(57)【要約】  本発明は、腫瘍壊死因子−αに対して方向付けられた、１若しくは２以上の抗体単一ドメイン又はその抗原結合断片、詳細には高い溶解性を有する二量体形態にある軽鎖可変ドメイン２個を含むポリペプチドに関する。関節リウマチを含む炎症性障害の治療における抗腫瘍壊死因子−αポリペプチドの使用方法にも関する。抗腫瘍壊死因子−αポリペプチドの治療可能性を増強するための組成物及び方法が、抗腫瘍壊死因子−αポリペプチドの特異的結合特性を実質的に維持する一方で、良好な溶解性、増強された血清半減期及び／又は低減した免疫原性を有する治療薬を提供するために、ポリペプチドをアルブミン結合ドメインに連結すること及び／又はポリペプチドを脱免疫化（de-immunizing）することを含んで提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ−αに結合する抗体単一ドメイン又はその抗原結合断片を含むポリペプチドであって、前記ドメインが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
前記可変ドメインが配列番号１〜１８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
可変ドメインが配列番号１（ＶＬ１８）又は配列番号２（ＶＬ１１）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
可変ドメインがヒトＴＮＦ−αのＴＮＦ−α受容体への結合に拮抗する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
可変ドメインが少なくとも１種の他の哺乳動物ＴＮＦ−αとさらに交差反応し、前記哺乳動物が霊長類ではない、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
哺乳動物がラット又はマウスである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
可変ドメインが少なくとも２種の他の哺乳動物のＴＮＦ−αと交差反応し、前記少なくとも２種の他の哺乳動物がげっ歯類及び非げっ歯類種である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
可変ドメインが前記可変ドメインの少なくとも１つのＴＨエピトープを除くことによって脱免疫化されている、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
可変ドメインが、配列番号１（ＶＬ１８）に対応する配列を含み、Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ及びＬ１１１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換によって脱免疫化されており、前記置換が配列番号１におけるアミノ酸位置を参照する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
可変ドメインが、配列番号２（ＶＬ１１）に対応する配列を含み、Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、Ｒ３１Ｓ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ、Ａ１００Ｓ及びＥ１０６Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換によって脱免疫化されており、前記置換が配列番号２におけるアミノ酸位置を参照する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
可変ドメインが、配列番号１９〜２３（ＶＬ１８バリアント５個）、配列番号２４〜２８（ＶＬ１１バリアント５個）及びそのＴＮＦ−α結合断片又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
アルブミン結合ドメインがさらに連結している、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
アルブミン結合ドメインが融合物として連結している、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アルブミン結合ドメインが融合物としてリンカーを介して連結している、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
リンカーが配列番号２９（３Ｌ）に対応するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アルブミン結合ドメインがポリペプチドの半減期を５倍向上させる、請求項１１〜１４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
アルブミン結合ドメインがＳ．ズーエピデミカス（S. zooepidemicus）Ｚ５から単離されたアルブミン結合ドメインに対応する、請求項１１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
アルブミン結合ドメインが配列番号３０（ＰＥＰ）に対応する配列又はそのアルブミン結合断片若しくは誘導体を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
可変ドメイン中及び／又はアルブミン結合ドメイン中の少なくとも１つのＴＨエピトープを除くことによって脱免疫化されている、請求項１１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アルブミン結合ドメインがＥ１２Ｄ、Ｔ２９Ｈ−Ｋ３５Ｄ及びＡ４５Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換によって脱免疫化されており、前記置換が配列番号３０におけるアミノ酸位置を参照する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アルブミン結合ドメインが配列番号３１に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＴＮＦ−αに結合する第二の抗体単一ドメイン又はその抗原結合断片をさらに含み、前記第二のドメインが第二の軽鎖可変ドメインを含み、前記単一ドメインが一緒になって二量体を形成する、請求項１〜２０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
二量体が配列番号１（ＶＬ１８）及び配列番号２（ＶＬ１１）に対応する配列又は一方若しくは両方の配列についてそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
二量体が配列番号３２（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）に対応する配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
二量体が可変ドメインの少なくとも１つ中の少なくとも１つのＴＨエピトープを除くことによって脱免疫化されている、請求項２１〜２３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号３５〜３９（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１バリアント）からなる群から選択される少なくとも１つの配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
二量体が、可変ドメインの少なくとも１つに連結しているアルブミン結合ドメインをさらに含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２７】
アルブミン結合ドメインが、配列番号３０（ＰＥＰ）に対応する配列又はそのアルブミン結合断片若しくは誘導体を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号３３（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）に対応する配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
可変ドメインの少なくとも１つ中及び／又はアルブミン結合ドメイン中の少なくとも１つのＴＨエピトープを除くことによって脱免疫化されている、請求項２６〜２８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号３４及び４０〜４４（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアント）からなる群から選択される少なくとも１つの配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ＴＮＦ−α関連状態に罹患している及び／又はその素因を有する対象においてそれを治療する及び／又は遅延させるための医薬の調製のための、請求項１〜３０のいずれかに記載のポリペプチドの有効量の使用。
【請求項３２】
ＴＮＦ−α関連状態が炎症性障害である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
炎症性障害が関節リウマチである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
医薬が１カ月に２回以下で投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３５】
医薬が１カ月に１回以下で投与される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１〜３０のいずれかに記載のポリペプチドの有効量及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３９】
請求項３８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３０のいずれかに記載のポリペプチドの作製方法であって、
（ｉ）前記ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を用意するステップ；
（ii）前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養するステップ；及び
（iii）前記培養物から前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が本明細書に全体が参照により組み込まれる、２０１１年９月２３日出願の米国仮特許出願第６１／５３８，５４８号の利益を主張する。本出願は、その内容も本明細書に全体が参照により組み込まれるFrederico Aires da Silva, Sofia Volker Corte-Real, Rui Freitas and Sara Lourencoによる２０１１年９月２３日出願の米国仮特許出願第６１／５３８，５５２号、表題「Modified Albumin-binding Domains and Uses Thereof to Improve Pharmacokinetics」にも関する。
【０００２】
本発明は、１又は２以上の抗体単一可変ドメイン又はその抗原結合断片、詳細には高い溶解性を有する軽鎖可変ドメイン２個を含む二量体を含む、抗腫瘍壊死因子ポリペプチドに関する。本発明はまた、炎症性障害、例えば関節リウマチなどの腫瘍壊死因子−α関連状態の治療、予防又は管理における本発明の抗腫瘍壊死因子−αポリペプチドの使用方法にも関する。抗腫瘍壊死因子−αポリペプチドの特異的結合特性を実質的に維持しながら良好な溶解性、増強された血清半減期及び／又は低減した免疫原性を有する治療薬を提供するために、ポリペプチドをアルブミン結合ドメインに連結すること及び／又はポリペプチドを脱免疫化することを含む、抗腫瘍壊死因子−αポリペプチドの治療可能性を増強するための組成物及び方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α、Tumor necrosis factor alpha）は、三量体分子として存在し、２つの生理活性形態（膜結合ＴＮＦ−α及び可溶性ＴＮＦ−α）を有するサイトカインである。ＴＮＦ−αの膜結合形態は、細胞外、膜貫通及び細胞質性ドメインからなる。膜結合形態（約２６ｋＤａ）の切断は、ホモ二量体として存在する可溶型（約１７ｋＤａ）を生じる。両形態が生物学的に活性であるが、ＴＮＦ−αの可溶型がより強力である。
【０００４】
ＴＮＦ−αは、特異的細胞表面受容体に結合することによって細胞増殖、細胞分化、炎症及び細胞死並びに免疫制御に効果を及ぼす。三量体分子の隣接するサブユニットによって作られる溝は、その受容体との相互作用のために重要である。２つの公知のＴＮＦ−α受容体は、ｐ５５（ＣＤ１２０ａ）及びｐ７５（ＣＤ１２０ｂ）受容体を含む。ｐ５５受容体は大部分の細胞で発現されている；一方ｐ７５受容体は、主に活性化された白血球細胞でのより限定された発現を示す。ＴＮＦ−αは、例えば関節リウマチ、乾癬性関節炎及びクローン病などの炎症性障害を含む種々の状態及び障害において重要な役割を演じると考えられている。
【０００５】
慢性炎症性疾患は、人生を変えるような衰弱状態である場合があり、関節リウマチ（ＲＡ、rheumatoid arthritis）は最も一般的なものの１つである。ＲＡは、末梢関節の全身性炎症によって特徴付けられ、関節の進行性破壊を生じる。世界人口のおよそ１〜２％がＲＡに冒され、患者の３分の１が診断から２０年以内に重度の身体障害者になる可能性がある。ＲＡの発症は、４０〜５０歳の間に最も生じ、男性よりも女性が３倍多く冒される。ＲＡに治療法は無く；治療は生活の質を維持しながら疾患を遅延させる及び関節損傷を最少化することを目的とする。
【０００６】
いくつかの戦略が、サイトカインが原因物質として関与している種々の状態においてＴＮＦ−αのその受容体との作用に拮抗するように開発されている。例えば過剰なＴＮＦ−αの作用を遮断することは、関節リウマチなどのいくつかの炎症性疾患における治療戦略である。特にＲＡでは、疾患の経過のより早期にＴＮＦ−αに対する治療を開始することを新たに強調する治療パラダイムにおける転換が近年あった。ＴＮＦ−αを対象とする治療の１種は、抗ＴＮＦ−α抗体を含む。
【０００７】
しかしＴＮＦ−αの活性形態の場合のように受容体結合ドメインが溝に埋め込まれている場合には、従来の抗体を多量体タンパク質に対して産生するのは困難な場合がある。さらに、インタクトな機能性抗体を発現するためには哺乳動物細胞系が通常必要であり、高い製造費用の一因となる。治療に有用な抗体を得ることは、ヒト対象への投与における望まれない免疫学的反応を回避するなどの追加的修飾を必要とする場合がある。伝統的な抗体は室温で安定でない場合もあり、製造、保存及び輸送の際に冷蔵を必要とし、さらに必要経費を追加する。さらに、従来の抗体の大きなサイズは溶解性及び組織浸透を限定する場合がある。
【０００８】
これらの問題のいくつかに対処するための一手法は、単一ドメイン抗体の使用を含む。しかしそのような分子の比較的小さなサイズは、短いインビボ半減期を有する産生物を生じる場合がある。短い血清半減期に伴う問題を克服するために、いくつかの戦略が用いられている。例えばある種のタンパク質融合物が、サイズを増加すること、及びそれによりタンパク質治療剤の安定性及び半減期を増大することが試みられている（Syed et al. (1997) Blood 89:3243-3252；Yeh, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:1904-1908）。しかし融合産生物は、ミスフォールディングする傾向があり、融合領域は追加的免疫原性部位を作る場合がある。それでもなお治療用タンパク質のアルブミンへの融合は試みられている。
【０００９】
アルブミン（分子量６７ｋＤａ）は、血漿中において最も豊富なタンパク質であり、５０ｍｇ／ｍｌで存在し、ヒトにおいて１９日間の半減期を有する (Peters, T., Jr. (1985) Adv. Protein Chem. 37:161-245；Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin, Academic Press, Inc., San Diego, CA)。アルブミンは、多種多様な内在性物質及び薬剤に可逆的に結合し、輸送することによってインビボで極めて重要な役割を演じており、アルブミン中のいくつかの主要な小分子結合部位は記載されている（例えばFrick, et al. (1994) Mol Microbiol. 12:143-51及びAkesson et al. (1994) Biochem. J. 300:877-886を参照されたい）。さらなる戦略は、血清アルブミンへのインビボでの会合を可能にする別のタンパク質への治療剤のカップリングを含む。この手法の例も記載されている（例えば、他のタンパク質の半減期を増加させるためのアルブミン結合ペプチド又は連鎖球菌タンパク質Ｇ（ＳｐＧ、streptococcal protein G）由来タンパク質の使用を記載しているＥＰ０４８６５２５及び米国特許第６，２６７，９６４号明細書）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＥＰ０４８６５２５
【特許文献２】米国特許第６，２６７，９６４号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Syed et al. (1997) Blood 89:3243-3252
【非特許文献２】Yeh, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:1904-1908
【非特許文献３】Peters, T., Jr. (1985) Adv. Protein Chem. 37:161-245
【非特許文献４】Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin, Academic Press, Inc., San Diego, CA
【非特許文献５】Frick, et al. (1994) Mol Microbiol. 12:143-51
【非特許文献６】Akesson et al. (1994) Biochem. J. 300:877-886
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
少なくとも５種の抗ＴＮＦ−α産生物が販売されており、インフリキシマブ（Remicade（商標））、アダリムマブ（Humira）、エタネルセプト（Enbrel）、セルトリズマブペゴール（Cimzia）及びゴリムマブ（Simponi）、それぞれは高い治療費と関連している。例えば販売されている各抗ＴＮＦ産生物は、毒性を評価するための主な関連種として非ヒト霊長類を用いており、高いコストの原因となっている。さらに重要なことには、既存の治療はわずかに有効である及び／又は不十分に許容される一方で、組合せでの適した使用のためには高価すぎる場合がある。患者のおよそ３分の１は、これらの治療法に応答せず、有害反応は一般的である。１つのＴＮＦ−α阻害剤への反応が乏しい患者は、典型的には別のものに切り換えられ、さらに多数の患者が所与の産生物に対して免疫応答（immunogenic response）を発症し、それにより彼らの治療を変更する必要が同様にある。
【００１３】
したがって対象において特異性、溶解性及びより長い半減期並びに免疫原性の低減を費用効率性が高いやり方で提供する、ＴＮＦ−αを対象とする治療剤が必要である。詳細には炎症性障害などのＴＮＦ−α介在性状態を治療するために、低頻度、低用量、既存の薬剤との組合せで及び／又は自己投与を促進するやり方で与えられ得る治療剤が必要である。本明細書において提供される抗体単一ドメインに基づく治療剤は、これらの及び他の必要性に対処する。
【００１４】
前述の考察は、当技術分野が直面している問題の性質のより良い理解を提供するためだけに示されており、いかなる方法においても先行技術としての承認として解釈されるべきではなく、本明細書におけるいかなる参考文献の引用もそのような参考文献が本出願への「先行技術」を構成することの承認として解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様は、抗ＴＮＦ−αポリペプチドと称されるＴＮＦ−αに結合する抗体単一ドメイン又はその抗原結合断片を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、ドメインは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、可変ドメインは配列番号１（ＶＬ１８）；配列番号２（ＶＬ１１）；配列番号３〜１８及びそのＴＮＦ−α結合断片又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ポリペプチドの可変ドメインは、ＴＮＦ−α受容体へのヒトＴＮＦ−αの結合に拮抗する及び／又は少なくとも１種の他の哺乳動物のＴＮＦ−αとさらに交差反応する。いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物は、霊長類ではなく、例えば哺乳動物はラット又はマウスであってよい。いくつかのさらに好ましい実施形態では、可変ドメインは、げっ歯類及び非げっ歯類種を含む少なくとも２種の他の哺乳動物のＴＮＦ−αと交差反応する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、単一ドメインが一緒になって二量体を形成するようにＴＮＦ−αに結合する第二の抗体単一ドメイン又はその抗原結合断片をさらに含む。第二ドメインは軽鎖可変ドメインも含んでよい。例えばいくつかの詳細な実施形態では、二量体は配列番号１（ＶＬ１８）及び配列番号２（ＶＬ１１）に対応する配列又は一方若しくは両方の配列についてのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む。いくつかの詳細な実施形態では、二量体は、配列番号３２（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）に対応する配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、それに連結したアルブミン結合ドメインをさらに含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドに関する。アルブミン結合ドメインは融合物として（例えば、リンカーを介する融合物として）ポリペプチドに連結されてよい。いくつかの詳細な実施形態では、リンカーは、配列番号２９（３Ｌ）に対応するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。いくつかの好ましい実施形態では、アルブミン結合ドメインは、ポリペプチドの半減期を、例えば５倍近く増強する。いくつかのより具体的な実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０（ＰＥＰ）に対応する配列又はそのアルブミン結合断片若しくは誘導体を含む。例えばいくつかの詳細な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）に対応する配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド及び／又はアルブミン結合ドメインとのその融合物若しくはコンジュゲートは、脱免疫化（de-immunized）される。脱免疫化は宿主における免疫原性を低減し、可変ドメイン及び／又はアルブミン結合ドメイン中の少なくとも１つのＴＨエピトープを除くことによって達成され得る。いくつかの詳細な実施形態では、可変ドメインは、配列番号１（ＶＬ１８）に対応する配列を含み、Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ及びＬ１１１Ｋ（置換は配列番号１におけるアミノ酸位置を参照する）からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換によって脱免疫化される。いくつかの詳細な実施形態では、可変ドメインは、配列番号２（ＶＬ１１）に対応する配列を含み、Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、Ｒ３１Ｓ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ、Ａ１００Ｓ及びＥ１０６Ｋ（置換は配列番号２におけるアミノ酸位置を参照する）からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換によって脱免疫化される。いくつかの詳細な実施形態では、可変ドメインは、配列番号１９〜２３（脱免疫化ＶＬ１８バリアント５個）、配列番号２４〜２８（脱免疫化ＶＬ１１バリアント５個）及びそのＴＮＦ−α結合断片又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。いくつかのより具体的な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５〜３９（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１バリアント）又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む場合がある。いくつかのより具体的な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４及び４０〜４４（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアント）又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。
【００１９】
いくつかの具体的な実施形態では、アルブミン結合ドメインは、例えばＥ１２Ｄ、Ｔ２９Ｈ−Ｋ３５Ｄ及びＡ４５Ｄ（置換は配列番号３０におけるアミノ酸位置を参照する）からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換によって脱免疫化される。いくつかの詳細な実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３１に対応するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、ＴＮＦ−α関連状態を罹患している及び／又はその素因を有する対象においてそれを治療する及び／又は遅延させるための医薬の調製物のための本発明による１又は２以上のポリペプチドの有効量の使用に関する。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αが関連する状態は、関節リウマチなどの炎症性障害である。いくつかの好ましい実施形態では、医薬は月に２回以下、より好ましくは月に１回以下で投与される。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドの有効量及び／又は同物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
別の態様は、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸並びに同物を含むベクター及び／又は宿主細胞及び／又は医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、（ｉ）ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を用意するステップ；（ii）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養するステップ；及び（iii）培養物からポリペプチドを回収するステップを含む本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの作製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒトＴＮＦ−αに高親和性結合を示すＶＬ単一ドメインの配列比較を例示する図である。
【図２Ａ−Ｄ】（Ａ〜Ｃ）はＶＬ単量体及び二量体についてのウエスタンブロット発現分析の結果；並びに（Ｄ）はヒト及びラットＴＮＦ−αに対するＶＬ単量体及び二量体の結合親和性を例示する図である。
【図３Ａ−Ｆ】本発明のＶＬ−ＶＬ二量体の結合アッセイ及び薬物動態の結果を例示するグラフである。図３Ａ〜Ｃは、Remicade（商標）と比較して、ヒトＴＮＦ−α及びそのアルブミン結合融合物への二量体のＢＩＡｃｏｒｅによる親和性決定の結果を例示する；図３Ｄ〜Ｅは、様々な種のＴＮＦ分子への二量体のＥＬＩＳＡによる相対的結合及び特異性を例示する；図３Ｆは、そのインビボ血清半減期を決定するためにウィスターメスラットへの投与によって検査されたＶＬ−ＶＬ構築物（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）の薬物動態を例示する、データは投与５分後にアッセイされた最大濃度を考慮して標準化された（５分値の％）。
【図４】本発明のＶＬ−ＶＬ二量体を用いるＴＮＦ−α依存性細胞溶解活性の中和についてのアッセイの結果を例示し、二量体がＬ９２９細胞をＴＮＦ誘導性細胞傷害から保護したことを示すグラフである。
【図５】ウィスターメスラットでのアジュバント誘導関節炎モデルにおいて誘導された疾患進行を例示するグラフである。
【図６】確立されたラットアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ、adjuvant-induced arthritis model）における本発明のＶＬ−ＶＬ二量体の治療効果を四肢の臨床的評価に基づいて例示するグラフである。
【図７】確立されたラットアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ）における本発明のＶＬ−ＶＬ二量体の治療効果を後足首腫脹での変化に基づいて例示するグラフである。
【図８Ａ−Ｅ】確立されたラットアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ）における本発明のＶＬ−ＶＬ二量体の治療効果を後足首腫脹での変化に基づいて写真で例示する図である。
【図９Ａ−Ｆ】確立されたラットアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ）における本発明のＶＬ−ＶＬ二量体の治療効果を組織学的分析に基づいて例示する図である。
【図１０Ａ−Ｂ】本発明の組換えＶＬ−ＶＬ二量体２個：ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１（図１０Ａ）、ヒト及びラットＴＮＦ−αに対する特異性を有する二量体形態の組換え単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）（単量体ＶＬ１１に結合している単量体ＶＬ１８）；並びにＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ（図１０Ｂ）、半減期を延長するアルブミン結合ドメイン（ＰＥＰ）に融合している二量体分子、を例示する図である。
【図１１Ａ−Ｂ】ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ分子についての３Ｄモデルを例示する図である。
【図１２Ａ−Ｃ】本発明のＶＬ単一ドメイン抗体２個（Ａ〜Ｂ）及びアルブミン結合ドメイン（Ｃ）において提案されている置換位置（灰色で強調）をＫａｂａｔ及び序数番号付けを用いて例示する図である；ＣＤＲはｘによって示される。
【図１３】本発明のＶＬ−ＶＬ−ＰＥＰ構築物とヒトアルブミンとの間の結合様式を例示する図である。
【図１４】本発明の組換え脱免疫化ＶＬ−ＶＬ二量体（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８）のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果を例示する図である。発現された二量体のゲル位置は、矢印で示されている。レーン１〜４は以下の通り：レーン１：Ｓｅｅ  Ｂｌｕｅ２  Ｐｌｕｓラダー、１０μＬ；レーン２：誘導前試料、全タンパク質；レーン３：誘導後一晩での試料、全タンパク質；及びレーン４：誘導後一晩での試料、可溶性タンパク質。
【図１５Ａ−Ｅ】本発明の脱免疫化ＶＬ−ＶＬ二量体についての下流工程開発を例示する図である。図１５Ａは下流工程開発の模式図を例示する。図１５Ｂ〜Ｃは本発明の脱免疫化二量体（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８）のタンパク質Ｌ親和性精製後のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果を例示する。図１５Ｄは、本発明の脱免疫化二量体（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８）のＳＰセファロースカチオン交換クロマトグラフィー後のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果を例示する。図１５Ｄは本発明の脱免疫化二量体（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８）のサイズ排除クロマトグラフィー後のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果を例示する。
【図１６】確立されたラットアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ）における本発明の脱免疫化ＶＬ−ＶＬ二量体の治療効果を例示する図である。
【図１７Ａ−Ｉ】確立されたラットアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ）における本発明の脱免疫化ＶＬ−ＶＬ二量体の治療効果を組織学的分析に基づいて例示する図である。
【図１８Ａ−Ｂ】ｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１（図１８Ａ）及びｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ（図１８Ｂ）について関連臓器における体内分布データをウィスターラット（ｎ＝３）へのｉ．ｐ．投与の１５分、１時間、３時間、６時間及び２４時間後について％ＩＤ／臓器として表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．定義
タンパク質剤（protein agent）（全長タンパク質、多量体タンパク質、ポリペプチド、ペプチド並びに特に抗体及びその断片を含む）のコンテキストにおいて用いられる場合、用語「誘導体」は、第二の薬物として類似する又は同一の機能を有するが、第二の薬物と類似する若しくは同一のアミノ酸配列、グリコシル化などの修飾又は二次、三次若しくは四次構造を含む必要はない薬物を指す。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質剤は、次の少なくとも１つを満たす第二のタンパク質剤を指す：（ａ）第二のタンパク質剤のアミノ酸配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質剤；（ｂ）第二のタンパク質剤の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基又は少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質剤；及び（ｃ）第二のタンパク質剤をコードするヌクレオチド配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質剤。第二のタンパク質剤に類似する構造を有するタンパク質剤は、第二のタンパク質剤に類似する二次、三次又は四次構造を有するタンパク質剤を指す。ポリペプチドの構造は、これだけに限らないがペプチド配列決定、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴法、円二色性及び結晶解析電子顕微鏡を含む当業者に公知の方法によって決定され得る。
【００２６】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性百分率を決定するために、配列は最適な比較目的で配列比較される（例えば、第二のアミノ酸又は核酸配列との最適な配列比較のためにギャップが第一のアミノ酸配列又は核酸配列に導入され得る）。次いでアミノ酸位置又はヌクレオチド位置に対応するアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列における位置が第二配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合に、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有されている同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一性重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【００２７】
２つの配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを用いても達成され得る。２つの配列の比較のために利用可能な数学アルゴリズムの非限定的一例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 2264-2268のアルゴリズムが、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:5873-5877においての通り改良されたものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。
【００２８】
抗体及びその断片を含むタンパク質の内容において本明細書において用いられる用語「誘導体」は、アミノ酸残基置換、欠失若しくは付加の導入によって変更されているアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチドも指す。本明細書において用いられる用語「誘導体」は、修飾されている（すなわち、ポリペプチド又はペプチドへのいかなる種類の分子の共有結合的付着によって）ポリペプチド又はペプチドも指す。例えば、限定の目的ではなくポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング（blocking）基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾され得る。誘導体ポリペプチド又はペプチドは、これだけに限らないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む当業者に公知の技術を用いる化学的修飾によって産生され得る。さらに誘導体ポリペプチド又はペプチド誘導体は、それが由来したポリペプチド又はペプチドと類似の、同一の又は改善された機能を有する。
【００２９】
本明細書において用いられる「誘導体」は「バリアント」と互換的に用いられる。
【００３０】
本明細書において用いられる用語「断片」は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基又は少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。具体的な実施形態では、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持している。
【００３１】
本明細書において用いられる用語「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などは、免疫学分野におけるそれらの通常の意味を有し、天然に存在する免疫グロブリン中のドメイン及び合成（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、１本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを指す。
【００３２】
本明細書において用いられる用語「免疫特異的に結合」、「免疫特異的に認識」、「特異的に結合」、「特異的に認識」及び類似する用語は、生理的条件下で抗原（例えば、エピトープ又は免疫複合体）に特異的に結合し、別の分子に特異的に結合しない分子を指す。抗原に特異的に結合する分子は、例えば免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ又は当業者に公知の他の技術によって同定され得る。抗原に特異的に結合する分子は、他のペプチド又はポリペプチドに結合する場合があるが、例えば免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ又は当技術分野において公知の他のアッセイによって決定される通り低い親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原に特異的に結合する分子は、他の分子（他の種由来の類似タンパク質など）に交差反応する。本明細書において用いられる用語「その抗原結合断片」は、他に指定がない限り、ＴＮＦ−α結合断片を指す。
【００３３】
本明細書において用いられる用語「インビボ半減期」、「血清半減期」又は「血漿半減期」（ｔ１／２とも称される）は、所与の宿主の循環における分子の生物学的半減期を指し、動物に投与された量の半分が動物内の循環及び／又は他の組織から除去されるために必要とされる時間によって表される。インビボ半減期は、治療のための投与の量及び頻度を決定する重要な臨床的指標である。所与の分子のクリアランス曲線が時間の関数として作成される場合、曲線は、血管内腔と血管外腔との間での注射された分子の平衡を表す急速な「α−相」（ある程度分子のサイズによって決定される）；及び血管内腔中での分子の異化反応を表す長い「β−相」を有して通常二相性である。実際にはインビボ半減期は、β−相での分子の半減期に通常密接に対応する。
【００３４】
本明細書において用いられる用語「核酸」及び「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子との組合せ又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子及びＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の誘導体を含む。そのような誘導体は、例えばヌクレオチド（これだけに限らないがイノシン又はトリチル化塩基を含む）を用いて生成され得る。そのような誘導体は、（例えばヌクレアーゼ耐性又は細胞膜を通過する能力の増大など）分子に有益な特質を与える修飾された主鎖を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子も含む場合がある。核酸又はヌクレオチドの配列は、１本鎖、２本鎖であってよく、１本鎖及び２本鎖部分の両方を含有してもよく、３本鎖部分を含有してもよいが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００３５】
「単離された」又は「精製された」分子は、分子が由来する細胞若しくは組織供給源由来の細胞材料又は他の混入物を実質的に含まない、或いは化学的に合成された場合は化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。専門用語「細胞材料を実質的に含まない」は、分子が単離された又は組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離されている分子の調製物を含む。したがって細胞材料を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％又は５％未満（乾燥重量による）の混入タンパク質を有する調製物を含む。分子（典型的にはタンパク質）が組換え的に産生される場合、それも典型的には培養培地を実質的に含まない、すなわち培養培地は調製物の容量の約３０％、２０％、１０％又は５％未満に相当する。分子が化学合成によって産生される場合、典型的には化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち分子の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、そのような調製物は所望の分子以外に約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量による）未満の化学的前駆体又は化合物を有する。本発明の一実施形態では、タンパク質並びに詳細には単一ドメイン抗体及びその融合タンパク質は、単離される又は精製される。
【００３６】
本明細書において用いられる用語「対象」、「宿主」及び「患者」は、互換的に用いられる。対象は、典型的には非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物であり、最も頻繁にはヒトである。
【００３７】
２．抗ＴＮＦ−αポリペプチド
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を対象とするポリペプチド又はその抗原結合断片に関する。そのようなポリペプチドは、本明細書において「抗ＴＮＦ−αポリペプチド」と称され、例えばその抗原結合断片及びその誘導体並びに、アルブミン結合ドメインとの融合物などのその融合物を含む。本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、１又は２以上の免疫グロブリン単一ドメイン（一般に「単一ドメイン抗体」（本明細書において語句「抗体単一ドメイン」と互換的に用いられる）と称される）を含む。抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、同物をコードする核酸及び同物を含む医薬組成物と共に、本明細書において「抗ＴＮＦ−α剤」と称される場合がある。
【００３８】
抗体断片は、インタクトな従来のＩｇＧから生成でき、抗原結合断片、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ））、Ｆ（ａｂ’）断片、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）（ＶＨ−ＶＬ二量体）、重鎖ドメインのみ、軽鎖ドメインのみ並びに個々の（単一）ドメイン、例えばＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＬドメインなどを含む。本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、軽鎖抗体、従来の４本鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、操作された抗体及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャホールドを含み得る。
【００３９】
用語「抗体単一ドメイン」、「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、抗体のＶＨ又はＶＬドメイン（単一の単量体可変抗体ドメイン）のいずれかを含む又はそれからなる抗体断片を指す。いくつかの実施形態では、抗体は、その二量体、三量体又はより高次の多量体を含む。同様にインタクト抗体、抗体単一ドメインは、特定の抗原に免疫特異的に結合できる。しかし全抗体とは異なって抗体単一ドメインは、それらがＦｃ領域を欠失していることから補体系誘発細胞傷害性を示さない。
【００４０】
抗体単一ドメインは、長さ約１１０アミノ酸、分子量約１２〜約１５ｋＤａの範囲のペプチド鎖をしばしば有する。それにより抗体単一ドメインは、一般に約１５０〜約１６０ｋＤａであり、重鎖２本及び軽鎖２本からなるインタクト抗体よりもかなり小さい。抗体単一ドメインは、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ；軽鎖１個及び重鎖半分）並びに１本鎖可変断片（約２５ｋＤａ；軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメイン）よりも小さい。例えば、Harmsen, MM, et al. (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77(1): 13-22を参照されたい。
【００４１】
抗体単一ドメインの小さなサイズは、より良い溶解性及び組織でのより良い浸透性並びにより大きな熱抵抗性並びに界面活性剤及び尿素に対する安定性を可能にする。小さな分子はより容易に腎性に除かれることから小さなサイズは、短い血清半減期をしばしばもたらす。それにもかかわらず小さなサイズは、インタクト抗体又は大きな抗体断片には到達できない場合がある「隠れた」エピトープへの結合を促進する、例えば酵素の隠れた活性部位又は多量体ポリペプチド間に形成される溝の中の結合部位（上に記載のＴＮＦ−αの受容体結合部位の場合など）。
【００４２】
初期ｓｄＡｂは、ラクダにおいて見出された重鎖抗体から操作された。これらのｓｄＡｂは「ＶＨＨ断片」としばしば称される。ｓｄＡｂに関する研究のほとんどは、今もなお重鎖可変ドメインに重点を置いている。
【００４３】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、いかなる種（例えばウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ウシ、ラクダ科（ラクダ、ラマ）及びヒト免疫グロブリン分子）由来の抗体単一ドメインも含み得る。いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドの可変ドメインは、ウサギ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドの可変ドメインは、ラクダ科可変ドメインではない。免疫グロブリンは、いかなる種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）並びに／又はクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）並びに／又はサブクラスのものであってもよい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧのドメインが用いられる。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、インタクトな天然に存在する免疫グロブリンにおいて見出される１又は２以上の抗体ドメインを特異的に除外する。例えば本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ））又はＦ（ａｂ’）断片以外の１又は２以上の単一ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）（ＶＨ−ＶＬ二量体）、重鎖ドメインのみ、軽鎖ドメインのみ及び個々の（単一）ドメインのみ、例えばＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン、又は二量体、三量体若しくはＶＬ−ＶＬ二量体などの抗体単一ドメインのより高次の構造を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドは、Ｆｃドメインを含まない。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＶＨドメイン（例えばウサギＶＨドメイン）を含まない及び／又はウサギ以外のいかなる種由来のＶＨドメインも含まない。他の実施形態では、ポリペプチド（又はその断片）はＶＬドメインを含まない、及び／又はウサギ以外のいかなる種由来のＶＬドメインも含まない。特定の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＣＨ１ドメインを含まない、及び／又はウサギ以外のいかなる種由来のＣＨ１ドメインも含まない。特定の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＶＨドメイン（例えば、ヒトＶＨドメイン）を含まない、及び／又はヒト以外のいかなる種由来のＶＨドメインも含まない。他の実施形態ではポリペプチド（又はその断片）は、ＶＬドメインを含まない、及び／又はヒト以外のいかなる種由来のＶＬドメインも含まない。特定の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＣＨ１ドメインを含まない、及び／又はヒト以外のいかなる種由来のＣＨ１ドメインも含まない。
【００４６】
他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ３ドメイン又はＨドメイン（ヒンジ領域）の１若しくは２以上を含まない、又はいかなるＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ３ドメイン又はＨドメイン（ヒンジ領域）も含まない。さらに他の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＣＨ１ドメイン、Ｈドメイン（ヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン又はＣＨ３ドメインの内の１個を含み、免疫グロブリン由来のいかなる他の定常ドメイン又はヒンジ領域も含まない（例えば特定の実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、ＣＨ１ドメインを含むが、いかなるＨドメイン（ヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメインも含まない；又はＣＨ２ドメインを含むが、いかなるＣＨ１ドメイン、Ｈメイン（ヒンジ領域）若しくはＣＨ３ドメインも含まない、など）。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、重鎖のみ、軽鎖のみ、ＶＨドメインのみ、ＶＬドメインのみ又は上記断片及び／又はドメインのいかなる組合せも含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体断片、ＶＨ及び／又はＶＬを含むポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、単量体（例えば、単量体ＶＨドメイン又はＶＬドメイン）として用いられる単一ドメインを含む場合がある。ＶＬ又はＶＨ単量体は、１又は２以上のＴＮＦ−α分子への結合に関するその親和性及び特異性に基づいて選択され得る。好ましくは、選択されたＶＨ又はＶＬドメインは、ヒトＴＮＦ−αに対する高い結合親和性を有する。例えば、ＴＮＦ−αで免疫化された動物（例えば、免疫化ウサギ）由来の血清は、１又は２以上のＴＮＦ−α分子（例えば、ヒト、ラット、マウス、及び／又はサルＴＮＦ−α）への結合について当技術分野において公知の技術を用いて分析される。選択されたクローンは、可変ドメインライブラリー（例えば、好適な抗ＴＮＦ−αポリペプチドをさらに選択するためのＶＨ及び／又はＶＬライブラリー）を生成するために用いられ得る。選択は、１又は２以上のＴＮＦ−α分子への高い結合及び／又は交差反応性に基づく場合がある。
【００４８】
いくつかの実施形態では、クローンは、ヒトＴＮＦ−αへの高い結合並びにラット及び／若しくはマウスＴＮＦ−αとの又は１若しくは２以上の非ヒト種（好ましくは霊長類以外の比較的小さな哺乳動物を含む）由来のＴＮＦ−αとの交差反応性を示すものが選択される。比較的小さな哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ハムスターなどを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、クローンは、少なくとも１種のげっ歯類種及び少なくとも１種の非げっ歯類種由来のＴＮＦ−αへの交差反応性を示すものが選択される。げっ歯類種は、例えばラット、マウス、リス、スナネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、シマリス、モルモット及びハタネズミを含む。治療効果がヒト患者において達成でき、そのようなインビボ検査（例えば有効性及び毒性学アッセイの観点から）がラット及び／若しくはマウスモデルにおいて並びに／又は１種のげっ歯類及び非げっ歯類種において実施され得る、本発明における使用のために好適な抗ＴＮＦ−αポリペプチドをそのようなクローンは提供する。すなわち、交差反応性は推定治療用ポリペプチドのある種のインビボ（前臨床）検査を動物（そのＴＮＦ−αはヒトＴＮＦ−αと共に推定治療剤についての結合標的である）において実施できるようにする。例えば、ラットＴＮＦ−α及びヒトＴＮＦ−αに対する結合親和性を有する推定治療用ポリペプチドは、検査され得る（例えば、関節リウマチのラットモデルにおいて毒性学について）。ラット及び／又はマウスモデルは、例えば本発明による推定治療用抗ＴＮＦ−αポリペプチドの前臨床研究のための霊長類モデルを超える費用有意性を提供する。非霊長類（例えばラット及びマウス）において交差反応性について抗ＴＮＦ−αポリペプチドを計画的に選択することは、霊長類の使用を、特に毒性学評価において、低減でき、市場に出すまでのコストを抑えることができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、単量体として用いられる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、単量体として用いられる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）である。そのような単量体は、天然に存在する抗体の選択されたクローンから得られる。例えばＶＬライブラリーは、選択されたクローンから軽鎖可変ドメインＲＮＡを抽出するステップ、対応するｃＤＮＡを合成するステップ及びファージディスプレイライブラリーを生成するために同物を用いるステップによって構築され得る。ファージディスプレイ技術は、ＴＮＦ−α分子などの標的抗原及び／又はエピトープに対する抗体ドメインの親和性を増大するために用いられ得る。技術は親和性成熟と称され、選択された配列の初期プールと比較してより高い親和性でＴＮＦ−αに結合する本発明のアミノ酸配列を同定するために、変異誘発又はＣＤＲウォーキング及び標的抗原及び／又はそのエピトープを用いる再選択を使う。ライブラリーは、単一ＣＤＲ中の単一アミノ酸変更によってそれぞれ異なるバリアントクローンのプールを有して構築でき、各ＣＤＲ残基についてそれぞれ可能なアミノ酸置換を示すバリアントを含有する。抗原に対する結合親和性が増大したドメインは、例えば標識抗原を有する固定化ミュータントドメインに接触させるステップによってスクリーニングされ得る。当技術分野において公知のいかなるスクリーニング方法も、抗原への結合活性が増大したミュータント抗体を同定するために用いられ得る（例えば、ＥＬＩＳＡ）（それぞれ本明細書にその全体が参照により組み込まれる、Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:6037；Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994を参照されたい）。可変軽鎖ドメインは、上に記載の通り１又は２以上のＴＮＦ−α分子に関して親和性、特異性及び／又は交差反応性についてスクリーニングされ得る。
【００５０】
特に好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号１〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。実施例１及び図１も参照されたい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、免疫グロブリンの１個より多い単一ドメインをより高い次元の形態で（例えば二量体、三量体、四量体などとして）含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、抗体単一ドメイン２個又はその抗原結合断片を二量体の形態で含む。二量体形態は、例えばＶＨ−ＶＨ二量体、ＶＬ−ＶＬ二量体及びＶＨ−ＶＬ二量体を含む。ＶＨ−ＶＨ及びＶＬ−ＶＬ二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であってよい。いくつかの好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、２個の異なるＶＬドメイン（ＶＬ１−ＶＬ２）を含み、各ＶＬ単一ドメインはＴＮＦ−α分子を対象としている。具体的な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ＶＬ−ＶＬホモ又はヘテロ二量体を含み、ＶＬドメインの一方又は両方は配列番号１〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。二量体形態は結合ドメイン２個を提供でき、標的分子へのより有効な結合を促進し、結果としてより有効なＴＮＦ−α遮断及び／又は阻害を提供できる。
【００５２】
二量体形成では個々のドメインは、当技術分野において公知の通り種々の方法によって連結され得る。いくつかの実施形態では、個々の単一ドメインは、例えばジスルフィド結合によって、直接連結される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、個々の単一ドメインは、リンカー、例えばペプチドリンカー又は化学的リンカーによって連結される。化学的リンカーの例は、非限定的にマレイミドリンカー、生体適合性ポリマー（好ましくは長さ約１〜約１００原子を有する）、アルデヒド／シッフ塩基連結、スルフィドリル連結などを含む。例えばSelinfreundへの米国特許出願公開第２０１１／０１９６０８５号明細書を参照されたい。
【００５４】
代替的にペプチドリンカーは、ポリペプチド構築物が繋いでいるリンカーと共に融合タンパク質として発現される場合に用いられ得る。ペプチドリンカーは、グリシン及びセリンなどの可動性アミノ酸残基をしばしば含み、それにより隣接ドメインは相互に自由に移動する。好ましい実施形態では、リンカーは、標的ＴＮＦ−α分子（複数可）への結合に実質的に影響を与えることなく２個の単一ドメインが架橋されるような長さである。いくつかの実施形態では、用いられるペプチドリンカーは、長さ２〜１００アミノ酸、長さ５〜８０、１０〜５０、１０〜２０又は１５〜２０アミノ酸である。ペプチドリンカーの例は、非限定的にポリグリシン、ポリセリン、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリイソロイシン若しくはポリアルギニン残基又はそれらの組合せを含む。具体的な実施形態では、ポリグリシン又はポリセリンリンカーは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０及び４０個のグリシン及び／又はセリン残基を含む。別の具体的な実施形態ではリンカーは、グリシン及びセリン残基の反復、例えば（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基又は例えば溶解性を増大させるために全体に分散されたＧｌｕ又はＬｙｓ残基を有する（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基を含む。グリシン及びセリンの反復を含む他のリンカーは、例えば（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ反復；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ反復；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復；又は（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ反復；それぞれの１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回又はそれ以上の反復を含む。標準的なリンカーは（ＧＧＧＧＳ）；（ＧＧＧＧＳ）２；（ＧＧＧＧＳ）３；（ＧＧＧＧＳ）４；（ＧＧＧＧＳ）５；（ＧＧＧＧＳ）６を含む。いくつかの詳細な実施形態では、リンカーは、式［Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４］ｎ−（Ｓｅｒ）２−Ｇｌｙ−による反復を含む（式中ｎは１、２、３、４、５又は７である）。他の実施形態では、ｎは６、８、９、１０又はより大きな整数である。
【００５５】
別の具体的な実施形態ではリンカーは、プロリン及びスレオニン残基、例えば（（ＰＴ）３Ｔ（ＰＴ）３Ｔ（ＰＴ）３Ｓ）リンカーを含む。追加的ペプチドリンカーは、Argos P. "An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion." J Mol Biol 211(4): 943-58, 1990；Crasto, CJ et al. "LINKER: a program to generate linker sequences for fusion proteins." Protein Eng 13(5): 309-12, 2000；George, RA et al. "An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding." Protein Eng 15(11): 871-9, 2002；及びArai R, et al. "Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein." Protein Eng 14(8): 529-32, 2001に提供されており、それぞれは本明細書にその全体が参照により組み込まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２９に対応するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーであり、本明細書で「３Ｌ」とも称される。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２９のアミノ酸配列の誘導体を含むペプチドリンカーであり、誘導体は１又は２以上のアミノ酸残基によって配列番号２９のアミノ酸配列から異なるがリンカーの望まれる機能性を維持している。例えば本発明による使用のための３Ｌ誘導体は、ＶＬ−ＶＬ二量体のＴＮＦ−α分子へ免疫特異的結合を可能にする又は改善するような方法で、ＶＬドメインを連結する能力を一般に維持している。
【００５７】
二量体は、カルボキシ末端ＶＬが最初のステップで、次に他方のＶＬが第二ステップでプラスミド（次に二量体構築物を発現できる細胞を形質転換するために用いられる）にクローン化される２ステップクローニング戦略を用いて構築され得る。二量体形成は、例えば二量体形態がそれらの単量体構築物のおよそ２倍のサイズ及び分子量を有すると予測されるウエスタンブロット分析によって確認され得る。実施例２及び図２Ａ〜Ｃを参照されたい。
【００５８】
単量体形態に関して記載した通り二量体を構成する単一ドメインの一方又は両方は、ＴＮＦ−α分子、好ましくはヒトＴＮＦ−αに高い親和性を示し得る、及び／又は１又は２以上の非ヒト種（好ましくはラット、マウス若しくは霊長類以外の他の小さな哺乳動物を含む）由来のＴＮＦ−αに交差反応性を示し得る。いくつかの好ましい実施形態では、二量体を構成する一方又は両方の単一ドメインは、少なくとも１種のげっ歯類種及び少なくとも１種の非げっ歯類種由来のＴＮＦ−αに交差反応性を示し得る。げっ歯類種は、例えばラット、マウス、リス、スナネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、シマリス、モルモット及びハタネズミを含む。上に記載の通り交差反応性は、非霊長類動物でのインビボアッセイを可能にし、非霊長類の小さな哺乳動物の使用は安価な前臨床研究を促進する。実施例２及び図２Ｄを参照されたい。
【００５９】
特に好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２に対応するアミノ酸配列又は両方をヘテロ二量体として含む軽鎖可変ドメインを含む又はそれからなる。本明細書において配列番号１は、「ＶＬ１８」と称される場合があり；一方配列番号２は「ＶＬ１１」と称される場合がある。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含むＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号１及び／又は２のアミノ酸配列の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号１及び／又は２のアミノ酸配列に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６２】
特定の実施形態では本発明は、アミノ酸配列配列番号１及び／又は２と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作られ得る。欠失誘導体は、機能（例えばＴＮＦ−結合）に不可欠ではない天然ポリペプチドの１又は２以上の残基を欠失している。挿入ミュータントは、典型的にはポリペプチド中の非末端位に材料の付加を含む。置換誘導体は、典型的には、タンパク質中の１又は２以上の部位に、あるアミノ酸から別への交換を含有し、タンパク質分解性切断に対する安定性などのポリペプチドの１又は２以上の特性を他の機能又は特性を失うことなく調節するように設計され得る。この種の置換は、好ましくは保存的であり、すなわち、あるアミノ酸は形状及び電荷が類似するものに置き換えられる。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば：アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミン又はヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミンへ；イソロイシンからロイシン又はバリンへ；ロイシンからバリン又はイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシン又はイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン又はメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシン又はロイシンへの変更を含む。
【００６３】
好ましくはタンパク質のアミノ酸の変異は、等価又はさらに改善された第二世代分子を作る。例えばある種のアミノ酸は、機能（例えば、ＴＮＦ−α結合）の検出可能な損失を伴わずにタンパク質構造中で他のアミノ酸に置換され得る。そのような変更の作製ではアミノ酸の疎水性親水性指標が考慮される場合がある。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている。得られるタンパク質の二次構造にアミノ酸の相対的な疎水性親水性特徴が寄与し、それが次にタンパク質と他の分子との相互作用（例えばＴＮＦ−α分子との相互作用）を定めることは認められている。各アミノ酸には、それらの疎水性及び電荷特徴に基づいて疎水性親水性指標が与えられている；例えば：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。似ているアミノ酸の置換は、親水性に基づいても有効に作製され得ることも当技術分野において理解されている。疎水性と同様に親水性値が各アミノ酸に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。一般に等価分子は、それらの親水性指標が相互に±２、好ましくは±１、又は最も好ましくは±０．５以内である一アミノ酸から別への置換によって得られる。
【００６４】
本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチド、例えば単一ドメインの単量体又は二量体を含むポリペプチドは、ＴＮＦ−α分子のＴＮＦ−α受容体への結合に拮抗するようにヒトＴＮＦ−αに結合する。好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、下により詳細に考察される通り、１又は２以上のＴＮＦ−α関連状態において治療効果を生じ得る。
【００６５】
抗ＴＮＦ−αポリペプチドの結合及び／又は交差反応性を分析することにおいて用いられ得る当技術分野において公知の結合アッセイは、結合対相互作用を特徴付けるための当技術分野において公知のいかなる免疫学又は生化学に基づく方法も用いるなどの、結合パートナーへの特異的結合を検出するためのいかなる技術も含む。特異的結合は、これだけに限らないがＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、親和性クロマトグラフィー及び平衡透析を含む、いかなる当技術分野において公知の免疫学又は生化学に基づく方法を例えば用いても決定され得る。
【００６６】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの免疫特異的結合及び交差反応性を分析するために用いられ得る免疫アッセイは、これだけに限らないが数例を挙げると、ウエスタンブロット、放射線免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ、enzyme linked immunosorbent assay）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びタンパク質Ａ免疫アッセイなどの技術を用いる競合的及び非競合的アッセイ系を含む。そのようなアッセイは当技術分野において日常的かつ周知である（本明細書にその全体が参照により組み込まれる、例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい）。
【００６７】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、免疫特異的タンパク質と所望の抗原及び／又はエピトープ（ＴＮＦ−α分子）との相互作用の動力学的パラメーターを特徴付けるための当技術分野において公知の表面プラズモン共鳴に基づくアッセイを用いてもアッセイされ得る。これだけに限らないが、BIAcore Instruments、Biacore AB社（Uppsala, Sweden）から入手可能；IAsys instruments、Affinity Sensors社（Franklin, Mass.）から入手可能；IBIS system、Windsor Scientific Limited社（Berks, UK）から入手可能；SPR-CELLIA systems、Nippon Laser and Electronics Lab社（Hokkaido, Japan）から入手可能；及びSPR Detector Spreeta、Texas Instruments社（Dallas, Tex.）から入手可能を含む商業的に入手可能ないかなるＳＰＲ装置も用いられ得る。ＳＰＲに基づく技術の総説については、本明細書にその全体が参照により組み込まれるMullet et al., 2000, Methods 22: 77-91；Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23；Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101；Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照されたい。追加的に、米国特許第６，３７３，５７７号明細書；第６，２８９，２８６号明細書；第５，３２２，７９８号明細書；第５，３４１，２１５号明細書；及び第６，２６８，１２５号明細書に記載されているタンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのいかなるＳＰＲ装置及びＳＰＲに基づく方法も本発明の方法において考慮され、それら全ては本明細書にその全体が参照により組み込まれる。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ＶＬ二量体のヘテロ二量体を含み、前記二量体はヒトＴＮＦ−α又はその抗原結合断片に対する高い結合親和性を有する。具体的な実施形態では、例えば抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ヒト（又は他の）ＴＮＦ−αのその同族受容体の１又は２以上への結合に少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又はそれ以上で拮抗できる。
【００６９】
いくつかの実施形態では抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片のヒト（又は他の）ＴＮＦ−αへの親和性は、少なくとも０．５×１０９Ｍ−１である。他の場合では、親和性は、少なくとも１×１０４Ｍ−１、少なくとも１×１０５Ｍ−１、少なくとも１×１０６Ｍ−１、少なくとも１×１０７Ｍ−１、少なくとも１×１０８Ｍ−１、少なくとも１×１０９Ｍ−１、少なくとも２×１０９Ｍ−１、少なくとも３×１０９Ｍ−１、少なくとも４×１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも６×１０９Ｍ−１、少なくとも７×１０９Ｍ−１、少なくとも８×１０９Ｍ−１又は少なくとも９×１０９Ｍ−１である。親和性結合は、上に記載の通り当技術分野において公知のいかなる技術によっても測定され得る。
【００７０】
具体的な実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、少なくとも１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも３×１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも８×１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも３×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも７×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも８×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はｋｏｎ速度を有する。具体的な実施形態では本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、少なくとも１０−６ｓ−１、少なくとも５×１０−６ｓ−１、少なくとも１０−５ｓ−１、少なくとも５×１０−５ｓ−１、少なくとも１０−４ｓ−１、少なくとも５×１０−４ｓ−１又は少なくとも１０−３ｓ−１の解離速度定数又はｋｏｆｆ速度を有する。具体的な実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１．５ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも２．５ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも３．５ｎＭ、少なくとも４ｎＭ、少なくとも４．５ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも５．５ｎＭ、少なくとも６ｎＭ、少なくとも６．５、ｎＭ、少なくとも７ｎＭ、少なくとも８ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも４５ｎＭ又は少なくとも５０ｎＭのＫｄを有する。
【００７１】
詳細な実施形態では、本発明のＶＬ−ＶＬ二量体の一方又は両方のＶＬドメインは、配列番号１（ＶＬ１８）及び配列番号２（ＶＬ１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列又は一方若しくは両方の配列についてのそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む。例えば本発明のポリペプチドは、ＶＬ１８−ＶＬ１８；ＶＬ１８−ＶＬ１１；ＶＬ１１−ＶＬ１１；ＶＬ１１−ＶＬ１８又は個々のＶＬ二量体の一方若しくは両方についてのその抗原結合断片若しくは誘導体からなる群から選択される二量体を含み得る（例えば上に詳述の通り）。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーなどのリンカーは、本発明の二量体を含む個々のドメイン間に生じる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号１及び２の一方又は両方を含む二量体である。いくつかの実施形態では二量体の一方又は両方のＶＬドメインは、配列番号１又は２に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号１及び２の一方又は両方を含み、その少なくとも一方が修飾されている二量体抗ＴＮＦ−αポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１及び／又は２と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に詳述の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作製され得る。
【００７４】
詳細な実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３２に対応するアミノ酸配列（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）又はそのＴＮＦ−α結合断片を含むＶＬ−ＶＬ二量体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３２のアミノ酸配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に詳述の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作られ得る。
【００７６】
さらなる特定の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは配列番号３〜１８及びそのＴＮＦ−α結合断片又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片を（前記配列の少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に記載の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作られ得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、本発明のポリペプチドの可変ドメインの１又は２以上のフレームワーク領域中に生じる。フレームワーク領域中の変異は、ポリペプチドのその標的（ＴＮＦ−α分子）への結合に影響を与える（又は実質的に影響を与える）ことなくある種の治療パラメーターを改善できる。例えば好ましい実施形態では、フレームワーク領域中の修飾は、ポリペプチドの安定性及び／又は半減期を増強する。いくつかの好ましい実施形態では、フレームワーク領域中の修飾は、ポリペプチドのその標的への結合親和性を改善する又は他の結合パラメーターを改善する。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域変異は、下により詳細に記載する通り、例えばその中に生じるＴＨエピトープの破壊によって免疫原性の低下を生じる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、本発明のポリペプチドの可変ドメインの１又は２以上のＣＤＲ中に生じる。ＣＤＲ中の変異は、ある種の治療パラメーターを改善できる、例えば、ポリペプチドのヒトＴＮＦ−α分子への結合を改善及び／又は別の非ヒトＴＮＦ−α分子、好ましくはマウス又はラットなどの非霊長類哺乳動物のＴＮＦ−α、より好ましくは少なくとも１種のげっ歯類及び少なくとも１種の非げっ歯類種の両方のＴＮＦ−αへの交差反応性の改善。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ変異は、下により詳細に記載する通り、例えばその中に生じるＴＨエピトープの破壊によって免疫原性の低下をもたらす。
【００８２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、例えば安定性及び／若しくは半減期の増強、結合及び／若しくは交差反応性の改善、発現の増強、溶解性の増大、並びに／又は免疫原性の低減などの１又は２以上の治療パラメーターの改善を有する誘導体を提供するために、１又は２以上のフレームワーク領域及び１又は２以上のＣＤＲ両方に生じる。本発明のポリペプチドの治療可能性を改善するための追加的手法は、下により詳細に考察される通り、アルブミン結合ドメインとの融合物の作製を含む。
【００８３】
３．アルブミン結合ドメインを有する抗ＴＮＦ−αポリペプチド融合物
いくつかの実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、アルブミン−結合ドメインに連結されている。アルブミン結合ドメインは、生理的条件下でアルブミンに結合できるいかなるポリペプチドも含む。本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドをアルブミン結合ドメインにカップリングすることは、血清アルブミンへのインビボ会合を可能にでき、次にポリペプチドの半減期を延長及び溶解性を改善及び／又は安定性を改善できる。したがってアルブミン結合ドメインは、（好ましくは生物学的利用率及び／又は生理活性を維持する一方で）安定性及び／又は血清半減期を改善するために、治療分子とのコンジュゲート及び／又は融合物を作製するために用いられ得る。理論に束縛されることなく好ましい戦略は、血清半減期を改善するためのアルブミンとの高親和性非共有結合相互作用を含む。
【００８４】
アルブミン結合ドメインの例は、例えばＥＰ  ０４８６５２５；米国特許第６，２６７，９６４号明細書；Makrides, S. et al. (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther. 277, 534-542；及びSjolander, A et al. (1997) J. Immunol. Methods 201, 115-123に記載の連鎖球菌タンパク質Ｇ（ＳｐＧ、streptococcal protein G）由来のアルブミン結合ペプチド又はタンパク質を含む。追加的アルブミン結合タンパク質配列は、例えばＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ９１／１９７４１号明細書、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ０５／０９７２０２号明細書、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ０１／４５７４６号明細書；米国特許出願公開第２００４／０００１８２７号明細書；及びKonig T, et al. J Immunol Methods. 218 (1-2): 73-83, 1998に提供されている。
【００８５】
別のアルブミン結合タンパク質は、タンパク質ＭＡＧ（ウシ乳腺炎の症例において見出されたストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）株から単離されたタンパク質）を含む（例えば、Jonsson, H. et al. (1994) Gene 143: 85-89；及びJonsson, H. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 220: 819-826を参照されたい）。タンパク質ＭＡＧは、血清アルブミンにポリペプチドの中央部の５０アミノ酸ストレッチ（タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインに部分的に相同である）を介して結合する。別のアルブミン結合タンパク質は、ＤＧ１２タンパク質（ウシＧ群連鎖球菌（bovine group G streptococcus）から単離されたタンパク質）を含む（例えば、Sjobring, U. (1993) Infect. Immun. 60: 3601-3608を参照されたい）。さらに別のアルブミン結合タンパク質は、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus magnus）から単離されたタンパク質ＰＡＢを含む（例えば、de Chateau, M. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 12147-12151を参照されたい）。このタンパク質は、ある種の連鎖球菌アルブミン結合ドメインに相同性を有する短いアルブミン結合ドメインを含有する。さらに別の関連するアルブミン結合ドメインは、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）のいくつかの株から単離されたタンパク質ＥＡＧを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、タンパク質Ｈ（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のいくつかの株の表面に発現される分子）から単離される及び／又はそれに由来するものを含む（例えば、Nilson, et al. (1995) Biochem. 34:13688-98を参照されたい）。細菌化膿性連鎖球菌は、急性咽頭炎及び皮膚感染症などのヒトにおける多数の化膿性感染症の原因である。タンパク質Ｈが免疫グロブリンＧの定常領域（ＩｇＧＦｃ）及び血漿アルブミンに対する親和性を有することは公知である（Frick IM, et al. (1994) Mol Microbiol. 12:143-51）。タンパク質Ｈのアルブミン結合ドメインはヒト、ラット及び／又はマウス血清アルブミンに結合できる。いくつかの実施形態では、タンパク質Ｈのアルブミン結合ドメインにラット、マウス及びヒトアルブミンへの交差反応性がある。タンパク質Ｈのアルブミン結合ドメインは、タンパク質ＨのＣ末端半分中の「Ｃ１Ｃ２Ｃ３」又は「Ｃ１−Ｃ３」と称される３個の反復領域に対応する。このアルブミン結合ドメインは、例えば結合領域を位置付けるためのアルブミンのタンパク質Ｈへの結合を分析するステップによって決定され得る。アルブミン結合ドメイン領域は、Ｃ末端細胞壁付着領域におおよそ対応する。興味深いことには、アルブミンに対するタンパク質Ｈ結合領域の親和性定数は、ＩｇＧについてのものよりも高く、つまりアルブミンとタンパク質Ｈドメイン（Ｃ１Ｃ２Ｃ３）との間の反応についての親和性定数は、７．８×１０９Ｍ−１であり、ＩｇＧとタンパク質Ｈドメイン（Ｃ１Ｃ２Ｃ３）との間の親和性（Ｋａ＝１．６×１０９Ｍ−１）よりも高い。
【００８７】
いくつかの実施形態ではアルブミン結合ドメインは、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）のいくつかの株で発現されるタンパク質Ｇ関連細胞表面タンパク質から単離された及び／又はそれに由来するものを含む（例えば、Jonsson, et al. (1995) Infection and Immunity. 63(8): 2968-2975を参照されたい）。細菌ストレプトコッカス・ズーエピデミカスは、種々のウマ疾患における一般的な病因学的病原体である。Ｓ．ズーエピデミカスは、細胞表面構成成分を通じて、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、immunoglobulin G）、血清アルブミン、フィブロネクチン、コラーゲン及びα２−マクログロブリン（α２Ｍ、α2-macroglobulin）を含む多数の宿主タンパク質に特異的に結合する（例えば、Wideback, K. et al. (1983) Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B 91: 373-382を参照されたい）。１つの具体的なアルブミン結合タンパク質は、Ｓ．ズーエピデミカスＺ５から単離される。Nygren, P., et al. (1990) Eur. J. Biochem. 1993: 143-148）
【００８８】
詳細な実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０に対応するアミノ酸配列（本明細書において「ＰＥＰ」とも称される場合がある）を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態では、配列番号３０のアルブミン結合断片が用いられる。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むタンパク質ＰＥＰのアルブミン結合断片を含む又はそれからなる。他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むＰＥＰのアルブミン結合断片を含む。他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むＰＥＰのアルブミン結合断片を含む。他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むＰＥＰのアルブミン結合断片を含む。他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含むＰＥＰのアルブミン結合断片を含む。他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含むＰＥＰのアルブミン結合断片を含む。他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号３０の少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含むＰＥＰのアルブミン結合断片を含む。
【００８９】
さらに他の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、一緒になってアルブミンに結合し、配列番号３０の少なくとも１０個の連続するアミノ酸をそれぞれ独立に含むＰＥＰの少なくとも２つの断片を含む又はそれからなる。さらに他の実施形態ではアルブミン結合ドメインは、一緒になってアルブミンに結合し、配列番号３０の少なくとも１５個の連続するアミノ酸をそれぞれ独立に含むＰＥＰの少なくとも２つの断片を含む。さらに他の実施形態ではアルブミン結合ドメインは、一緒になってアルブミンに結合し、配列番号３０の少なくとも２０個の連続するアミノ酸をそれぞれ独立に含むＰＥＰの少なくとも２つの断片を含む。さらにさらなる実施形態ではアルブミン結合ドメインは、一緒になって配列番号３０の少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個又は少なくとも５０個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる。
【００９０】
いくつかの実施形態ではアルブミン結合ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む又はそれからなる。いくつかの場合ではアルブミン結合ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９１】
特定の実施形態ではアルブミン結合ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む。アルブミン結合ドメインのアミノ酸配列誘導体は、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの誘導体に関して上に詳述の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作られ得る。得られた誘導体は、溶解性の改善、安定性並びに／又はアルブミン結合の改善、ヒトＴＮＦ−αへの結合の改善並びに／又は１又は２以上の非霊長類哺乳動物ＴＮＦ−α分子への若しくは少なくとも１種のげっ歯類及び少なくとも１種の非げっ歯類種への交差反応性の改善；免疫原性の低減；或いは本明細書に記載の及び／又は当技術分野において公知の他の有利な特性を示し得る。
【００９２】
いくつかの場合では、アルブミン結合ドメインペプチド又はその抗ＴＮＦ−αポリペプチドとのコンジュゲート若しくは融合物のアルブミンへの親和性は、少なくとも０．５×１０９Ｍ−１である。他の場合では親和性は、少なくとも１×１０４Ｍ−１、少なくとも１×１０５Ｍ−１、少なくとも１×１０６Ｍ−１、少なくとも１×１０７Ｍ−１、少なくとも１×１０８Ｍ−１、少なくとも１×１０９Ｍ−１、少なくとも２×１０９Ｍ−１、少なくとも３×１０９Ｍ−１、少なくとも４×１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも６×１０９Ｍ−１、少なくとも７×１０９Ｍ−１、少なくとも８×１０９Ｍ−１又は少なくとも９×１０９Ｍ−１である。アルブミン結合は、当技術分野において公知のいかなる技術によっても測定され得る。ある種の場合ではアルブミン結合は、例えばEpps, et al. (1999) J. Pharm. Pharmacol. 51:4l-48；Nguyen, et al. (2006) Prot. Engin. Design Select. 19:291-297；Weisiger, et al. (2001) J Biol. Chem., 276:29953-29960に記載のものなどのインビトロアッセイによって測定される。
【００９３】
アルブミン結合ドメインは、１又は２以上の本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド（詳細には単量体形態中の単一ドメイン（例えばＶＬ若しくはＶＨ）又はその二量体（例えば、ＶＬ−ＶＬ）を含む）に連結され得る。好ましい実施形態では、連結は、下により詳細に記載する通り、ＴＮＦ−α分子への元の結合親和性を維持（又は実質的に維持）する一方で血清アルブミンに結合する産生物を生じる融合である。したがっていくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、融合によってアルブミン結合ドメインに連結されている。連結は、当技術分野において公知のいかなる手段によって生じてよく、リンカーを含んでも含まなくてもよい。リンカーは、二量体構築物に関して上に記載のいかなるリンカーも含み得る（例えば、（ＧＧＧＧＳ）反復を含むペプチドリンカー）。典型的には融合は、当技術分野において公知の組換え技術を用いて作製され、下により詳細に記載される。実施例３も参照されたい。
【００９４】
本発明によるアルブミン結合ドメインとの抗ＴＮＦ−αポリペプチド融合物は、抗原結合特異性、すなわちＴＮＦ−α分子への結合特異性を保持している。融合物はＴＮＦ−α分子への結合特異性の保持について検査でき、結合は例えば上に詳述の通り当技術分野において公知のいかなる手段によっても決定できる。実施例４も参照されたい。
【００９５】
好ましい実施形態では、本発明によるアルブミン結合ドメインに連結している抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、インビボ薬物動態の改善を示す。特定の実施形態では、ＰＥＰ、又はその誘導体若しくはアルブミン結合断片への連結は、宿主における抗ＴＮＦ−αポリペプチドの半減期を増大させる。いくつかの実施形態では、宿主における抗ＴＮＦ−αポリペプチドの半減期は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約５００％、約１０００％又はそれ以上増大される。他の実施形態では、ＰＥＰ、又はその誘導体若しくはアルブミン結合断片への連結は、抗ＴＮＦ−αポリペプチド単体（アルブミン結合ドメインに連結されていない）の半減期と比較して、宿主における抗ＴＮＦ−αポリペプチドの半減期を少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれ以上増大させる。実施例５も参照されたい。
【００９６】
好ましい実施形態では、本発明によるアルブミン結合ドメインに連結している抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、少なくとも約１０時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間又は少なくとも約５５時間の半減期を有する。いくつかの詳細な実施形態では、本発明によるアルブミン結合ドメインに連結している抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、約３５〜約４２時間の半減期を有する、例えば構築物が配列番号３３に対応する場合。比較のためにいくつかの詳細な実施形態では、アルブミン結合ドメインに連結していない抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、約２〜約５時間だけの半減期を有する場合がある、例えば二量体が配列番号３２に対応する場合。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＰＥＰ又はその誘導体若しくはアルブミン結合断片への連結は、抗ＴＮＦ−αポリペプチドの宿主からの除去を少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間又はそれ以上低減する。いくつかの実施形態では、ＰＥＰ、又はその誘導体若しくはアルブミン結合断片に連結している抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、約１２時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間又はそれ以上、例えば約３週間、約４週間又はそれ以上などの血清半減期（ｔ１／２）を有する。
【００９８】
具体的な実施形態では抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、アルブミン結合ドメインに融合され、配列番号３３に対応するアミノ酸配列（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）又はその抗原結合断片を含む薬物を提供する。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰは、下に詳述の通りＴＮＦ−αへの結合特異性を保持する。実施例６及び実施例７ａ及び７ｂ並びに図３及び４を参照されたい。
【００９９】
具体的な好ましい実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、関節リウマチを治療するための市販の製品に匹敵する（例えば、インフリキシマブ（Remicade（商標））及びエタネルセプト（Enbrel）に匹敵する）親和性を有して組換えヒトＴＮＦ−αに結合する。下の表１も参照されたい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、ＶＬ１８及び／又はＶＬ１１のＴＮＦ−α結合断片（配列番号１及び／又は２それぞれの少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む又はそれからなる）を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、配列番号１及び／又は２のアミノ酸配列の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合物は、配列番号１及び／又は２のアミノ酸配列に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号１及び／又は配列番号２のアミノ酸配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物を包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に記載の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作製され得る。
【０１０３】
さらなる具体的な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメインは、軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは配列番号３〜１８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、配列番号３〜１８からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含んで又はそれからなる）を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上の誘導体にも対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合物は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上にも少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３〜１８のいかなる１又は２以上と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物を包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に記載の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作製され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、配列番号３３のアミノ酸配列の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合物は、配列番号３３のアミノ酸配列に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３３のアミノ酸配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物を包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に記載の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作製され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、本発明の融合物の可変ドメインのフレームワーク領域の１若しくは２以上に、融合物の可変ドメインの１若しくは２以上のＣＤＲに又は両方に生じる。フレームワーク領域中の変異は、ポリペプチドのその標的（ＴＮＦ−α分子及び／若しくは血清アルブミン）への結合に影響を与える（若しくは実質的に影響を与える）ことなくある種の治療パラメーターを改善できる、又は結合を改善できる。好ましい実施形態では、フレームワーク領域中の修飾は、さらにポリペプチドの安定性及び／又は半減期をさらに増強する。
【０１１０】
ＣＤＲ中の変異は、ある種の治療パラメーターも改善できる、例えば、血清アルブミンに対する融合物の結合親和性に影響を与えることなく（若しくは実質的に影響を与えることなく）ヒトＴＮＦ−α分子に対するポリペプチドの結合親和性を改善する並びに／又は別の非ヒトＴＮＦ−α分子へ（例えば、非霊長類哺乳動物ＴＮＦ−α分子へ若しくは少なくとも１種のげっ歯類及び少なくとも１種の非げっ歯類種へ）の交差反応性を改善する。いくつかの実施形態では、いかなるフレームワーク、ＣＤＲ又はアルブミン結合ドメイン中の変異も、下により詳細に記載する通り、例えばその中に生じるＴＨエピトープの破壊によって、免疫原性の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、１若しくは２以上のフレームワーク領域、ＣＤＲ又はアルブミン結合ドメインの両方に生じ、血清アルブミンへの結合を維持する一方で例えば、安定性及び／若しくは半減期の増強、結合及び／若しくは交差反応性の改善並びに／又は免疫原性の低減などの１又は２以上の治療パラメーターの改善を有する誘導体を提供する。
【０１１１】
抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物の誘導体は、抗原結合特異性を、例えばＴＮＦ−αに対して保持している。本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、下に詳細に記載の通り、その抗原結合断片及び誘導体と共に治療薬としての使用法を見出す。実施例８及び図５〜９も参照されたい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド半減期を増強するためにアルブミン結合ドメインの使用の代わりに又は付加的に追加的戦略が用いられる。そのような追加的戦略は、下により詳細に記載される。
【０１１３】
４．半減期の増強を有する他の抗ＴＮＦ−αポリペプチド
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその融合物は、誘導体をもたらすように修飾されている。詳細には本発明は、ポリペプチドの血清半減期を増大する又は改善するためにアルブミン結合ドメインへの融合を伴って又は伴わずに当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載のいかなる方法によって修飾されている１又は２以上の抗体単一ドメインを含む、抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はそのアルブミン結合融合物を包含する。
【０１１４】
例えば、非限定的に、誘導体は例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンド若しくは他のタンパク質への連結などによって修飾されている抗ＴＮＦ−αポリペプチドを含む。多数のいかなる化学的修飾もこれだけに限らないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術によって行われ得る。追加的に誘導体は、１又は２以上の非古典的アミノ酸も含有できる。すなわち、本発明の分子の血清半減期を延長するための別の修飾は、非天然アミノ酸、例えばＤ型の使用及び／又はアミノ酸のイオウ含有形態などのアミノ酸の使用を含む。特定の実施形態では、アミノ酸残基の反応性側鎖はキャップされる、例えばグルタミン酸中のカルボキシ側鎖。当技術分野において公知の通りキャッピングは、いかなる好適なキャッピング基を用いても達成され得る。
【０１１５】
本発明による使用のための抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、これだけに限らないが、アミド化又はアセチル化を含むＣ−及び／又はＮ−末端への修飾を含有でき、それは血清半減期も改善できる。アセチル化は、ＣＯＣＨ３基の導入を指し、タンパク質又はその断片のアミノ末端又はリジン側鎖（複数可）のいずれにも生じ得る。重要なことにアセチル化は、タンパク質安定性を制御できる。例えばインビボアセチル化Ｅ２Ｆ１の分析は、アセチル化バージョンがより長い半減期を有することを示す（Martinez-Balbas et al, (2000) EMBO J. 19(4):662-71；Takemura et al. (1992) J Cell Sci. 103 (Pt 4):953-64も参照されたい；それぞれ本明細書にその全体が組み込まれる）。したがって特定の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドのアミノ末端は、アセチル化によって修飾されている。特定の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド中のリジン側鎖は、アセチル化によって修飾されている。さらに他の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、両方のアミノ末端及び１又は２以上のリジン側鎖でアセチル化されている。
【０１１６】
別の詳細な例としてタンパク質の血清半減期は、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、polyethyleneglycol）などのポリマー分子を付着させることによっても増大され得る。ＰＥＧは、多機能性リンカーを伴って若しくは伴わずに、及びＮ若しくはＣ末端いずれかへのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを通じて；又はリジン残基に存在するイプシロンアミノ基を介してポリペプチド又はその断片に付着され得る。生物学的活性の損失が最少である直鎖状又は分岐状ポリマー誘導体化が用いられる場合がある。コンジュゲーションの程度は、本発明のポリペプチドへのＰＥＧ分子の適正なコンジュゲーションを確実にするために例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって綿密にモニターされ得る。未反応ＰＥＧは、ポリペプチド−ＰＥＧコンジュゲートから、例えばサイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって分離され得る。
【０１１７】
血清半減期を増大させるための当技術分野において公知の他の方法は、これだけに限らないがＦｃ及び／若しくはヒンジ領域を含む抗体定常領域を含む抗体ドメインへのコンジュゲーション及び／若しくは融合（例えば、米国特許第５，５６５，３３５号明細書及び第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい）；並びに／又はインターフェロン、チモシン標的化ペプチド及び／若しくは浸透性増大性タンパク質へのコンジュゲーション及び／若しくは融合（例えば、米国特許第６，３１９，６９１号明細書及び第５，６４３，５７０号明細書を参照されたい）を含む。
【０１１８】
本発明は、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの血清半減期を延長する又は増大させるためのリポソームの使用も包含する。特定の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド、例えばＶＬ及び／又はＶＨドメイン（複数可）を含む単量体又は二量体は、既に記載の方法を用いてリポソームにコンジュゲートされ得る、例えば本明細書にその全体が参照により組み込まれる、Martin et al, 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288を参照されたい。このため本発明は、アルブミン結合ドメインを伴って又は伴わずに、血清半減期の延長、すなわち循環時間の延長を有する抗ＴＮＦ−αポリペプチドを含有しているリポソームの調製方法を包含する。例えば、米国特許第５，０１３，５５６号明細書を参照されたい。詳細には立体的に安定化されたリポソームは、例えば、血清タンパク質との反応を低減する、血清構成成分とのオプソニン化を低減する及び／又は単核食細胞系（mononuclear phagocyte system）ＭＰＳによる認識を低減する、かさ高く高度に可動性の親水性成分を有する脂質構成成分がある長所のために半減期を増大させる。立体的に安定化されたリポソームは、通常ポリエチレングリコールを用いて調製される。リポソーム及び立体的に安定化されたリポソームの調製について、例えば、Bendas et al, 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224；Allen et al, 1987 FEBS Lett. 223: 42-6；Klibanov et al, 1990 FEBS Lett., 268: 235-7；Blum et al, 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7；Torchilin .et al, 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116；Litzinger et al, 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190: 99-107；Maruyama et al, 1991, Chem. Pharm. Bull., 39: 1620-2；Klibanov et al, 1991, Biochim Biophys Acta, 1062；142-8；Allen et al, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309を参照されたい；これら全ては本明細書にその全体が参照により組み込まれる。
【０１１９】
本発明は、特定の臓器標的化のために（例えば米国特許第４，５４４，５４５号明細書を参照されたい）又は特定の細胞標的化のために（例えば米国特許出願公開第２００５／００７４４０３号明細書を参照されたい）適用されるリポソームも包含する。本発明の組成物及び方法における使用のために特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ、PEG derivatized phosphatidylethanolamine）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、望まれる径のリポソームを得るために規定の孔径のフィルターを通して押し出される。
【０１２０】
５．免疫原性が低減している抗ＴＮＦ−αポリペプチドバリアント
本発明の別の態様は、免疫原性が低減している抗ＴＮＦ−αポリペプチド（ＴＨエピトープの少なくとも１つが除かれている及び／又は低減している抗ＴＮＦ−αポリペプチド）に関する。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、溶解性及び／又は親和性の改善並びに（又は別々に）免疫原性の低減を提供するために変異導入されている。免疫原性が低減しているポリペプチドは「脱免疫化」ポリペプチドと称される。本発明の脱免疫化抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、意図される宿主における、例えばヒト患者における免疫原性の低減を生じる。アルブミン結合ドメインへの融合を伴う又は伴わない抗ＴＮＦ−αポリペプチドは修飾が免疫原性を低減する場合に、修飾されている場合がある。いくつかの実施形態では、融合物のアルブミン結合ドメインは、別々に脱免疫化され得る。詳細には本発明は、１又は２以上のアルブミン結合ドメインに融合している１又は２以上の抗体単一ドメインを含み、その一方又は両方が当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載のいかなる方法によってポリペプチド構築物の免疫原性を低減するために修飾されている抗ＴＮＦ−αポリペプチドを包含する。
【０１２１】
脱免疫化は、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載のいかなるプロセスによっても達成され得る。一手法では、ポリペプチドの３Ｄ構造のモデルが築かれる。次いで置換の一覧がＴＨエピトープの数を最少化するために、好ましくはポリペプチドの安定性又は標的（例えばヒトＴＮＦ−α及び／又は血清アルブミン）へのその結合親和性に影響を与えることなく最も重要なエピトープを除くために提案される。示唆された置換の種々の組合せを含む遺伝子を合成及び発現でき、次いで溶解性、親和性及び交差反応性は決定され得る。実施例９及び図１０〜１３も参照されたい。
【０１２２】
したがっていくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド及びそのアルブミン結合ドメインとの融合物は、脱免疫化されて提供される。「脱免疫化」ポリペプチドは、ＴＨエピトープ含有量を低減するために変異導入されており、免疫原性を低減する１又は２以上の置換を含む。一般にポリペプチドは、脱免疫化されている（例えば、１又は２以上のＨＬＡクラスII受容体に結合するエピトープを低減する又は除くために１又は２以上のアミノ酸位置で置換されている）１又は２以上のドメインを含む。置換は、例えば、軽鎖可変ドメイン；及び／又はアルブミン結合ドメイン中などの抗体単一ドメイン中に生じ得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、脱免疫化ポリペプチドは、少なくとも１０個のＴＨエピトープ、少なくとも１５個のＴＨエピトープ、少なくとも２０個のＴＨエピトープ、少なくとも２５個のＴＨエピトープ、少なくとも３０個のＴＨエピトープ、少なくとも４０個のＴＨエピトープ又は少なくとも５０個のＴＨエピトープを除く置換を含む。好ましい実施形態では、置換は、脱免疫化前の構築物と比較して、血清アルブミンへの及び／又はＴＮＦ−α分子へのポリペプチド構築物の結合に影響を与えない又は少なくとも実質的に影響を与えない。
【０１２４】
詳細な実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、本明細書に記載のいかなる抗体単一ドメイン、二量体、誘導体及び／又はアルブミン結合ドメインの１又は２以上を含み、抗体単一ドメイン、二量体、誘導体及び／又はアルブミン結合ドメインは脱免疫化されている。いくつかの好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、アルブミン結合ドメインに融合しているＶＬ−ＶＬヘテロ二量体を含み、一方若しくは両方のＶＬドメイン及び／又はアルブミン結合ドメインは脱免疫化されている。いくつかのさらに好ましい実施形態では、ＶＬ−ＶＬヘテロ二量体は、ＶＬ１８又はＶＬ１１の一方又は両方を含み、その一方又は両方は脱免疫化されている。詳細な実施形態では、ヘテロ二量体は、ＰＥＰに融合され、それは脱免疫化されていてもされていなくてもよい。いくつかのさらに好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ＶＬ１８、ＶＬ１１及びＰＥＰの１又は２以上を含み、その１又は２以上は脱免疫化されている。
【０１２５】
詳細な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは配列番号１（ＶＬ１８）に対応するアミノ酸配列又はその抗原結合断片若しくは誘導体を含み、それは例えば、Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ及びＬ１１１Ｋからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換によって脱免疫化されている。番号付けは配列番号１のアミノ酸位置を参照する。同様に、括弧内の値は生殖系列選別されたペプチド、例えば（Ｃ８０Ｓ）を参照し；二重ミュータントはハイフンによって連結され、例えばＡ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ；及び同位置を含んで代替的に提案された置換は括弧内に斜線によって分けて表される、例えば（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）。
【０１２６】
詳細な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは配列番号２（ＶＬ１１）に対応するアミノ酸配列又はその抗原結合断片若しくは誘導体を含み、それは例えばＴ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、Ｒ３１Ｓ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ、Ａ１００Ｓ及びＥ１０６Ｋからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換によって脱免疫化されている（番号付けは配列番号２のアミノ酸位置を序数系に従って参照する）。
【０１２７】
さらに具体的な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは配列番号１９〜２３（脱免疫化ＶＬ１８バリアント５個）、配列番号２４〜２８（脱免疫化ＶＬ１１バリアント５個）、及びそのＴＮＦ−α結合断片又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。配列番号１９〜２３に対応する脱免疫ＶＬ１８バリアント５個も本明細書においてそれぞれＶＬ１８＃１、ＶＬ１８＃２、ＶＬ１８＃３、ＶＬ１８＃４及びＶＬ１８＃５と称される場合がある。配列番号２４〜２８に対応する脱免疫化ＶＬ１１バリアント５個も本明細書においてそれぞれＶＬ１１＃１、ＶＬ１１＃２、ＶＬ１１＃３、ＶＬ１１＃４及びＶＬ１１＃５と称される場合がある。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、配列番号１９〜２８からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含む）を含む。他の実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上のＴＮＦ−α結合断片（前記配列の少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む）を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上の誘導体に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合物は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号１９〜２８のいかなる１又は２以上と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドアルブミン結合ドメイン融合物を包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列誘導体は、上に記載の通り、それらが置換誘導体、挿入誘導体又は欠失誘導体であるように作製され得る。
【０１３１】
詳細な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、アルブミン結合ドメインを含み、前記アルブミン結合ドメインは配列番号３０（ＰＥＰ）に対応するアミノ酸配列又はそのアルブミン結合断片若しくは誘導体を含み、それは例えば、Ｅ１２Ｄ、Ｔ２９Ｈ−Ｋ３５Ｄ及びＡ４５Ｄからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換によって脱免疫化されている（番号付けは配列番号３０のアミノ酸残基を序数系に従って参照する）。より詳細な好ましい実施形態では、ＰＥＰは、配列番号３１に対応するアミノ酸配列を含んで脱免疫化されている。配列番号３１は、特定の脱免疫化されたＰＥＰバリアントを指し、本明細書において「ＰＥＰ  ＤＩ」とも称される。
【０１３２】
さらなる詳細な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、二量体を含み、前記二量体は配列番号３２（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）若しくは配列番号３３（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）に対応するアミノ酸配列又はその抗原結合断片若しくは誘導体を含み、それは脱免疫化されている。例えば具体的な実施形態では、発明のポリペプチドは、配列番号３４〜４４（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰバリアント１１個）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列又はそのＴＮＦ−α結合断片若しくは誘導体を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の薬物は、配列番号３４〜４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる。これらの配列は、脱免疫化されているＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰバリアント１１個に対応する。配列番号３４は、本明細書に記載の通りＰＥＰが脱免疫化されているＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ構築物を指し、本明細書において「ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ  ＤＩ」とも称される。配列番号３５〜３９は、脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１構築物を指し、本明細書においてそれぞれＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃１、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃２、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃３、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃４及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃５とも称される。配列番号４０〜４４は、脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ構築物を指し、本明細書においてそれぞれＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃１−ＰＥＰ  ＤＩ、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃２−ＰＥＰ  ＤＩ、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃３−ＰＥＰ  ＤＩ、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃４−ＰＥＰ  ＤＩ及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃５−ＰＥＰ  ＤＩとも称される。
【０１３４】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、その融合物及び／又は脱免疫化バリアントを含んで、下に詳述される通り、当技術分野において公知の又は本明細書に記載のいかなる技術によっても作製され得る。
【０１３５】
６．抗ＴＮＦ−αポリペプチド、そのバリアント及び融合物の作製方法
本発明の別の態様は本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド、その抗原結合断片又は誘導体を作製すること並びに脱免疫化されている及び／又はアルブミン結合ドメインに連結されている抗ＴＮＦ−αポリペプチドを作製することを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術又は他のタンパク質合成技術、例えばペプチド合成機の使用によって産生される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はそのアルブミン結合ドメイン融合物（若しくはコンジュゲート）は、例えば本発明の特定の態様によるＶＬ−ＶＬ二量体などの二量体、三量体、四量体などを形成するために連結されている１個より多い抗体単一ドメインを含む。二量体ポリペプチド及びさらに高次のポリペプチド構築物を産生するための方法は当技術分野において公知である。例えば、第一の抗体単一ドメインをコードする核酸は、第二の抗体単一ドメインを含有している発現ベクターに２個のドメインがインフレームで連結されるように介在性リンカーを伴って又は伴わずにクローン化され得る。例えば本明細書にその全体が参照により組み込まれるMorrison, 1985, Science 229: 1202；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214；Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；並びに米国特許第６，３１１，４１５号明細書；第５，８０７，７１５号明細書；第４，８１６，５６７号明細書；及び第４，８１６，３９７号明細書を参照されたい。第一及び第二の抗体単一ドメインは、上に記載の通り同じ又は異なってよく、例えばＶＬ−ＶＬ、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨホモ−若しくはヘテロ−二量体構築物を産生する。好ましい実施形態では、各単一ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、本明細書に記載の通り、小さな非霊長類哺乳動物のものなどの非ヒトＴＮＦ−αとの又は、少なくとも１種のげっ歯類及び少なくとも１種の非げっ歯類種の両方との交差反応性可能性を有してヒトＴＮＦ−αなどのＴＮＦ−α分子に方向付けられている。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、アルブミン結合ドメインに融合されている。融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術又はタンパク質合成技術によって、例えばペプチド合成機の使用又はＰＣＲ増幅によっても産生され得る。組換え融合に加えて、アルブミン結合ドメインへの連結は、例えば、共有結合及び非共有結合コンジュゲーションの両方を含む化学的コンジュゲーションも含み得る。
【０１３８】
連結は、直接である必要はなく、リンカー配列を通じて又は化学的コンジュゲーションを通じて生じる場合もある。アルブミン結合ドメインと所望の抗ＴＮＦ−αポリペプチドとの間のタンパク質リンカーは、可動性及び適正なフォールディングを維持するために、好ましくは連結された産生物がアルブミンへの及びＴＮＦ−α分子への結合を示すように選択され得る。リンカーは、例えばＴＮＦ−α及び血清アルブミンの両方への良好な同時結合を可能にするように選択され得る。そのような結合は当業者に公知の技術によってアッセイされ得る。
【０１３９】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの発現のためのベクターなどのベクターも包含する。本発明によるポリペプチドのコード配列を適切な転写及び翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターは、当業者に周知の方法を用いて構築され得る。これらの方法は、例えばインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝的組換えを含む（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術も参照されたい）。下の実施例１０及び表２〜４も参照されたい。
【０１４０】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドのヌクレオチド配列（例えばアルブミン結合ドメインを有する融合タンパク質）を含む発現ベクターは、従来技術（例えば、電気穿孔、リポソームトランスフェクション及びリン酸カルシウム沈殿）によって宿主細胞にトランスファーでき、次いでトランスフェクトされた細胞は、本発明のポリペプチドを産生するように従来技術によって培養され得る。
【０１４１】
具体的な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその融合物の発現は、構成的プロモーターによって制御される。別の実施形態では、発現は、誘導性プロモーターによって制御される。これらの実施形態によりプロモーターは、組織特異的プロモーターであってよい。
【０１４２】
具体的な実施形態では、タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター、１又は２以上の複製開始点を含み、１又は２以上の選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含んでいてもよいベクターが用いられる。種々の宿主−発現ベクター系が本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド及び／又はアルブミン結合ドメインとのその融合物を発現するために利用され得る。組換え抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその融合物を発現するために用いられる宿主細胞は、例えば大腸菌（Escherichia coli）などの細菌細胞又は真核細胞のいずれであってもよい。好適な細菌細胞の例は、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌大腸菌又は枯草菌（B. subtilis）を含む。
【０１４３】
詳細な実施形態では、大腸菌Tuner（商標）（ＤＥ３）細胞が本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの大規模発現のために用いられる。「Tuner（商標）株」は、細胞培養におけるタンパク質発現レベルの管理された調節を促進する大腸菌ＢＬ２１のｌａｃＺＹ欠失ミュータントである。発現レベルは、集団中の細胞へのＩＰＴＧの均一な流入を可能にし、ＩＰＴＧ濃度の変化に応じて濃度依存性の均質な誘導をもたらすｌａｃパーミアーゼ（ｌａｃＹ）変異によって管理される。「ＤＥ３」は、宿主がλＤＥ３の溶原菌であり、ｌａｃＵＶ５プロモーターの調節下にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを保有していることを示す。下の実施例１１及び表５〜６も参照されたい。
【０１４４】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその融合物の発現レベルは、例えばベクター増幅によって増大され得る（総説については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい）。本明細書に記載のポリペプチドを発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、培養物培地の変更はマーカー遺伝子のコピー数を増大できる。増幅された領域が本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と関連する場合があることから、ポリペプチドの産生も増大できる（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０１４５】
組換えタンパク質の長期間の高収量産生のためには、安定発現が好ましい。例えば、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドを安定に発現する細胞株は、操作され得る。ウイルス性複製開始点を含有する発現ベクターを用いるよりも宿主細胞は、適切な発現制御因子（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって調節されるＤＮＡ及び選択可能マーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は富栄養培地（enriched media）で１〜２日間増殖させる場合があり、次いで選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択への耐性を付与し、細胞にその染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、増殖巣を形成するよう増殖させ、次いでクローン化させ及び細胞株に増殖させ得る。この方法は、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドを長期間、高収量産生で発現する細胞株を操作するために有利に用いられ得る。そのように操作された細胞株は、抗ＴＮＦ−αポリペプチド及び／又はその融合物と直接的又は間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用でもあり得る。
【０１４６】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドが組換え発現されると、薬物の精製のための当技術分野において公知のいかなる方法によっても、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａ後での特定の抗原に対する親和性によって、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（differential solubility）によって又はタンパク質の精製のためのいかなる他の標準的技術によってもそれは精製され得る。本発明のポリペプチドは、精製を促進するためにペプチドなどのマーカー配列に融合され得る。いくつかの実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc.社、9259 Eton Avenue、Chatsworth、Calif、91311）に付けられたタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは商業的に入手可能である。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821 824, 1989（本明細書にその全体が参照により組み込まれる）に記載の通り、例えばヘキサヒスチジンタグは、抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその融合物の好都合な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、これだけに限らないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Wilson et al., Cell, 37:767 1984、本明細書にその全体が参照により組み込まれる）及び「フラッグ」タグ（Knappik et al., Biotechniques, 17(4):754 761, 1994）を含み、それぞれ本明細書にその全体が参照により組み込まれる。別の技術は、大腸菌での発現後の内毒素除去のためのニッケル親和性クロマトグラフィーを含む。別の技術は、タンパク質Ｌ及び／又はヒトアルブミン親和性クロマトグラフィーを含む。実施例１２も参照されたい。
【０１４７】
脱免疫化抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、上に詳述の通り、ポリペプチド中の１又は２以上のＴＨエピトープを低減又は除くための技術を用いて生成され得る。アミノ酸レベルでの置換は、下により詳細に記載する通り、同物をコードする対応する核酸の構築に情報を与える。
【０１４８】
７．本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、１又は２以上の抗体単一ドメインを含む抗ＴＮＦ−αポリペプチド及び、アルブミン結合ドメインへのその融合物又はその断片若しくは誘導体などの本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。具体的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜４４の１又は２以上などの本明細書に開示のポリペプチドをコードする核酸を含む又はそれからなる。本発明は、高ストリンジェンシー、中程度又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０１４９】
当技術分野において公知のいかなる方法によってもポリヌクレオチドは、得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は決定され得る。例えば本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源（例えば、ＴＮＦ−α免疫化ウサギ）由来の核酸から生成され得る。具体的なポリペプチドをコードする核酸を含有する供給源が入手できないが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が公知である場合、ポリペプチドをコードする核酸は化学的に合成され、当技術分野において周知の方法を用いて複製可能クローニングベクターにクローン化され得る。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるとヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発及びＰＣＲなど）（例えば、本明細書にその全体が参照により組み込まれるSambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY及びAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照されたい）のための当技術分野において周知の方法を用いて、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成するために、例えばアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を作るために操作され得る。上に記載の通り、そのような変異導入された配列は増強された薬学的特性、例えば血清半減期の改善及び／又は免疫原性の低減を有する本発明のポリペプチドを提供できる。
【０１５１】
融合産生物をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において周知であり、日常的に実施される通り、組換え技術によって得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、「キメラポリヌクレオチド」と称される場合がある。典型的には組換えキメラポリヌクレオチドは、元は別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子又はその部分を連結することによって作製される。典型的には個々の配列は、融合ポリペプチドが二重の機能性（例えば、血清アルブミンへ及びＴＮＦ−αへの結合）を有する融合タンパク質をコードするようにそれぞれ各タンパク質の機能性ドメインに対するコード配列に対応する。例えば、第一コード配列又はその部分はインフレームで第二コード配列又はその部分に連結でき、それは典型的にはライゲーション又はオーバーラップ伸長ＰＣＲを通じて達成される。ライゲーションは、キメラ遺伝子を作製するための従来法と共に用いられ、「カセット変異誘発法」と称される。この方法では、ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位に作用する制限エンドヌクレアーゼによって特異的断片に切断でき、次いで特異的断片はライゲートされ得る。具体的な断片は、親ＤＮＡにライゲートするための適合末端を有する異種性のものに置換され得る。例えば、本明細書にその全体が参照により組み込まれるWells et al., Gene 34:315-23 (1985)を参照されたい。
【０１５２】
代替的に、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法などのＰＣＲを含む種々の手法が用いられ得る。例えば、本明細書にその全体が参照により組み込まれるHo, S.N., et al (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77: 51-59を参照されたい。このＰＣＲ手法のいくつかの変法は公知であり、融合産生物を生成するために用いられている。例えば１つのそのような手法は、制限酵素の非存在でキメラ遺伝子を３ステップで作製する改変オーバーラップ伸長ＰＣＲを含む：（ｉ）従来のＰＣＲステップ、キメラ分子を作製するために融合される隣接断片に５’端で部分的に相補的であるプライマーを用いる；（ii）第二ＰＣＲステップ、第一ステップで生成されたＰＣＲ断片がプライマーの相補的末端を用いて融合される；及び（iii）融合産生物のＰＣＲ増幅を含む第三ステップ。最終ＰＣＲ産生物は、様々に増幅されたＰＣＲ断片で築かれるキメラ遺伝子である。例えば、本明細書にその全体が参照により組み込まれるWurch, T. et al (1998) A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnology Techniques. 12(9):653-657を参照されたい。いかなるライゲーション及び／又はＰＣＲに基づく組換え手法も本発明のキメラポリヌクレオチドを作るために用いられ得る。
【０１５３】
代替的に、融合産生物をコードする核酸は、化学的に合成され得る。例えば本発明の融合ポリペプチドの望まれるアミノ酸配列を用いて、対応するヌクレオチド配列は、例えば当技術分野において公知の方法を用いて考案され、化学的に合成され及び複製可能クローニングベクターにクローン化され得る。
【０１５４】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。本発明は、本発明の１又は２以上のベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。ベクター、発現ベクター及び宿主細胞は、上に考察のいかなるものも含み得る。
【０１５５】
８．使用方法
本発明の別の態様は、ＴＮＦ−α関連状態と関係する症状を遅延、予防、治療又は回復させるために本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチド（又は核酸）を宿主へ投与することを含む治療法に関する。本明細書において用いられる「ＴＮＦ−α関連状態」は、ＴＮＦ−αが役割を演じる（例えば状態がＴＮＦ−αの同族受容体（ＴＮＦ−α受容体）への結合によって介在される及び／若しくは関係する）又はＴＮＦ−αが状態の発症、進行又は症状に他に関係する、いかなる障害、疾患又は感染症も指す。ＴＮＦ−α関連状態は、これだけに限らないが、全身性炎症及び局所的炎症を含む炎症性障害を含む。炎症性障害は、これだけに限らないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群（inflammatory bowl syndrome）、多発性硬化症、脊椎関節症、ぜん息及び黄斑変性症などを含む。
【０１５６】
炎症は、急性又は慢性であってよい。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の初期反応であり、例えば血漿及び白血球（詳細には顆粒球）の血液から損傷組織への移動の増加によって達成される。生化学的事象のカスケードは、炎症性応答を伝播及び成熟させ、血管系、免疫系及び損傷組織中の種々の細胞を巻き込む。慢性及び遷延性炎症は、炎症部位に存在する細胞の種類に進行性の移行をもたらし、炎症性プロセス自体からの組織破壊をもたらす場合がある。慢性炎症は、枯草熱、粥状動脈硬化、関節リウマチ及びがん（例えば、胆嚢がん）さえも含む宿主の関連状態をもたらす場合もある。炎症は、通常身体によって厳密に制御されている一方で、不完全な制御は本明細書で定義のＴＮＦ−α関連状態をもたらす場合がある。特に好ましい実施形態では、本発明は、例えば本開示による抗ＴＮＦ−αポリペプチド（又は同物を包含する核酸）を必要とするヒト対象に投与することによるヒト対象の治療に方向付けられる。
【０１５７】
本発明は、ＴＮＦ−αに対して特異的な少なくとも１個の抗体単一ドメインをアルブミン結合ドメインへの融合を伴って若しくは伴わずに含むポリペプチド又は同物をコードする核酸の有効量を対象に投与することによる；或いは本発明の少なくとも１つのポリペプチド又は核酸を含む医薬組成物を投与することによる、ＴＮＦ−α関連状態に関係する１又は２以上の症状の治療、予防及び回復の方法を提供する。本発明の医薬組成物、ポリヌクレオチド及び核酸は、ＴＮＦ−α関連状態に対する治療薬及び／又は予防薬として機能する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の使用のための抗ＴＮＦ−α剤は配列番号１（ＶＬ１８）；Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ及びＬ１１１Ｋからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む配列番号１（ＶＬ１８）（番号付けは配列番号２のアミノ酸位置を序数系に従って参照する）；配列番号２（ＶＬ１１）；Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、Ｒ３１Ｓ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ、Ａ１００Ｓ及びＥ１０６Ｋからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む配列番号２（ＶＬ１１）（番号付けは配列番号２のアミノ酸残基を序数系に従って参照する）；配列番号３〜１８（ウサギＶＬ１６個）；配列番号１９〜２３（ＶＬ１８バリアント５個）；配列番号２４〜２８（ＶＬ１１バリアント５個）；配列番号３２（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）；配列番号３３（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）；並びに配列番号３４〜４４（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰバリアント１１個）の１又は２以上を含む又はそれからなるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−α剤は、配列番号２９（３Ｌ）；配列番号３０（ＰＥＰ）；Ｅ１２Ｄ、Ｔ２９Ｈ−Ｋ３５Ｄ及びＡ４５Ｄからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む配列番号３０（ＰＥＰ）（番号付けは配列番号３０のアミノ酸残基を序数系に従って参照する）；並びに／又は配列番号３１（脱免疫化ＰＥＰ）の１又は２以上を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−α剤は、１若しくは２以上の前記ポリペプチド、前記ポリペプチドの１若しくは２以上をコードする１若しくは２以上の核酸、上に列挙したアミノ酸配列及び／又は核酸配列の１若しくは２以上を含む医薬組成物又はそれらのいかなる組合せである。
【０１５９】
詳細な実施形態では、ＴＮＦ−αに特異的な本発明による少なくとも１個の抗体単一ドメイン又はその抗原結合断片若しくは誘導体を含む１又は２以上の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ＴＮＦ−α関連状態に対する予防薬及び／又は治療薬として作用できる。理論に束縛されることなく、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ＴＮＦ−αのその受容体（複数可）での作用に拮抗するようにＴＮＦ−αに結合できる。これは、関節リウマチなどＴＮＦ−αが原因物質である状態において過剰なＴＮＦ−αの作用を遮断する効果を有し得る。
【０１６０】
したがって本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ＴＮＦ−α関連状態に関係する１又は２以上の症状を治療、遅延、予防又は回復させるために宿主（詳細にはヒト）に投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、少なくとも１個のアルブミン結合ドメイン（例えば、ＰＥＰ、他のアルブミン結合ドメイン又はそのアルブミン結合断片若しくは誘導体）に、上に記載の通り、融合産生物を形成するように連結される。タンパク質に基づく治療と同様に、本発明の予防薬及び治療薬は、これだけに限らないが、抗ＴＮＦ−αポリペプチド及び／又はその融合物をコードする核酸を含む。薬物は、当技術分野において公知の通り及び／又は本明細書に記載の通り、薬学的に許容される組成物として提供され得る。同様に本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、単独で又は他の予防薬及び／若しくは治療薬との組合せで投与され得る。
【０１６１】
本明細書において用いられる用語「治療薬」は、ＴＮＦ−α関連状態に関係する症状を治療する又は回復させることにおいて用いられ得るいかなる薬物も指す。本明細書において用いられる「治療有効量」は、ＴＮＦ−α関連状態の治療又は管理において、それを罹患している対象に投与された場合に、少なくとも１つの治療的利益を提供する薬物の量（例えば、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの量）を指す。さらに、本発明の薬物に関して治療有効量は、薬物単独で又は他の治療との組合せで状態の治療又は管理において少なくとも１つの治療的利益を提供する量を意味する。
【０１６２】
本明細書において用いられる用語「予防薬」は、ＴＮＦ−α関連状態の進行を予防、遅延又は遅くすることに用いられ得るいかなる薬物も指す。「予防有効量」は、ＴＮＦ−α関連状態の予防又は遅延において、それらの素因を有する対象に投与された場合に、少なくとも１つの予防的利益を提供する予防薬の量（例えば、抗ＴＮＦ−αポリペプチドの量）を指す。予防有効量は、状態の出現を予防若しくは遅延させるために；又は状態の進行を遅くするために十分な薬物の量；状態の発生を遅延させる若しくは最少化するために十分な量；又はその再発若しくは伝播を予防若しくは遅延させるために十分な量の薬物の量も指す場合がある。予防有効量は、ＴＮＦ−α関連状態の症状の増悪を予防又は遅延するために十分な薬物の量を指す場合もある。さらに、本発明の予防薬に関して予防有効量は、予防薬単独で又は他の薬物との組合せで状態の予防又は遅延において少なくとも１つの予防的利益を提供する量を意味する。
【０１６３】
本発明の予防薬は、ＴＮＦ−α関連状態に「素因を有する」対象に投与され得る。ＴＮＦ−α関連状態に「素因を有する」対象は、状態の発生に関係する症状を示すもの又は遺伝子構造、環境曝露若しくはそのような状態についての他の危険要因を有するものであるが、症状が状態として診断されるレベルにまだない場合である。例えば、関節リウマチの家族歴を有する患者は、それに素因を有すると認定される場合がある。
【０１６４】
本明細書で提供される投与量及び投与頻度は、用語、治療有効及び予防有効によって包含される。用量及び頻度は、投与される具体的な治療薬又は予防薬、疾患の重症度及び種類、投与の経路並びに患者の年齢、体重、応答及び過去の病歴に依存して各患者に特異的な要因に応じて典型的には変化し、医師の診断及び各患者の状況によって決められるべきである。好適な治療計画は、そのような要因及び以下の、例えば文献に報告された及びthe Physician 's Desk Reference（56th ed., 2002）において推奨される用量を考慮することによって当業者によって選択され得る。予防薬及び／又は治療薬は、繰り返し投与され得る。手順のいくつかの態様は、予防薬又は治療薬を投与する一時的治療計画、及びそのような薬物が別々に又は混合物として投与されるかどうかなどのように変化する。
【０１６５】
有効である本発明の薬物の量は、標準的臨床技術によって決定され得る。有効量は、インビトロ又は動物モデル検査系由来の用量反応曲線から外挿され得る。本発明の方法において用いられるいかなる薬物についても治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルに処方され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられ得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１６６】
予防薬及び／又は治療薬並びにその組合せは、ヒトでの使用の前に好適な動物モデル系において検査され得る。そのような動物モデル系は、これだけに限らないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどを含む。当技術分野において公知のいかなる動物系も用いられ得る。そのようなモデル系は、広く用いられており、当業者に周知である。いくつかの好ましい実施形態では、ラット、マウス又は霊長類以外の他の小さな哺乳動物に基づくＴＮＦ−α関連状態のための動物モデル系が用いられる。例えば具体的な実施形態では、推定される予防的及び／又は治療的な本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドが、例えば確立されたラットアジュバント誘導関節炎（ＡＩＡ、adjuvant-induced arthritis）モデル又はコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ、collagen-induced arthritis）モデルなどのマウス又はラットモデル系において検査される。ＡＩＡモデルは、ＣＩＡモデルと比較して関節炎のさらに高悪性度のモデルである。そのような系での検査は、霊長類に基づくモデル系よりむしろ、インビボ及び／又は前臨床検査において経費の低減の有利点を与える。理論に束縛されることなく、霊長類以外の動物での検査は、抗ＴＮＦ−α抗体分子がラット及び／若しくはマウスＴＮＦ−αとの、又は別の非霊長類、小さな哺乳動物のＴＮＦ−αとの交差反応性に基づいて選択される場合に適している。そのような抗体は、治療効果がヒト患者において達成され得る本発明における使用のために好適な抗ＴＮＦ−αポリペプチドを提供する一方で、インビボ検査、例えば低毒性に関する検査はラット及び／又はマウスモデルにおいて実施され得る。実施例１３ａ及び図１６も参照されたい。
【０１６７】
別の動物モデルは、遺伝子導入マウス（Ｔｇ１９７）モデルを含む。関節炎のＴｇ１９７モデルは、ヒト関節リウマチのものに酷似している関節炎病態の自然発症を生じるヒトＴＮＦ−α発現の調節解除された発現を有するヒト化ＴＮＦ遺伝子導入マウスモデルである（Keffer et al. 1991 "Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis" The EMBO Journal 10(13): 4025-4031、その内容は本明細書にその全体が参照により組み込まれる）。Ｔｇ１９７マウスは、出現率１００％で４〜７週齢に慢性多発性関節炎を発症し、関節リウマチ治療用のヒト治療剤を評価するための迅速なインビボモデルを提供する。このモデルは、Remicade（商標）の治療有効性の確立において成功裏に用いられ、後発生物製剤又は新規抗ヒトＴＮＦ−α治療剤を検査する有効性研究のために現在広く用いられている。実施例１３ｂ及び実施例１４〜１９並びに図７〜１２も参照されたい。
【０１６８】
本発明の予防薬及び／又は治療薬が動物モデルにおいて検査されると、それらは、その有効性を確立するために臨床試験において検査され得る。臨床試験の確立は、当業者に公知の一般的方法論に従って行われ、本発明の薬物の最適な投与量及び投与の経路並びに毒性プロファイルは、確立され得る。例えば臨床試験は、ヒト患者における関節リウマチに対する有効性及び毒性について本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドを検査するために設計され得る。下の実施例２０を参照されたい。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ヒト患者における関節リウマチなどのＴＮＦ−α関連状態を治療するために約０．１ｎｇ〜約１ｇの総投与量で投与される。より詳細な実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、約０．１μｇ〜約１ｍｇ；約１μｇ〜約５００μｇ；約１０μｇ〜約４００μｇ；又は約５０μｇ〜約２００μｇの総投与量で投与される。
【０１７０】
本発明の予防薬及び／又は治療薬の毒性及び有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養又は実験動物での標準的薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きな治療指数を示す予防薬及び／又は治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防薬及び／又は治療薬が用いられる場合は、非感染細胞への損傷可能性を最少化し、それにより副作用を低減するために罹患組織部位にそのような薬物を標的化する送達系を設計するために注意が払われるべきである。
【０１７１】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための予防薬及び／又は治療薬の投与量範囲を定めるために用いられ得る。そのような薬物の投与量は、毒性がわずか又は無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に好ましくはある。投与量は、使用される投与形態及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。
【０１７２】
ＴＮＦ−α関連状態のアンタゴニストとして機能する本発明の治療薬又は予防薬は、状態に関係する１又は２以上の症状を治療、遅延、予防又は回復させるために宿主に投与され得る。本発明の抗ＴＮＦ−α剤（例えば、アルブミン結合ドメインに融合している抗体単一ドメインを含むポリペプチド）は、炎症性症状及び／又は障害を有する動物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒトによって経験される炎症を低減するために用いられ得る。
【０１７３】
具体的な実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド、抗原結合断片誘導体又はその融合物を含む治療薬又は予防薬は、炎症性状態に関係する１又は２以上の症状を治療、遅延、予防又は回復させるために投与され得る。具体的な実施形態では、本発明によるポリペプチドは、薬物を投与されていない動物での炎症と比較して動物での炎症を、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％低減する。別の実施形態では、抗ＴＮＦ−αポリペプチド、抗原結合断片誘導体又はその融合物の組合せを含む治療薬又は予防薬は、組合せを投与されていない動物での炎症と比較して動物での炎症を、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％低減する。
【０１７４】
具体的な実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド、抗原結合断片誘導体又はその融合物を含む治療薬又は予防薬は、関節リウマチに関係する１又は２以上の症状を治療、遅延、予防又は回復させるために投与され得る。関節リウマチは、滑膜関節における炎症性応答（滑膜炎）によって特徴付けられ、軟骨の破壊及び関節の強直につながる。滑膜炎は、滑膜内層関節の及び腱鞘の炎症を含む。罹患した関節は、腫脹し、圧痛があり、硬化する。ＲＡの他の特徴的な症状は、径が数ミリメートルから数センチメートルになる場合があり、しばしば皮下に、一般に骨突出及び（皮膚の紫色の変色をもたらす）血管炎の上に見出されるリウマトイド結節を含む。肺、腎臓、心臓及び血管も冒される場合がある。例えば、肺の線維症及び胸水貯留は関節リウマチに関係し；並びに腎アミロイドーシスは慢性炎症のために生じる場合がある。同様に関節リウマチ患者は、粥状動脈硬化、心筋梗塞及び発作になりやすい。
【０１７５】
好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、動物での滑膜関節における炎症を、薬物を投与されていない動物での滑膜関節における炎症と比較して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％低減する。特に好ましい実施形態では、炎症の低減は、罹患した関節の腫脹、圧痛及び／又は硬化の低減をもたらす。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、動物でのリウマトイド結節を例えば骨突出上での頻度及び／又はそれらのサイズに関して低減する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、血管炎を低減（例えば皮膚表面の血管炎の変色の範囲及び／又は程度を低減）する。
【０１７６】
関節リウマチの臨床診断は、多数の診断基準に基づいて行われる。診断基準は、２つ以上の関節腫脹、少なくとも６週間にわたり１時間以上持続する朝のこわばり、リウマトイド因子（非特異的抗体）又は抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ、anti-citrullinated protein antibody）の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドは、これらの診断基準の１又は２以上を低減する。例えばいくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、動物の血液中のリウマトイド因子のレベルを、薬物を投与されていない動物でのリウマトイド因子のレベルと比較して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％低減する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、動物の血液中のＡＣＰＡのレベルを、薬物を投与されていない動物でのＡＣＰＡのレベルと比較して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％低減する。リウマトイド因子及びＡＣＰＡについてのアッセイは、当技術分野において公知であり、例えばリウマトイド因子とＡＣＰＡの検出とを組み合わせる関節リウマチの早期発見のための血清学的なポイントオブケア検査が開発されている。例えば、Luime JJ, et al. (2009) Ann Rheum Dis. 69 (2): 337-44を参照されたい。
【０１７７】
関節リウマチの進行は、２８関節疾患活動性スコア（ＤＡＳ２８、Disease Activity Score of 28 joints）などのスコアを用いて経過観察され得る。これから関節リウマチの重症度は、疾患活性度及び改善（ある場合）に基づいて分類できる。いくつかの実施形態では、本発明による本発明のポリペプチドは、ＤＡＳ２８の低下をもたらす。例えばいくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは動物のＤＡＳ２８スコアを薬物を投与されていない動物のＤＡＳ２８スコアと比較して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％低下させる。
【０１７８】
関節リウマチ臨床研究における結果測定値は、詳細にはＡＣＲ診断基準又はAmerican College of Rheumatology Criteriaを含む。診断基準は、有効性を評価する（例えば種々の関節炎薬物療法若しくは関節炎治療の有効性を比較する又はある治験を別の治験と比較する）関節リウマチについての臨床試験のほとんど全ての発表された研究において参照されている。ＡＣＲ診断基準は、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０及びＡＣＲ７０として示される。ＡＣＲ診断基準は、圧痛又は関節腫脹カウントにおける改善及び次の５つのパラメーターの内の３つにおける改善を測定する：（１）急性相反応物質（沈降速度など）；（２）患者評価；（３）医師評価；（４）疼痛スケール；及び（５）障害／機能質問票。臨床試験は、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０及びＡＣＲ７０を達成する研究参加者の百分率を報告する。例えば患者の６０％がＡＣＲ２０を達成したと研究が報告した場合、研究における患者の６０％が圧痛又は関節腫脹カウントにおける２０％改善及び他の５つの診断基準の内の３つにおける２０％改善を達成したことを意味する。別の例として、患者の４５％がＡＣＲ５０を達成したと臨床試験が報告する場合、研究における患者の４５％が圧痛又は関節腫脹カウントにおける５０％改善及び他の５つの診断基準の内の３つにおける５０％改善を達成したことを意味する。いくつかの実施形態では、本発明による本発明のポリペプチドは、ＡＣＲ診断基準の改善をもたらした。例えばいくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０又はＡＣＲ７０を達成する患者の％を、薬物を投与されていない患者がＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０又はＡＣＲ７０を達成する％と比較して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％又は少なくとも１０％増大させる。
【０１７９】
関節リウマチの予防的治療は、１若しくは２以上の特徴的症状、診断基準及び／又は疾患活動性スコアを予防する、遅延する又は遅らせることを含んで疾患を遅延、予防又は遅らせ得る。いくつかの実施形態では、関節リウマチの素因を有する動物に本発明のポリペプチドを投与することは、１又は２以上の特徴的症状の発症、診断基準及び／又は疾患活動性スコアを薬物を投与されていない動物と比較して遅延、予防及び／又は遅らせる。例えばいくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、滑膜炎、軟骨の破壊及び／又は関節の強直を遅延、予防及び／又は遅くする。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、関節の腫脹、圧痛及び／又は硬直を遅延、予防及び／又は遅くする。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、リウマトイド結節及び／又は血管炎を遅延、予防及び／又は遅くする。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、血液中のリウマトイド因子及び／又はＡＣＰＡの出現を遅延、予防及び／又は遅くする。
【０１８０】
本発明の薬物の治療的又は予防的な有効量での対象の治療は、単一治療を含む場合がある又は一連の治療を含む場合がある。例えば本発明の薬物を含む医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与され得る。いくつかの実施形態では、薬物は、１日１回、１日おきに、１週間に１回、１週間に２回、２週間ごとに１回、１カ月に１回、６週間ごとに１回、２カ月ごとに１回、１年に２回又は１年に１回投与され得る。ある種の薬物の有効投与量（例えば抗体単一ドメイン若しくは抗原結合断片誘導体又はその融合物を含む薬物の有効投与量）が治療の経過において増加又は減少され得ることは理解される。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、進行中の治療が（例えば、関節リウマチなどの慢性炎症性障害の進行中の治療及び／又は管理など長期間に基づいて）示される。例えば詳細な実施形態では、本発明の薬物は、例えば少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間、少なくとも１０年間、少なくとも１５年間、少なくとも２０年間又は必要とする対象のその後の生涯にわたる期間において投与される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、ポリペプチドの免疫原性を低減する１又は２以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、投与の頻度が低減されるようにポリペプチドの半減期を延長するアルブミン結合ドメインを含む。例えば特定の実施形態は、約３５〜約４２時間のインビボ半減期を有する抗ＴＮＦ−αポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のアルブミン結合ドメインに融合している少なくとも１個の抗体単一ドメインを含む抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、１週間に２回以下、１週間に１回以下、２週間に１回以下、１カ月に１回以下、６週間ごとに１回以下、２カ月ごとに１回以下、１年に２回以下又は１年に１回以下で投与される。具体的な実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドを含む治療薬は、１カ月に１回だけ、例えば関節リウマチを治療するために投与される。
【０１８３】
本発明の治療薬又は予防薬は、例えば抗炎症剤など具体的なＴＮＦ−α関連状態を治療するために用いられる１又は２以上の他の薬物との組合せでも有利に利用され得る。したがって本発明の治療薬又は予防薬は、ＴＮＦ−α関連状態の治療、予防又は管理において有用な１又は２以上の他の予防薬及び／又は治療薬との組合せで投与され得る。
【０１８４】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の治療薬又は予防薬は、関節リウマチの治療において用いられる１又は２以上の薬物との組合せで投与される。例えば本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、disease modifying anti-rheumatic drug）との組合せで投与され得る。一般的にＤＭＡＲＤは、関節リウマチから生じる骨及び軟骨への損傷の速度を低減する薬物を指す。ＤＭＡＲＤは、非限定的にアザチオプリン、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、Ｄ−ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、シクロホスファミドなどを含む。本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドとの組合せで投与され得る関節リウマチの治療において有用な他の薬物は、非限定的に、アナキンラなどのインターロイキン１（ＩＬ−１、interleukin 1）遮断剤（Kineret）；リツキシマブ（Rituxan）などのＢ細胞に対するモノクローナル抗体；アバタセプト（Orencia）などのＴ細胞共刺激遮断剤；トシリズマブ、抗ＩＬ−６受容体抗体などのインターロイキン６（ＩＬ−６、interleukin 6）遮断剤；などを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、関節リウマチに対して用いられる１又は２以上の他のＴＮＦ−α遮断剤との組合せで投与される。例えばいくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えばインフリキシマブ（Remicade（商標））、アダリムマブ（Humira）、エタネルセプト（Enbrel）、セルトリズマブペゴール（Cimzia）及びゴリムマブ（Simponi）との組合せで投与される。いくつかの特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、メトトレキサートとの組合せで投与される。組合せ効果は、相加的又は相乗的である場合がある。
【０１８５】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の治療薬又は予防薬は、関節リウマチの治療において用いられる１又は２以上の抗炎症剤との組合せで投与される。抗炎症剤は、これだけに限らないが、イブプロフェン、ナプロキセン、メロキシカム、エトドラク、ナブメトン、スリンダク、トレメンチン（tolementin）、サリチル酸コリンマグネシウム、ジクロフェナク、ジフルシナル（diflusinal）、インドメチシン（indomethicin）及びピロキシカムなどを含むグルココルチコイド及び非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ、non-steroidal anti-inflammatory drug）を含む。別のＮＳＡＩＤは、Celecoxib、選択的ＣＯＸ−２阻害剤（Celebrexの名称で販売されている）を含む。いくつかの実施形態では、抗炎症性薬物は、鎮痛剤である。鎮痛剤は、これだけに限らないが、パラセタモール（アセトアミノフェン）、オピエート、ジプロクアロン（diproqualone）及び局所リドカインなどを含む。
【０１８６】
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド、抗原結合断片、誘導体又はその融合物は、単独で又は他の予防薬及び／又は治療薬との組合せで投与され得る。各予防薬又は治療薬は、同時に又はいかなる順序で様々な時点ででも連続的に投与され得るが；同時に投与されない場合には、それらは望まれる治療的又は予防的効果を提供するために十分に近い時間で投与されるべきである。各治療的薬物は、いかなる好適な形態において及びいかなる好適な経路によっても別々に投与され得る。
【０１８７】
種々の実施形態では、様々な予防薬及び／又は治療薬が、１時間差未満で、約１時間差で、約１時間〜約２時間差で、約２時間〜約３時間差で、約３時間〜約４時間差で、約４時間〜約５時間差で、約５時間〜約６時間差で、約６時間〜約７時間差で、約７時間〜約８時間差で、約８時間〜約９時間差で、約９時間〜約１０時間差で、約１０時間〜約１１時間差で、約１１時間〜約１２時間差で、２４時間差以下で、４８時間差以下で、７２時間差以下で、９６時間差以下で、５日間差以下で、６日間差以下で、１週間差以下で、２週間差以下で、３週間差以下で、１カ月差以下で、２カ月差以下で又は３カ月差以下で投与される。特定の実施形態では、患者の同一の来診時に２つ以上の薬物が投与される。
【０１８８】
種々の送達系が公知であり、本発明の薬物を投与するために用いられ得る、例えば、リポソームへのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその融合物を発現できる組換え細胞（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照されたい）、レトロウイルス又は他のベクターの部分としての核酸の構築物など。本発明の薬物を投与する方法はこれだけに限らないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下、注入又はボーラス注射を含む）、硬膜外、並びに上皮又は皮膚粘膜若しくは粘膜内層を通じた吸収による（例えば、鼻腔内、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を含む。
【０１８９】
特定の実施形態では、本発明の薬物は、筋肉内、静脈内又は皮下に投与され、他の生物学的活性剤と一緒に投与され得る。具体的な実施形態では、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、皮下投与用に滅菌産生物として製剤される。投与は、全身性又は局所性であってよい。
【０１９０】
具体的な実施形態では、本発明の薬物を治療の必要がある領域に局所的に投与することが望ましい場合がある；これは例えば、非限定的に、局所注入、注射によって又はインプラント（前記インプラントは多孔性材料、非多孔性材料又はシアラスティック膜（sialastic membranes）などの膜若しくは繊維を含むゼラチン性材料）の手段によって達成され得る。典型的には抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片、誘導体若しくは融合物を含む薬物を投与する場合は、ポリペプチドが吸着しない材料を用いることに注意が払われなければならない。
【０１９１】
別の実施形態では、薬物は、小胞、詳細にはリポソーム中で送達され得る（参照、Langer, Science, 249:1527 1533, 1990；Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353 365 (1989)；Lopez-Berestein,同書., pp.3 17 327；一般に同書を参照されたい）。
【０１９２】
別の具体的な実施形態では、本発明の薬物は、徐放性製剤（例えば製剤が投与された薬物の放出の延長及びそれによる半減期の延長を提供する）において送達され得る。使用のための好適な放出制御系は、非限定的に、拡散制御、溶媒制御及び化学的制御系を含む。拡散制御系は、例えばリザーバーデバイス（本発明の抗ＴＮＦ−α剤が、分子の放出が拡散障壁を通じた浸透によって制御されるようにデバイス内に封入される）を含む。通常のリザーバーデバイスは、例えば、膜、カプセル、マイクロカプセル、リポソーム及び中空繊維を含む。モノリシック（monolithic）（マトリクス）デバイスは、拡散制御系の第二の種類であり、抗ＴＮＦ−α剤は速度制御マトリクス（例えば、ポリマーマトリクス）中に拡散又は溶解される。本発明の薬物は、速度制御マトリクス全体に均一に拡散されてよく、放出速度はマトリクス全体への拡散によって制御される。モノリシックマトリクスデバイスにおける使用のために好適なポリマーは、天然に存在するポリマー、合成ポリマー及び合成的に修飾された天然ポリマー並びにポリマー誘導体を含む。
【０１９３】
当業者に公知のいかなる技術も本明細書に記載の１又は２以上の薬剤を含む徐放性製剤（例えば、具体的にはアルブミン結合ドメインに融合している抗体単一ドメインを含む抗ＴＮＦ−αポリペプチド）を産生するために用いられ得る。例えば、それぞれ本明細書にその全体が参照により組み込まれる、米国特許第４，５２６，９３８号明細書；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ９１／０５５４８号明細書；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ９６／２０６９８号明細書；Ning et al., "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology, 39:179 189, 1996；Song et al., "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 50:372 397, 1995；Cleek et al., "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24:853 854, 1997；及びLam et al., "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 24:759 760, 1997、を参照されたい。一実施形態では、ポンプが放出制御系において用いられ得る（Langer,上記；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:20, 1987；Buchwald et al, Surgery, 88:507, 1980；及びSaudek et al, N. Engl. J. Med., 321:574, 1989を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料が抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はその抗原結合断片、誘導体若しくは融合物を含む薬物の制御された放出を達成するために用いられ得る（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, N.Y. (1984)；Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61, 1983を参照されたい；Levy et al., Science, 228:190, 1985；During et al., Ann. Neurol., 25:351, 1989；Howard et al., J. Neurosurg., 7 1:105, 1989も参照されたい）；米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ９９／１５１５４号明細書；及びＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ９９／２０２５３号明細書）。さらに別の実施形態では、放出制御系は、治療標的（例えば、罹患した関節）に近接して置かれ、それにより全身用投与量のごく一部だけを必要とする（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,上記,vol. 2, pp.115 138 (1984)を参照されたい）。他の放出制御系はLanger, Science, 249:1527 1533, 1990による総説において考察されている。
【０１９４】
９．医薬組成物及びキット
本発明は、薬学的に許容される担体及び本発明の薬物を含む医薬組成物をさらに提供し、前記薬物は本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又は抗ＴＮＦ−αポリペプチドをコードする核酸を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、抗ＴＮＦ−αポリペプチド、抗原結合断片、誘導体又はその融合物を含み、融合はアルブミン結合ドメインにであり、及び／又はポリペプチドは脱免疫化されている；及びポリペプチドは対象への投与のために薬学的に許容される担体と組み合わせられている。具体的な実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されている又は米国薬局方若しくは、動物における、より詳細にはヒトにおける使用のために一般に認められた他の薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、それと共に薬物が投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、賦形剤又は媒体を指す。そのような薬学的担体は、水及び油（例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油及びゴマ油などを含む石油、動物、植物又は合成由来のものを含む）などの滅菌液体であってよい。医薬組成物が静脈内に投与される場合に水が通常の担体である。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も液体担体、詳細には注射可能溶液として使用され得る。好適な医薬用担体は、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水及びエタノールなどを含む。薬学的に許容される担体、賦形剤及び安定剤の追加的例は、これだけに限らないが、当技術分野において公知の通り、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アルコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン及びゼラチンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性サーファクタントを含む。本発明の医薬組成物は、上記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味料、乳化剤、懸濁剤及び保存剤も含む場合がある。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤及び徐放性製剤などの形態をとり得る。
【０１９５】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として製剤され得る。薬学的に許容される塩は、これだけに限らないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のものなどのアニオンと形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどのカチオンと形成されたものを含む。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明の方法による使用のために提供され、前記医薬組成物は本発明の薬物の治療的及び／又は予防有効量を薬学的に許容される担体と共に含む。
【０１９７】
好ましい実施形態では、本発明の薬物は、実質的に精製されている（すなわち、効果を制限する又は望ましくない副作用を産生する物質を実質的に含まない）。具体的な実施形態では、宿主又は対象は、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ及びラットなど）並びに霊長類（例えば、カニクイザル（cynomolgous）などのサル及びヒト）などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、宿主はヒトである。
【０１９８】
本発明は、上の方法において用いられ得るキットをさらに提供する。一実施形態では、キットは本発明の１又は２以上の薬物を、例えば１又は２以上の容器中に含む。別の実施形態では、キットはＴＮＦ−α関連状態の治療のために有用な１又は２以上の他の予防薬又は治療薬を、１又は２以上の容器中にさらに含む。
【０１９９】
本発明は、薬物又は活性剤の量を表示しているアンプル又はサシェなどの密封容器に包装された本発明の薬物も提供する。一実施形態では、薬物は、密封容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉剤又は水不含有濃縮物として供給され、対象への投与のために適切な濃度に例えば、水又は生理食塩水で再構築され得る。典型的には薬物は、密封容器中に乾燥滅菌凍結乾燥粉剤として、少なくとも５ｍｇ、より頻繁には少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ又は少なくとも７５ｍｇの単位投与量で供給される。代替的実施形態では、本発明の薬物は、薬物又は活性剤の量及び濃度を表示している密封容器中に液体形態で供給される。典型的には薬物の液体形態は、密封容器に少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２５ｍｇ／ｍｌで供給される。
【０２００】
本発明の組成物は、医薬組成物の製造において有用なバルク薬剤組成物（例えば、純粋でない又は未滅菌組成物）及び医薬組成物（すなわち、対象又は患者への投与のために好適である組成物）を含む。バルク薬剤組成物は、単位投与形態の調製において用いられ得る、例えば本明細書で開示の薬物の予防的若しくは治療有効量又はこれらの薬物の組合せ及び薬学的に許容される担体を含む。
【０２０１】
本発明は、本発明の薬物の１又は２以上を充填された１又は２以上の容器を含む医薬用パック又はキットをさらに提供する。追加的に、ＴＮＦ−α関連状態（例えば、関節リウマチ）の治療のために有用な１又は２以上の他の予防薬又は治療薬も医薬用パック又はキットに含まれ得る。本発明は、本発明の医薬組成物の成分の１又は２以上を充填された１又は２以上の容器を含む医薬用パック又はキットも提供する。場合によりそのような容器（複数可）に、医薬品又は生物学的産生物の製造、使用又は販売を規制する行政機関による所定の書式での通知を伴ってよく、通知はヒト投与のための製造、使用又は販売の機関による認可を示す。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明の予防薬又は治療薬は、皮下に投与される。皮下投与は、薬物の急速な送達を可能にする、例えば皮下投与後数分間以内。詳細な実施形態では、例えば、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、薬学的に許容される担体と共に提供され、担体は皮下投与のために好適である。一般に担体は、滅菌され、血液への投与に浸透圧的適合性を有する。
【０２０３】
自己投与を促進するキット及びデバイスもいくつかの実施形態では、好ましい。例えばインスリン又はHumiraの送達に関して用いられる「ペン」は、本発明の薬物の皮下送達を行うために用いられ得る（例えば、それぞれ本明細書にその全体が参照により組み込まれる、McCoy EK, et al. 2010 "A Review of Insulin Pen Devices" Postgrad Med 122(3): 81-88；及びPearson, TL. 2010 "Practical Aspects of Insulin Pen Devices," Symposium, J. of Diabetes Sci and Tech, 4(3): 522-531を参照されたい）。本発明の抗ＴＮＦ−α剤の送達のためのペンデバイスは、使い捨て又は再利用可能であってよく、予め充填されてよく又は薬物のカートリッジでの使用のために設計されてもよい。販売されている充填済み使い捨てペンは、商標名Humalog（登録商標）、KwikPen（登録商標）、Humulin（登録商標）、Lantus（登録商標）、Apidra（登録商標）、Levemir（登録商標）、Novolog（登録商標）、FlexPen（登録商標）などで販売されているものを含む。販売されている再充填可能ペンは、商標名Autopen（登録商標）、HumaPen（登録商標）、LUXURA（商標）、NovoPen（登録商標）及びOptiClik（登録商標）などで販売されているものを含む。ペンデバイスは、皮下経路による治療薬の自己投与のためにバイアル及びシリンジ手法の代替法を提供し、使用の大幅な簡便化、より高い携帯性及び利便性、投薬精度の改善、疼痛低下、より高い社会的受容、より高い離散性並びにより高い患者コンプライアンスを含む多数の有利点を提供できる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ペンは、ダイアルバック（dial-back）特性を有し、「ダイアルバック」することによって投与される量を戻すことができる。いくつかの実施形態では、ペンは、前回の用量又は前回の投与回数の記録及びデジタル表示を有する。ペンは、通常室温で保たれ、ペンが極端な温度に曝される場所で保存される場合には断熱保存パックが用いられる場合がある。ペンデバイスは、ペン針と共に又は別に販売され得る。針は、様々なゲージ及び／又は長さで販売され得る。ゲージは、２９ゲージ、３０ゲージ、３１ゲージ又は３２ゲージなどの約２５〜約３５ゲージ、及び長さ約２ｍｍ〜約３０ｍｍ、例えば長さ約３ｍｍ、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１２．７ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ又は約２５ｍｍであってよい。
【０２０５】
一般に本発明の組成物の成分は、単位投与形態中に別々に又は一緒に混合されてのいずれかで、例えば、薬物又は活性剤の量を表示しているアンプル又はサシェなどの密封容器中に凍結乾燥粉剤又は水不含有濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ビンに分注される場合がある。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルは投与の前に成分が混合され得るように提供され得る。
【０２０６】
本明細書に引用した特許出願及び刊行物を含む全ての参考文献は、それぞれ個々の刊行物又は特許又は特許出願が具体的かつ個別に全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれると示されたのと同程度に、全ての目的のために本明細書にその全体が参照により組み込まれる。当業者に明らかである通り、本発明の多数の改変及び変更がその精神及び範囲から逸脱することなく作製され得る。本明細書に記載の具体的な実施形態は、例示の方法によってのみ提案され、本発明は、特許請求の範囲に認められた等価物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ限定される。
【実施例】
【０２０７】
［実施例１］
ＶＬ単一ドメインのシーケンシング
特にヒトＴＮＦ−αへの高親和性結合を示す１８個のＶＬ単一ドメインである、ＶＬ１８（配列番号１）及びＶＬ１１（配列番号２）、加えて配列番号３〜１８をシーケンシングした。その配列を、各ＶＬ単一ドメインの４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）に関して比較した。高親和性結合を示す２つのＶＬドメイン、ＶＬ１８（配列番号１）及びＶＬ１１（配列番号２）を、二量体として組み合わせるために選択した。結果は図１に示されている。
【０２０８】
［実施例２］
ＶＬ−ＶＬ二量体の構築及び結合分析
高親和性結合を示す２つのＶＬドメイン、ＶＬ１８（配列番号１）及びＶＬ１１（配列番号２）を、二量体として組み合わせるために選択した。２つのＶＬドメインの間のスペーサーとして、８アミノ酸ＧｌｙＳｅｒリンカーか、１３アミノ酸ＧｌｙＳｅｒリンカーか、又は１８アミノ酸ＧｌｙＳｅｒリンカーのいずれかを用いた。二量体の組み合わせは、ＶＬ１８−ＶＬ１８、ＶＬ１８−ＶＬ１１、ＶＬ１１−ＶＬ１１、及びＶＬ１１−ＶＬ１８とした。ＶＬ１８及びＶＬ１１の単量体を、２ステップクローニングストラテジーを用いて、pET28a（Novagen）発現ベクターにおいて二量体構造としてクローニングした。簡単に述べると、カルボキシ末端ＶＬをまずNheI及びNotIでクローニングし、さらに第２ステップにおいて他方のＶＬをNot及びXhoIによって挿入した。
【０２０９】
抗ＴＮＦ−α抗体断片を発現させるために、各ＤＮＡプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に導入して形質転換した。簡単に述べると、各クローンの新鮮なコロニーを、カナマイシンを追加したＳＢ培地中、３７℃で一晩、成長させた。１０ｍｌ試料の細胞を用いて、カナマイシンを追加した１ＬのＳＢ培地に播種した。細胞を、Ａ６００ｎｍが０．９に達するまで、３７℃で成長させた。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって抗体発現を誘導し、１６℃で６〜１８時間、成長を継続させた。発現した産物を、ウエスタンブロット分析により同定し、個々のＶＬ単量体との比較により二量体形成を確認した。ＶＬ単量体、並びにＶＬ１８−ＶＬ１８、ＶＬ１８−ＶＬ１１；ＶＬ１１−ＶＬ１８、及びＶＬ１１−ＶＬ１１の二量体についての結果は、図２Ａ〜Ｃに示されている。
【０２１０】
Talonスピンカラム（Clontech）により、製造会社のプロトコールに従って、抗体断片を、それらのヘキサヒスチジンテールによって、誘導された培養物の濃縮上清から精製した。
【０２１１】
ＶＬ単量体及び構築された二量体の相対的結合活性を、ヒト及びラットＴＮＦ−αに対して測定し、ＢＳＡを陰性対照として用いた。簡単に述べると、３８４ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、８０ｎｇのヒト又はラットＴＮＦ−αでコーティングし、４℃で一晩、インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで、３７℃で１時間、ブロッキングした。抗体断片をウェルに加え、室温で１時間、インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄後、抗ＨＡ−ＨＲＰモノクローナル抗体（Roche）を検出のために用いた。４０５ｎｍでの光学密度を測定し、アッセイを３連で実施した。Remicade（商標）を陽性対照として用い、ＶＬ  ４ＢＬ（Goncalves J et al. J Biol Chem. (2002) 277(35):32036-45）を無関係な抗体として用いた。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１二量体（配列番号３２）をさらなる試験のために選択した。結果は図２Ｄに示されている。
【０２１２】
［実施例３］
アルブミン結合ドメインとのＶＬ−ＶＬ融合物の構築
ＰＥＰのアルブミン結合ドメイン、及びそのアルブミン結合断片又はその誘導体を含むＤＮＡ断片を、ＰＣＲを用いて作製し、SpeI及びNcoI制限部位を、それぞれ、断片の５’末端及び３’末端に付加した。生じたＰＣＲ断片をゲル精製し、SpeI及びNcoI制限酵素で消化し、ファージミドベクターpComb3Xへクローニングした。発現したペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３０及びその断片又は誘導体を含む。
【０２１３】
配列番号３０に対応するペプチド及びそのアルブミン結合断片又はその誘導体はＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１（配列番号３２）に融合して、抗体融合物を生じ、その融合物を、それらが、ＴＮＦ−αに対する結合親和性、さらにまたヒト、ラット、及び／又はマウス血清アルブミンへの結合を保持しているかどうかに関して試験した。融合タンパク質は、配列番号３０に対応するペプチド、及び配列番号３２に対応するＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１二量体を用いて調製されて、配列番号３３に対応する融合タンパク質ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰを生じた。
【０２１４】
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１二量体及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−３Ｌ−ＰＥＰ融合タンパク質を発現させ、かつ精製するために、各遺伝子を含有するpET28aプラスミドを用いて、大腸菌（E. coli）Tuner（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
【０２１５】
各クローンの新鮮なコロニーを、カナマイシンを追加したＳＢ培地中、３７℃で一晩、成長させた。１０ｍｌ試料の細胞を用いて、カナマイシンを追加したＳＢ培地の１Ｌに播種した。細胞を、Ａ６００ｎｍが０．９に達するまで、３７℃で成長させた。０．１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって抗体発現を誘導し、１６℃で１８時間、成長を継続させた。誘導後、細菌を、遠心分離（４，０００×ｇ、４℃、１５分間）により収集し、プロテアーゼインヒビター（Roche）を追加した５０ｍｌの平衡緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。細胞を、超音波により溶解させた。遠心分離（１４，０００×ｇ、４℃、３０分間）を用いて、細胞残屑を除去し、上清を、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。
【０２１６】
全てのクロマトグラフィーステップを４℃で実施した。まず、抗体断片抽出物を、Ｃ末端Ｈｉｓタグを用いて、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。結合したタンパク質を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール（ｐＨ７．４）中０ｍＭから３００ｍＭまでのイミダゾールの直線的イミダゾール勾配で溶出した。適切な画分をプールし、濃縮し、その後、Superdexカラム及びＨｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ７．４）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製された抗体断片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブルー染色及びＨＲＰコンジュゲート化抗ＨＡモノクローナル抗体でのウエスタンブロットにより分析した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍで光学密度を測定することにより、決定した。
【０２１７】
［実施例４］
抗ＴＮＦ−α二量体融合物は血清アルブミンを結合する
実施例３の融合物のアルブミンへの結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。結合ＥＬＩＳＡを、以下に簡単に記載しているように、実施した：１０μｇ／ｍｌのヒト、ラット、又はマウス血清由来のアルブミンを、９６ウェルプレート中、４℃で一晩、固定化した。ＰＢＳ／３％豆乳での２時間のブロッキング後、組換え単一ドメイン抗体（ＶＬ１８、ＶＬ１１）、その二量体（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）、及びアルブミン結合ドメインへのその融合物（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）を、室温で１時間、インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄した後、抗ＨＡ−ＨＲＰモノクローナル抗体（Roche）を検出のために用いた。４０５ｎｍでの光学密度を測定し、アッセイを３連で実施した。
【０２１８】
結合試験は、ヒト、ラット、及びマウス血清アルブミンのそれぞれへの、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ融合物の結合を非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１の結合と比較する。融合物は、１又は２以上の濃度において、ヒト、マウス、及びラットアルブミンのそれぞれへの血清アルブミン結合の増加を示している。すなわち、本発明によるＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰによるアルブミン結合は、非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１と比較して、数倍の向上、例えば、５倍又は６倍又はそれ以上、向上を示している。
【０２１９】
競合ＥＬＩＳＡはさらに、本発明による融合物のアルブミン結合を実証する。競合ＥＬＩＳＡを、以下に簡単に記載されているように、実施する：増加性濃度におけるＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ融合物を、異なるアルブミンのそれぞれの１０μｇと、室温で１時間、プレインキュベートし、その後、対応するアルブミンでコーティングされたマイクロタイタープレートに加えた。マウスＨＲＰコンジュゲート化抗ＨＡタグ抗体を用いて検出を実施し、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。各場合において、プレインキュベーションは、結合を低下させる。
【０２２０】
［実施例５］
抗ＴＮＦ−α二量体融合物は、インビボで薬物動態の向上を示す
実施例３の融合物の薬物動態を、ラット及びマウスへ投与してその血清中半減期をインビボで決定することにより、試験した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰを、様々な濃度でＩＰ又はＩＶ注射により投与した；一方、非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１を、対照ラットに同様に投与した。１００ｍｇの融合物を、雌ウィスターラットへ腹腔内に注射した。５分間目、３０分間目、６０分間目、１２０分間目、及び３６０分間目、２４時間目、４８時間目、及び７２時間目の規則的な間隔で、注射されたラットから血漿試料を採取し、融合物又は非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１の濃度についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。簡単に述べると、ＴＮＦ−αを、３８４ウェルプレート内（８０ｎｇ／ウェル）に４℃で一晩、固定化した。豆乳での２時間のブロッキング後、組換え抗体断片を、２連で滴定し、室温で１時間、インキュベートした。検出を、ＡＢＴＳ基質を用いるマウスＨＲＰコンジュゲート化抗ＨＡ抗体（Roche）で実施した。吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。血漿中濃度を、各時点について取得し、２コンパートメント消失モデルへフィットさせる。データを、最初の時点（５分間目）における最大濃度を考慮して標準化した。
【０２２１】
薬物動態試験は、インビボで、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ融合物の血清中半減期を非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１の血清中半減期と比較する。融合物は、１又は２以上の濃度において、血清中半減期の増加を示している。すなわち、本発明によるＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ融合物のインビボ血清中半減期は、非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１と比較して、数倍の向上、例えば、２００〜１０００％（すなわち、２〜１０倍）、向上を示している。結果は図３Ｆに示されている。
【０２２２】
［実施例６］
抗ＴＮＦ−α二量体融合物は抗原結合特異性を保持する
実施例３の融合物を、抗ＴＮＦ−α抗体部分のＴＮＦ−αへの結合特異性についてＥＬＩＳＡを用いて分析した。結合ＥＬＩＳＡを、本明細書に記載されているように、実施した。簡単に述べると、８０ｎｇ／ウェルでのヒトＴＮＦ−αを、９６ウェルプート内に４℃で一晩、固定化した。ＰＢＳ／３％豆乳での２時間のブロッキング後、組換え単一ドメイン抗体（ＶＬ１８、ＶＬ１１）、その二量体（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１）、及びアルブミン結合ドメインへのその融合物（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ）を、室温で１時間、インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄した後、抗ＨＡ−ＨＲＰモノクローナル抗体（Roche）を検出のために用いた。４０５ｎｍでの光学密度を測定し、アッセイを３連で実施した。
【０２２３】
結合試験は、ＴＮＦ−αへの、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ融合物の結合を非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１の結合と比較する。各融合物は、１又は２以上の濃度において、ＴＮＦ−αへの特異的結合を維持している。すなわち、本発明によるＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰによるＴＮＦ−α結合は、非融合型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１と比較して、おおよそ同じ結合特異性を示している。
【０２２４】
［実施例７ａ］
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの結合親和性
抗ＴＮＦ−αポリペプチドＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１（ＶＬ二量体構築物）及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの、ヒトＴＮＦ−α、加えてマウス、ラット、又はヒトアルブミンに対する結合親和性を、BIAcore 2000を用いて得た。BIAcoreシステムは、それらの特異性、会合速度及び解離速度（Ｋｏｎ及びＫｏｆｆ速度式）、並びに結合強度（親和性）に関して分子を特徴付け、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ、Surface Plasmon Resonance）（リアルタイムに非標識相互作用物の検出を容易にする光学的現象）に基づいている。
【０２２５】
ヒトＴＮＦ−α、マウス、ラット、又はヒトアルブミンを、約１０００レゾナンスユニットで、アミンカップリングを用いてＣＭ５チップ上に捕獲した。０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、及び５００ｎＭにおけるＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１又はＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰを、１０μｌ／分の流速で４分間、注入した。結合したタンパク質を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を用いるマトリクス再生の前に、１０分間、解離させた。カップリングされていないセルを通過した注入物からのシグナルは、固定化されたセルのシグナルから引き算されて、時間の関数としての結合した分子の量のセンサーグラムを作成した。Remicade（商標）親和性もまた測定し、対照として用いた。ランニング緩衝液、ＨＢＳを全ての試料希釈に用いた。BIAcore動態学的評価ソフトウェア（バージョン３．１）を用いて、１対１の結合モデルを用いる会合速度及び解離速度からＫＤを決定した。結果は図３Ａ〜Ｃに示されている。
【０２２６】
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰのヒト、ラット、及びマウスＴＮＦ−αに対する相対的結合活性及び特異性もまた決定した。上記で概要を示されたプロトコールに従うことができ、１００ｎｇのヒトＴＮＦ−α、ラットＴＮＦ−α、及びＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡを用いて評価され、吸光度を４０５ｎｍで読み取る。Remicade（商標）抗ＴＮＦ製品を対照として用いた。表されたデータは、３連の平均±Ｓ．Ｄ．である。結果は図３Ｃに示されている。
【０２２７】
さらなる結合試験は、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１の、１００ｎｇのヒトＴＮＦ−α、カニクイザルＴＮＦ−α、ミニブタＴＮＦ−α、及びＢＳＡに対する相対的結合親和性及び特異性を、再び、ＥＬＩＳＡを用い、かつ４０５ｎｍでの光学密度を測定して、比較した。結果は図３Ｅに示されている。
【０２２８】
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰについての親和性及び結合動態パラメーターは、ＶＬ１８及びＶＬ１１単量体について、並びにRemicade（商標）についてのそれらと共に、下記の表１に示されている。
【０２２９】
【表１】
2014530001.tif 000002
【０２３０】
［実施例７ｂ］
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰによるＴＮＦ依存性細胞溶解活性の中和
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１のヒトＴＮＦ−αに対する結合親和性をまた、ＴＮＦ−α依存性細胞溶解活性の中和について、インビトロアッセイを用いて測定した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの結合親和性もまた、このアッセイにおいて測定した。
【０２３１】
抗ＴＮＦ  ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰのＴＮＦ−α／ＴＮＦＲ相互作用へのブロッキング効果を測定するために、マウス異数体線維肉腫細胞系（Ｌ９２９）を、細胞傷害性ＴＮＦ媒介性アッセイとして用いた。簡単に述べると、Ｌ９２９細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を追加したDulbeccoの改変Eagle培地中、９０％培養密度まで成長させた。細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート内に２５，０００細胞／ウェルの密度で蒔き、その後、一晩、インキュベートした。細胞生存率を測定するために、試験される抗ＴＮＦ−α抗体の段階希釈を、細胞傷害性濃度のＴＮＦ−α（最終アッセイ濃度１ｎｇ／ｍｌ）と、又はこのサイトカインの非存在下で、混合した。細胞感受性を増加させるために、アクチノマイシンＤを、この混合物に、１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。３７℃で振盪しながらの少なくとも２時間のインキュベーション後、この混合物を、蒔かれた細胞に加えた。細胞を混合物と共に、５％ＣＯ２の大気中、３７℃で２４時間、インキュベートした。細胞生存率を、少なくとも３０分間のインキュベーション後、テトラゾリウム塩WST-1（ROCHE）（１０μｌ／ウェル）を用いて、４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。Remicade（商標）を対照として用いた。無関係の抗体（ＶＬ  ４ＢＬ）を陰性対照（Ｃ−）として用いた。
【０２３２】
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰが、ＴＮＦ−α誘導性細胞傷害性からＬ９２９細胞を保護し、それゆえに、販売中の製品（Remicade（商標））に匹敵する用量でＴＮＦ−α活性を中和することが示された。結果は、図４に示されている。
【０２３３】
［実施例８］
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ二量体の治療効果
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの治療効果を決定するために、確立されたラットアジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ、adjuvant induced arthritis）モデルを用いた。フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、Freunds complete adjuvant）は、ラットにおいて関節リウマチを誘発する。例えば、尾の付け根におけるＦＣＡの注射は、ラットにおいて、複数の関節に関わり、かつ広範な全身性疾患、重篤な不快感、及び苦痛を促進する、慢性関節炎を生じる。
【０２３４】
１５０〜１７０ｇの平均体重を有する雌ウィスターラット（Charles River）は、ＦＣＡ（１ｍｇ／ｍｌ）の注射を皮内に（ｉ．ｄ．）受けた。誘発された関節炎を、疾患誘発後３週間にわたって、以下：臨床スコア（肢分析）、体重、足首関節の測定に基づいて、及び下記のように組織学的に、評価する。全てのラットは、Institute of Medicine動物飼育施設において研究所ガイドラインに従って、特定の無菌状態下で飼育かつ維持された。動物は、標準げっ歯類固形飼料及び水を与えられ、換気されたケージ内で維持された。改作されたＡＩＡモデルの図（出典In Vivo Models of Inflammation, Vol. I, C.S. Stevenson, L.A. Marshall, and D.W. Morgan (eds.), page 17 (2006) Birkhauser Veriag Basel, Switzerland）は、図５に示されている。
【０２３５】
３つの独立した実験を実行した。第１の実験（ｎ＝３）は、ＶＬ二量体構築物の半減期を、ＰＥＰへの融合のあり及びなしで、異なる投与経路下で、評価することを目的とした。ＩＶ、ＩＰ、及びＳＣ経路を用いる投与を、用いた。薬物動態測定を、実施例５に記載されているように、実施した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１半減期平均は、５．１時間であることが見出された。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ半減期平均は、４２時間であることが見出され、それは、８倍を超える増加を表す。これらの結果は、注射による投与の頻度に情報を与える。
【０２３６】
第２の実験（ｎ＝３）は、用量を決定することを目的とした。５０μｇ、１００μｇ、及び２００μｇでの３つの試験用量をＩＰ注射によって投与した。１００μｇの用量が、満足できるものだと判明し、それを効力実験について選択した。
【０２３７】
第３の実験は、効力を決定することを目的とした。１群のラット（ｎ＝６）を、１００μｇのＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１でＩＰ注射により処置した。他の群を、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰで２日間の間隔で処置した。ＰＢＳを陰性対照として用い（動物に媒体のみを注射した）、４００μｇでのデキサメタゾン（毎日）を陽性対照として用いた。
【０２３８】
処置期間は３週間であり、動物を、関節炎の臨床症状について毎日、モニターした。評価は、各動物の四肢の合計スコアに基づいた。関節炎の重症度を、２〜４日間の間隔で、以下の通り、０〜３までの臨床スコア測定により定量化した：０＝正常；１＝軽微な紅斑；２＝中等度の紅斑；３＝強度の紅斑から無能力状態の肢；最大スコア＝１２。結果は、平均値＋／−Ｓ．Ｄ．であり、図６に示されている。
【０２３９】
治療効果のさらなる測定として、後肢の足首腫脹の変化を、処置の２０日間の間、誘発された関節炎を有するラットについて評価した。臨床重症度を、後肢の足首腫脹の定量化により評価し、それは、後肢の足首の周囲長のダイヤルゲージカリパスでの測定により得られた。４日目は臨床関節炎が観察された最初の日に対応し、２０日目は処置の最終日に対応する。「ＰＢＳ対照」は、媒体を注射されたＡＩＡセットの動物に対応する。最後のセットのカラムは、健康な動物（Ｃ−）に対応する。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰは、有意な結果を生じた。結果は、平均値＋／−Ｓ．Ｄ．であり、図７に示されている。
【０２４０】
動物の後肢の写真を撮り、２０日目（処置の最終日）に観察された後肢の足首腫脹の変化を図示した。写真を、健康なラットのそれと比較した。写真は図８Ａ〜Ｅに示されている。
【０２４１】
組織病理学的観察のために、屠殺の時点（２０日目）に足試料を収集した。試料を、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中ですぐに固定し、固定した後、試料をまた、１０％ギ酸中で脱灰し、その後、エタノール濃度の増加（７０％、９６％、及び１００％）を用いて、脱水した。次に、試料をパラフィン中に包埋し、ミクロトーム（Leica RM 2145、Germany）を用いて切片にし、形態学的検査のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。カラーカメラを備えたLeica DM 2500（Leica microsystems、Germany）顕微鏡を用いて画像を取得した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ、ＰＢＳ、又はデキサメタゾンで処置されたＡＩＡラットの関節からヒストグラムを作成した。
【０２４２】
食塩水（ＰＢＳ）を与えられたＡＩＡラットの関節腔における大量の炎症性細胞の流入、滑膜の過形成、並びに大量の単形核細胞及び多形核細胞の蓄積は、正常の対照ラットと比較して明らかであった。比較により、１００μｇのＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１又はＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰで２０日間にわたって処置されたラットは、デキサメタゾンで処置されたラットのように、処置された動物の関節における滑膜が、正常な動物由来のそれらとほとんど同等であったという程度までの、四肢における炎症及び関節破壊の明白な低下が、明らかにされた。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰを用いて、有意な結果が得られた。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ、ＰＢＳ又はデキサメタゾンで処置されたＡＩＡ及び対照ラットからの結果は、図９Ｃ〜Ｆに示されている。
【０２４３】
［実施例９］
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの脱免疫化
ヒトＴ細胞エピトープに対するインシリコ評価（Algonomics Epibase（商標）−LONZA）を、ＴＨエピトープ含有量を低減するためのＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの脱免疫化ストラテジーとして行った。要点をまとめると、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１は、ヒト及びラットのＴＮＦ−αに対する特異性を有する、二量体（単量体ＶＬ１１に結合した単量体ＶＬ１８）の形をとる、組換え単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ、single domain antibody）である；ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰは、半減期を延ばすアルブミン結合ドメイン（ＰＥＰ）に融合したＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１二量体分子である。図１０Ａ〜Ｂ参照。
【０２４４】
ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの３Ｄモデルを、Tripoleモデリングツール（LONZA）を用いて開発した。図１１は、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１分子及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ分子についての３Ｄモデルを示す。
【０２４５】
推定Ｔ細胞エピトープのプロファイリング及び位置決めの結果に基づいて、アミノ酸置換のリストを同定した。
【０２４６】
提案されるアミノ酸置換
下記に挙げた要約において、二重ミュータントは、ハイフンによって連結され（例えば、Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ）、同じ位置に関わる異型の置換は、丸括弧内にスラッシュにより分けられて、示されている（例えば、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ））。加えて、溶媒曝露されるフレームワークのシステインからセリンへの２個の変異は、安定性を増加させるために提案された。
【０２４７】
ＶＬ１８において：Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ、Ｌ１１１Ｋ（９個の提案されるアミノ酸置換）。
【０２４８】
ＶＬ１１において：Ｔ７Ｑ、Ｖ１５Ｐ、Ｒ３１Ｓ、（Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｒ／Ａ５１Ｖ−Ｌ５４Ｅ）、Ｋ６３Ｓ、Ｅ７９Ｋ、（Ｃ８０Ｓ）、Ｔ９１Ａ、Ａ１００Ｓ、及びＥ１０６Ｋ（１１個の提案されるアミノ酸置換）。
【０２４９】
Ｐｅｐにおいて：Ｅ１２Ｄ、Ｔ２９Ｈ−Ｋ３５Ｄ、及びＡ４５Ｄ（４個の提案されるアミノ酸置換）。
【０２５０】
置換を含有するＶＬ１８、ＶＬ１１、及びＰＥＰドメインの配列は、それぞれ、図１２Ａ〜Ｃに提示されている。図は、様々なドメインについてＫａｂａｔ及びＯｒｄｉｎａｌのナンバリングを示す。ＣＤＲはｘによって示されている。置換についての提案される位置は、灰色で強調されている。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰとヒトアルブミンの間の結合様式は、図１３に示されている。
【０２５１】
［実施例１０］
脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰバリアントの合成
実施例９に記載された、提案されるアミノ酸置換の結果として、ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰの推定脱免疫化バリアントを、下記の表２及び３に示されているように、合成した。ＨＡ−タグ配列（YPYDVPDYA）をコードする配列もまた、Ｃ末端に付加した。脱免疫化バリアントをコードする遺伝子を、NheI及びXhoI消化により、pET28a発現ベクターへクローニングした。
【０２５２】
【表２】
2014530001.tif 000003
【０２５３】
【表３】
2014530001.tif 000004
【０２５４】
脱免疫化バリアントを、上記の実施例に記載されているような、発現試験、抗原交差反応性、親和性測定、及びＬ９２９細胞系での細胞傷害性アッセイにおける効力試験において調べた。表示番号のバリアントについての結果は、下記の表４に示されている。
【０２５５】
【表４】
2014530001.tif 000005
【０２５６】
［実施例１１］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物のラージスケール発現
本発明の組換え抗ＴＮＦ−αポリペプチド（Ｈｉｓタグなし）を細菌において発現するように設計された発現構築物を用いて、大腸菌Tuner（ＤＥ３）、大腸菌BLR（ＤＥ３）、及び／又はDL21（ＤＥ３）を形質転換して、発現スクリーニングのためのクローンを作製した。誘導実験（０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、１８時間）を３つのコロニーに実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はイムノブロットを、タンパク質発現（全体及び可溶性）を比較するために実行し、最高の発現体を保管し、その後、最初に１５Ｌスケールでの生産、続いて１００Ｌでのスケールアップ生産に利用した。成長及び誘導を、以下の通り実施した。簡単に述べると、新鮮な培養物由来の細胞を、ＳＢ培地＋選択用薬剤中、３７℃で、０．７から０．９の間のＯＤまで成長させ、温度を１８℃まで降下させ、培養物を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。一晩の曝露後、細胞ペーストを、遠心分離によって収集し、精製まで−２０℃で保存した。タンパク質発現を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は（抗原特異的抗体を用いる）ウエスタン−イムノブロットのいずれかを分析試料に実施した。実験は、Paragon（ＵＳＡ）と協力して行われた。
【０２５７】
組換え二量体ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果は図１４に示されている。発現した二量体のゲルにおける位置は、矢印で示されている。本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド及びその脱免疫化バリアントについての発現収量は、下記の表５及び６に提供されている。
【０２５８】
【表５】
2014530001.tif 000006
【０２５９】
【表６】
2014530001.tif 000007
【０２６０】
［実施例１２］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の精製
実施例１１の組換えで発現した抗ＴＮＦ−αポリペプチドを、タンパク質Ｌ及び／又はヒトアルブミンアフィニティクロマトグラフィー標準手順を用いて、精製した。簡単に述べると、抗プロテアーゼを追加したＰＢＳ緩衝液中に、ポリトロンを中速で用いて、細胞ペーストを再懸濁した。ホモジナイザを用いて、懸濁液を溶解し、可溶性材料を、遠心分離により清澄化した。清澄化された可溶化液を、タンパク質Ｌ及び／又はヒトアルブミン樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムに添加した。混入したタンパク質及び内毒素を除去するために、樹脂を洗浄し、結合したポリペプチドを、１００ｍＭグリシン（ｐＨ＝３）を用いて溶出した。関心対象となるポリペプチドを含有する画分をプールし、残留内毒素除去のために処理した（ActiClean Etox）。
【０２６１】
望ましい純度規格を満たすために、追加の研磨ステップを実施してもよく、企図される研磨ステップの型（例えば、ＩＥＸ、ＳＥＣ）は、混入物の分析後に決定される。ステップは、SP Sepharose陽イオン交換；サイズ排除クロマトグラフィー、及び内毒素低減、続いて、製剤化を含んだ。脱免疫化二量体ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８についての下流過程発生は、図１５Ａ〜Ｅに示されている。下流過程発生の概略図は図１５Ａに示されている。脱免疫化二量体ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８のタンパク質Ｌ親和性精製後のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果は、図１５Ｂ〜Ｃに示されている。脱免疫化二量体ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８のSP Sheparose陽イオン交換クロマトグラフィー後のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果は、図１５Ｄに示されている。脱免疫化二量体ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ３−ＰＥＰ  ＤＩ  ＃８のサイズ排除クロマトグラフィー後のクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析の結果は、図１５Ｅに示されている。
【０２６２】
最終の精製されたポリペプチドを、ＰＢＳ緩衝液へ透析し、約５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−８０℃で凍結保存した。精製の全ステップを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−クーマシー及びA280吸光度によりモニターした。精製されたポリペプチドに、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−クーマシー）、収量（Bradfordアッセイ又はA280）、内毒素（PTS EndoSafeアッセイ）、及びアイデンティティ（ウエスタンブロット−抗体）を記述する仕様書を添付した。実験は、Paragon（ＵＳＡ）と協力して行われた。
【０２６３】
［実施例１３ａ］
脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰバリアントの治療効果
脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアントの治療効果を決定するために、上記のように、確立されたラットアジュバント誘発関節炎モデル（ＡＩＡ）を用いた。雌ウィスターラット（Charles River）は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（１ｍｇ／ｍｌ）の注射を皮内（ｉ．ｄ．）に受けた。ラットを、１００μｇのＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ、加えて、それぞれの２つの脱免疫化バリアント（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１  ＤＩ  ＃３及びＤＩ  ＃５；ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＤＩ  ＃３−ＰＥＰ  ＤＩ及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＤＩ  ＃５−ＰＥＰ  ＤＩ）で処置した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１及び２つの脱免疫化バリアントを毎日、投与した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ及び２つのＰＥＰ融合脱免疫化バリアントを２日間の間隔で投与した。デキサメタゾン及びＰＢＳを、再び、対照として用いた。
【０２６４】
上記のように、関節炎の重症度を、疾患誘発後、臨床スコア（肢分析）、足関節測定、及び組織学的分析に基づいて評価し、処置の２０日間の間、ラット（ｎ＝６）における関節炎重症度スコアを提供した。陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１バリアント及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアントで処置されたラットは、野生型ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰ及びデキサメタゾンで処置されたラットのように、四肢において炎症及び関節破壊の明白な低下を示した。結果は図１６に示されている。
【０２６５】
組織病理学的観察のために、屠殺の時点（２０日目）に足試料を収集した。試料を、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中ですぐに固定し、固定した後、試料をまた、１０％ギ酸中で脱灰し、その後、エタノール濃度の増加（７０％、９６％、及び１００％）を用いて、脱水した。次に、試料をパラフィン中に包埋し、ミクロトーム（Leica RM 2145、Germany）を用いて切片にし、形態学的検査のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。カラーカメラを備えたLeica DM 2500（Leica microsystems、Germany）顕微鏡を用いて画像を取得した。ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１、ＶＬ１８−３Ｌ−ＰＥＰ、又はＰＢＳ、又はデキサメタゾンで処置されたＡＩＡラットの関節からヒストグラムを作成した。結果は、図１７Ａ〜Ｉに示されている。
【０２６６】
［実施例１３ｂ］
慢性多発性関節炎の予防における脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１／ＰＥＰバリアントの治療効果
関節炎の発生を予防することにおける脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアントの効力効果を決定するために、トランスジェニックマウス（Tg197）モデルを用いる。関節炎のTg197モデルは、ヒト関節リウマチの病態とよく似た関節炎病態の自発的発生を生じる、ヒトＴＮＦ発現が調節解除された、ヒト化ＴＮＦトランスジェニックマウスモデルである（Keffer et al. 1991）。
【０２６７】
Tg197での実験研究は以下を含む：陰性対照、陽性対照（Remicade（商標））、及び試験処置される群（ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアント）を含む、８匹のマウスの４群。別の４匹のマウスを、病理組織診断のための対照としての役割を果たすように、試験の開始時点に屠殺する。７週間の予防的処置を、３週間目から１０週間目まで実施する。抗ＴＮＦ−α抗体、及び脱免疫化ＰＥＰとのその融合物の投与を、腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇの最終用量で週に２回、行う。７週間の処置期間中、臨床スコアを、各動物についての関節形態における巨視的変化を観察することにより、記録する。週齢１０週間において、全動物を屠殺し、関節及び血清を収集する。血清を−７０℃で保存し、足関節をホルマリン中に保存する。足関節薄片をパラフィンに包埋し、切片にし、その後、続いて、疾患進行の組織病理学的評価のために用いる。
【０２６８】
［実施例１４ａ］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の薬物動態
本発明による抗ＴＮＦ−αポリペプチドのインビボ血漿中時間経過及び組織分布を決定するために、薬物動態試験をラットにおいて実施する。１４Ｃ標識抗ＴＮＦ−αポリペプチドの単一の皮下又は静脈内（ＳＣ／ＩＶ）用量をラットに投与する。放射標識ポリペプチドを、開始日、又は開始日の１日前に調製する；放射化学的濃度を、投薬前及び投薬後に分析する；放射化学ＨＰＬＣ分析により、投与間隔にわたって安定性を評価する。試験設計は、下記の表７に概要が示されている。
【０２６９】
【表７】
2014530001.tif 000008
【０２７０】
ラットを、死亡率、及び健康障害又は処置に対する有害反応の徴候について１日２回、観察する。群１について、試料を、以下の通り、コホート採血から収集する：約０．５ｍＬの血液又は血漿を、投薬前、並びに投薬後１時間目、２時間目、４時間目、８時間目、１２時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目、１２０時間目、及び１６８時間目を含む、１時点あたり３匹の動物から収集する。群２について、試料を以下の通り、収集する：投薬後１時間目、４時間目、８時間目、２４時間目、７２時間目、及び１６８時間目において、１時点あたり１匹の動物から組織を収集する。含まれる組織は、副腎、膀胱（泌尿器）、骨、骨髄、脳、眼（両方）、脂肪（褐色）、脂肪（白色）、心臓、腎臓、大腸／盲腸、肝臓、肺、リンパ節（腸管膜）、筋肉、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、及び残りの死体である。
【０２７１】
血漿、組織、及び残りの死体における放射活性レベルを、公知の手順に従って測定する。組織ホモジネートのアリコートを、分析前に、酸化又は可溶化し、一方、他の試料を、アリコートをシンチレーション液と混合することにより、直接的に分析する。投薬された放射活性の全回収、及び各間隔における回収を、組織及び死体由来の試料について決定する。組織分布を、剖検で得られた個々の組織によって分析する。本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドのインビボ血漿中時間経過及び組織分布を提供するために、薬物動態学的血漿中曲線を作成する。
【０２７２】
［実施例１４ｂ］
ＰＥＰとの脱免疫化ＶＬ融合物バリアントの体内分布
本発明によるＰＥＰとの融合物バリアントのインビボ血漿中時間経過及び組織分布を決定するために、予備的体内分布アッセイを、９９ｍＴｃ（ＣＯ３）標識を用いて、以下の通り、ラットにおいて実施した：
【０２７３】
９９ｍＴｃ（Ｉ）トリカルボニル前駆体の調製
IsoLin Kit（Covidien）のバイアルへ９９ｍＴｃＯ４−／食塩水（２ｍｌ、約２５ｍＣｉ）を加えた。混合物を、３０分間、加熱し、生じた溶液のｐＨを７．４に調整した。［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３］＋の放射化学的純度を、溶出剤としてＭｅＯＨ中６Ｎ  ＨＣｌ（５％）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ及びインスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ、instant thin-layer chromatography）によってチェックした（Ｒｆ≒１）。
【０２７４】
ｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−構築物の標識
その構築物を、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０で緩衝し、約０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。その構築物をｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３］＋と反応させることにより、化合物ｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１、ｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ、及びｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−Ｈｉｓ６−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＤＩ＃３−ＰＥＰ  ＃８を、０．１２５ｍｇ／ｍＬ最終濃度で得た。簡単に述べると、２％のＳＤＳ界面活性剤を含有するｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３］＋の溶液を、その構築物を含有する微小遠心管へ加えた。その混合物を、３７℃で１時間、反応させ、９９ｍＴｃ放射標識構築物の放射化学的純度を、ＩＴＬＣによってチェックした（Ｒｆ＝０；放射化学的収量約８０〜９５％）。反応していない遊離の「９９ｍＴｃ（ＣＯ）３」を、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０で溶出されるSephadex G-25カラムを用いて脱塩することにより、除去した。
【０２７５】
分配係数決定
分配係数を、「振盪フラスコ」方法により評価した。放射性構築物を、オクタノール（１ｍＬ）と０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４（１ｍＬ）の混合物（撹拌によりお互いに予め飽和している）に加えた。この混合物をボルテックス及び遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）して、相分離させた。
【０２７６】
オクタノール及びＰＢＳの両方のアリコートを、γカウンターでカウントした。オクタノール相におけるカウントを、緩衝液におけるカウントで割ることにより分配係数（Ｐｏ／ｗ）が計算され、その結果を、ｌｏｇ  Ｐｏ／ｗ±ＳＤとして表した。
【０２７７】
インビトロ安定性決定
９９ｍＴｃ放射標識構築物を、緩衝溶液中に３７℃で２４時間、保存した。インキュベーション後、溶液を、ＩＴＬＣによって分析した。［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３］＋の遊離がないことが観察された。
【０２７８】
体内分布試験
放射標識構築物のインビボ評価試験を、雌ウィスターラット（Charles River）において１５分間目、１時間目、３時間目、６時間目、及び２４時間目に実施した。全ての動物実験を、機関内動物倫理委員会のガイドラインに従って実施した。動物に、軽いイソフルラン麻酔下で放射標識化合物（約１ｍＣｉ；約３００μＬ；約１６〜２０μｇの９９ｍＴｃ（ＣＯ）３標識構築物）を腹腔内に注射し、過剰麻酔により屠殺した。
【０２７９】
屠殺された動物における放射活性を、線量キャリブレータ（Curiemeter IGC-3、Aloka、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ、又はCarpintec CRC-15W、Ramsey、ＵＳＡ）を用いて測定した。注射された動物における放射活性と殺害された動物における放射活性との差は、排泄によると想定された。関心対象となる組織を解体し、すすいで余分な血液を除去し、重量を測定し、それらの放射活性を、γカウンター（LB2111、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。血液、骨、及び筋肉組織のそれぞれを含む最も関連性のある器官についての取り込みを、これらの器官がそれぞれ、動物の総体重の６％、１０％、及び４０％を占めると仮定して、推定した。結果を、ウィスターラット（ｎ＝３）におけるｉ．ｐ．投与後の１５分間目、１時間目、３時間目、６時間目、及び２４時間目についての％ＩＤ／器官として表した。動物を殺害した時点に一緒に尿も収集し、プールした。結果は、図１８Ａ〜Ｂに、ｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１（図１８Ａ）及びｆａｃ−［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］−ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰ（図１８Ｂ）について示されている。
【０２８０】
［実施例１５］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の毒性試験
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの毒性を決定するために、下記の表８に概要を示された試験設計を、ラットにおいて企図する。
【０２８１】
【表８】
2014530001.tif 000009
【０２８２】
相Ａにおいて、最大耐用量（ＭＴＤ、maximum tolerated dose）を決定するために全ての用量を１日目に投与する；それぞれの設計されたレベルで１回、動物に投薬する。相Ｂにおいて、相Ａに基づいた用量で１日目に１回、動物に投薬する。投与は、皮下又は静脈内注射による。
【０２８３】
相Ａにおける動物を、各レベルにおいて４日間、死亡率及び／又は瀕死率について１日２回、観察する。相Ｂにおける動物を、７日間、１日２回、観察する。また、各観察時点において、各動物について体重を測定する。相Ｂの動物について、試験の終了時点に、生存している動物において、血液学、凝固、臨床化学、及び検尿評価を含む臨床病理学分析を実施し、生存していない動物から組織を保存する。相Ｂの動物の終了後、以下の器官もまた重量を測定する：副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、副甲状腺を含む甲状腺、胸腺。標準統計解析を用いる。
【０２８４】
［実施例１６］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の急性毒性試験
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの毒性を決定するために、下記の表９に概要を示された試験設計を、ラットにおいて企図する。
【０２８５】
【表９】
2014530001.tif 000010
【０２８６】
試験の１日目に用量を皮下注射により１回投与し、１日２回、死亡率及び瀕死率について動物を観察する。試験の開始前、加えて、試験の１日目及び１４日目の投薬前と投薬後に、全動物について心電図もまた取得する。試験の経過中、毎日、詳細な臨床観察及び体重も測定する。試験の終了時点（１５日目）に、生存している動物における血液学、凝固、臨床化学、及び検尿評価を含む臨床病理学分析もまた行う。
【０２８７】
［実施例１７］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の４週間の毒性試験
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの毒性をさらに評価するために、下記の表１０に概要を示された試験設計を、ラットにおいて企図する。
【０２８８】
【表１０】
2014530001.tif 000011
【０２８９】
群につき性別あたり６匹の動物が、神経行動学的評価について指定され、群につき性別あたり４匹の動物が呼吸機能評価について指定される。
【０２９０】
毎週（試験の１日目、８日目、１５日目、２２日目、及び２９日目）、用量を皮下又は静脈内注射により投与し、１日２回、死亡率及び瀕死率について動物を観察する。試験の経過中、毎週、詳細な臨床観察及び体重も測定する。投薬前、１日目における推定のピーク効果時点、及び初回投薬後２４時間目に、群につき性別あたり主要試験の６匹の動物が、神経行動学的評価を受ける。
【０２９１】
群につき性別あたり４匹の主要試験動物を、呼吸機能評価に供する。動物を、１日目において投薬の少なくとも２時間前に、プレスチモグラフチャンバに置く。少なくとも６０分間後、ベースラインデータを確立するために呼吸モニタリングを開始する。少なくとも１時間のベースライン記録後、動物を、投薬のためにプレスチモグラフチャンバから一時的に取り出す。投薬後すぐに、動物を、プレスチモグラフチャンバに戻し、少なくとも４時間、モニターし続ける。呼吸記録セッション中、食物及び水は入手できない。測定される呼吸機能評価項目には、呼吸数、一回換気量、及び毎分換気量が挙げられる。
【０２９２】
終了時又は回復時剖検において１回、生存している主要試験動物に、血液学、凝固、臨床化学、及び検尿評価を含む臨床病理学分析もまた行う。眼科検査もまた、試験前に全動物において、並びに終了時及び回復時に、生存している主要試験動物において、行う。
【０２９３】
毒物動態を、１日目及び２９日目に収集された血液（０．５ｍＬ）（３匹の動物／性のコホートから；２つのコホートは、３回、採血されて、６時点及び合計２１６個の試料に相当する）に基づいて測定する。主要試験動物から収集された血液試料をまた、免疫原性及び免疫表現型について予備試験し、終了時又は回復時の剖検においてもう一度、試験する（合計２８０個の試料）。全ての主要試験動物（３１日目）及び回復動物（５７日目）を剖検に供する。毒物動態試験からの動物を安楽死させ、処分する。以下の器官について重量を測定する：副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵管を含む卵巣、下垂体、前立腺、唾液腺、精嚢、脾臓、副甲状腺を含む甲状腺、胸腺、精巣、及び子宮。
【０２９４】
媒体対照群及び高用量群における全ての動物、並びに死んでいるのが見出された全ての動物について、顕微鏡的病理学によって組織を分析する。標的器官を含む標準組織一式（約６５個）を、低用量群及び中用量群、並びに全ての回復動物において顕微鏡的病理学によって分析する。任意の肉眼的病変もまた、それを示す任意の動物について顕微鏡的病理学によって分析する。
【０２９５】
データを、標準統計解析によって解析する。群間ペアワイズ比較もまた、連続的評価項目について用いられる；コクラン・マンテル・ヘンツェル検定は、カテゴリ神経行動学的評価項目についてのみ用いられる；共分散の反復測定解析は、呼吸機能評価項目に関してのみ用いられる。毒物動態学解析は、ＡＵＣ、ｔ１／２、ｔｍａｘ、及びＣｍａｘなどの標準パラメーターを含む。
【０２９６】
［実施例１８］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の心血管系安全性
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの毒性及び心血管系安全性を決定するために、下記の表１１に概要を示された試験設計を、サルにおいて企図する。
【０２９７】
【表１１】
2014530001.tif 000012
【０２９８】
群につき性別あたり２匹の動物を、心血管系評価に指定する。毎週（試験の１日目、８日目、１５日目、２２日目、及び２９日目）、用量を皮下又は静脈内注射により投与し、１日２回、死亡率及び瀕死率について動物を観察する。試験の経過中、毎週、詳細な臨床観察及び体重も測定する。心血管系評価に指定された動物を、１日目にリモートカメラを介して観察する。試験の開始前、全ての動物において、動物の理学的検査が獣医師によって行われる。試験前の全ての動物において、並びに終了時及び回復時に、生存している主要試験動物において、眼科的検査もまた行われる。
【０２９９】
心血管系評価について、群につき性別あたり２匹の主要試験動物に、圧力トランスデューサーを備えたテレメトリ送信機を外科的に埋め込む。送信機組立品は内部に固定され、液体で満たされたカテーテルが適切な動脈へ設置され、心電図リードが、心血管系（血行動態的及び心電図）データの収集を可能にするように設置される。心血管系評価に指定された動物について、動物がホームケージで自由な行動を許されながら、データが収集される。動物は、最初の投与前の少なくとも２時間、及び最初の投与後の約２０時間、連続的にモニターされる。以下のパラメーターがモニターされる：収縮期、拡張期、及び平均の動脈圧；心拍数；心電図（ＲＲ、ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴ、及びＱＴｃ）；並びに体温。
【０３００】
試験前に全ての動物を、１日目における投薬前と投薬後に、終了時剖検より前の投薬前と投薬後に、及び回復時剖検より前に、全ての生存している動物を、心電図検査に供する。心血管系評価に指定された動物について、代表的なＥＣＧトレースは、生データテレメトリ記録から印刷され、これらの動物については、１日目において、及び心血管系モニタリング期間の終わりに、予想されるピーク効果時点に追加のＥＣＧトレースが印刷される。全てのトレースは、心電図の定性評価を実施する有資格の獣医学心臓専門医によって再検討される。
【０３０１】
手術前、試験前に全ての動物において、及び終了時又は回復時の剖検の前に全ての生存している動物において、血液学、凝固、臨床化学、及び検尿評価を含む臨床病理学分析もまた行う。毒物動態は、心血管系評価に指定されていない各動物から、１日目及び２９日目に６時点において収集された血液に基づいて測定される（合計３８４個の試料）。
【０３０２】
心血管系評価に指定されていない全動物から収集された血液試料をまた、免疫原性及び免疫表現型について予備試験し、終了時及び回復時の剖検においてもう一度、試験する（合計７２個の試料）。心血管系評価に指定されていない全動物を、３１日目又は５７日目に剖検に供する。
【０３０３】
以下の器官について重量を測定する：副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵管を含む卵巣、下垂体、前立腺、唾液腺、脾臓、副甲状腺を含む甲状腺、胸腺、精巣、及び子宮。心血管系評価に指定されていない全動物について組織を顕微鏡的病理学によって分析する。標準組織一式（約７０個）を分析し、かつ任意の肉眼的病変もまた、それを示す任意の動物について顕微鏡的病理学によって分析する。
【０３０４】
データを、標準統計解析によって解析する。共分散の反復測定解析は、テレメトリデータに関してのみ用いられる。毒物動態学解析は、ＡＵＣ、ｔ１／２、ｔｍａｘ、及びＣｍａｘなどの標準パラメーターを含む。
【０３０５】
［実施例１９］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の２６週間の毒性試験
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの毒性をさらに評価するために、下記の表１２に概要を示された試験設計を、ラットにおいて企図する。
【０３０６】
【表１２】
2014530001.tif 000013
【０３０７】
毎週（合計２７回の投薬；試験の１８３日目において最終投薬）、用量を皮下又は静脈内注射により投与し、１日２回、死亡率及び瀕死率について動物を観察する。試験の経過中、毎週、詳細な臨床観察及び体重も測定する。眼科検査もまた、試験前に全動物において、並びに終了時に、生存している主要試験動物において、行う。
【０３０８】
終了時の剖検において１回、生存している主要試験動物に、血液学、凝固、臨床化学、及び検尿評価を含む臨床病理学分析もまた行う。
【０３０９】
毒物動態を、１日目及び１８３日目に収集された血液（０．５ｍＬ）（３匹の動物／性のコホートから；２つのコホートは、３回、採血されて、６時点及び合計２１６個の試料に相当する）に基づいて測定する。主要試験動物から収集された血液試料をまた、免疫原性及び免疫表現型について予備試験し、終了時の剖検においてもう一度、試験する（合計２４０個の試料）。全ての主要試験動物を（１８５日目に）剖検に供する。毒物動態試験からの動物を安楽死させ、処分する。以下の器官について重量を測定する：副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵管を含む卵巣、下垂体、前立腺、唾液腺、精嚢、脾臓、副甲状腺を含む甲状腺、胸腺、精巣、及び子宮。
【０３１０】
媒体対照群及び高用量群における全ての動物、並びに死んでいるのが見出された全ての動物について、顕微鏡的病理学によって組織を分析する。標的器官を含む標準組織一式（約６５個）を、低用量群及び中用量群において顕微鏡的病理学によって分析する。任意の肉眼的病変もまた、それを示す任意の動物について顕微鏡的病理学によって分析する。
【０３１１】
データを、標準統計解析によって解析する。毒物動態学解析は、ＡＵＣ、ｔ１／２、ｔｍａｘ、及びＣｍａｘなどの標準パラメーターを含む。
【０３１２】
［実施例２０］
脱免疫化ＶＬ二量体及びその融合物の臨床開発
本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドについての予備的な第１／２相の臨床開発計画は、下記に概要を示されているように、３ステージを含む。
【０３１３】
ステージ１は、安全性及び薬物動態（ＰＫ）を決定するために、４０人の対象を用い、２８日間にわたって、正常なボランティア（６及び２）において実施される第１ａ相の単回投与用量漸増（ＳＡＤ、single ascending dose）試験を含む。第１ａ相試験は、包括的な１８〜５５歳の４０人の健康なボランティアにおける、単一施設コホート系列法二重盲検プラセボ対照ＳＡＤ試験として設計される。治療的抗体（治験用又は他）への事前曝露を受けていない健康な成人ボランティアが選択される。試験は、連続的に高くなっている単回投与後、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの安全性及び忍容性を評価し、かつＰＫ及び薬力学（ＰＤ、pharmacodynamics）を特徴付ける。用量選択は、薬理学的活性用量からの外挿に基づく。
【０３１４】
適格の成人対象を、連続的に高くなっている単回投与における５つのコホートのうちの１つへ順々に割り当てる。コホートあたり８人の対象を、活性薬物又はマッチングプラセボを受けるように３：１の様式でランダム化する。対象を、観察及びＰＫ／ＰＤ試料採取のために、投薬前の１２時間、投薬中、及び投薬後２４時間（試験１〜２日目）、第１相ユニットにおいて拘束する。対象は、追加の安全性評価のために試験８日目（投薬から７日後）、及び試験２９日目、並びにＰＫ試料採取のためにより頻度の高い間隔で、戻る。全対象からの安全性及び入手可能なＰＫデータは、コホートにおける全対象が試験８日目の評価を完了した後に、再検討される。ＰＤは正常なボランティアにおいて評価することができるため、本試験は、ラット試験及び単回投与サル試験からのデータから導かれたＰＫ／ＰＤシミュレーションを確認することができる。
【０３１５】
ステージ２は、中等度から重度の関節リウマチ（American College of Rheumatology Criteria of 1987及び2010 Classification Systemsに基づく）を有する４０〜５０人の対象において、多施設コホート系列法二重盲検プラセボ対照試験として設計される第１ｂ相反復投与用量漸増（ＭＡＤ、multiple ascending dose）試験を含む。本試験は、皮下に投与された４回の投薬後の関節リウマチを有する対象における、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの安全性及び忍容性を評価し、かつＰＫ、ＰＤ、及び予備的な臨床効力（１４週間目におけるＡＣＲ２０／ＤＡＳ２８に基づく）を特徴付ける。
【０３１６】
毎週の一定の用量でメトトレキサートを受け続けている、適格の成人対象を、連続的に高くなっている反復投与における最高５つのコホートのうちの１つへ順々に割り当てる。コホートあたり８〜１０人の対象を、試験１日目、２９日目／４週間目、５７日目／８週間目、及び８５日目／１２週間目に活性薬物又はマッチングプラセボを受けるように３：１（又は４：１）の様式でランダム化する。対象は、安全性及びＰＫ評価のために特定された時点に、並びに効力評価のために６週間目及び１４週間目に戻る。全対象からの安全性及びＰＫデータは、全てのコホート対象が６週間目の評価を完了した後に、再検討される。適格の対象は、以下の判定基準：（ｉ）３カ月以内の関節リウマチの診断；及び（ii）ランダム化前にメトトレキサートでの少なくとも１２週間の処置を満たすが、以下の特性：（ｉ）関節リウマチ以外の自己免疫疾患；（ii）関節リウマチ以外の急性炎症性関節疾患の病歴；（iii）潜在性又は活動性結核；（iv）スクリーニング訪問前４週間以内の抗生物質、抗ウイルス剤、又は抗真菌剤での処置を必要とする発熱若しくは持続性慢性若しくは活動性再発性感染症、又は頻繁な反復性感染症の病歴；（ｖ）ランダム化訪問前３カ月以内の任意の生（弱毒化）ワクチンでの免疫化（例えば、水痘帯状疱疹ワクチン、経口ポリオ、狂犬病）；（vi）スクリーニング前１２カ月以内の結核ワクチン接種；又は（vii）算入前３カ月以内のＴＮＦインヒビター又は任意の他の生物剤での事前治療のいずれももたない。
【０３１７】
ステージ３は、中等度から重度の関節リウマチ（ACR 1987及び2010 Classification Systems）を有する約２００人の対象において、皮下に投与される本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの３つの投与計画の多施設ランダム化二重盲検プラセボ対照並行アーム試験として設計される最初の第２相試験を含む。本試験は、第３相試験のために安全かつ治療的な用量を同定する、６カ月間にわたる３つの投与計画における本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチドの安全性、忍容性、ＰＤ、及び予備的効力（１４週間目及び２６週間目におけるＡＣＲ２０及び／又はＤＡＳ２８に基づく）を評価する。
【０３１８】
毎週の一定の用量でメトトレキサートを受け続けている、適格の成人対象を、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド又はプラセボの３つの投与計画の１つを受けるように３：１様式でランダム化する。一定の用量のメトトレキサート以外のＤＭＡＲＤは、ランダム化の少なくとも４週間前に中止され、生物製剤については少なくとも１２週間前に中止される。対象は、登録前の少なくとも１２週間（少なくとも４週間、一定の用量）、毎週メトトレキサートを受ける。一定の用量の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、nonsteroidal anti-inflammatory drug）は許可される。
【０３１９】
約２００人の適格の対象は、７回の投薬について４週間ごとに活性薬物又はマッチングプラセボを受けるようにランダム化される。対象は、安全性及びＰＫ評価のために特定された時点に、並びに効力評価のために１４週間目及び２６週間目に戻る。最後の試験訪問は、２８週間目である。適格の対象は、３カ月間持続の関節リウマチの診断があることを除いて、上記で概要を示されているのと同じ判断基準を満たす。
【０３２０】
［実施例２１］
脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアントの免疫原性分析
脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＰＥＰバリアントの免疫原性分析を、Epibase IVプラットフォーム（Algonomics／LONZA）を用いて実施する。Algonomics Epibase IV（商標）は、ナイーブドナー集団代表においてＴ細胞応答を直接的に測定することにより、抗体治療用物質の免疫原性可能性を評価する。それは、タンパク質上のＴ細胞エピトープを同定し、かつタンパク質リードの免疫原性プロファイルの直接的比較を可能にする。Algonomics Epibase（商標）インシリコのツールと組み合わせて、Algonomics Epibase IV（商標）細胞アッセイは、最良のリードの選択を容易にする。脱免疫化ＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＤＩ  ＃３−ＰＥＰ  ＤＩ及びＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１−ＤＩ  ＃５−ＰＥＰ  ＤＩバリアントにより生じたＴ細胞応答の特徴付け及び比較を、ＤＣ：ＣＤ４アッセイを用いて５０人のドナー集団において実施する。野生型ＰＥＰ及び脱免疫化ＰＥＰに融合したＶＬ１８−３Ｌ−ＶＬ１１の評価もまた、実施し、対照として用いる。
【図１４】
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【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｅ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｆ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｆ】
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【図１７Ｇ−Ｉ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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