(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、α−シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質発現を低下させるためのアンチセンス化合物および方法である。また、本明細書に開示されるのは、それを必要とする個体において、神経変性疾患を治療、防止、および改善するための方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１〜８８および９８〜１３６に列挙される核酸塩基配列の中から選択される、核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドから成る、修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、１本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、ヒトα−シヌクレイン核酸に１００％相補的である、核酸塩基配列を有する、請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオシドは、修飾糖を含む、請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記修飾糖は、二環式糖である、請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記二環式糖は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む、請求項７に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１個のテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、テトラヒドロピラン環は、前記フラノース環を置換する、請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１個のテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドの各々は、以下の構造：
【化１】
2014501507.tif 000035
を有し、Ｂｘは、任意に保護されるヘテロ環塩基部分である、請求項９に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル基を含む、請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含む、請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである、請求項１２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、
結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
結合されたヌクレオシドから成る５’ウィングセグメントと、
結合されたヌクレオシドから成る３’ウィングセグメントと、
を含み、前記ギャップセグメントは、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む、請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、
１０個の結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドから成る５’ウィングセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドから成る３’ウィングセグメントと、
を含み、前記ギャップセグメントは、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であって、各シトシンは、５−メチルシトシンである、請求項１４に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
神経変性疾患を有する動物を同定することと、前記動物に、配列番号１１〜８８および９８〜１３６に列挙される、核酸塩基配列の中から選択される、核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドから成る、修飾オリゴヌクレオチドを含む組成物の治療有効量を投与することとを含む、方法。
【請求項１７】
前記投与は、α−シヌクレインの発現を減少させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与は、運動協調を改善する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与は、嗅覚を改善する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与は、空間記憶を改善する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与は、α−シヌクレインの凝集を減少させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
１２〜３０個の結合されたヌクレオシドから成り、配列番号１の核酸塩基４０４〜４６３の等長部分に相補的である、少なくとも８個の連続核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を有し、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも９０％相補的である、修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２３、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１２０、および１２１から成る群から選択される、核酸塩基配列から成る、請求項２２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ３８７９８５、ＩＳＩＳ４８９３５１、ＩＳＩＳ４８９３５２、ＩＳＩＳ４８９３５６、ＩＳＩＳ４８９３５７、ＩＳＩＳ３８９３５８、ＩＳＩＳ４８９３５９、ＩＳＩＳ４８９３６０、ＩＳＩＳ４８９３７３、およびＩＳＩＳ４８９３７４から成る、請求項２２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０１１年１１月７日に作成され、１７０ＫｂのサイズであるＢＩＯＬ０１３９ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔと表題を付けられたファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の実施形態は、動物において、α−シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を阻害するための方法、化合物、および組成物を提供する。かかる方法、化合物、および組成物は、パーキンソン病、認知症、多系統萎縮症、およびアルツハイマー病を含む、神経変性疾患を治療、防止、または改善するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
アルファシヌクレイン（α−シヌクレイン、ＳＮＣＡ、およびａ−ＳＹＮとしても知られる）は、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンに主に発現される、低分子で高電荷の１４０個のアミノ酸残基から成るタンパク質であって、シナプス小胞に近接して、シナプス前終末に局在する（Ｉｗａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．１９９５．１４：４６７−４７５）。α−シヌクレインは、体外で示されたように、両親媒性α−ヘリックスを形成することによって、脂質膜と結合し得る（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８．２７３：９４４３−９４４９）。α−シヌクレインの機能は、依然として、ほとんど理解されていないが、いくつかの研究は、シナプス伝達、シナプス小胞の密度、および神経可塑性の調節に関与することを示唆する（Ｃａｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２．２２：８７９７−８８０７）。また、α−シヌクレインは、体外アッセイにおいて、タンパク質の凝集の防止におけるその有効性によって示されるように、シャペロン機能を有し得ることも示唆されている（Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０００．４７４：１１６−１１９）。さらに、体内アッセイは、α−シヌクレインシャペロン活性が、脳のシナプス前終末における神経伝達物質放出に不可欠である、ＳＮＡＲＥ錯体の会合の助長に関与することを実証している（Ｂｕｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１６６３−１６６７）。ＳＮＡＲＥ錯体会合の低下は、神経学的障害と関連付けられ、したがって、シナプス前α−シヌクレイン凝集体と神経変性との間の関連性を示す（Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｚ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７．２７：１４０５−１４１０）。α−シヌクレインのノックアウトマウスモデルは、致死的ではなく、脳形態は、無傷であって、α−シヌクレインは、神経発達のために要求されず、および／または代償性経路が存在することを示唆する（Ａｂｅｌｉｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２０００．２５：２３９−２５２）。
【０００４】
α−シヌクレインの誤った折り畳み、凝集、および細動は、パーキンソン病、アルツハイマー病レビー小体亜型、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、および多系統萎縮症を含む、いくつかの神経変性疾患における重要因子に関係があるとされる（Ｓｃｈｕｌｚ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１０．１２０：１３１−１４３；Ｙｏｓｈｉｄａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００７．２７：４８４−４９３）。これらの症例の各々において、α−シヌクレインタンパク質は、誤って折り畳まれており、レビー小体およびレビーニューライトにおける凝集体中に会合する（Ｕｖｅｒｓｋｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００７．１０３：１７−３７）。いくつかの最近の研究は、α−シヌクレインの折り畳みを助長する脂質環境もまた、α−シヌクレイン凝集を加速させることを示しており、α−シヌクレインの脂質と関連付けられた配座が、神経変性疾患におけるα−シヌクレインの誤った折り畳みに関連し得ることを示唆する（Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１．２９４：６−９；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２．２７７：６７１−６７８）。アラニンが、スレオニンに変化される、５３位における突然変異、およびアラニンが、プロリンに変化される、３０位における突然変異は、α−シヌクレインをランダムコイル状態にさせ、凝集が生じる可能性が高いことが示されている（Ｃｌａｙｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９．５８：１２０−１２９）。
【０００５】
現在、かかる神経変性疾患を治療するための容認可能選択肢が欠如している。したがって、本明細書では、かかる疾患および障害の治療のための化合物および方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に提供されるのは、α−シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節するための方法、化合物、および組成物である。ある種の実施形態では、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、α−シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節する。ある種の実施形態では、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、核酸、タンパク質、抗体、または小分子である。
【０００７】
ある種の実施形態では、調節は、細胞または組織内で生じ得る。ある種の実施形態では、細胞または組織は、動物内にある。ある種の実施形態では、動物は、ヒトである。ある種の実施形態では、α−シヌクレインｍＲＮＡレベルは、減少される。ある種の実施形態では、α−シヌクレインタンパク質レベルは、減少される。ある種の実施形態では、α−シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、減少される。かかる減少は、時間依存様式または用量依存様式で生じ得る。
【０００８】
また、提供されるのは、疾患、障害、および状態を防止、治療、ならびに改善するために有用な方法、化合物、および組成物である。ある種の実施形態では、かかる疾患、障害、および状態は、神経変性疾患、障害、ならびに状態である。ある種の実施形態では、かかる神経変性疾患、障害、および状態は、パーキンソン病、認知症、多系統萎縮症（また、シャイ・ドレーガー症候群）、孤発性および家族性アルツハイマー病、アルツハイマー病レビー小体亜型、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、ならびに純粋自律神経機能不全症（ブラッドバリー・エグルストン症候群としても知られる）を含む。ある種の実施形態では、かかる疾患、障害、および状態は、シヌクレイン病と称される。ある種の実施形態では、かかるシヌクレイン病は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、および純粋自律神経機能不全症を含む。
【０００９】
かかる疾患、障害、および状態は、一般的に、１つ以上の危険因子、原因、または転帰を有し得る。神経変性疾患、特に、シヌクレイン病の発症のある危険因子および原因は、老化、神経毒への暴露、遺伝的素質、ならびに外傷を含む。
【００１０】
ある種の実施形態では、治療の方法は、それを必要とする個体に、α−シヌクレイン特異的阻害剤を投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的および説明的なものでしかなく、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。本明細書で使用されるとき、単数形の使用は、別段の指示がない限り、複数を含む。本明細書で使用されるとき、「または」は、別段の指示がない限り、「および／または」を意味する。加えて、本明細書で使用されるとき、別段の指示がない限り、「および」は、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる」ならびに「含む」および「含まれる」等の他の形態の使用も限定的なものではない。また、「要素」または「構成要素」等の用語は、別段の指示がない限り、１つのユニットを含む、要素および構成要素と、２つ以上のサブユニットを含む、要素および構成要素の両方を包含する。
【００１２】
本明細書で使用される項目見出しは、構成的な目的のためでしかなく、説明される主題を限定すると解釈すべきではない。限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含む、本願に引用される、あらゆる文書または文書の一部は、本明細書で論じられる文書の一部に対して、ならびにその全体として、参照することによって、明示的に本明細書に組み込まれる。
【００１３】
定義
特定の定義がなされない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学と関連して利用される命名法、ならびにその手順および技法は、当技術分野において公知であって、一般的に使用されるものである。標準的技法が、化学合成および化学分析のために使用されてもよい。許可される場合、あらゆる特許、出願、公開出願、および他の刊行物、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）等のデータベースを通して入手可能なＧＥＮＢＡＮＫ登録番号および関連付けられた配列情報、ならびに本開示全体を通して参照される他のデータは、本明細書で論じられる文書の一部に対して、ならびにその全体として、参照することによって、本明細書に組み込まれる。
【００１４】
別段の指示がない限り、次の用語は、次の意味を有する。
【００１５】
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３ともいう）は、フロシル環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。
【００１６】
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含む、ヌクレオチドを意味する。
【００１７】
「５−メチルシトシン」は、メチル基が５’位に付着して修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。
【００１８】
「活性医薬品」は、個体に投与されると、治療利益を提供する、医薬組成物中の物質または複数の物質を意味する。例えば、ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸へ標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性医薬品である。
【００１９】
「活性標的領域」または「標的領域」は、１つ以上の活性アンチセンス化合物が標的指向される領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを減少させるアンチセンス化合物を意味する。
【００２０】
「同時に投与される」は、両剤の薬理効果が患者において同時に顕在化される、任意の様式における、２つの薬剤の同時投与を指す。同時投与は、両剤が単一の医薬組成物において、同一剤形において、または同一投与経路によって投与されることを要求しない。両剤の効果は、同時に顕現される必要はない。その効果は、ある時間期間の間だけ重複し、共存する必要はない。
【００２１】
「投与すること」は、医薬品を個体に提供することを意味し、限定されないが、医療従事者による投与および自己投与を含む。
【００２２】
「α−シヌクレイン核酸」または「α−シヌクレイン」または「ＳＮＣＡ」または「ａ−ＳＹＮ」は、α−シヌクレインをコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸は、α−シヌクレインをコードするＤＮＡ配列、α−シヌクレインをコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含む、ゲノムＤＮＡを含む）、およびα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡ配列を含む。「α−シヌクレインｍＲＮＡ」は、α−シヌクレインタンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００２３】
「α−シヌクレイン特異的阻害剤」は、標的外効果がほとんどもしくは全くない、α−シヌクレインｍＲＮＡおよび／またはα−シヌクレインタンパク質の発現を阻害することが可能な任意の薬剤を指す。α−シヌクレイン特異的阻害剤として、α−シヌクレインｍＲＮＡおよび／またはα−シヌクレインタンパク質の発現を阻害することが可能である、核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、および他の薬剤が挙げられるが、それらに限定されない。ある種の実施形態では、α−シヌクレインｍＲＮＡ発現および／またはα−シヌクレインタンパク質発現を特異的に調節することによって、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、他の下流タンパク質および分子に影響を及ぼす。
【００２４】
「改善」は、関連付けられた疾患、障害、または状態の少なくとも１つの指標、徴候、または症状を軽減することを指す。指標の重症度は、当業者に公知である、主観的または客観的尺度によって決定されてもよい。
【００２５】
「動物」は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、および非ヒト霊長動物、限定されないが、サルおよびチンパンジーを含む、を含む、ヒトまたは非ヒト動物を指す。
【００２６】
「抗体」は、ある方法において、抗原と特異的に反応することを特徴とする、分子を指し、抗体および抗原は各々、反対の観点から定義される。抗体は、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域、およびＦｃ領域等、完全抗体分子あるいはその任意の断片またはその領域を指し得る。
【００２７】
「アンチセンス活性」は、その標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションに起因する、任意の検出可能または測定可能活性を意味する。ある種の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸またはかかる標的核酸によってコードされるタンパク質の量あるいは発現における低下である。
【００２８】
「アンチセンス化合物」は、水素結合を介して標的核酸にハイブリダーセーションすることが可能なオリゴマー化合物を意味する。
【００２９】
「アンチセンス阻害」は、アンチセンス化合物の不在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較した、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの減少を意味する。
【００３０】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを許容する核酸塩基配列を有する、１本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００３１】
「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されるフロシル環を意味する。二環式糖は、修飾糖である。
【００３２】
「二環式ヌクレオシド」は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含む糖部分を有し、それによって、二環式環系を形成する、ヌクレオシドを意味する。ある種の実施形態では、架橋は、糖環の４’−炭素および２’−炭素を接続する。
【００３３】
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれの末端でも取り込まれた化学修飾を意味する。
【００３４】
「ｃＥｔ」または「拘束エチル」は、４’−炭素および２’−炭素を接続する架橋を含む糖部分を有する、二環式ヌクレオシドを意味し、架橋は、化学式：４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’を有する。
【００３５】
「化学的に異なる領域」は、いくつかの点において、同一アンチセンス化合物の別の領域と化学的に異なる、アンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴わないヌクレオチドを有する領域と化学的に異なる。
【００３６】
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有する、アンチセンス化合物を意味する。
【００３７】
「同時投与」は、２つ以上の医薬品の個体への投与を意味する。２つ以上の医薬品は、単一医薬組成物中にあってもよく、または別個の医薬組成物中にあってもよい。２つ以上の医薬品は各々、同一または異なる投与経路を通して投与されてもよい。同時投与は、並行または連続投与を包含する。
【００３８】
「相補性」は、第１の核酸および第２の核酸の核酸塩基間で対合する能力を意味する。
【００３９】
「連続核酸塩基」は、相互に直接隣接する核酸塩基を意味する。
【００４０】
「希釈剤」は、薬理活性を欠くが、薬学的に必要または望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注射用組成物中の希釈剤は、液剤、例えば、生理食塩水溶液であり得る。
【００４１】
「用量」は、単回投与または規定された時間期間において提供される、医薬品の規定された量を意味する。ある種の実施形態では、用量は、１つ、２つ、またはそれ以上のボーラス、錠剤、または注射剤において投与されてもよい。例えば、皮下投与が所望される、ある種の実施形態では、所望の用量は、単回注射剤によって容易に対応されない容量を要求し、したがって、２つ以上の注射剤を使用して、所望の用量を達成してもよい。ある種の実施形態では、医薬品は、延長された時間期間にわたって、または連続的に、注入によって投与される。用量は、１時間、１日、１週間、または１ヶ月あたりの医薬品の量として述べられ得る。
【００４２】
「有効量」は、薬剤を必要とする個体において、所望の生理学的転帰をもたらすために十分な活性医薬品の量を意味する。有効量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類学的な群、組成物の製剤、個体の状態の査定、および他の関連要因に応じて、個体間で変動し得る。
【００４３】
「完全に相補的」または「１００％相補的」は、第１の核酸の各核酸塩基が、第２の核酸において相補的核酸塩基を有することを意味する。ある種の実施形態では、第１の核酸は、アンチセンス化合物であって、標的核酸は、第２の核酸である。
【００４４】
「ギャップマー」は、ＲＮａｓｅＨ切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１個以上のヌクレオシドを有する外部領域間に位置付けられる、キメラアンチセンス化合物を意味し、内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含むヌクレオシドまたは複数のヌクレオシドと化学的に異なる。内部領域は、「ギャップ」と称され、外部領域は、「ウィング」と称され得る。
【００４５】
「ギャップ拡張」は、１〜６個のヌクレオシドを有する５’および３’ウィングセグメント間およびそれに直接隣接して位置付けられる、１２個以上の連続２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有する、キメラアンチセンス化合物を意味する。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある種の実施形態では、相補的核酸分子は、アンチセンス化合物および標的核酸を含む。
【００４７】
「神経変性疾患の危険状態にある動物を同定すること」は、神経変性疾患と診断された動物を同定すること、または神経変性疾患を発症する素因がある動物を同定することを意味する。かかる同定は、個体の病歴を評価すること、および標準的臨床検査または査定を含む、任意の方法によって達成されてもよい。
【００４８】
「直接隣接する」は、直接隣接する要素間に介在要素が存在しないことを意味する。
【００４９】
「α−シヌクレインを阻害すること」は、α−シヌクレイン特異的阻害剤の不在下におけるα−シヌクレインｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの発現と比較した、α−シヌクレイン特異的阻害剤の存在下におけるα−シヌクレインｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの発現の減少を意味する。
【００５０】
「個体」は、治療または療法のために選択されるヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００５１】
「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間の化学結合を指す。
【００５２】
「結合されたヌクレオシド」は、共に結合される隣接するヌクレオシドを意味する。
【００５３】
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」は、第１の核酸の核酸塩基が、第２のまたは標的核酸の対応する核酸塩基と対合することが不可能である場合を指す。
【００５４】
「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換または任意の変化を指す。
【００５５】
「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。「非修飾核酸塩基」は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【００５６】
「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾核酸塩基を有する、ヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、独立して、修飾糖部分または修飾核酸塩基を有する、ヌクレオシドを意味する。
【００５７】
「修飾オリゴヌクレオチド」は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖、または修飾核酸塩基を含む、オリゴヌクレオチドを意味する。
【００５８】
「修飾糖」は、天然糖からの置換または変化を指す。
【００５９】
「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
【００６０】
「天然に存在するヌクレオシド間結合」は、３’からの５’ホスホジエステル結合を意味する。
【００６１】
「天然糖部分」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）に見出される糖を意味する。
【００６２】
「神経変性疾患」は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性消失を特徴とする、疾患を意味する。
【００６３】
「核酸」は、モノマーヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、１本鎖核酸、２本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。
【００６４】
「核酸塩基」は、別の核酸の塩基と対合することが可能な複素環式部分を意味する。
【００６５】
「核酸塩基配列」は、任意の糖、結合、または核酸塩基修飾とも無関係な連続核酸塩基の順序を意味する。
【００６６】
「ヌクレオシド」は、糖に結合された核酸塩基を意味する。
【００６７】
「ヌクレオシド模倣体」は、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環または三環糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有する、ヌクレオシド模倣体等のオリゴマー化合物の１つ以上の位置において、必ずしもではないが、糖または糖および塩基を置換するために使用される構造を含む。ヌクレオチド模倣体は、例えば、ペプチド核酸またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ）等のオリゴマー化合物の１つ以上の位置において、ヌクレオシドおよび結合を置換するために使用される構造を含む。糖代用物は、やや広義では、ヌクレオシド模倣体と重なるが、糖単位（フラノース環）の置換だけを示す。本明細書に提供するテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置換された糖代用物の１例の例示である。
【００６８】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【００６９】
「標的外効果」は、意図された標的核酸以外の遺伝子のＲＮＡまたはタンパク質発現の調節と関連付けられた望ましくないまたは有害生物学的効果を指す。
【００７０】
「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」は、核酸分子の少なくとも１つの領域へハイブリダイズすることが可能である、結合されたモノマーサブユニットのポリマーを意味する。
【００７１】
「オリゴヌクレオチド」は、その各々が、互いに独立して、修飾または非修飾であり得る、結合されたヌクレオシドのポリマーを意味する。
【００７２】
「非経口投与」は、注射または注入を通しての投与を意味する。非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば、鞘内または脳室内投与を含む。
【００７３】
「ペプチド」は、アミド結合によって、少なくとも２個のアミノ酸を結合することによって形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質を指す。
【００７４】
「医薬組成物」は、個体に投与するための好適な物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つ以上の活性医薬品および滅菌水溶液剤を含んでもよい。
【００７５】
「薬学的に許容される塩」は、アンチセンス化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を留保し、望ましくない毒性効果をそこに付与しない、塩を意味する。
【００７６】
「ホスホロチオエート結合」は、ヌクレオシド間の結合を意味し、ホスホジエステル結合は、非架橋酸素原子の１個を硫黄原子と置換することによって修飾される。ホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【００７７】
「部分」は、一定数の核酸の連続（すなわち、結合）核酸塩基を意味する。ある種の実施形態では、部分は、標的核酸の一定数の連続核酸塩基である。ある種の実施形態では、部分は、アンチセンス化合物の一定数の連続核酸塩基である。
【００７８】
「防止する」は、疾患、障害、または状態の発病あるいは発症を数分の時間期間から無限に遅延もしくは未然に防ぐことを指す。防止はまた、疾患、障害、または状態を発症する危険を減少させることを意味する。
【００７９】
「プロドラッグ」は、不活性形態で調製され、内因性の酵素あるいは他の化学物質または条件の作用によって、身体またはその細胞内において、活性形態に変換される、治療薬剤を意味する。
【００８０】
「副作用」は、所望の効果以外の治療に起因する生理学的応答を意味する。ある種の実施形態では、副作用は、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系の異常、ミオパシー、および倦怠感を含む。例えば、血清アミノトランスフェラーゼレベルの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。
【００８１】
「１本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖へハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８２】
「特異的にハイブリダイズし得る」は、所望の効果を引き起こすのにアンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に十分な程度の相補性を有する一方、特異的結合が、所望される条件の下、すなわち、体内アッセイおよび療法的治療の場合における生理学的条件下において、非標的核酸に最小限または全く効果を示さない、アンチセンス化合物を指す。
【００８３】
「標的指向する」または「標的指向される」は、標的核酸へ特異的にハイブリダイズして、所望の効果を引き起こすアンチセンス化合物の設計および選択のプロセスを意味する。
【００８４】
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ｍＲＮＡ」、および「標的ＲＮＡ転写物」はすべて、アンチセンス化合物によって標的指向されることが可能な核酸を指す。
【００８５】
「標的セグメント」は、アンチセンス化合物が標的指向される、標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
【００８６】
「治療的有効量」は、個体へ治療利益をもたらす医薬品の量を意味する。
【００８７】
「治療する」は、疾患、障害、または状態の可変または改善をもたらすための医薬組成物を投与することを指す。
【００８８】
「非修飾ヌクレオチド」は、天然に存在する核酸塩基、糖部分、およびヌクレオシド間結合から構成される、ヌクレオチドを意味する。ある種の実施形態では、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【００８９】
ある種の実施形態
本発明の実施形態は、α−シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を阻害するための方法、化合物、および組成物を提供する。
【００９０】
本発明の実施形態は、それを必要とする個体において、α−シヌクレインと関連付けられた疾患、障害、および状態の治療、予防、または改善のための方法を提供する。また、α−シヌクレインと関連付けられた疾患、障害、または状態の治療、予防、あるいは改善のための薬物の調製のための方法も想定される。α−シヌクレインと関連付けられた疾患、障害、および状態は、神経変性疾患、ならびにパーキンソン病、認知症、多系統萎縮症（また、シャイ・ドレーガー症候群）、孤発性および家族性アルツハイマー病、アルツハイマー病レビー小体亜型、びまん性レビー小体病、およびレビー小体型認知症を含む、シヌクレイン病を含む。
【００９１】
本発明の実施形態は、α−シヌクレインと関連付けられた疾患を治療、防止、または改善するためのα−シヌクレイン特異的阻害剤の使用を提供する。ある種の実施形態では、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、α−シヌクレインｍＲＮＡおよび／またはα−シヌクレインタンパク質の発現を阻害することが可能な核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、および他の薬剤である。
【００９２】
本発明のある種の実施形態では、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、限定されないが、合成構造物α−シヌクレイン（６８−７８）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２００４．３５９：８９−９３に説明されるようなＧ１ｙ７３におけるＮ−メチル体、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００．２７５：２５１０９−２５１１２に説明されるようなＳＮＣＡ（２５−３５）のＮ−メチル化誘導体、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００４．１８：１３１５−１３１７に説明されるようなＡＳＩペプチド、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２００５．３３：１１０６−１１１０に説明されるようなＲＧＡＶＶＴＧＲ−アミドおよびＲＧＧＡＶＶＴＧＲＲＲＲＲＲ−アミド、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０．３０：２４５４−２４６３に説明されるようなＦＫ５０６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００８．１７：１３９５−１４０２に説明されるような組織トランスグルタミナーゼ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５．２８０：７５６２−７５６９に説明されるようなβ−シヌクレイン、ならびに第ＵＳ２００９／０２８６７４５号に説明されるようなα−シヌクレイン配列のレトロエナンチオマーである、ペプチジル化合物等のペプチドまたはタンパク質である。
【００９３】
本発明のある種の実施形態では、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、限定されないが、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４．１０：１０２３−１０３１に説明されるようなヒト１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、Ｄ１０、第ＵＳＰＮ７，７２７，９５７号に説明されるようなヒトα−ＳＮＣＡ抗体、第ＵＳＰＮ６，８９０，５３５号に説明されるような抗シヌクレイン抗体、第ＵＳＰＰＮ２０１０／０２７８８１４号に説明されるようなヒト化またはキメラ９Ｅ４抗体、第ＵＳＰＰＮ２０１０／００３１３７７号に説明されるようなマウスモノクロナール抗体６Ｈ７のヒト化バージョン、ならびに第ＵＳＰＰＮ２００８／０３００２０４号に説明されるようなヒト化抗シヌクレインモノクロナール抗体等の抗体である。
【００９４】
本発明のある種の実施形態では、α−シヌクレイン特異的阻害剤は、限定されないが、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２００８．１４：３２４７−３２６６に説明されるようなクルクミン、ニコチン、およびワイン関連ポリフェノール、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００５．１７０３：１５７−１６９に説明されるような４％  Ｈ２Ｏ２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０．Ｎｏｖ．１ｓｔ．Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔに説明されるようなセレギリン、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１０．１１４：４１９−４２９に説明されるようなバイカレイン；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９．１０６：１０５７−６２に説明されるような環状テトラピロールフタロシアニンテトラスルホン酸、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２０１０．３３２：８４９−８５７に説明されるようなＳＮＸ−０７２３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０．３９１：４６１−４６６に説明されるようなＮ’−ベンズアルデヒドベンゾイルヒドラゾン化合物、Ｎｅｕｒｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．２０１０．１７：２１５−２２７に説明されるようなＭＧ１３２およびエポキソミシン、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９．４８：８３２２−８３３４に説明されるようなコンゴレッドおよびラクモイド、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９．４８：８２０６−８２２４に説明されるようなフラボノイドキニーネ、Ｎｅｕｒｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．２０１０．１７：１３０−１４１に説明されるようなバルプロ酸、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９．３８８：５９７−６１０に説明されるような３，４−ジドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００９．９：２３０−２３８に説明されるようなＰＡＭＡＭデンドリマー、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００８．３：ｅ３３９４に説明されるようなドーパミン、Ｊ．Ｐｉｎｅａｌ  Ｒｅｓ．２００７．４２：１２５−１３０に説明されるようなメラトニン、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００７．１１３９：２２０−２２５およびＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００４．１１：１５１３−１５２１に説明されるようなリファンピシン、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７．４６：４８６８−１８７７に説明されるようなガングリオシドＧＭ１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７．２８２：５８６２−５８７０に説明されるような４−ヒドロキシ−２−ノネナール、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７．２８２：５６４１−５６５２に説明されるようなトレハロース、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３．２７８：１６８７３−１６８７７に説明されるような１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート／１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）／１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、第ＵＳＰＰＮ２０１０／０１７９２２３号および第ＵＳＰＮ７，７６３，７４７号に説明されるようなビス−およびトリス−ジヒドロキシアリール化合物およびそのメチレンジオキシ類似体、第ＵＳＰＰＮ２０１０／０２６１７５３号に説明されるよう���５−（フルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、５−（クロロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、第ＵＳＰＰＮ２０１０／００５６６２２号に説明されるようなラメルテオン、第ＵＳＰＰＮ２０１０／００３６１２２号に説明されるような切断剤、第ＵＳＰＰＮ２００９／０１２３５７５号に説明されるようなキャッツクロー抽出物、イチョウ、緑茶抽出物、ブドウ種子抽出物、およびクルクミン、第ＵＳＰＰＮ２００８／０３０６１４３号に説明されるようなカテキンまたは緑茶抽出物、第ＵＳＰＰＮ２００７／０２１３３６６号に説明されるようなファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等の小分子である。
【００９５】
本発明の実施形態は、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物を提供する。ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸は、配列番号１として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００３４５．３、配列番号２として本明細書に組み込まれるヌクレオチド１５１４００００から１５２５５０００が切断されたＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＴ＿０１６３５４．１７の相補体、配列番号３として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００７３０８．１、配列番号４として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｌ３６６７４．１、配列番号５として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＣ０１３２９３．２、配列番号６として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＧ７０１０２６．１、または配列番号７として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＭ０６９７６９．１に記載の配列のいずれかである。
【００９６】
ある種の実施形態では、本発明は、修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。ある種の実施形態では、本発明の化合物は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドから成る、修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【００９７】
ある種の実施形態では、本発明の化合物は、配列番号１、２、３、４、５、６、または７の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含む、修飾オリゴヌクレオチドを含んでもよい。ある種の実施形態では、本発明の化合物は、配列番号１、２、３、４、５、６、または７の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含む、修飾オリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００９８】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基４０４〜４６３の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基４０４〜４６３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（例えば、実施例６に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも４０％の阻害を達成し得る。
【００９９】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１０７〜１２６の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１０７〜１２６の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の阻害を達成し得る。
【０１００】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基２３６〜３０１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基２３６〜３０１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の阻害を達成し得る。
【０１０１】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基３０４〜３３１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基３０４〜３３１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の阻害を達成し得る。
【０１０２】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基３６１〜４００の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基３６１〜４００の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の阻害を達成し得る。
【０１０３】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基４０４〜４２３の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基４０４〜４２３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも９０％の阻害を達成し得る。
【０１０４】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基４４４〜４６３の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基４４４〜４６３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも９０％の阻害を達成し得る。
【０１０５】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基４６９〜４８８の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基４６９〜４８８の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも９０％の阻害を達成し得る。
【０１０６】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基５４２〜５７３の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基５４２〜５７３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも６０％の阻害を達成し得る。
【０１０７】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基６０７〜７２１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基６０７〜７２１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも３０％の阻害を達成し得る。
【０１０８】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基７３４〜８３７の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基７３４〜８３７の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも３０％の阻害を達成し得る。
【０１０９】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基８８１〜９２７の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基８８１〜９２７の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも６０％の阻害を達成し得る。
【０１１０】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基９５２〜９８３の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基９５２〜９８３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも４０％の阻害を達成し得る。
【０１１１】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１００１〜１０２０の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１００１〜１０２０の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも８０％の阻害を達成し得る。
【０１１２】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１０３０〜１０４９の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１０３０〜１０４９の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも３０％の阻害を達成し得る。
【０１１３】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１０５５〜１０９１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１０５５〜１０９１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも８０％の阻害を達成し得る。
【０１１４】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１２４２〜１２６１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１２４２〜１２６１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも２０％の阻害を達成し得る。
【０１１５】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１２９２〜１３３３の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１２９２〜１３３３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも２０％の阻害を達成し得る。
【０１１６】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１３４５〜１３７４の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１３４５〜１３７４の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも２０％の阻害を達成し得る。
【０１１７】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１４３２〜１５０１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１４３２〜１５０１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも３０％の阻害を達成し得る。
【０１１８】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１５２２〜１５４１の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１５２２〜１５４１の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも４０％の阻害を達成し得る。
【０１１９】
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１の核酸塩基１７０３〜１７４２の少なくとも一部に相補的である核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１７０３〜１７４２の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の連続核酸塩基を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の等長部分に１００％相補的である核酸塩基配列を含んでもよい。該修飾オリゴヌクレオチドは、任意に、ＨｕＶＥＣ細胞（例えば、実施例１に説明されるような）において、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を使用して決定されるように、ヒトｍＲＮＡレベルの少なくとも６０％の阻害を達成し得る。
【０１２０】
本発明の実施形態は、配列番号１１〜８８および９８〜１３６に列挙される核酸塩基配列の中から選択される、核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドを含む、修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１２１】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１２２】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ヒトα−シヌクレイン核酸に１００％相補的である、核酸塩基配列を有する。
【０１２３】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【０１２４】
ある種の実施形態では、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１２５】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオシドは、修飾糖を含む。
【０１２６】
ある種の実施形態では、修飾糖は、二環式糖である。
【０１２７】
ある種の実施形態では、二環式糖は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む。
【０１２８】
ある種の実施形態では、少なくとも１個のテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、テトラヒドロピラン環は、フラノース環を置換する。
【０１２９】
ある種の実施形態では、少なくとも１個のテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドの各々は、以下の構造を有し、
【化１】
2014501507.tif 000002
式中、Ｂｘは、任意に保護されるヘテロ環塩基部分である。
【０１３０】
ある種の実施形態では、修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル基を含む。
【０１３１】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含む。
【０１３２】
ある種の実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。
【０１３３】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
（ｉｉ）結合されたヌクレオシドから成る５’ウィングセグメントと、
（ｉｉｉ）結合されたヌクレオシドから成る３’ウィングセグメントと、
を含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。
【０１３４】
ある種の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）１０個の結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
（ｉｉ）５個の結合されたヌクレオシドから成る５’ウィングセグメントと、
（ｉｉｉ）５個の結合されたヌクレオシドから成る３’ウィングセグメントと、
を含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であって、各シトシンは、５−メチルシトシンである。
【０１３５】
本発明の実施形態は、神経変性疾患を有する動物を同定することと、該動物に、配列番号配列番号１１〜８８および９８〜１３６に列挙される、核酸塩基配列の中から選択される、核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドから成る、修飾オリゴヌクレオチドを含む組成物の治療有効量を投与すること、のための方法を提供する。
【０１３６】
ある種の実施形態では、投与は、α−シヌクレインの発現を減少させる。
【０１３７】
ある種の実施形態では、投与は、運動協調を改善する。
【０１３８】
ある種の実施形態では、投与は、嗅覚を改善する。
【０１３９】
ある種の実施形態では、投与は、空間記憶を改善する。
【０１４０】
ある種の実施形態では、投与は、α−シヌクレインの凝集を減少させる。
【０１４１】
本発明の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドから成り、配列番号１の等長部分の核酸塩基４０４〜４６３に相補的である少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である。
【０１４２】
本発明の実施形態は、動物において、α−シヌクレインの発現を減少させるための本明細書で説明される任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【０１４３】
本発明の実施形態は、動物において、運動協調を改善するための本明細書で説明される任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【０１４４】
本発明の実施形態は、動物において、α−シヌクレインの凝集を減少させるための本明細書で説明される任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【０１４５】
本発明の実施形態は、動物に、α−シヌクレインの発現が阻害されるように、化合物の治療的有効量を投与することによって、α−シヌクレインと関連付けられた疾患または状態を有する動物の治療において使用するための本明細書で説明される任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【０１４６】
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物として、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に「アンチセンス」であって、水素結合を通して、標的核酸にハイブリダイゼーションを起こすことが可能であることを意味し得る。
【０１４７】
ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’方向に書かれる時、標的指向される、標的核酸の標的セグメントの逆相補体を含む、核酸塩基配列を有する。ある種のかかる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に書かれる時、標的指向される、標的核酸の標的セグメントの逆相補体を含む、核酸塩基配列を有する。
【０１４８】
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、１２〜３０個のサブユニットの長さである。言い換えると、かかるアンチセンス化合物は、１２〜３０個の結合されたサブユニットである。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０個の結合されたサブユニットである。ある種のかかる実施形態では、アンチセンス化合物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０個の結合されたサブユニットの長さ、または前述の値のうちの任意の２つによって画定される範囲である。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、結合されたサブユニットは、ヌクレオチドである。
【０１４９】
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、短縮または切断され得る。例えば、単一サブユニットは、５’端（５’切断）、または代替として、３’端（３’切断）から欠失されてもよい。α−シヌクレイン核酸に対して標的指向される短縮または切断されたアンチセンス化合物は、５’端から欠失された２つのサブユニットを有してもよく、または代替として、アンチセンス化合物の３’端から欠失された２つのサブユニットを有してもよい。代替として、欠失されたヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に分散してもよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、１個のヌクレオシドが、５’端から欠失され、１個のヌクレオシドが、３’端から欠失されている。
【０１５０】
延長されたアンチセンス化合物中に単一の付加サブユニットが存在するとき、付加サブユニットは、アンチセンス化合物の５’または３’端に位置してよい。２つ以上の付加サブユニットが存在するとき、付加されたサブユニットは、互いに隣接してよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、２つのサブユニットがアンチセンス化合物の５’端へ付加（５’付加）される、または代替として、３’端へ付加（３’付加）されてもよい。代替として、付加されたサブユニットは、アンチセンス化合物全体に分散してよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、１つのサブユニットが５’端へ付加して、１つのサブユニットが３’端へ付加している。
【０１５１】
活性を消失させること無く、アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物の長さを増加あるいは減少させること、および／またはミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７３０５−７３０９，１９９２）では、長さが１３〜２５核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドの系列について、卵母細胞注入モデルにおいて標的ＲＮＡの切断を誘導するその能力が試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８または１１のミスマッチ塩基がある、長さが２５核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドより低い程度であったが、標的ｍＲＮＡの特異的な切断を指令することができた。同様に、１または３つのミスマッチがあるものが含まれる、１３核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、標的特異的な切断が達成された。
【０１５２】
Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ  ２００１）は、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡへの１００％相補性を有して、ｂｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡに対して３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドがｂｃｌ−２とｂｃｌ−ｘＬの両方の発現を体外および体内で低下させる能力を実証した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、強力な抗腫瘍活性を体内で明示した。
【０１５３】
Ｍａｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、タンデム１４核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドの系列と、このタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの２または３の配列より構成される、各々２８および４２の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を阻止するその能力を試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドの各々は、２８または４２の核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより控え目なレベルであるものの、単独で翻訳を阻害することができた。
【０１５４】
アンチセンス化合物モチーフ
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、抑制活性の増強、標的核酸への結合親和性の増加、または体内ヌクレアーゼによる分解への抵抗性といった特性をそのアンチセンス化合物へ付与する、パターン配置された化学修飾サブユニットまたはモチーフを有する。
【０１５５】
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解への抵抗性増加、細胞取り込み増加、標的核酸への結合親和性の増加、および／または抑制活性の増加を付与するように修飾された、少なくとも１つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合物の第２の領域は、任意に、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞性エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＨの基質としての役割を果たしてもよい。
【０１５６】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物とみなされる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅＨ切断切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ウィングセグメントが修飾ヌクレオシドを含むのに対し、ギャップセグメントは、概して、エンドヌクレアーゼ切断の基質としての役割を果たす。ある種の実施形態では、ギャップマーの領域は、各々異なる領域を含む糖部分の種類によって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分の種類として、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（かかる２’−修飾ヌクレオシドは、とりわけ、２’−ＭＯＥ、および２’−Ｏ−ＣＨ３を含んでもよい）、および二環式糖修飾ヌクレオシド（かかる二環式糖修飾ヌクレオシドは、４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を有するものを含んでもよく、ここでは、ｎ＝１またはｎ＝２である）が挙げられ得る。好ましくは、各異なる領域は、均一の糖部分を含む。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフは、多くの場合、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載され、ここでは、「Ｘ」は、５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」は、ギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は、３’ウィング領域の長さを表す。本明細書で使用されるとき、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」として記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメントの各々に直接隣接して位置付けられるような構成を有する。したがって、５’ウィングセグメントとギャップセグメントとの間、またはギャップセグメントと３’ウィングセグメントとの間に介在ヌクレオチドは存在しない。本明細書で説明されるアンチセンス化合物のいずれも、ギャップマーモチーフを有する可能性がある。いくつかの実施形態では、ＸおよびＺは、同一であって、他の実施形態では、異なる。好ましい実施形態では、Ｙは、８から１５のヌクレオチドである。Ｘ、Ｙ、またはＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。したがって、本発明のギャップマーとして、例えば、５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１、２−８−２、５−８−５、または６−８−６が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５７】
ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、ウィング−ギャップまたはギャップ−ウィング構成、すなわち、ギャップマー構成について上記に説明されるようなＸ−ＹまたはＹ−Ｚ構成を有する、「ウィングマー」モチーフを有する。したがって、本発明のウィングマー構成として、例えば、５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、５−１３、５−８、または６−８が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５８】
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを保有する。
【０１５９】
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、ギャップ拡張モチーフを有する。
【０１６０】
標的核酸、標的領域、およびヌクレオチド配列
α−シヌクレインをコードするヌクレオチド配列は、限定ではないが、配列番号１として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００３４５．３、配列番号２として本明細書に組み込まれるヌクレオチド１５１４００００から１５２５５０００が切断されたＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＴ＿０１６３５４．１７の相補体、配列番号３として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００７３０８．１、配列番号４として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｌ３６６７４．１、配列番号５として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＣ０１３２９３．２、配列番号６として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＧ７０１０２６．１、または配列番号７として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＭ０６９７６９．１を含む。
【０１６１】
本明細書に含有される例において、各配列番号に記載される配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対するどの修飾とも無関係であると理解されたい。したがって、配列番号によって定義されるアンチセンス化合物は、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対する１つ以上の修飾を独立的に含んでよい。Ｉｓｉｓ番号（ＩｓｉｓＮｏ）によって記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列およびモチーフの組み合わせを示す。
【０１６２】
ある種の実施形態では、標的領域は、標的核酸の構造的に規定される領域である。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接続部分、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の規定核酸領域を包含し得る。α−シヌクレインに対して構造的に規定される領域は、ＮＣＢＩのような配列データベースからの登録番号によって入手可能であって、かかる情報は、参照することによって本明細書に組み込まれる。ある種の実施形態では、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から同一標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含し得る。
【０１６３】
標的指向することには、所望の効果が生じるようにアンチセンス化合物がハイブリダイズする、少なくとも１つの標的セグメントの決定が含まれる。ある種の実施形態では、所望の効果は、ｍＲＮＡ標的核酸レベルの低下である。ある種の実施形態では、所望の効果は、標的核酸によってコードされるタンパク質のレベルの低下、または標的核酸に関連した表現型の変化である。
【０１６４】
標的領域は、１つ以上の標的セグメントを含有してもよい。標的領域内の複数の標的セグメントは、重複してよい。代替として、非重複であってよい。ある種の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００以下のヌクレオチドによって分離している。ある種の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の一定数（すなわち、約２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０である、それ以下である、または先行値の任意の２つによって規定される範囲である）のヌクレオチドによって分離している。ある種の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の５以下、または約５以下のヌクレオチドによって分離している。ある種の実施形態では、標的セグメントは、連続的である。考慮されるのは、本明細書に列挙される５’標的部位または３’標的部位のいずれかである、開始核酸を有する範囲によって規定される標的領域である。
【０１６５】
好適な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、またはエクソン／イントロン接続部分内に見出され得る。開始コドンまたは終止コドンを含有する標的セグメントも、好適な標的セグメントである。好適な標的セグメントには、開始コドンまたは終止コドンのような、ある構造的に規定される領域が特異的に排除されてよい。
【０１６６】
好適な標的セグメントの決定は、標的核酸の配列を他の配列とゲノム全体で比較することを含めてもよい。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、異なる核酸の間で類似した領域を同定することができる。この比較により、選択される標的核酸以外の配列（すなわち、非標的または標的外配列）に非特異的な様式でハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列の選択を防止することができる。
【０１６７】
アンチセンス化合物の活性（例えば、標的核酸レベルの低下パーセントによって明確化されるような）には、活性標的領域内で変動があり得る。ある種の実施形態では、α−シヌクレインｍＲＮＡレベルの減少は、α−シヌクレイン発現の阻害を示す。α−シヌクレインタンパク質レベルの減少もまた、標的ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。さらに、表現型の変化が、α−シヌクレイン発現の阻害を示す。例えば、運動協調の改善、安静時震顫の発生の減少、運動緩徐（運動緩慢）の発生の減少、硬直化または不変性の減少、平衡感覚の改善、微細運動の器用度の改善、粗大運動協調の改善、α−シヌクレインの凝集の減少、嗅覚喪失からの回復、および起立性低血圧の低下等の自律機能の改善である。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のアンチセンス化合物とα−シヌクレイン核酸との間でハイブリダイゼーションが起こる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序は、核酸分子の相補的な核酸塩基間での水素結合（例、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合）を伴う。
【０１６９】
ハイブリダイゼーションは、多様な条件の下で起こり得る。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質および組成によって決定される。
【０１７０】
ある配列が標的核酸へ特異的にハイブリダイズ可能であるかどうかを決定する方法は、当技術分野において公知である。ある種の実施形態では、本明細書に提供するアンチセンス化合物は、α−シヌクレイン核酸と特異的にハイブリダイズし得る。
【０１７１】
相補性
アンチセンス化合物と標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果（例、α−シヌクレイン核酸のような標的核酸のアンチセンス阻害）が生じるように、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
【０１７２】
アンチセンス化合物とα−シヌクレイン核酸との間の非相補的な核酸塩基は、アンチセンス化合物が標的核酸へ特異的にハイブリダイズすることが可能なままであれば、忍容される場合がある。さらに、アンチセンス化合物は、介在または隣接セグメント（例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）がハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、α−シヌクレイン核酸１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてよい。
【０１７３】
ある種の実施形態では、本明細書に提供するアンチセンス化合物、またはその特定部分は、α−シヌクレイン核酸、標的領域、標的セグメント、またはその特定部分に少なくとも、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸との相補性パーセントは、常法を使用して定量化することができる。
【０１７４】
例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうち１８が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を表すだろう。本例では、残る非相補的な核酸塩基は、密集していても、相補的な核酸塩基で分散されてもよく、互いに、または相補的な核酸塩基に連続している必要はない。したがって、長さが１８の核酸塩基であり、標的核酸との完全な相補性の２つの領域によって隣接されている４つの非相補的な核酸塩基を有するアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の全体相補性を有するので、本発明の範囲に入るだろう。標的核酸の領域とアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本ローカルアライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３  ４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９  ６５６）を使用して、常法により定量化することができる。相同性パーセント、配列同一性、または相補性は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２  ４８９）を用いたデフォルト設定を使用するギャッププログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８、Ｕｎｉｘ（登録商標）用、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，ウィスコンシン州マジソン）によって定量化することができる。
【０１７５】
ある種の実施形態では、本明細書に提供するアンチセンス化合物またはその特定部分は、標的核酸またはその特定部分に完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、α−シヌクレイン核酸、または標的領域、または標的セグメント、またはその標的配列に完全に相補的であり得る。本明細書で使用されるとき、「完全に相補的」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合することが可能であることを意味する。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在する限り、４００核酸塩基長である標的配列に完全に相補的である。完全に相補的はまた、第１のおよび／または第２の核酸の特定部分を参照して使用することができる。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長である標的配列に「完全に相補的」であり得る。３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、標的配列が対応する２０核酸塩基部分を有する場合、標的配列に完全に相補的であって、各核酸塩基は、アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に相補的である。同時に、３０核酸塩基アンチセンス化合物全体は、そのアンチセンス化合物の残る１０核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに依存して、標的配列に完全に相補的であり得るか、またはあり得ない。
【０１７６】
非相補的核酸塩基の場所は、アンチセンス化合物の５’端または３’端であり得る。代替として、非相補的核酸塩基または核酸塩基は、アンチセンス化合物の内部位置にあってよい。２つ以上の非相補的核酸塩基が存在するとき、連続的（すなわち、結合される）または非連続的であってもよい。一実施形態では、非相補的核酸塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント内に位置する。
【０１７７】
ある種の実施形態では、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基であるかまたはそれ以下であるアンチセンス化合物は、α−シヌクレイン核酸またはその特定部分のような標的核酸に関連して、４以下、３以下、２以下、または１以下の非相補的な核酸塩基を含む。
【０１７８】
ある種の実施形態では、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基であるかまたはそれ以下であるアンチセンス化合物は、α−シヌクレイン核酸またはその特定部分のような標的核酸に対して、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下の非相補的な核酸塩基を含む。
【０１７９】
本明細書に提供するアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的であるものも含まれる。本明細書で使用されるとき、「部分」は、標的核酸の領域またはセグメント内にある一定数の連続（すなわち、結合）核酸塩基を指す。「部分」はまた、アンチセンス化合物の一定数の連続核酸塩基を指し得る。ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも８つの核酸塩基部分に相補的である。ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１２の核酸塩基部分に相補的である。ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１５の核酸塩基部分に相補的である。また、考慮されるのは、標的セグメントの少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上、あるいはこれらの値の任意の２つによって画定される範囲の核酸塩基部分に相補的であるアンチセンス化合物である。
【０１８０】
同一性
本明細書に提供するアンチセンス化合物はまた、特別なヌクレオチド配列、配列番号、または特定のＩｓｉｓ番号によって表される化合物、あるいはその部分に対して一定の同一性パーセントを有し得る。本明細書で使用されるとき、アンチセンス化合物は、同一核酸塩基対合能力を有する場合、本明細書に開示される配列と同一である。例えば、開示されるＤＮＡ配列においてチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、ウラシルとチミジンが共にアデニンと対合するので、そのＤＮＡ配列と同一であるとみなされよう。本明細書で説明されるアンチセンス化合物の短縮または延長バージョン、ならびに本明細書に提供するアンチセンス化合物に対して非同一の塩基を有する化合物も考慮される。この非同一の塩基は、互いに隣接していても、またはアンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較される配列に対する、同一の塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。
【０１８１】
ある種の実施形態では、アンチセンス化合物またはその部分は、本明細書に開示されるアンチセンス化合物または配列番号またはその部分のうちの１つ以上に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１８２】
ある種の実施形態では、アンチセンス化合物の一部は、標的核酸の等長部分と比較される。ある種の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５核酸塩基部分は、標的核酸の等長部分と比較される。
【０１８３】
ある種の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの一部は、標的核酸の等長部分と比較される。ある種の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５核酸塩基部分は、標的核酸の等長部分と比較される。
【０１８４】
修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部分は、通常、ヘテロ環塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドは、相互に隣接するヌクレオシドの共有結合を通して形成され、線状のポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成すると称される。
【０１８５】
アンチセンス化合物への修飾には、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基への置換あるいは変化を包含する。修飾アンチセンス化合物は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、または抑制活性の増加のような望ましい特性のために、ネイティブ型に優って好ましい。
【０１８６】
化学修飾ヌクレオシドはまた、短縮または先端切断アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸への結合親和性を増加させるために利用し得る。結果として、かかる化学修飾ヌクレオシドを有する、より短いアンチセンス化合物では、多くの場合、同等の結果を得ることができる。
【０１８７】
修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間結合は、３’から５’のホスホジエステル結合である。１つ以上の修飾、すなわち、非天然に存在する、ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような望ましい特性のために、天然に存在するヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物に優って選択される。
【０１８８】
修飾ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間連結、ならびにリン原子を有さないヌクレオシド間連結を含む。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結として、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、およびホスホロチオエートが挙げられるが、それらに限定されない。リン含有および非リン含有の結合の製造の方法は、公知である。
【０１８９】
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある種の実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。ある種の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１９０】
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、任意に、糖基が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含有することができる。かかる糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増加、または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物へ付与し得る。ある種の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例として、限定ではないが、置換基（５’および２’置換基を含む）の付加、ノンジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸（ＢＮＡ）の形成、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基）での置き換え、およびそれらの組み合わせが挙げられる。化学修飾糖の例として、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の開示された５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについての２００８年８月２１日公開のＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１０１１５７号を参照されたい）、リボシル環酸素原子のＳでの置き換えと２’位でのさらなる置換（公開された２００５年６月１６日公開の米国特許出願第ＵＳ２００５／０１３０９２３号を参照されたい）、または代替として、ＢＮＡの５’置換（２００７年１１月２２日公開のＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００７／１３４１８１号を参照されたい。ここでＬＮＡは、例えば５’−メチルまたは５’−ビニル基で置換される）が挙げられる。
【０１９１】
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例として、限定ではないが、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含む、ヌクレオシドが挙げられる。２’位での置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され得、各ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換あるいは未置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
【０１９２】
本明細書で使用されるとき、「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾されたヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例としては、限定ではないが、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある種の実施形態では、本明細書に提供するアンチセンス化合物は、１つ以上の二環式ヌクレオシドを含み、ここで架橋は、４’〜２’二環式ヌクレオシドを含む。かかる４’〜２’二環式ヌクレオシドの例としては、次の式のうちの１つが挙げられるが、これらに限定されない：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）、４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’、および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’、およびそれらの類似体（２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）、４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’、およびそれらの類似体（２００９年１月８日に公開されたＰＣＴ公開国際出願第ＷＯ／２００９／００６４７８号を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’、およびそれらの類似体（２００８年１２月１１日に公開されたＰＣＴ公開国際出願第ＷＯ／２００８／１５０７２９号を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日に公開された公開米国特許出願第ＵＳ２００４／０１７１５７０号を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）である）、４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照されたい）、ならびに４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’、およびそれらの類似体（２００８年１２月８日に公開されたＰＣＴ公開国際出願第ＷＯ２００８／１５４４０１号を参照されたい）。また、例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９（２６）８３６２−８３７９（Ｊｕｌ．４，２００７）；Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７；Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３；米国特許第Ｕ．Ｓ．６，６７０，４６１号、第７，０５３，２０７号、第６，２６８，４９０号、第６，７７０，７４８号、第６，７９４，４９９号、第７，０３４，１３３号、第６，５２５，１９１号、第７，３９９，８４５号；公開ＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００４／１０６３５６号、第ＷＯ９４／１４２２６号、第ＷＯ２００５／０２１５７０号、および第ＷＯ２００７／１３４１８１号、米国特許公報第ＵＳ２００４／０１７１５７０号、第ＵＳ２００７／０２８７８３１号、および第ＵＳ２００８／００３９６１８；および米国特許第１２／１２９，１５４号、第６０／９８９，５７４号、第６１／０２６，９９５号、第６１／０２６，９９８号、第６１／０５６，５６４号、第６１／０８６，２３１号、第６１／０９７，７８７号、および第６１／０９９，８４４号；およびＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号、第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号、および第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号を参照されたい。前述の二環式ヌクレオシドは各々、例えば、α−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを含む、１つ以上の立体化学糖構成を有するように調製することができる（第ＷＯ９９／１４２２６号として、１９９９年３月２５日公開のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号を参照されたい）。
【０１９３】
ある種の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分は、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位との間の少なくとも１個の架橋を有する化合物を含むが、これらに限定されず、ここでかかる架橋は独立して、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１個または２〜４個の結合基を含み、
式中、
ｘは、０、１、または２であり、
ｎは、１、２、３、または４であり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、
各Ｊ１およびＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である。
【０１９４】
ある種の実施形態では、二環式糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−、または−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある種の実施形態では、架橋は、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、および４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【０１９５】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドはさらに、異性体構成によって定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ構成中またはβ−Ｄ構成中にあってもよい。以前は、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡは、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド中に組み込まれていた（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
【０１９６】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドには、下に示されるような、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、および（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【化２】
2014501507.tif 000003
式中、Ｂｘは、塩基部分であり、Ｒは独立して、Ｈ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【０１９７】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式Ｉ：
【化３】
2014501507.tif 000004
を有し、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、または−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり、
Ｒｃは、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアミノ保護基であり、
ＴａおよびＴｂは各々、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合である。
【０１９８】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式ＩＩ：
【化４】
2014501507.tif 000005
を有し、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂは各々、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Ｚａは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオである。
【０１９９】
一実施形態では、置換された基の各々は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、およびＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択される置換基群で一置換または多置換され、式中、各Ｊｃ、ＪｄおよびＪｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｘは、ＯまたはＮＪｃである。
【０２００】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式ＩＩＩ：
【化５】
2014501507.tif 000006
を有し、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂは各々、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Ｚｂは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。
【０２０１】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式ＩＶ：
【化６】
2014501507.tif 000007
を有し、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂは各々、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Ｒｄは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり、
各ｑａ、ｑｂ、ｑｃ、およびｑｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニルもしくは置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルもしくは置換Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルである。
【０２０２】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式Ｖ：
【化７】
2014501507.tif 000008
を有し、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂは各々、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｅ、およびｑｆは各々、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであるか、
あるいはｑｅおよびｑｆは一緒に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、
ｑｇおよびｑｈは各々、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２０３】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製が、それらのオリゴマー化、および核酸認識特性と共に記載されている（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０を参照されたい）。ＢＮＡおよびそれらの調製もまた、第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号に記載される。
【０２０４】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、および２’−チオ−ＢＮＡの類似体もまた、調製されている（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２を参照されたい）。核酸ポリメラーゼのための基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含む、固定されたヌクレオシド類似体の調製もまた、記載されている（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ、第ＷＯ９９／１４２２６号を参照されたい）。さらに、２’−アミノ−ＢＮＡ、新規の立体配座的に制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体の合成が、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９を参照されたい）。加えて、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製されており、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖によるそれらの二重鎖の熱安定性が以前に報告されている。
【０２０５】
ある種の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式ＶＩ：
【化８】
2014501507.tif 000009
を有し、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂは各々、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
各ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ、およびｑｌは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり、
ｑｉおよびｑｊまたはｑｌおよびｑｋは一緒に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、式中、ｑｇ、およびｑｈは各々、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２０６】
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋およびアルケニル類似体架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’を有する１つの炭素環式二環式ヌクレオシドが記載されている（例えば、Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３およびＡｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０を参照されたい）。それらのオリゴマー化と共にした炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および調製、ならびに生化学的研究もまた、記載されている（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９を参照されたい）。
【０２０７】
本明細書で使用されるとき、「４’−２’二環式ヌクレオシド」または「４’〜２’二環式ヌクレオシド」は、２’炭素原子および４’炭素原子を結合する、架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指す。
【０２０８】
本明細書で使用されるとき、「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分でない修飾された糖部分を含むヌクレオシドを指す。ある種の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分、または糖部分類似体は、任意の位置において修飾または置換されてもよい。
【０２０９】
本明細書で使用されるとき、「２’修飾糖」は、２’位において修飾されたフラノシル糖を意味する。ある種の実施形態では、かかる修飾は、置換および非置換アルコキシ、置換および非置換チオアルキル、置換および非置換アミノアルキル、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリル、ならびに置換および非置換アルキニルを含むが、これらに限定されないハロゲン化物から選択される置換基を含む。  ある種の実施形態では、２’修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含むが、これらに限定されない置換基から選択され、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の２’置換基群もまた、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態的特性を改善するための基、およびアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基から選択することができる。ある種の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ側鎖を含む（例えば、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００を参照されたい）。かかる２’−ＭＯＥ置換は、修飾されていないヌクレオシド、ならびに２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、およびＯ−アミノプロピル等の他の修飾されたヌクレオシドと比較して改善された結合親和性を有することが記載されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドもまた、体内での使用に有望な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害物質であることが示されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６、Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７、およびＡｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７−９２６を参照されたい）。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、「修飾されたテトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾されたＴＨＰヌクレオシド」は、正常なヌクレオシドにおけるペントフラノシル残基の代わりに置換された６員テトラヒドロピラン「糖」を有するヌクレオシドを意味する（糖代用物）。修飾されたＴＨＰヌクレオシドは、当該技術分野でヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール（ａｎｉｔｏｌ）核酸（ＡＮＡ）、マンニトール核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ、ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）１０：８４１−８５４を参照されたい）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と称されるもの、または式Ｘ：
式Ｘ：
【化９】
2014501507.tif 000010
を有する化合物が含まれるが、これらに限定されず、式中、式Ｘの該少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体の各々について独立して、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ３およびＴ４は各々、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であるか、あるいはＴ３およびＴ４の１つは、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ３およびＴ４のもう１つは、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合共役基、または５’もしくは３’末端基であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７は各々、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり、
Ｒ１およびＲ２の１つは、水素であり、もう１つは、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、およびＣＮから選択され、式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３は、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
【０２１１】
ある種の実施形態では、式Ｘの修飾されたＴＨＰヌクレオシドが提供され、式中、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ、およびｑｕは各々、Ｈである。ある種の実施形態では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ、およびｑｕのうちの少なくとも１つは、Ｈ以外である。ある種の実施形態では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ、およびｑｕのうちの少なくとも１つは、メチルである。ある種の実施形態では、式ＸのＴＨＰヌクレオシドが提供され、式中、Ｒ１およびＲ２の１つは、Ｆである。ある種の実施形態では、Ｒ１がフルオロであり、かつＲ２がＨである、Ｒ１がメトキシであり、かつＲ２がＨである、またＲ１がメトキシエトキシであり、かつＲ２がＨである。
【０２１２】
本明細書で使用されるとき、「２'修飾」または「２'置換」は、２'位において、ＨまたはＯＨ以外の置換基を含むヌクレオシド糖を指す。２'修飾ヌクレオシドは、その中で糖環の２個の炭素原子を結合する架橋が２'炭素および糖環の別の炭素を結合する、二環式ヌクレオシド、ならびにアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）等の非架橋２'置換基を有するヌクレオシドを含むが、これらに限定されず、式中、各ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈ、または置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。２'修飾ヌクレオシドはさらに、例えば、糖の他の位置におけるおよび／または核酸塩基における、他の修飾を含んでもよい。
【０２１３】
本明細書で使用されるとき、「２'−Ｆ」は、２'位においてフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２１４】
本明細書で使用されるとき、「２'−ＯＭｅ」または「２'−ＯＣＨ３」または「２'−Ｏ−メチル」は各々、糖環の２'位において−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２１５】
本明細書で使用されるとき、「ＭＯＥ」または「２'−ＭＯＥ」または「２'−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」または「２'−Ｏ−メトキシエチル」は各々、糖環の２'位において−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２１６】
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合されたヌクレオシドを含む化合物を指す。ある種の実施形態では、複数のヌクレオシドのうちの１つ以上が修飾される。ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【０２１７】
当該技術分野では、アンチセンス化合物への取り込み用にヌクレオシドを修飾するために使用し得る、多くの他の二環および三環糖代用環系も公知である（例えば、総説：Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１０，８４１−８５４を参照されたい）。
【０２１８】
かかる環系は、活性を高めるために、種々の追加の置換を受けることができる。
【０２１９】
修飾糖の調製方法は、当業者に公知である。
【０２２０】
修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾、またはそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０２２１】
ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する、１つ以上のヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、修飾糖部分は、２'−ＭＯＥである。ある種の実施形態では、２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフにおいて配列される。ある種の実施形態では、修飾糖部分は、ｃＥｔである。ある種の実施形態では、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング全体に配列される。
【０２２２】
組成物および医薬組成物を製剤化するための方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤のために薬学的に容認可能活性または不活性物質と混合されてもよい。組成物および医薬組成物の製剤化のための方法は、限定されないが、投与の経路、疾患の程度、投与すべき用量を含む、いくつかの判断基準に依存している。
【０２２３】
α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を好適な薬学的に容認可能希釈剤または担体と組み合わせることによって、医薬組成物において利用することができる。薬学的に容認可能希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは、非経口的に送達される組成物での使用に好適な希釈剤である。故に、一実施形態では、本明細書に説明される方法において採用されるのは、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物および薬学的に容認可能希釈剤を含む、医薬組成物である。ある種の実施形態では、薬学的に容認可能希釈剤は、ＰＢＳである。ある種の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２２４】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、または任意の他のオリゴヌクレオチドが含まれ、それらは、ヒトを含む動物への投与時に、生理活性のある代謝物またはその残基を（直接的および間接的に）提供することが可能である。したがって、例えば、本開示はまた、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、かかるプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物へ引用される。好適な薬学的に許容される塩として、ナトリウム塩とカリウム塩が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２５】
プロドラッグには、アンチセンス化合物の一端または両端での追加ヌクレオシドの取り込みを含めることができる。これは、身体内で内因性ヌクレアーゼによって切断されて、活性のあるアンチセンス化合物を生成する。
【０２２６】
共役したアンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める、１つ以上の部分または共役へ共有結合されてもよい。典型的な共役基には、コレステロール部分と脂質部分が含まれる。追加の共役基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。
【０２２７】
アンチセンス化合物はまた、例えば、ヌクレアーゼ安定性のような特性を高めるために、一般的にはアンチセンス化合物の一端または両端へ付ける、１つ以上の安定化基を有するように修飾することができる。安定化基に含まれるのは、キャップ構造である。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエクソヌクレアーゼ分解から保護して、細胞内での送達および／または局在化に役立てることができる。キャップは、５'−末端（５'−キャップ）、または３'−末端（３'−キャップ）に存在し得るか、あるいは両方の末端に存在し得る。キャップ構造は、当技術分野において公知であって、例えば、逆位デオキシ脱塩基キャップが含まれる。さらに、ヌクレアーゼ安定性を付与するためにアンチセンス化合物の一端または両端をキャップするのに使用し得るさらなる３'および５'−安定化基には、第ＷＯ０３／００４６０２号（２００３年１月１６日公開）に開示されるものが含まれる。
【０２２８】
細胞培養とアンチセンス化合物処置
α−シヌクレイン核酸のレベル、活性、または発現に対するアンチセンス化合物の効果について、多様な細胞種において体外で試験することができる。分析のために使用される細胞種は、市販ベンダー（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓｕｓ，ＶＡ；  Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ；  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手可能であり、ベンダーの説明書に従って、市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して培養される。例証的細胞種として、ＨｕＶＥＣ細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの体外試験
本明細書に説明されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処置についての方法であって、これは、他のアンチセンス化合物での処置のために適宜修飾することができる。
【０２３０】
細胞が培養中にほぼ６０〜８０％の集密度に達したときに、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。
【０２３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞の中へ導入するのに通常使用される１つの試薬には、カチオン性脂質トランスフェクション試薬、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮと混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度と、典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及ぶＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ濃度を達成する。
【０２３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の試薬には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥと混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及ぶＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ濃度を達成する。
【０２３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の技術には、エレクトロポレーションが含まれる。
【０２３４】
常法によって、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後１６〜２４時間で細胞を採取して、この時点で、当技術分野において公知のおよび本明細書に説明される方法によって、標的核酸のＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する。一般に、処置を多数の反復物で実施するとき、データは、その反復処置の平均として提示する。
【０２３５】
使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞系ごとに変動する。特別な細胞系に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当該技術分野で公知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥでトランスフェクトするとき、典型的には、１ｎＭ〜３００ｎＭに及ぶ濃度で使用する。エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトするときは、６２５〜２０，０００ｎＭに及ぶ、より高い濃度でアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。
【０２３６】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、当技術分野において公知である。ＲＮＡは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、製造業者の推奨プロトコールに従って、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、調製される。
【０２３７】
標的レベルまたは発現の阻害の分析
α−シヌクレイン核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野において公知の多様な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量的リアルタイムＰＣＲによって定量化することができる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、当該技術分野において公知である。ノーザンブロット分析も、当該技術分野では、常法である。定量的リアルタイムＰＣＲは、簡便には、市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能）を使用して、そして製造業者の説明書に従って使用して達成することができる。
【０２３８】
標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用する、定量的リアルタイムＰＣＲによって達成することができる。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は、当該技術分野において公知である。
【０２３９】
リアルタイムＰＣＲに先立って、単離したＲＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応へ処して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生してから、これをリアルタイムＰＣＲ増幅の基質として使用する。ＲＴ反応とリアルタイムＰＣＲ反応は、同一の試料ウェルにおいて連続的に実施する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲの試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手される。ＲＴリアルタイム−ＰＣＲ反応は、当業者に公知の方法によって行う。
【０２４０】
リアルタイムＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的の量は、シクロフィリンＡのような、その発現が一定である遺伝子の発現レベルを使用して、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して全ＲＮＡを定量化することによって、正規化する。シクロフィリンＡの発現は、標的と同時に、または別々に実施して多重化することによって、リアルタイムＰＣＲによって定量化する。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ  ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して定量化する。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡ定量の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）に教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ  ４０００機器（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ蛍光を測定する。
【０２４１】
α−シヌクレイン核酸とハイブリダイズするようにプローブとプライマーを設計する。リアルタイムＰＣＲのプローブおよびプライマーを設計する方法は、当該技術分野で公知であって、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のようなソフトウェアの使用を含めてよい。
【０２４２】
タンパク質レベルの分析
α−シヌクレインタンパク質レベルを測定することによって、α−シヌクレイン核酸のアンチセンス阻害を査定することができる。α−シヌクレインのタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学、または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）のような、当該技術分野で公知の種々の方法で評価または定量化することができる。標的指向される抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）のような多様な供給源より同定して入手するか、あるいは当該技術分野で公知の慣用のモノクローナルまたはポリクローナル抗体作製法により製造することができる。マウス、ラット、サル、およびヒトα−シヌクレインの検出に有用な抗体が市販されている。
【０２４３】
アンチセンス化合物の体内試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、α−シヌクレインの発現を阻害し、運動協調の改善、嗅覚の改善、空間記憶の改善、安静時震顫の発生の減少、運動緩徐（運動緩慢）の発生の減少、硬直化または不変性の減少、平衡感覚の改善、微細運動の器用度の改善、粗大運動協調の改善、α−シヌクレインの凝集の減少、および起立性低血圧の低下等の自律機能の改善のような表現型の変化をもたらすその能力を査定するために、動物において試験する。試験は、正常な動物において、または実験的な疾患モデルにおいて実施してもよい。動物への投与のために、リン酸緩衝化生理食塩水のような医薬的に許容される希釈剤でアンチセンスオリゴヌクレオチドを製剤化する。投与には、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、または頭蓋内投与、例えば、髄腔内または脳室内投与のような非経口の投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量および投薬頻度の計算は、投与経路や動物体重のような多くの要因に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置の期間に続いて、肝臓組織よりＲＮＡを単離して、α−シヌクレイン核酸発現の変化を測定する。α−シヌクレインタンパク質レベルの変化も測定する。
【０２４４】
ある種の適応症
ある種の実施形態では、本発明は、本発明の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、個体を治療する方法、化合物、および組成物を提供する。ある種の実施形態では、個体は、神経変性疾患を有する。ある種の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、認知症、多系統萎縮症（また、シャイ・ドレーガー症候群）、孤発性および家族性アルツハイマー病、アルツハイマー病レビー小体亜型、びまん性レビー小体病、またはレビー小体型認知症である。ある種の実施形態では、個体は、シヌクレイン病を有する。ある種の実施形態では、シヌクレイン病は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、または多系統萎縮症である。ある種の実施形態では、個体は、神経変性疾患および／またはシヌクレイン病を発症する危険がある。これは、個体が、老化、神経毒への暴露、および遺伝的素質を含む、神経変性疾患および／またはシヌクレイン病を発症する１つ以上の危険因子を有することを含む。ある種の実施形態では、個体は、神経変性疾患および／またはシヌクレイン病の治療を必要とするものとして同定されている。ある種の実施形態では、本発明は、個体において、α−シヌクレイン発現を予防的に減少させるための方法を提供する。ある実施形態は、個体に、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物の治療的有効量を投与することによって、それを必要とする個体を治療することを含む。
【０２４５】
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物の投与は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％、あるいはこれらの値の任意の２つによって画定される範囲だけ、α−シヌクレイン発現の減少をもたらす。ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物の投与は、運動協調の改善、嗅覚の改善、空間記憶の改善、安静時震顫の発生の減少、運動緩徐（運動緩慢）の発生の減少、硬直化または不変性の減少、平衡感覚の改善、微細運動の器用度の改善、粗大運動協調の改善、α−シヌクレインの凝集の減少、および起立性低血圧の低下等の自律機能の改善をもたらす。ある種の実施形態では、α−シヌクレインアンチセンス化合物の投与は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％、あるいはこれらの値の任意の２つによって画定される範囲だけ、運動協調を改善し、安静時震顫の発生を減少させ、運動緩徐（運動緩慢）の発生を減少させ、硬直化または不変性を減少させ、平衡感覚を改善し、微細運動の器用度を改善し、粗大運動協調を改善し、α−シヌクレインの凝集を減少させ、自律機能を改善し、および起立性低血圧を低下させる。
【０２４６】
ある種の実施形態では、α−シヌクレインに対して標的指向されるアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、神経変性疾患および／またはシヌクレイン病に罹患する、またはそれに対して感受性を持つ患者を治療するための薬物の調製のために使用される。
【０２４７】
投与
ある種の実施形態では、本明細書に記載される化合物および組成物は、非経口で投与される。
【０２４８】
ある種の実施形態では、非経口投与は、注入による。注入は、慢性的または継続的または短期的または間欠的であってもよい。ある種の実施形態では、注入される医薬品は、ポンプで送達される。ある種の実施形態では、非経口投与は、注射による。
【０２４９】
ある種の実施形態では、化合物および組成物は、ＣＮＳに送達される。ある種の実施形態では、化合物および組成物は、脳脊髄液に送達される。ある種の実施形態では、化合物および組成物は、脳柔組織に投与される。ある種の実施形態では、化合物および組成物は、髄腔内投与または脳室内投与によって、動物に送達される。本明細書に記載される化合物および組成物の中枢神経系内の広範な分布は、実質内投与、髄腔内投与、または脳室内投与により達成されてもよい。
【０２５０】
ある種の実施形態では、非経口投与は、注射による。注射は、シリンジまたはポンプで送達されてもよい。ある種の実施形態では、注射は、ボーラス注射である。ある種の実施形態では、注射は、線条体、尾状核、皮質、海馬、および小脳等の組織に、直接に投与される。
【０２５１】
ある種の組み合わせ療法
ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物は、１つ以上の他の医薬品と同時に投与される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある種の実施形態では、１つ以上の他の医薬品は、ペプチド、抗体、または小分子のいずれかである。ある種の実施形態では、ペプチド、抗体、または小分子は、本明細書の上記で説明されたもののいずれかである（例えば、上記のある種の実施形態を参照されたい）。
【０２５２】
ある種の実施形態では、かかる１つ以上の他の医薬品は、本発明の１つ以上の医薬組成物として、同一疾患、障害、または状態を治療するように設計される。ある種の実施形態では、かかる１つ以上の他の医薬品は、本発明の１つ以上の医薬組成物として、異なる疾患、障害、または状態を治療するように設計される。ある種の実施形態では、かかる１つ以上の他の医薬品は、本発明の１つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用に対処するように設計される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物は、別の医薬品と同時に投与され、他の医薬品の望ましくない効果に対処する。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物は、別の医薬品と同時に投与され、組み合わせ効果をもたらす。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物は、別の医薬品と同時に投与され、相乗効果をもたらす。
【０２５３】
ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物および１つ以上の他の医薬品は、同時に投与される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物および１つ以上の他の医薬品は、異なる時に投与される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物および１つ以上の他の医薬品は、単一製剤内に共に調製される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物および１つ以上の他の医薬品は、別個に調製される。ある種の実施形態では、１つ以上の他の医薬品は、レボドパ、ドーパミン作動薬、ＣＯＭＴ阻害剤、および抗鬱剤を含む。
【０２５４】
ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物が、物理的療法によって投与される。
【実施例】
【０２５５】
非限定的な開示および参照による組み込み
本明細書に記載されるある種の化合物、組成物、および方法が、ある種の実施形態に従って特異的に記載されている一方で、次の例は、本明細書に記載される化合物を例証するのみの役割を果たしており、それらを限定するようには意図されない。本出願に列挙される参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５６】
実施例１：ＨｕＶＥＣ細胞におけるヒトα−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）のアンチセンス阻害
ＳＮＣＡ核酸に対して標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡに対するその効果を体外で試験した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）試薬を１０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドと併用して、５，０００個の細胞／ウェルの密度の培養されたＨｕＶＥＣ細胞にトランスフェクトした。約２４時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ２６２１（フォワード配列ＡＣＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴ、本明細書では配列番号８として指定される；リバース配列ＧＡＧＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＴ、本明細書では配列番号９として指定される、プローブ配列ＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡ、本明細書では配列番号１０として指定される）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによって測定されるように、総ＲＮＡ含有量に従って調節した。結果は、未処置対照細胞と比較して、ＳＮＣＡの阻害パーセントとして提示される。
【０２５７】
表１、２、および３におけるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。ギャップマーは、２０ヌクレオシドの長さであり、中央のギャップセグメントは、１０個の２'−デオキシヌクレオシドから構成され、各々５ヌクレオシドを含むウィングが両端に（５'および３'方向に）隣接する。５'ウィングセグメントにおける各ヌクレオシドおよび３'ウィングセグメントにおける各ヌクレオシドは、２'−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全体のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。「開始部位」は、ギャップマーがヒト遺伝子配列において標的指向される、最も５'側のヌクレオシドを示す。「終結部位」は、ギャップマーがヒト遺伝子配列において標的指向される、最も３'側のヌクレオシドを示す。表１に列挙される各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００３４５．３）に対して標的指向される。表２に列挙される各ギャップマーは、配列番号２（ヌクレオチド１５１４００００から１５２５５０００が切断されたＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＴ＿０１６３５４．１７の相補体）に対して標的指向される。表３に列挙される各ギャップマーは、配列番号３（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００７３０８．１）、配列番号４（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｌ３６６７４．１）、配列番号５（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＣ０１３２９３．２）、配列番号６（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＧ７０１０２６．１）、または配列番号７（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＢＭ０６９７６９．１）のいずれかに対して標的指向される。
【０２５８】
表１および２に示されるように、ＩＳＩＳ番号：３８７９７３、３８７９７４、３８７９７５、３８７９７６、３８７９７７、３８７９７８、３８７９７９、３８７９８０、３８７９８１、３８７９８２、３８７９８３、３８７９８４、３８７９８５、３８７９８６、３８７９８７、３８７９８８、３８７９８９、３８７９９０、３８７９９１、３８７９９４、３８７９９５、３８７９９６、３８７９９７、３８７９９８、３８７９９９、３８８０００、３８８００１、３８８００２、３８８００４、３８８００５、３８８００６、３８８００７、３８８００８、３８８００９、３８８０１０、３８８０１２、３８８０１３、３８８０１４、３８８０１６、３８８０１７、３８８０２１、３８８０２５、３８８０２６、３８８０２７、３８８０２９、３８８０３２、３８８０３３、および３８８０３０９を含む、ギャップマーのうちのいくかは、プライマープローブセットＲＴＳ２６２１によって測定されるように、少なくとも５０％の阻害を呈した。
【０２５９】
ＩＳＩＳ番号：３８７９７３、３８７９７４、３８７９７５、３８７９７６、３８７９７７、３８７９７８、３８７９７９、３８７９８０、３８７９８１、３８７９８２、３８７９８３、３８７９８４、３８７９８５、３８７９８６、３８７９８８、３８７９８９、３８７９９０、３８７９９４、３８７９９５、３８７９９６、３８７９９７、３８７９９８、３８７９９９、３８８０００、３８８００１、３８８００２、３８８００４、３８８００５、３８８００６、３８８００７、３８８００８、３８８００９、３８８０１０、３８８０１４、３８８０１６、３８８０１７、３８８０２６、３８８０２７、３８８０２９、３８８０３２、３８８０３３、および３８８０３９を含む、ギャップマーのうちのいくかは、少なくとも６０％の阻害を呈した。
【０２６０】
ＩＳＩＳ番号：３８７９７３、３８７９７４、３８７９７５、３８７９７６、３８７９７７、３８７９７８、３８７９７９、３８７９８０、３８７９８１、３８７９８２、３８７９８３、３８７９８４、３８７９８５、３８７９８６、３８７９８９、３８７９９４、３８７９９５、３８７９９６、３８７９９７、３８７９９８、３８７９９９、３８８０００、３８８００１、３８８００４、３８８００６、３８８００８、３８８００９、３８８０１０、３８８０１４、３８８０１６、３８８０１７、３８８０２７、３８８０２９、および３８８０３９を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも７０％の阻害を呈した。
【０２６１】
ＩＳＩＳ番号：３８７９７３、３８７９７４、３８７９７５、３８７９７６、３８７９７８、３８７９７９、３８７９８１、３８７９８３、３８７９８４、３８７９８５、３８７９８６、３８７９９４、３８７９９８、３８７９９９、３８８０００、３８８００１、３８８００４、３８８００６、３８８００８、３８８００９、３８８０１０、３８８０１４、３８８０１６、および３８８０１７を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも８０％の阻害を呈した。
【０２６２】
ＩＳＩＳ番号：３８７９７３、３８７９７５、３８７９８３、３８７９８４、３８７９８５、３８７９８６、３８７９９４、３８７９９８、および３８８００４を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも９０％の阻害を呈した。
【表１−１】
2014501507.tif 000011
【表１−２】
2014501507.tif 000012
【表２−１】
2014501507.tif 000013
【表２−２】
2014501507.tif 000014
【表３】
2014501507.tif 000015
【０２６３】
実施例２：ＨｕＶＥＣ細胞におけるヒトＳＮＣＡの用量依存的アンチセンス阻害
実施例１において説明された研究におけるヒトＳＮＣＡの８４％以上の体外阻害を呈した１１のギャップマーについて、ＨｕＶＥＣ細胞において種々の用量で試験した。細胞を６，０００の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）試薬を、表４に規定されるように、０．０８ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．７４ｎＭ、２．２２ｎＭ、６．６７ｎＭ、および２０．００ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと併用して、トランスフェクトした。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、およびＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ヒトＳＮＣＡプライマープローブセットＲＴＳ２６２１（本明細書の実施例１において上述される）を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによって測定されるように、総ＲＮＡ含有量に従って調節された。結果は、未処置対照細胞と比較して、ＳＮＣＡの阻害％として提示される。表４に図示されるように、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞において、用量依存的に減少した。
【表４】
2014501507.tif 000016
【０２６４】
実施例３：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるヒトＳＮＣＡの用量依存的アンチセンス阻害
ギャップマーは、実施例２において説明される研究から選択され、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において種々の用量で試験した。細胞を２０，０００の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、エレクトロポレーションを使用して、表５に規定されるように、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ヒトＳＮＣＡプライマープローブセットＲＴＳ２６２０（フォワード配列ＧＧＴＧＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＧＡＡＧＴ、本明細書では配列番号８９として指定される；リバース配列ＡＣＡＴＣＧＴＡＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡ、本明細書では配列番号９０として指定される、プローブ配列ＡＡＴＡＣＡＴＧＧＴＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＴＧ、本明細書では配列番号９１として指定される）を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによって測定されるように、総ＲＮＡ含有量に従って調節された。結果は、未処置対照細胞と比較して、ＳＮＣＡの阻害％として提示される。表５に図示されるように、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞において、用量依存的に減少した。
【表５】
2014501507.tif 000017
【０２６５】
実施例４：マウスモデルにおけるヒトＳＮＣＡを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
実施例２および３において本明細書で説明される研究で用量依存的阻害を実証したＩＳＩＳオリゴヌクレオチドについて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける種々の代謝マーカーのレベルにおける変化を監視することによって、マウスモデルにおいて認容性を評価した。
【０２６６】
処置
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ３８７９７３、ＩＳＩＳ３８７９７５、ＩＳＩＳ３８７９７８、ＩＳＩＳ３８７９８３、ＩＳＩＳ３８７９８４、ＩＳＩＳ３８７９８５、ＩＳＩＳ３８７９８６、ＩＳＩＳ３８８００４、ＩＳＩＳ３８８００８、ＩＳＩＳ３８８０１０、またはＩＳＩＳ３８８０４１を、週２回、３週間、皮下に注射投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を、週２回、３週間、皮下に注射投与した。最後の用量を受けてから４８時間後に、マウスを犠牲にした。血漿をさらなる分析のために採取した。
【０２６７】
肝機能
肝機能に及ぼすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を処置期間の終了時に測定した。表６に提示される結果は、肝臓トランスアミナーゼが、ＩＳＩＳ３８７９８６以外、全ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドに対して、正常パラメータ以内であったことを示す。
【表６】
2014501507.tif 000018
【０２６８】
体重および臓器重量
マウスの体重、ならびに肝臓、脾臓、および腎臓重量を、研究の終了時に測定した。測定された全重量は、ＰＢＳ対照における対応する重量の１３％以内であった。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのいずれも、マウスの全体的健康にいかなる悪影響も及ぼさなかったことを実証する。
【０２６９】
実施例５：トランスジェニックマウスモデル（ＳＮＣＡ  ＰＡＣマウス）におけるヒトＳＮＣＡを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドについて、さらにＳＮＣＡ  ＰＡＣ（ＰＡＣ−Ｔｇ（ＳＮＣＡＷＴ）Ｓｎｃａ−／−）トランスジェニックマウスモデルにおいて、その有効性を評価した。これらのマウスは、ノックアウトＳｎｃａ対立遺伝子と、ＰＡＣ（Ｐ１人工染色体構造物）プロモーター下、ヒトＳＮＣＡをコードする導入遺伝子を内部に持つ。
【０２７０】
処置
４匹のＳＮＣＡ  ＰＡＣマウス群は各々、１００μｇのＩＳＩＳ３８７９７３、ＩＳＩＳ３８７９７５、ＩＳＩＳ３８７９７８、ＩＳＩＳ３８７９８３、ＩＳＩＳ３８７９８４、ＩＳＩＳ３８７９８５、ＩＳＩＳ３８８００４、ＩＳＩＳ３８８００８、ＩＳＩＳ３８８０１０、またはＩＳＩＳ３８８０４１を線条体内ボーラス注射を介して注射投与された。対照群のマウスは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を線条体内ボーラス注射を介して注射投与された。注射を受けてから２週間後に、マウスを犠牲にした。脳組織をさらなる分析のために採取した。
【０２７１】
ＲＮＡ分析
ＲＮＡは、ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析のために、脳の線条体および皮質組織から抽出された。結果は、表７に提示されており、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの大部分が、ＰＢＳ対照と比較して、有意にヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡを阻害することを実証する。
【表７】
2014501507.tif 000019
【０２７２】
実施例６：マイクロウォークによって設計したオリゴヌクレオチドによる、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるヒトＳＮＣＡのアンチセンス阻害
付加的ギャップマーは、ＩＳＩＳ３８７９８４（配列番号１の開始部位４０４）とＩＳＩＳ３８７９８５（配列番号１の開始部位４４４）の標的部位間のＳＮＣＡ遺伝子の領域を標的指向するように設計され、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡの有意な阻害を実証した。これらのギャップマーは、２つのギャップマー間の領域の相互から１個の核酸塩基だけシフトされた（すなわち、「マイクロウォーク」）ギャップマーを生成することによって設計された。新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ギャップマーとして設計された。これらのギャップマーは、体外で試験した。ＩＳＩＳ３８７９８４およびＩＳＩＳ３８７９８５もまた、比較のためにアッセイに含めた。５，０００個の細胞／ウェルの密度で培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、エレクトロポレーションを使用して、２，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。２つのヒトプライマープローブセット６７２（フォワード配列ＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡ、本明細書では配列番号９５として指定される；リバース配列ＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＡＣＡ、本明細書では配列番号９６として指定される；プローブ配列ＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＴＧＴＴＣＴＣ、本明細書では配列番号９７として指定される）およびプライマープローブセット６７３（フォワード配列ＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＴＴＧＣＡ、本明細書では配列番号９２として指定される；リバース配列ＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＴ、本明細書では配列番号９３として指定される；プローブ配列ＣＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＡＡＡ、本明細書では配列番号９４として指定される）を個々に使用し、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを測定した。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルは、サイクロフィリンレベルによって測定されるように、総ＲＮＡ含有量に従って調節された。結果は、未処置対照細胞と比較して、ＳＮＣＡの阻害％として提示される。結果は、表８に提示される。
【０２７３】
５−１０−５ＭＯＥギャップマーは、２０ヌクレオシドの長さであって、中央ギャップセグメントは、１０個の２'−デオキシヌクレオチドから構成され、各々５個のヌクレオシドを含むウィングが両端に（５'および３'方向に）隣接する。各ギャップマー全体のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される最も５'側のヌクレオシドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される最も３'側のヌクレオシドを示す。表８に列挙される各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００３４５．３）に標的指向される。
【０２７４】
表８に示されるように、プライマープローブセット６７３によって測定されるように、ＩＳＩＳ番号：３８７９８４、４８９３５１、４８９３５２、４８９３５３、４８９３５４、４８９３５５、４８９３５６、４８９３５７、４８９３５８、４８９３５９、４８９３６０、４８９３６１、４８９３６２、４８９３６４、４８９３６５、４８９３６６、４８９３６７、４８９３６８、４８９３６９、４８９３７１、４８９３７２、４８９３７３、４８９３７４、４８９３７５、４８９３８１、４８９３８２、４８９３８３、４８９３８７、および３８７９８５を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも５０％の阻害を呈した。
【０２７５】
ＩＳＩＳ番号：３８７９８４、４８９３５１、４８９３５２、４８９３５３、４８９３５５、４８９３５６、４８９３５７、４８９３５８、４８９３５９、４８９３６０、４８９３６１、４８９３６６、４８９３７１、４８９３７２、４８９３７３、４８９３７４、４８９３８１、４８９３８３、および３８７９８５を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも６０％の阻害を呈した。
【０２７６】
ＩＳＩＳ番号：３８７９８４、４８９３５１、４８９３５２、４８９３５６、４８９３５７、４８９３５８、４８９３５９、４８９３６０、４８９３６１、４８９３７３、４８９３７４、４８９３８１、および３８７９８５を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも７０％の阻害を呈した。
【０２７７】
ＩＳＩＳ番号：４８９３５７、４８９３５８、４８９３５９、および４８９３６０を含む、ギャップマーのいくつかは、少なくとも８０％の阻害を呈した。
【０２７８】
ＩＳＩＳ番号：４８９３５７および４８９３５８を含む、ギャップマーのうちの２つは、少なくとも８５％の阻害を呈した。
【０２７９】
ＩＳＩＳ４８９３５７である、１つのギャップマーは、少なくとも９０％の阻害を呈した。
【表８−１】
2014501507.tif 000020
【表８−２】
2014501507.tif 000021
【０２８０】
実施例７：トランスジェニックマウスモデル（ＳＮＣＡ  ＰＡＣマウス）におけるヒトＳＮＣＡを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性
実施例６において本明細書で説明される研究において、有意な阻害を実証したＩＳＩＳオリゴヌクレオチドについて、さらに、ＳＮＣＡ  ＰＡＣマウスにおいて、その有効性を評価した。
【０２８１】
処置
１２匹のＳＮＣＡ  ＰＡＣマウス群に各々、５０μｇのＩＳＩＳ３８７９８５、ＩＳＩＳ４８９３５１、ＩＳＩＳ４８９３５２、ＩＳＩＳ４８９３５６、ＩＳＩＳ４８９３５７、ＩＳＩＳ４８９３５８、ＩＳＩＳ４８９３５９、ＩＳＩＳ４８９３６０、ＩＳＩＳ４８９３７３、ＩＳＩＳ４８９３７４、ＩＳＩＳ４８９３８１、またはＩＳＩＳ４８９３８３を線条体内ボーラス注射を介して注射投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を線条体内ボーラス注射を介して注射投与した。注射を受けてから２週間後に、マウスを犠牲にした。脳組織をさらなる分析のために採取した。
【０２８２】
ＲＮＡ分析
ＲＮＡを、プライマープローブセット６７３（前述の実施例６において本明細書で説明される）を使用して、ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析のために、脳の海馬、線条体、および皮質組織から抽出した。結果は、表９に提示されており、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの大部分が、ＰＢＳ対照と比較して、ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡを有意に阻害することを実証する。
【表９】
2014501507.tif 000022
【０２８３】
実施例８：トランスジェニックマウスモデル（Ｔｈｙ１−ａＳＹＮマウス）におけるヒトＳＮＣＡを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性
実施例７において本明細書で説明される研究において、有意な阻害を実証したＩＳＩＳオリゴヌクレオチドについて、さらに、Ｔｈｙ１−ａＳＹＮマウスにおいて評価した。
【０２８４】
処置
４Ｔｈｙ１−ａＳＹＮマウス群に各々、５０μｇのＩＳＩＳ３８７９８５、ＩＳＩＳ４８９３５２、ＩＳＩＳ４８９３５６、およびＩＳＩＳ４８９３５７を、線条体内ボーラス注射を介して注射投与した。ペントバルビタール・ナトリウム（滅菌０．９％生理食塩水中６６ｍｇ／ｋｇネンブタール、腹腔内）でマウスに麻酔をかけた。次いで、マウスの頭皮を剃毛し、足反射の喪失後、マウスを定位固定フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ）に載置した。麻酔の外科的水準を維持するために、必要に応じて、ノーズコーンを介して、イソフルレン（０．５Ｌ／分で１００％酸素中１−２％）をマウスに投与した。ベタジンおよび７０％エタノールで３回代替払拭布を使用して、頭皮を滅菌した。頭皮を切開し、頭蓋骨表面を露出させ、ブレグマが明白に同定された。ブレグマに対して、０．５ｍｍ  ＡＰ、２ｍｍ  ＭＬで、頭蓋骨に穴を穿孔した。０．２ｕＬ／分の流速で、微量注射器ポンプコントローラ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３１０）に接続された２７ゲージ針を伴う１０ｕＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して、２μＬ溶液中５０μｇの用量で、ＩＳＩＳ３８７９８５、ＩＳＩＳ４８９３５２、ＩＳＩＳ４８９３５６、およびＩＳＩＳ４８９３５７を右側線条体中に一方的に注射した。頭蓋骨表面下３ｍｍにおいて、ＤＶ座標を測定した。注射後、さらに３分間、針を定位置に残し、脳内に溶液を拡散させた。注射器をゆっくりと引き抜いた後、頭蓋骨を縫合し、マウスに、０．５ｍＬの加温された滅菌生理食塩水を皮下注射し、補水を支援し、温水加温パッド上に載置し、意識および運動能力を回復するまで監視した。４匹のマウス群に、ＰＢＳを同様に注射した。マウスをそのホームケージに戻し、ケージの床上に、粉砕した食料を供給した。術後、毎日、マウスの体重および健康を監視した。注射を受けてから２週間後、マウスを犠牲にした。脳組織をさらなる分析のために採取した。４匹のマウス群に、ＰＢＳを同様に注射した。
【０２８５】
ＲＮＡ分析
サイクロフィリンＡ  ｍＲＮＡに正規化されたヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析のために、ＲＮＡを脳の線条体および皮質組織から抽出した。結果は、表１０に提示される。
【表１０】
2014501507.tif 000023
【０２８６】
タンパク質分析
タンパク質を脳の線条体および皮質組織の細胞溶解物から抽出し、抗α−シヌクレイン、クローンＳｙｎ２１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＮＹ）を使用して、ウェスタンブロット分析によって定量化した。結果は、α−チューブリンに正規化され、表１１に提示される。
【表１１】
2014501507.tif 000024
【０２８７】
脳区画におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドレベルの定量化
脳の線条体および皮質組織の吻側および尾側領域を個々に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する免疫蛍光抗体（Ａｂ６６５３，ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＣＡ）またはマウス抗ＳＮＣＡ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）を使用して、染色した。染色された区画の画像は、マイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して取得した。免疫蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量化した。免疫蛍光の定量化の結果は、表１２および１３に提示される。表１２からの結果は、ゼロ強度と指定されたＰＢＳ対照レベルと比較して、脳の異なる領域に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの均等分布を実証する。表１３は、対応する脳区画内のＳＮＣＡタンパク質レベルを提示し、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのいくつかによって、ＳＮＣＡの阻害を実証する。
【表１２】
2014501507.tif 000025
【表１３】
2014501507.tif 000026
【０２８８】
脳区画におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与による毒性の評価
脳の線条体および皮質組織の吻側および尾側領域もまた、個々に、免疫蛍光抗体ウサギ抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ  Ｉｎｃ，ＣＡ）または抗ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ）で染色した。染色された区画の画像は、マイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して取得した。免疫蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量化した。定量化の結果は、表１４および１５に提示される。表１４は、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与の結果、非特異的に中等度に増加される、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）のレベルを示す。これは、予期される転帰であって（Ｃｈｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９９４．１４：５０７−５２１）、結果は、増加が、有意ではないことを実証する。表１５は、ニューロン毒性を示す、ニューロンマーカーであるＮｅｕＮに関するデータを提示する。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのいずれも、ＰＢＳ対照と比較して、ＮｅｕＮレベルの増加を誘発しないことを示す。
【０２８９】
脳区画を別個に、ウサギ抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｃ，ＣＡ）で染色し、ミクログリア細胞を検出した後、ビオチン化二次抗体でプローブした。アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体法を使用して、区画を発現させた。次いで、ＤＡＢ基質によって、区画を発現させた。Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ）の光学分留装置機能を使用して、線条体および皮質内のＩｂａ１−陽性ミクログリア細胞の４つの代表的試料をカウントした。次いで、静止型または活性化型ミクログリアのいずれかとして、ミクログリアをスコア化した。スコア化は、分枝（静止型）またはアメーバ状（活性化型）外観のいずれかの形態学的基準に基づいた。活性化型ミクログリアは、ニューロン毒性のマーカーである。結果の平均は、Ｉｂａ１−陽性細胞の総数と比較した、活性化型Ｉｂａ１−陽性細胞の数の％として表した。結果は、表１８に提示され、ＩＳＩＳ３８７９８５またはＩＳＩＳ４８９３５７のいずれにより処置も、ミクログリア活性化を生じさせないことを実証する。故に、いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療も、任意の神経毒性を生じさせなかった。
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０２９０】
実施例９：トランスジェニックマウスモデル（Ｔｈｙ１−ａＳＹＮマウス）におけるヒトＳＮＣＡを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性
実施例５において本明細書で説明される研究からのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのいくつかについて、さらに、ヒトＳＮＣＡ（Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６８：５６８−５７８，２００２）を過剰発現する、Ｔｈｙ１−ａＳＹＮマウスにおいて評価した。ＩＳＩＳ３８７９７８、ＩＳＩＳ３８７９８３、ＩＳＩＳ３８７９８４、およびＩＳＩＳ３８７９８５はすべて、Ｔｈｙ−ａＳＹＮマウスにおける導入遺伝子ｍＲＮＡを標的指向し、本モデルにおいて処置された。
【０２９１】
ヒトｍＲＮＡ配列、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００３４５．３）に対するヒトオリゴヌクレオチドの標的部位は、表１７に提示される。ヒトオリゴヌクレオチドのいくつかは、マウスＳＮＣＡ配列と交差反応性である。ヒトオリゴヌクレオチドとマウス配列との間の相補性が大きいほど、ヒトオリゴヌクレオチドは、マウス配列と交差反応し得る可能性が高い。マウス配列、配列番号１３７（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００１０４２４５１．１）に対するヒトオリゴヌクレオチドの標的開始部位もまた、表１７に提示される。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、マウス配列に対して、３つを超えるミスマッチを有することを示す。
【表１７】
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【０２９２】
処置
４Ｔｈｙ１−ａＳＹＮマウス群に各々、５０μｇのＩＳＩＳ３８７９７８、ＩＳＩＳ３８７９８３、ＩＳＩＳ３８７９８４、またはＩＳＩＳ３８７９８５を、線条体内ボーラス注射を介して、注射投与した。ペントバルビタール・ナトリウム（滅菌０．９％生理食塩水中６６ｍｇ／ｋｇネンブタール、腹腔内）でマウスに麻酔をかけた。次いで、マウスの頭皮を剃毛し、足反射の喪失後、マウスを定位固定フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ）に載置した。麻酔の外科的水準を維持するために、必要に応じて、ノーズコーンを介して、イソフルレン（０．５Ｌ／分で１００％酸素中１−２％）をマウスに投与した。術中を通して、および術後３０分間、酸素を投与した。直腸プローブ体温計（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）を使用して、マウスの体温を監視した。ベタジンおよび７０％エタノールで３回代替払拭布を使用して、頭皮を滅菌した。頭皮を切開し、頭蓋骨表面を露出させ、ブレグマが明白に同定された。頭蓋骨表面が平坦である、すなわち、ブレグマ＋／−２ｍｍ前後方向（ＡＰ）において、背腹（ＤＶ）偏差＜０．２ｍｍであることを確証後、ブレグマに対して、０．５ｍｍＡＰ、２ｍｍ内外方向（ＭＬ）で、頭蓋骨に穴を穿孔した。０．２ｕＬ／分の流速で、微量注射器ポンプコントローラ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３１０）に接続された２７ゲージ針を伴う１０ｕＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して、２μＬ溶液中５０μｇの濃度で、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの各々を右側線条体中に一方的に注射した。頭蓋骨表面下３ｍｍにおいて、ＤＶ座標を測定した。注射後、さらに３分間、針を定位置に残し、脳内に溶液を拡散させた。注射器をゆっくりと引き抜いた後、頭蓋骨を縫合し、マウスに、０．５ｍＬの加温された滅菌ＰＢＳを皮下注射し、補水を支援した。マウスを温水加温パッド上に載置し、意識および運動能力を回復するまで監視した。４匹のマウス群に、ＰＢＳを同様に注射した。次いで、動物をそのホームケージに戻し、ケージの床上に、粉砕した食料を供給した。術後、毎日、マウスの体重および健康を監視した。注射を受けてから２週間後、頚椎脱臼によって、マウスを犠牲にした。
【０２９３】
マウスの脳を直ちに採取および解剖した。冠状面ブレインマトリックスを使用して、脳の１ｍｍ切片をｍＲＮＡおよびタンパク質抽出のために摘出した。注射部位のすぐ吻側の１ｍｍの切片をｍＲＮＡのために採取し、注射部位のすぐ尾側の１ｍｍの切片をタンパク質分析のために採取した。同側半球からの線条体および皮質を氷上で解剖した。
【０２９４】
ＲＮＡ分析
ｍＲＮＡ精製のために、脳組織を０．５ｍＬ  ＧＩＴＣ／ＢＭＥおよび滅菌セラミックビーズを含有する２ｍＬ管中のドライアイス上で急冷した。サイクロフィリンＡ  ｍＲＮＡに正規化されたヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析のために、ＲＮＡを脳の線条体および皮質組織から抽出した。ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルを、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ２６１８（フォワード配列ＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧ、本明細書では配列番号１３８として指定される；リバース配列ＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴ、本明細書では配列番号１３９として指定される；プローブ配列ＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＴＧ、配列番号１４０として指定される）を使用して測定した。結果は、表１８に提示され、ＰＢＳ対照と比較して、阻害％として表される。マウスＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルもまた、マウスプライマープローブセットＲＴＳ２９５６（フォワード配列ＧＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧ、本明細書では配列番号１４１として指定される；リバース配列ＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡ、本明細書では配列番号１４２として指定される；プローブ配列ＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＴＡＣＡＡ、本明細書では配列番号１４３として指定される）を使用して測定した。結果は、表１９に提示され、ＰＢＳ対照と比較して、阻害％として表される。ＩＳＩＳ３８７９７８およびＩＳＩＳ３８７９８５は両方とも、配列番号１３７を標的指向するため、いずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置も、マウスＳＮＣＡ  ｍＲＮＡ発現を阻害する。
【表１８】
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【表１９】
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【０２９５】
タンパク質分析
タンパク質分析のための組織資料を、滅菌セラミックビーズを含有する管内に急冷した。ＳＮＣＡのタンパク質レベルを、ヒトおよびマウスＳＮＣＡの両方を標的指向する抗ＳＮＣＡ抗体（Ｓｉｇｎｅｔ，＃４Ｄ６）を使用して、ウェスタンブロット分析によって測定した。結果は、表２０に提示され、ＰＢＳ対照と比較した阻害％として表される。
【表２０】
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【０２９６】
免疫蛍光分析
各脳から１つの冠状断面を、尾側線条体のレベルにおいて採取した。ＰＢＳ中で洗浄後、１時間、Ｍ．Ｏ．Ｍ．マウスＩｇＧ遮断試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＫ−２２００）中で断面をインキュベートした。次いで、一次抗体である、マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００希釈；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ３７７）および６６５３Ａｂウサギ抗ＡＳＯ（１：３，０００希釈；ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）によって、ＰＢＳ中２％ＮＧＳ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において、４℃で一晩断面をインキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄後、二次抗体である、Ｃｙ３共役ヤギ抗ウサギ（１：２５０希釈；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＣｙ５共役ヤギ抗マウス（１：２５０希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）によって、ＰＢＳ中５％ＮＧＳにおいて、２時間、断面をインキュベートした。いくつかの断面を二次抗体のみでインキュベートし、一次抗体インキュベーションを省略し、対照としての役割を果たすようにした。ＰＢＳ中で洗浄後、水中において、ガラス顕微鏡スライド上に断面を搭載し、一晩乾燥させた。Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光色素を励起するために、レーザを使用する、高分解能マイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、スライドをスキャンした。次いで、スキャンした断面の画像を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して分析し、免疫蛍光染色の強度を定量化した。ＡＳＯを受けたマウスの脳から同側および対側半球の線条体および皮質中の染色の平均強度を計算し、対照マウスのものと比較した。ＰＢＳ対照の免疫蛍光強度を基準値とし、任意に、１．００として指定した。結果は、表２１に提示され、試験されたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの大部分において、軽微なニューロン毒性が存在したことを示す。
【表２１】
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【０２９７】
ＡＳＯの分布は、Ａｂ６６５３染色によって表示されるように、線条体の吻側−尾側軸全体に沿って延在する、線条体および皮質を含む、同側半球全体に拡散した。淡蒼球、海馬の吻側範囲、および視床を含む、他の脳構造もまた、免疫陽性であった。
【０２９８】
実施例１０：ヒトＳＮＣＡを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後のＴｈｙ１−ａＳＹＮマウスの挙動に及ぼす効果
前述に説明される研究における有意な有効性を実証したＩＳＩＳ３８７９８５をＴｈｙ１−ａＳＹＮマウスに投与する。運動機能、嗅覚、および空間記憶をマウスにおいて試験する。
【０２９９】
処置
３．５月齢の１６匹のオスのＴｈｙ１−ａＳＹＮマウス群各々に、脳注入キットを伴うＡｌｚｅｔミニポンプモデル＃２００２を使用して、２週間、５０μｇ／日のＩＳＩＳ３８７９８５または滅菌ＰＢＳをＩＣＶ注入した。この後、２週間の排出が続き、そこで、ミニポンプを除去し、マウスを回復させた。マウスは、４．５月齢からおよび５月齢において、挙動に関して試験する。挙動を分析するために使用される試験は、課題的梁および支柱のタスクを含む、運動試験（Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２４：９４３４−９４４０，２００４）、埋設ペレットを使用した嗅覚試験（Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：２４７−２５６，２００８）、および新規場所認識を使用した空間作業記憶試験（Ｍａｇｅｎｅｔａｌ．，提出済み）である。マウスは、５月齢で安楽死させた。脳および周辺組織を生化学的および組織学的分析のために採取した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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