(57)【要約】  （ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供すること；（ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供すること；ならびに（ｃ）固定可能な混合物から固体ペレットを形成することを含む方法。本方法は、場合により、溶媒により固体ペレットを抽出して抽出微生物油を提供することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ある水分レベルを有し含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して、破砕バイオマス混合物を提供すること；
ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして、固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供すること；ならびに
ｃ）前記固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成すること
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの粉砕剤が、好ましくは
ａ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、２．０から６．０のＭｏｈ硬度およびＡＳＴＭ法Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上の吸油係数を有する粒子である；
ｂ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される；ならびに
ｃ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約１から２０質量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物バイオマスの水分レベルが、約１から１０質量パーセントの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの結合剤が、好ましくは
ａ）前記少なくとも１つの結合剤は、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物から選択される；ならびに
ｂ）前記少なくとも１つの結合剤は、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約０．５から１０質量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマスを混合する工程（ａ）および少なくとも１つの結合剤をブレンドする工程（ｂ）を押出機中で実施し、同時に実施し、または押出機中で同時に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程（ｃ）は、
（ｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成すること；
（ｉｉ）前記ストランドを乾燥および破壊すること；ならびに
（ｉｉｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程（ｉ）ならびに前記ストランドを乾燥および破壊する工程（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択される工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記固体ペレットが、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０から約８．０ｍｍの平均長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固体ペレットを、粗砕機を使用して形成し、流動床乾燥機を使用して乾燥させ、または粗砕機を使用して形成し、かつ流動床乾燥機を使用して乾燥させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記含油微生物が、酵母、藻類、菌類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌綱からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記含油微生物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物バイオマスが、前記含油微生物の少なくとも５０％の破壊効率を有する破砕バイオマスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物バイオマスを、
（ａ）約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の総比エネルギーインプット（ＳＥＩ）；
（ｂ）次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および
（ｃ）流動制限を使用する圧縮帯域
を含む２軸スクリュー押出機中で破砕して破砕バイオマスを生成し；
前記押出機中で前記圧密帯域は前記圧縮帯域よりも先行する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記流動制限を、好ましくは、リバーススクリューエレメント、制限／ブリスターリングエレメントまたはニーディングエレメントから提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｄ）溶媒により前記固体ペレットを抽出して油を含む抽出物を提供することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶媒が、液体または超臨界流体二酸化炭素を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により作製されたペレット化含油微生物バイオマス。
【請求項１７】
ａ）約７０から約９８．５質量パーセントの、含油微生物を含む破砕バイオマス；
ｂ）約１から約２０質量パーセントの、少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤；および
ｃ）約０．５から１０質量パーセントの少なくとも１つの結合剤
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の質量パーセントは、固体ペレット中の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の総和に対する固体ペレット。
【請求項１８】
（ａ）約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０および約８．０ｍｍの平均長さ；ならびに
（ｂ）約０．１から５．０質量パーセントの水分レベル
からなる群から選択される特性を有する、請求項１７に記載の固体ペレット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８３６号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、含油微生物を含む微生物バイオマスから固体ペレットを形成する方法および前記固体ペレットを抽出して油を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；ω−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；ω−３）を医薬品および食品に含めることへの関心が高まっている。多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有脂質組成物は、例えば、天然微生物源、組換え微生物、または魚油および海洋プランクトンから得ることができる。ＰＵＦＡ含有脂質組成物は、ある条件下で酸化的に不安定なものとして認識され、未酸化組成物を得るためにかなりの注意を払う必要がある。
【０００４】
特許文献１は、高トリグリセリド含有率および高い酸化安定性を有する微生物ＰＵＦＡ含有油を開示する。さらに、低温殺菌された発酵ブロスに由来する微生物バイオマスからそのような油を回収する方法であって、微生物バイオマスを抽出に供して顆粒粒子を形成し、乾燥させ、次いで適切な溶媒を使用して乾燥顆粒から油を抽出する方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２は、微生物細胞中に含有される脂溶性構成成分を抽出する方法であって、脂溶性構成成分を含有する微生物細胞を乾燥させ、同時に乾燥微生物細胞を破砕し、押出機の使用によりペレットに成形し、含有される脂溶性構成成分を有機溶媒の使用により抽出することを要求する方法を開示している。
【０００６】
特許文献３は、細胞および水を含む組成物から脂質を得る方法であって、組成物を乾燥剤と接触させ、細胞から脂質を回収することを含む方法を開示している。
【０００７】
高濃度ＥＰＡを生成する連続向流超臨界二酸化炭素分画法について開発されたプロセスフローダイアグラムは、非特許文献１により開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，７２７，３７３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２５８，９６４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０２２７６７８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖ．Ｊ．Ｋｒｕｋｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖ．Ｓｅａｆｏｏｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．（１９９２），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９８７，１６９−７９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
微生物バイオマスから油を効率的に回収する方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の実施形態において、本発明は：
ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供すること；
ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供すること；ならびに
ｃ）固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成すること
を含む方法に関する。
【００１２】
本方法の第２の実施形態において、微生物バイオマスの水分レベルは、好ましくは、約１から１０重量パーセントの範囲である。
【００１３】
本方法の第３の実施形態において、少なくとも１つの粉砕剤は、好ましくは
ａ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、２．０から６．０のＭｏｈ硬度およびＡＳＴＭ法Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上の吸油係数を有する粒子である；
ｂ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される；ならびに
ｃ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の重量の総和に対して約１から２０重量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する。
【００１４】
本方法の第４の実施形態において、少なくとも１つの結合剤は、好ましくは
ａ）前記少なくとも１つの結合剤は、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物から選択される；ならびに
ｂ）前記少なくとも１つの結合剤は、固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の重量の総和に対して約０．５から１０重量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する。
【００１５】
本方法の第５の実施形態において、前記バイオマスを混合する工程（ａ）および少なくとも１つの結合剤をブレンドする工程（ｂ）は、押出機中で実施し、同時に実施し、または押出機中で同時に実施する。
【００１６】
本方法の第６の実施形態において、前記固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程（ｃ）は、
（ｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成すること；
（ｉｉ）前記ストランドを乾燥および破壊すること；ならびに
（ｉｉｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程（ｉ）ならびに前記ストランドを乾燥および破壊する工程（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択される工程を含む。
【００１７】
本方法の第７の実施形態において、ペレットは、粗砕機を使用して形成し、流動床乾燥機を使用して乾燥させ、または粗砕機を使用して形成し、かつ流動床乾燥機を使用して乾燥させる。
【００１８】
本方法の第８の実施形態において、含油微生物は、酵母、藻類、菌類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイルおよび卵菌綱からなる群から選択される。好ましくは、含油微生物は、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中に含む。
【００１９】
本方法の第９の実施形態において、微生物バイオマスは、含油微生物の少なくとも５０％の破砕効率を有する破砕バイオマスである。
【００２０】
本方法の第１０の実施形態において、微生物バイオマスを、
（ａ）０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の総比エネルギーインプット（ＳＥＩ）；
（ｂ）次第に短くなるピッチ長さを有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および
（ｃ）流動制限を使用する圧縮帯域
を含む２軸スクリュー押出機中で破砕して破砕バイオマスを生成し；
押出機中で圧密帯域は圧縮帯域よりも先行する。
【００２１】
流動制限は、好ましくは、リバーススクリューエレメント、制限／ブリスターリングエレメントまたはニーディングエレメントから提供する。
【００２２】
含油微生物の少なくとも５０％の破砕効率を有する微生物バイオマスが破砕バイオマスである本方法の第１１の実施形態において、本方法は、溶媒により固体ペレットを抽出して油を含む抽出物を提供する工程（ｄ）をさらに含み得る。
【００２３】
好ましくは、溶媒は液体または超臨界流体二酸化炭素を含む。
【００２４】
本方法の第１１の実施形態において、それから作製されたペレット化含油微生物バイオマスが存在する。
【００２５】
本方法の第１２の実施形態において、
ａ）約７０から約９８．５重量パーセントの、含油微生物を含む破砕バイオマス；
ｂ）約１から約２０重量パーセントの、少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤；および
ｃ）約０．５から１０重量パーセントの少なくとも１つの結合剤
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の重量パーセントは、固体ペレット中の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の総和に対する固体ペレットが存在する。
【００２６】
固体ペレットは、好ましくは、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０および約８．０ｍｍの平均長さを有する。好ましくは、固体ペレットは、約０．１から５．０重量パーセントの水分レベルを有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】特注高圧抽出装置フローシートを説明する。
【００２８】
生物寄託
以下の生物材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受託番号および寄託日を有する。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
上記列挙した生物学的材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って寄託された。列挙された寄託株は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行為により付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００３１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２から誘導した。同様に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９から誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書に引用される全ての特許および非特許文献の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００３３】
量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、または好ましい上方値および好ましい下方値の列挙として挙げられる場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関わらず、任意の範囲上限または好ましい上方値と、任意の範囲下限または好ましい下方値との任意のペアから形成される全ての範囲を具体的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が引用されている場合、特に記載のない限り、この範囲は、その終点、および範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。本発明の範囲が、範囲を定義する場合において規定の値に限定されることは意図されない。
【００３４】
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、またはその任意の他の変形は、非排他的包含をカバーするものと意図される。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに必ずしも限定されるものではなく、表現的に列挙されていないかまたはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、表現的に逆の記載がない限り、「または」は、包含的なまたはを指すかまたは排他的なまたはを指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つにより充足される：Ａは真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在せず）、Ｂは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢは真である（または存在する）。
【００３５】
また、本発明の要素または構成成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成成分の例の数（すなわち、出現率）に関して非限定的であると意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含めるように読まれるべきであり、要素または構成成分の単数形の単語形態は、数字が明らかに単数を意味しない限り複数形も含む。
【００３６】
本明細書において使用される用語「発明」または「本発明」は、特許請求の範囲および本明細書に記載の本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されるものと読まれるべきではない。
【００３７】
以下の定義を本開示において使用する：
「二酸化炭素」は「ＣＯ２」と略す。
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略す。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略す。
「リン脂質」は、「ＰＬ」と略す。
「モノアシルグリセロール」は、「ＭＡＧ」と略す。
「ジアシルグリセロール」は、「ＤＡＧ」と略す。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略す。本明細書において、用語「トリアシルグリセロール」（ＴＡＧ）は、用語「トリアシルグリセリド」と同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂肪を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに短鎖飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
「遊離脂肪酸」は、「ＦＦＡ」と略す。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略す。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略す。
「乾燥セル重量」は、「ＤＣＷ」と略す。
【００３８】
本明細書において使用される用語「微生物バイオマス」は、微生物油を生成するために実施される含油微生物の微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。微生物バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズされた細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または破砕細胞の形態であり得る。好ましくは、微生物油は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む。
【００３９】
用語「未処理微生物バイオマス」は、溶媒による抽出前の微生物バイオマスを指す。場合により、未処理微生物バイオマスは、溶媒による抽出前に少なくとも１つの機械的プロセス（例えば、バイオマスの乾燥、バイオマスの破砕、バイオマスのペレット化、またはそれらの組合せによる）に供することができる。
【００４０】
用語「破砕微生物バイオマス」は、破砕のプロセスに供された微生物バイオマスを指し、前記破砕は、微生物バイオマスの少なくとも５０％の破砕効率をもたらす。
【００４１】
用語「破砕効率」は、光学的可視化により定性的に測定されるかまたは以下の式：％破砕効率＝（％遊離油＊１００）を（％総油）で割る（％遊離油および％総油は、固体ペレットについて計測される）に従って定量的に測定される、加工の間に破断または破裂された細胞壁のパーセントを指す。微生物バイオマスの破砕効率の増加は、典型的には、微生物バイオマス内に含有される微生物油の抽出収率の増加をもたらす。
【００４２】
用語「パーセント総油」は、固体ペレット試料内に存在する全ての油（例えば、細胞膜、脂肪体などに存在する中性脂肪画分［ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＴＡＧ］、遊離脂肪酸、リン脂質などからの脂肪酸を含む）の総量を指す。パーセント総油は、機械的破砕に供されたペレット化試料内の全ての脂肪酸を変換し、次いでアシル脂質のメタノリシスおよびメチル化を行うことにより効率的に計測する。したがって、脂肪酸（トリグリセリド形態で表現）の総和は、試料の総油含有量と解釈される。本発明において、パーセント総油は、乳鉢および乳棒を使用して固体ペレットを微粉末に穏やかに粉砕し、次いで分析のためのアリコート（トリプリケートで）を秤量することにより選択的に測定される。試料中の脂肪酸（主としてトリグリセリドとして存在する）は、８０℃における塩化アセチル／メタノールとの反応により対応するメチルエステルに変換する。次いで、Ｃ１５：０内部標準を、較正目的のために既知量でそれぞれの試料に添加する。個々の脂肪酸の測定は、火炎イオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）を用いるキャピラリーガスクロマトグラフィーにより行う。さらに、脂肪酸（トリグリセリド形態で表現）の総和は、試料の総油含有量と解釈される。
【００４３】
用語「パーセント遊離油」は、特定の固体ペレット試料からの抽出に容易に利用可能な遊離および未結合油（例えば、トリグリセリド形態で表現される脂肪酸だが、一部はリン脂質）の量を指す。したがって、例えば、パーセント遊離油の分析は、破砕されていない膜結合脂肪体中に存在する油を含まない。本発明において、パーセント遊離油は、試料をｎ−ヘプタンと撹拌し、遠心分離し、次いで上清を乾燥するまで蒸発させることにより選択的に測定される。次いで、得られた残留油を重量測定し、元の試料の重量割合として表現する。
【００４４】
用語「破砕バイオマス混合物」は、微生物バイオマスおよび少なくとも１つの粉砕剤を混合することにより得られる生成物を指す。
【００４５】
用語「粉砕剤」は、破砕バイオマス混合物を得るために微生物バイオマスと混合される吸油し得る薬剤を指す。好ましくは、少なくとも１つの粉砕剤は、微生物バイオマス１００部に対して約１から５０部存在する。一部の好ましい実施形態において、粉砕剤はシリカまたはケイ酸塩である。粉砕剤の他の好ましい特性は、以下に考察する。
【００４６】
用語「固定可能な混合物」は、少なくとも１つの結合剤を破砕バイオマス混合物とブレンドすることにより得られる生成物を指す。固定可能な混合物は、溶媒の除去（例えば、乾燥工程における水の除去）時に固体ペレットを形成し得る混合物である。
【００４７】
用語「結合剤」は、固定可能な混合物を得るために破砕バイオマス混合物とブレンドされる薬剤を指す。好ましくは、少なくとも１つの結合剤は、微生物バイオマス１００部に対して約０．５から２０部存在する。一部の好ましい実施形態において、結合剤は炭水化物である。結合剤の他の好ましい特性は、以下に考察する。
【００４８】
用語「固体ペレット」は、構造的剛性および形状または容積の変化に対する耐性を有するペレットを指す。固体ペレットは、本明細書において、微生物バイオマスから「ペレット化」のプロセスを介して形成される。典型的には、固体ペレットは、約０．１から５．０重量パーセントの最終水分レベルを有し、約０．５から３．０重量パーセントの範囲がより好ましい。
【００４９】
本明細書において使用される用語「残留バイオマス」は、溶媒（例えば、無機または有機溶媒）により少なくとも１回抽出された、微生物油を生成するために実施される微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。抽出に供する最初の微生物バイオマスが固体ペレットの形態である場合、残留バイオマスは「残留ペレット」と称することができる。
【００５０】
用語「脂質」は、任意の脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質は、多くの重要な生物学的機能を有する多様な群の化合物、例えば細胞膜の構造的構成成分、エネルギー保存源、およびシグナル伝達経路中間体である。脂質はケトアシルまたはイソプレン基のいずれかに、完全にまたは部分的に由来する、疎水性または両親媒性の小分子として広く定義することができる。Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）分類体系（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づく脂質の一般的概要を以下の表１に示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
用語「油」は、２５℃において液体であり、通常は多価不飽和である脂質物質を指す。油性生物において、油は総脂質の大部分を構成する。「油」は主としてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から構成されるが、他の中性脂肪、リン脂質（ＰＬ）および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）も含有し得る。油中の脂肪酸組成および総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００５３】
「中性脂肪」は、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見出される脂質を指し、細胞のｐＨにおいて脂質は荷電基を担持しないため、そのように称される。一般にこれらは完全に非極性であり、水についての親和性を有さない。中性脂肪は、一般に脂肪酸とのグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールもしくはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とも称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールからＦＦＡを放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００５４】
用語「抽出油」は、油が合成される細胞材料、例えば微生物から分離された油を指す。微生物から抽出することができる油の量は、破砕効率に比例することが多い。
【００５５】
抽出油は、広範な方法を介して得られ、最も単純なものは物理的手段のみを伴う。例えば、種々のプレス構造（例えばスクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなど）を使用する機械的圧潰が、細胞材料から油を分離し得る。あるいは、油抽出は種々の有機溶媒（例えばヘキサン、イソヘキサン）による処理、酵素的抽出、浸透圧衝撃、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）、鹸化およびそれらの方法の組合せを介して行うことができる。抽出油のさらなる精製または濃縮は、任意選択である。
【００５６】
本明細書において用語「総脂肪酸（ＴＦＡ）」は、例えば微生物バイオマスまたは油であり得る所与の試料中において、（当技術分野において公知の）塩基エステル交換法により脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化することができる全ての細胞脂肪酸の総和を指す。したがって、総脂肪酸は、（ＤＡＧ、ＭＡＧ、およびＴＡＧを含む）中性脂肪画分からの、および（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分を含む）極性脂質画分からの脂肪酸を含むが、ＦＦＡは含まない。
【００５７】
細胞の「総脂質含有率」という用語は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含有率は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥ（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）の尺度として近似させることができる。したがって総脂質含有率（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、例えばＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００５８】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書においてＴＦＡの重量パーセント（％ＴＦＡ）、例えばＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラムとして表現される。本開示において、特に具体的な記載のない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００５９】
場合によっては、細胞中の所与の脂肪酸含有率をその乾燥細胞重量の重量パーセント（％ＤＣＷ）として表現することが有用である。したがって例えばエイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、以下の式に従って求められる：（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００。しかしながら、乾燥細胞重量の重量パーセント（％ＤＣＷ）としての細胞中の所与の脂肪酸含有率は、以下のとおり近似させることができる：
（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００。
【００６０】
「脂質プロファイル」および「脂質組成」という用語は同義であり、特定の脂質画分、例えば総脂質中または油中などに含有される個々の脂肪酸の量を指し、その量はＴＦＡの重量パーセントとして表現される。混合物中に存在するそれぞれの個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
【００６１】
用語「脂肪酸」は、変動する約Ｃ１２からＣ２２の鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の両方も公知である。優勢な鎖長は、Ｃ１６からＣ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である）の簡易表記体系により表される。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）、および「ω−６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］と「ω−３脂肪酸」［「ω−３」または「ｎ−３」］の区別に関する追加的詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。
【００６２】
本明細書でＰＵＦＡを記載するために使用される命名法を表２に示す。「略記法」と題された欄ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、この目的で１番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸ならびにそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略語、ならびにそれぞれの化合物の化学名をまとめる。
【００６３】
【表３】
2014507944.tif 000005
【００６４】
「高レベルＰＵＦＡ生成」という用語は、微生物宿主の総脂質の少なくとも約２５％のＰＵＦＡ、好ましくは、総脂質の少なくとも約３０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約３５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４０〜４５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４５〜５０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、少なくとも約５０〜６０％のＰＵＦＡ、最も好ましくは、総脂質の少なくとも約６０〜７０％のＰＵＦＡの生成を指す。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でなく；したがって例えばＰＵＦＡは、ＦＦＡとして、またはエステル化形態、例えばアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質で総脂質中に存在し得る。
【００６５】
「含油微生物」という用語は、微生物油を生成し得る微生物を指す。したがって、含油微生物は、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル、菌類、またはそれらの組合せであり得る。好ましい実施形態において、含油微生物は油性である。
【００６６】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄＥｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。一般に、油性微生物の細胞油含有率はＳ字形曲線に従い、脂質の濃度は対数後期または初期静止期においてそれが最大に達するまで増加し、次に後期静止期および死滅期中に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％を超えて、油として蓄積することは珍しくない。油性生物の例には、限定されるものではないが、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属の生物が含まれる。
【００６７】
「油性酵母」という用語は、油を生成し得る酵母に分類される油性微生物を指す。油性酵母の例には、決して限定されるものではないが、以下の属：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【００６８】
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、成長培地内に存在する全炭素対窒素比に応答して誘発される。油性微生物中で遊離パルミテート（１６：０）のデノボ合成をもたらすこのプロセスについては、米国特許第７，２３８，４８２号明細書において詳述されている。パルミテートは、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を介して形成される、鎖長のより長い飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である。
【００６９】
幅広い脂肪酸（飽和および不飽和脂肪酸、ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む）を、脂肪酸の主要貯蔵単位であるＴＡＧ中に取り込むことができる。長鎖ＰＵＦＡのＴＡＧ中への取り込みが最も望ましいが、ＰＵＦＡの構造的形態は限定的でない。より具体的には、一実施形態において、含油微生物は、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する。より好ましくは、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＰＵＦＡのように、少なくともＣ２０鎖長を有する。一実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＰＡおよびＤＨＡからなる群から選択される。
【００７０】
ほとんどのＰＵＦＡは中性脂肪としてＴＡＧ中に取り込まれて脂肪体中に貯蔵される。しかしながら、油性生物中の総ＰＵＦＡの計測は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびＴＡＧ画分中に局在するＰＵＦＡを最低限含むべきであることに留意することが重要である。
【００７１】
本発明は、場合により抽出に供して微生物油を生成することができる破砕含油微生物を含む固体ペレットを形成する方法に関するが、含油微生物自体を得るために有用であり得る関連方法の概要が認識される。ほとんどの方法は、微生物発酵から開始し、特定の微生物を、成長および微生物油の生成を可能とする条件下で培養する。適切な時間において、微生物細胞を発酵容器から回収する。この未処理微生物バイオマスは、種々の手段、例えば脱水、乾燥などを使用して機械的に加工することができる。次いで、本明細書に開示される方法を開始することができる：（ａ）微生物バイオマスを粉砕剤と混合して破砕バイオマス混合物を提供し；（ｂ）結合剤を破砕バイオマス混合物とブレンドして固定可能な混合物を提供し；（ｃ）固定可能な混合物を固体ペレットに形成する。固体ペレットは、場合により油抽出に供することができ、残留バイオマス（例えば、残留ペレットの形態の細胞デブリス）および抽出油を生成する。それらの態様のそれぞれは以下にさらに詳細に考察される。
【００７２】
含油微生物は、微生物が成長および増殖するにつれて微生物バイオマスを生成する。微生物バイオマスは、天然または組換え（「遺伝子操作」）に関わらず、微生物油を生成し得る任意の微生物からのものであり得る。したがって、例えば、含油微生物は、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル、菌類、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。好ましくは、微生物は、微生物油内の高レベルＰＵＦＡ生成が可能である。
【００７３】
例としてＡＲＡ油の商業的供給源は、典型的には、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（糸状菌）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属（紅藻）の微生物から生成される。最も注目すべきことに、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）はＡＲＡ含有真菌油（ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）；米国特許第５，６５８，７６７号明細書）を生成し、これは実質的にＥＰＡを含まず、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）またはピシウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｕｏｓｕｍ）のいずれかに由来する。
【００７４】
同様に、ＥＰＡは、利用される規定の微生物の天然能力に基づく多数の異なる方法を介して、微生物を利用して生成することができる［例えば、従属栄養珪藻キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種（米国特許第５，２４４，９２１号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）種またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種（米国特許第５，２４６，８４１号明細書）；ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の糸状菌（米国特許第５，２４６，８４２号明細書）；またはモルティエラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、またはＭ．ハイグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）（米国特許第５，４０１，６４６号明細書）；およびナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属の真正眼点藻（Ｋｒｉｅｎｉｔｚ，Ｌ．ａｎｄ  Ｍ．Ｗｉｒｔｈ，Ｌｉｍｎｏｌｏｇｉｃａ，３６：２０４−２１０（２００６））］。
【００７５】
ＤＨＡも、天然微生物の天然能力に基づく方法を使用して生成することができる。例えばシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（米国特許第５，３４０，７４２号明細書；米国特許第６，５８２，９４１号明細書）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）（米国特許第６，５０９，１７８号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種ＹＳ−１８０（米国特許第６，２０７，４４１号明細書）；スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＬＦＦ１株（米国特許出願公開第２００４／０１６１８３１Ａ１号明細書）；クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）（米国特許出願公開第２００４／００７２３３０Ａ１号明細書；ｄｅＳｗａａｆ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．，８１（６）：６６６−７２（２００３）およびＡｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６１（１）：４０−３（２００３））；エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）種（特開平５−３０８９７８号公報（１９９３））；およびジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ＃２８２０７；特開１９９５８８／１９８９号公報］について開発された方法参照。さらに以下の微生物がＤＨＡ生成能を有することが公知である：ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（深海から単離された細菌；ＡＴＣＣ＃１５３８１）；微小藻類キクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）；ならびに鞭毛菌類、例えばスラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３４３０４；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌｉｐｉｄｓ，２７：１５（１９９２））およびＡＴＣＣ＃２８２１１、ＡＴＣＣ＃２０８９０、およびＡＴＣＣ＃２０８９１と称されるスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種。現在、ＤＨＡを商業生成する少なくとも３つの異なる発酵法が存在する：ＤＨＡＳＣＯ（商標）を生成するためのＣ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）；以前にＤＨＡＧｏｌｄとして公知の油を生成するためのシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；およびＤＨＡｃｔｉｖｅ（商標）を生成するためのウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）種の発酵（Ｎｕｔｒｉｎｏｖａ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００７６】
組換え手段を使用する微生物油中のＰＵＦＡの微生物生成は、天然微生物源からの生成と比べて、いくつかの利点を有することが予期される。例えば、宿主中への新しい生合成経路の導入により、および／また不所望な経路の抑制により宿主の天然の微生物脂肪酸プロファイルを変えることができ、それにより所望のＰＵＦＡ（またはそのコンジュゲート形態）の生成レベルの増加および不所望なＰＵＦＡの生成の減少がもたらされるため、油生成に好ましい特徴を有する組換え微生物を使用し得る。第２に組換え微生物は、規定の用途を有し得る特定形態でＰＵＦＡを提供し得る。さらに培養条件を制御することにより、とりわけ微生物により発現される酵素のための特定基質源を提供することにより、または化合物／遺伝子操作を付加して不所望な生化学的経路を抑制することにより、微生物油生成を操作することができる。したがって、例えば、こうして生成されるω−３脂肪酸とω−６脂肪酸との比を改変し、または他のＰＵＦＡの下流もしくは上流生成物の顕著な蓄積なしに、規定のＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の生成を遺伝子操作することが可能である。
【００７７】
したがって、例えば、適切なＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、例えばδ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよびＣ２０／２２エロンガーゼの規定の組合せを導入することにより、ＥＰＡを生成する天然能力を欠く微生物を遺伝子操作してＰＵＦＡ生合成経路を発現させることができるが、導入される規定の酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）は、本発明を決して限定するものではないと認識されるべきである。
【００７８】
例として、いくつかの酵母が、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成するように組換え遺伝子操作されている。例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）および油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，４６５，５６４号明細書；米国特許第７，５８８，９３１号明細書；米国特許第７，９３２，０７７号明細書；米国特許第７，５５０，２８６号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；および米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書）における研究参照。
【００７９】
一部の実施形態において、微生物宿主細胞が油性である場合に利点が認識される。油性酵母は天然で油合成および蓄積が可能であり、総油含有率は、細胞乾燥重量の約２５％を超えて、より好ましくは、細胞乾燥重量の約３０％を超えて、最も好ましくは、細胞乾燥重量の約４０％を超えて構成し得る。代替実施形態において、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非油性酵母を、細胞乾燥重量の２５％を超える油を生成し得るように、それを遺伝子操作して油性にすることができる（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
【００８０】
典型的に油性酵母として同定される属には、限定されるものではないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。より具体的には、例証的な油合成酵母には、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が含まれる。
【００８１】
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり；さらなる実施形態において、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−９（２００２））。
【００８２】
一部の実施形態において、油性酵母は「高レベルＰＵＦＡ生成」が可能であることが望ましいことがあり、生物は総脂質の少なくとも約５〜１０％の所望のＰＵＦＡ（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３および／またはＤＨＡ）を生成し得る。より好ましくは、油性酵母は、総脂質の少なくとも約１０〜７０％の所望のＰＵＦＡを生成する。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でないが、好ましくは、ＴＡＧはＰＵＦＡを含む。
【００８３】
したがって、本明細書に記載のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、および遺伝子産物は、異種微生物宿主細胞中、特に油性酵母細胞（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中で生成することができる。組換え微生物宿主中における発現は、種々のＰＵＦＡ経路中間体を生成するのに、または従来は宿主を使用して可能でなかった新しい生成物を合成するために宿主中に既存のＰＵＦＡ経路をモジュレートするのに、有用であり得る。
【００８４】
上記に提供される引用教示に基づき、好ましいω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成のために多数の油性酵母を遺伝子操作することができるが、油性酵母の代表的ＰＵＦＡ生成株であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）について表３に記載する。これらの株は、以下のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子：δ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼの種々の組合せを有するが、導入される規定の酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）および生成される規定のＰＵＦＡは、決して本発明を限定するものではないことが認識されるべきである。
【００８５】
【表４】
2014507944.tif 000006
【００８６】
【表５】
2014507944.tif 000007
【００８７】
ＰＵＦＡ生合成経路を油性酵母中に導入する手段は周知であるため、当業者は、本発明の方法論が、上記のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株にも、本発明が実証される種（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））または属（すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ））にも限定されないことを認識する。それよりむしろ、ＰＵＦＡを含無微生物油を生成し得る任意の油性酵母または任意の他の好適な微生物が、実施例１１に実証されるとおり本方法論において使用するのに同等に好適である（しかし、取り扱われるそれぞれの新たな微生物について、例えば、それぞれの微生物の細胞壁組成の差異に基づき一部のプロセス最適化が要求され得る）。
【００８８】
脂質が微生物により生成される条件下で、好ましくはＰＵＦＡを含む脂質を生成する微生物種を発酵培地中で培養し、成長させることができる。典型的には、微生物に微生物の成長および／または微生物油（好ましくはＰＵＦＡを含む）の生成を可能にする多数の追加的化学薬品または物質とともに炭素および窒素源をフィードする。発酵条件は、上記引用に記載のとおり、使用される微生物に依存し、得られるバイオマス中のＰＵＦＡを高含有率にするために、最適化することができる。
【００８９】
一般に、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成期の長さ、油蓄積相の長さ、ならびに細胞回収時期および方法を改変することにより、培地条件を最適化することができる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、複合培地、例えば酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ）中で、または限定最小培地（例えば成長に必要な構成成分を欠き、それによりＰＵＦＡの生成を可能にする所望の組換え発現カセットの選択を強制する、酵母窒素原礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＩＭ））中で成長させる。
【００９０】
好ましくはＰＵＦＡを含む微生物油の所望量が微生物により生成された場合、発酵培地を機械的に加工して微生物油を含む未処理微生物バイオマスを得ることができる。例えば、発酵培地を濾過し、または別の方法により処理して水性構成成分の少なくとも一部を除去することができる。当業者により認識されるとおり、未処理微生物バイオマスは、典型的に水を含む。好ましくは、微生物発酵後に、水の一部を未処理微生物バイオマスから除去して、１０重量％未満の水分レベル、より好ましくは、５重量％未満の水分レベル、最も好ましくは、３重量％以下の水分レベルを有する微生物バイオマスを提供する。微生物バイオマスの水分レベルは、乾燥において制御することができる。好ましくは、微生物バイオマスは、約１から１０重量パーセントの範囲の水分レベルを有する。
【００９１】
場合により、発酵培地および／または微生物バイオマスを低温殺菌し、または他の手段により処理して、微生物油および／またはＰＵＦＡ生成物を損ない得る、内在微生物酵素の活性を低減させることができる。
【００９２】
したがって、微生物バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズされた細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または破砕細胞（すなわち、破砕微生物バイオマス）の形態であり得る。
【００９３】
破砕微生物バイオマスは、含油微生物の少なくとも５０％の破砕効率を有する。より好ましくは、破砕効率は、含油微生物の少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、最も好ましくは、８５〜９０％以上である。好ましい範囲を上記したが、破砕効率の有用な例には、５０％から１００％の任意の整数割合、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の破砕効率が含まれる。
【００９４】
破砕効率は、光学的可視化により定性的に測定されるかまたは以下の式：％破砕効率＝（％遊離油＊１００）を（％総油）で割る（％遊離油および％総油は、固体ペレットについて計測される）に従って定量的に測定される、加工の間に破断または破裂された細胞壁のパーセントを指す。
【００９５】
破砕（例えば、スクリュー押出、エキスペラー、ピストン、ビードビーター、乳鉢および乳棒、ハンマーミル処理、エアジェットミル処理などを使用する、例えば、機械的圧潰）のプロセスに供されなかった固体ペレットは、典型的には、低い破砕効率を有する。それというのも、破砕のプロセスが細胞壁および脂肪体を包囲する膜を含む種々のオルガネラの内膜の両方を破壊するまで、ＤＡＧ、ＭＡＧおよびＴＡＧ、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分内の脂肪酸ならびに遊離脂肪酸は一般に微生物バイオマスから抽出不可能であるためである。種々の破砕のプロセスは、そのプロセスにおいて固有に生成される特定の剪断、圧縮、静的および動的な力に基づき種々の破砕効率をもたらす。
【００９６】
微生物バイオマスの破砕効率の増加は、典型的には、抽出収率（例えば、粗製抽出油の重量パーセントにより計測）の増加をもたらし、それというのも、細胞壁および膜の破砕とともに微生物油の多くが抽出溶媒の存在に影響を受ける可能性が高いためである。
【００９７】
種々の装置を利用して破砕微生物バイオマスを生成することができるが、好ましくは、破砕は、２軸スクリュー押出機中で実施する。より具体的には、２軸スクリュー押出機は、好ましくは、（ｉ）約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）、より好ましくは、０．０５から０．２ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）、最も好ましくは、約０．０７から０．１５ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の押出機中の総比エネルギーインプット（ＳＥＩ）；（ｉｉ）次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および（ｉｉｉ）流動制限を使用する圧縮帯域を含む。細胞破砕に要求される機械的エネルギーのほとんどは、圧縮帯域中で付与され、例えばリバーススクリューエレメント、制限／ブリスターリングエレメントまたはニーディングエレメントの形態の流動制限を使用して作出される。圧密帯域は、押出機中で圧縮帯域よりも先行する。押出機の第１の帯域は、バイオマスを圧密帯域中にフィードおよび輸送するために存在し得る。
【００９８】
本発明の工程（ａ）は、ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供する工程を含む。
【００９９】
吸油し得る粉砕剤は、２．０から６．０、好ましくは、２．０から約５．０；より好ましくは、約２．０から４．０のＭｏｈ硬度；およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上、好ましくは、１．０以上、より好ましくは、１．３以上の吸油係数を有する粒子であり得る。好ましい粉砕剤は、約２から２０ミクロン、好ましくは、約７から１０ミクロンの中央粒径；およびＢＥＴ法（Ｂｒｕｎａｕｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６０：３０９（１９３８））により測定される少なくとも１ｍ２／ｇ、好ましくは、２から１００ｍ２／ｇの比表面積を有する。
【０１００】
好ましい粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される。本明細書において使用される用語「シリカ」は、主に（少なくとも９０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％の）ケイ素および酸素原子からなり、約２つの酸素原子と１つのケイ素原子との比であり、したがってＳｉＯ２の実験式を有する固体化学物質を指す。シリカには、例えば、沈殿シリカ、ヒュームドシリカ、アモルファスシリカ、珪藻土としても公知の珪藻シリカおよびそれらのシリカのシラン処理形態が含まれる。用語「ケイ酸塩」は、主に（少なくとも９０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％の）ケイ素、酸素の原子および少なくとも１つの金属イオンからなる固体化学物質を指す。金属イオンは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、またはそれらの混合物であり得る。天然および合成のゼオライトの形態のケイ酸アルミニウムを使用することができる。有用であり得る他のケイ酸塩は、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ナトリウム、およびケイ酸カリウムである。
【０１０１】
好ましい粉砕剤は、約１０〜２０ｍ２／ｇの比表面積および１．３以上の吸油係数を有する珪藻土である。好適な吸油し得る粉砕剤の市販源は、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡから入手可能なＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土である。
【０１０２】
他の粉砕剤は、ポリ（メタ）アクリル酸、ならびにナトリウムまたはカリウム塩基によるポリ（メタ）アクリル酸の部分および完全中和から誘導されるイオノマーであり得る。本明細書において、（メタ）アクリレートという用語は、化合物がアクリレート、メタクリレート、またはその２つの混合物のいずれかであり得ることを意味する。
【０１０３】
少なくとも１つの粉砕剤は、固体ペレット中の構成成分（ａ）微生物バイオマス、（ｂ）粉砕剤および（ｃ）結合剤の総和に対して約１から２０重量パーセント、より好ましくは、１から１５重量パーセント、最も好ましくは、約２から１２重量パーセント存在する。
【０１０４】
微生物バイオマスおよび吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供すること［工程（ａ）］は、当技術分野において公知の任意の方法により実施してエネルギーを混合媒体に適用することができる。好ましくは、混合は、９０℃以下、より好ましくは、７０℃以下の温度を有する破砕バイオマス混合物を提供する。
【０１０５】
例えば、微生物バイオマスおよび粉砕剤は、混合機、例えば単軸スクリュー押出機もしくは２軸スクリュー押出機、撹拌機、単軸スクリューもしくは２軸スクリューニーダー、またはＢａｎｂｕｒｙ混合機中にフィードすることができ、添加工程は、１回における全ての成分の添加またはバッチでの漸次添加であり得る。
【０１０６】
好ましくは、混合は、約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）のＳＥＩ、次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域、および流動制限を使用する圧縮帯域を有する上記の２軸スクリュー押出機中で実施する。これらの条件下、最初の微生物バイオマスは全乾燥細胞であり得、含油微生物の少なくとも５０％の破砕効率を有する破砕微生物バイオマスをもたらす細胞破砕のプロセスは、混合工程の開始時または混合工程の間に行うことができ、すなわち、細胞破砕および工程（ａ）を組み合わせ、同時として破砕バイオマス混合物を生成することができる。粉砕剤の存在は、細胞破砕を向上させるが、ほとんどの細胞破砕は、２軸スクリュー押出機自体の結果として生じる。
【０１０７】
したがって、明確性のために、微生物バイオマスの細胞破砕は、例えば、上記の圧縮帯域を有する２軸スクリュー押出機中で粉砕剤の不存在下で実施することができ、次いで粉砕剤および破砕微生物バイオマスの混合を２軸スクリュー押出機または種々の他の混合機中で実施して破砕バイオマス混合物を提供する。または、微生物バイオマスの細胞破砕は、例えば、圧縮帯域を有する２軸スクリュー押出機中で粉砕剤の存在下で実施することができる。しかしながら、いずれの場合においても、細胞破砕（すなわち、破砕効率）は、後続のプロセス工程において含油微生物からの抽出油の収率の最大化を所望する場合、最大化すべきである。
【０１０８】
本発明の工程（ｂ）は、結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程を含む。
【０１０９】
本発明において有用な結合剤には、水溶性または水分散性の親水性有機材料および親水性無機材料が含まれる。好ましい水溶性結合剤は、２３℃において少なくとも１重量パーセント、好ましくは、少なくとも２重量パーセント、より好ましくは、少なくとも５重量パーセントの水中溶解度を有する。
【０１１０】
結合剤は、好ましくは、１ｘ１０−３モル分率未満；好ましくは、１ｘ１０−４未満、より好ましくは、１ｘ１０−５未満、最も好ましくは、１ｘ１０−６モル分率未満の５００ｂａｒにおける超臨界流体二酸化炭素中溶解度を有する。溶解度は、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ」，Ｒａｍ
Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｊａｅ−Ｊｉｎ  Ｓｈｉｍ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ（２００７）開示されている方法に従って測定することができる。
【０１１１】
結合剤は、ペレット化プロセスから形成されたペレットの整合性およびサイズを保持するように作用し、さらにペレットのさらなる加工および輸送において微粉を低減させるように作用する。
【０１１２】
好適な有機結合剤には、０．５から１の置換度を有するアルカリ金属カルボキシメチルセルロース；好ましくは、１，０００未満の平均分子量を有するポリエチレングリコールおよび／またはアルキルポリエトキシレート；リン酸化デンプン；セルロースおよびデンプンエーテル、例えばカルボキシメチルデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよび対応するセルロース混合エーテル；ゼラチンおよびカゼインを含むタンパク質；トラガカント、アルギン酸ナトリウムおよびカリウム、グアムアラビア（ｇｕａｍ  Ａｒａｂｉｃ）、タピオカ、マルトデキストロースおよびデキストリンを含む部分加水分解デンプン、水溶性デンプンを含む多糖；スクロース、転化糖、グルコースシロップおよび糖蜜を含む糖；ポリ（メタ）アクリレート、マレイン酸またはビニル基を含有する化合物とのアクリル酸のコポリマー、ポリビニルアルコール、部分加水分解ポリビニルアセテートならびにポリビニルピロリドンを含む合成水溶性ポリマーが含まれる。上記の化合物が遊離カルボキシル基を含有するものである場合、それらは通常、それらのアルカリ金属塩、より特定すると、それらのナトリウム塩の形態で存在する。
【０１１３】
リン酸化デンプンは、デンプン無水グルコース単位のヒドロキシル基が−−Ｏ−−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２基により置き換えられているデンプン誘導体またはその水溶性塩、より特定するとアルカリ金属塩、例えばナトリウムおよび／またはカリウム塩と理解される。デンプンの平均リン酸化度は、全てのサッカリド単位にわたり平均化されたデンプンのサッカリドモノマー当たりのリン酸基を担持するエステル化酸素原子の数と理解される。好ましいリン酸デンプンの平均リン酸化度は、１．５から２．５の範囲である。
【０１１４】
本発明に関する部分加水分解デンプンは、慣用の例えば酸または酵素触媒プロセスを使用するデンプンの部分加水分解により得ることができる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーと理解される。部分加水分解デンプンは、好ましくは、４４０から５００，０００の平均分子量を有する加水分解生成物である。０．５から４０、より特定すると、２から３０のデキストロース当量（ＤＥ）を有する多糖が好ましく、ＤＥは、デキストロース（１００のＤＥを有する、すなわちＤＥ１００）との比較による多糖の還元効果の標準的尺度である。マルトデキストリン（ＤＥ３〜２０）および乾燥グルコースシロップ（ＤＥ２０〜３７）ならびにさらに約２，０００から３０，０００の比較的高い平均分子量を有するいわゆる黄色デキストリンおよび白色デキストリンの両方をリン酸化後に使用することができる。
【０１１５】
結合剤の好ましいクラスは、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物である。好ましい結合剤は、少なくとも５０℃、好ましくは、少なくとも８０℃、より好ましくは、少なくとも１００℃の融点を有する。
【０１１６】
好適な無機結合剤には、ケイ酸ナトリウム、ベントナイト、および酸化マグネシウムが含まれる。
【０１１７】
好ましい結合剤は、「食品グレード」または「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）とみなされる材料である。
【０１１８】
結合剤は、固体ペレット中の（ａ）微生物バイオマス、（ｂ）粉砕剤および（ｃ）結合剤の構成成分の総和に対して約０．５から１０重量パーセント、好ましくは、１から１０重量パーセント、より好ましくは、約３から８重量パーセント存在する。
【０１１９】
当業者が認識するとおり、固定可能な混合物（すなわち、破砕バイオマス混合物を少なくとも１つの結合剤とブレンドすることにより得られる）は、最終固体ペレットの水分レベルよりも顕著に高い水分レベルを有して容易な取扱（例えば、固定可能な混合物のダイ中への押出）を可能とする。したがって、例えば、スクロースおよび水の溶液を含む結合剤は、０．５から２０重量パーセントの水を有する固定可能な混合物をもたらす様式で、破砕バイオマス混合物に添加することができる。しかしながら、固定可能な混合物を乾燥させて固体ペレットを形成するとき、固体ペレットの最終水分レベルは５重量パーセント未満の水であり、スクロースは１０重量パーセント未満である。
【０１２０】
少なくとも１つの結合剤を破砕バイオマス混合物とブレンドして固定可能な混合物を提供すること［工程（ｂ）］は、結合剤の溶解および破砕バイオマスとのブレンドを可能とする任意の方法により実施して固定可能な混合物を提供することができる。「固定可能な混合物」という用語は、混合物が乾燥工程における溶媒、例えば水の除去時に固体ペレットを形成し得ることを意味する。
【０１２１】
結合剤は、種々の手段によりブレンドすることができる。１つの方法は、結合剤を溶媒中で溶解させて結合剤溶液を提供し、次いで結合剤溶液を、破砕バイオマス混合物中に制御速度において計量供給することを含む。好ましい溶媒は水であるが、他の溶媒、例えばエタノール、イソプロパノールなどを有利に使用することができる。別の方法は、結合剤を固体または溶液としてバイオマス／粉砕剤に混合工程の開始時またはその間に添加することを含み、すなわち工程（ａ）および（ｂ）を組み合わせ、同時とする。結合剤を固体として添加する場合、好ましくは、ブレンド工程の間に結合剤を溶解させるために十分な水分が破砕バイオマス混合物中に存在する。好ましいブレンド方法は、結合剤溶液を、押出機中で、好ましくは、上記の圧縮帯域後に破砕バイオマス混合物中に制御速度において計量供給することを含む。圧縮帯域後の結合剤溶液の添加は、破砕バイオマス混合物の急速冷却を可能とする。
【０１２２】
固定可能な混合物から固体ペレットを形成すること［工程（ｃ）］は、当技術分野において公知の種々の手段により実施することができる。１つの方法は、固定可能な混合物をダイ、例えばドーム粗砕機中に押出して均一直径のストランドを形成し、それを振動または流動床乾燥機上で乾燥させてストランドを破壊してペレットを提供することを含む。ペレット化材料は、下流の油抽出、輸送、または他の目的に好適である。
【０１２３】
本明細書に開示される方法により提供される固体ペレットは、望ましくは、室温において非粘着性である。固体ペレットの大部分は、ペレット構造の分解なしで、一緒に結合することもなく何日間も一緒に充填することができる。ペレットの大部分は、望ましくは、自由流動するペレット化組成物である。好ましくは、ペレットは、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０から約８．０ｍｍの平均長さを有する。好ましくは、固体ペレットは、約０．１％から５．０％の最終水分レベルを有し、約０．５％から３．０％の範囲がより好ましい。最終固体ペレットの水分レベルの増加は、例えばカビの成長に起因する貯蔵の間の困難性をもたらし得る。
【０１２４】
したがって、一実施形態において、本発明は、上記の工程（ａ）〜（ｃ）のプロセスにより作製されたペレット化含油微生物バイオマスに関する。
【０１２５】
ａ）約７０から約９８．５重量パーセントの、含油微生物を含む破砕バイオマス；
ｂ）約１から２０重量パーセントの、吸油し得る粉砕剤；および
ｃ）約０．５から１０重量パーセントの結合剤
を含み、重量パーセントは、固体ペレット中の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の総和に対する固体ペレットも開示される。固体ペレットは、７５から９８重量パーセントの（ａ）；１から１５重量パーセントの（ｂ）および１から１０重量パーセントの（ｃ）；を含み得、好ましくは、ペレットは、８０から９５重量パーセントの（ａ）；２から１２重量パーセントの（ｂ）および３から８重量パーセントの（ｃ）を含む。
【０１２６】
本明細書の本発明の別の実施形態は、工程（ｄ）、すなわち、固体ペレットを溶媒により抽出して抽出油および抽出ペレット（すなわち、「残留バイオマス」または「残留ペレット」）を提供することをさらに含む、上記の工程（ａ）〜（ｃ）の方法である。
【０１２７】
油抽出は、種々の有機溶媒（例えば、ヘキサン、イソヘキサン）、酵素的抽出、浸透圧ショック、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えば、ＣＯ２抽出）、鹸化およびそれらの方法の組合せによる処理を介して行うことができる。
【０１２８】
１つの好ましい実施形態において、抽出は、超臨界流体（ＳＣＦ）を使用して行う。ＳＣＦは、気体と液体との中間の特性を示す。ＳＣＦの重要な特性は、温度もしくは圧力、またはそれらの組合せを変動させることにより流体密度が液体様から気体様密度に連続的に変動し得ることである。同様に、種々の密度依存性物理的特性は、この領域中で同様の連続的変動を示す。これらの特性の一部には、限定されるものではないが、溶媒強度（ＳＣＦ媒体中の種々の物質の溶解度により証明される）、極性、粘度、拡散性、熱容量、熱伝導性、等温圧縮性、膨張性、収縮性、流動性、および分子充填が含まれる。ＳＣＦの密度変動は、溶質の化学ポテンシャル、ひいては反応速度および平衡定数にも影響する。したがって、ＳＣＦ媒体中の溶媒環境は、種々の密度依存性流体特性を調整することにより規定の用途について最適化することができる。
【０１２９】
系の温度および圧力が、臨界温度（Ｔｃ）および圧力（Ｐｃ）により定義される対応する臨界点値を超過する場合、流体はＳＣＦ状態である。純粋な物質について、臨界温度および圧力は、蒸気および液相が共存し得る最高値である。臨界温度を超えると、印加される圧力にかかわらず純粋な物質については液体は形成しない。同様に、臨界圧力および臨界モル容積は、蒸気および液相が融合する状態に対応するこの臨界温度において定義される。多成分混合物についてはより複雑になるが、混合物の臨界状態は、共存する蒸気および液相の特性が区別不能になる条件として同様に同定される。超臨界流体の考察については、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌ．ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄ．，Ｖｏｌ．２３，ｐｇ．４５２−４７７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９７）参照。
【０１３０】
任意の好適なＳＣＦまたは液体溶媒を、油抽出工程、例えば、固体ペレットを溶媒と接触させて微生物バイオマスから油を分離することにおいて使用することができ、それには、限定されるものではないが、ＣＯ２、テトラフルオロメタン、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、イソブタン、イソブテン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、およびそれらの混合物が含まれるが、全ての試薬および生成物に不活性であることを条件とする。好ましい溶媒には、ＣＯ２またはＣ３−Ｃ６アルカンが含まれる。より好ましい溶媒は、ＣＯ２、ペンタン、ブタン、およびプロパンである。最も好ましい溶媒は、ＣＯ２を含む超臨界流体溶媒である。
【０１３１】
好ましい実施形態において、超臨界ＣＯ２抽出は、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書、標題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ」（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるとおり実施する。この特定の方法論は、微生物バイオマスを油抽出に供してリン脂質（ＰＬ）および残留バイオマスを除去し、次いで得られた抽出物を分別して「リファインド脂質組成物」を有する抽出油を生成する。リファインド脂質組成物は、中性脂肪および／または遊離脂肪酸を含み得る一方、ＰＬを実質的に含まない。リファインド脂質組成物は、微生物バイオマスの油組成物に対してＴＡＧ（ＰＵＦＡを含む）を濃縮することができる。リファインド脂質組成物は、さらなる精製に付して「精製油」を生成することができる。
【０１３２】
したがって、抽出油は、ＰＬを実質的に含まない脂質画分、およびＰＬを含む残留バイオマスを含む抽出残留ペレットを含む。この方法において、ＣＯ２を含む超臨界流体は、追加の溶媒の存在または量がプロセスに有害でない限り、例えば、微生物バイオマス中に含有されるＰＬを一次抽出工程の間に可溶化させない限り、少なくとも１つの追加の溶媒（すなわち、共溶媒）、例えば、上記列挙の溶媒の１つ以上をさらに含み得る。しかしながら、極性共溶媒、例えばエタノール、メタノール、アセトンなどを添加して溶媒相に極性を故意に付与して、任意選択の二次油抽出の間に微生物バイオマスからのＰＬの抽出を可能としてＰＬを単離することができる。
【０１３３】
含油破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットは、少なくとも２つの方法に従って好適な抽出条件下で液体または超臨界ＣＯ２と接触させて抽出物および残留バイオマスを提供することができる。米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書の第１の方法によれば、未処理微生物バイオマスのＣＯ２との接触を、溶媒密度の増加に対応する抽出条件下で、例えば増加圧力および／または温度減少下で複数回実施して脂質画分がＰＬを実質的に含まないリファインド脂質組成物を含む抽出物を得る。抽出物のリファインド脂質組成物は、ＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの分布がそれらの相対溶解度に従って変動し、それは複数の抽出のそれぞれの選択抽出条件に対応する溶媒密度に依存する。
【０１３４】
あるいは、および本方法によれば、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書の第２の方法において、未処理微生物バイオマスは、溶媒、例えばＣＯ２と、ＰＬを実質的に含まない脂質画分を含む抽出物を提供するために選択された抽出条件下で接触させ、続いて一連の複数の段階的圧力降下工程に付してリファインド脂質組成物を提供する。これらの段階的圧力降下工程のそれぞれは、分別機容器中で、溶媒密度の減少に対応する圧力および温度条件下において実施して液相リファインド脂質組成物を単離し、それを例えば簡単なデカンテーションにより抽出相から分離することができる。提供されるリファインド脂質組成物は、ＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの分布が、それらの相対溶解度に従って変動し、それは段階的分別機容器の選択条件に対応する溶媒密度に依存する。
【０１３５】
第２の方法により得られるリファインド脂質組成物は、抽出条件が適切に適合する場合、第１の方法において得られる抽出物に対応し得る。したがって、第１の方法の実施を介して本方法により得ることができるリファインド脂質組成物を例示することが可能と考えられる。
【０１３６】
本方法によれば、含油破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットは、溶媒、例えば液体またはＳＣＦ  ＣＯ２と、ＰＬを実質的に含まない脂質画分を含む抽出物を得るために十分な温度および圧力ならびに接触時間において接触させることができる。脂質画分は、中性脂肪（例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、およびＭＡＧを含む）およびＦＦＡを含み得る。接触および分別温度は、液体またはＳＣＦ  ＣＯ２を提供するように、ＰＵＦＡの熱安定性の範囲内であるように、ならびにＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、およびＦＦＡを可溶化させるために十分なＣＯ２の密度を提供するように選択することができる。一般に、接触および分別温度は、約２０℃から約１００℃、例えば約３５℃から約１００℃であり得；圧力は、約６０ｂａｒから約８００ｂａｒ、例えば約８０ｂａｒから約６００ｂａｒであり得る。十分な接触時間、および適切なＣＯ２とバイオマスとの比は、固体ペレットの特定の試料についての抽出曲線を作成することにより決定することができる。これらの抽出曲線は、温度、圧力、ＣＯ２流速、ならびに可変要素、例えば細胞破砕の程度およびバイオマスの形態の抽出条件に依存する。本方法の一実施形態において、溶媒は、液体または超臨界流体ＣＯ２を含み、ＣＯ２と微生物バイオマスとの質量比は、約２０：１から約７０：１、例えば約２０：１から約５０：１である。
【０１３７】
本発明の方法論は、有効で、高度にスケーラブルで堅牢でユーザフレンドリーある一方、比較的高い収率およびハイスループット速度における生成を可能とすることが証明された。慣用の技術、例えば噴霧乾燥、高剪断混合機などの使用を使用する細胞破砕は、例えば、キチンを含む酵母細胞壁には不適切であることが見出された。現行の湿潤媒体ミル破砕プロセスは、微粉およびコロイド状汚染物を生成し、さらなる分離工程を必要とし、顕著な油損失をもたらした。さらに、湿潤媒体ミル処理工程は、液体担体（例えば、イソヘキサンまたは水）を導入し、固液分離工程を要求することにより下流加工を複雑化し、油損失を伴った。本明細書に記載の方法は、破砕バイオマス混合物の生成に依拠し（すなわち、破砕バイオマス混合物は、ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスを、少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤と混合することにより生成する）；しかしながら、有利には、破砕は、液体担体を要求せずに行う。さらに、固体ペレット内の粉砕剤の存在は、高レベルの油抽出を促進すると思われる。ペレットは抽出プロセス全体にわたり耐久性を保持するため、このことは操作性およびサイクル時間を支援する。
【０１３８】
少なくとも１つのＰＵＦＡ、例えばＥＰＡ（またはその誘導体）を含む抽出油組成物は、周知の臨床および薬学的価値を有する。例えば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３Ａ１号明細書参照。例えば、ＰＵＦＡを含む脂質組成物を、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を防止もしくは治療するために食事代用品または補助品、特に特殊調製粉乳として使用することができる。あるいは、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）を、通常使用において受容者が食事補給について所望量を受容するように配合された食用油、脂肪またはマーガリン中に取り込むことができる。ＰＵＦＡは、特殊調製粉乳、栄養補助品または他の食品中にも取り込むことができ、抗炎症またはコレステロール低下剤として使用することができる。場合により、組成物は、ヒトまたは動物のいずれかの薬学的使用に使用することができる。
【０１３９】
ヒトまたは動物のＰＵＦＡの補給は、添加ＰＵＦＡ、およびそれらの代謝結果のレベルの増加をもたらし得る。例えば、ＥＰＡによる治療は、ＥＰＡのレベルの増加だけでなく、ＥＰＡの下流生成物、例えばエイコサノイド（すなわち、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）、ＤＰＡｎ−３およびＤＨＡのレベルの増加ももたらし得る。複雑な調節機序は、種々のＰＵＦＡを組み合わせ、またはＰＵＦＡの異なるコンジュゲートを添加してそのような機序を防止、制御または克服して個体における所望レベルの規定のＰＵＦＡを達成することを望ましくし得る。
【０１４０】
あるいは、ＰＵＦＡ、またはその誘導体は、動物および水産飼料、例えば乾燥飼料、半湿潤および湿潤飼料の合成において利用することができる。それというのも、これらの配合物は、一般に、栄養組成物の少なくとも１〜２％がω−３および／またはω−６ＰＵＦＡであることを要求するためである。
【実施例】
【０１４１】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ挙げられるものと理解すべきである。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認してその趣旨および範囲を逸脱することなく本発明の種々の変更および改変を行い、それを種々の使用および条件に適応させることができる。
【０１４２】
以下の略語が使用される：
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーであり、「ＡＳＴＭ」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓであり、「Ｃ」は摂氏であり、「ｋＰａ」はキロパスカルであり、「ｍｍ」はミリメートルであり、「μｍ」はマイクロメートルであり、「μＬ」はマイクロリットルであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「Ｌ」はリットルであり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｍＭ」はミリモル濃度であり、「ｍＴｏｒｒ」はミリＴｏｒｒであり、「ｃｍ」はセンチメートルであり、「ｇ」はグラムであり、「ｗｔ」は重量であり、「ｈ」または「ｈｒ」は時間であり、「ｔｅｍｐ」または「Ｔ」は温度であり、「ＳＳ」はステンレス鋼であり、「ｉｎ」はインチであり、「ｉ．ｄ．」は内径であり、「ｏ．ｄ．」は外径である。
【０１４３】
材料
バイオマス調製
ＰＵＦＡを含む種々の量の微生物油を生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）酵母の株について、下述する。バイオマスは２段階流加発酵プロセスで得、次いで下記のとおり下流加工に供した。
【０１４４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株：本明細書の比較例Ｃ１〜Ｃ４ならびに実施例１および２において使用される酵母バイオマスは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株を利用した。Ｙ８６７２株の作製は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ８６７２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約６１．８％のＥＰＡを生成し得た。
【０１４５】
野性型Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ８６７２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、およびＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。上記発現カセットの構造は、簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」により表され、Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結する。略称は、以下のとおりである：ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）δ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）δ−９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成突然変異体δ−８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化δ−８デサチュラーゼ���伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９  δ−９エロンガーゼ（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）と、δ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍは、δ−９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前出）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する合成突然変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］であり；ＥａＤ５ＳＭは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］に由来する合成突然変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）δ−１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１
７デサチュラーゼ遺伝子であり；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］であり；ＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来するコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子である。
【０１４６】
Ｙ８６７２株の総脂質含有率および組成の詳述な分析のために、細胞を２段階で合計７日間成長させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ８６７２株は３．３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生成し、細胞の総脂質含有率は２６．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は１６．４であり、それぞれの脂肪酸濃度をＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（パルミテート）は２．３、１６：１（パルミトレイン酸）は０．４、１８：０（ステアリン酸）は２．０、１８：１（オレイン酸）は４．０、１８：２（ＬＡ）は１６．１、ＡＬＡは１．４、ＥＤＡは１．８、ＤＧＬＡは１．６、ＡＲＡは０．７、ＥＴｒＡは０．４、ＥＴＡは１．１、ＥＰＡは６１．８、その他は６．４。
【０１４７】
対照的に、本明細書の比較例Ｃ５〜Ｃ６ならびに実施例３および１０に使用された酵母バイオマスは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株を利用した。Ｙ９５０２株の作製については、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ９５０２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを生成し得た。
【０１４８】
野生型Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ９５０２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ｕｎｋｎｏｗｎ９−、ｕｎｋｎｏｗｎ１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹＩＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。上記定義されていない略語は、以下のとおり：ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）δ−９エロンガーゼ［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【０１４９】
Ｙ９５０２株の総脂質含有率および組成の詳述な分析のために、細胞を２段階で合計７日間成長させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ９５０２株は３．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生成し、細胞の総脂質含有率は３７．１［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は２１．３であり、それぞれの脂肪酸濃度をＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（パルミテート）は２．５、１６：１（パルミトレイン酸）は０．５、１８：０（ステアリン酸）は２．９、１８：１（オレイン酸）は５．０、１８：２（ＬＡ）は１２．７、ＡＬＡは０．９、ＥＤＡは３．５、ＤＧＬＡは３．３、ＡＲＡは０．８、ＥＴｒＡは０．７、ＥＴＡは２．４、ＥＰＡは５７．０、その他は７．５。
【０１５０】
発酵：振とうフラスコ中で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の凍結培養物から接種材料を調製した。インキュベーション期間後、培養物を使用して種発酵槽に接種した。種培養物が適切な標的細胞密度に達したとき、次いでそれを使用してより大きな発酵槽に接種した。発酵は、２段階流加法である。第１の段階において、高細胞密度への急速成長を促進する条件下で酵母を培養し；培養培地は、グルコース、種々の窒素源、微量金属、およびビタミンを含むものであった。第２の段階において、酵母を窒素飢餓状態にし、グルコースを連続的にフィードして脂質およびＰＵＦＡの蓄積を促進した。標準操作条件につき温度（３０〜３２℃に制御）、ｐＨ（５〜７に制御）、溶解酸素濃度およびグルコース濃度を含むプロセス可変要素をモニタリングおよび制御して一貫したプロセス性能および最終ＰＵＦＡ油の品質を確保した。
【０１５１】
発酵当業者は、発酵ラン自体、培地条件、プロセスパラメーター、スケールアップなど、ならびに培養物をサンプリングする特定の時点に応じて規定のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の油プロファイルに変動が起きることを把握する（例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書参照）。
【０１５２】
下流加工：加工前に抗酸化剤を発酵ブロスに場合により添加して、ＥＰＡ油の酸化安定性を確保した。酵母バイオマスを脱水し、洗浄して塩と残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小化した。次いで、ドラム乾燥（典型的に８０ｐｓｉｇの蒸気による）または噴霧乾燥のいずれかを実施して水分レベルを５％未満に低減させ、短期貯蔵および輸送の間の油安定性を確保した。約１０から１００ミクロンの範囲の粒子サイズ分布を有するドラム乾燥フレーク、または噴霧乾燥粉末を、以下の比較例および実施例において最初の「含油微生物を含む微生物バイオマス」として使用した。
【０１５３】
粉砕剤：Ｃｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土は、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡから入手可能である。Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土は、ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ａｎ  Ｅａｇｌｅ  Ｐｉｔｃｈｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶから入手可能である。
【０１５４】
他の材料：全ての市販の試薬はそのまま使用した。使用された全ての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。塩化アセチルは、９９＋％であった。ＴＬＣプレートおよび溶媒は、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から入手した。ＨＰＬＣまたはＳＣＦグレード二酸化炭素は、ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から入手した。
【０１５５】
方法
２軸スクリュー押出法
粉砕剤を用いる乾燥酵母バイオマスの破砕および破砕バイオマス混合物の調製において、２軸スクリュー押出を使用した。
【０１５６】
乾燥酵母を押出機、好ましくは、下記操作を達成するために好適な長さ、通常２１〜３９Ｌ／Ｄを有する２軸スクリュー押出機中にフィードする（しかし、この特定のＬ／Ｄ比は本明細書において限定的なものとみなされるべきではない）。押出機の第１の区画を使用して材料をフィードおよび輸送する。第２の区画は、次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用してフィードを圧密および圧縮するように設計された圧密帯域である。圧密帯域後、細胞破砕に要求される機械的エネルギーのほとんどを付与するために機能する圧縮帯域が続く。この帯域は、リバーススクリューエレメントまたはニーディングエレメントの形態のいずれかの流動制限を使用して作出される。破砕バイオマスを調製するとき、粉砕剤（例えば、珪藻土）を微生物バイオマスフィードと、両方が圧縮／圧密帯域を通るように同時にフィードし、こうして破砕レベルを向上させる。圧縮帯域後、結合剤（例えば、水／スクロース溶液）を液体注入ポートを介して添加し、混合エレメントの種々の組合せからなる後続の混合区画中で混合する。最終混合物（すなわち、「固定可能な混合物」）は、端部において開口する最終バレルを介して排出し、こうして押出機中の背圧をほとんど生じさせないかまたは生じさせない。次いで、固定可能な混合物をドーム粗砕機および振動または流動床乾燥機のいずれかにフィードする。これは、下流の油抽出に好適なペレット化材料（すなわち、固体ペレット）をもたらす。
【０１５７】
ＣＯ２によるＳＣＦ抽出
以下の実施例における酵母試料の超臨界ＣＯ２抽出は、図１のフローシートに例証される特注高圧抽出装置中で実施した。一般に、乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（自由流動する、またはペレット化されたもの）を、グラスウールのプラグ間で充填された抽出容器（１）に装填し、ＣＯ２によりフラッシュし、次いでＣＯ２流下で所望の操作条件に加熱および加圧した。８９ｍｌ抽出容器は、３１６ＳＳ管（２．５４ｃｍのｏ．ｄ．ｘ１．９３ｃｍのｉ．ｄ．ｘ３０．５ｃｍの長さ）から製作し、容器の流出端部上に２ミクロン焼結金属フィルターを備えた。抽出容器を、自動化温度制御装置により制御される４つのｃａｌｒｏｄ加熱カートリッジを備える特注機械加工アルミニウムブロックの内側に設置した。排出管を備える市販のシリンダー（２）からＣＯ２を液体として直接フィードし、冷蔵ヘッドアセンブリ（ＪａｓｃｏモデルＰＵ−１５８０−ＣＯ２）を備える高圧容積式ポンプ（３）により計量供給した。抽出圧力は、容器の流出側上で流動制限を提供する自動背圧調節装置（４）（ＪａｓｃｏモデルＢＰ−１５８０−８１）により維持し、抽出油試料を試料容器中で回収する一方、同時にＣＯ２溶媒を大気に発散させた。
【０１５８】
報告される酵母試料からの油抽出収率は、抽出の間の試料からの質量損失を計測することにより重量測定した。したがって、報告される抽出油は、微生物油および固体ペレットに伴う水分を含む。
【０１５９】
実施例
比較例Ｃ１、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、実施例１、実施例２ならびに比較例Ｃ３およびＣ４：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のドラム乾燥フレークからの破砕バイオマス混合物を作出するための手段の比較
比較例Ｃ１、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ３およびＣ４ならびに実施例１および２は、酵母（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）のドラム乾燥フレークの破砕を最適化するために実施された一連の比較試験を記載する。具体的には、粉砕剤を添加するかまたは添加しないハンマーミル処理を試験し、単軸スクリューまたは２軸スクリュー押出機のいずれかを使用した。結果を総遊離微生物油および微生物細胞の破砕効率、ならびに総抽出収率（超臨界ＣＯ２抽出に基づく）に基づき比較する。
【０１６０】
比較例Ｃ１：
粉砕剤を用いないハンマーミル処理酵母粉末
２４．２％の総油（乾燥重量）を含有する酵母（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）バイオマスのドラム乾燥フレークを、周囲温度においてジャンプギャップ（ｊｕｍｐ  ｇａｐ）分別機を１６０００ｒｐｍにおいて使用して３つのハンマーによりハンマーミル処理（１２Ｋｇ／ｈのフィード速度におけるＭｉｋｒｏｐｕｌ  Ｂａｎｔａｍミル）してミル処理粉末を提供した。ミル処理粉末の粒子サイズは、フラウンホーファーレーザー回折を使用して水中で懸濁させて分析してｄ１０＝３μｍ；ｄ５０＝１６μｍおよびｄ９０＝１０８μｍであった。
【０１６１】
比較例Ｃ２Ａ：
粉砕剤および空気ミル混合を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ１により提供されたハンマーミル処理酵母粉末（８３３ｇ）を、空気（ジェット）ミル（Ｆｌｕｉｄ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｅｔ−ｏ−ｍｉｚｅｒ  ０１０１、６Ｋｇ／ｈのフィード速度）中でＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土（１６７ｇ）と周囲温度において約２０分間混合した。
【０１６２】
比較例Ｃ２Ｂ：
粉砕剤および手動混合を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ１により提供されたハンマーミル処理酵母粉末（８３３ｇ）を、プラスチックバッグ中でＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土（１６７ｇ）と手動で混合した。
【０１６３】
実施例１：
粉砕剤、手動混合、および単軸スクリュー押出機を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ２Ｂからの珪藻土を有するハンマーミル処理酵母粉末（１０００ｇ）を、１７．６重量％のスクロース水溶液（２９１．６ｇの水中６２．５ｇのスクロース）とＨｏｂａｒｔ混合機中で約２．５分間混合し、次いで１ｍｍの開口部を有する単軸スクリュードーム粗砕機に通して押出した（５０〜２００ｐｓｉ、５５０ｉｎ−ｌｂｓを超過しないトルク；４０℃以下の押出物温度）。押出物を流動床乾燥機中で、６５℃に制御された流動空気を使用して５０℃の床温度に乾燥させて、約１４分後に３．９％の残留水を有する非粘着ペレット（８１５ｇ、２から８ｍｍの長さおよび約１ｍｍ直径の寸法を有する）を提供した。
【０１６４】
実施例２：
粉砕剤、空気ミル混合、および単軸スクリュー押出機を用いるハンマーミル酵母処理粉末
比較例Ｃ２Ａからの珪藻土を有するハンマーミル酵母粉末（１０００ｇ）を実施例１に従って加工して、約１０分後に６．９％の残留水を有するペレット（８５５ｇ、２から８ｍｍの長さおよび約１ｍｍ直径の寸法を有する）を提供した。
【０１６５】
比較例Ｃ３：
粉砕剤を用いず、２軸スクリュー押出機を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ１から提供されたハンマーミル処理酵母粉末を、１０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより１５０ｒｐｍおよび６６〜６８の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で２６℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０１６６】
比較例Ｃ４：
粉砕剤を用いず、２軸スクリュー押出機を用いる酵母粉末
２４．２％の総油を含有する酵母（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）バイオマスのドラム乾燥フレークを、１０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより１５０ｒｐｍおよび７１〜７３の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で２３℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０１６７】
破砕酵母粉末における遊離微生物油および破砕効率の比較
遊離微生物油および破砕効率は、実施例１および２、ならびに比較例Ｃ１〜Ｃ４の破砕酵母粉末において以下の方法に従って測定した。具体的には、押出バイオマス試料の遊離油および総油含有率は、Ｔｒｏｅｎｇ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃ．，３２：１２４−１２６（１９５５））により報告された方法の改変バージョンを使用して測定した。この方法において、押出バイオマスの試料を、計測容積のヘキサンを有するステンレス鋼遠心分離管中に秤量した。総油を測定すべき場合、いくつかのクロム鋼ボールベアリングを添加した。遊離油を測定すべき場合、ボールベアリングは使用しなかった。次いで、管にキャップし、シェーカー上に２時間装入した。振とうさせた試料を遠心分離し、上清を回収し、容積を計測した。一定の重量が得られるまで、ヘキサンを上清から、最初に回転フィルム蒸発により、次いで乾燥窒素流下での蒸発により蒸発させた。次いで、この重量を使用して元の試料中の遊離または総油の割合を計算した。油含有率は、試料の含水率の計測によりパーセント乾燥重量基準で表現し、適宜補正する。
【０１６８】
パーセント破砕効率（すなわち、加工の間に破断した細胞壁のパーセント）は、光学的可視化により定量した。
【０１６９】
表４は、実施例１および２、ならびに比較例Ｃ１〜Ｃ４についての酵母細胞破砕効率データをまとめ、以下のことを表す：
比較例Ｃ１は、粉砕剤の不存在下でのハンマーミル処理が酵母細胞の３３％の破砕をもたらすことを示す。
比較例Ｃ２Ａは、粉砕剤の存在下でのハンマーミル処理酵母の空気ジェットミル処理が、酵母細胞の破砕を６２％に増加させることを示す。
実施例１は、粉砕剤の存在下でのＨｏｂａｒｔ単軸スクリュー混合機中でのハンマーミル処理酵母（比較例Ｃ１からのもの）のさらなる混合が、酵母細胞の破砕を３８％に増加させることを示す。
実施例２は、Ｈｏｂａｒｔ単軸スクリュー混合機中での空気ミル処理およびハンマーミル処理酵母と粉砕剤（比較例Ｃ２Ａからのもの）とのさらなる混合が、酵母細胞の破砕を５７％に増加させることを示す。
比較例Ｃ３およびＣ４は、粉砕剤の不存在下、ハンマーミル処理を用いるかまたは用いない場合（それぞれ）、圧縮帯域を有する２軸スクリュー押出を使用すると、酵母細胞破砕は８０％超であったことを示す。
【０１７０】
【表６】
2014507944.tif 000008
【０１７１】
ＳＣＦ抽出
抽出容器に、約２５ｇ（酵母基準）の比較例Ｃ１、Ｃ２ＡおよびＣ４の破砕酵母バイオマスをそれぞれ装填した。酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。酵母をこれらの条件において４．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約６．７ｈｒ抽出し、約７５ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。抽出収率を表５に報告する。
【０１７２】
データは、より高い細胞破砕は、粗製抽出油の重量パーセントとして計測された顕著に高い抽出収率をもたらすことを示す。
【０１７３】
【表７】
2014507944.tif 000009
【０１７４】
比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃ：
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から破砕バイオマス混合物を作出するための手段の比較
比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃは、破砕酵母粉末を調製するために実施された一連の比較試験を記載し、最初の微生物バイオマスは、２軸スクリュー押出機中で粉砕剤と混合したかまたは混合しない酵母のドラム乾燥フレークまたは噴霧乾燥粉末であった。
【０１７５】
比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃのそれぞれにおいて、最初の酵母バイオマスは、２．８％の水分レベルを有し、約３６％の総油を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのものであった。乾燥酵母フレークまたは粉末（粉砕剤を有するかまたは有さない）を、１０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより１５０ｒｐｍにおいて稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）にフィードした。得られた破砕酵母粉末を最終水冷バレル中で冷却した。
【０１７６】
次いで、比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃにおいて調製された破砕酵母粉末を超臨界ＣＯ２抽出に供し、総抽出収率を比較した。
【０１７７】
比較例Ｃ５Ａ：
粉砕剤を用いないドラム乾燥酵母フレーク
酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、３４〜３５の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２７℃に冷却した。
【０１７８】
比較例Ｃ５Ｂ：
粉砕剤を用いるドラム乾燥酵母フレーク
９２．５部の酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、７．５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、４４〜４７の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２９℃に冷却した。
【０１７９】
比較例Ｃ５Ｃ：
粉砕剤を用いるドラム乾燥酵母フレーク
８５部の酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、１５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、４８〜５１の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２９℃に冷却した。
【０１８０】
比較例Ｃ６Ａ：
粉砕剤を用いない噴霧乾燥酵母粉末
酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、３３〜３４の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２６℃に冷却した。
【０１８１】
比較例Ｃ６Ｂ：
粉砕剤を用いる噴霧乾燥酵母粉末
９２．５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、７．５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、３７〜３８の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２６℃に冷却した。
【０１８２】
比較例Ｃ６Ｃ：
粉砕剤を用いる噴霧乾燥酵母粉末
８５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、１５部の珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ  ２０９）とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、３８〜３９の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２７℃に冷却した。
【０１８３】
ＳＣＦ抽出
抽出容器に、１１．７ｇ（酵母基準）の比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃの破砕酵母バイオマスをそれぞれ装填した。酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において４．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約３．２ｈｒ抽出し、約７６．６ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。種々の配合物についての抽出収率を表６に報告する。
【０１８４】
データは、粉砕剤としての珪藻土を有する試料（すなわち、比較例Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃ）が、珪藻土が存在しない場合（すなわち、比較例Ｃ５ＡおよびＣ６Ａ）よりも高い抽出収率をもたらすことを示す。
【０１８５】
【表８】
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【０１８６】
実施例３、４、５、６、７、８、９および１０
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から固体ペレットを作出するための手段の比較
実施例３〜１０は、酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末またはドラム乾燥フレークを、粉砕剤および結合剤と混合して固体ペレットを提供するために実施された一連の比較試験を記載する。
【０１８７】
実施例３〜１０のそれぞれにおいて、最初の酵母バイオマスは、２．８％の水分レベルを有し、約３６％の総油を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのものであった。約１ｍｍ直径×２〜８ｍｍ長さの固体ペレットの調製後、ペレットを超臨界ＣＯ２抽出に供し、総抽出収率を比較した。固体ペレットの機械的圧縮特性および耐摩耗性も分析した。
【０１８８】
実施例３：
８５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、１５部のＣｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１４部の水および５．１部の糖から作製された水／糖溶液を、押出機の破砕帯域後に８．２ｍｌ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび５８〜６０の％トルク範囲において稼働して最終水冷バレル中で２４℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０１８９】
次いで、固定可能な混合物を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、７０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を６７．５ｋｇ／ｈｒおよび定常２．７アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１０分間乾燥させて、７．１％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０１９０】
実施例４：
実施例３に従って調製された固定可能な混合物を、粗砕機に４５ＲＰＭにおいて導通させた。押出物を３１．７ｋｇ／ｈｒにおいて形成し、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１０分間乾燥させて８．１５％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０１９１】
実施例５：
実施例３に従って調製された固定可能な混合物を、粗砕機に９０ＲＰＭにおいて導通させた。押出ペレットをＭＤＢ−４００流動床乾燥機中で１５分間乾燥させて４．５３％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０１９２】
実施例６：
８５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、１５部のＣｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび７０〜７４の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で３１℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０１９３】
次いで、破砕酵母粉末を、スクロースおよび水の２２．６％溶液（すなわち、１７．５部の水および５．１部の糖）とＫｉｔｃｈｅｎ  Ａｉｄ混合機中で混合した。総混合時間は４．５分間であり、最初の２分間にわたり溶液を添加した。
【０１９４】
固定可能な混合物を、１ｍｍの穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、７０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機にフィードした。押出物を７１．４ｋｇ／ｈｒおよび定常２．７アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で合計２０分間乾燥させて６．５％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０１９５】
実施例７：
実施例６に従って調製された破砕酵母粉末を、スクロースおよび水の２２．６％溶液（すなわち、１７．５部の水および５．１部の糖）を有するＫＤＨＪ−２０回分式シグマブレードニーダー中に装入した。総混合時間は３．５分間であり、最初の２分間にわたり溶液を添加した。
【０１９６】
固定可能な混合物を、１ｍｍの穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機にフィードした。押出物を４７．５ｋｇ／ｈｒおよび定常２．３アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で合計１５分間乾燥させて７．４％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０１９７】
実施例８：
酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび３８〜４０の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で３０℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０１９８】
破砕酵母粉末（６９．５部）を、１２．２％のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土（１２．２部）および水と糖との比３．３から作製されたスクロース水溶液（１８．３部）とＫｉｔｃｈｅｎ  Ａｉｄ混合機中で混合した。総混合時間は４．５分間であり、最初の２分間にわたり溶液を添加した。
【０１９９】
固定可能な混合物を、１ｍｍの穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機にフィードした。押出物を６８．２ｋｇ／ｈｒおよび定常２．５アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で合計１５分間乾燥させて６．８３％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２００】
実施例９：
酵母バイオマスのドラム乾燥フレーク（８５部）を、１５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１４部の水および５．１部の糖から作製された水／糖溶液を、押出機の破砕帯域後に８．２ｍｌ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび６１〜６５の％トルク範囲において稼働して最終水冷バレル中で２５℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２０１】
次いで、固定可能な混合物を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を８１．４ｋｇ／ｈｒおよび定常２．５アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１５分間乾燥させて、８．３％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２０２】
実施例１０：
酵母バイオマスのドラム乾燥フレーク（８５部）を、１５部のＣｅｌａｔｏｍ  ＮＭ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に４．６ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１４部の水および５．１部の糖から作製された水／糖溶液を、押出機の破砕帯域後に８．２ｍｌ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、３００ｒｐｍおよび約３４の％トルク範囲において稼働して破砕酵母粉末を提供した。
【０２０３】
次いで、固定可能な混合物を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を８１．４ｋｇ／ｈｒおよび定常２．５アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１５分間乾燥させて固体ペレットを提供した。
【０２０４】
固体ペレットの圧縮試験および耐摩耗性
圧縮試験を以下のとおり実施した。ＡＳＴＭ規格Ｄ−６６８３に記載の試験装置およびプロトコルを使用して外部負荷、例えばガス圧勾配により負荷されるものに対する固体ペレットの応答を評価した。本試験において、既知質量の容積を機械的に適用される圧密ストレスの関数として計測する。結果の片対数グラフは、典型的には、試料の圧縮を反映する傾きβを有する直線である。βの値が高ければ圧縮が大きいことを反映する。この圧縮は、加工の間に不所望な隔離およびガス流制限をもたらす粒子破損を示し得る。
【０２０５】
ＡＳＴＭ試験の最後、負荷をペレット上でさらに２時間維持し、加工時間の延長を模擬した。２時間後に計測されたクリープは、固体ペレットが変形する見込みのさらなる指標である。クリープが低ければ変形が少ないことを示す。
【０２０６】
次いで、試料を含有する試験セルを反転させ、ペレット試料を注ぎ出した。必要により、セルを穏やかにタップして内容物を放出させた。セルを空にすることの容易性およびペレットの得られるテキスチャー（すなわち、ルーズまたは凝集）を記録した。
【０２０７】
試験後のテキスチャーは、事前の計測において使用された試験セルを空にするのがいかに困難であるかの定性的観察である。最も望ましい試料は直ちに注ぎ出た一方、一部の試料はタップの量の増加を要し、大きい塊になり得た（すなわち、あまり望ましくない）。
【０２０８】
耐摩耗性を測定するため、次いで圧縮試験ＡＳＴＭ試験において事前に圧縮した固体ペレット（１０ｇ）を３インチ直径の５００ミクロンの篩に移した。篩を手作業でタップして５００ミクロンよりも小さいペレットのいかなる最初の断片も除去した。残留ペレットの正味重量を記録した。次いで、それぞれ０．５０インチ直径×０．５０インチ厚でそれぞれ重量５．３グラムの３つの円筒粉砕媒体ビーズを、篩に添加した。篩を自動篩いシェーカー（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ＳＳ−３、「８」の設定、自動化タップ「オン」）に装入し、２、５または１０分の時間振とうさせた。粉砕媒体ビーズは、ペレットにランダムな角度から何度も衝突する。振とう後、篩下のパンを秤量して摩耗し、篩を介して落下した材料の量を測定した。本試験は、油抽出プロセス後のペレットの極めて粗い取扱を模擬するものとする。
【０２０９】
実施例３〜１０からの固体ペレットをそれぞれ分析してそれらの圧縮特性および耐摩耗性を決定した。結果を以下に表７にまとめる。
【０２１０】
【表９】
2014507944.tif 000011
【０２１１】
ＳＣＦ抽出
抽出容器に、実施例３〜９からの固体ペレット（乾燥重量基準、表８に列挙）をそれぞれ装填した。ペレットをＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。ペレットをこれらの条件において４．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約６．８ｈｒ抽出し、約１５０ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。一部の実施例において、総抽出時間が１１．６時間になるように第２のランをさらに４．８時間実施した。油抽出収率および抽出に使用された規定のパラメーターを表８に列挙する。
【０２１２】
【表１０】
2014507944.tif 000012
【０２１３】
残留ペレット（抽出後）の圧縮試験および耐摩耗性
ＳＣＦ抽出後、実施例３〜９からの残留ペレットをそれぞれ分析してそれらの圧縮特性および耐摩耗性を決定した。結果を以下の表９にまとめる。
【０２１４】
【表１１】
2014507944.tif 000013
【０２１５】
上記に基づき、本明細書に記載の方法［すなわち、（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマ
ス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；ならびに（ｃ）固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程を含む方法］は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットを生成するために首尾良く利用することができることが結論づけられる。さらに、本実施例は、固体Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ペレットを溶媒（すなわち、ＳＣＦ抽出）により抽出して微生物油を含む抽出物を提供することができることを実証する。
【０２１６】
実施例１１
ナンノクロロプシス・アルガエ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  Ａｌｇａｅ）からの固体ペレットの作出およびその油抽出
本実施例は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）以外の微生物バイオマスを用いる使用についての本明細書に開示される方法論の適用性を実証するために実施された試験を記載する。具体的には、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）バイオマスを、粉砕剤および結合剤と混合して固体ペレットを提供した。これらのペレットを超臨界ＣＯ２抽出に供し、総抽出収率を比較した。
【０２１７】
Ｋｕｅｈｎｌｅ  Ａｇｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｎｏｌｕｌｕ，ＨＩ）は、購入用の種々の純培養の単藻ストック藻類を提供している。依頼時、少なくとも２０％の脂質含有率を有する適切な微生物バイオマスとして、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種を含む藻類ＫＡＳ６０４株が提案された。バイオマスを標準条件（油含有率について最適化しない条件）下で成長させ、Ｋｕｅｈｎｌｅ  Ａｇｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により乾燥させ、次いで微細藻類粉末を以下の使用のために購入した。
【０２１８】
９１．７部の微細藻類粉末を、８．３部のＣｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に０．９１ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１０．９部の水および５．０部の糖から作製された糖の３１％水溶液を、押出機の破砕帯域後に２．５ｍＬ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、２００ｒｐｍおよび４６〜８１の％トルク範囲において稼働して最終水冷バレル中で３１℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２１９】
次いで、固定可能な混合物を、１．２ｍｍ穴径×１．２ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、２０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５  ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を２０ｋｇ／ｈｒおよび６〜７アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で７０℃において２０分間乾燥させて４．９％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。約１．２ｍｍ直径×２〜８ｍｍ長の固体ペレットは、８２．１％の藻類であり、組成物の残部はペレット化助剤であった。次いで、固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレット中の総油および遊離油の量を測定し、ＳＣＦにより固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットから抽出された油の量と比較した。
【０２２０】
固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットの総油含有率の測定
具体的には、総油は、ペレット化試料について、乳鉢または乳棒を使用してそれを穏やかに微粉末に粉砕し、次いで分析のためのアリコート（トリプリケートで）を秤量することにより測定した。試料中の脂肪酸（主としてトリグリセリドとして存在）を、８０℃における塩化アセチル／メタノールとの反応により対応するメチルエステルに変換させた。次いで、Ｃ１５：０内部標準を、較正目的のために既知量でそれぞれの試料に添加した。個々の脂肪酸の測定は、火炎イオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）を用いるキャピラリーガスクロマトグラフィーにより行った。脂肪酸（トリグリセリド形態で表現）の総和は６．１％であり；これを試料の総油含有率と解釈した。正規化後、ペレット中の藻類は総質量の８２．１％のみを表したため、藻類の総油含有率は７．４％と決定した（すなわち、６．１％を０．８２１で割った）。
【０２２１】
総油試料内の個々の脂肪酸の分布を以下の表に示す。
【０２２２】
【表１２】
2014507944.tif 000014
【０２２３】
固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットの遊離含油率の測定
遊離油は、通常、試料をｎ−ヘプタンと撹拌し、遠心分離し、次いで上清を乾燥するまで蒸発させることにより測定する。次いで、得られた残留油を重量測定し、元の試料の重量割合として表現する。この手順は、ペレット化藻類試料について十分でないことが見出された。それというのも、得られた残留物が顕著なレベルの色素を含有したためである。したがって、上記手順は、上記の残留物を回収し、既知量のＣ１５：０内部標準を添加し、次いで総油測定と同一のパラメーターを使用するＧＣ／ＦＩＤにより分析することにより改変した。このようにして、試料の遊離油含有率を３．７％と測定した。正規化後、藻類の遊離油含有率は４．５％（すなわち、３．７％を０．８２１で割った）と測定した。
【０２２４】
固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットのＳＣＦ抽出
抽出容器に、２４．６０ｇの固体ペレット（乾燥重量基準）を装填し、粉砕剤および結合剤を補正すると約２１．２４ｇの藻類をもたらした。ペレットをＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。ペレットをこれらの条件において３．８ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約６．７ｈｒ抽出し、約７１ｇのＣＯ２／ｇ藻類の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。抽出収率は装填された藻類の６．２％であった。
【０２２５】
上記に基づき、本明細書に記載の方法［すなわち、（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；ならびに（ｃ）固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程を含む方法］は、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）からの破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットを生成するために首尾良く利用することができることが結論づけられる。本方法論は、多くの他の含油微生物に好適であることが証明されることが仮定されるが、それぞれの特定の微生物についてのプロセスの最適化が破砕効率の増加をもたらすことが予期される。さらに、本実施例は、固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットを種々の手段において溶媒により抽出して油を含む抽出物を提供することができることを実証する。当技術分野において周知のとおり、異なる抽出法は、異なる量の抽出油をもたらし；抽出収率は、抽出プロセスの最適化時に特定の固体ペレットについて増加させることができることが予期される。
【図１】
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【国際調査報告】
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