(57)【要約】  本開示は、皮膚からサンプル採取した線維芽細胞ネットワークの定量的に測定された複雑さに基づいて患者におけるアルツハイマー病をスクリーニングするための末梢性診断方法に関する。
2014526031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
（ａ）被検体から線維芽皮膚細胞の２つのサンプルを取得すること；
（ｂ）前記細胞サンプルの１つをアミロイドβペプチド（Ａβ）で処理すること；
（ｃ）Ａβ処理細胞サンプルおよび未処理細胞サンプルの各々を培地で培養すること；
（ｄ）Ａβ処理細胞サンプルおよび未処理細胞サンプルの各々を画像化して、各サンプルの少なくとも１つの画像を取得すること；
（ｅ）アルツハイマー病（ＡＤ）を有することが知られているコントロールと比べて、各サンプルの少なくとも１つの画像を少なくとも１の形態学的分析法により分析すること；および
（ｆ）工程（ｅ）の分析に基づいて被検体を診断し、ここでＡβ処理細胞サンプルおよび未処理細胞サンプルの両方がＡＤ様表現型を示す場合、診断はＡＤについて陽性であり、Ａβ処理細胞サンプルがＡＤ様表現型を示し、未処理細胞サンプルが示さない場合、診断はＡＤについて陰性であること
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｅ）が、大きい凝集体の存在、凝集体への細胞の付着、凝集体の成長の証拠、凝集体の密度（単位面積あたりの数）、凝集体ネットワーク内のエッジの出現、細胞移動の証拠、パーコレーション限界への近さ、およびこれらの組み合わせから選択される細胞凝集特性を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｅ）が、凝集体の数あたりの平均凝集体面積を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｅ）が、フラクタル次元を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｅ）が、空隙性を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｅ）が、移動する細胞の数を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）が、各サンプルの少なくとも１つの画像を分析して、細胞凝集特性、凝集体の数あたりの平均凝集体面積、フラクタル次元、空隙性、および移動する細胞の数から選択される少なくとも２つの細胞形態学特性を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）が、各サンプルの少なくとも１つの画像を分析して、細胞凝集特性、凝集体の数あたりの平均凝集体面積、フラクタル次元、空隙性、および移動する細胞の数を決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｅ）で使用された分析方法の少なくとも２つが、独立して、陽性の診断を提供する場合、前記診断がＡＤについて陽性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン、またはこれらの任意の組み合わせを含む細胞外マトリクスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、成長因子を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、ゲルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）が、Ａβ処理細胞サンプルおよび未処理細胞サンプルを約１分〜約１６８時間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）が、Ａβ処理細胞サンプルおよび未処理細胞サンプルを約２４時間〜約４８時間培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、アルツハイマー病（ＡＤ）と非アルツハイマー病認知症（非ＡＤＤ）とを識別する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ＡＤＤが、ハンチントン病およびパーキンソン病から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
被検体においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
（ａ）被検体から線維芽皮膚細胞のサンプルを取得すること；
（ｂ）前記被検体からの前記細胞を培地で培養すること；
（ｃ）前記細胞を、所定時間後に培養から取り出して、少なくとも１つの画像を取得すること；
（ｄ）コントロールと比べて少なくとも１つの画像を分析して、ノードあたりのエッジの平均数を決定し、コントロールと比べてノードあたりの少ない数のエッジが、アルツハイマー病を示すこと
を含む方法。
【請求項１８】
前記所定時間が、約１時間〜約５時間の範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記所定時間が、約１時間である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願は、２０１１年５月１２日出願の米国仮出願第６１／４８５，２５６号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、皮膚からサンプル採取した線維芽細胞ネットワークの定量的に測定された複雑さに基づいて患者におけるアルツハイマー病をスクリーニングするための末梢性診断方法に関する。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶力および認知機能の進行性の低下により特徴づけられる神経変性障害である。５百万人を超える米国人がこの進行性かつ致死的な疾患を抱えて生きていると推定されている。アルツハイマー病は、脳細胞を破壊し、それにより、記憶喪失および生活の質を低下させる思考および挙動の問題が引き起こされる。ＡＤには公知の治癒法がないが、症状に対する治療により、何百万ものＡＤに罹患している人、および彼らの家族の生活の質が改善され得る。ＡＤを早期に診断することにより、患者に、生活の質を最大にする選択を行うためおよび今後の計画を立てるための時間が与えられ、未知の問題に関する不安が減少し、かつ患者に治療の利益を得るより良い機会が提供される。
【０００４】
ＡＤの複雑さにより、早期スクリーニングに大きな課題が生じる。症候性診断または早期ＡＤの決定的な診断の前にＡＤを予測する生物学的マーカーがＡＤの検査および治療に大きな影響を及ぼす可能性がある。長期の前駆期、他の非アルツハイマー病認知症（非ＡＤＤ）との共存症およびＡＤの多因子性により、診断の成功についてさらに課題がもたらされる。
【０００５】
したがって、当技術分野では、アルツハイマー病を診断するための改良された方法に対する需要が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、速い（上の段）および遅い（下の段）ダイナミクスを例示している、マトリゲルの厚い層上のＡＤ線維芽細胞のダイナミクスを示す。凝集体がプレーティングした２４時間後および４８時間後に出現することに留意されたい。
【図２】図２は、培養したヒト皮膚線維芽ＡＤおよびＡＣ細胞の画像、ならびにＡＣ、ＡＤ、および非ＡＤＤ細胞についての統合スコア値を示す。マトリゲルにプレーティングした後のＡＤ細胞が図２Ａ（１時間）および図２Ｃ（４８時間）に示されており、プレーティングした後のＡＣ細胞が図２Ｂ（１時間）および図２Ｄ（４８時間）に示されている。スケールバー＝１００μｍ。図２Ｅは、４８時間の時点の皮膚線維芽細胞についての統合スコアについての母集団データを示す。図２Ｆは、年単位の罹患期間の関数としてＡＤ細胞についての統合スコアをプロットする。各点の下の数は、細胞株の数を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【図３】図３は、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞についての凝集体の数あたりの凝集体面積（面積／＃）分析を例示する。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれマトリゲルにプレーティングした４８時間後のＡＤおよびＡＣ線維芽細胞を示す。図３Ｃは、ＡＣ（ｎ＝１１）、ＡＤ（ｎ＝１３）、および非ＡＤＤ（ｎ＝９）についての面積／＃母集団データを示す。図３Ｄは、年単位の罹患期間の関数として面積／＃を示す。各点の下の数は、細胞株の数を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。図３Ｅおよび３Ｆは、プレーティングした４８時間後の面積および数の関数として細胞凝集体の同じ確率分布の２つの見方を示す。
【図４】図４は、凝集体の数あたりの平均凝集体面積の決定における精度を示す。図４Ａは、ＡＣ（ｎ＝１）、ＡＤ（ｎ＝１）、および非ＡＤＤ（ｎ＝２）についての結果の再現性を示す。実験は、同じ細胞株について少なくとも１ヶ月あけて行い、最初の細胞の数は１０％以内であった。図４Ｂは、最初の細胞密度の関数として凝集体の数あたりの面積をプロットし、指数関数的な関係（実線）が示されており、ＡＤがＡＣよりも急激に上昇している。エラーバーは標準偏差を示す。フィット関数は、ｆ（ｘ）＝ａ＊ｅｘｐ（ｘ／ｂ）であり、ここでＡＤについてはａ＝１１２．８およびｂ＝２２．８であり、ＡＣについてはａ＝６４．１およびｂ＝３０．５である。これは、１ｍｍ３あたり細胞５０個の細胞密度の場合に、分離がＡＤをスクリーニングするために合理的に良好であることを示唆している。
【図５】図５は、フラクタルおよび空隙性分析を例示する。図５Ａは、マトリゲルにプレーティングした１時間後のＡＣ細胞を示し（フラクタル次元＝１．７２、空隙性＝０．３７）、図５Ｂは、プレーティングした４８時間後の同じ細胞を示す（フラクタル次元＝１．０５、空隙性＝０．７５）。図５Ｃは、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞についてのフラクタル曲線を示し、回復の傾きおよび切片を、最大−最小差の２０〜８０％の範囲内の線（淡紅色）を当てはめることによってモニターした。図５Ｄは、図５Ｃに示されているフラクタル曲線ＡＤ（ｎ＝１３）、ＡＣ（ｎ＝１０）、および非ＡＤＤ（ｎ＝９）について、回復の切片に対する傾きの母集団データを示す。図５Ｅは、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞についての空隙性曲線を示し、図５Ｆは、３つの群（ＡＤ（ｎ＝７）、ＡＣ（ｎ＝６）、非ＡＤＤ（ｎ＝８））を分離するための手段としての平均空隙性を示す。
【図６】図６は、細胞移動分析を例示する。図６Ａ（ＡＤ）および図６Ｂ（ＡＣ）において、マトリゲルにプレーティングした４８時間後に自由に移動する線維芽細胞の例に緑色の点で印がつけられている。図６Ｃは、移動する細胞の数に対する移動速度を示し、緑色の四角はＡＤ（ｎ＝１０）を示し、青色の三角形は非ＡＤＤ（ｎ＝７）を示し、赤色の丸はＡＣ（ｎ＝９）を示す。青色の線は分離閾値である。図６Ｄは、年単位の罹患期間の関数として移動する細胞の数をプロットする。
【図７】図７は、ネットワーク形成および細胞凝集に対するＡβオリゴマーの効果を示す。図７Ａは、マトリゲルにプレーティングした２．５時間後のコントロール細胞株を示す。図７Ｂは、マトリゲルにプレーティングした２．５時間後の、１μＭのオリゴマー形成Ａβで一晩処理した同じコントロール細胞株を示し、ネットワーク形成の欠陥が示されている。図７Ｃは、ＡＤ様表現型を有するＡβ処理コントロール細胞株（緑色）についてのフラクタル次元を示す。図７Ｄは、ＡＤ表現型を示すＡβ処理コントロール細胞株（緑色）についての高い空隙性を示す。図７Ｅは、１μＭのＡβ処理に起因する、プレーティングした４８時間後における凝集体の数あたりの面積の増加の例を示す。
【図８】図８は、ノードの数およびノードあたりのエッジの決定を例示する。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、マトリゲルにプレーティングした１時間後の、ノード（緑色の矢印）およびノードと連結したエッジ（青色の矢印）を含むＡＤおよびＡＣネットワークの例を示す（スケールバー１００μｍ）。図８Ｃおよび８Ｄは、それぞれ、拡大率を上げた、ＡＣ細胞サンプルにおける、３つ以上のエッジおよび５つのエッジを伴うノードを示す。ＡＤ細胞の方が、ノードあたりの少ないエッジ（図８Ｅ）およびクラスターあたりの少ないノード（図８Ｆ）を示した。測定は、プレーティングした１時間後に実施した（ｎ＝１０、ｐ＜０．０３、２つのサンプルについて不等分散を用いた両側ｔ検定）。
【説明】
【０００７】
本開示の特定の側面は、以下に詳細に説明されている。本出願で使用され、本明細書で明らかにされる用語および定義は、本開示の範囲内の意味を示すものとする。本明細書で言及される特許および科学文献は、これによって参照により組み込まれる。参照により組み込まれる用語および／または定義と矛盾する場合は、本明細書において提供される用語および定義が支配する。
【０００８】
単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが示されない限り、複数への言及を含む。
【０００９】
「およそ」および「約」という用語は、参照された数または値とほぼ同じであることを意味する。本明細書で使用される場合、「およそ」および「約」という用語は、一般に、指定の量、頻度、または値の平均からの１標準偏差を包含するものと理解されるべきである。
【００１０】
本開示は、皮膚からサンプル採取した線維芽細胞ネットワークの定量的に測定された複雑さに基づいて、患者におけるアルツハイマー病をスクリーニングするための末梢性診断方法、ならびにＡＤに対する潜在的な治療薬をスクリーニングする方法に関する。本明細書に開示されている、線維芽細胞ネットワークの複雑さのダイナミクスの測定により、侵襲性が最小限である手順を用いて患者におけるＡＤを診断する新しい機会がもたらされる。本明細書に開示されている方法により、ＡＤをスクリーニングするための、現在当技術分野で公知の手段よりも正確であり、単純であり、かつ／または低費用の手段を提供することができる。
【００１１】
皮膚線維芽細胞は、アルツハイマー病（ＡＤ）の特性の同定において有用である。増加している証拠により、いわゆる脳−皮膚軸が裏付けられる。マウスおよびヒト線維芽細胞は、例えば、多能性の状態を媒介する４種の転写因子の組み合わせを有する機能的なニューロンに再プログラミングすることができる。皮膚神経系と皮膚細胞の間の相互作用が皮膚の炎症および創傷治癒に関与する。末梢皮膚線維芽細胞の概日時計は、視床下部の視交叉上核内の概日性ペースメーカーと同期する。さらに、ＡＤ患者の脳におけるアミロイド代謝の異常の皮膚（すなわち全身性の）徴候とアミロイド沈着の関連性を裏付ける証拠が存在する。例えば、プレセニリン−１は、γ−セレクターゼ複合体の主要な構成成分の１つである。プレセニリン−１の突然変異により、γ−セレクターゼ複合体のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対する活性が増大し、毒性のアミロイドベータの産生が増加し、これは、ＡＤの主要な原因のうちの１つであると考えられている。プレセニリン−１は、上皮成長因子受容体ターンオーバーにも関与する。プレセニリン−１発現の部分的喪失により、脂漏性角化症および炎症性皮膚疾患を導くことができる。
【００１２】
皮膚線維芽細胞における種々の分子的尺度により、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のＡＤ特異的欠損、および細胞外調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）シグナル伝達が示される。このシグナル伝達は、培養物中で成長させた線維芽細胞におけるカリウムチャネルのＡＤ特異的調節解除および電気的連結にも関係づけられている。細胞の機能および組織構造の調節に重要な巨大分子のアレイで構成される複雑なネットワークである細胞外マトリックスは、ＡＤ皮膚線維芽細胞では調節解除されている。さらに、家族性ＡＤ皮膚線維芽細胞を用いた遺伝子発現試験により、疾患過程は、認知の低下が発症する前に開始する可能性さえあることが示された。家族性ＡＤ線維芽細胞は、培養した線維芽細胞において過剰なアミロイドベータを産生することも見いだされた。
【００１３】
ヒト皮膚線維芽細胞ネットワークは、ＡＤ脳における神経回路網と同様に、年齢を釣り合わせたコントロール（ＡＣ）および非アルツハイマー病認知症（非ＡＤＤ）細胞と比較して複雑さの低下を示した。線維芽細胞ネットワークにおける細胞間コミュニケーションの尺度およびそれらの時空間の複雑さに対するアミロイドベータの効果を用いて、ＡＤについてスクリーニングすることができる。したがって、ヒト皮膚線維芽細胞ネットワークにより、正確なＡＤ診断および治療薬スクリーニングのために有用な脳ネットワークのモデルがもたらされる。皮膚線維芽細胞サンプルは、被検体から、穿孔生検によって、または例えばメスを使用することによって取得することができる。
【００１４】
アミロイドベータ
いくつかの態様では、ＡＤ陽性コントロールと比較するために、アミロイドベータを線維芽細胞に加えてＡＤ様表現型を刺激する。
【００１５】
「アミロイドベータペプチド」、「ベータアミロイドタンパク質」、「ベータアミロイドペプチド」、「ベータアミロイド」、「Ａ．ベータ」および「Ａ．ベータペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの形態では、アミロイドベータペプチド（例えば、Ａ．ベータ３９、Ａ．ベータ４０、Ａ．ベータ４１、Ａ．ベータ４２およびＡ．ベータ４３）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と称されるより大きな膜貫通糖タンパク質の３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内部断片である。ＡＰＰには多数のアイソフォーム、例えば、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０が存在する。現在ヒトにおいて存在することが知られているＡＰＰの特定のアイソタイプの例は、Ｋａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ、３２５：７３３−７３６、１９８７）に記載されている、「標準の」ＡＰＰと称される６９５アミノ酸ポリペプチド；Ｐｏｎｔｅら（Ｎａｔｕｒｅ、３３１  ：５２５−５２７、１９８８）およびＴａｎｚｉら（Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５２８−５３０、１９８８）に記載されている７５１アミノ酸ポリペプチド；ならびにＫｉｔａｇｕｃｈｉら（Ｎａｔｕｒｅ、３３１  ：５３０−５３２、１９８８）に記載されている７７０アミノ酸ポリペプチドである。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにおける、異なるセレクターゼ酵素によるＡＰＰのタンパク質プロセシングの結果として、Ａ．ベータは４０アミノ酸の長さの「短い形態」と、４２〜４３アミノ酸にわたる長さの「長い形態」の両方で見いだされる。ＡＰＰの疎水性ドメインの一部はＡ．ベータのカルボキシ末端において見いだされ、特に長い形態の場合に、Ａ．ベータの凝集する能力の原因となる。Ａ．ベータペプチドは、正常な個体とアミロイド形成性障害に罹患している個体の両方を含めたヒトおよび他の哺乳動物の体液、例えば脳脊髄液において見いだすことができる、またはそれから精製することができる。
【００１６】
「アミロイドベータペプチド」、「ベータアミロイドタンパク質」、「ベータアミロイドペプチド」、「ベータアミロイド」、「Ａ．ベータ」および「Ａ．ベータペプチド」という用語は、ＡＰＰのセレクターゼ切断によって生じるペプチドおよび切断産物と同じまたは基本的に同じ配列を有する合成ペプチドを包含する。本開示のために適したＡ．ベータペプチドは、これらだけに限定されないが、組織、細胞株および体液（例えば、血清および脳脊髄液）を含めた、種々の供給源に由来してよい。例えば、Ａ．ベータは、ＡＰＰ発現細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、Ｗａｌｓｈら（Ｎａｔｕｒｅ、４１６：５３５−５３９、２００２）に記載の細胞に由来してよい。Ａ．ベータ調製物は、例えば、組織供給源に由来してもよく（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１５５０、１９９７を参照されたい）、当技術分野で公知の方法によって合成することもできる（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、ｅｄ．Ｇｒａｎｔ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、７７頁を参照されたい）。したがって、ペプチドは、自動化メリフィールド固相合成技法を用いて、側鎖が保護されたアミノ酸を使用したｔ−ＢｏｃまたはＦ−ｍｏｃ化学作用のいずれかによって保護されたａ−アミノ基を用いて、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ４３０Ａまたは４３１で合成することができる。より長いペプチド抗原は、公知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。例えば、ペプチドまたは融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成または分子的にクローニングし、トランスフェクションおよび適切な宿主細胞による異種発現のために適切な発現ベクターに挿入することができる。Ａ．ベータペプチドとは、正常な遺伝子のＡ．ベータ領域における突然変異によって生じる関連Ａ．ベータ配列も指す。
【００１７】
細胞形態におけるアミロイドベータ誘導性異常を、アルツハイマー病の存在または不在のいずれかの確認試験として用いることができる。例えば、陰性アミロイドベータ−指標反応は疾患の存在を示す可能性があり、一方、陽性反応は疾患の不在を示す可能性がある。すなわち、インキュベートした際またはアミロイドベータペプチドと接触させた際に細胞においてＡＤ形態の表現型が誘導されれば、それにより、試験細胞または試験されている被検体におけるＡＤの不在が示される。対照的に、インキュベートした際またはアミロイドベータペプチドと接触させた際に細胞において表現型の変化がほとんどまたは全く誘導されなければ（すなわち、ネットワークの複雑さの測定値に統計的に有意な変化がなければ）、それにより、試験細胞または試験されている被検体におけるＡＤの存在が示される。
【００１８】
本発明では、アミロイドベータ（１−４２）（すなわち、Ａβ（１−４２））、ならびに／または、これらだけに限定されないが、（１−３９）、（１−４０）、（１−４１）、（１−４３）、（２５−３５）、（１６−２２）、（１６−３５）、（１０−３５）、（８−２５）、（２８−３８）、（１５−３９）、（１５−４０）、（１５−４１）、（１５−４２）、および（１５−４３）を含めた任意の他のアミロイドベータ断片を用いることができる。
【００１９】
細胞培養
ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞（複数可）または細胞サンプル（複数可）は、タンパク質混合物、例えば、ゼラチン質タンパク質混合物を含む培地で培養またはインキュベートすることができる。少なくともいくつかの態様では、細胞を、アミロイドベータを加えた後に培養する。
【００２０】
いくつかの態様では、培養培地は調製物を含む。いくつかの態様では、調製物は可溶化されている。少なくとも１つの態様では、調製物は、腫瘍、例えばＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に富んでいる。そのような調製物は、例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ニドゲンの少なくとも１つを含んでよい。本開示のために適した非限定的な例はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）であり、これはＥＨＳマウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン質タンパク質混合物の商品名（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。この混合物は、多くの組織に見いだされる複雑な細胞外の環境と似ており、細胞培養の培養基として使用することができる。マトリゲルは、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１を含む。３７℃でマトリゲルは重合して、哺乳動物細胞基底膜と似た、生物活性のあるマトリックス材料を生じる。
【００２１】
本開示のいくつかの態様では、調製物は、ＴＧＦ−ベータ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、および／または腫瘍において天然に見いだされてもよく見いだされなくてもよい他の成長因子をさらに含む。いくつかの態様では、ＴＧＦ−ベータ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、および／または他の成長因子は、腫瘍、例えば、ＥＨＳマウス肉腫腫瘍において天然に見いだされる。ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＧＦＲ）は、例えば、より高度に定義されたゲル培養基の基底膜調製物を必要とする適用のために適する可能性がある。
【００２２】
調製物は、正常および形質転換された足場依存性類上皮細胞および他の細胞型の両方の付着および分化のために有効なＥＣＭタンパク質調製物を含んでよい。例示的な細胞型としては、これらだけに限定されないが、ニューロン、肝細胞、セルトリ細胞、ニワトリ水晶体、および血管内皮細胞が挙げられる。ＥＣＭタンパク質調製物は、成体ラット肝細胞ならびにマウスおよびヒト乳房上皮細胞における三次元培養物における遺伝子発現に影響を及ぼす可能性がある。調製物は、例えば、腫瘍細胞の浸潤アッセイのための基礎としての機能を果たし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける末梢神経再生を支持し、かつ／または血管新生をｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で試験するための培養基をもたらす。ＥＣＭタンパク質は、免疫抑制マウスにおけるヒト腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏでの繁殖も支持することができる。
【００２３】
本開示のいくつかの態様では、冷却したＥＣＭタンパク質の体積を組織培養実験器具上に分配する。本明細書で使用される場合、「冷却した」という用語は、室温未満、例えば、約１５℃未満、約１０℃未満、約５℃未満の温度、例えば約４℃の温度を指す。高い温度でインキュベートすると、ＥＣＭタンパク質は自己組織化して、実験器具の表面を覆う薄膜を生じる可能性がある。本明細書で使用される場合、「高い」という用語は、室温を超える温度、例えば、約２０℃超、約２５℃超、約３０℃超、約３５℃超、例えば、およそヒトの平均体温である約３７℃の温度を指す。
【００２４】
ＥＣＭタンパク質上で培養した細胞により、他のやり方では観察することが難しい複雑な細胞の挙動を実験室条件下で実証することができる。例えば、内皮細胞は、ＥＣＭタンパク質で覆われた表面では複雑なクモの巣様ネットワークを創出することができるが、プラスチック表面上ではそれを創出することができない。そのようなネットワークは、生きている組織を血液で覆う微小血管毛管系を示唆し、したがって、ＥＣＭタンパク質はそのプロセスの観察に役立つ。
【００２５】
いくつかの態様では、より大きな体積のＥＣＭタンパク質を使用して、細胞を培養するための厚い三次元ゲルを作製する。例えば、厚いゲルは、細胞を、表面からゲルの内部に移動するように誘導することにおいて有用であり得る。いくつかの態様では、この移動性挙動は、腫瘍細胞転移についてのモデルとしての機能を果し得る。いくつかの態様では、培養培地は、厚さが約１．０ｍｍ〜約２．０ｍｍ、例えば、約１．５ｍｍまたは約１．８ｍｍの層を含む。培養培地の量は、関係式Ｖ＝（πｒ２）ｈ（式中、ｈは層の厚さであり、ｒは半径である）に従って、ウェルプレート中の体積（Ｖ）として表すこともできる。いくつかの態様では、例えば、培養培地の体積は、約４００μｌ〜約８００μｌの範囲、例えば、約７００μｌであってよく、ｒ＝１１．０５ｍｍである。
【００２６】
理論に束縛されることなく、ＥＣＭタンパク質の、複雑な細胞挙動を刺激する能力は、不均一な組成に起因する可能性があると考えられている。いくつかの態様では、ＥＣＭタンパク質の主要な構成成分は、構造タンパク質、例えば、ラミニンおよびコラーゲンであり、これは培養細胞に、それらの天然の環境において遭遇する接着性ペプチド配列を与える。本開示のいくつかの態様では、多くの細胞型の分化および増殖を促進させることができる成長因子を使用する。ＥＣＭタンパク質は、多数の他のタンパク質も少量含有してよい。
【００２７】
培養物において１〜２時間以内に、皮膚線維芽細胞は連結して測定可能なネットワークを形成することができる。この状態により、細胞形態、細胞の生化学的機能、細胞の運動性または侵入、および／または遺伝子発現を試験するための生理的に関連性のある環境がもたらされる。これらのネットワークは経時的に変性し（例えば、約５時間から約４８時間まで）、ノード間のエッジ（連結）は退縮して測定可能な凝集体が残る。細胞（複数可）および／または細胞線維芽細胞ネットワークが変化するにつれ、画像を取得して定量的、定性的、および半定量的情報を収集することができる。本開示のいくつかの態様では、画像を、培養の約２０分後、約３０分後、約４５分後、約１時間後、約１．５時間後、約２時間後、約２．５時間後、約３時間後、約５時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約２４時間後、約３６時間後、約４８時間後、約６０時間後、または、さらには約７２時間以上後に取得する。図１は、マトリゲルの厚い層（１．８ｍｍ）上にプレーティングしたＡＤ細胞についての線維芽細胞のダイナミクスの例を示す。ＡＣ細胞株は同様のダイナミクスを示すが、ＡＣ細胞株はより多数のより小さい凝集体を示す傾向がある（例えば、例１および図２Ｄ、３Ｂ、５Ｂ、および６Ｂを参照されたい）。
【００２８】
いくつかの態様では、画像（複数可）の特定の特性に、線維芽細胞ネットワークダイナミクスのパターンを定量的に評価するための１以上の以下の方法に従って値を割り当てることができる。
【００２９】
１．統合スコア
表１に列挙されている８つのパラメータを使用して、培養後（例えば、マトリゲルにプレーティングした４８時間後）のＡＤ細胞をＡＣ、非ＡＤＤ細胞と分離する。
【表１】
2014526031.tif 000003
【００３０】
これらの８つのパラメータから、半定量的スコア（「統合スコア」）を以下の通り算出する。最初の４つのパラメータ（１〜４）は、アルツハイマー病に特異的であり、各々のスコアは、存在する場合が「−１」であり、不在の場合が「０」である。最後の４つのパラメータ（５〜８）は非ＡＤＤおよびＡＣに特異的であり、スコアは、存在する場合が「＋１」であり、不在の場合が「０」である。統合スコアを、８つの値全ての合計として算出する。統合スコアが正またはゼロである場合、細胞はＡＣまたは非ＡＤＤである。統合スコアが負である場合、細胞はＡＤである。いくつかの態様では、公知の画像処理技法を用いて方法を完全に自動化することができる。
【００３１】
本開示のいくつかの態様では、統合スコアを使用して、ＡＤ線維芽細胞を、年齢を釣り合わせたコントロール（ＡＣ）および／または非アルツハイマー認知症（非ＡＤＤ）から分離する。いくつかの態様では、統合スコアを、培養の（例えば、マトリゲルにプレーティングした）４８時間後に取得した細胞画像について算出する。
【００３２】
本開示のいくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞についての統合スコアが未処理試験細胞についての統合スコアよりも低い場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。いくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞とＡＤコントロール細胞の間の統合スコアの差異が統計的に有意ではない、すなわち、標準偏差が２以上である場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。
【００３３】
２．凝集体の数あたりの面積
統合スコアに使用するパラメータ４および５を凝集体の数あたりの凝集体面積（＜面積＞／凝集体の数）として表して、形態のより定量的な尺度をもたらすこともできる。ＡＤ細胞は、より大きな、孤立した凝集体を形成する傾向があるが、正常コントロールおよび非ＡＤＤ線維芽細胞は、多数のより小さな凝集体を形成する傾向がある。したがって、＜面積＞／凝集体の数の値は、一般に、ＡＤ細胞ではＡＣおよび／または非ＡＤＤ細胞よりも相当に高い。
【００３４】
＜面積＞／凝集体の数は、各画像から、比＜Ａ＞ｉ／Ｎｉを平均することによって決定された平均凝集体面積＜Ａ＞ｉおよび凝集体の数Ｎｉから算出することができる。例えば、例１．３および図３Ｃを参照されたい。これは、任意の適切な方法、例えば、凝集体全体にわたって楕円を当てはめることによって行うことができる。次いで、凝集体を画像上で計数することができる。計数および／または面積の算出は、手動で行うこともでき、例えば画像処理技法によって自動化することもできる。
【００３５】
本開示のいくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞についての＜面積＞／凝集体の数が未処理試験細胞についての＜面積＞／凝集体の数を超える場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。いくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞とＡＤコントロール細胞の間の＜面積＞／凝集体の数の差異が統計的に有意ではない場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。
【００３６】
３．フラクタル次元
ヒト皮膚線維芽細胞ネットワークの複雑さは、それらのフラクタル次元を計算することによって数量化することができる。フラクタル分析では、ネットワークの複雑さを、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞を区別するための手段として利用する。ＡＤに罹患している患者から取得した線維芽細胞は、組織培養物中で成長させた際に、ＡＣ細胞よりも統計的に有意に低いフラクタル次元を有する。フラクタル次元によって測定されるネットワークの複雑さも、ＡＤから取得した線維芽細胞ではＡＣおよび非ＡＤＤ線維芽細胞と比較して著しく異なる。したがって、ＡＤの場合の低下したヒト皮膚線維芽細胞ネットワークの複雑さによりＡＣおよび非ＡＤＤの場合との違いがもたらされる。
【００３７】
ネットワーク変性（例えば、約４８時間）後、細胞は移動し、数日以内に集密に到達する。この回復はフラクタル次元における直線的増加によって捕捉される。したがって、フラクタル曲線の傾きおよび切片によって測定される回復は、ＡＤ、非ＡＤＤ、およびＡＣ細胞の間の数量化できる差異を示す。
【００３８】
フラクタル次元は、Ｎ（ｓ）＝（１／ｓ）Ｄ（式中、Ｄは次元であり、整数であっても非整数であってもよい）に一般化することができる。両側の対数を取ることにより、ｌｏｇ（Ｎ（ｓ））＝Ｄ  ｌｏｇ（１／ｓ）が得られ、したがって、フラクタル次元は、ｌｏｇ（Ｎ（ｓ））をｌｏｇ（１／ｓ）に対してプロットすることによって決定することができる。傾きが非整数である場合、次元は分数（フラクタル）次元である。
【００３９】
フラクタル次元は、生の画像（例えば、デジタル画像）を例えば、２つのガウスの差異を用いるエッジ検出手順を通して選別した後に、標準のボックスカウント手順を用いて算出することができる。エッジ検出とは、画像処理の分野、特に特徴検出および特徴抽出の分野において使用される用語であり、デジタル画像内の、例えば、画像の輝度が急激に変化する点または他の不連続性を有する点を同定することを目的とするアルゴリズムを指す。
【００４０】
画像形成モデルについてのどちらかといえば一般的な仮定の下で、画像の輝度の不連続性は、深さの不連続性、表面方向の不連続性、材料の性質の変化およびシーン照明の変動のうちの１以上に対応する可能性があることを示すことができる。
【００４１】
エッジ検出器を画像に適用することにより、対象の境界、表面マーキングの境界を示す一連の連結曲線ならびに表面方向の不連続性に対応する曲線を導くことができる。したがって、エッジ検出器を画像に適用することにより、処理すべきデータの量を有意に減少させることができ、したがって、関連性が低いとみなすことができる情報を選別して取り除き、一方で画像の重要な構造的性質を保存することができる。エッジ検出工程に成功した場合、したがって、元の画像内の情報の内容を解釈するという次の課題が実質的に簡易化される。
【００４２】
エッジ検出のための方法は、一般に、２つのカテゴリー：検索に基づくものおよびゼロ交差に基づくものに群分けすることができる。検索に基づく方法では、エッジを、まずエッジ強度の尺度、通常一次導関数式、例えば勾配の大きさを計算し、次いで勾配の大きさの局所方向の極大を、エッジの局所方向、通常、勾配方向の計算された推定値を用いて検索することによって検出する。ゼロ交差に基づく方法では、エッジ、通常ラプラシアンのゼロ交差または非線形の示差的な発現のゼロ交差を見いだすために、画像から計算された二次導関数式においてゼロ交差を検索する。エッジ検出のための前処理工程として、平滑化段階、例えば、ガウス平滑化を適用することができる。他の態様では、ノイズ選別アルゴリズムを用いることができる。
【００４３】
公開されているエッジ検出方法は、適用される平滑化フィルターの種類およびエッジ強度の尺度の計算の仕方が主に異なる。多くのエッジ検出方法は画像勾配の計算に依拠しているので、ｘ方向およびｙｙ方向に勾配推定値を計算するために使用するフィルターの種類も異なる。
【００４４】
本開示の一態様では、フラクタル次元を、画像をボックスで、例えば、コンピュータによって覆うボックスカウント手順を用いて決定する。目的は、画像を覆うために必要なボックスの数がボックスのサイズでどのように変化するかを決定することである。対象が１次元、例えば、線である場合、関係式は上記の通りＮ（複数可）＝（１／ｓ）１であり、より高い次元についても同様である。いくつかの態様では、ボックスカウント手順は、コンピュータで、細胞サンプルのデジタル画像を用いて実行する。
【００４５】
本開示のいくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞についてのフラクタル次元が未処理試験細胞についてのフラクタル次元よりも低い場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。いくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞とＡＤコントロール細胞の間のフラクタル次元の差異が統計的に有意ではない場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。
【００４６】
４．空隙性
本明細書で使用される場合、「空隙性」とは、どのくらいのフラクタルが空間を満たしているかの尺度を指す。空隙性を使用して、同じフラクタル次元を共有する可能性があるが、非常に視覚的に異なると思われるフラクタルおよびテクスチャーをさらに分類する。密集したフラクタルは低い空隙性を有する。フラクタルの粗さが増加するにつれて、空隙性も増加する；空隙が「ギャップ」を意味することから直感的に（ギャップが多い＝空隙性が高い）。空隙性は、一般にはＬ：
【数１】
2014526031.tif 000004
【００４７】
で表される。
【００４８】
空隙性は、細胞ネットワーク内のギャップを数量化する、複雑さを識別するための補足的な尺度である。ＡＤ細胞株は、ＡＣおよび非ＡＤＤ個体からの細胞株と比較して増加した平均空隙性を示す。
【００４９】
現在開示されている空隙性分析方法では、線維芽細胞パターンのギャップを、第２の識別のレベルとして使用する複雑さの補足的な尺度として数量化する。平均空隙性は、ＡＤ線維芽細胞でＡＣおよび非ＡＤＤ線維芽細胞と比較して高い。一般には、ネットワークが変性する際の空隙性の増加およびピークが最大である、すなわち、孤立した凝集体のみが可視である。空隙性はネットワークの再生が開始すると急降下する。
【００５０】
本開示のいくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞についての空隙性が未処理試験細胞についての空隙性を超える場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。いくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞とＡＤコントロール細胞の間の空隙性の差異が統計的に有意ではない場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。
【００５１】
５．細胞移動
細胞移動により、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞を区別することが可能になる。自由に移動する細胞は、凝集体に付着していない細胞と定義される。自由に移動する細胞は、培養している間の違う時間に計数することができる。例えば、時間Ｎ１およびＮ２について、移動速度をＲ＝（Ｎ２−Ｎ１）／ΔＴ（式中、ΔＴは細胞移動の計数間の時間間隔である）として算出する。例えば、いくつかの態様では、自由に移動する細胞の数は、プレーティングした約２４時間後、例えば、プレーティングした約３６時間後、約４８時間後、約５０時間後、約５２時間後、約５５時間後、約５７時間後、または約６０時間後に計数することができる。少なくとも１つの態様では、移動速度を、時間Ｎ１＝プレーティングした４８時間後およびＮ２＝プレーティングした５５時間後について計数する。いくつかの態様では、最初の細胞密度を制御する。少なくとも１つの態様では、最初の細胞密度を約１ｍｍ３あたり細胞５０個に調節する。
【００５２】
本開示のいくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞についての移動する細胞の数が未処理試験細胞についての移動する細胞の数よりも少ない場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。いくつかの態様では、Ａβ処理試験細胞とＡＤコントロール細胞の間の移動する細胞の数の差異が、平均からの１標準偏差よりも低い場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。少なくとも１つの態様では、約０．３ｈｒ−１より低い移動速度により、ＡＤが示される。
【００５３】
上記の５つの分析方法（すなわち、統合スコア、凝集体の数あたりの面積、フラクタル次元、空隙性、および細胞移動）は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。いくつかの態様では、例えば、統合スコアおよび凝集体の数あたりの面積を算出する。別の態様では、例えば、フラクタル分析、空隙性分析、および細胞移動分析の組み合わせを用いる。別の態様では、統合スコアおよび凝集体の数あたりの平均凝集体面積を、フラクタル分析、空隙性分析、および／または細胞移動分析を適用することに加えて算出する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法では、ＡＤ細胞のＡＣ細胞からのスクリーニングだけでなく、ＡＣ細胞の非ＡＤＤ細胞、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）および／またはパーキンソン病（ＰＤ）からのスクリーニングもなされる。
【００５４】
いくつかの態様では、分析方法の２つ以上により、それぞれ独立にＡＤに対する陽性の診断が与えられた場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。他の態様では、全ての分析方法（例えば、２つの異なる技法、３つの異なる技法、４つの異なる技法、または５つの異なる技法）により、それぞれ独立にＡＤに対する陽性の診断が与えられた場合、ＡＤについて陽性の診断がなされる。
【００５５】
本開示のいくつかの態様では、上記の変数のいずれかについて特定の多数の母集団標準偏差（複数可）に診断閾値を設定することによって、偽陽性および／または偽陰性を回避し、かつ／または最小限にすることができる。
【００５６】
細胞間コミュニケーションの尺度としての形態学的分析
線維芽細胞ネットワークの複雑さの分析により、細胞間コミュニケーションに関する情報がもたらされる。ネットワークは天然に遍在し、相互作用、例えば、インターネット上のコンピュータ間の相互作用、生物体内のニューロン間の相互作用、送電網内のエレメント間の相互作用、および人々の間の相互作用から生じる連結性を理解するための枠組みをもたらす。ＡＤでは、神経細胞ネットワークは、シナプスの損失に起因して次第に撹乱される。ヒト皮膚線維芽細胞ネットワークも、ＡＤ脳の神経回路網と同様に、撹乱し、定量的、物理的尺度、例えば、ノードあたりのエッジの数またはクラスターあたりのノードの数によって特徴付けることができる。ノードとは、連結点（例えば、再分布点またはコミュニケーション終点）であり、エッジとは、２つのノード間の連結である。クラスターまたはサブネットワークとは、他のノードと連続的に連結したノードの群である。
【００５７】
培養細胞サンプルにおけるノードあたりのエッジの数は、細胞間コミュニケーションの尺度として計数することができる。いくつかの態様では、培養細胞のノードあたりのエッジの数を所定期間、例えば、プレーティングした約１時間〜５時間後の範囲の時間に計数する。少なくとも１つの態様では、ノードあたりのエッジの数をプレーティングした約１時間後に計数する。
【００５８】
本明細書の方法には線維芽細胞が記載されているが、他の細胞、例えば血液細胞または神経系細胞の形態学的分析も意図されている。
【００５９】
以下の例は、本開示を、全く限定することなく例示することを意図している。当業者には、本明細書において提供される本開示と一致する追加的な態様が構想されることが理解される。
【実施例】
【００６０】
例１．ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞の比較
１．１：細胞の調製および画像診断
実験を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）からの３３のヒト皮膚線維芽細胞を使用して行った（表２および３）。
【表２】
2014526031.tif 000005
【表３】
2014526031.tif 000006
【００６１】
細胞を１２ウェルプレート上のマトリゲルの厚い層（約１．８ｍｍ）上にプレーティングした。分析した細胞株（３０／３３）は、大部分が剖検または遺伝家族歴のいずれかに基づいてよく特徴付けられた（表２）。診療所から新たに取得した線維芽細胞で同様の結果が得られた。
【００６２】
最初の細胞密度を１ｍｍ３あたり細胞５０個になるように制御し、各ウェルについて１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を伴うダルベッコ改変イーグル培地１．５ｍｌでホモジナイズした。細胞をＣＯ２水ジャケットインキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、プレーティングした７日後まで保持した。
【００６３】
細胞ネットワークの画像を、コンピュータによって制御された倒立顕微鏡を１０×対物レンズを使用してコンピュータに取り込んだ。図１を参照されたい。一般には、細胞株当たり３つのウェルで、ウェル当たり５つの画像を取得した。画像を１日目は毎時、２日目は１時間おきに、残りの３日は１日３回獲得した。画像を、ＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）からの自由に利用可能なソフトウェアであるＩｍａｇｅＪを用いて処理した。フラクタルおよび空隙性分析をＦｒｃＬａｃ＿２．５ｐｌｕｇｉｎを用いて行った。カスタムスクリプトを自動画像分析のために書き込んだ。凝集体を、Ｍｉｃｒｏｎ２．０ソフトウェアを使用して楕円に手動で当てはめ、それらの面積および数を記録した。ＩｍａｇｅＪのために開発した自動スクリプトは手動の楕円当てはめと一致し、これらの２つの手法は互いに１標準偏差以内であった。
【００６４】
１．２：統合スコア
例１．１に記載の通り調製した２つの細胞株の典型的な皮膚線維芽細胞ネットワーク形成および変性を示す画像が図２Ａ〜２Ｄに示されている。ＡＤ細胞株（図２Ａ）はネットワークの形成が、年齢を釣り合わせたコントロールと比較して遅かった（図２Ｂ）。これらのネットワークのエッジはプレーティングしたおよそ５時間後に変性し始め、最終的に消失するまで次第に薄くなった。エッジ退縮の結果として、ネットワークのノードのみが細胞凝集体のままであった。凝集体はプレーティングした２４時間後すぐに可視であった。図２Ｃおよび２Ｄは、それぞれＡＤ細胞およびＡＣ細胞について４８時間の時点で取得した画像を示す。
【００６５】
８つのパラメータを使用して、マトリゲルにプレーティングした４８時間後に、統合スコア（８つの値全ての合計）を算出することによってＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ線維芽細胞を区別した。正の統合スコアまたはゼロのスコアは、細胞がＡＣまたは非ＡＤＤであることを示し、負の統合スコアは細胞がＡＤの患者由来であることを示す。
【００６６】
プレーティングした４８時間後における皮膚細胞線維芽細胞の統合スコアの母集団データは、ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤ細胞の良好な分離を示す（図２Ｅ）。統合スコアは、アルツハイマー病の持続時間と相関すると思われ、罹患期間が増加するにつれて負が大きくなる（図２Ｆ）。
【００６７】
１．３：凝集体の数あたりの平均面積
診断の正確度は、統合スコアからの８つのパラメータのうち２つが凝集体の数あたりの平均凝集体面積（＜面積＞／凝集体の数）の尺度で表した場合に増加した。この値を算出するために、まず平均凝集体面積＜Ａ＞ｉおよび凝集体の数Ｎｉを各画像について算出した。次いで、比率＜Ａ＞ｉ／Ｎｉを評価した。一般にはウェル当たり５つの画像を使用し、各ウェルについて数当たりの平均面積を、
【数２】
2014526031.tif 000007
【００６８】
に従って決定した。３つのウェルを、
【数３】
2014526031.tif 000008
【００６９】
に従って平均し、この数は図３Ｃに各細胞株について示されている。この尺度は、ＡＤでＡＣおよび非ＡＤＤよりも相当高かった（診断の正確度９６％、Ｎ＝３３（ｎＡＤ＝１３、ｎＡＣ＝１１、およびｎ非ＡＤＤ＝９）、ＡＤ対ＡＣについてｐ＜０．０００００１、ＡＤ対非ＡＤＤについてｐ＜０．００００１）。
【００７０】
ＡＤ細胞は大きな孤立した凝集体（図３Ａおよび５Ａ）を示すが、正常コントロール（ＡＣ）および非ＡＤＤ線維芽細胞は多数のより小さな凝集体を示す（図３Ｂおよび５Ｂ）。
【００７１】
母集団データ（図３Ｃ）はＡＣ、非ＡＤＤ、およびＡＤの間で重複を示さない。＜面積＞／凝集体の数は、ＡＤ罹患期間に伴って増加した（図３Ｄ）。４８時間における面積および数に応じた細胞凝集体の確率分布はＡＤ群（ｎ＝１３）がＡＣ群（ｎ＝１１）からよく分離されていることを示す。面積および凝集体の数についての値を点の密度に反比例する間隔でビンに入れ、各変数についてガウス関数に当てはめ、次いで正規化した分布に組み込んだ。ＡＤ集団についてのピーク確率値はＮ＝５、Ａｒｅａ＝１２３７０においてであり、一方ＡＣ集団はＮ＝８、Ａｒｅａ＝１００４のピークを有した。ＡＣ集団についての標準偏差はσＮ＝２．３、σ面積＝４５１であり、一方ＡＤ集団ではσＮ＝２．６、σ面積＝５０００であった。これらの標準偏差は、凝集体の数についての確率分布はいくつかの重複を有するが、領域についての確率分布は半値幅で重複を有さないことを示している。したがって、ＡＤ集団とＡＣ集団の可分性を増加させる単純な方法は、２つの変数を、面積／数として割ることによって１つに崩すことである。このように、ダイナミックレンジを、Ｎについて８／５＝１．６、および面積について１２３７０／１００４＝１２．３から、面積／Ｎについて１９．７まで増加させる。結果の再現性が図４に示されている。
【００７２】
＜面積＞／凝集体の数について同様の結果を、診療所からの４つの新鮮なサンプルについて取得した。新鮮なサンプルについての異なる細胞型（例えば、ＡＣおよびＡＤ）についての閾値は、Ｃｏｒｉｅｌｌサンプル（面積／＃約１０００）と比較して高い（面積／＃約２０００）と思われる。図４Ａを参照されたい。
【００７３】
ＡＣ細胞は、非ＡＤＤ細胞から、フラクタル分析（例１．４）、空隙性分析（例１．５）、および細胞移動分析（例１．６）によってさらに区別することができる。
【００７４】
１．４：フラクタル次元分析
時空間の複雑さのダイナミクス、例えば、ネットワーク形成（図５Ａ）、ネットワーク変性（図５Ｂ）および回復は、フラクタルおよび空隙性曲線（図５Ｃおよび５Ｄ）によって測定することができる。これらの物理的パラメータによって測定されたＡＤ線維芽細胞ネットワークは、ＡＣおよび非ＡＤＤネットワークと比較して複雑さが著しく低かった。ネットワーク変性の後（約４８ｈ、図５Ｂ）、細胞は移動し、数日以内に集密に近づいた。この回復は、図５Ｃに示されているように、フラクタル次元における直線的増加で捕捉された。フラクタル次元を時間に応じて追跡する各曲線の傾き対切片は３つの群ＡＣ、ＡＤ、および非ＡＤＤで著しく異なる（９６％の正確度、ｎ＝３３（ｎＡＤ＝１３、ｎＡＣ＝１０、ｎ非ＡＤＤ＝９）；ＡＤ対ＡＣについてｐ＜０．０００１、およびＡＤ対非ＡＤＤについてｐ＜０．００００１）。フラクタル分析では、ＡＤおよびＡＣ、非ＡＤＤ細胞だけでなく、ＡＣ細胞と非ＡＤＤ細胞も識別される（ｐ＜０．０１）（図５Ｆ）。
【００７５】
１．５：空隙性分析
空隙性とは、フラクタル次元に対する補足的な尺度である。空隙性は、線維芽細胞パターンにおけるギャップを数量化する第２の複雑さの識別のレベルとして使用する。線維芽細胞の平均空隙性は、ＡＤ患者から取得した線維芽細胞でＡＣおよび非ＡＤＤ線維芽細胞と比較して高かった。一般には、空隙性は、ネットワーク変性が最大になった時、すなわち、４８時間の時点付近で孤立した凝集体のみが可視である時に増加し、ピークに達した（図５Ｂおよび５Ｄ）。空隙性は、細胞が移動し、より集密になるにつれて減少した。図５Ｆにおける母集団データは、平均空隙性により、フラクタル分析と同様、ＡＤおよびＡＣ、非ＡＤＤ細胞だけではなく、ＡＣ細胞と非ＡＤＤ細胞も識別されたことを示している（ｐ＜０．０１）。
【００７６】
１．６：細胞移動
自由に移動する細胞を、４８時間後（Ｎ１）およびおよそ７時間後（Ｎ２）に計数し、移動速度をＲ＝（Ｎ２−Ｎ１）／ΔＴ、ΔＴ＝数値間の時間間隔として算出した。自由に移動する細胞（すなわち、凝集体に付着していない細胞）は図６Ａ（ＡＤ細胞）および６Ｂ（ＡＣ細胞）において緑色の点で示されている。移動する細胞の数は、ＡＤ線維芽細胞で正常コントロールと比較して減少した。
【００７７】
図６Ｃにおける母集団データは、ＡＤ線維芽細胞（緑色）および非ＡＤＤ線維芽細胞（青色）がＡＣ線維芽細胞と比較して有意に少ない移動する細胞および低い移動の速度を有することを示している。ＡＤ線維芽細胞（緑色）は、最小の移動する細胞の数および最低の移動速度を示し、一方ＡＤ線維芽細胞（赤色）は最大の移動する細胞の数および最高の移動速度を示した。興味深いことに、非ＡＤＤ線維芽細胞は（１つの例外を伴って）ＡＤ細胞およびＡＣ細胞から分離された。また、移動する細胞の数は、図６Ｄに示されているように、アルツハイマー病の持続時間が増加するとともに減少すると思われた。
【００７８】
１．７：正確度、特異度、および感度
５つの分析方法（例１．２〜１．６）により、診断の正確度について、平均空隙性についての９５％から凝集体の数あたりの平均面積についての１００％までにわたり平均率９６．８％（表４）がもたらされた。統合スコアおよびフラクタル分析（傾き対切片）について、成功率は９７％であり、一方細胞移動についての成功率は９６％であった。
【００７９】
感度は、疾患を有する患者の一群に適用した場合に該方法が陽性である確率、Ｓｎ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）（式中、ＴＰおよびＦＮはそれぞれ真陽性および偽陰性結果の数である）と定義される。５つの方法の組み合わせについて、平均感度は９６．８％であり、統合スコアおよびフラクタル分析についての９２％から＜面積＞／凝集体の数、空隙性分析、および細胞移動分析についての１００％までにわたる。
【表４】
2014526031.tif 000009
【００８０】
５つの方法により、平均特異度９８．８％が得られ、細胞移動についてただ１つの値が１００％とは異なり、９４％の特異度を示した。
【００８１】
全体的に、５つの方法により、平均正確度９６．８％、平均感度９６．８％、および平均特異度９８．８％がもたらされた。
【００８２】
例２：アミロイドベータ
最初の実験は、予め観察された、ＡＤ線維芽細胞とＡＣ線維芽細胞の間のネットワークの複雑さの差異のいくつかがオリゴマー形成ベータアミロイド（Ａβ）に起因する可能性があることを示唆している。
【００８３】
皮膚線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から取得した。バンクに保存されていたアルツハイマー病（ＡＤ）患者および年齢を釣り合わせたコントロール（ＡＣ）由来の線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を伴うＴ２５培養フラスコで維持し、培養し、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターに入れた。全てのフラスコを定期的に検査し、７〜１０日後に培養物は集密になった。細胞継代の総数は１６を超えないようにした。細胞をトリプシン処理し、細胞計数チャンバー（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて計数した（１ｍｍ３あたりの細胞数）。ＡＣおよびＡＤ細胞のサンプルを、１μＭのオリゴマー形成アミロイドベータ（Ａβ）で一晩処理した。処理および未処理ＡＣおよびＡＤ細胞を、１２ウェルプレート中、マトリゲルの厚い層（約１．８ｍｍ）上にプレーティングした。９つの計数用正方形の平均数を、１ｍｍ３あたり細胞５０個の細胞計数のために使用した。
【００８４】
ウェル当たり５つの１０×画像を定量的画像分析のために使用した（中央、上、下、左、右）。一般には各細胞株について３つのウェルを使用した。細胞培養顕微鏡（Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＡＭＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ２２００）を、画像を．ｐｎｇ形式で記録するために１０×拡大率の下で使用した。ＧＮＵ  Ｉｍａｇｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ（ＧＩＭＰ２．６）およびＩｍａｇｅＪ（１．４５ａ）ソフトウェアを画像分析のために使用した。フラクタル分析のために、ＩｍａｇｅＪ、ＦｒａｃＬａｃ２．５用のプラグインを標準のボックスカウントのオプションと共に使用した。生の．ｐｎｇ画像を、ＩｍａｇｅＪ用のカスタムスクリプトを使用して３回自動的にスペックル除去し、選別し、平滑化し、バイナリにした。バイナリ画像を保存し、プラグインＦｒａｃＬａｃを用いたフラクタルおよび空隙性分析のためにＩｍａｇｅＪにインポートした。
【００８５】
図７Ａ〜７Ｅに示されているように、１μＭのオリゴマー形成Ａβで一晩処理したＡＣ線維芽細胞はマトリゲル上にプレーティングするとＡＤ様表現型に変化した。図７Ａは、プレーティングした２．５時間後の未処理コントロール（ＡＣ）細胞株を示す。図７Ｂは、同じくプレーティングした２．５時間後の、低い連結性を示す１μＭのオリゴマー形成Ａβで一晩処理した同じコントロール細胞株を示す。ネットワーク形成の欠陥は、ＡＤ特性のＡβ処理した細胞の低いフラクタル次元および／または高い空隙性にさらに反映された。図７Ｃにおけるフラクタル次元分析は、Ａβ処理コントロール細胞株（緑色）がＡＤ様であることを示す。図７Ｄに示されている、Ａβ処理コントロール細胞株（緑色）についての空隙性が高いことも、ＡＤ表現型を示す。図７Ｅは、ＡＣおよびＡＤ細胞株についての凝集体の数あたりの面積が、プレーティングした４８時間後に、１μＭのＡβ処理に起因して、未処理細胞と比較して増加したことを示す。図７Ｅの矢印は、未処理ＡＣおよびＡＤ細胞についての面積／＃値からＡβ処理した細胞についての面積／＃までを指す。Ａβは、ＡＤ細胞と同様に、ＡＣ細胞株における細胞の移動も、４８時間後に移動する細胞の数を減少させることによって損なう（例えば、図６Ｃを参照されたい）。
【００８６】
ＡＤ線維芽細胞（ｎ＝３）に対する同様の実験は、４８時間における細胞凝集、フラクタル次元、または空隙性において、Ａβ処理に起因する区別可能な効果を示さなかった。
【００８７】
これらの結果は、Ａβ処理ＡＤ細胞株と比較したＡβ処理ＡＣ細胞株についての数あたりの面積の大きな差異は、アルツハイマー病のスクリーニングにおいて有用であり得ることを示唆している。
【００８８】
例３．細胞間コミュニケーションの尺度
皮膚線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から取得した。バンクに保存されていたアルツハイマー病（ＡＤ）患者および年齢を釣り合わせたコントロール（ＡＣ）由来の線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を伴うＴ２５培養フラスコで維持し、培養し、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターに入れた。全てのフラスコを定期的に検査し、７〜１０日後に培養物は集密になった。細胞継代の総数は１６を超えないようにした。細胞をトリプシン処理し、細胞計数チャンバー（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて計数し（１ｍｍ３あたりの細胞数）、１２ウェルプレート中、マトリゲルの厚い層（約１．８ｍｍ）上にプレーティングした。９つの計数用正方形の平均数を１ｍｍ３あたり５０個の細胞計数のために使用した。
【００８９】
ウェル当たり５つの１０×画像を、定量的画像分析のために使用した（中央、上、下、左、右）。一般には各細胞株について３つのウェルを使用した。細胞培養顕微鏡（Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＡＭＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ２２００）を、画像を．ｐｎｇ形式で記録するために１０×拡大率の下で使用した。ＧＮＵ  Ｉｍａｇｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ（ＧＩＭＰ２．６）およびＩｍａｇｅＪ（１．４５ａ）ソフトウェアを画像分析のために使用した。
【００９０】
画像を、ＡＣおよびＡＤ細胞株をプレーティングした１時間後に取得した（ｎ＝１０、ｐ＜０．０３、２つのサンプルについて不等分散を用いた両側ｔ検定）。ノードあたりのエッジの数を、細胞間コミュニケーションの尺度として手動で計数した。
【００９１】
図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、プレーティングした１時間後の、ノード（緑色の矢印）およびノードと連結したエッジ（青色の矢印）を含むＡＤおよびＡＣネットワークの例を示す。線維芽細胞は画像中に暗い楕円形として現れる。図８Ｃは、拡大率を上げたＡＣ細胞サンプルからの３つ以上のエッジを伴うノードを示し、図８Ｄは、同じくＡＣ細胞からの、５つのエッジを伴うノードを示す。図８Ｅに示されているように、ノードあたりのエッジの平均数はＡＤ細胞ではＡＣおよび非ＡＤＤ細胞と比較して少なく、これは、正常コントロール（ＡＣ）ノードと比較して連結したＡＤノードが少ないことを示している。図８Ｆに示されているように、細胞のクラスターあたりのノードの数もＡＤサンプルにおいて少なく、これは、ノードあたりのエッジが少ないことと一致する。
【００９２】
これらの結果は、ＡＤでは細胞間コミュニケーションが損なわれていることを示唆している。これらの細胞間コミュニケーションの尺度により、アルツハイマー病についての患者の迅速な読み取り（細胞をマトリゲルの厚い層上にプレーティングした約１〜２時間後）およびスクリーニングをもたらすことができる。
【参考文献】
【００９３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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