(57)【要約】【課題】本発明は、哺乳動物における不妊および／または不妊症を診断および／または処置するための方法に関する。【解決手段】本発明は、不妊および／または不妊症を処置するための使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤、ならびに対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法であって、雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程、および／または雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程を含み、場合により、前記雄対象または雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程をさらに含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不妊および／または不妊症を処置するための使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項２】
前記シスタチンがシスタチン３である、請求項１に記載のその使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項３】
シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドが、少なくとも１つの別のシスタチンのＮ末端フラグメントと組み合わせて投与される、請求項１または２に記載のその使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項４】
雄および／または雌の、不妊および／または不妊症を処置するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のその使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項５】
カップルの対象の不妊および／または不妊症を処置するための、請求項１から４のいずれか一項に記載のその使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドまたはシスタチン発現誘導剤が局部投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載のその使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項７】
受精促進薬または受精改善薬としての使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項８】
雌の哺乳動物における卵管から子宮への受精卵の移動のステップを促進または改善するための使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項９】
前記雌の哺乳動物が、生殖補助医療（ART）において、配偶子卵管内移植術（GIFT）もしくは治療的非配偶者間人工授精（TDI）を受けている哺乳動物であるかまたは体外受精（IVF）を行おうとしている哺乳動物である、請求項８に記載のその使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤。
【請求項１０】
シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドを含む流体媒体中で、雌の哺乳動物から得られた卵子と、雄の哺乳動物から得られた精子とを接触させる工程を含む、体外受精および／または人工授精の方法。
【請求項１１】
前記シスタチンがシスタチン３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ１）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ａ２）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ１）および／または（ａ２）において測定された少なくとも１つのシスタチンのレベルを、それぞれに応じて適切に、前記少なくとも１つのシスタチンの雄対照レベルまたは前記少なくとも１つのシスタチンの雌対照レベルと比較する工程を含み、
場合により、
（ｃ１）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ｃ２）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される工程；
（ｄ）それぞれに応じて適切に、工程（ａ１）および（ｃ１）ならびに／あるいは工程（ａ２）および（ｃ２）の測定値に基づき、少なくとも１つのシスタチン／カテプシン比［（ａ１＋ａ２）／（ｃ１＋ｃ２）］を計算する工程、および計算されたシスタチン／カテプシン比を、シスタチン／カテプシン比の対照閾値レベルと比較する工程をさらに含み、
ｉ）工程（ａ１）および／または（ａ２）において測定された少なくとも１つのシスタチンのレベルの、前記少なくとも１つのシスタチンの前記雄対照レベル、もしくは前記少なくとも１つのシスタチンの雌対照レベルと比較した低下、または
ｉｉ）工程（ｄ）において計算されたシスタチン／カテプシン比の、シスタチン／カテプシン比の前記対照閾値レベルと比較した減少
が、前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を示すか、前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症の、より高いリスクを示す方法。
【請求項１３】
（ａ１）請求項１２に定義された雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程、
（ａ２）請求項１２に定義された雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程；
（ａ３）工程（ａ１）において測定された前記少なくとも１つのシスタチンのレベルと、工程（ａ２）において測定された前記少なくとも１つのシスタチンのレベルとを足し合わせる工程；および
（ｂ）工程（ａ３）において得られた前記少なくとも１つのシスタチンのレベルを、前記少なくとも１つのシスタチンの対照レベルと比較する工程を含み、
場合により、さらに、
（ｃ１）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ｃ２）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される工程；
（ｄ）それぞれに応じて適切に、工程（ａ１）および（ｃ１）ならびに／あるいは工程（ａ２）および（ｃ２）の測定値に基づき、少なくとも１つのシスタチン／カテプシン比［（ａ１＋ａ２）／（ｃ１＋ｃ２）］を計算する工程、および計算されたシスタチン／カテプシン比を、シスタチン／カテプシン比の対照閾値レベルと比較する工程
を含み、
ｉ）工程（ａ３）において得られる少なくとも１つのシスタチンのレベルの、前記少なくとも１つのシスタチンの対照レベルと比較した低下が、前記カップルの対象の不妊および／または不妊症を示すか、または
ｉｉ）工程（ｄ）において計算されたシスタチン／カテプシン比の、シスタチン／カテプシン比の前記対照閾値レベルと比較した減少が、前記カップルの対象の不妊および／または不妊症の、より高いリスクを示す、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ１）、（ｃ２）、および（ｄ）が実施される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象および／またはカップルの対象の、不妊および／または不妊症を、診断および／または予測することを意図したキットであって、
（ｉ）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンを検出するための手段であって、前記試料が、血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される手段、および／または
（ｉｉ）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンを検出するための手段であって、前記試料が、血液、血漿、血清、頸管粘液、および膣粘液からなる群から選択される手段
を含むキット。
【請求項１６】
不妊および／または不妊症を患う対象および／またはカップルの対象が、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤による処置を包含する処置レジメンから利益を得る可能性があるかを決定する方法であって、
（ａ１）雄対象の生物学的試料中のシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が、血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ａ２）雌対象の生物学的試料中のシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が、血液、血漿、血清、頸管粘液、および膣粘液からなる群から選択される工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における不妊および／または不妊症を診断および／または処置するための方法に関する。特に、本発明は、不妊および／または不妊症を処置するための使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／またはシスタチン発現誘導剤、ならびに対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法であって、雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程、および／または雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程を含み、場合により、前記雄対象または雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程をさらに含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関では、ヒト不妊症を、カップルが、妊娠に曝露されている２年以内に身ごもる能力がないことと定義しているが、「妊娠に曝露されている」という表現は、妊娠のリスクがある（妊娠しておらず、性的に活発であり、避妊しておらず、授乳していない）生殖年齢（１５〜４９歳）の女性を指す。
【０００３】
この定義によれば、世界中で７０００万組を超える男女が不妊症であり、これは、世界中のカップルのうちの１３％〜１５％を占める。有病率は、ばらつきが大きいが、先進国では小さく、研究および処置のための入手可能な資源が限定されている開発途上国では大きい。フランスでは、約１５％のカップルが、生殖能力の問題を有している。
【０００４】
加えて、不妊症は、カップルの生活に影響を及ぼすだけでなく、また、医療サービスおよび社会環境にも影響を及ぼすために、公衆問題としても考えられている。実際、不妊症のカップルが抱く感情には、抑うつ、悲嘆、罪悪感、恥辱感、および社会的孤立感を伴う不全感が含まれる（Kamel（2010）、Reprod. Biol. Endocrin. 8: 21）。
【０００５】
生殖能力の問題を有するカップルでは、不妊症のうちの約３０％が、女性に由来するもので、排卵障害または卵管に関連する不妊症と連関し；不妊症のうちの２０％が、男性に由来し；４０％が男女両方に由来し、１０％が性状不詳である。性状不詳の不妊症の場合は、男性または女性の配偶者のいずれにおいても生殖機能の異常を確立することができない。
【０００６】
したがって、不妊症、特に、性状不詳の不妊症の診断方法および処置方法が依然として必要とされている。
【０００７】
本発明は、本発明者らによる、シスタチン３が、性交後の膣内における精子の保護において重要な役割を果たすことの予測外の発見に由来する。
【０００８】
シスタチン（CST）は、分子的特性および生物学的分布を異にしながらも構造的には関連のある、タンパク質のスーパーファミリーを形成する。これらは全て、パパインおよび多くのヒトカテプシンなどのシステインプロテアーゼの強力で可逆的な競合的阻害剤である（Abrahamsonら（2003）、Biochem. Soc. Symp. 70: 179-199）。カテプシン（CTS）は、酸性環境において活性なリソソームプロテイナーゼのファミリーである。これらは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、およびプロテオグリカンを含めた細胞外マトリックス分子を分解する能力を有し、また、細胞内タンパク質の異化およびプロホルモンのプロセシングにも関与する。カテプシンは主に、細胞外マトリックスおよび基底膜のタンパク質を分解しうるリソソームプロテアーゼ（Buckら（1992）、Biochem. J. 282: 273-278）であり、これらの酵素のうちの一部はまた、炎症性疾患および悪性疾患の発症機序にも関与すると考えられている。したがって、これらの酵素とそれらの阻害剤（例えば、シスタチン）との間の均衡が、内因性のタンパク質分解に対する保護のために最も重要である。
【０００９】
シスタチンタンパク質のスーパーファミリーは、阻害剤の以下の３つの主要な種類を含有する：
・１型シスタチンは、細胞内プロテアーゼ阻害剤を代表するが、低レベルの１型シスタチンはまた、一部の体液中でも見出される（Abrahamsonら（1986）、J. Biol. Chem. 261: 11282-11289）；
・分泌のためのシグナルペプチドと共に合成されるために、おそらく主に細胞外の機能を有する２型シスタチン（Abrahamsonら（2003）、Biochem. Soc. Symp. 70: 179-199）。２型シスタチンのメンバーにおいて、シスタチンＣは、全てのシスタチンのうちで、リソソームシステインプロテアーゼ一般に対する最も強力な阻害活性を示し、ヒトの組織および体液において広範に分布する（Abrahamsonら（1986）、J. Biol. Chem. 261: 11282-11289）；ならびに
・３型シスタチンは、シスタチンＣおよびα２−マクログロブリンと共に、システインプロテアーゼの最も重要な血漿中阻害剤である（Abrahamsonら（1986）、J. Biol. Chem. 261: 11282-11289）。
【００１０】
シスタチンのうちで、またシスタチン３（CST3）とも称するシスタチンＣは、パパイン様カテプシンの主要な細胞外阻害剤のうちの１つである。ＣＳＴ３は、プロテアーゼとの等モル複合体を結果としてもたらす基質競合機構における緊密で可逆的な結合を介して、Ｃ１システインプロテアーゼのファミリーを阻害する（Abrahamsonら（1987）、J. Biol. Chem. 262: 9688-9694）。
【００１１】
ＣＳＴ３の発現は、全てのヒト器官において報告されており、ＣＳＴ３は、多くの生物学的流体において検出され、精漿、脳脊髄液、および滑液において最高濃度が見出されている（Abrahamsonら（1986）、J. Biol. Chem. 261: 11282-11289）。ＣＳＴ３はまた、ヒト雄の生殖管において高度に発現することも報告されている（Jibornら（2004）、J. Androl. 25: 564-572）。しかし、ｍＲＮＡレベルは、異なる組織型間で大幅に変化する（Abrahamsonら（1990）、Biochem. J. 268: 287-294）。ＣＳＴ３は特に、精巣、精巣上体、輸精管、精嚢、および前立腺に由来する正常組織において広範に分布する。免疫反応性のＣＳＴ３は、基底上皮細胞および分泌上皮細胞において局在化されており、また、前立腺の神経内分泌細胞においても局在化されている。
【００１２】
そのサイズが小さく（１３．３ｋＤａ）、産生が安定的であるため、シスタチンＣの血清レベルは、非妊娠状況下における糸球体濾過量（GFR）の信頼できるマーカーである（Grubb（2000）、Adv. Clin. Chem. 35: 63-99）。炎症性状態下において、ＣＳＴ３の活性は、好中球エラスターゼであるセリンプロテアーゼにより下方制御される可能性がある（Abrahamsonら（1991）、Biochem. J. 273: 621-626）。ファミリー２のシスタチン（例えば、シスタチンＤ、シスタチンＳ、シスタチンＳＡ、およびシスタチンＳＮ）の他のメンバーと同様、ＣＳＴ３は、骨吸収（LernerおよびGrubb（1992）、J. Bone Mineral Res. 7: 433-440）および組織リモデリングを含めた正常な体内プロセスにおいて、システインプロテイナーゼの作用を制御することが報告されている。ＣＳＴ３の欠損およびシステインプロテイナーゼ活性の増大は、がんの進行およびアテローム性動脈硬化を含めた、細胞外マトリックスの分解と関連する多数の病理学的状態と関連する（Shiら（1999）、J. Clin. Invest. 104: 1191-1197）。
【００１３】
ヒトの雌では、増殖期および分泌期の子宮内膜においてＣＴＳＢ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＫ、ＣＴＳＬ、およびＣＴＳＳが発現し、正常な子宮の発育および機能ならびに月経に要請されると考えられている（Jokimaaら（2001）、Mol. Hum. Reproduction 7: 73-78）。ＣＴＳＤ（Camierら（1996）、Hum. Reproduction 11: 392-397）、ＣＴＳＨ（Allanら（2003）、Endocr. Res. 29: 53-65）、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＬ、およびＣＴＳＳ（Jokimaaら（2001）、Mol. Hum. Reproduction 7: 73-78）は、霊長動物の月経周期下にある子宮内膜において、特異調節を示すものとして同定された。これらの知見により、カテプシンは、増殖期および分泌期のいずれにおいても、ヒト子宮内膜の正常な発育および機能に必要とされることが示唆されている。
【００１４】
他方、ＣＳＴは、脊椎動物の濾胞または子宮内膜の発育において、ごくわずかしか研究されていない。これまでに以下の２つの論考だけが、マカクザルの膣におけるＣＳＴ３の発現について報告している。Ｓｌａｙｄｅｎら（2004 J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 883-891）は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学により、ＣＳＴ３が、膣の線維芽細胞および平滑筋細胞に局在化することを明らかにした。エストラジオールは、膣の線維芽細胞および平滑筋細胞束におけるＣＳＴ３の発現を増大させ、プロゲステロンは、この効果を抑制した。より近年になって、妊娠していない雌ヒツジの月経周期下におけるＣＳＴ３の発現が研究され、妊娠した雌ヒツジの場合と比較されている（Songら（2006）、Endocrinology 147: 3478-3483）。子宮におけるＣＳＴ３のｍＲＮＡおよびタンパク質両方の配置を決定するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析および免疫細胞化学解析により、ＣＳＴ３は、子宮内膜の内腔上皮（LE）および腺上皮（GE）の両方に限り存在することが明らかとなっている。ＣＳＴ３のタンパク質が主に、月経周期下にある雌ヒツジの１２日目の子宮内フラッシュにおいて検出されていることは、免疫組織化学研究と符合し、これにより、ＣＳＴ３は、排卵のピーク近傍において産生されることが示唆される。
【００１５】
入手可能な証拠は、多様なプロテアーゼならびにそれらの特異的な阻害剤が、多くの種（例えば、マウス、ラット、ネコ、ブタ、およびヒト）の受胎産物の着床時における栄養膜の浸潤を制御するという概念を支持する（Jokimaaら（2001）、Mol. Hum. Reproduction 7: 73-78; Afonsoら（1997）、Development 124: 3415-3425; ElangovanおよびMoulson（1980）、Biol. Reprod. 23: 663-668; Liら（1991）、Biol. Reprod. 44: 625-631 ; Liら（1992）、Biol. Reprod. 47: 21-28）。とりわけ、これらの研究は、多くの哺乳動物における着床および栄養膜浸潤に対する子宮の受容性の制御におけるＣＴＳの存在を暗示している（SalamonsenおよびWooley（1996）、Human Reproduction 11: 124-133; CurryおよびOsteen（2003）、Endocr. Rev. 24: 428-465）。
【００１６】
ヒツジの子宮におけるＣＳＴ３の発現は、マウスについて報告されているＣＳＴ３の発現と類似しており（Afonsoら（1997）、Development 124: 3415-3425）、そこでは、浸潤性の栄養膜における巨細胞によるＣＴＳＬおよびＣＴＳＢの発現が、着床部位の脱落膜化する間質における、ＣＳＴ３の協調的な発現により均衡を保っている（Songら（2006）、Endocrinology 147: 3478-3483）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、上記の先行研究により、精子の成熟および着床（implantationおよびnidation）におけるＣＳＴ３の潜在的な役割が実証されたが、ＣＳＴ３が受精ステップ、特に、精子の膣から卵管への移動のステップおよび卵子の精子との融合のステップの両方に影響を及ぼしうることが示唆されているわけではない。
【００１８】
本発明者らは、無精子でない雄の精液においてＣＳＴ３が極めて高濃度で存在すれば、精漿が膣内に放出されるときに、カテプシンに対して精子が保護されることを実証した。精漿中のＣＳＴ３が高量であるほど、膣内で分泌されるカテプシンに対する保護の付与が良好となる。この理論に束縛されるわけではないが、ＣＳＴ３レベルの低い患者では、性交後に雌宿主の反応を効率的に低減することができず、過剰な胚細胞破壊により不妊となる可能性が高いことが考えられる。本発明者らは実際、不妊男性の３０％の提示する精液中のＣＳＴ３濃度が、低濃度〜極めて低濃度である、すなわち、３０ｎｇ／ｍｌ未満であり、これにより、プロテイナーゼ／抗プロテイナーゼ間の均衡の破壊が誘導されることを実証した。この場合、ＣＳＴ／ＣＴＳ比の不均衡は、不妊症をもたらしうる。同じことは、膣および子宮内膜により分泌されるＣＳＴが、雄の胚細胞に対するカテプシンの活性を制限するには低濃度に過ぎる場合、またはＣＴＳが、ＣＳＴにより相殺できない高量で雌の生殖管により産生される場合にも成り立つ。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は、膣における少なくとも１つのＣＳＴ活性を増大させ、したがって、ＣＳＴ／ＣＴＳ比を最適化して、精子の保護を改善することにより、不妊および／または不妊症を処置するための方法に関する。特に、不妊および／または不妊症を処置するのに、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤を使用することができる。
【００２０】
本発明はまた、対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ｉ）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ｉｉ）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、および膣粘液、または任意の種類の雌の生殖管における液体からなる群から選択される工程、ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において測定された少なくとも１つのシスタチンのレベルを、それぞれに応じて適切に、前記少なくとも１つのシスタチンの雄対照レベル、または前記少なくとも１つのシスタチンの雌対照レベルと比較する工程を含み、
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において測定された少なくとも１つのシスタチンのレベルの、前記少なくとも１つのシスタチンの前記雄対照レベル、または前記少なくとも１つのシスタチンの雌対照レベルと比較した低下が、前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を示すか、または前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症の、より高いリスクを示す方法にも関する。
【００２１】
これらの測定値は、同じ種類の試料における少なくとも１つのカテプシンの測定値と併せて、ＣＳＴ／ＣＴＳ比を正確に決定することができれば有利である。ＣＳＴ／ＣＴＳ比の低下は、前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を示すか、または前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症の、より高いリスクを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例に記載される、不妊男性３１例の精液中のシスタチンＣ濃度の分布を示す。
【図２】精子および頸管粘液中のシスタチンＣ濃度を示す。
【図３】精子および頸管粘液中のカテプシンＢ濃度を示す。
【図４】性交後（PCT）検査におけるシスタチンＣ濃度を示す（検査が陰性の場合を陰性と称し、ＰＣＴ陽性度が極めて低度な場合を不良と称し、ＰＣＴ陽性度が低度な場合を不十分と称し、ＰＣＴ陽性度が中程度な場合を良好と称し、陽性度が高度な場合を極めて良好と称する）。
【図５】ＰＣＴ検査におけるカテプシンＢ濃度を示す（検査が陰性の場合を陰性と称し、ＰＣＴ陽性度が極めて低度な場合を不良と称し、ＰＣＴ陽性度が低度な場合を不十分と称し、ＰＣＴ陽性度が中程度な場合を良好と称し、陽性度が高度な場合を極めて良好と称する）。
【図６】ＰＣＴ検査におけるＣＳＴ／ＣＴＳ比を示す（検査が陰性の場合を陰性と称し、ＰＣＴ陽性度が極めて低度な場合を不良と称し、ＰＣＴ陽性度が低度な場合を不十分と称し、ＰＣＴ陽性度が中程度な場合を良好と称し、陽性度が高度な場合を極めて良好と称する）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
シスタチンおよびシスタチン発現誘導剤
本発明の文脈では、本明細書の下記において引用されるＳｗｉｓｓ  ＰｒｏｔおよびＧｅｎｂａｎｋの参照番号は、２０１０年１２月１日に参照可能であった参照番号である。
【００２４】
当業者により知られる通り、シスタチンとは、ニワトリシスタチンとの相同性を有するシステインプロテアーゼ阻害剤のファミリーである。シスタチンは、典型的に約１４５アミノ酸を含み、大部分が酸性であり、２つのジスルフィド結合を形成することが知られる、４つの保存的システイン残基を含有し、グリコシル化および／またはリン酸化される可能性があり、フェチュイン、キニノゲン、ステフィン、ヒスチジンに富む糖タンパク質、およびシスタチン関連タンパク質との類似性を有する。それらは、ペプチダーゼファミリーＣ１（パパインファミリー）およびＣ１３（レグメインファミリー）に属するペプチダーゼを主に阻害する（TurkおよびBode（1991）、FEBS Letters 285: 213-219）。
【００２５】
シスタチンファミリーは、以下を包含する。
・多くの細胞型の細胞質ゾル中に存在するが、また、体液中にも著明な濃度で出現しうる細胞内シスタチンである、１型シスタチン。１型シスタチンは、ジスルフィド結合も炭水化物側鎖も有さない、約１００残基の単鎖ポリペプチドである。
・１９〜２８残基のシグナルペプチドにより合成される主に細胞外の分泌ポリペプチドである、２型シスタチン。２型シスタチンは、大半の体液中で広く分布し、見出される。２型シスタチンには、特に、シスタチンＣが含まれる。
・マルチドメインタンパク質である、３型シスタチン。
・ある範囲の生物において見出されるシスタチン様タンパク質であり、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼファミリーＭ１２のメタロプロテアーゼ（アスタシン／アダマライシン）を阻害する、植物におけるフィトシスタチン、哺乳動物におけるフェチュイン、昆虫におけるシスタチン、およびパフアダー毒におけるシスタチンが含まれる、未分類のシスタチン。
【００２６】
本発明の文脈では、シスタチンが、上記で規定された２型シスタチンであることが好ましい。より好ましくは、シスタチンがシスタチンＣである。
【００２７】
シスタチン３、γ−トレース、ポスト−γ−グロブリン、神経内分泌塩基性ポリペプチドまたはＣＳＴ３とも呼ばれるシスタチンＣは、ＣＳＴ３遺伝子によりコードされるタンパク質である。ヒトＣＳＴ３遺伝子の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２２５５として参照される。シスタチン３タンパク質は、典型的に１４６アミノ酸から構成される。ＣＳＴ３は、アミノ酸１〜２６に対応するシグナルペプチドおよびアミノ酸２７〜１４６に対応する成熟鎖を含めた前駆体型で合成される。ヒトシスタチン３の前駆体型のアミノ酸配列は、例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ番号Ｐ０１０３４として参照され、典型的には配列番号１に示される通りである。本明細書の後続で用いられる、「シスタチン３タンパク質」または「ＣＳＴ３」という用語は、シスタチン３の成熟鎖、好ましくは、ヒトシスタチン３の成熟鎖に対応する。
【００２８】
複数の研究により、ＣＳＴ３のＮ末端ドメインは、ＣＳＴ３のシステインプロテアーゼ阻害活性を観察するのに必要であることが実証された（Abrahamsonら（1987）、J. Biol. Chem. 262: 9688-9694; Abrahamsonら（1991）、Biochem. J. 273: 621-626）。このＣＳＴ３のＮ末端ドメイン（またはＮ末端フラグメント）は、配列ＳＳＰＧＫＰＰＲＬ（配列番号２）からなり、ＣＳＴ３の前駆体型のアミノ酸２７〜３５または成熟ＣＳＴ３のアミノ酸１〜９に対応する。
【００２９】
好ましい実施形態では、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドが、成熟シスタチンタンパク質のフラグメント、特に、成熟２型シスタチンのフラグメント、より具体的には、成熟ＣＳＴ３タンパク質のフラグメントであるか、またはシスタチンの前駆体型のフラグメント、特に、２型シスタチンの前駆体型のフラグメント、より具体的には、ＣＳＴ３の前駆体型のフラグメントである。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドが、成熟シスタチンタンパク質、特に、成熟２型シスタチン、より具体的には、成熟ＣＳＴ３タンパク質であるか、またはシスタチンの前駆体型、特に、２型シスタチンの前駆体型、より具体的には、ＣＳＴ３の前駆体型である。シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドは、成熟シスタチンタンパク質、特に、成熟２型シスタチン、より具体的には、成熟ＣＳＴ３タンパク質であることが好ましい。
【００３１】
本発明の文脈では、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語が区別なく用いられ、天然ペプチド（タンパク質分解の産物、または合成的に合成されたペプチド）を指し、さらにペプトイドおよびセミペプトイドなどの修飾ペプチドまたはペプチド模倣体も指す。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの自然ステップ、または当技術分野でよく知られている化学修飾法により修飾されたアミノ酸配列を包含する。このような修飾は、文献において十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めたポリペプチド内のいずれにおいても生じうる。同じ種類の修飾が、同じ程度または異なる程度で、所与のポリペプチド内の複数の部位に存在しうることが察知される。所与のポリペプチドはまた、多くの種類の修飾も含有しうる。
【００３２】
修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的接合、ヘム部分の共有結合的接合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的接合、脂質または脂質誘導体の共有結合的接合、ホスファチジルイノシトールの共有結合的接合、架橋形成、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化；アルギニル化、スモイル化、およびユビキチン化など、転移ＲＮＡを介するアミノ酸のタンパク質への付加が含まれる。これらの修飾は、例えば、「Proteins-Structure and molecular properties」、２版、Creighton,T.E.、Freeman,W.H.ら、New York、1993；Wold,F.、「Post-translational protein modifications: perspectives and prospects」、１−１２頁、「Post-translational covalent modification of proteins」、Johnson,B.C.、Academic Press、New York、1983；Seifterら（1990）、Meth. Enzymol. 182:626-646；およびRattanら（1992）、Ann NY Acad Sci 663:48-62に記載されている。
【００３３】
ペプトイドおよびセミペプトイドは、ペプチド類似体であり、例えば、体内にある間のペプチドの安定性を高めるか、または免疫原性を高める修飾を有する場合がある。このような修飾には、環化、Ｎ末端の修飾、Ｃ末端の修飾、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨが含まれるがこれらに限定されないペプチド結合の修飾、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるがこれらに限定されない。当技術分野では、ペプチド模倣体化合物を調製する方法がよく知られており、「Quantitative Drug Design」、CA.Ramsden Gd.、１７．２章、F.Choplin Pergamon Press（1992）に詳述されている。
【００３４】
特に、本発明に従うポリペプチドは、対応する内因性のポリペプチドから区別されうるような形で、上記の通りに修飾されたポリペプチドでありうる。このような修飾ポリペプチドには、質量分析によりＮ１４原子およびＣ１２原子を含む自然のポリペプチドから識別可能な、Ｎ１５原子またはＣ１３原子を含むポリペプチドが含まれる。
【００３５】
本発明に従うポリペプチドは、少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも３０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも４０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも５０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも６０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも７０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも８０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも９０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも１００アミノ酸、なお好ましくは少なくとも１１０アミノ酸、なお好ましくは少なくとも１２０アミノ酸からなる。本発明に従うポリペプチドの長さは、約９〜約１４６アミノ酸、約１０〜約１４０アミノ酸、約２０〜約１３０アミノ酸、約３０〜約１２０アミノ酸、約４０〜約１１０アミノ酸、約５０〜約１００アミノ酸であることがより好ましい。本発明に従うポリペプチドの長さは、１２０アミノ酸であることが最も好ましい。
【００３６】
本明細書で用いられる「アミノ酸」という用語は、２０の自然発生のアミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン；ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホトレオニンなど、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて見出されうる翻訳後修飾を保有するアミノ酸；ならびに２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンが含まれるがこれらに限定されない、他のまれなアミノ酸を包含することが理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を包含する。「アミノ酸」という用語はまた、修飾アミノ酸、特に、塩、アミノ酸の誘導体（アミドなど）、置換体、および／または化学反応を介して、および／または生合成により修飾されたアミノ酸が含まれるがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸も包含する。ペプチドにおけるカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸を含めたアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはそれらの活性に有害な影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させうる他の化学基による置換を介して修飾することができる。アミノ酸は、１または複数の化学的実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合など、１または複数の翻訳後修飾を含みうる。
【００３７】
本発明の文脈では、「シスタチン発現誘導剤」という表現が、ＣＳＴタンパク質の発現を誘導し、および／または増大させる化合物を指す。好ましい実施形態では、本発明に従うシスタチン発現誘導剤が、２型シスタチンの誘導剤である。より好ましくは、前記シスタチン発現誘導剤が、シスタチン３発現誘導剤である。
【００３８】
当業者には、シスタチン発現誘導剤がよく知られており、特に、ＣＳＴ３発現誘導剤がよく知られており、これらには、例えば、エストラジオール、プロゲステロン（Songら（2006）、Endocrinology 147: 3478-3483）；インターフェロン−τ（Songら（2006）、Endocrinology 147: 3478-3483）、インターフェロン−β（Staun-RamおよびMiller（2010）、J. Neuroimmunol）、インターフェロン−γ（Spencerら（2007）、Reprod. Fertil. Dev. 19: 65-78）；ＴＧＦ−β（Solemら（1990）、Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 945-951）；グルココルチコイド、特に、デキサメタゾン（Bjarnadottirら（1995）、Scand. J. Clin. Lab. Invest. 55: 617-623）；シクロスポリンＡ（Tsaiら（2009）、J. Periodontal. Res. 44：459−464）；および６−ヒドロキシドーパミン（Leeら（2006）、NeuroToxicology 27: 260-276）が含まれる。したがって、シスタチン発現誘導剤は、エストラジオール、プロゲステロン、インターフェロン−τ、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＧＦ−β、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、シクロスポリンＡ、および６−ヒドロキシドーパミンからなる群から選択されることが好ましい。
【００３９】
当業者には、シスタチン発現誘導剤を同定するアッセイがよく知られている。典型的に、このようなアッセイは、子宮内膜細胞、特に、石川細胞またはＥＣＣ−１細胞系（Moら（2006）、Biol. Reprod. 75: 387-394）などの子宮内膜がん細胞系を候補化合物と接触させ、前記子宮内膜細胞によるシスタチンの放出を検出することを包含する。
【００４０】
対象
本発明の文脈では、「対象」が、ヒト、または齧歯動物（ラット、マウス、ウサギ）、霊長動物（チンパンジー）、ネコ科動物（ネコ）、イヌ科動物（イヌ）、ウシ亜科動物（ウシ）、ヒツジ（雌ヒツジ）、ヤギ（caprine（goat））、およびウマ科動物（ウマ）などの非ヒト哺乳動物を指す。対象はヒトであることが好ましい。
【００４１】
本発明に従う対象は、雄の哺乳動物の場合もあり、雌の哺乳動物の場合もある。
【００４２】
本明細書では、「雄」という用語を、精子を産生する生物の性と定義する。精子の各々は、受精ステップにおいて卵子と融合しうる。雄は、雌に由来する少なくとも１つの卵子との接触がなければ、性的に生殖することができない。
【００４３】
本明細書では、「雌」という用語を、卵子を産生する生物の性または生物の部分と定義する。雌の哺乳動物は、雄の配偶子との接触がなければ、性的に生殖することができない。本発明に従う雌の哺乳動物は、妊娠のリスクがある生殖年齢の雌の哺乳動物、すなわち、妊娠しておらず、性的に活発であり、避妊しておらず、授乳していない雌の哺乳動物であることが好ましい。
【００４４】
本発明に従う対象は、雄のヒト、すなわち、男性、または雌のヒト、すなわち、女性であることが好ましい。
【００４５】
本明細書で用いられる「カップルの対象（couple of subjects）」という表現は、性交を行う雄の哺乳動物および雌の哺乳動物により構成されるカップルを指す。本発明に従うカップルの対象は、性交を行う男女により構成されることが好ましい。
【００４６】
処置方法
本発明は、上記で規定された、不妊および／または不妊症を処置するための使用のための、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤に関する。
【００４７】
具体的な実施形態では、本発明が、上記で規定された、不妊および／または不妊症を処置するための使用のための、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、特に、シスタチン３のＮ末端フラグメント、および／または２型シスタチン発現誘導剤、特に、シスタチン３発現誘導剤に関する。
【００４８】
本明細書で用いられる「不妊症(infertility)」という用語は、月経周期の受精可能期における避妊処置されない性交による、１年間にわたる望ましくない不妊に対応する。不妊症は、原発性不妊症および続発性不妊症を包含する。
【００４９】
本明細書で用いられる「原発性不妊症」という用語は、過去に妊娠を達成したことがない雌を指す。
【００５０】
本明細書で用いられる「続発性不妊症」という用語は、過去に妊娠を達成し、出産したことがあるが、現在は妊娠が困難である雌を指す。
【００５１】
本明細書で用いられる「不妊(sterility)」という用語は、生殖能力(fertility)の完全な欠如を指す。本発明によれば、不妊である者は、常に子孫をもたらす可能性がない者であり、一方、不妊症である者は、時間と共に懐妊することが可能でありうる者である。本発明の文脈では、不妊が雄不妊および／または雌不妊でありうる。
【００５２】
本明細書で用いられる「雄不妊」という用語は、上記で規定された雄対象の不妊を指す。雄不妊の原因には、以下が含まれる。
・精巣前性の原因、すなわち、睾丸の十分な支援を妨げる状態であり、性腺機能低下症を含めた、ホルモン支援の低下および全般的健康の低下の状況を包含する状態；薬物、アルコール、喫煙；過労；化学療法、アナボリックステロイド、シメチジン、スピロノラクトンなど、精子形成に影響を及ぼす薬剤、フェニトインなど、ＦＳＨレベルを低下させる薬剤、スルファサラジンおよびニトロフラントインなど、精子の運動性を減殺する薬剤を含めた薬剤；ロバートソン転座などの遺伝子異常；
・精巣性の要因、すなわち、十分なホルモン支援にもかかわらず、睾丸の産生する精液の量が減少し、および／または質も低下した状態であり、年齢を包含する状態；Ｙ染色体における遺伝子欠損；クラインフェルター症候群など、染色体セットの異常；精上皮腫などの新生物；特発性不全；停留睾丸症；精索静脈瘤；外傷；睾丸瘤；ムンプス；マラリア；精巣性発育不全症候群；卵への透過に影響を及ぼす先体欠損；特発性精子減少症；
・精巣後性の原因、すなわち、精巣による精子の産生後に雄の生殖器系に影響を及ぼす状態であり、生殖管の欠損ならびに輸精管閉塞などの射精における問題を包含する状態；輸精管の欠如；前立腺炎；抗精子抗体；逆行性射精；射精管閉塞；尿道下裂；インポテンス。
【００５３】
本明細書で用いられる「雌不妊」という用語は、上記で規定された雌対象の不妊を指す。雌不妊の原因には、以下が含まれる。
・視床下部における機能不全および高プロラクチン血症など、視床下部下垂体に関する要因；
・多膿疱性卵巣症候群；無排卵；卵巣予備能の減退；若年性閉経；閉経；黄体機能不全；性腺発育障害（ターナー症候群）；卵巣がんなど、卵巣に関する要因；
・子宮内膜症；骨盤内癒着；骨盤内炎症性疾患；卵管閉塞；卵管機能不全など、卵管または腹膜に関する要因；
・子宮奇形；子宮筋腫；アッシャーマン症候群など、子宮に関する要因；
・頸管狭窄；抗精子抗体；非受容性頸管粘液など、頸管に関する要因；
・膣痙；膣閉塞など、膣に関する要因；
・アンドロゲン不応症など、遺伝子に関する要因。
【００５４】
本発明者らは、まず、精子を雌のプロテイナーゼ、特に、カテプシンから保護し、次いで、卵の受精が生じることを確保するため、雄および雌の両方に由来する所与のレベルのシスタチンが必要であることを実証した。
【００５５】
したがって、本発明に従うシスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドまたはシスタチン発現誘導剤はまた、カップルの対象の不妊および／または不妊症を処置するための使用に供することができる。
【００５６】
特に、本発明に従う２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より具体的には、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、または２型シスタチン発現誘導剤、より具体的には、シスタチン３発現誘導剤は、カップルの対象の不妊および／または不妊症を処置するための使用に供することができる。
【００５７】
本発明はまた、対象および／またはカップルの対象における不妊および／または不妊症を処置する方法であって、上記で規定された、治療有効量の（ｉ）シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、特に、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より具体的には、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／または（ｉｉ）シスタチン発現誘導剤、特に、２型シスタチン発現誘導剤、より具体的には、シスタチン３発現誘導剤を、それらを必要とする対象および／またはカップルの対象に投与する工程を含む方法にも関する。
【００５８】
本発明はまた、本発明に従う、（ｉ）シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、特に、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より具体的には、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／または（ｉｉ）シスタチン発現誘導剤、特に、２型シスタチン発現誘導剤、より具体的には、シスタチン３発現誘導剤の、対象および／またはカップルの対象における不妊および／または不妊症を処置することを意図する医薬を製造するための使用にも関する。
【００５９】
本発明の文脈では、「〜を処置する」または「処置」という用語が、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１もしくは複数の症状を可逆化するか、緩和するか、その進行を阻害するか、またはこれを防止することを意味する。
【００６０】
具体的な実施形態では、同時投与、個別投与、または逐次投与のために、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドを、別のシスタチンの少なくとも１つのＮ末端フラグメントと組み合わせて投与する。特に、本発明は、不妊および／または不妊症を処置するための使用のための、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、またはシスタチン３のＮ末端フラグメントであって、別のシスタチンのＮ末端フラグメントを含む１もしくは複数のポリペプチド、特に、別の２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含む１もしくは複数のポリペプチド、および／または別のシスタチンの１もしくは複数のＮ末端フラグメント、特に、別の２型シスタチンの１もしくは複数のＮ末端フラグメントと組み合わせて用いられる、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、またはシスタチン３のＮ末端フラグメントに関する場合がある。
【００６１】
同様に、シスタチン発現誘導剤も、同時投与、個別投与、または逐次投与のために、別のシスタチンの少なくとも１つ発現誘導剤と組み合わせて投与することができる。特に、シスタチン３発現誘導剤は、別のシスタチンの少なくとも１つの誘導剤、より好ましくは別のシスタチン２の少なくとも１つの誘導剤と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドおよびシスタチン発現誘導剤が、薬学的に許容される媒体、担体、希釈剤、もしくは賦形剤、またはこれらの混合物をさらに含む医薬組成物の形態で提供される。本発明に従う医薬組成物は特に、放出調節剤形であり得、したがって、本明細書で記載されている１または複数の放出制御賦形剤をさらに含みうる。適切な放出調節投与媒体には、親水性または疎水性のマトリックスデバイス、水溶性の分離層コーティング、浸透圧デバイス、マルチパーティクルデバイス、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。医薬組成物はまた、非放出制御賦形剤も含みうる。本発明に従う医薬組成物はまた、１つの剤形内にあり、かつ、即時放出成分および少なくとも１つの遅延放出成分を有する場合もあり、０．１〜２４時間の時間により隔てられた少なくとも２つの連続パルスの形態で化合物の非連続的放出をもたらすことが可能でありうる。
【００６２】
本発明に従う医薬組成物はまた、単位投与剤形で提供することもでき、複数回投与剤形で提供することもできる。本明細書で用いられる単位投与剤形とは、当技術分野で知られる通り、対象への投与に適し、個別に包装された、物理的に個別の単位を指す。各単位用量は、要請される医薬担体または医薬賦形剤と併せた、所望の治療効果を産生するのに十分な所定量の（１または複数の）有効成分を含有する。単位投与剤形の例には、アンプル、シリンジ、および個別に包装された錠剤、カプセル、ならびに膣内坐剤が含まれる。単位投与剤形は、その分数量(fractions)または倍数量(multiples)で投与することができる。複数回投与剤形とは、単位投与剤形に分けて投与されるように、単一の容器内に包装された複数の同一な単位投与剤形である。複数回投与剤形の例には、バイアル、錠剤、カプセル、もしくは膣内坐剤のボトル、またはパイント（0.47l）単位もしくはガロン（3.8l）単位のボトルが含まれる。
【００６３】
本明細書で記載されるポリペプチドおよびシスタチン発現誘導剤は、単独で投与することもでき、１または複数の他の有効成分と組み合わせて投与することもできる。特に、本明細書で記載されるポリペプチドおよびシスタチン発現誘導剤は、不妊および／または不妊症を処置するのに使用される１または複数の有効成分と組み合わせて投与することができる。当業者には、不妊および／または不妊症を処置するのに使用される有効成分の例がよく知られており、これらには、例えば、エストロゲン；ゴナドトロピン；ｃｌｏｍｉｄおよびｐｅｒｇｏｔｉｍｅを含めたクロミフェン；ゴナドレリン、ブセレリン、およびトリプトレリンを含めたゴナドトロピン放出ホルモン類似体；セトロレリクスおよびガニレリクスを含めたルテイノスティミュリンアンタゴニストが含まれる。
【００６４】
本明細書で記載されるポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤を含む医薬組成物は、好ましくは局部投与のための多様な剤形で調合することができる。医薬組成物はまた、遅延放出剤形、持続放出（extended-、prolonged-、sustained-release）剤形、パルス放出剤形、制御放出剤形、加速化放出剤形、高速放出剤形、標的化放出剤形、およびプログラム放出剤形を含めた放出調節剤形としても調合することができる。これらの剤形は、当業者に知られる従来の方法および技法に従い調製することができる（「Remington's Pharmaceutical Sciences」、（19版）、A. Gennaro編、1995、Mack Publishing Company、Easton、Pa.；「Modified-Release Drug Deliver Technology」、Rathboneら編、「Drugs and the Pharmaceutical Science」、Marcel Dekker, Inc.: New York、NY、2002; 126巻）。
【００６５】
本明細書で提供される医薬組成物は、一度に投与することもでき、ある時間間隔で複数回にわたり投与することもできる。正確な用量および処置の持続期間は、処置される対象の年齢、体重、および状態と共に変化する可能性があり、既知の検査プロトコールを用いて経験的に決定する場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの検査または診断のデータからの外挿により決定する場合もあることが理解される。任意の特定の対象、特定の投与レジメンは、ある時間にわたり、対象の必要、および処方物を投与するかまたはその投与を監視する担当医師の職業的判断に応じて調整すべきであることもさらに理解される。
【００６６】
本発明に従うポリペプチド、シスタチン発現誘導剤、および医薬組成物は、特に、経口投与することもでき、非経口投与することもでき、局所投与（すなわち、局部投与）することもできる。本発明に従うポリペプチドまたはシスタチン発現誘導剤は、局部投与することが好ましい。
【００６７】
本発明に従うポリペプチド、シスタチン発現誘導剤、および医薬組成物は、開口部または粘膜へと局所投与（または局部投与）することができる。本明細書で使用される局所投与には、特に、経粘膜投与、膣内投与、尿道内投与、および子宮内投与が含まれる。
【００６８】
本明細書で提供される医薬組成物は、エマルジョン、溶液、懸濁液、クリーム、ゲル、ハイドロゲル、軟膏、散布剤、包帯剤、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、発泡剤、フィルム、エアゾール、灌注剤、スプレー、坐剤、包帯、皮膚パッチを含め、局部的効果のための局所投与に適する任意の剤形で調合することができる。本明細書で提供される医薬組成物の局所処方物にはまた、リポソーム、ミセル、マイクロスフェア、ナノシステム、およびこれらの混合物も含まれうる。本明細書で提供される局所処方物において用いるのに適する薬学的に許容される担体および賦形剤には、水性媒体、水混和性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、または微生物の増殖に対する防腐剤、安定化剤、可溶性増強剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局部麻酔剤、懸濁剤および分散剤、保湿剤または乳化剤、複合体化剤、封鎖剤またはキレート化剤、浸透増強剤、抗凍結剤、リオプロテクタント、増粘剤、および不活性ガスが含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
本明細書で提供される医薬組成物は、軟膏、クリーム、およびゲルの形態で、特に、婦人科用の軟膏、クリーム、およびゲルの形態で提供することができる。
【００７０】
本明細書で提供される医薬組成物は、坐剤、ペッサリー、ブジー、湿布またはパップ、ペースト、粉末、包帯剤、クリーム、プラスター、避妊剤、軟膏、溶液、エマルジョン、懸濁液、タンポン、ゲル、発泡剤、スプレー、または浣腸の形態で、経粘膜投与、尿道内投与、膣内投与、膣周囲投与、または子宮内投与することができる。これらの剤形は、Remington:「The Science and Practice of Pharmacy」（「Remington's Pharmaceutical Sciences」、（19版）、A. Gennaro編、1995、Mack Publishing Company、Easton、Pa.）において記載されている通り、従来のプロセスを用いて製造することができる。尿道内坐剤および膣内坐剤とは、体内の開口部へと挿入される固体であり、常温では固体であるが、体温では溶融または軟化して、これらの開口部内に（１または複数の）有効成分を放出する。膣内坐剤において使用される、薬学的に許容される担体には、本明細書で提供される医薬組成物と調合すると体温に近い融点をもたらす硬化剤；ならびに亜硫酸水素塩およびピロ亜硫酸ナトリウムを含めた本明細書で記載されている抗酸化剤などの媒体が含まれる。適切な媒体には、ココアバター（カカオ脂）、グリセリンゼラチン（glycerin-gelatin）、ｃａｒｂｏｗａｘ（ポリオキシエチレングリコール）、鯨蝋、パラフィン、白蝋および黄蝋、ならびに脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドの適切な混合物、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリル酸などのハイドロゲル；グリセリン化ゼラチン（glycerinated gelatin）が含まれるがこれらに限定されない。多様な媒体の組合せを用いることができる。膣内坐剤は、圧縮法または成形法により調製することができる。膣内坐剤の典型的な重量は、約２〜３ｇである。
【００７１】
局所投与用に本明細書で提供される医薬組成物は、即時放出するように調合することもでき、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、およびプログラム放出を含め、放出調節するように調合することもできる。
【００７２】
本発明に従うポリペプチドおよびシスタチン発現誘導剤は、膣内坐剤の形態で投与されることが好ましい。
【００７３】
本明細書で記載されるポリペプチドおよびシスタチン発現誘導剤の用量は、投与経路（経口経路、静脈内経路、膣内経路など）、および組成物または化合物を投与する形態（溶液形態、制御放出形態など）に応じて変化する可能性がある。適切な用量の決定は、当業者の能力の範囲内にある。
【００７４】
本明細書で用いられる、薬剤の「有効量」、「治療有効量」、または「薬理学的有効量」とは、その薬物が用いられる期間にわたり送達される薬物の治療的レベルを結果としてもたらすような濃度で存在する薬剤の量を指す。これは、送達方式、投与期間、薬剤を施される対象の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食餌に依存しうる。当技術分野では、有効量を決定する方法が知られている。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明に従う、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／またはシスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤が、受精促進薬または受精改善薬として用いられる。
【００７６】
本明細書で用いられる「受精促進薬または受精改善薬」という表現は、精子の卵子との遭遇を誘導するかもしくは容易にする薬物、または精子の卵子内への侵入を誘導するかもしくは容易にする薬物を指す。
【００７７】
本発明はまた、それを必要とする対象における受精を促進または改善する方法であって、前記対象に、本発明に従う、治療有効量の（ｉ）シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／または（ｉｉ）シスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤を投与する工程を含む方法にも関する。
【００７８】
別の好ましい実施形態では、本発明に従う、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／またはシスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤を、受精を促進もしくは改善するか、または受精卵の、雌の哺乳動物における卵管から子宮への移動のステップを促進もしくは改善するための使用に供する。
【００７９】
上記で開示した通り、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドは、別のシスタチンの少なくとも１つのＮ末端フラグメントと組み合わせて投与することができる。同様に、シスタチン発現誘導剤は、別のシスタチンの少なくとも１つ発現誘導剤と組み合わせて投与することができる。
【００８０】
本明細書で用いられる「受精卵」という用語は、卵子の精子との融合から形成される始原細胞を指す。受精が生じた後、受精卵は、受精卵自体のサイズを増大させることなく、分裂して多くの細胞を形成しながら、卵管伝いに子宮へと移動する。受精卵は最終的に胚へと発育し、次いで、胎児へと発育する。
【００８１】
本発明に従うポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤は、不妊および／または不妊症についての既知の問題を有する対象であって、生殖するのに生殖補助医療（ART）を必要とする対象を処置するのに特に有用でありうる。
【００８２】
したがって、具体的な実施形態では、本発明に従う、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／またはシスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤を、受精を促進もしくは改善するか、または受精卵の、雌の哺乳動物における卵管から子宮への移動のステップを促進もしくは改善するための使用に供し、前記雌の哺乳動物が、生殖補助医療（ART）を行おうとしている哺乳動物である。
【００８３】
本明細書で用いられる「生殖補助医療」またはＡＲＴという表現は、人工的な手段または部分的に人工的な手段により妊娠を達成するのに使用される方法を指す。
【００８４】
生殖補助医療には、特に、体外受精およびそれへの拡張が含まれるが、必ずしもこれらが必要なわけではない。本明細書で用いられる生殖補助医療は、体外受精、自家子宮内膜共培養、受精卵卵管内移植（ZIFT）、配偶子卵管内移植（GIFT）、人工授精、特に、治療的非配偶者間人工授精（TDI）を包含する。
【００８５】
本明細書で用いられる「体外受精」または「ＩＶＦ」という表現は、雄および雌の配偶子の受精を雌の体外で生じさせる技法を指す。
【００８６】
本明細書で用いられる、「自家子宮内膜共培養」という用語は、患者の受精卵を患者自身の子宮の内膜に由来する細胞層の上部に置き、胚の発育に対してより自然な環境を創出する処置を指す。
【００８７】
本明細書で用いられる「受精卵卵管内移植」または「ＺＩＦＴ」という用語は、卵子を雌の卵巣から摘出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて受精させ、次いで、結果として得られる受精卵を卵管内に入れる技法を指す。
【００８８】
本明細書で用いられる「配偶子卵管内移植」または「ＧＩＦＴ」という用語は、経膣採卵後に、精子と卵子との混合物を、腹腔鏡検査を用いて直接雌の卵管内に入れる技法を指す。
【００８９】
本明細書で用いられる、「人工授精」という用語は、自然の交合によるのではなく、人工的手段を用いて、精子を雌の子宮（子宮内）または頸管（頸管内）に入れる技法を指す。「治療的非配偶者間人工授精」または「ＴＤＩ」とは、より具体的には、雌が機能性の精子を伴う配偶者を有さない場合を指す。代わりに、精子提供者が精子を提供する。
【００９０】
本発明に従う、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、および／またはシスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤を、受精を促進もしくは改善するか、または受精卵の、雌の哺乳動物における卵管から子宮への移動のステップを促進もしくは改善するための使用に供し、前記雌の哺乳動物が、生殖補助医療（ART）において、配偶子卵管内移植術（GIFT）もしくは治療的非配偶者間人工授精（TDI）を受けている哺乳動物であるかまたは体外受精（IVF）を行おうとしている哺乳動物であることが好ましい。
【００９１】
体外受精法および／または人工授精法
本発明はまた、上記で規定されたシスタチンのＮ末端フラグメント、好ましくは２型シスタチンのＮ末端フラグメント、より好ましくはシスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチドを含む流体媒体中で、雌の哺乳動物から得られた卵子と、雄の哺乳動物から得られた精子とを接触させる工程を含む、体外受精および／または人工授精の方法にも関する。
【００９２】
具体的な実施形態では、前記流体媒体が、各々が異なるシスタチンのＮ末端フラグメントを含む複数のポリペプチドを含む。
【００９３】
本明細書で用いられる「卵子（ovumまたはova）」という用語は、一倍体の雌の生殖細胞または配偶子を指す。生殖補助医療では、例えば、経膣採卵（OCR）により、雌から卵子を回収することができる。
【００９４】
本明細書で用いられる「精子（spermまたはspermatozoonまたはspermatozoa）」という用語は、雄の生殖細胞を指す。
【００９５】
本明細書で用いられる「流体媒体」という用語は、液体形態または半液体形態にある生物学的媒体を指す。本発明に従う流体媒体は、卵子および精子が、少なくとも個体の体内の通常の条件下にある場合と同じ時間にわたり生存することが可能な媒体を指すことが好ましい。本発明に従う流体媒体は、人工流体媒体の場合もあり、自然流体媒体の場合もある。流体媒体が自然流体媒体である場合、それは特に、卵管内または子宮内に存在する流体媒体でありうる。流体媒体が人工流体の場合、それは特に、体外受精媒体でありうる。体外受精媒体は、当業者によく知られており、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＩＶＦ  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（Origioにより市販されている）、受精用ｇｌｏｂａｌ（登録商標）（LifeGlobalにより市販されている）、およびＳｙｄｎｅｙ  ＩＶＦ  ｍｅｄｉｕｍ（Sydney IVFにより市販されている）が含まれる。
【００９６】
本発明に従う流体媒体は、上記で規定された、シスタチンのＮ末端フラグメント、好ましくは２型シスタチンのＮ末端フラグメント、より好ましくはシスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチドを含む。前記シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドは、シスタチンタンパク質、好ましくは２型シスタチンタンパク質、より好ましくはシスタチン３タンパク質であることが好ましい。具体的な実施形態では、流体媒体が、別のシスタチンの少なくとも１つのＮ末端フラグメントをさらに含みうる。特に、流体媒体は、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、またはシスタチン３のＮ末端フラグメントを含む可能性があり、別のシスタチンのＮ末端フラグメント、特に、別の２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含む１もしくは複数のポリペプチド、および／または１もしくは複数の別のシスタチンのＮ末端フラグメント、特に、別の２型シスタチンのＮ末端フラグメントをさらに含みうる。
【００９７】
好ましい実施形態では、前記シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドが、生理学的濃度に近い十分な濃度で本発明に従う流体媒体中に存在する。
【００９８】
具体的な実施形態では、本発明に従う流体媒体が、上記で規定された、不妊および／または不妊症を処置するのに有用な化合物をさらに含む。
【００９９】
本明細書で用いられる「〜を接触させる」という用語は、精子が卵子に受精させる可能性があるように、卵子を精子と共にインキュベートすることを意味する。当技術分野の技術によれば典型的に、卵子と精子とを、十分な温度で、好ましくは十分な時間にわたり接触させる。
【０１００】
不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法
本発明はまた、対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測する、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ１）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ａ２）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される工程、ならびに
（ｂ）工程（ａ１）および／または（ａ２）において測定された少なくとも１つのシスタチンのレベルを、それぞれに応じて適切に、前記少なくとも１つのシスタチンの雄対照レベルまたは前記少なくとも１つのシスタチンの雌対照レベルと比較する工程を含み、
場合により、
（ｃ１）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ｃ２）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される工程；
（ｄ）それぞれに応じて適切に、工程（ａ１）および（ｃ１）ならびに／または工程（ａ２）および（ｃ２）の測定値に基づき、少なくとも１つのシスタチン／カテプシン比［（ａ１＋ａ２）／（ｃ１＋ｃ２）］を計算する工程、および計算されたシスタチン／カテプシン比を、シスタチン／カテプシン比の対照閾値レベルと比較する工程をさらに含み、
ｉ）工程（ａ１）および／または（ａ２）において測定された少なくとも１つのシスタチンのレベルの、前記少なくとも１つのシスタチンの前記雄対照レベル、もしくは前記少なくとも１つのシスタチンの雌対照レベルと比較した低下、または
ｉｉ）工程（ｄ）において計算されたシスタチン／カテプシン比の、前記シスタチン／カテプシン比の対照閾値レベルと比較した減少
が、前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を示すか、前記対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症の、より高いリスクを示す方法にも関する。
【０１０１】
工程（ｃ１）、（ｃ２）、および（ｄ）は、上記の方法の実装時に実行されることが好ましい。
【０１０２】
好ましい実施形態では、工程（ａ１）が、上記で規定された雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つの２型シスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１０３】
別の好ましい実施形態では、工程（ａ２）が、上記で規定された雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つの２型シスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１０４】
より好ましい実施形態では、工程（ａ１）が、上記で規定された雄対象の生物学的試料中の少なくともシスタチン３のレベルを測定する工程である。
【０１０５】
別のより好ましい実施形態では、工程（ａ２）が、上記で規定された雌対象の生物学的試料中の少なくともシスタチン３のレベルを測定する工程である。
【０１０６】
具体的な実施形態では、工程（ａ１）が、上記で規定された雄対象の生物学的試料中の複数の異なるシスタチン、より具体的には、シスタチン３および少なくとも別のシスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１０７】
別の具体的な実施形態では、工程（ａ２）が、上記で規定された雌対象の生物学的試料中の複数の異なるシスタチン、より具体的には、シスタチン３および少なくとも別のシスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１０８】
工程（ｃ１）または（ｃ２）において測定されうる前記少なくとも１つのカテプシンは、特に、カテプシンＢ（CTSB）でありうる。したがって、工程ｄ）で計算されるシスタチン／カテプシン比は、例えば、２型シスタチン／カテプシンＢ比の場合もあり、より具体的には、シスタチン３／カテプシンＢ比の場合もあろう。
【０１０９】
本明細書で意図される「診断」または「〜を診断する」という用語は、患者が罹患する病態を決定する方法に関する。
【０１１０】
本明細書で意図される「予測」または「〜を予測する」という用語は、病態の出現を予測するか、または病態が個体において生じるリスクもしくは可能性を決定する方法に関する。
【０１１１】
本明細書で用いられる、シスタチンまたはカテプシンの「レベル」は、シスタチンまたはカテプシンの濃度、量、または活性に対応する。シスタチンまたはカテプシンのレベルは、シスタチンまたはカテプシンの量または濃度、より具体的には、シスタチンまたはカテプシンのモル量もしくは質量、またはモル濃度もしくは質量濃度を指すことが好ましい。
【０１１２】
当業者には、生物学的試料中のシスタチンまたはカテプシンのレベルを測定する技法がよく知られている。適切な技法の例には、質量分析が含まれるが、また、免疫学的アッセイなど、リガンドベースの方法も含まれる。特に、シスタチンまたはカテプシンのレベルは、前記シスタチンまたはカテプシンに特異的なリガンドを用いて測定される。
【０１１３】
「リガンド」とは、化合物に対して結合アフィニティーを有する分子に関する。特に、リガンドは、シスタチンに特異的な形で結合する、すなわち、リガンドは、生物学的試料の他の構成要素と比較して、それが特異的な化合物に優先的に結合することが好ましい。特異的なリガンドは、特に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体、またはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびｓｃＦｖフラグメントなど、これらのフラグメント；ファージ抗体（PhAb）；ラマ抗体、ラクダ抗体、およびサメ抗体；ならびにアプタマーからなる群から選択される。
【０１１４】
「生物学的試料」という表現は、組織生検または体液試料など、対象から採取されうる全ての試料を包含する。特に、生物学的試料は、液体の生物学的試料でありうる。したがって、生物学的試料は、血液試料、血清、および血漿からなる群から選択することができる。生物学的試料はまた、生殖管の流体に由来する試料でもありうる。より具体的には、雄対象の生物学的試料は、血液、血漿、および血清から選択しうるが、また、精液、精子、および精漿から選択することもできる。同様に、雌対象の生物学的試料は、血液、血漿、および血清から選択しうるが、また、頸管粘液および膣粘液から選択することもできる。
【０１１５】
本明細書で用いられる「精液（semen）」という用語は、また精液（seminal fluid）としても既知であり、精子を含有しうる、有機流体を指す。精液（semen）とは典型的に、３つの画分、すなわち、非胚単核細胞（白血球、生殖管壁からの落屑細胞、および未成熟胚細胞を含む）、精子（spermatozoa（またはsperm））、および精漿から構成される。
【０１１６】
本明細書で用いられる「精漿」という用語は、精嚢により分泌される液体であって、精液中に包含され、アスコルビン酸、フルクトース、プロスタグランジン、ホスホリルコリン、およびベシクリンを含む液体を指す。
【０１１７】
本明細書で用いられる「頸管粘液」という用語は、子宮頸管により産生される粘液(glar)を指す。
【０１１８】
本明細書で用いられる「膣粘液」という用語は、膣により産生される粘液(glar)を指す。
【０１１９】
本明細書で意図される「シスタチンの対照レベル」とは、前記シスタチンの標準(norm)カットオフ値内にあるシスタチンのレベルを指す。前記シスタチンの対照レベルは、生物学的試料の種類と、生物学的試料中の前記シスタチンのレベルを測定するのに用いられる方法とに依存する。シスタチンの対照レベルは、健康な集団における前記シスタチンの発現の平均レベルであることが好ましい。より具体的には、本発明に従う「雄のシスタチンの対照レベル」とは、健康な雄集団における前記シスタチンの発現の平均レベルである。同様に、本発明に従う「雌のシスタチンの対照レベル」とは、健康な雌集団における前記シスタチンの発現の平均レベルである。
【０１２０】
典型的には、シスタチン３に特異的な抗体、特に、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｄａｋｏ、Ｄｉａｇａｍ他による抗体を用いて、シスタチン３レベルを精漿試料である雄の生物学的試料中で測定する場合、ＣＳＴ３の対照レベルは、約３０ｎｇ／ｍｌとなる。
【０１２１】
本明細書で用いられる「健康な集団」とは、不妊および／または不妊症の問題を提示しない対象から構成される集団を意味する。
【０１２２】
好ましくは、本発明の診断法および／または予測法では、シスタチンレベルの前記シスタチンの対照レベルと比較した減少が、シスタチンの前記レベルが、前記シスタチンの対照レベルより著明に低いことを意味する。なお好ましくは、シスタチンレベルの前記シスタチンの対照レベルと比較した減少は、シスタチンの前記レベルが、前記シスタチンの対照レベルの７５％、５０％であることを意味する。
【０１２３】
本発明者らは、より具体的には、雄または雌におけるシスタチン３濃度の低下が不妊症をもたらしうることを実証した。より具体的に述べると、本発明者らは、雄および雌におけるシスタチン３の組合せ濃度が低過ぎれば不妊症の一因となりうることを示した。
【０１２４】
本発明者らはまた、このＣＳＴレベルの低下が、ＣＳＴ／ＣＴＳ比の低下をもたらす可能性があり、これが不妊症をもたらしうることも示した。ＣＳＴ産生の減少またはＣＴＳ合成の増大によるＣＳＴ／ＣＴＳ比の不均衡は、精子の破壊をもたらし、さらに、不妊症をもたらす。
【０１２５】
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従う、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの、診断および／または予測の方法が、カップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法であって、
（ａ１）上記で規定された雄対象の生物学的試料における少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程、
（ａ２）上記で規定された雌対象の生物学的試料における少なくとも１つのシスタチンのレベルを測定する工程；
（ａ３）工程（ａ１）において測定された前記少なくとも１つのシスタチンのレベルと、工程（ａ２）において測定された前記少なくとも１つのシスタチンのレベルとを足し合わせる工程；および
（ｂ）工程（ａ３）において得られる前記少なくとも１つのシスタチンのレベルを、前記少なくとも１つのシスタチンの対照レベルと比較する工程を含み、
場合により、
（ｃ１）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ｃ２）雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つのカテプシンのレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される工程；
（ｄ）それぞれに応じて適切に、工程（ａ１）および（ｃ１）ならびに／または工程（ａ２）および（ｃ２）の測定値に基づき、少なくとも１つのシスタチン／カテプシン比［（ａ１＋ａ２）／（ｃ１＋ｃ２）］を計算する工程、および計算されたシスタチン／カテプシン比を、シスタチン／カテプシン比の対照閾値レベルと比較する工程をさらに含み、
ｉ）工程（ａ３）において得られる少なくとも１つのシスタチンのレベルの、前記少なくとも１つのシスタチンの対照レベルと比較した低下が、前記カップルの対象の不妊および／または不妊症を示すか、または
ｉｉ）工程（ｄ）において計算されたシスタチン／カテプシン比の、前記シスタチン／カテプシン比の対照閾値レベルと比較した減少が、前記カップルの対象の不妊および／または不妊症の、より高いリスクを示す方法であることが好ましい。
【０１２６】
工程（ｃ１）、（ｃ２）、および（ｄ）は、上記の方法の実装時に実行されることが好ましい。
【０１２７】
好ましい実施形態では、工程（ａ１）が、上記で規定された雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つの２型シスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、工程（ａ２）が、上記で規定された雌対象の生物学的試料中の少なくとも１つの２型シスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１２９】
より好ましい実施形態では、工程（ａ１）が、上記で規定された雄対象の生物学的試料中の少なくともシスタチン３のレベルを測定する工程である。
【０１３０】
別のより好ましい実施形態では、工程（ａ２）が、上記で規定された雌対象の生物学的試料中の少なくともシスタチン３のレベルを測定する工程である。
【０１３１】
具体的な実施形態では、工程（ａ１）が、上記で規定された雄対象の生物学的試料中の複数の異なるシスタチン、より具体的には、シスタチン３および少なくとも別のシスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１３２】
別の具体的な実施形態では、工程（ａ２）が、上記で規定された雌対象の生物学的試料中の複数の異なるシスタチン、より具体的には、シスタチン３および少なくとも別のシスタチンのレベルを測定する工程である。
【０１３３】
工程（ｃ１）または（ｃ２）において測定されうる前記少なくとも１つのカテプシンは、特に、カテプシンＢ（CTSB）でありうる。したがって、工程ｄ）で計算されるシスタチン／カテプシン比は、例えば、２型シスタチン／カテプシンＢ比の場合もあり、より具体的には、シスタチン３／カテプシンＢ比の場合もありうるであろう。
【０１３４】
シスタチンの対照レベルは、健康なカップルの集団における前記シスタチンの発現の平均レベルであることが好ましい。
【０１３５】
本明細書で用いられる、「健康なカップルの集団」とは、性交を行うカップルであって、不妊および／または不妊症の問題を提示しないカップルから構成される集団を意味する。
【０１３６】
キット
本発明はまた、対象および／またはカップルの対象の不妊および／または不妊症を診断および／または予測することを意図したキットであって、
（ｉ）雄対象の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチン、特に、少なくとも１つの２型シスタチン、より具体的には、少なくともシスタチン３を検出するための手段であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される、手段、および／または
（ｉｉ）雌対象の雌の生物学的試料中の少なくとも１つのシスタチン、特に、少なくとも１つの２型シスタチン、より具体的には、少なくともシスタチン３を検出するための手段であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、膣粘液、および任意の他の種類の雌の生殖管試料からなる群から選択される、手段を含むキットにも関する。
【０１３７】
前記キットは、カテプシン、特に、カテプシンＢを、前述の雄および／または雌の生物学的試料中で検出するための手段をさらに含みうる。
【０１３８】
本発明の文脈では、「シスタチンを検出するための手段」および「カテプシンを検出するための手段」という表現が、特に、上記で規定されたシスタチンまたはカテプシンに特異的なリガンドを指す。
【０１３９】
本発明のキットは、不妊および／または不妊症の診断および／または予測を実行するための、上記で規定されたキットに包含される、少なくとも１つのシスタチンを検出するための手段、および場合により、少なくとも１つのカテプシンを検出するための手段を使用するための指示書をさらに含むことが好ましい。
【０１４０】
「使用のための指示書」は典型的に、キットの構成要素を用いるのに使用される技法について記載し、不妊および／または不妊症の診断および／または予測を実行するのに用いられる条件を説明する理解可能な表現を包含する。
【０１４１】
処置から利益を得る可能性
本発明はまた、不妊および／または不妊症を患う対象および／またはカップルの対象が、上記で規定された（ｉ）シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチドによる処置、および／または（ｉｉ）シスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤による処置を包含する処置レジメンから利益を得る可能性があるかを決定する方法であって、
（ａ１）上記「不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法」の節で規定された雄対象の生物学的試料中のシスタチン、好ましくは、２型シスタチン、より好ましくは、シスタチン３のレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される、工程、および／または
（ａ２）上記「不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法」の節で規定された雌対象の生物学的試料中のシスタチン、好ましくは、２型シスタチン、より好ましくは、シスタチン３のレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、および膣粘液からなる群から選択される、工程を含む方法にも関する。
【０１４２】
本明細書で用いられる「利益を得る可能性」という用語は、対象が、不妊および／または不妊症を患う対象であって、シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤による処置を施されない対象と比較して、高度な生殖能力を提示する確率が高いことを意味する。
【０１４３】
本明細書で用いられる「処置レジメン」という用語は、対象における疾患を処置するための、任意の体系的な計画またはコースを指す。
【０１４４】
本発明はまた、不妊および／または不妊症を患う対象および／またはカップルの対象が、上記で規定された（ｉ）シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチドによる処置、および／または（ｉｉ）シスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤による処置を包含する処置レジメンから利益を得る可能性があるかを決定する方法、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ１）上記「不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法」の節で規定された雄対象の生物学的試料中のシスタチン、好ましくは、２型シスタチン、より好ましくは、シスタチン３のレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、精液、精子、および精漿からなる群から選択される工程、および／または
（ａ２）上記「不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法」の節で規定された雌対象の生物学的試料中のシスタチン、好ましくは、２型シスタチン、より好ましくは、シスタチン３のレベルを測定する工程であって、前記試料が血液、血漿、血清、頸管粘液、および膣粘液からなる群から選択される工程；
（ｂ）工程（ａ１）および／または（ａ２）において測定された前記シスタチンのレベルを、それぞれに応じて適切に、上記「不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法」の節で規定された雄対照における前記シスタチンのレベルまたは雌対照における前記シスタチンのレベルと比較する工程を含み、
工程（ａ１）および／または（ａ２）において測定されたシスタチンレベルの、前記雄対照における前記シスタチンのレベル、または雌対照における前記シスタチンのレベルと比較した減少が、対象および／またはカップルの対象が、上記で規定されたシスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤による処置を包含する処置レジメンから利益を得る可能性が高いことを示す方法にも関する。
【０１４５】
本発明者らは、より具体的には、雄または雌におけるシスタチン３濃度の低下が不妊症をもたらしうることを実証した。より具体的に述べると、本発明者らは、雄および雌におけるシスタチン３の組合せ濃度が低過ぎれば不妊症の一因となりうることを示した。さらに、本発明者らは、このＣＳＴレベルの低下が、ＣＳＴ／ＣＴＳ比の低下ももたらす可能性があり、これが不妊症に行き着きうることも示した。ＣＳＴ産生の減少またはＣＴＳ合成の増大によるＣＳＴ／ＣＴＳ比の不均衡は、精子の破壊をもたらし、さらに、不妊症をもたらす。
【０１４６】
したがって、好ましい実施形態では、上記で規定した方法が、不妊および／または不妊症を患うカップルの対象が、上記で規定された（ｉ）シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、好ましくは、２型シスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチド、より好ましくは、シスタチン３のＮ末端フラグメントを含むポリペプチドによる処置、および／または（ｉｉ）シスタチン発現誘導剤、好ましくは、２型シスタチン発現誘導剤、より好ましくは、シスタチン３発現誘導剤による処置を包含する処置レジメンから利益を得る可能性があるかを決定する方法であって、
（ａ１）上記で規定された雄対象の生物学的試料中のシスタチン、好ましくは、２型シスタチン、より好ましくは、シスタチン３のレベルを測定する工程；
（ａ２）上記で規定された雌対象の生物学的試料中のシスタチン、好ましくは、２型シスタチン、より好ましくは、シスタチン３のレベルを測定する工程；
（ａ３）工程（ａ１）において測定されたシスタチンのレベルと、工程（ａ２）において測定されたシスタチンのレベルとを足し合わせる工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ３）において得られた前記シスタチンのレベルを、上記「不妊および／または不妊症を診断および／または予測する方法」の節で規定された前記シスタチンの対照レベルと比較する工程を含み、
工程（ａ３）において得られたシスタチンレベルの、前記シスタチンの前記対照レベルと比較した減少が、カップルの対象が、上記で規定されたシスタチンのＮ末端フラグメントを含むポリペプチドおよび／またはシスタチン発現誘導剤による処置を包含する処置レジメンから利益を得る可能性が高いことを示す。
【０１４７】
本発明は、以下の図および実施例によりさらに例示される。
【実施例】
【０１４８】
以下の例は、不妊男性が、彼らの精液中でシスタチン３レベルの低下を提示することを実証する。
【０１４９】
材料および方法
シスタチンＣアッセイは、ＢＮＩＩ免疫比濁計（Dade Behring）を用いるイムノアッセイにより実施した。
【０１５０】
ＢＮＩＩ免疫比濁計
免疫比濁計とは、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇにより開発された、コンピュータにより駆動される装置であり、以下の方法で、抗原−抗体複合体を介して拡散する光の強度を測定することを可能とする。
【０１５１】
波長を８４０ｎｍとする光のビームをレーザーダイオードにより発生させ、抗原−抗体反応が生じるチャンバーへと送る。このビームは、このチャンバーを横断し、ここで散乱する。散乱してチャンバーの端部でフィルタリングされた光は、光検出器の複合レンズにより焦点化され、これにより電気信号へと変換される。
【０１５２】
散乱光の測定は、一定時間における反応速度の原理に従い行う：第１の測定は、初期化の１０秒後に実施し、第２の測定は、６分間にわたるインキュベーション後に実施する。
【０１５３】
抗原−抗体複合体により散乱した光は、以下の通りに測定することができる：
・反応終了時における最終地点；
・反応速度の測定では、反応時間において連続的に測定がなされるが、計算は、時間を一定とする２つの時点間で測定されるシグナル間の差違、すなわち、一定時間における測定により行う。ここでは、この種の測定を用いる。空白値は、７．５秒後に測定された第１の値に対応する。第２の値は、６．１２〜２４分のインキュベーション後に測定する。
【０１５４】
このようなアッセイを実施するためには、検量線が必要である。検量線は、試験に特異的な基準物質により得られるが、測定されるシグナルと被験タンパク質濃度とには直線的関係が見られないので、曲線を得るには、異なる測定点を取らなければならない。
【０１５５】
ハイデルベルガー−ケンドール曲線もまた、抗原の量と一定濃度の抗体について測定されるシグナルとの関係を示すための基準曲線として用いられる。
【０１５６】
試薬
・シスタチンＣ試薬：ウサギ抗シスタチンＣ抗体でコーティングされたポリスチレン粒子の凍結乾燥物。
・シスタチンＣ補助試薬Ａ：緩衝液中にウサギ免疫グロブリンを含有する。これは、リウマチ因子に起因する干渉の低減を可能とする。
・シスタチンＣ補助試薬Ｂ：洗浄剤を含有する。
・シスタチンＣ対照：ヒト尿中タンパク質を添加したポリゲリンから得られる凍結乾燥物。
・ＵＹタンパク質の基準物質
・希釈剤
・Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ製の緩衝液。
【０１５７】
試薬の調製
・シスタチンＣ試薬：凍結乾燥させたバイアルの内容物は、キットの容量の蒸留水で再構成した。撹拌後、使用前の３０分間にわたり放置した。
・シスタチンＣ補助試薬：容量０．５ｍｌのシスタチンＣ補助試薬Ｂを、シスタチンＣ補助試薬Ａのバイアルへと添加した。溶液は、使用前に混合した。
・シスタチンＣ対照：凍結乾燥させたバイアルの内容物は、使用の３０分前に、蒸留水１ｍｌ中で再構成し、ホモジナイズすることにより調製した。
【０１５８】
試料の調製
精液試料は、Ｄａｄｅ製の緩衝液中で１／４０に希釈した。次いで、精液試料を、免疫比濁計により自動で、希釈率を１／２０として希釈した。
【０１５９】
精液におけるシスタチンＣ量の測定
免疫比濁計により得られる、ｍｇ／ｌで表される結果に４０を乗じ、次いで、患者から採取される精子の容量を乗じた。こうして、精液中のシスタチンＣの総量が得られた。
【０１６０】
統計学的解析
得られた結果を、統計学のソフトウェアであるＳＴＡＴＦＲＡ  ２００５（Alcatel TITN Answare）により解析した。
【０１６１】
相関は、スピアマンの相関検定を用いて検証した。
【０１６２】
結果
シスタチンＣ濃度の値
男性の不妊患者３１例に対してシスタチンＣアッセイを実施し、うち１８例には精液の生化学的解析を施した。
【０１６３】
表１は、不妊患者３１例の精液中のシスタチンＣ濃度を示す。表２は、精液の生化学的解析を受けた１８例の不妊患者の精液中のシスタチンＣ濃度を示す。
【０１６４】
【表１】
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【０１６５】
【表２】
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【０１６６】
表３は、生殖能力のある男性の精液の射精画分中のシスタチンＣ濃度を示す。
【０１６７】
【表３】
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【０１６８】
不妊患者３１例の集団におけるシスタチンＣの分布は、３つの群への再分割を示す（図１）。
【０１６９】
患者の大半におけるシスタチンＣ濃度は、３０〜４０ｎｇ／ｍｌである。他の２つの患者群は、１５〜３０ｎｇ／ｍｌのシスタチンＣ濃度、または６０ｎｇ／ｍｌを超えるシスタチンＣ濃度を示す。
【０１７０】
精子が、頸管粘液より高量（最大で１０倍）のシスタチンＣを含有する（図２）のに対し、頸管粘液は、精子より高量（最大で５倍）のＣＴＳ−Ｂを含有する（図３）。
【０１７１】
頸管粘液中では、ＣＳＴ３（図４）およびＣＴＳＢ（図５）のいずれもが、ＰＣＴ陽性度と共に減少する。加えて、ＣＳＴ３／ＣＴＳ−Ｂ比は、ＰＣＴ陽性度と共に増大すると考えられる（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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