚａｗａら．２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；１７９（２）：８６９−８７７）；虚血性疾患（Ｉｓｅｎｂｅｒｇら．２００８，Ａｒｔｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２８（４）：６１５−２１；Ｉｓｅｎｂｅｒｇ  ２００８，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７３（４）：１１００−１２）、又は腫瘍関連疾患（Ｃｈａｎら．２００９，ＰＮＡＳ，１０６（３３）：１４０１６−１４０２１；Ｍａｊｅｔｉら．２００９，Ｃｅｌｌ，１３８（２）：２８６−９９）を含む、いくつかの障害の発病の一因となり得るか、又はそれを制御すらし得ることを示唆している。したがって、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７経路の調節は、多数の疾患に対する有望な治療選択肢であり得る。
【０００５】
ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、又はＣＤ４７由来ＳＩＲＰα結合ポリペプチドに対する抗体の使用は、治療アプローチとして提案されている（例えば、ＷＯ１９９８／４０９４０号、ＷＯ２００４／１０８９２３号、ＷＯ２００７／１３３８１１号、及びＷＯ２００９／０４６５４１号を参照されたい）。さらに、ＳＩＲＰα結合ＣＤ４７由来融合タンパク質は、疾患、例えば、ＴＮＢＳ大腸炎（Ｆｏｒｔｉｎら．２００９，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，２０６（９）：１９９５−２０１１）、ランゲルハンス細胞遊走（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２：４０９１−４０９９）、及び関節炎（ＶＬＳＴ  Ｉｎｃ，２００８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｐａｔ．，１８（５）：５５５−５６１）の動物モデルにおいて有効であった。
【０００６】
さらに、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７は、食作用の制御に関与することが示唆され（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら．２００８，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９（５）：２０３−６）、ＳＩＲＰα結合ポリペプチドによる介入は、ＮＯＤマウス系統においてヒト幹細胞生着を増強させることが主張されており（ＷＯ２００９／０４６５４１号）、ヒト幹細胞移植で使用されるＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）含有治療薬の潜在的な利益を示唆している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、第一及び第二のポリペプチド鎖のヘテロダイマーを含む可溶性結合タンパク質であって、各々の鎖が抗体の重鎖又は軽鎖配列に融合した結合部分を含む、可溶性結合タンパク質を提供する。この可溶性タンパク質は、抗原、標的、又は結合パートナーに対する単一、二重、三重、又は四重特異性、及び先行技術の分子と比較して増加した価数を有することができる。先行技術の分子と比較して、本発明の可溶性タンパク質は、結合パートナーに対する増加した数の特異性、及び増加した価数を提供する。これは、以下に示すような、重要な利点を有する。この可溶性タンパク質は、治療薬として使用するためのものである。
【０００８】
本発明はさらに、治療薬として使用される改善された可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質を提供する。本発明で定義されるＳＩＲＰ結合抗体様タンパク質は、優れた開発可能性特性を維持すると同時に、先行技術のＣＤ４７タンパク質融合体と比較して、標的とされるＳＩＲＰα発現細胞に対する結合力を増加させる手段を提供することができる。さらに、任意の理論に束縛されるものではないが、より高い結合力は、より長い薬力学的半減期をもたらし、その結果、治療効力の増強をもたらすと考えられる。これらの新しい知見は、ＳＩＲＰα発現細胞を標的とするための新しい治療ツールを提供し、特に、多数の自己免疫疾患及び炎症性疾患、癌障害、又は幹細胞移植のための治療的視点を示す。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００１０】
本出願人は、以前、「Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」と呼ばれる、抗体様分子を開発したが、この分子では、抗体の両方のアームの可変領域が、哺乳動物結合分子の領域、例えば、ＳＩＲＰα結合ドメインに置き換えられ、それにより、多価可溶性タンパク質を提供している。本発明の可溶性タンパク質は、これらの分子が抗体配列も含むという点において、本出願人のＦｕｓｏｂｏｄｙと類似している。しかしながら、本発明の分子に関しては、抗体配列のＶＨ及びＶＬ領域−並びに関連する価数及び抗原特異性−が保持されており、これらの領域は、哺乳動物結合分子の領域に融合されている。したがって、本発明の分子は、二価抗体配列によって提供される１以上の結合特異性、及び哺乳動物結合分子の４つの一価領域によって提供されるさらなる特異性を有する。本発明の可溶性タンパク質を本出願人によって以前に開発されたものと区別するために、以下では、「拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」という用語を使用することにする。本出願人が以前に開発した分子は、引き続き、「Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」、又は「非拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」と呼ぶことにする。
【００１１】
拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの１つの例を図１に示す。図１には、参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子とともに、本出願人が以前に開発したＦｕｓｏｂｏｄｙも示されている。
【００１２】
先行技術の分子と比較して、本発明の可溶性タンパク質は、増加した価数を有する。本発明のヘテロダイマーは、好ましくは、ポリペプチド鎖１つ当たりの一価性に基づいて、３の価数を有し、かつＶＨ及びＶＬ領域の各々の対が、一価の抗原結合特異性をさらに提供する。したがって、本発明の可溶性タンパク質は、４つのポリペプチド鎖上の哺乳動物結合分子の領域によって寄与される四価性、及び抗体のＶＨ及びＶＬ領域によって寄与される二価性に基づいて、６の価数（六価性）を有する。好ましい実施形態において、各々の単鎖ポリペプチドは一価であり、各々のヘテロダイマーは三価であり、各々の可溶性タンパク質（２つのヘテロダイマーの複合体に基づく）は六価である。各々の第一及び第二の単鎖ポリペプチド中の一価結合分子、並びにＶＨ及びＶＬ領域の各々の対によって提供される一価の抗原結合特異性の取込みにより、各々のヘテロダイマーの価数は３となり、すなわち、各々のヘテロダイマーは、最大３つの別々の結合パートナーと、又は同じ結合パートナー上で、最大３回結合することができる。これは、２つのヘテロダイマーの複合体が、２の価数を有する限り、第一及び第二のポリペプチド鎖のヘテロダイマーの価数が１である（すなわち、両方の鎖が、結合パートナーに結合する必要がある）先行技術の分子（例えば、ＷＯ０１／４６２６１号に開示されているもの）と対比させることができる。本発明の２つの三価ヘテロダイマーの複合体は、６の価数を有し、すなわち、このタンパク質は、最大６つの結合パートナーと、又は同じ結合パートナー上で、最大６回結合することができる。本発明のヘテロダイマーは三価であり、ヘテロダイマーの複合体は、ｎ×３（式中、ｎは、複合体内に含まれるヘテロダイマーの数である）の価数を有する。好ましい実施形態において、この複合体は、２つのヘテロダイマーを含み、６の価数を有する。３以上のヘテロダイマーを含む複合体は、６よりも大きい価数、例えば、９、１２、１５、又は１８を有する。本発明の可溶性タンパク質の増加した価数は、半減期及び効力に対する有利な効果とともに、より高い結合力をもたらす。これらの効果の他に、（より低い結合力を有するものと比較した）高い結合力を有する治療分子の別の利点は、例えば、最大１０倍の、投与の低減を使用することができるということである。
【００１３】
抗体の定常領域に融合した二重可変ドメインを有する抗体様分子は、ＷＯ２０１０／１２７２８４号に開示されている。開示されている分子は、二重特異性で、かつ４の価数を有し、これは、この分子の各々のアーム上の２対のＶＨ及びＶＬ領域に由来する。本発明の可溶性タンパク質又は拡張型ＦｕｓｏｂｏｄｙとＷＯ２０１０／１２７２８４号に開示されている二重可変ドメイン分子の重要な違いの１つは、１つの可変ドメイン（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）しか、本発明の可溶性タンパク質／拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの各々のアーム上で利用されていないことである。第二の可変ドメインの代わりに、哺乳動物結合分子の一価領域−例えば、ＣＤ４７などの細胞表面受容体の細胞外ドメイン−を用いることによって、第二（又は第三の抗原）に対する特異性をなおも得ることができる。天然の受容体ドメインを使用する利点の１つは、そのコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）結合パートナーとの相互作用が、特異性、親和性、及び結合力を改善するために免疫原性領域及び／又は突然変異を含み得る治療的抗体又は二重可変ドメイン分子と比較して、より予測可能で、より自然で、より特異的であり、また、治療の文脈において、哺乳動物結合分子のドメインが、予期される免疫原性を有さないということである。二重可変ドメイン分子と比較して、抗体可変ドメインに融合した一価の哺乳動物結合領域の使用における別の利点は、哺乳動物結合分子の領域を抗体可変ドメインの近くに構造的に配置する（そしてさらに、必要とされる結合特異性を保持する）という問題が、リンカーの正確でかつ最適な使用が常に必要となる、異なる特異性を有する２つの可変ドメインを配置することよりもはるかに簡単であることである。したがって、先行技術の分子で達成される多重特異性を、本発明の可溶性タンパク質でより容易に達成することができ、それにより、これらの分子は、増加した価数及びさらなる利点を提供する。
【００１４】
一態様において、本発明は、本発明の２以上の可溶性タンパク質を含む多価可溶性タンパク質複合体を提供するものであり、ここで、このタンパク質複合体が、Ｎ個の可溶性タンパク質を含む場合、価数は、Ｎ×６である。
【００１５】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも六価性を有し（又は少なくとも六価であり）、少なくとも２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、抗原に対する特異性を有し（すなわち、一価であり）、かつ哺乳動物結合分子の各々の領域が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、一価性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、各々の可溶性タンパク質が少なくとも六価性を有し（又は少なくとも六価であり）、少なくとも２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質の複合体であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、抗原に対する特異性を有し（すなわち、一価であり）、哺乳動物結合分子の各々の領域が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、一価性を有し、かつこのタンパク質複合体が、Ｎ個の可溶性タンパク質を含む場合、価数がＮ×６であることを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）２つのＣＨ１領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を、ＣＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３という順序で有する修飾された抗体重鎖配列；及び
（ｂ）第一のＣＨ１領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）２つの融合したＣＬ領域を有する修飾された抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）第一のＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、該可溶性タンパク質の全価数が４であることを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。この態様において、可溶性タンパク質の価数は４であるが、この分子は、ＶＨ及びＶＬ配列が、それぞれ、ＣＨ１及びＣＬ配列と置き換えられているので、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ様構造を保持する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の少なくとも１つの一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；胃￥及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した哺乳動物結合分子の少なくとも１つの一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
を含み、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が少なくとも６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００１９】
好ましい態様において、可溶性タンパク質は、１つ、２つ、又は３つの抗原に対する結合特異性を有する。結合特異性は、（ｉ）抗体配列のＶＨ及びＶＬ領域の抗原結合特異性、並びに（ｉｉ）哺乳動物結合分子の各々の領域の結合特異性から生じる。
【００２０】
好ましい態様において、各々のヘテロダイマー内のＶＨ及びＶＬ領域は、同じ抗原、好ましくは、その抗原上の同じエピトープに特異的である。
【００２１】
好ましい態様において、該第一及び第二の単鎖ポリペプチド内に含まれる哺乳動物結合分子は同じである。より好ましい態様において、該第一及び第二の単鎖ポリペプチド内に含まれる哺乳動物結合分子の領域は同じである。
【００２２】
したがって、本発明は、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した同じ哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した同じ哺乳動物結合分子の同じ領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該可溶性タンパク質の全価数が６となるような、抗原に対する特異性を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００２４】
一実施形態において、哺乳動物結合分子の各々の領域、並びにＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対は、同じ単一の抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態において、哺乳動物結合分子の領域は、抗原上の第一のエピトープに結合することができ、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対は、同じ抗原上の第二のエピトープに結合することができる。別の実施形態において、哺乳動物結合分子の領域、並びにＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対は、同じ抗原上の同じエピトープに結合することができる。
【００２５】
一実施形態において、本発明の可溶性タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、２つの抗原に対する結合特異性を有し、ここで、哺乳動物結合分子の各々の領域は、第一の抗原に対する結合特異性を有し、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対は、第二の抗原に対する結合特異性を有する。具体的な実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質は、（各々のポリペプチド配列内に含まれるＣＤ４７の細胞外結合ドメインに基づく）ＳＩＲＰαに対する特異性、並びにＶＨ／ＶＬ及び関連ＣＤＲ配列の特異性に基づく、ＴＮＦα又はシクロスポリンＡのいずれかに対する特異性を有する。
【００２６】
別の実施形態において、該第一及び第二の単鎖ポリペプチド内に含まれる哺乳動物結合分子は異なる。したがって、本発明は、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した第一の哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した第二の哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、該第一及び第二の哺乳動物結合分子が、第一及び第二の抗原に対する結合特異性を有し、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、該第一の抗原又は該第二の抗原のいずれかに対する特異性を有し、それにより、可溶性タンパク質が二重特異性となり、６の全価数を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００２７】
代わりの実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、哺乳動物結合分子の領域によって結合される１つ又は２つの抗原とは異なる抗原に結合することができる。そのような拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは三重特異性であり、すなわち、３つの異なる抗原に結合することができ、ここで、第一の単一ポリペプチド鎖内に含まれる哺乳動物結合分子の領域は、第一の抗原に対する結合特異性を有し、第二の単一ポリペプチド鎖内に含まれる哺乳動物結合分子の領域は、第二の抗原に対する結合特異性を有し、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対は、第三の抗原に対する結合特異性を有する。したがって、本発明は、２つのヘテロダイマーの複合体を含む、可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）第一の単鎖ポリペプチドであって：
（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；及び
（ｂ）ＶＨ領域に融合した第一の哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第一の単鎖ポリペプチド、並びに
（ｉｉ）第二の単鎖ポリペプチドであって：
（ｃ）ＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；及び
（ｄ）ＶＬ領域に融合した第二の哺乳動物結合分子の一価領域；
を含む、第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になり、該第一及び第二の哺乳動物結合分子が、第一及び第二の抗原に対する結合特異性を有し、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列の各々の対が、第三の第二の抗原に対する特異性を有し、それにより、可溶性タンパク質が三重特異性となり、６の全価数を有することを特徴とする、可溶性タンパク質を提供する。
【００２８】
具体的な実施形態において、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列は、ＴＮＦアルファ、もしくはシクロスポリンＡ、又はそれらに由来するエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２９】
好ましい実施形態において、哺乳動物結合分子の領域は、抗体配列のＮ末端部分に（すなわち、ＶＨ及びＶＬ定常領域に）融合している。したがって、哺乳動物結合分子の領域のＣ末端は、抗体配列のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態において、配列は直接接続されており、いくつかの実施形態において、リンカー配列を使用することができる。
【００３０】
一実施形態において、結合分子は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、低分子量化合物（薬物）、リガンド、又は細胞表面受容体である。好ましくは、結合分子は、哺乳動物のモノマー状又はホモポリマー状細胞表面受容体である。結合分子の領域は、分子全体、又はその生物学的活性を保持し得るその部分もしくは断片であることができる。結合分子の領域は、細胞外領域又はドメインであることができる。一実施形態において、該哺乳動物のモノマー状又はホモポリマー状細胞表面受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインを含み、例えば、それは、ＳＩＲＰアルファ結合ドメインを含み、これは、ＣＤ４７の細胞外ドメインであってもよい。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、２つの三価ヘテロダイマーの六価複合体を含む、単離された可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又はＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙであって、各々のヘテロダイマーが：
（ｉ）抗体のＶＨ領域のＮ末端部分で融合した第一のＳＩＲＰα結合ドメインを含む第一の単鎖ポリペプチド；及び
（ｉｉ）抗体のＶＬ領域のＮ末端部分で融合した第二のＳＩＲＰα結合ドメインを含む第二の単鎖ポリペプチド
から本質的になる、単離された可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又はＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙに関する。
【００３２】
好ましい実施形態において、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域は、サイレントエフェクター機能及び／又は低下した殺細胞機能、ＡＤＣＣエフェクター機能、もしくはＣＤＣエフェクター機能、例えば、低下したＡＤＣＣエフェクター機能を有する野生型又は突然変異体変種のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４対応領域に由来することができる。
【００３３】
一実施形態において、該可溶性タンパク質又はＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、二価動力学的フィッティングモデルを適用して、ＢｉａＣＯＲＥアッセイなどの表面プラズモン共鳴で測定したとき、０．０５［１／ｓ］以下のｋｏｆｆ（ｋｄ１）でヒトＳＩＲＰαに対する結合から解離する。
【００３４】
別の実施形態において、該可溶性タンパク質又はＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、インビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）コワン（Ｃｏｗａｎ）株粒子刺激放出を阻害する。
【００３５】
例えば、該可溶性タンパク質又はＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定したとき、インビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出を、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、例えば、１０ｐＭ〜２ｎＭ、又は２０ｐＭ〜１ｎＭ、又は３０ｐＭ〜０．２ｎＭのＩＣ５０で阻害する。
【００３６】
別の関連する実施形態において、各々のヘテロダイマーの該第一及び第二の単鎖ポリペプチドは、ジスルフィド架橋によって、例えば、対応するＣＨ１及びＣＬ領域のシステイン残基間の天然のジスルフィド架橋を用いて、共有結合している。
【００３７】
一実施形態において、該哺乳動物結合分子の各々の領域は、ペプチドリンカーの非存在下で、そのそれぞれのＶＨ又はＶＬ配列に融合している。別の実施形態において、該哺乳動物結合分子の各々の領域は、ペプチドリンカーを介して、そのそれぞれのＶＨ又はＶＬ配列に融合している。ペプチドリンカーは、５〜２０個のアミノ酸を含むことができ、例えば、それは、グリシン及びセリンアミノ酸の、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、１〜４の任意の整数、好ましくは、２である）のポリマーであることができる。
【００３８】
好ましい一実施形態において、該可溶性タンパク質又はＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、２つのヘテロダイマーから本質的になり、ここで、各々のヘテロダイマーの該第一の単鎖ポリペプチドは、免疫グロブリン定常部分のヒンジ領域を含み、２つのヘテロダイマーは、そのヒンジ領域のシステイン間のジスルフィド架橋によって互いに安定に会合している。
【００３９】
一実施形態において、本発明の可溶性タンパク質は：
（ｉ）ヒト細胞表面受容体ＣＤ４７の細胞外ドメイン；
（ｉｉ）配列番号：２に由来する細胞外ドメイン；
（ｉｉｉ）ＳＩＲＰα結合特性を保持する、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：５７のポリペプチド、又はそれらの断片；及び、
（ｉｖ）少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有し、かつＳＩＲＰα結合特性を保持する、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：５７の変異体ポリペプチド、又は該断片
からなる群から選択される、少なくとも１つのＳＩＲＰα結合ドメインを含む。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＣＤ４７の細胞外ドメインの領域は、配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：５７である。
【００４１】
具体的な一実施形態において、該第一及び第二の単一ポリペプチド鎖内に含まれる２以上のＳＩＲＰα結合ドメインは、相互に少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５％パーセントの配列同一性を共有する。好ましい実施形態において、２以上のＳＩＲＰα結合ドメインは、同一のアミノ酸配列を有する。
【００４２】
具体的な一実施形態において、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ内の全てのＳＩＲＰα結合ドメインは、同一のアミノ酸配列を有する。例えば、全てのＳＩＲＰα結合ドメインは、配列番号：３又は配列番号：４又は配列番号：５又は配列番号：５７からなる。
【００４３】
具体的な一実施形態において、本発明の該可溶性タンパク質、又はＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、２つのヘテロダイマーを含み、ここで、各々のヘテロダイマーは：
（ｉ）配列番号：２０の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：２１の第二の単一の軽鎖ポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号：２２の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：２３の第二の単一の軽鎖ポリペプチド；又は
（ｉｉ）配列番号：４０の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：４１の第二の単一の軽鎖ポリペプチド
から本質的になる。該第一及び第二の単鎖ポリペプチドは、抗体の重鎖及び軽鎖と同様に、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して安定に会合している。
【００４４】
関連する実施形態において、可溶性タンパク質又はＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、２つのヘテロダイマーを含み、ここで、各々のヘテロダイマーの第一及び第二の単鎖ポリペプチドは、それぞれ、（ｉ）配列番号：２０及び配列番号：２１；（ｉｉ）配列番号：２２及び配列番号：２３；又は（ｉｉ）配列番号：４０及び配列番号：４１の対応する第一及び第二の単鎖ポリペプチドとの少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有する。好ましくは、これらの分子は、本明細書に記載のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの有利な機能的特性を保持する。
【００４５】
具体的な一実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの４つのＳＩＲＰα結合ドメインは、配列が同一である。
【００４６】
本発明はさらに、２以上の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを含む、そのような多価可溶性タンパク質複合体に関するものであり、ここで、このタンパク質複合体がＮ個の可溶性タンパク質を含む場合、価数はＮ×６である。
【００４７】
本発明はさらに、例えば、自己免疫疾患並びに急性及び慢性炎症性疾患の治療又は診断において薬物又は診断ツールとして使用される、そのような可溶性タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、特に、ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙに関する。特に、ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、Ｔｈ２媒介性気道炎症、アレルギー性疾患、喘息、炎症性腸疾患、及び関節炎からなる群から選択される治療において使用するためのものである。
【００４８】
本発明の可溶性タンパク質又はＦｕｓｏｂｏｄｙは、虚血性疾患、白血病、もしくは他の癌障害の治療もしくは診断において、又は造血幹細胞生着をその必要がある対象で増加させる際に使用することもできる。
【００４９】
定義
本発明をより容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して示される。
【００５０】
ＳＩＲＰαという用語は、ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）への接着を示すヒトシグナル調節タンパク質α（ＣＤ１７２ａ又はＳＨＰＳ−１とも表記される）を指す。ヒトＳＩＲＰαは配列番号：１を含むが、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の天然の多型変異体、又はヒトＳＩＲＰαのスプライス変異体をさらに非限定的に含む。ヒトで見られるＳＩＲＰαヌクレオチド配列中のスプライス変異体又はＳＮＰの例は、表１に記載されている。
【００５１】
【表１】
2014519338.tif 000003
【００５２】
ＣＤ４７という用語は、細胞外マトリックスへの細胞接着によって生じる細胞内カルシウム濃度の増加に関与する哺乳動物膜タンパク質である、インテグリン関連タンパク質を指す。ヒトＣＤ４７は配列番号：２を含むが、ヒトＣＤ４７の、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の天然の多型変異体、又はスプライス変異体も含む。ヒトで見られるＣＤ４７ヌクレオチド配列中のスプライス変異体又はＳＮＰの例は、表２に記載されている。
【００５３】
【表２】
2014519338.tif 000004
【００５４】
本明細書で使用されるように、「タンパク質」という用語は、１以上の直鎖中に配列されたアミノ酸でできており、かつ球形にフォールディングされている、任意の有機化合物を示す。ポリマー鎖中のアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合によって接続されている。「タンパク質」という用語は、限定されないが、ペプチド、単鎖ポリペプチド、又は主に２以上のアミノ酸鎖からなる任意の複合体分子をさらに含む。それは、限定されないが、糖タンパク質又は他の既知の翻訳後修飾をさらに含む。それは、天然タンパク質の既知の天然又は人工化学修飾、例えば、限定されないが、糖鎖エンジニアリング、ペグ化、ＨＥＳ化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）など、非天然アミノ酸の組込み、及び別の分子との化学的コンジュゲーションのためのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「複合タンパク質」は、少なくとも２つの単鎖ポリペプチドでできているタンパク質を指し、ここで、該少なくとも２つの単鎖ポリペプチドは、非共有結合、又は例えば、ジスルフィド架橋による共有結合のいずれかを介して、適当な条件下で会合している。「ヘテロダイマータンパク質」は、複合タンパク質を形成する２つの単鎖ポリペプチドでできているタンパク質を指し、ここで、該２つの単鎖ポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有し、特に、それらのアミノ酸配列は、互いに９０、８０、７０、６０、又は５０％を上回る同一性を共有しない。それとは反対に、「ホモダイマータンパク質」は、複合タンパク質を形成する２つの同一の又は実質的に同一のポリペプチドでできているタンパク質を指し、ここで、該２つの単鎖ポリペプチドは、１００％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性、又は少なくとも９５％の同一性を共有し、アミノ酸の違いは、ホモダイマーのもう一方と比較して、ポリペプチドの機能的及び物理的特性に影響を及ぼさないアミノ酸置換、付加、又は欠失、例えば、保存的なアミノ酸置換からなる。
【００５６】
本明細書で使用されるように、タンパク質は、それが、ポリペプチドを、そのようなポリペプチドを発現する細胞の膜に固定するかもしくは組み込む任意の膜貫通ドメイン又はタンパク質ドメインを欠いている場合、「可溶性」である。特に、本発明の可溶性タンパク質は、同様に、ＣＤ４７の膜貫通及び細胞内ドメインを含まなくてもよい。本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域へとさらに細かく分割することができる。各々のＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は宿主因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００５７】
「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各々の重鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各々の軽鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。
【００５８】
所与のＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番方式）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番方式）に記載のものを含む、いくつかの方法によって決定することができる。「定常領域」という語句は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。
【００５９】
本テキストで使用されるように、「Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」（又は「非拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」）という用語は、２つのヘテロダイマーを含む、抗体様可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが、例えば、１以上のジスルフィド結合を介して安定に会合しているアミノ酸の１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる、抗体様可溶性タンパク質を指す。各々の重鎖又は軽鎖は、以後それぞれ、Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域と呼ばれる、抗体の定常領域を含む。重鎖定常領域は、抗体の少なくともＣＨ１領域を含み、かつヒンジ領域を含む、ＣＨ２及びＣＨ３領域をさらに含み得る。軽鎖定常領域は、抗体のＣＬ領域を含む。Ｆｕｓｏｂｏｄｙにおいて、抗体の可変領域は、哺乳動物結合分子の領域に置き換えられており、これらは、異種可溶性結合ドメインである。「異種」という用語は、これらのドメインが、天然では、抗体の定常領域と会合して見られないことを意味する。特に、そのような異種結合ドメインは、４つのフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びにそれらの間にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる抗体可変ドメインの典型的な構造を有さない。したがって、Ｆｕｓｏｂｏｄｙの各々のアームは、抗体の定常ＣＨ１重鎖領域のＮ末端部分で共有結合した第一の結合ドメインを含む第一の単鎖ポリペプチド、及び抗体の定常ＣＬ軽鎖領域のＮ末端部分で共有結合した第二の結合ドメインを含む第二の単鎖ポリペプチドを含む。共有結合は、例えば、ペプチド結合を介する直接的なもの、又はリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介する間接的なものであってもよい。Ｆｕｓｏｂｏｄｙの２つのヘテロダイマーは、抗体構造と同様に、例えば、そのヒンジ領域の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって共有結合している。
【００６０】
「拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」は、２つのヘテロダイマーを含む、抗体様可溶性タンパク質であって、各々のヘテロダイマーが、例えば、１以上のジスルフィド結合を介して安定に会合しているアミノ酸の１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる、抗体様可溶性タンパク質を指す。各々の重鎖又は軽鎖は、以後それぞれ、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖領域及び軽鎖領域と呼ばれる、抗体の定常領域及び可変領域を含む。重鎖において、定常領域は、ヒンジ領域を含む、抗体のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。抗体のＣＨ２及びＣＨ３領域は、抗体構造との類似性により、拡張型ＦｕｓｏｂｏｄｙのＦｃ部分（ｐａｒｔ）又はＦｃ部分（ｍｏｉｅｔｙ）と呼ばれる。拡張型ＦｕｓｏｂｏｄｙのＦｃ部分（ｐａｒｔ）の詳細な説明は、さらに以下のパラグラフに記載されている。軽鎖において、軽鎖定常領域は、抗体のＣＬ領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域に融合しているのは、哺乳動物結合分子の領域であり、これらは、異種可溶性結合ドメインである。「異種」という用語は、これらのドメインが、天然では、抗体の可変領域又は定常領域と会合して見られず、また、４つのフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、並びにそれらの間にある３つのＣＤＲからなる抗体可変ドメインの典型的な構造を有さないことを意味する。したがって、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの各々のアームは、抗体の重鎖のＶＨ領域のＮ末端部分で共有結合した第一の結合ドメインを含む第一の単鎖ポリペプチド、及び抗体の軽鎖のＶＬ領域のＮ末端部分で共有結合した第二の結合ドメインを含む第二の単鎖ポリペプチドを含む。共有結合は、例えば、ペプチド結合を介する直接的なもの、又はリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介する間接的なものであってもよい。拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの２つのヘテロダイマーは、抗体構造と同様に、例えば、そのヒンジ領域の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって共有結合している。先に記載されているように、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、そのＶＨ及びＶＬ領域によって提供される抗原に対する特異性、並びに抗体重鎖及び軽鎖配列に融合した異種可溶性結合ドメインによって提供されるさらなる特異性を有する。
【００６１】
本明細書で使用されるように、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖並びに本発明の可溶性タンパク質及び拡張型ＦｕｓｏｂｏｄｙのＣ末端領域を定義するために使用される。この定義は、ネイティブ配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、ＩｇＧ抗体の位置Ｃ２２６又はＰ２３０からカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むものと定義される。Ｆｃ領域中の残基の付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの付番とする。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（残基Ｋ４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製中に、除去することができる。
【００６２】
抗体の「価数」という用語は、個々の抗体分子が結合することができる抗原性決定基の数を指す。全ての抗体の価数は、少なくとも２、場合により、それより大きい。
【００６３】
「結合力」という用語は、タンパク質間の多数の結合相互作用の合わせた強度を説明するために使用される。結合力は、単一の結合の強度を説明する親和性とは異なる。したがって、結合力は、結合の総和ではなく、結合親和性の合わせた相乗的強度（機能的親和性）である。本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙに関して、哺乳動物結合分子の領域及びＶＨ／ＶＬ対由来の抗原結合部位は、そのぞれぞれの結合パートナーと同時に相互作用する。各々の単一の結合相互作用は（相対的親和性に応じて）容易に破壊され得るが、多くの結合相互作用が同時に存在するため、単一の部位の一時的な未結合によって分子が拡散することはなく、その部位の結合はもとに戻る可能性が高い。全体的な効果は、抗原の抗体に対する相乗的な、強い結合である（例えば、ＩｇＭは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの２カ所の強い結合部位とは対照的に、１０カ所の弱い結合部位を有するため、低い親和性を有するが、高い結合力を有すると言われる）。図１は、参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子と比較した、Ｆｕｓｏｂｏｄｙ及び拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ分子の略図である。Ｆｕｓｏｂｏｄｙ様構造を有する分子、特に、各々のヘテロダイマーの両方の鎖が、各々のリガンドに結合する必要がある、すなわち、ヘテロダイマー１つ当たり１の価数、及び２つのヘテロダイマーからなるタンパク質について２の全価数を有するヘテロダイマー受容体のリガンド結合領域を含む分子の例は、当技術分野で記載されている（例えば、ＷＯ０１／４６２６１号を参照されたい）。
【００６４】
好ましい実施形態において、哺乳動物のモノマー状もしくはホモポリマー状細胞表面受容体の細胞外ドメイン、又はリガンド結合活性を保持するそのような細胞外ドメインの変異体もしくは領域は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に融合している。得られる拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ分子は、治療分子として使用される抗体分子の有利な特性を保持する多価タンパク質である。
【００６５】
本明細書で使用される「哺乳動物結合分子」という用語は、標的分子、細胞、複合体、及び／又は組織に結合することができる任意の分子、又はその部分もしくは断片であって、可溶性タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞表面受容体タンパク質、細胞内タンパク質、炭水化物、核酸、ホルモン、もしくは低分子量化合物（小分子薬物）、又はこれらの断片：からなる群から選択されるメンバーの１つ又は複数に結合する能力を各々有するタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、及びこれらの断片を含むものである。哺乳動物結合分子は、タンパク質、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、受容体、又はこれらの断片であり得る。好ましい実施形態において、哺乳動物結合分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するネイティブの又は突然変異したタンパク質；その天然の受容体に結合することができるネイティブのホルモン又はその変異体；相補的配列及び／又は可溶性、細胞表面、もしくは細胞内核酸／ポリヌクレオチド結合タンパク質に結合することができる核酸又はポリヌクレオチド配列；他の炭水化物結合部分及び／又は可溶性、細胞表面、もしくは細胞内タンパク質に結合することができる炭水化物結合部分；可溶性又は細胞表面又は細胞内標的タンパク質に結合する低分子量化合物（薬物）である。
【００６６】
「ＩｇＳＦドメイン」という用語は、細胞の結合、認識、又は接着プロセスを媒介することによって免疫系に関与する膨大な細胞表面及び可溶性タンパク質群を含む免疫グロブリンスーパーファミリードメイン含有タンパク質を指す。ＩｇＳＦドメイン分子の免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンとの構造的類似性を共有している。ＩｇＳＦドメインは、約７０〜１１０個のアミノ酸を含み、そのサイズ及び機能によって分類される。Ｉｇドメインは、逆平行ベータストランドの２つのシートによって形成されるサンドイッチ様構造を有する特徴的なＩｇフォールドを有する。Ｉｇフォールドは、システイン残基間に形成される高度に保存されたジスルフィド結合、及びサンドイッチの内部の疎水性アミノ酸間の相互作用によって安定化される。Ｉｇドメインの１つの末端は、ＩｇＳＦドメインの特異性のために重要である相補性決定領域と呼ばれる部分を有する。ほとんどのＩｇドメインは、可変（ＩｇＶ）又は定常（ＩｇＣ）のいずれかである。１以上のＩｇＳＦドメインを提示するタンパク質の例は、細胞表面共刺激分子（ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、抗原受容体（ＴＣＲ／ＢＣＲ）共受容体（ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８）である。他の例は、細胞接着に関与する分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）又はＩｇＳＦドメインを有し、サイトカイン結合受容体（ＩＬ１Ｒ、ＩＬ６Ｒ）を形成する分子、及び細胞内筋肉タンパク質である。多くの例において、細胞環境に近接した多数のＩｇＳＦドメインの存在は、そのようなＩｇＳＦドメインを含む該細胞表面受容体によって引き起こされるシグナル伝達の効力のために必要である。顕著な例は、抗原提示細胞による最適な抗原提示を可能にするだけでなく、ナイーブＴ細胞の制御された活性化ももたらす微小環境を可能にする免疫学的シナプスにおけるＩｇＳＦドメイン含有分子（ＣＤ２８、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ８０、及びＣＤ８６）のクラスター化である（Ｄｕｓｔｉｎ，２００９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）。適切な機能のためにクラスター化する必要がある他のＩｇＳＦ含有分子の他の例は、ＣＤ２（Ｌｉら．１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３（２）：２０９−２６）及びＩＣＡＭ−１（Ｊｕｎら．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７６（３１）：２９０１９−２７）である。
【００６７】
したがって、ＩｇＳＦドメインを含有するオリゴ価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅｎｔ）構造を模倣することにより、いくつかのＩｇＳＦドメインを含む本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを、その対応する結合パートナーの活性を調節するために有利に使用することができる。
【００６８】
本明細書で使用されるように、ＳＩＲＰγという用語は、ＣＤ１７２ｇを示す。ヒトＳＩＲＰγは、配列番号：１１５を含むが、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の天然の多型変異体、又はヒトＳＩＲＰγのスプライス変異体も含む。ヒトで見られるＳＩＲＰγヌクレオチド配列中のスプライス変異体又はＳＮＰの例は、表３に記載されている。
【００６９】
【表３】
2014519338.tif 000005
【００７０】
本明細書で使用される「二価動力学的フィッティングモデル」という用語は、その内容が引用により組み込まれる、Ｂａｕｍａｎｎら（１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２１（１−２）：９５−１０６）に記載されているような、二価解析物の一価リガンドへの結合を説明するモデルを指す。このモデルでは、各々の結合段階について１つの速度定数で、２組の速度定数、ｋａ１、ｋａ２、ｋｄ１、及びｋｄ２が生み出される。本明細書で使用される「ｋａｓｓｏｃ」又は「ｋａ」という用語は、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の会合速度定数を指すことが意図されるのに対し、本明細書で使用される「ｋｄｉｓ」又は「ｋｄ」という用語は、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の解離速度定数を指すことが意図される。「ｋｏｆｆ」という用語は、ｋｄｉｓ又はｋｄ１又は解離速度定数の同義語として使用される。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、この解離定数は、ｋａに対するｋｄの比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、ＫＤ１については、モル濃度（Ｍ）として、及びＫＤ２については、共鳴単位（ＲＵ）として表される。ＫＤ２（ＲＵ）は、Ｂａｕｍａｎｎらに記載されているように、モル濃度（Ｍ）に変換することができる。タンパク質−タンパク質相互作用のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。例えば、タンパク質／タンパク質相互作用のＫＤ（又はＫＤ１又はＫＤ２）を決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるもの、又はバイオセンサーシステム、例えば、ＢｉａＣＯＲＥシステムを使用することによるものである。ＳＩＲＰαと相互作用する本発明のタンパク質のＫＤ値を決定するための少なくとも１つのアッセイは、以下の実施例に記載されている。
【００７１】
本明細書で使用されるように、「親和性」という用語は、単一の部位でのポリペプチドとその標的との間の相互作用の強さを指す。各々の部位内で、ポリペプチドの結合領域は、弱い非共有結合力を介して数多くの部位でその標的と相互作用し；相互作用がより多ければ、親和性はより強くなる。
【００７２】
本明細書で使用されるように、結合ポリペプチド又はタンパク質に対する「高い親和性」という用語は、その標的に対して１μＭ以下のＫＤを有するポリペプチド又はタンパク質を指す。
【００７３】
一実施形態において、本発明の可溶性タンパク質は、黄色ブドウ球菌コワン１（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）又は可溶性ＣＤ４０Ｌ及びＩＦＮ−γで刺激された末梢血単球、定常型樹状細胞（ＤＣ）、及び／又は単球由来ＤＣからの免疫複合体刺激細胞サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＩＬ−８、及び／又はＴＮＦ−α）の放出を阻害する。免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイの１つの例は、以下の実施例でより詳細に記載されているインビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出である。好ましい実施形態において、免疫複合体刺激細胞サイトカイン放出を阻害するタンパク質は、樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定したとき、２ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、例えば、２ｎＭ〜２０ｐＭ、又は１ｎＭ〜１０ｐＭのＩＣ５０で、インビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出を阻害するタンパク質である。
【００７４】
本明細書で使用されるように、別途より具体的に定義されていない限り、機能アッセイに関する場合の「阻害」という用語は、陰性対照と比較したとき、測定される機能の任意の統計的に有意な阻害を指す。
【００７５】
ＳＩＲＰαの機能的特性に対する本発明の可溶性タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの効果を評価するアッセイは、実施例でさらに詳細に記載されている。
【００７６】
本明細書で使用されるように、「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。
【００７７】
「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００７８】
本明細書で使用されるように、「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列が、真核細胞、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）もしくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又はヒト細胞、或いは原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の株のいずれかの、生産細胞又は生物体で好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように改変されていることを意味する。
【００７９】
最適化されたヌクレオチド配列は、完全に、又は可能な限り多く、「親」配列としても知られている出発ヌクレオチド配列によって本来コードされているアミノ酸配列を保持するように操作されている。本明細書における最適化された配列は、対応する生産細胞又は生物体、例えば、哺乳動物細胞で好ましいコドンを有するように操作されているが、他の原核細胞又は真核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も、本明細書で想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると言われる。
【００８０】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＲＰα結合ドメイン」は、適切な条件下でのＳＩＲＰαへの結合に必要である任意の単鎖ポリペプチドドメインを指す。ＳＩＲＰα結合ドメインは、ＳＩＲＰαとの物理的相互作用に直接関与する全てのアミノ酸残基を含む。それは、ＳＩＲＰαと直接は相互作用しないが、ＳＩＲＰαと相互作用するためのＳＩＲＰα結合ドメインの適切な立体構造に必要とされる他のアミノ酸をさらに含むことができる。ＳＩＲＰα結合ドメインは、ＳＩＲＰαに対するその結合特性の顕著な変化を伴わずに、異種ドメインに融合させることができる。ＳＩＲＰα結合ドメインは、ＣＤ４７タンパク質などの、ＳＩＲＰαに結合することが知られているタンパク質の結合ドメインの中から選択することができる。ＳＩＲＰα結合ドメインはさらに、ＳＩＲＰαに対する人工バインダーからなり得る。特に、バインダーは、単一ドメイン抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又はラクダ科抗体などの単鎖免疫グロブリンスキャフォールド、に由来する。一実施形態において、「ＳＩＲＰα結合ドメイン」という用語は、ＳＩＲＰαに結合する抗体の可変領域、例えば、ＶＨ及びＶＬ領域に由来するＳＩＲＰα抗原結合領域を含まない。
【００８１】
本発明の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明されている。
【００８２】
本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの好ましい実施形態は、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質、その複合体、及び誘導体であり、その全てが、以下に記載するようなＳＩＲＰα結合ドメインを含む。読みやすくするために、ＳＩＲＰα結合ドメインを含む、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、その複合体、及び誘導体を、本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質と呼ぶ。
【００８３】
好ましい一実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは：
（ｉ）ヒトＣＤ４７の細胞外ドメイン；
（ｉｉ）配列番号：４のポリペプチド又はＳＩＲＰα結合特性を保持する配列番号：４の断片；
（ｉｉｉ）配列番号：４との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有し、かつＳＩＲＰα結合特性を保持する、配列番号：４の変異体ポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号：３のポリペプチド又はＳＩＲＰα結合特性を保持する配列番号：３の断片；
（ｖ）配列番号：３との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有し、かつＳＩＲＰα結合特性を保持する、配列番号：３の変異体ポリペプチド；
（ｖｉ）配列番号：５７のポリペプチド又はＳＩＲＰα結合特性を保持する配列番号：５７の断片；及び
（ｖｉｉ）配列番号：５７との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有し、かつＳＩＲＰα結合特性を保持する、配列番号：５７の変異体ポリペプチド
からなる群から選択される。
【００８４】
本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質は、ＳＩＲＰαに結合する能力を保持すべきである。ＣＤ４７の結合ドメインは、十分に特徴付けられており、ヒトＣＤ４７の１つの細胞外ドメインは、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３のポリペプチドである。したがって、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３のポリペプチドの断片は、ＣＤ４７のＳＩＲＰα結合ドメインを含む断片の中から選択することができる。これらの断片は、通常、ＣＤ４７の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含まない。非限定的で例示的な実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、又は配列番号：５７から本質的になる。断片は、１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：５のＣ末端又はＮ末端から切断されているより短いポリペプチド、例えば、配列番号：５７を含むが、これらに限定されない。ＳＩＲＰα結合ドメインは、ネイティブの配列に対する変化がＳＩＲＰα結合タンパク質の生物学的活性、特に、そのＳＩＲＰαに対する結合特性に実質的に影響を及ぼさない限り；アミノ酸残基が、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換によって突然変異しているが、それぞれ、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３の変異体ポリペプチドをさらに含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、それは、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３と比較したとき、１、２、３、４、又は５個以下のアミノ酸が、ＳＩＲＰα結合ドメインにおけるアミノ酸の欠失又は置換によって突然変異している突然変異体アミノ酸配列を含む。突然変異体アミノ酸配列の例は、単一ヌクレオチド多型に由来する配列である（表２参照）。
【００８５】
本明細書で使用されるように、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮して、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全体の＃×１００）。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、以下に記載される数学アルゴリズムを用いて達成することができる。
【００８６】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれているＥ．Ｍｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムを用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを用いて決定することができる。同一性パーセントを決定するためのさらに別のプログラムは、スタンドアロンプログラムとして又はウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／参照）経由で利用可能なＣＬＵＳＴＡＬ（Ｍ．Ｌａｒｋｉｎら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：２９４７−２９４８，２００７；Ｄ．Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＰ．Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４，１９８８によって初めて記載された）である。
【００８７】
具体的な実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３に対する変化を含み、ここで、該配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３に対する変化は、保存的アミノ酸置換から本質的になる。
【００８８】
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族性側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、配列番号：４、配列番号：５７、又は配列番号：３のＳＩＲＰα結合ドメイン内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基と置き換えることができ、新しいポリペプチド変異体を、保持された機能について、本明細書に記載の結合アッセイ又は機能アッセイを用いて試験することができる。
【００８９】
別の実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、例えば、カニクイザル又はアカゲザルなどの、非ヒト霊長類ＳＩＲＰαと交差反応するものの中から選択される。
【００９０】
別の実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、ＳＩＲＰαと密接に関連するヒトタンパク質、例えば、ＳＩＲＰγと交差反応しないものの中から選択される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、プレートベースの細胞接着アッセイで測定したときに、そのようなＳＩＲＰα結合ドメインを含むＳＩＲＰα結合タンパク質が、配列番号：４又は配列番号：３のヒトＳＩＲＰαの細胞外ドメインを含むＳＩＲＰα結合タンパク質と少なくとも同程度に、ＣＤ４７−Ｆｃ融合体のＳＩＲＰα＋Ｕ９３７細胞への結合を阻害する能力を保持するものの中から選択される。
【００９２】
他の実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定したときに、そのようなＳＩＲＰα結合ドメインを含むＳＩＲＰα結合タンパク質が、配列番号：４又は配列番号：３のヒトＳＩＲＰαの細胞外ドメインを含むＳＩＲＰα結合タンパク質と少なくとも同程度に、インビトロで分化した骨髄樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出を阻害する能力を保持するものの中から選択される。
【００９３】
ＳＩＲＰα結合ドメインは、ＶＨもしくはＶＬ領域とインフレームで直接的に、又はポリペプチドリンカー（スペーサー）を介して融合させることができる。そのようなスペーサーは、単一のアミノ酸（例えば、グリシン残基）又は５〜１００個のアミノ酸、例えば、５〜２０個のアミノ酸であってもよい。リンカーは、ＳＩＲＰαとの結合部位を形成するように、ＳＩＲＰα結合ドメインが適切な空間的配向を取るのを許容すべきである。好適なポリペプチドリンカーは、柔軟な立体構造を取るものの中から選択することができる。そのようなリンカーの例は、（限定されないが）グリシン及びセリン残基を含むリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１〜１２の整数、例えば、１〜４、例えば、２である）である。
【００９４】
本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質を１つにコンジュゲート又は融合させて、多価タンパク質を形成させることができる。
【００９５】
当業者はさらに、抗体分子を操作するために開発された背景技術を有利に用いて、分子の価数を増加させるか、又は操作された分子の特性をその具体的な使用のために改善し、もしくは該特性をその具体的な使用のために適合させることができる。
【００９６】
別の実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質は、得られる融合タンパク質の血中半減期を増加させることができる別の異種タンパク質に融合させることができる。
【００９７】
そのような異種タンパク質は、例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、及びこれらの断片であることができる。そのような異種タンパク質は、対象において投与したとき、血清アルブミンタンパク質に結合して、得られる分子の半減期を増加させることができるポリペプチドであることができる。そのようなアプローチは、例えば、ＥＰ０４８６５２５号に記載されている。
【００９８】
代わりに又はさらに、本発明の可溶性タンパク質は、多量体化のためのドメインをさらに含む。
【００９９】
ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ
一態様において、本発明は、少なくとも１つのＳＩＲＰα結合ドメインを含む拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙに関する。拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの２つのヘテロダイマーは、異なる結合特異性を有する異なる結合ドメインを含み、それにより、二重又は三重特異性Ｆｕｓｏｂｏｄｙを生じさせることができる。例えば、Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰα結合ドメインを含有する１つのヘテロダイマーと、別の異種結合ドメインを含有する別のヘテロダイマーとを含むことができる。或いは、Ｆｕｓｏｂｏｄｙの両方のヘテロダイマーは、ＳＩＲＰα結合ドメインを含む。後者において、そのようなＳＩＲＰα結合ドメインの構造又はアミノ酸配列は、同一のものであっても、異なるものであってもよい。好ましい一実施形態において、Ｆｕｓｏｂｏｄｙの両方のヘテロダイマーは、同一のＳＩＲＰα結合ドメインを含む。
【０１００】
本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの具体例
本発明のＦｕｓｏｂｏｄｙには、限定されないが、実施例の表４に記載の通りに構造的に特徴付けられたＦｕｓｏｂｏｄｙが含まれる。これらの実施例で使用されるＳＩＲＰα結合ドメインは、配列番号：３又は配列番号：４に示されている。本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖アミノ酸配列の具体例は、配列番号：２０、配列番号：２２、及び配列番号：４０：からなる群から選択されるポリペプチド配列である。本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの軽鎖アミノ酸配列の具体例は、配列番号：２１、配列番号：２３、及び配列番号：４１：からなる群から選択されるポリペプチド配列である。
【０１０１】
本発明の他のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換によって突然変異しているが、配列番号：３又は配列番号：４の対応するＳＩＲＰα結合ドメインのいずれか１つにおいて少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有するＳＩＲＰα結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＦｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：３又は配列番号：４の配列のいずれか１つに示されるＳＩＲＰα結合ドメインと比較したとき、１、２、３、４、又は５個以下のアミノ酸が、ＳＩＲＰα結合ドメインにおけるアミノ酸の欠失又は置換によって変化している突然変異体アミノ酸配列を含むＳＩＲＰα結合ドメインを含む。
【０１０２】
一実施形態において、実施例＃４として記載されている、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：１８の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：１９の第二の単一の軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１０３】
一実施形態において、実施例＃５として記載されている、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：２０の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：２１の第二の単一の軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１０４】
一実施形態において、実施例＃６として記載されている、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：２２の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：２３の第二の単一の軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１０５】
一実施形態において、実施例＃７として記載されている、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：４０の第一の単一の重鎖ポリペプチド及び配列番号：４１の第二の単一の軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１０６】
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、上記の実施例＃４、＃５、＃６、又は＃７の対応する重鎖及び又は軽鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つとの少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、配列番号：７５のヌクレオチド配列によってコードされた第一の単一の重鎖ポリペプチド；及び配列番号：７６のヌクレオチド配列によってコードされた第二の単一の軽鎖ポリペプチド：を有する実施例＃４として記載されている、本発明の単離された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、配列番号：７７のヌクレオチド配列によってコードされた第一の単一の重鎖ポリペプチド；及び配列番号：７８のヌクレオチド配列によってコードされた第二の単一の軽鎖ポリペプチド：を有する実施例＃５として記載されている、本発明の単離された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、配列番号：７９のヌクレオチド配列によってコードされた第一の単一の重鎖ポリペプチド；及び配列番号：８０のヌクレオチド配列によってコードされた第二の単一の軽鎖ポリペプチド：を有する実施例＃６として記載されている、本発明の単離された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、（ｉｉｉ）配列番号：９７のヌクレオチド配列によってコードされた第一の単一の重鎖ポリペプチド；及び配列番号：９８のヌクレオチド配列によってコードされた第二の単一の軽鎖ポリペプチド：を有する実施例＃７として記載されている、本発明の単離された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１１１】
本発明の他のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換によって突然変異しているが、配列番号：７７又は配列番号：７９又は配列番号：９７との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされた重鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：７７又は配列番号：７９又は配列番号：９７と比較したとき、１、２、３、４、又は５個以下のヌクレオチドが、ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換によって変化している突然変異体ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされた重鎖を含む。本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換によって突然変異しているが、配列番号：７８又は配列番号：８０又は配列番号：９８との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：７８又は配列番号：８０又は配列番号：９８と比較したとき、１、２、３、４、又は５個以下のヌクレオチドが、ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換によって変化している突然変異体ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖を含む。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）ＶＨ領域が、配列番号：２７、配列番号：２８、及び配列番号：２９：からなる群から選択される１以上のＣＤＲを含み、かつ／もしくはＶＬ領域が、配列番号：３１、配列番号：３２、及び配列番号：３３：からなる群から選択される１以上のＣＤＲを含むか、又は（ｂ）ＶＨ領域が、配列番号：４５、配列番号：４６、及び配列番号：４７：からなる群から選択される１以上のＣＤＲを含み、かつ／もしくはＶＬ領域が、配列番号：４９、配列番号：５０、及び配列番号：５１：からなる群から選択される１以上のＣＤＲを含むか、又は（ｃ）ＶＨ及び／もしくはＶＬ領域が、上記の（ａ）もしくは（ｂ）に記載されているような対応するＣＤＲ配列との少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセントの配列同一性を共有する１以上のＣＤＲを含む、本発明の単離された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１１３】
好ましい実施形態において、本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、（ａ）配列番号：２６及び配列番号：４４：からなる群から選択されるＶＨポリペプチド配列、並びに／又は（ｂ）配列番号：３０及び配列番号：４８：からなる群から選択されるＶＬポリペプチド配列、並びに／又は（ｃ）上記の（ａ）もしくは（ｂ）に記載されているような対応するＶＨもしくはＶＬ配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも９５パーセントの配列同一性を有するＶＨもしくはＶＬポリペプチド配列を含む。
【０１１４】
好ましい態様において、本発明はさらに、先に記載されているような少なくとも１つの可溶性タンパク質もしくは拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを交差遮断するか、又は該可溶性タンパク質もしくは拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙによって交差遮断される、或いは先に記載されているような可溶性タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙと同じエピトープに対する結合について競合する、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１１５】
機能的Ｆｕｓｏｂｏｄｙ
さらに別の実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列；重鎖及び軽鎖ヌクレオチド配列、又は上記パラグラフに記載されている特異的ＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、特に、表４に記載されている実施例＃４、＃５、＃６、及び＃７の対応するアミノ酸及びヌクレオチド配列に相同である重鎖及び軽鎖定常領域に融合したＳＩＲＰα結合ドメインを有し、ここで、該拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、上記パラグラフに記載されている特異的ＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、特に、表４に記載されている実施例＃４〜７のうちの少なくとも１つの実質的に同じ機能的特性を保持する。
【０１１６】
例えば、本発明は、重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含む単離された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供するものであり、ここで：この重鎖は、配列番号：２０、配列番号：２２、及び配列番号：４０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し；この軽鎖は、配列番号：２１、配列番号：２３、及び配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し；この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰα、及びＴＮＦα又はシクロスポリンＡのいずれかに特異的に結合し、また、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、インビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン株粒子刺激放出を阻害する。
【０１１７】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＲＰαに特異的に結合する」拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、実施例に記載の結合親和性アッセイの少なくとも１つにおいて、例えば、ＢｉａＣＯＲＥアッセイにおける表面プラズモン共鳴によって、０．０５［１／ｓ］以下のｋｏｆｆ（ｋｄ１）で、配列番号：１のヒトＳＩＲＰαポリペプチドに結合するＦｕｓｏｂｏｄｙを指すことが意図される。「ＳＩＲＰα以外のポリペプチドと交差反応する」拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、０．０５［１／s］以下のｋｏｆｆ（ｋｄ１）で、その他のポリペプチドに結合するＦｕｓｏｂｏｄｙを指すことが意図される。「特定のポリペプチドと交差反応しない」拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、同様の条件下でヒトＳＩＲＰαに対する該拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの結合親和性の測定単位となるｋｏｆｆ（ｋｄ１）よりも少なくとも１０倍高い、好ましくは、少なくとも１００倍高いｋｏｆｆ（ｋｄ１）で、そのポリペプチドに結合するＦｕｓｏｂｏｄｙを指すことが意図される。ある実施形態において、他のポリペプチドと交差反応しないそのようなＦｕｓｏｂｏｄｙは、標準的な結合アッセイでこれらのタンパク質に対する本質的に検出不可能な結合を示す。
【０１１８】
様々な実施形態において、Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、上で論じられた機能的特性の１つもしくは複数又は全てを示すことができる。
【０１１９】
他の実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、限定されないが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：５７のポリペプチド、又はＳＩＲＰα結合特性を保持するこれらの断片を含む、「ＳＩＲＰα結合ドメイン」に関連する上記パラグラフに記載されているＳＩＲＰα結合ドメインの特定の配列の少なくとも１つと５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得る。他の実施形態において、ＳＩＲＰα結合ドメインは、限定されないが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：５７のポリペプチド、又はＳＩＲＰα結合特性を保持するこれらの断片を含む、「ＳＩＲＰα結合ドメイン」に関連する上記パラグラフに記載されているＳＩＲＰα結合ドメインの特定の配列の少なくとも１つと、該特定の配列の１、２、３、４、又は５個以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除いて、同一であり得る。
【０１２０】
具体的に記載されているＳＩＲＰα結合ドメインと高い（すなわち、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれを上回る）同一性を有するＳＩＲＰα結合ドメインを有する拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、該特定のＳＩＲＰα結合ドメインをそれぞれコードする核酸分子を突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発）させ、その後、コードされる改変された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを、本明細書に記載されている機能アッセイを用いて、保持される機能（すなわち、上記の機能）について試験することによって得ることができる。
【０１２１】
他の実施形態において、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、上記のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの機能的特性の少なくとも１つを保持すると同時に、上記の特異的Ｆｕｓｏｂｏｄｙの実施例＃４〜７の重鎖及び軽鎖と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得る。配列番号：２０又は配列番号：２２又は配列番号：４０のいずれかの対応する重鎖及び配列番号：２１又は配列番号：２３又は配列番号：４１のいずれかの対応する軽鎖と、それぞれ、高い（すなわち、少なくとも８０％、９０％、９５％、又はそれを上回る）同一性を有する重鎖及び軽鎖を有するＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：７７、配列番号：７９、及び配列番号：９７の重鎖；並びに配列番号：７８、配列番号：８０、及び配列番号：９８の軽鎖；をそれぞれコードする核酸分子を突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発）させ、その後、コードされる改変されたＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙを、本明細書に記載されている機能アッセイを用いて、保持される機能（すなわち、上記の機能）について試験することによって得ることができる。
【０１２２】
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：１８と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の重鎖及び配列番号：１９と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の軽鎖を有する実施例＃４の変異体であり、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰαに特異的に結合し、また、このＦｕｓｏｂｏｄｙは、様々な細菌派生物、例えば、黄色ブドウ球菌コワン株粒子又はその他のものにより誘発されるインビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの放出を阻害する。
【０１２３】
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：２０と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の重鎖及び配列番号：２１と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の軽鎖を有する実施例＃５の変異体であり、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰαに特異的に結合し、また、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、以下の機能的特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）それは、様々な細菌派生物、例えば、黄色ブドウ球菌コワン株粒子又はその他のものにより誘発されるインビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、及び（ｉｉ）それは、ＴＮＦアルファに対する結合特異性を有する。
【０１２４】
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：２２と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の重鎖及び配列番号：２３と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の軽鎖を有する実施例＃６の変異体であり、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰαに特異的に結合し、また、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、以下の機能的特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）それは、様々な細菌派生物、例えば、黄色ブドウ球菌コワン株粒子又はその他のものにより誘発されるインビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、及び（ｉｉ）それは、ＴＮＦアルファに対する結合特異性を有する。
【０１２５】
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、配列番号：４０と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の重鎖及び配列番号：４１と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％同一の軽鎖を有する実施例＃７の変異体であり、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰαに特異的に結合し、また、この拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、以下の機能的特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）それは、様々な細菌派生物、例えば、黄色ブドウ球菌コワン株粒子又はその他のものにより誘発されるインビトロで作製された単球由来樹状細胞における炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、及び（ｉｉ）それは、シクロスポリンＡに対する結合特異性を有する。
【０１２６】
拡張型ＦｕｓｏｂｏｄｙのＦｃドメイン
Ｆｃドメインは、少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。本明細書で使用されるように、Ｆｃドメインという用語は、抗体の天然のＦｃ断片、例えば、ヒトＦｃ断片と比較して、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入が、１、２、３、４又は５つのアミノ酸位置で導入されているＦｃ変異体をさらに含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
ヒトにおける増大したインビボ半減期を有する可溶性コンストラクトを作製するためのＦｃドメインの使用は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｃａｐｏｎら（ＵＳ５，４２８，１３０号）に記載されている。一実施形態において、Ｆｕｓｏｂｏｄｙコンストラクト内に同様のＦｃ部分を使用することが提案される。しかしながら、本発明は、「Ｆｃ融合タンパク質」又は「イムノアドヘシン」と呼ばれることがある当技術分野の既知のタンパク質に関するものではないことが認識される。実際、「Ｆｃ融合タンパク質」又は「イムノアドヘシン」という用語は、通常、当技術分野において、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに直接融合しているが、ＣＬ又はＣＨ１領域の少なくともどちらかを含まない異種結合領域を指す。得られるタンパク質は、２つの異種結合領域を含む。Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＣＨ１領域のＮ末端に融合したＦｃ部分を含み、それにより、通常ＣＨ１及びＣＬジスルフィド結合を介して、軽鎖と相互作用することができる全長定常重鎖を再構成し得る。
【０１２８】
一実施形態において、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変する、例えば、増加又は減少させるように、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質のＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号（Ｂｏｄｍｅｒら）にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を、例えば、軽鎖及び重鎖の集合を促進するように、又は融合ポリペプチドの安定性を増加もしくは減少させるように改変する。
【０１２９】
別の実施形態において、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質のＦｃ領域を、その生物学的半減期を増大させるために修飾する。様々なアプローチが可能である。例えば、以下の位置：米国特許第６，２７７，３７５号に記載されている、２５２、２５４、２５６のうちの１つ又は複数を、例えば：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅに突然変異させることができる。
【０１３０】
さらに他の別の実施形態において、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質のＦｃ領域を、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することにより改変し、Ｆｃ部分のエフェクター機能を改変する。例えば、Ｆｃ部分がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するように、１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置換することができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１コンポーネントであることができる。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０１３１】
別の実施形態において、アミノ酸残基から選択される１以上のアミノ酸は、得られるＦｃ部分が、改変されたＣ１ｑ結合及び／又は低下もしくは消失した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基と置換することができる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）にさらに詳細に記載されている。
【０１３２】
別の実施形態において、１以上のアミノ酸残基を改変し、それにより、補体を固定するＦｃ領域の能力を改変する。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【０１３３】
さらに別の実施形態において、１以上のアミノ酸を修飾することにより、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質のＦｃ領域を修飾して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する融合ポリペプチドの能力を増加させ、及び／又はＦｃγ受容体に対するＦｃ領域の親和性を増加もしくは減少させる。このアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら，２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。
【０１３４】
一実施形態において、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質のＦｃドメインは、ヒト起源であり、免疫グロブリンのクラスのいずれか、例えば、ＩｇＧ又はＩｇＡ由来のもの、並びに任意のサブタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のキメラ由来のものであり得る。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、非ヒト動物、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ科動物、サメ、非ヒト霊長類、又はハムスター由来のものである。
【０１３５】
ある実施形態において、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質において使用する。いくつかの具体的な実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片の突然変異体型変異体、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介し、及び／又はＦｃγ受容体に結合する融合ポリペプチドの能力を低下もしくは消失させるサイレントＩｇＧ１  Ｆｃを使用する。ＩｇＧ１アイソタイプのサイレント突然変異体の例は、Ｈｅｚａｒｅｈら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２００１  Ｄｅｃ；７５（２４）：１２１６１−８）によって記載されているように、ロイシン残基が、アミノ酸位置２３４及び２３５でアラニン残基に置換されている、いわゆるＬＡＬＡ突然変異体である。ＩｇＧ１アイソタイプのサイレント突然変異体の別の例は、Ｄ２６５Ａ突然変異、及び／又はＰ３２９Ａ突然変異を含む。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの位置２９７の残基でのグリコシル化、例えば、Ｆｃドメインの位置２９７のアスパラギン残基のアミノ酸置換を妨げる突然変異体である。そのようなアミノ酸置換の例は、グリシン又はアラニンによるＮ２９７の置換である。
【０１３６】
別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来する。
【０１３７】
一実施形態において、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又はＳＩＲＰα結合タンパク質のＦｃドメインは、好ましくは、そのようなＦｃドメインを含む２つの融合ポリペプチド間の共有結合的ジスルフィド架橋を作ることができるシステインを介する二量体化ドメインを含む。
【０１３８】
グリコシル化修飾
また別の実施形態において、特に、ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを含む、本発明の可溶性タンパク質のグリコシル化パターンを、典型的な哺乳動物グリコシル化パターン、例えば、ＣＨＯ又はヒト細胞株で得られるものと比較して改変することができる。例えば、非グリコシル化タンパク質は、グリコシル化を欠くように操作されている宿主細胞又は哺乳動物細胞として原核細胞株を用いることによって作製することができる。炭水化物修飾は；例えば、ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ内の１以上のグリコシル化部位を改変することによって達成することもできる。
【０１３９】
さらに又は代わりに、改変されたグリコシル化タイプを有するグリコシル化タンパク質を作製することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で本発明の可溶性タンパク質を発現させることによって達成することができる、すなわち、可溶性タンパク質のグリコシル化パターンを、対応する野生型細胞で観察されるグリコシル化パターンと比較して改変する。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野で記載されており、組換え可溶性タンパク質を発現し、それにより、改変されたグリコシル化を有するそのような可溶性タンパク質を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、ＥＰ１，１７６，１９５号（Ｈａｎｇら）には、そのような細胞株で発現された糖タンパク質が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。ＷＯ０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、その宿主細胞内で発現される糖タンパク質の低フコシル化ももたらす変異体ＣＨＯ細胞株である、Ｌｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌら，２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照されたい）。或いは、可溶性タンパク質を、哺乳動物様グリコシル化パターンを得るために操作された、酵母、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、又は糸状菌、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）で産生することができる（例えば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１号を参照されたい）。これらの糖鎖改変された宿主細胞の利点は、とりわけ、均質なグリコシル化パターン及び／又は高い収量を有するポリペプチド組成物を提供することである。
【０１４０】
ペグ化可溶性タンパク質及び他のコンジュゲート
可溶性タンパク質又は本発明の別の実施形態は、ペグ化に関するものである。本発明の可溶性タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ペグ化することができる。ペグ化は、ペグ化されていない同じ生物製剤と比較して、得られる生物製剤の生物学的（例えば、血清）半減期を増大させる周知の技術である。ポリペプチドをペグ化するために、ポリペプチドを、通常、１以上のＰＥＧ基がポリペプチドに結合されるようになる条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって実施することができる。本明細書で使用されるように、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれか、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを包含することが意図される。タンパク質をペグ化する方法は、当技術分野で公知であり、本発明の可溶性タンパク質に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６号及びＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４号を参照されたい。
【０１４１】
代替のコンジュゲート又はポリマー担体を用いて、特に、得られるコンジュゲートの薬物動態特性を改善することができる。ポリマー担体は、少なくとも１つの天然又は合成の分岐状、線状、又は樹状ポリマーを含み得る。ポリマー担体は、好ましくは、水及び体液中で可溶性であり、好ましくは、医薬として許容し得るポリマーである。水溶性ポリマー部分としては、例えば、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、例えば、ＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（ここで、該ホモポリマー及びコポリマーは、非置換であるか、又は一方の末端において、例えば、アシル基と置換されている）；ポリグリセリン又はポリシアル酸；炭水化物、多糖、セルロース、及びセルロース誘導体、例えば、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース；デンプン（例えば、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、とりわけ、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）及びデキストリン、並びにこれらの誘導体；デキストラン及びデキストラン誘導体、例えば、デキストラン硫酸、架橋デキストリン、及びカルボキシメチルデキストリン；キトサン（線状多糖）、ヘパリン及びヘパリンの断片；ポリビニルアルコール及びポリビニルエチルエーテル；ポリビニルピロリドン；アルファ、ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド；並びにポリオキシ−エチル化ポリオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
薬剤としてのＳＩＲＰα結合タンパク質の使用
拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、及び特に、本発明のＳＩＲＰα結合可溶性タンパク質を薬剤として用いて、特に、炎症性応答及び／又は自己免疫応答、特に、対象におけるＳＩＲＰα＋細胞によって媒介される応答を（統計的に又は生物学的に有意な様式で）減少させるか又は抑制することができる。細胞毒性剤にコンジュゲートされているか、又はＦｃ部分によって提供される殺細胞エフェクター機能を有する場合、ＳＩＲＰα結合を、癌障害又は腫瘍、例えば、特に、骨髄リンパ増殖性疾患、例えば、急性骨髄リンパ増殖性（ＡＭＬ）障害又は膀胱癌の治療、減少、又は抑制において有利に使用することもできる。
【０１４３】
本発明の可溶性タンパク質をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、限定されないが、例えば、実施例の表４に記載されている拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙに関連した実施形態を含む、本発明の可溶性タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は、可溶性タンパク質の１つのヘテロダイマーの少なくとも１つの単鎖ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙをコードするヌクレオチド配列の非限定的な例は、各々の対がＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖をそれぞれコードする、配列番号：７７及び配列番号：７８；又は配列番号：７９及び配列番号：８０；又は配列番号：９７及び配列番号：９８を含む。
【０１４４】
核酸は、全細胞中、細胞ライセート中に存在し得るか、又は部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態の核酸であり得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他のものを含む、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から精製分離されたときに、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」ものとなる。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編．１９８７  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、イントロン配列を含有していても、含有していなくてもよい。一実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクター中、又は組換えプラスミドベクター中に存在していてもよい。したがって、本発明は、単離された核酸、又は配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：９７、及び配列番号：９８：からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含むクローニングもしくは発現ベクターを提供する。
【０１４５】
上記及び実施例の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型ＦｕｓｏｂｏｄｙをコードするＤＮＡ断片を、例えば、発現系における適切な分泌のための任意のシグナル配列、任意の精製タグ、及びさらなる精製工程のための切断可能なタグを含むように、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、ＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子に、又は別のタンパク質をコードする断片、例えば、精製／分泌タグもしくは柔軟なリンカーに機能的に連結される。この文脈において使用される「機能的に連結される」という用語は、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームの状態で維持されるように、又はタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、２つのＤＮＡ断片が機能的な形で接続されることを意味することが意図される。
【０１４６】
ＳＩＲＰα結合タンパク質及び拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の可溶性タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマで産生することができる。宿主細胞トランスフェクトーマで組換え拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを発現させる及び産生するために、当業者は、抗体分子又は抗体様分子の発現及び組換え産生に関連する自らの一般知識を有利に使用することができる。本発明は、本発明の可溶性タンパク質又はタンパク質複合体の産生に好適な組換え宿主細胞であって、該タンパク質の該ヘテロダイマーの該第一及び第二の単鎖ポリペプチド、並びに任意に分泌シグナルをコードする核酸を含む、組換え宿主細胞を提供する。
【０１４７】
一態様において、組換え宿主細胞は、ゲノム中に安定に組み込まれた配列番号：７７及び配列番号：７８；又は配列番号：７９及び配列番号：８０；又は配列番号：９７及び配列番号：９８の核酸を含む。好ましい態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞株である。本発明は、先に記載されているような、本発明の可溶性タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合タンパク質もしくは拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、又はタンパク質複合体の産生のためのプロセスであって、宿主細胞を、可溶性タンパク質又はタンパク質複合体の産生のための適切な条件下で培養すること、及び該タンパク質を単離することを含む、プロセスを提供する。
【０１４８】
例えば、本発明の可溶性タンパク質又はその中間体を発現させるために、対応するポリペプチドをコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅又は関心対象のポリペプチドを発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、また、これらのＤＮＡを、対応する遺伝子が転写及び翻訳制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。本発明の可溶性タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ又は中間体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、標準的な方法（例えば、遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。さらに又は代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチド鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。遺伝子は、シグナルペプチドがポリペプチド鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローニングすることができる。ＳＩＲＰα結合領域としてＣＤ４７由来配列を有する具体的な実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ４７シグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、天然ではＣＤ４７配列と関連しないシグナルペプチド）であることができる。
【０１４９】
ポリペプチドをコードする配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。「調節配列」という用語は、ポリペプチド鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９０）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどのような因子に左右され得ることが当業者に理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列としては、哺乳動物細胞内で高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。或いは、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーター又はＰ−グロビンプロモーターを使用することができる。またさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復とに由来する配列を含むＳＲａプロモーター系などの、異なる供給源由来の配列から構成される（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら，１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【０１５０】
これに加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子を担持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞内で使用される）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【０１５１】
タンパク質の発現のために、可溶性タンパク質又は中間体、例えば、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖配列をコードする発現ベクターを、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の可溶性タンパク質を発現させることが理論的に可能である。真核細胞、特に、哺乳動物宿主細胞における糖タンパク質の発現が論じられているが、それは、そのような真核細胞、及び特に、哺乳動物細胞が、適切に折り畳まれ、かつ生物学的に活性のある糖タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを会合させ、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。
【０１５２】
拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、抗体分子のために開発された周知の発現系を用いて有利に産生することができる。二重可変ドメインを含む先行技術の分子と比べた本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの利点の１つは、抗原／標的特異性を、天然の又は天然に近い哺乳動物結合ドメイン配列と、抗体により提供されるＶＨ及びＶＬ配列との組合せを用いて達成することができるということである。可溶性タンパク質は、ヘテロダイマー１つ当たり１組のＶＨ及びＶＬ配列しか含まないので、これらの領域を哺乳動物結合分子の関連領域の近くに配置することは、２組（又はそれより多くの組）のＶＨ及びＶＬ配列を配置するときに必要とされることよりも重要でない。したがって、任意のリンカー配列の利用及び最適化に関して、またさらに、宿主細胞内でのヘテロダイマーの発現に関して、本発明の可溶性タンパク質は、単純さの増加及び産生の容易さを提供し、分子生物学を用いるより単純な操作を必要とする。言い換えれば、本発明の可溶性タンパク質内に含まれる配列の間隔を最適化する必要はあまりないが、それでも、必要とされる機能性を保持している。これは、二重特異性が２組のＶＨ及びＶＬドメインを用いて達成される分子と対比させることができ、その場合、そのそれぞれの立体構造及び互いに対する配置がより重要となることがあり、それゆえ、より大きな空間的最適化を必要とする。
【０１５３】
可溶性タンパク質及び中間体、例えば、本発明のＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖を発現させるための哺乳動物宿主細胞としては、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，１９８２  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているような、ＤＨ  ＦＲ選択マーカーとともに使用される、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されている）を含む、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞、又はヒト細胞株（ＰＥＲ−Ｃ６細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ、もしくはＨＥＫ２９３細胞を含む。Ｙｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ３０，Ｎｏ  ２  ｅ９）が挙げられる。ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、可溶性タンパク質及び中間体、例えば、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖は、宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現又は宿主細胞が成長する培養培地中への組換えポリペプチドの分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。その後、ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
【０１５４】
多価ＳＩＲＰα結合タンパク質
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの同一の又は異なる本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質を含む、例えば、複合体の形態の、多価タンパク質を提供する。一実施形態において、多価タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、又は４つの本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質を含む。可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質は、タンパク質融合又は共有結合もしくは非共有結合を介して連結させることができる。本発明の多価タンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いて構成成分の結合特異性をコンジュゲートさせることによって、調製することができる。例えば、多価タンパク質の各々の結合特異性を別々に生成させ、その後、互いにコンジュゲートさせることができる。
【０１５５】
種々のカップリング剤又は架橋剤を共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら，１９８４  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡら，１９８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照されたい）。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅら，１９８７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）に記載されているものが挙げられる。共有結合は、２つのシステイン間のジスルフィド架橋、例えば、Ｆｃドメインのシステイン由来のジスルフィド架橋によって得ることができる。
【０１５６】
コンジュゲート型ＳＩＲＰα結合タンパク質
別の態様において、本発明は、治療的部分、例えば、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）、又は放射性毒素にコンジュゲートされた、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、特に、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを特徴とする。そのようなコンジュゲートは、本明細書において、「コンジュゲート型拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」又は「コンジュゲート型ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ」と呼ばれる。細胞毒素又は細胞毒性剤には、細胞にとって有害である（例えば、細胞を死滅させる）任意の薬剤が含まれる。そのような薬剤は、抗体のコンジュゲート又は免疫コンジュゲートを調製するために使用されている。そのような技術は、コンジュゲート型拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、特に、コンジュゲート型ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙとともに有利に適用することができる。細胞毒素又は細胞毒性剤の例としては、タキソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又はホモログが挙げられる。また、治療剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、切除剤（ａｂｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラクスンブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｘｎｂｕｃｉｌ）、メイファラン（ｍｅｉｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名、ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
【０１５７】
本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙにコンジュゲートさせることができる治療的細胞毒素の他の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシン、及びアウリスタチン、並びにこれらの誘導体が挙げられる。
【０１５８】
サイトキシンは、当技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて、本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙにコンジュゲートさせることができる。細胞毒素を本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙにコンジュゲートさせるために使用されているリンカータイプの例としては、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、及びペプチド含有リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低いｐＨによって切断されやすいか、又はプロテアーゼ、例えば、腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼ、例えば、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）によって切断されやすいリンカーを選択することができる。
【０１５９】
細胞毒素の種類、治療剤を抗体にコンジュゲートさせるためのリンカー及び方法のさらなる考察については、Ｓａｉｔｏ，Ｇ．ら，２００３  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５；Ｔｒａｉｌ，Ｐ．Ａ．ら，２００３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．，２００３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，２００２  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，２００２  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．，２００１  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４も参照されたい。
【０１６０】
本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを放射性同位体にコンジュゲートさせて、細胞毒性のある放射性医薬品を生成させることができる。診断的又は治療的に使用される本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙにコンジュゲートさせることができる放射性同位体の例としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、及びルテチウム１７７が挙げられるが、これらに限定されない。放射性免疫コンジュゲートを調製するための方法は、当技術分野で確立されている。放射性免疫コンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含め、市販されており、同様の方法を用いて、発明の本発明のＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを用いた放射性医薬品を調製することができる。さらに、毒素又は放射性同位体を抗体にコンジュゲートさせるための技術は周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）における、Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）における、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、及びＴｈｏｒｐｅら，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｎｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０１６１】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、１以上の医薬として許容し得るビヒクル又は担体とともに製剤化された、本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの１つ又は組合せを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【０１６２】
本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを含む医薬製剤は、所望の純度を有するタンパク質と、任意の生理的に許容し得る担体、賦形剤、又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版（２０００））とを、水溶液、凍結乾燥製剤、又は他の乾燥製剤の形態で混合することによって、貯蔵用に調製することができる。本発明はさらに、少なくとも本発明の可溶性タンパク質、例えば、本発明のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ及び１以上の適切な医薬として許容し得る担体を含む凍結乾燥組成物に関する。本発明はまた、少なくとも本発明の可溶性タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ及び１以上の適切な医薬として許容し得る担体又はビヒクルを含む液体製剤で予め満たされたシリンジに関する。
【０１６３】
医薬組成物は、少なくとも１つの他の活性成分をさらに含むことができる。したがって、本発明の医薬組成物は、併用療法で投与する、すなわち、他の薬剤と組み合わせることもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の活性成分、例えば、抗炎症剤又は別の化学療法剤と組み合わせた、本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを含むことができる。併用療法で使用することができる治療剤の例は、本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質の使用に関する節において、以下でより詳細に説明されている。
【０１６４】
本明細書で使用されるように、「医薬として許容し得る担体」又は「医薬として許容し得るビヒクル」としては、生理的に適合性がある任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適であるべきである。投与経路に応じて、活性成分は、それを酸の作用、及び活性成分を不活性化し得る他の自然条件から保護する材料でコーティングされ得る。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は、１以上の医薬として許容し得る塩を含み得る。「医薬として許容し得る塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ任意の望ましくない毒物学的効果を与えない塩を示す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら，１９７７  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、並びに非毒性有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などに由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、及び非毒性有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものが挙げられる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容し得る抗酸化剤も含み得る。医薬として許容し得る抗酸化剤の例としては：水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；及び金属キレート化剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１６７】
本発明の医薬組成物で利用され得る好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合、所要の粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０１６８】
これらの組成物は、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤も含み得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌処置と様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方によって保証され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの含有によってもたらされ得る。
【０１６９】
医薬として許容し得る担体としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１７０】
治療組成物は、通常、製造及び貯蔵の条件下において滅菌性でかつ安定でなければならない。組成物は、高薬物濃度に好適な溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒又は分散媒体、並びにこれらの好適な混合物であることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合、所要の粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１７１】
滅菌注射可能溶液は、所要量の可溶性タンパク質、例えば、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを、適切な溶媒中で、上に列挙した成分の１つ又は組合せとともに組み込み、必要に応じて、その後、滅菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性成分を、基礎分散媒体及び上に列挙されているもの由来の所要の他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の方法は、活性成分に任意の追加の所望の成分を加えた粉末を、事前に滅菌濾過したその溶液から生じさせる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１７２】
単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象、及び特定の投与様式によって異なる。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、通常、治療効果を生じる組成物の量である。通常、１００％のうち、この量は、医薬として許容し得る担体と組み合わせて、約０．０１％から約９９％の活性成分、約０．１％から約７０％、又は約１％から約３０％の活性成分の範囲である。
【０１７３】
投薬レジメンを調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供する。例えば、単回ボーラスを投与することができ、数回の分割用量を長時間かけて投与することができ、又は用量を、治療状況の緊急性によって示される場合、比例的に減少もしくは増加させることができる。投与の容易さ及び投薬量の均一性を求めて、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療されるべき対象に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し；各々の単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を所要の医薬担体を伴って含む。本発明の投薬単位形態のための仕様は、活性化合物の固有の特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個体における感受性を処置するためのそのような活性化合物を配合する分野に固有の限界により決定され、それらに直接左右される。
【０１７４】
本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの投与のために、投薬量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であることができる。例示的な治療レジメンは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１カ月に１回、３カ月毎に１回、又は３〜６カ月毎に１回の投与を必要とする。本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙに対する投薬レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、タンパク質は、以下の投与スケジュール：４週間毎に６回投薬、その後、３カ月毎；３週間毎；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後、１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間毎のうちの１つを用いて投与される。
【０１７５】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、通常、複数回投与される。１回の投薬の間の間隔は、例えば、１週間、１カ月、３カ月毎、又は１年であることができる。間隔は、患者における可溶性ポリペプチド／タンパク質の血液レベルを測定することで示されるように不規則であることもできる。いくつかの方法では、約０．１〜１０００μｇ／ｍｌ、また、いくつかの方法では、約５〜３００μｇ／ｍｌの血漿ポリペプチド濃度を達成するように投薬量が調整される。
【０１７６】
或いは、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、持続放出製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。投薬量及び頻度は、患者における可溶性タンパク質の半減期によって異なる。投薬量及び投与頻度は、処置が予防的であるか、それとも治療的であるかによって異なり得る。予防的適用では、比較的低い投薬量が、比較的少ない間隔で長期間にわたって投与される。患者の中には、その人生の残りの間ずっと処置を受け続ける者もいる。治療的適用では、疾患の進行が低下もしくは終了するまで、又は患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が必要とされる場合がある。その後、患者に、予防レジメンを施すことができる。
【０１７７】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性がなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るように変化させることができる。選択される投薬量レベルは、利用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、利用される特定の化合物の排泄速度、処置の持続期間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／もしくは材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、及び以前の病歴、並びに医療分野で周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態因子によって決まる。
【０１７８】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの「治療的有効投薬量」は、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度及び持続期間の増加、又は疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防をもたらすことができる。
【０１７９】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法のうちの１つ又は複数を用いて、１以上の投与経路によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果によって異なる。本発明の可溶性タンパク質の投与経路としては、例えば、注射又は注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常、注射による、腸内及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、眼内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）への注射及び注入を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
或いは、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、局所、表皮、又は粘膜投与経路などの経口的でない経路により、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、舌下、又は局所に投与することができる。
【０１８１】
活性成分は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤のように、タンパク質を急速な放出から保護する担体とともに調製することができる。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、公表されているか、又は一般に当業者に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１８２】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療装置で投与することができる。例えば、一実施形態において、本発明の治療組成物は、無針皮下注射装置、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号、又は第４，５９６，５５６号に示されている装置で投与することができる。本発明で有用な周知のインプラント及びモジュールの例としては：制御された速度で医薬を分配するための埋込み型微小注入ポンプを示す、米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して薬剤を投与するための治療装置を示す、米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを示す、米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流埋込み型注入装置を示す、米国特許第４，４４７，２２４号；多チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す、米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物送達系を示す、米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のそのようなインプラント、送達系、及びモジュールが、当業者に公知である。
【０１８３】
ある実施形態において、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物が（所望の場合に）ＢＢＢを越えることを確実にするために、それらを、例えば、リポソームに入れて製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；及び第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に輸送され、それにより、標的薬物送達を増強する、１以上の部分を含み得る（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ，１９８９  Ｊ．Ｃｌｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。
【０１８４】
本発明の使用及び方法
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、インビトロ及びインビボでの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養下の細胞に、例えば、インビトロもしくはインビボで、又は対象内の細胞に、例えば、インビボで投与して、種々の障害を治療、予防、又は診断することができる。一実施形態において、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、別の場合には拡大を妨げる他の細胞型の存在下で、幹細胞又は膵臓ベータ細胞のような他の細胞型のインビトロ拡大において使用することができる。さらに、特に、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを用いて、生物体、例えば、ヒトの生物学的試料由来の細胞の細胞表面での機能性ＳＩＲＰαの発現をインビトロで定性化及び定量化する。市販のＳＩＲＰα抗体がＳＩＲＰβの様々なアイソフォームと交差反応し、細胞表面でのＳＩＲＰαタンパク質発現を明確に定量化することを困難にするので、本出願は有用であり得る。したがって、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの定量化を診断目的で用いて、例えば、ＳＩＲＰαタンパク質発現の量と免疫障害又は癌障害との相関関係を評価することができ、したがって、例えば、ＳＩＲＰαに対して標的化されたコンジュゲート型ＳＩＲＰα結合タンパク質又は抗体に基づく療法による治療のための患者の選択（患者の層別化）を可能にする。
【０１８５】
本方法は、ＳＩＲＰα＋細胞によって媒介される自己免疫障害及び炎症性障害、例えば、アレルギー性喘息又は潰瘍性大腸炎を治療、予防、又は診断するのに特に好適である。これらには、急性及び慢性炎症状態、アレルギー及びアレルギー状態、自己免疫疾患、虚血性疾患、重度の感染症、並びに非ヒト組織の移植（異種移植）を含む細胞又は組織又は器官の移植拒絶反応が含まれる。本方法は、ＣＤ４７に反応性であり、かつＣＤ４７又は他のＳＩＲＰαリガンドへの結合を介して機能不全に陥る活性化ＳＩＲＰβ受容体の異常な又は突然変異した変種を発現する細胞によって媒介される自己免疫障害及び炎症性障害又は悪性障害を治療、予防、又は診断するのに特に好適である。
【０１８６】
自己免疫疾患の例としては、関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎、及び変形性関節炎）並びにリウマチ性疾患、例えば、骨量減少を伴う炎症状態及びリウマチ性疾患、炎症性疼痛、脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、例えば、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、及び腸疾患性関節炎（ｅｎｔｅｒｏｐｈａｔｈｉｓ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、過敏症（気道過敏症と皮膚過敏症の両方を含む）、並びにアレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、及び特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｏｍａ）、ウェゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、内分泌眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季カタル、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、並びに糸球体腎炎（例えば、痛風、ランゲルハンス細胞組織球増加症、特発性ネフローゼ症候群、又は微小変化型腎症を含む、ネフローゼ症候群を伴うもの、及びこれらを伴わないもの）、腫瘍、多発性硬化症、皮膚及び角膜の炎症性疾患、筋炎、骨のインプラントの緩み、代謝障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、及び脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）が挙げられる。
【０１８７】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫、及び気道の他の閉塞性又は炎症性疾患の治療、予防、又は改善にも有用である。
【０１８８】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、免疫系媒介性又は炎症性筋疾患、例えば、冠状動脈筋疾患（ｃｏｒｏｎａｒ  ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）の治療、予防、又は改善にも有用である。
【０１８９】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＳＩＲＰαを発現する内皮又は平滑筋系を侵す疾患の治療、予防、又は改善にも有用である。
【０１９０】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＩｇＥ媒介性障害の治療にも有用である。ＩｇＥ媒介性障害は、多くの一般的な天然の吸入抗原及び摂取抗原に対して免疫学的に応答する遺伝的性向、並びにＩｇＥ抗体の継続的な産生を特徴とするアトピー性障害を含む。具体的なアトピー性障害としては、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、及びアレルギー性胃腸疾患が挙げられる。
【０１９１】
しかしながら、ＩｇＥレベルの上昇と関連する障害は、遺伝的な（アトピー性の）病因を有するものに限定されない。ＩｇＥ媒介性であると思われ、本発明の製剤で治療可能であるＩｇＥレベルの上昇と関連する他の障害としては、過敏症（例えば、アナフィラキシー過敏症）、湿疹、蕁麻疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫症、高ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫、及び移植片対宿主反応が挙げられる。
【０１９２】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、炎症性経路が、ＳＩＲＰα＋細胞、例えば、活性化ミクログリア細胞によって媒介される主神経系を侵す急性疾患の一次治療として有用である。例えば、特定の用途は、治癒を加速させ、神経系の一部に自己反応性があるリンパ球構造及び抗体の形成を予防するための、脊髄損傷後の活性化ミクログリア細胞のサイレンシングであることができる。
【０１９３】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、単独の活性成分として、或いは他の薬物、例えば、免疫抑制剤もしくは免疫調節剤又は他の抗炎症剤とともに、例えば、それらに対するアジュバントとして、又はそれらと組み合わせて、例えば、上述の疾患の治療又は予防のために投与することができる。例えば、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ＤＭＡＲＤ、例えば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６；リンパ球再循環のモジュレーター、例えば、ＦＴＹ７２０及びＦＴＹ７２０類似体；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、又はＴＡＦＡ−９３；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えば、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスパルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎｅ）又はその免疫抑制性ホモログ、類似体、もしくは誘導体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調節化合物、例えば、ＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えば、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１もしくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト、又はＶＬＡ−４アンタゴニスト；或いは化学療法剤、例えば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラスチン、ドキソルビシン、又は５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えば、ＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、又はＴＮＦ−ＲＩもしくはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体コンストラクト、例えば、エタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症促進性サイトカインの遮断薬、ＩＬ−１遮断薬、例えば、アナキンラ又はＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６遮断薬；ケモカイン遮断薬、例えば、プロテアーゼの阻害剤又は活性化剤、例えば、メタロプロテアーゼ、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＩＬ１７抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１２Ｒ抗体、抗ＩＬ２３抗体、抗ＩＬ２３Ｒ抗体、抗ＩＬ２１抗体、ＮＳＡＩＤ、例えば、アスピリン、イブプロフェン、パラセタモール、ナプロキセン、選択的Ｃｏｘ２阻害剤、ジクロフェナクのようなＣｏｘ１阻害剤及びＣｏｘ２阻害剤の組合せ、又は抗感染剤と組み合わせて使用することができる（リストは、上記の薬剤に限定されない）。
【０１９４】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙはまた、特に、閉塞性又は炎症性気道疾患、例えば、上述のものの治療において、抗炎症薬又は気管支拡張薬とともに使用するための共治療剤として、例えば、そのような薬物の治療活性の増強剤として、又はそのような薬物の所要の投薬量もしくは潜在的副作用を低下させる手段として有用である。本発明の薬剤は、固定医薬組成物中で抗炎症薬もしくは気管支拡張薬と混合することができるか、又はそれは、抗炎症薬もしくは気管支拡張薬と別々に、その前に、同時に、又はその後に投与することができる。そのような抗炎症薬としては、ステロイド、特に、グルココルチコステロイド、例えば、ブデソニド、ベクロメタゾン、フルチカゾン、又はモメタゾン、及びドーパミン受容体作動薬、例えば、カベルゴリン、ブロモクリプチン、又はロピニロールが挙げられる。そのような気管支拡張薬としては、抗コリン剤又は抗ムスカリン剤、特に、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、及び臭化チオトロピウムが挙げられる。
【０１９５】
本発明の薬剤とステロイドの組合せは、例えば、ＣＯＰＤ又は特に、喘息の治療において使用することができる。本発明の薬剤と抗コリン剤もしくは抗ムスカリン剤又はドーパミン受容体作動薬の組合せは、例えば、喘息又は特に、ＣＯＰＤの治療において使用することができる。
【０１９６】
上記に従って、本発明はまた、閉塞性又は炎症性気道疾患の治療のための方法であって、それを必要とする対象、特に、ヒト対象に、上記の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを投与することを含む、方法を提供する。別の態様において、本発明は、閉塞性又は炎症性気道疾患の治療用の薬剤の調製において使用される上記の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０１９７】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙはまた、慢性胃腸炎、例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患の治療、予防、又は改善に特に有用である。
【０１９８】
「慢性胃腸炎」は、比較的長い期間の発症を特徴とし、持続性であり（例えば、数日、数週間、数カ月、又は数年から対象の一生まで）、単核細胞の浸潤又は流入と関連する胃腸管の粘膜の炎症を指し、これは、自然寛解及び自然発生の期間とさらに関連することがある。したがって、慢性胃腸炎を有する対象は、長期間の監視、観察、又は世話を必要とすると考えることができる。そのような慢性炎症を有する「慢性胃腸炎状態」（「慢性胃腸炎疾患」とも呼ばれる）としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、外界からの刺激によって誘導される大腸炎（例えば、治療レジメン、例えば、化学療法、放射線療法などの投与によって引き起こされるか、又は該投与と関連する（例えば、副作用としての）胃腸炎（例えば、大腸炎））、慢性肉芽腫症などの状態の大腸炎（Ｓｃｈａｐｐｉら  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ．２００１  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１９８４（２）：１４７−１５１）、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ）（腸の内層が、グルテンとして知られるタンパク質の摂取に応答して炎症を起こす遺伝性疾患）、食物アレルギー、胃炎、感染性胃炎、又は腸炎（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）感染性慢性活動性胃炎）、及び感染性因子によって引き起こされる胃腸炎の他の形態、並びに他の同様の状態が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１９９】
本明細書で使用されるように、「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は、腸の全て又は一部の炎症を特徴とする種々の疾患のいずれかを示す。炎症性腸疾患の例としては、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書を通したＩＢＤへの言及は、本明細書において胃腸炎状態の例示として言及されることが多いが、限定を意図するものではない。
【０２００】
上記に従って、本発明は、慢性胃腸炎又は炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎の治療のための方法であって、それを必要とする対象、特に、ヒト対象に、上記の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを投与することを含む、方法も提供する。別の態様において、本発明は、慢性胃腸炎又は炎症性腸疾患の治療用の薬剤の製造において使用される上記の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙを提供する。
【０２０１】
本発明は、白血病又は他の癌障害の治療、予防、又は改善においても有用である。例えば、本発明の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質は、白血病における細胞枯渇又はアポトーシスを誘導し得る。可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、膀胱癌、悪性型のランゲルハンス細胞組織球増加症から選択される癌障害の治療、予防、又は改善において使用することができる。
【０２０２】
ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用の調節を用いて、造血幹細胞生着を増加させることができる（例えば、ＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の使用に関連するＷＯ２００９／０４６５４１号を参照されたい）。したがって、本発明、及び例えば、可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、ヒト造血幹細胞生着を増加させるために有用である。造血幹細胞生着を用いて、造血欠陥に、又は遺伝性免疫不全症、自己免疫障害、もしくは造血障害に罹患しているか、或いは何らかの骨髄機能廃絶処置を受けた患者の症状を治療又は軽減することができる。例えば、そのような造血障害は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、赤芽球癆、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニー貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球増加症、及び先天性代謝異常から選択される。したがって、一実施形態において、本発明は、造血幹細胞生着を改善するために、特に造血幹細胞を含む拡大された細胞集団による処置後の、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、赤芽球癆、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニー貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球増加症、及び先天性代謝異常から選択される造血障害を治療する際に使用される可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又はＦｕｓｏｂｏｄｙに関する。
【０２０３】
また、本発明の範囲に包含されるのは、治療的有効量の可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、及び少なくとも１つの第２の原薬の、例えば、同時の又は連続的な、共投与を含む、上で定義されている方法であって、該第２の原薬が、例えば、上で示したような、免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症性化学療法薬、又は抗感染症薬である方法である。
【０２０４】
また、本発明の範囲に包含されるのは、治療的有効量のａ）可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ、及びｂ）例えば、上で示したような、免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症性化学療法薬、又は抗感染症薬から選択される少なくとも１つの第２の物質を含む、治療的組合せ、例えば、キットである。キットは、その投与のための指示書を含み得る。
【０２０５】
可溶性ＳＩＲＰα結合タンパク質又は拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙが、他の免疫抑制療法／免疫調節療法、抗炎症性化学療法、又は抗感染症療法とともに投与される場合、共投与される組合せ化合物の投薬量は、当然、利用される共薬物の種類、治療される状態などによって様々に異なるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】非拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ及び参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子と比較した、ＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの実施例の略図。
【図２Ａ】参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子（実施例＃９）の固定化されたヒトＳＩＲＰαに対する結合。
【図２Ｂ】ＣＤ４７及びＴＮＦα特異性を有する拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃５）の固定化されたヒトＳＩＲＰαに対する結合。
【図３】ＣＤ４７特異性を有する非拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃２）及び抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（実施例＃８）と比較した、ＣＤ４７及びＴＮＦαに対する特異性を有する拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃５及び＃６）の固定化された組換えヒトＴＮＦαに対する結合。
【０２０７】
本発明は十分に説明されており、以下の実施例及び特許請求の範囲でさらに説明されるが、これは、例示的なものであり、さらに限定的であることを意図するものではない。
【実施例】
【０２０８】
実施例
１．本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの実施例
以下の表４には、開示された拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いた組換え法によって生成させることができる本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの実施例（実施例＃４、＃５、＃６、及び＃７）が提供されている。この表には、非拡張型形式を有するＦｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃２及び＃３）、並びに参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子（実施例＃１及び＃９）、並びに市販の従来型抗ＴＮＦ抗体（実施例＃８）がさらに含まれる。
【０２０９】
【表４−１】
2014519338.tif 000006
【表４−２】
2014519338.tif 000007
【表４−３】
2014519338.tif 000008
【０２１０】
２．親和性決定
２．１．ＳＩＲＰαに対する結合アッセイ（ＢｉａＣＯＲＥアッセイ）
ＳＩＲＰα結合部分を有する拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの二価組換えＳＩＲＰαに対する結合力を、表面プラズモン共鳴によって特徴付けることができる。このために、ヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を、ぞれぞれ、ＥＤＣ／ＮＨＳ又はエタノールアミンのような標準的な処置による表面活性化／不活化の後、プロテインＡを介して、ＣＭ５（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）のようなＢｉａＣＯＲＥチップ上に固定化することができる。評価は、注入されたＳＩＲＰα結合部分を有する拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの１２０秒間の接触時間、２４０秒間の解離時間、及び５０μｌ／分の流速によって行なうことができる。解析物の各々の注入の後、チップを穏やかな溶出バッファー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で再生することができる。
【０２１１】
２．２  固定化抗原に対する結合アッセイ
拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙが下層の抗体スキャフォールドの一次抗原に（或いは、ヒューズオン（ｆｕｓｅｄ−ｏｎ）受容体ドメインのリガンドに）結合する能力を、ＤＥＬＦＩＡベースの方法によって試験することができる。図３に示すＣＤ４７−ＴＮＦα拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃５及び＃６）について、これは、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．６（ＰＢＳ，Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＨ）中の１〜３μｇ／ｍＬのヒト組換えＴＮＦα（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ｉｎｈｏｕｓｅ又はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を適切なマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ  Ｂｒａｎｄ，ＣＨ）上に固定化することによって行なわれた。１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社，ＣＨ）を含むＰＢＳでブロッキングした後、試験タンパク質を、シェーカー上で、室温で、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中に、０．０１〜１μｇ／ｍＬの濃度で添加する。未結合のタンパク質をＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．５％／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％中での３回の洗浄サイクルによって除去し、その後、１〜３μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加する。３回の洗浄サイクルの後、結合したビオチン化抗ヒトＩｇを、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って、ストレプトアビジン−ユーロピウム及びＤＥＬＦＩＡ検出試薬を用いて検出する。ユーロピウム由来の時間分解蛍光を専用の読取機（Ｖｉｃｔｏｒ２，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量することができる。
【０２１２】
２．３  全血ヒト細胞結合アッセイ
健常ボランティア由来のヒト血液を、倫理ガイドラインを適用して、Ｎａ−ヘパリンコートバキュテナー（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｉｓｏｎ，ＢＤ）中に回収する。血液を、９６ウェルディープウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に分注し、全て、最終０．１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムの存在下、氷上で、本発明のＦｕｓｏｂｏｄｙ及び参照ＣＤ４７  Ｆｃ分子を含む、様々な濃度のＳＩＲＰα結合タンパク質とともにインキュベートする。蛍光色素のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＸ６４７）を、標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＩＲＰα結合タンパク質にコンジュゲートさせることができる。ＡＸ６４７コンジュゲートＳＩＲＰα結合タンパク質（実施例１及び表４に記載のもの）を、氷上で３０分間、１〜１０ｎＭの濃度で全血試料に添加することができる。最後の１５分間に、表現型細胞表面マーカーに対する濃度最適化抗体を添加する：ＣＤ１４−ＰＥ（クローンＭＥＭ１８，Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ３  Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５（クローンＳＫ７，ＢＤ）、ＣＤ１６  ＦＩＴＣ（クローン３Ｇ８，ＢＤ）。全血を、１０×容量のＦＡＣＳＬＹＳＩＮＧ溶液（ＢＤ）の添加及びＲＴで１０分間のインキュベーションにより溶解させる。試料を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を含むリン酸緩衝溶液で２回洗浄する。試料を、溶解後２４時間以内にＦａｃｓ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）で取得する。細胞サブセットを、単球の光散乱プロファイルに従って、並びにＣＤ１４＋及びＣＤ３−発現によってゲーティングする。これらの細胞サブセットに関して、蛍光ヒストグラムを作成し、蛍光強度中央値を読出しとして解釈して統計的に評価することができる。
【０２１３】
３．炎症促進性サイトカインの黄色ブドウ球菌コワン１株粒子刺激放出の阻害を測定するための樹状細胞サイトカイン放出アッセイ
末梢血単球（ＣＤ１４＋）を、以前に記載されている通りに（Ｌａｔｏｕｒら，Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１：１６７：２５４７）、ＧＭＳＣＦ／ＩＬ４を用いて単球由来樹状細胞（ＤＣ）に分化させる。ＤＣを、Ｘ−ＶＩＶＯ１５無血清培地中、様々な濃度のヒトＳＩＲＰα結合Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（１〜１００００ｐＭ）の存在下で、１／４０．０００の黄色ブドウ球菌コワン１粒子（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）を用いて刺激する。２４時間の培養後のＴＮＦα放出をＨＴＲＦ（Ｃｉｓｂｉｏ）によって評価する。
【０２１４】
４．結果
表４に記載のＳＩＲＰα結合拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ及び参照分子の結合特性を表５Ａ及び５Ｂに示す。
【０２１５】
【表５−１】
2014519338.tif 000009
【表５−２】
2014519338.tif 000010
【０２１６】
４．１  親和性決定
参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子（実施例＃９）と比較した、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ実施例＃５についてのＢｉａＣＯＲＥ結合データ（Ｋｏｆｆ）を表５Ｂに示す。これらの分子についてのＢｉａＣＯＲＥ結合は、それぞれ、図２Ａ及び２Ｂに示されている。これらの結果は、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ＃５が、（改善されたＫｏｆｆ又はｋｄ１に基づいて）ＳＩＲＰαに対するより高い結合力を有することを示している。この知見は、表５Ａに記載の結果においても反映されており、表５Ａにおいて、拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙは、参照ＣＤ４７−Ｆｃ分子と比較して、最大２００倍の改善されたＩＣ５０値を示している。
【０２１７】
【表５−３】
2014519338.tif 000011
【０２１８】
４．２  サイトカイン放出の阻害
ＴＮＦα放出の阻害が黄色ブドウ球菌コワン１粒子で刺激したヒト単球由来樹状細胞から起こる濃度（ＩＣ５０）を表６に示す。これらの結果は、ＣＤ４７拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙが、ｐＭの効力で樹状細胞活性化を遮断する機能的活性を有することを示している。これらのデータは、ＣＤ４７ドメインの機能が、単一特異性拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙスキャフォールドと二重特異性拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙスキャフォールドの両方で保持されていることを示している。
【０２１９】
【表６】
2014519338.tif 000012
【０２２０】
４．３  ＴＮＦαに対する結合
図３は、ＣＤ４７とＴＮＦαの両方に対する特異性を有する拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃５及び＃６）が、基礎となるスキャフォールド抗体の可変ドメインに導入された修飾、この場合、ＣＤ４７ドメインを抗ＴＮＦα抗体のＶＨ／ＶＬに融合させるリンカーの導入にもかかわらず、ＴＮＦαに結合することができることを示している。対照的に、ＣＤ４７特異性を有する単一特異性の非拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙ（実施例＃２）は、固定化されたＴＮＦαに結合しなかった。これらのデータから、７５ＫＤａの一次抗原、例えば、ＴＮＦαが、様々なリンカー長を含むＣＤ４７−ＴＮＦα拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙによって依然として効率的に結合され得ることが示される。さらに、プラスチック表面上への抗原の固定化にもかかわらず、抗原への結合は実現可能である。他の実験から、可溶性抗原（ＴＮＦα）もまた、ＣＤ４７ドメインがＳＩＲＰαによって同時に占められるＣＤ４７−ＴＮＦα  Ｆｕｓｏｂｏｄｙによって結合され、かつ中和され得ることが示された（データは示さない）。まとめて、これらのデータから、本発明の拡張型Ｆｕｓｏｂｏｄｙの多重特異性結合能が裏付けられる。
【０２２１】
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列
【０２２２】
【表７−１】
2014519338.tif 000013
【表７−２】
2014519338.tif 000014
【表７−３】
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【表７−４】
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【０２２３】
【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表７−２３】
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【表７−２４】
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【表７−２５】
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【表７−２６】
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【表７−２７】
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【表７−２８】
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【表７−２９】
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【表７−３０】
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【表７−３１】
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【表７−３２】
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【表７−３３】
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【表７−３４】
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【表７−３５】
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【表７−３６】
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【表７−３７】
2014519338.tif 000049
【表７−３８】
2014519338.tif 000050
【表７−３９】
2014519338.tif 000051
【図１】
2014519338.tif 000052
【図２Ａ】
2014519338.tif 000053
【図２Ｂ】
2014519338.tif 000054
【図３】
2014519338.tif 000055
【配列表】
2014519338000001.app
【国際調査報告】
2014519338.tif 000056
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