(57)【要約】  本方法は、幹細胞または前駆細胞の特性を有する細胞を網膜に投与すること、および前記細胞と前記網膜細胞との細胞融合を介して網膜細胞をリプログラミングすることを含んでなり、前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介したものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択され、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている、細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、細胞がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理された細胞であり、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する細胞である、細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターがＷｎｔアイソフォーム、β−カテニン、Ｒ−スポンジン、２−（４−アセチルフェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（ＩＱ１）、（２Ｓ）−２−［２−（インダン−５−イルオキシ）−９−（１，１’−ビフェニル−４−イル）メチル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ］−３−フェニル−プロパン−１−オール（ＱＳ１１）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、表１に示される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の（ヘテロ）アリールピリミジン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞。
【請求項４】
請求項２に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤がＧＳＫ−３阻害剤、ＳＦＲＰ１阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記網膜変性疾患が色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー先天性黒内障、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー、前部虚血性視神経症、コロイデレミア、加齢性黄斑変性、中心窩黄斑ジストロフィー、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー、アッシャー症候群、および原発病態に由来する網膜変性症状からなる群から選択される、細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記網膜変性が白内障、糖尿病または緑内障に由来する、細胞。
【請求項７】
複数の細胞を含んでなる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている、細胞集団。
【請求項８】
請求項７に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、細胞がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理された細胞であり、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する細胞である、細胞集団。
【請求項９】
請求項８に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターがＷｎｔアイソフォーム、β−カテニン、Ｒ−スポンジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＤＣＡ、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、表１に示される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の（ヘテロ）アリールピリミジン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞集団。
【請求項１０】
請求項８に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤がＧＳＫ−３阻害剤、ＳＦＲＰ１阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞集団。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記網膜変性疾患が色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー先天性黒内障、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー、前部虚血性視神経症、コロイデレミア、加齢性黄斑変性、中心窩黄斑ジストロフィー、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー、アッシャー症候群、および原発病態に由来する網膜変性症状からなる群から選択される、細胞集団。
【請求項１２】
請求項１１に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記網膜変性が白内障、糖尿病または緑内障に由来する、細胞集団。
【請求項１３】
網膜変性疾患の処置において使用するための、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択される細胞であって、前記細胞と対象の眼の網膜ニューロンとの接触時の前記細胞と網膜細胞との融合による、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を介した網膜細胞のリプログラミングによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤と組み合わせた、細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターがＷｎｔアイソフォーム、β−カテニン、Ｒ−スポンジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＤＣＡ、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、表１に示される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の（ヘテロ）アリールピリミジン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤がＧＳＫ−３阻害剤、ＳＦＲＰ１阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記網膜変性疾患が色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー先天性黒内障、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー、前部虚血性視神経症、コロイデレミア、加齢性黄斑変性、中心窩黄斑ジストロフィー、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー、アッシャー症候群、および原発病態に由来する網膜変性症状からなる群から選択される、細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞であって、前記網膜変性が白内障、糖尿病または緑内障に由来する、細胞。
【請求項１９】
造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される複数の細胞を含んでなる細胞集団であって、前記細胞と対象の眼の網膜細胞との接触時の前記細胞と前記網膜細胞との融合による、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を介した前記網膜細胞のリプログラミングによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団。
【請求項２０】
請求項１９に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤と組み合わせた、細胞集団。
【請求項２１】
請求項２０に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターがＷｎｔアイソフォーム、β−カテニン、Ｒ−スポンジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＤＣＡ、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、表１に示される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の（ヘテロ）アリールピリミジン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞集団。
【請求項２２】
請求項２０に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記Ｗｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤がＧＳＫ−３阻害剤、ＳＦＲＰ１阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、細胞集団。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記網膜変性疾患が色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー先天性黒内障、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー、前部虚血性視神経症、コロイデレミア、加齢性黄斑変性、中心窩黄斑ジストロフィー、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー、アッシャー症候群、および原発病態に由来する網膜変性症状からなる群から選択される、細胞集団。
【請求項２４】
請求項２３に記載の網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団であって、前記網膜変性が白内障、糖尿病または緑内障に由来する、細胞集団。
【請求項２５】
細胞組成物であって、前記細胞組成物の少なくとも５０％の細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、かつ、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている、細胞組成物。
【請求項２６】
１）造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの細胞と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物であって、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている医薬組成物、ならびに
２）Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターまたはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤と組み合わせた、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの細胞と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物
からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項２７】
１）造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの細胞と、キットの構成要素の使用に関する説明書とを含んでなるキットであって、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されているキット、ならびに
２）Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターまたはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤と組み合わせた、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの細胞と、キットの構成要素の使用に関する説明書とを含んでなるキット
からなる群から選択されるキット。
【請求項２８】
網膜変性疾患の処置において使用するための、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
請求項２８に記載の網膜変性疾患の処置において使用するためのキットであって、前記網膜変性疾患が色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー先天性黒内障、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー、前部虚血性視神経症、コロイデレミア、加齢性黄斑変性、中心窩黄斑ジストロフィー、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー、アッシャー症候群、および原発病態に由来する網膜変性症状からなる群から選択される、キット。
【請求項３０】
請求項２８に記載の網膜変性疾患の処置において使用するためのキットであって、前記網膜変性が白内障、糖尿病または緑内障に由来する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼疾患のための細胞に基づく療法または再生療法の分野に関する。特に、本発明は、幹細胞または前駆細胞の特性を有する細胞を網膜に投与すること、および前記細胞と前記網膜細胞との細胞融合を介して、網膜ニューロンまたは網膜グリア細胞などの網膜細胞をリプログラミングすることによる網膜変性疾患の処置方法であって、前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介したものである、処置方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
網膜は、光受容細胞（桿体および錐体）ならびに視覚情報の処理のための神経網に接続したニューロンを含む、眼の奥にある特殊な光感受性組織である。桿体は低照度条件で機能し、錐体は色覚および高解像度を必要とするあらゆる視覚的作業（例えば、読むこと）を担う。桿体はほとんどが眼の中心から離れて網膜周辺部に位置する。最も高濃度の錐体は網膜の中心である黄斑に見られ、視力に必要である。その代謝機能を維持するため、網膜は隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞に依存している。
【０００３】
網膜変性は網膜細胞または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の進行的および最終的な死滅によって引き起こされる網膜の変質である。網膜変性には、動脈または静脈閉塞、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症／未熟児網膜症、または疾患（通常は遺伝性）を含め、いくつかの理由がある。これらは視力障害、夜盲症、網膜剥離、羞明、トンネル視野、および周辺視力の欠落から失明などの多くの異なる現れ方をする。網膜変性は、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、白内障、および緑内障を含む、網膜疾患の多くの異なる形態で見られる。
【０００４】
色素性網膜炎（ＲＰ）は最も多い網膜変性であり、罹患率はおよそ３，０００人に１人〜５，０００人に１人であり、世界でおよそ１５０万人が罹患している。ＲＰは、光受容器の進行的変性と続いてのＲＰＥの変性を特徴とする遺伝性の網膜障害の異質な一系統である。ＲＰは、最も多い遺伝性網膜変性であり、色素が主として網膜周辺部に沈着し、網膜中心部には比較的少ないことを特徴とする。典型的な症状発現は青年期〜成人早期の間に見られ、高い確率で破壊的な視力低下をもたらす。ＲＰ症例の大部分では、光受容桿体の一次変性が見られ、二次的な錐体変性が伴う。ＲＰは、通常数十年をかけて進行し、初期には夜盲症として、人生の終盤には日中条件での視力障害として現れる長期持続性の疾患である。現在のところ、網膜変性の進行を止める、または視力を回復させる療法は無い。光回避および／または弱視用補助具の使用など、ＲＰの進行を緩徐化する処置選択肢はほとんど無い。ビタミンＡをＲＰの進行を緩徐化する可能性のある処置選択肢と考える医師もいる。
【０００５】
網膜変性の効果的な処置は広く検討されてきた。動物モデルにおける多くの研究が、幹細胞は失われた光受容器および網膜ニューロンを再生し、視力を改善する能力を有することを示唆することから、幹細胞に基づく療法の分野は網膜変性疾患の治療に大きな可能性を持っている。これまでのところ、これらの細胞には、網膜前駆細胞、胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、および誘導多能性幹細胞が含まれる。
【０００６】
網膜前駆細胞（ＲＰＣ）は胎児または新生児網膜に由来し、胚発生の際に総ての網膜細胞の生成を担う未熟な細胞集団を含んでなる。ＲＰＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、増殖し、新たなニューロンおよび特殊な網膜支持細胞を生成することができ、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、総ての網膜層に遊走し、種々の網膜細胞種の形態学的特徴を発達させることができる(MacLaren et al., 2006, Nature 444:203-7)。これらの結果は、ＲＰＣ移植が網膜変性疾患の可能性のある処置であるという仮説を裏付けている。
【０００７】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、胚盤胞期胚の内部細胞塊に由来し、自己再生能、ならびにマウスおよびヒトにおいて、光受容器前駆体、光受容器、またはＲＰＥを含む総ての成体細胞種に分化する能力を持っている(Lamba et al., 2006, PNAS USA 103:12769-74; Osakada et al., 2008, Nat Biotechnol 26:215-224)。Lamba et al.は、ヒトＥＳＣ由来の網膜細胞を成体Ｃｒｘ（−／−）マウスの網膜下腔に移植したところｈＥＳＣ由来網膜細胞の機能的光受容器への分化が促進され、この手法がこれらの動物の光応答を改善したことを示した(Lamba et al., 2009, Cell Stem Cell 4:73-9)。ＥＳＣは網膜補充療法に有望であるが、考慮すべき倫理的問題および免疫拒絶の問題がなおあり、また、ＥＳＣは奇形腫形成にも関連づけられている。
【０００８】
骨髄は、少なくとも２つの異なる幹細胞集団、すなわち、間葉幹細胞（ＭＳＣ）と造血幹細胞（ＨＳＣ）を含んでいる。ＭＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アクチビンＡ、タウリン、および上皮細胞増殖因子を用いて、光受容器系列特異的マーカーを発現する細胞へと誘導することができる(Kicic et al., 2003, J Neurosci 23:7742-9)。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルでは、Royal College of Surgeons (RCS)ラットにおいて、網膜下腔に注射されたＭＳＣは網膜細胞変性を緩徐化し、網膜に組み込まれ、光受容器へと分化できることが実証された(Kicic et al., 2003, J Neurosci 23:7742-9; Inoue et al., 2007, Exp Eye Res 85:234-41)。
【０００９】
Otani et al.は、ｌｉｎｅａｇｅ陰性（Ｌｉｎ−）造血幹細胞（ＨＳＣ）を硝子体内に注射すると、ｒｄ１およびｒｄ１０マウスにおいて網膜変性を救済できることを報告した(Otani et al., 2004, J Clin Invest 114:755-7;ＵＳ２００８／０３１７７２１；ＵＳ２０１０／０３０３７６８)。しかしながら、移植された網膜はほとんど錐体のみから形成されており、網膜電位図応答は極めて異常であり、非処置動物に匹敵していた。硝子体内に注射されたＬｉｎ−  ＨＳＣは初期の、出生直後の発達段階でのみ網膜に効果的に組み込まれたが、成体マウスでは組み込まれず、新生児マウスまたは成体の傷害誘導モデルに見られる活性化星状細胞のみを標的とするという制限があった(Otani et al., 2002, Nat Med 8:1004-10; Otani et al., 2004, J Clin Invest 114:755-7; Sasahara et al., 2004, Am J Pathol 172:1693-703)。
【００１０】
成体組織に由来する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最終分化状態の体細胞から、４つの転写因子、すなわち、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃのレトロウイルス形質導入によりリプログラミングされた多能性ＥＳＣ様細胞である。ヒトｉＰＳは正常な網膜形成を模倣するというＥＳＣと同様の可能性を有することが報告された(Meyer et al., 2009, PNAS USA 106:16698-703)。しかしながら、主要な問題としては、ｉＰＳの作製に関するウイルスの組み込みおよび癌遺伝子の発現のリスクを軽減することが含まれる。これらの制限は、Ｗｎｔ／β−カテニン、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＴＧＦ−βおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路(ssignalling pathways)を含むシグナル伝達経路の活性化などの、ｉＰＳを得るための別の方法を用いて克服することができる（ＷＯ２００９／１０１０８４；Sanges & Cosma, 2010, Int J Dev Biol 54:1575-87）。
【００１１】
よって、網膜変性疾患を処置するための有効な方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、今般、網膜再生は幹細胞または前駆細胞の特性を有する細胞を対象の網膜に移植することによって達成することができ、前記細胞は網膜ニューロン、例えば桿体など、または網膜グリア細胞、例えばミュラー細胞などの網膜細胞と融合してハイブリッド細胞を形成し、前記ハイブリッド細胞はニューロン前駆体マーカーを再活性化し、増殖し、脱分化し、そして、例えば、光受容細胞、神経節細胞などの、対象とする最終分化状態の網膜ニューロンに最終的に分化し、これにより、傷害を受けた網膜組織を再生することができることを見出した。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、前記ハイブリッド細胞の脱分化および対象とする網膜ニューロンにおける最終的な再分化を誘導するために不可欠である。一実施形態において、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、少なくとも一部は、移植された細胞（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理された、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する）により提供されるが、別の実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤を、処置を受ける対象に単に投与する結果として、または単に例えば、網膜変性疾患（例えば、色素性網膜炎）で起こるような網膜傷害もしくは損傷の結果として提供される。新生児網膜ニューロンは移植された哺乳動物で網膜を完全に再生し、機能的な視力をある程度救済する。組織学的分析は、移植２か月後、前記の再生された網膜は野生型哺乳動物の網膜と区別できないことを示す。これらのデータは、細胞融合を介した再生が哺乳動物網膜において極めて有効なプロセスであること、およびそれが移植された細胞においてＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化により誘発され得ること、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける最終分化状態の網膜ニューロンのリプログラミングは組織再生の可能性のある機構であることを示す。結果として、これらの教示は、網膜が変性する疾患を処置するために適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞融合の制御。（ａ）実験計画の概略図。ＨＳＰＣＲＦＰ／ＣｒｅとＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰマウス（Ｒ２６Ｙ）の網膜ニューロンとのｉｎ−ｖｉｖｏ細胞融合は、網膜ニューロンにおけるｆｌｏｘｅｄ終止コドンの切除、およびその後のＹＦＰの発現をもたらす。得られるハイブリッドはＲＦＰおよびＹＦＰの両方を発現する。（ｂ）ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥ／ＲＦＰの網膜下移植から２４時間後のＲ２６Ｙｒｄ１網膜の代表的な蛍光顕微鏡写真。ＹＦＰ陽性細胞は、ＨＳＰＣとＲ２６Ｙｒｄ１網膜細胞の細胞融合から得られるハイブリッドに相当する。（ｃ）標的遺伝子Ａｘｉｎ２のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＢＩＯ処理ＨＳＰＣにおけるβ−カテニンシグナル伝達の活性化を示す。（ｄ−ｅ）ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥ／ＲＦＰの網膜下移植から２４時間後のｐ１０野生型Ｒ２６Ｙ網膜の代表的な蛍光顕微鏡写真。ＹＦＰ陽性細胞（緑）が検出されなかった。（ｅ）では核をＤＡＰＩで対比染色した。点線は、網膜組織の最終部分を示す。ＯＳ：外節；ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層。
【図２】移植されたＨＳＰＣは、ｒｄ１マウス網膜細胞と融合し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化時にｒｄ１マウス網膜細胞の脱分化を誘導する。（ａ−ｄ）ＨＳＰＣＣＲＥ／ＲＦＰの網膜下移植から２４時間後のＲ２６Ｙｒｄ１マウス網膜の代表的な蛍光顕微鏡写真。ＨＳＰＣ（赤）とｒｄ１網膜細胞の細胞融合後の二重陽性ＲＦＰ／ＹＦＰ（赤／緑）ハイブリッドがＯＮＬで検出され、ＩＮＬには少なかった。これらのＹＦＰ陽性ハイブリッド（ＹＦＰ、緑）は、桿体細胞（ロドプシン；ｂの赤）およびミュラー細胞（グルタミンシンセターゼ；ｃの赤）に対するマーカーも陽性であるが、錐体（ｄ）に対するマーカーは陰性であった。（ｅ〜ｇ）ｐ１０  Ｒ２６Ｙｒｄ１眼に非ＢＩＯ処理（Ｎｏ  ＢＩＯ）およびＢＩＯ処理（ＢＩＯ）ＨＳＰＣＣＲＥを移植してから２４時間後のアポトーシス光受容器（ｅ）、アポトーシスハイブリッド（ｆ）および増殖ハイブリッド（ｇ）の定量。数値は、全光受容器核に対するＴＵＮＥＬ陽性光受容器のパーセンテージ（ｅ）またはＹＦＰ陽性ハイブリッド細胞の総数に対するアネキシンＶ（ｆ）もしくはＫｉ６７（ｇ）陽性細胞のパーセンテージとして算出した。（ｈ）ＨＳＰＣおよび網膜およびハイブリッド細胞（示した通り）で発現された遺伝子（示した通り）のリアルタイムＰＣＲ。ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層。
【図３】脱分化したハイブリッドの増殖および細胞死分析。ｐ１０においてＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥ（ＢＩＯ；ａ、ｃ）または非処理ＨＳＰＣＣＲＥ（Ｎｏ  ＢＩＯ；ｂ、ｄ）を移植してから２４時間後に分析したＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片に対するアネキシンＶ（ａ、ｂ）およびＫｉ６７（ｃ、ｄ）の代表的な免疫蛍光染色。ＹＦＰ蛍光（緑）は、融合後に得られたハイブリッドに局在する。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。黄色の矢印は、アポトーシスハイブリッド（ｂ）または増殖ハイブリッド（ｃ〜ｄ）を示す。
【図４】脱分化したハイブリッドにおける前駆体マーカーの発現の免疫蛍光分析。ｐ１０においてＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥ（ＢＩＯ；ａ〜ｃ）または非処理細胞（Ｎｏ  ＢＩＯ；ｄ〜ｆ）を移植してから２４時間後のＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片におけるＮｅｓｔｉｎ（ネスチン）（ａ、ｄ、赤）、Ｎｏｇｇｉｎ（ノギン）（ｂ、ｅ、赤）およびＯｔｘ２（ｃ、ｆ、赤）の代表的な免疫蛍光染色。融合後に得られたＹＦＰハイブリッド（緑）は、ＢＩＯ処理後にのみこれらのマーカーに関して陽性であった（ａ〜ｃ、黄色の矢印）。
【図５】ｒｄ１マウスにおける網膜再生の組織学的分析の経時的推移。（ａ〜ｈ）ｐ１０において非処理（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはＢＩＯ処理（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）ＨＳＰＣＲＦＰ／ＣＲＥを移植したＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片の代表的なＨ＆Ｅ染色（ａ、ｂ、ｅ〜ｈ）およびＴＵＮＥＬ染色（ｃ、ｄ；赤）、移植から５日後（ｐ１５；ａ〜ｄ）、１０日後（ｐ２０；ｅ、ｆ）および１５日後（ｐ２５；ｇ、ｈ）に分析。（ｉ−ｐ）移植無し（ｉ、ｊ、ｏ、ｐ）またはｐ１０（ｋ〜ｎ）において非処理（ｍ、ｎ）またはＢＩＯ処理（ｋ〜ｌ）ＨＳＰＣを移植した（ｍ〜ｎ）野生型（ｉ、ｊ）およびｒｄ１マウス（ｋ〜ｐ）の代表的なＨ＆Ｅ染色、総てｐ６０において分析。倍率：２０×  ａ〜ｈ、ｊ、ｌ、ｎ、ｐ；５×  ｉ、ｋ、ｍ、ｏ。ＯＮＬ：外顆粒層。
【図６】移植を行ったＲ２６Ｙｒｄ１眼の組織学的分析の経時的推移。（ａ）ｐ１０において非処理またはＢＩＯ処理ＨＳＰＣＲＦＰ／ＣＲＥを移植し、移植５日後（ｐ１５）、移植１０日後（ｐ２０）および移植１５日後（ｐ２５）に分析したＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片の代表的なＨ＆Ｅ染色およびＴＵＮＥＬ染色。（ｂ）非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＲＦＰ／ＣＲＥを移植したＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片の代表的な免疫染色。ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層。
【図７】ｐ６０におけるハイブリッド分化の分析。（ａ〜ｆ）移植無し（ｅ）およびｐ１０においてＢＩＯ処理ＨＳＰＣを移植した（ａ〜ｄ、ｆ）Ｒ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片の代表的な免疫蛍光染色、ｐ６０において分析。（ａ〜ｄ）ＹＦＰ陽性ハイブリッド（緑）はロドプシンに関して陽性であるが（ａ、赤）、錐体オプシン（ｂ、赤）、グルタミンシンセターゼ（ｃ、赤）、およびＣＤ３１（ｄ、赤）に関しては陰性である。下の画像：ＤＡＰＩ（青）で対比染色された核と共に、赤と緑のマージ。（ｅ〜ｆ）Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（ロドプシン）（赤）、Ｐｄｅ６ｂ（マゼンタ）およびＤＡＰＩ（青）で対比染色された核。（ｇ）非処理（ｒｄ１  ＮＴ）またはＢＩＯ処理ＨＳＰＣを移植した（ｒｄ１  ＢＩＯ）、野生型（ｗｔ）およびＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜におけるＰｄｅ６ｂタンパク質発現のウエスタンブロット、総てｐ６０に分析。全タンパク質溶解液を抗β−アクチン抗体で正規化した。ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＧＣＬ：神経節細胞層。
【図８】ＹＦＰ陽性ハイブリッドはＰＤＥ６Ｂを発現する。（ａ）ｐ１０において非処理ＨＳＰＣＣＲＥ細胞を移植してから２か月後のＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜切片におけるロドプシン（赤）の代表的な免疫蛍光染色。ＹＦＰハイブリッド（緑）陽性光受容器もロドプシン（赤）陽性光受容器も検出されなかった。核はＤＡＰＩで対比染色した。（ｂ）ｐ１０においてＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥを移植したＲ２６Ｙｒｄ１マウスの代表的な網膜切片、ｐ６０において分析。ＹＦＰ陽性ハイブリッド（緑）は、ロドプシン（赤）およびＰｄｅ６ｂ（マゼンタ）の両方に対して陽性であった。マージした画像の核はＤＡＰＩ（青）で対比染色された。ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＧＣＬ：神経節細胞層。
【図９】ｉｎ−ｖｉｖｏにおける傷害依存性細胞融合。（Ａ）細胞融合実験計画の概略図。赤で標識したＳＰＣＣｒｅとＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰマウス（Ｒ２６Ｙ）の網膜ニューロンとのｉｎ−ｖｉｖｏ細胞融合は、網膜ニューロンにおけるｆｌｏｘｅｄ終止コドンの切除、およびその後のＹＦＰの発現をもたらす。得られるハイブリッドはＹＦＰを発現し、かつ、赤で標識もされる。（Ｂ、Ｃ）ＨＳＰＣＲＦＰ／Ｃｒｅを移植したマウスのＲ２６Ｙ  ＮＭＤＡ傷害網膜（Ｂ）または健常網膜（Ｃ）の共焦点光学顕微鏡写真。マウスは組織傷害から２４時間後に犠牲にした。細胞融合から得られた二重陽性ＲＦＰ（赤）およびＹＦＰ（緑）ハイブリッドはＮＭＤＡ傷害の存在下では検出されるが（Ｂ、ＮＭＤＡ）、傷害を受けていない眼では検出されない（Ｃ、Ｎｏ  ＮＭＤＡ）。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。ｏｎｌ：外顆粒層；ｉｎｌ：内顆粒層；ｇｃｌ：神経節細胞層。スケールバー：５０μｍ。（Ｄ）細胞移植から２４時間後に形成されていたハイブリッドの、視野に局在した総ての赤色のＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰに対するＹＦＰ陽性細胞のパーセンテージとしての定量。ＮＭＤＡ傷害を受けた眼および傷害を受けていない眼（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）の切片を分析した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝９０（各眼について１０枚の異なる網膜連続切片の、異なる３視野。３つの異なる眼を分析した）。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｅ〜Ｇ）：網膜融合細胞相手の免疫組織化学分析。神経節細胞マーカー（Ｅ、Ｔｈｙ１．１、赤）、無軸索細胞マーカー（Ｆ、シンタキシン（sintaxin）、赤）に関しても陽性であり、またはミュラー細胞マーカー（Ｇ、ＧＳ、赤）に関して陰性であるＹＦＰハイブリッドは、ＮＭＤＡ傷害を受けた眼においてＨＳＰＣＣｒｅを移植してから１２時間後に検出される。黄色の矢印は、ＹＦＰおよびマーカー染色の両方に陽性である細胞を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図１０】細胞融合事象の分析。（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色（左）および網膜組織の概略図。（Ｂ）ＮＭＤＡ注射から４８時間後に犠牲にしたＲ２６Ｙマウスの眼の切片に対するＴＵＮＥＬ染色（緑）。（Ｃ）Ｒ２６ＹマウスにおけるＮＭＤＡ処理は、網膜ニューロンにおいてＹＦＰ発現（緑）を活性化しない。（Ｄ）細胞移植は各実験に対して少なくとも３つの異なる眼で行った。次に、各眼から得た計１０枚の連続切片で、各切片について異なる３領域を調べた。各切片において、網膜の３領域（４０×視野）内の免疫反応性マーカー陽性細胞、ＹＦＰ陽性細胞またはＧＦＰ陽性細胞の数を数えた。同じ視野内の前記の数と赤で標識された（ＤｉＤ）細胞またはＲＦＰ陽性細胞の総数との比から陽性細胞のパーセンテージを得た。網膜組織のｇｃｌおよびｉｎｌを含む領域において、４０×視野（赤い長方）を選択した。（Ｅ）４Ｃ  ＤＮＡ含量を有する四倍体細胞のフローサイトメトリー分析を、ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣｒｅを移植したＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ網膜から単離した全細胞に対して行った。細胞周期のＧ２／Ｍ期における四倍体細胞の存在は、ＲＦＰ陽性細胞（ハイブリッド）にゲートを設定した際に検出されたが（右のグラフ）、対照の非融合ＲＦＰ  ＨＳＰＣＣｒｅでは検出されなかった（左のグラフ）。（Ｆ）網膜融合相手の統計分析。数値は、ＮＭＤＡ傷害を受けたＲ２６Ｙ眼にＨＳＰＣＣｒｅを移植してから１２時間後に検出された、神経節細胞マーカー、無軸索細胞マーカーまたはミュラー網膜細胞マーカーのいずれかに関して陽性であるＹＦＰハイブリッドのパーセンテージを表す。
【図１１】ＥＳＣおよびＲＳＰＣ融合事象の分析。（Ａ）細胞傷害を誘導するためにＮＭＤＡで２４時間前処理したマウスの眼、または健常眼（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）のいずれかに注射したＤｉＤ−ＥＳＣＣｒｅおよびＤｉＤ−ＲＳＰＣＣｒｅの代表的なサンプル。細胞注射（ＤｉＤ細胞、赤）から２４時間後のＲ２６Ｙ眼において、ＹＦＰ発現（ＹＦＰ、緑）はＮＭＤＡ傷害を受けた眼（ＮＭＤＡ）では検出されたが、傷害を受けていない眼（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）では検出されなかった。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。スケールバー：２０μｍ。（Ｂ）視野に局在する移植されたＤｉＤ−ＥＳＣＣｒｅおよびＤｉＤ−ＲＳＰＣＣｒｅの総数に対するパーセンテージとしてのＹＦＰ陽性細胞の定量。ＮＭＤＡ傷害を受けた眼および傷害を受けていない眼の切片を、移植から２４時間後に犠牲にしたマウスで分析した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０（各眼について１０枚の異なる網膜連続切片の、異なる３領域）。Ｐ値＜０．００１（＊＊＊）。（Ｃ）ＮＭＤＡ（硝子体内）およびＢｒｄＵ（腹腔内）をＲ２６Ｙマウスに注射し；１日後に非標識ＥＳＣを注射し（硝子体内）、最後に、さらに２４時間後に犠牲したマウスの眼の切片にＢｒｄＵ染色を行った。ｇｃｌにおいて全ＢｒｄＵ陽性細胞（赤矢印）を４０×視野で計数した。ＹＦＰ陽性ハイブリッドはＢｒｄＵ染色に陽性ではなかった（緑矢印）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０。
【図１２】融合後の網膜ニューロンのリプログラミングの分析。（Ａ）ＮＭＤＡもしくはＮＭＤＡとＤＫＫ１の両方のいずれかで処理した眼、または対照としての非処理の眼からの切片に対して、抗β−カテニン抗体を用いた免疫蛍光染色（赤）を行った。ＮＭＤＡ傷害を受けた眼において検出された網膜細胞におけるβ−カテニンの発現および核蓄積（赤矢印）は、ＤＫＫ１処理後に減少する。スケールバー：２０μｍ。（Ｂ）ｉｎ−ｖｉｖｏリプログラミング実験計画の概略図。非処理（対照）またはＢＩＯで２４時間処理した、赤で標識したＳＰＣを、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ−ＰｕｒｏレシピエントマウスのＮＭＤＡ傷害を受けた眼または傷害を受けていない眼に注射した。リプログラミングされたハイブリッドにおけるＧＦＰの発現を注射１日後に分析した。（Ｃ）ＮＭＤＡ処理は、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ網膜ニューロンにおいてＧＦＰ発現（緑）を活性化しない。（Ｄ〜Ｆ）ＨＳＰＣのＢＩＯ処理は、標的遺伝子Ａｘｉｎ２のＲＴ−ＰＣＲにより（Ｄ）、または非処理細胞（Ｅ）もしくはＢＩＯ処理細胞（Ｆ）におけるβ−カテニンの核移行により示されるように、β−カテニンシグナル伝達を活性化する。（Ｇ）健常なＮａｎｏｇ−ＧＦＰ眼にＢＩＯ処理ＨＳＰＣＲＦＰ（赤）を移植してもＮａｎｏｇ−ＧＦＰ導入遺伝子（緑）の再活性化は誘導されない。核はＤＡＰＩで対比染色した。
【図１３】Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、ｉｎ−ｖｉｖｏ細胞融合後のニューロンのリプログラミングを促進する。（Ａ）ｉｎ−ｖｉｖｏリプログラミング実験計画の概略図。Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥマウスに、ＨＳＰＣＲ２６Ｙ注射の１日前に、ＮＭＤＡとＤＫＫ１の両方、ＮＭＤＡ単独、または対照としてのＰＢＳの硝子体内注射を施した。移植前にＨＳＰＣＲ２６ＹをＷｎｔ３ａまたはＢＩＯによる前処理を行いまたは行わずに、ＤｉＤ赤色素で標識した。サンプルを細胞移植から２４時間後に分析した。細胞融合およびリプログラミングの結果としてのみ、Ｎｅｓｔｉｎプロモーターの活性化により成体マウスで再発現されるＣｒｅがハイブリッドにおいてＹＦＰの発現を誘導することができ、前記ハイブリッドは赤色の膜を保持する。（Ｂ）ＤＫＫ１無しのＮＭＤＡの存在下でのみ、移植された赤色のＨＳＰＣＲ２６ＹはＹＦＰの発現を開始する（緑矢印）。黄色の矢印は、赤と緑の二重陽性細胞を示す。移植前に赤色のＨＳＰＣＲ２６ＹをＷｎｔ３ａで前処理すると、二重陽性赤／緑ハイブリッドの量が増える。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ〜Ｄ）非処理ＨＳＰＣの移植またはＷｎｔ３ａもしくはＢＩＯ処理ＨＳＰＣの移植から２４時間後に、ＮＭＤＡ、ＮＭＤＡ＋ＤＫＫ１で処理した、または非処理（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）の、Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥ（Ｃ）網膜またはＮａｎｏｇ  ＧＦＰ（Ｄ）網膜で検出された二重赤／緑（ＤｉＤ／ＹＦＰ）陽性ハイブリッドの数の統計分析。パーセンテージは、これらの視野で検出された赤色のＨＳＰＣの総数に対するＹＦＰ陽性細胞の数として算出した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝９０。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｅ）非傷害（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ網膜およびＷｎｔ３ａで前処理したＨＳＰＣを移植したＮＭＤＡ  Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ網膜（ＮＭＤＡ＋Ｗｎｔ３ａ）の、移植から２４時間後の共焦点光学顕微鏡写真。
【図１４】Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞融合後にニューロンのリプログラミングを促進する。（Ａ）Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ−ｐｕｒｏマウスにおいてＰＢＳ注射（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）またはＮＭＤＡ注射から２４時間後にＤｉＤ−ＥＳＣを注射した場合の代表的なサンプル。ＥＳＣ注射から２４時間後に、ＮＭＤＡ傷害を受けた（ＮＭＤＡ）眼ではＥＳＣ−ニューロンハイブリッド（赤と緑）にＮａｎｏｇ−ＧＦＰ発現（緑）が検出されるが、非処理の眼（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）では検出されない。ＤＫＫ１で前処理すると（ＮＭＤＡ＋ＤＫＫ１）、ＧＦＰ陽性ハイブリッドの数が減少する。ＥＳＣをＢＩＯおよびＷｎｔ３ａで前処理すると、非処理ＥＳＣ（Ｎｏ  ＢＩＯ）に比べてＧＦＰ陽性のリプログラミングニューロン（赤／緑）の数が増加した。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。スケールバー：２０μｍ。（Ｂ）ＢＩＯで処理した（ＢＩＯ）または非処理の（Ｎｏ  ＢＩＯ）ＥＳＣを移植したＮＭＤＡ傷害Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ眼から単離したハイブリッドをｉｎ  ｖｉｔｒｏピューロマイシン選択下で培養したもの。１か月の細胞培養後に検出された平均２３のＧＦＰ陽性クローン。クローンはアルカリ性ホスファターゼ  染色にも陽性である。（Ｃ）移植されたＲＳＰＣ（赤）は、ＢＩＯ処理の存在下または不在下でＮＭＤＡ傷害を受けた網膜ニューロンをリプログラミングしない。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。（Ｄ）ＮＭＤＡで前処理した（ＮＭＤＡ）または非処理の（Ｎｏ  ＮＭＤＡ）Ｒ２６Ｙ眼において非処理またはＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣｒｅ（白いバー）、ＥＳＣＣｒｅ（グレーのバー）またはＲＳＰＣＣｒｅ（黒いバー）のいずれかを注射した後のＹＦＰ−ハイブリッドのパーセンテージの統計分析。
【図１５】リプログラミングされたハイブリッドの特徴。（Ａ）Ｒ２６Ｙ  ＮＭＤＡ傷害眼にＢＩＯ（黒いバー）処理または非ＢＩＯ処理（グレーのバー）ＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰを移植してから２４時間後にＦＡＣＳにより選別されたＲＦＰ陽性ハイブリッドにおける種々の遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｂ）ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣｒｅを移植し、その後、抗Ｏｃｔ４抗体、抗Ｎａｎｏｇ抗体、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体、抗ｃＫｉｔ抗体または抗Ｔｕｊ−１抗体で染色したＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ網膜の共焦点光学顕微鏡写真。ＹＦＰ陽性ハイブリッド（緑）はＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＮｅｓｔｉｎ発現に関しても陽性（赤、矢印）であったが、ｃ−ＫｉｔまたはＴｕｊ−１に対しては陽性でなかった（緑、矢印）。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ〜Ｄ）Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰマウスのＮＭＤＡ傷害眼にＢＩＯ処理およびＤｉＤ標識ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣを移植してから２４時間後にＦＡＣＳ選別したハイブリッドにおいて、マウス（Ｃ）またはヒト（Ｄ）特異的オリゴを用いたＲＴ−ＰＣＲにより種特異的遺伝子発現を評価した。（Ｅ〜Ｊ）ＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ眼の硝子体内にＢＩＯ処理（ＢＩＯ）または非処理（Ｎｏ  ＢＩＯ）ＨＳＰＣＣｒｅを注射し、２４時間後に分析した。ＹＦＰ陽性ハイブリッド（緑）の増殖（Ｅ〜ＧおよびＩ）および細胞死（Ｆ、ＨおよびＪ）を評価するために、抗Ｋｉ６７抗体（ＧおよびＩ、赤）または抗アネキシンＶ抗体（ＨおよびＪ）のいずれかで切片を染色した。陽性ハイブリッドの量は、ＹＦＰハイブリッドの総数に対するＫｉ６７陽性細胞（Ｅ）またはアネキシンＶ陽性細胞（Ｆ）のパーセンテージとして評価した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０。Ｐ値＜０．００１（＊＊＊）。ＧおよびＪの黄色の矢印は、それぞれＫｉ６７陽性またはアネキシンＶ陽性ハイブリッドを示した。スケールバー：５０μｍ。（Ｋ〜Ｌ）Ｒ２６ＹマウスのＮＭＤＡ傷害眼にＢＩＯ処理（Ｋ）または非処理（Ｌ）ＨＳＰＣＣｒｅを注射した後に形成されたＹＦＰハイブリッドで、ＥＳＣマーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）、中胚葉マーカー（Ｇａｔａ４）、内胚葉マーカー（Ｈａｎｄ１）、神経外胚葉マーカー（Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２）、ＨＳＰＣマーカー（ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ１）または最終分化ニューロンマーカー（Ｔｕｊ−１）の発現を評価した（マウスは細胞移植から２４時間後（白いバー）、４８時間後（グレーのバー）および７２時間後（黒いバー）に犠牲にした）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０。
【図１６】ハイブリッドにおける増殖および遺伝子発現。（Ａ〜Ｂ）移植していないＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ網膜（Ａ）または非処理（Ｎｏ  ＢＩＯ、グレーのバー）もしくはＢＩＯ処理（ＢＩＯ、黒いバー）ＨＳＰＣ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｃ）ＤｉＤ標識およびＢＩＯ処理ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣ（赤）を移植したＮＭＤＡ傷害Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ網膜の共焦点光学顕微鏡写真。ＹＦＰ陽性ハイブリッド（緑／赤の細胞、黄色の矢印）が検出された。（Ｄ〜Ｅ）ＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ眼にＢＩＯ処理または非処理ＥＳＣを注射した後に得られたＹＦＰ陽性のリプログラミングされたハイブリッドに対して、Ｋｉ６７（Ｄ）およびアネキシンＶ（Ｅ）染色を行った。陽性ハイブリッドは、ＹＦＰハイブリッドの総数に対する陽性細胞のパーセンテージとして評価した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０。Ｐ値＜０．００１（＊＊＊）。（Ｆ）Ｒ２６ＹマウスのＮＭＤＡ傷害眼にＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣｒｅを注射した後に形成されたＹＦＰハイブリッドで、中胚葉マーカー（Ｇａｔａ４）、内胚葉マーカー（Ｈａｎｄ１）、神経外胚葉マーカー（Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２）、最終分化ニューロンマーカー（Ｔｕｊ−１）またはＥＳＣマーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）の発現を評価した（マウスは細胞移植から２４時間後（白いバー）、４８時間後（グレーのバー）および７２時間後（黒いバー）に犠牲にした）。データはｎ＝３０の平均である。
【図１７】ＮＭＤＡ傷害網膜は、移植されたＨＳＰＣの融合後に再生することができる。（Ａ）ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣｒｅ移植から１か月後のＮＭＤＡ傷害網膜における、内顆粒層の厚み（ｉｎｌ、括弧）の増加および神経節細胞層の再生（ｇｃｌ、矢印の先）を示すＨ＆Ｅ染色。矢印は、ＮＭＤＡ傷害網膜における神経節細胞の欠如を示した。スケールバー：５０ｍｍ。（Ｂ〜Ｃ）ＢＩＯ処理（ＢＩＯ）または非処理ＨＳＰＣを移植した傷害（ＮＭＤＡ）または非傷害網膜の垂直網膜切片において計数した、ｇｃｌ（Ｂ）の神経節核およびｉｎｌ（Ｃ）の核列の定量。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝３０）。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ｇｃｌのニューロンを、鼻側頭軸（左）および背腹軸（右）に沿って計数し、１平方ミリメートル当たりの細胞をグラフ化した。各サンプルについて、網膜全体を含む計８０の異なる画像を計数した。データは３つの網膜からの平均±ｓ．ｅ．ｍである。＊Ｐ＜０．０１。ＯＮ：視神経。（Ｅ）内皮細胞を除くｇｃｌの全細胞を、鼻側頭軸（左）および背腹軸（右）に沿って計数し、密度マップとしてグラフ化した。濃い赤は、カラーバーに示すように１０，０００細胞／ｍｍ２の細胞密度に相当する。
【図１８】細胞融合を介したリプログラミングの後に得られるハイブリッドの長期分化能。（Ａ）ＮＭＤＡ傷害を受けたＲ２６Ｙ網膜におけるＢＩＯ処理または非処理ＨＳＰＣＣｒｅから１か月後にＹＦＰ＋ハイブリッドを同定するための実験戦略。（Ｂ）ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣｒｅ移植から１か月後のＮＭＤＡ損傷Ｒ２６Ｙ網膜のフラットマウントでＹＦＰ＋ニューロンが検出された。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。スケールバー：５０μｍ。高倍率のＹＦＰ＋ニューロンを右のパネルに示す。（Ｃ）ＹＦＰ＋分化ハイブリッド（緑）は、神経節細胞マーカーＳＭＩ−３２（左、赤）または無軸索細胞マーカーＣｈａｔ（右、赤）のいずれかを発現した。（Ｄ）ＹＦＰ＋軸索（緑）は、ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣｒｅを移植した眼の視神経には検出されたが、非処理ＨＳＰＣＣｒｅを用いた場合には検出されなかった。視神経における高倍率のＹＦＰ＋陽性軸索（緑）を右のパネルに示す。
【図１９】骨髄補充効率の分析ならびに内因性ＢＭ動員および細胞融合後のハイブリッド増殖およびアポトーシスの分析。（Ａ）骨髄補充から１か月後のマウスの代表的なヘモクロモサイトメトリック(haemochromocytometric)分析。（Ｂ〜Ｃ）ＢＭＲＦＰ／Ｃｒｅ補充を受けたマウスのＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ眼にＢＩＯを注射してから２４時間後に得られたＹＦＰ陽性のリプログラミングされたハイブリッドに対して、Ｋｉ６７（Ｂ）およびアネキシンＶ（Ｃ）染色を行った。
【図２０】傷害を受けた眼に動員された内因性ＢＭ由来細胞は網膜ニューロンと融合することができる。（Ａ）実験スキーム。Ｒ２６Ｙマウスに、亜致死線量照射後に尾静脈注射によりＢＭＲＦＰ／Ｃｒｅ移植を施した。ＢＭの再形成の後（１か月）、右眼にＮＭＤＡの硝子体内注射を施し、左眼には注射は行わず、マウスを２４時間後に分析した。動員されたＢＭ細胞（赤）とニューロンが細胞融合した場合にのみ、ＹＦＰ／ＲＦＰ二重陽性ハイブリッドが検出される。（Ｂ〜Ｆ）二重陽性ＹＦＰ／ＲＦＰハイブリッドは、ＮＭＤＡ傷害を受けた眼（Ｂ〜Ｃ、ＮＭＤＡ）では検出されたが、健常な眼（Ｄ〜Ｅ、Ｎｏ  ＮＭＤＡ）では検出されなかった。（Ｆ）検出されたＲＦＰ細胞の総数に対するＹＦＰ／ＲＦＰ二重陽性ハイブリッドのパーセンテージを算出した。（Ｇ〜Ｋ）網膜細胞融合相手の免疫組織化学的分析。ＹＦＰハイブリッド（緑）は、ＮＭＤＡ傷害から２４時間後に、Ｓｃａ１（Ｇ）およびｃ−Ｋｉｔ（Ｈ）ＨＳＰＣマーカー、ならびに神経節（Ｉ、Ｔｈｙ１．１、赤）、無軸索（Ｊ、シンタキシン、赤）およびミュラー（Ｋ、ＧＳ、赤）網膜細胞マーカーについても陽性である。黄色の矢印は、二重陽性細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図２１】内因性ＢＭの細胞融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングがＢＩＯにより誘導される。（Ａ）実験スキーム。Ｎｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウスに、亜致死線量照射後に尾静脈注射によりＢＭＲ２６Ｙ移植を施した。ＢＭ再形成後（１か月）、右眼にＢＩＯ＋ＮＭＤＡの硝子体内注射を施し、反対側の眼にＮＭＤＡ単独を注射した。動員されたＢＭＣＲ２６Ｙとニューロンの間のハイブリッドが細胞融合を介してリプログラミングされた場合にのみ、Ｎｅｓｔｉｎを介したＣｒｅ発現は、ＹＦＰの発現をもたらす。（Ｂ〜Ｃ）ＢＩＯ注射後（Ｃ）にのみ、動員されたＢＭ細胞と傷害ニューロンの融合後にＹＦＰ陽性のリプログラミングされたハイブリッド（緑）が検出された。これに対して、ＢＩＯを用いない場合のＮＭＤＡ傷害眼ではＹＦＰハイブリッド（Ｂ）は見られなかった。（Ｄ〜Ｅ）増殖ハイブリッド（Ｋｉ６７陽性、Ｄ）または死滅ハイブリッド（アネキシンＶ陽性、Ｅ）のパーセンテージは、ＹＦＰ細胞の総量に対するＹＦＰ二重陽性細胞の数として評価した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０。（Ｆ〜Ｉ）ＮＭＤＡ＋ＢＩＯ処理網膜の共焦点光学顕微鏡写真は、ＹＦＰリプログラミングハイブリッド（緑、ＧおよびＩのマージを参照）におけるＯｃｔ４タンパク質（Ｆ〜Ｇの赤）およびＮａｎｏｇ（Ｈ〜Ｉの赤）タンパク質の発現を示す。Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ陽性ハイブリッド（Ｅ）のパーセンテージは、ＹＦＰ細胞の総量に対するＹＦＰ二重陽性細胞の数として評価した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；ｎ＝３０。
【図２２】ＨＳＰＣ移植後のマクロファージ／単球分析。（Ａ）非処理ＨＳＰＣの移植から１か月後の、フラットマウントしたＮＭＤＡ傷害網膜の代表的な共焦点画像。わずかなＹＦＰ＋細胞（緑）だけが検出された。スケールバー：５０μｍ。（Ｂ）ＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ眼にＨＳＰＣＣｒｅを移植してから２４時間後に採取した視神経。スケールバー：２００μｍ。（Ｃ〜Ｆ）ＮＭＤＡ傷害Ｒ２６Ｙ眼にＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰを移植してから２４時間後（Ｃ、Ｄ）および２週間後（Ｅ、Ｆ）にＣＤ４５（Ｃ〜Ｅ）およびＭａｃ１（Ｄ〜Ｆ）染色にも陽性であるＲＦＰ＋／ＹＦＰ＋ハイブリッドのパーセンテージとしてのＦＡＣＳ分析。
【発明の具体的な説明】
【００１４】
網膜再生は、対象の網膜にいくつかの細胞種を移植することによって達成することができ、前記細胞は、造血幹細胞、前駆細胞および／または間葉幹細胞などの幹細胞または前駆細胞の特性を有する。これらの細胞は網膜ニューロン、例えば、桿体、神経節細胞、および無軸索細胞などの網膜細胞、または網膜グリア細胞、例えば、ミュラー細胞と融合してハイブリッド細胞を形成し、次に、脱分化し、例えば光受容細胞および／または神経節細胞などの目的の網膜ニューロンに最終的に分化するが、この場合、前記ハイブリッド細胞の脱分化および目的の網膜ニューロンへの最終的な再分化を誘導するためには、移植細胞またはハイブリッド細胞内でのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化が不可欠である。一実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、少なくとも部分的に、移植細胞（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理されており、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する）により提供されるが、別の実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、処置を受ける対象に単にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターもしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤を投与する結果として、または例えば網膜変性疾患で起こるような網膜傷害もしくは損傷の結果として提供される。
【００１５】
その細胞と融合した網膜細胞の、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化を介したリプログラミングにより網膜変性疾患を処置するための、幹細胞または前駆細胞の特性を有する細胞の使用
処置Ａ
一態様において、本発明は、網膜変性疾患の処置において使用するための細胞に関し、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される。言い換えれば、この態様によれば、本発明は、網膜変性疾患の処置において使用するための、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択される細胞であって、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている細胞を提供する。
【００１６】
よって、本発明は、網膜変性疾患の処置において使用するための、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理され、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される細胞を提供する。前記処置、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現するための細胞操作の結果として、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、網膜変性疾患の処置において使用することができる。この目的で、このような処理または操作が施された前記細胞は、網膜変性疾患の処置を必要とする対象の眼に移植される。
【００１７】
言い換えれば、本発明のこの態様は、網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される細胞の使用に関し；あるいは、本発明のこの態様は、網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理され、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される細胞の使用に関する。
【００１８】
処置Ａによれば、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、少なくとも部分的に、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される移植細胞により提供される。処置を受ける対象は、網膜傷害または損傷後にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化させている。一般に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、標的遺伝子が転写された際に活性化され；例として、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、例えばＡｘｉｎ２などの標的遺伝子の発現を分析することによるか、例えばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）などの遺伝子発現を分析するための当業者に公知の手段によるか、あるいは例えば、免疫染色などの従来技術による細胞の核内へのβ−カテニンの移行を検出することによるなどの従来技術によるか、またはＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのリン酸化もしくはＬＲＰテールのリン酸化の検出により確認することができる。
【００１９】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化される様式は様々であってよい。例として、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択される細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、下記に述べるが、前記経路が活性化されるように、前記細胞をＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理することによるか、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターとしてのタンパク質またはペプチドを過剰発現するように細胞を操作することによって達成することができる。あるいは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、例えば網膜変性疾患で起こるような網膜傷害もしくは損傷の結果として、または以下に述べるが、前記経路が活性化されるように、処置を受ける対象にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターもしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤を投与することによって達成することができる。
【００２０】
本明細書において用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）のあらゆる血液細胞種を生じる多能性幹細胞（multipotent stem cell）を意味する。ＨＳＣは、ヘテロな集団である。血中のリンパ系後代と骨髄系後代の比（Ｌ／Ｍ）で識別される３つのクラスの幹細胞が存在する。骨髄偏向（Ｍｙ−ｂｉ）ＨＳＣは低Ｌ／Ｍ比（＞０、＜３）を有し、リンパ偏向（Ｌｙ−ｂｉ）ＨＳＣは大きな比（＞１０）を示す。３つ目のカテゴリーは、バランスの取れた（Ｂａｌａ）ＨＳＣ（３≦Ｌ／Ｍ≦１０）からなる。幹細胞として、ＨＳＣは、あらゆる血液細胞種を補うそれらの能力（多能性）およびそれらの自己再生能によって定義される。表現型に関して、ＨＳＣは、小さいサイズ、細胞系（ｌｉｎ）マーカーの欠如、ローダミン１２３（ローダミンＤＵＬＬ、ｒｈｏｌｏとも呼ばれる）またはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などの生体染色色素による低い染色（サイドポピュレーション）、およびそれらの表面の種々の抗原マーカーの存在によって特定される。ヒトでは、ＨＳＣの大部分はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である。しかしながら、総てのＨＳＣが前記組合せによってカバーされるわけではないが、それにもかかわらず、これが周知となっている。実際に、ヒトでさえ、ＣＤ３４−ＣＤ３８−のＨＳＣが存在する。好ましい実施形態では、ＨＳＣは哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞である。
【００２１】
特定の実施形態では、ＨＳＣは、長期型ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、すなわち、何ヶ月もまたは一生であっても造血に寄与することができる造血幹細胞であり、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏｗ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋を特徴とする。
【００２２】
別の特定の実施形態では、ＨＳＣは、短期型ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、すなわち、数週間に限定される再形成能を有するＨＳＣであり、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏｗ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏｗである。
【００２３】
本明細書において用語「ＣＤ３４」は、ヒト体内の特定の細胞上に存在する分化抗原群(cluster of differentiation)を意味する。ＣＤ３４は細胞表面糖タンパク質であり、細胞−細胞接着因子として機能する。ＣＤ３４はまた、幹細胞の、骨髄細胞外マトリックスまたは直接的には間質細胞への接着を媒介する。ＣＤ３４を発現する細胞（ＣＤ３４＋細胞）は通常、臍帯および骨髄には造血細胞、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、血管内皮細胞として見られるが、リンパ管には見られない。ヒトＣＤ３４の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２８９０６（２０１２年７月２６日）を有する。
【００２４】
本明細書において用語「ＣＤ３８」は、サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られる分化抗原群３８を意味し、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞（白血球細胞）の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ３８はまた、細胞接着、シグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達において機能する。ＣＤ３８は、シグナル伝達分子として機能し、リンパ球と内皮細胞の間の接着を媒介する、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ３８はまた、セカンドメッセンジャーサイクリックＡＤＰリボースの形成および加水分解に酵素的に機能する。造血系において、ＣＤ３８は形質細胞で発現が最も高い。ヒトＣＤ３８の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２８９０７（２０１２年７月２６日）を有する。
【００２５】
本明細書において用語「ＣＤ９０」またはＴｈｙ−１は分化抗原群９０を意味し、最初に胸腺細胞抗原として発見され、単一のＶ様免疫グロブリンドメイン（この免疫グロブリンドメインは、ギリシャキートポロジーを有する２つのβ−シート内に配置された７と９の逆平行β−ストランド間の２層サンドイッチからなるタイプのタンパク質ドメインである）を有する、２５〜３７ｋＤａの、高度にＮ−グリコシル化された、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の保存された細胞表面タンパク質である。ヒトＣＤ９０の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１６（２０１２年７月２６日）を有する。
【００２６】
本明細書において用語「ＣＤ４５」は、単一の複合遺伝子の全産物である複数のメンバーからなるファミリーを意味する。この遺伝子は３４のエキソンを含み、一次転写産物の３つのエキソンは選択的にスプライシングされて、最大８つの異なる成熟ｍＲＮＡ、そして、翻訳後には８つの異なるタンパク質産物を生成する。これらの３つのエキソンは、ＲＡ、ＲＢおよびＲＣアイソフォームを生成する。ＣＤ４５には種々のアイソフォームが存在する：ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）。ヒトＣＤ４５の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８５７５（２０１２年７月２６日）を有する。
【００２７】
用語「ＳＣＡ−１」は、ａｔａｘｉｎ  １（アタキシン１）を意味し、その機能は未知である。ヒトＳＣＡ−１の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５４２５３（２０１２年７月２６日）を有する。
【００２８】
用語「ｃ−ｋｉｔ」は、癌原遺伝子ｃ−Ｋｉｔまたはチロシンタンパク質キナーゼＫｉｔまたはＣＤ１１７としても知られる肥満／幹細胞増殖因子受容体（ＳＣＦＲ）を意味し、ヒトではＫＩＴ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＣＤ１１７は、「スティール因子」または「ｃ−ｋｉｔリガンド」としても知られる幹細胞因子と結合する受容体チロシンキナーゼＩＩＩ型である。ヒトｃ−ｋｉｔの全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０７２１（２０１２年７月２６日）を有する。
【００２９】
本明細書において用語「ＣＤ１３５」は、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）または受容体型チロシンタンパク質キナーゼとしても知られる分化抗原群抗原１３５（ＣＤ１３５）を意味する。ＣＤ１３５は、造血前駆細胞の表面に発現されるサイトカイン受容体である。ヒトＣＤ１３５の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６８８８（２０１２年７月２６日）を有する。
【００３０】
本明細書において用語「ＳＬＡＭＦ１」は、シグナル伝達リンパ球活性化分子(lymphocytic activation molecule)を意味し、ヒトではＳＬＡＭＦ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＳＬＡＭＦ１は、最近ＣＤ１５０（分化抗原群１５０）と呼ばれるようになった。ヒトＳＬＡＭＦ１の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３２９１（２０１２年７月２６日）を有する。
【００３１】
本明細書において用語「Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）」は、マクロファージ−１抗原（Ｍａｃ−１）または補体受容体３（ＣＲ３）として知られるヘテロ二量体インテグリンα−Ｍ  β−２（αＭβ２）分子を形成する、１つのタンパク質サブユニットであるインテグリンαＭ（ＩＴＧＡＭ）を意味する。ＩＴＧＡＭはまたＣＲ３Ａ、および分化抗原群分子１１Ｂ（ＣＤ１１Ｂ）としても知られる。ヒトＭａｃ−１の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１１２１５（２０１２年７月２６日）を有する。
【００３２】
用語「ｌｉｎ」は、サンプルから成熟造血細胞を取り出すように設計された抗体の標準カクテルである細胞系マーカーを意味する。これらの抗体は、マウスではＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、ＴＥＲ−１１９、およびＧｒ−１、ヒトではＣＤ３（Ｔリンパ球）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞、顆粒球）、ＣＤ１９（Ｂリンパ球）、ＣＤ２０（Ｂリンパ球）、およびＣＤ５６（ＮＫ細胞）を標的とする。
【００３３】
「前駆細胞」は、分化により幹細胞から誘導され、より成熟した細胞種にさらに分化することができる細胞を意味する。前駆細胞は一般に、幹細胞に比べて限定された増殖能を有する。特定の実施形態では、前駆細胞は、ＨＳＣから分化した機能的細胞への進行の過程で、分化によりＨＳＣから誘導される造血前駆細胞である。前記造血前駆細胞は、マーカーＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４５ＲＡ−を特徴とする。好ましい実施形態では、前駆細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００３４】
特定の実施形態では、前駆細胞は、ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１−、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５＋、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０−、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏｗ、ＣＤ４ｌｏｗを特徴とする初期多分化能前駆細胞(Early Multipotent Progenitor)（Ｅａｒｌｙ  ＭＰＰ）である。
【００３５】
別の特定の実施形態では、前駆細胞は、ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１−、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５ｈｉｇｈ、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０−、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏｗ、ＣＤ４ｌｏｗにより定義される後期多分化能前駆細胞(Late Multipotent Progenitor)（Ｌａｔｅ  ＭＰＰ）である。
【００３６】
別の特定の実施形態では、前駆細胞は、ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋を特徴とする細胞系列限定前駆（ＬＲＰ）細胞である。
【００３７】
別の特定の実施形態では、前駆細胞は、骨髄球性共通前駆細胞(Common Myeloid Progenitor)（ＣＭＰ）、すなわち、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ３ＲａｌｏｗＣＤ４５ＲＡ−を特徴とする骨髄性細胞を生成するコロニー形成単位である。別の特定の実施形態では、前駆細胞は、顆粒球−マクロファージ前駆細胞(Granulocyte-Macrophage Progenitor)（ＧＭＰ）、すなわち、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ３Ｒａ−ＣＤ４５Ｒａ−を特徴とする単芽球および骨髄芽球の前駆細胞である。
【００３８】
別の特定の実施形態では、前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ３ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＡ−を特徴とする巨核球赤血球系前駆細胞(Megakaryocyte-Erythroid Progenitor)（ＭＥＰ）である。
【００３９】
本明細書において用語「ＣＤ４」は、分化抗原群４を意味する。ＣＤ４は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ４は、抗原提示細胞とともにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を補助する共受容体である。ＣＤ４は、Ｔ細胞内に存在するその一部を用いて、活性化されたＴ細胞のシグナル伝達カスケードに関与する多くの分子を活性化するために不可欠な酵素（チロシンキナーゼｌｃｋとして知られる）を動員することにより、ＴＣＲが生成したシグナルを増幅する。ＣＤ４はまた、その細胞外ドメインを用いて、抗原提示細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と直接相互作用する。ヒトＣＤ４の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１７３０（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４０】
本明細書において用語「ＣＤ２４４」は、ＣＤ２４４分子、すなわち、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４である。この遺伝子は、非主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）拘束細胞死を媒介するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（および一部のＴ細胞）上で発現される細胞表面受容体をコードする。この受容体を介するＮＫ細胞と標的細胞の間の相互作用は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性を調節すると考えられる。ヒトＣＤ２４４の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＢＺＷ８（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４１】
本明細書において用語「ＩＬ３ＲＡ」は、ＣＤ１２３（分化抗原群１２３）としても知られるインターロイキン３受容体α（低親和性）（ＩＬ３ＲＡ）を意味し、４１．３ＫｄａのＩ型膜貫通タンパク質であり、ＩＬ３ＲＡはインターロイキン３と相互作用することが示されている。ヒトＩＬ３ＲＡの全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２６９５１（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４２】
本明細書において用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、骨芽細胞（骨の細胞）、軟骨細胞（軟骨の細胞）、および脂肪細胞（脂肪の細胞）を含む、様々な細胞種に分化することができる多分化能間質細胞を意味する。間葉系幹細胞により発現されるマーカーとしては、ＣＤ１０５（ＳＨ２）、ＣＤ７３（ＳＨ３／４）、ＣＤ４４、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ７１およびＳｔｒｏ−１ならびに接着分子ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、およびＣＤ２９が含まれる。ＭＳＣの陰性マーカー（発現されない）としては、造血系マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０、ならびに接着分子ＣＤ３１がある。
【００４３】
本明細書において用語「ＣＤ１０５」は、細胞表面に存在するＩ型膜糖タンパク質であるエンドグリンを意味し、ＴＧＦβ受容体複合体の一部である。ヒトＣＤ１０５の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１７８１３（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４４】
本明細書において用語「ＣＤ７３」は、エクト−５’−ヌクレオチダーゼまたはＣＤ７３（分化抗原群７３）としても知られる５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴ）を意味し、ヒトではＮＴ５Ｅ遺伝子によりコードされている酵素である。ヒトＣＤ７３の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２１５８９（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４５】
用語「ＣＤ４４」は、細胞−細胞相互作用、細胞間接着および遊走に関与する細胞表面糖タンパク質である抗原に関する。ヒトＣＤ４４の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１６０７０（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４６】
本明細書において用語「ＣＤ７１」は、（分化抗原群７１）（ＣＤ７１）としても知られる、トランスフェリンから細胞へ鉄を送達するのに必要なタンパク質であるトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）である。ヒトＣＤ７１の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８６（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４７】
本明細書において用語「ＳＴＲＯ−１」は、骨髄間質細胞および赤血球前駆体により発現される細胞表面タンパク質を意味する。
【００４８】
用語「ＣＤ１０６」は、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）または分化抗原群１０６（ＣＤ１０６）としても知られる、ヒトではＶＣＡＭ１遺伝子によりコードされ、細胞接着分子として機能するタンパク質である血管細胞接着タンパク質１である。ヒトＣＤ１０６の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９３２０（２０１２年７月２６日）を有する。
【００４９】
本明細書において用語「ＣＤ１６６」は、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、１００〜１０５ｋＤのＩ型膜貫通糖タンパク質を意味する。ヒトＣＤ１６６の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３７４０（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５０】
本明細書において用語「ＣＤ２９」は、最晩期抗原受容体に会合したインテグリン単位であるインテグリンβ−１を意味する。ヒトＣＤ２９の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５５５６（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５１】
本明細書において用語「ＣＤ１４」は、先天免疫系の成分である分化抗原群１４を意味する。ヒトＣＤ１４の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８５７１（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５２】
本明細書において用語「ＣＤ８０」は、活性化されたＢ細胞および単球上に見られる、Ｔ細胞の活性化および生存に必要な共刺激シグナルを提供するタンパク質である分化抗原群８０（ＣＤ８０およびＢ７−１とも）を意味する。ヒトＣＤ８０の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３３６８１（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５３】
本明細書において用語「ＣＤ８６」は、抗原提示細胞上で発現される、Ｔ細胞の活性化および生存に必要な共刺激シグナルを提供するタンパク質である分化抗原群８６（ＣＤ８６およびＢ７−２としても知られる）を意味する。ヒトＣＤ８６の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４２０８１（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５４】
本明細書において用語「ＣＤ４０」は、抗原提示細胞上に見られる、それらの活性化に必要な共刺激タンパク質を意味する。ヒトＣＤ４０の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５９４２（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５５】
本明細書において用語「ＣＤ３１」は、身体からの加齢好中球の除去に重要な役割を果たすタンパク質である、分化抗原群３１（ＣＤ３１）としても知られる血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）を意味する。ヒトＣＤ３１の全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１６２８４（２０１２年７月２６日）を有する。
【００５６】
細胞におけるマーカーの有／無は、例えば、従来の方法および装置を用いたフローサイトメトリーの手段によって決定することができる。例えば、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳ）を市販の抗体とともに、当技術分野で公知のプロトコールに従って使用することができる。よって、バックグラウンドノイズよりも強い特異的細胞表面マーカーシグナルを発する細胞を選択することができる。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ分析において各表面マーカーを検出するために使用される特異的抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体によって示されるシグナル強度と定義される。マーカーが陽性とみなされるには、観察される特異的シグナルが、従来の方法および装置を用いて（例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳ）および市販の抗体を使用することにより）バックグラウンドシグナルよりも２０％、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％またはそれを超える強度でなければならない。そうでなければ、細胞は前記マーカーに関して陰性とみなされる。
【００５７】
特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する細胞は、ＨＳＣである。別の特定の実施形態では、前記細胞はＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣである。
【００５８】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する細胞は、前駆細胞である。別の特定の実施形態では、前記前駆細胞は、初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【００５９】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する細胞は、ＭＳＣである。
【００６０】
本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、前記細胞の集団の一部を形成してもよく、網膜変性疾患の処置におけるその使用は本発明のさらなる態様をなす。
【００６１】
よって、他の態様において、本発明はさらに、網膜変性疾患の処置において使用するための複数の細胞を含んでなる細胞集団に関し、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。よって、この態様によれば、本発明は、網膜変性疾患の処置において使用するための複数の細胞を含んでなる細胞集団を提供し、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている。
【００６２】
言い換えれば、本発明は、網膜変性疾患の処置において使用するための複数の細胞を含んでなる細胞集団に関し、前記細胞はＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、前記細胞はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理され、かつ／または前記細胞はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する。前記処置、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターとしてのタンパク質もしくはペプチドを過剰発現するための細胞操作の結果として、前記細胞集団の細胞は、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、網膜変性疾患の処置に使用することができる。この目的で、前記細胞集団は、網膜変性疾患の処置を必要とする対象の眼に移植される。
【００６３】
別法として企図される本発明のこの態様は、網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される複数の細胞を含んでなる細胞集団の使用に関し；あるいはまた、網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される複数の細胞を含んでなる細胞集団の使用に関し、前記細胞はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されるように、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理され、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する。
【００６４】
前記ＨＳＣ、前駆細胞、およびＭＳＣの詳細は従前に述べられている。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を目的とする上述の処置の詳細を下記に述べる。
【００６５】
特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、複数、すなわち、３以上のＨＳＣを含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。特定の実施形態では、前記ＨＳＣは、ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびそれらの組合せから選択される。
【００６６】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は複数の前駆細胞を含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。特定の実施形態では、前記前駆細胞は、初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰおよびそれらの組合せから選択される。
【００６７】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は複数のＭＳＣを含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。
【００６８】
特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は少なくとも１のＨＳＣと少なくとも１の前駆細胞を含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。特定の実施形態では、前記ＨＳＣ細胞はＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣであり；別の特定の実施形態では、前記前駆細胞は初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【００６９】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１のＨＳＣと少なくとも１のＭＳＣを含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。特定の実施形態では、前記ＨＳＣ細胞はＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣである。
【００７０】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１の前駆細胞と少なくとも１のＭＳＣを含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。特定の実施形態では、前記前駆細胞は初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【００７１】
別の特定の実施形態では、処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１のＨＳＣ、少なくとも１の前駆細胞および少なくとも１のＭＳＣを含んでなり、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する。特定の実施形態では、前記ＨＳＣ細胞はＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣであり；別の特定の実施形態では、前記前駆細胞は初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【００７２】
特定の実施形態では、骨髄から得ることができるＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣを含んでなる細胞集団は、本明細書において「ＨＳＰＣ」、すなわち、「造血幹細胞および前駆細胞」と呼ぶこともある。前記細胞集団ＨＳＰＣは、種々の比率または割合でＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣを含み得る。前記ＨＳＰＣ細胞集団は、例えば、骨髄から、あるいはまたＨＳＰＣ細胞集団を得るためにＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣを所望の比率または割合で混合することにより得ることができる。当業者には、前記細胞集団では、従来の手段、例えば、対応する表面マーカーに対する結合対の使用に基づく任意の好適な技術によって特定の細胞種を分離することにより任意の特定の細胞種を富化し得ることが理解されるであろう。よって、特定の実施形態では、ＨＳＰＣ細胞集団では、ＨＳＣ、または前駆細胞、またはＭＳＣを富化することができる。ＨＳＰＣとして特定される前記細胞集団が処置Ａに従った網膜変性疾患の処置において使用するために好適であるには、前記細胞集団の細胞が活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有することが必要である。
【００７３】
本発明の教示の範囲内での使用に関して、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有し、かつ、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉系幹細胞からなる群から選択される細胞、または本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、起こり得る拒絶または望ましくない副反応のリスクを最小にするために同じ対象に由来するもの、すなわち、自己のものであってよいが、本発明はまた、同種異系細胞、すなわち、レシピエント対象と同種の他の対象からの細胞の使用も企図し、この場合には、全身または局所的な免疫抑制剤の使用が推奨される場合があるが、網膜の免疫応答は低いので、細胞がＨＳＣ、前駆細胞、およびＭＳＣから選択されかつ前述のようにそれらのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されるような処理または操作を施されている限り、異なるヒト対象からの匹敵する細胞を使用することができる。
【００７４】
「Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路」という表現は、胚発生、細胞分化、および細胞極性の形成において様々な重要な役割を果たすタンパク質のネットワークを意味する。特に断りのない限り、これはカノニカルＷｎｔ経路を意味し、Ｗｎｔタンパク質がＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの細胞表面受容体に結合した際に起こる、これらの受容体にＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄファミリータンパク質を活性化させ、最後に核に到達するβ−カテニンの量に変化をもたらすという一連の事象を意味する。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＳＨ）は、Ｗｎｔの結合により活性化された際に、アキシン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）、および大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）タンパク質を含むタンパク質の二次複合体を阻害する膜結合型のＷｎｔ受容体複合体の重要な成分である。アキシン／ＧＳＫ−３／ＡＰＣ複合体は通常、β−カテニン細胞内シグナル伝達分子のタンパク質分解を促進する。このβ−カテニン破壊複合体が阻害された後、細胞質のβ−カテニンプールは安定化し、一部のβ−カテニンは核に入ることができ、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子と相互作用して特定の遺伝子発現を促進する。数種のタンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼが、細胞表面Ｗｎｔにより活性化されたＷｎｔ受容体複合体のアキシンと結合しアキシン／ＧＳＫ３複合体を解離させる能力に関連づけられている。ＣＫ１およびＧＳＫ３によるＬＲＰの細胞質ドメインのリン酸化は、アキシンのＬＲＰへの結合を調節することができる。ＧＳＫ３のタンパク質キナーゼ活性は、膜結合型Ｗｎｔ／ＦＲＺ／ＬＲＰ／ＤＳＨ／アキシン複合体の形成とアキシン／ＡＰＣ／ＧＳＫ３／β−カテニン複合体の機能の両方に重要であると思われる。ＧＳＫ３によるβ−カテニンのリン酸化は、β−カテニンの破壊をもたらす。
【００７５】
本明細書において「Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター」は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化することができる分子を意味する。一般に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、標的遺伝子が転写された際に活性化され；例として、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、標的遺伝子、例えばによりアキシン２の発現を分析することによるか、例えば、免疫染色により細胞の核内へのβ−カテニンの移行を検出することによるか、またはＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのリン酸化もしくはＬＲＰテールのリン酸化の検出などにより確認することができる。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質の膜受容体に、また、このシグナル伝達カスケードを含んでなるタンパク質に作用し得る。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターの具体的な非限定例としては、以下のようなペプチドまたはタンパク質ならびにペプチドまたはタンパク質以外の化学化合物（すなわち、非ペプチド薬が挙げられる：
・ペプチドまたはタンパク質、例えば、Ｗｎｔタンパク質アイソフォーム、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１またはＷｎｔ１６；β−カテニン；スポンジン、例えば、Ｒ−スポンジンなど；またはそれらの機能的変種、例えば、前述のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも４０％、一般に少なくとも５０％、有利には少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化する能力を維持するペプチドまたはタンパク質；または
・非ペプチド化合物、例えば、２−（４−アセチルフェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（ＩＱ１）、（２Ｓ）−２−［２−（インダン−５−イルオキシ）−９−（１、１’−ビフェニル−４−イル）メチル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ］−３−フェニル−プロパン−１−オール（ＱＳ１１）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、またはGilbert et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 20, Issue 1, 1 January 2010, 366-370に開示されている（ヘテロ）アリールピリミジン。
【００７６】
Ｗｎｔ分泌タンパク質ファミリーに属し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のアクチベーターとして働くＷｎｔタンパク質アイソフォームの例としては、下記のものまたはそれらの相同分子種（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ参照）が挙げられる：
ホモ・サピエンス(Homo sapiens)：Ｗｎｔ１：Ｐ０４６２８；Ｗｎｔ２：Ｐ０９５４４；Ｗｎｔ２ｂ／１３：Ｑ９３０９７；Ｗｎｔ３：Ｐ５６７０３；Ｗｎｔ３ａ：Ｐ５６７０４；Ｗｎｔ４：Ｐ５６７０５；Ｗｎｔ５ａ：Ｐ４１２２１；Ｗｎｔ５ｂ：Ｑ９Ｈ１Ｊ７；Ｗｎｔ６：Ｑ９Ｙ６Ｆ９；Ｗｎｔ７ａ：Ｏ００７５５；Ｗｎｔ７ｂ：Ｐ５６７０６；Ｗｎｔ８ａ：Ｑ９Ｈ１Ｊ５；Ｗｎｔ９ａ：０１４９０４；Ｗｎｔ９ｂ：０１４９０５；Ｗｎｔ１０ａ：Ｑ９ＧＺＴ５；Ｗｎｔ１０ｂ：０００７４４；Ｗｎｔ１１：０９６０１４；Ｗｎｔ１６：Ｑ９ＵＢＶ４；
ハツカネズミ(Mus musculus)：Ｗｎｔ１：Ｐ０４４２６；Ｗｎｔ２：Ｐ２１５５２．１；Ｗｎｔ２ｂ／１３：Ｏ７０２８３．２；Ｗｎｔ３：Ｐ１７５５３；Ｗｎｔ３ａ：Ｐ２７４６７；Ｗｎｔ４：Ｐ２２７２４；Ｗｎｔ５ａ：Ｐ２２７２５；Ｗｎｔ５ｂ：Ｐ２２７２６；Ｗｎｔ６：Ｐ２２７２７．１；Ｗｎｔ８ａ：Ｑ６４５２７；Ｗｎｔ９ａ：Ｑ８Ｒ５Ｍ２；Ｗｎｔ９ｂ：０３５４６８．２；Ｗｎｔ１０ａ：Ｐ７０７０１；Ｗｎｔ１０ｂ：Ｐ４８６１４；Ｗｎｔ１１：Ｐ４８６１５；Ｗｎｔ１６：Ｑ９ＱＹＳ１．１；
ならびに機能的アイソフォーム、変種またはその断片、すなわち、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化する能力を有するアイソフォーム、変種またはその断片。
【００７７】
β−カテニンの例としては、下記のものまたはそれらの相同分子種（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ参照）が挙げられる：
ホモ・サピエンス：Ｐ３５２２２；
ハツカネズミ：Ｑ０２２４８；
ならびに機能的アイソフォーム、変種またはその断片、すなわち、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化する能力を有するアイソフォーム、変種またはその断片。
【００７８】
Ｒ−スポンジン（ＲＳｐｏ）は、カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の４つの分泌型アゴニストである。システインに富むシングルトロンボスポンジンドメイン含有タンパク質（Ｃｒｉｓｔｉｎｓ（クリスチン））としても知られるＲ−スポンジンは４０％前後のアミノ酸同一性を有する(Lowther, W. et al. (2005) J. Virol. 79:10093; Kim, K.-A. et al. (2006) Cell Cycle 5:23)。Ｒ−スポンジンは総て、２つの隣接するシステインに富むフューリン様ドメインと、その後にトロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）モチーフおよび塩基性残基に富む領域を含む。β−カテニンの安定化に必要なのはフューリン様ドメインだけである(Kim, K.-A. et al. (2006) Cell Cycle 5:23; Kazanskaya, O. et al. (2004) Dev. Cell 7:525)。マウスに組換えＲ−スポンジン１を注射すると、β−カテニンの活性化および腸陰窩上皮細胞の増殖が起こり、実験的大腸炎が改善される(Kim, K.-A. et al. (2005) Science 309:1256; Zhao, J. et al. (2007) Gastroenterology 132:1331)。Ｒ−スポンジン１（ＲＳＰＯ１）は、Ｗｎｔ共受容体クレメン(Kremen)との結合に関してＷｎｔアンタゴニストＤＫＫ−１と競合することによりＷｎｔ／β−カテニンを調節すると思われる。この競合によりＤＫＫ−１／ＬＲＰ−６／クレメン複合体のインターナリゼーションが低下する(Binnerts, M.E. et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:147007)。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のアクチベーターとして働くＲ−スポンジンの具体的な非限定例としては、下記のものまたはそれらの相同分子種（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）が挙げられる：
ホモ・サピエンス：Ｒ−スポンジン−１：Ｑ２ＭＫＡ７；Ｒ−スポンジン−２：Ｑ６ＵＸＸ９；Ｒ−スポンジン−３：Ｑ９ＢＸＹ４；Ｒ−スポンジン−４：Ｑ２ＩＯＭ５、または機能的アイソフォーム、変種またはその断片、すなわち、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化する能力を有するアイソフォーム、変種またはその断片、例えば、それらの機能的ドメインを維持するアイソフォーム、変種またはその断片。
【００７９】
前記（ヘテロ）アリールピリミジンの具体的な非限定例としては、下記の式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物が挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態では、（ヘテロ）アリールピリミジンは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）［表１］のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の（ヘテロ）アリール−ピリミジンアゴニストである。
【００８１】
【表１】
2014527407.tif 000002
【００８２】
本明細書において「Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤」は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサーを阻害または遮断することによってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化することができる分子、すなわち、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制、遮断またはサイレンシングする化合物を意味する。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサーの具体的な非限定例としては、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）などが挙げられる。
【００８３】
ＳＦＲＰ１阻害剤の具体的な非限定例としては、５−（フェニルスルホニル）−Ｎ−（４−ピペリジニル）−２−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＷＡＹ−３１６６０６）が挙げられる。
【００８４】
ＧＳＫ−３阻害剤の具体的な非限定例としては、リチウム塩（例えば、塩化リチウム）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＢＩＯ−アセトキシム）、６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル−アミノ｝−ニコチノ−ニトリル（ＣＨＩＲ９９０２１）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−Ｎ’−（５−ニトロ−２−チアゾリル）尿素（ＡＲ−Ａ０１４４１８）、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ−２１６７６３）、５−ベンジルアミノ−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１，２，４−チアジアゾール（ＴＤＺＤ−２０）、３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ４１５２８６）など、またはそれらの機能的類似体もしくは誘導体、すなわち、対象に投与した際に目的化合物を与える官能基を含む化合物が挙げられる。
【００８５】
ＧＳＫ−３阻害剤のさらなる例は当業者に公知である。例は例えば、ＷＯ９９／６５８９７およびＷＯ０３／０７４０７２およびそこに引用されている参照文献に記載されている。例えば、種々のＧＳＫ−３阻害剤化合物が、ＵＳ２００５／００５４６６３、ＵＳ２００２／０１５６０８７、ＷＯ０２／２０４９５およびＷＯ９９／６５８９７（ピリミジンおよびピリジン系化合物）；ＵＳ２００３／０００８８６６、ＵＳ２００１／００４４４３６およびＷＯ０１／４４２４６（二環式系化合物）；ＵＳ２００１／００３４０５１（ピラジン系化合物）；およびＷＯ９８／３６５２８（プリン系化合物）に開示されている。さらなるＧＳＫ−３阻害剤化合物としては、ＷＯ０２／２２５９８（キノリノン系化合物）、ＵＳ２００４／００７７７０７（ピロール系化合物）；ＵＳ２００４／０１３８２７３（炭素環式化合物）；ＵＳ２００５／０００４１５２（チアゾール化合物）；およびＵＳ２００４／００３４０３７（ヘテロアリール化合物）に開示されているものが挙げられる。さらなるＧＳＫ−３阻害剤化合物としては、Johnson & Johnsonにより開発され、例えばKuo et al. (2003) J Med Chem 46(19):4021-31に記載されている大環状マレイミド選択性ＧＳＫ−３β阻害剤が挙げられ、特定の例としては、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２２，２３−デカヒドロ−９，４：２４，２９−ジメト−１Ｈ−ジピリド（２，３−ｎ：３’、２’−ｔ）ピロロ（３，４−ｑ）−（１，４，７，１０，１３，２２）テトラオキサジアザシクロテトラコシン−１，３（２Ｈ）−ジオンである。さらに、置換アミノピリミジン誘導体ＣＨＩＲ  ９８０１４（６−ピリジンジアミン，Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−）およびＣＨＩＲ  ９９０２１（６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチルアミノ｝−ニコチノニトリル）はヒトＧＳＫ−３を強力に阻害する。また、本発明に有用であり得る他のいくつかのＧＳＫ−３阻害剤がＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（商標）から市販されており、例えば、５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン、４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＴＤＺＤ８）、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール、３−（１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオンなどがある。上述の化合物の機能的類似体または誘導体も本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化することができる化合物に関する総説としては、Chen et al, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010、Barker et al., Nat Rev Drug Discov. 2006およびMeijer et al, Trends Pharmacol Sci. 2004を参照。
【００８７】
特定の実施形態では、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞をそのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されるように処理するために使用される化合物は、Ｗｎｔアイソフォーム、β−カテニン、Ｒ−スポンジン、またはそれらの機能的変種もしくは断片、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＤＣＡ、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）−ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、（ヘテロ）アリールピリミジン、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）［表１］の（ヘテロ）アリールピリミジン、ＧＳＫ−３阻害剤、ＳＦＲＰ１阻害剤、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、前記Ｗｎｔタンパク質アイソフォームは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、およびそれらの組合せ、またはそれらの機能的変種もしくは断片からなる群から選択される。別の特定の実施形態では、前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、β−カテニンまたはその機能的変種もしくは断片である。別の特定の実施形態では、前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、Ｒ−スポンジン、例えば、Ｒ−スポンジン−１、Ｒ−スポンジン−２、Ｒ−スポンジン−３、Ｒ−スポンジン−４、またはそれらの機能的アイソフォーム、変種もしくは断片である。
【００８８】
別の特定の実施形態では、ＳＦＲＰ１阻害剤はＷＡＹ−３１６６０６である。別の特定の実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤は、リチウム塩、好ましくは、塩化リチウム、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＳＢ−２１６７６３、ＴＤＺＤ−２０、ＳＢ４１５２８６、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００８９】
好ましい実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、Ｗｎｔ３ａ、β−カテニン、Ｒ−スポンジン−１、およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｗｎｔ  β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤は、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９９０２１、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される、単独の細胞または複数の前記細胞を含んでなる細胞集団であって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターで、前記経路が活性化されるように処理された細胞である。この実施形態によれば、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞、または複数の細胞を、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターと接触させる、例えば、それとともに培養またはインキュベートする。前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターの量は一定の範囲内で可変であるが、好ましくは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは好適な量、すなわち、特定量のβ−カテニンの細胞核内蓄積を得ることを可能とする量で添加する。例として、特定の実施形態では、好適な特定の培養条件下で前記細胞を処理するために約１００〜約３００ｎｇ／ｍｌの範囲のＷｎｔ３ａを使用することができる。特定量のβ−カテニンの細胞内蓄積および細胞核内への移行（これに伴って細胞融合を介したリプログラミングが見られる）を得ることを可能とするＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターの量は、従来のアッセイ、例えば、細胞をＷｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターと、種々の濃度で、このように処理された細胞を動物に移植するまでの期間を様々にして接触させること、およびその後、細胞融合を介したリプログラミングが起こるかどうかを、例えば、未分化細胞マーカー、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｏｔｘ２、Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＳＥＡ−１などの発現を検出および／または測定することによって分析することにより、当業者により決定することができる。特定の実施形態では、これらの細胞は、処理を施した細胞を移植する２４時間前に約１００〜３００ｎｇ／μｌの好適な量の、Ｗｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターとしてのＷｎｔ３ａで処理する。
【００９１】
別の特定の実施形態では、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される、単独の細胞または複数の前記細胞を含んでなる細胞集団は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で前記経路が活性化されるように処理された細胞である。この実施形態によれば、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞を、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤と接触させる、例えば、それとともに培養またはインキュベートする。前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤の量は一定の範囲内で可変であるが、好ましくは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤は好適な量、すなわち、特定量のβ−カテニンの細胞核内蓄積を得ることを可能とする量で添加する。例として、特定の実施形態では、特定の培養条件下（下記参照）で前記細胞を処理するために約１〜約３μＭの範囲のＢＩＯを使用することができる。特定量のβ−カテニンの細胞内蓄積および細胞核内への移行（これに伴って細胞融合を介したリプログラミングが見られる）を得ることを可能とするＷｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤の量は、実施例１に述べられているアッセイの手段によって、当業者により決定することができる。簡単に述べると、前記アッセイは、細胞をＷｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤と、種々の濃度で、このように処理された細胞を動物に移植するまでの期間を様々にして接触させること、およびその後、細胞融合を介したリプログラミングが起こるかどうかを、例えば、未分化細胞マーカー、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｏｔｘ２、Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＳＥＡ−１などの発現を検出および／または測定することにより分析することを含んでなる。特定の実施形態では、これらの細胞は、処理を施した細胞を移植する２４時間前に約１〜３μＭの好適な量の、Ｗｎｔ／β−カテニン経路レプレッサー阻害剤（ＧＳＫ−３）としてのＢＩＯで処理する。
【００９２】
別の特定の実施形態では、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための、前述のように細胞集団中に存在し得るＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路アクチベーターを過剰発現する細胞である。
【００９３】
本明細書において「Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する細胞」は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現するように遺伝的に操作された、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞などの細胞であり、前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターはペプチドまたはタンパク質である。特定の実施形態では、前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、Ｗｎｔタンパク質アイソフォーム、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、またはそれらの機能的変種もしくは断片である。別の特定の実施形態では、前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、β−カテニンまたはそれらの機能的変種もしくは断片である。別の特定の実施形態では、前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターは、Ｒ−スポンジン、例えば、Ｒ−スポンジン−１、Ｒ−スポンジン−２、Ｒ−スポンジン−３、Ｒ−スポンジン−４、またはそれらの機能的アイソフォーム、変種もしくは断片である。一実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドは発現カセットに含まれ、前記ポリヌクレオチドは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる前記ポリヌクレオチドの発現制御配列に作動可能に（すなわち制御下に）結合されている。発現制御配列は、タンパク質の転写、および適当であれば翻訳を制御および調節する配列であり、プロモーター配列、転写レギュレーターをコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）および／または転写ターミネーター配列を含む。特定の実施形態では、前記発現制御配列は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞などの真核細胞において機能的であり、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントとニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）の組合せ、真核生物翻訳開始因子（ｅＩＦ）プロモーターなどである。
【００９４】
有利には、前記発現カセットは、前記発現カセットで形質転換された宿主細胞の選択を可能とするモチーフまたは表現型をコードするマーカーまたは遺伝子をさらに含んでなる。本発明の発現カセットに存在し得る前記マーカーの具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、毒性化合物耐性遺伝子、蛍光マーカー発現遺伝子、および一般に、遺伝的に形質転換された細胞の選択を可能とする総ての遺伝子が含まれる。遺伝子構築物は好適なベクターに挿入することができる。ベクターの選択は、次にそれが導入される宿主細胞によって決まる。例としては、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドが導入されるベクターは、宿主細胞に導入された際に前記細胞のゲノムに組み込まれるまたは組み込まれないプラスミドまたはベクターであり得る。前記ベクターは、当業者に知られている従来の方法によって得ることができる[Sambrook and Russell, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001 Vol 1-3]。特定の実施形態では、前記組換えベクターは、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞を形質転換するのに有用なベクターである。前記ベクターは、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞などの細胞を形質転換するか、トランスフェクトするかまたは感染させるために使用することができる。形質転換細胞、トランスフェクト細胞または感染細胞は、当業者に知られている従来の方法によって得ることができる[Sambrok and Russell, (2001),前掲]。
【００９５】
本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞、好ましくは、単離された細胞は、細胞培養物を起こすまたは播種するために使用することができる。従前に述べられているように、それらのマーカーに関して特定の細胞を単離してもよい。単離された細胞は、コーティングされていない、または細胞外マトリックスまたはリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（天然型、変性型または架橋型）、ゼラチン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた無菌組織培養容器に移すことができる。本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、前記細胞の増殖を維持することができる好適な培養培地（細胞の性質に依存する）、例えば、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、アドバンスドＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ  ２０１、イーグルの基本培地、ハムのＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムのＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコブの改変ダルベッコ−１７培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０などで培養することができる。必要に応じて、培養培地には、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥまたは２−ＭＥ）、好ましくは、約０．００１％（ｖ／ｖ）；１以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびエリスロポエチン；サイトカイン、例えば、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）；Ｌ−バリンなどのアミノ酸；および細菌汚染を抑えるための１以上の抗生物質および／または抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンを単独でまたは組み合わせて含む１以上の成分を添加することができる。これらの細胞は、培養容器に細胞の増殖を可能とする密度で播種することができる。
【００９６】
最も適当な培養培地の選択のための方法、培地調製、および細胞培養技術は当技術分野で周知であり、Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley &Sons, Chichester;およびHo and Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Bostonを含む様々な情報源に記載されている。
【００９７】
実施例１に示す通り、出生１０日後（ｐ１０）にｒｄ１マウスの網膜下腔に移植された、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための前記細胞または細胞集団は、桿体およびミュラー細胞と融合してハイブリッドを形成し、これらのハイブリッドは脱分化し、最終的に例えば、光受容細胞（桿体など）、神経節細胞などの網膜ニューロンに再分化する。この場合、移植された細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化が、新たに形成されたハイブリッドの脱分化を誘導するために不可欠であると思われ、これらのハイブリッドは最終的に新生網膜ニューロンに再分化する。さらに、移植されたマウスにおいて新生光受容細胞は網膜を完全に再生し、機能的視覚の救済を伴う。これらのデータは、細胞融合を介した再生は哺乳動物網膜において極めて有効なプロセスであること、およびそれはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化により惹起され得ることを実証している。色素性網膜炎（ＲＰ）は、現在のところ治療法のない極めて重篤な疾患である。しかしながら、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団の移植を介した網膜再生は、ＲＰに、またはさらには様々な網膜変性疾患に罹患した対象の視力の救済のためのアプローチとなる。
【００９８】
本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団は、ひと度眼の標的部位に移植されると、網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞と融合して、１以上の表現型へと分化するハイブリッド細胞をもたらすので、前記細胞は網膜変性疾患を処置するための細胞療法として使用可能である。本発明によれば、網膜変性疾患の処置は、前記細胞と前記網膜細胞、例えば、網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞との細胞融合を介した網膜細胞のリプログラミングによりなされる。リプログラミングは、一般に、胚状態または前駆状態の両レベルで、分化状態（または分化細胞、すなわち、心臓、肝臓などのような、他の細胞種を生じることのできない特定の機能に特化した細胞）から未分化状態（または未分化幹細胞、すなわち、特化細胞を生じる能力を保持する、特定の機能に特化していない細胞）に至る細胞の経路を意味し得るが、リプログラミングはまた、ある分化状態から別の分化状態（例えば、前駆／胚状態に戻らずにニューロンとなる線維芽細胞、または前駆／胚状態に戻らずに別の網膜ニューロンとなる網膜ニューロン）に至る経路も意味し得る。本明細書で「リプログラミング」とは、細胞（例えば、ＨＳＣ、前駆細胞またはＭＳＣ）と体細胞（例えば、網膜ニューロンまたは網膜グリア細胞）の間の細胞融合の結果として事前に形成されたハイブリッド細胞の分化が後に続く、体細胞の脱分化のみを意味する。
【００９９】
本明細書において「細胞融合」という表現は、自発的に起こる、または外因性因子により媒介される細胞−細胞融合を意味する。細胞−細胞融合は、多くの発生プロセス、ならびに細胞の運命および細胞分化を調節する。体細胞は自発的に幹細胞と融合し、得られるハイブリッドクローンは幹細胞様表現型を有する。幹細胞の幹細胞的特徴は体細胞の形質よりも優位であり、体細胞核のリプログラミングを可能とする。よって、細胞−細胞融合は細胞の運命を課す方法であり、ＨＳＣ、前駆細胞またはＭＳＣなどの細胞と融合する場合には、この機構は細胞のリプログラミング、すなわち、体細胞の脱分化を誘導する。本発明者らは、融合を介した体細胞のリプログラミングは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の時間依存的活性化により大きく促進されることを示した。Ｗｎｔがその受容体と結合するか、またはＧＳＫ−３の阻害の後、本記載の明細書の複合体の成分としてのβ−カテニンが安定化され、核に移行し、そこでいくつかの標的遺伝子を活性化する。
【０１００】
本明細書において「網膜ニューロン」は、網膜の一部を形成するニューロンを意味する。網膜は、眼の内面を裏打ちする光感受性組織である。網膜は、シナプスにより相互に連絡したニューロンを数層備えた層状構造である。光に直接感受性のあるニューロンのみが光受容細胞である。これらには主として桿体と錐体の２種類がある。桿体は主として、薄暗い光で機能し、白黒視覚をもたらし、一方、錐体は、日中視覚と色彩認識を補助する。３つ目に、はるかに少ない光受容器種であるが、光感受性神経節細胞は、明るい昼光に対する反射応答に重要である。桿体および錐体からの神経シグナルは、網膜の他のニューロンによりプロセシングを受ける。その出力は網膜神経節細胞の活動電位の形態を採り、網膜神経節細胞の軸索は視神経を形成する。網膜ニューロンはさらに、とりわけ水平細胞、双極性細胞、無軸索細胞、間網状細胞、神経節細胞を含む。前記細胞に加えて、網膜には、網膜の主要なグリア細胞であり、支持細胞、星状細胞およびマイクログリア細胞として働く、ミュラー細胞（ミュラーグリア）などのグリア細胞が存在する(Webvision - The Organization of the Retina and Visual System, Part II, Chapter entitled “Glial cells of the Retina”, by Helga Kolb, dated July 31, 2012)。
【０１０１】
特定の実施形態では、網膜細胞は、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団、例えばＢＩＯ処理ＨＳＰＣと融合する、桿体などの網膜ニューロンおよびミュラー細胞などの網膜グリア細胞を含んでなる（実施例１）。別の特定の実施形態では、網膜ニューロンは、移植されたＨＳＰＣと融合する、神経節細胞および／または無軸索細胞を含んでなる（実施例２）。別の特定の実施形態では、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞、またはその集団、例えばＨＳＰＣなどの、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞と内因性の増殖細胞（例えばＲＳＰＣ）との融合が企図される。
【０１０２】
融合した網膜ニューロンのリプログラミングの後に得ることのできる最終的な網膜ニューロンは、例えば、光受容細胞、神経節細胞、介在ニューロンなど多様である。特定の実施形態では、融合した網膜ニューロン（例えば、桿体）および網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞）は主として桿体へとリプログラミングされ（実施例１）、別の特定の実施形態では、融合した網膜ニューロン（例えば、神経節細胞および／または無軸索細胞）は神経節細胞および介在ニューロンへとリプログラミングされる（実施例２）。
【０１０３】
本発明者らはいずれの理論に縛られるつもりもないが、リプログラミングされた網膜ニューロンは、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団と融合した網膜ニューロンと同じ（または異なる）種類のものであってよいと考えられ；例えば、桿体は桿体へとリプログラミングされてもよいし、または例えば、神経節細胞、無軸索細胞などの別の種類の網膜ニューロンへとリプログラミングされてもよく；神経節細胞は神経節細胞へとリプログラミングされてもよいし、または例えば、桿体、無軸索細胞などの別の種類の網膜ニューロンへとリプログラミングされてもよく；無軸索細胞は無軸索細胞へとリプログラミングされてもよいし、または例えば、桿体、神経節細胞などの別の種類の網膜ニューロンへとリプログラミングされてもよい。さらに、ミュラー細胞などの網膜グリア細胞は、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団と融合した後、桿体などの網膜ニューロンへとリプログラミングされてもよいし、または例えば、神経節細胞、無軸索細胞などの別の種類の網膜ニューロンへとリプログラミングされてもよい。実際に、実施例１は、ＨＳＰＣと桿体との融合、およびそれらのハイブリッド細胞の桿体のみへの分化を示す。
【０１０４】
特定の実施形態では、前記網膜変性疾患の処置は、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための前記細胞または細胞集団と前記網膜細胞との細胞融合を介した網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）および／または網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）などの網膜細胞のリプログラミングと、得られるハイブリッド細胞の、光受容細胞（例えば、桿体など）、神経節細胞、無軸索細胞などの網膜ニューロンへの分化を含んでなる。別の特定の実施形態では、前記網膜変性疾患の処置は、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための前記細胞または細胞集団と前記網膜ニューロンとの細胞融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングと、得られるハイブリッド細胞の、同じまたは異なる種類の網膜ニューロン、例えば、桿体などの光受容細胞、神経節細胞、無軸索細胞などへの分化を含んでなる。
【０１０５】
特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）および網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。
【０１０６】
本明細書で定義される「網膜変性疾患」は、網膜組織の細胞の進行的および最終的な死滅によって引き起こされる網膜の変質に関連する疾患である。用語「網膜変性疾患」はまた、網膜変性の間接的原因、すなわち、白内障、糖尿病、緑内障などの原発病態から誘発される網膜変性症状を含む。特定の実施形態では、前記網膜変性疾患は、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー先天性黒内障、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー、前部虚血性視神経症、コロイデレミア、加齢性黄斑変性、中心窩黄斑ジストロフィー、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー、アッシャー症候群など、ならびに白内障、糖尿病、緑内障などの他の原発病態から誘発される網膜変性症状を含んでなる群から選択される。特定の実施形態では、前記網膜変性疾患は、白内障、糖尿病または緑内障から誘発される。別の特定の実施形態では、前記網膜変性疾患は、網膜下の網膜色素上皮層の萎縮を原因とし、眼の中央部における光受容器（桿体および錐体）の喪失により視力低下を引き起こす「萎縮型（dry）」と；脈絡毛細管板内からブルッフ膜への異常な血管成長（脈絡膜新血管新生）により視力低下を引き起こし、やがて黄斑下への血液およびタンパク質の漏出に至り、最終的に光受容器への不可逆的傷害および急速な視力低下を招く「滲出型(wet)」の２つの形態で現れる加齢性黄斑変性である。さらに特定の実施形態では、前記網膜変性疾患は、光受容器の進行性の変性とその後のＲＰＥの変性を特徴とする遺伝性の網膜障害の異質な系列であるＲＰであり、主として周辺網膜における色素沈着および中心網膜の相対的回避を特徴とする。ＲＰの大部分の症例では、光受容器桿体の一次変性が見られ、二次的な錐体変性を伴う。
【０１０７】
本発明に関して、「網膜変性疾患の処置」とは、網膜変性疾患の症状、合併症または生化学的徴候の発生を予防もしくは治療するため、その症状を緩和するため、またはその発生および進行、例えば、失明の発生を停止もしくは阻害するために、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞もしくは前記細胞の集団、または前記細胞を含んでなる医薬組成物もしくは本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞以外の細胞を含んでなる医薬組成物（下記の処置Ｂを参照）を投与することを意味する。処置は、疾病の発症を遅延させるまたはその臨床症状もしくは亜臨床症状の発現を予防するための予防的処置、あるいは疾病の発現後の症状を除去または緩和するための治療的処置であり得る。
【０１０８】
生体対象における移植細胞の生存率は、種々の走査技術、例えば、コンピューター体軸断層撮影（ＣＡＴまたはＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャンまたは陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）スキャンの使用によって決定することができる。あるいは、移植片の生存率の決定は死後に、組織を摘出し、目視または顕微鏡で検査することによって行ってもよい。傷害を受けたまたは罹患した眼の機能の回復検査により、移植細胞の対象の眼の組織への機能的統合を評価することができる。例えば、網膜変性疾患の処置における有効性は、視力の改善ならびに立体カラー眼底写真の異常性およびグレードに関する評価によって決定することができる(Age-Related Eye Disease Study Research Group, NEI5 NIH, AREDS Report No. 8, 2001, Arch. Ophthalmol. 119: 1417-1436)。
【０１０９】
対象に投与するために、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団は、薬学上許容される担体を用い、医薬組成物、調製物または処方物として処方してもよい（詳細は、下記の「医薬組成物」と題した節で述べる）。
【０１１０】
処置Ｂ
別の態様において、本発明は、造血幹細胞、前駆細胞、および間葉系幹細胞からなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミング（前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介する）による網膜変性疾患の処置において使用するための前記細胞に関する。言い換えれば、この態様によれば、本発明は、対象の眼において造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞とを接触させた際の前記細胞と前記網膜細胞との融合による前記網膜細胞の、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を介したリプログラミングによる網膜変性疾患の処置において使用するための前記細胞に関する。
【０１１１】
あるいは、言い換えれば、本発明のこの態様は、造血幹細胞、前駆細胞、間葉系幹細胞からなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミング（前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介する）による網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における前記細胞の使用に関する。
【０１１２】
造血幹細胞、前駆細胞、間葉系幹細胞からなる群から選択される細胞、および処置される網膜変性疾患の詳細は、上記処置Ａに関して従前に述べており、その詳細をここに組み入れる。
【０１１３】
特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）および網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。
【０１１４】
上記処置Ａとは対照的に処置Ｂでは、移植される細胞（ＨＳＣ、前駆細胞またはＭＳＣ）は、その細胞が眼に移植された時点でそのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている必要はなく、これは、下記に述べるように、前記経路が内因的に、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターもしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤の投与により活性化され得るからである。よって、処置Ｂによれば、細胞（ＨＳＣ、前駆細胞またはＭＳＣ）が、それを眼に移植する前に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターまたはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理される必要、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する必要はないが、網膜再生が、前記細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜のリプログラミング（前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介する）により起こることを必要とする。この場合、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は内因的であってよく、すなわち、それは細胞が投与される（埋植もしくは移植される）対象により、網膜の傷害、病変もしくは損傷（網膜変性疾患で起こり得るもの）の結果として達成可能であり、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターもしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤の投与によるものであってもよい。本発明者らが実施したいくつかのアッセイは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の内因的活性化後に、傷害後に生じたハイブリッド細胞のリプログラミングが見られることを示した（実施例２）。他方、眼の傷害およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の異所的活性化の後の内因性骨髄細胞（ＢＭＣ）の動員は、ハイブリッド細胞のリプログラミングを認めるのに十分なものである（実施例２）。従って、特定の実施形態では、処置Ｂ（すなわち、前記細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した網膜細胞のリプログラミングによる、このリプログラミングはＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化を介する）による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、骨髄（ＢＭ）から眼に動員されたＢＭＣ（ｃ−ｋｉｔ＋、ｓｃａ−１＋）であり、眼は網膜組織の再生を得るためにＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターで処置される。
【０１１５】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化の効果、ならびにＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターおよびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤の具体的な非限定例は、上記処置Ａに関して述べており、その詳細をここに組み入れる。
【０１１６】
実施例２は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化時に、マウス網膜ニューロンは、移植細胞（例えば、ＨＳＰＣ、またはＥＳＣ）との自発的融合の後にｉｎ  ｖｉｖｏで一時的にリプログラミングされて前駆体段階に戻り得ることを示す。新たに形成されたハイブリッド細胞はニューロン前駆体マーカーを再活性化する（例えば、ＨＳＰＣおよびＥＳＣは、網膜ニューロンをリプログラミングしてＮａｎｏｇおよびＮｅｓｔｉｎ発現に戻す）。さらに、前記ハイブリッド細胞は増殖し、神経外胚葉系列へと（ＨＳＰＣおよび網膜ニューロンにより形成されたハイブリッド細胞の場合）、最終的には、最終分化状態の網膜ニューロン（例えば、光受容細胞）へと分化することができ、これにより傷害を受けた網膜組織を再生することができ；あるいは、ＥＳＣおよび網膜ニューロンにより形成されたハイブリッド細胞もまた増殖し、神経外胚葉性系列に加えて内胚葉および外胚葉系列を分化することができ、奇形腫の形成をもたらし得る。網膜傷害および眼におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の誘導の後、細胞融合を介したリプログラミングは、眼における骨髄細胞の内因的動員後にも起こる。これらのデータは、最終分化状態の網膜ニューロンのｉｎ−ｖｉｖｏリプログラミングが可能性のある組織再生機構であることを示す。
【０１１７】
特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞はＨＳＣである。別の特定の実施形態では、前記細胞はＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣである。
【０１１８】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は前駆細胞である。別の特定の実施形態では、前記前駆細胞は初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【０１１９】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞はＭＳＣである。
【０１２０】
処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、前記細胞の集団の一部を形成してもよく、網膜変性疾患の処置におけるその使用は本発明のさらなる態様をなす。
【０１２１】
よって、本発明はさらに、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される複数の細胞を含んでなる細胞集団に関する。
【０１２２】
言い換えれば、本発明は、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミング（前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介する）を介した網膜変性疾患の処置において使用するための、複数の前記細胞を含んでなる細胞集団に関する。この目的で、前記細胞集団は、網膜変性疾患の処置を必要とする対象の眼に移植される。よって、この態様によれば、本発明は、対象の眼においてＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞とを接触させた際の前記細胞と前記網膜細胞との融合による前記網膜細胞の、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を介したリプログラミングによる網膜変性疾患の処置において使用するための複数の前記細胞を含んでなる細胞集団を提供する。
【０１２３】
別法として企図される本発明のこの態様は、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミング（前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介する）による網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における、複数の前記細胞を含んでなる細胞集団の使用、あるいはまた、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミング（前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を介する）による網膜変性疾患の処置のための医薬組成物の製造における複数の前記細胞を含んでなる細胞集団の使用に関する。
【０１２４】
前記ＨＳＣ、前駆細胞、およびＭＳＣの詳細は従前に述べた。
【０１２５】
特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）および網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。
【０１２６】
特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、複数の、すなわち、３以上のＨＳＣを含んでなる。特定の実施形態では、前記ＨＳＣは、ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびそれらの組合せから選択される。
【０１２７】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、複数の前駆細胞を含んでなる。特定の実施形態では、前記前駆細胞は、初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰおよびそれらの組合せから選択される。
【０１２８】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、複数のＭＳＣを含んでなる。
【０１２９】
特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１のＨＳＣおよび少なくとも１の前駆細胞を含んでなる。特定の実施形態では、前記ＨＳＣ細胞は、ＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣであり；別の特定の実施形態では、前記前駆細胞は、初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【０１３０】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１のＨＳＣと少なくとも１ＭＳＣを含んでなる。特定の実施形態では、前記ＨＳＣ細胞は、ＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣである。
【０１３１】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１の前駆細胞と少なくとも１のＭＳＣを含んでなる。特定の実施形態では、前記前駆細胞は、初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【０１３２】
別の特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、少なくとも１のＨＳＣ、少なくとも１の前駆細胞と少なくとも１のＭＳＣを含んでなる。特定の実施形態では、前記ＨＳＣ細胞は、ＬＴ−ＨＳＣまたはＳＴ−ＨＳＣであり；別の特定の実施形態では、前記前駆細胞は、初期ＭＰＰ、後期ＭＰＰ、ＬＲＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰまたはＭＥＰである。
【０１３３】
特定の実施形態では、処置Ｂによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞集団は、「ＨＳＰＣ」として特定される細胞組成物、すなわち、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣを含んでなる細胞集団であり；前記細胞集団は、例えば骨髄から、あるいはまたＨＳＰＣ細胞集団を得るためにＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣを所望の比率または割合で混合することによって得ることができる。よって、前記細胞集団ＨＳＰＣは、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣを種々の比率または割合で含み得る。当業者には、前記細胞集団では、従来の手段、例えば、対応する表面マーカーに対する結合対の使用に基づく任意の好適な技術によって特定の細胞種を分離することにより任意の特定の細胞種を富化し得ることが理解されるであろう。よって、特定の実施形態では、ＨＳＰＣ細胞集団では、ＨＳＣ、または前駆細胞、またはさらにＭＳＣを富化することができる。
【０１３４】
組成物
別の態様において、本発明は、以下のような細胞組成物（以下、「本発明の細胞組成物」と呼ぶ）に関し、前記細胞組成物の細胞の少なくとも５０％が造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、かつ、前記細胞は活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有するか、または前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されるか、または前記細胞がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理されており、かつ／または前記細胞はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現する。
【０１３５】
特定の実施形態では、本発明の細胞組成物は、前記細胞の少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、いっそうより好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、およびさらにいっそうより好ましくは１００％が、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する（例えば、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理された結果として、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現するような操作による）任意の比率のＨＳＣ、前駆細胞、および／またはＭＳＣである、組成物である。本発明の細胞組成物は、培地をさらに含んでなり；前記培地は前記組成物に含まれる細胞と適合しなければならず；本発明の細胞組成物中に存在することができる培地の例示的な非限定例としては、場合により血清を添加した等張溶液；細胞培養培地、あるいはまた固体、半固体、ゼラチン状または粘稠な支持媒体が挙げられる。
【０１３６】
医薬組成物
本発明の処置ＡおよびＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞および細胞集団は、薬学上許容される担体を使用することにより、医薬組成物、調製物、または処方物として投与することができる。
【０１３７】
よって、一態様において、本発明は、以下からなる群から選択される医薬組成物（以下、「本発明の細胞組成物」と呼ぶ）に関する：
１）造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの細胞と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物であって、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている、医薬組成物、ならびに
２）造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１の細胞とＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターまたはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤との組合せと、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【０１３８】
ＨＳＣ、前駆細胞、および／またはＭＳＣが、それらのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化させるためには、［本発明の医薬組成物１）］、前記ＨＳＣ、前駆細胞および／またはＭＳＣはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路阻害剤で処理され、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現するように操作される。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、網膜変性疾患の処置に使用することができる。
【０１４０】
本明細書において、用語「担体」としては、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞を投与することができる、ビヒクル、培地または賦形剤が挙げられる。明らかに、前記担体は前記細胞と適合しなければならない。好適な薬学上許容される担体の例示的な非限定例としては、任意の生理学的に適合する担体、例えば、血清、好ましくは自己血清が添加されていてもよい等張溶液（例えば、０．９％ＮａＣｌの無菌生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、乳酸リンゲル液など）；細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭなど）などが挙げられる。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、医化学者または生物学者によく知られているであろう補助成分、例えば、眼への投与に好適な酸化防止剤（例えば、ＥＤＴＡ、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、β−メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似種、アスコルビン酸およびその塩または亜硫酸もしくはメタ重亜硫酸ナトリウムなど）、ｐＨを眼の刺激作用を最小にするのに好適なｐＨに維持するための緩衝剤（例えば、直接的硝子体内または眼内注射では、医薬組成物はｐＨ７．２〜７．５、あるいはｐＨ７．３〜７．４であるべきである）、眼への投与に好適な等張化剤（例えば、組成物を０．９％生理食塩水でおよそ等張とするための塩化ナトリウム）、増粘剤（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）などを含んでなり得る。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀または硝酸フェニル水銀、チメロサール、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）を含有し得る。本発明の医薬組成物に使用することができる前記薬学上許容される物質は一般に当業者に知られており、細胞組成物の調製に通常使用される。好適な医薬担体は、例えば、E.W. Martin の“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
【０１４２】
本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、単独で（例えば、実質的に均質な集団として）または他の細胞、例えば、ニューロン、神経幹細胞、網膜幹細胞、眼前駆細胞、網膜上皮幹細胞または角膜上皮幹細胞および／または他の多分化能（multipotent）もしくは多能性(pluripotent)幹細胞との混合物として投与することができる。本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞を他の細胞とともに投与する場合、それらは前記他の細胞と同時にまたは逐次に（前記の他の細胞の前または後のいずれかで）投与することができる。異なる種類の細胞は、投与の直前もしくはしばらく前に、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞と混合してもよく、またはそれらは投与前に一定の期間、共培養してもよい。
【０１４３】
本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、例えば、増殖因子、栄養因子、細胞馴化培地、または他の活性剤、例えば、当技術分野で公知の抗炎症剤、抗アポトーシス剤、酸化防止剤、神経栄養因子または神経再生もしくは神経保護剤といった少なくとも１の医薬剤とともに、単一の医薬組成物として一緒に、または別個の医薬組成物として他の薬剤と同時にもしくは逐次に（他の薬剤の前または後のいずれかで）投与することができ；前記薬剤の使用が細胞再生の効率を高める、または細胞変性を低減すると思われる。
【０１４４】
本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞とともに投与可能な前記他の薬剤または成分の例としては、限定されるものではないが、いくつか例を挙げると、（１）他の神経保護または神経有用薬；（２）選択された細胞外マトリックス成分、例えば、当技術分野で公知の１以上のコラーゲン、および／または増殖因子、血小板富化血漿、および薬物（あるいは、前記細胞は増殖因子を発現および産生するように遺伝的に操作されてもよい）；（３）抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）；（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト(Pemirolast)、トラニラスト(Tranilast)、レミケード(Remicade)、シロリムス(Sirolimus)、および非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、例えば、テポキサリン、トルメチン、およびスプロフェン；（５）免疫抑制剤または免疫調節剤、例えば、カルシニュリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖剤、コルチコステロイドおよび種々の抗体；（６）酸化防止剤、例えば、プロブコール、ビタミンＣおよびＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステインなど；および（７）局所麻酔が含まれる。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は一般に、液体または流体組成物、半固体（例えば、ゲルまたはヒドロゲル）、フォーム、または多孔質固体（例えば、眼の組織工学に適当なポリマーマトリックス、コンポジット、およびリン酸カルシウム誘導体など）または細胞のより良好な投与もしくはより高い生存および機能を可能とするための、天然もしくは合成起源の細胞封入用粒子として処方することができる。特定の実施形態では、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、外科的移植に好適な半固体もしくは固体デバイスで投与してもよく、または液体担体とともに投与してもよい（例えば、レシピエント対象に注射される）。よって、前記細胞は、眼の傷害または苦痛部位に外科的に移植しても、注射してもまたはそれ以外の方法で直接的もしくは間接的に投与してもよい。細胞を半固体または固体デバイスで投与する場合、身体の正確な場所への外科的移植が一般に好適な投与手段である。しかしながら、液体または流体医薬組成物を眼のより全般的な位置（例えば、眼内）に投与してもよい。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、それを必要とする対象（患者）の眼に、当技術分野で公知のいくつかの送達様式の１以上で送達することができる。一実施形態では、医薬組成物を、間欠的眼内または硝子体内注射により網膜もしくは周囲領域に、または網膜下に移植または送達する。さらに、細胞は疾病の発症初期に１回だけ送達するのが理想的であるが、表現型の復帰が存在する場合には、対象の生涯にわたって追加送達が可能である。当業者によって理解されているように、利益を望む部位への本発明の医薬組成物の直接投与が有利であり得る場合がある。よって、所望の器官または組織への本発明の医薬組成物の直接投与は、好適なデバイス、例えば好適なカニューレを挿入する手段による、または本明細書で述べられるもしくは当技術分野で公知の他の手段による、直接投与（例えば、注射によるなど）によって達成することができる。
【０１４７】
注射用医薬組成物は、単回投与用に設計されてよく、保存剤を含有しない。注射溶液は０．９％塩化ナトリウム溶液（モル浸透圧濃度２９０〜３００ミリオスモル）に相当する等張性を有してよい。これは、塩化ナトリウムまたは上記に挙げた緩衝剤および酸化防止剤などの賦形剤を添加することによって達成できる。
【０１４８】
本発明の医薬組成物の対象への投与は従来の手段によって行われ、例えば、前記医薬組成物は、シリンジ、カニューレなどの好適なデバイスを使用することにより、硝子体内経路で前記対象に投与することができる。総ての場合において、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の細胞組成物を投与するために好適な器具、装置およびデバイスを用いて投与される。
【０１４９】
本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または本明細書に記載の他の任意の医薬組成物を投与するための投与形および投与計画は、適正診療規範に従い、対象の病態、例えば網膜変性症状の性質および程度、齢、性別、体重および健康状態、ならびに医師に知られている他の因子を考慮して設定される。よって、対象に投与される医薬組成物の有効量は、当技術分野で公知のようにこれらの考慮事項によって決定される。
【０１５０】
しかしながら、一般に、本発明の医薬組成物（または本明細書に記載の他の任意の医薬組成物）は、所望の治療効果を提供するために治療上有効な量の、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞、好ましくは、前記細胞の実質的に均質な集団を含有する。本明細書で使用される意味において、用語「治療上有効な量」は、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞の、所望の治療効果を生じる（例えば、網膜を完全にもしくは部分的に再生し、かつ／または機能的視覚を救済するなど）ことのできる量に関し、一般に、他の因子の中でも、前記細胞それら自体の特徴および所望の治療効果によって決定される。一般に、投与しなければならない本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための前記細胞の治療上有効な量は、他の因子の中でも、対象自身の特徴、疾病の重篤度、投与形などによって異なる。この目的で、本発明に述べられる用量は当業者にとっての指針として考慮すべきことであるに過ぎず、当業者はこの用量を前述の因子に応じて調整しなければならない。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞を１眼当たり約１０４〜約１０１０の間で、好ましくは１眼当たり約１０６〜１０８細胞の間で含有する用量で投与される。前記細胞の用量は、対象の状態および進展に応じて何日間か、何週間か、または何か月かの時間間隔（各場合において専門家が設定しなければならない）で繰り返すことができる。
【０１５１】
場合によっては、細胞療法を開始する前に対象を薬理学的に免疫抑制することが望ましいまたは適当であることがある。これは全身または局所的免疫抑制剤の使用によって達成してもよいし、または被包デバイスで細胞を送達することによって達成してもよい。移植された細胞に対する免疫応答を低減または排除するためのこれらおよびその他の手段は当技術分野で公知である。別法として、本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞は、それらの免疫原性を低減するように遺伝的に改変してもよい。
【０１５２】
キット
別の態様において、本発明は、下記からなる群から選択されるキット（以下、「本発明のキット」と呼ぶ）に関する：
１）造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１の細胞と、前記キット成分の使用に関する説明書とを含んでなるキットであって、前記細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されている、キット、および
２）造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１の細胞とＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターまたはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤の組合せと、前記キット成分の使用に関する説明書とを含んでなるキット。
【０１５３】
ＨＳＣ、前駆細胞、および／またはＭＳＣがＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化させる［本発明のキット１）］ためには、前記ＨＳＣ、前駆細胞および／またはＭＳＣは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理され、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現するように操作される。
【０１５４】
本発明のキットは、網膜変性疾患の処置において使用することができる。
【０１５５】
本発明の処置ＡまたはＢによる網膜変性疾患の処置において使用するための細胞、本発明の医薬組成物、および処置される網膜変性疾患の詳細は従前に述べており、ここに組み入れる。
【０１５６】
処置方法
本発明の別の態様によれば、網膜変性疾患を有する対象（すなわち、患者）を処置するために、処置を必要とする前記対象に、本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞または細胞集団、本発明の医薬組成物を、網膜変性疾患を処置するために有効な量で投与することを含んでなる方法により提供され、前記網膜変性疾患の処置は、前記細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミングにより行われ、前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化を介する。
【０１５７】
本発明による網膜変性疾患の処置において使用するための細胞、本発明の医薬組成物、処置される網膜変性疾患および前記疾病を処置するための有効量の詳細は従前に述べており、ここに組み入れる。
【０１５８】
特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。別の特定の実施形態では、網膜細胞は、網膜ニューロン（例えば、桿体、神経節細胞、無軸索細胞など）および網膜グリア細胞（例えば、ミュラー細胞など）を含んでなる。
【０１５９】
特定の実施形態では、網膜変性疾患を有する対象を処置する方法は、本発明の医薬組成物１）、すなわち、活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を有する、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１の細胞と薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を、網膜変性疾患を処置するために有効な量で投与することを含んでなり、前記網膜変性疾患の処置は、前記細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミングにより行われ、前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化を介する。
【０１６０】
ＨＳＣ、前駆細胞、および／またはＭＳＣがＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化させる［本発明のキット１）］ためには、前記ＨＳＣ、前駆細胞および／またはＭＳＣは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、もしくはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤で処理され、かつ／またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーターを過剰発現するように操作される。
【０１６１】
別の態様において、本発明は、網膜変性疾患を有する対象（すなわち、患者）を処置する方法であって、処置を必要とする前記対象に、ＨＳＣ、前駆細胞およびＭＳＣからなる群から選択される細胞、またはＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される複数の細胞を含んでなる細胞集団、または前記細胞または細胞集団を含んでなる医薬組成物を、網膜変性疾患を処置するために有効な量で投与することを含んでなる方法を提供し、前記網膜変性疾患の処置は、前記細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミングにより行われ、前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化を介する。
【０１６２】
特定の実施形態では、網膜変性疾患を有する対象を処置する上記方法は、ＨＳＣ、前駆細胞、ＭＳＣ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１の細胞と、本発明の細胞以外の細胞から製造された薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を、網膜変性疾患を処置するために有効な量で投与することを含んでなり、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路アクチベーター、またはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路レプレッサー阻害剤を伴ってもよく、前記網膜変性疾患の処置は、前記細胞と網膜ニューロンおよび／または網膜グリア細胞などの網膜細胞との細胞融合を介した前記網膜細胞のリプログラミングにより行われ、前記リプログラミングはＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化を介する。
【０１６３】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらに限定されるものではない。
【０１６４】
実施例１
造血幹細胞融合は色素性網膜炎のマウスモデルにおいて網膜再生を誘発する
１．方法
細胞の調製
系列陰性ＨＳＰＣは、Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、Ｃｒｅ−ＲＦＰマウス（ＣＲＥおよび赤色蛍光タンパク質［ＲＦＰ］を安定発現するマウス；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給）の全骨髄から単離した。それらを移植２４時間前に１μＭ  ＢＩＯまたはＰＢＳのいずれかで、および１μＭタモキシフェンで処理した。
【０１６５】
動物
Ｒ２６Ｙｒｄ１マウス（Ｒ２６Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ＹＦＰ導入遺伝子を保持し、かつ、ｒｄ１突然変異に関して同型接合であるマウス）[Srinivas et al., BMC Dev Biol 1, 4 (2001)]。
【０１６６】
移植
ケタミン：メトミジン(metomidine)（８０ｍｇ／ｋｇ：１．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の腹腔内注射で予め麻酔した麻酔したマウスに１０５〜１０６個の範囲の細胞を移植し、眼瞼を注意深く開き、鋸状縁の下を小さく切開し、ＰＢＳ中に細胞懸濁液を含有する溶液最大５μｌを１回、硝子体または網膜下腔に注射した。還流を避けるため、キャピラリーを眼内に約３秒間維持した。
【０１６７】
ハイブリッドＦＡＣＳ選別
遺伝子発現分析では、細胞移植から２４時間後に、マウス網膜組織を単離し、トリプシン中で機械的摩砕により解離させた。ＦＡＣＳセルソーターを用いて赤と緑の陽性ハイブリッド細胞を単離した。ＲＮＡ  Ｉｓｐｏｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って用い、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをスーパースクリプトＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００リアルタイムＰＣＲ機にて実施した。実験は総て３反復で行い、ｃＤＮＡインプットの違いは、ＧＡＰＤＨの発現に対する正規化により補正した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に用いたプライマーを表２に示す。
【０１６８】
【表２】
2014527407.tif 000003
【０１６９】
ＴＵＮＥＬアッセイ
アポトーシス核を、製造者のプロトコールに従い、ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｉｃｋ−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇキット（ＴＵＮＥＬ、フルオレセイン；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、モンツァ、イタリア）により検出した。
【０１７０】
Ｈ＆Ｅ染色
簡単に述べると、組織切片を、製造者のプロトコールに従い、Ｈｉｓｔｏ・Ｐｅｒｆｅｃｔ（商標）Ｈ＆Ｅ染色キット(商標）（製造社：ＢＢＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で染色した。
【０１７１】
サンプル処理
４％パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬することにより組織を固定した後、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋した。１０ｍｍ厚の水平断連続切片を分析用に処理した。フルオレセイン免疫染色では、使用した一次抗体は下記のものであった：抗Ｎｅｓｔｉｎ（１：３００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｏｔｘ２（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｎｏｇｇｉｎ（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｔｈｙ１．１（１：１００、Ａｂｃａｍ）、抗シンタキシン（１：５０、Ｓｉｇｍａ）、抗グルタミンシンセターゼ（Ｓｉｇｍａ、１：１００）、抗アネキシンＶ（１：２００、Ａｂｃａｍ）および抗Ｋｉ６７（Ｓｉｇｍａ、１．１００）。使用した二次抗体は下記のものであった：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３と結合された抗マウスＩｇＧおよび抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１７２】
統計分析
各切片において３つの異なる網膜領域（４０×視野）内の免疫反応性またはＹＦＰ陽性細胞の数を計数した。少なくとも３個体の異なるマウスから各眼について計１０枚の連続切片を検査した。統計分析では、データは、各２反復で行った少なくとも３回の独立した実験からプールした場合の平均±ＳＥＭで表した。
【０１７３】
２．結果
色素性網膜炎は、１００を超える既知の遺伝子における種々の突然変異から起こる破壊的失明障害である[Wright et al. Nat Rev Genet 11, 273-284, doi:nrg2717 [pii]10.1038/nrg2717 (2010)]。Ｒｄ１マウスは、サイクリックＧＭＰ特異的３’，５’−環状ホスホジエステラーゼのβサブユニットをコードするＰＤＥ６Ｂ遺伝子における自然劣性突然変異を有する。この機能欠失型突然変異は、桿体におけるサイクリックＧＭＰおよびＣａ２＋の蓄積を生じ、やがて光受容細胞死に至る[Doonan et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 3530-3538, doi:46/10/3530 [pii]10.1167/iovs.05-0248 (2005)]。Ｒｄ１マウスはこの突然変異について同型接合であり、これらのマウスはこの変性疾患の急速進行の重篤モデルに相当する。
【０１７４】
ＨＳＰＣは、全種類の血液細胞を生じることができる多分化能細胞である。さらに、ＨＳＰＣは、ＣＮＳを含め種々の組織に対してある程度の再生能を伴う、いくらかの可塑性を保持していることが提示されている[Alvarez-Dolado, M. Front Biosci 12, 1-12 (2007)]。
【０１７５】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化は、網膜変性の種々のマウスモデルにおいてミュラーグリア（ミュラー細胞）の増殖および脱分化を促進することが示されており、ＣＮＳ可塑性の調節におけるこの経路の関与の可能性が示唆される[Osakada, F. et al. J Neurosci 27, 4210-4219 (2007)]。実際に、発明者らは最近、胚性幹細胞（ＥＳＣ）におけるＷｎｔ３ａまたはＧＳＫ−３阻害剤ＢＩＯによるＷｎｔ／β−カテニン経路の間欠的活性化は、細胞融合後の神経系前駆細胞のリプログラミングを強く促進することを報告した[Lluis et al. Cell Stem Cell 3, 493-507 (2008)]。従って、発明者らは、ＨＳＰＣと網膜ニューロンとの融合は、移植されたＨＳＰＣにおけるＷｎｔ／β−カテニン経路の一時的な活性化と相まって、ｒｄ１マウスにおける網膜再生および機能的視力の救済の機構となり得るかどうかに答えを求めた。
【０１７６】
従って、発明者らは、出生１０日後（ｐ１０）のＲ２６Ｙｒｄ１マウス（Ｒ２６Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ＹＦＰ導入遺伝子を保持し、ｒｄ１突然変異に関して同型接合である）の眼の網膜下にＬｉｎ−  ＨＳＰＣＣＲＥ／ＲＦＰ（ＣＲＥと赤色蛍光タンパク質［ＲＦＰ］を安定発現するドナーマウスから単離）を移植し、２４時間後にこれらのマウスを犠牲にした。細胞融合の場合にはＲＦＰおよび黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の二重陽性ハイブリッド細胞が見られると予測された（図１ａ）。実際に、網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）に極めて多数のハイブリッド（ＲＦＰ／ＹＦＰ陽性）が見られ、少量ながら内顆粒層（ＩＮＬ）にも見られた（図２ａ）。
【０１７７】
発明者らは、ＧＳＫ−３阻害剤ＢＩＯはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＥＳＣと神経系前駆細胞との融合効率を高めないことが従前に示されている[Lluis et al. (2008)前掲]。ここでも同様に、発明者らがＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化させるために、ＢＩＯで２４時間前処理したＨＳＰＣＣＲＥ，ＲＦＰ（以下、ＢＩＯ−ＨＳＰＣと呼ぶ）を移植した場合に、ＯＮＬにおいて匹敵するレベルのハイブリッドが見られた（図１ｂおよび１ｃ）。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの融合効率の調節におけるＢＩＯの役割は除外された。対照的に、対照野生型Ｒ２６Ｙマウスでのｐ１０における網膜下移植後には融合事象は見られず（図１ｄおよび１ｅ）、このことは遺伝的な細胞傷害が網膜ニューロンとＨＳＰＣの間の融合を誘発することを示している。
【０１７８】
次に、網膜細胞融合相手を特定するために、ＨＳＰＣＣＲＥ（ＲＦＰ陽性でない）をＲ２６Ｙｒｄ１マウスの網膜下に移植した。これらのＨＳＰＣはＯＮＬにおいて桿体と特異的に融合し（ロドプシン／ＹＰＦ二重陽性細胞）（図２ｂ）、また、ミュラー細胞と特異的に融合した（グルタミンシンセターゼ／ＹＦＰ二重陽性細胞）（図２ｃ）。しかしながら、これらのＨＳＰＣと錐体の間の融合は全く見られなかった（図２ｄ）。
【０１７９】
ｒｄ１マウスにおける神経変性は、ｐ１０において、光受容器（最初は桿体、その後、結果として錐体）がアポトーシスおよび変性を受けることからすでに明らかであり；ｐ２０までにこれらはすでにほとんど全面的に進んでしまう。興味深いことに、アポトーシス光受容器の数は、ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植後に実質的に減少し、移植後２４時間の時点ですでに桿細胞死が遅延または停止されたことを示唆した（図２ｅ）。さらに、ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣＲＥ，ＲＦＰと網膜ニューロンとの融合（すなわち、ＢＩＯ−ハイブリッド）から得られたＹＦＰ陽性ハイブリッドでは、低レベルのアポトーシス（全ＹＦＰ陽性細胞の２０％）と高い増殖速度（１６％）が存在した。対照的に、非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥ，ＲＦＰと網膜ニューロンの間で形成されたハイブリッド（すなわち、ｎｏ−ＢＩＯ−ハイブリッド）では、高いレベルの細胞死（７５％）と低増殖速度（２％）が存在した（図２ｆ、２ｇおよび図３）。
【０１８０】
ＹＦＰ／ＲＦＰハイブリッドの特性を決定するために、それらを移植網膜からＦＡＣＳで選別し、いくつかの前駆ニューロンマーカーおよび網膜マーカーの発現をｑＲＴ−ＰＣＲ分析により解析した（図２ｈ）。ニューロン前駆体Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２は、ＢＩＯ−ハイブリッドにおいて明らかに活性化され、Ｃｒｘ、ＲｘおよびＣｈｘ１０光受容器前駆体マーカーの活性は低かった。さらに、最終分化状態の光受容器で発現されるロドプシンおよびフェリフェリン(pheripherin)（ｒｄｓ）、およびＧＡＴＡ−１、ＨＳＰＣマーカーは、ＢＩＯ−ハイブリッドにおいて強くダウンレギュレートされた。対照的に、ｎｏ−ＢＩＯ−ハイブリッドでは、前駆細胞マーカーの再活性化または系列遺伝子のサイレンシングは見られなかった（図２ｈ）。
【０１８１】
次に、切片においてタンパク質発現を分析した。この場合、ＢＩＯ−ハイブリッドはＮｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２の発現が活性化されており；対照的に、ｎｏ−ＢＩＯ−ハイブリッドでは、これらのマーカーの活性化はほとんど見られなかった（図４）。従って、これらのデータは、新たに生成したＢＩＯ−ハイブリッドにおける脱分化プロセスの誘導を示す。
【０１８２】
結論として、ＢＩＯ処理ＨＳＰＣと網膜ニューロンとの融合から得られるＢＩＯ−ハイブリッドはアポトーシスに入らず、代わりに、細胞増殖および脱分化を受けて、種々の膜前駆ニューロンマーカーを再活性化する。対照的に、非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣから得られるハイブリッドは増殖も脱分化もせず、代わりに、アポトーシスを受ける。
【０１８３】
次に、これらのＢＩＯ−ハイブリッドが網膜組織を再生するかどうかを調べるために、発明者らは、経時的実験を行った。ＢＩＯ−ＨＳＰＣＲＦＰ／ＣＲＥおよびｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣＲＦＰ／ＣＲＥをｐ１０において種々のＲ２６Ｙｒｄ１マウス群の網膜下に移植し、５日後（ｐ１５）、１０日後（ｐ２０）、１５日後（ｐ２５）、および２か月後（ｐ６０）の網膜切片に対してＴＵＮＥＬおよびＨ＆Ｅ染色を行った。ＢＩＯ−ＨＳＰＣおよびｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣを移植した両場合の眼の網膜切片では、ＯＮＬの正常構造により示されるように（図５ａ、５ｂおよび６ａ）、ｐ１５においてなお明らかに光受容器が存在していたが、網膜ニューロンの生存率は大きく異なっていた。ｐ１５では、ｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣを移植した眼の切片の光受容器層には広範なアポトーシスが存在したが（図５ｃおよび６ａ）；対照的に、ＢＩＯ−ＨＳＰＣを移植した網膜のＯＮＬには、ｐ１５において、細胞死がほとんど存在しなかった（図５ｄおよび６ａ）。注目すべきは、それ以降の時点（ｐ２０およびｐ２５）では、ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植眼の光受容器層はその正常構造を維持していたが（図５ｆ、５ｈおよび６ａ）、ｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植眼のＯＮＬには桿体および錐体の核が存在しなかった。その代わりに、細胞に異常な核の層が少し見られ、これらは色素を発現し、網膜色素上皮マーカーＲｐｅ６５およびＲＦＰに対してのみ陽性であった（図５ｅ、５ｆ、５ｇ、６ａおよび６ｂ）。
【０１８４】
最後に、移植後２か月の時点では、ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植ｒｄ１マウスの網膜は、組織全体において、１０列の光受容器核と正常な外部および内部セグメント構造を持つことで、野生型網膜となお区別可能であった（図５ｉ、５ｊ、５ｋおよび５ｌ）。他方、ｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植網膜の組織構造は非移植ｒｄ１眼の組織構造に匹敵するものであり、完全に脱分化した光受容器層を持っていた（図５ｍ、５ｎ、５ｏおよび５ｐ）。
【０１８５】
よって、移植されたＢＩＯ−ＨＳＰＣは、移植後少なくとも２か月まで、ｒｄ１マウスの網膜において光受容器層を保存したと結論付けることができる。これは変性機構の遮断か再生プロセスの活性化のいずれかを示唆すると思われる。対照的に、ｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣの移植は、仮に移植細胞が網膜色素上皮細胞に分化転換するそこそこの能力を保持していたとしても、ｒｄ１マウスの表現型を救済しなかった。
【０１８６】
ハイブリッドの長期分化を調べるために、ｐ１０のＲ２６Ｙｒｄ１マウスにＢＩＯ−ＨＳＰＣＣＲＥまたはｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣＲＥを移植し、移植から２か月後に再び分析を行った。この場合には、ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植ｒｄ１マウス網膜には、全層にＹＦＰ陽性細胞が存在した（図７ａ）。
【０１８７】
免疫蛍光染色は、ＹＦＰハイブリッドはロドプシン染色に対しては陽性であったが（図７ａ）、錐体オプシン染色に対しては陽性でなかった（図７ｂ）ので、これらのハイブリッドは桿体に分化したが、錐体には分化しなかったことを示した。さらに、ミュラー細胞マーカーであるグルタミンシンセターゼまたは内皮細胞マーカーであるＣＤ３１に関しても陽性であったＹＦＰハイブリッド細胞は見られず、従って、これらのハイブリッドのミュラー細胞または網膜血管への分化は除外された（図７ｃおよび７ｄ）。対照的に、ｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植細胞では、移植から２か月後にＹＦＰ陽性ハイブリッドはほとんど見られず、これはこれらのハイブリッドがこの期間生存しなかったためである（図８ａ）。よって、ＢＩＯ−ハイブリッドは桿体に特異的に分化し、その結果として、錐体が生存し得ると結論付けることができる。要するに、総ての桿体にＹＦＰが発現するということは、新生ハイブリッドがｒｄ１突然変異光受容器に取って代わり、それにより、網膜組織を再生することを明らかに示す。
【０１８８】
ハイブリッドの桿体への分化をさらに評価し、この融合を介した再生プロセスがｒｄ１マウス突然変異を救済できるかどうかを調べるために、ｒｄ１マウスには発現されないＰＤＥ６Ｂの発現を分析した。注目すべきは、移植網膜からの全抽出物のウエスタンブロット法により確認されたように、ＹＦＰ／ロドプシン二重陽性桿体はまた、ＰＤＥ６Ｂ発現に関しても陽性であった（図７ｇ）。これらの結果は、ＢＩＯ−ハイブリッドが野生型桿体を生成し、それにより、網膜を再生し得ることを示し（図７ｅ、７ｆおよび８ｂ）；これは、ｒｄ１桿体は野生型ＰＤＥ６Ｂを発現することができず、この突然変異はこれらのハイブリッド内のＨＳＰＣゲノムによって補償されたためである。
【０１８９】
次に、再生した桿体が電気生理学的機能もあったかどうかを調べるために、発明者らは、ＢＩＯ−ＨＳＰＣまたはｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣの移植から１か月後にｒｄ１マウスに対して網膜電位図検査を行った。重要なこととしては、ＢＩＯ−ＨＳＰＣを移植した８個体のうち４個体のマウスにおいて、暗所および明所条件下でＡ波およびＢ波の両方が記録され、振幅Δは平均１５０μＶ程度であったが（非掲載）、このことは、再生した桿体が光刺激に応答して細胞−膜の過分極を受けたこと、およびそれらの再生桿体が、Ｂ波応答が示すように、介在ニューロンに電気信号を送ることができたことを示す。組織学的分析下での網膜再生により機能的救済が確認された（非掲載）。さらに、２．０〜２．５か月齢のｒｄ１マウスの処置群の視力をオプトメーター検査で分析した。ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植ｒｄ１マウスでは、動いている対象を検知する動物の自動応答を測定するヘッドトラッキング運動の回数[Abdeljalil et al. Vision Res 45, 1439-1446, doi:S0042-6989(05)00005-2 [pii]10.1016/j.visres.2004.12.015 (2005)]は、非移植およびｎｏ−ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植ｒｄ１マウスで測定されたものよりも有意に高かった（示されていない）。これは、ＢＩＯ−ＨＳＰＣ移植ｒｄ１マウスにおける刺激後の視覚応答を実証した。
【０１９０】
３．考察
骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）を用いて網膜変性の機能を改善するための試みをいくつか行った。ｒｄ１マウス眼の硝子体内に注射したＬｉｎ−  ＨＳＰＣは、二次的な疾患表現型である網膜血管変性を防ぐことができ、これが次に網膜錐体の変性を遅延させたことが報告されている。しかしながら、移植された網膜は、ほとんど錐体のみから形成され、網膜電位図応答は極めて異常であり、非処置動物に匹敵していた[Otani et al. J Clin Invest 114, 765-774, doi:10.1172/JCI21686 (2004)]。ＢＭＳＣ移植後の網膜機能の改善機構に関するさらなる検討は、血管新生の増大、または炎症の軽減、またはさらには抗アポトーシス作用（これらは疾病の進行を緩徐化するために、網膜変性を遅延させ、従って、有益であり得る）を促進するＢＭＳＣの役割に基づくものであった。さらに、光受容器の生存を持続させ得る、網膜色素上皮における移植ＢＭＳＣの分化転換が急性眼損傷マウスモデルにおいて示されている[Siqueira et al. Arq Bras Oftalmol 73, 474-479, doi:S0004-27492010000500019 [pii] (2010)]。しかしながら、これらのアプローチは総て、網膜組織の再生を有意に改善するとは思われなかったので、治療上有効と言うにはなおほど遠かった。
【０１９１】
さらに、全身移植されたＢＭＳＣは、心臓、骨格筋、肝臓および脳などの種々の組織において常在細胞と融合することが報告されている[Terada et al. Nature 416, 542-545 (2002); Alvarez-Dolado et al. Nature 425, 968-973 (2003); Piquer-Gil et al. J Cereb Blood Flow Metab 29, 480-485 (2009)]。しかしながら、これらの融合事象は極めて稀であると思われ、当然のことながら、それらの生理学的関連に関していくらかの懐疑を生む[Wurmser & Gage. Nature 416, 485-487 (2002)]。ゆえに、発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されなければ、これらのハイブリッドはアポトーシスを受け、従って、後期の段階では検出できないことを明らかに証明した。これらの移植ＨＳＰＣの大部分は融合せず、その代わりに死滅するが、少数は網膜色素上皮細胞に分化転換することができ、これらは間葉起源のものである。この分化転換は変性のある程度の緩徐化を提供することができるが、この表現型を救済することはできない。
【０１９２】
対照的に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、ハイブリッド内のＨＳＰＣゲノムにＰＤＥ６Ｂ遺伝子を活性化させるが、この条件において、ハイブリッドはそれら自体、一時的な脱分化状態を経て、桿体へ分化する指示を受けている。ヘテロカリオンは検出できなかったが、一部存在していたということは外見上では排除できない。しかしながら、再生した光受容器はＰＤＥ６ＢとＹＦＰを共発現しており、このことは、網膜ニューロンと移植されたＨＳＰＣのゲノムが同じ細胞内で混合していたことを示した。還元分裂または肝臓再生の際に従前に報告されているような多極分裂機構が再生した光受容器の倍数性を減じることができるかどうか、または二重のゲノムコピーが新生桿体に許容され、最終的に錐体変性を防ぐかどうかが、なお決定されるべきである。実際に、四倍体ニューロンはマウスおよびヒト脳において同定されている[Wurmser & Gage前掲]。
【０１９３】
個々の色素性網膜炎突然変異を治療するためにいくつかの遺伝子療法の試みが行われてきたが、各単一の遺伝子突然変異を治療するために個々の遺伝子療法を作り出すよりも、突然変異非依存性細胞療法のアプローチの方がはるかに有効で実用的である可能性がある。これらのデータは、色素性網膜炎ならびにさらには網膜変性疾患を有する患者の処置に真の希望を与える。
【０１９４】
実施例２
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達がマウス網膜におけるニューロンのリプログラミングを惹起する
この実施例は、哺乳動物の組織において体細胞のリプログラミングが誘導可能であるかどうかを分析するために行った。得られた結果は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化されると、マウス網膜ニューロンはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、移植された造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）との自発的融合後に、一時的にリプログラミングされて前駆体段階に戻ることができることを示す。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞ハイブリッドの形成には網膜傷害が不可欠であることが示された。新たに形成されたハイブリッドは、ニューロン前駆体マーカーＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを再活性化し、さらに、これらのハイブリッドは増殖可能である。これらのハイブリッドは間もなく、神経外胚葉系列へ、最終的には最終分化ニューロンへの分化が運命付けられ、これにより、傷害を受けた網膜組織を再生することができる。網膜傷害および眼におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の誘導に次いで、眼における骨髄細胞の内因的動員の後にも細胞融合を介したリプログラミングが起こる。これらのデータは、最終分化状態の網膜ニューロンのｉｎ−ｖｉｖｏリプログラミングが組織再生の可能性のある機構であることを示す。
【０１９５】
１．実験手順
動物の飼育および処置
マウスに対する手順は総て、眼科および視覚研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言(the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)および動物研究に関する当所指針に従って行った。総ての動物を１２時間明／暗周期下で維持し、食物および水は自由に摂らせた。
【０１９６】
網膜傷害およびＢｒｄＵ処置
３か月齢のマウスをケタミン：メントミジン（８０ｍｇ／ｋｇ：１．０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））注射により麻酔した。網膜傷害を誘発するために、マウスの硝子体を２μｌの２０ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）（計４０ｎｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ）で２４時間処置した[Timmers et al., Mol Vis 7, 131-137 (2001)]。対照眼には２μｌのＰＢＳを施した。ＢｒｄＵ組み込みアッセイでは、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に５０ｍｇ／ｋｇ体重のＢｒｄＵ投与を施した。
【０１９７】
幹細胞の調製および移植
網膜幹細胞および前駆細胞（ＲＳＰＣ）は、従前に記載されているように[Sanges et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 17366-17371 (2006)]、成体Ｃｒｅマウスの毛様体縁から単離した。系列陰性ＨＳＰＣ（Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ）は、Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、Ｃｒｅ、Ｃｒｅ−ＲＦＰまたはＲ２６Ｙマウスの全ＢＭから単離した。ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣは、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。細胞を１μＭのタモキシフェンで２４時間前処理してＣｒｅリコンビナーゼの核移行を誘導し、必要であれば、移植前にＶｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤ（５μｌ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。
【０１９８】
ＥＳＣＣｒｅを得るために、ＥＳ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ａｍａｘａ）を用い、５×１０６のＥＳＣに、Ｃｒｅリコンビナーゼ担持ベクター（ＣＡＧＧ−Ｃｒｅ）をエレクトロポレーションした。
【０１９９】
幹細胞（ＳＣ）は、未処理のままとするか、または１００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａもしくは１μＭのＢＩＯで２４時間前処理し、最後に５×１０５細胞を麻酔したマウスの硝子体内に注射した。マウスを頚椎脱臼により犠牲にし、組織学的分析のためにそれらの眼球を摘出した。
【０２００】
遺伝子発現および四倍性分析のためのハイブリッドの単離
細胞移植から２４時間後に、網膜組織を処置マウスから単離し、トリプシン中で機械的摩砕により解離させた。
【０２０１】
四倍体含量のハイブリッドを分析するために、細胞をペレットとし、１×ＰＢＳで２回洗浄し、氷中にて７０％エタノールで２時間固定した。固定後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび２５μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに室温で３０分間インキュベートした。サンプルをＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析した。ダブレットの識別は、ＰＩチャネルのパルス面積に対するパルス幅にゲートを設定することにより行った。サンプルはＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を用いて分析した。
【０２０２】
遺伝子発現分析では、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩソーティングマシーン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、赤と緑の陽性ハイブリッド細胞を単離した。ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｅ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って用い、全ＲＮＡを抽出した。溶出したＲＮＡをスーパースクリプトＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、製造者の推奨に従い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００リアルタイムＰＣＲマシーンにて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。使用した種特異的オリゴを表３に挙げる。実験は総て３反復で行い、ｃＤＮＡインプットの違いは、ＧＡＰＤＨの発現に対する正規化により補正した。
【０２０３】
表３
ｑＲＴ−ＰＣＲ用のヒトおよびマウス特異的プライマー
【表３】
2014527407.tif 000004
【０２０４】
【表４】
2014527407.tif 000005
【０２０５】
骨髄（ＢＭ）補充
ＢＭ移植は、軽微な修正を行って、従前に報告された通りに行った。４〜６週齢のＲ２６ＹまたはＮｅｓｔｉｎ−ＣｒｅレシピエントマウスのＢＭを、それぞれＲＦＰ／ＣＲＥまたはＲ２６Ｙトランスジェニックマウスの脛骨および大腿由来のＢＭ細胞で再構成した。ＢＭ細胞（１×１０７細胞）をγ線照射（９Ｇｙ）から３時間後にレシピエントに静注した。レシピエントの眼を鉛遮蔽体で保護して放射線誘発性の傷害（放射線網膜症）を防止した。移植から４週間後に、キメラマウスの末梢血を尾静脈から採取し、再構成されたＢＭを評価した。
【０２０６】
固定、切片化および免疫組織化学
４％パラホルムアルデヒドに一晩浸漬することにより組織を固定し、次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋した。１０μｍ厚の水平断連続切片を免疫組織化学用に処理し、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰおよびＲｏｓａ２６−ＹＦＰ蛍光の可視化は、蛍光顕微鏡により行った。
【０２０７】
フルオレセイン免疫染色では、使用した一次抗体は下記のものであった：抗Ｎａｎｏｇ（１：２００、Ｒ＆Ｄ）、抗Ｏｃｔ４（１：１００、ＡｂＣａｍ）、抗Ｎｅｓｔｉｎ（１：３００、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＡＴＡ４（１：５００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｏｔｘ２（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｎｏｇｇｉｎ（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｈａｎｄ１（１：４００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｔｕｊ−１（１：１００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｔｈｙ１．１（１：１００、Ａｂｃａｍ）、抗シンタキシン（１：５０、Ｓｉｇｍａ）、抗グルタミンシンセターゼ（Ｓｉｇｍａ、１：１００）、抗アネキシンＶ（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗Ｋｉ６７（Ｓｉｇｍａ、１．１００）および抗ＢｒｄＵ（１：３００、Ｓｉｇｍａ）。使用した二次抗体は下記のものであった：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３と結合された抗マウスＩｇＧおよび抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０２０８】
ＧＦＰおよびＹＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、組織切片をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で対比染色して評価し、Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）またはＬｅｉｃａレーザー共焦顕微鏡システムのいずれかを用いてそれらの写真を撮影した。
【０２０９】
リプログラミングされたハイブリッドのＩｎ−ｖｉｔｒｏ培養
ＢＩＯ処理または非ＢＩＯ処理のＥＳＣまたはＨＳＰＣを、ＮＭＤＡ傷害を受けたＮａｎｏｇ−ＧＦＰ−ｐｕｒｏマウスの眼に注射した。移植から２４時間後に、網膜組織を単離し、３７℃にて３０分間トリプシンで処理した。次に、火で穴をあけたパスツール(fire bore hole Pasteur)を用いて、これらの細胞を、ＥＳ培養培地中の単一細胞懸濁液として再懸濁させ、ゼラチンコーティングディッシュに３×１０５細胞／９．６ｃｍ２濃度での播種した。リプログラミングクローンを選択するために、７２時間後に培養培地にピューロマイシンを加えた。ＧＦＰ陽性クローンを計数し、培養１か月後に写真を撮影した。これらのクローンを培養１か月後に従前に記載されているように、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）で染色した[Lluis et al., Cell Stem Cell 3, 493-507 (2008)]。
【０２１０】
フラットマウント網膜および視神経の調製と神経節細胞の計数
網膜フラットマウントは従前に記載されているように調製した。簡単に述べると、眼を鋸状縁に沿って二等分し、網膜を色素上皮から分離し、Ｉｓｏｐｏｒｅ  ３ｍｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に神経節細胞側を上にしてマウントした。次に、網膜を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、上記のように免疫染色用に処理した。視神経を眼から切り取り、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、スライス上に直接マウントした。
【０２１１】
神経節細胞層内の全細胞を、軽微な修正を施して従前に記載されているように(Jakobs et al., (2005). J Cell Biol 171:313-315)計数した。フラットマウント網膜をＤＡＰＩで対比染色し、ｇｃｌに焦点を合わせた共焦顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５）にて２０倍で調査写真を撮影した。網膜全体にわたるには約８０枚の画像を必要とした。Ｆｉｊｉソフトウエアを用いて細胞核を計数し、細胞数／平方ミリメートルとしてグラフ化した。Ｍａｔｌａｂにおける定期的書き込みによって各画像の二次元密度地図を得、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ９で、各写真からマウント網膜全体の写真をアセンブルした。
【０２１２】
統計分析
各切片において３つの異なる網膜領域（４０×視野）内の免疫反応性細胞、またはＮａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性細胞およびＮａｎｏｇ−ＹＦＰ陽性細胞の数を計数した。少なくとも３個体の異なるマウスから各眼について計１０枚の連続切片を検査した。統計分析では、データは、各２反復で行った少なくとも３回の独立した実験からプールした場合の平均±ＳＥＭで表した。実験は少なくとも３個体の異なるマウスを用いて行った。対応のないスチューデントのｔ検定を用いて差を調べた。
【０２１３】
２．結果
ＮＭＤＡ誘発損傷は網膜ニューロンと幹細胞の間の融合を惹起する
細胞融合を介した体細胞のリプログラミングは培養において誘導することができるが、最終分化細胞が成体脊椎動物の組織内での細胞融合によりリプログラミングできるかどうかは、なお確認すべきである。
従って、発明者らはまず、ＳＰＣがｉｎ  ｖｉｖｏで網膜ニューロンと融合できるかどうかを調べた。このために、発明者らは、遍在的に発現されるＲｏｓａ２６プロモーターの制御下にｌｏｘＰ部位に挟み込まれたＹＦＰ（すなわち、ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰ［Ｒ２６Ｙ］対立遺伝子を有する）を有するトランスジェニックマウスをレシピエントとして用いた[Srinivas et al., BMC Dev Biol 1, 4 (2001)]。Ｃｒｅリコンビナーゼを安定発現し、かつ、赤で標識された種々のＳＰＣをレシピエントマウスの眼に硝子体内注射により移植した（５×１０５細胞／眼）。具体的には、発明者らは、ＣＲＥ−ＲＦＰ二重トランスジェニックドナーマウスから単離した系列陰性（Ｌｉｎ−）ＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰ、Ｃｒｅトランスジェニックマウス眼の毛様体縁から単離した１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン色素（ＤｉＤ）標識ＲＳＰＣＣｒｅ[Sanges et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 17366-17371 (2006)]、および発明者らにより作製されたＤｉＤ標識ＥＳＣＣｒｅ遺伝子を用いた。マウスをＳＰＣ注射後の種々の時点で犠牲にした。注射されたＳＰＣＣｒｅとＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰ（Ｒ２６Ｙ）網膜ニューロンの間で細胞融合が起こっていたとしたら、Ｃｒｅによる終止コドンの切除のために、網膜切片においてＹＦＰ発現を検出することが期待できた（図９Ａ）。
【０２１４】
まず、発明者らは、Ｒ２６ＹマウスにおけるＮＭＤＡの硝子体内注射により引き起こされた網膜組織傷害が細胞融合を誘導できるかどうかを調べた。従前に示されたように[Osakada et al., J Neurosci 27, 4210-4219 (2007)]、ＮＭＤＡは網膜のｉｎｌおよびｇｃｌ内のニューロンのアポトーシスを引き起こしたが（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ＮＭＤＡは、これらのＲ２６ＹマウスにおけるＹＦＰ導入遺伝子の確率的発現を増強しなかった（図１０Ｃ）。次に、発明者らは、Ｒ２６Ｙマウスの右眼にＮＭＤＡ傷害を誘導し、反対側の左眼は対照として傷害無しとし、２４時間後にＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰを両眼に移植した。最後に、マウスを移植から２４時間後、４８時間後または７２時間後に犠牲にした（図９Ａ）。
【０２１５】
移植２４時間後にすでに、この視野において検出された、注射されたＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰの最大７０％が網膜細胞と融合しており、従って、ＹＦＰ陽性ハイブリッドを生じていた（図９Ｂ、９Ｄおよび１０Ｄ）。興味深いことに、移植された細胞は網膜組織に組み込まれ、ｇｃｌ超えて、ｉｎｌに至りさえした（図９Ｂ、ＮＭＤＡ）。対照的に、反対側の非傷害眼ではＹＦＰ陽性ハイブリッドは存在せず、さらに、移植されたＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰはｇｃｌの境界に留まり、網膜組織には組み込まれなかった（図９Ｃおよび９Ｄ、Ｎｏ  ＮＭＤＡ）。同様の結果が、移植４８時間後および７２時間後に犠牲にしたマウスの網膜切片でも見られた（図９Ｄ）。四倍体細胞の存在もフローサイトメトリーにより分析した。４Ｃ  ＤＮＡ含量を有する核は、ＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰを移植したＲ２６Ｙマウスの網膜に存在するハイブリッドにおいて明らかな証拠があった（図１０Ｃ）。
【０２１６】
これらのデータは、移植されたＨＳＰＣの網膜組織への遊走およびそれらの網膜ニューロンとの融合を誘導するためには損傷が必要であったことを示した。
【０２１７】
網膜組織におけるハイブリッド（ＹＦＰ陽性細胞）の局在は、移植された細胞が神経節細胞（ｇｃｌにおけるそれらの核に局在する）および無軸索細胞（ｉｎｌおよび内網状層(inner plaxiform layer)（ｉｐｌ）にわたって局在する）と融合したことを示唆した（図１０Ａ）（それらはＮＭＤＡ処理後に特異的に傷害された網膜細胞であることを注記しておく）[Osakada et al. (2007),前掲]。従って、どの網膜細胞がＨＳＰＣと融合したかを確認するために、発明者らは、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰをＮＭＤＡ傷害を受けたＲ２６Ｙ眼に移植してから１２時間後に、ＹＦＰ陽性ハイブリッドにおける種々の網膜細胞マーカーの発現を分析した。ｇｃｌにおける神経節細胞マーカーｔｈｙ１．１に対して陽性のＹＦＰハイブリッド（図９Ｅ）、またはｉｐｌにおける無軸索細胞マーカーシンタキシンに対して陽性のＹＦＰハイブリッド（図９Ｆ）。ミュラー細胞マーカーグルタミンシンセターゼとの共局在は見られなかった（図９Ｇ）。ＹＦＰ陽性ハイブリッドの６０％はｔｈｙ１．１陽性であったが、２２％はシンタキシン陽性であり（図１０Ｆおよび１０Ｆ）、このことは、大多数のハイブリッドが神経節細胞とＨＳＰＣの間で形成され、一部、無軸索細胞との融合が存在することを示している。ＹＦＰ陽性ハイブリッドの残りの１８％では、融合相手は明らかでなく、実際には、新たに形成されたハイブリッドではｔｈｙ１．１および／またはシンタキシンのダウンレギュレーションが見られる場合もあった。
【０２１８】
次に、発明者らは、ＤｉＤ標識ＥＳＣＣｒｅおよびＤｉＤ−ＲＳＰＣＣｒｅをＲ２６Ｙマウスの非傷害眼およびＮＭＤＡ傷害眼に注射することにより、同様の実験を行った。両細胞種とも、視野において検出される注射細胞の最大７０％が網膜ニューロンと融合していた（図１１Ａ、１１Ｂ、および１０Ｄ）。また、これらの細胞は、ｇｃｌおよびｉｐｌにおけるＹＦＰシグナルの局在により、およびＹＦＰとｔｈｙ１．１またはシンタキシンシグナルの共局在により示されるように、神経節細胞および無軸索細胞と融合する（図１１Ａ、１１Ｂおよびデータは示されていない）。
【０２１９】
注射したＳＰＣが実際に有糸分裂後の網膜ニューロンと融合することをさらに確認するために、融合事象前の網膜細胞の増殖能を分析した。Ｒ２６Ｙマウスの眼へのＮＭＤＡと同時に、発明者らは、チミジン類似体５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹膜内に注射し、次に、２４時間後にＥＳＣＣｒｅを注射し、最後に、この移植から２４時間後にマウスを犠牲にした。ＹＦＰに対しても陽性であると見られる（緑矢印）ＢｒｄＵ陽性細胞（赤矢印）は無く、ＥＳＣと増殖中の細胞との融合は除外された（図１１Ｃ）。ｇｃｌに隣接して見られたＢｒｄＵ陽性細胞は（図１１Ｃ、赤矢印）おそらく、傷害後の網膜に動員されたマイクログリア細胞であった[Davies et al., Mol Vis 12, 467-477]。
【０２２０】
全体的に見れば、これらのデータは、細胞傷害時には、ＨＳＰＣ、ＥＳＣおよびＲＳＰＣがｉｎ  ｖｉｖｏで網膜ニューロンと自発的に融合可能であることを実証する。
【０２２１】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて網膜ニューロンのリプログラミングを惹起する
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路はＮＭＤＡ傷害後に活性化されてβ−カテニンの発現の増強をもたらし、β−カテニンが細胞に蓄積する（図１２ＡおよびOsakada et al. (2007)前掲参照）。よって、発明者らは、内因性のＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化がｉｎ  ｖｉｖｏで細胞融合後のリプログラミングを媒介できるかどうかを検討した。
【０２２２】
このために、下記の２つの異なるマウスモデルをレシピエントマウスとして使用した：Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥ（神経前駆体においてＮｅｓｔｉｎプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス）[Tronche et al., Nat Genet 23, 99-103 (1999); Okita et al., Nature 448, 313-317 (2007)]およびＮａｎｏｇ−ＧＦＰ−Ｐｕｒｏマウス（胚においてＮａｎｏｇプロモーターの制御下でＧＦＰ−ピューロマイシン遺伝子を発現するトランスジェニックマウス）[Okita et al., Nature 448, 313-317 (2007)]、これらは、本発明者らに、それぞれ神経前駆体および胚段階でのリプログラミングを検討することを可能とした。ＤｉＤ標識ＨＳＰＣＲ２６ＹおよびＨＳＰＣＲＦＰをそれぞれＮｅｓｔｉｎ−ＣＲＥマウスおよびＮａｎｏｇ−ＧＦＰ−ｐｕｒｏマウスの眼に注射した。ＮＭＤＡは一マウス群の一方の眼の硝子体内に注射し、反対側の眼は対照として傷害無しとした。ここで重要なことに、ＮＭＤＡ処理後に神経節細胞および無軸索細胞においてＮａｎｏｇ−ＧＦＰ（図１２Ｃ）またはＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ（データは示されていない）導入遺伝子の発現は検出されなかった。２４時間後、ＨＳＰＣを非処理眼およびＮＭＤＡ処理眼の両方に注射し、さらに２４時間後にマウスを犠牲にした。これらのマウスモデルで、網膜ニューロンのリプログラミングの場合には、赤／緑二重陽性細胞が見られるということが予測できた（図１３Ａおよび図１２Ｂ）。非傷害眼にＨＳＰＣを注射した後では、緑の陽性細胞は見られなかった（図１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄおよび１３Ｅ、Ｎｏ  ＮＭＤＡ）。対照的に、Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥおよびＮａｎｏｇ−ＧＦＰ−ｐｕｒｏマウスそれぞれのＮＭＤＡ傷害眼にＨＳＰＣを注射した場合には、全赤血球の約３０％および２０％が緑でもあり（図１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄおよび１３Ｅ、ＮＭＤＡ；および１０Ｃ）、ハイブリッドの最大３０％が、それらがニューロンゲノムに再活性化されたＮａｎｏｇおよびＮｅｓｔｉｎプロモーターを持っていたことから、実際にリプログラミングされていたことを示す。
【０２２３】
網膜ニューロンのリプログラミングにおける内因性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化の役割を評価するために、これらのマウスモデルの両方において、ＮＭＤＡ注射直後にＤＫＫ１も注射した（ＤＫＫ１はＷｎｔ／β−カテニン経路の阻害剤である）[Osakada et al. (2007)前掲、図１２Ａ]。２４時間後にＨＳＰＣを移植し、２４時間後にマウスを犠牲にした。ＤＫＫ１注射はニューロン−ＨＳＰＣハイブリッドのリプログラミングをほぼ完全に遮断し（図１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄ、ＮＭＤＡ＋ＤＫＫ１）、これは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路内因的および傷害依存的活性化が、網膜ニューロンがＨＳＰＣと融合した後に、その網膜ニューロンのリプログラミングを惹起することを実証した。
【０２２４】
次に、発明者らは、注射前にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路がＧＳＫ−３阻害剤ＢＩＯまたはＷｎｔ３ａ処理により予め活性化されている場合のＨＳＰＣの移植後に、網膜ニューロンのリプログラミングが増強されたかどうかを分析することを目的とした（図１２Ｄ、１２Ｅおよび１２Ｆ）。驚くことに、Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥマウスおよびＮａｎｏｇ−ＧＦＰマウスのＮＭＤＡ傷害眼にＢＩＯ前処理またはＷｎｔ３ａ前処理ＨＳＰＣを移植してから２４時間後に、リプログラミングされた（緑陽性）ハイブリッドの数に、非処理ＨＳＰＣを施したＮＭＤＡ傷害眼で見られたものに比べて著しい増加が見られた（図１３Ｂおよび１３Ｅ；ＮＭＤＡ＋ＢＩＯ、ＮＭＤＡ＋Ｗｎｔ３ａ）。同様の結果が、細胞移植から４８時間後および７２時間後に犠牲にしたマウスでも見られた（データは示されていない）。ＢＩＯ処理ＨＳＰＣを非傷害眼に注射した後には、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ−ｐｕｒｏ（図１２Ｇ）およびＮｅｓｔｉｎ−ＣＲＥ導入遺伝子は両方とも発現されず（データは示されていない）、自発的細胞融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングには組織傷害が必要であることが確認されたことを注記しておく。
【０２２５】
このｉｎ−ｖｉｖｏリプログラミングの効率を評価するために、発明者らは、視野において検出された赤色ＨＳＰＣの全集団に対する緑陽性のリプログラミング細胞を計数した（図１０Ｃ）。傷害網膜では、ＢＩＯ前処理ＨＳＰＣおよびＷｎｔ３ａ前処理ＨＳＰＣの両方の最大６５％が融合後に網膜ニューロンをリプログラミングし、これらの両マウスモデルにおいて二重陽性ＨＳＰＣ−ニューロンハイブリッドをもたらした（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。
【０２２６】
ＨＳＰＣと最終分化ニューロンの融合後に胚段階でリプログラミングを認めたことは驚くべきことであったので、ＥＳＣおよびＲＳＰＣをＮＭＤＡ注射眼に移植した後のＮａｎｏｇ−ＧＦＰ導入遺伝子の活性化を検討した。
【０２２７】
予測できたように、ＥＳＣ移植の場合、内因性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化にも依存する網膜ニューロンのリプログラミングも見られた。ＧＦＰ陽性細胞もまた、ＥＳＣを移植前にＢＩＯまたはＷｎｔ３ａで前処理した際に著しく増加した（図１４Ａ）。ＥＳＣ−網膜ニューロンハイブリッドのリプログラミングを確認するために、発明者らは、ＢＩＯ処理または非処理ＥＳＣを移植したＮａｎｏｇ−ＧＦＰ−ｐｕｒｏマウスのＮＭＤＡ傷害網膜からＦＡＣＳにより選別したＧＦＰ陽性ハイブリッドを培養した。リプログラミングされたＧＦＰ陽性コロニーを培養増殖させたところ、それらはピューロマイシン選択にも耐性があり、かつ、アルカリ性ホスファターゼ(alkaline phosphatise)（ＡＰ）染色にも陽性であった（図１４Ｂ）。
【０２２８】
対照的に、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰマウスのＮＭＤＡ注射眼にＲＳＰＣを注射した後には、移植ＲＳＰＣをＢＩＯで前処理した場合であっても、リプログラミング事象は見られなかった（図１４Ｃ）。興味深いことに、Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥマウスのＮＭＤＡ傷害眼では、ＢＩＯ処理ＲＳＰＣＲ２６Ｙの移植後にわずかなＹＦＰ陽性細胞が見られたに過ぎなかった（示されていない）。
【０２２９】
最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける融合事象の増強におけるＢＩＯの効果も除外された。ＢＩＯの前処理は、Ｒ２６ＹマウスのＮＭＤＡ傷害眼に注射したＨＳＰＣ、ＥＳＣまたはＲＳＰＣの融合効率を高めなかった（図１４Ｄ）。
【０２３０】
ここでの結論として、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は胚／ニューロン前駆段階へと戻る網膜ニューロンのリプログラミングを惹起すること、およびこれはＨＳＰＣおよびＥＳＣの傷害依存性細胞−細胞融合の後に起こるが、ＲＳＰＣの場合には起こらないことが示された。
【０２３１】
リプログラミングされたハイブリッドをより良く同定するために、Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥおよびＮａｎｏｇ−ＧＦＰ導入遺伝子の再活性化を調べることに加え、新たに形成されたハイブリッドにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける前駆体および胚遺伝子の発現プロフィールを分析した。次に、Ｒ２６ＹマウスのＮＭＤＡ傷害眼にＢＩＯ処理または非処理ＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰを注射し、２４時間後に、網膜由来のハイブリッド細胞をＦＡＣＳにより選別した。マーカー発現をリアルタイムＰＣＲにより分析した。ＢＩＯ−ハイブリッド（ＢＩＯ処理ＨＳＰＣにより形成されたハイブリッド）では、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２がアップレギュレートされており（図１５Ａ）；実際に、これらの遺伝子の発現は、非移植ＮＭＤＡ注射網膜でも、ＨＳＰＣにおけるＮａｎｏｇを除きＨＳＰＣでも検出されなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。対照的に、ＨＳＰＣ特異的遺伝子であるＧａｔａ１は、ＢＩＯ−ハイブリッドではダウンレギュレートされていた（図１５Ａ）。Ｇａｔａ１の発現がＨＳＰＣに見られるものに匹敵していた非ＢＩＯ−ハイブリッドにおいて、再発現された前駆体マーカーは無かった（またはＮａｎｏｇおよびＮｅｓｔｉｎの場合には、発現が低かった）（図１５Ａおよび図１６Ｂ）。
【０２３２】
ＢＩＯ−ハイブリッドにおけるＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現は、それらのマージした免疫染色シグナルによっても確認され、切片にはＹＦＰ陽性ハイブリッドが存在する（図１５Ｂ）。
【０２３３】
しかしながら、胚および前駆体マーカーの再発現が、注射したＨＳＰＣのゲノムからではなく、ニューロンゲノムのリプログラミングから生じたことを明らかに証明するために、種間ハイブリッドを分析した。このために、発明者らは、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰマウスの傷害眼にＢＩＯ処理およびＤｉＤ標識ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣを移植した。ヒトＨＳＰＣの融合後の切片に、網膜ニューロンのリプログラミングが確認された（図１６Ｃ）。興味深いことに、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２は総て、選別されたハイブリッドの、リプログラミングされたマウスニューロンゲノムから発現された（マウス特異的オリゴヌクレオチドを用いて分析した通り；表３）（図１５Ｃ）。さらに、ヒトゲノムにおいて、Ｏｃｔ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｏｔｘ２およびＮｏｇｇｉｎの発現は活性化されたが、ＣＤ３４はダウンレギュレートされた（図１５Ｄ）。
【０２３４】
全体的に見れば、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路により制御されるＨＳＰＣ融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて起こり得ると結論付けることができる。
【０２３５】
リプログラミングされたニューロンはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖および分化可能である
次に、リプログラミングされたニューロンの増殖能を検討した。従って、ＢＩＯ処理および非処理ＨＳＰＣＣｒｅをＲ２６Ｙマウス群のＮＭＤＡ傷害眼に注射し、２４時間後に網膜切片を分析した。
【０２３６】
驚くことに、ＹＦＰ陽性のリプログラミングされたハイブリッドの８％（ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣｒｅの注射後）が増殖下にあり（図１５Ｅおよび１５Ｇ、Ｋｉ６７／ＹＦＰ二重陽性）；これらのハイブリッドのうちアネキシン−Ｖ染色に陽性であったのは約５％だけなので、これらの細胞はアポトーシスに運命付けられてはいなかった（図１５Ｆおよび１５Ｈ）。これに対して、非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣＲＥの注射は非増殖性ハイブリッドの形成をもたらし（図１５Ｅおよび１５Ｉ；Ｋｉ６７染色陰性）、ＹＦＰ陽性ハイブリッドの最大３０％がアネキシン−Ｖ染色に関して陽性であったことから（図１５Ｆおよび１５Ｊ、Ａｎｅｘｉｎ−Ｖ／ＹＦＰ二重陽性）、これらのハイブリッドはアポトーシス下にあった。ＢＩＯ処理または非ＢＩＯ処理ＥＳＣの移植から７２時間後にも同様の結果が得られた（図１６Ｄおよび１６Ｅ）。全体として見れば、これらのデータは、ＨＳＰＣまたはＥＳＣと網膜ニューロンの間で形成されたハイブリッドはアポトーシスに入るが、移植されたＳＰＣにおいてＷｎｔ／β−カテニン経路が活性化されれば、それらのニューロンはリプログラミングされ、生存し、再び細胞周期に入り得ることを示す。
【０２３７】
次に、発明者らは、ＢＩＯ処理および非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣｒｅを注射したＲ２６ＹマウスのＮＭＤＡ傷害網膜における、リプログラミングされた網膜ニューロンのｉｎ−ｖｉｖｏ分化能を分析した。移植２４時間後、４８時間後および７２時間後にマウスを犠牲にした。各マーカーに対するＹＦＰ陽性ハイブリッドのパーセンテージを網膜切片から求めた（図１０Ｃ）。注目すべきは、ＢＩＯ処理ＨＳＰＣの注射から２４時間後に、リプログラミングされたニューロン（ＹＦＰ陽性）はすでにＮｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２を再発現しており、この発現は、分析した後の時点（４８時間、７２時間）でも維持されていた。逆に、ニューロン最終分化マーカーＴｕｊ−１は段階的にサイレンシングされた。さらに、Ｓｃａ１およびｃ−ｋｉｔはこれらのハイブリッドにおいて強いダウンレギュレーションを受けていた。Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇもまた２４時間および４８時間では発現が高かったが、それらの発現は７２時間までに低下した（図１５Ｂおよび１５Ｋ）。対照的に、非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣとの融合後に得られた少数のＹＦＰ陽性ハイブリッドはＮｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２を再活性化し、これに対して、ハイブリッドの大多数では、Ｔｕｊ−１、Ｓｃａ−１およびｃ−ｋｉｔの発現を維持していた。また、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇも発現されていたが、これは２４時間の時点とその後の時点（４８、７２時間）では極めて少数のハイブリッドに限られ（図１５Ｌ）、これらのハイブリッドでは、中胚葉マーカーＧＡＴＡ４および内胚葉マーカーＨａｎｄ１は全く発現されなかった（図１５Ｋおよび１５Ｌ）。結論として、ＢＩＯ−ハイブリッドは、リプログラミングされ、神経外胚葉系列に分化する傾向があった。対照的に、非ＢＩＯハイブリッドのリプログラミングは低く、従って、それらは神経外胚葉分化に入らなかった。
【０２３８】
傷害Ｒ２６Ｙ網膜にＢＩＯ処理ＥＳＣＣｒｅを注射した後に行った同様の分化分析では、得られたハイブリッドの神経外胚葉分化能の遅延（Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２はＥＳＣ注射から７２時間後により多く発現されたが、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇは２４〜７２時間に発現が高かったため）およびＧａｔａ４  およびＨａｎｄ１の陽性発現）が示された。これらの結果は、ＥＳＣ−ニューロンハイブリッドの方が多能性が高く、神経外胚葉系列に分化できるだけでなく、中胚葉および内胚葉系列にも分化できることを示す（図１６Ｆ）。
【０２３９】
最後に、発明者らは、神経系分化へ運命付けられたＢＩＯ−ハイブリッドが網膜ニューロンへ最終的に分化することができるかどうか、従って、傷害網膜を再生することができるかどうかを検討した。このため、Ｒ２６ＹマウスのＮＭＤＡ傷害眼の一群にＢＩＯ処理または非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰを注射し、２週間後に犠牲にした。注目すべきは、ｇｃｌおよびｉｎｌにおけるＹＦＰ／ＲＦＰニューロンは、ＢＩＯ処理ＨＳＰＣの移植後にのみ観察された。これらの細胞は、ｔｈｙ１．１およびシンタキシンマーカーに陽性であり、これらのハイブリッドが神経節および無軸索ニューロンに分化したことを明らかに示す。これに対して、ＹＦＰ／ＲＦＰハイブリッドは短時間で細胞死を受けるので、非処理ＨＳＰＣの移植から２週間後に検出されたものは無かった。次に、移植された網膜の組織構造を分析した。注目すべきは、ＢＩＯ処理ＨＳＰＣを移植した網膜のｇｃｌおよびｉｎｌの核列の数は、非ＢＩＯ処理ＨＳＰＣを移植した場合に比べて、また、非移植網膜に比べて実質的に増加していたことが認められた。それらの数は野生型網膜の場合に匹敵していた（図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃ）。これらのデータは、リプログラミングされたＨＳＰＣ−ニューロンハイブリッドが網膜ニューロンに分化でき、傷害網膜を再生できることを明らかに示す。よって、細胞融合を介したリプログラミングは網膜組織の再生を惹起し得ると結論付けることができる。
【０２４０】
リプログラミングされたハイブリッドは傷害を受けた網膜を再生することができる
リプログラミングされたハイブリッドが増殖可能であり、かつ、神経外胚葉系統へ分化できることが分かったので、発明者らは、長期分化およびそれらの再生能を評価することを目的とした。そして、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するためにＨＳＰＣＣｒｅをＢＩＯで前処理し、ＮＭＤＡ傷害を受けたＲ２６Ｙ眼に移植した。並行して、非処理ＨＳＰＣＣｒｅを対照として移植した。４週間後にマウスを犠牲にした（図１８Ａ）。
【０２４１】
ＢＩＯ−ＨＳＰＣＣｒｅを移植した網膜のフラットマウントを分析したところ、多数のＹＦＰ＋ハイブリッド（図１８Ｂ）が、神経節（ＳＭＩ−３２）および無軸索（Ｃｈａｔ）ニューロンマーカーの発現に関して陽性であったことが示された（図１８Ｃ）。次に、発明者らは移植から２４時間後および１か月後の視神経も分析した。注目すべきは、１か月の視神経において、本発明者らは、おそらく再生した神経節ニューロンの突起に由来するＹＦＰ＋軸索を観察した（図１８Ｄ）。対照的に、非処理ＨＳＰＣＣｒｅを移植した網膜は、極めてわずかなＹＦＰ＋ハイブリッドを示し（図２２Ａ）、視神経にはＹＦＰ＋軸索は見られなかった（図１８Ｄ、ｕｎｔｒ．ＨＳＰＣ）。興味深いことに、ＢＩＯ−ＨＳＰＣの移植から２４時間後の視神経にはＹＦＰ＋軸索は見られず（図２２Ｂ）、新たに生成された神経節ニューロンは、移植のしばらく後に、おそらくは再生プロセス中にそれらの軸索を突出させることを示す（図１８Ｄ）。
【０２４２】
ＮＭＤＡ処理は眼におけるマクロファージの動員を誘導する(Sasahara et al., Am J Pathol 172, 1693-1703 (2008))。実際に、予測されるように、移植２４時間後に採取した網膜では、一定のパーセンテージのＹＦＰ＋ハイブリッドが単球／マクロファージＣＤ４５およびＭａｃ１マーカーに対して陽性であったが、これにより、Ｒ２６Ｙ対立遺伝子を保有する内因性マクロファージによる移植されたＨＳＰＣＣｒｅ／ＲＦＰの一部の食作用、または一部のＹＦＰ＋ハイブリッドそれら自体の食作用が示唆された（図２２Ｃおよび２２Ｄ）。興味深いことに、このパーセンテージは、移植２週間後に採取された網膜ですでに劇的に低下していた（図２２Ｅおよび２２Ｆ）。この結果は、一部のハイブリッドは移植後間もなく(son after transplantation)食作用を受け得るが、あるパーセンテージのものは生存し、網膜を再生し得ることを明らかに示す。
【０２４３】
次に、発明者らは、垂直切片において細胞核再生の発生を分析した。興味深いことに、ＢＩＯ−ＨＳＰＣを移植した網膜の、神経節細胞層のニューロン核の数（図１７Ａおよび１７Ｂ、ｇｃｌ）、および内顆粒層の核列の数（図１７Ａおよび１７Ｃ、ｉｎｌ）は野生型網膜に匹敵しており、非移植網膜または非処理ＨＳＰＣを移植した網膜に比べて実質的に増加していた（図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃ）。これは網膜再生を明らかに示す。発明者らはまた、移植１か月後に採取した網膜全体における神経節核の総数を数えることにより、フラットマウント網膜全体における神経節ニューロンの核密度を調べた。注目すべきは、非移植網膜に比べてＢＩＯ−ＨＳＰＣＣｒｅ移植網膜には核数の有意な増加が見られた（図１７Ｄ）。しかしながら、新たに生成した神経節ニューロンは、核密度地図により示されるように、均一に分布しておらず、不均一な網膜再生を示す（図１７Ｅ）。
【０２４４】
これらのデータは、Ｗｎｔシグナル伝が活性化されれば、ＮＭＤＡ傷害後の網膜細胞の部分的再生が、移植されたＨＳＰＣの融合後に達成され得ることを明らかに実証する。
【０２４５】
内因性ＢＭＣ融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて傷害後に起こる
内因性ＢＭＣがＮＭＤＡ傷害後の眼に動員され得ることが報告されている[Sasahara et al., Am J Pathol 172, 1693-1703 (2008)]が、それらの役割は未知のままである。よって、発明者らは、内因性ＢＭＣがＮＭＤＡ傷害後の網膜ニューロンと融合し、これをリプログラミングすることができるかどうかを調べた。このために、ドナーＲＦＰ−ＣＲＥマウス（ＲＦＰおよびＣＲＥ（両方とも遍在的に発現されるβ−アクチンプロモーターの制御下にある）を発現するトランスジェニックマウス(Long et al., (2005). BMC Biotechnol 5, 20; Srinivas et al. (2001)前掲)からのＢＭＣを亜致死線量を照射したＲ２６Ｙレシピエントマウスに尾静脈移植し、これにより、ＢＭをＢＭＣｒｅ／ＲＦＰに置換した。ドナー起源の細胞を含むＢＭの再増殖を、血液細胞中のＲＦＰの発現に従って、および血球計算分析によって分析した（図１９Ａ）。移植１か月後に、ＮＭＤＡを各キメラマウス群の一方の眼の硝子体内に注射した後、２４時間後にマウスを犠牲にした（図２０Ａ）。興味深いことに、ＮＭＤＡ傷害後に、ＲＦＰ陽性細胞の５０％はＹＦＰ陽性でもあることが見出され、これは眼に動員された内因性ＢＭＣの融合を示す（図２０Ｂ、２０Ｃおよび２０Ｆ、ＮＭＤＡ、および図１０Ｄ）。対照的に、非ＮＭＤＡ注射眼の切片にはＲＦＰ／ＹＦＰ陽性細胞は見られなかった（図２０Ｄ、２０Ｅおよび２０Ｆ、Ｎｏ  ＮＭＤＡ）。これらの結果は、眼に動員されたＢＭＣと網膜ニューロンとの間に細胞融合が起こることを明らかに実証する。
【０２４６】
次に、発明者らは、内因性の細胞融合後に得られたこれらのハイブリッド細胞のアイデンティティを分析した。ＮＭＤＡ傷害から１２時間後に、網膜切片におけるＹＦＰ陽性細胞はＳｃａ１、Ｃｋｉｔ、Ｔｈｙ１．１、シンタキシン、およびＧＳ細胞マーカーに関しても陽性であることが認められたが、このことは、ＨＳＰＣがＢＭから動員され、神経節、無軸索およびミュラー細胞と融合することを明らかに示す（図２０Ｇ、２０Ｈ、２０Ｉ、２０Ｊおよび２０Ｋ）。
【０２４７】
次に、発明者らは、ＢＭＣ動員および網膜ニューロンとの融合の後にリプログラミングが起こり得るかどうかを調べ、この目的のために、ＢＭＣＲ２６Ｙを亜致死線量を照射したＮｅｓｔｉｎ−ＣＲＥマウス群に移植してキメラマウスを作出した。Ｎｅｓｔｉｎ−ＣＲＥ導入遺伝子の再活性化と結果としてのＹＦＰ発現により、本発明者らはｔｈｅ眼にＢＭＣが動員された後のリプログラミング事象を特定することが可能であった。１か月後、ＮＭＤＡおよびＢＩＯをキメラマウスの一方の眼だけに注射し、２４時間後に犠牲にした（図２１Ａ）。ＮＭＤＡ傷害眼のｇｃｌおよびｉｎｌには、ＢＩＯの注射後にＹＦＰ陽性細胞が見られたが、ＮＭＤＡ傷害を受けた（非ＢＩＯ注射）非処理の反対側の眼には見られなかった（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。このことは、網膜ニューロンが、動員されたＢＭＣと融合し、Ｎｅｓｔｉｎプロモーターの再活性化のためにリプログラミングされたことを明らかに示す。これらのＹＦＰ陽性ハイブリッドの約８％がＫｉ６７発現に関して陽性であり、アネキシン−Ｖ陽性は１％に過ぎなかったが、このことは、ハイブリッドの一部が分裂しており、アポトーシスは極めてわずかであったことを示す（図２１Ｄ、１９Ｂおよび１９Ｃ）。注目すべきは、これらのＹＦＰ陽性ハイブリッドの５０％はＯｃｔ４発現に関しても陽性であり（図２１Ｅ、２１Ｆおよび２１Ｇ）、７０％はＮａｎｏｇに関しても陽性であり（図２１Ｅ、２１Ｈおよび２１Ｉ）、眼へのＢＭＣの動員の後にも網膜ニューロンのリプログラミングが起こったことが確認された。
【０２４８】
結論として、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化されれば、眼においてＢＭＣ融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングの内因的活性化が起こり得る。
【０２４９】
３．考察
本明細書において、カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路がｉｎ  ｖｉｖｏで網膜ニューロンのリプログラミングを媒介することが実証された。さらに、損傷後にマウス網膜で自発的細胞融合が起こり得ること、およびそれらがＷｎｔ活性によりリプログラミングされれば、一定の割合の融合ハイブリッドが増殖することが示された。さらに、リプログラミングされなければ、ニューロン−ＳＰＣハイブリッドはアポトーシスを受けることも示された。驚くことに、リプログラミングされたハイブリッドは傷害を受けた網膜組織を再生することができる。最後に、眼においてＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化の後、損傷を受けた網膜に動員されるＢＭ由来細胞は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化の際に網膜ニューロンと融合することができ、その網膜ニューロンをリプログラミングできることが明らかに示された。全体として見れば、細胞融合を介したリプログラミングが傷害修復の内因性機構となり得ると結論付けることができる。
【０２５０】
成体ＳＰＣは高い程度の可塑性および多能性を示し、それらは広域の分化細胞に寄与し得る。移植されたＢＭＣは肝臓細胞、プルキニエニューロン、腎臓細胞、上皮細胞、およびその他と融合することができ、それらの特徴を獲得することができる。この可塑性は、分化転換または細胞−細胞融合機構のいずれかのためであるとされた。
【０２５１】
しかしながら、これまでに、細胞融合事象は極めて稀であると考えられており、従って、「新生」ハイブリッドの細胞アイデンティティは明らかに検討されたことがない。ここで、発明者らは、ＨＳＰＣを傷害眼に移植した少し後に、細胞−細胞融合が起こり、極めて関連のある事象として可視化できることを実証した。これはＢＭから傷害網膜にｃ−ｋｉｔ／ｓｃａ−１陽性細胞が動員された後にも起こる。従前の研究では、ＢＭＣ融合から得られたハイブリッドの数は大幅に過小評価されており；実際には、これらの新たに形成されたハイブリッドがリプログラミングされなければ、それらは細胞死を受け、従って、移植後長期間、検出することができないことが判明した。
【０２５２】
ＨＳＰＣは神経節および無軸索ニューロンと高い効率で融合し；得られた「新生」ハイブリッドは、Ｗｎｔシグナル伝達刺激が提供されれば、まず一時的にリプログラミングされ、増殖することができ、次いで最終分化ニューロンとなり得る新規な細胞実体である。これらのハイブリッドにおいて、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現、そして同時にＮｅｓｔｉｎ、ＮｏｇｇｉｎおよびＯｔｘ２前駆ニューロンマーカーの発現が見出されたことは注目すべきである。ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現は、胚段階に戻るリプログラミングの明らかな証拠であるが、この状態は、少なくともＨＳＰＣと網膜ニューロンの間の融合の場合には一時的なものである。ハイブリッドは間もなく神経外胚葉系統へ運命付けられ、実際には、移植７２時間後に、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇがすでにダウンレギュレートされていた。最後に、２週間で、これらのハイブリッドは最終分化ニューロンとなり、網膜組織のｇｃｌおよびｉｎｌを再生する。興味深いことに、色素性網膜炎（ＲＰ）のマウスモデルにおける、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が活性化されたＨＳＰＣを移植した際の細胞融合を介した網膜ニューロンのリプログラミングの後に、光受容器の完全な機能的再生も見られた（実施例１）。
【０２５３】
これらの所見は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇは、胚において発現される幹細胞遺伝子であるということだけでなく、細胞融合を介した再生プロセスの過程で成体組織においても機能的役割を持つということを予想させる。成人におけるこれらの遺伝子の発現については議論があるが[Shin et al., Mol Cells 29, 533-538 (2010); Kucia et al., J Physiol Pharmacol 57 Suppl 5, 5-18 (2006)]、おそらくその極めて一時的な性質のために、それらの発現が場合によっては明確に評価されなかったことももっともなことである。
【０２５４】
ＥＳＣも大きな可塑性を持ち、本明細書で、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける脱分化事象を特定することができ；すなわち、網膜ニューロンがＥＳＣと融合した後に、Ｎａｎｏｇを発現するハイブリッドをリプログラミングした。ＥＳＣ−網膜ニューロンハイブリッドは、おそらくＨＳＰＣ由来のハイブリッドよりも多能性が大きい。それらは培養でクローンを形成することができ、３つの異なる系列のマーカーを発現し；加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて奇形腫を形成する（データは示されていない）。対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、発明者らは、ＨＳＰＣ−網膜ニューロンハイブリッドからクローンを単離することはできず、これは明らかにそれらの一時的リプログラミングおよび急速な神経外胚葉系列分化への運命付けを示す。興味深いことに、ＲＳＰＣの融合後には、Ｎａｎｏｇの発現までの網膜ニューロンのリプログラミングは見られず、これはＨＳＰＣに比べてこれらの細胞の可塑性の程度が低いことを示す。
【０２５５】
長い間、分化は一方向の機構であると思われてきたが、体細胞リプログラミングを誘導できる可能性はこの見解を完全に廃した。しかしながら、これまで、ニューロンの脱分化は相対的に難しいと考えられてきた。本明細書で、ニューロンは生体生物において、それら本来の組織に内在しながら、それらの発生段階を実際に変化させることができるということが実証された。しかしながら、ニューロンがＨＳＰＣと融合する場合には、これらの「新生」ハイブリッドはニューロンに最終分化するので、ニューロンは自らのニューロンアイデンティティの記憶を保持している。研究者は通常リプログラミングされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞に、脱分化状態の表現型で増殖することを強いるので、これはささいな所見ではなく；実際に、ＥＳＣでさえ基本的に胚には存在しない。リプログラミングされた細胞などの多能性細胞（pluripotent stem cell）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてすぐさま運命変化を受けるはずであり、これは種々の組織シグナルに依存するであろうし、また、多能性細胞は特定の分化運命に進むように運命付けられるはずである。リプログラミングプロセスの過程で消えない系列アイデンティティの記憶は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて適正な分化を指示するために有益となる可能性がある。興味深いことに、誘導多能性ＳＣ（ｉＰＳＣ）は、それらの体細胞の、起源に関するエピジェネティック記憶を保持することが示されている[Polo et al., Nat Biotechnol 28, 848-855 (2010); Kim et al., Nature 467, 285-290 (2010)]。ここで、本明細書で使用したモデルでは、ある細胞運命から別の運命への遷移は直接的なものではなく、前駆体の遺伝子の一時的再発現を経たものであり、これにより、中間体である低分化状態の発生前駆体を経由する。
【０２５６】
Ｗｎｔシグナル伝達は、下等真核生物において、傷害に応答して組織の再生を制御する[Lengfeld et al., Dev Biol 330, 186-199 (2009)]。ゼブラフィッシュの尾びれおよびアフリカツメガエル(Xenopus)の手足の再生には、プラナリアの組織再生の場合と同様に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化が必要である[De Robertis, Sci Signal 3, pe21 (2010)]。興味深いことに、魚類および出生直後のニワトリの網膜では、グルタミンシンセターゼなどのミュラー細胞特異的マーカーのダウンレギュレーション、ならびにＰａｘ６およびＣｈｘ１０などの前駆マーカーの活性化がこれらの細胞の再生能に関連づけられている。しかしながら、Ｗｎｔシグナル伝達の外因的活性化はマウス網膜におけるミュラー細胞の脱分化の誘導に必要である。従って、下等真核生物に存在するＷｎｔシグナル伝達の再生活性は、進化の過程で失われた可能性がある。
【０２５７】
これらの研究は総て、再生プロセスにおけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の重要な役割を強調するが、この再生の基礎をなす生物学的機構はこれまでにはまだあまり知られていなかったが、本明細書で、少なくともマウス網膜では、細胞融合を介したリプログラミングにより再生が起こり得ることが示される。他方、移植された網膜の均一でない再生が見られ、これは例えば神経成長因子などの他の因子がこのプロセスの増強に使用されている可能性があることを示す。また、新たなニューロンを生成する、従って、網膜組織を真に再生するだけでなく、ニューロン変性の遅延も誘導された可能性があることを排除することはできない。
【０２５８】
さらに、このプロセスは、眼にＢＭＣが動員された際にも誘導され得る。興味深いことに、動員された少数のＢＭＣが傷害後のミュラー細胞と融合することが認められた。従って、従前に報告されている[Osakada et al., (2007)前掲]ミュラー細胞の脱分化が、動員されたＢＭＣとの融合事象によるものであるというのももっともなことである。
【０２５９】
この内因性のｉｎ  ｖｉｖｏリプログラミングは傷害修復の一機構であり得、光傷害または機械的傷害などの小さな傷害は、ＢＭＣの動員後の細胞融合を介したリプログラミングによって修復され得る。Ｗｎｔを介したリプログラミングはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞融合後の安全機構でもあり得る。リプログラミングされないハイブリッドはアポトーシスを介した細胞死を受ける。代わりに、Ｗｎｔを介してリプログラミングされたハイブリッドは生存かつ増殖可能である。
【０２６０】
しかしながら、眼におけるＷｎｔシグナル伝達の異所的活性化後に傷害マウス網膜を完全に再生する他の試みは失敗したものの[Osakada et al., (2007)前掲]、本明細書で、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に加えて、細胞融合を介したリプログラミングもまた再生プロセスに不可欠であることが実証された。従って、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化とともに眼へのＢＭＣの動員を増大させる戦略は、傷害網膜組織の再生に治療上適切であり得る。
【０２６１】
これらのアッセイは、２つの異なる融合相手のゲノムに由来するＲＦＰおよびＹＦＰ導入遺伝子の発現が、細胞融合から２週間後に検出されたことを示すが、このことはこれらのハイブリッドにおける両ゲノムの関与を示す。さらに、リプログラミングされたハイブリッドの増殖が見られ、このことはそれらが単核細胞または真の融合核であったことを示す。プルキニエ細胞とＢＭ由来細胞との融合では安定なヘテロカリオンが見られ、それらの数は炎症時に非常に多かった[Johansson et al., Nat Cell Biol 10, 575-583 (2008)]。さらに最近、野生型網膜にもヘテロカリオンが見出された[Morillo et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107, 109-114 (2010)]。しかしながら、発明者らは、その存在を形式的に排除することはできないものの、注射した眼の網膜においてヘテロカリオンを検出したことはない。
【０２６２】
他方、癌ＳＣと体細胞の融合後にアポトーシス耐性の増強が見られた場合に、発達中の腫瘍の多剤耐性などの有害な結果が見られたこと[Lu & Kang. Cancer Res 69, 8536-8539 (2009)]も考慮すべきである。さらに、細胞融合、従って倍数性細胞は病態の過程でも生じる場合があり、これらの細胞の遺伝的不安定性が異数性および癌の発生をもたらし得る場合が多い。従って、本発明により提供されるデータは、今後、違う経路をたどるため、すなわち、腫瘍発生過程において癌ＳＣと体細胞の融合を研究するためにも重要であり得る。
【０２６３】
リプログラミングは、多能性（pluripotency）に関連する内因性遺伝子が誘導されている間の、サイレンシングされた系統特異的遺伝子による、段階的かつ緩慢なプロセスである。全体として見れば、このプロセスは、種々の遺伝的およびエピジェネティックな障壁[Sanges & Cosma. Int J Dev Biol 54, 1575-1587 (2010)]のために極めて効率が悪い。実際に、ｐｒｅ−ｉＰＳ（部分的にリプログラミングされた細胞）は、他の特徴の中でも、不完全なエピジェネティックリモデリングおよび持続的なＤＮＡの高メチル化を示す。ｐｒｅ−ｉＰＳはＤＮＡメチル化の全体的阻害によってｉＰＳ細胞に変換することができる。発明者らは、最近、β−カテニン標的遺伝のレプレッサーであるＴｃｆ３の欠失が、リプログラミング中のエピゲノム修飾を軽減し、それにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｉＰＳ細胞誘導を助長することを示した[Lluis et al., (2011) 印刷中]。これはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞融合の際にも起こり得、ＳＰＣのエピゲノムは活発にリモデリングされ、数種のリプログラマーが転写され、これらがハイブリッド内のニューロンエピゲノムをトランスで変化させる可能性がある。
【０２６４】
結論として、Ｗｎｔシグナル伝達により制御される細胞融合を介したリプログラミングは、正常組織における細胞の再生／修復に寄与し得る生理学的なｉｎ  ｖｉｖｏプロセスであると断言することができる。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014527407.tif 000029
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