(57)【要約】  本発明は、真核細胞中のゲノムＤＮＡにおける、複製事象の開始の発生を検出するための方法に関する。前記方法は、第一のヌクレオチドプローブが、ＤＮＡゲノム中の標的領域とインサイチュハイブリダイゼーションすることができる条件下で、前記ゲノムＤＮＡを含む前記真核細胞を前記第一のヌクレオチドプローブと接触させ、ここで前記標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持し、そして、前記ＤＮＡにハイブリダイズされる前記第一のヌクレオチドプローブを検出することを含む。少なくとも１つのＲＮＡ分子の検出が、さらになされ得る。本発明はまた、プローブとしての使用に適している核酸分子に関する。当該核酸分子は、真核細胞のゲノムＤＮＡ中の標的領域とハイブリダイズし、そして前記真核細胞のゲノムＤＮＡを含む代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する。本発明はまた、固定された細胞上でインサイチュハイブリダイゼーションを実施するためのキットを含む。本発明はまた、１若しくは２以上のミトコンドリア疾患、１若しくは２以上の腫瘍性疾患、又は１若しくは２以上の癌の検出における、或いは、有機化合物若しくは化学化合物、特に薬剤の真核細胞に対する毒性の試験における、本発明の方法、核酸分子又はキットの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞中のゲノムＤＮＡにおける、複製事象の開始の発生を検出するための方法であって、以下のステップ：
−  第一のヌクレオチドプローブが、ＤＮＡゲノム中の標的領域とインサイチュハイブリダイゼーションすることができる条件下で、前記ゲノムＤＮＡを含む前記真核細胞を前記第一のヌクレオチドプローブと接触させ、ここで前記標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持し、そして
−  前記ＤＮＡにハイブリダイズされる前記第一のヌクレオチドプローブを検出し、
そして場合により、
−  前記細胞中のＤＮＡ分子の転写された領域に対応する少なくとも１つのＲＮＡ分子のさらなる検出のために、前記真核細胞を、少なくとも第二のヌクレオチドプローブと接触させ、そして前記ＲＮＡ分子にハイブリダイズされる前記第二のヌクレオチドプローブを検出すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ゲノムＤＮＡが、ミトコンドリアのｇＤＮＡ若しくは核のｇＤＮＡ、又はそれらの両方であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のヌクレオチドプローブが、少なくとも２つの、プローブのサブセットからなり、ここで少なくとも１つの前記サブセットは、ＤＮＡゲノム中の標的領域とハイブリダイズし、ここで前記標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ａ．前記ゲノムＤＮＡを含む真核細胞を、７２〜７８℃で、好ましくは７５℃で、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間加熱すること；又は
ｂ．化学剤、例えばホルムアミドと、例えば７０％ホルムアミド溶液と接触させること；或いは
ａ及びｂの両方を行うこと
のいずれか１つのステップによって、前記標的領域を含むゲノムＤＮＡ分子を部分的に変性するステップを含むことを特徴とする、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のヌクレオチドプローブが、８０ｂｐ〜３０００ｂｐ、８０〜２０００ｂｐ、又は、８０〜４００、８００、１２００若しくは１５００ｂｐ、又は９０〜１５０ｂｐ、特に９５〜１１０ｂｐ、好ましくは９９ｂｐの大きさの一本鎖ＤＮＡ断片であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第一のヌクレオチドプローブが、真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（ＨＳＰ）とＬＳＰとの間に局在化されるゲノムＤＮＡ配列を標的とするか、又は、前記第一のヌクレオチドプローブが、真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（ＨＳＰ）とＬＳＰとの間に局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のヌクレオチドプローブが、ミトコンドリアのｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、そして、
ａ．配列番号１７及び配列番号１８を含む核酸分子、特に、ｍｔＤＮＡの配列と、又は、前記ｍｔゲノムのＨ鎖の４２５番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドと、相補的であるか、若しくは少なくとも相補的であるか、又はハイブリダイズする核酸分子；或いは
ｂ．その配列が配列番号１及び配列番号１７によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜２２５番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約４００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｃ．その配列が配列番号１及び配列番号１８によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約８００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｄ．その配列が、配列番号１、配列番号１７及び配列番号１８をこの順番で含む核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６０２４番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約１２００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子
を含むか、又はからなることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のヌクレオチドプローブが、転写されないミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、そして、
ｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの配列を有する核酸、或いは、
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である配列を有する核酸、或いは、
ｉｉｉ．前記（ｉ）若しくは（ｉｉ）の断片、或いは、
ｉｖ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、若しくは、配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、又はそれらの断片
を含むか、又はからなり、前記核酸分子は、一本鎖分子であるか、又は相補的配列の二本鎖分子であるか、のいずれかであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ミトコンドリアのｇＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方が検出され、１若しくは２以上のＲＮＡ分子を検出する少なくとも第二のヌクレオチドプローブが、１若しくは２以上のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を標的とするか、又は、ミトコンドリアのｇＤＮＡのＤループ領域中でミトコンドリアのｇＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡを標的とすることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二のヌクレオチドプローブが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド構造の形成に関連するＲＮＡ分子若しくはその断片と特異的であるか、又は、Ｄループ領域中でｇＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ若しくはその断片と特異的であり、そして、配列番号１８を含むか若しくは配列番号１８からなるか、又は配列番号１８の断片であるか、又は配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のヌクレオチドプローブ、及び場合により前記第二のヌクレオチドプローブが、蛍光性基で直接標識化され、そして／又は修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡゲノム上の標的領域の核酸配列、及びＲＮＡ分子の検出は、１ステップで、特に、同時になされることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
固定された１若しくは２以上の細胞上か、又は固定された１若しくは２以上の組織上で行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの真核細胞中においてヌクレオチド性物質をインサイチュハイブリダイゼーションし、且つ検出するために、以下のステップ：
ａ．１〜４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で、好ましくは２％ＰＦＡ中で、約２０〜３０分間、特に３０分間かけて前記細胞を固定化し、
ｂ．０．５％〜１％のトリトン（Triton） Ｘ１００のＰＢＳ １Ｘ液で、約５〜１０分間、４℃にて、特に５分間、前記固定化された細胞を透過処理し、
ｃ．７２〜７８℃にて、好ましくは７５℃にて、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間かけて、浸透処理された前記固定化細胞の核酸含有物を変性し、
ｄ．前記ステップ（ｃ）にしたがって処理された細胞中の１又は２以上の核酸が、１又は２以上のヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができるように、前記１又は２以上の核酸を前記１又は２以上のプローブと接触させ、ここで前記プローブは、８０〜３０００ヌクレオチドの大きさを有し、特に９５〜１１０ヌクレオチドの大きさを有し、そして１００ｎｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中に含有され、
ｅ．前記ステップ（ｄ）において添加された１又は２以上のプローブとハイブリダイズされる１又は２以上の核酸を検出すること
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出ステップの前に、好適なバッファーを用いて、前記１又は２以上のヌクレオチドプローブと接触される細胞を洗浄するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハイブリダイゼーションステップが、約１５時間、３７℃にて行われる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
真核細胞中の少なくとも１つの目的のタンパク質の標識化を可能とするステップ、及び、前記タンパク質を免疫蛍光法によって検出するステップをさらに含み、ここで、核酸性物質及び目的のタンパク質の検出が、場合により１ステップで、特に同時になされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
実施された１又は２以上の検出の結果を分析するステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
真核細胞のゲノムＤＮＡ中の標的領域とハイブリダイズする核酸分子であって、請求項５〜８のいずれか１項で規定されたものであり、場合により標識化され、ここで前記標的領域は、前記真核細胞のゲノムＤＮＡを含む代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する、前記核酸分子。
【請求項２０】
ＲＮＡフリーの核酸配列とハイブリダイズし、そして前記ＲＮＡフリーの核酸配列と同じ長さか、又はそれよりも長い、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
ｍｔゲノムのＨ鎖上の４４６番目のヌクレオチドと１６２０２４番目のヌクレオチドとの間に、特にヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの４４６番目のヌクレオチドと１６３６６番目のヌクレオチドとの間に局在化されるミトコンドリアのｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、或いは、ｍｔゲノムのＨ鎖上の４４６番目のヌクレオチドと１６２０２４番目のヌクレオチドとの間に、特にヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの４４６番目のヌクレオチドと１６３６６番目のヌクレオチドとの間に局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的であり、そして、
ａ．配列番号１７及び配列番号１８を含む核酸分子、特に、ｍｔＤＮＡの配列と、又は、前記ｍｔゲノムのＨ鎖の４２５番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドと、相補的であるか、若しくは少なくとも相補的であるか、又はハイブリダイズする核酸分子；或いは
ｂ．その配列が配列番号１及び配列番号１７によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜２２５番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約４００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｃ．その配列が配列番号１及び配列番号１８によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約８００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子；或いは
ｄ．その配列が、配列番号１、配列番号１７及び配列番号１８をこの順番で含む核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６０２４番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約１２００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子
からなる群から選択される、請求項１９又は２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
転写されないミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、そして、
ｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの配列を有する核酸、或いは、
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である配列を有する核酸、或いは、
ｉｉｉ．前記（ｉ）若しくは（ｉｉ）の断片、或いは、
ｉｖ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、若しくは、配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、又はそれらの断片
を含むか、又はからなり、前記核酸分子は、一本鎖分子であるか、又は相補的配列の二本鎖分子であるかのいずれかである、請求項１９又は２０に記載の核酸分子。
【請求項２３】
ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ／ＤＮＡ分子と結合する、請求項９又は１０に記載の核酸分子であって、ここで前記ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ／ＤＮＡ分子は、ミトコンドリアｇＤＮＡのＤループ領域中に局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントとハイブリダイズする分子であり、ここで前記核酸分子は、配列番号１７若しくは配列番号１８の配列を含むか、又は配列番号１７若しくは配列番号１８の配列を有するか、又は配列番号１７若しくは配列番号１８の配列の断片であるか、又は配列番号１７若しくは配列番号１８と相補的である配列と少なくとも８０％の同一性を有する、前記核酸分子。
【請求項２４】
固定された細胞上でインサイチュハイブリダイゼーションを実施するためのキットであって、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の検出可能な核酸分子からなる第一のヌクレオチドプローブを含み、そして場合により、ＲＮＡ分子とハイブリダイズする第二のヌクレオチドプローブを含む、前記キット。
【請求項２５】
請求項２３に記載の検出可能な核酸分子からなる核酸プローブを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
１若しくは２以上のミトコンドリア疾患のインビトロでの検出における使用のための、或いは、１若しくは２以上の腫瘍性疾患、又は１若しくは２以上の癌のインビトロでの検出における使用のための、或いは、１若しくは２以上の慢性感染性疾患に関連する筋障害のインビトロでの検出若しくはモニタリングにおける使用のための、或いは、有機化合物若しくは化学化合物、特に薬剤の真核細胞に対する毒性の試験における使用のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法、核酸分子又はキット。
【請求項２７】
細胞中における、変更されたミトコンドリアの活性を検出するための方法であって、
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の第一のプローブを用いて、ＤＮＡ複製のミトコンドリアにおける開始のレベルを検出し、そして
請求項２３に記載の第二のプローブを用いて、ミトコンドリアにおける転写物のレベルを検出すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インサイチュハイブリダイゼーション技術を使用した、真核細胞、特に哺乳類細胞中のゲノムＤＮＡにおける複製関連事象を分析するための方法を対象とする。本発明の方法は、特にゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生の検出を対象としている。特定の実施形態において、本発明はまた、１つの細胞中でのＤＮＡ及びＲＮＡ分子の同時検出をも可能にする。さらに特定の実施形態によれば、本発明は、１つの細胞中でのＤＮＡと、そして場合により、ＲＮＡやタンパク質との同時検出及び同時可視化を可能にする。
【０００２】
本発明において、ゲノムＤＮＡ分子は細胞のゲノムに属する核酸分子であり、代謝的に活性な１若しくは２以上の細胞において、特に細胞調節因子の制御下、特別な自律的に又は独立した様式で複製するので、したがってその複製はインサイチュ（in situ）で観察できる。細胞のゲノムは、生物体のＤＮＡであると見なされ、それは生物体が合成する全てのタンパク質の全ての情報を運んでおり、そしてより一般的に、ゲノムは細胞の生存のために必要なすべての情報を含んでいる。ゲノムＤＮＡは、染色体ＤＮＡであるか、又はプラスミドＤＮＡであり得るが、但し、本明細書中に規定されるように、前述のプラスミドＤＮＡは細胞のゲノムに属するものとする。より具体的には、本発明において、１若しくは２以上のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子は、ミトコンドリアｇＤＮＡであるか、又は核ｇＤＮＡであるか、或いはその両方である。プラスミドは、染色体ＤＮＡから切り離され、そして染色体ＤＮＡを独立に複製できるＤＮＡ分子である。プラスミドは、二本鎖であり、大抵の場合、特に環状である場合が多い。プラスミドは、通常細菌内に自然に発生しているが、真核生物では時々しか見られない。対照的に、機能で規定した場合にゲノムに属さないプラスミドＤＮＡは、本発明との関係においてゲノムＤＮＡであると見なされない。
【０００３】
本発明はまた、特異的プローブ、特にヌクレオチドプローブに関し、前記プローブは、特に真核細胞中のゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生の検出のために構築される。本発明は、ゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生を検出するために有効である手段、特に本発明をおこなうためのプローブ及びプロセスを含むキットを包含する。特定の実施形態によると、本発明の方法、プローブ、及びキットは、単独細胞レベルでのゲノムＤＮＡの複製開始を分析するのに好適なので、したがってｇＤＮＡの複製障害を検出するための手段、特に１若しくは２以上のミトコンドリア疾患、１若しくは２以上の腫瘍性疾患、又は１若しくは２以上の癌を含めたそのような障害に関連している疾患を検出するために有用な手段を提供する。
【０００４】
特定の実施形態において、本発明は特に、ヒト細胞中のミトコンドリアのゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生を観察するように設計された実験で得られた結果を利用する。
【背景技術】
【０００５】
実際には、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の複製及び転写が細胞機能に重要ではあるが、これらのプロセスは単独細胞レベルでは十分に理解されていない。現在、生物学者に提供されているツールでは、ＤＮＡ複製の開始に関与しているミトコンドリアの特異的検出ができない。核のｇＤＮＡに関して、現在、生物学者に提供されているツールでは、細胞内の、複製開始に関与している核のｇＤＮＡが検出できない。すなわち、単独細胞レベルにおいて、その細胞含有物から単離されない。
【０００６】
ミトコンドリアは、その機能が核ゲノムだけによって管理されるのではなく、それら自身のゲノムによっても管理されるＡＴＰ産生細胞小器官である。各ミトコンドリアは、ゲノムＤＮＡの数個のコピー、すなわち、細胞小器官内で自律的に複製され、そして転写される環状の二本鎖ＤＮＡを持つ。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、核タンパク質複合体である核様体の状態で配置されており、前記核様体は、複製及びに転写にかかわる因子、並びにミトコンドリアの維持に必要な構造タンパク質を含んでいる（Chen and Butow 2005; Spelbrink 2010）。これらのタンパク質としては、ＤＮＡポリメラーゼγ（Ｐｏｌγ）というｍｔＤＮＡの複製に関与する酵素、及びＴＦＡＭ（ｍｔＴＦＡとしても既知の）というｍｔＤＮＡの転写及びｍｔＤＮＡへの結合の両方に関係するタンパク質が挙げられ、そのレベルはｍｔＤＮＡのレベルと相関している（Poulton et al. 1994; Falkenberg et al. 2007; Shutt et al. 2010）。ヒトｍｔＤＮＡ（１６．５ｋｂｐの分子）は、タンパク質をコードするもの１３個、ｒＲＮＡ２個及びｔＲＮＡ遺伝子２２個で構成され、そしてヒトｍｔＤＮＡは、ポリシストロン性前駆体ＲＮＡの産生に伴い（重）Ｈ鎖（ｍＲＮＡ１２個、ｒＲＮＡ２個、及びｔＲＮＡ１４個）及び（軽）Ｌ鎖（ＮＤ６遺伝子のｍＲＮＡ１個及びｔＲＮＡ８個）から転写される。これらの一次転写産物は、個々のｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びｔＲＮＡ分子を生じるようにプロセシングされる1。ｍｔＤＮＡ複製についての一般的な見方は、新生Ｈ鎖が７００ｂｐ下流で頻繁に終了し、そして７Ｓ ＤＮＡをもたらす起点ＯＨからＤＮＡ合成は始まり、そしてそれが独特の三本鎖構造物であるＤループを生じさせるというものである2,3。主鎖合成がゲノムの３分の２に達すると、前記ＤＮＡは別の主要な起点であるＬ鎖ＤＮＡ複製の起点（ＯL）を晒し、次いで逆方向にラギング鎖ＤＮＡの合成が始まる。逆に、対をなすリーディング鎖合成とラギング鎖合成は分子数の減少で説明されてきたが4、それは、このモデルが完全に解明されていないことを示唆している。ミトコンドリアは、高度に相互接続されたチューブ状の構造から個別の小さい球状ユニットに及ぶ様々な形状を示す。これらの構造は、非常に動的であるので、ミトコンドリアの融合及び分裂によって調整でき、そして、それらは細胞の成長中に変化する（Chan 2006; Lee et al. 2007; Mitra et al. 2009）。これらの異なった構造がｍｔＤＮＡプロセシング要求の明確化に関連するか否かは別問題である。
【０００７】
一般に、核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）は染色体内で小さくまとめられており、そして一般に、その複製は「（１若しくは２以上の）起点」又は「（１若しくは２以上の）複製起点」と呼ばれるゲノム内の特定位置で始まり、そこはＤＮＡヘリックスが最初に解かれて、「複製バブル」を生じる位置である。起点におけるＤＮＡの巻き戻し、そして新しい鎖の合成は、複製フォークを形成し、その複製フォークは、非対称構造を有している。連続的に合成されるＤＮＡ娘鎖は、リーディング鎖として知られており、このリーディング鎖の合成は、ラギング鎖として知られる非連続的に合成される娘鎖の合成よりわずかに先行する。一般に、真核生物の染色体には、複数の複製起点がある。真核生物の染色体内の別の複製起点は、一つにはクロマチンの構造によって判断され、クロマチンの最も凝集された領域を有する配列内で活性化されることができ、そして最後にそれらの複製が開始する。
【０００８】
ミトコンドリアＤＮＡのプロセシングは、生化学的アプローチを用いて集中的に分析されたが（5、6で概説）、生化学的アプローチでは大域的な細胞及びミトコンドリア集団を実質的に調べたのであって、単独細胞レベルにおけるミトコンドリア活性について、又は単独細胞レベルのＤＮＡやＲＮＡについてはほとんどわかっていない。そのため、同じ細胞中のｍｔＤＮＡ転写及び複製の動態並びに調整に関するいくつかの問題が、細胞機能におけるｍｔＤＮＡの影響と同様に未解決のままである。これまで、ｍｔＤＮＡ複製に対する研究は、広く分子生物学（複製中間体の２Ｄゲルやインビトロアッセイ）に基づいている。最近の改善点7を含めて現在利用可能な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ツールは、ＤＮＡ複製に関与しているミトコンドリアを識別することはないので、それらは単独細胞中の細胞小器官の転写プロフィールを区別することはない。一回に１個のミトコンドリア転写産物を検出することを可能にする技術が開発されているが30、その技術は、遺伝子操作ステップを必要とし、且つ、転写産物ＮＤ６だけを示した。
【０００９】
そのうえ、連続したＲＮＡとＤＮＡの標識化8、並びにＤＮＡ又はＲＮＡ、及びタンパク質9、10の標識化がおこなわれたが、使用した技術、すなわち、免疫蛍光法及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）では、タンパク質、並びにミトコンドリアＤＮＡ及びＲＮＡを同時に検出すること（三重検出）はできなかった。その結果、利用可能な技術では、特に異なった分子亜集団、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、或いはタンパク質もが関与する場合のｇＤＮＡ、特にｍｔＤＮＡの転写及び複製中に起こる事象の成り行きの効果的な、且つ、直接利用可能な観察をおこなうことができない。
【発明の概要】
【００１０】
したがって、本発明は、ＤＮＡ複製を研究するための優れたツールであって、（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の中でのＤＮＡ複製と、その他の事象、例えば、ＲＮＡ転写、或いは（１若しくは２以上の）タンパク質分布などとの協調に関する、付随様式、或いは、同時様式でのこれらの異なった分子亜集団の追跡及び観察による理解を含めた、ＤＮＡ複製と関連している事象のより深い理解を可能にする優れたツールを入手する必要性に取り組む。その結果、本発明は、複雑な細胞動力学をさらに調査するための新しい方法、及び病理学的状態の検出においてそうした調査を使用するための新しい方法を提案する。
【００１１】
本発明の特定の実施形態によると、生理学的プロセス及び病理学的プロセス中のｇＤＮＡ、特にミトコンドリアｇＤＮＡの動態であるプロセシングに関して、新しい情報が提供される可能性がある。これらの知見は、疾患、特にミトコンドリア疾患、或いは（１若しくは２以上の）ミトコンドリア機能不全に関連している疾患又は障害、特に、ｍｔＤＮＡ減少とｍｔＤＮＡ喪失が観察できる疾患又は障害の診断ツールにかかわる。
【００１２】
実際には、ミトコンドリアの複製機構の欠陥は、ミトコンドリアの（ｍｔ）ＤＮＡの欠失及び／又は減少による遺伝情報の損失につながる可能性があり、続いてそれが、患者の酸化的リン酸化障害及び神経筋症状を引き起こし得る。ｍｔＤＮＡの減少は、遺伝的欠損から生じる可能性があるか、又は抗ＨＩＶヌクレオシド類似体の長期投与のような、即ち臨床治療によって、もたらされる可能性がある。ｍｔＤＮＡのｑＰＣＲ分析は現在、所定の細胞集団におけるｍｔＤＮＡ含有量の変化を検出するために使用されている。ミトコンドリアのゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生のモニタリングを可能にすることによって、例えば、疾患の進行中に、これらの事象と、続くそれらの発生を評価することによって、本発明は、そのような欠陥のある機能又は消失した機能の判定を提供する。その結果、ＤＮＡ複製事象の開始を検出し、そして場合により、この検出を他のシグナルの検出と組み合わせ、それにより、単独細胞レベルでのｍｔＤＮＡの状況を測定することで、より強力な研究及び診断ツールの出現を可能にする。
【００１３】
この目的のために、本発明は、真核細胞中のゲノムＤＮＡにおける、複製事象の開始の発生を検出するための方法であって、以下のステップ：
−  第一のヌクレオチドプローブが、ＤＮＡゲノム中の標的領域とインサイチュハイブリダイゼーションすることができる条件下で、前記ゲノムＤＮＡを含む前記真核細胞を前記第一のヌクレオチドプローブと接触させ、ここで前記標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記標的領域は、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持し、そして
−  前記ＤＮＡにハイブリダイズされる前記第一のヌクレオチドプローブを検出すること
を含む前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ａ）分裂ＨｅＬａ細胞の３Ｄ再構成像は、ｍｔＤＮＡプローブ混合物であるｍＴＯＴ（赤色）で標識されたミトコンドリア亜集団の核周囲分布を示す。ミトコンドリアネットワーク全体は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（緑色）で標識され、そして、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青色）で標識される。右側には、拡大図がＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ標識（下部）、ｍＴＯＴ（真ん中）、及び組み合わせ（上部）を示す。スケールバー＝１０μｍ。ズームスケールバー＝３μｍ。
【図１Ｂ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｂ）ヌクレアーゼ処理（それぞれのパネルの上部に指定；矢印は、第一のヌクレアーゼとの１時間のインキュベーション後に第二のヌクレアーゼが添加されたことを示す）を伴う、ｍＴＯＴプローブ（赤色）で標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ再構成ＨｅＬａ細胞。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｃ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｃ）Ｘ軸上に示したヌクレアーゼ処理の有無を伴う、ｍＴＯＴの蛍光強度の定量（「次いで（then）」は、第一のヌクレアーゼとの１時間のインキュベーション後に第二のヌクレアーゼが添加されたことを示す）ｎ＝３０。無処理細胞と比較したｔ検定、（*）ｐ＜０．０５；（**）ｐ＜０．０１；（***）ｐ＜０．００１。
【図１Ｄ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｄ−Ｇ）この研究に使用される関連抗体のｍＴＲＩＰ処理中のエピトープ保存。免疫標識前に、示されたとおり処理された、又は無処理のＨｅＬａ細胞の（Ｄ）抗ＴＯＭ２２免疫染色。ＩＦ：免疫蛍光法；ステップ１＋２：ホルムアミド５０％を用いた透過処理＋インキュベーション；ステップ３：７０％のホルムアミド中での変性；ｍＴＲＩＰ：全手順。プロテイナーゼＫを用いた軽い処理（３７℃にて５分間）が、タンパク質分解の対照として使用された；この処理は、タンパク質を完全に分解するわけではなく（未掲載）、これにより蛍光標識に適合できる。
【図１Ｅ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｄ−Ｇ）この研究に使用される関連抗体のｍＴＲＩＰ処理中のエピトープ保存。免疫標識前に、示されたとおり処理された、又は無処理のＨｅＬａ細胞の（Ｅ）蛍光強度の定量化。ＩＦ：免疫蛍光法；ステップ１＋２：ホルムアミド５０％を用いた透過処理＋インキュベーション；ステップ３：７０％のホルムアミド中での変性；ｍＴＲＩＰ：全手順。プロテイナーゼＫを用いた軽い処理（３７℃にて５分間）が、タンパク質分解の対照として使用された；この処理は、タンパク質を完全に分解するわけではなく（未掲載）、これにより蛍光標識に適合できる。
【図１Ｆ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｄ−Ｇ）この研究に使用される関連抗体のｍＴＲＩＰ処理中のエピトープ保存。全ｍＴＲＩＰプロトコールで前処理された、又は無処理のＨｅＬａ細胞の（Ｆ）Ｐｏｌγ免疫染色の蛍光強度の定量化。
【図１Ｇ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｄ−Ｇ）この研究に使用される関連抗体のｍＴＲＩＰ処理中のエピトープ保存。全ｍＴＲＩＰプロトコールで前処理された、又は無処理のＨｅＬａ細胞の（Ｇ）ＴＦＡＭ免疫染色の蛍光強度の定量化。
【図１Ｈ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｈ）免疫標識細胞の３Ｄ解析のスキーム。共焦点取得、３Ｄ再構成像及び定量化（方法を参照のこと）。ＴＯＭ２２免疫標識が、ミトコンドリアの質量を規定するのに使用された。同じ手順はまた、ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡプローブの標識化にも用いられた。
【図１Ｉ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｉ）ｍＴＲＩＰはミトコンドリアＲＮＡとＤＮＡを標識する：ＨｅＬａ細胞の３Ｄ再構成像は、ｍｔＤＮＡプローブ混合物であるｍＴＯＴ（赤色）で標識化されたミトコンドリア分画を示す。ミトコンドリアネットワークは、免疫蛍光（緑色）によりＴＯＭ２２で標識化され、そして核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）で標識化される。下図は、ｍＴＯＴ（左側）及び組み合わせ（右側）の２．５ｘ拡大図。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｊ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｊ）プロテイナーゼＫ処理の存在又は不存在下での、ｍＴＯＴで標識化された３Ｄ再構成細胞。この作業で使用される他の主要なＦＩＳＨプローブであるｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰ（それらは、文中で以下に記載されているように、それぞれ転写産物及びＤＮＡだけを標識する）もまた検討された。
【図１Ｋ】改変３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ方法は、核周囲のミトコンドリア亜集団を明らかにする。ｍＴＲＩＰ標識の効率と特性もまたに開示される。（Ｋ）プロテイナーゼＫ処理の有無を伴う、ｍＴＯＴ、ｍＴＲＡＮＳ、及びｍＲＥＰの蛍光強度の定量化；各条件に関しては、ｎ＝３０、３回の独立した実験。無処理細胞と比較されるｔ検定、（***）ｐ≦０．００１．
【図２Ａ】ＤＮＡプロセシングするミトコンドリア亜集団の空間的−時間的分布。（Ａ）それぞれミトコンドリアゲノム全体のうちの一部を対象とする１４種類の個々のｍｔＤＮＡプローブ（赤色）を用いたＨｅＬａ細胞の３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ。核（青色）はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で標識される。スケールバー＝１０μｍ。プローブの番号／名称、そのプローブが対象とする（単数若しくは複数の）ミトコンドリア遺伝子は、それぞれ、各パネルの上部及び下部に示されている。真ん中のパネルは、同スケールのｍｔゲノム（外側の円）及びその中の単独遺伝子の略図である。ｔＲＮＡ遺伝子は、対応する文字で示されている。Ｌ鎖に見られたＮＤ６を除いて、全遺伝子がＨ鎖に見られる。リボソームＲＮＡ（１６Ｓと１２Ｓ）は、暗灰色であって、円の外側にわずかに移行している。Ｈ鎖の複製起点（ＯＨ）及びＨ鎖とＬ鎖の両方のプロモーター（それぞれＰＨ１−ＰＨ２、及びＰＬ）を含むＤループ領域は、黒色で示されていて、円の外側に移行している。内側の円は、それぞれの個々のプローブの位置を表す（表１及び２の座標を参照のこと）；いくつかのプローブが、隣接プローブと数ダースの塩基で重複している。１４種類の個々のプローブが、ｍｔゲノム全部を累積的にカバーしている。
【図２Ｂ】ＤＮＡプロセシングするミトコンドリア亜集団の空間的−時間的分布。（Ｂ）Ｘ軸に示した１４種類の個々のｍｔＤＮＡプローブで標識した、無処理の又はＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡのいずれかで処理した３Ｄ再構成ＨｅＬａ細胞の蛍光強度の定量化。主要な遺伝子及び調節領域を、上部に示す。ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの。各プローブに関して、ヌクレアーゼで処理細胞対無処理細胞について、ｔ検定がおこなわれた；（*）ｐ＜０．０５；（**）ｐ＜０．０１；（***）ｐ＜０．００１。Ｌ鎖に位置する同名の遺伝子を対象とする、ＮＤ６と呼ばれる更なるプローブもまた、検討した。ほとんどのプローブに関して、標識は、ＲＮａｓｅ処理後に劇的に減るか又はほとんど見えなくなり、そしてそれは、標識が事実上ＲＮＡ分子を標的としていることを示している。標識の部分的又は全体的な低減は、プローブ４、８、及び１３のＤＮａｓｅ処理により生じ、そしてそれは、これらのプローブがｍｔＤＮＡも標的とすることを示している。プローブ４及び１３は、下部に示した複製起点（それぞれＯLとＯＨ）を含むｍｔゲノムの領域を対象としている。
【図２Ｃ】ＤＮＡプロセシングするミトコンドリア亜集団の空間的−時間的分布。（Ｃ）１４種類の個々のｍｔＤＮＡプローブ（赤色）で標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ再構成ＩＭＲ９０初代線維芽細胞；（ａ）と同様の凡例要素。
【図２Ｄ】ＤＮＡプロセシングするミトコンドリア亜集団の空間的−時間的分布。（Ｄ）１４種類の個々のｍｔＤＮＡプローブの蛍光強度の定量化；（Ｂ）と同様の凡例要素。ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの。
【図３Ａ】ミトコンドリアの複製起点を含む領域の検出。（Ａ）３Ｄ−ＦＩＳＨアッセイに使用されるｍｔプローブによる、ＤＮＡ及びＲＮＡ標識の局在図。ＤＮＡ標識は、３つの領域で（同じスケールでない）観察され、そのうちの２つがｍｔゲノムの複製の主要な起点に対応し（ＯＨとＯL、それぞれプローブ１３と８）、そして３つ目（プローブ８）は複製の追加のＯL起点に対応する（以前に同定されている13）。ｍｔ起点の間の距離を示す。
【図３Ｂ】ミトコンドリアの複製起点を含む領域の検出。（Ｂ）段階的に短くなるプローブを用いた３Ｄ−ＦＩＳＨによって分析されたＯＨ領域の特徴づけ。各プローブに対応する領域は、その領域に存在している主な遺伝要素も示す左側のパネルに示されている（ＬＳＰ＝軽鎖プロモータ；ＰH1及びРH2はそれぞれ重鎖プロモーター１及び２を表す；ＯＨ＝Ｈ鎖ＤＮＡ複製の起点；Ｆ＝ｔＲＮＡPhe；１２Ｓ＝１２Ｓ ｒＲＮＡ、Ｐ＝ｔＲＮＡPro）。プローブｍＲＥＰだけは、実質的に転写されない（ＲＮＡフリーと示される）ＤＮＡ領域を対象としているが、それに対して、プローブ１３及び１３−１はまた、転写された領域も対象とする。右側のパネルは、それぞれのプローブ（赤色）；青色の核（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）で標識したミトコンドリア実体の局在を３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰによって示した。スケールバー＝１０μｍ。
【図３Ｃ】ミトコンドリアの複製起点を含む領域の検出。（Ｃ）ヌクレアーゼ処理の有無を伴う、ｍＲＥＰ（赤色）及びｍＴＲＡＮＳ（緑色）プローブで標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ再構成ＨｅＬａ細胞。スケールバー＝１０μｍ（上のパネル）及び蛍光強度の定量化（下のパネル）。ＤＮａｓｅＩの存在下でのｍＲＥＰの値、及びＲＮａｓｅＡの存在下でのｍＴＲＡＮＳの値は、バックグラウンドに相当している。ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの：ヌクレアーゼ処理細胞対無処理細胞に関するｔ検定；（***）ｐ＜０．００１。
【図３Ｄ】ミトコンドリアの複製起点を含む領域の検出。（Ｄ）ｍＲＥＰプローブ（赤色）及び抗Ｐｏｌγ（緑色）を用いたＩＦ結合３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ。右側は、ｍＲＥＰ陽性及びｍＲＥＰ陰性のＰｏｌγ標識領域の蛍光強度の定量化。それぞれの領域に関する例は、下部の丸印を付けたもの、下のパネル：Ｐｏｌγ；上のパネル：組み合わせ、に示されている。ｎ＝３００、３回の独立した実験からのもの。ｔ検定（***）ｐ＜０．００１。
【図３Ｅ】ミトコンドリアの複製起点を含む領域の検出。（Ｅ）ｍＲＥＰプローブ（赤色）及び抗ＴＦＡＭ（緑色）を用いたＩＦ結合３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ。右側は、ｍＲＥＰ陽性及びｍＲＥＰ陰性のＴＦＡＭ標識領域の蛍光強度の定量化。それぞれの領域に関する例は、下部の丸印を付けたもの、下のパネル：ＴＦＡＭ；上のパネル：組み合わせ、に示されている。ｎ＝３００、３回の独立した実験からのもの。ｔ検定（***）ｐ＜０．００１。
【図４】３Ｄ−ＦＩＳＨは、転写及び複製開始活性を欠いているミトコンドリアを明らかにする。（ａ）ミトコンドリアタンパク質であるＴＯＭ２２に対しても免疫標識したＨｅＬａ細胞を再構成した３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰは、ｍｔＤＮＡ、ｍｔＲＮＡ、及びミトコンドリアネットワークを同時に明らかにする。右のパネル：ｍＲＥＰ；真ん中のパネル：ｍＴＲＡＮＳ；左のパネル：組み合わせ。左のパネルでは、ミトコンドリア転写産物（ｍＴＲＡＮＳ、赤色、矢印を参照のこと）は、ミトコンドリアネットワーク（抗ＴＯＭ２２、緑色）内に独立した実体として検出されるが、それに対し、複製単位ｍｔ開始（プローブｍＲＥＰ、青色）は、転写産物輸送ユニットと事実上共局在化している（組み合わせ、紫色、矢印を参照のこと）。
【図５Ａ】３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ標識の特徴づけ。（Ａ）以下のもので標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ再構成ＨｅＬａ細胞：飽和濃度のｍＴＯＴプローブ（赤色）（２００ｎｇ；左のパネル）；ヒト核Ａｌｕ配列に対するｍＴＯＴプローブ（赤色）及びＨｓ Ａｌｕプローブの同時ＦＩＳＨ（緑色）（真ん中の左パネル）；無処理（真ん中の右パネル）及びＲＮＡｓｅＡで処理された（右のパネル）、（ｍｔリボソーム遺伝子に対応するプローブ１、２、及び１４を含まないｍＴＯＴからなる）ｍＴＯＴΔｒ。スケールバー＝１０μｍ。
【図５Ｂ】３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ標識の特徴づけ。（Ｂ）ヌクレアーゼ処理の有無を伴う、ｍＴＯＴ及びｍＴＯＴΔｒの蛍光強度の定量化。ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの；無処理細胞と比較したｔ検定、（*）ｐ＜０．０５；（**）ｐ＜０．０１；（***）ｐ＜０．００１。
【図６Ａ】個々のミトコンドリア遺伝子のリアルタイムの定量的ＰＣＲ、及びＦＩＳＨデータとの比較。（Ａ）ＨｅＬａ細胞における個々のミトコンドリア遺伝子の発現レベル。１６Ｓ及び１２Ｓは、２組の独立したプライマーセットを用いて分析された。３つの実験の平均±標準偏差。
【図６Ｂ】個々のミトコンドリア遺伝子のリアルタイムの定量的ＰＣＲ、及びＦＩＳＨデータとの比較。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞及びＩＭＲ−９０ヒト初代線維芽細胞における１２Ｓ（任意に１２Ｓを１と示した）と比較した１６Ｓ及びＮＤ１の相対遺伝子発現。
【図６Ｃ】個々のミトコンドリア遺伝子のリアルタイムの定量的ＰＣＲ、及びＦＩＳＨデータとの比較。（Ｃ）ヌクレアーゼの存在及び不存在下でのプローブＮＤ１（及び３プローブ、図２Ｂからのデータ、比較として使用）の蛍光強度の定量化。各プローブに関して、ミトコンドリアゲノムの座標を以下に示す。ｎ＝３０、３回の独立した実験。無処理細胞と比較したｔ検定、（***）ｐ≦０．００１。右側には、ＮＤ１遺伝子の一部を認識するプローブＮＤ１で標識化された３Ｄ再構成ＨｅＬａ細胞；スケールバー＝１０μｍ。
【図７Ａ】１４種類のｍｔＤＮＡプローブのそれぞれで標識したミトコンドリアの割合の半定量分析。（Ａ）免疫蛍光法と組み合わせた３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ。示したｍｔＤＮＡプローブ（赤色）及び抗ＴＯＭ２２（緑色）で標識した再構成ＨｅＬａ細胞。各パネル中の数字は、使用したプローブを示す。
【図７Ｂ】１４種類のｍｔＤＮＡプローブのそれぞれで標識したミトコンドリアの割合の半定量分析。（Ｂ）総ミトコンドリア集団（各プローブに関して、３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰと抗ＴＯＭ２２の同時標識）中の３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ標識化されたミトコンドリアのパーセンテージ。ＴＯＭ２２標識ミトコンドリアの蛍光強度、各プローブについて、ｎ＝３０細胞；３回の独立した実験。
【図７Ｃ】１４種類のｍｔＤＮＡプローブのそれぞれで標識したミトコンドリアの割合の半定量分析。（Ｃ）各プローブについてＦＩＳＨ標識ミトコンドリアの蛍光強度（ｆｉ）にパーセンテージ（ｐ）を掛けることによって計算された（＝ｆｉ ｘ ｐ）。各値は、ＴＯＭ２２標識ミトコンドリア集団によって運ばれた転写産物の相対量を示す。
【図８Ａ】代替プローブを使用した１２Ｓ領域に対する３Ｄ−ＦＩＳＨ。（Ａ）プローブ１４−１を用いた２種類のＨｅＬａ細胞の３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ。スケールバー＝１０μｍ。
【図８Ｂ】代替プローブを使用した１２Ｓ領域に対する３Ｄ−ＦＩＳＨ。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞におけるプローブ１４−１（プローブ１及び１４に関するデータは図２ｂからのもの）を用いた蛍光強度の定量化、そしてこれは、標識が、１６Ｓ（プローブ１）含有領域に比べて１２Ｓ（プローブ１４及び１４−１）に関して劇的に低いことを示している。ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの。
【図９】個々のｍｔＤＮＡプローブで標識したミトコンドリアの核周囲分布。ヒストグラムは、ＨｅＬａ細胞及びＩＭＲ−９０初代線維芽細胞における、Ｘ軸上に示したプローブで標識したミトコンドリアの、（核境界から２μｍ以内の領域と規定される）核周囲への局在を示す（ｎ＝３０；３回の独立した実験からのもの）。平均±ＳＥＭ。
【図１０Ａ】いくつかのｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識。（Ａ）プローブ２（緑色）、３（赤色）及び４（青色）（上のパネル）、並びに（３つの異なる領域の５ｘ拡大図がある）組み合わせ（下のパネル）を用いて同時標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ再構成ＨｅＬａ細胞。使用されるプローブを上に示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１０Ｂ】いくつかのｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識。（Ｂ）様々なプローブの共局在のパーセンテージ。ｎ＝３０細胞、３回の独立した実験からのもの。同時標識は、プローブ２（１６ＳのＲＮＡ）で標識されるほとんどのミトコンドリア実体はまた、Ｈ鎖上の次の遺伝子であるプローブ３（ＮＤ１）でも標識されるが、しかし、Ｈ鎖上のもっと遠い遺伝子であるＮＤ２に対応するプローブ４では標識されないことを示す。同時標識のパーセンテージは、各プローブに特異的な全蛍光強度を考慮して評価される。したがって、（プローブ２対３はプローブ３対２と比較されるので）プローブ対の間で同時標識のパーセンテージが異なっていてもよい。
【図１０Ｃ】いくつかのｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識。（Ｃ）図２ａからのミトコンドリアゲノム上のプローブ位置のスキーム。
【図１０Ｄ】いくつかのｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識。（Ｄ）プローブ７（赤色）及び９（緑色）、上のパネル；プローブ１０（赤色）及び９（緑色）、真ん中のパネル；プローブ１２（青色）及び１４（緑色）（下のパネル）により同時標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ再構成ＨｅＬａ細胞。使用されるプローブを各パネルの上に示す。組み合わせは、右のパネルにある。スケールバー＝１０μｍ。
【図１０Ｅ】いくつかのｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識。（Ｅ）様々なプローブの共局在のパーセンテージ；それぞれのプライマー対について、ｎ＝３０細胞、３回の独立した実験からのもの。いくつかのミトコンドリア実体におけるプローブ７での標識の高い強度に留意のこと、そしてそれは、プローブ９との同時標識の低いパーセンテージを説明し得る。プローブ９でのより拡散している標識と比べて、プローブ１０での強く、且つ、異なった標識、並びに２つのタイプの標識の異なった空間分布にもまた留意のこと。これらの相違点は、プローブ９と１０の間の限定された共局在を説明し得る。
【図１０Ｆ】いくつかのｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識。（Ｆ）共局在結果の概要。Ｘ軸上には検討されたプローブを示す。Ｙ軸上には、列の部分に示したプローブでの同時標識の強さ報告されている。これらのＹ値は、検討されたプローブの蛍光強度シグナルを掛けた同時標識のパーセントを表す。
【図１１Ａ】ｍｔＤＮＡ複製の開始を標識するプローブの分析。（ａ）無処理か、又は示されたヌクレアーゼで処理し、プローブ１３−１（赤色）で標識した３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ再構成ＨｅＬａ細胞。各条件に関して、２つの異なった細胞を示す（それぞれ上のパネルと下のパネル）。スケールバー＝１０μｍ。
【図１１Ｂ】ｍｔＤＮＡ複製の開始を標識するプローブの分析。（ｂ）上に示した、プローブ１３、プローブ１３−１、又はプローブｍＲＥＰのいずれかで標識した３Ｄ再構成ＨｅＬａの蛍光強度の定量化。Ｘ軸は、細胞が無処理であるか、又はＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡのいずれかで処理したかを示す。各プローブ及び各条件について、ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの。無処理細胞と比較したｔ検定、（**）ｐ＜０．０１；（***）ｐ＜０．００１。直接比較のためにここに示されたｍＲＥＰの値は、図３Ｂにある。ＤＮａｓｅＩでの処理は、プローブ１３−１での標識の増大を引き起こし、そしてそれは、このプローブの一部が、ＤＮＡ関連構造の存在のため、通常、結合が阻害されていることを示している。しかしながら、これはさらに伸長されたプローブ１３を用いた場合ではない。そうした増大の理由は明らかではないので、かかわった配列は同定されていない。
【図１２Ａ】ｍＲＥＰは、ｍｔＤＮＡ複製の開始を標識する。（Ａ）ｍＲＥＰプローブでの標識は、酸化ストレス依存性のｍｔＤＮＡ含有量の増大が予測される。Ｈ2Ｏ2で処理されたＨｅＬａ細胞の３Ｄ−ＦＩＳＨと組み合わせた免疫蛍光法（ＩＦ）の動態；抗ＴＯＭ２２（緑色、上のパネル）、及びｍＲＥＰ（赤色、真ん中のパネル）又はｍＴＲＡＮＳ（赤色、下のパネル）プローブのいずれか。スケールバー＝１０μｍ。
【図１２Ｂ】ｍＲＥＰは、ｍｔＤＮＡ複製の開始を標識する。（ｂ）蛍光強度の定量化。ＴＯＭ２２；ｍＲＥＰとｍＴＲＡＮＳ。ｎ＝３０、３回の独立した実験からのもの。ｑＰＣＲ（１２Ｓ領域）によるｍｔＤＮＡ含有量の推定；ｑＰＣＲによる、核内遺伝子にコードされたＣｙｔＣ転写産物の発現。ｎ＝３。ｔ検定（*）ｐ＜０．０５；（**）ｐ＜０．０１；（***）ｐ＜０．００１。Ｃｔｒｌ、無処理。
【図１２Ｃ】ｍＲＥＰは、ｍｔＤＮＡ複製の開始を標識する。（Ｃ）ｍＲＥＰプローブは、ＢｒｄＵ陽性ミトコンドリアと共に様々な程度まで共局在する。ｍＲＥＰ（赤色）、抗ＢｒｄＵ（緑色）、及び組み合わせで標識された３Ｄ再構成像細胞；核はＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって標識される。スケールバー＝１０μｍ。下方には、核表面の近位及び遠位の２つの領域の２．５ｘ拡大図が、右のパネルに示されている。円印は、代表的なｍＲＥＰ陽性及びｍＲＥＰ陰性の領域が示されており、ここでＢｒｄＵ標識化もまた評価された。
【図１２Ｄ】ｍＲＥＰは、ｍｔＤＮＡ複製の開始を標識する。（Ｄ）ＢｒｄＵ標識の蛍光強度の測定では、ｍＲＥＰ陽性の領域に比べて、ｍＲＥＰ陰性の領域においてより高い値を示した。ｎ＝３００領域、３回の独立した実験。（***）ｐ≦０．００１。
【図１３Ａ】ｍＲＥＰ配列および整列。（ａ）受入番号ＮＣ＿０１２９２０．１（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ受入番号）で開示されているヒトｍｔＤＮＡ配列上の座標４４６〜５４４を有する、ヒトｍＲＥＰ配列（配列番号１）。
【図１３Ｂ】ｍＲＥＰ配列および整列。（ｂ）ｍＲＥＰ（配列番号１）−ヒト多型−変異。多型性、例えば、（単数若しくは複数の）ヌクレオチドの（単数若しくは複数の）変異が見られる位置は、黒色のバックグラウンドの中にある。当業者は、先に触れた指示からｍＲＥＰ配列中の可変位置を同定できる。
【図１３Ｃ１】ｍＲＥＰ配列および整列。（ｃ）ヒトｍＲＥＰの、異なった生物体の対応配列（配列番号２〜１６）との整列（前記図面で開示された受入番号は、ＮＣＢＩ受入番号である、http://www.ncbi.nlm.nih.gov)/）。
【図１３Ｃ２】ｍＲＥＰ配列と整列。（ｃ）ヒトｍＲＥＰの、異なった生物体の対応配列（配列番号２〜１６）との整列（前記図面で開示された受入番号は、ＮＣＢＩ受入番号である、http://www.ncbi.nlm.nih.gov)/）。
【図１３Ｃ３】ｍＲＥＰ配列と整列。（ｃ）ヒトｍＲＥＰの、異なった生物体の対応配列（配列番号２〜１６）との整列（前記図面で開示された受入番号は、ＮＣＢＩ受入番号である、http://www.ncbi.nlm.nih.gov)/）。
【図１３Ｃ４】ｍＲＥＰ配列と整列。（ｃ）ヒトｍＲＥＰの、異なった生物体の対応配列（配列番号２〜１６）との整列（前記図面で開示された受入番号は、ＮＣＢＩ受入番号である、http://www.ncbi.nlm.nih.gov)/）。
【図１４Ａ】（Ａ）健常な初代細胞におけるｍｔのＤＮＡ複製開始とｍｔ転写産物との密接な関係を開示するが、癌由来細胞系ではそうではないことを開示する実験：３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ再構成ＨｅＬａ細胞（上のパネル）及びヒト初代線維芽細胞であるＩＭＲ−９０（下のパネル）はまた、ミトコンドリアタンパク質であるＴＯＭ２２に対して免疫標識された。ミトコンドリア転写産物（プローブｍＴＲＡＮＳ、赤色）は、ミトコンドリアネットワーク（抗ＴＯＭ２２、緑色）中で独立実体として検出されるが、対して、ｍｔ複製開始ユニット（プローブｍＲＥＰ、青色）は、転写産物輸送ユニット（組み合わせ、紫色）と実質的に共局在している。右のパネルは、左のパネルの詳細を表す（５Ｘ拡大図）。白い矢印は、ｍＴＲＡＮＳとｍＲＥＰが共局在している紫色の点（転写及び複製開始シグナルの共局在）を示す。初代線維芽細胞のミトコンドリア転写産物が、複製開始ユニットと実質的に共局在しているため、前記ミトコンドリア転写産物が独立したユニットとしてほとんど検出されないことに留意のこと。スケールバー＝１０μｍ。
【図１４Ｂ】（Ｂ）ＨｅＬａ細胞及びＩＭＲ−９０初代線維芽細胞におけるｍＴＲＡＮＳ又はｍＲＥＰのいずれかと、抗ＴＯＭ２２の同時標識化の定量は、同時標識のパーセンテージで表した。
【図１４Ｃ】（Ｃ）ＨｅＬａ細胞（左のパネル）及びＩＭＲ−９０初代線維芽細胞（右のパネル）におけるｍＴＲＡＮＳとｍＲＥＰ（転写産物を運ぶ及び複製開始にかかわるミトコンドリア実体）の同時標識化の定量、白い列、そしてｍＴＲＡＮＳとｍＲＥＰ（また、転写産物を運びもする、複製開始にかかわるミトコンドリア実体）のそれは灰色の列。各条件について、ｎ＝３０細胞；３回の独立した実験。
【図１４Ｄ】（Ｄ）癌細胞におけるミトコンドリア転写産物の発現レベル。
【図１４Ｅ】（Ｅ）健常細胞におけるミトコンドリア転写産物の発現レベル。各条件について、ｎ＝３０細胞；３回の独立した実験。
【図１５Ａ】ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の分析。（Ａ）示したヌクレアーゼの存在又は不存在下における、プローブＰＬ−ＯＨ（左側）と７Ｓ（右側）の蛍光強度の定量化。ｎ＝３０、３回の独立した実験：無処理細胞に対するヌクレアーゼで処理された細胞についてのｔ検定；（***）ｐ≦０．００１。
【図１５Ｂ】ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の分析。（Ｂ）ｍＴＲＩＰによって分析されたｍｔＤＮＡのＤループ領域の略図（正確な縮尺ではない）、主要な要素及びｍｔＤＮＡにおける座標を示す；ＯＨ領域の垂直な灰色の棒は、３つのＣＳＢ部位を表す；１６Ｓ及び１２Ｓ遺伝子、並びに７Ｓ領域が示される。ＦＩＳＨプローブ（水平な黒色の棒）には名称が付され、そして、ｍｔＤＮＡ上のそれらの位置が示されている。以下には、図解の対応部分にある検出された核酸をまとめ、そしてそれは、図３ＤからのプローブｍＲＥＰ及びパネルＥからのプローブＰＨ１−２に関するデータを含んでいる（＋＋：唯一検出；＋：検出；−：検出なし；ｎｄ＝おこなわれなかった）。
【図１５Ｃ】ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の分析。（Ｃ）ＰＬ−ＯＨ、７Ｓ、及び組み合わせで標識化された細胞の３Ｄ再構成像。細胞は、先に示したヌクレアーゼによって処理されているか、又は無処理であった。組み合わせのパネルでは、矢印の先及び矢印は、様々なヌクレアーゼに対する感度に応じて、それぞれ、一般的（１）及び代替（２〜６）標識パターンを示す。
【図１５Ｄ】ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の分析。（Ｄ）パネルＣに示したパターン番号を用いて、ＰＬ−ＯＨ及び７Ｓの主な点おいて検出された核酸（ａ／ｏ＝及び／又は）。
【図１５Ｅ】ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の分析。（Ｅ）上のパネル：示したヌクレアーゼの存在及び不存在下でプローブＰＨ１−２を用いて標識化された細胞の３Ｄ再構成像。右側には、蛍光強度の定量化；ｎ＝３０、３回の独立した実験：無処理細胞に対するヌクレアーゼで処理された細胞についてのｔ検定；（***）ｐ≦０．００１。下のパネル：ＰＨ１−２、プローブ１、及び組み合わせを用いて同時標識化された細胞の３Ｄ再構成像。プローブ間の共局在のパーセンテージが、右側に示されている。
【図１５Ｆ】ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の分析。（Ｆ）ｍＲＥＰの値で標準化された（ヌクレアーゼの不存在下）、ヌクレアーゼの存在又は不存在下における異なったプローブを用いた蛍光標識の強度の図式的な要約。
【図１６Ａ】ｍＴＲＩＰは、乱された（perturbed）ｍｔＤＮＡ含有物を有する細胞における、ｍｔＤＮＡプロセシングの変化を検出する。（Ａ）上のパネル：プローブのｍＲＥＰとｍＴＲＡＮＳを用いた３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰによって、及びＴＯＭ２２（各パネルに示した色）を用いた免疫蛍光法によって分析された３Ｄ再構成ＨｅＬａ細胞。細胞は、無処理であった、又は臭化エチジウムで３日間処理して、前記細胞のｍｔＤＮＡ含有量を減少させた。無処理細胞と比較した、これらの細胞中におけるｍＲＥＰ及びｍＴＲＡＮＳ標識の分布と態様の顕著な変異に留意のこと。ＨｅＬａ ｒｈｏ0細胞もまた分析された。スケールバー＝１０μｍ。蛍光強度の定量化は、下のパネル中に示されている；ｎ＝３０、３回の独立した実験。１２Ｓ領域におけるｑＰＣＲによって分析された細胞のｍｔＤＮＡ含有量、及びＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された１６Ｓ及びＣｙｔＢ ＲＮＡの発現レベルが、示されている。無処理細胞に対する処理又は変異細胞についてのｔ検定、（***）ｐ≦０．００１。
【図１６Ｂ】ｍＴＲＩＰは、乱されたｍｔＤＮＡ含有物を有する細胞における、ｍｔＤＮＡプロセシングの変化を検出する。（Ｂ）プローブのｍＲＥＰとｍＴＲＡＮＳを用いたｍＴＲＩＰによって、及びＴＯＭ２２を用いた免疫蛍光法によって分析された、正常ヒト初代線維芽細胞（ＩＭＲ−９０）及び変異Ｒｒｍ２ｂを有する患者からの繊維芽細胞の３Ｄ再構成像。ＩＭＲ−９０と同様の結果が、他の２つのタイプのヒト初代線維芽細胞（未掲載）によって得られた。スケールバー＝１０μｍ。蛍光強度の定量化は、右側に示されている；ｎ＝３０、３回の独立した実験。ｑＰＣＲによるｍｔＤＮＡ含有量（１２Ｓ領域）の定量化は、以下に示されている。
【図１７Ａ】ミトコンドリア疾患を患っている患者のアッセイ。（Ａ）ミトコンドリア疾患（ｍｔＤＮＡ減少症候群）を患っている患者からの初代線維芽細胞に対するｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰ標識化。核（青色）は、Ｈｏｅｃｈｓｔ（プローブｍＲＥＰだけを用いた）で標識化される。
【図１７Ｂ】ミトコンドリア疾患を患っている患者のアッセイ。（Ｂ）数人の正常人（対照）及びミトコンドリア疾患（ｍｔＤＮＡ減少）を患っている患者からの繊維芽細胞におけるｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰ標識の蛍光強度の定量化。赤い線は、対照の平均に対応する値を示す。これらの患者すべてが重度のｍｔＤＮＡ減少を示しているにもかかわらず、ｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰの様々なレベルが検出され、そしてそれは、何人かの患者のミトコンドリアには、通常のｍｔＤＮＡの転写、及び複製開始活性があることを示しているが、それに対し、他の患者では、これらの活性の一方若しくは両方が低減又は増強されていることに留意のこと。したがって、低レベルのｍｔＤＮＡは、疾患におけるｍｔＤＮＡプロセシング活性の低下を必ずしも意味するわけではない。すなわち、疾患の程度及び／又は進行と関連し得るという概念を必ずしも意味するわけではない。
【図１８Ａ】早老症関連症候群と診断され、且つ、ミトコンドリア疾患とは診断されなかった患者に対するアッセイ。（Ａ）早老症関連症候群に罹患しているが、しかし、ミトコンドリア疾患又はミトコンドリア関連疾患と診断されていない患者からの初代線維芽細胞に対するｍＲＥＰ標識化（赤色）。健常人（対照）、及び早老症に関係しないＵＶ感受性の症候群からの繊維芽細胞もまた示す。核（青色）は、Ｈｏｅｃｈｓｔで標識化される。スケールバー＝１０μｍ。
【図１８Ｂ】早老症関連症候群と診断され、且つ、ミトコンドリア疾患とは診断されなかった患者に対するアッセイ。（Ｂ）ｍＲＥＰ標識の蛍光強度の定量化。赤い線は、対照の平均に対応する値を示す。対照と比較されたｔ検定、（*）ｐ≦０．０１；（***）ｐ≦０．００１。ｍＲＥＰ標識化が、それぞれ、中程度又は重度の早老症において減少又は増強することに留意のこと。これにより、ミトコンドリア障害が同定されていない疾患は、ｍＲＥＰ標識化によって患っているミトコンドリア機能が明らかになる。
【図１９】ＡＺＴでの長期治療中のヒト細胞におけるアッセイ。ＨｅＬａ細胞は、ＡＺＴで１〜１５日間処理された。いくつかのパラメーターが、示された時点において分析された：（Ａ）ＴＯＭ２２免疫標識によるミトコンドリアの質量；（Ｂ）ｑＰＣＲによるｍｔＤＮＡ含有量；（Ｃ）ｍＲＥＰ、及び（Ｄ）ｍＴＲＡＮＳ。無処理対照群と比較されたｔ検定。星印はｐ＜０．０１〜０．００１を表す。ＡＺＴでの処理後、ミトコンドリア質量及びｍｔＤＮＡ含有量の無変化若しくはわずかな変化にもかかわらず、ｍＲＥＰ及びｍＴＲＡＮＳ値は、処理の初日から劇的に減少したことに留意のこと。これにより、たとえ古典的なミトコンドリアのパラメーターが対照と比較して同じか又はわずかにしか影響を受けていない値だとしても、ｍＲＥＰ／ｍＴＲＡＮＳ標識化は、障害を受けたミトコンドリア機能を示す。
【図２０】リファンピシンで処理された細胞におけるアッセイ。ＨｅＬａ細胞は、示された濃度のリファンピシンによって２４時間処理された。リファンピシンは、ＤＭＳＯ中に溶解された。桃色の列は、リファンピシンの存在下でおこなった実験を示し、そして緑色の列は、同量のＤＭＳＯ含有バッファーの存在下での実験を示す。白い列は、無処置の対照群を示す。（Ａ）ｍＴＲＡＮＳ及び（Ｂ）ｍＲＥＰの標識化。異なった濃度のリファンピシンにおけるｍＴＲＡＮＳとｍＲＥＰのレベル変化は、バッファーだけの存在下の変化と関連しているとは限らなかったことに留意のこと。この実験では、潜在的細胞毒性を有する処理（細胞死の増加がリファンピシンの濃度増大に伴って観察された、未掲載）が、ｍｔＤＮＡプロセシングに影響することが示された。ｍＴＲＡＮＳ及び／又はｍＲＥＰ値の変化が、低用量のリファンピシンにおいて検出される。
【図２１】癌と診断された患者におけるアッセイ。（Ａ）単離された癌細胞及び通常の血球細胞の標識化。左のパネル：細胞骨格の標識化（Ｆ−アクチン、赤色、ローダミン−ファロイジンによる）及びミトコンドリアの質量（ＴＯＭ２２免疫染色）。右のパネル：ｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰ標識化。（Ｂ）ｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰの蛍光強度の定量化。正常細胞に対して癌細胞においてｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰ標識化のレベルがより高いことに留意のこと。しかしながら、正常細胞（血液由来）は、ここで検討した癌細胞と比較して、サイズが小さく、且つ、基本的に低い細胞質質量しか有していない。異なった細胞型が比較されるとき、したがって、ｍＴＲＡＮＳ／ｍＲＥＰの値は、細胞サイズ及びミトコンドリアの質量もまた考慮に入れながら分析されなければならない。
【図２２】本発明の３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ法の効率はプローブの大きさによって影響を受けない：上のパネル：プローブ（ミトコンドリアの座標を付した）及び検討した領域に存在している遺伝子の位置の略図；ｔＲＮＡは示されていない。ＭＩＴＯＭＡＰ（http://www.mitomap.org/MITIMAP）によるミトコンドリアの座標。下のパネル：示したプローブ（赤色）を用いたＨｅＬａ細胞のｍＴＲＩＰ／ＦＩＳＨ標識化。核（青色）は、Ｈｏｅｃｈｓｔで標識化される。スケールバー＝１０μｍ。右側には、３Ｄ再構成細胞の蛍光強度の定量化。ｎ＝３０；３回の独立した実験。ｔ検定、サンプル間の有意な相違は示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特定の実施形態によれば、ＲＮＡフリーの状態を維持する能力を有する標的領域、又は当該標的領域の核酸配列は、代謝的に活性な細胞中のｇＤＮＡの２本の相補的な一本鎖の天然に起こる一時的な開放構造（open structure）内に位置している。
【００１６】
本発明による方法及び使用は、生物物質のサンプルに対してインビトロにおいておこなわれる。
【００１７】
特定の実施形態によれば、「代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含むＤＮＡゲノムの標的領域は、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する(the target region in the DNA genome that comprises a nucleic acid sequence which has no identified corresponding annealing RNA in a metabolically active cell remains RNA-free during transcription and replication of said DNA genome)」という表現は、前記核酸配列が、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間、実質的にＲＮＡフリーの状態を維持する場合を包含し、そして前記核酸配列にアニーリングしたと分かるＲＮＡ転写産物の量が、本発明によるハイブリダイゼーション検出の実験条件の検出レベルより低く維持されていることを意味するものであり、特に、ＲＮＡ転写産物の量は、本明細書中でおこなわれた実験に影響を及ぼすことがない、すなわち、それらのシグナルはバックグラウンドレベル又はノイズを超えていない。
【００１８】
特に、そのような転写産物の量は、本発明にしたがってＤＮＡｓｅ、特にＤＮＡｓｅＩでの処理後にそれらの検出を可能にするには不十分であろうことを示す。これらの量は、転写産物の全体量に対してわずかな量でしかない。
【００１９】
本発明との関係において、ＤＮＡゲノム中の「標的領域（target region）」は、アッセイ下、代謝的に活性な細胞中において同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない、したがって、核酸配列が属するＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する核酸配列を含むゲノムＤＮＡ領域である。
【００２０】
言い換えれば、標的領域は、試験される細胞中において標的領域が属するＤＮＡゲノム（ｍｔＤＮＡ又はｎＤＮＡ）の転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態、特に（１若しくは２以上の）ＲＮＡ転写産物フリーの状態を維持する能力を有する配列ドメインを含むゲノムＤＮＡ領域である。
【００２１】
具体的な実施形態によると、前記第一のプローブの標的領域は、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さないゲノムＤＮＡの核酸領域からなる。
【００２２】
特定の実施形態において、前記第一のプローブの標的領域は、前記ＲＮＡフリーのドメインを包含するが、前記標的領域は、以降に例示されるとおり前記ドメインより実質的に長いことを含め、前記ドメインより長い。
【００２３】
特定の実施形態によると、そのような天然に起こる一時的な開放構造は、複製起点の遺伝子座の周りに発生する複製バブルである。特定の実施形態によると、そのような天然に起こる一時的な開放構造は、いわゆるミトコンドリアゲノムのＤループ領域によって包含されたＤＮＡであり、そしてそれは、ヒトミトコンドリアゲノム内の座標１６０２４〜５７６番目の間に位置している（ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ配列参照番号ＮＣ＿０１２９２０．１）。特定の実施形態によると、ＲＮＡフリーの状態を維持する能力を有する標的領域の配列は、既知の（１若しくは２以上の）複製起点、特にミトコンドリアの複製起点の近位に配置されているか、それを含んでいるか、又はそれと重複しているか、或いは、前記標的領域の配列末端の一方は、既知の複製起点、特にミトコンドリアの複製起点から１０ヌクレオチド未満、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９ヌクレオチド、特に６ヌクレオチドの距離以内に存在している。特にヒトｍｔＤＮＡでは、かかる複製起点は、ミトコンドリアゲノムの座標１１０〜４４１の間に位置するＯＨ複製起点である可能性もある（ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ配列参照番号ＮＣ＿０１２９２０．１）。
【００２４】
特定の実施形態によると、前記標的部位又は前記標的領域の核酸配列は、代謝的に活性な細胞中のｇＤＮＡの２本の相補的な一本鎖の天然に起こる一時的な開放構造の上流又は下流の１０ヌクレオチド未満、特に１、２、３、４、５、６、７、８又は９ヌクレオチドの距離以内のヌクレオチドを包含する。
【００２５】
本発明との関係において、「ハイブリダイゼーション」は、ヌクレオチドプローブの検出で明らかになるはずの、ヌクレオチドプローブと標的領域との緊密な相互作用を得るという事実に関する。そうした相互作用は、ヌクレオチドプローブと標的配列の間の水素結合の形成によって達成されることができ、そしてそれは、塩基対合できる相補的なヌクレオチド分子の間の相互作用の典型である。水素結合は、例えば、ＤＮＡの２本の相補鎖のアニーリングで見られる。
【００２６】
本発明との関係の中で、ハイブリダイゼーション条件は、従来のバッファー、例えば、実施例中に例示されるものなど、例えば、２ｘＳＳＣ ｐＨ７．０中に５０％のホルムアミド、１０％の硫酸デキストラン塩を含むハイブリダイゼーションバッファー又は必要に応じて別の同様のバッファー中、３７℃で、約１５時間の間、ヌクレオチドプローブを標的領域と接触させることを包含する。ハイブリダイゼーション条件はさらに、例えば、実施例で例示されるように、検出ステップの前の適当な従来のバッファーで（１若しくは２以上の）ヌクレオチドプローブと接触させた細胞を洗浄するステップにかかわることもある。
【００２７】
例えば、洗浄は、室温で２ＸＳＳＣバッファー中、２〜５分間を数回おこない、次いで、室温にて１ＸＳＳＣバッファー中で数回おこない、その後、室温で０．１ＸＳＳＣバッファー中で数回おこなわれ得る。最後に、最終洗浄が、室温でＰＢＳの１Ｘバッファー中で数回行われ得る。
【００２８】
プローブの核酸配列は、ゲノムＤＮＡの標的領域の配列と少なくとも一部相補的でなければならない。すなわち、安定した塩基対合を可能にするのに十分な領域に亘って相補的でなければならない。
【００２９】
通常、ゲノムＤＮＡの標的領域とハイブリダイズするように設計された第一のヌクレオチドプローブは、ゲノムＤＮＡの標的領域と相補的な標識化された核酸配列断片であり、そして、実質的に又は特に厳密に、前記標的と同じ長さを有する。
【００３０】
特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡの標的領域とハイブリダイズするように設計された第一のヌクレオチドプローブは、標的ＤＮＡ断片と相補的な標識化された核酸配列断片であり、そして、代謝的に活性な細胞中において同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない、したがって、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する核酸配列と実質的に又は特に厳密に同じ長さを有する。
【００３１】
特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡの標的領域とハイブリダイズするように設計された第一のヌクレオチドプローブは、標的ＤＮＡ断片と相補的である核酸配列を含む標識化された核酸配列断片であって、そして代謝的に活性な細胞中において同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない、したがって、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する前記核酸配列と実質的に又は特に厳密に同じ長さを有する。
【００３２】
しかしながら、他の実施形態によると、ヌクレオチドプローブと標的領域の相互作用はまた、ファンデルワールス相互作用、イオン結合又は共有結合にかかわることもある。そうした（１若しくは２以上の）相互作用は、ヌクレオチドプローブがヌクレオチド分子内に一般に存在しない、改変ヌクレオチドを含むか、又は特有の残基を担持することを含意する可能性がある。
【００３３】
「インサイチュハイブリダイゼーション（In situ hybridization）」は、ハイブリダイゼーションがアッセイしている生物物質上でおこなわれるという事実を指す。前記生物物質は、（１若しくは２以上の）単独細胞又は組織、或いはそれらを含むサンプルであり得る。好ましくは、生物物質の構造物及び／又は含有物の完全性は維持される。したがって、本発明を達成するためには、生物物質は好ましくは固定されている。
【００３４】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法は、固定化された（１若しくは２以上の）細胞又は組織上でおこなわれる。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、（１若しくは２以上の）細胞の体積の完全性（integrity）を維持することにより、三次元での（１若しくは２以上の）固定サンプルの分析をさらに可能にしている。
【００３６】
特定の実施形態によると、（１若しくは２以上の）細胞又は組織は、（１若しくは２以上の）真核細胞又は組織、特に（１若しくは２以上の）ヒト細胞又は組織である。例示のために、ヒト細胞株から得られた細胞又は組織、例えば、ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＡＧＳ細胞株など、及び／又はヒト初期細胞、すなわち、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣから入手したＢＪヒト線維芽細胞）が使用される。
【００３７】
特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、ミトコンドリアｇＤＮＡである。
【００３８】
別の特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、核のｇＤＮＡである。
【００３９】
別の特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、核のｇＤＮＡとミトコンドリアｇＤＮＡの両方である。そうした実施形態において、「ゲノムＤＮＡ（genomic DNA）」という表現は、ゲノムＤＮＡ分子群を指す、すなわち、２以上のゲノムＤＮＡ分子を指し、前記ゲノムＤＮＡ分子群は、（単独のミトコンドリアで見られる）２コピー以上のゲノムＤＮＡ分子、及び／又は互いに異なった２以上のゲノムＤＮＡ分子（例えば、ミトコンドリアｇＤＮＡや核のｇＤＮＡなど）からなる。
【００４０】
本発明によると、「プローブ」は、着目の標的領域を明らかにすることを目的としているので、プローブは、通常、標識化されるが、そうとも限らない。又は、ＤＮＡゲノム中で標的部位を明らかにすることを目的としたプローブの標識化は、好ましくは、放射性タグ、抗体で発見可能なタグ、又は蛍光タグ若しくはビオチン化タグ、或いは量子ドット、特に蛍光量子ドットを用いて達成される。前記タグ又は量子ドットは、プローブに直接的又は間接的に（結合を含め）結び付けられる。
【００４１】
標識化のタイプに応じて、プローブは、例えば、オートラジオグラフィー又は蛍光顕微鏡などの適当な技術を使用して、その標的とのハイブリダイゼーション後に生物物質上で局在化、可視化、又は測定できる。発見可能なタグの例は、例えば、ジゴキシゲニンに対して生じた蛍光抗体又は、例えば、アビジン若しくはストレプトアビジンなどの標識化されたビオチン結合性分子などの標識化抗体又は標識化試薬によって明らかにされるジゴキシゲニン、ビオチン、又はハプテンである。
【００４２】
具体的な実施形態によると、プローブは、前記プローブ内に抗原を導入することによって、又は前記プローブを二次抗抗原抗体、特に蛍光抗抗原抗体によってさらに明らかになる抗原と組み合わせることによって、特に蛍光検出法で発見可能にされる。抗体を使用する１つの利点は、得られた蛍光シグナルの強さの増強であるだろう。
【００４３】
特定の実施形態において、（１若しくは２以上の）プローブが、蛍光残基（タグ）で直接標識化される。そうした実施形態の１つの利点は、例えば、標識化／検出方法の特異性又は実行可能性を高めるために、プローブの検出のための抗体の使用を回避することだろう。
【００４４】
（１若しくは２以上の）プローブは、好ましくはヌクレオチドプローブであり、且つ、特にそれらの相補ＤＮＡと塩基対合できる一本鎖ＤＮＡの短配列である。本発明は、（１若しくは２以上の）他の分子又は部分に結合又は連結された（１若しくは２以上の）ヌクレオチドを含んでいるプローブを包含する。特定の実施形態によると、（１若しくは２以上の）プローブは、（１若しくは２以上の）プラスミドプローブ又はそうした要素を含んでいる（１若しくは２以上の）プローブを含めた、（１若しくは２以上の）ＤＮＡプローブ、例えば、（１若しくは２以上の）ＰＣＲ産物又は（１若しくは２以上の）ＤＮＡ断片などである。
【００４５】
特定の実施形態によると、それらは、その利用前に一本鎖に変性される必要がある二本鎖ＤＮＡプローブであり得る。
【００４６】
特定の実施形態によると、ヌクレオチドプローブは、１若しくは２以上の修飾されたヌクレオチド、又はヌクレオチド分子内に一般に存在しない特異的な部分をそのヌクレオチド内に担持しているヌクレオチドを含む。ロックド核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）は、相補ＤＮＡやＲＮＡに対して非常に高い親和性を有する修飾されたヌクレオチドやＲＮＡ類似体のクラスである。それらは、ＤＮＡプローブ内で天然のヌクレオチドを置換できる。
【００４７】
本発明の特定の実施形態において、「プローブ」という用語は、標的領域を明らかにするために一緒に使用される２つ以上の分子実体を包含する。
【００４８】
そうした特定の実施形態において、標的部位は、検討されたゲノムＤＮＡに沿って断片化される。例えば、ＤＮＡゲノムの標的部位を、単独のゲノムＤＮＡ分子上の又は２つ以上のゲノム分子上の２つ以上の位置に分散させることができる。
【００４９】
特定の実施形態によると、本発明の方法は、第一のヌクレオチドプローブが少なくとも２つのプローブのサブセットからなる点を特徴とし、ここで少なくとも１つのサブセットが、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持するＤＮＡゲノム中の標的領域とハイブリダイズする。
【００５０】
具体的な実施形態において、前記プローブのサブセットの１つは、配列番号１７を含んでいるか、それからなるか、その断片であるか、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する核酸分子を含む。
【００５１】
別の実施形態によると、本発明の第一のプローブは、ＲＮＡフリードメインに相補的な配列より長く、且つ、代謝的に活性な細胞中において転写されるｍｔＤＮＡとハイブリダイズする配列を特に含む。
【００５２】
「発生（occurrence）」とは、本発明の方法が、ゲノムＤＮＡの複製の開始を質的に検出すること、そして、特定の実施形態によれば、複製プロセスの（１若しくは２以上の）そうした開始事象を量的に検出することを可能にすることを意味する。
【００５３】
「複製事象の開始（initiation of replication events）」は、例えば、分析されたゲノムＤＮＡ上の（１若しくは２以上の）複製バブルの形成であり得、或いは、ミトコンドリアｇＤＮＡが複製開始に関してアッセイされる特定の実施形態において、三本鎖Ｄループ構造の形成を含めたＤループ構造の形成であり得る。そうした事象は、分析されたｇＤＮＡの全体の複製に先行することもあり、そしてそうした事象が分析されたｇＤＮＡ全体に及ぶ複製に先行することもあることを意味する。或いは、そうした事象には、新生ＤＮＡ鎖の断続的合成が続くこともある。
【００５４】
細胞中では、通常、ＤＮＡ複製は、「起点（origin(s)）」又は「複製起点(replication origin(s))」と呼ばれる、ゲノム内の特定位置において始まる。ポリメラーゼが二本鎖ゲノムＤＮＡ分子を開くとすぐに、「複製バブル（replication origin(s)）」と呼ばれる領域を形成する（通常、特定のヌクレオチドセットである複製起点で開始される）。
【００５５】
ミトコンドリアのゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生を検出することを目的とする特定の実施形態に関して、哺乳類、鳥類、魚類、又は植物細胞では、ミトコンドリアゲノム複製の開始が「制御領域（control region）」、「Ｄループ（D-Loop）」又は「置換ループ（displacement loop）」と呼ばれる特定の領域で一般に起こることを考慮するのが賢明である。ｍｔＤＮＡ複製開始が始まるとき、Ｄループ領域が開かれ、そして、対応するＤＮＡは新しいｍｔＤＮＡの合成のための鋳型として機能する一本鎖を局所的にもたらす。この一時的に開かれたＤループ領域は三重鎖ＤＮＡ構造を示し得るが、しかしながら、前記構造は、ｇＤＮＡの２本の相補的な一本鎖の天然に起こる一時的な開放構造の中に位置している。Ｄループ領域の存在は、ヒト及びその他のｍｔＤＮＡ、例えば、哺乳類、鳥類、魚類又は植物のｍｔＤＮＡに典型的なものである。前記Ｄループ領域の座標は、検討された生物体に応じて異なるが、文献31の中に見出すことができる。しかしながら、Ｄループ領域は、すべてのｍｔＤＮＡの中に見られるわけではない。
【００５６】
特にヒト細胞では、Ｄループ領域は、ミトコンドリアゲノム上のＬ鎖の座標１６０２４〜５７６番目の間におおむね位置している（特に受入番号ＮＣ＿０１２９２０．１（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ配列参照番号）についての、データベースにある日付までに公開されたデータによる、特に、ＭＩＴＯＭＡＰ：http://www.mitomap.org/MITOMAP/HumanMitoSeqを参照のこと）。
【００５７】
特定の実施形態において、標的部位、又は前記標的部位に含まれているＲＮＡフリーの核酸配列は、先に記載のように及び以下の実施形態で開示されるように、代謝的に活性な細胞中のｇＤＮＡの２本の相補的な一本鎖の天然に起こる一時的な開放構造内に位置している。
【００５８】
特定の実施形態によると、標的部位、又は前記標的部位に含まれているＲＮＡフリーの核酸配列は、ミトコンドリアゲノム上の主要なＨ鎖プロモーターの上流（ＰＨ１）に位置しており、その座標は表２に示されている（座標と方向は、本明細書中にｍｔＤＮＡのＬ鎖に関して示されている）。しかしながら、本発明との関係において、標的部位、又は前記標的部位に含まれているＲＮＡフリーの核酸配列は、本明細書中に言及された特定位置のＬ鎖又はＨ鎖のいずれかに見られる配列を包含する。主要なＨ鎖プロモーターの位置を示すためだけにＬ鎖について言及する。
【００５９】
特定の実施形態によると、特に（１若しくは２以上の）プローブがＰＣＲ増幅の結果として合成されるか又は得られるとき、（１若しくは２以上の）プローブは、（１若しくは２以上の）二本鎖ＤＮＡプローブである。それらは、利用の前に一本鎖に変性させる。変性後と同時に使用されると、（１若しくは２以上の）相補的な１本鎖プローブのそうした混合物は、ｍｔＤＮＡの標的領域のＬ鎖とＨ鎖の両方をアニーリングする結果となる。
【００６０】
特定の実施形態において、標的部位、又は前記標的部位に含まれているＲＮＡフリーの核酸配列は、ミトコンドリアゲノム上のＬ鎖プロモーターの下流（ＬＰ又はＬＳＰ）に位置しており、そしてその座標は表２に示されている（座標と方向は、本明細書中にｍｔＤＮＡのＬ鎖に関して示されている）。しかしながら、本発明との関係において、標的部位、又は前記標的部位に含まれているＲＮＡフリーの核酸配列は、本明細書中に言及された特定位置のＬ鎖又はＨ鎖のいずれかに見られる配列を包含する。Ｌ鎖プロモーターの位置を示すためだけにＬ鎖について言及する。
【００６１】
「ｇＤＮＡの２本の相補的な一本鎖の天然に起こる一時的な開放構造（naturally transiently open structure of two complementary single strands of gDNA）」とは、複製機構及び代謝的に活性な細胞のライフサイクル中の、その細胞に固有の（１若しくは２以上の）機構によるプロセシングの結果として、ｇＤＮＡを構成する２本のＤＮＡ鎖の解離によって形成されるｇＤＮＡ構造を意味する。
【００６２】
より詳しく述べると、標的領域は、前記ゲノムＤＮＡの複製事象初期にかかわるゲノムＤＮＡの領域、例えば、複製バブルで見られた領域又は複製バブルに少なくとも部分的に含まれる領域などの近く又は領域内に位置していると理解される。そうした領域は一般に、真核細胞のゲノムＤＮＡの複製起点の周囲、特にすぐ周囲又は近く、すなわち、真核細胞のゲノムＤＮＡの複製起点から１０ヌクレオチド以内に局在化する。
【００６３】
特定の実施形態によると、標的領域は、複製バブルの周囲、又は複製バブルに含まれる遺伝子座（複製バブルが見られる遺伝子座）、特にそうしたバブル又はそうしたバブルに含まれる遺伝子座から１０ヌクレオチド以内に位置している。複製バブルは、複製起点の遺伝子座で開始する。
【００６４】
具体的な実施形態によると、標的領域は、ヒトｍｔＤＮＡ内のＯH複製起点の５ヌクレオチドに位置している。
【００６５】
「代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡ」を有さない核酸配列（A nucleic acid sequence having "no identified corresponding annealing RNA in a metabolically active cell"）は、厳密に対応する、すなわち、相補的又は合致するＲＮＡを有さない、特に、本明細書中に開示された検出条件のアッセイ下で、生きている真核細胞中において天然に起こる転写プロセスから生じる（１若しくは２以上の）ＲＮＡ転写産物を有さない配列である。「対応する」とは、整列させた核酸配列の実質的な、特に、厳格な相補性であると理解され、そして、その類似性は、整列させた配列の全長にわたって、例えば、ＮｅｅｄｅｌｍａｎやＷｕｎｓｃｈアルゴリズムなどの整列アルゴリズムによって計算される（実質的な類似性又は完全な合致が予想される）。したがってそうした核酸配列は、分析細胞中で、ＲＮＡフリー、特にＲＮＡ転写産物フリーの状態を維持する能力があり、そしてそれは、そうした核酸配列が、同定されたＲＮＡ分子、特に、分析細胞中のゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子を生じることなく、また前記核酸配列を含んでいる代謝的に活性な細胞中において、複製プロセスにかかわるＲＮＡプライマーとハイブリダイズもしないことを意味している。そうした核酸配列は、細胞中において起こる転写事象の結果を検出することを目的とするプローブで検出できない。
【００６６】
しかしながら、ＲＮＡフリーの核酸配列が、厳密に対応する、すなわち、相補的又は合致するＲＮＡ、特に、アッセイ下で生きている真核細胞中において天然に起こる転写プロセスから生じるＲＮＡ転写産物を有さない配列であるという事実は、第一のプローブの標的配列が（１若しくは２以上の）ＲＮＡ転写産物又はその一部と相補的である特定の部分を有することを妨げない。特定の実施形態によると、「代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない」核酸配列は、したがって、その配列の特定部位、特にその配列のほんの一部、例えば、標的の７０％未満、５０％未満、２０％未満又は約１０％未満に相当する部分の範囲内でしか同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない配列である。
【００６７】
特定の実施形態によると、「代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない」核酸配列は、厳密に対応する、すなわち、相補的又は合致するＲＮＡを実質的に有さない配列であり、特に、本明細書中に開示された転写産物の検出条件のアッセイ下で生きている真核細胞中において天然に起こる転写プロセスから生じる（１若しくは２以上の）ＲＮＡ転写産物を有さない配列である。そうした核酸配列は、前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間、実質的にＲＮＡフリーの状態を維持し、そしてそれは、前記核酸配列にアニーリングしたと分かるＲＮＡ転写産物の量が、標準的なハイブリダイゼーション検出の実験条件の検出レベルより低く維持されていることを意味するものであり、特に、ＲＮＡ転写産物の量は、本明細書中でおこなわれた実験に影響を及ぼすことがない、すなわち、それらのシグナルはバックグラウンドレベル又はノイズを超えていないことを意味する。
【００６８】
特に、そうした転写産物の量は、本発明にしたがってＤＮＡｓｅ、特にＤＮＡｓｅＩでの処理後にそれらの検出を可能にするには十分であろうことを示す。これらの量は、転写産物の全体量に対してわずかな量でしかない。
【００６９】
そうした配列が、ｇＤＮＡの転写及び複製プロセスを記載する文献を発端として又はデータベース内で、前記データベースで入手可能な（１若しくは２以上の）注釈を考慮して、若しくは前記注釈から生じる推論の結果として同定されうることを指摘する。
【００７０】
特定の実施形態によると、「代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない」核酸配列又は「代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを実質的に有さない」核酸配列は、ゲノムの複製起点の近くに位置するか、又はそこに包含されている配列である。すなわち、（１若しくは２以上の）既知の複製起点の近位に位置するか、含んでいるか、又は重複する前記配列の特定の局在は、先に記載するとおりのものである。
【００７１】
その結果、特定の実施形態において、その配列が先に述べたように核酸配列の配列に厳密に合致する第一のヌクレオチドプローブは、代謝的に活性な細胞中において天然に発現されるどんなＲＮＡ分子にもハイブリダイズしないであろう。
【００７２】
したがって、そうした核酸配列は、細胞中におけるＤＮＡプロセシングの転写レベルに反映されるいずれのコード情報も担持していないことを特徴とする。
【００７３】
特定の実施形態によると、その配列が先に議論したＲＮＡフリーの核酸配列の配列に実質的に合致するか、又はその全長のかなりの部分にわたって前記配列に少なくとも合致する第一のヌクレオチドプローブは、代謝的に活性な細胞中において天然に発現されるいかなるＲＮＡ分子にも実質的にハイブリダイズしないだろうし、又はそうしたＲＮＡ分子には全長でハイブリダイズしないだろう。
【００７４】
特定の実施形態によると、本明細書中で言及される標的領域は、ヒトｍｔＤＮＡ内のＯH複製起点の近位に位置しており、そして特にｍｔゲノムのＨ鎖上の４４６番目のヌクレオチド〜１６２０２４番目のヌクレオチドに局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのＤＮＡセグメントを含むか、包含するか、又はそれらからなり、そしてそれは、ヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの配列である配列番号１９に対応し、前記セグメントは約８０〜約１２００ヌクレオチドの長さに及ぶ。特定の実施形態によると、本明細書中に言及した標的領域は、４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドの間に局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのＤＮＡセグメントを含むか、包含するか、又はそれらからなる。特定の実施形態によると、本明細書中に言及した標的領域は、ヒトｍｔＤＮＡ内のＯH複製起点の近位に位置し、特にｍｔゲノムのＨ鎖上の５４４番目のヌクレオチド〜１６２０２４番目のヌクレオチドの間で局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのＤＮＡセグメントを含むか、包含するか、又はそれらからなり、そしてそれは、ヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの配列である、配列番号１９と連結される配列番号１に対応し、前記セグメントは約８０〜約１２００ヌクレオチドの長さに及ぶ。定義では、ヌクレオチドの位置は、Ｈ鎖に関して示されている。
【００７５】
配列番号１９は、以下のヌクレオチド配列と規定される：
ｔｔｃｔｔｔｃ  ａｔｇｇｇｇａａｇｃ  ａｇａｔｔｔｇｇｇｔ  ａｃｃａｃｃｃａａｇ  ｔａｔｔｇａｃｔｃａ  ｃｃｃａｔｃａａｃａ  ａｃｃｇｃｔａｔｇｔ  ａｔｔｔｃｇｔａｃａ  ｔｔａｃｔｇｃｃａｇ  ｃｃａｃｃａｔｇａａ  ｔａｔｔｇｔａｃｇｇ  ｔａｃｃａｔａａａｔ  ａｃｔｔｇａｃｃａｃ  ｃｔｇｔａｇｔａｃａ  ｔａａａａａｃｃｃａ  ａｔｃｃａｃａｔｃａ  ａａａｃｃｃｃｃｔｃ  ｃｃｃａｔｇｃｔｔａ  ｃａａｇｃａａｇｔａ  ｃａｇｃａａｔｃａａ  ｃｃｃｔｃａａｃｔａ  ｔｃａｃａｃａｔｃａ  ａｃｔｇｃａａｃｔｃ  ｃａａａｇｃｃａｃｃ  ｃｃｔｃａｃｃｃａｃ  ｔａｇｇａｔａｃｃａ  ａｃａａａｃｃｔａｃ  ｃｃａｃｃｃｔｔａａ  ｃａｇｔａｃａｔａｇ  ｔａｃａｔａａａｇｃ  ｃａｔｔｔａｃｃｇｔ  ａｃａｔａｇｃａｃａ  ｔｔａｃａｇｔｃａａ  ａｔｃｃｃｔｔｃｔｃ  ｇｔｃｃｃｃａｔｇｇ  ａｔｇａｃｃｃｃｃｃ  ｔｃａｇａｔａｇｇｇ  ｇｔｃｃｃｔｔｇａｃ  ｃａｃｃａｔｃｃｔｃ  ｃｇｔｇａａａｔｃａ  ａｔａｔｃｃｃｇｃａ  ｃａａｇａｇｔｇｃｔ  ａｃｔｃｔｃｃｔｃｇ  ｃｔｃｃｇｇｇｃｃｃ  ａｔａａｃａｃｔｔｇ  ｇｇｇｇｔａｇｃｔａ  ａａｇｔｇａａｃｔｇ  ｔａｔｃｃｇａｃａｔ  ｃｔｇｇｔｔｃｃｔａ  ｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ  ａｔａａａｇｃｃｔａ  ａａｔａｇｃｃｃａｃ  ａｃｇｔｔｃｃｃｃｔ  ｔａａａｔａａｇａｃ  ａｔｃａｃｇａｔｇ  ｇａｔｃａｃａｇｇｔ  ｃｔａｔｃａｃｃｃｔ  ａｔｔａａｃｃａｃｔ  ｃａｃｇｇｇａｇｃｔ  ｃｔｃｃａｔｇｃａｔ  ｔｔｇｇｔａｔｔｔｔ  ｃｇｔｃｔｇｇｇｇｇ  ｇｔａｔｇｃａｃｇｃ  ｇａｔａｇｃａｔｔｇ  ｃｇａｇａｃｇｃｔｇ  ｇａｇｃｃｇｇａｇｃ  ａｃｃｃｔａｔｇｔｃ  ｇｃａｇｔａｔｃｔｇ  ｔｃｔｔｔｇａｔｔｃ  ｃｔｇｃｃｔｃａｔｃ  ｃｔａｔｔａｔｔｔａ  ｔｃｇｃａｃｃｔａｃ  ｇｔｔｃａａｔａｔｔ  ａｃａｇｇｃｇａａｃ  ａｔａｃｔｔａｃｔａ  ａａｇｔｇｔｇｔｔａ  ａｔｔａａｔｔａａｔ  ｇｃｔｔｇｔａｇｇａ  ｃａｔａａｔａａｔａ  ａｃａａｔｔｇａａｔ  ｇｔｃｔｇｃａｃａｇ  ｃｃａｃｔｔｔｃｃａ  ｃａｃａｇａｃａｔｃ  ａｔａａｃａａａａａ  ａｔｔｔｃｃａｃｃａ  ａａｃｃｃｃｃｃｃｔ  ｃｃｃｃｃｇｃｔｔｃ  ｔｇｇｃｃａｃａｇｃ  ａｃｔｔａａａｃａｃ  ａｔｃｔｃｔｇｃｃａ  ａａｃｃｃｃａａａａ  ａｃａａａｇａａｃｃ  ｃｔａａｃａｃｃａｇ  ｃｃｔａａｃｃａｇａ  ｔｔｔｃａａａｔｔｔ  ｔａｔｃｔｔｔｔｇｇ  ｃｇｇｔａｔｇｃａｃ  ｔｔｔｔａａｃａｇｔ  ｃａｃｃｃｃｃｃａａ  ｃｔａａｃ。
【００７６】
配列番号１９は、環状ヒトｍｔ ｇＤＮＡの座標１６０２４〜４４５番目の間のヒトｍｔＤＮＡ断片に相当し、そしてＧｅｎｂａｎｋ配列参照番号ＮＣ＿０１２９２０．１からの１６０２４〜１６５６８番目の間の断片と、１〜４４５番目（付番はＨ鎖に対しておこなわれる）の間の断片との連結から生じる。
【００７７】
「インサイチュハイブリダイゼーションを可能にする条件（conditions enabling in situ hybridization）」とは、標的領域へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的領域が物理的に前記プローブに接触できるようにされていることを意味する。
【００７８】
特定の実施形態によると、標的領域へのプローブのハイブリダイゼーションは、プローブ又は標的領域の全長に沿って一部分だけであってもよく、ハイブリダイゼーション後の（１若しくは２以上の）洗浄ステップの間、特異的、且つ、安定であるだけで十分である。
【００７９】
別の実施形態によると、標的領域への第一のヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、プローブの長さにわたり、及び／又は標的領域の長さにわたり起こる。前記ハイブリダイゼーションのための条件は、先に規定されている。
【００８０】
特定の実施形態によると、プローブの標的領域へのハイブリダイゼーションを可能とするように、標的領域が前記プローブに接触可能にするために、前記標的領域は、複製プロセスの間、一時的であってもｇＤＮＡの接触可能な一本鎖の形態で利用可能でなければならない。特定の実施形態によると、それは、複製プロセスの間、一時的であってもｇＤＮＡの接触可能な一本鎖の形態で利用可能でなければならない、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列である。
【００８１】
特定の実施形態によると、第一のヌクレオチドプローブは、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない標的領域に含まれた先に触れた核酸配列に厳密にアニーリングする。言い換えれば、前記実施形態において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない標的領域に含まれた核酸配列とハイブリダイズするとき、第一のプローブは、前記核酸配列の枠を超えない。
【００８２】
ミトコンドリアのゲノムＤＮＡを検討すると、前記ＤＮＡのＤループ領域は、新たに合成された単独ＤＮＡ鎖がｇＤＮＡの親ＤＮＡ鎖の一方に結合したままであるときに形成され、そして二重の親鎖の一方を置換する、三本鎖ＤＮＡ構造にかかわる特別な構造として見出すことができる。
【００８３】
存在しているとき、そうした三本鎖ＤＮＡ構造は、Ｄループ構造内、又はプローブに接触可能なこの構造の近くに標的領域を配置する助けとなる。標的領域は、この立体配置では、ミトコンドリアのゲノムＤＮＡが複製に参加しているときには、ｇＤＮＡの２本の相補的な一本鎖の天然に起こる一時的な開放セグメント内に位置しているか、或いは、タンパク質又は標的領域を混雑した状態にする他の要素をわきへ押しやる、及び／又は前記プローブの標的領域へのその後のハイブリダイゼーションのためのプローブが前記領域に接触できなくなる結果を標的領域が回避するのを助ける第三のＤＮＡ鎖の存在によって影響を受ける領域内に位置している。
【００８４】
しかしながら、本発明との関係において、複製の開始は、Ｄループ内の第三のＤＮＡ鎖の存在がミトコンドリアＤＮＡ鎖全体の複製をさらに生じなくても、ミトコンドリアｇＤＮＡで検出されるべき事象であると見なされる。言い換えれば、ミトコンドリアｇＤＮＡの複製開始は、複製バブルの形成を伴って起こると見なされ、そしてそれには、複製起点の遺伝子座の周りのＤループ形成が含まれる。
【００８５】
具体的な実施形態において、本発明の方法がミトコンドリアのゲノムＤＮＡにおける複製事象の開始の発生の検出に適用されるとき、本発明の方法は、前記Ｄループの近く又は前記Ｄループに含まれる遺伝子座に位置する標的領域に少なくとも部分的にハイブリダイズする、本発明によるプローブでミトコンドリアのゲノムＤＮＡを標識することによってＤループ領域の開放の特異的検出を可能とする。
【００８６】
特定の実施形態によると、第一のヌクレオチドプローブは、代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない標的領域に含まれた上記核酸配列に厳密にアニーリングする。
【００８７】
特定の実施形態によると、本発明の第一のプローブに対する標的領域の接近性は、ハイブリダイゼーションステップの前に、標的領域を含むゲノムＤＮＡ分子を部分的に変性することを目的とするステップをおこなうことによって、例えば、７２〜７８℃、好ましくは７５℃で、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間、前記ゲノムＤＮＡを含む真核細胞を加熱することによって改善される。
【００８８】
特定の実施形態によると、前記部分的な変性は、核酸の完全な変性をもたらすあらゆる化学剤も使用せずにおこなわれる。その結果、ＨＣｌ、ペプシン、アルカリ化剤又はエタノールによる処理は禁止される。逆に、核酸の部分変性を可能にするか、又は補助する化学剤、及び／又は温度条件の使用は可能である。使用できる化学剤の例は、ホルムアミドである。本明細書中に開示した提案される処理の組み合わせが、本発明に包含される。「部分的な変性（partial denaturation）」とは、そうした変性後に、すなわち、二本鎖の核酸を構成する２本の鎖が、一本鎖の形態の中にあって、完全に切り離されて見つからないことを意味する。具体的な実施形態によると、前記部分的変性は、その部分変性を誘発する前にｇＤＮＡの二本鎖核酸上で見られることがある（１若しくは２以上の）開放又は（１若しくは２以上の）バブルの大きさの増加をもたらす。
【００８９】
温度及び／又は（１若しくは２以上の）化学剤が二本鎖の標的核酸の部分変性を補助するのに使用される特定の実施形態によると、それらの全長にわたって、二本鎖の標的核酸の鎖の解離からなる結果を除外するために、（１若しくは２以上の）前記作用物質は、二本鎖の標的核酸上の（１若しくは２以上の）開放又は（１若しくは２以上の）バブルの大きさの増大を実行するか又は助けることによって部分変性を可能にする。したがって、部分的な変性は、二本鎖ＤＮＡ分子の中にゆるんだ一本鎖ＤＮＡをもたらす変性ステップである。
【００９０】
本発明との関係において、細胞又は組織におけるゲノムＤＮＡ複製の開始と、産生されたＲＮＡ分子であって、例えば、前記細胞又は組織で付随して転写されたゲノムＤＮＡの転写産物に対応するＲＮＡ分子の両方を追跡するのは有利であるだろう。
【００９１】
これにより、特定の実施形態において、本発明の方法は、真核細胞におけるＤＮＡ分子の転写された領域に対応する少なくとも１つのＲＮＡ分子のさらなる検出のために使用され、この方法は、前記ＲＮＡ分子を発現する前記真核細胞を、少なくとも第二のヌクレオチドプローブと接触させ、そして、前記ＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションの後に前記第二のヌクレオチドプローブを検出するステップを含む。
【００９２】
特定の実施形態によると、第二のヌクレオチドプローブによって検出されたＲＮＡ転写産物分子をもたらすＤＮＡ分子は、前記細胞（分析細胞）の中のゲノムＤＮＡである。
【００９３】
特定の実施形態において、ＤＮＡゲノム上の標的領域の核酸配列とＲＮＡ分子の標識化は、特に同時に、１ステップで達成される。
【００９４】
特定の実施形態において、ＤＮＡゲノム上の標的領域の核酸配列とＲＮＡ分子の検出は、１ステップで、特に同時に達成される。
【００９５】
本発明との関係において、ＤＮＡ分子の転写された領域に対応するＲＮＡ分子への第二のヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチドプローブの検出で明らかになるはずの、ヌクレオチドプローブとＲＮＡ分子の緊密な相互作用を得ることによって達成される。そうした相互作用は、ヌクレオチドプローブとＲＮＡ分子との間の水素結合の形成で達成され、そしてそれは、相補的なヌクレオチド分子の間の相互作用の典型的な例である。例えば、水素結合は、ＤＮＡの２本の相補鎖のアニーリングで見られる。
【００９６】
典型的に、ＲＮＡフラグメント（ＲＮＡ分子）とハイブリダイズするように設計されたヌクレオチドプローブは、検出するＲＮＡフラグメントに相補的な標識化された核配列断片である。プローブの核酸配列は、検出するＲＮＡ分子の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に相補的でなければならない、すなわち、安定した塩基対合を可能にするのに十分な領域にわたって相補的でなければならない。
【００９７】
しかしながら、他の実施形態によると、ヌクレオチドプローブとＲＮＡ分子の相互作用はまた、ファンデルワールス相互作用、イオン結合又は共有結合にもかかわる可能性がある。そうした（１若しくは２以上の）相互作用は、ヌクレオチドプローブが修飾ヌクレオチドを含むか、又は一般にヌクレオチド分子の中に存在していない特有の残基を担持することを含意する。
【００９８】
特定の実施形態において、（１若しくは２以上の）プローブが、蛍光部分（タグ）で直接標識化される。
【００９９】
（１若しくは２以上の）プローブが、好ましくはヌクレオチドプローブであり、特にそれらの相補性ＲＮＡに結合するＤＮＡ又はＲＮＡの短い配列（ｃＲＮＡプローブ又はリボプローブ）である。本発明は、（１若しくは２以上の）他の分子又は部分に結合されるか、又は連結された（１若しくは２以上の）ヌクレオチドを含む（１若しくは２以上の）プローブを包含する。
【０１００】
特定の実施形態によると、ヌクレオチドプローブは、修飾ヌクレオチドを含むか、又はヌクレオチド分子の中に一般に存在しない特有の残基を担持する。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡに対して非常に高い親和性を有する、修飾されたヌクレオチド及びＲＮＡ類似体のクラスである。それらは、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブにおいて天然のヌクレオチドを置換できる。
【０１０１】
本発明は、そのいくつかの異なったＲＮＡ分子又はその断片を明らかにするのに好適なプローブの使用、異なったＲＮＡ分子又はその断片を標的とする（ＲＮＡ分子又はその断片のプールに特異的な）単独のプローブの使用、或いは、細胞又は組織の中で独特なＲＮＡ分子又はその断片の配列に特異的な単独のプローブの使用を包含する。このような関係において、「プローブ」という用語は、１又は多くのＲＮＡ分子を明らかにするのに一緒に使用される多くの分子実体を包含するが、ここで、前記ＲＮＡ分子は別個のものであるか又は異なっている。
【０１０２】
特定の実施形態によると、第一のヌクレオチドプローブ又は第二のヌクレオチドプローブのいずれかによって標的とされたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、ＲＮＡ／ＤＮＡ構造にかかわっていてもよい。
【０１０３】
本発明によると、ＲＮＡ分子を明らかにするのに好適なプローブは、通常、標識化されているが、そうとも限らない。又は、プローブの標識化は、放射性タグ、抗体で発見可能なタグ、又は蛍光タグ若しくはビオチン化タグ、或いは、量子ドット、特に蛍光量子ドットのいずれかを用いて達成される。前記タグ又は量子ドットは、プローブに直接的又は間接的に（結合を含めて）結び付けられる。標識化のタイプに応じて、プローブは、オートラジオグラフィー又は蛍光顕微鏡などの適当な技術を使用して、生物物質内で局在化できる。また、ＤＮＡゲノムにおける標的部位を明らかにすることを目的としたプローブの標識化に関して先になされた進歩はまた、（１若しくは２以上の）ＲＮＡ分子の検出を目的とした（１若しくは２以上の）プローブの標識化にも適切である。
【０１０４】
検出したＲＮＡ分子は、ポリシストロン性ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（核のゲノムＤＮＡ及び／又はミトコンドリアのゲノムＤＮＡ）の転写された断片に対応するＲＮＡ、前記細胞内でプロセシングＲＮＡ又は未プロセシングＲＮＡであり得る。
【０１０５】
本発明の特定の実施形態において、ｇＤＮＡ標的領域を明らかにすることを目的とした第一のプローブは、８０ｂｐ〜１０００、２０００又は３０００ｂｐの大きさを有する一本鎖ＤＮＡ断片である。そうしたプローブは、９０〜１５０、２００、３００又は５００ｂｐ、特に９５〜１１０、１２０又は１３０ｂｐの大きさを有し、好ましくは９９ｂｐの大きさを有する。特定の実施形態によると、第一のプローブは、２００、４００又は６００ｂｐ〜９００、１０００、１１００又は１３００ｂｐの大きさを有する。具体的な実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、８０〜３０００ｂｐ、又は８０〜２０００ｂｐ或いは、８０〜１２００ｂｐ若しくは１５００ｂｐの大きさを有する一本鎖ＤＮＡ断片である。
【０１０６】
図２２は、本発明の３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ法の有効性がプローブの大きさに影響されないことを実証する実験を開示する。
【０１０７】
したがって、本発明はまた、本発明によるプローブとして、特に第一のプローブとして使用するための核酸分子にも関するが、前記プローブは、ｍｔゲノム（配列番号１９）のＨ鎖上の４４６番目のヌクレオチド〜１６２０２４番目のヌクレオチドの間に局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントに特異的であるか、若しくはそうしたセグメント（配列番号１９）と８０％の同一性を有するセグメントに特異的であるか、又はその断片に特異的である。特定の実施形態によると、前記核酸分子は、ヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチド（ｍｔゲノムのＨ鎖に関して付番）の間のミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントに特異的である。別の実施形態によると、核酸分子は、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６２０２４番目のヌクレオチド、特にヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドに局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的である。
【０１０８】
したがって、本発明の核酸分子は、以下の群の中から選択され得る：
ｉ．配列番号１７及び配列番号１８を含む核酸分子、特に、ｍｔＤＮＡ配列と、又は、前記ｍｔゲノムのＨ鎖の４２５番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドと、相補的であるか、若しくは少なくとも相補的であるか、又はハイブリダイズする核酸分子、或いは
ｉｉ．その配列が配列番号１及び配列番号１７によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜２２５番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約４００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子、或いは
【０１０９】
ｉｉｉ．その配列が配列番号１及び配列番号１８によって構成される核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約８００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子、或いは
ｉｖ．その配列が、配列番号１、配列番号１７、及び配列番号１８をこの順番で含む核酸分子、特に配列番号１９に開示された通りの核酸分子であって、ｍｔゲノムのＨ鎖の４４６番目のヌクレオチド〜１６０２４番目のヌクレオチドのｍｔ ｇＤＮＡ配列と、相補的であるか、若しくは少なくとも部分的に相補的であるか、又はハイブリダイズし、そして８０〜約１２００個のヌクレオチドを有する、前記核酸分子。
【０１１０】
特定の実施形態によると、本発明によるプローブは、ｍｔゲノム（配列番号１９と連結された配列番号１）のＨ鎖上の５４４番目のヌクレオチド〜１６２０２４番目のヌクレオチドの間に局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントに特異的であるか、或いは、そうしたセグメント（配列番号１９と共に連結された配列番号１）と８０％の同一性を有するセグメントに特異的であるか、或いは、その断片に特異的である。
【０１１１】
別の実施形態によると、本発明の核酸分子プローブは、ｍｔゲノムＨ鎖の５４４番目のヌクレオチド〜１６３６６番目のヌクレオチド、特にヒト真核細胞のミトコンドリアゲノムの５４４番目のヌクレオチド〜１６２０２４番目のヌクレオチドの間に局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的である。
【０１１２】
ＲＮＡ分子を明らかにすることを目的とする第二のプローブを検討する場合、本発明の特定の実施形態によると、前記第二のプローブは、ミトコンドリア転写産物の検出を目的としたとき、１００ｂｐ〜３０００ｂｐ、好ましくは１００、２００、３００ｂｐ〜１０００、１２００、１５００、２０００ｂｐの大きさを有する一本鎖のヌクレオチドＤＮＡ断片である。
【０１１３】
特定の実施形態によると、（１若しくは２以上の）ＲＮＡ分子を明らかにすることを目的とした（１若しくは２以上の）第二のプローブの大きさ及び／又は配列は、ゲノムＤＮＡのコードセグメント、特に遺伝子に対応するセグメントの転写から得られた転写産物の検出を可能にするために特に適合させる。
【０１１４】
先に述べたとおり、特定の実施形態において、第一のヌクレオチドプローブとしての使用に好適な核酸分子は、本明細書中に提供された定義にしたがって、転写されないミトコンドリアｇＤＮＡのセグメント、特に全く転写されないミトコンドリアｇＤＮＡセグメントに特異的である。
【０１１５】
したがって、第一のヌクレオチドプローブ又は分子が、細胞レベルでいかなる対応するＲＮＡ転写産物も有さないゲノムＤＮＡ領域の相補鎖であり、したがって、細胞レベルでＲＮＡフリーの状態を維持する。
【０１１６】
特定の実施形態において、第一のヌクレオチドプローブ又は分子は、真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（又はＨＳＰ−Heavy Strand Promoter）とＬＳＰ（Light Strand Promoter）の間に局在化されるゲノムＤＮＡ配列を標的とする。ＨＳＰとＬＳＰプロモーターは両方ともすべての真核生物のｍｔＤＮＡに見られるが、検討された真核生物のｍｔＤＮＡが属する種によってそれらの名称は異なる。対応する名称は、文献により認定される。
【０１１７】
ヒトミトコンドリアゲノム（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ配列参照番号ＮＣ＿０１２９２０．１）上のこれらの２つのプロモーターのそれぞれの位置（座標）を、表２で示す。
【０１１８】
ヒトミトコンドリアゲノムでは、そうした第一のプローブ又は核酸分子配列は、ｍＲＥＰが発明者らによって設計された。この配列の座標を表１で示す（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ配列ＮＣ＿０１２９２０．１、参照番号として使用される）。ｍＲＥＰ（配列番号１）はまた、図１３ａでも開示される。
【０１１９】
別の実施形態において、前記第一のプローブは、ｍＲＥＰ配列（配列番号１）を含む。
【０１２０】
具体的な実施形態において、第一のヌクレオチドプローブ又は分子は、真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（又はＨＳＰ）とＬＳＰとの間に局在化される標的ＤＮＡ領域と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列、或いは、ｍＲＥＰと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列と相補的である。
【０１２１】
「少なくとも８０％の同一性」とは、それらのヌクレオチド配列が、検討された配列の全長にわたって計算されたもの（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムによって計算された大域的な整列）と２０％未満しか異なっていないことを意味する。相補性は、そうした大域的な整列によって同様に測定される。特定の実施形態において、例えば、比較された配列がその長さの中で実質的に異なっているとき、同一性及び相補性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって計算される局所的な整列を使用することによって同じカットオフ値を使用して決定できる。ヌクレオチドの修飾は、特に置換である。
【０１２２】
基準の配列に部分的に相補的であると言われる配列は、前記基準の配列と「少なくとも８０％の同一性」を有する配列であってもよい。
【０１２３】
真核細胞のミトコンドリアゲノムの２つのプロモーターであるＰＨ１（又はＨＳＰ）とＬＳＰの間に局在化したゲノムＤＮＡ配列は、ミトコンドリアゲノムの高度可変領域の一部である。図１３ｂは、本発明のヒトｍＲＥＰ配列（配列番号１）に関してこれまでに知られている多型変異を開示している。しかしながら、これらの変異のほんのいくつかは、一個体において同時に見られる、すなわち、これらの変異のうちの１、２、３又は４つだけは同時に見られる。前記変異は、一般に、亜集団タイプ（例えば、白人、アフリカ人など）に関係している。これらの多型変異は、ｍＲＥＰのバリアント設計の基礎である。
【０１２４】
表３は、ヒトｍＲＥＰプローブに関して、数種類の生物体及び種におけるｍＲＥＰプローブ（配列番号１）に対応する配列の間の同一性のパーセンテージを、対応するミトコンドリアゲノム（配列番号２〜１６）上の前記配列の座標に沿って開示する。
【０１２５】
表３  数種類の生物体及び種におけるｍＲＥＰ（配列番号１）プローブに対応する配列（配列番号２〜１６）の間の同一性のパーセンテージ。Ｒｅｆｓｅｑとは、ＮＣＢＩ又はＧｅｎＢａｎｋ参照番号である。
【０１２６】
【表１】
2014509862.tif 000002
【０１２７】
具体的な実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つの配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つに相補的である配列を有する核酸分子を含むか、或いは、前記配列の断片である。
【０１２８】
具体的な実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つの核酸配列の断片を包含する核酸分子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つに相補的である核酸配列を含む。
【０１２９】
具体的な実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つの核酸配列を有する核酸分子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つに相補的である核酸配列からなる。
【０１３０】
特定の実施形態によると、第一のヌクレオチドプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のいずれか１つと相補的である核酸配列である。
【０１３１】
特定の実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、２以上の、しかし、異なったプローブ、特に先に開示された配列の中から選ばれた互いに固有の配列を有する核酸分子を含むプローブの混合物を含む。具体的な実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、互いに相補的な配列を有する２種類の核酸分子の混合物を含む。そうした混合物は、使用前に変性されなければならない。
【０１３２】
図１３ｂは、ｍＲＥＰ配列に関してこれまでに知られている多型変異を開示している。これらの多型変異は、配列番号１に対応するｍＲＥＰに対する代替のプローブを設計するのに使用され得る。
【０１３３】
図１３ｃは、ヒトｍＲＥＰ配列と、（本明細書中に配列番号２〜１６でも開示されている）異なった生物体の対応配列との間の整列を開示している。
【０１３４】
本発明の特定の実施形態によると、ミトコンドリアｇＤＮＡとＲＮＡ分子の両方が検出されるとき、（１若しくは２以上の）ＲＮＡ分子を検出する第二のヌクレオチドプローブは少なくとも、（１若しくは２以上の）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を標的とするか、又はミトコンドリアｇＤＮＡのＤループ領域内のミトコンドリアｇＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡを標的とする。
【０１３５】
具体的な実施形態において、第二のヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド構造の形成にかかわるＲＮＡ分子又はその断片に特異的であるか、或いは、Ｄループ領域内のｇＤＮＡをハイブリダイズするＲＮＡ又はその断片に特異的であり、そして、配列番号１７又は配列番号１８で開示された配列若しくはその断片を含むか、又はそれらからなることもある。特定の実施形態において、第二のヌクレオチドプローブは、配列番号１７又は配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施形態において、第二のヌクレオチドプローブは、配列番号１７又は配列番号１８で開示された配列を有する。
【０１３６】
配列番号１７は、参照ヒトミトコンドリア配列ＮＣ＿０１２９２０．１、ＧｅｎＢａｎｋによるＰＬ−ＯＨプローブ（２２５〜４２５番目）の配列である：
２２５  ｇｔａｇｇａ  ｃａｔａａｔａａｔａ  ａｃａａｔｔｇａａｔ  ｇｔｃｔｇｃａｃａｇ  ｃｃａｃｔｔｔｃｃａ  ｃａｃａｇａｃａｔｃ  ａｔａａｃａａａａａ  ａｔｔｔｃｃａｃｃａ  ａａｃｃｃｃｃｃｃｔ  ｃｃｃｃｃｇｃｔｔｃ  ｔｇｇｃｃａｃａｇｃ  ａｃｔｔａａａｃａｃ  ａｔｃｔｃｔｇｃｃａ  ａａｃｃｃｃａａａａ  ａｃａａａｇａａｃｃ  ｃｔａａｃａｃｃａｇ  ｃｃｔａａｃｃａｇａ  ｔｔｔｃａａａｔｔｔ  ｔａｔｃｔｔｔｔｇｇ  ｃｇｇｔａｔｇｃａｃ  ｔｔｔｔａ  ４２５。
【０１３７】
ＧｅｎＢａｎｋ、配列番号１８は、参照ヒトミトコンドリア配列番号ＮＣ＿０１２９２０．１による７Ｓプローブ（１６３６６〜１６５６６番目）の配列である：
１６３６６  ｃａｔｇｇ  ａｔｇａｃｃｃｃｃｃ  ｔｃａｇａｔａｇｇｇ  ｇｔｃｃｃｔｔｇａｃ  ｃａｃｃａｔｃｃｔｃ  ｃｇｔｇａａａｔｃａ  ａｔａｔｃｃｃｇｃａ  ｃａａｇａｇｔｇｃｔ  ａｃｔｃｔｃｃｔｃｇ  ｃｔｃｃｇｇｇｃｃｃ  ａｔａａｃａｃｔｔｇ  ｇｇｇｇｔａｇｃｔａ  ａａｇｔｇａａｃｔｇ  ｔａｔｃｃｇａｃａｔ  ｃｔｇｇｔｔｃｃｔａ  ｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ  ａｔａａａｇｃｃｔａ  ａａｔａｇｃｃｃａｃ  ａｃｇｔｔｃｃｃｃｔ  ｔａａａｔａａｇａｃ  ａｔｃａｃｇａ  １６５６６。
【０１３８】
特定の実施形態において、第一のヌクレオチド又は第二のヌクレオチドプローブは、特に蛍光基で直接標識化される。
【０１３９】
標識化は、基又は標識、例えば、ビオチン、ジゴキシン及びジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、アルカリホスファターゼ及び蛍光基など、又は標識、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ及びローダミン若しくはその誘導体、又はクマリン、ローダミン、カルボピロニン、オキサジン若しくはその誘導体を含めた色素、或いは、量子ドット、特に蛍光量子ドット若しくはその誘導体を用いて達成される。
【０１４０】
「直接標識化（directly labelled）」とは、標識の検出が、その達成のために別のもの、すなわち、抗体を含めた二次的な化学剤又は化合物の介入を必要としないことを意味する。そうした直接標識化は、標識化の特異性を改善するだろう。
【０１４１】
標識化は、市販キット、例えば、ニックトランスレーション手順にしたがって達成される。そうした市販キットの例は、JenaBioscience製のNick Translation Atto NT Labelingキット（以下の色素：Ａｔｔｏ４２５＝青色、Ａｔｔｏ４８８＝緑色、Ａｔｔｏ５５０＝赤色を含む）である。
【０１４２】
特定の実施形態において、第一のヌクレオチドプローブは、本明細書中に開示されている修飾ヌクレオチドを含む。
【０１４３】
本発明はまた、少なくとも１つの真核細胞中におけるヌクレオチド性物質のインサイチュハイブリダイゼーション及び検出のための方法であって、以下のステップ：
ａ．１〜４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で、好ましくは２％のＰＦＡ中で、約２０〜３０分間、特に３０分間かけて前記細胞を固定化し、
ｂ．０．５％〜１％のトリトンＸ１００のＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline Buffer）１Ｘ液で、約５〜１０分間、４℃にて、特に５分間、前記固定化された細胞の透過処理し、
ｃ．７２〜７８℃にて、好ましくは７５℃にて、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間加熱し、透過処理された前記固定化された細胞の核酸含有物を変性し、
ｄ．前記ステップ（ｃ）にしたがって処理された細胞中の１又は２以上の核酸が、１又は２以上のヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができるように、前記１又は２以上の核酸を、第一のプローブそして場合により、第二のプローブとして本明細書中に定義される前記１又は２以上のヌクレオチドプローブと接触させ、ここで前記プローブは、８０〜３０００ヌクレオチド、又は９０〜１０００ヌクレオチド、特に９５〜１１０ヌクレオチドの大きさを有し、そして１００ｎｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中に含有され、
ｅ．前記ステップ（ｄ）において添加された１又は２以上のプローブとハイブリダイズされる１又は２以上の核酸を検出すること、
を含む前記方法に関する。
【０１４４】
前記方法の変性ステップは、本明細書中に開示されるように、核酸を部分的に変性することを目的とする適当なバッファー中、及び／又は化学剤を用いてさらに実施できる。
【０１４５】
本発明の具体的な実施形態によると、固定化された細胞の核酸含有物の変性ステップは、例えば、ホルムアミドなど、の化学剤、特に、７０％のホルムアミド又は７０％のホルムアミド／２ｘＳＳＣの溶液の存在下、７２〜７８℃、好ましくは７５℃の温度にて、２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間加熱することによっておこなわれる。
【０１４６】
前記方法は、検出ステップの前に、適当なバッファーでヌクレオチドプローブと接触させた細胞を洗浄するステップをさらに含む。
【０１４７】
特定の実施形態によると、ハイブリダイゼーションステップは、３７℃にて約１５時間おこなわれる。
【０１４８】
特定の実施形態によると、本発明の方法は、特に免疫蛍光法によって、真核細胞中の少なくとも１つの着目のタンパク質の標識化及び検出を可能にするステップをさらに含む。
【０１４９】
検出は、特に、単独細胞イメージングによって実施できる。
【０１５０】
このために、アッセイ下の（１若しくは２以上の）細胞又は組織を、検出が求められる（１若しくは２以上の）タンパク質に特異的な抗体と接触させることができる。
【０１５１】
特定の実施形態によると、着目のヌクレオチド性物質及びタンパク質の検出は、１ステップで、特に同時に達成される。
【０１５２】
（１若しくは２以上の）検出の（１若しくは２以上の）結果の分析のステップが、続いておこなわれるだろう。
【０１５３】
細胞の固定化は、或いは、例えば、パラフィン、アセトン、メタノール、エタノールなどの作用物質、メタノールとアセトンの組み合わせ、メタノールとエタノールの組み合わせ、ホルマリン、パラホルムアルデヒドとメタノールの組み合わせ、又は本明細書中に開示した作用物質のあらゆる組み合わせを用いておこなうことができる。
【０１５４】
本発明による方法にかかわる前記ステップを以下に詳述する。
【０１５５】
１．（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の固定化
特定の実施形態によると、（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の固定化は、１〜４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、好ましくは２％のＰＦＡの溶液を用いて、約２０〜３０分間、特に３０分間、（１若しくは２以上の）ガラススライド上でおこなわれる。具体的な実施形態によると、固定化は、２％のＰＦＡの溶液中で、約３０分間おこなわれる。前記固定化は、室温（ＲＴ）にておこなうことができる。
【０１５６】
固定化後、固定化材料の保存は、例えば、ＰＢＳ １Ｘなどのバッファー中でおこなうことができる（４℃にて最長１年間）。
【０１５７】
或いは、固定化は、以下のプロトコールのいずれかにしたがって実施できる：
−  アセトンによる固定（５〜１０分間−２０℃のアセトン中で細胞を固定する）；
−  メタノールによる固定（５〜１０分間−２０℃のメタノール中で細胞を固定する）；
−  エタノールによる固定（５〜１０分間９５％の冷エタノール、５％の氷酢酸中で細胞を固定する）；
−  メタノール−アセトンによる固定（冷メタノール中で固定する、１０分間−２０℃；余分なメタノールを取り除く）；
−  メタノール−アセトン混合物による固定（１：１のメタノールとアセトンの混合物；新しく混合物を作り、そして５〜１０分間−２０℃にて細胞を固定する）；
−  メタノール−エタノール混合物による固定（１：１のメタノールとエタノールの混合物；新しく混合物を作り、そして５〜１０分間−２０℃にて細胞を固定する）；
−  ホルマリンによる固定（５〜１０分間、１０％の中性緩衝ホルマリン中で細胞を固定する）；
−  パラホルムアルデヒド−メタノールによる固定（１０〜２０分間、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで簡単にすすぎ、５〜１０分間−２０℃にて冷メタノールで透過処理する）。
【０１５８】
標準的なＤＮＡ ＦＩＳＨ手順では、一般にこの段階で（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の固定化をおこなわないが、標準的なＲＮＡ ＦＩＳＨ手順では、最短でも１０分間の４％のＰＦＡを用いた（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の固定化を必要とする。
【０１５９】
２．（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の透過処理
特定の実施形態において、プローブの良好な浸潤、特に、プローブがそれらの標的配列に達するための、細胞膜を通過する浸潤を可能にするために、透過処理ステップが必要である。従来技術で細胞を透過処理するのに使用される既知の化学試薬は、ＨＣｌ、例えば、トリトン又はＳＤＳなどの界面活性剤、或いは、プロテイナーゼＫである。
【０１６０】
本発明の特定の実施形態によると、固定化された（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織は、例えば、５分間、例えば、ＰＢＳ １Ｘなどの適当なバッファー中の０．５％〜１％のトリトンＸ１００溶液を使用して透過処理される。前記透過処理は、４℃にておこなわれる。
【０１６１】
特定の実施形態によると、固定化された（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織は、透過処理前に、ＰＢＳ １Ｘ中で最高３回、そして透過処理後にＰＢＳ １Ｘ中で最高４回洗浄されてもよい。
【０１６２】
特定の実施形態によると、透過処理には、３０分間、ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中に５０％のホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ（生理食塩水−クエン酸ナトリウムバッファー）中での（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織のインキュベーション、そして、変性直前の７０％のホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣへの切り替えがその後に続く。
【０１６３】
そして場合により、プローブ特異性に関する対照アッセイは、ＲＮａｓｅ又はＤＮａｓｅ溶液（１００μｇ／ｍｌ）中で３７℃にて１時間、サンプルをインキュベートすることと、それに伴うホルムアミド中での（単数若しくは複数の）細胞又は（単数若しくは複数の）組織のインキュベーション前のＰＢＳ １Ｘ中での最大３回の洗浄によって実施できる。
【０１６４】
標準的なＤＮＡ ＦＩＳＨ手順は、一般に、実験を妨げる場合があるすべての酵素を取り除くためのガラススライドの熱処理（例えば、９０℃にて１時間３０分間又は３７℃にて一晩）を伴い、そして、透過処理は、０．００５％のペプシン／０．００１ＭのＨＣｌと一緒に３７℃にて１５分間のインキュベーション、（４％）パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、エタノール系列：７０％、９０％、１００％中でのインキュベートし、さらに続いて、一次転写産物を取り除くためにおこなわれるＲＮａｓｅ処理、それと続く洗浄及びエタノール系列中での脱水によって達成される。最終的に、サンプルは空気乾燥される。
【０１６５】
標準的なＲＮＡ ＦＩＳＨ手順は、一般に、バッファー（その組成は、ＰＩＰＥＳ、ＭｇＣｌ2、スクロース又はＮａＣｌなどを含む）中のトリトンＸ１００ ０．５％を用いた透過処理し、４％のＰＦＡ／ＰＢＳ中での氷上１０分間の洗浄及び７０％のエタノール中でのさらなる洗浄（二度）し、その後エタノール系列：８０％、９５％、１００％のエタノール中での脱水し、そして、４２℃の加熱板上でサンプルを風乾する必要がある。
【０１６６】
それとは異なり、本発明の方法は、酵素（すなわち、ペプシン）処理、酸（すなわち、ＨＣｌ）処理又はアルカリ処理、アルコール処理（すなわち、エタノール）、乾燥剤又は乾燥処理（すなわち、風乾）の不存在下でおこなった。
【０１６７】
３．変性
変性ステップは、７２〜７８℃、好ましくは７５℃にて２〜８分間、好ましくは４〜５分間、特に５分間、アッセイされる（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織を含むサンプルを加熱することによっておこなわれる。具体的な実施形態によると、サンプルは７５℃にて５分間加熱される。その後、プローブが準備できるまで、サンプルは氷上に置いておく。
【０１６８】
ＲＮＡが一本鎖分子なので、そうしたステップが不要であるため、標準的なＲＮＡ ＦＩＳＨ手順では一般に変性ステップがおこなわれないが、標準的なＤＮＡ ＦＩＳＨ手順は、一般に、およそ８０℃にてサンプルを加熱することを伴い、そして、一本鎖ＤＮＡ分子を得るために核酸を変性するために、通常、例えば、化学的処理又は物理的処理などの他の処理の支援が使用される（例えば、氷上の７０％のエタノールでの洗浄又はエタノール系列を用いた脱水）。
【０１６９】
しかしながら、本発明による変性ステップは、核酸を部分的に変性することを目的とした化学剤の存在下、又は例えば、ホルムアミドなどの適当なバッファー中でおこなわれてもよい。
【０１７０】
４．プローブの設計と調製
本発明によると、（単数若しくは複数の）プローブは、好ましくはサイズが小さく（３ｋｂ以下、好ましくは１ｋｂ以下）、そして、（単数若しくは複数の）ＤＮＡと（単数若しくは複数の）ＲＮＡを標識化するための蛍光プローブの直接利用が好まれる。
【０１７１】
ニック・トランスレーション（直接蛍光）とビオチン／ジゴキシゲニン（非直接蛍光）のステップがプローブ標識化に必要であり、これにより、ビオチン／ジゴキシゲニン−ＤＮＡ又はＲＮＡプローブハイブリダイゼーションを明らかにするために一次及び二次蛍光抗体をさらに必要とする場合、キット、例えば、Jena Nick Translation kit（Atto fluorescence）を（単数若しくは複数の）プローブの標識化に使用できるので、精製後に回収されたＤＮＡの数量を見積もる必要がある（入力に比べ約１０％の損失）。
【０１７２】
５．プレハイブリダイゼーション
特定の実施形態によると、次のステップを含むプレハイブリダイゼーションステップがおこなわれる：
−  １枚のスライドにつき、以下の：
・  ４０ｎｇの蛍光プローブ（終濃度：１．６ｎｇ／μｌ）
・  ４００ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌの溶液から）
・  バッファー：ＰＢＳ １Ｘ中の１０％の硫酸デキストラン／５０％のホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ
を２５μＬの終量に混合し；
−  前記混合物を、暗所内で８０℃にて１０分間インキュベートする。
【０１７３】
そして場合により、プレハイブリダイズしたスライドを、スライドをインキュベートする前に暗所内で３７℃にて３０分間、予冷することもできる。
【０１７４】
標準的なＤＮＡ及びＲＮＡ ＦＩＳＨ手順は、一般に、高濃度の蛍光又はタグ付与プローブ（約１０ｎｇ／μｌの終濃度）、並びに０．５μｇ／μＬ超の終濃度でのＣｏｔ−１ ＤＮＡ及びサケ精子ＤＮＡの添加を必要とする。その後、混合物は、暗所内で７４〜８５℃にてインキュベートされる（５〜１０分間）。
【０１７５】
特定の実施形態によると、プレハイブリダイゼーション及び／又はハイブリダイゼーションステップは、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡの不存在下でおこなわれる。
【０１７６】
６．ハイブリダイゼーション
本発明の特定の実施形態によると、ハイブリダイゼーションステップは、標準的なバッファー中、例えば、実施例に示されたものなど、例えば、２ｘ ＳＳＣ ｐＨ７．０中に５０％のホルムアミド、１０％の硫酸デキストランを含むハイブリダイゼーションバッファーや適宜、別の同様のバッファー中、３７℃にて約１５時間、実施される。
【０１７７】
より詳しく述べると、ハイブリダイゼーションステップは、暗所内の加熱用金属ブロック上で３７℃にて約１５時間、サンプルをインキュベートすることによっておこなうことができる。標準的なＤＮＡ及びＲＮＡ ＦＩＳＨ手順は、一般に、一晩のハイブリダイゼーションを必要とする。
【０１７８】
７．洗浄と据え付け（mounting）
特定の実施形態によると、本発明の方法は、検出ステップの前に適当なバッファーを用いて、ヌクレオチドプローブと接触させた細胞を洗浄するステップをさらに含む。
【０１７９】
例えば、洗浄は、ＲＴにて３ｍＬの２Ｘ ＳＳＣ中で２分間を最高２回（光を遮るために黒い蓋で覆う）、次いで、ＲＴにて１Ｘ ＳＳＣ中で最高２回、そして、ＲＴにて０．１Ｘ ＳＳＣ中で最高２回おこなうことができる。最後に、最終的な洗浄が、ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中で最高２回おこなうことができる（すべて暗所内）。
【０１８０】
この時点で、簡単な２Ｄイメージングが実施できる。高い分解能を得るために、３Ｄ解析が好まれることもある。
【０１８１】
８．ｍＴＲＩＰ（Mitochondrial TranscriptionとReplication Imaging Protocol）を達成するための３Ｄ−ＦＩＳＨ
【０１８２】
３Ｄ−ＦＩＳＨがおこなわれるとき、以下のステップを実施してもよい：
−  終濃度１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の中で１時間インキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで５回洗浄し、
−  ２０μＬのＰＢＳ １Ｘによる７０％エタノールで洗浄し、そして乾燥させたスライド上に据え付け、
−  共焦分析までＲＴにて清潔な暗箱内にスライドを置いておいた。
これまでに記載したとおり、前記手順は、ゲノムＤＮＡ、特にｍｔＤＮＡ及びＲＮＡの標識化を可能にする。ミトコンドリア又は細胞タンパク質の追加標識のために、更なるステップが必要である。
【０１８３】
有利な実施形態によると、本発明の方法は、ヌクレオチド性物質のインサイチュハイブリダイゼーションと検出のために処理された真核細胞中の着目の少なくとも１種類のタンパク質の標識化及び検出を可能にするステップをさらに含む。この目的のために、免疫蛍光法が使用でき、そして、細胞を、検出が求められる（単数若しくは複数の）タンパク質に特異的な抗体と接触させることができる。特定のタンパク質又はエピトープに対して作製した抗体は、免疫学分野で一般的に使用される普通の技術にしたがって得られる。
【０１８４】
特定の実施形態において、本発明のｍＴＲＩＰ／３Ｄ−ＦＩＳＨ法では、１ステップで、特に同時に着目のヌクレオチド性物質とタンパク質の検出を実現する。
【０１８５】
９．免疫蛍光法と組み合わせた３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ：
以下のステップがおこなわれるであろう：
−  スライドを暗所内でＲＴにて１時間、ＰＢＳ １Ｘ中の５％ＢＳＡと共にインキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで２回洗浄し、
−  暗所内でＲＴにて１時間、ＢＳＡ１％、ＰＢＳ １Ｘ中の一次抗体と共にインキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで３回洗浄し、
−  暗所内でＲＴにて１時間、１０μｇ／ｍｌの終濃度のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＢＳＡ１％、ＰＢＳ １Ｘ、中の二次抗体と共にインキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで５回洗浄し、
−  ２０μＬのＰＢＳ １Ｘによる７０％のＥｔＯＨで洗浄し、そして乾燥させたスライド上に据え付け、
−  共焦分析までＲＴにて清潔な暗箱内にスライドを置いておく。
【０１８６】
本発明の方法の特定の実施形態でおこなわれた特定のステップについて詳しく述べた本発明によるプロトコールの例
【０１８７】
以下の手順は、ヒト細胞株及びヒト初代線維芽細胞のミトコンドリアのゲノムＤＮＡ、並びに他の真核生物体の細胞における複製事象の開始の発生の検出に好適である。
【０１８８】
複製事象の開始の発生を追跡するのに使用される（単数若しくは複数の）ｍｔＤＮＡプローブの設計は、対応するミトコンドリアゲノムの配列に適合させなければならない（他の生物体におけるｍＲＥＰプローブの一致を示す表３を参照のこと）。
【０１８９】
１．細胞の固定
−  ガラススライド上への細胞固定：２％のパラホルムアルデヒド、つまりＰＦＡで室温（ＲＴ）にて３０分間、
−  ＰＢＳ １Ｘ中に保存（４℃にて最長１年間）
【０１９０】
２．細胞の透過処理
−  ＰＢＳ １Ｘで３回洗浄し、
−  ＰＢＳ １Ｘ中の０．５％のトリトンＸ１００の中で４℃にて５分間、透過処理し、
−  ＰＢＳ １Ｘで４回洗浄し、
−  任意のステップ（プローブ特異性に関する対照アッセイ）
ＲＮａｓｅ又はＤＮａｓｅ溶液（１００μｇ／ｍｌ）中で３７℃にて１時間インキュベートし、
ＰＢＳ １Ｘ中で３回洗浄し、
−  細胞をＰＢＳ １Ｘ中の５０％のホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中でＲＴにて３０分間インキュベートし、
−  変性の直前に７０％のホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣに切り替える。
【０１９１】
３．変性
−  ７５℃にて４〜５分間、特に５分間変性し、
−  プローブが準備できるまで氷上に置いておく。
【０１９２】
４．プローブの設計と調製
−  プローブの大きさは〜１ｋｂより短く、
−  蛍光プローブの直接的な利用が好まれる。
【０１９３】
５．プレハイブリダイゼーション
−  １枚のスライドにつき、以下の：
・  ４０ｎｇの蛍光プローブ（終濃度：１．６ｎｇ／μｌ）
・  ４００ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌの溶液から）
・  バッファー：ＰＢＳ １Ｘ中の１０％の硫酸デキストラン／５０％のホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ
を２５μＬの終量に混合し；
−  前記混合物を、暗所内で８０℃にて１０分間インキュベートする。
−  スライドをインキュベートする前に暗所内で３７℃にて３０分間予冷する。
【０１９４】
６．ハイブリダイゼーション
−  正方形のパラフィルム上に２５μＬのプレハイブリダイゼーション混合物を滴下し、
−  液滴上にスライドを逆さまにし、
−  暗所内（暗い場所を設けるためにプラスチック製の蓋で覆う）の加熱用金属ブロック上で３７℃にて１５時間インキュベートする。
【０１９５】
７．洗浄と据え付け
−  ＲＴにて２分間、３ｍＬの２Ｘ ＳＳＣで２回洗浄し、
−  光を遮るために黒い蓋で覆い、
−  ＲＴにて２回、１Ｘ ＳＳＣで洗浄し、次いで、ＲＴにて２回０．１Ｘ ＳＳＣで洗浄し、
−  ＲＴにて２回ＰＢＳ １Ｘで洗浄する（すべての暗所内）。
【０１９６】
８．３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ
以下のプロトコールは、共焦回転盤顕微鏡を使用した哺乳類細胞の３Ｄ Ｚ走査に最適化される。２００ｎｍのＺスタック。ＩＭＡＲＩＳ（Bitplaneソフトウェア）を使用した３Ｄ再構成像。
−  終濃度１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の中で１時間インキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで５回洗浄し、
−  ２０μＬのＰＢＳ １Ｘによる７０％エタノールで洗浄し、そして乾燥させたスライド上に据え付け、
−  共焦分析までＲＴにて清潔な暗箱内にスライドを置いておいた。
【０１９７】
この時点までで、前記手順は、ｍｔＤＮＡ及びＲＮＡの標識化を可能にする。次のステップで、前記手順は、ミトコンドリアの又は細胞のタンパク質の追加標識を可能にする。
【０１９８】
９．免疫蛍光法を組み合わせた３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ
以下のプロトコールは、共焦回転盤顕微鏡を使用した哺乳類細胞の３Ｄ Ｚ走査に最適化されている。２００ｎｍのＺスタック。ＩＭＡＲＩＳ（Bitplaneソフトウェア）を使用した３Ｄ再構成像。
−  スライドを暗所内でＲＴにて１時間、ＰＢＳ １Ｘ中の５％ＢＳＡと共にインキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで２回洗浄し、
−  暗所内でＲＴにて１時間、ＢＳＡ１％、ＰＢＳ １Ｘ中の一次抗体と共にインキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで３回洗浄し、
−  暗所内でＲＴにて１時間、１０μｇ／ｍｌの終濃度のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＢＳＡ１％、ＰＢＳ １Ｘ、中の二次抗体と共にインキュベートし、
−  ＰＢＳ １Ｘで５回洗浄し、
−  ２０μＬのＰＢＳ １Ｘによる７０％のＥｔＯＨで洗浄し、そして乾燥させたスライド上に据え付け、
−  共焦分析までＲＴにて清潔な暗箱内にスライドを置いておく。
【０１９９】
本発明はまた、本明細書中に規定される、特に本発明のプロセスでの使用のための「第一のプローブ」と示される、（単数若しくは複数の）プローブとしての使用に好適な核酸分子に関する。
【０２００】
本発明は、特に、ゲノムＤＮＡを標的とする、インサイチュハイブリダイゼーションに好適なプローブとしての使用に好適な核酸分子を対象とする。
【０２０１】
したがって、本発明はまた、真核生物のゲノムＤＮＡの標的領域とハイブリダイズするプローブとしての使用に好適な核酸分子に関するが、ここで前記標的領域は、前記真核生物のゲノムＤＮＡを含む代謝的に活性な細胞中において、同定された対応するアニーリングＲＮＡを有さない核酸配列を含み、したがって前記ＤＮＡゲノムの転写及び複製の間ＲＮＡフリーの状態を維持する。特定の実施形態によると、そうした核酸分子は、前記ＲＮＡフリーの核酸配列とハイブリダイズし、且つ、前記ＲＮＡフリー核酸配列と同じ長さを持つか、又はそれより長い。
【０２０２】
本発明による方法に関して、先に及び本明細書中に開示された（単数若しくは複数の）核酸分子又は（単数若しくは複数の）プローブは、それら自体が本発明の目的の一部である。それらは、一本鎖分子であるか、又は相補的配列の二本鎖分子のいずれかとして調製及び／又は使用される。
【０２０３】
特に、そうした核酸分子は、転写されないミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントと特異的であり、そして、以下の：
ｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの配列を有する核酸、又は
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的な配列を有する核酸、又は
ｉｉｉ．前記（ｉ）若しくは（ｉｉ）の断片、又は
ｉｖ．配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸、若しくは、配列番号１〜配列番号１６のいずれか１つと相補的である核酸配列、又はそれらの断片、
を含むか、又はからなり、前記核酸分子は、一本鎖分子であるか、又は相補的配列の二本鎖分子であるか、のいずれかである。
【０２０４】
本発明はまた、ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ／ＤＮＡ分子に結合する核酸分子であって、前記ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ分子は、ミトコンドリアｇＤＮＡのＤループ領域中に局在化されるミトコンドリアｇＤＮＡのセグメントとハイブリダイズする分子であり、ここで前記核酸分子は、前記配列を含むか、若しくは有するか、又は配列番号１７の配列の断片であるか、若しくは配列番号１７の配列と少なくとも８０％の同一性を有するか、或いは、前記配列を含むか、若しくは有するか、又は配列番号１８の配列の断片であるか、若しくは配列番号１８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
【０２０５】
本発明はまた、固定化された細胞上でインサイチュハイブリダイゼーションをおこなうためのキットに関するが、前記キットは、本発明の核酸分子からなる、いわゆる第一のプローブを含み、そして場合により、本明細書中に開示されるようにＲＮＡ分子又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子とハイブリダイズする、本発明の核酸分子からなる、いわゆる第二のプローブを含む。
【０２０６】
本発明はまた、本明細書中に開示されるゲノムＤＮＡを標的とするインサイチュハイブリダイゼーションに好適な核酸分子からなるプローブを含み、そして場合により、本明細書中に開示されているとおり、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子とハイブリダイズする、本発明の核酸分子からなる、いわゆる、第二のプローブを含むキットに関する。
【０２０７】
特定の実施形態によると、前記キットは、（単数若しくは複数の）核酸分子からなるプローブ、及び／又はタンパク質を検出するための（単数若しくは複数の）抗体をさらに含んでいる。
【０２０８】
同じ（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織におけるＤＮＡ、そして場合によりＲＮＡ及び／又はタンパク質を標識化し、そして検出するためのキットは、（１若しくは２以上の）真核細胞又は（１若しくは２以上の）組織におけるゲノムＤＮＡ複製の開始事象の発生の検出に有用である。
【０２０９】
前記キットは、本明細書中に開示される本発明の方法により、真核細胞中におけるゲノムＤＮＡの複製事象の開始の発生を検出するためのプロセスに使用する取扱説明書をさらに含むことができる。
【０２１０】
前記キットは、本明細書中に開示される、そうしたプロセスをおこなうのに必要な試薬をさらに含むことができる。
【０２１１】
前記キットは、本発明によるプロセスによって評価されたデータを回収又は分析するために、器具、例えば、計測器具、（単数若しくは複数の）データ記憶媒体、（単数若しくは複数の）記録補助機器をさらに含む。
【０２１２】
本発明は、（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織におけるＤＮＡ、ＲＮＡ又は代謝産物のプロセシングを分析すること、及び／又は前記（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の動態を分析すること、及び／又は特定の疾患を検出することに特に有益なものである。
【０２１３】
本発明は、（単数若しくは複数の）ミトコンドリア疾患、（単数若しくは複数の）腫瘍性疾患、又は（単数若しくは複数の）癌のインビトロ分析、インビトロ検出、そして場合により、その後の診断、或いは、ミオパシーのインビトロ検出又はモニタリングの有用な手段を提供することに特に有益なものである。本発明は、（単数若しくは複数の）ミトコンドリア疾患、（単数若しくは複数の）腫瘍性疾患又は（単数若しくは複数の）癌のインビトロ分析、インビトロ検出、そして場合により、それに続く診断のために特に有益なものである。
【０２１４】
ミトコンドリアの機能不全との関係で、複製事象の開始の発生を分析するか又は検出することの利益に関して、ミトコンドリアの生理及び代謝が細胞エネルギーの産生（ＡＴＰ）に影響を与えるだけではなく、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達、及び死滅（アポトーシス）にも影響を与えることに気付くことは、賢明である。これにより、ミトコンドリアの機能不全が、様々な疾患（癌、ミオパシー、神経病理、感染）、及び加齢プロセスに関連している。
【０２１５】
ミトコンドリア疾患は、心筋障害、神経障害、網膜色素変性症、脳筋症、肝障害、低血圧症、腎細尿管疾患、リー症候群、バース症候群、視神経萎縮症、及び運動失調、大脳白質委縮症、糖尿病、カーンズ−セイヤー症候群を包含する。
【０２１６】
ミトコンドリア機能不全は、２型糖尿病、パーキンソン、アルツハイマー、アテローム性動脈硬化心臓病、脳卒中又は癌につながる又は関与する可能性がある。
【０２１７】
本発明の方法、本明細書中に記載したプローブ、及び前記プローブを含んでいるか又は本発明の方法を実施できるキットは、ミトコンドリアのｍｔＤＮＡプロセシング、例えば、転写や複製、或いは、ｍｔＤＮＡ含有物の欠如によるミトコンドリア機能不全に関連している疾患を同定及び／分類するのに必要な手段に貢献することで臨床診断プロトコールに有用である。これには、遺伝病（ｍｔＤＮＡ減少疾患）及び癌が含まれる。それはまた、臨床治療（すなわち、ｍｔＤＮＡを激減させる抗ＨＩＶヌクレオシド類似体を用いた長期治療）によって引き起こされたｍｔＤＮＡ減少、或いは、ｍｔＤＮＡ複製開始の欠陥又は廃止を同定するのに使用される。
【０２１８】
本発明の方法、本明細書中に記載したプローブ又は核酸分子、及び前記プローブ又は核酸分子を含んでいるか又は本発明の方法を実施できるキットは、（単数若しくは複数の）ミトコンドリア疾患、（単数若しくは複数の）ミトコンドリア機能不全又は障害から生じる（単数若しくは複数の）疾患、又は（単数若しくは複数の）ミトコンドリア機能不全又は障害をもたらす（単数若しくは複数の）疾患の分析及び検出に使用できる。
【０２１９】
本発明の方法は、ヒト、マウス、昆虫、酵母、魚類又は植物細胞を含めたすべての真核細胞に対して、前記細胞の機能について調査するための診断ツール又は生物工学ツールとして適切である。
【０２２０】
本発明の方法、本明細書中に記載したプローブ又は核酸分子、及び前記プローブ又は核酸分子を含んでいるか又は本発明の方法を実施できるキットは、（単数若しくは複数の）腫瘍性疾患又は（単数若しくは複数の）癌の分析及び検出に使用できる。
【０２２１】
本発明は、腫瘍性又は腫瘤（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の検出及び診断、特に健常な（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の中の前記（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織を識別するために有用な手段を提供する。
【０２２２】
本発明はまた、有機及び化学的化合物、特に薬物の細胞毒性を研究するのに特に有益なものである。
【０２２３】
本発明はまた、細胞において変更されたミトコンドリア活性をインビトロで検出するための方法であって、本明細書中に開示される第一のプローブでＤＮＡ複製のミトコンドリアの開始レベルを検出し、そして、本明細書中に開示される第二のプローブを用いてミトコンドリア転写産物のレベルを検出するステップを含む前記方法に関する。
【０２２４】
本発明のその他の例及び特徴は、当該明細書に示された特徴及び定義を例示する、（発明者らによっておこなわれた実験を説明する）実施例及び図面を読めば明らかになる。
【実施例】
【０２２５】
実施例
Ａ．材料と方法
細胞と培養条件。ヒトＨｅＬａ細胞とＩＭＲ９０初代線維芽細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地中、並びにＨｅＬａ ｒｈｏ0細胞を、１０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び０．２ｍＭのウリジンを含むＤＭＥＭ培地中、５％のＣＯ2存在下、３７℃にて培養した。細胞培養物を、異なった実験のために必要に応じて、一定の間隔を置いて取り分けた。ＩＭＲ−９０細胞は、１５代目の継代であった。低酸化ストレス下の培養物は、提示した時間の間、５０μМのＨ2Ｏ2で処理した。
【０２２６】
試薬と抗体。
ＢｒｄＵ、抗ＴＯＭ２２ Ａｔｔｏ４８８、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を、Sigmaから購入し；抗ＢｒｄＵ抗体をBD Biosciencesから購入し；MitoTracker（登録商標）Green FM及び二次抗体（ヤギ抗マウス抗体及びヤギ抗ウサギ抗体Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ５５５又はＡｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ４８８標識）をInvitrogenから購入した。
【０２２７】
免疫蛍光法（ＩＦ）。
スライド上に乗せた細胞を、２％のＰＦＡで固定し、そして０．５％のトリトンＸ−１００で透過処理した。スライドを、ブロッキングバッファー（ＢＳＡ５％；ＰＢＳ １ｘ）中で１時間インキュベートし、次いで、一次抗体と共に１時間インキュベートした。二次抗マウス又は抗ウサギ抗体であるＡｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ５５５又はＡｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ４８８標識を利用した。ＤＮＡを、１０ｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、そして、画像解析を、Perkin-Elmer Ultraview RS Nipkow-回転盤共焦点顕微鏡を使用しておこなった。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ分析のために、２００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＦＭを、固定化／透過処理細胞に加え、そして、１時間インキュベートした。
【０２２８】
プローブ標識と変性。
ＦＩＳＨのためのＤＮＡプローブを、市販のキット（Ａｔｔｏ４２５／Ａｔｔｏ４８８／Ａｔｔｏ５５０ ＮＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット、Jena Bioscience）を使用した、Ａｔｔｏ４２５−ｄＵＴＰ、Ａｔｔｏ４８８−ｄＵＴＰ、又はＡｔｔｏ５５０−ｄＵＴＰを組み込む、ＰＣＲ産物のニックトランスレーションによって標識した。４０ｎｇの標識プローブを、４００ｎｇの超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（Sigma）及びハイブリダイゼーションバッファー（２ｘ ＳＳＣ ｐＨ７．０中に５０％のホルムアミド、１０％の硫酸デキストラン）と混合した。ハイブリダイゼーション混合物を、８０℃にて１０分間変性させ、次いで、３７℃にて３０分間、保持した。
【０２２９】
修飾３Ｄ−ＦＩＳＨと３Ｄ−ＦＩＳＨ結合ＩＦ。
スライド上に乗せた細胞を、２％のＰＦＡで固定し、そして０．５％のトリトンＸ１００で透過処理した。次いで、細胞を、５０％のホルムアミド（ｐＨ＝７．０）／２ｘ ＳＳＣ中でＲＴにて３０分間インキュベートし、そして７０％のホルムアミド／２ｘＳＳＣ中で７５℃にて５分間変性した。４０ｎｇのプローブ（単独のプローブ又は混合物）を用いて、３７℃にて１６時間、ハイブリダイゼーションをした。２ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣ、次いで、０．１ｘＳＳＣ中でスライドを洗浄した後、ＤＮＡを、１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２及び４０ｎｇのプローブ（単独のプローブ又は混合物）で染色し、そして画像解析を、回転盤Perkin Elmer共焦点顕微鏡を使用しておこなった。飽和状態での実験を、２００ｎｇのプローブを用いておこなった。必要なときには、スライド上の固定／透過処理細胞を、ＲＮＡｓｅＡ（１００μｇ／ｍｌ、Roche）、ＲＮＡｓｅＨ（１００Ｕ／ｍｌ、ＮＥＢ）又はＤＮＡｓｅＩ（１００Ｕ／ｍｌ、Invitrogen）で３７℃にて１時間、処理した。２つ以上のヌクレアーゼを使用するとき、酵素を、同時に添加するか、又は第二のヌクレアーゼを、第一のヌクレアーゼとのインキュベーションと、続くＰＢＳでの３回の洗浄の後に添加し、そして３７℃にて１時間さらなるインキュベーションをおこなった。３Ｄ−ＦＩＳＨ結合ＩＦのために、ハイブリダイゼーション及び０．１ｘＳＳＣでの洗浄の後に、免疫蛍光法手順を適用した。
【０２３０】
ＢｒｄＵの組み込み。
スライド上に乗せた細胞を、１００μΜのＢｒｄＵの存在下で１０分間インキュベートし、次いで、すぐに２％のＰＦＡ（１０分間）中で固定し、４ＮのＨＣｌ及び０．５％のトリトンＸ−１００で１０分間処理し、そして１００ｍＭのホウ酸ナトリウムによって３０分間中和した。細胞を、ＰＢＳ中の５％のＢＳＡでブロッキングし、そして０．５％のトリトンＸ１００で透過処理した26。ＢｒｄＵを、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫染色によって検出した。ＤＮＡを、１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、そして、画像解析を、回転盤Perkin Elmer共焦点顕微鏡を使用しておこなった。
【０２３１】
ＦＩＳＨ結合ＢｒｄＵ。
スライド上に乗せた細胞を、２％のＰＦＡで固定し、そして０．５％のトリトンＸ１００で透過処理した。変性を、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭの塩化カリウム、５％のグリセロールを含むバッファーを使用して９５℃にて８分間おこなった。スライドを、０．１ｘＳＳＣ中で洗浄し、７０％、９０％、及び１００％のエタノール中で一連の脱水をし、そして最後に風乾した27。ハイブリダイゼーションを３７℃にて一晩おこなった。２ｘＳＳＣ、次いで０．１ｘＳＳＣ中でスライドを洗浄した後、スライドを、ブロッキングバッファー（ＢＳＡ５％；ＰＢＳ １ｘ）中で１時間インキュベートし、次いで、マウス抗ＢｒｄＵ抗体と共に１時間インキュベートした。二次抗マウス抗体Ａｌｅｘａ（登録商標） Ｆｌｕｏｒ５５５又はＡｌｅｘａ（登録商標） Ｆｌｕｏｒ４８８標識を適用した。ＤＮＡを、１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、そして、画像解析を、回転盤Perkin Elmer共焦点顕微鏡を使用しておこなった。
【０２３２】
共焦点取得、３Ｄ再構成像、及び定量化。
共焦点取得を、Apochromat 63x/1.4オイル対物レンズ及びHamamatsu ORCA II ERカメラ（Imagopole, PFID, Institut Pasteur）を備えた回転盤Perkin-Elmer Ultraview RS Nipkow Disk、倒立レーザ走査共焦点顕微鏡Zeiss Axiovert 200Mを使用しておこなった。１．０２４／１．０２４ピクセルの分解能で、細胞の全深度に及ぶｚ軸に沿った２００ｎｍ間隔ごとに、光学的切片を得た。三次元再構成をＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Bitplane）を使用して達成した。蛍光の定量化を、単一撮像フレームコレクション及びImageJ 1.34-sソフトウェア（post-acquisition analysis）を使用しておこなった。ＦＩＳＨ標識細胞小器官の核周囲の配置は、核表面から２μｍ以内に位置するミトコンドリアに相当する。核周囲の３Ｄ−ＦＩＳＨミトコンドリアのパーセンテージは、総３Ｄ−ＦＩＳＨ標識に対して計算した。ｍＲＥＰ陽性及びｍＲＥＰ陰性ミトコンドリアの定量化は、Ｐｏｌγ又はＴＦＡＭ免疫標識領域のいずれかでおこなった。各条件について、同一表面の３００サンプルを分析した。共局在の検討を、ImageJ JACoP plug-inを用いておこなった28。
【０２３３】
統計解析。
データ間の相違の有意性は、対応のない観察に関するにスチューデントｔ検定を使用して判定した。
【０２３４】
ＲＴ−ｑＰＣＲ。
全ＲＮＡを、それぞれ、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen）とＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Qiagen）を使用して、ＨｅＬａ細胞とＩＭＲ９０初代線維芽細胞から単離した。全ＲＮＡを、ＤＮａｓｅＩ（Qiagen）で処理し、次いで、Superscript（登録商標） III逆方向転写酵素（Invitrogen）を使用して逆転写した。リアルタイム定量的ＰＣＲを、Power Sybr Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を使用しておこない、そして、StepOneTM Plus RealTime PCR system（Applied Biosystems）を使用して色素の取り込み率を観察した。３つの生物学的複製物を、各条件に使用した。データを、StepOne Plus RT PCRソフトウェアv2.1及びマイクロソフトExcelによって分析した。ＴＢＰ転写産物レベルを、それぞれの標的の標準化に使用した（＝ΔＣＴ）。リアルタイムＰＣＲのＣＴ値を、２-ΔΔCt法を使用して分析して、発現倍率を計算した（Δ（Δ2ＣＴ）法）29。カスタムプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓオンラインソフトウェア（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus.cgi）を使用して設計した。増幅に使用されるプライマーを、必要により利用可能である。
【０２３５】
表３：ＲＴ−ｑＰＣＲとｑＰＣＲプライマー。ＲＴ−ｑＰＣＲ（上のパネル）及びｑＰＣＲ（下のパネル）のための順方向プライマー及び逆方向プライマーの配列を、（分析された遺伝子も示してある）プローブの名称の後に示す。括弧内の数字は、同じ遺伝子を試験するために使用した別のセットを示している。ペアＡ−Ｂ１は、７Ｓ内に含まれるｍｔＤＮＡ領域を増幅するが、ペアＡ−Ｂ２は、Ｈ鎖の向きに７Ｓを超えた領域を増幅する。参考文献を、最後の列に示す。
【０２３６】
【表２】
2014509862.tif 000003
【０２３７】
Ｂ．結果
改良されたＦＩＳＨ（ｍＴＲＩＰ）によるミトコンドリア亜集団の識別
細胞小器官内のミトコンドリアＤＮＡ及びＲＮＡの動態に関する洞察を得るために、発明者らは、改善された蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、ＤＮＡとＲＮＡ、特にヒト細胞のｍｔＤＮＡとｍｔＲＮＡを同時に標識するｍＴＲＩＰ（Mitochondrial Transcription and Replication Imaging Protocol）と呼ばれる新規アプローチを開発し、そして、３Ｄ共焦点取得（３Ｄ−ＦＩＳＨ）をおこなった。ｍＴＲＩＰは、ＤＮＡ ＦＩＳＨとＲＮＡ ＦＩＳＨ技術の組み合わせであり、そしてそれは、潜在的に巨大分子に対する傷害物質の使用を制限する。この処理中にタンパク質が破壊されないため、そして既存のプロトコールとは対照的に、３Ｄ−ＦＩＳＨは免疫蛍光法と組み合せられた（図１Ｄ〜Ｇ）。したがって、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を同時に観察すること、特に定量的に観察することが、初めて可能になった。そのうえ、蛍光の強さが定量化でき、その結果、単独細胞の分解能でこれらの核酸の相対評価を可能にした。
【０２３８】
ミトコンドリアにおいて一様に分布しているミトコンドリア外膜トランスロカーゼのサブユニット（Yano et al. 2000）であるＴＯＭ２２は、ここではミトコンドリアの質量の指標として使用される。このような関係において、ミトコンドリアは、個々のユニットとして可視化されるか、又は相互接続されたミトコンドリアネットワークの状態で構築される（図１Ｈ）。ＴＯＭ２２免疫蛍光法（immunofluorescence）（ＩＦ）を用いたｍＴＲＩＰプローブの同時標識化は、ミトコンドリア内のＦＩＳＨ標識の分布を評価するためにおこなった。我々は、ミトコンドリアゲノム全体に及ぶ１４種類のプローブの混合物（表１）であるｍＴＯＴが、ヒト細胞においてミトコンドリアネットワーク部分だけを標識化したことを観察した（図１Ｉ）。ｍＴＯＴによるこの標識化は、ミトコンドリア質量中の小構造を指し示し、そしてそれらが、核様体を表しているのだろうことを示唆した（以下を参照のこと）。
【０２３９】
とりわけ、３Ｄ−ＦＩＳＨは、ミトコンドリアの異なった部分に起こった標識化が、主に単独のヒトＨｅＬａ細胞の核周囲の領域に位置していることを明らかにした（図１ａ；７７．７８％±１．７２％の標識化されたミトコンドリアが、核境界から２μｍ以内に位置している）。発明者らが１６．５ｋｂｐのミトコンドリアゲノム全体に及ぶプローブ（１４種類のプローブの等モル量の混合物、ｍＴＯＴと呼ばれる、表１〜２）を使用しており、すべてのミトコンドリアが標識化されると予想していたので、この結果は興味深かった。ｍＴＯＴプローブのハイブリダイゼーション前の、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＡ又はＲＮａｓｅＨ（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに特異的）のいずれか、及びこれらの特定のヌクレアーゼの組み合わせを用いた細胞の処理は、８４％の標識化がＲＮＡを標的としていることを示し、そしてそれは、ＲＮａｓｅＡ存在下での喪失するシグナルに相当する（図１ｂ、ｃ）。さらに、約２３％の標識化は、ＤＮＡ及び／又は構造ＲＮＡに相当したが、なぜなら、それが、併用ＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＨ処理に耐性であったからである。いくつかのヌクレアーゼを用いた処理が標識化の強さを増強するので、これらの値は１００％を超えて累積した。以下を参照のこと。興味深いことに、ＲＮａｓｅＨの存在下で観察された高い蛍光強度（無処理細胞と比較して１．４倍）が、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡ部分の除去で蛍光プローブと対合するＤＮＡが利用可能になることが明らかになった。これらのハイブリッドは、たぶんそれらのＤＮＡ鋳型に結合した転写産物に相当する。ＲＮａｓｅＨと、それに続くＤＮａｓｅＩでのサンプルの処理は、無処理細胞の蛍光レベルを回復させ（図１ｃ）、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＤＮＡ部分が、ＲＮＡ部分の破損後に蛍光プローブと対合したことを確認した。後者の観察、及びＤＮａｓｅＩ処理の効果の見かけ上の不存在は、それが局所的な開放構造に関与していない場合を除き、ｍｔＤＮＡが数量限定で蛍光プローブとの結合に利用可能であることを示している。
【０２４０】
ｍＴＲＩＰ前のプロテイナーゼＫでの処理が、無処理細胞と比較して、大幅なシグナルの増大をもたらし（ｍＴＯＴに対して１５４％、ｍＴＲＡＮＳに対して２０６％、及びｍＲＥＰに対して２０２％、図１、Ｊ及びＫ、最後の２つのプローブは、それぞれＲＮＡとＤＮＡを認識する。以下を参照のこと）、そしてそれは、いくつかのｍｔＲＮＡ及びｍｔＤＮＡが、プローブに接触不可能であるか（なぜなら、前記ｍｔＲＮＡ及びｍｔＤＮＡは、プローブに結合することもできるからである）、又はタンパク質でマスクされていることを示している（図１、Ｊ〜Ｋ）。シグナル強度のこの増大にもかかわらず、ｍＴＲＩＰはタンパク質の検出のための免疫蛍光法に頻繁に組み合わせられるので、プロテイナーゼＫ処理は、ここでは回避した。
【０２４１】
表１．プローブの座標。ＦＩＳＨ実験に使用されるプローブの始点及び終点をミトコンドリアＤＮＡ上で示した（ＮＣ＿０１２９２０．１、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ受入番号が参照番号として使用された）。個々のプローブを、上のパネルに示す。２以上のプローブの混合物とそれらの組成を、以下の個々のパネルに示す。逆方向（Ｌ鎖における転写）であるプローブＮＤ６を除いて、すべてのプローブがＨ鎖の転写の向きを向いている。
【０２４２】
【表３】
2014509862.tif 000004
【０２４３】
３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰは、ミトコンドリアの転写産物プロフィールを標識する。
このアプローチで明らかにされるミトコンドリア亜集団の性質を調査するために、発明者らは、ＤＮＡｓｅＩ又はＲＮＡｓｅＡの存在又は不存在下、ｍＴＯＴと組み合わせたそれぞれの単独の１４種類のプローブを用いてＦＩＳＨをおこなった。発明者らは、各プローブがミトコンドリアネットワーク全体ではなく、ミトコンドリアの特異的なサブセットを認識することを観察し（図２ａ）、そしてそれは、強度だけではなく、標識のサブセットの分布も試験したｍｔＤＮＡ領域の機能によって変化することを示している。それはさらに、ミトコンドリアの亜集団だけが検出可能な量の標的核酸を運んでおり、且つ、ミトコンドリアが機能上、全く類似していないことを示している。飽和実験は、ミトコンドリアのサブセットの標識化が、プローブの限定された濃度に起因しないことを示している（図５）。ヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅＩ又はＲＮＡｓｅＡ）での処理は、ＤＮＡも認識するプローブ４、８、及び１３を除いて、すべてのプローブが、実質的にＲＮＡ標的を認識することを示している（ＤＮＡｓｅＩでの処理後には、それぞれ６５％、９７％及び４７％の蛍光の低減）。
【０２４４】
それぞれのプローブの蛍光測定、及びヌクレアーゼでの処理後の前記蛍光の減少は、１６ＳのｒＲＮＡが標識化の主な対象であることを明らかにした（プローブ１と２、図２ｂ）。強いシグナルはまた、ＮＤ１転写産物に関しても観察されたが、その遺伝子は、Ｈ鎖のさらに下流に位置している（プローブ３、図１０ｃも参照のこと）。しかしながら、ＮＤ１の転写産物レベルは、この遺伝子に特異的なプローブを使用した、他のミトコンドリアｍＲＮＡの転写産物レベルに匹敵した（以下、プローブＮＤ１、図６Ｃを参照のこと）。蛍光標識は、Ｈ鎖の真ん中及び末端に当たるプローブにより明らかに、且つ、次第に減少するが、それは、初期のＨ鎖転写産物に対して後期のもののシグナル量が減少することを示している。
【０２４５】
単独の転写産物の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、他の転写産物の大部分と比較して、１６Ｓが、予想されたとおり11、大過剰に存在しており（図６ａ）、ｍＴＲＩＰによって同定されるＲＮＡレベルと一致し、これにより、ＦＩＳＨデータが正当であることを確認した。さらに、全ミトコンドリア集団を同定するミトコンドリア外膜マーカーである抗ＴＯＭ２２を用いた免疫蛍光法のための１４種類のｍｔＤＮＡプローブのそれぞれに３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰを組み合わせることによって、発明者らは、他の転写産物に比べて、１６ＳのｒＲＮＡ（プローブ１と２）がミトコンドリアのより大きな割合を占めて存在しているだけでなく、他の転写産物と比較して、ミトコンドリアがより大量のこの転写産物を運んでいることを見出した（図７）。
【０２４６】
ＲＴ−ｑＰＣＲでは、１２ＳのｒＲＮＡが１６ＳのｒＲＮＡよりかなり低いレベルで存在しているという３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ結果を確認した（図６ａ）。両ｒＲＮＡが同じプロモーターであるＰＨ１からより低い程度のＰＨ２まで転写されること12（図２ａのスキームを参照のこと）、及びそれらがインビトロにおいて同じレベルで産生される11と以前に報告されていたことを考えれば、このことは予期していなかった。１２ＳのｒＲＮＡの弱いシグナルがプライマー／プローブの接触しにくさに起因する可能性は排除できないが、１２ＳのｒＲＮＡレベルが２つの異なった試験で確認され、そして３つの異なった標的領域を使用していたので、この可能性は疑わしく思える（図８も参照のこと）。低レベルの１２ＳのＲＮＡはまた、初代線維芽細胞においても見られた（図２ｄ、図６ｂ）。図２ａはまた、ＨｅＬａ細胞において、標識化されたミトコンドリアの分布が、試験されたｍｔＤＮＡ領域に応じて変化することも示している。
【０２４７】
実際には、１６ＳのｒＲＮＡは、核周囲の領域に主に位置するミトコンドリア、及びチューブ状である糸状性ミトコンドリアの中に存在しているが、それに対し、Ｈ鎖の最後の３番目の転写産物は、細胞質内によりランダムに分布する断片化ミトコンドリア実体に見える。
【０２４８】
これにより、ミトコンドリアは、１６ＳＲＮＡのプロセシング中の核周囲に群がり、そして、それらは、Ｈ鎖におけるＲＮＡプロセシングが終了するとき、細胞末梢に広がってゆく。この知見は、３Ｄ−ＦＩＳＨ標識化されたミトコンドリア集団の核周囲への局在の定量分析で確認された（それぞれ、プローブ１及び２を用いて標識化されたミトコンドリアの７２．１８±２．２８％及び７２．３５±２．６６％が核周囲の領域に位置した、図９）。そのうえ、定量分析は、例えば、（プローブ６の標的とされる）ＡＴＰ８などのミトコンドリアが運ぶ豊富な転写産物についてもまた、選択的な核周囲への配置（７２．８７±２．６６％）を明らかにした。加えて、ｍｔＤＮＡ（下を見る）を認識するプローブを伴う核周囲のミトコンドリアが観察された（プローブ８及び１３について、それぞれ、８０．６５±１．５４％及び７３．３７±２．２４％、そして、プローブ４について６５．４７±２．２４％）。一般に、３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰによって標識化されたミトコンドリアの核周囲への局在は、ＨｅＬａ細胞において高い（総ミトコンドリア集団の＞５０％）。検出された転写産物のタイプによるミトコンドリア集団の異なった局在もまた、ＩＭＲ−９０初代線維芽細胞において観察されたが、よく見られるミトコンドリアの核周囲への分布もこれらの細胞では現れない（３０〜４７％、すべてのプローブを含む；図２ｃ及び図９）。そのうえ、様々なＲＮＡ及びＤＮＡについて標識化されたミトコンドリアは、ＨｅＬａ細胞よりＩＭＲ−９０繊維芽細胞においてより断片化されているように見えた。
【０２４９】
ミトコンドリア転写産物は、単独遺伝子のプロセシングを受けた転写産物、及びプロセシングされていないポリシストロン性転写産物として存在している1。我々が３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰを用いて観察したＲＮＡ標識化は、これらのタイプの転写産物の一方又は両方を意味し得る。１若しくは複数のｍｔＤＮＡプローブを用いた同時標識化を伴う実験は、未プロセシングのＲＮＡ分子と個々の転写産物を見分けるのに役立つ（図１０）。Ｈ鎖における初期の転写産物は未プロセシングの分子として主に現れたが、後期のＨ鎖転写産物はプロセシングを受けた分子として現れることが多かった。
【０２５０】
さらなるミトコンドリア転写を分析するために、環状ゲノムに沿って均等に分布されたプローブの新しい混合物が使用された（ｍＴＲＡＮＳ：プローブ１、６、及び１１）。これらのプローブはｒＲＮＡ及びｍＲＮＡを標識化し、そして、それらは、ＤＮＡ複製の開始にかかわる領域を認識しない（以下を参照のこと）。ヌクレアーゼの不存在又は存在下での、ｍＴＲＡＮＳを用いたＦＩＳＨ実験では、このプローブセットがＲＮＡだけを検出することを確認した。
【０２５１】
ミトコンドリア核様体マーカーを用いた３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰ標識の共局在（colocalization）
次いで、発明者らは、ミトコンドリア転写産物を標識するｍＴＲＡＮＳと、亜ミトコンドリア構造物を標識化する核様体マーカーのＴＦＡＭ及びＰｏｌγとの間の共局在を調べた。又はＰｏｌγ又はｍＴＲＡＮＳのいずれか、及びＴＦＡＭの免疫染色の間の大規模な共局在（図３Ａ）は、先に示唆されたとおり、ＦＩＳＨによって検出された転写産物が、標識化されたミトコンドリア核様体にほとんど閉じ込められていることを示した。実際には、発明者らは、ここで試験された組み合わせのすべてにおいて大規模な共局在が見られたが、各ケースにおいて、焦点の一部では共局在を示さなかった。ＴＦＡＭ及びＰｏｌγは、それぞれ、８３．８９±４．７％及び９２．６９±４．０％がｍＴＲＡＮＳと共局在し、そしてそれは、これらのマーカーで標識したミトコンドリア核様体の１０分の１未満しか、ｍＴＲＩＰによって検出可能なレベルの転写産物を含まなかったことを示している。逆に、ｍＴＲＡＮＳは、ＴＦＡＭ及びＰｏｌγとそれぞれ、６３．５３±４．１％及び６６．２３±５．１％が共局在し、そしてそれは、ｍＴＲＩＰによって標識されたミトコンドリア転写産物の約３分の１が、（ＴＦＡＭ又はＰｏｌγのいずれかが検出可能なレベルで存在している）核様体の中に位置するように見えなかったことを示している。焦点中の共局在の異なった程度は、核様体の中の著しく異なったＴＦＡＭの量に一致している（Chen, 2005; Shutt, 2010;Spelbrink, 2010; Wai, 2008）。このような関係において、最近、ＴＦＡＭがインビトロにおける転写機構の主要な成分よりも転写活性化因子として機能することがわかった（Shutt et al. 2010）、そして、Ｐｏｌγは、転写活性核様体が低いレベルか、又は検知されないレベルで存在し得る。したがって、ｍＴＲＩＰの分解能の制限の中で、ｍＴＲＡＮＳは、核様体マーカーと主に共局在している。異なったレベルのＦＩＳＨプローブと核様体マーカーの間の共局在は、核様体（ＤＮＡとタンパク質内容物）の多様性につながっているだろう。
【０２５２】
ＦＩＳＨシグナルは、プローブ濃度によって制限されなかった。
【０２５３】
３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰによる標識の強度がプローブの量によって制限されたかどうか調査するために、発明者らは、ＦＩＳＨ実験に関する文献33に記載されている最高値の１つ対応する２００ｎｇのｍＴＯＴを使用して、５倍までプローブ濃度を高めた。高いプローブ濃度が、標識化されたミトコンドリアの割合を高めることはなく、シグナルの絶対値も高めることもなく（図５）、そしてそれが、３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰによるミトコンドリアのサブセットの標識化がプローブの限られた濃度に起因するものではないことを示していることがわかった。
【０２５４】
次いで、発明者らは、ｍＴＯＴ、及び核のＡｌｕ配列を標的とするプローブ3４（プローブＨｓ Ａｌｕ）を用いて細胞を同時標識し、そして、ミトコンドリア核酸の標識化が、核の核酸の標識化を妨げることはなく（図５）、そしてそれが、核周囲領域でのｍｔＤＮＡ標識化の蓄積が、プローブの核への接触不可能に起因しないことを示しているのがわかった。この実験ではまた、ｍｔＤＮＡプローブでの標識化がミトコンドリアの核酸に特異的であることも確認した。
【０２５５】
ＨｅＬａ細胞はまた、ｍｔゲノムのｒＤＮＡ部分に当たるプローブ１、２、及び１４を除いて、ｍＴＯＴ内に存在しているすべてのプローブを含んでいる、ｍＴＯＴΔｒと呼ばれるプローブのさらなる混合物でも標識化された。図５は、ｒＤＮＡプローブの不存在下での標識化の強度がプローブｍＴＯＴと少なくとも同じくらい高いことを示し、そしてそれは、３Ｄ−ＦＩＳＨが大量のｒＲＮＡの存在下であっても、ミトコンドリアｍＲＮＡを標識することを示唆している。発明者らはまた、ｍＴＯＴΔｒ標識化ミトコンドリアが、それがｍＴＯＴ混合物を用いた場合のように、核周囲の領域にほとんど位置しなかったことも観察した。この実験は、ｍｔＤＮＡプローブの異なった組み合わせが異なったミトコンドリア集団を標識することを示唆している。それはまた、核周囲の領域に位置するｍＴＯＴ標識ミトコンドリアが、ｒＲＮＡを含む細胞小器官に主に対応していることを示した。この考えは、１６ＳのｒＲＮＡに関して最も高い標識化を示した個々のプローブを用いた実験で確認した（図２ａ、ｂを参照のこと）。
【０２５６】
１２ＳのｒＲＮＡではなく、１６ＳのｒＲＮＡは、他の転写産物より多量に存在し、且つ、ミトコンドリアの大部分で産生された。
【０２５７】
１６ＳのｒＲＮＡは、インビトロにおいてＨ鎖の他の遺伝子より約１０〜３０倍多く転写される35。ｒＲＮＡ転写産物は、プロモーターのＰＨ１からほとんどが生じ、そして１６Ｓの下流に位置する特定領域で止まり36、それに対し、ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡは、ＰＨ２プロモーターから実質的に生じる、図２ａのスキームを参照のこと。３Ｄ−ＦＩＳＨによって、発明者らは、予想どおり、１６Ｓ ｒＲＮＡ（プローブ１と２）を含む転写産物が他の転写産物より多量に存在するが、驚いたことに、これが１２Ｓ ｒＲＮＡ（プローブ１４、図２）を含む転写産物には当てはまらないことがわかった。この知見は、１６Ｓ及び１２Ｓ ｒＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析によって（図６ａ）、及び１２Ｓ ＲＮＡの領域内の第二の蛍光プローブ（１４−１）によって（図８）確認された。高レベルの１６Ｓ ｒＲＮＡ、しかし、そうでない１２Ｓ ｒＲＮＡは、ヒト初代線維芽細胞においても観察された（図２ｄ、図６ｂ）。
【０２５８】
驚いたことに、Ｈ鎖上の１６Ｓの下流に局在するＮＤ１遺伝子を実質的に対象とするプローブ３についても、高レベルの蛍光が観察された。予想どおり３５、プローブ３のシグナルは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（プローブ１と２）より低かったが、それは、ｒＲＮＡ転写ターミネータの下流に位置する他の遺伝子の少なくとも２倍高かった（図２Ｂ）。ＨｅＬａ細胞において観察されたが、初代線維芽細胞（図２ｄ）において観察されなかった、プローブ３による高い蛍光は、１６Ｓも含む未プロセシング転写産物のターゲッティングに起因するようであった（次節を参照のこと）。蛍光標識の強度は、Ｈ鎖の下流領域（遺伝子ＮＤ２〜ＣＯＩＩＩ）を認識するプローブ４〜７で少なくとも２分の１低下し、そして、最下流領域、ＮＤ３〜ＣｙｔＢまでを対象にするプローブ８〜１２でよりいっそう低下した。興味深いことに、低レベルの標識化は、Ｄループを含む領域を認識するプローブ１３にも見られた。Ｌ鎖上では、プローブＮＤ６が、Ｈ鎖上のプローブ４〜７のものに匹敵する強度を有するＮＤ６遺伝子を含む領域を標識する。これらのプローブがＤＮＡも認識するなら、プローブ４、８、及び１３で検出された転写産物の蛍光強度が実際の値よりさらに低かったことに気付かれなければならない（図２ｂ）。
【０２５９】
所定のＲＮＡの大量産生は、個々のミトコンドリアによる高い転写からか、又は転写状態に入った多数のミトコンドリアからか、或いは、その両方から生じ得る。この態様を調査するために、発明者らは、免疫蛍光法のための３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰのそれぞれの１４種類のｍｔＤＮＡプローブと、ミトコンドリア集団全体を同定するミトコンドリア外膜マーカーである抗ＴＯＭ２２とを組み合わせた。まず最初に、抗ＴＯＭ２２と各プローブとの間の共局在のパーセンテージ（ｐ）を算定した。発明者らは、ミトコンドリアの大部分（４９〜６９％）がプローブ１〜３及びプローブ６〜７で標識化されるが、それに対して、残りのプローブでは、１９〜３８％のミトコンドリアしか標識化されないことがわかった（図７ａ〜ｂ）。これらのデータは、多数のミトコンドリアが、他のミトコンドリア転写産物よりも１６Ｓ〜ＮＤ１ ＲＮＡ及びＣＯＩＩ〜ＣＯＩＩＩ ＲＮＡを持つことを示した。次いで、各プローブに関して、ＴＯＭ２２標識ミトコンドリアの中に存在している蛍光の強度を、ミトコンドリア集団によって担持されるは転写産物の相対量の指標として評価した。したがって、各プローブについて、標識化されたのミトコンドリアのパーセンテージ（値ｐ、上記を参照のこと）に、そのプローブの蛍光強度を掛けた。プローブ１〜３が最高値を有するのに対し、プローブ６〜７に関しては、値は２．５分の１であり、そして残りのプローブについては２０分の１まで低いことが観察された（図７ｃ）。同時に、これらの結果は、１６Ｓそして稀にＮＤ１ ＲＮＡが、他の転写産物に比べてミトコンドリアのより多くの部分を占めているだけではなく、ミトコンドリアが他の転写産物より多量にこれらを担持してもいることを示した。逆に、残りの転写産物は、それらが小量しか存在していないミトコンドリアのわずかな割合しか占めていない。中間的な状況は、ＣｏＩＩ〜ＣＯＩＩＩＲＮＡ（プローブ６〜７）に関して観察されたが、それはミトコンドリアの比較的大きい部分を占めているにもかかわらず、そこには少量しか存在していない。
【０２６０】
未プロセシング及びプロセシングを受けた転写産物の標識化
３Ｄ−ＦＩＳＨ実験の興味深い結果は、ＮＤ１を実質的にカバーしているプローブ３に関する高レベルのＲＮＡ標識化に関係があった（上記を参照のこと）。高レベルＮＤ１標識化は、ターミネータで止まらなかったｒＲＮＡのＰＨ１転写からか、又は特定の長寿命ＲＮＡからもたらされ得るが、ＨｅＬａ細胞において、ＮＤ１転写産物が他のｍＲＮＡより長寿命であることは報告されていなかった37。第一の仮説に一致して、ＮＤ１の標識（プローブ３）のレベルは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（プローブ１〜２）のものに近かった。発明者らは、大量のＮＤ１ ＲＮＡがＰＨ１からの転写の停止漏れから生じうると推論した。３Ｄ−ＦＩＳＨによって標識化されたＮＤ１及び１６Ｓ ＲＮＡが、同じ分子に存在しているか、より一般には、３Ｄ−ＦＩＳＨによるＲＮＡ標識化が、ポリシストロン性前駆体ＲＮＡ及び／又はプロセシングされた転写産物を標的とするか調査するために、発明者らは、同時に２つ又は３つのプローブを用いた３Ｄ−ＦＩＳＨをおこなった。その標識化がプローブ２及び３を用いた標識化は、ほとんど重複し（プローブ２の９２±１．４％がプローブ３と共局在し、そしてプローブ３の８４±１．９％がプローブ２と共局在した、図１０）、そしてそれが、１６Ｓ及びＮＤ１ ＲＮＡが、実質的に同じ分子上、又は同じミトコンドリア実体の等モル量に存在している異なった分子上に位置することが示唆されていることがわかった。このことは、ＮＤ１のすぐ下流の領域を標的としたプローブ４には当てはまらないので、プローブ４は、プローブ２及び３と、それぞれの場合の２３±３．２％と２７±３．２％しか共局在しない、図１０。これにより、３Ｄ−ＦＩＳＨによって標識化された１６Ｓ及びＮＤ１ＲＮＡは、同じ分子に存在していれば、少なくともＨｅＬａ細胞においては、ＰＨ１由来ｒＲＮＡ転写産物の関連部分は終了シグナルで停止するが、ＮＤ１によってプロセシングされるはずである。
【０２６１】
発明者らは、追加のプローブ対を用いた同時標識化をおこなって、ミトコンドリアにおける転写産物の同時存在について確かめた。Ｈ鎖の初めに位置する１２Ｓ ｒＲＮＡを標識するプローブ１４は、同じ転写産物の終わりに位置するＣｙｔＢを標識するプローブ１２と、その５５．６±７％が共局在し、そしてそれが、共局在を示すミトコンドリア実体は、ＰＨ２方向の転写産物の５’及び３’末端、すなわち、完全なＨ鎖転写産物を含んでいるか、或いは、１２Ｓ及びＣｙｔＢのプロセシングされた転写産物が同じミトコンドリア実体上の当モル量に存在していることを示唆していることがわかった（図１０）。Ｈ鎖の後半に局在する狭い領域を対象とするプローブ７及び９を用いた標識化について大きい重複（＞６０％）が観察されもしたが、それは、ほとんどのミトコンドリア実体が両方の転写産物を含んでいること、又はこれらの転写産物が同じ分子に存在していることを示唆している。共局在レベルは、隣接するプローブ９と１０で減少し、それはかなり多様な空間分布をさらに示したが、それは、これらのプローブが異なったミトコンドリア実体又は異なった分子に位置する転写産物のほとんどを標識化したことを示唆している（図１０）。これらの結果は、共局在のパーセント及び試験されたプローブの総蛍光強度を考慮に入れた図１０ｆにまとめられている。定量的な条件の指標にもかかわらず、これらのデータは、プローブ２と３（Ｈ鎖の４分の１の部分に位置する）、同様にプローブ７と９（Ｈ鎖の４分の３の部分に位置する）によって標的とされた転写産物の関連する共局在を確認している。これに対して、データは、プローブ２〜３及び４、並びにプローブ９及び１０によって標的とされた転写産物の不十分な共局在を示したが、それは、これらの転写産物対の大部分が同じミトコンドリアに存在していないことを明らかにしている。結論として、共局在実験は、３Ｈ−ＦＩＳＨプローブによって標識化された転写産物が、未プロセシングＲＮＡ分子、特にＨ鎖における初期転写産物と、プロセシングを受けた個々の転写産物の両方を示したことを強く示唆している。この原理証明は、プロセシングを受けた又は未プロセシングＲＮＡ分子が、共局在実験において適当なプローブ対を使用した、いずれかの着目のミトコンドリア遺伝子を同定できることを示した。
【０２６２】
ミトコンドリア転写産物のｑＰＣＲ分析、又は３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰとＲＴ−ｑＰＣＲ転写産物レベルの間の相関関係
異なったミトコンドリア集団において３Ｄ−ＦＩＳＨで検出される様々な転写産物の割合がミトコンドリアの転写産物レベルと一致しているかどうか調査するために、発明者らは、それぞれのミトコンドリアｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ遺伝子についてｑＲＴ−ＰＣＲ実験をおこなった（図６ａ）。ここで使用されたＦＩＳＨプローブは、それぞれＣＯＩとＮＤ５だけを対象としているプローブ５と１０を除いて、単独遺伝子より広大な領域を対象としているので、３Ｄ−ＦＩＳＨとｑＲＴ−ＰＣＲのデータの直接比較には好適でなかった。それにもかかわらず、分析された他のミトコンドリア遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＦＩＳＨ分析で観察されたものと矛盾しない発現レベル特性を示した。ＮＤ１の転写産物レベルは、この遺伝子に特異的なプローブ（プローブＮＤ１、図６Ｃ）を使用したＦＩＳＨと矛盾しないが、（前項「未プロセシング及びプロセシングを受けた転写産物の標識化」で示唆されたとおり）おそらく未プロセシングｒＲＮＡ転写産物も標識する、より長いプローブ３とは矛盾した。結論として、ミトコンドリア全体及び細胞集団の転写産物を検出するＲＴ−ｑＰＣＲと、一部のミトコンドリアと単細胞レベルでＲＮＡを明らかにするｍＴＲＩＰとの良好な相関関係に気付いた。
【０２６３】
表２．ヒトミトコンドリアゲノム上のプローブの位置。
ミトコンドリアゲノム（ＮＣ＿０１２９２０．１、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ又はＭＩＴＯＭＡＰ受入番号）の所定の位置に存在している遺伝要素の座標を、列１に示す（ＭＩＴＯＭＡＰからのデータ：http://www.mitomap.org/MITOMAP/HumanMitoSeq）。前記要素自体の名称を列２又は３（それぞれ、Ｈ鎖の転写方向に対して順方向又は逆方向）に示す。最後の列３には、提示した領域とハイブリダイズする（単数若しくは複数の）プローブを示す。いくつかのヌクレオチドのハイブリダイゼーションであっても示している。
【０２６４】
【表４】
2014509862.tif 000005
【０２６５】
３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰは、ｍｔＤＮＡの複製開始を明らかにした。
発明者らは、３つのプローブ（１３、４、及び８）がＲＮＡだけではなく、ＤＮＡも検出したことを先に観察した（図２ｂ）。興味深いことに、プローブ１３及び４は、それぞれＨ鎖及びＬ鎖の複製開始領域を含んでおり、それは、これらのプローブで検出されたＤＮＡ領域が複製開始に関与していたことを示唆している。プローブ８は、ＮＤ４領域を含んでいるが、この領域では、Ｌ鎖の追加の複製起点が原子間力顕微鏡を使用して観察され13、そしてその複製起点は、２つの主要な複製起点より低い頻度でしか活性化されないと予想される。これらの３つの起点は、図３ａで図式化されるように、ｍｔゲノム上にほぼ対称的に位置している。３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰで標識されたＤＮＡがＤＮＡ複製の開始に関連しているかどうか評価するために、発明者らは、ミトコンドリアゲノム全体の中でも独特である、プローブ１３が対象とする領域を調査した。なぜなら、それが、本明細書中に使用される用語によると、転写されない配列、特に実質的に転写されない配列を含んでおり、したがって、それがそのＤＮＡ形態だけで存在しているはずであるからである（図３ｂ）。発明者らは、プローブ１３より短い領域を対象とし、且つ、遺伝子を含まない第二のプローブ（１３−１）、及び転写されないＤＮＡだけを対象とした３番目のプローブ（ｍＲＥＰ）を作り出した（図３ｂ）。それぞれの３つのプローブを用いた３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰは、ｍＲＥＰだけが、完全なＤＮａｓｅＩ感受性、且つ、完全なＲＮａｓｅＡ耐性の標識化をもたらしたことを示し（図３ｃ、図１１）、それは、このプローブがＤＮＡを特異的に標識化しことを示唆している。
【０２６６】
ｍＲＥＰによって標識化されたＤＮＡ領域は、すべてのミトコンドリアのゲノム中に通常存在しているので、発明者らは、３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰが、すぐ近くのＤＮＡ複製（ＯＨ起点）の開始のため、このＤＮＡ領域が構造的に接触可能であったミトコンドリアだけを標識化したと推論した。これが当てはまるかどうか評価するために、複製ｍｔＤＮＡに関与する酵素であるＤＮＡポリメラーゼγ（Ｐｏｌγ）の免疫染色を、３Ｄ−ＦＩＳＨ／ｍＴＲＩＰと組み合わせた。ｍＲＥＰは、ＤＮＡ複製及び転写にかかわる因子を含む核様体に関連している。Ｐｏｌγ又はＴＦＡＭを用いた免疫蛍光法と組み合わせたｍＲＥＰ標識化は、これに当てはまることを示し（ｍＲＥＰの７４．４±２．５％がＰｏｌγと共局在、及び７１．７±１．５％がＴＦＡＭと共局在；図３Ｄ〜Ｅ）、そして、ｍＲＥＰ焦点の大部分が優先的にＰｏｌγ及びＴＦＡＭの多い領域に局在化されることも示した（図の３Ｄ〜Ｅ）。そのうえ、Ｐｏｌγの蛍光強度が、ｍＲＥＰ陰性領域と比較して、ｍＲＥＰで標識化された領域においてほぼ倍増することがわかった（細胞ｎ＝３０；ｍｔ領域ｎ＝３００、図３ｄ）。さらに、ｍＲＥＰ陽性のミトコンドリアが、ｍＲＥＰ陰性のミトコンドリアと比較して、より高いレベルのＴＦＡＭ免疫標識に関連していた（図３ｅ）。ＴＦＡＭは、ｍｔＤＮＡの転写と、ｍｔＤＮＡへの結合に関係したタンパク質なので、そのレベルは高いｍｔＤＮＡに関連する14。
【０２６７】
ｍＲＥＰ標識が、ｍｔＤＮＡ含有量の増大に先行する。
発明者らは、ｍＲＥＰ標識化がｍｔＤＮＡ複製開始の指標であれば、それは、ｍｔＤＮＡ含有量の増大を予期できるはずであると推論した。それが当てはまるかどうか評価するために、ｍｔＤＮＡコピー数とミトコンドリア質量を増大させることが知られている38低用量（５０μＭ）のＨ2Ｏ2で、培養中にＨｅＬａ細胞を処理した。予想されたように、Ｈ2Ｏ2での処理は（ミトコンドリアタンパク質ＴＯＭ２２の蛍光強度によって評価された）約３０％のミトコンドリア質量の増大とミトコンドリア発生マーカーＮｒｆ１の発現増加をもたらした（図１２ａ、ｂ）。ｍＲＥＰ標識が、処理の１時間後に約７０％増加し、そのとき、たぶん処理のストレスのため、ＤＮＡ含量は低く、そして、ｍＲＥＰ標識が、処理の３時間後には対照値に戻り、そのとき、本来のミトコンドリアＤＮＡ含有量が回復された。高ｍｔＤＮＡ含有量の２４時間の時点で、ｍＲＥＰ標識は無処理細胞と同じくらい低かった。これにより、ｍＲＥＰ標識化は、ｍｔＤＮＡ含有量が低かったときに高く、ｍｔＤＮＡ含有量が高いとき、本来の値に戻った。そのうえ、ｍＲＥＰ標識は、２時間以内にｍｔＤＮＡ含有量の上昇に続き、ｍｔゲノムを複製するのに必要な時間（総ｍｔＤＮＡ 複製には約９２分間39）と矛盾することなく、ｍＲＥＰがｍｔＤＮＡ複製の開始を検出したとする考えを支持している。低用量のＨ2Ｏ2下で、我々はまた、それぞれ、ｍＴＲＡＮＳプローブによる標識化とＣｙｔＣ発現によって計測される、ミトコンドリアの転写増加があるが、核の転写増加がないことも観察した。
【０２６８】
さらに、発明者らは、ミトコンドリア内への（ＤＮＡ複製の指標である）ＢｒｄＵの組み込み（１０μΜのＢｒｄＵ、２４時間）を調査した。ｍＲＥＰ陽性の実体がＢｒｄＵで同時標識されることがわかり、そして、ｍＲＥＰ標識ミトコンドリアがＤＮＡ複製に関与することを確認した。重要なことには、ｍＲＥＰは、ＢｒｄＵ陽性ミトコンドリアのサブセットだけを標識し、そしてそれは、ｍＲＥＰが完全なｍｔゲノムの広範な又は完了した複製ではなく、むしろＤＮＡ複製の開始に対応する特別な事象を検出したことを示している。同時に、これらのデータは、ｍＲＥＰがｍｔＤＮＡ複製の開始のマーカーであるという概念を支持している。
【０２６９】
このような関係において、ＢｒｄＵ標識の強度は、ミトコンドリアゲノムの複製の始まりの時点でのヌクレオチド類似体の限定された組み込みに合致し、ｍＲＥＰ陰性領域と比較して、ｍＲＥＰ陽性領域において低かった。総合すれば、これらの結果、及びｍＲＥＰによって認識されたｍｔＤＮＡの領域の独特な特徴は、ｍＲＥＰが複製開始を指し示すという概念を支持している。
【０２７０】
ＤＮＡ合成がＯＨからＨ鎖の末端まで進んでいるか、又はそれより早く終了し、７Ｓ鎖の形成に至り、その結果、Ｄループの形成に至るかどうかは、ＦＩＳＨ標識化だけでは解決しなかった。ｍＲＥＰシグナルが実際にｍｔＤＮＡ又は７Ｓ ＤＮＡ、或いは、その両方の標識化に対応するかどうか評価するために、発明者らは、先に記載したとおり、無処理細胞、及び低レベルのＨ2Ｏ2で処理された細胞において、以前に記載されたとおり（Antes et al. 2010）、リアルタイムｑＰＣＲによってＤＮＡの内在レベルを比較した。発明者らは、Ｈ2Ｏ2にさらした後のｍｔＤＮＡ含有量で観察され、且つ、ｍＲＥＰレベルの変化に関係する（以前ｍｔＤＮＡの１２Ｓ領域で評価された）変動が、ｍｔＤＮＡの変動に合致し、そして７Ｓ ＤＮＡのそれには合致せず、そしてそれのレベルは、処理の３時間後にｍＲＥＰシグナルが正常に戻った後も増強し続けることがわかった。これにより、ｍＲＥＰは、ｍｔＤＮＡ複製（Ｄループの形成）の増殖開始と開始失敗の両方を標識化し得るが、ｍＲＥＰの変動は、Ｄループの形成よりむしろ、ｍｔＤＮＡの増殖複製に合致する。
【０２７１】
一部のミトコンドリアだけが、ｍＴＲＩＰによって検出されるＤＮＡ複製の開始及び／又は転写に関与している。
ミトコンドリアネットワークのｍｔＤＮＡプロセシング活性（すなわち、ｍｔＤＮＡの転写及び複製）のフラクションと分布を評価するために、発明者らは、ｍＲＥＰ、ｍＴＲＡＮＳ、及びＴＯＭ２２を用いた同時標識化をおこなった。著しく、ミトコンドリア質量（ＴＯＭ２２免疫標識）の５８．９±２．７％及び１２．９％±１．３％が、それぞれｍＴＲＡＮＳ及びｍＲＥＰで同時標識化された。したがって、ミトコンドリアの有意な部分は、どちらのプローブでも標識化されず、試験された遺伝子の転写及び／又はｍｔＤＮＡの複製にかかわらないか、或いは、標的分子のレベルがこのアプローチでは検出できないことを示唆している。加えて、ｍＲＥＰで標識化した焦点の７１．３±２．９％もｍＴＲＡＮＳ転写産物を担持しているのに対して、ｍＴＲＡＮＳを担持している焦点の８．５±０．８％だけがｍＲＥＰ陽性でもあった。これらの結果は、複製開始にかかわるミトコンドリアの大部分が、ｍＴＲＡＮＳ転写産物も担持しているが、それに対し、検出可能な転写産物を担持しているミトコンドリアの少数だけが、これらの細胞におけるｍｔＤＮＡ複製の開始にもかかわっていることを明らかにした。
【０２７２】
単独細胞中のミトコンドリアの調節Ｄループ領域の不均一標識
発明者らは、ｍＴＲＩＰが、複製開始に関与しているＤＮＡ及び転写産物の含有量によって、単独細胞中で異なったミトコンドリア集団を同定できるなら、（ｍｔＤＮＡ自体の調整に対して機能的であり得る）調節領域において異なったＲＮＡ及びＤＮＡ標識化パターンを有するミトコンドリアを同定することもできるはずであると推論した。この点を評価するために、発明者らは、Ｄループ領域（プローブＰＬ−ＯＨと７Ｓ）及びＨ鎖のプロモーター（ＰH1とＰH2、プローブＰＨ１−２）に位置している３つのプローブを用いてＦＩＳＨをおこなった。図１５Ｂ。彼らは、ヌクレアーゼの存在及び不存在下、単独標識実験と２つのプローブを用いた共局在実験をおこなった。蛍光定量分析法は、プローブＰＬ−ＯＨ（ＤＮＡ複製の向きにｍＲＥＰの下流に見られ、そしてＰＬ及びＯＨ領域を含む）が（ＰＬ転写バブル、ＯＨ複製バブル、又はその両方の一部である）接触可能なＤＮＡ構造を標識することを示した（ＤＮａｓｅＩ感受性標識、図１５Ａ及びＣ）。この最後の可能性は、ＰＬからの転写がＨ鎖複製と組合されていることを示す多くの一連の証拠に一致している（Scarpulla 2008）。
【０２７３】
プローブＰＬ−ＯＨはまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド内のＲＮＡを標識する（ＲＮａｓｅＨの存在下で標識の低減、図１５Ａ及びＣ）。これらのＲＮＡ分子は、Ｒループからなる、すなわち、ＯＨ起点のＤＮＡ合成のためのＲＮＡプライマー（Brown et al. 2008）は、様々な長さのプロセシングされた、並びに未プロセシングの分子、定期的なＬ鎖の転写産物、又はその両方として存在する。興味深いことに、ＤＮＡｓｅＩとＲＮａｓｅＨとの同時処理はまた、細胞がＲＮＡｓｅＡでも処理されたときには見えなくなる残留標識（１９．８９％±１．４％）をもたらす（図１５Ａ）。この実験は、プローブＰＬ−ＯＨがまた、（そのＲＮＡが、ＤＮａｓｅＩの作用によってＤＮＡ部分が取り除かれた後にＲＮａｓｅＡに接触可能になる）ＲＮＡｓｅＨ抵抗性ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標識することも示している。この知見は、Ｒループ内のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの構造がＲＮａｓｅＨへの抵抗性を与え得るという概念（Brown et al. 2008）に一致している。ＲＮａｓｅＡ存在下での標識の強度の増大は、ＲＮＡだけがＰＬ−ＯＨの有意の標的でないが、ＲＮＡ分子がある程度、他の標的の標識化を阻害することを示している。
【０２７４】
ミトコンドリア中のＤループ領域の核酸組成の多様性に対するより詳細な情報は、焦点の直接測定によって提供される（図１５Ｃ）。実際には、ＰＬ−ＯＨ標識化は、わずかな蛍光強度しかない小さい焦点、並びに強力な蛍光の大きい焦点、そして他のプローブとの異なった共局在パターンからなる。ほとんどＤＮａｓｅＩ耐性であり、且つ、ＲＮａｓｅＨ感受性である（図１５Ａ）、大きいＰＬ−ＯＨ焦点は、７Ｓ領域中に位置している下流７Ｓプローブの焦点と実質的に共局在する（図１５Ａ、下のパネル）。しかしながら、ＰＬ−ＯＨと異なって、大きい７Ｓ焦点は、実質的にＲＮａｓｅＨ耐性である。これにより、ＰＬ−ＯＨと７Ｓの大きい焦点は共局在するにもかかわらず、前者のプローブは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを認識するが、後者は、ＲＮＡを認識する。このパターンは、プロモーター近位のＤＮＡ鋳型に結合する転写産物（プローブＰＬ−ＯＨ）、及びプロモーターから遠位の一本鎖ＲＮＡ（プローブ７Ｓ、図１５Ｃ）の標識化と合致するが、ＦＩＳＨの分解能の制限は、標識化された核酸が同じ分子に存在しているかどうかを明らかとはしない。この一般的なタイプの標識化に加えて、たくさんのＤＮａｓｅＩ抵抗性７Ｓ焦点と明らかなＤＮａｓｅＩ感受性ＰＬ−ＯＨ焦点が検出され（図１５Ｃのパターン３）、そしてそれは、ＤＮａｓｅＩの存在下で減少するＰＬ−ＯＨシグナルと合致する。これらの焦点は、ＰＬ−ＯＨレベルで接触可能なＤＮＡ構造を明らかにするが、ＲＮＡは７Ｓのレベルで存在している。そのうえ、ＲＮａｓｅＨ抵抗性ＰＬ−ＯＨ及び７Ｓ焦点が観察され（図１５Ｃのパターン５）、そしてそれは、一方又は両方の遺伝子座のＲＮＡｓｅＨ抵抗性ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、又はＤＮＡ（ＰＬ−ＯＨ）とＲＮＡ（７）からなる。単独細胞中のこの領域のｍＴＲＩＰ標識の多様性は、図１５Ｄにまとめられている。
【０２７５】
ＲＮａｓｅＡでの処理がプローブ７Ｓでの標識化をバックグラウンドレベルまで低減しなかったので、このプローブは、ＲＮＡだけでなく、おそらくそれ以外の標的にも結合する。実際に、ＲＮＡｓｅＨとＲＮａｓｅＡとの同時の処理は、ＲＮａｓｅＡ（ｐ＝０．００１３）だけと比較して、シグナルの有意の減少をもたらすが、それは、いくつかのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドがプローブ７Ｓによって認識されたことを示している（図１５Ａ）。
【０２７６】
興味深いことに、ＲＮａｓｅＡ単独での処理後に数が激減する大きなＰＬ−ＯＨ及び７Ｓ焦点は、ＲＮａｓｅＡとＲＮａｓｅＨでの処理後に、実質的に見えなくなるが（図４Ｃ）、それは、ＲＮＡがこれらの焦点によって同定された構造に不可欠であること、及びＰＬ−ＯＨと７Ｓ焦点が繋がっていることを示している。そのうえ、大きなＰＬ−ＯＨ及び７Ｓ焦点が、ＲＮＡｓｅＨとＤＮａｓｅＩとの同時処理によって見えなくなったのに対し、ＤＮａｓｅＩでの処理は実質的に効果がなく、そしてＲＮａｓｅＨでの処理はＰＬ−ＯＨ焦点だけに影響した。この実験は、少なくとも７Ｓのレベルで、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ及びＤＮＡ残基が、プローブ７Ｓによって標識化された構造だけではなく、プローブＰＬ−ＯＨによって標識化された構造についても形成に不可欠であることを示しており、さらに、２つのプローブによって標識された核酸が繋がっているという概念を支持している。
【０２７７】
興味深いことに、２つのヌクレアーゼの存在下、大きいＰＬ−ＯＨ及び７Ｓ焦点の消滅は、小さい焦点（ＲＮａｓｅＡとＲＮａｓｅＨ）又は小さくなった焦点（ＤＮＡｓｅＩとＲＮＡｓｅＨ）の外観で置き換えられたが、それは、いくつかの共局在を表している（図１５Ｄ）。しかしながら、大きい焦点と異なって、他の焦点の大部分は、共局在しておらず、それは、これらの場合では、２つのプローブで標識化された核酸が繋がっていないことを示している。
【０２７８】
重要なことには、ミトコンドリアの限定された部分だけがプローブＰＬ−ＯＨと７Ｓで標識化されたが（ｍＴＯＴとの同時標識化、未掲載）、それは、非標識ミトコンドリアにおいて、この調節領域では、核酸が、接触可能でなかったか、又は検出可能なレベルでしか接触できなかったことを示している。最後に、共局在実験では、ＰＬ−ＯＨが７Ｓと９９．４４％±０．０５％共局在し、その結果、２つのプローブによって標識化された核酸の間の連結に関する概念がさらに支持されただけではなく、ｍＲＥＰが７Ｓと９９．３３％±０．０７％共局在することも明らかにした。この結果は、ｍＲＥＰ、ＰＬ−ＯＨ、及び７Ｓが、（単数若しくは複数の）不均一な核酸構造ではあるが連結したものをおそらく標識したことを示している。その反面、大部分ではあるが、その全てではない７Ｓは、ｍＲＥＰ（５９．８％±２．６％）やＰＬ−ＯＨ（６９．７％±２．７％）と共局在し、それが、７Ｓはまた、複製開始につながる構造にかかわらないＲＮＡも標識し、Ｌ鎖転写産物の標識と一致することが示されている。この概念に一致して、ＰＬ−ＯＨでの標識の強度は、ｍＲＥＰを用いたものより２．３倍高く、そしてそれは、ＰＬ−ＯＨが、複製バブル中のＤＮＡだけではなく、転写産物も標的とすることに合致している。
【０２７９】
結論として、プローブＰＬ−ＯＨ及び７Ｓは、一部のミトコンドリアにおいて、ＯH ＤＮＡ複製やＬ鎖の転写に関連して現れる、並びに単独細胞中に共存している異なった核酸混合物を有する様々な構造を識別する。
【０２８０】
単独細胞レベルにおけるＰHプロモーター領域のｍｔＤＮＡ転写動態
ｍＲＥＰの反対側では、プロモーターであるＰH1とＰH2の領域に位置している（図１５Ｂ）プローブＰＨ１−２は、ＤＮａｓｅＩに完全に感受性であり、それが、実質的にＤＮＡを標識することを示している（図１５Ｅ）。この領域内の接触可能なＤＮＡは、近くのＯＨ複製バブルに起因してそれが開くことでもたらされるか、又はＰH1／ＰH2転写バブルを意味するだろう。プローブＰＨ１−２と（ＰH1から実質的に転写された１６Ｓ ＲＮＡを標識する）プローブ１との間の圧倒的な共局在は、第二の概念を支持している（図４Ｅ）。そのうえ、プローブ１（図４Ｆ）で検出されたシグナルと合致する、プローブＰＨ１−２を用いて観察された高い強度の蛍光は、プローブＰＨ１−２がｒＲＮＡの大量の転写のためにＰH1で形成された転写バブルにおいてＤＮＡを標識することを示している。ＲＮａｓｅＡ又はＲＮａｓｅＨのいずれかでの処理が標識化の効率を大きく変えることないが、焦点が、無処理対照群と比較して異なった態様を有し、それは、ＲＮＡとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドがこのプローブに結合するように見えないが、それらが、プローブが結合するＤＮＡの構造に影響するだろうということを示している。
【０２８１】
ｍｔＤＮＡの調節領域に位置するプローブの間の標識化の程度における大きな違いに気付いた。ＰＨ１−２の蛍光強度は、ｍＲＥＰに比べて６．９倍であり、そして（１６Ｓの転写産物を指し示す）プローブ１の蛍光強度は、１０倍であり、ｒＲＮＡの強力な（robust）転写と一致していた（図１５Ｆ）。２つのプローブを用いた同時標識化は、４８．７３％±３．４４％のｍＲＥＰ焦点がＰＨ１−２焦点と共局在することを明らかにし、それは、ある場合には、これらの２つの調節領域の接触可能なＤＮＡが連結され得るが、別の場合には、ｒＲＮＡの転写が（ＯH領域での複製を促進する）ＤＮＡ構造の形成から切り離されるという概念に合致しないことを示している。
【０２８２】
これらのデータは、調査した領域の予想される複製及び転写活性と質的及び量的（蛍光強度、図１５Ｆ）に一致している（Chang and Clayton 1985; Clayton 1991 ; Falkenberg et al. 2007; Scarpulla 2008）。これらの知見はまた、単独細胞中におけるｍｔＤＮＡの調節領域の同時に起こるＤＮＡ複製及び転写活性の関する新規情報を提供する。
【０２８３】
Ｃ．考察
ミトコンドリアネットワーク内でのＤＮＡ転写及び複製の動態を理解することは、ミトコンドリア機能を評価する上で不可欠である。ミトコンドリアは、ニューロンではシナプス性ミトコンドリアと非シナプス性ミトコンドリアとの機能差が説明されているが20、単独細胞中の集団として均質であるように見える。発明者らは、ここで、単独細胞中において様々なミトコンドリア集団を同定する新規３Ｄ−ＦＩＳＨアプローチを構築した。これらの集団は、細胞内の局在、それらが持つ転写産物の相対量及びＤＮＡ複製開始におけるそれらのかかわり、並びにｍｔＤＮＡの調節領域のシグナルにおいて異なっており、そしてそれは、ミトコンドリアが、ＤＮＡプロセシング活性において以前に考えられていたよりも不均一であることを示している。
【０２８４】
本明細書中に記載した新規ＦＩＳＨプロトコール（ｍＴＲＩＰ）は、単独細胞内の異なった特性を有する、予期しない様々なミトコンドリア集団を同定する。これらの集団は、それらの細胞内での局在、それらが発現する転写産物の相対量、ＤＮＡ複製の開始、及びｍｔＤＮＡの調節領域のシグナルにおいて異なっており、そしてそれは、ｍｔＤＮＡ合成中のミトコンドリア動態を含め、ミトコンドリアは、ＤＮＡプロセシング活性において、これまでに報告されてきたよりも、さらに高いレベルの多様性を発揮することを示している（Davis and Clayton 1996）。１６Ｓ ｒＲＮＡだけが、ミトコンドリアの大部分を標識化し、且つ、１ユニットあたり高いシグナルを有しているように見えるが、他のプローブはすべて、異なる、時にはわずかなミトコンドリア画分を同定している。このアプローチの分解能の制限の範囲内で、ｍｔＤＮＡ及びＲＮＡの標識化はまた、ｍｔＤＮＡプロセシングにかかわるミトコンドリアの部分構造である核様体にも関連することを示した。発明者らは、ＦＩＳＨと核様体マーカーの間の異なったレベルの共局在について観察したが、核様体中に見られる異なった量の調節タンパク質に合致し、そしてそれは、制御的機能を有している（Chen and Butow 2005; Spelbrink 2010; Shutt et al. 2011）。
【０２８５】
本明細書中に記載の３Ｄ−ＦＩＳＨ法は、所定の転写産物において豊富であるミトコンドリア及びミトコンドリア部分構造を検出したが、それらは、プロセシングを受けた分子、ポリシストロン性ＲＮＡとして存在したか、又はＤＮＡ鋳型へと結合され、後者は転写の進行中に生じることが多い。そのうえ、ＲＮＡｓｅＨ処理は、ＤＮＡ鋳型にまだ結合している、転写の進行中に生じることが多い、（追加シグナルの３８％を占める）別のクラスの転写産物の存在を明らかにした。切断型及び誤ったプロセシングを受けた転写産物も含めた、３Ｄ−ＦＩＳＨによって標識化された様々なＲＮＡ分子は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって検出された完全長の転写産物と比べ、より大規模な情報を提供した。そのうえ、本明細書中に記載した３Ｄ−ＦＩＳＨ法は、ｍｔＤＮＡ動態の詳細な調査を可能にした、なぜなら、３Ｄ−ＦＩＳＨが、単独細胞中の関連ミトコンドリアを標識化したのに対して、ＲＴ−ｑＰＣＲは、全ミトコンドリア及び細胞集団の転写産物レベルを評価しただけだからである。
【０２８６】
一般に、発明者らは、ｍＴＲＩＰを用いて検出されたＲＮＡレベルとＲＴ−ｑＰＣＲとの間に良好な相関関係を見出し、これにより、個別の細胞中におけるミトコンドリアネットワーク内のミトコンドリア転写産物の評価を可能にする本明細書中に記載したＦＩＳＨアプローチが正当であると確認した。
【０２８７】
これらの新規ツールを用いて、発明者らは、意外なことに、ミトコンドリア内で量が多いのは、同じＰＨ１プロモーター11である１６Ｓ、そしてそれよりは少ないが、１２Ｓから生じた２種類のｒＲＮＡであることを見出した。ＲＴ−ｑＰＣＲデータで３Ｄ−ＦＩＳＨの知見を確認し、そして、これがＨｅＬａ細胞及び初代線維芽細胞の両方に当てはまった。重要なことには、１６ＳｒＲＮＡ対１２Ｓ ｒＲＮＡの可変レベルは、肝臓細胞で検出され21、そして、それらのアデニル化形態において、１６Ｓ ＲＮＡは、１２Ｓ ＲＮＡよりも多く、骨格筋に存在しており22、当該分析を用いて検出された１６Ｓ ＲＮＡに対して低レベルの１２Ｓが、生理学的状況に相当することを示している。
【０２８８】
重要なことには、ｍｔＤＮＡプロセシングが、すべての細胞型で同様ではないことを観察した。ＨｅＬａ細胞において、ミトコンドリア運ぶ大量の転写産物（１６Ｓ、ＮＤ１及びある程度までのＡＴＰ８）は、核周囲の領域に主に位置しているのに対して、Ｈ鎖の最後の３番目のそれほど多くない転写産物は、細胞質内やより断片的なミトコンドリア実体内に次第に分散したように見えた。ミトコンドリアの核周囲への局在は、集中的なミトコンドリア転写及び／又はＤＮＡ複製のため、或いは、細胞質からのＣａ2+変動23の緩衝のために必要な分子を核が組み込むのに必要とされ得る。しかしながら、ミトコンドリアの核周囲への局在は、ミトコンドリアの機能不全を特徴とした24、25、筋障害性疾患や神経変性疾患の患者の細胞においても説明された。このような関係において、興味深いことには、ほとんどのミトコンドリア、特に主要な１６Ｓ ＲＮＡを生じさせる細胞小器官の核周囲への分布が、初代線維芽細胞で観察されず、その結果、そうした局在がミトコンドリアの障害に関連している可能性が高まった。更なる相違点が、初代細胞対癌由来細胞株中におけるミトコンドリアＤＮＡを特徴づけする。本明細書中に記載した３Ｄ−ＦＩＳＨ法は、ＨｅＬａ細胞中において高レベルのＮＤ１ ＲＮＡを検出したが、初代線維芽細胞では検出しなかった。この転写産物は、おそらく、プロモーターであるＰＨ１からの停止漏れによるポリシストロン性ＲＮＡとして存在するが、それは、ミトコンドリアのｒＲＮＡ転写停止がＨｅＬａ細胞で変更され得ることを示している。
【０２８９】
本明細書中に記載した３Ｄ−ＦＩＳＨ法によるＤＮＡの標識化は、ＲＮＡ部分の破損後の転写複合体及び複製開始に関与しているＤＮＡのように、局所的な開放構造に限定されたに見える。興味深いことには、以前に原子力顕微鏡を用いて検出され、そして、時々しか活性化されないと予想される13、第三のミトコンドリア複製起点は、おこなった実験で明らかになり、そしてそのミトコンドリアゲノム内での位置がより高い分解能で規定された。これまで、単独細胞におけるミトコンドリアの複製開始の判定は、とらえどころがなかった。重要なことには、発明者らは、プローブが特にＤＮＡ複製開始を特異的に指し示すのに必要な特徴を規定し、そしてｍｔＤＮＡ複製開始の効果的なマーカーである、特異的プローブ、ｍＲＥＰを提案した。したがって、ＤＮＡ複製に関与しているミトコンドリアは、細胞単位で、且つ、生物学関連の実験条件下で検出及び分析される。
【０２９０】
ｍｔＤＮＡ転写と複製開始の標識の組み合わせは、様々な生理学的プロセスにおけるミトコンドリア動態に関する情報を提供する（例えば、細胞周期の中のミトコンドリアＤＮＡ転写及び複製の動態、Chatre & Ricchetti、準備中）。そのうえ、本明細書中に記載した３Ｄ−ＦＩＳＨ法は、ｍｔＤＮＡ動態の変化に対する新しい情報を提供し、そして、ミトコンドリア機能に関連する疾患のスクリーニングに影響を与える新規ツールを示す。
【０２９１】
ｍＴＲＩＰによるｍｔＤＮＡ調節領域の調査では、大域的なミトコンドリア集団に関する現在の知識にしたがって、予想された位置でＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＲＮＡ ＤＮＡハイブリッドを同定し（Chang and Clayton 1985; Clayton 1991 ; Falkenberg et al. 2007; Scarpulla 2008）、これにより、（しかしながら、単細胞レベルで作動する）このアプローチをさらに正当であると確認した。実際には、プローブ対の間の共局在は、複製起点の接触可能なＤＮＡ上流を含み、且つ、一方の側にプロモーターＰLそしてもう一方の側にＰＨ１及びＰＨ２を含む構造を明らかにする。逆に、ＲＮＡは、ＰH1転写産物で予想されるように、１６Ｓ領域において、そしてそれがたぶんＬ鎖の転写産物を表す７Ｓ領域において、ほとんど排他的な標的である。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、Ｒループの形成に合致するＰLプロモーターのレベルで検出され、それは、ＤＮＡ複製のためのＲＮＡプライマーを提供し、それらがＤＮＡ鋳型に結合するＬ転写産物を表す７Ｓのレベルのわずかな程度でもある。そのうえ、プローブ間の共局在の強度は、領域、ｍＲＥＰに関して同程度の標識化を明らかにし、そしてそれは、我々の実験によると、複製開始を示し、且つ、前記領域は、ＯH複製及び下流７Ｓ転写産物を含んでいて、Ｌ鎖転写及び複製が組み合わせられるという概念に一致している。我々のデータは、これらの２つのプロセスが時間的にだけではなく、量的にもつながっていることを示している。これらの態様に加えて、我々の知見は、ミトコンドリア集団におけるｍｔＤＮＡの主要な調節領域の動態に関する新しい情報を提供する。
【０２９２】
第一に、ＯH複製起点とＬ鎖プロモーターの接触可能なＤＮＡは、Ｈ鎖プロモーター内の接触可能なＤＮＡに連結され得（相対シグナル共局在のおよそ半分）、それに対し、２つのタイプの事象は、シグナルの残り半分を切り離すように見え、それは、これらの場合において、ｒＲＮＡ転写がＯH複製／Ｌ鎖転写につながらないことを示している。これらの焦点とｍＲＥＰ焦点（ｍＲＥＰは反対のプロモーターＰLとＰＨ1-2の真ん中に位置し、そして主な複製起点ＯHの上流にも位置する）の共局在は、受身の領域であるよりむしろ、ｍＲＥＰが（主たる複製起点だけではなく、Ｈ及びＬ鎖両方の転写についても）指標又は主要調節因子領域として見えることを示唆している。
【０２９３】
さらに、ｍＴＲＩＰは、単独細胞の中で、一般的なパターン、並びに複製起点のレベルにおいて接触可能なＤＮＡのより高いレベル、又は複製起点のレベルにおけるＲＮＡｓｅＨ抵抗構造、又は７Ｓの転写のレベルにおいて標識されたその他のＤＮＡを示す特徴的パターンを含めた様々な標識化を同定するが、これらの焦点で予想される活性にも一致する。
【０２９４】
結論として、ｍＴＲＩＰによって、ｍｔＤＮＡ転写の動態及び複製の開始が、単細胞レベルにおいて、これまでにない分解能で晒され、そしてそれが、ミトコンドリアの転写と複製の間でのさらなる連結を解明する助けとなり得、且つ、生理学的及び病理学的な条件下での、ｍｔＤＮＡプロセシングのさらなる調査に使用され得る。
【０２９５】
Ｄ．結論
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）複製と転写は、細胞機能にとって重要であるが、これらのプロセスは単細胞レベルで十分に理解されていない。３Ｄ−ＦＩＳＨと呼ばれる、改変蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによって、発明者らは、ヒト細胞においてＤＮＡ複製の開始に関与しているミトコンドリアを同定した。ミトコンドリアはまた、転写プロフィールにしたがって、はっきりと指し示された。これにより、発明者らは、一般的なｍｔＤＮＡプロセシング活性にしたがって、単独細胞におけるミトコンドリア亜集団の存在を記録したが、それは、ミトコンドリアが機能上類似していないかもしれないことを示している。重要なことには、発明者らは、インサイチュハイブリダイゼーション手順、特に免疫蛍光法と組み合わせることができる３Ｄ−ＦＩＳＨプロトコールを提案したが、これにより、初めて、単独細胞中でｍｔＤＮＡ、ｍｔＲＮＡ、及びタンパク質を同時に観察することができ、そして、これまで見逃されてきた顕著な多様性を実証することができた。このアプローチにより、新しい情報が、生理学的及び病態学的プロセス中のｍｔＤＮＡプロセシングの動態に対して提供できる。これらの知見には、ミトコンドリア疾患、特にｍｔＤＮＡ減少及びｍｔＤＮＡ損失に関係する疾患のための診断ツールの最適化のための意味がある。
【０２９６】
最近の改善点7を含めて現在利用可能なツールは、ＤＮＡ複製に関与しているミトコンドリアを同定できないので、それらは、単独細胞中の細胞小器官に関する転写プロフィールを識別できない。そのうえ、連続したＲＮＡ及びＤＮＡの標識化8、並びにＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかとタンパク質9、10の良好な標識化をおこなったが、タンパク質とミトコンドリアＤＮＡやＲＮＡを同時に検出するために、免疫蛍光法をＦＩＳＨと直接組み合わせることはなかった。これにより、ｍｔＤＮＡの転写及び複製の間、着目のタンパク質は、観察されることはなかった。結果として、ｍｔＤＮＡプロセシングが、各細胞内に存在している多くの細胞小器官の間でどのように調整されているか、さらに、疾患の間、このプロセスが亜集団において無秩序になっているかどうかわからないままであった。新規アプローチを使用することで、発明者らは、ｍｔＤＮＡ複製の開始及びＲＮＡプロセシングに関与するミトコンドリア亜集団を同定し、そして、単独細胞中におけるそれらの動態を評価した。これらの知見は、これまで見逃されてきた単独細胞中における著しい多様性を明らかにし、さらに、このことは、どのようにミトコンドリアの機能を評価するかに関して影響を与えることができた。ｍｔＤＮＡの損失に関係する疾患に罹患している場合、変更されたＤＮＡ及びＲＮＡのプロセシングを伴うミトコンドリアは、この新規アプローチで判定できる。
【０２９７】
Ｅ．適用
本発明は、（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織でＤＮＡ、ＲＮＡ又は代謝産物のプロセシングを分析すること、前記（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の動態を分析すること、及び／又は特異疾患を検出することに特に着目するものである。
【０２９８】
先に述べられたとおり、ミトコンドリアの機能不全は、様々な疾患（癌、ミオパシー、神経病理、感染）、及び加齢プロセスに関連していて、そして、多くのミトコンドリア疾患で見られる。
【０２９９】
ミトコンドリア疾患は、世界で年間１１．５人／１０００００人の成人及び子供（〜８０００００人の患者／年）、及び１人／４０００人（２５人／１０００００人）の米国の小児で診断される。
【０３００】
ミトコンドリア疾患は診断するのが難しい。適当な検査センターへの紹介は重要である。もしも経験豊富な医師がかかわれば、臨床的観察、検査室の評価、脳のイメージング、及び筋生検の組み合わせで診断できる。これらの進歩にもかかわらず、多くのケースで特有の診断を受けていない。
【０３０１】
ほとんどの病院が、代謝向けの検査室を持っておらず、したがって、最も基本的な検査だけをおこなう。加えて、正常な結果の血液又は尿の検査室検査一種類だけでは、ミトコンドリア疾患を除外しない。これは、有機酸、乳酸、カルニチン分析、及びアミノ酸分析にとっても言える。筋生検でさえ１００％正確ということはない。
【０３０２】
これまで、ミトコンドリアに対する検査の大部分は、分子生物学的アッセイ（ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、サザンブロット）、生化学（ウエスタンブロット、ＡＴＰ／活性酸素種（ＲＯＳ）／膜電位検出アッセイ）、及び電子顕微鏡的検査（ミトコンドリア微細構造に関するもの）に基づいている。
【０３０３】
例えば、ミトコンドリア疾患の最近の診断ツールには、血液と尿の代謝スクリーニング（全血球評価、乳酸、ピルビン酸、血漿アミノ酸、肝酵素、アンモニア、尿有機酸など）、髄液の代謝スクリーニング（乳酸、ピルビン酸、アミノ酸、細胞数、グルコース、タンパク質）、全身性病変の特徴づけ（心エコー図、眼科検査、脳ＭＲＩ、心電図、聴覚検査）、臨床神経遺伝学的評価（核型、小児神経学相談、脆弱Ｘ染色体検査、遺伝子相談）が含まれる。
【０３０４】
したがって、ミトコンドリア疾患及びミトコンドリア機能不全の診断プロトコールに含まれるための、簡便で、信頼でき、且つ、迅速な方法及びツールに対するニーズが存在する。
【０３０５】
加えて、蛍光画像法は、固定化された細胞において、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、個別にミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ（ｍｔＲＮＡ）、及び免疫蛍光法（ＩＦ）によってタンパク質を追跡する。しかしながら、２つの態様が、ミトコンドリアの蛍光画像法の効力を抑制している。１つ目に、異なった撮像法の組み合わせを使用したとしても（例えば、ＩＦとＲＮＡ ＦＩＳＨ、ＩＦとＤＮＡ ＦＩＳＨ、若しくはＲＮＡとＤＮＡ ＦＩＳＨ）、同じ細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を検出することができない。これは、化学物質の交差反応、及び（単数若しくは複数の）手順中のサンプルの損傷に起因する。例えば、ＩＦとＦＩＳＨを組み合わせたとき、ＦＩＳＨがタンパク質への損傷を引き起こし、そしてそれが、正しく解釈されることを不可能にする、タンパク質の弱い蛍光シグナルにつながる。２つ目に、ｍｔＤＮＡの検出のための従来技術であるＦＩＳＨ手順は、巨大なＤＮＡプローブ（すなわち、３ｋｂｐ超）を含んでおり、それが、高レベルの非特異的な染色を作り出し、これにより、総合的な分解能が低下する。
【０３０６】
したがって、単独細胞の分解能でミトコンドリアＤＮＡの複製開始の追跡を可能にする細胞の新規ＦＩＳＨ標識アプローチの開発は、このレベルで機能不全を明らかにするために特に興味深いものである。加えて、本発明は、さらに、ミトコンドリアＲＮＡの同時検出を可能にし、これにより、転写事象のモニタリングを可能にする。二次元又は三次元の撮像もおこなうことができる。そのうえ、開発したＦＩＳＨ手順は、エピトープ／抗原に損害を与えないので、それはまた、ミトコンドリア及び／又は細胞のタンパク質の同時解析を可能にする。その３Ｄバージョンでは、この技術は、３Ｄ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション結合型免疫蛍光法（３Ｄ−ＦＩＳＨ結合型ＩＦ）と呼ばれ、そして細胞固定、透過処理、ｍｔＤＮＡプローブ設計、大きさ及び蛍光標識化、細胞及びＤＮＡプローブ変性の点で、古典的なＦＩＳＨ手順の抜本的な改変につながる。
【０３０７】
そのうえ、ミトコンドリアＤＮＡの減少は、現在、生検検体に対するリアルタイム定量的ＰＣＲによって検出されるが（優先的に筋生検、なぜなら、この組織中のミトコンドリアの豊富さと、比較的無害な外科的処理によるからである）、これらの検査は、ミトコンドリア集団全体の中に存在している平均したミトコンドリアＤＮＡ含有量を示すだけであり、そして、これは、生検検体に含まれたすべての細胞において、生検検体中に存在している非筋肉細胞を含んでいる。対照的に、本発明は、ｉ）生検検体を避ける頬側サンプルから抽出された細胞を含めたあらゆる単独型の細胞におけるミトコンドリアＤＮＡ転写及び複製における変化；ｉｉ）（ミトコンドリアＤＮＡ分子の結果である）ミトコンドリアの一部分又は全体におけるｍｔＤＮＡ複製と転写における障害；ｉｉｉ）特定の番号における又は検査された細胞の完全におけるｍｔＤＮＡ複製と転写の障害、を検出することができる。現在のところ、ミトコンドリア減少疾患細胞が、それらのミトコンドリアＤＮＡ組成及び活性に等しく又は異なって影響を受けるか否かについての指標は、実際には存在しない。そのうえ、本発明は、同時にミトコンドリアＤＮＡ転写及び複製シグナル（効果的な細胞活性を示す）を示すミトコンドリアの割合を明らかにすることができる、図１４を参照のこと。これらのデータは、ミトコンドリア疾患の進行を追うか又は進行を予期するのに興味深いものであるか又は直接有用であるだろう。
【０３０８】
本発明の方法、本明細書中に記載したプローブ、及び前記プローブを含むか又は本発明の方法を実施できるキットは、（単数若しくは複数の）腫瘍性疾患又は（単数若しくは複数の）癌の分析及び検出にも使用できる。
【０３０９】
本発明は、腫瘍性又は腫瘤（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の検出と診断、特に健常な（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織の中の前記（１若しくは２以上の）細胞又は（１若しくは２以上の）組織を識別するために有用な手段を提供する。
【０３１０】
追実験は、健常な初代細胞の中のｍｔＤＮＡ複製の開始とｍｔ転写産物の緊密な関係を示したが、癌由来細胞株ではなかった（図１４）。これらの実験では、ｍＴＲＡＮＳとｍＲＥＰプローブ（紫色のスポット、図１４）を用いた同時標識化が実施されて、ｍｔＤＮＡ複製の開始とｍｔ転写産物の関係を明らかにする。これらの実験は、ＨｅＬａ細胞において、ミトコンドリア転写産物の約９２％がｍｔＤＮＡ複製に関係しない、そして初代線維芽細胞において、ミトコンドリア転写産物の約２７％だけがｍｔＤＮＡ複製に関係しないことを実証した（ｎ＝３０、３回の独立した実験から）。これらの結果は、他の腫瘍由来細胞株及び初代線維芽細胞において確認された（データ未掲載）。
【０３１１】
したがって、検査された正常細胞では、ＤＮＡ複製において活性なミトコンドリアはまた、転写産物も豊富であったのに対し（効果的なミトコンドリア活性の標徴）、癌細胞株において、これはミトコンドリアのわずかな部分だけに起こった。
【０３１２】
正常細胞中におけるミトコンドリアの強力な（robust）活性が、高レベルのミトコンドリア転写産物によって確認され（癌由来細胞株に比べて１０〜７６倍高い、図１４ｂを参照のこと）、結果、すなわち、癌細胞における低減されたミトコンドリア活性に一致している（「ワールブルク効果（Warburg effect）」として知られている）。
【０３１３】
このようにして、（これまでは決して実施されなかった）ｍＴＲＡＮＳとｍＲＥＰを用いたミトコンドリアの同時標識は、単独細胞中におけるミトコンドリアＤＮＡプロセシングの効率を評価した。
【０３１４】
したがって、本発明の方法は、低減されたミトコンドリア活性の指標、癌細胞の特徴として使用される場合がある。
【０３１５】
細胞におけるｍｔＤＮＡプロセシングの変化は、障害されたｍｔＤＮＡ含有量を伴う。
ｍＴＲＩＰが、ミトコンドリア障害を伴う細胞におけるＤＮＡプロセシングの変化を検出するかどうか評価するために、発明者らは、ｍｔＤＮＡを欠いているＨｅＬａ ｒｈｏ0細胞（Parfait et al. 1998）を調べ、そして、ＨｅＬａ細胞をエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で３日間処理して、それらのｍｔＤＮＡ含有量を低減した（King and Attardi 1996）。とりわけ、ＨｅＬａ ｒｈｏ0細胞は、標準的なＨｅＬａ細胞と比較して、約３分の１のミトコンドリア質量（ＴＯＭ２２免疫標識）しかないが、ｍＴＲＡＮＳ又はｍＲＥＰのいずれかを用いて検出してもシグナルがなく、これらの細胞におけるｍｔＤＮＡ転写及び複製開始の不存在を確認した（図１６Ａ）。対照的に、臭化エチジウムで処理した細胞は、ｍｔＤＮＡ含有量が低減し、通常のミトコンドリア質量を維持し、そして、無処理細胞と比較して、ｍＲＥＰ及びｍＴＲＡＮＳのレベルのそれぞれ９．３倍及び５．９倍の増大を示した（図１６Ａ）。高レベルの転写産物を、ミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡ及びＣｙｔＢのＲＴ−ｑＰＣＲによって確認した。これらのデータは、ｍｔＤＮＡ減少にもかかわらず、臭化エチジウムで処理された細胞がそれらのｍｔＤＮＡ複製と転写活性を劇的に増強し、低いＤＮＡ含量を補う可能性があり、転写に対するこれまでの研究と一致していた（Seidel-Rogol and Shadel 2002）。
【０３１６】
最後に、発明者らはまた、ｍｔＤＮＡ減少症候群（Bourdon et al. 2007）に関連している変異を有する、いくつかの疾患（Rotig and Poulton 2009）、例えば、Ｒｒｍ２ｂ繊維芽細胞の場合のようｍｔＤＮＡが減少した細胞を調べた。
【０３１７】
ＲＲＭ２Ｂで変異した初代線維芽細胞を分析した。ｐ５３誘導性リボヌクレオチドは、ｍｔＤＮＡ減少症候群に関連しており、且つｍｔＤＮＡ合成に不可欠なレダクターゼサブユニットである（Bourdon et al. 2007）。発明者らは、Ｒｒｍ２ｂ繊維芽細胞が、ミトコンドリア質量の４４％の低減にもかかわらず、正常線維芽細胞と比較して、ｍＲＥＰの４倍の低減とｍＴＲＡＮＳシグナルの３倍の低減を示すことがわかった（図１５Ｂ）。
【０３１８】
ここで、低減されたｍｔＤＮＡ転写及び複製は、ｍＴＲＩＰを使用して観察した。加えて、我々は、臭化エチジウムでの処理に続いてｍｔＤＮＡ含有量が減少した細胞においてミトコンドリア転写及び複製シグナルが劇的に増加したことに気付いた。この状況は、誘発されたｍｔＤＮＡ減少を有する細胞で観察されたミトコンドリア転写産物の正常量に類似しているはずである（Seidel-Rogol and Shadel 2002）。さらに、それはまた、特に重度のｍｔＤＮＡ減少を患っている患者からの細胞に典型的であり、そしてそれは、定常レベルのｍｔ転写を示し、且つ、他のｍｔＤＮＡ減少症候群と比較して驚くほど遅い疾患の進行を有する（Barthelemy et al. 2001）。これにより、ｍＴＲＩＰは、定性的及び定量的な変化を明らかにし、そしてそれが、疾患におけるミトコンドリアの機能不全を解明するための追加のツールを提供する。
【０３１９】
総合すれば、３つの異なった細胞型の分析では、ｍＲＥＰ及びｍＴＲＡＮＳ標識化が、ｍｔＤＮＡプロセシングの変化又は損失を同定したが、それは、ミトコンドリア機能に影響し、これにより、質的に及び量的に疾患の状態を観察するためのｍＴＲＩＰが正当であると確認した。
【０３２０】
ミトコンドリア疾患と診断された患者のサンプルにおけるアッセイもまたおこなった。図１７で結果を示す。結論は、ミトコンドリアの質量の低減が、ｍＤＮＡプロセシング活性の低減又は増大のいずれかに関連しているということである。このことは、ミオパシーの観察及び／又は診断の実施のためのツールの可能性を立証する。
【０３２１】
ミトコンドリア関連であることがまだ知られていない疾患と診断された患者のサンプルにおけるアッセイが、疾患をミトコンドリア機能に関連づける目的でおこなわれた。図１８で結果を示す。異なったｍｔＤＮＡプロセシングが、Ｃｏｋａｙｎｅ症候群の「中程度」及び「重度」の形態で観察された。結果として、ｍＴＲＩＰは、（原発性ミトコンドリア変化が知られない疾患を含めて）欠陥のあるミトコンドリア機能を示すいくつかの疾患の検出にも有用であるように見える。
【０３２２】
本発明はまた、有機化合物又は化学化合物、特に薬物の細胞毒性を検査するためにも特に有効なものである。
【０３２３】
実際には、本発明は、心臓、骨格筋、及び肝臓のために、細胞がミトコンドリアを多く含む組織及び臓器をアッセイするのに特に使用される。したがって、薬物又はこれらの組織／臓器に直接的又は間接的に影響する処理による細胞毒性の誘導が、同定でき、そして、ミトコンドリアＤＮＡ転写及び複製を調査することによって評価される。致死的な細胞毒性が、多くの入手可能な検査で評価されるが、本発明は、非致死性及び一時的な細胞毒性（長期間で影響し得るもの）の検出と定量に備える。このために、発明者らは、ＨｅＬａ細胞において、ｍｔＤＮＡ含量を低減することが知られている32緩やかな細胞毒性薬（５０μΜのＨ2０2-）が、数時間の処理後にｍＲＥＰとｍＴＲＡＮＳの増大をもたらし、これらの事象がミトコンドリア質量及びミトコンドリア発生因子の転写の増大に関連していることを示している（図１２Ｂ）。発明者らが（筋や肝臓細胞のようにミトコンドリアが特に豊富でない）ＨｅＬａ細胞を使用したので、この実験は、本発明が細胞の任意型における細胞傷害効果の検出を可能にすることを示している。したがって、ミトコンドリアが豊富な細胞において、より明白な検出が予想される。
【０３２４】
Ｈ2Ｏ2は、弱い酸化ストレスであるとみなされる。また、ｍＴＲＩＰが細胞毒性試験（長期治療のための選択的使用、及び次第に細胞機能を弱める製品、すなわち、抗炎症薬）としてミトコンドリア機能不全を評価するのに使用できるかどうか調査するために、開発したｍＴＲＩＰプロトコールを、ＡＺＴによるＨＩＶ治療のモニタリングに適用した。ｍＴＲＩＰが、ＡＺＴ処理による、ミトコンドリア機能やミトコンドリア質量のレベルでの目に見えないミトコンドリアの変化の検出を予期することを実証した。図１９で結果を示す。ＡＺＴでの長期治療が、特に筋においてミトコンドリア機能に影響することが知られている。ｍＴＲＩＰを用いて、発明者らは、ｍｔＤＮＡ含有量やｍｔ質量が比較的正常な値であるにもかかわらず、ＡＺＴがやがてｍｔＤＮＡプロセシングに大いに影響することがわかった。この実験は、抗ウィルス性（ＡＺＴ）ＨＩＶ治療に関連している進行性筋障害のインビトロ検出における使用のための本発明の有用性を立証する。おそらく、ミオパシーの臨床的所見の前である。
【０３２５】
同様に、影響を受けるｍｔＤＮＡプロセシングを、リファンピシン（臨床抗生物質）によって処理された細胞で実証した。我々は、この処理も細胞毒性ストレスであるとみなす。図２０で結果を示す。
【０３２６】
これらの実験では、本発明が薬物の使用によるミトコンドリアの障害の検出を可能にするという事実が正当であることを確認している。
【０３２７】
これにより本発明はまた、本発明の第一のプローブを用いてミトコンドリアのＤＮＡ複製開始のレベルを検出するステップ、そして本発明の第二のプローブでミトコンドリア転写産物のレベルを検出するステップを含む、細胞における変更されたミトコンドリア活性の検出のための方法にも関係する。
【０３２８】
前記方法は、単独細胞、特に、活性を損なった細胞、例えば、癌細胞などのレベルでの検出のために使用され得る。
【０３２９】
したがって、癌と診断された患者のサンプルにおけるアッセイもまたおこなった。図２１で結果を示す。特定の正常細胞及び癌細胞（血液癌細胞及び固形癌細胞の塗抹サンプル）における標識の検出をおこない、癌細胞対正常細胞の異なったレベルのｍｔＤＮＡプロセシングと判断できた。これらの実験はまた、癌細胞株対正常細胞のミトコンドリア依存性ＡＴＰ産生と判断でき、開発したツールの有用性を実証した。
文献目録
【０３３０】
【化１】
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【０３３１】
【化２】
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【０３３２】
【化３】
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【０３３３】
【化４】
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【０３３４】
【化５】
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【０３３５】
【化６】
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【０３３６】
【化７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ１】
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【図１３Ｃ２】
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【図１３Ｃ３】
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【図１３Ｃ４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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