(57)【要約】直接給与微生物を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと組み合わせて含む、飼料添加用組成物、並びに、対象とする動物の性能の向上、又は原材料に対する可消化性（例えば、アミノ酸可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性の向上、のための方法を提供し、方法は、直接給与微生物と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接給与生菌を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと組み合わせて含む、飼料添加用組成物。
【請求項２】
前記直接給与生菌が抗病原体用直接給与生菌である、請求項１に記載の飼料添加用組成物。
【請求項３】
前記直接給与生菌が生菌である、請求項１又は２に記載の飼料添加用組成物。
【請求項４】
前記直接給与生菌が、次の属：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸球菌（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、桿菌（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上の細菌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項５】
前記直接給与生菌が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、腸球菌（Enterococcus）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、乳酸桿菌種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上の細菌を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項６】
前記直接給与生菌が、次の株：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項７】
前記直接給与生菌が芽胞の形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項８】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼ又は１，４  β−キシロシダーゼであり、好ましくはエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項９】
前記キシラナーゼが、桿菌（Bacillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、サーモマイセス（Thermomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、アオカビ属（Penicillium）、及びヒュミコラ（Humicola）に由来するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１０】
前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、ケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１１】
前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１２】
前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項１１に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１３】
前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１４】
前記アミラーゼが、α−アミラーゼ、Ｇ４−形成アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びγ−アミラーゼからなる群のうち１種以上から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１５】
前記アミラーゼがα−アミラーゼである、請求項１４に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１６】
前記アミラーゼが、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、トリコデルマ菌種（Trichoderma spp）、又はアスペルギルス菌種（Aspergillus spp）由来のものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１７】
前記フィターゼが、２００ＦＴＵ／飼料添加用組成物（ｇ）〜１００００ＦＴＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１８】
前記アミラーゼが、５０ＡＵ／飼料添加用組成物（ｇ）〜２００００ＡＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１９】
前記キシラナーゼが、５００ＸＵ／ｇ飼料添加用組成物（ｇ）〜４００００ＸＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項２０】
前記プロテアーゼが、１０００ＰＵ／飼料添加用組成物（ｇ）及び６００００ＰＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項２１】
前記ＤＦＭが、３．７５×１０７ＣＦＵ／飼料添加用組成物（ｇ）及び１×１０１１ＣＦＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項２２】
対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の可消化性（例えば、アミノ酸可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性の向上、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物における体重増加性の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性の向上、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少のための方法であって、直接給与生菌を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を投与する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記直接給与生菌が抗病原体用直接給与生菌である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記直接給与生菌が生菌である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記直接給与生菌が、次の属：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸球菌（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、桿菌（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記直接給与生菌が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、腸球菌（Enterococcus）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、乳酸桿菌種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記直接給与生菌が、次の株：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記直接給与生菌が芽胞の形態である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼ又は１，４  β−キシロシダーゼであり、好ましくはエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記キシラナーゼが、桿菌（Bacillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、サーモマイセス（Thermomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、及びヒュミコラ（Humicola）に由来する、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシスプ（Nocardiopsis）ロテアーゼである、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記アミラーゼが、α−アミラーゼ、Ｇ４−形成アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びγ−アミラーゼからなる群のうちの１種以上から選択される、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記アミラーゼがα−アミラーゼである、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記アミラーゼが、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、トリコデルマ菌種（Trichoderma spp）、又はアスペルギルス菌種（Aspergillus spp）由来のものである、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の可消化性（例えば、アミノ酸可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上）、又は壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性の向上、又は飼料要求効率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性の向上、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少のために、直接給与生菌を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと組み合わせる、使用法。
【請求項４０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を使用する、請求項３９に記載の使用法。
【請求項４１】
前記直接給与生菌が抗病原体用直接給与生菌である、請求項３９又は４０に記載の使用法。
【請求項４２】
前記直接給与生菌が生菌である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４３】
前記直接給与生菌が、次の属：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸球菌（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、桿菌（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４４】
前記直接給与生菌が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、腸球菌（Enterococcus）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、乳酸桿菌種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４５】
前記直接給与生菌が、次の株：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４６】
前記直接給与生菌が芽胞の形態である、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４７】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼ又は１，４  β−キシロシダーゼであり、好ましくはエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼである、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４８】
前記キシラナーゼが、桿菌（Bacillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、サーモマイセス（Thermomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、及びヒュミコラ（Humicola）に由来する、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４９】
前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５０】
前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５１】
前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項５０に記載の使用法。
【請求項５２】
前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項３９〜５１のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５３】
前記アミラーゼが、α−アミラーゼ、Ｇ４−形成アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びγ−アミラーゼからなる群のうちの１種以上から選択される、請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５４】
前記アミラーゼがα−アミラーゼである、請求項３９〜５３のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５５】
前記アミラーゼが、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、トリコデルマ菌種（Trichoderma spp）、又はアスペルギルス菌種（Aspergillus spp）由来のものである、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５６】
直接給与生菌、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、及び投与についての指示書を含むキット。
【請求項５７】
前記キットが、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記直接給与生菌が抗病原体用直接給与生菌である、請求項５６又は５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記直接給与生菌が生菌である、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
前記直接給与生菌が、次の属：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸球菌（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、桿菌（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
前記直接給与生菌が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、腸球菌（Enterococcus）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、乳酸桿菌種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６２】
前記直接給与生菌が、次の株：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記直接給与生菌が芽胞の形態である、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６４】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼ又は１，４  β−キシロシダーゼであり、好ましくはエンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼである、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６５】
前記キシラナーゼが、桿菌（Bacillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、サーモマイセス（Thermomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、及びヒュミコラ（Humicola）に由来する、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６７】
前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項５６〜６６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６８】
前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項５６〜６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
前記アミラーゼが、α−アミラーゼ、Ｇ４−形成アミラーゼ、β−アミラーゼ及びγ−アミラーゼからなる群のうちの１種以上から選択される、請求項５６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記アミラーゼがα−アミラーゼである、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７２】
前記アミラーゼが、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、トリコデルマ菌種（Trichoderma spp）、又はアスペルギルス菌種（Aspergillus spp）由来のものである、請求項５６〜７１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７３】
直接給与生菌を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと混合する工程、並びに（所望により）パッケージングする工程、を含む、飼料添加用組成物の製造法。
【請求項７４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。
【請求項７５】
前記フィターゼが、４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７４に記載の飼料。
【請求項７６】
前記アミラーゼが、１００ＡＵ／飼料（ｋｇ）〜２０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７４又は７５に記載の試料。
【請求項７７】
前記キシラナーゼが、１０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）〜４０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の飼料。
【請求項７８】
前記プロテアーゼが、２０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）〜６０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７４〜７７のいずれか一項に記載の飼料。
【請求項７９】
前記ＤＦＭが、７．５×１０４ＣＦＵ／飼料（ｋｇ）及び１×１０７ＣＦＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７４〜７７のいずれか一項に記載の飼料。
【請求項８０】
飼料成分を請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物と混合する工程を含む、動物用飼料の製造法。
【請求項８１】
直接給与生菌を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼ、並びに少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む飼料添加用組成物を含むプレミックス。
【請求項８２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を、少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む、プレミックス。
【請求項８３】
対象とする動物においてコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項８４】
壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症の予防及び／又は処置法であって、対象とする動物に、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の有効量の飼料添加用組成物を投与する、方法。
【請求項８５】
図面及び実施例を参照して本明細書において全体的に定義される通りの飼料添加用組成物又は飼料又はキット又は方法又は使用法又はプレミックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の組み合わせの酵素と組み合わせて直接給与生菌を用いることにより、飼料組成物を改良する方法、並びに直接給与生菌を特定の組み合わせの酵素と組み合わせて含む飼料添加用組成物に関する。本発明は、更に、使用法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素添加物は、栄養効率及び生産効率を向上させるという方法として、動物用飼料、特に家禽及び豚用飼料に添加剤として使用されている。酵素ブレンドの利用により、大豆ミール、動物性タンパク質ミール、又は高繊維飼料副産物を含有している飼料の栄養価を改良することができる。
【０００３】
直接給与生菌（ＤＦＭ）という概念は、ストレス期（疾患、飼料の移行、環境ストレス又は生産ストレス）にある乳牛などの動物に対し、有益な微生物を給与することを包含する。この分類に当てはまる飼料添加物にはプロバイオティクスという別称があり、これまでにプロバイオティクス又はＤＦＭは、管理下試験において、動物の性能を向上させることが示されている。ＤＦＭには、直接給与生菌及び／又は酵母系の産物も包含される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＤＦＭと一部の酵素を組み合わせるという手法は想到されているものの、ＤＦＭと酵素との相互作用は完全には解明されていない。本発明は、動物の生産効率を非常に向上させる新規の特定の組み合わせに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＤＦＭと、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ及びフィターゼとを組み合わせることで、動物の性能に関し非常に有益な効果が得られるという、独創性に富んだ発見に基づくものである。
【０００６】
特に、本発明は、ＤＦＭと、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ及びフィターゼとを組み合わせることで、次の：飼料要求率（ＦＣＲ）、原材料可消化性（例えば、アミノ酸可消化性などの栄養素可消化性）、窒素保持、生存時間、枝肉歩留まり、成長速度、体重増加、飼料効率、壊死性腸炎に対する動物の抵抗性、対象とする動物の免疫応答性、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性、のうちの１つ以上の点が改良されるなど、動物の性能において非常に有益な効果が得られるという、独創性に富んだ発見に基づく。
【０００７】
その他に本発明は、対象とする動物から得られる糞尿の成分に含まれる排出栄養素量を減少させ得る（例えば、窒素及びリンの排出を減少させる）という点でも、驚くべきものである。
【０００８】
一態様では、本発明は、直接給与生菌と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を提供する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、対象とする動物の性能の向上、又は飼料の含まれる原材料の可消化性（例えば、アミノ酸可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の症状回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物における体重増加の向上、又は対象とする動物における飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、に関係する方法を提供し、本方法は、直接給与生菌と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む。
【００１０】
本発明の更に他の態様は、対象とする動物の性能の向上、又は飼料に含まれる原材料に対する可消化性（例えば、アミノ酸可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の症状回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物における体重増加の向上、又は対象とする動物における飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、を目的として、直接給与生菌と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて使用するものである。
【００１１】
本発明の更なる態様では、直接給与生菌、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、フィターゼ（及び所望により少なくとも１種のビタミン及び／又は所望により少なくとも１種のミネラル）、及び投与についての指示書、を含む、キットが提供される。
【００１２】
他の態様では、本発明は、直接給与生菌を、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと混合する工程、並びに（所望により）パッケージングする工程、を含む、飼料添加用組成物の製造法を提供する。
【００１３】
本発明の更に他の態様は、直接給与生菌と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を含む、飼料又は家畜用飼料を提供する。
【００１４】
プレミックスは、直接給与生菌と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼ、並びに少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を含む。
【００１５】
他の態様では、本発明は、直接給与生菌と、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を、飼料成分と混合する工程を含む、家畜用飼料の製造法を提供する。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、対象とする動物におけるコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための飼料添加用組成物に関する。
【００１７】
本発明は、壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症を予防及び／又は処置する方法を更に提供し、本方法は、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＤＦＭ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））と、キシラナーゼ（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）のキシラナーゼ由来のエンドキシラナーゼ）、アミラーゼ（例えば、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ）、プロテアーゼ（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）プロテアーゼ）、及びフィターゼ（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能な５００ＦＴＵ／ｋｇのＰｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））とを組み合わせることで、動物の腸において、処理対照群と比較して、壊死性腸炎病変スコアが有意に改善する（低下する）ことを示す。一部の実施例では、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びプロテアーゼを、同様にＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｘｔｒａＸＡＰ（登録商標）［キシラナーゼ２０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）；アミラーゼ２００ＡＵ／飼料（ｋｇ）及びプロテアーゼ４０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）］として共に配合することができる。
【図２】（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））と、キシラナーゼ（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）のキシラナーゼ由来のエンドキシラナーゼ）、アミラーゼ（例えば、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ）、プロテアーゼ（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）のプロテアーゼ）及びフィターゼ（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能な５００ＦＴＵ／ｋｇのＰｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））とを組み合わせることで、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）に曝露したブロイラーにおいて、処理対照群のブロイラーと比較して体重増加性（ＢＷ獲得）を有意に向上させ、更には陰性対照群（すなわち、非処理対照群）と比較してＢＷを増加させさえしたことを示す。この組み合わせは、アミラーゼ及びフィターゼ、又はプロテアーゼ及びフィターゼのいずれかなどといった任意のその他の酵素の組み合わせよりも有意に良好であり、かつ処理対照群にＤＦＭを投与するよりも有意に良好である。一部の実施例では、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びプロテアーゼを、同様にＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｘｔｒａＸＡＰ（登録商標）［キシラナーゼ２０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）；アミラーゼ２００ＡＵ／飼料（ｋｇ）及びプロテアーゼ４０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）］として共に配合することができる。プールされたＳＥＭは２８．６であった。
【図３】（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））と、キシラナーゼ（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）のキシラナーゼ由来のエンドキシラナーゼ）、アミラーゼ（例えば、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ）、プロテアーゼ（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）プロテアーゼ）、及びフィターゼ（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能な５００ＦＴＵ／ｋｇのＰｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））とを組み合わせることで、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）に曝露したブロイラーにおいて、飼料要求率（ＦＣＲ）（摂取飼料（ｇ）／ＢＷ増加（ｇ））が、未処理対照群と同等の要求率へと有意に向上することを示す。これは、アミラーゼ及びフィターゼ、又はプロテアーゼ及びフィターゼのいずれかなどといったその他の酵素とＤＦＭとの組み合わせよりも有意に良好であった。一部の実施例では、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びプロテアーゼを、同様にＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｘｔｒａＸＡＰ（登録商標）［キシラナーゼ２０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）；アミラーゼ２００ＡＵ／飼料（ｋｇ）及びプロテアーゼ４０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）］として共に配合することができる。
【図４】腸における炎症マーカーとして使用したＩＦＮ−ｇの相対的なｍＲＮＡ発現を示し、かつＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））と、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２（登録商標）＋Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ）５００ＦＴＵ／ｋｇとの組み合わせにより、１１日目にはＩＦＮ−ｇの発現が上昇し、２０日目には減少したことを示す。
【図５】見かけの回腸可消化エネルギー（ｍＣａｌ／ｋｇ）を示し、ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））と、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼ（２種の異なる酵素混合物を用いた。１種目は、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２（登録商標）＋Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）のフィターゼ）５００ＦＴＵ／ｋｇであり、２種目は同様にＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｘｔｒａＸＡＰ［キシラナーゼ２０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）；アミラーゼ２００ＡＵ／飼料（ｋｇ）、及びプロテアーゼ４０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）を含有］＋Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ）５００ＦＴＵ／ｋｇ）とを組み合わせることで、エネルギー消化効果が有意に向上することを示す。
【図６】ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））を、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼと組み合わせることで、アミノ酸消化率が有意に向上することを示す。ＤＭＦをキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼと組み合わせた場合、回腸でのアミノ酸の未消化画分の消化率の向上度は、ＤＦＭ単独、又はＤＦＭを含まないキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼの組み合わせによる向上度よりも大きかった。
【図７】ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））を、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼと組み合わせることで、エネルギー消化率が向上することを示す。
【図８】１７〜２１日齢ブロイラーに給与した処理飼料に関する、窒素補正した見かけの代謝エネルギーＡＭＥｎを示す。
【図９】ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））と、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼ（２種の異なる酵素混合物を用いた。１種目は、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２（登録商標）＋Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ）５００ＦＴＵ／ｋｇであり、２種目は同様にＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｘｔｒａＸＡＰ＋Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ）５００ＦＴＵ／ｋｇ）とを組み合わせることで、窒素保持が有意に向上することを示す。
【図１０】ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））を、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手可能なＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２（登録商標）＋Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））と組み合わせると、対照処理を行った場合及び行わなかった場合と比較して、孵化場にてコクシジウムワクチンを過剰投与した場合、１４日目の回腸粘膜擦過物において、ＭＵＣ−２のｍＲＮＡ量が有意に減少することを示す。
【図１１】バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のペプシン消化耐性αアミラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１２】バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のペプシン消化耐性αアミラーゼのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１３】トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のペプシン消化耐性αアミラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図１４】トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のペプシン消化耐性αアミラーゼのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図１５】４８日齢のブロイラーの飼料要求率を示す。
【図１６】２３日齢の時点の空腸に関し、すべての処理についての、対象とする遺伝子の発現プロファイルのヒートマップを示す。
【００１９】
未処理対照＝未処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＝処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＋アミラーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋アミラーゼ
ＣＣ＋ＸＡＰ＝処理対照＋フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ
ＣＣ＋ＥＰ＝処理対照＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋アミラーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋アミラーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋ＸＡＰ＝処理対照＋フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ。
【図１７】２３日齢の時点のすい臓におけるすべての処理についての、ニワトリαアミラーゼの発現プロファイルのヒートマップを示す。
【００２０】
未処理対照＝未処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＝処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＋アミラーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋アミラーゼ
ＣＣ＋ＸＡＰ＝処理対照＋フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ
ＣＣ＋ＥＰ＝処理対照＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋アミラーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋アミラーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋ＸＡＰ＝処理対照＋フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ。
【図１８】２１日齢のブロイラーの窒素保持量により補正を行った見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥｎ）を示す。ＤＦＭの効果；Ｐ＜０．００１；酵素の効果；Ｐ＜０．００１；ＤＦＭ  ｘ酵素の効果；Ｐ＝０．２７；プールしたＳＥＭ＝３２ｋｃａｌ。
【図１９】壊死性腸炎モデル（プールしたＳＥＭ：０．０１５）のブロイラーの飼料要求率（ＦＣＲ）を示す。
【図２０】２１日齢のブロイラーの空腸におけるラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）の相対比を示す（ＣｈＳｑ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましくは、本発明で使用する各酵素は、ＤＭＦにとって外来性のものである。換言すれば、好ましくは酵素はＤＭＦに添加され、又はＤＭＦと混合される。
【００２２】
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びに、Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くについての一般的辞書を当業者に提供する。
【００２３】
本開示は、本明細書において開示される代表的な方法及び材料に限定されるものではなく、本開示の実施形態を実施又は試験するにあたって、本明細書に開示されるものと類似する又は同等である任意の方法及び材料を使用することができる。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。別途記載のない限り、任意の核酸配列は、それぞれ、左から右に５’→３’の向きで記載され、アミノ酸配列は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記載される。
【００２４】
本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。
【００２５】
本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸名、３文字略記、又は１文字略記により参照される。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを包含する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【００２８】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に対し一般的な１文字表記及び２文字表記が用いられる場合がある。アミノ酸の３文字表記は、ＩＵＰＡＣＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義される通りのものである。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。
【００２９】
用語についての他の定義は本明細書中で明らかになる場合がある。実施例をより詳細に説明する前に、本開示は記載される具体的な実施形態に制限されるものではなく、言うまでもなく、多岐にわたることは理解される。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるであろう。
【００３０】
値について範囲が提供される場合、文脈上明記されていない限り、下限とする単位の少数第一位までが開示されているものとし、それ以外には、範囲の上限値及び下限値の間の各数値も明確に開示されているものとする。規定の任意の値又は規定の範囲に含まれる値、及びその他の任意の規定の値又は規定の範囲に含まれる値、に挟まれる、より小さな各々の範囲も本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に包含させることができ、あるいは除外させることができ、かつ各範囲が、記載の範囲内の任意の特定の制限を包含するよう、上限及び下限のいずれかを包含し、又はいずれも包含せず、又はいずれをも包含する、より小さな範囲も本開示に包含させる。規定の範囲が上限又は下限のいずれか又は両方を含有する場合、これらの含有される上限又は下限のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。したがって、例えば、「酵素（an enzyme）」には、複数の候補となる剤が包含され、「飼料（the feed）」を参照する場合には、当業者に知られる１種以上の飼料及びその同等物等が包含される。
【００３２】
本明細書で述べる開示は、本開示の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術に相当するものと解釈すると判断される記載は存在しない。
【００３３】
本発明において使用される酵素は、バッチ培養法、フェドバッチ培養法、及び連続培養法などの、固体培養又は液内培養のいずれかにより製造することができる。培養は、水溶性無機塩類培地、有機増殖因子、炭素供給源及びエネルギー供給源、酸素分子、及び言うまでもなく、採用した１種以上の特定の微生物の初回接種材料、を含む、増殖培地で実施する。
【００３４】
直接給与生菌（ＤＦＭ）
本明細書において、用語「微生物（microbial）」は、「微生物（microorganism）」と互換的に使用される。
【００３５】
好ましくはＤＦＭは生菌を含む。好ましくは、ＤＦＭは生菌、又は生酵母、又は生真菌を含む。
【００３６】
好ましい一実施形態では、ＤＦＭは生菌を含む。
【００３７】
用語「生菌」は、代謝的に活性であるか、又は分化することのできる微生物を意味する。
【００３８】
一実施形態では、ＤＦＭは、芽胞形成細菌であってよく、すなわち用語「ＤＦＭ」は、芽胞、例えば細菌芽胞からなり、又は芽胞を含有する。したがって、一実施形態では、本明細書で使用される用語「生菌」には、芽胞又は分生子などの細菌芽胞が包含される場合がある。
【００３９】
他の実施形態では、本発明に従う飼料添加用組成物に含まれるＤＦＭは、細菌芽胞、例えば、芽胞又は分生子からは構成されず、又は細菌芽胞を含有しない。
【００４０】
微生物は天然に生じる微生物であっても、あるいは形質転換を起こした微生物であってもよい。微生物は、好適な微生物の組み合わせであってもよい。
【００４１】
一部の態様では、本発明に従うＤＦＭは、微生物、酵母、又は真菌のうちのいずれか１種以上であり得る。
【００４２】
好ましくは、本発明に従うＤＦＭはプロバイオティク微生物である。
【００４３】
本発明では、用語「直接給与生菌（ＤＦＭ）」は、直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与酵母、及びこれらの組み合わせを包含する。
【００４４】
好ましいＤＦＭは、直接給与生菌である。
【００４５】
好ましいＤＦＭは、２種以上の微生物、例えば、３種以上、又は４種以上の微生物を含む混合物であり、あるいはＤＦＭは、２種以上の微生物株、例えば、３種以上、又は４種以上の微生物株を含む混合物である。
【００４６】
好ましくは、これらの単独種又は複数種の微生物は、単離されたものである。
【００４７】
好適なＤＦＭは、次の属：乳酸菌（Lactobacillus）属、乳酸球菌（Lactococcus）属、連鎖球菌（Streptococcus）属、桿菌（Bacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、腸球菌（Enterococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ビフィズス菌（Bifidobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属及びメガスフェラ（Megasphaera）属、並びにこれらの組み合わせ、のうちの１種以上に由来する細菌を含み得る。
【００４８】
一実施形態では、ＤＦＭは、次のバチルス菌種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）から選択され得る。
【００４９】
一実施形態では、ＤＦＭは２種以上のバチルス（Bacillus）株を含む混合物であり得る。
【００５０】
一実施形態では、ＤＦＭは、２種以上の枯草菌（Bacillus subtilis）株、３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）、２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）、ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）、及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）の混合物であり得る。
【００５１】
株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、及び２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）より公的に入手可能である。
【００５２】
株２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）は、米国の農業研究サービス機関の系統保存株（ＮＲＲＬ）より公的に入手可能である。枯草菌（Bacillus subtilis）株ＬＳＳＡ０１はしばしば枯草菌８と呼ばれる。
【００５３】
これらの株については米国特許第７，７５４，４６９（Ｂ２）号に教示される。
【００５４】
枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＳ  １８及び枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＳ  ２７８は、ブダペスト条約の下、Ａｎｄｙ  Ｍａｄｉｓｅｎ（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６，ＵＳＡ）又はＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６，ＵＳＡ）により、農業研究サービス機関の微生物株保存施設（ＮＲＲＬ）（１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）に、それぞれ寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３及びＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４で２０１２年１月９日に寄託されている。
【００５５】
Ａｎｄｙ  Ｍａｄｉｓｅｎ（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６，ＵＳＡ）及びＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６）、ＵＳＡ  ａｕｔｈｏｒｉｓｅ  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ（Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ  １，ＰＯ  Ｂｏｘ  １７，ＤＫ−１００１，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）は、本開示において、これらの寄託された生物材料を指すものであり、制限は受けておらず、かつ取り消しを受けぬよう、寄託された材料は公共に利用され得るものであると承認されている。
【００５６】
一部の実施形態では、ＤＦＭは、次の表に詳しく記載する枯草菌（Bacillus subtilis）株を含む混合物であり得る。
【００５７】
【表１】
2014507946.tif 000002
【００５８】
一実施形態では、ＤＦＭは次の乳酸球菌種（Lactococcus spp）：タクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、及びラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、及びこれらの混合物から選択され得る。
【００５９】
一実施形態では、ＤＦＭは次の乳酸菌種（Lactococcus spp）：ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ビフィダス（Lactobacillus bifidus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス・へルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、発酵ラクトバチルス（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、デルブリュッキ菌（Lactobacillus delbreuckii）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ガセリ菌（Lactobacillus gasseri）、ジョンソニイ菌（Lactobacillus johnsonii）、及びラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、並びにこれらのうちの任意の組み合わせ、から選択され得る。
【００６０】
一実施形態では、ＤＦＭは次のビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）：ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidium）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及びビフィドバクテリウム・アンギュラツム（Bifidobacterium angulatum）、並びにこれらのうちの任意の組み合わせ、から選択され得る。
【００６１】
好適なＤＦＭは次の属：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、腸球菌（Enterococcus）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、乳酸桿菌種、ビフィドバクテリウム菌種、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、枯草菌（Bacillus subtilis）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミニス、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）及びこれらの組み合わせ、のうちの１種以上に由来する微生物を含み得る。
【００６２】
本発明に使用される直接給与生菌は、同じ種類（属、種及び株）であってよく、又は複数の属、種、及び／又は株の混合物を含んでよい。
【００６３】
本発明に従う好適なＤＭＦは、次の表に記載される通りの１種以上の製品、又はこれらの製品に含有される微生物を含んでよい。
【００６４】
【表２−１】
2014507946.tif 000003
【００６５】
【表２−２】
2014507946.tif 000004
【００６６】
一実施形態では、好適なＤＦＭはＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）である場合がある。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから市販されている製品であり、桿菌（Bacillus）株２０８４  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲｌ  Ｂ−５００１３、桿菌（Bacillus）株ＬＳＳＡＯ１  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０４及び桿菌（Bacillus）株１５Ａ−Ｐ４  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０７の混合物である（米国特許第７，７５４，４６９（Ｂ）号に教示の通りのものである−参照により本案件に組み込まれる）。
【００６７】
好適には、ＤＦＭにはサッカロミセス菌種（Saccharomyces spp）由来の酵母を含ませることができる。
【００６８】
好ましくは、本発明に従って使用されるＤＦＭは、一般に安全であると認識されている微生物であり、好ましくはＧＲＡＳにより認可されている微生物である。
【００６９】
当業者であれば、食品産業及び／又は農産業において使用され、動物による消費に好適であると一般的に考えられ、本明細書に記載の属の範囲に含まれる微生物の、具体的な種及び又は株は容易に見当がつくであろう。
【００７０】
好ましくは、本発明に従って使用されるＤＦＭは、動物による消費に好適なものである。
【００７１】
有利なことに、製品は飼料又は飼料添加用組成物であり、生活性を有するＤＦＭは、製品の一般的な「販売期限」又は「消費期限」の間、すなわち飼料又は飼料添加用組成物が販売業者によって販売される期間中は効果を保持すべきである。所望の期間及び一般的な貯蔵寿命は、家畜用飼料によって異なる場合があり、当業者であれば、貯蔵寿命は、家畜用飼料の種類、家畜用飼料の容量、保管温度、加工条件、梱包材料及び梱包装置に応じ変化することを認識するであろう。
【００７２】
一部の実施例では、ＤＦＭが熱に耐性を有すること、すなわち熱耐性であることが重要である。これは特に、飼料がペレット形態である場合に当てはまる。したがって、一実施形態では、ＤＦＭは熱耐性微生物であり、例えば、バチルス菌種（Bacillus spp）などの熱耐性細菌であってよい。
【００７３】
一部の実施例では、ＤＦＭが芽胞形成細菌、例えば、バチルス菌種などのバチルス（Bacilli）であることが好ましい場合がある。バチルス（Bacilli）は、増殖に望ましくない条件下で安定な芽胞を形成することができる微生物であり、熱、ｐＨ、湿度、及び殺菌剤に対し非常に抵抗性である。
【００７４】
一実施形態では、ＤＦＭは、腸内での病原微生物（ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又は大腸菌（E. coli）及び／又はサルモネラ菌（Salmonella spp）及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）など）の増殖を低減又は予防できることが好適である。
【００７５】
本発明に従うＤＦＭは、任意の好適なＤＦＭであってよい。一実施形態では、次のアッセイ「ＤＦＭアッセイ」により、ＤＦＭに好適な微生物を判定することができる。誤解を避けるため、一実施形態では、本明細書で教示する「ＤＦＭアッセイ」に従って阻害株（又は抗病原ＤＦＭ）として選別されたＤＦＭは、本発明に従って使用するのに、すなわち、本発明に従う飼料添加用組成物に使用するのに好適なＤＦＭである。
【００７６】
ＤＦＭアッセイ：
各試験管に、代表的なクラスターの代表的な病原体を接種した。
【００７７】
可能性の高いＤＦＭの好気的又は嫌気的増殖物の上清を試験管に接種し、インキュベートした。
【００７８】
インキュベート後、各病原体について、対照処理及び上清処理を行った試験管の吸光度（ＯＤ）を測定した。
【００７９】
対照と比較してＯＤの値が低かった株（潜在的ＤＦＭ）のコロニーを阻害株（又は抗病原性ＤＦＭ）として分類した。
【００８０】
本明細書で使用するＤＦＭアッセイは、米国特許第２００９／０２８００９０号（参照により本案件に組み込まれる）により詳細に説明される。
【００８１】
好ましくは、アッセイに使用される代表的な１種（以上の）病原体は、次の：ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、及び／又は大腸菌（E. coli）、及び／又はサルモネラ菌種（Salmonella spp）、及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）などのクロストリジウム（Clostridium）属である。好ましい実施形態では、アッセイは、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、及び／又は大腸菌（E. coli）のうちの１種以上を用い実施され、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、より好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）を用い実施される。
【００８２】
一実施形態では、本発明のＤＦＭは好ましくは抗病原体である。
【００８３】
本明細書で使用するとき、用語「抗病原体」は、ＤＦＭが、病原体のもつ作用（負の効果）に対抗することを意味する。
【００８４】
一実施形態では、ＤＦＭが抗病原性ＤＦＭであるか否かを評価するために、上述のＤＦＭアッセイを使用することができる。上述の「ＤＦＭアッセイ」において、例えば、病原体がウェルシュ菌（Clostridium perfringens）である際に阻害株であると分類された場合、ＤＦＭは抗病原体又は抗病原性ＤＦＭであると見なされる。
【００８５】
一実施形態では、抗病原体ＤＦＭは、次の微生物：枯草菌（Bacillus subtilis）株２０８４  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３、
枯草菌（Bacillus subtilis）株ＬＳＳＡＯ１  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０４、
枯草菌（Bacillus subtilis）株１５Ａ−Ｐ４  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０７、
枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０６、及び
枯草菌（Bacillus subtilis）株ＢＳ２７  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５、のうちの１種以上であり得る誤解を避けるため、これらの株は入手可能なものであり、かつ米国特許第７，７５４，４５９（Ｂ）に引用されるものである。
【００８６】
一実施形態では、本発明に従って使用されるＤＦＭは、国際公開第２００８／０１６２１４号に教示されるようなガセリ菌（Lactobacillus gasseri）ＢＮＲ  １７株Ａｃｃ番号ＫＣＴＣ  １０９０２ＢＰではない。
【００８７】
好ましくは、ＤＦＭは、不活性化した微生物ではない。
【００８８】
一実施形態では、本明細書で使用されるＤＦＭは、本明細書に記載の通りのＤＦＭ微生物を１種以上含む組成物である。組成物には、本発明の酵素を更に含ませることができる。組成物は、直接給与生菌（ＤＦＭ）として動物に給与することができる。１つ以上の担体又はその他の材料をＤＦＭに添加することもできる。ＤＦＭは、例えば、トップドレス、若しくは液体ドレンチ剤に使用される水溶性濃縮物として、又は代用乳、ゼラチンカプセル、若しくはゲルに加えるなどして、様々な物理形態で存在させることができる。トップドレス形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び／又はアルミノ珪酸ナトリウムなどの担体に添加する。水溶性濃縮物の一実施形態では、液体ドレンチ剤用又は代用乳添加剤用の凍結乾燥させた発酵産物を、水溶性担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、乾燥デンプン、アルミノ珪酸ナトリウムに添加し、液体を加えてドレンチ剤を生成するか、又は乳又は代用乳に添加剤を加えるかする。ゼラチンカプセル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、糖、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び／又はアルミノ珪酸ナトリウムに加える。一実施形態では、微生物及び担体は分解性ゼラチンカプセルに封入される。ゲル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、ゲルを形成するための、担体、例えば植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、及び／又は合成着色料に加える。
【００８９】
ＤＦＭは、所望により添加剤の乾燥製剤と混合してよく、このような乾燥製剤としては、増殖基質、酵素、糖、炭水化物、抽出物、及び増殖促進目的の微量成分が挙げられるが、これらに限定されない。糖としては、次の：ラクトース、麦芽糖、ブドウ糖、マルトデキストリン、ブドウ糖、フルクトース、マンノース、タガトース、ソルボース、ラフィノース、及びガラクトースが挙げられる。糖はそれぞれ又は合計して５０〜９５％の範囲である。抽出物には、可溶性の酵母又は乾燥酵母発酵産物が５〜５０％含有され得る。増殖促進剤には、トリプチケースが５〜２５％、乳酸ナトリウムが５〜３０％、及びＴｗｅｅｎ  ８０が１〜５％含有され得る。炭水化物としては、マニトール、ソルビトール、アドニトール、及びアラビトールが含まれ得る。炭水化物はそれぞれ又は合計して５〜５０％の範囲である。微量成分としては、炭酸カルシウムが０．５〜５．０％、塩化カルシウムが０．５〜５．０％、リン酸二カリウムが０．５〜５．０％、リン酸カルシウムが０．５〜５．０％、マンガンプロテアーゼが０．２５〜１．００％、及びマンガンが０．２５〜１．０％の範囲で含有され得る。
【００９０】
本明細書で記載のＤＦＭを調製する際、培養物及び担体（使用する場合）をリボンミキサ又はパドルミキサに加え、約１５分混合することができる。ただし、この混合時間は増減させてよい。培養物と単体が均一に混合されるように成分を混合する。最終生成物は好ましくは流動性の乾燥粉末である。次に、ＤＦＭ又はこれを含む組成物を動物用飼料又は飼料プレミックスに添加することができ、又は動物用飲用水に添加することができ、又は当該技術分野で既知の他の手法により投与することができる（好ましくは、本発明の酵素とともに同時に）。動物用飼料には、本明細書に記載の１種以上のＤＭＦを添加でき、あるいは本明細書に記載の組成物を添加できる。
【００９１】
「少なくとも２種の株からなる混合物」は、２、３、４、５、又は６種以上の株の混合物を意味する。一部の実施例の株混合物では、割合は１％〜９９％で変化し得る。株混合物の他の実施例は２５％〜７５％である。株混合物の追加例では、各株約５０％である。混合物が２種を超える株を含む場合、この株は混合物中に実質的に同じ比率で、又は異なる比率で存在し得る。
【００９２】
ＤＦＭは適切に投与できる。
【００９３】
飼料へのＤＦＭの好適な投与量は、約１×１０３ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０９ＣＦＵ／飼料（ｇ）、好適には約１×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０８ＣＦＵ／飼料（ｇ）、好適には約７．５×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０７ＣＦＵ／飼料（ｇ）であり得る。
【００９４】
一実施形態では、ＤＦＭは約１×１０３ＣＦＵ／飼料（ｇ）超、好適には約１×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）超、好適には約７．５×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）超で飼料に添加される。
【００９５】
飼料添加用組成物へのＤＦＭの好適な添加量は、約１×１０５ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０１３ＣＦＵ／組成物（ｇ）、好適には約１×１０６ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０１２ＣＦＵ／組成物（ｇ）、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０１１ＣＦＵ／組成物（ｇ）であり得る。
【００９６】
一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加用組成物に、約１×１０５ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１×１０６ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／組成物（ｇ）超で添加される。
【００９７】
一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加用組成物に、約２×１０５ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２×１０６ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／組成物（ｇ）超で添加される。
【００９８】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を意味し、単一の前駆細胞から分裂した細胞の凝集塊を示すコロニーに含まれる生菌数に関する尺度である。
【００９９】
キシラナーゼ
キシラナーゼは、直鎖多糖類のβ−１，４−キシランをキシロースへと、すなわち植物の細胞壁の主要成分のうちの１つであるヘミセルロースへと分解する部類の酵素に付される名称である。
【０１００】
本発明に使用するキシラナーゼは、任意の市販のキシラナーゼであってよい。
【０１０１】
好適には、キシラナーゼは、エンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８と分類）又は１，４  β−キシロシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７と分類）であり得る。
【０１０２】
一実施形態では、好ましくは、キシラナーゼはエンドキシラナーゼであり、例えば、エンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼである。エンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼはＥ．Ｃ．３．２．１．８．と分類される。
【０１０３】
一実施形態では、本発明は、ＤＦＭと、エンドキシラナーゼ（例えば、エンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼ）及びその他の酵素との組み合わせに関する。
【０１０４】
本明細書で参照される、酵素についてのすべてのＥ．Ｃ．分類は、国際生化学分子生物学連合の「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ−Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ」（１９９２）−ＩＳＢＮ  ０−１２−２２６１６４−３において提供される分類に関係する。
【０１０５】
好適には、本発明での使用を目的としたキシラナーゼは、桿菌（Bacillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、サーモマイセス（Thermomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）属、及びアオカビ属（Penicillium）由来のキシラナーゼであり得る。
【０１０６】
一実施形態では、キシラナーゼは、Ａｘｔｒａ  ＸＡＰ（登録商標）又はＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２（登録商標）（いずれもＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓより市販の製品）に含まれるキシラナーゼであってよい。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本発明での使用を目的としたキシラナーゼは、次の市販品のうちの１種以上に含まれる１種以上のキシラナーゼであり得る。
【０１０８】
【表３−１】
2014507946.tif 000005
【０１０９】
【表３−２】
2014507946.tif 000006
【０１１０】
好ましくは、キシラナーゼは飼料中に約５００ＸＵ／飼料（ｋｇ）〜約１６，０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約７５０ＸＵ／飼料（ｋｇ）〜約８０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）、及び更により好ましくは約１０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）〜約４０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で存在する。
【０１１１】
一実施形態では、キシラナーゼは、飼料中に約５００ＸＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約６００ＸＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約７００ＸＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約８００ＸＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約９００ＸＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約１０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）超で存在する。
【０１１２】
一実施形態では、キシラナーゼは、飼料中に約１６，０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約８０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約７０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約６０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約５０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約４０００ＸＵ／飼料（ｋｇ）未満で存在する。
【０１１３】
好ましくは、キシラナーゼは、飼料添加用組成物中に約１００ＸＵ／組成物（ｇ）〜約３２０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約３００ＸＵ／組成物（ｇ）〜約１６０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約５００ＸＵ／組成物（ｇ）〜約５０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約５００ＸＵ／組成物（ｇ）〜約４０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）の範囲で存在する。
【０１１４】
一実施形態では、キシラナーゼは、飼料添加用組成物中に約１００ＸＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２００ＸＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３００ＸＵ／組成物（ｇ）超、好適には約４００ＸＵ／組成物（ｇ）超、好適には約５００ＸＵ／組成物（ｇ）超で存在する。
【０１１５】
一実施形態では、キシラナーゼは、飼料添加用組成物中に約３２０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１６０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約５０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約４０，０００ＸＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約３００００ＸＵ／組成物（ｇ）未満で存在する。
【０１１６】
キシラナーゼ単位（ＸＵ）は、ｐＨ  ５．３及び５０℃にて、オーツ麦−スペルト小麦−キシラン基質から１分あたり０．５μｍｏｌ相当の還元糖（糖還元法のジニトロサルチル酸（Dinitrosalicylic acid）（ＤＮＳ）アッセイによりキシロースとして）を放出させる酵素量であることは理解されるであろう。（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｅｌｙ，Ｐ．ａｎｄ  Ｐｏｕｔａｎｅｎ，Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３，（３），Ｍａｙ  １９９２，２５７〜２７０）。
【０１１７】
一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＸＵの定量に関し本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。
【０１１８】
アミラーゼ
アミラーゼは、糖をマルトースなどのより短鎖のオリゴ糖に加水分解し得る種類の酵素に割り当てられる名称である。加水分解後、グルコース部分は、元のデンプン分子から転移させる場合と比べて容易に、マルトースからモノグリセリド又はグリコシルモノグリセリドに転移させることができる。
【０１１９】
用語「アミラーゼ」には、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、Ｇ４形成アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６０）、β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）、及びγ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）が包含される。
【０１２０】
一実施形態では、好ましくはアミラーゼはα−アミラーゼである。α−アミラーゼは（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）として分類される。
【０１２１】
これらのアミラーゼには、化学的に修飾された、又はタンパク質工学により導入された変異を包含する、細菌又は真菌由来のアミラーゼが含有される。
【０１２２】
一実施形態では、好ましくはアミラーゼは、例えば、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ、及び／又はバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のα−アミラーゼであり得る。
【０１２３】
一実施形態では、α−アミラーゼはＡｘｔｒａ  ＸＡＰ（登録商標）又はＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２（登録商標）（いずれもＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓより市販の製品）に含まれるα−アミラーゼであってよい。
【０１２４】
他の実施形態では、アミラーゼは、ペプシン消化耐性のトリコデルマ（Trichoderma）属（トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）など）αアミラーゼなどといった、ペプシン消化耐性α−アミラーゼであってよい。好適なペプシン消化耐性α−アミラーゼは、英国特許出願第１０１１５１３．７号（参照により本明細書に組み込まれている）及びＰＣＴ／ＩＢ第２０１１／０５３０１８号（参照により本明細書に組み込まれている）に教示のものである。
【０１２５】
一実施形態では、アミラーゼは、アミノ酸配列：
ｉ）配列番号１又は配列番号３に記載の通りのアミノ酸配列；
ｉｉ）１つ又は複数のアミノ酸が付加／挿入、欠失又は置換されていることを除き配列番号１又は配列番号３に記載の通りのアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）配列同一性である、又は配列番号３と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性であるアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号２又は配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列を発現させることで産生されるアミノ酸配列；
ｖ）遺伝子暗号の縮重に起因し配列番号２又は配列番号４とは異なるヌクレオチド配列を発現させることで産生されるアミノ酸配列；
ｖｉ）１箇所又は複数個所のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換に起因し配列番号２又は配列番号４とは異なるヌクレオチド配列を発現させることで産生されるアミノ酸配列；又は
ｖｉｉ）配列番号２又は配列番号４と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）配列同一性であるヌクレオチド配列を発現させることで産生されるアミノ酸配列；を含む又はこれらからなるペプシン消化耐性α−アミラーゼであってよい。
【０１２６】
ペプシン消化耐性のαアミラーゼは、厳密な又は非常に厳密な条件下で配列番号２又は配列番号４の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列にもコードされ得る。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本発明での使用を目的としたアミラーゼは、次の市販品のうちの１種以上に含まれる１種以上のアミラーゼであり得る。
【０１２８】
【表４】
2014507946.tif 000007
【０１２９】
一実施形態では、アミラーゼは、バチルス属由来のマルトース生成型α−アミラーゼであってよい（欧州特許第１２０  ６９３号参照）。このアミラーゼは、商品名Ｎｏｖａｍｙｌ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で市販されている。Ｎｏｖａｍｙｌについては、国際公開第９１／１０４６６９号に詳述されている。
【０１３０】
好ましくは、アミラーゼは飼料中に約５０ＡＵ／飼料（ｋｇ）〜約１０，０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約７０ＡＵ／飼料（ｋｇ）〜約７５００ＡＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約７０ＡＵ／飼料（ｋｇ）〜約５０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）、及び更により好ましくは約１００ＡＵ／飼料（ｋｇ）〜約２０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で存在する。
【０１３１】
一実施形態では、アミラーゼは、飼料中に約５０ＡＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約６０ＡＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約７０ＡＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約８０ＡＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約９０ＡＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約１００ＡＵ／飼料（ｋｇ）超で存在する。
【０１３２】
一実施形態では、アミラーゼは、飼料中に約１０，０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約８０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約７０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約５０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約４０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約３０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約２０００ＡＵ／飼料（ｋｇ）未満で存在する。
【０１３３】
好ましくは、アミラーゼは、飼料添加用組成物中に約１０ＡＵ／ｋｇ〜約２００，０００ＡＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約３０ＡＵ／組成物（ｇ）〜約１００，０００ＡＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約４０ＡＵ／組成物（ｇ）〜約５０，０００ＡＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約５０ＡＵ／組成物（ｇ）〜約２０，０００ＡＵ／組成物（ｇ）の範囲で存在する。
【０１３４】
一実施形態では、アミラーゼは、飼料添加用組成物中に約１０ＡＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２０ＡＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３０ＡＵ／組成物（ｇ）超、好適には約４０ＡＵ／組成物（ｇ）超、好適には約５０ＡＵ／組成物（ｇ）超で存在する。
【０１３５】
一実施形態では、アミラーゼは、飼料添加用組成物中に約２００，０００ＡＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１００，０００ＡＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約５０，０００ＡＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約４０，０００ＡＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約３００００ＡＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約２００００ＡＵ／組成物（ｇ）未満で存在する。
【０１３６】
アミラーゼ単位（ＡＵ）は、ｐＨ  ６．５及び３７℃にて（この条件は、本明細書において、１ＡＵを定量するアッセイとして参照され得る）、非水溶性架橋デンプンポリマー基質から１分あたり１ｍｍｏｌ相当のグリコシド結合を放出させる酵素量であることは理解されるであろう。
【０１３７】
１ＴＡＵ（α−アミラーゼ活性）は、ｐＨ  ８．０、４０℃にて、（過剰量のα−グルコシダーゼの存在下で）マルトヘプタオシド基質から１分あたり０．２０μｍｏｌ相当のグリコシド結合（ｐ−ニトロフェノール等量として表わされる）を放出させる酵素量である。この条件は、本明細書において、１ＴＡＵを定量するアッセイとして参照され得る。
【０１３８】
一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＡＵを定量するために本明細書において教示されるアッセイにより試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。
【０１３９】
プロテアーゼ
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」は、ペプチダーゼ又はプロテイナーゼと同義である。
【０１４０】
本発明での使用を目的としたプロテアーゼは、サブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）又はバシロリジン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）又はアルカリセリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）又はケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ）であり得る。
【０１４１】
好ましくは、本発明に従うプロテアーゼはサブチリシンである。
【０１４２】
適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。化学的に修飾された、又はタンパク質工学により生成された変異体も好適である。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼであってよく、例えば、好アルカリ菌のプロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリシン、特に、例えば、桿菌（Bacillus）属のサブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号を参照されたい）、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８（例えば、国際公開第８９／０６２７９号を参照されたい）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及びフザリウム（Fusarium）プロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号を参照されたい）が挙げられる。有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号及び同第９８／２０１１５号に記載の変異体も挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
好ましい実施形態では、本発明での使用を目的としたプロテアーゼは、次の市販品のうちの１種以上に含まれる１種以上のプロテアーゼであり得る。
【０１４４】
【表５】
2014507946.tif 000008
【０１４５】
一実施形態では、プロテアーゼは枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼであってよい。
【０１４６】
一実施形態では、プロテアーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能なノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼであり得る。
【０１４７】
好ましくは、プロテアーゼは、飼料中に約１０００Ｕ／飼料（ｋｇ）〜約２０，０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約１５００ＰＵ／飼料（ｋｇ）〜約１００００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約２０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）〜約６０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で存在する。
【０１４８】
一実施形態では、プロテアーゼは、飼料中に約１０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約１５００ＰＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約２０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）超で存在する。
【０１４９】
一実施形態では、プロテアーゼは、飼料中に約２０，０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約１００００ＰＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約７０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約６０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）未満で存在する。
【０１５０】
好ましくは、プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に約２００ＰＵ／ｇ〜約４００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約３００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約２００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約５０００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約１００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約７００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約７０，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約１０００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約６０，０００ＰＵ／組成物（ｇ）の範囲で存在する。
【０１５１】
一実施形態では、プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に約２００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約４００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約５００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約７５０ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１０００ＰＵ／組成物（ｇ）超で存在する。
【０１５２】
一実施形態では、プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に、約４００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約２００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約８０，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約７００００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約６００００ＰＵ／組成物（ｇ）未満で存在する。
【０１５３】
プロテアーゼ単位（ＰＵ）は、ｐＨ  ７．５（４０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４／乳酸緩衝液）及び４０℃にて、１分あたりに１μｇフェノール化合物（トリプシン等量として表わす）を、基質（０．６％カゼイン溶液）から遊離させる酵素量であることは理解されるであろう。この条件は、本明細書において、１ＰＵを定量するアッセイとして参照され得る。
【０１５４】
一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＰＵを定量するために本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。
【０１５５】
フィターゼ
本発明での使用を目的としたフィターゼは、６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６として分類）又は３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８として分類）に分類される。
【０１５６】
一実施形態では、フィターゼは６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）であってよい。
【０１５７】
好ましい実施形態では、本発明での使用を目的としたフィターゼは、次の市販品のうちの１種以上に含まれる１種以上のフィターゼであり得る。
【０１５８】
【表６】
2014507946.tif 000009
【０１５９】
本明細書で使用するとき、用語「共通遺伝子」は、微生物を形質転換させるのに使用されるＤＮＡベクターが、共通配列に基づく合成フィターゼ遺伝子、非病原性酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＵＲＡ遺伝子、及び大腸菌（E. coli）プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点を含有することを意味する。
【０１６０】
一実施形態では、フィターゼは、例えば、国際公開第２００６／０３８０６２号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２００６／０３８１２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来のシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ、好ましくはＣ．フレウンディＮＣＩＭＢ  ４１２４７、及びこれらの変異体、国際公開第２００４／０８５６３８号に開示されるものなどのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５、国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３、並びに例えば国際公開第２００７／１１２７３９号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２０１１／１１７３９６号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどの、これらの変異体、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、好ましくは、国際公開第２００６０３７３２７号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０５又はシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０７、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、好ましくは、国際公開第２００６０３７３２７号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）ＤＳＭ  １３６９４、又はシトロバクター（Citrobacter）中間種、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキィ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、シトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）、シトロバクター（Citrobacter）種ポリペプチド、又はこれらの変異体である。
【０１６１】
一実施形態では、フィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）属、例えば、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来のフィターゼであってよく、国際公開第２００６／０３８１２８号（この開示は参照により本案件に組み込まれる）において教示される通りのフィターゼ酵素であってよい。
【０１６２】
好ましい実施形態では、好ましくはフィターゼは、商品名Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（商標）でＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓより市販の大腸菌（E. coli）フィターゼである。
【０１６３】
あるいはフィターゼはブティアウクセラ（Buttiauxella）のフィターゼ、例えば、ブティアウクセラ・アグレスティス（Buttiauxella agrestis）のフィターゼであってよく、このフィターゼは国際公開第２００６／０４３１７８号、同第２００８／０９７６１９号、同第２００９／１２９４８９号、同第２００８／０９２９０１号、ＰＣＴ／米国特許第２００９／４１０１１号、ＰＣＴ／ＩＢ第２０１０／０５１８０４号に教示される。これらの開示の各々は参照により本案件に組み込まれる。
【０１６４】
一実施形態では、フィターゼは、ハフニア（Hafnia）由来の、例えば、米国特許第２００８２６３６８８号（この開示は参照により本案件に組み込まれる）に教示のハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）由来のフィターゼであってよい。
【０１６５】
一実施形態では、フィターゼは、アスペルギルス（Aspergillus）属由来の、例えばコウジカビ（Aspergillus oryzae）由来のフィターゼであってよい。
【０１６６】
一実施形態では、フィターゼはアオカビ属（Penicillium）由来の、例えば、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）由来のフィターゼであってよい。
【０１６７】
好ましくは、フィターゼは、動物用飼料中に、約２００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約３００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約７５０ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約５００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で存在する。
【０１６８】
一実施形態では、フィターゼは、動物用飼料中に、約２００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約３００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超で存在する。
【０１６９】
一実施形態では、フィターゼは、動物用飼料中に、約１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約７５０ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）未満で存在する。
【０１７０】
好ましくは、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約４０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約８０ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約２０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約１００ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約２００ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）の範囲で存在する。
【０１７１】
一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約６０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１００ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１５０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２００ＦＴＵ／組成物（ｇ）超で存在する。
【０１７２】
一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約２０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１５，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満で存在する。
【０１７３】
１ＦＴＵ（フィターゼ単位）は、ＩＳＯ  ２００９フィターゼアッセイ−すなわち、国際標準ＩＳＯ／ＤＩＳ  ３００２４：１〜１７，２００９に見られる、フィターゼ活性及び１ＦＴＵを定量するための標準アッセイ−に定義される反応条件下で、基質から１分あたり１μｍｏｌの無機オルトリン酸を放出させるのに必要とされる酵素量であることは理解されるであろう。
【０１７４】
一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＦＴＵを定量するために本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。
【０１７５】
利点
ＤＦＭと酵素の相互作用は複雑であり、理論に束縛されることは望ましくないが、驚くべきことに、対象とする動物の壊死性腸炎に対する抵抗性の改善が認められ、例えば、病変スコアの低下が認められる。本発明以前には、ＤＦＭと酵素（例えば本明細書に教示のもの）との組み合わせは、この特定の目的に関しては教示されていない。
【０１７６】
本発明の利点の一つは、本発明に従う飼料添加用組成物は、壊死性腸炎の悪影響を回避することができ、すなわち壊死性腸炎に対する対象とする動物の抵抗性を改善するために使用できるというものである。
【０１７７】
理論に束縛されるものではないが、フィターゼは、穀類及びマメ科植物に含まれるリンの主な貯蔵形態であるフィチン酸の連続的な加水分解を触媒し、これに伴い無機リン酸を放出させて、ミオイノシトール誘導体のリン酸化の程度を低下させる。フィチン酸の加水分解により、腸内腔に対するアミノ酸の内因性の損失が減少することになる。腸において内因性のアミノ酸の損失が減少すると、微生物の増殖に利用され得る窒素が減少するため、ＤＦＭが持つ、ウェルシュ菌（C. perfringens）及びその他の病原菌に対する阻害活性が補助される。
【０１７８】
理論に束縛されることを望むものではないが、プロテアーゼは、腸管において食物タンパク質を非特異的に加水分解し、様々なポリペプチドを生成する。動物類はタンパク質の加水分解を完了させ、アミノ酸などを吸収する。しかしながら、腸内病原菌に曝露させた場合、病原菌は、空腸及び回腸内腔においてペプチド効率の高さを巧みに利用する。ＤＦＭは、例えば、Ｎ供給源に関し競合することで、並びに直接阻害することで、腸管病原菌の増殖を阻害する。
【０１７９】
加えて、キシラナーゼは、直鎖多糖類のβ−１，４−キシランをキシロースに分解する。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書において、デンプン、脂肪、又はタンパク質については、ＤＦＭと酵素とを組み合わせることによりエネルギー消化率が上昇するとは説明せず、したがって、非デンプン性多糖類について説明されることになる。
【０１８０】
アミラーゼ活性は、デンプンなどの、大きなα結合型多糖類のα結合を加水分解して、デキストリン及びオリゴ多糖類などを生成する。デキストリン及びオリゴ多糖類などの糖類は腸壁でマルトース及びグルコースに加水分解された後、小腸で吸収される。驚くべきことに、前腸におけるデンプンの急速な加水分解及び十二指腸におけるグルコースの吸収増大により、病原菌は空腸及び回腸において重要なエネルギー源（ブドウ糖）を欠乏することになり、このエネルギー源の欠乏は、五炭糖を効率的に利用できない病原菌に対して競争優位性なものであることから、ＤＦＭ活性が向上する。
【０１８１】
驚くべきことに、４種の酵素とＤＦＭとを組み合わせることで、それ以外のＤＦＭと酵素との組み合わせ及び／又はＤＦＭ単独及び／又は酵素単独を用いた場合と比較して、病原菌の減少性及び／又は壊死性腸炎に対する抵抗性が非常に向上する。
【０１８２】
本明細書において教示される、ＤＦＭと酵素との特異的な組み合わせにより、ムチンの分泌が有利に減少し得る。理論に束縛されるものではないが、このムチン分泌の減少により、アミノ酸の内因性の損失が減少する可能性があり、及び／又はムチン分泌の減少は性能の向上に関与し得る。
【０１８３】
本明細書において教示される、ＤＦＭと酵素との特異的な組み合わせにより、回腸における炎症が有利に減少し得る。この炎症の減少は、回腸におけるＩＦＲ−ｇの発現の下方制御によるものであると見ることができる。本発明者らは、免疫反応の制御により効率を改善できることを示している。
【０１８４】
ＤＦＭと酵素の処方
ＤＦＭと酵素は、活性ＤＦＭと活性酵素とを処方に確実に含有させるのに好適な任意の方法で処方できる。
【０１８５】
一実施形態では、ＤＦＭと酵素は液体、乾燥粉末、又は顆粒として処方され得る。
【０１８６】
乾燥粉末又は顆粒は、トップスプレー式流動床コーター、ボトムスプレー式Ｗｕｒｓｔｅｒコーター又はドラム式造粒（例えば、高せん断造粒）、押出、パンコーティング又はマイクロミキサなど、当業者に既知の手法により製造できる。
【０１８７】
一部の実施形態ではＤＦＭ及び／又は酵素は被覆してよく、例えば、カプセル封入してよい。好適には、ＤＦＭと酵素は同一の被覆内に配合してよく又は同一のカプセル内にカプセル封入してよい。あるいは、１又は２又は３又は４種の酵素を同一の被覆内に配合してもよく、あるいは同一のカプセル内にカプセル封入してもよく、かつＤＦＭは、１種以上の又はすべての酵素とは別にして被覆中に配合することもできる。ＤＦＭが芽胞を産生し得る一部の実施形態では、ＤＦＭには何ら被覆を行わなくてもよい場合もある。このような状況では、ＤＦＭの芽胞は１又は２又は３又は４種の酵素と単純に混合してもよい。後者の場合、酵素を被覆してもよく、例えば、カプセル封入してもよく、例としては、１種以上の又はすべての酵素を被覆してもよく、例えばカプセル封入してもよい。酵素は酵素の混合物（すなわち、１種以上、２種以上、又は３種以上、又はすべての酵素の混合物）としてカプセル封入することができ、あるいは酵素は別個に、例えば、単一の酵素としてカプセル封入することもできる。一部の好ましい実施形態では、４種の酵素すべてを一緒に被覆してよく、例えば、一緒にカプセル封入してよい。
【０１８８】
一実施形態では、被覆は熱から酵素を保護し、熱保護材としてみなすことができる。
【０１８９】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）又は同第１９９７／０１６０７６号又は同第１９９２／０１２６４５号（これらの各々が参照により本案件に組み込まれる）に記載の通り、乾燥粉末又は顆粒剤中に配合される。
【０１９０】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、活性剤、及び少なくとも１つの被覆を含む飼料組成物用の顆粒として配合されてよく、顆粒に含まれる活性剤は、ａ）飼料のペレット加工、ｂ）蒸気加熱した飼料の前処理加工、ｃ）貯蔵、ｄ）ペレット加工していない混合物としての材料の貯蔵、及びｅ）微量元素、有機酸、還元糖、ビタミン、塩化コリン、及び、酸性若しくは塩基性飼料ベースミックス又は飼料プレミックスをもたらす化合物から選択される少なくとも１種の化合物を含む飼料ベースミックス又は飼料プレミックスとしての成分の貯蔵、のうちの１つ以上から選択される条件で処理した後に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％の活性を保持する。
【０１９１】
顆粒に関しては、少なくとも１つのコーティングは湿分水和材料（moisture hydrating material）を含み得る。この材料は顆粒の少なくとも５５重量％を構成し、及び／又は少なくとも１つのコーティングには２つのコーティングが含まれ得る。２つのコーティングは、湿分水和コーティング（moisture hydrating coating）及び防湿コーティングであってもよい。一部の実施形態では、湿分水和コーティングは顆粒の２５重量％〜６０重量％であってよく、防湿コーティングは顆粒の２重量％〜１５重量％であってよい。湿分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン、及びマルトデキストリンから選択されてよく、かつ防湿コーティングは、ポリマー、ガム、乳清、及びデンプンから選択されてよい。
【０１９２】
顆粒は、飼料のペレット加工により製造してよく、飼料の前処理加工は、７０℃〜９５℃で、例えば８５℃〜９５℃で最大で数分間実施してよい。
【０１９３】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、貯蔵後及び顆粒が材料となる蒸気加熱ペレット加工後に活性を少なくとも８０％保持している活性剤、防湿コーティング、及び顆粒の少なくとも２５重量％の湿分水和コーティング、蒸気加熱ペレット加工前の水分活性が０．５未満である顆粒、を含む、動物飼料用の顆粒に配合することができる。
【０１９４】
顆粒はポリマー及びガムから選択される防湿コーティングを有してよく、湿分水和材料は無機塩であってよい。湿分水和コーティングは顆粒の２５重量％〜４５重量％であってよく、防湿コーティングは顆粒の２重量％〜１０重量％であってよい。
【０１９５】
顆粒は、蒸気加熱ペレット加工により製造することができ、このペレット加工は８５℃〜９５℃で最大で数分間実施することができる。
【０１９６】
一部の実施例では、粉末澱粉、又は石灰石などの希釈剤を用いて、ＤＦＭ（例えば、ＤＦＭの芽胞）を希釈してもよい。
【０１９７】
一実施形態では、組成物は消費に好適な液体配合物であり、好ましくは、緩衝材、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールのうちの１つ以上を含有する液体製剤などである。
【０１９８】
他の実施形態では、飼料添加用組成物は、塗布により、例えば、酵素の担体基材、例えば粉末小麦などへの噴霧により配合することができる。
【０１９９】
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、プレミックスとして配合され得る。例えば、プレミックスは１種以上の飼料成分、例えば、１種以上のミネラル及び／又は１種以上のビタミンを含み得る。
【０２００】
一実施形態では、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、マルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、小麦又は小麦成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩（sorbiate）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１種の生理学的に許容できる担体とともに配合される。
【０２０１】
パッケージング
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は動物用飼料はパッケージ化される。
【０２０２】
好ましい一実施形態では、飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は動物用飼料は、袋、例えば紙袋によりパッケージ化される。
【０２０３】
代替的な実施形態では、飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は動物用飼料は、容器に密閉され得る。任意の好適な容器を使用できる。
【０２０４】
飼料
本発明の飼料添加用組成物は、飼料として、又は飼料の調製に使用できる。
【０２０５】
本明細書において、用語「飼料」は、「動物用飼料」と同義に使用される。
【０２０６】
飼料は、使用及び／又は適用態様及び／又は投与態様に応じ、液体又は固体形態であり得る。
【０２０７】
機能性飼料などの飼料として使用する際、又はその調製に使用する際、本発明の組成物は、次の：栄養学的に許容できる担体、栄養学的に許容できる希釈剤、栄養学的に許容できる賦形剤、栄養学的に許容できる補助剤、栄養学的有効成分、のうちの１つ以上と組み合わせて使用できる。
【０２０８】
好ましい実施形態では、本発明の飼料添加用組成物を飼料成分と混合して動物用飼料を製造する。
【０２０９】
本明細書で使用するとき、用語「飼料成分」は、動物用飼料の全て又は一部を意味する。「動物用飼料の一部」は、動物用飼料に含まれる成分のうちの１つ、あるいは動物用飼料に含まれる成分のうちの１つ以上、例えば、２、又は３、又は４を意味し得る。一実施形態では、用語「飼料成分」は、プレミックス又はプレミックス成分を包含する。
【０２１０】
好ましくは、飼料は、飼い葉又はそれらの混合物、配合飼料又はそれらのプレミックスであり得る。一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、配合飼料又は配合飼料成分と混合してよく、あるいは配合飼料のプレミックス、又は飼い葉、飼い葉成分、若しくは飼い葉プレミックスと混合してよい。
【０２１１】
本明細書で使用するとき、用語「飼い葉」は、動物に提供される（動物がそれを求めて探しまわるというものではない）任意の食物を意味する。飼い葉には、切断済みの植物を包含する。
【０２１２】
用語「飼い葉」には、干し草、わら、貯蔵牧草、圧縮及びペレット化飼料、油及び混合飼料、並びに同様に発芽穀類及びマメ科植物が包含される。
【０２１３】
飼い葉は次の植物：アルファルファ（ルーサン）、大麦、シャジクソウ（birdsfoot trefoil）、アブラナ属、シャウ・モエラー（Chau moellier）、ケール、菜種（キャノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、カブ、ツメクサ、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽エンバク（false oat grass）、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒース・グラス（heath grass）、牧草（牧草地及び草原の草が自然と混ぜ合わされたもの）、カモガヤ、ホソムギ、オオアワガエリ、コーン（ｍａｉｚｅ）、アワ、エンバク、サトウモロコシ、大豆、樹木（まぐさ用に刈り込まれた枝葉）、小麦、及びマメ科植物のうちの１種以上から得られる。
【０２１４】
用語「配合飼料」は、粉末、ペレット、ナッツ、ケーキ、又はクランブルの形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、各種原材料及び添加剤を配合したものであってよい。これらの配合物は、対象とする動物の求める具体的な必要量に従って配合される。
【０２１５】
配合飼料は、１日に必要とされる栄養分をすべて提供する完全飼料、飼料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃厚飼料、又はミネラル及びビタミンなどのその他の微量栄養素のみを提供する栄養補助剤であってよい。
【０２１６】
配合飼料には、コーン、大豆、サトウモロコシ、オーツ麦、及び大麦などの飼料用穀類が主成分として使用される。
【０２１７】
本明細書で記載される通りに好適なプレミックスは、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵産物、及びその他の必須成分などの微量成分からなる組成物であり得る。一般的に、プレミックスは、市販の飼料に配合するのに好適な組成物である。
【０２１８】
本発明の任意の動物用飼料は、ａ）シリアル類、例えば、小粒穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大粒穀物（例えば、コーン又はサトウモロコシなど）など、ｂ）シリアル類を原料とする製品、例えば、コーングルテンミール、コーン等の穀物からアルコールを作製した後の蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート（wheat shorts）、米ぬか、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプ、ｃ）タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質など、ｄ）油類及び脂肪類、例えば、植物資源及び動物資源から得られる油類及び脂肪類、ｅ）ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。
【０２１９】
本発明の動物用飼料は、コーン及び大豆ミール、又はコーン及び高脂肪分大豆又は小麦ミール又はヒマワリミールを、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％含有し得る。
【０２２０】
これに加え、又はこれに代替して、本発明の動物用飼料には、少なくとも１種の高繊維飼料材料及び／又は少なくとも１種の高繊維飼料材料の少なくとも１種の副産物を含有させて、動物用高繊維飼料を提供することもできる。高繊維飼料材料の例としては、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、穀類由来の副産物、例えば、コーングルテンミール、コーン等の穀物からアルコールを作製した後の蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート、コメヌカ、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプが挙げられる。一部のタンパク質資源：ヒマワリ、ルピナス、ソラマメ、及び綿などの資源から得られたタンパク質も、高繊維であるとみなすことができる。
【０２２１】
本発明では、飼料は、次の：ペレット、ナッツ又は（ウシ用）ケーキなどの配合飼料及びプレミックス、農作物又は農作物廃棄物：コーン、大豆、サトウモロコシ、オーツ麦、大麦、コーン茎葉、コプラ、麦わら、まぐさ、サトウダイコン廃棄物；魚粉；刈りたての牧草類及びその他の飼料用植物；肉骨粉飼料；糖蜜；油かす及び圧搾ケーキ；オリゴ糖；保存加工した飼料植物：まぐさ及び貯蔵牧草；海草；全粒の又は圧砕、製粉などを施した種子及び穀類；発芽粒及び豆類；酵母エキス、のうちの１つ以上であり得る。
【０２２２】
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、ペットフードも包含する。ペットフードは、ドッグフード又はキャットフードなど、ペットによる消費が意図された植物性又は動物性物質である。ドッグフード及びキャットフードなどのペットフードは、犬用キブルなどの乾燥形態、又はウェットタイプの缶詰のいずれかであってもよい。キャットフードには、アミノ酸のタウリンを含有させてもよい。
【０２２３】
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、魚用飼料も包含する。一般的に、魚用飼料は、飼育している魚の健康を良好に保つのに必要とされる多量栄養素、微量栄養素、及びビタミンを含有している。魚用飼料は、フレーク、顆粒、又は錠剤形態であり得る。顆粒形態の飼料のうち、一部の迅速に沈降する飼料は、多くの場合、大型の魚又は水槽底部で生活する種に使用される。一部の魚用飼料は、観賞魚の発色を人工的に改良する目的で、βカロテン又は性ホルモンなどの添加剤も含有する。
【０２２４】
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、鳥用飼料も包含する。鳥用飼料には、バードフィーダーに用いられるもの及びペットの鳥に給餌するためのものの両方の飼料が包含される。典型的な鳥用サンプルは多様な種子から構成されるが、獣脂（牛脂又は羊脂）を含有させてもよい。
【０２２５】
本明細書で使用するとき、用語「接触」は、本発明の組成物が間接的に又は直接的に製品（例えば、飼料）に適用されていることを意味する。使用することのできる本開示の適用例としては、限定するものではないが、飼料添加用組成物を材料として含む製品を処理する工程、飼料添加用組成物を製品と混合して直接適用する工程、飼料添加用組成物を製品表面に噴霧する工程、又は製品を飼料添加用組成物の調合液に浸漬する工程、が挙げられる。
【０２２６】
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、好ましくは製品（例えば、動物用飼料）と混合させる。別の方法としては、飼料添加用組成物は、動物用飼料の乳濁液又は原材料に含有させてもよい。
【０２２７】
一部の用途に関しては、組成物を作用させる／組成物で処理する製品表面上に又は表面に対して利用可能であるように、組成物を製造することが重要である。これにより、組成物に次の望ましい特性：性能利益のうちの１つ以上を付与する。
【０２２８】
本発明の飼料添加用組成物は、ＤＦＭ及び酵素の量を調整して、製品（例えば、動物用飼料、又は動物用飼料の原材料）に点在、被覆、及び／又は含浸させることができる。
【０２２９】
ＤＦＭ及び酵素は、同時に（例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも）、又は連続的に（例えば、これらを別の経路により送達した場合）使用できる。一実施形態では、好ましくはＤＦＭと酵素は同時に適用する。好ましくは、ＤＦＭと酵素は、動物用飼料への送達前に、又は動物用飼料の原材料への送達前に混合させる。
【０２３０】
本発明の飼料添加用組成物に含まれるＤＦＭは、好適な濃度で添加でき、例えば、最終的な飼料製品中で、日用量あたり約２×１０５ＣＦＵ〜約２×１０１１ＣＦＵ、好適には約２×１０６〜約１×１０１０、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ〜約１×１０１０ＣＦＵの濃度になるよう添加できる。
【０２３１】
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、約７０℃、約８５℃、又は約９５℃までの熱処理に対して熱安定性である。熱処理は、最大で約１分、約５分、約１０分、約３０分、約６０分まで実施することができる。用語「熱安定性」は、特定温度への加熱前に添加剤中に存在した／添加剤中で活性であった酵素成分及び／又はＤＦＭのうちの少なくとも約７５％が、室温への冷却後も存在する／活性であることを意味する。好ましくは、特定温度への加熱前に添加剤中に存在しかつ活性であった酵素成分及び／又はＤＦＭのうちの少なくとも約８０％が、室温への冷却後も存在しかつ活性である。
【０２３２】
特に好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を均質化させて、粉末を製造する。
【０２３３】
代替的な好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）に記載の通りに顆粒に配合する。
【０２３４】
他の好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を顆粒に配合する場合、顆粒は、タンパク質コアを被覆する防水塩を含む。このような塩コーティングには、熱耐性の向上、貯蔵安定性の向上、及びそのままでは酵素及び／又はＤＦＭに対し悪影響を及ぼすその他の飼料添加物からの保護、という利点がある。
【０２３５】
好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、２０℃下で、６０％超の一定湿度と、０．２５超の水分活性を有する。
【０２３６】
好ましくは、塩コーティングは、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【０２３７】
飼料添加用組成物の製造法は、更に、粉末をペレット化する工程も含み得る。粉末は、当該技術分野において知られているその他の成分と混合させることもできる。粉末、又は粉末を含む混合物に、ダイを通過させ、得られたストランドを望ましい長さで好適なペレットに切断する。
【０２３８】
任意に、ペレット化工程は、ペレットの製造前の蒸気処理、又は調整工程を包含し得る。粉末を含む混合物は、調整槽に、例えば、蒸気噴射装置を備えるミキサに入れることができる。混合物を調整槽内で、規定の温度まで、例えば６０〜１００℃に加熱する。典型的な加熱温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃である。滞留時間は、例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び１時間などのように、秒単位から分単位、及び更には時間単位で変化させることができる。
【０２３９】
本発明の飼料添加用組成物は、任意の適切な飼料材料に添加するのに好適であることは理解されるであろう。
【０２４０】
本明細書で使用するとき、用語「飼料材料」は、動物により消費されている基本的な飼料材料を意味する。飼料材料には、例えば、少なくとも１種以上の未加工の穀類、及び／又は加工植物、及び／又は大豆ミール又は骨粉などの動物性材料が含まれ得ることは更に理解されるであろう。
【０２４１】
本明細書で使用するとき、用語「動物用飼料」は、１種以上の飼料添加組成物が添加されている飼料材料を意味する。
【０２４２】
異なる動物種は異なる動物用飼料を必要とすること、並びに同種の動物であってさえも、動物の飼育目的に応じ、異なる動物用飼料を必要とする場合があることは、当業者により理解されるであろう。
【０２４３】
好ましくは、動物用飼料は、コーン（ｍａｉｚｅすなわちｃｏｒｎ）、小麦、大麦、ライ小麦、米、タピオカ、サトウモロコシ、及び／又は任意の副産物、並びに大豆ミール、ナタネミール、セイヨウアブラナミール、綿実ミール、ヒマワリ種子ミール、動物性残渣、及びこれらの混合物などの高タンパク質成分を含む飼料材料を含み得る。より好ましくは、動物用飼料は、動物性脂肪及び／又は植物油を含み得る。
【０２４４】
場合により、動物用飼料には、カルシウムなどの追加のミネラル、及び／又は追加のビタミン類を含有させることもできる。
【０２４５】
好ましくは、動物用飼料は、コーン／大豆ミール混合物である。
【０２４６】
一実施形態では、好ましくは、飼料はペットフードではない。
【０２４７】
他の態様では、動物用飼料の製造方法を提供する。動物用飼料では、典型的には、最初に原材料を安定な粒経に挽き、次に適切な添加剤と混合する。次に、動物用飼料を水で溶くか、又はペレット化することができる。後者の場合、典型的には、目的とする高さまで温度を上昇させ、次に飼料をダイに通過させて、特定の大きさのペレットを製造する手法を包含する。ペレットを冷却させる。続いて、脂肪、及び酵素などの液性添加物を添加してもよい。動物用飼料の製造には、特に、少なくとも蒸気の使用を包含し得る適切な技術により、ペレット化の前に押し出す又は膨張させることを含む、追加工程を包含させてもよい。
【０２４８】
動物用飼料は、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラ種鶏、七面鳥、鴨、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全年齢種）、ペット（例えば、イヌ類、ネコ類）、又は魚などの単胃動物用の動物用飼料であってよく、好ましくは、動物用飼料は家禽用である。
【０２４９】
一実施形態では、動物用飼料は産卵鶏用のものではない。
【０２５０】
ほんの一例として、鶏、例えば、ブロイラー用の鶏用動物飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％（%ages）で含み得る。
【０２５１】
【表７】
2014507946.tif 000010
【０２５２】
ほんの一例として、ブロイラーなどの鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２５３】
【表８】
2014507946.tif 000011
【０２５４】
ほんの一例として、産卵鶏用飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２５５】
【表９】
2014507946.tif 000012
【０２５６】
ほんの一例として、産卵鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２５７】
【表１０】
2014507946.tif 000013
【０２５８】
ほんの一例として、七面鳥用飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２５９】
【表１１】
2014507946.tif 000014
【０２６０】
ほんの一例として、七面鳥用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２６１】
【表１２】
2014507946.tif 000015
【０２６２】
ほんの一例として、子豚用の飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２６３】
【表１３】
2014507946.tif 000016
【０２６４】
ほんの一例として、子豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２６５】
【表１４】
2014507946.tif 000017
【０２６６】
ほんの一例として、育成期／出荷期の豚用の飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２６７】
【表１５】
2014507946.tif 000018
【０２６８】
ほんの一例として、育成期／仕上げ期の豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２６９】
【表１６】
2014507946.tif 000019
【０２７０】
形態
本発明の飼料添加用組成物、及び他の成分及び／又は他の成分を含む動物用飼料は、任意の好適な形態で使用できる。
【０２７１】
本発明の飼料添加用組成物は、固体又は液体製剤の形態で、又はこれらの代替形態で使用できる。固体製剤例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、カプセル、ペレット、タブレット、細粉、及び可溶性のもの、噴霧乾燥させたもの、又は凍結乾燥させものであり得る顆粒が挙げられる。液体製剤例としては、限定するものではないが、水溶液、有機溶液、又は有機溶媒水溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられる。
【０２７２】
一部の用途では、本発明のＤＦＭ又は飼料添加用組成物は、飼料と混合してもよく、又は飲用水に投与してもよい。一実施形態では、水に含有させる際の投与範囲は、約１×１０３ＣＦＵ／動物／日〜約１×１０１０ＣＦＵ／動物／日、及びより好ましくは約１×１０７ＣＦＵ／動物／日である。
【０２７３】
好適な形態例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、ペレット、タブレット、丸剤、カプセル、腔坐剤、溶液又は懸濁液のうちの１つ以上が挙げられ、これらには、即効性、徐放性、修飾性（modified-）、持続性、周期性、拍動性、又は放出制御性投与用の着香剤又は着色剤を含有させることもできる。
【０２７４】
例えば、本発明の組成物を固体形態、例えば、ペレット形態で使用する場合、組成物には、賦形剤（例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム及びグリジンなど）、崩壊剤（例えば、デンプン（好ましくは、コーン、ポテト、又はタピオカ澱粉）、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の珪酸塩複合体など）、造粒結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルク）のうちの一種以上を含有させることもできる。
【０２７５】
成形の際に使用するにあたって栄養学的に許容できる担体例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル（petroethral fatty acid esters）、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０２７６】
成形に好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２７７】
水懸濁液及び／又はエリキシル剤の場合には、本発明の組成物は、各種甘味料又は着香料、着色剤又は染料、乳化剤及び／又は懸濁剤、並びに希釈剤（例えば、水、プロピレングリコール及びグリセリン、及びこれらの組み合わせ）と組み合わせることができる。
【０２７８】
多くの場合、非吸湿性乳清は、ＤＦＭ用（特に、微生物系ＤＦＭ）の担体として使用され、ＤＦＭの増殖開始に良好な培地である。
【０２７９】
ペーストを含有している微生物性ＤＦＭは、植物油及び不活性なゲル化材料と配合することもできる。
【０２８０】
穀類副産物を担体とし、これに真菌製品を配合することもできる。
【０２８１】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、国際公開第２００５／１２３０３４号に教示される微小粒子などの微小粒子系の形態ではない。
【０２８２】
投与
本発明のＤＦＭ及び／又は飼料添加用組成物は、単回投与用に設計することができ、又は日単位での供給を目的として設計することもできる。
【０２８３】
本発明と組み合わせて使用する組成物（及び組成物に含まれる各成分）の最適量は、処理する製品、及び／又は組成物を製品に接触させる方法、及び／又は製品の使用目的に応じて異なる。
【０２８４】
組成物に使用するＤＦＭ及び酵素の量は、有効性を得るために、及びかかる組成物を含有している飼料を給与された動物の性能を向上させるのに十分な有効性を保持させるために、十分な量でなくてはならない。このような有効時間の長さは、少なくとも製品（例えば、飼料添加用組成物、又は飼料添加用組成物を含有している飼料）が利用される時間だけ延長させるべきである。
【０２８５】
飼料に含まれるＤＦＭ対各酵素の比は、下記範囲であり得る：
ＤＦＭ：フィターゼ（ＣＦＵ／ＦＴＵ）：５．０×１０２ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＦＴＵ酵素〜５．０×１０９ＣＦＵ：１ＦＴＵ酵素、好ましくは７．５×１０４ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＦＴＵ酵素〜２．５×１０７ＣＦＵ：１ＦＴＵ酵素の範囲。
【０２８６】
ＤＦＭ：キシラナーゼ（ＣＦＵ／ＸＵ）：６．２５×１０１ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＸＵ酵素〜２．０×１０９ＣＦＵ：１ＸＵ酵素、好ましくは１．８８×１０４ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＸＵ酵素〜１．０×１０７ＣＦＵ：１ＸＵ酵素の範囲。
【０２８７】
ＤＦＭ：アミラーゼ（ＣＦＵ／ＡＵ）：１．０×１０２ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＡＵ酵素〜２．０×１０１０ＣＦＵ：１ＡＵ酵素、好ましくは３．７×１０４ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＡＵ酵素〜１．０×１０８ＣＦＵ：１ＡＵ酵素の範囲。
【０２８８】
ＤＦＭ：プロテアーゼ（ＣＦＵ／ＰＵ）：５．０×１０１ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＰＵ酵素〜１．０×１０９ＣＦＵ：１ＰＵ酵素、好ましくは１．２５×１０４ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＰＵ酵素〜５．０×１０６ＣＦＵ：１ＰＵ酵素の範囲。
【０２８９】
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む：
少なくとも４０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）のプロテアーゼ；
少なくとも１０００ＸＵ／ｋｇ〜２０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）のキシラナーゼ（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）、又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを少なくとも２０００ＸＵ／ｋｇ（飼料））；
アミラーゼ；少なくとも１８００ＡＵ／ｋｇ又は２００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１８００ＡＵ／ｋｇ又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを少なくとも２００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料））；
フィターゼを少なくとも５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、並びに
Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を少なくとも７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２９０】
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む：
プロテアーゼを４０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
キシラナーゼを１０００ＸＵ／ｋｇ〜２０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを２０００ＸＵ／ｋｇ（飼料））；
アミラーゼ；１８００ＡＵ／ｋｇ又は２００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１８００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを２００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料））；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２９１】
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む：
プロテアーゼを５０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
キシラナーゼを１２５０ＸＵ／ｋｇ（飼料）〜２５００ＸＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを２５００ＸＵ／ｋｇ（飼料））；
アミラーゼ；２２５０ＡＵ／ｋｇ（飼料）又は２５０ＴＡＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１８００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを２５０ＴＡＵ／ｋｇ（飼料））；
フィターゼを６２５ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）；及び
Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２９２】
他の実施形態では、動物用飼料は、次のものを含む：
プロテアーゼを２０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
キシラナーゼを５００ＸＵ／ｋｇ（飼料）〜１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを５００ＸＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料））；
アミラーゼ；９００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又は１００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを９００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを１００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料））；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）；及び
Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を３７，５００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２９３】
好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、動物用飼料に投与するのに十分な量の酵素及びＤＦＭを含む：
プロテアーゼを４０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
キシラナーゼを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）〜２０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを２０００ＸＵ／ｋｇ（飼料））；
アミラーゼ；１８００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又は２００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを１８００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを２００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料））；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）；及び
Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２９４】
好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、動物用飼料を投与するにあたって、十分な酵素及びＤＦＭを次の通りに含む：
プロテアーゼを２０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
キシラナーゼを５００ＸＵ／ｋｇ（飼料）〜１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを５００ＸＵ／ｋｇ（飼料）又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを１０００ＸＵ／ｋｇ（飼料））；
アミラーゼ；９００ＡＵ／ｋｇ（飼料）又は１００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料）（例えば、Ａｖｉｚｙｍｅを９００ＡＵ／ｋｇ又はＡｘｔｒａ  ＸＡＰを１００ＴＡＵ／ｋｇ（飼料））；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）；及び
Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を３７，５００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２９５】
他の成分との組み合わせ
本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び酵素は、他の成分と組み合わせて使用できる。したがって、本発明は、組み合わせにも関係する。ＤＦＭをプロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びフィターゼと組み合わせたものを、本明細書では「本発明の飼料添加用組成物」と呼ぶ。
【０２９６】
本発明の組み合わせは、本発明の飼料添加用組成物（又はこれらの構成成分の１種以上）と、動物による消費に好適でありかつ消費者に薬用効果又は生理学的効果を提供し得る他の成分と、を含む。
【０２９７】
一実施形態では、好ましくは「他の成分」は、更なる酵素又は更なるＤＦＭではない。
【０２９８】
成分はプレバイオティクスであってもよい。典型的には、プレバイオティクスは、難消化性糖質（オリゴ糖類又は多糖類）、又は糖アルコールであり、上部消化管内では分解されず、すなわち吸収されない。市販品として用いられており、本発明に有用である既知のプレバイオティクスとしては、イヌリン（フラクトオリゴ糖、又はＦＯＳ）、及びトランス型ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ又はＴＯＳ）が挙げられる。好適なプレバイオティクスとしては、パラチノースオリゴ糖、大豆オリゴ糖、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、難消化性デンプン、ラクトサッカロース、ラクツロース、ラクチトール、マルチトール、マルトデキストリン、ポリデキストロース（すなわち、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標））、ラクチトール、ラクトスクロース、大豆オリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖及びキシロオリゴ糖、ペクチン断片、食物繊維、マンナンオリゴ糖が挙げられる。
【０２９９】
食物繊維としては、非デンプン性多糖類、例えば、アラビノキシラン、セルロース、及びその他の多くの植物成分、例えば、難消化性デキストリン、イヌリン、リグニン、ワックス、キチン、ペクチン、β−グルカン、及びオリゴ糖が挙げられる。
【０３００】
一実施形態では、本発明は、本発明の飼料添加用組成物（又は飼料添加用組成物の１種以上の成分）と、プレバイオティクスとの組み合わせに関する。他の実施形態では、本発明は、ＤＦＭと、キシラナーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、及びプレバイオティクスとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物に関する。
【０３０１】
プレバイオティクスは、本発明の飼料添加用組成物（又はこれらの成分）と同時に（例えば、一緒に混合することにより、又は同一の若しくは異なる経路により送達することにより同時に）、又は連続的に（例えば、同一の若しくは異なる経路により送達することにより連続的に）投与することができる。
【０３０２】
本発明の組み合わせの他の成分としては、ポリデキストロース、例えば、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標）、及び／又はマルトデキストリン、及び／又はラクチトールが挙げられる。場合によりこれらのその他の成分を飼料添加用組成物に添加することで、乾燥加工を補助し、かつＤＦＭの生存を助けることもできる。
【０３０３】
他の好適な成分の更なる例としては、次の：増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤、甘味剤（人口甘味剤を包含する）、レオロジー改質剤、安定化剤、抗酸化剤、染料、酵素、担体、賦形剤、添加剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、懸濁剤、崩壊剤、造粒結合剤などが挙げられる。これらのその他の成分は天然素材であってもよい。これらのその他の成分は化学的手法及び／又は酵素的手法を用い調製してもよい。
【０３０４】
一実施形態では、ＤＦＭ及び／又は酵素はカプセル封入することができる。一実施形態では、飼料添加用組成物、及び／又はＤＦＭ、及び／又は酵素は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）に記載される通りの乾燥粉末又は顆粒として配合される。
【０３０５】
一実施形態では、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、１種以上の脂質と組み合わせて使用することもできる。
【０３０６】
例えば、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、１種以上の脂質ミセルと組み合わせて使用することもできる。脂質ミセルは、単純脂質ミセル又は脂質ミセル複合体であってよい。
【０３０７】
脂質ミセルは、脂質及び／又は油などの配向性両親媒性分子の集合体であってよい。
【０３０８】
本明細書で使用するとき、用語「増粘剤又はゲル化剤」は、不混和性の液体の液滴、空気、又は不溶性固体のうちのいずれかの粒子の移動を緩慢にさせるか又は予防することにより、分離を防ぐ製品を指す。個々の水和分子の粘性が上昇し、分離が緩慢になった場合に、増粘がもたらされる。水和分子が結合して３次元ネットワークを形成し、粒子を捕捉し不動化させた場合に、ゲル化がもたらされる。
【０３０９】
本明細書で使用するとき、用語、「安定化剤」は、経時変化から製品（例えば、食品）を保護する成分又は成分の組み合わせとして定義される。
【０３１０】
本明細書で使用するとき、用語「乳化剤」は、エマルションの分離を予防する成分（例えば、食品成分）を指す。エマルションは、２種の不混和性の物質のうちの他方が液滴形態で存在し、他方に含有されている状態を指す。エマルションは、水中油型（油が液滴又は分散相となり、水が連続相となる）、又は油中水型（水が分散相となり、油が連続相となる）で構成される場合がある。液中気体の状態である発泡体、及び液中固体の状態である懸濁液も、乳化剤を使用して安定化させることができる。
【０３１１】
本明細書で使用するとき、用語「結合剤」は、物理的又は化学的反応により製品を互いに結合させる成分（例えば、飼料成分）を指す。例えば、「ゲル化」中に水が吸収されることで、結合効果が得られる。しかしながら、結合剤は、油などの他の液体を吸収し、製品中に保持する場合もある。典型的には、本発明の文脈において、結合剤は、例えば、焼成製品、ペストリー、ドーナッツ、及びパンなどの、固体又は低湿分製品に使用されることになる。
【０３１２】
「担体」又は「賦形剤」は、ＤＦＭ及び／又は酵素の投与に好適な材料を意味し、このような材料としては、例えば、当該技術分野で知られている任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、又は可溶化剤などの任意の材料が挙げられる。これらの材料は、非毒性であり、かつ組成物に関係する任意の成分と有害な様式で相互作用しない。
【０３１３】
本発明は、ＤＦＭ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ及びアミラーゼを、マルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩（sorbiate）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ブドウ糖、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種の生理学的に許容できる担体と混合する工程を含む、飼料添加用組成物の製造方法を提供する。
【０３１４】
賦形剤の例としては：微結晶セルロース及びその他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム、グリジン、デンプン、乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールのうちの１種以上が挙げられる。
【０３１５】
崩壊剤の例としては：デンプン（好ましくはコーン、ポテト、又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の珪酸塩複合体のうちの１種以上が挙げられる。
【０３１６】
造粒結合剤の例としては：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチン、及びアカシアのうちの１種以上が挙げられる。
【０３１７】
滑沢剤の例としては：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクのうちの１種以上が挙げられる。
【０３１８】
希釈剤の例としては：水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上が挙げられる。
【０３１９】
他の成分は、同時に（例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも）、又は連続的に（例えば、これらを別の経路により送達した場合）使用できる。
【０３２０】
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物を他の成分と混合した場合にもＤＦＭは生存活性を保持する。
【０３２１】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物はクロム又は有機クロムを含まない。
【０３２２】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はグルカナーゼを含有しない。
【０３２３】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はソルビン酸を含有しない。
【０３２４】
濃縮物
本発明での使用を目的としたＤＦＭは、濃縮物の形態であってもよい。典型的には、これらの濃縮物は、実質的に高濃度のＤＦＭを含む。
【０３２５】
本発明の飼料添加用組成物には、生菌成分（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を含ませることができ、含ませることの出来る範囲は、少なくとも１０４ＣＦＵ／ｇ（好適には、少なくとも１０５ＣＦＵ／ｇ、例えば、少なくとも１０６ＣＦＵ／ｇ、例えば、少なくとも１０７ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０８ＣＦＵ／ｇ、例えば、少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇ）〜約１０１０ＣＦＵ／ｇ（又は更には約１０１１ＣＦＵ／ｇ若しくは約１０１２ＣＦＵ／ｇ）である。
【０３２６】
ＤＦＭが濃縮物の形態である場合、本発明の飼料添加用組成物には生菌を少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１０１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは少なくとも１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１０１２ＣＦＵ／ｇの範囲で含ませることができる。
【０３２７】
濃縮形態の粉末、顆粒及び液体組成物を水で希釈するか、あるいは水又はその他の好適な希釈剤（例えば、ミルク又は鉱物油若しくは植物油などの好適な増殖培地）に再懸濁するかして、使用に際して組成物を用意することもできる。
【０３２８】
本発明のＤＦＭ又は飼料添加用組成物、あるいは濃縮形態の本発明の組み合わせは、当該技術分野で知られている手法により製造することができる。
【０３２９】
本発明の一態様では、酵素又は飼料は、濃縮形態の組成物と接触している。
【０３３０】
本発明の組成物は、当該技術分野で知られている手法により噴霧乾燥又は凍結乾燥させてもよい。
【０３３１】
噴霧乾燥工程を用い粒子を製造するための典型的な加工法は、固体材料を適切な溶媒に溶解させること（例えば、発酵培地でのＤＦＭの培養）を伴う。別の方法としては、材料を非溶媒に懸濁又は乳化させて懸濁液又はエマルションを生成することもできる。場合により、この段階で、他の成分（上述のもの）、又は例えば、抗菌剤、安定化剤、染料、及び乾燥工程の助剤などの要素を添加してもよい。
【０３３２】
次に溶液を霧化して、液滴の微細な霧を生成する。この液滴を直ちに乾燥チャンバに入れ、ガスと接触させる。液滴から乾燥ガス中に溶媒を蒸発させ、液体を固化させることで、粒子を生成する。次に粒子を乾燥ガスから分離し、回収する。
【０３３３】
対象とする動物
本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物（subject）」は、本発明の飼料添加用組成物、又は本発明の飼料添加用組成物を含む動物用飼料を、投与される又は投与されている動物を意味する。
【０３３４】
本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物（subject）」は、動物（animal）を意味する。好ましくは、対象は、例えば、家畜類（livestock）、又は家畜（domesticated animal）（例えば、ペット）などの哺乳類、鳥類、魚類、又は甲殻類である。
【０３３５】
一実施形態では、「対象とする動物」は家畜類である。
【０３３６】
本明細書で使用するとき、用語「家畜類」は、任意の飼育動物を指す。好ましくは、家畜類は、雌牛又は雄牛（仔牛を含む）、家禽、豚（子豚を含む）、家禽（ブロイラー、鶏及び七面鳥を含む）、鳥類、魚類（サーモン、タラ、トラウト及びコイ科の魚（例えば、鯉）などの淡水魚、並びに海産魚（例えば、シーバス）を含む）、甲殻類（エビ、イガイ、及びホタテ貝など）、馬（競走馬を含む）、羊（子羊を含む）のうちの１種以上である。
【０３３７】
一実施形態では、用語「家畜類及び／又は家禽及び／又は鶏」には産卵鶏は包含されない。
【０３３８】
他の実施形態では、「対象とする動物」は家畜又はペット又は動物園などの環境で飼育されている動物である。
【０３３９】
本明細書で使用するとき、用語「家畜」又は「ペット」、又は「動物園などの環境で飼育されている動物」は、イヌ科の動物（例えば、犬）、ネコ科の動物（例えば、猫）、げっ歯目（例えば、モルモット、ラット、マウス）、鳥類、魚類（淡水魚及び海産魚を含む）、並びに馬などの任意の関係性のある動物を指す。
【０３４０】
一実施形態では、対象とする動物は腸内病原菌に曝露されている場合がある。
【０３４１】
例えば、対象とする動物の腸又は消化管内には１種以上の腸内病原菌が存在している場合がある。例えば、対象とする動物の腸又は消化管内には１種以上の腸内病原菌が次の程度存在している場合がある：
ｉ）動物の性能が低下する程度、及び／又は
ｉｉ）臨床的に意義のある程度、又は
ｉｉｉ）無症状の程度。
【０３４２】
例えば、腸内病原菌はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）であり得る。
【０３４３】
性能
本明細書で使用するとき、「動物性能」は、飼料効率及び／又は動物の体重増加により、並びに／あるいは飼料要求率により、並びに／あるいは飼料に含まれる栄養分の可消化性（例えば、アミノ酸の可消化性）及び／又は飼料に含まれるエネルギー又は代謝エネルギーの可消化性により、並びに／あるいは窒素保持により、並びに／あるいは動物が壊死性腸炎の悪影響を回避する能力により、並びに／あるいは対象とする動物の免疫応答性により、決定することができる。
【０３４４】
好ましくは「動物性能」は、飼料効率及び／又は動物の体重増加により、並びに／あるいは飼料要求率により決定される。
【０３４５】
「動物性能の向上」により、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用した場合に、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料と比較して、飼料効率の向上、及び／又は体重増加の向上、及び／又は飼料要求率の減少、及び／又は飼料に含まれる栄養分若しくはエネルギーの可消化性の向上、及び／又は窒素保持の向上、及び／又は壊死性腸炎による悪影響を回避する能力の向上、及び／又は対象とする動物の免疫応答性の向上が得られることを意味する。
【０３４６】
好ましくは、「動物性能の向上」により、飼料効率の向上及び／又は体重増加の上昇及び／又は飼料要求率の減少が意味される。
【０３４７】
本明細書で使用するとき、用語「飼料効率」は、一定期間の間、動物に飼料を適宜又は規定量で給与した場合に生じる、体重増加の程度を指す。
【０３４８】
「飼料効率の向上」は、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用することで、飼料取り込み単位あたりの体重増加率が、既存の飼料添加用組成物を使用した場合と比較して向上していることを意味する。
【０３４９】
飼料要求率（ＦＣＲ）
本明細書で使用するとき、用語「飼料要求率」は、体重を特定量だけ増加させるために動物に給与する飼料量を指す。
【０３５０】
飼料要求率の向上とは、飼料要求率が低くなることを意味する。
【０３５１】
「飼料要求率の減少」又は「飼料要求率の向上」は、飼料に飼料添加用組成物を使用した場合に、動物の体重を特定量だけ増加させるために動物に給餌する必要のある飼料量が、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料を同量使用した場合と比較して少なくなることを意味する。
【０３５２】
栄養素可消化性
本明細書で使用するとき、栄養素可消化性は、胃腸管又は胃腸管の特定の分節（例えば、小腸）から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素可消化性は、対象とする動物に投与した量と、対象とする動物の糞便に分泌された量、又は胃腸管の特定の分節、例えば回腸において消化物中に残存している量との差として測定することができる。
【０３５３】
本明細書で使用するとき、栄養素可消化性は、期間中の排泄物の総回収量を用いて、栄養素の摂取量と排出量の差から測定することができ、あるいは動物により吸収されず、かつ胃腸管又は胃腸管分節において消失した栄養素の量が研究者により算出可能な不活性マーカーを用い測定することができる。このような不活性マーカーとしては、二酸化チタン、酸化クロム、又は酸不溶性灰分が挙げられる。消化能は、飼料に含まれる栄養素の割合（％）として、又は飼料に含まれる栄養素の質量単位あたりの可消化栄養素の質量単位として、表すことができる。
【０３５４】
本明細書で使用するとき、栄養素可消化性は、デンプン可消化性、脂肪可消化性、タンパク質可消化性、及びアミノ酸可消化性を包含する。
【０３５５】
本明細書で使用するとき、「エネルギー消化率」は、飼料に含まれる総エネルギーから糞便に含まれる総エネルギーを減じるか、あるいは消費された飼料に含まれる総エネルギーから動物の胃腸管の特定の分節、例えば回腸に残存している総エネルギーを減じるかして算出された値を意味する。本明細書で使用するとき、「代謝エネルギー」は、見かけの代謝エネルギーを指し、消費された飼料に含まれる総エネルギーから、糞便、尿、及び消化に由来するガスに含まれる総エネルギーを減じた値を意味する。エネルギー消化率及び代謝エネルギーは、栄養素消化率の測定法と同様の方法を用い、飼料の代謝エネルギーを算出するために窒素排出について適切な補正を行って、摂取総エネルギーと、糞便に分泌された又は胃腸管の特定の分節に存在する消化物に残存する総エネルギーとの差として測定することができる。
【０３５６】
窒素保持
本明細書で使用するとき、「窒素保持」は、対象とする動物が、食物由来の窒素を体重として保持する能力を意味する。窒素の排出が日常摂取量を超過した場合に負の窒素バランスが生じ、多くの場合、筋肉量の減少が見られる。正の窒素バランスは、多くの場合に筋肉の成長と関連付けられ、これは成長期の動物において顕著である。
【０３５７】
窒素保持は、期間中の糞尿の総回収量を用いて、窒素摂取量と窒素排出量の差として測定することができる。窒素排出量には、飼料由来の未消化タンパク質、内因性のタンパク質性分泌物、微生物タンパク質、及び尿窒素が包含されることは理解されるであろう。
【０３５８】
生存率
本明細書で使用するとき、用語「生存率」は、対象とする動物が生存し続ける率を意味する。用語「生存率の向上」は、「斃死率の低下」と言い換えることができる。
【０３５９】
枝肉歩留まり及び精肉歩留まり
本明細書で使用するとき、用語「枝肉歩留まり」は、食肉処理に関係する商業工程又は試験工程後に得られる枝肉が生体重に占める割合を意味する。用語「枝肉」は、頭部、尾部、肢部、及び羽又は皮を取り除き食用に食肉処理された動物の肉体を意味する。本明細書で使用するとき、用語「精肉歩留まり」は、食肉が生体重に占める割合、あるいは特定の切り出し肉が生体重に占める割合を意味する。
【０３６０】
体重増加
本発明は、更に、対象とする動物、例えば、家禽又はブタにおいて、体重増加率を向上させる方法を提供し、この方法は、本発明の飼料添加用組成物を含む動物用飼料を、対象とする動物に給与する工程を含む。
【０３６１】
「体重増加の向上」は、飼料添加用組成物を含む飼料の給与を受けた動物の体重増加が、この飼料添加用組成物を含まない飼料の給与を受けた動物の体重増加と比較して向上していることを指す。
【０３６２】
壊死性腸炎
壊死性腸炎は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）により引き起こされる急性又は慢性の腸毒血症であり、世界中の鶏、七面鳥、及びアヒルで観察されている。多くの場合、壊死性腸炎は、一般的に小腸中央部に生じる線維素壊死性腸炎により特徴づけられる。斃死率は５〜５０％であり、一般的には１０％付近である。感染は、糞口感染により生じる。原因となる生物の芽胞は非常に耐性が高い。素因としては、コクシジウム症（coccidiosis/coccidiasis）、飼料（高タンパク）が挙げられ、アヒルでは、極度のストレス、高粘度の食餌（多くの場合、飼料のライ麦及び小麦含量が高いことに関係付けられる）、汚染された飼料及び／又は水、その他の衰弱を招く疾患などが挙げられる。
【０３６３】
本発明は、対象とする動物の壊死性腸炎に対する耐性を向上させる工程に関する。換言すれば、本発明は、壊死性腸炎の副作用を回避する又は減少させる工程に関する。
【０３６４】
本明細書で使用するとき、用語「に対する耐性」は、用語「〜耐性」を包含し得る。したがって、一実施形態では、対象とする動物は、壊死性腸炎耐性でない場合にも壊死性腸炎耐性とされる場合があり、すなわち、対象とする動物の性能に悪影響が現れない場合などがこれに当てはまる。
【０３６５】
一実施形態では、本発明は、対象とする動物において壊死性腸炎を処理又は予防するための、本発明の飼料添加用組成物に関する。通常、対象とする動物は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はエイメリア（Eimeria）種を保有しているか、又はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はエイメリア（Eimeria）種に対し曝露されている。このような曝露は、環境に起因するか、あるいは例えば、コクシジウム生ワクチンが使用された場合など、飼料若しくは飲用水に生菌が適用されたことに起因するものであり得る。
【０３６６】
他の実施形態では、本発明は、対象とする動物におけるコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための飼料添加用組成物に関する。
【０３６７】
本発明は、壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症を予防及び／又は処置する方法を更に提供し、本方法は、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与するものである。
【０３６８】
免疫応答
本明細書で使用するとき、免疫応答は、抗体産生の増加、細胞介在性免疫の上方制御、炎症促進性サイトカインの上方制御、及びｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の増強など、ＤＦＭが動物の免疫系を調節する複数の経路のうちの１つを意味する。ＤＦＭによる胃腸管の免疫賦活は疾患から宿主を保護するのに有益な場合があり、及び胃腸管の免疫抑制は、免疫機能の支持に使用される栄養素及びエネルギーがより少なくなることから、宿主に有益な場合があることは、理解されるであろう。
【０３６９】
好ましくは、免疫応答は、細胞性免疫応答である。
【０３７０】
好ましくは、免疫応答は、免疫マーカーの観察により測定される。
【０３７１】
病原菌
本明細書で使用するとき、用語「病原菌」は、例えば、毒素産生性のクロストリジウム（Clostridium）属例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又は大腸菌（E. coli）、及び／又は、サルモネラ菌種（Salmonella spp）、及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）を意味する。一実施形態では、病原菌は、トリ病原性大腸菌（E. coli）属であり得る。
【０３７２】
本発明は、対象とする動物の胃腸管において、病原菌数を減少させることができる。
【０３７３】
栄養素の排出
一実施形態では、本発明は、糞尿への栄養素の排出の減少に関する。これにより、環境ハザードの減少に正の効果が得られる。例えば、好ましい実施形態では、本発明は、対象とする動物の糞尿糞尿に含まれる窒素、及び／又はリン含量を減少させることに関する。したがって、環境中の窒素及び／又はリンの量が減少することになり、都合がよい。
【０３７４】
プロバイオティクス
一部の態様では、本発明の組成物に含まれるＤＦＭは、プロバイオティクス培養効果を発揮し得ると考えられている。本発明の組成物に更にプロバイオティクス及び／又はプレバイオティクスを添加することも同様に本発明の範囲内に含まれる。
【０３７５】
本明細書において、プロバイオティクスは、
「有益な細菌のうち１種又は限定種の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することで宿主に有効に作用する難消化性食品成分」である。
【０３７６】
本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス培養物」は、例えば、必要数だけ経口摂取又は局所適用された場合に、宿主生物に有利に作用する、すなわち、１種以上の実証可能な健康効果を宿主生物に付与する、生菌（例えば、細菌又は酵母など）であると定義する。プロバイオティクスは、１箇所以上の粘膜表面において、微生物のバランスを改善し得る。例えば、粘膜表面は腸、尿路、気道又は皮膚であり得る。本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス」は、免疫系の有効な分岐を刺激し得ると同時に、例えば、腸などの免疫表面において炎症応答を減少させる生菌も包含する。
【０３７７】
プロバイオティクス摂取の下限又は上限は存在しないものの、日用量として、少なくとも１０６〜１０１２、好ましくは少なくとも１０６〜１０１０、好ましくは１０８〜１０９ｃｆｕを用いることが、対象とする動物において有利な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。
【０３７８】
単離
一態様では、本発明で使用される好適な酵素又はＤＦＭは、単離形態であってよい。用語「単離」は、酵素又はＤＦＭが、少なくとも１種のその他の成分を少なくとも実質的に不含であることを意味し、少なくとも１種のその他の成分は、酵素又はＤＦＭと、自然界において天然に関係するものであり、天然に見られる通りのものである。本発明の酵素又はＤＦＭは、本来であればこの物質が関連付けられていたであろう１種以上の汚染物質を実質的に不含の形態で提供され得る。したがって、例えば、混入する可能性のある１種以上のポリペプチド及び／又は核酸分子を実質的に含まない。
【０３７９】
精製
一態様では、好ましくは本発明に従う酵素及び／又はＤＦＭは精製された形態である。用語「精製」は、酵素及び／又はＤＦＭが高濃度で存在していることを意味する。酵素及び／又はＤＦＭは、組成物中に存在する主成分として望ましいものである。好ましくは、酵素及び／又はＤＦＭは、考慮中の総組成物に対し少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の濃度で存在し、この濃度は、乾燥重量／乾燥重量基準で決定される。
【０３８０】
本明細書に記載の任意の特徴を組み合わせて、本発明の範囲内に包含させるよう本発明の実施例を組み合わせ得ることも本発明の範囲内であると見なされる。特に、細菌に関係する何らかの治療上の効果が付随して発揮され得ることも本発明の範囲内のものであると見なされる。
【０３８１】
ヌクレオチド配列
本発明の範囲は、本明細書に定義される通りの特性を有するタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を包含する。
【０３８２】
本明細書で使用するとき、用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びに変異体、相同体、断片、及びこれらの誘導体（これらの一部分など）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来、合成由来、又は組み換え由来であってよく、センス鎖又はアンチセンス鎖に関わらず二本鎖又は一本鎖であり得る。
【０３８３】
本発明に関係する用語「ヌクレオチド配列」としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられる。好ましくはＤＮＡを意味し、より好ましくは本発明をコードしているｃＤＮＡ配列を意味する。
【０３８４】
好ましい実施形態では、本発明の範囲それ自体に関係するとき、及び本発明の範囲それ自体に包含されるとき、ヌクレオチド配列は、天然の状態であるならば、及び同様にその天然の状態である天然に関連付けられる配列と結合しているならば、本発明に従うネイティブなヌクレオチド配列を含有しない。参照しやすさのため、出願人らは、この好ましい実施形態のことを「非ネイティブなヌクレオチド配列」と呼ぶことにする。この観点で、用語「ネイティブなヌクレオチド配列」は、ネイティブな状態のヌクレオチド配列全長を意味し、かつ天然に関連付けられる完全なプロモータに操作可能に連結させてある場合には、このプロモータもネイティブな状態のものである。しかしながら、本発明の範囲に包含されるアミノ酸配列は、ネイティブな生物においてヌクレオチド配列を発現させた後で単離することができ、及び／又は精製することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の範囲内に包含されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によりそのネイティブな生物において発現させることができるものの、本明細書では、ヌクレオチド配列は、生物内で天然に関連付けられるプロモータの制御下にはない。
【０３８５】
典型的には、本発明の範囲内に包含されるヌクレオチド配列は、組み換えＤＮＡ技術を用い調製される（すなわち、組み換えＤＮＡ）。しかしながら、本発明の代替的な実施形態においては、ヌクレオチド配列は、当該技術分野で広く知られる化学な手法により、その全体又は一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３及びＨｏｒｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２を参照されたい）。
【０３８６】
ヌクレオチド配列の調製
本明細書に定義される通りの特性を有するタンパク質又は修飾に好適なタンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列は、このタンパク質を生産する任意の細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製することができる。当該技術分野ではヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製に関し各種手法が広く知られている。例えば、同定及び／又は単離及び／又は精製された好適な配列をより多量に調製するためには、ＰＣＲによる増幅法を使用できる。
【０３８７】
更なる例に関しては、酵素を産生する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用い、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリを構築することができる。酵素のアミノ酸配列が既知のものである場合、標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用い、生物から作成したゲノムライブラリ由来のクローンをコードしている酵素を同定することもできる。別の方法としては、その他の既知の酵素遺伝子と配列相同性である、標識化したオリゴヌクレオチドプローブを使用して、クローンをコードしている酵素を同定することもできる。後者の場合、厳密度の低いハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件が用いられる。
【０３８８】
別の方法としては、ゲノムＤＮＡ断片を、プラスミドなどの発現ベクターに挿入し、これにより得られるゲノムＤＮＡライブラリにより、酵素の発現が陰性の細菌を形質転換させ、この形質転換させた細菌を、酵素用の基質（すなわち、マルトース）を含有している寒天プレートに播種することにより、酵素を発現しているクローンを同定することもできる。
【０３８９】
更に他の態様では、酵素をコードしているヌクレオチド配列を、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，ｐ  １８５９〜１８６９により記載のホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，ｐ  ８０１〜８０５により記載の方法などの、確立されている標準法により合成し、調製することもできる。ホスホラミダイト法では、例えば、ＤＮＡ自動合成装置によりオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、アニーリングされ、適切なベクターにライゲーションされ、及びクローン化される。
【０３９０】
ヌクレオチド配列は、合成起点、ゲノム起点、又はｃＤＮＡ起点（必要に応じて）の断片を、一般的な手法により連結することで調製される、ゲノム起点と合成起点の混合物、合成起点とｃＤＮＡ起点の混合物、又はゲノム起点とｃＤＮＡ起点の混合物、であってよい。ライゲートした各断片は、完全なヌクレオチド配列の各部位に対応する。ＤＮＡ配列は、特異的なプライマーを用い、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号又はＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ  ４８７〜４９１）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできる。
【０３９１】
アミノ酸配列
本発明の範囲には、本明細書に定義される通りの特性を有する酵素のアミノ酸配列も包含される。
【０３９２】
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０３９３】
アミノ酸配列は、好適な供給源から調製／単離することができ、あるいは合成することができ、あるいは組み換えＤＮＡ法により調製することができる。
【０３９４】
本発明に包含されるタンパク質は、他のタンパク質、特に酵素と組み合わせて使用することもできる。したがって、本発明は、タンパク質の組み合わせも範囲とし、この組み合わせには、本発明のタンパク質／酵素、及びその他のタンパク質／酵素が含まれ、その他のタンパク質／酵素は、本発明のその他のタンパク質／酵素であってよい。
【０３９５】
好ましくは、アミノ酸配列は、本発明の範囲に関係する場合、及び本発明の範囲に包含される場合、ネイティブな酵素ではない。この点において、用語「ネイティブな酵素」は、そのネイティブな環境に存在し、かつネイティブなヌクレオチド配列により発現されたものである場合、完全な酵素を意味する。
【０３９６】
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に定義される特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列と、又はこのようなポリペプチドをコードしている任意のヌクレオチド配列と、ある程度の配列同一性又は配列相同性を有する、配列の使用も包含する（本明細書において、以降「相同性配列」として参照する）。本明細書において、用語「相同性」は、参照している配列が、対象とするアミノ酸配列及び対象とするヌクレオチド配列と一定の相同性を有することを意味する。本明細書において、用語「相同性」は、「同一性」と等しい。
【０３９７】
相同性アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持し及び／又は酵素活性を増大させるポリペプチドを提供及び／又はコードしなくてはならない。
【０３９８】
本文脈では、相同性配列は、対象とする配列と少なくとも７５、８５、又は９０％同一性である、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一性であるアミノ酸配列を含有する。一般的には、相同性配列は、対象とするアミノ酸配列と同様の活性部位などを含み得る。相同性は、類似度（すなわち、アミノ酸残基が類似する化学特性／機能を有する程度）の観点から考慮することもできるものの、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表現するのが好ましい。
【０３９９】
本発明の文脈では、相同性配列は、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（参照配列）と少なくとも７５、８５又は９０％同一である、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を包含する。一般的には、相同性配列は、対象とする配列の活性部位などをコードする配列と同様の配列を含む。相同性は、類似度（すなわち、アミノ酸残基が類似する化学特性／機能を有する程度）の観点から考慮することもできるものの、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表現するのが好ましい。
【０４００】
相同性比較は、目視検査により実施することができ、あるいはより一般的には、すぐに利用できる配列比較プログラムの補助により実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムでは、２つ以上の配列の相同性（％）を算出することができる。
【０４０１】
相同性（％）は、連続する配列間で算出することができ、すなわち１つの配列を他の配列と整列させ、一方の配列に含まれる各アミノ酸を、他方の配列に含まれる対応するアミノ酸と一度に一残基ずつ直接比較することで算出することができる。この手法は「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアライメントは、残基数が比較的少ない場合にのみ実施される。
【０４０２】
この手法は非常に単純でかつ着実な手法であるものの、例えば、本来であれば同一である配列対において、１箇所に挿入又は欠失が入っている場合を考慮に入れることができず、以降のアミノ酸残基はアラインメントから除外されることになり、したがって、グローバルアラインメントを実施した場合に、相同性（％）が大幅に低下する可能性がある。これらを踏まえ、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに対して重すぎるペナルティを設けずに、可能性のある挿入及び欠失を考慮に入れ、最適なアラインメントを生成するよう設計されている。この手法は、配列アラインメント時に「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化させることで実施される。
【０４０３】
しかしながら、これらのより複雑な手法は各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てるものであり、同数の同一のアミノ酸に関し可能な限りギャップが少なくなる−比較する２つの配列間の関連性がより大きく反映される−ような配列アラインメントは、ギャップを多く含むアラインメントと比較してより高いスコアが付けられるようになる。「アフィンギャップコスト」は、一般的に用いられる手法であり、この手法では、ペナルティは、ギャップの伸長に対して比較的重く設定され、ギャップ中で続く各残基に対しては軽く設定される。この手法は、最も一般的に使用されているギャップスコアリング系である。当然のことながら、ギャップペナルティが高い場合には、ギャップ数がより少なくなるよう最適化されたアラインメントが得られることになる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較の際にこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用することが好ましい。
【０４０４】
したがって、配列の最大一致度を計算するには、まず第一にギャップペナルティを考慮に入れて最適アラインメントを行うことが必要とされる。このようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータプログラムはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実行するソフトウェアの例としては、限定するものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照されたい）、ＢＬＡＳＴ  ２（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）、及びＡｌｉｇｎＸが挙げられる。オフライン及びオンライン検索には、少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２及びＦＡＳＴＡを利用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９９，ｐａｇｅｓ  ７〜５８〜７〜６０を参照されたい）。
【０４０５】
最終的な相同性（％）は、同一性の観点から評価され得るものの、アラインメント方法は、典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。その代わりに、一般的にはスケールを用いた類似性スコアマトリックスが用いられ、各一対比較に対し、科学的類似性又は進化距離に基づきスコアが割り当てられる。一般的に用いられるこのようなマトリックス例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスが挙げられ、この場合、プログラムにはＢＬＡＳＴ向けのデフォルトのマトリックスが適する。ベクターＮＴＩプログラムには、概して、一般的なデフォルト値、又は提供された場合にはカスタムされたシンボル比較表のいずれかが用いられる（更なる詳細については使用者マニュアルを参照されたい）。一部の用途に関しては、ベクターＮＴＩパッケージにはデフォルト値を用いることが好ましい。
【０４０６】
別の方法としては、相同性（％）は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７〜２４４）に類似するアルゴリズムに基づき、ベクターＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）における多重配列アラインメントによる特性を用い、算出することができる。
【０４０７】
ソフトウェアにより最適アラインメントを生成すれば、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこの算出を行い、計算結果を生成する。
【０４０８】
配列同一性を決定する場合にはギャップペナルティを用いるべきであり、好ましくは、ペアワイズアラインメントに関し以降のパラメータを用いる：
【０４０９】
【表１７】
2014507946.tif 000020
【０４１０】
【表１８】
2014507946.tif 000021
【０４１１】
一実施形態では、ギャップペナルティ及びギャップ伸長については上記の通りの設定を用い、ＣＬＵＳＴＡＬを使用することができる。
【０４１２】
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドにわたって決定される。
【０４１３】
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、配列全長にわたって決定することができる。
【０４１４】
ハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の核酸配列に対する相補的配列、あるいは本発明の配列又は本発明の配列に相補的な配列のいずれかとハイブリッド形成し得る配列に対する相補的配列、も包含する。
【０４１５】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する工程」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で実施される増幅工程を包含するものとする。
【０４１６】
本発明は、本明細書において示す配列に相補的な配列に対してハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列、又は任意の誘導体、断片、あるいはこれらの誘導体の使用も包含する。
【０４１７】
用語「変異体」は、本明細書において示すヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成し得る配列に相補的な配列も包含する。
【０４１８】
好ましくは、相補的配列は、厳密な条件下（例えば、５０℃かつ０．２ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ  ７．０｝）で、本明細書に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得る。
【０４１９】
より好ましくは、相補的配列は、厳密度の高い条件下（例えば、６５℃かつ０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ  ７．０｝）で、本明細書に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得る。
【０４２０】
より好ましい態様では、本発明は、厳密度の高い条件下（例えば、６５℃かつ０．１ｘＳＳＣ）で、本発明のヌクレオチド配列、又はその相補配列とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列を含む。
【実施例】
【０４２１】
（実施例１）
材料及び方法
３６００羽の１日齢のＣｏｂｂ雄雛を民間の孵化場から購入した。試験の開始時に５５羽の雄を一集団として各処理区画に割り付けた。試験は、次の処理から構成された（表１）：
【０４２２】
【表１９】
2014507946.tif 000022
【０４２３】
１  大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ
２  バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のアミラーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
４  Ａｘｔｒａ  ＸＡＰ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
各区画の鳥の体重を、試験初日、２３日目、３５日目、及び最終日（４２日）に測定した。各区画を測定単位とした。ブロイラー用飼料をクランブル（前期飼料）又はペレット（後期飼料及び仕上げ飼料）として給餌した。飼料はＮＲＣ飼養標準に一致するか超過した（表２）。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサはフラッシングした。すべての処理飼料はＤａｖｉｓ  Ｓ−２０ミキサを用い混合し、カリフォルニアペレットミル（低温ペレット温度６５〜７０℃）を用いペレット化した。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料からサンプルを回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏの存在を確認した。
【０４２４】
【表２０】
2014507946.tif 000023
【０４２５】
鳥類に適宜給餌し、０日〜４２日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供された。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼをそれぞれもともと５００ＦＴＵ含有していた。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。試験の２３日目に、前期飼料から後期飼料に変えた。試験の３５日目に、後期飼料を仕上げ飼料に変えた。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填した。試験の最終日に飼料を計量した。各区画の斃死を毎日確認した。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量（ｋｇ）を記録した。すべての斃死又は間引き鶏に対し、肉眼剖検を実施し、性別及び推定される死因を判定した。壊死性腸炎の兆候を記録した。
【０４２６】
すべての区画は約１０．２ｃｍ（４インチ）に組み立て、マツ材の新しい床敷を敷き詰めた。
【０４２７】
区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ）を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種した。２０、２１、及び２２日目に、処理群１を除きすべての鳥類に、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のブロス培地を投与した。ＮＥを引き起こすことが知られており、商用ブロイラーの運用に由来する、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の野生分離株を曝露菌として利用した。毎日、新鮮な摂取材料を使用した。滴定レベルは約１．０×１０８〜９であった。各区画に対する接種は同量で行った。接種材料は、チューブフィーダーのベースに一般的に見られる飼料に混合して投与した。２３日目に、各区画から５羽の鳥を選別し、屠殺し、グループを計量し、及び壊死性腸炎領域の病変の程度について評価した。採点は、０〜３点で行った。０が正常であり、３が最も深刻である（０＝所見なし、１＝わずかに症状が見られる、２＝中等度の症状が見られる、３＝顕著な／深刻な症状が見られる；Ｈｏｆａｃｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｕｌｔ．Ｒｅｓ．１２：６０〜４）。試験の間、薬剤の併用は行わなかった。
【０４２８】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用した。
【０４２９】
結果
図１は、壊死性腸炎モデルのブロイラーの壊死性腸炎を、０〜３点で採点した病変スコアを示す。プールされたＳＥＭは０．１５であった。
【０４３０】
処理対照群では、未処理対照群と比較して病変スコアが上昇した。ＤＦＭを、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼと組み合わせて添加し、すべての他の処理群に対し病変スコアの低下を比較した。ＤＦＭを追加して酵素と組み合わせたところ、ＤＦＭ単独又は酵素のみの場合と比較して、病変スコアが低下した。
【０４３１】
図２は、壊死性腸炎モデルのブロイラーの体重増加を示す。プールされたＳＥＭは２８．６であった。
【０４３２】
図２は、ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標））とキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼとの組み合わせが、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）に曝露したブロイラーにおいて、処理対照と比較して体重増加（ＢＷの獲得）を有意に向上させ、更には陰性対照（すなわち、非投与対照）と比較してＢＷを向上させさえしたことを示す。これは任意の他の処理群と比較して有意に良好であった。
【０４３３】
図３は、壊死性腸炎モデルのブロイラーの飼料要求率を示す。プールされたＳＥＭは０．０１６であった。
【０４３４】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）と、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼとの組み合わせは、０日齢〜４２日齢のブロイラーのＦＣＲ（ＢＷ増加（ｇ）／飼料摂取（ｇ））を、対照、及び酵素単体及びその他の処理と比較して有意に向上させた（減少させた）。
【０４３５】
（実施例２）
材料及び方法
Ｃｏｂｂ  ５００の雄のブロイラーを民間の孵化場から得た。合計２６羽の雛を、各処理ごとに８つの複製区画のうちの１つにランダムに割りつけた。熱制御されており、循環ファン、熱ランプ、及び新しい床敷を備え付けたビニールハウス（curtain-sided house）に床区画（１．５ｍ２／区画（１６ｆｔ２／ｐｅｎ））を割りつけた。最初の４日間は、２４時間の光サイクルで鳥類を蛍光灯に曝露し、次に試験の残りの期間は１６時間明：８時間暗サイクルに曝露した。飼料はベル型給餌器に給餌し、水は適宜ニップル型給水器により提供した。注射器を用い、１日齢の雛に５倍量のＣｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）を手技操作で経口投与した。
【０４３６】
【表２１】
2014507946.tif 000024
【０４３７】
１  大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ
２  バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のアミラーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
４  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されたＡｖｉｚｙｍｅ  １５０５（登録商標）
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ又はキシラナーゼ、アミラーゼ、及びプロテアーゼ（Ａｖｉｚｙｍｅ  １５０２；表３）のいずれかと共に、又はこれらのいずれかを加えずに雛に給与した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供された。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼを５００ＦＴＵ含有していた。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。
【０４３８】
すべての飼料はコーン−大豆ミール−ＤＤＧＳ系のサンプルであった。試験中、前期飼料を提供した（１日〜２０日）。飼料をペレット化し（６５〜７０℃）、クランブル化した。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料からサンプルを回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏの存在を確認した。
【０４３９】
【表２２】
2014507946.tif 000025
【０４４０】
飼料摂取、体重増加、及び飼料効率を算出するために、１、１１、２０、３８、及び４８日目に体重及び飼料重量を記録した。毎日斃死及び間引きを観察し、飼料の消費量及び増加量を調節するために使用した。１１日目及び２０日目に、粘膜擦過物を回収するために、６つの複製区画から１羽を頚椎脱臼により屠殺した。回腸から粘膜擦過物を回収した（メッケル憩室〜回盲接合部）。回腸を切除し、内腔を曝露するよう長手方向に沿って切り開き、次に手早くかつ穏やかに腸内容物をＰＢＳにより洗い流した。切り出した組織片の長手方向に沿って、顕微鏡スライドの端部により粘膜層を掻爬し、回収した。ＲＮＡの完全性を保存するため、この粘膜層を直ちにアルミニウムプレート間に固定し、液体窒素中で凍結させ、それぞれ回転式パックバッグ（whirl-pack bags）で保管した。サンプリング中に凍結組織サンプルは液体窒素中で保管し、かつ解析まで−８０℃で保管した。トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、組織を機械式ホモジナイザーにより破壊し、粘膜擦過物由来の全ＲＮＡを単離した。製造元の推奨に従ってｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、全ＲＮＡ（０．５μｇ）を相補的ＤＮＡに逆転写させた。分泌された炎症性サイトカインの遺伝子（インターロイキン−１０、インターフェロン−γ、及びインターロイキン−１７）に関係するｍＲＮＡ量を、ニワトリ特異的なプライマーを用い評価した。加えて、データ正規化にｇｅＮｏｒｍソフトウェアを用い、ＴＡＴＡ−ＢＰ、ＨＰＲＴ−１、及びβ−アクチンのｍＲＮＡ量を測定した。Ｒｕｄｒａｐｐａ  ａｎｄ  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２００７）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３７：４２７〜４３２に記載の通りに、改変したδ−δＣｔ式を用い、遺伝子発現におけるｍＲＮＡ量の倍数変化を評価し、データ解析の際にｌｏｇ変換した。
【０４４１】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。ｍＲＮＡデータの試験単位として鳥類を使用した。
【０４４２】
結果
図４は、ブロイラーの回腸粘膜擦過物に含まれるインターフェロン−γ遺伝子のｍＲＮＡ量を示す。
【０４４３】
１１日齢：プールされたＳＥＭは０．１であった。
【０４４４】
２０日齢：プールされたＳＥＭは０．６であった。
【０４４５】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼとを組み合わせたところ、孵化場でコクシジウム症の生ワクチンを５回投与した１１日齢のブロイラーの回腸において、陰性対照のＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ＋フィターゼ、並びにキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼと比較してＩＦＲ−ｇの発現が上方制御された。２１日目には、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ＋フィターゼ、並びにＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ＋キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼでは、陰性対照と比較して、回腸におけるＩＦＲ−ｇ発現が下方制御されていた。これらのデータにより、免疫応答の調節は、ブロイラーにおいて、ＤＦＭと４種の酵素との組み合わせにより性能が向上する機序のうちの１つであり得ることが示唆される。
【０４４６】
図１５は、４８日齢のブロイラーの飼料要求率を示す。４８日齢：プールされたＳＥＭは０．０４１であった。
【０４４７】
（実施例３）
材料及び方法
ブロイラーに可可消化性試験を実施して、飼料用酵素及びＤＦＭによる処理が栄養利用におよぼす効果を評価した。環境的に制御された室内にケージを収容した。鳥類には２０時間蛍光灯照射を行い、かつ飼料及び水は自由に摂取させた。１日目に、飲用水を介し、すべての雛にブロイラー用コクシジウム症生ワクチンを投与した。最初の３日間、ケージのワイヤ床には紙を敷き、アイメリア・オオシスト（Eimeria Oocystes）を再利用できるようにした。試験は、次の処理から構成された（表５）。
【０４４８】
【表２３】
2014507946.tif 000026
【０４４９】
１  大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ
２  バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のアミラーゼ１、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のアミラーゼ２、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１  並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
４  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されたＡｖｉｚｙｍｅ  １５０５（登録商標）
５  Ａｘｔｒａ  ＸＡＰ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供された
合計１９２羽の鳥類をそれぞれ計量し、体重をもとに４８のケージに割りつけた（４羽／ケージ）。次に、８種の飼料処理を６つのケージ毎にランダムに割りつけた。０日〜２１日目に鳥類に前期飼料を適宜給与した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供された。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼを５００ＦＴＵ含有していた。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。鳥類には、試験の間、マッシュ形態の前期飼料を給餌した（表６）。
【０４５０】
【表２４】
2014507946.tif 000027
【０４５１】
２１日目に、ペントバルビタール・ナトリウムを心臓内注射して各ケージ毎に４羽の鳥類を屠殺し、回腸下部の腸内容物を蒸留水で穏やかに押し流した。ケージ内の鳥から得られた腸内容物をプールし、食事処理群毎に６種のサンプルを得た。腸内容物サンプルを回収後直ちに凍結し、凍結乾燥させ、加工した。トリプトファンを除き、標準法通りに、腸内容物サンプル及び飼料をＴｉ、ＤＭ、ＧＥ、デンプン、脂質、Ｎ、及びアミノ酸について解析した。Ｒａｖｉｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）により報告されているとおりに、難消化性Ｔｉの濃度をもとに回腸消化吸収率を算出した。デンプン（４．２ｋｃａｌ／ｇ）、脂質（９．４ｋｃａｌ／ｇ）、又はタンパク質（５．５ｋｃａｌ／ｋｇ）の平均総エネルギーをもとに、回腸可消化エネルギーに対し、デンプン、脂質、及びタンパク質のエネルギー寄与率を算出した。酵素及びＤＦＭに対する応答としてのアミノ酸消化能の向上は、回腸での未消化アミノ酸量と関係付けて説明された。このとき、直線関数式の傾きをアミノ酸消化能に対する添加物の効果の指標として用いた。
【０４５２】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位としてケージを使用した。
【０４５３】
結果
図５は、２１日齢のブロイラーの見かけの回腸可消化エネルギーを示す。
【０４５４】
プールされたＳＥＭは０．０２７であった。
【０４５５】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（ＤＦＭ）と、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼとを組み合わせて添加した場合、酵素類のみを用いた場合、及び陰性対照を用いた場合と比較して、回腸可消化エネルギーは、商業に相関する程度に増分を示した。これらのデータにより、外来酵素が家禽用飼料のエネルギー消化率に対しもたらす効果をＤＦＭが向上させたことが示される。疑念を回避するため、アミラーゼ２としてはＡｘｔｒａＸＡＰに含まれるアミラーゼを使用し、アミラーゼ１としてはＡｖｉｚｙｍｅ  １５０２に含まれるアミラーゼを使用する。
【０４５６】
図６では、２１日齢のブロイラーを用い、対照処理群に対する、３種の飼料処理群の回腸のアミノ酸可消化性の増分を、対照処理時の回腸未消化アミノ酸の関数として示す。
【０４５７】
この図は、対照処理群のブロイラーの回腸におけるアミノ酸の未消化画分と比較して、飼料処理群の回腸アミノ酸可消化性が向上することを表す。処理群の各点は、それぞれアミノ酸測定値を表す。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ＋キシラナーゼ、アミラーゼ２、プロテアーゼ＋フィターゼを加えた場合、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ＋フィターゼ（＋３．６％）、並びにキシラナーゼ、アミラーゼ２、プロテアーゼ＋フィターゼ（すなわち、ＤＦＭ不含）（＋４．７％）のみを加えた場合と比較して、回腸のアミノ酸消化能は向上した（＋１１．３％）。これらのデータは、ＤＦＭが、これらの外来性酵素が家禽用飼料のアミノ酸消化能を向上させる効果を増大させることを示す。
【０４５８】
図７は、２１日齢のブロイラーを用いた対照処理群と比較して、回腸可消化エネルギーが増大することを示す。
【０４５９】
この図は、各飼料処理群の回腸可消化エネルギーの増分を、フィターゼ処理した陰性対照の可消化エネルギーと比較して示す。加えて、算出された、デンプン、脂質、又はタンパク質のエネルギー寄与率を示す。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ２、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせて添加した場合、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ＋フィターゼのみでの処理、並びにキシラナーゼ、アミラーゼ２、プロテアーゼ＋フィターゼのみでの処理と比較して、回腸可消化エネルギーが増大していた。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ１、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせて加えた場合、回腸可消化エネルギーは商業的に重要な程度増加した。これらのデータは、ＤＦＭの存在下で、４種の酵素の性能が向上し、ブロイラー飼料の回腸可消化エネルギーが増大することを示す。
【０４６０】
（実施例４）
材料及び方法
ブロイラーに可消化試験を実施して、飼料用酵素及びＤＦＭによる処理が栄養利用に対しおよぼす効果を評価した。環境的に制御された室内にケージを収容した。鳥類には２０時間蛍光灯照射を行い、かつ飼料及び水は自由に摂取させた。１日目に、飲用水を介し、すべての雛にブロイラー用コクシジウム症生ワクチンを投与した。最初の３日間、ケージのワイヤ床には紙を敷き、アイメリア・オオシスト（Eimeria Oocystes）を再利用できるようにした。試験は、次の処理から構成された（表７）：
【０４６１】
【表２５】
2014507946.tif 000028
【０４６２】
１  大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ
２  バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のアミラーゼ１、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のアミラーゼ２、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
４  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されたＡｖｉｚｙｍｅ  １５０５（登録商標）
５  Ａｘｔｒａ  ＸＡＰ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供された
合計１４４羽の鳥類をそれぞれ計量し、体重をもとに３６のケージに割りつけた（４羽／ケージ）。次に、６種の食餌処理を６つのケージ毎にランダムに割りつけた。０日〜２１日目に鳥類に前期飼料を適宜給餌した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供された。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。鳥類には、試験の間、マッシュ形態の前期飼料を給餌した（表６）。
【０４６３】
【表２６】
2014507946.tif 000029
【０４６４】
窒素量を補正して見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥｎ）及び窒素保持量を定量するため、４日連続して（第１７日目〜第２０日目）、ケージ毎に飼料摂取量及び総排泄量を定量的に測定した。排泄物は、毎日ケージ内でプールして回収し、ブレンダで混合し、サブサンプリングした。各サブサンプルを凍結乾燥させ、０．５ｃｍシーブを通して粉砕し、気密性のプラスチック容器に入れ、解析までの間−４℃で保管した。加工した飼料を、標準法を用いＤＭ、ＧＥ、及びＮについて解析した。
【０４６５】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位としてケージを使用した。
【０４６６】
結果
図８は、１７〜２１日齢ブロイラーに給与した飼料処理に関し、窒素補正した見かけの代謝エネルギーＡＭＥｎを示す。プールされたＳＥＭは０．０１５であった。
【０４６７】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせて添加した場合、飼料のＡＭＥｎは、陰性対照飼料と比較して、酵素の作用により向上した。特に、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ２、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせた場合、飼料のＡＭＥｎは、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏのみを添加した飼料と比較して、酵素に応答して向上した。
【０４６８】
図９は、１７〜２１日齢ブロイラーの窒素保持を示す。プールされたＳＥＭは０．００６であった。
【０４６９】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせて添加した場合、ブロイラーの窒素保持は、陰性対照飼料と比較して、酵素に応答して向上した。詳細には、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと、キシラナーゼ、アミラーゼ２、プロテアーゼ＋フィターゼとを添加した場合、ブロイラーの窒素保持は、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏのみを添加した飼料を給与した場合と比較して、酵素に応答して向上した。
【０４７０】
（実施例５）
材料及び方法
Ｒｏｓｓ  １０８の雄のブロイラーを民間の孵化場から得た。合計１０羽の雛を、各処理ごとに６つの複製ケージのうちの１つにランダムに割りつけた。最初の４日間は、２４時間の光サイクルで鳥類を蛍光灯に曝露し、次に試験の残りの期間は１６時間明：８時間暗サイクルに曝露した。飼料及び水は適宜供給した。試験設計は、次の処理から構成された。
【０４７１】
【表２７】
2014507946.tif 000030
【０４７２】
１  大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ
２  バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のアミラーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
４  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されたＡｖｉｚｙｍｅ  １５０５（登録商標）
処理群２〜６において、１日齢の雛に、コクシジウム症ワクチン（Ｂ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）を手作業でシリンジにより過剰投与した（常用量の５倍）。処理群２では、抗コクシジウム剤としてサリノマイシン（Ｂｉｏ−ｃｏｘ）を認可濃度で（６０ｇ／ＭＴ）使用した。アイメリア・オオシスト（Eimeria oocysts）及びＤＦＭの相互混入を回避するため、設備内に区画を配置し、直接的な接触を予防した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから提供された。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼをそれぞれもともと５００ＦＴＵ含有していた。
【０４７３】
表１０．実施例５の試験飼料の組成
【０４７４】
【表２８】
2014507946.tif 000031
【０４７５】
複製ケージあたり合計２羽の鳥類を１４日齢で屠殺し、回腸中部から粘膜擦過物を回収した。回腸を蒸留水で洗い流し、ハサミで切り開いた。切り開いた部位を清潔なガラスプレートに平らに広げた。スライド・ガラスの長端により、回腸中部領域から粘膜を注意深く掻き集めた。各飼料を２ｍｌのＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中に保管し、−８０℃の冷凍庫で凍結した。サンプルを氷上で解凍した。標準的なプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用い、全ＲＮＡを単離した。アガロースゲルを用いＲＮＡの完全性を確認した。ＭＭＬＶ逆転写酵素により、ＲＮＡを逆転写した。ＢｉｏｒａｄリアルタイムＭｙＩＱ装置でリアルタイムＰＣＲを行い、ムチンの発現（ＭＵＣ２）を測定した。
【０４７６】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。ｍＲＮＡデータの試験単位として鳥類を使用した。
【０４７７】
結果
図１０は、１４日齢のブロイラーの回腸粘膜擦過物に含まれる、ＭＵＣ２遺伝子のｍＲＮＡ量を示す。プールされたＳＥＭは０．１４であった。
【０４７８】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏとキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼを組み合わせて添加することで、コクシジウム症生ワクチンを５回投与したブロイラーの回腸において、ＭＵＣ  ２の発現は対照を曝露した場合の回腸と比較して下方制御されていた。これらのデータは、ムチン分泌の減少により、内因性のアミノ酸の損失が減少することで、ＤＦＭを４種の酵素と組み合わせて投与したブロイラーの性能が向上し得ることを示す。
【０４７９】
（実施例６）
材料及び方法
実施例１に記載の試験の２３日齢のブロイラーから、組織サンプルを採取した。処置の仕様を表１に表す。各区画毎に２羽の鳥から空腸、膵臓及び肝臓を切除し、処理群毎に８体のサンプルから得られる粘膜をプールした。サンプルを緩衝液（ＰＢＳ）ですすぎ、製造元のプロトコルに従い組織保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ）に浸漬し、−８０℃で保存した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａａｃｈｉ（１９８７；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６〜９）に記載の通りに、一工程フェノールクロロホルム抽出法により各組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で吸光度を測定してＲＮＡ濃度を決定し、１．２％アガロースゲルでゲル電気泳動を行い、完全性をモニターした。純度が十分であり、かつ２６０ｎｍの吸光度対２８０ｎｍの吸光度が１．８７超であるＲＮＡのみを使用可能な品質であるものと見なした。
【０４８０】
Ｄｒｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８；Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８７：２４１８〜２９）のプロトコルに従って、７０塩基対のオリゴヌクレオチド（Ｏｐｅｒｅｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を用い、マイクロアレイを製造した。アレイの試験設計は、Ｇａｒｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５；Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．９３：４２５〜３２）に記載される通りに、完全混交型ループデザイン（complete interwoven loop design）であった。各サンプルは、すべての処理を比較できるよう多重対比較式の手法で他のサンプルと直接比較された。Ｄｒｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８；Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８７：２４１８〜２９）の記載の方法に従って、サンプルの半量はシアニン系蛍光色素のＣｙ３で、もう半量はＣｙ５で標識した。Ｐｒｏｎｔｏ  Ｐｌｕｓ！によりハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション・キットを添加した後に、Ｃｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡプローブを添加し、透明なガラス製カバーグガラス（Ｌｉｆｔｅｒｓｌｉｐ）でカバーし、１６時間ハイブリダイズさせた。次に、レーザーの出力を６５％に設定したＳｃａｎ  Ａｒｒａｙ  Ｇｘ  ＰＬＵＳマイクロアレイスキャナセットでマイクロアレイをスキャンし、画像を得た。
【０４８１】
個々のサンプルから得た全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成し、これを、Ｄｒｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８；Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８７：２４１８〜２９）の記載する通りのｑＰＣＲ増幅の際にテンプレートとして用いた。各遺伝子についてサーモサイクリングパラメータを最適化し、かつ各遺伝子をそれぞれ２つ組で用い、１つの装置で同時に増幅させた。
【０４８２】
マイクロアレイのスキャンイメージからデータファイルを生成したが、各スライド及び色素の組み合わせに関する強度についての生データの抽出には、ＳｃａｎＡｌｙｚｅソフトウェアを用いた。次にＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ及び初期ｌｏｇ２変換により強度のデータファイルを解析した。データの正規化は、局所重みづけ回帰を用い、最初のアレイとすべてのアレイとの間で補整した。得られた正規化ｌｏｇ２強度を、混合モデルＡＮＯＶＡにより解析した。
【０４８３】
ボンフェローニの補正に基づき、有意性の閾値に関しＰ＝０．０５とし、中央強度を比較した。すべての複製を含む完全アレイに関し、グリッド強度の中央値を算出した。各遺伝子に対し３つのサイドバイサイドプローブを用い、遺伝子毎の各グリッドに関し計４つの複製中央値を得た。処理に応じて２つ組サンプル（サンプル遺伝子のＣｔ：サンプルＧＡＰＤＨのＣｔ）から得られたＣｔ比に関するデータを一元配置ＡＮＯＶＡにより処理した。
【０４８４】
結果
マイクロアレイプラットフォームにより発現データを回収し、「ヒートマップ」を生成して空腸（図１６）及び膵臓（図１７）のデータを可視化した。対照とした６つの遺伝子の相対発現量を、目盛りに基づき視覚的に把握できるよう変換し、図１６に示す。低発現だった遺伝子はマイナス記号（「−」）で表し、高発現だった遺伝子はプラス記号（「＋」）で表す。また、灰色が濃くなるほど、処理群の平均的な発現レベルと差があった。評価した遺伝子及びそれらに意図される機能を表１１に示す。スクラーゼ−イソマルターゼ（ＳＩ）及びアミラーゼ２Ａ（ＡＭＹ２ａ）についてリアルタイムＰＣＲにより検証した遺伝子発現を、ヒートマップに示す。これらの発現はアレイデータと高度に相関していた。
【０４８５】
表１１．測定した遺伝子に意図される機能
【０４８６】
【表２９】
2014507946.tif 000032
【０４８７】
図１６は、２３日齢の時点の空腸に関し、すべての処理についての、対象とする遺伝子の発現プロファイルのヒートマップを示す。
【０４８８】
図１７は、２３日齢の時点のすい臓における、すべての処理についてのニワトリαアミラーゼの発現プロファイルのヒートマップを示す。
【０４８９】
図１６及び１７の要点は次の通りである：
未処理対照＝未処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＝処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＋アミラーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋アミラーゼ
ＣＣ＋ＸＡＰ＝処理対照＋フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ
ＣＣ＋ＥＰ＝処理対照＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋アミラーゼ＝処理対照群＋フィターゼ＋アミラーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋ＸＡＰ＝処理対照＋フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ
オリゴペプチド輸送体１（ＰＥＰＴ１）の発現は、キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼにより増加し、かつこれらの酵素をＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせた場合には更に増加した。ＰＥＰＴ１は、ペプチド輸送系の一部であり、かつ多様なジペプチド及びトリペプチドの摂取に関与する。
【０４９０】
グルコキナーゼ（ＧＣＫ）の発現は、処理対照群では下方制御されたが、アミラーゼ＋フィターゼ、又はキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼをＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせることで、未処理対照群と同程度に上方制御された。上方制御の度合いは、キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼをＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと共に用いた場合の方が大きかった。
【０４９１】
同様のパターンが、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）に関しても見られ、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、アミラーゼ＋フィターゼ、又はキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせた場合に、処理対照群及び未処理対照群のいずれの場合よりも上方制御の度合いが大きかった。ＧＣＫはグルコース代謝において重要な酵素であり、ＳＩは、スクロース及びイソマルトースの加水分解に関与するものであることから、動物における炭水化物の消化及び吸収において重要な役割を有する。
【０４９２】
処理対照群では、密着結合タンパク質１（ＺＯ１）が最も発現が高かった。酵素処理群では発現の低下が観察されたが、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを使用した場合に、特にキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせて使用した場合に、未処理対照群と同程度にまで、より大きく下方制御された。ＺＯ１は、密着結合の細胞質面に存在するタンパク質であり、密着結合組立体に関するシグナル伝達から、密着結合自体の安定性まで様々な役割を担う。
【０４９３】
Ｔ細胞抗原ＣＤ３（ＣＤ３Ｄ）は、処理対照群において高発現していた。酵素単独で処理した場合には発現は若干低下したが、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせた場合には著しく下方制御された。酵素処理群の中ではキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼの組み合わせが最も大きく下方制御し、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせた場合には、未処理対照群と近い値まで更に大きく下方制御した。ＣＤ３Ｄは、Ｔ細胞に見られる表面分子であり、Ｔ細胞受容体と会合している間のシグナル伝達において重要な役割を果たし、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体の一部を構成する。
【０４９４】
αアミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ）は、未処理対照群及び処理対照群において高発現していたが、アミラーゼ＋フィターゼ、又はキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼを添加することで発現は減少し、これらの酵素をＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせて使用した場合には、特にキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼをＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせて使用した場合には、発現は更に減少した。ニワトリαアミラーゼは、主にすい臓で産生され、デンプン消化において主要な役割を有する。
【０４９５】
考察
キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼを投与した場合に、特にこれらの酵素をＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせて投与した場合に、ペプチド輸送体のオリゴペプチド輸送体１（ＰＥＰＴ１）の発現が増加したことから、ペプチドの可用性が向上したことが示唆され、ひいてはペプチド輸送体の必要性が増加したことが示唆され、これにより、動物のペプチド吸収能を増加させるにあたって酵素及びＤＦＭが相乗効果をもち、この効果により成長が促進されることが示される。実施例１の動物性能に関する結果はこの結論を支持する。アミラーゼ＋フィターゼ、又はキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼと、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏとの組み合わせにより、グルコキナーゼ及びスクラーゼイソメラーゼの発現の増加したことから、グルコースの吸収が増加したこと、及び刷子縁におけるスクロース及びイソマルトースの可用性が増加したことが示唆され、これらにより、小腸における炭水化物の吸収の向上に対し、酵素及びＤＦＭが正の相互作用をもち、ひいては飼料からのエネルギー可用性が向上することが示される。処理対照群ではグルコキナーゼの発現が減少したことから、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）への暴露により粘膜の損傷が引き起こされること、並びにＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ、及びキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼを添加することで損傷が緩和されること、が示される。
【０４９６】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、密着結合タンパク質１の発現を減少させるよう作用することから、腸でタンパク質代謝をする必要性が減ったことが示される。すなわち、これに相関して腸の統合性が高くなっている可能性がある。しかしながら、処理対照群での発現増加により、コクシジウム及びウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の感染により腸が破損していることに起因して、タンパク質の代謝／要求が高くなっていたことが示される。酵素単独でもある程度の緩和効果は有していたものの、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと組み合わせた場合に見られる相加効果は、酵素を組み合わせただけの場合に得られる効果よりも大きいことが示された。これにより、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、腸の統合性を向上させるよう作用し、ひいては動物の健康に役立つことが示される。腸の統合性、ひいては吸収能力の向上は、ＤＦＭを存在させた場合に、外来性酵素の有効性を向上させる機序のうちの１つであり得る。
【０４９７】
処理対照群において、Ｔ細胞抗原ＣＤ３  ｄの発現が増大したことから、処理に起因して細胞性免疫反応が増大したことが示される。これらの条件下では、成長に使用され得るエネルギーを免疫応答が必要とするとことから、並びに一部の鳥類は全身性疾患に罹患することから、鳥類は準最適な性能下に置かれることになる。この免疫マーカーの発現増加は、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを単独で、又は酵素と組み合わせて用いた場合に著しく抑制された。腸における免疫応答の下方制御は、ＤＦＭを存在させた場合に、栄養素の吸収及び性能に対する外来性酵素の有効性を向上させる機序のうちの１つであり得る。
【０４９８】
アミラーゼ＋フィターゼ、又はキシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼの組み合わせで観察されるαアミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ）産生の下方制御により、ニワトリが、供給された外来性酵素に応答して内因性アミラーゼの産生を減少させることが示される。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏと、キシラナーゼ＋アミラーゼ＋プロテアーゼ＋フィターゼとを組み合わせることで観察される相加効果により、ＤＦＭが、試料に含まれるデンプンを消化する酵素を産生する際に消費される予定であったエネルギーを鳥に利用させるよう、外来性酵素と相乗的に作用することが示される。
【０４９９】
酵素とＤＦＭを組み合わせることによる、免疫応答の下方制御及び腸の統合性強化、並びに栄養素の良好な消化及び吸収に関係する、正味の効果により、ブロイラーの産生性能は向上しているものと疑いなく結論付けられる。
【０５００】
（実施例７）
材料及び方法
ブロイラーの消化性試験を実施して、飼料用酵素及びＤＦＭによる処理がエネルギー利用に対し示す効果を評価した。合計２８８日齢の雄Ｒｏｓｓ  ３０８雛を民間の孵化場より得て、１４日間、ワイヤを起こして仕切った一連の区画で飼育した。鳥類には、孵化場で、コクシジウム生ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ）によりワクチン接種を行った。雛にはコーン−ＳＢＭ−ＤＤＧＳ系前期飼料を給餌した。第１４日目〜第２１日目には、雛には試験飼料を与えた。第２１日目まで、飼料及び水は適宜与えた。環境を制御した室内に配置した一連の区画では、一区画あたり６羽の雛を収容した。この区画では、鳥を、１日目には補助暖房により３５℃で加温し、この温度を１週間毎に２℃下げた。明かりは、２３時間明：１時間暗で提供した。１５日目に、雛をそれぞれ計量し、選別し、ウイングバンドを取り付け、完全にランダムに各試験単位に割りつけた。各処理群は、一処理あたり８区画から構成された。試験は、次の処理から構成された（表１２）。
【０５０１】
表１２．実施例７の試験設計
【０５０２】
【表３０】
2014507946.tif 000033
【０５０３】
１  ブティアウクセラ（Buttiauxella）由来のフィターゼ
２  バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のアミラーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている。
【０５０４】
４  ＧａｌｌｉＰｒｏ  Ｔｅｃｔは、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）株（ＤＳＭ１７２３６）から構成されるＤＦＭである。
【０５０５】
すべての試験処理群に関し、酵素及びＤＦＭは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから調達され、及び提供された。相互混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。試験期間を通して、鳥類にはマッシュ形態の前期飼料（表１３）を給餌した。
【０５０６】
表１３．実施例７の試験飼料の組成
【０５０７】
【表３１】
2014507946.tif 000034
【０５０８】
糞尿用の清潔なトレーを所定の位置に少なくとも２日間配置し、２１日目に区画から糞尿サンプルを回収した。回収した糞尿サンプルを−２０℃で凍結した後、サンプルを６５℃のオーブンで３日間乾燥させて、乾燥物質を測定した（ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００５；ｍｅｔｈｏｄ  ９３４．０１）。各サンプル５．０ｇを測定し、１００℃のオーブンで２４時間乾燥させて、乾燥物質ベースで飼料サンプルも補正した。次に、１ｍｍスクリーンを通して糞尿サンプルを挽き、０．５ｍｍスクリーンを通して飼料サンプルを挽いた。一般的な手法により、Ｔｉ、ＤＭ、ＧＥ、及びＮについて、糞尿サンプル及び飼料を分析した。可消化マーカー（Ｔｉ）及び飼料の総エネルギー及び糞尿の濃度をもとに、見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥ）を算出した。必要に応じて、湿分含量の差について補正を行った。体内で保持された窒素１グラムにつき８．２２ｋｃａｌを乗じることで、Ｎ補正したＡＭＥ（ＡＭＥｎ）の、ゼロ窒素保持を測定した（Ｈｉｌｌ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９５８；Ｊ．Ｎｕｔｒ．６４：５８７〜６０３）。
【０５０９】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位としてケージを使用した。
【０５１０】
結果
図１８は、２１日齢のブロイラーの窒素保持量により補正を行った見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥｎ）を示す。ＤＦＭの効果；Ｐ＜０．００１；酵素の効果；Ｐ＜０．００１；ＤＦＭ  ｘ酵素の効果；Ｐ＝０．２７；プールしたＳＥＭ＝３２ｋｃａｌ。
【０５１１】
キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びフィターゼを、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ又はＧａｌｌｉＰｒｏ  Ｔｅｃｔと組み合わせて添加することで、処理対照群と比較してＡＭＥｎが向上した。この向上は、酵素又はＤＦＭを単独で添加した場合と比較して非常に大きかった。キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及びフィターゼと、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（２３５ｋｃａｌ／ｋｇ）又はＧａｌｌｉＰｒｏ  Ｔｅｃｔ（２１５ｋｃａｌ／ｋｇ）とを組み合わせて添加した場合に陰性対照群と比較して得られるＡＭＥｎの増分は、酵素及びＤＦＭを別個に添加した場合に陰性対照群と比較して得られる増分（Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏについては１５２ｋｃａｌ／ｋｇ、又はＧａｌｌｉＰｒｏ  Ｔｅｃｔについては１２０ｋｃａｌ／ｋｇ）よりも大きい。
【０５１２】
（実施例８）
材料及び方法
１４００羽の１日齢のＣｏｂｂ雄雛を民間の孵化場から購入した。試験の開始時に、各処理毎に７つの区画を設け、それぞれの区画に５０羽の雄を割りつけた。試験は、次の処理から構成された（表１）：
表１．実施例８の試験設計
【０５１３】
【表３２】
2014507946.tif 000035
【０５１４】
１  大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ
２  バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のアミラーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のキシラナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ
３  Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１  並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
４  Ａｘｔｒａ  ＸＡＰ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓにより提供されている
各区画の雛の体重を、試験初日、２１日目目、及び最終日（４２日）に測定した。各区画を測定単位とした。ブロイラー用飼料をクランブル（前期飼料）又はペレット（後期飼料及び仕上げ飼料）として給餌した。飼料はＮＲＣ飼養標準に一致するか超過した（表２）。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサはフラッシングした。すべての処理飼料はＤａｖｉｓ  Ｓ−２０ミキサを用い混合し、カリフォルニアペレットミル（低温ペレット温度６５〜７０℃）を用いペレット化した。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料からサンプルを回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏの存在を確認した。
【０５１５】
表２．実施例８の試験飼料の組成
【０５１６】
【表３３】
2014507946.tif 000036
【０５１７】
鳥類に適宜給餌し、０日〜４２日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供された。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼをそれぞれもともと５００ＦＴＵ含有していた。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。
【０５１８】
試験の２１日目に、前期飼料から後期飼料に変えた。試験の３５日目に、後期飼料を仕上げ飼料に変えた。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填した。試験の最終日に飼料を計量した。各区画の斃死を毎日確認した。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量（ｋｇ）を記録した。すべての斃死又は間引き鶏に対し、肉眼剖検を実施し、性別及び推定される死因を判定した。壊死性腸炎の兆候を記録した。
【０５１９】
すべての区画は約１０．２ｃｍ（４インチ）に組み立て、マツ材の新しい床敷を敷き詰めた。
【０５２０】
区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ）を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種した。１８、１９、及び２０日目に、処理群１を除きすべての鳥類に、ウェルシュ菌のブロス培地を投与した。壊死性腸炎を引き起こすことが知られており、商用ブロイラー経営に由来する、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の野生分離株を曝露菌として利用した。毎日、新鮮な摂取材料を使用した。滴定レベルは約１．０×１０８〜９であった。各区画に対する接種は同量で行った。接種材料は、チューブフィーダーのベースに一般的に見られる飼料に混合して投与した。
【０５２１】
サンプル採取
２１日目に、各処理毎に計８羽の鳥（１区画につき１〜２羽）を屠殺し、それぞれの鳥から砂嚢〜回腸・盲腸接合部までの消化管をすべて回収し、氷で冷やしながら一晩のうちに研究室に送った。研究室で、サンプルを更に細断し、メッケル憩室周辺の空腸（２０ｃｍ）を得て、腸管の残りは廃棄した。このようにして得た空腸を０．１％ペプトンですすぎ洗いし、腸内容物を洗い流し、長手方向軸に沿って切り開いて上皮層を露出させた。９９ｍｌの０．１％ペプトンを用い、回腸断片を７．０ストローク／ｓで６０秒間処理しパルプ状にし、粘膜関連細菌を放出させた。１２，０００×ｇで１０分遠心分離し、パルプ溶液から細菌を回収した。得られた細菌ペレットを、１０ｍｌのＭＲＳブロス＋１０％グリセロールに再懸濁し、液体窒素で瞬間冷凍し、更なる解析までの間−２０℃で保存した。
【０５２２】
ＤＮＡ単離
フェノールクロロホルム抽出を行い、すべてのサンプルからゲノムＤＮＡを単離し、ロシュ・アプライド・サイエンスのＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用い精製した。処理あたり計４つのサンプルが含まれるよう、サンプルを抽出後のＤＮＡ濃度で対にしてランダムにプールした。
【０５２３】
パイロシーケンス
Ｄｏｗｄ（Ｄｏｗｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８；ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，１２５）の記載の通りに、細菌タグをコードさせたＦＬＸアンプリコンのパイロシーケンスを実施した。各鳥の腸粘膜から単離したＤＮＡを当量含むよう２羽の鳥由来のＤＮＡを含むサンプルをプールし、解析した。プライマー２８Ｆ（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＮＴＧＧＣＴＣＡＧ）及び５１９Ｒ（５’−ＧＴＮＴＴＡＣＮＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ）を用い、各試料において１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１〜Ｖ３領域を増幅させた。配列決定後、生データを選別し、品質に応じてトリミングした。個々のサンプルのバーコード配列をもとに、配列を選別した。バーコードタグを除去し、非細菌性リボソーム配列を除去した。ＢｌａｓｔＮ比較により、細菌集団の組成を決定して品質を制御し、かつＮＣＢＩのデータベースを手作業で精選した。各サンプル毎に、各細菌ＩＤの相対量を決定した。ＮＣＢＩ命名法により、各分類レベルをもとにデータを編集した。
【０５２４】
統計解析
ペアワイズｔ検定により性能データの中央値を分取した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用した。
【０５２５】
パイロシーケンスデータの解析にあたって属レベルで同定を行った。各属の相対的存在量を算出し、解析に用いた。分類によるモデル解析を用い結果を解析し、次いで、ＪＭＰ８．０．２（ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）によりカイ二乗検定を行った。この場合、各サンプルは実験単位として２羽の鳥から構成される。
【０５２６】
結果：
図１９は、壊死性腸炎モデル（プールしたＳＥＭ：０．０１５）のブロイラーの飼料要求率（ＦＣＲ）を示す。
【０５２７】
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせることで、処理対照群、並びにＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ及びフィターゼ単独で処理した群と比較して、ＦＣＲ（ＢＷ増加（ｇ）／飼料摂取（ｇ））が減少した。この組み合わせにより、飼料要求率は未処理対照群＋フィターゼの程度にまで減少した。
【０５２８】
図２０は、２１日目のブロイラーの空腸粘膜に存在するラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）の相対量を示す。ＣｈＳｑ＜０．０００１。
【０５２９】
図２０は、壊死性腸炎モデルの２１日目のブロイラーの空腸粘膜に存在するラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）の相対量を、他の種と比較して示す。未処理対照群と比較して、処理対照群において、乳酸菌（Lactobacilli）集団は減少した。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏを、キシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせた場合、乳酸菌（Lactobacilli）集団は、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ及びフィターゼを単独で使用した場合並びに処理対照群と比較して増加した。
【０５３０】
乳酸菌（Lactobacilli）は、ヒト及び動物用途のいずれにおいてもプロバイオティクスとして広範に用いられており（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅｈｏｌｄｅｒ  ２００３；Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ８２（４）６２７〜３１）、抗微生物増殖プロモータと匹敵するレベルまで腸の健康を向上させることが報告されている（Ａｗａｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ８８（１）４９〜５６）。したがって、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏとキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ＋フィターゼとの組み合わせにより、腸内微生物叢において乳酸菌（Lactobacilli）の割合を増加させることで、腸の健康が向上し、飼料効率に正の効果が出る。
【０５３１】
本明細書においてこれまでに言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明に関し記載される手法及び系に対し、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく加えられる各種修正及び変更は当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは明白である。加えて、生化学及びバイオテクノロジー又は関連する分野に属する当業者には本発明を実施する際に記載のモデルに関し加えられる各種修正は明白なものであり、このような修正も以降の特許請求の範囲内で意図されるものとする。
【図１】
2014507946.tif 000037
【図２】
2014507946.tif 000038
【図３】
2014507946.tif 000039
【図４】
2014507946.tif 000040
【図５】
2014507946.tif 000041
【図６】
2014507946.tif 000042
【図７】
2014507946.tif 000043
【図８】
2014507946.tif 000044
【図９】
2014507946.tif 000045
【図１０】
2014507946.tif 000046
【図１１】
2014507946.tif 000047
【図１２】
2014507946.tif 000048
【図１３】
2014507946.tif 000049
【図１４】
2014507946.tif 000050
【図１５】
2014507946.tif 000051
【図１６】
2014507946.tif 000052
【図１７】
2014507946.tif 000053
【図１８】
2014507946.tif 000054
【図１９】
2014507946.tif 000055
【図２０】
2014507946.tif 000056
【配列表】
2014507946000001.app
【国際調査報告】
2014507946.tif 000057
2014507946.tif 000058
2014507946.tif 000059
2014507946.tif 000060
2014507946.tif 000061