(57)【要約】  放射性核種及びキレーターと結合した単離ポリペプチドを含むイメージング剤であって、該単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、イメージング剤。これらイメージング剤を調製及び使用する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
同位体フッ素交換化学作用によって１８Ｆと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含むイメージング剤組成物であって、単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、組成物。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをフッ化ケイ素含有部分と反応させて、フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させること、及び（ｉｉｉ）フッ化ケイ素結合ポリペプチドを18Ｆ部分又は18Ｆ供給源と反応させて、18Ｆ−フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させることを含む、請求項１記載のイメージング剤組成物を作成する方法。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをＳｉＦＡ基を含むリンカーと反応させて、ＳｉＦＡ結合ポリペプチドを形成させること、及び（ｉｉｉ）ＳｉＦＡ結合ポリペプチドを18Ｆ部分又は18Ｆ供給源と反応させることを含む、請求項１記載のイメージング剤組成物を作成する方法。
【請求項４】
請求項１記載のイメージング剤組成物、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ヒト上皮成長因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２）に結合するイメージング剤並びにかかる剤を作成及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮成長因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２）は膜貫通型タンパク質で、受容体型チロシンキナーゼタンパク質であるｅｒｂＢファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２は、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がん及び口腔がんを包含する幅広い種類のがんにおいて過剰発現している、十分に確立した腫瘍バイオマーカーである。それ故にＨＥＲ２は、分子標的として、及び患者生存の診断若しくは予後の指標として、又は抗悪性腫瘍外科手術への応答の予測マーカーとして、大きな価値がある。
【０００３】
この１０年間にわたって、様々なイメージングモダリティを用いた非侵襲性のＨＥＲ２発現分子イメージングが広範に研究されてきた。これらのモダリティとしては、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）及び単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を使用した放射性核種イメージングが挙げられる。ＨＥＲ２のＰＥＴ及びＳＰＥＣＴイメージング（それぞれＨＥＲ２−ＰＥＴ及びＨＥＲ２−ＳＰＥＣＴ）は、高感度、高空間分解能をもたらす。ＨＥＲ２のＰＥＴイメージングはまた、強力な定量化能力をもたらす。ＨＥＲ２−ＰＥＴ及びＨＥＲ２−ＳＰＥＣＴは、患者における全身的な腫瘍ＨＥＲ２発現のリアルタイムアッセイ、腫瘍におけるＨＥＲ２発現の経時的な同定、ＨＥＲを標的とした治療（例として、トラスツズマブをベースにした療法）のための患者の選択、療法に対する応答の予測、薬効の評価及び多くの他の用途で特に有用である。しかしながら、化学作用を有し、臨床応用に適しているであろうインビボでの挙動を呈するＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ標識のＨＥＲ２リガンドは開発されていない。
【０００４】
自然に存在するブドウ球菌タンパク質Ａは、免疫グロブリンアイソタイプＧ（ＩｇＧ）の結晶化可能領域（Ｆｃ）断片に結合する３ヘリックス構造（スキャフォールド）を形成するドメインを含む。タンパク質ＡのＺ−ドメイン由来のあるポリペプチドは、ループにより接続された３つのα−ヘリックスから構成されるスキャフォールドを含有する。２つのこれらヘリックス上に位置する、あるアミノ酸残基は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合部位を構成する。別のバインダー分子は、これらの分子の結合能力を変えるために、ヘリックス１及び２上に位置する表面に露出したアミノ酸残基（１３残基）を置き換えることにより調製されている。１つのかかる例はＨＥＲ２結合分子又はＨＥＲ２バインダーである。これらのＨＥＲ２バインダーは、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ活性のある放射性核種で標識されている。かかるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ標識のバインダーはインビボのＨＥＲ２発現パターンを患者の中で測定する能力を与え、それ故にＨＥＲ２に関連した病態の診断、予後判定及び治療において臨床医及び研究者を補助する。
【０００５】
ＰＥＴ活性のある放射性核種の18Ｆで放射性標識されたＨＥＲ２結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子は、ＨＥＲ２を過剰発現する悪性腫瘍用のイメージング剤として評価されている。キレーター、例えばｍａＧＧＧ（メルカプトアセチルトリグリシル）、ＣＧＧ（システイン−ジグリシル）、ＣＧＧＧ（配列番号６）（システイン−トリグリシル）又はＡＡ３などによって99mＴｃと結合したＨＥＲ２結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子もまた、診断イメージングに用いられている。これら分子の標的ＨＥＲ２発現腫瘍への結合は、マウスにおいて実証されている。
【０００６】
多くの場合、シグナルを生成する18Ｆ基は、チオール反応性のマレイミド基を通じてＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）に導入される。チオール反応性のマレイミド基は、18Ｆ導入後、多段階合成を用いて調製される。しかしながら、この化学作用は低い放射化学的収率をもたらすのみである。同様に、99mＴｃのＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）とのコンジュゲーションは多段階プロセスである。加えて、Ｔｃの還元及びキレートとの錯体形成には、高いｐＨ（例として、ｐＨ＝１１）条件及び長い反応時間が必要である。
【０００７】
18Ｆ標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子のインビボでの性能は中程度に良好であるが、顕著な改良の余地がある。例えば、いくつかの研究において、腫瘍への取込みはイメージング剤注入後２時間でたったの６．３６±１．２６％ＩＤ／ｇであったことが見出された。
【０００８】
それ故に、放射性部分、例えば18Ｆなどを最終ステージで導入することが可能で、結果として高い放射化学的収率をもたらす放射性標識ポリペプチドを合成する化学作用及び方法へのニーズがある。加えて、改良された性質、とりわけ腎クリアランス及び毒性作用に関連した性質を有する、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングのための新たなＨＥＲ２標的化イメージング剤へのニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１８６０１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の組成物は、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する能力がある新たな種類のイメージング剤である。
【００１１】
１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、ジアミンジオキシムキレーターによって99mＴｃと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。ジアミンジオキシムキレーターは、Ｐｎ２１６、ｃＰｎ２１６、Ｐｎ４４又はそれらの誘導体を含むことができる。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。
【００１２】
１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、ＮＯＴＡキレーターによって67Ｇａ又は68Ｇａと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。
【００１３】
１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、Ａｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレートと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。
【００１４】
１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、リンカーによって18Ｆと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。リンカーは、アミノキシ基、アジド基又はアルキン基に由来する基を含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。
【００１５】
１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、同位体フッ素交換化学作用によって18Ｆと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。
【００１６】
１以上の実施形態では、本明細書で記載されるイメージング剤組成物を作成する方法が提供される。本発明のイメージング剤組成物を調製する方法の例は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、及び（ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、キレーター結合ポリペプチドを形成させることを含む。別の例において、方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをリンカーと反応させること、及び（ｉｉｉ）リンカーを18Ｆ部分と反応させて、18Ｆ結合ポリペプチドを形成させることを含む。リンカーはアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むことができる。
【００１７】
別の例において、方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをＮＯＴＡ−キレーターと反応させて、ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドを形成させること、及び（ｉｉｉ）ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドをＡｌ18Ｆ部分と反応させて、Ａｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーター結合ポリペプチドを形成させることを含む。
【００１８】
別の例において、方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをフッ化ケイ素（例として［19Ｆ］−フッ化ケイ素）含有部分と反応させて、フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させること、及び（ｉｉｉ）フッ化ケイ素結合ポリペプチドを18Ｆ部分と反応させて、18Ｆ−フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させることを含む。
【００１９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、以下の詳細な説明を添付の図を参照しながら読むと、より良く理解されるようになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】それぞれ８つの異なる濃度での２つの抗ＨＥＲ２ポリペプチド、Ｚ４７７（配列番号３）及び（Ｚ４７７）2（配列番号５）の、ヒトＨＥＲ２に対する結合アフィニティーの表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）のグラフである。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれＣ６（ラット神経膠腫、対照）及びＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん）に対するヒト抗ＨＥＲ２抗体の定性的フローサイトメトリーのグラフである。図２Ｃは、ＳＫＯＶ３及びＣ６細胞株についての細胞あたりのＨｅｒ２受容体の棒グラフである。
【図３】ＳＫＯＶ３細胞に関する腫瘍タイプＳＫＯＶ３  ２−１、ＳＫＯＶ３  ３−１、ＳＫＯＶ３  ３−４のパネル及びブランクに関する、Ｈｅｒ２についてのＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフである。
【図４】99mＴｃ標識Ｚ００４７７（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣγクロマトグラムである。
【図５】図５Ａは、凝集99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）Ｚ００４７７（配列番号４）（「Ｈｉｓ６」は配列番号７として開示）のｐＨ９でのサイズ排除ＨＰＬＣγクロマトグラムである。図５Ｂは、非凝集99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）Ｚ００４７７（「Ｈｉｓ６」は配列番号７として開示）標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）標品のサイズ排除ＨＰＬＣγクロマトグラムである。
【図６】ＳＫＯＶ３担がんマウスからの血液、腫瘍、肝臓、腎臓及び脾臓試料におけるＺ００４７７（配列番号３）の生体分布プロファイルを、経時的な腫瘍：血液比を包含して表したグラフである。
【図７】Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６リンカーの化学構造の図である。
【図８】図８Ａはエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のグラフであり、図８Ｂは精製されたＺ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６についての質量デコンボリューション結果のグラフである。
【図９】99mＴｃで標識されたＺ０２８９１−ｃＰＮ２１６（配列番号２）についての逆相ＨＰＬＣγトレースクロマトグラムである。
【図１０】ＳＫＯＶ３担がんマウスからの血液、肝臓、腎臓、脾臓及び尾部試料における、ｃＰＮ２１６によって99mＴｃで標識されたＺ０２８９１（配列番号２）の生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）のグラフである。
【図１１】ＳＫＯＶ３担がんマウスからの腫瘍、血液、肝臓、腎臓、膀胱／尿、尾部、腸及び脾臓試料における、ｃＰＮ２１６によって99mＴｃで標識されたＺ０２８９１（配列番号２）の生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）のグラフである。
【図１２】ＳＫＯＶ３担がんマウスにおけるＺ０２８９１（配列番号２）についての生体分布プロファイルのグラフであり、腫瘍：血液比を示す。
【図１３】Ｂｏｃ保護されたマレイミド−アミノキシ（Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ）及びマレイミド−アミノキシ（Ｍａｌ−ＡＯ）リンカーの化学構造の図である。図１３Ａはｔｅｒｔ−ブチル  ２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−２−オキソエトキシカルバメート（Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ）の化学構造であり、図１３Ｂは２−（アミノオキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アセトアミド塩酸塩（Ｍａｌ−ＡＯ．ＨＣｌ）の化学構造である。
【図１４】図１４ＡはＺ００３４２（配列番号１）出発物質の逆相ＨＰＬＣクロマトグラム、図１４Ｂは精製されたＺ００３４２（配列番号１）−ＡＯイメージング剤組成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムであり、いずれも２８０ｎｍで分析されたものである。
【図１５】18Ｆ−フルオロベンジル−Ｚ００３４２（配列番号１）及び18Ｆ−フルオロベンジル−Ｚ０２８９１’（配列番号２）の粗反応混合物及び精製された最終生成物についての逆相ＨＰＬＣγクロマトグラムである。
【図１６】ＳＫＯＶ３腫瘍動物からの18Ｆで標識されたＺ０２８９１（配列番号２）ポリペプチドの生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）のグラフである。
【図１７】ＳＫＯＶ３腫瘍動物からの18Ｆで標識されたＺ０２８９１（配列番号２）ポリペプチドの生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）及び腫瘍：血液比のグラフである。
【図１８】血液、腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓及び骨試料における18Ｆ標識Ｚ００３４２（配列番号１）及び18Ｆ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）の生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）の棒グラフである。
【図１９】Ｍａｌ−ＮＯＴＡリンカーの化学構造の図である。
【図２０】図２０ＡはＺ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡについてのエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のグラフであり、図２０ＢはＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量デコンボリューション結果のグラフである。
【図２１】67Ｇａ標識Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡの反応１時間後の粗反応混合物についての逆相ＨＰＬＣγトレースのグラフである。
【図２２】精製された67Ｇａ標識ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡポリペプチドについての逆相ＨＰＬＣγトレースのグラフである。
【図２３】処方物２の分析ＨＰＬＣを示す図である［上：２８０ｎｍでのＵＶチャネルであり、アスコルビン酸塩を０．５分、ペプチド前駆体３を４．５分に示す。下：放射活性チャネルであり、２を５．１分（ＲＣＰ  ９５％）、分解生成物を４．６分に示す。］。
【図２４】ｔＣ２  ＳｅｐＰａｋ精製を用いた２の調製のためのＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットのレイアウト図である。
【図２５】ＦＡＳＴｌａｂ（商標）を用いて調製された処方物２の分析ＨＰＬＣを示す図である［上：放射活性チャネルであり、２（７．７分）、18Ｆ−ＦＢＡ（１０．４分）及び未知の不純物（１２．２分）を示す。中央：２８０ｎｍでのＵＶチャネルであり、ｐ−アミノ安息香酸処方添加物（３分）を示す。下：３５０ｎｍでのＵＶチャネルであり、ジメチルアミノベンズアルデヒド副産物（１０．２分）及び未知の不純物（３．８分）を示す。］。
【図２６】Ｓｅｐｈａｄｅｘ精製を用いた２の調製のためのＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットのレイアウト図である。
【図２７】Ｓｅｐｈａｄｅｘ精製を使用したＦＡＳＴｌａｂを用いて調製された処方物２の分析ＨＰＬＣを示す図である［上：放射活性チャネルであり、２（７．１分）、18Ｆ−ＦＢＡ（８．８分）及び未知の不純物（１０．２分）を示す。中央：２８０ｎｍでのＵＶチャネルである。下：３５０ｎｍでのＵＶチャネルであり、ジメチルアミノベンズアルデヒド副産物（１０．０分）を示す。］。
【図２８】処方物５の分析ＨＰＬＣを示す図である［上：放射活性チャネルであり、生成物（４．７分、９２％）及び副産物（３．９分、８％）を示す。下：２８０ｎｍでのＵＶチャネルである。］。
【図２９】分析的放射性ＨＰＬＣにより測定された標識効率を示す５のタイムコース研究を描写する図である。
【図３０】ペプチド／ＡｌＣｌ3濃度上昇後の５の分析的ＲＣＹを示す図である（Ｐ：生成物、ＢＰ：副産物、図２８を参照）。
【図３１】５の標識混合物の分析ＨＰＬＣプロファイルを示す図である（上のトレース：放射活性チャネル、下のトレース：２８０ｎｍでのＵＶチャネル）。
【図３２】単離物７の分析的放射活性チャネルＨＰＬＣを示す図である（赤色：放射活性チャネル、青色：２８０ｎｍでのＵＶチャネル）。
【図３３】ＮＣＩ−Ｎ８７及びＡ４３１異種移植モデルからの腫瘍切片中のＨＥＲ２タンパク質の発現を、ＤＡＫＯの免疫組織化学ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴにより描写する図である。左図は×２の倍率、右図は強調表示された正方形部分の×１０である。
【図３４】９、２、５及び７のナイーブマウスでの生体分布を示す図である。
【図３５】ＮＣ８７／Ａ４３１担がんマウスにおける９、２、５及び７の生体分布を示す図である。
【図３６】二重腫瘍異種移植モデルにおける２の生体分布プロファイルを示す図である。
【図３７】コールドの前駆体を濃度を上昇させながら用いた、２のＮＣＩ−Ｎ８７異種移植生体分布プロファイルを示す図である。
【図３８】二重腫瘍異種移植モデルにおける２を使用した予備的なイメージング（Ａ）及びＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）９のイメージング研究（Ｂ）との比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のイメージング剤組成物は、一般に、放射性同位体、例えば18Ｆ、99mＴｃ、67Ｇａ若しくは68Ｇａ、111Ｉｎ、123Ｉ、124Ｉ、89Ｚｒ又は64Ｃｕなどと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体の単離ポリペプチド及び該組成物を作成及び使用する方法を含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。１以上の実施形態では、単離ポリペプチドの配列は、配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体のいずれかに対して９０％以上の配列類似性を有する。
【００２２】
単離ポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸又は自然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸模倣物を含むことができる。自然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたものや、同様に後から修飾されたアミノ酸であり、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、ホスホスレオニン及びホスホチロシンである。
【００２３】
単離ポリペプチドは標準的な固相合成技術を用いて調製することができる。あるいは、ポリペプチドは組換え技術を用いて調製してもよい。ポリペプチドが組換え技術を用いて調製される場合、ポリペプチド又はその保存的変異体をコードするＤＮＡを単離することができる。ポリペプチド又はその保存的変異体をコードするＤＮＡは、クローニングベクター内に挿入し、宿主細胞（例として、真核生物細胞、植物細胞又は原核生物細胞）中に導入して、当該技術分野で認められている任意の発現系を用いて発現させることができる。
【００２４】
ポリペプチドは、単一のキラル型のアミノ酸残基から実質的に構成することができる。従って、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸のいずれかから実質的に構成することができる。しかし、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との組み合わせもまた利用することができる。
【００２５】
本明細書で提供されるポリペプチドはタンパク質ＡのＺ−ドメインに由来することから、結合面上の残基は、結合活性を保つかぎり、非保存的に置換されてもよく、保存的に置換されてもよい。いくつかの実施形態では、置換される残基は２０個の自然に存在するアミノ酸又はそれらの任意のアナログのいずれかに由来し得る。
【００２６】
ポリペプチドは約４９残基から約１３０残基の長さであることができる。具体的なポリペプチド配列は表１に記載される。
【００２７】
【表１】
2014503547.tif 000002
選択的機能性を付与するため、付加配列を末端に加えることができる。従って、付加配列は、ポリペプチドの精製又は単離を促進するため、片方又は両方の末端に、単独又は結合標的と連結して付け加えることができる（例として、Ｈｉｓタグをポリペプチドに付け加えることによって）。
【００２８】
表１に記載されたポリペプチドは、リンカーによって18Ｆと、ジアミンジオキシムキレーターによって99mＴｃと、ＮＯＴＡキレーターによって67Ｇａ若しくは68Ｇａと、Ａｌ18Ｆ−ＮＯＴＡによって18Ｆと、ＳｉＦＡ（すなわち、フッ化ケイ素アクセプター）若しくはフッ化ケイ素交換化学作用によって18Ｆと、ＤＯＴＡキレーター化学作用によって111Ｉｎと、ヨードベンズアルデヒドを用いたフルオロベンズアルデヒド様化学作用によって123Ｉ若しくは124Ｉと、又はＮＯＴＡ−キレーター化学作用によって64Ｃｕと結合させることができる。表２はこれらポリペプチドの等電点（ｐＩ）を提供する。
【００２９】
【表２】
2014503547.tif 000003
１以上の実施形態では、配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドは、18Ｆと結合させることができる。18Ｆは、単離ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端又は内部位置に組み込むことができる。
【００３０】
１以上の実施形態では、18Ｆはリンカーによって単離ポリペプチドに結合させることができる。リンカーはアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むことができる。リンカーのアミノキシ基はアルデヒド、例えばフッ素置換アルデヒドなどと結合することができる。リンカーのアジド基はフッ素置換アルキンと結合することができる。同様に、リンカーのアルキン基はフッ素置換アジドと結合することができる。リンカーはまた、チオール反応性基を含んでもよい。リンカーはマレイミド−アミノキシ、マレイミド−アルキン又はマレイミド−アジド基から構成されてもよい。18Ｆ結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むリンカーと反応させて、リンカー結合ポリペプチドを形成させること、及びリンカーを18Ｆ部分と反応させて、18Ｆ結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。
【００３１】
18Ｆ結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをマレイミド−アミノキシ、マレイミド−アルキン又はマレイミド−アジド基を含むリンカーと反応させて、リンカー結合ポリペプチドを形成させること、及びリンカーを18Ｆ部分と反応させて、18Ｆ結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。
【００３２】
別の実施形態では、方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）リンカーを用意すること、（ｉｉｉ）リンカーを18Ｆ部分と反応させて、18Ｆ標識リンカーを形成させること、及び（ｉｖ）18Ｆ標識リンカーを配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体の単離ポリペプチドと反応させて、18Ｆ結合ポリペプチドを形成させることを含むことができる。
【００３３】
上記の例を用いて、フッ素又は放射性フッ素原子（複数可）、例えば18Ｆなどを、ポリペプチド上に導入することができる。フッ素置換アルデヒドをリンカー結合ポリペプチドのアミノキシ基と反応させる場合、フッ素置換ポリペプチドが結果として得られる。同様に、フッ素置換アジド又はアルキン基をリンカー結合ポリペプチドの各アルキン又はアジド基と反応させる場合、フッ素置換ポリペプチドが結果として得られる。放射性フッ素置換アルデヒド、アジド又はアルキンをリンカー結合ポリペプチドの各アミノキシ、アルキン又はアジド基と反応させる場合、放射性フッ素標識ポリペプチド又はイメージング剤組成物が結果として得られる。さらに、リンカーは、放射性フッ素（18Ｆ）標識のイメージング剤組成物を調製するため、放射性フッ素置換基を有してもよい。ポリペプチド上にフッ素を導入する方法はまた、任意の長さのフッ化イメージング剤組成物を調製するのに用いてもよい。従って、いくつかの実施形態では、イメージング剤組成物のポリペプチドは、例えば、４０から１３０個のアミノ酸残基を含むことができる。
【００３４】
本発明のイメージング剤又はイメージング剤組成物の調製において用いるためのリンカー結合ポリペプチド又は18Ｆ結合リンカーは、本発明の方法により調製することができるが、この方法は今まで知られていた方法より効率的で高い収率につながるものである。この方法はより容易に行うことができ、より早く、及びより緩やかでよりユーザーフレンドリーな条件下で実施される。例えば、ポリペプチドを18Ｆ結合リンカー（例として、18Ｆ−フルオロベンズアルデヒド）（「18Ｆ−ＦＢＡ」）で標識する方法は、当該技術分野で知られている手順より簡単である。18Ｆ結合リンカーは、トリメチルアニリニウム前駆体上に18Ｆを直接的に求核導入することにより１段階で調製される。18Ｆ−リンカー（すなわち18Ｆ−ＦＢＡ）は次いでポリペプチド、例えばＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）及び本明細書で記載されるポリペプチドなどに結合される。リンカーの調製もまた、当該技術分野で知られている方法より容易である。その上、放射性標識アミノキシ系リンカーと結合したポリペプチド及びｃＰｎファミリーのキレーターと結合したポリペプチド（例として、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））は、顕著により良好な生体分布及びより良好な腫瘍取込み、同様により少ない肝臓取込みを伴うより良好なクリアランスを示す。
【００３５】
フッ素標識のイメージング剤組成物は、診断用途で大変望ましい物質である。18Ｆ標識イメージング剤組成物は、確立したイメージング技術、例えばＰＥＴを用いて可視化することができる。
【００３６】
別の実施形態では、ポリペプチドは式（１）のジアミンジオキシムキレーターによって99mＴｃと結合させることができる。
【００３７】
【化１】
2014503547.tif 000004
式中、Ｒ'、Ｒ''、Ｒ'''、Ｒ''''は独立してＨ若しくはＣ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10アルキルアミン、Ｃ1-10フルオロアルキルであり、又は２以上のＲ基は、それらが結合している原子と共に炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成し、ここでＲはＨ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10アルキルアミン若しくはＣ1-10フルオロアルキルであることができる。１つの実施形態では、ｎは０〜５まで変わり得る。ジアミンジオキシムキレーターを調製する方法の例は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏ  ｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ」と題するＰＣＴ出願、国際公開番号ＷＯ２００４０８０４９２（Ａ１）及び「Ｒａｄｉｏ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ＲＧＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｌｉｃｋ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」と題するＰＣＴ出願、国際公開番号ＷＯ２００６０６７３７６（Ａ２）に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
99mＴｃは、ジアミンジオキシムによって単離ポリペプチドのＮ末端で、単離ポリペプチドに結合させることができる。キレーターは二官能性化合物であることができる。１つの実施形態では、二官能性化合物はＭａｌ−ｃＰＮ２１６であることができる。Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は、配列番号１又は配列番号２のポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び99mＴｃをキレートするためのビス−アミノオキシム基（ジアミンジオキシムキレーター）を含む。Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は式（ＩＩ）を有することができる。
【００３９】
【化２】
2014503547.tif 000005
ジアミンジオキシムキレーター結合ペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、ジアミンジオキシム結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。ジアミンジオキシムキレーターはさらに99mＴｃと結合してもよい。
【００４０】
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリ酢酸）キレーターによって67Ｇａ又は68Ｇａと結合させることができる。ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ＮＯＴＡキレーターをポリペプチドと反応させて、ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。ＮＯＴＡキレーターはさらに67Ｇａ又は68Ｇａと結合してもよい。
【００４１】
１つの実施形態では、Ｇａ、特に67Ｇａは、ＮＯＴＡキレーターによって単離ポリペプチドに結合させることができる。ＮＯＴＡキレーターは、式（ＩＩＩ）に記載されるように、マレイミド基で官能化することができる。
【００４２】
【化３】
2014503547.tif 000006
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリ酢酸）キレーターによってＡｌ18Ｆと結合させることができる。ＮＯＴＡキレーター結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ＮＯＴＡ−キレーターをポリペプチドと反応させて、ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドは次いで、さらにＡｌ18Ｆと結合して、Ａｌ18Ｆ−ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドを形成させてもよい。
【００４３】
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡ−キレーターによって18Ｆと結合させることができる。ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ＮＯＴＡ−キレーターを18Ｆ供給源（例として、Ａｌ18Ｆ）と反応させて、18Ｆ−ＮＯＴＡ−キレーターを形成させること、及び（ｉｉｉ）18Ｆ−ＮＯＴＡ−キレーターを単離ポリペプチドと反応させて、18Ｆ−ＮＯＴＡ−キレーター結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。
【００４４】
１以上の実施形態では、キレーターは、キレート部分（例としてＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ）単独で、又はキレート部分及びリンカーを含むことができ、これらは各々本明細書で記載されている。例として、ＮＯＴＡ−キレーターは、本明細書で記載されているＮＯＴＡキレート部分単独又はリンカーに結合したＮＯＴＡキレート部分を表すことが可能である。
【００４５】
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＳｉＦＡ化学作用によって18Ｆと結合させることができる。18Ｆ−ＳｉＦＡ結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをフッ化ケイ素アクセプター（ＳｉＦＡ）基を含むリンカーと反応させて、ＳｉＦＡ結合ポリペプチドを形成させること、及び（ｉｉｉ）ＳｉＦＡ結合ポリペプチドを18Ｆ部分又は18Ｆ供給源と反応させることにより、調製することができる。18Ｆ部分又は18Ｆ供給源は、ＳｉＦＡ基と反応する能力のある任意のかかる部分又は供給源であり、同位体フッ素交換化学作用を受けることが可能である。下のスキームＩは、［18Ｆ］ＳｉＦカップリングを用いたＺ０２８９１（配列番号２）の放射性標識を説明する。
【００４６】
【化４】
2014503547.tif 000007
１以上の実施形態では、本明細書で記載される本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物を作成する方法は、自動化されている。例えば、本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、自動放射性合成装置によって自動で好都合に調製することができる。かかるプラットフォーム装置の市販例はいくつかあり、ＴＲＡＣＥＲｌａｂ（商標）（例として、ＴＲＡＣＥＲｌａｂ（商標）ＭＸ）及びＦＡＳＴｌａｂ（商標）（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．）が挙げられる。かかる装置は一般に「カセット」を含むが、これはしばしば使い捨てで、その中で放射性化学作用を実施するものであり、放射性合成を実施するため装置に取り付けられる。カセットは通常、液体経路、反応器及び試薬バイアルを受け入れるためのポート、同様に放射性合成後の精製段階において用いられる任意の固相抽出カートリッジを包含する。任意選択で、本発明のさらなる実施形態では、自動放射性合成装置は高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に連結可能である。
【００４７】
本発明はそれ故に、各々本明細書で規定される本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物の自動合成のためのカセットを提供する。
【００４８】
本発明はまた、対象の少なくとも一部をイメージングする方法を含む。１つの実施形態では、方法は、本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物を対象に投与すること及び対象をイメージングすることを含む。対象は、例えば、診断デバイスを使用してイメージングすることができる。
【００４９】
１以上の実施形態では、イメージング方法は、該剤又は組成物が対象に送達されるのをモニターする段階、及び対象をＨＥＲ２関連の病態（例として、乳がん）と診断する段階をさらに含んでもよい。１つの実施形態では、対象は哺乳類、例えばヒトであることができる。別の実施形態では、対象は細胞又は組織を含むことができる。組織は生検において用いることができる。診断デバイスは、磁気共鳴イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影、Ｘ線、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）又はそれらの組み合わせから選ばれるイメージング方法を利用することができる。
【００５０】
本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は医薬組成物としてヒト及び他の動物に非経口的に投与することができる。本発明の医薬組成物は、本明細書で記載される放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物、及び医薬的に許容される担体、賦形剤、溶媒又は希釈剤を含む。
【００５１】
例えば、非経口注入のための本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される滅菌された水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、同様に使用直前に滅菌された注入可能な溶液若しくは分散液へと再構成するための滅菌粉末を含む。適した水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又は媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適した混合物、植物油（例えばオリーブ油など）、並びに注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどが挙げられる。例えばコーティング材料、例えばレシチンなどを用いることにより、分散液中の粒子サイズを調整することにより、及び界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持可能である。
【００５２】
本発明の医薬組成物はまた、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などを含有してもよい。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることにより、確実にできる。等張性の剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを包含させることもまた望ましい。注入可能な医薬形態の持続性吸収は、吸収を遅らせる剤、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどを包含させることにより、もたらされ得る。
【００５３】
本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、潜在的な毒性を最小化するため、生理的に許容される担体中に分散することができる。従って、イメージング剤はｐＨが約６から約８の生体適合性溶液中に分散することができる。いくつかの実施形態では、該剤はｐＨが約７から約７．４の生体適合性溶液中に分散することができる。他の実施形態では、該剤はｐＨが約７．４の生体適合性溶液中に分散される。
【００５４】
本発明のイメージング剤組成物又は医薬組成物は、医薬産業において化合物を水性媒体中に懸濁又は溶解するのに一般に用いられる他の添加物と組み合わせ、次いで懸濁液又は溶液は当該技術分野で知られている技術により滅菌することができる。イメージング剤組成物は、種々の形態で投与し、選ばれた投与経路に適合させることができる。例えば、該剤は、局所的に（すなわち組織又は粘膜経由で）、静脈内に、筋肉内に、皮内に又は皮下に投与することができる。注入に適した形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌された注入可能な溶液、分散液、リポソーム製剤若しくはエマルジョン製剤を調製するための滅菌粉末が挙げられる。吸入使用に適した形態としては、エアロゾル中に分散されたような剤が挙げられる。局所投与に適した形態としては、クリーム、ローション、軟膏などが挙げられる。
【００５５】
本発明のイメージング剤組成物又は医薬組成物は、好ましい量の剤を対象へと好都合に送達するように濃縮し、所望の形態で容器中に包装することができる。剤は容器中に分注することができ、この中で剤は、対象のｋｇ体重あたり０．１ｍｇから５０ｍｇの間の剤濃度での剤の投与を好都合に促進する、生理的に許容される溶液中に分散される。
【００５６】
１以上の実施形態では、標的組織は、該剤の投与後約４時間でイメージングすることができる。代替的実施形態では、標的組織は、対象への該剤の投与後約２４時間でイメージングすることができる。
【実施例】
【００５７】
以下の例は説明の目的のみのために提供されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５８】
材料
合理的なＨＥＲ２発現の可能性を有する腫瘍原性細胞株のパネルを、利用可能な文献（Ｂｒｕｓｋｉｎ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２００４：  ３１：  ２０５；  Ｔｒａｎ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．  ２００７：  １８：  １９５６）に基づいて、表３に記載されるように選択した。
【００５９】
【表３】
2014503547.tif 000008
全ての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、推奨されるように培養した。細胞は、使用前に＞９０％コンフルエンスまで培養した。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ）は、間接的な免疫蛍光染色の定量分析のため、表４に記載された細胞株に対して、抗Ｈｅｒ２一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ  ＭＡＢ１１２９）及びＤａｋｏ  ＱＩＦＩＫＩＴ（ＰＮ  Ｋ００７８）を用いて行った。異なる数のＭａｂ分子を有する５つの異なる集団を持つ較正ビーズを、細胞株と一緒に、細胞あたりの表面受容体数を決定するのに用いた。全ての場合、適切なアイソタイプの対照を該当する販売業者から入手した。
【００６０】
付着細胞は、細胞表面受容体のタンパク質分解を避けるため、トリプシンよりむしろ細胞分離緩衝液（ＰＢＳ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いてフラスコから遊離させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷冷ＦＣ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡｗ／ｖ）中に濃度５〜１０×１０6細胞／ｍｌになるように再懸濁した。１００μＬの一定分量の細胞を５μｇの一次抗体と混合し、氷上で４５分間インキュベートした。細胞を次いで１ｍｌの氷冷フローサイトメトリー（ＦＣ）緩衝液（２％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ）で洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離して、０．５μＬのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。ＰＢＳで１：５０に希釈した二次抗体断片（Ｆ（ａｂ）2ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン）を１００μＬ加え、氷上、暗所で４５分間インキュベートした。細胞を次いで１ｍＬの氷冷ＦＣ緩衝液で２回洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離して、５００μＬのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。全ての染色細胞は、フローセルが詰まるのを防ぐため、フローサイトメトリーの前に１００ミクロンのフィルターを通過させた。
【００６１】
フローサイトメトリーはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ上で行った。各チューブについて最少で５×１０4のイベントを収集した。全ての分析は単一色で、ＦＬ１におけるＦＩＴＣの検出を使用したものであった。前方散乱（ＦＳ）及び側方散乱（ＳＳ）のデータは、全ての細胞集団がしっかりグループ分けされることを実証した。
【００６２】
フローサイトメトリーはインビトロでのＨＥＲ２発現について細胞を評価するのに用いられ（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）、ＳＫＯＶ３細胞は最も高いＨＥＲ２発現レベルを示した（図３）。図３の結果は再現性があった（ｎ＝３）。
【００６３】
最も高発現の細胞株はＳＫＯＶ３であった。これらの細胞を６〜１２週齢の免疫不全マウスに注射し、腫瘍を増殖させた。腫瘍増殖曲線及び成功率は、接種した細胞数に依存した。最適な腫瘍増殖は３００万から４００万個の細胞／マウスを使用して得られた。
【００６４】
インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０6〜４×１０6の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。
【００６５】
剥離によりマウスから腫瘍を回収し、全腫瘍を処理まで−２０℃で保存した。腫瘍はプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ＃２４９４８）添加ＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌの中で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー中で氷上で粉砕した。ホモジネートは次いで氷上で３０分間インキュベートし、次いで冷却遠心分離機中で１０，０００×Ｇで１０分間、遠心分離した。上清を回収して、さらなる処理まで氷上又は４℃で保存した。溶解液中のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３２２５）を用いて決定した。溶解液は、マイクロタイタープレート中で２０μｇのタンパク質／ウェルが得られるよう、標準的な濃度に希釈した。ＥＬＩＳＡは市販のヒトＨＥＲ２キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１１２９）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。各試料について３回測定を行い、データをｐｇ  ＨＥＲ２／μｇ総タンパク質として報告し、誤差を標準偏差として報告した。
【００６６】
インビボでの標的の発現は、ＥＬＩＳＡにより測定した。切除した腫瘍をホモジナイズし、市販のマッチドペアキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１１２９、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてＨＥＲ２について分析した。図３の結果は、ＳＫＯＶ３細胞株が高発現腫瘍を増殖させることを示す。ＥＬＩＳＡの対照は、フローサイトメトリーに用いた陰性対照株の細胞培養物溶解液であった。これらの結果は、ＳＫＯＶ３の腫瘍異種移植片がヒトＨＥＲ２を標的とする分子のインビボ研究に適切であることを指し示す。
【００６７】
全てのポリペプチドは、ＳｗｅｄｅｎにあるＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）ＡＢから受け入れた。ポリペプチドは、「Ｚ」を前に付けた、数字で表される内部開発コードで呼ばれる。表１は本明細書で記載されるポリペプチドを詳述する。ポリペプチドとしては、ポリペプチドＺ００３４２（配列番号１）、ポリペプチドＺ０２８９１（配列番号２）、ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３及び４）及びＺ００４７７のダイマー、すなわち（Ｚ００４７７）2（配列番号５）が挙げられる。
【００６８】
ポリペプチドとＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原との間の結合相互作用は、インビトロで表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の検出を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で測定した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外ドメインは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からヒトＩｇＧのＦｃ領域とのコンジュゲート（Ｆｃ−Ｈｅｒ２）として入手し、ＣＭ−５デキストラン官能化センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に共有結合で結合させたが、このセンサーチップはＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）を１０μＬ／分で使用して予め平衡化し、続いてＥＤＣ及びＮＨＳで活性化したものである。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中のＦｃ−ＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）は、所望の固定化レベル（約３０００Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）に達するまで（２分）、活性化センサーチップ上に注入した。センサーチップ上の残りの活性化基は、エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を注入してブロックした。非共有結合的に結合したあらゆるコンジュゲートは、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＨを使用して繰り返し（５回）洗浄することで除去した。同じセンサーチップ上の２つ目のフローセルは、屈折率変化及びセンサーチップとの非特異的な結合相互作用の対照表面として働かせるため、Ｆｃ−ＨＥＲ２固定化を行わない点を除いて同様に処理した。動態研究の前に標的分析物の結合を両表面上で試験して表面安定性実験を実施し、結合した分析物の十分な除去と、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＨでの処理後のセンサーチップ再生とを確実にした。ＳＰＲセンサーグラムはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて分析した。動態学的モデルのロバスト性は、計算された動態学的パラメーターの各々についての残差及び標準誤差、「適合度」（χ2＜１０）を評価することにより、並びにモデル化したセンサーグラムを実験データと直接的に比較することにより決定した。ＳＰＲ測定値を８つの分析物濃度（０〜１００ｎＭタンパク質）で収集し、結果として得られたセンサーグラムを１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。
【００６９】
図１は、ヒトＨＥＲ２官能化表面上で測定したときのＺ００４７７（配列番号３）及び（Ｚ００４７７）2（配列番号５）について得られた、例の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）データを示す。この関係はアフィニティーが知られている全てのポリペプチド（表２）について当てはまり、この中でダイマーＺ（４７７）２（配列番号５）の値は親和性の性向（ａｆｆｅｃｔ）に基づく推定である。
【００７０】
Ｈｉｓ６（配列番号７）タグ付加ポリペプチドのｆａｃ−［99mＴｃ（ＣＯ）3］+コアでの標識は、以前に公表された手順（Ｗａｉｂｅｌ，  Ｒ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９９，  １７，  ８９７）を改変したものを用いて達成した。簡潔には、生理食塩水中のＮａ［99mＴｃＯ4］（４ｍＣｉ、２ｍＬ）をＩｓｏｌｉｎｋ（登録商標）ボラノカーボネートキット（Ａｌｂｅｒｔｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００１，  １２３，  ３１３５）に加えた。結果として得られた溶液を９５℃まで１５〜２０分間加熱することで、ｆａｃ−［99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈ2Ｏ）3］+が生じた。溶液の一定分量（２ｍＣｉ、１ｍＬ）を取り出し、１Ｎ  ＨＣｌを使用してｐＨ約７に中和した。３２５μＬの一定分量を取り出し、Ｈｉｓ６−ポリペプチド（配列番号７）（４０μｇ）の溶液に加えた。結果として得られた溶液を３５〜３７℃の水浴中で４０分間加熱した。典型的な放射化学的収率は８０〜９５％の範囲であった（ＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ、０．９％ＮａＣｌにより決定）。粗反応生成物についてＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  ＰＢＳ）上でクロマトグラフィーにかけて、＞９９％放射化学的純度の生成物が生じた。得られた典型的活性は３〜４μＣｉ／μｇであった。結果として得られた溶液を次いで１０ｍＭ  ＰＢＳで希釈することで、その後の生体分布研究に適当な濃度を与えた。
【００７１】
ＨＰＬＣは、Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４（４．６×２５０ｍｍ）カラム及びＲａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩ放射能検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ上で行った。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを添加した９５：５  水：ＭｅＣＮで、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを添加した５：９５  水：ＭｅＣＮであった。グラジエントは以下であった（全ては直線的に変化する。時間／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０、３１／０。
【００７２】
各ポリペプチドは、精製前にトリカルボニルテクネチウムのコアで高収率（＞９０％）に標識した。ＮＡＰ−５クロマトグラフィーによる精製で、99mＴｃ標識ポリペプチド試料が＞９９％の放射化学的純度で生じた（表４）。
【００７３】
【表４】
2014503547.tif 000009
ＮＡＰ−５で精製された放射性標識ポリペプチドの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。放射性標識種の保持時間は、２２０ｎｍのＵＶクロマトグラムにおける対応する非標識ポリペプチドの保持時間と実質的に変わらなかった（ＵＶ検出器及びγ検出器の物理的分離が原因である時間差を除く。データは図示せず）。
99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ6）−ポリペプチドの研究に用いた動物モデル（「Ｈｉｓ6」は配列番号７として開示）
インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０6〜４×１０6の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。
【００７４】
生体分布
マウスに約１μｇの99mＴｃ標識ポリペプチド（約３μＣｉ／１μｇ）を尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０γＣｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注入部位（尾部）についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織＋尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についての％注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラムあたりの％注入用量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために秤量した。データは、その時点での全３匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。
【００７５】
99mＴｃ標識Ｚ００４７７（配列番号４）ポリペプチドをＳＫＯＶ３マウスに注入した。図６はこれらの実験についての腫瘍及び血液曲線を示す。Ｚ００４７７（配列番号４）ポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において良好な腫瘍への取込みを示し、最大値は注入後（ＰＩ）３０分で組織のグラムあたりの注入用量のおよそ３％であり、ピークの腫瘍：血液比はＰＩ２４０分で８より大きい。
【００７６】
ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は２分未満である。このクリアランスは主として肝臓及び腎臓が媒介する。表５に記載されるように、脾臓におけるポリペプチドの取込みは中程度で、肝臓において中程度から高度の取込みが観察されている。
【００７７】
【表５】
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二価のポリペプチドは対応するモノマーより高いアフィニティーを呈するが、これはおそらく親和性効果のためである。それらのより大きなサイズは、しかしながら、腫瘍の浸透を妨げ得る。ＨＥＲ２ポリペプチドの場合、各々４つの高アフィニティーポリペプチドの二価形態が利用可能であった。Ｚ００４７７（配列番号３）のダイマーである（Ｚ００４７７）2（配列番号５）を放射性標識し、ＳＫＯＶ３腫瘍マウスにおける４時間の生体分布実験に用いた。
【００７８】
一価及び二価のポリペプチドはその他の点では似たような生体分布特性を呈し、血中半減期はいずれについても１から２分の範囲内に観察されている。結果は、モノマー及び二価ポリペプチドのいずれもインビボでＨＥＲ２を標的にすることが可能であることを明確に指し示す。
【００７９】
99mＴｃキレーターのｃＰＮ２１６（図７）を導入するため、二官能性化合物のＭａｌ−ｃＰＮ２１６を、ポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び99mＴｃをキレートするためのアミンオキシム基を含んで合成した。
【００８０】
ｃＰＮ２１６−アミンはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸はＰｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。Ｎ−メチルモルフォリン、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、炭酸水素アンモニウム及び無水ＤＭＦはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、ＨＰＬＣグレードのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水をＨＰＬＣ精製に用いた。
【００８１】
実施例１
Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸（１０８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、ｃＰＮ２１６−アミン（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）及びＰｙＢｏＰ（３３３ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を０℃の無水ＤＭＦ中に溶解した氷冷溶液に、０．４ＭのＤＭＦ中Ｎ−メチルモルフォリン（１２８μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を２時間後に除去し、混合物を室温で一晩撹拌し、ＨＰＬＣ精製に供した。生成物のＭａｌ−ｃＰＮ２１６は白色粉末として得られた（２３０ｍｇ、８０％収率）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．３５（ｍ、２Ｈ）、１．４３（ｓ、１２Ｈ）、１．５６（ｍ、５Ｈ）、１．８５（ｓ、６Ｈ）、２．３３（ｄｄ、Ｊ１＝８Ｈｚ、Ｊ２＝４Ｈｚ、２Ｈ）、２．７８（ｍ、４Ｈ）、３．０４（ｍ、２Ｈ）、３．６１（ｄｄ、Ｊ１＝８Ｈｚ、Ｊ２＝４Ｈｚ、２Ｈ）、７．０２（ｓ、２Ｈ）、８．０２（ｓ、１Ｈ）、８．６８（ｓ、４Ｈ）、１１．２６（ｓ、２Ｈ）；［Ｍ＋Ｈ］+についてのｍ／ｚ＝４９５．２（Ｃ２４Ｈ４３Ｎ６Ｏ５、計算されたＭＷ＝４９５．３）。
【００８２】
ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３）を、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を使用して濃度およそ１ｍｇ／ｍＬで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中にＤＴＴ溶液を加えることにより還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間ボルテックスし、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予め平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過させて、過剰なＤＴＴ試薬を除去した。溶出した還元ポリペプチド分子を回収し、二官能性化合物のＭａｌ−ｃＰＮ２１６をＤＭＳＯ溶液として加え（等価のポリペプチドあたり２０当量）、混合物を室温で３時間ボルテックスして、液体窒素で凍らせた。反応混合物を一晩保存して、逆相ＨＰＬＣ精製に供した（図８Ａ及び８Ｂ）。
【００８３】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を添加）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を添加）。グラジエント：３０分間かけて５〜１００％のＢ。
【００８４】
所望の生成物を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、所望のイメージング剤組成物を白色固体として生じた（収率４１％）。
【００８５】
精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析により所望の生成物の存在を確認し、ＭＷによりｃＰＮ２１６標識は１つだけがポリペプチドコンストラクトに加えられたことが示唆された（Ｚ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６：計算されたＭＷ：７４２９Ｄａ、見出されたもの：７４２９Ｄａ；Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６  計算されたＭＷ：７５２４Ｄａ、見出されたもの：７５２４Ｄａ）。
【００８６】
実施例２
２０ｍＬバイアルに１０．００ｍＬの蒸留脱イオン水を加えた。窒素ガスをこの溶液に通しておよそ３０分間バブリングした後、ＮａＨＣＯ3（４５０ｍｇ、５．３６×１０-3ｍｏｌ）、Ｎａ2ＣＯ3（６０ｍｇ、５．６６×１０-4ｍｏｌ）及びパラ−アミノ安息香酸ナトリウム（２０ｍｇ、１．２６×１０-4ｍｏｌ）を加えた。全ての試薬は独立して秤量し、水を含有するバイアルに加えた。塩化スズ（１．６ｍｇ、７．０９×１０-6ｍｏｌ）及びＭＤＰ（２．５ｍｇ、１．４２×１０-5ｍｏｌ）を１ドラムバイアル中に合わせて秤量し、その後におよそ１ｍＬの炭酸塩緩衝液混合物中に迅速に懸濁することにより移動させた（その後に１回洗浄した）。１０μＬの一定分量を取り出して、窒素流下でシラン処理されたバイアルに移し、直ちに凍らせて凍結乾燥まで液体窒素浴の中で維持した。各バイアルはゴムのセプタムを使用して部分的に蓋をかぶせ、トレー式凍結乾燥機の中に一晩置いた。バイアルは真空下で密封し、凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムキャップでクリンプシールし、無水窒素で再加圧して、将来使用するまで冷凍庫の中で保存した。
【００８７】
実施例３
放射性標識ポリペプチドの合成は、テクネチウム還元剤としての塩化第一スズ、フリーラジカルスカベンジャーとしてのメチレンジホスホン酸、ｐ−アミノ安息香酸及び緩衝液としての炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）からなる凍結乾燥混合物を含有する内製の１段階キット処方（Ｃｈｅｌａｋｉｔ  Ａ＋）を用いて実施した。間断なく、２０μＬの２μｇ／μＬポリペプチド生理食塩水溶液をＣｈｅｌａｋｉｔに加え、その後直ちにＣａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）から入手した０．０８０ｍＬの生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中のＮａ99mＴｃＯ4（０．８ｍＣｉ、２９．６ＭＢｑ）を加えた。混合物を１回かき混ぜ、周囲温度で２０分間置いた。終了次第、粗放射化学的収率をＩＴＬＣにより決定した（下の表６はＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ、０．９％ＮａＣｌによる）。
【００８８】
【表６】
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０．３５ｍＬの１５０ｍＭ滅菌ＮａＣｌを使用して反応容量を０．４５ｍＬに増量し、最終生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  ＰＢＳを使用して飽和させたもの）により精製した。粗反応混合物をＮＡＰ５カラム上にロードし、ゲル層に入り込ませ、０．８ｍＬの１０ｍＬ  ＰＢＳを使用して溶出した後に最終精製生成物を単離した。最終活性は標準的な用量キャリブレーター（ＣＲＣ−１５Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ、Ｒａｍｓｅｙ、ＮＪ）中でアッセイした。放射化学的収率（表６）及び純度は、ＩＴＬＣ（＞９８．５％）、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（図９）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により決定した。最終生成物（１０〜１５μＣｉ／μｇ、０．２〜０．５μＣｉ／μＬ（０．３７ＭＢｑ／μｇ、７．４ＭＢｑ／ｍＬ））は直ちに生体分布研究に用いた。
【００８９】
この実験に用いたＨＰＬＣ条件は以下であった。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ方法１：溶媒Ａ：９５／５  Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを添加）、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡを添加した９５／５  ＣＨ3ＣＮ／ｄｄＨ2Ｏ（蒸留脱イオン水）。グラジエント溶出：０分  ０％Ｂ、４分  ２０％Ｂ、１６分  ６０％Ｂ、２０分  １００％Ｂ、２５分  １００％Ｂ、２６分  ０％Ｂ、３１分  ０％Ｂ。
【００９０】
Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ方法２：溶媒Ａ：０．０６％ＮＨ3水、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ。グラジエント溶出：０分  ０％Ｂ、４分  ２０％Ｂ、１６分  ６０％Ｂ、２０分  １００％Ｂ、２５分  １００％Ｂ、２６分  ０％Ｂ、３１分  ０％Ｂ。
【００９１】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーの付いたＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ−タンパク質Ｃ４カラム（Ｓ／Ｎ  Ｅ０５０９２９−２−１、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で実施した。
【００９２】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣ：溶媒：１×（１０ｍＭ）ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ2及びＭｇＣｌ2を含有する）。３０分間均一濃度で溶出。分析は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＥＣ−４  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌコントロール、Ｓｅｒｉｅｓ  ４１０  ＬＣポンプ、ＩＳＳ  ２００  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＬＣサンプルプロセッサー及びＳｅｒｉｅｓ  ２００  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ上で実施した。Ｓｏｃｋｅｔ  ８１０３  ０１１１ピンホール（０．７のｍｍ内径、２５０μＬの容量を有する）を備えたＲａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩフローセルγ検出器はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＣＩ  ９００  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅによってインターフェーズ接続した。用いたカラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．コード：１７−５１７４−０１、ＩＤ番号０６３９０５９）であった。
【００９３】
99mＴｃをｃＰＮ２１６キレートに組み込むのに用いたＣｈｅｌａｋｉｔの動作ｐＨ（ｐＨ＝９．２）は、計算されたＺ００４７７（配列番号３）ポリペプチドのｐＩとほとんど一致した。これらの条件下での標識は、最終生成物中の凝集の原因になると決定された（図５Ａ及び５Ｂ）。凝集は、サイズ排除ＨＰＬＣにより、及び生体分布研究において観察された血液滞留時間及び肝臓取込みの増加を通じて確認された。ポリペプチドの等電点を変えることにより、99mＴｃはＺ０２８９１（配列番号２）コンストラクト上に成功裡に組み込まれた。サイズ排除ＨＰＬＣにより適切な分子量を有する種の存在を確認し、生体分布研究により腫瘍異種移植片へのトレーサーの取込みが示された。
【００９４】
インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０6〜４×１０6の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。
【００９５】
マウスに約１μｇの99mＴｃ標識ポリペプチド（約１０μＣｉ／１μｇ）を尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０γＣｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注入部位（尾部）についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織＋尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についての％注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラムあたりの％注入用量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために秤量した。データは、その時点での全４から５匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。４時間の間に４つの時点が取られた（注入後５、３０、１２０及び２４０分）。
【００９６】
Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６−99mＴｃポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍への取込みを示し、注入後（ＰＩ）３０分での組織のグラムあたりの注入用量の７．１１±１．６９％（ｎ＝５）という値であって、この値はＰＩ２４０分までの研究のタイムコースにわたってほとんど一定のままである。腫瘍：血液比は注入後３０、１２０及び２４０分でそれぞれ２、５及び５であった。図１０、１１及び１２はこれらの実験についての腫瘍、血液及び腫瘍：血液曲線を示す。
【００９７】
ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は２分未満である。このクリアランスは主として腎臓が媒介し、注入後ＰＩ２４０分で１０．５８±２．９６（ｎ＝５）ＩＤ／器官である。活性は主として尿中に分泌されている。脾臓におけるポリペプチドの取込みは潜在的な凝集が原因で中程度から高いものであって、肝臓において中程度の、例として、研究経過全体にわたって１２％ＩＤ／器官（マウスにおける値で％ＩＤ／ｇと等価）の取込みが観察されている。
【００９８】
Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６−99mＴｃの生体分布結果
【００９９】
【表７】
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実施例４
Ｚ００４７７（配列番号４）、Ｚ００３４２（配列番号１）及びＺ０２８９１（配列番号２）−システインポリペプチドを、人工的に作り出されたＣ末端システインによって、アミノキシ基で官能化した。与えられたポリペプチド分子の純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により＞９５％と決定した。
【０１００】
実施例５
18Ｆをポリペプチド分子に組み込むため、２つの直交性の基：人工的に作り出されたシステインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びアルデヒド反応性アミノキシ基を含む二官能性リンカーのＭａｌ−アミノオキシを合成した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。このリンカーは、Ｂｏｃ保護形態のリンカーを生じる１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を介したカップリング条件を用いて、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドを２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸と反応させることにより調製した。Ｂｏｃ保護基を次いで酸切断により脱保護することで、最終のＭａｌ−ＡＯ生成物が定量的収率で生じた。最終生成物はさらに精製せずに直接的に用いた。
【０１０１】
一般事項
ジクロロメタン、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸、トリエチルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び全ての他の標準的合成試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。全ての化学物質はさらに精製せずに用いた。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＨＰＬＣグレードの酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水を精製に用いた。
【０１０２】
実施例６
２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸（３８２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）にトリエチルアミン（３０７μＬ、２．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（５０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３０６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を順次加えた。室温で２４時間撹拌後、反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３×３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過した。ろ液を淡黄色固体へと濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中に７０％の酢酸エチル）で精製することで、生成物が白色粉末として生じた（５００ｍｇ、８０％収率）。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ１．５０（ｓ、９Ｈ）、３．５５（ｔｔ、Ｊ１＝６．０Ｈｚ、Ｊ２＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．７７（ｄｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．３０（ｓ、２Ｈ）、６．３（ｓ、２Ｈ）。
【０１０３】
実施例７
９．３ｍｇのＭａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃを１ｍＬのメタノール中３Ｍ  ＨＣｌに溶解した溶液を室温で１８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去することで、Ｍａｌ−ＡＯが薄黄色の固体として生じた（８０％収率）。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ３．２７  ＣＨ2（ｔ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．４９  ＣＨ2（ｔ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９  ＣＨ2Ｏ（ｓ、２Ｈ）、７．００  ＣＨ＝ＣＨ（ｓ、２Ｈ）；［Ｍ＋Ｈ］+についてのｍ／ｚ＝２１４．０７（Ｃ8Ｈ12Ｎ3Ｏ4、計算されたＭＷ＝２１４．１１））
実施例８
ポリペプチド（Ｚ００４７７（配列番号４）、Ｚ００３４２（配列番号１）又はＺ０２８９１（配列番号２））を、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を使用して濃度およそ１ｍｇ／ｍＬで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中にジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を加えることにより還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭである。反応混合物を２時間ボルテックスし、脱気ＰＢＳ緩衝液で予め平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過させて、過剰なＤＴＴ試薬を除去した。還元したポリペプチドを回収し、二官能性Ｍａｌ−ＡＯ化合物をＤＭＳＯ溶液として加えた（等価のポリペプチドあたり１５当量）。室温で一晩ボルテックスした後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
【０１０４】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を添加）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を添加）。グラジエント：３０分間かけて５〜１００％のＢ。所望の生成物を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、アミノキシ修飾ポリペプチドが白色固体として生じた。
【０１０５】
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により予想された分子量を有する標的生成物の存在を確認した（Ｚ００４７７（配列番号４）−ＯＮＨ2、Ｚ００３４２（配列番号１）−ＯＮＨ2及びＺ０２８９１（配列番号２）−ＯＮＨ2それぞれについて計算されたＭＷ：６９６４Ｄａ、８５３１Ｄａ及び７２４３Ｄａ、見出されたもの：６９６３Ｄａ、８５３２Ｄａ及び７２４４Ｄａ）。
【０１０６】
実施例９
１８ＦＢＡの調製
方法：全ての反応は、窒素雰囲気下又は使用前に窒素パージしたクリンプトップの密封バイアル中のいずれかで実施した。Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２２２（Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫ2ＣＯ3（ＥＭＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）は購入して受け取ったらすぐに用いた。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ及び反応溶媒の両方として用いた。
【０１０７】
Ｋ18Ｆ（精製水中に４０ｍＣｉ・ｍＬ-1（１４８０ＭＢｑ・ｍＬ-1））はＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）及びＰＥＴＮＥＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）から入手し、受け取ったらすぐに用いた。［18Ｆ-］フッ化物は最初にＣｈｒｏｍａｆｉｘ  ３０−ＰＳ−ＨＣＯ３アニオン交換カートリッジ（ＡＢＸ、Ｒａｄｅｂｅｒｇ、ドイツ）上に固定化し、次いで、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２（３７６ｇ．ｍｏｌ-1、８ｍｇ、２．１３×１０-5ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３８．２ｇ．ｍｏｌ-1、２．１ｍｇ、１．５２×１０-5ｍｏｌ）を含有するアセトニトリル：蒸留脱イオン化Ｈ2Ｏ（ｄｄＨ2Ｏ）の４：１混合物を１ｍＬ使用してドライダウン（ｄｒｙｄｏｗｎ）容器中に溶出した。部分的な真空下、窒素流下で穏やかに加温しながら溶媒を除去した（約４５℃）（約１５分間）。供給源のバイアル及びアニオン交換カートリッジを次いでＫ２２２（８ｍｇ）を含有するアセトニトリル０．５ｍＬで洗浄し、反応混合物を再び部分的な真空下で穏やかに加温しながら乾燥させた（約１０分間）。反応器は窒素を使用して再加圧し、共沸性ドライダウンを０．５ｍＬのアセトニトリルを添加して１回繰り返した。４−ホルミル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウムトリフレート（３１３．３０ｇ・ｍｏｌ-1、３．１ｍｇ、９．８９×１０-6ｍｏｌ）を０．３５ｍＬの無水ＤＭＳＯ（Ａｃｒｏｓ）中に溶解し、Ｋ18Ｆ・Ｋ２２２、Ｋ2ＣＯ3を含有する反応器に直接的に加えた。反応混合物を９０℃まで１５分間加温し、直ちに３ｍＬのｄｄＨ2Ｏを使用してクエンチした。この混合物を続いてカチオン交換カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌ  Ｐｌｕｓ  ＣＭ）を通過させ、ｄｄＨ2Ｏで１０ｍＬに希釈し、逆相Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８）上にロードした。ＳｅｐＰａｋは１０ｍＬのｄｄＨ2Ｏでフラッシュし、次いで３０ｍＬの空気でパージした。［18Ｆ］４−フルオロベンズアルデヒド（18ＦＢＡ）を１．０ｍＬのメタノール中に溶出した。
【０１０８】
実施例１０
別々に、高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＺ００４７７−（配列番号３）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）、Ｚ００３４２−（配列番号１）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）又はＺ０２８９１−（配列番号２）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）のいずれかを充填した。固体を２５μＬのｄｄＨ2Ｏ及び８μＬのトリフルオロ酢酸中に懸濁した。２５μＬのメタノール中の18ＦＢＡ（実施例９を参照）を反応バイアルに移した。容器は蓋をかぶせ、クリンプし、ヒートブロック中に置いて、６０℃で１５分間維持した。この時点で小分量（＜５μＬ）を分析ＨＰＬＣ分析用に取り出した。４５０μＬの０．１％ＴＦＡ添加ｄｄＨ2Ｏは、セミ分取ＨＰＬＣ精製のための調製において、溶液をおよそ５００μＬに希釈するのに用いた。18ＦＢ−ポリペプチドはセミ分取ＨＰＬＣにより単離精製された。生成物（０．１１３ｍＣｉ／４．１８ＭＢｑ）を含有するＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏで５：１希釈し、続いてｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐ  Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）上に固定化した。ＳｅｐＰａｋは最初に５ｍＬのｄｄＨ2Ｏ、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした。18ＦＢ−ポリペプチドは、最初に空隙容量（およそ０．５ｍＬ）を溶出し、その後に２５０から３００μＬの溶出液を別々のフラスコ中に回収することにより、最小限の量のエタノール中に単離した。放射化学的及び化学的純度を確立するため、単離生成物に対してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。典型的には、処方後分析のため、１０μＬの０．１μＣｉ／μＬ溶液を注入した。単離放射化学的収率は表９中に指し示され、18ＦＢＡへのポリペプチド添加量及び放射化学的純度＞９９％から減衰補正されている。あるいは、反応混合物を１０ｍＭ  ＰＢＳでおよそ０．５ｍＬに希釈してゲル上にロードすることにより、18Ｆ標識ポリペプチドをＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。18Ｆ標識ポリペプチドは０．８ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳでカラムを溶出することにより単離し、さらなる修飾はせずに用いた。これらの結果を表８及び図１５中で説明する。
【０１０９】
【表８】
2014503547.tif 000013
用いた分析ＨＰＬＣ条件は以下である。分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーの付いたＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、５μ、１００Å（Ｓ／Ｎ  ４２０４７７−１０）、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で実施した。０．０５％ＴＦＡを添加した９５：５  ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡを添加したＣＨ3ＣＮ。グラジエント溶出（１．０ｍＬ・ｍｉｎ-1）：０分  ０％Ｂ、１分  １５％Ｂ、２１分  ５０％Ｂ、２２分  １００％Ｂ、２６分  １００％Ｂ、２７分  ０％Ｂ、３２分  ０％Ｂ又はグラジエント溶出（１．２ｍＬ・ｍｉｎ-1）：０分  ０％Ｂ、１分  １５％Ｂ、１０分  ３１％Ｂ、１０．５分  １００％Ｂ、１３．５分  １００％Ｂ、１４分  ０％Ｂ、１７分  ０％Ｂ。
【０１１０】
用いたセミ分取ＨＰＬＣ条件は以下である。精製は、ＤＧ−２０８０−５４  ４ラインＤｅｇａｓｓｅｒ、ＭＸ−２０８０−３２  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｉｘｅｒ及び２個のＰＵ−２０８６  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｐポンプ、大容量注入キットがインストールされたＡＳ−２０５５  Ｐｌｕｓ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔオートインジェクター、ガード付きＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ５μ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）１００Å、２５０×１０ｍｍ、５μカラム（Ｓ／Ｎ２９５８６０−１、Ｐ／Ｎ００Ｇ−４２５２−Ｎ０）、ＭＤ−２０５５  ＰＤＡ及びＣａｒｒｏｌｌ  ＆  Ｒａｍｓｅｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０５Ｓ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｒａｔｅｍｅｔｅｒを取り付けた固体ＳｉＰＩＮフォトダイオードγ検出器を備えたＪａｓｃｏ  ＬＣ上で実施した。グラジエント溶出：０分  ５％Ｂ、３２分  ２０％Ｂ、４３分  ９５％Ｂ、４６分  ９５％Ｂ、４９分  ５％Ｂ、溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡを添加したｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡを添加したＣＨ3ＣＮ。
【０１１１】
実施例１１
インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０6〜４×１０6の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。
【０１１２】
マウスに約１μｇの18Ｆ標識ポリペプチド（約４μＣｉ／１μｇ）を尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０γＣｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓、骨及び注入部位（尾部）についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織＋尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についてのパーセント注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラムあたりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために秤量した。データは、その時点での全３匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。
【０１１３】
ポリペプチドに対し、ＳＫＯＶ３細胞異種移植モデルにおける生体分布研究を行った。４時間の間に４つの時点が取られた（注入後５、３０、１２０及び２４０分）。完全な生体分布データを表１２（ＳＫＯＶ３担がんマウスにおける％ＩＤ／ｇ  Ｚ０２８９１（配列番号２）−18Ｆ−フルオロベンジルオキシム）及び表１３（ＳＫＯＶ３担がんマウスにおける％ＩＤ／ｇ  Ｚ００３４２（配列番号１）18Ｆ−フルオロベンジルオキシム）中に記載する。図１６、１７及び１８はこれらの試験についての腫瘍、血液、腫瘍：血液及びクリアランス曲線を示す。
【０１１４】
Ｚ０２８９１（配列番号２）18Ｆ−フルオロベンジルオキシムポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍への取込みを示し、注入後（ＰＩ）２４０分での組織のグラムあたりの注入用量の１７．４７±２．８９（ｎ＝３）という値である。腫瘍：血液比は注入後３０、１２０及び２４０分でそれぞれおよそ３、３４及び１２８であった。Ｚ００３４２（配列番号１）18Ｆ−フルオロベンジルオキシムポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍への取込みを示し、ＰＩ２４０分での組織のグラムあたりの注入用量の１２．４５±２．５２（ｎ＝３）という値である。腫瘍：血液比は注入後３０、１２０及び２４０分でそれぞれおよそ３、３２及び５３であった。
【０１１５】
ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は２分未満である。このＺ０２８９１（配列番号２）のクリアランスは主として腎臓が媒介し、ＰＩ２４０分で０．９５±０．０７（ｎ＝３）ＩＤ／器官である。活性は主として尿中に分泌されている。脾臓におけるポリペプチドの取込みはごくわずかであって、肝臓において低い取込み、例として、研究経過全体（注入後４時間）にわたって約１．８％ＩＤ／器官（マウスにおける値で％ＩＤ／ｇと等価）の取込みが観察されている。
【０１１６】
【表９】
2014503547.tif 000014
【０１１７】
【表１０】
2014503547.tif 000015
一般事項
全ての反応は、窒素雰囲気下又は窒素パージしたクリンプトップの密封バイアル中のいずれかで実施する。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ及び反応溶媒の両方として用いる。
【０１１８】
実施例１２
［123Ｉ］４−ヨードベンズアルデヒド（123ＩＢＡ）を、ポリペプチド−ＯＮＨ2（Ｚ０２８９１、配列番号２）、０．３５〜０．５ｍｇ）を含有する高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加える。反応は、ポリペプチドを２５μＬのｄｄＨ2Ｏ中に溶解し、８μＬのトリフルオロ酢酸、その後にメタノール中の123ＩＩＢＡを添加することにより、始まる。容器は蓋をかぶせ、クリンプし、ヒートブロック中に置いて、６０℃で１５分間維持する。反応状況を査定するため、小分量（＜５μＬ）を分析ＨＰＬＣ分析用に取り出す。反応混合物は、セミ分取ＨＰＬＣ精製のための調製において、０．１％ＴＦＡを含有するｄｄＨ2Ｏ：アセトニトリル混合物の１：１混合物の最少量に希釈される。123ＩＢ−ポリペプチドはセミ分取ＨＰＬＣ又はＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーにより単離精製される。生成物を含有するＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏでさらに希釈（５：１）し、続いてｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐ  Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）上に固定化する。ＳｅｐＰａｋを最初に５ｍＬのｄｄＨ2Ｏ、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュすることで、最小限の量のエタノール中に123ＩＢ−ポリペプチドが生じるが、これは最初に空隙容量（およそ０．５ｍＬ）を溶出し、その後に２５０から３００μＬの溶出液を別々のフラスコ中に回収することにより、得られるものである。放射化学的及び化学的純度を確立するため、単離生成物に対してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施する。
【０１１９】
実施例１３
６７Ｇａ−ＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）の調製
ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリ酢酸）キレーターをポリペプチドに結合した後、ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３）をＧａ、特に67Ｇａで標識した（図１９）。
【０１２０】
Ｍａｌ−ＮＯＴＡのポリペプチド分子へのバイオコンジュゲーションは、次のように達成した。脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を使用して濃度およそ１ｍｇ／ｍＬで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中にＤＴＴ溶液を加えることにより還元させた。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間ボルテックスし、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予め平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過させて、過剰なＤＴＴ試薬を除去した。溶出した還元ポリペプチドを回収し、二官能性化合物ｍａｌ−ＮＯＴＡをＤＭＳＯ溶液として加え（等価のポリペプチドあたり１５当量）、混合物を室温でボルテックスした。反応は、ポリペプチド分子の完全な変換を確実にするため、一晩続けられた。
【０１２１】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で実施された。溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸を添加）、溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸を添加）。グラジエント：３０分間かけて５〜１００％のＢ（図２０Ａ）。
【０１２２】
所望の生成物を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、結合ポリペプチドが白色固体として生じた。
【０１２３】
精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析により所望の生成物の存在を確認し、ＭＷによりＮＯＴＡキレーターは１つだけがポリペプチドコンストラクトに加えられたことが示唆された（Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡについて計算されたＭＷ：７５０４Ｄａ、見出されたもの：７５０６Ｄａ）（図２０Ｂ）。
【０１２４】
放射性標識は続いて次のように達成した。２５μｌのＨＥＰＥＳ溶液（６３ｍＭ）を始めにスクリュートップバイアルに加え、その後に０．０４Ｍ  ＨＣｌ中の４０．５ＭＢｑ  67ＧａＣｌ3（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０μｌ加えた。３０μｌ  Ｈ2Ｏ中の３０μｇ（ＭＷ＝７５０６、４．０×１０-9ｍｏｌ）のＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）を次いで反応混合物に加えることで、濃度が６１μＭでｐＨが３．５〜４．０である最終ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）が生じた。反応バイアルを密封して、反応を周囲温度で維持した。粗反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析により、67Ｇａ−ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）の放射化学的純度は、室温で２時間の後にＨＰＬＣによると９５％であると決定された（図２１）。１日の反応時間の後、67Ｇａ−ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）をＨＰＬＣにより精製した。２２ＭＢｑの67Ｇａ−ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）を精製のためにＨＰＬＣ上に注入した。１５ＭＢｑの67Ｇａ標識生成物が精製から得られた（放射化学的収率＝６８％）。ＨＰＬＣ溶媒を真空下で除去することで、容量がおよそ０．５ｍＬの溶液を生じた。およそ１．４５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水を次いで添加することで、ｐＨ６〜６．５で放射能濃度が７．７ＭＢｑ／ｍＬである最終溶液を生じた。精製された処方物67Ｇａ−ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）は室温で２時間以上安定であることが見出された（ＲＣＰ＝９６％、ＨＰＬＣによる）（図２２）。
【０１２５】
用いた分析ＨＰＬＣ条件は以下である。Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ4タンパク質５ミクロン、３００Å、４．６×２５０ｍｍ  ＨＰＬＣカラム。溶媒Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の９５／５  Ｈ2Ｏ／ＭｅＣＮ、溶媒Ｂ＝０．０５％ＴＦＡ中の９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ。ＨＰＬＣグラジエント（分／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０。
【０１２６】
用いたセミ分取ＨＰＬＣ条件は以下である。カラム：Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４タンパク質５ミクロン、３００Å、４．６×２５０ｍｍ。溶媒Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の９５／５  Ｈ2Ｏ／ＭｅＣＮ、溶媒Ｂ＝０．０５％ＴＦＡ中の９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ。ＨＰＬＣグラジエント（分／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０。
【０１２７】
一般事項
組換えＨＥＲ２  Ｚ２８９２１−ＣｙｓはＡｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎから購入し、Ｅｅｉ−アミノオキシ酢酸コハク酸エステルはＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈから、及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジフルオロシランはＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍから購入した。試薬及び溶媒はＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｅｒｃｋ、Ｒｏｍｉｌ及びＦｌｕｋａから購入した。
【０１２８】
分析ＬＣ−ＭＳスペクトルは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によりポジティブモードで運転されるＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＳＱ機器上で記録したが、これに連結したＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＰＤＡクロマトグラフィーシステムでは以下の条件を用いた。特に指示がなければ溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μｍ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４／２５４ｎｍ。
【０１２９】
セミ分取逆相ＨＰＬＣのランは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄクロマトグラフィーシステム上で、以下の条件を用いて実施した。特に指示がなければ溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ。
【０１３０】
分取逆相ＨＰＬＣのランは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４０００システム上で、以下の条件を用いて実施した。特に指示がなければ溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  １０μ  Ｃ１８（２）２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４／２５４ｎｍ。
【０１３１】
略語：
Ａｌａ（Ａ）：アラニン
Ａｒｇ（Ｒ）：アルギニン
Ａｓｎ（Ｎ）：アスパラギン
Ａｓｐ（Ｄ）：アスパラギン酸
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃｙｓ（Ｃ）：システイン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＢ：４−ジメチルアミノ−ベンズアルデヒド
ＤＯＴＡ：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸
ＥＤＴ：１，２−エタンジチオール
ＥＭＳ：エチルメチルスルフィド
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
ｅｑ：当量
ＦＢＡ：４−フルオロベンズアルデヒド
Ｇｌｎ（Ｑ）：グルタミン
Ｇｌｕ（Ｅ）：グルタミン酸
ｈｒ（複数可）：時（複数可）
ＨＥＲ２：ヒト上皮成長因子受容体
ＨＯＡｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｉｌｅ（Ｉ）：イソロイシン
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー−質量分析
Ｌｅｕ（Ｌ）：ロイシン
Ｌｙｓ（Ｋ）：リジン
Ｍｅｔ（Ｍ）：メチオニン
ｍｉｎ：分
μｍ：マイクロメーター
ｎｍ：ナノメーター
ＮＭＰ：１−メチル−２−ピロリジノン
ＮＯＴＡ：１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸
ＰＤＡ：フォトダイオードアレイ
ＰＥＴ：陽電子放射断層撮影
Ｐｈｅ（Ｆ）：フェニルアラニン
Ｐｒｏ（Ｐ）：プロリン
ＰｙＡＯＰ：（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｓｅｒ（複数可）：セリン
ＳｉＦＡ：４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフルオロシリル）ベンズアルデヒド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｈｒ（Ｔ）：スレオニン
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｐ（Ｗ）：トリプトファン
Ｔｙｒ（Ｙ）：チロシン
Ｖａｌ（Ｖ）：バリン
実施例１４
化合物２の半自動放射性合成
【０１３２】
【化５】
2014503547.tif 000016
ＦＡＳＴｌａｂＴＭプラットフォーム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を［１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒド（「［１８Ｆ］ＦＢＡ」）の調製に用いたが、これは典型的にはエタノール中で７ＧＢｑの［１８Ｆ］ＦＢＡ（１．５ｍＬ、減衰未補正の収率で１２〜５４％）を産出するものである。この［１８Ｆ］ＦＢＡ溶液の小画分（９２μＬ）を次いで、シラン処理されたＰ６バイアル中、水（１３８μＬ）中のアニリン塩酸塩（３．２ｍｇ、２５μｍｏｌ）の存在下で、アミノキシ前駆体３（０．４ｍｇ、５５ｎｍｏｌ）と手作業で結合させた。混合物を７０℃まで２０分間、Ｐｅｌｔｉｅｒヒーターを用いて加熱した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５  カートリッジ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって２を単離した。０．２５ｍＬ生理食塩水／０．１％アスコルビン酸ナトリウムを使用した初めの溶出は廃棄した。その後の２を含有する０．７５ｍＬ生理食塩水／０．１％アスコルビン酸ナトリウム溶出物を回収し、同じ溶出混合物と共にｐＨ５〜５．５で処方することで、所望の放射性濃度を生じた。コンジュゲーション段階から単離された２の減衰未補正収率は１７〜３８％、手作業で調製した２の放射化学的純度（ＲＣＰ）値は≧９５％であった（ＴＬＣシステム：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ、水／３０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を移動相として使用したＣ１８逆相シートを用いた。標識ペプチドは起点に留まった）。Ｇｉｌｓｏｎ  ３２２ポンプを用い、Ｇｉｌｓｏｎ  ＵＶ／ＶｉＳ  １５６検出器、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ放射能検出器及びＬｕｎａ  Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム（５０×４．６ｍｍ、３μｍ）又はＬｕｎａ  Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えたＨＰＬＣにより、生成物をさらに分析した。移動相は溶媒Ａ（０．１Ｍ酢酸アンモニウム）及びＢ（アセトニトリル）からなり、１ｍＬ／分で直線的なグラジエント（１５分間で５〜９５％のＢ）で流した。ＵＶ吸収を２８０及び３５０ｎｍで測定した。図２３は処方２の分析ＨＰＬＣトレースの代表例を示す。
【０１３３】
実施例１４ａ
化合物３の調製
（ｉ）Ｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドの調製
【０１３４】
【化６】
2014503547.tif 000017
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（５１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＥｅｉ−ＡＯＡｃ−ＯＳｕ（７７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍＬ）中に溶解した。Ｓｙｍ．−コリジン（８０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０分間撹拌した。反応混合物を水（７ｍＬ）で希釈し、生成物のｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドをセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて１５〜３０％のＢ、Ａ＝水／０．１％酢酸及びＢ＝ＡＣＮ）を用いた精製は、４３ｍｇ（７５％）の純粋なＥｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドを産出。精製された物質のｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドをＬＣ−ＭＳにより性質決定した（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）。ｔR：１．９３分、見出されたｍ／ｚ：２８４．１、予想されたＭＨ+：２８４．１。
【０１３５】
（ｉｉ）化合物３の調製
組換えＺ０２８９１−Ｃｙｓ（１４４ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎから購入）及びｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミド（１７ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）中に溶解した。酢酸アンモニウムの添加により溶液をｐＨ６に調整し、反応混合物を９０分間振とうした。反応混合物を水（７ｍＬ）で希釈し、生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製することで、１２６ｍｇの凍結乾燥Ｅｅｉ保護生成物を産出した。ｅｅｉ保護生成物をアルゴン被覆下で２０分間、２．５％ＴＦＡ／水（１６ｍＬ）を使用して処理した。溶液を水（１４４ｍＬ）で希釈し、アルゴン被覆下でイソプロパノール／ドライアイス浴を用いて凍結させ、凍結乾燥することで、１４９ｍｇ（１００％）のＺ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル（３）を産出した。凍結乾燥Ｚ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル（３）を分析ＬＣ−ＭＳにより分析した（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ、ｔR：３．２８分、見出されたｍ／ｚ：１８１１．８、予想されたＭＨ44+：１８１１．４）。
【０１３６】
実施例１５
ｔＣ２ ＳｅｐＰａｋ精製を用いた化合物２の自動放射性合成
ＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットは、第一のバイアル（８．２５ｍｇ／２１．９μｍｏｌのＫｒｙｐｔｏｆｉｘ、１．１６ｍｇ／８．４μｍｏｌのＫ2ＣＯ3、１６５μＬの水、６６０μＬのアセトニトリル）、第二のバイアル（１．５ｍｇ／４．８μｍｏｌのトリフレート１、１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ）、第三のバイアル（５．５ｍｇ／０．７６μｍｏｌの３、８．２ｍｇ／６３μｍｏｌのアニリン塩酸塩、０．７ｍＬの酢酸アンモニウム緩衝液  ｐＨ４．５／０．２５Ｍ）、第四のバイアル（４ｍＬ、４％ｗ／ｖのアンモニア水）、エタノール（２５ｍＬ）及びリン酸（１％ｗ／ｗ、２５ｍＬ）の外部バイアル、調整済みのＱＭＡ  ｌｉｇｈｔ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ、ＯＡＳＩＳ  ＭＣＸ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ並びに２個のtＣ２  ＳｅｐＰａｋカートリッジを含有して組み立てた。生成物バイアルはｐ−アミノ安息香酸水溶液（０．０８％ｗ／ｗ、１９ｍＬ）を含有した。カセットのレイアウトを図２４に示す。
【０１３７】
必要とされるプログラムシーケンスをＰＣコントロールから合成機モジュールへとアップロードし、組み立てたカセットを機械上に設置した。ウォーターバッグ及び生成物バイアルを取り付けた。［18Ｆ］水（３００ＭＢｑ、１ｍＬ）を含有するバイアルをＦＡＳＴｌａｂ（商標）モジュールに取り付け、放射性合成を始めた。プロセスは、ＱＭＡカートリッジから溶出した［18Ｆ］−Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ／炭酸カリウム複合体の共沸乾燥段階、［18Ｆ］ＦＢＡの放射性合成、ＭＣＸカートリッジ、アンモニア溶液及びエタノールでの溶出を用いた［18Ｆ］ＦＢＡの精製、２を生産するコンジュゲーション段階並びにtＣ２カートリッジ上でリン酸／エタノールを用いた精製及び処方段階を包含した。全プロセスは１時間かかり、２を３３％の減衰未補正の放射化学的収率で、９４％の放射化学的純度で生成させた。
【０１３８】
実施例１６
Ｓｅｐｈａｄｅｘ精製を用いた化合物２の自動放射性合成
ＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットは、第一のバイアル（８．２５ｍｇ／２１．９μｍｏｌのＫｒｙｐｔｏｆｉｘ、１．１６ｍｇ／８．４μｍｏｌのＫ2ＣＯ3、１６５μＬの水、６６０μＬのアセトニトリル）、第二のバイアル（１．５ｍｇ／４．８μｍｏｌのトリフレート１、１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ）、第三のバイアル（５．０ｍｇ／０．６９μｍｏｌの３、８．２ｍｇ／６３μｍｏｌのアニリン塩酸塩、０．７ｍＬの酢酸アンモニウム緩衝液  ｐＨ４．５／０．２５Ｍ）、第四のバイアル（４ｍＬ、４％ｗ／ｖのアンモニア水）、エタノール（２５ｍＬ）及び生理食塩水（Ｐｏｌｙｆｕｓｏｒ、０．９％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）の外部バイアル、調整済みのＱＭＡ  ｌｉｇｈｔ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ、ＯＡＳＩＳ  ＭＣＸ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ並びに乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０（５００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｇ１０１２０）を含有するカスタム充填サイズ排除カートリッジ（２ｍＬ、Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｃａｔ．＃５７６０８−Ｕ）を含有して組み立てた。カセットのレイアウトを図２６に示す。２の放射性合成を実施例１５に記載されたように実施した。生理食塩水（５ｍＬ）を使用してＳｅｐｈａｄｅｘカートリッジをプライミングした後、粗反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘカートリッジを通して送り込み、純粋な２を生成物バイアル中に回収した。合成時間は４０分間で、減衰未補正の放射化学的収率は１０％であった。生成物の放射化学的純度は９５％で、ＤＭＡＢレベルは０．８μｇ／ｍＬであった。図２７は最終生成物のＨＰＬＣ分析を示す。
【０１３９】
実施例１７
［１８Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）２−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射性合成
【０１４０】
【化７】
2014503547.tif 000018
ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）2−Ｚ０２８９１（４）（７４６μｇ、１００ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液を、コニカルポリプロピレン遠心分離バイアル（１．５ｍＬ）中でＡｌＣｌ3溶液（酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０、０．５Ｍ中に３μＬ、３．３３μｇ、２５ｎｍｏｌ）と混合した。この混合物をキャップ付きのＰ６バイアル中で少量の［18Ｆ］フッ化物（５０μＬ）に加えた。このバイアルを１００℃で１５分間加熱した。生理食塩水（１００μＬ）で希釈した後、反応溶液をＮＡＰ５サイズ排除カートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。最終生成物は生理食塩水（７５０μＬ）を用いてＰ６バイアル中に溶出した。標識ペプチド５は１１％の減衰未補正の放射化学的収率を有するものとして得られた。図２８は処方生成物の分析ＨＰＬＣを示す。表１１に個々のランのデータをまとめる。
【０１４１】
【表１１】
2014503547.tif 000019
実施例１７ａ
化合物４の調製
（ｉ）ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）の調製
【０１４２】
【化８】
2014503547.tif 000020
（ａ）テトラトシル−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミンの合成
【０１４３】
【化９】
2014503547.tif 000021
Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、１４．８ｇ、１００ｍｍｏｌ）及びピリジン（Ｆｌｕｋａ、２００ｍＬ）を０℃、窒素下で、トルエン−４−スルホニルクロリド（Ｆｌｕｋａ、７７ｇ、４００ｍｍｏｌ）のピリジン（Ｆｌｕｋａ、１００ｍＬ）溶液を７５分間かけてこの溶液中に入れながら撹拌した。温度をゆっくりと室温に上昇させ、４時間撹拌し続けた。溶液を氷（２５０ｍＬ）と塩酸（濃縮物、２５０ｍＬ）との混合物中に撹拌しながら注ぎ込んで、黒ずんだ粘着性の油を産出した。溶媒をデカンテーションにより除去し、粗生成物を水で洗浄し、デカンテーションしてメタノール（２５０ｍＬ）中に再溶解した。結果として得られたスラリーをろ過により単離し、粗生成物を熱メタノール（６０℃、６００ｍＬ）中に再溶解して冷却した。固体生成物をろ別し、真空中で乾燥させた。収率３６．３６ｇ（４７．５％）。生成物をＮＭＲにより検証した。
【０１４４】
（ｂ）１−ベンジル−４−７−ジトシル−１，４，７−トリアゾナンの合成
【０１４５】
【化１０】
2014503547.tif 000022
テトラトシル−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン（実施例１７ａ（ｉ）（ａ）を参照、２．０ｇ、２．６ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（５００μｌ、４．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（Ｆｌｕｋａ、７９２ｍｇ、５．７ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ、２５ｍＬ）を１００℃まで加熱し、一晩撹拌した。ろ過により溶媒を固体生成物から除去した。固体をアセトニトリルで洗浄し（２×１０ｍＬ）、溶媒を蒸発させて除いた。固体を熱エタノール（１５ｍＬ）中に溶解し、室温で３日間置いた。ろ過により結晶を回収して、真空中で一晩乾燥させた。生成物をＬＣ−ＭＳにより確認した（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜８０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）。ｔR＝３．６６分。収率１ｇ（７２％）。
【０１４６】
（ｃ）（４−ベンジル−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル）−酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【０１４７】
【化１１】
2014503547.tif 000023
硫酸（Ｓｉｇｍａ、濃縮物、２５ｍＬ）を撹拌しながら１−ベンジル−４−７−ジトシル−１，４，７−トリアゾナン（実施例１７ａ（ｉ）（ｂ）を参照、２．５ｇ、４．７ｍｍｏｌ）に加え、１００℃に加熱して２０時間置いた。反応混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル（ＶＷＲ、５００ｍＬ）中に滴下した。生成物（白色沈殿）をろ別し、アセトニトリル、クロロホルム及びジクロロメタンで洗浄した。溶媒を真空中で除去した。粗生成物（９８６．３ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）中でトリエチルアミン（Ｆｌｕｋａ、１．４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）と混合した。ｔｅｒｔ−ブチルブロモ酢酸（Ｆｌｕｋａ、１．４７ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解し、滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ｐＨを制御し、必要な場合はトリエチルアミンを加えた。溶媒を真空中で除去し、粗物質をジクロロメタン（１５０ｍＬ）中に溶解して、水（２×２５ｍＬ）、０．１Ｍ塩酸（１×２５ｍＬ）及び水（１×２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をろ過し、溶媒を蒸発させて除いた。粗物質をアセトニトリル／水（１：１）中に溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５μｍ  ２５０×２１．２ｍｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは６０分間かけて１０〜８０％のＢ）により精製して凍結乾燥した。ＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜８０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）。ｔR＝３．９９分、（Ｍ１）４４７．４。生成物をＮＭＲにより検証した。
【０１４８】
生成物をＰｄ／Ｃ（１０％、２３５ｍｇ）及びメタノール（２５ｍＬ）と混合し、アルゴン下で撹拌した。次いで吸引によりアルゴンを除去し、水素ガスの供給を開始した。撹拌して連続的に水素ガスを供給しながら、反応混合物を３時間置いた。触媒を遠心分離により除去し、溶媒を蒸発させて除いた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５μｍ  ２５０×２１．２ｍｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは６０分間かけて２〜８０％のＢ）を使用して精製した。ＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜８０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）。ｔR＝２．５５分、（Ｍ１）３５７．９。収率１５０ｍｇ。生成物をＮＭＲにより確認した。
【０１４９】
（ｄ）（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル）−酢酸［ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）］の合成
【０１５０】
【化１２】
2014503547.tif 000024
（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル）−酢酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１７ａ（ｉ）（ｄ）を参照、２８０μｍｏｌ、１００ｍｇ）及びブロモ酢酸（Ｆｌｕｋａ、１ｍｍｏｌ、１３８．２１ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）中に溶解した。水（１ｍＬ）中に溶解した炭酸カリウムを撹拌しながら加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空中で濃縮した。残渣を水（２．５ｍＬ）中に溶解し、塩酸（１Ｍ）を使用してｐＨを４に調整した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５μｍ  ２５０×２１．２ｍｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは６０分間かけて１０〜８０％のＢ）により精製した。ＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜８０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）。ｔR＝２．４０分。収率１１７．７ｍｇ。生成物をＮＭＲにより確認した。
ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）を分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて２０〜４０％のＢ）により精製して、７２ｍｇの純粋なＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）を産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）により性質決定した。ｔR：３．７５分、見出されたｍ／ｚ：４１６．２、予想されたＭＨ+：４１６．３。
【０１５１】
（ｉｉ）ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）−マレイミドの調製
【０１５２】
【化１３】
2014503547.tif 000025
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（２３ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）及びＰｙＡＯＰ（５１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２ｍＬ）中に溶解した。Ｓｙｍ．−コリジン（２９μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間振とうした。混合物を水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（６ｍＬ）で希釈し、生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：６０分間かけて２０〜５０％のＢ）を用いた精製は、３３ｍｇ（８７％）の純粋なＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）−マレイミドを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）により性質決定した。ｔR：４．０９分、見出されたｍ／ｚ：５３８．２、予想されたＭＨ+：５３８．３
（ｉｉｉ）ＮＯＴＡ（ビス−酸）−マレイミドの調製
【０１５３】
【化１４】
2014503547.tif 000026
ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）−マレイミド（３３ｍｇ、６１μｍｏｌ）は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び２．５％水のＴＦＡ（１０ｍＬ）溶液を使用して４時間３０分、処理した。ＴＦＡを真空中で蒸発させ、残渣を水／０．１％ＴＦＡ（８ｍＬ）中に溶解し、生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて０〜２０％のＢ）を用いた精製は、１５ｍｇ（５８％）の純粋なＮＯＴＡ（ビス−酸）−マレイミドを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて０〜３０％のＢ）により性質決定した。ｔR：１．３４分、見出されたｍ／ｚ：４２６．０、予想されたＭＨ+：４２６．２。
【０１５４】
（ｉｖ）４の調製
組換えＺ０２８９１−Ｃｙｓ（４０ｍｇ、５．７μｍｏｌ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎから購入）及びＮＯＴＡ（ビス−酸）−マレイミド（６．１ｍｇ、１４μｍｏｌ）を水（１．５ｍＬ）中に溶解した。酢酸アンモニウムを加えることにより溶液をｐＨ６に調整し、混合物を１時間振とうした。反応混合物を水／０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、生成物をセミ分取ＨＰＬＣを用いて精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて２０〜３０％のＢ）を用いた精製は、３８ｍｇ（９０％）の純粋な化合物４を産出した。精製された４を分析ＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）により分析した。ｔR：３．３１分、見出されたｍ／ｚ：１８６４．５、予想されたＭＨ44+：１８６４．５。
【０１５５】
実施例１８
［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）3−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５ａ）の放射性合成についてのタイムコース研究
Ｗ．  Ｊ．  ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１０，  ２１，  １３３１）に記載されているように、フッ素−１８をＱＭＡカートリッジを用いて精製して生理食塩水で溶出した。18Ｆ水溶液（２５μＬ、１２ＭＢｑ）を酢酸ナトリウム緩衝液（１．５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（１．６６７μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）及び化合物６（３８０μｇ、５０ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液と混合した。
【０１５６】
【化１５】
2014503547.tif 000027
混合物を１００℃に加熱し、一定分量をＨＰＬＣにより分析した。分析データを図２９に示す。
【０１５７】
実施例１８ａ
化合物６の調製
（ｉ）ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）の調製
【０１５８】
【化１６】
2014503547.tif 000028
（ａ）α−ブロモグルタル酸 ５−ベンジルエステルの合成
【０１５９】
【化１７】
2014503547.tif 000029
０℃に冷却したＬ−グルタミン酸−５−ベンジルエステル（Ｆｌｕｋａ、３．０ｇ、０．０１３ｍｏｌ）及び臭化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、４．６ｇ、０．０４４ｍｏｌ）の臭化水素酸水溶液（Ｆｌｕｋａ、１Ｍ、２２．５ｍＬ）に亜硫酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ、１．６ｇ、０．０２３ｍｏｌ）を少しずつ加えた。０℃で２時間の撹拌後、濃硫酸（Ｍｅｒｃｋ、１．２ｍＬ）、その後にジエチルエーテル（Ｅｔｅｒｎｅｌｌ）を加えた。水相をジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで４回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水して、減圧下で蒸発させた。粗生成物を順相クロマトグラフィー（シリカカラム（４０ｇ）、溶媒：Ａ＝ヘキサン、Ｂ＝酢酸エチル、グラジエント：２０分間かけて１０〜３５％のＢ、流速４０ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出）を用いて精製し、１．８１ｇの純粋な生成物を産出した。収率４６％。構造をＮＭＲにより検証した。
【０１６０】
（ｂ）α−ブロモグルタル酸 ５−ベンジルエステル １−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000 10, 2133-2135）
【０１６１】
【化１８】
2014503547.tif 000030
α−ブロモグルタル酸−５−ベンジルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ａ）を参照、１．２ｇ、４．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ、５ｍＬ）溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル  ２，２，２−トリクロロアセトイミデート（Ｆｌｕｋａ、１．５７ｍＬ、８．５２ｍｍｏｌ）のシクロヘキサン（Ｍｅｒｃｋ、５ｍＬ）溶液を５分間かけて滴下した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｆｌｕｋａ、０．８８ｍＬ）を、その後にホウ素トリフルオリドエチルエーテラート（Ａｌｄｒｉｃｈ、８０μＬ）を触媒として加えた。反応混合物を室温で５日間撹拌した。ヘキサンを加え、有機相をブラインで３回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水して、減圧下で蒸発させた。粗生成物を順相クロマトグラフィー（シリカカラム（４０ｇ）、溶媒：Ａ＝ヘキサン、Ｂ＝酢酸エチル、グラジエント：１５分間かけて１０から３５％のＢ、流速４０ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出）を用いて精製し、１．１３ｇ（７９％）の純粋な生成物を産出した。構造をＮＭＲにより検証した。
【０１６２】
（ｃ）２−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸 ５−ベンジルエステル １−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【０１６３】
【化１９】
2014503547.tif 000031
α−ブロモグルタル酸−５−ベンジルエステル  １−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ａ）を参照、５１３ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ、２０ｍＬ）溶液を３時間かけて１，４，７トリアザシクロノナン（Ｆｌｕｋａ、５５７ｍｇ、４．３１ｍｍｏｌ）のクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ、２０ｍＬ）溶液に加えた。混合物を室温で３日間撹拌し、真空中で薄黄色の油になるまで濃縮した。粗生成物を順相クロマトグラフィー（シリカカラム（４０ｇ）、溶媒：Ａ＝エタノール：アンモニア（水）９５：５、Ｂ＝クロロホルム：エタノール：アンモニア（水）３８５：１７５：２０、グラジエント：６分間かけて０％のＢ、１２分間かけて１００％のＢ、流速４０ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出）を用いて精製し、半純粋な（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｅ）生成物（２８９ｍｇ）を産出した。収率４９％。生成物をＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜５０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により確認した。ｔR＝２．５分、ｍ／ｚ（ＭＨ+）、４０６．３。
【０１６４】
（ｄ）２−（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸  ５−ベンジルエステル  １−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【０１６５】
【化２０】
2014503547.tif 000032
乾燥アセトニトリル（４０ｍＬ）中の２−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸  ５−ベンジルエステル  １−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ｂ）を参照、６００ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）をゼロ度に冷却した後、乾燥アセトニトリル（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルブロモ酢酸（Ｆｌｕｋａ、５４８ｍｇ、４１４μＬ、２．８１ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下した。反応混合物をさらに１５分間撹拌した後に乾燥炭酸カリウム（Ｆｌｕｋａ、１．１３ｇ、８１４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４時間かけてゆっくりと室温に温めた。混合物をＣｅｌｉｔｅでろ過し、乾燥するまで蒸発させて、粗生成物を産出した。生成物をＬＣ−ＭＳ（カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜８０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により確認した。ｔR＝３．９分、ｍ／ｚ（ＭＨ+）、６３４．４。
【０１６６】
（ｅ）２−（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸  １−ｔｅｒｔ−ブチルエステル［ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）］の合成
【０１６７】
【化２１】
2014503547.tif 000033
２−（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸  ５−ベンジルエステル  １−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ｃ）を参照、９３８ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を２−プロパノール（Ａｒｃｕｓ、１１５ｍＬ）中に溶解し、水（３ｍＬ）中に懸濁した１０％Ｐｄ／Ｃ（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ、３１５ｍｇ）を加えた。混合物は水素（４気圧）を使用して３時間処理し、Ｃｅｌｉｔｅでろ過して、乾燥するまで蒸発させた。残渣はシリカゲル上でクロマトグラフィーを行い（シリカカラム（４ｇ）、溶媒：２−プロパノール：アンモニア  ９５：５、流速４０ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出）、半純粋な生成物（２２５ｍｇ）を産出した。生成物をＬＣＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、２．０ｘ５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、グラジエントは５分間かけて１０〜８０％のＢ、流速０．６ｍＬ／分、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ検出、ＥＳＩ−ＭＳ）により確認した。ｔR２．４分、ＭＨ+  ５４４．５。
精製されたＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜８０％のＢ）により性質決定した。ｔR：２．４分、見出されたｍ／ｚ：５４４．５、予想されたＭＨ+：５４４．４。
【０１６８】
（ｉｉ）ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２の調製
【０１６９】
【化２２】
2014503547.tif 000034
ＮＭＰ（１ｍＬ）中に溶解したＰｙＡＯＰ（９６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びエチレンジアミン（１．２ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を１時間振とうし、次いで２回目の一定分量のＰｙＡＯＰ（３８ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を加えた。振とうを３０分間続けた。２０％ＡＣＮ／水（５ｍＬ）を加え、生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて２０〜５０％のＢ）を用いた精製は、１２３ｍｇ（９８％）の純粋なＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2を産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて２０〜５０％のＢ）により性質決定した。ｔR：１．９５分、見出されたｍ／ｚ：５８６．４、予想されたＭＨ+：５８６．４。
【０１７０】
（ｉｉｉ）ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−マレイミド
【０１７１】
【化２３】
2014503547.tif 000035
ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2（１２３ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、３−マレイミド−プロピオン酸ＮＨＳエステル（７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びｓｙｍ．−コリジン（３４６μＬ、２．６０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を６時間撹拌した。水（６ｍＬ）を加え、生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて２０〜５０％のＢ）を用いた精製は、１１５ｍｇ（８７％）の純粋なＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミドを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜６０％のＢ）により性質決定した。ｔR：３．３６分、見出されたｍ／ｚ：７３７．４、予想されたＭＨ+：７３７．４。
【０１７２】
（ｉｖ）ＮＯＴＡ（トリス−酸）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−マレイミドの調製
【０１７３】
【化２４】
2014503547.tif 000036
ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミド（１１５ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）は、２．５％ＴＩＳ及び２．５％水のＴＦＡ（１０ｍＬ）溶液を使用して４時間処理した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を水（８ｍＬ）中に再溶解して、生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて０〜２０％のＢ）を用いた精製は、８０ｍｇ（９０％）の純粋なＮＯＴＡ（トリス−酸）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミドを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて０〜３０％のＢ）により性質決定した。ｔR：２．７４分、見出されたｍ／ｚ：５６９．５、予想されたＭＨ+：５６９．２。
【０１７４】
（ｖ）化合物６の調製
（ａ）合成Ｚ０２８９１−Ｃｙｓの調製
配列：ＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣを、０．０５ｍｍｏｌ  ＮｏｖａＰＥＧ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂を使用して開始するＦｍｏｃ化学作用を用いたＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成機上で組み立てた。０．４５ｍｍｏｌ  ＨＢＴＵ／０．４５ｍｍｏｌ  ＨＯＡｔ／１．０ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡをインサイチュ活性化のために用いる各カップリング段階（７５℃で５分間）において、０．５ｍｍｏｌのアミノ酸をアプライした。ＤＭＦ中の５％ピペラジンによりＦｍｏｃを除去した。両Ａｒｇについてダブルカップリングを適用した。Ａｓｐ−Ｓｅｒ及びＬｅｕ−Ｓｅｒのシュードプロリンジペプチド（０．５ｍｍｏｌ）を配列内に組み込んだ。
【０１７５】
同時に起こる側鎖保護基の除去及び樹脂からのペプチドの切断は、２．５％ＴＩＳ、２．５％ＥＤＴ、２．５％ＥＭＳ及び２．５％水を含有するＴＦＡ（４０ｍＬ）中で１時間行った。ろ過により樹脂を除去し、ＴＦＡで洗浄し、合わせたろ液を真空中で蒸発させた。ジエチルエーテルを残渣に加え、形成された沈殿をジエチルエーテルで洗浄して乾燥させた。切断手順をもう１度繰り返した。乾燥沈殿を２０％ＡＣＮ／水中に溶解し、残存するＴｒｐ保護基を除去するため、一晩置いた。溶液を凍結乾燥して、１４８ｍｇ（４２％）の粗Ｚ０２８９１−Ｃｙｓを産出した。１４８ｍｇの粗Ｚ０２８９１−Ｃｙｓをセミ分取ＨＰＬＣ（４ラン、グラジエント：４０分間かけて２５〜３０％のＢ）により精製して、３３ｍｇ（９％）の純粋なＺ０２８９１−Ｃｙｓを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）により性質決定した。ｔR：３．４０分、見出されたｍ／ｚ：１７５８．３、予想されたＭＨ44+：１７５８．４。
【０１７６】
合成Ｚ０２８９１−Ｃｙｓ（１３．７ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）及びＮＯＴＡ（トリス−酸）−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−マレイミド（１１ｍｇ、１９．３μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）中に溶解した。酢酸アンモニウムを加えることにより溶液をｐＨ６に調整し、混合物を３時間振とうした。反応混合物を水／０．１％ＴＦＡ（６．５ｍＬ）で希釈し、生成物をセミ分取ＨＰＬＣを用いて精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて１５〜３５％のＢ）を用いた精製は、８．４ｍｇ（５７％）の純粋な６を産出した。化合物６を分析ＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）により分析した。ｔＲ：３．３１分、見出されたｍ／ｚ：１９００．７、予想されたＭＨ４４＋：１９００．２。
【０１７７】
実施例１９ ［１８Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）２−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学的収率に対するＡｌＣｌ３／ペプチド比の影響
４（１４９μｇ、２０ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液３つをコニカルポリプロピレン遠心分離バイアル（１．５ｍＬ）中でＡｌＣｌ3（それぞれ０．３３μｇ、２．４９ｎｍｏｌ；０．６６μｇ、４．９８ｎｍｏｌ；及び１．３３μｇ、９．９６ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（１μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液と混合した。これらのバイアルに少量の［18Ｆ］フッ化物（１０μＬ）を添加した。バイアルを１００℃で１５分間加熱し、続いてＨＰＬＣにより分析した。導入収率を表１２に示す。
【０１７８】
【表１２】
2014503547.tif 000037
実施例２０ ［１８Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）２−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学的収率に対する試薬希釈の影響
４（３７３μｇ、５０ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液をコニカルポリプロピレン遠心分離バイアル（１．５ｍＬ）中でＡｌＣｌ3（１．６６μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（１．５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液と混合した。少量の［18Ｆ］フッ化物（１０μＬ、８０ＭＢｑ）を加えた。この混合物を酢酸ナトリウム緩衝液（１．５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）で２段階希釈したもの（５０％及び２５％ｖ／ｖ）を調製した。３つのバイアルを次いで１００℃で１５分間加熱し、続いてＨＰＬＣにより分析した。データを表１３に示す。
【０１７９】
【表１３】
2014503547.tif 000038
実施例２１ ［１８Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）２−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学的収率に対するペプチド／ＡｌＣｌ３濃度の影響
［18Ｆ］フッ化物（２５μＬ、２３〜２５ＭＢｑ）、ＡｌＣｌ3（１．５μＬの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０、０．５Ｍ中にペプチド４の１／４当量）及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の４（５０、１００、１５０ｎｍｏｌ）を含有する３つのバイアルを１００℃で３０分間加熱した。図３０は１５及び３０分後の導入データを示す。
【０１８０】
実施例２２ ［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）2−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学的収率に対するマイクロ波加熱の影響
［18Ｆ］フッ化物（２５μＬ、２９ＭＢｑ）、１．５μＬの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０、０．５Ｍ中のＡｌＣｌ3（１．６６μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）、及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の４（３７３μｇ、５０ｎｍｏｌ）を含有するＷｈｅａｔｏｎバイアル（３ｍＬ）を、マイクロ波デバイス（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ５２１、設定温度８０℃、５０Ｗ）を用いて５、１０及び１５秒間加熱した。表１４はこれらの時点の後のＨＰＬＣ分析の概要を示す。
【０１８１】
【表１４】
2014503547.tif 000039
実施例２３ ［１８Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ（ＣＯＯＨ）３−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５ａ）の調製
【０１８２】
【化２５】
2014503547.tif 000040
［18Ｆ］フッ化物（２５μＬ、２９ＭＢｑ）、１．５μＬの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０、０．５Ｍ中のＡｌＣｌ3（１．６６μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）、及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の６（３８０μｇ、５０ｎｍｏｌ）を含有するＰＰ遠心分離バイアル（１．５ｍＬ）を１００℃で１５分間加熱した。５ａの分析的ＲＣＹは１５〜２０％であった。図３１は反応混合物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【０１８３】
実施例２４
［１８Ｆ］ＳｉＦＡ−Ｚ０２８９１（配列番号２）（７）の調製
【０１８４】
【化２６】
2014503547.tif 000041
ペプチド前駆体８（７５０μｇ、１００ｎｍｏｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）溶液を、ポリプロピレン遠心分離バイアル（１．５ｍＬ）中の［18Ｆ］フッ化物の水（５０μＬ）溶液に加え、９５℃で１５分間加熱した。生理食塩水（１００μＬ、０．９％ｗ／ｖ）を加えた後、混合物を生理食塩水で調整したＮＡＰ５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。生成物７は、２６分後に１８％の減衰未補正の放射化学的収率及び８７％の放射化学的純度を有するものとして得られた。図３２は最終生成物のＨＰＬＣ分析を示す。
【０１８５】
実施例２４ａ 化合物８の調製
（ｉ）ＳｉＦａの合成
【０１８６】
【化２７】
2014503547.tif 000042
ヘキサン中のｎ−ブチルリチウム（２．５Ｍ、３．２ｍＬ、７．９ｍｍｏｌ）を、冷却（−７８℃）した２−（４−ブロモフェニル）−１，３−ジオキソラン（１．８ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６ｍＬ）溶液にアルゴン下で滴下した。−７８℃で２時間撹拌後、結果として得られた黄色の懸濁液をシリンジ中に吸い上げ、冷却（−７０℃）したジ−ｔｅｒｔ−ブチルジフルオロシラン（１．５ｍＬ、８．３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に２０分間かけて滴下した。反応混合物を−７０℃で１時間撹拌し、次いで周囲温度まで温めた。２時間３０分後に試料（３ｍＬ）を反応混合物から取り出し、水／０．１％ＴＦＡを使用してクエンチして、ジオキソラン保護基の除去に至った。脱保護された生成物を分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣ（グラジエント：６０分間かけて４０〜９５％のＢ）を用いた精製は、純粋なＳｉＦＡを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて５０〜９５％のＢ）により性質決定した。ｔR：２．０５分、見出されたｍ／ｚ：検出されず、予想されたＭＨ+：２６７．２。
【０１８７】
（ｉｉ）ＳｉＦＡ−アミノオキシアセチル−マレイミドの調製
【０１８８】
【化２８】
2014503547.tif 000043
Ｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミド（２０ｍｇ、７１μｍｏｌ）を水／ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のＳｉＦＡに加えた（ＨＰＬＣ分取画分から）。１Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を加えて反応混合物を一晩撹拌した。生成物をセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて４０〜８０％のＢ）を用いた精製は、１５ｍｇ（４５％）の純粋なＳｉＦＡ−アミノオキシアセチル−マレイミドを産出した。精製された物質をＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて４０〜７０％のＢ）により性質決定した。ｔR：３．００分、見出されたｍ／ｚ：４６２．１、予想されたＭＨ+：４６２．２。
【０１８９】
（ｉｉｉ）化合物８の調製
組換えＺ０２８９１−Ｃｙｓ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ（２４ｍｇ、３．４μｍｏｌ）及びＳｉＦＡ−アミノオキシアセチル−マレイミド（４．７ｍｇ、１０μｍｏｌ）を５０％ＡＣＮ／水（１ｍＬ）中に溶解した。酢酸アンモニウムを加えることにより溶液をｐＨ６に調整し、混合物を１時間振とうした。反応混合物を１０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（８ｍＬ）で希釈し、生成物をセミ分取ＨＰＬＣを用いて精製した。セミ分取ＨＰＬＣ（グラジエント：４０分間かけて２０〜４０％のＢ）を用いた精製は、２６ｍｇ（１００％）の純粋なＺ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル−ＳｉＦＡ（８）を産出した。精製されたＺ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル−ＳｉＦＡ（８）を分析ＬＣ−ＭＳ（グラジエント：５分間かけて１０〜４０％のＢ）により分析した。ｔR：３．８７分、見出されたｍ／ｚ：１８７３．６、予想されたＭＨ44+：１８７３．５。
【０１９０】
実施例２５
腫瘍モデルの検証
腫瘍増殖及びＨＥＲ２発現についてＡ４３１及びＮＣＩ−Ｎ８７異種移植モデルを検証した。動物モデルの立ち上げには動物あたりで（１００μｌの５０％ＰＢＳ／５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の）２×１０6個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞又は１０7個のＡ４３１細胞を右脇腹に皮下接種することが必要で、その後に３０日の接種期間があった。これらの腫瘍におけるＨＥＲ２発現を、免疫組織化学により、ＦＤＡがバリデートしたＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（Ｄａｋｏ、Ｋ５２０４）を用いて査定した。
【０１９１】
図３３は、推奨される強度スケール（０→＋３）を使用するとＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍は強く染色されるが（＋３）、Ａ４３１細胞はかなり弱い染色強度（＋１）を示すことを描写する。これらのデータは、腫瘍モデルのＨＥＲ２発現は顕著に異なり、それ故にＨＥＲ２を標的とするＡｆｆｉｂｏｄｙ分子の取込みを比較するのに適していることを示唆する。ＩＨＣスコアが十分に離れていたことに基づいて、さらなる定量的評価は必要ないと考えられた。
【０１９２】
実施例２６
正常マウスにおける化合物２、５及び７の生体分布
生理食塩水で処方されたトレーサー化合物２、５及び７はナイーブＣＤ１マウスを用いて評価されている。活性３ＭＢｑの静脈内注射（２分の時点で２．５ＭＢｑ）の後、動物を注入後２、９０、１２０及び１８０分で屠殺し、放射活性の保持を主要な器官において評価した。生体分布測定において、５は顕著な腎臓での保持（注入後９０分で７０．３％ＩＤ）を示したが、２及び７では観察されなかった（注入後９０分でそれぞれ４．８％ＩＤ及び１０％ＩＤ）。７の脱フッ素が観察された（注入後９０分の骨への取込みが５．３％ＩＤ／ｇ）。図３４では対応する［111Ｉｎ］ＤＯＴＡ−Ｚ０２８９１（配列番号２）（９）化合物と生体分布データを比較する。
【０１９３】
【化２９】
2014503547.tif 000044
実施例２７
化合物２、５及び７の腫瘍への取込み
高レベル及び低レベルのＨＥＲ２発現腫瘍細胞（それぞれＮＣ８７及びＡ４３１）を有する腫瘍マウスモデルにおいて、化合物２、５及び７の取込みの差が予想通り観察された。図３５、表１５及び１６では、対応する［111Ｉｎ］ＤＯＴＡ−Ｚ０２８９１（配列番号２）（９）化合物と生体分布データを比較する。
【０１９４】
【表１５】
2014503547.tif 000045
【０１９５】
【表１６】
2014503547.tif 000046
実施例２８
二重腫瘍異種移植モデルにおける２のイメージング
Ａ４３１及びＮＣＩ−Ｎ８７を２つの脇腹の各々に移植することにより、二重腫瘍異種移植マウスが生み出された。これらのマウスは２の生体分布を評価するのに用いられ、低及び高ＨＥＲ２発現腫瘍の両方における取込みを同一の動物で評価することを可能にした。時点は注入後３０及び６０分を包含した。
【０１９６】
図３６は２の性能が単一腫瘍動物研究において観察されたものに匹敵するものであったことを示し、Ａ４３１腫瘍とＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍との間でバインダー取込みが、注入後３０分の早い時期から始まって良好に分離している。バックグラウンドの組織クリアランスに関しては（主要な組織比について表７を参照）、注入後６０分の血液レベルが顕著に低下しておりＮＣＩ−Ｎ８７の腫瘍：血液比４．５２をもたらしたが、３０分においては、部分的な血液クリアランスにより２．３９の比を生じ、これは肯定的な腫瘍：肝臓比である１．３９を伴っている。これらの性質は、２の薬物動態が適したイメージングウィンドウ内でヒト対象をイメージングするのに十分なことを示唆する。
【０１９７】
【表１７】
2014503547.tif 000047
実施例２９
ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍マウスにおける化合物２のアドバック（ａｄｄ−ｂａｃｋ）研究
バインダーの効力における過剰量のコールドリガンドの効果を査定するためにＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍モデルにおいて実施されるアドバック研究のため、以下の４つの異なる調製物を注入後９０分で査定した。
１．標準的な化合物２調製物
２．標準的な調製物＋マウスあたり１００μｇ／ｋｇのコールド前駆体
３．標準的な調製物＋マウスあたり５００μｇ／ｋｇのコールド前駆体
４．標準的な調製物＋マウスあたり１０００μｇ／ｋｇのコールド前駆体
標準的な調製物におけるコールド前駆体の濃度はマウスあたり１２０μｇ／ｋｇであって、それ故にこの研究では、（マウスにおいて）元々用いられた濃度の１０倍の濃度でコールド前駆体の効果が試験された。図３７は、腫瘍取込みに対する効果は顕著ではなく、他の組織からのクリアランスも顕著には影響されなかったことを示す。
【０１９８】
実施例３０
二重脇腹Ａ４３１／ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍マウスにおける化合物２のインビボイメージング研究
実施例２８に記載した二重腫瘍マウスモデルを予備的なイメージング研究を実施するのに用いた。動物あたり１０ＭＢｑの２を静脈内注射して、マウスを注入後１２０分で開始して３０分間イメージングした。図３８のイメージは、生体分布研究を通じて先に実証されたようにクリアランスが腎臓及び膀胱を経由したことを示す。横断イメージングは、２の腫瘍における取込みがＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍ではＡ４３１腫瘍よりかなり高いシグナル強度を示しており、実施例２８の二重腫瘍生体分布研究と一致することを示す。
【０１９９】
現行の２のイメージング研究とＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）９のイメージング研究との比較（図３８）は、高及び低ＨＥＲ２発現腫瘍の間の取込みの差が同様であることを示す。しかしながら、２は腎臓からのバックグラウンドがかなり改善されており、これは生体分布においてまた見られる最小限の腎臓保持のためである。
【０２００】
上で論じられた、及び／又は引用された全ての特許、雑誌論文、刊行物及び他の資料は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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