(57)【要約】  本明細書において、グリコシル化タンパク質を含有するバイオコンジュゲートを作製することが可能である原核細胞が提供される。また本明細書において、そのようなバイオコンジュゲートを含有する組成物、及び／又はそのようなバイオコンジュゲートの糖残基を含有する組成物に加え、そのような組成物を使用する対象のワクチン接種の方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)担体タンパク質及び単糖；(ii)担体タンパク質及び二糖；又は、(iii)担体タンパク質及び三糖を含有する、バイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記単糖、二糖、又は三糖が、担体タンパク質のグリコシル化部位内のAsnへ共有結合されており、ここで該グリコシル化部位は、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrを含む、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記グリコシル化部位が、組換え操作されており、且つ未変性担体タンパク質中には存在しない、請求項2記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記担体タンパク質が、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrを各々有するグリコシル化部位を、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個含む、請求項2記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
前記単糖が、N.メニンギチディス由来である、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
前記二糖が、N.メニンギチディス由来である、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
前記三糖が、N.メニンギチディス由来である、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
前記担体タンパク質が、緑膿菌外毒素A、CRM197、ジフテリア毒素、破傷風毒素、黄色ブドウ球菌の解毒されたヘモリシンA、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒された変種、コレラ毒素Bサブユニット、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒された変種、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、又はナイセリア・メニンギチディスの抗原からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載のバイオコンジュゲート。
【請求項９】
前記N.メニンギチディスの抗原が、N.メニンギチディスB群由来である、請求項8記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１０】
前記N.メニンギチディスの抗原が、ピリン、NMB0088、亜硝酸レダクターゼ(AniA)、ヘパリン-結合抗原(NHBA)、H因子結合タンパク質(fHBP)、接着分子、NadA、Ag473、又は表面タンパク質A(NapA)である、請求項8記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１１】
前記N.メニンギチディスの抗原が、ピリン、NMB0088、亜硝酸レダクターゼ(AniA)、ヘパリン-結合抗原(NHBA)、H因子結合タンパク質(fHBP)、接着分子、NadA、Ag473、又は表面タンパク質A(NapA)である、請求項9記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１２】
前記単糖が、DATDH又はGATDHである、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１３】
前記二糖が、Gal-DATDH、Gal(OAc)-DATDH、Gal-GATDH、Gal-GATDH、Gal(OAc)-GATDH、Gal-GlcNAc、Gal(OAc)-GlcNAc、Glc-DATDH、又はGlc-GATDHである、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１４】
前記三糖が、Gal(OAc)-Gal-DATDH、Gal-Gal-DATDH、Gal(OAc)-Gal-GATDH、又はGal- Gal-GATDHである、請求項1記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載のバイオコンジュゲートを含有する、免疫原性組成物。
【請求項１６】
バイオコンジュゲートを作製するための原核宿主細胞であって、ここで該原核宿主細胞が：
a.  X及びZが、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であってよい、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrを含む少なくとも1つのグリコシル化部位を含む、担体タンパク質をコードしている異種ヌクレオチド配列；並びに
b.  オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列；を含み、
ここで該原核宿主細胞が、組換え操作され、Und-PP-単糖、Und-PP-二糖、又はUnd-PP-三糖を生成し、且つここで該オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、二糖又は三糖を、該グリコシル化部位のAsnへ転移する、前記原核宿主細胞。
【請求項１７】
大腸菌である、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項１８】
前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニのPglBである、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項１９】
フリッパーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を更に含む、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項２０】
前記フリッパーゼが、カンピロバクター・ジェジュニのPglK又はナイセリア・メニンギチディスのPglFである、請求項19記載の原核宿主細胞。
【請求項２１】
グリコシルトランスフェラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を更に含む、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項２２】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、ナイセリア・メニンギチディスのPglA又は志賀赤痢菌のRfpBである、請求項21記載の原核宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、Und-PP-DATDHを生成する、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、N.メニンギチディスPglB、PglC、及びPglDを含む、請求項23記載の原核宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、Und-PP-GATDHを生成する、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、N.メニンギチディスPglB2、PglC、及びPglDを含む、請求項25記載の原核宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、Und-PP-DATDH-Gal(OAc)を生成し且つフリップさせる、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、N.メニンギチディスPglB、PglC、及びPglD、PglF、PglA及びPglIを含む、請求項27記載の原核宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、Und-PP-GATDH-Gal(OAc)を生成し且つフリップさせる、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、N.メニンギチディスPglB2、PglC、及びPglD、PglF、PglA及びPglIを含む、請求項29記載の原核宿主細胞。
【請求項３１】
前記原核宿主細胞が、galE中にトランスポゾン変異を保有するカンピロバクター・ジェジュニのpglクラスターを含む、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項３２】
前記原核宿主細胞の作製に関する薬物選択マーカーとして、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、及び／又はトリメトプリムが使用される、請求項16記載の原核宿主細胞。
【請求項３３】
a.  請求項16〜32のいずれか一項記載の原核宿主生物を培養する工程；及び
b.  バイオコンジュゲートを単離する工程：を含む、請求項1記載のバイオコンジュゲートの作製方法。
【請求項３４】
前記培養工程が、テリフィックブロス(TB)培地において実行される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記培養工程が、MgCl2の存在下で実行される、請求項33記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1. 緒言）
グリコシル化タンパク質を含有するバイオコンジュゲートを作製することが可能な原核細胞、及びそのような原核細胞の作製方法が、本明細書において提供される。そのようなバイオコンジュゲートを含有する組成物、及び／又はそのようなバイオコンジュゲートの糖残基を含有する組成物に加え、そのような組成物を用い対象をワクチン接種する方法も、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
（2. 背景）
グリコシル化は、生命の全ての領域(domain)において認められる生物学的プロセスである。グリコシル化のプロセスは、タンパク質又はポリペプチド鎖などのアクセプター分子への糖質の付加を含み、且つ細胞相互作用、タンパク質フォールディング、分泌及び分解を含む、多くの生物学的機能に関与している。
【０００３】
タンパク質のアスパラギン残基へのオリゴ糖の付加である、N型-グリコシル化は、真核生物の最も頻繁な翻訳後修飾である。N型-グリコシル化は、小胞体において起こり、そこでは予め集成されたオリゴ糖が、脂質担体（ドリコールリン酸）から、新生タンパク質のアスパラギン残基へ、保存配列Asn-X-Ser/Thr（式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である）内で、酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)により、転移される。その後この糖鎖は、ゴルジ装置において、他の修飾を受ける。
【０００４】
先行する研究が、N型-グリコシル化を実行することができる大腸菌(E. coli)株をいかに作製するかを明らかにしている（例えば、Wackerらの文献、Science, 2002; 298(5599):1790-3；Nita-Lazarらの文献、Glycobiology, 2005; 15(4):361-7；Feldmanらの文献、Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(8):3016-21；Kowarikらの文献、EMBO J. 2006; 25(9):1957-66；Wackerらの文献、Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(18):7088-93；国際公開公報番号WO2003/074687、WO2006/119987、WO 2009/104074、及びWO/2011/06261；並びに、国際特許出願番号PCT/EP2011/057111を参照されたい）。グリコシル化の別の形であるO型-グリコシル化は、セリン残基又はトレオニン残基の修飾を含む。加えて、グラム陰性菌であるカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)は、それ自身のグリコシル化機構を有する。この機構は、pglと称されるクラスターにより（タンパク質グリコシル化に関して）コードされており、これは大腸菌へ転移されることができ、大腸菌により発現される組換えタンパク質のグリコシル化を可能にする。
【０００５】
ナイセリア・メニンギチディス(Neisseria meningitidis)は、髄膜炎の主因である。世界保健機関(WHO)によると、年間100万例を超える侵襲性髄膜炎菌疾患が存在し、平均死亡率は9％であると推定されている。N.メニンギチディス菌は、莢膜多糖(CPS)及びリポオリゴ糖(LOS)などのそれらの細胞表面グリカンを基に、いくつかのグループに分類されている。今日までに、いくつかのグライココンジュゲート-ベースの髄膜炎菌ワクチンが、N.メニンギチディスから単離されたCPSのタンパク質への化学的カップリングにより、開発に成功しているが；しかしB群CPSは、構造がヒトプロテオグリカンに類似しているという理由で、CPS-ベースのワクチンの製造は、N.メニンギチディスB群血清型については成功していない。最近の研究は、N.メニンギチディス、N.ゴノローエ(N. gonnorroae)、及びN.ラクタミカ(N. lactamica)などの様々なナイセリア菌種の表面に位置した新たなオリゴ糖を同定した（例えば、Borudらの文献、2010, J. Bacteriol. 192(11):2816-2829参照）。これらのオリゴ糖は、O型-グリコシド結合を介して、ピリンなどの数多くの細胞-表面タンパク質へ付着されている。この生物におけるO型-グリコシル化を左右するプロセスは、カンピロバクターのN型-グリコシル化経路に類似している。従ってこれらの表面グリカンは、ワクチン開発のための、特にN.メニンギチディス株B群血清型に対するワクチン開発のための、新たな標的を表している。
【０００６】
本発明において、ワクチン候補として使用することができる様々なナイセリア表面オリゴ糖を伴う独創的なグリコシル化タンパク質を生成する方法が開発されている。新規且つ革新的なグリコシル化タンパク質を生成するために、異なる大腸菌株を操作し、初めてナイセリアタンパク質O型-グリコシル化システムとカンピロバクター菌種タンパク質N型-グリコシル化システムを組合せた。
【発明の概要】
【０００７】
（3. 概要）
本発明は、原核宿主において、単糖、二糖、又は三糖により、標的タンパク質をグリコシル化する方法を提供する。いくつかの実施態様において、単糖、二糖、又は三糖によるグリコシル化は、グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn-X-Ser/Thr（式中、Xは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる）；又は、Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる）のアスパラギン残基で起こる。より具体的には、いくつかの実施態様において、N型-グリコシル化のためのコンセンサス配列が、標的タンパク質へ組換えにより導入される。いくつかの実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核宿主へ導入される。このオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、任意の給源に由来することができる。特定の実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクターに由来している。
【０００８】
本発明はまた、本明細書記載の方法を基に特異的コンジュゲートの生合成のために操作されている原核宿主細胞も提供する。本発明は更に、先に説明された方法により、操作された原核生物から作製されたバイオコンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される原核宿主細胞は、非限定的に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、及びグリコシルトランスフェラーゼを含む、脂質結合型オリゴ糖の生合成に必要な遺伝子のセットを発現するように、操作されている。
【０００９】
本発明は更に、標的タンパク質のグリコシル化のための培養条件を提供する。いくつかの実施態様において、MgCl2が培養培地へ添加され、特に1〜100mM MgCl2、1〜50mM MgCl2、1〜25mM MgCl2、1〜10mM MgCl2、5〜100mM MgCl2、5〜50mM MgCl2、5〜25mM MgCl2、5〜15mM MgCl2、少なくとも1mM MgCl2、少なくとも5mM MgCl2、少なくとも10mM MgCl2、少なくとも15mM MgCl2、少なくとも20mM MgCl2、又は少なくとも25mM MgCl2が、添加される。特定の実施態様において、最大でも1mM MgCl2、最大でも5mM MgCl2、最大でも10mM MgCl2、最大でも15mM MgCl2、最大でも20mM MgCl2、又は最大でも25mM MgCl2が添加される。具体的実施態様において、10mM MgCl2が添加される。具体的実施態様において、培養培地中のMgCl2濃度は、10mMである。
【００１０】
いくつかの実施態様において、テリフィックブロスが、本明細書に提供される原核宿主細胞のための培養培地として使用される。いくつかの実施態様において、プラスミドの存在を選択するために必要な異なる抗生物質の数を減らすために、複数のオープンリーディングフレームが、単独のプラスミド上に導入される。
【００１１】
一態様において、担体タンパク質及びオリゴ糖を含むバイオコンジュゲート、例えば単離されたバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。
【００１２】
特定の実施態様において、担体タンパク質及び単糖を含むバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。当業者は、本発明の発見を基に、単糖を、担体タンパク質へ転移することができることを認めるであろう。従って当業者は、本明細書記載の方法に従い使用するために選択される特定の単糖は限定されないことを認めるであろう。いくつかの実施態様において、この単糖は、DATDH又はGATDHである。別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び単糖を含み、ここで該単糖がN.メニンギチディス由来である、バイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。
【００１３】
別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び二糖を含むバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。当業者は、本発明の発見を基に、二糖を、担体タンパク質へ転移することができることを認めるであろう。従って当業者は、本明細書記載の方法に従い使用するために選択される特定の二糖は限定されないことを認めるであろう。いくつかの実施態様において、この二糖は、Gal-DATDH、Gal(OAc)-DATDH、Gal-GATDH、Gal-GATDH、Gal(OAc)-GATDH、Gal-GlcNAc、Gal(OAc)-GlcNAc、Glc-DATDH、又はGlc-GATDHである。別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び二糖を含み、ここで該二糖がN.メニンギチディス由来である、バイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。
【００１４】
別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び三糖を含むバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。当業者は、本発明の発見を基に、三糖を、担体タンパク質へ転移することができることを認めるであろう。従って当業者は、本明細書記載の方法に従い使用するために選択される特定の三糖は限定されないことを認めるであろう。いくつかの実施態様において、この三糖は、Gal(OAc)-Gal-DATDH、Gal-Gal-DATDH、Gal(OAc)-Gal-GATDH、又はGal-Gal-GATDHである。別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び三糖を含み、ここで該三糖がN.メニンギチディス由来である、バイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの単糖、二糖、又は三糖は、担体タンパク質のグリコシル化部位内のAsnに、共有結合されており、ここで該グリコシル化部位は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい）を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの担体タンパク質は、グリコシル化部位を天然には（例えば、それらの通常の／未変性の、又は「野生型の」状態では）含まない。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの担体タンパク質は、1つ以上のグリコシル化部位を含むように、操作されており、例えば該担体タンパク質は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい）を含む1つ以上のグリコシル化部位を含むように、操作されている。例えば、本明細書に記載の方法に従い使用される担体タンパク質は、各々、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい）を有するグリコシル化部位を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれよりも多く含んでよく；且つ、ここで一部(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、又は9)又は全てのグリコシル化部位は、担体タンパク質へ組換えにより導入されている。
【００１６】
本明細書記載の方法での使用に適した任意の担体タンパク質を、本明細書に記載の方法に従い使用することができる。担体タンパク質の例は、緑膿菌(P. aeruginosa)の外毒素A、CRM197、ジフテリア毒素、破傷風毒素、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の解毒されたヘモリシンA、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒された変種、コレラ毒素Bサブユニット、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒された変種、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、及びC.ジェジュニ天然糖タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを作製するための担体タンパク質は、ナイセリアの抗原、例えばN.メニンギチディスB群の抗原などの、ナイセリア・メニンギチディスの抗原である。N.メニンギチディスの抗原の例は、ピリン、NMB0088、亜硝酸レダクターゼ(AniA)、ヘパリン-結合抗原(NHBA)、H因子結合タンパク質(fHBP)、接着分子(adhesion)、NadA、Ag473、又は表面タンパク質A(NapA)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
第二の態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを生成することが可能である原核宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００１９】
特定の実施態様において、バイオコンジュゲートを作製するための原核宿主細胞が、本明細書において提供され、ここで該原核宿主細胞は：(i)アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（式中、X及びZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であってよい）を含む、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む担体タンパク質をコードしている異種ヌクレオチド配列；並びに、(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列：を含み；ここで該原核宿主細胞は、組換えにより操作され、Und-PP-単糖、Und-PP-二糖、又はUnd-PP-三糖を生成し、且つここで該オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、二糖又は三糖をグリコシル化部位のAsnへ転移する。特定の実施態様において、本明細書記載の原核宿主細胞は、大腸菌宿主細胞である。別の特定の実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、本明細書記載の宿主細胞、例えば大腸菌宿主細胞へ、組換えにより導入され、これはカンピロバクター・ジェジュニのPglBである。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本明細書記載の宿主細胞は、異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼに加え、異種核酸配列（すなわち、その天然／未変性の状態、例えばその「野生型の」状態においては、宿主細胞とは通常会合しない、核酸配列、例えば遺伝子）を含む。そのような追加の異種核酸配列は、フリッパーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニのPglK若しくはナイセリア・メニンギチディスのPglF）；及び／又は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ナイセリア・メニンギチディスのPglA若しくは志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)のRfpB）を含んで良いが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様において、本明細書記載の宿主細胞（例えば、原核宿主細胞、例えば大腸菌）に組換えにより導入された異種核酸(nucleic)配列は、N.メニンギチディスPglB、PglC、及びPglD；N.メニンギチディスPglB2、PglC、及びPglD；N.メニンギチディスPglB、PglC、及びPglD、PglF、PglA及びPglI；並びに／又は、N.メニンギチディスPglB2、PglC、及びPglD、PglF、PglA及びPglIの遺伝子をコードしている核酸を含む。また他の特定の実施態様において、本明細書記載の宿主細胞（例えば、原核宿主細胞、例えば大腸菌）に組換えにより導入された異種核酸(nucleic)配列は、カンピロバクター・ジェジュニの全pglクラスター、又は例えば該クラスターのgalE内のトランスポゾン変異などの、所望の遺伝子の変異若しくは欠失を保有するカンピロバクター・ジェジュニの全pglクラスターに対応する遺伝子をコードしている核酸を含む。
【００２１】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される原核宿主細胞は、Und-PP-DATDH、Und-PP-GATDH、Und-PP-DATDH-Gal(OAc)、及び／又はUnd-PP-GATDH-Gal(OAc)を生成し且つフリップする。
【００２２】
また別の態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを作製する方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを作製する方法は、本明細書記載の宿主細胞を、タンパク質の生成に適した条件下で培養すること、及びバイオコンジュゲートを単離することを含む。当業者は、本明細書記載のバイオコンジュゲートが、該宿主細胞により生成され、それに続き単離され得るように、宿主細胞の成長の維持に適した条件を認めるであろう。そのような方法は追加的に、本明細書に提供した作業実施例を包含している（セクション6参照）。
【００２３】
また別の態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを含有する組成物、例えば免疫原性組成物が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、本明細書記載の免疫原性組成物は、本明細書記載のバイオコンジュゲート及び1種以上の追加成分、例えばアジュバントを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
（4. 図面の説明）
【図１】図1は、C-末端hexa-Hisタグを持つ2つのN型-グリコシル化部位を伴うコレラ毒素サブユニットB(CTB)の発現に使用した、「プラスミドp6」を描いている。プラスミドp6のマップは、(A)に示している。OmpAシグナル配列は、ペリプラズム内のCTBの発現に使用される。(B)は、プラスミドp6のDNA及び翻訳されたタンパク質の配列を示している。タンパク質配列中の下線をつけたAsn残基は、N型-グリコシル化部位の位置を示している。
【００２５】
【図２】図2は、4つのN型-グリコシル化部位を伴う緑膿菌外毒素A(EPA)の発現に使用した、「プラスミドp18」を描いている。プラスミドp18のマップは、(A)に示している。DsbAシグナル配列は、ペリプラズム内のEPAの発現に使用される。(B)は、プラスミドp18のDNA及び翻訳されたタンパク質の配列を示している。タンパク質配列中の下線をつけたAsn残基は、N型-グリコシル化部位の位置を示している。
【００２６】
【図３】図3は、合成N.メニンギチディスPglA-Iオペロンの発現に使用した、「プラスミドp15」を描いている。pglAは、N.メニンギチディスのガラクトシルトランスフェラーゼをコードし、且つpglIは、O-アセチルトランスフェラーゼをコードしている。このプラスミドにおいて、PglA-Iの合成のコドン利用が最適化されたオペロンを、pMLBADベクターにクローニングした。プラスミドp15のマップは、(A)に示している。(B)は、PglA-IオペロンのDNA配列を示している。
【００２７】
【図４】図4は、フリッパーゼをコードしているN.メニンギチディスpglFの発現に使用した、「プラスミドp13」を描いている。pglFを、N.メニンギチディスL2 35EのゲノムDNAから、PCRにより増幅し、且つpMLBADへクローニングした。プラスミドp13のマップは、(A)に示している。(B)は、プラスミドp13のDNA及び翻訳されたタンパク質配列を示している。
【００２８】
【図５】図5は、合成N.メニンギチディスPglFBCDAIオペロンの発現に使用した、「プラスミドp17」を描いている。合成PglFBCDAIオペロンを、pMLBADへクローニングした。プラスミドp17のマップは、(A)に示している。(B)は、PglFBCDAIオペロンのDNA配列を示している。プラスミドp17は、Gal(OAc)-DATDH-Undppの生合成及びペリプラズムへの移行に必要な遺伝子を全て含む。
【００２９】
【図６】図6は、合成N.メニンギチディスPglFB2CDAIオペロンの発現に使用した、「プラスミドp20」を描いている。合成PglFB2CDAIオペロンを、pMLBADへクローニングした。プラスミドp20のマップは、(A)に示している。(B)は、PglF-B2-C-D-A-IオペロンのDNA配列を示している。プラスミドp20は、Gal(OAc)-GATDH-Undppの生合成及びペリプラズムへの移行に必要な遺伝子を全て含む。
【００３０】
【図７】図7は、C.ジェジュニのN-グリカン生合成経路を使用する、大腸菌における異なるリポオリゴ糖(LOS)構造の合成を明らかにしている。大腸菌SCM7及び大腸菌Sφ874ΔwecA-wecG（例えば、Alaimoらの文献、EMBO, 2006参照）を、生合成経路遺伝子クラスターの異なる遺伝子にトランスポゾン変異を収容する異なるC.ジェジュニ81116 pglプラスミドにより形質転換した（例えば、Lintonらの文献、Mol. Micro., 2005参照）。全細胞抽出物を、レムリ試料緩衝液中で、プロテイナーゼKにより消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行い、ゲルを銀染色に供した。レーン1、「プラスミドp1」(pACYC184、エンプティベクター)；レーン2、「プラスミドp3」(pACYCpglA::Kan)；レーン3、「プラスミドp4」(pACYCpglJ::Kan)；レーン4、「プラスミドp5」(pACYCpglH::Kan)；レーン5、「プラスミドp2」(pACYCpgl、全タンパク質グリコシル化クラスターを含む)。C.ジェジュニ切断型オリゴ糖及びN-グリカン変種の合成のための全てのプラスミドは、構成的プロモーターの制御下であった（Wackerらの文献、Science, 2002参照）。振盪フラスコ培養物を、37℃で一晩インキュベーションした後収集した。消化された全細胞抽出物(OD 0.01)を、12％ビス-トリスNuPageゲル(Invitrogen社)上、MES緩衝液を用い、200Vで50分間流した。
【００３１】
【図８】図8は、大腸菌におけるC.ジェジュニN-グリカンの切断型変種により操作されたコレラ毒素サブユニットB(CTB)のグリコシル化を明らかにしている。操作されたCTBをコードし、2つのN型-グリコシル化部位を含むプラスミドp6、及び糖生成及びPglB発現のための他の2つのプラスミドにより同時形質転換された、大腸菌SCM6及び大腸菌SCM7ΔwaaLのペリプラズム抽出物のウェスタンブロット分析を描いている。レーン1、pEXT21エンプティベクター（「プラスミドp7」)及び「プラスミドp8」（W458A/D459Aの二重変異により失活されたPglBを伴う、C.ジェジュニ全タンパク質グリコシル化クラスターを含む、pACYCpglBmut)；レーン2、「プラスミドp9」（C.ジェジュニPglBを発現している）及びプラスミドp8；レーン3、プラスミドp9及びプラスミドp5；レーン4、プラスミドp9及びプラスミドp7。振盪フラスコ培養に、一晩予備培養物を接種し、且つODが0.4〜0.8に達するまで、振盪インキュベーター内で、37℃で維持した。培養物を、0.02％アラビノース及び1mM IPTGにより誘導し、且つ振盪インキュベーター内で、37℃で一晩インキュベーションした。ペリプラズム抽出物のある量（OD 0.02に等しい）を、NuPAGE 12％SDS-ゲル(Invitrogen社)上に装加し、MES緩衝液を用い、200Vで65分間流し、iBlotへエレクトロブロッティングした。ブロットを、PBST中の10％ミルクでブロッキングした後、呈色させ、且つ抗-CTBポリクローナル抗体(1：1000)と一緒にインキュベーションし、引き続きHRP結合した抗-ウサギ(1：10,000、BioRad社)と一緒にインキュベーションした。
【００３２】
【図９】図9は、N.メニンギチディスフリッパーゼPglFの機能的特徴を明らかにしている。ウンデカプレニルピロリン酸に連結されたグリカンフリッパーゼ活性を欠いている大腸菌SCM7を、「プラスミドp10」(N型-グリコシル化経路のフリッパーゼを失活している、pglKにトランスポゾン変異を伴う、C.ジェジュニ81116 pglクラスターを含む)により形質転換し、且つフリッピング活性の相補性を、他のフリッパーゼにより試験した：レーン1、「プラスミドp11」(pMLBAD、エンプティベクター)；レーン2、機能性C.ジェジュニPglKを発現している、「プラスミドp12」(Alaimoらの文献、EMBO, 2006参照)；レーン3；プラスミドp13(N.メニンギチディス35E pglFを発現している、pGVX654)。培養物は、振盪フラスコ内で37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、レムリ緩衝液中のプロテイナーゼKにより消化した。消化した試料(OD 0.01)を、12％ビス-トリスNuPage SDS-ゲル(Invitrogen社)上、MES緩衝液を用い、200Vで50分間流した。
【００３３】
【図１０】図10は、大腸菌における、N.メニンギチディスPglAガラクトシルトランスフェラーゼの機能的特徴を明らかにしている。Aは、以下を収容する大腸菌SCM7において生成されたLOSの銀染色したPAGEプロファイルを示している：レーン1、プラスミドp2（pACYCpgl、全タンパク質グリコシル化クラスター）及びエンプティベクター対照（pMLBAD、プラスミドp11）；レーン2、プラスミドp3（Undpp-DATDH上の第一のGalNAc集成体を損なっている、pglAのトランスポゾン変異を伴うC.ジェジュニpglクラスターを含む）及びエンプティベクター（pMLBAD）；レーン3、プラスミドp3及びプラスミドp14（Undpp-GlcNAcへGalを集成するO-抗原Gal-トランスフェラーゼをコードしている、志賀赤痢菌O1 rfpBを発現している）；レーン4、プラスミドp3及びプラスミドp15（各々、Gal-トランスフェラーゼ及びO-アセチルトランスフェラーゼをコードしている、N.メニンギチディスpglA-Iオペロン）；レーン5；エンプティベクター対照pMLBAD（プラスミドp11）及びpACYC184（プラスミドp1）。Bは、C.ジェジュニ七糖（N-グリカン）を特異的に認識する抗体を使用する、パネルAからの対応する試料のウェスタンブロット分析の結果を図示している。培養物は、0.2％アラビノースで誘導した後接種し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、プロテイナーゼKにより消化し、試料のある量(OD 0.01)を銀染色し、更に試料のある量(OD 0.01)をウェスタンブロットした。両方に関して、試料は、12％ビス-トリスNuPage SDS-ゲル(Invitrogen社)上、MES緩衝液を用い、200Vで50分間流した。
【００３４】
【図１１】図11は、N.メニンギチディスPglAの特異性を明らかにしている。大腸菌SCM3（大腸菌Sφ874ΔwaaL）を、pglA及びpglIをコードしているプラスミドp15、又はエンプティベクター（pMLBAD、プラスミドp11）により形質転換し、脂質結合型オリゴ糖(LLO)を抽出し且つ分析した。(A)は、GlycoSep(商標)Nカラム(Prozyme社)に流され、分離された、2ABで標識されたLLOのHPLCクロマトグラムを示す。矢印は、エンプティベクターのプラスミドp11を伴う細胞由来の対照抽出物(破線)と比べ、プラスミドp15を収容する細胞由来の抽出物のクロマトグラムで認められた強いピーク(実線)を示す。(B)は、先に指摘されたピークのMS/MS分析を示す。
【００３５】
【図１２】図12は、N.メニンギチディスpglA-Iを発現している大腸菌SCM3からのLLO抽出物のインビトロ分析を明らかにしている。図14に使用したものと同じ試料を含む濃縮したLLO抽出物(OD 200)を、精製したC.ジェジュニPglB及び合成ペプチドTamra-DANYTKを使用する、インビトロN型-グリコシル化アッセイに使用した。(A)は、インビトログリコシル化後の糖ペプチドのPAGE分析を図示している。(B)において、インビトロ糖ペプチド試料(パネルAのレーン3と同じ試料)を、キサントモナス・マニホチス(Xanthamonas manihotis)(NEB)由来のα1-3,6ガラクトシダーゼにより処理し、PAGE分析に供した。レーン1、未処理の糖ペプチド；レーン2、ガラクトシダーゼで処理した糖ペプチド；レーン3；PAGEゲルに装加する前に混合した、等量の処理した試料及び未処理の試料。(C)は、精製したペプチドのMS/MS分析を示す。
【００３６】
【図１３】図13は、大腸菌におけるN.メニンギチディスMC58二糖Gal(OAc)-DATDHの生成を明らかにしている。LOSの銀染色PAGE分析は、以下を収容する大腸菌SCM7を形成している：レーン1、プラスミドp15（pglA-Iを発現している）及びエンプティベクター（pACYC184）；レーン2、プラスミドp16（galEエピメラーゼにトランスポゾン変異を伴う、C.ジェジュニpglクラスターを含み、UDP-GalNAcの生成を無効にし、その結果Undpp-diNAcBacを蓄積する）及びエンプティベクター（pMLBAD、p11）；レーン3、プラスミドp16及びプラスミドp14（ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしている、志賀赤痢菌O1 rfpBを発現している）；レーン4、プラスミドp15及びプラスミドp16。培養物は、0.2％アラビノースで誘導し、振盪フラスコ内で37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、プロテイナーゼKにより消化し、試料のある量(OD 0.01)を銀染色し、更に試料のある量(OD 0.01)をウェスタンブロットした。両方に関して、試料を、12％ビス-トリスNuPage SDS-ゲル(Invitrogen社)上、MES緩衝液を用い、200Vで50分間流した。
【００３７】
【図１４】図14は、C.ジェジュニN-グリカン生合成経路とナイセリアガラクトシルトランスフェラーゼの組合せによる、N.メニンギチディスMC58二糖Gal(OAc)-DATDHとのグライココンジュゲートの生成を明らかにしている。大腸菌SCM6を、プラスミドp15（pglA-IN.メニンギチディスを発現する）、p16（pACYCgalEmut、C.ジェジュニpglのgalE変異体を発現する）、p9（p114、pglBC.ジェジュニを発現する）及びp6（2つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたCTBを発現する）により形質転換した。(A)は、IMACを使用し精製したCTBのクーマシー-染色したSDS-PAGEを描いている。(B)は、ペリプラズム抽出後に細胞から抽出されたLLOの2AB-標識物のHPLCクロマトグラムを描いている。(C)は、トリプシン消化されグリコシル化されたCTBのMS分析を描いている。テリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質を抽出し、且つIMACに適用した。
【００３８】
【図１５】図15は、N.メニンギチディスMC58二糖Gal(OAc)-DATDHとの組換えグライココンジュゲートの生成のために操作された大腸菌のLLO分析を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp17（合成オペロンpglFBCDAIN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）、及びp6（2つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたCTBを発現する）により形質転換した。(A)は、細胞から抽出されたLLOの2AB-標識物のHPLCクロマトグラムを描いている。(B)は、パネルAにおいて矢印で示されたピークのMS/MS分析を描いている。10mM MgCl2を補充したテリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質を抽出し、且つIMACに適用した。
【００３９】
【図１６】図16は、N.メニンギチディスMC58二糖Gal(OAc)-DATDHによるグライココンジュゲートの生成を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp17（合成オペロンpglFBCDAIN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）及びp6（2つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたCTBを発現する）により形質転換した。(A)は、IMAC精製されたCTBのクーマシー-染色されたSDS-PAGEを描いている。(B)は、グリコシル化されたCTBのトリプシン消化後の糖ペプチドのMS/MS分析を描いている。上左側パネル、Gal-DATDHによりグリコシル化された
【化１】
2014526449.tif 000002
(ペプチド1、配列番号:10)のイオンフラグメンテーション；下左側パネル、Gal(OAc)-DATDHによりグリコシル化された
【化２】
2014526449.tif 000003
(ペプチド2、配列番号:11)の87位で誤切断された同じペプチド；下側パネル、Gal-DATDH(左側)及びGal(OAc)(右側)による、
【化３】
2014526449.tif 000004
(ペプチド3、配列番号:12)のイオンフラグメンテーション。ペプチド3は、カルボキシメチル化される。10mM MgCl2を補充したテリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質を抽出し、且つIMACに適用した。
【００４０】
【図１７】図17は、N.メニンギチディスMC58二糖Gal(OAc)-DATDHにより操作されたEPAのグリコシル化を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp17（合成オペロンpglFBCDAIN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）及びp18（4つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたEPAを発現する）により形質転換した。(A)は、ペリプラズム抽出物のウェスタンブロット分析を描いている。レーン1、グリコシル化されないEPA；レーン2及び3、グリコシル化されたEPA。(B)は、グリコシル化されたEPAの最終精製工程、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)のクーマシー-染色したSDS-PAGEを描いている。精製された糖タンパク質は、トリプシンにより消化し、LC-MSに供される。(C)は、トリプシン処理した糖ペプチドのMS/MS分析を描いている。
【００４１】
【図１８】図18は、N.メニンギチディスMC58二糖Gal-DATDHによるグライココンジュゲート生成を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp19（O-アセチルトランスフェラーゼ(PglI)を欠いている合成オペロンpgFBCDAN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）及びp6（2つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたCTBを発現する）により形質転換した。(A)は、ペリプラズム抽出後の細胞ペレット由来の2AB標識されたLLOプロファイルのHPLCクロマトグラムを描き、矢印は、Gal-DATDH-2ABを含むピークを描いている。(B)は、IMAC精製されたCTBのクーマシー-染色したSDS-PAGEを描いている。レーン1、陰性対照、精製されたグリコシル化されないCTB；レーン2-7、Ni-カラムからの溶離画分；レーン8、陽性対照、Gal(Oac)-DATDHによりグリコシル化された精製されたCTB。(C)は、グリコシル化されたCTBのトリプシン消化後の糖ペプチドのMS/MS分析を描いている。Gal-DATDHによりグリコシル化された
【化４】
2014526449.tif 000005
(配列番号:10)のイオンフラグメンテーションが示されている。10mM MgCl2を補充したテリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質を抽出し、且つIMACに適用した。
【００４２】
【図１９】図19は、N.メニンギチディス二糖Gal(OAc)-GATDHによる組換えコンジュゲートの生成のための操作された大腸菌のLLO分析を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp20（合成オペロンpglFB2CDAIN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）及びp6（2つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたCTBを発現する）により形質転換した。(A)は、細胞から抽出された2AB-標識されたLLOのHPLCクロマトグラムを描き、矢印は、指定された糖構造を含むピークを示している。(B)は、パネルAにおいて矢印により示されたピークのMS/MS分析を描いている。10mM MgCl2を補充したテリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質を抽出し、且つIMACに適用した。LLOは、ペリプラズム抽出後に、細胞ペレットから抽出した。
【００４３】
【図２０】図20は、N.メニンギチディス二糖Gal(OAc)-GATDHによるグライココンジュゲートの生成を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp20（合成オペロンpglFB2CDAIN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）及びp6（2つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたCTBを発現する）により形質転換した。(A)は、IMAC精製されたCTBのクーマシー-染色されたSDS-PAGEを描いている。レーン1、グリコシル化されない精製されたCTB；レーン2-7、Ni-カラムからの溶離画分；レーン8、陽性対照、(Gal(OAc)-DATDHによりジ-グリコシル化された精製されたCTB)。(B)は、グリコシル化されたCTBのトリプシン消化後の糖ペプチドのMS/MS分析を描いている。トリプシン処理されたペプチド
【化５】
2014526449.tif 000006
(配列番号:10)は、Gal(OAc)-GATDHによりグリコシル化され（上側パネル）、且つ非-アセチル化型（下側パネル）であると同定された。10mM MgCl2を補充したテリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で37℃で、一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質を抽出し、且つIMACに適用した。
【００４４】
【図２１】図21は、N.メニンギチディス二糖Gal(OAc)-GATDHによるグライココンジュゲートの生成を明らかにしている。大腸菌SCM6は、プラスミドp20（合成オペロンpglFB2CDAIN.メニンギチディスを発現する）、p9（pglBC.ジェジュニを発現する）及びp18（4つのN型-グリコシル化部位を含む、操作されたEPAを発現する）により形質転換した。(A)は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)後の精製されたEPAのクーマシー-染色されたSDS-PAGEを描いている。レーン1、グリコシルされない精製されたEPA；レーン2-7、SECカラムからの溶離画分。(B)は、グリコシル化されたEPAのトリプシン消化後の糖ペプチドのMS/MS分析を描いている。トリプシン処理されたペプチド
【化６】
2014526449.tif 000007
(配列番号:13)は、Gal(OAc)-GATDHによりグリコシル化され（上側パネル）、且つ非-アセチル化型（下側パネル）であると同定された。10mM MgCl2を補充したテリフィックブロス(TB)を、細胞の成長に使用した。培養物は、0.1％アラビノース及び1mM IPTGで誘導し、振盪フラスコ内で、37℃で一晩成長させ、次に細胞を収集し、ペリプラズム抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、引き続きSECに適用し、精製されたEPAを得た。
【００４５】
【図２２】図22は、異なるN.メニンギチディスO型-グリコシル化されたピリンに対し産生された特定のグリカン抗体は、組換えN型-グリコシル化タンパク質を認識することを明らかにしている。グリコシル化されたEPA(A)及びCTB(B)のウェスタンブロット分析。レーン1、非グリコシル化タンパク質；レーン2、Gal(OAc)-DATDHによるグリコシル化タンパク質；レーン3、Gal-DATDHによるグリコシル化タンパク質；レーン4、Gal(OAc)-GATDHによるグリコシル化タンパク質。精製されたタンパク質200ngを、12％NuPAGEゲル(Invitrogen社)に装加し、且つMES緩衝液を用い、200Vで70分間流した。ゲルを、iBlotへトランスブロットし、ミルクによりブロッキングした。ウサギ由来の一次抗体、α-EPA(1：1000)、α-CTB(1：1000)、α-DATDH-Gal(1：20,000)、α-GATDH(1：20,000)を使用し；HRP結合した抗-ウサギ抗体(1：10,000)を、二次抗体として使用した。
【００４６】
【図２３】図23は、ウサギにおけるCTB-DATDH-Gal(OAc) の免疫原性を明らかにしている。IgG力価(titter)は、ELISAを用い、組換えグライココンジュゲートの注射後に、ウサギ血清中で測定した。ホワイトニュージーランドウサギに、異なるアジュバントと共にグライココンジュゲートの低用量(1μg)及び高用量(10μg)を、28日間隔で、3回注射した。ミョウバンでアジュバントしたグライココンジュゲートを注射したウサギには、アルハイドロゲル0.06％を使用した。初回注射にはフロイント完全アジュバント(FCA)を使用し、引き続きフロイント不完全アジュバント(FIC)を使用した。ウサギ血清は、77日後に得た。対照ウサギには、アジュバントを含有する緩衝液を注射した。グリコシル化されたEPAを使用し、ELISAプレートをコーティングした。
【００４７】
【図２４】図24は、CTB-DATDH-Gal(OAc)を注射されたウサギの血清は、ナイセリア・メニンギチディスのグリコシル化されたピリンを認識することを明らかにしている。ウェスタンブロット分析は、異なるN.メニンギチディス株由来の全細胞抽出物について行った：未知のO-グリカンを伴う臨床単離株である、Mφ1 240013；Gal(OAc)-GATDHによりグリコシル化されたピリンを含む、NZ 98/254；並びに、両方共Gal(OAc)-DATDHによりグリコシル化されたピリンを含む、H4476-SL及びMC58。ゲルブロットに装加された全細胞抽出物(OD 0.09)は、下記と共にインキュベーションした：(A)N.メニンギチディスピリンに対するポリクローナル抗体を含む血清(1：2000)；(B)コンジュゲートの注射前のウサギ由来の血清(1：50)；及び、(C)免疫後血清(1：50)。
【００４８】
【図２５】図25は、C.ジェジュニの二糖による、CTBのグリコシル化を明らかにしている。CTB（「プラスミド2」）、PglJmut（「プラスミド3」、レーン1及び2）又はPglクラスター（「プラスミド1」、レーン3）及び過剰発現されたPglB（「プラスミド5」、レーン1及び3）又はエンプティベクター（eV、レーン2）を発現しているSCM6のペリプラズム抽出物ウェスタンブロット分析。抗-CTBを使用し、OD 0.2を装加した。
【００４９】
【図２６】図26は、CTBのグリコシル化の最適化を明らかにしている。下記由来のペリプラズム抽出物のCTBに対するウェスタンブロット分析：(A)異なる抗生物質を伴うLBにおいて成長され、4時間誘導され、OD 0.2で装加されたCTB（「プラスミド2」）、過剰発現されたPglB（「プラスミド5」、レーン1〜6、及び8）又はなし（eV、レーン7）、N.メニンギチディスのO-アセチル化されたガラクトース（「プラスミド12」、レーン1〜6）及びGalEで変異されたpglクラスター（「プラスミド4」、レーン1〜6）又はWTクラスター（「プラスミド1」、レーン8）を発現しているSCM6；(B)LB、SOB、TB、TSB又はBHIにおいて成長され、一晩誘導され、OD 0.2で装加されたCTB、過剰発現されたPglB、N.メニンギチディスのO-アセチル化されたガラクトース、及びGalEで変異されたpglクラスターを発現しているSCM6；(C)TB±10mM MgCl2において成長され、一晩誘導され、且つHis SpinTrapカラムにおいて精製された、同じ菌株由来のペリプラズム抽出物。各画分5μLを装加した。L：装加画分、FT：通過画分、W：洗浄画分、E：溶離画分。
【００５０】
【図２７】図27は、グリコシル化されたCTBの精製を明らかにしている。下記由来の溶離画分のSDS-PAGE分析：(A)CTB（「プラスミド2」）、過剰発現されたPglB（「プラスミド5」）、N.メニンギチディスのO-アセチル化されたガラクトース（「プラスミド12」）、及びGalEで変異されたpglクラスター（「プラスミド4」）を発現しているSCM6；各画分5μLを装加した；(B)CTB、過剰発現されたPglB、及びN.メニンギチディスの全二糖を形成するオペロン（「プラスミド16」、pglFは誤配向にある）を発現しているSCM6；各画分10μLを装加した；(C)CTB、過剰発現されたPglB、及びN.メニンギチディスの全二糖を形成するオペロン（「プラスミド17」、pglFは正配向にある）を発現しているSCM6；各画分10μLを装加した。ゲルは、クーマシーシンプリーブルーで染色した。全ての実験に関して、細胞は、TB＋10mM MgCl2 において成長させ、且つ一晩誘導した。
【００５１】
【図２８】図28は、ナイセリア・メニンギチディスにおいて同定されたいくつかのO-グリカン構造を描いている（Borudらの文献、2011, PNAS USA 108:9643-9648を参照されたい）。
【００５２】
【図２９】図29は、C.ジェジュニにおける一般的N型-グリコシル化経路を描いている。(A)は、タンパク質グリコシル化に関与している遺伝子、Pglクラスターを示す。(B)は、N-グリカンの生合成及びN-グリカンのタンパク質アクセプターへの転移に関与した工程を図示している。
【００５３】
【図３０】図30は、ナイセリアにおける一般的O型-グリコシル化経路を描いている。(A)は、ナイセリアピリングリコシル化に関与している遺伝子の一部の遺伝子組織化を示す。C.ジェジュニpglとは異なり、ナイセリアタンパク質O型-グリコシル化に関する遺伝子の単独のクラスターは、同定されていない。(B)は、2,4-ジアセトイミド-2,4,6-トリデオキシヘキソピラノース(DATDH)の生合成、ウンデカプレニルピロリン酸(Undpp)上の集成、PglAの機能としてのガラクトース残基による伸長、及びPglIによるO-アセチル化、その後のPglFによるペリプラズムへのフリッピングに関与している工程を図示している。ペリプラズムPglLへの移行後、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、このグリカンをひとまとめで、ピリンなどのタンパク質担体へ集成する。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
（5. 詳細な説明）
本発明は、短い糖残基、例えば、単糖、二糖、及び三糖の生成、並びに原核システムにおける標的（担体）タンパク質上へのそのような糖残基（例えば、単糖、二糖、及び三糖）の集成に関する方法を提供する。いくつかの実施態様において、担体タンパク質は、グリコシル化されており、例えば、グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn?X-Ser/Thrコンセンサス配列（式中、Xは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる）；又は、Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrコンセンサス配列（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる）でグリコシル化されている。いくつかの実施態様において、そのようなグリコシル化コンセンサス配列の1つ以上が、選択されたタンパク質（標的／担体タンパク質）へ、組換えにより導入され得る。
【００５５】
従って本発明はまた、本明細書記載の方法に従い使用するために操作された（例えば、組換え手法を用い遺伝的に操作された）原核宿主細胞も提供する。本発明は更に、本明細書記載の方法を使用し作製される、バイオコンジュゲート、すなわちその上に短い糖残基（例えば、単糖、二糖、又は三糖）が集成された担体タンパク質を提供する。更に、宿主細胞及び／又は本明細書記載のバイオコンジュゲートを含有する組成物、例えば免疫原性組成物が、本明細書において提供される。そのような免疫原性組成物は、例えば、それから本明細書記載の方法に従い使用される短い糖残基（例えば、単糖、二糖、又は三糖）が誘導される特定の生物に対するワクチンとして、例えば、N.メニンギチディス及び他の細菌種に対するワクチンとして使用することができる。
【００５６】
いくつかの実施態様において、脂質結合型オリゴ糖(LLO)の生合成に必要な遺伝子が、本明細書記載の方法に従い使用される原核宿主細胞へ、すなわち、短い糖残基（例えば、単糖、二糖、又は三糖）の生成が可能である原核宿主細胞へ導入される。特定の実施態様において、該オリゴ糖は、ナイセリア・メニンギチディスのオリゴ糖であり、すなわち本明細書に記載され且つ本明細書記載の方法に従い使用される原核宿主細胞は、N.メニンギチディスの短い糖残基（例えば、単糖、二糖、又は三糖）の生合成に使用される遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、組換えグリコシルトランスフェラーゼは、本明細書記載の方法において使用される原核宿主細胞へ導入される。特定の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼは、ウンデカプレニルピロリン酸などの脂質上の単糖、二糖又は三糖を合成する。いくつかの特定の実施態様において、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼは、原核宿主細胞以外の異なる生物に由来し、すなわちグリコシルトランスフェラーゼは、該原核宿主細胞に対し異種である（例えば、通常会合していない）。そのようなグリコシルトランスフェラーゼは、カンピロバクター及びナイセリアを含む細菌種などの、様々な給源から入手することができる。いくつかの実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核宿主へ導入される。このオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、任意の給源に由来することができ、且つ異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、すなわちその原核宿主細胞以外の異なる生物由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、異なる細菌種由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ）を含んでよい。特定の実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター種、例えばC.ジェジュニに由来している。
【００５７】
いくつかの実施態様において、その上に本明細書記載の方法に従いオリゴ糖が集成されている標的タンパク質は、コレラ毒素サブユニットB(CTB)又は緑膿菌外毒素A(EPA)である。
【００５８】
本発明は更に、本明細書記載の方法による、本明細書記載の標的タンパク質のグリコシル化のための培養条件を提供する。例えばいくつかの実施態様において、MgCl2は、培養培地へ添加され、特に1〜100mM MgCl2、1〜50mM MgCl2、1〜25mM MgCl2、1〜10mM MgCl2、5〜100mM MgCl2、5〜50mM MgCl2、5〜25mM MgCl2、5〜15mM MgCl2、少なくとも1mM MgCl2、少なくとも5mM MgCl2、少なくとも10mM MgCl2、少なくとも15mM MgCl2、少なくとも20mM MgCl2、又は少なくとも25mM MgCl2が添加される。特定の実施態様において、最大でも1mM MgCl2、最大でも5mM MgCl2、最大でも10mM MgCl2、最大でも15mM MgCl2、最大でも20mM MgCl2、又は最大でも25mM MgCl2が添加される。特定の実施態様において、10mM MgCl2が添加される。特定の実施態様において、培養培地中のMgCl2濃度は、10mMである。
【００５９】
いくつかの実施態様において、テリフィックブロスが、タンパク質グリコシル化のための培養培地として使用される。
【００６０】
いくつかの実施態様において、複数のオープンリーディングフレームが、単独のプラスミドに導入され、該プラスミドが宿主原核細胞へ導入された場合（例えば、宿主細胞が該プラスミドにより形質転換された場合）の、特定の脂質結合型オリゴ糖の生成のための合成クラスターを形成する。いずれか特定の操作理論に結びつけられるものではないが、1つのプラスミド上に単独の合成クラスターを導入することによるプラスミドの数の減少は、プラスミドの存在を選択するために必要な異なる抗生物質の数を減少するために使用することができる。図5及び図6を参照されたい。
【００６１】
特定の実施態様において、ナイセリア・メニンギチディスの短い糖残基（例えば、単糖、二糖、又は三糖）によりグリコシル化される担体タンパク質（例えば、CTB、EPA）は、例えば免疫原性組成物において、抗原として使用される。本明細書に明らかにするように、グリカン特異的抗体は、本明細書記載の方法に従いオリゴ糖とコンジュゲートされたタンパク質に対して産生されることができる。従って、いずれか特定の操作理論に結びつけられるものではないが、本明細書記載のバイオコンジュゲートを使用し、宿主生物（例えば、ヒト対象）において免疫反応を誘起することができ、従ってワクチン候補を表している。
【００６２】
（5.1 宿主細胞）
任意の宿主細胞を使用し、本明細書記載の方法に従いバイオコンジュゲートを生成することができる。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に使用される宿主細胞は、原核宿主細胞である。原核宿主細胞の例は、エシェリキア属(Escherichia)菌種、赤痢菌種、クレブシエラ(Klebsiella)菌種、ザントモナス(Xhantomonas)菌種、サルモネラ(Salmonella)菌種、エルシニア(Yersinia)菌種、ラクトコッカス(Lactococcus)菌種、ラクトバチルス(Lactobacillus)菌種、シュードモナス(Pseudomonas)菌種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)菌種、ストレプトマイセス(Streptomyces)菌種、連鎖球菌(Streptococcus)種、ブドウ球菌(Staphylococcus)種、バチルス(Bacillus)種、及びクロストリジウム(Clostridium)菌種を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される宿主細胞は、大腸菌(E.coli)である。
【００６３】
いくつかの実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば1種以上の担体タンパク質をコードしている異種核酸（例えば、セクション5.2参照）及び／又は1種以上のタンパク質をコードしている異種核酸、例えば1種以上のタンパク質をコードしている遺伝子（例えば、セクション5.1.1参照）を含むように操作されている。特定の実施態様において、グリコシル化経路（例えば、原核生物及び／又は真核生物グリコシル化経路）に関与したタンパク質をコードしている異種核酸が、本明細書記載の宿主細胞へ導入されてよい。そのような核酸は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、及び／又はフリッパーゼを含むが、これらに限定されるものではないタンパク質をコードすることができる。異種核酸（例えば、担体タンパク質をコードしている核酸、及び／又は他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与したタンパク質をコードしている核酸）を、例えば電気穿孔法、熱ショックによる化学的形質転換、天然の形質転換、ファージ形質導入、及びコンジュゲーションなど当業者に公知の任意の方法を使用し、本明細書記載の宿主細胞へ導入することができる。特定の実施態様において、異種核酸は、プラスミド上の本明細書記載の宿主細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミドにより、宿主細胞において発現される。
【００６４】
いくつかの実施態様において、追加の修飾が、糖タンパク質生成に有用である宿主細胞へ導入されてよい（例えば、組換え技術を用いて）。例えば、恐らく競合するか又は干渉する経路をコードしている宿主細胞DNAは除去することができる。いくつかの実施態様において、除去されるべき経路は、所望の配列、例えば糖タンパク質生成に有用である配列により、置き換えられる。所望の活性と干渉する遺伝子の欠失も、その干渉活性がDNA挿入により置き換えられない場合には、選択肢である。欠失することができる遺伝子の例は、waaL（例えば、Feldmanらの文献、2005, PNAS USA 102:3016-3021参照）、リピドAコア生合成クラスター、ガラクトースクラスター、アラビノースクラスター、コラン酸(colonic acid)クラスター、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-p生合成遺伝子、und-Pリサイクリング遺伝子、ヌクレオチド活性化された糖生合成に関与した代謝酵素、腸内細菌共通抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原修飾クラスターなど、糖脂質生合成に関与した宿主細胞の遺伝子を含む。
【００６５】
（5.1.1 グリコシル化機構）
いくつかの実施態様において、前記宿主細胞のグリコシル化機構は、単糖、二糖、又は三糖を生成するように操作される。より特定の実施態様において、宿主細胞のグリコシル化機構は、ナイセリア・ メニンギチディスなどの原核細胞の脂質結合型オリゴ糖の一部である単糖、二糖、又は三糖を生成するように操作される。更により特定の実施態様において、宿主細胞のグリコシル化機構は、UndPP-連結された単糖、二糖、又は三糖を生成するように操作される。
【００６６】
理論に結びつけられるものではないが、UndPP-連結された単糖、二糖、又は三糖は次に、宿主細胞の細胞質ゾルから、宿主細胞のペリプラズム空間へフリップされる。更に、理論に結びつけられるものではないが、単糖、二糖、又は三糖は次に、担体タンパク質のグリコシル化部位のAsn上においてUndPPから担体タンパク質上へ転移される。
【００６７】
いくつかの実施態様において、宿主細胞のグリコシル化機構のグリコシルトランスフェラーゼは、組換え手段により機能的に失活され、その結果脂質結合型オリゴ糖の合成が妨害され、単糖、二糖、又は三糖を生じる。加えて、グリコシル化機構の他の成分は、生じる単糖、二糖、又は三糖の化学構造を修飾するように修飾されるか又は失活され得る。
【００６８】
いくつかの実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼをコードしている異種核酸を宿主細胞へ導入し、その結果単糖、二糖、又は三糖がUndPP上で生成される。いくつかのより特定の実施態様において、異種グリコシル化オペロンが、宿主細胞へ導入され、そこで該異種グリコシル化オペロンが変異され、その結果その酵素の発現時に、UndPP-連結された単糖、二糖、又は三糖が、宿主細胞において生成される。いくつかの特定の実施態様において、この異種グリコシルトランスフェラーゼは、ナイセリア・メニンギチディスのPglA又は志賀赤痢菌のRfpBである。
【００６９】
いくつかの特定の実施態様において、宿主細胞は、Und-PP-DATDHを生成するように、操作される。より更なる特定の実施態様において、ナイセリア・メニンギチディスのPglB、PglC、及び／又はPglDが、宿主細胞へ導入される。いくつかの特定の実施態様において、宿主細胞は、Und-PP-GATDHを生成するように操作される。より更なる特定の実施態様において、ナイセリア・メニンギチディスのPglB2、PglC、及び／又はPglDが、宿主細胞へ導入される。より更なる特定の実施態様において、ナイセリア・メニンギチディスのPglB、PglC、PglD、PglF、PglA、及び／又はPglIが、宿主細胞へ導入される。より更なる特定の実施態様において、ナイセリア・メニンギチディスのPglB2、PglC、PglD、PglF、PglA、及び／又はPglIが、宿主細胞へ導入される。
【００７０】
（5.2 担体タンパク質）
本明細書記載の方法における使用に適した任意の担体タンパク質は、本明細書記載の方法に従い使用することができる。担体タンパク質の例は、緑膿菌外毒素A、CRM197、ジフテリア毒素、破傷風毒素、黄色ブドウ球菌の解毒されたヘモリシンA、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒された変種、コレラ毒素Bサブユニット、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒された変種、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、及びC.ジェジュニ天然糖タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを作製するための担体タンパク質は、ナイセリアの抗原、例えばB群N.メニンギチディスの抗原などのナイセリア・メニンギチディスの抗原である。N.メニンギチディスの抗原の例は、ピリン、NMB0088、亜硝酸レダクターゼ(AniA)、ヘパリン-結合抗原(NHBA)、H因子結合タンパク質(fHBP)、接着分子、NadA、Ag473、又は表面タンパク質A(NapA)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
いくつかの実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される担体タンパク質は、修飾され、例えば、そのタンパク質は毒性が低いか及び／又はよりグリコシル化を受けやすいなどのように修飾される。特定の実施態様において、本明細書記載の方法において使用される担体タンパク質は、そのようなタンパク質中のグリコシル化部位の数が、例えば免疫原性組成物中、そのバイオコンジュゲート型中などで、投与されるタンパク質のより低い濃度を可能にする様式で最大化されるように修飾される。従っていくつかの実施態様において、本明細書記載の担体タンパク質は、通常担体タンパク質に会合されるよりも（例えば、その未変性の／天然の、例えば「野生型」状態において担体タンパク質と会合されるグリコシル化部位の数に対して）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれよりも多いグリコシル化部位を含むように修飾される。特定の実施態様において、グリコシル化部位の導入は、そのタンパク質の一次構造内のどこかへのグリコシル化コンセンサス配列の挿入により達成される。そのようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造への新たなアミノ酸の付加（すなわち、グリコシル化部位が、完全に又は一部付加される）によるか、又はグリコシル化部位を生成するためのタンパク質中に存在するアミノ酸の変異（すなわち、アミノ酸はタンパク質に付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように変異される）により、達成することができる。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知のアプローチ、例えばタンパク質をコードしている核酸配列の修飾を含む組換えアプローチを使用し、容易に修飾され得ることを認めるであろう。特定の実施態様において、グリコシル化コンセンサス配列は、該タンパク質のN末端又はC末端で、及び／又はタンパク質の塩基でのジスルフィド橋により安定化されたループ内で、タンパク質の表面構造へ導入される。いくつかの実施態様において、古典的5アミノ酸コンセンサスは、より効率的なグリコシル化のためにリジン残基により延長されてよく、その結果挿入されたコンセンサス配列は、挿入されるべきアミノ酸又はアクセプタータンパク質アミノ酸を置き換えるアミノ酸を5、6、又は7個コードすることができる。
【００７３】
いくつかの実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される担体タンパク質は、「タグ」、すなわち担体タンパク質の単離及び／又は同定を可能にするアミノ酸の配列を含む。例えば、本明細書記載の担体タンパク質へのタグの付加は、そのタンパク質の精製において有用であることができる。本明細書において使用することができるタグの例は、ヒスチジン(HIS)タグ（例えば、ヘキサヒスチジン-タグ、又は6XHis-Tag）、FLAG-TAG、及びHAタグを含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、本明細書において使用されるタグは、例えば該タンパク質が精製された後など、一旦それらが最早必要でなくなると、除去可能であり、例えば、化学物質によるか又は酵素的手段により除去される。
【００７４】
（5.3 糖残基）
本発明は一部、その上に短い糖残基が集成された担体タンパク質（すなわち、担体タンパク質上のグリコシル化部位に）を含有するバイオコンジュゲートを生成するために、宿主細胞、例えば原核宿主細胞を、組換えアプローチを用いて操作することができるという本出願人の発見に関する。従って当業者に公知の担体タンパク質及び任意の短い糖残基を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書に包含される。特定の実施態様において、単糖が本明細書記載の担体タンパク質上に集成される。別の特定の実施態様において、二糖が本明細書記載の担体タンパク質上に集成される。別の特定の実施態様において、三糖が本明細書記載の担体タンパク質上に集成される。
【００７５】
当業者は、本発明の発見を基に、単糖を担体タンパク質へ転移することができることを認めるであろう。従って当業者は、本明細書記載の方法に従う使用のために選択された特定の単糖は限定されないことを認めるであろう。いくつかの実施態様において、単糖は、DATDH又はGATDHである。別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び単糖を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供され、ここで単糖はN.メニンギチディス由来である。
【００７６】
更に当業者は、本発明の発見を基に、二糖を担体タンパク質へ転移することができることを認めるであろう。従って当業者は、本明細書記載の方法に従う使用のために選択された特定の二糖は限定されないことを認めるであろう。いくつかの実施態様において、二糖は、Gal-DATDH、Gal(OAc)-DATDH、Gal-GATDH、Gal-GATDH、Gal(OAc)-GATDH、Gal-GlcNAc、Gal(OAc)-GlcNAc、Glc-DATDH、又はGlc-GATDHである。別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び二糖を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供され、ここで二糖はN.メニンギチディス由来である。
【００７７】
更にまた当業者は、本発明の発見を基に、三糖を担体タンパク質へ転移することができることを認めるであろう。従って当業者は、本明細書記載の方法に従う使用のために選択された特定の三糖は限定されないことを認めるであろう。いくつかの実施態様において、三糖は、Gal(OAc)-Gal-DATDH、Gal-Gal-DATDH、Gal(OAc)-Gal-GATDH、又はGal-Gal-GATDHである。別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び三糖を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供され、ここで三糖はN.メニンギチディス由来である。
【００７８】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの単糖、二糖、又は三糖は、担体タンパク質のグリコシル化部位内のAsnへ共有結合されており、ここで該グリコシル化部位は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrを含む（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい）。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの担体タンパク質は、グリコシル化部位を天然には（例えば、それらの通常の／未変性の、又は「野生型の」状態では）含まない。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートの担体タンパク質は、1以上のグリコシル化部位を含むように操作され、例えば該担体タンパク質は、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい）を含む1以上のグリコシル化部位を含むように操作される。例えば、本明細書記載の方法に従い使用される担体タンパク質は、各々、アミノ酸配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrを有する（式中、X及びZは、Pro以外の任意のアミノ酸であってよい）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれよりも多いグリコシル化部位を含んでよく；且つ、ここでグリコシル化部位の一部（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、又は9）又は全ては、担体タンパク質へ組換えにより導入されている。
【００７９】
特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを形成するために担体タンパク質に結合された短い糖残基は、図28に図示された糖残基であり、例えば、該糖残基は、図28に図示された糖残基のひとつと同じ構造及び連結を有する。
【００８０】
特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを形成するために担体タンパク質に結合された糖残基は、同じ連結を含む。特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを形成するために担体タンパク質に結合された糖残基は、α1,3結合を含む。別の特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを形成するために担体タンパク質に結合された糖残基は、α1,4結合を含む。別の特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを形成するために担体タンパク質に結合された糖残基は、α1,3結合及びα1,4結合を含む。図28を参照されたい。
【００８１】
特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを形成するために担体タンパク質に結合された糖残基は、同じキラリティーを有する。特定の実施態様において、これらの糖は、D異性体を含む。
【００８２】
特定の実施態様において、本明細書記載の短い糖残基（例えば、単糖、二糖、及び三糖）の還元端は、特定の構成成分を有する。特定の実施態様において、短い糖残基（例えば、単糖、二糖、及び三糖）の還元端は、ガラクトースを含む。
【００８３】
（5.4 バイオコンジュゲート）
本明細書記載の宿主細胞により生成されるバイオコンジュゲートが、本明細書において提供され、ここで該バイオコンジュゲートは、担体タンパク質並びに単糖、二糖、及び／又は三糖を含む。本明細書に言及されるように、バイオコンジュゲートは、担体タンパク質及び短い糖残基（例えば、単糖、二糖、及び／又は三糖）を含み、ここで該短い糖残基（例えば、単糖、二糖、及び／又は三糖）は、担体タンパク質のアスパラギン(ASN)残基に共有結合されている（例えば、担体タンパク質のグリコシル化部位で連結されている）。
【００８４】
特定の実施態様において、担体タンパク質及び単糖、例えばDATDH又はGATDHを含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。別の特定の実施態様において、単糖はN.メニンギチディス由来である、担体タンパク質及び単糖を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。別の特定の実施態様において、担体タンパク質は、CTB、EPA、又はN.メニンギチディスの抗原である。
【００８５】
別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び二糖、例えばGal-DATDH、Gal(OAc)-DATDH、Gal-GATDH、Gal-GATDH、Gal(OAc)-GATDH、Gal-GlcNAc、Gal(OAc)-GlcNAc、Glc-DATDH、又はGlc-GATDHを含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。別の特定の実施態様において、二糖はN.メニンギチディス由来である、担体タンパク質及び二糖を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。別の特定の実施態様において、担体タンパク質は、CTB、EPA、又はN.メニンギチディスの抗原である。
【００８６】
別の特定の実施態様において、担体タンパク質及び三糖、例えばGal(OAc)- Gal-DATDH、Gal- Gal-DATDH、Gal(OAc)- Gal-GATDH、又はGal- Gal-GATDHを含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。別の特定の実施態様において、三糖はN.メニンギチディス由来である、担体タンパク質及び三糖を含有するバイオコンジュゲートが、本明細書において提供される。別の特定の実施態様において、担体タンパク質は、CTB、EPA、又はN.メニンギチディスの抗原である。
【００８７】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは単離され、すなわちバイオコンジュゲートは、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書記載のバイオコンジュゲートの生成方法を使用し、本明細書記載の宿主細胞により生成され、且つ生成されたバイオコンジュゲートは、単離及び／又は精製される。いくつかの実施態様において、本明細書において提供されるバイオコンジュゲートは、純度が少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％であり、例えば、他の夾雑物を含まないなどである。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、バイオコンジュゲートのグリコシル化部位に結合した短い糖残基に関して均質であり、例えば、バイオコンジュゲートは、そのバイオコンジュゲートのグリコシル化部位に、全て同じ単糖、全て同じ二糖、全て同じ三糖などを発現する。
【００８９】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、バイオコンジュゲートのグリコシル化部位に結合した短い糖残基に関して均質ではなく、例えば、バイオコンジュゲートは、そのバイオコンジュゲートのグリコシル化部位に、異なる単糖、異なる二糖、及び／又は異なる三糖、又はそれらの組合せ（例えば、一部単糖及び一部二糖）を発現する。
【００９０】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、2以上のグリコシル化部位を有し、ここでバイオコンジュゲートの各グリコシル化部位は、グリコシル化される（すなわち、バイオコンジュゲートのグリコシル化部位の100％がグリコシル化される）。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるバイオコンジュゲートは、2以上のグリコシル化部位を有し、ここでバイオコンジュゲートのグリコシル化部位の全ては、グリコシル化されず、例えば、バイオコンジュゲートのグリコシル化部位の約又は少なくとも10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％がグリコシル化されるが、全てのバイオコンジュゲートのグリコシル化部位はグリコシル化されない。いくつかの実施態様において、グリコシル化されているバイオコンジュゲートのグリコシル化部位は全て、同じ単糖、同じ二糖、又は同じ三糖を含む（すなわち、これらによりグリコシル化される）。
【００９１】
いくつかの実施態様において、バイオコンジュゲートの集団が、本明細書において提供される。一実施態様において、該集団中のバイオコンジュゲートの担体タンパク質内の第一のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又はその100％が、グリコシル化されている、バイオコンジュゲートの集団が、本明細書において提供される。特定の実施態様において、各バイオコンジュゲートの第一のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％は、該集団中の他のバイオコンジュゲートと同じ単糖、二糖、又は三糖によりグリコシル化される（すなわち、全てのバイオコンジュゲートは、担体タンパク質の第一のグリコシル化部位に同じ糖残基を有する）。いくつかの実施態様において、該集団中のバイオコンジュゲートの担体タンパク質内の第二のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、グリコシル化される。特定の実施態様において、各バイオコンジュゲートの第二のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、該集団中の他のバイオコンジュゲートと同じ単糖、二糖、又は三糖によりグリコシル化される（すなわち、全てのバイオコンジュゲートは、担体タンパク質の第二のグリコシル化部位に同じ糖残基を有する）。いくつかの実施態様において、該集団中のバイオコンジュゲートの担体タンパク質内の第三のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、グリコシル化される。特定の実施態様において、各バイオコンジュゲートの第三のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、該集団中の他のバイオコンジュゲートと同じ単糖、二糖、又は三糖によりグリコシル化される（すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第三のグリコシル化部位に同じ糖残基を有する）。いくつかの実施態様において、該集団中のバイオコンジュゲートの担体タンパク質内の第四のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、グリコシル化される。特定の実施態様において、各バイオコンジュゲートの第四のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、該集団中の他のバイオコンジュゲートと同じ単糖、二糖、又は三糖によりグリコシル化される（すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第四のグリコシル化部位に同じ糖残基を有する）。いくつかの実施態様において、該集団中のバイオコンジュゲートの担体タンパク質内の第五のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、グリコシル化される。特定の実施態様において、各バイオコンジュゲートの第五のグリコシル化部位の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％、又は100％が、該集団中の他のバイオコンジュゲ���トと同じ単糖、二糖、又は三糖によりグリコシル化される（すなわち、全てのバイオコンジュゲートが、担体タンパク質の第五のグリコシル化部位に同じ糖残基を有する）。
【００９２】
（5.5 組成物）
（5.5.1宿主細胞を含有する組成物）
一実施態様において、本明細書記載の宿主細胞を含有する組成物が、本明細書において提供される。そのような組成物は、本明細書記載のバイオコンジュゲートを作製する方法において使用することができ、例えば、該組成物は、タンパク質の生成に適した条件下で培養することができる。それに続いて、バイオコンジュゲートは、該組成物から単離することができる。
【００９３】
本明細書において提供される宿主細胞を含有する組成物は、本明細書記載の宿主細胞の維持及び生存に適した追加成分を含有することができ、且つ、宿主細胞によるタンパク質の生成に必要な又は有益な追加成分、例えば、アラビノース、IPTGなどの、誘導性プロモーターのインデューサーを、追加的に含有することができる。
【００９４】
（5.5.2 バイオコンジュゲートを含有する組成物）
別の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを含有する組成物が、本明細書において提供される。そのような組成物は、疾患の治療及び予防の方法において使用することができる。
【００９５】
特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを1種以上含有する免疫原性組成物が、本明細書において提供される。本明細書に提供される免疫原性組成物は、組成物が投与される宿主において、免疫反応を誘発するために使用することができる。従って、本明細書記載の免疫原性組成物は、ワクチンとして使用することができ、従って医薬組成物として製剤することができる。
【００９６】
本明細書記載のバイオコンジュゲートを含有する組成物は、医薬品投与における使用に適した任意の追加成分を含有してよい。特定の実施態様において、本明細書記載の免疫原性組成物は、一価の製剤である。他の実施態様において、本明細書記載の免疫原性組成物は、多価の製剤である。例えば多価の製剤は、本明細書記載のバイオコンジュゲートを2種以上含有する。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本明細書記載の組成物は追加的に、保存剤、例えば、水銀誘導体チメロサールを含有する。特定の実施態様において、本明細書記載の医薬組成物は、チメロサールを0.001％〜0.01％含有する。他の実施態様において、本明細書記載の医薬組成物は、保存剤を含有しない。
【００９８】
いくつかの実施態様において、本明細書記載の免疫原性組成物は、アジュバントを含有するか、又はアジュバントと組合せて投与される。本明細書記載の組成物と組合せた投与のためのアジュバントは、該組成物の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与されてよい。一部の実施態様において、用語「アジュバント」とは、この化合物が、本明細書記載の組成物と一緒に、又は一部として投与される場合に、バイオコンジュゲートに対する免疫反応を、増大、増強及び／又はブーストするが、該化合物が単独で投与される場合には、バイオコンジュゲートに対する免疫反応を生じない化合物を意味する。一部の実施態様において、アジュバントは、ポリバイオコンジュゲートペプチドに対する免疫反応を生じ、且つアレルギー又は他の有害反応を生じない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B細胞及び／又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかの機構により、免疫反応を増強することができる。
【００９９】
（5.6 使用）
一実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲート又はそれらの組成物を対象へ投与することを含む、対象における免疫反応を誘導する方法が、本明細書において提供される。特定の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートに対する免疫反応を誘導する方法は、本明細書記載のバイオコンジュゲート又はそれらの組成物の有効量をそれらを必要とする対象に投与することを含む。
【０１００】
特定の実施態様において、バイオコンジュゲート又はそれらの組成物が投与される対象は、感染症、例えば細菌感染症を有するか、又はそれに易罹患性である。特定の実施態様において、バイオコンジュゲート又はそれらの組成物が投与される対象は、ナイセリア・メニンギチディス、例えば、ナイセリア・メニンギチディスB群による感染症に易罹患性であり、すなわち、該バイオコンジュゲートは、ナイセリア・メニンギチディス、例えばナイセリア・メニンギチディスB群に対するワクチンとして投与される。
【０１０１】
別の実施態様において、本明細書記載のバイオコンジュゲートを使用し、例えば、診断及び研究目的での使用のための抗体を作製することができる。実施例8並びに図23及び図24を参照されたい。
【実施例】
【０１０２】
（6. 実施例）
（6.1 実施例1）
本実施例は、C.ジェジュニのフリッパーゼであるPglKは、短いオリゴ糖を宿主細胞のペリプラズムへフリップすることができることを明らかにしている。図7は、銀染色されたLOS変種が、フリッパーゼ活性を欠いている大腸菌SCM7において生成されることを示している。大腸菌SCM7を、様々なグリコシルトランスフェラーゼ活性を欠いているが、フリッパーゼ(PglK)活性は含んでいる、C.ジェジュニpglプラスミド変種により形質転換した。レーン2-4は、リピドAコア単独のレーン1と比べより少ない移動度を伴うバンドを示し、レーン5のリピドA上のC.ジェジュニ七糖と比べ移動度がより小さい。レーン2-4の上側バンドは、大腸菌リピドAコアに結合された単糖、二糖及び三糖に対応している。従って大腸菌は、異種フリッパーゼを利用し、短い糖残基をペリプラズムへフリップすることができる。
【０１０３】
（6.2 実施例2）
本実施例は、C.ジェジュニPglBは、二糖及び三糖を大腸菌中のタンパク質アクセプター上に効率的に転移することができることを明らかにしている。図8は、PglBは、C.ジェジュニpglクラスター変種により生成された二糖（レーン4）及び三糖（レーン3）を、2つのグリコシル化部位を含む操作されたCTB（担体タンパク質）へ転移することができることを示している。従って、異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、大腸菌宿主細胞において、短い糖残基を転移するために利用することができる。
【０１０４】
（6.3 実施例3）
本実施例は、N.メニンギチディスフリッパーゼPglFは、短い脂質結合型オリゴ糖に対する特異性を有することを明らかにしている。図9は、大腸菌株SCM7により生成された銀染色されたリポオリゴ糖(LOS)を示している。これは、pglF核酸を含むプラスミドが、機能性フリッパーゼ(pglK)を欠いているC.ジェジュニpgl遺伝子クラスターの発現のためのプラスミドを収容している大腸菌SCM7へトランスで追加された場合、野生型pglクラスターを持つ同じ菌株（レーン3）と比べ、より少ない移動度シフトを伴うバンド（レーン2）が出現することを明らかにしている。レーン2に出現するバンドは、pglクラスターを含み且つPglKフリッパーゼ活性を欠く菌株によって生成されるリピドAコアのみに対応するバンド（レーン1）よりもより高い移動度を有することが明らかにされる。
【０１０５】
（6.4 実施例4）
本実施例は、N.メニンギチディスPglAは、大腸菌において機能することを明らかにしている。C.ジェジュニpglクラスターにより形質転換された大腸菌株SCM7は、DATDH上のGalの集成により七糖の生合成を回復することができる。図10は、C.ジェジュニにおけるUndpp-DATDH上の第一のGalNAcの集成体を損なっている、PglAに変異を有するC.ジェジュニpglクラスターにより形質転換された大腸菌SCM7から抽出されたLOSの銀染色及びウェスタンブロット分析を示している。UndPP-GlcNAc上にガラクトース残基を集成するO抗原α-(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼである、N.メニンギチディスPglAI（図10A、レーン4）又は志賀赤痢菌O1 RfpB（図10A、レーン3）の発現は、無傷のC.ジェジュニ遺伝子クラスターを持つ菌株において形成されたLOS（図10A、レーン1）と、電気泳動移動度シフトが同等であるLOSの形成を回復している。同じく志賀赤痢菌RfpB（図10B、レーン3）及びN.メニンギチディスPglA（図10B、レーン4）の両方の発現は、完全なC.ジェジュニpgl遺伝子クラスターを伴う菌株において形成されたLOS（図10B、レーン1）と比べ、C.ジェジュニ特異性抗-グリカンに対する同等の反応性を有するLOS変種の形成を生じた。この反応性は、pglA変異を伴うpgl遺伝子クラスターを収容している同じ菌株が、ガラクトシルトランスフェラーゼのエンプティベクターにより形質転換された場合には、観察されなかった（図10B、レーン2）。
【０１０６】
（6.5 実施例5）
本実施例は、N.メニンギチディスPglAは、大腸菌バックグラウンドにおいて、α-(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有することを明らかにしている。ガラクトシルトランスフェラーゼ及びO-アセチルトランスフェラーゼの活性を含むN.メニンギチディスpglAオペロンを、UndPP-GlcNAcを合成する大腸菌株SCM3へ形質転換した。LLOを、この菌株から抽出し、且つオリゴサッカリルトランスフェラーゼである、精製したC.ジェジュニPglB、及び精製したペプチドアクセプターを使用する、インビトログリコシル化に使用した。N.メニンギチディスpglAIを発現する大腸菌SCM3由来のLLOをインビトログリコシル化に使用する場合、このペプチドの電気泳動移動度（図12A、レーン3）は、グリコシル化されないペプチド（図12A、レーン1）と比べ、減少したことが、図12に示されている。精製されたペプチドに、MS/MS分析を施し、これは、該ペプチドは、Hex-HexNAc又はHex(OAc)-HexNAcによりグリコシル化されていることを明らかにした（図12C）。
【０１０７】
糖ペプチドを、キサントモナス・マニホチス由来のα1-3,6ガラクトシダーゼにより処理し、PAGE分析に供した。ガラクトシダーゼにより処理された糖ペプチド（図12B、レーン2）は、未処理の試料（図12B、レーン1）と比べ、ゲル上のより少ない移動度シフトを有することが観察された。
【０１０８】
これらの結果は集合的に、ナイセリアPglAは、大腸菌において、ガラクトシルトランスフェラーゼとして機能すること、及びこの酵素は、アクセプターグリカンに対する緩和された(relaxed)特異性を有し、このことは、UndPP-GlcNAc及びUmp-DATDHの両方の使用を可能にすることを指摘している。更に、O-アセチルトランスフェラーゼであるPglIは、大腸菌において機能することが明らかにされている。
【０１０９】
（6.6 実施例6）
本実施例は、大腸菌におけるN.メニンギチディス二糖Gal-DATDHの合成を明らかにしている。この二糖の生成は、galEエピメラーゼにトランスポゾン変異を保有するC.ジェジュニpglクラスターを用いて達成された。このエピメラーゼの変異は、UDP-GalNAcの生成を無効にし、その結果Undpp-DATDHの蓄積を生じた。図13は、C.ジェジュニpgl galE変異体とN.メニンギチディスpglAI（レーン4）又は志賀赤痢菌rfpB（レーン3）により形質転換された大腸菌株SCM7において生成された銀染色されたLOSを示している。示されたように、対応するエンプティベクターを収容する菌株由来のLOS（レーン2）よりも、より少ない電気泳動移動度を伴うバンドが観察された。これらの結果は、PglA及びRfpBの両方は、Gal-DATDHを形成するために互換的に使用することができることを指摘している。同じく、RfpBは、UndPP-DATDHをアクセプターとして受容することができることも示している。
【０１１０】
本実施例はまた、N.メニンギチディス二糖Gal(OAc)-DATDHを伴うグライココンジュゲートの合成を明らかにしている。CTBの二糖によるグリコシル化を、C.ジェジュニpgl galE変異体、N.メニンギチディスPglAI、CTB及びC.ジェジュニpglBを発現するプラスミドを組合せることにより、大腸菌株SCM6において実現した。図14は、二糖Hex-DATDHによりグリコシル化されたCTBのPAGE分析及びMS分析を示し、このHexはまた、アセチル化された形状において認めることができる。更に、大腸菌株SCM6においてN.メニンギチディス合成クラスターpglFBCDAIを含むプラスミドを使用することにより、大量のUndPP-Hex(OAc)-DATDHが生成された（図15A）ことが明らかにされた。図16は、CTBは、異なる細菌由来の遺伝子の組合せを使用し、先に記載されたシステム（図15A、対照）と比べ、二糖によりインビボにおいて効率的にグリコシル化されたことを示している。グリコシル化されたCTBから放出された糖ペプチドのMS分析は、二糖の配列が、Hex_DATDH又はHex(OAc)-DATDHであることを明らかにした。図17は、4つのグリコシル化部位を含む操作されたEPAは、大腸菌バックグラウンドにおいて二糖によりグリコシル化され得ることを明らかにしている。図18は、O-アセチル基を伴わない二糖Gal-DATDHも、大腸菌バックグラウンドにおいてCTBへ効率的に転移され得ることを示している。
【０１１１】
この実施例はまた、N.メニンギチディス二糖Gal(OAc)-GATDHによるグライココンジュゲートの合成を明らかにしている。二糖によるCTBのグリコシル化は、大腸菌SCM6においてN.メニンギチディス合成クラスターpglFB2CDAI、CTB及びC.ジェジュニpglBを発現するプラスミドを組合せることにより、大腸菌株SCM6において達成された。図20は、二糖Hex-GATDH又はHex(OAc)-GATDHによりグリコシル化されたCTBのPAGE分析（図20A）及びMS分析（図20B）を示している。図21は、Gal(OAc)-GATDHによるEPAのグリコシル化を示している。
【０１１２】
（6.7 実施例7）
本実施例は、特異的グリカン抗体が、異なるナイセリア株由来のO型-グリコシル化されたピリンに対して生じたこと、及びそのような抗体は、同一グリカン構造を有する組換えN型-グリコシル化タンパク質を認識することを明らかにしている。図22を参照されたい。
【０１１３】
（6.8 実施例8）
本実施例は、Gal-DATDHにより組換えグリコシル化されたCTBは、ウサギにおいて免疫原性であることを明らかにしている。図23及び図24を参照されたい。
【０１１４】
（6.9 実施例9）
本実施例は、大腸菌バックグラウンドにおいて、C.ジェジュニグリコシル化機構を使用し、二糖を、タンパク質担体上に、具体的にはコレラ毒素B(CTB)上に、巧く転移することができることを明らかにしている。
【０１１５】
(a)材料及び方法
(i)細菌株、プラスミド、培地及び培養
本実施例において使用した大腸菌株に加えプラスミドを、表1に列挙している。一般に、培養物は、必要に応じアンピシリン(100μg/mL)、クロラムフェニコール(30μg/mL)、カナマイシン(50μg/mL)、スペクチノマイシン(80μg/mL)、又はトリメトプリム(100μg/mL)を補充した、LBにおいて37℃で成長させた。指示された場合は、菌株は、テリフィックブロス(TB、1Lにつき、Bactoトリプトン12g、Bacto酵母抽出物24g、グリセロール4mL、並びに0.17M KH2PO4及び0.72M K2HPO4 100mL)、Super Optimal Broth (SOB、1Lにつき、Bactoトリプトン20g、Bacto酵母抽出物5g、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2)、トリプシン処理大豆ブロス(TSB、BD)、又は脳心臓灌流液(BHI、Merck社)において成長させた。指示された場合は、培養物に10mM MgCl2を添加した。
表１：
【表１】
2014526449.tif 000008
【０１１６】
(ii)分子生物学
PCR及びコロニーPCR反応を、Taqポリメラーゼ(〜1kbp/分)、25mM MgCl2、10mM dNTP(Fermentas社)、5μMプライマー、及び鋳型としてDNA(又は、プレート直接由来の1コロニー)を用いて行った。高忠実度PCRのために、Phusion酵素を使用した(1U、Finnzyme社)。
【０１１７】
制限分析を、最高活性のそれらの緩衝液中の酵素(Fermentas社)5〜50Uを用いて行った。DNAおよそ2μgを、37℃で1〜2時間消化した。その後この酵素を、65℃で20分間、熱で失活させた。酵素消化物を、0.7％アガロースゲル上を流し、そこでGelRed(Biotum社)を用い、DNAを可視化した。移動は、トリス、酢酸、及びEDTA(TAE)緩衝液において行った。
【０１１８】
クローニングのために、挿入断片及びベクターを両方共、前述のように消化した。その後消化されたベクターを、脱リン酸化のために10Uエビのアルカリホスファターゼ(SAP、Fermentas社)と共に、37℃で1時間インキュベーションした。失活後、NucleoSpin抽出IIキット(Macherey-Nagel社)を製造業者のプロトコールに従い使用し、消化された生成物をクリーニングした。ベクター100ng及び挿入断片100〜300ngを、T4 DNAリガーゼ5Uの存在下で、室温で2時間インキュベーションした。その後この酵素を失活させ、ヒートショック(42℃で1分間及び氷上で2分間)によるライゲーションで20ngを用い、コンピテントDH5αを形質転換した。
【０１１９】
作出されたプラスミドの各々の配列を、DNAシークエンシング(MicroSynth社)により実証した。
【０１２０】
(iii)細胞成長
タンパク質及び糖の発現のために、細胞を、OD600nmの0.05〜0.1まで30〜37℃で成長させた、オーバーナイト(ON)予備培養物から希釈した。細胞は、0.4〜1まで37℃で成長させ、且つ0.02〜0.1％アラビノース(w/v)、及び必要に応じ1mM IPTGを用い、誘導した。細胞を、37℃で4時間又は一晩インキュベーションした。全細胞抽出(WCE)又はペリプラズム抽出を行った。前者に関して、細胞を収集し(5000×g、15分間、4℃)、レムリ緩衝液中に1 OD/100μLになるよう再懸濁し、95℃で15分間煮沸した。後者は、収集後の、1mg/mLリゾチームを含有する溶解緩衝液中での4℃で30分間のインキュベーションからなる（溶解緩衝液：20％w/vショ糖、30mMトリス-HCl(pH8)、1mM EDTA、溶解緩衝液は20 OD/mLで使用した）。この懸濁液を、透明化のために23,000×gで遠心し、ペリプラズム画分は上清に相当した。培養物にMgCl2が添加される場合は、この溶解工程に、30mMトリス-HCl(pH8)、1mM EDTA中での洗浄工程が先行した。
【０１２１】
His-タグ付けされたタンパク質の精製のために、結合緩衝液(0.5M NaCl、50mMトリス-HCl(pH8)、10mMイミダゾール)及びMgCl2最終濃度4mMを、ペリプラズム画分へ添加した。この調製物を、His SpinTrap(GE Healthcare社)又はHisTrap FFクルード1mL若しくは5mL(GE Healthcwere社)上、及びCTBのためにpH7に調節したPBS、500mMイミダゾール中に装加した。
【０１２２】
精製後、タンパク質濃度を、NanoDrop(NanoDrop 2000C、Thermo Scientific社)及びBCAにより、提供されたプロトコールに従い決定した。
【０１２３】
(iv)タンパク質分析
クーマシー染色によるグリコシル化タンパク質の分析のために、精製されたタンパク質を、レムリ緩衝液中で15分間煮沸後、SDS-PAGEゲル上に装加し、且つCTBのためにMES緩衝液中、200Vで50分間〜70分間流した。水中で数回洗浄した後、タンパク質を、クーマシーシンプリーブルーを使用し染色した。
【０１２４】
ウェスタンブロット分析のために、SDS-PAGEゲル上で分離後、タンパク質を、半-乾燥転写(iBlot、Invitrogen社)を用い、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを、PBS-Tween 20中0.1％＋10％ミルクで、1時間ブロッキングした。PBS-Tween中で数回洗浄した後、メンブレンを、PBS-Tween＋10％ミルク中に希釈した一次抗体と一緒に、室温で1〜2時間又は4℃で一晩、インキュベーションした。PBS-Tween中での洗浄工程後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合された二次抗体を、室温で1時間又は4℃で一晩添加した。メンブレンを再度洗浄し、テトラメチルベンジジン(TMB、Sigma社)の添加により、タンパク質を可視化した。使用した抗体は以下であった：(a)一次抗体：マウス抗-Penta-His(Qiagen社、1:2000希釈)；ウサギ抗-コレラ毒素(Virostat社、1:1000希釈)；ウサギ抗血清R12(Pineda社、1:2000希釈)；(b)二次抗体：ヤギ抗-マウスHRP(Sigma社、1:2000希釈)；及び、ヤギ抗-ウサギHRP(Bio-Rad社、1:20,000希釈)。
【０１２５】
(b)結果
(i)ピリングリカンのCTB上への転移
大腸菌へ一旦転移された、C.ジェジュニN型-グリコシル化機構は、標的タンパク質に付加された糖質に対する緩和された特異性を有することが、先に示されている。ここで試験された糖質は、二糖であったが、先の研究では、pgl機構によるそのような短い糖の転移に関しては実行されなかった。従って二糖は、2つのグリコシル化部位を有するタンパク質担体CTBへ転移され得るかどうかを研究した。
【０１２６】
(A)C.ジェジュニ二糖によるCTBのグリコシル化
C.ジェジュニにおいて、N型-グリコシル化は、七糖(GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-(Glc-β1,3)-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-Bac)の、脂質担体ウンデカプレニルピロリン酸への付加を含む。次にこの七糖は、タンパク質の特定の保存された配列Asp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr(式中、X1及びX2は、プロリンを除く任意のアミノ酸である)内のアスパラギン残基へ転移され、ペリプラズム内に生じる。より具体的には、C.ジェジュニ内で、この反応は、脱水酵素(PglF)、アミノトランスフェラーゼ(PglE)及びアセチルトランスフェラーゼ(PglD)による、UDP-Bac(バシロスアミン、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシグルコース)中のウリジン二リン酸UDP-GlcNAc又はUDP-GalNAcの逐次転換により始まる。このUDP-Bacは、内膜の細胞質側で、第一の中間体ウンデカプレニルピロリン酸-バシロスアミン(Und-PP-Bac)を作出するために、PglCにより脂質担体ウンデカプレニルリン酸(Und-P)へ転移される。第一のGalNAc残基は、PglAにより付加され、且つ第二のものはPglJにより付加され、その後PglHが、3つの他のGalNAc残基を付加する。最後に、4位で分岐した独特なGlc残基が、PglIにより連結される。一旦七糖全体が形成されたならば、これは、PglKによりペリプラズムへフリップされ、その後PglBにより、アクセプタータンパク質のAsn残基上に転移される。
【０１２７】
C.ジェジュニの七糖の第三のGalNAc残基の付加を触媒するpglJ遺伝子は、pglクラスターの内部で先に変異されており、このことは、Und-PP上の二糖Bac-GalNAcの形成を生じる。PglBは、そのような短い糖によりCTBをN型-グリコシル化することができるかどうかを試験するために、プラスミド3(表1参照)により発現されたこの変異されたクラスター、プラスミド2により発現された2つのグリコシル化部位(glycosite)を提示しているタンパク質担体CTBの遺伝子、及びPglBの過剰発現を生じるプラスミド5を、大腸菌株SCM6に導入した。この菌株は、その表面上にいずれの内因性糖も発現せず、関心対象の糖質の研究を可能にする。0.1％アラビノース及び1mM IPTGによる4時間の誘導後、これらの細胞のペリプラズムを、先に記載した方法に従い抽出し、且つCTBのグリコシル化状態を、ウェスタンブロットにより分析した。図25に示したように、C.ジェジュニの七糖によるグリコシル化の対照は、SDS-PAGEゲル上でCTBの移動度の変動を生じた(図25、レーン3)。図25のレーン3において、3本のバンドを識別することができ、最も高い移動度バンドは、CTBの非グリコシル化型に対応し；中間の移動度バンドは、その2つの部位の一方のみの七糖によるCTBのグリコシル化に対応し；並びに、最も低い移動度は、その2つの部位がグリコシル化されたCTBを表している。この移動度シフトはまた、pglJの変異の状況においても認められるが、認められたシフトはより短い(図25、レーン1)。3本のバンドはまた、図25のレーン1においても認められた。同様に、これらのバンドは、CTBの非グリコシル化、モノグリコシル化及びジグリコシル化型に対応している。PglBが過剰発現されない場合は、CTBの非グリコシル化型のみを検出した(図25、レーン2)。このpglJの非変異型と変異型の間で認められた移動度シフトは、CTBは、C.ジェジュニの七糖よりもより短い糖質によりグリコシル化されることを指摘している。
【０１２８】
これらのデータは、pglクラスター内部のPglJの変異は、二糖の形成を生じ、且つこの二糖は、C.ジェジュニグリコシル化機構を使用し、タンパク質担体CTB上に転移され得ることを指摘している。
【０１２９】
(B)N.メニンギチディス二糖によるグリコシル化及びその最適化
先に示したように、PglBは、二糖をCTBへ転移することができる。UDP-GlcNAcのUDP-GalNAcへの形質転換を触媒するエピメラーゼGalEの変異の状況において、ナイセリア・メニンギチディスのO-アセチル化されたガラクトースにより伸長されたC.ジェジュニのバシロスアミンの転移が可能である。C.ジェジュニのエピメラーゼGalEの変異は、バシロスアミン上のGalNAc残基の付加を防止する。しかし、この新たな二糖によるCTBの弱い発現及びグリコシル化レベルが、認められた。これを改善するために、抗生物質の異なる組合せを、細胞により受けるストレスを減少するために試験した。MgCl2の添加に加え、いくつかの培養培地も試験した。
【０１３０】
GalEが変異されたC.ジェジュニグリコシル化クラスターを保有するプラスミド4に加え、N.メニンギチディスのO-アセチル化されたガラクトースによるC.ジェジュニのバシロスアミンの伸長を可能にするプラスミド2、5及び12を、大腸菌株SCM6に導入した。この菌株を、プラスミドにより保有される4種の選択マーカー(各々、Clm/Kan、Amp、Spc、及びTmp)の存在下で成長させた場合、誘導4時間又はON後で、細胞のペリプラズム内でCTBの発現は検出されなかった。これを修復するために、抗生物質のいくつかの組合せを試験した。ペリプラズム画分を、誘導の4時間後に収集し、且つウェスタンブロットにより分析した。図26Aに示したように、CTBの発現及びそのグリコシル化のレベルは、これらの抗生物質により高度に影響を受けた。例えば、カナマイシンの添加(図26A、レーン2及び3)は、CTBの発現を強力に損なうようにみえる。最高レベルのCTBの発現及びグリコシル化は、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びトリメトプリムの存在下であった(図26A、レーン1)。従って、この組合せを更に分析した。
【０１３１】
次に、異なる培養培地を、CTBの発現及びグリコシル化を改善することを目的とし、試験した。プラスミド2、4、5、及び12を保有する同じSCM6株を、LB、SOB、TB、TSB、又はBHIにおいて成長させた。図26Bは、ウェスタンブロットによる、ONで誘導された細胞のペリプラズム画分の分析を表している。濃厚培地TSB及びBHI(図26B、レーン6及び7)は、CTBの発現を示さなかったが、TB培地における発現及びグリコシル化は強力であった(図26B、レーン5)。図26Bのレーン3において認められたように、弱い発現及びグリコシル化が、LBにおいて認められた。最後に、10mM MgCl2を含有するSOB培地は、MgCl2非存在よりも、CTBのジグリコシル化型の高い比を示した。従って、CTBの最高レベルの発現を可能にするTB培地を、次の実験に使用した。
【０１３２】
そのグリコシル化のレベルをより正確に評価するために、CTBを、ON誘導された細胞のペリプラズム抽出物から、Ni2+カラム上のそのヒスチジンタグを使用し精製し、且つ10mM MgCl2を含有又は非含有するTBにおいて成長させた。MgCl2存在又は非存在下で成長させたCTBの精製の各工程の分析を、ウェスタンブロットにより行った。図26Cに示したように、CTBの大半を精製することができた。少量のタンパク質のみが、フロースルー(FT)において認められた。細胞がTB＋10mM MgCl2において成長された場合、CTBの溶離画分は、MgCl2を伴わずに成長された細胞のものと比べ、わずかに高いジグリコシル化のレベルを示す。従って、MgCl2は、CTBのグリコシル化に対し正作用を有するように見える。
【０１３３】
認められるように、CTB上の二糖の転移は、C.ジェジュニのグリコシル化機構を使用することが可能である。従って、これは、N.メニンギチディスのO-アセチル化された二糖のCTBへの転移のために使用された。発現及びグリコシル化のレベルは、最適化され、且つ最良の培養条件は、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びトリメトプリムの存在下で、TBにおいてであるように見える。更に、10mM MgCl2の添加は、CTBのグリコシル化に対し正作用を有する。
【０１３４】
(C)グリコシル化されたCTBの大規模発現及び精製
大量のグリコシル化されたCTBを収集するために、より高容積の培養物からのその精製を、先に記載した条件を使用し、行った。
【０１３５】
プラスミド2、4、5及び12を、大腸菌株SCM6に導入し、且つクロラムフェニコール、スペクチノマイシン、トリメトプリム及び10mM MgCl2を補充したTBの6Lにおいて成長させた。ペリプラズム画分の抽出を行い、且つCTBを、先の「材料及び方法」のセクションに示したように、精製した。図27Aは、HisTrapカラム5mL上での精製時に収集し、クーマシーシンプリーブルーにより染色したSDS-PAGEゲル上で分析した、異なる溶離画分を描いている。CTBの非グリコシル化、モノグリコシル化及びジグリコシル化された型を、溶離画分E1からE9中に検出した。
【０１３６】
プラスミド16は、N.メニンギチディスのO-アセチル化された二糖の全体の集成及びペリプラズムへの移行に必要な全ての遺伝子を生じるが、このオペロンは、誤配向でフリッパーゼpglFを含んでいる。これは、一方で、N.メニンギチディスの修飾されない二糖の生合成(C.ジェジュニのバシロスアミンを使用しない)の研究を可能にし、他方で単独プラスミド16によるプラスミド4及び12の置き換えを可能にする。このプラスミドを試験し、且つCTBの非グリコシル化、モノグリコシル化及びジグリコシル化された型を、アンピシリン、スペクチノマイシン、トリメトプリム及び10mM MgCl2を補充したTBにおいて検出した。このプラスミドを、プラスミド2及び5と一緒に、大腸菌SCM6株に導入した。培養物を、添加したアンピシリン、スペクチノマイシン、トリメトプリム及び10mM MgCl2を伴うTB 6Lにおいて成長させた。ペリプラズム画分を、説明したように抽出し、Ni2+カラム上で精製し、且つクーマシーシンプリーブルーにより染色したSDS-PAGEゲルにより分析した(図27B)。凝集物の存在が第一の溶離画分(E1)中に検出されたが、主にグリコシル化された(モノグリコシル化及びジグリコシル化)高量のCTBが収集された(レーンE2からE9)。BCAアッセイを行い、これはCTBおよそ14mgが収集されたことを示した。
【０１３７】
最後に、プラスミド17は、N.メニンギチディスの二糖の合成のためのオペロン全体を含むが、ここでフリッパーゼpglFは、正配向にある。プラスミド2及び5と一緒に大腸菌SCM6へ導入され、且つアンピシリン、スペクチノマイシン、トリメトプリム及び10mM MgCl2を補充したTBにおいて成長された場合、精製された画分は、ほぼ100％であるCTBのグリコシル化状態を示した(図27C)。
【０１３８】
これらのデータは、CTBは、N.メニンギチディスの二糖により、高度にグリコシル化され得ることを示している。更に、このグリコシル化タンパク質は、高量で精製することができる。培養物6Lの各バッチから、関心対象のタンパク質5〜15mgを収集することができた。最後に、糖構造を、MS分析により確認した。
【０１３９】
(c)結論
LLO生成のための生合成経路は、ナイセリア、カンピロバクター由来の特定の遺伝子及び酵素、並びに他の原核生物遺伝子を用い、再現された。
【０１４０】
精製されたLLOの質量分析及び液体クロマトグラフィー分析は、操作された大腸菌において合成されたそのような操作されたグリカン構造が、ナイセリアにおいて同定された該グリカンと同一であることを明らかにした。
【０１４１】
ナイセリアオリゴ糖による、グラム陽性菌及び陰性菌由来のいくつかの抗原性タンパク質(タンパク質アクセプター)のインビボにおけるグリコシル化は、ナイセリアundpp-オリゴ糖、タンパク質アクセプター及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼを生成するように、特定のタンパク質をコードしている遺伝子を導入することにより、新規に操作された原核細胞(例えば大腸菌)を作製することで達成される。高度にグリコシル化されたタンパク質を、様々な液体クロマトグラフィー工程を使用し、均質になるまで、操作された大腸菌から精製した。これらの糖の構造は、トリプシン消化されたグリコシル化されたタンパク質の質量分析により決定した。記載された方法を使用し、培養物1Lあたりミリグラム量のグリコシル化されたタンパク質を生成する。
【０１４２】
このアプローチで生成されたグリココンジュゲートを、抗-ナイセリアコンジュゲートワクチンとしての本タンパク質コンジュゲートの機能の特徴を表す免疫原性及び血清殺菌活性をチェックするための、前臨床アッセイに使用することができる。
【０１４３】
（同等物）
本発明は、それらの特定の実施態様を参照し詳細に説明されるが、機能的に同等である変動は本発明の範囲内であることは理解されるであろう。実際、本明細書に提示され且つ説明されたものに加え、本発明の様々な修飾が、先の説明及び添付図面から当業者には明らかになるであろう。そのような修飾は、添付された請求項の範囲内に収まることが意図された。当業者は、慣習にすぎない実験を用い、本明細書記載の本発明の特定の実施態様との多くの同等物を認めるか又は解明することができるであろう。そのような同等物は、以下の請求項により包含されることが意図された。
【０１４４】
本明細書において言及された刊行物、特許及び特許出願は全て、各々個別の刊行物、特許又は特許出願が、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれていることを具体的且つ個別に指摘される場合と同じ程度に、引用により本明細書中に組み込まれている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図６Ｂ−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月27日(2014.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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