(57)【要約】  関連する参照配列を有するサンプル中の標的ＤＮＡ配列を配列決定するための方法およびキットが本明細書で提供される。特に、癌または癌治療に関連付けられる変異を配列決定するためのキットおよび方法が記載されている。同様に、ミトコンドリア変異を検出するための、および、密接に関連するウイルス株を識別するためのキットおよび方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定プライマーとブロッキング核酸を含む、参照配列を有するサンプル中の標的ＤＮＡ配列を配列決定するためのキットであって、
配列決定プライマーは、標的配列と参照配列の一本鎖の一部に相補的であり、ブロッキング核酸は、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的であり、
配列決定プライマーとブロッキング核酸は、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、ブロッキング核酸は、ポリメラーゼでは伸長できないように、３’末端でブロックされる、ことを特徴とするキット。
【請求項２】
標識化された連鎖停止ヌクレオチド三リン酸をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
標的配列と参照配列は、標的鎖と参照鎖を形成するために変性可能であり、および、ブロッキング核酸は、ハイブリダイズが可能となると、完全に相補的な参照鎖を含むホモ二本鎖を、部分的に相補的な標的鎖を含むヘテロ二本鎖を形成することができる、ことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
ブロッキング核酸と相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖は、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖よりも低い温度で変性する、ことを特徴とする請求項３に記載のキット。
【請求項５】
配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で標的鎖にアニーリングされることが可能であることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と結合する参照配列の鎖上の塩基の近くで参照配列の鎖に結合することができ、あるいは、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的である、ことを特徴とする請求項１−５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項７】
ブロッキング核酸の５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項１−６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項８】
ブロッキング核酸は一本鎖核酸である、ことを特徴とする請求項１−７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項９】
ブロッキング核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１−８のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１０】
ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択される、ことを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ブロッキング核酸と部分的に相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖を変性させるために必要とされる温度と、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるために必要とされる温度の差は最大化される、ことを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項９−１１のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１３】
５’−リン酸化プライマーをさらに含み、
５’−リン酸化プライマーは、配列決定プライマーと同じ鎖に相補的ではない、ことを特徴とする請求項１−１２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１４】
５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼをさらに含む、ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
標的配列または参照配列は、Ｋ−ＲＡＳエキソン２、コドン１２、および／または１３を含む、ことを特徴とする請求項１−１４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１６】
標的配列または参照配列はミトコンドリア変異を含む、ことを特徴とする請求項１−１４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１７】
ミトコンドリア変異はＭＥＬＡＳに関連付けられる、ことを特徴とする請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
標的配列または参照配列はＨＰＶ核酸を含む、ことを特徴とする請求項１−１４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１９】
標的配列または参照配列は、ＢＲＡＦエキソン１１および／またはエキソン１５を含む、ことを特徴とする請求項１−１４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２０】
配列決定のためにサンプル中の標的配列を調製するための方法であって、
前記方法は、
ａ）反応混合物を形成するために、ＤＮＡ配列決定反応混合物にサンプルを加える工程であって、
サンプルが参照配列を有し、１以上の標的配列を有する疑いもあり、ＤＮＡ配列決定反応混合物が、配列決定プライマーと、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的な過剰モル量のブロッキング核酸を含み、
ブロッキング核酸と配列決定プライマーが、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、
ブロッキング核酸が、ポリメラーゼによって伸長できないように３’末端でブロックされる、工程、
ｂ）変性した参照鎖と変成した標的鎖を形成するために、参照配列と標的配列の融解温度（Ｔｍ）よりも高い第１の変性温度に、標的配列を有している疑いのある反応混合物をさらす工程、
ｃ）ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖の形成と、ブロッキング配列と標的鎖のヘテロ二本鎖の形成を可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、
ｄ）ブロッキング核酸と相補的な標的鎖の前記ヘテロ二本鎖の変性を可能にするほどには十分であるが、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるには不十分である臨界温度（Ｔｃ）まで、反応混合物の温度を上げる工程、
ｅ）配列決定プライマーが反応混合物中の遊離標的鎖および遊離参照鎖にアニーリングされることを可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、および、
ｆ）伸長生成物を生成するために配列決定プライマーを伸長する工程であって、伸長生成物が標的配列の核酸配列の決定を可能にするために解析可能である工程を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
標的配列の核酸配列を決定する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列は、ジ−デオキシ配列決定、単一分子配列決定、パイロシーケンシング、または、第２世代ハイスループットシーケンシングによって決定される、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端に結合する参照鎖の塩基の近くで参照鎖に結合し、あるいは、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的である、ことを特徴とする請求項２０−２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
配列決定プライマーの３’末端とブロッキング核酸の５’末端は、参照鎖の同じ塩基の２つ以上に相補的である、ことを特徴とする請求項２０−２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
ブロッキング核酸の５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２０−２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）のブロッキング核酸は一本鎖核酸である、ことを特徴とする請求項２０−２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
ブロッキング核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項２０−２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択される、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
標的配列は参照配列に対して少なくとも５０％の相同性を有する、ことを特徴とする請求項２０−２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
ブロッキング核酸は、参照配列と長さが等しいか、参照配列よりも短い、ことを特徴とする請求項２０−３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で、参照配列の鎖にアニーリングされ得る、ことを特徴とする請求項２０−３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
配列決定プライマーは、ブロッキング核酸に対して過剰なモルで反応混合物に加えられる、ことを特徴とする請求項２０−３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
参照鎖とブロッキング核酸の二本鎖の融解温度は、標的鎖とブロッキング核酸のヘテロ二本鎖の融解温度よりも高い、ことを特徴とする請求項２０−３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、工程ａ）のサンプルとして、増幅産物の少なくとも一部を用いる前に、サンプル中の標的配列の少なくとも１つを増幅する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項２０−３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、サンプル中の標的配列の少なくとも１つを増幅する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項２０−３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３７】
増幅産物の一本鎖を選択的に分解させる工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
増幅プライマーが標識化されることによって、結果として生じる標識化された標的鎖が分解可能となる、ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
増幅プライマーは５’リン酸によって標識化され、前記方法は、５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼによって配列決定反応をインキュベートする、ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法はサイクル配列決定反応中の２以上のサイクルにわたって繰り返される、ことを特徴とする請求項２０−３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
前記反応混合物は核酸検出用色素を含む、ことを特徴とする請求項２０−４０のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この特許出願は、２０１１年２月２８日に出願された米国仮特許出願６１／４４７，４９０と、２０１１年９月９日に出願された米国仮特許出願６１／５３２，８８７の優先権の利益を請求し、両方の文献ともそのまま引用することによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（序論）
本発明は、他の参照配列を包含している核酸サンプル中の標的ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列決定における改善に関する。参照配列と標的配列は密接に関連づけられることもあり、例えば、標的配列は、参照配列の対立遺伝子、参照配列の変異型、あるいは、別の株または種からの参照配列であってもよい。特に、本発明は、標的配列ではなく参照配列の配列決定を妨げるために、ＤＮＡ配列決定反応の間のブロッキング核酸の使用に関する。
【０００３】
ＤＮＡの配列決定は、核酸の特定の領域に特異的な配列決定プライマーを用いることによって、特定のＤＮＡ配列の同定を可能にする。その方法は非常に強力で、配列決定プライマーがサンプル中の１つの配列にのみ特異的である限り、配列情報を迅速に提供する。配列決定において一般に遭遇する問題は、適切に分離することができない２つの配列を配列決定プライマーが可能にするように、配列の個体群が混合されるときである。関連する参照配列の背景において、標的配列を同定し配列決定する必要性は、新しく高度に発達した配列決定方法とともに依然として存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
関連する参照配列を有するサンプル中の標的ＤＮＡ配列を配列決定するためのキットおよび方法が、本明細書で提供されている。キットは、標的配列と参照配列の一本鎖の一部に相補的な配列決定プライマーと、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的で、標的配列の鎖とは完全には相補的ではないブロッキング核酸（ＢＮＡ）を含んでいる。配列決定プライマーとブロッキング核酸は参照配列の同じ鎖に相補的であり、ブロッキング核酸は、ポリメラーゼでは伸長できないように、３’末端でブロックされる。キットは、標識化された連鎖停止（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ヌクレオチド三リン酸を含んでもよい。
【０００５】
別の態様では、標的配列を増幅し、標的配列を配列決定するためのキットも提供される。加えて、上に記載されたキットへの要素に、これらのキットは、配列決定プライマーと同じようには標的配列の鎖と結合しない５’−リン酸化増幅プライマーも含んでいる。キットは、５’−リン酸を含む増幅産物を分解するためにラムダエキソヌクレアーゼを含んでもよい。
【０００６】
さらに別の態様では、配列決定のためにサンプル中の標的配列を調製する方法が提供される。該方法は、参照配列を有し、１つ以上の標的配列を有する疑いのあるサンプルを、反応混合物を形成するためのＤＮＡ配列決定反応混合物に加える工程を含んでいる。ＤＮＡ配列決定反応混合物は、配列決定プライマーと、過剰な量のブロッキング核酸を含んでいる。ブロッキング核酸は、参照配列の１つの鎖の少なくとも一部と完全に相補的であり、標的配列の一方の鎖と完全には相補的ではない。ブロッキング核酸は、ポリメラーゼで伸長できないように、３’末端でブロックされ、ブロッキング核酸および配列決定プライマーの両方は、参照配列の同じ鎖に相補的である。標的配列を有している疑いのある反応混合物は、変性した参照鎖と変性した標的鎖を形成するために、参照配列と標的配列の融解温度（Ｔｍ）以上である第１の変性温度にさらされる。その後、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖の形成、およびブロッキング配列と標的鎖のヘテロ二本鎖の形成を可能にするために、反応混合物の温度は下げられる。その後、反応混合物は、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の変性二本鎖と比較して、ブロッキング核酸と相補的な標的鎖の前記ヘテロ二本鎖を優先的に変性させるのに十分な臨界温度（Ｔｃ）にさらされる。配列決定プライマーが反応混合物中の遊離標的鎖および遊離参照鎖にアニーリングされることを可能にするために、その後、反応混合物の温度は下げられる。最後に、標的配列の核酸配列の決定を可能にするために解析可能な伸長生成物を生成するべく、配列決定プライマーは伸長される。
【０００７】
さらに別の態様では、標的配列は、上に記載された配列決定方法よりも前に、またはその方法と同時に、ＰＣＲを使用して増幅されてもよい。１つの実施形態では、増幅された標的配列の１つの鎖が選択的に分解されてもよい。適切に、分解された鎖は配列決定プライマーに相補的な鎖である。１つの実施形態では、５’−リン酸化増幅プライマーが配列決定プライマーとともにＰＣＲ反応に加えられ、標的配列が増幅される。５’−リン酸を含む増幅された標的配列の鎖を、ラムダエキソヌクレアーゼによるインキュベーションによって分解することができる。
【０００８】
本発明の他の実施形態と利点は、図面と以下の詳細な記載を再検討すると当業者に明白になるものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本明細書に記載の方法の描写である。
【図２】逆のＭ１３プライマーを用いる、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖと野生型のＤＮＡの１組の配列決定電気泳動法である。サンプルは８５％野生型で１５％Ｇ１２Ｖの変異ＤＮＡを包含している。
【図３】順方向Ｍ１３プライマーを用いる、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖと野生型のＤＮＡの１組配列決定電気泳動法である。サンプルは８５％野生型で１５％Ｇ１２Ｖの変異ＤＮＡを包含している。
【図４】Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｒの最初のＩｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲと、その後の逆方向のブロッキング核酸（ＢＮＡ）と逆方向Ｍ１３プライマーによる  ＢＬＯＣｋｅｒ（商標）配列決定の後の、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｒと野生型のＤＮＡの１組の配列決定電気泳動法である。ＰＣＲ用の最初のサンプルは、９９％野生型で１％Ｇ１２Ｖの変異ＤＮＡを包含している。最上部のパネルは、配列決定反応中に０ｎＭ  ＢＮＡを包含する反応の結果を示し、第２のパネルは、５０ｎＭ  ＢＮＡを包含する反応の結果を示し、第３のパネルは、７５ｎＭ  ＢＮＡを包含する反応の結果を示し、最下部のパネルは、１００ｎＭ  ＢＮＡを包含する反応の結果を示す。
【図５】Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｒの最初のＩｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲと、その後の順方向ＢＮＡおよび順方向Ｍ１３プライマーによるＢＬＯＣｋｅｒ配列決定の後の、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｒと野生型のＤＮＡの１組の配列決定電気泳動法である。ＰＣＲ用の最初のサンプルは、９９％野生型で１％Ｇ１２Ｖの変異ＤＮＡを包含している。最上部のパネルは、配列決定反応において０ｎＭ  ＢＮＡを包含する反応物の結果を示し、第２のパネルは、５０ｎＭ  ＢＮＡを包含する反応物の結果を示し、第３のパネルは、７５ｎＭ  ＢＮＡの反応物の結果を示し、最下部パネルは、１００ｎＭ  ＢＮＡの反応物の結果を示している。
【図６】実施例４に述べられるような逆方向プライマーと逆方向ＢＮＡを用いる、ミトコンドリア変異の１組の配列決定電気泳動法である。
【図７】ＨＰＶ１８Ｆ  ＢＮＡ（０−７５ｎＭのＢＮＡ滴定、７５．３°ＣのＴｃ）を用いる、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。
【図８】ＨＰＶ１８Ｆ  ＢＮＡ（７５ｎＭのＢＮＡ濃度、７４．２−８０．０°Ｃの変性温度（Ｔｃ））を用いる、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。
【図９】ＨＰＶ４５Ｆ  ＢＮＡ（０−７５ｎＭからＢＮＡ滴定、７６．３°Ｃの変性温度（Ｔｃ））を用いる、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。
【図１０】ＨＰＶ４５Ｆ  ＢＮＡ（５０ｎＭのＢＮＡ濃度、７４．２−８０．０°Ｃの変性温度（Ｔｃ））を用いる、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。
【図１１】ＨＰＶ５６Ｆ  ＢＮＡ（０、５０、７５、および１００ｎＭからのＢＮＡ滴定、７３．３°Ｃの変性温度（Ｔｃ））を用いる、ＨＰＶ９７とＨＰＶ５６の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。暗く強調された部分は、ＢＮＡを含まない混合物の、予想される配列結果のそれへの整列を可能にした。明るく強調された部分は、シーケンスがＨＰＶ５６とＨＰＶ９７の間で異なる部分である。
【図１２】ＨＰＶ９７Ｆ  ＢＮＡ（０、５０、７５、および１００ｎＭからのＢＮＡ滴定、７３．３°Ｃの変性温度（Ｔｃ））を用いる、ＨＰＶ５６とＨＰＶ９７の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。配列の暗く強調された部分は、ＢＮＡを含まない混合物の、予想される配列結果のそれへの整列を可能にした。配列の明るく強調された部分は、配列がＨＰＶ５６とＨＰＶ９７の間で異なる部分である。
【図１３】ＢＮＡを含まない配列決定と比較して、ＨＰＶ９７ＦまたはＨＰＶ５６Ｆ  ＢＮＡ（変性７５ｎＭのＢＮＡ濃度、７３．３°Ｃの変性温度（Ｔｃ））のいずれかを用いる、ＨＰＶ５６とＨＰＶ９７の混合物の１組の配列決定電気泳動法である。２つの株の間の配列の差が強調されている。
【図１４】大量の野生型のＫ−ＲＡＳという背景において、少量のＫ−ＲＡＳエキソン２変異を増幅し、配列決定するために使用されるプライマーとＢＮＡを含んでいる、Ｉｃｅ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよびＢＬＯＣｋｅｒ配列決定の戦略を示す図である。ボールド体の配列は、Ｋ−ＲＡＳエキソン２コード領域である。２つのイタリック体の領域は、ＰＣＲの第一ラウンドの中で使用される順方向および逆方向プライマーの位置を示す。下線を引いた配列は、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲ増幅反応で使用される順方向および逆方向プライマーの位置を示す。括弧内の領域は、ＬＮＡのとり込みの位置を示す、下線（Ｃ）によるＢＮＡの配列を示している。明るいグレー色の配列は、配列決定プライマーの位置を示す。
【図１５】ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ＢＬＯＣｋｅｒ配列決定、または標準サンガー配列決定の後に検知されるような、野生型のＤＮＡの背景において、Ｖ６００Ｅ変異の量の減少を示すＢＲＡＦエキソン１５の１組の配列決定電気泳動法である。矢印はＶ６００Ｅ変異の位置を示し、変異の検出限界が囲まれている。
【図１６】ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲおよびＢＬＯＣｋｅｒ配列決定の後に検知されるような野生型のＤＮＡの背景において、Ｇ４６９Ａ変異の量の減少を示す、ＢＲＡＦエキソン１１の１組の配列決定電気泳動法である。矢印は、Ｇ４６９Ｅ変異の位置を示し、変異の検出限界が囲まれている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
関連する参照配列を有するサンプル中の標的ＤＮＡ配列を配列決定するためのキットおよび方法は、本明細書で提供される。キットと方法は、配列決定反応の間にブロッキング核酸を追加することによって、関連する参照配列の背景において、標的配列を配列決定することを可能にする。本明細書に記載のキットおよび方法は、ＰＣＲ増幅と組み合わせされてもよい。
【００１１】
本明細書に記載のキットおよび方法は、部分的に配列相同性を有する配列の混合個体群の内部から標的核酸を同定したい様々な状況下で使用されてもよい。とりわけ、該キットと方法は、変異解析、特に体細胞変異解析に役立つものであってもよく、例えば、癌の進行、癌の予後、または小分子薬剤および生物学的薬剤の有効性、、モザイク性、またはミトコンドリアミオパチーに関連する変異を有する細胞または被験体を同定するために使用することができる。体細胞変異解析に用いるこの方法の他の潜在的な適用については、例えば、ｒｉｃｋｓｏｎ  ＲＰ．  （２０１０）  Ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．  ７０５（２）：９６−１０６を参照のこと。
【００１２】
実施例において、細胞の癌性の形質変換に関連することが知られているＫ−ＲＡＳおよびＢＲＡＦ中の変異を検知するためのアッセイと、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸酸性症、および脳卒中のようなエピソード）（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ，  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ−ｌｉｋｅ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ）の進行に関連したミトコンドリアＤＮＡ中の変異を検知するためのアッセイが実証されている。該方法とキットは、他の種類の低レベルのミトコンドリアのヘテロプラスミーを同定するために使用されてもよい。加えて、該方法とキットは、感染などの間に、潜在的に混合する個体群における株または種の表示を決定するためにも役立つ。実施例において、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）株１８および４５、または、該ウイルス株５７および９６は、混合個体群内で区別された。ウイルス（例えば、ＨＩＶ）への感染または細菌感染の薬物療法中に進行する抗生物質耐性の変異を同定するために、該方法を使用することもできる。当業者には、本明細書に記載されたキットと方法の他の用途が理解されよう。
【００１３】
図１は、本発明の方法およびキットによる配列決定のための標的配列の調製を例証している。まず初めに（図１、工程１、上方左隅）、核酸サンプルは、二本鎖の参照配列（１０）（例えば、野生型の配列）と、二本鎖の標的配列（１２）（例えば、変異配列）を含有している。配列決定反応混合物は、サンプル、配列決定プライマー（１６）、他の配列決定成分、例えば、そのいくつかが標識化されるヌクレオチド三リン酸塩（ＮＴＰ）、および、連鎖停止ＮＴＰまたはジデオキシＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、および、２５ｎＭのような超過濃度レベルのブロッキング核酸（１４）を包含している。標的配列および参照配列と比較して、ブロッキング核酸は適切に、過剰なモル濃度レベルで存在する。
【００１４】
図１では、描かれたブロッキング核酸（１４）は、参照配列（１０）の鎖（１０Ａ）の１つと相補的な一本鎖核酸配列である。ブロッキング核酸（１４）および配列決定プライマー（１６）は、参照配列（１０）の同じ鎖に相補的であり、ブロッキング核酸（１４）は、ポリメラーゼによって伸長されることがないように３’末端でブロックされる。
【００１５】
図１の工程１の反応混合物は、第１の変性温度、例えば９５°Ｃに１５秒間さらされ、その結果、（参照鎖と標的鎖をもたらすために）参照配列（１０Ａ）、（１０Ｂ）と、標的配列（１２Ａ）、（１２Ｂ）の変性鎖がもたらされる。その後、反応混合物は、例えば、１２０秒間７０°Ｃでハイブリダイゼーションを促進するために冷やされる。ブロッキング配列核酸（１４）が、参照配列の相補鎖（１０Ａ）や標的配列の相補鎖（１２Ａ）とも優先的にハイブリダイズすることが可能となるように、温度低下は、過剰な量のブロッキング核酸（１４）の存在下で起こる。図１の工程２は、７０°Ｃでのハイブリダイゼーション後の反応混合物の状態を説明している。ブロッキング核酸（１４））と相補的な参照鎖（１０Ａ）のホモ二本鎖（１８）、および、ブロッキング核酸（１４）と相補的な標的鎖（１２Ａ）のヘテロ二本鎖（２０）に加えて、反応混合物は、参照配列と標的配列の変性したマイナス鎖（１０Ｂ）および（１２Ｂ）をそれぞれ含有している。相補鎖と標的鎖のヘテロ二本鎖と同様に、相補鎖と標的鎖のホモ二本鎖もあってもよく、反応中の過剰なブロッキング核酸は、これらの複合体の量を最小化するために設計される。
【００１６】
図１の工程３では、反応混合物はその後、臨界温度「Ｔｃ」（例えば、８４．５ °Ｃ）にさらされ、この温度は、標的鎖（１２Ａ）とブロッキング核酸（１４）のヘテロ二本鎖（２０）の優先的な変性を可能にするために選ばれる。適切に、工程３の温度は、臨界温度まで上昇するように、工程２で使用される温度よりも高い。反応混合物がＴｃでインキュベートされる際に、ブロッキング核酸（１４）と相補的な参照鎖（１０Ａ）の二本鎖（１８）がほとんど変性しないままであるように、臨界温度（Ｔｃ）を選択する。ブロッキング核酸（１４）と標的鎖（１０Ｂ）の二本鎖（２０）の融解温度は常に、ブロッキング核酸（１４）と相補的な参照鎖（１０Ａ）の二本鎖（１８）の融解温度未満である。というのも、ブロッキング核酸（１４））は参照鎖（１０Ａ）の少なくとも一部と完全に相補的であるため、標的鎖（１２Ａ）と少なくとも１つのミスマッチがあるからである。
【００１７】
図１の工程４を参照すると、優先的な変性の後、反応混合物の温度は、反応混合物中の遊離標的鎖（１２Ａ）にアニーリングされることが可能となるように、例えば、５０ °Ｃに下げられる。図１の工程４は、配列決定プライマー（１６）が遊離参照鎖（１０Ｂ）または遊離標的鎖（１２Ｂ）には結合しないが、遊離標的鎖（１２Ａ）にのみ結合することを例証している。配列決定プライマー（１６）は、残りの遊離参照鎖（１０Ａ）に有効にアニーリングされることができず、あるいは、残りの遊離参照鎖（１０Ａ）の配列決定をかのうにするために伸長されること不可能である。なぜなら、参照鎖（１０Ａ）はブロッキング核酸（１４）とハイブリダイズし、ブロッキング核酸（１４）にハイブリダイズされた参照鎖（１０Ａ）の少なくとも一部が配列決定に利用できないからである。配列決定プライマーは、それが過剰なブロッキング核酸中に存在するように、反応混合物に適切に加えられ、配列決定プライマーは、標的鎖：配列決定プライマー二本鎖が優先的にブロッキング核酸配列二本鎖に対して形成されるように、ＢＮＡに対して過剰なモルで存在する。その後、アニーリングされた配列決定プライマー（１６）を伸長するために、反応混合物の温度を例えば６０ °Ｃに上昇させてもよい。あるいは、サイクル配列決定反応は、伸長生成物を濃縮するために、図１の工程１−４を繰り返すことによって完成することができる。図１で示される方法は、個々のプロトコルについて最適化でき、かつ、最適化されなければならない。
【００１８】
最後に、標的配列の核酸配列は、当業者に既知のＤＮＡ配列決定方法を用いて決定されてもよい。例えば、標識化された連鎖停止ヌクレオチドは、サンガー配列決定またはジ−デオキシ配列決定のための伸長生成物を調製するために、ＤＮＡ配列決定反応混合物に含まれてかまわない。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）、４５４（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＳＯＬｉＤ（登録商標）システム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓのような様々な次世代プラットフォーム、または第３世代の配列決定プラットフォームなどの他の配列決定方法が使用されてもよいことが当業者には理解されよう。提案されたパイロシーケンス方法は以下の工程を含む：（１）標的配列のＰＣＲ、（２）アルカリ変性、（３）一本鎖鋳型を精製、（４）ブロッキングプリマーを７０ °Ｃでアニーリング、（５）Ｔｃへの温度上昇、（６）任意の非結合のブロッキングプライマーを取り除くための十分可能な洗浄工程、（７）配列決定プライマーをアニーリングするために温度を下げる、（８）室温まで冷まして、標準的なＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ反応で処理する。
【００１９】
上に記載されたように、該キットと方法は、標的配列および参照配列の１つの鎖の一部に相補的な配列決定プライマーを含んでいる。配列決定プライマーは、標的配列の鎖の一部に完全に相補的であり、参照配列の鎖の一部に完全に相補的であってもよい核酸である。配列決定プライマーは、参照鎖と標的鎖にアニーリングされることができ、その結果、ポリメラーゼが配列決定プライマーに付けられ、配列決定プライマーを伸長することができる。配列決定プライマーは一般にＤＮＡであるが、ＲＮＡであってもよく、修飾ヌクレオチドを包含してもかまわない。配列決定プライマーは、最小の二次構造を有し、かつ参照鎖と標的鎖の再アニーリングを阻害するために設計されてもよい。配列決定プライマーは、臨界温度（Ｔｃ）未満のアニーリング温度を適切に有している。配列決定方法に精通している当業者は、該キットと方法に使用するための配列決定プライマーを設計することができる。コンピュータプログラムは、適切な配列決定プライマーおよびブロッキング核酸（例えば、オリゴおよびＰｒｉｍｅｒ３）を設計する際に使用するために当業者が利用可能である。
【００２０】
標的配列は、混合サンプル、または、潜在的に参照配列を含む混合サンプル内で決定したい配列である。標的配列は、対応する参照配列ほどには核酸サンプル中では見られない核酸を指す。標的配列は、サンプル中で、参照配列＋標的配列の総量の０．０１％から９９％以上までを構成してもよい。検出の下限はサンプルの大きさに基づき、その結果、サンプルは、標的配列を配列決定することができるために少なくとも１つの増幅可能な標的配列を包含していなければならない。実施例において示されるように、参照配列＋標的配列の合計の５０％、１５％、１％、または０．５％存在する際にも、該方法を用いて標的配列を配列決定することができる。参照配列の背景において、標的配列の検出限界を増加させるために、標的配列の選択的な増幅の他の方法と、本明細書に記載される方法を組み合わせることができることが予想されよう。実施例において示されるように、本明細書に記載の方法は、国際特許公開公報ＷＯ２０１１／１１２５３４で記載されるような、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲにさらされたサンプル上で使用されてもよく、該文献はそのまま引用によって本明細書に組み込まれる）。ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲを本明細書に記載のＢＬＯＣｋｅｒ配列決定方法と組み合わせたときの実施例で示される検出限界は、それ自体で使用されるいずれかの方法よりも低い。例えば、検出限界は、参照配列の背景において、０．０１％未満であってもよい。さらなる最適化によって、標的配列の単一配列が参照配列の背景において、検知可能な点まで、検出限界を下げることができると我々は予想する。
【００２１】
標的配列は、限定されないが、体細胞変異、ミトコンドリア変異、株、または種を含んでもかまわない。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は、多くの正常細胞とわずかな癌細胞および／または遊離循環腫瘍ＤＮＡを含有してもよい。正常細胞は、変異体ではない対立遺伝子または野生型の対立遺伝子を含有するが、少数の癌細胞と低レベルの遊離循環腫瘍ＤＮＡは体細胞変異を含有する。この場合、変異体は標的配列であり、その一方で野生型の配列は参照配列である。標的配列は参照配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが異ならなければならないが、対応する参照配列に対して少なくとも５０％相同でなければならない。配列決定プライマーは、標的配列および参照配列の両方に結合することができなければならない。本明細書で使用されているように、「標的鎖」は、標的配列の１つの核酸鎖を指す。
【００２２】
参照配列は、核酸サンプル中に存在し、ブロッキング核酸を用いることなく従来の配列決定方法によって標的配列の有効な配列決定を阻害する、核酸を指す。参照配列は、本明細書に記載の方法の使用前に、サンプル中の参照配列と標的配列の合計の０．０１％〜９９％を構成してもよい。検出の下限はサンプルの大きさに基づき、その結果、参照配列を配列決定することができるよう、サンプルは、少なくとも１つの増幅可能な参照配列を包含していなければならない。上述のとおり、検出限界は、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲのような他の方法を用いて、本明細書に記載の方法を組み合わせることによって最適化されてもよい。本明細書で使用されているように、「参照鎖」は、参照配列の１つの核酸鎖を指す。
【００２３】
参照配列は野生型とも呼ばれることもある。用語「野生型」は、個体群中の特定の遺伝子に関して、最も一般的なポリヌクレオチド配列または対立遺伝子を指す。一般に、野生型対立遺伝子は正常細胞から得られる。
【００２４】
標的配列は変異配列と呼ばれることもある。用語「変異体」は、核酸配列中のヌクレオチドの変化（すなわち、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、逆位、欠失、または挿入）を指す。変異に耐える核酸は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列とは配列において異なる核酸配列（変異対立遺伝子）を有している。本発明は、体細胞変異と多型性に広く関連している。本明細書に記載の方法は、参照鎖と比較して、１つ以上のヌクレオチド配列変化を包含している標的鎖を選択的に濃縮する際に役立つ。標的配列は、病変組織または細胞から通常は得られ、疾患状態に関連付けられるか、疾患状態の前兆となるか、あるいは、与えられた処置の有効性の前兆となるものであってもよい。
【００２５】
標的配列と参照配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、寄生虫のＤＮＡ、または、細菌ＤＮＡを含む様々なソースから得ることができる。参照配列は一般に野生型で、標的配列は変異体であるが、逆もまた真実であることもある。変異体は１つ以上のどんなヌクレオチドの欠失、挿入、または変化を含んでもよい。標的配列は、細胞中の癌、異なる組織または血液中の変異を含む細胞の欠失による癌の転移、癌または別の疾患の予後、治療薬に対する薬物または化学療法の感受性、治療薬に対する癌または微生物の耐性、またはミトコンドリアヘテロプラスミーなどの体細胞変異に関連する疾患の存在を示す配列であってもかまわない。
【００２６】
ブロッキング核酸は、オリゴヌクレオチドなどの操作された一本鎖核酸配列であり、好ましくは標的配列よりも短い長さを有する。ブロッキング核酸は参照配列よりも適切に小さい。ブロッキング核酸は、ブロッキング核酸と標的鎖の二本鎖の融解温度と、ブロッキング核酸と参照鎖の二本鎖の溶解温度を区別することを可能にする組成でなければならない。ブロッキング核酸の３’−ＯＨ末端は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長に対してブロックされ、５’−末端はＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシス（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓ）を避けるために修飾されてもよい。ブロッキング核酸は、反応混合物が臨界温度「Ｔｃ」にさらされる際に、参照配列にアニーリングされたままの他の形状（例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、あるいは、別の修飾されたヌクレオチドの間のキメラなど）をとることもできる。ブロッキング核酸中のＰＮＡ、ＬＮＡ、または他の修飾ヌクレオチドは、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択されてもよい。そのような設計は、ブロッキング核酸と部分的に相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖を変性させるために必要とされる温度と、ブロッキング核酸と完全に相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるために必要とされる温度の間の差を最大限にする。代替的に、または、加えて、修飾ヌクレオチドの位置は、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度を有するようにブロッキング核酸を設計するために選択されてもよい。
【００２７】
ブロッキング核酸は多くの形態をとることができるが、好ましい形態は一本鎖の非伸長性のＤＮＡである。適切に、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端の近くの、あるいはブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的な位置に結合する。代替的な実施形態では、配列決定プライマーは、３−５の塩基によってブロッキング核酸に重複する。この実施形態では、配列決定するために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換または非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。別の代替案では、配列決定プライマーおよびブロッキング核酸は重複しない。配列決定プライマーおよびブロッキング核酸が重複しない場合、配列決定反応のために非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。より具体的には、好ましいブロッキング核酸は以下の特徴を有する：
（ａ）一本鎖核酸を含む；
（ｂ）参照配列の少なくとも一部と完全に相補的である：
（ｃ）配列決定プライマーと同じ参照配列の鎖に相補的である；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ伸長にブロックされる３’−末端を含有している。
【００２８】
ブロッキング核酸は、いくつかの方法の１つで合成可能である。まず、ブロッキング核酸は、配列の３’−末端の修飾を可能にする標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて、直接的な合成によって作ることができる。あるいは、ブロッキング核酸は、最終生成物として一本鎖ＤＮＡを生成するＰＣＲ反応の間に、ポリメラーゼ合成によって作ることができる。この場合、生成された一本鎖は、ブロッキング核酸に必要な正確な配列に相当する。ポリメラーゼ合成によって一本鎖ＤＮＡを合成する方法は、当業者に周知である。あるいは、一本鎖ブロッキング核酸は、固体の支持体上で二本鎖ＰＣＲ生成物と結合することによって合成可能である。これは、ビオチン化されるプライマー対のひとつを用いて、標準的なＰＣＲ反応を行なうことにより遂行される。ＰＣＲの後、ＰＣＲ生成物は、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体（例えば、電磁ビーズ）でインキュベートされ、ビーズに結合することが可能となる。その後、温度を２−３分間９５°Ｃに上げることで、ＤＮＡを変性して、固定化されたＰＣＲ生成物からビオチン化されていないＤＮＡ鎖を溶液に放出する。相補的ＤＮＡ鎖を含む磁気ビーズはその後取り除かれ、溶液中に残っている一本鎖生成物は、ブロッキング核酸として役立つ。
【００２９】
一本鎖ブロッキング核酸が使用される前に、３’−末端はポリメラーゼ伸長を防ぐためにブロックされる。３’−末端は、リン酸基、アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、または、５’から３’のポリメラーゼ伸長をブロックする他の部分を含有することもある。これは当業者に周知のいくつかの方法で遂行することができる。例えば、一本鎖ブロッキング核酸の末端に単一のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を加えるために、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）による反応は、溶液中のｄｄＮＴＰの存在下で用いられ得る。ｄｄＮＴＰは、ポリメラーゼ伸長をブロックする役目をする。あるいは、ブロッキング核酸の３’−末端に相補的なオリゴヌクレオチド鋳型は、一過性の二本鎖構造を提供するために使用することができる。その後、ポリメラーゼは、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの逆のブロッキング核酸の３’−末端に、単一のｄｄＮＴＰを挿入するために使用され得る。
【００３０】
ブロッキング核酸は、参照鎖と標的鎖の合計量を超えて（すなわち、モル過剰で）存在しなければならない。ブロッキング核酸の必要とされる量は、当業者によって経験的に決定されることもある。一般に、ブロッキング核酸の量は５ｎＭを超えている。実施例は、プロトコルで２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、および１００ｎＭのブロッキング核酸を用いて、データを提供している。一般に、配列決定プライマーは、ブロッキング核酸と比較して、過剰モル濃度で反応混合物中に存在するように、加えられなければならない。
【００３１】
融解温度または「Ｔｍ」は、ポリヌクレオチドがその相補的配列から解離する温度を指す。一般的に、Ｔｍは、ニ本核酸分子中のワトソンクリック塩基対の半分が破壊または解離し（すなわち、「溶解している」）、その一方で、ワトソンクリック塩基対のもう半分が二本鎖構造中でインタクトなままである、温度として定義されてもよい。言いかえれば、Ｔｍは、２つの相補的配列のヌクレオチドの５０％がアニーリングされ（二本鎖）、ヌクレオチドの５０％が変性される（一本鎖）、温度として定義される。したがって、Ｔｍは、二本鎖核酸分子から一本鎖核酸分子への移行時（または、逆に、一本鎖核酸分子から二本鎖核酸分子への移行時）の中間点を定義する。
【００３２】
Ｔｍは、多くの方法、例えば、Ｗｅｔｍｕｒ  １９９１（Ｗｅｔｍｕｒ，  Ｊ．  Ｇ．  １９９１．  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：  ２２７−２５９）のように最近接計算（ａ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）、および、Ｏｌｉｇｏ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎやインターネットで利用可能なプログラムを含む市販のプログラムによって、推定可能である。あるいは、Ｔｍは実際の実験を介して決定可能である。例えば、二本鎖ＤＮＡ結合、あるいは、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ（登録商標）−ｇｒｅｅｎ（分子プローブ）などの挿入色素は、核酸の実際のＴｍを決定するために、融解曲線アッセイで使用され得る。核酸のＴｍを決定するための追加の方法は、当該技術では周知である。
【００３３】
用語「臨界温度」または「Ｔｃ」は、標的鎖とブロッキング核酸の二本鎖を優先的に変性するために選択された温度を指す。反応混合物がＴｃでインキュベートされる際にブロッキング核酸と相補的な参照鎖からなる二本鎖はほとんど未変性のままであるが、ブロッキング核酸と標的鎖からなる二本鎖がほとんど変性するように、臨界温度（Ｔｃ）は選択される。「ほとんど」という用語は、所定の変性型または未変性型の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、または、さらに好ましくは少なくとも９８％を意味する。
【００３４】
（サンプル）
サンプルは、対象の核酸（標的配列と参照配列）を含有するまたは含有すると推定される任意の物質を含み、あるいは、それ自体は、対象の標的核酸を含有するまたは含有すると推定される核酸である。ゆえに、サンプルという用語は、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、流体、または、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便、皮膚の外分泌物、気道、腸管、および、泌尿生殖器、唾液、血球、生検、腫瘍、器官、組織、インビトロの細胞培養物成分のサンプル、自然分離株（飲用水、海水、固形物など）、微生物標本、および、核酸トレーサー分子で「標識化」された標本を含む物質のサンプルを含む。
【００３５】
本発明の核酸配列は、例えば、本明細書に記載の方法で使用する前に、ポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅することができる。増幅産物は、増幅された標的配列の一本鎖を選択的に分解することにより直接配列決定されてもよい。二本鎖ＤＮＡ生成物の一本鎖を選択する１つの方法は、一本鎖のブロッキング核酸の調製に関して上に記載されており、すなわち、一本鎖はビオチン化されてもよく、ストレプトアビジンでコーティングされたカラムまたは固体支持体に結合されてもよい。その後、ビオチン化されていない鎖は、ビオチン化されていない鎖の配列決定を可能にするために、鎖を変性させることによって、および、アビジンでコーティングされた固体支持体に結合されたビオチン化された鎖を取り除くことによって、精製可能である。あるいは、実施例に述べられているように、ＰＣＲ反応は、配列決定プライマーに加えて５’−リン酸化増幅プライマーを用いて実行可能であり、それによって、生成物の一本鎖は５’リン酸を含む。その後、この鎖は、実施例で使用されたラムダエキソヌクレアーゼなどの５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼによるインキュベーションによって分解され得る。
【００３６】
核酸配列は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはゲノムＤＮＡからのものであってもよい。これらの核酸は、当業者に既知の方法によって、組織または細胞から分離することができる。相補的ＤＮＡまたはｃＤＮＡも、当業者に既知の方法によって生成されてもよい。あるいは、本発明の核酸配列は、当該技術で周知の方法によって血液から分離することができる。
【００３７】
実施例で示されるように、Ｋ−ＲＡＳエキソン２、コドン１２、および／または１３の変異を検知し、配列決定することができる方法およびキットが提供される。これらの変異の検知は、薬物耐性の腫瘍細胞の存在または発生を決定するのと同様に、癌の被験者の予後を決定するために重要である。セツキシマブおよびパニツムマブなどの上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニストは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）処置に有効になりうる治療薬である。ＣＲＣ腫瘍の４０％が活性化Ｋ−ＲＡＳエキソン２、コドン１２、および、１３の変異を有しており、これらの変異がＥＧＦＲアンタゴニストに対する乏しい反応に関係づけられてもよいことが分かっている。そのような診断バイオマーカーの非常に高感度な検出は、薬物耐性の腫瘍細胞個体群の存在または発生を決定するのに必要である。
【００３８】
実施例において、ブロッキング核酸は、位置３２４３（Ａ→Ｇ）で既知のミトコンドリア変異を配列決定および同定するのを可能にするために使用された。この変異は、ミトコンドリアゲノム中の９つの確認されたＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸酸性症、および脳卒中のようなエピソード）変異のうちの１つである。したがって、本発明の方法およびキットは、疾患に関連する低レベルの変異を有する被験体を同定するために使用することができる。
【００３９】
同様に、実施例において、該方法はＨＰＶの株を区別するためにも使用される。実施例は、ＨＰＶ１８および４５、またはＨＰＶ５６および９７の混合物を含むサンプルが区別され得ることを実証している。そのような株の識別は、疫学的研究にとって重要なこともあり、処置の決定に影響を与えることもある。
【００４０】
実施例は、０．５％の検出限界で２つのＢＲＡＦ変異（Ｖ６００Ｅ（エキソン１５）およびＧ４６９Ａ（エキソン１１））を検知するために、該方法を使用することができることを実証している。これらのＢＲＡＦ変異は特定のメラノーマ中の癌に関連付けられる。Ｋ−ＲＡＳに関して上に記載されたように、これらの変異の検出は、癌の被験者の予後を決定するのに重要で、化学療法の有効性を決定するのに適切だと分かることもある。
【００４１】
以下の実施例は、単に例証目的に過ぎず、本発明または添付の請求項の範囲を限定するものとは意味しない。本明細書で引用される文献はすべて、そのまま引用されることによって本明細書に組み入れられる。
【００４２】
（実施例）
実施例１．Ｋ−ＲＡＳエキソン２逆方向ＢＮＡを用いる標準ＰＣＲの後のＫ−ＲＡＳ  ＢＬＯＣｋｅｒ配列決定
Ｋ−ＲＡＳエキソン２、コドン１２、および、１３での変異は、いくつかの癌で見られ、特定の抗がん剤に対する耐性に関連付けられる。したがって、これらのＫ−ＲＡＳ変異を含むサンプルまたは被験体を同定するためのアッセイは有益であるとされる。多くの場合、個体群が混成であるので、これらの変異を同定するのは難しい。
【００４３】
ブロッキング核酸（ＢＮＡ）は、野生型のＫ−ＲＡＳ配列に特異的に結合するように設計され、特に明記されない限り、Ｅｘｉｑｏｎによって作られた。この実験に使用されたＢＮＡおよび配列決定プライマーは、以下のとおりであった。
【００４４】
【表１】
2014507950.tif 000003
【００４５】
ここで、下線を引いたヌクレオチドはＬＮＡであり、他のヌクレオチドは従来のヌクレオチドである。
ＢＮＡと配列決定プライマーの間に重複はなかった。
【００４６】
核酸サンプルは標準的なプロトコルを用いて調製され、コドン１２変異を含む核酸（Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ；ＧＴＴ；５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＴ−３’；配列番号：３；下線を引いた塩基が変異部位である）は、全核酸の１５％を表し、サンプルの残りの８５％は野生型のゲノムＤＮＡ（ＧＧＴ；５’−ＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴ−３’；配列番号：４；下線を引いた塩基が変異の部位である）であった。ＢＮＡ（２５ｎＭ）および核酸は、標準的なサイクル配列決定反応混合物（ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｕｒｅ）に加えられた。
【００４７】
配列決定反応混合物を１５秒間９５ °Ｃで変性させ、次に、参照鎖と標的鎖に対するＢＮＡのハイブリダイゼーションを可能にするために、温度を４５秒間で７０ °Ｃに下げた。その後、ＢＮＡと標的鎖の二本鎖が変性することを可能にするために、３０秒間８１ °ＣのＴｃに反応混合物をさらした。その後、配列決定プライマーが遊離標的鎖にアニーリングされ得るように、１０秒間５０ °Ｃの温度に反応混合物をさらした。最後に、伸長生成物を生成させるために、６０ °Ｃで２５秒間、配列決定プライマーの伸長を処理した。ＡＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で読み取られるのに十分な配列を生成するために、上記のサイクルを４０時間繰り返した。
【００４８】
図２に示されるように、Ｇ１２Ｖ  Ｋ−ＲＡＳ変異は、ＢＮＡを含まない配列決定反応中で合計１５％に存在する場合には検知するのが難しかった（中央の痕跡の強調された塩基の小さなピークを参照）が、配列決定反応が野生型の配列を対象とするＢＮＡを含んでいた場合、検出は増加した（最上部の痕跡において、２つのピークが比較的等しい量で存在している）。顕著に、野生型のみの配列決定反応にＢＮＡを含めることは、配列決定する能力を完全にはブロックしなかったが、ピークの大きさ（規模）を減らしただけであった。
【００４９】
実施例２：Ｋ−ＲＡＳエキソン２順方向ＢＮＡを用いる標準的なＰＣＲの後のＫ−ＲＡＳ  ＢＬＯＣｋｅｒ配列決定
ブロッキング核酸（ＢＮＡ）は、特に野生型のＫ−ＲＡＳ配列の逆鎖に特異的に結合するように設計された。この実験に使用されたＢＮＡおよび配列決定プライマーは以下のとおりであった：
【００５０】
【表２】
2014507950.tif 000004
【００５１】
ここで、下線を引いたヌクレオチドはＬＮＡであり、他のヌクレオチドは従来のヌクレオチドである。ＢＮＡと配列決定プライマーの間に重複はなかった。
【００５２】
核酸サンプルは標準的なプロトコルを用いて調製され、コドン１２変異を含有する核酸（Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ；５’−ＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧ−３’；配列番号：７；下線を引いた塩基は変異部位である）は、総核酸の１５％を表し、サンプルの残りの８５％は野生型のゲノムＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧ−３’；配列番号：８；下線を引いた塩基は変異の部位である）であった。ＢＮＡ（２５ｎＭ）および核酸は標準的なサイクル配列決定反応混合物に加えられた。実施例１に上に述べられているように、サイクル配列決定反応は完了した。したがって、サイクル配列決定は、参照配列の各鎖に特異的なＢＮＡの設計によって双方向の配列決定に使用され得る。
【００５３】
図３で示されるように、Ｇ１２Ｖ  Ｋ−ＲＡＳ変異は、ＢＮＡを含まない配列決定反応中に合計の１５％で存在する場合、検出が困難であった（中央の痕跡中の強調された塩基の小さなピークを参照）が、配列決定反応が野生型のシーケンスを対象としたＢＮＡを含んでいた場合、検出は増加した（最上部の痕跡中に２つのピークが明らかに存在する）。顕著に、野生型のみによる配列決定反応にＢＮＡを含めることは、再度、配列決定する能力を完全にはブロックしなかったが、ピークの大きさ（規模）を減らすだけだった。
【００５４】
実施例３：Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ変異のＣＯＬＤ−ＰＣＲ検出後のＫ−ＲＡＳ  ＢＬＯＣｋｅｒ配列決定の例
近年、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ＣＯ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｌｏｗｅｒ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ＰＣＲ；  Ｍｉｌｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１１  Ｊａｎ  １；３９（１）：ｅ２．）は、Ｋ−ＲＡＳエキソン２変異の検出限界を劇的に改善することが分かっている。国際特許公開広報ＷＯ２０１１／１１２５３４も参照。ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲでは、変異ＤＮＡ（Ｍｕｔ）は、野生型の（ＷＴ）ＤＮＡの存在下で優先的に増幅される。ＷＴ鎖の１つに相補的な参照配列オリゴヌクレオチド（ＲＳ−オリゴ）の使用により、ＷＴ配列の直線的な増幅がもたらされるが、任意のＭｕｔ配列の指数関数的な増幅が結果として生じる。ＲＳ−オリゴは、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））を包含してもよく、これは、ＲＳ−オリゴ：Ｍｕｔ  ＤＮＡ二本鎖と比較して、ＲＳ−オリゴ：ＷＴ  ＤＮＡ二本鎖間の変性温度の差を増加させる。ＰＣＲは、第一回ＰＣＲ中のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼと、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ中のオプティマーゼを用いて、Ｍｉｌｂｕｒｙらによって記載されたように実行された。Ｋ−ＲＡＳ配列内のＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲに使用されたプライマーおよびＲＳ−オリゴの位置を描く図については、図１４（配列番号：１４）を参照する。用いられるプライマーおよびＲＳ−オリゴは以下のとおりである：
【００５５】
【表３】
2014507950.tif 000005
【００５６】
ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲの検出限界を高めるために、ＢＮＡの使用はサイクル配列決定反応にまで拡張される。ここで、ＬＮＡを包含するオリゴ（ＢＮＡ）は、野生型のＤＮＡの配列決定をブロックし、任意の変異を包含しているＤＮＡ配列決定（ＢＬＯＣｋｅｒ配列）を可能にする。ブロックを生じさせるためには、変性工程（臨界温度Ｔｃでの）と同様に追加のハイブリダイゼーション工程も、サイクル配列決定工程に加えられる。Ｔｃは、ＢＮＡ：ＷＴ  ＤＮＡ複合体がインタクトなままであるが、ＢＮＡ：Ｍｕｔ  ＤＮＡ複合体は変性する温度である。この例ではＢＮＡの５’末端に重複する配列決定プライマーは変異配列にアニーリングされ、その後に伸張する。
【００５７】
ブロッキング核酸（ＢＮＡ）は、野生型のＫ−ＲＡＳ配列に特異的に結合するように設計された。
この実験に使用されるＢＮＡおよび配列決定プライマーは以下のとおりであった。
【００５８】
【表４】
2014507950.tif 000006
ここで、下線を引いたヌクレオチドはＬＮＡであり、他のヌクレオチドは従来のヌクレオチドである。イタリック体の塩基は、配列決定プライマーとＢＮＡの重複を表す。
【００５９】
核酸サンプルは、標準的なプロトコルを用いて調製され、コドン１２変異を包含する核酸（Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ；  ５’−ＧＣＣＡＣＧ／ＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：１９）、および、５’−ＧＡＧＣＴＣ／ＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号：２０））；（下線を引いた塩基は、最初に列挙された標的または変異の配列とスラッシュの後の野生型の配列による変異の部位を示す）は、最初のＰＣＲ実験に加えられた全核酸の１％を表し、サンプルの残りの９９％は野生型のゲノムＤＮＡであった。ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ反応からのＢＮＡ（５０ｎＭ、７５ｎＭ、または１００ｎＭ）および核酸は、標準的なサイクル配列決定混合物に加えられた。ハイブリダイゼーション時間が１２０秒で、サイクル配列決定伸長時間が４５秒であったことを除けば、サイクル配列決定反応は実施例１に上に述べられているように完了した。したがって、本発明の方法はＰＣＲ濃縮方法と組み合わせることができる。
【００６０】
図４および５に示されるように、Ｋ−ＲＡＳ変異は、全配列の１％しか存在しないとき、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲの後でさえＢＮＡを含まない配列決定反応で検知するのは難しかった（０ｎＭ；最上部の痕跡中の強調された塩基の２つのピークを参照）が、配列決定反応が野生型の配列を対象としたＢＮＡを包含していた場合、検出は増加した（大きな方のピークは次の３つの痕跡のそれぞれにおいて変異配列を表わす）。
【００６１】
実施例４：ミトコンドリア体細胞変異の検出
ＢＬＯＣｋｅｒ配列決定は、位置３２４３（Ａ→Ｇ）で既知のミトコンドリアの変異を含むサンプル上で行なわれた。この変異は、ミトコンドリアゲノム中の９つの確認されたＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸酸性症、および脳卒中のようなエピソード）変異のうちの１つである。下記の実施例は、逆方向ブロッキング核酸を用いて逆方向に配列決定を反映する。
【００６２】
ブロッキング核酸（ＢＮＡ）は、野生型のミトコンドリア配列に特異的に結合するように設計された。この実験に使用されたＢＮＡおよび配列決定プライマーは以下のとおりであった：
【００６３】
【表５】
2014507950.tif 000007
【００６４】
ここで、下線を引いたヌクレオチドはＬＮＡであり、他のヌクレオチドは従来のヌクレオチドである。イタリック体で示されるＢＮＡと配列決定プライマーの間に４つの塩基の重複があった。
【００６５】
核酸サンプルは、標準的なプロトコルを用いて調製され、変異を包含する核酸（５’−ＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧ；配列番号：２３；下線を引いた変異）は、全核酸の１０％を表し、サンプルの残りの９０％は野生型のゲノムＤＮＡ（５’−ＧＧＣＡＧＡＧＣＣＣＧ；配列番号：２４；下線の野生型の塩基）であった。ＢＮＡ（１５および２５ｎＭ）および核酸は、標準的なサイクル配列決定反応混合物に加えられた。サイクル配列決定反応は実施例１で上に述べられたように完了し、ハイブリダイゼーション時間は１２０秒、サイクル配列決定反応伸張時間は４５秒で、サイクルの総数を５０にまで増やした。
【００６６】
図６で示されるように、ミトコンドリアの変異は、ＢＮＡを含まない配列決定反応中で検出することは困難であった（最下部の痕跡の強調された塩基の小さなピークを参照）が、配列決定反応が野生型の配列をブロックするＢＮＡを含んでいた場合、検出は増加した（最上部の痕跡と最上部から三つ目の痕跡を参照）。ＬＮＡを含まないサンプルの配列決定と比較したＧピーク（黒）の存在の増加は、変異の読みやすさの改善を示している。２番目、４番目、および最下部の痕跡は、野生型の配列がＢＮＡの存在下または不在下で、容易に配列決定されたことを示している。
【００６７】
実施例５：ＨＰＶ株１８および４５を識別するための配列決定
ＨＰＶはしばしば様々な菌株の混合感染として現れる。どの株がサンプル中に存在しているかを特定するために、ＤＮＡ配列決定を必要とする。様々な菌株の間のヌクレオチド変化が比較的少なく、かつ、１つの任意のサンプル中にどの株が存在しているかを特定する能力が欠けているため、株を識別することができる配列決定反応を設計することは有益である。
【００６８】
ブロッキング核酸（ＢＮＡ）は、ＨＰＶ１８またはＨＰＶ  ４５配列のいずれかに特異的に結合するように設計された。この実験に使用されたＢＮＡおよび配列決定プライマーは以下のとおりであった：
【００６９】
【表６】
2014507950.tif 000008
【００７０】
ここで、下線を引いたヌクレオチドはＬＮＡであり、他のヌクレオチドは従来のヌクレオチドである。イタリック体で示されたＢＮＡと配列決定プライマーの間に３つの塩基の重複があった。
【００７１】
プラスミドのストック（Ｓｔｏｃｋ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＨＰＶ株の鋳型のクローン）は、本明細書に記載の実験で使用された（１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）。核酸サンプルは、標準的なプロトコルを用いて調製され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＩＩＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いてＰＣＲによって増幅された。最初の増幅に使用されるプライマーは、ＨＰＶのＬ１領域のコンセンサスプライマーである。ユニバーサルタグ（ＵＰ）は、特定の配列決定をベースにしたプライマーを開発するために、順方向プライマーおよび逆方向プライマー（陰の領域）の両方に加えられた（表１を参照）。
【００７２】
【表７】
2014507950.tif 000009
【００７３】
ＰＣＲの後、核酸は混合され、その結果、ＨＰＶ１８核酸が全核酸の５０％を表し、サンプルの残りの５０％がＨＰＶ４５  ＤＮＡであった。その後、ＢＮＡ（ＨＰＶ１８用に５０ｎＭ、およびＨＰＶ４５用に７５ｎＭ）および核酸は、標準的なサイクル配列決定反応混合物に加えられた。サイクル配列決定反応は実施例１に記載されたように完了し、ハイブリダイゼーション時間は１２０秒で、サイクル配列決定反応伸張時間は４５秒であった。
【００７４】
各ＢＮＡのＴｃを決定するために、ＢＮＡの様々な濃度は、ＢＮＡ（その参照配列を含む）の計算されたＴｍに及ぶ温度勾配を用いて、サイクル配列決定される。各配列決定反応は、両方の株のピークの存在について、および、ＢＮＡによって配列決定をブロックされているサンプル中の参照配列のピークの優先的な消失について、配列決定電気泳動法を用いて評価される。その後、ＢＮＡに特異的な濃度およびＴｃが決定され、この混合サンプル個体群の優先的なサイクル配列決定に、今後使用され得る。
【００７５】
ＨＰＶ１８  ＢＮＡがＨＰＶ１８株によって二重になったままである一方で、ＨＰＶ４５の配列解析を可能にする臨界温度を決定するために、様々な濃度のＨＰＶ１８  ＢＮＡは、勾配サーマルサイクラーとともに使用された。実験の第２の組では、ＨＰＶ４５  ＢＮＡは、ＨＰＶ４５の配列決定をブロックする間に、優先的にＨＰＶ１８を配列決定するために使用された。
【００７６】
図７および９でそれぞれ示されるように、ＨＰＶ  １８（図７−１０で示されるように、配列番号：３０）と、ＨＰＶ  ４５（図７−１０で示されるように、配列番号：３１）株は、ＢＮＡを含まない状態では配列決定することが困難であった（最上部の痕跡中の強調された塩基の重複するピークを参照）が、配列決定反応が参照配列をブロックするＢＮＡを包含していれば標的配列の検出は増加した（より多くのＨＰＶ１８に特異的なＢＮＡが加えられると、ＨＰＶ４５配列は下部の痕跡で支配的なピークとなる。図７および９それぞれで、逆もまた同様である）。
【００７７】
図８および１０は、反対の株からのＢＮＡの変性が生じるはずの温度を変更する効果を示す。ＢＮＡを含まない最上部の痕跡が不明瞭であることが示されている。低すぎる変性温度は、参照配列の配列決定をブロックせず、両方のピークは見ることができる。中央の痕跡で温度が上昇すると、標的配列は支配的なピークとなる。最下部の痕跡では、温度はＴｃよりも高く上げられ、参照配列の配列決定と混合したピークを再度可能にした。この実施例は、ＢＮＡの量と、変性のために選ばれた温度の両方が経験的に選択され得ることを実証している。
【００７８】
実施例６：ＨＰＶ５６および９７を識別するための配列決定
ブロッキング核酸（ＢＮＡ）は、ＨＰＶ５６またはＨＰＶ９７のいずれかの配列に特異的に結合するように設計された。この実験に使用されたＢＮＡおよび配列決定プライマーは、以下のとおりであった：
【００７９】
【表８】
2014507950.tif 000010
【００８０】
ここで、下線を引いたヌクレオチドはＬＮＡであり、他のヌクレオチドは従来のヌクレオチドである。イタリック体で示されるＢＮＡと配列決定プライマーの間に３つの塩基の重複があった。
【００８１】
プラスミドのストック（ＨＰＶ株の鋳型のクローン）は、本明細書に記載の実験で使用された（１０，０００  ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）。核酸サンプルは、標準的なプロトコルを用いて調製され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲによって増幅された。最初の増幅に使用されたプライマーは、ＨＰＶのＬ１領域のコンセンサスプライマーである。普遍的なタグ（ＵＰ）は、特定の配列決定ベースのプライマーを開発するために、前方向と逆方向プライマーの両方に加えられた（表１を参照）。
【００８２】
ＰＣＲの後、核酸が混合され、その結果、ＨＰＶ５６核酸は全核酸の５０％を表し、サンプルの残りの５０％はＨＰＶ９７  ＤＮＡであった。その後、ＢＮＡ（ＨＰＶ５６とＨＰＶ９７の両方のために７５ｎＭ）と核酸は、標準的なサイクル配列決定反応混合物に加えられた。サイクル配列決定反応は、実施例１に記載されたように完了し、ハイブリダイゼーション時間は１２０秒で、サイクル配列決定反応伸張時間は４５秒であった。
【００８３】
各ＢＮＡのＴｃを決定するために、ＢＮＡの様々な濃度は、ＢＮＡ（その参照配列を含む）の計算されたＴｍに及ぶ温度勾配を用いて、サイクル配列決定される。各配列決定反応は、両方の株のピークの存在について、および、ＢＮＡによって配列決定をブロックされているサンプル中の参照配列のピークの優先的な消失について、配列決定電気泳動法を用いて評価される。その後、ＢＮＡに特異的な濃度およびＴｃが決定され、この混合サンプル個体群の優先的なサイクル配列決定に、今後使用され得る。
【００８４】
ＨＰＶ５６  ＢＮＡがＨＰＶ５６株によってインタクトなままである一方で、ＨＰＶ９７の配列解析を可能にする臨界温度を決定するために、様々な濃度のＨＰＶ１８  ＢＮＡが、勾配サーマルサイクラーとともに使用された。実験の第２の組では、ＨＰＶ９７  ＢＮＡは、ＨＰＶ９７の配列決定をブロックする間にＨＰＶ５６を優先的に配列決定するために使用された。
【００８５】
図１１および１２でそれぞれ示されるように、ＨＰＶ９７（配列番号：３５）とＨＰＶ５６（配列番号：３６）の株は、ＢＮＡを含まない状態では配列決定するのが困難であった（最上部の痕跡の重複するピークを参照）が、配列決定反応が参照配列をブロックするＢＮＡを含んでいると、標的配列の検出は増加した（より多くのＨＰＶ５６に特異的なＢＮＡが加えられると、ＨＰＶ９７配列は下部の痕跡で支配的なピークとなる。図１１および１２それぞれで逆もまた同様である）。図１３は、ＢＮＡの随意の濃度と変性温度を用いて得られた痕跡と比較して（最上部と最下部の痕跡はＨＰＶ５６および９７それぞれの分離した配列を示している）、ＢＮＡを含まない配列決定反応の電気泳動法を示す（読みとることができない多くの領域を備えた中央の痕跡）。
【００８６】
実施例７：増幅と、ＢＲＡＦ変異を検出するためのその後の配列決定
ブロッキング核酸とプライマーは、２つのＢＲＡＦ変異、Ｖ６００ＥおよびＧ４６９Ａを特異的に増幅し、配列決定を可能にするために設計された。配列決定プライマー、ＰＣＲの間に増幅プライマーとしても使用された。配列決定プライマーおよびＢＮＡは、ＤＮＡの同じ鎖に結合するように設計された。増幅プライマーは、逆鎖または相補鎖を結合するように設計され、５’リン酸化された。
【００８７】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの検出のために、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは以下の配列および修飾を有する：
配列決定プライマー１
５’−ＡＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＧＣＧＡＣＣＣＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣ−３’（配列番号：３７）
５’リン酸化増幅プライマー２
／５Ｐｈｏｓ／ＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：３８）
ブロッキングオリゴ（ＢＮＡ）３
５’−ＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴ＋Ｃ＋＋Ｃ＋ＴＧＴＡＧＣＴＡＧ／３Ｐｈｏｓ／（配列番号：３９）
【００８８】
ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ａについては、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは以下の配列および修飾を有する：
配列決定プライマー
５’−ＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＧ−３’（配列番号：４０）
５’リン酸化増幅プライマー
／５Ｐｈｏｓ／／５Ｐｈｏｓ／ＣＣＡＣＡＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：４１）
ブロッキングオリゴ（ＢＮＡ）
５’−ＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＧＡＣＴＧＴＴ＋Ｃ＋ＣＡＡＡＴＧＡＴ＋ＣＣＡＧＡＴ＋ＣＣＡＡＴＴＣ／３Ｐｈｏｓ／（配列番号：４２）；
ここで、／５Ｐｈｏｓ／は５’−リン酸化を表し、「＋」はロックド核酸（ＬＮＡ）を表し、および、／３Ｐｈｏｓ／／は３’−リン酸化を表している。
【００８９】
プラスミドのストック（ＢＲＡＦのクローン）およびその希釈物は、本明細書に記載の実験で使用された（１０，０００  ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）。核酸サンプルは、標準的なプロトコルを用いて調製され、ＰＣＲによって増幅され、および、反応当たり１０μＬの全体積に対して、２．５μＬのＢｅｔｔｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、０．２５μＬのＢｉｇ  Ｄｙｅ  ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．１３μＬ、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ、１０μＭの配列決定プライマー、１μＬ、１μＭの５’−リン酸化増幅プライマー、１．６μＬ（または最適化された）２．５μＭブロッキング核酸、および、１μＬのＤＮＡ鋳型を含む反応混合物中で配列決定された。反応は、サーマルサイクラー内で以下のように行なわれた：１５秒間９５°Ｃ、２分間７０°Ｃ、３０秒間の臨界温度、１０秒間の５０°Ｃ、および、４５秒間の６０°Ｃを４０サイクルと、その後の１２°Ｃでのインキュベーション。その後、ラムダエキソヌクレアーゼ（５，０００Ｕ／ｍＬで０．５μＬ）が反応混合物に加えられ、５’−リン酸を含む増幅された鎖を分解するために、３０分間３７°Ｃでインキュベートされた。配列決定用のＶ６００Ｅの臨界温度は７７．６°Ｃであり、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲのための臨界温度は７６．４°Ｃである。配列決定用のＧ４６９Ａの臨界温度は７４．６°Ｃであり、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲのための臨界温度は７３．２°Ｃである。最後に、材料は、ＣｌｅａｎＳＥＱプロトコル（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にしたがって、標準的な配列決定に関してはさらに精製される。Ｔｃが決定され、上に記載されたように、使用されるＢＮＡの濃度が最適化された。
【００９０】
図１５は、過剰な野生型の配列（配列番号：４３；５’−ＣＴＡＣＡＧＡ／ＴＧＡＡＡＴ−３’；下線を引いた塩基は変異の部位であり、最初の塩基は変異であり、スラッシュの後の塩基は野生型である）の背景において、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦエキソン１５変異の検出のための電気泳動法を示す。その割合は、反応混合物に加えられた合計のＤＮＡ鋳型中の変異標的の割合を示す。第１の電気泳動法は、標的Ｖ６００Ｅ変異の検出限界が、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲによって０．０５％であることを実証しており、中央の電気泳動法は、本明細書に記載の反応が、０．５％の検出限界を提供することを示しており、および、右側の電気泳動法で示された標準的な配列決定は、標準的な配列決定が１０％の検出限界を提供することを示している。
【００９１】
図１６は、過剰な野生型の配列（配列番号：４４；５’−ＴＴＴＧＣ／ＧＡＡＣＡＧ−３’；下線を引いた塩基は変異の部位であり、最初の塩基は変異であり、スラッシュの後の塩基は野生型である）の背景において、Ｇ４６９Ａ  ＢＲＡＦエキソン１１変異の検出のための電気泳動法を示す。その割合は、反応混合物に加えられた合計のＤＮＡ鋳型中の変異標的の割合を示す。左の電気泳動法は、標的Ｇ４６９Ａ変異の検出限界がＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲによっては０．０１％であることを実証している。右の電気泳動法は、本明細書に記載のＢＬＯＣｋｅｒ配列決定反応が０．５％の検出限界を提供することを示している。我々は、ＩＣＥ  ＣＯＬＤ  ＰＣＲおよびＢＬＯＣｋｅｒ配列反応の組み合わせが、本明細書に記載されるような従来のＰＣＲとＢＬＯＣｋｅｒ配列決定の代わりに、さらに低い検出の下限をもたらすものと予想する。
【図４】
2014507950.tif 000011
【図５】
2014507950.tif 000012
【図１４】
2014507950.tif 000013
【図１】
2014507950.tif 000014
【図２】
2014507950.tif 000015
【図３】
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【図６】
2014507950.tif 000017
【図７】
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【図８】
2014507950.tif 000019
【図９】
2014507950.tif 000020
【図１０】
2014507950.tif 000021
【図１１】
2014507950.tif 000022
【図１２】
2014507950.tif 000023
【図１３】
2014507950.tif 000024
【図１５】
2014507950.tif 000025
【図１６】
2014507950.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月31日(2013.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定プライマー、ブロッキング核酸、および、標識化された連鎖停止ヌクレオチド三リン酸を含む、参照配列を有するサンプル中の標的配列を配列決定するためのキットであって、
配列決定プライマーは、標的配列と参照配列の一本鎖の一部に相補的であり、ブロッキング核酸は、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的であり、
配列決定プライマーとブロッキング核酸は、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、ブロッキング核酸は、ポリメラーゼでは伸長できないように、３’末端でブロックされる、ことを特徴とするキット。
【請求項２】
ブロッキング核酸は、ハイブリダイズが可能となると、完全に相補的な参照鎖を含むホモ二本鎖を、部分的に相補的な標的鎖を含むヘテロ二本鎖を形成することができ、その結果、ブロッキング核酸と相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖は、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖よりも低い温度で変性し、配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で標的鎖にアニーリングされることが可能である、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と結合する参照配列の鎖上の塩基の近くで参照配列の鎖に結合することができ、あるいは、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的である、ことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
ブロッキング核酸の５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項１−３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５】
ブロッキング核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含み、随意に、ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択されるか、あるいは、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項１−４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項６】
５’−リン酸化プライマーおよび／または５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼをさらに含み、
５’−リン酸化プライマーは、配列決定プライマーと同じ鎖に相補的ではない、ことを特徴とする請求項１−５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項７】
標的配列および参照配列は、Ｋ−ＲＡＳエキソン２、コドン１２、および／または１３、ミトコンドリア変異、ＭＥＬＡＳに関連付けられるミトコンドリア変異、ＨＰＶ核酸、および、ＢＲＡＦエキソン１１および／またはエキソン１５の少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項１−６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項８】
配列決定のためにサンプル中の標的配列を調製するための方法であって、
前記方法は、
ａ）反応混合物を形成するために、ＤＮＡ配列決定反応混合物にサンプルを加える工程であって、
サンプルが参照配列を有し、１以上の標的配列を有する疑いもあり、ＤＮＡ配列決定反応混合物が、配列決定プライマーと、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的な過剰モル量のブロッキング核酸を含み、
ブロッキング核酸と配列決定プライマーが、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、
ブロッキング核酸が、ポリメラーゼによって伸長できないように３’末端でブロックされる、工程、
ｂ）変性した参照鎖と変成した標的鎖を形成するために、参照配列と標的配列の融解温度（Ｔｍ）よりも高い第１の変性温度に、標的配列を有している疑いのある反応混合物をさらす工程、
ｃ）ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖の形成と、ブロッキング配列と標的鎖のヘテロ二本鎖の形成を可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、
ｄ）ブロッキング核酸と相補的な標的鎖の前記ヘテロ二本鎖の変性を可能にするほどには十分であるが、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるには不十分である臨界温度（Ｔｃ）まで、反応混合物の温度を上げる工程、
ｅ）配列決定プライマーが反応混合物中の遊離標的鎖および遊離参照鎖にアニーリングされることを可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、および、
ｆ）伸長生成物を生成するために配列決定プライマーを伸長する工程であって、伸長生成物が標的配列の核酸配列の決定を可能にするために解析可能である工程を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項９】
標的配列の核酸配列を決定する工程をさらに含み、
配列は、ジ−デオキシ配列決定、単一分子配列決定、パイロシーケンシング、または、第２世代ハイスループットシーケンシングによって随意に決定され、
前記方法はサイクル配列決定反応中の２以上のサイクルにわたって随意に繰り返され、
前記反応混合物は核酸検出用色素を随意に含む、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端に結合する参照鎖の塩基の近くで参照鎖に結合し、あるいは、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的であり、あるいは、配列決定プライマーの３’末端とブロッキング核酸の５’末端は、参照鎖の同じ塩基の２つ以上に相補的であり、あるいは、ブロッキング核酸の５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項８または９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
ブロッキング核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含み、ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように随意に選択されるか、あるいは、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項８−１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
標的配列は参照配列に対して少なくとも５０％の相同性を有する、ことを特徴とする請求項８−１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で、参照配列の鎖にアニーリングされ得るか、あるいは、配列決定プライマーは、ブロッキング核酸に対して過剰なモルで反応混合物に加えられる、ことを特徴とする請求項８−１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、工程ａ）のサンプルとして、増幅産物の少なくとも一部を用いる前に、サンプル中の標的配列の少なくとも１つを増幅する工程、あるいは、反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、サンプル中の標的配列の少なくとも１つを増幅する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項８−１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
増幅産物の一本鎖を選択的に分解させる工程をさらに含み、
増幅プライマーが標識化されることによって、結果として生じる標識化された標的鎖が分解可能となり、増幅プライマーは５’リン酸によって随意に標識化され、および、前記方法は、５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼによって配列決定反応をインキュベートする工程を含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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