(57)【要約】  本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏ前処理によって、造血幹細胞の生着を増進させるための新規方法であって、造血幹細胞を含有する試料を得て、そしてプロスタサイクリン類似体と混合して混合物を得て、前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに十分な期間、前記混合物をインキュベーションして、そして場合によって前記の刺激された細胞を単離する工程を含む、前記方法を提供する。さらに、造血幹細胞移植を受けている個体の治療において使用するためのプロスタサイクリン類似体を含む組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞（ＨＳＣ）のｅｘ  ｖｉｖｏ前処理によって、ＨＳＣの生着を増進させるための方法であって：
ａ．造血幹細胞を含有する試料を得て、
ｂ．前記試料に少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体を混合して、混合物を得て、
ｃ．前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに十分な期間、前記混合物をインキュベーションして、そして場合によって
ｄ．前記の刺激された細胞を単離する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストおよびベラプロストまたはその薬学的に許容されうる塩の群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記プロスタサイクリン類似体がトレプロスチニルである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記トレプロスチニルが、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形およびトレプロスチニルの異性体の群より選択されるトレプロスチニル誘導体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記試料が骨髄である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
試料を少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体と、好ましくはコレラ毒素およびフォルスコリンより選択される非特異的ｃＡＭＰ活性化剤と一緒に混合する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体を含む、骨髄疾患を患う個体の治療において使用するための組成物。
【請求項８】
前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストおよびベラプロストまたはその薬学的に許容されうる塩の群より選択される、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニル、好ましくは、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形およびトレプロスチニルの異性体の群より選択されるトレプロスチニル誘導体である、請求項７または８記載の組成物。
【請求項１０】
骨髄疾患が、白血病、血球区画の欠陥、化学療法または放射線照射によって引き起こされる骨髄疾患である、請求項７〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
血球区画の前記欠陥が、ヘモグロビン症または好中球顆粒球機能の欠陥である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
プロスタサイクリン類似体を、骨髄移植後、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１４日間、投与することによって、骨髄疾患を患う被験体の治療において使用するための、請求項７〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体および刺激された造血幹細胞を含む、組成物。
【請求項１４】
薬学的組成物である、請求項７〜１３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
フォルスコリンをさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
静脈内または皮下投与のための、あるいは持続放出型、錠剤およびカプセルの群より選択される経口的に利用可能な型である、請求項７〜１５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
前記幹細胞が、臍帯血、ドナー骨髄または胎盤由来である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法、または請求項７〜１６のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏ前処理によって、造血幹細胞の生着を増進させるための新規方法であって、造血幹細胞を含有する試料を得て、そしてプロスタサイクリン類似体と混合して混合物を得て、前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに十分な期間、前記混合物をインキュベーションし、そして場合によって前記の刺激された細胞を単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【０００２】
さらに、造血幹細胞移植を受けている個体の治療において使用するためのトレプロスチニルを含む組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、個体の生涯に渡ってすべての血液産物を再生可能な原始的細胞であり、自己再生と子孫分化のバランスを取っている。ＨＳＣは、発生の間は場所を変え、哺乳動物の中で生涯に渡って循環し、血流に入り、そして血流から出て、ホーミング、生着および保持の連続段階で、骨髄ニッチと関与する。ホーミングは、ドナー幹細胞が骨髄への道を見出すプロセスであり、幹細胞の生着は、骨髄における該細胞の増殖を意味する。
【０００４】
造血幹細胞は、移植レシピエントにおいて、血液および免疫細胞を回復する能力の結果として、療法的潜在能力を有する。さらに、ＨＳＣは、脳、筋肉および肝臓などの他の組織のための細胞を生成する潜在能力を有する。ヒト自己および同種骨髄移植法は、現在、白血病、リンパ腫、および生命を脅かす他の疾患などの疾患のための療法として用いられている。これらの方法のためには、多量のドナー骨髄を単離して、生着のためのＨＳＣが十分であることを確実にしなければならない。
【０００５】
造血幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨髄ニッチに定植するために、Ｇαｓ伝達シグナルを必要とする（１）。これらの最近の発見は、Ｇαｓの活性化が、造血幹細胞の生存および分化を促進することを示した、先のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を確証している（２、３）。Ｇαｓは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のグアニンヌクレオチド結合性αサブユニットであり、膜結合型哺乳動物アデニリルシクラーゼの９つのアイソフォームすべてを刺激する。Ｇαｓは、コレラ毒素で細胞を処理することによって、ｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏで恒常的に活性化可能であり、これは、コレラ毒素が触媒性アルギニン残基（Ｒ１８６／１８７／２０１／２０２、アルギニンの正確な数字は、Ｇαｓのスプライス変異体に応じる）をＡＰＤ−リボシル化するためであり；損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）アルギニン残基はＧＴＰ加水分解およびその結果生じるＧαｓの脱活性化に必要である（４）。生着増進は、実際、コレラ毒素での造血幹細胞の前処理後に観察されうる：幹細胞調製物をコレラ毒素で前処理すると、骨髄中、約２倍多い（Ｌｉｎ−）前駆体細胞が存在した（１）。
【０００６】
しかし、骨髄移植を受けている患者のための幹細胞調製物に関しては、コレラ毒素は非常に不都合であろう。コレラ毒素（ＣＴ）、特にその非毒性Ｂサブユニット五量体部分（ＣＴＢ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で強い免疫調節特性を有する粘膜アジュバントであり、そして最も強力な粘膜免疫原の１つである。コレラ毒素およびＣＴＢは、強い腸ＩｇＡ抗体反応および長期に渡って持続する免疫学的記憶を刺激する。これに基づいて、ＣＴＢは、コレラおよび毒素原性大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）によって引き起こされる下痢に対して、近年開発された経口ワクチンにおける重要な構成要素となってきている。ＣＴおよびＣＴＢの強い免疫原性は、かなりの程度まで、腸粘膜表面上の受容体に結合する能力によって説明可能である。
【０００７】
さらに、天然感染経過中、毒素分子の五量体部分Ｂが腸上皮細胞表面に結合し、そしてＡサブユニットとともに迅速にエンドサイトーシスされる。ひとたびエンドサイトーシスされると、触媒活性Ａサブユニットは、五量体部分Ｂから離れ、そしてＢサブユニットによって形成された孔を通じて細胞に進入する。ひとたび細胞内部に入ると、該サブユニットは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧｓアルファサブユニットを永続的にリボシル化し、恒常的ｃＡＭＰ産生を生じる。これは次に、小腸ルーメン内へのＨ２Ｏ、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−、およびＨＣＯ３−の分泌を導き、急激な脱水症、およびコレラに関連する他の要因を生じる。静脈内注射されると、コレラ毒素は、大部分の細胞に取り込まれる（血液脳関門などのごくわずかな細胞は特定のバリアによってシールドされる）。したがって、これは、体の細胞の大部分でｃＡＭＰを上昇させ、そして広い範囲の副作用を引き起こす（頻脈から血管拡張、筋振戦、高血糖症などの範囲）。
【０００８】
したがって、これらの影響のため、造血幹細胞の刺激に関して、コレラ毒素はヒト使用には不適切である。
しかし、幹細胞を刺激する療法的な関連性は、異種骨髄移植（すなわち免疫適合ドナーから採取された造血幹細胞）を受けている際には重要であり、そして白血病を患う人々の治療、血球区画に遺伝的欠陥を持つ人々（例えばサラセミアなどの異常ヘモグロビン症；好中球顆粒球機能の欠陥など）の治療に用いられる標準的な方法である。
【０００９】
これはまた、細胞毒性薬剤の療法ウィンドウ（therapeutic window）を増加させるため、そしてしたがって高用量強度化学療法を可能にするために用いられる自己骨髄移植が標準的な方法であるため、重要である（５、６）。
【００１０】
造血幹細胞は、４つのプロスタグランジンＥ受容体（ＥＰ１〜４）をすべて発現する。造血幹細胞を（ジメチル化）プロスタグランジンＥ２で前処理すると、生着が増進される（７、８）。この効果は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のｃＡＭＰ誘導性活性化が、Ｗｎｔ依存性シグナルと協同でβ−カテニンを安定化するため、標準的Ｇαｓ依存性シグナル伝達によって仲介される（９）。
【００１１】
自己骨髄（ＢＭ）単核細胞（ＭＮＣ）の移植は、Ｏｔｓｕｋａらによれば、ウサギモデルにおいて、ベラプロスト・ナトリウムによって増進されうる。この研究の目的は、末梢および心筋虚血において、動脈の発生を支持することであった。しかし、造血幹細胞は、骨髄細胞内の特定の種類の細胞である（１６）。
【００１２】
幹細胞療法および薬理学的治療の組み合わせが、Ｍａｄｏｎｎａらによって記載され、ここで、冠内投与後、ＡＤＳＣ心筋生着においてプロスタサイクリンが試験されている（１７）。
【００１３】
Ｉｓｈｉｉ  Ｍ．らは、プロスタサイクリンの持続放出が、虚血組織における間葉系幹細胞の血管新生促進機能および筋細胞増殖を増進することを開示する（１８）。
ＷＯ２００６／０１７１６９は、とりわけ、プロスタサイクリン類似体を含有可能な、組織増殖を調節するための生体適合性コーティングを含む移植可能（ｉｍｐｌａｔａｂｌｅ）センサーを記載する。
【００１４】
ヒトＴＨＰ１細胞における組織因子、腫瘍壊死因子およびインターロイキン１β合成に対するシカプロストまたはイロプロストの阻害効果がＣｒｕｔｃｈｌｅｙ  Ｄ．らによって記載される（１９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１７１６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
移植後の幹細胞の局在は、移植成功の重要な決定要因である。現在、幹細胞が骨髄に成功裡に生着せず、そして成熟血球の減少を導く長期の骨髄形成不全があるため、移植には多数の幹細胞が必要である。
【００１７】
したがって、骨髄移植を受けている被験体の骨髄ニッチへの単離ＨＳＣのホーミング、生着および保持を増加させるため、ＨＳＣを刺激する方法および組成物を提供する、満たされていない必要性がなおある。
【００１８】
この問題は、本発明の態様によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、例えばトレプロスチニル、イロプロスト、ベラプロストおよびシカプロストのような合成プロスタサイクリンＩ２（ＰＧＩ２）類似体が、造血幹細胞においてｃＡＭＰレベルを増加させることが可能であり、これが骨髄における幹細胞の生着増加を導くことが示されてきた。
【００２０】
トレプロスチニルのようなプロスタサイクリン類似体は、プロスタグランジンＥ２に勝るいくつかの利点を提供する：
（ｉ）該プロスタサイクリン類似体は、プロスタサイクリン／ＰＧＩ２の安定類似体であり、これはまた、ＥＰ２−およびＥＰ４受容体も刺激する（１０）。したがって、該類似体は、多数のＧｓ共役型受容体を刺激する潜在能力を有しつつ、ｃＡＭＰ集積を阻害する阻害性（すなわちＧｉ共役型）ＥＰ３受容体と関与しない。後者に関しては、ジメチル−ＰＧＥ２は完全アゴニストである（１）。対照的に、トレプロスチニルは、ＥＰ３受容体では低アフィニティアゴニストでしかない。
【００２１】
（ｉｉ）該類似体は、天然プロスタサイクリンよりも代謝的により安定であるため、トレプロスチニル、イロプロスト、ベラプロストおよびシカプロストは、ｉｎ  ｖｉｖｏで適用された際、より長い持続効果を誘発し、そしてしたがって、より効率的な骨髄生着を支持することも可能である。
【００２２】
（ｉｉｉ）プロスタサイクリン類似体の、特にトレプロスチニル、イロプロスト、ベラプロストおよびシカプロストの持続／反復投与はよく許容される。
本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏ前処理によって、造血幹細胞の生着を増進させるための新規方法であって：
ａ．造血幹細胞を含有する試料を得て、そして
ｂ．少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体と混合して、混合物を得て、
ｃ．前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに十分な期間、前記混合物をインキュベーションして、そして場合によって
ｄ．前記の刺激された細胞を単離し、そして場合によって精製する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２３】
本発明の態様にしたがって、プロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストおよびベラプロストまたはその薬学的に許容されうる塩の群より選択される。
【００２４】
本発明の方法にしたがって、刺激された幹細胞および未刺激の幹細胞の混合物もまた提供可能である。
特に、試料は骨髄である。幹細胞は、一般的に、既知のいかなる供給源のものであってもよく、特に、これらは、末梢血、臍帯血または骨髄から単離されたＨＳＣであってもよい。
【００２５】
本発明にしたがって、トレプロスチニルは、酸誘導体、プロドラッグ、多形または異性体の群より選択される誘導体であってもよい。
同様に、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストは、その酸誘導体、プロドラッグ、多形または異性体の群より選択される誘導体であってもよい。
【００２６】
本発明の別の態様にしたがって、試料を少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体と、好ましくはコレラ毒素およびフォルスコリンより選択される、非特異的ｃＡＭＰ活性化剤と一緒に混合してもよい。
【００２７】
本発明の特定の態様にしたがって、プロスタサイクリン類似体を含む組成物を、造血幹細胞移植を受ける可能性がある骨髄疾患を患う個体の治療において使用するために提供する。
【００２８】
本発明の特定の態様にしたがって、組成物のプロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストあるいはその薬学的に許容されうる塩の群より選択される。
【００２９】
好ましい態様にしたがって、組成物はトレプロスチニルを含む。
具体的には、個体は、白血病、血球区画の欠陥、化学療法または放射線照射後の骨髄移植を患う。
【００３０】
本発明のさらなる態様にしたがって、血球区画の欠陥は、ヘモグロビン症または好中球顆粒球機能の欠陥である。
本発明の組成物はまた、プロスタサイクリン類似体を、骨髄移植後、少なくとも７日間、投与することによって、骨髄疾患を患い、造血幹細胞移植を受けている個体を治療するために、使用可能である。具体的には、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストおよびベラプロストの群より選択されるプロスタサイクリン類似体、より具体的にはトレプロスチニルを使用する。
【００３１】
さらなる態様にしたがって、プロスタサイクリン類似体および刺激された造血幹細胞を含む、組成物を提供する。
さらなる態様にしたがって、トレプロスチニルまたはその薬学的に許容されうる塩および刺激された造血幹細胞を含む、組成物を提供する。
【００３２】
特に、動物または動物研究において使用するため、本発明の組成物は、フォルスコリンまたはコレラ毒素をさらに含んでもよい。
本発明の組成物は、薬学的組成物であってもよい。
【００３３】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知のすべての経路によって投与可能であり、具体的には、静脈内または皮下投与のために調製される。
プロスタサイクリン類似体は、持続放出型、錠剤またはカプセルの群より選択される経口的に利用可能な型で提供されてもよい。
【００３４】
プロスタサイクリン類似体の量は、療法適用または刺激されたＨＳＣを調製するための方法に応じる。非常に具体的には、療法適用のため、トレプロスチニルの有効量は、少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ体重である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】磁気ビーズによって保持されたＬｉｎ＋細胞集団の性質決定。ｘ軸（ＡＰＣ−Ｃ７−Ａと標識）は、系譜マーカー：Ｔ細胞に関してはＣＤ３ε、Ｂ細胞に関してはＣＤ４５Ｒ（＝Ｂ２２０）、骨髄（単球性／顆粒球性）系譜に関してはＣＤ１１ｂおよびＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ（Ｇｒ−１）、赤血球系譜に関してはＴｅｒ−１１９に対して向けられる抗体の混合物によって記録された蛍光を示す。ｙ軸は、ネズミ幹細胞因子受容体ｃ−Ｋｉｔに対する抗体に関して記録された蛍光である。上部左象限（ｃ−Ｋｉｔ＋および系譜マーカー陰性細胞を示す）には細胞が枯渇していることが明らかである。
【図２】磁気ビーズに結合しなかったＬｉｎ−細胞集団の性質決定。図１におけるように、ｘ軸（ＡＰＣ−Ｃ７−Ａと標識）は、系譜マーカー：Ｔ細胞に関してはＣＤ３ε、Ｂ細胞に関してはＣＤ４５Ｒ（＝Ｂ２２０）、骨髄（単球性／顆粒球性）系譜に関してはＣＤ１１ｂおよびＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ（Ｇｒ−１）、赤血球系譜に関してはＴｅｒ−１１９に対して向けられる抗体の混合物によって記録された蛍光を示す。ｙ軸は、ネズミ幹細胞因子受容体ｃ−Ｋｉｔに対する抗体に関して記録された蛍光である。下部象限（ｃ−Ｋｉｔ陰性および系譜マーカー陽性細胞を示す）には細胞が枯渇しており、そして細胞は主に、ｃ−Ｋｉｔ陽性でありそして系譜マーカー陰性である細胞が予期されるはずの左上部象限に見られることが明らかである。
【図３】図３は、Ｓｃａ−１およびｃ−Ｋｉｔの存在に関するＬｉｎ＋（図３Ａ）およびＬｉｎ−細胞集団（図３Ｂ）の性質決定を示す。パネル３Ａおよび３Ｂは、磁気ビーズ上に保持された細胞（図１において性質決定される）およびフロースルー中に現れたもの（図２において性質決定される）を示す。これらを、方法セクションにおいて概略されるように染色し、そしてｃ−Ｋｉｔ（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５−５−Ａ、ｙ軸）およびＳｃａ−１（ＰＥ−Ｃｙ７−Ａ、ｘ軸）の存在に関して同時に分析した。パネルＡにおいて分析される系譜陽性細胞が、左下部象限に見られ、すなわちこれらはｃ−ＫｉｔおよびｓＳｃａ−１の両方を欠くことが明らかである。対照的に、パネルＢ中の細胞は、主に、上部象限中にあり、すなわち、これらは、造血幹細胞集団および非拘束子孫に関して予期されるように、高レベルのｃ−Ｋｉｔ（左上部象限）またはｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１の両方（上部右象限）のいずれかを有する。
【図４】フォルスコリン、トレプロスチニル、イロプロスト、ベラポスト、またはフォルスコリンとプロスタノイドとの組み合わせによる刺激後の（Ｌｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋）造血幹細胞におけるサイクリックＡＭＰ集積。方法以下に概略するように、Ｌｉｎ−細胞（７＊１０５／アッセイ）を［３Ｈ］アデニンの存在下でインキュベーションし、アデニン・ヌクレオチド・プールを代謝的にあらかじめラベルした。示された化合物の非存在下（０と標識された左側のカラム）および存在下で、細胞をインキュベーションした。Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０−Ｘ８およびアルミナカラム上の連続クロマトグラフィーによって、集積した［３Ｈ］ｃＡＭＰを精製し、そして液体シンチレーション計測によって定量化した。データは、平均±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝４）。
【図５】（Ｌｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋）造血幹細胞におけるトレプロスチニル誘導性ｃＡＭＰ集積に関する濃度反応曲線。アッセイ条件は、図４のレジェンドに概略する通りであった。データは、平均±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝２）。
【図６】トレプロスチニルでの造血幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理は、致死性に放射線照射されたマウスにおいて、骨髄の生着増進を生じる。方法以下に概略するように、図３におけるように調製した造血幹細胞を、示された化合物（ＦＳＫ、フォルスコリン）で前処理した。白血球数をＦＡＣＳによって決定した。調べた動物の数を示す。
【図７】骨髄移植１６週後のＬｙ５．２陽性血球およびＬｙ５．１陽性血球の比。Ｌｙ５．１細胞をＣＴＸまたはトレプロスチニルおよびフォルスコリンで前処理した。
【図８】骨髄移植１６週後のＬｙ５．２陽性血球およびＬｙ５．１陽性血球の比。Ｌｙ５．２細胞をＣＴＸまたはトレプロスチニルおよびフォルスコリンで前処理した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
骨髄環境へのＨＳＣのホーミングおよび生着を増加させる方法および手段を提供することは、強い生物学的および医学的意味を有する。現在では臨床的移植において莫大な数の幹細胞が必要とされ、それゆえに、多量のドナー細胞の必要性に通じているように、移植後の幹細胞の局在は、臨床的処置のために非常に重要である。こうした方法はまた、かなりの数の自己ドナー移植物が、不十分な数の幹細胞、またはＨＳＣしか含有していないため、非常に有用である。さらに、多くの場合、患者は組織適合性のドナーを見出すことができず、このことは、移植の成功に求められるＨＳＣの数を減少させるための方法および組成物に対する必要性を強調している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのＨＳＣのホーミングおよび生着を改善可能であれば、ドナーから、より少ない細胞を収集し、それによって骨髄/末梢幹細胞採取に関連する時間および不快感を減少させ、そして協力的なＨＳＣドナーのプールを増加させることが可能になる。
【００３７】
本発明はしたがって、ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏ前処理によって、ＨＳＣの生着を増進させるための新規方法であって、ａ）造血幹細胞を含有する試料を得て、そしてｂ）少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体を混合して、混合物を得て、ｃ）前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに十分な期間、前記混合物をインキュベーションして、そしてｄ）場合によって、さらなる使用のために、例えば治療または移植のために、前記の刺激された細胞を単離するか、または前記の刺激された細胞を含有する前記混合物を用いる工程を含む、前記方法を提供する。
【００３８】
具体的には、プロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニル、イロプロスト、ベラプロストおよびシカプロストまたはその薬学的に許容されうる塩の群より選択される。
トレプロスチニルは、プロスタサイクリンの合成類似体である。トレプロスチニルは、リモジュリンＴＭとして市販されている。トレプロスチニルは、（１Ｒ，２Ｒ，３ａＳ，９ａＳ）−［［２，３，３ａ，４，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−ヒドロキシ−１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシオクチル］−１Ｈ−ベンズ［ｆ］インデン−５−イル］オキシ］酢酸一ナトリウム塩である。
【００３９】
イロプロストは、「イロメジン」として市販され、そして５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−６［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル］−ビ−シクロ［３．３．０］オクタン−３−イリデン｝ペンタン酸である。
【００４０】
ベラプロストは、２，３，３ａ，８ｂ−テトラヒドロ−２−ヒドロキシ−１−（３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル）−１Ｈ−シクロペンタ（ｂ）ベンゾフラン−５−ブタン酸である。
【００４１】
シカプロストは、２−［（２Ｅ）−２−［（３ａＳ，４Ｓ，５Ｒ，６ａＳ）−５−ヒドロキシ−４−［（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−メチルノナ−１，６−ジイニル］−３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ペンタレン−２−イリデン］エトキシ］酢酸である。
【００４２】
本発明の態様にしたがって、少なくとも２つ、特に少なくとも３つの異なるプロスタサイクリン類似体を、前記方法に使用することができる。あるいは、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つまたはさらにより多くの異なるプロスタサイクリン類似体を、前記方法に使用することができる。
【００４３】
この方法は、好適に、個体に直接投与可能であり、そして多量の非選択性ｃＡＭＰ活性化剤によるいかなる望ましくない副作用も示さない、刺激された幹細胞を提供する。
本発明のさらなる態様にしたがって、ｅｘ  ｖｉｖｏ前処理によって、造血幹細胞の生着を増進させるための方法であって、以下の工程：
ａ．造血幹細胞を含有する試料を得て、そして
ｂ．プロスタサイクリン類似体およびフォルスコリンを混合して、混合物を得て、
ｃ．前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに十分な期間、前記混合物をインキュベーションして、そして場合によって
ｄ．前記の刺激された細胞を単離して、そして場合によって
ｅ．前記の刺激された細胞を精製するおよび／または濃縮する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００４４】
本発明の特定の態様にしたがって、プロスタサイクリン類似体およびフォルスコリンの比は、約１：３であることも可能である。フォルスコリンおよびプロスタサイクリン類似体で処理したＨＳＣを、再移植する前に精製してもよいが、少量のフォルスコリンが存在する可能性はあるがいかなる負の副作用も引き起こさない可能性もあるため、これらのＨＳＣをまた、さらなる精製工程を伴わずに再移植してもよい。
【００４５】
あるいは、トレプロスチニルと、イロプロスト、ベラプロストまたはシカプロストの１つとの組み合わせを、幹細胞に添加してもよい。あるいは、トレプロスチニルを１つより多い、例えば２つ、３つ、４つ、または５つの他のプロスタサイクリン類似体、例えば限定されるわけではないが、イロプロスト、ベラプロストまたはシカプロストあるいはその生理学的に許容されうる塩と組み合わせて混合してもよい。
【００４６】
動物研究または動物治療において使用するための特定の態様にしたがって、インキュベーション前に、フォルスコリンおよび／またはコレラ毒素のようなｃＡＭＰ増進剤を、ＨＳＣ、あるいはＨＳＣ／トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロスト混合物とさらに混合してもよい。
【００４７】
前記細胞においてＧアルファｓシグナル伝達を刺激するのに必要な期間を、例えば多くのバリエーションがあるｃＡＭＰ測定：ＲＩＡ、ＥＰＡＣ（ｅｐａｃ１）を伴う蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Ｐｏｎｓｉｏｕｅｎ  Ｂ．ら，  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ，  ５，  １２，  １１７６−１１８０（２００４））、放射化学法等を用いることによって、測定してもよい。Ｇアルファｓシグナル伝達が起こっている刺激された細胞は、ＦＲＥＴに基づくｃＡＭＰレポーターのような、当該技術分野において公知の方法によって、未刺激細胞から選択されるか、または区別されるか、または単離されることも可能である。
【００４８】
本発明の態様にしたがって、インキュベーション時間は約１〜６０分間、好ましくは約２〜３０分間である。
ｃＡＭＰ依存性経路は、造血幹細胞の生着を促進するために必須の経路である。本発明者らによって、プロスタサイクリン類似体が、造血幹細胞におけるｃＡＭＰ上昇を誘発可能であることが示されてきている。該類似体は、多数の受容体、すなわちＩＰおよびＥＰ受容体を活性化し、こうしてＧアルファｓシグナル伝達増加を導くことによってこれを行う。したがって、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストのようなプロスタサイクリン類似体は、ｃＡＭＰレベルをより効率的に上昇させる。
【００４９】
非常に特定の態様にしたがって、トレプロスチニルは、本発明の方法にしたがって用いられる、好ましいプロスタサイクリン類似体である。
あるいは、本発明の特定の方法および組成物において、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）増進剤またはプロスタグランジンＥＰ受容体に対するリガンドより選択される少なくとも１つの剤もまた添加されてもよい。ｃＡＭＰ増進剤の例には、限定されるわけではないが、当該技術分野において公知のものの中でも、幹細胞または幹細胞／トレプロスチニルまたは幹細胞／トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストおよび／またはベラプロスト混合物に、インキュベーション前に添加してもよい、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、ホルボールエステル、フォルスコリン、スクラレリン（ｓｃｌａｒｅｌｉｎｅ）、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、コレラ毒素（ＣＴ）、アミノフィリン、２，４ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、イソプロテレノール、イソブチルメチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン、テオフィリン（ジメチルキサンチン）、ドーパミン、ロリプラム、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、および血管作用性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）が含まれる。ｃＡＭＰ増進剤の例にはまた、とりわけｃＡＭＰおよびｃＡＭＰ類似体、例えばｓｐ−５，６−ＤＣｌ−ＢＩＭＰＳ（ＢＩＭＰＳ）が含まれる。
【００５０】
本発明の特定の態様にしたがって、フォルスコリンおよび／またはコレラ毒素またはコレラ毒素のＡサブユニットを、インキュベーション前に、さらに幹細胞または幹細胞／トレプロスチニル混合物と混合する。
【００５１】
特定の態様において、前記ｃＡＭＰ増進剤は、幹細胞の生着を考慮して、動物細胞の幹細胞処理を実行するために、または幹細胞生着に関する動物研究を実行するために、用いられる。
【００５２】
プロスタサイクリン類似体に関して、本発明にしたがって、用語「プロスタサイクリン類似体」にはまた、前記物質の誘導体および類似体も含まれる。
用語「類似体」または「誘導体」は、構造および機能において、別の化学物質と類似である化学分子であって、しばしば単一の要素または基が構造的に異なり、親化学物質と同じ機能を保持するならば、１つより多い基（例えば２つ、３つ、または４つの基）の修飾によって異なってもよい、前記化学分子に関する。こうした修飾は、当業者にはルーチンであり、そしてこれには、例えば、さらなる化学部分または置換された化学部分（例えば酸のエステルまたはアミド）、保護基（例えばアルコールまたはチオールに関してはベンジル基、およびアミンに関してはｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル基）が含まれる。やはり含まれるのは、アルキル側鎖に対する修飾であり、例えばアルキル置換（例えばメチル、ジメチル、エチル等）、側鎖の飽和または不飽和レベルに対する修飾、ならびに置換フェニルおよびフェノキシなどの修飾基の付加である。誘導体にはまた、コンジュゲート（例えばビオチンまたはアビジン部分）、酵素（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ等）、および放射標識、生物発光、化学発光、または蛍光部分も含まれてもよい。さらに、本明細書記載の剤に部分を付加して、薬理学的特性を改変し、他の望ましい特性の中でも、例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させるか、あるいはその細胞浸透特性を増加させてもよい。やはり含まれるのは、薬剤の多くの望ましい特性（例えば可溶性、生物学的利用能、製造等）を増進させることが知られるプロドラッグである。
【００５３】
用語「誘導体」にはまた、その範囲内に、機能的に同等なまたは機能的に改善された分子を提供する、付加、欠失、および／または置換を含む、親配列に対して行われた改変も含まれる。
【００５４】
本発明の特定の態様にしたがって、トレプロスチニル誘導体は、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形またはトレプロスチニルの異性体の群より選択される。
【００５５】
同様に、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストは、これらの酸誘導体、プロドラッグ、多形または異性体の群に由来する誘導体であってもよい。
用語「造血幹細胞」（ＨＳＣ）またはより一般的な用語「幹細胞」は、本発明の説明において、同等の用語と理解され、そして一般的に、骨髄（例えば単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系譜（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および当該技術分野において公知の他のものを含む血球タイプを生じさせる多能性「幹細胞」または多分化能「幹細胞」のいずれかに関する。「幹細胞」は、通常、多数の細胞タイプを形成する能力（すなわち多分化能があること）および自己再生する能力によって特徴付けられる。しかし、少分化能（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）前駆体および単一分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）前駆体もまた、含まれてもよい。「造血」は、一般的に、ＨＳＣからの細胞分化または特殊化血球形成のプロセスを指す。発生中、造血は、胎児肝臓から骨髄へと転位置し、次いで、骨髄は、成人期の間、造血部位であり続ける。骨髄においてひとたび確立されると、ＨＳＣは、骨空洞全体にランダムに分布はしない。むしろ、ＨＳＣは、典型的には、骨内膜表面にごく近接して見られる。骨表面からの距離が増加するにつれて、より成熟した幹細胞の数が増加していく。
【００５６】
造血組織は、長期再生能および短期再生能を持つ細胞、ならびに拘束された多分化能前駆体、少分化能前駆体および単一分化能前駆体を含有する。
ＨＳＣを含有する試料は、具体的には骨髄であってもよい。
【００５７】
ＨＳＣは、ＨＳＣを含有することが知られる任意の供給源から、特に末梢血、臍帯または臍帯血、胎盤および骨髄から、既知の技術によって得られうる。あるいは、動物の胎児肝臓、胎児脾臓、および大動脈−性腺−中腎のような供給源が可能である。本発明の方法および組成物に関しては、ヒト起源由来のＨＳＣが好ましい。
【００５８】
例えば、ＨＳＣは、大腿、臀部、肋骨、胸骨、および他の骨を含む、成人骨髄に見出されうる。ＨＳＣは、しばしば、骨髄区画から細胞が放出されるのを誘導する、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）などのサイトカインでの前処理後、針およびシリンジを用いて臀部からの除去によって直接、あるいは血液から得られうる。
【００５９】
特定の表現型または遺伝子型マーカーにしたがって、ＨＳＣを同定してもよい。例えば、ＨＳＣは、その小さいサイズ、系譜（ｌｉｎ）マーカーの欠如、生体染色、例えばローダミン１２３（ｒｈｏ１０）またはヘキスト３３３４２での染色が低いこと（サイドポピュレーション）、およびその多くが分化シリーズクラスターに属する表面上の多様な抗原性マーカー（例えば、ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＧＲ−１（＝Ｌｙ−６Ｇ／Ｃ）、７−４、Ｔｅｒ−１１９およびｃ−ｋｉｔ）の存在によって同定可能である。ＨＳＣは、主に、分化系列決定（lineage commitment）を検出するために典型的に用いられるマーカーに関しては陰性であり、そしてしたがって、多くの場合、ｌｉｎ（−）細胞と称される。大部分のヒトＨＳＣは、ＣＤ５＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）＋、ＣＤ１１＋、ＧＲ−１＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙｌ／ＣＤ９０＋，ＣＤ３８ｌｏ／〜、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびｌｉｎ（−）として特徴付けられうる。しかし、特定のＨＳＣは、ＣＤ３４７＋およびＣＤ３８＋であるため、すべての幹細胞がこれらの組み合わせによって含まれるわけではない。また、いくつかの研究によって、最も早期の幹細胞は、細胞表面上にｃ−ｋｉｔを欠く可能性があることが示唆されている。
【００６０】
フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによるｌｉｎ（−）ＨＳＣの精製のため、当該技術分野において公知の他のものの中でも、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＧＲ−１、７−４およびＴｅｒ−１１９、ＣＤ１３、ＣＤ３２およびＣＤ３３、ＣＤ７１、ＣＤ  １９、ＣＤ６１、Ｍａｃ−１（ＣＤｌ  ｌｂ／ＣＤ１８）、Ｇｒ−Ｉ、１１７Ｒａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、およびＣＤ８に対する抗体を含む、多くの成熟血液系譜マーカー抗体を用いて、ｌｉｎ（＋）細胞または後期多分化能前駆体（ＭＰＰ）を枯渇させることも可能である。さらなる精製法が当該技術分野において公知であり、例えば、細胞表面分子の「シグナル伝達リンパ球活性化分子」（ＳＬＡＭ）ファミリーの特定のサインを用いる方法がある。
【００６１】
ＨＳＣは、臍帯血由来、骨髄由来、末梢血由来、または他の供給源由来のいずれであっても、任意の適切な、商業的に入手可能な培地または顧客に合わせて規定された培地で、血清を含むものまたは含まないものの中で増殖または拡大可能である。ヒト供給源由来のＨＳＣが、本発明の好ましい態様である。例えば、特定の態様において、血清不含培地は、アルブミンおよび／またはトランスフェリンを利用可能である。さらに、サイトカイン、例えばとりわけ、Ｆｌｔ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）が含まれてもよい。ＨＳＣはまた、バイオリアクターなどの容器中でも増殖可能である。ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏ拡大に適した培地はまた、ＨＳＣを支持する細胞、例えばリンパ組織の脱凝集から得られる可能性があり、そしてＨＳＣならびにその子孫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの維持、増殖、および分化を支持することが示されている、間質細胞（例えばリンパ細網間質細胞）も含んでもよい。
【００６２】
「臍帯血」（「ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ」または「ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ」）は、一般的に、新生児循環に戻っていく、新生児由来の相対的に少量の血液（最大約１８０ｍｌ）に関する。臍帯血にはＨＳＣが豊富であり、そして臍帯血は、当該技術分野において公知の技術にしたがって採取し、そして後の使用のために保存することも可能である。
【００６３】
用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」または「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、生物の外で行われる活動であり、例えば生物外部の人工的な環境で、生存組織において、または生存組織に対して、好ましくは、天然条件の最小限の改変しか伴わずに、行われる実験または測定を指す。特定の態様において、こうした組織または細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ処理のため、収集し、そして凍結し、そして後に融解することも可能である。生存細胞または組織を用いる、数日より長く続く組織培養実験または方法は、典型的には、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」と見なされるが、この用語はｅｘ  ｖｉｖｏと交換可能に使用可能である。「ｅｘ  ｖｉｖｏ投与」、「ｅｘ  ｖｉｖｏ処置」、または「ｅｘ  ｖｉｖｏ療法的使用」は、一般的に、１つまたはそれより多い臓器、細胞、または組織を、生存または最近死亡した被験体から得て、場合によって精製／濃縮し、幹細胞を取り扱う処置または方法（例えば、細胞と本発明の組成物とをインキュベーションしてＨＳＣの生着能を増進させることを含むｅｘ  ｖｉｖｏ投与工程）に曝露し、そして次いで、随意的な処置または方法の後に、同じ生存被験体または異なる生存被験体に投与する医学的方法に関する。
【００６４】
こうしたｅｘ  ｖｉｖｏ療法適用にはまた、例えば本発明の組成物を１回またはそれより多く、臓器、細胞、または組織の投与後に、生存被験体に投与することによる、任意的なｉｎ  ｖｉｖｏ処置または方法の工程が含まれてもよい。当該技術分野に周知の技術にしたがって、局所および全身投与の両方が、これらの態様に意図される。場合によって被験体に投与されるさらなる剤とともに、トレプロスチニルの量、またはトレプロスチニルおよび刺激された幹細胞を含有する混合物の量は、被験体の特性、例えば全身健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤に対する耐性、ならびにトレプロスチニルおよび／または細胞移植に対する反応の度合い、重症度、およびタイプに応じる。
【００６５】
本発明の特定の態様にしたがって、造血幹細胞移植を受けている個体の治療において使用するためのプロスタサイクリン類似体を含む組成物を提供する。
好ましい態様にしたがって、組成物は、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストおよびベラプロストまたはその薬学的に許容されうる塩の群より選択されるプロスタサイクリン類似体を含み、より具体的には、トレプロスチニルを含む。
【００６６】
本発明の組成物はまた、トレプロスチニルとともに、１またはそれより多いイロプロスト、シカプロストまたはベラプロストも含んでもよい。あるいは、組成物は、イロプロストと組み合わせて、１またはそれより多い、トレプロスチニル、シカプロストまたはベラプロストあるいはその薬学的に許容されうる塩を含んでもよい。あるいは、組成物は、ベラプロストと組み合わせて、１またはそれより多い、トレプロスチニル、シカプロストまたはイロプロストあるいはその薬学的に許容されうる塩を含んでもよい。あるいは、組成物は、シカプロストと組み合わせて、１またはそれより多い、トレプロスチニル、ベラプロストまたはイロプロストあるいはその薬学的に許容されうる塩を含んでもよい。
【００６７】
前記被験体は、任意の骨髄疾患、すなわち正常骨髄構造が、悪性疾患、再生不良性貧血、または感染によって置換され、血球および血小板産生減少を導く疾患を患うことも可能である。前記骨髄疾患は、例えば、白血病、血球区画（blood cell compartment）の欠陥あるいは化学療法または放射線照射治療後の骨髄移植に関する必要性であることも可能である。
【００６８】
より具体的には、血球区画の欠陥は、サラセミアのような異常ヘモグロビン症または好中球顆粒球機能の複数の欠陥または好中球顆粒球機能の単数の欠陥であることも可能である。
【００６９】
骨髄移植後の限定された期間に渡って、例えば化学療法または放射線照射により骨髄疾患を患い、そのため造血幹細胞移植を受けている個体の治療のための使用であって、少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体を投与することによる使用もまた、本発明に含まれる。
【００７０】
少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体、少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体とともに１つまたはそれより多い、具体的には２つの、より具体的には３つのｃＡＭＰ増進剤、あるいは少なくとも１つの、具体的には２つの、より具体的には３つのプロスタサイクリン類似体および刺激された幹細胞と、場合によって１つまたはそれより多いｃＡＭＰ増進剤のようなさらなる剤とを一緒に含む混合物を用いた、骨髄移植を受けている被験体の治療もまた、本発明によって含まれる。
【００７１】
より具体的には、ｃＡＭＰ増進剤はフォルスコリンであってもよい。
骨髄移植中、またはＨＳＣを用いることによる骨髄の再構築の際、ヒトＨＳＣの生着を増進させるため、少なくとも１つのプロスタサイクリン類似体を用いてもよい。生着を加速させることによって、被験体が潜在的に致死性の感染、出血および他の深刻な合併症に感受性である期間が短くなる。したがって、プロスタサイクリン類似体は、ドナー骨髄を前処理して、骨髄生着を増進させる、有用な療法的オプションとなるはずである（すなわち必要な細胞数を減少させ、そして骨髄無形成期間を短くすることによって）。
【００７２】
具体的には、プロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストあるいはその薬学的に許容されうる塩の群より選択される。より具体的には、トレプロスチニルは、用いるべき好ましいプロスタサイクリン類似体である。
【００７３】
骨髄移植後、数日間、プロスタサイクリン類似体で被験体を連続治療すると、生着が改善されることによって（すなわち必要な細胞数を減少させ、そして骨髄無形成期間を短くすることによって）、臨床転帰の改善がもたらされるはずである。
【００７４】
したがって、特定の態様にしたがって、移植後少なくとも５日間、より具体的には移植後少なくとも１０日間、より具体的には少なくとも１４日間、治療を行う。
本発明の別の態様にしたがって、１つのまたは１つより多いプロスタサイクリン類似体および刺激された造血幹細胞を含む組成物が含まれる。
【００７５】
あるいは、特定の態様において、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）増進剤またはプロスタグランジンＥＰ受容体に対するリガンドより選択される剤を、組成物に添加してもよい。特定の態様にしたがって、本発明の組成物はまた、フォルスコリンも含んでもよい。
【００７６】
具体的には、本発明の組成物は、薬学的組成物である。当該技術分野において公知であるようなさらなる薬学的に許容されうる賦形剤が、前記組成物中に含有されてもよい。
プロスタサイクリン類似体の量は、刺激されたＨＳＣを調製するための療法または方法に応じる。非常に具体的には、療法適用のため、有効量のトレプロスチニルは、少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ体重である。
【００７７】
適用可能なそして当該技術分野において公知の任意の様式によって、本発明の組成物を被験体に投与してもよい。より具体的には、静脈内または皮下投与を提供する。
前記組成物は、持続放出型、錠剤またはカプセルの群より選択される、経口的に利用可能な型であってもよい。
【００７８】
前述の説明は、以下の実施例を参照すると、より完全に理解されるであろう。こうした例は、しかし、本発明の１つまたはそれより多い態様を実施する方法の単なる代表であり、そして本発明の範囲を限定するように読むべきではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
材料および方法
骨髄幹細胞の単離
１０匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を頸椎脱臼によって屠殺した。後肢の長骨（すなわち大腿骨および脛骨）を筋肉および結合組織からはずし、そしてシリンジおよび２７  １／２Ｇ針を用いて、ＲＰＭＩ培地でフラッシュした。細胞懸濁物を可視結合組織からはずし、収集し、そして遠心管に移した。遠心分離（１，２００ｒｐｍ／〜１００ｇ、５分間）によって細胞を採取し、そして３ｍＬ赤血球溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨを７．２〜７．４に調整）中に再懸濁した。細胞懸濁物を２０℃で２分間、その後、氷上で４分間インキュベーションした。その後、ＲＰＭＩ（１０ｍＬ）を添加し、そして遠心分離によって細胞を採取し、そして計数した。細胞の典型的な収量は３＊１０７／マウスであった。
【００８０】
２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有する氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に、２．５＊１０８細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を再懸濁し、これに、１０８細胞あたり０．１ｍＬ抗体溶液の比で、ＣＤ５、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ、ＧＲ−１（＝Ｌｙ−６Ｇ／Ｃ）、７−４、およびＴｅｒ−１１９に対して向けられる系譜特異的抗体を含有するビオチン化抗体カクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの「系譜細胞枯渇キット」）を添加した。細胞を、抗体と氷上で２０分間インキュベーションし、そして遠心分離によってペレットにした。再懸濁（３．３＊１０８細胞／ｍＬ）後、二次抗ビオチンコーティングマイクロビーズ（０．２ｍＬ／１０８細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの「系譜細胞枯渇キット」とともに提供される）を細胞懸濁物に添加し、そして混合物を氷上で１５分間インキュベーションした。その後、試料をＭＡＣＳ−緩衝液（３０ｍＬ）中で希釈し、細胞を遠心分離によって収集し、そして６ｍＬのＭＡＣＳ−緩衝液中に再懸濁した。細胞適合性プラスチック材料でコーティングされた強磁性ビーズを含有するプレパックＬＳカラム上にこの懸濁物を装填した。典型的には、（２ｍＬ細胞懸濁物／カラム）に関して３つのカラムを使用した。フロースルーは系譜マーカー陰性細胞（Ｌｉｎ−細胞）を含有し、一方、系譜拘束細胞は、カラム上に保持された。遠心分離によって細胞をペレットにし、そしてｍＬ  ＰＢＳ中に再懸濁した。
【００８１】
典型的な収量は７＊１０５  Ｌｉｎ−細胞／マウスであった。
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析
細胞表面マーカーの染色のために使用した抗体は、以下の供給源由来であった：マウス系譜パネル抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であり（ＢＤ  ５５９９７１、抗ＣＤ３ε、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４５Ｒ、抗Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６ｃ、抗Ｔｅｒ−１１９のビオチン化型を含有する）、アフィニティ精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（マウスＦｃγＩＩ／ＩＩＩブロック、ＢＤ５５３１４２）および蛍光色素ストレプトアビジン−アロフィコシアニン−Ｃｙ７（ストレプトアビジンＡＰＣ−Ｃｙ７、ＢＤ５５４０６３）もまた、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であった。フィコエリトリン（ＰＥ）−Ｃｙ７標識抗マウスＬｙ６Ａ／Ｅ（＝幹細胞抗原−１＝Ｓｃａ１）ＰＥ−Ｃｙ７（カタログ番号２５−５９８１−８２）およびＰＥ−Ｃｙ５抗マウスＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（カタログ番号１５−１１７１−８１）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であった。
【００８２】
ＭＡＣＳ直後、１＊１０６系譜陽性（Ｌｉｎ＋）および陰性（Ｌｉｎ−）細胞を、ＦＡＣＳ試験管に移し、そして５０μＬ  ＰＢＳ中、氷上で保存した。その間、以下のＦＡＣＳ抗体を希釈し（１：５０）、そしてＰＢＳ中で混合した：抗ＣＤ１６／ＣＤ３２精製（Ｆｃ受容体をブロッキングするため）、ビオチン化抗ＣＤ３ε、ビオチン化抗ＣＤ１１ｂ、ビオチン化抗ＣＤ４５Ｒ、ビオチン化抗Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ、およびビオチン化抗Ｔｅｒ−１１９、ストレプトアビジン標識ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗Ｓｃａ−１、ＰＥ−Ｃｙ５標識抗ｃ−ｋｉｔ。このマスター混合物（５０μＬ）を各試料に添加し、次いでこれを穏やかなボルテックスによって混合し、そして暗所で１５分間、４℃でインキュベーションした。その後、遠心分離によって細胞を採取し、２ｍＬ  ＰＢＳ中で洗浄し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で試料を分析した。ゲート化法は以下の通りとした：前方および側方散乱を記録することによって、生存細胞に関するゲートを設定した。系譜マーカー（すなわちＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５Ｒ、Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ、Ｔｅｒ−１１９）の発現に基づいて、生存細胞をさらに区別した。これによって、Ｌｉｎ−細胞に関するゲートを定義することが可能になり、Ｓｃａ−１およびｃ−Ｋｉｔの発現に関して、これをさらに分析した。
【００８３】
［３Ｈ］ｃＡＭＰ集積アッセイ
各０．５ｍｇ／Ｌのベンジルペニシリンおよびストレプトマイシン、各５０ｎｇ／ｍＬのネズミ幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、ヒトＦｌｔ−３、ｈＩＬ−１１  ５０ｎｇ／ｍＬ、ｍ−ＩＬ３（１０ｎｇ／ｍＬ）（すべてＰｒｅＰｒｏＴｅｃｈ）、１０μｇ／ｍＬアデノシンデアミナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および［３Ｈ］アデニン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１μＣｉ／ｍＬ）を含有する１ｍＬの幹細胞培地（Ｓｔｅｍ  Ｓｐａｍ  ＳＦＥＭ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  ＃０９６５０）中で、Ｌｉｎ−／Ｓｃａ１＋細胞をインキュベーションした。プレインキュベーションを３７℃で４時間続けた。次いで、細胞を化合物（フォルスコリン、トレプロスチニルおよび他のプロスタノイド；コレラ毒素）で１時間刺激した。次いで、細胞をペレットにし（１００ｇ、５分間）、培地を除去し、そして０．１ｍＭ  ｃＡＭＰを含有する氷冷２．５％過塩素酸（０．９ｍＬ）中にペレットを溶解し、氷上で１時間保持し、そして４．２Ｍ  ＫＯＨ（０．１ｍＬ）で中和した。系譜マーカー陽性細胞を類似の方式で、しかし血清不含幹細胞培地の代わりにＲＭＰＩを含有する培地でプレインキュベーションした。Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０−Ｘ８および中性アルミナを含有するカラム上の連続クロマトグラフィーによって、ＡＴＰおよびｃＡＭＰを分離した（１２）。
【００８４】
相違が、フォルスコリンの存在下でのみ見られうるという事実は、技術的な問題である−シグナルは、フォルスコリン感作の非存在下では、異なる化合物、すなわちイロプロスト、ベラプロストおよびトレプロスチニルの間のいかなる相違も示すには低すぎる。感作は、これらの細胞が極端に低いｃＡＭＰを含有するため、受容体反応に関して感作されることを意味する。
【００８５】
トレポスチニルに関する濃度反応曲線（図５）にしたがって、ｃＡＭＰの増加がフォルスコリンの添加を伴わずに有意であることが明らかに示されうる。
骨髄移植：
同質遺伝子レシピエントマウスを致死性放射線照射に供した。造血幹細胞の静脈内投与によってレスキューされない場合、これらのマウスは最初の２週間で死んだ。Ｌｉｎ−（Ｓｃａ１＋およびｃ−Ｋｉｔ＋）造血幹細胞を上に概略するように調製し、そして１０μＭトレプロスチニルの非存在下および存在下、トレプロスチニル＋３０μＭフォルスコリン（ＦＳＫ）の組み合わせの非存在下および存在下、１０μｇ／ｍＬコレラ毒素の非存在下および存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで、３７℃で１時間前処理した。その後、細胞（３ｘ１０５／マウス）に、尾静脈を通じて注射した。ＦＡＣＳによって白血球数を決定した。白血球数を第９日（血球数が〜１Ｇ／Ｌの時点）から始めて５日ごとに決定した。
【００８６】
結果
造血幹細胞の精製：
ＭＡＣＳに基づく方法は、磁気ビーズ上に系譜マーカー陽性（Ｌｉｎ＋）細胞を保持し、そして系譜マーカー陰性細胞（Ｌｉｎ−）の回収を可能にする：細胞集団の性質をＦＡＣＳによって特徴付けた。ＭＡＣＳ保持細胞集団では、実際、系譜特異的マーカーに関して染色された細胞が濃縮されており、そして幹細胞受容体ｃ−Ｋｉｔ／ＣＤ１１７を欠いていた（図１）。
【００８７】
対照的に、カラムフロースルーから回収された細胞は、主に、上部左象限に見られ、すなわち、これらは高いｃ−Ｋｉｔレベルを示し、そしてＡＰＣ−Ｃｙ７−Ａ蛍光を欠いており、これは系譜マーカーの枯渇を示した（図２）。
【００８８】
ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１（幹細胞抗原−１）の両方に関して染色することによって、細胞集団をさらに評価した：系譜陽性細胞は、これらの２つのマーカーを欠き（図３Ａ）、一方、系譜陰性分画は、高レベルのｃ−Ｋｉｔまたはｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１の組み合わせを発現した（図３Ｂ）。
【００８９】
ｃ−Ｋｉｔ＋およびＳｃａ１＋細胞におけるサイクリックＡＭＰ集積
造血幹細胞のアデニンヌクレオチドプール（ｃ−Ｋｉｔ＋およびＳｃａ−１＋集団、図３Ｂを参照されたい）を、［３Ｈ］アデニンで代謝的に標識し、そしてトレプロスチニルおよび他のプロスタグランジン受容体アゴニストに対するその反応を調べた。これらの細胞は、非常に穏やかなｃＡＭＰ反応を有するため、フォルスコリンを用いることによって、酵素を感作した。このジテルペンは、アデニリルシクラーゼの触媒性Ｃ１およびＣ２ドメインの間の偽基質間隙において結合し、そして酵素の多様なアイソフォームを刺激性Ｇタンパク質Ｇαｓに対してより反応性を高める（１３〜１５）。図４からわかるように、トレプロスチニル、ベラプロストおよびイロプロストは、それ自体、ｃＡＭＰの穏やかな集積を引き起こし、これは３０μＭフォルスコリンによって誘発される度合いと同程度であった。しかし、フォルスコリンと組み合わせた際、トレプロスチニルは、ＩＰ（Ｉプロスタノイド）受容体特異的化合物イロプロストおよびベラプロストによって引き起こされるものを超えるｃＡＭＰレベルの増加を引き起こした。これは、ＥＰ（Ｅプロスタノイド）受容体に対するトレプロスチニルの作用を考慮に入れると合理的でありうる（１０）。トレプロスチニルは、０．１〜１０μＭの範囲でｃＡＭＰの濃度依存性集積を引き起こした（図５）。概算されるＥＣ５０は、０．３μＭの範囲であった。トレプロスチニルは、Ｌｉｎ＋造血細胞分画において、ｃＡＭＰレベルを増加させることができなかった（データ未提示）。
【００９０】
（Ｌｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ１＋）造血幹細胞による骨髄の再構成
致死性に放射線照射されたマウスを、３＊１０５Ｌｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ１＋細胞の静脈内注射によってレスキューした。白血球数は、第９日、最下点から増加し始め、そして次の数週間に渡ってゆっくりと増加した。６０日後、循環白血球は生着した造血幹細胞から産生されたもののみであり得たため、造血幹細胞注射６０日後の白血球レベルを適切な終点として選択した。図６からわかるように、トレプロスチニル前処理造血幹細胞を注射されたマウスは、ビヒクル処理造血幹細胞を受けたものよりも有意により高いレベルの循環白血球を有した（ｐ＜０．０５、独立データに関するｔ−検定）。
【００９１】
さらなる対照として、動物に
（ｉ）コレラ毒素は最も有効でそして持続性のＧαｓ活性剤であるため、コレラ毒素で処理した細胞、
（ｉｉ）上述のように、フォルスコリンはアデニリルシクラーゼアイソフォームを直接活性化するため、フォルスコリン
（ｉｉｉ）フォルスコリンおよびトレプロスチニルの組み合わせ
を注射した。
【００９２】
トレプロスチニルは、有効なｅｘ  ｖｉｖｏ操作として確立された陽性対照コレラ毒素（１、２）と同程度に有効であったことが明らかである。
実施例２
骨髄幹細胞の単離
Ｃ５７ＢＬ／６およびＢ６ＳＪＬマウスを屠殺し、そして骨髄幹細胞を実施例１に記載するように単離した。
【００９３】
単離幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ前処理
Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ６ＳＪＬマウス由来の骨髄幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでコレラ毒素（ＣＴＸ）またはトレプロスチニル＋フォルスコリン（ＦＳＫ）で前処理し、そして幹細胞をＬｙ５．２またはＬｙ５．１でマーキングする。
【００９４】
最初の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄幹細胞を、前処理なしに用い、そして幹細胞をＬｙ５．２でマーキングした。Ｃ６ＪＬ由来の骨髄幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでコレラ毒素またはトレプロスチニル＋フォルスコリンで前処理し、そして幹細胞をＬｙ５．１でマーキングした。
【００９５】
比較研究のため、Ｌｙ５．１＋細胞およびＬｙ５．２＋細胞の１：１混合物を、骨髄移植によってマウスに導入し、そしてＬｙ５．２陽性血球およびＬｙ５．１陽性血球の比を最初に測定した。次いで、骨髄移植の１６週後、血球増殖を測定した。結果を図７に示し、ここで、トレプロスチニル／ＦＳＫ前処理細胞（Ｌｙ５．１＋）は、未処理細胞およびＣＴで前処理した細胞と比較して、有意に増加した増殖を示すことが明らかに示される。
【００９６】
第二の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６由来の骨髄幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでコレラ毒素またはトレプロスチニル＋フォルスコリンで前処理し、そして幹細胞をＬｙ５．２でマーキングした。Ｌｙ５．１でマーキングされたＣ６ＪＬマウス由来の骨髄幹細胞を、いかなる前処理も伴わずに用いた。
【００９７】
再び、比較研究のため、Ｌｙ５．１＋細胞およびＬｙ５．２＋細胞の１：１混合物を骨髄移植によってマウス内に導入し、そしてＬｙ５．２陽性血球およびＬｙ５．１陽性血球の比を最初に測定した。次いで、骨髄移植１６週後、血球増殖を測定した。結果を図８に示し、ここで再び、明らかにトレプロスチニル／ＦＳＫ前処理細胞（Ｌｙ５．２＋）は、未処理細胞およびＣＴで前処理した細胞と比較して、有意に増加した増殖を示すことが立証される。したがって、トレプロスチニルおよびフォルスコリンの影響は、骨髄細胞の起源には依存しないことが示されうる。
【００９８】
トレプロスチニルおよびフォルスコリンの組み合わせは、したがって、造血幹細胞の生着を増加させ、そしてコレラ毒素での前処理と同程度にまたはそれよりも有効である。
参考文献
【００９９】
【化１−１】
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【０１００】
【化１−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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