(57)【要約】  本発明は、地下水から単離され、特性決定された新規な細菌株に関する。本発明はまた、細菌抽出物、およびその治療的使用、特に炎症の治療に関連する使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の懸濁液から得られた細菌抽出物であって、前記懸濁液の細菌がβプロテオバクテリア網ナイセリア亜科に属する非病原性グラム陰性細菌であり、前記細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１の配列を含むことを特徴とする、細菌抽出物。
【請求項２】
前記細菌が、配列番号２の配列、または配列番号２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる、少なくとも１つのプラスミドを含む、請求項１に記載の細菌抽出物。
【請求項３】
前記細菌が、２０１０年４月８日に、ＣＮＣＭに参照番号Ｉ−４２９０として寄託された細菌、または該細菌の他の変異体である、請求項１または２に記載の細菌抽出物。
【請求項４】
細胞内成分を除去するという方法で前記細菌懸濁液を処理した後に得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌抽出物。
【請求項５】
前記細胞内成分が少なくとも核酸を含む、請求項４に記載の細菌抽出物。
【請求項６】
少なくとも膜タンパク質、周辺質タンパク質、および鞭毛由来タンパク質を含んでなる画分Ｅ０を含む、請求項４または５に記載の細菌抽出物。
【請求項７】
前記膜タンパク質が、ポーリン、ＯｍｐＡ、リポ多糖、および／またはリポタンパク質からなる、請求項６に記載の細菌抽出物。
【請求項８】
少なくとも分泌されたペプチドおよびタンパク質、ならびに二次代謝産物を含んでなる画分Ｓ０を含む、請求項４または５に記載の細菌抽出物。
【請求項９】
少なくとも画分Ｅ０および画分Ｓ０を含んでなる画分ＥＳ０を含む、請求項４または５に記載の細菌抽出物。
【請求項１０】
前記画分ＥＳ０が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られる、それぞれ３０ｋＤａ〜３６ｋＤａ、４１ｋＤａ〜４５ｋＤａ、および４７ｋＤａ〜５１ｋＤａの範囲の分子量に相当する３つの主要バンドを含む、タンパク質プロフィールを有する、請求項９に記載の細菌抽出物。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項で定義される細菌、および／または請求項１〜７、９および１０のいずれか一項に記載の細菌抽出物の、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５アクチベーターとしての使用。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項で定義される細菌、および／または請求項１〜７、９および１０のいずれか一項に記載の細菌抽出物の、Ｔｈ１応答をホメオスタシスに回復させるための使用。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に定義される細菌、および／または請求項１〜７、９および１０のいずれか一項に記載の細菌抽出物の、Ｔｈ２応答をホメオスタシスに回復させるための使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌、および／または請求項４〜８および１１のいずれか一項に記載の細菌抽出物の、Ｔｈ１７応答をホメオスタシスに回復させるための使用。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項に定義される細菌、および／または請求項８、９および１０のいずれか一項に記載の細菌抽出物の、ＰＡＲ２アンタゴニストとしての使用。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか一項に定義される細菌、および／または請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細菌抽出物の、消化管および口腔炎症性疾患の治療および／または予防を目的とした組成物を調製するための使用。
【請求項１７】
前記消化管および口腔炎症性疾患がクローン病、大腸炎、過敏性腸症候群、または歯周炎からなる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
少なくとも、有効成分として、請求項１〜３のいずれか一項で定義される細菌、および／または請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細菌抽出物を含んでなる、組成物。
【請求項１９】
消化管および口腔炎症性疾患の治療のための、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記消化管および口腔炎症性疾患がクローン病、大腸炎、または歯周炎からなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
薬学的に許容可能な担体をさらに含んでなる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、地下水から単離され、特性決定された新規な細菌株に関する。本発明はまた、細菌抽出物、およびその治療的使用、特に炎症の治療に関連する使用に関する。
【０００２】
より詳しくは、本発明は、慢性腸炎症性障害および歯周炎の治療および予防における、対象とする新規組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
急性大腸炎、過敏性腸症候群、およびクローン病は、先進国で増加している疾患であり、およそ１４０万人の米国人が罹患している(Arijs, I. et al., 2009. PLoS ONE.4:e7984, and Hill, D.A. and D. Artis. 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:623-67、およびKaser, A. et al., 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:573-621)。クローン病は、炎症性腸疾患であり、消化管部分を侵すが、その好発部位は回腸（小腸終末部）および結腸である。侵された腸壁は浮腫を引き起こす。その進行過程で、この腸壁の浮腫は腸の直径の縮小を引き起こす。狭窄（収縮）の原因である線維症への進展も起こり得る。
【０００４】
この疾患は、程度の差はあるが範囲が広く、また、程度の差はあるが深い潰瘍の存在を特徴とし、潰瘍は腸壁を穿通し（裂隙）、それゆえに膿瘍および瘻孔を引き起こす。この疾患は両性においてみられ、一般に２０〜４０歳代の間に発現する。その典型的なタイプにおいては、疾患はゆっくりと徐々に始まる。数か月または数年にわたる症状をまとめると、一時的な下痢およびはっきりしない腹痛である。
【０００５】
この疾患が確立した場合、中等度の、時として脂肪性、まれに出血性の下痢が主な症状である。右側腸骨窩の固定した持続性疼痛、または発作性もしくは非定型疼痛もまた、本疾患に付随するものである。その他の重要な症状は、体重減少および発熱である。徴候は、病変の形状によって異なる。
【０００６】
この疾患は、様々な激しさの、多くの場合、自然に消退する急激な再燃により進行する。
【０００７】
しかしながら、腸閉塞、腸瘻、腸穿孔、皮膚または腹腔内臓器における瘻孔（開口）、肛門直腸の合併症（裂隙、膿瘍）などの合併症は高頻度に起こり、多様な外科的処置が必要となり得る。
【０００８】
外科的処置に加えて、クローン病を軽減するためにモノクローナル抗体（抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１２／ｐ４０、または抗ＩＬ−２３／ｐ４０）を用いる治療が存在するが、非常にコストが高いという欠点がある。
【０００９】
本特許出願の発明は、これに関連して、この疾患に苦しむ患者の苦痛を軽減するための、また違った効果的かつ低コストのアプローチを提案する。
【００１０】
クローン病は、多因子性で複雑な疾患である。本疾患において特定されている因子のうちの１つは、本質的に免疫学的なものである。最近の発表では、炎症誘発性反応および炎症反応が不均衡であり、悪化していることが証明され、宿主の免疫系が「破壊されている」ことが明らかにされた。免疫系の脱制御が示唆され、すなわち、Ｔｈ１プロフィールがＩＬ−１２の産生とともに促進され、Ｔｈ１７プロフィールがＩＬ−２３の増加とともに促進され、腸の本来の細菌叢の破壊および耐性の低下が不適切な局所性および全身性免疫応答を引き起こし、結果として異常な腸内細菌叢に対する免疫応答が病因（Ｔ細胞活性化、炎症性サイトカイン、腸内細菌に対する抗体）をもたらすというものである(Abraham C. and Cho J.H., N Engl J Med 2009;361:2066-78)。
【００１１】
Cenac et al., (Am J Pathol. 2002.161:1903-1915)は、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）の活性化が動物において急性腸炎を引き起こすことを発見した。ＰＡＲ２は、消化管における内皮細胞、結腸筋細胞、腸細胞、腸ニューロン、免疫細胞等で過剰発現されている。消化管に豊富に存在するプロテアーゼ（トリプシン、トリプターゼ）は、ＰＡＲ２をＮ末端で切断し、同受容体を活性化する特異的ペプチドを露出する（自己活性化現象）。結果として、これにより炎症促進性サイトカインの産生が活性化され、炎症を引き起こす(Vergnolle, N. 2005. Gut. 54:867-874およびVergnolle, N. 2009. Pharmacol. Ther. 123:292-309)。この現象は、野生型マウスでは観察されるが、ＫＯマウス（ＰＡＲ２欠損）では現れない。抗プロテアーゼおよび／またはＰＡＲ２アンタゴニストを用いる治療は、この炎症現象を避けることを可能にする。
【００１２】
歯肉炎と同様に、歯周炎は、歯肉、セメント質、歯周靭帯、および歯槽骨などの、歯を取り囲み、支える特殊な組織である歯周組織の炎症性疾患である。歯周炎は、歯槽崩壊（骨損失）を伴うことが多い。慢性歯周炎はどの年代にも発現し得るが、成人においてより多くみられる。歯周炎は、多因子性（遺伝因子および環境因子）の疾患である。慢性歯周炎は、歯の細菌バイオフィルムにより発現し、維持される。
【００１３】
しかしながら、免疫防御メカニズムは、その発症機序において重要な役割を果たしている。最近の研究から、ＰＡＲ２は骨芽細胞、口腔上皮細胞、および歯肉線維芽細胞において発現されているため、歯周炎において重要な役割を果たしていることが明らかになった(Holzhausen, M. et al., 2006. Am J Pathol. 168:1189-1199)。
【００１４】
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)（慢性歯周炎の主要病原体）により産生されるジンジパイン−Ｒプロテアーゼは、ＰＡＲ２受容体を活性化する特異的ペプチドを露出させるＮ末端のタンパク質分解による切断により、ＰＡＲ２を活性化し得る（自己活性化現象）ことが報告されている(Abraham, L.A. et al., 2000. Bone. 26:7-14およびLourbakos, A. et al., 2001. Infect. Immun. 69:5121-5130)。これは炎症誘発性サイトカインの産生を誘導し、続いて炎症が起こり、骨損失をもたらす。
【００１５】
プロテアーゼ阻害を目的とする治療法、またはＰＡＲ２アンタゴニストの使用は、歯周炎などの炎症性疾患の感染起源の病状を調節するための可能なアプローチとなる。
【００１６】
これに関連して、本発明は、従前に記載されたことのない新規な細菌の単離、特性決定、および分画により、これらの炎症性疾患を治療するための解決策を提供する。
【発明の開示】
【００１７】
出願人は初めて、また驚くべき方法で、新規な細菌種に属する株を地下水から単離することに成功し、前記新規な細菌株（または細菌）はＬＭＢ６４と名付けられている。
【００１８】
単離された事実に加え、この細菌ＬＭＢ６４は、βプロテオバクテリア(Betaproteobacteria)綱ナイセリア(Neisseriaceae)亜科、そしておそらくまだ定義されていない新しい属に属すると特性決定され、定義された。１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列コードの解析により、この細菌を、９５％の配列類似性を有するクロモバクテリウム(Chromobacterium)、パルディモナス(Paludimonas)、ルテリア(Lutelia)およびグルベンキアナ(Glubenkiana)属近縁に位置づけることが可能であった。
【００１９】
この非病原性細菌はグラム陰性であり、実施例でさらに詳細に記載する。また、この細菌は非糸状細菌であるという特徴を有する。さらに、この細菌は任意の種類の水、より詳しくは、普通の水を含む培地で培養することができるという利点を有する。一例として、ビトレオスシラ・フィリフォルミス(Vitreoscilla filiformis)とは対照的に、本発明の細菌ＬＭＢ６４の培養には特別な培養条件、より詳しくは、少なくとも１種類の硫黄不含の無機物および／または温泉水を含む培地は必要としない（この点に関しては、アトピー性皮膚炎の治療のためのＶ．フィリフォルミスの細菌抽出物の使用について記載されている特許文献ＥＰ２０１８８９１(Gueniche A., 2009)およびGueniche et al. 2006 (European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384)による文献に言及されている）。このことは、培養条件および設備の両方の観点から、また経済的観点から明らかな利点を示す。
【００２０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子コードは、ほぼ完全に配列決定されている（１４８７ｂｐ）。細菌ＬＭＢ６４は１０９４８ｂｐの環状プラスミドを有する。このプラスミドは完全に配列決定され、その配列は、配列番号２の配列として表される。
【００２１】
第１の実施態様によれば、本発明は、βプロテオバクテリア綱ナイセリア亜科に属し、１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子コードのヌクレオチド配列が配列番号１の配列、または配列番号１の配列と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する任意のヌクレオチド配列を含むかまたは含んでなる、非病原性グラム陰性細菌に関する。
【００２２】
好ましい様式では、本発明は、βプロテオバクテリア綱ナイセリア亜科に属する非病原性グラム陰性細菌であって、前記細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１の配列を含むかまたは含んでなることを特徴とする、細菌に関する。
【００２３】
本発明において、２つの核酸配列間の「同一性パーセント」とは、比較される２つの配列間で、ベストアライメント（最適アライメント）の後に得られる同一のヌクレオチドのパーセントを意味し、このパーセントは単に統計学的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたりランダムに分布している。２つの核酸配列間の配列の比較は、通常、最適な方法でアライメントした後にこれらの配列を比較することによりなされるが、この場合、前記比較はセグメントごとに、または「比較ウィンドウ」ごとに行われてよい。比較のための配列の最適アライメントは、手動に加えて、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85:2444]の類似性検索法によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウエア（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Group Computer, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴ  ＮもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ比較ソフトウエア）によって行うことができる。
【００２４】
２つの核酸配列間の同一性パーセントは、これら２つのアライメント配列を、最適な方法で比較することにより決定され、ここで比較する核酸配列はこれらの２つの配列間の最適アライメントのために参照配列に対して付加または欠失を含んでよい。同一性パーセントは、２つの配列間でヌクレオチドが同一である位置の数を決定し、同一の位置の数を比較ウィンドウの位置の総数で割り、得られた商に１００を掛けることによって計算され、これら２つの配列の同一性パーセントが得られる。
【００２５】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにて入手可能な「ＢＬＡＳＴ２配列」プログラム(Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences,” FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)を、デフォルトパラメーターとともに使用することができ（特に、パラメーターとそては「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティ」：２、選択マトリクスは例えばプログラムにより提案された「ＢＬＯＳＵＭ６２」マトリクスである）、プログラムにより、比較する２つの配列間の同一性パーセントが直接的に計算される。「ＡＬＩＧＮ」または「Ｍｅｇａｌｉｇｎ」ソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの他のプログラムを使用することも可能である。
【００２６】
別の実施態様によれば、本発明による細菌は、配列番号２の配列、または配列番号２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する任意の配列を含んでなる少なくとも１つのプラスミドを含む。
【００２７】
好ましい様式では、細菌ＬＭＢ６４は、配列番号２の配列を含んでなる少なくとも１つのプラスミドを含む。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様によれば、細菌ＬＭＢ６４は非糸状細菌であると特徴付けられる。
【００２９】
前記細菌ＬＭＢ６４の他の特徴は、下記で実施例において詳述する。
【００３０】
さらに、本発明の細菌ＬＭＢ６４は、出願人の名前で、２０１０年４月８日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)，パスツール研究所，パリに、参照番号Ｉ−４２９０として寄託されている。
【００３１】
従って、本発明の１つの対象は、２０１０年４月８日に、ＣＮＣＭに参照番号Ｉ−４２９０として寄託された細菌、または同族体、後代、または他の任意の変異体である。
【００３２】
用語「変異体」は、Ｉ−４２９０株から直接的に生じた任意の細菌を意味し、自然突然変異または、例えば、細胞増殖、細胞分裂（細菌の分裂またはＤＮＡ複製時に起こるエラーによる突然変異）に関連する任意の組換えなどの組換え、または自然選択、もしくは所与の化合物に対し耐性であるか耐性となった変異体の選択などの、培地における選択といったその他の機構を含んでなってよい。これらの変異体としては、それらのゲノム配列（またはそれらのプラスミドのゲノム配列）に１以上の突然変異を含んでなり、その突然変異が放射線、ウイルス、トランスポゾン、または変異誘発化学物質により引き起こされたものであるＩ−４２９０株由来のいずれの細菌も含まれる。
【００３３】
本発明の第１の実施態様によれば、例えば、濾過、アルコール（エタノール、イソプロパノール、イソブタノール）による凝固、掻き取った予備層とともにシリンダー上で乾燥させるなどの様々な公知の方法により、細菌培養液から全体のバイオマスが分離し、その後、凍結乾燥の形態または熱不活性化形態で使用してよい。
【００３４】
他の好ましい実施態様によれば、本発明は、一般には、上記のように細菌、すなわち、細菌ＬＭＢ６４の懸濁液から得られる、細菌画分とも呼ばれる細菌抽出物に関する。
【００３５】
用語「細菌抽出物」は、細菌バイオマスの任意の抽出物もしくは画分、または前記抽出物の任意の活性画分を意味する。例えば、このような抽出物は、細菌ＬＭＢ６４の培養物から得ることができ、その場合、調製方法は、細菌溶解の少なくとも１つの工程と、遠心分離または濾過から構成される様々な画分の分離の１つの工程を含んでなる。
【００３６】
非制限的な様式において、本発明の抽出物は、例えば、遠心分離により濃縮された培養培地から単離された細菌細胞；または超音波もしくはオートクレーブの作用によるなど当業者に公知の任意の手段により細胞エンベロープが破裂するような操作を受けた、濃縮された細菌細胞；または、濾過により得られた上清、からなってよい。
【００３７】
本発明による抽出物調製法の重要な工程は、例えば、核酸（染色体ＤＮＡ、染色体外環状ＤＮＡ、プラスミド）、リボソーム、および細胞内貯蔵物質（例えば、グリコーゲン、デンプンおよびポリ−β−ヒドロキシ酪酸）などの様々な細胞成分の除去からなる。
【００３８】
好ましい様式では、本発明による細菌抽出物は、細胞内成分を除去するという方法で前記細菌懸濁液を処理した後に得られる。
【００３９】
その結果、本発明による抽出物は、主として膜、周辺質間隙および／または細胞外間隙由来の成分を含む。
【００４０】
より詳しくは、前記細胞内成分は、少なくとも核酸を含んでなる。
【００４１】
細胞内化合物の除去に加えて、また、非限定的な例として、細菌の溶解および遠心分離後に、培養上清成分（以下、画分Ｓ０とする）およびペレットを構成する成分（以下、Ｅ０とする）を分離することは、当業者にとって容易に可能である。例えば、Ｓ０とＥ０の構成要素間の分離閾値は、分子量１００ｋＤａ付近であることが示唆され得る。結果として、画分Ｓ０の構成要素は、大部分が１００ｋＤａより小さい分子量を有し、一方、画分Ｅ０の成分は、大部分が１００ｋＤａよりも大きい分子量を有する。
【００４２】
従って、より詳しくは、当業者に公知の技術により、表面タンパク質および細菌の周辺質間隙に局在するタンパク質（Ｅ０）を主として含んでなるものから、培養上清（Ｓ０）中に見出される生体分子を抽出および単離することが可能である。
【００４３】
本発明の一つの実施態様によれば、細菌抽出物には、少なくとも膜タンパク質、周辺質タンパク質および鞭毛由来タンパク質を含んでなる画分Ｅ０が含まれる。
【００４４】
周辺質タンパク質には、グラム陰性菌の周辺質間隙に詰まっているタンパク質が含まれ、それは浸透圧衝撃、またはカオトロピック剤もしくは界面活性剤を含有する培地中でのインキュベーションにより放出され得る(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition: Sambrook and Russell. CSHL Press)。
【００４５】
鞭毛由来タンパク質は、鞭毛または鞭毛断片の多量体タンパク質を含む。細菌の鞭毛全体を、界面活性剤を用いた後に超遠心分離により（ＣｓＣｌ勾配存在下で）分離および精製する方法は、文献に記載されている。本発明では、抽出法の複数の例が鞭毛断片の回収を可能にする。
【００４６】
膜タンパク質には、膜に固定されており、その一部分が表面に露出しているタンパク質（例えば、外膜タンパク質、またはＯｍｐ）、膜表面に付着しているタンパク質、リポタンパク質およびポーリンが含まれる(Ward JB., Microbial adhesion to surfaces, 1980)。
【００４７】
好ましい様式では、前記膜タンパク質はポーリン、ＯｍｐＡ、リポ多糖、および／またはリポタンパク質からなる。
【００４８】
本発明の他の実施態様によれば、画分Ｓ０を使用することが好ましい。
【００４９】
より詳しくは、本発明による細菌抽出物は、少なくとも分泌されたペプチドおよびタンパク質、ならびに二次代謝産物を含んでなる画分Ｓ０を含む。
【００５０】
分泌されたペプチドおよびタンパク質には、細菌ＬＭＢ６４により天然に産生および分泌され、遠心分離または濾過により回収され得るペプチドおよびタンパク質が含まれる。
【００５１】
二次代謝産物には、培養培地中で細菌ＬＭＢ６４が産生し、分泌する小分子が含まれる。
【００５２】
ここで、画分Ｓ０中のリポ多糖の存在に言及する必要がある。実際、リポ多糖は、主として画分Ｅ０に見られるにもかかわらず、それでもなお少量が画分Ｓ０に見られる。
【００５３】
有利な様式においては、画分Ｅ０とＳ０は、例えば、培養培地をインキュベートして、塩基性培地（ｐＨ９から１１）と４℃にておよそ５時間にわたり反応させ、遠心分離および０．２μｍでの濾過により、透明なＥＳ０溶液を得ることにより、画分ＥＳ０を得るような方法で合わせることができる。
【００５４】
従って、細菌抽出物ＥＳ０は特に、膜タンパク質、リポ多糖、周辺質タンパク質、鞭毛のタンパク質断片、ならびに細菌による一次および二次代謝産物から構成される。
【００５５】
好ましい方法において、抽出物ＥＳ０は、少なくとも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術により、それぞれ、分子量の範囲が（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製の分子量標準に対しておよそ）以下の範囲：
バンド１：３０ｋＤａ〜３６ｋＤａ、好ましくは３４ｋＤａ；
バンド２：４１ｋＤａ〜４５ｋＤａ、好ましくは４３ｋＤａ；
バンド３：４７ｋＤａ〜５１ｋＤａ、好ましくは４９ｋＤａ
に相当する３つの主要バンドを含む１２のバンドを含んでなる、タンパク質プロフィールを有する。
【００５６】
本発明の別の実施態様によれば、細菌抽出物には、少なくとも画分Ｅ０および画分Ｓ０を有する画分ＥＳ０が含まれる。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様によれば、細菌抽出物にはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたタンパク質プロフィールを含んでなる画分ＥＳ０が含まれ、それぞれ３０ｋＤａ〜３６ｋＤａ、４１ｋＤａ〜４５ｋＤａ、および４７ｋＤａ〜５１ｋＤａの範囲の分子量に相当する、３つの主要バンドが含まれる。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様によれば、細菌抽出物にはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたタンパク質プロフィールを有する画分ＥＳ０が含まれ、それぞれ３４ｋＤａ、４３ｋＤａ、および４９ｋＤａの分子量に相当する、３つの主要バンドが含まれる。
【００５９】
別の側面によれば、本発明は以下の工程：
ａ）好適な培地中で細菌ＬＭＢ６４を培養する工程；および
ｂ）細胞内成分を除去する工程
を含んでなる、細菌抽出物を調製するための方法を記載する。
【００６０】
別の実施態様によれば、本発明による方法は、細菌抽出物Ｓ０を調製するための方法からなり、前記方法は以下の工程：
ａ）好適な培地中で細菌ＬＭＢ６４を培養する工程；および
ｂ）前記培養物を遠心分離する工程；
ｃ）上清Ｓ０を回収する工程
を含んでなる。
【００６１】
別の実施態様によれば、本発明による方法は、細菌抽出物Ｅ０を調製するための方法からなり、前記方法は以下の工程：
ａ）好適な培地中で細菌ＬＭＢ６４を培養する工程；
ｂ）前記培養物を遠心分離し、上清を除去する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られたバイオマスを、細胞内成分を除去するという方法で処理すること；
ｄ）ペレットＥ０を回収すること
を含んでなる。
【００６２】
好ましい様式では、工程ｃ）は、工程ｂ）で得られたバイオマスの超音波処理した後に、前記細胞内成分を含んでなるペレットの除去を目的とする最初の遠心分離と、続いての上清の第二の遠心分離からなる。
【００６３】
別の実施態様によれば、本発明による方法は、細菌抽出物Ｅ０を調製するための方法からなり、前記方法は以下の工程：
ａ）好適な培地中で細菌ＬＭＢ６４を培養すること；
ｂ）前記培養物を遠心分離し、上清を除去すること；
ｃ）工程ｂ）で得られたバイオマスを超音波で処理すること；
ｄ）超音波で処理された前記バイオマスを遠心分離し、得られたバイオマスを除去すること；
ｅ）工程ｄ）で得られた上清を遠心分離すること；
ｆ）ペレットＥ０を回収すること
を含んでなる。
【００６４】
上述の様々な方法は単に例示のために示され、当業者に公知のいずれの方法を用いてもよいことに留意されたい。
【００６５】
以下の実施例から明らかになるように、出願人はこのタイプの抽出物に期待される活性に加え、まだ記載されたことのないいくつかの新規な活性を証明した。
【００６６】
本発明の第一の有利な側面は、免疫調節に関し、炎症誘発性サイトカインの調節特性に基づいている。より詳しくは、細菌および／または本発明による抽出物の使用は、クローン病のように応答がＴｈ１またはＴｈ１７プロフィールに強く配向している場合は、ホメオスタシスを回復させることができる。
【００６７】
本発明の他の利点は、実施例からも明らかなように、細菌および／または本発明による抽出物の使用は、例えば、限定されるものではないが、ペプチドｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３、Ｓ１００７Ａ、およびＬＬ−３１などの抗微生物ペプチドの産生を誘導するという事実に基づいている。これらのペプチドは、共生微生物叢の正常な増殖には影響を与えずに、腸管に定着する病原体に対する抗微生物作用を有する。その結果、それらの作用は腸における正常な微生物叢を回復させる。
【００６８】
より詳しくは、前述のように、細菌ビトレオスシラ・フィリフォルミスの抽出物(Gueniche A. et al., 2006)は、ＯｍｐＡの存在のためにＴＬＲ２に対する活性を、そしてリポ多糖の存在のためにＴＬＲ４に対する活性を持つことが知られている。Ｖ・フィリフォルミス細菌には鞭毛がないため、Ｖ・フィリフォルミスから得られた抽出物はＴＬＲ５活性を持たない。
【００６９】
出願人は初めて、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４に対する活性に加えて、ＴＬＲ５に対する活性を有する、本発明による細菌抽出物を記載する。
【００７０】
従って、本発明は、上記のようなＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５のアクチベーターとしての細菌および／または細菌抽出物の使用に関する。
【００７１】
好ましい様式では、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５の前記細菌抽出物アクチベーターは、鞭毛由来タンパク質の総てまたは一部を含んでなる抽出物からなる。この場合、例として、前記抽出物は優先的には抽出物Ｅ０または抽出物ＥＳ０である。
【００７２】
前記ＴＬＲ５活性化活性は、ＴＬＲ５がソリアシン（psoriasin（Ｓ１００Ａ７））およびｈＢＤ−２などのある種の抗微生物ペプチドを誘導することが知られていることから、非常に興味深い(Glaser et al., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649)。さらに、ＴＬＲ５アゴニストはＴＬＲ２およびＴＬＲ４のアゴニストと相乗作用を示し、従って抗微生物ペプチドの産生の促進を可能にする。抗体を用いてＴＬＲ５を遮断することにより、後者はほとんどまたは全く産生されないことが示されている。
【００７３】
よって、この側面は、本発明の細菌および／または抽出物のための免疫修飾の適用という観点から、特に革新的である。
【００７４】
従って、本発明はまた、病因の、特に、感染または免疫応答異常に関する病因の治療または予防のための方法を目的とし、前記病因はＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５の活性における異常に関連し、前記治療または予防は、前記受容体のアクチベーターの投与による活性の調節、特に前記ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５の活性の増大に関与し、前記方法は、前記病因を有するか、有する可能性のある患者に、本発明の細菌または細菌抽出物の有効量を投与することを含んでなる。
【００７５】
さらに、思いがけないことに、出願人は、これまで記載された細菌抽出物とは対照的に、ＰＡＲ２に対するアンタゴニスト活性も証明した。この活性は、抗炎症治療に関連して非常に興味深いものである。
【００７６】
従って、本発明は、特に、細菌および／または細菌抽出物、例えば上記のようなＰＡＲ２アンタゴニストの使用に関する。
【００７７】
本発明はまた、病因の、特に炎症に関する病因の治療または予防のための方法を目的とし、前記病因はＰＡＲ２の機能障害に関連し、前記治療または予防は、特に前記受容体のアンタゴニストの投与による前記ＰＡＲ２の活性の調節に関与し、前記方法は、前記病因を有するか、有する可能性のある患者に、本発明の細菌または細菌抽出物の有効量を投与することを含んでなる。
【００７８】
好ましい様式では、前記ＰＡＲ２アンタゴニスト細菌抽出物は、抽出物Ｓ０または抽出物ＥＳ０からなる。
【００７９】
ＰＡＲ２は、内皮細胞、結腸筋細胞、腸細胞、腸ニューロン、免疫細胞およびケラチノサイトにおいて過剰発現されている。環境に豊富に存在するプロテアーゼ（トリプシン、トリプターゼ）は、ＰＡＲ２をＮ末端で切断し、同受容体を活性化する特異的ペプチドを露出させる（自己活性化現象）。結果として、これにより炎症誘発性サイトカインの産生が活性化され、炎症を引き起こす(Vergnolle, N. 2009. Pharmacol. Ther. 123:292-309)。この現象は、野生型マウスにおいて観察されるがＫＯマウス（ＰＡＲ２欠損）では現れない。抗プロテアーゼおよび／またはＰＡＲ２アンタゴニストを用いる治療は、この炎症現象の回避を可能にする。
【００８０】
これら総ての活性の組合せおよび相乗効果が、細菌ＬＭＢ６４、または同細菌により得られる任意の抽出物に、炎症性疾患、および特に、ＰＡＲ２が関与しているおよび／または免疫系が弱体化し、障害され、不均衡である炎症性疾患を治療するための高い可能性を与える。
【００８１】
従って、本発明は、消化管および口腔炎症性疾患の治療および／または予防を対象とした組成物の調製のための、例えば上記のような細菌および／または前記細菌由来の細菌抽出物の使用に関する。
【００８２】
好ましい様式では、前記消化管および口腔炎症性疾患は、クローン病、大腸炎、または歯周炎からなる。
【００８３】
別の実施態様によれば、本特許出願の本発明は、有効成分として、本発明による少なくとも１つの細菌および／または１つの細菌抽出物を含んでなる組成物に関する。
【００８４】
本発明による組成物は、消化管および口腔炎症性疾患の治療に関する。
【００８５】
好ましい様式では、前記消化管および口腔炎症性疾患は、クローン病、大腸炎、または歯周炎からなる。
【００８６】
従って、本発明は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでなる医薬組成物に関する。
【００８７】
本明細書において、「薬学的に許容可能な担体」とは、二次反応を引き起こさず、かつ、例えば、活性化合物の投与を容易にし、体内でのそれらの寿命および／または有効性を増大させ、溶液中でのそれらの溶解度を高め、またはそれらの保存を改善する、化合物または医薬組成物の一部をなす化合物の組合せを意味する。前記薬学的に許容可能な担体は周知であり、当業者ならば、選択された活性化合物の特性および投与方法に従って適合させることができる。
【００８８】
好ましくは、前記化合物は筋肉内、皮内、腹腔内、もしくは皮下経路、または経口経路により全身的に投与されてよい。本発明の抗体を含んでなる組成物は、数回の用量で、経時的に展開して投与されてよい。
【００８９】
それらの投与、投薬計画およびガレヌス製剤の最適な様式は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、治療に対する耐性および確認された副作用などの、患者に適用される治療の確立の際に一般的に考慮される判定基準に従って決定することができる。
【００９０】
本発明は、その範囲を制限することなく本発明を例示する以下の実施例を熟考すれば、より良く理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＬＭＢ６４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列コードの系統発生的位置を示す。この系図上にある配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからの、ＬＭＢ６４の配列に最も近い配列である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、透過型電子顕微鏡（Ａ）および走査型電子顕微鏡（Ｂ）による細菌ＬＭＢ６４の画像を示す。
【図３】温度、ｐＨ、およびＲ３培養培地の塩分の関数として決定された、増殖最適条件を示す。
【図４】表面分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＣＤ５４の、抽出物Ｅ０による誘導を示す（用量依存効果）。
【図５】抽出物Ｅ０によるＩｇＥ受容体の阻害を示す。
【図６】抽出物ＥＳ０によるＴＬＲ２の活性化を示す。
【図７】抽出物ＥＳ０によるＴＬＲ４の活性化を示す。
【図８】抽出物ＥＳ０によるＴＬＲ５の活性化を示す。
【図９】抽出物ＥＳ０による特定のＰＡＲ２アンタゴニスト活性を示す。
【図１０】抽出物ＥＳ０のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１１】抗微生物ペプチド遺伝子のＴＬＲ５依存性発現の誘導におけるＥＳ０の作用を示す。
【図１２】ヒト口腔ケラチノサイトに対するＥＳ０活性はＴＬＲ５によりもたらされることを示す。
【図１３】ラット急性大腸炎モデルにおけるＥＳ０の抗炎症作用を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、予防的に投与されたＬＭＢ６４株がＴＮＢＳにより誘導された腸病変［Ａ］、ならびに炎症性反応（ＭＰＯ活性）［Ｂ］を有意に減少させることを示す。
【実施例】
【００９２】
実施例１：細菌ＬＭＢ６４の選択および特性決定
細菌ＬＭＢ６４を地下水から単離した。
【００９３】
新規な細菌ＬＭＢ６４の分類学的位置を図１に提案する。
【００９４】
より詳しくは、細菌ＬＭＢ６４は長さがおよそ２．３μｍ（±０．３）、幅がおよそ１．０μｍ（±０．１）の桿菌である。この細菌の顕著な特徴は、極鞭毛の存在である（図２Ａおよび２Ｂ）。これらの画像からも分かるように、細菌ＬＭＢ６４は非糸状性細菌である。
【００９５】
前述のように、細菌ＬＭＢ６４はおよそ１１ｋｐｂの環状プラスミドを有する。このプラスミドは完全に配列決定がなされている（配列番号２）。
【００９６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子コードも、配列決定がなされている（配列番号１）。細菌は、合成培地中で、発酵槽内で培養した。増殖速度は、培地の炭素基質濃度が低い場合に、より速くなる。
【００９７】
試験された培養培地はＲ３、ＭＳ−グルコース、およびＬＢ培地であり、その組成は以下の表１ａ、１ｂ、および１ｃにそれぞれ記載されている。
【００９８】
【表１】
2014503541.tif 000002
【００９９】
【表２】
2014503541.tif 000003
【０１００】
【表３】
2014503541.tif 000004
【０１０１】
培養培地の関数としての細菌ＬＭＢ６４の増殖速度は以下の表２に示した。
【０１０２】
【表４】
2014503541.tif 000005
【０１０３】
増殖の最適条件は、温度、ｐＨ、およびＲ３培養培地の塩分の関数として決定した（図３）。
【０１０４】
細菌によって吸収可能な炭素源は、ＡＰＩ  ５０ＣＨギャラリー（インキュベーション温度：２５℃）を用いて特性決定を行った。結果は、以下の表３にまとめた。
【０１０５】
【表５】
2014503541.tif 000006
【０１０６】
ＡＰＩ  ＺＹＭギャラリーに示された酵素活性は、アルカリ性ホスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ４）、エステラーゼ／リパーゼ（Ｃ８）、ロイシンアリールアミダーゼ、バリンアリールアミダーゼ、酸性ホスファターゼ、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスフォヒドロラーゼ、およびα−グルコシダーゼであった。
【０１０７】
以下の表４に見られるように、細菌ＬＭＢ６４は、試験したすべての抗生物質に対して感受性を示した。
【０１０８】
【表６】
2014503541.tif 000007
【０１０９】
実施例２：Ｅ０、Ｓ０およびＥＳ０画分の抽出のための方法
前培養：ＡＶ１３株を、２５０ｍｌのＭＳグルコースピルビン酸培地（以下の表５参照）を含むエルレンマイヤー(Erlenmyer)フラスコに播種した後、３０℃（ｐＨ７）にて２００ｒｐｍで撹拌しながら、ＯＤ６００が約１．５となるまでおよそ４０時間インキュベーションした。
【０１１０】
【表７】
2014503541.tif 000008
【０１１１】
培養：前培養物を３．７ｌのＭＳピルビン酸培地＋１１４ｍｌの２０％グルコース溶液を含有する発酵装置（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）中に播種する。温度センサーは、好ましくは３０℃付近に温度を制御する。酸素センサー（ＡｐｐｌｉＳｅｎｓ）を用い、培地中に溶解した酸素濃度を１８〜２５％に維持する。ｐＨセンサー（ＡｐｐｌｉＳｅｎｓ）を用い、一定流速のポンプを介して１０％ＮＨ４ＯＨを加えることにより、ｐＨを７に維持する。ウェッジウッド分析センサーを用い、光学密度の変化をリアルタイムでモニターする。培養は流加モードでプログラムし、様々な流速のポンプを介して、培養物に２０％グルコース溶液を供給する。一般におよそ３０時間後、ＯＤ６００約２２〜２６となった時に発酵を停止させる。
【０１１２】
抽出物Ｓ０：４℃および４０００ｇで１時間の遠心分離により、バイオマスから上清を分離する。
【０１１３】
抽出物Ｅ０：湿潤バイオマスをＮａＣｌ溶液（１Ｍ）に取る。４℃および９０００ｇで１５分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを１ＭのＮａＣｌ溶液に取る。次に、サンプル試験管を、電力設定５０〜６０Ｗの、冷却した超音波浴に数分間浸漬する。４℃および６０００ｇで３０分間遠心分離した後、ペレットを捨て、上清を回収する。２容量の低温エタノールを加えて、懸濁液を４℃にて一晩静置する。４℃および６０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．８）に取る。
【０１１４】
抽出物ＥＳ０：塩基性バッファーを用いて培養物を塩基性のｐＨとする（ｐＨ９〜１１）。次の工程で、４℃の温度で５時間撹拌しながらインキュベーションを行う。遠心分離後、上清を前置フィルターで濾過し、残存しているバイオマス残渣を除去した後、０．２μｍのフィルターで濾過する。透明な黄色い溶液が得られる（ＥＳ０）。
【０１１５】
タンパク質は、ＤＣタンパク質アッセイキットＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）プロトコールに従ってアッセイする。糖類は、フェノール／硫酸法(Dubois, M. et al., 1956)に従って、グルコース当量でアッセイする。
【０１１６】
例として、以下の表６に、上述の条件で得られた、抽出物ＥＳ０のある特有の特性を示す。
【０１１７】
【表８】
2014503541.tif 000009
【０１１８】
本明細書に記載された上記のデータは、単に例示のためであることは、明らかに理解される。
【０１１９】
より正確には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたタンパク質プロフィールに関するデータは、３つの主要バンドを示している。
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロトコール：
抽出物ＥＳ０をバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；２．５％ＳＤＳおよび０．０１％ブロモフェノールブルー）および１Ｍ  ＤＴＴ（１，４−ジチオトレイトール）に取る。サンプルおよび分子量マーカー（ＷｅｓｔｅｒｎＣ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の混合物を、それぞれ８〜１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミドゲル（ＧｅＢａＧｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のウェルに注入した。泳動バッファーは、２．５ｍＭのＴｒｉｓ、１９．２ｍＭのグリシン、および０．０１％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含有する。泳動は、１６０Ｖの定電圧下でおよそ１時間行った（ＧｅＢａＧｅｌシステム）。次に、タンパク質バンドをクーマシーブルー（Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を用いて染色した。サイズは、既知の標準（ＳＴＤ）との関連で計算した。
【０１２１】
得られたゲルを図１０に示す。
【０１２２】
本発明の一つの実施態様によれば、この３つのバンドはそれぞれ、およそ３４ｋＤａ、４３ｋＤａ、および４９ｋＤａの分子量を有している。
【０１２３】
実施例３：画分Ｅ０およびＥＳ０の薬理学的活性の実証
ランゲルハンス細胞（ＬＣ）は、French National Blood Service(Etablissement Francais du Sang (EFS) Pyrenees Mediterranee)からのバッフィーコートポーチから単離したヒト単球よりin vitroで作製した：フィコール勾配（リンパ球分離媒体、密度１．０７７ｇ／ｍｌ）での単離、および磁気免疫選択(magnetic immunoselection)（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による精製；ＬＣの分化は、サイトカインカクテル（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４／ＴＧＦβ）存在下、６日間にわたって行う。２４ウェルプレートに分注したＲＰＭＩ−５％ＦＣＳ培養培地中のＬＣを、抽出物ＥＳ０とともに２４時間インキュベートする。
【０１２４】
表面分子は三重または四重染色を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析し（ＣＤ１ａ／ＣＤ５４／ＣＤ８０／ＣＤ８３／ＣＤ８６／ＦｃεＲＩ）；培養上清中に分泌されたサイトカインはサイトメトリービーズアレイ（カタログ番号５５０７４９、ＢＤ）を用いてフローサイトメトリーにより分析する（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）。
【０１２５】
３．１  ランゲルハンス細胞の成熟およびＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）阻害
抽出物Ｅ０は、表面分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＣＤ５４の用量依存的誘導により観察される、ランゲルハンス細胞の成熟を誘導する（図４）。同様に、抽出物Ｅ０は、用量依存効果によりＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）の発現を阻害する（図５）。
【０１２６】
３．２  Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化
ＥＳ０のＴＬＲ活性を、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ５の遺伝子およびリポーター遺伝子ＮＦκＢ−ｓＡＰ（分泌型アルカリ性ホスファターゼ）をコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のモデルを用いて、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５について評価した。リガンドの、そのＴＬＲへの結合は転写因子ＮＦκＢの活性化をもたらし、ｓＡＰ遺伝子は、ＮＦκＢにより誘導され得るプロモーターの制御下に置かれる。このリポーター遺伝子は、ＴＬＲを介して細胞シグナル伝達をモニターすることを可能にする。すなわち、ＥＳ０により誘導され、比色定量アッセイにより測定されたｓＡＰの放出は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ５アゴニストとしてのこの有効成分の活性を測定することを可能にする。
【０１２７】
この試験は、以下のヒト胎児腎細胞系統（ＨＥＫ２９３）について実施した。
・ＴＬＲ２のためのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−２細胞
・ＴＬＲ４のためのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−４細胞
・ＴＬＲ５のためのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−５細胞
【０１２８】
これらの細胞系統は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）選択１０％ＦＣＳ培養培地中で維持した後、ＥＳ０存在下、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）検出培地の入った９６ウェルプレートに分注し、１８時間維持する。熱量測定法を用いて６２０ｎｍにてプレートを読み取る。
【０１２９】
３．２．１  ＴＬＲ２の活性化
抽出物ＥＳ０は、１００ｎｇ／ｍｌで最大活性を示す用量依存効果に従って、ＴＬＲ２の活性化を誘導する（図６）。
【０１３０】
３．２．２  ＴＬＲ４の活性化
抽出物ＥＳ０は、１０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示すＴＬＲ４の活性化を誘導する（図７）。
【０１３１】
３．２．３  ＴＬＲ５の活性化
抽出物ＥＳ０は、用量依存的にＴＬＲ５の活性化を誘導する。この活性は、抗ＴＬＲ５抗体の存在下で阻害され、抽出物ＥＳ０のＴＬＲ５に対する活性化特異性を示している（図８）。
【０１３２】
３．３  ＰＡＲ２の阻害
抽出物ＥＳ０によるプロテアーゼ活性化受容体の阻害を、細胞系統（ＨａＣａＴ）由来のヒトケラチノサイトにおいて、角質層トリプシン酵素（ＳＣＴＥ）を用いるＰＡＲ２の特異的な刺激後に誘導される細胞内カルシウム流入を測定することにより評価する。蛍光プローブＦｌｕｏ−４／ＡＭを用いるが、そのエステル化された形態は、細胞における受動拡散により、その浸透を容易にし；カルシウムイオンに結合する脱エステル化された形態のみが４８５ｎｍ蛍光で励起し、５３５ｎｍで発光する。
【０１３３】
蛍光プローブを、９６ウェルプレートに播種した細胞中に３０分間取り込ませた後、抽出物ＥＳ０を３０分間インキュベートする。ＳＣＴＥの注入前後の速度論に従って、ウェル毎にリアルタイムで、カルシウム流入を測定する。プレートをＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（商標）リーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて読み取る。
【０１３４】
抽出物ＥＳ０は、ヒトＳＣＴＥにより誘導されたＰＡＲ２活性化を用量依存的に阻害する（図９）。
【０１３５】
実施例４：歯周炎の治療のための抽出物ＥＳ０の使用
歯周疾患は、歯周組織の破壊につながり得る慢性炎症性疾患である。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｇ）などの病原性の好気性菌株を含んでなる細菌叢に変化が起きる。これらの菌株は抗微生物ペプチドに対して感受性を有し、少なくともｈＢＤ−３に関しては、歯周疾患に苦しむ被験体の歯肉溝浸出液において少量見られる(Brancatisano FL et al. (2011) Reduced human Beta defensin 3 in individuals with periodontal disease. J Dent Res. 90:241-245)。本実験において、本発明者らは抽出物ＥＳ０が口腔ケラチノサイトにおいて抗微生物ペプチドを誘導し得ることを実証した。
【０１３６】
初代ヒト口腔ケラチノサイトを、それぞれのＴＬＲ：ＴＬＲ２（ａＴＬＲ２）、ＴＬＲ４（ａＴＬＲ４）、またはＴＬＲ５（ａＴＬＲ５）を特異的に遮断する抗体１μｇ／ｍｌの存在下または不在で、１０μｇ／ｍｌのＥＳ０を用いて４８時間刺激した。様々な抗微生物ペプチド（以下の表７）のｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲで定量化した。
【０１３７】
【表９】
2014503541.tif 000010
【０１３８】
４８時間の刺激の後、細胞を溶解させて全ＲＮＡを抽出した後、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｎ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてアッセイした。１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。９６ウェルプレートの中で、ＳＹＢＲグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｋｉｔ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲ増幅工程を行った。用いたプライマーのＤＮＡ配列を、以下の表８に示す。
【０１３９】
【表１０】
2014503541.tif 000011
【０１４０】
サイクル閾値（Ｃｔ）の値を参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＰＰＩＡ：ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ；ＹＷＨＡＺ：チロシン３／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ；ＲＰＬＰ０：リボゾームタンパク質Ｐ０）に関してノーマライズした。目的の遺伝子の発現レベルは、下式：ΔＣｔ：ΔＣｔ＝Ｃｔ（目的の遺伝子）−Ｃｔ（参照遺伝子）で示される。目的の各遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの相対量（ＲＱ）は、相当する未処理対照細胞に関して計算される。
【０１４１】
ＲＱ＝２（−ΔΔＣｔ）、式中、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ（処理細胞）−ΔＣｔ（対照細胞）
目的の遺伝子の発現は、ＲＱ≧２（誘導）またはＲＱ≦０．５（阻害）である場合に制御されると考えられる。
【０１４２】
培養上清中のｈＢＤ−２濃度は、製造業者（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の推奨に従って、市販のキットを用いてＥＬＩＳＡで決定した。結果は、平均±標準偏差で表し、誘導された産生の阻害パーセントが有意に変化した場合は、太字の青字で示した（抗体を用いずに誘導された産生との関連で評価した「ＡＢなし」）。
【０１４３】
結果は、ＥＳ０が、試験した抗微生物ペプチド総ての発現の強力なインデューサーであることを示す（図１１、「ＡＢなし」）。ＤＥＦＢ４遺伝子の過剰発現は、ｈＢＤ−２タンパク質分泌の著しい増加と相関していた（図１２）。
【０１４４】
細胞と抗ＴＬＲ２または抗ＴＬＲ４抗体とのプレインキュベーションの後、ペプチド発現は影響を受けない。一方、抗ＴＬＲ５抗体の存在下、ＤＥＦＢ１０３、ＤＥＦＢ４、Ｓ１００Ａ７、およびＲＮアーゼ７の発現は強く抑制される：それぞれ７１％、９４％、９９％、および８２％（図１１）。同様に、ｈＢＤ−２分泌は抗ＴＬＲ５抗体単独とともに８２％と大幅に減少する（図１２）。
【０１４５】
従って、ＥＳ０は、抗微生物ペプチド発現および分泌の強力なアクチベーターである。この効果はＴＬＲ５の活性化と関連している。現在までに知られている唯一のＴＬＲ５リガンドは、フラジェリンである。従って、ＥＳ０中に含まれているＬＭＢ６４フラジェリンがＴＬＲ５の活性化および抗微生物ペプチドの産生を担っている可能性がある。
【０１４６】
実施例５：慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）治療のための抽出物ＥＳ０の使用
ＥＳ０の効果を、実験的大腸炎における炎症性反応で評価した。ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）により誘発された急性大腸炎のラットモデルは、クローン病によく似ていることが知られている。ＥＳ０は、消化管通過時のその分解を避けるために、直腸内に投与した。本明細書では、ＥＳ０がミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の阻害を介して炎症を阻止し得ることが示されている。
【０１４７】
予防的手段としての、生存細菌ＬＭＢ６４の経口経路による効果も、ＩＢＤにおいて評価した。すなわち、ＬＭＢ６４株の効果を、ＴＮＢＳにより誘発された急性大腸炎のラットモデルにおいて評価した。生存ＬＭＢ６４株を、経口経路で投与した。
【０１４８】
５．１  抽出物ＥＳ０
実験的大腸炎において、炎症性反応に対するＥＳ０の効果を評価した。ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）により誘発された急性大腸炎のラットモデルは、クローン病によく似ていることが知られている。ＥＳ０は、消化管通過時のその分解を避けるために、直腸内に投与した。
【０１４９】
１０匹のＷｉｓｔａｒラットの群に、試験０日目（Ｄ０）に、３０ｍｇのＴＮＢＳを直腸内投与した。様々な用量のＥＳ０（７．５、０．７５、および０．０７５ｍｇタンパク質／ｋｇ）を、試験０日目から６日目（Ｄ０〜Ｄ６）まで毎日投与した。試験７日目（Ｄ７）に動物を犠牲にして、好中球中に存在する酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）をアッセイすることにより、局所炎症性反応を判定した。要するに、結腸の切片をホモジナイズし、分光学的定量法により上清のＭＰＯ活性を定量化した。
【０１５０】
結果は、平均±標準偏差として表す。
【０１５１】
データの統計学的分析は、一元配置ＡＮＯＶＡの後にボンフェローニの検定を用いて行った。
【０１５２】
ＴＮＢＳの投与は、未処置の対照群と関連して、有意な活性の増大を誘導した。最も高い用量ではなく、０．７５ｍｇ／ｋｇまたは０．０７５ｍｇ／ｋｇの用量のＥＳ０を投与されたラットにおいて、ＴＮＢＳ処理陽性対照群と比較して、ＭＰＯ活性は有意に阻害された。ＭＰＯ活性が正常に戻った、すなわちＴＮＢＳで処理していない陰性対照群の活性と類似しているため、ＥＳ０の効果は強力である（図１３）。
【０１５３】
５．２慢性炎症性腸疾患における予防的手段としての細菌ＬＭＢ６４
ＬＭＢ６４株の効果を、ＴＮＢＳにより誘発された急性大腸炎のラットモデルにおいて評価した。ＬＭＢ６４培養物を遠心分離し、生理学的バッファーを用いて洗浄した。細菌を、０．９％ＮａＣｌ生理学的バッファーに再懸濁する。ＬＭＢ６４の細菌数の濃度検定を行った溶液を、動物に経口投与した。
【０１５４】
１０匹のＷｉｓｔａｒラットの群に、試験０日目（Ｄ０）に、３０ｍｇのＴＮＢＳを直腸内投与した。様々な用量のＬＭＢ６４（１０８または１０９個の生存細菌）を、試験６日前から０日目まで毎日投与した。同じプロトコールに従って、参照分子として用いた３ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンを投与したラットの群も含めた。動物は、試験７日目に犠牲にした。
【０１５５】
下表９に記載したパラメーターに基づくスコアで、肉眼的病変を評価および表示した。
【０１５６】
【表１１】
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【０１５７】
局所炎症性反応は、上記のようにＭＰＯアッセイで判定した。
【０１５８】
結果は、平均±標準偏差として表す。データの統計学的分析は、一元配置ＡＮＯＶＡの後にボンフェローニの検定を用いて行った。
【０１５９】
結果は、驚くことに、ＬＭＢ６４はＭＰＯ活性により表される炎症性反応を阻害することを示す（図１４Ｂ）。この効果は用量依存的であり、最大活性は細菌ＬＭＢ６４が１０９の場合に得られる。
【０１６０】
この用量において、ＬＭＢ６４株は、参照分子であるプレドニゾロンよりも効果的であった。ＬＭＢ６４もまた、病変スコアを大幅に低減したが、それは細菌ＬＭＢ６４の１０９の用量においてのみであった(図１４Ａ）。この場合もやはり、参照分子、プレドニゾロンよりも効果的であるということが証明された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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