(57)【要約】    本発明は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）によるプロファイリング技法を用いて、多種多様な臨床試料のタンパク質に由来する小ペプチドを検出および定量する方法に関する。良性のものから病的なものまであらゆる種類の病理学的実体を同定、診断、定量、およびプロファイリングできるようにする目的で、本発明は、特定のタンパク質を特異的に同定するこのような特有ペプチドを標的とすることにより、複数の試料について多重化された様式で解析を行うことを可能にする。このような病理学的実体として、全種類の癌、ならびに炎症細胞解析および骨髄細胞解析を含む炎症性疾患の領域が挙げられるが、これらに限定されない。本ＳＲＭ解析は、臨床的血液型検査の役目を果たすができ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）検査に基づいて子宮頸癌の危険性が特に高い女性を同定する診断検査の機能を果たすこともできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択反応モニタリング（ＳＲＭ）技法を用いて、以下のヒトタンパク質からなる群より選択されるタンパク質バイオマーカーを検出する方法：
プロオピオメラノコルチンおよびその誘導体（副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−エンドルフィン、およびＭｅｔ−エンケファリンを含む）、α−胎児タンパク質、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ受容体Ｒ３、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（別名ＡＭＡＣＲ）、血清アミロイドＰ成分、β−カテニン、アポトーシス調節因子Ｂｃｌ−２、Ｂ細胞リンパ腫６のタンパク質、上皮細胞接着分子（別名Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＰＯＵドメインクラス２関連因子１、補体Ｃ４−Ａ、カルシトニン、カルデスモン、カルレチニン、ネプリライシン、肥満／幹細胞増殖因子受容体（２種のアイソフォーム）、インテグリンα−Ｘ、シンデカン１、α−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ、シグナル伝達因子ＣＤ２４、ＣＤ４４抗原、トランス作動性Ｔ細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−３、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ１ａ、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、補体受容体２型、Ｂ細胞受容体ＣＤ２２、低親和性免疫グロブリンεＦｃ受容体、グリコホリンＡ、インターロイキン２受容体サブユニットα、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３（Ｅ、Ｄ、Ｇ、およびＺ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８、血小板内皮細胞接着分子、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４、ＡＤＰリボシルシクラーゼ１、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４、ロイコシアリン、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）低分子量アイソフォームである（ＬＣＡ）アイソフォーム２、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５、神経細胞接着分子１、炭水化物スルホトランスフェラーゼ１０、インテグリンβ−３、マクロシアリン、Ｔ細胞抗原ＣＤ７、Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖、ＣＤ９９抗原、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ−２、癌胎児抗原関連細胞接着分子５、クロモグラニンＡ、サイトケラチン４、サイトケラチン５、サイトケラチン６Ａ、サイトケラチン６Ｂ、サイトケラチン６Ｃ、サイトケラチン６Ｄ、サイトケラチン６Ｅ、サイトケラチン６Ｆ、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１７、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、コラーゲンα−４（ＩＶ）鎖、Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＤ１、ポドプラニン、デスミン、アノクタミン１、カドヘリン１（別名Ｅカドヘリン）、ムチン１（別名ＥＭＡ）、ムチン２、ムチン５ＡＣ、ムチン６、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＸＩＩＩＡ鎖、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、フォリトロピンサブユニットβ、プロラクチン誘導タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、ソマトトロピン（成長ホルモン）、溶質輸送体ファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー１、グリピカン３、グランザイムＢ、絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ、上皮増殖因子受容体、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−３、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４、メラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬ（別名ｇｐ１００）、絨毛性乳腺刺激ホルモン、インヒビンα鎖、インヒビンβＡ鎖、インヒビンβＢ、インヒビンβＣ、イ���ヒビンβＥ、抗原ＫＩ−６７、ルトロピンサブユニットβ、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＭｄｍ２、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｌｈ１、大動脈平滑筋アクチン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ２、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、ミエロペルオキシダーゼ、ミオゲニン、神経細繊維軽ポリペプチド、神経細繊維重ポリペプチド、γ−エノラーゼ、ＰＯＵドメインクラス２転写因子２、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、オボマクログロブリン、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（アイソフォーム１、２、３）、細胞腫瘍抗原ｐ５３、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ、腫瘍タンパク質６３、カテニンδ−１、前立腺酸性ホスファターゼ、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ相互作用型４（別名ＰＩＮ４）、アルカリホスファターゼ胎盤型、ミスマッチ修復エンドヌクレアーゼＰＭＳ２、プロゲステロン受容体、プロラクチン、前立腺特異的抗原（カリクレイン３）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン７、アンドロゲン受容体、タンパク質Ｓ１００−Ａ１、タンパク質Ｓ１００−Ｂ、タンパク質Ｓ１００−Ａ６、ミオシン１１平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームＳＭ１、シナプトフィジン、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、サイログロブリン、サイロトロピンサブユニットβ、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．１、ビリン１、ウィルムス腫瘍タンパク質、網膜芽細胞腫関連タンパク質、メソテリン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、プロニューレグリン１、ＧＰ３０、１型乳癌感受性タンパク質、２型乳癌感受性タンパク質、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４、クローディン５、クローディン６クローディン７、クローディン１６、細胞質型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、ミトコンドリア型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、卵胞刺激ホルモン受容体、食欲抑制ホルモン（グレリンおよびオベスタチンを含む）、成長ホルモン分泌促進物質受容体１型（ＡアイソフォームおよびＢアイソフォーム）、ＧＴＰアーゼＫＲａｓ、ＧＴＰアーゼＮＲａｓ、ＧＴＰアーゼＨＲａｓ、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼＢ−ｒａｆ、Ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、Ｉｇλ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−２Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−３Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−６Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−７Ｃ鎖領域、ＩｇκＣ鎖領域、ＩｇμＣ鎖領域、Ｉｇγ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−２Ｃ鎖領域、ＩｇδＣ鎖領域、ＩｇεＣ鎖領域、ＡＢＯ式組織血液型トランスフェラーゼ、補体Ｃ４−Ａ、補体Ｃ４−Ｂ、アクアポリン１、アクアポリン３、補体崩壊促進因子、バンド３アニオン輸送タンパク質、Ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ４、ダッフィ抗原／ケモカイン受容体、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ１、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ２、ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＤ４４抗原��セマフォリン７Ａ、Ｋｅｌｌ式血液型糖タンパク質、尿素輸送体１、補体受容体１型、膜輸送タンパク質ＸＫ、細胞接着分子４、基底細胞接着分子、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、ベイシジン、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ１、ＣＤ１５１抗原、Ｒｈ（Ｄ）血液型ポリペプチド、Ｒｈ（ＣＥ）血液型ポリペプチド、赤血球膜関連タンパク質、糖タンパク質Ｘｇ、ならびにアセチルコリンエステラーゼ；
ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、高リスク型のＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８型のＬ１タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質に最適なＳＲＭペプチドおよび質量遷移を選択して最大臨床能力を向上させる方法であって、以下：
（ｉ）各タンパク質バイオマーカーについて、ＭＲＭ  Ｐｉｌｏｔ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いてＳＲＭ質量遷移の組を設計すること；
（ｉｉ）ペプチド質量遷移を手作業で評価し、該注目しているタンパク質が相同タンパク質のファミリーに属しているかどうか、または該注目しているタンパク質が複数の対立アイソフォームを有するかどうか、または該注目しているタンパク質に天然の変異型が複数存在するかどうか、または患者にとって治療上重要である既知の翻訳後修飾が複数存在するかどうかを突き止めること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の条件のいずれかが当てはまるならば、コンピュータシミュレーションでの消化を行い、これらの注目しているアイソフォームまたは修飾ペプチドをそれぞれ同定できるペプチドを浮かび上がらせること；および
（ｉｖ）浮かび上がったペプチドをＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを用いて手作業で検証して、それらが該タンパク質のそれぞれに対して独自のペプチドであったと確定すること、
を含む方法。
【請求項３】
以下の工程：
（ａ）上手く消化できるように前記臨床試料を調製する工程；
（ｂ）該タンパク質試料を還元およびアルキル化する工程；ならびに
（ｃ）該得られる試料をトリプシンで消化してトリプシンペプチドを得る工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記トリプシンペプチドは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣにＮａｎｏｓｐｒａｙ（登録商標）Ｉｏｎ  ＳｏｕｒｃｅおよびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｐｅｐｍａｐカラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて分離し；ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）システムで質量スペクトルを得て；各ペプチドについて得られた該スペクトルおよび複数の質量遷移の分析にＭｕｌｔｉｑｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＲＭ解析で処理された各臨床試料から、請求項１に記載の個々のタンパク質アイソフォームを相対量または絶対量で検出する方法。
【請求項６】
前記選択反応モニタリング（ＳＲＭ）プロファイリング技法を用いて、サイトケラチン５アイソフォームかサイトケラチン６アイソフォームかを識別する方法。
【請求項７】
前記サイトケラチン類は、癌を種類によって区別するためのマーカーとして用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
良性のものから病的なものまで広く病理学的実体を診断するのに役立つと思われる多重化診断プラットフォームを提供して、発生器官部位（例えば、乳房、肺、または前立腺）の異なる腫瘍由来のタンパク質の同定と合わせて、全種類の癌（腺癌、扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない）について定量可能なプロファイルを提供するための、ＳＲＭを利用した解析に請求項１に記載のタンパク質の組み合わせを用いる方法。
【請求項９】
前記ＳＲＭ解析は、炎症細胞解析および骨髄細胞解析を含む、炎症性疾患の領域の診断も可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記解析を行うために、利用可能な様々な種類のＳＲＭとして、以下のタンパク質に限定されないが、それらを含めることができる、請求項８または９のいずれか１項に記載の方法：
プロオピオメラノコルチンおよびその誘導体（副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−エンドルフィン、およびＭｅｔ−エンケファリンを含む）、α−胎児タンパク質、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ受容体Ｒ３、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（別名ＡＭＡＣＲ）、血清アミロイドＰ成分、β−カテニン、アポトーシス調節因子Ｂｃｌ−２、Ｂ細胞リンパ腫６のタンパク質、上皮細胞接着分子（別名Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＰＯＵドメインクラス２関連因子１、補体Ｃ４−Ａ、カルシトニン、カルデスモン、カルレチニン、ネプリライシン、肥満／幹細胞増殖因子受容体（２種のアイソフォーム）、インテグリンα−Ｘ、シンデカン１、α−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ、シグナル伝達因子ＣＤ２４、ＣＤ４４抗原、トランス作動性Ｔ細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−３、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ１ａ、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、補体受容体２型、Ｂ細胞受容体ＣＤ２２、低親和性免疫グロブリンεＦｃ受容体、グリコホリンＡ、インターロイキン２受容体サブユニットα、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３（Ｅ、Ｄ、Ｇ、およびＺ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８、血小板内皮細胞接着分子、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４、ＡＤＰリボシルシクラーゼ１、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４、ロイコシアリン、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）低分子量アイソフォームである（ＬＣＡ）アイソフォーム２、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５、神経細胞接着分子１、炭水化物スルホトランスフェラーゼ１０、インテグリンβ−３、マクロシアリン、Ｔ細胞抗原ＣＤ７、Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖、ＣＤ９９抗原、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ−２、癌胎児抗原関連細胞接着分子５、クロモグラニンＡ、サイトケラチン４、サイトケラチン５、サイトケラチン６Ａ、サイトケラチン６Ｂ、サイトケラチン６Ｃ、サイトケラチン６Ｄ、サイトケラチン６Ｅ、サイトケラチン６Ｆ、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１７、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、コラーゲンα−４（ＩＶ）鎖、Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＤ１、ポドプラニン、デスミン、アノクタミン１、カドヘリン１（別名Ｅカドヘリン）、ムチン１（別名ＥＭＡ）、ムチン２、ムチン５ＡＣ、ムチン６、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＸＩＩＩＡ鎖、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、フォリトロピンサブユニットβ、プロラクチン誘導タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、ソマトトロピン（成長ホルモン）、溶質輸送体ファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー１、グリピカン３、グランザイムＢ、絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ、上皮増殖因子受容体、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−３、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４、メラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬ（別名ｇｐ１００）、絨毛性乳腺刺激ホルモン、インヒビンα鎖、インヒビンβＡ鎖、インヒビンβＢ、インヒビンβＣ、イ���ヒビンβＥ、抗原ＫＩ−６７、ルトロピンサブユニットβ、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＭｄｍ２、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｌｈ１、大動脈平滑筋アクチン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ２、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、ミエロペルオキシダーゼ、ミオゲニン、神経細繊維軽ポリペプチド、神経細繊維重ポリペプチド、γ−エノラーゼ、ＰＯＵドメインクラス２転写因子２、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、オボマクログロブリン、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（アイソフォーム１、２、３）、細胞腫瘍抗原ｐ５３、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ、腫瘍タンパク質６３、カテニンδ−１、前立腺酸性ホスファターゼ、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ相互作用型４（別名ＰＩＮ４）、アルカリホスファターゼ胎盤型、ミスマッチ修復エンドヌクレアーゼＰＭＳ２、プロゲステロン受容体、プロラクチン、前立腺特異的抗原（カリクレイン３）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン７、アンドロゲン受容体、タンパク質Ｓ１００−Ａ１、タンパク質Ｓ１００−Ｂ、タンパク質Ｓ１００−Ａ６、ミオシン１１平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームＳＭ１、シナプトフィジン、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、サイログロブリン、サイロトロピンサブユニットβ、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．１、ビリン１、ウィルムス腫瘍タンパク質、網膜芽細胞腫関連タンパク質、メソテリン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、プロニューレグリン１、ＧＰ３０、１型乳癌感受性タンパク質、２型乳癌感受性タンパク質、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４、クローディン５、クローディン６クローディン７、クローディン１６、細胞質型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、ミトコンドリア型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、卵胞刺激ホルモン受容体、食欲抑制ホルモン（グレリンおよびオベスタチンを含む）、成長ホルモン分泌促進物質受容体１型（ＡアイソフォームおよびＢアイソフォーム）、ＧＴＰアーゼＫＲａｓ、ＧＴＰアーゼＮＲａｓ、ＧＴＰアーゼＨＲａｓ、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼＢ−ｒａｆ、Ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、Ｉｇλ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−２Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−３Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−６Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−７Ｃ鎖領域、ＩｇκＣ鎖領域、ＩｇμＣ鎖領域、Ｉｇγ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−２Ｃ鎖領域、ＩｇδＣ鎖領域、ＩｇεＣ鎖領域。
【請求項１１】
子宮頸癌の危険性が特に高い女性を同定する診断検査を提供するための、ＳＲＭを利用した解析に以下のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質の組み合わせを用いる方法：
Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、高リスク型のＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８型のＬ１タンパク質。
【請求項１２】
臨床的血液型判定基準を形成するタンパク質群に含まれるタンパク質を検出および定量するのに用いられる、ＳＲＭを利用した多重化診断プラットフォームを提供するための、以下のタンパク質の組み合わせの利用法：
ＡＢＯ式組織血液型トランスフェラーゼ、補体Ｃ４−Ａ、補体Ｃ４−Ｂ、アクアポリン１、アクアポリン３、補体崩壊促進因子、バンド３アニオン輸送タンパク質、Ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ４、ダッフィ抗原／ケモカイン受容体、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ１、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ２、ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＤ４４抗原、セマフォリン７Ａ、Ｋｅｌｌ式血液型糖タンパク質、尿素輸送体１、補体受容体１型、膜輸送タンパク質ＸＫ、細胞接着分子４、基底細胞接着分子、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、ベイシジン、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ１、ＣＤ１５１抗原、Ｒｈ（Ｄ）血液型ポリペプチド、Ｒｈ（ＣＥ）血液型ポリペプチド、赤血球膜関連タンパク質、糖タンパク質Ｘｇ、アセチルコリンエステラーゼ。
【請求項１３】
ＥＧＦＲタンパク質の４種のアイソフォームを定量可能なように分離する、ＳＲＭを利用した解析法であって、以下の工程：
（ｉ）現在用いられている抗体を利用した検出法よりも高感度で高精度のＳＲＭ解析により、該タンパク質の該４種のアイソフォームを分離する工程；
（ｉｉ）特定ペプチドを標的とすることで、これらのタンパク質から変異により生じる、肺癌、結腸直腸癌、および乳癌で検出されている多数の天然変異型タンパク質を同定および定量する工程；および
（ｉｉｉ）翻訳後修飾により修飾されている該様々なアイソフォームから注目しているペプチドを検出する工程、修飾としては、リン酸化、グリコシル化、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない、
を含む、方法。
【請求項１４】
受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢタンパク質の４種のアイソフォームを定量可能なように分離する、ＳＲＭを利用した解析法であって、以下の工程：
（ｉ）現在用いられている抗体を利用した検出法よりも高感度で精度の高いＳＲＭ解析により、該タンパク質の該４種のアイソフォームを分離する工程；
（ｉｉ）特定ペプチドを標的とすることで、これらの受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２タンパク質からインフレーム変異により生じる、肺腺癌、胃腺癌、卵巣癌、および神経膠腫に関係している多数の天然変異型タンパク質を同定および定量する工程；および
（ｉｉｉ）翻訳後修飾により修飾されている該様々なアイソフォームから注目しているペプチドを検出する工程、修飾としては、リン酸化およびグリコシル化が挙げられるが、これらに限定されない、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記癌には、基底細胞型および乳管上皮細胞型乳癌が含まれる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１６】
ＳＲＭを利用した、サイトケラチン５およびサイトケラチン６を含む試料の質量分析法。
【請求項１７】
サイトケラチン５およびサイトケラチン６を含む試料の質量分析を可能にする、該質量分析に用いるキットならびに試薬。
【請求項１８】
前記ＳＲＭ技法を用いて、短鎖ペプチドを識別する方法。
【請求項１９】
前記ペプチドはサイトケラチンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サイトケラチンは、ＣＫ５またはＣＫ６である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＲＭ技法を用いて、短鎖ペプチドを検出する方法であって、該ペプチドは癌を種類ごとに検出するマーカーとして用いられる、方法。
【請求項２２】
前記癌には、乳癌が含まれ、前記ＳＲＭ技法は、乳癌細胞を基底細胞型と乳管上皮細胞型に分離できるだけではなく、分子に基づく乳癌のサブタイプの全ての型に分離できる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドはサイトケラチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記サイトケラチンは、ＣＫ５またはＣＫ６である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ホルマリン固定してパラフィンブロックに埋め込んだ細胞または組織、新鮮なまたは新鮮なまま凍結した組織、生体液（血液、血清、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、骨髄、乳頭吸引液が挙げられるが、これらに限定されない）、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）保存液またはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液のいずれかを含有する細胞診断薄層バイアルからの試料、および細針吸引法（ＦＮＡ）による試料、のいずれかに由来する、幅広い細胞株ならびに良性および悪性の腫瘍細胞溶解液を研究するための、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
患者の予後すなわち治療の意義を評価する方法であって、該方法は、前記ＳＲＭ技法を用いて、前記患者から採取した試料における少なくとも１種のバイオマーカーの発現を検出することを含み、該バイオマーカーは、請求項１に記載のバイオマーカーからなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
前記バイオマーカーは、サイトケラチン４、サイトケラチン５、サイトケラチン６Ａ、サイトケラチン６Ｂ、サイトケラチン６Ｃ、サイトケラチン６Ｄ、サイトケラチン６Ｅ、サイトケラチン６Ｆ、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１７、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、およびサイトケラチン２０からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質プロファイリングを含む試料分析を行うための、質量分析を利用したキット。
【請求項２９】
前記キットは、データベースインターフェイスの形をしていて、該インターフェイスは質量分析機によりもたらされた情報を統合することで、定量可能なパラメーターに基づく報告を依頼者に提出することができる、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
サイトケラチン５および６ならびにそれらのアイソフォーム、ならびに前記分析を可能にする、試薬またはソフトウェアを含む、請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）としても知られる選択反応モニタリング（ＳＲＭ）によるプロファイリング技法を用いて、様々な癌および他の病理学的実体のプロファイリングを可能にする、多数のタンパク質から小ペプチドの構造基盤を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、様々な病理学的実体の分子表現型を研究する場合には、抗体を利用した多様な検出法がルーチンとして用いられて、多数の抗原が検出されている。実際、特定の抗体の組を使用することで、腺癌、扁平上皮癌、黒色腫、および中皮腫をはじめとする多種多様な癌を分離同定することができる。他にも、体の様々な部位を起原とする腫瘍に適用される抗体コホートがあり、このコホートは腫瘍起原部位の確証を与えるだけでなく、予後および治療のガイダンスも与えるものである。どの特定抗体でも、その親和性は、１つの抗原結合部位とその抗原の一致の質を反映したものであり、抗原部位の個数に依存しない。このため、癌組織の切片試料中に存在する抗原量を、抗体結合に基づいて定量することは不可能である。
【０００３】
質量分析の分野においては、近年、技術の進歩があった。いわゆる三連四重極型測定機の登場である。これにより、測定機の質量検出範囲は大幅に拡張され、タンデム質量分析を利用した配列分析が可能になった。この測定機の登場により、質量分析技法による選択反応モニタリング（ＳＲＭ）をタンパク質およびペプチドの定量分析ツールに応用することが、現実味を帯びてきた。選択反応モニタリング技法は、注目している個々のタンパク質から多数の独特の同定ペプチドを選択することで機能する。注目している標的ペプチドは、ＨＰＬＣタンデム質量分析法を用いて、臨床試料から検出される。
【０００４】
乳癌は、欧米人女性では悪性と診断されることが最も多く、多くの場合、死に至る。従来、乳房細胞を基底型（基底／筋上皮細胞）か内腔型（乳管上皮細胞）か区別するマーカーとして、および基底細胞乳癌を含む乳腫瘍のサブセットを定義するマーカーとしても、サイトケラチンが使用されてきた。
【０００５】
免疫組織化学に基づいた研究（Ｗｅｔｚｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ；  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９１  １３８：  ７５１−７６３）（非特許文献１）により、乳管上皮細胞ではサイトケラチン７、８、１８、および１９が発現するのに対して、基底／筋上皮細胞ではサイトケラチン５、１４、および１７が発現することが実証されている。サイトケラチン発現差異は、臨床的に分析されているものの、しかしながら、抗体を利用した検出法をはじめとする現行手法の特異性および感度には限界がある。例えば、サイトケラチン５とサイトケラチン６は、非常に相同性の高いタンパク質であり、入手可能な抗体を用いてどちらのタンパク質であるかを正確に識別することは困難である。そのうえさらに、サイトケラチン５、ならびにサイトケラチン６のアイソフォーム、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦが同定されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ；  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，  Ｖｏｌ  ２７０，  Ｎｏ  ３１，  １８５８１−１８５９２）（非特許文献２）。
【０００６】
本発明の目的は、サイトケラチン５およびサイトケラチン６のアイソフォーム、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦなどの相同タンパク質を正確に識別して定量する技法を提供することである。本発明による方法は、サイトケラチン５とサイトケラチン６アイソフォームを分離できるだけでなく、同時に、以下に列挙する範囲のサイトケラチンのプロファイリングも行うことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｅｔｚｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ；  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９１  １３８：  ７５１−７６３
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ；  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，  Ｖｏｌ  ２７０，  Ｎｏ  ３１，  １８５８１−１８５９２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）技法を用いて、以下のヒトタンパク質からなる群より選択されるタンパク質バイオマーカーを検出する方法を提供する：
【０００９】
プロオピオメラノコルチンおよびその誘導体（副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−エンドルフィン、およびＭｅｔ−エンケファリンを含む）、α−胎児タンパク質、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ受容体Ｒ３、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（別名ＡＭＡＣＲ）、血清アミロイドＰ成分、β−カテニン、アポトーシス調節因子Ｂｃｌ−２、Ｂ細胞リンパ腫６のタンパク質、上皮細胞接着分子（別名Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＰＯＵドメインクラス２関連因子１、補体Ｃ４−Ａ、カルシトニン、カルデスモン、カルレチニン、ネプリライシン、肥満／幹細胞増殖因子受容体（２種のアイソフォーム）、インテグリンα−Ｘ、シンデカン１、α−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ、シグナル伝達因子ＣＤ２４、ＣＤ４４抗原、トランス作動性Ｔ細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−３、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ１ａ、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、補体受容体２型、Ｂ細胞受容体ＣＤ２２、低親和性免疫グロブリンεＦｃ受容体、グリコホリンＡ、インターロイキン２受容体サブユニットα、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３（Ｅ、Ｄ、Ｇ、およびＺ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８、血小板内皮細胞接着分子、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４、ＡＤＰリボシルシクラーゼ１、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４、ロイコシアリン、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）の低分子量アイソフォームである（ＬＣＡ）アイソフォーム２、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５、神経細胞接着分子１、炭水化物スルホトランスフェラーゼ１０、インテグリンβ−３、マクロシアリン、Ｔ細胞抗原ＣＤ７、Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖、ＣＤ９９抗原、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ−２、癌胎児抗原関連細胞接着分子５、クロモグラニンＡ、サイトケラチン４、サイトケラチン５、サイトケラチン６Ａ、サイトケラチン６Ｂ、サイトケラチン６Ｃ、サイトケラチン６Ｄ、サイトケラチン６Ｅ、サイトケラチン６Ｆ、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１７、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、コラーゲンα−４（ＩＶ）鎖、Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＤ１、ポドプラニン、デスミン、アノクタミン１、カドヘリン１（別名Ｅカドヘリン）、ムチン１（別名ＥＭＡ）、ムチン２、ムチン５ＡＣ、ムチン６、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＸＩＩＩＡ鎖、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、フォリトロピンサブユニットβ、プロラクチン誘導タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、ソマトトロピン（成長ホルモン）、溶質輸送体ファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー１、グリピカン３、グランザイムＢ、絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ、上皮増殖因子受容体、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−３、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４、メラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬ（別名ｇｐ１００）、絨毛性乳腺刺激ホルモン、インヒビンα鎖、インヒビンβＡ鎖、インヒビンβＢ、インヒビンβＣ、���ンヒビンβＥ、抗原ＫＩ−６７、ルトロピンサブユニットβ、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＭｄｍ２、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｌｈ１、大動脈平滑筋アクチン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ２、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、ミエロペルオキシダーゼ、ミオゲニン、神経細繊維軽ポリペプチド、神経細繊維重ポリペプチド、γ−エノラーゼ、ＰＯＵドメインクラス２転写因子２、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、オボマクログロブリン、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（アイソフォーム１、２、３）、細胞腫瘍抗原ｐ５３、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ、腫瘍タンパク質６３、カテニンδ−１、前立腺酸性ホスファターゼ、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ相互作用型４（別名ＰＩＮ４）、アルカリホスファターゼ胎盤型、ミスマッチ修復エンドヌクレアーゼＰＭＳ２、プロゲステロン受容体、プロラクチン、前立腺特異的抗原（カリクレイン３）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン７、アンドロゲン受容体、タンパク質Ｓ１００−Ａ１、タンパク質Ｓ１００−Ｂ、タンパク質Ｓ１００−Ａ６、ミオシン１１平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームＳＭ１、シナプトフィジン、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、サイログロブリン、サイロトロピンサブユニットβ、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．１、ビリン１、ウィルムス腫瘍タンパク質、網膜芽細胞腫関連タンパク質、メソテリン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、プロニューレグリン１、ＧＰ３０、１型乳癌感受性タンパク質、２型乳癌感受性タンパク質、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４、クローディン５、クローディン６クローディン７、クローディン１６、細胞質型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、ミトコンドリア型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、卵胞刺激ホルモン受容体、食欲抑制ホルモン（グレリンおよびオベスタチンを含む）、成長ホルモン分泌促進物質受容体１型（ＡアイソフォームおよびＢアイソフォーム）、ＧＴＰアーゼＫＲａｓ、ＧＴＰアーゼＮＲａｓ、ＧＴＰアーゼＨＲａｓ、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼＢ−ｒａｆ、Ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、Ｉｇλ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−２Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−３Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−６Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−７Ｃ鎖領域、ＩｇκＣ鎖領域、ＩｇμＣ鎖領域、Ｉｇγ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−２Ｃ鎖領域、ＩｇδＣ鎖領域、ＩｇεＣ鎖領域、ＡＢＯ式組織血液型トランスフェラーゼ、補体Ｃ４−Ａ、補体Ｃ４−Ｂ、アクアポリン１、アクアポリン３、補体崩壊促進因子、バンド３アニオン輸送タンパク質、Ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ４、ダッフィ抗原／ケモカイン受容体、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ１、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ２、ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＤ４４抗��、セマフォリン７Ａ、Ｋｅｌｌ式血液型糖タンパク質、尿素輸送体１、補体受容体１型、膜輸送タンパク質ＸＫ、細胞接着分子４、基底細胞接着分子、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、ベイシジン、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ１、ＣＤ１５１抗原、Ｒｈ（Ｄ）血液型ポリペプチド、Ｒｈ（ＣＥ）血液型ポリペプチド、赤血球膜関連タンパク質、糖タンパク質Ｘｇ、ならびにアセチルコリンエステラーゼ；
【００１０】
ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、高リスク型のＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８型のＬ１タンパク質。
【００１１】
別の態様において、本発明は、請求項１に記載のタンパク質に最適なＳＲＭペプチドおよび質量遷移を選択して最大臨床能力を向上させる方法を提供し、本方法は以下を含む：
（ｉ）各タンパク質バイオマーカーについて、ＭＲＭ  Ｐｉｌｏｔ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いてＳＲＭ質量遷移の組を設計すること；
（ｉｉ）ペプチド質量遷移を手作業で評価し、注目しているタンパク質が相同タンパク質のファミリーに属しているかどうか、または注目しているタンパク質が複数の対立アイソフォームを有するかどうか、または注目しているタンパク質に天然の変異型が複数存在するかどうか、または患者にとって治療上重要である既知の翻訳後修飾が複数存在するかどうかを突き止めること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の条件のいずれかが当てはまるならば、コンピュータシミュレーションでの消化を行い、これらの注目しているアイソフォームまたは修飾ペプチドをそれぞれ同定できるペプチドを浮かび上がらせること；および
（ｉｖ）浮かび上がったペプチドをＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを用いて手作業で検証して、それらが個々のタンパク質に対して独自のペプチドであったと確定すること。
【００１２】
好ましくは、本方法は以下の工程を含む：
（ａ）上手く消化できるように臨床試料を調製する工程；
（ｂ）タンパク質試料を還元およびアルキル化する工程；ならびに
（ｃ）得られる試料をトリプシンで消化してトリプシンペプチドを得る工程。
【００１３】
好ましくは、トリプシンペプチドは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣにＮａｎｏｓｐｒａｙ（登録商標）Ｉｏｎ  ＳｏｕｒｃｅおよびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｐｅｐｍａｐカラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて分離し；ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）システムで質量スペクトルを得て；各ペプチドについて得られたスペクトルおよび複数の質量遷移の分析にＭｕｌｔｉｑｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明に従って、ＳＲＭ解析で処理された各臨床試料から、個々のタンパク質アイソフォームを相対量または絶対量で検出する方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本方法は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）プロファイリング技法を用いて、サイトケラチン５アイソフォームなのかサイトケラチン６アイソフォームなのかを識別することができる。
【００１６】
好ましくは、これらのサイトケラチンは、癌を種類によって区別するためのマーカーとして用いられる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＳＲＭを利用した解析に請求項１に記載のタンパク質の組み合わせを用いる方法を提供することで、良性のものから病的なものまで広く病理学的実体を診断するのに役立つと思われる多重化診断プラットフォームを提供し、発生器官部位（例えば、乳房、肺、または前立腺）の異なる腫瘍由来のタンパク質の同定と合わせて、全種類の癌について定量可能なプロファイルを提供する。そのような癌として、腺癌、扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
好ましくは、ＳＲＭ解析は、炎症細胞解析および骨髄細胞解析を含む、炎症性疾患の領域の診断が可能である。
【００１９】
上記解析を行うために、様々な種類のＳＲＭが利用可能であり、利用可能なものとして、好ましくは、以下のタンパク質が含まれるが、それらに限定されない：
【００２０】
プロオピオメラノコルチンおよびその誘導体（副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−エンドルフィン、およびＭｅｔ−エンケファリンを含む）、α−胎児タンパク質、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ受容体Ｒ３、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（別名ＡＭＡＣＲ）、血清アミロイドＰ成分、β−カテニン、アポトーシス調節因子Ｂｃｌ−２、Ｂ細胞リンパ腫６のタンパク質、上皮細胞接着分子（別名Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＰＯＵドメインクラス２関連因子１、補体Ｃ４−Ａ、カルシトニン、カルデスモン、カルレチニン、ネプリライシン、肥満／幹細胞増殖因子受容体（２種のアイソフォーム）、インテグリンα−Ｘ、シンデカン１、α−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ、シグナル伝達因子ＣＤ２４、ＣＤ４４抗原、トランス作動性Ｔ細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−３、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ１ａ、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、補体受容体２型、Ｂ細胞受容体ＣＤ２２、低親和性免疫グロブリンεＦｃ受容体、グリコホリンＡ、インターロイキン２受容体サブユニットα、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３（Ｅ、Ｄ、Ｇ、およびＺ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８、血小板内皮細胞接着分子、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４、ＡＤＰリボシルシクラーゼ１、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４、ロイコシアリン、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＣ（ＬＣＡ）低分子量アイソフォームである（ＬＣＡ）アイソフォーム２、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５、神経細胞接着分子１、炭水化物スルホトランスフェラーゼ１０、インテグリンβ−３、マクロシアリン、Ｔ細胞抗原ＣＤ７、Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖、ＣＤ９９抗原、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ−２、癌胎児抗原関連細胞接着分子５、クロモグラニンＡ、サイトケラチン４、サイトケラチン５、サイトケラチン６Ａ、サイトケラチン６Ｂ、サイトケラチン６Ｃ、サイトケラチン６Ｄ、サイトケラチン６Ｅ、サイトケラチン６Ｆ、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１７、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、コラーゲンα−４（ＩＶ）鎖、Ｇ１／Ｓ特異的サイクリンＤ１、ポドプラニン、デスミン、アノクタミン１、カドヘリン１（別名Ｅ−カドヘリン）、ムチン１（別名ＥＭＡ）、ムチン２、ムチン５ＡＣ、ムチン６、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＸＩＩＩＡ鎖、糖タンパク質ホルモン類α鎖、フォリトロピンサブユニットβ、プロラクチン誘導タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、ソマトトロピン（成長ホルモン）、溶質輸送体ファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー１、グリピカン３、グランザイムＢ、絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ、上皮増殖因子受容体、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−３、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４、メラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬ（別名ｇｐ１００）、絨毛性乳腺刺激ホルモン、インヒビンα鎖、インヒビンβＡ鎖、インヒビンβＢ、インヒビンβＣ、イ���ヒビンβＥ、抗原ＫＩ−６７、ルトロピンサブユニットβ、糖タンパク質ホルモン類のα鎖、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＭｄｍ２、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｌｈ１、大動脈平滑筋アクチン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ２、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、ミエロペルオキシダーゼ、ミオゲニン、神経細繊維軽ポリペプチド、神経細繊維重ポリペプチド、γ−エノラーゼ、ＰＯＵドメインクラス２転写因子２、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、オボマクログロブリン、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（アイソフォーム１、２、３）、細胞腫瘍抗原ｐ５３、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ、腫瘍タンパク質６３、カテニンδ−１、前立腺酸性ホスファターゼ、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ相互作用型４（別名ＰＩＮ４）、胎盤型アルカリホスファターゼ、ミスマッチ修復エンドヌクレアーゼＰＭＳ２、プロゲステロン受容体、プロラクチン、前立腺特異的抗原（カリクレイン３）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン７、アンドロゲン受容体、タンパク質Ｓ１００−Ａ１、タンパク質Ｓ１００−Ｂ、タンパク質Ｓ１００−Ａ６、ミオシン１１平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームＳＭ１、シナプトフィジン、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、サイログロブリン、サイロトロピンサブユニットβ、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．１、ビリン１、ウィルムス腫瘍タンパク質、網膜芽細胞腫関連タンパク質、メソテリン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１、プロニューレグリン１、ＧＰ３０、１型乳癌感受性タンパク質、２型乳癌感受性タンパク質、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４、クローディン５、クローディン６クローディン７、クローディン１６、細胞質型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、ミトコンドリア型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ］、卵胞刺激ホルモン受容体、食欲抑制ホルモン（グレリンおよびオベスタチンを含む）、成長ホルモン分泌促進物質受容体１型（ＡアイソフォームおよびＢアイソフォーム）、ＧＴＰアーゼＫＲａｓ、ＧＴＰアーゼＮＲａｓ、ＧＴＰアーゼＨＲａｓ、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼＢ−ｒａｆ、Ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、Ｉｇλ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−２Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−３Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−６Ｃ鎖領域、Ｉｇλ−７Ｃ鎖領域、ＩｇκＣ鎖領域、ＩｇμＣ鎖領域、Ｉｇγ−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−１Ｃ鎖領域、Ｉｇα−２Ｃ鎖領域、ＩｇδＣ鎖領域、ＩｇεＣ鎖領域。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ＳＲＭを利用した解析に以下のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質の組み合わせを用いる方法を提供することで、子宮頸癌の危険性が特に高い女性を同定する診断検査を提供する：
【００２２】
Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、高リスク型のＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８型のＬ１タンパク質。
【００２３】
別の態様において、本発明は、以下のタンパク質の組み合わせの利用法を提供することで、臨床的血液型判定基準を形成するタンパク質群に含まれるタンパク質を検出および定量するのに用いられる、ＳＲＭを利用した多重化診断プラットフォームを提供する：
【００２４】
ＡＢＯ式組織血液型トランスフェラーゼ、補体Ｃ４−Ａ、補体Ｃ４−Ｂ、アクアポリン１、アクアポリン３、補体崩壊促進因子、バンド３アニオン輸送タンパク質、Ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ４、ダッフィ抗原／ケモカイン受容体、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ１、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ２、ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＤ４４抗原、セマフォリン７Ａ、Ｋｅｌｌ式血液型糖タンパク質、尿素輸送体１、補体受容体１型、膜輸送タンパク質ＸＫ、細胞接着分子４、基底細胞接着分子、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、ベイシジン、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ１、ＣＤ１５１抗原、Ｒｈ（Ｄ）血液型ポリペプチド、Ｒｈ（ＣＥ）血液型ポリペプチド、赤血球膜関連タンパク質、糖タンパク質Ｘｇ、アセチルコリンエステラーゼ。
【００２５】
別の態様において、本発明は、ＥＧＦＲタンパク質の４種のアイソフォームを定量可能なように分離する、ＳＲＭを利用した解析法を提供し、本方法は以下の工程を含む：
（ｉ）現在用いられている抗体を利用した検出法よりも高感度で高精度のＳＲＭ解析により、ＥＧＦＲタンパク質の４種のアイソフォームを分離する工程；
（ｉｉ）特定ペプチドを標的とすることで、これらのタンパク質から変異により生じる、肺癌、結腸直腸癌、および乳癌で検出されている多数の天然変異型タンパク質を同定および定量する工程；および
（ｉｉｉ）翻訳後修飾により修飾されている様々なアイソフォームから注目しているペプチドを検出する工程、修飾としては、リン酸化、グリコシル化、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
別の態様において、本発明は、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢタンパク質の４種のアイソフォームを定量可能なように分離する、ＳＲＭを利用した解析法を提供し、本方法は以下の工程を含む：
（ｉ）現在用いられている抗体を利用した検出法よりも高感度で精度の高いＳＲＭ解析により、このタンパク質の４種のアイソフォームを分離する工程；
（ｉｉ）特定ペプチドを標的とすることで、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２タンパク質からインフレーム変異により生じる、肺腺癌、胃腺癌、卵巣癌、および神経膠腫に関係している多数の天然変異型タンパク質を同定および定量する工程；および
（ｉｉｉ）翻訳後修飾により修飾されている様々なアイソフォームから注目しているペプチドを検出する工程、修飾としては、リン酸化およびグリコシル化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
好ましくは、癌には、基底細胞型および乳管上皮細胞型乳癌が含まれる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、ＳＲＭを利用した、サイトケラチン５およびサイトケラチン６を含む試料の質量分析法を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、質量分析を可能にする、サイトケラチン５およびサイトケラチン６を含む試料の質量分析に用いるキットならびに試薬を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＳＲＭ技法を用いて、短鎖ペプチドを識別する方法を提供する。
【００３１】
好ましくは、短鎖ペプチドはサイトケラチンである。
【００３２】
好ましくは、サイトケラチンは、ＣＫ５またはＣＫ６である。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ＳＲＭ技法を用いて、短鎖ペプチドを検出する方法を提供し、短鎖ペプチドは癌を種類ごとに検出するマーカーとして用いられる。
【００３４】
好ましくは、癌には、乳癌が含まれ、ＳＲＭ技法は、乳癌細胞を基底細胞と乳管上皮細胞に分離できるだけではなく、分子に基づく乳癌のサブタイプの全ての型を分離できる。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ホルマリン固定してパラフィンブロックに埋め込んだ細胞または組織、新鮮なまたは新鮮なまま凍結した組織、生体液（血液、血清、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、骨髄、乳頭吸引液が挙げられるが、これらに限定されない）、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）保存液またはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液のいずれかを含有する細胞診断薄層バイアルからの試料、および細針吸引法（ＦＮＡ）による試料、のいずれかに由来する、幅広い細胞株ならびに良性および悪性の腫瘍細胞溶解液を研究するための、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、患者の予後すなわち治療の意義を評価する方法を提供し、本方法は、ＳＲＭ技法を用いて、この患者から採取した試料における少なくとも１種のバイオマーカーの発現を検出することを含み、このバイオマーカーは、本発明によるバイオマーカーからなる群より選択される。
【００３７】
好ましくは、バイオマーカーは、サイトケラチン４、サイトケラチン５、サイトケラチン６Ａ、サイトケラチン６Ｂ、サイトケラチン６Ｃ、サイトケラチン６Ｄ、サイトケラチン６Ｅ、サイトケラチン６Ｆ、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１７、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、およびサイトケラチン２０からなる群より選択される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、タンパク質プロファイリングを含む試料分析を行うための、質量分析を利用したキットを提供する。
【００３９】
好ましくは、本キットは、データベースインターフェイスの形をしていて、このインターフェイスは質量分析機によりもたらされた情報を統合することで、定量可能なパラメーターに基づく報告を依頼者に提出することができる。
【００４０】
好ましくは、本キットは、サイトケラチン５および６ならびにそれらのアイソフォーム、および分析を可能にする試薬またはソフトウェアを含む。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、病理検査または臨床検査産業において癌および疾患の診断のルーチン検査として役立つ多重化診断解析である。この多重化診断解析は、質量分析を利用した選択反応モニタリング（ＳＲＭ）技法（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）としても知られる）を用いて、タンパク質から小ペプチドを検出する方法に基づく。この多重化診断解析の本発明の態様は、病理関連産業が解剖病理学、免疫学、および血液学部門において現在毎日のように検査しているタンパク質バイオマーカーの全て（約２００種類のタンパク質）に、このＳＲＭ技法を適用することである。
【００４２】
現在、病理関連産業は、抗体を利用した様々な検査を用いて、これらのタンパク質バイオマーカーを検出している。こうした抗体を利用した検査は、制約が多く、免疫組織化学用途では検査が定量的でなかったり、抗体反応が非特異的なことで有名だったり、１つの試料について非常に限られた数のタンパク質しか検出できなかったりする。
【００４３】
病理医が良性のものから病的なものまであらゆる種類の病理学的実体を同定、診断、定量、およびプロファイリングできるようにする目的で、本発明は、ＳＲＭを用いて特定タンパク質を特異的に同定する特有ペプチドを標的とすることにより、こうした解析が多重化された様式で実行されることを可能にする。このような病理学的実体として、腺癌、扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病を含む全種類の癌、ならびに炎症細胞解析および骨髄細胞解析を含む炎症性疾患の領域が挙げられるが、これらに限定されない。この解析は、病理医に、予後および治療のガイダンスも与えることができる。この解析は、臨床的血液型検査を行うことができ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）検査に基づいて子宮頸癌の危険性が特に高い女性を同定する診断検査の機能を果たすこともできる。
【００４４】
多重化ＳＲＭ解析は、特に、本発明によるヒトタンパク質バイオマーカーおよびヒトパピローマウイルスタンパク質を検出するように設計されている。
【００４５】
ＳＲＭ解析は、将来的には幅広いタンパク質を検出するように設計することができる。本発明によるＳＲＭプラットフォームは、数百種にも上る様々なタンパク質のタンパク質発現プロファイルに基づいて、良性のものから病的なものまで広く様々な病理学的実体についての定量的な診断プロファイルを研究機関にもたらすことができるようにという視点で設計されている。
【００４６】
この解析は、１つの試料で数多くのマーカーを検査することができるように、多重化することが容易である。現在、この技法は、血液１滴から３５分という時間枠で、３５０種にも上るタンパク質を検出しその絶対量を測定することができる。臨床試料に応用した場合、ＳＲＭ技法は、現行の診断プロセスおよび時間枠と完全に両立できる。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明により、この選択反応モニタリング技法は、多重化タンパク質プロファイリングプラットフォームとして、広範囲の癌をプロファイリングおよび研究するのに用いることができる。この技法は、幅広い細胞株、すなわち、ホルマリン固定してパラフィンブロックに埋め込んだ細胞または組織、新鮮なまたは新鮮なまま凍結した組織、生体液（血液、血清、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、骨髄、乳頭吸引液が挙げられるが、これらに限定されない）、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）保存液またはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液のいずれかを含有する細胞診断薄層バイアルからの試料、および細針吸引法（ＦＮＡ）による試料、のいずれかに由来する良性および癌性細胞溶解液を研究するのに適用することができる。
【００４８】
乳癌は、多重反応モニタリング法を用いて分析されている、ただ１種の癌である。
【００４９】
好適な実施形態において、このＭＲＭ技法は、乳癌細胞株の研究に適用されている。この研究に基づく結果から、ＳＲＭ技法が相同タンパク質群、つまりサイトケラチン５と様々なサイトケラチン６アイソフォームとを識別できることが実証されている。従来、サイトケラチン５および６は、基底細胞乳癌を診断するマーカーとして使用されてきたが、サイトケラチン５およびサイトケラチン６アイソフォームに対して利用可能な抗体は、限られている。というのも、相同性の高いこれらのタンパク質を抗体が見分けられないからである。本発明によれば、本方法は、複雑な混合物中の複数のタンパク質を選択的に定量することができる高特異性で高感度の質量分析（ＭＳ）技法である選択反応モニタリング（ＳＲＭ）に関する。それゆえ、本発明は、ＳＲＭを用いた標的化ＭＳアプローチを応用して、多数の乳癌細胞株におけるサイトケラチン発現を同定および特性決定する。本発明は、相同性の高いサイトケラチン５とサイトケラチン６アイソフォームとを分離することができる。
【００５０】
上皮ケラチン（Ｋ）群は、幅広いヒト腫瘍でも独特の発現パターンを示している。上皮ケラチンのいくつか（特にＫ５、Ｋ７、Ｋ８／Ｋ１８、Ｋ１９、およびＫ２０）は、細胞腫の免疫組織化学診断、特に詳細な分類およびサブタイプ決定において、重要性が高い。したがって、本発明は、特異的かつ定量的な多重化診断解析法として、幅広いヒト腫瘍に適用することができる。
技術方法論
標準操作手順
【実施例１】
【００５１】
各タンパク質バイオマーカーについて、ＭＲＭ  Ｐｉｌｏｔ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いて、１組のＳＲＭ質量遷移を設計した。ついで、ペプチド質量遷移を手作業で評価して、注目しているタンパク質が相同タンパク質のファミリーに属しているかどうか、または注目しているタンパク質が複数の対立アイソフォームを有するかどうか、または注目しているタンパク質に天然の変異型が存在するかどうか、または患者にとって治療上重要である既知の翻訳後修飾が存在するかどうかを突き止めた。これらの条件のうちいずれかが当てはまったら、コンピュータシミュレーションでの消化を行い、これらの注目しているアイソフォームまたは修飾ペプチドを同定できるペプチドを浮かび上がらせた。浮かび上がったペプチドについても、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを用いて手作業で検証して、それらが個々のタンパク質に対して独自のペプチドであったことを確定した。試料の処理は、細胞タンパク質を沈殿させ、試料を還元およびアルキル化して、得られた試料をトリプシンで消化することにより行った。試料のタンパク質を消化するのに必要であれば、他の酵素を加えてもよい。ついで、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣにＮａｎｏｓｐｒａｙ（登録商標）Ｉｏｎ  ＳｏｕｒｃｅおよびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｐｅｐｍａｐカラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて、トリプシンペプチドを分離した。ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）システムで質量分析を行った。ついで、Ｍｕｌｔｉｑｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いて、各ペプチドについて得られたスペクトルおよび複数の質量遷移を分析した。
【実施例２】
【００５２】
実施例１の修飾および改変として、選択反応モニタリングと組み合わせた、ｍＴＲＡＱ（登録商標）試薬（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）またはＡＱＵＡ型の重ペプチドのいずれか、さらには無標識の定量化までも解析標準として使用する幅広い定量化法を挙げることができ、これらの定量化法は全て、複雑な生体試料から、注目しているタンパク質バイオマーカーの相対量または絶対量をはじき出すために用いられてきたものである。
【００５３】
そのうえさらに、画像化質量分析をこれらのタンパク質の臨床検査に組み込むことも可能であるかもしれない。もっとも、この技法は、病理検査の臨床業務にルーチンとして組み込むことができるほどには、まだ十分進歩してはいない。
【００５４】
一方、多種のデータベースを検索するシステムを利用するＳＷＡＴＨ（登録商標）収集技法（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）が、様々なペプチドの定量化において、より重要な役割を果たすようになるかもしれない。この技法を利用した予備研究は、最先端の三連四重極型測定機に匹敵する定量性能を実証しつつあるが、この技法が適切な様式で組み込まれるまでにはさらなる評価が必要だろう。
試料調製技法
【００５５】
好ましくは、本発明による方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上手く消化できるように臨床試料を調製（例えば、パラフィン埋込組織の場合は脱ろうする必要がある）し、適切な緩衝液に入れて、酵素消化を行う工程；血液または血清試料中の多量タンパク質の除去を行ってもよいし；適切な抗体を用いてこの試料中の注目しているタンパク質の捕捉および抽出を含む免疫精製を行ってもよいし、様々な濃縮プロトコルを用いて試料中の特定ペプチド群の濃度を上昇させてもよい；
（ｂ）タンパク質試料を還元およびアルキル化する工程；ならびに
（ｃ）得られる試料を適切な酵素（トリプシンなど）で消化する工程。
タンパク質分解の方法は他にもあるが、しかしながら、酵素消化は特異的であり、コンピュータシミュレーションでの消化が行われていることで、どの特異的酵素が最適なタンパク質分解ペプチド、つまり特定の診断用タンパク質アイソフォーム、タンパク質変異体、または翻訳後修飾体を特徴付けることができるペプチドを生成できるかが確定している。試料タンパク質を消化するのに必要であれば、他の酵素も添加してよい。
【００５６】
ＳＲＭ法を用いることで、乳癌細胞を基底細胞型と乳管上皮型で分離できるだけではなく、これまでに遺伝子発現プロファイルにより区別されている分子サブタイプでも乳癌を分離することができる方法が開発された。遺伝子発現分析から、６種の腫瘍サブタイプ（ルミナルＡ型（ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ）、ルミナルＢ型（ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ）、ＨＥＲ２強発現型（ＨＥＲ２−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、正常様（ｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅ）型、基底細胞様型（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）、および低クローディン型（ｃｌａｕｄｉｎ−ｌｏｗ））が定義されている。これらのサブタイプは、再発の有無および全生存期間の予測を与えるものであり、化学療法への応答性の予測も与えるものである。
【００５７】
ＥＧＦＲタンパク質の４種のアイソフォームを定量的に分離する、ＳＲＭを利用した解析法が開発された。ＥＧＦＲタンパク質の４種のアイソフォームを分離するこのＳＲＭ法は、現在用いられている抗体を利用した検出法よりも高感度で高精度の解析法である。このＳＲＭ解析では、複数の異なる酵素（すなわち、トリプシン、キモトリプシン、およびペプシン）を用いて組織を消化するが、代替酵素を用いることもできる。この特別なＳＲＭ法は、特定ペプチドを標的とすることで、ＥＧＦＲタンパク質から様々な変異により生じる、肺癌、結腸直腸癌、および乳癌で検出されている天然の変異型タンパク質を同定および定量することもできる。このＳＲＭ法は、翻訳後修飾により修飾されている様々なアイソフォームから注目しているペプチドを検出することもでもきる。そのような翻訳後修飾として、リン酸化、グリコシル化、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、Ｕｎｉｐｒｏｔに記載されている全てのＥＧＦＲタンパク質アイソフォームおよび修飾体に適用されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）。
【００５８】
受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢタンパク質の４種のアイソフォームを定量的に分離する、ＳＲＭを利用した解析法が開発された。受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢタンパク質の過剰発現は、原発性乳癌の２５％〜３０％で観測される。このタンパク質の４種のアイソフォームを分離するこのＳＲＭ法は、現在用いられている抗体を利用した検出法よりも高感度で高精度の解析法である。このＳＲＭ法は、特定ペプチドを標的とすることで、受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２タンパク質からインフレーム変異により生じる、肺腺癌、胃腺癌、卵巣癌、および神経膠腫に関係している多数の天然変異型タンパク質を同定および定量することもできる。このＳＲＭ法は、翻訳後修飾により修飾されている様々なアイソフォームから注目しているペプチドを検出することもでもきる。そのような翻訳後修飾として、リン酸化およびグリコシル化が挙げられるが、これらに限定されない。上記のＥＧＦＲプロトコルで述べたとおり、この受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２についてのＳＲＭ解析には、他の酵素も用いられる。このＳＲＭ法は、Ｕｎｉｐｒｏｔに記載されている全ての受容体型タンパク質チロシンキナーゼｅｒｂＢタンパク質アイソフォームおよび修飾体に適用されている。
【００５９】
本明細書では好適な実施形態の特徴をかなり強調してきたものの、当然のことながら、本発明の原則から逸脱することなく、好適な実施形態にさらなる特徴を多数追加でき、また多くの変更を加えることができる。本発明の好適な実施形態におけるこのようなおよびその他の変更は、本明細書の開示から当業者には明らかであり、開示により、上記の記述内容は、本発明の例示にすぎないと解釈されて、制限と解釈されはしないことが明確に理解されるはずである。
【国際調査報告】
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