(57)【要約】  本発明は、事前調整した硬い種子と共に破砕ピンまたは他の破砕装置等の機械的装置を使用することによって、種子を断片化する方法に広く関する。抽出されるＤＮＡ収率および／またはＤＮＡ品質を高めるのに適している、より効果的な断片化のために種子を軟化させるための種子を事前調整する方法を示す。アルカリ浸漬された種子から抽出されるＤＮＡ収率は、種子を破砕する前に、種子の前処理に使用される種子軟化アルカリ浸漬液に浸透圧調節物質を添加することによって有意に増加させることができる。浸透圧調節物質は、種子による液体吸収を抑制し減少させるが、破砕ピンまたは他の破砕装置の使用を必要とせずに、スチールビーズで破砕されるのに十分に種子を弱くする。
2014533521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子からＤＮＡを抽出する方法であって、
ａ．前記種子を：
ｉ．前記種子を軟化させるのに十分な濃度のアルカリおよび任意選択的に
ｉｉ．アルカリのみで前記種子を前処理することを含むプロセスと比較して前記ＤＮＡの収率を高めるのに十分な濃度の浸透圧調節物質
を含む、前処理溶液に浸漬することにより前記種子を前処理すること；
ｂ．前記種子を破砕すること；
ｃ．前記破砕された種子から前記ＤＮＡを抽出すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アルカリが水酸化ナトリウムかまたは水酸化カリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルカリが約０．１Ｍ〜約１Ｍの濃度で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記浸透圧調節物質が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マンニトール、糖アルコール類、およびスクロースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記浸透圧調節物質が約１Ｍ〜約５Ｍの濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記種子が、トウモロコシ、大麦、ソバ、イネ科植物、モロコシ、花、コメ、小麦、ブルグア、ミレット、ライムギ、ダイズおよび他の豆類、メロン、ザクロ、ヒマワリ、トルティカーレ、大麦、キャノーラ、ワタ、ベニバナ、ヨード化ケシ、ゴマ、カルダモン、セロリ、ディル、ウイキョウ、ナツメグ、およびプランテーンの種子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記浸漬が、前記種子を軟化させるのに十分な期間続けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記浸漬が、約２２℃〜約６５℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記破砕が、前記種子を閉鎖空間の中に置くことおよび前記種子をサイズ縮小要素と一緒に振盪することを含む方法で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイズ縮小要素が、前記種子を粉砕するのに十分な硬度を有する物体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウェルの中で植物材料を溶液で前処理するステップ；前記前処理した種子を、リデューサー要素を用いて、力強い振盪または衝突力で粉砕し、結果的に断片化された種子材料を生じるステップ；を含む、植物材料を断片化する方法。
【請求項１２】
前記前処理した種子を粉砕する前に、前記前処理溶液が前記植物材料から分離されない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記種子と接触している前記前処理溶液が、ＤＮＡ抽出バッファーと取り替えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記粉砕ステップが自動化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）ウェル底部を有する少なくとも１つのウェルが付いたウェルプレートであって、前記ウェルが植物組織材料を受けるのに適しているウェルプレート；（ｂ）前記ウェルの中に入るための、少なくとも１つのピンを収容するのに適しているダイプレート；および（ｄ）前記ピンが前記受けた種子材料を破砕する、前記ダイプレートを前記ウェルプレートと湊合するためのプレス；を含む、種子断片化のための種子破砕機装置。
【請求項１６】
前記ウェルプレートが任意選択的に固定されているかまたは可動性であり、前記ダイプレートが任意選択的に固定されているかまたは可動性である、請求項１５に記載の種子破砕機。
【請求項１７】
前記ウェルプレートが、ウェル内に置かれた１つまたは複数の縮小要素を有する、請求項１５に記載の種子破砕機。
【請求項１８】
前記ウェル内の前記縮小要素を振盪する、回転させる、または振動させるプラットホームを含む、請求項３に記載の種子破砕機。
【請求項１９】
種子断片化から抽出媒体を回収する方法であって：（ａ）ウェルの中の少なくとも１つの種子を、前記種子断片化用の縮小要素と一緒に振盪するステップ；（ｂ）前記媒体が種子構成成分を溶解できる、抽出媒体を各ウェルの中に送達するステップ；および（ｃ）前記抽出媒体を回収するステップを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記ウェルの中の前記抽出媒体を送達した後で、ウェルプレートが振盪される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記種子がアルカリ溶液中で前処理され、前記種子の硬さが減少している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ウェルの中の種子材料を前処理するステップ；各ウェルの中に入って前記種子を破砕するのに適している少なくとも１つの垂直のピンが付いた水平のダイプレートを含む自動化システムで前記前処理した種子材料を破砕し、前記ウェルから分析用の種子構成成分を抽出するステップ；を含む、種子構成成分を破砕された種子材料から抽出するプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条に基づき、２０１１年１１月２８日提出の米国仮特許出願第６１／５６４，１３８号明細書および２０１２年７月３１日提出の米国仮特許出願第６１／６７７，５１４号明細書（共に、本明細書と矛盾しない範囲まで、参照により本明細書に援用する）に利益を要求する。
【背景技術】
【０００２】
種子の内容または遺伝子型を理解することは、植物遺伝子工学から従来の植物育種までの種々の農作業で有用である。種子内容は、改良された農学的、園芸学的または経済学的な特徴または形質を持った新しい植物を生産、選択または開発するために使用できる情報を明らかにする。選択された特徴について種子または種子の一部を試験するためには、多くの場合、ＤＮＡの抽出および分析が必要である。
【０００３】
種子は、破壊力に対して生来の抵抗力を有する傾向がある。トウモロコシ、穀類、ダイズ、コメ、ダイズおよび他の豆類、メロン、ザクロ、ヒマワリ、ベニバナ、ヨード化ケシ、ゴマ、カルダモン、セロリ、ディル、ウイキョウ、ナツメグ、およびプランテーンは、他の野菜、作物および花の種子と同様、非常に硬いことが多い。この保護のため、硬い種子を破砕するためにはかなりの機械的力を高頻度で必要とする。種子を破砕するために手の力を用いることは、遅くて、難しく、また実験室設備では困難である。
【０００４】
純度および他の種子内容について種子ロットをテストするためには、多くの場合、非常に多数の単一種子からのＤＮＡの抽出を必要とする。したがって、ハイスループットＤＮＡ抽出のための効率のよいシステムが必要である。種子からＤＮＡを抽出するためには、種子を先ず断片化しなければならない。乳鉢と乳棒を用いて手作業で種子を破砕できる幾つかの断片化方法がある。
【０００５】
アルカリ溶解法は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ  ａｎｄ  Ｄｏｌｙ：Ｃｅｌｌｓ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ａｌｋａｌｉ  ｓｏｌｕｔｉｏｎによって発明されたプラスミド抽出テクニックである。高ｐＨは、細胞を溶解するばかりでなく、ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを変性させる。次のステップで、溶解細胞を含有する溶液は中和され、環状のスーパーコイル化している小プラスミドＤＮＡは二本鎖へと急速に回復する。しかし、多量のゲノムＤＮＡは線状のままであり、細胞残屑に付着する。したがって、後続する遠心分離ステップ中に、ゲノムＤＮＡの大部分がペレット中に失われる。
【０００６】
塩化ナトリウムは、種子の吸水を減少させることが分かっている（Ｎｉｚａｍ，Ｉ．（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ７，２０１１），“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓａｌｉｎｉｔｙ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｗａｔｅｒ  ｕｐｔａｋｅ，ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ｒｙｅｇｒａｓｓ，”Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（５１）：１０４１８−１０４２４）。
【０００７】
本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願を、書面による説明および使用可能性のために、本明細書と矛盾しない範囲で、参照により本明細書に援用する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、破砕ピンおよび／またはスチールビーズ等の要素の使用を含む、種子断片化の装置および方法を記述する。本発明は、種子の内部構成要素をより利用しやすくまた入手しやすくするための、それらの使用を含む。
【０００９】
本発明はまた、種子断片化の容易性を高め、またＤＮＡ収率を高める、断片化前に種子を事前調整する方法も含む。本発明の一実施態様は、種子破砕機を使用し、種子事前調整ステップを用いることによりセパレータ装置が不要になる。本発明は、個々のウェルまたは種子保持容器および／またはプレートの中で種子を破砕するのに適している種子破砕機を提供し、次にはそれをテストに使用することができる。本発明による種子破砕機は、オス破砕要素を受けるための少なくとも１つのウェルが付いたウェルプレート；各ウェルが開口頂部および閉鎖底部および前記頂部から前記底部まで所定の長さを有する、ウェルプレート；（ｃ）水平のダイプレートであって、前記ウェルプレートの少なくとも１つのウェル内にちょうど収まるように、その上に配置された少なくとも１つのオス破砕要素を含む、水平のダイプレート；（ｄ）；ウェル内に配置されるのに合わせて作られた前記オス破砕要素；（ｅ）嵌合位置でオス破砕要素が前記ウェル底部と係合しないようにオス破砕要素がウェルに入るように、ウェルプレートと関連した位置でダイプレートを湊合するためのプレス；を有する。
【００１０】
プレートのいずれかまたは両方（ウェルプレートおよび／またはダイプレート）が可動性であってもよく、あるいは一方のプレートは可動性であり他方は固定されたままであってもよい。別の実施態様で、ウェルプレートは、アレイ配置されていてもよい、複数のウェルを有し、またダイプレートは、類似したアレイで固定されていてもよい、複数のオス破砕要素を含む。種子破砕機装置は、複数のオス破砕ピン、すなわち、各ウェルへの嵌合進入のために整列させたピンを有する、ダイプレートを含む。各ウェルプレートは、前処理した種子を保持し支持するのに役立つ複数のウェルを有する。前処理した種子を使用するのは、ウェル破損を防止するためである。前処理した種子は、破砕中に、より少ないピン力を必要とする；したがって、破砕された種子が、ウェルの底部を貫通する機会を減らす。
【００１１】
一実施態様では、ウェル内の種子との各嵌合可能な係合の間に、残遺種子材料を除去するために、オス破砕要素をすすぐ。別の実施態様では、ピンが嵌合位置から非嵌合位置まで移動するとき、オス破砕要素は、残遺物を除去する一連の流動液体または気流を有する。言い換えれば、種子破砕要素がウェルから引っ込んでいるかまたは引っ込むとき、破砕要素上の破砕された種子材料が今破砕された種子と一緒にウェルの中に沈殿するように、液体または空気がピンに適用される。別の実施態様では、複数のダイプレートが使用され、使用されていないダイプレートは、もう一度使用する前に残遺種子が除去される。ダイプレートは、種子破砕位置にないとき、残遺物を除去するのに適している洗浄サイクルを通して回転することができる。また別の実施態様では、オス破砕要素は使い捨てであって廃棄され、交換用オス破砕要素およびまたはダイプレートが使用される。
【００１２】
本発明はまた、１つまたは複数の前処理した種子を各ウェルの中に置き、種子破砕機器を操作して、破砕要素を、前処理した種子と嵌合させることによって、種子を破砕する方法も提供する。本発明はさらに、種子を前処理し、種子を破砕し、破砕された種子から１つまたは複数の構成成分を抽出し、ウェル内の種子構成成分を分析またはテストする方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、事前調整した種子の機械的破砕を使用することを含む種子断片化の装置および方法を記述する。本発明の一実施態様で、種子は、水、またはＳＤＳもしくは抽出バッファー、たとえば改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａに浸漬することによって軟化され、この浸漬は、６５Ｃのような昇温状体で起こり得る。前処理の目的は、種子が中に収容されている容器を、機械的破砕の力が壊さないように、種子を軟化させることである。加えて、ピン破砕が使用された後、さらなる種子断片化が望ましければ、その時は、スチールビーズ等の縮小要素が、事前調整した種子の断片化に使用される。
【００１４】
本発明の別の実施態様では、事前調整した種子を断片化するための力として、ピン破砕機は使用されないで、スチールビーズ等の縮小要素が使用される十分に軟化した状態まで、種子は生化学的に事前調整される。この実施態様の利点は、所与の時間で、縮小要素を用いると、同じ時間で、ピン破砕機を使用して処理できるよりも、多くの種子を処理できることである。
【００１５】
一般に、本発明は、事前調整した硬い種子と共に破砕ピンまたは他の破砕装置等の機械的装置を使用する、種子を断片化する方法に広く関する。抽出されるＤＮＡ収率および／またはＤＮＡ品質を高めるのに適している、より効果的な断片化のために種子を軟化させるために種子を事前調整する方法を示す。種子を事前調整する一方法は、アルカリ浸漬種子から抽出されるＤＮＡ収率を高めるために種子をさらに断片化するために、縮小要素を使用する前の種子の前処理に使用するための種子軟化用アルカリ浸漬液を使用することである。
【００１６】
しかし、これらの種子が多量のアルカリを吸収することにより、ＤＮＡ収率の若干の損失が生じる可能性がある。浸透圧調節物質が種子による吸水を調節することは周知である。浸透圧調節物質がアルカリ浸漬液に添加されるとき、種子は膨張は少ないが、スチールビーズで完全に断片化されるように十分に軟化していることが視覚的に認められる。アルカリ浸漬された種子からこのようにして抽出されるＤＮＡ収率は、種子の断片化の前に種子の前処理に使用される種子軟化アルカリ浸漬液に浸透圧調節物質を添加することによって有意に増加させることができる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、より少ないＤＮＡが変性されて、結果的により高いＤＮＡ収率になるようである。
【００１７】
浸透圧調節物質は、種子による液体吸収を抑制し減少させるが、それでも破砕ピンまたは他の破砕装置の使用を必要とせずに、スチールビーズで破砕されるのに十分に種子を弱くする。浸透圧調節物質は、塩化ナトリウムまたは当技術分野に知られている他の浸透圧調節物質であってもよい。約２２℃〜６５℃の温度で、約１２〜約２５時間の期間、約０．１Ｍ〜約０．１Ｍの水酸化ナトリウムおよび約１〜約５Ｍの塩化ナトリウムを含む前処理溶液に浸漬することは、種子を軟化させてスチールビーズで満足できる破砕を可能にすると同時に、抽出されるＤＮＡの収率を高める。したがってより大きいＤＮＡの収率が必要であれば、浸透圧調節物質を加えて、浸漬液の種子吸収を減少させることができる。
【００１８】
アルカリ軟化溶液からのＤＮＡ増収を達成する代替方法は、減量したアルカリを使用することである。利用できる液体の量が、種子の、液体を容易に吸収する潜在能力未満であるとき、より少ないＤＮＡが変性されてよりよいＤＮＡ収率につながるようである。
【００１９】
一般に、本発明は、事前調整した硬い種子と共に破砕ピンまたは他の破砕装置等の機械的装置を使用する、種子を断片化する方法に広く関する。抽出されるＤＮＡ収率および／またはＤＮＡ品質を高めるのに適している、より効果的な断片化のために種子を軟化させるための種子を事前調整する方法も示す。
【００２０】
破砕ピン等の機械的装置に転じて、本発明は、個々のウェルまたは種子保持容器および／またはプレートの中にある種子を破砕するのに適している、改良された種子破砕機を提供する。容器内の破砕された種子は、つぎにＤＮＡ抽出に直接使用することもでき、ＤＮＡ抽出前のさらなる断片化に使用することもできる。
【００２１】
このように、本発明の一実施態様は：ウェルの中で種子材料を前処理するステップ；各ウェルの中に入ってその中の種子を破砕するのに適している少なくとも１つの垂直のピンが付いた水平のダイプレートを含む自動化システムの中で、前処理した種子材料を破砕し、分析のために前記ウェルから種子構成成分を抽出するステップ；を含む、種子を破砕して、破砕された種子材料を形成するプロセスである。
【００２２】
また別の実施態様は：ウェル底部を有するウェルが付いたウェルプレートであって、前記ウェルが種子等の植物組織材料を受けるのに適している、ウェルプレート；ウェルの中に入るための、少なくとも１つのピンを収容するのに適している、ダイプレート；および、ウェルに入って前記受けた種子を、ピンとウェル底部との間で破砕するための破砕ピンと、ダイプレートを湊合するためのプレス；を含む、種子断片化のための種子破砕機装置である。破砕ピンは、ウェルプレートは可動性であってダイプレートが定位置であるか、あるいはウェルプレートは定位置であってダイプレートが可動性である、ダイプレートの一部である。
【００２３】
種子材料のさらなる断片化を容易にするために、ウェルプレートは、少なくとも１つのウェル内に置かれた１つまたは複数の縮小要素を有する。任意選択的に、種子材料の断片化のために、ウェル内の縮小要素を振盪、回転または振動させるための装置を使用することができる。これは、破砕機装置の一部であってもよく、独立型の装置であってもよい。一実施態様で、このプラットホームは破砕機装置の一部であり、ウェル内の縮小要素を振盪する、回転させる、または振動させる。
【００２４】
本発明は、断片化された種子から抽出媒体を回収する方法を含み、前記方法は：ウェルの中の少なくとも１つの種子を、種子断片化用の縮小要素と一緒に、振盪するステップ；前記媒体が断片化した種子構成成分を溶解できる、抽出媒体を各ウェルの中に送達するステップ；および抽出媒体を回収するステップ；を含む。任意選択的に、抽出媒体をウェルに加えた後、ウェルの中に抽出媒体を送達した後で且つ抽出媒体を回収する前に、ウェルプレートを再振盪する。断片化した種子から抽出媒体を回収する方法は、種子をアルカリ溶液中に浸漬することによって種子を前処理し、種子の硬さを低下させる、事前調整ステップを含むことができる。
【００２５】
したがって、種子材料を破砕するプロセスは：種子材料をウェルの中で前処理するステップ；前処理した種子を、リデューサー要素を用いて衝突力で粉砕し、分析のために、前記種子材料から種子構成成分を抽出するステップ；を含む。この溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または重曹を含む。
【００２６】
また別の実施態様で、本発明による種子破砕機は、オス破砕要素を受けるための少なくとも１つのウェルが付いたウェルプレート；各ウェルが開口頂部および閉鎖底部および前記頂部から前記底部まで所定の長さを有する、ウェルプレート；（ｃ）水平のダイプレートであって、前記ウェルプレートの少なくとも１つのウェル内にちょうど収まるように、その上に配置された少なくとも１つのオス破砕要素を含む、水平のダイプレート；（ｄ）；ウェル内に配置されるのに合わせて作られた前記オス破砕要素；（ｅ）嵌合位置でオス破砕要素が前記ウェル底部と係合しないようにオス破砕要素がウェルに入るように、ウェルプレートと関連した位置でダイプレートを湊合するためのプレス；を有する。
【００２７】
別の実施態様で、ウェルプレートは、アレイ配置されていてもよい、複数のウェルを有し、またダイプレートは、類似したアレイであってもよい、複数のオス破砕要素を含む。種子破砕機装置は、複数のオス破砕ピン、すなわち、各ウェルへの嵌合侵入のために整列させたピンを含む、ダイプレートを含む。各ウェルプレートは、前処理した種子を保持し支持するのに役立つ複数のウェルを有する。前処理した種子の使用は、破砕中のウェル破損を防止するために、種子を軟化させるためである。前処理した種子は、破砕中により少ないピン力を要する；したがって、破砕された種子が、ウェルの底部を貫通する機会を減らす。
【００２８】
さらなる一実施態様では、ウェル内の種子との各嵌合可能な係合の間に、残遺種子材料を除去するために、オス破砕要素をすすぐ。別の実施態様では、ピンが嵌合位置から非嵌合位置まで移動するとき、オス破砕要素は、種子残遺物を除去する一連の流動液体または気流を有する。言い換えれば、種子破砕要素がウェルから引っ込んでいるかまたは引っ込むとき、破砕要素上の破砕された種子材料が今破砕された種子と一緒にウェルの中に沈殿するように、液体または空気がピンに適用される。
【００２９】
別の実施態様では、複数のダイプレートが使用され、使用されていないダイプレートは、もう一度使用する前に残遺種子が除去される。ダイプレートは、種子破砕位置にないとき、残遺物を除去するのに適している洗浄サイクルを通して回転することができる。また別の実施態様では、オス破砕要素は使い捨てであって廃棄され、交換用オス破砕要素およびまたはダイプレートが使用される。
【００３０】
本発明はまた、１つまたは複数の前処理した種子を各ウェルの中に置き、種子破砕機器を操作して、破砕要素を、前処理した種子と嵌合させることによって、種子を破砕する方法も提供する。本発明はさらに、種子を前処理し、種子を破砕し、破砕された種子から１つまたは複数の構成成分を抽出し、ウェル内の種子構成成分を分析またはテストする方法を提供する。
【００３１】
トウモロコシ種子等の種子から抽出されるＤＮＡの分析におけるもう１つの問題は、種子が軟化されていると、スチールビーズでしか断片化できないことである。ＤＮＡ分析に関するさらなる問題は、破砕前にアルカリ前処理軟化プロセスを使用すると、結果的に比較的低いＤＮＡ収率となり、幾つかの下流アプリケーション、たとえば種子ロットの純度テストに必要な最低数量または品質基準を常に満たすとは限らないことである。簡単なＤＮＡ単離プロトコールを使用するとき、高いＤＮＡ収率が重要である。ＤＮＡ抽出後に、下流アプリケーションを阻害する汚染物質が存在するのであれば、汚染物質が下流アプリケーション（たとえば、ＰＣＲ）を妨げないように十分にＤＮＡ含有溶液を希釈しなければならない。この希釈ステップが有効であるために、下流アプリケーションが前進できる十分なＤＮＡが溶液中になければならない。
【００３２】
浸透圧調節物質を種子軟化アルカリ浸漬液に添加することによって、アルカリ浸漬された種子から抽出されるＤＮＡ収率を有意に上昇できることが分かった。浸透圧調節物質は、種子による吸水を抑制し減少させるが、ピンの使用を必要とせずに、スチールビーズのみで機械的に破砕されるのに十分に種子を弱くする。浸透圧調節物質は、塩化ナトリウムまたは当技術分野に知られている他の浸透圧調節物質であってもよい。
【００３３】
本方法が作用するメカニズムのいかなる理論にも束縛されるものではないが、本明細書で報告する発見に関する可能な説明は、種子による吸水減少が、変性されているＤＮＡ量を減少させるかもしれないということであるということを、出願人は提唱する。一本鎖ＤＮＡは細胞残屑に結合し、ＤＮＡ抽出の間の、次の遠心分離ステップ中に失われる。
【００３４】
したがって、種子からＤＮＡを抽出する方法、前記種子を軟化させるのに十分な濃度でアルカリを含む前処理溶液中に種子を浸漬することにより、種子を前処理する方法；およびアルカリのみで種子を前処理することを含むプロセスと比較してＤＮＡの収率を増強するのに十分な濃度の浸透圧調節物質；種子を破砕すること；および破砕された種子からＤＮＡを抽出すること；を本明細書で提供する。本発明のまた別の実施態様で、室温より高い温度で種子を浸漬することにより破砕ステップの効率を改良することができる。これらの温度は、室温２２Ｃから５０Ｃおよび６５Ｃ以上に及ぶことができる。
【００３５】
したがって、種子からＤＮＡを抽出する方法、種子を軟化させるのに十分な濃度で限られたアルカリ溶液を含む限られた量の前処理溶液中に種子を浸漬することにより種子を前処理する方法；種子を軟化させるのに十分な濃度のより多量のアルカリ溶液で種子を前処理することを含むプロセスと比較してＤＮＡの収率を高めるのに十分な；種子を破砕すること；および破砕された種子からＤＮＡを抽出することが本明細書で提供される。この方法は、ピン破砕機で、および／またはスチールビーズ型破砕機を使用して、種子を断片化することができる。この方法はまた、ビーズ型破砕機で種子を断片化することもできる。この種子断片化方法は、ビーズと種子を振盪するステップを使用する。したがって、種子からＤＮＡを抽出する方法が本明細書で提供され、前記方法は：
ａ．前記種子を：
ｉ．前記種子を軟化させるのに十分な濃度のアルカリ；および
ｉｉ．前記種子をアルカリで前処理することを含むプロセスと比較して前記ＤＮＡの収率を高めるのに十分な濃度の浸透圧調節物質；
を含む、前処理溶液に浸漬することにより、前記種子を前処理すること；
ｂ．前記種子を破砕すること；および
ｃ．前記破砕された種子から前記ＤＮＡを抽出すること；
を含む。
【００３６】
本明細書で提供されるプロセスは、機械的手段のみで破砕することが難しい種子からＤＮＡを抽出するのに有用である。たとえば、穀粒および果実は多くの場合、抽出が可能な前に軟化されることが必要な硬い種子を有する。トウモロコシ、大麦、ソバ、コメ、小麦、ブルグア、ミレット、ライムギ、およびコメ等の穀粒、ダイズ、および他の豆類、野菜、メロン、ザクロ、ヒマワリ、ベニバナ、ヨード化ケシ、ゴマ、カルダモン、セロリ、ディル、ウイキョウ、ナツメグ、およびプランテーンを含む他の作物および花の種の硬い種子を有する、そのような種子の例。硬い種子を有する他の多くの種子（それからＤＮＡが抽出されることが望まれる）は、当技術分野に知られており、本明細書に記載のプロセスで使用することができる。
【００３７】
このプロセスで抽出されるＤＮＡは、種子の構成成分を決定するためのテスト、種子の遺伝子型、または当技術分野に知られている他の目的のために使用することができる。そのようなテスト方法は、当技術分野に知られている。
【００３８】
ＤＮＡを抽出する、分離する、単離する、および精製する多くの方法は、当技術分野に知られている。
【００３９】
前処理溶液用のアルカリ成分は、種子の軟化を引き起こすのに十分高いｐＨ、たとえば、約１２．０〜約１４．０のｐＨを達成することができる、当技術分野に知られている任意の水酸化物ドナーであってもよく、抽出される予定のＤＮＡを変性させるが、損傷しない。実施態様で、アルカリは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである。アルカリは、ＤＮＡがそこで抽出される濃度で存在しなければならず、破砕を容易にするために種子を軟化させるのに十分強い。多くの実施態様で、種子を軟化させることができるアルカリ溶液は、約０．１Ｍ〜約１Ｍの濃度である；しかし、濃度は、場合によっては、これらの濃度より高くてもよく、低くてもよい。
【００４０】
浸透圧調節物質は、植物もしくは植物部分または植物細胞の培養で浸透圧を補うために作用する物質である。本明細書で有用な浸透圧調節物質は、下流抽出、抽出されるＤＮＡの単離または精製を妨害することなく、溶液の浸透圧を高めて種子による浸漬液からの液体の吸収を妨げるかまたは抑制することが当技術分野に知られている任意の物質または物質の組合せであってもよい。実施態様で、浸透圧調節物質は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マンニトール、ソルビトールおよび他の糖アルコール類、およびスクロースからなる群から選択されるが、但し、下流ＰＣＲが必要であれば、スクロースはＰＣＲを阻害するであろう量で使用されない。浸透圧調節物質は、種子による前処理溶液からの液体の吸収を有意に減少させるのに十分な濃度で前処理溶液中に存在しなければならない。抽出されるＤＮＡの収率を、より少量の浸透圧調節物質（または無浸透圧調節物質）を使用した以前のＤＮＡ抽出プロセスで達成される収率を越えて高めるために、ＤＮＡが抽出される種子の前処理に十分な浸透圧調節物質が使用される。実施態様で、浸透圧調節物質は、約１Ｍ〜約５Ｍの濃度で、前処理溶液中に存在する。
【００４１】
種子は、浸透圧調節物質が機能できるのに十分な期間、前処理溶液に浸漬してもよく、また抽出されるＤＮＡの破砕を容易にするのに十分に種子を軟化させるためにアルカリに浸漬してもよい。幾つかの実施態様で、この期間は約１２時間〜約２５時間である。浸漬の長さは、種子の耐久性に応じて、１２〜２５時間を超えて短縮することもでき、長くすることもできる。アルカリの濃度および浸透圧調節物質溶液が上方または下方に調節されるとき、必要な浸漬時間の量は、相応して、より強力な溶液ではより少なく、またはより低濃度溶液ではより多い。
【００４２】
結果的に種子の十分な軟化をもたらして破砕を容易にするのに十分であるが、抽出されるＤＮＡを損傷するほど高くはない温度で、種子を前処理溶液に浸漬する。実施態様で、浸漬温度は、約２２℃〜約６５℃である。
【００４３】
種子の破砕は、ピンで、またはスチールビーズか当技術分野に知られている任意の方法を用いて、実施することができる。幾つかの実施態様で、本方法は、種子を閉鎖空間の中に置くことおよびそれらをサイズ縮小要素と一緒に振盪することを含む。閉鎖空間は、十分な表面積の壁および種子を破砕するためにサイズ縮小要素と種子との間に十分な衝突が起こることを保証する壁強度を有するものである。幾つかの実施態様で、閉鎖空間はウェルプレートのウェルである。
【００４４】
サイズ縮小要素は、種子に衝撃を与えることによって、種子を断片化するのに十分な硬さの任意の粒子であってもよい。本明細書で有用なサイズ縮小要素は、ボールベアリング、ｂｅｅ−ｂｅｅｓ、小ペレット、ステンレススチールボール、カーバイドボール、セラミック、スチール、銅、アルミニウム、または種子を粉砕するのに十分な硬度を有するプラスチック、合成ダイアモンド、および他の材料で作られた球形様の形をもつ物体、からなる群から選択することができる。粒子は、回転楕円体であってもよく、種子の粉砕を容易にするために、小面形状または点および／またはエッジをもつ形状を含む他の形を有してもよい。
【００４５】
幾つかの実施態様で、破砕ステップは、種子をウェルプレートのウェルの中に置くこと、およびそれらを、ピンをウェルの中に押し込んで種子を破砕するように設計されたダイプレートに取り付けられたピンと接触させることによって、それらに圧縮圧を加えることを含む方法によって実施される。
【００４６】
破砕ステップはまた、当技術分野に知られている任意の閉鎖空間、たとえば、サイズ縮小要素および種子および種子断片の衝撃に耐える十分な強度の壁を有するチューブ、ポットまたは他の密閉容器もしくは蓋のあいた容器の中で実施することもできる。
【００４７】
少なくとも１つの実施態様で、前処理溶液は、種子を破砕する前に、種子から分離されない。別の実施態様で、前処理溶液は、種子を破砕する前に種子から分離される。さらに他の実施態様で、種子と接触している前処理溶液は、種子を破砕する前に、ＤＮＡ抽出バッファーまたはＤＮＡの抽出に使用される他の液体と取り替えられる。
【００４８】
幾つかの実施態様で、前処理ステップ、破砕ステップ、および抽出ステップ、またはこれらのステップのサブセットは自動化されており、本明細書に記載されている通りにアルカリ前処理溶液のｐＨを調整することおよび浸透圧調節物質を溶液に添加することによって、または浸漬液中での前処理を含まないプロセスで本明細書に記載のアルカリおよび浸透圧調節物質溶液に浸漬する前処理ステップを加えることによって、不当な実験なしに当業者により修正され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】種子破砕機の構成要素の図説である。ダイプレス、複数の種子破砕ピン要素を具有するダイプレートが表示されている。破砕ピンは、破砕位置で、種子保持ウェルプレートのウェル内にある。ピンは、この位置で、ウェル底部と係合していない。
【図２】複数の種子破砕要素が付いたダイプレートの側面図である。
【図３Ａ】複数の種子破砕要素が付いたダイプレートの上面図である。
【図３Ｂ】種子破砕要素であるピンの最先端部分である。
【図４】開口頂部および四角錐底部を有するウェルプレートの上面図である。このウェルプレートは、ウェルプレート上のウェル内に、前処理したトウモロコシ種子を有する。
【図５】遠心分離後、抽出バッファーの中の破砕された種子が入っているウェルプレート１０９を示す。各ウェルの底部における種子残渣１４９と共に、小さいスチールボール形の縮小エレメント１３９が、各ウェル１１９の中に見える。抽出バッファー中のＤＮＡを含む上澄１５９は、各ウェルの中の残渣の上に見られる。
【図６】トウモロコシ種子から抽出されたＤＮＡのＤＮＡプロフィールを示し、ＤＮＡ抽出前に、２２℃で、異なる水酸化ナトリウム濃度を用いた、浸漬種子のＤＮＡ収率に対する影響を示す。下段：種子を抽出バッファー（ｐＨ８．２）に浸漬し、ピン破砕機で破砕して、スチールビーズで完全に断片化した。中段：種子を、１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬し、次いで抽出バッファー中でスチールビーズと一緒に振盪した。上段：種子を１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．２Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬し、次いで抽出バッファー中でスチールビーズと一緒に振盪した。
【図７】トウモロコシ種子から抽出されたＤＮＡのＤＮＡプロフィールを示し、ＤＮＡ抽出前に、４０℃で、異なる水酸化ナトリウム濃度を用いた、浸漬種子のＤＮＡ収率に対する影響を示す。下段：種子を抽出バッファー（ｐＨ８．２）に浸漬し、ピン破砕機で破砕して、スチールビーズで完全に断片化した。中段：種子を、１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬し、次いで抽出バッファー中でスチールビーズと一緒に振盪した。上段：種子を１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．２Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬し、次いで抽出バッファー中でスチールビーズと一緒に振盪した。
【図８】３５℃で、３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．２Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬し、次いで抽出バッファー中でスチールビーズと一緒に振盪した、異なる種子ロットからの種子に関する対立遺伝子識別プロットを示す。プロットは、チャートの左角にＦＭ／Ａ遺伝子型を、右中央部分にＡ遺伝子型およびＧ遺伝子型を、右側下方にＧ遺伝子型を示し、チャートの左側下方には未確定の小さいばらつきがある。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
収穫時に十分に成熟したトウモロコシ種子は非常に硬い種子であり、通常は僅かに扁平な種子である。ＤＮＡを抽出するために、本発明は、種子断片化プロトコールまたは種子破砕プロトコールおよび断片化された種子からＤＮＡを容易に抽出できるように、ＤＮＡ収率を維持すると同時に種子の硬さを低下させる方法を提供する。一実施態様は、種子破砕機を使用して、種子を機械的に破砕する装置を提供する。この機械的破砕方法は、種子の前処理を含む。この前処理は、幾つかの実施態様で、ｐＨ８．２の抽出バッファーの浸漬液（ピン破砕機で種子を破砕する前におそらく捨てられる）の中で、種子の硬さを軟化させるのに適している。軟化浸漬液は、ウェルの中に破砕ピンのためのスペースを作るために捨てられる。浸漬液の大部分が種子に吸収されるのであれば、少量の軟化浸漬液は、流出ステップを回避する。軟化浸漬液は、ｐＨ８．２の抽出バッファーである；アルカリ溶液を使用することが可能であるが、大部分の種子には、アルカリ溶液が非常に有効なため、種子を断片化するためにピン破砕機をおそらく必要としないであろう。
【００５１】
このように、本発明の一実施態様は、ウェルの中で種子材料を前処理するステップ；各ウェルの中に入ってその中の種子を破砕するのに適している少なくとも１つの垂直のピンが付いた水平のダイプレートを含む自動化システムの中で、前処理した種子材料を破砕し、分析のために前記ウェルから種子構成成分を抽出するステップ；を含む、種子を破砕して、破砕された種子材料を形成するプロセスである。
【００５２】
また別の実施態様は、ウェル底部を有するウェルが付いたウェルプレートであって、前記ウェルが種子等の植物組織材料を受けるのに適している、ウェルプレート；ウェルの中に入るための、少なくとも１つのピンを収容するのに適している、ダイプレート；および、ウェルに入って前記受けた種子を、ピンとウェル底部の間で破砕するための破砕ピンと、ダイプレートを湊合するためのプレス；を含む、種子断片化のための種子破砕機装置である。破砕ピンは、ウェルプレートは可動性であってダイプレートが定位置であるか、あるいはウェルプレートは定位置であってダイプレートが可動性である、ダイプレートの一部である。
【００５３】
種子材料のさらなる断片化を容易にするために、ウェルプレートは、少なくとも１つのウェル内に置かれた１つまたは複数の縮小要素を有する。任意選択的に、種子材料の断片化のために、ウェル内の縮小要素を振盪、回転または振動させるための装置を使用することができる。これは、破砕機装置の一部であってもよく、独立型の装置であってもよい。一実施態様で、このプラットホームは破砕機装置の一部であり、ウェル内の縮小要素を振盪する、回転させる、または振動させる。
【００５４】
本発明は、断片化された種子から抽出媒体を回収する方法を含み、前記方法は：ウェルの中の少なくとも１つの種子を、種子断片化用の縮小要素と一緒に、振盪するステップ；前記媒体が断片化した種子構成成分を溶解できる、抽出媒体を各ウェルの中に送達するステップ；および抽出媒体を回収するステップ；を含む。任意選択的に、抽出媒体をウェルに加えた後、ウェルの中に抽出媒体を送達した後で且つ抽出媒体を回収する前に、ウェルプレートを再振盪する。断片化した種子から抽出媒体を回収する方法は、種子をアルカリ溶液中に浸漬することによって種子を前処理し、種子の硬さを低下させる、事前調整ステップを含むことができる。
【００５５】
したがって、種子材料を破砕する／粉砕するまたは断片化するプロセスは：種子材料をウェルの中で前処理するステップ；前処理した種子を、リデューサー要素を用いて衝突力で粉砕し、分析のために、種子材料から種子構成成分を抽出するステップ；を含む。
【００５６】
好ましくは、ピン破砕機が使用されないとき、そのときは上記プロセスで使用される前処理軟化溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または重曹を含む。
【００５７】
破砕ピンを具備するウェルプレートの中で事前調整した種子を破砕した後、必要であれば、その破砕された種子を、事前調整した種子を、縮小要素、たとえばスチールビーズ、小さいボールベアリング、または他の硬い小粒子等と一緒に振盪を受けさせることができる。また別の実施態様で、破砕ピンは必要ではない。この実施態様で、種子を、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液に浸漬する。アルカリ溶液に予浸された後の、この軟化した種子材料、すなわち事前調整した種子は、スチールビーズ、小さいボールベアリング、または他の硬い小粒子等の縮小要素の使用のみで適切に断片化されるのに十分に軟化されている。
【００５８】
図１を参照すると、第１開口端２７を有するウェル２０を有するプレート１０が示されている。種子６０がウェル２０の中に置かれた後、ダイプレート４０に取り付けられたピン５０がウェル２０に入る。図１は、ウェル２０の中の種子６０を破砕するのに十分な力をダイプレート４０に提供する、ダイプレス１００にあるダイプレート４０を示す。種子６０がピン５０で破砕された後、種子は破砕された種子粒子として現れる。次に、ピン５０がウェル２０から退出する。プレート１０は移動され、ピン５０から種子物質が洗い流される。あるいは、ピン５０を、ウェルに流れ込むすすぎ液ですすぎ、次いでピン５０を、特定のピンが係合していた特定のウェル２０周辺領域に移動させる。
【００５９】
図２を参照すると、ピン５０を有するダイプレート４０の側面図が示されている。図３Ａは、種子を係合するのに適したピンのヘッド部分４５を示す。これらのピンのヘッド部分４５の別の図案を、図３Ｂに示す。図３Ｂで、ピンヘッドのチップ４６は扁平である。この結果として、係合された種子表面に、より一様な破砕力の分布をもたらす。
【００６０】
図３Ａは、図２に表示されているものと同様のダイプレートを示すが、上面図である。この上面図から、ピン５０は、図１および図４に表示されているウェルプレート１０のウェル２０を係合するために整列されていることが分かる。ピン５０のチップ４６は、ウェル２０の底部２５の形状に近づくように設計されている。ウェル底部２５の四角錐形は、チップ４６が種子を通り抜け、チップ４６にウェル２０の底部２５を裂けさせずに下向きの力で種子を破砕することを可能にする。
【００６１】
図１、図４および図５を参照すると、一様なウェル２０、１１９（それぞれ）が付いた、矩形の、好ましくは積み重ね可能なプレートとしての、ウェルプレート１０、１０９の形状。各ウェル２０、１１９は、逆四角錐として設計された底部２５を有する矩形ウェルを有する。ウェルの形状は、四角形、円形、卵形、または他の形であってもよい。ピンが、ウェル側面２３または底部２５を損傷せずにウェルに出入りできるのであれば、異なる形をしたウェルが同じピンを使用することもできるであろう。あるいは、ウェル側面２３および底部２５の形状により近づけるように、ピン５０の形状を変更することも可能である。ウェルの具体的な形状は、ピンが、ウェル２０を損傷せずに前処理した種子を破砕できる範囲で重要なだけである。
【００６２】
図４を参照すると、この図に示されているトウモロコシ種子は前処理した種子である。収穫時に十分に成熟したトウモロコシ種子は非常に硬い種子であり、通常は僅かに扁平な種子である。しかし、図４の種子は前処理された種子であり、丸々として僅かに怒張して見える。前処理した種子を破砕するプロセスは、種子の頑丈な外側を通り抜けるために少ない力を要する。種子は、前処理されて軟化した後、ダイプレートのピンの力を受け、破砕された種子は異なる構成成分を有し、それらを抽出して試験目的に使用することができる。
【００６３】
任意選択的なプロセスで、前処理した種子は、ダイプレートで破砕されない。種子は、ウェル内でサイズ縮小要素と一緒にプレート１０を振盪することによって種子が小粒子に縮小される程度まで種子材料が軟化されるのに十分な時間、アルカリ溶液、たとえば水酸化カリウム、または水酸化ナトリウム等の前処理で軟化される。小さいボールベアリングまたは他の小さい粒子または粒子類等のサイズ縮小要素を各ウェル内に置き、ウェルにカバーをし、前処理した種子およびウェル内の粒子を勢いよく振盪する。ボールベアリングは、軟化した、前処理した種子を粉砕するように働き、種子の内容を露出する。改良したペイントシェーカー型装置上か、またはプレートを保持してウェルの内容物を撹拌または振盪または渦巻撹拌するのに適している回転可能な表面上で、蓋をしたウェルプレートの振盪または撹拌を実施することができる。
【００６４】
前処理した種子は、ウェル内で、ダイプレートを用いて破砕することができ、そのプロセスの後、ウェルプレートをダイプレスからはずし、サイズ縮小要素をウェル２０の中に置き、振盪または撹拌して、この場合には水平である、プレート１０で支持されたウェル２０内の、粒状の破砕された種子サイズを縮小させることによって利用できる種子材料の表面積をさらに増やす。
【００６５】
サイズ縮小要素は、幾つかの物体であってもよく、ただ１つの物体であってもよい。一実施態様で、要素は、小さい球形、たとえば金属製のボールベアリング、ｂｅｅ  ｂｅｅｓ、小ペレット、ステンレススチールボール、カーバイドボール、セラミック球形様形状、スチール、銅、アルミニウム、またはプラスチック、合成ダイアモンド等々で形成されている。要素はまた、小面の特徴を持つ形状、等々を有してもよい。縮小要素は、プレート１０を勢いよく振盪するか撹拌している間に、ウェル２０内で種子材料を断片化するのに適している。ビーズまたは他のサイズ縮小要素で種子を破砕することによって、種子は非常に微小の粒子を形成し、より少ない表面積を有するより大きい破砕された粒子と比較するとき、有意により多くのＤＮＡをそれから抽出することができる。また、前処理した種子と一緒に振盪するとき、縮小要素は、各種子当たりほぼ同量のＤＮＡをもたらす。対照的に、ＤＮＡ抽出バッファーを添加した、より大きい種子粒子は、縮小要素なしで振盪するとき、結果的に様々な量の抽出ＤＮＡ量をもたらす。この様々なＤＮＡ量は次には、下流ＤＮＡテストアプリケーション（たとえば、ＳＮＰ分析）に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００６６】
事前調整した種子の改良された断片化方法は、種子の付いた穂、またはヒマワリが付いた頭花を摘むことから、ヒマワリ頭花の殻剥きまたは穂上のコーンの殻剥きまでずっと、種子の殻剥きまで、種子から材料を抽出する全プロセスが自動プロセスであることを可能にし、そこで殻をとった種子が自動的にウェルの中に置かれる。種子材料が入っているウェルに浸漬液を加えるピペッティングシステムに溶液を給送する。ウェルの中の種子材料の浸漬は、室温以上であってもよい。種子は、ピンが付いたダイプレートで破砕することができる。あるいは、ピン破砕ステップは、飛ばすことができる。
【００６７】
種子材料が入っているウェルに浸漬液を加えるピペッティングシステムに溶液を給送する。ウェルの中の種子材料の浸漬は、室温以上であってもよい。種子は、ピンが付いたダイプレートで破砕することができる。あるいは、ピン破砕ステップは、飛ばすことができる。事前調整した種子の初期破砕にダイプレートが使用されたか使用されなかったかにかかわらず、種子を縮小要素で断片化することができる。粉末、または細粉またはほんの小さい粒子もしくは柔らかいマスに、すりつぶす、破砕する、または粉砕するのに適した、縮小要素を各ウェル２０に加えることができる。縮小要素と組み合わせて溶液のアリコートを、プレート１０のウェル２０に自動的に装填することができる。次いで、振盪運動または撹拌運動で、浸漬して軟化した種子と縮小要素を係合するために、輸送システム（非表示）は、プレート１０を機械的振盪装置に積むことができる。次いで、輸送システムは、自動ＤＮＡ抽出および分析システムを介して、各プレート内に粉状の解体された種子材料が入ったプレートを動かすことができる。これによって、自動化された方法で、種穂からＤＮＡテストおよび分析まで全プロセスを完結させることが可能である。
【００６８】
あるいは、種子浸漬のために溶液および／または縮小要素をウェルに添加するこのプロセス、振盪のためのプレート輸送、ウェル内での種子構成成分の抽出および／またはテストを、一部または全部、手作業で実施することができる。
【００６９】
プレート
水平プレートは、プレートが容易に保存され積み重ねられるような、複数のウェルを支持するための基部として機能する。プレートは、手作業で動かすことができてもよく、輸送システムの一部であってもよい。可動性のプレートは、種子を装填するシステムによって輸送されることが可能であり、プレートまたはウェルまたは種子を同定して、必要な情報を検索可能な形で記録する。位置または順序または配置の記録は、種子の同一性およびウェル内でのその位置等の必要な情報の検索を可能にする方法で行われる。ウェルのプレートは、ウェル内で種子を破砕するのに必要な圧力に耐えられる任意の材料で作られていてもよい。種子は、２，０００〜７，０００ポンド／平方インチ（１４０，６４８〜４９２，２４０ｇ／ｃｍ2）の圧力で押し込むことが可能である。プラスチックは、一般にプレートが形成されるものであるが、金属または、破砕力で破壊したり圧力骨折したりしない他の材料をプレートに使用することができる。
【００７０】
ウェル
ウェルの機能は、種子を保持するための容器を提供することである。図４に示すウェルは、ウェル閉端２５およびウェル開口端２７を有する。ウェル開口端は、破砕する予定の種子または種子の一部を受け取るのに合わせて作られる。他端は、図３Ｂに表示されている、ピン５０の破砕チップ４６の形に非常によく似た形状で設計される。種子がウェル開口端２７に装填されるとき、種子はウェル閉端２５付近に来る。プレート当たりのウェル数は、ウェルプレートに装填される種子の大きさによって変化してもよい。一般に、図中のウェルは、８行６列で配向された４８ウェルプレートである。ウェル閉端２５は、多くの異なる形をとることができる。ピンチップ４６は、好ましくはウェル閉端２５の輪郭に適合する。ウェル末端２５として、一点の代わりに扁平な底部を有する四辺形の逆ピラミッドを使用することにより、破砕力を種子に集中させる小さい扁平な破砕チップを有するピンチップ４６が可能になる。ウェルは、材料の組成物、多くの場合、クラッキングや小さい圧力骨折を形成せずに、種子に印加される圧力に耐えることができる高密度プラスチックから選択される。ウェルは、プロセスの後期段階で液体を保持するために使用され、それゆえ、種子が破砕された後のウェルの完全性の保持が重要である。
【００７１】
ダイプレート
ダイプレートの機能は、圧縮力、または粉砕力を種子材料に提供することである。ピストン、スクリュー、レバー、水圧等が、この力を推進できる。ダイプレートは、ウェルのそれぞれに対するピンを有し、この力を種子材料に移行させる。ダイプレート上のピンは、プレートにおけるウェルの位置と一致し、ダイプレートからの圧力は、ピンを介してウェル２０内の種子材料に移行する。ピンは、プレートのウェルの中に装填された種子を係合して破砕する。
【００７２】
特に、ピンおよび浸漬液用に十分なスペースがなければ、破砕前に浸漬液を除去しなければならないかもしれない。あるいは、浸漬液が種子に完全に吸収されるというように、供給される浸漬液は、種子を軟化させるのに十分なだけである。
【００７３】
ダイプレートは、ピンが、破砕する深さまでウェルに入れるが、ウェルの底部を破壊するであろう深さまで入れないように、プレス内に配置される。ピンは、多くの場合予浸され、したがって軟化している、種子材料との係合を可能にするのに適する。ピンは、種子を破砕するのに十分であるが、ウェルの底部に到達しない長さ、プレートのウェル内に達する。ウェルプレート内の種子とピンの係合はモニターすることができ、プレートおよび／またはダイ配置を、様々な大きさの種子の破砕プレートに最適に適合させることができる。既述の通り、種子の硬さ、したがって破砕に対するその抵抗性は、溶液による前処理によって強く影響される。この前処理は、種子材料を破砕するのに必要な力の量を減少させるであろう。加えて、種子は種々の形である。種子は、扁平形、円形および小型、中小型、および大型として形成され、この多様性のため、種子プレートおよびまたはダイプレートの位置、および種子に適用される力を、自動的にあるいは手作業で、調節できることは有益である。調節は、ウェルの完全性を維持しながら、様々な種子サイズが十分な圧力を受けて破砕されることを可能にする。
【００７４】
プレスは、ダイプレート上のピンが、水平プレート上のウェルと一直線になるように設計される。結果的にピンをウェル内に整列させられるように、整列を助けるために、ダイプレートおよび／または水平プレートは可動性であってもよい。
【００７５】
プレスは、プレートにおけるウェルに関して係合しない位置と係合する位置との間で、ダイプレートを移動させる。図１のダイプレートは、水圧を使用して移動させるが、手作業で移動させることも可能である。図１は、ウェル内の種子および係合位置のダイプレートを示す。係合位置は、ピンをウェル内部の中に置く。係合しない位置は、ウェルの外部にピンを有する。ウェル内の種子または種子部分を破砕する前に、ピンはウェル開口部の僅かに上であり、種子または種子部分を破砕する係合位置のピンは、ウェルの側面内である。
【００７６】
ダイプレートは、種子装填ウェルに近接した係合位置に手作業で配置することができ、次いでプレスを使用して、破砕力を提供することができる。あるいは、ダイプレートを種子装填ウェルと係合して破砕力を使用できるように、自動化することができる。破砕された種子材料がピンに粘りつくのであれば、ウェルの水平プレート間の汚染を回避するためにピンを処理しなければならないであろう。第一ウェルからの破砕種子からピン上に残存する残遺種子材料は、次のプレートの次のウェルの破砕前にピン上に残ることはできない。この残遺種子は、次のウェル内の種子材料を第一ウェルの種子材料で汚染するであろう。そのような汚染を回避する一方法は、種子とピンの間に存続する剥離材を使用することである。もう一つの方法は、各ウェル係合の間に、ピンから種子材料をすすぎ落とすことである。洗い流し液がウェル内に還流してもよく、すすぎがウェル領域外で生じてもよい。すすぎ流は、回転してスプレーすることもでき、またはダイプレートのピンサイドからのスプレーであってもよく、すすぎ液および残留する破砕種子材料を洗い落して、各ピンサイドを、その種子を保持しているウェル内に流れ落ちるように、すすぎを適合させることもできる。ピンをウェルからはずし、次いでピンを水浴にちょっと浸して、種子汚染物質を除去することにより、すすぎが生じてもよい。あるいは、ピンが鞘に収められているのであれば、そのときは、その付着した残遺物を有する鞘を、各使用後にすすぐかまたは廃棄することができる。ウェル間種子汚染を回避するこのプロセスは、手作業であってもよく自動化することもできる。
【００７７】
種子分析に対するテクノロジーの感受性のせいで、ウェル間の種子材料の交差汚染は種子組成分析の正確さに悪影響を及ぼし、したがって交差汚染を回避するためのテクニックを使用しなければならない。また別の実施態様では、ピンが使い捨て材料で作られているのであれば、各使用後にピンを処分することができる。あるいは、容易に穴があかない柔軟な材料、たとえばプラスチックシートや他のポリマーシート等は、ピンがウェルに入ったとき、この材料がピンを包むように、ウェル頂部を覆うことができる。ウェルから離脱すると同時に、シートまたはプラスチック様材料もしくは柔軟な材料の連続ロールの使用部分をプレートから外して処分し、再使用可能であれば保存するかまたはすすぐ。次いで、次のピン−ウェル係合の前に、次のプレートのための新しい部分または新しいシートを使用して、ピンをカバーするか効果的に被覆することができる。
【００７８】
ピンは、ダイプレートに取り外し可能に取り付けることができる。これによって、処分および交換、カバーの外しやすさ、より完全なすすぎまたはクリーニング手順が可能になる。ピンは、プラスチック、金属、ポリマー、木、石、セラミックおよび他の合成材料で作ることができる。ピンはまた、すすぎ材を輸送しやすいためまたは使い捨てピンのコストを下げるために使用することができるピンの中に中空穴をつけて作ることもできる。あるいは、ピンは、プラスチックや金属等の材料の固体片として形成されることもできる。固体であるか、内部に中空を有するかにかかわらず、ピンは、圧力に耐えるように形成されなければならず、それ故、ピンは砕け散ったりひび割れたりしない。図に表示されているこれらのピンの大きさおよび形状（ウェルの直交様底部）は、破砕された種子がほとんど何もピンにくっつかないという効果を有する。したがって、ウェル間の種子材料の交差汚染のほとんどを回避する。
【００７９】
ピンの種子係合端は圧力を集中させるように形成される。種子は種々の形状で出現し、ダイズ、キャノーラ種子は球形であり、トウモロコシ、小麦、燕麦、ライコムギ、大麦、イネ科植物の種子は涙形であるが、トウモロコシ種子はポップコーン種子のようなまさしく球形のこともあり、ピーナッツ種子は楕円形であり、ヒマワリ、および多くのメロン種子は、スイカ種子のように、かなり扁平である。
【００８０】
ピンの係合端は、とがった底部か、または逆ピラミッドの底部に小さい扁平な中心域のいずれかを有する、４面の、逆ピラミッドとして形成される。種子ウェル間汚染を回避するためにピン被覆材料が使用されるのであれば、扁平領域がピン被覆材料を貫通する可能性は高くない。ピンの係合端の面を、破砕しようとしている種子の形に応じて選択し、種子材料を破砕するために必要な圧力を最小にしながら破砕衝撃力を最大化することができる。ピンはまた、使用されるウェルの底部の形を反映するように設計される。
【００８１】
ピンで材料を破砕するために必要な圧力は、アルカリ溶液による種子材料の前処理によっても明らかに変えることができる。
【００８２】
本発明は、試験用に、ＤＮＡ、または蛋白質、油、炭水化物、真菌、胞子等のような他の種子構成成分を抽出するために、破砕された種子材料を使用する方法を含む。破砕材料のための構成成分は、この抽出物の分析を実施するために使用される。
【００８３】
種子破砕装置で種子が破砕された後、多くの場合、破砕された種子材料が入っているウェルに抽出媒体を送達し、次いで抽出物を回収してテストする。抽出プロセスは、多くの場合、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔ法かまたはＤＮＡ抽出用に改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ法である。本抽出方法は、分析に望ましい材料を、破砕された種子から抽出するための有用な方法であり得る。抽出物の分析は、種子害虫、種子構成成分、種子組成、または抽出物と関連した他の特性を検出することができる。ウェル内の破砕された種子材料に添加される抽出液は、テストしようとしている分析を行うために抽出しなければならない物に基づいて選択される。抽出媒体は、ピペットで、またはロボットシステムで、送達することができる。
【００８４】
本発明の他の実施態様では、以下の種子前処理を用いて、より少ない努力でより効率的にピン破砕装置または他の断片化装置を使用することができる。
【００８５】
ウェルプレートのウェル等の限定空間内のサイズ縮小要素と一緒にウェルプレートを振盪することにより種子が小さい粒子に縮小する程度まで、硬い種子材料を軟化させるのに十分な期間、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムまたは当技術に知られている他のアルカリ等のアルカリ溶液に種子を浸漬することを含む、前処理によって種子を軟化させる。次の抽出ステップでＤＮＡ収率を高めるのに十分に、固体の種子構成成分による前処理溶液からの液体の吸収が減少するように、溶液の浸透ポテンシャルを高めるために、前処理溶液はまた、浸透圧調節物質塩化ナトリウムまたは当技術に知られている他の浸透圧調節物質、たとえば、塩化カリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マンニトール、ソルビトールまたは他の糖アルコール類、またはスクロース（ただし、下流ＰＣＲが実施されるのであれば、スクロースは、ＰＣＲを実質的に妨げるのに十分な量で使用されない）も含む。
【００８６】
図５は、浸透圧調節物質としての３Ｍ塩化ナトリウムおよびアルカリとしての０．１Ｍ水酸化ナトリウムを含有する前処理溶液中に、３５℃で２１時間、トウモロコシ種子を浸漬した、多数の一様なウェル１１９を含む、プレートウェル１０９を示す。次いで、前処理溶液を除去して、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａＤＮＡ抽出バッファーと取り替え、数個のスチールビーズ１３９を各ウェルに加え、ウェルプレート１０９を撹拌することにより、種子をイン・サイチュで破砕した。ウェルプレート１０９を遠心分離した後、抽出されたＤＮＡを含有する上澄１５９から、種子残渣１４９を分離した。
【００８７】
サイズ縮小要素１３９、たとえば１つまたは複数の小さいボールベアリングまたは他の硬い小粒子等を、破砕される前処理した種子が入っているそれぞれの中に置いた。前処理した種子およびボールベアリングをウェルの中に入れ、ウェルをカバーして、たとえば、ペイントシェーカーで、勢いよく振盪する。ボールベアリングは、軟化した、前処理した種子を粉砕するように働き、種子の内部内容物を露出する。蓋をしたウェルプレートの振盪または撹拌は、改良されたペイントシェーカー型装置、またはプレートを保持してウェルの内容物を撹拌または振盪または渦巻撹拌するのに適した回転可能な表面で実施することができる。
【００８８】
実施態様で、サイズ縮小要素は小球、たとえば、金属製のボールベアリング、ｂｅｅ−ｂｅｅｓ、小ペレット、ステンレススチールボール、カーバイドボール、セラミック、スチール、銅、アルミニウム、または種子を粉砕するのに十分な硬度を有するプラスチック、合成ダイアモンドまたは他の材料で作られた球形様または他の形の物体である。粒子はまた、種子の粉砕を容易にするために、小面が作られていてもよく、点またはエッジで形作られていてもよい。サイズ縮小要素は、プレート１０９が勢いよく振盪されるか撹拌されている間に、ウェル１１９内の種子材料を砲撃するのに適している。種子がビーズまたは他のサイズ縮小要素で破砕されるとき、種子は、より大きい破砕された粒子と比べて有意により多いＤＮＡを抽出することができる非常に微小の粒子を形成する。また、前処理した種子と一緒に振盪されるとき、サイズ縮小要素は、各種子からほぼ同量のＤＮＡを生じさせる。対照的に、ＤＮＡ抽出バッファーが添加されたより大きい種子粒子は、サイズ縮小要素なしで振盪されるとき、種子１個当たり、様々なＤＮＡ抽出量をもたらす結果となる。このＤＮＡ抽出量の変動は、次には、下流テストアプリケーション（たとえばＳＮＰ分析）に悪影響を及ぼす。
【００８９】
種子の破砕が、ウェルプレートのウェルの中で行われ、破砕がピンとスチールビーズの両方を使用して行われた、上述の種子破砕プロセスの後で、本明細書に記載の前処理プロセスを使用してＤＮＡ収率を高めることができる。ビーズが入ったウェルプレートを、ペイント振盪装置等の、振盪プラットホーム上に置いた。ウェルサイズによって、サイズ縮小要素として各ウェル内に置かれるスチールビーズ数が決定された。一実施態様で、６つのスチールビーズが各ウェルに加えられた。４つのビーズが上手くいくこともある。６つのビーズを使用すると、種子断片に望ましい粒径を達成するために、僅か４分のペイントシェーカーでの振盪を必要とするだけであった。より少ないビーズを用いるとき、全ての種子が十分に断片化されなければ、または断片が一様に所望のサイズでなければ、振盪ステップを繰り返すことができる。プレートが振盪され、予浸されて、破砕された種子材料がウェル内で振盪するスチールビーズの衝撃力でさらに破壊された後、ピン破砕プロセスを単独使用したときより、ほぼ５０〜１００倍多いＤＮＡが抽出された。１つの種子から得られたＤＮＡ量の変動は、このように有意に減少した。本明細書に記載の前処理方法の使用は、各種子から得られるＤＮＡ量をさらに増加させる。
【００９０】
穂上に種子が付いたトウモロコシの穂の摘み取りから種子の殻剥きまで、種子から材料を抽出する全プロセスが、自動化したプロセスであることができ、ここで殻を取った種子は自動的にウェルの中に置かれる。アルカリおよび浸透圧調節物質を含有する前処理溶液を、種子材料が入ったウェルの中に浸漬液を分与するピペッティングシステムに、給送することができる。実施態様で、アルカリおよび浸透圧調節物質を含有する浸漬液は、破砕に足りるだけ種子を軟化させるのに必要な期間の後、ウェルから除去されて、抽出バッファーと取り替えられる。実施態様で、種子材料から前処理溶液が捨てられ、溶液の非存在下で破砕が実施される。あるいは、実施態様で、必要とされる下流アプリケーションのために十分なＤＮＡ収率をもたらすことができる限り、種子がアルカリ／浸透圧調節物質前処理溶液中に存在し続けている間に破砕を実施することができる。
【００９１】
実施態様で、ピンが付いたダイプレートで、種子を破砕することができる；あるいは、ピン破砕ステップを飛ばすことができる。ダイプレートが使用されるか否かにかかわらず、種子を粉、細粉、または小粒子に、または柔らかいマスに、すりつぶす、破砕する、または挽くのに適した、サイズ縮小要素を、各ウェル１１９に加えることができる。前処理溶液のアリコートを、縮小要素と併用して、プレート１０９のウェル１１９の中に自動的に装填することができる。次いで、振盪運動または撹拌運動で、サイズ縮小要素１３９を、浸漬して軟化した種子と係合させるために、輸送システム（非表示）は、プレート１０９を、機械的振盪装置に積むことができる。輸送システムは、自動ＤＮＡ抽出および分析システムを介して、各プレート内に粉状の解体された種子材料が入ったプレートを動かすことができる。これによって、自動化された方法で、種からＤＮＡテストおよび分析まで全プロセスを完結させることが可能である。
【００９２】
種子破砕装置で種子が破砕された後、多くの場合、破砕された種子材料が入っているウェルに抽出媒体を送達し、次いで抽出物を回収してテストする。抽出プロセスは、多くの場合、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ法かまたは改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ法である。抽出法は、分析用のＤＮＡを破砕された種子から抽出するための、当技術に知られている任意の有用な方法であってもよい。抽出物の分析は、種子遺伝子型、種子害虫、種子構成成分、種子組成、または抽出されたＤＮＡと関連した他の特性を検出することができる。抽出媒体は、ピペットで、またはロボットシステムで、送達することができる。
【００９３】
破砕された種子からのＤＮＡの抽出の効率を高めるために、振盪または撹拌または遠心分離型装置の中のサイズ縮小要素に加えて、抽出媒体を撹拌することができる。種子材料の粒径を減少させることは、界面の表面積を増加し、形成されるエマルジョン中の活性な結合を増加し、それにより、粒子がより多く相互に作用して互いにしっかりと結合するため、媒体の粘性を上昇させる。これにより、破砕された種子材料から抽出されるＤＮＡの回収が増加し、それをテストおよびさらなる分析に使用することができる。
【００９４】
あるいは、種子浸漬のために前処理溶液、抽出バッファー、および／または縮小要素をウェルに加えるプロセス、振盪のためのプレートの輸送、ウェル内でのＤＮＡの抽出および／またはテストは、一部または全部、手作業で実施することができる。
【００９５】
本明細書に記載のプロセスは、テスト用または他の用途のためにＤＮＡを抽出するために、破砕された種子材料を使用する方法を含む。
【実施例】
【００９６】
実施例１
１．縮小要素で粉砕されたピンで破砕された予浸種子
溶液（この実験では、種子上のあらゆる種子処理剤を洗い落すドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））に浸漬されたトウモロコシ種子を使用した。抽出バッファーは、Ｔｒｉｓ、ＨＣｌおよびＥＤＴＡも含有する。ＳＤＳは、水よりも効率よく種子を軟化させる。種子材料を軟化させるのであれば、Ｈ2Ｏをはじめとする、破砕された種子材料の下流アプリケーションを妨げない任意の浸漬液を使用することができる。浸漬時間は、穀粒の耐久性によって異なる。この実験では、種子材料を６５℃で２４時間浸漬した。温度はより高くてもより低くてもよく、室温でさえ使用できるが、一部の実験では、種子はこの温度で効率よく軟化されなかった。
【００９７】
ドデシル硫酸ナトリウムバッファー１５００μｌを使用して、種子を前処理した。１５００μｌは、最大のコーン種子の表面をカバーするのに十分な量であった。ウェル内の種子材料をカバーするために必要であれば、追加の液体を加えることができる。一部の液体は種子材料に吸収されるが、液体の全部が吸収される訳ではない。ウェル内で溶液およびピンを浸漬するための十分な余地がない可能性があるため、種子を破砕する前に、種子材料から浸漬液を洗い流す。この溶液が他のウェル内にオーバーフローすることが起きてはならない。
【００９８】
この実験では使用されないが、やはり可能な代替手法は、種子をＤＮＡ抽出バッファー４００〜６００μｌに浸漬することである。溶液の大部分は吸収され（種子サイズによって異なる）、種子は破砕され得ることもあり、あるいは振盪されるだけのこともある。仮に種子が破砕されるとすれば、そのときは図に示すものより細いピンがおそらく使用されるであろう。ウェルサイズの割に幾分細いこれらのピンは、このプロセスで有用なことが分かるであろう。
【００９９】
種子浸漬材料は、賞賛のために選択された、言い換えれば種子材料の下流テストを少しも妨げない。実験１で、種子のＤＮＡ組成は下流で分析されており、それ故ＤＮＡ抽出バッファーは適切な種子浸漬であった。しかし、油や蛋白質のような、異なるタイプの種子組成物（すなわち、ＤＮＡではない）を分析するためには、浸漬液が異ならなくてはならない。浸漬は、下流テストおよび分析に適していなければならない。
【０１００】
図１に示した通り、前処理した浸漬種子があり、それをピンで破砕した。種子浸漬前処理の唯一の目的は、ピンで容易に破砕することができ、次いで必要であれば破壊できるように、種子を軟化させることであった。
【０１０１】
前処理した種子は、水圧プレスでかけたピンの力を受けた。破砕された種子からピンを外した。ピン上の種子残遺物は、ウェルから抜き取られたとき、ウェルの中にすすぎ込まれなかった。ウェルプレートとは別の位置でピンをすすいだ。ウェルプレートは、抽出バッファーと一緒に振盪することもでき、あるいはスチールビーズ等の縮小要素をプレートの各ウェルに加えることもでき、どちらのプロセスも上手く作用する。ウェルサイズによりスチールビーズの数が決定された。ウェルサイズは図に示されているサイズであったため、この実験では６個のスチールビーズを各ウェルに加えた。４個のビーズも上手くいくが、ボール数の減少は種子の粒状サイズを減少する可能性がある。また、６個のボールを使用することによって、破砕された望ましい種子サイズを得るために必要な時間は、ペイントシェーカーで僅か４分であった。少ないボールベアリングを使用したとき、全部の種子で、破砕されたサイズが十分に減少しなければ、この振盪ステップを繰り返さなければならないかもしれない。６個のビーズまたは他のペレット様材料を使用して、種子粒状サイズが十分に減少しなければ、ペイントシェーカーでの、ウェル中のビーズの振盪の繰り返しもやはり選択肢である。
【０１０２】
ビーズが入ったウェルプレートを、ペイント振盪装置等の、振盪プラットホームに載せる。プレートを振盪しておき、予浸した破砕された種子材料が、ウェル内で振動しているスチールビーズの衝撃力によってさらに破壊された後、ピン破砕されるプロセスのみを使用して、ほぼ５０〜１００倍多いＤＮＡが抽出された。単一種子間のＤＮＡ量の変動は有意に減少する。
【０１０３】
この実験では、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出溶液が使用され、溶液はＳＤＳ、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含有していた。添加される量は、ＤＮＡが手作業で抽出されたかまたはロボティクスで抽出されたかによって異なる。この実験では、ＤＮＡはロボティクスを使用して抽出された。ロボティクスはほぼ（１５００μｌ）を必要とする。手作業による抽出を用いた実験は通常、約８００〜１０００μｌを使用する。量は調節可能である。破砕された種子材料およびＳＤＳ抽出溶液の遠心分離後、上澄が形成された。この上澄は、ＤＮＡを含んでおり、追加のテストステップのために移した。
【０１０４】
Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａを使用するこの実験で、ウェルの中で抽出バッファーを添加し、抽出物をスチールビーズと一緒に振盪した後、酢酸アンモニウムをウェルに加えた。ウェルプレートを簡単に再度振盪し、次いで２０分間遠心分離した。各ウェルからの上澄（ＤＮＡを含む）のアリコートを新しいプレート（たとえば、９６ウェルブロック（２つの４８ウェルブロック（その中で種子が破砕された）を結合する）に移した。それぞれのウェルで、アルコール（イソプロパノールまたはエタノール）を添加し、ＤＮＡのアルコール沈殿を実施した。これは周知の標準手順である。破砕された種子材料からＤＮＡを抽出するためにこの具体的なプロトコールが使用されたが、破砕された種子材料から、必要な抽出されたＤＮＡを生成するために、任意のＤＮＡ抽出プロトコールを適用することができる。
【０１０５】
実施例２
２．アルカリに浸漬することにより軟化され、スチールビーズで破砕された種子
この実験では、ピン破砕機装置は使用されない。代わりに、ＮａＯＨまたはＫＯＨ等を使用して種子を軟化した。この全種子ＮＡＯＨ前処理は、全種子からＤＮＡを抽出するためではなく、代わりに断片化用に種子を軟化するためである。ＮａＯＨを用いたＤＮＡ抽出は、破壊された材料（葉、種子チップ）からＤＮＡを抽出するための周知の手順であるが、前処理ステップで種子を軟化するためではない。
【０１０６】
ａ．ピン破砕機の必要がないように種子を軟化させる溶液に種子を予浸した。したがって使用されなかった。６５Ｃの１００ｍＭ  ＮａＯＨ、２０００μｌを、全種子が入っているウェルに添加した。これらの種子を一晩浸漬して前処理した。ＮａＯＨに代わるものとしては、ＫＯＨ、重曹（ｐＨレベルが十分に達成されるのであれば）または何か他のアルカリ等がある。これらの浸漬液の濃度は、種子の耐久性によってより高いかより低いか、さまざまであり得る。種子の前処理のための温度もまた、さまざまな６５Ｃであり得る；より高いまたはより低い（室温でさえも）。種子の前処理のための浸漬時間は、穀粒（耐久性）、アルカリ濃度および温度によって異なる。
【０１０７】
ｂ．浸漬液と一緒に、４個のスチールビーズ／ウェルを、各種子と一緒に各ウェルに加えた。
【０１０８】
ｃ．実施例１と違って、ピン破砕ステップを飛ばした。液体を添加することにより、ウェル内の種子材料に対するリデューサー要素衝撃力が減少する可能性があるため、プレートを振盪する前に、追加の液体は何も加えなかった。
【０１０９】
ｄ．ビーズと一緒に前処理浸漬が完了した後、ウェルのプレートを水平の振盪プラットホームに載せた。
【０１１０】
ｅ．ウェルプレートを、室温でほぼ４分間、振盪した。必要があれば、このステップを繰り返すことができる。種子粒子が十分に小さくなければ、このステップが繰り返される。
【０１１１】
ｆ．各ウェルの中にスチールボールベアリングがあるプレートを、水平の振盪装置から移動させた。ウェル内の予浸した種子材料を、各ウェル内の中のスチールベアリングで破壊した。
【０１１２】
ｇ．種子破砕された粒状物質からのＤＮＡの抽出は、上記実施例に記載のプロトコールに準じた。最も簡単な方法は、抽出溶液が入ったウェルを遠心分離し、上澄のアリコートを新しいブロック（たとえば、４８ウェルブロック）に移し、酢酸アンモニウムおよびイソプロパノールを加え、ＤＮＡ沈殿を実施し、遠心分離し、上澄を捨て、７０％エタノール洗浄を実施することである。
【０１１３】
ｈ．使用することが可能であろう代替プロトコールは、ＮａＯＨ浸漬液中、０．２５％  ＳＤＳを使用する。スチールビーズと一緒に振盪する。酢酸アンモニウムを加え、再度振盪する。遠心分離し、アリコートを、アルコール沈殿のために新しいブロックに移す。（ＳＤＳ／酢酸アンモニウムを用いた振盪／遠心分離は、より純粋なＤＮＡを与える）。必要であれば、方法のためにｐＨを調整する（すなわち、下げる）。
【０１１４】
実施例３
３．ウェル内の中で溶液により粉状にした、予浸した種子
１．実施例１に従って種子を軟化させるために種子を溶液中で一晩予浸した。
２．予浸した種子をウェル内に置くか、または種子をウェル内で浸漬することができ、浸漬液を捨てることができる。数個のスチールビーズを加え（無溶液）、水平のシェーカーで振盪し（種子は破壊される）、ウェル／ブロックを開ける前に残屑を回収するために簡単に遠心分離した。
３．液体（たとえば、ＤＮＡ抽出バッファー）を加え、水平のシェーカーで再度振盪し、種子を完全に破砕した。
４．上述の通り、テストが続行された。
【０１１５】
０．１Ｍ〜０．２５Ｍのさまざまな濃度の水酸化ナトリウム、１Ｍ〜５Ｍのさまざまな濃度の塩化ナトリウムおよび２２℃〜５０℃の浸漬温度に浸漬することを含む前処理方法によって、ＤＮＡ抽出のために、トウモロコシ種子を調製した。
【０１１６】
実施例４
ウェルプレート中で、３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２Ｍ  ＮａＯＨを含有する溶液に、３５℃で２１時間、種子を浸漬した。浸漬液を除去し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａＤＮＡ抽出バッファー（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１：１９，１９８３）の中で、種子を破砕した。図は、遠心分離後、抽出バッファーの中に破砕された種子が入っているウェルプレートを表す。各ウェルの底部の種子残渣と一緒に、スチールボールの形の縮小要素が各ウェルに見られる。各ウェル内の残渣の上に、抽出バッファー中にＤＮＡを含む上澄が見られる。
【０１１７】
実施例５
この実験は、２２℃におけるＤＮＡ収率に対するＮａＯＨ濃度の影響を示す：図６は、抽出されたＤＮＡに関するＤＮＡプロフィールを表す：下段：種子を改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファー（ｐＨ８．２）に浸漬し、４８ピン破砕機で破砕し、スチールビーズで完全に断片化した。中段：種子を１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａプロトコールを使用してＤＮＡを抽出した。上段：種子を、１Ｍ  ＮａＣｌ／０．２Ｍ  ＮａＯＨに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａプロトコールを使用してＤＮＡを抽出した。
【０１１８】
実施例６
この実験は、４０℃におけるＤＮＡ収率に対するＮａＯＨ濃度の影響を示す：改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａプロトコールを使用して、全ての種子試料からＤＮＡを抽出した：図７は、抽出されたＤＮＡに関するＤＮＡプロフィールを表す：下段：種子を改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファー（ｐＨ８．２）に浸漬し、４８ピン破砕機で破砕し、スチールビーズで完全に断片化した。中段：種子を１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａプロトコールを使用してＤＮＡを抽出した。上段：種子を、１Ｍ  ＮａＣｌ／０．２Ｍ  ＮａＯＨに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａプロトコールを使用してＤＮＡを抽出した。
【０１１９】
実施例７
この実験は、この方法を使用した対立遺伝子の識別の結果を例示する。さまざまな種子ロット由来の種子を、３５℃で、３Ｍ  ＮａＣｌ／０．２Ｍ  ＮａＯＨに浸漬した。浸漬液を廃棄し、改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで種子をスチールビーズと一緒に振盪した。改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａプロトコールを使用してＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎ分析用の鋳型として使用した。図８は、プロットの左下コーナーに示されている小さい未確定の遺伝子型と共に、３つのクラスターが明らかに同定された結果を示す。
【０１２０】
前述の結果は、前処理浸漬液の水酸化ナトリウム濃度および／または浸漬温度を上昇させることにより、スチールビーズを用いた破砕効率は上昇するが、ＤＮＡ収率は低下することを示した。浸漬液の塩化ナトリウム濃度を上昇させることにより、破砕効率は低下するが、ＤＮＡ収率は上昇する。
【０１２１】
実施例８
本実験は、さまざまな最少浸漬量の使用からの、ＤＮＡ収率の差を例示する。最少浸漬は、コーンの軟化のためである。最少浸漬を使用するとき、種子は液体でかろうじてカバーされるか丁度カバーされる。こうした最少浸漬プロトコールは、流体を使用してウェル内の種子をカバーするかカバーするよりも僅かに少ないとき、２００μｌ〜８００μｌの流体範囲を有し、ピラミッド形の底部を有する４８ウェルブロック内に入っているコーン種子を使用するとき、流体の好ましい範囲は４００μｌ〜６００μｌである。対照的に、同サイズのウェルの中で、非最少浸漬流体量で浸透圧調節物質を使用するとき、種子は、１５００μｌの前処理流体に浸かっていた。
【０１２２】
この実験は、ＤＮＡ収率に対する浸漬量の影響を示す：コーン種子を、４００μｌおよび６００μｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨ／１．５％  ＳＤＳに６５Ｃで１８時間、浸漬した。１８時間後、ＤＮＡ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、スチールビーズを用いて種子を破砕した。改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出方法を使用してＤＮＡを抽出した。結果は、４００μｌに浸漬された１２個の種子から、優れたＤＮＡ収率を示した。このＤＮＡは豊富であり、０．３Ｍ  ＮａＯＨ／１．５％  ＳＤＳに浸漬されたコーン種子から抽出されたＤＮＡを用いて、対立遺伝子識別プロットを実施した。この対立遺伝子識別プロットは、非常にはっきりと識別され、このＤＮＡの有用性を示した。対照的に、６００μｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨ／１．５％  ＳＤＳに、６５Ｃで１８時間浸漬された種子からのＤＮＡは、４００μｌに浸漬された種子からの収率より実質的に少ないＤＮＡ収率を有していた。
【０１２３】
この実験は、ＤＮＡ収率に対する浸漬量の影響を示す：コーン種子を、４００μｌおよび６００μｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨ／１．５％  ＳＤＳに６５Ｃで１８時間、浸漬した。１８時間後、ＤＮＡ抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、スチールビーズを用いて種子を破砕した。改良されたＤｅｌｌａｐｏｒｔａ抽出方法を使用してＤＮＡを抽出した。
【０１２４】
結果は、４００μｌに浸漬された１２個の種子から、優れたＤＮＡ収率を示した。このＤＮＡは豊富であり、０．３Ｍ  ＮａＯＨ／１．５％  ＳＤＳに浸漬されたコーン種子から抽出されたＤＮＡを用いて、対立遺伝子識別プロットが実施された。この対立遺伝子識別プロットは、非常にはっきりと識別され、このＤＮＡの有用性を示した。対照的に、６００μｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨ／１．５％  ＳＤＳに、６５Ｃで１８時間浸漬された種子からのＤＮＡは、４００μｌに浸漬された種子からの収率より実質的に少ないＤＮＡ収率を有していた。
【０１２５】
本明細書に提供されている方法は、具体的な方法ステップ、試薬および出発材料を使用して例示してきたが、同等のステップ、試薬および出発材料を、例示のために本明細書に言及されたものの代替にできることは、当業者に認識されるであろう、また添付の特許請求の範囲は、全てのそのような同等物を包含することを意図する。
【図１】
2014533521.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014533521.tif 000011
【国際調査報告】
2014533521.tif 000012
2014533521.tif 000013
2014533521.tif 000014
2014533521.tif 000015