(57)【要約】  カメラを有する携帯デバイスにおける広視野蛍光画像化は、取り外し可能なハウジングで携帯デバイスに機械的に固定した、小型かつ軽量であって安価な光学要素を利用して実現される。ハウジングに収容した電池式発光ダイオード（ＬＥＤ）は、バット・カップリングを利用して側面から関心があるサンプルをポンプし、ポンプ光は微小流体フローセル内に誘導されて試料を均一に励起する。次いで、携帯デバイスの既存のレンズに近接して配置された更なるレンズを用いて、サンプルからの蛍光発光を画像化する。カラーフィルタは、高価な薄膜干渉フィルタを必要とすることなく、蛍光画像化に必要な暗視野背景を作り出すのに十分である。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カメラ要素を有する携帯デバイス用の蛍光撮像素子において：
前記携帯デバイスに固定するよう構成されたハウジングと；
前記ハウジング内に配置された微小流体フローセルと；
前記ハウジング内に配置され、前記微小流体フローセルを側方から照明するよう方向付けられた励起光源と；
前記ハウジング内に配置され、中にフィルタ媒体を保持するよう構成されたフィルタホルダと；
前記ハウジング内に配置されたレンズとを具えており、
前記ハウジングは、前記カメラ要素に近接して前記レンズが位置するように前記携帯デバイスに取り付けられるよう構成されていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光撮像素子がさらに、前記微小流体フローセルを通ってサンプルを送り込むよう構成された流体ポンプを具えていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項３】
請求項１−２の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記フィルタホルダが、前記ハウジング内に、およびその外側へと移動可能であることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項４】
請求項１−３の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記携帯デバイスが、携帯電話を含むことを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項５】
請求項１−４の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記携帯デバイスが、ウェブカムを含むことを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項６】
請求項１−５の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記ハウジングが、前記携帯デバイスに脱着可能に固定するよう構成されていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項７】
請求項１−６の何れかに記載の蛍光撮像素子がさらに、前記フィルタホルダ内に配置されたフィルタを具えていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項８】
請求項１−７の何れかに記載の蛍光撮像素子がさらに、前記励起光源に電力供給するよう構成された電池を具えていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項９】
請求項７に記載の蛍光撮像素子がさらに複数の異なるフィルタを具え、各フィルタは特定の蛍光体に対応していることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項１０】
請求項１−９の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記ハウジングの重さが５０グラム未満であることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項１１】
請求項１−１０の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記ハウジングが、約１００ｃｍ３未満のサイズを有していることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項１２】
請求項１−１１の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記ハウジングが、前記携帯デバイス上に留めるよう構成されていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項１３】
請求項１−１２の何れかに記載の蛍光撮像素子において、前記ハウジングが、前記携帯デバイス上に恒久的に固定するよう構成されていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項１４】
請求項１−１３の何れかに記載のデバイスを使用する方法において：
前記微小流体フローセルを通ってサンプルを流動させるステップであって、前記サンプルは、セルまたは粒子と、前記セルまたは粒子の少なくとも一部に結合するよう構成された蛍光体とを含むステップと；
前記励起光源を用いて前記サンプルを照明するステップと；
前記携帯デバイスのカメラ要素を用いて複数の連続画像フレームを取得するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法がさらに、蛍光放射を放出しながら前記微小流体フローセルを通過するセルまたは粒子の数を集計するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法がさらに、蛍光放射を放出する前記セルまたは粒子の流れを追跡するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法がさらに、前記微小流体フローセルを通過する蛍光標識化した試料による合計の蛍光放射レベルを検出するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
携帯式の蛍光画像化システムにおいて：
カメラを有する携帯デバイスと；
前記携帯デバイスに取り付けるよう構成されたハウジングと；
前記ハウジング内に配置された微小流体フローセルと；
前記ハウジング内に配置され、試料ホルダを側面から照明するよう方向付けられた励起光源と；
前記ハウジング内に配置され、中にフィルタ媒体を保持するよう構成されたフィルタホルダと；
前記ハウジング内に配置されたレンズとを具えており、
前記ハウジングは、前記携帯デバイスのカメラに近接して前記レンズが位置するように前記携帯デバイスに取り付けられるよう構成されていることを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項１８に記載のシステムにおいて、前記携帯デバイスが、携帯電話またはウェブカムを含むことを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１８−１９の何れかに記載のシステムがさらに、前記微小流体フローセルを通ってサンプルを送り込むよう構成されたポンプを具えていることを特徴とするシステム。
【請求項２１】
請求項１８−２０の何れかに記載のシステムにおいて、前記フィルタホルダが、前記ハウジング内に、およびその外側へと移動可能であることを特徴とするシステム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のシステムがさらに、前記フィルタホルダ内に配置された１以上のフィルタを具えていることを特徴とするシステム。
【請求項２３】
請求項１８−２２の何れかに記載のシステムにおいて、前記ハウジングが、前記携帯デバイスを把持するよう構成された１以上の把持要素を具えていることを特徴とするシステム。
【請求項２４】
請求項１８−２３の何れかに記載のシステムがさらに、前記励起光源に電力供給するよう構成された電池を具えていることを特徴とするシステム。
【請求項２５】
請求項１８−２４の何れかに記載のシステムにおいて、前記ハウジングの重さが約２０グラム未満であることを特徴とするシステム。
【請求項２６】
請求項１８−２５の何れかに記載のシステムにおいて、前記ハウジングが、約１００ｃｍ３未満のサイズを有していることを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６１／４２５，６６５号および２０１１年７月２０日出願の米国仮特許出願第６１／５０９，９８５号の権利を主張するものである。優先権は、米国特許法第１１９条に準じて主張される。上記特許出願は、本書において完全に説明されたとして、参照により援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により認められた交付番号第ＯＤ００６４２７号、アメリカ国立科学財団により認められた交付番号第０７５４８８０号および第０９３０５０１号、米国海軍すなわち海軍研究事務所により認められた交付番号第Ｎ０００１４−０９−１−０８５８号の政府支援でなされたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の分野は概して、セルや粒子といった微小構造を画像化するための方法およびデバイスに関するものである。より具体的には、本発明の分野は、静止サンプル内または微小流体環境内を流動するセルまたは粒子を画像化するためのシステムおよび方法に関するものである。
【０００４】
世界人口の約６０％が少なくとも１台の携帯電話を契約しており、その数は２０１５年までに最大９０％までさらに増加すると考えられている。これらの携帯電話の約３分の２が実際には発展途上世界で使用されており、幾つもの世界的な健康問題の対策に影響を与える可能性がある様々な遠隔治療への利用が著しく期待される。ヘルスケアを向上させるために携帯電話に組み込まれた既存または内蔵型のハードウェアおよび／またはソフトウェア構造を使用することは最近の新たなテーマであり、これは既に、電気インピーダンス断層撮影、心電図検査、蛍光顕微鏡検査、およびレンズフリーのオンチップ顕微鏡検査を含む、携帯デバイスによる様々な遠隔治療技術の実施を可能にしている。
【０００５】
これらの技術の中でも、蛍光マーカーはこの１０年間に、例えば、病気の診断、対象セル／細菌の定量化、または生体指標の検出を含む様々なラボオンチップの用途に特異性および反応性をもたらす著しい発展を遂げてきたため、蛍光顕微鏡検査は特に重要である。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ等は近年、全長が１５ｃｍより大きい、比較的大型で分厚い光学機構アタッチメントを使用して、〜０．０２５ｍｍ２の視野（ＦＯＶ）にわたって〜１．２μｍの分解能を達成する携帯電話での蛍光顕微鏡検査を実証した。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  ＤＮ等、「Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈｏｎｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４（７）（２００９）を参照されたい。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ等に記載されたデバイスは、一直線に配置された顕微鏡用対物レンズ、接眼レンズ、発光フィルタおよび励起フィルタを含む従来の光学要素と共にＬＥＤ光源を使用しており、デバイスの全長は長くなってしまう。より小型かつ軽量の遠隔治療インタフェースを使用して、より広いサンプル面積および体積を画像化することができる、高い処理能力のプラットフォームが未だに必要である。さらに、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ等に開示されるような先の取り組みは、静止体積の画像を生成するものである。流動ベースの蛍光サイメトリの概念を小さい携帯デバイスに転換する必要がある。小型の画像化フローサイメトリデバイスは、設備が限られた状況における微量分析の可能性を、例えば、全血分析の実施または飲料水中の水媒介性寄生虫のスクリーニングといった利用にまで拡げることができる。
【発明の概要】
【０００６】
広視野を蛍光画像化する機能を有する携帯デバイスが開示されている。この携帯デバイスは、好適な実施形態では、画像化性能を有する従来の携帯電話、ウェブカム、または携帯情報端末（ＰＤＡ）などを含む。蛍光画像化システムは小型かつ軽量であって、既存の携帯デバイスに機械的に取り付けられる（または、場合によって取り外される）比較的安価な光学要素を含む。
【０００７】
例えば、照明光源、試料ホルダ、電源、フィルタ、および光学要素を有する独立したハウジングが提供される。一実施形態では、電池式発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いて、バット・カップリングを利用して側方位置から関心があるサンプルにポンプし、ポンプ光は試料を均一に励起するようにサンプルキュベット内に誘導される。次いで、携帯デバイス（例えば、携帯電話）に含まれる既存のカメラレンズの前方に配置された、ハウジング内に収容される更なるレンズを使用して、サンプルからの蛍光発光を画像化する。検出路に対してほぼ垂直方向に伝播する誘導波を通って励起が生じるため、安価なプラスチックのカラーフィルタは、高価な薄膜干渉フィルタを必要とすることなく蛍光画像化に必要な暗視野背景を作り出すには十分であった。
【０００８】
このプラットフォームの性能を、〜８１ｍｍ２の視野（ＦＯＶ）にわたって〜２０μｍの生解像度で二色（すなわち、赤と緑）の様々な蛍光微小物体を画像化することによって確認した。圧縮サンプリング理論を利用してキャプチャした画像を更にデジタル処理することにより、画像化するＦＯＶを犠牲にすることなく約２倍の分解能を実現する。広いＦＯＶを画像化する機能は、血液、尿、唾液または水といった大容量（例えば、０．１ｍＬを超える）のサンプルを試験するためには非常に重要となる。この点について、このプラットフォームはさらに、全血サンプルから標識化した白血球セル、さらには、ランブル鞭毛虫の嚢子といった水媒介性の病原体寄生原虫の蛍光画像化を実証することも試験している。
【０００９】
たった〜２８グラム（〜１オンス）の重さで、小型かつ費用効果がある蛍光画像化プラットフォームはモジュール式であって、画像化機能を有する様々に異なる携帯デバイスに固定する（および、必要なときに取り外す）ことができる。例えば、このプラットフォームは携帯電話に脱着可能に固定することができ、特に設備が限られた状況では非常に有用であり、世界的な健康利用のために発展した様々なラボオンチップ検査の広視野画像化および定量化に重要な器具を提供するものである。例えば、このプラットフォームは、ＣＤ４細胞数またはウイルス負荷測定のためにＨＩＶ＋の患者を費用効果がある方法でモニタリングするために使用することができる。
【００１０】
一実施形態では、カメラ要素を有する携帯デバイス用の蛍光撮像装置は、携帯デバイスに固定するよう構成されたハウジングと；ハウジング内に配置され、試料を保持するよう構成された試料ホルダと；ハウジング内に配置され、試料ホルダを側方から照明するように方向付けられた励起光源と；ハウジング内に配置され、その中にフィルタ媒体を保持するよう構成されたフィルタホルダと；ハウジング内に配置されたレンズとを具えており、ハウジングは、カメラ要素に近接してレンズが位置するように携帯デバイスに取り付けるよう構成されている。
【００１１】
他の実施形態では、蛍光画像化デバイスの使用方法は、試料を試料ホルダ内に入れるステップと；励起光源を用いて試料を照明するステップと；携帯デバイスのカメラ要素を用いて１以上の画像を取得するステップと、を含む。
【００１２】
他の実施形態では、カメラ要素を有する携帯デバイス用の蛍光撮像装置は、携帯デバイスに固定するよう構成されたハウジングと；ハウジング内に配置された試料ホルダと；ハウジング内に配置され、試料ホルダを側方から照明するよう方向付けられた励起光源と；ハウジング内に配置され、その中にフィルタ媒体を保持するよう構成されたフィルタホルダと；ハウジング内に配置されたレンズとを具えており、ハウジングは、カメラ要素に近接してレンズが位置するよう携帯デバイスに取り付けるよう構成されている。一態様では、試料ホルダは微小流体フローセルを有しうる。このハウジングは携帯デバイスに恒久的に取り付けられてもよく、代替的に、ハウジングは携帯デバイスから取り外し可能であってもよい。
【００１３】
他の実施形態では、蛍光撮像装置の使用方法は、微小流体フローセルを通ってサンプルを流動させるステップであって、サンプルはセルまたは粒子とセルまたは粒子の少なくとも幾つかに結合するよう構成された蛍光体とを有しているステップと；励起光源を用いて試料を照明するステップと；携帯デバイスのカメラ要素を用いて複数の連続画像フレームを取得するステップとを含む。複数の連続画像フレームはムービークリップを含みうる。ムービークリップで画像化したセルまたは粒子は、追跡および／または集計することができる。様々な病態や感染症の診断の代用として利用されうる幾つかの実施形態では、セルの総数をセル濃度に変換することもできる。例として、白血病、ＨＩＶ、および骨髄欠乏症を含む。さらに、ムービー内にキャプチャされたセルまたは粒子は標識化することができる。
【００１４】
カメラ機能を有する携帯デバイス（例えば、携帯電話）上で光学流体蛍光顕微鏡とフローサイトメトリを一体化させることは、比較的安価であって小型かつ軽量なモジュール式デバイスを用いて実証されている。微小流体フローセルは画像化容量内にサンプルを保持するように機能し、さらに多層の光学流体導波路としても機能して、複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いて微小流体フローセルの側面からバット・カップリングされた励起光を効果的に誘導する。この性能は、全血サンプル中の白血球セル（ＷＢＣ）の濃度を測定することによって検査されており、他の市販の血液分析器との優れた一致をもたらしている。画像化性能は、約２μｍの蛍光分解能を実証することも分かっている。光学流体画像化によるフローサイトメータを可能にする携帯デバイスは特に、様々なセルの集計を行うために体液を迅速かつ高精度に画像化する、あるいは設備が限られた場所で水質をスクリーニングするのに有用となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、一実施形態による、カメラ要素と蛍光撮像素子の取付デバイスとを有する携帯デバイスの分解図を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、物体の画像を含む画面を示す携帯デバイスの画像である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、一実施形態による蛍光撮像素子の分解図を示している。
【図１Ｄ】図１Ｄは、携帯電話に固定された蛍光撮像素子の取り付け図を示している。
【図２】図２は、未加工画像を高分解能の画像に圧縮復号することを伴う動作のフローチャートを示している。
【図３Ａ】図３Ａは、他の実施形態による蛍光撮像素子の斜視図を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの蛍光撮像素子の他の斜視図を示している。
【図４】図４は、携帯電話に固定された他の実施形態による蛍光撮像素子の図を示している。
【図５】図５は、携帯電話に固定された蛍光撮像素子から蛍光ビーズ（直径１０μｍ；励起／発光：５８０ｎｍ／６０５ｎｍ）を撮影した画像を示している。画像の中央視野は〜８１ｍｍ２である。さらに、メイン画像の下方に拡大フレームＡ−Ｊを示している。
【図６Ａ】図６Ａは、携帯電話ベースの蛍光画像化デバイスを使用して緑と赤の蛍光ビーズを撮影した画像を示している。図６Ａの画像Ａ−１、Ｂ−１、およびＣ−１は緑のビーズであって、図６Ａの画像Ｄ−１、Ｅ−１、およびＦ−１は赤のビーズである。図６Ａの画像は全て〜２０μｍの分解能を実証している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、圧縮復号後の図６Ａの画像を示している。図６Ｂの画像Ｃ−２およびＦ−２に見られるように、分解能は〜１０μｍまで向上し、密接して位置する粒子を分解することができる。
【図６Ｃ】図６Ｃは、従来の蛍光顕微鏡を用いて取得した同一サンプルの１０倍顕微鏡対物レンズの画像（ＮＡ＝０．２５）を示している。サンプルは溶液内に懸濁されているため、顕微鏡の比較画像では相対的な方向が僅かにシフトしていることに留意されたい。
【図７Ａ】図７Ａは、携帯電話ベースの蛍光画像化デバイスを使用して撮影した、蛍光標識化した白血球セルの〜８１ｍｍ２のＦＯＶ画像を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａから取り出した拡大フレームＡ、Ｂ、およびＣを示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、圧縮復号後の図７Ｂの画像を示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、従来の蛍光顕微鏡を用いて取得した同一の白血球セルサンプルの１０倍顕微鏡対物レンズの画像（ＮＡ＝０．２５）を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、携帯電話ベースの蛍光画像化デバイスを用いて撮影した、蛍光標識化したランブル鞭毛虫の嚢子の画像を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、従来の蛍光顕微鏡を用いて取得した同一のランブル鞭毛虫の嚢子サンプルの１０倍顕微鏡対物レンズの画像（ＮＡ＝０．２５）を示している。
【図９】図９は、平行な幾つかの毛細管内に入れて、携帯電話ベースの蛍光画像化デバイスを用いて画像化した１０μｍの蛍光ビーズを示している。サンプル溶液が入ると各毛細管はポンプ光子の導波路として機能し、これによりサンプルを効果的に励起することができる。上コーナーの挿入図は、この作業に使用される毛細管の１つ（内径１００μｍ；外径１７０μｍ）を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、携帯電話ベースの蛍光画像化デバイス、さらに低濃度サンプル（５０００セルμＬ−１）用の従来のシスメックスＫＸ−２１Ｎデバイスを用いて取得した自動ＷＢＣ集計結果を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、携帯電話ベースの蛍光画像化デバイス、さらに高濃度サンプル（７８００セルμＬ−１）用の従来のシスメックスＫＸ−２１Ｎデバイスを用いて取得した自動ＷＢＣ集計結果を示している。
【図１１】図１１は、１２人の異なる患者について、市販の血液分析器（シスメックスＫＸ−２１Ｎ）の結果に対する携帯電話ベースの画像化フローサイトメータを用いて取得したＷＢＣ濃度の測定結果の比較を表すグラフを示している。４０００μＬ−１乃至８０００μＬ−１の範囲にわたってＷＢＣが集中した実験データ（ｎ＝１２−線）の線形回帰は、〜０．９５の相関係数で２つのモダリティが十分に一致することを実証している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、数セットのビーズに対する携帯電話ベースの光学流体蛍光顕微鏡の画像化性能を示している。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、比較するために、従来のベンチトップ蛍光顕微鏡により、４０倍（ＮＡ＝０．６）顕微鏡対物レンズを用いて画像化した同一のビーズを示している。
【図１３】図１３は、携帯電話ベースの光学流体蛍光顕微鏡および４０倍対物レンズを使用するベンチトップ蛍光顕微鏡を用いて取得した、４μｍ、２μｍおよび１μｍの蛍光ビーズの横断図面を示している。これらの横断図面は挿入ビーズ画像から取得した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１Ａは、カメラ要素１２を有する携帯デバイス１０を示している。この携帯デバイス１０は、カメラ機能を有する携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、ウェブカメラ（例えば、ウェブカム）などを含みうる。図１Ａに見られるカメラ要素１２は概して、画像センサ１５（想像線に示す）やカメラ機能を有する携帯デバイス内で通常見られる他の機構といった内部のカメラ構成要素を伴うカメラレンズ１３を含んでいる。
【００１７】
さらに図１Ａを参照すると、携帯デバイス１０の画像化機能と共に動作する蛍光撮像素子１４が提供されている。この蛍光撮像素子１４は、全ての蛍光画像化要素を収容するハウジング１６を有している。ハウジング１６は、耐久性があって、更に軽量の材料から作ることができる。例として、ポリマ材料、プラスチック材料、金属または金属合金さえも含む。ハウジング１６は装着部１８を有し、当該装着部１８は把持するために使用する複数の把持要素２０を有しているため、ハウジング１６を携帯デバイス１０に固定することができる。このようにして、ハウジング１６を携帯デバイス１０上に留め付けることができ、必要な時にそこから取り外すことができる。把持要素２０は、携帯デバイス１０の側部周囲を部分的に覆うスナップフィットのフランジ等を含みうる。好適には、蛍光撮像素子１４の光路と携帯デバイス１０の光路が整列（例えば、蛍光撮像素子１４のレンズと携帯デバイス１０のレンズ１３が実質的に整列）するようハウジング１６を摺動させる、あるいは移動させることができるように、把持要素２０が作られている。
【００１８】
把持要素２０は、特定の携帯デバイス１０に対して特注することができる。例えば、把持要素２０の構造、位置、および寸法は、携帯電話の特定の物理的寸法と一致するように設計することができる。例えば、蛍光撮像素子１４のハウジング１６は装着部１８、ひいては把持要素２０と共に設計することができ、これらは特定の種類の電話（例えば、ＩＰＨＯＮＥまたはＳＡＭＳＵＮＧの携帯電話）に固有のエッジや厚みに係合する寸法に構成される。代替的に、装着部１８および把持要素２０は、殆どのモデルに取り付けることができ、携帯デバイス１０を作り出す汎用構造に設計してもよい。例えば、把持要素２０は、ハウジング１６を異なる寸法の携帯デバイスに固定することができる程度の柔軟性を有しうる。装着部１８および把持要素２０は、ハウジング１６を携帯デバイス１０に繰り返し取り付けたり、取り外すように構成されている。よって、蛍光撮像素子１４は、必要なときに携帯デバイス１０に装着し、使用後に携帯デバイス１０から簡単に取り外すことができる。代替的に、幾つかの実施形態では、蛍光撮像素子１４は、携帯デバイス１０に恒久的に取り付けることができる、あるいは固定することもできる。
【００１９】
図１Ｂは、画面２２を有する携帯デバイス１０の画面を示している。この画面２２は、蛍光撮像素子１４を用いて撮影した蛍光画像を表示するために使用される。図１Ｂは、概ね暗い背景に対する一連の明るいドット２３を示している。これらの明るいドット２３は、蛍光撮像素子１４および携帯デバイス１０によって画像化された蛍光セルまたは粒子を表している。殆どの携帯デバイス１０に共通の画面２２を使用して、携帯デバイス１０と相互作用させることができる。
【００２０】
図１Ｃは、蛍光撮像素子１４の分解図を示している。ハウジング１６の内側には、蛍光ポンプ光源として使用される励起光源２４が配置されている。この励起光源２４は１以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）を含みうる。励起光源２４は、さらにハウジング１６内に配置された１以上の電池２６によって電源供給される（ハウジング１６の一部が切り取られて図示されている）。以下に説明するように、励起光源２４は蛍光励起光を発するよう方向付けられており、励起光はカメラレンズ１３と中にサンプルを含む試料ホルダ２８の間の光路に対してほぼ垂直となる。図１Ｃは、既定の向き、さらに反転した向きにある試料ホルダ２８を示している。試料ホルダ２８はハウジング１６内に載るよう構成され、これにより励起光源２４は試料ホルダ２８の側面にバット・カップリングされる。このようにして、試料ホルダ２８のエッジまたは側面は、励起光源２４から放出されたポンプ光の導波路として機能する。試料ホルダ２８は、トレイ、隆起、プラットフォームなどの形状をなしうる支持部３０上でハウジング１６内に固定することができる。試料ホルダ２８は、サンプルを保持するために使用される幾つもの構造であってもよい。これらは、光学的に透明なスライド（例えば、ガラスまたはプラスチックのスライド）、キュベット、多層導波路、または毛細管のアレイさえも含む。
【００２１】
好適な一態様では、試料ホルダ２８は、３層の屈折率構造を含む多層導波路である。例えば、サンプル３２を、両側が空気で囲まれた対向するガラス基板３４、３６の間に挟むことができる（すなわち、ガラス−サンプル−ガラス）。この構造は、空気とガラスの界面（すなわち、上面と底面）に大きい屈折率差を有する、複数モードのスラブ型導波路として機能する。これにより、ポンプ光子は、励起光源２４からの側方照明をバット・カップリングした導波路内に確かに誘導される。ガラス−サンプル溶液の界面における屈折率差は空気−ガラスの界面と比較して小さいため、幾つかのポンプ光子をサンプル溶液内に漏出させて、標識化したセル、またはサンプル内に懸濁した病原体などを効率的に励起することができる。ハウジング１６内に挿入されたときの試料ホルダ２８の側面から励起光源２４までは、約数マイクロメートルから数ミリメートルの狭い隙間で隔てられている。
【００２２】
図１Ｃを更に参照すると、移動可能なフィルタホルダ３８がハウジング１６内に配置される。このフィルタホルダ３８は光が通過する開口部４０を有しているが、その上にフィルタ４２を保持することができる。フィルタホルダ３８はハウジング１６内にスライドインしたり、スライドアウトすることができ、これにより、異なるフィルタ４２をフィルタホルダ３８内に挿入することができる。幾つかの実施形態では、フィルタホルダ３８を定位置に固定することができる。フィルタ４２は、染料または他の色要素を含む有色のプラスチック材料から作られる。異なるフィルタ４２は、異なる波長の光を透過させることができる。ＬＥＤとフィルタ４２の双方は、異なる励起／発光色に対して容易に変更することができ、したがって、プラットフォームは広い範囲の蛍光体と互換性がある。フィルタ４２は、画像内の明るい蛍光ドット２３を検出するために必要な暗視野背景を作るのにのに十分な比較的安価なプラスチック材料（Ｋｏｄａｋラッテンカラーフィルタ１２）から作られる。
【００２３】
サンプルの励起モードは蛍光撮像素子１４の検出路に対して垂直に伝播し、拡散は無視するため、検出される光子は励起サンプルからの蛍光発光のみとなる。（ガラスサンプルの表面に起こりうる引っかき傷、またはセル／粒子からの拡散などによる）拡散したポンプ光子の検出を排除するため、この安価なプラスチックのカラーフィルタ４２を用いて暗視野状態を向上させる。
【００２４】
ハウジング１６はさらに、試料ホルダ２８と携帯デバイス１０のカメラ要素１２の間に作られる光路の範囲内に配置されるレンズ４４を有する。ハウジング１６が携帯デバイス１０に装着されたとき、レンズ４４は携帯デバイス１０のレンズ１３に近接して配置される。このレンズ４４は縮小レンズとして機能する。サンプル面と画像センサ面の間に縮小を作り出すため、レンズ４４の焦点距離は携帯デバイス１０のレンズ１３の焦点距離より長くてもよい。縮小率はレンズ４４の焦点距離を変化させることによって変更することができ、レンズ１３とレンズ４４の間の物理的距離に依存しない。
【００２５】
図１Ｄは、固定された蛍光撮像素子１４を有する携帯デバイス１０を示している。試料ホルダ２８がハウジング１６に部分的に挿入され、それにより、この実施形態では３つのＬＥＤを含む励起光源２４が露出して示されている。重要なことに、精密な位置調整またはチューニングを必要とすることなく、蛍光撮像素子１４を携帯デバイス１０に繰り返し取り付けたり、取り外すことができる。幾つかの実施形態では、携帯デバイス１０は、蛍光撮像素子１４を携帯デバイス１０のどこに固定すべきかを示す移動止め、隆起または表示を有しうる。しかしながら、他の実施形態では、ユーザは単に、携帯デバイス１０に収容されたレンズ１３に実質的に近接してレンズ４４を配置する位置で、蛍光撮像素子１４を携帯デバイス１０上に配置する。蛍光撮像素子１４は小さくて小型である。例えば、蛍光撮像素子１４は約２０グラム未満（または、他の実施形態では３０グラム未満）の重さであってもよく、約１００ｃｍ３未満または他の実施形態では５０ｃｍ３未満のサイズを有する。
【００２６】
画像化プラットフォームを使用するために、サンプルを試料ホルダ２８内に挿入し、次いで試料ホルダ２８をハウジング１６内に挿入する。サンプルは、対象に結合する蛍光体と共に、興味があるセル、病原体、粒子を含む。この対象は、蛍光体に結合する分子部分を有する特定の細胞表現型、病原体、あるいは有生物か無生物を含みうる。次いで、蛍光撮像素子１４のハウジング１６を携帯デバイス１０に固定する（当然のことながら、最初にハウジング１６を携帯デバイス１０に固定し、次いで試料ホルダ２８をハウジング１６に続けて挿入する）。次に、試料ホルダ２８を側方から照明するように、励起光源２４を作動する。励起光子が導波路として機能する試料ホルダ２８の側面に入り、励起光子の一部がサンプル溶液内に漏出して、蛍光体と結合した物体を効果的に励起する。次いで、従来の携帯デバイス１０のユーザインタフェースを用いて、携帯デバイス１０をカメラモードに設置する。携帯デバイス１０のカメラ要素１２を使用して画像を取得する。画像は概して、蛍光体と結合した物体の位置を表す明るいドット２３と共に暗い背景を含んでいる。同様に、携帯デバイス１０によって更なる画像フレームをキャプチャすることができる。
【００２７】
一態様では、次いで、分析または保存のために、これらの画像を遠隔位置に送信する。例えば、携帯デバイス１０は、ワイヤレスネットワークを介して画像を送信することができる。ワイヤレスネットワークは、例えば、音声やデータを運ぶために使用される携帯電話ネットワークを含みうる。このワイヤレスネットワークはさらに、ＩＥＥＥ８０２．１１または同様の規格を用いるローカルＷｉＦｉネットワークを含みうる。代替的に、携帯デバイス１０はケーブル等を介してコンピュータまたは他のネットワークデバイスに接続することができ、それによってデータを遠隔位置に転送することができる。画像分析は、セル数、病原体負荷レベルなどの有用な情報に変換することができる、画像内の明るいドット２３の数を集計することを含みうる。
【００２８】
本発明の代替的な一態様では、画像化プラットフォームの分解能は、圧縮サンプリングアルゴリズムを適用することによって向上する。圧縮サンプリング（圧縮検出としても知られている）は最近の新たな分野であって、シャノンのサンプリング定理により通常必要とされるよりも少ない測定値またはサンプルからスパース関数を復元することを目的としている。圧縮サンプリングに関する詳細は、本書において全て説明されたものとして参照により援用される以下の刊行物：Ｅ．Ｊ．Ｃａｎｄｅｓ、Ｊ．Ｋ．ＲｏｍｂｅｒｇおよびＴ．Ｔａｏ、「Ｃｏｍｍ．Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．」、２００６年、第５９巻、ｐ．１２０７−１２２３；Ｅ．Ｊ．ＣａｎｄｅｓおよびＴ．Ｔａｏ、「ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｉｎｆｏｒｍ．Ｔｈｅｏｒｙ」、２００６年、第５２巻、ｐ．５４０６−５４２５；Ｄ．Ｌ．Ｄｏｎｏｈｏ、「ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｉｎｆｏｒｍ．Ｔｈｅｏｒｙ」、２００６年、第５２巻、ｐ．１２８９−１３０６に見ることができる。
【００２９】
図２は、画像化プラットフォームの分解能を向上させるために圧縮復号を用いるプロセスを図示している。第１に、画像化プラットフォームの非干渉性点拡がり関数（ＰＳＦ）を生成する。このＰＳＦは、蛍光撮像素子１４を有する携帯デバイス１０を用いて、幾つかの分離した微小球の蛍光画像を記録することにより特定することができる。一つの粒子の蛍光画像は重心計算に基づいて互いに位置合わせされ、その詳細は、本書に参照により援用されているＴ．Ｓｕ、Ｓ．Ｏ．Ｉｓｉｋｍａｎ、Ｗ．Ｂｉｓｈａｒａ、Ｄ．Ｔｓｅｎｇ、Ａ．ＥｒｌｉｎｇｅｒおよびＡ．Ｏｚｃａｎ、「Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ」、２０１０年、第１８巻、ｐ．９６９０−９７１１に見ることができる。これらの整列した粒子画像を平均化することによって各画像を正規化した後、携帯デバイス１０および蛍光撮像素子１４のシステムについての非干渉性点拡がり関数（ＰＳＦ）を作成する。
【００３０】
図３Ａおよび３Ｂは、携帯デバイス１０（携帯デバイス１０は図４に示す）用の蛍光撮像素子５０の他の実施形態を示している。この実施形態では、蛍光撮像素子５０は、既出の実施形態に記載されたものと同様の把持要素５６を有する装着部５４を含むハウジング５２を有している。蛍光撮像素子５０は、サンプルを側面から照明する、複数の向かい合ったＬＥＤ６０を含む励起光源５８を有している。図３Ｂは図３Ａの図から隠れている１つのＬＥＤを示している（合計３つのＬＥＤを使用してサンプルを側方から照明するが、より多くまたは少ないＬＥＤを使用してもよい。）。電池６２等の電源をハウジング５２内に設けて、励起光源５８に電源供給する。図３Ａおよび３Ｂには見られないが、蛍光撮像素子５０は、既出の実施形態と同じ方法で、中にフィルタを保持するよう構成された（移動可能または固定式）フィルタホルダを有する。したがって、フィルタは、サンプルと携帯デバイス１０のカメラ要素１２の間の光路に配置される。レンズ６４（図３Ａ）をハウジング５２内に設けて、既出の実施形態におけるレンズ４４と同様の集光レンズとして機能する。
【００３１】
図３Ａおよび３Ｂの実施形態では、サンプルが中を通って流動する微小流体フローセル６６（図３Ａ参照）が提供されている。微小流体フローセル６６は微小流体チップなどの形態をなすことができる。例えば、微小流体フローセル６６は多層構造から形成することができ、当該構造には流体サンプルが通過できる微小流体チャネルが作られる。微小流体フローセル６６は入口６８と出口７０とを有する。導管７２、７４はそれぞれ、入口６８と出口７０の双方に接続されうる。入口６８に接続された導管７２は、シリンジポンプなどのポンプ光源（図示せず）に連結することができる。シリンジポンプ（または他の種類のポンプ）は関心があるサンプル流体を微小流体フローセル６６に連続的に送達し、これにより、携帯デバイス１０を用いて微小流体フローセル６６を通って流動している物質の蛍光顕微鏡ムービーを取得する。これらの物体は、既出の実施形態のように、セル、病原体、粒子、ビーズなどを含みうる。図３Ａを更に参照すると、出口７０に接続された導管７４は、空のサンプルコレクタ７６へとサンプル溶液を誘導することができる。このサンプルコレクタ７６はハウジング５２に一時的に挿入することができ、サンプルコレクタが満杯の場合、あるいはサンプルを更に処理および分析することが望ましい場合に取り外すことができる。
【００３２】
微小流体フローセル６６は複数モードの光学流体スラブ型導波路としても機能し、これは両側が空気で囲まれた三層屈折率構造（ＰＤＭＳ−液体−ガラス）を有している。ガラス−液体またはＰＤＭＳ−液体の界面と比較して、空気−ガラスおよび空気−ＰＤＭＳの界面の屈折率差は大きいため、このバット・カップリングされたＬＥＤ励起光はこの複数モードの光学流体導波路の構造の内側に確りと制限され、微小流体フローセル６６内の画像化容積を均一かつ効果的にポンプする。さらに、励起光は蛍光検出路に対して垂直に伝播するため、図１Ｃの実施形態のフィルタ４２のような簡単なプラスチックの吸収フィルタは、拡散したポンプ光子を拒絶し、必要に応じて、濃い暗視野背景を作りだすのに十分となる。さらに、この光学流体設計では、照明用光源（ＬＥＤ）およびプラスチックの吸収フィルタは異なる色に対して容易に変更することができるため、当該システムは異なる励起／発光波長を有する蛍光体に適合しうる。
【００３３】
図４は、携帯デバイス１０に固定される代替的な実施形態の蛍光撮像素子５０を示している。サンプルコレクタ７６は、サンプルコレクタ７６内に位置する出口導管７４を有するハウジング５２に挿入された位置に図示されている。この代替的な実施形態では、ハウジング５２は約３．５ｃｍ×５．５ｃｍ×２．８ｃｍの寸法を有している。蛍光撮像素子５０は小さくて小型である。例えば、蛍光撮像素子５０は約２０グラム未満（または、幾つかの好適な実施形態では３０グラム未満）の重さであって、約１００ｃｍ３未満（または、他の実施形態では６０ｃｍ３未満）のサイズを有する。
【００３４】
蛍光撮像素子５０は、位置調整の精密なチューニングを必要とすることなく、携帯デバイス１０に繰り返し取り付ける、あるいは取り外すことができる。携帯デバイス１０は、複数の連続画像フレームを撮影してムービークリップなどを形成するカメラ要素１２を有している。この点について、携帯デバイス１０は、微小流体フローセル６６を通過する蛍光標識化した物体（例えば、セル、粒子、ビーズ）のムービーをキャプチャすることができる。次に、蛍光ムービーのデジタル画像フレームを処理してムービー中の蛍光標識化した物体を集計する。これを利用して、サンプル容量内の対象の蛍光物体の濃度を特定または概算することができる。画像化処理は携帯デバイス１０の内部プロセッサを利用して行うことができ、あるいは代替的に、物体の集計や追跡を行う他のコンピュータまたは画像処理デバイスに画像フレームを転送することもできる。例えば、ムービークリップは、物体の集計や追跡を実施する他のコンピュータに無線で送信することができる。携帯デバイス１０は、ムービークリップを送信するために、ケーブルなどを介してコンピュータに物理的に連結することもできる。画像フレームのデジタル処理は、微小流体フローセルを通過する蛍光標識化した試料による合計蛍光放射レベルを検出することを含みうる。
【００３５】
以下に説明するように、一態様では、各物体それぞれの輪郭を検出し、各物体の重心を算出する。次に、重心を各物体のそれぞれの座標に利用する。各物体には、所与のムービークリップまたは一連の画像の分析プロセスを通して維持される固有のＩＤが割り当てられる。ムービークリップ内の連続する各フレームについて、物体検出プロセスを繰り返す。これらの新たに検出された物体の座標は次いで、以前のフレームにおける物体の座標と比較される。以前のフレームにおける物体との近さに基づいて、新たに検出された物体には新しいＩＤが割り当てられる。換言すると、粒子の座標は新たなフレームにおいて更新され、その結果、ムービークリップに最初に表れた瞬間から固有のＩＤで物体を追跡することが可能となる。
【００３６】
任意に、検出および追跡における誤差を減少させるため、垂直輪郭線のような物体の輪郭のカスケードを設定して、それぞれ独立した各輪郭線を通過する物体をモニタして集計することもできる。画像フレーム内に複数のカスケード線を規定して物体を追跡することにより、微小流体フローセル６６を通過する物体をより正確に集計することが可能となる。例えば、複数の画像フレーム（すなわち、長い期間）にわたって集計を平均化することができる。
【００３７】
実験−実施形態１
【００３８】
ここで、携帯電話における蛍光顕微鏡は、携帯電話の既存のカメラユニットに取り付ける小型（３．５×５．５×２．４ｃｍ）かつ軽量（〜２８グラム）の光学ハウジングを使用した図１Ａ−１Ｄの画像化プラットフォームを利用する。このプラットフォームは〜２０μｍの未加工の空間分解能で〜８１ｍｍ２の画像化ＦＯＶを実現し、この分解能はさらに、本書に記載の圧縮サンプリングに基づくキャプチャした蛍光画像のデジタル信号処理を利用して〜１０μｍまで向上させることができる。この手法では、蛍光サンプルは、サンプルに側面からバット・カップリングされた電池式発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いてポンプされる。このポンプ光は、興味がある試料を均一に励起しながらサンプルキュベット内に誘導される。サンプルからの蛍光発光は次いで、既存の携帯電話のカメラレンズの前方に配置されるレンズを用いて画像化される。励起光は検出路に対して垂直に誘導されるため、プラスチックのカラーフィルタを用いて必要な暗視野背景を作り出すことができる。この機能は、従来の蛍光顕微鏡に使用される高価な蛍光フィルタ（例えば、薄膜干渉フィルタ）の使用を排除する。
【００３９】
この携帯電話ベースの蛍光画像化プラットフォームには、世界的な健康問題への利用に特に適した幾つかの重要な特徴がある。これらの特徴は、比較的安価な構成要素の特性を含みうる。蛍光撮像素子の取付具の主な構成要素は、簡単なレンズ（費用：〜１２ＵＳドル／ピース）、プラスチックのカラーフィルタ（費用：〜１．１ＵＳドル／ピース）、３つのＬＥＤ（費用：〜０．３ＵＳドル／ピース）、および電池（費用：〜０．５ＵＳドル／ピース）を含み、携帯電話における蛍光画像化プラットフォームを極めて費用対効果が高いものにしている。このプラットフォームでは、画像化処理量も高い。このプラットフォームの広いＦＯＶ（〜８１ｍｍ２）および被写界深度（１−２ｍｍより大きい）によって０．１ｍＬより多くのサンプル容積を画像化することが可能となり、これは、まばらなセルまたは低濃度の細菌／病原体などを検出および定量化するために特別に設計された微小流体チャネルを高処理画像化するのに重要である。最後に、画像化プラットフォームは小型かつ軽量である。携帯電話に取り付けるハウジング全体（全ての光学要素、電池、さらに図１Ａ−１Ｄに示す機械的な構成要素を含む）は、〜２８グラム（〜１オンス）の重さがあり、〜３．５×５．５×２．４ｃｍの寸法を有する。この小型かつ軽量のユニットは、精密な位置調整／チューニングを必要とすることなく、携帯電話本体に繰り返し着脱することができ、設備が限られた状況でさえも、極めて容易に相互接続することができる。
【００４０】
上記の特徴はこのプラットフォームについて遠隔治療の利用を期待させるが、この設計では空間分解能の犠牲が生じる。すなわち、費用対効果が高く小型で広視野の、携帯電話における蛍光画像化インタフェースを実現する代わりに、空間分解能は〜１０−２０μｍに制限される。しかしながら、これは、血液、尿、唾液または水などの大量のサンプルを迅速にスクリーニングするのに要する幾つもの用途については許容可能な分解能である。このような可能性を実証するため、全血サンプルから標識化した白血球セル、さらにはランブル鞭毛虫の嚢子などの水媒介性の病原体寄生原虫を上手く画像化することによって、この広視野の蛍光プラットフォームの性能を確認している。さらに、このプラットフォームの性能は、異なる２色（すなわち、赤と緑）の蛍光微粒子を画像化し、同一サンプルの従来の蛍光顕微鏡画像と比較することによって確認されており、〜８１ｍｍ２のＦＯＶにわたる空間分解能を実証している。
【００４１】
図１Ｄに見られるように、蛍光顕微鏡プラットフォームは、３つのＬＥＤと、簡単なレンズと、図１Ｃに示すようなプラスチックのカラーフィルタを保持する機械的なトレイとを含む小型かつ軽量のインタフェースを利用して、携帯電話の既存のカメラユニットに直接取り付けられる。
【００４２】
携帯デバイスについては、Ｓｏｎｙ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  Ｕ１０ｉ  Ａｉｎｏ（商標）をプラットフォームのスターティングベースとして使用した。しかしながら、本書に記載されたデバイス及び方法は、動作システムまたは通信プロトコルから独立した様々な他の携帯電話に簡単に導入することができると理解されたい。この特定の携帯電話は、８メガピクセルのカラーＲＧＢセンサが設置され、サンプルの蛍光画像をキャプチャするために使用された。
【００４３】
携帯電話のデジタルカメラユニットは、ＣＭＯＳチップの前方に既に内蔵されたレンズを有しており、ｆが〜４．６５ｍｍの焦点距離を有している。ＣＭＯＳセンサチップ上の蛍光サンプルを画像化するため、既存のカメラレンズの前方に他のレンズ（ｆ２＝１５ｍｍ）を配置し（すなわち、レンズ４４）、（ｆ２の焦点面に位置する）サンプル面とＣＭＯＳセンサ面の間にｆ２／ｆ＝〜３．２の縮小を作り出した。この縮小率はｆ２の値を変化させることによって簡単に調整することができ、非常に便利なことに、これは２つのレンズ間の物理的距離から独立しているため、取り付けられるユニットの垂直方向の調整不良に寛容である。この画像化配置によると、サンプル面での有効ピクセルサイズは〜５−６μｍとなり、図６に実証されるように、〜２０μｍの未加工分解能と上手く一致する。次のセクションで詳述するように、この未加工分解能はさらに、画像化ＦＯＶを犠牲にすることなく〜２の他の倍率まで向上することができる。
【００４４】
分解能およびＦＯＶに加えて、蛍光顕微鏡における他の重要な課題は、ポンプ光子の拒絶である。従来の蛍光顕微鏡は主に比較的高価な薄膜干渉フィルタを利用している。この携帯電話顕微鏡のデザインでは、このような高価なフィルタを使用することなく適切な暗視野背景を実現するために、図１Ｃに示すような異なるポンプ機構を使用し、レンズフリーのバット・カップリングを利用して、側面からポンプ光（ミネソタ州、シーフリバーフォールズ、Ｄｉｇｉｋｅｙ社の３つＬＥＤによって生成される）を試料ホルダに実際に接続した。ＬＥＤ光の断面が大きいため、このカップリングは位置調整に対して非常に鈍感であり、サンプル毎の再現性が高くなる。この試料ホルダは、両面を空気で囲まれた３層屈折率構造（ガラス−サンプル−ガラス）を有する複数モードのスラブ型導波路とみなすことができる。このような導波路は空気−ガラスの界面（すなわち、上面と底面）に大きな屈折率差を有しており、その結果、ポンプ光は導波路内に確りと誘導される。一方、ガラス−サンプル溶液の界面における屈折率差は空気−ガラスの界面と比較して非常に小さく、これによりポンプ光の一部がサンプル溶液に漏出し、サンプル内に懸濁された、例えば標識化されたセル／病原体を効率的に励起することができる。この励起は極めて効率的かつ均一であって、サンプル毎の再現性が非常に高い。同じ原理を図９に実証されるような毛細管ベースの蛍光画像化にも適用し、ポンプ光を管内に誘導する。
【００４５】
サンプル構造の励起モードは蛍光顕微鏡の検出路に対して垂直に伝播するため、拡散を無視し、検出される光子は励起サンプルからの蛍光発光のみとなる。（ガラスサンプルの表面に起こりうる引っかき傷、またはセル／粒子からの拡散などによる）拡散したポンプ光子の検出を排除するため、安価なプラスチックのカラーフィルタ（Ｋｏｄａｋラッテンカラーフィルタ１２）を用いて暗視野状態を向上させる。本書に示す実験結果は、簡単で、小型かつ費用対効果の高いデザインがカメラを有する携帯電話ユニットに搭載されるにもかかわらず、この手法は成功であることを示している。
【００４６】
この画像化構造では、取得した蛍光画像は携帯電話のメモリにｊｐｇフォーマットで保存され、適切なデジタルズームをした後に携帯電話の画面を介して見ることができる。これらのｊｐｇファイル（〜８メガピクセルの画像につき通常は〜２−３ＭＢ）を更にデジタル処理するために（例えば、メモリカードを介して、あるいは無線通信を利用して）コンピュータに転送することもでき、デジタル処理は、未加工画像の重複した幾つかの蛍光シグネチャを分解するために圧縮復号することを含むがこれに限定はされない。小さいＦＯＶが容認できる場合、携帯電話は、現在では〜１ＭＢで保存することができる〜３メガピクセルの画像（〜２０−３０ｍｍ２のＦＯＶに対応する）などをキャプチャをすることもできる。
【００４７】
このプラットフォームの蛍光画像化性能を、２つの異なる発光波長、すなわち図５−６に示すような５１５ｎｍと６０５ｎｍで蛍光マイクロビーズ（直径１０μｍ）を使用して実証した。１０μｍの直径を有する蛍光ビーズ（赤いビーズ：製品＃Ｆ８８３４：励起／発光５８０ｎｍ／６０５ｎｍ；緑のビーズ：製品＃Ｆ８８３６：励起／発光５０５ｎｍ／５１５ｎｍ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールスバッド）から購入した。蛍光ビーズのサンプルを準備するため、１０μＬのビーズを４０μＬの脱イオン水と混合した。次いで、マイクロピペットを使用して、１０μＬの混合物を２枚のスライドガラス（１２．５ｍｍ×１７ｍｍ）の間に配置した。代替的に、単なる毛管現象を利用して、図９のようにサンプルを毛細管に装填した。次にサンプルをサンプルトレイに挿入し、携帯電話取付具（図１Ｃおよび図１Ｄ）に嵌め込む。
【００４８】
このプラットフォームのＦＯＶを特徴付けるため、図５に示すように、１４．７ｍｍ×１１ｍｍの領域にわたって赤の蛍光ビーズ（２つの顕微鏡スライドの間）を画像化した。この画像化領域は、そのエッジに向かって枠外部（例えば、図５；拡大フレームＦ−Ｊ参照）を有するため、〜９ｍｍ×９ｍｍの領域にわたる中央領域のみが適切な画像化性能を示し、図５の点線の四角に示すような〜８１ｍｍ２のＦＯＶを作り出す。広いＦＯＶおよび低い開口数により、この携帯電話ベースの蛍光顕微鏡プラットフォームは大量のサンプル（０．１ｍＬより多く）をスクリーニングする能力を有し、これは血液、尿、唾液、水などを迅速にスクリーニングするために特に重要となりうる。中央の画像化領域（例えば、図５；拡大フレームＡ−Ｅ）と比較すると、枠外領域（例えば、図５；拡大フレームＦ−Ｊ）は著しく歪んで見えるが、設備が限られた状況における様々なセルの集計または検出する用途に関しては、このような枠外領域はそれでも有用であり、８１ｍｍ２を越えて画像化領域を潜在的に更に増加させうる。
【００４９】
次に、緑と赤の蛍光ビーズ（直径１０μｍ）を用いて蛍光画像化プラットフォームの空間分解能を特徴付けるために、一連の実験を実施した。図６Ａ−６Ｂは、数セットのビーズについての携帯電話顕微鏡の画像化性能を示している。図６Ａは未加工の携帯電話画像を示しており、図６Ｂは圧縮復号を受けた携帯電話画像を示している。図６Ｃに示すように、１０倍顕微鏡対物レンズ（開口数０．２５）を使用する従来の蛍光顕微鏡によっても同一サンプルを画像化した。これらの結果に基づき、未加工の携帯電話画像を用いて、画像化プラットフォームは〜２０μｍ（中心間）で隔てられた２つのビーズを分解することができる。この分解能はさらに、キャプチャした蛍光画像の圧縮サンプリング理論に基づくデジタル信号処理を介して向上させることができる。
【００５０】
ｌ１正則化最小二乗最適アルゴリズムを利用することにより、システムが通常可能にする非干渉性点拡がり関数よりも非常に優れた空間分解能を実現することができる。圧縮サンプリングのスパース性の制約はむしろ、関心がある実際のサンプルに容易に適合するため、この手法は特に、（溶液内に懸濁された、あるいは微小流体チャネル内にキャプチャされた）不規則に分布したセル／細菌を画像化するのに有効である。
【００５１】
ここで、〜２の倍率まで未加工の蛍光画像の分解能を向上させるべく、圧縮サンプリングを利用した（図６Ｂ参照）。圧縮サンプリングプロセスの一部として、携帯電話の画像化プラットフォームを用いて、蛍光画像を幾つかの分離した微小球（直径４および１０μｍ）として最初に記録した。次いで、これらの個々の粒子の蛍光画像を重心計算に基づいて互いに整列させた。各画像を正規化した後、これらの整列した粒子の画像を平均化することにより、携帯電話顕微鏡についての非干渉性の点広がり関数（ＰＳＦ）を作成した。この明確なＰＳＦを利用して、サンプル面に任意に分布した蛍光点についてＣＭＯＳセンサに投影された画像を簡単に算出することができる。この原理を利用して、蛍光チャネルについてのスパース性の制約を維持しながら、理論的に投影された蛍光画像と測定された蛍光画像の間の差異を最小限にするために反復アルゴリズムを使用した。数学的に、この復元プロセスは、ｌ１正則化最小二乗の問題として以下のように表現することができる。
【００５２】
2014503822.tif 000003
【００５３】
ここで、β＞０は正則化パラメータであり；Ｉは、センサアレイで検出された未加工の蛍光画像（ベクタ形式）であり；Ｍは、画像化システムの非干渉性ＰＳＦに基づく２Ｄコンボリューション行列を表しており；
2014503822.tif 000004
は、センサ面に画像を生成する理論的な蛍光源分布であり；
2014503822.tif 000005
は
2014503822.tif 000006
のｌｐノルムを表している。この数値レシピに基づいて、携帯電話顕微鏡によって取得した未加工の蛍光画像を、図６Ｂに示すように上手く復号化した。復号した携帯電話画像は、〜１０μｍの中心間距離（未加工の携帯電話画像では分解することができない）を有する２つのビーズが、図６Ｂ（画像Ｃ−２およびＦ−２）に示すように、デジタル処理で分解されていることを示している。分解能（〜１０μｍ）は極めて中程度であるにもかかわらず、このプラットフォームのＦＯＶは広いため（〜８１ｍｍ２）、遠隔位置での体液分析などを伴う、様々なセル／病原体の検出および定量化の用途にも有用であることを主張したい。
【００５４】
最後に、このような再構築タスクに他の数値的な手法を使用することもできることに留意されたい。例えば、ルーシー・リチャードソンの解析アルゴリズムは、スパース物体および非スパース物体の双方に上手く作用しうる。しかしながら、スパースナ蛍光物体の分布は、再構築プロセスの際に完全には利用されないことが分かっているため、スパース物体で達成しうる分解能は制限される。
【００５５】
以下の評価実験で、携帯電話ベースの蛍光顕微鏡プラットフォームを利用する実現可能性を試験して全血サンプル中の標識化したセルを画像化した。ＳＴＹＯ（登録商標）１６核酸染料で標識化した白血球セルを画像化した。これらの標識化した白血球セルを青色ＬＥＤ（４７０ｎｍのピーク波長）を用いて励起し、携帯電話ベースの顕微鏡を用いて画像化した。その結果は図７Ａ−７Ｄに図示されている。白血球セルの画像化について、１×の赤血球セル溶解バッファ（製品＃００−４３３３）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入し、４℃で保管した。ＳＹＴＯ（登録商標）１６の緑の蛍光核酸染料（製品＃Ｓ７５７８、励起／発光４８８ｎｍ／５１８ｎｍ（＋ＤＮＡ）および４９４ｎｍ／５２５ｎｍ（＋ＲＮＡ））をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州、カールスバッド）から購入した。標識化した白血球セルサンプルを準備するために、１ｍＬの白血球セル溶解バッファを２００μＬの全血に加えて、３分間インキュベートした。次いで、溶解した血液サンプルを遠心分離機にかけて、白血球セルの沈殿物を２００μＬのＰＢＳに再度懸濁した。次に、この２００μＬの白血球セルサンプルに１ｍＭのＳＴＹＯ（登録商標）１６溶液を５μＬ加えて、暗所で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、サンプルを再び遠心分離機にかけた。上澄を除去し、標識化した白血球セルの沈殿物をＰＢＳバッファで再び懸濁した。次いで、この標識化した白血球セル溶液を２枚のスライドガラス（１２．５ｍｍ×１７ｍｍ）の間に配置し、携帯電話蛍光顕微鏡を用いて画像化した。
【００５６】
図７Ｂおよび７Ｃは携帯電話の蛍光画像の中央ＦＯＶからデジタルトリミングされており、標識化した白血球セルの未加工シグネチャを示している。比較するため、図７Ｄに示すように、従来の蛍光顕微鏡（１０倍顕微鏡対物レンズ）を用いて、同一サンプルの拡大領域も画像化した。これらの領域は全て携帯電話の蛍光画像との優れた適合を提供している。画像の品質を向上させるため、画像を圧縮復号して（図７Ｃ）高分解能の画像をデジタル処理で実現した。これは明らかに、図７Ｄと同等の分解能に向上することを実証している（例えば、図７Ｃ（画像Ｂ−２およびＣ−２）および図７Ｄ（画像Ｂ−３およびＣ−３）の白い矢印が指し示すような密接した間隔の白血球セルを参照）。
【００５７】
水質をモニタリングするための携帯電話ベースの蛍光画像化システムの潜在的な用途についても調査した。この目的のため、水資源に存在する最も広く発見される病原体であるためにランブル鞭毛虫をこの研究のモデル系として選択した。わずか１０のランブル鞭毛虫の嚢子を摂取するだけで感染を引き起こすため、飲料水中の低濃度の嚢子を迅速に識別できる検出法を有することが非常に望ましい。ランブル鞭毛虫の嚢子はＷａｔｅｒＢｏｒｎｅ社（米国、ルイジアナ州ニューオーリンズ）から購入した。ランブル鞭毛虫の嚢子の初期濃度は〜５×１０６寄生虫／ｍＬであり、ｐＨ７．４／０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０で５％ホルマリン／ＰＢＳに全て固定した。１００μＬのサンプルを遠心分離機にかけて、沈殿物を１００μＬのＰＢＳバッファに再懸濁した。この１００μＬのランブル鞭毛虫サンプルに１ｍＭのＳＹＴＯ（登録商標）１６溶液を２．５μＬ加えて、暗所で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、サンプルを遠心分離器にかけて、沈殿物をＰＢＳバッファに再懸濁した。次いで、ランブル鞭毛虫サンプルを２枚のスライドガラス（１２．５ｍｍ×１７ｍｍ）の間に配置し、携帯電話蛍光顕微鏡を用いて画像化した。図８（画像Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１）は、ＳＹＴＯ（登録商標）１６を用いて標識化したランブル鞭毛虫の嚢子の未加工の携帯電話の蛍光画像を示している。これらの携帯電話画像は広いＦＯＶ（〜８１ｍｍ２）からデジタル処理でトリミングされた。比較するため、図８Ｂ（画像Ａ−２、Ｂ−２、Ｃ−２）に見られるように、従来の蛍光顕微鏡（１０倍顕微鏡対物レンズ）を用いて同一の関心領域についても画像化した。これらは、携帯電話の画像化結果と非常によく一致している。
【００５８】
本書に記載するように、携帯電話の蛍光顕微鏡プラットフォームは、例えば０．１ｍＬより多くの大量サンプルを迅速に画像化する機能を有している。これに加えて、蛍光標識化することで、低濃度レベルの病原性寄生体を検出するための高い選択性と感度をも提供することができ、これら全てが、携帯電話蛍光顕微鏡を設備が限られた環境で水質をモニタリングするために期待できる器具にしている。
【００５９】
代替的なサンプル処理法は、携帯電話顕微鏡において毛細管を使用することを伴う。この実施形態では、平坦な基板を使用するよりむしろ、携帯電話ベースの蛍光顕微鏡は、単純な毛細管現象によって毛細管内に装填されたサンプルを画像化することもできる。このような毛細管内の試料の励起は以前に使用したものと同一の手法を共用し、これにより、サンプル溶液が一旦装填されると導波路として機能する毛細管内にポンプ光を誘導することができる。この導波路は、コアに低い屈折率を有しているにもかかわらず、図９に示すように、コア内の標識化した物体を効率的に励起することができる。このように簡単な毛細管ベースのサンプル準備方法は、特に便利基本的な実験用器具さえも容易に入手することができない遠隔地における使用に対して利便性が高い。
【００６０】
実験−実施形態２
【００６１】
携帯電話への光学流体蛍光サイトメトリのプラットフォームの一体化を、小型かつ費用対効果が高い光学取付具を用いて実証する。このデザインでは、使い捨ての微小流体フローセル（すなわち、微小流体チャネル）を用いて、関心があるサンプル溶液を画像化容量へと連続して送達／ポンプする。図４に示すような携帯電話の既存のカメラユニットと接触して設置される微小流体デバイスのアセンブリは、別個の安価なレンズの上に配置され、これにより、微小流体デバイスの断面全体を携帯電話カメラのＣＭＯＳセンサチップ上にマッピングすることができる。一旦、携帯電話ベースの画像化フローサイトメトリに挿入すると、簡単なバット・カップリングを利用して、すなわち、図３に示すような大きい光カップリング光学部品またはレンズを使用することなく、各微小流体デバイスは発光ダイオード（ＬＥＤ）によって側面からポンプされる。次いで、このポンプ光は、画像化容量内の標識化した試料を均一に励起する微小流体デバイス（空気に囲まれたポリ（ジメチルシロキサン）−液体−ガラス界面からなる多層の光学流体導波路として機能する）の断面に誘導される。誘導された励起光は検出路に対して垂直に伝播するため、この光学流体ポンプ機構によって、安価なプラスチックの吸収フィルタを使用して蛍光画像化に必要な暗視野背景を作ることが可能となる。この光学流体デザインでは、単純なシリンジポンプ等を用いて関心があるサンプル溶液が画像化フローサイトメトリまで連続的に送達され、これにより、携帯電話のカメラユニットを用いて、流動する粒子またはセルの蛍光顕微鏡ムービーを取得することができる。次に、これらの蛍光ムービーのデジタルフレームを迅速に処理し、標識化した粒子／セルの総数を特定して、サンプル溶液内の対象の蛍光物体の濃度を算出するために利用することができる。
【００６２】
携帯電話ベースの蛍光画像化サイトメトリのプラットフォームの性能が、人の血液サンプルの白血球セル濃度を測定することによって試験され、その結果は市販の血液分析器（シスメックスＫＸ−２１Ｎ）との優れた一致をもたらした。さらに、携帯電話ベースの蛍光顕微鏡プラットフォームの画像化性能は、同一の光学流体デザインを用いて〜２μｍの空間分解能を実証している。
【００６３】
ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）をＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社（ＵＳＡ）から購入した。ＳＹＴＯ（登録商標）１６の緑色蛍光核酸染料（製品＃Ｓ７５７８、励起／発光４８８ｎｍ／５１８ｎｍ（＋ＤＮＡ）および４９４ｎｍ／５２５ｎｍ（＋ＲＮＡ））と、直径４μｍ（製品＃８８５９）、直径２μｍ（製品＃８８２７）、および直径１μｍ（製品＃１３０８１）を有する蛍光ビーズ（黄−緑色蛍光発光：励起／発光５０５ｎｍ／５１５ｎｍ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国、カールスバッド）から購入した。１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファ（製品＃ＢＰ２４３８−４）および顕微鏡スライド（製品＃１２−５５００）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国、ペンシルベニア州ピッツバーグ）から購入した。ハリスユニコアパンチをＴｅｄ  Ｐｅｌｌａ社（米国、カリフォルニア州レディング）から購入した。高周波プラズマ発生装置（モデルＢＤ−１０ＡＳ）をＥｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社（米国、イリノイ州シカゴ）から購入した。タイゴンチューブ（ＩＤ：０．０１インチ／ＯＤ：０．０３インチ）（製品＃０６４１８−０１）をＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社（米国、イリノイ州バーノンヒルズ）から購入した。平凸レンズ（ｆ＝０．６ｍｍ）（製品＃ＮＴ４５−５８８）および黄色のＫｏｄａｋラッテンカラーフィルタ（製品＃ＮＴ５４−４６７）をＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ社（米国、ニュージャージー州バーリントン）から購入した。非球面レンズ（ｆ＝４．５ｍｍ）（製品＃Ｃ２３０ＴＭＥ−Ａ）をＴｈｏｒｌａｂ社（米国、ニュージャージー州ニュートン）から購入した。
【００６４】
微小流体デバイスの製造および準備
【００６５】
標準的なソフトリソグラフィック法を用いるＰＤＭＳベースの微小流体デバイスを製造した。例えば、本書に全て説明されたかのように参照により援用されている、Ｍｃｄｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｃ、およびＷｈｉｔｅｓｉｄｅ，Ｇ．Ｍ．、「Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．」、２００１年、第３５巻、ｐ．４９１−４９９を参照されたい。フォトレジスト（ＳＵ−８）を、初期立ち上がり５００ｒｐｍ、毎秒１００ｒｐｍの加速で１０秒間一定に保ち、次いで、さらなる立ち上がり３０００ｒｐｍ、毎秒３００ｒｐｍの加速で３０秒間一定に保ち、シリコンウエハ上にスピンコーティングした。フォトレジストをウエハ表面に適用した後、ホットプレート上で６５℃で３分間および９５℃で更に９分間、２つの連続するステップでソフトベーク（ｓｏｆｔ−ｂａｋｅｄ）を行い、溶媒を蒸発させてフィルム密度を高めた。所望の構造にフィルムを形成するため、マスクアライナー（Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ）上に８ｍＷｃｍ−２で４０秒間、透明マスク（すなわち、ＡｕｔｏＣＡＤで設計され、ＣＡＤ／Ａｒｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社によって印刷される）を介して、ＵＶ露光をコーティングした基板に適用した。ＵＶ露光の後、ホットプレート上で６５℃で２分間および９５℃で７分間、２つの連続するステップで露光後焼き締めをサンプルに適用し、フォトレジストの露出した部分を選択的にクロスリンクした。次いで、ＳＵ−８現像液によって６分間パターニングした基板を現像し、露出していない領域を溶解した。現像した後、最終的な基板をイソプロピルアルコール （ＩＰＡ）で洗い流し、次いで穏やかな窒素ガスストリームで乾燥させた。
【００６６】
ＰＤＭＳのプレポリマ混合物（ＰＤＭＳプレポリマ：硬化剤（ｖ：ｖ）＝１０：１）を型に注ぎ、３０分間室温でガス抜きした。次いで、７０℃で１時間焼成した。硬化後、ＰＤＭＳを型から剥がし、入口と出口を形成するために孔を開けた。最初に、ＰＤＭＳとスライドガラス（厚さ１ｍｍ）を石鹸水で簡単に洗浄し、次に高周波プラズマ生成器で１５秒間処理した。プラズマ処理の直後、ＰＤＭＳをガラス基板に接着し、接着を強化するために更に１時間７０℃で焼成した。最後に、タイゴンチューブ（内径：０．０１インチ）をチップの入口／出口に挿入し、エポキシで密封した。微小流体チャンバの寸法は、４４μｍ×３ｍｍ×１５ｍｍ（高さ×幅×長さ）であった。高温焼成の最終ステップにより、ＰＤＭＳ−ガラスチップの内面は疎水性となる。面への非特異性のセル吸収およびチャンバ内での気泡の発生を減少させるため、各実験の前に１分間、微小流体チャンバをプラズマ生成器で処理した。
【００６７】
蛍光ビーズサンプルの準備
【００６８】
蛍光ビーズサンプルを準備するために、１０μＬのビーズ（直径４μｍ、２μｍまたは１μｍ）を４０μＬの脱イオン（ＤＩ）水と混合した。次いで、マイクロピペットを用いて、１０μＬの混合物を２枚のスライドガラス（１２．５ｍｍ×１７ｍｍ）の間に挟んだ。このサンプルをサンプルトレイに挿入し、画像化するために携帯電話の取付具に嵌め込んだ。
【００６９】
全血中の白血球セルの蛍光標識化
【００７０】
まず第一に、ＳＹＴＯ（登録商標）１６を室温まで温め、次いでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液をバイアルの底部にするために微小遠心管内で簡単に遠心分離した。全血サンプルを静かに回転させてよく混合した。この後、２０μＬのＳＹＴＯ（登録商標）１６を上澄みからピペットで取り、２００μＬの全血に加えた。次に、この混合物を暗所で〜３０分間インキュベートした。セルの沈殿を避けるため、インキュベートしている間はサンプルを静かに回転させた。白血球セルの溶解ステップは実施しなかった。さらに、ＳＹＴＯ（登録商標）１６に内在する蛍光量は極端に低い（０．０１未満）ため、非結合のＳＹＴＯ（登録商標）１６はインキュベートした後の全血から分離しなかった。この標識化した全血サンプルをＰＢＳバッファで１０倍に直接希釈し、シリンジポンプを介して通常は毎分〜１μＬの流量で流動セル（微小流体チップ）に連続的に送達／ポンプした。実験中、血液サンプルのバイアルを緩速に攪拌し、セルの沈殿を防いだ。
【００７１】
画像化プラットフォームのデザイン
【００７２】
光学流体蛍光顕微鏡及びサイトメトリユニット用の基本的な携帯電話デバイスとして、Ｓｏｎｙ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  Ｕ１０ｉ  ＡＩＮＯを用いて実験を実施した。この携帯電話は、当該電話に装着された８メガピクセルのカラーＲＧＢセンサを有しており、これを用いて試料の蛍光画像／ムービーをキャプチャする。さらに、このカメラは、携帯電話のＣＭＯＳセンサの前方にｆ〜４．６５ｍｍの焦点距離を有する内蔵レンズを有している。
【００７３】
この携帯電話に光学流体蛍光顕微鏡ユニットを構築するため、焦点距離ｆ２（一般に、０．６ｍｍ乃至１０ｍｍでばらつきがある）を有する単一の安価なレンズを、図３および４に示すように、携帯電話の既存のレンズの前方に直接配置した。この画像化構造は、（ｆ２の焦点面に位置する）サンプル面とＣＭＯＳセンサの間にｆ／ｆ２の拡大をもたらす。その用途および分解能や視野（ＦＯＶ）に対する要求に応じて、ｆ２の値を変化させることにより、異なる拡大倍率を実現することができる。この拡大倍率は、理論的には２つのレンズ間の距離から独立しており、これにより携帯電話に取り付ける位置調整が多少容易になることに留意されたい。
【００７４】
蛍光サイトメトリのプラットフォームユニットにおける画像化処理量を高めるため、図３に示すように、ｆ２＝４．５ｍｍおよび開口数（ＮＡ）０．５５を有する非球面レンズ（レンズ６４）を既存の携帯電話のカメラレンズの前方に配置するように、倍率を利用した。しかし、光学流体設計において高い空間分解能を実現するために、ｆ２＝〜０．６ｍｍを有する平凸レンズを使用し、これにより〜７．８倍の倍率を実現し、蛍光画像化モードの分解能を〜２μｍまで改善した。
【００７５】
励起光について、光学流体の蛍光画像化サイトメトリユニットは、図３に示すように、微小流体チップに直接バット・カップリングされる青色ＬＥＤを利用する。標識化した試料を画像化容量に連続して送達することを除き、この微小流体チップは、両側を空気で囲まれた３層屈折率構造（ＰＤＭＳ−液体−ガラス）を有する複数モードの光学流体スラブ型導波路としても機能する。ガラス−液体の界面またはＰＤＭＳ−液体の界面と比較して、空気−ガラスの界面および空気−ＰＤＭＳの界面の屈折率差は大きいため、このバット・カップリングされたＬＥＤ励起光は複数モードの光学流体導波路の構造の内側に確りと制限され、微小流体フローセル内の画像化容積を均一かつ効果的にポンプする。さらに、励起光は蛍光検出路に対して垂直に伝播するため、プラスチックの吸収フィルタは、拡散したポンプ光子を拒絶し、必要に応じて、濃い暗視野を作り出すのに十分である。
【００７６】
フローサイトメトリ測定の際、携帯電話のほぼ高解像度（Ｎｅａｒ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ｎＨＤ））モードを利用して流動する試料の蛍光ビデオを記録し、この蛍光ビデオは一秒当たりのフレーム数が〜７（ｆｐｓ）のフレームレートで、フレーム当たり６４０×３５２ピクセルの分解能を提供する。これらのフローサイトメトリの実験では、タイゴンチューブを介して微小流体チップをシリンジポンプに連結し、通常は毎分〜１μＬの流量で蛍光標識化したサンプルを微小流体チャンバ内へと連続してポンプした。これらの蛍光ビデオフレームのデジタル処理を行って標識化したセル／粒子を自動集計し、次いで所与のサンプル濃度を算出した。
【００７７】
光学流体の携帯電話取付具の空間分解能を定量化する画像化実験のため、比較するために同一サンプルの従来の蛍光顕微鏡画像を取得することができるように、物体を動かないよう固定した（すなわち、流動しない）。この静的顕微鏡モードでは、光学流体プラットフォームによってキャプチャした蛍光画像は携帯電話のメモリにＪＰＧフォーマットで保存され、携帯電話の画面を通して直接見ることができる。これらのｊｐｇファイル（一般に、〜８メガピクセル画像について〜３−４ＭＢ）は、更なるデジタル処理または分析をするために、（例えば、メモリカードを介して、あるいはワイヤレス通信を用いて）コンピュータに転送することもできる。
【００７８】
蛍光流動ビデオのデジタル分析
【００７９】
ビデオ処理を利用して、微小流体フローセル（すなわち、微小流体チップ）を通過する標識化したセル／粒子を集計した。最初のフレームから始まり、輪郭検出アルゴリズムを用いて、全ての可視できる蛍光微小粒子を検出する。輪郭検出法に関する具体的な詳細は、参照により本書に援用される、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ、およびＡｂｅ，Ｋ、「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｖｉｓ．Ｇｒａｐｈ．Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」、１９８５年、第３０巻、ｐ．３２−４６に見出すことができる。検出した輪郭全てについて、質量中心を算出し、そこを粒子の座標と仮定する。次いで、各粒子には、所与のビデオストリームの分析プロセスを通して維持される固有のＩＤが割り当てられる。ビデオ内の連続する各フレームについて、粒子検出プロセスを繰り返す。これらの新たに検出された粒子の座標は次いで、以前のフレームにおける粒子の座標と比較される。以前のフレームにおける粒子との近さに基づいて、新たに検出された粒子には新しいＩＤが割り当てられる。換言すると、粒子の座標は新たなフレームにおいて更新され、その結果、ビデオに最初に表れた瞬間から固有のＩＤで粒子を追跡することが可能となる。
【００８０】
検出および追跡における誤差を減少させるため、複数のフレーム（すなわち、長い時間）にわたって数値を平均化した。このために輪郭のカスケードを設定し、これにより、実質的な各輪郭線が、その他から独立して通過する粒子をモニタする。粒子を追跡する複数のカスケード線を設定することにより、微小流体チャンバを通過するセルの数をより正確に集計することが可能となる。この作業に最も重要なパラメータは流動の単位時間当たりのセルの集計であるため、この作業に使用される追跡アルゴリズムは単純であることに留意されたい。しかしながら、より複雑な設定では、付加された複雑性に対処するようにアルゴリズムの異なる構成要素を構成する必要がある。例えば、粒子の流動の物理的パターンを測定し、時間／流動の関数として追跡する必要がある場合には、カルマンフィルタを加えるなどして、より複雑な追跡アルゴリズムを使用することもできる。
【００８１】
携帯電話の光学流体サイトメトリのプラットフォームの動作を実証するため、人の全血サンプル中の白血球セル（ＷＢＣ）をモデル系として選択した。全血中の白血球セル濃度は、感染症、白血病、ＨＩＶ、骨髄欠乏症を含む様々な病気の臨床診断に日常的に検査されている。携帯電話におけるフローサイトメトリのプラットフォームを試験するため、新鮮な全血サンプル中の白血球セルをＳＹＴＯ（登録商標）１６蛍光染料で標識化し、赤血球セルを溶解することなく、上記のように希釈した。１０倍に希釈し、標識化した全血サンプルを、毎分〜１μＬの流量でシリンジポンプを用いて微小流体フローセルを通って流し、標識化したＷＢＣから発せられた蛍光発光のビデオを連続して記録した。
【００８２】
画像化ソフトが、互いに〜２７０μｍの距離で隔てられた５つの輪郭のカスケードを規定した。これらのデジタル輪郭は、微小チャネルを通過するＷＢＣの数を動的にモニタする。セルの集計精度を向上させるため、このプログラムは、２１０フレーム（すなわち、〜３０秒）の期間にわたって各輪郭線を通過するＷＢＣの数を集計し、このプロセスを連続する血流について５乃至６分間繰り返した。次いで、チャンバを通って流れるＷＢＣの数を、５つの独立した輪郭からの集計結果を平均することによって概算した。体積流量及び特定の時間フレーム（すなわち、３０秒）内に集計されたＷＢＣの平均数に基づいて、連続して流動している間の血液サンプル中のＷＢＣ濃度を動的に概算することができる。
【００８３】
図１０Ａおよび１０Ｂは、２つの典型的なＷＢＣ集計曲線を示しており、２つの異なる全血サンプルのＷＢＣ濃度が時間の関数としてプロットされている。各サンプルの平均ＷＢＣ濃度を５−６分にわたる曲線を各々平均することによって算出し、その結果を市販の血液分析器（シスメックスＫＸ−２１Ｎ）から得た標準的な試験結果と比較した。図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、ＷＢＣ濃度の結果は、５％未満の誤差で標準的な試験結果と一致した。携帯電話ベースの画像化サイトメトリのプラットフォームおよびその集計精度をさらに評価するため、ＷＢＣ濃度が異なる１２人の異なる患者の血液サンプルを画像化した。各サンプルを５乃至６分間で画像化し、携帯電話サイトメータによってキャプチャされた対応する蛍光ビデオを処理することによって、全血の平均ＷＢＣ濃度を概算した。図１１は、携帯電話の画像化サイトメータを使用して得たＷＢＣ濃度と、シスメックスＫＸ−２１Ｎ血液分析器を使用して得た標準的な結果を比較しており、携帯電話プラットフォームの測定値との優れた相関関係を示している。１２人の患者の血液サンプル（〜４０００μＬ−１乃至８０００μＬ−１の範囲のＷＢＣ濃度を有する）について、２つの方法間で〜０．９５の相関係数が得られ、携帯電話の光学流体サイトメトリのプラットフォームの精度を実証した。
【００８４】
集計精度に加えて、処理量も画像化サイトメータには重要なパラメータである。携帯電話ベースのフローサイトメトリシステムの処理量は主に、携帯電話のカメラのフレームレートによって決定される。本書で試験された実装例では、カメラは〜７ｆｐｓの比較的緩速のフレームレートを有している。更に処理量を高めるために、〜１２０ｆｐｓのフレームレートを実現しうる高いフレームレートを有する携帯電話のカメラ、例えばＬＧ  Ｄａｒｅ  ＶＸ９７００を使用することもできる。これは、流量を潜在的に更に向上させることができ、ひいては集計処理量を、例えば１５倍以上に向上させることができ、全血サンプルなどの画像化時間は試験毎に２０秒未満にまで減少する。
【００８５】
最後に、静止した蛍光物体を画像化することにより、光学流体設計の空間分解能を試験した。携帯電話に取り付ける外付けレンズを〜０．６ｍｍの焦点距離に変更することにより、〜７．８倍の幾何学的拡大率を実現することができ、これによりサンプル面の有効ピクセルサイズは０．３μｍ未満となる。このシステムの空間分解能は、４μｍ、２μｍ、および１μｍを含む様々なサイズの緑の蛍光ビーズを用いて特徴付けられた。図１２Ａ（上段）は、幾つかのセットのビーズに対する携帯電話ベースの光学流体蛍光顕微鏡の画像化性能を示している。比較するために、図１２Ｂ（下段）に示すように、同一のビーズを、４０倍（ＮＡ＝０．６）顕微鏡対物レンズを用いる従来のベンチトップ蛍光顕微鏡によっても画像化した。図１２Ａの画像Ｂ−１およびＣ−１に基づいて、携帯電話ベースの画像化プラットフォームは、４μｍ（中心間）隔てられた２つの蛍光ビーズを容易に分解することができる。図１２Ａ（画像（Ｅ−１））に見られるように、携帯電話蛍光顕微鏡によって、２μｍの中心間距離を有する２つのビーズも上手く分解されている。この空間分解能レベルは、図１３に示すような、分離した１μｍの蛍光粒子の横断面形状によっても確認され、図１３は〜１．８μｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）を示している。
【００８６】
この代替的な実施形態では、光学流体蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリは、小型、軽量かつ費用対効果が高い、携帯電話の既存のカメラユニットへの取付具を用いて、携帯電話上で一体化される。この携帯電話ベースの光学流体画像化サイトメータでは、蛍光標識化した粒子／セルは、携帯電話の既存のカメラユニットの上に配置される使い捨ての微小流体チップを介して、画像化容量まで連続して送達される。同一の微小流体デバイスは多層の光学流体導波路としても機能し、安価なＬＥＤを用いて微小流体チャネルの側面からバット・カップリングされた励起光を効率的に誘導する。全血サンプル中のＷＢＣ濃度を測定することによって携帯電話ベースの画像化サイトメータの性能を試験し、市販の血液分析器との優れた一致をもたらした。プラットフォームの画像化性能を更に試験して、〜２μｍの蛍光分解能を実証した。光学流体画像化によるフローサイトメータを可能にする携帯電話は、設備が限られた場所で様々なセルの集計を行う、あるいは水質をスクリーニングするなどのために体液を迅速かつ感度よく画像化するのに特に有用となりうる。
【００８７】
複数の実施形態が図示され説明されているが、本書に開示された発明の概念の範囲を逸脱することなく様々な改変をすることができる。したがって、この発明は、以下の特許請求の範囲およびその均等物を除き、限定されるべきではない。
【図１Ａ】
2014503822.tif 000007
【図１Ｂ】
2014503822.tif 000008
【図１Ｃ】
2014503822.tif 000009
【図１Ｄ】
2014503822.tif 000010
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2014503822.tif 000013
【図４】
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【図５】
2014503822.tif 000015
【図６】
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【図７】
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【図８】
2014503822.tif 000018
【図９】
2014503822.tif 000019
【図１０】
2014503822.tif 000020
【図１１】
2014503822.tif 000021
【図１２】
2014503822.tif 000022
【図１３】
2014503822.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月21日(2013.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カメラ要素を有する携帯デバイス用の蛍光撮像素子において：
前記携帯デバイスに固定するよう構成されたハウジングと；
前記ハウジング内に配置された微小流体フローセルと；
前記ハウジング内に配置され、前記微小流体フローセルを側方から照明するよう方向付けられた励起光源と；
前記ハウジング内に配置され、中にフィルタ媒体を保持するよう構成されたフィルタホルダと；
前記ハウジング内に配置されたレンズとを具えており、
前記ハウジングは、前記カメラ要素に近接して前記レンズが位置するように前記携帯デバイスに取り付けられるよう構成されていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光撮像素子がさらに、前記微小流体フローセルを通ってサンプルを送り込むよう構成された流体ポンプを具えていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項３】
請求項１に記載の蛍光撮像素子において、前記フィルタホルダが、前記ハウジング内に、およびその外側へと移動可能であることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項４】
請求項１に記載の蛍光撮像素子において、前記携帯デバイスが、携帯電話を含むことを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項５】
請求項１に記載の蛍光撮像素子において、前記ハウジングが、前記携帯デバイスに脱着可能に固定するよう構成されていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項６】
請求項１に記載の蛍光撮像素子がさらに、前記フィルタホルダ内に配置されたフィルタを具えていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項７】
請求項１に記載の蛍光撮像素子がさらに、前記励起光源に電力供給するよう構成された電池を具えていることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項８】
請求項１に記載の蛍光撮像素子がさらに複数の異なるフィルタを具え、各フィルタは特定の蛍光体に対応していることを特徴とする蛍光撮像素子。
【請求項９】
請求項１に記載のデバイスを使用する方法において：
前記微小流体フローセルを通ってサンプルを流動させるステップであって、前記サンプルは、セル、細菌または粒子と、前記セル、細菌または粒子の少なくとも一部に結合するよう構成された蛍光体とを含むステップと；
前記励起光源を用いて前記サンプルを照明するステップと；
前記携帯デバイスのカメラ要素を用いて複数の連続画像フレームを取得するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法がさらに、蛍光放射を放出しながら前記微小流体フローセルを通過するセル、細菌または粒子の数を集計するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法がさらに、蛍光放射を放出する前記セル、細菌または粒子の流れを追跡するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法がさらに、前記微小流体フローセルを通過する蛍光標識化した試料による合計の蛍光放射レベルを検出するステップを含むことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2014503822.tif 000024
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