(57)【要約】【課題】女性に膣の健康状態を知らせることができるような迅速、低価格でかつ使いやすい検査のためのデバイス及び方法を提供する。【解決手段】膣の良好な健康状態のバイオマーカのための診断キットが提供される。本発明のキットは第１の検出ゾーンを含み、第１の検出ゾーン内においてＤ−乳酸検出信号を生じさせることができ、該Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量が判定可能である。本発明のキットはさらに第２の検出ゾーンを含み、第２の検出ゾーン内において過酸化水素検出信号を生じさせることができ、該過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量が判定可能である。【選択図】図１
2014501502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膣の良好な健康状態のバイオマーカのための診断検査キットであって、
Ｄ−乳酸検出信号を生じさせることができかつ該Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量が判定可能であるようにした第１の検出ゾーンと、
過酸化水素検出信号を生じさせることができかつ該過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量が判定可能であるようにした第２の検出ゾーンとを含むことを特徴とする診断検査キット。
【請求項２】
前記Ｄ−乳酸検出信号が色変化であることを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項３】
前記過酸化水素検出信号が色変化であることを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項４】
前記第１の検出ゾーンがクロマトグラフ媒体上に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項５】
前記第２の検出ゾーンがクロマトグラフ媒体上に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項６】
前記第１の検出ゾーンがＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項７】
前記第１の検出ゾーンがジアホラーゼをさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の診断検査キット。
【請求項８】
前記第１の検出ゾーンがＤ−乳酸オキシダーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項９】
前記第１の検出ゾーンが酸化還元色素を含むことを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項１０】
前記第２の検出ゾーンがペルオキシダーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項１１】
前記第２の検出ゾーンが酸化還元色素を含むことを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項１２】
吸収性物品内に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の診断検査キット。
【請求項１３】
膣の良好な健康状態のバイオマーカを検出する方法であって、
ｉ）Ｄ−乳酸検出信号を生じさせることができかつ該Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量が判定可能であるようにした第１の検出ゾーン及び、過酸化水素検出信号を生じさせることができかつ該過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量が判定可能であるようにした第２の検出ゾーンを含む検査キットに、検査サンプルを接触させるステップと、
ｉｉ）前記Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量を判定するステップと、
ｉｉｉ）前記過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量を判定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記Ｄ−乳酸検出信号が色変化であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記過酸化水素検出信号が色変化であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の検出ゾーンがクロマトグラフ媒体上に設けられていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の検出ゾーンがクロマトグラフ媒体上に設けられていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の検出ゾーンがＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の検出ゾーンがジアホラーゼをさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の検出ゾーンがＤ−乳酸オキシダーゼを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、良好な健康状態のバイオマーカを検出するための膣用インジケータ（指標体）に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性の膣は、様々な細菌、酵母及び微生物によって自然にコロニー形成されている。例えば、正常な膣は通常、膣液１ミリリットル（ｍＬ）当たり約１０４個以上の乳酸杆菌を含んでいる。正常な状態では、膣内細菌叢（フローラ）が、病原菌の侵入を防ぐのに役立つ弱酸性環境を作っている。しかし残念ながら、この膣のバランスは様々な外部要因によって容易に崩れ、最終的に膣の感染症を発症する場合がある。
【０００３】
例えば、細菌性腟症は、複数菌による膣の感染症であり、嫌気性菌の数の増加及びそれに付随する膣内の乳酸杆菌の減少が原因であると考えられている。乳酸杆菌の数の減少には、栄養競合を減少させる作用と、存在する乳酸の量を減少させる（すなわちｐＨを上昇させる）作用の二重の作用がある。これは、腟内の日和見性病原体の増殖につながる（日和見性病原体の成長は、通常は、乳酸杆菌及び膣の酸性ｐＨによって抑制されている）。ＢＶ感染中によく見られる菌種をいくつか挙げると、アトポビウム・バギナエ、バクテロイデス、ガードネレラ・バギナリス、モビルンカス、メガスフェラ、マイコプラズマ・ホミニス、ペプトストレプトコッカス及びプレボテラなどがある。
【０００４】
細菌性腟症の症状には通常、不快臭、膣内ｐＨの上昇（約５．０以上）、分泌物が薄く均一であること、クルーセル（すなわち、小さなグラム不定性桿菌に覆われた腟上皮細胞）の存在が含まれる。
【０００５】
現行の腟細菌感染治療計画には、種々の広域抗生物質（メトロニダゾールなど）の使用が含まれる。しかし、抗生物質は、善玉乳酸杆菌を含む様々な腟内正常細菌叢を死滅させる可能性があるので、多くの場合に望ましくない。乳酸杆菌は腟内の種々の日和見病原体を抑制するので、それらを死滅させることにより二次性合併症を引き起こす可能性がある。このような治療は、ひいては、さらなる治療計画、例えば、培養された乳製品の摂取による体内における乳酸杆菌の補充や、抗真菌薬による治療などを必要とすることがある。乳酸杆菌の不足に起因する嫌気性菌レベルの上昇は、感染症をさらに悪化させる場合がある。抗生物質は、腟内において頻繁に使用されるとき、腟からの吸収を通じて全身毒性をもたらすことがある。さらに、治療が比較的容易であることが臨床的意義を持たないと誤解してはならない。特に妊娠期には、細菌性腟症が深刻な問題を引き起こす可能性がある。細菌性腟症は、早産と、出生時の罹患率と死亡率の増加の寄与因子として認識されつつある。
【０００６】
これまでの細菌性腟症を検査する試みは、特に感染症に関連するバイオマーカの検出に限られていた。そのような手法の明らかな欠点は、細菌性腟症感染を検出するために細菌性腟症感染が既に現れていなければならないことである。しかし、より良好な衛生行動を推進しかつ場合により細菌性腟症感染及び他の感染を回避するために行動を変えるように膣の健康状態の頻繁な評価を与えることができる検査は存在しない。具体的に言うと、女性たちに、健康であるときにはかなりの安心感を与え、そうでないときには適切な腟ケアのためのガイダンスを与えることができる検査はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第２，９１２，３０９号明細書
【特許文献２】米国特許第２，９８１，６０６号明細書
【特許文献３】米国特許第３，３４９，００６号明細書
【特許文献４】米国特許第３，０９２，４６５号明細書
【特許文献５】米国特許第３，５５８，４３５号明細書
【特許文献６】米国特許第３，５９５，７５５号明細書
【特許文献７】米国特許第３，６２７，６９７号明細書
【特許文献８】米国特許第３，６２７，６９８号明細書
【特許文献９】米国特許第３，６３０，８４７号明細書
【特許文献１０】米国特許第３，６５４，１７９号明細書
【特許文献１１】米国特許第３，６５４，１８０号明細書
【特許文献１２】米国特許第３，８５３，４７０号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，０８９，７４７号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００２／０１１９１３６号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，０７５，０７７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、女性に膣の健康状態を知らせることができるような迅速、低価格でかつ使いやすい検査のためのデバイスが現在必要とされている。そのような検査を行う方法もあれば有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態に従って、膣の良好な健康状態のバイオマーカのための診断キットが提供される。本キットは第１の検出ゾーンを含み、第１の検出ゾーン内ではＤ−乳酸検出信号を生じさせることができ、該Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量が判定可能である。本キットは第２の検出ゾーンをさらに含み、第２の検出ゾーン内では過酸化水素検出信号を生じさせることができ、該過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量が判定可能である。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態では、膣の良好な健康状態のバイオマーカを検出する方法が提供される。本方法は、第１の検出ゾーンを含む検査キットに検査サンプルを接触させるステップを含み、第１の検出ゾーン内ではＤ−乳酸検出信号を生じさせることができる。該Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量が判定可能である。検査キットは第２の検出ゾーンをさらに含み、第２の検出ゾーン内では過酸化水素検出信号を生じさせることができ、該過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量が判定可能である。本方法はさらに、Ｄ−乳酸検出信号からＤ−乳酸の存在または量を検出するステップと、過酸化水素検出信号から過酸化水素の存在または量を判定するステップとを含む。
【００１１】
本発明の他の特徴及び態様については以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の診断検査キットにおいて用いられ得るアッセイデバイスの一実施形態の斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
【００１４】
本明細書では、「膣」なる語は、全体として、女性生殖管の、子宮から前庭まで延在する内部構造を指す。「膣」なる語はまた、外性器（例えば、大陰唇、小陰唇、陰核）を含むものとする。
【００１５】
本明細書では、「検査サンプル」なる語は、全体として、膣の健康状態の状態を示すことができる特定のバイオマーカが検査される物質を指す。例えば、検査サンプルは、生理液などの生物学的な源から得られるものまたは生物学的な源に由来するものであってよい。さらに、検査サンプルとして固形物を用いることもできる。検査サンプルは、源から直接採取したものを用いてもよいし、前処理を行ってサンプルの特性を変更した後に用いてもよい。例えば、そのような前処理は、血液からの血漿の調製、粘性流体の希釈などを含み得る。前処理方法には、ろ過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活化、試薬の添加などを含めることもできる。さらに、固体検査サンプルを改変して液体媒体を形成することも有益であろう。
【００１６】
発明の詳細な説明
【００１７】
ここで、本発明の様々な実施形態について詳細に言及する。本発明の１若しくは複数の例について、以下で説明する。各例は、本発明の説明として与えられており、本発明を限定するものではない。実際、本発明において、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な変更形態及び変形形態が可能であることは、当業者にとって明らかであろう。例えば、一実施形態の一部として図示または説明されている特徴を別の実施形態に用いてさらなる実施形態を生み出すことができる。それゆえ、本発明は、そのような変更形態及び変形形態を、添付の特許請求の範囲及びその等価形態に含まれるものとして包含することを意図している。
【００１８】
全体として、本発明は、膣の健康状態の状態を示すバイオマーカの存在及び／または量を検出するための技術に関する。例えば、特定の実施形態では、検査サンプル内で乳酸及び過酸化水素の存在及び／または量をそれぞれ示すために用いることができる診断検査キットが用いられる。
【００１９】
この点に関して、乳酸菌集団を維持するグリコーゲンの形で膣上皮細胞が栄養素を与える場合には膣及び乳酸杆菌は共生関係を築き、乳酸菌叢は他の病原体に対する防御を与える。具体的には、乳酸杆菌は、膣を酸性化する乳酸（本明細書においては同様の意味でラクテート（乳酸塩）とも称される）と、病原体の異常増殖を防止する過酸化水素（本明細書においては同様の意味で過酸化物とも称される）とを産出する。乳酸及び過酸化水素は共に、健常な膣の乳酸菌集団によって大量に産出される。
【００２０】
乳酸は、２つの異性体、すなわちＬ−乳酸及びＤ−乳酸を有する。Ｌ−乳酸は人体及び細菌の両者によって産出されるが、Ｄ−乳酸は細菌によってのみ産出される。膣内細菌叢において、乳酸菌は、Ｄ−乳酸をかなりの量産出する唯一の細菌種であることが知られている。腟上皮細胞はＤ−乳酸を産出するが、膣内のＤ−乳酸の大部分は乳酸菌叢によって産出されると考えられている。従って、Ｄ−乳酸の量は、膣の健康状態の状態の正確な指標である。検査サンプル１ｍＬ当たり約１０ｍｇ（約１０ｍｇ／ｍＬ）を超える量のＤ−乳酸が膣内に存在していれば健康な状態を示していると判定されてきた。例えば、特定の実施形態では、約２ｍｇ／ｍＬを超える量のＤ−乳酸が膣内に存在していれば健康な状態を示している。特定の実施形態では、約１５ｍｇ／ｍＬを超える量のＤ−乳酸が膣内に存在していれば健康な状態を示しており、さらに他の実施形態では、約２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬまたは２００ｍｇ／ｍＬを超える量のＤ−乳酸が膣内に存在していれば健康な状態を示している。
【００２１】
Ｄ−乳酸の検出は、酵素に基づくアッセイ、例えば、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼまたはＤ−乳酸オキシダーゼを利用するアッセイなどによって達成することができる。Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型（ＮＡＤＨ）を生じさせるが、Ｄ−乳酸オキシダーゼは過酸化水素を生じさせる。
【００２２】
例えば、特定の実施形態では、Ｄ−乳酸の定量化は複数の酵素反応を含み得る。Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＬＤＨ）によって触媒される第１の反応では、Ｄ−乳酸（Ｄ−ラクテート）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の存在下で酸化されてピルビン酸になる（１）。
（Ｄ−ＬＤＨ）
（１）Ｄ−ラクテート＋ＮＡＤ＋−−−−＞ピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋
【００２３】
しかし、反応（１）の平衡はＤ−乳酸及びＮＡＤ＋の方向に進みやすいので、さらなる反応を利用することによりピルビン酸産物を「閉じ込める」ことができる。このことは、非常に過剰なＤ−グルタミン酸の存在下で、Ｄ−グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｄ−ＧＰＴ）酵素を用いて、ピルビン酸をＤ−アラニン及び２−オキソグルタル酸に転換することによって達成される（２）。
（Ｄ−ＧＰＴ）
（２）ピルビン酸＋Ｄ−グルタミン酸−−−−＞Ｄ−アラニン＋２−オキソグルタル酸
【００２４】
上式（１）で形成されたＮＡＤＨの量は、Ｄ−乳酸の量と化学量論的（ストイキオメトリック）である。検査サンプル中に存在するＤ−乳酸の量を定量化するために、ジアホラーゼの存在下で適切な着色剤を利用することができる（３）。
（ジアホラーゼ）
（３）ＮＡＤＨ＋着色剤（酸化型）−−−−＞ＮＡＤ＋着色剤（還元型）
【００２５】
適切な着色剤は、以下のものを含むテトラゾリウム試薬を含むことができる：ｐＡＢＴ（ｐ−アニシルブルーテトラゾリウムクロリド）；ｐＡｐＮＢＴ、ｐ−アニシル−ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ＢＳＰＴ、チアゾリルブルー（２−２’−ベンゾチアゾリル−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）テトラゾリウムクロリド）；Ｂ Ｔ、ブルーテトラゾリウムクロリド；ＢＴＳＰＴ、２−（２’−ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）−テトラゾリウムクロリド；ＣＴＣ、（５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリド）；ＤＭＤＰＴ、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニル］臭化テトラゾリウム、１−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム；ＤＳＮＢＴ、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウムクロリド；（１Ｈ）−テトラゾール；ＩＤＮＴＴ、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド；ＩＮＴ、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットクロリド、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド；ＩｎｐＴ、２−（ｐ−ヨードフェニル）−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド；ｍＮＢＴ、ｍ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ｍＮＮＴ、ｍ−ニトロネオテトラゾリウムクロリド；ＭＮＳＴＣ、２，２−ビス（２−メトキシル−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド；ＭＴＳ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−  −２Ｈ−テトラゾリウム塩；ＭＴＴ、臭化テトラゾリウム、チアゾリルブルー臭化テトラゾリウム、（３−＞４，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム）；ＮＢＭＴ、ニトロブルーモノテトラゾリウムクロリド；ＮＢＴ、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（２，２’−ジ−ニトロフェニル−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド）；ＮＴ、ネオテトラゾリウムクロリド（２，２’，５，５’−テトラフェニル−３，３’（ｐ−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド；ＮＴＶ、ニトロテトラゾリウムバイオレット；チアゾリルブルー；ＴＢ、テトラゾリウムブルークロリド（３，３’−＞３，３’−ジメトキシ（１，１，−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）ジクロリド）；ＮＢＴ、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ｏＴＴＲ、ｏ−トリルテトラゾリウムレッド；ＰＣＴＭＢ、ナトリウム３’−［１−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼン−スルホン酸水和物；ＰＮＢＴ、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ＰＴＢ、ピペロニルテトラゾリウムブルー；ｐＴＴＲ、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド；ＴＣ−ＮＢＴ、チオカルバモイルニトロブルーテトラゾリウムクロリド（２，２’−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５’−ジ−ｐ−チオカルバモイルフェニル−３，３’［３，３’−ジメトキシ−４−  ，４’−ビフェニレン］−ジテトラゾリウムクロリド；ＴＮＢＴ、テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ＴＰＴＴ、１，３，５−トリフェニルテトラゾリウム；ＴＲ、ＴＴＣ、ＴＰＴ、テトラゾリウムレッド（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド）；ＴＶ、テトラゾリウムバイオレット、バイオレットテトラゾリウム、２，３，５−トリフェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−テトラゾリウムクロリド、２，５−ジフェニル−３−［１−ナフチル］−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド；ＶＴＢ、ベラトリルテトラゾリウムブルー；ＷＳＴ−１：４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリウム］−１，３−二硫酸ベンゼン；ＸＴＴ、２，２−ビス（２−メトキシル−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド、及び当分野で知られているであろう他の着色剤。
【００２６】
発現した色を、本発明の診断検査キットに付属させることができるカラーチャートと比較することによって、検査サンプルに存在するＤ−乳酸のレベルをｍｇ／ｍＬの単位で測定することができる。検査サンプルの色が２つのカラーチップの中間に位置する場合には、検査サンプルのＤ−乳酸レベルの中間値を選択することができる。
【００２７】
上記したように、乳酸オキシダーゼはまた、検査サンプル中のＤ−乳酸のレベルを定量的に測定するために酸素の存在下でＤ−乳酸をピルビン酸及び過酸化水素に転換する反応を触媒することができる。
【００２８】
そのような目的のために、当分野で既知であるような様々な乳酸オキシダーゼを利用することができる。Ｄ−乳酸をピルビン酸及び過酸化水素に転換することができる１つのそのような乳酸オキシダーゼは、ストレプトコッカス・フェカリスＡＴＣＣ１２７５５によって産出される。
【００２９】
未知の量のＤ−乳酸を含む検査サンプルを乳酸オキシダーゼを用いてアッセイを行うと、検査サンプル中のＤ−乳酸の量に比例して過酸化水素が産出される。任意の既知の方法によって過酸化水素を検出することができ、未知の量のＤ−乳酸を測定することができる。
【００３０】
アッセイにおいて過酸化水素を検出及び／または定量化する既知の方法では、通常、過酸化活性を有する物質、例えば、ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ様物質と、過酸化水素及び過酸化物質の存在下で検出可能な変化（通常は目に見える変化）を起こす材料とを含む組成物が用いられる。過酸化水素の存在下で、ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ様物質と、色の変化を引き起こす相溶性物質（酸化還元色素など）とを組み合わせることにより、過酸化水素の濃度と、それによってＤ−乳酸の濃度とに比例し得る強度を有する色が作られる。発現した色を、本発明の診断検査キットに付属させることができるカラーチャートと比較することによって、検査サンプルのＤ−乳酸レベルをｍｇ／ｍＬの単位で測定することができる。
【００３１】
過酸化水素とともに用いることができる物質が記載されている代表的な特許を挙げると、米国特許第２，９１２，３０９号明細書（特許文献１）、米国特許第２，９８１，６０６号明細書（特許文献２）、米国特許第３，３４９，００６号明細書（特許文献３）、米国特許第３，０９２，４６５号明細書（特許文献４）、米国特許第３，５５８，４３５号明細書（特許文献５）、米国特許第３，５９５，７５５号明細書（特許文献６）、米国特許第３，６２７，６９７号明細書（特許文献７）、米国特許第３，６２７，６９８号明細書（特許文献８）、米国特許第３，６３０，８４７号明細書（特許文献９）、米国特許第３，６５４，１７９号明細書（特許文献１０）、米国特許第３，６５４，１８０号明細書（特許文献１１）及び米国特許第３，８５３，４７０号明細書（特許文献１２）があり、これらは引用を以て本明細書の一部となす。先行技術で既に示唆されているペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ様物質の様々な発色物質の例として、とりわけ、必要に応じて発色剤を有する以下の物質が挙げられる。
（１）モノアミン、例えば、アニリン及びその誘導体であるオルト−トルイジン、パラ−トルイジン、及び同類のもの；
（２）ジアミン、例えば、オルト−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−パラ−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジエチルフェニレンジアミン、ベンジジン（青色または茶色を呈する）、ジアニシジン（緑色または茶色に変わる）、及び同類のもの；
（３）フェノール、例えば、フェノール（黄色を呈する）、チモール、オルト−、メタ−及びパラ−クレゾール（それぞれ、黄緑色、ピンク色、乳白色の懸濁液を生成する）、α−ナフトール（マゼンタ色を呈する）、β−ナフトール（白い沈殿物を生成する）、及び同類のもの；
（４）ポリフェノール、例えば、カテコール、グアヤコール（オレンジ色を呈色する）、オルシノール、ピロガロール（赤みがかった色または黄色を呈する）、ｐ，ｐ−ジヒドロキシジフェニル及びフロログルシノール；
（５）芳香族酸、例えば、サリチル酸、プロトカテク酸及び没食子酸；
（６）ロイコ色素、例えば、ロイコマラカイトグリーン（マラカイトグリーンを生成するため）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及びロイコフェノールフタレイン（アルカリ性媒体内で用いられることが望ましい）；
（７）有色色素、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール；
（８）種々の生物学的物質、例えば、エピネフリン、フラボン、チロシン、ジヒドロキシフェニルアラニン（赤みがかったオレンジ色を呈する）及びトリプトファン；
（９）他の物質、例えば、モリブデン酸アンモニウム、グアヤク脂、グアヤコン酸（guaiaconic acid）、カリウム、デンプン、ヨウ化カリウム、ナトリウム（例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩など）及び他の水溶性ヨウ化物；及びビリルビン（緑色がかった色を呈する）；並びに
（１０）２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）及び３，３’−ジアミノベンジジンなどの特定の色素。
【００３２】
ペルオキシダーゼは、過酸化水素が別の物質を酸化する反応を触媒することになる酵素である。ペルオキシダーゼは、概して、鉄ポルフィリンを含む複合タンパク質である。ペルオキシダーゼは、セイヨウワサビ、ジャガイモ、イチジクの木の樹液及びカブ中に存在し（植物ペルオキシダーゼ）、乳汁中に存在し（ラクトペルオキシダーゼ）、白血球中に存在し（ベルドペルオキシダーゼ）、微生物中にも存在し、発酵によって産出され得る。或る種の合成ペルオキシダーゼも、過酸化水素検出システムで用いるのに適している。同様に、ヘミン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモクロモゲン、アルカリ性ヘマチン、ヘミン誘導体及び特定の他の化合物であって過酸化活性またはペルオキシダーゼ様活性すなわち過酸化水素及び他の過酸化物によって別の物質の酸化を触媒する能力を示す化合物などの物質もまた、適している。
【００３３】
酵素ではないが過酸化活性を示す他の物質は、シリカゲルに吸収された第二クロム塩（硫酸クロムカリウムなど）、スルホシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン化鉄、及び同類のものである。
【００３４】
良好な膣の健康状態を示すバイオマーカに再び注意を向けると、本発明に従って別のバイオマーカであると考えられるのは過酸化水素である。乳酸杆菌は、乳酸、バクテリオシン及び過酸化水素などの膣内における殺菌化合物の産出に関与している。後者は、膣内における病原体の異常増殖の防止において特に重要な役割を果たすと考えられている。乳酸菌は、酸素を過酸化水素に転換するフラビンタンパク質を利用する。過酸化水素は、細菌、菌類、ウイルス及び哺乳類細胞を抑制することができるが、その理由は、多くの細菌は、過酸化水素を分解して過酸化水素による酸化から自身を保護するカタラーゼと呼ばれる酵素を欠いているからである。ＨＩＶ−１、ガードネレラ・バギナリス、バクテロイデス種（Bacterioides sp.）、淋菌及びカンジダ・アルビカンスを死滅させることを示すインビトロ研究からも明らかなように、過酸化水素はまた、単独で、または膣分泌物に存在するハロゲン化物及びペルオキシダーゼと組み合わせて、有毒な特性を示す。
【００３５】
細菌性腟症の女性は、膣内の過酸化物濃度が大幅に低下していると考えられる。従って、過酸化水素のレベルを同様に健康状態の指標として用いることもできる。さらに、膣内にモビルンカス種（Mobiliuncus species）及びＧ．バギナリスが存在することは、低濃度の過酸化物を産出する乳酸菌種と相まって、細菌性腟症を患う妊娠女性の間で早産に結び付けられてきた。検査サンプル１リットル当たり約１μＭを超える量の過酸化水素が膣内に存在していれば健康な状態を示していると判定されてきた。例えば、特定の実施形態では、１リットル当たり約５μＭを超える量の過酸化水素が膣内に存在していれば健康な状態を示している。特定の実施形態では、１リットル当たり約１０μＭを超える量の過酸化水素が膣内に存在していれば健康な状態を示しており、さらに他の実施形態では、１リットル当たり約１５μＭ、１リットル当たり２０μＭ、１リットル当たり５０μＭまたは１リットル当たり１００μＭを超える量の過酸化水素が膣内に存在していれば健康な状態を示している。
【００３６】
アッセイにおいて過酸化水素を検出及び／または定量化する既知の方法については、乳酸オキシダーゼを用いてＤ−乳酸のアッセイを行うときに検査サンプル中のＤ−乳酸の量に比例して過酸化水素が産出されることとの関連で上記した。検査サンプルに存在する過酸化水素を検出及び／または定量化するための他の適切な方法を利用することもできる。
【００３７】
例えば、本発明の診断キットは、過酸化水素の存在下で検出可能な色変化を起こすことができるクロモゲンを用いることができる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、クロモゲンの酸化により、吸収極大値がスペクトルの赤端側にずれる（「深色シフト」）かまたはスペクトルの青端側にずれる（「浅色シフト」）かのいずれかが起きると考えられている。この吸収のシフトは、目視または器具を用いてのいずれかで検出可能である色差を与え、それによって検査サンプル内に過酸化水素が存在することを示す。例えば、検査サンプルに接触させる前に、クロモゲンは、無色であってもよいし、特定の色を有していてもよい。しかし、クロモゲンは、検査サンプルに接触させて過酸化水素と反応させた後、最初の色と異なる色を呈する。それゆえ、この色変化を検査サンプル中の過酸化水素の存在と容易に関連付けることができる。
【００３８】
クロモゲンは、酸化の際に検出可能な色の変化を呈することができるロイコ塩基またはその誘導体であってよい。例えば、アリールメタンロイコ塩基（例えばジアリールメタン及びトリアリルメタン）は、本発明において用いるのに特に適切な、酸化可能なクロモゲンである。例えば、トリアリルメタンロイコ塩基は、以下の一般構造を有する。
【化１】
2014501502.tif 000003
ここで、Ｒ、Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、置換または非置換アリール基、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基などから選択される。アリール基は、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキル基などの官能基及び／または他の既知の官能基で置換され得る。そのようなトリアリルメタンロイコ塩基の例には、ロイコマラカイトグリーン、パラローズアニリン塩基、クリスタルバイオレットラクトン、クリスタルバイオレットロイコ、クリスタルバイオレット、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット２、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー、Ｃ．Ｉ．ビクトリアブルー、Ｎ−ベンゾイルロイコメチレンなどが含まれる。同様に適切なジアリールメタンロイコ塩基は、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロール（「ミヒラーハイドロール」としても知られている）、ミヒラーハイドロール・ロイコベンゾトリアゾール（leucobenzotriazole）、ミヒラーハイドロール・ロイコモルホリン（leucomorpholine）、ミヒラーハイドロール・ロイコベンゼンスルホンアミド（leucobenzenesulfonamide）などを含み得る。アリールメタンロイコ塩基に加えて、過酸化水素の存在下で検出可能な色変化を呈し得る他のクロモゲンが米国特許第４，０８９，７４７号明細書（特許文献１３）に記載されており、該文献は、あらゆる目的のために、全文を引用することを以て本明細書の一部となす。
【００３９】
１つの特定の実施形態では、クロモゲンは、通常は無色でありかつ以下の構造を有するロイコマラカイトグリーン（またはその類似体）である。
【化２】
2014501502.tif 000004
【００４０】
過酸化水素により酸化させると、ロイコマラカイトグリーンは、以下の構造を有するマラカイトグリーンカルビノール（ソルベントグリーン１）を形成する。
【化３】
2014501502.tif 000005
【００４１】
ロイコマラカイトグリーンのカルビノール型も無色である。しかし、酸性条件下では、ロイコマラカイトグリーンカルビノール型の１若しくは複数の遊離アミノ基をプロトン化することにより、色が緑色でありかつ以下の構造を有するマラカイトグリーン（アニリングリーン、ベーシックグリーン４、ダイヤモンドグリーンＢまたはビクトリアグリーンＢとしても知られている）を形成することができる。
【化４】
2014501502.tif 000006
【００４２】
分析物の酵素触媒酸化により放出される過酸化水素は、上記したようなクロモゲンの色変化を直接引き起こし得る。しかし、過酸化水素は或る種のクロモゲンに対して比較的低い酸化電位を有するので、過酸化物が低濃度（例えば検査サンプルの５ｗｔ％未満）で放出されるときに色変化を（例えば可視的に）検出することは、時として困難である。この点に関しては、過酸化水素と反応させかつクロモゲンに対して過酸化水素よりも高い酸化電位を有する中間化合物を生成するために、電子供与体を任意選択で用いることができる。この目的のために、様々な既知の電子供与体を用いることができる。一実施形態では、例えば、水溶液中の過剰なヨウ化物イオン（Ｉ−）は過酸化水素と反応して三ヨウ化物イオン（Ｉ３−）を形成することができ、この三ヨウ化物イオンは、過酸化水素よりも酸化電位がかなり高い。例示的なイオン性ヨウ化物の源には、ヨウ化水素（ＨＩ）及び水溶性ヨウ化物塩、例えば、アルカリ金属ヨウ化物塩（例えば、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、ヨウ化リチウム）、ヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）、ヨウ化カルシウム（ＣａＩ２）など）が含まれる。他の適切な電子供与体には、チオシアン酸イオン源、例えば、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム及び他のチオシアン酸塩などが含まれ得る。鉄（ＩＩ）などの金属を電子供与体として用いることもできる。例えば、フェントン試薬は、鉄（ＩＩ）及び過酸化水素の反応によって生じる溶液である。すなわち、鉄（ＩＩ）は過酸化水素によって鉄（ＩＩＩ）に酸化され、ヒドロキシルラジカル及びヒドロキシルアニオンを形成する。鉄（ＩＩＩ）はその後、同じ過酸化水素によって還元されて鉄（ＩＩ）に戻り、過酸化物ラジカル及びプロトンを形成する。結果として得られた試薬は、クロモゲンに対して強い酸化電位を有する。さらに他の適切な電子供与体は米国特許出願公開第２００２／０１１９１３６号明細書（特許文献１４）に記載されており、該文献は、あらゆる目的のために、全文を引用することを以て本明細書の一部となす。
【００４３】
電子供与体は酸化電位の高い中間化合物を生成し得るが、そうは言っても、そのような化合物の濃度が場合によっては低くなりすぎて、クロモゲンにおいて所望の色変化が生じないこともある。例えば、高濃度の三ヨウ化物イオンは、人間の目で見える色（例えば琥珀色）を生じさせ得る。しかし、その濃度が低下するにつれて、色ははっきり見えなくなる。それゆえ、より強い色を呈色するために、中間化合物（例えば三ヨウ化物イオン）に連結（complex）する発色剤を用いしてもよい。そのような発色剤の１つの特定の例はデンプンであり、自然なデンプン及び修飾された誘導体、例えば、デキストリン化されたデンプン、加水分解されたデンプン、アルキル化されたデンプン、ヒドロキシアルキル化されたデンプン、アセチル化されたデンプンまたは分画されたデンプンが含まれる。デンプンは通常、２つの構造的に特徴のある多糖類、すなわち、α−アミロース及びアミロペクチンから形成されており、これらは共にα−Ｄ−グルコピラノース単位から成っている。デンプンは、任意の起源、例えば、コーンスターチ、小麦デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、サゴデンプン、米デンプン、ワキシーコーンスターチまたは高アミロースコーンスターチであってもよいし、それらから得られるものであってもよい。上記したようなヨウ化物源とともに用いられるとき、デンプンのα−アミロース部分は、三ヨウ化物イオンを捕捉するかまたは三ヨウ化物イオンに結合することにより、水溶性でありかつ強い青色を有する直線状の三ヨウ化物イオン錯体を形成し得る。
【００４４】
電子供与体及び／または発色剤が所望の色変化を促進する度合いは、ある程度それらの濃度に依存する。すなわち、これらの成分のうちの１つ以上の成分の濃度が高すぎると、クロモゲンを圧倒し、酸化反応を抑えかねない。その一方で、濃度が低すぎると、酸化電位が望ましい程度まで上がらない場合がある。この点に関しては、電子供与体（例えばヨウ化物源）を検査サンプル１リットル当たり、約０．０１〜約２０００ミリモル（「ｍＭ」）、いくつかの実施形態では約０．１〜約１０００ｍＭ、いくつかの実施形態では約１〜約１００ｍＭの量で用いることができる。同じように、発色剤（例えばデンプン）を検査サンプルの重量に基づき約０．００１〜約１０ｗｔ％、いくつかの実施形態では約０．０１〜約５ｗｔ％、いくつかの実施形態では約０．１〜約２ｗｔ％の量で用いることもできる。
【００４５】
本発明に従って所望の色変化を達成するために、クロモゲンは、反応媒体のマトリックスを通して実質的に拡散しない（すなわち非拡散的に固定される）ような方法で反応媒体に適用される。これにより、ユーザは、クロモゲンの酸化時に生じる色の変化を容易に検出することが可能になる。例えば、クロモゲンを含む溶液を最初に検出ゾーン内の反応媒体に適用することができる。クロモゲン溶液は、クロマトグラフ媒体を形成するために用いる材料に応じて、水性溶媒及び／または非水溶媒を含み得る。適切な非水溶媒は、グリコール（例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシジグリコール及びジプロピレングリコール）；アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール及びイソプロパノール）；トリグリセリド；酢酸エチル；アセトン；トリアセチン；アセトニトリル、テトラヒドロフラン；キシレン；ホルムアルデヒド（例えば、ジメチルホルムアルデヒド）；などを含み得る。溶液中の溶媒及びクロモゲンの量は通常、所望の感度レベルによって異なり得る。例えば、いくつかの実施形態では、クロモゲンは、溶媒１ｍＬ当たり約０．１〜約１００ｍｇ、いくつかの実施形態では溶媒１ｍＬ当たり約０．５〜約６０ｍｇ、いくつかの実施形態では溶媒１ｍＬ当たり約１〜約４０ｍｇの濃度で存在し得る。
【００４６】
それとは関係なく、溶液を乾燥させて溶媒を除去し、クロモゲンの残留物を媒体上に残すことができる。クロモゲンは通常、流体の検査サンプルと接触するまで検出ゾーン内にとどまることになる。しかし、クロモゲンは水溶性であるので、別な方法で固定されない限り、検査サンプルに溶解して検査サンプルとともに流れることになる。それゆえ、本発明に従って、クロモゲンは、アニオン性化合物、すなわち、１若しくは複数のアニオンを含むかまたは溶液中において１若しくは複数のイオンを形成することができる化合物とともに、検出ゾーン内で実質的に非拡散的に固定される。そのようなアニオン性化合物は、種々の方法でクロモゲンの固定を促進することができる。例えば、アニオン性化合物は、クロマトグラフ媒体の表面上に存在する１若しくは複数の官能基とのイオン結合を形成するようにクロモゲンの変化を推し進める。さらに、或る種のアニオン性化合物（例えば酸）は、ロイコ塩基またはその誘導体（例えばプロトン化したロイコ塩基）と反応させたとき、実質的に不水溶性の沈殿物を形成することができる。当然のことながら、アニオン性化合物は、様々な他の効果ももたらし得る。例えば、少量のクロモゲンは、空気中または他の酸化環境中に置かれたままでいる時間が長すぎると、酸化反応を受け得る。これにより色の変化が生じることがあり、そうなれば、過酸化水素の存在を半定量的または定量的に検出する能力に悪影響を及ぼすであろう。アニオン性化合物は、意図せずしてクロモゲンが酸化することを防止するのに役立ち得る。
【００４７】
アニオン性化合物の選択は、クロモゲンの性質及び濃度を含む様々な因子に左右される。例えば、本発明での使用に適しているアニオン性化合物は、無機酸、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ポリリン酸、ホウ酸、ボロン酸など；種々のカルボン酸、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、マロン酸、コハク酸、サリチル酸、サリチル酸、アジピン酸、マレイン酸、リンゴ酸、オレイン酸、没食子酸、酒石酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、グリコール酸、シュウ酸、プロピオン酸、フタル酸、イソフタル酸、グルタル酸、グルコン酸、乳酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、イタコン酸、トリフルオロ酢酸、バルビツール酸、桂皮酸、安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸などを含む有機酸；スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、スチレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ヒドロキシベンゼンスルホン酸など；ポリマー酸、例えば、ポリ（アクリル）酸またはポリ（メタクリル）酸及びそれらのコーポリマー（例えば、マレイン酸−アクリル酸、スルホン酸−アクリル酸、スチレン酸−アクリル酸の各コーポリマー）、カラギーン酸（carageenic acid）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸など；及び同類のものを含み得る。無水物（例えば無水マレイン酸）及び上記の各酸の塩を用いてもよい。そのような塩は、金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、セシウム塩、亜鉛塩、銅塩、鉄塩、アルミニウム塩、ジルコニウム塩、ランタン塩、イットリウム塩、マグネシウム塩、ストロンチウム塩、セリウム塩）、または上記の酸をアミン（例えば、アンモニア、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピペラジン、２−メチルピペラジン、ポリアリルアミン）と反応させることによって作られる塩の形態であってよい。
【００４８】
クロモゲンが固定される度合いは、アニオン性化合物の濃度に左右され得る。例えば、クロモゲン溶液中のアニオン性化合物の濃度は、１リットル当たり、約０．１〜約２０ミリモル（「ｍＭ」）、いくつかの実施形態では約１〜約１０ｍＭ、いくつかの実施形態では約２〜約８ｍＭであってよい。
【００４９】
本発明に従って、反応を生じさせる媒体を選択的に制御することによって、試薬（例えば、酵素、過酸化水素、電子供与体、発色剤など）間の望ましい反応時間を達成することができる。すなわち、反応媒体はクロマトグラフ的な性質であるので、過酸化水素及び／または他の試薬は一貫性のあるかつ制御可能な方法で横方向に流れることができる。媒体を横方向に流れる間、過酸化水素は、分析のために別々の検出ゾーン内に含まれているクロモゲンを酸化する。制御された流体の流れの性質に起因のおかげで未反応の試薬は反応媒体の端部に移動するので、不都合にも検出ゾーン内でのクロモゲンの観察が妨げられるということはない。
【００５０】
例えば、図１を参照して、本発明において用いることができるアッセイデバイス２０の一実施形態についてここでより詳細に説明する。図のように、アッセイデバイス２０は、任意選択で、支持体２１によって支えられているクロマトグラフ媒体２３を含む。クロマトグラフ媒体２３は、流体が通過できる様々な材料のうちの任意のもの、例えば、流体チャネル、多孔質膜などから作製することができる。例えば、クロマトグラフ媒体２３は、以下の材料から形成された多孔質膜であってく、そのような材料とは、例えば、限定されるものではないが、天然材料、合成材料または合成的に修飾された天然起源の材料、例えば、多糖類（例えば、紙などのセルロース材料及びセルロース誘導体、例えば、酢酸セルロース及びニトロセルロース）；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；無機材料、例えば、不活性化されたアルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ４または、他の無機微細物質であって、ポリマー、例えば、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコーポリマー及び塩化ビニル−酢酸ビニルコーポリマーとともに多孔質ポリマーマトリックス中に均一に分散されたもの；天然起源の布（例えば綿）及び合成の布（例えばナイロンやレーヨン）；多孔質ゲル、例えば、シリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン；ポリマー薄膜、例えば、ポリアクリルアミド；及び同類のものである。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフ媒体は、ニトロセルロース及び／またはポリエーテルスルホン材料から形成される。「ニトロセルロース」なる語は、セルロースの硝酸エステルを指し、ニトロセルロース単独、または硝酸と他の酸との混合エステル、例えば、１〜７個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸であってよいことを理解されたい。
【００５１】
支持体２１は、クロマトグラフ媒体２３を支えることができる任意の材料から形成することができる。必須ではないが、支持体２１は、光が通過しやすいように透明であってもよい。さらに、クロマトグラフ媒体を流れる流体が支持体２１を通して漏れないように、支持体２１は通常、液体不浸透性であることも望ましい。支持体に適した材料の例には、ガラス；ポリマー材料、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル（例えばマイラー（登録商標）フィルム）、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリカーボネート、エポキシド、メタクリレート及びポリメラミン；及び同類のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。当分野で公知であるように、クロマトグラフ媒体２３を支持体２１上に成型することができ、ここで、得られた積層体を所望のサイズ及び形状に打ち抜くことができる。あるいは単純に、クロマトグラフ媒体２３を例えば接着剤により支持体２１に積層してもよい。いくつかの実施形態では、マイラー（登録商標）フィルムにニトロセルロースまたはナイロン多孔質膜が接着されている。多孔質膜をマイラー（登録商標）フィルムに結合するために、感圧接着剤などの接着剤が用いられる。このタイプの積層構造体は、米国マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社（Millipore Corp.）から市販されていると考えられる。適切な積層構造体のさらに他の例が米国特許第５，０７５，０７７号明細書（特許文献１５）に記載されており、該文献は、あらゆる目的のために、全文を引用することを以て本明細書の一部となす。
【００５２】
アッセイデバイス２０は、吸収性材料２８を含むこともできる。吸収性材料２８は通常、クロマトグラフ媒体２３全体を通って移動してきた流体を受容する。当分野で公知であるように、吸収性材料２８は、毛管作用及び媒体２３を通る流体流れの促進を助けることができる。アッセイデバイス２０には、サンプルパッド２２または、クロマトグラフ媒体２３と流体連通する他の材料を含めることもできる。サンプルパッド２２を形成するために用いられ得るいくつかの適切な材料には、ニトロセルロース、セルロース、多孔性ポリエチレンパッド及びガラス繊維ろ紙が含まれるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて、サンプルパッド２２は、拡散的または非拡散的のいずれかで付着させた１若しくは複数のアッセイ前処理試薬を含むことができる。
【００５３】
一般的に言うと、アッセイデバイス２０の機能の仕方は、反応性錯体に選ばれる化学種のタイプに左右され得る。この関連で、アッセイデバイス２０を用いるための種々の技術について、ここでより詳細に説明する。例えば、上記したように、反応性錯体は通常、所定の期間にわたって検査サンプルとともにインキュベートされる。このインキュベーション工程は、検査サンプルをクロマトグラフ媒体２３に適用する前に行ってもよいし、アッセイ手順の一部として組み込んでもよい（すなわち、インキュベーションウェル内などで検査サンプルが適用された後にインキュベーションが起こる）。例えば、インキュベーション混合物は、クロマトグラフ媒体２３の一部に直接適用され、その後、図１において矢印「Ｌ」によって示される方向に媒体２３を通って移動することができる。あるいは、混合物を先ずサンプルパッド２２に適用してもよい。
【００５４】
それとは関係なく、クロマトグラフ媒体２３は第１の検出ゾーン３１を画定し、第１の検出ゾーン３１内でＤ−乳酸の存在及び量を判定することができる。ユーザが検査サンプル内のＤ−乳酸の濃度をより良好に判定することができるように、第１の検出ゾーン３１は、通常、任意の数の個別の検出領域を提供し得る。各領域は、互いに同じかまたは異なる浸透性（receptive）材料を含み得る。例えば、第１の検出ゾーン３１は、２つ以上の個別検出領域（例えば、線、ドットなど）を含み得る。２つ以上の個別検出領域を用いることにより、半定量化を促進するなどの特定の効果をもたらすことができる。これらの検出領域は、クロマトグラフ媒体２３を通過する検査サンプルの流れに対して実質的に垂直な方向に線の形で配置することができる。同様に、いくつかの実施形態では、検出領域は、媒体２３を通過する検査サンプルの流れに対して実質的に平行な方向に線の形で配置することもできる。当然のことながら、第１の検出ゾーン３１の１若しくは複数の個別領域は信号強度とＤ−乳酸の濃度との上記関係を示し得るが、各個別領域がそのような関係を示す必要はない。
【００５５】
第２の検出ゾーン３５内では、過酸化水素の存在及び量を判定することができる。第２の検出ゾーン３５は、過酸化水素を検出する能力を除けば、第１の検出ゾーン３１と類似しているものであってよい。しかし、上記したように、第１の検出ゾーン３１におけるＤ−乳酸の検出は、同様に過酸化水素を生じさせるＤ−乳酸オキシダーゼを利用したアッセイによって達成することができる。そのような実施形態では、それぞれのバイオマーカを正確に計算できるように、これらの検出ゾーンを互いから分離しておくことができる。
【００５６】
上記ゾーン及びバイオマーカのうちの１若しくは複数のものを検査するためにコントロール（対照）として機能することができる第３検出ゾーン６１を、必要に応じてさらに設けることができる。
【００５７】
アッセイ手順の後、定性的に（例えば目視観測）、あるいは半定量的または定量的に（例えば器具を用いて）のいずれかで、第１の検出ゾーン３１及び第２の検出ゾーン３５をそれぞれの信号の存在または強度について分析することができる。使用されるレポータ及びケミクロミック（chemichromic）色素の性質に応じて、第１の検出ゾーン３１に対して第２の検出ゾーン３５と同じ検出技術を用いても異なる検出技術を用いてもよい。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明のデバイスの検出ゾーンは、比較的低濃度の被検出バイオマーカの検出を可能にする感度を持つ。例えば、特定の実施形態では、第１の検出ゾーン３１は、Ｄ−乳酸１リットル当たり少なくとも約１ｍＭを検出することができるような感度を持つように構成されている。さらに他の実施形態では、第１の検出ゾーン３１は、Ｄ−乳酸１リットル当たり少なくとも約５ｍＭ、さらに他の実施形態ではＤ−乳酸１リットル当たり１０ｍＭを検出することができるような感度を持つように構成されている。特定の実施形態では、第１の検出ゾーン３１は、Ｄ−乳酸１リットル当たり少なくとも約１ｍＭないし少なくとも約１００ｍＭを検出することができるような感度を持つように構成されている。
【００５９】
同様に、特定の実施形態では、第２の検出ゾーン３５は、過酸化水素１リットル当たり少なくとも約０．５μＭを検出することができるような感度を持つように構成されている。さらに他の実施形態では、第２の検出ゾーン３５は、過酸化水素１リットル当たり少なくとも約１μＭ、さらに他の実施形態では過酸化水素１リットル当たり５μＭを検出することができるような感度を持つように構成されている。特定の実施形態では、第２の検出ゾーン３５は、過酸化水素１リットル当たり少なくとも約１μＭないし過酸化水素１リットル当たり少なくとも約１００μＭを検出することができるような感度を持つように構成されている。
【００６０】
本発明は、検査サンプル（例えば膣液）内のＤ−乳酸及び／または過酸化水素を正確に検出するための比較的単純で、小型かつコスト効率の高いデバイスを提供する。このように、例えば、良好な膣の健康状態のバイオマーカに関して、膣液をシングルステップ（単一段階）で検査することができる。検査者が即座に、信頼性が高くかつ一貫性のある検査結果をもたらす検査条件下で、検査結果を容易に見ることができるように、検査結果を可視化することができる。検査により膣の健康状態が最善ではないことが示された場合には、検査は、任意選択で、膣の健康状態を向上させるために女性が取り得るステップを提供することができる。その後、上記デバイスは、検査終了時にユニットとして廃棄することができる。そのようなシングルステップ検出技術には、様々な利点がある。例えば、上記したように、膣の健康状態の繰り返し検査は、細菌性腟症を予防するかまたは少なくとも細菌性腟症の発症を女性に警告するのに役立つであろう。
【００６１】
本発明に従って、本明細書に記載の種々のデバイスのうちの１若しくは複数のデバイスを吸収性物品に組み込むことができる。「吸収性物品」なる語は通常、流体を吸収することができる任意の物品を指す。いくつかの吸収性物品の例には、使い捨ての吸収性物品、例えば、生理用ナプキン、パンティライナー、成人用失禁衣類、おむつ、医療包帯及びタンポンであって、膣の健康状態を繰り返し検査することが有益であるような医療用のものなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書では、「吸収性物品」なる句は、全体として、体液を吸収しかつ封じ込める物を指し、より詳細には、体外に排泄される種々の流体を吸収しかつ封じ込めるために皮膚に当てられるかまたは皮膚の近くに置かれる物を指す。「使い捨て」なる語は、本明細書においては、単回使用後に洗濯または別な方法で元の状態に戻されるかあるいは吸収性物品として再使用されることが意図されていない吸収性物品を説明するために使われている。
【００６２】
本発明とともに用いるのに適した生理用タンポンは、通常、膣腔内に容易に挿入され得る或るサイズの一体構造体に圧縮された天然及び合成繊維を含む吸水性のある繊維でできている。適切な繊維には、例えば、綿やレーヨンなどのセルロース系繊維が含まれる。繊維は、綿１００％、レーヨン１００％、綿とレーヨンの混合、または他の材料であってタンポンに使用するのに適していることが分かっているものであってよい。
【００６３】
生理用タンポンは、所要の吸収能力を与えるために十分に大きな材料体を有し得るように、通常、細長い円筒形で製造されるが、様々な形状に作ることができる。タンポンは圧縮されていてもされていなくてもよいが、現在一般的に好まれているのは圧縮されたタイプである。タンポンは、吸収性繊維及び非吸収性繊維の両者を含む様々な混合繊維から製造することができ、適切なカバーや包み紙の有無は問わない。タンポン製造のための適切な方法及び材料は、当業者に公知である。
【００６４】
本明細書に記載の吸収性物品を作るのに適した材料及び工程は、当業者に公知である。通常、吸収性物品は、実質的に液体不浸透性層（例えばアウターカバー）と、液体浸透性層（例えば、身体側ライナー、サージ層など）と、吸収性コアとを含む。
【００６５】
本発明について特定の実施形態に関連して説明してきたが、このような説明を理解すれば、当業者がこれらの実施形態の代替形態、変更形態及び等価形態を容易に考え出すであろうことは理解されよう。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価形態として評価されるものとする。
【図１】
2014501502.tif 000007
【国際調査報告】
2014501502.tif 000008
2014501502.tif 000009