(57)【要約】【課題】ＭＤＲポンプ阻害活性を有する新規なアザクマリン誘導体の提供。【解決手段】本発明は、式（Ｉ）［化１］2014503578.tif 000021（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり；Ｒ３は、水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり；Ｒ４は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、アリール基、又は、ヘテロアリール基であって、該アリール基及びヘテロアリール基は置換されていてもよく、且つ、Ｒ５は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基である；又は、Ｒ４及びＲ５は、炭素原子を３〜４個有する飽和炭化水素系鎖によって互いに結合していてもよい）の化合物であって、動物又は植物への投与に許容可能な水和物又は塩の形態であってもよく、ある抗菌剤の効果の増強剤として、又は、それ自体を抗菌剤として使用するための化合物に関する。【選択図】なし
2014503578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014503578.tif 000020
（式中：
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、又は、置換されていてもよいベンジル基であり、
Ｒ４は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、アリール基、又は、ヘテロアリール基であって、該アリール基及びヘテロアリール基は置換されていてもよく、且つ、Ｒ５は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基である、又は、
Ｒ４及びＲ５は、炭素原子を３〜４個有する飽和炭化水素系鎖を介して互いに結合していてもよい）の化合物であって、
動物又は植物への投与に許容可能な水和物又は塩の形態であってもよく、
それ自体を抗菌薬として、又は、ある抗菌剤の効果の増強剤として使用するための化合物。
【請求項２】
Ｒ３は、水素原子、又は、メチル若しくはベンジル基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、メチル基であることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ５は、メチル基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、細菌の排出ポンプの阻害活性（ＥＰＩ活性）、特に、抗生物質に対するＭＤＲ（多剤耐性）型の耐性の原因であるＮｏｒＡポンプに対して阻害活性を有する新規なアザクマリン誘導体、及び、ある抗菌剤の効果を増強するために用いる組成物、又は、抗菌剤として用いる組成物である。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年、様々な抗生物質に対して異なる耐性の表現型を示す新しい細菌株が出現している。このような耐性が出現したために、多くの抗感染薬分子が、今ではその効能を失っている。
【０００３】
このような耐性現象は、（クラス、化学構造に関わらず）すべての抗生物質、及び、その用途全般に影響する可能性があり、延いては、深刻な公衆衛生の問題となり得る。実際、このような耐性の重大さは、医学的、社会的、又は、経済的見地から見ても大きい（治療の行き詰まり、罹病率及び死亡率の増加、入院期間の長期化、高価且つ／又は有害な副作用がある分子の使用等）。
【０００４】
数種のグラム陽性菌及びグラム陰性菌に認められているこのような耐性のうちのいくつか、特に、院内感染と称される感染（病院での感染）に関するものは、抗生物質の排出システムと関係している。このような排出は、抗菌剤の細胞内濃度を低下させ、それにより、その効能を低下させる（非特許文献１）。このタイプの耐性が関係する抗生物質は、例えば、フルオロキノロン、テトラサイクリン、又は、マクロライド系に属する。なお、このタイプの耐性は、ある種の抗寄生虫剤及び抗腫瘍剤に対しても認められる。
【０００５】
細菌の排出ポンプは、活性経膜タンパク質輸送体であり、細胞膜の電気化学勾配によって生じるエネルギー又はＡＴＰの加水分解によって生じるエネルギーによって作動している（非特許文献２）。詳細は、非特許文献３〜６を参照されたい。これらのシステムは、構造が多様であるにもかかわらず、また、エネルギー源にかかわらず、同じ機能を有する。すなわち、重金属、胆汁塩、本件では抗生物質等、それらの基質が細胞内に蓄積されるのを阻害する。上述した通り、これらのシステムは、抗生物質による治療に悪影響を及ぼす。なぜなら、これらのシステムは、抗生物質自体の活性を一部低下させ（ｉ）、他の既存の耐性メカニズム（酵素による抗生物質の不活化、又は、標的の修飾、細菌膜透過性の減少等）の作用を増強し（ｉｉ）、遺伝子突然変異によって、既存の抗生物質に対して耐性を有する細菌の出現を促進し（例えば、フルオロキノロンのジャイレース）（ｉｉｉ）、概して、細菌が体内に適応又は潜伏することを容易にするからである（ｉｖ）。
【０００６】
細菌の排出ポンプ阻害剤を使用することは、抗生物質の排出と関連した細菌の耐性を克服するために考えられる解決策のひとつである（非特許文献７〜１０）。これらの阻害剤に関連する微生物は、排出機構による抗生物質に対する耐性を有する細菌であり、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ等のスタフィロコッカス属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等のストレプトコッカス属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓやＥ．ｆａｅｃｉｕｍ等のエンテロコッカス属、又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等の他の細菌が挙げられる。親水性フルオロキノロン類（ノルフロキサシン及び／又はシプロフロキサシン）の排出の原因であるＮｏｒＡポンプを含めた様々なポンプを標的とすることができる。
【０００７】
このように、排出ポンプ阻害剤、とりわけＮｏｒＡポンプ阻害剤は、特に抗生物質や殺菌剤等の各種抗菌剤と組み合わせて用いられることにより、治療において重要な存在となった。これらの阻害剤は、多剤耐性細菌に対して効能を失っていた抗生物質について、その細胞内濃度を増加させることによって、活性を回復させることができた。また、これらは、耐性の出現、特に標的において変異が発生することによる耐性の出現を大幅に減少させることにより、他の抗生物質の使用も安全なものとすることができた。なお、ポンプが比較的基質特異性を有すること、及び、各種輸送体の相同性から判断すると、競合的阻害剤は、多数の微生物種に対して活性を有していなければならない。
【０００８】
いくつかの排出ポンプ阻害剤が文献に記載されている。例えば、キノロン誘導体が、特許文献１〜４に記載されており、その他、チオフェン又はベンゾチオフェン基を有する誘導体が、特許文献５に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６３４６３９１号明細書
【特許文献２】米国特許第６２７１４１６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０７８１７６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／１４９０７４号明細書
【特許文献５】国際公開第２００６／０１８５４４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｅｆｆｌｕｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ｋｅｉｔｈ  Ｐｏｏｌｅ；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０００，４４（１０），２５９５−２５９９
【非特許文献２】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６，５７５−６０８
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００３，５１，９−１１
【非特許文献４】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０００，４４（９），２２３３−２２４１
【非特許文献５】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，３６（３），７７２−７７３
【非特許文献６】Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００１，４（２），２３７−４５
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４４（２），２６１−２６８
【非特許文献８】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００１，４５（１），１０５−１６
【非特許文献９】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，４３，２４０４−２４０８
【非特許文献１０】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００３，４７（２），７１９−７２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これに対して、本発明者らは、新規な排出ポンプ阻害剤、特にＮｏｒＡポンプ阻害剤を同定した。本発明者らは、アザクマリン型構造のこれらの化合物によって、フルオロキノロン系の通常の抗生物質のクラスの耐性細菌株に対する活性を回復させることができることを証明した。これらの阻害剤を組成物、特に薬学的組成物中で用いた場合、従来はＮｏｒＡポンプによって排出されることにより効能が低下していた抗生物質の効果が改善される。また、これらの阻害剤を、耐性表現型を発現している株を同定するための診断試験に用いることもできる。感染した患者から採取した生体試料を用い、これらの阻害剤のひとつが存在する場合と存在しない場合での、治療に用いる抗生物質（好ましくはシプロフロキサシ等のフルオロキノロン）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めることができた。得られた結果は、治療の際に考慮するべき耐性のメカニズムの存在と特徴についての情報を提供するものである。
【００１２】
より詳細には、本発明の主題は、式（Ｉ）：
【００１３】
【化１】
2014503578.tif 000003
【００１４】
（式中：
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、又は、置換されていてもよいベンジル基であり、
Ｒ４は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、アリール基、又は、ヘテロアリール基であって、該アリール基及びヘテロアリール基は置換されていてもよく、且つ、Ｒ５は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基である、又は、
Ｒ４及びＲ５は、炭素原子を３〜４個有する飽和炭化水素系鎖を介して互いに結合していてもよい）の化合物であって、
動物又は植物への投与に許容可能な水和物又は塩の形態であってもよく、
ある抗菌剤の効果の増強剤として、又は、抗菌剤として使用するための化合物である。
【００１５】
特定の実施形態によると、本発明の式（Ｉ）の化合物は、以下の特徴を１つ以上、又は、すべて有する。
・Ｒ３は、水素原子、又は、メチル若しくはベンジル基である。
・Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、メチル基である。
・Ｒ５は、メチル基である。
・Ｒ４は、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素原子、並びに、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及び（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよいベンジル、フェニル、ナフチル、チオフェニル及びインドリル基である。
【００１６】
好適な抗生効果を有する化合物となる好ましい実施形態によると、本発明の式（Ｉ）の化合物は、以下の特徴を１つ以上、又は、すべて有する。
・Ｒ３は、水素原子である。
・Ｒ４は、置換されていないフェニル基、置換されていないヘテロアリール（特に、チオフェニル又はインドリル）基、又は、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素原子、並びに、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及び（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基から選択される置換基を１、２、３又は４個有するフェニル基であり、塩素又はメトキシ置換基が好ましい。
・Ｒ５は、メチル基である。
・Ｒ１は、水素原子である。
・Ｒ２は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、特にメチル基である。
【００１７】
特に高いＮｏｒＡ排出ポンプ阻害活性を有する化合物となる他の好ましい実施形態によると、本発明の式（Ｉ）の化合物は、以下の特徴を１つ以上、又は、すべて有する。
・Ｒ３は、水素基、又は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、特にメチル基である。
・Ｒ４は、アリール基、アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、特にベンジル基、又は、ヘテロアリール基である。
・Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、特にメチル基である。
・Ｒ１は、メチル基である。
・Ｒ２は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、特にメチル基である。
【００１８】
本発明の化合物の例として、以下が挙げられる：
・３−（３−クロロフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１）、
・５，７−ジメトキシ−３−（４−メトキシフェニル）−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．２）、
・５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．３）、
・５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（チオフェン−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．４）、
・５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．５）、
・３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−５，７−ジメトキシ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．６）、
・５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチル−３−（チオフェン−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．７）、
・５−ヒドロキシ−７−メトキシ−１，４−ジメチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．８）、
・５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチル−３−（ナフタレン−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．９）、
・５，７−ジメトキシ−１，４−ジメチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１０）、
・７−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１１）、
・５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１２）、
・５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１３）、
・３−ベンジル−５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１４）、
・２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−７−メトキシ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］キノリン−４（５Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１５）、
・１−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物Ｉ．１６）。
【００１９】
また、本発明の主題は、化合物Ｉ．１〜Ｉ．１６自体であって、また、式（Ｉｐ）：
【００２０】
【化２】
2014503578.tif 000004
【００２１】
（式中：
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、又は、置換されていてもよいベンジル基であり、
Ｒ５は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基である）の化合物自体であって、
動物又は植物への投与に許容可能な水和物又は塩の形態であってもよい化合物である。
【００２２】
特定の実施形態によると、本発明の式（Ｉｐ）の化合物は、以下の特徴を１つ以上、又は、すべて有する。
・Ｒ５は、メチル基である。
・Ｒ３は、水素原子、又は、メチル若しくはベンジル基である。
・Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子又はメチル基である。
【００２３】
これら式（Ｉｐ）の化合物の中でも、Ｒ５＝Ｍｅ、Ｒ１＝Ｈ、且つ、Ｒ２＝Ｍｅである化合物が特に好ましい。
【００２４】
以下の説明により、本発明がより明確に理解できよう。はじめに、定義をいくつか記載しておく。
【００２５】
アルキルという用語は、特に明記しない限り、直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素ラジカルを意味する。「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基」という用語は、炭素原子を１〜６個有するアルキル基を意味する。アルキルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及び、ｎ−ヘキシル基が挙げられる。
【００２６】
アリール基という用語は、単環式、二環式又は多環式炭素環であって、好ましくは炭素原子を６〜１２個有し、少なくとも芳香族基を１つ有する基、例えば、フェニル、シンナミル又はナフチル基を意味する。フェニルが、特に好ましいアリール基である。
【００２７】
ヘテロアリール基という用語は、単環式、二環式又は多環式炭素環であって、好ましくは炭素原子を６〜１２個有し、少なくとも１つのヘテロ原子と芳香族基とを有する基を意味する。ヘテロアリール基の例としては、チオフェニル、インドリル、ピリジル、ベンゾフェラニル、及び、ベンゾチオフェニル基が挙げられる。
【００２８】
置換された基という用語は、一置換、又は、フッ素、塩素、臭素若しくはヨウ素原子、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１２）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１２）アルコキシ、（Ｃ５−Ｃ１２）シクロアルキル、ベンジロキシ、アリール、スルフヒドリル若しくはカルボキシ基、若しくは、アミン基−ＮＲａＲｂ（Ｒａ及びＲｂは、同一又は異なって、それぞれ互いに独立して水素原子又は（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であるか、あるいは、Ｒａ及びＲｂが互いに結合し、それらが結合している窒素原子とともにピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルピペラジン若しくはモルホリンを形成している）から選択される同一若しくは異なる２つ以上の置換基で置換された多置換基を意味する。置換されたアルキル基の例としては、ベンジル基が挙げられる。
【００２９】
アルケニルという用語は、上記で定義したアルキル基に対応するものであり、二重結合を有する。アルケニル基の例としては、ビニル、アリル、イソプロぺニル、１−，２−又は３−ブテニル、ペンテニル、及びヘキセニル基が挙げられる。
【００３０】
アルコキシという用語は、Ｏ−アルキル基を意味する。
【００３１】
シクロアルキルという用語は、炭素原子を３〜１０個有するシクロアルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、若しくは、シクロヘキシル、又は、アダマンチル、若しくは、ビシクロ［３．２．１］オクタニル基等の架橋シクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキル基という用語は、窒素、酸素及び硫黄原子から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む、上記で定義したシクロアルキル基を指す。
【００３２】
スルフヒドリルという用語は、−ＳＨを指し、カルボキシルという用語は、−ＣＯＯＨを指す。
【００３３】
「治療」という用語は、任意の予防的な治療的処置、又は、疾患若しくは疾病を抑制する治療的処置であり、その結果として、望ましい臨床的効果若しくは有益な効果が得られ、特に１つ以上の症状を抑制若しくは低減、又は、関連した疾患の進行を軽減、遅延、若しくは、停止することができる治療的処置を指す。
【００３４】
「治療的有効量」という表現は、組成物について、治療対象である疾患の特徴パラメーターの１つ以上を改善することができる任意の量を指す。
【００３５】
「抗菌剤の効果の増強剤」という表現は、抗菌剤を増強化剤、すなわち式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物と組み合わせて用いた場合に、抗菌剤の抗菌効果が増強されることを意味する。この増強については、以下の実施例において示した試験の１つで具体的に証明されている。特に、その時に認められる抗菌効果が、増強化剤、すなわち式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物なしで試験した抗菌剤で得られた基準活性と比較して、少なくとも４倍増加する。このことは、その時の抗菌剤の最小発育阻止濃度が、増強化剤がない場合に必要な濃度と比較して、少なくとも１／４になっていることを意味する。
【００３６】
「抗菌剤」という用語は、特に、微生物の増殖を阻害することができる物質、さらにはそれらを死滅させることができる物質を指す。本発明においては、静菌作用を有する抗生物質（細菌の増殖を阻害する物質）、及び、殺菌作用を有する抗生物質（細菌を死滅させる物質）が対象となる。より詳細には、上記分子のＥＰＩ活性は、シプロフロキサシン等のフルオロキノロン系に適している。
【００３７】
本発明で用いる化合物は、従来の方法で調製される。例えば、式（Ｉ）の化合物は、以下の反応式１によって得ることができる。式中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、上記（Ｉ）で定義したとおりであり、Ｒ’１及びＲ’２はそれぞれ、上記（Ｉ）で定義したＲ１及びＲ２、又は、その前駆体基であり、Ｘはハロゲン原子、特に塩素原子であり、且つ、Ｒ’はアルキル基、特にエチル基である。
【００３８】
反応式１
【００３９】
【化３】
2014503578.tif 000005
【００４０】
Ｒ３＝Ｈの式（Ｉ’）の化合物は特に、ｔＢｕＯＫ／ｔＢｕＯＨ混合物の作用下で、式（ＩＩ）の化合物から得ることができる。式（ＩＩ）の化合物自体は、市販、又は、簡便な化学合成で得た式（ＩＩＩ）の化合物から、トリエチルアミンの存在下、酸塩化物Ｒ４−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｃｌとの反応によって、又は、トリエチルアミン及びビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスホン酸（ＢＯＰ−Ｃｌ）等の酸の存在下、酸Ｒ４−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＨとの反応によって得ることができる。
【００４１】
あるいは、Ｒ’１＝Ｈである場合、Ｒ３＝Ｈの式（Ｉ’）の化合物は、フェノール類（ＩＶ）から、高温条件下、クロロベンゼン等の溶媒中で化合物（Ｖ）とのカップリングにより得ることができる。
【００４２】
次に、Ｒ３がＨ以外の式（Ｉ’）の化合物は、ＤＭＦ中、ＮａＨ等の水素化物の存在下、Ｒ３＝Ｈの対応する式（Ｉ’）の化合物から、ハロゲン化物、特に塩化アルキルＸ−Ｒ３との反応によりアミン官能基をアルキル化することによって調製することができる。
【００４３】
このように調製された式（Ｉ’）の化合物は、Ｒ’１及びＲ’２がそれぞれＲ１及びＲ２である場合、式（Ｉ）の化合物と一致する。また、前駆体基Ｒ’１又はＲ’２から一度以上の変換を経て、所望のＲ１又はＲ２を得ることも可能である。例えば、Ｒ１＝Ｈは、Ｒ１＝Ｍｅをジクロロメタン中、ＢＢｒ３と反応させて還元することで得られる。
【００４４】
従って、式（Ｉ）の分子は、簡便な化学反応で得ることができ、安い調製コストで得ることができる。
【００４５】
本発明の化合物の塩は、当業者には周知の方法で調製することができる。本発明の式（Ｉ）及び（Ｉｐ）の化合物の塩には、式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物を好適に分離又は結晶化することを可能にする無機若しくは有機酸、又は、塩基との塩、及び、薬学的に許容可能な塩が含まれる。適切な酸としては：シュウ酸又は光学活性酸、例えば、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、カンファースルホン酸、及び、生理学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、二水素リン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、メシラート、ベシル酸塩又はイソチオン酸塩等を形成する酸が挙げられる。適切な塩基としては、：リシン、アルギニン、メグルミン、ベネタミン、ベンザチン、及び、生理学的に許容可能な塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又は、カルシウム塩等を形成する塩基が挙げられる。
【００４６】
水和物の形態の化合物としては、例として、半水化物、一水和物、及び、多水和物が挙げられる。
【００４７】
また、上記式（Ｉ）及び（Ｉｐ）の化合物には、１つ以上の水素原子、炭素原子、又は、ハロゲン原子、特に塩素又はフッ素原子が、その放射性同位体（例えば、トリチウム又はＣ１４）で置換されているものも含まれる。このような標識化合物は、研究、代謝若しくは薬物動態調査、又は、生化学検査に有用である。
【００４８】
式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物、及び、その反応中間体がその分子中に含んでいてもよい官能基は、所望の化合物を確実に合成することを可能にする保護基によって、一時的又は恒久的に保護されていてもよい。この保護反応と脱保護反応は、当業者には周知の方法によって行うことができる。「アミン、アルコール、又は、カルボン酸類の一時的保護基」という表現は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．及びＷｕｔｓ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版，２００６、及び、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．，１９９４，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇに記載の基等の保護基を意味する。
【００４９】
本発明者らは、フルオロキノロン類、特にノルフロキサシン又はシプロフロキサシン等の親水性フルオロキノロン類を用いて、スタフィロコッカス属又はエンテロコッカス属のグラム陽性菌に対する本発明の化合物の増強効果を証明した。これらの効果は、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）又はグリコペプチド耐性黄色ブドウ球菌（グリコペプチド中等度耐性黄色ブドウ球菌（ＧＩＳＡ））等の耐性株に関する。概して、本発明の化合物は、既存の抗生物質の活性を２〜１２８倍改善する活性を示す。この増強効果の作用機序には、細菌の排出ポンプ、特にＮｏｒＡポンプの阻害作用が関与している。
【００５０】
従って、本発明の化合物は、抗菌剤、特に排出メカニズムによる耐性を有する株に対して不活性となった抗生物質の効果を増強、増加するために用いることができる。「増強」という用語は、式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物を抗菌剤と組み合わせた時、これらの化合物のいずれか一方で得られる抗菌効果よりも大きく、相乗的な、すなわち単独で得られる効果の合計よりも大きい抗菌効果が得られることを意味する。
【００５１】
このように、既存の抗生物質に対する深刻な耐性の原因が排出ポンプである場合、これらの抗生物質の作用を回復するために、式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物を上述のように用いることができる。抗生物質に対する耐性の例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのキノロン類に対する耐性、さらにはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種々の耐性（ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ，（１９９７），６３，６０５−６１０）が挙げられる。Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，第１１版，Ｂｕｄａｖａｒｉ編，１９８９，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．ＴＨＥＲ−９〜ＴＨＥＲ−１１及びＴＨＥＲ−１３（式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物によってその効果が増強される抗生物質が数種記載されている）を参照されたい。
【００５２】
これらの結果から、式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物は、ＮｏｒＡによる排出メカニズムの影響を受けた抗生物質の効能を回復するための薬学的組成物又は植物保護組成物に使用可能である。これらの組成物は、上記阻害剤に加えて、抗生物質、特にフルオロキノロン系抗生物質、及び、有効成分を摂取、送達するための通常の賦形剤を含んでいてもよい。
【００５３】
さらに、本発明の化合物には、薬理学的に有効な用量において、細胞傷害性が認められない。従って、その毒性は、医薬としての使用に適合し得る。
【００５４】
通常、本発明の化合物は、抗菌活性を有する医薬の調製、好ましくは、その効能が排出ポンプ、特にＮｏｒＡメカニズムに影響される抗菌剤の作用を改善するための医薬の調製に用いることができる。従って、後者の場合、式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物の投与は、その活性を改善したい抗菌剤の投与を伴う。式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の化合物は、上記抗菌剤と一緒に調合することもでき、別の調合とすることもできる。耐性記録等の診断検査に用いることもでき、対象とする株について、排出による耐性のメカニズムを明らかにすることができる。
【００５５】
従って、本発明の主題は、医薬としての式（Ｉｐ）の化合物、また、化合物Ｉ．１〜Ｉ．１６、その薬学的に適合可能な塩、あるいはその溶媒又は水和物である。
【００５６】
植物及び動物（ヒトを含む）に投与可能な該組成物は、効果的な量の本発明の化合物又はその許容可能な塩、溶媒和物若しくは水和物と、好適な賦形剤とを含む。
【００５７】
上記賦形剤は、形態、及び、所望の投与方法に従って選択される。経口、舌下、皮下、筋肉、静脈内、局所、気管内、経鼻、経皮、直腸、眼内投与用の本発明の薬学的組成物では、耐性又は非耐性細菌に関連した感染性疾患の予防又は治療のために、上記式（Ｉ）又は（Ｉｐ）の有効成分又はその塩、溶媒和物、水和物を、従来の薬学的塩との混合物として、単位投与形態で、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態としては、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒、経口溶液又は懸濁液等の経口形態、舌下、口腔、気管内、又は、経鼻投与形態、経皮、筋肉、又は、静脈内投与形態、及び、直腸投与形態が挙げられる。局所投与には、本発明の化合物を、クリーム、軟膏、ローション、又は、目薬として用いることができる。
【００５８】
効果を得るために、有効成分の容量は、体重１ｋｇ当たり、一日、１〜１００ｍｇが好ましい。化合物（Ｉ）又は（Ｉｐ）と、その効果が増強される抗菌剤とは、４対１の比で投与されるのが好ましい。
【００５９】
錠剤形態の固形組成物を調製する場合には、主要有効成分を、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガム等の薬学的な賦形剤と混合する。スクロース、セルロース系誘導体、又は、他の好適な材料で錠剤をコーティングしてもよく、あるいは、活性が持続又は遅延するように、また、継続して所定量の有効成分が放出されるように、錠剤を処理してもよい。
【００６０】
ゲルカプセルとしての製剤は、有効成分と希釈剤を混合し、得られた混合物をソフトカプセル又はハードカプセルに注入することによって得られる。
【００６１】
本発明の化合物を含む薬学的組成物は、例えば、溶液、エマルジョン、懸濁液、又は、シロップ等の液状であってもよい。適切な液状担体としては、水、グリセロール又はグリコール等の有機溶媒、及び、それらの様々な割合の水中混合物が挙げられる。
【００６２】
シロップ形態、エリキシル剤形態、又は、滴剤での投与のための製剤は、有効成分に加えて、甘味料、好ましくはノンカロリー甘味料、メチルパラベン、及び、プロピルパラベン等の防腐剤、さらに、香味料及び好適な着色剤を含んでいてもよい。水分散性粉末又は顆粒は、有効成分を、分散剤若しくは湿潤剤との混合物、又は、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤との混合物として含んでいてもよく、該混合物に甘味料又は調味料が含まれていてもよい。
【００６３】
また、本発明の主題は、いくつかの有効成分を組み合わせて含んだ薬学的組成物であり、該有効成分の内の１つは、化合物（Ｉ）又は（Ｉｐ）であり、もう一つは上記に定義した抗菌剤である。
【００６４】
さらに、概して、上記医薬及びこれらの化合物の使用に、上記化合物及び組成物について上記で記載したものと同じ好ましい形態を、必要に応じて変更を加えて適応可能である。
【００６５】
また、本発明の主題は、上記に定義した阻害剤の診断方法における使用であり、特に、抗生物質に耐性を有する細菌が生体サンプル中に存在するか、また、その耐性の程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで示すための使用である。以下に、添付の図を参照しながら、合成と生物学的試験の記載によって本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Ｉ．１２／シプロフロキサシンの組合せの抗菌活性のｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ法を用いた評価を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６７】
Ａ．実施例
表１に示す以下の化合物を合成した。
【００６８】
【表１】
2014503578.tif 000006
2014503578.tif 000007
【００６９】
方法Ａ：
【００７０】
【化４】
2014503578.tif 000008
【００７１】
以下の表２に示す化合物を、方法Ａに従って合成した。
【００７２】
【表２】
2014503578.tif 000009
【００７３】
方法Ｂ
【００７４】
【化５】
2014503578.tif 000010
【００７５】
以下の表３に示す化合物を、方法Ｂに従って調製した。
【００７６】
【表３】
2014503578.tif 000011
【００７７】
方法Ｃ：
【００７８】
【化６】
2014503578.tif 000012
【００７９】
以下の表４に示した化合物を、方法Ｃに従って調製した。
【００８０】
【表４】
2014503578.tif 000013
【００８１】
方法Ｄ：
【００８２】
【化７】
2014503578.tif 000014
【００８３】
以下の表５に示した化合物を、方法Ｄに従って調製した。
【００８４】
【表５】
2014503578.tif 000015
【００８５】
方法Ａ
第一工程：
経路Ａ：アニリン誘導体１（市販、又は、Ｆｅｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，２００２，５７，１２３−１２８に従って調製）を、０℃、アルゴン雰囲気下でテトラヒドロフラン（５ｍｌ／ｍｍｏｌ）に溶解する。トリエチルアミン（１．２ｅｑ）を添加した後、塩化アリール酢酸（１．２ｅｑ）のテトラヒドロフラン溶液（９ｍｌ／ｍｍｏｌ）を滴下する。反応混合物を１５時間、常温で撹拌し、Ｈ２Ｏを添加して加水分解する。この溶液を酢酸エチルで抽出し、ＮａＨＣＯ３（５％水中）溶液と飽和ＮａＣｌ溶液で有機相を連続して洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮する。ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９９．５：０．５；ｖ：ｖ）で溶出したシリカゲルカラムで精製し、純粋生成物２を得る。
【００８６】
経路Ｂ：アニリン誘導体２をアルゴン雰囲気下でＤＭＦ（８ｍｌ／ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（２ｅｑ．）、ＢＯＰ−Ｃｌ（２ｅｑ．）及び２−酢酸アリール（２ｅｑ．）で連続して処理する。常温で４８時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３（５％Ｈ２Ｏ中）を添加することで反応を停止させた。ＤＭＦを真空で留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、ＮａＣｌの飽和溶液で洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮する。ＣＨ２Ｃｌ２で溶出したシリカゲルカラムで精製することによって、所望の生成物２が得られる。
【００８７】
第二工程：
誘導体２（１．５２ｇ、４．３９ｍｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ（５ｍｌ／ｍｍｏｌ）に溶解する。ｔ−ＢｕＯＫ（５ｅｑ．）を添加し、溶液を常温で１２時間撹拌する。次いで、ｔ−ＢｕＯＨを真空下で留去し、ＮＨ４Ｃｌの飽和溶液を添加する。溶液を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出し、水、次いでＮａＣｌの飽和溶液で洗浄し、最後にＭｇＳＯ４で乾燥させる。有機相を濃縮し、生成物をＭｅＯＨから結晶化させ、その結晶をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、純粋生成物３を得る。
【００８８】
方法Ｂ
ＮａＨ（４ｅｑ．）を、アルゴン雰囲気下で誘導体３のＴＨＦ（８ｍｌ／ｍｍｏｌ）溶液に添加し、溶液を常温で３０分間撹拌する。ヨウ化メチル（１．５ｅｑ．）を滴下し、溶液を２４時間撹拌する。Ｈ２Ｏを添加して反応を停止し、酢酸エチルで抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、留去する。ＣＨ２Ｃｌ２で溶出しながらシリカゲルクロマトグラフィーで精製することによって、所望の生成物４を得る。
【００８９】
方法Ｃ
誘導体４のＣＨ２Ｃｌ２溶液（２０ｍｌ／ｍｍｏｌ）を、０℃、アルゴン雰囲気下、ＢＢｒ３（１ｅｑ．）で処理する。０℃で３０分間撹拌した後、水を添加し、溶液をろ過して、茶色の沈殿物を得る。この固体生成物をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。ＣＨ２Ｃｌ２で溶出しながらシリカゲルで精製することによって、所望の化合物５を得る。
【００９０】
方法Ｄ
３−アミノ−５−メトキシフェノール７（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ，Ａ．Ｋ．；Ｓｈａｒｍａ，Ｌ．；Ｎａｙａｋ，Ｍ．Ｋ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，６４０６−６４１４に従って調製）を、クロロベンゼン溶液に溶解させたアセト酢酸エチル誘導体８（２〜１．１ｅｑ．）を含む丸底フラスコに投入する。反応混合物をマイクロ波反応器に投入する。１６０℃、１３０Ｗで５〜３０分間、反応を行う。
【００９１】
観察：熱的加熱により、同じ反応を行う。反応媒体を１６５℃で直接グラファイト浴に投入する。反応混合物をアルゴン雰囲気下、２〜７２時間、還流する。反応生成物を、常温でクロロベンゼンから沈殿させ、ろ過した後、ジクロロメタンで洗浄する。
【００９２】
方法Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤによって合成された化合物の物理化学的性質
３−（３−クロロフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１
収率：９５％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ１１．６３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．３６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｃｌ）；７．２０（ｓ，１Ｈ，Ｐｈ−Ｃｌ）；７．１０（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ−Ｃｌ）；６．４４（ｓ，１Ｈ，Ｈ６又はＨ８）；６．３１（ｓ，１Ｈ，Ｈ６又はＨ８）；３．７９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．７７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．２９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ：１６１．８７；１６１．２４；１６０．１１；１４５．４６；１４１．８３；１３９．９０；１３３．１３；１３０．９５；１３０．３６；１３０．００；１２８．２５；１２７．４４；１０５．５５；９４．４８；９１．５１；５６．４９；５５．９１；２２．０９
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３３０，［Ｍ＋Ｎａ］＋３５２
【００９３】
５，７−ジメトキシ−３−（４−メトキシフェニル）−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．２
収率：８０％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ１２．１２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｐｈ−ＯＣＨ３）；６．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｐｈ−ＯＣＨ３）；６．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ６又はＨ８）；６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ６又はＨ８）；３．８５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．８３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．７８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．４６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；１００ＭＨｚ）δ１６３．４８（Ｃｑ）；１６１．４３（Ｃｑ）；１５９．６２（Ｃｑ）；１５８．６５（Ｃｑ）；１４６．８６（Ｃｑ）；１４０．９０（Ｃｑ）；１３１．８８（Ｐｈ−ＯＭｅ  Ｃ２’及びＣ６’）；１２９．１５（Ｃｑ）；１２８．５６（Ｃｑ）；１１３．５３（Ｐｈ−ＯＭｅ  Ｃ３’及びＣ５’）；１０６．８３（Ｃｑ）；９４．６６（Ｃ８）；９１．０４（Ｃ６）；５５．５１（ＯＭｅ）；５５．４６（ＯＭｅ）；５５．３０（ＯＭｅ）；２１．８８（Ｍｅ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３２６，［Ｍ＋Ｎａ］＋３４８
【００９４】
５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．３
収率：９９％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ１１．５１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．４２（ｍ，１Ｈ，インドール）；７．２８（ｓ，１Ｈ，インドール）；７．１２（ｍ，２Ｈ，インドール）；６．９７（ｍ，１Ｈ，インドール）；６．４５（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．３１（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．８０（ｍ，６Ｈ，２ＯＣＨ３又はＯＣＨ３及びＣＨ３−インドール）；３．７７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３又はＣＨ３−インドール）；２．３７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ１６１．３３；１６０．７６；１５９．１３；１４４．７７；１４０．８０；１３６．１７；１３０．４３；１２７．６７；１２１．９４；１２０．７５；１１９．５４；１１８．８４；１０９．７１；１０８．８２；１０５．４４；９３．６３；９０．８０；５５．７９；５５．２４；３２．４４；２２．０４
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３４９，［Ｍ＋Ｎａ］＋３７１
【００９５】
５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（チオフェン−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．４
収率：６３％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ１２．５７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．４２（ｍ，１Ｈ，チオフェン）；７．１１（ｍ，１Ｈ，チオフェン）；７．０２（ｍ，１Ｈ，チオフェン）；６．４８（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．２３（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．８４（ｓ，６Ｈ，２  ＯＣＨ３）；２．６２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；１００ＭＨｚ）δ１６３．１８；１６２．１４；１５９．８１；１４９．７８；１４１．１７；１３７．３６；１２８．９５；１２６．５１；１２６．３５；１２１．５２；１０４．１０；９５．１３；９１．２７；５５．６８（２Ｃ）；２２．４２
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３０２
【００９６】
５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．５
収率：９８％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ７．３７−７．２９（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；７．２９−７．２６（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ）；７．１４−７．１２（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；６．４４（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．３０（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．７８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．７６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．２８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ１６１．６４；１６１．５１；１６０．０１；１４４．８７；１４１．７１；１３７．６９；１３１．１４；１２９．７１；１２８．４６；１２７．３７；１０５．６５；９４．３７；９１．４６；５６．４４；５５．８７；２２．０８
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２９６，［Ｍ＋Ｎａ］＋３１８
【００９７】
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−５，７−ジメトキシ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．６
収率：４５％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ１１．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；１１．１９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．４１（ｍ，１Ｈ，インドール）；７．３０（ｓ，１Ｈ，インドール）；７．１４（ｍ，１Ｈ，インドール）；７．０８（ｍ，１Ｈ，インドール）；６．９７（ｍ，１Ｈ，インドール）；６．４９（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．３４（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．８４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．８１（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．４１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３３５，［Ｍ＋Ｎａ］＋３５７
【００９８】
５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチル−３−（チオフェン−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．７
収率：７２％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ１１．５４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；１０．３７（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；７．５８（ｍ，１Ｈ，チオフェン）；７．０８（ｍ，１Ｈ，チオフェン）；６．９６（ｍ，１Ｈ，チオフェン）；６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ６又はＨ８）；６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ６又はＨ８）；３．７４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．４９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ：１６１．３９；１６０．９０；１５８．１４；１４７．８４；１４１．３７；１３７．３９；１２８．７９；１２６．７２；１２６．５５；１２０．９２；１０４．７４；９６．７４；９０．２０；５５．２９；４８．７９；２１．９０
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２８８，［Ｍ＋Ｎａ］＋３１０
【００９９】
５−ヒドロキシ−７−メトキシ−１，４−ジメチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．８
収率：４０％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ７．３９−７．３７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；７．３１（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ）；７．１５（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；６．４３（ｓ，１Ｈ，Ｈ８又はＨ６）；６．３５（ｓ，１Ｈ，Ｈ６又はＨ８）；３．８３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．５６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；２．３４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２９６，［Ｍ＋Ｎａ］＋３１８
【０１００】
５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチル−３−（ナフタレン−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．９
収率：６１％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ７．９２（ｍ，３Ｈ，ビフェニル）；７．７２（ｓ，１Ｈ，ビフェニル）；７．５２（ｍ，２Ｈ，ビフェニル）；７．３２（ｍ，１Ｈ，ビフェニル）６．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ８）；６．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ６）；３．７５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．４０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３３２，［Ｍ＋Ｎａ］＋３５４
【０１０１】
５，７−ジメトキシ−１，４−ジメチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１０
収率：５７％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ・７．４１−７．３７（ｍ，２Ｈ）；７．３３−７．３１（ｍ，１Ｈ）；７．１５（ｍ，２Ｈ）；６．５６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ８）；６．４８（ｄ，Ｊ＝２Ｈ，１Ｈ，Ｈ６）；３．９１（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．８５（ｓ，ＯＣＨ３）；３．３４（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．２９（ｓ，３Ｈ，Ｃ−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ：１６１．３；１６０．４２；１５９．８６；１４２．９２；１４１．８９；１３７．８４；１３０．４１（２Ｃ）；１２８．３８；１２７．９３（２Ｃ）；１２６．７８；１０５．６４；９３．７５；９１．５０；５５．９６；５５．５１；３０．３４；２１．７９
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３１０，［Ｍ＋Ｎａ］＋３３２；［Ｍ＋Ｎａ］＋；［２Ｍ＋Ｎａ］＋６４１
【０１０２】
７−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１１
収率：４％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ７．４０−７．３６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；７．３１（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ）；７．１５（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；６．３５（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．２０（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．７９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ：１６１．００；１５９．５２；１４４．３５；１４１．１５；１３７．２７；１３０．５９；１２８．１８；１２７．８１；１２６．６４；１０４．０４；９４．４１；９３．１５；５５．５９；２１．４５
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２８２
【０１０３】
５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１２
収率：８９％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）δ７．３９−７．３７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；７．３０（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ）；７．１６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；６．３４（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．２２（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．７４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．３６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；１００ＭＨｚ）δ：１６１．０３；１６０．７１；１５７．８２；１４４．８３；１４１．２６；１３７．１５；１３０．５７；１２８．２６；１２７．８１；１２６．６６；１０４．３９；９６．３３；９０．００；５５．００；２１．２２
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２８２
【０１０４】
５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１３
収率：８６％
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；４００ＭＨｚ）：δ１１．３４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；１０．０５（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；９．８２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；７．３８−７．３０（ｍ，３Ｈ，Ｐｈ）；７．１５（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；７．１５（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）；６．２０（ｓ，１Ｈ，Ｈ８）；６．１２（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；３．３４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；２．３３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２６８，［Ｍ＋Ｎａ］＋２９０
【０１０５】
３−ベンジル−５−ヒドロキシ−７−メトキシ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１４
収率：８８％（白色結晶）
Ｍ．ｐ．＞２７８℃、分解
Ｒｆ＝０．２９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９７：３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．５３（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ）；３．７２（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ）；３．９６（ｓ，２Ｈ，２×Ｈ１’）；６．２（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６）；６．３４（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ８）；７．１２−７．２３（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；１０．２３（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；１１．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１９．５（ＣＭｅ）；３１．１（Ｃ１’）；５５．０（ＣＯＭｅ）；９０．０（Ｃ６）；９６．４（Ｃ８）；１０４．５（Ｃ４ａ）；１２５．３（Ｃ３）；１２５．５（Ｃ５’）；１２７．９（Ｃ４’，Ｃ６’）；１２８．２（Ｃ３’，Ｃ７’）１４０．７（Ｃ２’）；１４０．８（Ｃ８ａ）；１４５．３（Ｃ４）；１５７．４（Ｃ５）；１６１．３（Ｃ７）；１６１．９（Ｃ２）
質量（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ（％）２９６［Ｍ＋Ｈ］＋（１００），３１８［Ｍ＋Ｎａ］＋（５０），６１３［２×Ｍ＋Ｎａ］＋（３０）
【０１０６】
２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−７−メトキシ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］キノリン−４（５Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１５
収率：７４％（茶色粉末）
Ｍ．ｐ．１８９〜１９０℃
Ｒｆ＝０．２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９７：３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．９６（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，２×Ｈ２’）；２．６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，２×Ｈ１’）；３．２７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，２×Ｈ３’）；３．７１（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ）；６．１６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６）；６．３３（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ８）；１０．１３（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；１１．２７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２２．６（Ｃ２’）；２９．１（Ｃ１’）；３５．７（Ｃ３’）；５５．０（ＣＯＭｅ）；８９．９（Ｃ６）；９５．６（Ｃ８）；１０３．２（Ｃ４ａ）；１２８．０（Ｃ３）；１４２．０（Ｃ８ａ）；１５０．６（Ｃ４）；１５６．１（Ｃ５）；１６０．６（Ｃ７）；１６０．７（Ｃ２）
質量（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ（％）２３２［Ｍ＋Ｈ］＋（１００），２５４［Ｍ＋Ｎａ］＋（５０），４８５［２×Ｍ＋Ｎａ］＋（６０）
【０１０７】
１−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−フェニルキノリン−２（１Ｈ）−オン、化合物Ｉ．１６
収率：６７％
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．４５−７．２０（ｍ，１０Ｈ）；６．６１（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ８）；６．５０（ｄ，Ｊ＝２Ｈ，１Ｈ，Ｈ６）；４．３２（ｓ，２Ｈ）；３．８９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）；３．８２（ｓ，ＯＣＨ３）；２．３１（ｓ，３Ｈ，Ｃ−ＣＨ３）
質量（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３８５
【０１０８】
Ｂ．生物学的試験
Ｂ．Ｉ  シプロフロキサシンの活性に対する本発明の化合物の組合せの「増強」作用及びそれら自体の抗菌活性の評価
・化合物
本発明のすべての化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化する。各化合物について、溶媒の毒性（細菌接触時のＤＭＳＯの最終濃度が３％未満）、及び、化合物のミューラーヒントンＩＩ（ＭＨ  ＩＩ）培地への可溶化能を考慮して、実験中の最高濃度を決定する。これは、ＭＨ  ＩＩ培地においてＤＭＳＯ系溶液を希釈する際に、化合物が沈殿してしまうことがあるからである。
【０１０９】
・抗生物質
用いる抗生物質は、フルオロキノロンの一種、シプロフロキサシンである。これは、滅菌浸透水（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｏｓｍｏｓｅｄ  ｗａｔｅｒ）又はＨＣｌ溶液で酸性化したＭＨ  ＩＩに可溶化する。１ｍｌの滅菌浸透Ｈ２Ｏに１０ｍｇのシプロフロキサシンを可溶化するために、２０μｌの１２ＮのＨＣｌ（又は３５％ＨＣｌを５μｌ）が必要である。
【０１１０】
・細菌株
化合物をスクリーニングするための株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３と称されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの株である。
【０１１１】
・シプロフロキサシンの活性に対する本発明の各化合物の組合せの増強効果の評価
ＭＩＣ法に従って、シプロフロキサシン単独のＭＩＣを、本発明の化合物と組み合わせたシプロフロキサシンのＭＩＣと比較することにより、増強効果を評価する。上記方法は、Ｃｏｍｉｔｅ  ｄｅ  ｌ’Ａｎｔｉｂｉｏｇｒａｍｍｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ  （ＣＡＳＦＭ）［Ａｎｔｉｏｂｉｏｇｒａｍ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ］及びＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）によるプロトコルに従って実施する。ＭＩＣは、丸底９６ウェルマイクロプレート、ＭＨ  ＩＩ液体培地中で測定する。シプロフロキサシンのある希釈域を、ＭＨ  ＩＩ培地で調製する。第一行の各ウェルに、１０６ＣＦＵ／ｍｌの細胞懸濁液１００μｌ、シプロフロキサシン希釈域５０μｌ、及び、ＭＨ  ＩＩ５０μｌを混合する。第二行の各ウェルにおいて、１０６ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ）／ｍｌの細菌懸濁液１００μｌと、シプロフロキサシン濃度域の５０μｌと、本発明の化合物の最高濃度溶液５０μｌとを混合する。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、合成分子を含む行と含まない行の２行において、細菌の増殖が認められない抗生物質の最低濃度（ＭＩＣ）を記録する。本発明の化合物は、該化合物の存在下で、そのＭＩＣが希釈率４倍以上減少していれば、シプロフロキサシン単独での効果と比較してシプロフロキサシンの活性を増強する効果を有していることとする。
【０１１２】
・本発明の化合物単独での抗生物質活性の評価
ＭＩＣ法を用いて、分子の抗生物質活性を評価する。分子のＭＩＣは、ＣＡＳＦＭ及びＣＬＳＩのプロトコルに従って、９６ウェルマイクロプレート、ＭＨ  ＩＩ液体培地中で測定する。この分子のある希釈域を、ＭＨ  ＩＩ培地で事前に調製する。各ウェルにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３の細菌懸濁液（１０６ＣＦＵ／ｍｌ）１００μｌと、試験化合物の希釈域５０μｌと、ＭＨ  ＩＩ５０μｌとを混合する。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、細菌の増殖を阻害した分子を、抗生物質活性を有するとして記録する。細菌の増殖が認められない化合物の最低濃度が、ＭＩＣ（細菌増殖阻害最低濃度）である。
【０１１３】
・結果
試験した本発明の１６種の化合物は、（程度は異なるが）シプロフロキサシンの活性を増大する。
【０１１４】
この１６種の化合物中、４種の化合物（化合物Ｉ．１１、Ｉ．１２、Ｉ．１３及びＩ．７）は、単独でも抗生物質活性を示す。化合物Ｉ．１２、Ｉ．１３及びＩ．７はそれぞれ、濃度６２．５〜１２５μＭ，１５５μＭ及び６２．５〜１２５μＭで抗生物質活性を示す。化合物Ｉ．１１については、分析を継続するために十分な量がない。
【０１１５】
Ｂ．ＩＩ  化合物Ｉ．１２の活性のスペクトルの説明
・抗生物質及び化合物Ｉ．１２
用いる抗生物質は、Ｂ．１と同様に希釈したシプロフロキサシンである。化合物Ｉ．１２も、Ｂ．１と同じ条件で用いる。
【０１１６】
・細菌株
１９属、５６株を用いた（表６）。
【０１１７】
【表６】
2014503578.tif 000016
2014503578.tif 000017
2014503578.tif 000018
【０１１８】
これらの株のうち９株はＡＴＣＣ株であり、４７株は病院由来であり、ブロンのＣｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｅｓｔ［Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ］から得ている。スタフィロコッカス属は、１８株を試験する：１株はＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓであり、２株はＳ．ａｕｒｅｕｓであり、１０株はＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）であり、５株はＶＩＳＡ（バンコマイシン低感受性黄色ブドウ球菌）である。また、エンテロコッカス属１６株、すなわちＥ．ｆａｅｃｉｕｍ９株及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ７株も試験する。後者の２種は、バンコマイシン−感受性株を２株（各種１株）と、耐性株を１４株（ＶＲＥ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍが８株とＥ．ｆａｅｃａｌｉｓが６株）を含む。その他の属については、上記表６に示す。
【０１１９】
・シプロフロキサシンの活性に対する化合物Ｉ．１２との組合せの増強効果の評価
この増強効果は、上述のように評価する。しかし、いくつかの微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）では、液体培地での増殖のために、凍結（−２０℃）／解凍（常温）を７回連続して行い、５０％の滅菌浸透水で溶解した脱フィブリンウマ血が必要となる。次いで、この５０％血液を常温、１２０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離する。滅菌、添加物フリーのＭＨ  ＩＩに、５体積％の上清を投入する。
【０１２０】
・化合物Ｉ．１２の抗生物質活性の評価
化合物Ｉ．１２の抗生物質活性を、ある株の血液要求を考慮して、上述のプロトコルに従って、ＭＩＣ法で評価する。
【０１２１】
・結果
試験した細菌５６株のうち、化合物Ｉ．１２と組み合わせた場合、２８株でシプロフロキサシンに対する感受性が高まることがわかった。これらの株は、スタフィロコッカス属とエンテロコッカス属のグラム陽性菌であり、以下の耐性株を含む（多剤耐性株も含む）：
・既存の抗生物質に感受性を有するＳ．ａｕｒｅｕｓは２／２、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は１０／１０、バンコマイシン低感受性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）は５／５；
・Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは１／１
・Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓは５／７（４株はＶＲＥ、すなわちバンコマイシン耐性株である）、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍは５／９（５株ともＶＲＥである）。
【０１２２】
表７に、シプロフロキサシンと化合物Ｉ．１２との組合せに感受性を有するスタフィロコッカス属とエンテロコッカス属の株の分布を示す。
【０１２３】
【表７】
2014503578.tif 000019
【０１２４】
各株について、化合物Ｉ．１２存在下でのシプロフロキサシンのＭＩＣが、１／１６以下になる。ただし、例外として、一株については活性が４以上である。上記の２８種には含まれていないＥ．ｆａｅｃｉｕｍの２種類のＶＲＥ株は、化合物Ｉ．１２及びシプロフロキサシンの組合せの作用に若干感受性を有する（倍率≧２）。
【０１２５】
化合物Ｉ．１２単独での作用に感受性を有するのも、同じ株である（化合物Ｉ．１２自体の抗生効果）。
【０１２６】
Ｂ−ＩＩＩ−化合物Ｉ．１２の作用様式の調査
・抗生物質
用いる抗生物質は、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、及び、オキサシリンである。
【０１２７】
シプロフロキサシンは、上述の通り調製する。
【０１２８】
エリスロマイシン（４℃で保存）を９６％エタノールで、濃度１０ｍｇ／ｍｌで回収する。次いで、その溶液をＭＨ  ＩＩ培地で１０倍希釈した後、３１．３倍に希釈し、３２μｇ／ｍｌの原液を得る（ウェル中、８μｇ／ｍｌ）。
【０１２９】
バンコマイシンを滅菌浸透水中、濃度１０ｍｇ／ｍｌで回収する。次いで、その溶液をＭＨ  ＩＩ培地で１０倍希釈した後、１５．６倍に希釈し、６４μｇ／ｍｌの原液を得る（ウェル中、１６μｇ／ｍｌ）。
【０１３０】
テトラサイクリン濃度１０ｍｇ／ｍｌでテトラサイクリンを滅菌浸透水中に回収する。次いで、その溶液をＭＨ  ＩＩ培地で１０倍希釈した後、３１．３倍に希釈し、３２μｇ／ｍｌの原液を得る（ウェル中、８μｇ／ｍｌ）。
【０１３１】
オキサシリンを、濃度１０ｍｇ／ｍｌで滅菌浸透水中に回収する。次いで、その溶液をＭＨ  ＩＩ培地で１０倍希釈した後、６２．５倍に希釈し、１６μｇ／ｍｌの原液を得る（ウェル中、４μｇ／ｍｌ）。
【０１３２】
・細菌株
以下のＳ．ａｕｒｅｕｓ株を用いる：
・参照株ＡＴＣＣ  ２９２１３；
・それぞれメチシリン耐性（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性（ＶＩＳＡ）と認められたＳＴ０７  １０１２及びＶ４の２株；
・遺伝子改変株とそれが派生した株：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  １１９９ｂ（ＮｏｒＡ排出ポンプの過剰発現）及びその「親」株１１９９；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｋ  １７１２（細菌膜レベルでのＮｏｒＡ排出ポンプがない）及びその「親」株８３２５−４。
【０１３３】
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３株に対する化合物Ｉ．１２と各種抗生物質との組合せの抗細菌活性の評価（チェス盤法）
抗生物質分子シプロフロキサシンと、化合物Ｉ．１２との組合せに対するＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３の感受性、及び、これら２分子それぞれの他方の活性に対する影響を、チェス盤法を用いて求める。この方法は、丸底９６ウェルプレート（１２行×８列）で行う。各種濃度のシプロフロキサシン及び化合物Ｉ．１２を、それらの原液をＭＨ  ＩＩ培地に希釈して得る。化合物Ｉ．１２の希釈域５０μｌを１〜１０行の各ウェルに配置する。各列がこの化合物の希釈に対応する。シプロフロキサシンの希釈域５０μｌを２〜１０行の各ウェルに配置する。各列が希釈に対応する。同じ希釈域のシプロフロキサシンを、１１行にも用意する。１行と１１行のウェルに、５０μｌのＭＨ  ＩＩ培地を投入する。最後に、１０６ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ）／ｍｌの細菌懸濁液１００μｌを、１行〜１０行の各ウェルに投入する（細菌最終濃度：５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）。
【０１３４】
プレートを目視で観察する。各ウェルに投入した２００μｌの試薬が、不透明（細菌増殖）又は透明（細菌増殖なし）になる。化合物Ｉ．１２のＦＩＣ（ＦＩＣＩ．１２）とシプロフロキサシンのＦＩＣ（ＦＩＣシプロ）とを下記式に従って足すことにより、分画阻害濃度（ＦＩＣ）を算出する：
・ＦＩＣＩ．１２＝シプロフロキサシンと組み合わせた化合物Ｉ．１２のＭＩＣ／化合物Ｉ．１２単独でのＭＩＣ
・ＦＩＣシプロ＝シプロフロキサシンと組み合わせた化合物Ｉ．１２のＭＩＣ／シプロフロキサシン単独でのＭＩＣ
・ＦＩＣ＝ＦＩＣＩ．１２＋ＦＩＣシプロ
【０１３５】
結果は以下のように解釈できる：ＦＩＣ≦０．５の場合は、２分子間の相乗作用を示し、ＦＩＣ＞４の場合は、２分子間の拮抗作用を示し、ＦＩＣが０．５〜４である場合は、２分子間に相互作用がないことを示す。
【０１３６】
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３株に対するＩ．１２／シプロフロキサシンの組合せの抗菌活性の評価（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ法）
ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ法を６ウェルプレートで行う。各ウェルは、指数増殖期の細菌（最終濃度１０６ＣＦＵ／ｍｌ）を播種したＭＨ  ＩＩ培地５ｍｌを含む。各種細菌増殖条件を試験する：
・ウェル１：０．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシン＋３１μＭ  Ｉ．１２
・ウェル２：０．１２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシン＋３１μＭ  Ｉ．１２
・ウェル３：０．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシン
・ウェル４：０．１２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシン
・ウェル５：３１μＭ  Ｉ．１２
・ウェル６：分子なし
【０１３７】
培養液を３７℃、４００ｒｐｍで振盪培養する。最初の６時間は１時間毎に、そして２２時間でサンプルを取る。培養液を希釈したあと、皿で培養して生存している細菌をカウントする。２分子間の相乗又は拮抗効果を、２分子両方を含むウェルと分子が最も活性を有するウェルとの間での減少≧２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ、及び、増加≧２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌと定義する。
【０１３８】
・結果
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３株に対する化合物Ｉ．１２と各種抗生物質との組合せの抗菌活性の評価（チェス盤法）
チェス盤法により以下のことが示された：
・Ｉ．１２とシプロフロキサシンとは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３、並びに、ＭＲＳＡ（ＳＴ０７  １０１２株）及びＶＩＳＡ（Ｖ４株）タイプの耐性株に対して相乗（ＦＩＣ≦０．５）抗菌性組合せである。オキサシリン、エリスロマイシン、テトラサイクリン又はバンコマイシンは、Ｉ．１２との間に同一細菌株に対して相互作用がない（ＦＩＣ＞０．５且つ＜４）。
・各ＡＴＢは、Ｋ１７１２株（ＮｏｒＡポンプ欠損株）では相互作用が見られず、１１９９Ｂ株（ＮｏｒＡ過剰発現株）では非常に相乗的な組合せがある。
【０１３９】
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３株に対するＩ．１２／シプロフロキサシンの組合せの抗菌活性の評価（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ法）
結果は２回の実験の平均である。Ｉ．１２／シプロフロキサシンの組合せの抗菌活性のｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ法を用いた評価を示した一枚の図に見られるように、シプロフロキサシン（０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．１２５ｍｇ／ｍｌ）／Ｉ．１２（３１μＭ）の組合せ（減少≧２ｌｏｇ１０）では、相乗効果が認められる。
【０１４０】
このように、本発明の化合物は、シプロフロキサシンと組み合わせると、スタフィロコッカス属及びエンテロコッカス属のグラム陽性菌、特に病院での惨事の原因となる耐性菌（ＭＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥ）に対するこの抗生物質の活性を、明らかに増進する。
【０１４１】
これらの化合物のうちのいくつかは、顕著な抗生物質活性も有する。それらの活性は、シプロフロキサシンと組み合わせることで、この抗生物質の活性と相乗的（単純に相加的ではなく）になる。この相乗効果によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌を駆逐するために使用する抗生物質の濃度を減らすことができ、おそらくｉｎ  ｖｉｖｏで用いる濃度も減らすことができる（抗感染薬分子による毒性作用の減少）。この活性はＭＲＳＡ及びＶＩＳＡ株に対しても認められる。相乗効果が得られることは、おそらく、本発明の化合物の排出ポンプ阻害活性と関連しているであろう。
【０１４２】
この相乗効果は、フルオロキノロン系抗生物質、特に、ノルフロキサシン（ｎｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、シプロフロキサシン等の親水性フルオロキノロン類に対してのみ認められる。この活性は、１１９９Ｂ株（ＮｏｒＡ過剰発現）に対しては優れているが、Ｋ１７１２株（ＮｏｒＡポンプ欠損）に対しては実質的にゼロである。このことは、細菌の排出ポンプ、特にＮｏｒＡポンプに対する阻害作用を示していると思われる。
【０１４３】
Ｂ−ＩＶ．ＮｏｒＡに対する本発明の化合物の阻害活性を示す補足試験
・化合物
以下の分子のＥＰＩ効果を評価した：Ｉ．１（２４μｍｏｌ／ｌ）、Ｉ．６（１６μｍｏｌ／ｌ）、及び、Ｉ．１４（３１μｍｏｌ／ｌ）。
【０１４４】
・抗生物質
これらの分子と以下の抗生物質を組み合わせた：シプロフロキサシン及びノルフロキサシン；テトラサイクリン；オキサシリン；エリスロマイシン及びバンコマイシン。
【０１４５】
細菌株：試験した細菌株は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３；ＮｏｒＡ過剰発現のＳ．ａｕｒｅｕｓ  １１９９ｂ及びその由来となった株であるＳ．ａｕｒｅｕｓ  １１９９；ＮｏｒＡを発現しないＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｋ１７１２及びＳ．ａｕｒｅｕｓ  ８３２５．４（その由来となった株）である。
【０１４６】
・シプロフロキサシンの活性に対する上記の本発明の各化合物の組合せの増強効果の評価
上述のＭＩＣ法に基づいた手順を用いる。その活性が「ＭＩＣ抗生物質／ＭＩＣ抗生物質＋本発明の化合物≧４」の条件を満たす分子の組合せのみを、ＮｏｒＡ排出ポンプに対して阻害活性を示すものとした。
【０１４７】
以下に結果を示す：
・ノルフロキサシン及びシプロフロキサシンの存在下では、化合物Ｉ．６によって、ＭＩＣを４倍、８倍、さらには１６倍改善することができる。上記化合物をこの２種類のフルオロキノロン類の一方と組み合わせて、ＮｏｒＡ過剰発現の１１９９ｂ株を用いて評価した場合に、この活性は特に顕著である。しかし、これらの組合せでＫ１７１２株に対して評価した場合、この活性はゼロである。最後に、この分子を非フルオロキノロン系抗生物質と組み合わせた場合は、この活性は効果的でない。
・この結果は、化合物Ｉ．１４についても同様である。しかしながら、このＥＰＩ分子は、テトラサイクリン及びエリスロマイシン存在下で、１１９９ｂ株に対して化合物Ｉ．６では見られない弱い活性を示す特徴がある。
・化合物Ｉ．１は効果があるように思われるが、その効果は小さい。
【０１４８】
本発明のこれらの化合物は、フルオロキノロン類と組み合わされると選択的に活性を示す。さらに、この組合せでは既存の抗生物質の活性が促進されないＫ１７１２株とは異なり、すべての株の中でも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  １１９９ｂが、この組み合わせの活性に最も感受性が高い株である。
【０１４９】
これらの結果はすべて、ＮｏｒＡによって細菌から排出される分子であるフルオロキノロン類と組み合わせた場合の、Ｉ．６及びＩ．１４の増強活性を示している。さらに、ＮｏｒＡ過剰発現株（１１９９ｂ）は、この組み合わせに非常に感受性が高く、これに対して、それを発現しないもの（Ｋ１７１２）は、ほとんど感受性がない。本発明の化合物の標的は、明らかにＮｏｒＡであると思われる。
【図１】
2014503578.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014503578.tif 000023
（式中：
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、又は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、又は、置換されていてもよいベンジル基であり、
Ｒ４は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基、アリール基、又は、ヘテロアリール基であって、該アリール基及びヘテロアリール基は置換されていてもよく、且つ、Ｒ５は、置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル基である、又は、
Ｒ４及びＲ５は、炭素原子を３〜４個有する飽和炭化水素系鎖を介して互いに結合していてもよい）の化合物を含有する組成物であって、
抗菌薬として、又は、ある抗菌剤の効果の増強剤として使用される組成物。
【請求項２】
Ｒ３は、水素原子、又は、メチル若しくはベンジル基であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれ独立して水素原子、又は、メチル基であることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ５は、メチル基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2014503578.tif 000024
2014503578.tif 000025
2014503578.tif 000026
2014503578.tif 000027
2014503578.tif 000028
2014503578.tif 000029