(57)【要約】遺伝的安定性が向上したゲノム縮小化細菌が提供される。また、遺伝的安定性が向上したゲノム縮小化細菌を使用してポリペプチドを製造する方法も提供される。本発明により、例えば、天然親株のゲノムよりも約５％〜約３０％縮小するように遺伝子操作されたゲノムを有するゲノム縮小化大腸菌であって、全ての挿入配列を欠き、ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣからなる群から選択される少なくとも１つの機能しない遺伝子を含む、ゲノム縮小化大腸菌細菌が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然親株のゲノムよりも約５％〜約３０％縮小するように遺伝子操作されたゲノムを有するゲノム縮小化大腸菌であって、全ての挿入配列を欠き、ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣからなる群から選択される少なくとも１つの機能しない遺伝子を含む、ゲノム縮小化大腸菌細菌。
【請求項２】
少なくとも、大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３およびｂ２９４５のＤＮＡセグメントが欠失している、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記細菌の天然親株がＢ株である、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
前記細菌の天然親株が株ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
前記細菌の天然親株がＫ１２株である、請求項２に記載の細菌。
【請求項６】
前記細菌の天然親株がＫ１２株ＭＧ１６５５である、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記細菌がＭＤＳ４２である、請求項６に記載の細菌。
【請求項８】
前記細菌がＭＤＳ６６である、請求項６に記載の細菌。
【請求項９】
ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣからなる群から選択される少なくとも２つの機能しない遺伝子を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１０】
機能しない遺伝子ｐｏｌＢおよびｄｉｎＢを有する、請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】
機能する遺伝子ｕｍｕＤＣを有する、請求項１０に記載の細菌。
【請求項１２】
機能しない遺伝子ｕｍｕＤＣを有する、請求項１０に記載の細菌。
【請求項１３】
異種核酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１４】
前記異種核酸が、発現制御配列に作動的に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１２に記載の細菌。
【請求項１５】
ポリペプチドを製造するための方法であって、ポリペプチドの発現に好適な条件下で請求項１４に記載の細菌をインキュベートすることと、該ポリペプチドを回収することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１１年１０月２０日に出願された米国仮出願第６１／５４９，３７５号の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、突然変異率が極めて低いゲノム縮小化細菌および該ゲノム縮小化細菌の使用方法に関する。該ゲノム縮小化細菌は、核酸の忠実度の高い維持および細菌宿主でのクローニングが困難であることが判明している遺伝子の安定な発現に特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
自然界に存在する動的に変化する環境条件での細菌集団の生存には多様性を生み出す内在機構が重要である。しかしながら、実験室の制御された環境では、これらの機構は不要な遺伝子型および表現型の変化を引き起こすことがあり、確立された生産株またはクローンライブラリーの自発的遺伝子改変は一般的に極めて望ましくない。
【０００４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．  ｃｏｌｉ）は、汎用的なクローニング宿主であり、研究と産業の両方においてタンパク質、代謝産物および二次代謝産物の生産に使用される最も一般的な生物である。これらの背景において大腸菌宿主の性能を向上させるためにいくつかの改変がなされてきたが、それらは全て、不要な副産物の低減とともに所与の生体材料を増産するための代謝経路合理化の基本原理に従うものであった。これらの方針に沿って、様々な非必須遺伝子が大腸菌バックグラウンドから除去され、増殖の著しい低下がほとんどないかまたは全くない実現性のあるゲノム縮小化大腸菌株が作製されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらのゲノム縮小化細菌は多くの点で有益であることが判明しているが、一部の遺伝子は、それらの機能する形態で、ゲノム縮小化細菌の場合であっても細菌ベクター内でのクローニングは依然として困難であるかまたは不可能である。従って、遺伝子がクローニング可能な、突然変異率が極めて低い安定な細菌宿主が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、３つの    変異しやすいＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩ、ＰｏｌＩＶおよびＰｏｌＶの少なくとも１つをコードする遺伝子が機能しないゲノム縮小化細菌を提供する。好ましい実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩおよびＰｏｌＩＶをコードする遺伝子は機能せず、ＰｏｌＶをコードする遺伝子は機能するかあるいは機能しない。特に好ましい実施形態では、これらの遺伝子のうちで該ゲノム縮小化細菌において機能するものが存在しない。これらの遺伝子は、該細菌のゲノムからの遺伝子の部分的または完全な欠失によって機能しないようにさせても、あるいはこれらの遺伝子の破壊によっても機能しないようにさせてもよい。
【０００７】
一実施形態では、ゲノム縮小化細菌のゲノムは、その天然親株のゲノムよりも約５％〜約３０％縮小するように遺伝子操作されたゲノムを有し、全ての挿入配列を欠いている。ゲノム縮小化細菌は、細菌の天然親株から選択された遺伝子を欠失させることにより作製することも、または、例えば、事前に選択された遺伝子の集合体として完全合成することもできる。本明細書における考察から容易に分かるように、ゲノム縮小化細菌は、比較対象の天然親株で見出される遺伝子の全要素よりも少なく、天然親株と特定の必須遺伝子を共有している。
【０００８】
また、前記ゲノム縮小化細菌を用いたポリペプチド生産方法も提供する。一実施形態では、該ポリペプチドは、Ｐｏｌ  ＩＩ、ＰｏｌＩＶおよびＰｏｌＶをコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の機能しない遺伝子を有し、さらに、発現制御配列と機能し得る形で連結された、ポリペプチドをコードする核酸を含むゲノム縮小化細菌を、該ポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）の発現に好適な条件下で培養することにより生産される。関連の実施形態では、該核酸は、機能する遺伝子ＰｏｌＩＩ、ＰｏｌＩＶおよびＰｏｌＶを有する細菌内でのクローニングが困難であるかまたは不可能である「毒性」ポリペプチドをコードする。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の実施形態を本明細書の以下にさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】機能しない（この場合は欠失）遺伝子ｄｉｎＢ、ｐｏｌＢおよびｕｍｕＤＣを、単独でおよび考えられる全ての組合せで含むゲノム縮小化細菌（ＭＤＳ４２）の自然突然変異率を、対照であるＭＤＳ４２およびＭＧ１６５５と比較して示す。突然変異率は、ｃｙｃＡで起こる突然変異についての揺動解析により決定した。野生型ＭＧ１６５５からＭＤＳ４２の間での突然変異率の減少は挿入事象が起こらないことによるが、ＭＤＳ４２から種々の変異しやすいポリメラーゼ変異体へのさらなる減少は点突然変異率の低下による。値は４つの独立した測定値の平均である。
【図２】様々な株の突然変異率に及ぼす種々のストレスの影響を示す。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の過剰生産、ｐＳＧ−ＯＲＦ２３８からの毒性ペプチドの過剰生産、およびマイトマイシンＣ処理によって受けるストレスの影響を示している。測定は全て、ｃｙｃＡ揺動アッセイを用いて行い、値はそれぞれ３つの独立した測定値の平均である。ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＭＤＳ４２ｒｅｃＡは０．１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣの存在下で増殖することができなかった。
【図３】様々な株の突然変異スペクトルの比較を示す。棒グラフは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析によって検出されたｃｙｃＡ突然変異型の分布を示す。ＭＧ１６５５、ＭＤＳ４２およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣにおける欠失の割合は低すぎてはっきりしないが、ＢＬ２１（ＤＥ３）では欠失は全く検出されなかった。
【図４】リファンピシン耐性アッセイによって測定したＭＤＳ４２およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣの突然変異率を示す。値はそれぞれ３つの独立した測定値の平均である。
【図５】ＭＤＳ４２−Ｔ７（ｍｃｒＢＣ−）宿主の増殖に対するＳｉｎＩ酵素の過剰生産の毒性作用を示す。ＳｉｎＩはＩＰＴＧ誘導性ｐＳｉｎ３２プラスミドから過剰生産された。両測定値は、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ自動機器を使用して５分毎に測定された、それぞれ２５の独立したコロニーのＯ．Ｄ．５４０値の平均である。
【図６】突然変異率に及ぼすＳｉｎＩメチルトランスフェラーゼ過剰生産の影響を示す図である。ＳｉｎＩメチルトランスフェラーゼ酵素はｐＳｉｎ３２プラスミドから過剰生産された。突然変異率はｃｙｃＡ揺動アッセイを用いて測定した。値はそれぞれ３つの独立した測定値の平均である。
【図７】様々な宿主における突然変異ｓｉｎＩを有するプラスミドの蓄積を示す。ＳｉｎＩメチルトランスフェラーゼはｐＳｉｎ３２から発現された。プラスミドは様々な間隔で単離し、該酵素の機能喪失を引き起こす突然変異についてスクリーニングした（宿主ＭｃｒＢＣ＋およびＭｃｒＢＣ−での形質転換による）。値はそれぞれ３つの独立した測定値の平均である。
【図８】ＳｉｎＩを発現する様々な株の培養物がＯＤ＝０．７まで増殖するために必要な時間を示す。ＯＤ＝０．２（０分）時点においてＩＰＴＧで誘導した、ｐＳｉｎ３２を保有する株の増殖曲線を求めた。あるサンプルが過剰生産されたＳｉｎＩメチルトランスフェラーゼの毒性作用を克服したことを示したことを示すカットオフとしてＯＤ＝０．７を選択した。示した値は各株の５０の独立したサンプルについての測定値の平均である。
【図９】ＭＧ１６５５を形質転換することができるｐＳｉｎ３２プラスミドにおいて保有されているｓｉｎＩにおける突然変異を示す。ＭｃｒＢＣ＋宿主から単離した８つのｐＳｉｎ３２プラスミドサンプルを配列決定した。それらのうちの７サンプルは、ｓｉｎＩにおいて新たな停止コドン（１８２位、１８３位、１９４位、１９５位、１９６位、２０８位および８６２位）を生み出すフレームシフト突然変異を有していた。これらの突然変異の１つは、Ａｓｎ→Ｔｈｒ変化（８８０位）につながるＡ→Ｃ変異であった。各突然変異のヌクレオチド位置はｓｉｎＩの最初のヌクレオチドに対して示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は様々な形態で実施することが可能であるが、本開示は本発明の例示と考えられるべきであり、本発明を例示される特定の実施形態に限定するものではないという理解で、一部の実施形態を以下に説明する。見出しは単に便宜上示すものであり、本発明を何ら限定するものと解釈されるべきでない。見出しの下に例示される実施形態は、他の見出しの下に例示される実施形態と組み合わせることができる。
【００１２】
本出願において明記される様々な範囲の数値の使用は、特に明示しない限り、記載される範囲内の最小値および最大値の両方の前に「約」という単語を付けて近似値として記載されている。このように、記載された範囲からのわずかな上下変動は、その範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために使用することができる。本明細書において使用する場合、「約」および「およそ」という用語は、数値について使用する場合、対象とする関連技術における当業者にとってそれらの平易かつ通常の意味を有するものとする。また、範囲の開示は、列挙された最小値と最大値の間のあらゆる値ならびにそのような値によって形成され得る任意の範囲を含む連続範囲として意図される。これは、形成され得る、有限の上限および／または下限を含むまたは含まない範囲を含む。また、これは、ある開示数字で別の開示数字を割ることにより導き出すことができる割合も含む。従って、当業者ならば、多くのそのような割合、範囲、および割合の範囲は、本明細書において提示したデータと数字から明確に導き出すことができ、全てが本発明の様々な実施形態を表すことが分かるであろう。
【００１３】
本明細書における「ゲノム縮小化細菌」という用語は、当該ゲノム（例えば、タンパク質コード遺伝子）の約１％〜約７５％が欠失している、例えば、ゲノムの約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％または約６０％が欠失している細菌を意味する。一実施形態では、本発明の実施において使用されるゲノム縮小化細菌は、好ましくは、天然親株のゲノムよりも少なくとも２パーセント（２％）〜最大２０パーセント（２０％）（その間の任意の数を含む）縮小するように遺伝子操作されたゲノムを有する。好ましくは、該ゲノムは天然親株のゲノムよりも少なくとも５パーセント（５％）〜最大３０パーセント（３０％）小さい。より好ましくは、該ゲノムは天然親株のゲノムよりも８パーセント（８％）〜１４パーセント（１４％）〜２０パーセント（２０％）（その間の任意の数を含む）またはそれ以上小さい。あるいは、該ゲノムは天然親株のゲノムよりも２０％未満、３０％未満、４０％未満または５０％未満縮小するように操作してもよい。「天然親株」という用語は、科学界で一般的に理解されている自然または天然の環境で見出される細菌株であって、より小さいゲノムを有する細菌株を作製するためにそのゲノムにおいて一連の欠失を作り出すことができる細菌株を意味する。また、天然親株とは、操作された株が比較される株を指し、その操作株は天然親株の全要素よりも少ない。一連の欠失後にゲノムが縮小化されたパーセンテージは、「全ての欠失後に欠失した塩基対の総数」を「全ての欠失前のゲノム中の塩基対の総数」で割った後、１００を掛けることによって算出される。同様に、ゲノムが天然親株よりも縮小化されるパーセンテージは、ゲノムがより小さい株のヌクレオチド総数（それが作出されたプロセスとは無関係）を天然親株のヌクレオチド総数で割った後、１００を掛けることによって算出される。
【００１４】
一実施形態では、「ゲノム縮小化細菌」という用語は、上記ゲノム量の除去が最少培地での該生物の増殖能力に許容できない影響を及ぼさない細菌を指す。本文脈において、２以上の遺伝子の除去が最少培地での該生物の増殖能力に「許容できない影響を及ぼす」かどうかは、具体的な用途に依存する。例えば、増殖速度の３０％減はある適用には許容されるが別の適用には許容されないという場合がある。さらに、ゲノムからのＤＮＡ配列を欠失させる悪影響は、培養条件を変更するなどの手段によっても軽減させることができる。このような手段は、それ以外の点では許容できない悪影響も許容されるものへと変えることができる。一実施形態では、増殖速度は親株とほぼ同じである。しかしながら、親株よりも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％から約５０％までの範囲で低い増殖速度も本発明の範囲内である。より詳細には、本発明の細菌の倍加時間は約５分から約３時間までの範囲であり得る。好適なゲノム縮小化細菌の非限定的な例、ならびに大腸菌などの細菌からＤＮＡを欠失させる方法は、米国特許第６，９８９，２６５号および同第７，３０３，９０６号、米国特許出願公開第２００６０２７００４３号、同第２００６／０１９９２５７号および同第２００７／００５４３５８号ならびに国際公開第２００３／０７０８８０号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【００１５】
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの機能しない遺伝子を有するゲノム縮小化細菌が提供される。これらの遺伝子のうち１以上が機能しないゲノム縮小化細菌は、同じ遺伝的背景を有するがこれらの遺伝子が機能する細菌と比べて、遺伝的安定性の実質的な向上を示す。一態様では、遺伝子は、欠失によって、例えば、米国特許第６，９８９，２６５号の第８段４５行〜第１４段４１行に記載されている「傷跡のない（ｓｃａｒｌｅｓｓ）」欠失法によって機能しないとされる。これらの方法は、欠失プロセスによるＤＮＡ挿入が起こらず、標的遺伝子の正確な欠失（すなわち、「傷跡のない」欠失）を引き起こすため、好ましい欠失方法である。しかしながら、当技術分野で公知の、標的遺伝子を完全にまたは部分的に欠失させる任意の方法を用いて、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子の１以上を機能させないようにすることも理解すべきである。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子の１以上を、当技術分野で公知の任意の技術を用いることにより該遺伝子を破壊することによって機能させないようにしてもよい。例えば、標的遺伝子は、相同組換えにより該遺伝子を機能しない対立遺伝子と置き換えることによって破壊し得る。破壊と欠失を併用して、該細菌においてＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする機能しない遺伝子の任意の組合せを作り出してもよい。
【００１６】
一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子のいずれか１つは機能せず、残り２つの遺伝子は機能してもよい。他の実施形態では、ゲノム縮小化細菌において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子のうちの２つの遺伝子の任意の組合せは機能せず、残りの遺伝子は機能してもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子は機能せず、ＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子は機能してもよい。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子は機能せず、ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子は機能してもよい。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子は機能せず、ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝子は機能してもよい。好ましい実施形態では、ゲノム縮小化細菌において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子は機能せず、ＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子は機能するかあるいは機能しない。特に好ましい実施形態では、ゲノム縮小化細菌において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子が全て機能しない。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の機能しない遺伝子を有するゲノム縮小化細菌は、天然親株のゲノムよりも少なくとも５パーセント（５％）〜最大３０パーセント（３０％）（その間の任意の数を含む）縮小するように遺伝子操作されたゲノムを有する。別の好ましい実施形態では、ゲノム縮小化細菌は、４．４１Ｍｂ〜３．７１Ｍｂの間、４．４１Ｍｂ〜３．２５Ｍｂの間または４．４１Ｍｂ〜２．７８Ｍｂの間のゲノムを有する。
【００１８】
本発明のゲノム縮小化細菌の親株はいずれの細菌株であってもよい。好ましい実施形態では、本発明のゲノム縮小化細菌の親株は大腸菌株、例えば、大腸菌株Ｋ−１２またはＢである。大腸菌Ｋ１２株には、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、Ｉｎｖα、Ｔｏｐ１０、Ｔｏｐ１０Ｆ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＥＣ１００、ＢＷ２９５２またはＥＣ３００などの誘導株が含まれる。大腸菌Ｂ株には、ＲＥＬ６０６、ＢＬ／ＲおよびＢＬ２１（ＤＥ３）が含まれる。
【００１９】
親株のゲノムのヌクレオチド配列は部分的または完全に既知であり得る。いくつかの大腸菌および他の一般的に使用される研究用微生物の全ゲノム配列は既知である（例えば、Ｂｌａｔｔｎｅｒらの、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：１４５３−７４  （１９９７）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０００９６；ＮＣＢＩデータベース受託番号ＡＰ００９０４８、Ｐｅｒｎａ  らの、  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９，  ５２９−５３３  （２００１）；Ｈａｙａｓｈｉ  らの、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，  ８，  １１−２２  （２００１）；Ｗｅｌｃｈらの、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９９：１７０２０−１７０２４  （２００２）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１４０７５、ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ０００９４８、ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ００１６３７、ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ００１３９６、ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ０００８１９およびＥＭＢＬ受託番号ＣＰ００１５０９（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる）を参照）。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明のゲノム縮小化細菌の親株は、ゲノムが４，６３９，６７４塩基対を有する大腸菌株Ｋ１２  ＭＧ１６５５（注釈付きのｍ５６）、（ＮＣＢＩ受託番号Ｕ０００９６１）である。別の好ましい実施形態では、該ゲノム縮小化細菌の親株は、ゲノムが４，５５７，５０８塩基対を有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ００１５０９）である。大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５ゲノムにおけるＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝子（ｐｏｌＢ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子（ｄｉｎＢ）およびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子（ｕｍｕＤＣ）の座標を表１に示す。
【００２１】
表１
【表１】
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【００２２】
特に好ましい実施形態では、ゲノム縮小化大腸菌細菌は、天然親株のゲノムよりも５パーセント（５％）〜３０パーセント（３０％）縮小しているゲノムを有し、全ての挿入配列（ＩＳ）要素を欠いており、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの機能しない遺伝子を有するものが提供される。大腸菌ＭＧ１６５５（注釈付きの５４）のゲノムマップ上のＩＳ要素の位置は、米国特許出願公開第２００３／１３８９３７号の図１および表２に示されており、これらの記載内容は参照により本明細書に組み入れられる。一般的に大腸菌において存在する、除去し得る挿入配列要素としては、限定されるものではないが、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５、ＩＳ３０、ＩＳ１５０、ＩＳ１８６、ＩＳ６００、ＩＳ９１１およびＩＳ１０が挙げられる。特に好ましい実施形態では、ゲノム縮小化大腸菌は、全ての挿入配列を欠いており、機能しない遺伝子ｐｏｌＢおよびｄｉｎＢを有し、さらに好ましくは、機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣを有するものが提供される。
【００２３】
関連実施形態では、ゲノム縮小化細菌は、少なくとも次の遺伝子（Ｂｌａｔｔｎｅｒ  らの、  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：１４５３−７４およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号４０００９６に記載されている名称に基づいて「ｂ」番号で識別される）：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠いており、さらに、ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣから選択される１以上の機能しない遺伝子を有する大腸菌細菌である。特に好ましい実施形態では、ｐｏｌＢおよびｄｉｎＢは機能せず、さらに好ましくは、ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣは全て機能しない。ゲノム縮小化大腸菌細菌は株ＭＤＳ４２であってよく、このゲノムは全ての挿入配列を欠いており、１以上の機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣを有する、好ましくは、機能しない遺伝子ｐｏｌＢおよびｄｉｎＢを有する、さらに好ましくは、３つ全ての遺伝子が機能しない。また、ゲノム縮小株はＭＤＳ４３株またはＭＤＳ６６株（あるいは任意の誘導株）であってよく、１以上の機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣを有する、好ましくは、３つ全ての遺伝子が機能しない。
【００２４】
様々なタンパク質コード遺伝子を欠失させ、ゲノム縮小化細菌を作製することができる。大腸菌および他の細菌では、欠失させることが可能なＤＮＡ配列の種類としては、一般的に、その生物の安定性またはその生物の遺伝子産物の安定性に悪影響を及ぼさないものが含まれる。不安定にするような要素としては、限定されるものではないが、転移因子、挿入配列、およびゲノムの不安定性に関与し得る他の「利己的ＤＮＡ」要素が挙げられる。例えば、挿入配列（ＩＳ）要素および関連の転移は細菌ゲノムにしばしば見出されるため、それらは欠失の標的である。ＩＳ配列は大腸菌において一般的であり、それらの全てを欠失させることができる。本明細書では明確にするために、一般に、本発明者らはＩＳ要素および転移要素という用語を使用して、完全であれ不完全であれ、ゲノム内のある点から別の点へと移動することができるＤＮＡ要素を指す。科学技術におけるＩＳ要素の有害な影響の例は、配列決定のための増殖中に、それらが宿主である大腸菌のゲノムからＢＡＣプラスミド内へ飛び移り得るという事実である。この人工産物は全てのＩＳ要素を宿主細胞から欠失させることによって防ぐことができる。特定の適用では、ゲノムの不安定性に関連する他の特定の遺伝子、例えば、活性および不活性プロファージも欠失させることができる。
【００２５】
また、本発明のゲノム縮小化細菌は、例えば、限定されるものではないが、該細菌の増殖および代謝に不要な特定の遺伝子、偽遺伝子、プロファージ、望ましくない内因性制限修飾遺伝子、病原性遺伝子、毒素遺伝子、線毛遺伝子、周辺細胞質タンパク質遺伝子、インベイシン遺伝子、リポ多糖遺伝子、クラスＩＩＩ分泌系、ファージ病原性決定因子、ファージ受容体、病原性島、ＲＨＳ要素、機能未知の配列、ならびに同じ天然親細菌種の２株間で共通に見られない配列を持たないように操作してもよい。細胞の生存に必要ではない他のＤＮＡ配列も欠失または除去してもよい。
【００２６】
本発明のゲノム縮小化細菌は、ポリペプチドをコードする異種核酸を含んでもよい。該ポリペプチドは、治療用タンパク質、例えば、インスリン、インターロイキン、サイトカイン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、インターフェロンまたは抗体であり得る。異種核酸は、プラスミドなどのベクター内に収容され、プロモーターと、また所望により付加的な調節配列とも、機能し得る形で連結させることができる。
【００２７】
１以上の機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣを有し、好ましくは、少なくとも機能しない遺伝子ｐｏｌＢおよびｄｉｎＢを有し、さらに、全ての挿入配列を欠いているゲノム縮小化細菌は、全ての挿入配列を欠いているゲノム縮小化細菌でも単離または維持が困難であるかまたは不可能である毒性核酸のクローニングを可能にする驚くべき遺伝的安定性を示す。「毒性」核酸とは、宿主株での増殖の際に突然変異率を上昇させる核酸であり得る。毒性核酸はまた、ＩＳ要素の転移率も上昇させ得る。毒性核酸の突然変異率の上昇は、宿主株が増殖させる対照核酸との比較により決定することができる。
【００２８】
１以上の機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＤＣを含むゲノム縮小化細菌を使用して、ポリペプチドを生産することができる。簡単に述べると、上記のように、発現制御配列と機能し得る形で連結された、ポリペプチドをコードする異種核酸を含む本発明の細菌を、ポリペプチド産物の発現を可能にするのに十分な条件下でインキュベートすればよい。
【００２９】
十分に許容される対象タンパク質であっても過剰発現はＩＳ転移率を上昇させ、突然変異率を大幅に増大させる細胞のストレス応答を活性化する可能性がある。対象タンパク質をコードするプラスミドはこれらの条件下で機能喪失突然変異を急速に獲得し、このような変異したプラスミドを保有する細菌は、少なくとも部分的に、過剰発現されるタンパク質をコードする無傷のプラスミドの増殖阻害作用によって、培養物中ですぐに優勢なものとなる。驚くべきゲノムの安定性および忠実度を示す本発明の細菌は、そのような突然変異プラスミドの出現を遅らせ、それらの細胞は機能する毒性タンパク質を長期間生産することができる。
【００３０】
組換えタンパク質は、周辺細胞質または細胞質で発現させることができる。周辺細胞質でのタンパク質の発現は工業用途に常用され、Ｈａｎａｈａｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６６：５５７−５８０  （１９８３）；  Ｈｏｃｋｎｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １２：４５６−６３２  （１９９４）；およびＨａｎｎｉｇらの、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６：５４−６０  （１９９８）において総説されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。組換えタンパク質は、それらが周辺細胞質間隙への分泌を引き起こすシグナルペプチドに結合している融合タンパク質を発現させることによって、周辺細胞質において生産することができる。そこでは、シグナルペプチドが特異的シグナルペプチダーゼによって切断され得る。周辺細胞質間隙に輸送されたタンパク質は生物学的に活性であり得る。
【００３１】
組換えタンパク質は、組換えタンパク質の適切な折り畳みを引き起こし得るシャペロン／ジスルフィド結合形成酵素と共発現させることができる。組換えタンパク質の周辺細胞質発現に有用なこのようなタンパク質の核酸配列としては、限定されるものではないが、米国特許第５，７４７，６６２号；同第５，５７８，４６４号および同第６，０２２，９５２号に記載されているものが挙げられ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３２】
実施例１
ゲノム縮小化大腸菌の作製
ゲノム縮小株ＭＤＳ３９を国際公開第２００３／０７０８８０号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載のとおりに作製した。簡単に述べると、親株大腸菌ＭＧ１６５５から核酸配列の一連の３９の累積的欠失（ゲノムの約１４．１％）を得誘発することにより、一連のゲノム縮小株（ＭＤＳ０１〜ＭＤＳ３９）を作製した。
【００３３】
Ｋ−１２配列およびＩＳデータベース中の全配列を含むゲノムスキャニングチップ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）とのハイブリダイゼーションにより、全てのＩＳ要素を欠失するように設計された第一の株であるＭＤＳ３９が、予期しないことに、その作製中に新たな位置へ飛び移ったＩＳ要素のさらなるコピーを含むことが明らかになった。これらのＩＳ要素を欠失させてＭＤＳ４０を作製した。ＭＤＳ４０からｆｈｕＡＣＤＢ（ｔｏｎＡ遺伝子座）を欠失させてＭＤＳ４１を作製した。ＭＤＳ０１〜ＭＤＳ４１を作製するために行った各累積的欠失の位置および機能は米国特許出願公開第２００７／００５４３５８号の表２に記載されており、その全内容を参照により本明細書に組み入れられる。次に、ＭＤＳ４１からｅｎｄＡ遺伝子を欠失させてＭＤＳ４２を作製した。
【００３４】
ＭＤＳ４２のゲノムから、米国特許第６，９８９，２６５号およびプラスミドｐＳＴ７６−ＡおよびｐＳＴＫＳＴを用いたＦｅｈｅｒ  らの、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４１６：２５１−２５９  （２００８）に記載されているように、自殺プラスミドに基づく方法を用いた傷跡のない方法で、ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝子（ｐｏｌＢ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＶをコードする遺伝子（ｄｉｎＢ）およびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子（ｕｍｕＤＣ）を欠失させた。遺伝子欠失は個々に行うほか、考えられる全ての組合せでも行い、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢ、ＭＤＳ４２ｄｉｎＢ、ＭＤＳ４２ｕｍｕＤＣ、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢ、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｕｍｕＤＣ、ＭＤＳ４２ｄｉｎＢｕｍｕＤＣおよびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣの株を作製した。個々の欠失の組合せは、欠失構築物のマーキングされた（自殺プラスミドが組み込まれている）中間体のＰ１ファージ形質導入と、その後のエンドヌクレアーゼ切断刺激アウトリコンビネーション（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｏｕｔ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）およびプラスミドの消滅によって行った。全ての欠失を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびフランキングプライマーを用いた配列決定により確認した。研究に用いたプライマー配列を表２に列挙する。
【００３５】
表２
【表２】
2014530625.tif 000004
Ａ、Ｃ、ＢＦおよびＢＲを付けたプライマーは、自殺プラスミドのゲノム組込みのために組換えＰＣＲにより相同性領域を作製するために用いた。ＤまたはＥを付したプライマーは、フランキングゲノム領域と相同であり、ＰＣＲおよび配列決定による欠失／対立遺伝子置換の確認のために用いた。ｌｅｘＡプライマー中の大文字は遺伝子に導入された点突然変異を示す。
【００３６】
実施例２
ゲノム縮小化大腸菌における自然突然変異率
次に、各株の自然突然変異率を、Ｆｅｈｅｒ  らの、  Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．  ５９５（１−２）：１８４−１９０  （２００６）に記載されているように、ｃｙｃＡ遺伝子における全ての種類の突然変異を検出するＤ−サイクロセリン耐性アッセイを用いて決定した。簡単に述べると、揺動アッセイにおいて、０．２％グルコースを添加したＭＳ培地（Ｈａｌｌ，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  １５（１）：１−５  （１９９８）に記載のとおり）１ｍｌの試験管２０本のそれぞれに約１０４細胞を播種し、培養物を定常期初期まで増殖させた。その後、各試験管の５０μｌアリコートをＤ−サイクロセリン（０．０４ｍＭ）が入っているＭＳプレート上に拡げた。試験管当たりの推定突然変異数（ｍ）は、Ｍａ−Ｓａｎｄｒｉ−Ｓａｒｋａｒ最尤法（Ｓａｒｋａｒ  らの、  Ｇｅｎｅｔｉｃａ，  ８５（２）：１７３−１７９  （１９９２））を用いることによりコロニー数から算出した。５０μｌで求めた有効ｍ値から、Ｓｔｅｗａｒｔ  らの、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １２４（１）：１７５−１８５  （１９９０）の式４１を用いて１ｍｌの値を推定した。ｍ値の統計比較は、総細胞数の差がごくわずかである場合のみ行った（＜３％、Ｐ≦０．６、対応のない両側ｔ検定による）。試験管中の細胞総数は、３本の無作為抽出の試験管の希釈物を非選択的プレート上に拡げることにより算出した。試験管当たりの突然変異数を試験管中の平均細胞総数で割ることにより突然変異率（突然変異／細胞／世代）を得た。
【００３７】
各遺伝子単独での欠失では、この方法により測定した突然変異率を少なくとも２０％低下させる（全ての値が有意、Ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。結果は図１においてグラフで示す。異なる欠失を組み合わせることによって、減少した突然変異率はさらに低下し、突然変異率が最も低いのはＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢおよび三重欠失株ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣであった。ｐｏｌＢとｄｉｎＢの欠失を組み合わせた効果は倍数的に増加し、このことはこれらのポリメラーゼの独立した作用様式を示している。ｕｍｕＤＣの欠失では、他の２つの変異しやすいポリメラーゼのいずれもが欠失している場合には、突然変異率のさらなる減少は起こらなかったが、このことはおそらく遺伝子またはそれらの産物の間での相互作用を示している。親ＭＤＳ４２株と比較して、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢ株およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ株は自然突然変異率のほぼ５０％の減少を示した（８．２×１０−８突然変異／細胞／世代がそれぞれ、４．３４×１０−８および４．４５×１０−８に減少）。
【００３８】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子の欠失が適応度に悪影響を及ぼさないことを確認するために、異なる株の増殖速度をＭＯＰＳ最少培地で測定した。各株の１０の個々のコロニーから生じた１０の並行培養物を採取し、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ機器内で増殖させた。増殖曲線は、各培養物の５４０ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を追跡することにより求めた。三重欠失株ＭＤＳ４２ｐｏｌｂｄｉｎＢｕｍｕＤＣとして組み合わせた場合でも、ＭＯＰＳ最少培地での適応度に有意な影響を及ぼした欠失はなかった。
【００３９】
レギュレーター変異体による完全なＳＯＳ応答の上流不活性化が、自然突然変異率に対して、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶをコードする遺伝子の欠失と同じ影響を及ぼすかどうかを判定するために、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡおよびＭＤＳ４２ｌｅｘＡを作出した。ＭＤＳ４２ｒｅｃＡはｒｅｃＡの傷跡のない欠失（ＭＧ１６５５の座標２８２０７８３−２８２１８６１）を含み、この産物はＬｅｘＡの自己タンパク質分解の誘導に必要である。ＭＤＳ４２ｌｅｘＡは、１１９番のセリンがアラニンで置換されている（Ｓ１１９Ａ）機能しない対立遺伝子でのｌｅｘＡ遺伝子の置換を含む。これらの遺伝子（ｒｅｃＡおよびｌｅｘＡ）はそれぞれＳＯＳレギュロン遺伝子の脱抑制に必要である。従って、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡもＭＤＳ４２ｌｅｘＡもＳＯＳ経路を誘導することができない。これらの改変はいずれも、上記のようにＭＯＰＳ最少培地における株の増殖速度により測定した場合には、株の全体的な適応度に悪影響を及ぼさなかった。驚くべきことに、ＭＤＳ４２と比較した場合、いずれの株も自然突然変異率の有意な減少を示さなかった。ＭＤＳ４２ｌｅｘＡの場合では、実際には、わずかな増加が認められた（ＭＤＳ４２の８．２×１０−８に対して２．０７×１０−７）。結果を図２に示す（白色のバー（ストレス無し））。
【００４０】
実施例３
ゲノム縮小化大腸菌におけるストレス誘発突然変異率
次に、ストレス条件下でのＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、ＭＤＳ４２ｌｅｘＡおよびＭＤＳ４２ｐｏｌｂｄｉｎＢｕｍｕＤＣの突然変異率を測定し、比較した。
【００４１】
ＤＮＡ架橋剤マイトマイシン−Ｃは、二本鎖ＤＮＡの損傷を引き起こし、ＳＯＳ応答を直接活性化し、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＤＮＡポリメラーゼＶのアップレギュレーションを引き起こす。阻害濃度に満たない（０．１μｇ／ｍｌ）マイトマイシン−Ｃを用いて、細胞にストレスを与え、突然変異率への影響を解析した。結果を図２に示す（斜線のバー（マイトマイシン））。
【００４２】
タンパク質過剰生産は宿主細胞にストレスを与える。良性タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の過剰生産の、突然変異率に対する影響を試験した。ＧＦＰをコードする遺伝子を、Ｔ７プロモーターによって制御される誘導構築物としてのプラスミドにクローニングした。ＧＦＰを発現させるために、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ株のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化変異体（ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７）、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化変異体（ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ−Ｔ７）、およびＭＤＳ４２ｌｅｘＡのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化変異体（ＭＤＳ４２ｌｅｘＡ−Ｔ７）を、ｙａｈＡ−ｙａｉＬゲノム領域をＩＰＴＧ誘導性のｌａｃオペレーター／Ｔ７ポリメラーゼカセットで置換することにより構築した。また、ＭＤＳ４２のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化変異体（ＭＤＳ４２−Ｔ７）、ＭＧ１６５５のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化変異体（ＭＧ１６５５−Ｔ７）、および広く使用されているタンパク質生産株ＢＬ２１のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化変異体（ＤＥ３）も構築し、各株における突然変異率に対するＧＦＰ過剰発現の影響を測定し、比較した。結果を図２に示す（黒いバー（ｐＥＴ−ＧＦＰ））。
【００４３】
次に、細菌における突然変異率に対する毒性タンパク質（ＯＲＦ２３８、低分子、ロイシンリッチ疎水性タンパク質）過剰生産の影響を、これらの株を、ＯＲＦ２３８タンパク質を過剰発現することが可能な、ＩＰＴＧ誘導性の、ｐＳＧ１１４４に基づく構築物であるプラスミドｐＳＧ−ＯＲＦ２３８で形質転換させることにより試験した。結果を図２に示す（灰色のバー（ｐＳＧ−ＯＲＦ２３８））。ＯＲＦ２３８の過剰生産はＭＤＳ４２の突然変異率を有意に増加させた。ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣの値は同じ条件下で安定していた。
【００４４】
これらの結果は、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡおよびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣを除いて、様々なストレスがＭＤＳ４２を含む全ての株の突然変異率を増加させたことを示している。毒性ＯＲＦ２３８タンパク質の過剰生産が最大の影響を持ち、突然変異率に５倍を超える増加が測定された。阻害濃度に満たないマイトマイシン−Ｃは突然変異率を２〜３倍増大させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＭＤＳ４２ｒｅｃＡはこれらの条件下では増殖できなかった。ＧＦＰの過剰生産の影響は比較的小さく、突然変異率を１．５〜２倍増大させた。
【００４５】
これに対して、ストレッサーの存在下では、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡでもＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣでも突然変異率の有意な増加は見られなかった。興味深いことに、ＭＤＳ４２ｌｅｘＡはこの挙動に従わず、該株は全てのストレスに応答して突然変異率の増加を示した。ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣは、最も低い自然突然変異率を示し、ストレス条件に対して示す応答はごくわずかである、遺伝的に最も安定な株と特徴付けることができる。
【００４６】
最も一般的に使用されるタンパク質生産株であるＢＬ２１（ＤＥ３）は、毒性ＯＲＦ２３８タンパク質を過剰発現する場合、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣよりもほぼ２桁高い突然変異率を示した。この差を解析するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＭＧ１６５５、ＭＤＳ４２およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣの突然変異スペクトルを、サイクロセリン耐性変異体におけるｃｙｃＡのＰＣＲ解析により研究した。簡単に述べると、遺伝子全体を包含する１，８７ｂｐのゲノムセグメントを、プライマー対ｃｙｃＡ１−Ｄ／ｃｙｃＡ２−Ｅを用いて、変異細胞から増幅した。代表的なサンプルは、各並行プレートから５コロニーを解析することにより得、１実験につき合計９６サンプルを得た。増幅した断片をアガロースゲル上で分離し、野生型鋳型から作製した断片と比較した。サ同一のサイズは１個または数個のヌクレオチドにだけ影響を与える突然変異を示し、サイズ縮小または増幅の失敗は欠失を示し、検出可能なサイズ拡大はＩＳ挿入を示した。結果を図３に示す。ＭＧ１６５５では、突然変異の７４％は点突然変異であることが判明し、２４％はＩＳ挿入であり、２％は欠失であった。これに対して、ＢＬ２１（ＤＥ３）では、ｃｙｃＡ突然変異の７７％がＩＳ挿入であった。ＢＬ２１（ＤＥ３）での点突然変異の割合ははるかに低かったが（ＭＧ１６５５では７４％に対してＢＬ２１（ＤＥ３）では２３％）、ＢＬ２１（ＤＥ３）での実際の点突然変異率は有意に高かった（ＭＧ１６５５での９．２×１０−８に対して２．２８×１０−７）。ＢＬ２１（ＤＥ３）ではｃｙｃＡ対立遺伝子の間で欠失は認められなかった。
【００４７】
ｃｙｃＡ揺動アッセイを用いて得られたデータを確認するために、それぞれ異なるストレス条件下でのＭＤＳ４２およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣの突然変異率も、リファンピシン耐性アッセイを用いて測定した。このアッセイでは、Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０２（１）：４５−５８  （１９８８）に記載のとおり、必須ｒｐｏＢ遺伝子における点突然変異を検出する。簡単に述べると、ＬＢ  １ｍｌの試験管２０本に各１０４細胞を播種し、培養物を定常期初期まで増殖させた。適当な希釈物を非選択的ＬＢ寒天プレートおよびにリファンピシン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天プレートに拡げた。２４時間後または４８時間後にそれぞれコロニー計数を行った。突然変異頻度は、総生菌数に対するリファンピシン耐性コロニー数の割合として報告した。この結果は、各株および条件について３回の独立した実験で得た平均値に相当する。必要に応じて、ｃｙｃＡアッセイの場合と同様に、異なるストレス条件を与えた。リファンピシン耐性アッセイを用いて得たデータは、図４に示すように、ｃｙｃＡ揺動データと一致した。ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣは、ＭＤＳ４２と比べて有意に低い自然突然変異頻度を示した。毒性ＯＲＦ２３８タンパク質の過剰生産に応答して、ならびにマイトマイシン−Ｃの存在下でも、ＭＤＳ４２の突然変異率は著しく上昇したが、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣの応答はかなり低かった。
【００４８】
実施例４
ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣは毒性タンパク質発現プラスミドに安定性の向上を提供する
機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよび／またはｕｍｕＤＣを含むゲノム縮小化細菌の驚くべき利点を示すために、プラスミドに基づく突然変異スクリーニングを設計した。プラスミドｐＳｉｎ３２は、ｐＥＴ３−ＨｉｓプラスミドのＸｈｏＩ部位にクローニングされた、サルモネラ・エンテリカ血清型インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）のＳｉｎＩメチルトランスフェラーゼをコードする、ｓｉｎＩの誘導性コピーを保有する。ＳｉｎＩはＤＮＡの内部のシトシンをＧＧ（Ａ／Ｔ）ＣＣ部位でメチル化して、５−メチルシトシンを生成し、それにより、メチルシトシンを含有するＤＮＡを切断するＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼの標的を作り出す。そのため、メチル化ＳｉｎＩ部位を保有するプラスミド（例えば、ｐＳｉｎ３２、その８つのＳｉｎＩ部位で自己メチル化される）は、ｍｃｒＢＣ＋宿主内でそれ自体安定化できない。ｍｃｒＢＣ−宿主に導入された場合には、該プラスミドは、ｓｉｎＩの発現が誘導された際にメチル化されるが、維持することができる。
【００４９】
ＭＤＳ４２の作製中にｍｃｒＢＣ遺伝子は欠失されたので、全てのＭＤＳ４２株はｍｃｒＢＣ−である。ＢＬ２１（ＤＥ３）からｍｃｒＢＣ遺伝子を欠失させ、株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣを作出した。プラスミドｐＳｉｎ３２を、ＭＤＳ４２−Ｔ７、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣにエレクトロポレーションにより導入した。１ｍｌのＬＢ中３７℃で１時間の回復インキュベーション後、１００μｌの形質転換培養物を、アンピシリン（Ａｐ）を添加したＬＢ  １００ｍｌに入れ、３７℃でインキュベートした。残りの９００μｌから、プラスミドＤＮＡを標準的なプロトコールに従って単離した。７時間のインキュベーション後に、培養物はＯ．Ｄ．５４０＝約０．２に達し、この時点で、サンプルをＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）で誘導した。また、この時点でプラスミド調製物のサンプルも採取し（８時間のサンプル）、その後、２時間おきに１８時間まで追加サンプルを採取し、次いで、形質転換後の増殖２４時間および３６時間の時点で追加サンプルを採取した。次に、精製したｐＳｉｎ３２プラスミドサンプル（各株から９サンプル）をＭＤＳ４２（ＭｃｒＢＣ−）およびＭＧ１６５５（ＭｃｒＢＣ＋）に形質転換した。各プラスミドサンプルの形質転換ＭＧ１６５５およびＭＤＳ４２コロニーを計数することにより、突然変異したプラスミドの相対数を計算することができる。突然変異したプラスミドの数の絶対値を得るために、エレクトロコンピテントＭＤＳ４２およびＭＧ１６５５指標株の各バッチを、Ａｐ耐性カセットを保有する対照（ｐＳＴ７６−Ａ）プラスミドで形質転換した。次に、ＭＧ１６５５およびＭＤＳ４２形質転換体の割合を補正係数として用いて、各サンプルの突然変異ｐＳｉｎ３２プラスミド数の絶対値を算出した。
【００５０】
ｐＳｉｎ３２でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣ、ＭＤＳ４２−Ｔ７およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７の形質転換に続き、ＩＰＴＧによる誘導によって、ＳｉｎＩ酵素の過剰生産はＭｃｒＢＣ−株でさえも中程度の増殖阻害作用を示すことが分かった（図５）。この中程度の毒性はＭＤＳ４２−Ｔ７の突然変異率を上昇させるが、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７ではその作用ははるかに弱く（図６）、上述の知見が裏付けられる。
【００５１】
ＩＰＴＧ誘導に続いて、プラスミドサンプルを一定の間隔で採取した。該プラスミドサンプルを再びＭＧ１６５５（ｍｃｒＢＣ＋）に形質転換することにより、ｓｉｎＩ無効化突然変異を保有するプラスミドサンプル（非メチル化プラスミド）の画分が検出された。サンプル当たりの総プラスミド数は、サンプルをＭＤＳ４２に同時に形質転換することにより決定した。エレクトロコンピテント細胞の各セットについて対照プラスミドから得られた形質転換体数で各値を補正した後、機能する／機能しないｓｉｎＩをコードするプラスミドの割合を算出した。結果を図７に示す。
【００５２】
驚くべきことに、ＭＤＳ４２由来の開始（０時間）プラスミドサンプルの９６．７％は、ＭＧ１６５５において安定させることができなかった。これは、Ｔ７ポリメラーゼを欠失する宿主でも、ｓｉｎＩの偽転写によってＳｉｎＩ発現が起こり、その結果として、ｓｉｎＩ部位のメチル化が起こったことを示した。最初のプラスミドサンプルにおけるＳｉｎＩ部位のメチル化状態は、ＳｉｎＩによるそれらの非切断性により確認した。
【００５３】
異なる株におけるクローン安定性に関する違いは、ＳｉｎＩ発現のＩＰＴＧ誘導後に明らかになった。形質転換から３６時間後（ＩＰＴＧ誘導から２８時間後）に、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣ細胞に保持されたｐＳｉｎ３２の５１．７％が、活性ＳｉｎＩの生産を阻害する突然変異を保有していた。この値はＭＤＳ４２−Ｔ７では有意に低かった（２５．８％）。ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７では、突然変異したｐＳｉｎ３２プラスミドの画分がさらに低かった（８．２％）。突然変異したｓｉｎＩ遺伝子を保有するプラスミドにおけるＳｉｎＩ部位の非メチル化状態は、ＳｉｎＩによるそれらの切断性により確認した。
【００５４】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣおよびＭＤＳ４２−Ｔ７における変異プラスミドの蓄積は、ストレス誘発突然変異誘発とＳｉｎＩ発現プラスミドによる増殖阻害との複合効果によるものであった。該酵素の過剰生産により突然変異率は上昇し、増殖は減少した。これらの増殖の遅い培養物では、経時的にＳｉｎＩ不活性化突然変異が起こり、次に、それらの正常な増殖速度を取り戻し、残りの培養物よりも速く増殖した。低突然変異率のＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７では、ＳｉｎＩ不活性化突然変異は、平均して、より長時間発現した。ＭＤＳ４２−Ｔ７およびＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７の５０の独立したコロニー（全てｐＳｉｎ３２プラスミドを保有する）の増殖曲線の評価はこの見解を裏付けている（図８）。培養物が誘導プラスミドの増殖阻害作用を克服したことを示すカットオフとしてＯ．Ｄ．５４０値０．７を用いた。ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣ−Ｔ７がこの密度レベルに達するのに要した平均時間はＭＤＳ４２−Ｔ７の場合よりも有意に長かった（それぞれ７２７．８分と５７１．８分；Ｐ＜０．００５、対応のない両側ｔ検定）。
【００５５】
ＭｃｒＢＣ＋細胞での増殖を可能にするプラスミドにおいて実際に突然変異が起こったことを確認するために、８つの異なるプラスミドサンプル（実現性のあるｐＳｉｎ３２形質転換ＭＧ１６５５コロニーから採取した）のｓｉｎＩ領域を配列決定した（図９）。８サンプルのうちの７サンプルで、ｓｉｎＩにおいてフレームシフト突然変異が起こり、その結果、遺伝子内に新たな停止コドンが形成された。８番目のサンプルはＡからＣへの転換を示し、その結果、タンパク質のＮ８８０Ｔ突然変異が引き起こされた。フレームシフトによって生じた７つの新たな停止コドンのうちの６つは遺伝子の最初の１２５ｂｐ内にあった。
【００５６】
これらの結果は、特に、ＩＳ要素のない遺伝的背景において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＩＶおよび／またはＶをコードする機能しない遺伝子を有するゲノム縮小化細菌の明確かつ予想外の実用的利点を示している。ＳｉｎＩが過剰生産されると、プラスミドにおいて保有されるｓｉｎＩ遺伝子は、ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣでは、ＭＤＳ４２の場合の約３分の１の頻度で、また、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣの場合の５分の１を下回る頻度で機能喪失突然変異を獲得した。注目すべきことに、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｍｃｒＢＣでの過剰生産からわずか１６時間後に、プラスミドにコードされる全てのｓｉｎＩ遺伝子の半数近くが無効化突然変異を受けていた。
【００５７】
ＳｉｎＩを過剰発現する培養物において突然変異クローンの割合が予想外に高いことは、ストレス誘発突然変異誘発だけでは説明できず、この全体的突然変異率は絶対値が低すぎて（１０−６突然変異／遺伝子／世代程度）、そのような劇的な効果を引き起こすことができない。むしろ、その現象は毒性遺伝子を保有するプラスミドの増殖阻害作用によるところが大きい。一連の事象は以下のとおりである：毒性遺伝子が発現すると、細胞の増殖速度が減少する。同時に、突然変異率はストレスによって増加する。毒性機能をもはや発現しない突然変異体がプラスミド集団内でひと度発生すると、それを保有する細胞は正常な増殖を取り戻すことができ、その培養物中で優勢となる。ＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣにより例示されるような、１以上の機能しない遺伝子ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢおよび／またはｕｍｕＤＣを有するゲノム縮小化細菌では、このような突然変異体の出現は遅延され、細胞は機能する毒性産物を長期間生産することができる。親株ＭＤＳ４２や一般的に使用される生産株ＢＬ２１（ＤＥ３）に優るＭＤＳ４２ｐｏｌＢｄｉｎＢｕｍｕＤＣなどの株の利点は著しく、産物過剰生産のストレスの重度が増すにつれて増大する。本明細書に記載の高いゲノム安定性を有する細菌株は治療適用において特に有益であり、その場合、核酸および／またはタンパク質産物の忠実度が基本的に重要である。また、本発明の細菌は、長期連続培養条件が必要とされる場合も驚くべきことに有用である。
【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月22日(2014.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014530625000001.app
【国際調査報告】
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