(57)【要約】細胞、例えば、遺伝子改変されていない親微生物細胞と比較して、より高い収率および／または増加した持続性で１または複数の化合物を産生するように遺伝子改変された微生物細胞中の、かかる化合物の産生を検出するのに有用な方法および組成物が本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、溶液を、組換え産生された化合物に直接結合する蛍光色素と接触させるステップであって、この溶液は、この化合物を組換え産生する複数の細胞を含む、ステップ、および組換え産生された化合物に結合した蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件下で蛍光色素を検出するステップを含む。
2014519028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中で、複数の細胞から組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）を検出する方法であって、
（ａ）溶液を、前記ＷＩＣに直接結合する蛍光色素と接触させるステップであって、前記溶液は、前記ＷＩＣを組換え産生する複数の細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）前記組換え産生されたＷＩＣに結合した前記蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件下で前記蛍光色素を検出するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＷＩＣが、前記ＷＩＣを組換え産生する前記細胞から分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光色素がＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３またはＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の細胞を含む前記溶液が、マルチウェル細胞培養プレートのウェル中に含まれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記検出するステップの前に少なくとも１２時間の期間にわたり培養される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞バイオマスが、前記複数の細胞の自己蛍光を検出するステップを含む方法によって決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の細胞の前記自己蛍光を検出するステップが、前記ＷＩＣに結合した前記蛍光色素からの蛍光を検出しないスペクトル条件下で前記自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）を検出するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己蛍光が、３３０〜３５０ｎｍの励起波長および４７０〜５１０ｎｍの発光波長で検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄであり、ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップが、緑色対赤色蛍光の比を決定するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記スペクトル条件が、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、請求項１に記載の細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第１の複数由来の細胞集団と、前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘの細胞集団と細胞密度５ｘの細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
によって選択される励起波長において前記蛍光色素を検出するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）の前記励起スペクトルについての前記発光波長が、５５０ｎｍに固定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記スペクトル条件が、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、請求項１に記載の細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第１の複数由来の細胞集団と、前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
によって選択される発光波長において前記蛍光色素を検出するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）の前記発光スペクトルについての前記励起波長が、２９０ｎｍに固定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の複数の前記細胞集団が、少なくとも２ｇ／ＬのＷＩＣを含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換え産生された水不混和性化合物がイソプレノイドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組換え産生された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換え産生された水不混和性化合物がファルネセンである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む組換え酵母細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードする核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記１または複数の異種ヌクレオチド配列が、前記メバロン酸経路の１つより多い酵素をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、ＩＰＰまたはポリプレニルを改変してイソプレノイド化合物を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ヌートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
溶液中で、細胞から産生され分泌されたファルネセンを検出する方法であって、
（ａ）溶液をＮｉｌｅ  Ｒｅｄと接触させるステップであって、前記溶液は、ファルネセンを組換え産生し分泌する細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）約２６０〜２９０ｎｍの励起波長および約５３０〜５７０ｎｍの発光波長においてＮｉｌｅ  Ｒｅｄを検出するステップ、
を含む、方法。
【請求項３１】
前記複数の細胞を含む前記溶液が、マルチウェル細胞培養プレートのウェル中に含まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記マルチウェル細胞培養プレートがＴｅｆｌｏｎで被覆される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、前記検出するステップの前に少なくとも１２時間の期間にわたり培養される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出するステップの前に、前記マルチウェル細胞培養プレートを振盪するステップをさらに含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が酵母細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）水不混和性化合物を組換え産生し分泌する細胞；
（ｂ）前記細胞から分泌された水不混和性化合物；
（ｃ）前記分泌された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素；および
（ｄ）細胞培養培地
を含む、液体組成物。
【請求項３９】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記細胞が酵母細胞である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組換え産生された水不混和性化合物がイソプレノイドである、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記蛍光色素がＮｉｌｅ  Ｒｅｄである、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記蛍光色素がＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３またはＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５である、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組換え産生された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記組換え産生された水不混和性化合物がファルネセンである、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む組換え酵母細胞である、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードする核酸を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
前記組換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５１】
前記１または複数の異種ヌクレオチド配列が、前記メバロン酸経路の１つより多い酵素をコードする、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５２】
前記細胞が、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５３】
前記細胞が、ＩＰＰまたはポリプレニルを改変してイソプレノイド化合物を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ヌートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
細胞から組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）に直接結合した蛍光色素の選択的検出のためのスペクトル条件を決定する方法であって、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）前記第１の複数由来の細胞集団と、同じ細胞密度を有する前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
を含む、方法。
【請求項５８】
ステップ（ｂ）の前記励起スペクトルについての前記発光波長が、５５０ｎｍに固定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
細胞から組換え産生された水不混和性化合物に直接結合した蛍光色素の選択的検出のためのスペクトル条件を決定する方法であって、
（ａ）前記蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、前記第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第１の複数の前記細胞集団の各々がＷＩＣを含み、前記第２の複数の前記細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）前記第１の複数および前記第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）前記第１の複数由来の細胞集団と、同じ細胞密度を有する前記第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）前記第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
を含む、方法。
【請求項６０】
ステップ（ｂ）の前記発光スペクトルについての前記励起波長が、２９０ｎｍに固定される、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年５月１３日に出願され、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＷＡＴＥＲ−ＩＭＭＩＳＣＩＢＬＥ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ」と題された米国仮特許出願第６１／４８６，２１１号への優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本明細書中で提供される方法および組成物は一般に、微生物の産業的使用に関する。特に、細胞、例えば、遺伝子改変されていない親微生物細胞と比較して、より高い収率および／または増加した持続性で１または複数の産業的に有用な化合物を産生するように遺伝子改変された微生物細胞中の、かかる化合物の産生を検出するのに有用な方法および組成物が本明細書中で提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
商業的に有用な化合物の産生のための微生物の利用は、産業的バイオテクノロジーの出現につながっている。市販の産生株は、代謝操作、即ち、宿主細胞における代謝フラックスの指向性の改変を介して誘導され得る。代謝操作の特定の目的は、他のフラックスを生存および産生力に最適なものにしつつ、有用な化合物の細胞内濃度または分泌を増加させることである。高い収率（基質１グラム当たりの化合物のグラム数）、高い産生（１リットル当たりのグラム数）および／または高い産生力（１時間当たり１リットル当たりのグラム数）が可能な組換え株が特に望ましい。株を操作して所望の表現型にすることは、数ラウンドの代謝フラックスの操作、分析およびモデル化が関与する反復性のプロセスとしてしばしば実施される。しかし、代謝操作の全ての方法が、共通の制限、即ち、改善された形質に適したスクリーニング方法への依存を共有している。
【０００４】
改善された性能を有する株についてのスクリーニング方法は、理想的には以下である：（１）１つの改変された集団から次の改変された集団への、性能における漸進的な改善を識別するのに充分に高感度である；（２）細胞内に含まれるか周囲の培地中に分泌されるかによらず、組換え産生された異種産物から内因性分子を識別するのに充分に特異的である；（３）改変株の多数のライブラリーを一度にスクリーニングするのに充分にロバストである；および（４）宿主に対する産物の代謝的影響に関する情報を与える。後者に関しては、宿主における異種遺伝子の取り込みおよび発現が、代謝不均衡および／または毒性代謝物の蓄積を引き起こす場合に当てはまり得る。かかるシナリオでは、産生が宿主の生存の低下という代償を支払うか否かを知ることが有用である。さらに、１つの産生集団から次の産生集団への広範に多様なバイオマスの可能性を考慮すると、細胞バイオマスからの影響もインプットもなしに組換え産物を特異的に検出する能力は、所与の株の収率、産生および／または産生力のより正確な描写を提供し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ロボットマイクロタイタープレートアッセイまたは蛍光関連セルソーティングなどのハイスループットのスクリーニング方法が、以前より記載されている。しかし、代謝操作のための新規適用の開発では、より高感度で産物特異的なロバストなアッセイ、特に、所望の化合物の産生と宿主細胞生存との間の適合性のいくつかの指標を提供するアッセイが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
細胞、例えば、遺伝子改変されていない親微生物細胞と比較して、より高い収率および／または増加した持続性で１または複数の水不混和性化合物（ＷＩＣ）を産生するように遺伝子改変された微生物細胞中の、組換え産生された水不混和性化合物を検出するのに有用な方法および組成物が本明細書中で提供される。特に、本明細書中で提供される方法は、例えばイソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸およびそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない産業的に有用な水不混和性化合物を産生するように操作された微生物株をスクリーニングするための、ハイスループットで高感度な定量的手段を提供する。この方法は、水不混和性化合物に直接結合することが可能な蛍光色素、およびそのバイオマスと比較した、産生された化合物の量についての組換え細胞集団の調査を可能にする選択されたスペクトル条件を使用した、異種の細胞内化合物または分泌された化合物の特異的検出を可能にする。
【０００７】
第１の態様では、溶液中の、複数の細胞から組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）を検出する方法であって、
（ａ）溶液を、ＷＩＣに直接結合する蛍光色素と接触させるステップであって、この溶液は、ＷＩＣを組換え産生する複数の細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）組換え産生されたＷＩＣに結合した蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件下で蛍光色素を検出するステップ、
を含む、方法が本明細書中で提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣは、ＷＩＣを組換え産生する細胞から分泌される。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄである。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３またはＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、複数の細胞を含む溶液は、マルチウェル細胞培養プレートのウェル中に含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、検出するステップの前に少なくとも１２時間の期間にわたり培養される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞バイオマスは、ＷＩＣに結合した蛍光色素からの蛍光を検出しないスペクトル条件を使用して、複数の細胞の自己蛍光を検出するステップを含む方法によって決定される。いくつかの実施形態では、蛍光色素はＮｉｌｅ  Ｒｅｄであり、ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップは、緑色対赤色蛍光の比を決定するステップを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣを特異的に検出するのに適したスペクトル条件は、
（ａ）蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、第１および第２の複数の細胞が、スクリーニングされるＷＩＣ産生細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、第１の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、第２の複数の細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）第１の複数および第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
を含む方法によって決定される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の励起スペクトルの発光波長は、５５０ｎｍに固定される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣを特異的に検出するのに適したスペクトル条件は、
（ａ）蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、第１および第２の複数の細胞が、スクリーニングされるＷＩＣ産生細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、第１の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、第２の複数の細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）第１の複数および第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
を含む方法によって決定される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の発光スペクトルの励起波長は、２９０ｎｍに固定される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞集団は、少なくとも２ｇ／ＬのＷＩＣを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、組換え産生された水不混和性化合物はイソプレノイドである。いくつかの実施形態では、組換え産生された水不混和性化合物は、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである。いくつかの実施形態では、組換え産生された水不混和性化合物はファルネセンである。
【００１７】
別の態様では、溶液中の、細胞から産生され分泌されたファルネセンを検出する方法であって、
（ａ）溶液をＮｉｌｅ  Ｒｅｄと接触させるステップであって、この溶液は、ファルネセンを組換え産生し分泌する細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）約２６０〜２９０ｎｍの励起波長および約５３０〜５７０ｎｍの発光波長においてＮｉｌｅ  Ｒｅｄを検出するステップ、
を含む、方法が本明細書中で提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００１９】
別の態様では、
（ａ）水不混和性化合物を組換え産生し分泌する細胞；
（ｂ）細胞から分泌された水不混和性化合物；
（ｃ）分泌された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素；および
（ｄ）細胞培養培地
を含む、液体組成物が本明細書中で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色し、４８８ｎｍの励起波長および５１５ｎｍの発光波長で検出した細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを提供する図である。ＯＤ５、１０、１５、２０および２５のナイーブ酵母細胞の集団ならびに細胞なし対照を、９６ウェルマイクロタイタープレートのｘ軸に沿って増殖培地中にプレートし、一方で漸増濃度の精製ファルネセン（０、２、４、６、８および１０ｇ／Ｌ）をｙ軸に沿ってウェルに添加した。
【００２１】
【図２】図２は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色し、５００ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長で検出した細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを提供する図である。（Ａ）ＯＤ５、１０、１５、２０および２５のナイーブ酵母細胞の集団ならびに細胞なし対照を、９６ウェルマイクロタイタープレートのｘ軸に沿って増殖培地中にプレートし、一方で漸増濃度の精製ファルネセン（０、２、４、６、８および１０ｇ／Ｌ）をｙ軸に沿ってウェルに添加した。（Ｂ）５００ｅｘ／５５０ｅｍにおける、漸増細胞密度にわたるファルネセン濃度対蛍光単位のプロット。Ｒ２＝０．６５０。
【００２２】
【図３】図３Ａは、５５０ｎｍの発光波長における、２５０〜５２０ｎｍの励起スペクトルを提供する図である。（◇）１０ｇ／Ｌファルネセン、細胞なし；（□）ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞、ファルネセンなし；および（△）１０ｇ／Ｌファルネセン＋ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞。図３Ｂは、２９０ｎｍの励起波長における、３３０〜７１０ｎｍの発光スペクトルを提供する図である。（◇）１０ｇ／Ｌファルネセン、細胞なし；（□）ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞、ファルネセンなし；および（△）１０ｇ／Ｌファルネセン＋ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞。
【００２３】
【図４】図４は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色し、２９０ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長で検出した細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを提供する図である。（Ａ）ＯＤ５、１０、１５、２０および２５のナイーブ酵母細胞の集団ならびに細胞なし対照を、９６ウェルマイクロタイタープレートのｘ軸に沿って増殖培地中にプレートし、一方で漸増濃度の精製ファルネセン（０、２、４、６、８および１０ｇ／Ｌ）をｙ軸に沿ってウェルに添加した。（Ｂ）２９０ｅｘ／５５０ｅｍにおける、漸増細胞密度にわたるファルネセン濃度対蛍光単位のプロット。Ｒ２＝０．９１８。
【００２４】
【図５】図５は、３５０ｎｍの励起波長における、４３０ｎｍ〜７５０ｎｍの発光スペクトルを示す図である。（◇）１０ｇ／Ｌファルネセン、細胞なし；（□）ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞、ファルネセンなし；および（△）１０ｇ／Ｌファルネセン＋ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞。
【００２５】
【図６】図６は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色し、３５０ｎｍの励起波長および４９０ｎｍの発光波長で検出した細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを提供する図である。（Ａ）ＯＤ５、１０、１５、２０および２５のナイーブ酵母細胞の集団ならびに細胞なし対照を、９６ウェルマイクロタイタープレートのｘ軸に沿って増殖培地中にプレートし、一方で漸増濃度の精製ファルネセン（０、２、４、６、８および１０ｇ／Ｌ）をｙ軸に沿ってウェルに添加した。（Ｂ）３５０ｅｘ／４９０ｅｍにおける、漸増ファルネセン濃度にわたる細胞密度対蛍光単位のプロット。Ｒ２＝０．９５５。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
６．発明の詳細な説明
６．１  定義
本明細書中で使用する場合、用語「メバロン酸経路」または「ＭＥＶ経路」は、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する生合成経路を指すために本明細書中で使用される。ＭＥＶ経路は、図１Ａに模式的に示される。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「デオキシキシルロース５−リン酸経路」または「ＤＸＰ経路」は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートおよびピルベートをＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに変換する経路を指すために本明細書中で使用される。ＤＸＰ経路は、図１Ｂに模式的に示される。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、語句「異種ヌクレオチド配列」とは、以下であり得るヌクレオチド配列を指す：（ａ）宿主細胞にとって外来である（即ち、細胞にとって「外因性」である）；（ｂ）宿主細胞中に天然に見出される（即ち、「内因性」である）が、その細胞中に異常な量で存在する（即ち、宿主細胞中に天然に見出される量よりも多いまたは少ない）；または（ｃ）宿主細胞中に天然に見出されるが、その天然の場所の外側に位置する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、遺伝子改変微生物細胞によるイソプレノイドの産生に関して、用語「持続性」とは、非遺伝子改変親微生物細胞と比較して、産業的発酵におけるより長い期間にわたりイソプレノイド化合物を産生する、遺伝子改変微生物細胞の能力を指す。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、用語「親」とは、本明細書中に記載される遺伝子改変微生物細胞、例えば、細胞内の増加した産生および／または増加したレベルの水不混和性化合物、例えば、イソプレノイド、ポリケチドまたは脂肪酸をもたらすように遺伝子改変されているが、遺伝子改変細胞の遺伝子改変の全てを含むわけではない遺伝子改変微生物細胞の生成を引き起こす遺伝子改変の導入のための出発点として機能する細胞を指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、語句「組換え産生された水不混和性化合物」、「異種水不混和性化合物」および「ＷＩＣ」とは、少なくとも４つの炭素原子を有する、遺伝子改変細胞または微生物から産生された化合物を指し、この化合物は、水と不混和性である。少なくとも４つの炭素原子を有する化合物は、分枝鎖、直鎖または環状であり得、任意選択で、１または複数のヘテロ原子（例えば、窒素、酸素および硫黄）ならびに１または複数の置換基または官能部分（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｈ）＝Ｏ、−ＮＯ３、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−など）を含み得る。いくつかの実施形態では、この化合物は油である。他の実施形態では、この化合物は疎水性である。本明細書中で提供される方法および組成物の、例示的な組換え産生された、即ち異種の水不混和性化合物には、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え産生された、即ち異種の水不混和性化合物は、４炭素原子〜４０炭素原子の範囲の長さの炭素鎖を含む。いくつかの実施形態では、組換え産生された、即ち異種の水不混和性化合物は、５〜３０、１０〜２５または１５〜２０炭素原子の炭素鎖を含む。いくつかの実施形態では、組換え産生された、即ち異種の水不混和性化合物は、５、１０、１５または２０より多い炭素原子の炭素鎖を含む。いくつかの実施形態では、組換え産生された、即ち異種の水不混和性化合物は、４０未満の炭素原子の炭素鎖を含む。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、語句「選択的に検出する」または「選択的に検出すること」とは、試料中の他の分子種からの蛍光をほぼ排除する選択スペクトル条件下での、試料中の蛍光種の検出を指す。いくつかの実施形態では、細胞中の複数の分子種に結合した蛍光色素は、色素が結合した種のサブセットのみが検出されるように、特定の励起／発光波長に供され得る。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、語句「スペクトル条件」とは、励起波長、発光波長および励起／発光波長ペアリングが含まれるがこれらに限定されない光学パラメータを指す。励起波長は、試料、例えば、ＷＩＣに結合した蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ）色素を含む溶液中の蛍光を刺激するために使用される照射の波長である。発光波長は、測定される試料、例えば蛍光色素によって発光される照射の波長である。
６．２  組換え産生された水不混和性化合物を検出する方法
【００３４】
第１の態様では、溶液中の、複数の細胞から組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）を検出する方法であって、
（ａ）溶液を、ＷＩＣに直接結合する蛍光色素と接触させるステップであって、溶液は、ＷＩＣを組換え産生する複数の細胞を含む、ステップ；および
（ｂ）組換え産生されたＷＩＣに結合した蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件下で蛍光色素を検出するステップ、
を含む、方法が本明細書中で提供される。
【００３５】
６．２．１  溶液中でのＷＩＣ産生細胞の接触
いくつかの実施形態では、ＷＩＣを、例えば細胞培養容器などの培養容器中に含まれる、ＷＩＣを組換え産生する細胞を含む溶液中の蛍光色素と接触させ得る。培養容器は、検出アッセイを実施するために具体的に使用される培養皿または９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェルが含まれるがこれらに限定されない任意の容器であり得る。いくつかの実施形態では、容器は、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルまたは他の類似の固体ポリマー性基材で製造されている。特定の実施形態では、ＷＩＣを組換え産生する細胞を含む溶液は、９６ウェル黒色ポリスチレン平底アッセイプレート中に含まれる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、この溶液は、ＷＩＣを産生する微生物細胞を培養するのに適した培地を含む。いくつかの実施形態では、炭素供給源は、単糖（単一の糖）、二糖、多糖、非発酵性炭素供給源、あるいはそれらの１または複数の組み合わせである。適切な単糖の非限定的な例には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボースおよびそれらの組み合わせが含まれる。適切な二糖の非限定的な例には、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオースおよびそれらの組み合わせが含まれる。適切な多糖の非限定的な例には、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチンおよびそれらの組み合わせが含まれる。適切な非発酵性炭素供給源の非限定的な例には、アセテートおよびグリセロールが含まれる。いくつかの実施形態では、適切な培地には、１または複数の添加剤、例えば、インデューサー（例えば、遺伝子産物をコードする１または複数のヌクレオチド配列が、誘導プロモーターの制御下にある場合）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１または複数のヌクレオチド配列が、抑制可能なプロモーターの制御下にある場合）、または選択剤（例えば、遺伝子改変を含む微生物細胞を選択するための抗生物質）などが補充されている。
【００３７】
いくつかの実施形態では、細胞は、異種水不混和性化合物の産生に適した条件下で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、蛍光色素との接触前に、少なくとも１２時間の期間、１２〜２４時間の期間、少なくとも２４時間の期間、または約３６、４８、６０、７２、９６時間または９６時間より長い時間の期間にわたり、培養される。ハイスループット適用に有用ないくつかの実施形態では、細胞は、９６ウェルプレート中で増殖され、プレートは、蒸発に起因する体積喪失を防止するため、および好気的培養を維持するのに適切な酸素移行を可能にするために、培養期間の持続時間にわたって通気性メンブレンシールで密封される。複数のプレートの細胞がインキュベーター中に積み重ねられる他の実施形態では、プレートは、位置的な偏りを最小化するために、１ｃｍのゴムガスケットで分離される。特定の実施形態では、細胞は、培養期間の全体の間振盪される。いくつかの実施形態では、細胞は１０００ＲＰＭで振盪される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣを組換え産生する細胞を含む溶液を、細胞の事前の処理なしで、例えば、蛍光色素の取り込みを増強し得る細胞の化学的または熱的透過処理なしで、蛍光色素と接触させる。他の実施形態では、細胞は、例えば、色素との接触前に細胞をＤＭＳＯに接触させることまたは細胞を熱処理に供することによって、色素の取り込みを増強するために処理される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を含む溶液を、組換え産生された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素と接触させるステップ、および溶液内の蛍光色素を検出するステップを含む。いくつかの実施形態では、蛍光色素はソルバトクロミック色素である。蛍光ソルバトクロミック色素は、分子周囲の溶媒の極性に依存して色が変化する色素であり、例えば、生物学的分子、特に脂質分子の動力学の高感度リアルタイム観察におけるプローブとして使用される。その色変化機構は、直接的結合を介して達成され、特定の化学種との接触を必要としない。かかる蛍光ソルバトクロミック色素には、ＮＢＤ、Ｄａｎｓｙｌ、ＤＡＳＰＭＩ、Ｐｒｏｄａｎ、Ｄａｐｏｘｙｌ、４−ＤＭＡＰ、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド誘導体、Ｒｅｉｃｈａｒｄｔの色素およびＮｉｌｅ  Ｒｅｄが含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、この溶液をＢＯＤＩＰＹフルオロフォア誘導体と接触させる。ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア誘導体は、非極性構造ならびに長波長の吸収および蛍光、小さい蛍光ストークシフト、典型的には８０，０００ｃｍ−１Ｍ−１より大きい吸光係数、ならびに水中で減退しない高い蛍光量子収率を特徴とする。ＢＯＤＩＰＹ色素は、中性脂質に関する染色としての、ならびに油および他の非極性液体に関するトレーサーとしての、潜在的な適用を有する。ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３色素による染色は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄによる染色よりも、細胞性脂質滴に対してより特異的であることが、フローサイトメトリーによって示されている。さらに、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３色素の低い分子量（２６２ダルトン）は、膜中での比較的速い拡散速度を有するプローブを生じる。ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３色素は、マイクロチップチャネル分離デバイス中の中性化合物を検出するためにも使用されてきた。ＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５は、生きたゼブラフィッシュの胚の細胞膜を透過し、細胞質卵黄血小板を選択的に染色することが報告されている。
【００４１】
いくつかの実施形態では、この溶液を蛍光色素Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄと接触させる。Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄは、例えば、哺乳動物細胞、細菌、酵母および微細藻類を含む動物細胞および微生物の脂質含量を評価するために、蛍光顕微鏡およびフローサイトフルオロメトリーによる細胞内脂質滴の検出のために頻繁に使用されてきた脂溶性蛍光色素である。Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄは、本明細書中に記載される組換え産生された水不混和性化合物のハイスループット検出にとってＮｉｌｅ  Ｒｅｄを理想的なものにしている独自の特性をいくつか有する。例えば、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄは、疎水的環境中で高度に蛍光性であり、親水的環境中でクエンチされ、ソルバトクロミズムを示す、即ち、その励起スペクトルおよび発光スペクトルが、その環境の性質によってスペクトルの位置、形状および強度が変動する。Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄのソルバトクロミック特性により、リン脂質および極性脂質に結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄならびに中性脂質に結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄの部分的識別が可能になる。リン脂質細胞膜などの極性脂質では、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄは、約５９０ｎｍの蛍光発光最大を有する。対照的に、中性脂質、例えば炭化水素産物（例えば、ファルネセン）の存在下で、スペクトルは、５５０ｎｍの発光最大で青シフトする。従って、本明細書中に記載される方法の特定の実施形態では、理想的な産生細胞（例えば、純粋なファルネセン）と完全な非産生細胞との間の、緑色対赤色蛍光の比を最大化するために、スペクトルの緑（５２５＋／−２０ｎｍ）領域および赤（６７０＋／−２０ｎｍ）領域における光学フィルターが、検出の間に使用される。蛍光データは、緑スペクトルおよび赤スペクトルの両方で捕捉され得、緑色対赤色蛍光の比は、溶液中の細胞バイオマスの量に対して正規化された溶液内の水不混和性化合物の量を決定するために使用され得る。従って、本明細書中で提供される方法は、（ａ）細胞集団により産生された水不混和性化合物の量；および（ｂ）集団の細胞バイオマスを同時に決定するために、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄなどのソルバトクロミック色素を有利に利用する。細胞バイオマスの個別の決定の要求を排除することによって、例えば、細胞壁もしくは核特異的染色で細胞集団を対比染色すること、または細胞集団の光学密度を測定することによって、他のスクリーニング方法と比較してより高いスループットおよび効率が達成され得る。
【００４２】
培養容器中の溶液中に含まれる細胞集団の緑色対赤色蛍光の比（Ｇ／Ｒ）は、細胞集団の相対的産物：バイオマス比を決定するために有利に使用され得、集団が然るべくランク付けされ得る。例えば、細胞集団は、以下を有するとしてランク付けされ得る：（ａ）比較的遅く増殖する集団／高産生集団を示し得る比較的高いＧ／Ｒ比；または（ｂ）比較的速く増殖する集団／低産生集団、比較的速く増殖する集団／高産生集団、もしくは比較的遅く増殖する株／低産生株を示し得る比較的低いＧ／Ｒ比。細胞集団のＧ／Ｒ比はさらに、集団をさらに特徴付けるために、集団により産生された化合物の量を示すその緑色蛍光値単独（Ｇ）と組み合わせて使用され得る。例えば、低いＧ／Ｒ比を有するが高いＧ値を有する細胞集団は、比較的速く増殖する集団／高産生集団を示し得、低いＧ／Ｒ比を有するが低いＧ値を有する細胞集団は、比較的遅く増殖する集団／低産生集団または速く増殖する集団／低産生集団を示し得る。
【００４３】
従って、本明細書中で提供される検出方法のいくつかの実施形態では、その方法は、培養容器内の溶液中の細胞集団の水不混和性化合物の量を培養容器内の細胞バイオマスの量に対して正規化するステップを含む。いくつかの実施形態では、この正規化するステップは、（ａ）培養容器内の水不混和性化合物の蛍光のレベル、および（ｂ）培養容器内の細胞バイオマスの蛍光のレベルを決定するステップ；ならびに（ａ）において決定された蛍光の、（ｂ）において決定された蛍光に対する比を決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この蛍光色素はＮｉｌｅ  Ｒｅｄであり、この正規化するステップは、培養容器内の水不混和性化合物のレベルに対応する緑色スペクトル（例えば、５２５＋／−２０ｎｍ）内の蛍光のレベルを決定するステップ、および培養容器内の細胞バイオマスのレベルに対応する赤色スペクトル（６７０＋／−２０ｎｍ）内の蛍光のレベルを決定するステップ、および緑色対赤色蛍光の比（Ｇ／Ｒ）を決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、高いＧ／Ｒ比を有する細胞集団を選択するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、高いレベルの緑色蛍光を有する細胞集団を選択するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、高いＧ／Ｒ比および高いレベルの緑色蛍光を有する細胞集団を選択するステップをさらに含む。
６．２．２  検出
【００４４】
細胞または細胞のクローン性集団から産生された組換え産生された水不混和性化合物は、フローサイトメトリー、セルソーティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）または光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡などの標準的な細胞検出技術を使用して検出され得る。特定の実施形態では、水不混和性化合物産生細胞からの蛍光は、９６ウェルプレート蛍光分光光度計で定量される。
６．２．２．１  検出のためのスペクトル条件の選択
【００４５】
複数の細胞から産生されたＷＩＣに結合した蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件の決定は、いくつかの実施形態で実施され得る。一実施形態では、（１）複数の細胞によって組換え産生されたＷＩＣ；（２）ＷＩＣに直接結合する蛍光色素；および（３）宿主細胞、の任意の組み合わせについて、スペクトル条件は、ＷＩＣに結合した色素の特異的検出を可能にする励起波長を同定するステップを含む方法によって決定され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、ＷＩＣに結合した色素の特異的検出を可能にする発光波長を同定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＷＩＣに結合した色素の特異的検出を可能にする励起波長および発光波長のペアリングを同定するステップを含む。好ましい実施形態では、この方法は、宿主細胞バイオマスからの蛍光が検出されないように、ＷＩＣに結合した蛍光色素の検出に関して充分選択的な励起波長および発光波長のペアリングを同定するステップを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣに結合した蛍光色素を検出するのに選択的なスペクトル条件を決定する方法は、適合する励起波長を決定するステップを含む。一実施形態では、適合する励起波長は、
（ａ）蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、第１および第２の複数の細胞が、スクリーニングされるＷＩＣ産生細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、第１の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、第２の複数の細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）第１の複数および第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
によって決定される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣに結合した蛍光色素を選択的に検出するのに充分なスペクトル条件を決定する方法は、適合する発光波長を決定するステップを含む。一実施形態では、適合する発光波長は、
（ａ）蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、第１および第２の複数の細胞が、スクリーニングされるＷＩＣ産生細胞と同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、第１の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、第２の複数の細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）第１の複数および第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ
（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である、
ステップ、
によって決定される。
【００４８】
特定の実施形態では、ＷＩＣに結合した蛍光色素を選択的に検出するのに充分なスペクトル条件を決定する方法は、励起波長および発光波長の両方、即ち、適合する発光波長および励起波長のペアリングを選択するステップを含み、ここで、（ｉ）第１の複数由来の細胞集団と、同じ光学密度を有する第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも８０％であり；かつ（ｉｉ）第２の複数由来のＯＤ５の細胞集団とＯＤ２５の細胞集団との間の蛍光における差異が、２５０％以下である。
【００４９】
この方法が、第１および第２の複数の細胞についての励起スペクトルを決定するステップを含む場合、発光波長は一定に維持され、例えば、２５０ｎｍ〜５００ｎｍまたはその波長のサブセットの励起スペクトルが得られる。いくつかの実施形態では、発光波長は、得られる励起スペクトルの励起波長の範囲の直ぐ外側の波長で一定に維持される。特定の実施形態では、発光波長は５５０ｎｍで一定に維持される。同様に、この方法が第１および第２の複数の細胞についての発光スペクトルを決定するステップを含む場合、励起波長は一定に維持され、例えば、２６０ｎｍ〜７２０ｎｍまたはその波長のサブセットの発光スペクトルが得られる。特定の実施形態では、励起波長は２９０ｎｍで一定に維持される。蛍光スペクトルを得ることが可能な当該分野で公知の任意の蛍光光度計が、本明細書中に記載される方法において使用され得る。
【００５０】
上記方法において有用な第１および第２の複数の細胞集団は、好ましくは、感知できる量のバックグラウンド蛍光をアッセイに与えない液体培地内に含まれる。例えば、細胞は、細胞培養または細胞ベースのアッセイにおいて一般に使用される水溶液、例えば、生物学的緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、または細胞の増殖を支持し得る任意の培地中で、マイクロタイタープレートのウェルに添加され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、細胞集団の細胞密度ｘは、６００ｎｍにおける細胞集団の光学密度（ＯＤ６００）である。例えば、細胞密度ｘを有する第１の細胞集団は１のＯＤ６００を有し、細胞密度５ｘを有する細胞集団は、５のＯＤ６００を有する。いくつかの実施形態では、第１および第２の複数の細胞は、漸増する細胞密度の細胞集団、例えば、ｘおよび５ｘの細胞集団（例えば、１および５のＯＤ６００）、ｘおよび１０ｘの細胞集団（例えば、１および１０のＯＤ６００）またはｘおよび２０ｘの細胞集団（例えば、１および２０のＯＤ６００）を、少なくとも２つ、各々が含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の複数は、より低いまたはより高い光学密度の集団を含む。例えば、第１および第２の複数は、ＯＤ１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３５、４０、４５の、または５０より高いＯＤの細胞集団をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の複数は、蛍光スペクトルが得られる漸増する細胞密度の細胞の集団を、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２より多く含み、これらの複数は、５のＯＤ６００の集団および２５のＯＤ６００の集団を含む。特定の実施形態では、第１および第２の複数は、５、１０、１５、２０および２５のＯＤ６００の細胞集団を含む。他の実施形態では、第１および第２の複数の細胞は、１および１０、１および１５、５および２０、１０および２０、または１０および２５のＯＤ６００の集団を含む。好ましくは、細胞密度ｘおよび細胞密度５ｘは、所与の細胞型について、６００ｎｍにおける分光光度的検出のためのダイナミックレンジ内である。
【００５２】
選択的スペクトル条件が求められる水不混和性化合物（ＷＩＣ）に関して、スペクトル条件を決定する目的のために、ＷＩＣは、例えば精製化合物として、第１の複数の細胞を含む水性培地に添加され得る。あるいは、第１の複数の細胞は、ＷＩＣを産生するように改変された組換え細胞であり得る。ＷＩＣを産生する組換え細胞を利用するいくつかの実施形態では、細胞によって産生されたＷＩＣの量は、例えば、収率（スクロースなどの基質１グラム当たりの化合物のグラム数）、産生のレベル（１リットル当たりのグラム数）および／または産生力のレベル（１時間当たり１リットル当たりのグラム数）として予め確立される。第１の複数がＷＩＣを産生する組換え細胞を含むいくつかの実施形態では、細胞は、ＷＩＣに特異的なスペクトル条件を決定する前に、ＷＩＣの産生に充分な時間の期間にわたり培養される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞集団の各々は、等量でＷＩＣを含む。他の実施形態では、第１の複数の細胞集団は、異なる量でＷＩＣを含む。好ましくは、ＷＩＣの量は、接触させるステップの間にＷＩＣに結合するのに利用可能な蛍光色素の量を超えない。いくつかの実施形態では、第１の複数の細胞集団の各々は、少なくとも０．１ｇ／Ｌの量でＷＩＣを含む。他の実施形態では、第１の複数の細胞集団の各々は、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／ｌの量でＷＩＣを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数の集団の各々は、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０ｇ／Ｌの量、または１５．０ｇ／Ｌより多い量で、ＷＩＣを含む。特定の実施形態では、ＷＩＣは、例えば、感知できる量のバックグラウンド蛍光をアッセイに与えない溶媒中で、精製ＷＩＣとして、第１の複数の集団の各々に添加される。特定の実施形態では、ＷＩＣは、少なくとも２ｇ／Ｌの濃度で、第１の複数の細胞の集団の各々に外因的に添加される。
【００５４】
好ましくは、第１および第２の複数の細胞は、蛍光色素によって結合され得る内因性細胞性標的の量または質における任意の差異を最小化するために、同じ細胞型の細胞である。好ましくは、第２の複数の細胞は、ＷＩＣ、例えば、外因的に添加または組換え産生されたＷＩＣを含まない。しかし、ＷＩＣが内因性分子として第２の複数の細胞中に存在し得る場合、ＷＩＣは、内因性分子として第１の複数の細胞中にも存在する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣの特異的検出のために選択された励起波長および／または発光波長において、同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団（ＷＩＣを含む）と、第２の複数由来の細胞集団（ＷＩＣを含まない）との間の蛍光における差異は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、これらの細胞集団間の蛍光における差異は、少なくとも約８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００％、または５００％より上である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＷＩＣの特異的検出のために選択された励起波長および／または発光波長において、第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異は、２５０％以下である。いくつかの実施形態では、この差異は、約２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、２０または１０％以下である。
【００５７】
複数の細胞から産生されたＷＩＣに結合した蛍光色素を選択的に検出するのに充分なスペクトル条件の決定のために有用な、本明細書中で提供される方法は、酵母細胞の存在下でファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄの選択的検出に適したスペクトル条件の同定に適用された。実施例２において以下に提供されるこれらの結果は、ファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄが、細胞バイオマスからの蛍光の溢流が回避されるスペクトル条件下で検出され得ることを実証する。従って、別の態様では、溶液中の、細胞から産生されたファルネセンを選択的に検出する方法が本明細書中で提供され、この方法は、（ａ）溶液をＮｉｌｅ  Ｒｅｄと接触させるステップであって、この溶液は、ファルネセンを組換え産生する細胞を含む、ステップ；および（ｂ）約２６０〜２９０ｎｍの励起波長および約５３０〜５７０ｎｍの発光波長においてＮｉｌｅ  Ｒｅｄを検出するステップ、を含む。
【００５８】
Ｎｉｌｅ−Ｒｅｄ蛍光、例えば、ＷＩＣに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄからの蛍光の影響なしに、細胞からの自己蛍光を検出するのに選択的なスペクトル条件を決定する方法が、本明細書中でさらに提供される。自己蛍光は、細胞バイオマスの代用として使用され得、従って、自己蛍光に選択的なスペクトル条件が一旦決定されると、所与のＷＩＣ産生細胞集団についてのＷＩＣ：細胞バイオマス比が、２つの選択的励起／発光波長ペアを使用して得られ得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、細胞自己蛍光に選択的なスペクトル条件を決定する方法は、
（ａ）蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、第１および第２の複数の細胞が、同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、第１の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、第２の複数の細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）第１の複数および第２の複数についての励起スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）励起波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、８０％以下であり；かつ
（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも２５０％である、
ステップ、
を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、細胞自己蛍光に選択的なスペクトル条件を決定する方法は、
（ａ）蛍光色素を、第１の複数の細胞集団および第２の複数の細胞集団と接触させるステップであって、第１および第２の複数の細胞が、同じ細胞型の細胞であり、各複数が、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、第１の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、第２の複数の細胞集団がＷＩＣを含まない、ステップ；
（ｂ）第１の複数および第２の複数についての発光スペクトルをそれぞれ決定するステップ；および
（ｃ）発光波長を選択するステップであって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、８０％以下であり；かつ
（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも２５０％である、
ステップ、
を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、細胞自己蛍光に選択的なスペクトル条件を決定する方法は、励起波長および発光波長の両方、即ち、適合する発光波長および励起波長のペアリングを選択するステップを含み、ここで、（ｉ）同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団と、第２の複数由来の細胞集団との間の蛍光における差異が、８０％以下であり；かつ（ｉｉ）第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異が、少なくとも２５０％である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、細胞自己蛍光の特異的検出のために選択された励起波長および／または発光波長において、同じ細胞密度を有する、第１の複数由来の細胞集団（ＷＩＣを含む）と、第２の複数由来の細胞集団（ＷＩＣを含まない）との間の蛍光における差異は、８０％以下である。いくつかの実施形態では、これらの細胞集団間の蛍光における差異は、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０％以下である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、細胞自己蛍光の特異的検出のために選択された励起波長および／または発光波長において、第２の複数由来の細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団との間の蛍光における差異は、少なくとも２５０％である。いくつかの実施形態では、この差異は、少なくとも２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００％、または５００％より上である。
【００６４】
６．３  スクリーニングする方法
別の態様では、水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団について細胞のライブラリーをスクリーニングする方法が本明細書中で提供され、この方法は、（ａ）溶液を、ＷＩＣに直接結合する蛍光色素と接触させるステップであって、この溶液は、ＷＩＣを組換え産生する複数の細胞を含む、ステップ；（ｂ）組換え産生されたＷＩＣに結合した蛍光色素の選択的検出に適したスペクトル条件下で蛍光色素を検出するステップ；および（ｃ）組換え産生された水不混和性化合物を産生する細胞または細胞のクローン性集団を選択するステップ、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、水不混和性化合物産生細胞または細胞のクローン性集団が連続ラウンドの選択で豊富化されるように、検出するステップおよび選択するステップを反復するステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞は、遺伝子改変されていない親微生物細胞と比較して、より高い収率および／または増加した持続性で１または複数の水不混和性化合物を産生するように遺伝子改変された微生物細胞である。いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、遺伝子改変されていない親微生物細胞と比較して、増加した水不混和性化合物産生を有するかかる遺伝子改変微生物細胞を同定および選択するのに充分である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、ＷＩＣ対細胞バイオマスの比として表現される、１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。かかる実施形態では、スクリーニングする方法は、ステップ（ｂ）において、ＷＩＣ：細胞バイオマス比を決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞バイオマスは、ＷＩＣに結合した蛍光色素からの蛍光が検出されないスペクトル条件下で、複数の細胞の自己蛍光を検出するステップを含む方法によって決定される。ＷＩＣ：バイオマス比は、本明細書中に記載される選択スペクトル条件を利用して、それぞれＷＩＣおよびバイオマスの個別ではあるが特異的な測定の相対蛍光単位（ＲＦＵ）に基づいて計算され得る。いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、約１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５または１：１００のＷＩＣ：バイオマス比で１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、１００：１より大きいまたは１：１００より小さいＷＩＣ：バイオマス比で１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムより多い量で１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。いくつかの実施形態では、組換え産生された水不混和性化合物は、細胞培養物１リットル当たり、約１０〜約５０グラムの量、約１５グラムより多い量、約２０グラムより多い量、約２５グラムより多い量または約３０グラムより多い量で産生される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ミリグラムより多い量で１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。いくつかの実施形態では、組換え産生された水不混和性化合物は、乾燥細胞重量１グラム当たり、約５０〜約１５００ミリグラムの量、約１００ミリグラムより多い量、約１５０ミリグラムより多い量、約２００ミリグラムより多い量、約２５０ミリグラムより多い量、約５００ミリグラムより多い量、約７５０ミリグラムより多い量または約１０００ミリグラムより多い量で産生される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、細胞培養物基準の単位体積当たり、本明細書中に記載されるような遺伝子改変されていない微生物細胞によって産生される水不混和性化合物の量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１，０００倍もしくはそれより多い量で、１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、単位乾燥細胞重量基準当たり、本明細書中で提供される方法に従って遺伝子改変されていない微生物細胞によって産生される水不混和性化合物の量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１，０００倍もしくはそれより多い量で、１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、単位時間基準当たり細胞培養物の単位体積当たり、本明細書中で提供される方法に従って遺伝子改変されていない微生物細胞によって産生される水不混和性化合物の量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１，０００倍もしくはそれより多い量で、１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、スクリーニングする方法は、単位時間基準当たり単位乾燥細胞重量当たり、本明細書中で提供される方法に従って遺伝子改変されていない微生物細胞によって産生される水不混和性化合物の量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１，０００倍もしくはそれより多い量で、１または複数の水不混和性化合物を組換え産生する細胞または細胞のクローン性集団を同定するのに充分である。
６．４  宿主細胞およびＷＩＣを産生する組換え細胞
【００７２】
別の態様では、１または複数の組換え産生された水不混和性化合物を含む細胞またはクローン性細胞集団が本明細書中で提供される。本明細書中で提供される方法および組成物において有用な細胞には、例えば、イソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸などの水不混和性化合物を天然に産生可能なまたは組換え産生可能な任意の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性癌腫細胞またはマウス胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｓ２細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞またはＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、単細胞真核生物細胞である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、細胞は菌糸体細菌細胞である。いくつかの実施形態では、菌糸体細菌細胞は、放線菌の綱の細胞である。特定の実施形態では、菌糸体細菌細胞は、属Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｕｒａｃｏｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇａｌｉｌａｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒの細胞である。
【００７４】
別の実施形態では、細胞は真菌細胞である。より特定の実施形態では、細胞は酵母細胞である。本明細書中で提供される方法および組成物において有用な酵母には、微生物寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託された、とりわけ属Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、およびＺｙｇｏｚｙｍａに属する酵母が含まれる。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される方法および組成物において有用な酵母には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓまたはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして公知である）が含まれる。いくつかの実施形態では、微生物は、属Ｃａｎｄｉｄａ、例えばＣａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓの株である。
【００７６】
特定の実施形態では、細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の株は、パン酵母、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、ＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９６３、ＣＢＳ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１およびＡＬ−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１およびＳＡ−１からなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＰＥ−２である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＣＡＴ−１である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＢＧ−１である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、細胞は一倍体微生物細胞である。他の実施形態では、細胞は二倍体微生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヘテロ接合体である。他の実施形態では、細胞は、その交配型対立遺伝子以外についてホモ接合体である（即ち、細胞が胞子形成する場合、得られた４つの一倍体微生物細胞は、それらの交配型対立遺伝子を除き遺伝学的に同一であり、一倍体細胞のうち２つは交配型ａであり、残り２つの一倍体細胞は、交配型アルファである）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、細胞は、産業的発酵、例えば、バイオエタノール発酵に適した細胞である。特定の実施形態では、細胞は、産業的発酵環境の認識されたストレス条件である、高溶媒濃度、高温、拡大された基質利用、栄養制限、浸透圧ストレスデュー、酸性度、サルファイトおよび細菌汚染、またはそれらの組み合わせの下で存続するように条件付けられる。
【００７９】
例示的な水不混和性化合物産生細胞、例えば、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸を組換え産生する細胞、ならびにかかる細胞を生成する方法が、以下に提供される。
６．４．１  イソプレノイドを産生する組換え細胞
【００８０】
一態様では、例えば１または複数のイソプレノイド化合物を組換え産生するように遺伝子改変された細胞または細胞のクローン性集団におけるイソプレノイド産生を検出する方法が、本明細書中で提供される。イソプレノイドは、メバロン酸依存的（「ＭＥＶ」）経路または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ジホスフェート（「ＤＸＰ」）経路の酵素によって生合成され得るイソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）から誘導される。ＭＥＶ経路の模式的描写は図１Ａに記載され、ＤＸＰ経路の模式的描写は図１Ｂに記載される。
６．４．１．１  ＭＥＶ経路
【００８１】
本明細書中で提供されるイソプレノイド産生細胞を検出する方法のいくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、遺伝子改変されていない親細胞と比較して、１または複数のイソプレノイド化合物の増加した産生をもたらす、ＭＥＶ経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、２分子のアセチル−補酵素Ａを縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成できる酵素、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＮＣ＿０００９１３  ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡの別の分子と縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成できる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＮＣ＿００１１４５．  相補体  １９０６１．２０５３６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＮＭ＿２０６５４８；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７０；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ＮＭ＿２０４４８５；Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、（ＡＢ０１５６２７；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ  ３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｔｔｅｎｕａｔａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＡＸ１２８２１３、切断型ＨＭＧＲをコードする配列を提供する；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および（ＮＣ＿００１１４５：相補体（１１５７３４．１１８８９８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェート（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変換できる酵素、例えばメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）および（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、メバロン酸５−ホスフェートをメバロン酸５−ピロホスフェートに変換できる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ４２９３８５；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）および（ＮＣ＿００１１４５．相補体７１２３１５．７１３６７０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、メバロン酸５−ピロホスフェートをＩＰＰに変換できる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（Ｘ９７５５７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）および（Ｕ４９２６０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８８】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路の１より多い酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路の２つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素およびメバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路の３つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路の４つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路の５つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路の６つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成されたＩＰＰをその異性体ジメチルアリルピロホスフェート（「ＤＭＡＰＰ」）に変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。ＤＭＡＰＰは、単純なイソプレノイドおよびより複雑なイソプレノイドを形成するために、種々のさらなる酵素の作用を介して縮合および改変され得る（図２）。
６．４．１．２  ＤＸＰ経路
【００９０】
本明細書中で提供されるイソプレノイド産生細胞を検出する方法のいくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、遺伝子改変されていない親細胞と比較して、１または複数のイソプレノイド化合物の増加した産生をもたらす、ＤＸＰ経路の１または複数の酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、２分子のアセチル−補酵素Ａを縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成できる酵素、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＮＣ＿０００９１３  ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）および（Ｌ２０４２８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ピルベートをＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートと縮合して１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートを生成できる酵素、例えば１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ０３５４４０；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ０５２７；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）、（ＣＰ００００２６、遺伝子座タグＳＰＡ２３０１；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ、ＡＴＣＣ  ９１５０を参照）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿０２５４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、（ＮＣ＿００５２９６、遺伝子座タグＲＰＡ０９５２；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９）、（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座タグＰＤ１２９３；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）、および（ＮＣ＿００３０７６、遺伝子座タグＡＴ５Ｇ１１３８０；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９３】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートを２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートに変換できる酵素、例えば１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＢ０１３３００；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＡＦ１４８８５２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ１５９７；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）、（ＡＬ９３９１２４、遺伝子座タグＳＣＯ５６９４；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿２７０９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、および（ＮＣ＿００７４９２、遺伝子座タグＰｆｌ＿１１０７；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９４】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートを４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに変換できる酵素、例えば４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ２３０７３６；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿２８３５；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、（ＮＣ＿００３０７１、遺伝子座タグＡＴ２Ｇ０２５００；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、および（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ１６１４；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールを４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２−ホスフェートに変換できる酵素、例えば４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ２１６３００；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿１７７９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２−ホスフェートを２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートに変換できる酵素、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ２３０７３８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿６０７１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、および（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ１６１８；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ジホスフェートに変換できる酵素、例えば１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＹ０３３５１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ０８５３；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）、および（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿２９８２；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９８】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ジホスフェートをＩＰＰまたはその異性体ＤＭＡＰＰのいずれかに変換できる酵素、例えば、イソペンチル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＹ０６２２１２；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ０６０６；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の１より多い酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の２つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の３つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の４つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の５つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の６つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の５つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＤＸＰ経路の７つの酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、宿主細胞自身の代謝プロセスとＩＰＰ産生と関連するプロセスとの間の「クロストーク」（または干渉）は、最小化または完全に排除される。例えば、宿主微生物がＩＰＰを合成するためにＤＸＰ経路に排他的に依存しており、ＭＥＶ経路がさらなるＩＰＰを提供するために導入される場合、クロストークは、最小化または完全に排除される。かかる宿主生物は、ＭＥＶ経路の酵素の発現を変更させるまたはＭＥＶ経路に関連する中間体を処理する能力を備えていない。ＤＸＰ経路に排他的または主に依存している生物には、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが含まれる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、排他的にまたはＤＸＰ経路と組み合わせてのいずれかで、ＭＥＶ経路を介してＩＰＰを産生する。他の実施形態では、宿主細胞が異種導入されたＭＥＶ経路を介して排他的にＩＰＰを産生するように、宿主のＤＸＰ経路は機能的に不能にされる。ＤＸＰ経路は、１または複数のＤＸＰ経路の酵素の遺伝子発現を不能にするまたはその機能を不活化することによって、機能的に不能にされ得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、細胞によって産生されるイソプレノイドは、Ｃ５イソプレノイドである。これらの化合物は、１つのイソプレン単位から誘導され、ヘミテルペンとも呼ばれる。ヘミテルペンの例示的な例はイソプレンである。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ１０イソプレノイドである。これらの化合物は、２つのイソプレン単位から誘導され、モノテルペンとも呼ばれる。モノテルペンの例示的な例は、リモネン、シトラネロール（ｃｉｔｒａｎｅｌｌｏｌ）、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロール、ツジョンおよびミルセンである。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ１５イソプレノイドである。これらの化合物は３つのイソプレン単位から誘導され、セスキテルペンとも呼ばれる。セスキテルペンの例示的な例は、ペリプラノンＢ、ギンコライド（ｇｉｎｇｋｏｌｉｄｅ）Ｂ、アモルファジエン、アルテミシニン、アルテミシン酸、バレンセン、ヌートカトン、エピ−セドロール、エピ−アリストロチェン、ファルネソール、ゴシポール、サノニン（ｓａｎｏｎｉｎ）、ペリプラノン、フォルスコリンおよびパチョロール（パチュリアルコールとしても公知である）である。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ２０イソプレノイドである。これらの化合物は４つのイソプレン単位から誘導され、ジテルペンとも呼ばれる。ジテルペンの例示的な例は、カスベン、エリュテロビン、パクリタキセル、プロストラチン、シュードプテロシンおよびタキサジエンである。なお他の例では、イソプレノイドはＣ２０＋イソプレノイドである。これらの化合物は、４つより多いイソプレン単位から誘導され、以下が含まれる：トリテルペン（６つのイソプレン単位から誘導されるＣ３０イソプレノイド化合物）、例えば、アルブルシドＥ、ブルセアンチン、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシンおよびスクアレン；テトラテルペン（８つのイソプレノイドから誘導されるＣ４０イソプレノイド化合物）、例えばβ−カロテン；ならびにポリテルペン（８つより多いイソプレン単位から誘導されるＣ４０＋イソプレノイド化合物）、例えば、ポリイソプレン。いくつかの実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される。イソプレノイド化合物には、以下も含まれるがこれらに限定されない：カロテノイド（例えば、リコピン、α−カロテンおよびβ−カロテン、α−クリプトキサンチンおよびβ−クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンならびにルテイン）、ステロイド化合物、ならびに他の化学基によって改変されたイソプレノイドから構成される化合物、例えば、混合型テルペン−アルカロイドおよび補酵素Ｑ−１０。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成されるＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換できる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および（ＡＦ０８２３２６；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５つより多い炭素を含むポリプレニル化合物を形成できるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、１分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合して１分子のゲラニルピロホスフェート（「ＧＰＰ」）を形成できる酵素、例えばＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ５１３１１１；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１３；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（Ｙ１７３７６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８７７、遺伝子座ＡＰ１１０９２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ  １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４５；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）、（ＤＱ２８６９３０；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、遺伝子座ＣＡＤ２４４２５；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８；Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、および（ＡＦ２０３８８１、遺伝子座ＡＡＦ１２８４３；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、２分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合してまたは１分子のＩＰＰを１分子のＧＰＰに付加して１分子のファルネシルピロホスフェート（「ＦＰＰ」）を形成できる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＴＵ８０６０５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＡＵ３６３７６；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ４６１０５０；Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、（Ｄ００６９４；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、遺伝子座ＡＡＬ９５５２３；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＣＰ０００００９、遺伝子座ＡＡＷ６００３４；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＬＡＵ１５７７７；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳＣＦＰＰ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３、遺伝子座ＡＡＴ８７３８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００００１７、遺伝子座ＡＡＺ５１８４９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２、遺伝子座ＹＰ＿５９８８５６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、遺伝子座ＹＰ＿６００８４５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、遺伝子座ＹＰ＿６０２８３２；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、（ＡＥ０００６５７、遺伝子座ＡＡＣ０６９１３；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｄ８４４３２、遺伝子座ＢＡＡ１２５７５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８、遺伝子座ＡＡＣ２８８９４；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、遺伝子座ＮＰ＿８７３７５４；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、遺伝子座ＡＡＣ２３０８７；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＹＰ＿３９５２９４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、遺伝子座ＹＰ＿０００２７３；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ．  Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、遺伝子座ＹＰ＿２０８７６８；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、遺伝子座ＡＡＢ９１７５２；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１、遺伝子座ＡＡＶ９３５６８；Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、遺伝子座ＡＡＫ９９８９０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）、および（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＮＰ  ７７９７０６；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰまたはＩＰＰおよびＦＰＰを結合させてゲラニルゲラニルピロホスフェート（「ＧＧＰＰ」）を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ＡＴＣＣ  ３５６４６  ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ＿００１４４５０９；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ  ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ０５５４９６；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９；Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ；Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７、遺伝子座ＢＡＡ１４１２４；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１、遺伝子座ＣＡＡ３６５３８；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２、遺伝子座ＡＡＦ２４２９４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、および（ＮＣ＿００４３５０、遺伝子座ＮＰ＿７２１０１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ポリプレニルを改変して、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイドまたは改変イソプレノイド化合物を形成できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはカレンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ４６１４６０、ＲＥＧＩＯＮ  ４３．１９２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＦ５２７４１６、ＲＥＧＩＯＮ：７８．１８７１；Ｓａｌｖｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはゲラニオールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＪ４５７０７０；Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）、（ＡＹ３６２５５３；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  １８６４）、（ＤＱ２３４２９９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ｓｔｒａｉｎ  １８６１）、（ＤＱ２３４２９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ｓｔｒａｉｎ  ４９３５）、および（ＤＱ０８８６６７；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはリナロールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ４９７４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＣ００２２９４、遺伝子座ＡＡＢ７１４８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＹ０５９７５７；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１０４７９３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＦ１５４１２４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ０６７６０３；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；Ｃｌａｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、（ＡＦ０６７６０１；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（Ｕ５８３１４；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＤＱ２６３７４１；Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔｅ）、（ＡＹ６９３６４７；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＰ００４０７８、遺伝子座ＢＡＤ０７６０５；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＸＭ＿４６３９１８、遺伝子座ＸＰ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＹ９１７１９３；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２３；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＤＱ１９５２７４；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、および（ＡＦ４４４７９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．  ｃｒｉｓｐａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｎｏ．  ７９）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはリモネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．１８６７；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）および（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．１８８９；Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ）ならびに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ：１．１９０５；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：７３．１９８６；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩＯＮ：２９．１８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはミルセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（Ｕ８７９０８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿ｈ１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＡＦ３６９９１９；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、および（ＡＪ３０４８３９；Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはオシメンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＹ１９５６０７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＫ２２１０２４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ＣｉｔＭＴＳＬ４）、および（ＡＹ５７５９７０；Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはα−ピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．１８８７；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．１９２１；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）および（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはβ−ピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．１７４９；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）および（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１８３４；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはサビネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来のＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１７９８が含まれるが、これに限定されない。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはγ−テルピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＦ５１４２８６、ＲＥＧＩＯＮ：３０．１８３２、Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ由来）および（ＡＢ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ１．１８０３、Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ由来）が含まれる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはテルピノレンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（ＡＹ６９３６５０、Ｏｓｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ由来）および（ＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．１８８７、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ由来）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはアモルファジエンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例は、米国特許公開公報２００４／０００５６７８号の配列番号３７である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはα−ファルネセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ｄ’Ａｎｊｏｕ由来のＤＱ３０９０３４（西洋ナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）およびＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ由来のＡＹ１８２２４１（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）が含まれるがこれらに限定されない。Ｐｅｃｈｏｕｕｓら、Ｐｌａｎｔａ  ２１９巻（１号）：８４〜９４頁（２００４年）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはβ−ファルネセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２４６１５（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａ１１）およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ由来のＡＹ８３５３９８が含まれるがこれらに限定されない。Ｐｉｃａｕｄら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６巻（９号）：９６１〜９６７頁（２００５年）。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはファルネソールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５２９２６６およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＤＲ４８１Ｃ（遺伝子Ｐｈｏ８）が含まれるがこれらに限定されない。Ｓｏｎｇ，  Ｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２８巻：１４９〜１５８頁（２００６年）。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはネロリドールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＡＦ５２９２６６（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）が含まれるが、これに限定されない。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはパチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ由来のＡＹ５０８７３０  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５９が含まれるが、これに限定されない。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはヌートカトンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ由来のＡＦ４４１１２４  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６４７およびＰｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ由来のＡＹ９１７１９５  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５３が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドはアビエタジエンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、（Ｕ５０７６８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＡＹ４７３６２１；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
６．４．２  ポリケチドを産生する組換え細胞
【０１２８】
別の態様では、例えば１または複数のポリケチド化合物を組換え産生するように遺伝子改変された細胞または細胞のクローン性集団におけるポリケチド産生を検出する方法が本明細書中で提供される。ポリケチド合成は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に関連する多機能酵素であるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって媒介される。ＰＫＳは、アシルチオエステル、通常はアセチル、プロピオニル、マロニルまたはメチルマロニル間の反復（脱炭酸的）Ｃｌａｉｓｅｎ縮合を介したポリケチドの生合成を触媒する。各縮合後に、ＰＫＳは、成長中のポリケチド鎖のβ−ケト基におけるケト還元、脱水およびエノイル還元を含む還元サイクルの全て、一部を触媒することまたは還元サイクルを触媒しないことにより、ポリケチド産物中に構造上の変動を導入する。
【０１２９】
本明細書中で提供されるポリケチド産生細胞を検出する方法のいくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、遺伝子改変されていない親細胞と比較して、１または複数のポリケチド化合物の増加した産生をもたらす、ＰＫＳ系、即ち、ポリケチドの合成を触媒することが可能な１または複数のＰＫＳをコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３０】
触媒部位が使用される様式が異なる２つの主要なクラスのポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）が存在する：それぞれ、芳香族ＰＫＳおよびモジュラーＰＫＳ。芳香族ＰＫＳについて、最小の系、即ち、ポリケチドの産生を触媒するのに必要な最小の成分は、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性を含む。モジュラーＰＫＳ系について、最小の系は、合成における中間体が基質として提供されることを条件として、ＫＳ触媒領域、ＡＴ触媒領域およびＡＣＰ活性を含む。新規ポリケチド合成が必要とされる場合、最小のモジュラーＰＫＳ系は、さらなるＡＴ領域およびＡＣＰ領域を含む、ローディングアシルトランスフェラーゼをさらに含む。
【０１３１】
従って、いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＫＳ触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードする１より多い異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードする１より多い異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小の芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素およびＡＣＰ活性を含む酵素をそれぞれコードする異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小のモジュラーＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、およびＡＣＰ活性を含む酵素をそれぞれコードする異種ヌクレオチド配列を含む。なお別の特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新規ポリケチド合成のためのモジュラー芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む１または複数の酵素およびＡＣＰ活性を含む１または複数の酵素をそれぞれコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、最小のＰＫＳ系、例えば、上記のような最小の芳香族ＰＫＳ系または最小のモジュラーＰＫＳ系を含むポリケチド産生細胞は、最終産物ポリケチドの産生に寄与し得るさらなる触媒活性をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新生ポリケチド骨格の環化を促進するシクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰのパンテテイニル化をもたらすホロＡＣＰシンターゼ活性を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、合成後ポリケチド改変活性を付与する１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、例えば抗生物質活性を有するポリケチドが所望される場合、ポリケチドの合成後改変をもたらすグリコシラーゼ活性を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ヒドロキシラーゼ活性を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エポキシダーゼ活性を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、メチラーゼ活性を含む酵素をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、以下のポリケチドから選択されるがそれらに限定されないポリケチドを産生することが可能なＰＫＳ酵素およびポリケチド改変酵素をコードする配列などの、異種ヌクレオチド配列を含む：エバーメクチン（例えば、米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第４，７０３，００９号；欧州公開公報１１８，３６７号；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３年、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」；Ｂａｌｔｚ、ＨｅｇｅｍａｎおよびＳｋａｔｒｕｄ編（ＡＳＭ）、２４５〜２５６頁、「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ，  Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，  ａｎｄ  Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ」；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９２年、Ｇｅｎｅ  １１５巻：１１９〜１２５頁；ならびにＩｋｅｄａおよびＯｍｕｒａ、１９９７年、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．９７巻：２５９９〜２６０９頁を参照のこと）；カンジシジン（ＦＲ００８）（例えば、Ｈｕら、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４巻：１６３〜１７２頁を参照のこと）；カルボマイシン、クラマイシン（例えば、Ｂｅｒｇｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年２月；１５巻（１号）：８０〜９頁を参照のこと）；ダウノルビシン（例えば、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４年１０月；１７６巻（２０号）：６２７０〜８０頁を参照のこと）；エポチロン（例えば、ＰＣＴ公開公報９９／６６０２８号；およびＰＣＴ公開公報００／０３１２４７号を参照のこと）；エリスロマイシン（例えば、ＰＣＴ公開公報９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；米国特許第５，８２４，５１３号；Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２巻：６７５〜９頁；およびＣｏｒｔｅｓら、１９９０年１１月８日、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：１７６〜８頁を参照のこと）；ＦＫ−５０６（例えば、Ｍｏｔａｍｅｄｉら、１９９８年；Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６巻：５２８〜５３４頁；およびＭｏｔａｍｅｄｉら、１９９７年、Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４巻：７４〜８０頁を参照のこと）；ＦＫ−５２０（例えば、ＰＣＴ公開公報００／０２０６０１号；およびＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０巻：５７８９〜９６頁を参照のこと）；グリセウシン（例えば、Ｙｕら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４年５月；１７６巻（９号）：２６２７〜３４頁を参照のこと）；ロバスタチン（例えば、米国特許第５，７４４，３５０号を参照のこと）；フレノリシン（Ｆｒｅｎｏｌｙｃｉｎ）（例えば、Ｋｈｏｓｌａら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９３年４月；１７５巻（８号）：２１９７〜２０４頁；およびＢｉｂｂら、Ｇｅｎｅ  １９９４年５月３日；１４２巻（１号）：３１〜９頁を参照のこと）；グラナチシン（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８９年９月；８巻（９号）：２７１７〜２５頁；およびＢｅｃｈｔｏｌｄら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９５年９月２０日；２４８巻（５号）：６１０〜２０頁を参照のこと）；メデルマイシン（例えば、Ｉｃｈｉｎｏｓｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３年７月；１４９巻（７部）：１６３３〜４５頁を参照のこと）；モネンシン（例えば、Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２年８月；２３４巻（２号）：２５４〜６４頁を参照のこと）；ノナクチン（例えば、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０００年２月１日；１８３巻（１号）：１７１〜５頁を参照のこと）；ナナオマイシン（例えば、Ｋｉｔａｏら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  （Ｔｏｋｙｏ）．１９８０年７月；３３巻（７号）：７１１〜６頁を参照のこと）；ネマデクチン（例えば、ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３年、前出を参照のこと）；ニダマイシン（例えば、ＰＣＴ公開公報９８／５１６９５号；およびＫａｋａｖａｓら、１９９７年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９巻：７５１５〜７５２２頁を参照のこと）；オレアンドマイシン（例えば、Ｓｗａｎら、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．２４２巻：３５８〜３６２頁；ＰＣＴ公開公報００／０２６３４９号；Ｏｌａｎｏら、１９９８年、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．２５９巻（３号）：２９９〜３０８頁；およびＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ９９／０５２８３号を参照のこと）；オキシテトラサイクリン（例えば、Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．１９９４年４月８日；１４１巻（１号）：１４１〜２頁を参照のこと）；ピクロマイシン（例えば、ＰＣＴ公開公報９９／６１５９９号；ＰＣＴ公開公報００／００６２０号；Ｘｕｅら、１９９８年、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５巻（１１号）：６６１〜６６７頁；Ｘｕｅら、１９９８年１０月、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１２１１１〜１２１１６頁を参照のこと）；プラテノリド（例えば、欧州公開公報７９１，６５６号；および米国特許第５，９４５，３２０号を参照のこと）；ラパマイシン（例えば、Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年８月、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：７８３９〜７８４３頁；およびＡｐａｒｉｃｉｏら、１９９６年、Ｇｅｎｅ  １６９巻：９〜１６頁を参照のこと）；リファマイシン（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／０７８６８号；およびＡｕｇｕｓｔら、１９９８年２月１３日、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５巻（２号）：６９〜７９頁を参照のこと）；ソランギウム（例えば、米国特許第６，０９０，６０１号を参照のこと）；ソラフェン（例えば、米国特許第５，７１６，８４９号；Ｓｃｈｕｐｐら、１９９５年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７巻：３６７３〜３６７９頁を参照のこと）；スピノシン（Ｓｐｉｎｏｃｙｎ）（例えば、ＰＣＴ公開公報９９／４６３８７号を参照のこと）；スピラマイシン（例えば、米国特許第５，０９８，８３７号を参照のこと）；テトラセノマイシン（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９２年３月；１７４巻（６号）：１８１０〜２０頁；およびＳｈｅｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９２年６月；１７４巻（１１号）：３８１８〜２１頁を参照のこと）；テトラサイクリン（例えば、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００９年１２月９日��１３１巻（４８号）：１７６７７〜８９頁を参照のこと）；タイロシン（例えば、米国特許第５，８７６，９９１号；米国特許第５，６７２，４９７号；米国特許第５，１４９，６３８号；欧州公開公報７９１，６５５号；欧州公開公報２３８，３２３号；Ｋｕｈｓｔｏｓｓら、１９９６年、Ｇｅｎｅ  １８３巻：２３１〜６頁；ならびにＭｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３巻：３４９〜３５５頁を参照のこと）；および６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．１９９９年４月；１巻（２号）：１８０〜７頁；およびＳｈａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６年６月２３日；３４５巻（１号）：１３３〜９頁を参照のこと）。
６．４．３  脂肪酸を産生する組換え細胞
【０１３６】
別の態様では、例えば１または複数の脂肪酸を組換え産生するように遺伝子改変された細胞または細胞のクローン性集団における脂肪酸産生を検出する方法が、本明細書中で提供される。脂肪酸合成は、アシル鎖の開始および伸長を触媒する脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）によって媒介される。アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）は、ＦＡＳ経路中の酵素と共に、産生された脂肪酸の長さ、飽和の程度および分枝を制御する。脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを含む。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成（ｆａｂ）およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅ）遺伝子の酵素によって触媒される。
【０１３７】
本明細書中で提供される脂肪酸産生細胞を検出する方法のいくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、遺伝子改変されていない親細胞と比較して、１または複数の脂肪酸の増加した産生をもたらす、アセチル−ＣｏＡシンターゼおよび／またはマロニル−ＣｏＡシンターゼをコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３８】
例えば、アセチル−ＣｏＡ産生を増加させるために、１または複数の以下の遺伝子が、細胞中で発現され得る：ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルビン酸および２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥＩｐデヒドロゲナーゼ成分およびＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分をコードする）、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰおよびｆａｂＦ。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡとしても公知である、ＡＡＣ７６９５２）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡＣ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、増加した脂肪酸レベルは、脂肪酸分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子を減衰またはノックアウトすることによって、細胞中にもたらされ得る。例えば、ｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｉｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡおよび／またはａｃｋＢの発現レベルは、当該分野で公知の技術を使用して、操作された宿主細胞中で減衰またはノックアウトされ得る。かかるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例示的な例には、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇｓｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、ＩｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａｄｈＥ（ＡＡＣ７４３２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡＣ７５３５６）およびａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）が含まれるがこれらに限定されない。得られた宿主細胞は、適切な環境中で増殖する場合、増加したアセチル−ＣｏＡ産生レベルを有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換できる酵素、例えば、マルチサブユニットＡｃｃＡＢＣＤタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ＡｃｃＡＢＣＤをコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号ＡＡＣ７３２９６、ＥＣ  ６．４．１．２が含まれるが、これに限定されない。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、リパーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。リパーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号ＣＡＡ８９０８７およびＣＡＡ９８８７６が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、増加した脂肪酸レベルは、脂肪酸生合成経路の初期段階（例えば、ａｃｃＡＢＣＤ、ｆａｂＨおよびｆａｂｌ）を阻害する長鎖アシル−ＡＣＰレベルにおける増加を導き得るＰｌｓＢを阻害することによって、細胞中にもたらされ得る。ＰｌｓＢの発現レベルは、当該分野で公知の技術を使用して、操作された宿主細胞中で減衰またはノックアウトされ得る。ＰｌｓＢをコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号ＡＡＣ７７０１１が含まれるが、これに限定されない。特定の実施形態では、ｐｌｓＢ  Ｄ３１  ＩＥ変異が、細胞中の利用可能なアシル−ＣｏＡの量を増加させるために使用され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、モノ不飽和脂肪酸の増加した産生は、ｆａｂＡの抑制を生じるｓｆａ遺伝子を過剰発現させることによって細胞中にもたらされ得る。ｓｆａをコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号ＡＡＮ７９５９２が含まれるが、これに限定されない。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、増加した脂肪酸レベルは、脂肪酸基質の鎖長を制御する酵素、例えばチオエステラーゼの発現をモジュレートすることによって、細胞中にもたらされ得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、ｔｅｓ遺伝子またはｆａｔ遺伝子を過剰発現するように改変されている。適切なｔｅｓヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号：（ｔｅｓＡ：ＡＡＣ７３５９６、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することが可能）および（ｔｅｓＢ：ＡＡＣ７３５５５、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）が含まれるがこれらに限定されない。適切なｆａｔヌクレオチド配列の例示的な例には、（ｆａｔＢ：Ｑ４１６３５およびＡＡＡ３４２１５、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ由来、Ｃ１２：０脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＢ２：Ｑ３９５１３およびＡＡＣ４９２６９、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ８：０〜Ｃ１０：０脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＢ３：ＡＡＣ４９２６９およびＡＡＣ７２８８１、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ１４：０〜Ｃ１６：０脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＢ：Ｑ３９４７３およびＡＡＣ４９１５１、Ｃｉｎｎａｍｏｎｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ由来、Ｃ１４：０脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＢ［Ｍ１４１Ｔ］：ＣＡＡ８５３８８、ｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来、Ｃ１６：１脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＡ：ＮＰ  １８９１４７およびＮＰ１９３０４１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＡ：ＣＡＣ３９１０６、Ｂｒａｄｖｒｈｉｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を優先的に産生することが可能）、（ｆａｔＡ：ＡＡＣ７２８８３、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することが可能）および（ｆａｔＡ１、ＡＡＬ７９３６１、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ由来）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、増加したレベルのＣ１０脂肪酸は、当該分野で公知の技術を使用して、チオエステラーゼＣ１８の発現または活性を減衰させることによって、細胞中にもたらされ得る。チオエステラーゼＣ１８をコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号ＡＡＣ７３５９６およびＰ０ＡＤＡ１が含まれるがこれらに限定されない。他の実施形態では、増加したレベルのＣ１０脂肪酸は、当該分野で公知の技術を使用して、チオエステラーゼＣ１０の発現または活性を増加させることによって、細胞中にもたらされ得る。チオエステラーゼＣ１０をコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号Ｑ３９５１３が含まれるが、これに限定されない。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、増加したレベルのＣ１４脂肪酸は、当該分野で公知の技術を使用して、非Ｃ１４脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減衰させることによって、細胞中にもたらされ得る。他の実施形態では、増加したレベルのＣ１４脂肪酸は、当該分野で公知の技術を使用して、基質Ｃ１４−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現または活性を増加させることによって、細胞中にもたらされ得る。かかるチオエステラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号Ｑ３９４７３が含まれるが、これに限定されない。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、増加したレベルのＣ１２脂肪酸は、当該分野で公知の技術を使用して、非Ｃ１２脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減衰させることによって、細胞中にもたらされ得る。他の実施形態では、増加したレベルのＣ１２脂肪酸は、当該分野で公知の技術を使用して、基質Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現または活性を増加させることによって、細胞中にもたらされ得る。かかるチオエステラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の例示的な例には、受託番号Ｑ４１６３５が含まれるが、これに限定されない。
６．４．４  さらなる遺伝子改変
【０１４８】
本明細書中で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態では、１または複数の水不混和性化合物を産生するように操作された遺伝子改変細胞は、産業的発酵に関して有用な特性を細胞に付与する１または複数の遺伝子改変をさらに含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、細胞は、フロキュレーションを増加させる１または複数のタンパク質をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。フロキュレーションは、微生物細胞の、無性的で可逆的なカルシウム依存性の凝集であり、液体増殖基質の底に迅速に沈殿する、多数の細胞を含むフロックを形成する。フロキュレーションは、産業的発酵においてそこから製造される発酵製品から懸濁酵母細胞を分離するプロセスを大いに簡略化するので、酵母の産業的発酵において、例えば、バイオエタノール、ワイン、ビールおよび他の製品の製造のために重要なものである。分離は、遠心分離または濾過によって達成され得るが、これらの方法による分離は、時間もお金もかかる。清澄化は、微生物細胞の天然の沈降によって代替的に達成され得る。単一の微生物細胞は時間とともに沈降する傾向があるが、天然の沈降は、細胞が凝集する（即ち、フロキュレートする）場合にのみ、産業的加工において実行可能な選択肢となる。最近の研究により、酵母細胞のフロキュレーション挙動は、特定の産業上の要件を満たすために、厳密に制御され微調整され得ることが実証されている（例えば、Ｇｏｖｅｒｎｄｅｒら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７４巻（１９号）：６０４１〜５２頁（２００８年）を参照のこと、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。酵母細胞のフロキュレーション挙動は、ＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ８、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０およびＦＬＯ１１遺伝子の産物が含まれるがこれらに限定されない特定のフロキュレーションタンパク質の機能に依存している。従って、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される１または複数の水不混和性化合物を産生するように操作された遺伝子改変細胞は、Ｆｌｏ１ｐ、Ｆｌｏ５ｐ、Ｆｌｏ８ｐ、Ｆｌｏ９ｐ、Ｆｌｏ１０ｐおよびＦｌｏ１１ｐからなる群から選択される１または複数のフロキュレーションタンパク質をコードする１または複数の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、細胞は、胞子形成が損なわれているおよび／または内因性交配が損なわれている。胞子形成および／または内因性交配が損なわれた遺伝子改変微生物細胞は、以下のリスクが低下している：（１）播種の性質；および（２）性質上播種するその能力が損なわれない遺伝子改変微生物細胞と野生型微生物との間の遺伝物質の交換。酵母では、二倍体微生物細胞が胞子形成する能力および一倍体微生物細胞が交配する能力は、特定の遺伝子産物の機能に依存する。これらのうち、酵母では、胞子形成遺伝子、例えば、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１遺伝子の産物、ならびにフェロモン応答遺伝子、例えば、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１遺伝子の産物である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の以下のフェロモン応答遺伝子が機能的に破壊された一倍体酵母細胞である：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１。いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の以下の胞子形成遺伝子が機能的に破壊された一倍体酵母細胞である：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１。いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の以下のフェロモン応答遺伝子：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１、ならびに１または複数の以下の胞子形成遺伝子：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１が機能的に破壊された、一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊された、一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊され、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊され、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、一倍体酵母細胞である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の以下のフェロモン応答遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊された二倍体酵母細胞である：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１。いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の以下の胞子形成遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊された二倍体酵母細胞である：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１。いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の以下のフェロモン応答遺伝子：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１の両方のコピー、ならびに１または複数の以下の胞子形成遺伝子：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１の両方のコピーが機能的に破壊された、二倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊された二倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊され、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、二倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊され、メバロネートをメバロン酸５−ホスフェートに変換できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、二倍体酵母細胞である。
【０１５３】
フロキュレーションタンパク質をコードする異種配列の導入のため、ならびに１または複数の胞子形成遺伝子および／またはフェロモン応答遺伝子の機能的破壊のために有用な方法および組成物は、米国特許出願公開公報２０１０／０３０４４９０号および米国特許出願公開公報２０１０／０３１１０６５号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、細胞は、１または複数の生合成遺伝子中に機能的破壊を含み、この細胞は、この破壊の結果として栄養要求性である。特定の実施形態では、細胞は、抗生物質化合物に対する耐性を付与する異種ヌクレオチド配列を含まない。他の実施形態では、細胞は、１または複数の選択マーカー遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの例示的な例には、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲおよびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が含まれるがこれらに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢＬＡ遺伝子産物は、ベータ−ラクタム系抗生物質（例えば、狭いスペクトルのセファロスポリン、セファマイシンおよびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドールならびにセフォペラゾン）、およびテモシリン以外の全ての抗グラム陰性細菌ペニシリンに対する耐性を付与する；Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ由来のＮＡＴ１遺伝子産物は、ノーセオスリシンに対する耐性を付与する；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのＴｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物は、ビアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対する耐性を付与する；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジンＡ（Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａ）（ＡｂＡ）に対する耐性を付与する；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに対する耐性を付与する；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメチュロンメチルに対する耐性を付与する；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに対する耐性を付与する；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する；Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子産物は、単一の窒素供給源としてＤ−セリンを含むプレート上で細胞が増殖することを可能にする；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を付与する；およびＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性マーカーは、例えば、増加した水不混和性化合物産生をもたらすために細胞が遺伝子改変された後に、宿主細胞ゲノムから切り出される。遺伝子改変宿主細胞のゲノムからの、ヌクレオチド配列、例えば、かかる抗生物質耐性マーカーをコードする配列の正確な切り出しに有用な方法および組成物は、２０１０年１２月２３日出願の米国特許出願１２／９７８，０６１号に記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、遺伝子改変微生物細胞における栄養要求性（例えば、栄養素栄養要求性）をレスキューする。かかる実施形態では、親微生物細胞は、アミノ酸またはヌクレオチドの生合成経路において機能する１または複数の遺伝子産物、例えば、酵母中のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２およびＵＲＡ３遺伝子産物中に機能的破壊を含み、１または複数の栄養素の補給なしには培地中で親微生物細胞が増殖できないようにしている（栄養要求性表現型）。次いで、栄養要求性表現型は、破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクターまたは染色体組込みによって親微生物細胞を形質転換することによってレスキューされ得、生成された遺伝子改変微生物細胞は、親微生物細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択され得る。選択マーカーとしてのＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２遺伝子の利用は、陽性および陰性の両方の選択が可能であるので、顕著な利点を有する。陽性選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２変異の栄養要求性補完によって実施され、陰性選択は、原栄養性株の増殖を防止するが、それぞれＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２変異体の増殖を可能にする特異的インヒビター、即ち、それぞれ５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸およびａ−アミノアジピン酸（ａＡＡ）に基づく。
【０１５６】
他の実施形態では、選択マーカーは、公知の選択方法によって同定され得る他の非致死性の欠損または表現型をレスキューする。
【０１５７】
例えば、宿主細胞における１または複数の水不混和性化合物の増加した産生をもたらすために、あるいは上記のようにかかる細胞に有用な特性を付与するために、発現ベクターまたは染色体組込み構築物を使用して微生物を遺伝子改変する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｆ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９７８年）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，  Ｃ．ら（編）Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ．を参照のこと；これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、例えば、細胞における１または複数の水不混和性化合物の増加した産生を生じる、遺伝子発現の阻害は、欠失、変異および／または遺伝子再編成によって達成され得る。これは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、三本鎖ＤＮＡならびに転写および／または翻訳インヒビターの使用によっても実施され得る。さらに、例えば、プロモーターとコード領域との間、または２つの隣接遺伝子間にトランスポゾンを挿入して、一方または両方の遺伝子を不活化することによって、遺伝子発現を破壊するために、トランスポゾンが使用され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、細胞における水不混和性化合物の増加した産生は、特定のタンパク質、例えば、上記のような生合成経路に関与するタンパク質を発現させる発現ベクターの使用によってもたらされる。一般に、発現ベクターは、複製シグナルおよび発現制御配列、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターおよびターミネーターを含む組換えポリヌクレオチド分子である。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるために有用な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）、プラスミドベクターおよびコスミドが含まれる。酵母細胞での使用に適した発現ベクターの例示的な例には、ＣＥＮ／ＡＲＳおよび２μプラスミドが含まれるがこれらに限定されない。酵母細胞での使用に適したプロモーターの例示的な例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制可能なプロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、および誘導性プロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトース誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）。
【０１５９】
発現ベクターおよび染色体組込み構築物は、当業者に公知の任意の限定されない方法によって、微生物細胞中に導入され得る。例えば、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５巻：１２９２〜３頁（１９７８年）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５巻：３３７６〜３３８５頁（１９８５年）；米国特許第５，２７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、編、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照のこと。例示的技術には、スフェロプラスティング、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００媒介性の形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性の形質転換が含まれるがこれらに限定されない。
【実施例】
【０１６０】
（実施例１）
遺伝子改変一倍体細胞の生成
【０１６１】
この実施例は、イソプレノイドを産生するように操作された遺伝子改変一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の生成を記載する。
【０１６２】
Ｐｈａｓｅ  Ｉ組込み構築物は、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の制御下に、選択マーカー（ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するｈｙｇＡ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＶ経路の２つの酵素（切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする切断型ＨＭＧ１コード配列およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３コード配列）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの別の酵素（アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＥＲＧ１０コード配列）をコードするヌクレオチド配列を組込み配列として含み、これらには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ８０遺伝子座の上流および下流のヌクレオチド配列からなる相同配列が隣接する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞中への導入に際し、Ｐｈａｓｅ  Ｉ組込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＧＡＬ８０遺伝子座中に相同組換えによって組み込むことができ、ＧＡＬ８０コード配列をその組込み配列で置き換えることによって、ＧＡＬ８０遺伝子座を機能的に破壊できる。Ｐｈａｓｅ  Ｉ組込み構築物を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ−Ｐｈａｓｅ  Ｉ組込み構築物を得た。この構築物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上で増殖させたＴＯＰ１０細胞中で増殖させた。
【０１６３】
Ｐｈａｓｅ  ＩＩ組込み構築物は、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の制御下に、選択マーカー（ノーセオスリシンに対する耐性を付与するｎａｔＡ）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＶ経路のいくつかの酵素（メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２コード配列およびホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８コード配列）をコードするヌクレオチド配列；ならびにＧＡＬ４ｏｃプロモーター（ＭＩＧ１結合部位を除去する、従ってグルコースによる抑制に対するプロモーターの感受性を低くする変異を含むＧＡＬ４プロモーター）の制御下にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４遺伝子のコード配列を、組込み配列として含み、これらには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＥＵ２遺伝子座の上流および下流のヌクレオチド配列からなる相同配列が隣接する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞中への導入に際し、Ｐｈａｓｅ  ＩＩ組込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＬＥＵ２遺伝子座中に相同組換えによって組み込むことができ、ＬＥＵ２コード配列をその組込み配列で置き換えることによって、ＬＥＵ２遺伝子座を機能的に破壊できる。Ｐｈａｓｅ  ＩＩ組込み構築物を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター中にクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ−Ｐｈａｓｅ  ＩＩ組込み構築物を得た。この構築物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上で増殖させたＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で増殖させた。
【０１６４】
Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み構築物は、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７のプロモーター）の制御下に、選択マーカー（Ｇ４１８に対する耐性を付与するｋａｎＡ）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＶ経路の酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９コード配列）およびＭＥＶ経路の産物ＩＰＰをＦＰＰに変換することに関与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの酵素（ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするＥＲＧ２０コード配列およびイソペンテニルピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするＩＤＩ１コード配列）をコードするヌクレオチド配列；ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＴＲ３遺伝子のプロモーターを、組込み配列として含み、これらには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ９遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびコードヌクレオチド配列が隣接する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞中への導入に際し、Ｐｈａｓｅ  ＩＩ組込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＥＲＧ９遺伝子座の上流に相同組換えによって組み込むことができ、ＥＲＧ９（スクアレンシンターゼ）の発現が銅によってモジュレートできるように、ネイティブのＥＲＧ９プロモーターをＣＴＲ３プロモーターで置き換えできる。Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み構築物を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター中にクローニングし、プラスミドＴＯＰＯ−Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み構築物を得た。この構築物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上で増殖させたＴＯＰ１０細胞中で増殖させた。
【０１６５】
Ｐｈａｓｅ  Ｉマーカーリサイクル構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの調節的制御下に、選択マーカー（ウラシルを欠く培地上で増殖する能力を付与するＵＲＡ３）；およびＡ．ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含み、これらには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ８０遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子のコード配列が隣接する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞中への導入に際し、Ｐｈａｓｅ  Ｉマーカーリサイクル構築物は、既に組み込まれたＰｈａｓｅ  Ｉ組込み配列中に相同組換えによって組み込むことができ、その結果、選択マーカーｈｐｈＡがＵＲＡ３で置き換えられる。
【０１６６】
Ｐｈａｓｅ  ＩＩマーカーリサイクル構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの調節的制御下に、選択マーカー（ウラシルを欠く培地上で増殖する能力を付与するＵＲＡ３）およびＡ  ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含み、これらには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＥＵ２遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１２遺伝子のコード配列が隣接する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞中への導入に際し、Ｐｈａｓｅ  ＩＩマーカーリサイクル構築物は、既に組み込まれたＰｈａｓｅ  ＩＩ組込み配列中に相同組換えによって組み込むことができ、その結果、選択マーカーｎａｔＡがＵＲＡ３で置き換えられる。
【０１６７】
Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩマーカーリサイクル構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの調節的制御下に、選択マーカー（ウラシルを欠く培地上で増殖する能力を付与するＵＲＡ３）およびＡ  ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードするＦＳコード配列）をコードするヌクレオチド配列を含み、これらには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ９遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１９遺伝子のコード配列が隣接する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞中への導入に際し、Ｐｈａｓｅ  ＩＩマーカーリサイクル構築物は、既に組み込まれたＰｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み配列中に相同組換えによって組み込むことができ、その結果、選択マーカーｋａｎＡがＵＲＡ３で置き換えられる。
【０１６８】
発現プラスミドｐＡＭ４０４は、β−ファルネセンシンターゼをコードする。ヌクレオチド配列挿入を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のためにコドン最適化されたＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａのβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８３５３９８）を鋳型として使用して、合成により生成した。
【０１６９】
スターター宿主株Ｙ１１９８を、１００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン（ｃａｒｂａｍｉｃｉｌｌｉｎ）および５０ｕｇ／ｍＬカナマイシンを含むＹＰＤ培地５ｍＬ中に、活性乾燥ＰＥ−２酵母（１９９４年に単離された；Ｓａｎｔｅｌｉｓａ  Ｖａｌｅ、Ｓｅｒｔａｏｚｉｎｈｏ、Ｂｒａｚｉｌからの贈与）を再懸濁することによって生成した。培養物を、ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍ、３０℃で一晩インキュベートした。次いで、培養物の１０ｕＬアリコートを、ＹＰＤプレート上にプレートし、乾燥させた。細胞を、シングルコロニーになるまで連続してストリークし、３０℃で２日間インキュベートした。１２個のシングルコロニーを取り、新たなＹＰＤプレート上に貼り付け、３０℃で一晩増殖させた。コロニーの株の正体を、製造業者の仕様書に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｌｕｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  ＤＲ  ＩＩ系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、その染色体サイズを分析することによって、検証した。１つのコロニーを取り、株Ｙ１１９８としてストックした。
【０１７０】
株Ｙ１６６１、Ｙ１６６２、Ｙ１６６３およびＹ１６６４を、株Ｙ１１９８を一倍体にして遺伝子操作を可能にすることによって、この株から生成した。株Ｙ１１９８を、ローラードラム中のガラス管中で、５ｍＬのＹＰＤ培地中で３０℃で一晩増殖させた。ＯＤ６００を測定し、細胞を、２％酢酸カリウムを含むＹＰ培地５ｍＬ中で、０．２のＯＤ６００に希釈した。培養物を、ローラードラム中のガラス管中で３０℃で一晩増殖させた。ＯＤ６００を再度測定し、４ＯＤ６００＊ｍＬの細胞を、５，０００×ｇで２分間の遠心分離によって収集した。細胞ペレットを滅菌水で１回洗浄し、次いで、０．０２％ラフィノースを含む２％酢酸カリウム３ｍＬ中で再懸濁した。細胞を、ローラードラム中のガラス管中で、３０℃で３日間増殖させた。胞子形成を顕微鏡で確認した。培養物の３３μＬアリコートを、１．５ｍＬ遠心管に移し、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。細胞ペレットを、１０ｍｇ／ｍＬ  Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）２μＬを含む滅菌水５０μＬ中に再懸濁し、細胞を、３０℃の水浴中で１０分間インキュベートした。管を氷上に移し、１５０μＬの氷冷水を添加した。この混合物の１０μＬアリコートを、１２ｍＬのＹＰＤプレートに添加し、テトラドを、Ｓｉｎｇｅｒ  ＭＳＭ  ３００解剖顕微鏡（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＵＫ）で解体した。ＹＰＤプレートを３０℃で３日間インキュベートし、その後、胞子を新たなＹＰＤプレート上に貼り付け、３０℃で一晩増殖させた。８つの４胞子テトラド由来の各胞子の交配型を、コロニーＰＣＲで分析した。２ＭＡＴａ胞子および２ＭＡＴα胞子を有する単一の４胞子テトラドを取り、株Ｙ１６６１（ＭＡＴａ）、Ｙ１６６２（ＭＡＴａ）、Ｙ１６６３（ＭＡＴα）およびＹ１６６４（ＭＡＴα）としてストックした。
【０１７１】
酵母細胞形質転換について、２５ｍｌのイーストエキストラクトペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地に、出発宿主株のシングルコロニーを接種した。培養物を、ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍ、３０℃で一晩増殖させた。培養物のＯＤ６００を測定し、次いで培養物を使用して、５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種して０．１５のＯＤ６００にした。新たに接種した培養物を、ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍで３０℃で増殖させて、０．７〜０．９のＯＤ６００にし、この時点で、細胞を１μｇのＤＮＡで形質転換した。細胞を、ＹＰＤ培地中で４時間回復させ、その後、選択剤を含む寒天上にプレートして、宿主細胞形質転換体を同定した。
【０１７２】
宿主株Ｙ１５１５を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して完了するまで消化されたプラスミドＴＯＰＯ−Ｐｈａｓｅ  Ｉ組込み構築物で株Ｙ１６６４を形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体を、３００ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ培地上で選択し、ＧＡＬ８０遺伝子座において組み込まれたＰｈａｓｅ  Ｉ組込み配列を含む陽性形質転換体を、ＰＣＲ増幅によって検証した。
【０１７３】
宿主株Ｙ１７６２を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して完了するまで消化されたプラスミドＴＯＰＯ−Ｐｈａｓｅ  ＩＩ組込み構築物で株Ｙ１５１５を形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体を、１００ｕｇ／ｍＬノーセオスリシンを含むＹＰＤ培地上で選択し、ＬＥＵ２遺伝子座において組み込まれたＰｈａｓｅ  ＩＩ組込み配列を含む陽性形質転換体を、ＰＣＲ増幅によって検証した。
【０１７４】
宿主株Ｙ１７７０を、発現プラスミドｐＡＭ４０４およびＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して完了するまで消化されたプラスミドＴＯＰＯ−Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み構築物で、２ステップで株Ｙ１７６２を形質転換することによって生成した。ｐＡＭ４０４を有する宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびロイシンを欠く完全合成培地（ＣＳＭ）上で選択した。ｐＡＭ４０４およびＰｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み構築物を有する宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびロイシンを欠き２００ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））を含むＣＳＭ上で選択し、ＥＲＧ９遺伝子座において組み込まれたＰｈａｓｅ  ＩＩＩ組込み配列を含む陽性形質転換体を、ＰＣＲ増幅によって検証した。
【０１７５】
宿主株Ｙ１７９３を、ＵＲＡ３ノックアウト構築物で株Ｙ１７７０を形質転換することによって生成した。ＵＲＡ３ノックアウト構築物は、ＵＲＡ３遺伝子座（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ２ゲノムＤＮＡから生成した）の上流および下流の配列を含む。宿主細胞形質転換体を、５−ＦＯＡを含むＹＰＤ培地上で選択した。
【０１７６】
宿主株ＹＡＡＡを、Ｐｈａｓｅ  Ｉマーカーリサイクル構築物で株Ｙ１７９３を形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠くＣＳＭ上で選択した。ＵＲＡ３マーカーを、ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍ、３０℃でＹＰＤ培地中で細胞を一晩増殖させ、次いで５−ＦＯＡを含む寒天上に細胞をプレートすることによって切り出した。マーカー切り出しを、コロニーＰＣＲによって確認した。
【０１７７】
宿主株ＹＢＢＢを、Ｐｈａｓｅ  ＩＩマーカーリサイクル構築物で株ＹＡＡＡを形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠くＣＳＭ上で選択した。ＵＲＡ３マーカーを、ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍ、３０℃でＹＰＤ培地中で細胞を一晩増殖させ、次いで５−ＦＯＡを含む寒天上に細胞をプレートすることによって切り出した。マーカー切り出しを、コロニーＰＣＲによって確認した。
【０１７８】
宿主株Ｙ１９１２を、Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩマーカーリサイクル構築物で株ＹＢＢＢを形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびウラシルを欠くＣＳＭ上で選択した。ＵＲＡ３マーカーを、ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍ、３０℃でＹＰＤ培地中で細胞を一晩増殖させ、次いで５−ＦＯＡを含む寒天上に細胞をプレートすることによって切り出した。マーカー切り出しを、コロニーＰＣＲによって確認した。
（実施例２）
組換え産生された水不混和性化合物（ＷＩＣ）を特異的に検出するためのスペクトル条件の決定
【０１７９】
この実施例は、親油性色素Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄを使用して、実施例１に記載したように調製された組換え酵母細胞の集団によって産生されたファルネセンの特異的検出のために有用なスペクトル条件を決定するための例示的方法を提供する。以下に実証するように、これらのスペクトル条件は、細胞膜特異的（即ちバイオマス特異的）蛍光の溢流が殆どなし〜全くなしに、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄにより発光されたファルネセン特異的蛍光の検出を可能にし、従って、バイオマスによって影響を受けないファルネセン産生の評価が可能になる。組換え化合物産生のバイオマス非依存的評価は、複数の細胞集団を比較する場合に、例えば、組換え産生体のライブラリーをスクリーニングする場合に重要であり、このとき細胞の生存およびバイオマスは、組換え産物の産生によって負の影響を受け得る。
【０１８０】
Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄは、哺乳動物細胞、細菌、酵母および微細藻類を含む動物細胞および微生物の脂質内容物を評価するために頻繁に使用されてきた脂溶性蛍光色素である。これらの研究は、広い見地から、公知の非極性溶媒または中性脂質の励起最大および発光最大に大まかに基づいたスペクトル条件下での、天然に産生された細胞内脂質の検出に焦点を当てている。Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １００巻：９６５〜９７３頁（１９８５年））は、黄金色蛍光について、即ち、４５０〜５００ｎｍの励起波長および＞５２８ｎｍの発光波長で細胞を観察した場合に、細胞質脂質滴に対する選択性が得られたことを報告した。これらのスペクトル条件は、光学顕微鏡またはフローサイトメトリーで観察した単一細胞内の細胞膜から中性脂質滴を識別するのに充分であるとされていたが、特に分光光度的検出による、変動する光学密度（ＯＤ）の細胞集団中の細胞膜が寄与する黄金色蛍光の量の評価は行わなかった。さらに、細胞外溶液中に分泌または拡散される脂質または他の中性化合物をＮｉｌｅ  Ｒｅｄが検出する能力の評価は行わなかった。
【０１８１】
変動するＯＤの細胞集団の存在下でのファルネセンの黄金色蛍光へのバイオマス特異的な寄与を決定するために、細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを準備し、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色し、黄金色スペクトルでの蛍光を検出した。図１中に示すように、ＯＤ５、１０、１５、２０および２５のナイーブ酵母細胞の集団ならびに細胞なし対照を、９６ウェルマイクロタイタープレートのｘ軸に沿って増殖培地中にプレートし、漸増濃度の精製ファルネセン（０、２、４、６、８および１０ｇ／Ｌ）を、ｙ軸に沿ってウェルに添加した。Ｎｉｌｅ  ＲｅｄのＤＭＳＯ中１００μｇ／ｍｌの溶液２μｌを、細胞および／またはファルネセンを含む溶液９８μｌに添加した。黄金色スペクトル内の２つの異なるスペクトル条件：（１）４８８ｎｍの励起波長および５１５ｎｍの発光波長（図１）；および（２）５００ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長（図２）、の下で、マトリクスを観察した。
【０１８２】
図１中に示されるように、４８８ｅｘ／５１５ｅｍで観察した場合、蛍光は、漸増細胞密度および漸増ファルネセンの両方によって高度に影響を受ける。蛍光は、ｙ軸に沿った漸増ファルネセン濃度と共に増加するが、蛍光は、ｘ軸に沿った漸増細胞密度と共にも増加する。特に、ファルネセンの非存在下でのＯＤ５〜ＯＤ２５間の蛍光における差異は、３倍よりも大きかった。類似の結果が５００ｅｘ／５５０ｅｍで観察され（図２Ａ）、このときファルネセンの非存在下でのＯＤ５〜ＯＤ２５間の蛍光における差異は、５倍近かった。漸増細胞密度にわたるファルネセン濃度対蛍光単位のプロットは、Ｒ２＝０．６５０の比較的低い相関係数を示した（５００ｅｘ／５５０ｅｍ；図２Ｂ）。従って、黄金色スペクトル内のスペクトル条件下で、蛍光は、ファルネセンおよびバイオマスの両方に帰すると言うことができる。これらのデータは、黄金色スペクトル（４５０〜５００ｎｍの励起波長および５１８〜５５０ｎｍの発光波長）内で動作するＮｉｌｅ  Ｒｅｄ検出スキームが、変動する細胞数を有する細胞集団の調査を必要とする適用、例えば、ＷＩＣ産生細胞のライブラリーのハイスループットスクリーニングとは不適合であり得ることを示す。この設定において、高いバイオマスを有するが低いＷＩＣ産生を有する試料は、低いバイオマスを有するが高いＷＩＣ産生を有する試料から容易に識別できない可能性がある。
【０１８３】
次に、細胞による寄与が殆どなし〜全くなしに、蛍光がファルネセンに大部分帰するといえるまたは専ら帰するといえるときの励起／発光波長ペアが同定できるか否かを決定するための実験を実施した。１つの設定では、発光波長を５５０ｎｍで一定に維持し、励起スペクトルを、２５０ｎｍから５２０ｎｍで発生させた（図３Ａ）。第２の設定では、励起波長を２９０ｎｍで一定に維持し、発光スペクトルを３３０ｎｍから７１０ｎｍで発生させた（図３Ｂ）。３つの試料を、これらのスペクトル条件下で試験した：（１）１０ｇ／Ｌファルネセン、細胞なし；（２）ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞、ファルネセンなし；および（３）１０ｇ／Ｌファルネセン＋ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞。
【０１８４】
図３Ａは、５５０ｎｍの発光波長での励起スペクトルを示す。以前の結果と一致して、５００ｅｘ／５５０ｅｍにおける検出は、細胞単独について約２０００の相対蛍光単位（ＲＦＵ）のシグナル、ファルネセン単独について約５０００ＲＦＵのシグナル、および細胞＋ファルネセンについて約１４０００ＲＦＵのシグナルを生じる。従って、細胞をファルネセンと組み合わせた場合、５００ｅｘ／５５０ｅｍにおいてアーチファクトは上昇するように見え、ここで、組み合わせからの蛍光は、細胞およびファルネセンそれぞれからの蛍光の合計を大きく超える。対照的に、２６０〜２９０ｎｍの励起範囲および５５０ｎｍでの発光において、ファルネセン単独からの蛍光は、ファルネセン＋細胞と同程度であり、細胞単独からの蛍光は、バックグラウンドレベルに近い。２９０／５５０の励起／発光波長ペアもまた、図３Ｂに示すように、２９０ｎｍの励起波長における発光スペクトルを考慮して、好都合であることが観察された。５３０ｎｍから５７０ｎｍの発光波長の範囲で、細胞単独からの蛍光寄与はバックグラウンドレベルに近く、ファルネセンのみのシグナルはその発光ピークに近い。
【０１８５】
ファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄの２９０ｅｘ／５５０ｅｍでの検出が、漸増細胞密度によって影響を受けないことを確認するために、細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを、上記のように準備し、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色した。図４Ａに示すように、蛍光は、ｙ軸に沿った漸増ファルネセン濃度と共に増加するが、蛍光は、ｘ軸に沿った漸増細胞密度と共にはほぼ変化しない。さらに、漸増細胞密度にわたるファルネセン濃度対蛍光単位のプロットは、Ｒ２＝０．９１８の高度に改善された相関係数を示す（図４Ｂ）。
【０１８６】
これらの結果は、選択スペクトル条件下、例えば、２６０〜２９０ｎｍの励起波長および５３０〜５７０ｎｍの発光波長で、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄが、ファルネセン、例えば酵母細胞の集団によって組換え産生され分泌されたファルネセンの選択的検出に使用され得ることを実証し、このとき、バイオマスからの蛍光は大部分が排除される。さらに、これらの結果は、組換え産生された水不混和性化合物に結合した色素を検出するのに選択的な、蛍光色素に関するスペクトル条件を決定するために本明細書中で提供された一般的方法の検証を提供する。
（実施例３）
バイオマスを特異的に検出するためのスペクトル条件の決定
【０１８７】
実施例２に記載される研究は、ファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄからの蛍光の検出がバイオマスからの蛍光によって影響を受けないスペクトル条件を同定することを求めるものであった。さらなる研究を実施して、自己蛍光を介したバイオマスの検出がファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄからの蛍光によって影響を受けないスペクトル条件を同定した。ファルネセンおよびバイオマスの個別ではあるが特異的な測定により、例えばハイスループットＮｉｌｅ  Ｒｅｄスクリーニングの間に細胞集団を階層化およびランク付けするために使用され得るファルネセン：バイオマスの正確な比が得られ得る。
【０１８８】
ファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄによる寄与が殆どなし〜全くなしに、蛍光が細胞の自己蛍光に大部分帰するといえるまたは専ら帰するといえるときの励起／発光波長ペアが同定できるか否かを決定するための実験を実施した。励起波長を３５０ｎｍで一定に維持し、発光スペクトルを、４３０ｎｍから７５０ｎｍで発生させた。３つの試料を、これらのスペクトル条件下で試験した：（１）１０ｇ／Ｌファルネセン、細胞なし；（２）ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞、ファルネセンなし；および（３）１０ｇ／Ｌファルネセン＋ＯＤ２５のナイーブ酵母細胞。
【０１８９】
図５は、３５０ｎｍの励起波長での発光スペクトルを示す。３５０ｅｘ／４３０ｅｍは、細胞単独について約１０００ＲＦＵのシグナル、ファルネセン単独について０ＲＦＵに近いシグナルを生じる。しかし、細胞＋ファルネセンの組み合わせは、細胞単独と比較して、蛍光における実質的な増加を生じた（約１４５０ＲＦＵ）。対照として、３５０ｎｍでの励起および４７０〜５１０ｎｍの発光範囲で、細胞＋ファルネセンからの蛍光は、細胞単独よりも僅かに大きいだけであり、ファルネセン単独からの蛍光は、バックグラウンドレベルに近い。
【０１９０】
細胞の自己蛍光３５０ｅｘ／４９０ｅｍが、漸増ファルネセンによって影響を受けないことを確認するために、細胞／ファルネセン力価決定マトリクスを、上記のように準備し、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで染色した。図６に示すように、蛍光は、ｘ軸に沿った漸増細胞密度と共に増加するが、蛍光は、ｙ軸に沿った漸増ファルネセン濃度と共にはほぼ変化しない。さらに、漸増ファルネセン濃度にわたる細胞密度対蛍光単位のプロットは、Ｒ２＝０．９５５の相関係数を示す（図６Ｂ）。これらの結果は、選択スペクトル条件下、例えば、約３５０の励起波長および４７０〜５１０ｎｍの発光波長で、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄが酵母細胞バイオマスの選択的検出に使用され得ることを実証し、このとき、ファルネセンに結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄからの蛍光は大部分が排除される。バイアスのかかっていないバイオマス読み取りを決定するこの方法は、ＷＩＣの組換え産生に利用され得る任意の細胞型に対して外挿され得る。
（実施例４）
ハイスループットスクリーニング
【０１９１】
この実施例は、実施例１に記載のように調製した組換え酵母細胞におけるファルネセン産生についてのハイスループットＮｉｌｅ  Ｒｅｄスクリーニングのための例示的方法を提供する。
【０１９２】
【表１】
2014519028.tif 000003
【０１９３】
前培養プレートの調製
【０１９４】
シングルコロニーを、寒天プレートから、３６０μｌのＢＳＭ  ２％スクロース０．２５Ｎ＋ｃｒｂ（前培養培地）を含む１．１ｍｌの９６ウェルプレート中に取る。培地へのカルベニシリンの添加は、アッセイ性能に影響を与えることなく、細菌汚染を低下させることが見出されている。低い変動係数（ＣＶ）を維持するために、全てのコロニーを、全て同様に処理した新たな寒天プレートから取ることが好ましい。１セットを４℃で数日間保存した２セットのプレートからのコロニーを使用することで、高いＣＶと、予測したように増殖できないおよび機能できないウェルの数によって定量される一様でないライブラリー性能とが導かれ得る。一旦新たなコロニーを接種すると、前培養プレートは、ライブラリー性能における微量な減少のみを伴って、最大２日間まで４℃で保存され得る。
【０１９５】
前培養プレートを、通気性メンブレンシールで密封し、培養物を、１０００ＲＰＭで振盪しながら、３３．５℃、湿度８０％で９６時間インキュベートする。通気性レーヨンプレートシールは、蒸発に起因する体積喪失を最小化し、好気的培養を維持するための適切な酸素移行を可能にする。複数のプレートをインキュベートする場合、プレート位置の偏りは、積み重ねたプレートを１ｃｍのゴムガスケットを使用して分離することによって、排除され得る。最上部のプレートを使用して、試料プレートの上部を覆う。
【０１９６】
産生培地中への前培養プレートの希釈
【０１９７】
１４．４μｌの前培養培地を、１．１ｍｌの９６ウェル産生プレート中に含まれた３６０μｌ（１：２５希釈）のＢＳＭ  ４％スクロース（産生培地）中に移す。１：２５の産生プレート中への前培養プレートの希釈は、アッセイ性能に最適であることが見出された。より低い希釈およびより高い希釈は、アッセイＣＶを増加させる、またはアッセイ時間を４８時間から７２時間もしくはそれ以上に延長させることが見出された。１：２５希釈で、大部分のウェルは、４８時間後に炭素が使い尽くされており、アッセイＣＶは正常レベルに維持される。
【０１９８】
産生プレートを、通気性メンブレンシールで密封し、培養物を、１０００ＲＰＭで振盪しながら、３３．５℃、湿度８０％で４８時間インキュベートする。
【０１９９】
アッセイ
【０２００】
インキュベーション後、９８μｌの産生培養物を、９６ウェル黒色ポリスチレン平底アッセイプレート中で２μＬのＮｉｌｅ  Ｒｅｄ溶液（最終Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ濃度２μｇ／ｍｌ）と混合する。プレートを３０秒間混合し、その後分光光度計にロードする。ファルネセン特異的読み取りを、２９０ｎｍでの励起および５５０ｎｍでの発光で取得し、その後、バイオマス特異的読み取りを３５０ｎｍでの励起および４９０ｎｍでの発光で取得し、ファルネセン対バイオマス比を得る。
【０２０１】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されるのと同様に、参照によって本明細書中に組み込まれる。上述の発明は、理解の明瞭さを目的として例示および例としていくらか詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対してなされ得ることは、本発明の教示の下に、当業者に容易に明らかとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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