(57)【要約】  本発明は、天然及び変性アルブミンの混合物を含む外部シェルを有しかつペルフルオロカーボンガスを封入したマイクロバブル、治療剤、及び一端が治療剤に結合しかつ他端がリガンドに結合した二官能性リンカーを含んでなり、リガンドが疎水性相互作用によってマイクロバブルの外部シェルに結合しているマイクロバブル複合体に関する。また、上述したマイクロバブル複合体を組織標的に送達するための方法も包含される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然及び変性アルブミンの混合物を含む外部シェル並びにペルフルオロカーボンガスを封入した中空コアを有するマイクロバブル、
小分子化学療法剤、ペプチド、炭水化物、オリゴヌクレオチド、細胞毒素、タンパク質合成阻害剤及びこれらの組合せを含む群から選択される治療剤、並びに
一端が治療剤に結合しかつ他端がリガンド上の反応性基の反応によって前記リガンドに結合した二官能性リンカー
を含んでなり、リガンドが疎水性相互作用によってマイクロバブルの外部シェルに結合している、マイクロバブル複合体。
【請求項２】
治療剤がオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが天然に存在する若しくは修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項２記載の複合体。
【請求項４】
ＲＮＡが小干渉ＲＮＡである、請求項３記載の複合体。
【請求項５】
二官能性リンカーが、オリゴ−又はポリ−アミノ酸、ペプチド、糖、ヌクレオチド、約１〜２５０個の炭素原子を有する有機部分或いはこれらの組合せを含む、請求項１記載の複合体。
【請求項６】
二官能性リンカーがテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）又はポリエチレングリコールを含む、請求項１記載の複合体。
【請求項７】
反応性基が、活性化エステル、ホスホラミダイト、イソシアネート、イソチオシアネート、アルデヒド、酸塩化物、スルホニルクロリド、マレイミド、アルキルハライド、アミン、ホスフィン、ホスフェート、アルコール又はチオールを含む、請求項１記載の複合体。
【請求項８】
リガンドが、脂肪酸、ステロイド又はこれらの組合せである、請求項１記載の複合体。
【請求項９】
リガンドが、４−ヨードフェニル酪酸或いはその類似体又は誘導体である、請求項１記載の複合体。
【請求項１０】
天然アルブミンに対する変性アルブミンの量が約０．５〜３０ｗｔ％の範囲内にある、請求項１記載の複合体。
【請求項１１】
治療剤がｓｉＲＮＡを含み、リンカーがテトラエチレングリコールを含み、リガンドがコレステロールを含む、請求項１記載の複合体。
【請求項１２】
マイクロバブル複合体を組織標的に送達するための方法であって、
天然及び変性アルブミンの混合物を含む外部シェル並びにペルフルオロカーボンガスを封入した中空コアを有するマイクロバブル、
小分子化学療法剤、ペプチド、炭水化物、オリゴヌクレオチド、細胞毒素、タンパク質合成阻害剤及びこれらの組合せを含む群から選択される治療剤、並びに
一端が治療剤に結合しかつ他端がリガンド上の反応性基の反応によって前記リガンドに結合した二官能性リンカー
を含み、リガンドが疎水性相互作用によってマイクロバブルの外部シェルに結合しているマイクロバブル複合体を用意する段階、
組織標的の供給源である被験体にマイクロバブル複合体を投与する段階、並びに
組織標的中においてマイクロバブル複合体のキャビテーションを引き起こすのに十分な超音波エネルギーを被験体に投与する段階
を含んでなる方法。
【請求項１３】
組織標的が生体内にあり、マイクロバブル複合体の投与がマイクロバブル複合体の静脈内又は腹腔内注射を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、マイクロバブル複合体のキャビテーションのために超音波エネルギーを投与するのに先立って組織標的の位置にあるマイクロバブル複合体を可視化する段階を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
可視化及び超音波エネルギーの投与がリアルタイムで実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
組織標的が生体内にある、請求項１６記載の方法。
【請求項１７】
治療剤がｓｉＲＮＡを含み、リンカーがテトラエチレングリコールを含み、リガンドがコレステロールを含む、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、治療剤へのアルブミン親和性リガンドの結合を用いたアルブミンマイクロバブル医薬品への治療剤の新規な結合に関する。かかる結合は、インビトロ又はインビボの興味ある標的化細胞又は組織への治療剤のマイクロバブル支援送達方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
薬物を担持するマイクロバブルの超音波媒介破壊は、非侵襲的薬物送達系として有用であることが判明している。薬物又は他の治療剤は、マイクロバブルシェルへの薬物の結合及びリガンドの結合を含む複数の異なるやり方でマイクロバブル中に組み込むことができる。例えば、ペルフルオロカーボンで満たされたマイクロバブルは血液プール剤として血管系を循環するために十分安定であり、興味ある部位に到達するまでこれらの薬剤のキャリヤーとして働く。次いで、皮膚表面に適用された超音波を用いてこの部位にあるマイクロバブルを破裂させることで、部位特異的な位置における薬物又は治療剤の局所放出を引き起こすことができる。
【０００３】
さらに詳しくは、アルブミンマイクロバブルが使用され、部位指向性の音響学的超音波によって特定の臓器標的に送達されてきた。アルブミンは血液中の主要タンパク質であり、その本来の生理学的役割は多種多様の親油性／難溶性リガンドと結合して身体全体に運ぶことである。アルブミンに対して親和性を有し得るこれらのリガンドには、本質的に疎水性である脂肪酸並びに他の生合成及び異化産物がある。それ故、アルブミンマイクロバブルは、特定の標的化メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に対して相補的な配列を有するアンチセンスＯＤＮのようなオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）及びポリヌクレオチドを含むタンパク質及び他の生物学的物質に基づく多種多様の治療剤を運ぶために使用されてきた。これらのマイクロバブル−核酸複合体は、マイクロバブルシェル形成中にアルブミン又は脂質成分と混合された非修飾オリゴヌクレオチドから生成できる。別法として、複合体の生成は、予め形成されたマイクロバブルを興味あるＯＤＮと混合することによっても実施できる。いずれの場合にも、ＯＤＮは遺伝子翻訳の過程における機械的介入又は早期プロセシングイベントとして作用する。このアプローチの利点は、比較的低い用量で反映されるべき遺伝子特異的作用及び最小の非標的化副作用が可能になることである。
【０００４】
しかし、ＯＤＮの強力な生物学的作用を薬物に移すための重大な障害は、有効性及び安全性をもった薬物送達のレベルにあることが知られている。例えば、化学製剤、ウイルスベクター及び粒子送達を伴うＯＤＮ送達は、治療効果の達成以前に臨床安全性に関する問題によって阻止されてきた。さらに、ｓｉＲＮＡのようなＯＤＮのキャリヤーとしてアルブミンマイクロバブルを使用することは、アルブミンマイクロバブルに対するＯＤＮの結合の制限並びにアルブミン−ＯＤＮ複合体の安定性によって制限される。アルブミンが負のシェル表面電位を有するため、負に帯電した短い核酸はマイクロバブルに対して非常によく結合せず、これらの複合体を用いた遺伝子トランスフェクション効率は一般に最適とは言えない。
【０００５】
このように、マイクロバブルに対する治療剤の結合の改善並びにマイクロバブル複合体の安定性及び有効性の改善に対するニーズが存在している。
【０００６】
さらに、細胞毒性の高い薬物の選択的送達における毒性の低減に対するニーズも存在している。これらの薬物の非標的化送達は全身毒性を引き起こすことがあり、これらの薬物を一緒に又は良好な効果のために必要な高い用量で使用することを妨げてきた。多くの場合にこれらをプロドラッグとして送達する試みはこの問題を低減させたが、罹患組織中ほの取込み機構の大部分は正常組織でも示されるので、標的化組織中への選択的取込みを達成するのは必ずしも容易でない。したがって、本明細書中に開示されるような非天然機構によって選択的組織中へのこれらの薬物の取込みを増強することは、多大な価値を付加することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
国際公開第９７／３３４７４号パンフレット
【発明の概要】
【０００８】
本明細書中では、アルブミンシェルに対するリガンド−治療剤組成物の親和性を用いてマイクロバブルへの治療用薬物の結合を高めるための新規な組成物及び方法が提供される。
【０００９】
治療剤組成物を担持するマイクロバブルの全身循環は、超音波イメージングによって容易に可視化できる。治療部位に対して特異的な高エネルギーのパルス状超音波のトリガーを用いて、マイクロバブルから治療剤が放出される。マイクロバブルのキャビテーションは、隣接する細胞／組織のソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を引き起こす。
【００１０】
一実施形態では、天然及び変性アルブミンの混合物を含む外部シェル並びにペルフルオロカーボンガスを封入した中空コアを有するマイクロバブル、小分子化学療法剤、ペプチド、炭水化物及びオリゴヌクレオチドを含む群から選択される治療剤、並びに一端が治療剤に結合しかつ他端がリガンド上の反応性基の反応によってリガンドに結合した二官能性リンカーを含んでなるマイクロバブル複合体が開示される。リガンドは疎水性相互作用によってマイクロバブルの外部シェルに結合している。
【００１１】
別の実施形態では、上述のマイクロバブル複合体を組織標的に送達するための方法が開示される。本方法は、マイクロバブル複合体を用意する段階、組織標的の供給源である被験体にマイクロバブル複合体を投与する段階、並びに組織標的中においてマイクロバブル複合体のキャビテーションを引き起こすのに十分な超音波エネルギーを被験体に投与する段階を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。
【図１】図１は、アルブミンマイクロバブルに対するｓｉＲＮＡ−リガンドの非共有結合を表す図である。
【図２】図２は、コレステロールコンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（２ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ））と様々な量のＯｐｔｉｓｏｎ（ｉ、ii、iii及びivについてそれぞれ０、９、２２及び４６ピコモル）との混合物に関するゲルシフトアッセイの典型的な顕微鏡写真である。
【図３】図３は、様々な濃度のＯｐｔｉｓｏｎ又は天然ＨＳＡと混合したＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（４ピコモル）に関するゲルシフトアッセイの典型的な顕微鏡写真であり、これはゲルアッセイにおいていかなるシフトも示していない。
【図４】図４は、様々な濃度のＯｐｔｉｓｏｎ、天然ＨＳＡ又は変性ＨＳＡと混合したＣｙ３−コレステロール−ｓｉＲＮＡ（２ピコモル）に関するゲルアッセイの典型的な顕微鏡写真である。
【図５】図５は、Ｏｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡに対するコレステロール−ｓｉＲＮＡの結合性のグラフ表示である。（Ａ）ではコレステロール−ｓｉＲＮＡバンドの相対蛍光がゲルシフトアッセイから測定され、（Ｂ）ではｓｉＲＮＡの結合分率が相対蛍光から計算され、アルブミン濃度に対してプロットされている。
【図６】図６は、細胞のｃｙ３蛍光を測定することで定量化された、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ内のＵ−８７腫瘍細胞によるｓｉＲＮＡの取込みのグラフ表示である。
【図７】図７は、脂質トランスフェクション試薬（ＲＮＡｉｆｅｃｔ）とＯｐｔｉｓｏｎとの間におけるｓｉＲＮＡトランスフェクションの比較を示す蛍光画像の顕微鏡写真を含んでいる。
【図８】図８は、脂質トランスフェクション試薬（ＲＮＡｉｆｅｃｔ）とＯｐｔｉｓｏｎとの間におけるｓｉＲＮＡトランスフェクションの平均細胞蛍光値及び標準誤差のグラフ表示である。
【図９】図９は、アニソトロピー値から計算された、Ｏｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡに対するフルオレセインミリステートの結合分率のグラフ表示である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、フルオレセインミリステート（６３ピコモル）に関する、Ｏｐｔｉｓｏｎ（ｉ、ii、iii及びivについてそれぞれ０，８，４０及び２００ピコモル）に結合しかつゲル上に暗バンドとして可視化されたフルオレセインである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、フルオレセインステアレート（１８０ピコモル）に関する、Ｏｐｔｉｓｏｎ（ｉ、ii、iii及びivについてそれぞれ０，８，４０及び２００ピコモル）に結合しかつゲル上に暗バンドとして可視化されたフルオレセインである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本願の発明及び本発明の用途を限定する意図はない。さらに、先行する本発明の背景又は図面の説明中に示されたいかなる理論によっても限定する意図は存在しない。
【００１４】
本発明は、一般的には、インビトロ又はインビボの興味ある細胞又は組織への治療剤のマイクロバブル支援送達に関する。
【００１５】
若干の実施形態では、治療剤は小分子化学療法剤、ペプチド、炭水化物又はオリゴヌクレオチドからなり得ると共に、一端が治療剤に結合しかつ他端がリガンド上の反応性基の反応によってリガンドに結合した二官能性リンカーが含まれ、リガンドはマイクロバブルの外部シェルに結合している。若干の実施形態では、治療剤はオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）であり得る。オリゴヌクレオチドとは、長い核酸の結合開裂によって生成されるか、又は構成ブロックを用いて合成される核酸ポリマー、天然の又は化学的に修飾されたヌクレオシドの保護ホスホラミダイト、或いは（程度は低いものの）非ヌクレオシド化合物の保護ホスホラミダイトをいう。オリゴヌクレオチドの長さは、５０塩基対以下の短い核酸ポリマーから、２００塩基対を超える核酸ポリマーにまで変化し得る。本明細書中で使用されるＯＤＮはまた、２００を超える塩基対を有するポリヌクレオシドも意味する。また、選択された配列に対して相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖を意味するアンチセンスＯＤＮも含まれる。アンチセンスＲＮＡの場合には、アンチセンスＲＮＡは特定のメッセンジャーＲＮＡ鎖に結合することによってそれのタンパク質翻訳を妨げる。アンチセンスＤＮＡは、特定の相補的（コーディング又は非コーディング）ＲＮＡを標的化するために使用できる。また、通例は２０〜２５％ヌクレオチドの長さを有する１群の二本鎖ＲＮＡ分子である（時には短干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られる）小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も含まれる。これらは、特定の遺伝子の発現に干渉するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を含む生物学的作用において、抗ウイルス機構として、或いはゲノムのクロマチン構造の形成において様々な役割を演じる。
【００１６】
若干の実施形態では、治療剤は細胞毒素であり得る。本明細書中で使用される細胞毒素とは、細胞に対して毒性効果を有する物質をいう。例えば、細胞毒素は壊死を引き起こすことがあり、この場合には細胞が膜の健全性を失い、細胞溶解の結果として死ぬ。他の例では、細胞毒素は抗体依存性細胞媒介細胞毒性に関連することがあり、この場合には細胞が抗体でマークされ、特定のリンパ球による作用を受ける。
【００１７】
細胞毒性薬剤の例は、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎの“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１中に記載されている。これらは、タキソール、ナイトロジェンマスタード類（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード及びクロラムブシル）、エチレンイミン誘導体（例えば、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン及びストレプトゾシン）、トリアゼン類（例えば、ダカルバジン）、葉酸類似体（例えば、メトトレキセート）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル、シタラビン及びアザリビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン及びチオグアニン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン及びビンクリスチン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びマイトマイシン）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、白金配位錯体（例えば、シスプラチン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン）、ホルモン及びアンタゴニスト（例えば、アドレノコルチステロイド（プレドニゾン）、プロゲスチン類（ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロプロゲステロンアセテート及びメゲストロールアセテート）、エストロゲン類（ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール）、アンチエストロゲン類（タモキシフェン）及びアンドロゲン類（テストステロンプロピオネート及びフルオキシメステロン））を含んでいる。
【００１８】
細胞内タンパク質合成を妨げる薬物（タンパク質合成阻害剤）をリガンドにカップリングすることもできる。かかる薬物は当業者にとって公知であり、ピューロマイシン、シクロヘキシミド及びリボヌクレアーゼを含んでいる。
【００１９】
一実施形態では、治療剤がそれに対する阻害剤として作用するタンパク質には、特に限定されないが、酵素、可溶性血清タンパク質、細胞の表面で発現されるタンパク質、非免疫グロブリンタンパク質、細胞内タンパク質、及び水溶性であるか又は水溶性化し得るタンパク質のセグメントが個別に又はこれらの組合せとして含まれ、またかかるタンパク質の誘導体も含まれる。
【００２０】
特定の実施形態では、タンパク質には、特に限定されないが、システインプロテアーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ（ＥＨ）、チオラーゼ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ依存性オキシドレダクターゼ、エノイルｃｏＡヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ヒドロラーゼピルビン酸レダクターゼ、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、ホルミミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（ＦＴＣＤ）、アミノレブリン酸デヒドラーゼ（ＡＤＤ）、クレアチンキナーゼ、カルボキシルエステラーゼ（ＬＣＥ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）リパーゼ、メタロプロテアーゼ（ＭＰ）、ホスホターゼ（プロテインチロシンホスホターゼ、ＰＴＰ）、プロテオソーム、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ、別にＦＫＢＰ−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）としても知られる）、セリンヒドロラーゼ（スーパーファミリー）、ユビキチン結合タンパク質、−ガラクトシダーゼ、ヌクレオチド結合酵素、プロテインキナーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質、クチナーゼ、アデニロコハク酸シンターゼ、アデニロコハク酸リアーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、脂肪酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ＨＭＧコール酸レダクターゼ及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）が個別に又はこれらの組合せとして含まれる。また、かかるタンパク質のいずれかの誘導体も含まれる。
【００２１】
別の例では、タンパク質は補助因子を実質的に含まない。「補助因子を実質的に含まない」とは、溶液又は固体の状態において生理学的条件並びに室温及び室圧の下で自然に安定であるためにいかなる追加の補助因子、化学物質、化学的修飾又は物理的修飾も必要とせず、かつインビボでそれに対応するリガンドと結合し得るタンパク質をいう。
【００２２】
一実施形態では、アルブミンマイクロバブルを利用して治療剤を全身送達で運ぶことができる。次いで、組織標的化超音波音響エネルギーを用いてアルブミンマイクロバブルをキャビテートし、治療剤を細胞内環境中に送達する。例えば、細胞又は組織を標的化すべき被験体の静脈内又は腹腔内にマイクロバブル複合体を投与すればよい。マイクロバブル複合体が被験体内で運はれて標的化細胞に到達した後、超音波音響エネルギーが送達される。若干の実施形態では、超音波の送達前に標的化細胞の可視化を行い得る一方、さらに他の実施形態では、リアルタイムで可視化を実施し、キャビテーションをモニターすることができる。
【００２３】
若干の実施形態では、マイクロバブルりアルブミン外部シェルは、大部分はシステイン−システイン結合によって合体された天然及び変性アルブミンの両方からなっている。若干の実施形態では、アルブミンシェルの一次組成は主として天然形態であり、変性部分はシステイン結合の増加を可能にする。若干の実施形態では、天然アルブミンに対する変性アルブミンの相対量は約０．５〜３０ｗｔ％の範囲内にある。他の実施形態では、相対量は約１〜１５ｗｔ％の範囲内にある。天然及び変性アルブミンの混合物は、マイクロバブル表面上の反応性結合部位を増加させると共に、キャビテーションのために必要なシェル弾性のバランスを与える。マイクロバブルは、予熱アルブミン溶液の存在下でペルフルオロカーボンガスを超音波処理するか、或いは別法として高い剪断力を用いてガスと予熱アルブミンとを混合することによって形成できる。アルブミン分子の小部分は予熱アルブミン溶液の超音波処理中に転位し、アルブミン分子間でジスルフィド結合を介して架橋が起こる。これらのアルブミン分子は、より疎水性の残基が露出したＦ形のアルブミンと構造的に類似していると考えられる。このことは、疎水性相互作用のための結合部位の増加を可能にする。
【００２４】
若干の実施形態では、マイクロバブルには不溶性のペルフルオロカーボンガス（例えば、特に限定されないが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン又はこれらの組合せ）を満たすことができる。若干の実施形態では、マイクロバブルは直径が約１〜約５ミクロンであり、サイズは血流中での循環を可能にするように最適化される。
【００２５】
若干の実施形態では、治療剤−マイクロバブル複合体は、アルブミンに対して親和性を有するリガンドと結合し得る反応性基を有するリンカーで修飾された治療剤を含んでいる。それ故、治療剤はリガンドを介してアルブミンにカップリングすることができる。
【００２６】
リンカーは、第１の部分を介してリガンドを治療剤に結合する任意の連結部分を含んでいる。リンカーは１個の炭素のように短くてもよいし、或いは治療剤の薬物動態及び生体分布特性を調節するために製薬業界で通常使用されるポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ポリリシン又は他のポリマー化学種のような長いポリマー化学種であってもよい。様々な長さの他のリンカーには、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐから選択される１以上のヘテロ原子を含みかつハロゲン原子で任意に置換されたＣ１〜Ｃ２５０の長さのものがある。特定の実施形態では、リンカーは、天然又は合成モノマーから製造されたオリゴマー又はポリマー化学種、薬学的に許容されるオリゴマー又はポリマー組成物から選択されるオリゴマー又はポリマー部分、オリゴ−又はポリ−アミノ酸、ペプチド、糖、ヌクレオチド及び１〜２５０の炭素原子を有する有機部分の１以上を個別に又はこれらの組合せとして含んでいる。１〜２５０の炭素原子を有する有機部分は、１以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ又はＰ）を含みかつ１以上の位置においてハロゲン原子で置換されていてもよい。
【００２７】
第１の部分は、単に、リンカー上の反応性化学種が治療剤上の反応性基と反応することによって形成されたリンカーの延長部であり得る。反応性化学種及び反応性基の例には、特に限定されないが、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル）、ホスホラミダイト、イソシアネート、イソチオシアネート、アルデヒド、酸塩化物、塩化スルホニル、マレイミド、アルキルハライド、アミン、ホスフィン、ホスフェート、アルコール及びチオールがあるが、
反応性化学種及び反応性基は反応を受けて共有結合したコンジュゲートを生じるように整合していることを条件とする。
【００２８】
若干の実施形態では、反応性基は第一アミン官能基であり、したがってアミン修飾治療剤はリガンドのカルボキシル部分の反応によって親和性リガンドにコンジュゲートし得る。若干の他の実施形態では、反応性基はリン酸基を介してリガンドに結合したアルコールであり得る。
【００２９】
リガンド（本明細書中では親和性リガンドともいう）には、脂肪酸、ステロイド、小さい芳香族化合物及びこれらの組合せがある。アルブミン結合分子の例は、２０１０年６月８日付けの米国特許出願公開第２０１０／０１７２８４４号中に見出すことができる。
【００３０】
例えば、若干の実施形態では、親和性リガンドは、特に限定されないが、ミリストイル、リトコリックオレイル、ドコサニル、ラウロイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル又はリノレオイルを含む脂肪酸である。他の実施形態では、親和性リガンドは、コレステロール、コール酸、リトコール酸又はケノデオキシコール酸を含むステロイド又は修飾ステロイドのような親油性分子である。他の実施形態では、親和性リガンドは、４−ｐ−ヨードフェニル酪酸及びその類似体又は誘導体から選択される高親和性分子である。さらに他の実施形態では、治療剤はｓｉＲＮＡを含み、リンカーはテトラエチレングリコールを含み、リガンドはコレステロールを含んでいる。
【００３１】
若干の実施形態では、治療剤−アルブミン複合体は、リガンド修飾治療剤をペルフルオロカーボンの存在下でアルブミン又は脂質と共に超音波処理するか、或いは予め形成されたバブルをリガンド修飾治療剤と混合することで製造できる。若干の実施形態では、これらの分子は治療剤合成中に興味ある治療剤に結合できる。例えば、コレステロールのホスホラミダイトを用いて核酸合成装置上でのＤＮＡ又はＲＮＡ合成中にコレステロールを組込みことができ、或いは合成後に反応部分を組込みことができる。
【００３２】
若干の実施形態では、治療剤は修飾ＯＤＮであり、これはリガンド自体で修飾され又は合成後にリガンドで修飾するための反応性官能基で修飾された修飾ヌクレオシドトリホスフェートを用いて酵素的に製造することができる。リガンドの結合は、ＯＤＮの用途に応じ、一方又は両方の末端、核酸配列の内部、或いは複数の位置にあってよい。ｓｉＲＮＡがＯＤＮである若干の実施形態では、結合は３’−ＯＨ位置を介したものであってよい。
【００３３】
若干の実施形態では、リガンドに加えて、治療剤（治療剤がＯＤＮである場合を含む）をヌクレアーゼから保護するため選択的に修飾することができる。若干の実施形態では、安定化修飾はホスホロチオエート修飾又は２’−ＯＭｅ修飾を含み得る。
【００３４】
若干の実施形態では、マイクロバブル複合体は興味ある細胞又は組織と共にインキュベートするか、或いは体内に（好ましくは静脈内に）注射し、次いで所望の部位及び所定の時点又はライブイメージング中において超音波エネルギーでキャビテートすることができる。
【００３５】
若干の実施形態では、マイクロバブル複合体は通常の超音波診断イメージングの下で血液循環中の全身移動時に観察することができる。バブルが組織標的（この場合には腫瘍）に到達した場合、一連のパルス状音響エネルギー波が腫瘍に送られる。これがマイクロバブル上に慣性キャビテーションを海だし、マイクロバブルを破裂させる。マイクロバブルのキャビテーションは、音響エネルギーが最大限に位置する場所で起こる。この方向は、機械的指標力、最適の超音波音響距離及び超音波音響掃引の寸法に関するパラメーターに
より、超音波プローブ上で達成される。その場合、発生する力は細胞質膜中に微小孔を形成する可能性がある。通例、パルス状エネルギーは約０．５〜約５ＭＨｚの周波数で投与される。
【００３６】
これらの微小孔は、慣性キャビテーション下で生み出されるマイクロ噴流力と共に、細胞質環境中へのＯＤＮの侵入を容易にし得る。例えば、ＯＤＮがｓｉＲＮＡである場合、細胞内環境中のｓｉＲＮＡはホスト機構を利用してｍＲＮＡを沈黙させ、後にはタンパク質合成を沈黙させる。同様に、ｍＲＮＡメッセージが血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む血管形成促進タンパク質として作用する場合、腫瘍におけるＶＥＧＦ発現の低減は腫瘍増殖を停止又は減速させ得る。マイクロバブルのキャビテーション後、マイクロバブル中心の高濃度ガスは体外に放出され、アルブミンシェルは代謝され、肝臓排出経路を通して排泄される。
【００３７】
例示的な実施形態では、マイクロバブル複合体のボーラスを以前の治療学的研究からの最適比に混合することができる。複合体の混合物を確立した後、ボーラス薬剤は静脈経路によって全身に注射される。
【００３８】
例えば、ｓｉＲＮＡ−マイクロバブルボーラスの場合、ボーラスは第１パスの血液動態においてモニターすることができる。マイクロバブル共鳴及びそれによって増強された超音波コントラストは、低い診断レベルの音響エネルギーを用いる超音波プローブによってモニターし得る。循環中、ボーラスは臓器標的に到達する。心臓血管組織灌流は、小さい内腔直径を有する深部微小血管へのボーラスの送達を助けることができる。パルス状の音響エネルギーを供給することにより、マイクロバブルが慣性キャビテーションを受けるのに十分なエネルギーを与えることができる。マイクロバブルのキャビテーションが完了すれば、細胞質膜を通してｓｉＲＮＡ内容物を罹患細胞中に送達することができる。細胞内の細胞質環境中に存在する場合、ｓｉＲＮＡは治療効果を有することができる。
【００３９】
マイクロバブルのキャビテーション中、細胞中へのｓｉＲＮＡ侵入は様々な機構によって起こり得る。例えば、破裂するマイクロバブルからのマイクロ噴流力がｓｉＲＮＡを細胞質中に押し込むことによってｓｉＲＮＡが細胞に侵入し得る。別法として、かかる機構には、マイクロ噴流エネルギー又はソノルミネセンスエネルギーが細胞質膜中に一時的な微小孔を生み出して細胞中へのｓｉＲＮＡの受動拡散を可能性にすること、或いは実際のキャビテーション前のマイクロバブル共鳴中に細胞質膜へのマイクロバブルバンピングがｓｉＲＮＡを細胞中に押し込むことが含まれ得る。
【００４０】
それ故、マイクロバブル送達の機構は、癌、炎症性疾患、感染性疾患、心臓血管疾患、代謝性疾患、自己免疫疾患及び中枢神経系疾患を含み得る多種多様の疾患の治療における潜在的な用途を有している。これらの疾患の多くは、通常の小分子薬物及びモノクローナル抗体にアクセスできない標的化分子機構のため、現在では効果的に治療できない。
【００４１】
実験の部
【実施例】
【００４２】
実施例１ マイクロバブル−ｓｉＲＮＡ複合体
図１は、アルブミンでカプセル化されたマイクロバブルに対するｓｉＲＮＡの結合によるマイクロバブル−ｓｉＲＮＡ複合体の形成を表す図である。
【００４３】
ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）サイレンシング用の標的ｓｉＲＮＡをＩＤＴＤＮＡ技術によって合成した。ＩＤＴＤＮＡは、ｓｉＲＮＡ上のコレステリルＴＥＧ（Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ）のような脂質修飾並びに色素コンジュゲーションをもたらした。
【００４４】
センス鎖：５’−Ｃｙ３／ＧＣＡＵＵＵＧＵＵＵＧＵＣＣＡＡＧＡＵｍＵｍＵ／３’−脂質（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’／ｍＡｍＡｒＡ ｒＵｒＣｒＵ ｒＵｒＧｒＧ ｒＡｒＣｒＡ ｒＡｒＡｒＣ ｒＡｒＡｒＡ ｒＵｒＧｒＣ／３’（配列番号２）
ｓｉＲＮＡ上のシアニン色素Ｃｙ３は、５５０ｎｍの励起波長及び５８０ｎｍのピーク発光を有している。ｓｉＲＮＡは、結合アッセイ及び他の特性決定技法中におけるｓｉＲＮＡの容易な可視化のためにｃｙ３色素で標識されてきた。Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、チャルフォントセントジャイルズ、英国、１０ｍｇ／ｍｌアルブミン）を遠心し、上層を廃棄し、下部の過剰アルブミン溶液を結合試験のために使用した。凍結乾燥ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）粉末（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、米国ミズーリ州）を１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬの原液を作製した。Ｏｐｔｉｓｏｎ及び天然アルブミン溶液の両希釈液を１×ＰＢＳで調製した。変性ＨＳＡは、天然ＨＳＡ溶液を８０℃で２０分間加熱することで調製した。
【００４５】
結合反応：
ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ及びｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−コレステロールの原液（２０μＭ）を無ＲＮＡｓｅ水で調製し、−２０℃で貯蔵した。４ピコモルのｃｙ３−ｓｉＲＮＡ溶液及び２ピコモルのコレステロール−ｓｉＲＮＡ溶液を、０〜５０ピコモルの範囲内の様々な量のＯｐｔｉｓｏｎ溶液、天然ＨＳＡ溶液及び変性ＨＳＡ溶液と混合した。反応緩衝液は１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４であった。反応混合物を暗所において２５℃で４５分間インキュベーはした。インキュベーション後、１０μＬのｓｉＲＮＡ混合物を２μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）高密度ＴＢＥ試料緩衝液（５×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）と混合した。
【００４６】
ゲル電気泳動：
全ての反応物をプレキャスト６％非変性ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）上にロードした。ゲルを０．５×Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）中において１００Ｖで４５分間泳動した。タイフーンスキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）９４１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、ＤＮＡ、タンパク質又はその両方を含むゲルをｃｙ３蛍光に関してイメージングした。
【００４７】
結果：
ｓｉＲＮＡに結合したＣｙ３の蛍光は、ゲル上に明瞭なｓｉＲＮＡバンドとして可視化できる。ｓｉＲＮＡ及びアルブミン溶液の混合物をゲル上で泳動した場合、アルブミンに結合いたｓｉＲＮＡの移動度は遊離のｓｉＲＮＡより低く、ゲル上に２つのバンドを生じる。予備試験において、ＥＭＳＡキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、米国オレゴン州）によるシプロルビー染色を用いてゲル中のアルブミンバンドを観察した。一例を図２に示すが、これはコレステロールコンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（２ピコモル）と様々な量のＯｐｔｉｓｏｎ（ｉ、ii、iii及びivについてそれぞれ０、９、２２及び４６ピコモル）との混合物に関するゲルシフトアッセイである。ゲルの蛍光イメージングは、ｓｉＲＮＡ（下方のバンドセクション）及びアルブミン（上方のバンドセクション）に関してはっきりと異なるバンドを示している。
【００４８】
Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ
ｃｙ３−ｓｉＲＮＡと天然ＨＳＡ／Ｏｐｔｉｓｏｎとの混合物をゲル上で泳動した場合、アルブミン濃度が増加しても結合ｓｉＲＮＡは可視化されなかった。ｃｙ３−ｓｉＲＮＡと天然ＨＳＡ又はＯｐｔｉｓｏｎ溶液との顕著な結合は存在しなかった。これは、様々な濃度のＯｐｔｉｓｏｎ又は天然ＨＳＡと混合したＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（４ピコモル）に関するゲルの蛍光画像である図３に示されていて、ゲルアッセイにおいていかなるシフトも示していない。ゲル上の暗バンドはｓｉＲＮＡ上のｃｙ３蛍光である。Ｏｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡのいずれに対しても、ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの顕著な結合は存在しない。
【００４９】
Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ
図４は、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡとＯｐｔｉｓｏｎ、天然ＨＳＡ及び変性ＨＳＡとの結合に関するゲル画像を示している。Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡは天然ＨＳＡ及びＯｐｔｉｓｏｎ溶液の両方に結合した一方、同じ量の変性ＨＳＡに関しては結合が顕著に減少した。各レーンにおけるｓｉＲＮＡの蛍光強度を、バンドの周囲にボックスを描くことにより、手作業で推定した。ゲルの平均強度値と同等の背景を、各ｓｉＲＮＡバンドの強度値から差し引いた。広範囲のアルブミン濃度にわたる結合ｓｉＲＮＡの蛍光強度を計算した。相対蛍光（Ｒ）を次式に従って計算した。
【００５０】
Ｒ＝（Ｆbound−Ｆfree）／Ｆfree      （１）
Ｆboundは結合ｓｉＲＮＡバンドの蛍光強度であり、Ｆfreeは遊離ｓｉＲＮＡバンドの蛍光強度である。相対蛍光をアルブミン濃度に対してプロットした。これは、下記に記載するようなＯｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡに対するコレステロール−ｓｉＲＮＡの結合性のグラフ比較である図５に示されている。
【００５１】
０〜１５μＭの範囲内の低いアルブミン濃度では、アルブミン濃度に対する結合蛍光の直線的依存性が可視化された。図５のグラフＡは、この濃度範囲では、Ｏｐｔｉｓｏｎ溶液に結合したｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの量が天然ＨＳＡに対する結合より高いことを示している。結合定数を推定するため、より高いアルブミン濃度を用いてアルブミンに結合したｓｉＲＮＡの量の飽和を可能にした。結合分率（ｘ）を次式に従って求める。
【００５２】
ｘ＝（Ｆbound−Ｆfree）／（Ｆsat−Ｆfree）    （２）
Ｆsatは飽和条件下での最大結合ｓｉＲＮＡの蛍光強度である。
【００５３】
図５のグラフＢに示すように、結合分率を増加するアルブミン濃度に対してプロットし、データ点を次の平衡式に当てはめた。
【００５４】
ｘ＝ｎ＊［アルブミン］／（ｋｄ＋［アルブミン］） （３）
ｋｄは解離定数であり、ｎは結合部位の数であり、［アルブミン］はそれぞれの試料に関する総アルブミン濃度である。非線形当てはめを用いて式３を解くことで、Ｏｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡの両方に対するｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの結合に関してｋｄ及びｎを求めた（表１）。この非線形当てはめのためにはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの解決ツールを使用し、二乗誤差の和（ＳＳＥ）はＯｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡに関してそれぞれ０．０７及び０．０６であることが判明した。ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの結合定数はＯｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡの両方に関して同様であった。
【００５５】
実施例２ 腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ送達
細胞培養：
ＭＡＴＢIIIラット乳癌細胞及びＵ−８７ヒト神経膠芽腫細胞を、それぞれＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（修正）（１×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）及びＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）（ＡＴＣＣ、マナサス、米国バージニア州）中で培養した。いずれの培地溶液にも、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、スプリングフィールド、米国ニュージヤージー州）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｏｒｉｃｈ社、セントルイス、米国ミズーリ州）を補充した。細胞は５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中で３７℃に維持した。
【００５６】
基体付着細胞の超音波処理：
ＭＡＴＢ−III及びＵ−８７細胞を１０ｍＬ容量のＯｐｔｉｃｅｌｌユニット（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ロチェスター、米国ニュージャージー州）内で９０％コンフルエンスまで増殖させた。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ内の培地を、１０ピコモルのｃｙ３−ｓｉＲＮＡ又はコレステロール−ｓｉＲＮＡを含む１０ｍＬの新鮮培地と交換した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌをインキュベーター内に３７℃で２４時間放置した。別途、Ｏｐｔｉｓｏｎマイクロバブル（３００μＬ）又は脂質トランスフェクション試薬（９０μＬ）（ＲＮＡｉｆｅｃｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、米国カリフォルニア州）と混合したｓｉＲＮＡ溶液で細胞を処理した。ｓｉＲＮＡ／Ｏｐｔｉｓｏｎ混合物に関しては、心臓セクタープローブ（３Ｓ）を有するＶｉｖｉｄ ｉイメージャーを用いてマイクロバブル区を破裂させ、マイクロバブルからｓｉＲＮＡ薬物を送達した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌを水浴中に固定化し、超音波プローブをＯｐｔｉｃｅｌｌの全長にわたる運動アームに取り付けた。プローブの先端を水中に浸し、Ｏｐｔｉｃｅｌｌの全幅の超音波処理を可能にするゆうにプローブとＯｐｔｉｃｅｌｌ表面との距離を３ｃｍにした。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ内のマイクロバブルを機械的指数（ＭＩ）＞１．３の連続超音波処理によって処理した。プローブはＯｐｔｉｃｅｌｌの全長にわたって１ｍ／秒の速度で移動した。超音波処理後、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。同様に、ＲＮＡｉｆｅｃｔで処理した細胞もインキュベーター内に２４時間保った。インキュベーション後、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ．Ｚ１、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて細胞をイメージングした。ｃｙ３に関して使用したフィルターは、ＤｓＲｅｄ／Ｃｙ３（５４０ ｅｘ／６２０ ｅｍ）であった。蛍光イメージャーの対象領域（ＲＯＩ）内において、細胞蛍光を測定し、細胞蛍光の平均値を計算した。Ｉｍｓｇｅ Ｊを用いて画像を処理し、蛍光強度を計算した。
【００５７】
データは、Ｎ＝４に関する平均＋１．０標準誤差（ＳＥ）として報告されている。群間の差の統計的有意性は２試料ｔ検定を用いて評価し、統計分析はＭｉｎｉｔａｂ（登録商標）１２（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ、ステートカレッジ、米国ペンシルベニア州）を用いて実施した。
【００５８】
結果：
ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ又はｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡと共にインキュベートしたＵ−８７細胞に関し、送達系の効果を図６に示す。腫瘍細胞中へのｓｉＲＮＡの送達は、平均細胞ｃｙ３蛍光によって表される。各群に関し、平均蛍光値及び標準誤差が報告されている。細胞の超音波処理は、細胞中へのｃｙ３−ｓｉＲＮＡ侵入を実質的に増強した。ソノポレーションの効果により、Ｏｐｔｉｓｏｎ／超音波で処理した細胞に関する均細胞蛍光は、未処理細胞より３９％高かった。コレステロール−ｓｉＲＮＡに関しては、Ｏｐｔｉｓｏｎ／超音波で処理した後の平均細胞蛍光は５３％増加した。群間の差の有意差は２試料ｔ検定を用いて評価した（ｃｙ３−ｓｉＲＮＡについてｐ＝０．０３２及びコレステロール−ｓｉＲＮＡについてｐ＝０．０５９）。
【００５９】
同様に、ＭＡＴＢIII細胞に関し、Ｏｐｔｉｓｏｎ／超音波処理の効果を市販の脂質トランスフェクション試薬と比較した。ＲＮＡｉｆｅｃｔ又はＯｐｔｉｓｏｎ／超音波送達剤と組み合わせたＣｙ３−ｓｉＲＮＡ又はコレステロール−ｓｉＲＮＡで細胞を処理し、結果を図７及び図８に示す。図７は、処理後の細胞の代表的画像を示している。図８は、全ての群に関する平均細胞蛍光を、誤差バーで表した標準誤差と共に報告している。ｃｙ３−ｓｉＲＮＡに関しては、平均細胞蛍光はＯｐｔｉｓｏｎ／超音波処理の場合より高かった（２試料ｔ検定、ｐ＝０．００７）。これは主としてマイクロバブルの存在下における細胞のソノポレーションに原因している。細胞中へのｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉｆｅｃｔ及びＯｐｔｉｓｏｎ／超音波送達の間には有意差が存在しなかった。平均細胞蛍光は同様であったものの、脂質トランスフェクション試薬は、図７における細胞の不規則形状によって証明されるように、瘍細胞にとって有毒であることが判明した。非修飾ｓｉＲＮＡ及びコレステロール−ｓｉＲＮＡの両方において同じ量のトランスフェクション試薬及びｓｉＲＮＡかせ使用されたことに注意すべきである。トランスフェクション試薬はいずれの場合にも有毒であったが、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡに関してより高かった。
【００６０】
実施例３ フルオレセイン−脂肪酸コンジュゲートを用いて評価した、マイクロバブルに対する治療剤−脂肪酸コンジュゲートの予備的結合試験
コンジュゲーション方法：
脂肪酸ＮＨＳエステル（２当量、５．３７ｍｇミリスチン酸ＮＨＳエステル又は５．３８ｍｇステアリン酸ＮＨＳエステル）をＤＭＳＯ及びジクロロメタンの５０：５０混合物（１００μｌ）中に取り、フルオレセインカダベリンの溶液（ＦＬ−カダベリン、５ｍｇ、１当量、５０μｌのＤＭＳＯに溶解）と混合した。これにジイソプロピルエチルアミン（３．８当量）を添加し、混合物を渦動させて透明な溶液を得た。試料を室温で暗所に保った。４．５時間後、ＨＰＬＣによって反応をチェックしたところ、完了していることが判明した。予想通り、両コンジュゲートに関して保持時間の大きなシフトが認められた（保持時間：ＦＬ−カダベリン４．７分、ＦＬ−カダベリンステアレート１２．１分及びＦＬ−カダベリンミリステート９．９分、カラム：Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ １８，４．６×５０ｍｍカラム、粒子サイズ：５μｍ、勾配方法：１５分で０〜１００％Ｂ及び５分間１００％Ｂ、溶媒：Ａ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０及びＢ １００％アセトニトリル、流量：１ｍｌ／分）。粗生成物をＤＭＳＯで約２ｍｌに希釈し、Ｘｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８，１９×１００ｍｍカラム、１８．７カラム容積で０〜１００％Ｂの勾配、及び１０ｍｌ／分の流量を用いてＡＫＴＡ精製装置上で精製した。溶媒Ａ及びＢは、分析方法に関して上記に記載した通りである。生成物を複数の画分中に集め、各画分を分析ＨＰＬＣによって分析した。各々の場合において最も純粋な画分（純度約９０％）のみを結合試験のために使用した（出発原料自体は純度約８６％であり、恐らくは同じスペクトル特性を有する位置異性体が残留していた）。この画分を室温で濃縮乾固した。残留物を水（約２ｍｌ）中に懸濁し、ジクロロメタン（３×２ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮乾固した。
【００６１】
蛍光分極アッセイ：
１×ＰＢＳ中でフルオレセインミリステートの原液を調製した。フルオレセイン分極アッセイのためには、フルオレセインの濃度を低く保った（１２６ｎＭ）。０〜１５μＭアルブミン濃度範囲内にある様々な濃度のＯｐｔｉｓｏｎ又はＨＳＡ溶液をフルオレセインミリステート溶液に添加した。反応緩衝液は１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４であった。反応混合物を暗所において２５℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール、米国カリフォルニア州）を用いてフルオレセインの未処理アニソトロピー値の変化を測定した。
【００６２】
試料はＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルプレート（透明な底部を有する黒色プレート）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、米国ミズーリ州）中で測定した。フルオレセインを４７０ｎｍで励起し、発光を５４０ｎｍで発光を測定した。前回と同じ式（式２）を用いて結合分率（ｘ）を計算したが、蛍光値の代わりにアニソトロピー値を使用した。次いで、図９に示すように、計算した結合分率をアルブミン濃度に対してプロットした。データは、Ｎ＝３に関する平均＋１．０標準誤差（ＳＥ）として報告されている。式３を用いて、Ｏｐｔｉｓｏｎ及び天然ＨＳＡの両方に対するフルオレセインミリステートの結合に関してｋｄ及びｎを求めた（表２）。これは図１０にも表されていて、そこにはフルオレセインミリステート（図１０Ａ）（６３ピコモル）及びフルオレセインステアレート（図１０Ｂ）（１８０ピコモル）に関してＯｐｔｉｓｏｎ（ｉ、ii、iii及びivについてそれぞれ０，８，４０及び２００ピコモル）に結合したフルオレセインがゲル上に暗バンドとして可視化されている。
【００６３】
ミリステートコンジュゲーションを有しないフルオレセインをアルブミンに対する結合性に関して試験した場合、アニソトロピーの有意な変化は認められなかった。脂肪酸がコレステロールより強い結合性を有することは公知であり、ここでもフルオレセインミリステートコンジュゲートに関してより低い解離定数（ｋｄ）が観察されることによって確認される（表１及び表２）。
【００６４】
【表１】
2014526493.tif 000002
【００６５】
【表２】
2014526493.tif 000003
【００６６】
したがって、治療用化合物に対するミリスチン酸のような脂肪酸のコンジュゲーションは、アルブミンシェルマイクロバブルへのかかる治療用化合物の結合を増加させることができる。Ｏｐｔｉｓｏｎに対するフルオレセインミリステート結合の解離定数は、天然ＨＳＡに対する結合の解離定数より低かった。これは、天然及び部分変性アルブミンの両方を有するマイクロバブルシェルの疎水的結合性がより良好であることを示唆している。
【００６７】
実施例４  インビボでのｓｉＲＮＡの安定性
ｓｉＲＮＡのような治療用化合物の安定性は、体内に注射した際には非常に低い。アルブミンマイクロバブルと天然ｓｉＲＮＡ（コンジュゲートなし）との混合物の皮下注射及び尾静脈注射を比較して調べた。
【００６８】
１１〜１４週齢（体重約３０ｇ）のｎｕ／ｎｕマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、米国マサチューセッツ州）から入手した。動物は、米国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって採用されている実験動物のケア及び使用のためのガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って飼育した。Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞（ＬＬＣ）を麻酔したマウスの右脇腹に皮下接種した（３．５×１０6細胞／１００μｌ／マウス）。
【００６９】
接種から４日後、マウスを抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、セントルイス、米国ミズーリ州）−マイクロバブル混合物で処理した。皮下注射のためには１．０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ投与量を使用し、尾静脈注射のためには２．０ｍｇ／ｋｇの投与量を使用した。注射混合物は、１００μＬのマイクロバブル溶液及び１００μＬの無ＲＮＡｓｅ水中ｓｉＲＮＡを含んでいた。注射後、心臓セクタープローブ（３Ｓ）を有するＶｉｖｉｄ ｉイメージャーを用いて腫瘍を超音波処理した。エネルギーは、１．３のピークＭＩを有するパルス形態で送達された。対照群はいかなる処理も受けなかった。
【００７０】
処理日から２４時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。腫瘍を直ちに凍結し、−２０℃で貯蔵した。ＶＥＧＦ測定の日、腫瘍を室温で解凍した。次いで、溶解マトリックス管（Ｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｔｕｂｅ Ａ、ＲＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を用いて、腫瘍をＲＩＰＡ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤添加）中で溶解した。次いで、試料から集めた溶解物を希釈し、タンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ試薬タンパク質アッセイキット）を用いて総タンパク質を測定し、ＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｕｓｅ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社、ノークロス、米国ジョージア州）を用いてＶＥＧＦを測定した。
【００７１】
結果は、対照群及び異なる処理群に関し、平均ｐｇ ＶＥＧＦ／ｍｇタンパク質として表３に報告されている。１．０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−マイクロバブル混合物の皮下注射は、対照群と比較して約３９％のＶＥＧＦ減少をもたらした（２試料ｔ検定、ｐ＝０．００９６）。対照群とｓｉＲＮＡ−マイクロバブル混合物の２．０ｍｇ／ｋｇ尾静脈注射との間には小さな差しか存在しなかったが、これはマイクロバブルに対する非修飾ｓｉＲＮＡの結合が欠如又は低効率であるためかもしれない。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
本発明は、その技術思想又は本質的特徴から逸脱することなく他の形態で実施することができる。したがって、上記の実施形態はあらゆる点で、本明細書中に記載した発明に関して限定的ではなく例示的なものと見なすべきである。かくして、本発明の技術的範囲は上記の説明ではなく添付特許請求の範囲によって示されており、したがって特許請求の範囲の意味及び同等性範囲に含まれる全ての変更はその中に包含されるものとする。
【図１】
2014526493.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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