(57)【要約】  本発明は、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）に対する新規治療用組換え抗体、ならびに前記組換え抗ＨＥＲ３抗体の少なくとも２つの混合物を含む組成物、および癌の処置のための抗体および抗体組成物の使用に関する。
2014503189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、前記抗体の少なくとも１つが、
（ａ）抗体４７８５の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｂ）抗体４８８９の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｃ）抗体４９３５の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｄ）抗体５０３８の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｅ）抗体５０８２の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｆ）抗体５１０１の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｇ）抗体５１０６の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｈ）抗体５１４３の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｉ）抗体５１４４の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；ならびに
（ｊ）抗体５２５９の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体
から成る群より選択される、抗体組成物。
【請求項２】
前記第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体が、どちらも抗体（ａ）〜（ｊ）から選択される、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項３】
抗体（ａ）〜（ｊ）から選択される第三組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む、請求項２に記載の抗体組成物。
【請求項４】
ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、前記第一および第二抗体のそれぞれが、請求項１で定義される抗体（ａ）〜（ｊ）の１つと同じエピトープに結合し、結合に関して競合する、抗体組成物。
【請求項５】
ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、前記抗体の少なくとも１つが、
（Ａ）抗体４７８５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｂ）抗体４８８９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｃ）抗体４９３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｄ）抗体５０３８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｅ）抗体５０８２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｆ）抗体５１０１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｇ）抗体５１０６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｈ）抗体５１４３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｉ）抗体５１４４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；ならびに
（Ｊ）抗体５２５９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体
から成る群より選択される、抗体組成物。
【請求項６】
前記第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体が、どちらも抗体（Ａ）〜（Ｊ）から選択される、請求項５に記載の抗体組成物。
【請求項７】
抗体（Ａ）〜（Ｊ）から選択される第三組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む、請求項６に記載の抗体組成物。
【請求項８】
ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、前記第一および第二抗体のそれぞれが、請求項５で定義される抗体（Ａ）〜（Ｊ）の１つと同じエピトープに結合し、結合に関して競合する、抗体組成物。
【請求項９】
ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、
ａ）第一組換え抗体が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から選択される任意の１つの参照抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含み、かつ第一組換え抗体が、前記参照抗体と同じエピトープに結合し、結合に関して競合する；ならびに
ｂ）第二組換え抗体が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から選択される任意の１つの参照抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含み、前記参照抗体がａ）の参照抗体とは異なり、かつ第二組換え抗体が、前記参照抗体と同じエピトープに結合し、結合に関して競合する、
抗体組成物。
【請求項１０】
２、３、４、５または６の組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項１１】
２つの組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む、請求項１０に記載の抗体組成物。
【請求項１２】
第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体が、抗体：
・５０８２および５１０６、
・５０８２および４７８５、
・５０８２および５０３８、
・５０８２および５１４４、
・４８８９および５１４３、
・４７８５および５０３８、
・４７８５および５２５９、または
・５１０６および４８８９
の重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、請求項１１に記載の抗体組成物。
【請求項１３】
第一および第二抗体が、抗体：
・５０８２および５１０６、
・５０８２および４７８５、
・５０８２および５０３８、
・５０８２および５１４４、
・４８８９および５１４３、
・４７８５および５０３８、
・４７８５および５２５９、または
・５１０６および４８８９
の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１２に記載の組換え抗体組成物。
【請求項１４】
３つの組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む、請求項１０に記載の組換え抗体組成物。
【請求項１５】
第一、第二および第三組換え抗体を含み、第一、第二および第三抗体が、抗体：
・５０８２、４７８５および５０３８、
・５０８２、５０３８および５１０６、
・５０８２、５１０６および５２５９、
・４８８９、５１０６および５２５９、または
・４８８９、５１４３および５２５９
の重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、請求項１４に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物。
【請求項１６】
第一、第二および第三組換え抗体を含み、第一、第二および第三抗体が、抗体：
・５０８２、４７８５および５０３８、
・５０８２、５０３８および５１０６、
・５０８２、５１０６および５２５９、
・４８８９、５１０６および５２５９、または
・４８８９、５１４３および５２５９
の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１５に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物。
【請求項１７】
４つの組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む、請求項１０に記載の組換え抗体組成物。
【請求項１８】
前記組成物中の少なくとも１つの抗ＨＥＲ３抗体が、抗癌剤に結合した組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む免疫複合体である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え抗体組成物。
【請求項１９】
抗癌剤が、細胞傷害剤、サイトカイン、毒素および放射性核種から成る群より選択される、請求項１８に記載の組換え抗体組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項で定義される２つの抗体の結合特異性を有する二重特異性結合分子。
【請求項２１】
前記２つの抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２０に記載の二重特異性結合分子。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項で定義される抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸分子または請求項２３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記核酸分子によってコードされる抗ＨＥＲ３抗体を発現することができる宿主細胞。
【請求項２５】
抗ＨＥＲ３抗体の作製方法であって、請求項２４に記載の宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養すること、および生じた抗体を単離することを含む方法。
【請求項２６】
少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物の作製方法であって、それぞれ請求項１〜１７のいずれか一項で定義される組換え抗ＨＥＲ３抗体を発現することができる、少なくとも第一宿主細胞および第二宿主細胞を提供すること、第一および第二宿主細胞を第一および第二抗体の発現に適した条件下で培養すること、ならびに生じた少なくとも第一および第二抗体を単離することを含む方法。
【請求項２７】
少なくとも第一および第二宿主細胞を別々のバイオリアクターで培養する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも第一および第二宿主細胞を単一バイオリアクターで培養する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物または請求項２０もしくは２１に記載の二重特異性結合分子、および少なくとも１つの医薬的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
ヒトまたは他の哺乳動物における癌の処置方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物、請求項２０もしくは２１に記載の二重特異性結合分子、または請求項２９に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３１】
ＨＥＲ３の発現を特徴とする障害を有する患者の処置方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物、請求項２０もしくは２１に記載の二重特異性結合分子、または請求項２９に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３２】
ＨＥＲ３を発現する細胞においてＨＥＲ３と他のＥｒｂＢファミリー受容体との間のヘテロ二量体形成を低減するための方法であって、前記細胞を請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物、請求項２０もしくは２１に記載の二重特異性結合分子、または請求項２９に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３３】
ＨＥＲ３を発現する細胞の表面でＨＥＲ３のインターナリゼーション(internalization)を誘導する方法であって、細胞を請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物、請求項２０もしくは２１に記載の二重特異性結合分子、または請求項２９に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＥＲ３受容体を標的とする新規組換え抗体およびヒト癌治療における使用のためのこれらの抗体の２またはそれ以上を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲ受容体ファミリー
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリー（ＥｒｂＢファミリーとしても知られる）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のサブグループであり、４つの成員：ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４から成る。ＥＧＦＲファミリーの成員は、細胞外リガンド結合領域、単一の膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼを有する密接に関連した一本鎖モジュラー糖タンパク質である（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ（２００８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７：３５３−３７３に総説されている）。通常の生理的状況では、ＥｒｂＢファミリーは細胞の増殖、分化および移動の調整において鍵となる事象を調節する（Ｃｉｔｒｉら（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：５０５−５１６）。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３は、正常細胞の悪性形質転換および癌細胞の持続的な増殖（プロ生存経路）において極めて重要な役割を果たすと考えられる。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は多くの上皮癌によって過剰発現されることが認められている（Ｓｌａｍｏｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７−１８２；Ａｒｔｅａｇａ（２００２）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ７、補遺４：３１−３９；Ｂｏｄｅｙら（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：１３１９−１３３０；Ｒａｊｋｕｍａｒら（１９９６）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１７９：３８１−３８５）。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の過剰発現はさらに、いくつかのヒト上皮癌における疾患の進行、生存率の低下、応答不良および化学療法抵抗性に結びついてきた（Ｓｌａｍｏｎら（１９８７）前出；Ｂａｓｅｌｇａら（２００２）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ７、補遺４：２−８）。
【０００３】
ＨＥＲ３の構造
ヒト上皮増殖因子受容体３としても知られるＥｒｂＢファミリーの３番目の成員（ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ３）は、１９８９年にＫｒａｕｓら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８９；８６：９１９３−９１９７）によって同定された。ＨＥＲ３遺伝子は１３４２アミノ酸のタンパク質をコードし、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と顕著な構造類似性を有する。全体的な大きさ、２つのシステインクラスター（ドメインＩＩおよびＩＶ）を伴う４つの細胞外サブドメイン（Ｉ−ＩＶ）、ならびにチロシンキナーゼドメインなどの特徴は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と構造類似性を示す（ＣｈｏおよびＬｅａｈｙ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：１３３０−１３３３）。ＨＥＲ３のチロシンキナーゼドメインは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインと５９％の配列相同性を示す（Ｂｒｅｎｎａｎら（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：６０９３−６１０１）。
【０００４】
ＨＥＲ３活性化の調節
Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）およびニューレグリン１（ＮＲＧ１）は、ＨＥＲ３についてのリガンドである糖タンパク質の同義語である（Ｐｅｌｅｓら（１９９２）Ｃｅｌｌ，６９：２０５−２１６；Ｗｅｎら（１９９２）Ｃｅｌｌ，６９：５５９−５７２）。ＮＲＧ１タンパク質の少なくとも１５のアイソフォームが同定されている。アイソフォームは、選択的スプライシングおよび多数のプロモーターを介して１個のＮＲＧ１遺伝子から生成される（Ｆａｌｌｓら（２００３）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２８４：１４−３０）。３つの構造特徴はアイソフォームの機能的相違に当てはまる。これらの構造特徴は、ＥＧＦ様ドメインの種類（αまたはβ）、Ｎ末端配列（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）およびアイソフォームが最初に膜貫通タンパク質または非膜貫通タンパク質のいずれとして合成されるかである（Ｆａｌｌｓら（２００３）前出）。ＮＲＧ１アイソフォームのＩ型サブグループは、ユニークなＮ末端配列とそれに続く免疫グロブリン様ドメインおよびその後のＥＧＦ様ドメインを有する。ＩＩ型変異体は、Ｎ末端クリングル様配列、免疫グロブリンドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含む。ＩＩＩ型変異体は、システインリッチ領域内にＮ末端疎水性ドメインを含み、免疫グロブリンドメインを含まず、その後ＥＧＦ様ドメインおよび様々な下流の選択的エクソンへと続く。ＥＧＦ様ドメインから下流では、ＮＲＧ１アイソフォームはリンカー配列、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含み得る（Ｆａｌｌｓら（２００３）前出）。ＮＲＧ１アイソフォームの一部は、免疫グロブリン様ドメインとＥＧＦ様ドメインの間のスペーサー領域でグリコシル化を受ける（Ｈａｙｅｓら（２００８）Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１３：２０５−２１４）。
【０００５】
ＥＧＦＲの場合のように、ＨＥＲ３は繋留立体配座と伸長立体配座で存在する。繋留立体配座では、二量体化アームがドメインＩＶとの相互作用によって埋没し、ドメインＩとＩＩＩは効率的なリガンド結合のためには離れすぎている（ＣｈｏおよびＬｅａｈｙら（２００２）前出）。細胞外ドメインＩおよびＩＩＩへのリガンド結合はＨＥＲ３の伸長立体配座で起こり、ＥｒｂＢファミリーの他の成員（または他のＲＴＫ成員、例えばＭＥＴ）とのヘテロ二量体化をもたらし、伸長したリガンド結合ＨＥＲ３分子はＨＥＲ２と優先的にヘテロ二量体化する（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ，１５：２４５２−２４６７）。リガンド結合時にＨＥＲ３ホモ二量体は形成されない（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ，１９：４６３２−４６４３）。
【０００６】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と異なり、ＨＥＲ３のチロシンキナーゼは触媒活性が損なわれており、検出可能な生物学的応答のためには不十分である（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら（１９９６）前出；Ｇｕｙら（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：８１３２−８１３６）。プロテインキナーゼの触媒ドメインにおいて高度に保存された２つのアミノ酸残基（Ｈａｎｋｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４２−５２）は、ＨＥＲ３の触媒ドメインでは変化している。これらは、残基８１５のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換および残基７４０のグルタミン酸のヒスタミンによる置換である。これら２つのアミノ酸置換が、ＨＥＲ３がそのチロシンキナーゼドメインの触媒活性を欠く理由であると考えられる（Ｐｌｏｗｍａｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７：４９０５−４９０９）。ＨＥＲ３の内因性キナーゼ活性の低下のせいで、受容体は、それ自体のリガンド結合に応答するために別のＥｒｂＢファミリー成員とヘテロ二量体化する必要がある（Ｂｅｒｇｅｒら（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５６９：３３２−３３６）。
【０００７】
ＨＥＲ３シグナル伝達の終結
ＨＥＲ３のエンドサイトーシスについてはほとんど知られていない。その上、種々の試験が、ＨＥＲ３はＨＥＲ２と同程度にエンドサイトーシスが低下していることを示唆している（Ｂａｕｌｉｄａら（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１：５２５１−５２５７）。これと一致して、ＨＥＲ３−ＮＲＧ１複合体はＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体よりもインターナリゼーションが非効率的で、より緩慢であることが認められており、ＨＥＲ３がＥＧＦＲほど効率よくエンドサイトーシスされないことを裏づける（Ｂａｕｌｉｄａら（１９９７）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２３２：１６７−１７２；Ｗａｔｅｒｍａｎら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ，１８：３３４８−３３５８）。しかし、ＥＧＦＲのＣ末端尾部がＨＥＲ３のＣ末端尾部で置換された場合、ＥＧＦＲはエンドサイトーシス障害となり、ＨＥＲ３のＣ末端の領域が受容体をインターナリゼーションから保護することを示唆した（Ｗａｔｅｒｍａｎら（１９９９）前出）。また、ＮＲＧ１は、ＥＧＦがＴＧＦαによって活性化される場合に認められるように、エンドソームにおけるリガンド−受容体複合体の解離のためにＨＥＲ３を効率的に標的として分解に至らしめることもないと示唆されている（Ｗａｔｅｒｍａｎら（１９９９）前出）。
【０００８】
ＨＥＲ３の発現および生理的役割
ＨＥＲ３は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と同様に、乳腺の発達において重要であることが示されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，９：４５１−４６４）。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２が思春期マウスの乳腺において高発現され、共局在する一方で、ＨＥＲ３は、処女マウスからの思春期後乳腺では低レベルでしか発現されないが、妊娠および授乳期にはより高いレベルで発現される（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら（１９９８）前出）。妊娠および授乳期のＨＥＲ３のより高い発現レベルは、乳腺の発達および分化の後期におけるＨＥＲ３の重要性を意味する（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｆｉｓｈｅｒら（２００８）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０：Ｒ９６）。ＨＥＲ３欠損マウスに関する試験は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路を介した乳腺上皮の形態発生におけるＨＥＲ３の調節的役割をさらに示した（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｆｉｓｈｅｒら（２００８）前出）。他の試験は、妊娠の１４−１６日目までのラットにおける乳管上皮細胞による高レベルのＨＥＲ３発現を示し、同じく乳腺上皮の形態発生におけるＨＥＲ３の調節的役割を実証した（Ｄａｒｃｙら（２０００）Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，４８：６３−８０）。
【０００９】
マウスにおけるＨＥＲ３遺伝子の標的化ノックアウトは、血液逆流のために適切な心機能を支持することができない心臓弁の不十分な発達に起因する、１３．５日目での胚致死性をもたらした（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４：４９９９−５０１１）。他の欠陥には、脳発達の異常、特に小脳を含む中脳領域の異常、ならびに感覚および運動ニューロンの末梢軸索のシュヴァン細胞の重篤な欠陥が含まれる（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９７）前出；Ｒｉｅｔｈｍａｃｈｅｒ  ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８９：７２５−７３０）。
【００１０】
インビトロ試験も、ＨＥＲ３を、ＨＥＲ２と組み合わせて、ケラチノサイト（Ｍａｒｉｋｏｖｓｋｙら（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１０：１４０３−１４１１）、シュヴァン細胞前駆体（Ｓｙｒｏｉｄら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３：９２２９−９２３４）、乏突起膠細胞（Ｖａｒｔａｎｉａｎら（１９９７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１３７：２１１−２２０）および神経筋シナプス（Ｚｈｕら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ，１４：５８４２−５８４８）の発生に関係づけている。
【００１１】
ＨＥＲ３の組織分布はＥＧＦＲと大きくは異ならない（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）。ＨＥＲ３のキナーゼ活性低下にもかかわらず、受容体はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を介したＥｒｂＢネットワークにおいて欠くことのできない役割を果たす（Ｃｉｔｒｉら（２００３）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２８４：５４−６５）。シグナル伝達の開始にはヘテロ二量体化が必要であるため、ＨＥＲ３の生理的役割はＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に関して同定されたものと全体的に類似し得る。しかし、マウスにおけるＨＥＲ３ノックアウトの胚致死性およびＨＥＲ３阻害に関するデータの乏しさのために、成人におけるＨＥＲ３の正確な役割は不明である。
【００１２】
ＨＥＲ３と癌
ＨＥＲ３は、腫瘍の増殖および進行を促進する、ＥｒｂＢシグナル伝達をＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路へと向かわせるその能力が独特である（Ｐｒｉｇｅｎｔら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ，１３：２８３１−２８４１）。腫瘍増殖の調節におけるＨＥＲ３の極めて重要な役割は、ヒト乳癌におけるＨＥＲ２の過剰発現がより高レベルのＨＥＲ３発現に結びつくことが多いという所見によっても裏づけられる（Ｎａｉｄｕら（１９９８）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，７８：１３８５−１３９０）。さらに、ＨＲＧの過剰発現は形質転換および腫瘍形成性の増大をもたらすが（Ａｔｌａｓら（２００３）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１：１６５−１７５）、ＮＲＧの遮断は腫瘍形成性および転移を阻害し（Ｔｓａｉら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：７６１−７６８）、癌発生のためのＨＥＲ３リガンドの存在の重要性を示している。
【００１３】
細胞表面のＨＥＲ２ホモ二量体の存在およびそれによるＨＥＲ２シグナル伝達の強調は上皮細胞の形質転換を引き起こす（ＹａｒｄｅｎおよびＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ（２００１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２：１２７−１３７に総説されている）。しかし、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＡＫＴ経路の両方を介してシグナル伝達を誘導する能力を有する。ＭＡＰＫ経路とＡＫＴ経路の両方の活性化は、ＨＥＲ２ホモ二量体と比較してＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の付加的な発癌能を示唆する（Ｃｉｔｒｉら（２００３）前出に総説されている）。
【００１４】
ＨＥＲ３の高発現は、乳癌に加えて膀胱癌および結腸直腸癌を含む、ＨＥＲ２を過剰発現する同じ腫瘍型の多くで認められる（Ｂｏｄｅｙら（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１７：１３１９−１３３０；Ｒａｊｋｕｍａｒら（１９９６）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１７９：３８１−３８５；Ｌｅｍｏｉｎｅら（１９９２）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，６６：１１１６−１１２１；Ｍａｕｒｅｒ  ら（１９９８）Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ，２９：７７１−７７７）。ＨＥＲ３の過剰発現と臨床転帰の間の関連性を確立するためにはより多くの試験が必要であるが、臨床徴候は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３のいずれもが癌に関する独立した受容体とみなすことはできないというインビトロ試験からの結果を裏づける。
【００１５】
抗ＨＥＲ３抗体
多数の抗ＨＥＲ３抗体が文献で記述されている。 例えば、国際公開第２０１１／０６０２０６号、同第２０１１／０４４３１１号、同第２０１１／０２２７２７号、同第２０１０／１２７１８１号、同第２００８／１００６２４号、同第２００７／０７７０２８号、同第０３／０１３６０２号および同第９７／３５８８５号参照。
【００１６】
ＡＭＧ８８８（Ａｍｇｅｎ／Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）は、ヒトＨＥＲ３の発癌性シグナル伝達を阻害すると言われている完全ヒトモノクローナル抗体である。ＡＭＧ  ８８８は、現在、癌の治療のための臨床試験において検討されている。
【００１７】
ＭＭ−１２１（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ＨＥＲ３へのヘレグリンの結合をブロックする、したがってＨＥＲ３の活性化をブロックすると言われている抗ＨＥＲ３抗体である；国際公開第２０１０／０１９９５２号およびＳｃｈｏｅｂｅｒｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０（６）：２４８５−９４、２０１０年３月、参照。 ＭＭ−１２１も、現在、癌の治療のための臨床試験において検討されている。
【００１８】
ペルツズマブは、ＨＥＲ３およびその他のＥＧＦＲ受容体へのＨＥＲ２の二量体化を阻害するＨＥＲ二量体化阻害剤として機能する抗ＨＥＲ２抗体である。Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４、５（４）：３１７−２８）は、ペルツズマブがドメインＩＩの中心近傍でＨＥＲ２に結合して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体化およびシグナル伝達のために必要な結合ポケットを立体的にブロックすることを開示している。ペルツズマブのアミノ酸配列は、国際公開第２００６／０３３７００号および米国特許出願第２００６／０１２１０４４  Ａ１号に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
特定の抗ＨＥＲ３抗体が公知であり、一部の場合には臨床試験で検討されているという事実にもかかわらず、現在、治療用途のために承認されている抗ＨＥＲ３抗体はない。上記で概説したように腫瘍増殖の調節におけるＨＥＲ３の極めて重要な役割を考慮して、ＨＥＲ３受容体を標的とする新しい抗体ならびにそのような抗ＨＥＲ３抗体の混合物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＨＥＲ３受容体を標的とする新規組換え抗体、ならびにヒト癌治療のため、例えば乳癌、卵巣癌、胃癌、およびＨＥＲ３を発現するもしくは過剰発現するまたはＨＥＲ３経路活性化のシグネチャーを有する他の癌（例えばＮＳＣＬＣ、グリア芽細胞腫）の治療のための、これらの抗体の２またはそれ以上を含む組成物および抗体と組成物の使用に関する。ＥＧＦＲファミリーの他の受容体に対する使用可能なモノクローナル抗体を含む、そのような癌のための現在使用可能な治療と比較して、本発明の抗体は、単独でまたは、好ましくは、２もしくはそれ以上のそのような抗体を含む組成物中で、および場合により化学療法などの他の治療と組み合わせて、優れた臨床応答を提供し得ることが企図される。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、本明細書で抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９と称される抗体に基づく新規組換え抗ＨＥＲ３抗体、ならびにそのヒト化および／または親和性成熟変異体に関する。１つの実施形態では、本発明のこの態様は、本明細書で抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９と称される抗体の任意の１つの重鎖ＣＤＲ３配列を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体分子に関する。
【００２２】
本発明のこの態様のさらなる実施形態には以下が含まれる：抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９の任意の１つの重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、前記抗体と結合に関して競合する組換え抗ＨＥＲ３抗体分子；これらの抗体の任意の１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体分子；ならびにこれらの抗体の任意の１つの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む、またはそれぞれこれらの抗体の任意の１つの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、それぞれ少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含み、前記抗体と結合に関して競合する組換え抗ＨＥＲ３抗体。
【００２３】
本発明の別の態様は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一抗体と第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体の一方または両方が上記で概説した抗体の群から選択される、組換え抗体組成物に関する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、抗癌剤に結合した本発明の組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む免疫複合体に関する。 関連する態様は、少なくとも本発明の第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組成物であって、前記組成物中の少なくとも１つの抗ＨＥＲ３抗体が免疫複合体である組成物に関する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗ＨＥＲ３抗体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【００２６】
本発明のなおさらなる態様は、本発明の抗体およびポリクローナル抗体組成物を作製するための方法に関する。
【００２７】
本発明のなおさらなる態様は、本発明の抗ＨＥＲ３抗体または組成物をヒトまたは動物対象に投与することにより、前記対象において疾患を治療するための方法、特にヒトにおける癌の治療のための方法に関する。 関連する態様は、ヒトまたは動物において疾患を治療するのに使用するための、特にヒトにおける癌の治療のための薬剤を製造するための本発明の１またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体の使用である。
【００２８】
本発明のなおさらなる態様は、ＨＥＲ３を発現するまたは過剰発現する細胞の表面でＨＥＲ３のインターナリゼーションを誘導するための方法であって、細胞を本発明の組換え抗ＨＥＲ３抗体または免疫複合体または組換え抗ＨＥＲ３抗体組成物と接触させることを含む方法に関する。
【００２９】
本発明のさらなる態様および特定の実施形態は、以下の説明および実施例から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図２】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図３】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図４】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図５】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図６】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図７】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図８】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図９】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図１０】図１−１０は、種々の濃度の示されている抗ＨＥＲ３抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。
【図１１】図１１は、示されている抗体での１時間の前処理、次いで１０ｎＭヘレグリンβでの刺激後の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ７におけるホスホ−ＨＥＲ３レベルのウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図１２】図１２−１５は、４つの癌細胞株における２つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１３】図１２−１５は、４つの癌細胞株における２つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１４】図１２−１５は、４つの癌細胞株における２つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１５】図１２−１５は、４つの癌細胞株における２つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１６】図１６−１９は、４つの癌細胞株における３つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１７】図１６−１９は、４つの癌細胞株における３つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１８】図１６−１９は、４つの癌細胞株における３つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図１９】図１６−１９は、４つの癌細胞株における３つの抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物の代謝活性を示す。
【図２０】図２０および２１は、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５における、２つの抗ＨＥＲ３抗体の２つの異なる混合物中の個々の抗ＨＥＲ３抗体と比較した、これら２つの混合物の増殖阻害活性を示す。
【図２１】図２０および２１は、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５における、２つの抗ＨＥＲ３抗体の２つの異なる混合物中の個々の抗ＨＥＲ３抗体と比較した、これら２つの混合物の増殖阻害活性を示す。
【図２２】図２２および２３は、２つの癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ７における、参照抗体ＭＭ−１２１（抗ＨＥＲ３）およびペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）と比較した本発明の２つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物の増殖阻害活性を示す。
【図２３】図２２および２３は、２つの癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ７における、参照抗体ＭＭ−１２１（抗ＨＥＲ３）およびペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）と比較した本発明の２つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物の増殖阻害活性を示す。
【図２４】図２４は、個別の抗ＨＥＲ３抗体５０８２もしくは５０３８またはこれら２つの抗体の混合物で処理したＯＶＣＡＲ−８細胞の全細胞溶解物における様々な時点でのＨＥＲ３レベルを示すウエスタンブロットである。
【図２５】図２５は、個別の抗ＨＥＲ３抗体５０８２もしくは５０３８またはこれら２つの抗体の混合物による様々な時点でのＨＥＲ３およびＡＫＴのリン酸化の阻害を示す、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の全細胞溶解物に関して実施したウエスタンブロットである。
【図２６】図２６は、Ａ５４９肺癌異種移植モデルにおける個別の抗ＨＥＲ３抗体５０３８および５０８２ならびに５０３８＋５０８２の混合物のインビボ効力を示す。
【図２７】図２７−３２は、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定による抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングの結果を示す。
【図２８】図２７−３２は、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定による抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングの結果を示す。
【図２９】図２７−３２は、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定による抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングの結果を示す。
【図３０】図２７−３２は、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定による抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングの結果を示す。
【図３１】図２７−３２は、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定による抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングの結果を示す。
【図３２】図２７−３２は、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定による抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングの結果を示す。
【図３３】図３３は、抗体交差競合分析による抗ＨＥＲ３抗体のエピトープビニングの結果を含む表を示す。
【図３４】図３４は、抗ＨＥＲ３抗体に関して割り当てられたエピトープビン間の関係の図解であり、重複する円は、オーバーラップするエピトープを有する抗体を表す。
【図３５】図３５は、腫瘍体積として表した、ＢｘＰＣ３膵癌異種移植モデルにおける抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体５０３８および５０８２ならびに５０３８＋５０８２の混合物のインビボ効力を示す。
【図３６】図３６は、生存率パーセントとして表した、ＢｘＰＣ３膵癌異種移植モデルにおける抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体５０３８および５０８２ならびに５０３８＋５０８２の混合物のインビボ効力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
「抗体」または「抗体分子」という用語は血清の機能性成分を表し、しばしば分子（抗体もしくは免疫グロブリン）の集合体または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）と称される。抗体は、特異的抗原決定基（抗原または抗原性エピトープ）と結合または反応することができ、続いて免疫学的エフェクター機構の誘導を導き得る。個々の抗体は通常単一特異性とみなされ、抗体の組成物はモノクローナル（すなわち同一の抗体分子から成る）またはポリクローナル（すなわち同じ抗原またはさらには別個の異なる抗原上の同一または異なるエピトープと反応する２またはそれ以上の異なる抗体から成る）であり得る。それぞれの抗体は、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする独特の構造を有し、すべての天然抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖の同じ全体的基本構造を有する。抗体はまた、集合的に免疫グロブリンとしても知られる。
【００３２】
本明細書中で使用される「抗体（単数または複数）」という用語はまた、キメラおよび一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆｖフラグメントまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントなどの抗体の結合フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭなどの多量体形態を包含するものとする。抗体は、ヒトもしくは非ヒト起源、例えばマウスもしくは他のげっ歯動物由来の抗体、または、例えばマウス抗体に基づく、キメラ、ヒト化もしくは再構成抗体であり得る。
【００３３】
抗体の各重鎖は、典型的には重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、典型的にはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む。各抗体軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬと称される単一ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変性の領域（配列および／または構造的に規定されるループにおいて超可変的であり得る、「超可変領域」）にさらに細分され得る。これらはまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が間に介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含む。可変領域内のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔの番号付け方式として知られる標準化された番号付け方法を用いて番号付けされることが多い（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、米国メリーランド、ベセスダ）。
【００３４】
付属の配列表において、軽鎖（ＬＣ）ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列とヒトカッパ定常領域配列の両方を含む。以下の実施例１で言及するように、ヒトカッパ定常領域は、アミノ酸-ＴＶＡＡＰ−（Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ）で始まり、Ｃ末端においてアミノ酸-ＮＲＧＥＣ（Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ）で終了する。それゆえ、本明細書で使用される場合、「軽鎖可変領域配列」または「ＶＬ」は、ヒトカッパ定常領域の開始点の前の（すなわちアミノ酸ＴＶＡＡＰの前の）配列表における軽鎖配列のＮ末端部分を指すと理解される。
【００３５】
抗体全体に関連して本明細書で使用される抗体番号、例えば「抗体５０８２」は、実施例で説明され、付属の配列表で定義される特定の抗体を指す。例えば、抗体５０８２は、配列番号１８に示す重鎖可変領域配列と配列番号：４４に示すＩＧＨＧ１重鎖定常領域配列を含む重鎖、および上記で説明した軽鎖配列が軽鎖可変領域配列（配列番号２０の残基１−１０８）とヒトカッパ定常領域配列（配列番号２０の残基１０９−２１４）の両方を含む、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を備える抗体である。
【００３６】
本発明はまた、本明細書で述べる特定の抗体に「由来する」または「基づく」抗体を包含することが意図されており、そのような抗体は、特定の状況によって、以下の１つを含む：前記特定抗体の重鎖ＣＤＲ３配列；前記特定抗体の重鎖ＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ３配列；前記特定抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または前記特定抗体の重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列、または前記重鎖可変領域配列および／もしくは軽鎖可変領域配列のヒト化および／もしくは親和性成熟変異体、またはそれぞれの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列。本明細書で述べる特定の抗体に由来するまたは基づく抗体は、一般に前記特定抗体と同じＨＥＲ３エピトープに結合し、好ましくは前記特定抗体と実質的に同じ活性を示す。抗体は、前記特定抗体と結合に関して競合する場合、前記特定抗体と同じＨＥＲ３エピトープに結合するとみなされる。
【００３７】
抗体の標的抗原との相互作用の特異性は、主として重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基に存する。ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、それゆえ、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間ではるかに可変的である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特異的抗体からのＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することにより、特異的な天然の抗体またはより一般的に所与のアミノ酸配列を有する任意の特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。結果として、非ヒト抗体を「ヒト化」し、なおも元の抗体の結合特異性および親和性を実質的に維持することが可能である。ヒト化についてのより詳細な考察を以下で述べる。
【００３８】
「キメラ抗体」は、その最も広い意味で、１つの抗体からの１またはそれ以上の領域と１またはそれ以上の他の抗体からの１またはそれ以上の領域を含む抗体を指す。本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、一般に、部分的にヒト起源であり、かつ部分的に非ヒト起源である、すなわち一部が非ヒト動物、例えばマウスもしくは他のげっ歯動物またはニワトリなどの鳥類に由来する抗体である。キメラ抗体は、ヒトの抗抗体応答、例えばネズミ抗体の場合にはヒトの抗マウス抗体応答の危険性を低減するために、非ヒト抗体よりも好ましい。典型的なキメラ抗体の一例は、可変領域配列がマウスの免疫化に由来するネズミ配列であり、一方定常領域配列はヒトである抗体である。キメラ抗体の場合、非ヒト部分、すなわち典型的には可変領域配列のフレームワーク領域は、抗体をヒト化するためにさらなる変化に供され得る。
【００３９】
「ヒト化する」という用語は、抗体が完全にまたは部分的に非ヒト起源であるという事実、例えば対象とする抗原でのマウスの免疫化から得られたネズミ抗体またはそのようなネズミ抗体に基づくキメラ抗体を指し、ヒトにおける免疫応答を回避するまたは最小限に抑えるために特定のアミノ酸、特にフレームワーク領域ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメインのアミノ酸を置換することが可能である。すべての抗体はヒトの抗抗体応答を惹起する潜在能を有し、ヒトの抗抗体応答は、問題の抗体の「ヒトらしさ（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）」の度合いとある程度相関することが知られている。免疫原性を正確に予測し、それによって特定の抗体のヒト抗抗体応答を予測することは不可能であるが、非ヒト抗体はヒト抗体よりも免疫原性が高い傾向がある。異種（通常はげっ歯動物）定常領域がヒト起源の配列で置換されたキメラ抗体は、一般に完全な異種起源の抗体よりも免疫原性が低く、治療用抗体はヒト化または完全ヒト抗体を目指す傾向にある。キメラ抗体または他の非ヒト起源の抗体に関しては、それゆえ、ヒトの抗抗体応答の危険性を低減するためにヒト化されることが好ましい。
【００４０】
キメラ抗体に関して、ヒト化は、典型的には可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であるアミノ酸残基は、典型的にはヒト化に関連して変化させないが、一部の場合には、例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位または望ましくないシステイン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましいと考えられる。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ［式中、ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る］中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の連結によって起こる。Ｎグリコシル化部位の除去は、好ましくは保存的置換によって、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に突然変異させることによって達成され得る。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの因子に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主として配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、およびより低い度合いでＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列中に存在する場合、特に脱アミド化を受けやすい。そのような脱アミド化部位、特にＡｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合は、それゆえ、典型的には関与する残基の１つを除去する保存的置換によって、その部位を除去することが望ましいと考えられる。
【００４１】
抗体配列のヒト化の数多くの方法が当分野において公知である；例えばＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３による総説参照。１つの一般的に使用される方法はＣＤＲ移植であり、この方法は、例えばネズミ由来のキメラ抗体に関しては、ネズミ可変領域遺伝子に対するヒト生殖細胞遺伝子対応物の同定およびこのフレームワークへのネズミＣＤＲ配列の移植を含む。ＣＤＲ移植はＫａｂａｔのＣＤＲ定義に基づき得るが、最近の公表文献（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎら（２００７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：２１０−２２５）は、ＩＭＧＴの定義（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）がヒト化の結果を改善し得ることを示唆した。ＣＤＲ移植は、ＣＤＲ移植した非ヒト抗体の結合特異性および親和性、したがって生物活性を低下させ得るので、親抗体の結合特異性および親和性を保持するためにＣＤＲ移植した抗体の選択位置に復帰突然変異を導入し得る。可能な復帰突然変異のための位置の同定は、文献および抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて実施することができる。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的には抗体分子の表面に位置するものであるが、埋もれた残基または表面露出の度合いが低い残基は通常変化させない。ＣＤＲ移植と復帰突然変異に代わる選択的ヒト化技術は、非ヒト起源の非表面露出残基を保持し、表面残基をヒト残基に変化させる、表面再構成である。
【００４２】
特定の場合には、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために１またはそれ以上のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることも望ましいと考えられる。これは「親和性成熟」として知られ、例えば抗体のヒト化が結合特異性または親和性の低下をもたらし、復帰突然変異だけでは結合特異性または親和性を十分に改善することができない状況では、場合によりヒト化と併せて実施され得る。様々な親和性成熟方法が当分野において公知であり、例えばＢｕｒｋｓら（１９９７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９４巻、４１２-４１７頁によって記述されたインビトロスキャニング飽和突然変異誘発およびＷｕら（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９５巻、６０３７-６０４２頁の段階的インビトロ親和性成熟法が挙げられる。
【００４３】
上述したように、本発明は、ヒト化抗体、すなわちヒト化に供されたと表される抗体を包含する。これらは、本発明の抗体の「ヒト化変異体」とも称され得る。特に、任意の特異的アミノ酸配列に関して本明細書で使用される「重鎖可変領域配列」および「軽鎖可変領域配列」という用語は、その特異的配列だけでなくその任意のヒト化変異体も包含するものとする。本明細書で述べる抗ＨＥＲ３抗体の親和性成熟変異体も本発明に包含されるものとする。
【００４４】
本明細書で使用される場合、例えば参照配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、特定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域配列と比較して、特定の最小レベルの配列同一性を有する重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列と言えば、そのような参照配列のヒト化および／または親和性成熟変異体を包含するが、これらに限定はされないものとする。
【００４５】
「組換え抗体」という用語は、抗体のコード配列を含む１つの発現ベクター（またはおそらく２以上の発現ベクター、典型的には２つの発現ベクター）でトランスフェクトされた細胞または細胞株から発現される抗体であって、前記コード配列が天然では該細胞に結合していない、抗体を指す。
【００４６】
「ベクター」という用語は、核酸配列が、異なる遺伝的環境の間での輸送のためおよび／または宿主細胞における発現のために挿入され得る核酸分子を指す。核酸配列の転写のための調節エレメント（少なくとも適切なプロモーター）を担持するベクターは、「発現ベクター」と称される。「プラスミド」と「ベクター」という用語は互換的に使用され得る。本発明に関連して使用される発現ベクターは、当分野で公知の任意の適切な種類、例えばプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００４７】
「ポリクローナル抗体」または「（モノクローナル）抗体の混合物」という用語は、同じまたは異なる抗原上の異なる特異的抗原決定基と結合するまたは反応することができる２またはそれ以上の異なる抗体分子の組成物を指す。本発明に関連して、ポリクローナル抗体の個々の抗体は、ＨＥＲ３の異なる抗原決定基に結合する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体の個々の抗体は、ＨＥＲ３の異なるエピトープ、より好ましくは別個の実質的にオーバーラップしないエピトープに結合する。ポリクローナル抗体の可変性は、一般に抗体分子の可変領域に位置すると考えられる。「組換えポリクローナル抗ＨＥＲ３抗体組成物」は、ＨＥＲ３に結合する２またはそれ以上の組換えモノクローナル抗体の混合物を含む組成物である。
【００４８】
抗体が種々のアイソタイプとして、例えばヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、またはネズミアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡとして存在することは当分野において周知である。本発明の抗体は任意のアイソタイプであり得る。本発明のポリクローナル抗体組成物の個々の抗体が２以上のアイソタイプの抗体を含むことは可能であるが、それらは、好ましくはすべて同じアイソタイプである。
【００４９】
「少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体」を含む組換え抗体組成物は、特定の抗体の少なくとも２つを含むが、本明細書で述べる抗ＨＥＲ３抗体の３以上を含み得る。特定の場合、そのような組換え抗体組成物は、比較的大きな数の個々の抗ＨＥＲ３抗体、例えば１０以下またはそれ以上、例えば１５または２０までを含み得るが、通常は１０未満の異なる抗ＨＥＲ３抗体、すなわち２、３、４、５、６、７、８または９の抗体を含む。本発明の組換え抗体組成物は、より典型的には約６以下の異なる抗ＨＥＲ３抗体を含み、多くの場合それらは４以下の異なる抗ＨＥＲ３抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組換え抗体組成物は、それゆえ、２、３または４の異なる抗ＨＥＲ３抗体、典型的には２または３の異なる抗ＨＥＲ３抗体を含む。
【００５０】
「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、主として抗体の結合特異性を決定することに関与する抗体の可変ドメインに認められる「超可変」領域を指す。Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３），ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，５５−７７における定義参照。抗体の重鎖および軽鎖はそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲ領域を含み、そのうちＣＤＲ３が最も大きな可変性を示す。
【００５１】
「エピトープ」という用語は、動物において抗原性または免疫原性活性を有する、より大きな分子（例えば抗原または抗原性部位）の一部分を表すために使用される。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を惹起するより大きな分子の一部分である。抗原性活性を有するエピトープは、当分野で公知の任意の方法によって測定した場合抗体が免疫特異的に結合するより大きな分子の一部分である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性であるとは限らない。抗原は、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する物質、例えば毒素、ウイルス、細菌、タンパク質またはＤＮＡである。抗原または抗原性部位は、非常に小さなものでない限り、多くの場合２以上のエピトープを有し、多くの場合免疫応答を刺激することができる。エピトープは直鎖状または立体配座であり得る。直鎖状エピトープは、一般に、抗体によって認識されるタンパク質分子上の約６〜１０の隣接アミノ酸から成る。これに対し、立体配座エピトープは、連続的に配置されていないが、抗体が特定の三次元構造を認識するアミノ酸から成る。タンパク質分子が三次元構造に折りたたまれた場合、エピトープを形成するアミノ酸が並置されて、抗体が立体配座エピトープを認識することが可能になる。変性タンパク質では直鎖状エピトープだけが認識される。立体配座エピトープは、当然、折りたたまれたタンパク質の外側になければならない。
【００５２】
「別個のエピトープ」という用語は、本発明の２つの異なる抗体が別個のエピトープに結合する場合、抗原結合に関して１００％未満の競合、好ましくは抗原結合に関して８０％未満の競合、より好ましくは抗原結合に関して５０％未満の競合、および最も好ましくはできる限り少ない競合、例えば抗原結合に関して約２５％未満の競合が存在するという事実を指す。同じ抗原への結合に関して互いに競合することができる抗体は、同じエピトープもしくはオーバーラップするエピトープに結合し得るかまたは互いのすぐ近傍に結合部位を有し得るので、競合は主として立体障害によって引き起こされる。抗体対の「別個のエピトープ」についての分析は、当分野で公知の方法によって、例えばＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）もしくはＨＥＲ３および個々の蛍光標識抗体を発現する細胞に関する他のフローサイトメトリー分析を用いた飽和抗体条件下での結合実験によって、またはフローセル表面に捕捉されたまたは結合したＨＥＲ３抗原を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施され得る。ＳＰＲを用いて抗体間の競合を測定するための方法は以下の実施例１２で述べる。
【００５３】
別個のエピトープは、好ましくは、本発明の組成物中の２つの異なる抗ＨＥＲ３抗体が、それらのそれぞれのエピトープに同時に結合することができるのに十分なほど抗原結合に関して低い競合を有するという意味で「オーバーラップしてない」。種々の度合いのオーバーラップが存在し得ること、および別個のエピトープは、それぞれの抗体がそれらのエピトープに実質的に結合することができる限り、ある程度のオーバーラップの存在にもかかわらず「オーバーラップしていない」とみなされ得ることは当業者に理解される。これは一般に、２つの抗体間の抗原結合に関する競合が約５０％未満である場合に当てはまるとみなされる。
【００５４】
同様に、本発明の抗ＨＥＲ３抗体と「結合に関して競合する」抗体は、抗原結合に関して約５０％またはそれ以上の競合を示すものと定義され得る。
【００５５】
同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体は、エピトープの位置によって、それらが結合する抗原の活性に対し様々な作用を有し得る。抗原の活性部位にあるエピトープに結合する抗体は抗原の機能を完全にブロックし得るが、異なるエピトープに結合する別の抗体は、単独では抗原の活性にほとんどまたはまったく作用を及ぼさないこともあり得る。そのような抗体は、しかしながら、なおも補体を活性化し、それによって抗原の排除をもたらすことがあり、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する１またはそれ以上の抗体と組み合わせた場合相乗効果をもたらし得る。本発明に関連して、エピトープは、好ましくはＨＥＲ３の細胞外ドメインの一部分である。本発明の抗原は、好ましくは、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する細胞外ドメインＨＥＲ３タンパク質、ポリペプチドまたはそのフラグメントである。ＨＥＲ３関連抗原はまた、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合するＨＥＲ３ポリペプチドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントの類似体または誘導体であり得る。
【００５６】
「免疫グロブリン」という用語は、一般に血液または血清中で認められる抗体の混合物の集合的名称として使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を表すためにも使用され得る。
【００５７】
「コグネイトＶＨおよびＶＬコード対」という用語は、同じ抗体産生細胞内に含まれるまたは同じ抗体産生細胞に由来するＶＨおよびＶＬコード配列の元の対を表す。したがって、コグネイトＶＨおよびＶＬ対は、そのような細胞が由来するドナー中に元々存在するＶＨおよびＶＬ対合を示す。「ＶＨおよびＶＬコード対から発現される抗体」という用語は、抗体または抗体フラグメントが、ＶＨおよびＶＬＬコード配列を含むベクター、プラスミドまたは他のポリヌクレオチドから産生されることを示す。コグネイトＶＨおよびＶＬコード対が完全な抗体としてまたはその安定したフラグメントとして発現される場合、それらは、それらが由来する細胞から元々発現される抗体の結合親和性および結合特異性を保持する。コグネイト対のライブラリは、コグネイト対のレパートリーまたはコレクションとも呼ばれ、個別に保持され得るかまたはプールされ得る。
【００５８】
「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾にかかわりなく、あらゆるアミノ酸の鎖を意味する。タンパク質は、単量体として、または２もしくはそれ以上の集合したポリペプチド鎖、タンパク質のフラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチドもしくはペプチドを含む多量体として存在し得る。
【００５９】
「ヘッドトゥーヘッドプロモーター（「二方向性プロモーター」としても知られる）」という用語は、プロモーターによって駆動される２つの遺伝子フラグメントの転写が反対の方向で起こるようにごく近接して位置するプロモーター対を指す。
【００６０】
「トランスフェクション」という用語は、本明細書では外来ＤＮＡを細胞に導入することについての広義語として使用される。この用語はまた、外来ＤＮＡを細胞に導入するための他の機能的に均等内容の方法、例えば形質転換、感染、形質導入またはドナー細胞とアクセプター細胞の融合を包含するものとする。
【００６１】
「ＨＥＲ３」（ＥｒｂＢ−３としても知られる）という用語は、「背景技術」の章で上述した「ヒト上皮増殖因子受容体３」を表す。本明細書で使用される場合、この用語はＨＥＲ３の変異体、アイソフォームおよび種ホモログを包含するものとする。好ましくは、ＨＥＲ３への本発明抗体の結合は、ＨＥＲ３と他のＥｒｂＢファミリー成員とのヘテロマ複合体の形成、例えばＨＥＲ２とのヘテロ二量体化を阻害することにより、ＨＥＲ３を発現する細胞（すなわち典型的には腫瘍細胞）の増殖を阻害する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「増殖を阻害する」（例えば細胞に関して）という用語は、抗ＨＥＲ３抗体と接触した場合、抗ＨＥＲ３抗体の不存在下での同じ細胞の増殖と比較して細胞の増殖（細胞数の増大）または代謝の測定可能な低下、例えば少なくとも約１０％、好ましくはそれ以上、例えば少なくとも約２０％または３０％、より好ましくは少なくとも約４０％または５０％、例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９９％またはさらには１００％の細胞培養物の増殖の阻害を包含するものとする。増殖阻害は、例えば以下の実施例で述べるように関連する癌細胞株において測定することができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「二量体化を阻害する」または「二量体形成を阻害する」という用語は、抗ＨＥＲ３抗体の不存在下での二量体形成と比較して抗ＨＥＲ３抗体の結合の結果として、他の受容体、特にＨＥＲ２、のみならずＥＧＦＲまたはＨＥＲ４とも二量体を形成するＨＥＲ３の能力の測定可能な低下を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「処置」という用語は、症状または疾患状態を緩和する、軽減する、改善するまたは根絶する（治癒する）のに十分な量での本発明の抗ＨＥＲ３抗体または抗体組成物の投与を指す。本発明の２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体の投与は、一般に抗体の同時投与として、好ましくは処置に使用されるすべての抗ＨＥＲ３抗体を含む組成物の形態で行われる。しかし、本発明の２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体を別々に投与することも可能である。したがって、本明細書における、例えば少なくとも２つの抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物の投与と言えば、少なくとも２つの抗体をそのまま含む組成物の投与のみならず、抗体の別々の投与も包含することは言うまでもない。すなわち、本発明の２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体の組合せは、同時に、連続的にまたは別々に投与され得る。
【００６５】
２つの配列、例えば可変領域配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入されねばならないギャップを考慮に入れて、それらの配列によって共有される同一位置の数（同一位置の数／総位置数×１００として計算される）を指す。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、容易に入手可能なソフトウェアを用いて達成され得る。適切なソフトウェアプログラムは、オンラインでの使用とダウンロードの両方に関して、ならびにタンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアラインメントに関して、様々なソースから入手可能である。１つの適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能な、あるいは、例えば、同じく様々な他のタンパク質およびヌクレオチドインフォマティクスツールを提供する、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）から入手可能な、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１１；２２（２２）：４６７３−８０）である。
【００６６】
特定の実施形態
本発明の１つの態様は、様々な新規抗ＨＥＲ３抗体に関する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、本明細書で抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９と称される抗体の任意の１つの重鎖ＣＤＲ３配列を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体に関する。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９の任意の１つの重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体に関する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９の任意の１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体に関する。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明は、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９の任意の１つの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む、または前記重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列のヒト化および／もしくは親和性成熟変異体を含む、またはそれぞれ前記重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば前記配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む、前記抗体と結合に関して競合する組換え抗ＨＥＲ３抗体に関する。
【００７０】
さらなる実施形態では、本発明は、上記で定義した抗体のいずれかと同じエピトープに結合し、結合に関して競合する組換え抗ＨＥＲ３抗体、ならびに本明細書の別の部分で記述される、そのような抗体の１またはそれ以上を含む、好ましくは少なくとも２つのそのような抗体、例えば２または３のそのような抗体を含む抗体組成物に関する。
【００７１】
以下の表１は、付属の配列表に示すように、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖（ＬＣ）（上記で説明したように、軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）配列とヒトカッパ定常領域配列の両方を含む）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列についての配列ＩＤ番号を示す。
表１：選択した抗ＨＥＲ３抗体の重鎖可変領域および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列についての配列ＩＤ番号
【表１】
2014503189.tif 000003
【００７２】
別の態様では、本発明は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一抗体と第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体の少なくとも一方が上記で概説した抗体の群から選択される、例えば組成物中の抗ＨＥＲ３抗体の両方または全部が上記で概説した抗体の群から選択される、組換え抗体組成物に関する。
【００７３】
したがって、本発明のこの態様の１つの実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体のそれぞれが、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲ３配列を含む、組換え抗体組成物に関する。
【００７４】
本発明のこの態様の別の実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体の各々が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、組換え抗体組成物に関する。
【００７５】
本発明のこの態様のさらなる実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体のそれぞれが、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、組換え抗体組成物に関する。
【００７６】
本発明のこの態様のさらなる実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体のそれぞれが、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択される抗体の重鎖可変領域配列またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体ならびに軽鎖可変領域配列またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体を含むか、あるいは第一および第二抗体のそれぞれが、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択される抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含み、かつ第一および第二抗体が、それらが由来するそれぞれの抗体と結合に関して競合する、組換え抗体組成物である。
【００７７】
特定の実施形態は、ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、
ａ）第一組換え抗体が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から選択される任意の１つの参照抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含み、かつ第一組換え抗体が、前記参照抗体と同じエピトープに結合し、結合に関して競合する；ならびに
ｂ）第二組換え抗体が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から選択される任意の１つの参照抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含み、前記参照抗体がａ）の参照抗体とは異なり、かつ第二組換え抗体が、前記参照抗体と同じエピトープに結合し、結合に関して競合する、
抗体組成物である。
【００７８】
本発明のこの態様のなおさらなる実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択されるか、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体である、組換え抗体組成物である。
【００７９】
本発明のこの態様のなおさらなる実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み、第一および第二抗体がＨＥＲ３の別個のエピトープに結合し、かつ第一および第二抗体が、抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９と同じエピトープに結合し、結合に関して競合する抗体から成る群より選択される、組換え抗体組成物である。
【００８０】
本発明のこの態様のさらなる実施形態は、ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、前記抗体の少なくとも１つが、
（ａ）抗体４７８５の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｂ）抗体４８８９の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｃ）抗体４９３５の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｄ）抗体５０３８の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｅ）抗体５０８２の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｆ）抗体５１０１の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｇ）抗体５１０６の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｈ）抗体５１４３の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
（ｉ）抗体５１４４の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；ならびに
（ｊ）抗体５２５９の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体
から成る群より選択される、抗体組成物である。
【００８１】
好ましくは、前記第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体はどちらも、上記に示す抗体（ａ）−（ｊ）から選択される。組成物はまた、少なくとも第三組換え抗ＨＥＲ３抗体、好ましくは上記の抗体（ａ）−（ｊ）から選択される抗体も含み得る。別の実施形態では、抗体組成物は、ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み得、前記第一および第二抗体のそれぞれは、上記に示す抗体（ａ）−（ｊ）の１つと同じエピトープに結合し、結合に関して競合する。
【００８２】
本発明のこの態様のさらなる実施形態は、ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、前記抗体の少なくとも１つが、
（Ａ）抗体４７８５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｂ）抗体４８８９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｃ）抗体４９３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｄ）抗体５０３８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｅ）抗体５０８２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｆ）抗体５１０１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｇ）抗体５１０６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｈ）抗体５１４３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；
（Ｉ）抗体５１４４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体；ならびに
（Ｊ）抗体５２５９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体
から成る群より選択される、抗体組成物である。
【００８３】
この実施形態では、前記第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体はどちらも、好ましくは上記に示す抗体（Ａ）−（Ｊ）から選択される。組成物はまた、少なくとも第三組換え抗ＨＥＲ３抗体、好ましくは上記の抗体（Ａ）−（Ｊ）から選択される抗体も含み得る。別の実施形態では、抗体組成物は、ＨＥＲ３の別個のエピトープに結合する少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含み得、前記第一および第二抗体のそれぞれは、上記に示す抗体（Ａ）−（Ｊ）の１つと同じエピトープに結合し、結合に関して競合する。
【００８４】
本発明のこの態様の１つの特定の実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体５０８２および５１０６と結合に関して競合し、かつ
・抗体５０８２および５１０６、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体５０８２の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体５１０６の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５１０６の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５１０６の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体５１０６の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体５１０６の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００８５】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体５０８２および４７８５と結合に関して競合し、かつ
・抗体５０８２および４７８５、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体５０８２の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体４７８５の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体４７８５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体４７８５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体４７８５の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体４７８５の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００８６】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体５０８２および５０３８と結合に関して競合し、かつ
・抗体５０８２および５０３８、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体５０８２の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体５０３８の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５０３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５０３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体５０３８の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体５０３８の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００８７】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体５０８２および５１４４と結合に関して競合し、かつ
・抗体５０８２および５１４４、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体５０８２の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体５１４４の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５１４４の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５１４４の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体５１４４の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体５０８２の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体５１４４の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００８８】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体４８８９および５１４３と結合に関して競合し、かつ
・抗体４８８９および５１４３、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体４８８９の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体５１４３の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４８８９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５１４３の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４８８９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５１４３の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４８８９の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体５１４３の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体４８８９の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体５１４３の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００８９】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体４７８５および５０３８と結合に関して競合し、かつ
・抗体４７８５および５０３８、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体４７８５の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体５０３８の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４７８５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５０３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４７８５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５０３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４７８５の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体５０３８の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体４７８５の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体５０３８の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００９０】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体４７８５および５２５９と結合に関して競合し、かつ
・抗体４７８５および５２５９、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体４７８５の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体５２５９の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４７８５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５２５９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４７８５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体５２５９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体４７８５の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体５２５９の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体４７８５の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体５２５９の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００９１】
別のそのような実施形態は、少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物であって、第一および第二抗体が、それぞれ抗体５１０６および４８８９と結合に関して競合し、かつ
・抗体５１０６および４８８９、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体；
・抗体５１０６の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、および抗体４８８９の重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５１０６の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体４８８９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５１０６の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体、ならびに抗体４８８９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体；
・抗体５１０６の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに抗体４８８９の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体；または
・それぞれ抗体５１０６の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびにそれぞれ抗体４８８９の重鎖および軽鎖可変領域配列と、それぞれ、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体
である、組換え抗体組成物に関する。
【００９２】
下表２および３は、本発明による様々な抗ＨＥＲ３抗体の重鎖（表２）および軽鎖（表３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。これらの抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む軽鎖のアミノ酸配列、ならびにエンコードＤＮＡ配列（ＣＨＯ細胞における発現のために最適化した）を付属の配列表に示す。これらの配列の配列ＩＤ番号の概要については上記の表１参照。
表２：選択した抗ＨＥＲ３抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
【表２】
2014503189.tif 000004
表３：選択した抗ＨＥＲ３抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
【表３】
2014503189.tif 000005
【００９３】
本発明の別の態様は、本発明の抗体、すなわち抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９から成る群より選択される抗体、またはそのヒト化および／もしくは親和性成熟変異体をコードする、あるいはそのような抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列、またはそのような重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖および／もしくは軽鎖配列をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００９４】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７もしくは３９から成る群より選択されるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列の任意の１つと同じアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【００９５】
本発明のさらなる態様は、上記で定義した核酸分子を含む発現ベクターに関する。上述したように、本発明に関する使用のための発現ベクターは、当分野で公知の任意の適切な種類、例えばプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００９６】
本発明のなおさらなる態様は、上記で定義した核酸分子を含む宿主細胞であって、前記核酸分子によってコードされる抗ＨＥＲ３抗体を発現することができる宿主細胞に関する。
【００９７】
さらなる態様では、本明細書で開示される任意の２つの個々の抗体の結合特異性を１つの二重特異性結合分子において組み合わせ得る。そのような二重特異性結合分子は、好ましくは２つの選択抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。二重特異性結合分子は、二重可変ドメイン抗体、すなわち抗体の２本のアームが２つの異なる可変ドメインを含むものであり得るか、または二重特異性Ｆａｂフラグメントもしくは二重特異性ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントの形態であり得る。
【００９８】
抗ＨＥＲ３抗体および抗体組成物の生産
本発明のさらなる態様は、本発明の抗ＨＥＲ３抗体または抗ＨＥＲ３抗体の混合物を生産するための方法に関する。本発明のこの態様の１つの実施形態は、抗ＨＥＲ３抗体を発現することができる上記で定義した宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養すること、および生じた抗体を単離することを含む、本明細書で定義する抗ＨＥＲ３抗体を生産するための方法に関する。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で述べる少なくとも第一および第二組換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗ＨＥＲ３抗体の混合物を生産するための方法であって、それぞれ組換え抗ＨＥＲ３抗体を発現することができる、少なくとも第一宿主細胞および第二宿主細胞を提供すること、第一および第二宿主細胞を第一および第二抗体の発現に適した条件下で培養すること、ならびに生じた第一および第二抗体を単離することを含む方法に関する。
【０１００】
本発明の抗体または抗体組成物は、組換えモノクローナルまたはポリクローナル抗体の生産のための当分野で一般に公知の方法によって生産され得る。したがって、本発明の単一抗体の生産の場合、組換えモノクローナル抗体の生産のための当分野で公知の任意の方法を使用し得る。本発明の２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物の生産のためには、個々の抗体を別々に生産し得る、すなわちそれぞれの抗体を別個のバイオリアクターで生産し得るか、または個々の抗体を単一のバイオリアクターで一緒に生産し得る。組成物中の異なる抗体の数が、例えば２または３より多い場合は、一般に費用効率の理由から抗体を単一のバイオリアクターで一緒に生産することが好ましい。他方で、組成物が少数の異なる抗体、例えば２、３または場合により４つの異なる抗体だけを含む場合は、異なるバイオリアクターで別々に生産するかまたは単一のバイオリアクターで一緒に生産するかの決定は個々の状況に基づいて行わねばならない。抗体組成物が２以上のバイオリアクターで生産される場合、各バイオリアクターから個別に精製された上清から得られた抗体をプールすることによって精製抗ＨＥＲ３抗体組成物を得ることができる。多数のバイオリアクターにおけるポリクローナル抗体組成物の生産のための様々な方法が国際公開第２００９／１２９８１４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、それらのアプローチでは、細胞株または抗体製剤を上流のより後の時点でまたは下流のプロセシングの前またはプロセシングの間に組み合わせる。
【０１０１】
単一バイオリアクターにおける２またはそれ以上の個別抗体の生産の場合、これは、例えば国際公開第２００４／０６１１０４号または同第２００８／１４５１３３号（どちらも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように実施され得る。国際公開第２００４／０６１１０４号に記載されている方法は、ＶＨおよびＶＬタンパク質鎖が生産の間それらの元の対合で維持されることを確実にする、個々の宿主細胞のゲノムへの抗体コード配列の部位特異的組込みに基づく。さらに、部位特異的組込みは位置効果を最小限に抑え、それゆえポリクローナル細胞株における個々の細胞の増殖および発現特性は非常に類似すると予想される。一般に、この方法は以下を含む：ｉ）１またはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位を有する宿主細胞；ｉｉ）宿主細胞のものと適合性の少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を有する発現ベクター；ｉｉｉ）スクリーニングベクターからの選択したＶＨおよびＶＬコード対を、完全長抗体または抗体フラグメントがベクターから発現され得るように発現ベクターに移入することによる発現ベクターのコレクションの作製（スクリーニングベクターが発現ベクターと同一である場合はそのような移入が必要でないとこともある）；ｉｖ）発現ベクターのコレクションおよび宿主細胞のゲノム内のリコンビナーゼ認識部位とベクター内のリコンビナーゼ認識部位を組み合わせることができるリコンビナーゼをコードするベクターでの宿主細胞のトランスフェクション；ｖ）トランスフェクトした宿主細胞からポリクローナル細胞株を得る／作製すること；ならびにｖｉ）ポリクローナル細胞株から抗体組成物を発現させ、収集すること。
【０１０２】
国際公開第２００８／１４５１３３号は、単一バイオリアクターにおける２またはそれ以上の異なる抗体の生産のための別法を述べている。この方法は、ａ）ベクターのそれぞれが、ポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする別個の核酸の少なくとも１コピーを含む、発現ベクターのセットを提供すること、ｂ）細胞のゲノムへの発現ベクターの部位特異的組込みを回避する条件下で宿主細胞を発現ベクターのそれぞれで別々にトランスフェクトし、それにより、それぞれの組成物がポリクローナルタンパク質の１つの別個の成員を発現する、細胞の２またはそれ以上の組成物を得ること；ならびにｃ）細胞の少なくとも２つの組成物を混合してポリクローナル細胞株を得ることによる、２またはそれ以上の別個の成員を含むポリクローナル抗体または他のポリクローナルタンパク質を発現することができるポリクローナル細胞株の作製を含む。国際公開第２００４／０６１１０４号および同第２００８／１４５１３３号の方法はどちらも、組換えポリクローナル抗体を構成するすべての成員を単一バイオリアクターで生産し、単一工程で精製することを可能にし、それにより各抗体のための別々の生産および精製工程の必要性を回避して、同時に異なる抗体の驚くほど均一な生産をもたらすという利点を有する。国際公開第２００８／１４５１３３号の方法は、各生産細胞が特定の抗体をコードするポリヌクレオチドの多数のコピーを担持し得るので、高い収率を提供するというさらなる利点を有する。
【０１０３】
本発明の抗体は、哺乳動物細胞ならびに非哺乳動物真核または原核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等を含む、様々な種類の細胞において生産され得る。しかし、抗体は、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えばＳｐ２／０もしくはＮＳ０細胞）、ＮＩＨ ３Ｔ３などの線維芽細胞、またはＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞などの不死化ヒト細胞において生産される。
【０１０４】
核酸配列を宿主細胞にトランスフェクトするための方法は当分野において周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第３版、２００１参照）。例えば国際公開第２００４／０６１１０４号に記載されている部位特異的組込みに関して、適切な宿主細胞は、そのゲノム内に１またはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位を含む。この場合、適切な発現ベクターは、宿主細胞のリコンビナーゼ認識部位（複数可）にマッチする組換え認識部位を含む。例えば部位特異的組込み方法を用いたスクリーニングベクターからの選択ＶＨおよびＶＬコード対の移入に関するさらなる詳細は、国際公開第２００４／０６１１０４号に見出され得る。
【０１０５】
２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体を含む本発明の抗体組成物を単一バイオリアクターで生産しようとする場合、類似した増殖速度および好ましくは類似した抗体発現レベルを有する細胞株を選択して、ポリクローナル細胞株を作製し得る。次に、個々の細胞株を所定の割合で混合することによってポリクローナル細胞株を作製する。ポリクローナル抗体を発現するポリクローナル細胞株を作製することならびにそのような細胞株を使用したポリクローナル抗体の生産に関するさらなる情報および例については、国際公開第２００９／１２９８１４号、同第２００４／０６１１０４号および同第２００８／１４５１３３号（参照により本明細書に組み込まれる）参照。
【０１０６】
したがって、本発明の１つの実施形態は、本発明の２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体を発現することができるポリクローナル細胞株である。さらなる実施形態は、個々の細胞がそれぞれ単一のＶＨおよびＶＬ対を発現することができ、全体としてのポリクローナル細胞株が、それぞれのＶＨおよびＶＬ対が抗ＨＥＲ３抗体をコードする、ＶＨおよびＶＬ対のコレクションを発現することができる、ポリクローナル細胞株である。
【０１０７】
本発明の組換え抗体組成物は、ポリクローナルワーキングセルバンク（ｐＷＣＢ）からの１アンプルを、ポリクローナル細胞株によって発現される個々の抗体の相対的発現レベルの実質的な均一性を維持しながら十分なレベルの抗体発現を可能にする期間、適切な培地で培養することにより、単一バイオリアクターで製造され得る。約１５〜５０日間の生産時間が通常適切である。流加培養または灌流培養などの当分野で公知の培養方法を使用し得る。培地は、好ましくは無血清培地、より好ましくは無血清および無タンパク質培地、例えば化学的組成の明らかな培地である。そのような培地は、典型的には生産のために使用される特定の細胞型の増殖用に設計され、数多くの適切な培地製剤が市販されている。
【０１０８】
組換え抗体組成物は、培地から得られ、慣用的精製技術によって精製される。これらには、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィおよびゲル濾過などの後続精製段階と組み合わせたアフィニティクロマトグラフィが含まれ得、これらの精製技術は組換え抗体の精製のために頻繁に使用されている。２またはそれ以上の抗体を単一バイオリアクターでポリクローナル細胞株によって生産する場合は、ポリクローナル抗体組成物中の個々の成員すべての存在を、典型的には精製の後で、例えばイオン交換クロマトグラフィによって評価する。ポリクローナル抗体組成物の特性検定は、例えば国際公開第２００６／００７８５３号、同第２００９／０６５４１４号、同第２０１１／０４２０２４号および同第２０１１／０４２０２７号（本明細書中、出典明示により援用）に記載されているように実施し得る。
【０１０９】
治療用組成物
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも１つの抗ＨＥＲ３抗体、または抗ＨＥＲ３組換えＦａｂもしくは別の抗ＨＥＲ３組換え抗体フラグメント組成物を有効成分として含む医薬組成物である。好ましくは、そのような医薬組成物の有効成分は、２またはそれ以上の抗ＨＥＲ３抗体を含む上述したような抗ＨＥＲ３組換え抗体組成物である。そのような組成物は、癌の改善、予防および／または処置を目的とする。医薬組成物は、ヒトまたは家畜もしくはペットに投与され得るが、典型的にはヒトに投与される。
【０１１０】
本発明の治療用組成物中の個々の抗体間の比率、または本発明の個々の抗体が同時に、連続的にもしくは別々に投与される場合には、投与される抗体間の比率は、抗体が等量で投与される比率であることが多いが、これは必ずしもそうである必要はない。したがって、２つの抗ＨＥＲ３抗体を含む本発明の組成物は、それらを１：１の比率で含むことが多く、３つの抗ＨＥＲ３抗体を含む本発明の組成物は、それらを１：１：１の比率で含むことが多い。しかし、個々の抗体の特性によっては、異なる抗体を等しくない量で使用することが望ましい場合があり得る。本発明の組成物中の異なる抗ＨＥＲ３抗体についての適切な比率は、国際公開第２０１０／０４０３５６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように決定され得、そこには、最適の効力および効果を有するコンビナトリアル薬剤を得るために、コンビナトリアル薬剤製品、例えばポリクローナル抗体組成物中の化学的実体間の最適化学量論比を特定し、選択するための方法が記載されている。
【０１１１】
本発明の少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントに加えて、医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤をさらに含む。これらには、例えば防腐剤、安定剤、界面活性剤／湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤が含まれ得る。溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの増粘物質をさらに含み得る。医薬組成物についての適切なｐＨ値は、一般に、必要に応じて緩衝剤を使用して維持され、約５．５〜８．５、例えば約６〜８の範囲内、例えば約７である。
【０１１２】
従来の製薬慣例を用いて、例えば癌患者に投与する適切な製剤または組成物を提供し得る。投与は、典型的には治療的であり、これは、癌状態が診断された後に投与されることを意味する。任意の適切な投与経路、例えば、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻内、エアロゾル、坐剤または経口投与を使用し得る。本発明の医薬組成物は、典型的には液体溶液または懸濁液、より典型的には水溶液または水性懸濁液、特に等張水溶液または等張水性懸濁液の形態で投与される。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で、例えば従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または糖剤化工程によって調製される。医薬組成物は、従来の製薬慣例に従って製剤され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルベニア、米国；およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ編、第３版、２００６，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニューヨーク、ニューヨーク、米国、参照）。
【０１１４】
液体製剤に代わるものとして、本発明の組成物は、少なくとも１つの抗体を単独でまたは担体、例えばマンニトールと共に含む凍結乾燥形態で調製されてもよく、この場合、組成物は使用前に滅菌水などの液体で再構成される。
【０１１５】
医薬組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは約２０％〜約９０％の有効成分を含む。本発明による医薬組成物は、例えばアンプル、バイアル、坐剤、錠剤またはカプセル剤の形態などの単位用量形態で生産され得る。製剤は、癌性疾患または他の状態に対する治療を提供するために治療的または予防的に有効な量（例えば病的状態を予防する、排除するまたは軽減する量）でヒト個体に投与され得る。投与される治療薬の好ましい用量は、癌の重症度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の処方、およびその投与経路などの変数に依存する可能性が高い。
【０１１６】
本発明による抗体および組成物の治療的使用
本発明による抗ＨＥＲ３抗体および医薬組成物は、哺乳動物における疾患の処置または改善のため、特にヒトにおける癌の処置のために使用され得る。本発明の１つの実施形態は、ヒトまたは他の哺乳動物において癌に伴う１またはそれ以上の症状を予防、処置または改善する方法であって、本発明の抗ＨＥＲ３組換え抗体組成物の有効量を前記哺乳動物に投与することを含む方法である。
【０１１７】
特定の実施形態は、ＨＥＲ３の発現を特徴とする障害、特に癌を有するヒト患者を処置するための方法であって、本明細書で定義される組換え抗ＨＥＲ３抗体または、好ましくは、少なくとも２つの本明細書で定義される抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物を前記患者に投与することを含む方法に関する。
【０１１８】
さらなる実施形態は、ＨＥＲ３を発現する細胞においてＨＥＲ３と他のＥｒｂＢファミリー受容体との間のヘテロ二量体形成を低減するための方法であって、前記細胞を本明細書で定義される組換え抗ＨＥＲ３抗体または、好ましくは、少なくとも２つの本明細書で定義される抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物と接触させることを含む方法に関する。
【０１１９】
本発明のさらなる実施形態は、ヒトまたは他の哺乳動物における癌に伴う１またはそれ以上の症状の処置、改善または予防のため、例えばＨＥＲ３の発現を特徴とする障害を有するヒト患者の処置のための組成物を調製するための、本発明の抗ＨＥＲ３組換え抗体または抗体組成物の使用である。
【０１２０】
ＨＥＲ３発現レベルを含む多くの因子に基づき、以下の腫瘍型が特に本発明の抗体組成物による治療に適応され得る：乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、膵癌、頭頸部癌および非小細胞肺癌。本発明の抗体組成物は、ＨＥＲ３を発現する癌、例えば多くの乳癌、卵巣癌および胃癌などの特定の上皮癌の処置に特に適用できることが考えられる。
【０１２１】
これらの適応症のそれぞれに関して、２つの主要な臨床経路、すなわち１）少なくとも１つの付加的な治療処置に関連する補助療法または２）単独療法が考えられる。これら２つの選択肢を以下で簡単に論じる。
【０１２２】
１）補助療法：併用療法としても知られる補助療法では、患者は、少なくとも１つの付加的な治療処置、典型的には化学療法剤もしくは抗腫瘍薬および／または放射線療法を併用して本発明の抗体で処置される。あるいはまたは付加的に、本発明の抗ＨＥＲ３抗体および組成物はまた、異なる抗癌抗体、例えばＥＧＦＲまたはＶＥＧＦを標的とする抗体と組み合わせて使用され得る。したがって、上記で列挙した一次癌標的は、標準的な第一選択療法および第二選択療法に加えて本発明の抗体または組成物の投与によって処置され得る。プロトコールの設計は、例えば腫瘍量の低減ならびに標準的な化学療法の通常用量を低減する能力によって評価される有効性に対応する。そのような用量の低減は、化学療法剤の用量関連毒性を低減することにより付加的なおよび／または長期的な治療を可能にし得る。
【０１２３】
本発明の抗体組成物を、癌細胞の終末分化を誘導することが知られている薬剤と組み合わせることにより、効果をさらに改善し得る。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、シスレチノイン酸、フェニルブチレート、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ヘキサメチレンビスアセトアミド、トランスフォーミング増殖因子β、酪酸、サイクリックＡＭＰおよびベスナリノンから成る群より選択され得る。好ましくは、化合物は、レチノイン酸、フェニルブチレート、オールトランスレチノイン酸、活性型ビタミンＤから成る群より選択される。
【０１２４】
本発明の抗体組成物および少なくとも１つの化学療法化合物または抗腫瘍化合物を含む医薬品は、癌療法における同時、個別または連続投与のための併用処置として使用され得る。化学療法化合物は、問題の特定の癌の処置に適する任意の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物アルカロイド、例えばパクリタキセル、ドセタキセルまたはイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）；トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；および代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシルまたは他のフルオロピリミジンから成る群より選択される薬剤であり得る。
【０１２５】
また、本発明の抗体は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に関連する補助療法において使用され得ることも考えられる。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ部位に関して競合することによりリガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。ＥＧＦＲファミリー受容体をブロックするいくつかのチロシンキナーゼ阻害剤が現在臨床開発段階にある。これらのＴＫＩの総説については、Ｓｐｅｃｔｏｒら（２００７）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９（２）：２０５参照。本発明の抗体組成物およびＨＥＲ３を標的とする少なくとも１つのＴＫＩを含む医薬品は、したがって、癌療法における同時、個別または連続投与のための併用処置としても使用され得る。
【０１２６】
他の実施形態では、本発明の抗体組成物を他の抗体治療薬と組み合わせて使用し得る。これらの例には、例えばＥＧＦＲに対する抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）もしくはＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））またはＶＥＧＦに対する抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ならびに他のＲＴＫ抗体、例えばＨＥＲ２またはＭＥＴなどの１またはそれ以上の他のＲＴＫ標的に対する１またはそれ以上の抗体が含まれる。さらに他の実施形態では、本発明の抗体組成物は、免疫系の細胞を刺激することが知られている薬剤と組み合わせて使用してもよく、そのような併用処置は本発明の抗体組成物の効果の免疫介在性増強をもたらす。そのような免疫刺激剤の例には、組換えインターロイキン（例えばＩＬ−２１およびＩＬ−２）が含まれる。
【０１２７】
２）単独療法：腫瘍の単独療法における本発明に従った抗体の使用に関連して、抗体は、化学療法剤または抗腫瘍薬の同時使用を伴わずに、すなわち単独療法として患者に投与され得る。
【０１２８】
免疫複合体
本発明の抗体および組成物の治療的使用についての別の選択肢は、免疫複合体、すなわち１またはそれ以上の抗癌剤と結合した抗体の形態である。特に別個のＨＥＲ３エピトープに結合する本発明の２またはそれ以上の個別抗体を含む組成物の場合、これは細胞表面に架橋した抗体−受容体格子を生成し、それにより単一モノクローナル抗体の使用と比較して受容体インターナリゼーションのレベル上昇を潜在的にもたらし得ることが考えられる。そのような組成物の個別抗体の１またはそれ以上の、１またはそれ以上の抗癌剤への結合は、それゆえ、結合した抗癌剤を特異的かつ有効に腫瘍細胞の内部へと送達する可能性を有し、それにより本発明の抗ＨＥＲ３抗体の作用を増大させ、改善された腫瘍細胞死滅活性を提供する。
【０１２９】
細胞傷害性物質（従来の化学療法剤および他の低分子抗癌薬）、サイトカイン（この場合複合体は「免疫サイトカイン」と称され得る）、毒素（この場合複合体は「免疫毒素」と称され得る）および放射性核種を含む、様々な種類の抗癌剤を本発明の抗体に結合することができ、少数の免疫複合体は既に臨床使用に関して承認されている。これらには、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（９０Ｙに結合したネズミ抗ＣＤ２０抗体）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（１３１Ｉに結合したネズミ抗ＣＤ２０抗体）およびＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）カリケアマイシンに結合したヒト化抗ＣＤ３３抗体）が含まれる。臨床試験で検討されている他の免疫複合体には、例えばドキソルビシンまたはメイタンシノイド化合物に結合した抗体が含まれる。臨床試験で検討されている免疫毒素には、切頭型シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａに結合したいくつかの抗体が含まれる。ＩＬ−２に結合したヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む免疫サイトカインも試験されている。
【０１３０】
細胞傷害剤に結合させた本発明抗体の場合、これらは、例えば、アルキル化剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン）、アントラサイクリン（例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ）ならびに植物アルカロイド（例えばドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド）を含む、化学療法剤の主要なクラスのいずれかに属し得る。免疫複合体の使用は、抗癌剤を腫瘍に、特にインターナリゼーション後に腫瘍細胞の内部に特異的に向かわせるので、本発明の抗ＨＥＲ３抗体に基づく免疫複合体は、好都合にはカリケアマイシンもしくはメイタンシン誘導体などの高度細胞傷害性物質、または細菌毒素（例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素）もしくは植物毒素（例えばリシン）などの毒素に基づき得る。
【０１３１】
免疫複合体中の結合した抗癌剤は、一般に、血清中では比較的安定であるが、免疫複合体が標的細胞内にインターナライズされた場合薬剤の放出を可能にする不安定なリンカーによって抗体に連結される。適切なリンカーには、例えば、血清中の中性ｐＨでは安定であるが、インターナリゼーション後にリソソーム内の弱酸性条件下で酸加水分解を受ける化学的リンカー、細胞内チオールによって切断されるジスルフィドリンカー、および血清中で安定であるが、細胞内区画では酵素切断を受けるペプチドリンカーが含まれる。
【０１３２】
様々な結合配置が、本発明の２またはそれ以上の抗体を含む組成物において想定され得る。例えば、２つの抗体に関しては、抗体を２もしくはそれ以上の異なる抗癌薬に結合するか、または一方の抗体を、他方の抗体に結合した酵素などの作用物質によって活性化されるプロドラッグに結合することが可能である。抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）の一般的な概念がモノクローナル抗体に関して記述されており、この場合、ｍＡＢ−酵素複合体により腫瘍に標的化された酵素によってプロドラッグが活性化されるが、本発明は、この方法を特定の条件に適合させる可能性を提供し得る。したがって、正常組織への損傷を回避または低減しつつ、腫瘍細胞の死滅を特異的に増大させることが可能であり得る。
【０１３３】
抗癌性免疫複合体に関するさらなる情報については、Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１３７−１１４６；Ｓｃｈｒａｍａら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１４７−１５９；およびＲｏｈｒｅｒ（２００９）ｃｈｉｍｉｃａ ｏｇｇｉ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｄａｙ ２７（５）：５６−６０参照。
【０１３４】
用量および投与経路
本発明の抗体および組成物は、問題の状態の処置に有効な量で、すなわち所望結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与される。治療有効量は、治療されている特定の状態、患者の年齢、性別および体重などの因子、ならびに抗ＨＥＲ３抗体が単独処置として投与されるかまたは１もしくはそれ以上の付加的な抗癌処置と組み合わせて投与されているかによって異なり得る。
【０１３５】
腫瘍治療のための有効量は、患者において疾患の進行を安定化するおよび／または症状を改善する、好ましくは、例えば腫瘍サイズを低減することによって、疾患の進行を逆転させるその能力によって測定され得る。癌を阻害する本発明の抗体または組成物の能力は、例えば実施例で述べるような、インビトロアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における効果を予測する適切な動物モデルにおいて評価され得る。適切な用法は、個々の特定状況において最適の治療応答を提供するために選択され、例えば単回ボーラスとしてまたは持続注入として、および場合によりそれぞれの症例の緊急性によって指示される投与量の調整を伴って投与される。
【０１３６】
本発明による抗体についての明確な投与量はまだ決定されていないが、治療的使用に関して承認されている類似製品（例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体）との比較を通して一定の投与上の考慮事項を決定することはできる。したがって、本発明の抗体組成物の適切な投与量は、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））についての推奨投与量と同様であることが考えられる。 個々の状態によって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、４ｍｇ／ｋｇの初回用量およびその後週１回の２ｍｇ／ｋｇの用量、または８ｍｇ／ｋｇの初回用量およびその後３週間に１回の６ｍｇ／ｋｇの用量のいずれかで乳癌の処置のために（注入によって）投与され、一方Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）は１４日ごとに６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１３７】
本発明の抗体組成物の適切な用量は、０．１−１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５−５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１−２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であると考えられる。抗体組成物は、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、および例えば最大５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大３０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大２０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大１５ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与され得る。投与は、通常は適切な間隔で、例えば週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、担当医師が適切と判断する期間にわたって反復され、担当医師は場合により必要に応じて用量を増加または減少させ得る。
【０１３８】
３つの別個の送達方法が本発明の抗体の送達のために企図される。従来の静脈内送達は、おそらく腫瘍の大多数についての標準的な送達技術である。しかし、卵巣、胆管、他の管等の腫瘍のような腹腔における腫瘍に関しては、腹腔内投与が、腫瘍において抗体の高用量を得るためおよび抗体のクリアランスを最小限に抑えるために好ましいことが証明され得る。同様に、一部の固形腫瘍は局所灌流に適した血管系を有する。局所灌流は、腫瘍の部位で抗体の高用量を得ることを可能にし、抗体の短期的なクリアランスを最小限に抑え得る。
【０１３９】
タンパク質または抗体の注入に基づく治療用製品と同様に、安全上の懸案事項は、主として（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち高血圧、熱、震え、悪寒、（ｉｉ）タンパク質に対する免疫原性応答の発現（すなわち組換え抗体製品に対する患者によるヒト抗体の発現）、および（ｉｉｉ）ＨＥＲ３受容体を発現する正常細胞への毒性に関連する。そのような安全上の懸案事項を監視するために標準的な試験およびフォローアップ手順が用いられる。
【０１４０】
本出願において引用されるすべての特許および非特許参考文献については、それらの全体を出典明示により本明細書に援用する。
【０１４１】
本発明を以下の非限定的実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：抗ＨＥＲ３抗体のクローニング
免疫化
３匹の雌マウス、すなわち１匹のＢＡＬＢ／ｃＪマウス、１匹のＣ５７ＢＬ／６マウスおよび１匹のＣ３Ｈマウス（８−１０週齢）を免疫化のために使用した。マウスを市販のＨＥＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）で免疫化した。最初の４回の免疫化に関しては、ＨＥＲ３タンパク質をＰＢＳに希釈し、フロイントアジュバントと１：１（ｖ／ｖ）で混合した。５回目および最後の免疫化は、アジュバントなしで、ＰＢＳ中のＨＥＲ３タンパク質で行った。
【０１４３】
アジュバントは、免疫応答を増強し、調節するために使用される。１回目の免疫化では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用し、２回目、３回目および４回目の免疫化には不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。ＩＦＡは鉱油から成る水中油型エマルションであり、ＣＦＡは、加熱殺菌した乾燥ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種を添加したＩＦＡである。どちらのアジュバントもデポー作用を有する。ＣＦＡ中のミコバクテリウムは免疫系の強力な活性化を生じさせ、免疫応答の長期的な持続をもたらす。安定なエマルションだけをマウスに投与した。
【０１４４】
組換えＨＥＲ３タンパク質１０μｇをそれぞれの免疫化に使用した。合計で、マウスは５回の注射を受けた。最初の４回の注射についてはすべてのマウスに抗原−アジュバントエマルション２００μｌを皮下（ｓ．ｃ．）注射し、５回目の注射についてはＰＢＳ中の抗原１００μｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。免疫化、アジュバント、注射経路等の要約を表４に示す。
【０１４５】
マウスを頚椎脱臼によって犠死させ、脾臓と鼡径リンパ節を採取した。７０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５２３５０）に通して解離させることにより、単細胞懸濁液を調製した。３匹のマウスからの細胞をプールし、１０％ＦＢＳを含む冷ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁して、遠沈させた。
表４：免疫化の要約
【表４】
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【０１４６】
ネズミ形質細胞のＦＡＣＳ選別
赤血球を取り除くため、プールした細胞懸濁液を０．１７Ｍ  ＮＨ４Ｃｌに溶解した。 溶解後、細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳ  １ｍｌに再懸濁し、Ｆｃ−ブロック（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３１４１） と共にインキュベートして、１回洗浄した。２％ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した後、細胞を抗マウスＣＤ４３−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３２７０）、抗マウスＣＤ１３８−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３７１４）、抗マウスＩｇＭ−Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６０５７５）、抗マウスＩｇＧ１−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５０８７４）、抗マウスＭＨＣ ＩＩ（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅｄ）−ビオチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３６２２）および抗マウスＢ２２０／ＣＤ４５Ｒ−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３０９３）で２０分間、暗所において染色した。 細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４０６３）と共に２０分間インキュベートして、洗浄した。細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーターでＦＡＣＳ選別した。Ｂ２２０ｌｏｗＭＨＣＩＩｉｎｔＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋ＩｇＭ−である細胞を、ＰＣＲ反応緩衝液を含む３８４ウェルマイクロタイタープレートに単細胞選別した。プレートを遠心分離し、凍結して、−８０℃で保存した。
【０１４７】
コグネイトＶＨおよびＶＬ対の連結
ＶＨおよびＶＬコード−配列の連結を、形質細胞としてゲートした単一細胞に関して実施し、ＶＨおよびＶＬコード配列のコグネイト対合を容易にした。手順は、１段階多重オーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲとそれに続くネステッドＰＣＲに基づく２段階ＰＣＲ手法を用いた。本実施例で使用したプライマーミックスはκ軽鎖だけを増幅する。しかし、所望する場合は、λ軽鎖を増幅することができるプライマーを多重プライマーミックスおよびネステッドＰＣＲプライマーミックスに添加することができる。λプライマーを添加する場合は、λ陽性細胞が排除されないように選別手順を適合させるべきである。コグネイトＶＨおよびＶＬ配列の連結についての原理は、国際公開第２００５／０４２７７４号およびＭｅｉｊｅｒら（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３５８（３）：７６４−７２で詳細に説明されている。
【０１４８】
９６ウェルＰＣＲプレートを解凍し、選別した細胞を多重オーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。単細胞選別の前に各ウェルに添加した選別緩衝液は、反応緩衝液（ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液；Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーおよびＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。オーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーならびにプライマー濃度は、国際公開第２００８／１０４１８３号の表３に列挙されているものと同じであった。これに、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ５Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（２５倍希釈；Ｑｉａｇｅｎ）およびｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）を添加して、反応容量２０μｌ中で所与の最終濃度を得た。プレートを５５℃で３０分間インキュベートし、各細胞からＲＮＡを逆転写（ＲＴ）させた。ＲＴ後、プレートを以下のＰＣＲサイクルに供した：９４℃、１０分、３５×（９４℃、４０秒、６０℃、４０秒、７２℃、５分）、７２℃、１０分。
【０１４９】
ＰＣＲ反応は、ハイスループットを容易にするため２４枚の９６ウェルプレート用のＰｅｅｌ Ｓｅａｌ Ｂａｓｋｅｔ（ＡＢｇｅｎｅ）を用いてＨ２０ＢＩＴ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで実施した。サイクリング後、ＰＣＲプレートを−２０℃で保存した。
【０１５０】
ネステッドＰＣＲ段階については、所与の最終濃度を得るために各ウェル中に以下の混合物（反応物２０μｌ）を含む９６ウェルＰＣＲプレートを調製した：１× ＦａｓｔＳｔａｒｔ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ネステッドプライマーミックス、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（０．０８Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｌｅｎｄ（０．８Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）。ネステッドＰＣＲに使用したプライマーならびにプライマー濃度は、国際公開第２００８／１０４１８３号の表４に列挙されているものと同じであった。ネステッドＰＣＲのための鋳型として、多重オーバーラップ伸長ＰＣＲ反応物から１μｌを移した。ネステッドＰＣＲプレートを以下のサーモサイクリングに供した：３５×（９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、９０秒）、７２℃、１０分。無作為に選択した反応物を１％アガロースゲル上で分析し、約８９０塩基対（ｂｐ）のオーバーラップ伸長フラグメントの存在を確認した。ＰＣＲフラグメントのさらなるプロセッシングまで、プレートを−２０℃で保存した。
【０１５１】
ネステッドＰＣＲからの連結したＶＨおよびＶＬコード対のレパートリーを、異なるドナーからの対を混合せずにプールし、分取用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。ヒトκ定常軽鎖をコードする配列を、国際公開第２００８／１０４１８３号に記載されているように、オーバーラップ伸長法によって連結したＶＨおよびＶＬコード対のプールしたＰＣＲ産物のＶＬコード領域にスプライスした。ヒトκ定常軽鎖コード配列を、κ軽鎖を有するヒト抗体のコード配列を含むプラスミドから、総容量５０μｌ中、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（２Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ｈＫＣｆｏｒｗ−ｖ２プライマーおよびκ３’プライマー（使用したプライマーおよび濃度については国際公開第２００８／１０４１８３号の表５参照）ならびにプラスミド鋳型ｐＬＬ１３８（１０ｎｇ／μｌ）を含む反応物において増幅した。反応物を以下のサーモサイクリングに供した：２５×（９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、４５秒）、７２℃、１０分。生じたＰＣＲフラグメントを分取用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１５２】
各レパートリーからの精製プールＰＣＲフラグメントを、次のものを含むオーバーラップ伸長ＰＣＲ（総容量５０μｌ）による以下のスプライシングによって、ヒトκ定常コード領域の増幅精製したＰＣＲフラグメント（配列番号４２）にスプライスした：ヒトκ定常コード領域フラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、精製プールＰＣＲフラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｌｅｎｄ（０．２Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）、１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ｍｈＫＣｒｅｖプライマーおよびｍＪＨセットプライマー（使用したプライマーおよび濃度については国際公開第２００８／１０４１８３号の表５参照）。反応物を以下のサーモサイクリングに供した：９５℃、２分、２５×（９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分）、７２℃、１０分。生じたＰＣＲフラグメント（約４５１８ｂｐ）を分取用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１５３】
コグネイトＶＨおよびＶＬコード対のスクリーニングベクターへの挿入
ＨＥＲ３に対して結合特異性を有する抗体を同定するために、得られたＶＨおよびＶＬコード配列を完全長抗体として発現させた。これには、ＶＨおよびＶＬコード対のレパートリーを発現ベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトすることが含まれた。
【０１５４】
連結したＶＨおよびＶＬコード対を含む発現ベクターのレパートリーを作製するため、２段階クローニング手順を用いた。統計的に、発現ベクターのレパートリーが、スクリーニングレパートリーの作製に使用されるコグネイト対のＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物の数の１０倍に相当する数の組換えプラスミドを含む場合、すべてのユニークな遺伝子対が示される可能性は９９％ある。したがって、４００個のオーバーラップ伸長Ｖ遺伝子フラグメントが得られた場合、すべてのユニーク遺伝子対の９９％の可能性を有するスクリーニングのために少なくとも４０００クローンのレパートリーを作製する。
【０１５５】
簡単に述べると、ヒトκ定常コード領域にスプライスした、連結ＶＨおよびＶＬコード対のレパートリーの精製ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物の末端に導入した認識部位でＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ  ＤＮＡエンドヌクレアーゼにより切断した。切断し、精製したフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター００−ＶＰ−００２（国際公開第２００８／１０４１８３号に記載されている）に、標準的な連結手順によって連結した。連結混合物を大腸菌に電気穿孔し、適切な抗生物質を含む２×ＹＴプレートに添加して、３７℃で一晩インキュベートした。増幅したベクターのレパートリーを、標準的なＤＮＡ精製方法（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプレートから回収した細胞から精製した。ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩエンドヌクレアーゼを使用した切断によるプロモーター−リーダーフラグメントの挿入のためにプラスミドを調製した。これらの酵素の制限部位は、ＶＨおよびＶＬコード遺伝子対の間に位置した。ベクターの精製後、ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩ消化二方向性哺乳動物プロモーター−リーダーフラグメントを標準的な連結手順によってＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。連結されたベクターを大腸菌で増幅し、標準的な方法を用いてプラスミドを精製した。作製したスクリーニングベクターのレパートリーを、従来の手順によって大腸菌に形質転換した。得られたコロニーを３８４ウェルマスタープレートに集約し、保存した。
【０１５６】
哺乳動物発現プラスミドの増幅のために２段階手順を使用した。最初に、水酸化ナトリウム中でインキュベートすることによって細菌を溶解し、ＤＮＡを変性させた。その後、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅を実施した（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）。この方法は、ローリングサークル増幅法によって二本鎖環状ＤＮＡ鋳型を指数関数的に増幅するためにバクテリオファージΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを利用する。哺乳動物細胞における抗体発現のために、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者によって推奨される標準的なトランスフェクション条件を用いて適用した。トランスフェクションの前に細胞にバルプロエートを添加して５０ｍＭとし、その翌日、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｎ１を加えてトランスフェクション容量の１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度にした。トランスフェクションの６日後に抗体を含む上清を採取した。標準的な抗ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで発現レベルを評価した。
【０１５７】
組換えＨＥＲ３タンパク質への結合に関するスクリーニング（ＥＬＩＳＡ）
組換えＨＥＲ３タンパク質を抗原として使用して、抗体特異性をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１５８】
簡単に述べると、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（カタログ番号４６４７１８）を、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌ  ＨＥＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）により４℃で一晩被覆した。５０μｌの２％乳−ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中でのブロッキングに先立ち、プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した。プレートをＰＢＳ−Ｔおよび２０μｌの２％乳−ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３トランスフェクタントからの上清１０μｌを添加して、室温で１時間インキュベートし、その後プレートを各ウェルにつきＰＢＳ−Ｔ、２０μｌで１回洗浄した。ウェルに結合した抗体を検出するために２％乳−ＰＢＳ−Ｔで１：２５０００希釈した二次抗体（ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトκ軽鎖、Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＳＴＡＲ １００Ｐ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した後、基質２５μｌ（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号４５１８）を添加し、５分間インキュベートした。反応を停止させるため、インキュベーション後に１Ｍ硫酸２５μｌを添加した。４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーにて特異的シグナルを検出した。ＥＬＩＳＡデータから４８０の陽性抗体クローンを同定し、配列分析およびＨＥＲ３への結合の確認のために選択した。
【０１５９】
配列分析およびクローン選択
ＥＬＩＳＡによりＨＥＲ３に結合すると同定されたクローンを元のマスタープレート（３８４ウェル形式）から回収し、寒天プレートに画線接種して単一コロニーを作製し、コロニーをＬＢ培地培養物に取り、激しく振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。Ｑｉａｐｒｅｐ ９６ターボミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１９３）を用いてプラスミドＤＮＡをクローンから単離し、Ｖ遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定に供した。配列を整列させ、すべてのユニークなクローンを選択した。得られた配列のマルチプルアラインメントは個々のクローンのユニーク性を明らかにし、ユニークな抗体の同定を可能にした。配列決定したクローンの配列分析後、２〜４０を超える成員を有する関連配列の３３のクラスターならびに一度だけ提示された２０のクローン型を同定した。関連配列の各クラスターは、おそらく共通の前駆体クローンの体細胞超突然変異を通して誘導された。全体で、各クラスターから１〜２個のクローンを配列および特異性の検証のために選択した。クラスター分析に基づき、１１９のクローンを小規模発現およびさらなる特性検定のために選択した。選択した抗体可変領域の配列を付属の配列表に示す。上記で説明したように、配列表に示す軽鎖配列はすべて、アミノ酸−ＴＶＡＡＰ−で始まり、Ｃ末端の−ＮＲＧＥＣで終了する、同じヒトκ定常領域を含む。抗体をコードするクローンを検証するため、ＤＮＡプラスミドを調製し、２ｍｌ規模でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションを発現のために実施した。トランスフェクションの６日後に上清を採取した。発現レベルを標準的な抗ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで評価し、「組換えＨＥＲ３タンパク質への結合に関するスクリーニング」で上述したようにＨＥＲ３特異的ＥＬＩＳＡによって、およびＨＥＲ３過剰発現細胞への抗体結合のハイスループットスクリーニング共焦点顕微鏡検査によって特異性を測定した（下記参照）。
【０１６０】
ＨＥＲ３過剰発現細胞への結合に関するスクリーニング（ＯＰＥＲＡ）
１１９のクローンを、共焦点顕微鏡検査を用いてＨＥＲ３過剰発現性乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）への結合に関してスクリーニングした。１００００個のＭＣＦ−７細胞を３８４ウェル細胞担体プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００７４３９）の各ウェルに接種し、一晩付着させた。培地を再び廃棄し、細胞を２％ホルムアルデヒド溶液（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号５３３９９８）で洗浄し、固定した。洗浄後、抗体上清４０μｌを各ウェルに移し、プレートを２時間インキュベートして、その後ウェル中の培地を廃棄し、２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１０１３）、２μｇ／ｍｌのＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｈ３４５５８）および１μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｈ３５７０）を含む新しい培地３０μｌを各ウェルに添加して、プレートをさらに３０分間インキュベートした。次にＯＰＥＲＡハイスループット共焦点顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて蛍光のレベルを測定した。
【０１６１】
ＥＬＩＳＡおよびＯＰＥＲＡ検証スクリーニングによって得られた結合データから、６４のクローンを中規模発現のために選択した。
【０１６２】
実施例２：選択した抗ＨＥＲ３抗体の機能的特性検定
６７のユニークな抗体を、生存性アッセイを用いた機能試験のために選択した。細胞損傷は、代謝細胞機能および増殖を維持し、そのためのエネルギーを提供する細胞の能力の喪失を不可避的にもたらす。代謝活性アッセイはこの前提に基づいており、通常はミトコンドリア活性を測定する。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１ ６４４ ８０７ ００１）は、生細胞の代謝活性を測定する、すぐ使用できる基質である。この実施例では、ＷＳＴ−１アッセイを使用して、２μｇ／ｍｌの種々の抗ＨＥＲ３抗体で癌細胞を９６時間処理した後、代謝活性細胞の数を測定した。
【０１６３】
癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−２５）、Ａ４３１ＮＳ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２５９２）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−２２）およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−１３０）を、２μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体を含む培地中１０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに接種した。プレートを加湿インキュベータにおいて３７℃で４日間インキュベートした。次にＷＳＴ−１試薬２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次にプレートを軌道プレートシェーカーに移し、さらに１時間放置した。ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍと６２０ｎｍ（参照波長）で吸光度を測定した。代謝活性細胞（ＭＡＣ）のレベルの差を以下のように対照上清のパーセントとして計算した：
【数１】
2014503189.tif 000007
【０１６４】
代謝活性は生細胞の数と相関し、より低いＭＡＣ％はより高いレベルの抗体による細胞増殖阻害に対応すると推測される。
【０１６５】
選択抗体についてのこの分析の結果を以下の表５に示しており、表５では、個々の癌細胞株ならびに４つの細胞株にわたる阻害のメジアンレベルのデータが提供される。一連の機能活性を有するＨＥＲ３抗体が同定され、レパートリー内の抗体が試験した癌細胞株の全部または大部分に対して阻害作用を示すことは、これらの結果から明らかである。
表５：抗ＨＥＲ３抗体の存在下での代謝活性細胞（ＭＡＣ）パーセント
【表５】
2014503189.tif 000008
【０１６６】
ＨＥＲ３阻害に対して最も感受性の高い細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５を使用して、表５の１０の抗体に関して用量反応曲線を作成した：図１−１０参照、これらの表は、種々の濃度の示された抗体で９６時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の代謝活性を示す。試験したすべての抗体がＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の増殖をブロックするが、図１−１０に示すインビボデータに基づくと、抗体５１０１および５１０６が最も有効であると思われる。
【０１６７】
実施例３：抗ＨＥＲ３抗体によるＨＥＲ３リン酸化の阻害
この実施例は、抗ＨＥＲ３抗体がＨＥＲ３のリガンド誘導性リン酸化を阻害できることを明らかにする。
【０１６８】
方法
抗ＨＥＲ３抗体で処理した細胞株におけるＨＥＲ３リン酸化のレベルを調べるため、抗体で１時間前処理し、その後１０ｎＭのヘレグリンβで刺激したＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物に関してウエスタンブロット分析を実施した。細胞をＴ−７５培養フラスコで増殖させ、８０％の集密度で培地を取り除いて、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＢＳを含む培地５ｍｌに希釈した１０μｇ／ｍｌの抗体で処理した。細胞を１時間処理し、その後標準的なＲＩＰＡ緩衝液を使用して全細胞溶解物を調製した。各試料において総タンパク質濃度を測定し、タンパク質１０μｇを、リン酸化ＨＥＲ３（ｐＨＥＲ３）に対する一次抗体を使用してウエスタンブロット法によって分析した。
【０１６９】
結果
示されている抗体での１時間の前処理とそれに続く１０ｎＭヘレグリンβでの刺激後の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ７におけるホスホ−ＨＥＲ３レベルのウエスタンブロット分析の結果を図１１に示す。種々の抗ＨＥＲ３抗体はリガンド誘導性ＨＥＲ３リン酸化を様々な程度に阻害したが、このアッセイにおける最良の抗体は５１０１、５１０６、５２５９および４８８９であった。抗体５０３８および５１４３は、これらの細胞株においてリン酸化ＨＥＲ３のレベルに限られた効果しか及ぼさなかった。
【０１７０】
実施例４：２つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物の機能的特性検定
この実施例は、ヒトＨＥＲ３への結合が確認された本発明の１０の選択された抗ＨＥＲ３抗体の中の２つの抗体のすべての可能な混合物のインビトロ試験を述べる。抗体混合物を、４つの異なる癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＣＦ７（＋１ｎＭヘレグリンβ）、Ｈ１４３７（＋１ｎＭヘレグリンβ）およびＡ４３１ＮＳ（１μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ混合物９９２＋１０２４）の増殖を阻害するそれらの能力に関して評価した。抗ＥＧＦＲ混合物９９２＋１０２４は、国際公開第２００８／１０４１８３号に記載されている９９２および１０２４と称される２つの抗ＥＧＦＲ抗体の等量を含む。
【０１７１】
方法
それぞれヒトＨＥＲ３受容体への結合が確認されている抗体４７８５、４８８９、４９３５、５０３８、５０８２、５１０１、５１０６、５１４３、５１４４および５２５９を、最適効果を有する抗体混合物を同定するために２つの抗体のすべての可能な混合物において試験した。例えば３８４ウェルプレートにおいて種々の抗体の組合せを調製するために使用した方法は、国際公開第２０１０／０４０３５６号で一般的に述べられているものであった。さらなる詳細は下記で述べる。
【０１７２】
２つの抗体の混合物
１０の抗体を、１×ＰＢＳ中で２５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、試験用の２つの抗体の混合物を調製するのに使用するために抗体溶液１００μｌを３８４ウェルフィーダープレートのウェルに添加した。
【０１７３】
試験した４つの細胞株のそれぞれについて、２つの別々の３８４ウェルプレートを使用し、細胞を含む培地４６μｌをウェルに添加した。Ｂｉｏｍｅｋ ３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、２つの異なる抗体のすべての組合せが提示されるように、フィーダープレートから２つの異なる抗体各２μｌを、培地＋細胞を含む３８４ウェルプレートのウェルに添加した。加えて、プレートは、培地対照ウェル（１×ＰＢＳ培地５０μｌ；細胞なし）、未処理対照ウェル（１×ＰＢＳ培地５０μｌ＋細胞；抗体なし）、および付加的な対照として本発明の１０抗体のうち１つだけと培地４μｌを含む（培地４６μｌ＋細胞に加えて）ウェルを含んだ。
【０１７４】
２つの抗体の混合物を含むウェル、ならびに培地対照および未処理対照ウェルまたは本発明の単一抗体を含むウェルを有するプレートを加湿インキュベータにおいて３７℃で４日間インキュベートし、その後１×ＰＢＳ中で１：１希釈した細胞増殖試薬ＷＳＴ−１、５μｌをプレート上のすべての関連ウェルに添加した。次にプレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後軌道シェーカーに移して、さらに１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍと６２０ｎｍ（参照波長）で吸光度を測定した。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を実施例２で述べたように計算した。
【０１７５】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ−７を使用して、選択した混合物（下記の表６において太字で表示している）に関して用量反応曲線を作成した。ＷＳＴ−１アッセイを実施する前に、適切な抗体および抗体混合物を、２％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加した適切な培地中１００μｇ／ｍｌの最終総抗体濃度に希釈し、最高抗体濃度を含むウェルで５０μｇ／ｍｌの最終総抗体濃度を生じさせた。次に抗体の２倍連続希釈を実施した。その後適切な数の細胞を３８４ウェルプレートの実験ウェルに添加した。プレートを加湿インキュベータにおいて３７℃で４日間インキュベートした。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を、実施例２で述べたように未処理対照のパーセントとして計算した。
【０１７６】
結果
個々の抗体および２つの抗体の混合物を、ＭＡＣ％として計算した、細胞増殖へのそれらのメジアン効果によってランク付けをした。結果を以下の表６に示す。
【０１７７】
結果は、様々な混合物による増殖阻害のレベルは種々の細胞株の間で大きく異なるが、メジアンＭＡＣ％の差はそれほど顕著でないことを示す。モノクローナル抗体５０８２は最高レベルのメジアン増殖阻害（最低ＭＡＣ％）を有することが認められたが、いくつかの抗体混合物は細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５を阻害するうえで勝っている。表６の抗体および抗体混合物は４つの細胞株についてのメジアンＭＡＣ％に基づいてランク付けされているが、個々の抗体混合物はいずれか１つまたはそれ以上の細胞株で明らかにされた効果に基づいて興味深いものであり得ること、および単一細胞株だけでの高レベルの阻害（低いＭＡＣ％）は特定の種類の癌に対するインビボでの極めて有用な抗体の組合せになり得ることに留意すべきである。
【０１７８】
ＨＥＲ３の非オーバーラップエピトープおよびユニークなエピトープビンの組合せに結合する２つの抗体の混合物（太字で表示）について用量反応曲線を作成した。結果は、すべての混合物が、効力は異なるが、４つの細胞株すべてを阻害することを示す。
表６：４つの癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＣＦ７、Ｈ１４３７およびＡ４３１ＮＳにおける２つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物による癌細胞増殖阻害のレベル。阻害のレベルを代謝活性細胞の％（ＭＡＣ％）として示す。
【表６−１】
2014503189.tif 000009
【表６−２】
2014503189.tif 000010
＊Ｓｙｍ００４は、非オーバーラップＥＧＦＲエピトープに対する２つの組換え抗ＥＧＦＲ抗体の混合物である；国際公開第２００８／１０４１８３号およびＰｅｄｅｒｓｅｎら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（２）：５８８−５９７参照。
【０１７９】
図１２−１５は、４つの異なる細胞株における抗ＨＥＲ３抗体の選択混合物（上記の表において太字で表示した混合物）の代謝活性を示す。図１２は、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞株における代謝活性を示し、図１３は、１μｇ／ｍｌのＳｙｍ００４の存在下でのＡ４３１ＮＳ細胞株における活性を示し、図１４は、１ｎＭヘレグリンβの存在下でのＭＣＦ７細胞株における活性を示し、図１５は、１ｎＭヘレグリンβの存在下でのＨ１４３７細胞株における活性を示す。
【０１８０】
実施例５：３つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物の機能的特性検定
この実施例は、ヒトＨＥＲ３への結合が確認された本発明の選択された抗ＨＥＲ３抗体の中で非オーバーラップエピトープおよびユニークなエピトープビンの組合せを有する３つの抗体の混合物のインビトロ試験を述べる。抗体混合物を、４つの異なる癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＣＦ７（＋１ｎＭヘレグリンβ）、Ｈ１４３７（＋１ｎＭヘレグリンβ）およびＡ４３１ＮＳ（１μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ混合物９９２＋１０２４）の増殖を阻害するそれらの能力に関して評価した。
【０１８１】
方法
それぞれヒトＨＥＲ３受容体への結合が確認されている抗体４７８５、４８８９、５０３８、５０８２、５１０６、５１４３および５２５９を、最適効力を有する抗体混合物を同定するために３つの抗体混合物において試験した。選択した抗体および抗体混合物を、実施例４で述べたＷＳＴ−１生存性アッセイを用いて癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＣＦ７（＋１ｎＭヘレグリンβ）、Ｈ１４３７（＋１ｎＭヘレグリンβ）およびＡ４３１ＮＳ（１μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ混合物９９２＋１０２４）の成長および増殖を阻害する能力に関して評価した。
【０１８２】
結果
３つの抗体の試験した混合物すべてが、効力は異なるが、４つの細胞株すべてを阻害することが認められた。
【０１８３】
図１６−１９は、４つの癌細胞株における３つの抗ＨＥＲ３抗体の異なる混合物の代謝活性を示す。図１６は、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞株における代謝活性を示し、図１７は、１μｇ／ｍｌのＳｙｍ００４の存在下でのＡ４３１ＮＳ細胞株における活性を示し、図１８は、１ｎＭヘレグリンβの存在下でのＭＣＦ７細胞株における活性を示し、図１９は、１ｎＭヘレグリンβの存在下でのＨ１４３７細胞株における活性を示す。
【０１８４】
実施例６：抗ＨＥＲ３の２つの混合物による癌増殖の相乗作用的阻害
この実施例は、特定の抗ＨＥＲ３抗体混合物が癌細胞の増殖を相乗作用的に阻害することを明らかにする。
【０１８５】
方法
それぞれヒトＨＥＲ３受容体に結合することが確認されている抗体５０３８、５０８２および５１４４を、２つの抗体の混合物、５０３８＋５０８２および５０８２＋５１４４として試験し、それぞれの場合に、細胞増殖の相乗作用的阻害を調べるため、２抗体の混合物を混合物中の２つの個々の抗体と比較した。選択した抗体および抗体混合物を、実施例４で述べたＷＳＴ−１生存性アッセイを用いて癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５の成長および増殖を阻害するそれらの能力に関して試験した。
【０１８６】
結果
結果は、抗体の混合物５０３８＋５０８２または５０８２＋５１４４が癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５の増殖を相乗作用的に阻害することを示す（図２０および２１）。
【０１８７】
実施例７：抗ＨＥＲ３抗体混合物と参照モノクローナル抗体の比較
この実施例では、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ−７における抗ＨＥＲ３抗体混合物（５０３８＋５０８２）と参照抗体ペルツズマブおよびＭＭ−１２１の類似体とのインビトロ比較について述べる。 ペルツズマブは、ＨＥＲ２の二量体化アームに結合し、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化をブロックする抗ＨＥＲ２抗体である。ペルツズマブ類似体は、国際公開第２００６／０３３７００号および米国特許出願第２００６／０１２１０４４ Ａ１号に開示されているようにペルツズマブの軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する。ＭＭ−１２１は、ＨＥＲ３へのヘレグリンの結合をブロックし、したがってＨＥＲ３の活性化をブロックする抗ＨＥＲ３抗体である（国際公開第２０１０／０１９９５２号およびＳｃｈｏｅｂｅｒｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０（６）：２４８５−９４、２０１０年３月参照）。
【０１８８】
方法
実施例４で述べたように用量反応曲線を作成した。参照抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体ＭＭ−１２１（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ；国際公開第２００８／１００６２４号に開示されている配列）および参照抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）、２Ｃ４およびＲ−１２７３としても知られる；米国特許出願第２００６／１２１０４４ Ａ１号に開示されている配列）の類似体を、シグナルペプチドを有さないそれぞれの抗体のλ軽鎖（ＭＭ−１２１）またはκ軽鎖（ペルツズマブ）全体を合成し、隣接するＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を付加して、ＨＥＫ ２９３細胞の一過性発現のために発現ベクターにクローニングすることによって作製した。それぞれの抗体の重鎖ＶＨ領域をシグナルペプチドなしで合成し、その後ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位を付加して、生じた配列を軽鎖発現のために使用したのと同じ発現ベクターにクローニングしたところ、前記発現ベクターは、３つの定常ＩｇＧ重鎖ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３をコードする配列も同時に含んでいた。ベクターは、各抗体の２本鎖の発現のためにヘッドトゥーヘッド配向で一対のＣＭＶプロモーターを含んだ。
【０１８９】
結果
結果は、抗体混合物５０３８＋５０８２が、２つの癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＣＦ７の増殖を阻害するうえで参照抗体ＭＭ−１２１より優れていることを示す。これらの細胞株を使用したところ、ペルツズマブに対する５０３８＋５０８２の明らかな優位性は認められなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞における代謝活性を図２２に示し、１ｎｍヘレグリンβの存在下でのＭＣＦ７細胞の代謝活性を図２３に示す。
【０１９０】
実施例８：抗ＨＥＲ３抗体混合物はＨＥＲ３の分解を誘導する
この実施例は、２つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物が、個々の抗ＨＥＲ３抗体と比較してより有効なＨＥＲ３分解を誘導できることを明らかにする。ペルツズマブ類似体もこの試験で検討した。
【０１９１】
方法
抗ＨＥＲ３抗体で処理した細胞株におけるＨＥＲ３のレベルを調べるため、抗体で様々な時間処理したＯＶＣＡＲ−８細胞の全細胞溶解物に関してウエスタンブロット分析を実施した。細胞をＴ−７５培養フラスコで増殖させ、８０％の集密度で培地を取り除いて、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＢＳを含む培地５ｍｌに希釈した２０μｇ／ｍｌの抗体で処理した。細胞を１、２、４、１６または４８時間処理し、その後標準的なＲＩＰＡ緩衝液を使用して全細胞溶解物を調製した。各試料において総タンパク質濃度を測定し、タンパク質１０μｇを、ＨＥＲ３に対する一次抗体を使用してウエスタンブロット法によって分析した。
【０１９２】
結果
ＨＥＲ３レベルの検討からの結果（図２４）は、個々の抗体および混合物の両方が迅速なＨＥＲ３分解を誘導することを明らかにした。しかし、抗ＨＥＲ３混合物は、個々の抗体と比較してより高レベルのＨＥＲ３分解を誘導した。ペルツズマブ類似体はＨＥＲ３分解を誘導することができず、これは、ペルツズマブがＨＥＲ３ではなくＨＥＲ２に結合することを考慮すると予想されたことであった。
【０１９３】
実施例９：抗ＨＥＲ３抗体混合物はＨＥＲ３シグナル伝達を阻害する
この実施例は、２つの抗ＨＥＲ３抗体の混合物が個々の抗体よりも有効なＨＥＲ３リン酸化および下流シグナル伝達の抑制を誘導できることを明らかにする。
【０１９４】
方法
ＨＥＲ３リン酸化および下流シグナル伝達のレベルを調べるため、細胞株を抗ＨＥＲ３抗体で様々な時間処理し、全細胞溶解物に関してウエスタンブロット分析を実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞をＴ−７５培養フラスコで増殖させ、８０％の集密度で培地を取り除いて、その後細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＢＳを含む培地５ｍｌに希釈した１０μｇ／ｍｌの抗体で処理した。細胞を２、４、１６または４８時間処理し、その後標準的なＲＩＰＡ緩衝液を使用して全細胞溶解物を調製した。各試料において総タンパク質濃度を測定し、タンパク質１０μｇを、ｐＨＥＲ３、ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４６５）、ＡＫＴおよびＡｃｔｉｎに対する一次抗体をそれぞれ使用してウエスタンブロット法によって分析した。
【０１９５】
結果
ＨＥＲ３シグナル伝達の検討からの結果（図２５）は、個々の抗体および混合物の両方がＨＥＲ３およびＡＫＴリン酸化の迅速な阻害を誘導することを明らかにした。しかし、抗ＨＥＲ３混合物は、ＨＥＲ３およびＡＫＴリン酸化を阻害するうえで個々の抗体より優れていた。
【０１９６】
実施例１０：抗ＨＥＲ３混合物のインビボ効力
抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体５０３８および５０８２ならびに５０３８＋５０８２の混合物のインビボ効力を評価するため、化合物をＡ５４９肺癌異種移植モデルで試験した。
【０１９７】
方法
２×１０６のＡ５４９細胞を８〜１０週齢の雌無胸腺ヌードマウスの左側腹部に皮下接種した。腫瘍をカリパスで週に２回測定し、ｍｍ３での腫瘍体積を式：（幅）２×長さ×０．５に従って計算した。１１５ｍｍ３の平均腫瘍サイズでマウスをランダム化し、処置を開始した。マウスを５０ｍｇ／ｋｇの５０３８、５０８２または５０３８＋５０８２の腹腔内注射で週に２回５週間にわたって（合計１０回の注射）処置し、その後を観察期間とした。実験は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ（アイソタイプ対照として）およびビヒクル対照を含み、これらをそれぞれ抗ＨＥＲ３抗体に関するのと同じスケジュールに従って投薬および投与した。
【０１９８】
結果
この試験の結果を図２６に示しており、５０３８または５０３８＋５０８２の組合せで処置したマウスでは、２６日目（処置開始）から３７日目まで処置に応答して腫瘍増殖が抑制されたことがわかる。この時点以後、２つの群の腫瘍は増殖し始めたが、成長はセツキシマブまたはビヒクル対照群と比較してより緩やかであった。この時点後の結果は統計的に有意ではないが、５０３８および５０３８＋５０８２処置群における腫瘍は、対照群ならびにセツキシマブまたは５０８２摂取群における腫瘍と比較してよりゆっくり増殖する明らかな傾向がある。５０８２単独またはセツキシマブで処置したマウスは処置に応答せず、ビヒクル対照群と同様の腫瘍増殖速度を示した。
【０１９９】
要約すると、結果は、５０３８および５０３８＋５０８２の組合せが、５０８２単独、セツキシマブまたはビヒクル対照での処置と比較してＡ５４９腫瘍異種移植片の成長を抑制するのにより良好であったことを示唆する。
【０２００】
実施例１１：個々のＨＥＲ３ドメインへの抗ＨＥＲ３抗体のマッピング
この実施例は、機能活性を有する抗ＨＥＲ３抗体の作製したパネルが、ヒト／マウスキメラ受容体構築物への結合プロフィールによって示されるＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のドメインＩまたはドメインＩＩを対象とすることを明らかにする。
【０２０１】
方法
抗ＨＥＲ３抗体パネルはマウスにおいて惹起されたため、「自己耐性」の概念により抗体はネズミＨＥＲ３上に存在するエピトープを認識しないと予想される。その結果として、抗体はヒトＨＥＲ３構築物に挿入されたネズミ配列に結合しないと予想されるので、個々のドメインをコードするヒト配列がネズミ配列で置換されたキメラ受容体構築物をエピトープマッピングのために使用することができる。ヒトおよびネズミＨＥＲ３  ｍＲＮＡ配列（それぞれ受入番号Ｍ２９３６６およびＮＭ＿０１０１５３．１）をＮＣＢＩからダウンロードし、細胞外ドメインＩ−ＩＶをＫａｎｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：８２３８−８２４７）によって述べられているように割り当てた。４つの各ヒト細胞外ＨＥＲ３ドメインがそれぞれのネズミＤＮＡ配列によって置換された、キメラヒト／ネズミドメイン交換変異体にＮ末端ヒスチジンタグを付し、遺伝子合成して、Ｈｅｋ ２９３細胞において一過性発現させた。完全ヒトおよびネズミＥＣＤ構築物をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。一過性発現させた受容体構築物からの上清を、ニッケルＮＴＡカラムを使用してヒスチジンタグアフィニティクロマトグラフィによって精製し、精製したタンパク質を炭酸塩緩衝液中１μｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレートにおいて一晩被覆した。その翌日ウェルを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔでブロックし、ブロッキング緩衝液に希釈した抗体の滴定物を添加した。最後に、ウェルを洗浄し、ＨＲＰに結合したマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを添加してＥＬＩＳＡを展開し、次に洗浄して、ＴＭＢ基質を添加した。
【０２０２】
結果
抗体５１０１および５１０６は、免疫化の過程で耐性が壊れ、ネズミＨＥＲ３に対して反応したことが認められた（図２７−３２）。しかし５１０１および５１０６は、ドメインＩがヒト配列を有する他のキメラ構築物よりもネズミＤＩ−ヒトＤＩＩ−ＩＶ  ＨＥＲ３構築物（すなわちネズミドメインＩとヒトドメインＩＩ−ＩＶを有する構築物）でより低いＥＬＩＳＡ光学密度（ＯＤ）値を有するので、これら２つの抗体はヒトＨＥＲ３のドメインＩ（ＤＩ）内に位置するエピトープに結合すると結論付けることができる。抗体５１４４および５２５９はネズミＤＩを認識せず、ネズミＤＩＩ交換変異体に弱く結合した。これらの２つの抗体は、その結果、ヒトＨＥＲ３上のドメインＩおよびＩＩとオーバーラップするエピトープを対象とする。残りの抗体はネズミＤＩ交換変異体を認識しなかったが、他の変異体に結合し、それゆえヒトＨＥＲ３のドメインＩ上のエピトープを対象とする。
【０２０３】
抗ＨＥＲ３抗体のドメインマッピングを図２７−３２に示しており、これは、被覆したＨＥＲ３抗原に対する抗ＨＥＲ３抗体および陰性対照の滴定である。結合抗体を抗ヒトＦｃ抗体で検出した。抗Ｆｃ複合体とＨＥＲ３  Ｅｃ融合タンパク質との間の交差反応性のために、ヒトＨＥＲ３  Ｆｃに対して高いバックグラウンドが認められる。しかし、陰性対照は特異的結合と非特異的結合の間の相違を明らかに示す。以下の表７は、種々の抗ＨＥＲ３抗体が標的とするＨＥＲ３ドメインの概略を提供する。
表７：種々の抗ＨＥＲ３抗体が標的とするドメイン
【表７】
2014503189.tif 000011
＊ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤとマウスＨＥＲ３  ＥＣＤとの間で交差反応する抗体
【０２０４】
実施例１２：表面プラズモン共鳴による抗ＨＥＲ３抗体のエピトープビンニング
この実施例は、機能活性を有する抗ＨＥＲ３抗体の対がどのようにしてＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩまたはＩＩ上の少なくとも５つの非オーバーラップエピトープビンを標的とするかを明らかにする。
【０２０５】
方法
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、デンマーク国）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いて抗体対を試験することにより、抗体交差競合分析を実施した。ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、デンマーク国）を、製造者の指示に従って１００００共鳴単位（ＲＵ）の抗テトラヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）と結合した。ヒスチジン標識ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質 （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＨＢＳ緩衝液に希釈し、５μｌ／分の流速で抗ヒスチジン表面上に捕捉した。抗体の組合せを、４０μｇ／ｍｌの飽和濃度での競合結合実験において、競合を伴うおよび伴わない最大応答レベルを記録することによって評価した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ ２を注入してチップ表面を再生した。
【０２０６】
結果
試験した１０の抗ＨＥＲ３抗体は、５つの異なる非オーバーラップエピトープビンにクラスター化することが認められた（図３３＋３４）。エピトープビンＩは、３つの抗体４７８５、４９３５および５１４３を含んだ。エピトープビンＩＩは抗体５０８２および４８８９を含み、そのうちｍＡｂ ５０８２はエピトープビンＩからのｍＡｂ ５１４３と交差競合することも認められた。エピトープビンＩＩＩはユニークであり、ｍＡｂ ５０３８だけを含んだ。エピトープビンＩＶはｍＡｂ ５１０１および５１０６を含み、マウスＨＥＲ３タンパク質とも交差反応した（実施例１１）。最後に、エピトープビンＶは抗体５１４４および５２５９を含み、これらはＤＩおよびＤＩＩの両方に存在する類似のエピトープに結合することが認められた（実施例１１）。
【０２０７】
図３３は、抗体交差競合分析によるエピトープビンニングの結果を含む表を示す。最初に上部に列挙する抗体でＨＥＲ３抗原を飽和させ、次に左側に列挙する抗体を注入することによって分析を実施した。セル内の数は、以下のように計算した競合パーセントを示す：
（１−（競合を伴う最大応答／競合を伴わない最大応答））×１００
箱で囲んだセルは、互いに少なくとも５０％阻害する抗体対を示す。抗体を競合プロフィールに従ってエピトープビンに割り当てる；図３４参照、この図は割り当てられたエピトープビンの間の関係の図解を示し、重複する円は、オーバーラップするエピトープを有する抗体を表す。
【０２０８】
実施例１３：抗ＨＥＲ３混合物のインビボ効力
抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体５０３８および５０８２ならびに５０３８＋５０８２の混合物のインビボ効力を評価するため、化合物をＢｘＰＣ３膵癌異種移植モデルで試験した。
【０２０９】
方法
５×１０６のＢｘＰＣ３細胞を８〜１０週齢の雌無胸腺ヌードマウスの左側腹部に皮下接種した。腫瘍をカリパスで週に２回測定し、ｍｍ３での腫瘍体積を式：（幅）２×長さ×０．５に従って計算した。１６５ｍｍ３の平均腫瘍サイズでマウスをランダム化し、処置を開始した。マウスを５０ｍｇ／ｋｇの５０３８、５０８２または５０３８＋５０８２の混合物の腹腔内注射で週に２回３週間にわたって（合計６回の注射）処置し、その後を観察期間とした。実験には、上記で抗ＨＥＲ３抗体について述べたのと同じスケジュールに従って投薬および投与した、ビヒクル対照が含まれた。
【０２１０】
結果
５０３８または５０３８＋５０８２の組合せで処置したマウスでは、ビヒクル対照群のマウスと比較して腫瘍の増殖が有意に良好に阻害された（図３５）。５０３８＋５０８２で処置したマウスでは、ビヒクル対照群と比較して有意差が最初の処置から５日後に早くも認められ、試験期間を通じて持続した。５０３８で処置したマウスは、１日（６４日目）を除き、５７日目からビヒクル対照処置動物と比較して腫瘍増殖を抑制するうえで有意に良好であり、これは試験期間を通じて認められた。
【０２１１】
５０３８および５０３８＋５０８２の組合せによる腫瘍増殖の有効な阻害はまた、生存率を見ても認めることができた。これらの処置はいずれも、ログランク（マンテル・コックス）検定によって計算した場合、５０３８については０．００３および５０３８＋５０８２については０．００１のｐ値でビヒクル対照群と比較して有意に良好であった（図３６）。
【０２１２】
要約すると、５０３８および５０３８＋５０８２の組合せは、ビヒクルと対照と比較してＢｘＰＣ３腫瘍異種移植片を有する動物の腫瘍増殖を阻害し、生存率を改善するうえで有意に良好であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014503189.tif 000049
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