(57)【要約】本発明は、被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断する方法であって、ｉ）前記被験体由来の生物学的試料中の血小板のミオシン非筋肉性重鎖１０（ＭＹＨ１０）発現レベルを決定する工程を含み、検出可能な血小板のＭＹＨ１０発現レベルが、ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理の指標である、方法、ならびにこのような方法に使用され得る、被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断するためのキットであって、ｉ）前記被験体由来の生物学的試料中の血小板ＭＹＨ１０発現レベルを決定するための少なくとも１つの抗体を含む、キットに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断する方法であって、ｉ）前記被験体由来の生物学的試料中の血小板のミオシン非筋肉性重鎖１０（ＭＹＨ１０）発現レベルを決定する工程を含み、検出可能な血小板のＭＹＨ１０発現レベルがｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理の指標である、方法。
【請求項２】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）に起因する前記病理が、急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を含む群において選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する前記病理が、ＦＰＤ／ＡＭＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する前記病理が、ＣＭＭＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する前記病理が、パリス・トルソー症候群（ＰＴＳ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、血液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ）、パリス・トルソー症候群（ＰＴＳ）などのＲＵＮＸ１経路調節解除に関連する他の解明されていない血小板減少症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および／または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を発生するまたは発生しやすいと考えられる被検体を試験するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、（ｉｉ）前記生物学的試料中の前記血小板のＭＹＨ１０発現レベルを対照と比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照が、健常な被験体由来の生物学的試料の血小板に対応する対照試料中のＭＹＨ１０発現レベルに対応する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｉ）が、前記生物学的試料中の血小板のＭＹＨ１０タンパク質（配列番号１）発現レベルの発現を決定することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｉ）が、前記生物学的試料中の血小板のＭＹＨ１０転写産物（配列番号２）発現レベルの発現を決定することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断するためのキットであって、ｉ）前記被験体由来の生物学的試料中の血小板のＭＹＨ１０発現レベルを決定するための少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドまたは抗体を含む、キット。
【請求項１４】
ｉｉ）前記生物学的試料由来の血小板を精製するための少なくとも１つの手段をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記手段が、血液試料由来の血小板を精製するためである、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、欧州特許出願第１１００１４９９号および２０１１年２月２３に出願された米国仮特許出願第６１／４４５６０８号の優先権を主張し、それらは本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＦＰＤ／ＡＭＬ、ＣＭＭＬおよびＡＭＬなどのＲＵＮＸ１遺伝子の変異に起因する病理を診断するための新規マーカーに関する。
【背景技術】
【０００３】
造血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）が多能性前駆細胞を生じ、次いで血小板を含む全ての種類の成熟血球に分化する階層系により維持される。
【０００４】
前記血小板は層流の間に血管壁付近を移動する小さな無核細胞である。血管損傷に反応して血小板は形態の交代を受け、それにより損傷部位を凝集させ、覆うことができる。血小板前駆細胞と呼ばれる血小板前駆体の形成に関するプロセスにおける巨核球増生の間に血小板は産生され、続いてそれらの血小板前駆体を血液循環に放出する。細胞質ゾル内に分離膜系を形成することによって、巨核細胞は、一つの成熟巨核細胞ごとに数千の血小板の生産を可能にする、膜リザーバを含有する。巨核球増生と呼ばれるこの複雑な分化プロセスはいくつかの調節因子の制御下であり、その調節因子の主な一つはトロンボポイエチン（ＴＰＯ）である。ＴＰＯ欠損マウスは、非常に減少した巨核細胞産生および減少した数の成熟巨核細胞を示すという点で、ＴＰＯは巨核細胞成熟に必要である。いくつかの転写因子もまた、ＧＡＴＡ−１、フレンドオブＧＡＴＡ−１（ｆｒｉｅｎｄ  ｏｆ  ＧＡＴＡ−１）（ＦＯＧ−１）、核因子−赤血球２（ＮＦ−Ｅ２）、ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）およびＦｌｉ−１を含む、巨核球増生に関与する。
【０００５】
ＡＭＬ１、ＣＢＦＡ２、ＡＭＬＣＲ１またはＰＥＢＰ２ａＢとしても知られている、ＲＵＮＸ１は、ＦＰＤ／ＡＭＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）およびまた、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患（すなわち慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ））を含むいくつかのヒト病理に関連している。これらの病理におけるＲＵＮＸ１の関わりは、キメラ融合タンパク質を生じるフレームシフトまたは転座をもたらすナンセンス変異などのＲＵＮＸ１遺伝子の変異に起因する（非特許文献１）。
【０００６】
急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ；ＯＭＩＭ６０１３９９）は常染色体優性疾患であり、罹患したメンバーは、出血傾向の病歴および正常な血小板サイズおよび形態を有する軽度から中等度の血小板減少症、ならびに／またはアラキドン酸に反応する異常な血小板凝集を有する（非特許文献２）。ＦＰＤ／ＡＭＬはＲＵＮＸ１に関連している（非特許文献３）。
【０００７】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は通常、Ｍ１〜Ｍ７のそれらの形態に基づいたＦＡＢ分類に従う。それらはまた、例えば以下の４つの群における遺伝的異常に本質的に基づいた他の基準に基づいて分類され得る：（ｉ）ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ融合遺伝子を有する再発性遺伝的異常ＡＭＬｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を有するＡＭＬ（非特許文献４）；異常骨髄好酸球およびＣＢＦＢ／ＭＹＨ１１再配列を有するｉｎｖ（１６）（ｐ１３；ｑ２２）またはｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）を有するＡＭＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）ＰＭＬ／ＲＡＲＡを有する急性前骨髄球性白血病ＡＰＬ；１１ｑ２３（ＭＬＬ）異常を有するＡＭＬ；（ｉｉ）ＭＤＳもしくはＭＤＳ／ＭＰＤ後またはＭＤＳもしくはＭＰＤの先行を有さない多系列異形成を有するＡＭＬ；（ｉｉｉ）関連するＡＭＬまたはＭＤＳ治療ならびに（ｉｖ）予後がＦＬＴ３−ＩＴＤまたはＮＰＭ１の変異などの癌遺伝子の分子分析に基づく正常な核型を有するＡＭＬの群を含む中の他の未分類ＡＭＬ。
【０００８】
骨髄異形成／骨髄増殖性症候群は１９９９年にＷＨＯにより分類された４つの骨髄疾患：慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、異型慢性骨髄性白血病（ａＣＭＬ）および未分類の骨髄異形成／骨髄増殖性症候群（Ｕ−ＭＤＳ／ＭＰＳ）を含む。慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）は、＞１×１０９／１の絶対的単球増加、フィラデルフィア染色体またはＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子もしくはＰＤＧＦＲｂ遺伝子（例えばＴＥＬ−ＰＤＧＦＲｂ融合遺伝子）を含む融合遺伝子の非存在、２０％より低い骨髄における芽細胞の割合、および全ての３つの系統における様々な程度の異形成を含む４つの定義的特徴を有する。骨髄芽球および前単球は末梢血中の５％未満の有核細胞を含む。およそ半分の患者は一般に、肝肥大および脾腫大、いわゆる疾患の骨髄増殖性形態と関連する高い白血球数で存在する（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｌｙｔｈら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ｖｏｌ．５，ｐ：３７６−３８７１，２００５
【非特許文献２】ＨＯら，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８７，ｐ：５２１８−５２２４，１９９６
【非特許文献３】Ｓｏｎｇら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，ｖｏｌ．２３，ｐ：１６６−１７５，１９９９；Ｍｉｃｈａｕｄら，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９９，ｐ：１３６４−１３７２，２００２
【非特許文献４】Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２３，ｐ：４２５５−６２，２００４
【非特許文献５】Ｋｕｏら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．２３，ｐ：１４２６−３１，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの病理、大部分はＦＰＤ／ＡＭＬの診断において、またはそれらの不均一性（ＣＭＭＬ）の理解において、完全なＲＵＮＸ１遺伝子配列の配列決定をすることが必要である。それにも関わらず、またＦＰＤ／ＡＭＬは非常にまれであるので、この配列決定は非常に大過剰で行われ、多大なコストをもたらす。それらの希少性のために、多くのＦＰＤ／ＡＭＬは診断未確定であることに加えて、ＲＵＮＸ１は遺伝性血小板減少症において系統的に配列決定されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは現在、ＭＹＨ１０の発現が、巨核球増生の間、ＲＵＮＸ１により抑制されることを発見している。本発明者らはさらに、ＲＵＮＸ１ノックアウトマウスにおいて、ＭＹＨ１０発現が成熟巨核細胞において検出されるが、前記ＭＹＨ１０タンパク質は野生型マウスにおいて検出されないことを確立した。
【００１２】
最終的に、本発明者らは、血小板におけるＭＹＨ１０発現の検出、ＲＵＮＸ１不活性化に関連する病理の新規バイオマーカー指標を提供する。
【００１３】
したがって、本発明の第１の目的は、被験体においてｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断する方法であって、ｉ）前記被験体由来の生物学的試料中の血小板のＭＹＨ１０発現レベルを決定する工程であって、検出可能な血小板のＭＹＨ１０発現レベルはｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理の指標である、工程を含む、方法に関する。
【００１４】
有益には、ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する前記病理は、急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を含む群において選択され、好ましくは、前記病理はＦＰＤ／ＡＭＬである。
【００１５】
さらに有益には、前記方法は、急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ）、パリス・トルソー症候群（Ｐａｒｉｓ  Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＴＳ）などのＲＵＮＸ１経路調節解除に関連する他の解明されていない血小板減少症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および／または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を発生すると考えられるか、または発生しやすいと考えられる被験体を試験するためである。
【００１６】
第２の目的において、本発明は、被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断するためのキットであって、ｉ）前記被験体由来の生物学的試料中の血小板ＭＹＨ１０発現レベルを決定するための少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドまたは抗体を含む、キットに関する。
【００１７】
好ましくは、前記キットはさらに、ｉｉ）生物学的試料由来の血小板を精製するための少なくとも１つの手段を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＭＫ分化の間のＭＹＨ９およびＭＹＨ１０の転写産物発現レベルを示す。
【図２】図２は、ＭＫ分化の間のＭＹＨ９およびＭＹＨ１０のタンパク質発現レベルを示す。
【図３】図３は、ｗｔＭＫのものと比べたｍｙｈ９−／−マウス由来のＭＫの倍数性レベルを示す。
【図４】図４は、５０μＭのブレビスタチン、非筋肉性ミオシンＩＩの阻害剤の存在下でｗｔＭＫのものと比べたｍｙｈ９−／−マウス由来のＭＫの倍数性レベルを示す。
【図５】図５は、ＭＹＨ１０遺伝子の構造ならびにＭＹＨ１０プロモーターにおけるＲＵＮＸ１結合部位の相対占有率をＲＵＮＸ１（左）および対照としてＩｇＧ（右）により示す。
【図６】図６は、２つの異なって使用されたＭＹＨ１０プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物ならびにＲＵＮＸ１および／またはＣＢＦβの存在下または非存在下の両方の構築物で得られたルシフェラーゼ発現を示す。
【図７】図７は、ＭＹＨ１０発現に対するＲＵＮＸ１ノックダウンの効果を示す。
【図８】図８は、ｗｔおよびＲｕｎｘ１ＫＯマウスにおけるＭＹＨ１０の発現レベルを示す。
【図９】図９は、健常者（ＲＵＮＸ１変化を有さない）（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）と比べてＲｕｎｘ１変異（ＡＩＩ−１、ＡＩＩ−２、ＢＩＩ−２、ＢＩＩＩ−１およびＤ）を有するＦＰＤ／ＡＭＬ患者におけるＨＳＣ７０と比較したＭＹＨ１０発現を示す。
【図１０】図１０は、ＣＭＭＬ患者および対照として使用した１人の健常者の血小板におけるＭＹＨ１０のウェスタンブロット分析を示す。
【図１１】図１１は、ＣＭＭＬ、ＲＣＭＤ、ＡＭＬ−Ｍ４を有する患者の血小板中のＭＹＨ１０の存在と、反応性単球増加および血小板減少の程度との間の相関関係を示す。
【図１２】図１２は、十分に認識された遺伝性血小板減少を有する患者由来の血小板中のＭＹＨ１０発現を示す。
【図１３】図１３は、高いＭＰＶを有する（Ａ）または正常なＭＰＶを有する（Ｂ）解明されていない血小板減少症の患者由来の血小板中のＭＹＨ１０発現を示す。
【図１４】図１４は、健康なドナーと比べてＲｕｎｘ１変異を有するＦＰＤ／ＡＭＬ患者の血小板中のｍＲＮＡ  ＭＹＨ１０相対発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の態様において、本発明は、被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断する方法であって、ｉ）前記被験体に由来する生物学的試料中の血小板のＭＹＨ１０発現レベルを決定する工程であって、検出可能な血小板のＭＹＨ１０発現レベルが、ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理の指標である、工程を含む、方法に関する。
【００２０】
ＮＭＭＨＣＢ、ＭＧＣ１３４９１３またはＭＧＣ１３４９１４としても知られているＭＹＨ１０（ミオシン非筋肉性重鎖１０、遺伝子番号：４６２８）遺伝子はミオシン非筋肉性重鎖１０をコードする。ＭＹＨ１０は、１９７６個のアミノ酸配列の配列番号１（アクセッション番号：ＮＰ＿００５９５５）を有し、核酸配列の配列番号２（アクセッション番号：ＮＭ＿００５９６４）によりコードされる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「被験体」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００２２】
被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理は、当業者により周知であり、急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および／または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を含む。
【００２３】
特定の実施形態によれば、前記病理は急性骨髄性白血病（ＦＰＤ／ＡＭＬ）である。
【００２４】
別の特定の実施形態によれば、前記病理は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。
【００２５】
さらに別の特定の実施形態によれば、前記病理はパリス・トルソー症候群（ＰＴＳ）である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）の不活性化は、ＲＵＮＸ１  ＤＮＡ結合活性の損失および／またはＲＵＮＸ１トランス活性化活性の損失に対応する（Ｈａｒａｄａら，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０３，ｐ：２３１６−２４，２００４）。このようなＲＵＮＸ１の不活性化は、野生型ＲＵＮＸ１タンパク質（配列番号３）に関連するＬ５６ＳおよびＫ８３Ｅ変異のようなＲＵＮＸ１遺伝子のミスセンス変異に起因するか、またはＴＡＮＧら（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１１４，ｐ：５３５２−６１，２００９）に開示されているものに起因するか、またはＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＡＭＬ１−ＥＴＶ６、ＡＭＬ１−ＭＤＳ１にそれぞれ関与する転座ｔ（８；２１）、ｔ（１２；２１）およびｔ（３；２１）のようなＲＵＮＸ１遺伝子に関わる転座（ＲＯＵＭＩＥＲら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．１７，ｐ：９−１６，２００３）に起因する。このようなＲＵＮＸ１トランス活性化活性の損失は、ＲＵＮＸ１の変異に起因し得るか、またはＦＬＩ１もしくはＡＮＫＲＤ２６などのＲＵＮＸ１リプレッサー複合体の別のタンパク質の変異に起因し得る。
【００２７】
血小板を含む生物学的試料は、当業者により周知であり、血液試料および骨髄試料を含む。好ましくは、生物学的試料は血液試料である。
【００２８】
血液試料などの生物学的試料から血小板を精製するための方法は、当業者により周知であり、一例として、ＮＩＵＬら（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．２（２），ｐ：１０６−１１０，１９９２）、ＧＮＡＴＥＮＫＯら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．４９６，ｐ：２４５−７２，２００９）、ＳＣＨＥＤＥＬ  ＆  ＲＯＬＦ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．４９６，ｐ：２７３−８３，２００９）、またはＣＨＯＩら（Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ．，「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｈｅａｒ−ｓｔｒｅｓｓ  ｒａｎｇｅ」，２０１０）に開示されている。
【００２９】
被験体は健康であってもよいが、本発明の方法は、急性骨髄性白血病になる傾向を有する家族性血小板異常症（ＦＰＤ／ＡＭＬ）、パリス・トルソー症候群（Ｐａｒｉｓ  Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＴＳ）などのＲＵＮＸ１経路調節解除に関連する他の解明されていない血小板減少症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および／または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を発生すると考えられるか、または発生しやすいと考えられる被験体を試験するのに特に有用である。その場合、本発明の方法により、前記被験体は、ＦＰＤ／ＡＭＬ、ＡＭＬおよび／またはＣＭＭＬを発生しているか、または発生しやすい傾向があることを確認できる。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、（ｉｉ）前記生物学的試料中の前記血小板のＭＹＨ１０発現レベルを対照と比較する工程をさらに含む。
【００３１】
本明細書で使用する場合、前記「対照」という用語は、健常な被験体由来の生物学的試料の血小板に対応する対照試料中のＭＹＨ１０発現レベルを指す。前記対照は好ましくは、いくつかの対照生物学的試料中のＭＹＨ１０の平均発現レベルである。本発明者により決定されるように、健常体の血小板中のＭＹＨ１０の検出可能な発現レベルは存在しない。
【００３２】
血小板中のＭＹＨ１０タンパク質のＭＹＨ１０発現レベルの発現を決定するための方法は当業者に周知である。
【００３３】
別の特定の実施形態において、ＭＹＨ１０の発現はＭＹＨ１０タンパク質（すなわち配列番号１）の発現レベルを決定することにより評価される。
【００３４】
このような分析は、ＭＹＨ１０タンパク質に特異的に結合する、抗体（例えば放射性標識した抗体、発色団標識した抗体、フルオロフォア標識した抗体または酵素標識した抗体）、抗体誘導体（例えば基質またはタンパク質もしくはタンパク質／リガンド対（例えばビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質のリガンドとの抗体コンジュゲート）、または抗体断片（例えば単鎖抗体、単離した抗体超可変領域など）を使用して評価され得る。前記分析は、限定されないが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、当業者に周知の様々な技術により評価され得る。
【００３５】
ポリクローナル抗体は、ＭＹＨ１０タンパク質（配列番号１）またはその断片（例えば少なくとも１０または１５個のアミノ酸）を有する、マウス、ウサギまたはヤギなどの適切な動物を免疫化することにより調製され得る。免疫化した動物における抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用したＥＬＩＳＡなどの標準的な技術により経時的にモニターされてもよい。このようなＭＹＨ１０ポリクローナル抗体は、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．，ＬＩＦＥＳＰＡＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＢＩＯＬＯＧＹから、またはＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから既に市販されている。
【００３６】
免疫化後の適切な時間にて、例えば特異的抗体力価が最も高い場合、抗体産生細胞が動物から得られ得、ＫＯＨＬＥＲおよびＭＩＬＳＴＥＩＮ（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ：４９５−４９７，１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（ＫＯＺＢＯＲら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．４，ｐ：７２，１９８３）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（ＣＯＬＥら，Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ：７７−９６，１９８５）またはトリオーマ技術などの標準的な技術によりモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製するために使用され得る。ハイブリドーマを産生するための技術は周知である（概してＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＣＯＬＩＧＡＮら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと）。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡを使用して目的のポリペプチドに結合する抗体に対してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【００３７】
本発明のさらに別の特定の実施形態において、ＭＹＨ１０遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子の新生ＲＮＡなどのそのｍＲＮＡ転写産物（すなわち配列番号２）またはｍＲＮＡ前駆体の発現レベルを決定することにより評価される。
【００３８】
このような分析は、被験体由来の生物学的試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製すること、およびｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを基準ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることにより評価され得る。調製したｍＲＡＮ／ｃＤＮＡは、限定されないが、サザンまたはノーザン分析、定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ）などのポリメラーゼ連鎖反応分析、およびＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）などのプローブアレイを含むハイブリダイゼーション／増幅アッセイにおいて使用され得る。
【００３９】
有益には、ＭＹＨ１０遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルの分析は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（実験的実施形態は米国特許第４，６８３，２０２号に記載している）、リガーゼ連鎖反応（ＢＡＲＡＮＹ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８８，ｐ：１８９−１９３，１９９１）、自家持続配列複製法（ＧＵＡＴＥＬＬＩら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８７，ｐ：１８７４−１８７８，１９９０）、転写増幅系（ＫＷＯＨら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６，ｐ：１１７３−１１７７，１９８９）、Ｑ−Ｂｅｔａレプリカーゼ（ＬＩＺＡＲＤＩら，Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６，ｐ：１１９７，１９８８）、ローリングサイクル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅、続いて当業者に周知の技術を使用した増幅した分子の検出のプロセスを含む。これらの検出スキームは、このような分子が非常に低い数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。本明細書で使用する場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラスマイナス鎖、逆もまた同様）にアニールでき、間に短い領域を含有できる一対の核酸分子として定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で、適切な試薬を用いて、このようなプライマーはプライマーに隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【００４０】
好ましくは、前記プライマーは配列番号６および配列番号７の配列を有する。
【００４１】
第２の態様において、本発明は、被験体におけるｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）不活性化に起因する病理を診断するためのキットであって、ｉ）血小板ＭＹＨ１０発現レベルを決定するために、以前に開示された方法に使用され得る、少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドまたは抗体を含む、キットに関する。
【００４２】
好ましくは、オリグヌクレオチドは少なくとも１つのＰＣＲプライマー、最も好ましくは配列番号６および配列番号７である。
【００４３】
本発明のキットは、生物学的試料由来、好ましくは血液試料由来の血小板を精製するための少なくとも１つの手段をさらに含んでもよい。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「キット」という用語は物質を送達するための任意の送達系を指す。反応アッセイの文脈において、このような送達系は、反応試薬（例えば適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための記載された指示書など）の、ある位置から別の位置までの貯蔵、輸送または送達を可能にする系を含む。例えば、キットは関連反応試薬および／または支持材料を含有する１つ以上のエンクロージャ（例えばボックス）を含む。本明細書で使用する場合、「断片化キット」という用語は、各々、全キット成分のサブ部分を含有する２つ以上の別の容器を含む送達系を指す。容器は一緒にまたは別々に目的とする受容者に送達されてもよい。例えば、第１の容器はアッセイに使用するための酵素を含有してもよく、一方で第２の容器はオリゴヌクレオチドを含有する。「断片化キット」という用語は、これらに限定されないが、連邦食品・医薬品・化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）のセクション５２０（ｅ）下で規制された検体特異的試薬（ＡＳＲ）を含有するキットを包含することを意図する。実際に、各々、全キット成分のサブ部分を含有する２つ以上の別個の容器を含む任意の送達系は「断片化キット」という用語に含まれる。対照的に、「組み合わせキット」とは、単一容器中（例えば、所望の成分の各々を収容する単一ボックス中）に反応アッセイの成分の全てを含有する送達系を指す。「キット」という用語は、断片化キットおよび組み合わせキットの両方を含む。
【００４５】
本発明のキットはまた、本発明の方法の実施を容易に促進するために、１つ以上の試薬、緩衝液、ハイブリダイゼーション媒体、核酸、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、分子量マーカー、酵素、固体支持体、データベース、分配オーダーを計算するためのコンピュータプログラムおよび／またはマルチウェルプレートなどの使い捨て実験器具を含んでもよい。本発明のキットに含まれ得る酵素としては、ヌクレオチドポリメラーゼなどが挙げられる。固体支持体はビーズなどを含んでもよく、一方、分子量マーカーは、コンジュゲート可能なマーカー、例えばビオチンおよびストレプトアビジンなどを含んでもよい。
【００４６】
一実施形態において、キットは、本明細書に記載した方法を実施するための指示書から構成されてもよい。指示書は、紙への印刷、コンピュータ可読媒体などの有形的表現媒体による任意の理解できる形態で与えられてもよい。
【００４７】
以下において、本発明を、アミノ酸配列、核酸配列および実施例を参照してより詳細に記載する。しかし、実施例の詳細により本発明を限定することを意図するわけではない。むしろ、本発明は、本明細書の実施例に明確に述べられていない詳細を含む任意の実施形態に関し、当業者はそれらを過度の努力なしに理解する。
【実施例】
【００４８】
１）巨核細胞分化の間の新規非筋肉性ミオシンＩＩ重鎖発現の同定
造血系幹細胞をトロンボポエチン（ＴＰＯ）の存在下で培養し、ＣＤ４１陽性細胞を培養の６、９および１２日に分類した。ＲＮＥＡＳＹ  ＭＩＮＩまたはＭＩＣＲＯキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｍＲＮＡを単離し、逆転写（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）によりｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって、ＭＫ分化の間にＭＹＨ１０およびＭＹＨ９の発現を分析した。
【００４９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）においてプローブまたはＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて実現できる。ＭＹＨ１０およびＭＹＨ９の遺伝子発現レベルはＨＰＲＴに正規化した。
【００５０】
ウェスタンブロット分析のために、ＭＹＨ１０およびＭＹＨ９のタンパク質発現レベルはＨＳＣ７０に正規化した。タンパク質は、健常な対照の血小板由来、およびＨｅｌａ細胞株由来の、ＴＰＯの存在下で培養の６、９および１２日に巨核細胞から抽出した。ウェスタンブロットは、ＭＹＨ９（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ）、ＭＹＨ１０（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ）およびＨＳＣ７０（ＣＴＲＥＳＳＧＥＮ）に向けられる抗体を使用して以前に記載されている（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００８）ように実施した。
【００５１】
図１は、ＭＫ分化の間のＭＹＨ９およびＭＹＨ１０の転写産物発現レベルを示す（分化の６、９および１２日におけるＣＤ４１細胞）。
【００５２】
図２は、ＭＫ分化の間のＭＹＨ９およびＭＹＨ１０のタンパク質発現レベルを示す（分化の６、９および１２日におけるＣＤ４１細胞）。
【００５３】
その結果は、巨核細胞（ＭＫ）分化の初期段階におけるＭＹＨ１０の発現、ＭＫ成熟および倍数化の間の発現低下を示すが、ＭＹＨ１０発現は成熟ＭＫおよび血小板において検出されなかった（図１および２）。
【００５４】
対照的に、別の非筋肉性ミオシン、ＭＹＨ９の発現レベルは、ＭＫ成熟の間、血小板中で増加することがその発現により確立された（図１および２）。
【００５５】
２）ミオシンＩＩは、有糸分裂／核内分裂（ｅｎｄｏｍｉｔｏｔｉｃ）ＭＫの収縮環においてある程度活性化され、ミオシンＩＩ活性の阻害はＭＫ収縮環におけるアクチン代謝回転を減少させる。
ミオシンＩＩ活性化はその調節軽鎖（ＭＬＣ２）のリン酸化により制御される。１つの抗体を認識するＳｅｒ１９およびＴｈｒ１８リン酸化ＭＬＣ２（ＰＰＭＬＣ２）を、有糸分裂および核内分裂の終期においてミオシンＩＩ活性化を試験するために使用した。
【００５６】
その結果により、終期に試験した合計１０２個の双極性有糸分裂／核内分裂ＭＫ（分裂溝≧７５％細胞を横切る直径）について、ＰＰＭＬＣ２陽性信号が６８．６％の細胞で見られた（データは示さず、３回の独立した実験）ことが確立された。並行して、２４個の多極性核内分裂ＭＫを、レトロ−細胞質分裂（ｒｅｔｒｏ−ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）プロセスの終期または間に試験し、それらのうちの６個のみが、分裂溝の全ての部分またはその一部において局在化したＰＰＭＬＣ２について陽性信号を示した。これらのデータは、ミオシンＩＩが、ＭＫ双極性有糸分裂／核内分裂の間、収縮環においてある程度活性化され、この活性化は多極性核内分裂の間あまり重要でないことを示唆している。
【００５７】
このように、細胞質分裂の達成は収縮環において高いアクチン動力学（集合および分解）を必要とし、この動的挙動はミオシンＩＩ活性により調節されることが示された。
【００５８】
ＭＫにおける収縮環がミオシンＩＩ活性の減少に起因して十分に作用しないかを検証するために、ＣＤ３４＋細胞を増殖因子のカクテルによりＭＫまたは非ＭＫ分化を誘導し、ＧＦＰ−β−アクチン構築物によりトランスフェクトした。ＣＤ４１＋ＧＦＰ＋およびＣＤ４１−ＧＦＰ＋細胞を分類し、双極性有糸分裂または核内分裂においてＦＲＡＰによりアクチン代謝回転を細胞質分裂の終了時に収縮環において測定した。
【００５９】
その結果により、アクチン−ＧＦＰを過剰発現するＭＫについて、白くなる前の全蛍光の５５．７％±１２．８を、６．３±２．５秒のｔ１／２で収縮環において記録した（ｎ＝１５、３回の独立した実験）ことが示される。非ＭＫ細胞の収縮環において、白くなる前の全蛍光の７７．６％±１０．９を、８．６±３．７秒のｔ１／２で記録した（ｎ＝１６、３回の独立した実験）。対照的に、代謝回転の同様の速度を、ＭＫ細胞（５０％の全ての回復した蛍光／ｔ２／１＝４．４２％）または非ＭＫ細胞（５０％の全ての回復した蛍光／ｔ１／２＝４．４０％）の間で測定した。アクチン−ＧＦＰ蛍光回復は、対照骨髄細胞においてよりＭＫの収縮環において低かった（約２８％、ｐ＜０．０００７）という結果は、双極性有糸分裂／核内分裂ＭＫの細胞質分裂の終了時の非動的Ｆ−アクチンのより多いプールの存在を示唆している（データは示さず）。
【００６０】
興味深いことに、我々が、低濃度のブレビスタチン（１２．５μＭ）を有するＣＤ４１＋細胞においてミオシンＩＩ活性を部分的に阻害した場合、非動的Ｆ−アクチンの画分は収縮管において依然として高かった。実際に、ブレビスタチンを有するＭＫの収縮環におけるアクチン−ＧＦＰ蛍光回復は、２．９４±１．３５秒のｔ１／２で５５．７％±１２．８から４２．９％±９．０％まで低下した（ｎ＝８、ｐ＝０．０１）（データは示さず）。
【００６１】
まとめると、これらの結果は、ＭＫの収縮環においてミオシンＩＩ活性が依然として存続するが、収縮環におけるミオシンＩＩ活性の減衰は、細胞質分裂の終了時に非動的Ｆ−アクチン蓄積のプールを増加させ、ＭＫにおいて細胞質分裂が起こらない可能性を増加させることを示唆している。
【００６２】
３）ブレビスタチンによるミオシンＩＩの阻害は溝進入を無効にし、ＭＫ倍数化を増加させる。
ＭＫ核内分裂におけるミオシンＩＩの役割を調査するために、ブレビスタチンを、巨核球増生の間にそのアクチンを阻害するために使用した。ブレビスタチンは６日にＭＫ培養物に加える。ブレビスタチンを添加してから７２時間後、フローサイトメトリーによりＣＤ４１＋／ＣＤ４２＋ＭＫの倍数性レベルを分析した。
【００６３】
その結果により、ブレビスタチンのＭＫ培養物への添加がＭＫ倍数化の顕著な増加を導くことが示される。なぜなら、平均倍数性は、６．２８Ｎから１２．１３Ｎまで（１００μＭブレビスタチン、ｎ＝４、ｐ＝０．００８）および６．４７Ｎから１１．２７Ｎまで（２５μＭ、ｎ＝３、ｐ＝０．０１５；データは示さず）増加したからである。この結果により、ミオシンＩＩの活性化が、ＭＫ倍数性において負の役割を果たし得ることが示唆される。
【００６４】
ミオシンＩＩの阻害が核内プロセスにどのように影響を与えるかをより正確に調べるために、我々は、ブレビスタチン（２５μＭ）で処理したＨ２Ｂ−ＧＦＰを発現するＭＫにおいて核内分裂をモニターするためにリアルタイムビデオ顕微鏡法を使用した。ブレビスタチンで処理したまたはブレビスタチンで処理していない核内分裂ＭＫを３回の独立した実験で撮影した。
【００６５】
その結果により、ブレビスタチンで処理したＭＫが、見かけは正常な中期−後期移行を有することが示される（データは示さず）。しかしながら、細胞質分裂の遅い失敗を示す対照ＭＫと比べて、ブレビスタチンにより処理したＭＫの溝進入はほぼ完全に阻害された。
【００６６】
４）ＭＫ倍数化は、巨核細胞が制限されたＭＹＨ９不活性化を有するマウスにおいて変化されないが、ブレビスタチンによるミオシンＩＩの阻害により増加する。
我々は、ｍｙｈ９−／−マウス由来のＭＫの倍数性レベルはｗｔＭＫのものと異ならないので、ＭＹＨ９がＭＫ倍数化のプロセスにおいて関与しないことを実証した（図３）。
【００６７】
しかしながら、５０μＭのブレビスタチンの存在で、非筋肉性ミオシンＩＩの阻害剤は、ｍｙｈ９−／−マウス（１０．４０から１４．７２まで、ｐ＝０．０１、ｎ＝３）およびｗｔ対照（１０．００Ｎから１３．４０Ｎまで、ｐ＝０．０１、ｎ＝３）の平均倍数性レベルの増加を生じた（図４）。
【００６８】
まとめると、これらの結果により、ＭＹＨ９以外の別のミオシンＩＩが倍数化のプロセスに関与することが示唆される。我々は巨核球増生の初期段階におけるＭＹＨ１０の存在を実証したので、我々は、ＭＹＨ１０が倍数化プロセスに関与する原則的な作用因子であり得ると仮定した。
【００６９】
このように、ＣＤ４１＋ＭＫの倍数性レベルを、骨髄ＭＫについて以前に記載されている（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００９）ように、胎児肝臓を解離した後に直接分析した。簡潔に述べると、造血系幹細胞（系統陰性、Ｌｉｎ−、細胞）を、キットＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣによりＥ１３．５の胎児肝臓から精製し、ＴＰＯおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）を有する無血清培地中で培養した。ブレビスタチンを精製直後に培養物中に加え、ＣＤ４１＋細胞の倍数性レベルを培養の３日に分析した。
【００７０】
５）ｓｈＲＮＡによるＭＹＨ１０のノックダウンはＭＫ増殖を減少させ、ＭＫ倍数化を増加させる。
非筋肉性ミオシンＩＩ重鎖は収縮環の１つの主要な組成であり、中間帯において終期の開始時に現れる。
【００７１】
ＭＹＨ１０が有糸分裂および核内分裂ＭＫの収縮環に正常に動員されるかを調べるために、免疫蛍光を使用して、培養の６日にＣＤ４１＋ＭＫを調査した。
【００７２】
その結果により、終期におけるＭＫの一部分のみが収縮環においてＭＹＨ１０を蓄積したことが示される（データは示さず）。陽性細胞の割合は終期の進行後に増加した。２Ｎおよび４Ｎ移行時に、分裂溝が現れ始めた場合、ＭＹＨ１０は特定の細胞中の中間帯において蓄積し始めた。分裂溝の深さ≦７５％細胞を横切る直径である場合、２４．５％の細胞のみが、中間帯周囲にＭＹＨ１０蓄積を示した（３回の独立した実験で、８５個の終期細胞を計数した）。しかしながら、終期（分裂溝≧７５％）において、５７％の細胞は分裂溝においてＭＹＨ１０蓄積を示す（３回の独立した実験で、１４１個の終期細胞を計数した）。多極性核内分裂ＭＫ（４Ｎから８Ｎまたは＞８Ｎ）に関して、分裂溝の深さ≦７５％細胞を横切る直径である場合、９％のみの細胞が分裂溝において不完全なＭＹＨ１０蓄積を示した（３回の独立した実験で、４２個の終期細胞を計数した）。割合は終期の終わりに２９％まで増加する（分裂溝≧７５％細胞を横切る直径、３回の独立した実験で、１７個の終期細胞を計数した）。これらの結果により、ＭＹＨ１０が収縮環の形成に関与することが示唆される。
【００７３】
上記の全ての結果により、ＭＹＨ９ではなくＭＹＨ１０が核内分裂プロセスにおいて負の役割を果たすことが示唆された。しかしながら、阻害剤は特異性を欠く場合があるので、我々は、ＨＩＶ由来のレンチウイルスにおいてベクター化されたＭＹＨ１０に対するｓｈＲＮＡを利用することによって、より特異的な阻害アプローチを使用した。
【００７４】
ＣＤ３４＋細胞を培養の１日および２日に感染させ、培養の９日にフローサイトメトリーによりＧＦＰ＋／ＣＤ４１＋細胞の倍数性レベルを分析した。ＭＹＨ１０のｓｈＲＮＡはＭＫ倍数性を顕著に増加させた（データは示さず）。平均倍数性レベルは、ＧＦＰ＋＋ＭＫにおいて７．６５Ｎ（対照）から９．８４Ｎ（ｎ＝３、ｐ＝０．０１５）まで増加した。ＭＹＨ９またはＭＹＨ１０がｓｈＲＮＡにより効果的に枯渇していることを確認するために、ＧＦＰ＋細胞集団を感染の４８時間後に分類した。ウェスタンブロット分析により、対照として使用したスクランブル（ＳＣＲ）ｓｈＲＮＡと比較してＭＹＨ１０タンパク質レベルの約４０％の減少が明らかになった。
【００７５】
６）Ｒｕｎｘ１は巨核細胞分化の間にＭＹＨ１０転写を負に調節する。
以前に我々は、ＲＵＮＸ１、マスター造血転写因子が、血小板前駆細胞形成（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００９）に関与するミオシン軽鎖９（ＭＹＬ９／ＭＬＣ２）および核内分裂の停止（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００８）に関与するＰ１９ＩＮＫ４Ｄの転写を直接調節することを実証した。小さな２倍体巨核細胞はｒｕｎｘ１ＫＯマウスの骨髄に存在する。従って、我々は、ｐ１９ＩＮＫ４Ｄの調節による倍数化停止に既に関与しているＲＵＮＸ１がまた、ＭＹＨ１０を直接標的することによって核内分裂の調節にも関与し得ると仮定した。
【００７６】
ＣＨＩＰＭＡＰＰＥＲオンラインソフトウェアによるコンピュータ内でのアプローチを使用して、我々は、ＲＵＮＸ１によるその発現の直接調節を示唆しているＭＹＨ１０プロモーター領域において１つの推定ＲＵＮＸ１転写因子結合部位を同定した。ＲＵＮＸ１がインビボでＭＹＨ１０プロモーターに結合することを実証するために、我々は、ＣｈＩＰアッセイを行い、ＲＵＮＸ１がＭＫ内のこの部位に結合することを示した。
【００７７】
クロマチン免疫沈降アッセイを、以前に記載されている（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００８）ように、コンピュータ内で予測したＲＵＮＸ−１結合部位に対して向けられたプライマーセット（ＭＹＨ１０＿Ａおよび＿Ｂ）を用いて巨核細胞（ＴＰＯとの培養中で９日）において実施した。
【００７８】
図５は、ＭＹＨ１０遺伝子の構造ならびにＭＹＨ１０プロモーターにおけるＲＵＮＸ１結合部位の相対占有率をＲＵＮＸ１（左）および対照としてＩｇＧ（右）により示す。エラーバーは２回の実験の標準偏差を表す。
【００７９】
このＲＵＮＸ１部位の機能的関連性を試験するために、プロモーター活性アッセイを以前に記載されている（Ｇｉｌｌｅｓ  Ｌら，Ｂｌｏｏｄ  ２００８）ように実施した。
【００８０】
簡潔に述べると、ルシフェラーゼアッセイを、野生型ＲＵＮＸ１  ｃＤＮＡを含有するＭＰＩベクターおよびＣＢＦβ  ｃＤＮＡを含有するｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターによるＨＥＬ細胞の一過性トランスフェクションにより実施した。相対ルシフェラーゼ活性は構成的ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対する誘導性ホタルルシフェラーゼ活性の正規化後に示す。正規化発現を、ＭＹＨ１０プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物単独でトランスフェクトしたルシフェラーゼ活性細胞に対して計算した。我々は、２つの異なるＭＹＨ１０プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物：変異ＲＵＮＸ１結合部位を有するｐＭＹＨ１０−ｌｕｃおよびｐＭＹＨ１０ｍｕｔ＿ｌｕｃを使用した。
【００８１】
図６は、２つの異なる使用したＭＹＨ１０プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物：変異ＲＵＮＸ１結合部位を有するｐＭＹＨ１０−ｌｕｃ（黒）およびｐＭＹＨ１０ｍｕｔ＿ｌｕｃ（灰色）を示す。図６はまた、ＲＵＮＸ１および／またはＣＢＦβの存在下または非存在下の両方の構築物で得たルシフェラーゼ発現を示す。ヒストグラムは２回（各々、３連）のうちの１回の代表的な実験を示す。エラーバーは３連の標準偏差を表す。ｐ＜０．０５。
【００８２】
その結果により、その補因子ＣＢＦβを有するｗｔＲＵＮＸ１の過剰発現は、ＨＥＬ細胞における一過性トランスフェクションアッセイにおいてルシフェラーゼ活性を増加させるのに対して、この最後の１つは、ＲＵＮＸ１結合部位の定方向突然変異誘発後、顕著に低下させることが立証された（図６）。
【００８３】
これらのデータは、ＭＹＨ１０がＲＵＮＸ１の直接的な転写標的であることを強く支持する。
【００８４】
７）Ｒｕｎｘ１ノックアウトはＭＹＨ１０発現を増加させ、インビトロおよびインビボにおいてＭＫ倍数化を減少させる。
ＭＹＨ１０がヒト巨核細胞において機能的に負のＲＵＮＸ１標的であることを確認するために、我々は、最近公開されたＲＵＮＸ１のｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＵＮＸ１）（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００８）を用いてＣＤ３４＋細胞においてＲＵＮＸ１をノックダウンした。
【００８５】
次いで細胞をトロンボポエチンの存在下で培養して巨核細胞を得た。以前に示したように、ｓｈＲＮＡ処理はＲＵＮＸ１転写産物において顕著な減少（５０％）を生じたので、ＲＵＮＸ１ハプロ不全を模倣する。
【００８６】
図７はＭＹＨ１０発現に対するＲＵＮＸ１ノックダウンの効果を示す。対照ＣＤ３４＋細胞は、スクランブル（対照）ｓｈＲＮＡまたはＲＵＮＸ１  ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＵＮＸ１）をコードするレンチウイルスで形質導入した。ＴＰＯ単独の存在下での培養の６日に、細胞を分類し、ＲＵＮＸ１およびＭＹＨ１０レベルを、Ｑ−ＰＣＲによりＣＤ４１＋４２＋ＧＦＰ＋細胞において分析した。それらの発現レベルをＰＰＩＡ発現に正規化した。
【００８７】
その結果は、ｓｈＲＮＡで処理したＣＤ４１＋ＣＤ４２＋ＧＦＰ＋細胞（ＭＫ）において、ＭＹＨ１０発現の有意な１．５倍の増加が観測されたことを示し、ＭＹＨ１０がＭＫにおけるＲＵＮＸ１により負に調節されたことを示唆している（図７）。
【００８８】
ＣＤ４１＋ＭＫの倍数性レベルに対するＲＵＮＸ１ノックダウンの効果もまた決定した。対照ＣＤ３４＋細胞は、スクランブル（対照、ＳＣＲ）ｓｈＲＮＡまたはＲＵＮＸ１  ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＵＮＸ１）をコードするレンチウイルスで形質導入し、ＴＰＯおよびＳＣＦの存在下で培養した。倍数性レベルは以前に記載されている（ＧＩＬＬＥＳら，Ｂｌｏｏｄ，２００８）ように培養の９日に分析した。
【００８９】
ＭＹＨ１０発現および倍数性レベルに対するＲｕｎｘ１ノックアウトの効果をインビボモデルにおいて決定した。条件付きのＲｕｎｘ１マウス株をＧＲＯＷＮＥＹら（２００５，Ｂｌｏｏｄ）により成長させた。これらのマウスをマウスＭｘ１−Ｃｒｅマウスと交配し、ＬｏｘＰ部位に隣接しているＲｕｎｘ１遺伝子座の検出を、インターフェロン誘導剤ｐＩｐＣの注入により誘導した（Ｍｘ１はインターフェロン誘導プロモーターであり、ＣｒｅはＬｏｘＰ隣接部位の検出を可能にするＣｒｅ−リコンビナーゼである）。Ｒｕｎｘ１ＫＯを誘導してから５週後、血小板の計数を実施した。Ｒｕｎｘ１ＫＯマウスは、Ｃｒｅ−リコンビナーゼについて陰性であるマウス（約１×１０６個の血小板／ｍｌ）と対照的に血小板減少（２〜３×１０５血小板／ｍｌ）の兆候を示した。ＬｏｘＰ部位に隣接するＲｕｎｘ１遺伝子座のＣｒｅ−リコンビナーゼによる切除を、骨髄前駆細胞（Ｌｉｎ−細胞）から単離したＤＮＡにおいてＰＣＲにより検証した。Ｌｉｎ−細胞をＴＰＯおよびＳＣＦの存在下で、無血清培地中で上記のように培養した。２．５日に、ＣＤ４１＋細胞を分類し、ＭＹＨ１０発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【００９０】
図８はｗｔおよびＲｕｎｘ１ＫＯマウスにおけるＭＹＨ１０の発現レベルを示す。
【００９１】
その結果により、ＭＹＨ１０発現レベルが、Ｒｕｎｘ１ＫＯにおけるＨＰＲＴ発現レベルまで比較的増加することが示される。
【００９２】
倍数性レベルに対するＲｕｎｘ１ＫＯの効果を、Ｇｉｌｌｅｓら（２００８，Ｂｌｏｏｄ）に記載しているように骨髄ＭＫにおいて直接分析した。
【００９３】
その結果により、ＲＵＮＸ１がノックダウンし、ＭＹＨ１０の増加がＭＫの倍数性レベルの減少を生じることが示される（データは示さず）。これらの結果はインビボモデルにおいても確認された。実際に、以前に仮定したように、我々は、ＫＯ  ＲＵＮＸ１マウスの巨核細胞が高いレベルのＭＹＨ１０を有するｗｔマウスのＭＫより低い倍数性レベルを示したことを確認した。
【００９４】
８）ＲＵＮＸ１の生殖細胞変異を有するＦＰＤ／ＡＭＬ患者の血小板中のＭＹＨ１０の発現
２人の健常なドナーの血小板において、ＭＹＨ１０はウェスタンブロットにより検出されなかった。血小板は、特に病理学的試料中での精製時に他の血液細胞により汚染される場合があるので、我々はまた、ＭＹＨ１０が、他の正常な血液細胞：健常なドナー由来の赤血球、赤血球中に枯渇したまたは豊富にある血小板、単球、顆粒球、Ｂリンパ球およびＴリンパ球中で発現するかどうかを調べた。ＭＹＨ９と対照的に、我々は、これらの成熟血球のいずれにおいてもＭＹＨ１０を検出せず（データは示さず）、ＭＹＨ９と比較してＭＹＨ１０の特異的機能に関連し得ることを見出した。反対に、ＭＹＨ１０は陽性対照として使用したＨＥＬ細胞などの分裂細胞株中で容易に検出された。
【００９５】
ＭＹＨ１０が正常な健常被験体の血小板に存在せず、ＭＫ中のＲＵＮＸ１により直接負に調節されるという結果は、ＭＹＨ１０がＲＵＮＸ１の遺伝子変化により患者の血小板中に存在し得ることを示唆している。
【００９６】
この仮説を確認するために、我々はまず、急性骨髄性白血病（ＦＰＤ／ＡＭＬ、ＯＭＩＭ６０１３９９）になる性質を有する家族性血小板異常症に焦点を当てた。ＦＰＤ／ＡＭＬは、異常巨核球増生（ｄｙｓｍｅｇａｋａｒｙｏｐｏｉｅｓｉｓ）、定性的および定量的血小板異常、ならびにＭＤＳおよび／またはＡＭＬを発生する性質により特徴付けられる常染色体優性疾患である。重要なことに、Ｒｕｎｔドメイン内のミスセンス、フレームシフトおよびナンセンス変異、大きな遺伝子内の欠失および単一ヌクレオチド欠失を含む、いくつかの種類のヘテロ接合型生殖細胞系列変異またはＲＵＮＸ１の欠失が同定される。
【００９７】
我々は、ウェスタンブロットにより、３個の系統の血小板中のＭＹＨ１０発現を分析した。変異Ｒ１７４Ｑを有する系統由来の２人の患者のＡＩＩ−１およびＡＩＩ−２、変異Ｒ１３９Ｘを有する系統由来の２人の患者のＢＩＩ−２、ＢＩＩＩ−１、および１つの対立遺伝子上にＲＵＮＸ１欠失（Ｄ）を有する系統由来の１人の患者を調べた。３人の健常な個体由来の血小板（ＲＵＮＸ１変化なし）（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）を陰性対照として使用した。
【００９８】
患者および健常な個体の多血小板血漿（ＰＲＰ）を、９００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離により調製した。血小板は、２０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離によりペレット化した。残っている赤血球（ＧＰＡ＋）は免疫磁性ビーズ技術（ＭＩＬＴＥＮＹＩ，ＢＩＯＴＥＣ）を使用して枯渇させた。免疫ブロット法に関して、２×１０６個の血小板／μｌから溶解物を得て、３０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、ニトロセルロース膜に移した。ＭＹＨ１０（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ）に対する抗体と共にブロットをインキュベートし、ＨＳＣ７０に対する抗体、続いてＨＲＰ結合二次抗体および検出用のＥＣＬ試薬（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＢＩＯＴＥＣＨ）を用いて再プローブした。
【００９９】
図９は、健常な個体（ＲＵＮＸ１変化を有さない）（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）と比較したＲｕｎｘ１変異（ＡＩＩ−１、ＡＩＩ−２、ＢＩＩ−２、ＢＩＩＩ−１およびＤ）を有するＦＰＤ／ＡＭＬ患者におけるＨＳＣ７０と比較したＭＹＨ１０発現を示す。
【０１００】
その結果により、ＭＹＨ１０は全ての５人のＦＰＤ／ＡＭＬ患者の血小板中に存在するが、それは３個の対照試料の１個のみにわずかに発現されたことが示される（図９）。
【０１０１】
対照血小板中のＭＹＨ１０存続の個体間変動性を理解するために、８個の補足対照を試験した。その結果により、これら（Ｃｏ８〜Ｃｏ１１）のうちの４つが検出の閾値において微量のＭＹＨ１０を依然として発現したことが示された。ＭＹＨ１０検出はＲＵＮＸ１変化の分子機構に依存しておらず、配列決定へと逃れることができるＲＵＮＸ１欠失を検出するのに特に興味深い対象となり得る。我々の知る限り、これは、ＭＫ分化の間に正常に抑制されたタンパク質が、病理の間、血小板中に存在することを示す最初の報告である。ＦＰＤ／ＡＭＬは現在認識されているものより広まり得るので、この新たな発見は、常染色体優性血小板減少症をスクリーニングするのに役立ち得る。
【０１０２】
９）ウェスタンブロットによるＣＭＭＬの血小板中のＭＹＨ１０の発現
次に、我々は、確認したＣＭＭＬの１９人の症例、および異なる診断の５人の症例を含む、ＣＭＭＬの疑いのある２４人の患者においてＲＵＮＸ１変化の診断として血小板中のＭＹＨ１０の検出を使用する可能性を調べた［多系列異形成を有する難治性血球減少（ｎ＝３）、単球分化を有する急性骨髄性白血病（ｎ＝１）および反応性単球増加（ｎ＝１）］。実際に、ここ最近、これらのＲＵＮＸ１が慢性骨髄単球性白血病の４０％以下で検出されたことが公表されている。
【０１０３】
したがって、我々は、数人の患者の血小板中のＭＹＨ１０のウェスタンブロット分析を実施し、このようなアプローチが実行可能であることを実証した。上記の段落に記載したようにウェスタンブロット分析を行った。
【０１０４】
図１０は、ＣＭＭＬ患者および対照として使用した１人の健常な個体の血小板中のＭＹＨ１０のウェスタンブロット分析を示す。
【０１０５】
その結果により、ＭＹＨ１０タンパク質発現がこれらの２４人のＣＭＭＬ患者のうちの８人（３３％）の血小板中で検出されたことが示される。
【０１０６】
１０）ＣＭＭＬ患者の血小板中のＭＹＨ１０の存在とＲＵＮＸ１のゲノム状態との間の相関関係
上記の結果により、いくつかのＣＭＭＬ試料がＭＹＨ１０に対して陽性であることが示された。分類したＣＤ１４＋単球または全末梢血単核細胞から抽出したＤＮＡにおいてＲＵＮＸ１のエクソン１〜８を配列決定することによってＲＵＮＸ１状態をこれらの患者について調べた。
【０１０７】
表１は患者の血小板中のＭＹＨ１０発現とＲＵＮＸ１変異状態との間の相関関係を示す。
【０１０８】
表１
ＣＭＭＬ（ｎ＝１９）、ＲＣＭＤ（ｎ＝３）、ＡＭＬ−Ｍ４（ｎ＝１）および反応性単球増加（ｎ＝１）を有する患者における血小板中のＭＹＨ１０の存在、ＲＵＮＸ１状態および血小板数の間の相関関係
【表１】
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【０１０９】
その結果により、ＲＵＮＸ１変異が、血小板ＭＹＨ１０に対して陽性である８人の患者のうちの５人において同定され、血小板ＭＹＨ１０に対して陰性である患者において同定されなかったことが示される。ＭＹＨ１０タンパク質は、汚染に関連する偽陽性を除外するＲＵＮＸ１変異（データは示さない）を有さない血小板ＭＹＨ１０発現に対して陽性である３人の患者の血液から分類したＣＤ１４＋単球およびＣＤ１４−未成熟顆粒球を欠いた。
【０１１０】
ＲＵＮＸ１変異を有さない患者におけるＭＹＨ１０サイレンシングの非存在により、ＰＴＳ患者におけるＦＬＩ１としてＭＹＨ１０リプレッサー複合体のメンバーであるタンパク質中またはＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１およびＩＤＨ１／ＩＤＨ２以外の後成的調節因子中の遺伝子変化が示唆され得る。
【０１１１】
図１１は、ＣＭＭＬ、ＲＣＭＤ、ＡＭＬ−Ｍ４および反応性単球増加を有する患者の血小板中のＭＹＨ１０の存在と、血小板減少の度合いとの間の相関関係の統計的評価を示す（ＭＹＨ１０＋：血小板中にＭＹＨ１０の存在を有する患者；およびＭＹＨ１０−：血小板中にＭＹＨ１０が存在しない患者）。
【０１１２】
その結果により、血小板中のＭＹＨ１０の存在はこれらの８人の患者において血小板減少の度合いと顕著に相関することが示される（表１および図１１）。
【０１１３】
最終的に、ＭＹＨ１０の存在と、ＣＭＭＬ（特にＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＣＢＬおよびＳＲＳＦ２）において頻繁に変異される他の遺伝子の状態との間に顕著な相関関係は見られなかった。
【０１１４】
１１）未知の起源の他の血小板減少症を有する患者の血小板中のＭＹＨ１０検出
血小板中のＭＹＨ１０強発現がＦＰＤ／ＡＭＬまたはＣＭＭＬに対して特異的であるかどうかを決定するために、我々は、十分に同定された遺伝性血小板異常を有する８人の患者の血小板中のその発現を調べた：ベルナール・スーリエ症候群を有する２人の患者、血小板糖タンパク質ＧＰＩｂβ（ＢＳ１）をコードする遺伝子中に１３ヌクレオチド欠失を有する１人、血小板糖タンパク質ＧＰＩＸ（ＢＳ２）をコードする遺伝子中にヘテロ接合型変異（Ｐｒｏ３１Ｓｅｒ）を有する１人；パリス・トルソー症候群、ＦＬＩ１遺伝子（ＰＴＳ１、ＰＴＳ２）の単一対立遺伝子欠失により特徴付けられる血小板減少症を有する２人の患者；灰色血小板症候群（ＧＰＳ１）を有する１人の患者；ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）欠失（ＧＰＩＶＤ１、ＧＰＩＶＤ２）に関連する軽度の血小板減少症を有する２人の患者ならびにＭＹＨ９症候群を有する４人の患者、頭部ドメイン内に局在化した遺伝子変化（ＭＹＨ９−１：Ｖ３２Ｅ）を有する１人および尾部ドメイン（ＭＹＨ９−２；Ｒ１９３３／Ｒｆｓ＊８；ＭＹＨ９−３：Ｄ４２４Ｎ；ＭＹＨ９−４：Ｔ１１５５Ｉ（示さず））における３人。
【０１１５】
図１２は、ベルナール・スリエ症候群（ＢＳ）に対応する十分に同定された遺伝性血小板減少症、パリス・トルソー症候群（ＰＴＳ）、灰色血小板症候群（ＧＰＳ）、ＧＰＩＶ欠失に関連する血小板減少症（ＧＰＩＶＤ）、およびＭＹＨ９変異に関連する血小板減少症（ＭＹＨ９）を有する患者の血小板中のＭＹＨ１０発現のイムノブロット分析を示す。全てのパネルにおいて、陽性対照としてＨＥＬ細胞および負荷対照としてＨＳＣ７０を使用した。
【０１１６】
その結果により、分析した患者の中で高いＭＹＨ１０レベルがパリス・トルソー症候群を有する２人の患者由来の血小板中に見られ、ＭＹＨ１０発現がＲＵＮＸ１変化を有さない血小板減少症において見出され得ることを示す（図１２）。しかしながら、パリス・トルソー症候群はＦＬＩ１ハプロ不全により特徴付けられ、大きな転写複合体の成分として巨核球増生の間にＦＬＩ１およびＲＵＮＸ１が協働することが強力に証明される。さらに、２つの転写因子はＭＹＨ１０プロモーターにおける特有の領域に結合する。これにより、リプレッサー複合体もまた、ＧＡＴＡ１およびＳＣＬを含み、両方共ＦＬＩ１としてＭＹＨ１０プロモーターにおける同じ領域に結合することが推測され、ＭＹＨ１０が、ＧＡＴＡ１変異に関連するＸが結合した巨大血小板性血小板減少症の血小板中に同様に存在するはずであることが示唆される。
【０１１７】
我々はまた、解明されていない遺伝性血小板減少症を有する１１人の患者の血小板中のＭＹＨ１０発現を調べた。
【０１１８】
図１３Ａは、多くのＭＰＶを有する解明されていない遺伝性血小板減少症を有する２つの系統（ＰＧ１およびＰＧ２、各々、３人の患者）由来の患者の血小板中のＭＹＨ１０発現のイムノブロット解析を示す。
【０１１９】
図１３Ｂは、正常なＭＰＶを有する解明されていない血小板減少症を有する患者の血小板中のＭＹＨ１０発現のイムノブロット解析を示す。同じ系統由来の２人の患者が含まれる（ＰＧ３）。ＦＰＤ／ＡＭＬの診断は、２つの単離した症例（Ｉ−１、Ｉ−２）および同じ系統由来の２つの症例（ＰＧ３−１およびＰＧ３−２）を含む、それらのうちの４人で疑わしかった。
【０１２０】
その結果により、多くのＭＰＶを有する解明されていない血小板減少症を有する６人の患者のうち、誰もＭＹＨ１０発現を示さず（図１３Ａ、２系統、ＰＧ１、ＰＧ２）、これらの６人の患者でＲＵＮＸ１変異は検出されなかった。
【０１２１】
その結果はまた、正常な血小板容積を有する常染色体優性血小板減少症を有する５人の他の患者の中で、ＭＹＨ１０が１人の患者の血小板中で検出されたことを示す（図１３Ｂ、Ｉ−２）。この患者に関して、ＲＵＮＸ１遺伝子配列決定によりＲ１７４Ｑ変異を同定した。ＲＵＮＸ１変異は４人の他の患者において同定されなかった。したがって、血小板中のＭＹＨ１０発現は、遺伝性血小板減少症をスクリーニングし、ＡＮＫＲＤ２６（１人の他の患者において同定された）または他の同定されていない遺伝子における変異を有する患者から、ＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ１リプレッサー複合体の遺伝子における変異を有する患者を分離するための有用なバイオマーカーであるようである。ＲＵＮＸ１変異を有する所与の系統において、この検査は、血小板減少症を有さないが、ＲＵＮＸ１変異を有する家族の一員、より重要なことには、骨髄移植のための最適なドナーを選択するためにＲＵＮＸ１変異を有さない家族の一員を迅速に検出するのに有用であり得る。
【０１２２】
１２）ＲＵＮＸ１の生殖細胞系列変異を有するＦＰＤ／ＡＭＬ患者の血小板中のＭＹＨ１０転写産物発現
ＲＮＡを、４人の健常なドナーおよび２人のＦＰＤ／ＡＬＭ患者由来の多血小板血漿から抽出した（「Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ」ＮＯＲＧＥＮ」）。Ｑ−ＰＣＲ分析を実施した。ＭＹＨ１０遺伝子の発現レベルをＰＰＩＡハウスキーピング遺伝子まで相対的に発現させた。プライマー配列は、ＰＰＩＡ（配列番号４：ＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴ；および配列番号５：ＰＰＩＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＴＧＴ）のため、およびＭＹＨ１０（配列番号６：ＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＴＣＣＧＡＡＡＣ；および配列番号７：ＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＡＣＡＧＣＧ）のためであった。
【０１２３】
図１４は、健常なドナー（ＲＵＮＸ１変化を有さない）（Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８）と比較してＲｕｎｘ１変異（ＬＦ＿ＦＰＤおよびＬＣ＿ＦＰＤ）を有するＦＰＤ／ＡＭＬ患者の血小板中のＰＰＩＡに対するｍＲＮＡ  ＭＹＨ１０発現を示す。
【０１２４】
その結果により、ｍＲＮＡ  ＭＹＨ１０発現レベルがＰＲＰにおいて検出可能であり、健常なドナーのＰＲＰにおけるより、ＦＰＤ／ＡＭＬ患者のＰＲＰにおいて高度に発現されることが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014507156.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
2014507156.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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