(57)【要約】本発明は、抗プロペルジン抗体を用いた補体系の代替経路（AP）の選択的阻害に関する。具体的には、本発明は、個体を抗プロペルジン抗体に接触させることによって個体におけるAP介在性の病態またはAP介在性の状態を治療するための方法に関する。2014522845.tif 000013
2014522845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロペルジンに特異的に結合する抗体を含む組成物。
【請求項２】
プロペルジンがヒトプロペルジンである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
抗体がヒト化抗体である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
抗体がキメラ抗体である、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID N0: 3；VH-CDR2：SEQ ID NO: 4；VH-CDR3：SEQ ID NO: 5；VL-CDR1：SEQ ID NO: 8；VL-CDR2：SEQ ID NO: 9；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 10からなる群より選択されるCDRの少なくとも1つを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID NO: 3；VH-CDR2：SEQ ID NO: 4；VH-CDR3：SEQ ID NO: 5；VL-CDR1：SEQ ID NO: 8；VL-CDR2：SEQ ID NO: 9；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 10のCDRを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
抗体が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
抗体が、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
抗体が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
抗体が、SEQ ID NO: 52の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID N0: 13；VH-CDR2：SEQ ID NO: 14；VH-CDR3：SEQ ID NO: 15；VL-CDR1：SEQ ID NO: 18；VL-CDR2：SEQ ID NO: 19；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 20からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID N0: 13；VH-CDR2：SEQ ID NO: 14；VH-CDR3：SEQ ID NO: 15；VL-CDR1：SEQ ID NO: 18；VL-CDR2：SEQ ID NO: 19；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 20のCDRを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
抗体が、SEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
抗体が、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
抗体が、SEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
抗体が、SEQ ID NO: 53の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID N0: 23；VH-CDR2：SEQ ID NO: 24；VH-CDR3：SEQ ID NO: 25；VL-CDR1：SEQ ID NO: 28；VL-CDR2：SEQ ID NO: 29；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 30からなる群より選択されるCDRの少なくとも1つを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID N0: 23；VH-CDR2：SEQ ID NO: 24；VH-CDR3：SEQ ID NO: 25；VL-CDR1：SEQ ID NO: 28；VL-CDR2：SEQ ID NO: 29；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 30のCDRを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２０】
抗体が、SEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２１】
抗体が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２２】
抗体が、SEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２３】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID N0: 33；VH-CDR2：SEQ ID NO: 34；VH-CDR3：SEQ ID NO: 35；VL-CDR1：SEQ ID NO: 38；VL-CDR2：SEQ ID NO: 39；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 40からなる群より選択されるCDRの少なくとも1つを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２４】
抗体が、VH-CDR1：SEQ ID NO: 33；VH-CDR2：SEQ ID NO: 34；VH-CDR3：SEQ ID NO: 35；VL-CDR1：SEQ ID NO: 38；VL-CDR2：SEQ ID NO: 39；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 40のCDRを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２５】
抗体が、SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２６】
抗体が、SEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２７】
抗体が、SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２８】
抗体が、SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２９】
抗体が、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３０】
抗体が、SEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３１】
抗体が、SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３２】
抗体が、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３３】
抗体が、SEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３４】
抗体が、SEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３５】
抗体が、SEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３６】
抗体が、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３７】
抗体が、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３８】
抗体が、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３９】
抗体が、SEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４０】
抗体が、SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４１】
抗体が、SEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４２】
抗体が、SEQ ID NO: 22およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４３】
抗体が、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４４】
抗体が、SEQ ID NO: 22およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４５】
抗体が、SEQ ID NO: 32およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４６】
抗体が、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４７】
抗体が、SEQ ID NO: 32およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４８】
プロペルジンに結合して、請求項1記載の抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体を含む、組成物。
【請求項４９】
プロペルジンに結合して、mAb 19.1と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体を含む、組成物。
【請求項５０】
プロペルジンに結合して、mAb 25と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体を含む、組成物。
【請求項５１】
プロペルジンに結合して、mAb 22.1と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体を含む、組成物。
【請求項５２】
プロペルジンに結合して、mAb 30と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体を含む、組成物。
【請求項５３】
個体における代替経路（AP）介在性の病態を治療する方法であって、該個体に請求項1記載の抗プロペルジン抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項５４】
病態が、黄斑変性、虚血性再灌流障害、関節炎、慢性関節リウマチ、発作性夜間血色素尿症（PNH）症候群、非定型溶血性尿毒症（aHUS）症候群、喘息、臓器移植敗血症、炎症、糸球体腎炎、狼瘡、およびその組み合わせからなる群より少なくとも選択される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
抗プロペルジン抗体が代替経路を選択的に阻害するが、古典的経路およびレクチン経路を阻害しない、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
抗プロペルジン抗体が古典的経路およびレクチン経路のAP増幅ループに影響を及ぼさない、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
抗プロペルジン抗体の投与がC3bBbタンパク質の産生を阻害する、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
ヒトプロペルジンの核酸配列がSEQ ID NO: 67であり、ヒトプロペルジンのアミノ酸配列がSEQ ID NO: 54であるヒトプロペルジンを発現するトランスジェニックマウスであって、マウスプロペルジンを発現しないトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
補体系は侵入する病原体に対する最前線の宿主防御を提供する。補体はヒト炎症性疾患において病原性の役割も担う。補体系の活性化は3つの異なる経路である古典的経路（CP）、レクチン経路（LP）、および代替経路（AP）を介して起こる。CPは抗原−抗体結合によって開始される。LPは、マンノース結合レクチン（MBL）が微生物の表面糖分子と相互作用した際に引き起こされる。両経路の活性化はCP C3コンバターゼC4b2aの構築に至るが、MBL関連セリンプロテアーゼによるC3の直接の開裂も起こり得る。APはAP C3コンバターゼであるC3bBbによって駆動される自己増幅ループである。AP活性化はCPまたはLP活性化に対して二次的に起こり得るか、あるいは独立して開始される。後者の場合、低レベルの自然発生性のC3「遊転」が最初のC3bBbを産生して、これが十分な調節の不在下において直ちにAPを増加させる。従って、一般的には、負の調節のないまたは不十分な非自己表面でのAP活性化はデフォルトの過程と考えられることが想定されるが、自己細胞は典型的には複数の膜結合型および液相の補体阻害タンパク質を利用してこの結果を避ける。特定の条件下では、変化した、損傷されたまたはストレスを受けた自己の細胞および組織もAPを活性化して炎症性の損傷を引き起こすことができる。
【０００２】
多くの阻害タンパク質の存在とは対照的に、血漿タンパク質であるプロペルジン（properdin）は補体活性化カスケードの唯一の公知の正の調節物質である。プロペルジンは約53kDaの血漿糖タンパク質であり、推定血中濃度は5〜10μg/mlである。プロペルジンはほとんどは、ヘッド−テイル配座の、固定した割合の二量体、三量体および四量体として存在する。プロペルジン機能に関する現在唱えられている見解は、このプロペルジンが新生C3bBbコンバターゼの半減期を延長することによってAP活性化を促進するということである。この見解に従うと、プロペルジンはAP活性化において促進的ではあるが必須ではない役割を担う。CPおよびLPの活性化は必ずAP増幅ループを引き起こすので、プロペルジンはCPおよびLP介在性補体活性化を間接的にも促進すると予想される。従って、本発明以前の支配的な知識に基づくと、プロペルジンは特異性を欠き、かつ、補体活性化に不可欠ではないことから、魅力的な抗補体治療ターゲットとは見なされない可能性がある。
【０００３】
補体活性化の3つのすべての経路が微生物感染との闘いにおいて宿主を助けると同時に、近年の試験は、加齢性黄斑変性、非定型溶血性尿毒症症候群、発作性夜間血色素尿症（PNH）、慢性関節リウマチ、アレルギー性喘息および虚血性再灌流障害のようなヒトにおける補体介在性の病態が主にAPによって介在されることを示している。従って、病原体と闘うためおよび宿主を感染から保護するためにCPおよびLPをそのまま残しながら、APを選択的に阻害することによってヒト炎症性疾患を治療する抗補体組成物および方法について、当技術分野において必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明は、抗プロペルジン抗体、および抗プロペルジン抗体を使用して補体の代替経路（AP）を阻害する方法に関する。
【０００５】
一つの態様において、本発明はプロペルジンに特異的に結合する抗体を含む組成物である。好ましい態様において、プロペルジンはヒトプロペルジンである。いくつかの態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、本発明の抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、本発明の抗体はキメラ抗体である。
【０００６】
一つの態様において、本発明の抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 3；VH-CDR2：SEQ ID N0: 4；VH-CDR3：SEQ ID N0: 5；VL-CDR1：SEQ ID NO: 8；VL-CDR2：SEQ ID NO: 9；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 10からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID N0：2のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID N0：7のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 52の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。
【０００７】
一つの態様において、本発明の抗体は、VH-CDR1：SEQ ID NO: 13；VH-CDR2：SEQ ID NO: 14；VH-CDR3：SEQ ID NO: 15；VL-CDR1：SEQ ID NO: 18；VL-CDR2：SEQ ID NO: 19；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 20からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 53の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。
【０００８】
一つの態様において、本発明の抗体は、VH-CDR1：SEQ ID NO: 23；VH-CDR2：SEQ ID NO: 24；VH-CDR3：SEQ ID NO: 25；VL-CDR1：SEQ ID NO: 28；VL-CDR2：SEQ ID NO: 29；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 30からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID N0： 22のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０００９】
一つの態様において、本発明の抗体は、VH-CDR 1：SEQ ID NO: 33；VH-CDR2：SEQ ID NO: 34；VH-CDR3：SEQ ID NO: 35；VL-CDR1：SEQ ID N0;38；VL-CDR2：SEQ ID NO: 39；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 40からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１０】
一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１１】
一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１２】
一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１３】
一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１４】
一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 22およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 22およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１５】
一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 32およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、本発明の抗体はSEQ ID NO: 32およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む重鎖ならびにSEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１６】
一つの態様において、本発明の抗体は、プロペルジンに結合して、本明細書に記載される抗プロペルジン抗体の少なくとも一つの結合と競合する抗体である。もう一つの態様において、本発明の抗体は、プロペルジンに結合して、mAb 19.1と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体である。もう一つの態様において、本発明の抗体は、プロペルジンに結合して、mAb 25と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体である。もう一つの態様において、本発明の抗体は、プロペルジンに結合して、mAb 22.1と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体である。もう一つの態様において、本発明の抗体は、プロペルジンに結合して、mAb 30と表される抗体のプロペルジンへの結合と競合する抗体である。
【００１７】
もう一つの態様において、本発明は、個体において代替経路（AP）介在性の病態を治療する方法であって、本明細書に記載される抗プロペルジン抗体の少なくとも一つを該個体に投与する工程を含む方法である。様々な態様において、代替経路（AP）介在性の病態は、少なくとも黄斑変性、虚血性再灌流障害、関節炎、慢性関節リウマチ、発作性夜間血色素尿症（PNH）症候群、非定型溶血性尿毒症（aHUS）症候群、喘息、臓器移植敗血症、炎症、糸球体腎炎、狼瘡、およびその組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は代替経路を選択的に阻害するが、古典的経路およびレクチン経路は阻害しない。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は古典的経路およびレクチン経路のAP増幅ループに影響を及ぼさない。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はC3bBbタンパク質の産生を阻害する。
【００１８】
一つの態様において、本発明は、ヒトプロペルジン（例えば、SEQ ID NO: 67；SEQ ID NO: 54）を発現するがマウスプロペルジンを発現しないトランスジェニックマウスである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
前記の概要、および本発明の好ましい態様に関する以下の詳細な説明は、添付される図面と合わせて読むとよりよく理解される。本発明を例証するために、図面には、現時点での好ましい態様を示す。但し、本発明は図面に示される態様の厳密な仕組みおよび手段に限定されると理解されるべきではない。図面において：
（図１）図1は補体経路の図である。補体は3つの経路を介して活性化されることができる：古典的、レクチン、および代替。古典的経路は、C1qが抗原に接続する抗体に結合すると活性化されて、C4およびC2を開裂するC1rおよびC1sを活性化する。レクチン経路は、マンノース結合レクチン（MBL）が保存された病原性炭水化物モチーフと遭遇すると活性化されて、MBL関連セリンプロテアーゼ（MASP）を活性化して、同じくC4およびC2を開裂する。C4およびC2開裂産物は、古典的およびレクチン経路のC3コンバターゼでありC3をC3bおよびC3aに開裂するC4bC2aを形成する。C3bの第二の分子はC4bC2aと結合して古典的およびレクチン経路のC5コンバターゼであるC4bC2aC3bを形成することができる。代替経路（AP）は、B因子およびD因子の存在下においてC3が自然発生性の加水分解を受けて最初のAP C3コンバターゼであるC3(H2O)Bbを形成すると、活性化されて、さらなるC3の開裂ならびにAP C3コンバターゼ（C3bBb）およびAP C5コンバターゼ（C3bBbC3b）の最終的な形成に至る。プロペルジンはAPコンバターゼを安定化させることによってAP活性化を促進する。3つの経路すべてがコンバターゼの形成に至り、次いで、補体系の主要なエフェクターを産生する：アナフィラトキシン（C4a／C3a／C5a）、細胞膜傷害複合体（MAC）、およびオプソニン（例えば、C3b）。アナフィラトキシンは、C4、C3およびC5の開裂から派生する強力な炎症誘発性分子である。MACは、標的化された表面を直接溶解することができるC5bからC9の補体成分の最終構築物である。C3bはオプソニン化されたターゲットの食作用を誘発して、APを介しての補体活性化の増幅にも役立つ。
（図２）図2は、mAb 19.1、22.1、25および30によるLPS誘発性AP補体活性化の用量依存性の阻害を実証する実験の結果を示す。mAbの4つのクローンすべてが、50％正常ヒト血清（NHS）に5μg/mlの最終濃度で添加された際にAP補体活性化を効果的に阻害した。EDTAを添加された試料（NHSEDTA）は陰性対照とした（EDTAは補体活性化を遮断する）。mAbを添加されていない試料（0 Ab）はAP補体活性化ベースラインとした。実験はGVB-EGTA-Mg++緩衝液中で実施された。ELISAプレートをLPSで一晩、コーティングした。NHSは、プレートへの添加前にmAbと共にプレインキュベートした。AP補体活性化は、プレート上でのC3析出量（OD450）を測定することによって検出した。
（図３）図3は、抗ヒトプロペルジンmAbがfHおよびDAF機能障害によって引き起こされるヒト赤血球（RBC）溶解を阻害することを実証する実験の結果を示す。ヒトRBCはヒト血清の不在下（Ehのみ）では溶解しない。それらは、自己細胞（0fh1920）とのfH相互作用を防ぐ組換え型fHフラグメントであるfH 19-20の不在下ではヒト血清（50％）による溶解に対して抵抗性でもある。しかし、ヒトRBCを30μM fH 19-20および7.5μg/mlの機能遮断抗崩壊促進因子（DAF、膜補体調節因子）mAb（fh1920＋抗CD55）の存在下で50％ヒト血清と共にインキュベートすると、RBCの約70％が溶解した。この溶解は、4つの各抗プロペルジンmAb（19.1、22.1、25、30）によって5μg/mlで完全に阻害された。蒸留水（Eh＋DDW）で処理されたRBC試料は完全な溶解を引き起こして、陽性対照とした。EDTAで処理した正常ヒト血清（NHSEDTA）中のRBC試料は陰性対照とした（EDTAが補体活性化を遮断するので、溶解なし）。溶解アッセイは、AP補体活性化のみを可能とするために、Mg++-EGTA GVB++緩衝液中で実施された。
（図４）図4は、抗プロペルジンmAbの5μg/mlの不在下または存在下において50％正常ヒト血清（NHS）と共にインキュベートした、抗体に感作させたヒツジRBCについて調べる実験の結果を示す。ヒト血清を添加していない（ShEsのみの）RBC試料は溶解を示さなかった；抗プロペルジンmAbを添加していない50％NHSと共にインキュベートしたRBCは完全な溶解（50％NHS）を示した；50％NHSおよびmAb 19.1、22.1、25または30の5μg/mlと共にインキュベートしたRBCも完全に溶解し、感作させたヒツジRBCの古典的経路に介在される補体溶解に対してmAbは阻害作用を持たないことが実証された。EDTAの存在下での50％NHS（NHSEDTA）と共にインキュベートしたRBCは溶解を示さず、この溶解が補体に介在されることが実証された；蒸留水（Es＋DDW）で処理したヒツジRBCは100％溶解対照とした。
（図５Ａ）図5A〜5Cを含む図5は、mAb 19.1および25のエピトープマッピングの結果ならびにヒトプロペルジン（fP）の欠失変異型の産生を示す。図5aはヒトプロペルジンの推定されるアミノ酸配列（SEQ ID NO: 54）を示す。シグナルペプチドに下線を付した。成熟タンパク質は残基28から始まる。
（図５Ｂ）図5A〜5Cを含む図5は、mAb 19.1および25のエピトープマッピングの結果ならびにヒトプロペルジン（fP）の欠失変異型の産生を示す。図5bは、ヒトプロペルジンの7つのトロンボスポンジンリピート（TSR）ドメインのアミノ酸配列を示す。それらは次の通りである：TSR0（SEQ ID NO: 55）、TSR1（SEQ ID NO: 56）、TSR2（SEQ ID NO: 57）、TSR3（SEQ ID NO: 58）、TSR4（SEQ ID NO: 59）、TSR5（SEQ ID NO: 60）、TSR6（SEQ ID NO: 61）。
（図５Ｃ）図5A〜5Cを含む図5は、mAb 19.1および25のエピトープマッピングの結果ならびにヒトプロペルジン（fP）の欠失変異型の産生を示す。図5cは、mAb 19.1および25におけるエピトープマッピングの結果ならびにヒトプロペルジン（fP）の欠失変異型の産生を示す。ヒトプロペルジン（fP）は、0から6までの番号が振られた7つのトロンボスポンジンリピート（TSR）ドメインから構成される。個々のTSRドメイン（およびいくつかの場合は2つのTSRドメイン）を欠失させて、変異型タンパク質をチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞で発現させた。予想されたサイズよりも実質的に小さいTSR5欠失変異型を除いて、すべてのTSR欠失変異型が予想されたサイズで発現する。TSR5欠失変異型はタンパク質分解を受けた可能性が高い。TSR5欠失のサイズはTSR5+6欠失変異型のそれとほぼ等しく、TSR6がTSR5欠失変異型においてタンパク分解性に除去された可能性があることを示唆する。CHO細胞溶解物を、ポリクローナルヤギ抗ヒトfP抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。M：分子量（MW）マーカー。
（図６）図6は、mAb 19.1および25におけるエピトープマッピング、ならびにヒトプロペルジン欠失変異型に対するmAb 19.1および25の結合に関するELISAアッセイの結果を示す。CHO細胞はELISAプレート上にコーティングしてmAb 19.1または25で検出した。19.1および25とは異なるエピトープに結合する第三のmAb 29.3は、タンパク質発現を確認するための対照として用いた。結果は、mAb 19.1および25の双方が次の欠失変異型と反応したことを示す：dTSR0、dTSR1、dTSR2、dTSR3、dTSR4。従って、mAb 19.1および25のエピトープはTSR 0-4には位置しないと結論付けることができる。さらに、mAb 19.1はdSTR5およびdSTR5+6への結合を失うが、dTSR6への結合は保たれて、そのエピトープがTSR5に位置することが示唆される。mAb 25はdTSR5、dTSR5+6およびdTSR6への結合を失い、そのエピトープがTSR5-6に位置することを示唆する。しかし、dTSR5は想定されるTSR6の除去に至るタンパク分解性の分解を受けているので（図5）、mAb 25のエピトープはTSR6に位置する可能性が高い。HuPは、陽性対照として用いられる完全長ヒトプロペルジン形質移入を指す。Conは、結合の欠除に関する陰性対照として用いられる形質移入されていないCHO細胞溶解物を指す。変異型タンパク質はすべて、C末端に6×Hisタグを含有する。
（図７）図7は、mAb 19.1のエピトープがアミノ酸配列：
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を伴うTSR5のC末端側1/2にマッピングされることを示すエピトープマッピングの結果を示す。TSR0-4（即ち、dTSR5+6）はmAb 19.1とは反応しないのに対して、TSR0-5（即ち、dTSR6）は19.1と反応するので（図6）、さらなる欠失変異型が産生される：TSR0-4＋1/4TSR5、TSR0-4＋1/2TSR5およびTSR0-4＋3/4TSR5。無傷ではなく変異型プロペルジンタンパク質はそのC末端に6×Hisタグを含有した。抗ヒトfPおよび抗Hisタグ抗体の双方を用いたウェスタンブロット分析は、TSR0-4＋3/4TSR5が十分に発現しないことを示した。その他の2つの変異型であるTSR0-4＋1/4TSR5およびTSR0-4＋1/2TSR5は発現されることが確認されたが、どちらもmAb 19.1によって認識されず、それらがmAb 19.1のためのエピトープを失っていたことを示唆する。従って、mAb 19.1のための重要なエピトープ残基はTSR5のC末端側半分に位置すると結論づけることができる（SEQ ID NO: 52）。
（図８Ａ）図8Aおよび8Bを含む図8はmAb 25のエピトープを示すエピトープマッピングの結果を示す。図8Aでは、アミノ酸配列
2014522845.tif 000004
を伴うTSR6のC末端側1/4セグメントにマッピングされたエピトープを示す。TSR0-5（即ち、dTSR6）はmAb 25への結合を失っているので、TSR6はmAb 25のエピトープの少なくとも一部を構成すると結論付けられた。TSR6のさらなる変異型は次のように産生された：TSR0-5＋1/4TSR6、TSR0-5＋1/2TSR6およびTSR0-5＋3/4TSR6。無傷ではないが、変異型プロペルジンタンパク質はC末端に6×Hisタグを含有した。抗ヒトfPおよび抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロットに示される通り、3つのすべての変異型が適切に発現された。ELISA結合実験は、3つのすべての変異型がmAb 25との結合を失っていることを示した。陽性対照として、すべての変異型タンパク質がmAb 19.1と反応した。この結果は、TSR6の最後の1/4セグメント（SEQ ID NO: 53により表される配列を伴う）がmAb 25のエピトープの重要な部分を構成することを示唆する。HuPは、陽性対照である完全長（無傷）ヒトfPを形質移入されたCHO細胞を指す；Con溶解物（ConLysate）は結合に関する陰性対照とである形質移入されていないCHO細胞を指す。
（図８Ｂ）図8Aおよび8Bを含む図8はmAb 25のエピトープを示すエピトープマッピングの結果を示す。図8Bでは、データはmAb 25のエピトープがTSR6（SEQ ID NO: 61、図5Bに示す）の2つのシステイン残基に依存することを示す。これらは、TSR6のシステイン62（C62）およびシステイン78（C78）である。完全長ヒトプロペルジンにおけるC62またはC78のいずれかのアラニン（A）への単独の変異はmAb 25結合を無効にしなかったが、C62AおよびC78Aの双方の変異はmAb 25結合を無効にした。変異型タンパク質発現の陽性対照として、mAb 19.1はすべての試料に対して反応性を示した。この結果は、TSR6の最後の1/4セグメント内（SEQ ID NO: 53によって表される配列を伴う）のC78、ならびにSEQ ID NO: 53の外側ではあるがTSR6内に位置するC62（SEQ ID NO: 61）はmAb 25のエピトープの2つの重要な残基を構成することを示唆する。mAb 19.1および25の結合アッセイは、形質移入されたCHO細胞のホモジネートを用いてELISAプレートにて実施された。HuPは、陽性対照である完全長（無傷）ヒトfPを形質移入したCHO細胞を指す；Conは結合の陰性対照である形質移入されていないCHO細胞を指す。その他の試料は、単独または二重のC62AおよびC78A変異を含有する変異型ヒトfP cDNAを形質移入されたCHO細胞である。
（図９）図9は、CDR（VH-CDR1：SEQ ID NO: 3；VH-CDR2：SEQ ID NO: 4；VH-CDR3：SEQ ID NO: 5；VL-CDR1：SEQ ID NO: 8；VL-CDR2：SEQ ID NO: 9；VL-CDR3：SEQ ID NO: 10）を内包する、mAb 19.1の重鎖（SEQ ID NO: 1；SEQ ID NO: 2）および軽鎖（SEQ ID NO: 6；SEQ ID NO: 7）の可変性領域配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
（図１０）図10は、CDR（VH-CDR1：SEQ ID NO: 13；VH-CDR2：SEQ ID NO: 14；VH-CDR3：SEQ ID NO: 15；VL-CDR1：SEQ ID NO: 18；VL-CDR2：SEQ ID NO: 19；VL-CDR3：SEQ ID NO: 20）を内包する、mAb 25の重鎖（SEQ ID NO: 11；SEQ ID NO: 12）および軽鎖（SEQ ID NO: 16；SEQ ID NO: 17）の可変性領域配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
（図１１）図11は、CDR（VH-CDR1：SEQ ID NO: 23；VH-CDR2：SEQ ID NO: 24；VH-CDR3：SEQ ID NO: 25；VL-CDR1：SEQ ID NO: 28；VL-CDR2：SEQ ID NO: 29；VL-CDR3：SEQ ID NO: 30）を内包する、mAb 22.1の重鎖（SEQ ID NO: 21；SEQ ID NO: 22）および軽鎖（SEQ ID NO: 26；SEQ ID NO: 27）の可変性領域配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
（図１２）図12は、CDR（VH-CDR1：SEQ ID NO: 33；VH-CDR2：SEQ ID NO: 34；VH-CDR3：SEQ ID NO: 35；VL-CDR1：SEQ ID NO: 38；VL-CDR2：SEQ ID NO: 39；VL-CDR3：SEQ ID NO: 40）を内包する、mAb 30の重鎖（SEQ ID NO: 31；SEQ ID NO: 32）および軽鎖（SEQ ID NO: 36；SEQ ID NO: 37）の可変性領域配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
（図１３）図13は、2つのヒト生殖系列VH配列（ヒトVH 4-59-01（SEQ ID NO: 41）；ヒトVH 3-66-04（SEQ ID NO: 43））を用いたCDR移植後のmAb 19.1の重鎖の可変性領域のヒト化アミノ酸配列（ヒト化19.1 VH-4-59-01（SEQ ID NO: 42）；ヒト化19.1 VH-3-66-04（SEQ ID NO: 44））を示す。
（図１４）図14は、ヒト生殖系列VL配列（ヒトVL 4-1-01（SEQ ID NO: 45）；ヒトJK2（SEQ ID NO: 46））を用いたCDR移植後のmAb 19.1の軽鎖の可変性領域のヒト化アミノ酸配列（ヒト化19.1 VL-4-1-01（SEQ ID NO: 47））を示す。
（図１５）図15は、ヒト生殖系列VH配列（ヒトVH 1-69-06（SEQ ID NO: 48））を用いたCDR移植後のmAb 25の重鎖の可変性領域のヒト化アミノ酸配列（ヒト化25-VH-1-69-06（SEQ ID NO: 49））を示す。
（図１６）図16は、ヒト生殖系列VL配列（ヒトVL 1-69-06（SEQ ID NO: 50））；ヒトJk3（SEQ ID NO: 62）を用いたCDR移植後のmAb 25の軽鎖の可変性領域のヒト化アミノ酸配列（ヒト化25-VL-1-69-06（SEQ ID NO: 51））を示す。
（図１７Ａ）図17Aおよび17Bを含む図17は、組換え型キメラおよびヒト化19.1 mAbを評価する実験の結果を示す。図17Aは、セリン229のプロリンへの変異を伴うヒトIgG4重鎖定常領域（SEQ ID NO: 63）およびヒトκ軽鎖定常領域（SEQ ID NO: 64）のアミノ酸配列を示す。これらの配列はキメラ（マウス可変性領域＋ヒト定常領域）およびヒト化（ヒト化マウス可変性領域＋ヒト定常領域）抗プロペルジン抗体を構築するために用いられた。
（図１７Ｂ）図17Aおよび17Bを含む図17は、組換え型キメラおよびヒト化19.1 mAbを評価する実験の結果を示す。図17Bは、組換え型キメラおよびヒト化19.1 mAbの発現を評価する実験の結果を示す。組換え型キメラ19.1 mAbおよび2つのヒト化19.1 mAbのSDS PAGE分析。キメラ19.1重鎖の構築は、19.1のVH領域をヒトIgG4重鎖の定常領域と接合させることによって達成された。キメラ19.1軽鎖の構築は、19.1のVL領域をヒトκ鎖の定常領域と接合させることによって達成された。ヒト化19.1重鎖および軽鎖は同じように構築されて、即ち、ヒト化VH領域をヒトIgG4重鎖の定常領域と接合させて、ヒト化軽鎖はヒトκ鎖の定常領域と接合させた。CHO細胞は重鎖および軽鎖cDNAを同時形質移入して、薬剤セクションにより安定な系統を確立した。2つのヒト化mAbのために、2つの各ヒト化重鎖を形質移入に備えて同一のヒト化軽鎖と対合させた。発現したmAbは、Gタンパク質アフィニティカラムによりCHO細胞培養培地から精製した。
（図１８）図18は、Biacoreを用いた19.1、キメラ19.1およびヒト化19.1 mAbの抗原結合親和性を測定する実験の結果を示す。精製ヒトfPをアミンカップリング法を用いてCM4チップにカップリングさせた。Biacore分析はBiacore-2000装置で実施した。チップは、結合と結合の間に50mM NaOHを用いて再生処理した。
（図１９）図19は、Biacore分析により決定される、mAb 25、22.1および30の抗原結合親和性を測定する実験の結果を示す。精製ヒトfPをアミンカップリング法を用いてCM4チップにカップリングさせた。Biacore分析はBiacore-2000装置で実施した。チップは、結合と結合の間に50mM NaOHを用いて再生処理した。
（図２０）図20は、LPS誘発性ヒトAP補体活性化の遮断における、19.1、キメラ19.1およびヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価する実験の結果を示す。LPSを用いてELISAプレートを一晩、コーティングして、抗C3抗体を用いてのC3析出の検出前に、GVB-Mg++-EGTAで希釈した50％正常ヒト血清（NHS）を加えて37℃で1時間、インキュベートした。抗体を加えないNHSは陽性対照（NHS）として、EDTAを加えたNHSは陰性対照（NHSEDTA）とした。19.1 mAbの場合、5μg/mlおよび10μg/mlの濃度は補体活性化を阻害するために十分であった。キメラおよび2つのヒト化19.1 mAbでは、5μg/mlの濃度は補体活性化を阻害するには十分でなかった。しかし、10μg/mlおよび20μg/mlの濃度はAP補体活性化の遮断に有効であった。
（図２１）図21は、fHおよびDAF機能障害の状況において、ヒトAP補体によるヒトRBC溶解の遮断における19.1、キメラ19.1およびヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価する実験の結果を示す。ヒトRBCを、fH19-20（30μM）および抗DAF抗体（7.5μg/ml）の存在下で50％正常ヒト血清と共にインキュベートした。ヒト血清をGVB-Mg++-EGTA で希釈して、37℃で1時間、インキュベートを行った。RBCへの添加前に、ヒト血清を19.1、キメラ19.1およびヒト化19.1 mAbの漸増濃度（1〜15μg/ml）と共に4℃で1時間、プレインキュベートした。4つのすべてのmAbにおいて、用量依存性のRBC溶解阻害があった。しかし、キメラおよびヒト化19.1 mAbのEC50は19.1 mAbのそれよりも高かった。この結果は図20に示されるデータと一致した。
（図２２）図22は、LPS誘発性アカゲザルAP補体活性化の遮断における、19.1、キメラ19.1およびヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価する実験の結果を示す。ELISAプレートをLPSで一晩、コーティングして、抗ヒトC3抗体を用いてC3の析出を検出する前に、GVB-Mg++-EGTAで希釈した50％正常アカゲザル血清（NRS）を加えて37℃で1時間、インキュベートした。抗体を加えていないNRSを陽性対照（NRS）として、EDTAを加えたNRSを陰性対照（NRSEDTA）とした。19.1およびキメラ19.1 mAbでは、10〜40μg/mlの濃度はアカゲザルの補体活性化を阻害するために十分であった。2つのヒト化19.1 mAbでは、30または40μg/mlの濃度が補体活性化を阻害するために有効であった。10または20μg/mlの濃度もアカゲザルのAP補体活性化を実質的に阻害した。
（図２３）図23は、LPS誘発性カニクイザルAP補体活性化の遮断における、19.1、キメラ19.1およびヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価する実験の結果を示す。ELISAプレートをLPSで一晩、コーティングして、抗ヒトC3抗体を用いてC3の析出を検出する前に、GVB-Mg++-EGTAで希釈した50％正常カニクイザル血清（NCS）を加えて37℃で1時間、インキュベートした。抗体を加えていないNCSは陽性対照（NCS）として、EDTAを加えたNCSは陰性対照（NCSEDTA）とした。19.1 mAbでは、10〜40μg/mlの濃度がカニクイザルAP補体活性化を阻害するために十分であった。キメラ19.1 mAbでは、20〜40μg/mlの濃度がカニクイザルのAP補体活性化を阻害するために十分であったが、10μg/mlの濃度も補体活性化を顕著に阻害した。2つのヒト化19.1 mAbでは、30または40μg/mlの濃度がカニクイザル補体活性化を阻害するために有効であった。しかし、20μg/mlの濃度もカニクイザルAP補体活性化を実質的に阻害した。10μg/mlの濃度もカニクイザルAP補体活性化をある程度、阻害した。
（図２４）図24は、mAb 19.1、25およびヒト化19.1によるPNH患者赤血球の酸性化血清溶解の阻害を評価する実験（Ham試験）の結果を示す。発作性夜間血色素尿症（PNH）患者からのRBCをmAbの存在下または不在下においてHamの酸性化血清試験に供した。RBCを自己血清（最終濃度 83％）と共に37℃で2時間、インキュベートして、上清のOD405を測定することによって溶解パーセントを算出して、蒸留水により完全に溶解したRBC（Eh DDW）の試料に対して正規化した。インキュベート混合物は以下から構成された：血清240μl、1/6N HCL 25μl（または陰性対照としての生理食塩液25μl）、50％（v/v）RBC懸濁液 12.5μl、生理食塩液中mAb 10μl。酸性化していない自己血清（NHS）と共にインキュベートしたRBCの試料を陰性対照（バックグラウンド溶解）として用いた。mAbの不在下においてRBCの約50％が酸性化血清により溶解された。この溶解は、8μg/mlおよびこれよりも高い濃度のmAb 19.1により、20μg/mlの濃度のヒト化19.1 mAb（#459）により、また8μg/mlおよびこれよりも高い濃度のmAb 25により完全に阻害された。
（図２５）図25A〜25Eを含む図25は、プロペルジンヒト化マウスの作出を示す。ヒトfP発現ベクターは、CVM-IEエンハンサーを伴うニワトリβ-アクチンプロモーターおよび真核細胞におけるcDNAの安定発現のためのウサギβ-グロブリンポリA尾部を用いて、図25Aのスキームに例証する通り構築した。このプラスミドを直線化して、ヒトfPトランスフェニックファウンダーマウスを作るために、C57BL/6マウスの接合子に微量注入した。（ヒトfP
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に特異的なプライマーを用いた）PCRスクリーニングによって、（約800bpのヒトfP cDNAフラグメントを示す）陽性ファウンダーマウスを特定した。分析した40匹のマウスの内、5匹（＃15、20、24、27および32）が陽性であった（図25B、赤色の矢印）。トランスジェニック陽性マウスにおいてヒトfPを検出するために、ELISAアッセイを実施した（図25C）。プレートをヒトfPに対する非遮断mAbでコーティングした（クローン 8.1）。希釈した血清（10％）と共にインキュベートした後、HRP抱合ヤギ抗ヒトfP抗体を用いてELISAによりヒトfPを検出した。正常ヒト血清（NHS）を陽性対照として用いた。認められる通り、ヒトfPはNHSおよび5匹のトランスジェニックマウスの血清では検出されたが、正常（即ち、非トランスジェニック）マウス血清（NMS）、トランスジェニック陰性（#29）またはfP-/-マウス血清では検出されなかった。ファウンダーマウス#32をWTマウスと交配して、児動物を前記の通り、PCRによってスクリーニングした。1匹のPCR陰性（F1-429）および2匹のPCR陽性（F1-430およびF1-431）の3匹の代表的なF1マウスについて、それらの血清におけるヒトfPの存在に関してELISAで試験した（図25D）。示される通り、ヒトfPは2匹のPCR陽性マウスでは検出されたが、PCR陰性マウスでは検出されなかった。NHSおよびファウンダー親マウス（#32）からの血清を陽性対照として用いた。この結果は、導入遺伝子が安定であり、生殖系列を介して伝達可能であることを示唆した。続いて、fP-/--ヒトfP導入遺伝子+マウスを作出するために、ファウンダーマウス#32をfP-/-マウスと交配した。LPS誘発性AP補体活性化アッセイは、fP-/--ヒトfP導入遺伝子+マウスはWTマウスのそれと識別不能な血清AP補体活性を持つが、fP-/-マウスは持たないことを示して（図25E）、遺伝子導入により発現されたヒトfPがfP-/-マウスの表現型を救出できることが示唆された。EDTAで処理したWT血清を陰性対照として用いた。この結果より、プロペルジンヒト化マウスの系統が作出されたことが確認された。
（図２６）図26は、「プロペルジンヒト化」マウスにおけるmAb 25のインビボでの活性およびキネティクスを調べる実験を示す。プロペルジンヒト化マウス（fP-/--ヒトfP導入遺伝子+）にmAb 25の0.5mg（i.p.）を注入した。血清の試料を注入前（0時間）およびその後、注入後の様々な時点で採取して、LPS誘発性AP補体活性化について試験した。示される通り、fP-/-マウス血清またはEDTAで処理したWT血清にAP補体活性は存在しなかった。これに対して、WT血清およびfPヒト化マウスの血清では0時（mAb処理前）の時点でAP補体活性が検出された。ヒト化マウスにおけるAP補体活性はmAb処理後8、24および48時間には検出不能を維持したが、72、96および120時間には検出となった。これらの結果は、mAb 25が0.5mg/マウスの投与量でインビボにおいてAP補体活性を48時間阻害できたことを示唆する。
（図２７）図27は、抗ヒトプロペルジンmAb 19.1が血管外溶血（EVH）を防ぐことを実証する実験の結果を示す。このEVHモデルでは、プロペルジンヒト化マウス（実験群当たりn＝4）にCrry/DAF/C3トリプルノックアウト（TKO）マウスの赤血球（RBC）を輸血した。レシピエントマウス（プロペルジンヒト化マウス）はRBC輸血6時間前にmAb 19.1（2mg/マウス、i.p.）で処理して、または対照マウスはIgG1 mAb（MOPC、MoPC 31Cハイブリドーマから精製、ACTTから）で処理した。RBCは、既報の手順（Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716）に従って、ドナーTKOマウスから採取して、PBS中で洗浄処理し、レシピエントマウスへの注入（尾静脈を介して）前にCFSEで標識した。各レシピエントマウスは血液 100μlに相当するRBCを輸血された。RBC輸血後5分、および6、24、48、72、96、120時間の時点で、レシピエントマウスから採血して、循環中に残っているCFSE標識された（即ち、輸血された）RBCの数を決定するためにRBCを分析した。各レシピエントにおけるCFSE標識されたRBCの数を5分の時点で検出された数に対して（％として）正規化した。対照のIgG（MOPC）処理したレシピエントマウスにおいて、TKO RBCは、先行の所見（Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716）に一致して、EVHを介して速やかに排出された。しかし、抗ヒトプロペルジン19.1 mAbで処理されたレシピエントマウスでは、EVHは起こらずに輸血されたRBCは存続して、抗プロペルジンmAbがEVHの予防に有効であることを実証している。
（図２８）図28は、ヒトプロペルジントランスジェニックマウスを作出するために用いられたヒトプロペルジンcDNAの核酸配列（SEQ ID NO: 67）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、抗プロペルジン抗体を用いた補体の代替経路（AP）の阻害に関する。様々な態様において、本発明は、個体を抗プロペルジン抗体に接触させることによって個体におけるAP介在性の病態またはAP介在性の状態を治療するための組成物および方法に方向付けられる。本発明の組成物および方法で治療することができるAP介在性の病態および状態は、黄斑変性、虚血性再灌流障害、関節炎、慢性関節リウマチ、喘息、発作性夜間血色素尿症（PNH）症候群、非定型溶血性尿毒症（aHUS）症候群、敗血症、臓器移植、炎症（心肺バイパス術および腎透析に関連する炎症を非限定的に含む）、糸球体腎炎（抗好中球細胞質抗体（ANCA）介在性糸球体腎炎を非限定的に含む、狼瘡およびその組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
定義
別途定義される場合を除いて、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されるものと同一の意味を持つ。本明細書に述べられるものと同等または相当する任意の方法および材料が本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料について記載する。
【００２２】
本明細書で用いられる通り、以下の用語は各々、本節におけるそれと関連する意味を持つ。
【００２３】
「一つ（a）」および「一つ（an）」の冠詞は、本明細書では一つまたは一つよりも多い（即ち、少なくとも一つ）のその冠詞の文法上の対象物を指すために用いられる。実施例により、「要素」は一つの要素または一つよりも多い要素を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられる通り、「阻害する」および「阻害」という用語は、対照値に比して少なくとも約10％、活性または機能を低下させる、抑制する、減弱するまたは遮断することを意味する。好ましくは、活性は対照値に比して50％、より好ましくは75％、さらにより好ましくは95％、抑制または遮断される。
【００２５】
「有効量」および「薬学的な有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供するための物質の十分な量を指す。その結果は、疾患もしくは障害の徴候、症状もしくは原因の低下および／もしくは緩和、または生物学的な系の任意のその他の所望される変化であり得る。当業者は日常的な実験を用いて個々の任意の症例における適切な有効量を決定することが可能である。
【００２６】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は本明細書において互換的に用いられて、状態もしくはその続発症の治療を必要とする、または状態もしくは続発症に対して感受性であるヒトを含めて、補体系を持つ任意の動物、好ましくは哺乳動物、もっとも好ましくはヒトを指す。個体は、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サルおよびマウス、ならびにヒトを内包することができる。
【００２７】
有機体、組織、細胞またはその構成成分の文脈において用いられる場合の「異常」という用語は、少なくとも一つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、齢期、治療、一日の時刻など）において、「正常」な（予測される／恒常性の）それぞれの特徴を示す有機体、組織、細胞またはその構成成分と異なる有機体、組織、細胞またはその構成成分を指す。一つの細胞、組織タイプ、または対象において正常であるまたは予測される特徴が、異なる細胞または組織タイプでは異常である場合がある。
【００２８】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができない動物の健康状態であり、該疾患が寛解しなければ動物の健康が引き続き悪化する動物の健康状態である。
【００２９】
一方、動物の「障害」は、動物は恒常性を維持できるが、動物の健康状態は該障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。未治療のままとした場合、障害は必ずしも動物の健康状態のさらなる低減を引き起こすとは限らない。
【００３０】
疾患または障害は、該疾患または該障害の徴候または症状の重症度、患者が経験するこのような徴候または症状の頻度、または両者が低下するならば、「軽減」する。
【００３１】
化合物の「有効量」または「治療上有効量」は、該化合物が投与される対象に対して有益な効果を提供するために十分な化合物の量である。
【００３２】
本明細書で用いられる通り、「説明用材料」は、本明細書に列挙される様々な疾患または障害の軽減を達成するためのキットとしての本発明の化合物、組成物、ベクター、または送達系の実用性を伝えるために用いることができる刊行物、記録、ダイアグラム、またはその他の任意の表現媒体を内包する。任意で、または、説明用材料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を軽減する一つまたは複数の方法を説明することができる。本発明のキットの説明用材料は、例えば、本発明の明示される化合物、組成物、ベクターもしくは送達系を含有する容器に添付される、または明示される化合物、組成物、ベクターもしくは送達系を含有する容器と共に輸送することができる。または、説明用材料は、該説明用材料および化合物が受取人によって協調的に使用されることを意図して容器とは別に輸送することができる。
【００３３】
「治療的な」処置は、病態の徴候を発現する対象に対して、それらの徴候の減弱または排除のために投与される処置である。
【００３４】
本明細書で用いられる通り、「疾患または障害を治療する」は、疾患、障害または病態の徴候および／または症状の頻度および／または重症度の低下が患者によって経験されることを意味する。疾患、障害および病態は、本明細書において互換的に用いられる。
【００３５】
本明細書で用いられる通り、「生物学的試料」の語句は、核酸またはポリペプチドの発現を検出することができる細胞、組織または体液を含む任意の試料を内包することが意図される。このような生物学的試料の例には、血液、リンパ、骨髄、生検標本および塗沫標本が内包されるが、これらに限定されるものではない。本来、液体である試料は本明細書では「体液」として言及される。生物学的試料は、例えば、領域の掻破もしくはぬぐい取りによって、または体液を入手するためには注射針を使用することを内包する、様々な手法によって患者から入手され得る。様々な身体試料を採取するための方法は当技術分野において周知である。
【００３６】
本明細書で用いられる通り、「抗体」という用語は、抗原の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源から、または組換え型の供給源から誘導される無傷の免疫グロブリンであり得て、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性の部分であり得る。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内の抗体（「細胞内抗体」）であるFv、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab')2、ならびに一本鎖抗体（scFv）、ラクダ抗体のような重鎖抗体ならびにヒト化抗体を内包する様々な形で存在し得る（Harlow et al., 1999, Using Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。
【００３７】
本明細書で用いられる通り、「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書で用いられるようなバクテリオファージによって発現される抗体のような、組換えDNA手法を用いて作出される抗体を意味する。本用語は、さらに、該抗体をコードするDNA分子の合成によって作出された抗体であって、DNA分子が抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現して、該DNAまたはアミノ酸配列が当技術分野において利用可能であり、かつ、周知である合成DNAまたはアミノ酸配列手法を用いて入手された抗体を意味すると解釈されるべきである。
【００３８】
本明細書で用いられる通り、「重鎖抗体（heavy chain antibody）」または「重鎖抗体（heavy chain antibodies）」という用語は、ペプチドを用いた免疫化およびその後の血清の分離によって、またはこのような抗体をコードする核酸配列のクローニングおよび発現によってラクダから誘導された免疫グロブリン分子を含む。「重鎖抗体（heavy chain antibody）」または「重鎖抗体（heavy chain antibodies）」という用語は、重鎖病を伴う動物から単離された、または動物のVH（可変性重鎖免疫グロブリン）のクローニングおよび発現によって調製された免疫グロブリン分子を包含する。
【００３９】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体から誘導された軽鎖および重鎖の定常領域に結合するドナー抗体から誘導された自然に発生する可変性領域（軽鎖および重鎖）を含有する工学的に操作された抗体のタイプを指す。
【００４０】
「ヒト化抗体」は、ヒト以外のドナーの免疫グロブリンから誘導されたCDRを持ち、分子の残りのイムノグロブリン由来部分は一つ（または複数）のヒト免疫グロブリンから誘導される工学的に操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は結合親和性を保存するように変更され得る（例えば、1989, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86;10029-10032；1991, Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421を参照）。適切なヒトアクセプター抗体は、例えば、KABATデータベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Proteinデータベースの従来のデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対するホモロジーによって選択される抗体であってよい。（アミノ酸ベースでの）ドナー抗体のフレームワーク領域に対するホモロジーによって特徴付けられるヒト抗体は、重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域をドナーCDRの挿入に提供するために適切であり得る。軽鎖の定常領域または可変フレームワーク領域を供与することができる適切なアクセプター抗体は同様の方法で選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同一のアクセプター抗体を起源とすることを要求されない点は留意されるべきである。先行技術は、このようなヒト化抗体を作成する複数の方法を記載している（例えば、EP-A-0239400およびEP-A-054951を参照されたい）。
【００４１】
「ドナー抗体」という用語は、変化した免疫グロブリンコード領域およびその結果発現する変化した抗体にドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を与えるために、第一の免疫グロブリンパートナーに対して、その可変性領域、CDRまたはその他の機能性フラグメントもしくはその類似体のアミノ酸配列を付与する抗体（モノクローナルおよび／または組換え型）を指す。
【００４２】
「アクセプター抗体」という用語は、第一の免疫グロブリンパートナーに対して、重鎖および／もしくは軽鎖のフレームワーク領域ならびに／または重鎖および／もしくは軽鎖の定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（または任意の部分、但し、いくつかの態様ではすべて）を付与するドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナルおよび／または組換え型）を指す。一部の態様において、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００４３】
「CDR」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高頻度可変性領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変性部分には3つの重鎖および3つの軽鎖CDR（またはCDR領域）がある。従って、本明細書で用いられる通り「CDR」は、3つすべての重鎖CDRまたは3つすべての軽鎖CDR（または、該当するならば、すべての重鎖およびすべての軽鎖CDRの双方）を指す。抗体の構造およびタンパク質の折り畳みは、その他の残基が抗原結合領域の一部と考えられて、当業者によってそのように解釈されることを意味し得る。例えば、Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883を参照されたい。
【００４４】
本明細書で用いられる通り、「免疫アッセイ」は、標的分子を検出および定量するために標的分子に対して特異的に結合することができる抗体を使用する任意の結合アッセイを指す。
【００４５】
抗体に関して本明細書で用いられる通り「特異的に結合する」という用語は、特異抗原を認識するが試料中のその他の分子に対しては実質的に認識しないまたは結合しない抗体を意味する。例えば、一つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は一つまたは複数の種からのその抗原に対しても結合する可能性がある。しかし、このような異種間反応性はそれだけで特異的としての抗体の分類を変更することはない。もう一つの例では、抗原に特異的に結合する抗体は、該抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかし、このような交差反応性はそれだけで特異的としての抗体の分類を変更することはない。
【００４６】
いくつかの場合において、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語は、第二の化学種を伴う抗体、タンパク質、またはペプチドの相互作用への言及において、該相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するために用いることができる；例えば、抗体は一般にタンパク質というよりは特異的なタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「A」に関して特異的であるとすると、標識された「A」および抗体を含有する反応においてエピトープAを含有する分子（または、フリーの未標識のA）の存在は抗体に結合する標識されたAの量を低下させる。
【００４７】
遺伝子の「コード領域」は、該遺伝子の転写によって作られるmRNA分子のコード領域に対して、それぞれ、相同であるまたは相補性である、該遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基、および該遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
【００４８】
mRNA分子の「コード領域」は、さらに、mRNA分子の翻訳中にトランスファーRNA分子のアンチコドン領域と一致する、または停止コドンをコードする、mRNA分子のヌクレオチド残基からなる。従って、コード領域は、mRNA分子によってコードされる成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質移行シグナル配列におけるアミノ酸残基）のコドンを含むヌクレオチド残基を内包し得る。
【００４９】
本明細書において核酸を指すために用いられる「相補性の」は、2本の核酸鎖の領域間または同一の核酸鎖の2つの領域間での配列相補性の幅広い概念を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と、その残基がチミンまたはウラシルであるならば、特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）できることが公知である。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は第一の鎖と逆平行である第二の核酸の残基と、その残基がグアニンであるならば、塩基対形成できることが公知である。核酸の第一の領域は、2つの領域が逆平行の様式で配列される場合に第一の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対形成できるならば、同一または異なる核酸の第二の領域と相補性である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含み、第二の領域は第二の部分を含み、それによって、第一および第二の部分が逆平行の様式で配列される場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75％、少なくとも約90％または少なくとも約95％が第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。より好ましくは、第一の部分のすべてのヌクレオチド残基が第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。
【００５０】
本明細書で用いられる通り、「DNA」という用語はデオキシリボ核酸と定義される。
【００５１】
「コードする」は、ヌクレオチドの所定の配列（即ち、rRNA、tRNAおよびmRNA）またはそれから生じるアミノ酸の所定の配列および生物学的特性を持つ、生物学的な過程においてその他のポリマーおよび高分子の合成において鋳型として用いるための、遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞またはその他の生物学的な系においてタンパク質を作るならば、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であって、通常、配列リストに示されるコーディング鎖、および遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コーディング鎖はいずれも、その遺伝子またはcDNAのタンパク質またはその他の産物をコードするとして言及され得る。
【００５２】
別途特記する場合を除いて、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の変性型であり、同一のアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を内包する。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列の語句は、該タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列がいくつかの型においてイントロンを含有し得る範囲で、イントロンをさらに内包し得る。
【００５３】
「単離された」は、天然の状態からの変化または回収を意味する。例えば、生存動物においてその正常な状況で自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、自然の状況の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同一の核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は実質的に精製された型で存在することができて、または、本来の環境でない、例えば、宿主細胞のような環境下で存在することができる。
【００５４】
「単離された核酸」は、自然に生じる状態でそれに隣接する配列から分離された核酸のセグメントまたはフラグメント、即ち、該フラグメントに正常に近接する配列、即ち、自然に生じるゲノム内のフラグメントに近接する配列から回収されたDNAフラグメントを指す。本用語は、自然に核酸を伴うその他の成分、即ち、細胞内において自然にそれを伴うRNAもしくはDNAまたはタンパク質から実質的に精製された核酸に対しても当てはまる。従って、前記用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み入れられた組換え型DNA、またはその他の配列と無関係の独立した分子として（即ち、cDNAまたはPCRもしくは制限酵素消化によって作られるゲノムもしくはcDNAフラグメントとして）存在する組換え型DNAを内包する。前記用語はさらに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え型DNAも内包する。
【００５５】
本発明の状況において、一般的に生じる核酸塩基に関する以下の略号が用いられる。「A」はアデニンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【００５６】
本明細書で用いられる通り、「ポリヌクレオチド」という用語はヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。従って、本明細書で用いられる通り、核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸はポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは単量体の「ヌクレオチド」に加水分解され得るという一般的な知識を持っている。単量体のヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で用いられる通り、ポリヌクレオチドは、組換えの方法、即ち、通常のクローニング手法およびPCRなどを用いて、および合成方法により組換え型ライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを非限定的に内包する、当技術分野において有効な任意の方法によって入手されるすべての核酸配列を内包するが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本明細書で用いられる通り、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」の用語は互換的に用いられて、ペプチド結合によって共有結合性に連結されるアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に関しては制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって相互に接合する2つまたはそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を内包する。本明細書で用いられる通り、本用語は、例えば、当技術分野において広くペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる単鎖、ならびに多くのタイプのある、当技術分野において一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖を指す。「ポリペプチド」は、中でも、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に同種のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異型、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を内包する。ポリペプチドは、自然のペプチド、組換え型ペプチド、合成ペプチドまたはその組み合わせを内包する。
【００５８】
本明細書で用いられる通り、「後代」という用語は子孫または次世代を指し、哺乳動物の次世代を内包し、親細胞に由来する分化または未分化の子孫細胞も内包する。一つの使用において、後代という用語は、遺伝的に親と同一である子孫細胞を指す。もう一つの使用において、後代という用語は、遺伝的および表現型的に親と同一である子孫細胞を指す。さらにもう一つの使用において、後代という用語は親細胞から分化した子孫細胞を指す。
【００５９】
本明細書で用いられる通り、「RNA」という用語はリボ核酸と定義される。
【００６０】
本明細書で用いられる通り、「組換え型DNA」という用語は、異なる供給源からのDNAの小片を接合することによって作られたDNAとして定義される。
【００６１】
本明細書で用いられる通り、「組換え型ポリペプチド」という用語は組換えDNA法を用いることによって作られたポリペプチドとして定義される。
【００６２】
本明細書で用いられる通り、「抱合された」は一つの分子の第二の分子への共有結合性の接続を指す。
【００６３】
本明細書で用いられる用語である「変異型」は、それぞれ、基準となる核酸配列またはペプチド配列とは配列の点で異なるが、基準となる分子の本質的な生物学的特性は保持している核酸配列またはペプチド配列である。核酸変異型の配列の変化は基準となる核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変化させない場合があり、またはアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断に至る場合もある。ペプチド変異型の配列の変化は典型的には限定的または保存的であり、基準となるペプチドおよび変異型の配列は全体的に非常に似通っていて、多くの領域において同一である。変異型および基準となるペプチドは、任意の組み合わせにおいて一つまたは複数の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列の点で異なることができる。核酸またはペプチドの変異型は対立遺伝子の変異型のように自然に生じ得て、または自然に生じないことが公知である変異型であることができる。核酸およびペプチドの自然には生じない変異型は突然変異誘発手法または直接的な合成によって作成され得る。
【００６４】
「交配」という用語は、本明細書において、結果が少なくとも一つの次世代である、種の繁殖を指すために用いられる。
【００６５】
「自然交配」という用語は、本明細書において、性的な合体による種の繁殖を指すために用いられる。
【００６６】
「近交動物」という用語は、本明細書において、一定の特性を保存および固定するために、またはその他の特性が交配する集団に導入されることを防ぐために、同一種の他の同様の動物と近親交配された動物を指すために用いられる。
【００６７】
「非近交動物」という用語は、本明細書において、一定の特性の保存には構わずに同一種の他の任意の動物と交配される動物を指すために用いられる。
【００６８】
範囲：本開示を通じて、本発明の様々な局面が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は単に便宜上および簡略のためであることが理解されるべきであり、本発明の範囲に対する不動の制限として解釈されるべきではない。従って、範囲の記載は、その範囲内のすべての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、1から6までのような範囲の記載は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどのような部分範囲、ならびに例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6などのその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。これは範囲の幅に関わらず当てはまる。
【００６９】
説明
本発明は、抗プロペルジン抗体を用いた補体の代替経路（AP）の阻害に関する。一つの態様において、本発明は、個体を抗プロペルジン抗体に接触させることによって個体におけるAP介在性の病態またはAP介在性の状態を治療する方法に方向付けられる。
【００７０】
一つの態様において、本発明は、個体におけるAP介在性の病態を治療する方法であって、該個体に抗プロペルジン抗体を投与する工程、それによってC3bBbタンパク質複合体の産生を阻害する工程を含む方法である。本発明の方法を用いて治療することができる補体介在性の病態の例には、黄斑変性、虚血性再灌流障害、関節炎、慢性関節リウマチ、発作性夜間血色素尿症（PNH）症候群、非定型溶血性尿毒症（aHUS）症候群、喘息、炎症、糸球体腎炎、狼瘡、臓器移植敗血症、またはその組み合わせが内包されるが、それらに限定されるものではない。
【００７１】
「自己」および「非自己」の抗原を識別する免疫系の能力は、侵入する微生物に対する特異的防御としての免疫系の機能に極めて重要である。「非自己」抗原は、動物自身の構成物とは検出可能な程度に異なるまたは異質である体内に侵入または存在する物質上の抗原であり、「自己」抗原は、健常な動物においてそれ自身の構成物と検出可能な程度に異ならないまたは異質でない抗原である。本明細書に記載される方法の様々な態様において、阻害されるAP活性化は微生物の抗原、非生物学的な異質な表面、変化した自己組織、またはそれらの組み合わせからなる群の少なくとも一つを引き金とするものである。非生物学的な異質な表面の一つの例は、心肺バイパス術または腎透析において用いられるような血液回路である。変化した自己組織の例には、アポトーシス性、壊死性および虚血性のストレスを受けた組織および細胞またはその組み合わせが内包される。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はAPは選択的に阻害するが、古典的経路（CP）またはレクチン経路（LP）は阻害しない。一般に、CPは抗原−抗体複合体によって開始されて、LPは微生物表面の糖分子へのレクチンの結合によって活性化されて、一方、APは少量が構成的に活性であるが、細菌、ウイルスおよび寄生虫の細胞表面では調節タンパク質を欠くために速やかに増幅されることができる。宿主細胞は、通常、調節タンパク質によってAP補体活性化から保護される。しかし、調節タンパク質が欠損しているまたは欠失しているようないくつかの状況では、APは宿主細胞においても制御不能に活性化され得て、補体介在性の病態に至る。CPは構成成分C1、C2、C4からなり、C3活性化の工程でAPと合流する。LPはマンノース結合レクチン（MBL）およびMBL関連セリンプロテアーゼ（Masp）からなり、CPと成分C4およびC2を共有する。APは構成成分C3ならびにB因子、D因子、プロペルジンおよび液相調節因子のH因子のような複数の因子からなる。補体活性化は3つの工程からなる：（a）認識、（b）酵素的活性化、および（c）細胞死に至る膜傷害。CP補体活性化の最初の段階はC1で開始する。C1は、認識サブユニットC1q、ならびにセリンプロテアーゼ小成分であるC1rおよびC1sの3つの特徴的なタンパク質から構成されて、このC1rおよびC1sはカルシウム依存性四量体複合体であるC1r2 s2において共に結合する。C1の生理学的活性化が生じるためには無傷のC1複合体が必要である。活性化は、無傷のC1複合体が抗原と複合体形成した免疫グロブリンに結合した際に起こる。この結合はC1sを活性化して、その後、C4aおよびC4bならびにC2aおよびC2bを産生するためにC4およびC2タンパク質の双方を開裂する。C4bおよびC2aのフラグメントは一体となってC3コンバターゼを形成し、次にC4b2aはC3aおよびC3bを形成するためにC3を開裂する。LPの活性化は標的表面上の特定の糖へのMBL結合によって開始されて、これはMaspの活性化の引き金となり、続いて、CPのC1sの活性と類似の方法でC4およびC2を開裂して、その結果、C3コンバターゼであるC4b2aを産生する。このように、CPおよびLPは異なるメカニズムによって活性化されるが、それらは同一の構成成分であるC4およびC2を共有して、双方の経路は同一のC3コンバターゼであるC4b2aの産生に至る。C4b2aによるC3のC3bおよびC3aへの開裂は、2つの理由により補体経路の中心的事象である。表面に析出したC3bはAPの中心的な中間体であり、それはAP増幅ループを開始する。C3aおよびC3bはいずれも、生物学的に重要である。C3aは炎症誘発性であり、C5aと共にアナフィラトキシンと呼ばれる。C3bおよびそのさらなる開裂産物はさらに好中球、好酸球、単球およびマクロファージに存在する補体レセプターに結合して、それによって、C3bオプソニン化粒子の食作用およびクリアランスを促進する。最後に、C3bはCPおよびLPのC5コンバターゼを形成するためにC4b2cと結合して終末補体配列を活性化することができて、強力な炎症誘発性介在物質であるC5a、および溶解性膜傷害性複合体（MAC）の構築物であるC5-C9が生成する。
【００７３】
CPおよびAPは宿主の防御において重要な役割を果たして、また、多くの補体依存性のヒトの病態がAPによって介在されることから、このようなヒトの病態の治療においてはAPを選択的に阻害することが望ましい。従って、本明細書に記載される方法の好ましい態様において、CPおよびLPによって提供される免疫は維持されて、APが選択的に阻害される。従って、様々な態様において、本明細書に記載される方法で用いられる抗プロペルジン抗体はCPおよびLPを阻害しない。一部の態様において、本明細書に記載される抗プロペルジン抗体はAPおよびCPの双方を阻害する過去に開発された抗プロペルジン抗体とは異なる。
【００７４】
APは、C3(H2O)を形成するためのC3の自然発生的な加水分解のために、少量が構成的に活性であると考えられる。C3(H2O)はfBと結合できるという点でC3bのように行動して、それはfBをfDの開裂および活性化に対して感受性とする。続いて、得られるC3(H20)Bbは、APのC3コンバターゼであるC3bBbを形成することによってAPカスケードを開始するために、C3を開裂してC3bおよびC3aを生成する。最初のC3コンバターゼはC3bの漸増量を産生するので、増幅ループが確立される。CPおよびLPもC3bを産生して、C3bはB因子と結合することができてAPに係合し、CPおよびLPの経路が活性化されるとAP増幅ループはこれらの経路にも関与する。このように、APは、CPまたはLPとは無関係の独立した補体活性化経路、ならびにCPおよびLPに関与して完全な発現する増幅過程の2つの機能性の実体からなる。一つの態様において、本明細書に記載される方法で用いられる抗プロペルジン抗体はAP活性化過程を選択的に阻害してCPおよびLPのAP増幅ループには干渉しない。
【００７５】
プロペルジンは構造的にN末端ドメインおよび6つのトロンボスポジンタイプIリピート（TSR）ドメインで構成される。生理学的な条件では、それは単量体のヘッド−テイル結合によって形成されるサイクリックポリマー（二量体、三量体、四量体）として血漿中に存在する。ヒトプロペルジンはX染色体の短腕にコードされていて、その欠損、特にC2、MBLまたはIgG2の欠損と併発すると、致命的なナイセリア感染の危険因子となる。
【００７６】
APの開始におけるプロペルジンの必要性は変わりやすく、活性化表面の性状に依存することが見出されている。非限定的な例として、プロペルジンは、LPSおよびLOS誘発性のAP活性化、ならびにCrry欠損マウス赤血球の血管外溶血のようなAP介在性の自己組織損傷に不可欠であることが見出されている（米国特許出願第2010/0263061号を参照されたい）。本明細書に記載される本発明は、fHおよびDAF機能障害／遮断の状況におけるヒトAP補体介在性赤血球溶解に必須であることを開示する（図3）。本明細書に記載される本発明は、プロペルジンがPNH赤血球の自己血清溶解に必須であることも開示する（図24）。一方、ザイモサン誘発性AP活性化はプロペルジン欠乏によって中等度に障害されて、プロペルジンはCVFおよびCPを引き金とするAP増幅において実質的な役割を担わないことが見出されている（米国特許出願第2010/0263061号を参照されたい）。所与の表面でのAP活性化は、C3bBbを介するプロペルジン依存性の促進とH因子（fH）依存性のC3「遊転」阻害の均衡を示す可能性がある。プロペルジンが必須ではないAP活性化物質はfHと限定的な相互作用を持つ可能性があり、十分なfH依存性阻害欠除の結果として、プロペルジンに頼ることなくデフォルトの過程として自然発生性のC3の活性化および増幅が起こり得る。従って、本明細書に記載される本発明の様々な態様において、本発明の抗プロペルジン抗体によるプロペルジン機能の阻害は、それがCPおよびLPのAP増幅ループを損なわず、これらの経路を宿主防御に関して完全に活性な状態に維持すること；必ずしもすべてのAP活性化物質（即ち、病原体）がこの経路の引き金となるためにプロペルジンを必要としないために、それがAP補体活性化を完全には排除せず、抗fBおよび抗fD抗体のようなAP阻害のその他の方法に比べて宿主防御の障害の度合いを低下させることを内包する、複数の利点を提供する。
【００７７】
一つの態様において、本発明の方法を用いて阻害されるAPの活性は、リポ多糖（LPS）、リポオリゴ糖（LOS）、病原体関連分子パターン（PAMP）、および損傷関連分子パターン（DAMP）から選択される群の少なくとも一つによって誘発されるAP活性化である。もう一つの態様において、本発明の方法を用いて阻害されるAPの活性は、C3bBbタンパク質複合体の生成である。もう一つの態様において、本発明の方法を用いて阻害されるAPの活性はプロペルジン依存性である。
【００７８】
いくつかの態様において、本発明の方法は個体のCPおよびLPを介して感染と闘う能力を維持する。一つの態様において、本発明は、個体において細菌性のリポオリゴ糖（LOS）によって誘発されるAP活性化を阻害する方法であって、該個体に抗プロペルジン抗体を投与する工程、およびそれによって個体において細菌性のLOSに誘発されるAP活性化を阻害する工程を含む方法である。もう一つの態様において、本明細書において、細菌性のLPSに誘発されるAP活性化を阻害する方法が提供される。一部の態様において、AP活性化はチフス菌（S. typhosa）のLPSによって誘発されて、本明細書で提供される方法において用いられる阻害物質はサルモネラミネソタ（S. minnesota）のLPSまたは大腸菌（E. coli）のLPSによって誘発されるAP活性は阻害しない。様々な態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はAPを選択的に阻害するが、CPを引き金とする補体活性化、LPを引き金とする補体活性化、ザイモサンに誘発される活性化、またはコブラ毒因子に誘発される活性化は阻害しない。
【００７９】
一つの態様において、本明細書では、個体における病原体関連分子パターン介在性のAP活性化を阻害する方法であって、該個体に抗プロペルジン抗体を投与する工程、それによって個体におけるPAMP介在性のAP活性化を阻害する工程を含む方法を提供する。APの活性化が本発明の方法によって阻害されることができるPAMPの例には、ムラミルジペプチド（MDP）、細菌性DNAからのCpGモチーフ、二本鎖ウイルス性RNA、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、ボレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）からの細胞表面タンパク質A、合成マイコプラズママクロファージ活性化リポタンパク質2、トリパルミトイル-システイニル-セリル-(リシル)3-リジン（P3CSK4）、ジパルミトイル-CSK4（P2-CSK4）、モノパルミトイル-CSK4（PCSK4）、アンホテリシンB、トリアシル化またはジアシル化細菌性ポリペプチド、およびその組み合わせ内包されるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
一つの態様において、本発明は個体におけるAP活性化の開始を阻害する方法であって、該個体に抗プロペルジン抗体を投与する工程、それによって個体におけるAP活性化の開始を阻害する工程を含む方法である。もう一つの態様において、本明細書において、個体におけるAP活性化の増幅を阻害する方法であって、該個体にAPの阻害剤を投与する工程、それによって個体におけるAP活性化の増幅を阻害する工程を含む方法が提供される。これらの態様の例は、AP補体介在性溶血を患うPNH患者、およびAP補体介在性のaHUS、喘息、虚血性／再灌流障害、慢性関節リウマチおよびANCA介在性腎疾患を患っている個体である。本発明の様々な態様において、本発明の組成物および方法を用いて治療することができる疾患および障害は、AP補体介在性溶血、AP補体介在性aHUS、喘息、虚血性／再灌流障害、慢性関節リウマチおよびANCA介在性腎疾患を内包するが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
様々な態様において、本明細書において、APに対する阻害作用を持つ潜在的な抗体を特定する方法であって、（a）個体に抗プロペルジン抗体を投与する工程；（b）該個体の得られる表現型を測定する工程；および（c）該個体の得られる表現型をプロペルジン-/-ノックアウト動物の表現型と比較する工程を含む方法が提供される（米国特許出願第2010/0263061号を参照されたい）。もう一つの態様において、本明細書で提供される方法において用いられる抗プロペルジン抗体は、プロペルジン-/-ノックアウト動物を用いて潜在的な治療用化合物を選択する方法によって特定される（米国特許出願第2010/0263061号を参照されたい）。
【００８２】
様々なその他の態様において、本明細書において、APに対する阻害作用を有する潜在的な抗プロペルジン抗体を特定する方法が提供される。このような一つの方法は、（a）プレートをリポ多糖類（LPS）でコーティングする工程；（b）未結合のLPSを除去するために該プレートを洗浄処理する工程；（c）リン酸緩衝生理食塩液（PBS）中ウシ血清アルブミン（BSA）を加える工程；（d）未結合のBSAを除去するために該プレートを洗浄処理する工程；（e）ヒト血清に混合した抗プロペルジン抗体候補化合物の混合物を加える工程；（f）該プレートを洗浄処理する工程；（g）抗ヒトC3抗体を加える工程；（h）未結合の抗体を除去するために該プレートを洗浄処理する工程；（i）TMB基質試薬を加える工程；（j）反応を停止させるために硫酸を加える工程；（k）450nmにて吸光度を測定する工程；（l）抗プロペルジン抗体候補化合物を含有するプレートの吸光度を陽性比較物質対照および陰性比較物質対照の吸光度と比較する工程であって、該吸光度が陽性比較物質対照に比べて減弱する場合に該抗プロペルジン抗体が同定される工程を内包する。
【００８３】
抗プロペルジン抗体
いくつかの態様において、本発明はプロペルジンと特異的に結合する抗体を含む組成物を内包する。一つの態様において、抗プロペルジン抗体はポリクローナル抗体である。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はキメラ抗体である。さらなる態様において、抗プロペルジン抗体はヒト化抗体である。好ましい態様において、プロペルジンはヒトプロペルジンである。
【００８４】
一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 3；VH-CDR2：SEQ ID N0: 4；VH-CDR3：SEQ ID N0; 5；VL-CDR1：SEQ ID NO: 8；VL-CDR2：SEQ ID NO: 9；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 10からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 3；VH-CDR2：SEQ ID N0: 4；VH-CDR3：SEQ ID N0: 5；VL-CDR1：SEQ ID NO: 8；VL-CDR2：SEQ ID NO: 9；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 10からなる群のすべてのCDRを含む。
【００８５】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体はmAb 19.1と表されるモノクローナル抗体である。mAb 19.1と表される前記モノクローナル抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、mAb 19.1と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はヒト化される。
【００８６】
いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はTSR5（SEQ ID NO: 60）の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はアミノ酸配列
2014522845.tif 000006
の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 52の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する抗プロペルジン抗体はmAb 19.1として表されるmAbである。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は結合に関してmAb 19.1として表される抗体と競合する抗体である。様々な態様において、本発明の抗体が結合することができるエピトープは直鎖状のエピトープまたは立体配座のエピトープである。
【００８７】
一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 13；VH-CDR2：SEQ ID N0: 14；VH-CDR3：SEQ ID N0: 15；VL-CDR1：SEQ ID NO: 18；VL-CDR2：SEQ ID NO: 19；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 20からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 13；VH-CDR2：SEQ ID N0: 14；VH-CDR3：SEQ ID N0: 15；VL-CDR1：SEQ ID NO: 18；VL-CDR2：SEQ ID NO: 19；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 20からなる群より選択されるすべてのCDRを含む。
【００８８】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体はmAb 25と表されるモノクローナル抗体である。mAb 25と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、mAb 25と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はヒト化される。
【００８９】
いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はTSR5（SEQ ID NO: 60）および／またはTSR6（SEQ ID NO: 61）の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はアミノ酸配列
2014522845.tif 000007
の少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 61に存在するシステイン62（C62）を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本発明の抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 53に存在するシステイン78（C78）を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 53のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する抗プロペルジン抗体はmAb 25として表されるmAbである。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は結合に関してmAb 25として表される抗体と競合する抗体である。様々な態様において、本発明の抗体が結合することができるエピトープは直鎖状のエピトープまたは立体配座のエピトープである。
【００９０】
一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID NO: 23；VH-CDR2：SEQ ID NO: 24；VH-CDR3：SEQ ID NO: 25；VL-CDR1：SEQ ID NO: 28；VL-CDR2：SEQ ID NO: 29；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 30からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID NO: 23；VH-CDR2：SEQ ID NO: 24；VH-CDR3：SEQ ID NO: 25；VL-CDR1：SEQ ID NO: 28；VL-CDR2：SEQ ID NO: 29；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 30からなる群のすべてのCDRを含む。
【００９１】
いくつかのの態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID N0：22のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体はmAb 22.1と表されるモノクローナル抗体である。mAb 22.1と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は結合に関してmAb 22.1として表される抗体と競合する抗体である。いくつかの態様において、mAb 22.1と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はヒト化される。
【００９２】
一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 33；VH-CDR2：SEQ ID N0: 34；VH-CDR3：SEQ ID N0: 35；VL-CDR1：SEQ ID NO: 38；VL-CDR2：SEQ ID NO: 39；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 40からなる群より選択されるCDRの少なくとも一つを含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体は、VH-CDR1：SEQ ID N0: 33；VH-CDR2：SEQ ID N0: 34；VH-CDR3：SEQ ID N0: 35；VL-CDR1：SEQ ID NO: 38；VL-CDR2：SEQ ID NO: 39；およびVL-CDR3：SEQ ID NO: 40からなる群のすべてのCDRを含む。
【００９３】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。もう一つの態様において、抗プロペルジン抗体はmAb 30と表されるモノクローナル抗体である。mAb 30と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は結合に関してmAb 30として表される抗体と競合する抗体である。いくつかの態様において、mAb 30と表されるモノクローナル抗プロペルジン抗体はヒト化される。
【００９４】
その他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含むヒト化された重鎖を含む。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むヒト化された重鎖を含む。さらにその他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含むヒト化された軽鎖を含む。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒト化抗体を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒト化抗体を含む。さらなる態様において、抗プロペルジン抗体は結合に関して本明細書に記載されるヒト化抗体と競合する抗体である。
【００９５】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含むヒト化された重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含むヒト化された軽鎖を含む。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒト化抗体を含む。さらなる態様において、抗プロペルジン抗体は結合に関して本明細書に記載されるヒト化抗体と競合する抗体である。
【００９６】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むヒトIgG4定常領域のようなヒト重鎖定常領域を含むキメラ重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むヒトκ軽鎖定常領域のようなヒト軽鎖定常領域を含むキメラ軽鎖を含む。一部の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖ならびにSEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むキメラ軽鎖を含む。
【００９７】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 12のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むヒトIgG4定常領域のようなヒト重鎖定常領域を含むキメラ重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むヒトκ軽鎖定常領域のようなヒト軽鎖定常領域を含むキメラ軽鎖を含む。一部の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖、ならびにSEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むキメラ軽鎖を含む。
【００９８】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 22のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むヒトIgG4定常領域のようなヒト重鎖定常領域を含むキメラ重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むヒトκ軽鎖定常領域のようなヒト軽鎖定常領域を含むキメラ軽鎖を含む。一部の態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 22およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖ならびにSEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むキメラ軽鎖を含む。
【００９９】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むヒトIgG4定常領域のようなヒト重鎖定常領域を含むキメラ重鎖を含む。その他の態様において、抗プロペルジン抗体は、SEQ ID NO: 37のアミノ酸配列、および非限定的な例としてSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むヒトκ軽鎖定常領域のようなヒト軽鎖定常領域を含むキメラ軽鎖を含む。一部の態様において、抗プロペルジン抗体はSEQ ID NO: 32およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖ならびにSEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を含むキメラ軽鎖を含む。
【０１００】
スクリーニングアッセイ
本発明は、抗プロペルジン抗体候補がAPを阻害できるかどうかを決定する工程を内包する、様々なスクリーニングアッセイにおける応用を持つ。
【０１０１】
いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体候補の存在下でのAP活性の量は陽性比較物質対照に検出されるAP活性と比較される。陽性比較物質対照は、加えられる試験化合物の不在下においてAP活性化を含む。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体候補は、抗プロペルジン抗体候補の存在下でのAP活性が陽性比較物質対照において検出されるAP活性の約70％よりも低い場合、APの阻害剤として同定される；これは、試験化合物の存在下でのAP活性の約30％よりも高い阻害に対応する。その他の態様において、抗プロペルジン抗体候補は、該抗プロペルジン抗体候補の存在下におけるAP活性が陽性比較物質対照において検出されるAP活性の約80％よりも低い場合、APの阻害剤として同定される；これは、試験化合物の存在下でのAP活性の約20％よりも高い阻害に対応する。さらにその他の態様において、抗プロペルジン抗体候補は、該抗プロペルジン抗体候補の存在下におけるAP活性が陽性比較物質対照において検出されるAP活性の約90％よりも低い場合、APの阻害物質として同定される；これは、試験化合物の存在下でのAP活性の約10％よりも高い阻害に対応する。いくつかの態様において、抗プロペルジン抗体候補によるAP阻害の量を、陰性比較物質対照において検出される阻害の量と比較する。
【０１０２】
競合的および非競合的免疫アッセイの様式、抗原捕捉アッセイ、二抗体サンドウィッチアッセイ、および三抗体サンドウィッチアッセイを内包する様々な免疫アッセイの様式が本発明の有用な方法である（Self et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65）。アッセイがAPの阻害を検出できるのであれば、本発明は公知またはこれまで未知であるアッセイの任意の一つのタイプに限定されると解釈されるべきでない。
【０１０３】
溶血アッセイは本発明の方法に内包される。様々な態様において、赤血球（RBC）は正常（健常）な個体から、または例えばPNHのような疾患または障害の徴候または症状を呈している個体から入手される。様々な態様において、RBCは、fHの補体調節タンパク質（CCP）リピート19および20（fH 19-20、5〜50μM）を含む組換え型fHフラグメントならびに抗DAF中和抗体（3〜20μg/ml）の存在下にて5％ないし75％の正常ヒト血清（NHS）で溶解される。いくつかの態様において、PNHのような疾患または障害の徴候または症状を呈している個体からのRBCは酸性化された血清で溶解される。いくつかの態様において、溶血アッセイはAPの補体活性化のみを可能とするためにGVB++-Mg++-EGTA緩衝液中で実施されるが、当業者は緩衝液がAP補体活性化のみを可能とするのであれば、その他の適切な緩衝液が使用可能であることを理解する。一つの態様において、溶解の程度は、溶液中へのヘモグロビン放出の指標として、インキュベート混合液の上清のOD410を測定することによって算出される。様々な態様において、少なくとも一つの抗プロペルジン抗体が約1μg/mlから約50μg/mlの濃度で加えられて、血清と共にプレインキュベートされ、RBCの溶血阻害の規模が測定される。
【０１０４】
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）は本発明の方法において有用である。限定されるものではないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはウレアーゼのような酵素は、例えば、本発明の方法での使用において、抗C3抗体または二次抗体に連結することができる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば、過酸化水素の存在下において450nmにおいて検出可能な可溶性産物を生じる発色性基質であるテトラメチルゼンジジン（TMB）と共に用いてもよい。その他の簡便な酵素結合系は、例えば、405nmにおいて容易に検出可能な可溶性産物を生じる発色性基質であるp-ニトロフェニルホスフェートと共に用いることができるアルカリホスファターゼ検出系を内包する。同様に、β-ガラクトシダーゼ検出系は、410nmにて検出可能な可溶性産物を生じる発色性基質であるo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）と共に用いられ得る。または、ウレアーゼ検出系はウレア-ブロモクレゾール紫（Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO）のような基質と共に用いられ得る。有用な酵素結合の一次および二次抗体は多くの任意の市販元から入手することができる。
【０１０５】
APの阻害の検出には化学発光の検出も有用である。化学発光性の二次抗体は多くの任意の市販元から入手することができる。
【０１０６】
APの阻害の検出には蛍光検出も有用である。有用な蛍光色素には、DAPI、フルオレセイン、Hoechst 33258、R-フィコシアニン、B-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミン蛍光またはローダミン標識抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
放射免疫アッセイ（RIA）も本発明の方法において有用である。このようなアッセイは当技術分野では周知であり、例えば、Brophy et al.（1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903）およびGuechot et al.（1996, Clin. Chem. 42:558-563）に記載されている。放射免疫アッセイは、例えば、ヨウ素125で標識された一次または二次抗体を用いて実施される（Harlow et al.、前記、1999）。
【０１０８】
検出可能な抗体から放出されたシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出するための分光光度計；ヨウ素125の検出にはγ線計数器のような、放射線を検出するための放射線計数管；または特定の波長の光の存在下において蛍光を検出するための蛍光光度計を用いて分析される。酵素結合アッセイが用いられる場合、定量的な分析は分光光度計を用いて実施される。本発明のアッセイは手作業で実施することができて、または、所望ならば、自動化することができて、市販の多くの系では複数の試料から放出されるシグナルを同時に検出できることが理解される。
【０１０９】
本発明の方法は、所望ならば自動化することができるキャピラリー電気泳動をベースとする免疫アッセイ（CEIA）の使用も包含する。免疫アッセイは、例えば、Schmalzing et al.（1997, Electrophoresis 18:2184-2193）およびBao（1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-480）に記載されるようなレーザー励起蛍光と併用して用いてもよい。フローインジェクションリポソーム免疫アッセイおよびリポソーム免疫センサーのようなリポソーム免疫アッセイも本発明の方法に従って用いられ得る（Rongen et al., 1997, J. Immunol. Methods 204:105-133）。
【０１１０】
定量的ウェスタンブロット法も、本発明の方法においてAP阻害の量を決定するために用いられ得る。ウェスタンブロットは、スキャニングデンシトメトリー（Parra et al., 1998, J. Vasc. Surg. 28: 669-675）のような周知の方法を用いて定量される。
【０１１１】
投与の方法
本発明の方法は、少なくとも一つの抗プロペルジン抗体の治療上有効量をＡＰ介在性の病態を有すると指摘された個体に投与する工程を含む。好ましい態様において、個体はAP系を有する哺乳動物である。より好ましい態様において、個体はヒトである。
【０１１２】
本発明の方法は本明細書に記載される抗プロペルジン抗体の任意の少なくとも一つの投与を含むことができるが、本発明は決して本明細書に記載される抗プロペルジン抗体に限定されると解釈されるべきでなく、寧ろ、AP活性化を減弱および低下させる公知および未知の双方の任意の抗プロペルジン抗体を包含すると解釈されるべきである。
【０１１３】
本発明の方法は、少なくとも一つの抗プロペルジン抗体の治療上有効量を個体に投与する工程であって、抗プロペルジン抗体またはその組み合わせを含む本発明の組成物が単独またはその他の治療用物質と組み合わせて用いられる工程を含む。本発明は、例えば、抗炎症療法などのようなその他の治療様式と組み合わせて用いることができる。本発明の方法と組み合わせて用いることができる抗炎症療法の例には、例えば、ステロイド系の薬剤を用いる療法、および非ステロイド系の薬剤を用いる療法が内包される。
【０１１４】
薬学的組成物および治療法
本発明の治療の方法における抗プロペルジン抗体の投与は当技術分野で公知の方法を用いて多くの異なる方法で達成することができる。従って、本発明の治療および予防の方法は抗プロペルジン抗体を含む薬学的組成物の使用を包含する。本発明の実践において有用な薬学的組成物は1ng/kg/日から100mg/kg/日の間の用量を送達するように投与され得る。一つの態様において、本発明は、個体において本発明の抗プロペルジン抗体の1μMから10μMの間の濃度に至る用量の投与を想定する。もう一つの態様において、本発明は、個体の血漿において本発明の抗プロペルジン抗体の1μMから10μMの間の濃度に至る用量の投与を想定する。
【０１１５】
典型的には、本発明の方法において動物、好ましくはヒトに投与され得る投与量は動物の体重のkg当たり0.5μgから約50mgの量の範囲である。一方、投与される正確な投与量は、治療される動物のタイプおよび疾患状態のタイプ、動物の齢期、ならびに投与経路を非限定的に内包する任意の多くの要因に依存して変化する。好ましくは、化合物の投与量は動物の体重のkg当たり約1μgから約10mgまで変化する。より好ましくは、投与量は動物の体重のkg当たり約3μgから約1mgまで変化する。
【０１１６】
化合物は動物に対して1日に複数回の頻度で投与され得て、またはそれは1日1回、週1回、2週毎に1回、月1回のような低い頻度で、または複数カ月に1回もしくは1年に1回もしくはより低いようなさらに低い頻度で投与され得る。用量の頻度は当業者には容易に明らかであり、限定されるものではないが、治療される疾患のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび齢期のような任意の多くの要因に依存する。本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、活性成分を担体または一つもしくは複数のその他の副成分に結合させて、続いて必要または所望ならば、製品を所望の1回または複数回投与の単位に整形または包装する工程を内包する。
【０１１７】
本明細書において提供される薬学的組成物に関する記載は主としてヒトへの倫理的な投与に適切である薬学的組成物に方向付けられるが、当業者はこのような組成物は一般にすべての種類の動物への投与に適切であることを理解する。組成物を様々な動物への投与に適切とするためのヒトへの投与に適切な薬学的組成物の修飾は十分に理解されていて、通常の熟練した獣医薬理学者は、もしあれば、単なる通常の実験でこのような修飾をデザインおよび実施することができる。本発明の薬学的組成物の投与が意図される個体は、ヒトおよびその他の霊長類、ヒト以外の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連する哺乳動物を内包する哺乳動物を内包するが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、眼への投与、経口投与、直腸投与、経膣投与、非経口投与、局所適用、肺への投与、鼻腔内投与、口腔内投与、および投与経路に適切な製剤として調製、包装または販売することができる。その他の意図される製剤には、射出ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再シール赤血球、および免疫学をベースとする製剤が内包される。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物は単回単位用量として、または多くの単回単位用量として調製、包装または販売され得る。単回用量は、活性成分の予め決定された量を含む薬学的組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、個体に投与される活性成分の投与量、または例えばこのような投与量の1/2もしくは1/3のようなこのような投与量の簡便な分画に等しい。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物における活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加の成分の相対的な量は、治療される個体の同定、サイズおよび状態に依存して、さらには前記組成物が投与される経路に依存して変化する。例として、前記組成物は0.1％から100％（w/w）の活性成分を含み得る。
【０１２１】
活性成分に加えて、本発明の薬学的組成物は一つまたは複数の追加の薬学的な活性物質をさらに含み得る。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物の徐放性または持効性製剤は従来の手法を用いて作製してよい。
【０１２３】
薬学的組成物の非経口投与は、個体の組織の物理的突破および組織における突破口からの薬学的組成物の投与を特徴とする任意の投与経路を内包する。従って、非経口投与には、組成物の注入、外科的切開を介しての組成物の適用、組織を穿孔する非外科的な創傷を介しての組成物の適用などによる薬学的組成物の投与が内包されるが、これらに限定されるものではない。特に、非経口投与は、静脈内、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入および腫瘍内を内包することを意図するが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
非経口投与に適切な薬学的組成物の製剤は、無菌の水または無菌の等張生理食塩液のような薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。このような製剤は、瞬時投与または連続投与に適切な剤形で調製、包装または販売され得る。注入可能な製剤は、アンプル入りのような単位投与量剤形で、または保存料を含有する複数回用量の容器にて調製、包装または販売され得る。非経口投与のための製剤には、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中の乳濁液、および移植可能な持効性または生分解可能な製剤が内包されるが、これらに限定されるものではない。このような製剤は、懸濁物質、安定化物質または分散物質を非限定的に内包する一つまたは複数の追加の成分をさらに含んでもよい。非経口投与のための製剤の一つの態様において、活性成分は、再溶解された組成物の非経口投与前に適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質非含有の水）を用いた再溶解のための乾燥（即ち、粉末または顆粒状の）剤形として提供される。
【０１２５】
薬学的組成物は、無菌の注入可能な水性または油性の懸濁液または溶液の剤形で調製、包装または販売され得る。この懸濁液または溶液は公知の技術に従って調製してよく、活性成分に加えて、本明細書に記載される分散物質、湿潤物質または懸濁物質のような追加の成分を含んでよい。このような無菌の注入可能な製剤は、例えば、水または1,3-ブタンジオールのような無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒を用いて調製することができる。その他の許容可能な希釈剤および溶媒には、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノ-またはジ-グリセリドのような不揮発性油が内包されるが、これらに限定されるものではない。有用であるその他の親らしく投与可能な製剤は、活性成分を微晶性の剤形として、リポソーム調製物として、または生分解可能なポリマー系の構成成分として含む製剤を内包する。持効性放出または移植のための組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩のような薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性の材料を含んでもよい。
【０１２６】
本発明の薬学的組成物は、口腔前庭からの肺への投与に適切な製剤として、調製、包装または販売され得る。このような製剤は、活性成分を含み、約0.5から約0.7ナノメートル、好ましくは約1から約6ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、便宜上、粉末を分散させるために噴霧剤の流れが方向付けられ得る乾燥粉末の貯留容器を含む装置を用いた、または目盛り付き容器内に低温沸騰噴霧剤中に溶解または懸濁された活性成分を含む装置のような自己噴霧式の溶媒／粉末分散容器を用いた投与のための乾燥粉末の剤形である。好ましくは、このような粉末は、重量に基づいて粒子の少なくとも98％が0.5ナノメートルよりも大きな直径を有して、また、数に基づいて粒子の少なくとも95％が7ナノメートルよりも小さな直径を有する粒子を含む。より好ましくは、重量に基づいて粒子の少なくとも95％が1ナノメートルよりも大きな直径を有して、また、数に基づいて粒子の少なくとも90％が6ナノメートルよりも小さな直径を有する。乾燥粉末の組成物は、好ましくは糖のような固体の微粉末の希釈剤を内包して、単位用量の剤形で簡便に提供される。
【０１２７】
低温沸騰噴霧剤は、一般に、大気圧において65OFを下回る沸点を有する液体噴霧剤を内包する。一般に、噴霧剤は組成物の50〜99.9％（w/w）を構成し得て、活性成分は組成物の0.1〜20％（w/w）を構成し得る。噴霧剤は、液体の非イオン性または固体の陰イオン性の界面活性剤または固体希釈剤（好ましくは活性成分を含む粒子と同じ程度の粒子サイズを有する）のような追加の成分をさらに含んでもよい。
【０１２８】
肺への送達のために調製される本発明の薬学的組成物は、活性成分を溶液または懸濁液の液滴の剤形でも提供し得る。このような製剤は、活性成分を含む任意で無菌の水性または希アルコール性の溶液または懸濁液として調製、包装または販売され得て、任意の噴霧または微粒化装置を用いて簡便に投与され得る。このような製剤は、サッカリンナトリウムのような香料物質、揮発油、緩衝物質、表面活性物質、またはメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含むがこれらに限定されない一つまたは複数の追加の成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、好ましくは、約0.1から約200ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【０１２９】
本明細書において肺への送達に有用であると記載される製剤は、本発明の薬学的組成物の鼻腔内への送達にも有用である。
【０１３０】
鼻腔内投与に適切なもう一つの製剤は、活性成分を含んで、約0.2から500マイクロメーターの平均粒子を有する粗大な粉末である。このような製剤は、鼻で吸われる方法で、即ち、外鼻孔の近くに保持された粉末の容器から鼻道を介しての急速な吸入によって投与される。
【０１３１】
経鼻投与に適切な製剤は、例えば、約0.1％（w/w）ほどの少なさから100％（w/w）の多さの活性成分を含み得て、本明細書に記載される追加の成分の一つまたは複数をさらに含んでもよい。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物は口腔内投与に適切な製剤として調製、包装または販売され得る。このような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作られた錠剤またはロゼンジの剤形であり得て、例えば、0.1〜20％（w/w）の活性成分、経口的に溶解可能または崩壊可能な組成物を含む差し引き分、および任意で本明細書に記載される追加の成分の一つまたは複数であり得る。または、口腔内投与に適切な製剤は、活性成分を含む粉末またはエアロゾル化もしくは微粒化された溶液もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化またはエアロゾル化された製剤は、散布された際に、好ましくは約0.1から約200ナノメートルの範囲の平均粒子または液滴サイズを有して、本明細書に記載される追加の成分の一つまたは複数をさらに含み得る。
【０１３３】
本明細書で用いられる通り、「追加の成分」には次の一つまたは複数が含まれるが、これらに限定されるものではない：賦形剤；表面活性物質；分散剤；不活性な希釈剤；顆粒化および崩壊物質；結合物質；潤滑物質；甘味物質；香料物質；着色物質；保存料；ゼラチンのような物理的に崩壊可能な組成物；水性のビヒクルおよび溶媒；油性のビヒクルおよび溶媒；懸濁物質；分散または湿潤物質；乳化物質、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘物質；充填剤；乳化物質；抗酸化剤；抗生剤；抗真菌物質；安定化物質；および薬学的に許容されるポリマー性または疎水性の材料。本発明の薬学的組成物に内包され得るその他の「追加の成分」は当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences（1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA）に記載されている。
【０１３４】
ヒトプロペルジンマウス
本発明は、ヒトプロペルジンを発現してマウスプロペルジンを発現しないトランスジェニックマウスをさらに内包する。トランスジェニックマウスを作出するために、ヒトプロペルジンタンパク質をコードする核酸を、宿主細胞内でのヒトプロペルジンタンパク質の発現に適切な形で組換え型発現ベクターに組み入れることができる。「宿主細胞内での融合タンパク質の発現に適切な形で」という用語は、組換え型発現ベクターが核酸のmRNAへの転写およびmRNAのヒトプロペルジンタンパク質への翻訳を可能とする方法でヒトプロペルジンタンパク質をコードする核酸に機能的に結合される一つまたは複数の制御配列を内包することを意味することを意図する。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を内包することが当技術分野で認識されていて、意図されている。このような制御配列は当業者に公知であり、1990, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.において記載されている。発現ベクターのデザインは形質移入される宿主細胞の選択および／または発現されるヒトプロペルジンタンパク質の量のような要因に依存し得ることが理解されるべきである。
【０１３５】
トランスジェニックマウスは、例えば、ヒトプロペルジンタンパク質をコードする核酸（典型的には、構成的または組織特異的エンハンサーのような適切な調節エレメントに結合した）を例えば微量注入によって卵母細胞に導入して、卵母細胞が雌の仮親マウス内で発育することを可能とすることによって作出することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の発現の効率を高めるために導入遺伝子にさらに内包されることができる。トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作るための方法は当技術分野において簡便になってきていて、例えば、米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、ならびに1986, Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている。導入遺伝子を持つさらなる動物を繁殖するためにトランスジェニックファウンダーマウスを使用することができる。本発明のプロペルジンタンパク質をコードする導入遺伝子を持つトランスジェニックマウスは、その他の導入遺伝子を持つその他のトランスジェニックマウスと、または、例えば、米国特許出願第2010/0263061号に記載されるようなマウスプロペルジン遺伝子を発現しないノックアウトマウスなどの、その他のノックアウトマウスとさらに交配することができる。本明細書に記載される系は、トランスジェニックマウスに加えてその他のヒトプロペルジン発現動物を作るために使用することができることが理解される。
【０１３６】
一つの態様において、本発明のトランスジェニックマウスはCVM-IEエンハンサーを伴うニワトリβ-アクチンプロモーターからヒトプロペルジンを発現するが、当業者は本発明のトランスジェニックマウスがその他のプロモーターおよびエンハンサーからヒトプロペルジンの発現を包含することを理解する。本発明において有用なプロモーターの例にはDNA pol IIプロモーター、PGKプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、グロビンプロモーター、オボアルブミンプロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、レトロウイルスLTRおよびレンチウイルスLTRが内包されるが、これらに限定されるものではない。本発明において有用なプロモーターおよびエンハンサー発現系は誘導可能および／または組織特異的な発現の系も内包する。
【０１３７】
いくつかの態様において、マウスゲノムに挿入されたヒトプロペルジンはSEQ ID NO: 67の核酸配列およびSEQ ID NO: 54のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
キット
本発明は、本発明の抗プロペルジン抗体またはその組み合わせ、および例えば、抗プロペルジン抗体またはその組み合わせを治療的投与としてまたは本明細書の他のところに記載されているような投与以外の使用として個体に投与する工程を記載する説明用材料を含むキットをさらに内包する。一つの態様において、このキットは、例えば、個体への抗体の投与に先立って、本発明の抗プロペルジン抗体またはその組み合わせを含む治療的組成物を溶解または懸濁するために適切な（好ましくは無菌の）薬学的に許容される担体をさらに含む。任意で、該キットは該抗体を投与するためのアプリケーターを含む。
【実施例】
【０１３９】
ここでは本発明を以下の実施例に関連して記載する。これらの実施例は専ら例証の目的のために提供されるものであり、決して本発明がこれらの実施例に制限されると解釈されるべきではなく、寧ろ、本明細書に提供される内容の結果として明らかとなる任意かつすべての変更を包含すると解釈されるべきである。
【０１４０】
さらなる記載を伴うことなく、当業者は前記の記載および後記の例証的な実施例を用いて、本発明の化合物を作成および利用して、特許請求の範囲に記載される方法を実践することができると信じられる。従って、以下の実用的な実施例は本発明の好ましい態様を特に指摘するものであり、いかなる点においても残りの開示を制限するとして解釈されるべきではない。
【０１４１】
実施例1
抗ヒトプロペルジンモノクローナル抗体はKohler et al.（1975, Nature, 256:495）によって最初に記載されていくつかの修正が加えられたハイブリドーマ法を用いて作成された。プロペルジンノックアウトマウス（fP-/-）（8週齢）は、Titermaxアジュバント100μl（Sigmaより）で乳化したヒトプロペルジン（Comp Tech Inc）50μg（100μl PBS中）を用いて腹腔内にて免疫した。14日および21日目にマウスを再び、Titermaxアジュバントで乳化した精製ヒトプロペルジン50μgで免疫した。1週間後、マウスの血清中抗プロペルジン力価を調べた。1：10,000またはそれよりも高い抗体価を持つマウスをハイブリドーマ融合実験に使用した。融合実験の2日前にマウスに精製ヒトプロペルジン50μg（100μl PBS中）を再度注入した（i.p.）。機械的破壊による単一細胞懸濁液の調製のために、マウスを頸椎脱臼により屠殺して脾臓を単離した。脾臓細胞懸濁液をHYB-SFM（Invitrogen）＋10％FBS培地で1回洗浄処理して、細胞をカウントし、X63-Ag8.653骨髄細胞（ATCC）と2：1の割合で混合した。細胞混合物を再度HYB-SFM培地で洗浄処理して、遠心分離（1000rpm、5分）により細胞沈渣を調製した。細胞沈渣を静かに振盪して緩ませた後、ポリエチレングリコール（PEG 1500）（3x108個の細胞に対して1.5ml PEG）をゆっくりと加えることによって細胞融合を誘発した。細胞を37℃で1分間放置した後、HYB-SFM培地 20mlを3分かけて細胞に加えた（最初の1分に1ml、次の1分に3ml、三番目の1分に16ml）。混合物を1000rpmで5分間、遠心分離して、細胞を24穴プレートにおいてHAT培地（HYB-SFM培地 500ml中、HAT［Sigma H0262］10ml、Pen/Strep 5ml、ゲンタマイシン 500μl、および10％FBS）に接種した。2週間後、視認可能なコロニーを伴うウェルの上清を、ELISAによる精製ヒトプロペルジンとの反応性のスクリーニングのために回収した。陽性のクローンを採取して、ELISAによる2回目のスクリーニング後に単一のクローンを得るために限界希釈法により96穴プレートに接種した。陽性コロニーをHT培地（HYB-SFM培地500ml中、HT 10ml、Pen/Strep 5ml、ゲンタマイシン 500μlおよび10％FBS）中で増殖させた。抗体の採取前にハイブリドーマ細胞を2〜3日間、血清無添加の培地（HYB-SFM）に移した。Gタンパク質アフィニティクロマトグラフィーによるmAb精製のために細胞培養培地を回収した。
【０１４２】
抗プロペルジンmAbのcDNAをクローニングするために、TRizol試薬（Sigma）によりハイブリドーマ細胞から全RNAを分離した。最初の鎖のcDNAはOligo（dT）プライマーを用いて逆転写により合成した。重鎖cDNA（IgG1、IgG2a/b）を増幅するために、PCR反応において次のプライマーを使用した：
2014522845.tif 000008
。κ軽鎖を増幅するためには次のプライマーを用いた：4つの上流プライマーの混合物：
2014522845.tif 000009
。PCR単位複製配列をpCR TOPO TA 2.1ベクター（Invitrogen）にクローニングして配列決定した。mAbのシグナルペプチド（リーダー）配列を得るために、5'-RACE法をInvitrogenからのキット（GeneRacer）と共に用いた。5'-RACEおよび最初のシーケンシングデータから決定された特異的プライマーを用いて、完全な可変性領域cDNAを増幅した。
【０１４３】
実施例2
mAb 19.1、22.1、25および30によるLPS誘発性AP補体活性化の用量依存性の阻害について調べた。mAbの4つのすべてのクローンが、50％正常ヒト血清（NHS）に5μg/mlの最終濃度で加えられた際にAP補体活性化を効率的に阻害した（図2参照）。ELISAのプレート（96穴、Nunc）を50μl LPS溶液（リン酸緩衝生理食塩液［PBS］中40μg/ml）を用いて4℃で一晩、コーティングした。翌日、0.05％ Tween-20を含有するPBS（PBS-T）で3回洗浄処理して、1〜5μg/ml抗プロペルジンmAbと共に4℃で1時間インキュベートしておいた50％正常ヒト血清（NHS）の50μlを加えた。NHSはGVB-EGTA-Mg++（10mM EGTAおよび2.5mM Mg++の最終濃度を含有）で希釈した。プレートを37℃で1時間インキュベートするために残して、PBS-Tで3回洗浄処理した後、HRP抱合ヤギ抗ヒトC3抗体（1：4000、Cappel）50μlを加えて、プレートを室温に1時間、置いた。プレートをPBS-Tで3回洗浄処理して、BD Pharmingen A+B試薬を用いて発現させた。反応は5分後に2N H2SO4を用いて停止させた。AP補体活性化は、プレートのC3析出の量（OD450）を測定することによって検出した。EDTAを加えた試料（NHSEDTA）を陰性対照として使用した（EDTAは補体活性化を遮断する）。mAbを加えていない（0Ab）の試料はAP補体活性化ベースラインとして使用した。
【０１４４】
実施例3
抗ヒトプロペルジン抗体mAbがfHおよびDAF機能障害によって引き起こされるヒト赤血球（RBC）の溶解を阻害することを実証する実験が実施された（図3参照）。正常なヒトRBC（5x106個 細胞）を、30μM組換え型fH 19-20および7.5μgマウス抗ヒトDAF（AbD Serotecより）の存在下で50％NHS（10mM EGTAおよび2.5mM Mg++の最終濃度を含有するGVB-EGTA-Mg++で希釈）100μlを用いて37Cで20分間、インキュベートした（2006, Ferreira et al., J Immunol. 177:6308-6316）。溶解反応は、PBS中20mM 氷冷EDTAの200μlを添加して停止させた。インキュベート混合物を1500gで5分間、遠心分離して、上清を回収してOD420nmを測定した。RBCの添加前に、NHSを0または5μg/mlの抗プロペルジン抗体と共に4Cで1時間、プレインキュベートした。NHSまたはfH19-20を添加していない試料またはEDTAを添加した試料を陰性溶解対照として用いて、蒸留水100μlを用いて完全に溶解したRBCの試料を、それに対してその他の試料の溶解％を正規化する陽性対照（100％溶解）として用いた。
【０１４５】
実施例4
5μg/mlの抗プロペルジンmAbの不在下または存在下において50％正常ヒト血清（NHS）と共にインキュベートした、抗体に感作させたヒツジRBCを調べる実験（図4参照）。抗体に感作させたヒツジRBC（5x106個 細胞、CompTech Incより）を50％NHS（GVB++緩衝液で希釈）100μlと共に37℃で20分間、インキュベートした。ヒツジRBCへの添加前に、NHSは0または5μg/ml抗プロペルジン抗体と共に4Cで1時間、プレインキュベートした。溶解反応は、PBS中20mM氷冷EDTAの200μlを加えることによって停止させた。インキュベート混合物を1500gで5分間、遠心分離して、上清を回収し、OD420nmにおいて測定した。NHSを加えていない試料またはEDTAを加えた試料を陰性溶解対照として用いて、蒸留水 100μlで完全に溶解したヒツジRBCの試料を、それに対してその他の試料における溶解％を正規化する陰性対照（100％溶解）として用いた。
【０１４６】
実施例5
ヒトプロペルジンの欠失変異型の産生およびそれらのCHO細胞での発現についてのウェスタンブロットによる確認（図5参照）。ヒトプロペルジン（fP）は0〜6と番号付けされる7つのトロンボスポンジンリピート（TSR）ドメインから構成される。0〜5の個々のTSRドメイン（SEQ ID NO: 55、56、57、58、59および60を参照）は、pCMVベクター（Origeneから）における完全長ヒトプロペルジンcDNA（SEQ ID NO: 67）を鋳型として用いて逆PCR（1989, Hemsley et al., Nucleic Acid.5 Res. 17:6545）により欠失させた。TSR 6（SEQ ID NO: 61）またはTSR 5〜6を欠失させるためには、通常のPCR法を用いて、続いて、発現ベクター（pCAGGSベクターを用いた）内にクローニングした。Optimem培地中の6穴プレートのリポフェクタミン試薬（Invitrogen）を用いて、欠失変異型をCHO細胞に形質移入した。48時間後、細胞を、150mM NaCl、10％グリセロール、1mM EDTA、ならびにプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）および1％Triton X-100を含有する50mM Tris-HCL、ph 7.4（ウェル当たり250μl）で溶解した。溶解物を10,000rpmにて10分間遠心分離して、タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイ法により決定した。各試料から総タンパク質 約100μgをSDS-PAGE分析に使用した。
【０１４７】
実施例6
ヒトプロペルジン欠失変異型に結合するmAb 19.1および25のサンドウィッチELISAアッセイを、mAb 19.1および25のエピトープマッピングのために実施した。（図6参照）。ELISAプレートを、関心のあるmAb 2μg/mlの50μlで4℃にて一晩、コーティングした。プレートをPBS-Tで3回洗浄処理した後、CHO細胞溶解物タンパク質25μg（1％BSAを含有するPBS 50μl中）をウェルに加えて、該プレートを室温で1時間、インキュベートした。該プレートをPBS-Tで3回、洗浄処理して、捕捉されたタンパク質をビオチン化したヤギ抗ヒトプロペルジン抗体およびHRP-アビジン系により検出した。19.1および25とは異なるエピトープに結合する第三のmAb 29.3は、変異型タンパク質の発現を確認するための対照として用いた。
【０１４８】
実施例7
エピトープマッピングは、次のアミノ酸配列を持つTSR5のC末端側半分にマッピングされるmAb 19.1のエピトープを示した：
2014522845.tif 000010
（図7参照）。TSR0-4＋1/4 TSR5、TSR0-4＋1/2 TSR5またはTSR0-4＋3/4TSR5を含む3つのヒトプロペルジン変異型は従来のPCRによって産生された。それらは、実施例5において記載するように、pCAGGSにクローニングしてCHO細胞内で発現させた。タンパク質の発現はヤギ抗プロペルジン抗体を用いてウェスタン分析により確認した。C末端Hisタグが存在すること（C末端のタンパク質分解がないこと）を確認するために、マウス抗Hisタグ抗体（Qiagen）を用いてブロットをストリップおよびリプローブした。mAb 19.1との反応性を決定するためのサンドウィッチELISAアッセイは実施例6に記載する通りに実施した。19.1とは異なるエピトープに結合するmAb 29.3は変異型タンパク質の発現を確認するための対照として用いた。
【０１４９】
実施例8
エピトープマッピングは次のアミノ酸配列を持つTSR6のC末端側1/4のセグメントにマッピングされるmAb25のエピトープを示した：
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（図8参照）。TSR0-5＋1/4 TSR6、TSR0-5＋1/2 TSR6またはTSR0-5＋3/4 TSR6を含む3つのヒトプロペルジン変異型が従来のPCRによって産生された。それらは、実施例5において記載するように、pCAGGSにクローニングしてCHO細胞内で発現させた。タンパク質の発現はヤギ抗プロペルジン抗体を用いてウェスタン分析により確認した。C末端Hisタグが存在すること（C末端のタンパク質分解がないこと）を確認するために、マウス抗Hisタグ抗体（Qiagen）を用いてブロットをストリップおよびリプローブした。mAb 25との反応性を決定するためのサンドウィッチELISAアッセイは実施例6に記載する通りに実施した。25とは異なるエピトープに結合するmAb 19.1は変異型タンパク質の発現を確認するための対照として用いられた。エピトープのマッピングは、mAb 25のエピトープがTSR6の2つのシステイン残基に依存することも示した（SEQ ID NO: 61、図5Bに示す）。これらはTSR6のシステイン62（C62）およびシステイン78（C78）である。完全長ヒトプロペルジンのC62またはC78のいずれかのアラニン（A）への単独の変異がmAb 25の結合を無効にすることはないが、C62AおよびC78Aの二重の変異はmAb 25の結合を無効にした。変異型タンパク質発現のための陽性対照として、mAb 19.1はすべての試料に対して反応性を示した。この結果は、TSR6の最後の1/4セグメント内のC78（SEQ ID NO: 53によって表される配列を伴う）、ならびにSEQ ID NO: 53の外側ではあるがTSR6（SEQ ID NO: 61）内に位置するC62はmAb25のエピトープの2つの重要な残基を構成することを示唆する。mAb 19.1および25の結合アッセイは、形質移入されたCHO細胞のホモジネートを用いてELISAプレートにて実施された。HuPは、陽性対照である完全長（無傷）のヒトfPを形質移入したCHO細胞を指す；Conは結合の陰性対照である形質移入されていないCHO細胞を指す。その他の試料は、単独または二重のC62AおよびC78A突然変異を含有する変異型ヒトfP cDNAを形質移入されたCHO細胞である。
【０１５０】
実施例9
CHO細胞における組換え型キメラおよびヒト化19.1 mAbの発現を評価する実験が実施された（図17参照）。キメラの19.1重鎖cDNAは、EcoRI/NheI部位を用いて、mAb 19.1（SEQ ID NO: 1）の可変性領域をpFUSE-CHIg-hG4ベクター（InvivoGenより、セリン229がプロリンに変異したヒトIgG4重鎖定常領域を含有）にクローニングすることによって構築された。キメラ19.1軽鎖cDNAは、AgeI/BsiWI位置を用いてmAb 19.1の可変性領域（SEQ ID NO: 6）をpFUSE2-CLIg-hkベクター（InvivoGenより、ヒトκ軽鎖定常領域を含有）にクローニングすることによって構築された。ヒト化19.1重鎖cDNAは、EcoRI/NheI部位を用いて19.1のヒト化重鎖可変性領域（SEQ ID NO: 42およびSEQ ID NO: 44をコードするcDNA、Genescriptにより合成）をpFUSE-CHIg-hG4 ベクター（InvivoGenより、セリン229がプロリンに変異したヒトIgG4重鎖定常領域を含有）にクローニングすることによって構築された。ヒト化19.1軽鎖cDNAは、AgeI/BsiWI部位を用いて19.1のヒト化軽鎖可変性領域（SEQ ID NO: 47をコードするcDNA、Genescriptによって合成）をpFUSE2-CLIg-hkベクター（InvivoGenより、ヒトκ軽鎖定常領域を含有）にクローニングすることによって構築された。リポフェクタミン試薬を用いて、CHO細胞に19.1のキメラの重鎖および軽鎖または19.1のヒト化重鎖および軽鎖（2つのヒト化重鎖は同一ヒト化軽鎖と対合した）を同時に形質移入した。形質移入後、CHO細胞をジオシン（Geocine）（1mg/ml）およびブラストサイジン（10μg/ml）を用いて約7日間、選択した。薬剤耐性細胞コロニーを拾って、トリプシン処理して、同一の選択薬剤の存在下において96穴プレートを用いて限界希釈培養に供した。96穴プレートにおいて細胞を稠密とした後、ELISAにより培地をヒトプロペルジンとの反応性に関して試験して、陽性コロニーを増殖させた。抗体産生のため、形質移入されたCHO細胞の安定株を150cm培養フラスコにおいて10％FBSを伴うDMEM:F12培地で生育させて、稠密とした後、血清非含有のCD-CHO培地（Invitrogen）に移した。3日後、培地を回収して、mAbをGタンパク質クロマトグラフィーにより精製した。精製されたmAbの画分をSDS-PAGEにより分析した。
【０１５１】
実施例10
mAb 19.1、キメラmAb 19.1、ヒト化mAb 19.1、mAb 25、mAb 22.1およびmAb 30の抗原結合親和性を測定する実験が実施された（図18および19参照）。抗ヒトプロペルジンmAbの固定化ヒトプロペルジンに対する結合の結合および解離速度定数を測定するために、BIAcore 2000装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いて表面プラスモン共鳴分析を用いた。Biacoreの実験は25℃で実施した。200RU表面密度を得るために、CM4センサーチップのカルボキシル化デキストランマトリックスを、アミンカップリング化学により精製ヒトプロペルジンをカップリングするために使用した。mAbをHBSET（EDTAおよびTween 20を伴うHEPES緩衝生理食塩液）緩衝液中150、75、35.5、17.75、8.87および0nMに希釈して、試料をプロペルジン表面に30μl/分（60μl注入）で120秒間注入して、結合分解物の解離を900秒間、進行させた。データは、二価の結合モデルを仮定してBIA評価ソフトウェア3.2により分析した。表面の再生は50mM NaOHの50μl注入（50μl/分）で達成した。
【０１５２】
実施例11
LPS誘発性ヒトAP補体活性化の遮断における19.1、キメラ19.1および2つのヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価するための実験が実施された（図20参照）。ELISAのプレート（96穴、Nunc）をLPS溶液 50μl（PBS中40μg/ml、4℃で一晩）でコーティングした。翌日、プレートを0.05％PBS-Tを含有するPBSで3回洗浄処理して、0、5、10または20μg/ml抗プロペルジンmAbと共に4℃で1時間インキュベートしておいた50μlの50％NHSを加えた。NHSはGVB-EGTA-Mg++（10mM EGTAおよび2.5mM Mg++の最終濃度を含有）で希釈した。プレートを37℃で1時間インキュベートして、PBS-Tで3回、洗浄処理した後、HRP抱合ヤギ抗ヒトC3抗体（1：4000、Cappel）50μlを加えて、プレートを室温に1時間、置いた。プレートをPBS-Tで3回、洗浄処理した後、BD Pharmingen A+B試薬を用いて発現させた。反応は2N H2SO4を用いて5分後に停止させた。AP補体活性化はプレート上のC3析出の量（OD450）を測定することによって検出した。EDTAを加えた試料（NHSEDTA）を陰性対照とした（EDTAは補体活性化を遮断する）。mAbを加えていない試料（NHS）はAP補体活性化のベースラインとして用いた。
【０１５３】
実施例12
fHおよびDAF機能障害の状況下でのヒトAP補体によるヒトRBC溶解の遮断における19.1、キメラ19.1および2つのヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価するための実験が実施された（図21参照）。正常なヒトRBC（5x106個 細胞）を、30μM組換え型fH 19-20および7.5μgマウス抗ヒトDAF（ADB Serotecから）の存在下において50％NHS（10mM EGTAおよび2.5mM Mg++の最終濃度を含有するGVB-EGTA-Mg++で希釈）100μlと共に37℃で20分間、インキュベートした（2006, Ferrelra et al., J Immunol. 177:6308-6316）。RBCへの添加前に、NHSは1〜15μg/mlの様々な抗プロペルジンmAbと共に4℃で1時間、プレインキュベートした。溶解反応はPBS中20mM 氷冷EDTAの200μlの添加により停止させた。インキュベート混合物を1500gで5分間、遠心分離して、上清を回収してOD420nmを測定した。NHSもしくはfH19-20を添加していない試料、またはEDTAを添加した試料の陰性溶解対照として用いて、蒸留水 100μlで完全に溶解したRBCの試料は、それに対してその他の試料中の溶解％を正規化する陽性対照（100％溶解）として用いた。
【０１５４】
実施例13
LPS誘発性アカゲザルおよびカニクイザルAP補体活性化の遮断における19.1、キメラ19.1および2つのヒト化19.1 mAbの相対的な活性を評価するための実験が実施された（図22および23を参照）。ELISAのプレート（96穴、Nunc）を50μlのLPS溶液（PBS中40μg/ml、4℃で一晩）でコーティングした。翌日、プレートを0.05％ PBS-Tを含有するPBSで3回、洗浄処理して、0、10、20、30または40μg/mlの抗プロペルジンmAbと共に4℃で1時間プレインキュベートしておいた50％正常アカゲザル血清（NRS）または正常カニクイザル血清（NCS）の50μlを加えた。NRSまたはNCSはGVB-EGTA-Mg++（10mM EGTAおよび2.5mM Mg++の最終濃度を含有）で希釈した。プレートを37℃で1時間インキュベートして、PBS-Tで3回、洗浄処理した後、50μl HRP抱合ヤギ抗ヒトC3抗体（1：4000、Cappel、サルC3と交差反応）を加えて、プレートを室温に1時間、置いた。プレートをPBS-Tで3回、洗浄処理した後、BD Pharmingen A+B試薬を用いて発現させた。反応は2N H2SO4を用いて5分後に停止させた。AP補体活性化はプレート上のC3析出の量（OD450）を測定することによって検出した。EDTAを加えた試料（NRSEDTAまたはNCSEDTA）を陰性対照とした（EDTAは補体活性化を遮断する）。mAbを加えていない試料（NRSまたはNCS）はAP補体活性化のベースラインとした。
【０１５５】
実施例14
PNH赤血球の酸性化血清溶解（Ham試験）のmAb 19.1、25およびヒト化19.1-459による阻害を評価するための実験が実施された（図24参照）。発作性夜間血色素尿症（PNH）患者からのRBCをmAbの存在下または不在下においてHamの酸性化血清試験に供した。RBCを自己血清（最終濃度 83％）と共に37℃で2時間、インキュベートして、上清のOD405を測定することによって溶解パーセントを算出して、蒸留水により完全に溶解したRBCの試料に対して正規化した（Eh DDW）。インキュベート混合物は次から構成された：血清 240μl、1/6N HCL 25μl（または陰性対照としての生理食塩液 25μl）、50％（v/v）RBC懸濁液 12.5μl、生理食塩液中mAb 10μl。酸性化していない自己血清（NHS）と共にインキュベートしたRBCの試料を陰性対照として用いた（バックグラウンドの溶解）。mAbの不在下ではRBCの約50％が酸性化血清によって溶解された。この溶解は、8μg/mlおよびこれよりも高い濃度のmAb 19.1により、20μg/mlの濃度のヒト化19.1 mAb（#459）により、また8μg/mlおよびこれよりも高い濃度のmAb 25により完全に阻害された。
【０１５６】
実施例15
プロペルジンヒト化マウスは次の通り作出された（図25参照）。ヒトfP発現ベクターは、CVM-IEエンハンサーを伴うニワトリβ-アクチンプロモーターおよび真核細胞におけるcDNAの安定的発現のためにウサギβ-グロビンポリA尾部を用いて、図25Aの図解に例証する通り、pACGGSプラスミド内で構築された。発現ベクターの構築に用いられるヒトプロペルジンcDNA配列およびそのコードするタンパク質配列をSEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 68に示す。プラスミドを制限酵素による消化によって直線化して、ヒトfPトランスジェニックファウンダーマウスを作るために、C57BL/6マウスの接合子に微量注入した。（ヒトfP
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およびマウス尾部から単離されたゲノムDNAに特異的なプライマーを用いた）PCRスクリーニングによって、陽性ファウンダーマウス（約800bpのヒトfP cDNAフラグメントを示す）を特定することができる。分析した40匹のマウスの内、5匹（＃15、20、24、27および32）が陽性であった（図25B、赤色の矢印）。トランスジェニック陽性マウスにおけるヒトfPを検出するため、サンドウィッチELISAアッセイを実施した（図25C）。プレートをヒトfP（クローン8.1）に対するノンブロッキングmAbでコーティングした。希釈したマウス血清（10％）と共にインキュベートした後、HRP抱合ヤギ抗ヒトfP抗体を用いてヒトfPを検出した。正常ヒト血清（NHS）を陽性対照として用いた。この方法により、NHSおよび導入遺伝子陽性マウス（例えば、15、20、24、27、32）の血清ではヒトfPが検出されるが、正常（即ち、非トランスジェニック、例えば、29）マウスまたはfP-/-マウスの血清では検出されない。続いて、生殖系列の移行を確立するために、トランスジェニック陽性ファウンダーマウスをWTマウスと交配した。このような交配からのF1マウスのスクリーニングは、導入遺伝子を検出するための尾部DNAのPCRによって、および前記のようなそれらの血清中のヒトプロペルジンを検出するためのサンドウィッチELISAによって達成された。生殖系列移行の確認後、fP-/--ヒトfP導入遺伝子+マウスを作製するために、ファウンダーマウスをfP-/-マウスと交配した。fP-/--ヒトfP導入遺伝子+マウスにおけるAP補体活性の回復を、実施例2に記載する通り、LPS誘発性AP活性化アッセイによって評価した。このアッセイでは、AP補体活性は、WTマウス血清中およびヒトfP導入遺伝子陽性であるfP-/-マウスの血清中では検出されるが、fP-/-マウスの血清中では検出されない。このアッセイでは、EDTAで処理されたWTマウス血清がAP補体活性化における陰性対照として用いられる。
【０１５７】
実施例16
mAb 25の「プロペルジンヒト化」マウスにおけるインビボでの活性およびキネティクスについて調べるための実験を実施した（図26）。プロペルジンヒト化マウス（fP-/--ヒトfP導入遺伝子+）にmAb 25の0.5mg（i.p.）を注入した。血液試料（50〜75μl）を注入前（0時）およびその後、注入後の様々な時期に後眼窩からの採血によって採取して、血清を分離した。血清試料について、LPS誘発性AP補体活性化について試験した。このアッセイに備えて、ELISAのプレート（96穴、Nunc）をLPS溶液 50μl（PBS中40μg/ml、4℃で一晩）でコーティングした。翌日、プレートを0.05％ Tween-20を含有するPBS（PBS-T）で3回、洗浄処理して、各ウェルに階段希釈（1：10から開始）した50μlのマウス血清を加えた。マウス血清をGVB-EGTA-Mg++（10mM EGTAおよび2.5mM Mg++の最終濃度を含有）で希釈した。プレートを37℃で1時間インキュベートして、PBS-Tで3回、洗浄処理した後、HRP抱合ウサギ抗マウスC3抗体（1：2000、Cappel）50μlを加えて、プレートを室温に1時間、置いた。プレートをPBS-Tで3回、洗浄処理した後、BD Pharmingen A+B試薬を用いて発現させた。2N H2SO4を用いて5分後に反応を停止させた。AP補体活性化はプレート上のC3析出の量（OD450）を測定することによって検出した。例証されるこの実施例では、fP-/-マウス血清またはEDTAで処理したWT血清にAP補体活性は存在しなかった。これに対して、WT血清およびfPヒト化マウスの血清では0時（mAb 25投与前）の時点でAP補体活性が検出された。ヒト化マウスにおけるAP補体活性はmAb 25投与後8、24および48時間に抑制されたままであったが、72、96および120時間の時点では検出となった。これらの結果は、0.5mg/マウスの投与量において、mAb 25はインビボにおいてAP補体活性を少なくとも48時間阻害できたことを実証する。
【０１５８】
実施例17
抗ヒトプロペルジンmAb 19.1の血管外溶血（EVH）に対する影響について評価するための実験を実施した。このEVHモデルでは、プロペルジンヒト化マウス（実験群当たりn＝4）にCrry/DAF/C3トリプルノックアウト（TKO）マウスの赤血球（RBC）を輸血した。レシピエントマウス（プロペルジンヒト化マウス）はRBC輸血6時間前にmAb 19.1（2mg/マウス、i.p.）を投与して、または対照マウスはIgG1 mAb（MOPC、MoPC 31Cハイブリドーマから精製、ACTTから）を投与した。RBCは、既報の手順（Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716）に従って、ドナーTKOマウスから採取して、PBS中で洗浄処理し、レシピエントマウスへの注入（尾静脈を介して）前にCFSEで標識した。各レシピエントマウスに血液 100μlに相当するRBCを輸血した。RBC輸血後5分、および6、24、48、72、96、120時間の時点で、レシピエントマウスから採血して、循環中に残っているCFSE標識された（即ち、輸血された）RBCの数を決定するためにRBCを分析した。各レシピエントにおけるCFSE標識されたRBCの数を5分の時点で検出された数に対して（％として）正規化した。対照のIgG（MOPC）投与されたレシピエントマウスでは、TKO RBCは、先行の所見（Miwa et al., 2002, Biood 99: 3707-3716）に一致して、EVHを介して速やかに排出された。しかし、抗ヒトプロペルジン19.1 mAbを投与されたレシピエントマウスでは、EVHは起こらずに輸血されたRBCは存続して、抗プロペルジンmAbがEVHの予防に有効であったことを実証している（図27）。
【０１５９】
本明細書に記載されるそれぞれのすべての特許、特許出願および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書組み入れられる。
【０１６０】
本発明は具体的な態様に関連して開示されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって本発明のその他の態様および変更が考案され得ることは明らかである。添付される特許請求の範囲はこのような態様および同等の変更のすべてを包含すると解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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