(57)【要約】本発明は、黄色ブドウ球菌感染の予防および治療に有用な免疫原性組成物を提供する。具体的には、本発明は、α溶血素発現黄色ブドウ球菌に対する免疫反応を誘導する方法、黄色ブドウ球菌感染を予防または治療する方法、および黄色ブドウ球菌感染を予防または治療するための組成物を提供する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸２７〜８８と少なくとも８５％同一の第１のアミノ酸配列を含む、少なくとも５５アミノ酸長であるが、１００アミノ酸長を超えない単離オリゴペプチド。
【請求項２】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項３】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８と少なくとも９５％同一である、請求項２に記載のオリゴペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸２７〜８８を含む、請求項３に記載のオリゴペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一であるか、または最大３個の単一アミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を除いて同一である第２のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項６】
前記第２のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、請求項５に記載のオリゴペプチド。
【請求項７】
前記第２のアミノ酸配列は、前記第１のアミノ酸配列のＣ末端に位置する、請求項５または請求項６に記載のオリゴペプチド。
【請求項８】
前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間にリンカーをさらに含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項９】
前記リンカーは、グリシン、セリン、アラニン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個であるが、１５個を超えないアミノ酸を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１０】
前記リンカーは、３つのグリシンから成る、請求項９に記載のオリゴペプチド。
【請求項１１】
−３０００ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の算出された分子エネルギーを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１２】
−３５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の算出された分子エネルギーを含む、請求項１１に記載のオリゴペプチド。
【請求項１３】
−４５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３０００ｋｃａｌ／ｍｏｌの算出された分子エネルギーを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１４】
−４２００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３５００ｋｃａｌ／ｍｏｌの算出された分子エネルギーを含む、請求項１３に記載のオリゴペプチド。
【請求項１５】
−３８００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３６００ｋｃａｌ／ｍｏｌの算出された分子エネルギーを含む、請求項１１に記載のオリゴペプチド。
【請求項１６】
−４１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３９００ｋｃａｌ／ｍｏｌの算出された分子エネルギーを含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１７】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１８】
前記異種アミノ酸配列は、Ｈｉｓタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐタグ、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド、Ｓタグ、Ｔ７タグ、前記異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および前記異種ペプチドのうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるペプチドをコードする、請求項１７に記載のオリゴペプチド。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列は、免疫原、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、前記異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および前記異種ペプチドのうちの２つ以上の組み合わせをコードする、請求項１７に記載のオリゴペプチド。
【請求項２０】
免疫原性炭水化物をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項２１】
前記免疫原性炭水化物は、サッカリドである、請求項２０に記載のオリゴペプチド。
【請求項２２】
前記免疫原性炭水化物は、莢膜多糖類または表面多糖類である、請求項２０または２１に記載のオリゴペプチド。
【請求項２３】
前記免疫原性炭水化物は、莢膜多糖類（ＣＰ）血清型５（ＣＰ５）、ＣＰ８、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、壁タイコ酸（ＷＴＡ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、前記免疫原性炭水化物のうちのいずれかの断片、および前記免疫原性炭水化物のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載のオリゴペプチド。
【請求項２４】
前記免疫原性炭水化物は、前記オリゴペプチドに接合される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
異種核酸をさらに含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記異種核酸は、前記オリゴペプチドをコードする前記核酸と動作可能に結合するプロモーターを含む、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２９】
プラスミドである、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
前記プラスミドは、ｐＥＴ２４プラスミドである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３２】
細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、または植物細胞である、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記細菌は、大腸菌である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することと、前記オリゴペプチドを回収することと、を含む、α溶血素オリゴペプチドを産生する方法。
【請求項３５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオリゴペプチドと、担体と、を含む、組成物。
【請求項３６】
アジュバントをさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アジュバントは、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、またはグルコピラノシル脂質Ａベースのアジュバントである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
免疫原をさらに含む、請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記免疫原は、細菌性抗原である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記細菌性抗原は、孔形成毒素、超抗原、細胞表面タンパク質、前記細菌性抗原のうちのいずれかの断片、および前記細菌性抗原のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ブドウ球菌株に対する宿主免疫反応を誘導する方法であって、免疫反応を必要とする対象に、有効な量の請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記免疫反応は、抗体反応である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫反応は、生得的反応、体液性反応、抗体反応、および前記免疫反応のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
対象におけるブドウ球菌、連鎖球菌、または腸球菌疾患もしくは感染を予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
前記感染は、皮膚、軟組織、血液、または臓器の局所もしくは全身感染であるか、あるいは本質的に自己免疫である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患は、呼吸器疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記呼吸器疾患は、肺炎である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象は、動物である、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象は、脊椎動物である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記脊椎動物は、哺乳動物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物は、ウシまたはイヌである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物は、筋肉注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈注射、経口投与、粘膜投与、鼻内投与、または肺内投与を介して投与される、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
黄色ブドウ球菌感染に対するワクチンを産生する方法であって、
（ａ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオリゴペプチドを単離することと、
（ｂ）前記オリゴペプチドをアジュバントと組み合わせることと、
を含む、方法。
【請求項５６】
配列番号２のアミノ酸２７〜８８にわたるドメイン内のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５７】
前記抗体は、α溶血毒（Ｈｌａ）オリゴマー化を阻害する、請求項５６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５８】
前記抗体は、α溶血毒（Ｈｌａ）を中和する、請求項５６または５７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５９】
請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、担体と、を含む、組成物。
【請求項６０】
第２の抗体またはその抗原結合断片をさらに含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記第２の抗体は、細菌性抗原に結合する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記細菌性抗原は、孔形成毒素、超抗原、細胞表面タンパク質、前記細菌性抗原のうちのいずれかの断片、および前記細菌性抗原のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
動物を受動的に免疫化するための方法であって、動物に、有効な量の請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の治療および予防に関する。具体的には、本発明は、黄色ブドウ球菌感染を予防し、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患を治療するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は、にきび、膿痂疹、腫れ物（せつ）、蜂巣炎毛嚢炎、癰、熱傷様皮膚症候、および膿瘍等の軽度の皮膚感染から、肺炎、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、心内膜炎、髄膜炎、術後創傷感染、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および毒素性ショック症候群等の生命を脅かす深部感染に及ぶ、多種多様の感染を引き起こす、グラム陽性ヒト病原体である（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９０），ｐｐ．４８５−５０６）。
【０００３】
肺炎は、米国だけで１年に５０，０００件にのぼる黄色ブドウ球菌感染の最も重度かつ顕著な合併症のうちの１つである（Ｋｕｅｈｎｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １１：８６８−８７２，  ２００５）。黄色ブドウ球菌肺炎は、従来、人工呼吸器関連であるが、近年、主に、他の点では健康な小児および若年個人における地域感染型肺炎の主な原因としても認識されている。
【０００４】
感染の治療に現在利用可能な抗生物質の多くに耐性を呈する黄色ブドウ球菌分離株の著しい増加が、世界中の病院で観察されている。黄色ブドウ球菌に効くペニシリンの開発は、感染の制御および治療における大きな進歩であった。残念ながら、ペニシリン耐性生物がすぐに出現し、新しい抗生物質の必要性が最重要であった。あらゆる新たな抗生物質の導入に伴い、黄色ブドウ球菌は、β−ラクタマーゼ、変性ペニシリン結合タンパク質、および変異細胞膜タンパク質に対抗することができ、細菌の存続を可能にしている。さらに、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および多剤耐性生物が出現し、世界中の病院および養護施設で大きな足掛かりを確立している（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．，１：１７３，１９８８、およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．，９４：３１３，１９９３）。今日、院内感染を引き起こすブドウ球菌株の半数近くは、バンコマイシンおよびリネゾリドを除く全ての抗生物質に耐性がある。ＭＲＳＡの中でも多くのバンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、およびわずかのバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌が文献で報告されているため、バンコマイシンも効力を失うのは時間の問題のようである（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ  ＰＣ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．，１２  Ｓｕｐｐｌ  １：１６−２３，２００６）。
【０００５】
黄色ブドウ球菌感染に対する天然免疫は、依然として不明なところが多いままである。典型的には、健康なヒトおよび動物は、黄色ブドウ球菌感染への高度の生得的耐性を呈する。保護は、無傷の上皮および粘膜障壁ならびに正常細胞および体液性反応に起因する。黄色ブドウ球菌構成要素に対する抗体の力価は、重度の感染後に上昇する（Ｒｙｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４３（５）：３２８−３３４，１９９５）。しかしながら、現在まで、これらの得られた抗体力価とヒトの免疫との間の相関の血清学的証拠はない。
【０００６】
黄色ブドウ球菌の病原性は、多数の病原性因子の組み合わせによるものであり、これらの組み合わせは、その細菌が真核細胞膜に付着することを可能にする表面結合タンパク質、オプソニン化貪食作用からその細菌を保護する莢膜多糖類（ＣＰ）、およびいくつかの外毒素を含む。黄色ブドウ球菌は、主に、溶血素、エンテロトキシン、および毒素性ショック症候群毒素等の分泌病原性因子の産生を通して、疾患を引き起こす。これらの分泌病原性因子の２つの主要な目的は、１）宿主における多くの免疫機構を不活性化することによって免疫反応を抑制すること、および２）組織の破壊を引き起こして感染を確立するのに役立つことである。後者は、一群の孔形成毒素によって達成され、そのうちの最も顕著なものは、「α溶血毒」または「Ｈｌａ」とも呼ばれる、α溶血素である。α溶血素は、黄色ブドウ球菌の病原性株の大部分に存在する。複数の研究が、α溶血素が黄色ブドウ球菌肺炎の主要な病原性因子であることを示している。この点に関して、点突然変異体または欠失変異体を使用したマウスでの概念研究の証拠は、このタンパク質に対するワクチン接種が、致命的肺炎の攻撃感染に対する保護を提供することを示している（Ｂｕｂｅｃｋ−Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０５（２）：２８７−９４，２００８、Ｂｒａｍｌｅｙ  ＡＪ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．；５７（８）：２４８９−９４，１９８９、Ｐａｔｅｌ  ＡＨ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．；５５（１２）：３１０３−１０，  １９８７）。
【０００７】
抗α溶血毒免疫は、実験モデルにおいてα溶血毒の有害かつ致命的な影響を中和する際に保護的であることが示されている。しかしながら、α溶血素は、その毒性作用により、その野生型形態でワクチンとして使用することができない。α溶血毒の化学および分子修飾は、報告によると、その毒性を減少させることができるが、免疫原性を維持しながらα溶血毒の毒性を完全に排除するといった修正は１つも報告されていない。
【０００８】
したがって、当技術分野において、α溶血素発現黄色ブドウ球菌に対する免疫を安全に与えることができる組成物および方法の必要性が未だ存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、α溶血素発現黄色ブドウ球菌に対する免疫反応を誘導する方法、黄色ブドウ球菌感染を予防または治療する方法、および黄色ブドウ球菌感染を予防または治療するための組成物を提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８と少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一の第１のアミノ酸配列を含む、少なくとも５５アミノ酸長であるが、１００アミノ酸長を超えない単離オリゴペプチドを対象とする。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、最大１、２、３、４、または５個の単一アミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を除いて、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、第２のアミノ酸配列をさらに含む、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを対象とする。第２のアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、上述の単離オリゴペプチドも含まれる。
【００１２】
本発明はさらに、該第１のアミノ酸配列と該第２のアミノ酸配列との間にリンカーを含む、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを含む。ある実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、例えば、ＧＧＧを含む。
【００１３】
本発明はまた、−３０００ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または−３５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または−４５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３０００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または−４２００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または−３８００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３６００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または−４１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３９００ｋｃａｌ／ｍｏｌの算出された分子エネルギーを有する、本明細書に記載の単離リゴペプチドも対象とする。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、異種アミノ酸配列をさらに含む、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫原性炭水化物、例えば、サッカリドをさらに含む、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを含む。一実施形態では、免疫原性炭水化物は、莢膜多糖類または表面多糖類、例えば、莢膜多糖類（ＣＰ）血清型５（ＣＰ５）、ＣＰ８、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、壁タイコ酸（ＷＴＡ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、該免疫原性炭水化物のうちのいずれかの断片、または該免疫原性炭水化物のうちの２つ以上の組み合わせである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫原性炭水化物に接合される、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを含む。
【００１７】
本発明はさらに、本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする、核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドはさらに、いくつかの実施形態では、異種核酸を含む。別の実施形態では、上述の異種核酸は、本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする該核酸と動作可能に結合するプロモーターを含む。
【００１８】
上述のポリヌクレオチドを含むベクター、またはベクターを含む宿主細胞も含まれる。ある実施形態では、本発明は、宿主細胞を培養することと、オリゴペプチドを回収することとを含む、オリゴペプチドを産生する方法を含む。本発明はさらに、上記のオリゴペプチドのうちのいずれかを含む、組成物を含む。本組成物はさらに、アジュバントを含むことができる。別の実施形態では、本組成物はさらに、追加の免疫原、例えば、細菌性抗原を含むことができる。ある実施形態では、細菌性抗原は、孔形成毒素、超抗原、細胞表面タンパク質、該細菌性抗原のうちのいずれかの断片、または該細菌性抗原のうちの２つ以上の組み合わせである。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、免疫反応を必要とする対象に、本明細書に記載の有効な量の組成物を投与することを含む、α溶血素発現黄色ブドウ球菌に対する該免疫反応を誘導する方法を対象とする。一実施形態では、免疫反応は、抗体反応である。別の実施形態では、免疫反応は、Ｔ細胞反応である。免疫反応はまた、合同でＴ細胞反応および抗体反応でもあり得る。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、対象における黄色ブドウ球菌感染を予防または黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患治療する方法を対象とし、それを必要とする対象に本明細書に記載の組成物を投与することを含む。感染は、皮膚感染であり得、疾患は、肺炎または敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）であり得る。対象は、動物、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、またはウシであり得る。本明細書に記載の組成物は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈注射、経口投与、粘膜投与、鼻内投与、または肺内投与を介して投与することができる。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８にわたるドメイン内のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を対象とする。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、α溶血毒（Ｈｌａ）オリゴマー化を阻害し、および／またはα溶血毒（Ｈｌａ）を中和する。本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片と、担体とを含む、組成物を対象とする。一実施形態では、本発明の組成物は、第２の抗体、例えば、細菌性抗原に結合する抗体を含む。
【００２２】
本発明はさらに、動物、例えば、哺乳動物に、本明細書に記載の有効な量の任意の組成物を投与することを含む、該動物を受動的に免疫化するための方法を含む。
【００２３】
また、本明細書に記載のオリゴペプチドを単離することと、アジュバントをオリゴペプチドに追加することを含む、黄色ブドウ球菌感染に対するワクチンを産生する方法も含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される配列同定子は以下の通りである。
配列番号１：例示的な全長野生型黄色ブドウ球菌α溶血素ヌクレオチド配列。
配列番号２：例示的な全長野生型黄色ブドウ球菌α溶血素アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿００１５７４９９６．１）。
配列番号３：配列番号２のアミノ酸２７〜８８、追加されたＮ末端メチオニン、追加されたＣ末端ロイシンおよびグルタミン酸（Ｘｈｏ  Ｉ制限酵素部位を介して導入される）、およびｐＥＴ−２４ａ（＋）発現ベクターに含まれる追加された６つのヒスチジン残基（ｈｉｓ６）を含む、オリゴペプチドである、「ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６」をコードするヌクレオチド配列。
配列番号４：配列番号２のアミノ酸２７〜８８、追加されたＮ末端メチオニン、追加されたＣ末端ロイシンおよびグルタミン酸（Ｘｈｏ  Ｉ制限酵素部位を介して導入される）、およびｐＥＴ−２４ａ（＋）発現ベクターに含まれる追加された６つのヒスチジン残基（ｈｉｓ６）を含む、α溶血素オリゴペプチド「ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６」。
配列番号５：アミノ酸（配列番号２の２７〜８８）−（ＧＧＧ）−（配列番号２の２４９〜２６２）、追加されたＮ末端メチオニン、ならびに追加されたＣ末端ロイシンおよびグルタミン酸（Ｘｈｏ  Ｉ制限酵素部位を介して導入される）、およびｐＥＴ−２４ａ（＋）発現ベクターに含まれる追加された６つのヒスチジン残基（ｈｉｓ６）を含む、オリゴペプチドである、「ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６」をコードするヌクレオチド配列。
配列番号６：アミノ酸（配列番号２の２７〜８８）−（ＧＧＧ）−（配列番号２の２４９〜２６２）、追加されたＮ末端メチオニン、追加されたＣ末端ロイシンおよびグルタミン酸（Ｘｈｏ  Ｉ制限酵素部位を介して導入される）、およびｐＥＴ−２４ａ（＋）発現ベクターに含まれる追加された６つのヒスチジン残基（ｈｉｓ６）を含む、α溶血素オリゴペプチド「ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６」。
配列番号７：順方向プライマー。
配列番号８：逆方向プライマー。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本明細書に記載の構築物が由来する、４本鎖シート構造を描写する、黒いリボンを伴うグレーのリボンでレンダリングされたα溶血素７量体結晶構造。
【図２】本発明のオリゴペプチドに対するα溶血素中の二次構造要素の局所構造。
【図３】７ＡＨＬ７量体溶血素結晶構造からのサブユニットのタンパク質表面上の配列番号２のオリゴペプチド「ＡＨＬ６２」アミノ酸２７〜８８およびオリゴペプチド「ＡＨＬ７９」アミノ酸（配列番号２の２７〜８８）−（ＧＧＧ）−（配列番号２の２４９〜２６２）の相対的局所構造。配列番号２のアミノ酸２７〜８８に対するタンパク質表面は、濃いグレーで色付けされ、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２に対するタンパク質表面は、黒で色付けされ、残りのタンパク質構造は、薄いグレーで色付けされている。
【図４】（Ａ）ＩＰＴＧ導入後に構築物ｐＥＴ２４−６２ＡＡ  Ｈｉｓ６またはｐＥＴ２４−７９ＡＡ  Ｈｉｓ６の過剰発現を伴う、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）からのｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＨＬ６２ＡＡ）およびｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＨＬ７９ＡＡ）タンパク質に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：Ｍ、分子量標準タンパク質サイズマーカー、レーン２：ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６、Ｌａｎｅ３：ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６。（Ｂ）ヒツジ抗α溶血素ポリクローナル抗体（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｒａｓｏｔａ，  ＦＬ）によるウェスタンブロット分析。レーン１：Ｍ、分子量標準タンパク質サイズマーカー、レーン２：ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６、レーン３：ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６。
【図５】黄色ブドウ球菌（ＳＡ）Ｎｅｗｍａｎ細菌株（ＳＡ  Ｎｅｗｍａｎ株）を用いた鼻腔内（ＩＮ）感染攻撃後の筋肉内で免疫化されたマウス対免疫化されていないマウスのワクチン接種スケジュールおよび生存率。ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）中の（Ａ）ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（６２ＡＡ）または（Ｂ）ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（７９ＡＡ）で免疫化されたマウスの生存率。
【図６】（Ａ）２×１０８ＣＦＵ  ＳＡ  Ｎｅｗｍａｎ株を用いたＩＮ感染攻撃後のＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）中の４０μｇのｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＴ−５０ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＴ−６２ａａ）、または４０μｇのＢＳＡで免疫化されたマウス（ｎ＝１０／グループ）の生存率（％）（ログランク（マンテル・コックス検定）を使用してＰ＝０．００８）。（Ｂ）５μｇのＨｌａを用いた皮内（ＩＤ）感染攻撃後の免疫マウスの病変サイズ。４μｇのＡＨＬ−５０ａａ（ＡＴ−５０ａａ）、ＡＨＬ−６２ａａ（ＡＴ−６２ａａ）、または４０μｇのＢＳＡで免疫化されたマウス（ｎ＝１０／グループ）の感染攻撃後の異なる時点での病変サイズ。統計的相関：双方向ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定、「＊」は、統計的有意性を表す。（Ｃ）指示されたワクチンを接種され、５μｇ精製Ｈｌａを用いて感染攻撃を受けたマウスの真皮病変の画像。
【図７】（Ａ）１μｇ／ｍｌのＨｌａに対するウサギ抗ＡＨＬ−６２ａａポリクローナル抗体（ｐＡｂ）の５０％中和価（ＮＴ５０）の判定。（Ｂ）抗Ｈｌａ−６２ａａ  ｐＡｂを用いた毒素オリゴマー化阻害。ウサギＲＢＣが、Ｈｌａ単独、またはｐＡｂで前培養されたＨｌａを用いて培養された。レーン１：煮沸、レーン２：４℃、レーン３：ＲＢＣがないＨｌａ対照、レーン４〜１０：減少する濃度の抗Ｈｌａ−６２ａａ  ｐＡｂ（ＡＴ−６２ａａ）を伴う中和された１５μｇ／ｍｌのＨｌａ（４００〜６．２５μｇ／ｍｌに２倍希釈）。
【図８】（Ａ）それぞれＩＤＣ−１００１アジュバントを用いて製剤化された、１０μｇのｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＴ−５０ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＴ−６２ａａ）、またはｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＴ−７９ａａ）で免疫化されたマウス（ｎ＝２０／グループ）から得られた、マウス血清中のα溶血毒（Ｈｌａ）に対する全抗体の中央ＥＬＩＳＡ価（ＥＣ５０）の判定。（Ｂ）それぞれＩＤＣ−１００１を用いて製剤化された、１０μｇのＡＨＬ−５０ａａ（ＡＴ−５０ａａ）、ＡＨＬ−６２ａａ（ＡＴ−６２ａａ）、またはＡＨＬ−７９ａａ（ＡＴ−７９ａａ）で免疫化されたマウス（ｎ＝５／グループ）から得られた、マウス血清中のＨｌａに対する中和抗体の中和価（ＮＴ５０）の判定。
【図９】６×１０７ＣＦＵのＳＡ  Ｎｅｗｍａｎ株を用いたＩＮ感染攻撃後の、それぞれＩＤＣ−１００１アジュバント中の１０μｇのｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（５０ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（６２ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（７９ａａ）で免疫化されたマウス（ｎ＝１０／グループ）、または対照タンパク質（ＢＳＡ）で免疫化されたマウス（ｎ＝５／グループ）の生存率（％）（ログランク（マンテル・コックス検定）を使用して、６２ａａ対対照：Ｐ＝０．０００２、６２ａａ対５０ａａ：Ｐ＝０．０００２、および６２ａａ対７９ａａ：Ｐ＝０．００４３）。
【図１０】３％ブタムチン中の５×１０４ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００株（ＬＡＣ）を用いたＩＰ感染攻撃後の、それぞれＩＤＣ−１００１アジュバント中の１０μｇのｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（５０ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（６２ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（７９ａａ）で免疫化されたマウス（ｎ＝１０／グループ）、または対照タンパク質（ＢＳＡ）で免疫化されたマウス（ｎ＝５／グループ）の生存率（％）（ログランク（マンテル・コックス検定）を使用して、５０ａａ対対照：Ｐ＝０．０１４７、６２ａａ／７９ａａ対対照：Ｐ＝０．０００８、および６２ａａ／７９ａａ対５０ａａ：Ｐ＝０．０６７）。
【図１１】１．５×１０８ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００株を用いたＩＮ感染攻撃後の、ＩＤＣ−１００１アジュバント中の１０μｇのｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（６２ａａ）で免疫化されたマウス（ｎ＝５／グループ）、または、ＩＤＣ−１００１単独で免疫化されたマウス（ｎ＝１０／グループ）の生存率（％）（ログランク（マンテル・コックス検定）を使用して、６２ａａ対対照：Ｐ＝０．０００５）。
【図１２】３％ブタムチン中の５×１０４ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００株を用いたＩＰ感染攻撃が後に続いた、抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧ（ＡＴ  ＩｇＧ）または無処理ＩｇＧを用いたマウス（ｎ＝２０／グループ）の受動免疫後の（Ａ）血液（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ血液）、（Ｂ）腎臓（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／腎臓）、（Ｃ）肝臓（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／肝臓）、（Ｄ）脾臓（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／脾臓）、および（Ｅ）肺（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／肺）における細菌負荷。細菌成長がないサンプルには、実験的に「０」というｌｏｇ１０値が与えられた（マンホイットニー検定を使用して、全症例において、ＡＴ  ＩｇＧ対無処理ＩｇＧ：Ｐ＜０．０００１）。
【図１３】１．３×１０８ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００株を用いたＩＮ感染攻撃が後に続いた、抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧ（ＡＴ  ＩｇＧ）または無処理ＩｇＧを用いたマウス（ｎ＝２０／グループ）の受動免疫後の（Ａ）血液（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ血液）、（Ｂ）腎臓（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／腎臓）、（Ｃ）肝臓（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／肝臓）、（Ｄ）脾臓（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／脾臓）、および（Ｅ）肺（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／肺）における細菌負荷。細菌成長がないサンプルには、実験的に「０」というｌｏｇ１０値が与えられた（マンホイットニー検定を使用して、ＡＴ  ＩｇＧ対無処理ＩｇＧ：腎臓についてはＰ＝０．０２２、肝臓についてはＰ＝０．０４９、および肺についてはＰ＝０．０４３）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ブドウ球菌属からのα溶血素由来オリゴペプチドおよびポリヌクレオチド、オリゴペプチドを含む組成物、およびブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌感染を治療するように組成物を投与する方法を対象とする。
略称
【００２７】
ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準略称が本明細書で使用される。加えて、以下の略称も本明細書で使用される。
【表１】
2014507142.tif 000003
定義
【００２８】
「１つの（「ａ」または「ａｎ」）」実体という用語は、１つ以上のその実体を示し、例えば、「ポリヌクレオチド」は、１つ以上のポリヌクレオチドを表すと理解されることに留意されたい。そのようなものとして、「１つの（「ａ」または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。
【００２９】
「核酸」または「核酸断片」という用語は、ポリヌクレオチドまたは構築物の中に存在する、いずれか１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。本発明の２つ以上の核酸は、単一のポリヌクレオチド構築物の中、例えば、単一のプラスミドの上、または別個の（同一ではない）ポリヌクレオチド構築物の中、例えば、別個のプラスミドの上に存在することができる。さらに、任意の核酸または核酸断片は、単一のポリペプチド、例えば、単一の抗原、サイトカイン、または調節ポリペプチドをコードすることができ、または１つよりも多くのポリペプチドをコードすることができ、例えば、核酸は、２つ以上のポリペプチドをコードすることができる。加えて、核酸は、プロモーターまたは転写ターミネータ等の調節要素をコードすることができ、あるいは分泌シグナルペプチドまたは機能ドメイン等のポリペプチドまたはタンパク質の特殊要素またはモチーフをコードすることができる。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸または核酸断片、ならびに複数の核酸または核酸断片を包含することを目的としており、単離分子または構築物、例えば、ウイルスゲノム（例えば、非感染性ウイルスゲノム）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、またはｐＤＮＡの誘導体（例えば、ポリヌクレオチドを含む、（Ｄａｒｑｕｅｔ，  Ａ−Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１３４１−１３４９，  １９９７）に記載のミニサークル）を指す。ポリヌクレオチドは、線形（例えば、ｍＲＮＡ）、円形（例えば、プラスミド）、または分岐形態、ならびに２本鎖または１本鎖形態で提供することができる。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見出されるようなアミド結合）を含むことができる。
【００３１】
本明細書で使用される際、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを目的とし、２つ以上のアミノ酸のいずれか１本または複数の鎖を含む。したがって、本明細書で使用される際、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、または２つ以上のアミノ酸の１本または複数の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、（これらの用語のそれぞれはより具体的な意味を有し得るが）「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに、またはそれと交換可能に使用することができる。本用語はさらに、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を受けた、ポリペプチドを含む。
【００３２】
本明細書で使用される際、「黄色ブドウ球菌α溶血素ポリペプチド」という用語は、全長α溶血素、および全長α溶血素の断片、変異体、または誘導体、全長α溶血素を含むキメラおよび融合ポリペプチド、または全長α溶血素の１つ以上の断片を包含する。
【００３３】
本発明の黄色ブドウ球菌α溶血素ポリペプチドを指すときの「断片」、「類似体」、「誘導体」、または「変異体」という用語は、自然発生タンパク質の免疫原性または抗原性のうちの少なくともいくつかを保持する、任意のポリペプチドを含む。本発明の黄色ブドウ球菌α溶血素ポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片、欠失断片、特に、発現、精製、および／または動物への投与中に増加した可溶性を呈するα溶血素ポリペプチドの断片を含む。α溶血素の断片はさらに、対象に送達されるときに低減した病原性を呈する、タンパク質分解断片または欠失断片を含む。ポリペプチド断片はさらに、線形ならびに３次元エピトープを含む、天然ポリペプチドの抗原または免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドの任意の部分を含む。
【００３４】
ポリペプチド抗原の「エピトープ断片」は、エピトープを含有する抗原の一部分である。「エピトープ断片」は、１つ以上のエピトープに加えて、アミノ酸配列を含有することができるが、その必要はない。
【００３５】
本明細書で使用される際、「変異体」という用語は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および／または修飾により、記載されたオリゴペプチドとは異なるオリゴペプチドを指す。当技術分野で公知の突然変異生成技法を使用して、非自然発生変異体を産生することができる。いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドは、３つ以下のアミノ酸の置換、欠失、または追加によって、同定された配列とは異なる。そのような変異体は、概して、オリゴペプチド配列を修飾し、例えば、本明細書に記載の代表的な手順を使用して、修飾ポリペプチドの抗原性質を評価することによって同定することができる。
【００３６】
本明細書で開示されるポリペプチド変異体は、同定されたオリゴペプチドとの少なくとも約８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を呈する。変異ポリペプチドは、保守的または非保守的なアミノ酸置換、欠失、または挿入を含むことができる。本発明の黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドの誘導体は、天然ポリペプチド上で見出されていない追加の特徴を呈するよう改変されているポリペプチドである。実施例は、融合タンパク質を含む。類似体は、本発明の黄色ブドウ球菌α溶血素ポリペプチドの別の形態である。実施例は、活性成熟ポリペプチドを産生するように前駆タンパク質の開裂によって活性化することができる、前駆タンパク質である。
【００３７】
変異体はまた、あるいは代替として、他の修飾を含有することができ、それにより、例えば、異種アミノ酸配列、例えば、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質の転移を指図するタンパク質のＮ末端におけるシグナル（またはリーダー）配列に、オリゴペプチドを接合または連結する、例えば、融合することができる。オリゴペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、６−Ｈｉｓ）の合成、精製、または同定を容易にするために、あるいは固体支持へのポリペプチドの結合を強化するように、リンカーまたは他の配列に連結に接合する、または連結して産生することもできる。例えば、オリゴペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に接合または連結することができる。オリゴペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン等）への免疫反応を付与または変調する、および／または抗原提示細胞あるいは他の免疫系細胞によるポリペプチドの取り込みおよび／または処理を強化する、配列に接合または連結することもできる。オリゴペプチドはまた、単独で、または種々のアジュバントと組み合わせて、他の病原性物への防御免疫を引き起こすことができる、ハイブリッド免疫原性タンパク質を生成するように、ブドウ球菌種から、および／または他の細菌および／または他のウイルスからの他のポリペプチド／エピトープに接合または連結することもできる。ポリペプチドはまた、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等であるが、それらに限定されない、より優れた安定性を与える、または半減期を向上させる部分に接合または連結することもできる。オリゴペプチドはまた、単独で、または１つ以上のアジュバントと組み合わせて、防御免疫を強化および／または防御免疫に相乗効果を与えることができる、修飾免疫原性タンパク質を生成するように、ブドウ球菌種から、および／または他の細菌および／または他のウイルスからの部分（例えば、免疫原性炭水化物、例えば、莢膜多糖類または表面多糖類）に接合または連結することもできる。ある実施形態では、本発明のオリゴペプチドはさらに、免疫原性炭水化物を含む。一実施形態では、免疫原性炭水化物は、サッカリドである。
【００３８】
本明細書の全体を通して「サッカリド」という用語は、多糖またはオリゴ糖を示してもよく、両方を含む。本発明の多糖は、細菌から単離することができ、かつ既知の方法によってサイズ決定することができる。例えば、全長多糖を「サイズ決定」することができる（例えば、それらのサイズは、酸加水分解処理、過酸化水素処理、オリゴ糖断片を精製するように過酸化水素処理が後に続くＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ（登録商標）によるサイズ決定、またはマイクロ流動化等の種々の方法によって縮小することができる）。多糖は、多糖サンプルにおける粘度を低減させるため、および／または共役生成物の濾過性を向上させるためにサイズ決定することができる。オリゴ糖は、少数の繰り返し単位（例えば、５〜３０の繰り返し単位）を有し、かつ典型的には加水分解された多糖である。本発明の多糖は、組み換え技術によって産生することができる。
【００３９】
黄色ブドウ球菌莢膜抗原は、表面に結合し、抗原特異性が限定され、臨床分離株の中でも高度に保存されている。一実施形態では、本発明の免疫原性炭水化物は、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖類（ＣＰ）である。一実施形態では、莢膜サッカリドは、全長多糖であり得るが、他の実施形態では、それは、１つのオリゴ糖単位、または反復オリゴ糖単位の自然長よりも短いサッカリド鎖であり得る。ブドウ球菌分離株の血清型決定研究は、いくつかの推定莢膜血清型を明らかにしており、５および８型（ＣＰ５およびＣＰ８）が、臨床感染からの分離株の中でも最も普及し、それぞれ、ヒトから回収される分離株の約２５％および５０％を占める（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４，  ｐ．  ２１８−２３４，  Ｖｏｌ．  １７，  Ｎｏ．  １、Ｐｏｕｔｒｅｌ  ａｎｄ  Ｓｕｔｒａ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９３  Ｆｅｂ；３１（２）：４６７−９）。同じ分離株はまた、家禽、ウシ、ウマ、およびブタからも回収された（Ｔｏｌｌｅｒｓｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０００  Ａｕｇ；３８（８）：２９９８−３００３、Ｃｕｎｎｉｏｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００１  Ｎｏｖ；６９（１１）：６７９６−８０３）。それぞれ、原型株ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＢｅｃｋｅｒから精製された５および８型莢膜多糖類は、相互に、かつＷｕおよびＰａｒｋによって以前に説明された株Ｔによって作られた莢膜と構造的に非常に類似している（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ．  １９７１．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １０８：８７４−８８４）。５型は、構造（→４）−３−Ｏ−Ａｃ−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→）ｎを有し（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７．  Ａｎｎ．  Ｉｎｓｔ．  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３８：５６１−５６７、Ｍｏｒｅａｕ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２０１：２８５−２９７）、８型は、構造（→３）−４−Ｏ−Ａｃ−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→）ｎ（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ４５：８７−９３）を有する。５および８型多糖は、糖の間の連鎖、およびマンノサミノウロン酸残基のＯ−アセチル化の部位でのみ異なるが、血清学的に明確に異なる。
【００４０】
解毒された組み換え緑膿菌外毒素Ａ担体に接合された５および８型ＣＰは、マウスモデルにおいて高度に免疫原性かつ防御性であることが示され（Ａ  Ｆａｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９３  Ｍａｒｃｈ；  ６１（３）：  １０２３−１０３２、Ａ  Ｆａｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９６  Ｍａｙ；  ６４（５）：  １６５９−１６６５）、免疫動物からのＣＰ５特異的抗体の受動転移は、マウスにおける全身性感染に対して（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９７  Ｏｃｔｏｂｅｒ；  ６５（１０）：  ４１４６−４１５１）、および血清型５黄色ブドウ球菌で感染攻撃されたラットにおける心内膜炎に対する保護を誘導した（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００２  Ｆｅｂ  １４；３４６（７）：４９１−６）。マウスにおいて黄色ブドウ球菌感染攻撃に対する７５％の保護を提供する、二価ＣＰ５およびＣＰ８共役ワクチン（ＳｔａｐｈＶＡＸ（登録商標）、Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が開発された。ワクチンはヒトで試験されている（Ｆａｔｔｏｍ  ＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００４  Ｆｅｂ  １７；２２（７）：８８０−７、Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒaｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００５  Ｏｃｔ；７３（１０）：６７５２−６２）。ある実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、免疫原性炭水化物（例えば、ＣＰ５、ＣＰ８、ＣＰ断片、またはそれらの組み合わせ）と組み合わせられるか、またはそれに接合される。
【００４１】
両方とも黄色ブドウ球菌表面炭水化物である、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）（ＭｃＫｅｎｎｅｙ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９９  Ｍａｙ  ２８；２８４（５４１９）：１５２３−７）またはポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）（Ｔｕｃｈｓｃｈｅｒｒ  ＬＰ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００８  Ｄｅｃ；７６（１２）：５７３８−４４．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｓｅｐ  ２２）を用いた免疫付与は、実験動物モデルにおいて黄色ブドウ球菌感染攻撃に対する少なくとも部分的な保護を生成することが示されている。ＰＮＳＧは、生体材料へのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）の付着を仲介し、ＰＳ／Ａを発現するＣｏＮＳ株の莢膜としての機能を果たし、かつ防御抗体の標的である、表皮ブドウ球菌莢膜多糖類／付着因子（ＰＳ／Ａ）の化学形態として同定された。ＰＮＳＧはまた、黄色ブドウ球菌によっても作製され、それは、環境的に調節された生体内発現表面多糖類であり、同様に、防御免疫の標的としての機能を果たす（ＭｃＫｅｎｎｅｙ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０００  Ｓｅｐｔ  ２９；８３（１−２）：３７-４４）。ある実施形態では、免疫原性炭水化物は、表面多糖類、例えば、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、表面多糖類断片、またはそれらの組み合わせである。
【００４２】
壁タイコ酸（ＷＴＡ）は、黄色ブドウ球菌株上で広く発現される顕著な多糖であり（Ｎｅｕｈａｕｓ，  Ｆ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｂａｄｄｉｌｅｙ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，  ２００３．  ６７（４）：  ｐ．  ６８６−７２３）、ＷＴＡへの抗血清は、単独で、および補体の存在下で、オプソニン食作用傷害作用を誘導することが示されている（（Ｔｈａｋｋｅｒ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  １９９８．  ６６（１１）：  ｐ．  ５１８３−９）、およびＦａｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第７，７５４，２２５号）。ＷＴＡは、ペプチドグリカンに結合され、細胞壁を通って突出し、米国での地域感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ  ＭＲＳＡ）のほとんどの症例に関与するＵＳＡ３００等の無莢膜株上で顕著に露出される（Ｈｉｄｒｏｎ，  Ａ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，  ２００９．  ９（６）：  ｐ．  ３８４−９２）。
【００４３】
リポタイコ酸（ＬＴＡ）は、グラム陽性菌、例えば、黄色ブドウ球菌の細胞壁の構成物質である。ＬＴＡは、膜リン脂質を通して非特異的に標的細胞に、または特異的にＣＤ１４に、またはトール様受容体に結合してもよい。標的結合ＬＴＡは、循環抗体と相互作用し、補体カスケードを活性化して受動免疫傷害現象を誘導することができる。それはまた、細胞傷害を増幅するように共同で作用し得る、反応性酸素および窒素種、酸性加水分解酵素、高度カチオン性プロテイナーゼ、殺菌カチオン性ペプチド、成長因子、および細胞傷害性サイトカインの好中球およびマクロファージからの放出も引き起こす。
【００４４】
一実施形態では、表面多糖類は、本発明のオリゴペプチドと組み合わせられるか、またはそれに接合される。ある実施形態では、表面多糖類は、例えば、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、壁タイコ酸（ＷＴＡ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、該表面多糖類の断片、または該表面多糖類のうちの２つ以上の組み合わせである。
【００４５】
本明細書で使用される際の「配列同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列の間、または２つ以上のポリペプチド配列の間の関係を指す。１つの配列内の位置が、比較配列の対応する位置における同じ核酸塩基またはアミノ酸によって占有されるとき、配列は、その位置で「同一」であると言われる。「配列同一性」の割合は、「同一」位置の数をもたらすように、両方の配列内で同一核酸塩基またはアミノ酸が発生する位置の数を判定することによって計算される。次いで、「同一」位置の数は、比較ウィンドウ内で位置の総数で割られ、「配列同一性」の割合をもたらすように１００が掛けられる。「配列同一性」の割合は、比較ウィンドウ上で２つの最適に整合させられた配列（例えば、配列番号２および別の黄色ブドウ球菌分離株からの同種ポリペプチド）を比較することによって判定される。比較のための配列を最適に整合させるために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分が、ギャップと称される付加または欠失を含むことができる一方で、参照配列（例えば、配列番号２）は、一定に保たれる。最適な整合は、ギャップがあっても、参照および比較配列の間で可能な限り最大数の「同一」位置を生じる整合である。２つの配列の間の「配列同一性」の割合は、２００４年９月１日時点でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能であったプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」のバージョンを使用して判定することができ、そのプログラムは、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）およびＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列比較用）といったプログラムを組み込み、それらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムに基づく（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，  １９９３）。「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を利用するときに、２００４年９月１日時点でデフォルトパラメータであったパラメータを、語長（３）、開放ギャップペナルティ（１１）、拡張ギャップペナルティ（１）、ギャップドロップオフ（５０）、期待値（１０）、およびマトリクスオプションを含むがそれに限定されない任意の他の必要パラメータに使用することができる。
【００４６】
本明細書で使用される際、「エピトープ」という用語は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて抗原または免疫原活性を有する、ポリペプチドの部分を指す。本明細書で使用される際、「免疫原性エピトープ」は、当技術分野で公知である任意の方法によって判定されるように、動物において免疫反応を引き起こすタンパク質の一部分として定義される。本明細書で使用される際、「抗原エピトープ」は、当技術分野で周知である任意の方法によって判定されるように、抗体またはＴ細胞受容体がその抗原を免疫特異的に結合させることができる、タンパク質の一部分として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応を除外するわけではない。全ての免疫原性エピトープが抗原性である一方で、抗原エピトープは免疫原性である必要はない。
【００４７】
本明細書で使用される際、「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、マウス化、またはキメラ抗体、１本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、およびＦ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むが、それらに限定されない、本発明の完全で無傷の抗体、それらの抗原結合断片、免疫特異的断片、変異体、または誘導体を指すように意図されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。標準組み換えＤＮＡ技法を使用して、抗体の種々の形態を産生することができる（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：  ２９３−９９，  １９９１）。ある実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナルであり、本明細書に記載のオリゴペプチドに結合する。
【００４８】
本明細書で使用される際、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンから成る核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部であると見なすことができ、しかし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネータ等は、コーディング領域の外側にある。
【００４９】
「コドン最適化」という用語は、天然配列の少なくとも１つ、１つよりも多く、または有意数のコドンを、目的とする宿主の遺伝子でより頻繁または最も頻繁に使用されるコドンと置換することによって、その宿主の細胞における強化された発現のために核酸配列を修飾することとして本明細書で定義される。種々の種が、特定のアミノ酸のあるコドンに対する特定のバイアスを呈する。
【００５０】
「組成物」または「医薬組成物」という用語は、例えば、黄色ブドウ球菌感染にすでに罹患している個体、または黄色ブドウ球菌感染に対する免疫を必要とする個体に投与される、アジュバントまたは薬学的に容認可能な担体、賦形剤、または希釈剤とともに、本発明の免疫原性オリゴペプチドを含有する組成物を含むことができる。
【００５１】
「薬学的に容認可能な」という用語は、妥当な損益比に見合った、過剰な毒性または他の合併症を伴わない、正しい医学的判断の範囲内でヒトおよび動物の組織と接触するために好適である組成物を指す。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、およびワクチンは、薬学的に容認可能である。
【００５２】
「有効な量」は、単回投与、または一連の一部としてのいずれかで、個体へのそれの投与が治療または予防に有効である、量である。量は、例えば、その投与が、菌血症の低減、毒血症の低減、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）の低減、症状の低減、免疫反応の増加、変調された免疫反応、または回復に必要な時間の短縮を含むが、それらに限定されない、例えば、感染性黄色ブドウ球菌の感染または感染攻撃後に判定されるような、未治療個体に対する黄色ブドウ球菌感染の発生率の低減をもたらすときに有効である。この量は、治療される個体の健康および体調、治療される個体の分類群（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、霊長類等）、個体の免疫系の応答能力、所望される治療または防御の程度、ワクチンの製剤化、医学的状況の専門的な評価、および他の関連因子に応じて変化する。有効な量は、日常的な試験を通して判定することができる、比較的広い範囲に入るであろうと期待される。典型的に、単回投与量は、約１０μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇの精製オリゴペプチド、または同程度の量の組み換え技術によって発現されたα溶血素オリゴペプチドを提供するのに十分な修飾担体生物またはウイルスあるいはその断片または残余の量である。「ペプチドワクチン」または「サブユニットワクチン」という用語は、動物に投与されたときに、黄色ブドウ球菌感染に対する免疫反応をシミュレートするのに有用である、本発明の１つ以上のオリゴペプチドを含む、組成物を指す。
【００５３】
「対象」という用語は、診断、予後、免疫付与、または治療が所望される、任意の対象または個体、具体的には哺乳動物の対象を意味する。哺乳動物の対象は、ヒト、家畜、農場動物、クマなどの動物園の動物、スポーツ用の動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、クマ、乳牛等のペット動物、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー等の霊長類、イヌおよびオオカミ等のイヌ科の動物、ネコ、ライオン、およびトラ等のネコ科の動物、ウマ、ロバ、およびシマウマ等のウマ科の動物、ウシ、ブタ、およびヒツジ等の食用動物、シカおよびキリン等の有蹄動物、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット等の齧歯類等を含むが、それらに限定されない。一実施形態では、対象は、ヒト対象である。別の実施形態では、対象は、ウシである。さらに別の実施形態では、対象は、イヌである。
【００５４】
本明細書で使用される際、「それを必要とする対象」は、黄色ブドウ球菌疾患の症状を治療する、すなわち、予防する、治癒する、遅延させる、または重症度を低減させること、および／または特定の期間にわたって黄色ブドウ球菌によって引き起こされる疾患の悪化をもたらさないことが望ましい、個体を指す。
【００５５】
本明細書で使用される際の「プライミング」または「一次」および「ブースト」または「ブースティング」という用語は、それぞれ、すなわち、免疫学においてこれらの用語が通常有する定義に従った、初回および後続の免疫付与を指す。しかしながら、例えば、プライミング構成要素およびブースティング構成要素が単一の製剤の中にある、ある実施形態では、「プライム」および「ブースト」組成物の両方が同時に投与されるため、初回および後続の免疫付与が必要ない可能性がある。
ポリペプチド
【００５６】
本発明は、例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、または溶血性ブドウ球菌からの強化した安定性を伴う単離ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチド、例えば、本明細書に記載の単離黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドを対象とする。黄色ブドウ球菌株である黄色ブドウ球菌亜種アウレウスＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６アミノ酸配列のα溶血素は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿００１５７４９９６．１として入手可能であり、ここでは配列番号２として示される：
2014507142.tif 000004
【００５７】
アミノ酸配列の配列番号２は、２９３アミノ酸成熟ポリペプチドが続く、２６アミノ酸シグナルペプチド（アミノ酸１〜２６、下線部分）を含む（合計アミノ酸３１９）。上記のα溶血素アミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、配列番号１として提示される：
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１００７９．１
＞ｇｉ｜１６１５０８２６６：ｃ１１７１２７３−１１７０３１４黄色ブドウ球菌亜種アウレスＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６染色体、完全ゲノム
2014507142.tif 000005
【００５８】
一実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８と少なくとも８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のアミノ酸配列を含む、少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７５、または７６アミノ酸長であるが、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１７５、または２００アミノ酸長を超えない黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドを含む。
【００５９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、または最大１、２、３、４、または５個の単一アミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を除いて、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、第２のアミノ酸配列をさらに含む、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを対象とする。
【００６０】
さらに別の実施形態では、本発明は、第２のアミノ酸配列が第１のアミノ酸配列のＣ末端に位置する、本明細書に記載の単離オリゴペプチドを対象とする。また、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間にリンカーをさらに含む、本明細書に記載の単離オリゴペプチドも含まれる。リンカーは、少なくとも１個〜最大約１５個のアミノ酸、例えば、小さい柔軟なアミノ酸、例えば、セリン、アラニン、およびグリシン残基から成ることができる。一実施形態では、リンカーは、３グリシン残基（「ＧＧＧ」）の配列を含む。
【００６１】
一実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ６２）から成る、または本質的に成る、単離オリゴペプチドを含む。一実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ７９）から成る、または本質的に成る、単離オリゴペプチドを含み、この配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ７９）は、３グリシンリンカーを通して、そのＣ末端で配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２に接続される。ある実施形態では、本明細書に記載の本発明のオリゴペプチドはさらに、天然Ｎ末端黄色ブドウ球菌α溶血素シグナルペプチド配列、または異種シグナルペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴペプチドはさらに、Ｎ末端にメチオニン、Ｃ末端にロイシンおよびグルタミン酸、およびｐＥＴ−２４ａ（＋）発現ベクターに含まれる追加された６つのヒスチジン残基（ｈｉｓ６）を含む（ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６またはｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６）。一実施形態では、本発明は、ＭＡＤＳＤＩＮＩＫＴＧＴＴＤＩＧＳＮＴＴＶＫＴＧＤＬＶＴＹＤＫＥＮＧＭＨＫＫＶＦＹＳＦＩＤＤＫＮＨＮＫＫＬＬＶＩＲＴＫＧＴＩＡＧＧＧＧＦＳＰＤＦＡＴＶＩＴＭＤＲＬＥＨＨＨＨＨＨを含む、それから成る、または本質的にそれから成る、黄色ブドウ球菌オリゴペプチドを対象とする（「ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６」、配列番号６）。
【００６２】
別の実施形態では、本発明のオリゴペプチドを、異種ポリペプチドに付着させることができる。ヘキサヒスチジンタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ｃ−ｍｙｃ、ＫＳＩ、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、ポリフェニルアラニン、ポリシステイン、ポリアルギニン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡＩ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、連鎖球菌タンパク質Ｇ、ブドウ球菌タンパク質Ａ、Ｔ７ｇｅｎｅ１０、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐ−タグ複合体、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ｈｉｓパッチチオレドキシン、チオレドキシン、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓタグ、またはＴ７タグ等の、安定化、分泌、または簡易精製を付与するＮまたはＣ末端ペプチドを含むが、それらに限定されない、種々の異種ポリペプチドを使用することができる。例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ８：Ｒ１７７−Ｒ１８５（２０００）を参照されたい。異種ポリペプチドはまた、微生物病原体のＴ細胞エピトープ、あるいは他の免疫原性タンパク質および／またはエピトープをコードする配列を含むが、それらに限定されない、宿主細胞または任意の有用な免疫原性配列からの黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドの輸送、転座、処理、および／または精製を促進する、任意のプレおよび／またはプロ配列を含むこともできる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドに付着したオリゴペプチドは、２つ以上のペプチド領域を含む配列を接合する、ペプチドリンカー配列を含むことができる。好適なペプチドリンカー配列は、柔軟な拡張立体配座、あるいは接合されたエピトープと相互作用することができる二次構造を採用する能力に基づいて、または融合ポリペプチドの全体的可溶性を増加させる能力に基づいて、または接合されたペプチド領域に影響を及ぼす静電または水相互作用効果の欠如に基づいて、選択することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、オリゴペプチドは、単離される。「単離」オリゴペプチドは、その自然環境から除去されたものである。「単離」という用語は、いずれの特定のレベルの精製も暗示しない。非天然宿主細胞において発現される組み換え技術によって産生された黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドは、濾過、クロマトグラフィ、遠心分離等を含む、任意の好適な技法によって、分離、分画、または部分的あるいは実質的に精製されている、オリゴペプチドのように、本発明の目的で単離されると見なされる。
【００６５】
オリゴペプチドの産生は、オリゴペプチドを動作可能にコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞を培養し、オリゴペプチドを回収することによって達成することができる。そのような宿主細胞を培養し、ポリヌクレオチドを発現するための決定条件は、概して、宿主細胞および発現系に特異的であり、かつ当業者の知識の範囲内である。同様に、オリゴペプチドを回収するための適切な方法は、当技術分野で公知であり、クロマトグラフィ、濾過、沈殿、または遠心分離を含むが、それらに限定されない。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、例えば、より良好な免疫原性、向上した立体配座の安定性、向上した可溶性、または向上した半減期と関連付けられる分子エネルギーを有する、本明細書に記載のブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドを対象とする。ある実施形態では、α溶血素オリゴペプチドは、−３０００ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または−３５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または−４５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３０００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または−４２００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または−３８００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３６００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または−４１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３９００ｋｃａｌ／ｍｏｌの算出された分子エネルギーを含む。理論によって拘束されるわけではないが、低減させられた分子エネルギーを含む、本発明のオリゴペプチドは、例えば、向上した立体配座の安定性によって、増加した免疫原性を有する。本発明によれば、α溶血素の「アーム」領域の立体配座的に安定した形態を含む、熱力学的に安定したＮ末端α溶血素断片が使用される。再度、理論によって拘束されることを所望するわけではないが、そのような免疫原性断片は、生体内で、α溶血素オリゴマー化、したがって孔形成に干渉することができる、抗体を誘導することが可能であると考えられる。
【００６７】
配列番号２のアミノ酸２７〜７６（Ｂｕｂｅｃｋ−Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  国際公開第２００９／０２９８３１号）、配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ６２）、または３グリシンリンカーを通して配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２に接続されるアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ７９）から成る、黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドの特定の算出された分子エネルギーが、表２に表される。これらの測定は、実施例の項で詳細に説明される。
【表２】
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ポリヌクレオチド
【００６８】
本発明はさらに、例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、または溶血性ブドウ球菌からの強化した安定性を伴うブドウ球菌α溶血素オリゴペプチド、例えば、本明細書に記載の単離黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドをコードする、核酸を含む単離ポリヌクレオチドを対象とする。一実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８と少なくとも８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のアミノ酸配列を含む、少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７５、または７６アミノ酸長であるが、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１７５、または２００アミノ酸長を超えない黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とし、オリゴペプチドはさらに、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、または最大１、２、３、４、または５個の単一アミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を除いて、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２と同一である、第２のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とし、第２のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列のＣ末端に位置する。また、本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする、核酸を含む単離ポリヌクレオチドも含まれ、オリゴペプチドはさらに、該第１のアミノ酸配列と該第２のアミノ酸配列との間にリンカーを含む。リンカーは、少なくとも１個〜最大約１５個のアミノ酸、例えば、小さい柔軟なアミノ酸、例えば、セリン、アラニン、および／またはグリシン残基を含むことができる。一実施形態では、リンカーは、３グリシン残基の配列を含む。
【００７１】
一実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ６２）を含む、それから成る、または本質的にそれから成る、オリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを含む。一実施形態は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ７９）を含む、それから成る、または本質的にそれから成る、オリゴペプチドをコードする核酸であって、この配列番号２のアミノ酸２７〜８８（ＡＨＬ７９）は、３グリシンリンカーを通して、そのＣ末端で配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２に接続される、核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、本明細書のオリゴペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドはさらに、天然Ｎ末端黄色ブドウ球菌α溶血素シグナルペプチド配列をコードする、核酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とし、オリゴペプチドはさらに、Ｎ末端におけるメチオニン、例えば、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２またはｍｅｔ−ＡＨＬ７９を含む。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、配列番号６から成る、または本質的に成る、黄色ブドウ球菌オリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とする。
ＭＡＤＳＤＩＮＩＫＴＧＴＴＤＩＧＳＮＴＴＶＫＴＧＤＬＶＴＹＤＫＥＮＧＭＨＫＫＶＦＹＳＦＩＤＤＫＮＨＮＫＫＬＬＶＩＲＴＫＧＴＩＡＧＧＧＧＦＳＰＤＦＡＴＶＩＴＭＤＲＬＥＨＨＨＨＨＨ（ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６、配列番号６）
【００７３】
ある実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドはさらに、本明細書の他の箇所に記載のプロモーター、オペレーター、または転写ターミネータ等の非コーディング領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、異種核酸をさらに含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドを対象とする。異種核酸は、いくつかの実施形態では、本発明のオリゴペプチドに融合される異種ポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載のオリゴペプチドに融合される異種ポリペプチドをコードする、追加のコーディング領域、または選択可能なマーカー、追加の免疫原、免疫エンハンサ等であるが、それらに限定されない、本発明のオリゴペプチドとは別個の異種ポリペプチドをコードする、コーディング領域を含むことができる。
【００７４】
また、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む、発現構築物、ベクター、および／または宿主細胞も提供される。
【００７５】
単離ポリヌクレオチドの実施例は、ベクターに含有される組み換えポリヌクレオチドである。単離ポリヌクレオチドのさらなる実施例は、異種宿主細胞内で維持される組み換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、「組み換え」である。単離ポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、合成的に産生される、そのような分子を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度の相対的程度は、周知の方法によって容易に判定される。
コドン最適化
【００７６】
また、本発明の範囲内に、本明細書に記載の本発明の黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドをコードする、遺伝子操作されたポリヌクレオチドも含まれる。本発明のα溶血素オリゴペプチドをコードする核酸の修飾は、例えば、オリゴヌクレオチド指向の部位特異的突然変異生成またはデノボ核酸合成により、当業者によって容易に達成することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のα溶血素オリゴペプチドをコードする、核酸断片を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とし、オリゴペプチドをコードするコーディング領域は、コドン最適化されている。当業者によって理解されるように、種々の核酸コーディング領域は、遺伝子コードの冗長性により、同じポリペプチドをコードするであろう。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含む、ヌクレオチド配列における偏差は、コーディング領域の配列における偏差を可能にする。各コドンが３つのヌクレオチドから成り、ＤＮＡを含むヌクレオチドが４つの特定塩基に制限されるため、ヌクレオチドの６４個の可能な組み合わせがあり、そのうちの６１が、アミノ酸をコードする（残りの３つのコドンが翻訳を終了するシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」が、表３として本明細書で再現される。結果として、多くのアミノ酸が、１つよりも多くのコドンによって指定される。例えば、アラニンおよびプロリンといったアミノ酸が、４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンが、６つのトリプレットによってコードされる一方で、トリプトファンおよびメチオニンは、１つだけのトリプレットによってコードされる。この縮退は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変することなく、ＤＮＡ塩基組成が広範囲にわたって変化することを可能にする。
【表３】
2014507142.tif 000007
【００７８】
本発明によりポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが、使用されるコドンにかかわらず、本発明の範囲内に入ることを理解されたい。
【００７９】
多くの生物は、成長するポリペプチド鎖内の特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドンの使用のバイアスを表す。生物間のコドン使用の差異である、コドン選好またはコドンバイアスは、遺伝子コードの縮退によって得られ、かつ多くの生物の間で十分に裏付けされている。
【００８０】
翻訳選択、ＧＣ組成、鎖特異的な突然変異バイアス、アミノ酸保存、タンパク質ハイドロパシー、転写選択、およびＲＮＡ安定性さえも含む、異なる因子が、コドン使用選好に寄与することが提案されている。コドン使用を判定する１つの因子は、ゲノムＧＣ組成を成形する突然変異バイアスである。この因子は、極端な塩基組成を伴うゲノム、高ＧＣ含有量を伴う種（例えば、グラム陽性菌）において最も重要である。突然変異バイアスは、コドン使用の遺伝子間差異だけでなく、同一ゲノム内のコドン使用バイアスにも関与する（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｍ，  Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３（４）：９１−９７，  ２００１）。
【００８１】
コドンバイアスはしばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率性と相関し、それはひいては、とりわけ、翻訳されているコドンの性質、および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられる。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優位性は、概して、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせることができる。
【００８２】
本発明は、本明細書に記載のα溶血素オリゴペプチドをコードする、コドン最適化コーディング領域を含むポリヌクレオチドに関する。コドン使用は、所与の原核または真核宿主細胞における最適化された発現のために適合される。
【００８３】
コドン最適化ポリヌクレオチドは、所与の種の遺伝子で使用するために好ましいコドンをＤＮＡ配列に組み込むことによって調製される。また、本明細書に記載の黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドをコードするコドン最適化コーディング領域を含む、ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド発現構築物、ベクター、宿主細胞も提供される。
【００８４】
多種多様な動物、植物、および微生物種に利用可能な多数の遺伝子配列を考慮すると、コドン使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１０年１２月１２日に訪問）で入手可能な「コドン使用データベース」において容易に利用可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適合することができる（Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２９２，  ２０００）。
【００８５】
利用可能な表を利用することによって、当業者であれば、頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用し、所望のポリペプチドをコードするが、所与の種に最適なコドンを使用する、コドン最適化コーディング領域の核酸断片を産生することができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、コーディング領域は、大腸菌における発現のためにコドン最適化される。
ＤＮＡ合成
【００８６】
当業者に周知である標準的および日常的な分子生物学的操作を使用して、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって設計されるコドン最適化コーディング領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。加えて、遺伝子合成は、商業的に容易に利用できる。
ベクターおよび発現系
【００８７】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本明細書で使用される際、「ベクター」という用語は、例えば、異なる遺伝環境間の輸送のため、または宿主細胞における発現のために、例えば、制限およびライゲーションによって、所望の配列を挿入することができる、いくつかの核酸のうちのいずれかを指す。核酸ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、およびウイルスゲノムを含むが、それらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内で複製することができるものであって、ベクターを決定可能な様式で切断することができ、新しい組み換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を保持するように、所望のＤＮＡ配列を結合することができる、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位によってさらに特徴付けられるものである。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌内のコピー数でプラスミドが増加するにつれて何回も、または宿主が有糸分裂によって繁殖する前に宿主につき１回だけ起こることができる。ファージの場合、複製は、溶解段階に能動的に、または溶原段階に受動的に起こることができる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製が可能である。他のベクターが、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。
【００８８】
適切な宿主とともに使用することができる、多種多様の好適なクローニングベクターのうちのいずれも、当技術分野で公知であり、市販されている。本明細書で使用される際、「プラスミド」という用語は、遺伝物質（すなわち、核酸）が染色体外であり、場合によっては自律的に複製する、遺伝物質で構成された円形の２本鎖構築物を指す。ポリヌクレオチドは、円形または線状化プラスミド内、または任意の他の種類のベクター内にあり得る。ベクター、例えば、発現ベクターにヌクレオチド配列を挿入し、適切な宿主細胞に変換または移入し、発現に好適な条件下で培養するための手順は、概して、当技術分野で公知である。
【００８９】
本発明の一態様によれば、本明細書に記載のα溶血素オリゴペプチドをコードする核酸配列を含む、ベクターが提供される。ある実施形態では、ベクターは、好適な宿主細胞において本発明のα溶血素オリゴペプチドを発現することが可能な発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、本発明のポリペプチドを発現することが可能なベクターを指し、すなわち、ベクター配列は、プロモーター、オペレーター、転写終結部位、リボソーム結合部位等を含むが、それらに限定されない、ポリペプチドの転写および翻訳に必要な調節配列を含有する。「発現」という用語は、コード配列によってコードされる生成物の生物学的産生を指す。大抵の場合、コード配列を含むＤＮＡ配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成するように転写される。次いで、メッセンジャーＲＮＡは、関連する生物学的活性を有するポリペプチド生成物を形成するように翻訳される。また、発現のプロセスは、イントロンを除去するスプライシング、および／またはポリペプチド生成物の翻訳後処理等の、転写のＲＮＡ生成物へのさらなる処理ステップを伴うことができる。
【００９０】
ベクター・宿主系は、例えば、動物において生体内、または例えば、細菌あるいは細胞培養において生体外のいずれかで、細菌、哺乳動物、酵母、昆虫、または植物細胞系等の体系を含むが、それらに限定されない。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると見なされる。ある実施形態では、宿主細胞は、細菌、例えば、大腸菌である。
【００９１】
宿主細胞は、本発明のベクターを用いて遺伝子操作（感染、形質導入、変換、または移入）される。したがって、本発明の一態様は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターを含む、宿主細胞を対象とする。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化する、形質転換細胞を選択する、またはポリヌクレオチドを増幅するために適宜に修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択される宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者に明白となるであろう。本明細書で使用される際、「移入」という用語は、真核細胞が、プラスミドの形態のＤＮＡを含むがそれに限定されない、それらのゲノム単離ＤＮＡを受け入れて組み込むように誘導される、任意の手順を指す。本明細書で使用される際、「変換」という用語は、細菌細胞が、プラスミドの形態のＤＮＡを含むがそれに限定されない、それらのゲノム単離ＤＮＡを受け入れて組み込むように誘導される、任意の手順を指す。
【００９２】
細菌宿主・発現ベクター系は、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで変換された原核生物（例えば、大腸菌）を含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態では、大腸菌とともに使用されるプラスミドは、ＩＰＴＧ誘導を介してＬａｃＩタンパク質によって調節されるＴ７プロモーター駆動型システムを使用する。多数の好適なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。以下の細菌ベクターが、一例として提供される：ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＥＴ２８、ｐＢＡＤ、ｐＴｒｃＨＩＳ、ｐＢＲ３２２、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２、ｐＰＳ１０、ＲＳＦ１０１０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＬｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＵＣプラスミド誘導体。
【００９３】
好適な発現ベクターは、本発明の黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドをコードする、挿入されたヌクレオチド配列に動作可能に接合することができる、調節配列を含有する。本明細書で使用される際、「調節配列」という用語は、宿主細胞による黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドをコードする挿入された配列の転写に必要である、あるいは転写を導く、および／または結果として生じる転写の宿主細胞による所望のα溶血素オリゴペプチドへの翻訳に必要である、あるいは翻訳を導く、ヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、オペレーター、プロモーター、およびリボソーム結合配列等の５′配列、およびポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネータ等の３′配列を含むが、それらに限定されない。調節配列はまた、エンハンサ配列または上流活性化因子配列を含むこともできる。
【００９４】
概して、細菌ベクターは、複製起点および選択可能なマーカー、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、大腸菌の耐性遺伝子を含み、下流構造配列の転写を指図するように、宿主細胞および高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターの変換を可能にするであろう。好適なプロモーターは、Ｔ７プロモーター、ラムダ（λ）プロモーター、Ｔ５プロモーター、およびｌａｃプロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質等の糖分解酵素をコードするオペロンに由来するプロモーター、カドミウム（ｐｃａｄ）およびβラクタマーゼ（ｐｂｌａ）のような誘導プロモーターを含むが、それらに限定されない。
【００９５】
いったん発現ベクターが選択されると、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、ポリリンカー領域内で、プロモーターの下流でクローン化することができる。ベクターは、適切な細菌株に変換され、ＤＮＡが標準技法を使用して調製される。ポリヌクレオチドならびにベクターに含まれる他の要素の配向およびＤＮＡ配列は、制限マッピング、ＤＮＡ配列分析、および／またはＰＣＲ分析を使用して確認される。正しいプラスミドを内部に持つ細菌細胞を、細胞バンクとして貯蔵することができる。
免疫原性および医薬組成物
【００９６】
本発明はさらに、有効な量の本明細書に記載の本発明のα溶血素オリゴペプチド、または本発明のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物、例えば、免疫原性または医薬組成物を提供する。本発明の組成物はさらに、例えば、多価ワクチン、ならびに担体、賦形剤、またはアジュバントとして、追加の免疫原性構成要素を含むことができる。
【００９７】
本発明の組成物は、既知の方法に従って製剤化することができる。好適な調製方法は、例えば、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に記載されている。組成物は、水溶液、乳剤、ゲル、懸濁液、凍結乾燥、または当技術分野で公知である任意の他の形態を含むが、それらに限定されない、種々の形態であり得る。加えて、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に容認可能な添加剤を含有することができる。いったん製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。治療される対象は、動物であり得、具体的には、ヒト対象を治療することができる。
【００９８】
本発明の組成物とともに使用することができる担体は、当技術分野で周知であり、制限なく、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミン等のアルブミン、破傷風トキソイド、およびポリＬ−リシン、ポリＬ−グルタミン酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質等のポリアミノ酸を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝用水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。組成物は、従来的な周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または無菌濾過することができる。結果として生じる組成物は、そのままで使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調合剤は、投与前に滅菌溶液と組み合わせられる。組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等の、生理学的条件に近づけるための薬学的に容認可能な補助物質を必要に応じて含有することができる。
【００９９】
本発明のある組成物はさらに、例えば、免疫原への免疫反応を強化する、持続する、限局する、または変調するように、免疫原性組成物に追加される物質である、１つ以上のアジュバントを含む。「アジュバント」という用語は、（１）特定の抗原への免疫反応を改変する、または増加させる、あるいは（２）薬剤の効果を増加させる、または補助する能力を有する、任意の材料を指す。ポリペプチドの発現、抗原性、または免疫原性を増加させることができる任意の化合物が、潜在的なアジュバントである。本明細書で使用される際の「免疫原性担体」という用語は、第２のポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体の免疫原性を強化する、第１の部分、例えば、ポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体を指す。
【０１００】
多種多様の材料が、種々の機構を通してアジュバント活性を有することが示されている。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して産生された抗体の力価の有意な増加によって明らかにされ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には、増加した細胞増殖、または細胞傷害性、またはサイトカイン分泌の増加で明らかにされる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性またはＴｈ２反応を主に細胞性またはＴｈ１反応に変えることによって、免疫反応を改変または調節することもできる。所与の抗原への免疫反応は、当業者に周知である、および／または本明細書の他の箇所に記載の種々の免疫測定法によって試験することができる。
【０１０１】
多数のアジュバントが、当業者によく知られており、多数の参考文献で説明されている。本発明による組成物で使用することができるアジュバントは、ミョウバン、ベントナイト、ラテックス、およびアクリル粒子等の不活性担体、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のアルミニウムベースの塩、カルシウムベースの塩、シリカ、または任意のＴＬＲ生物学的配位子を含むが、それらに限定されない。一実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＤＲＯＧＥＬ（商標）湿潤ジェル懸濁液）である。一実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントは、ＩＤＣ−１００１というグルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）ベースのアジュバントである。アジュバントの量、それが製剤化される方法、およびそれが投与される方法は全て、当業者の範囲内であるパラメータである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物はさらに、例えば、製剤を安定させる、製剤をリンパ系組織等の特定の組織へ標的化する、またはポリペプチド組成物の半減期を増加させる働きをすることができる、リポソームまたは他の粒子状担体を含む。そのような粒子状担体は、乳剤、発泡体、ミセル、不溶性単分子相、液晶、リン脂質分散、ラメラ層、イスコム等を含む。これらの調合剤では、本発明のオリゴペプチドを、リポソームまたは他の粒子の一部として組み込むことができ、またはリポソームと併せて送達することができる。本発明に従って使用するためのリポソームは、概して、中性および負に帯電したリン脂質およびコレステロール等のステロールを含む、標準的なベシクル形成脂質から形成することができる。リポソームまたは他の粒子状懸濁液ならびに本発明のオリゴペプチドを含む、組成物は、とりわけ、投与の方式、送達されているポリペプチド、および治療されている疾患の段階に従って変化する用量で、静脈内、局所的、局部的等に投与することができる。
【０１０３】
個体組成物については、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、蔗糖、炭酸マグネシウム等を含む、従来の非毒性個体担体を使用することができる。経口投与については、以前に記載されたそれらの担体等の通常採用されている賦形剤のうちのいずれか、および概して１０〜９５％の有効性分、つまり、しばしば２５％〜７５％の濃度での本明細書に記載のオリゴペプチドを組み込むことによって、薬学的に容認可能な非毒性組成物が形成される。
【０１０４】
エアロゾルまたは粘膜投与については、本発明によるオリゴペプチドは、随意に、界面活性剤、ならびに推進剤および／または粘膜付着剤、例えば、キトサンとともに、微粉形態で供給することができる。界面活性剤は、当然ながら、薬学的に容認可能でなければならず、いくつかの実施形態では、推進剤中で可溶性でなければならない。そのような薬剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を伴うカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸、およびオレイン酸等の６から２２個の炭素原子を含有する脂肪酸のエステルまたは部分的なエステルである。混合または天然グリセリド等の混合エステルを採用することができる。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、いくつかの実施形態では、０．２５〜５重量％を構成することができる。組成物の平衡は通常、推進するが、推進剤が必要ではなく、他の割合が適宜に調整される、噴霧器を使用することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性オリゴペプチドを、米国特許第６，９４２，８６８号または米国特許出願公開第２００５／０００８６３３号に記載の粒子等の空気力学的に軽い粒子内に組み込むことができる。担体、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンも含むことができる。
【０１０５】
本発明はまた、本発明による組成物を産生する方法も対象とする。いくつかの実施形態では、組成物を産生する方法は、（ａ）本発明によるα溶血素オリゴペプチドを単離することと、（ｂ）アジュバント、担体、および／または賦形剤を単離オリゴペプチドに追加することとを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、多価ワクチンも対象とする。多価ワクチンは、本明細書に記載のα溶血素オリゴペプチド、またはそのようなオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、および１つ以上の追加の免疫原性構成要素を含むことができる。そのような構成は、同一感染因子、例えば、黄色ブドウ球菌の追加の免疫原であり得るか、あるいは効果的、利便的、または経済的にともに投与することができる、他の感染因子に由来する免疫原であり得る。ある実施形態では、本発明のα溶血素オリゴペプチドは、複数の細菌毒性決定因子を標的化することが可能な広範な毒素ベースの多価ワクチンを作製するように、他の毒性または他の悪性構成要素ベースのワクチンと組み合わせることができる。他の実施形態では、本発明のα溶血素オリゴペプチドは、１本鎖で多価ワクチンを生成し、それらの全てに対する抗体を誘導するように、ポリペプチドを含有する他の免疫原性、生物学的有意、または防御エピトープに融合することができる。さらに別の実施形態では、本発明のα溶血素オリゴペプチドは、抗α溶血毒抗体とともにＴ細胞免疫を誘導するように、１つ以上のＴ細胞エピトープに融合することができる。さらなる実施形態では、本発明の組成物を含有するオリゴペプチドはさらに、追加の細菌性抗原、例えば、孔形成毒素、超抗原、細胞表面タンパク質、該細菌性抗原のうちのいずれかの断片、または２つ以上の細菌性抗原の組み合わせを含む。
【０１０７】
「孔形成毒素」（ＰＦＴ）は、典型的には、細菌、例えば、クロストリジウムセプチカムおよび黄色ブドウ球菌によって産生される、タンパク質毒素であり、通常は、標的細胞の膜に孔を形成するため、細胞傷害性である。本発明の孔形成毒素の非限定的実施例は、β孔形成毒素（例えば、パントン・バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）、α溶血素、およびγ溶血素）およびα孔形成毒素（例えば、細胞溶解素Ａ）を含む。一実施形態では、本発明のα溶血素オリゴペプチド組成物はさらに、孔形成毒素、例えば、ＰＶＬ、細胞溶解素Ａ、α溶血素、γ溶血素、孔形成毒素のサブユニットあるいは断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１０８】
「超抗原」（ＳＡｇｓ）は、オリゴクローナルＴ細胞活性化およびサイトカイン放出をもたらす、Ｔ細胞の非特異的活性化を引き起こす抗原の類である。ＳＡｇｓは、病原微生物、例えば、ウイルス、マイコプラズマ、および細菌によって産生することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体もまた、強力な超抗原であることが示されている。ブドウ球菌超抗原は、例えば、古典的に食中毒および非月経ＴＳＳの一般的な原因である、ブドウ球菌エンテロトキシン（例えば、エンテロトキシン血清型Ａ−Ｅ（ＳＥＡ−ＳＥＥ）およびＳＥＧ−ＳＥＱ）と、月経および非月経ＴＳＳの両方の原因であるＴＳＳ毒素１（ＴＳＳＴ−１）とを含む。一実施形態では、本発明のα溶血素オリゴペプチド組成物はさらに、超抗原、例えば、ブドウ球菌超抗原を含む。
【０１０９】
黄色ブドウ球菌細胞は、上皮および内皮表面の細胞外基質を形成する、ラミニンおよびフィブロネクチン等の宿主タンパク質への付着を促進する表面タンパク質を発現する。加えて、ほとんどの株は、血栓および外傷組織への付着を促進するフィブリン／フィブリノゲン結合タンパク質（クランピング因子）を発現する。ほとんどの黄色ブドウ球菌株は、フィブロネクチンおよびフィブリノゲン結合タンパク質の両方を発現する。クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、鉄調節表面決定因子Ｂ（ＩｓｄＢ）、またはＣｌｆＡとともにフィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎＢＰ）等のブドウ球菌表面タンパク質を用いた免疫付与は、実験動物モデルにおいて、黄色ブドウ球菌感染攻撃に対して少なくとも部分的な保護を生成することが示されている。一実施形態では、本発明のα溶血素オリゴペプチド組成物はさらに、細胞表面タンパク質（例えば、ブドウ球菌細胞表面タンパク質）、細胞表面タンパク質の断片、または細胞表面タンパク質の任意の組み合わせを含む。
治療／予防の方法および投薬計画
【０１１０】
また、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるブドウ球菌感染、例えば、黄色ブドウ球菌感染を治療または予防する、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる疾患を治療または予防する方法も提供される。ある実施形態では、対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ネコ、例えば、イヌ、例えば、ウシ、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む本明細書に記載の有効な量の組成物を、α溶血素発現ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫反応を必要とする対象に投与することを含む、該免疫反応を誘導する方法を対象とする。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、対象は、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌への潜在的または実際の暴露の前に、健康な動物におけるブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌への免疫、またはブドウ球菌関連症状の縮小を確立または強化し、したがって、疾患を予防する、症状を緩和する、症状を低減させる、または病状の重症度を低減させるように、例えば、予防ワクチンとして、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドを予防的にコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、本明細書に記載の組成物が投与される。一実施形態では、疾患は、呼吸器疾患、例えば、肺炎である。別の実施形態では、疾患は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）である。治療または予防される他の疾患または症状は、皮膚感染、創傷感染、心内膜炎、骨および関節感染、骨髄炎、および／または髄膜炎を含むが、それらに限定されない。本発明の１つ以上の組成物、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞はまた、動物の免疫系をさらに刺激するように、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌にすでに暴露されている、またはブドウ球菌関連症状にすでに罹患している対象を治療し、したがって、その暴露と関連付けられる症状を低減または排除するために使用することもできる。本明細書で定義される際、「動物の治療」は、動物における黄色ブドウ球菌症状を予防する、治癒する、遅延させる、または重症度を低減させる、および／または特定の期間にわたって黄色ブドウ球菌症状の悪化をもたらさないための本発明の１つ以上の組成物、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を指す。本発明の任意の組成物、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞が、ブドウ球菌感染に対する完全な保護を提供する、または全てのブドウ球菌関連症状を治癒あるいは排除することは要求されない。
【０１１２】
本明細書で使用される際、「治療的および／または予防的免疫を必要とする対象」は、ブドウ球菌関連症状を治療する、すなわち、予防する、治癒する、遅延させる、または重症度を低減させること、および／または特定の期間にわたってブドウ球菌関連症状の悪化をもたらさないことが望ましい、対象を指す。本明細書で使用される際、「該免疫反応を必要とする対象」は、溶血素、細胞溶解素、およびロイコシジン発現ブドウ球菌株のうちのいずれかに対する免疫反応が所望される、対象を指す。また、ウシ、イヌ、ネコ、または任意の他の家畜脊椎動物における異種間の汎発性または地方流行性ブドウ球菌感染を治療するためのこれらの実施形態の利用も考慮される。
【０１１３】
本発明の免疫原性組成物、オリゴペプチド、またはポリヌクレオチドを含む、医薬組成物を用いた治療は、別々に、または他の治療と併せて、適宜に起こることができる。
【０１１４】
治療用途では、本発明の組成物、オリゴペプチド、またはポリヌクレオチドは、症状および／または合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するように、黄色ブドウ球菌α溶血素由来オリゴペプチドへの効果的な生得的、体液性、および／または細胞性反応を引き起こすのに十分な量で患者に投与される。
【０１１５】
これを達成するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」または「単位用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド組成、投与の方式、治療されている疾患の段階および重症度、患者の体重および全体的な健康状態、および処方医師の判断に依存するであろうが、概して、（治療的または予防的投与用である）オリゴペプチドワクチンの初回予防接種のための範囲は、約０．１μｇから約５０００μｇのポリペプチド、いくつかの実施形態では、７０ｋｇの患者に対して約１０μｇから約３０μｇであり、その後に約１．０μｇから約１０００μｇのブースティング投与量が続き、いくつかの実施形態では、例えば、患者の血液中の抗体レベルを測定することによって、患者の反応および状態に応じて、数週間から数ヶ月にわたるブースティング投薬計画に準じた１０μｇから約３０μｇのポリペプチドである。
【０１１６】
非限定的実施形態では、本発明の有効な量の組成物は、投与前の抗体力価の少なくとも２、５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０＾４、５×１０＾４、または１０＾５倍までの抗体力価の上昇を生じる。
【０１１７】
代替実施形態では、概してヒトにとって、（治療的または予防的投与用である）初回予防接種のための用量範囲は、７０ｋｇの患者に対して約１．０μｇから約２０，０００μｇのポリペプチドであり、いくつかの実施形態では、２μｇ〜、５μｇ〜、１０μｇ〜、１５μｇ〜、２０μｇ〜、２５μｇ〜、３０μｇ〜、４０μｇ〜、または５０μｇ〜２０００μｇであり、その後に、患者の血液中の抗体またはＴリンパ球反応を測定することによって、患者の反応および状態に応じて、数週間から数ヶ月にわたるブースティング投薬計画に準じた同じ用量範囲内のブースティング投与量が続く。具体的な非限定的実施形態では、約０．０１〜２０００μｇ、またはいくつかの実施形態では、２μｇ〜２００μｇまたは１０μｇ〜３０μｇの本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはその断片、誘導体、変異体、または類似体が、宿主に投与される。
【０１１８】
本発明のオリゴペプチドおよび組成物は、概して、重篤な病状、つまり、生命を脅かす、または潜在的に生命を脅かす状況で採用できることに留意しなければならない。そのような場合、異物の最小限化およびオリゴペプチドの相対的非毒性を考慮して、大幅に過剰なこれらのオリゴペプチド組成物を投与することが望ましいと処置医師によって感じられる可能性がある。
【０１１９】
治療的使用については、投与は、黄色ブドウ球菌感染または危険因子の最初の兆候時に開始するべきである。ある実施形態では、例えば、症状が実質的に和らげられるまで、およびその後のある期間にわたって、ブースティング用量が、初回用量の後に続く。頻繁な感染では、ブースティング用量が後に続く負荷用量を必要とすることができる。
【０１２０】
ある実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の方法によって対象に送達され、それにより、効果的な免疫反応、および／または効果的な治療的あるいは予防的免疫反応を達成する。そのような反応を必要とする動物において、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌への免疫反応を生成する、および／またはブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌への予防的または治療的に有効な免疫反応を生成するのに十分な量で、投与方法が所望の組織において所望のオリゴペプチドの送達および／または発現をもたらす限り、任意の投与方法を使用することができる。開示された方法によれば、本発明の組成物は、粘膜送達、経皮的送達、皮下注射、静脈注射、経口投与、肺内投与、筋内（ｉ．ｍ．）投与によって、または腹腔内注射を介して投与することができる。他の好適な投与経路は、気管内、経皮、眼内、鼻内、吸入、腔内、導管内（例えば、膵臓の中へ）、および実質内（すなわち、任意の組織の中へ）投与を含むが、それらに限定されない。経皮的送達は、皮内（例えば、真皮または表皮の中へ）、経皮的（例えば、経皮）、および経粘膜投与（すなわち、皮膚または粘膜組織の中へ、またはそれを通した）を含むが、それらに限定されない。腔内投与は、口腔、膣腔、直腸腔、鼻腔、腹腔、または腸腔の中への投与、ならびに髄腔内（すなわち、脊柱管の中へ）、脳室・心室内（すなわち、脳室または心室内へ）、心房内（すなわち、心房の中へ）、およびくも膜下（すなわち、脳のくも膜下腔の中へ）投与を含むが、それらに限定されない。
【０１２１】
そのような反応を必要とする動物において、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌への免疫反応を生成する、および／またはブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌への予防的または治療的に有効な免疫反応を生成するのに十分な量で、投与方法が所望の組織において所望のオリゴペプチドの送達および／または発現をもたらす限り、任意の投与方法を使用することができる。本発明の投与は、例えば、針注射、または当技術分野で公知である他の送達あるいはデバイスによるものであり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、組成物は、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌感染に対する動物の保護に十分な抗体反応または細胞性免疫反応を刺激する。他の実施形態では、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、組成物は、体液性および細胞性反応の両方を刺激し、その組み合わせは、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌感染に対する動物の保護に十分である。いくつかの実施形態では、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、組成物はさらに、生得的、抗体、および／または細胞性免疫反応を刺激する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、組成物は、ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌α溶血素への抗体反応を誘導する。ある実施形態では、Ｔ細胞反応を誘導する構成要素（例えば、Ｔ細胞エピトープ）は、主に抗体反応を誘導する、本発明のオリゴペプチド等の構成要素と組み合わせられる。
【０１２４】
本発明はさらに、本明細書に記載の組成物のうちの１つ以上を、治療的および／または予防的免疫を必要とする対象に投与することを含む、対象における黄色ブドウ球菌感染への予防的および／または治療的免疫反応を生成、強化、または調節するための方法を提供する。
【０１２５】
本発明の組成物は、それが投与されている動物の生涯の間の任意の時に、動物に投与することができる。ヒトでは、本発明の組成物の投与が起こり得、しばしば、他のワクチンが、例えば、本明細書の他の箇所に記載の多価ワクチンとして投与されている間に、有利に起こる。
【０１２６】
さらに、本発明の組成物は、任意の所望の予防接種または投与計画で、例えば、単回投与で、または代替として、年に１回のワクチン接種等の周期的ワクチン接種計画の一部として、あるいは、同一または異なるオリゴペプチドまたはポリヌクレオチドの投与の前または後のいずれかで、本発明の組成物またはオリゴペプチドまたはポリヌクレオチドが投与される、プライム・ブースト投薬計画等で、使用することができる。近年の研究は、プライム・ブーストプロトコルが、しばしば、ワクチンを投与する好適な方法であることを示している。プライム・ブーストプロトコルでは、本発明の１つ以上の組成物を、「プライム・ブースト」投薬計画で利用することができる。「プライム・ブースト」投薬計画の実施例は、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：７９９−８０３，  ２００２で見出すことができる。
【０１２７】
ある実施形態では、本発明によるα溶血素オリゴペプチド、または同オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、あるいは宿主細胞を含む、組成物は、同様であるが同一ではない孔形成毒素を発現する細菌への交差反応性免疫反応を誘導するように投与することができる。非限定的実施例として、本発明のオリゴペプチドは、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、および溶血性ブドウ球菌を含むが、それらに限定されないブドウ球菌種、化膿連鎖球菌および肺炎連鎖球菌を含むが、それらに限定されない連鎖球菌種、大便連鎖球菌およびエンテロコッカス・フェシウムを含むが、それらに限定されない腸球菌種によって引き起こされる、感染または疾患を治療または予防するように投与することができる。
【０１２８】
治療される感染は、皮膚、軟組織、血液、または臓器の局所もしくは全身感染、あるいは自己免疫疾患を含むが、それらに限定されない。治療または予防される特定の疾患または症状は、呼吸器疾患、例えば、肺炎、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、皮膚感染、創傷感染、心内膜炎、骨および関節感染、骨髄炎、および／または髄膜炎を含むが、それらに限定されない。
免疫相関物
【０１２９】
黄色ブドウ球菌感染のいくつかの動物モデルが、当技術分野で公知であり、必要以上の実験を伴わずに本発明の方法とともに使用することができる。例えば、抗菌剤の試験用のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）肺炎のハムスターモデルが記載されている（Ｖｅｒｇｈｅｓｅ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ３４：４９７−５０３  （１９８８），  Ｋｅｐｈａｒｔ  ＰＡ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２１：３３−９，  （１９８８））。さらに、ヒト患者における肺炎の臨床的および病理学的特徴を密接に模倣する、成体の免疫能が正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける黄色ブドウ球菌誘導性肺炎のモデルが記載されている（Ｂｕｂｅｃｋ−Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７５：１０４０−４  （２００７））。加えて、毒性が、ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．  （ＭｃＥｌｒｏｙ  ＭＣ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ６７：５５４１−４  （１９９９））に記載の黄色ブドウ球菌肺炎のラットモデルにおいて試験されている。最終的に、新しい治療を評価するためのＭＲＳＡ誘導性敗血症性肺炎の標準化された再現可能なモデルが、ヒツジで確立された（Ｅｎｋｈｂａａｔａｒ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｃｋ．  ２９（５）：６４２−９，  ２００８）。
【０１３０】
本発明の実践は、特に指示がない限り、当技術分野の技能内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を採用するであろう。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  （１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２），  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．，  （１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  （１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）、Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）、論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  １５４  ａｎｄ  １５５  （Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ-ＩＶ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  （１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８６）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９��を参照されたい。
【０１３１】
免疫学の一般的原則を記載する標準参考資料は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｋｌｅｉｎ，  Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８２）、Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．，  Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  ｅｄ．  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｍｏｓｂｙ  （２００１）、Ａｂｂａｓ  Ａ．，  Ａｂｕｌ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ａ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ．  ５，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （２００５）、およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）を含む。
実施例
【実施例１】
【０１３２】
ワクチン候補の分子モデリングおよび設計
【０１３３】
この実施例は、ワクチン候補を設計するために、α溶血素の構造を導出、分析、および操作するための（コンピュータベースの）分子モデリング技法を説明する。
【０１３４】
図１は、α溶血素７量体結晶構造を示す。毒素の機能単位は、構造をともに保持して隣接サブユニットを包み込む、アミノ酸のＮ末端伸張を伴って、単量体サブユニットが相互に対して密集している、７量体である。本発明は、α溶血素機能に干渉するであろう複数の抗体を誘導する効果的な方式を提供する、オリゴマー化にも重要となるであろうα溶血素単量体の表面露出領域（Ｎ末端アーム等）を標的にする。
【０１３５】
Ｒｅｄ  Ｈａｔ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｌｉｎｕｘ（登録商標）  ４とともにＤｅｌｌ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ６９０で作動するＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．５（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，  Ｉｎｃ）プログラムが、タンパク質モデルを構築し、可視化し、および分析するために使用された。１という距離依存性誘電体、およびＣＨＡＲＭＭ力場で１４Å以内に限定された非結合相互作用を使用して、シミュレーションが真空内で行われた。最小限化は、０．１というＲＭＳ勾配を用いたＳｍａｒｔ  Ｍｉｎｉｍｉｚｅｒの１０００ステップを伴った。Ｃｈａｒｍｍエネルギー関数によって確立された原子間相互作用値を使用して、１４Å（オングストローム）という非結合相互作用限界との不利および有利な原子間接触を定量化することによって、各アミノ酸の単一点エネルギーの物理学ベースの推定を適用したプロトコルを使用して、ポリペプチドモデルの算出されたエネルギーが判定された。各アミノ酸に対する不良または不正確な主鎖および側鎖の配座を同定するように、タンパク質構造立証プロトコルを使用して、タンパク質モデルの質が継続的に監視された。７量体α溶血素の結晶構造（ＰＤＢコード７ＡＨＬ、該構造は、ｐｄｂ．ｏｒｇからダウンロードすることができる（最終閲覧日２０１１年１月３１日））。モデル構築におけるテンプレートは、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１３；  ２７４（５２９４）：１８５９−６６，  １９６６で開示されている。したがって、２つのオリゴペプチド候補が、モデリングおよび医薬品化学に基づいて設計され、マウスで試験された。
黄色ブドウ球菌α溶血素構造の分析
【０１３６】
黄色ブドウ球菌株亜種アウレウスＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６からの黄色ブドウ球菌α溶血素タンパク質が、プロトタイプとして使用された。そのアミノ酸配列、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿００１５７４９９６．１は、本明細書では配列番号２として提示される。このポリペプチドは、アミノ酸１〜２６からの２６アミノ酸シグナルペプチドと、アミノ酸２７〜３１９からの成熟タンパク質とを含む。例えば、他の黄色ブドウ球菌株から、または他のブドウ球菌から、または他の病原菌全般からの他のα溶血素タンパク質も、本明細書で開示される方法に従って、免疫原性オリゴペプチドを導出するための供給源として使用することができる。
【０１３７】
７ＡＨＬ結晶構造内のサブユニットのうちのそれぞれの中で、配列番号２のアミノ酸２７〜７６から成るオリゴペプチドが同定され、さらなる分析のためにグループにクラスタ化された。図２は、本明細書に記載のオリゴペプチドに対するα溶血素中の二次構造要素の局所構造を示す。この５０アミノ酸オリゴペプチドは、Ｎ末端ループと、２本の逆平行β鎖とを含む。これら２本の鎖は、逆平行の４本鎖シート構造から成る、より大きい二次構造の一部であった。結晶構造の詳細な分析は、この４本鎖シート構造から免疫原性融合タンパク質を生成できることを明らかにした。
免疫原性融合構築物の算出された分子エネルギー
【０１３８】
配列番号２のアミノ酸２７〜７６が、７量体α溶血素７ＡＨＬ結晶構造のサブユニットＡから切り取られ、その分子エネルギーが、候補オリゴペプチドと比較するための基準として算出された。第１の候補ポリペプチドが、α溶血素オリゴペプチド配列に沿った単一アミノ酸の追加により、配列番号２のアミノ酸２７〜７６を拡張することによって構築され、それぞれの結果として生じた構造が、エネルギーを最小限化され、その分子エネルギーが算出された。この一連のオリゴペプチドの相対的安定性は、配列番号２のアミノ酸２７〜８８から成る６２アミノ酸オリゴペプチドセグメント（ＡＨＬ６２）が、さらなる免疫原性研究のための理想的な候補であることを示した。表２は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸２７〜７６から成る、および配列番号２のアミノ酸２７〜８８から成る、オリゴペプチドセグメントの算出されたエネルギーを示す。それらの算出された分子エネルギーに基づいて、ＡＨＬ６２オリゴペプチドは、配列番号２のアミノ酸２７〜７６から成るオリゴペプチドセグメントよりも安定していると予測された。さらに、ＡＨＬ６２オリゴペプチドは、それが５０アミノ酸オリゴペプチドの２本鎖シートに対して３本鎖シート構造から成るという事実により、免疫原活性のためのより大きい秩序結合表面を提供する。したがって、ＡＨＬ６２が、生体内研究用の第１のオリゴペプチド構築物として選択された。
【０１３９】
一次α溶血素アミノ酸配列に沿って直線的にＡＨＬ６２を拡張することによって、分子モデルが生成されたが、これらのペプチドモデルは、免疫原活性のためのあまり規則正しくない結合表面をもたらした。したがって、７ＡＨＬ溶血素結晶構造で示された、４本鎖シートへのＡＨＬ６２の３本鎖シートの拡張は、論理的方式であった。しかしながら、この４本鎖シート中の最後の鎖は、ＡＨＬ６２に対して一次配列内で遠位にある、配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２を含む。分子モデリングが、第３の鎖のＡｌａ８８と第４の鎖のＧｌｙ２３１との間の異なるリンカーをサンプリングするために使用された。配列番号２のアミノ酸２７〜８８および配列番号２の２４９〜２６２から成るオリゴペプチドセグメントが、７ＡＨＬ結晶構造のサブユニットＡから切り取られ、異なる種類および長さのリンカーが評価された。その立体配座の柔軟性および小さい側鎖により、グリシン残基がリンカー単位として選択された。リンカー単位の数は、残基Ａｌａ８８およびＧｌｙ２３１に共有結合した１個から６個のグリシン残基から成る、モデリングリンカーに基づいて選択された。それらのリンカー単位の中に様々なグリシン数を伴う６個の異なるポリペプチドモデルが生成され、エネルギーを最小限化された。それらの分子エネルギーが、それらの相対的安定性を判定して順序付けるように算出された。３グリシンリンカーが、最適であることが示され、５０アミノ酸および６２アミノ酸セグメントの構造よりも低い算出された分子エネルギーを有した。したがって、３グリシンリンカーによって配列番号２のアミノ酸２４９〜２６２に接続された配列番号２のアミノ酸２７〜８８から成るオリゴペプチド（ＡＨＬ７９）が、この研究用の第２の構築物として選択された。
【０１４０】
ＡＨＬ６２およびＡＨＬ７９は、決定的なエピトープであることが以前に示された、配列番号２のアミノ酸２７〜７６から成る５０アミノ酸オリゴペプチドよりも安定していると予測された。さらに、配列番号２のアミノ酸７７〜８８および２３１〜２４１は、エピトープに付加的であると予測された。図３は、７ＡＨＬ７量体α溶血素結晶構造からのサブユニットＡのタンパク質表面上のＡＨＬ６２およびＡＨＬ７９の相対的局所構造を示す。
【実施例２】
【０１４１】
黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドのクローニングおよび発現
【０１４２】
この実施例は、黄色ブドウ球菌α溶血素遺伝子の単離およびクローニング、ならびに実施例１のようにモデル化されたｍｅｔ−ＡＨＬ６２およびｍｅｔ−ＡＨＬ７９の発現を説明する。
【０１４３】
Ａ）追加されたＮ末端メチオニンを伴う、配列番号２のアミノ酸２７〜７６から成るオリゴペプチドをコードする核酸断片が、黄色ブドウ球菌株ＵＳＡ３００からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって増幅された。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーは、合成制限部位、順方向プライマーにおいて大文字で示されたＮｄｅＩ、配列番号７ｔｔＣＡＴＡＴＧｇｃａｇａｔｔｃｔｇａｔａｔｔａａｔａｔｔａａａａｃｃ、および逆方向プライマーにおいて大文字で示されたＸｈｏ  Ｉ、配列番号８ｔｔＣＴＣＧＡＧｔｔｔａｔｔａｔｇａｔｔｔｔｔａｔｃａｔｃｇａｔａａａａｃを含んだ。ベクターｐＥＴ−２４ａ（＋）は、組み換えタンパク質の欠失および精製を促進するように、６個のヒスチジン残基をコードする人工配列を有する。ＰＣＲカラムを使用した精製後、合成断片、また、発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）が、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１制限酵素で消化され、ゲル精製された。次いで、ＰＣＲ断片およびｐＥＴ−２４ａ（＋）ベクターが、急速リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して結合された。結合後、組み換え発現構築物が、クローン選択のためにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に変換された。抗生物質耐性クローンがランダムに選ばれ、従来の制限エンドヌクレアーゼ消化による発現のための適切な配向においてα溶血素コード挿入物の存在について審査された。
【０１４４】
Ｂ）ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６およびｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６をコードする核酸断片が合成され、ＤＮＡ２．０  ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ  ９４０２５  ＵＳＡ）によってｐＥＴ２４ａ（＋）にクローン化された。これらの挿入物のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３および配列番号５として提示された。対象構築物であるｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６が、同じベクターで調製された。
【０１４５】
２つのオリゴペプチドの発現の成功を確認するために、組み換え構築物を伴う、または伴わないＢＬ２１（ＤＥ３）細胞が、０．４〜０．６の細胞密度（ＯＤ６５０）に達するまで、３０℃にて５０μｇ／ｍｌカナマイシンが補充されたＬＢ培地で培養された。次いで、細胞培養は、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導され、一晩成長させられた。細胞が収集され、ＩＰＴＧ誘導型発現タンパク質が、一般的な技法を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を介して、分子サイズに基づいて分離された。図４Ａは、大腸菌ＢＬ２１細胞において発現された、２つの黄色ブドウ球菌オリゴペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。次いで、タンパク質は、ヒツジ抗α溶血素ポリクローナル抗体（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｒａｓｏｔｅ，  ＦＬ）を使用したウェスタンブロット分析を受けた。図４Ｂは、大腸菌ＢＬ２１細胞において発現された、２つの黄色ブドウ球菌オリゴペプチドのウェスタンブロットを示す。
【実施例３】
【０１４６】
免疫原性組成物で使用するための組み換え黄色ブドウ球菌α溶血素オリゴペプチドの精製および製剤化
【０１４７】
組み換え黄色ブドウ球菌オリゴペプチドｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６およびｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６が、実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（＋）を伴うＢＬ２１大腸菌細胞において発現された。タンパク質産生のレベルを測定するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が行われた。小規模のＨｉｓタグ付けされたタンパク質の精製のために、「Ｈｉｓ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐ（商標）キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が、製造業者の指示に従って使用された。ワクチンが、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化され、使用するまで−８０℃で保管された。
【実施例４】
【０１４８】
黄色ブドウ球菌肺炎動物モデルにおけるｍｅｔ−ＡＨＬ６２およびｍｅｔ−ＡＨＬ７９の評価
【０１４９】
６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／グループ）が、０．０１ｍｌ体積のＰＢＳ中で、第０、１４、および２８日に、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）中のｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６またはｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６のいずれかの免疫を筋肉内に与えられた（ＩＭ）。マウスは、各免疫付与の前に、および最後の免疫付与後１４日に、尾静脈を介して採血された。血液サンプルが、血清セパレータ管の中で遠心分離され、血清中の抗体力価が、ＥＬＩＳＡによって判定された。概略すると、９６ウェルプレートが、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌ（１００ｎｇ／ウェル）の抗原（α溶血毒またはｍｅｔ−ＡＨＬ７９）で被覆された。プレートが、室温で２時間、ＰＢＳ中の４％牛乳でブロックされた。希釈剤としてＰＢＳ中の４％牛乳を使用して、血清サンプルが、９６ウェルプレートの中で１：１００および１：１０００希釈において調製された。プレートが、３回洗浄され、反転させられ、残留液体を除去するようにペーパータオル上で拭き取られ、サンプル希釈が、１００μｌ体積／ウェルで適用された。プレートが、室温（ＲＴ）で２時間培養され、ＰＢＳ溶液中の１％牛乳中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である、共役を適用する前に、上述のように３回洗浄された。プレートが、室温で１時間培養され、上述のように洗浄され、ＨＲＰを検出するようにＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン）を用いて３０分培養された。６５０ｎｍにおける光学密度が、Ｖｅｒｓａｍａｘ（商標）プレートリーダを使用して測定された。
【０１５０】
第５２日目に、マウスは、α溶血素を発現する、致死量の生黄色ブドウ球菌（ＳＡ）Ｎｅｗｍａｎ細菌株で鼻腔内に（ＩＮ）感染攻撃され、動物は、感染攻撃後の７２時間にわたって、死亡率および罹患率（体重減少および不快感の症状）について監視された。図５で実証されるように、（Ａ）ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６または（Ｂ）ｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６オリゴペプチドで免疫化されたマウスは、免疫化されていないマウスよりも有意に高い生存率を有した。
【実施例５】
【０１５１】
ＡＨＬ−６２ａａおよびＡＨＬ−５０ａａの生体内有効性の比較
【０１５２】
この実施例は、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＨＬ−６２ａａ）およびｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＨＬ−５０ａａ）と組み合わせて、潜在的にヒトで使用することができる、アジュバントの比較研究試験を示す。この研究では、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）が、ＡＨＬ−６２ａａおよびＡＨＬ−５０ａａ構築物のワクチンの可能性の評価のためにアジュバントとして使用された。１０匹のマウスのグループが、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）に吸着された４０μｇまたは４μｇのＡＨＬ−５０ａａまたはＡＨＬ−６２ａａのいずれかのワクチンを筋肉内に（ＩＭ）３回接種された。最後のワクチン接種後２週間で、４０μｇ用量を与えられたマウスは、２×１０８ＣＦＵのＳＡ株Ｎｅｗｍａｎで鼻腔内に（ＩＮ）感染攻撃された。ＡＨＬ−６２ａａが、致死性に対する８０％保護を提供した一方で、対照マウスは２４時間以内に死亡した（図６Ａ）。フロイントアジュバントを使用した以前の報告とは対照的に、ＡＨＬ−５０ａａ／ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）で免疫化されたマウスは、４８時間しか生存しなかった。真皮壊死モデルが、精製Ｈｌａに対するワクチン媒介保護を評価するために使用された。低用量（４μｇ）または模擬ワクチン接種マウスのグループが、５μｇの精製Ｈｌａで皮内に感染攻撃され、病変発生について７２時間観察された。ＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスは、７２時間後に、ＡＨＬ−５０ａａで免疫化されたマウスまたは模擬処置マウスよりも有意に小さい病変を発現させた（図６Ｂおよび６Ｃ参照）。
【０１５３】
ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）、リン酸アルミニウム（Ｅ．Ｍ．  ＳＥＲＧＥＡＮＴ  ＰＵＬＰ  ＡＮＤ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  Ｃｏ，  Ｉｎｃ．）、およびＩＤＣ−１００１（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｒｐ．）が、ＡＨＬ−６２ａａオリゴペプチドのワクチンの可能性のさらなる評価のためにアジュバントとして使用された。５匹の（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスのグループが、２週間間隔にて３回、０．０１ｍｌの５０ｍＭ  ＴＲＩＳ中の３５ｕｇのＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）（すなわち、Ａｌ（ＯＨ）３）（表４、（Ａ）部分）、０．０１ｍｌの５０ｍＭ  ＴＲＩＳ中の３５ｕｇのリン酸アルミニウム（すなわち、ＡｌＰＯ４）（表４、（Ｂ）部分）、０．０１ｍｌのＰＢＳ中の２０ｕｇのＩＤＣ−１００１（表４、（Ｃ）部分）、または０．０１ｍｌのＰＢＳ中の５ｕｇのＡＨＬ−６２ａａ（アジュバントなし）（表４、（Ｄ）部分）のいずれかを用いて製剤化された、５ｕｇのＡＨＬ−６２ａａの免疫を筋肉内に（ＩＭ）与えられた。第３５日に、マウスは、抗体力価の判定のために、尾静脈切開を介して採血された。血液サンプルが、血清セパレータ管の中で遠心分離され、マウス血清が、α溶血毒（Ｈｌａ）への総および中和抗体について分析された。被覆抗原としての全長精製Ｈｌａ、および１：１００から始まって１：１０，０００，０００までの１１個の血清の半対数希釈を使用して、実施例４に記載されるように、総抗体力価がＥＬＩＳＡによって判定された。ＥＬＩＳＡ力価（ＥＣ５０）は、５０％最大ＯＤ（４−ＰＬ曲線の変曲点）をもたらす血清の希釈として定義された。同様に、中和価（ＮＴ５０）は、１ｕｇ／ｍｌの精製Ｈｌａによって誘導されるウサギ赤血球（ＲＢＣ）の溶解の５０％阻害をもたらす抗体の希釈として定義された。ＮＴ５０分析については、２％ＲＢＣ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｍｐａｎｙ，  ＣＯ）を追加する前に、マウス血清の連続希釈が、α溶血毒（０．１ｕｇ／ｍｌ）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ＣＡ）を用いて室温で１０分間培養され、その後に３７℃で３０分の培養が続いた。培養細胞がペレット化され、上清中の吸光が、４１６ｎｍにおいてＶｅｒｓａＭａｘ  ＥＬＩＳＡ，  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＣＡ）で判定された。中和価５０（ＮＴ５０）が、４パラメータロジスティック（４−ＰＬ）曲線適合を使用して、希釈血清サンプルにおけるＯＤ４１６ｎｍを描画することによって判定された。高、中、および低ＮＴ５０を伴う標準血清サンプルが、各分析実行中に、分析に対して実行された。
【０１５４】
免疫原性と致死的攻撃からの保護との間の関係を評価するために、第４１日目に、マウスは、３％ブタムチン中の５×１０４ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（ＳＡ）ＵＳＡ３００株で腹腔内に（ＩＰ）感染攻撃され、７日にわたって罹患率および死亡率について監視された。
【０１５５】
３５ｕｇのＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（商標）を用いて製剤化されたＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスは、１８９という幾何平均を伴う低いＥＬＩＳＡ力価、および検出限界を下回る中和価を示した。低い抗体力価と一致して、このグループ内の５匹中３匹のマウスが、感染攻撃の２０時間以内に死亡した（表４、（Ａ）部分）。３５ｕｇのリン酸アルミニウムを用いて製剤化されたＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスは、３００という幾何平均を伴うより高い抗体力価を示し、５匹中３匹のマウスが検出可能な中和価を示した。このグループ内の全てのマウスが、感染攻撃に耐え抜いた（表４、（Ｂ）部分）。２０ｕｇのＩＤＣ−１００１を用いて製剤化されたＡＨＬ−６２ａａで免疫化された全てのマウスは、それぞれ、２４７６および３０９という幾何平均を伴う、はるかに高いＥＬＩＳＡおよびＮＴ５０力価を示した。高い力価と一致して、全てのマウスが感染攻撃に耐え抜いた（表４、（Ｃ）部分）。非常に低いＥＬＩＳＡおよび検出不可能なＮＴ５０力価が、アジュバントを伴わないＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスで観察された（表４、（Ｄ）部分）。水酸化アルミニウムとともに対照ワクチン（組み換えブドウ球菌エンテロトキシンＢワクチン、ＳＴＥＢＶａｘ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）で免疫化されたマウスは、Ｈｌａに対する力価を示さなかった（表４、（Ｅ）部分）。２つの対照グループ内の全てのマウスは、ＳＡ  ＵＳＡ３００株を用いた感染攻撃の２０時間以内に死亡した。
【表４】
2014507142.tif 000008
【実施例６】
【０１５６】
ポリクローナル抗ＡＨＬ−６２ａａ抗体がα溶血毒（Ｈｌａ）オリゴマー化を阻害する
【０１５７】
この実施例は、ＡＨＬ−６２ａａによって引き起こされる抗体の作用の機構の研究を示す。ウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）が、ＡＨＬ−６２ａａに対して産生され、毒素中和（ＴＮＡ）およびオリゴマー化分析で試験された。ＡＨＬ−６２ａａ  ｐＡｂは、１μｇ／ｍｌのＨｌａを効果的に中和した（ＮＴ５０：１３．４μｇ／ｍｌ、図７Ａ参照）。
【０１５８】
中和の機構を調査するために、７量体オリゴマー（Ｈｌａ７）形成へのＡＨＬ−６２ａａ  ｐＡｂの影響が、ウェスタンブロット分析で試験された。Ｈｌａが、ＲＢＣとの混合物を溶媒する前に、ｐＡｂｓを用いて培養された。細胞溶解物が、事前に煮沸することなくウェスタンブロット法を受けた。具体的には、混合物が、２％ウサギＲＢＣを用いて３７℃で３０分間培養され、加熱することなくＳＤＳ−ＰＡＧＥに装填された。ウェスタンブロットは、ヒツジ抗Ｈｌａポリクローナル抗体を用いて発現させられた。図７Ｂは、ＡＨＬ−６２ａａへのｐＡｂｓが７量体（Ｈｌａ７）構造の形成を妨げたことを示す。
【実施例７】
【０１５９】
ＡＨＬ−６２ａａに対するポリクローナル抗体が地域感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対してマウスを保護する
【０１６０】
地域感染型ＭＲＳＡヒト感染誘導分離株（ＣＡ−ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）に対するＡＨＬ−６２ａａ抗体の予防効果が評価された。ＡＨＬ−６２ａａワクチンを接種したウサギから得られたＡＨＬ−６２ａａ特異的抗体が、前述のＭＲＳＡマウス感染モデルにおける受動保護の実施例として使用された（Ｆａｔｔｏｍ，  Ａ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  （ＣＰ）  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ＣＰ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  １９９６．  ６４（５）：  ｐ．  １６５９−６５）。有効性が、ブタムチン菌血症モデルにおけるＣＡ−ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００致死的攻撃に対して試験された。このモデルを使用して、５匹のグループ内の９〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスが、５ｍｇ、２．５ｍｇ、１．２５ｍｇ、０．６２５ｍｇの総ポリクローナルＩｇＧ用量においてＡＨＬ−６２ａａ−ＩｇＧを腹腔内（ＩＰ）投与された一方で、対照グループ内のマウスは、５ｍｇの対照ＩｇＧ  （未処置ウサギＩｇＧ）または生理食塩水プラセボを与えられ、次いで、２４時間後に３％ブタムチンを加えた５×１０４ＣＡ−ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）でＩＰ感染攻撃された。次いで、ＡＨＬ−６２ａａ−ＩｇＧの予防効果が、細菌攻撃生存後の７日に評価された。
【表５】
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【０１６１】
表５は、免疫原としてＡＨＬ−６２ａａワクチンを使用して生成されたウサギポリクローナルＩｇＧの用量依存性有効性の実施例を示す。受動的に免疫化されたとき、５ｍｇ対照ＩｇＧでの１０％生存およびプラセボでの０％と対比して、５ｍｇのＡＨＬ６２ａａ−ＩｇＧは１００％保護を付与し、２．５ｍｇのＡＨＬ６２ａａ−ＩｇＧは４０％保護を付与し、１．２５ｍｇのＡＨＬ６２ａａ−ＩｇＧは２０％保護を付与し、０．６２５ｍｇのＡＨＬ６２ａａ−ＩｇＧは０％保護を付与する。
【実施例８】
【０１６２】
ＡＨＬ−６２ａａに対する抗体が致死的菌血症からマウスを保護するようにＰＶＬ抗体とともに相乗作用を与える
【０１６３】
この実施例は、ＡＨＬ−６２ａａに対して産生された抗体が、別の孔形成毒素であるパントン・バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）に対する抗体とともに相乗作用を与えることを示す。抗体が、ウサギにおけるＰＶＬのＳサブユニット（ＬｕｋＳ−ＰＶ）に対して産生され、抗ＬｕｋＳ  ＩｇＧが精製された。合成ビーズと接合された精製ＬｕｋＳとともに親和性カラムを使用して、特異的な抗ＬｕｋＳが、この抗体からさらに精製された。マウスは、対照ＩｇＧ、ＡＨＬ−６２ａａ−ＩｇＧ、精製抗ＬｕｋＳ、および抗体の組み合わせで処置され、５×１０４ＣＦＵのＵＳＡ３００  ＭＲＳＡ株（ＬＡＣ）で感染攻撃された。マウスは、罹患率および死亡率について５日にわたって監視された。ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧは、精製抗ＬｕｋＳと組み合わせられたときに相乗効果を示した（表６参照）。
【表６】
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【０１６４】
表６は、ＵＳＡ３００菌血症に対する保護においてＡＨＬ−６２ａａおよびＬｕｋＳ−ＰＶに対して産生された抗体間の相乗作用を示す（生存率）。これらのデータは、Ｈｌａ変異ワクチンに対して産生された抗体を用いた受動免疫付与が、他の黄色ブドウ球菌抗原の予防効果を補完および強化できることを示す。
【実施例９】
【０１６５】
ＡＨＬ−５０ａａ、ＡＨＬ−６２−ａａ、およびＡＨＬ−７９ａａの免疫原性および生体内有効性の比較
【０１６６】
ＡＨＬ−５０ａａタンパク質は、フロイントアジュバントとともに使用されたときに、黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ株による肺炎に対するワクチン候補として以前に報告された（Ｒａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７７：  ２７１２−２７１８  （２００９）。フロイントアジュバントをヒトで使用することができないため、現在臨床開発中であるＩＤＣ−１００１アジュバントと組み合わせて、ｍｅｔ−ＡＨＬ５０−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＨＬ−５０ａａ）、ｍｅｔ−ＡＨＬ６２−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｈｉｓ６（ＡＨＬ−６２ａａ）、およびｍｅｔ−ＡＨＬ７９−ｌｅｕ−ｇｌｕ-ｈｉｓ６（ＡＨＬ−７９ａａ）オリゴペプチドを使用して、比較有効性研究が行われた。２０匹のマウスのグループが、２週間間隔で３回、それぞれ０．０１ｍｌのＰＢＳ中の５μｇのＩＤＣ−１００１を用いて製剤化された、５μｇのＡＨＬ−５０ａａ、ＡＨＬ−６２ａａ、またはＡＨＬ−７９ａａオリゴペプチド、あるいは対照タンパク質（ＢＳＡ）の免疫を筋肉内に与えられた。第３５日目に、マウスは、抗体力価の判定のために、例えば、Ｈｌａに対する総および中和抗体のために採血された。抗体力価は、実施例４および５に記載されるように、ＥＬＩＳＡによって判定された。ＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスは、２０２２（範囲：５１０〜１４，９００）という中央ＥＣ５０を伴う着実なＥＬＩＳＡ力価を示した（図８Ａ）。ＡＨＬ−７９ａａで免疫化されたマウスは、４９（範囲：０〜６，０５０）という中央値を伴うより低いＥＬＩＳＡ力価を示し、その後に１１（範囲：０〜１，１５０）という中央値をＥＣ５０伴うＡＨＬ−５０ａａで免疫化されたマウスが続いた（図８Ａ）。同様に、中和価が血清サンプルのプールで判定されたとき、ＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスは、１２７７という最高ＮＴ５０を示し、その後に２１３というＮＴ５０を伴うＡＨＬ−７９ａａが続いた（図８Ｂ）。中和は、ＡＨＬ−５０ａａ免疫マウスからの血清のプールでは検出不可能であった（ＮＴ５０＜４０）（図８Ｂ）。
【０１６７】
感染攻撃研究のために、各グループが、１０匹ずつの２つのサブグループに分けられ、黄色ブドウ球菌肺炎および敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）に対するワクチン有効性を判定するために、以下の実施例１０および１１に記載されるように感染攻撃された。
【実施例１０】
【０１６８】
黄色ブドウ球菌（Ｎｅｗｍａｎ株）肺炎動物モデルにおけるＡＨＬ−６２ａａおよびＡＨＬ−７９ａａの生体内有効性の評価
【０１６９】
実施例８に記載の１０匹の免疫マウスまたは５匹の対照マウスのグループが、６×１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（ＳＡ）Ｎｅｗｍａｎ株の鼻内（ＩＮ）投与によって、第４８日目に感染攻撃された。マウスは、７日にわたって死亡率および罹患率について観察された。図９に示されるように、対照タンパク質またはＡＨＬ−５０ａａで免疫化されたマウスは、２４〜４８時間以内に死亡した。同様に、ＡＨＬ−７９ａａで免疫化された１０匹中９匹のマウスが感染に屈した一方で、１匹は感染攻撃に耐え抜いた。対照的に、ＡＨＬ−６２ａａで免疫化されたマウスは、致死的攻撃からの５０％保護を示し、他のグループよりも有意に遅く死亡が発生した。マウスが７日にわたって監視されたとき、７２時間を超えてこのグループでは追加の致死率が観察されなかった。
【実施例１１】
【０１７０】
黄色ブドウ球菌（ＵＳ３００株）菌血症動物モデルにおけるＡＨＬ−６２ａａおよびＡＨＬ−７９ａａの生体内有効性の評価
【０１７１】
実施例８に記載の１０匹の免疫マウスおよび５匹の対照マウスのグループが、３％ブタムチン中の５×１０４ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）の腹腔内（ＩＰ）投与によって、第４１日目に感染攻撃された。マウスは、７日にわたって死亡率および罹患率について観察された。図１０に示されるように、ＡＨＬ−６２ａａまたはＡＨＬ−７９ａａで免疫化されたマウスが、感染攻撃に耐え抜いた一方で、ＡＨＬ−５０ａａで免疫化されたマウスの３０％および対照マウスの８０％は、感染により死亡した。
【実施例１２】
【０１７２】
黄色ブドウ球菌（ＵＳ３００株）肺炎動物モデルにおけるＡＨＬ−６２ａａの生体内有効性の評価
【０１７３】
ＡＨＬ−６２ａａの有効性が、ＳＡ  ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）によって誘導された肺炎に対してさらに調査された。５匹の雌６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループが、２週間間隔で３回、０．０１ｍｌのＰＢＳ中の２０μｇのＩＤＣ−１００１で製剤化された１０μｇのＡＨＬ−６２ａａの免疫を筋肉内に与えられ、１０匹の「対照」マウスのグループが、０．０１ｍｌのＰＢＳ中のＩＤＣ−１００１単独で免疫化された。第２１日目および第３５日目に、マウスは、抗体力価、例えば、Ｈｌａに対する総抗体の判定のために採血された。総抗体力価は、実施例４に記載されるように、ＥＬＩＳＡによって判定された。第４１日目に、マウスは、１．５×１０８ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００のＩＮ投与によって感染攻撃された。第３５日目に、免疫マウスは、野生型Ｈｌａで被覆されたＥＬＩＳＡプレート上で、２４００から８９８０の範囲を伴う３６４０という中央抗体力価（ＥＣ５０）を示した。対照マウスは、検出可能な抗体力価を示さなかった。図１１に示されるように、全ての対照マウスが２０〜４８時間以内に死亡した一方で、５匹中４匹の免疫マウスは感染攻撃に耐え抜き、ＳＡ  ＵＳＡ３００誘導性肺炎に対するＡＨＬ−６２ａａの有効性を示した。
【実施例１３】
【０１７４】
ＡＨＬ−６２ａａに対する抗体を用いた受動免疫付与が黄色ブドウ球菌感染マウスの臓器中の細菌負荷を低減させる
【０１７５】
この実施例は、細菌播種および／または成長を阻害する際のＡＨＬ−６２ａａ抗体の生体内予防効果を評価する。肺炎および菌血症モデルを使用して、２つの研究が行われた。ポリクローナルＡＨＬ−６２ａａ特異的抗体（抗ＡＨＬ−６２ａａＩｇＧ）が、ウサギにおける精製ＡＨＬ−６２ａａに対して産生され、抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧがタンパク質Ａによって精製された。対照未処置ウサギＩｇＧが、商業的供給源（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，  Ｉｎｃ．）から入手された。
【０１７６】
第１の実験では、２０匹のマウスの２つのグループが受動的に免疫化され、一方のグループは未処置ＩｇＧ、他方のグループは抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧで免疫化された。２４時間後、マウスは、３％ブタムチン中の５×１０４ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００にＩＰ感染させられた（菌血症モデル）。１２時間後、感染マウスは安楽死させられ、血液および種々の臓器が無菌で除去され、以下のように調製された。各臓器は、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、３．２ｍｍステンレス鋼ビーズで均質化され、全体積５００ｕｌのＰＢＳに取り込まれた。血液および臓器ホモジネートの連続希釈がＰＢＳ中で調製され、ＢＨＩ寒天プレート上へ筋状に出された。３７℃での一晩の培養後、プレート上のＣＦＵ数が手動で数え上げられた。この実験では、対照マウスのうちの２匹が１２時間時点の前に死亡し、したがって、１８匹の対照マウスからのみデータを収集することができた。ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧ処置グループ内の２０匹全てのマウスが、犠牲時に生きていた。図１２（Ａ〜Ｅ）に示されるように、抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧを用いた処置は、血液（図１２Ａ）、腎臓（図１２Ｂ）、肝臓（図１２Ｃ）、脾臓（図１２Ｄ）、および肺（図１２Ｅ）中の細菌負荷の劇的な低減をもたらした。結果は、ＡＨＬ−６２ａａに対する抗体が、生体内で細菌の播種に対して防御したことを示す。
【０１７７】
第２の実験では、１０匹のマウスの２つのグループが受動的に免疫化され、一方のグループは未処置ＩｇＧ、他方のグループは抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧで免疫化された。２４時間後、マウスは、１．３×１０８ＣＦＵのＳＡ  ＵＳＡ３００にＩＮ感染させられた（肺炎モデル）。１２時間後、感染マウスは安楽死させられ、血液および種々の臓器が無菌で除去され、上述のように調製された。ＣＦＵが、上述のように血液および臓器ホモジネートにおいて判定された。図１３（Ａ〜Ｅ）に示されるように、ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧを用いた処置は、血液（図１２Ａ）、腎臓（図１２Ｂ）、肝臓（図１２Ｃ）、脾臓（図１２Ｄ）、および肺（図１２Ｄ）中の細菌負荷の低減をもたらした。マンホイットニー検定を使用した統計分析は、差が腎臓、肝臓、および肺について有意であったことを示した。血液および脾臓でも傾向を観察することができた。抗ＡＨＬ−６２ａａ  ＩｇＧで処置された１０匹中５匹のマウスが、脾臓で細菌播種を示さなかった一方で、１０匹中９匹のマウスに感染脾臓があった。これらのデータは、ＡＨＬ−６２ａａによって誘導された抗体が、生体内で細菌の播種に対して防御したことを示す。
＊＊＊
【０１７８】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の例証として意図される、説明された具体的実施形態によって範囲を限定されるものではなく、機能的に同等であるあらゆる組成物または方法が、本発明の範囲内である。実際に、本明細書で示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、先述の説明および添付図面から当業者に明白となるであろう。そのような修正は、添付の請求項の範囲内に入ることを目的としている。
【０１７９】
本明細書で挙げられる全ての出版物および特許出願は、各個別出版物または特許出願が、参照することにより特異的および個別に組み込まれることが示されるのと同じ程度に、本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014507142.tif 000026