(57)【要約】  対象のタンパク質（ＰＯＩ）を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であって、ａ）細胞系を、プロモーターを抑制する基礎炭素源と培養するステップと、ｂ）細胞系を、プロモーターを脱抑制する制限量の補助的炭素源で培養して、天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度で前記ＰＯＩの生産を誘導するステップと、ｃ）前記ＰＯＩを生産し、回収するステップとを含む方法、さらに、単離された調節可能なプロモーターおよびそれぞれの発現系。
2014530016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のタンパク質（ＰＯＩ）を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
ａ）前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップと、
ｂ）前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは制限量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度での前記ＰＯＩの生産を誘導するステップと、
ｃ）前記ＰＯＩを生産し、回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記基礎炭素源が、グルコース、グリセロール、エタノール、その混合物および複合栄養材料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補助的炭素源が、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）が、前記補助的炭素源を供給しないか、制限量、好ましくは培養培地中に０〜１ｇ／Ｌを供給する供給培地を使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記補助的炭素源の前記制限量が、比増殖速度を０．０２ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは０．０２ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つために増殖制限的である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが、野生型真核細胞の遺伝子の転写を制御することが可能であり、前記遺伝子が、Ｇ１（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、Ｇ４（配列番号９）、Ｇ６（配列番号１０）、Ｇ７（配列番号１１）およびＧ８（配列番号１２）、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記機能的活性変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞系が、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＯＩが異種タンパク質であって、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはＰＯＩの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下でＰＯＩの発現を制御する方法であって、前記発現が前記炭素源を制限する条件の下で誘導される方法。
【請求項１２】
炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でＰＯＩを生産する方法であって、前記プロモーターが、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する方法。
【請求項１３】
前記調節可能なプロモーターが、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度で組換え真核細胞でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離された核酸であって、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む、単離された核酸。
【請求項１７】
ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記プロモーターの転写制御下でＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される請求項１６〜１８に記載の核酸を含む発現構築物であって、前記核酸が前記ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない発現構築物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の構築物を含む組換え真核細胞。
【請求項２１】
真核細胞から炭素源で調節可能なプロモーターを同定する方法であって、
ａ）細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
ｂ）制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において前記細胞をさらに培養するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）の細胞培養の試料を準備するステップと、
ｄ）前記試料で転写分析を実施して、ステップａ）の細胞よりもステップｂ）の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は調節可能なプロモーター、および調節可能なプロモーターの制御下において真核生物細胞培養で対象のタンパク質を生成する方法に関する。
【背景】
【０００２】
組換えタンパク質の良好な生成が、真核生物の宿主で達成されている。最も顕著な例は、酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓもしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉもしくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、または哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。一部のタンパク質の生成は高速で容易に達成されるが、他の多くのタンパク質は比較的低レベルで得られるだけである。
【０００３】
宿主生物体での遺伝子の異種発現は、宿主生物体の安定した形質転換を可能にするベクターを通常必要とする。ベクターは、コード配列の５’末端に隣接する機能的プロモーターを遺伝子に提供する。それにより、このプロモーター配列によって転写が調節され、開始される。今日まで用いられているほとんどのプロモーターは、その細胞に通常高い濃度で存在するタンパク質をコードする遺伝子に由来する。
【０００４】
ＥＰ０１０３４０９Ａ２は、解糖系の特異的酵素の発現と関連する酵母プロモーター、すなわちピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、リン−グリセリン酸ムターゼ、ヘキソキナーゼ１および２、グルコキナーゼ、ホスホ−フルクトースキナーゼ、アルドラーゼならびに解糖調節遺伝子の発現に関与するプロモーターの使用を開示している。
【０００５】
ＷＯ９７／４４４７０は、酵母でのタンパク質の異種発現に適する翻訳伸長因子１（ＴＥＦ１）タンパク質およびリボソームタンパク質Ｓ７のためのＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからの酵母プロモーターを記載し、ＥＰ１９５１８７７Ａ１は、異種タンパク質の生成のためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＥＦ１プロモーターの使用を記載している。
【０００６】
ＷＯ２００５００３３１０は、油性酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼまたはホスホグリセリン酸ムターゼのプロモーターを用いる、酵母での対象のコード配列の発現のための方法を提供する。
【０００７】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール代謝経路に関与する遺伝子に由来するプロモーター配列が、ＵＳ４８０８５３７およびＵＳ４８５５２３１（アルコールオキシダーゼＡＯＸ１、ＡＯＸ２）ならびにＵＳ６７３０４９９Ｂ１（ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼＦＬＤ１）に開示されている。ＵＳ２００８０１５３１２６Ａ１は、ＡＯＸ１プロモーターに基づく突然変異体プロモーター配列を含む。
【０００８】
ＡＯＸ１プロモーターはメタノールに応答したときだけ誘導され、他の炭素源、例えばグルコースまたはエタノールによって抑制される。メタノールはその毒性および引火性のために潜在的に危険であるので、特定の産物の生産には使用不適である欠点を有する。したがって、ＡＯＸ１プロモーターの代替手段が求められる。
【０００９】
ＵＳ２００８２９９６１６Ａ１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの異種遺伝子発現のためにリンゴ酸シンターゼ（ＭＬＳ１）遺伝子の調節配列を導入し、それはグルコース含有培地で抑制され、グルコース絶食条件下または酢酸塩存在下で脱抑制される。しかし、ＭＬＳ１プロモーターは脱抑制条件下では低活性で弱いので、この系は効果的な生産方法に適するとみなされない。
【００１０】
ＳｃｈｏｅｌｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌｅｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  １４（６）：３６１３〜２２）は、発酵から非発酵増殖条件への細胞の移行の後に脱抑制されるイソシトレートリアーゼ遺伝子ＩＣＬ１の制御領域を記載している。
【００１１】
ＷＯ２００８０６３３０２Ａ２は異種タンパク質の発現のためにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＥＮＯ１（エノラーゼ）およびＧＵＴ１遺伝子に由来する新規の誘導可能なプロモーターの使用を記載し、ＣＮ１９６６６８８ＡはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのオメガ３−脂肪酸デヒドロゲナーゼプロモーター配列を、ＷＯ００２００７１１７０６２Ａ１はリン制限によって誘導されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の自己誘導可能なＮＰＳプロモーターを記載している。
【００１２】
ＷＯ２００８１２８７０１Ａ２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＴＨＩ３（チアミン代謝）遺伝子に由来するそのプロモーターが、チアミン含有培地で抑制され、チアミン枯渇により脱抑制される新規プロモーターの使用を記載している。
【００１３】
ＵＳ２００９３２５２４１Ａ１は、キシロース誘導可能なプロモーター（ＦＡＳ２プロモーター）を使用する、酵母細胞でのエタノール生産方法を記載している。
【００１４】
高収率で単離することができる発酵産物の生産のために改良された組換え真核生物細胞系を提供することが望ましい。したがって、本発明の目的は、単純で効率的な組換え生産方法に適する、代替調節エレメントを提供することである。
【発明の概要】
【００１５】
本目的は、特許請求される主題によって解決される。
【００１６】
本発明により、対象のタンパク質（ＰＯＩ）を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
ａ）プロモーターを抑制する基礎炭素源（basal carbon source）で細胞系を培養するステップと、
ｂ）プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは限定された量の補助的炭素源で細胞系を培養して、細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度でのＰＯＩの生産を誘導するステップと、
ｃ）ＰＯＩを生産し、回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００１７】
前記培養ステップは、前記炭素源の存在下で、したがって前記炭素源を含む培養培地で、またはステップｂ）では、さらに補助的炭素源の不在下で細胞系を培養することを特に含む。
【００１８】
ＰＯＩ生産の前記誘導は、転写の誘導を特に指し、前記ＰＯＩのさらなる翻訳および任意の発現を特に含む。
【００１９】
前記転写速度は、前記プロモーターの完全な誘導により得られる転写産物の量を特に指す。例えば０．４ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．０４ｇ／Ｌ未満、特に０．０２ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度で培養条件がほぼ最大の誘導を提供するならば、前記プロモーターは脱抑制され、完全に誘導されるとみなされる。完全に誘導されるプロモーターは、天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および少なくとも１００％の転写速度、または少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％のさらにより高い転写速度を好ましくは示す。例えば、転写速度は、以下の実施例のセクションに記載されているように、リポーター遺伝子、例えばｅＧＦＰが、溶液中のクローンの培養に関し、天然のｐＧＡＰプロモーターと比較してｐＧ１プロモーターの少なくとも５０％という比較的高い転写速度を示す転写産物の量によって判断することができる。あるいは、転写速度は、マイクロアレイでの転写強度によって判断することができ、そこでマイクロアレイデータは、抑制状態と脱抑制状態との間の発現レベルの差、および天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して完全に誘導された状態での高いシグナル強度を示す。そのようなマイクロアレイデータは、天然のｐＧＡＰと比較して、それぞれｐＧ１については２００％、ｐＧ３およびｐＧ４については３０％、ｐＧ６については６０％、ｐＧ７については３０％、ｐＧ８については２０％を超える転写速度を特に示す。先行技術のプロモーターＭＬＳ１またはＩＣＬ１は、あまりに弱く、したがって本発明において適しないことが見出された。
【００２０】
前記天然のｐＧＡＰプロモーターは、未改変（非組換え）または組換えの真核細胞を含む同じ種または株の、天然の真核生物細胞におけるのと同様に、前記組換え真核細胞で特に活性である。そのような天然のｐＧＡＰプロモーターは、内因性プロモーターであると一般的に理解され、したがって真核生物細胞において相同的であり、比較目的のための標準または参照プロモーターの役目をする。
【００２１】
例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のｐＧＡＰプロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでＧＡＰＤＨの発現を制御するために用いられる、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの未改変の内因性プロモーター配列であり、例えば、図１３に示す配列：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のｐＧＡＰプロモーター配列（ＧＳ１１５）（配列番号１３）を有する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが本発明によりＰＯＩを生産するための宿主として用いられる場合は、本発明によるプロモーターの転写強度または速度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのそのような天然のｐＧＡＰプロモーターと比較される。
【００２２】
別の例として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの天然のｐＧＡＰプロモーターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＧＡＰＤＨの発現を制御するために用いられる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの未改変の内因性プロモーター配列である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが本発明によりＰＯＩを生産するための宿主として用いられる場合は、本発明によるプロモーターの転写強度または速度は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのそのような天然のｐＧＡＰプロモーターと比較される。
【００２３】
したがって、本発明によるプロモーターの相対的転写強度または速度は、ＰＯＩを生産するための宿主として用いられる同じ種または株の細胞の、天然のｐＧＡＰプロモーターと通常比較される。
【００２４】
具体的な態様によれば、基礎炭素源は、補助的炭素源と、例えば量的および／または質的に異なる。量的な差は、プロモーター活性を抑制または脱抑制する異なる条件を提供することができる。
【００２５】
さらに具体的な態様によれば、基礎および補助的炭素源は、同じ種類の分子または炭水化物を、好ましくは異なる濃度で含む。さらに具体的な態様によれば、炭素源は２つ以上の異なる炭素源の混合物である。
【００２６】
真核生物の細胞培養のために用いられる、いかなる種類の適する有機炭素を用いてもよい。具体的な態様によれば、炭素源は、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である。
【００２７】
特に好ましい態様によれば、基礎炭素源は、グルコース、グリセロール、エタノールまたはそれらの混合物、および複合栄養材料からなる群から選択される。好ましい態様によれば、基礎炭素源はグリセロールである。
【００２８】
さらに具体的な態様によれば、補助的炭素源は、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースおよびマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である。好ましい態様によれば、補助的炭素源はグルコースである。
【００２９】
具体的には、本方法は基礎炭素源としてグリセロールを、および補助的炭素源としてグルコースを使用することができる。
【００３０】
脱抑制条件は、特定の手段によって好適に達成することができる。ステップｂ）は、補助的炭素源を提供しないか制限量で提供する供給培地を任意に使用してもよい。
【００３１】
具体的には、供給培地は既知組成で、無メタノールである。
【００３２】
供給培地は、液体形または代替形、例えば固体、例えば錠剤もしくは他の徐放性手段で、または気体、例えば二酸化炭素で培養培地に加えてもよい。さらに好ましい態様によれば、細胞培養培地に加えられる補助的炭素源の制限量は、ゼロであってさえよい。好ましくは、培養培地中の補助的炭素源の濃度は、０〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．６ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ未満、好ましくは１〜５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇ／Ｌ、さらにはそれ未満であり、例えば、適する標準アッセイで測定される、例えば増殖細胞培養による消費後の培養培地中の残留濃度として測定される検出限界未満である。
【００３３】
好ましい方法では、補助的供給源の制限量は、生産段階の終わりに発酵培養液で、または発酵工程の産出物で、好ましくは発酵産物を収穫した後に測定される検出限界未満である、細胞培養中の残留量を提供する。
【００３４】
好ましくは、補助的炭素源の制限量は、比増殖速度を０．０２ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは０．０２ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つために増殖制限的である。
【００３５】
本発明の具体的側面により、プロモーターはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロモーターまたはその機能的活性変異体である。
【００３６】
ここで、本発明によるプロモーターは、ここに記載される配列およびその機能的活性変異体を常に指すものとする。以下に詳細に説明されるように、そのような変異体にはホモログおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログが含まれる。
【００３７】
本発明による方法は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型プロモーターであるプロモーターまたはその機能的活性変異体、例えば野生型または組換え真核細胞で特定の遺伝子の転写を制御することが可能なもの、例えば選択される遺伝子のための野生型プロモーターを使用することができ、その遺伝子は、Ｇ１（配列番号７）、例えば（高親和性）グルコース輸送体をコードするもの、Ｇ３（配列番号８）、Ｇ４（配列番号９）、例えばミトコンドリアアルデヒド脱水素酵素をコードするもの、Ｇ６（配列番号１０）、Ｇ７（配列番号１１）、例えば主要促進剤糖輸送体ファミリーのメンバーをコードするもの、またはＧ８（配列番号１２）、例えばＧｔｉ１＿Ｐａｃ２スーパーファミリーのメンバーをコードするもの、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される。
【００３８】
本発明により、プロモーターまたはその機能的活性変異体が特に提供され、それは野性型酵母細胞でそのような遺伝子の１つと生来関連しているであろう。
【００３９】
具体的な態様によれば、細胞系は、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である。
【００４０】
具体的には、酵母は、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ａｒｘｕｌａ、Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａからなる群から選択され、好ましくはメチロトローフ酵母である。
【００４１】
特に好ましい酵母は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉまたはＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００４２】
さらに具体的な態様によれば、プロモーターは、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない。
【００４３】
具体的には、ＰＯＩは真核生物のタンパク質、好ましくは哺乳動物のタンパク質である。
【００４４】
本発明によって生産されるＰＯＩは、多量体タンパク質、好ましくは二量体または四量体であってよい。
【００４５】
本発明の一側面により、ＰＯＩは組換えまたは異種タンパク質であり、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはＰＯＩの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される。
【００４６】
具体的なＰＯＩは、抗原結合分子、例えば抗体またはその断片である。具体的なＰＯＩには、抗体、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）もしくは免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）、もしくはその断片、例えば抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆｄ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または操作されたその変異体、例えばＦｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トリアボディ）、Ｆｖ四量体、またはミニボディおよび単一ドメイン抗体、例えばＶＨもしくはＶＨＨもしくはＶ−ＮＡＲがある。
【００４７】
具体的な態様によれば、発酵産物はＰＯＩ、その代謝産物または誘導体を用いて製造される。
【００４８】
本発明の別の側面によれば、その細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でのＰＯＩの発現を制御する方法が提供され、ここで、発現は炭素源を制限する条件の下で誘導される。炭素源で調節可能なプロモーターは、好ましくは、参照ｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％の転写強度を有し、具体的には天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して転写速度に関して上に記載される転写強度を有する。したがって、完全に誘導されるプロモーターは、ＰＯＩの生産のために選択される真核細胞で測定する場合、その細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および少なくとも１００％の転写強度、または少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％のさらにより高い転写強度を好ましくは有する。
【００４９】
好ましい態様では、抑制された状態と比較して脱抑制された状態で、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０または１００倍である転写活性または転写強度を脱抑制状態で有するそのようなプロモーターが用いられる。
【００５０】
本発明の別の側面によれば、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でＰＯＩを生産する方法が提供され、ここで、前記プロモーターは上記の転写強度、すなわちその細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％を有する。炭素源で調節可能なプロモーターは、好ましくは、参照ｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、その細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および少なくとも１００％の転写強度、または少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％のさらにより高い転写強度を有する。好ましい態様では、抑制された状態と比較して脱抑制された状態で、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０または１００倍である転写活性を脱抑制状態で有するそのようなプロモーターが用いられる。好適には、本発明による特定のプロモーターが、そのような方法で用いられる。
【００５１】
本発明による特に好ましい方法では、プロモーターは、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）；
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列；および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含む調節可能なプロモーターであり、ここで、前記プロモーターは機能的に活性なプロモーターであり、それは細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度で組換え真核細胞でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである。
【００５２】
具体的には、ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の変異体は、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、親ヌクレオチド配列を、配列中のまたは配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換によって改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、機能的活性変異体である。
【００５３】
本発明によるプロモーターの好ましい機能的活性変異体のいくつかは、ｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６、ｐＧ７またはｐＧ８プロモーターヌクレオチド配列のいずれかの断片、好ましくはプロモーターヌクレオチド配列の３’末端を含む断片、例えば特定の長さおよび５’末端領域の欠失、例えば５’末端にヌクレオチド配列のカットオフを有し、それにより、３’末端から様々な５’末端までの範囲の特定の長さ、例えば少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列の長さが得られる、プロモーターヌクレオチド配列の１つに由来するヌクレオチド配列である。
【００５４】
そのような断片、例として、例えば３’末端配列を含めて、２００〜１０００ｂｐの範囲、好ましくは２５０〜１０００ｂｐの範囲、より好ましくは３００〜１０００ｂｐの範囲内の特定の長さを有する断片を含むかそれからなる例示的な変異体は、機能的に活性であることが判明した。例えば、ｐＧ１の機能的活性変異体は、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択され、したがって、ヌクレオチド１００１までの３’末端配列を含む３００〜１０００ｂｐの範囲内のヌクレオチド配列である。
【００５５】
本発明の別の側面によれば、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含む、単離された核酸が提供され、ここで、前記核酸は、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む。
【００５６】
具体的には、ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の変異体は、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、親ヌクレオチド配列を、配列中のまたは配列の遠位末端の一方もしくは両方の１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換によって改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である。
【００５７】
本発明によるプロモーターの好ましい機能的活性変異体のいくつかは、ｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ６、ｐＧ７またはｐＧ８プロモーターヌクレオチド配列のいずれかの断片、好ましくはプロモーターヌクレオチド配列の３’末端を含む断片、例えば特定の長さおよび５’末端領域の欠失、例えば５’末端にヌクレオチド配列のカットオフを有し、それにより、３’末端から様々な５’末端までの範囲の特定の長さ、例えば少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列の長さが得られる、プロモーターヌクレオチド配列の１つに由来するヌクレオチド配列である。
【００５８】
そのような断片、例として、例えば３’末端配列を含めて、２００〜１０００ｂｐの範囲、好ましくは２５０〜１０００ｂｐの範囲、より好ましくは３００〜１０００ｂｐの範囲内の特定の長さを有する断片を含むかそれからなる例示的な変異体は、機能的に活性であることが判明した。例えば、ｐＧ１の機能的活性変異体は、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択され、したがって、ヌクレオチド１００１までの３’末端配列を含む３００〜１０００ｂｐの範囲内のヌクレオチド配列である。
【００５９】
炭素源で調節可能なプロモーターは、好ましくは、参照ｐＧＡＰプロモーターと比較して好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは、天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および少なくとも１００％の上記転写強度、または少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％のさらにより高い転写強度を有する。好ましい態様では、抑制された状態と比較して脱抑制された状態で、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０または１００倍である転写活性を脱抑制状態で有するそのようなプロモーターが用いられる。好適には、本発明による特定のプロモーターがそのような方法で用いられる。
【００６０】
さらに、本発明のさらなる側面により、プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される、本発明による前記プロモーターを含む発現構築物が提供され、そのプロモーターはＰＯＩのコード配列と生来関連していない。
【００６１】
本発明のさらなる側面は、本発明による構築物を含むベクターに関する。
【００６２】
本発明のさらなる側面は、本発明による構築物またはベクターを含む組換え真核細胞に関する。
【００６３】
具体的には、細胞は、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である。
【００６４】
酵母は、好適には、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ａｒｘｕｌａ、Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａからなる群から選択することができ、好ましくはメチロトローフ酵母であってよい。
【００６５】
好ましくは、酵母は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉまたはＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００６６】
具体的な態様によれば、制限された炭素源の条件に対して過剰の炭素源の存在下でより高い比増殖速度を有する細胞が使用される。
【００６７】
本発明のさらなる側面は、ＰＯＩの生産のための本発明の組換え真核細胞の使用に関する。
【００６８】
本発明のさらなる側面により、真核細胞からの、炭素源で調節可能なプロモーターをスクリーニングまたは同定する方法であって、
ａ）細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
ｂ）制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において細胞をさらに培養するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）の細胞培養の試料を準備するステップと、
ｄ）前記試料で転写分析を実施して、ステップａ）の細胞よりもステップｂ）の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと、
を含む方法が提供される。
【００６９】
前記のより高い転写強度は、完全に誘導された状態での転写強度によって判断することができ、それは例えば、抑制された状態と比較して脱抑制された状態で、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０または１００倍である、グルコース制限ケモスタット培養条件下で得られる。
【００７０】
好ましくは、転写分析は定量的または半定量的であり、好ましくは、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ配列決定およびトランスクリプトーム分析を使用する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモーター配列ｐＧ１（配列番号１）。
【図２】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモーター配列ｐＧ３（配列番号２）。
【図３】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモーター配列ｐＧ４（配列番号４）。
【図４】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモーター配列ｐＧ６（配列番号３）。
【図５】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモーター配列ｐＧ７（配列番号５）。
【図６】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモーター配列ｐＧ８（配列番号６）。
【図７】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５ゲノムＧ１の遺伝子のコード配列（配列番号７）。
【図８】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５ゲノムＧ３の遺伝子のコード配列（配列番号８）。
【図９】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５ゲノムＧ４の遺伝子のコード配列（配列番号９）。
【図１０】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５ゲノムＧ６の遺伝子のコード配列（配列番号１０）。
【図１１】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５ゲノムＧ７の遺伝子のコード配列（配列番号１１）。
【図１２】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５ゲノムＧ８の遺伝子のコード配列（配列番号１２）。
【図１３】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のｐＧＡＰプロモーター配列（ＧＳ１１５）（配列番号１３）
【表１】
2014530016.tif 000003
【図１４】ｐＧ１（丸）、ｐＧ３（三角形）、ｐＧ４（ひし形）およびｐＧ６（四角）プロモーターの脱抑制特性：最大転写活性にはｐＧ１ではおよそ０．０４ｇグルコース／Ｌ以下で到達するが、他の全てのｐＧプロモーターはおよそ４ｇ／Ｌ以下で既にそこに到達する。異なるプロモーターの相対的誘導挙動を比較するために、各値をそれぞれのプロモーター構築物のＤ２０値によって割ることによってデータを標準化した。したがって、データは相対的蛍光値であり、Ｄ２０でのデータポイントは１．０である。
【図１５−１】プロモーター配列ｐＧ１の機能的活性変異体；Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＧ１ａ（配列番号４１）。
【図１５−２】プロモーター配列ｐＧ１の機能的活性変異体；Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＧ１ｂ−ｃ（配列番号４２〜４３）。
【図１５−３】プロモーター配列ｐＧ１の機能的活性変異体；Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＧ１ｄ−ｆ（配列番号４４〜４６）。
【発明の詳細な説明】
【００７２】
本明細書全体で用いられる特定の用語は、以下の意味を有する。
【００７３】
ここで用いられる用語「炭素源」は、微生物のためのエネルギー源として適する発酵性の炭素基質、一般的に炭水化物源、例えば宿主生物体または生産細胞系が代謝することが可能なもの、特に、精製形の、または原材料で、例えば複合体栄養素材料で提供される、単糖、オリゴ糖、多糖、グリセロールを含むアルコールからなる群から選択される供給源を意味するものとする。炭素源は、単一の炭素源として、または異なる炭素源の混合物として本発明により用いることができる。
【００７４】
例えば本発明によって用いられる「基礎炭素源」とは、一般的に、細胞増殖に適する炭素源、例えば真核細胞のための栄養素である。基礎炭素源は培地で、例えば基礎培地または複合培地で提供してもよいが、精製された炭素源を含有する既知組成培地で提供してもよい。例えば、細胞乾燥質量で、少なくとも５ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｇ／Ｌの細胞密度を得るために、基礎炭素源は、特に培養工程の増殖期の間の細胞増殖を可能にする量で一般的に提供され、例えば、標準の継代培養ステップで９０％を超える、好ましくは９５％を超える生存率を示す。
【００７５】
本発明により、基礎炭素源は、過剰または余剰の量で一般的に用いられ、それは、例えば流加培養工程での細胞系の増殖期の間、バイオマスを増加させるエネルギーを提供する過剰量と理解される。発酵培養液において、測定可能で、補助的炭素源の制限量を供給する間よりも、一般的に少なくとも１０倍高い、好ましくは少なくとも５０倍または少なくとも１００倍高い残留濃度を達成するために、この余剰量は、補助的炭素源の制限量を特に上回る。
【００７６】
細胞培養培地、例えば流加工程での供給培地に関する用語「既知組成」は、化学構成成分およびペプチドの全てが既知である、生産細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養に適する増殖培地を意味するものとする。一般的に、既知組成培地は、動物由来の構成成分を完全に含まず、純粋で一貫した細胞培養環境を表す。
【００７７】
例えば本発明によって用いられる「補助的炭素源」は、一般的に、特に培養工程の生産段階で、生産細胞系による発酵産物の生産を促進する補助的基質である。生産段階は、例えばバッチ、流加および連続的培養工程において、特に増殖期に続く。補助的炭素源は、流加工程の供給原料に特に含有されてもよい。
【００７８】
炭素源の「制限量」または「制限された炭素源」は、ここでは、生産細胞系を生産段階または生産モードに保つのに必要な炭素源の量と理解される。そのような制限量は流加工程で使用することができ、そこでは、炭素源は供給培地に含有され、ＰＯＩを生産するための持続的エネルギー送達のために低い供給速度で培養へ供給される一方で、バイオマスは低い増殖速度に保たれる。供給培地は、一般的に細胞培養の生産段階の間に発酵培養液に加えられる。
【００７９】
補助的炭素源の制限量は、例えば、細胞培養液中の補助的炭素源の残留量によって判断することができ、それは、所定の閾値未満、さらに標準（炭水化物）アッセイで測定される検出限界未満である。残留量は、発酵産物を収集した後に、発酵培養液で一般的に判断される。
【００８０】
補助的炭素源の制限量は、例えば、時間あたりの計算された平均量を判断するために、培養時間あたりの、全培養工程、例えば流加段階にわたって加えられる量によって判断される、発酵槽への補助的炭素源の平均供給速度を明確にすることによって判断する方がよい。この平均供給速度は、細胞培養による補助的炭素源の完全な使用を確保するために、例えば０．６ｇＬ-1ｈ-1（１時間あたりの１Ｌの初期発酵容量あたりの炭素源のｇ数）〜２５ｇＬ-1ｈ-1、好ましくは１．６ｇＬ-1ｈ-1〜２０ｇＬ-1ｈ-1に低く保たれる。
【００８１】
補助的炭素源の制限量は、生産工程の前と間に比増殖速度を測定することによって判断してもよく、比増殖速度は、生産段階の間、例えば所定範囲内、例えば０．０２ｈ-1〜０．２０ｈ-1の範囲内、好ましくは０．０２ｈ-1〜０．１５ｈ-1に低く保たれる。
【００８２】
ここで用いられる用語「細胞系」は、長期の間増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。用語「宿主細胞系」は、ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドによって媒介される細胞代謝産物を生産するために、内因性もしくは組換え遺伝子または代謝経路の産物を発現させるために用いられる細胞系を指す。「生産宿主細胞系」または「生産細胞系」は、生産工程の産物、例えばＰＯＩを得るためのバイオリアクターでの培養で直ちに使用できる細胞系であると、一般的に理解される。用語「真核生物宿主」または「真核生物細胞系」は、ＰＯＩまたは宿主細胞の代謝産物を生産するために培養してもよい、真核生物のあらゆる細胞または生物体を意味するものとする。この用語はヒトを含まないと十分理解される。
【００８３】
用語「発現」または「発現系」または「発現カセット」は、作動可能に連結されている所望のコード配列および制御配列を含有する核酸分子を指し、そのため、これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされる宿主は、コードされたタンパク質または宿主細胞代謝産物を生産することが可能である。形質転換を実行するために、発現系がベクターに含まれてもよい；しかし、関連するＤＮＡは、宿主染色体に組み込まれてもよい。発現は、ポリペプチドまたは代謝産物を含む、分泌されるか分泌されない発現産物を指すことができる。
【００８４】
ここで用いられる「発現構築物」または「ベクター」は、適する宿主生物体におけるクローン組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子のものの転写、およびそれらのｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターは、宿主細胞での自己複製起点、選択可能なマーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、または抗生物質、例えばゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンへの耐性を付与する遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適するプロモーター配列および転写ターミネーターを通常含み、それらの構成成分は作動可能に連結している。ここで用いられる用語「プラスミド」および「ベクター」は、自己複製ヌクレオチド配列ならびにゲノムに組み込むヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
本発明との関連でここで用いられる用語「変異体」は、特定の相同性または類似性を有する任意の配列を指すものとする。組換え細胞系でプロモーターとして用いるのに適する配列を生成するために、プロモーター配列ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）から突然変異誘発によって変異体プロモーターを誘導してもよい。そのような変異体プロモーターは、所定の特性を有するライブラリーメンバーを選択することによって、突然変異体配列のライブラリーから得てもよい。変異体プロモーターは、同じかまたはさらに向上した特性、例えばＰＯＩ生産の誘導が向上した特性を有することができ、抑制および脱抑制条件下での差別的効果が増加している。変異体プロモーターは、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の真核生物の種、またはＰｉｃｈｉａ以外の真核生物の属から、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからの類似した配列から誘導してもよい。具体的には、対応するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子に類似した遺伝子と生来関連している類似したプロモーター配列は、このように、または機能的活性変異体を生産する親配列として用いてもよい。
【００８６】
具体的には、
−  ｐＧ１に類似したプロモーターは、Ｇ１に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる（高親和性グルコース輸送体；Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５記載：推定上の輸送体、糖ポーターファミリーのメンバー；コード配列  配列番号７）；
−  ｐＧ３に類似したプロモーターは、Ｇ３に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる（コード配列  配列番号８）；
−  ｐＧ４に類似したプロモーターは、Ｇ４に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５：予測されたミトコンドリアアルデヒド脱水素酵素；コード配列  配列番号９）；
−  ｐＧ６に類似したプロモーターは、Ｇ６に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる（コード配列  配列番号１０）；
−  ｐＧ７に類似したプロモーターは、Ｇ７に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５：主促進糖輸送体（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｇａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）ファミリーのメンバー；コード配列配列番号１１）；
−  ｐＧ８に類似したプロモーターは、Ｇ８に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５：Ｇｔｉ１＿Ｐａｃ２スーパーファミリーのメンバー；コード配列  配列番号１２）。
【００８７】
そのような類似したプロモーター配列またはその機能的活性変異体の特性は、標準技術を用いて判断することができる。
【００８８】
ここで用いられるヌクレオチドまたはプロモーター配列の「機能的活性」変異体は、配列中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換による親配列の改変から生じる配列を意味し、この改変はこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に、損なわない）。
【００８９】
具体的には、本発明によるプロモーター配列の機能的活性変異体は、以下からなる群から選択される。
【００９０】
−  少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、
−  好ましくは少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列を有する（すなわち含むかそれからなる）配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、および
−  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログ。
【００９１】
具体的には、好ましい機能的活性変異体は、少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列を有する（すなわち含むかそれからなる）、改変によって本発明によるプロモーターから誘導されるもの、および／またはプロモーター配列の断片である。
【００９２】
本発明によるプロモーターの好ましい機能的活性変異体のいくつかは、ｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６、ｐＧ７またはｐＧ８プロモーターヌクレオチド配列のいずれかの断片、好ましくはプロモーターヌクレオチド配列の３’末端を含む断片、例えば特定の長さおよび５’末端領域の欠失、例えば５’末端にヌクレオチド配列のカットオフを有し、それにより、３’末端から様々な５’末端までの範囲の特定の長さ、例えば少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐのヌクレオチド配列の長さが得られる、プロモーターヌクレオチド配列の１つに由来するヌクレオチド配列である。
【００９３】
そのような断片、例として、例えば３’末端配列を含めて、２００〜１０００ｂｐの範囲、好ましくは２５０〜１０００ｂｐの範囲、より好ましくは３００〜１０００ｂｐの範囲内の特定の長さを有する断片を含むかそれからなる例示的な変異体は、機能的に活性であることが判明した。例えば、ｐＧ１の機能的活性変異体は、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択され、したがって、ヌクレオチド１００１までの３’末端配列を含む３００〜１０００ｂｐの範囲内のヌクレオチド配列である。
【００９４】
ここで用いられるプロモーターに関する用語「調節可能」は、バッチ培養の増殖期において過剰量の炭素源（栄養素基質）の存在下では真核細胞で抑制され、生産細胞系の生産段階で、例えば炭素量の低減により、例えば流加法により培養へ増殖制限炭素源（栄養素基質）を供給することにより、脱抑制されて強力なプロモーター活性を発揮するプロモーターを指すものとする。この点に関して、用語「調節可能な」は、「炭素源制限で調節可能な」または「グルコース制限で調節可能な」であると理解され、炭素の消費、低減、不足もしくは枯渇による、または細胞によって直ちに消費されるように制限された炭素源添加によるプロモーターの脱抑制を指す。
【００９５】
本発明による機能的に活性なプロモーターは、細胞増殖条件（増殖期）下で静止または抑制され、生産条件（生産段階）下で活性化または脱抑制される比較的強力な調節可能なプロモーターであり、したがって、炭素源を制限することによって生産細胞系でＰＯＩ生産を誘導するのに適している。したがって、プロモーターの機能的活性変異体は、少なくともそのような調節可能な特性を有する。
【００９６】
本発明による調節可能なプロモーターの強度とは、その転写強度を指し、高いか低い頻度でそのプロモーターで起こる転写の開始の効率によって表される。転写強度がより高いほど、そのプロモーターでより高い頻度で転写が起こる。プロモーター強度は所与のｍＲＮＡ配列がどのくらいの頻度で転写されるかを決定し、他よりも一部の遺伝子に転写のより高い優先権を効果的に与え、転写産物のより高い濃度をもたらすので重要である。例えば、大量に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子は、比較的強力なプロモーターを一般的に有する。ＲＮＡポリメラーゼは一度に１つの転写作業を実施することができるだけなので、効率を良くするためにその仕事の優先順位をつけなければならない。この優先順位付けを可能にするために、プロモーター強度の差が選択される。本発明により、調節可能なプロモーターは、約最大活性の状態と一般的に理解される、完全に誘導された状態で比較的強力である。相対的強度は、標準プロモーターに対して、例えば宿主細胞として用いられる細胞のそれぞれのｐＧＡＰプロモーターに対して一般的に判定される。転写の頻度は、例えば適するアッセイ、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングにおいて転写産物の量によって決定される、転写速度と一般的に理解される。例えば、本発明によるプロモーターの転写強度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである宿主細胞で決定され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のｐＧＡＰプロモーターと比較される。
【００９７】
ｐＧＡＰプロモーターは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするｇａｐ遺伝子の発現を開始し、それは、グルコースで増殖可能なあらゆる微生物に存在する構成的プロモーターである。ＧＡＰＤＨ（ＥＣ１＼２＼１＼１２）は、解糖の鍵酵素であり、異化的および同化的炭水化物代謝で重要な役割を演ずる。
【００９８】
本発明による調節可能なプロモーターは比較的高い転写強度を発揮し、それは、宿主細胞での「同種ｐＧＡＰプロモーター」と呼ばれることもある天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度または転写強度に反映される。好ましくは、転写速度または強度は、天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも２０％、特に好ましい場合は少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および少なくとも１００％、またはさらにそれ以上、例えば少なくとも１５０％または少なくとも２００％であり、例えば、ＰＯＩを生産するための宿主細胞として選択される真核細胞で判定される。
【００９９】
誘導された状態でｐＧ１、ｐＧ３、ＰＧ４、ｐＧ６、ｐＧ７またはｐＧ８プロモーターの１つの転写強度を少なくとも有する、調節可能なプロモーターが特に好ましい。参照としてｐＧＡＰプロモーターを使用する比較転写強度は、標準手段によって、例えば転写産物の量を測定することによって、例えばマイクロアレイを用いて、さもなければ細胞培養で、例えば組換え細胞でそれぞれの遺伝子発現産物の量を測定することによって判定してもよい。例示的な試験は、実施例のセクションで例示される。
【０１００】
具体的には、本発明によるプロモーターは、グルコース存在下およびグルコース制限下でその強度を比較する試験で判定される、差別的プロモーター強度により炭素源で調節可能であり、そのことは、比較的高いグルコース濃度、好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌの濃度でそれがなお抑制されることを示す。具体的には、本発明によるプロモーターは、制限されたグルコース濃度および完全にプロモーターを誘導するグルコース閾値濃度で完全に誘導され、その閾値は、２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは１０ｇ／Ｌ未満、１ｇ／Ｌ未満、さらに０．１ｇ／Ｌ未満、または５０ｍｇ／Ｌ未満であり、好ましくは、４０ｍｇ／Ｌ未満のグルコース濃度で例えば天然の同種ｐＧＡＰプロモーターの少なくとも５０％の完全な転写強度を有する。
【０１０１】
好ましくは、差別的プロモーター強度は、所定の炭素源閾値の下の誘導条件へスイッチングした後のＰＯＩ生産の開始によって判定され、抑制された状態での強度と比較される。転写強度は、完全に誘導された状態での強度、すなわち脱抑制条件下で約最大の活性を示すと一般的に理解される。差別的プロモーター強度は、例えば抑制条件と比較して脱抑制条件下での組換え宿主細胞系におけるＰＯＩ生産の効率または収量によって、さもなければ転写産物の量によって判定される。本発明による調節可能なプロモーターは、抑制された状態と比較して脱抑制された状態で、誘導倍率とも理解される、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０または１００倍である好ましい差別的プロモーター強度を有する。そのような差別的プロモーター強度は、包含される実施例で例示される試験によって判定することができる。
【０１０２】
先行技術のプロモーター（ＭＬＳ１プロモーターまたはＩＣＬ１プロモーター）は、２倍より有意に低い誘導の差別的プロモーター強度を有することがわかった。そのような先行技術プロモーターは、ｐＧＡＰプロモーター標準と比較しておよそ５％のプロモーター強度であり、ＰＯＩ工業生産にも有用でなかった。これは、本発明によるプロモーターとの直接比較で証明されている。
【０１０３】
用語「相同性」は、２つ以上のヌクレオチド配列が、対応する位置で１００％近くの程度まで、一定の程度で同じか保存された塩基対を有することを示す。相同配列は、少なくとも約５０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約６０％の同一性、より好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を一般的に有する。
【０１０４】
本発明による同種プロモーター配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６、ｐＧ７またはｐＧ８プロモーターヌクレオチド配列のいずれかに対して、例えばそれぞれのプロモーターヌクレオチド配列の３’領域を含む、ヌクレオチド配列の少なくとも特定の部分に、好ましくはそれぞれのプロモーターヌクレオチド配列の３’末端までの特定の長さを有する部分、例えば少なくとも２００ｂｐ、好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐまたは少なくとも１０００ｂｐの長さを有する部分において、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログに対して、一定の相同性を好ましくは有する。具体的には、少なくともそれらの部分は、それぞれのプロモーターヌクレオチド配列の３’末端配列を含めて、３００〜１０００ｂｐの範囲内は好ましくは相同的である。
【０１０５】
類似した配列は、他の種または株から一般的に誘導される。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種から誘導される本発明の類似したプロモーター配列のいずれも、相同配列、すなわちここで記載される一定の相同性を有する配列を含むことができると明白に理解される。したがって、用語「相同的」は、類似した配列を含むこともできる。他方、本発明は類似した配列、および一定の相同性を含むそのホモログも指すものと理解される。
【０１０６】
遺伝子のヌクレオチド配列に関する「同一性パーセント（％）」は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなすことなく、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドと同一である候補ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの百分率と規定される。ヌクレオチド配列同一性パーセントを判定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内である様々な方法で、例えば公開されているコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを判断することができる。
【０１０７】
本発明との関連で用いられる用語「突然変異誘発」は、非コードまたはコード領域で少なくとも１つの変化を有するその変異体を得るために、例えば１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を通して、ヌクレオチド配列の突然変異体を提供する方法を指すものとする。突然変異誘発は、ランダム、セミランダムまたは部位特異的突然変異であってよい。一般的に、大きな無作為化された遺伝子ライブラリーは高い遺伝子多様性で生成され、それは特に望まれる遺伝子型または表現型に従って選択してもよい。
【０１０８】
ここで用いられる用語「対象のタンパク質（ＰＯＩ）」は、宿主細胞で組換え技術によって生産されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は宿主細胞に天然に存在しないポリペプチド、すなわち異種タンパク質、または宿主細胞に固有のもの、すなわち宿主細胞と同種のタンパク質のいずれかであってよいが、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含有する自己複製ベクターによる形質転換、または組換え技術による宿主細胞のゲノムへのＰＯＩをコードする核酸配列の１つ以上のコピーの組込みにより、または、ＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列、例えばプロモーター配列の組換え改変によって生産される。場合により、ここで用いられる用語ＰＯＩは、組換えで発現されるタンパク質によって媒介される、宿主細胞によるあらゆる代謝産物も指す。
【０１０９】
ここで用いられる用語「組換え」は、「遺伝子操作によって調製されるかその結果であること」を意味するものとする。したがって、「組換え微生物」は、少なくとも１つの「組換え核酸」を含む。組換え微生物は発現ベクターまたはクローニングベクターを特に含むか、それは組換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。「組換えタンパク質」は、宿主でそれぞれの組換え核酸を発現することによって生産される。「組換えプロモーター」は、ここで記載される機能的に活性なプロモーターとしてのその使用に適する、遺伝子操作された非コードヌクレオチド配列である。
【０１１０】
驚くべきことに、真核細胞は、炭素源の利用可能性を制限することによってＰＯＩの生産を誘導することが可能であることがわかった。炭素絶食条件は、強力なプロモーター活性の誘導を引き起こすことが見出され、そのことはこれまで当技術分野で未知であった。糖制限下で脱抑制されるＵＳ２００８２９９６１６Ａ１に記載されるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＬＳ１プロモーターは、実際には、ＰＯＩ生産のための比較的弱い調節可能なプロモーターであった。したがって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのそのような強力な調節可能なプロモーターが同定され、特に組換えＰＯＩ生産のために、真核生物の生産細胞系で用いることができたことは意外だった。
【０１１１】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５株の９．４３Ｍｂｐゲノム配列がＵＳ２０１１００２１３７８Ａ１で決定され、開示されているが、個々の配列、例えばプロモーター配列の特性は詳細に調査されていない。例えば、ここで記載されるｐＧ４配列（配列番号４）は、ＵＳ２０１１００２１３７８Ａ１ではプロモーター配列として同定されたが、その調節可能な特性または炭素絶食条件下でのその使用は未知であった。そのようなプロモーターが、本発明による方法で効果的に用いることができたことは、意外でさえあった。先行技術の調節されたプロモーター、例えば工業規模のＰＯＩ生産で用いられるものは、主にメタノール代謝経路から誘導され、ＰＯＩ生産を誘導するためにメタノールの添加を必要としたが、それはしばしば望ましいことではない。本発明による方法は、強化された発現によって生産の増加を可能にすることができる利点を有し、特に無メタノールの既知組成培地を用いるときに、特定のプロモーター調節による汚染の危険が低減される。
【０１１２】
本発明による調節可能なプロモーターは、プロモーター抑制および脱抑制条件を確立するのに適する非常に特異的な培養培地の使用によってのみそれらの調節可能な活性を発揮することがわかった。例として、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを工業生産工程の条件下で培養することに成功した。先ず、基礎炭素源、例えばグリセロールでのバッチ培養を使用し、その後、補助的炭素源、例えばグルコースの供給が制限された流加が続いた。第１のバッチ段階の終了近くで、例えば制限量の補助的炭素源を用いる制限された増殖条件で試料を取得した。ＤＮＡマイクロアレイによるトランスクリプトーム分析は、補助的炭素源で活性が強く、余剰炭素、すなわち過剰量の基礎炭素源の存在下で弱いか不活性である特異的遺伝子を明らかにした。少なくとも６つのプロモーター配列、すなわちｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）およびｐＧ８（配列番号６）が、本発明による調節可能なプロモーターとして同定された。先行技術の同等のＭＬＳ１またはＩＣＬ１プロモーターはただ弱く、ｐＧ１プロモーターの強度の１／１０未満で、検出可能な調節もなかった。
【０１１３】
基礎炭素源での抑制組換え遺伝子の発現および制限された補助的炭素源での強力な発現、すなわち基質変化による誘導の特徴は、発酵工程で検証することができた。
【０１１４】
向上した組換えタンパク質生産を可能にする本発明による調節配列として用いることができたヌクレオチド配列は、様々な供給源から得ることができる。本発明によるプロモーターの起源は、好ましくは酵母細胞、最も好ましくはメチロトローフの酵母、例えばＰｉｃｈｉａ属またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種からであり、そのプロモーターは、次に、適する変異体、例えば突然変異体またはアナログを生産する親配列として用いてもよい。
【０１１５】
炭素絶食条件下でのタンパク質生産を担うそれぞれのプロモーター配列、または異なる種のそれぞれのアナログを得るために、一連の酵母細胞、特にＰｉｃｈｉａ属の株が適すると考えられる。
【０１１６】
機能的活性変異体、例えばホモログおよびアナログを含む、同定されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓプロモーターの変異体は、標準技術を使用して生産してもよい。変更された発現レベルおよび調節特性を有するプロモーター変異体を生成するために、例えばプロモーターを改変してもよい。
【０１１７】
例えば、本発明によるプロモーター配列の突然変異誘発によってプロモーターライブラリーを調製してもよく、それは、例えば、異なる発酵戦略の下でのそれらの発現について変異体を分析して適する変異体を選択することによって、真核細胞で遺伝子発現を微調整するために、親分子として用いてもよい。例えば選択されたＰＯＩを生産するための必要条件に適合するプロモーターを選択するために、変異体の合成ライブラリーを用いてもよい。そのような変異体は、炭素源の枯渇により、真核生物の宿主細胞でより高い発現効率および高い発現を有していてもよい。
【０１１８】
差別的発酵戦略は、増殖期、例えば本発明によるステップａ）と、生産段階、例えばステップｂ）とを区別する。
【０１１９】
増殖および／または生産は、好適には、バッチモード、流加モードまたは連続モードで起こることができる。バッチ、流加、連続、撹拌式タンク型反応器またはエアーリフト反応器を含む、あらゆる適するバイオリアクターを用いることができる。
【０１２０】
パイロットまたは工業規模で発酵工程を提供することが有利である。工業工程の規模は、好ましくは少なくとも１０Ｌ、特に少なくとも５０Ｌ、好ましくは少なくとも１ｍ3、好ましくは少なくとも１０ｍ3、最も好ましくは少なくとも１００ｍ3の容量を使用するであろう。
【０１２１】
例えば、数日の一般的な処理時間を使用する１００Ｌ〜１０ｍ3以上の反応器容量での流加培養、または約０．０２〜０．１５ｈ-1の希釈速度による約５０〜１０００Ｌ以上の発酵槽容量での連続工程を指す、工業規模の生産条件が好ましい。
【０１２２】
適する培養技術は、バッチ段階から出発し、高い比増殖速度の短期の指数関数的流加段階、さらに、低い比増殖速度の流加段階が続く、バイオリアクターでの培養を包含していてもよい。別の適する培養技術は、バッチ段階と、続く低い希釈速度での連続培養段階とを包含していてもよい。
【０１２３】
本発明の好ましい態様は、バイオマスを提供するバッチ培養と、続く高収率ＰＯＩ生産のための流加培養とを含む。
【０１２４】
例えば、本発明によるステップａ）で細胞系をグリセロールまたはグルコースで増殖させてバイオマスを得てもよい。
【０１２５】
細胞乾燥重量で、少なくとも１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌの細胞密度を得る増殖条件下で、バイオリアクターで本発明による宿主細胞系を培養するのが好ましい。パイロットまたは工業規模で、バイオマス生産のそのような収率を可能にすることが有利である。
【０１２６】
バイオマスの蓄積を可能にする増殖培地、特に基礎増殖培地は、炭素源、窒素源、硫黄の供給源およびリン酸の供給源を一般的に含む。一般的に、そのような培地は、微量元素およびビタミンをさらに含み、アミノ酸、ペプトンまたは酵母抽出物をさらに含んでいてもよい。
【０１２７】
好ましい窒素源には、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、またはＮＨ3または（ＮＨ4）2ＳＯ4があり；
好ましい硫黄源には、ＭｇＳＯ4または（ＮＨ4）2ＳＯ4またはＫ2ＳＯ4があり；
好ましいリン酸源には、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4またはＨ3ＰＯ4またはＮａＨ2ＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4またはＫ2ＨＰＯ4がある。
【０１２８】
さらなる一般的な培地構成成分には、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2および微量元素、例えばＦｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｉ、Ｂがある。
【０１２９】
好ましくは、培地はビタミンＢ7が追加される。
【０１３０】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための一般的な増殖培地は、グリセロールまたはグルコース、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ビオチンおよび微量元素を含む。
【０１３１】
生産段階では、生産培地は、特に制限量の補助的炭素源だけで用いられる。
【０１３２】
好ましくは、宿主細胞系は適する炭素源を有する無機培地で培養され、それによって単離工程をさらにかなり単純化する。好ましい無機培地の例は、利用できる炭素源（例えばグルコース、グリセロールまたはメタノール）、多量元素（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸、リン酸）を含有する塩、および微量元素（銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン酸塩、コバルト、亜鉛および鉄の塩、ならびにホウ酸）、および、例えば栄養素要求性を補うために、任意にビタミンまたはアミノ酸を含有するものである。
【０１３３】
発現系および発現タンパク質の性質、例えばタンパク質がシグナルペプチドと融合されるかどうか、およびタンパク質が可溶性であるか膜結合型であるかどうかに従い、細胞は、細胞または培養培地から精製することができる所望のＰＯＩの発現を実行するのに適する条件下で培養される。当業者によって理解されるように、使用される宿主細胞および特定の発現ベクターの種類を含む要因によって、培養条件は異なる。
【０１３４】
本発明によるプロモーターによるＰＯＩ生産の誘導は、好ましくは、炭素およびエネルギーの唯一の供給源として制限量の補助的炭素源で細胞を培養することによって制御される。炭素制限条件下で細胞は非常にゆっくりと増殖するが、調節可能なプロモーターの制御下で高収率のＰＯＩを生産する。
【０１３５】
プロモーター活性の差は、具体的には、抑制された状態と比較して脱抑制された状態で、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０または１００倍である。
【０１３６】
任意にさらに好ましい調節配列と組み合わせて本発明による適するプロモーター配列を選択することによって、プロモーター活性もしくは転写強度において、またはプロモーター強度による調節において、ＧＡＰプロモーターであって、生産細胞と同種のもの、天然のｐＧＡＰまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓから単離されるものと比較して、同等の条件下で少なくとも同じか、少なくとも約１．５倍、または少なくとも約２倍、または少なくとも約５倍、１０倍、または少なくとも約１５倍までの活性を可能にすることが可能である。
【０１３７】
一般的な生産培地は、補助的炭素源、さらにＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ビオチンおよび微量元素を含む。
【０１３８】
例えば、発酵へ加えられる補助的炭素源の供給原料は、最高５０重量％の発酵性糖を有する炭素源を含んでいてもよい。補助的培地の低い供給速度は、細胞増殖に及ぼす産物阻害の影響を制限し、このように、基質供給に基づく高い産物収率が可能になる。
【０１３９】
発酵は、好ましくは３〜７．５のｐＨで実行される。
【０１４０】
一般的な発酵時間は、２０℃〜３５℃、好ましくは２２〜３０℃の温度で約２４〜１２０時間である。
【０１４１】
一般に、ここで言及される組換え核酸または生物体は、当業者に周知の組換え技術によって生産してもよい。本発明に従って、当分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用されてよい。そのような技術は、文献で詳細に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）を参照。
【０１４２】
本発明の好ましい態様によれば、組換え構築物は、ベクターにプロモーターおよび関連する遺伝子を連結して得られる。そのようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによって、これらの遺伝子を宿主細胞ゲノムに安定して組み込むことができる。
【０１４３】
発現ベクターには、限定されずに、クローニングベクター、改変クローニングベクターおよび特別設計のプラスミドが含まれてよい。本発明で用いられる好ましい発現ベクターは、宿主細胞での組換え遺伝子の発現に適するいかなる発現ベクターであってよく、宿主生物体に従い選択される。組換え発現ベクターは、宿主ベクターとも呼ばれる、宿主生物体のゲノムの中で複製することまたはそれに組み込むことが可能であるいかなるベクターであってもよい。
【０１４４】
本発明では、ベクターとしてｐＰＵＺＺＬＥに由来するプラスミドを用いるのが好ましい。
【０１４５】
適当な発現ベクターは、真核生物の宿主細胞でＰＯＩをコードするＤＮＡを発現するのに適する、さらなる調節配列を一般的に含む。調節配列の例には、オペレーター、エンハンサー、リボゾーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する配列が含まれる。調節配列は、発現されるＤＮＡ配列に作動可能に連結されてよい。
【０１４６】
宿主細胞で組換えヌクレオチド配列の発現を可能にするために、発現ベクターはコード配列の５’末端に隣接して、例えばシグナルペプチド遺伝子の上流に、本発明によるプロモーターを提供することができる。それにより、このプロモーター配列によって転写が調節され、開始される。
【０１４７】
シグナルペプチドは、異種シグナルペプチド、または天然および異種シグナルペプチドのハイブリッドであってよく、特に、タンパク質を生産する宿主生物体に異種または同種であってよい。シグナルペプチドの機能は、ＰＯＩを分泌させて小胞体に入らせることである。それは通常、原形質膜の外へのタンパク質の輸送を指示し、それによって異種タンパク質を分離、精製することを容易にする短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖である。タンパク質が輸送された後、一部のシグナルペプチドはシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０１４８】
例示的なシグナルペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ交配因子プレプロペプチドからのシグナル配列およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）からのシグナルペプチドである。
【０１４９】
プロモーターがコード配列の転写を制御する場合は、プロモーター配列はコード配列に作動可能に連結していると理解される。プロモーター配列がコード配列と生来関連していない場合は、その転写は生来（野生型）の細胞でそのプロモーターによって制御されないか、またはその配列は異なる連続した配列と再結合するかのいずれかである。
【０１５０】
関連する配列の機能を証明するために、調節エレメントの１つ以上を含む発現ベクターを、ＰＯＩの発現を作動させるように構築してもよく、発現される収率は従来の調節エレメントによる構築物と比較される。実験手順の詳細な説明は、下記の例で見出すことができる。様々な異なるＰＯＩの高レベル生産のために、同定された遺伝子は、特定のヌクレオチドプライマーを用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからＰＣＲによって増幅され、例えば、酵母ベクターおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株を用いて、発現ベクターにクローニングされ、真核生物の細胞系に形質転換されてもよい。そのように生産される組換えＰＯＩの量に及ぼす本発明によるプロモーターの影響を推定するために、従来の、炭素源で調節不可能なプロモーター、例えばそれぞれの細胞で標準のｐＧＡＰプロモーターを含む株と比較して、真核生物の細胞系を、振盪フラスコ実験および流加またはケモスタット発酵で培養してもよい。特に、プロモーターの選択は、組換えタンパク質の生産に大きな影響をもたらす。
【０１５１】
微生物による組換えＤＮＡ断片の取り込みのための形質転換の好ましい方法には、化学的形質転換、エレクトロポレーションまたはプロトプラステーション（protoplastation）による形質転換が含まれる。本発明による形質転換体は、そのようなベクターＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡを宿主に導入して、関連するタンパク質または宿主細胞代謝産物を高収率で発現する形質転換体を選択することによって得ることができる。
【０１５２】
適当な培地でこのように得られる形質転換体を培養し、発現産物または代謝産物を培養物から単離し、適する方法によってそれを任意に精製することによって、組換え宿主細胞系を用いてＰＯＩを生産することができる。
【０１５３】
本発明による形質転換体は、そのようなベクターＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡを宿主に導入して、ＰＯＩまたは宿主細胞代謝産物を高収率で発現する形質転換体を選択することによって得ることができる。宿主細胞は、真核細胞の形質転換のために従来用いられる方法、例えば電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法およびその改変方法によってそれらが外来のＤＮＡを組み込むことを可能にするために処理される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、好ましくはエレクトロポレーションによって形質転換される。
【０１５４】
本発明による好ましい宿主細胞系は、本発明により使用される遺伝的性質を維持し、約２０世代、好ましくは少なくとも３０世代、より好ましくは少なくとも４０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代の培養後でさえ生産レベルは高く、例えば少なくともμｇレベルのままである。工業規模生産のために用いられる場合は、安定した組換え宿主細胞が大きな利点とみなされる。
【０１５５】
本発明の方法によるＰＯＩの生産のために、いくつかの異なるアプローチが好ましい。関連するタンパク質をコードする組換えＤＮＡおよび前記の調節エレメントの少なくとも１つを含む発現ベクターで真核生物の宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞の培養を調製し、培養物を増殖させ、転写およびＰＯＩ生産を誘導し、発酵工程の産物を回収することによって、物質を発現させ、処理し、任意に分泌させることができる。
【０１５６】
ＰＯＩは、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌの収率をもたらす条件を使用して発現される。
【０１５７】
本発明による宿主細胞は、好ましくは、以下の試験によってその発現能力または収率に関して試験される：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣまたは他の適する試験。
【０１５８】
ここで開示される方法は、好ましくは分泌された形で、さもなければ細胞内産物としてＰＯＩの発現を可能にする条件の下で、前記組換え宿主細胞を培養することをさらに含むことができるものと理解される。組換えで生産されたＰＯＩまたは宿主細胞代謝産物は、次に細胞培養培地から単離し、当業者に周知の技術によってさらに精製することができる。
【０１５９】
本発明によって生産されるＰＯＩは、一般的に、所望のＰＯＩの濃度の上昇および／または少なくとも１つの不純物の濃度の低下を含む、現在の技術を用いて単離し、精製することができる。
【０１６０】
ＰＯＩが細胞から分泌される場合は、それは現在の技術を用いて培養培地から単離し、精製することができる。宿主細胞からの組換え発現産物の分泌は、精製工程を促進することを含む理由のために一般に有利であるが、その理由は、酵母細胞が破壊されて細胞内タンパク質を放出するときに生じるタンパク質の複合混合物からではなく、培養上清から産物が回収されるからである。
【０１６１】
培養された形質転換細胞は、音波でまたは機械的に、酵素処理でまたは化学的に破裂させ、所望のＰＯＩを含有する細胞抽出物を得ることもでき、そこからＰＯＩが単離、精製される。
【０１６２】
組換えポリペプチドまたはタンパク質産物を得るための単離および精製方法として、溶解性の差を利用する方法などの方法、例えば塩析および溶媒沈殿、分子量の差を利用する方法、例えば限外濾過およびゲル電気泳動、電荷の差を利用する方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、比親和性を利用する方法、例えば親和性クロマトグラフィー、疎水性の差を利用する方法、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー、ならびに等電点の差を利用する方法、例えば等電集束法を用いてもよい。
【０１６３】
高度に精製された産物は、混入タンパク質を事実上含まず、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに少なくとも９８％、最高１００％の純度を有する。精製された産物は、細胞培養上清の精製によって、さもなければ細胞細片から得てもよい。
【０１６４】
単離および精製方法として、以下の標準方法が好ましい：細胞破壊（ＰＯＩが細胞内で得られる場合）、細胞（細片）分離および微量濾過または接線流フィルター（ＴＦＦ）または遠心分離による洗浄、沈殿または熱処理によるＰＯＩ精製、酵素消化によるＰＯＩ活性化、クロマトグラフィー、例えばイオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除（ＳＥＣ）またはＨＰＬＣクロマトグラフィーによるＰＯＩ精製、濃縮物のＰＯＩ沈殿および限外濾過工程による洗浄。
【０１６５】
単離および精製されたＰＯＩは、従来の方法、例えばウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、活性アッセイまたはＥＬＩＳＡによって同定することができる。
【０１６６】
ＰＯＩは、任意の真核生物、原核生物または合成ポリペプチドであってよい。それは、分泌されたタンパク質または細胞内タンパク質であってもよい。本発明は、天然に存在するタンパク質の機能的ホモログ、機能的に同等の変異体、誘導体および生物学的活性断片の組換え生産も可能にする。機能的ホモログは、ある配列と、好ましくは配列が同一であるか対応し、その機能的特性を有する。
【０１６７】
ここで言及するＰＯＩは、好ましくは治療的、予防的、診断的、分析的または産業的使用のための、真核生物の宿主細胞と同種または異種の産物であってもよい。
【０１６８】
ＰＯＩは、好ましくは、真核細胞、好ましくは酵母細胞で生産される、好ましくは分泌されたタンパク質としての異種組換えポリペプチドまたはタンパク質である。好ましく生産されるタンパク質の例は、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、アプロチニン、組織因子経路阻害剤もしくは他のプロテアーゼ阻害剤、ならびにインスリンもしくはインスリン前駆体、インスリン類似体、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲン活性化因子、トランスフォーミング増殖因子ａもしくはｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、血小板由来増殖因子１、血清アルブミン、酵素、例えばリパーゼもしくはプロテアーゼ、または天然のタンパク質と類似した機能を有する機能的ホモログ、機能的同等変異体、誘導体および生物学的活性断片である。ＰＯＩは天然のタンパク質に構造的に類似していてよく、天然タンパク質のＣ末端およびＮ末端の一方もしくは両方、または側鎖への１つ以上のアミノ酸の添加、または天然のアミノ酸配列中の１つもしくはいくつかの異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、または天然のタンパク質の一端もしくは両端またはアミノ酸配列中の１つもしくはいくつかの部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、または天然のアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって天然のタンパク質から誘導してもよい。そのような改変は、上記のタンパク質のいくつかについて周知である。
【０１６９】
ＰＯＩは、その生化学反応の産物を得る目的で宿主細胞で生化学反応を、または例えば宿主細胞の代謝産物を得るためにいくつかの反応のカスケードを提供する、基質、酵素、阻害剤または補因子から選択されてもよい。例示的産物は、ビタミン、例えばリボフラビン、有機酸およびアルコールであってよく、それらは本発明による組換えタンパク質またはＰＯＩの発現の後に上昇した収率で得ることができる。
【０１７０】
一般に、組換え産物を発現する宿主細胞は、ＰＯＩの組換え発現に適するいかなる真核細胞であってもよい。
【０１７１】
好ましい哺乳動物細胞の例は、ＢＨＫ、ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ−Ｓ）、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０およびＶＥＲＯ細胞である。
【０１７２】
本発明により宿主細胞として用いられる好ましい酵母細胞の例には、限定されずに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓが含まれる。
【０１７３】
より新しい文献は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉおよびＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓに分類、改称している。ここで、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは全てについて、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉおよびＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓと同義で用いられる。
【０１７４】
好ましい酵母宿主細胞は、メチロトローフ酵母、例えばＰｉｃｈｉａまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａからのもの、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、またはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ、またはＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓに由来する。宿主の例には、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母が含まれる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の例には、ＣＢＳ７０４（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１６０３＝ＤＳＭＺ７０３８２）、ＣＢＳ２６１２（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−７５５６）、ＣＢＳ７４３５（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０）、ＣＢＳ９１７３〜９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、およびＤＳＭＺ７０８７７（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）だけでなく、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの株、例えばＸ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１およびＳＭＤ１１６８が含まれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の例には、Ｗ３０３、ＣＥＮ．ＰＫおよびＢＹ系列（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が含まれる。上記の株の全ては、形質転換体を生成して、異種遺伝子を発現するために用いて成功した。
【０１７５】
本発明による好ましい酵母宿主細胞、例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、異種または組換えプロモーター配列を含有し、それらは、生産宿主と異なるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株から誘導してもよい。別の具体的な態様では、本発明による宿主細胞は、宿主細胞と同じ属、種または株を起源とするプロモーターを含む、本発明による組換え発現構築物を含む。
【０１７６】
プロモーターは、本発明によるプロモーター、または宿主細胞で転写活性を示す他の任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主に同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導してもよい。プロモーターは、好ましくは宿主細胞に同種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導される。
【０１７７】
例えば、本発明によるプロモーターは、酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株から誘導してもよいし、酵母でＰＯＩを発現させるために用いてもよい。特に好ましい態様は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ生産者宿主細胞系で組換えＰＯＩを生産する方法で用いるための、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを起源とする本発明によるプロモーターに関する。ヌクレオチド配列の同種起源は同じ属または種の宿主細胞へのその組込みを促進し、したがって、工業製造工程においておそらく上昇した収率によるＰＯＩの安定した生産を可能にする。さらに、他の適する酵母または他の真菌類、または他の生物体、例えば脊椎動物もしくは植物からのプロモーターの機能的活性変異体を用いることができる。
【０１７８】
ＰＯＩが宿主細胞と同種であるタンパク質、すなわち宿主細胞に天然に存在するタンパク質である場合は、宿主細胞でのＰＯＩの発現は、その天然のプロモーター配列と本発明によるプロモーター配列との交換によってモジュレートしてもよい。
【０１７９】
この目的は、例えば、部位特異的組換えを可能にするための標的遺伝子の相同配列、プロモーター配列および宿主細胞に適する選択マーカーを含む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換によって達成してもよい。部位特異的組換えは、プロモーター配列とＰＯＩをコードするヌクレオチド配列とを作動可能に連結するために起こるものとする。これは、天然のプロモーター配列からの代わりに、本発明によるプロモーター配列からのＰＯＩの発現をもたらす。
【０１８０】
本発明の特に好ましい態様では、プロモーター配列は、ＰＯＩの天然のプロモーター配列と比較して、増加したプロモーター活性を有する。
【０１８１】
本発明により、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される本発明によるプロモーター配列を含む、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞系を提供することが好ましい。
【０１８２】
本発明により、本発明によるプロモーターを含み、ＰＯＩをコードする対象の遺伝子を容易に組み込む、本発明によるワイルドカードベクターまたは宿主細胞を提供することも可能である。ワイルドカード細胞系は、したがって、予め形成された宿主細胞系であり、それはその発現能力について特徴づけられる。これは、例えば部位特異的リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いる、ＰＯＩ生産のための、生産者細胞系の生成のための革新的な「ワイルドカード」プラットホーム戦略に従う。そのような新しい宿主細胞は、再現性のある高度効率生産細胞系を得るために、例えば所定のゲノム発現ホットスポットへの、数日以内の対象の遺伝子（ＧＯＩ）のクローニングを促進する。
【０１８３】
好ましい態様によれば、本発明による方法は、宿主細胞のゲノムへの組込みに適するプラスミドの上で、１細胞につき単一コピーまたは複数コピーで提供される、ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列を使用する。ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列は、自己複製プラスミドの上で、１細胞につき単一コピーまたは複数コピーで提供してもよい。
【０１８４】
本発明による好ましい方法は、真核生物の発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターであるプラスミドを使用する。発現ベクターには、限定されずに、クローニングベクター、改変クローニングベクターおよび特別設計のプラスミドが含まれてよい。本発明で用いられる好ましい発現ベクターは、宿主細胞での組換え遺伝子の発現に適するいかなる発現ベクターであってよく、宿主生物体に従い選択される。組換え発現ベクターは、本発明によるＤＮＡ構築物を運ぶ、宿主ベクターとも呼ばれる、宿主生物体のゲノムの中で複製することまたはそれに組み込むことが可能であるいかなるベクター、例えば酵母ベクターであってもよい。好ましい酵母発現ベクターは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属によって代表されるメチロトローフ酵母からなる群から選択される酵母での発現のためである。
【０１８５】
本発明では、ベクターとして、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺａｌｆａ、ｐＧＡＰＺａｌｆａ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＧＡＰＨｉｓまたはｐＰＵＺＺＬＥに由来するプラスミドを用いるのが好ましい。
【０１８６】
本発明の好ましい態様によれば、組換え構築物は、ベクターに、関連する遺伝子を連結して得られる。そのようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによって、これらの遺伝子を宿主細胞ゲノムに安定して組み込むことができる。遺伝子によってコードされるポリペプチドは、適当な培地でこのように得られる形質転換体を培養し、発現されるＰＯＩを培養から単離し、特にＰＯＩを混入タンパク質から分離するために、発現される産物に適当な方法によってそれを精製することによって、組換え宿主細胞系を用いて生産することができる。
【０１８７】
発現ベクターは、表現型で選択可能な１つ以上のマーカー、例えば抗生物質耐性を付与するか自家栄養必要量を供給するタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。酵母ベクターは、酵母プラスミドからの複製起点、自己複製配列（ＡＲＳ）、あるいはその代わりとしての宿主ゲノムへの組込みのために用いられる配列、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカーを一般的に含有する。
【０１８８】
例えば前駆体配列および／またはＰＯＩをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれ連結し、組込みまたは宿主複製のために必要な情報を含んでいる好適なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）によって記載されている。
【０１８９】
本発明による調節エレメントおよび／または組込み標的としてのＰＯＩを用いるベクターは、調節エレメントおよび／またはＰＯＩをコードする全体のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を最初に調製し、その後この断片を適する発現ベクターに挿入すること、または、個々のエレメント、例えばシグナル、リーダーまたは異種タンパク質のための遺伝情報を含有するＤＮＡ断片を逐次的に挿入し、続いてライゲーションすることのいずれかによって構築してもよいことが理解されよう。
【０１９０】
マルチクローニング部位を有するベクターであるマルチクローニングベクターを本発明により用いることもでき、その場合、所望の異種遺伝子をマルチクローニング部位に組み込んで発現ベクターを提供することができる。発現ベクターでは、プロモーターはＰＯＩ遺伝子の上流に置かれて、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターの場合、ＰＯＩ遺伝子はマルチクローニング部位に導入されるので、プロモーターはマルチクローニング部位の上流に置かれる。
【０１９１】
本発明による組換え宿主細胞を得るために提供されるＤＮＡ構築物は、確立された標準方法、例えばホスホラミダイト法によって合成的に調製してもよい。ＤＮＡ構築物はゲノムまたはｃＤＮＡ起源であってもよく、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションによって本発明のポリペプチドの全部または一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることによって得てもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）。最後に、ＤＮＡ構築物は、適宜、標準技術に従って合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源の断片をアニールすることによって調製される、混合された合成およびゲノム起源、混合された合成およびｃＤＮＡ起源、または混合されたゲノムおよびｃＤＮＡ起源のものであってよく、断片は、全体のＤＮＡ構築物の様々な部分に対応する。
【０１９２】
別の好ましい態様では、酵母発現ベクターは、例えば相同組換えにより酵母ゲノムに安定して組み込むことができる。
【０１９３】
本発明による調節エレメントおよび／またはＰＯＩ遺伝子で細胞を形質転換することによって得られる本発明による形質転換体宿主細胞は、好ましくは、異種タンパク質を発現する負荷なしで多数の細胞まで効率的に増殖させる条件で先ず培養してもよい。細胞系がＰＯＩ発現のために調製される場合は、発現産物を生産するように培養技術が選択される。
【０１９４】
以下の定義の対象が、本発明の態様とみなされる：
１．対象のタンパク質（ＰＯＩ）を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
ａ）前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップと、
ｂ）前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは限定された量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度でのＰＯＩの生産を誘導するステップと、
ｃ）前記ＰＯＩを生産し、回収するステップと
を含む方法。
【０１９５】
２．前記基礎炭素源が、グルコース、グリセロール、エタノールおよび複合栄養材料からなる群から選択される、定義１による方法。
【０１９６】
３．前記補助的炭素源が、ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、定義１または２による方法。
【０１９７】
４．前記基礎炭素源がグリセロールであり、前記補助的炭素源がグルコースである、定義１〜３のいずれかによる方法。
【０１９８】
５．ステップｂが、前記補助的炭素源を供給しないか、制限量、好ましくは培養培地中に０〜１ｇ／Ｌを供給する供給培地を使用する、定義１〜４のいずれかによる方法。
【０１９９】
６．前記供給培地が既知組成で、無メタノールである、定義５による方法。
【０２００】
７．前記補助的炭素源の制限量が、比増殖速度を０．０２ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは０．０２ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つために増殖制限的である、定義１〜６のいずれかによる方法。
【０２０１】
８．前記補助的供給源の制限量が検出限界未満である残留量を細胞培養に供給する、定義７による方法。
【０２０２】
９．前記プロモーターが、野生型真核細胞の遺伝子の転写を制御することが可能であり、遺伝子が、Ｇ１（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、Ｇ４（配列番号９）、Ｇ６（配列番号１０）、Ｇ７（配列番号１１）またはＧ８（配列番号１２）、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される、定義１〜８のいずれかによる方法。
【０２０３】
１０．前記機能的活性変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列を含むかそれからなる配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、定義９による方法。
【０２０４】
１１．前記ｐＧ１の機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、定義９または１０による方法。
【０２０５】
１２．前記プロモーターが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロモーターまたはその機能的活性変異体である、定義１〜１１のいずれかによる方法。
【０２０６】
１３．前記細胞系が、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、定義１〜１２のいずれかによる方法。
【０２０７】
１４．前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ａｒｘｕｌａ、Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａからなる群から選択され、好ましくはメチロトローフ酵母である、定義１３による方法。
【０２０８】
１５．前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉまたはＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓである、定義１４による方法。
【０２０９】
１６．前記プロモーターが、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない、定義１〜１５のいずれかによる方法。
【０２１０】
１７．前記ＰＯＩが、異種タンパク質であって、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはＰＯＩの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される、定義１〜１６のいずれかによる方法。
【０２１１】
１８．前記ＰＯＩが真核生物のタンパク質、好ましくは哺乳動物のタンパク質である、定義１〜１７のいずれかによる方法。
【０２１２】
１９．前記ＰＯＩが多量体のタンパク質、好ましくは二量体または四量体である、定義１〜１８のいずれかによる方法。
【０２１３】
２０．前記ＰＯＩが、抗原結合分子、例えば抗体またはその断片である、定義１〜１９のいずれかによる方法。
【０２１４】
２１．前記ＰＯＩ、その代謝産物または誘導体を用いて発酵産物が製造される、定義１〜２０のいずれかによる方法。
【０２１５】
２２．細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でのＰＯＩの発現を制御する方法であって、前記発現が前記炭素源を制限する条件の下で誘導される方法。
【０２１６】
２３．炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でＰＯＩを生産する方法であって、前記プロモーターが、細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する方法。
【０２１７】
２４．前記調節可能なプロモーターが、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度で組換え真核細胞でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、定義１〜２３のいずれかによる方法。
【０２１８】
２５．ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列を含むかそれからなる配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、定義２４による方法。
【０２１９】
２６．ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、定義２４または２５による方法。
【０２２０】
２７．単離された核酸であって、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む単離された核酸。
【０２２１】
２８．ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列を有する配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、定義２７による核酸。
【０２２２】
２９．ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、定義２７または２８による核酸。
【０２２３】
３０．前記プロモーターの転写制御下でＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される定義２７〜２９のいずれかによる核酸を含む発現構築物であって、前記核酸が前記ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない発現構築物。
【０２２４】
３１．定義３０による構築物を含むベクター。
【０２２５】
３２．定義３０の構築物、または定義３１のベクターを含む組換え真核細胞。
【０２２６】
３３．哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、定義３１による細胞。
【０２２７】
３４．酵母が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ａｒｘｕｌａ、Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａからなる群から選択され、好ましくはメチロトローフ酵母である、定義３２による細胞。
【０２２８】
３５．酵母が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉまたはＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓである、定義３４による細胞。
【０２２９】
３６．制限された炭素源の条件に対して過剰の炭素源の存在下でより高い比増殖速度を有する、定義３２〜３５のいずれかの細胞。
【０２３０】
３７．真核細胞から炭素源で調節可能なプロモーターを同定する方法であって、
ａ）細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
ｂ）制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において細胞をさらに培養するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）の細胞培養の試料を準備するステップと、
ｄ）前記試料で転写分析を実施して、ステップａ）の細胞よりもステップｂ）の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと
を含む方法。
【０２３１】
３８．転写分析が定量的または半定量的であり、好ましくはＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ配列決定およびトランスクリプトーム分析を使用する、定義３７による方法。
【０２３２】
具体的な例は、グリセロールバッチ培地およびグルコース流加培地を使用する、リポータータンパク質を生産する組換え生産Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞系の流加発酵に関する。比較プロモーター活性研究は、本発明によるプロモーターが活性化されて組換えタンパク質生産を誘導することに成功できることを証明した。
【０２３３】
さらなる例により、グルコース制限で誘導されるプロモーターの制御下でヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）がＰＯＩとして生産され、ＨＳＡ収率および遺伝子コピー数が測定された。
【０２３４】
別の例により、本発明によるプロモーターの制御下でＨＳＡを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の流加培養を実施した。グルコース制限条件下のプロモーター活性の誘導は、抑制された状態と比較して、ｐＧ１で１２０倍さえも超え、ｐＧ６で２０倍を超えることが見出された。
【０２３５】
さらなる例は、ｐＧ１およびｐＧ６プロモーターの転写制御下で、モデルタンパク質としてブタのカルボキシペプチダーゼＢを発現させることに関する。
【０２３６】
さらに、さらなる例は、ｐＧ１の転写制御下での抗体断片の発現に関する。
【０２３７】
さらなる例は、本発明によるプロモーターの変異体、例えば３００〜１０００ｂｐの範囲の長さを有するｐＧ１の断片の機能的活性を証明する。ｐＧ１のさらに短い断片、例えば２００〜１０００ｂｐの範囲内の断片または２５０〜１０００の範囲内の断片が、類似した状況で機能的に活性であったことをさらなる実験は示している。
【０２３８】
前述の記載は、以下の例を参照してより完全に理解される。しかし、そのような例は本発明の１つ以上の態様を実施する方法を単に代表するだけであり、発明の範囲を限定するものと解釈するべきでない。
【０２３９】
［実施例］
下記の例は、新しい調節可能なプロモーターを同定して、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでのそれらの発現特性を分析するために用いられる材料および方法を例示する。
【０２４０】
例１：グルコース制限条件におけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの強力な、効率的に調節される遺伝子の同定
グルコース制限条件において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの強力な、効率的に調節される遺伝子およびそれらのそれぞれのプロモーターを同定するために、遺伝子発現パターンの分析を、マイクロアレイを用いて行った。グリセロールバッチ（余剰の炭素源）で増殖させたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を、グルコースが増殖制限性（ケモスタット）であり、それによって、通常流加モードで行われるタンパク質生産工程の過程をシミュレーションする条件で培養された細胞と比較した。
【０２４１】
ａ）株
補助剤なしで最少培地で増殖可能な、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。
【０２４２】
ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの培養
発酵は、２．５Ｌの最終作業容量の、Ｍｉｎｉｆｏｒｓ反応器（Ｉｎｆｏｒｓ−ＨＴ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施した。
【０２４３】
以下の培地を用いた：
ＰＴＭ1微量塩保存溶液は、１リットルにつき以下を含有した
６．０ｇ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０８ｇ  ＮａＩ、３．３６ｇ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．２ｇ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ  Ｈ3ＢＯ3、０．８２ｇ  ＣｏＣｌ2、２０．０ｇ  ＺｎＣｌ2、６５．０ｇ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇビオチンおよび５．０ｍｌ  Ｈ2ＳＯ4（９５％〜９８％）。
【０２４４】
グリセロールバッチ培地は、１リットルにつき以下を含有した
２ｇクエン酸一水和物（Ｃ6Ｈ8Ｏ7・Ｈ2Ｏ）、３９．２ｇグリセロール、２０．８ｇ  ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、０．５ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．６ｇ  ＫＣｌ、０．０２２ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．８ｍｇビオチンおよび４．６ｍｌ  ＰＴＭ１微量塩保存溶液。ＨＣｌを加えてｐＨを５に設定した。
【０２４５】
グリセロール流加培地は、１リットルにつき以下を含有した
６３２ｇグリセロール、８ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２２ｇ  ＫＣｌおよび０．０５８ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ。
【０２４６】
ケモスタット培地は、１リットルにつき以下を含有した
２ｇクエン酸一水和物（Ｃ6Ｈ8Ｏ7・Ｈ2Ｏ）、９９．４２ｇグルコース一水和物、２２ｇ  ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、１．３ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３．４ｇ  ＫＣｌ、０．０２ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．４ｍｇビオチンおよび３．２ｍｌ  ＰＴＭ１微量塩保存溶液。ＨＣｌを加えてｐＨを５に設定した。
【０２４７】
溶存酸素は、撹拌速度（５００〜１２５０ｒｐｍ）によりＤＯ＝２０％に制御した。曝気速度は空気が６０Ｌｈ-1であり、温度は２５℃に制御し、ｐＨ５の設定値はＮＨ4ＯＨ（２５％）の添加で制御した。
【０２４８】
発酵を開始するために、１．５Ｌのバッチ培地を滅菌濾過して発酵槽に入れ、開始光学濃度（ＯＤ６００）１で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを接種した（１８０ｒｐｍ、２８℃でのＹＰＧでの一晩の前培養から）。およそ２５時間のバッチ段階はおよそ２０ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度に到達し、その後グルコース培地による１０時間の指数関数的流加が続き、およそ５０ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度をもたらした。次に、容量を１．５Ｌに低減し、０．１５Ｌｈ-1の供給／回収速度でケモスタット培養を開始し、μ＝０．１の定常増殖速度になった。発酵は、ケモスタット開始から５０時間後に終了した。
【０２４９】
信頼できるマイクロアレイ分析のために必要な生物学的反復試験区を得るために、この発酵を３回実施した。
【０２５０】
ケモスタットの間の炭素制限条件（残留グルコースが検出されない）は、培養上清のＨＰＬＣ分析によって検証した。
【０２５１】
ｃ）試料採取
試料は、グリセロールバッチ段階の終わりに、およびグルコースケモスタットの定常状態条件で採取した。光学濃度または酵母乾燥質量の測定、定性的顕微鏡検査および細胞生存力分析としての慣例の試料採取を、各発酵の間に併行して行った。マイクロアレイ分析のために、試料を採取して以下の通りに処理した：最適クエンチングのために、９ｍＬの細胞培養ブロスを４．５ｍＬの氷冷５％フェノール（Ｓｉｇｍａ）溶液（純エタノール中）と直ちに混合して、等分した。各２ｍＬを前冷却収集管（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）に入れて遠心分離（１３２００ｒｐｍで１分間）し、上清を完全に除去し、ＲＮＡ精製まで管を−８０℃で保存した。
【０２５２】
ｄ）マイクロアレイハイブリダイゼーションのためのＲＮＡ精製および試料調製
ＲＮＡは、供給業者の指示（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳ）によってＴＲＩ試薬を用いて単離した。細胞ペレットをＴＲＩ試薬に再懸濁させ、ＦａｓｔＰｒｅｐ２４（Ｍ．Ｐ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＣＡ）を用いて、５ｍｓ-1で４０秒間、ガラスビーズによりホモジナイズした。クロロホルムの添加の後、試料を遠心分離し、イソプロパノールを加えることによって全ＲＮＡを水相から沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、無ＲＮアーゼ水に再懸濁させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００分光計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＤＥ）を用いてＯＤ２６０を測定することによって、ＲＮＡ濃度を求めた。ＤＮＡ  ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ、ＣＡ）を用いて、試料から残りのＤＮＡを除去した。１０μｇのＲＮＡと等しい試料容量を無ＲＮアーゼ水で５０μＬまで希釈し、次にＤＮアーゼ緩衝剤ＩおよびｒＤＮアーゼＩを加えて３７℃で３０分の間インキュベートした。ＤＮアーゼ不活性化試薬の添加の後、試料を遠心分離し、上清を新鮮な管に移した。前記のようにＲＮＡ濃度を再び測定した。さらに、ＲＮＡナノチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＲＮＡ完全性を分析した。試料の増幅および標識からハイブリダイゼーションまでのマイクロアレイワークフローを監視するために、Ｓｐｉｋｅ  Ｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、製品番号：５１８８−５２７９）を陽性対照として用いた。それは、アデノウイルスからの１０個の異なるポリアデニル化転写産物を含有し、それらは増幅され、標識されて、自己のＲＮＡ試料と一緒に同時ハイブリダイズされる。Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、製品番号：５１９０−０４４４）を用いて、試料をＣｙ３およびＣｙ５で標識した。したがって、５００ｎｇの精製された試料ＲＮＡを８．３μＬの無ＲＮアーゼ水、２μＬのＳｐｉｋｅＡまたはＢで希釈し、１．２μＬのＴ７プロモータープライマーを加えた。混合物を６５℃で１０分間変性させ、５分間氷上に保持した。その後、８．５μＬのｃＤＮＡ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（１試料につき：４μＬの５×第１鎖緩衝剤、２μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μＬのＭＭＬＶ−ＲＴ、０．５μＬのＲＮアーゼアウト）を加え、４０℃で２時間インキュベートし、次に６５℃に１５分間移し、氷上に５分間置いた。転写ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（１試料につき：１５．３μＬ無ヌクレアーゼ水、２０μＬ転写緩衝剤、６μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、６．４μＬの５０％ＰＥＧ、０．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤、０．６μＬの無機ホスファターゼ、０．８μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２．４μＬのシアニン３またはシアニン５）を調製し、各管に加え、４０℃で２時間インキュベートした。得られた標識ｃＲＮＡを精製するために、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を用いた。試料は、−８０℃で保存した。ｃＲＮＡ濃度および標識効率の定量化は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計で行った。
【０２５３】
ｅ）マイクロアレイ分析
グルコースを制限したケモスタット培養で強力な効率的に調節される遺伝子を同定するために、その３つの生物学的反復試験区を、各々１つのｄｙｅｓｗａｐで同じ参照と比較した。グリセロールバッチ培養試料を等量で合わせることによって、参照試料を生成した。
【０２５４】
標識試料ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションのために、遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５１８８−５２４２）を用いた。ハイブリダイゼーション試料の調製のために、各３００ｎｇのｃＲＮＡ（Ｃｙ３およびＣｙ５）および６μＬの１０倍ブロック剤を、２４μＬの最終容量まで無ヌクレアーゼ水で希釈した。１μＬの２５倍断片化緩衝剤の添加の後、混合液を６０℃で３０分間インキュベートした。次に、２５μＬのＧＥｘハイブリダイゼーション緩衝剤ＨＩ−ＲＰＭを加えて反応を停止させた。１３，２００ｒｐｍによる１分間の遠心分離の後、試料を氷上で冷却し、直ちにハイブリダイゼーションのために用いた。自家設計したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ特異的オリゴヌクレオチドアレイ（ＡＭＡＤ−ＩＤ：０２６５９４、８×１５Ｋカスタムアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた。マイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバーユーザーガイド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５３４Ａ）に従って、マイクロアレイハイブリダイゼーションを実行した。先ず、ガスケットスライドのカバーを取り、Ａｇｉｌｅｎｔラベルを上にしてチャンバーベースに置いた。試料（１アレイにつき４０μＬ）を、８つの四角の各々の中心にロードした。次に、マイクロアレイスライドをガスケットスライド（Ａｇｉｌｅｎｔラベルを下にして）の上に慎重に置き、チャンバーカバーを置き、クランプで固定した。ハイブリダイゼーションは、６５℃で１７時間、ハイブリダイゼーションオーブンで実行した。スキャンの前に、マイクロアレイチップを洗浄した。したがって、チャンバーを取り外し、洗浄緩衝液１中に沈めながら、サンドイッチスライドを互いから切り離した。マイクロアレイは、洗浄緩衝液１で別の皿に直接移し、１分間洗浄し、洗浄緩衝液２（温度は少なくとも３０℃）に移し、さらに１分間洗浄した。ティッシュでスライド端に触れることによってマイクロアレイスライドを乾燥させた後、それをスライドホルダー（Ａｇｉｌｅｎｔラベルを上にして）に入れた。スライドホルダーをカルーセルに入れ、スキャンを開始した。
【０２５５】
ｆ）マイクロアレイデータのデータ取得および統計的評価
Ｇ２５６５ＡＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により５０ｎｍの分解能で画像をスキャンし、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ９．５ソフトウェアにインポートした。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ９．５を、スポット強度の定量化のために用いた。さらなる標準化およびデータ分析のために、平均スポット強度の生データをオープンソースソフトウェアＲに次にインポートした。
【０２５６】
データ前処理および標準化のために、Ｒパッケージ、ｌｉｍｍａ、ｖｓｎおよびｍａｒｒａｙを用いた。強度データはバックグラウンド補正せずにＶＳＮで標準化し、標準化の後、それをＣｙ３チャネルに対するＣｙ５チャネルのｌｏｇ２比に形質転換した。ｌｉｍｍａパッケージのｌｍｆｉｔおよびｅＢａｙｅｓ関数を用いて、差別的発現を計算した。
【０２５７】
強く発現され、効率的に調節された遺伝子を同定するために、抑制と誘導状態の間の発現レベルの大きな差（変化倍率）、ならびに誘導状態での高いシグナル強度の両方でのエントリーについて、マイクロアレイデータを調べた。選択された遺伝子のリストを表１に示すが、変化倍率は抑制状態でのシグナル強度で割った誘導状態でのシグナル強度を意味する。ｐＧＡＰおよびｐＭＬＳ１、ｐＩＣＬ１のデータは、参照として加えられる。
【表２】
2014530016.tif 000004
【０２５８】
例２：細胞内に発現されるリポーター遺伝子としてｅＧＦＰを用いるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの新たに同定されたプロモーターの比較プロモーター活性研究
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した：炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で２４時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし（プロモーターの抑制状態）、その後、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする（プロモーターの誘導状態）。
【０２５９】
ａ）株および発現ベクター
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いた。株の形質転換は、大腸菌の複製起点（ｐＵＣ１９）、大腸菌および酵母での選択のための抗生物質耐性カセット（Ｚｅｏｃｉｎへの耐性を付与するＳｈ  ｂｌｅ遺伝子）、マルチクローニングサイトおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣ１の転写ターミネーターからなる対象遺伝子（ＧＯＩ）のための発現カセット、ならびにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム（３’ＡＯＸ１領域）への組込みのための遺伝子座を含む、ｐＰＵＺＺＬＥと名付けられた自家製ベクターで実行した（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）。
【０２６０】
ｂ）ＧＯＩとしてｅＧＦＰを含有するｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターへの、新たに同定されたプロモーターｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４およびｐＧ６の増幅およびクローニング
新たに同定されたプロモーター配列およびそれらのそれぞれの遺伝子（例１を参照）のリストを、表２に示す。表２に示すプライマーを用いて、プロモーター配列として開始コドンＡＴＧまでのそれぞれの遺伝子の５’非コード領域の１０００ｂｐをＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって増幅した。これらの配列をｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターｐＰＭ１ａＺ１０＿ｅＧＦＰにクローニングし、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ１＿ｅＧＦＰ、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ３＿ｅＧＦＰ、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ４＿ｅＧＦＰおよびｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ６＿ｅＧＦＰを得た。さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一般的に用いられるプロモーター（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＧＡＰ、ここでは配列番号２５）を含有する、ベクターｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧＡＰ＿ｅＧＦＰを参照として用いた。ＡｐａＩおよびＳｂｆＩ制限部位を用いて、ｅＧＦＰ遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入した（表２および３を参照）。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証した。
【表３】
2014530016.tif 000005
【表４】
2014530016.tif 000006
【０２６１】
ｃ）プロモーター活性の分析のためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのｅＧＦＰの発現
全てのプラスミドは、エレクトロコンピテントなＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓへのエレクトロポレーション（２ｋＶ、４ｍｓ、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ、ＢｉｏＲａｄ）の前に、３’ＡＯＸゲノム組込み領域中でＡｓｃＩによって線状化した。
【０２６２】
陽性形質転換体の選択は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＣＡ）を含有するＹＰＤプレート（１リットルにつき：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天）で実施した。形質転換プラスミドの存在を確認するために、コロニーＰＣＲを用いた。したがって、ゲノムＤＮＡはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓコロニーのそれぞれ５分間の加熱および凍結によって得られ、適当なプライマーによるＰＣＲに直接に適用された。発現スクリーニングのために、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種した。およそ２４時間の後、１０ｍｌのＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の０．１のＯＤ６００および２つのグルコース供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）で本培養に接種するために前培養を用いた。グルコース制限増殖条件は、これらの供給ビーズの以下の式で記載される遅いグルコース放出動態によって達成された：（グルコース）＝１．６３*ｔ０．７４［ｍｇ／ディスク］。前培養の終わりと本培養の接種から２４および４８時間後に試料をとった。細胞密度はＯＤ６００を測定することによって求め、Ｓｔａｄｌｍａｙｒら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）に記載のようにｅＧＦＰ発現はフローサイトメトリーによって分析した。各試料につき、１０，０００個の細胞を分析した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの自己蛍光を非形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型細胞を用いて測定し、シグナルから引き算した。相対的ｅＧＦＰ発現レベル（細胞サイズに関係する蛍光強度）は、構成的ｐＧＡＰプロモーターの制御下でｅＧＦＰを発現するクローンのｅＧＦＰ発現レベルの百分率として示す。さらなる類似した研究を、プロモーターｐＧ７およびｐＧ８で行う。クローニングは、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ−３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ７＿ｅＧＦＰおよびｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ８＿ｅＧＦＰの形質転換のために用いられたこと以外は、例２ｂに記載の通りに行う。用いたプライマーおよびクローニング断片は、表２および３に掲載する。結果を表４に示す。
【表５】
2014530016.tif 000007
【０２６３】
ｄ）選択されたｅＧＦＰ発現クローンでのｅＧＦＰ遺伝子コピー数（ＧＣＮ）の判定
発現強度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに組み込まれる発現カセットの数としばしば相関する。したがって、ｅＧＦＰの遺伝子コピー数を判定した。ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号６９５０４）を用いて単離した。遺伝子コピー数は、定量的ＰＣＲを用いて判定した。したがって、ＳｅｎｓｉＭｉｘ  ＳＹＢＲキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＱＴ６０５−０５）を用いた。ＳｅｎｓｉＭｉｘ  ＳＹＢＲをプライマーおよび試料と混合し、リアルタイムＰＣＲサイクラー（Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ、Ｑｉａｇｅｎ）でのリアルタイム分析に適用した。プライマーのリストは、表５に示す。全ての試料は、３または４反復で分析した。Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅソフトウェアを、データ分析のために用いた。アクチン遺伝子ＡＣＴ１は、キャリブレータとして用いた。結果を表６に示す。
【表６】
2014530016.tif 000008
【表７】
2014530016.tif 000009
【０２６４】
ｅ）１つのｅＧＦＰクローンの流加発酵でのｐＧ１プロモーター強度の分析
流加発酵は、０．７Ｌの最終作業容量で、ＤＡＳＧＩＰ反応器で実施した。
【０２６５】
以下の培地を用いた：
ＰＴＭ1微量塩保存溶液は、１リットルにつき以下を含有した
６．０ｇ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０８ｇ  ＮａＩ、３．３６ｇ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．２ｇ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ  Ｈ3ＢＯ3、０．８２ｇ  ＣｏＣｌ2、２０．０ｇ  ＺｎＣｌ2、６５．０ｇ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇビオチンおよび５．０ｍｌ  Ｈ2ＳＯ4（９５％〜９８％）。
【０２６６】
グリセロールバッチ培地は、１リットルにつき以下を含有した
２ｇクエン酸一水和物（Ｃ6Ｈ8Ｏ7・Ｈ2Ｏ）、３９．２ｇグリセロール、１２．６ｇ  ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、０．５ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．９ｇ  ＫＣｌ、０．０２２ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．４ｍｇビオチンおよび４．６ｍｌ  ＰＴＭ１微量塩保存溶液。ＨＣｌを加えてｐＨを５に設定した。
【０２６７】
グルコース流加培地は、１リットルにつき以下を含有した
４６４ｇグルコース一水和物、５．２ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．４ｇ  ＫＣｌ、０．２８ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．３４ｍｇビオチンおよび１０．１ｍＬ  ＰＴＭ１微量塩保存溶液。
【０２６８】
溶存酸素は、撹拌速度（４００〜１２００ｒｐｍ）によりＤＯ＝２０％に制御した。曝気速度は空気が２４Ｌｈ-1であり、温度は２５℃に制御し、ｐＨ５の設定値はＮＨ4ＯＨ（２５％）の添加で制御した。
【０２６９】
発酵を開始するために、４００ｍＬのバッチ培地を滅菌濾過して発酵槽に入れ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンｐＧ１＿ｅＧＦＰ＃８を、１の開始光学濃度（ＯＤ６００）で接種した（前培養から）。およそ２５時間のバッチ段階（およそ２０ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度に到達する）の後に、７時間の指数関数的供給で開始されるグルコース制限流加および１３時間の１５ｇ／Ｌの一定の供給速度が続き、およそ１００ｇ／Ｌの最終乾燥バイオマス濃度をもたらした。バッチおよび流加段階の間に試料をとり、プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００、Ｔｅｃａｎ、ＣＨ）を用いてｅＧＦＰ発現について分析した。したがって、試料を５の光学濃度（ＯＤ６００）に希釈した。結果は、バイオリアクターあたりの相対的蛍光（ＦＬ／ｒ）として、表７に示す。
【表８】
2014530016.tif 000010
【０２７０】
例３：細胞外に発現されるリポーター遺伝子としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの新たに同定されたプロモーターの比較プロモーター活性研究
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した：炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で２４時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし（プロモーターの抑制状態）、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う  −工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする（プロモーターの誘導状態）。
【０２７１】
ａ）株と発現ベクター
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いた。株の形質転換は、ｐＰＵＺＺＬＥと名付けられた自家製ベクターで実行し（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）、陽性形質転換体の選択は、Ｚｅｏｃｉｎ抵抗性に基づいた。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の分泌発現のために、その天然の分泌リーダーを用いた。
【０２７２】
ｂ）自家製発現ベクターへの、新たに同定されたプロモーターｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４およびｐＧ６の増幅およびクローニング
例２ｂで増幅した４つのプロモーターをｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターｐＰＭ１ａＺ１０＿ＨＳＡにクローニングし、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ１＿ＨＳＡ、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ３＿ＨＳＡ、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ４＿ＨＳＡおよびｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ６＿ＨＳＡを得た。さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一般的に用いられるプロモーター（ｐＧＡＰ）を含有するベクターｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧＡＰ＿ＨＳＡを参照として用いた。ＡｐａＩおよびＳｂｆＩ制限部位を用いて、ＨＳＡ遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入した（表３を参照）。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証した。
【０２７３】
ｃ）新たに同定されたグルコース制限で誘導されるプロモーターの制御下のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのＨＳＡの発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへのエレクトロポレーション（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための標準形質転換プロトコルを用いる）の前に、ＡｓｃＩ制限酵素を用いて全てのプラスミドを線状化した。陽性形質転換体の選択は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＹＰＤプレート（１リットルにつき：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天）で実施した。例２ｃに記載のように、形質転換プラスミドの存在を確認するために、コロニーＰＣＲを用いた。
【０２７４】
ＨＳＡ発現スクリーニングのために、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種した。およそ２４時間の後、ＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の１のＯＤ６００およびグルコース供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）で本培養に接種するために前培養を用いた。グルコース制限増殖条件は、これらの供給ビーズの以下の式で記載される遅いグルコース放出動態によって達成された：（グルコース）＝１．６３*ｔ0.74［ｍｇ／ディスク］。前培養の終わりと本培養の接種から２４および４８時間後に試料をとった。ＯＤ６００または細胞の湿重量を測定することによって、バイオマス濃度を判定した。培養上清中のＨＳＡ濃度は、供給業者の手引に従って、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量化セット（カタログ番号Ｅ８０−１２９、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）によって定量化した。ＨＳＡ標準は、４００ｎｇ  ｍＬ-1の開始濃度で用いた。したがって、試料は試料希釈剤（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に希釈した。各構築物のいくつかのクローンのスクリーニングからのＨＳＡ力価は、表８に提示される。
【表９】
2014530016.tif 000011
【０２７５】
ｄ）ＨＳＡ遺伝子コピー数の判定
表９に示されるプライマーを用いて、例２ｄの通りにゲノムＤＮＡ単離およびｑＰＣＲ測定を実施した。結果を、表１０に示す。
【表１０】
2014530016.tif 000012
【表１１】
2014530016.tif 000013
【０２７６】
ｅ）ｐＧ１およびｐＧ６プロモーターの制御下でＨＳＡを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の流加培養
発酵は、０．７Ｌの最終作業容量で、ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターで実施した。株ｐＧ１＿ＨＳＡ＃２３は２つのＨＳＡ遺伝子コピーを有し、株ｐＧ６＿ＨＳＡ＃３６はただ１つのＨＳＡ遺伝子コピーを運んでいた。したがって、ｐＧＡＰの制御下でＨＳＡを発現する２つの異なるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（１つのＨＳＡ遺伝子コピーを有するｐＧＡＰ＿ＨＳＡ＃３および２つのＨＳＡ遺伝子コピーを有するｐＧＡＰ＿ＨＳＡ＃４）を、参照として培養した。全ての発酵は、２反復で実施した。
【０２７７】
以下の培地を用いた：
ＰＴＭ1微量塩保存溶液は、１リットルにつき以下を含有した
６．０ｇ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０８ｇ  ＮａＩ、３．３６ｇ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．２ｇ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ  Ｈ3ＢＯ3、０．８２ｇ  ＣｏＣｌ2、２０．０ｇ  ＺｎＣｌ2、６５．０ｇ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇビオチンおよび５．０ｍｌ  Ｈ2ＳＯ4（９５％〜９８％）。
【０２７８】
グリセロールバッチ培地は、１リットルにつき以下を含有した
３９．２ｇグリセロール、２７．９ｇ  Ｈ3ＰＯ4（８５％）、７．８ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．６ｇ  ＫＯＨ、９．５ｇ  Ｋ2ＳＯ4、０．６ｇ  ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．４ｍｇビオチンおよび４．６ｍｌ  ＰＴＭ１微量塩保存溶液。発酵槽への滅菌濾過注入の後、ｐＨを５．８５に調整した。
【０２７９】
グルコース流加培地は、１リットルにつき以下を含有した
５５０ｇグルコース一水和物、６．５ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ  ＫＣｌ、０．３５ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．４ｍｇビオチンおよび１２ｍＬ  ＰＴＭ１微量塩保存溶液。
【０２８０】
溶存酸素は、撹拌速度（４００〜１２００ｒｐｍ）によりＤＯ＝２０％に制御した。曝気速度は空気が２４Ｌｈ-1であり、温度は２５℃に制御し、ｐＨ５．８５の設定値はＮＨ4ＯＨ（２５％）の添加で制御した。
【０２８１】
発酵を開始するために、４００ｍＬのバッチ培地を滅菌濾過して発酵槽に入れ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを、１の開始光学濃度（ＯＤ６００）で接種した（前培養から）。およそ２５時間のバッチ段階はおよそ２０ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度に到達し、その後グルコース培地による定常流加（１００時間）が続き、およそ１００ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度をもたらした。バッチの間のｐＨは５．８５で、発酵の間中５．８５に保たれた。バッチおよび流加段階の間、試料をとった。例３ｃに記載されている通りに、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量化セット（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ｅ８０−１２９）を用いて、ＨＳＡ濃度を定量化した。バイオマス濃度およびＨＳＡ力価を表１１に示し、バッチ（ｐＧ１およびｐＧ６の抑制条件）の終わりおよび流加（ｐＧ１およびｐＧ６の誘導条件）の終わりの産物収量（バイオマスあたりの分泌されたＨＳＡの量、ＨＳＡ／ＹＤＭ）を、表１２に示す。それによって、誘導戦略を検証することができた。ｐＧ１およびｐＧ６は炭素源余剰（グリセロールバッチ）の下で抑制され、ｐＧＡＰ作動型のクローンと対照的に検出可能なＨＳＡをほとんど示さなかった。ｐＧ１およびｐＧ６の誘導は、流加段階の開始を伴うＣ制限条件への切換えにより発生した。ｐＧ１の誘導（ＨＳＡ／ＹＤＭ）は抑制状態と比較して１２０倍を超え、ｐＧ６の誘導は抑制状態と比較して２０倍を超えたが、ｐＧＡＰについてはほとんど変化が観察されなかった（バッチ段階と比較してＨＳＡ／ＹＤＭの３倍の増加）。
【表１２】
2014530016.tif 000014
【表１３】
2014530016.tif 000015
【０２８２】
例４：細胞内に発現されるリポーター遺伝子としてｅＧＦＰを用いるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの新たに同定されたプロモーターの様々なグルコース濃度における比較プロモーター活性研究
様々なグルコース濃度における新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した：炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地（プロモーターの抑制状態）で２４時間の前培養を行い、その後、最少培地および炭素源としてグルコースによる本培養（プロモーターの誘導状態）が続いた。
【０２８３】
ａ）株と発現ベクター
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いる。株の形質転換は、ｐＰＵＺＺＬＥと名付けられた自家製ベクターで実行し（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）、陽性形質転換体の選択は、Ｚｅｏｃｉｎ抵抗性に基づいた。
【０２８４】
ｂ）ＧＯＩとしてｅＧＦＰを含有するｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターへの、新たに同定されたプロモーターｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４およびｐＧ６の増幅およびクローニング
増幅およびクローニングは、例２に記載されている通りに行う。
【０２８５】
ｃ）プロモーター活性の分析のためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのｅＧＦＰの発現
形質転換およびクローン選択は、例２に記載されている通りに行う。
【０２８６】
発現スクリーニングのために、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種した。およそ２４時間の後、１０ｍｌのＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の０．０１のＯＤ６００および炭素源としてグルコースにより本培養に接種するためにその前培養を用いる。グルコースは、２０〜０．００１ｇ  Ｌ-1の様々な濃度で用いられる。
【０２８７】
試料は、本培養の接種から１〜８時間後にとる。Ｓｔａｄｌｍａｙｒら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）に記載のようにｅＧＦＰ発現はフローサイトメトリーによって分析し、陽性形質転換体の選択はＺｅｏｃｉｎ抵抗性に基づく。各試料につき、１０，０００個の細胞を分析する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの自己蛍光を、非形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型細胞を用いて測定する。
【０２８８】
例５：細胞外に発現されるリポーター遺伝子としてブタのカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）を用いるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの新たに同定されたプロモーターの比較プロモーター活性研究
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した：炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で２４時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし（プロモーターの抑制状態）、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする（プロモーターの誘導状態）。
【０２８９】
ａ）株と発現ベクター
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いる。株の形質転換は、ｐＰＵＺＺＬＥと名付けられた自家製ベクターで実行し（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）、陽性形質転換体の選択は、Ｚｅｏｃｉｎ抵抗性に基づく。ブタのカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）の分泌発現のために、酵母アルファ交配因子リーダーを用いる。
【０２９０】
ｂ）自家製発現ベクターへの、新たに同定されたプロモーターｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４およびｐＧ６の増幅およびクローニング
例２ｂで増幅された２つのプロモーターを、ｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターｐＰＭ１ａＺ３０＿ａＭＦ＿ＣｐＢにクローニングし、ｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１＿ａＭＦ＿ＣｐＢおよびｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ６＿ａＭＦ＿ＣｐＢをもたらす。さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一般的に用いられるプロモーター（ｐＧＡＰ）を含有するベクターｐＰＭ１ｄＺ３０＿ｐＧＡＰ＿ＣＰＢを参照として用いる。ＡｐａＩおよびＳｂｆＩ制限部位を用いて、ＣｐＢ遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入する。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証する。
【０２９１】
ｃ）新たに同定されたグルコース制限で誘導されるプロモーターの制御下のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのＣｐＢの発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへのエレクトロポレーション（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための標準形質転換プロトコルを用いる）の前に、ＳｐｅＩまたはＳａｐＩ制限酵素を用いてプラスミドを線状化する。陽性形質転換体の選択は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＹＰＤプレート（１リットルにつき：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天）で実施する。形質転換プラスミドの存在を確認するために、例２ｃに記載の通りにコロニーＰＣＲを用いる。
【０２９２】
ＣｐＢ発現スクリーニングのために、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種する。およそ２４時間の後、ＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の１のＯＤ６００およびグルコース供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）で本培養に接種するためにその前培養を用いる。グルコース制限増殖条件は、これらの供給ビーズの以下の式で記載される遅いグルコース放出動態によって達成される：（グルコース）＝１．６３*ｔ0.74［ｍｇ／ディスク］。前培養の終わりと本培養の接種から２４および４８時間後に試料をとる。ＯＤ６００または細胞の湿重量を測定することによって、バイオマス濃度を判定する。培養上清中のＣｐＢ濃度は、ＣｐＢによる馬尿酸へのヒップリル−Ｌ−アルギニンの変換に基づいて、酵素アッセイによって定量化される。反応動態は、反応が開始されるときにＨｉｔａｃｈｉ  Ｕ−２９１０分光計を用いて、２５℃で２５４ｎｍでの吸収を監視することによって測定される。試料および標準は、アッセイ緩衝剤（２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．６５）で緩衝され、活性化緩衝剤（０．０１ｍｇ  Ｌ−１トリプシン、３００ｍＭトリス、１μＭ  ＺｎＣｌ2、ｐＨ７．６５）を用いて活性化される。トリプシンのない活性化緩衝剤は、陰性対照として試料の代わりに用いられる。基質溶液（アッセイ緩衝液中の１ｍＭのヒップリル−Ｌ−アルギニン）を加えることによって、反応を開始する。
【０２９３】
ｄ）ｐＧ６プロモーターの制御下でＣｐＢを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の流加培養
流加発酵は、例３ｅに記載されている通りに行う。クローンｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ６＿ＣｐＢ＃４は、バッチで検出可能なＣｐＢを生成せず、流加の終わりには２１０ｍｇ／Ｌを超えるＣｐＢを生成した。
【０２９４】
例６：細胞外に発現されるリポーター遺伝子としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの多コピークローンでの新たに同定されたプロモーターｐＧ１およびｐＧ６の比較プロモーター活性研究
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施する：炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で２４時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし（プロモーターの抑制状態）、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする（プロモーターの誘導状態）。
【０２９５】
ａ）株と発現ベクター
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いる。株の形質転換は、ｐＰＵＺＺＬＥと名付けられた自家製ベクターで実行し（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）、陽性形質転換体の選択は、Ｚｅｏｃｉｎ抵抗性に基づく。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の分泌発現のために、その天然の分泌リーダーを用いる。
【０２９６】
ｂ）自家製発現ベクターへの、新たに同定されたプロモーターｐＧ１およびｐＧ６の増幅およびクローニング
例２ｂで増幅された２つのプロモーターを、ｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターｐＰＭ１ｎＺ３０＿ＨＳＡにクローニングし、ｐＰＭ１ｎＺ３０＿ｐＧ１＿ＨＳＡおよびｐＰＭ１ｎＺ３０＿ｐＧ６＿ＨＳＡをもたらす。
【０２９７】
ＡｐａＩおよびＳｂｆＩ制限部位を用いて、ＨＳＡ遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入する。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証する。
【０２９８】
ｃ）新たに同定されたグルコース制限で誘導されるプロモーターの制御下のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのＨＳＡの発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへのエレクトロポレーション（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための標準形質転換プロトコルを用いる）の前に、ＡｓｃＩ制限酵素を用いて全てのプラスミドを線状化する。陽性形質転換体の選択は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＹＰＤプレート（１リットルにつき：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天）で実施する。遺伝子コピー数の増幅を、Ｍａｒｘら（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２００９  Ｄｅｃ；９（８）：１２６０〜７０）に記載されている通りに行う。形質転換プラスミドの存在を確認するために、例２ｃに記載の通りにコロニーＰＣＲを用いる。
【０２９９】
ＨＳＡ発現スクリーニングのために、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種する。およそ２４時間の後、ＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の１のＯＤ６００およびグルコース供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）で本培養に接種するためにその前培養を用いる。グルコース制限増殖条件は、これらの供給ビーズの以下の式で記載される遅いグルコース放出動態によって達成される：（グルコース）＝１．６３*ｔ０．７４［ｍｇ／ディスク］。前培養の終わりと本培養の接種から２４および４８時間後に試料をとる。ＯＤ６００または細胞の湿重量を測定することによって、バイオマス濃度を判定する。培養上清中のＨＳＡ濃度は、供給業者の手引に従って、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量化セット（カタログ番号Ｅ８０−１２９、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）によって定量化する。ＨＳＡ標準は、４００ｎｇ  ｍＬ-1の開始濃度で用いる。したがって、試料は試料希釈剤（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に希釈する。いくつかの多コピークローンおよび例３ｃからの単一コピークローンのスクリーニングからのＨＳＡ力価は、表１３に提示される。
【表１４】
2014530016.tif 000016
【０３００】
ｄ）ＨＳＡ遺伝子コピー数の判定
表９に示されるプライマーを用いて、例２ｄの通りにゲノムＤＮＡ単離およびｑＰＣＲ測定を実施する。結果は、表１４に示す。
【表１５】
2014530016.tif 000017
【０３０１】
ｅ）ｐＧ１およびｐＧ６プロモーターの制御下でＨＳＡを発現する多コピーＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の流加培養
流加発酵は、例３ｅに記載されている通りに行う。クローンｐＰＭ１ｎＺ３０＿ｐＧ１＿ＨＳＡ＃４*１０００およびｐＰＭ１ｎＺ３０＿ｐＧ６＿ＨＳＡ＃Ｃ６は、流加の終わりにそれぞれ１０６０および７２８ｍｇ／ＬのＨＳＡに到達した。
【０３０２】
例７：細胞外に発現されるリポーター遺伝子として抗体断片（Ｆａｂ）を用いるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの新たに同定されたプロモーターｐＧ１の比較プロモーター活性研究
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した：炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で２４時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし（プロモーターの抑制状態）、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする（プロモーターの誘導状態）。
【０３０３】
ａ）株と発現ベクター
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いる。株の形質転換は、ｐＰＵＺＺＬＥと名付けられた自家製ベクターで実行し（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）、陽性形質転換体の選択は、Ｚｅｏｃｉｎ抵抗性に基づく。抗体のＦａｂ断片の分泌発現のために、酵母アルファ交配因子リーダーを用いる。
【０３０４】
ｂ）自家製発現ベクターへの新たに同定されたプロモーターｐＧ１の増幅およびクローニング
例２ｂで増幅されたｐＧ１プロモーターを、例５ｂに記載の通りにＧＯＩとしてＦａｂを含有するｐＰＵＺＺＬＥ発現ベクターにクローニングする。ＡｐａＩおよびＳｂｆＩ制限部位を用いて、Ｆａｂ遺伝子の開始コドンの上流にそのプロモーターを挿入する。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証する。
【０３０５】
ｃ）新たに同定されたグルコース制限で誘導されるプロモーターｐＧ１の制御下のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのＦａｂの発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへのエレクトロポレーション（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための標準形質転換プロトコルを用いる）の前に、ＳｐｅＩまたはＳａｐＩ制限酵素を用いてプラスミドを線状化する。陽性形質転換体の選択は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＹＰＤプレート（１リットルにつき：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天）で実施する。形質転換プラスミドの存在を確認するために、例２ｃに記載の通りにコロニーＰＣＲを用いる。
【０３０６】
Ｆａｂ発現スクリーニングのために、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種する。およそ２４時間の後、ＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の１のＯＤ６００およびグルコース供給ビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）で本培養に接種するためにその前培養を用いる。グルコース制限増殖条件は、これらの供給ビーズの以下の式で記載される遅いグルコース放出動態によって達成される：（グルコース）＝１．６３*ｔ0.74［ｍｇ／ディスク］。前培養の終わりと本培養の接種から２４および４８時間後に試料をとる。ＯＤ６００または細胞の湿重量を測定することによって、バイオマス濃度を判定する。Ｆａｂ発現レベルは、ヤギで生成される抗ヒトカッパ軽鎖（結合および遊離）−アルカリ性ホスファターゼ抗体を用いてＥＬＩＳＡによって定量化する。ｐＧＡＰおよびｐＧ１の制御下のいくつかのＦａｂ発現クローンのスクリーニングからのＦａｂ力価を、表１５に提示する。
【表１６】
2014530016.tif 000018
【０３０７】
ｄ）ｐＧ１プロモーターの制御下でＦａｂを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の流加培養。
【０３０８】
流加発酵は例３ｅに記載されているのと同じように行うが、例２ｅに記載のグルコース流加が用いられる。クローンｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１＿Ｆａｂ＃Ｃ４およびｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１＿Ｆａｂ＃Ｃ７は、流加の終わりにそれぞれ１６５および１３１ｍｇ／ＬのＦａｂに到達した。
【０３０９】
例８：比増殖速度を新たに同定されたプロモーターの最大容量生産性に制御するための指数関数的流加発酵
異なる増殖速度で比生産性および容量生産性を判定するために、新たに同定されたプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンのケモスタット培養が用いられる。Ｍａｕｒｅｒら（ＭｉｃｒｏｂＣｅｌｌＦａｃｔ．２００６  Ｄｅｃ１１；５：３７）によって記載される通り、全供給段階の間の向上した生産のために特定の増殖速度でＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンを増殖させるために、指数関数的流加発酵を用いることができる。それによって、空時収量を最適化させることができる。最適化された供給を適用し、流加段階の空時収量は３５％を超えて向上した。
【０３１０】
例９：プロモーター／転写強度の判定：細胞内発現リポーター遺伝子としてｅＧＦＰを用いる、異なるグルコース濃度でのプロモーター調節を同定する比較プロモーター活性研究
プロモーターの調節特性は、前記プロモーターの制御下でｅＧＦＰを発現するクローンをスクリーニングすることによって分析する。したがって、前培養として液体ＹＰＧ−Ｚｅｏ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物、１２．６ｇグリセロールおよび２５ｍｇ  Ｚｅｏｃｉｎ）に単一のコロニーを接種する。およそ２４時間の後、１０ｍｌのＹＰ培地（１リットルにつき：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）中の０．０１のＯＤ６００および異なる濃度（２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０２０、０．０１０、０．００５および０．００２ｇ／Ｌ）のグルコースにより本培養に接種するためにその前培養を用いる。６時間後に試料をとり、Ｓｔａｄｌｍａｙｒら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０  Ｄｅｃ；１５０（４）：５１９〜２９）に記載の通りにフローサイトメトリーによって分析した。細胞サイズに関係する蛍光（前方散乱の１．５乗）を各細胞／データポイントについて計算し、その幾何平均を、異なるグルコース濃度で生成されるｅＧＦＰ発現レベルを比較するために用いる。ｐＧＡＰの制御下でｅＧＦＰを発現するクローンは、参照として用いられる（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＧＡＰ、ここでは配列番号２５）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの自己蛍光を非形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型細胞を用いて測定し、シグナルから引き算する。表１６は、約４０ｍｇ／Ｌ以下のグルコースでのｐＧ１プロモーターの完全な誘導、および天然のｐＧＡＰプロモーターと比較したその転写強度を示す。
【表１７】
2014530016.tif 000019
【０３１１】
脱抑制されたプロモーターｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６およびｐＧ７の相対的転写強度を比較するために、さらなる類似した研究を行った。プロモーターの１つの制御下でｅＧＦＰを発現するクローンをＹＰＧ（２０ｇ／Ｌグリセロール、抑制された状態）で培養し、次に、グルコースの異なる量（２０〜０．００２ｇ／Ｌ（Ｄ２０、Ｄ１０、・・・Ｄ０．００２）、誘導状態）を含有するＹＰ培地で接種し、５〜６時間培養した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、結果は以下の通りに評価した：各細胞につき蛍光を細胞サイズと関係づけ（前方散乱の１．５乗）、その幾何平均は、異なるグルコース濃度の比較のために用いた。これらのスクリーニングから下された結果は、図が相対的蛍光に対する対数的グルコース濃度を示し、グルコース制限で調節可能なプロモーターの誘導挙動の優れた像を与える図である、図１４に示す。図１４は、約４０ｍｇ／Ｌ以下のグルコースでのｐＧ１プロモーター、ならびに約４ｇ／Ｌ以下でのプロモーターｐＧ３、ｐＧ４およびｐＧ６の完全な誘導、ならびに天然のｐＧＡＰプロモーターと比較した転写強度を示す。ｐＧ７の誘導挙動は、ｐＧ１に類似している（データは示さず）。ｐＧ８による以前の結果に基づき、その誘導挙動は他のプロモーターの範囲内であると仮定される。
【０３１２】
例１０：グルコース濃度スクリーニングアッセイでの先行技術のｐＩＣＬ１およびｐＭＬＳ１プロモーターとｐＧ１との比較。
【０３１３】
本発明によるｐＧ１プロモーターと比較するために参照としてｐＩＣＬ１およびｐＭＬＳ１プロモーターを使用して、例９に従って比較プロモーター活性研究を実施する。
【０３１４】
ｐＩＣＬ１とｐＭＬＳ１の両方のプロモーターの活性は非常に弱いことが見出され、高い（Ｄ２０：２０ｇ／Ｌ／抑制）または低い（Ｄ０．０４：０．０４ｇ／Ｌ誘導＝脱抑制）グルコース濃度で有意差はない。いずれの場合も、活性は、同じ状況の抑制されたｐＧ１プロモーターの活性よりはるかに低い。結果は、ｐＧＡＰプロモーターに対する％のプロモーター活性として、表１７に示す。
【表１８】
2014530016.tif 000020
【０３１５】
例１１：ｐＧ１の変異体の比較
ｐＧ１プロモーターのより短い変異体を例２ａに記載の通りにクローニングし、例２ｃに記載のものと同じように、しかし２４ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＫ、品番７７０１−５１１０）および全体の代わりに供給ビーズ（１２ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）の四分の一を用いるスケールダウンされたセットアップでスクリーニングする。ｐＧ１およびｐＧＡＰの制御下で発現するクローンを、対照として用いる。ｐＧ１およびその変異体のフォワードプライマーおよび長さを、表１８に掲載する。ｐＧ１およびｐＧ１変異体ａ〜ｆの制御下でｅＧＦＰを発現する細胞の相対的蛍光には、有意差がなかった。
【表１９】
2014530016.tif 000021
【図１】
2014530016.tif 000022
【図２】
2014530016.tif 000023
【図３】
2014530016.tif 000024
【図４】
2014530016.tif 000025
【図５】
2014530016.tif 000026
【図６】
2014530016.tif 000027
【図７】
2014530016.tif 000028
【図８】
2014530016.tif 000029
【図９】
2014530016.tif 000030
【図１０】
2014530016.tif 000031
【図１１】
2014530016.tif 000032
【図１２】
2014530016.tif 000033
【図１３】
2014530016.tif 000034
【図１４】
2014530016.tif 000035
【図１５−１】
2014530016.tif 000036
【図１５−２】
2014530016.tif 000037
【図１５−３】
2014530016.tif 000038
【配列表】
2014530016000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月24日(2014.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のタンパク質（ＰＯＩ）を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
ａ）前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップであって、該基礎炭素源が細胞成長に適する炭素源であるステップと、
ｂ）前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは制限量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％の転写速度での前記ＰＯＩの生産を誘導するステップと、
ｃ）前記ＰＯＩを生産し、回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記基礎炭素源が、グルコース、グリセロール、エタノール、その混合物および複合栄養材料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補助的炭素源が、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）が、前記補助的炭素源を供給しないか、制限量、好ましくは培養培地中に０〜１ｇ／Ｌを供給する供給培地を使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記補助的炭素源の前記制限量が、比増殖速度を０．０２ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは０．０２ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つために増殖制限的である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが、野生型真核細胞の遺伝子の転写を制御することが可能であり、前記遺伝子が、Ｇ１（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、Ｇ４（配列番号９）、Ｇ６（配列番号１０）、Ｇ７（配列番号１１）およびＧ８（配列番号１２）、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記機能的活性変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞系が、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＯＩが異種タンパク質であって、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはＰＯＩの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下でＰＯＩの発現を制御する方法であって、前記発現が前記炭素源を制限する条件の下で誘導される方法。
【請求項１２】
炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でＰＯＩを生産する方法であって、前記プロモーターが、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％の転写強度を有する方法。
【請求項１３】
前記調節可能なプロモーターが、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％の転写速度で組換え真核細胞でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離された核酸であって、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも２０％の転写速度でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む、単離された核酸。
【請求項１７】
ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記プロモーターの転写制御下でＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される請求項１６〜１８に記載の核酸を含む発現構築物であって、前記核酸が前記ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない発現構築物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の構築物を含む組換え真核細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
例１１：ｐＧ１の変異体の比較
ｐＧ１プロモーターのより短い変異体を例２ａに記載の通りにクローニングし、例２ｃに記載のものと同じように、しかし２４ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＫ、品番７７０１−５１１０）および全体の代わりに供給ビーズ（１２ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）の四分の一を用いるスケールダウンされたセットアップでスクリーニングする。ｐＧ１およびｐＧＡＰの制御下で発現するクローンを、対照として用いる。ｐＧ１およびその変異体のフォワードプライマーおよび長さを、表１８に掲載する。ｐＧ１およびｐＧ１変異体ａ〜ｆの制御下でｅＧＦＰを発現する細胞の相対的蛍光には、有意差がなかった。
【表１９】
2014530016.tif 000039
本願の出願当初の請求項を実施態様として以下に付記する。
（１）
対象のタンパク質（ＰＯＩ）を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のＰＯＩをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
ａ）前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップと、
ｂ）前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは制限量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度での前記ＰＯＩの生産を誘導するステップと、
ｃ）前記ＰＯＩを生産し、回収するステップと
を含む方法。
（２）
前記基礎炭素源が、グルコース、グリセロール、エタノール、その混合物および複合栄養材料からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（３）
前記補助的炭素源が、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）
ステップｂ）が、前記補助的炭素源を供給しないか、制限量、好ましくは培養培地中に０〜１ｇ／Ｌを供給する供給培地を使用する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
前記補助的炭素源の前記制限量が、比増殖速度を０．０２ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは０．０２ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つために増殖制限的である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
前記プロモーターが、野生型真核細胞の遺伝子の転写を制御することが可能であり、前記遺伝子が、Ｇ１（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、Ｇ４（配列番号９）、Ｇ６（配列番号１０）、Ｇ７（配列番号１１）およびＧ８（配列番号１２）、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
前記機能的活性変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、（６）に記載の方法。
（８）
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、（６）または（７）に記載の方法。
（９）
前記細胞系が、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
前記ＰＯＩが異種タンパク質であって、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはＰＯＩの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）
組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下でＰＯＩの発現を制御する方法であって、前記発現が前記炭素源を制限する条件の下で誘導される方法。
（１２）
炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でＰＯＩを生産する方法であって、前記プロモーターが、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写強度を有する方法。
（１３）
前記調節可能なプロモーターが、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度で組換え真核細胞でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）
ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ４（配列番号４）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、（１３）に記載の方法。
（１５）
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、（１３）または（１４）に記載の方法。
（１６）
単離された核酸であって、
ａ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）、
ｂ）ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
ｃ）ストリンジェントな条件下でｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）とハイブリダイズする配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写速度でＰＯＩを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む、単離された核酸。
（１７）
ｐＧ１（配列番号１）、ｐＧ３（配列番号２）、ｐＧ６（配列番号３）、ｐＧ７（配列番号５）またはｐＧ８（配列番号６）の前記変異体が、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における１つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２００ｂｐのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、（１６）に記載の核酸。
（１８）
ｐＧ１の前記機能的活性変異体が、ｐＧ１ａ（配列番号４１）、ｐＧ１ｂ（配列番号４２）、ｐＧ１ｃ（配列番号４３）、ｐＧ１ｄ（配列番号４４）、ｐＧ１ｅ（配列番号４５）およびｐＧ１ｆ（配列番号４６）からなる群から選択される、（１６）または（１７）に記載の核酸。
（１９）
前記プロモーターの転写制御下でＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される（１６）〜（１８）に記載の核酸を含む発現構築物であって、前記核酸が前記ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない発現構築物。
（２０）
（１９）に記載の構築物を含む組換え真核細胞。
（２１）
真核細胞から炭素源で調節可能なプロモーターを同定する方法であって、
ａ）細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
ｂ）制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において前記細胞をさらに培養するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）の細胞培養の試料を準備するステップと、
ｄ）前記試料で転写分析を実施して、ステップａ）の細胞よりもステップｂ）の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと
を含む方法。
【国際調査報告】
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