(57)【要約】  本発明は、ＣＩＰ２Ａ（ＫＩ−ＡＡ１５２４）遺伝子をサイレンシングすると、特定の低分子化学療法剤によるアポトーシス誘導活性に対してがん細胞を感作するという発見に基づく。したがって、本発明はそれぞれの併用療法、感作の方法及び薬学的組成物に関する。本発明はさらに、対象から得られたサンプル中のＣＩＰ２Ａ及びｐ５３発現及び／又はタンパク質活性に基づく対象のためのがん療法を選択する方法に関する。
2014526456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３機能が欠損した細胞を含む過剰増殖性の疾患の治療に医薬として用いるための、少なくとも１種類のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤と、以下のものからなる群から選択される化合物との組合せ：
・ラパチニブ、タンズチニブ、バンデタニブ、ダサチニブ、ＰＫＣ−４１２、Ｈ−７及びスニチニブからなる群から選択される低分子キナーゼ阻害剤；
・ＡＢＴ−８８８、ＡＧ−０１４６９９、ＩＮＤ−７１６７７、オラパリブ及びＰＡＲＰ阻害剤ＩＩＩからなる群から選択されるＰＡＲＰ阻害剤；
・ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ−４７７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、及びＧｏ６９７６からなる群から選択されるＣＨＫ１阻害剤；
・インドール−３−カルビノールである、グリコシノレート；
・シスプラチン、及びテモゾロミドからなる群から選択されるアルキル化剤；
・パクリタキセル、及びビノレルビンからなる群から選択される植物アルカロイド；
・ラパマイシン、及びＴＧＸ−２２１からなる群から選択されるＰＩ３Ｋ/ｍＴＯＲ阻害剤；
・トリコスタチンＡである、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；
・ＮＵ−７４４１である、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤；
・Ｓ３１−２０１である、ＳＴＡＴ阻害剤；
・ゲムシタビンである、代謝拮抗剤；及び
・ＬＹ２１８１３０８、テラメプロコル、及びＹＭ１５５からなる群から選択される生存阻害剤。
【請求項２】
ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びＰＰ２Ａｃに対してＣＩＰ２Ａ機能を阻止する作用剤からなる群から選択される請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、配列番号１から２５、及び配列番号１から２５と少なくとも８０％の配列相同性を有し、そのＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を保持する配列からなる群から選択される核酸配列を含む請求項２に記載の組合せ。
【請求項４】
乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん、及び血液がんからなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置に用いるための請求項２に記載の組合せ。
【請求項５】
前記固形がんが、頭頸部扁平上皮がん、大腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、食道がん、肺がん、肝がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及び膠芽細胞腫からなる群から選択され、及び前記血液がんが、急性及び慢性Ｔ細胞及びＢ細胞白血病及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項４に記載の組合せ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の組合せ及び少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
過剰増殖性細胞を化学療法剤に対して感作させる方法であって、そのような感作を必要とするヒト又は動物対象に対してＣＩＰ２Ａ遺伝子をサイレンシングすることによる、上記方法。
【請求項８】
過剰増殖性疾患の治療を必要とするヒト又は動物対象における、該過剰増殖性疾患を治療する方法であって、少なくとも１種類のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤と、以下のものからなる群から選択される化合物：
・ラパチニブ、タンズチニブ、バンデタニブ、ダサチニブ、ＰＫＣ−４１２、Ｈ−７及びスニチニブからなる群から選択される低分子キナーゼ阻害剤；
・ＡＢＴ−８８８、ＡＧ−０１４６９９、ＩＮＤ−７１６７７、オラパリブ及びＰＡＲＰ阻害剤ＩＩＩからなる群から選択されるＰＡＲＰ阻害剤；
・ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ−４７７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、及びＧｏ６９７６からなる群から選択されるＣＨＫ１阻害剤；
・インドール−３−カルビノールである、グリコシノレート；
・シスプラチン、及びテモゾロミドからなる群から選択されるアルキル化剤；
・パクリタキセル、及びビノレルビンからなる群から選択される植物アルカロイド；
・ラパマイシン、及びＴＧＸ−２２１からなる群から選択されるＰＩ３Ｋ/ｍＴＯＲ阻害剤；
・トリコスタチンＡである、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；
・ＮＵ−７４４１である、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤；
・Ｓ３１−２０１である、ＳＴＡＴ阻害剤；
・ゲムシタビンである、代謝拮抗剤；及び
・ＬＹ２１８１３０８、テラメプロコル、及びＹＭ１５５からなる群から選択される生存阻害剤、
とを、併用して、同時に又は逐次に前記対象に投与することによる、上記方法。
【請求項９】
前記ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びＰＰ２Ａｃに対してＣＩＰ２Ａ機能を阻止する作用剤からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、配列番号１から２５、及び配列番号１から２５と少なくとも８０％の配列相同性を有し、そのＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を保持する配列からなる群から選択される核酸配列を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん、及び血液がんからなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置に用いるための請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記固形がんが、頭頸部扁平上皮がん、大腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及び膠芽細胞腫からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
がん療法を必要とする対象のためのがん療法を選択する方法であって、該対象から得られる試料中のＣＩＰ２Ａ及びｐ５３発現及び／又はタンパク質活性を評価し、及びサンプルがＣＩＰ２Ａ発現及び／又は活性が陰性であり、ｐ５３活性が欠損である対象のために少なくとも１種の化学療法剤による単一療法を選択し、及びサンプルがＣＩＰ２Ａ発現陽性であり、ｐ５３活性欠損である対象のための療法として請求項１に記載の組合せを選択することを含む上記方法。
【請求項１４】
前記対象が請求項５又は６に定義づけられる疾患を被る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載された方法を実行するための試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん併用療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、世界中の全てのコミュニティを苦しませている破壊的な疾患である。男性の２人に１人及び女性の３人に１人はその生涯でなんらかの形のがんを発症すると推定されている。
【０００３】
興味深いことに、近年では、異なるがんの型間の表現形のばらつきに関係なく、限られた遺伝子エレメントの混乱が、多くの異なるヒト細胞型で細胞の形質転換を誘導するのに十分であることが証明された（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４を参照）。実験的には、Ｒａｓ及びテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の活性化が、がん抑制タンパク質ｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の不活性化と一緒に、様々なヒト細胞型を不死化させ、それらは実質的にタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）を阻害することに応答して、腫瘍形成性の状態から変化させることができると証明された。従って、これらの一般的な遺伝エレメントはがん発生の主要な調節因子であるとみなされよう（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４を参照）。
【０００４】
ＰＰ２Ａは触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ又はＣ）、足場サブユニット（ＰＲ６５又はＡ）及び代替調節サブユニットＢのうち一つから構成される三量化タンパク質複合体として機能する、広く保存されたセリン／トレオニンホスファターゼタンパク質（ＰＳＰ）である。上述の通り、近年の実験的証拠はＰＰ２Ａ活性の阻害がヒト細胞形質転換の必要条件であることを確実に証明した（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ  ａｎｄ  Ｈａｈｎ，  ２００８を参照）。それにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＰ２Ａ複合体の組成及び／又は活性を調節する機構についてはほとんど知られていない。ＰＰ２Ａ阻害機構の同定は、ＰＰ２Ａの腫瘍サプレッサー活性を復活させるがん療法の新規クラスの開発の機会を提供する可能性がある。この考えは、Ｎｕｔｌｉｎ−３などの小分子によるｐ５３の腫瘍サプレッサー活性の再活性化を狙うがん療法アプローチに類似する（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【０００５】
２００７年、ＰＰ２Ａのがん性の阻害剤（ＣＩＰ２Ａ）を示す新規なＰＰ２Ａ阻害タンパク質が同定された（Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。ＣＩＰ２ＡはＰＰ２Ａ及び最も重要ながん化転写因子ＭＹＣの一つと相互に作用する。さらに、ＣＩＰ２ＡのｓｉＲＮＡ媒介の欠乏は、ＭＹＣ−ＰＰ２Ａ複合体においてＰＰ２Ａ活性が目に見えて増加し、ＭＹＣ中のセリン６２の脱リン酸化及びＭＹＣタンパク質の分解が生じた。これはまた、ＣＩＰ２Ａが悪性の細胞成長及びｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成にとって必要とされるということを示している（Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ  ａｎｄ  Ｈａｈｎ，  ２００８）。さらに、最近の研究では、いくつかの共通したヒト悪性腫瘍でのＣＩＰ２Ａ過剰発現を示し、及びその役割がヒト腫瘍性タンパク質に臨床上関連する役割を確認している（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ  ａｎｄ  Ｈａｈｎ，  ２００８）。したがって、これらの結果はＣＩＰ２Ａが、ヒト悪性腫瘍のＰＰ２Ａを阻害する新規なヒト腫瘍性タンパク質であることを示している。
【０００６】
細胞致死及び／又はアポトーシスは、がん療法レジメンのための好ましいエンドポイントである。他方、内在性の又は後天的な抵抗性は、現在用いられている化学療法に関係がある主要な問題である。したがって、悪性腫瘍の根底にある機構の少なくとも一部は明らかにされているが、過剰増殖性疾患、特にがんのための医薬の開発の必要性が当分野に存在する。がんサプレッサータンパク質ｐ５３の活性化は、臨床用の様々な化学療法剤に応じて細胞中にアポトーシス誘導を媒介する（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。しかしながら、ｐ５３機能はヒト腫瘍の約５０から７０％において欠損しているので、化学療法抵抗性の重要な原因となる（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ｐ５３は、遺伝子変異突然変異又はＭＤＭ２又ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）  １６  Ｅ６タンパク質のようなウイルスタンパク質のｐ５３は負の調節の過剰発現により多くの場合がん中で不活性化されている。したがって、機能的に欠損している内在するｐ５３をこれらのがん細胞を化学療法に対して感作させるアプローチは、この薬剤抵抗性を克服するために、明確に必要とされる（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【発明の概要】
【０００７】
一つの側面では、本発明は、少なくとも１種類のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤と、ｐ５３機能疾患に伴う細胞を含む過剰発現性障害の治療に医薬として用いるための低分子チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、グルコシノレート、アルキル化剤、植物アルカロイド、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、代謝拮抗剤、及び生存阻害剤からなる群から選択される化学療法剤との組合せを与えるものである。それぞれの薬剤の分類に適切な薬剤は請求項１の範囲である。
【０００８】
さらなる側面では、本発明はＣＩＰ２Ａサイレンシング剤と、本発明による化学療法剤と、及び少なくとも１種類の薬学的に許容される担体の組合せからなる医薬組成物を与えるものである。
【０００９】
さらに別の側面では、本発明は過剰増殖細胞を化学療法剤に対して感作させる方法であって、そのような感作を必要とするヒト又は動物対象においてＣＩＰ２Ａ遺伝子をサイレンシングすることによる上記方法を与える。
【００１０】
さらに別の側面では、本発明は過剰増殖性疾患の治療を必要とするヒト又は動物対象における、該過剰増殖性疾患を治療する方法であって、少なくとも１種類のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤と、低分子チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、グリコシノレート、アルキル化剤、植物アルカロイド、ＰＩ３Ｋ/ｍＴＯＲ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、代謝拮抗剤、及び生存阻害剤とを、併用して、同時に又は逐次に前記対象に投与することによる、上記方法を与える。それぞれの薬剤の分類の適切な化合物を請求項８に開示する。
【００１１】
さらに、本発明の一つの側面は、がん療法を必要とする対象のためのがん療法を選択する方法であって、該対象から得られる試料中のＣＩＰ２Ａ及びｐ５３発現及び／又はタンパク質活性を評価し、及びサンプルがＣＩＰ２Ａ発現及び／又は活性が陰性であり、ｐ５３活性が欠損である対象のために少なくとも１種の化学療法剤による単一療法を選択し、及びサンプルがＣＩＰ２Ａ発現陽性であり、ｐ５３活性欠損である対象のための療法として請求項１に記載の組合せ療法を選択することを含む上記方法を与える。
【００１２】
上記側面のいくつかの実施形態において、前記ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びＰＰ２Ａｃに対してＣＩＰ２Ａ機能を阻止する作用剤からなる群から選択される。さらなる実施形態において、前記ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、配列番号１から２５、及び配列番号１から２５と少なくとも８０％の配列相同性を有し、そのＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を保持する配列からなる群から選択される。
【００１３】
上記側面のいくつかの実施形態において、前記治療されるべき過剰増殖性障害は乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん、及び血液がんからなる群から選択される。該固形がんの限定されない例は、頭頸部扁平上皮がん、大腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、食道がん、肺がん、肝がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及び膠芽細胞腫を含み、及び該血液がんの限定されない例は、急性及び慢性Ｔ細胞及びＢ細胞白血病及びリンパ腫を含む。
【００１４】
本発明の他の具体的な実施形態、目的、詳細及び利点は、従属請求項、以下の図、詳細な説明及び実施例に示される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
以下において、本発明は、添付された図面を参照して好ましい実施形態によってより詳細に説明される。
【００１６】
【図１】図１は、アポトーシスのレベル（例えば、カスパーゼ３／７活性）を示す図であり、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞単独と比較した際、標準的な化学療法剤と組合せたｓｉＲＮＡのＣＩＰ２Ａ阻害に続いてヒト由来グリオーマ細胞Ｔ９８Ｇ細胞にアポトーシスが誘導されたことを示す。
【００１７】
【図２】図２は、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ単独と比較した際、ヒト由来子宮頸がん細胞ＨｅＬａ細胞にＣＴＧアッセイを使用して測定された細胞生存度を減少させる各種の化学療法薬剤を組合せて用いたＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡの有効性を示す。
【００１８】
【図３】図３は、カスパーゼ３／７アッセイにより測定されるＣＩＰ２Ａ欠損（ＣＩＰ２Ａ−／−）マウス又はＣＩＰ２Ａ発現（ＣＩＰ２Ａ＋／＋）マウスのマウス一次リンパ腫細胞中にアポトーシスを誘導する各種の化学療法薬剤の効果を示す。
【００１９】
【図４】図４は、ＣＩＰ２Ａ発現細胞と比較したとき、各種の化学療法薬剤で細胞を処理した後に細胞生存度（ＣＴＧアッセイを使用して測定した）がＣＩＰ２Ａ欠損（ＣＩＰ２Ａ−／−）マウス一次リンパ腫細胞中で有意に減少したことを示す。
【００２０】
【図５】図５は、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞単独と比較したとき、標準的な化学療法剤と組み合せたｓｉＲＮＡのためＣＩＰ２Ａの阻害に続くヒト由来胃がん細胞系ＭＫＮ細胞に誘導されるアポトーシスのレベル（例えば、カスパーゼ３／７活性）を測定するカスパーゼ３／７活性を示す。
【００２１】
【図６】図６は、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞単独と比較したとき、標準的な化学療法剤と組み合せたｓｉＲＮＡによるＣＩＰ２Ａの阻害に続くＣＩＰ２Ａアポトーシス（例えば、カスパーゼ３／７活性）がヒト由来乳がん細胞系ＭＣＦ−７細胞で誘導されていないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＩＰ２Ａ遺伝子サイレンシングが、特定の低分子化学療法剤のアポトーシス誘導活性に対してｐ５３がん調節タンパク質機能について危険にさらされたがん細胞を感作する、という驚くべき発見に基づく。ＣＩＰ２Ａ遺伝子のサイレンシング及びその化学療法剤の投与の併用は、ｐ５３機能が阻害されるようになった細胞におけるアポトーシス及び／又はその他のタイプの細胞死のレベルで、付加的な、又は相乗的な増加を生じた。他方、本発明は変異ｐ５３発現ＣＩＰ２Ａ陰性リンパ腫細胞が化学療法剤での単独療法に対してより感作的であることを示す。したがって、一つの側面では、本発明はＣＩＰ２Ａ欠損の療法及び化学療法剤の組合せを提供し、一方でその他の側面では、本発明は患者サンプルのＣＩＰ２Ａ及びｐ５３状態を検出することによる化学療法剤に対するがん患者の階層化方法を提供する。
【００２３】
本発明の患者の階層化方法は、患者から得られたがん組織サンプルのＣＩＰ２Ａ及びｐ５３状態を検出することよりなる。ＣＩＰ２Ａ陰性であり、ｐ５３不活性であるがん細胞の患者は、化学療法剤で単一療法処置を選択されるべきであり、一方でＣＩＰ２Ａ陽性であり、ｐ５３不活性であるがん細胞の患者は、本発明の組合せ（例えば、ＣＩＰ２Ａ阻害と共に特定の化学療法剤の投与）で治療されるべきである。
【００２４】
がん組織サンプル又は体液中のＣＩＰ２Ａレベルは様々な方法で測定することができる。例えば、組織又は体液中のＣＩＰ２Ａタンパク質レベルは、ｉ）ＲＴ-ＰＣＲ、又はハイブリダイゼーション技術によって組織又は体液中のＣＩＰ２Ａ  ｍＲＮＡ発現を検出すること、又はｉｉ）ＣＩＰ２Ａタンパク質に対してそのＣＩＰ２Ａを認識する抗体を含有すると期待される組織又は体液を対象とし、その抗体を検出し及び／又は定量し、又はその組織又は体液をプロテオミクス技術による分析の対象とすることより、定量化することができる。適切なハイブリダイゼーション技術は、例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びノーザンブロットを含む。抗体の検出又は定量は標準的な免疫学的プロトコル、例えば、ラベル結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット及び免疫組織化学法に従って実施することができる。
【００２５】
がん組織又は体液サンプル中のｐ５３機能欠損は、当業者によってよく知られた標準技法により検出することができる。選択の方法は、少なくとも部分的に、ｐ５３機能欠損に根底をなす機構に依存する。例えば、ｐ５３不活性化変異の検出は、同様に当業者に良く知られているハイブリダイゼーション技術により、又はＤＮＡ又はＲＮＡシーケンスにより、又はそのＲＮＡ又はＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析により、実施することができる。ＭＤＭ２又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６  Ｅ６タンパク質といったウイルスタンパクのようなｐ５３について負の調節の過剰発現は、ＣＩＰ２Ａのレベルと同様の方法で検出することができる。
【００２６】
患者の階層化方法は、ＣＩＰ２Ａ及びｐ５３単独の、又はその他のタンパク質又は遺伝子と組み合せた同様の状態を検出することで実施することができる。
【００２７】
ＣＩＰ２Ａ遺伝子サイレンシングは、当分野において既知のいかなる適切な方法によっても得ることができ、限定されるものではないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む。最も一般的なＲＮＡｉに基づく遺伝子サイレンシングのアプローチは低分子ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）である。
【００２８】
ｓｉＲＮＡの原理は、広く文献に公開されている。例として、米国特許公開公報２００３／０１４３７３２、２００３／０１４８５０７、２００３／０１７５９５０、２００３／０１９０６３５、２００４／００１９００１、２００５／０００８６１７及び２００５／００４３２６６を挙げることができる。ｓｉＲＮＡ二量体分子は、アンチセンス領域及びセンスストランドを含み、そのアンチセンスストランドは特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に相補性のある配列を有し、及びそのセンスストランドはそのアンチセンスストランドに相補性のある配列を有する。したがって、そのｓｉＲＮＡ二量体分子は、第一のフラグメントはアンチセンスストランドを含み、第二のフラグメントはｓｉＲＮＡのセンスストランドを含む二つの核酸フラグメントを含む。言い換えれば、ｓｉＲＮＡは小さい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡｓ）である。このセンスストランド及びアンチセンスストランドはリンカー分子を介して共有結合することができ、そのリンカー分子はポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであってもよい。アンチセンス及びセンスストランドの長さは、異なっていてもよく、一般的にはそれぞれ約１９から２１ヌクレオチドである。その他の場合において、ｓｉＲＮＡは２２、２３又は２４ヌクレオチドからなることもできる。
【００２９】
ＲＮＡｉを基礎としたＣＩＰ２Ａサイレンシングに対するその他のアプローチは、より長い、一般的には２５から３５ヌクレオチドのダイサー（Ｄｉｃｅｒ）基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｓ）を用いるものであり、ダイサー基質ｓｉＲＮＡはいくつかの場合において、対応する従来の２１量体ｓｉＲＮＡｓよりも効果があることが報告されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。ＤｓｉＲＮＡはダイサーによりｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡ活性を作用させるものである。
【００３０】
細胞中では、活性ｓｉＲＮＡアンチセンスストランドが形成され、及び標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。これは次々にＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘである）により標的ＲＮＡの開裂を誘導し、そして同様にＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により付加的なＲＮＡの合成を誘導する。それらはダイサーを活性化させ、付加的なｓｉＲＮＡ二量体分子を生じることができ、それにより応答を増幅する。
【００３１】
ここで用いるように、用語「ｄｓＲＮＡ」はｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡの両方を参照する。
【００３２】
一般的に、しかし必ずしもではないが、ｄｓＲＮＡのアンチセンスストランド及びセンスストランドの双方は３’末端がほんの少し、一般的には１から３ヌクレオチド突出している。この３’突起は一つ又は複数の、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。アンチセンスの５’末端は、一般的にはリン酸基（Ｐ）である。末端リン酸基（Ｐ）を有するｄｓＲＮＡ二量体は一本鎖アンチセンスよりも細胞中に投与することが容易である。いくつかの場合において、センスストランド又はアンチセンス及びセンスストランドの両方の５’末端はＰ基からなることができる。
【００３３】
通常、非修飾ＲＮＡは生細胞中に存在するリボヌクレアーゼ酵素によるその分解の理由から生理学上の状態下において低い安定性を有する。オリゴヌクレオチドが外因的に投与される場合には、化学的及び酵素的分解に対してその安定性を高めるための既知の方法によって分子の修飾をすることが強く望まれる。
【００３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏで外因的に投与されるヌクレオチドの修飾は、当分野で広く記載されている（例えば、米国特許公開番号２００５/０２５５４８７であり、ここに参照することにより取り込まれる）。原則として、ヌクレオチドのいかなる部分（例えば、リボース糖、塩基及び／又は核間ヌクレオチドホスホジエステルストランド）も、修飾することができる。例えば、２’デオキシリボヌクレオチドを与えるリボースユニット由来の２’水酸基の除去は、改善された安定性を生じる。先の開示はまた、この基のその他の修飾、つまりリボース２’水酸基のアルキル、アルケニル、アリル、アルコキシアルキル、ハロ、アミノ、アジド又はメルカプト基である。リボースユニットにおけるその他の修飾もまた実施することができ、リボースの２’及び４’位にメチレン結合を含むロックド核酸（ＬＮＡ）が高い本質的な安定性を授けるために採用することができる。
【００３５】
さらに、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合は、例えば、一つ又は複数の酸素が硫黄、アミノ基、アルキル基又はアルコキシ基により置換することができるように修飾することができる。ヌクレオチド中の塩基もまた修飾することができる。
【００３６】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは一つ又は複数のリボース糖の２’水酸基の修飾、及び／又は一つ又は複数の核間ホスホジエステル結合の修飾、及び／又は一つ又は複数のリボース糖の２’及び４’位間のロックド核酸（ＬＮＡ）の修飾を含む。
【００３７】
特に好ましい修飾は、例えば、２’−水酸基の一つ又は複数を２’−デオキシ−、２’−Ｏ−メチル、２’−ハロ、例えば、フルオロ又は２’−メトキシエチルにより置換することである。特に好ましくは、いくつかの核間ホスホジエステル結合のオリゴヌクレオチドを修飾し、例えば、ホスホジエステル結合により置換することである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは一つ又は複数の合成又は天然ヌクレオチドアナログを含んでいてもよく、限定されるものではないが、ｄｓＲＮＡがそれらのＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を保持する限り、ホスホロチエート、ホスホラミドン、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、及びペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含む。
【００３９】
上記の修飾は非限定的な例にすぎないことは強調されるべきである。
【００４０】
ＲＮＡｉに関する一つの挑戦は、ｍＲＮＡに対応する有力なｄｓＲＮＡの同定である。不完全な相補性を持っている遺伝子はｄｓＲＮＡにより不注意に下方制御され、データ解釈及び潜在毒性において問題を引き起こすことについて注意されるべきである。これは、しかしながら、設計アルゴリズムで適切なｄｓＲＮＡを注意深く設計することにより部分的に充当することができる。これらのコンピュータープログラムは低ＧＣ含量の配列伸張、内部反復の欠損、Ａ／Ｕリッチ５−末端及びｄｓＲＮＡのサイレンシング効果を高める特徴である高度局在自由結合エネルギーを発見する一連の規則に対して、与えられえた標的配列を篩い分ける。
【００４１】
本発明における有用な同定因子のために、いくつかの異なるＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡを商業的又は非商業的アルゴリズムを用いて設計した。最終的に、ＣＩＰ２Ａ(ＫＩ−ＡＡ１５２４)の全長ｃＤＮＡ配列をｓｉＲＮＡアルゴリズムプログラム（ユーロフィンＭＷＧオペロンオンラインデザインツール）に取り込み、また、独立形プログラムをＣｕｉらが開発した(Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４)。さらに、ｓｉＲＮＡ配列を生成したアルゴリズムについて、適切でないｓｉＲＮＡを除くためにゲノム広範ＤＮＡ配列アライメント（ＢＬＡＳＴ）を通してスクリーニングした。言い換えると、標的遺伝子（ＣＩＰ２Ａ）よりもその他の遺伝子に適合している短い配列領域を有するこれら全てのｓｉＲＮＡは、さらなる利用に適切でないと判断した。
【００４２】
得られたｓｉＲＮＡはその後異なる細胞系にトランスフェクトされ、ｍＲＮＡを減少し、さらにＣＩＰ２Ａの翻訳を損なうそれらの能力を、ＣＩＰ２Ａ特異的抗体とともにｓｉＲＮＡ処理した後でＣＩＰ２Ａタンパク質の量を測ることによりタンパク質レベルとして調査した（表１）。
【表１】
2014526456.tif 000003
【００４３】
適切なｄｓＲＮＡは、参照ｓｉＲＮＡとして類似又は強化された結合特性及びＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を有する限り、配列番号１から５について８０％超の配列相同性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有するものを包含する。
【００４４】
さらに、本発明の様々な実施形態に用いるために適したＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡは、当分野で既知の方法に従って設計し、合成することができる。そのような単離されたｄｓＲＮＡは、ＣＩＰ２Ａ遺伝子サイレンシングのためにＣＩＰ２Ａ  ｃＤＮＡ配列に十分な相補性が必要である。
【００４５】
人工ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）前駆体はＲＮＡｉ仲介のために適したその他の低分子ＲＮＡ分類である。一般的には、人工ｍｉＲＮＡ前駆体は約２１から２５ヌクレオチド長であり、そしてそれらは１から３、一般的には２の突出した３’ヌクレオチドを有していてもよい。ＣＩＰ２Ａサイレンシング人工ｍｉＲＮＡ前駆体は当分野で既知の方法により設計し、及び合成することができる。
【００４６】
短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）はさらにその他のＣＩＰ２Ａサイレンシング方法である。ｓｈＲＮＡは、ｉ）標的遺伝子に由来する短いヌクレオチド配列、一般的には１９から２９ヌクレオチド；ｉｉ）ループ、一般的には４から２３ヌクレオチド；及び、ｉｉｉ）初期標的配列に対して逆相補性の短いヌクレオチド配列、一般的には、１９から２９ヌクレオチド；から構成される。ＳｈＲＮＡ発現カセットはＲＮＡ阻害活性を増加する配列を含むこともできる。そのような配列の非限定的な例は、Ｓｉｌｖａらによって示されたｍｉｒ−３０のミクロＲＮＡ配列である（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【００４７】
ＣＩＰ２ＡサイレンシングｓｈＲＮＡは当業者に既知の手段及び方法によって設計し、合成することができる。ＣＩＰ２Ａ  ｓｈＲＮＡに使用される適切なセンス配列（例えば、上記ヌクレオチド配列ｉ））の非限定的な例は、表２に示される。配列番号６から配列番号９に表されるｓｈＲＮＡは、例えばオリゲネ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）から入手でき、一方で配列番号１０から配列番号２５で表されるｓｈＲＮＡは、例えばオープンバイオシステムズ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手できる。
【表２】
2014526456.tif 000004
【００４８】
適切なｓｈＲＮＡは、参照ｓｈＲＮＡとして類似又は強化された結合特性及びＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を有する限り、配列番号６から２５に対して８０％超の配列相同性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の配列相同性を有するものを包含する。
【００４９】
ＣＩＰ２Ａサイレンシングはまた、アンチセンス療法によっても得ることができ、それは比較的短い（一般的に、１３から２５ヌクレオチド）合成一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドが対応するｍＲＮＡに結合することによりＣＩＰ２Ａ遺伝子を不活性化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾しないか、又は化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態においては、リボースの２’位にある水素はメチルのようなＯ−アルキル基により置換される。更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはひとつ又は複数の合成又は天然ヌクレオチドアナログ（その例としてＰＮＡが挙げられるが、それに限定されるものではない）を含むことができる。
【００５０】
さらに、ＣＩＰ２ＡサイレンシングはＣＩＰ２Ａ  ｍＲＮＡ開裂リボザイムにより得ることができる。そのリボザイム技術は例えば、Ｌｉら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）により記載されている。
【００５１】
ここに用いられるように、用語「ＣＩＰ２Ａサイレンシング」とは、完全な又は部分的なＣＩＰ２Ａ遺伝子発現の減少を指す。いくつかの実施形態では、ＣＩＰ２Ａ遺伝子発現は、ＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、又はそれらのいずれの組合せをヒト又は動物対象に導入するときに、少なくとも５０％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％減少する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＣＩＰ２ＡサイレンシングはＣＩＰ２ＡとＰＰ２Ａ間の、特にＰＰ２Ａのｃサブユニットの相互作用を遮断又は阻害することにより得ることができ、ＰＰ２Ａｃに対するＣＩＰ２Ａ機能が、少なくとも５０％、又は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害される。そのような遮断又は阻害因子としては、リコンビナント又は化学的に生産された修飾又は非修飾ペプチド及び部分ペプチド、並びに、低分子化合物のような非ペプチド分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような剤の同定方法は、例えばＷＯ２００９／１００１７３及び米国特許公開番号２００９／２３９２４４に開示されている。
【００５３】
本発明の様々な実施形態に用いるのに適した化合物は表３に記入したもの、及びそれらのいかなる光学異性体、塩、溶媒和物又はプロドラッグをも含む。
【００５４】
【表３−１】
2014526456.tif 000005
【表３−２】
2014526456.tif 000006
【００５５】
開示された化合物のいずれもが薬学的に許容可能な塩に変換することができる。その薬学的に許容可能な塩は無毒性である限り、部分的に限定されない。無機的又は有機的な塩基についての塩の非限定的な例は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など）アンモニウム塩、アミン塩（例えば、トリエチルアミン塩）などを含む。酸付加塩の非限定的な例は、鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）に由来する塩、及び有機酸（例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、など）に由来する塩である。
【００５６】
開示された化合物のいずれもが、後述の医薬組成物のプロドラッグとして使用することができる。ここに用いられるように、用語「プロドラッグ」はｉｎ  ｖｉｖｏで投与後に、例えば、代謝されることによって活性医薬に変換することができるいずれの化合物をも指す。
【００５７】
ＣＩＰ２Ａ  ｄｓＲＮＡと式（Ｉ）の化合物の投与は、併用して、同時に又は逐次に行うことができる。
【００５８】
ＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡの送達は二つの主要な異なる方法で達成することができる。すなわち、１）オリゴヌクレオチドにコードされている核酸配列の内因性転写であって、そのオリゴヌクレオチドは核酸配列が発現コンストラクトに位置している方法、又は、２）オリゴヌクレオチドの外因的送達である。
【００５９】
内因性転写のために、ＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡは、当分野において既知の方法を使用する、適した発現系に挿入することができる。そのような発現系の非限定的な例は、一つ又は複数の当分野において既知の導入プロモーターを伴う又は伴わない、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、他のウイルスベクター、発現カセット及びプラスミド、例えばＰＥＧ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）にカプセル化されたものが含まれる。ｄｓＲＮＡストランドは同一の又は別々のプロモーターから単一の発現コンストラクトで発現することも、そのストランドが別々の発現コンストラクトで発現することもできる。
【００６０】
前述の発現系は、ＣＩＰ２Ａサイレンシング人工ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの送達のために用いることもできる。
【００６１】
一般的には、発現コンストラクトはヒト又は動物対象（例えば、イヌ対象）に投与する前に医薬組成物に製剤化される。投与は、それらは全身性及び局所的送達を含む、技術分野で既知のいかなる適切な方法でも実施することができる。その製剤化は当分野の当業者に良く知られた投与の目的経路に依存する。例示の方法により、発現コンストラクトは薬学的に許容される担体又は希釈剤で送達することができ、又は、適切な緩開放組成物中に包埋することができる。場合によっては、医薬組成物は発現系により生産された一つ又は複数の細胞を含むことができる。バクテリアもまたＲＮＡｉ送達に用いることができる。例えば、組み換え技術によって作られた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）はｉｎ  ｖｉｖｏ送達の後に哺乳動物細胞に入り、ｓｈＲＮＡを移すことができる。関連するアプローチは、例えばサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）由来の小細胞を用いるものである。
【００６２】
外因性送達について、ｄｓＲＮＡ分子は一般的にリポソーム又は脂質ベースの担体、コレステロール化合物、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合している。有望な新しいアプローチはｄｓＲＮＡと安定的な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を複合することである。外因的送達のための投与の適切な経路としては、前出の複合化の有無に関わらず、当業者に既知の、腸管外送達（例えば、静脈注射）、腸内送達（例えば、経口）、限局投与、局所投与（例えば皮膚又は経皮）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腫瘍の外科的除去はたいてい一次臨床的介入療法であるから、ｄｓＲＮＡは切除腫瘍キャビティに直接投与することができる。
【００６３】
式（Ｉ）の化学療法剤は、ヒト又は動物対象に、当分野で既知のいずれの適切な経路によっても投与することができ、その例としてはＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡの投与としてリストしたものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
本発明による併用療法において、ｄｓＲＮＡ分子及び式（Ｉ）の化合物は同じ又は別々の医薬組成物として製剤化することができる。別々の医薬組成物が用いられるときは、投与は、併用して、同時に又は逐次に行うことができる。ｄｓＲＮＡ分子及び式（Ｉ）の化合物の投与の剤形及び／又は経路はそれぞれから独立して選択される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は一つ又は複数の異なるＣＩＰ２ＡサイレンシングｄｓＲＮＡ及び／又は一つ又は複数の式（Ｉ）の化学療法剤から構成されてもよい。
【００６５】
医薬組成物は、投与に適する任意の適当な薬理学的担体で投与することができる。それらは、ヒト又は動物の患者でがんなどの過剰増殖性疾患の予防的、苦痛緩和的、防止的又は治癒効果を有する任意の形で投与することができる。
【００６６】
非経口又は局所の投与のために、ｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の化合物は、例えば、液剤、懸濁液又は乳剤として製剤化することができる。必要に応じて、製剤は、水性か非水性の溶媒、共存溶媒、可溶化剤、分散若しくは湿潤剤、懸濁剤及び／又は粘度剤を含むことができる。非水性溶媒の非限定例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注入用有機エステルである。水性担体としては、例えば、水、水−アルコール溶液が挙げられ、それらは生理食塩水及び緩衝医療用非経口ビヒクルを包含し、その例としては塩化ナトリウム溶液、リンガーのブドウ糖溶液、デキストロースプラス塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンガー液、又は固定油が挙げられている。静脈内ビヒクルの非限定例としては、流動性栄養補液、電解質補液、例えばリンガーのブドウ糖液に基づくもの、などが挙げられる。水性組成物は、目標のｐＨ範囲に応じて適する緩衝剤、例えばリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩又はグリシン緩衝液を含むことができる。張性調整剤（等張化剤）としての塩化ナトリウムの使用も有益である。組成物は、他の賦形剤、例えば安定化剤又は保存料を含むこともできる。有益な安定化賦形剤には、界面活性剤（ポリソルベート２０＆８０、ポロキサマー４０７）、ポリマー（ポリエチレングリコール、ポビドン）、炭水化物（スクロース、マンニトール、グルコース、ラクトース）、アルコール（ソルビトール、グリセロールプロピレングリコール、エチレングリコール）、適切なタンパク質（アルブミン）、適切なアミノ酸（グリシン、グルタミン酸）、脂肪酸（エタノールアミン）、抗酸化剤（アスコルビン酸、システインなど）、キレート化剤（ＥＤＴＡ塩、ヒスチジン、アスパラギン酸）又は金属イオン（Ｃａ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｍｎ）が含まれる。有益な保存剤には、ベンジルアルコール、クロルブタノール、塩化ベンザルコニウム及び、おそらくパラベンがある。
【００６７】
経口投与のための固体剤形には、以下に限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、丸薬、トローチ剤、ロゼンジ剤、散剤及び顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形では、ｄｓＲＮＡ及び／又は式（Ｉ）の化合物は、スクロース、ラクトース又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されてよい。そのような剤形は、慣例通り、医薬用アジュバント、例えばステアリン酸潤滑剤又は着香剤を含むこともできる。固形の経口製剤は、有効成分の放出を調整する腸溶性か他のコーティングで調製することもできる。
【００６８】
経口投与のための液状剤形の非限定例には、当分野で一般的に用いられる、水及びアルコールなどの不活性の非毒性希釈剤を含有する、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれる。そのような組成物は、湿展剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料及び着香剤などのアジュバントを含むこともできる。
【００６９】
医薬組成物は、要求に応じて再構成される濃縮形又は粉末の形で提供することができる。凍結乾燥する場合には、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖（スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）及びアルブミンを含む、特定の凍結保護物質が好ましい。再構成のための溶液がパッケージに添付される場合は、それは、例えば滅菌された注射用水、又は塩化ナトリウム溶液、又はブドウ糖若しくはグルコース溶液からなることができる。
【００７０】
本医薬製剤を製剤化するための手段及び方法は当分野の技術者に公知であり、それ自体公知である方法、例えば、従来の混合、造粒、溶解、凍結乾燥又は類似した方法によって製造することができる。
【００７１】
本併用療法は、それらに限定されないが、乾癬、心筋肥大、例えばアデノーマ、過誤腫及び軟骨腫のような良性腫瘍、並びに頭頸部扁平上皮癌、大腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、食道がん、肺がん、肝がん、脳がん（例えば神経膠腫、星状細胞腫及びグリア芽細胞腫）、及び血液がん（例えば慢性及び急性のＴ細胞及びＢ細胞の白血病及びリンパ腫）のようながんを包含するが、これらに限定されない、ヒト又は動物の過剰増殖性疾患を治療するために用いることができる。
【００７２】
本明細書で用いるように、用語「治療」又は「治療すること」は、疾患の完全治癒だけでなく、疾患又はそれに関連する症状の防止、軽減及び改善も指す。
【００７３】
ｄｓＲＮＡと式（Ｉ）の化合物との組合せの「効果的な量」は、腫瘍の有害作用が最低限で改善される量を意味する。本併用療法の投与のための量及びレジメンは、がん関連の障害の処置に関する臨床分野の技術者が容易に決定することができる。一般に、本併用療法の投薬量は、処置される患者の年齢、性及び健康状態；あるならば併行処置の種類；処置の頻度及び所望の効果の性質；組織傷害の程度；症状の継続期間；並びに個々の医師によって調整される他の変数などの考慮事項によって決まる。所望の結果を得るために、所望の用量を１回又は複数回の適用で投与することができる。本実施形態による医薬組成物は、単位剤形で提供することができる。
【００７４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．０１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０μｇ／ｋｇから約１０μｇ／ｋｇの投薬量範囲内の有効量で投与することができる。ＤｓＲＮＡは単一の日用量で投与することができるか、又は、総日投薬量を、例えば１日に２回、３回又は４回の分割用量で投与することができる。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、約０．１μｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲内の有効量で投与することができる。式（Ｉ）の化合物は単一の日用量で投与することができるか、又は、総日投薬量を、例えば１日に２回、３回又は４回の分割用量で投与することができる。投与スケジュールは、ｄｓＲＮＡの投与スケジュールと独立して選択することができる。
【００７５】
当分野における当業者にとって、技術の進歩に従って、この発明概念を様々な方法で実施することができることは自明である。本発明及びそれらの実施形態は後述される例に限定されることはなく、しかし特許請求の範囲において異なっていてもよい。
【実施例】
【００７６】
例１．ＣＩＰ２Ａ阻害剤は様々な化学療法剤に対してＴ９８Ｇ細胞を感作する
ｐ５３変異を発現しているヒト由来グリオーマがん細胞Ｔ９８Ｇ細胞をＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）又はＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（配列番号２；２５ｎＭ）のいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、ｓｉＲＮＡを含む培地を図１に示す濃度で化学療法剤を含む培地に置換した。ＣＩＰ２Ａ阻害と標準化学療法剤を組み合せたものが、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ又は化学療法剤単独のいずれかにより処理された細胞と比較した際に、アポトーシスをより強く誘導するかどうかを検証するため、細胞中のアポトーシス誘導の検出に用いるカスパーゼ３/７活性（カスパーゼ３/７グロ  アッセイ、プロメガ）を、製造者の指示に従って４８時間後に計測した。図１に示す結果は、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ単独ではアポトーシスを誘導しないことを示す。しかしながら、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡとラパチニブ、スニチニブ、Ｈ-７、バンデタニブ、シスプラチン、パクリタキセル、テモゾロミド、タンズチニブ又はインドール−３−カルビノールのいずれかを組み合せたものが、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ単独で処理した細胞と比較して、Ｔ９８Ｇ細胞におけるアポトーシスの誘導を明確に増強した。
【００７７】
例２．ＣＩＰ２Ａ阻害は様々な化学療法剤に対してＨｅＬａ細胞を感作する
野生型ｐ５３機能がＨＰＶ１８  Ｅ６により鈍化されているヒト由来子宮頸がん細胞ＨｅＬａ細胞をＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）又はＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（配列番号６；２５ｎＭ）のいずれかでトランスフェクトした。７２時間後、ｓｉＲＮＡを含む培地を図２に示す濃度で化学療法剤を含む培地に置換した。ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ又は化学療法剤単独のいずれかで処理した細胞と比較したとき、ＣＩＰ２Ａ阻害と標準化学療法剤を組み合せたものが細胞の生存度をより強く減少させるかどうかを検証するため、製造者の指示に従って４８時間後にＣＴＧアッセイ（プロメガ）を用いた。図２に示す結果はＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ単独では細胞の生存度を減少させることについて効果がないことを示す。しかしながら、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡとラパチニブ、ＰＡＲＰｉ（ＤＰＱ）、インドール−３−カルビノール、ＮＵ−７４４１、ラパマイシン、Ｓ３１−２０１、ＴＧＸ−２２１、トリコスタチンＡ、ゲムシタビン、又はＰＫＣ−４１２を組み合せたもののいずれもが、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ単独で処理した細胞と比較して細胞生存度がより強く減少し、ＣＩＰ２Ａの阻害がこれらの化学療法剤に対してＨｅＬａ細胞を感作したことを表す。
【００７８】
例３．ＣＩＰ２Ａ欠損（ＣＩＰ２Ａ−／−）マウス由来の一次リンパ腫細胞は化学療法剤に対して感作される
ｐ５３変異を発現しているマウス一次リンパ腫細胞系をＥｍｕ−ｍｙｃマウス系統と交雑させたＣＩＰ２Ａ野生タイプ（ＣＩＰ２Ａ＋／＋）又はＣＩＰ２Ａ欠損（ＣＩＰ２Ａ−／−）マウスの脾臓から得た。細胞を９６穴プレートに播種し、「正常増殖」培地を、図３に示す濃度で化学療法剤を含む培地に置換する前に、２４時間定着させた。ＣＩＰ２Ａ発現がん細胞と比較して、ＣＩＰ２Ａ欠損がん細胞が化学療法剤に対して感作されることを示す場合を検証するために、細胞中のアポトーシス誘導を計測するために用いられるカスパーゼ３/７活性（カスパーゼ３/７グロ  アッセイ、プロメガ）を、製造者の指示に従って、４８時間後に計測した。図３に示す結果は、ＣＩＰ２Ａ発現細胞と比較して、様々な化学療法剤（例えば、ラパチニブ、ＰＡＲＰｉ（ＤＰＱ）、ＰＫＣ−４１２、タンズチニブ、テモゾロミド、パクリタキセル、ＮＵ−７４４１、ＴＧＸ−２２１又はＳ３１−２０１）で処理したときに、極めて低いＣＩＰ２Ａ発現レベル（ＣＩＰ２Ａ−/−)を発現するリンパ腫細胞でアポトーシスがより強く誘導されることを示す。
【００７９】
例４．ＣＩＰ２Ａ欠損（ＣＩＰ２Ａ−／−）マウス由来の一次リンパ腫細胞が化学療法剤に対して感作され、細胞生存度が減少した
ｐ５３変異を発現しているマウス一次リンパ腫細胞系をＥｍｕ−ｍｙｃマウス系統と交雑させたＣＩＰ２Ａ野生型（ＣＩＰ２Ａ＋／＋）又はＣＩＰ２Ａ欠損（ＣＩＰ２Ａ−／−）マウスの脾臓から得た。細胞を９６穴プレートに播種し、「正常増殖」培地を図４に示す濃度で化学療法剤を含む培地に置換する前に２４時間定着させた。ＣＩＰ２Ａ発現細胞と比較して、ＣＩＰ２Ａ欠損がん細胞を化学療法剤で処理することにより細胞生存度が減少するかどうかを検証するために、ＣＴＧアッセイ（プロメガ）を、製造者の指示に従って、４８時間後に試みた。図４に示す結果は、ＣＩＰ２Ａ発現細胞と比較して、ラパチニブ、ＰＡＲＰｉ（ＤＰＱ）、Ｈ−７、タンズチニブ、ＰＫＣ−３１２、ラパマイシン、トリコスタチンＡ、Ｓ３１−２０１又はＴＧＸ−２２１を含む様々な化学療法剤で処理した極めて低いＣＩＰ２Ａレベル（ＣＩＰ２Ａ−/−)を発現しているリンパ腫細胞で細胞生存度がより低く減少していることを示す。
【００８０】
例５．ＣＩＰ２Ａ阻害はＭＫＮ２８細胞を様々な化学療法剤に対して感作する
ｐ５３変異を発現するヒト由来胃がん細胞ＭＫＮ２８細胞をＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）又はＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（配列番号６；２５ｎＭ）のいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、ｓｉＲＮＡを含む培地は図５に示す濃度の化学療法剤を含む培地に置換した。ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ又は化学療法剤単独のいずれかで処理した細胞と比較したときに、ＣＩＰ２Ａ阻害と標準化学療法剤を組み合せたものがアポトーシスをより強く誘導するかどうかを検証するために、細胞中のアポトーシス誘導を測定するために用いるカスパーゼ３／７活性（カスパーゼ３/７グロ  アッセイ、プロメガ）を、製造者の指示に従って４８時間後に計測した。図５に示す結果は、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ単独で処理したＭＫＮ２８細胞と比較して、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ単独でアポトーシスを誘導したことを示す。しかしながら、アポトーシスのレベルはＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡとＨ−７、バンデタニブ、シスプラチン、パクリタキセル、テモゾロミド、ゲムシタビン、ＰＫＣ−４１２、インドール−３−カルビノール及びタンズチニブを含む様々な化学療法剤とを組み合せたときに明らかに増強した。
【００８１】
例６．ＣＩＰ２Ａ阻害は化学療法剤に対してＭＣＦ−７細胞（野生型ｐ５３で発現する）を感作しない
野生型ｐ５３を発現しているヒト由来乳がん細胞ＭＣＦ−７細胞を、ＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）又はＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（配列番号２；２５ｎＭ）のいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、ｓｉＲＮＡを含む培地を図６に示す濃度で化学療法剤を含む培地に置換した。ＣＩＰ２Ａ阻害と標準化学療法剤とを組み合せるとＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ又は化学療法剤のいずれか単独で処理した細胞と比較してアポトーシスを有意に誘導するかどうかを検証するために、細胞中のアポトーシス誘導を測定するために用いるカスパーゼ３／７活性（カスパーゼ３／７グロ  アッセイ、プロメガ）を製造者の指示に従って４８時間後に測定した。図６に示す結果は、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡ単独ではＳＣＲ  ｓｉＲＮＡ単独で処理したＭＣＦ−７細胞と比較した際にアポトーシスを誘導しなかったことを示す。同様に、ＣＩＰ２Ａ  ｓｉＲＮＡと様々な化学療法剤を組み合せても、野生型のｐ５３を発現するそれらの細胞ではアポトーシスを誘導しなかった。
【００８２】
参考文献
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【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号１  ｓｉＲＮＡ分子
配列番号２  ｓｉＲＮＡ分子
配列番号３  ｓｉＲＮＡ分子
配列番号４  ｓｉＲＮＡ分子
配列番号５  ｓｉＲＮＡ分子
配列番号６  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号７  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号８  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号９  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１０  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１１  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１２  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１３  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１４  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１５  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１６  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１７  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１８  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号１９  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号２０  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号２１  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号２２  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号２３  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号２４  ｓｈＲＮＡセンス配列
配列番号２５  ｓｈＲＮＡセンス配列
【図１】
2014526456.tif 000007
【図２】
2014526456.tif 000008
【図３】
2014526456.tif 000009
【図４】
2014526456.tif 000010
【図５】
2014526456.tif 000011
【図６】
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【配列表】
2014526456000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月11日(2013.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３機能欠損細胞を含む過剰増殖性障害の治療に医薬として用いるための、
ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びリボザイムからなる群から選択される少なくとも１種のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤、及び
ＰＫＣ−４１２、ＰＡＲＰ阻害剤ＩＩＩ、インドール−３−カルビノール、シスプラチン、ラパマイシン、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ−７４４１、Ｓ３１−２０１、及びゲムシタビンからなる群から選択される化合物の組合せ。
【請求項２】
前記ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤が、配列番号１から２５、及び配列番号１から２５と少なくとも８０％の配列相同性を有し、そのＣＩＰ２Ａ活性を保持している配列からなる群から選択される核酸配列を含む請求項１記載の使用のための組合せ。
【請求項３】
乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん、及び血液がんからなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置に用いるための請求項２に記載の組合せ。
【請求項４】
前記固形がんが、頭頸部扁平上皮がん、大腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、食道がん、肺がん、肝がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及び膠芽細胞腫からなる群から選択され、及び前記血液がんが、急性及び慢性Ｔ細胞及びＢ細胞白血病及びリンパ腫からなる群から選択される請求項３の使用のための組合せ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組合せ及び少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
ｐ５３機能が欠損している過剰増殖性細胞を化学療法剤に対して感作させる方法であって、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びリボザイムからなる群から選択される少なくとも１種のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤、及び、ＰＫＣ−４１２、ＰＡＲＰ阻害剤ＩＩＩ，インドール−３−カルビノール、シスプラチン、ラパマイシン、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ−７４４１、Ｓ３１−２０１及びゲムシタビンからなる群から選択される化合物を投与して、そのような感作を必要とするヒト又は動物対象におけるＣＩＰ２Ａ遺伝子をサイレンシングすることによる、上記方法。
【請求項７】
ｐ５３機能が欠損している細胞を含む過剰増殖性疾患の治療を必要とするヒト又は動物対象における該疾患の治療方法であって、ｓｉＲＮＡ分子、ＤｓｉＲＮＡ分子、人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ｓｈＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムからなる群から選択される少なくとも１種のＣＩＰ２Ａサイレンシング剤、及び、ＰＫＣ−４１２、ＰＡＲＰ阻害剤ＩＩＩ、インドール−３−カルビノール、シスプラチン、ラパマイシン、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ−７４４１、Ｓ３１−２０１及びゲムシタビンからなる群から選択される化合物を、併用して、同時に又は逐次に該対象に投与することによる、上記方法。
【請求項８】
前記ＣＩＰ２Ａサイレンシング剤は、配列番号１から２５、及び前記配列番号１から２５に少なくとも８０％の配列相同性を有し、そのＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を保持している配列からなる群から選択される核酸配列を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
乾癬、心筋肥大、良性腫瘍、固形がん、及び血液がんからなる群から選択される過剰増殖性疾患の処置に用いるための請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記固形がんが、頭頸部扁平上皮がん、大腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、及び膠芽細胞腫からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
がん療法を必要とする対象のためのがん療法を選択する方法であって、該対象から得られる試料中のＣＩＰ２Ａ及びｐ５３発現及び／又はタンパク質活性を評価し、及びサンプルがＣＩＰ２Ａ発現及び／又は活性が陰性であり、ｐ５３活性が欠損である対象のために少なくとも１種の化学療法剤による単一療法を選択し、及びサンプルがＣＩＰ２Ａ発現陽性であり、ｐ５３活性欠損である対象のための療法として請求項１に記載の組合せを選択することを含む上記方法。
【請求項１２】
前記対象が請求項５又は６で定義づけられる疾患を被る対象である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法を実行するための試薬を含むキット。
【国際調査報告】
2014526456.tif 000013
2014526456.tif 000014