(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の遺伝子型３のレプリコンが提供される。これらのレプリコンは、ＨＣＶがインビトロにおいて複製する能力を引き出す適応変異を含む。遺伝子型３レプリコンを調製する方法、および抗ウイルス剤をスクリーニングするためにこれらのレプリコンを用いる方法もまた提供される。一実施形態において、遺伝子型３のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、上記の実施形態のいずれかにおける細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下または上記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法もさらに提供される。
2014522648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において複製することができる遺伝子型３のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物であって、該ＲＮＡ配列が５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂの１つまたは複数をコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む、構築物。
【請求項２】
請求項１に記載のＲＮＡ構築物であって、該ＲＮＡのｓと比較して、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂに適応変異を含む、構築物。
【請求項３】
前記変異が、ＮＳ３において、残基６０７でのセリンを含む、請求項２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項４】
前記変異が、ＮＳ３において、残基８９でのロイシンを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項５】
前記変異が、残基４１でのアルギニン、残基１６６でのスレオニン、残基３７９でのスレオニン、残基５３４でのグリシン、残基５８３でのグルタミン酸、および／または残基１でのシステインをさらに含む、請求項４に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項６】
前記変異が、２２０４位でのイソロイシンを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項７】
前記遺伝子型３のＨＣＶが遺伝子型３ａのＨＣＶである、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項８】
選択のためのマーカー遺伝子をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項９】
前記マーカー遺伝子がネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項８に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１０】
レポーター遺伝子をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項８に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１２】
５’から３’方向に、前記５’ＮＴＲと、前記ＩＲＥＳと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、前記３’ＮＴＲとを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１３】
Ｃ、Ｅ１またはＥ２の１つまたは複数をコードする配列をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載のＲＮＡ構築物に転写され得る一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれかに記載のＲＮＡ構築物または請求項１４に記載のＤＮＡを含む単離された細胞。
【請求項１７】
残基６０７でのセリンを含むＨＣＶ遺伝子型３のＮＳ３タンパク質。
【請求項１８】
２２０４位でのイソロイシンをさらに含む、請求項１７に記載のＮＳ３タンパク質。
【請求項１９】
残基８９でのロイシンを含むＨＣＶ遺伝子型３のＮＳ３タンパク質。
【請求項２０】
残基４１でのアルギニン、残基１６６でのスレオニン、残基３７９でのスレオニン、残基５３４でのグリシン、残基５８３でのグルタミン酸、および／または残基１でのシステインをさらに含む、請求項１９に記載のＮＳ３タンパク質。
【請求項２１】
請求項１７から２０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１７から２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むＲＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
請求項２１もしくは２２に記載のポリヌクレオチド、または請求項２３に記載のＲＮＡ構築物もしくはＤＮＡ構築物を含む細胞。
【請求項２５】
請求項１７から２０のいずれか一項に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項２６】
単離された細胞であって、該細胞において複製する遺伝子型３のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む細胞。
【請求項２７】
前記細胞において、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が存在しない、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記ＲＮＡの少なくとも１０コピーを含む、請求項２６または２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記ＲＮＡがサブゲノムＨＣＶ配列を含む、請求項２６から２８のいずれかに記載の細胞。
【請求項３０】
前記ＲＮＡが、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
前記ＲＮＡが全ゲノムＨＣＶ配列を含む、請求項２６から３０のいずれかに記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＲＮＡが２２０４位でのイソロイシンを含む、請求項２６から３１のいずれかに記載の細胞。
【請求項３３】
前記ＲＮＡが残基６０７でのセリンを含むＮＳ３をコードする配列を含む、請求項２６から３２のいずれかに記載の細胞。
【請求項３４】
前記ＲＮＡが残基８９でのロイシンを含むＮＳ３をコードする配列を含む、請求項２６から３２のいずれかに記載の細胞。
【請求項３５】
哺乳動物細胞である、請求項２６から３４のいずれかに記載の細胞。
【請求項３６】
ヘパトーマ細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
ＮＳ３の残基６０７をセリンで置換する工程を含む、遺伝子型３のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法。
【請求項３９】
ＮＳ３の残基８９をロイシンで置換する工程を含む、遺伝子型３のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法。
【請求項４０】
遺伝子型３のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載の細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下または前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質が該ＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法。
【請求項４１】
前記タンパク質がプロテアーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＮＡの前記複製または該ＲＮＡによってコードされる前記タンパク質の活性を測定する工程をさらに含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝子型３のＨＣＶの活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載の細胞の溶解物を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質が該ＨＣＶの活性を阻害することを示す方法。
【請求項４４】
前記タンパク質がプロテアーゼである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＲＮＡの前記複製または該ＲＮＡによってコードされる前記タンパク質の活性を測定する工程をさらに含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１１年７月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５０４，８５３号、および２０１１年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／５０９，９８９号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々の内容は、本開示に参考として援用される。
【０００２】
開示の分野
本開示は、遺伝子型３のＣ型肝炎レプリコンおよび該レプリコンを調製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
先行技術
慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、依然として世界の重大な健康（ｈｅａｔｈ）負担であり、世界中で推定１億６千万人が感染患者している。現在の標準治療は、ＰＥＧ化インターフェロン＋リバビリンの２４〜４８週にわたる投与である。このレジメンの有効性は部分的であり、忍容性に乏しいため、新規抗ウイルス薬の発見および開発が熱心に探求されている。最近では、これらの努力は、遺伝子型１の慢性ＨＣＶ感染の処置に関してＰＥＧ化インターフェロンとリバビリンの組合せの使用について、２つのＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（ボセプレビルおよびテラプレビル）のＦＤＡ承認に至っている。他の多くの阻害剤は先進臨床開発中であるが、しかしながら、その大部分は遺伝子型１の感染症を処置するために開発されている。
【０００４】
ＨＣＶは、非常な遺伝的多様性を示すプラス鎖のＲＮＡウイルスである。６つの主な遺伝子型（すなわち、遺伝子型１〜６）と複数のサブタイプ（例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃなど）が報告されている。遺伝子型１、２および３は世界中に分布している。遺伝子型１ａまたは１ｂは、概して、北米、南米、ヨーロッパおよびアジアにおいて優勢である。しかしながら、遺伝子型２および３が一般的であり、これらの地域の多くにおいて２０〜５０％の感染を構成し得る。遺伝子型４ａは、中東およびアフリカの多くの国において優性である；エジプトの人口の最大１５％がＨＣＶに感染し、感染の９３％が遺伝子型４である。遺伝子型５は南アフリカで蔓延し、一方、遺伝子型６はアジアで最も一般的である。ほとんどの大陸および国は「支配的な」遺伝子型を有するが、感染した集団は、ほぼ普遍的に、複数の遺伝子型の混合で構成される。さらに、ＨＣＶ感染の地理的分布および多様性（疫学）は、大規模な移住および蔓延した静脈薬物使用に起因して、絶えず拡大している。例えば、遺伝子型４ａは、中央および北ヨーロッパに顕著に広がっている。これは、個々の遺伝子型が、現在の標準治療を含む、直接的な抗ウイルス薬および免疫調節療法の両方に個別に応答することが十分に実証されているため、臨床的なチャレンジを提示する。
【０００５】
ＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶゲノムに由来する自己複製ＲＮＡ配列であり、分子ウイルス学研究と創薬の両方について大いに貢献するものとして役立つ。今日まで、レプリコンは、２つの遺伝子型と３つのサブタイプ（遺伝子型１ａ、１ｂおよび２ａ）から樹立されている。これらのレプリコンは、新規阻害剤クラスの同定、臨床候補物の最適化および臨床的耐性の特徴付けを含む創薬および医薬品開発の複数の局面において重要視されてきた。最近では、すべての主なＨＣＶ遺伝子型に対して活性である次世代医薬品の開発に関心が高まっている。理想的には、「全遺伝子型」薬物およびレジメンの承認が、ＨＣＶの処置を大いに簡素化する。
【０００６】
全遺伝子型の処置レジメンの探求における重要なステップは、すべての主要な遺伝子型およびサブタイプの研究を可能にするインビトロでのツールを開発することである。しかしながら、さらなる主な遺伝子型（すなわち、遺伝子型１ａ、１ｂまたは２ａ以外の遺伝子型）の配列に由来するレプリコンは生成されていない。特に、中東、北アフリカおよび欧州における遺伝子型３のＨＣＶの世界的な蔓延にもかかわらず、遺伝子型３のレプリコンは記載されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
遺伝子型３レプリコンを安定に複製するクローン細胞系は、サブゲノム遺伝子型３のｃＤＮＡを転写し、ＨＣＶ許容細胞系にエレクトロポレーションによって導入することによって得られたことが予期せずに発見された。野生型ウイルスと比較して、適応変異はこれらのクローンから同定されている。これらの変異は、部位特異的変異誘発によって工学的に作製され、これらの細胞系に導入された場合、ＨＣＶ遺伝子型３複製が結果として生じた。このような適応変異の１つは、ＮＳ３でのＮ６０７Ｓであり、別のこのような適応変異は、ＮＳ３でのＰ８９Ｌである。ロバストな遺伝子型３レプリコン系の樹立は、創薬および開発の努力を促進する強力なツールを提供する。
【０００８】
したがって、本開示の一実施形態は、真核細胞において複製することができる遺伝子型３のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物を提供し、ここで、該ＲＮＡ配列は、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂの１つまたは複数をコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む。
【０００９】
一態様において、該構築物は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂに適応変異を含む。別の態様において、該変異は、２２０４位でのイソロイシンを含む。さらに別の態様において、該変異は、ＮＳ３において残基６０７でのセリンを含む。
【００１０】
さらに別の態様において、該変異は、ＮＳ３において残基８９でのロイシンを含む。いくつかの態様では、該変異は、残基４１でのアルギニン、残基１６６でのスレオニン、残基３７９でのスレオニン、残基５３４でのグリシン、残基５８３でのグルタミン酸、および／または残基１でのシステインの１つまたは複数をさらに含む。なお別の態様において、該変異は、表７〜９に示されたものの１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）をさらに含む。
【００１１】
さらに、該ＲＮＡ構築物に転写するＤＮＡ、該ＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子、およびこのようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む細胞もまた提供される。
【００１２】
また、別の実施形態において、残基６０７でのセリンおよび／または残基８９でのロイシンを含むＨＣＶ遺伝子型３のＮＳ３タンパク質が提供される。別の実施形態において、２２０４位でのイソロイシンをさらに含むＮＳ３タンパク質が提供される。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および該タンパク質を特異的に認識する抗体もまた提供される。
【００１３】
別の実施形態において、本開示は、単離された細胞であって、前記細胞において複製する遺伝子型３のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む細胞を提供する。一態様において、該細胞において、該ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物は存在しない。別の態様において、該細胞は、該ＲＮＡの少なくとも１０コピー、あるいは少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、または１×１０９コピーを含む。このような態様のいずれかにおいて、該ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列または全長ＨＣＶ配列であってもよく、上記の適応変異の１つまたはそれより多くを含んでもよい。
【００１４】
ＮＳ３の残基６０７をセリンで置換し、かつ／またはＮＳ３の残基８９をロイシンで置換する工程を含む、遺伝子型４のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法もまた提供される。さらに、変異は、残基４１でのアルギニン、残基１６６でのスレオニン、残基３７９でのスレオニン、残基５３４でのグリシン、残基５８３でのグルタミン酸、および／もしくは残基１でのシステイン、または表７〜９に示されたものの１つまたは複数を含むことができる。
【００１５】
一実施形態において、遺伝子型３のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、上記の実施形態のいずれかにおける細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下または上記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法もさらに提供される。あるいは、該方法は、上記実施形態のいずれかにおける細胞の溶解物を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、該ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの活性を阻害することを示す。
【００１６】
本開示は、添付の図面と併せて以下の詳細な記載を読めば非常に良く理解される。図面に含まれるものは以下の図である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、遺伝子型３ａレプリコン構築物の概略図である。Ｓ５２  ３ａ株（受託番号ＧＵ８１４２６４）レプリコンは、ネオマイシン（Ａ）またはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）−ネオマイシン融合レポーター（Ｂ）をコードする。合成されたレプリコンは、５’から３’方向に、以下の要素：Ｓ５２  ５’ＵＴＲ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｅｏ）またはＲｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子；脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＹ）ＩＲＥＳ；ＮＳ５Ａ適応変異（Ｓ２２０４Ｉ）を含むＳ５２のＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、およびＳ５２の３’ＵＴＲを組み込んだ。黒塗りのボックスはＨＣＶコア配列を示す。点影付きボックスはＨＣＶポリタンパク質配列を示す。「＋」はＳ２２０４Ｉ適応変異を示す。５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが示される。
【００１８】
【図２】図２は、ＧＴ３ａレプリコンのＮＳ３プロテアーゼ活性が、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤である化合物Ｃへの曝露に応答することを示すデータを提示する。１×１０５個のＧＴ３ａレプリコン細胞をペレットにし、１５０ｍＭのＮａＣｌを補充した２．４ｍｌの１×Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ溶解緩衝液中で室温にて１５分間溶解した。次に、細胞溶解物は、ウェルあたり８０μｌの体積で９６ウェルプレートに分配された。抗ウイルス薬希釈物は、所望の最終濃度の１０倍（５ｎＭまたは５０ｎＭ）でＤＭＳＯ中に調製された。続いて、希釈した化合物Ｃの一部（１０μｌ）を細胞溶解物の各ウェルに添加し、プレートをプレートシェーカー上で１０分間、室温にてインキュベートした。その後、１μＭユーロピウム標識ＮＳ３基質の１０μｌを各ウェルに添加した。プロテアーゼ活性データを収集し、データをＤＭＳＯ対照の阻害百分率として表した。
【００１９】
【図３】図３は、遺伝子型３ａレプリコン細胞系におけるロバストなＮＳ５Ａ発現を示す。安定なＧＴ３ａ、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂおよびＧＴ２ａレプリコン細胞ならびに１Ｃ細胞の各々０．５×１０６個をペレットにし、１００μｌのＳＤＳ泳動緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中で完全に溶解した。１２μｌの溶解物をＳＯＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。ブロットは、一次抗ＮＳ５Ａ抗体（Ａｐａｔｈ；１：３０００希釈）および二次抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて染色された。次に、染色をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＬＩ−ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）により分析した。また、ブロットは、泳動対照として、抗ＢｉＰ抗体（Ａｂｃａｍ、１：１０００希釈）および二次抗ウサギ抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて共染色された。１Ｃ細胞を陰性対照として含めた。ＮＳ５Ａの強い発現は、遺伝子型３ａのレプリコン細胞クローンにおいて検出され、これらの細胞がこのレプリコンを安定およびロバストに複製することを裏付けた。
【００２０】
【図４】図４Ａ〜Ｃは、実施例３における遺伝子型３ａのレプリコン構築物の概略図を示す。遺伝子型３ａのＳ５２株レプリコンは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｅｏ）（Ａ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）−ｎｅｏ融合レポーター（Ｂ）、またはＰｉウミシイタケルシフェラーゼ（ＰｉＲｌｕｃ）融合レポーター（Ｃ）をコードする。合成されたレプリコンは、５’から３’方向に以下の要素：Ｓ５２  ５’ＵＴＲ、Ｎｅｏ、Ｒｌｕｃ−ｎｅｏまたはＰｉ−Ｒｌｕｃレポーター遺伝子；ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ；ＮＳ５Ａ適応変異（Ｓ２２１０Ｉ）を含むＳ５２のＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、およびＳ５２の３’ＵＴＲを組み込んだ。
【化１】
2014522648.tif 000003
は、ＨＣＶ  Ｓ５２コア配列を示す。
【化２】
2014522648.tif 000004
は、ＨＣＶポリタンパク質配列を示す。
【化３】
2014522648.tif 000005
は、Ｓ２２１０Ｉ適応変異を示す。５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが示される。
【００２１】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、選択された遺伝子型３ａレプリコン細胞におけるＮＳ５Ａ発現を示す。（Ａ）選択されたレプリコン細胞におけるＮＳ５Ａ発現。２つの安定な遺伝子型３ａレプリコンクローン、および遺伝子型１ｂレプリコン細胞をペレットにし、ＳＤＳ泳動緩衝液中で完全に溶解した。次に、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。ブロットは、一次抗ＮＳ５Ａ抗体（Ａｐａｔｈ；１：３０００希釈）、および二次抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて染色された。また、ブロットは、泳動対照として、抗ＢｉＰ抗体（Ａｂｃａｍ、１：１０００希釈）および二次抗ウサギ抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ６８０ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて共染色された。染色をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＬＩ−ＣＯＲ）により分析した。（Ｂ）選択されたレプリコン細胞のＮＳ５Ａ免疫染色。遺伝子型３ａレプリコンのクローン＃１は、抗ＮＳ５Ａ抗体（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青色、核を示す）を用いて染色された。１Ｃ細胞を陰性対照として染色した。
【００２２】
【図６】図６は、選択された遺伝子型３ａレプリコンのクローンが適応変異を獲得することを示す。全細胞ＲＮＡを遺伝子型３ａレプリコンの細胞クローン＃１から抽出し、次に、指定量でＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。トランスフェクトされた細胞を完全ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、１００ｍｍ径のディッシュに播種し、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）としても公知のアミノグリコシド系抗生物質）とともに培養した。３週間後、コロニープレートを４％ホルムアルデヒドで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。インビトロで転写されたＧＴ３ａレプリコンＲＮＡを対照として並行してトランスフェクトした。
【００２３】
【図７】図７は、安定およびロバストなＧＴ３ａのＲｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコン細胞系の樹立を示すチャートである。ＮＳ３におけるＰ８９Ｌ変異を部位特異的変異誘発によってＧＴ３ａ  Ｓ５２  Ｒｌｕｃ−ｎｅｏ構築物に導入した。ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌ−Ｒｌｕｃ−ｎｅｏ変異レプリコンＲＮＡおよび親ＧＴ３ａ−Ｒｌｕ−ｎｅｏレプリコンＲＮＡ（各々１０μｇ）を１Ｃ細胞またはＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞にトランスフェクトした。生存コロニーの数を各選択についてカウントした。
【００２４】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、遺伝子型３ａルシフェラーゼ細胞クローンにおけるルシフェラーゼ発現を示す。（Ａ）１Ｃ細胞由来の選択された遺伝子型３ａレプリコン細胞クローン。（Ｂ）Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞由来の選択された遺伝子型３ａレプリコン細胞クローン。遺伝子型１ａおよび遺伝子型１ｂの安定なレプリコン細胞を参照として含めた。トランスフェクトされていない１Ｃ細胞またはＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞を陰性対照として含めた。６０，０００細胞をウミシイタケルシフェラーゼ活性アッセイに使用した。
【００２５】
【図９】図９は、ＮＳ３におけるＰ８９ＬおよびＮＳ５ＡにおけるＳ２３２Ｉの組み合わせた変異（Ｓ２２１０Ｉ）が遺伝子型３ａレプリコン複製を高めたことを示す。ＮＳ３におけるＰ８９Ｌの変異ならびにＮＳ３におけるＰ８９ＬおよびＮＳ５ＡにおけるＩ２３２Ｓ二重変異は、部位特異的変異誘発によって、それぞれ遺伝子型３ａのＳ５２  ＰｉＲｌｕｃ構築物に導入された。すべてのレプリコンＲＮＡを個別に１Ｃ細胞にトランスフェクトし、１×１０４個のトランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートのウェルに播種した。トランスフェクション後の４時間および第１日から第７日に、細胞をウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。
【００２６】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、遺伝子型３ａ治癒（ｃｕｒｅｄ）細胞系が遺伝子型３ａ複製に対して非常に許容的であることを示すための曲線を提示する。Ｐｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌ（Ａ）、Ｐｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ１ａおよびＰｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ１ｂ（Ｂ）レプリコンＲＮＡを１Ｃ治癒細胞または遺伝子型３ａ治癒細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後の４日間、ルシフェラーゼ活性を毎日測定した。２つの治癒レプリコン細胞系である３ａ−Ｃ２および３ａ−Ｃ３は、遺伝子型３ａ複製に最も高い程度の許容性を示した。
【００２７】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、ＮＳ３またはＮＳ４Ａにおける二次変異が遺伝子型３ａレプリコン複製を高めたことを示す。二次変異であるＮＳ３におけるＱ４１Ｒ、Ａ１６６Ｔ、Ａ３７９Ｔ、Ｓ５３４Ｇ、Ｋ５８３Ｅ、またはＮＳ４ＡにおけるＳ１Ｃは、部位特異的変異誘発によってＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌ  ＰｉＲｌｕｃ構築物に導入された。レプリコンＲＮＡ（対照としてのＰｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ１ｂ）を個別に１Ｃ（Ａ）または３ａ−Ｃ３（Ｂ）治癒細胞にトランスフェクトし、９６ウェルプレートにウェルあたり１×１０４個のトランスフェクトされた細胞を播種した。細胞は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性について、トランスフェクション後の４時間、および７日間毎日分析された。この図に示されるデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表的な実験のものである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本開示をより詳細に記載する前に、初めに以下の用語を定義する。
【００２９】
本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、従って、当然に変更されてもよいことを理解するべきである。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的とするためのものであり、限定することを意図していないことも理解するべきである。
【００３０】
本明細書で使用するとき、および添付の特許請求の範囲において、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「スレッド（ｔｈｒｅａｄ）」への言及は、複数のスレッドを含む。
１．定義
【００３１】
他に定義がなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００３２】
本明細書において使用するとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、組成物および方法が、列挙されている要素を含み、他のものを排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために用いるときの「から本質的になる」は、所期の目的のための組合せに対して、任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。このようにして、本明細書において定義されるように要素から本質的になる組成物は、請求される開示の基本的および新規の特徴（単数または複数）に物質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量を超える要素および実質的方法工程を除外することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【００３３】
範囲を含む数字表示、例えば、温度、時間、量、および濃度の前に使用されるときの用語「約」は、（＋）または（−）１０％、５％または１％変化してもよい近似値を示す。
【００３４】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に用いられ、およびこれらの最も広い意味で、２つもしくはそれより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチドミメティックの化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に対してかけられる制限はない。本明細書において使用するとき、用語「アミノ酸」とは、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体を含む天然および／もしくは非天然または合成のいずれかのアミノ酸、アミノ酸類似体、ならびにペプチドミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸の１文字および３文字略語を下記に列挙する。３個もしくはそれより多くのアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にはオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、一般にはポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【化４】
2014522648.tif 000006
【００３５】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を果たし得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリ前または後にもたらすことができる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分を割り込ませることができる。重合後、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって、ポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方も指す。他に指定または要求されていない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるまたは予期される各々２本の相補的一本鎖形態の両方を含む。
【００３６】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特異的配列で構成される。このようにして、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示を、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースにインプットし、機能性ゲノム解析および相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。
【００３７】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２ペプチド間または２核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインすることができる各々の配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めるときには、これらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列が共有するマッチング位置または相同位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。一実施形態において、相同ペプチドは、適応変異の１つまたは複数を含む、記載されているものと同じ機能的特徴を共有するものである。
【００３８】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列との一定の百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するということは、アラインさせたとき、これら２つの配列を比較して同じである塩基（またはアミノ酸）の百分率を意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性またはパーセント配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータをアラインメントに用いる。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。具体的には、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート手段＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ（２０１１年７月１５日に最終アクセス）で見出すことができる。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、特定のパーセント相同性を有するポリヌクレオチド、および同じまたは同様な生物活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３９】
用語「核酸のホモログ」とは、核酸のヌクレオチド配列またはその相補体との一定程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、その相補体との一定程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有するまたはその相補体を有する核酸を含むことが意図される。一態様では、核酸のホモログは、核酸またはその相補体にハイブリダイズすることができる。
【００４０】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後の、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のいずれかを使用して、それらが関係づけられる遺伝子のより大きな断片または全長コード配列を同定することができる。より大きな断片配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００４１】
用語「発現する」とは、遺伝子産物の産生を指す。
【００４２】
本明細書において使用するとき、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
【００４３】
ポリヌクレオチドに適用される場合の用語「コードする」とは、その本来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されたとき、ポリヌクレオチドを、ポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生するように転写および／または翻訳することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補体であり、コードする配列をこれらから推定することができる。
【００４４】
「真核細胞」は、モネラを除く生物界のすべてを含む。これらは、膜に包まれた核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、真核生物であり、または細胞が内膜および細胞骨格によって複雑な構造に構成されている生物である。最も特徴的な包膜構造は核である。真核生物宿主としては、例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞、または代替的に上に記載した原核細胞由来のものが挙げられる。非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類およびヒトが挙げられる。
【００４５】
本明細書において使用するとき、「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合断片または一本鎖を含む。このようにして、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。このようなものの例としては、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられる。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、任意の適切な生物源、例えばマウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。
【００４６】
用語「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用されるとき、異なるＢ細胞系に由来する抗体の調製物を指す。これらは、各々が異なるエピトープを認識する、特異的抗原に対して分泌された免疫グロブリン分子の混合物である。
【００４７】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用するとき、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性をあらわす。
【００４８】
用語「単離された」とは、本明細書において使用するとき、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的材料もしくは細胞材料を指し、あるいはタンパク質またはポリヌクレオチドに言及する場合、天然の環境からタンパク質またはポリヌクレオチドを除くために共有結合の破壊を意味する。一態様では、用語「単離された」とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官であって、天然源に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官から各々分離されるものを指す。また、用語「単離された」とは、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、細胞材料、ウイルス材料もしくは培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、あるいは化学合成される場合、化学前駆体または他の化合物を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態で見出されない核酸断片を含むことを意味する。また、用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指し、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味するものとして本明細書において使用される。他の実施形態において、用語「単離されたまたは組換えの」とは、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（単数もしくは複数）が自然界で通常会合している、細胞のまたは別の構成成分から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、自然または天然環境において、例えば染色体上で通常会合している３’および５’の連続ヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（単数もしくは複数）は、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。また、用語「単離された」は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すために本明細書で使用され、培養された細胞または組織および工学的に作製された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
【００４９】
Ｃ型肝炎ウイルスまたは「ＨＣＶ」は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科の小さい（サイズが５５〜６５ｎｍ）、エンベロープを有した、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃ型肝炎ウイルスは、ヒトにおけるＣ型肝炎の原因である。Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、タンパク質の２０面体保護殻に囲まれ、さらに細胞起源の脂質（脂肪）エンベロープに包まれた遺伝物質（ＲＮＡ）のコアからなる。２つのウイルスエンベロープ糖タンパク質であるＥ１およびＥ２は、脂質エンベロープに埋め込まれている。
【００５０】
Ｃ型肝炎ウイルスは、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ゲノムは、長さが９６００ヌクレオチド塩基である単一のオープンリーディングフレームからなる。この単一のオープンリーディングフレームは翻訳され、単一のタンパク質産物を産生し、これは次に、プロセッシングされてより小さな活性タンパク質を産生する。
【００５１】
ＲＮＡの５’末端および３’末端には、タンパク質に翻訳されないが、ウイルスＲＮＡの翻訳および複製に重要であるＵＴＲがある。５’ＵＴＲは、約３，０００個のアミノ酸を含む非常に長いタンパク質の翻訳を開始するリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ−内部リボソーム進入部位）を有する。この大きなプレタンパク質は、後に細胞およびウイルスのプロテアーゼによって、宿主細胞内でウイルス複製を可能にし、または成熟ウイルス粒子にアセンブルする１０個のより小さいタンパク質に切断される。
【００５２】
Ｃ型肝炎ウイルスによって作製される構造タンパク質は、コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２を含む；非構造タンパク質は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂを含む。
【００５３】
ＨＣＶ分離株間の遺伝的差異に基づいて、Ｃ型肝炎ウイルス種は、６種の遺伝子型（１〜６）に分類され、各遺伝子型にいくつかのサブタイプ（文字で表される）を有する。サブタイプは、さらにこれらの遺伝的多様性に基づいて準種に分類される。ＨＣＶ遺伝子型の優勢と分布は世界的に異なる。例えば、北米では、遺伝子型１ａが優勢であり、続いて１ｂ、２ａ、２ｂ、および３ａである。欧州では、遺伝子型１ｂが優勢であり、続いて２ａ、２ｂ、２ｃ、および３ａである。遺伝子型４および５はアフリカでほぼ排他的に見出される。遺伝子型は、インターフェロンに基づく治療およびこのような治療の必要な期間に対する応答の可能性を決定する上で臨床的に重要である。遺伝子型１および４は、他の遺伝子型（２、３、５および６）よりもインターフェロンに基づく処置に対する応答が小さい。遺伝子型１および４に関する標準的なインターフェロンに基づく治療期間は４８週間であり、一方、遺伝子型２および３に関する処置は２４週間で完了する。
【００５４】
異なるＨＣＶ遺伝子型由来の配列は、全ウイルスゲノムにわたって、３３％程度異なり得、配列変異性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）は、高度に保存された５’ＵＴＲおよびコア領域および超可変エンベロープ（Ｅ）領域は別にして、ウイルスゲノム全体で均等に分布している。
【００５５】
ＨＣＶ遺伝子型は、当該技術分野で公知の種々の方法を用いて同定することができる。遺伝子型特異的なプライマーを用いたＰＣＲに基づく遺伝子型決定は、特にコア領域を標的としたプライマーを用いて、最初に１９９２年に導入された。市販のキット（例えば、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｚｗｉｊｉｎｄｒｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるＩｎｎｏＬｉｐａ（登録商標））も利用可能である。直接的な配列決定は、その特性において、より信頼性が高く、感受性の遺伝子型決定のために使用することができる。
【００５６】
血清学的な遺伝子型決定は、遺伝子型特異的な抗体を使用し、間接的に遺伝子型を同定する。２つの市販の血清学的な遺伝子型決定アッセイが導入され、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．からのＲＩＢＡ  ＳＩＡアッセイ、およびＮｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．からのＭｕｒｅｘ  ＨＣＶセロタイピング酵素免疫アッセイが挙げられる。
【００５７】
遺伝子型３のＨＣＶの配列は同定されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１４２６４は、Ｓ５２感染性クローンに基づいたサブゲノム遺伝子型３ａレプリコンの配列を提供する。遺伝子型３およびこれらの配列が臨床的に影響があるとするさらなる論考は、Ｚｅｉｎ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  １３巻（２号）：２２３〜３５頁（２０００年）に見出すことができる。
【００５８】
用語「レプリコン」とは、単一の複製起点から複製されるＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの領域を指す。大部分の原核生物の染色体については、レプリコンは染色体全体である。いくつかの態様において、レプリコンは、インビトロにおける細胞内で複製するＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物を指す。一態様において、レプリコンは複製して、インビトロにおける細胞内でそのレプリコンの少なくとも約１０コピー、あるいは代替的に、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーを産生することができる。あるいは、レプリコンの複製効率は、細胞ＲＮＡを含む総ＲＮＡ中の一定量のウイルスＲＮＡを産生することによって測定することができる。一態様において、レプリコンは、総ＲＮＡまたは細胞ＲＮＡの１μｇあたりのレプリコンの少なくとも約１０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２コピーを産生することができる。
【００５９】
「サブゲノム」ＨＣＶ配列とは、野生型ＨＣＶのすべての配列を含まないＨＣＶ配列を指す。一態様において、サブゲノムＨＣＶまたはサブゲノムＨＣＶレプリコンは、Ｅ１、Ｅ２およびＣ領域を含まない。別の態様において、サブゲノムＨＣＶまたはサブゲノムＨＣＶレプリコンは、５’ＵＴＲ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂおよび３’ＵＴＲ配列のすべてまたは一部を含む。対照的に、「全長」または「全ゲノム」ＨＣＶまたはＨＣＶレプリコンはＥ１、Ｅ２およびＣ領域を含む。いくつかの態様では、サブゲノムＨＣＶレプリコンと全長ＨＣＶレプリコンの両方は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）、マーカー遺伝子（例えば、Ｎｅｏ）、およびＩＲＥＳ（例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）配列の１つまたは複数を含むことができる。
【００６０】
ウイルス粒子（またはビリオン）は、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから作製される遺伝物質、および該遺伝物質を保護するタンパク質被覆からなる。一態様において、脂質のエンベロープは、これらが細胞の外側にあるときにタンパク質被覆を取り囲む。
【００６１】
特定の遺伝子型のＨＣＶレプリコンの「適応変異」なる用語は、該遺伝子型の野生型ＨＣＶ配列と比較して、野生型レプリコンを細胞内で、特に真核細胞、例えば哺乳動物細胞およびインビトロにおいて複製することができ、またはＨＣＶレプリコンの複製する能力を増大させる変異を指す。適応変異は、好適には、宿主細胞特異的タンパク質とのレプリカーゼ複合体のアセンブリに影響を及ぼすことができ、または代替的に、適応変異を含むタンパク質（例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａなど）と、宿主細胞の抗ウイルス防御と関連する細胞タンパク質との相互作用を促進することができることが意図される。
【００６２】
「レポーター遺伝子」とは、細胞培養物、動物または植物において対象とする別の遺伝子の調節配列に結合し、この他の遺伝子の同定を促進し得る遺伝子を指す。レポーター遺伝子は、多くの場合、特定の遺伝子が、細胞または生物集団によって取り込まれまたはそれにおいて発現されたかどうかの指標として使用される。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、ルシフェラーゼ遺伝子および緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられる。
【００６３】
「マーカー遺伝子」または「選択マーカー」は、通常は生物を死滅させるまたはその増殖を妨げる選択剤から生物を保護する遺伝子を指す。一つの非限定的な例は、発現に応じて、ゲンタマイシンＢ１と類似した構造を有するアミノグリコシド抗生物質であるＧ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）である。
ＨＣＶ遺伝子型３レプリコン構築物
【００６４】
本開示は、概して、遺伝子型３レプリコンを安定的に複製するクローン細胞系が、サブゲノム遺伝子型３のｃＤＮＡを転写し、ＨＣＶ許容細胞系にエレクトロポレーションによって導入することによって得ることができるという予想外の発見に関する。次に、クローン細胞から、適応変異が同定される。１つのこのような適応変異はＮＳ３でのＮ６０７Ｓである。別の適応変異はＰ８９Ｌである。Ｓ２２０４Ｉ変異もまたこの遺伝子型に適用可能である。これらの変異のいずれか１つまたは複数の効果は、Ｑ４１Ｒ（ＮＳ３）、Ａ１６６Ｔ（ＮＳ３）、Ａ３７９Ｔ（ＮＳ３ヘリカーゼドメイン）、Ｓ５３４Ｇ（ＮＳ３ヘリカーゼドメイン）、Ｋ５８３Ｅ（ＮＳ３ヘリカーゼドメイン）、Ｓ１Ｃ（ＮＳ４Ａ）または表７〜９に示されたものの１つまたは複数によってさらに高めることができる。
【００６５】
これらの変異の同定は、これらの変異が、インビトロでの細胞において複製するＨＣＶの能力に寄与することを示唆し、野生型ＨＣＶ遺伝子型３のＲＮＡでは観察されていない現象である。このような寄与は、遺伝子型３のＲＮＡに部位特異的変異誘発によって変異を工学的に作製し、これらを細胞系に導入することによって確認された。このような変異を有する遺伝子型３のＨＣＶ  ＲＮＡは細胞系において首尾よく複製された。したがって、本出願人は、本出願人が、インビトロにおいて複製し得るＨＣＶ遺伝子型３レプリコンを調製し、このような能力をもたらす適応変異を同定したことを実証した。
【００６６】
したがって、一実施形態において、本開示は、宿主細胞で複製することができる遺伝子型３のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを提供する。一態様において、複製はインビトロである。一態様において、複製は生産的な複製である。別の態様において、細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞などの真核細胞である。さらに別の態様において、細胞はヘパトーマ細胞である。いくつかの態様において、ＲＮＡは複製して、細胞中にＲＮＡの少なくとも１０コピーを産生することができる。別の態様において、コピー数は、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９である。
【００６７】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列であってもよい。具体的には、このような適応変異のいずれかまたはそれより多くを含む全長ＨＣＶレプリコンもまた複製できることが意図される。さらになお、適応変異（単数または複数）を含む対応する遺伝子型の全ＨＣＶウイルスは感染性であり、複製することができる。いずれかのこのような場合において、ＲＮＡは、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとのうちの１つまたは複数を含んでもよい。一態様において、ＲＮＡは、プラス鎖の核酸上で５’から３’方向に、最端の５’末端の保存配列を含む機能的ＨＣＶ５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ）；ＨＣＶポリタンパク質コード領域；および最端の３’末端の保存配列を含む機能的ＨＣＶ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）を含む。
【００６８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、細胞において該ＲＮＡを複製し得る適応変異を含むことができる。このような適応変異は、ＮＳ５Ａの２２０４位のイソロイシン、および／またはＮＳ３の残基６０７のセリンを含むことができる。別の適応変異はＰ８９Ｌである。これらの変異のいずれか１つまたは複数の効果は、Ｑ４１Ｒ（ＮＳ３）、Ａ１６６Ｔ（ＮＳ３）、Ａ３７９Ｔ（ＮＳ３ヘリカーゼドメイン）、Ｓ５３４Ｇ（ＮＳ３ヘリカーゼドメイン）、Ｋ５８３Ｅ（ＮＳ３ヘリカーゼドメイン）、Ｓ１Ｃ（ＮＳ４Ａ）または表７〜９に示されたものの１つまたは複数によってさらに高めることができる。
【００６９】
一実施形態において、表３に列挙されたレプリコンが提供される。具体的には、ＨＣＶ  ＲＮＡは、対応する適応変異（単数または複数）および／または活性が保持される限り、開示された配列のいずれかと少なくとも約７５％、または約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または約９９．５％の配列同一性を有するＲＮＡ配列であり得ることが意図される。
【００７０】
別の実施形態において、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む遺伝子型３のＨＣＶ  ＲＮＡ構築物が提供され、ここで、該構築物は真核細胞内で複製することができる。一態様において、該構築物は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂに適応変異を含む。該変異は、一態様において、ＮＳ５Ａにおいて、２２０４位でのイソロイシンを含み、別の態様において、ＮＳ３において、残基６０７でのセリンおよび／または残基８９でのロイシンを含む。いくつかの態様において、遺伝子型３は遺伝子型３ａである。
【００７１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＨＣＶ  ＲＮＡは、選択用のマーカー遺伝子をさらに含むことができる。このようなマーカー遺伝子の非限定的な例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。他の例は当該技術分野において周知である。
【００７２】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＨＣＶ  ＲＮＡは、レポーター遺伝子をさらに含むことができる。このようなマーカー遺伝子の非限定的な例は、ルシフェラーゼ遺伝子である。他の例は当該技術分野において周知である。
【００７３】
上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物は、Ｃ、Ｅ１またはＥ２の１つまたは複数をコードする配列をさらに含むことができる。一態様において、該ＲＮＡ構築物は、全長ＨＣＶレプリコンである。
【００７４】
本開示はまた、上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物に転写され得る一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子、または上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物を含む単離された細胞を提供する。
【００７５】
いずれかのこのような実施形態の一態様において、遺伝子型３は遺伝子型３ａである。なお別の態様では、このような実施形態のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。別の態様において、該ポリヌクレオチドを含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物が提供される。なお別の態様において、該ポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。さらに一態様において、上記の実施形態のいずれかのタンパク質を特異的に認識する抗体が提供される。
ＨＣＶ遺伝子型３レプリコンおよび該レプリコンを含む細胞
【００７６】
本開示の別の実施形態は、遺伝子型３であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む単離された細胞を提供し、ここで、該ＨＣＶ  ＲＮＡは該細胞内で複製する。一態様において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が該細胞内に存在せず、したがって、ＨＣＶ  ＲＮＡのコピーは、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ構築物から転写されない。
【００７７】
一態様において、該細胞は、該ＲＮＡの少なくとも１０コピーを含む。別の態様において、該細胞は、該ＲＮＡの少なくとも１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーを含む。
【００７８】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列または全長ＨＣＶ配列であってもよい。いずれかの場合において、ＲＮＡは、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとのうちの１つまたは複数を含むことができる。
【００７９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、細胞において該ＲＮＡが複製し得る適応変異を含むことができる。このような適応変異は、ＮＳ５Ａの２２０４位でのイソロイシンを含んでもよい。
【００８０】
一実施形態において、表３に列挙されたレプリコンが提供される。ＨＣＶ  ＲＮＡは、対応する適応変異（単数または複数）が保持される限り、開示された配列のいずれかと少なくとも約７５％、または約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または約９９．５％の配列同一性を有するＲＮＡ配列であり得ることが意図される。
【００８１】
一態様において、細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞などの真核細胞である。別の態様において、細胞は、限定されないがＨｕｈ７細胞（例えば、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃおよび１Ｃ）などのヘパトーマ細胞である。いくつかの態様において、細胞は、インビトロまたはエクスビボの条件で置かれる。
遺伝子型３レプリコンを調製する方法
【００８２】
ＨＣＶ遺伝子型３レプリコンが、実施例１に示されるように同定された後、対応する遺伝子型ＨＣＶ  ＲＮＡへの関連する適応変異の導入は、特にインビトロでの哺乳動物細胞におけるＲＮＡの複製する能力をもたらすことができる。したがって、本開示は、遺伝子型３のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法であって、ＮＳ３の残基６０７をセリンに、またはＮＳ３の残基８９をロイシンに置換する工程を含む、方法を提供する。一態様では、Ｓ２２０４Ｉ変異または本明細書に提供される任意の二次変異を該ＲＮＡにさらに導入することができる。
遺伝子型３を標的とするＨＣＶ阻害剤をスクリーニングする方法
【００８３】
多数の公知および未知のＨＣＶ阻害剤は、遺伝子型１ｂ（実施例１）と比較して、遺伝子型３のＨＣＶを阻害するこれらの効率について試験された。いくつかは遺伝子型３についてより高い有効性を示し、いくつかは有効ではなかった。したがって、新たに同定された遺伝子型３レプリコンの有用性は、十分に実証される。
【００８４】
このようにして、本開示はまた、一実施形態において、遺伝子型３のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下またはＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法を提供する。いくつかの態様では、該タンパク質は、例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかまたはそれより多くのプロテアーゼである。該ＲＮＡの複製は、一態様では、ルシフェラーゼ遺伝子などの該ＲＮＡ上のレポーター遺伝子によって測定することができる。
【００８５】
別の実施形態において、遺伝子型３のＨＣＶの活性を阻害する作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ３  ＨＣＶ）を同定する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の細胞の溶解物を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、そのＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質が該ＨＣＶの活性を阻害することを示す方法が提供される。いくつかの態様において、該タンパク質は、例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかまたはそれより多くのプロテアーゼである。一態様において、該方法は、該ＲＮＡの複製または該ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性を測定する工程をさらに含む。
【００８６】
ＨＣＶ阻害剤（または「候補作用物質」）は、有機化合物、抗体などのペプチドもしくはタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの核酸系である低分子薬物であってもよい。２０１１年５月に、食品医薬品局（ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、Ｃ型肝炎のための２つの薬物であるボセプレビルおよびテラプレビルを承認した。両薬物は、ウイルスの再生を支援する酵素をブロックする。ボセプレビルは、Ｃ型肝炎遺伝子型１上のＨＣＶ  ＮＳ３活性部位に結合するプロテアーゼ阻害剤である。テラプレビルは、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３．４Ａセリンプロテアーゼを阻害する。
【００８７】
より従来型のＨＣＶ処置は、ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ａまたはＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ｂ（ブランド名ＰｅｇａｓｙｓまたはＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ）と抗ウイルス薬リバビリンの併用を含む。無作為化対照試験の系統的精査によれば、ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ａ＋リバビリンは、ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ｂ＋リバビリンと比較して、慢性Ｃ型肝炎の患者間で持続的なウイルス学的応答を増大させ得る。
【００８８】
これらのＨＣＶ阻害剤のすべて、ならびに任意の他の候補作用物質は、ＨＣＶ遺伝子型３の阻害におけるこれらの有効性について、本開示された方法を用いて試験することができる。次に、細胞は、細胞においてレプリコンが複製し得るのに適切な温度、期間でインキュベートされる。レプリコンは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むことができ、このような場合において、インキュベーション期間の終了時点で、細胞は、レプリコンレベルに関するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイを用いて定量化することができる。
【００８９】
あるいは、ＨＣＶ阻害剤の有効性は、レプリコンによってコードされるタンパク質の発現または活性によって測定することができる。このようなタンパク質の一例はＮＳ３プロテアーゼであり、タンパク質の発現または活性の検出は、当該技術分野において公知の方法、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年）を用いて行うことができる。
【００９０】
次に、ルシフェラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼの活性レベルは、未処理またはＨＣＶを阻害する公知の活性を有する作用物質で処理され得る、対照におけるレベルと比較した百分率に変換される。未処理の対照と比較した場合、ＨＣＶ複製の低下またはＮＳ３活性の低下は、候補作用物質が、ＨＣＶの対応する遺伝子型を阻害することができることを示す。同様に、対照の作用物質と比較した場合、ＨＣＶ複製のより大きな低下またはＮＳ３活性のより大きな低下は、候補物が対照の作用物質よりも有効であることを示す。
【実施例】
【００９１】
本開示は、以下の実施例を参照することによってさらに明確になる。スレッドと方法の両方に対しての多くの変更は、現在の開示の範囲から逸脱することなく実施できることが当業者に明らかである。
省略形
【００９２】
他に記載がなければ、すべての温度は摂氏温度（℃）である。また、これらの実施例および他の場所において、省略形は以下の意味を有する。
【化５】
2014522648.tif 000007
（実施例１）
ロバストな遺伝子型３のＣ型肝炎ウイルスサブゲノムレプリコンの生成
【００９３】
この実施例は、適応変異がＨｕｈ７細胞において複製し得る遺伝子型３のＨＣＶウイルスレプリコンから同定されること、およびこれらの適応変異を有するＨＣＶレプリコンが抗ウイルス薬のスクリーニングに対して有用なツールであることを示す。
材料および方法
細胞培養
【００９４】
３つのＨＣＶ許容細胞系は、これらの試験中に使用された：Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃ、および１Ｃ。Ｈｕｈ７−ｌｕｎｅｔをＲｅＢＬｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した（Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９巻：３８０〜９２頁（２００５年））。５１Ｃ細胞、ならびに安定な遺伝子型１ａ  Ｈ７７および遺伝子型１ｂ  Ｃｏｎ−１  Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコン細胞の誘導は、従前に記載されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４巻：３０９９〜１０６頁（２０１０年）参照）。１Ｃ細胞は、５１Ｃ細胞（同上）から誘導されたＧＳ−５８８５耐性の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒することによって誘導された。ＧＳ−５８８５はＮＳ５Ａ阻害剤であり、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能である。このクローン株は、スクリーニングされた５０個のクローンのうち、ＧＴ１ａおよび１ｂレプリコンに対して最も高い許容性を示し、全体としてＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞および５１Ｃ細胞よりも５〜１０倍許容性が高かった。すべての細胞系は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１単位／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充され、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖された；この培地調合物を完全ＤＭＥＭと称する。レプリコン細胞系は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む完全ＤＭＥＭ中で選択され、維持された。
遺伝子型３ａのＨＣＶサブゲノムレプリコンをコードするプラスミドの構築
【００９５】
Ｓ５２感染性クローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１４２６４）に基づくサブゲノム遺伝子型３ａレプリコンをコードするプラスミド（ｐＧＴ３ａＳ５２ＳＧ）は、ＤＮＡ合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびクローニングによって調製された。合成されたレプリコンに５’から３’方向に以下の要素を組み込んだ（図１）：（１）コアの最初の４８ヌクレオチドに伸長する、Ｓ５２  ５’ＵＴＲ、（２）ＡｓｃＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列
【化６】
2014522648.tif 000008
を有するリンカー、（３）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｅｏ）遺伝子、（４）ＦｓｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列
【化７】
2014522648.tif 000009
を有するリンカー、（５）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、（６）ＭｌｕＩ制限部位（下線）、およびＨＣＶポリタンパク質の発現のためのＡＴＧ開始コドンを導入するヌクレオチド配列
【化８】
2014522648.tif 000010
を有するリンカー、（７）ＮＳ５Ａ適応変異（Ｓ２２０４Ｉ）を含むＳ５２のＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、ならびに（８）Ｓ５２の３’ＵＴＲ。Ｓ５２レプリコンをコードする合成ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩ制限部位間のＰＵＣ１９に挿入した。
【００９６】
プラスミドｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａは、プラスミドｐＬｕｃＮｅｏ２ａ（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年））から誘導された。ｈウミシイタケルシフェラーゼ−ネオマイシン融合遺伝子（ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ）は、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｆｅＩ  ｈＲＬｕｃ  ＦｗｄとＮｏｔＩ  Ｎｅｏ  Ｒｅｖのプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ｐＦ９  ＣＭＶ  ｈＲｌｕｃ−ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅された。これらの２つのプライマーは、以下の配列を有し、その後のクローニングのために制限部位が導入された：ＡｆｅＩ  ｈＲＬｕｃ：
【化９】
2014522648.tif 000011
、ＮｏｔＩ  Ｎｅｏ  Ｒｅｖ：
【化１０】
2014522648.tif 000012
。ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。得られたプラスミドをＡｆｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、切り出された断片（ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ）は、同じ酵素で消化されたｐＬｕｃＮｅｏ２ａにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲーションされた。得られたベクターのｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａを配列決定し、ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ融合遺伝子の正しい配向および配列を確認した。
【００９７】
その後のＰＣＲ断片をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩで切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ベクターおよび挿入片は、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてライゲーションされた。
変異レプリコンの構築
【００９８】
適応変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いた部位特異的変異誘発によってレプリコンに導入された。すべての変異は、ＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によるＤＮＡ配列決定によって確認された。
ＲＮＡ転写
【００９９】
遺伝子型３ａのサブゲノムＨＣＶレプリコンをコードするプラスミドを、ＸｂａＩを用いて線形化し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｔ７  ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＲＮｅａｓｙキットを用いて、それぞれ合成し、精製した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍの光学濃度を用いて測定され、０．８％アガロースゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確認された。
ＲＮＡトランスフェクションおよび安定なレプリコン細胞系の単離
【０１００】
インビトロ転写されたＲＮＡの１０μｇは、従前に記載の通り（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４巻：３０９９〜１０６頁（２０１０年））、エレクトロポレーションによってＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃ、または１Ｃ細胞にトランスフェクトされた。要約すると、細胞をトリプシン処理および遠心分離によって回収し、次に、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０７細胞／ｍｌの濃度のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。レプリコンＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）キュベット（０．４ｃｍのギャップ）中の４００μｌの細胞懸濁液に添加された。細胞に２７０Ｖおよび９６０μＦでエレクトロポレーションを施し、室温にて１０分間インキュベートし、３０ｍｌの完全ＤＭＥＭ中に再懸濁し、次に、１００ｍｍ径のディッシュに播種した。播種の４８時間後、培地は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。Ｇ４１８選択の約３週間後に細胞クローンを単離し、増殖させ、初期の継代で凍結保存した。
レプリコンコロニー形成アッセイ
【０１０１】
Ｇ４１８耐性コロニー形成の効率を測定するために、細胞に指定した量のレプリコンＲＮＡまたは細胞ＲＮＡ抽出物をエレクトロポレーションによって導入し、２×１０５〜２×１０６細胞／１００ｍｍディッシュの範囲の複数の密度で播種した。播種の４８時間後、培地は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。３週間後、コロニープレートを細胞増殖のために使用し、またはＧ４１８耐性の細胞増殖巣（ｆｏｃｉ）を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈ２Ｏ中の０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。
ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出、増幅、および遺伝子型分析
【０１０２】
ＨＣＶ  ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲ、および配列決定をＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって行った。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、ＨＣＶレプリコン細胞ＲＮＡを抽出し、精製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われた。ＰＣＲ産物をＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって配列決定した。
間接免疫蛍光法によるＮＳ５Ａタンパク質の検出
【０１０３】
レプリコン細胞をウェルあたり１×１０４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間培養後、次に、細胞は、従前に記載の通り（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年））、ＮＳ５Ａタンパク質について染色された。要約すると、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定した。続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％ＦＢＳでブロッキングし、次に、抗ＮＳ５Ａ抗体で染色した。染色は、マウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ａｐａｔｈ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ）の１：１０，０００希釈を用いて行われた。ＰＢＳ中で３回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５にコンジュゲートされた二次抗マウス抗体を用いて、抗ＮＳ５Ａ抗体で標識された細胞を検出した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核を１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて画像化した。
レプリコンＲＮＡ複製についてのレプリコン細胞ＮＳ３プロテアーゼアッセイ
【０１０４】
遺伝子型３ａクローンレプリコン細胞をウェルあたり１×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートし、その後、培養培地を除去した。次に、レプリコン細胞は、プレートシェーカー上で室温にて２０分間、１５０ｍＭのＮａＣｌを補充した１×Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ溶解緩衝液の９０μｌを用いて溶解された。上記の溶解緩衝液中で１μＭユーロピウム標識ＮＳ３基質の１０μｌを各ウェルに添加した。プロテアーゼ活性データを収集し、従前に記載の通り（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年））に分析した。
レプリコン抗ウイルスアッセイ
【０１０５】
２，０００細胞／ウェルは、Ｇ４１８を除いた９０μｌのＤＭＥＭ培地を含む３８４ウェルプレートに播種された。化合物を１：２２５希釈で細胞に添加し、９０．４μｌの総体積で最終濃度を０．４４％とした。１０種の濃度の３倍連続薬物希釈液を使用し、開始濃度は、すべての試験された化合物について４．４μＭまたは０．４４μＭであり、ただし、化合物Ａの開始濃度は４４．４ｎＭであった。細胞プレートを３７℃にて３日間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞をレプリコンレベルに対するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量化された。ルシフェラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼ活性レベルは、未処理の対照のレベル（１００％として定義される）と比較した百分率に変換され、データは、ＸＬＦｉｔ４ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いてロジスティック用量応答式ｙ ａ／［１ （ｘ／ｂ）ｃ］に適合させた（ｙは正規化されたルシフェラーゼシグナルの量であり、ｘは薬物濃度であり、ａは曲線の振幅であり、ｂはその転移中心でのｘ値［ＥＣ５０］であり、ｃは転移幅を定義するパラメータである）。
結果
適応変異
【０１０６】
遺伝子型４についての方法と類似した方法を用いて、遺伝子型３レプリコンを含むＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞コロニーを同定した。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃおよび１Ｃ細胞は、材料および方法に記載される通り、ＧＴ３ａレプリコンＲＮＡをトランスフェクトされた。生存コロニー数を各々の選択についてカウントした。データは、各細胞系における少なくとも６つの独立したトランスフェクションから選択されたコロニーの総数を表す。Ｈｕｈ７−ＬｕｎｅｔをＲｅＢＬｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。５１Ｃ細胞の誘導は、以前に記載された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４巻：３０９９〜１０６頁（２０１０年））。１Ｃ細胞は、５１Ｃ細胞由来のＧＳ−５８８５耐性の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒させることによって誘導された。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔのトランスフェクションは、ＧＴ３ａレプリコンを複製する２つのコロニーを生じさせ、その後、細胞系中で増殖させることができた。他の２つの細胞系のトランスフェクションは、いずれも生存可能なコロニーを生じさせなかった（表１）。
表１．Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞における安定なＧＴ３ａレプリコンクローンの選択
【表１】
2014522648.tif 000013
【０１０７】
５００００個のＧＴ３ａレプリコン細胞（表１に記載されるＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞において樹立されたコロニーから増殖させた）からの全細胞ＲＮＡは、製造業者によって推奨されるように、ウイルスＲＮＡ  ＱＩＡａｍｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出された。次に、全細胞ＲＮＡの半分をＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞にエレクトロポレーションによって導入し、他の半分を１Ｃ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。トランスフェクトされた細胞を完全ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、１５０ｍｍ径のディッシュに１×１０６および３×１０６細胞の密度で播種した。播種の４８時間後、培地は、０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。２５日後、すべてのディッシュからコロニーをカウントし、各細胞系について、総計を表２に示す。インビトロで転写されたＧＴ３ａレプリコンＲＮＡを対照として並行してトランスフェクトした。ＧＴ３ａレプリコン細胞から抽出されたレプリコンＲＮＡは、元の親のレプリコンと比較して、そのコロニー形成効率を大いに増大させる適合を明らかに含んだ。
表２．選択されたＧＴ３ａレプリコンクローンが適応遺伝子変化を獲得した。
【表２】
2014522648.tif 000014
【０１０８】
選択されたＧＴ３ａレプリコンクローンを増やし、遺伝子型分析に供した。全細胞ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、精製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われた。ＰＣＲ産物をＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ）によって配列決定した。遺伝子型分析は、適応変異としてＮＳ３変異Ｎ６０７Ｓを同定した（表３）。
表３．遺伝子型３ａレプリコン細胞系において同定されたＮＳ３変異Ｎ６０８Ｓ。
【表３】
2014522648.tif 000015
【０１０９】
ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ活性部位、ＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ５Ｂ非活性部位、ＮＳ４Ａおよび宿主因子を標的とする、異なるクラスのＨＣＶ阻害剤が、安定な遺伝子型１ｂおよび遺伝子型３ａのＲｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコン細胞に対するこれらの抗ウイルス活性について評価された。安定な遺伝子型１ｂレプリコン細胞の場合と同様に、遺伝子型３ａレプリコンに対するＥＣ５０値は、ＮＳ３プロテアーゼ活性を測定することによって、ハイスループットの３８４ウェルフォーマットにおいて、すべての阻害剤について首尾よく得られた。
【０１１０】
表４および図２〜３に示されたデータは、化合物Ｂが遺伝子型３ａレプリコンに対して効力のあることを示した。しかしながら、化合物Ｂは、遺伝子型１ｂレプリコンに対するその活性と比較して、２．５〜５倍の効力を喪失させた。対照的に、化合物Ａは、それぞれ遺伝子型３ａレプリコンに対する活性を＞２００００倍低下させた。さらに、化合物Ｄおよび化合物Ｅは、これらの活性を、４．４４μＭを下回るレベルに喪失させた。化合物Ｃは、遺伝子型３ａレプリコンに対する活性を、遺伝子型１ｂに対する活性よりも５８倍低下させた。
【０１１１】
これらの結果は、この新規な遺伝子型３ａレプリコンが、ＨＣＶ遺伝子型３ａに対する創薬およびリード化合物の最適化のための貴重なツールとして役立ち得ることを実証する。
表４．遺伝子型１ｂおよび３ａレプリコンに対するＨＣＶ阻害剤の抗ウイルス活性の比較
【表４】
2014522648.tif 000016
【０１１２】
ここで、本出願人は、インビトロにおいて効率的に複製する最初のＧＴ３ａレプリコンの単離を報告する。ロバストな複製は適応変異を必要とすることが実証される。適応変異を、ルシフェラーゼをコードする構築物に組み込むことによって、本出願人は、抗ウイルス化合物をプロファイルすることを可能にするＧＴ３ａレプリコン細胞クローンを生成することができた。これらのレプリコン細胞はまた、分子ウイルス学研究、およびＨＣＶ遺伝子型３の患者において明らかになりつつある耐性変異の特徴付けのための貴重なツールとして役立てるはずである。
【０１１３】
要約すると、遺伝子型３ａのＳ５２株に基づくサブゲノムレプリコンのｃＤＮＡを合成し、クローニングし、転写し、ＨＣＶ許容細胞系にエレクトロポレーションによって導入した。遺伝子型３ａレプリコンを安定に複製するクローン細胞系をＧ４１８で選択した。適応変異は、ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によって同定され、部位特異的変異誘発によって親のレプリコンへと工学的に作製した。
【０１１４】
複数の異なる許容細胞系への多数のエレクトロポレーションは、遺伝子型３レプリコンのいずれかを複製するいくつかのコロニーの同定を可能にした。これらのレプリコンクローンの増大および配列決定は、ウイルスタンパク質における適応変異を明らかにした。これまでに同定された１つの変異はＮＳ３（Ｎ６０７Ｓ）に位置した。
【０１１５】
ロバストな遺伝子型３ａレプリコン系の樹立は、創薬および医薬品開発の努力を促進するための強力なツールを提供する。他の遺伝子型に由来するものと併せたこれらの新規レプリコンの使用は、汎遺伝子型のＨＣＶレジメンの開発を支援する。
（実施例２）
遺伝子型３に関する新規ＨＣＶ阻害剤のスクリーニング
【０１１６】
実施例１は、遺伝子型１などの他の遺伝子型に対するＨＣＶ阻害剤であることが公知である作用物質が、遺伝子型３のＨＣＶの阻害におけるこれらの有効性について遺伝子型３レプリコンを用いて試験することができることを示す。また、ＨＣＶに阻害性であることが未だ知られていない作用物質が、これらの遺伝子型３レプリコンを用いて同様にスクリーニングされ得ることが意図される。
【０１１７】
候補ＨＣＶ阻害剤は、低分子薬物、抗体などのペプチドもしくはタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの核酸系であってもよい。候補ＨＣＶ阻害剤は、細胞においてレプリコンが複製し得るのに適切な温度、期間で、遺伝子型３レプリコンを含む細胞とともにインキュベートされる。レプリコンは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むことができ、このような場合において、インキュベーション期間の終了時点で、細胞は、レプリコンレベルに関するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイを用いて定量化することができる。あるいは、ＨＣＶ阻害剤の有効性は、レプリコンによってコードされるタンパク質の発現または活性によって測定することができる。このようなタンパク質の一例はＮＳ３プロテアーゼであり、タンパク質の発現または活性の検出は、当該技術分野において公知の方法、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年）を用いて行うことができる。
【０１１８】
次に、ルシフェラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼの活性レベルは、未処理またはＨＣＶを阻害する公知の活性を有する作用物質で処理することができる対照におけるレベルと比した百分率に変換される。未処理の対照と比較した場合、ＨＣＶ複製の低下またはＮＳ３活性の低下は、候補作用物質が、ＨＣＶの対応する遺伝子型を阻害することができることを示す。同様に、対照の作用物質と比較した場合、ＨＣＶ複製のより大きな低下またはＮＳ３活性のより大きな低下は、候補物が対照の作用物質よりも有効であることを示す。
（実施例３）
Ｐ８９Ｌ変異を含む遺伝子型３ａのＨＣＶサブゲノムレプリコンの生成
【０１１９】
この実施例は、インビトロにおいて効率的に複製する遺伝子型３ａレプリコンの単離を記載する。本研究は、ロバストな複製が、ＮＳ３プロテアーゼドメインにおける適応変異Ｐ８９Ｌに基づいて達成され、これは、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、およびＮＳ５Ａにおける変異によってさらに増大し得ることを実証する。この実施例では、Ｐ８９Ｌを、ルシフェラーゼをコードする構築物に組み込むことによって、安定に複製する遺伝子型３ａレプリコン細胞系が生成され、遺伝子型３レプリコンが治癒された、選択された宿主細胞と組み合わせることによって、一過性にトランスフェクトされた細胞培養物において、遺伝子型３ａのＨＣＶ  ＲＮＡの効率的な複製が樹立された。このシステムは、十分に、抗ウイルス化合物の効力プロファイリングを支持し、ＨＣＶ遺伝子型３の患者において明らかになりつつある臨床的耐性変異体を選択しおよび表現型を決定することができる。これらのレプリコンはまた、遺伝子型３のＨＣＶの分子ウイルス学研究のための貴重なシステムとして役立ち、これは、脂肪肝の高い発生率との関連性をより良く理解することを含む。
材料および方法
【０１２０】
細胞培養。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞をＲｅＢＬｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した（Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５年；７９巻：３８０〜９２頁）。５１Ｃ細胞は、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ系の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒することによって誘導され、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１０年；５４巻：３０９９〜１０６頁に記載された。１Ｃ細胞は、５１Ｃ細胞から誘導されたＧＳ−５８８５耐性の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒することによって誘導され、遺伝子型１ａレプリコン複製に対して非常に高い許容性を示した。すべての細胞系は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１単位／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充され、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（完全ＤＭＥＭ）で増殖された。レプリコン細胞系は、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む完全ＤＭＥＭにおいて選択され、維持された。
【０１２１】
治癒細胞系の生成。細胞系ＧＴ３ａ−Ｃ１、ＧＴ３ａ−Ｃ２、およびＧＴ３ａ−Ｃ３は、遺伝子型３ａのｐＧＴ３ａＳ５２ＳＧ−Ｎｅｏレプリコンを安定に複製する１Ｃクローンである。ＨＣＶ  ＲＮＡのこれらの細胞系を治癒するために、これらの細胞系をＩＦＮ（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ＮＳ５Ｂヌクレオシド阻害剤２’−ＣＭｅＡ（２μＭ）、ＮＳ５Ａ阻害剤ＢＭＳ−７９００５２（５００ｎＭ）、および非ヌクレオシドＮＳ５Ｂ阻害剤ＨＣＶ−７９６（１μＭ）の存在下で培養した。細胞は、全８継代のために、週２回、４つの薬物を含む培地で継代された。治癒細胞は、Ｇ４１８（５００ｍｇ／ｍｌ、アミノグリコシド系抗生物質であるＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）、としても公知）に対して十分に感受性であり、検出可能なＮＳ５Ａ染色を欠損し、レプリコンがないことを確認した。治癒細胞系を増殖させ、初期の継代レベルで凍結保存した。治癒細胞を３ａ−Ｃ１、３ａ−Ｃ２、および３ａ−Ｃ３と命名した。
【０１２２】
遺伝子型３ａのＨＣＶサブゲノムレプリコンをコードするプラスミドの構築。Ｓ５２感染性クローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１４２６３）に基づくサブゲノム遺伝子型３ａレプリコンをコードするプラスミド（ｐＧＴ３ａＳ５２ＮｅｏＳＧ）をＤＮＡ合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびクローニングによって調製した。合成されたレプリコンに５’から３’方向に以下の要素を組み込んだ（図４）：（１）Ｓ５２  ５’ＵＴＲ（３３９ｎｔ）、プラス  コアの最初の４８ヌクレオチド、（２）ＡｓｃＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列
【化１１】
2014522648.tif 000017
を有するリンカー、（３）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｅｏ）遺伝子、（４）ＦｓｅＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列
【化１２】
2014522648.tif 000018
を有するリンカー、（５）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、（６）ＭｌｕＩ制限部位（下線）、およびＨＣＶポリタンパク質の発現のためのＡＴＧ開始コドンを導入するヌクレオチド配列
【化１３】
2014522648.tif 000019
を有するリンカー、（７）ＮＳ５Ａ適応変異（Ｓ２２１０Ｉ；遺伝子型１におけるＳ２２０４Ｉと同等）を含むＳ５２のＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、ならびに（８）Ｓ５２の３’ＵＴＲ（２３５ｎｔ）。Ｓ５２レプリコンをコードする合成ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩ制限部位間のｐＵＣ５７に挿入した。
【０１２３】
ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）レポーター遺伝子を組み込んだサブゲノムレプリコンをコードする第二プラスミド（ｐＧＴ３ａＳ５２ＲｌｕｃＮｅｏＳＧ）を以下のように生成させた：ｐＧＴ３ａＳ５２ＮｅｏＳＧプラスミド（上記）をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ制限酵素（ｎｅｏ遺伝子を除くため）を用いて切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲル精製した。ｎｅｏ遺伝子と融合させたｈＲｌｕｃ遺伝子とｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａプラスミド（下記）由来のＥＭＣＶ領域をコードする遺伝子断片は、以下のプライマー：２ａＲｌｕｃＮｅｏＡｓｃＩＦｏｒ：
【化１４】
2014522648.tif 000020
（配列番号８、ＡｓｃＩ部位はプライマーによって導入され、下線が付される）、２ａＥＭＣＶＩＲＥＳＭｌｕＩＲｅｖ：
【化１５】
2014522648.tif 000021
（配列番号９、ＭｌｕＩ部位に下線を付す）を有するＡｃｃｕｐｒｉｍｅスーパーミックスＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅された。続いてＰＣＲ断片を、ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ベクターおよび挿入片は、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に従って、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてライゲーションされた。得られたベクターｐＧＴ３ａＳ５２ＲｌｕｃＮｅｏＳＧを配列決定し、ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏの正しい配向および配列を確認した。ｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａプラスミドは、従前に記載の通りに（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１０年；５４巻：３０９９〜１０６頁、およびＣｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１１年；５５巻：２１９７〜２０５頁）、プラスミドｐＬｕｃＮｅｏＳＧ２ａにおけるＬｕｃ−Ｎｅｏ断片をプラスミドｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）から増幅されたｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子で置き換えることによって構築された。
【０１２４】
第三のプラスミド（Ｐｉ−ＧＴ３ａＳ５２ＲｌｕｃＳＧ）は、ポリオウイルスＩＲＥＳ（ＰＩ）の下流にあるｈＲｌｕｃレポーター遺伝子を有する２シストロン性レプリコンと、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流にある遺伝子型３ａ（Ｓ５２株）ＨＣＶ非構造遺伝子（ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ）をコードし、一過性トランスフェクション研究に使用された。該プラスミドを以下のように生成させた：ｐＧＴ３ａＳ５２ＲｌｕｃＮｅｏＳＧプラスミド（上記）をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ制限酵素（Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子を除くため）を用いて切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ＰＩ、ｈＲｌｕｃ遺伝子およびＥＭＣＶ領域をコードする遺伝子断片は、以下のプライマー：３ａＰｉＲｌｕｃＡｓｃＩＦｏｒ：
【化１６】
2014522648.tif 000022
（配列番号１０、ＡｓｃＩ部位は該プライマーによって導入され、下線が付される）、１ｂＥＭＣＶＩＲＥＳＭｌｕＩＲｅｖ：
【化１７】
2014522648.tif 000023
（配列番号１１、ＭｌｕＩ部位に下線を付す）を有するＡｃｃｕｐｒｉｍｅスーパーミックスＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、遺伝子型１ｂプラスミドからＰＣＲ増幅された。続いてＰＣＲ断片をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ベクターおよび挿入片は、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてライゲーションされた。得られたベクターＰｉ−ＧＴ３ａＳ５２ＲｌｕｃＳＧを配列決定し、該遺伝子のＰＩ−ｈＲｌｕｃ領域の正しい配向および配列を確認した。
【０１２５】
変異体レプリコンの構築。適応変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＧＴ３ａＳ５２ＲｌｕｃＮｅｏＳＧまたはＰｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａＳ５２レプリコンに導入された。すべての変異をＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によるＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２６】
ＲＮＡ転写。遺伝子型３ａのサブゲノムＨＣＶレプリコンをコードするプラスミドを、ＸｂａＩを用いて線形化し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｔ７  ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、それぞれ合成し、精製された。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍの光学濃度を用いて測定され、０．８％アガロースゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確認された。
【０１２７】
ＲＮＡトランスフェクションおよび安定なレプリコン細胞系の単離。インビトロ転写されたＲＮＡの１０μｇは、従前に記載の通り（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１０年；５４巻：３０９９〜１０６頁）、エレクトロポレーションによってＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔまたは１Ｃ細胞にトランスフェクトされた。要約すると、細胞をトリプシン処理および遠心分離によって回収し、次に、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０７細胞／ｍｌの濃度でのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。レプリコンＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）キュベット（０．４ｃｍのギャップ）中の４００μｌの細胞懸濁液に添加された。細胞に２７０Ｖおよび９６０μＦでエレクトロポレーションを施し、室温にて１０分間インキュベートし、３０ｍｌの完全ＤＭＥＭに再懸濁し、次に、２つの１００ｍｍ径のディッシュに播種した。播種の４８時間後、培地は、０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。３週間後に細胞クローンを単離し、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で増殖させ、初期の継代で凍結保存した。
【０１２８】
レプリコンコロニー形成アッセイ。Ｇ４１８耐性コロニー形成の効率を測定するために、細胞に指定した量のレプリコンＲＮＡまたは抽出された細胞ＲＮＡをエレクトロポレーションによって導入し、２×１０５〜２×１０６細胞／１００ｍｍディッシュの範囲の複数の密度で播種した。播種の４８時間後、培地は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。３週間後、コロニープレートを細胞増殖のために使用し、またはＧ４１８耐性の細胞増殖巣を４％ホルムアルデヒドで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。
【０１２９】
ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出、増幅、および遺伝子型分析。ＨＣＶ  ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲ、および集団配列決定をＴＡＣＧｅｎによって行った。要約すると、製造業者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＨＣＶレプリコン細胞ＲＮＡを抽出し、精製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われ、次に、ＰＣＲ産物をＴＡＣＧｅｎによって配列決定した。
【０１３０】
間接免疫蛍光法によるＮＳ５Ａタンパク質の検出。レプリコン細胞をウェルあたり１×１０４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間のインキュベーション後、次に、細胞は、従前に記載の通り（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１１年；５５巻：２１９７〜２０５頁）、ＮＳ５Ａタンパク質について染色された。要約すると、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％ＦＢＳでブロッキングし、抗ＮＳ５Ａ抗体で染色した。染色は、マウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ａｐａｔｈ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ）の１：１０，０００希釈を用いて行われた。ＰＢＳで３回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５にコンジュゲートされた二次抗マウス抗体を用いて、抗ＮＳ５Ａ抗体で標識された細胞を検出した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核を１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて画像化した。
【０１３１】
ウェスタンブロットによるＮＳ５Ａタンパク質の検出。安定なＧＴ３ａレプリコンクローンおよびプールされた細胞系、ならびにＧＴ１ｂレプリコン細胞をペレットにし、ＳＤＳ泳動緩衝液で溶解した。次いで、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。ブロットは、一次抗ＮＳ５Ａ抗体（Ａｐａｔｈ；１：３０００希釈）および二次抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲ［Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ］からのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて染色された。また、ブロットは、泳動対照として、抗ＢｉＰの抗体（Ａｂｃａｍ、１：１０００希釈）および二次抗ウサギ抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて共染色された。染色をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＬＩ−ＣＯＲ）によって分析した。
【０１３２】
レプリコン抗ウイルスアッセイ。上記される通り、レプリコンＲＮＡを１Ｃ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。トランスフェクション後、細胞は、予め温められた１００ｍＬの培地に迅速に移され、９０μｌを２，０００細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレートに播種した。１０の異なる濃度での３倍連続薬物希釈物で細胞を処理した。細胞プレートを３７℃にて３日間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞をレプリコンレベルに対するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量化された。ルシフェラーゼレベルは、未処理の対照レベル（１００％として定義される）と比較した百分率に変換され、データは、ＸＬＦｉｔ４ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いてロジスティック用量応答式ｙ＝ａ／［１＋（ｘ／ｂ）ｃ］に適合させた。
【０１３３】
抗ウイルス化合物。ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ボセプレビル、および２−Ｃ−メチルアデノシン（２−ＣＭｅＡ）をＡｃｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）から購入した。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｗｙｅｔｈ  ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ部位ＩＶ阻害剤ＨＣＶ−７９６をＣｕｒｒａｇｈ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）によって合成した。Ｇｉｌｅａｄ化合物ＧＳ−５８８５、ＧＳ−９１９０、ＧＳ−９４５１、ＧＳ−９６６９、およびＧＳ−７９７７、ＰｆｉｚｅｒのＮＳ５Ｂ母指部位ＩＩ阻害剤フィリブビル、Ｍｅｒｃｋ  ＮＳ５Ｂ母指部位Ｉ阻害剤ＭＫ−３２８１およびプロテアーゼ阻害剤ＭＫ−５１７２、ならびにＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  ＮＳ５Ａ阻害剤（ＢＭＳ−７９００５２）をＧｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成した。
結果
【０１３４】
許容性Ｈｕｈ−７クローンにおけるサブゲノム遺伝子型３ａレプリコンの構築およびコロニー形成。サブゲノム遺伝子型３ａレプリコンは、Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年；２８５巻：１１０〜３頁によって従前に記載の通り、および遺伝子型３ａのＳ５２株のコンセンサス配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１４２６３）に基づいて構築された（図４）。Ｓ５２株は、チンパンジーにおけるそのロバストな感染に起因して選択された。複製の基底レベルを増大させるために、ＮＳ５Ａ変異Ｓ２２１０Ｉ（遺伝子型１ａにおけるＳ２２０４Ｉと同等）を組み込んだ。
【０１３５】
インビトロで転写されたレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃ、または１Ｃ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞において、各々１０μｇのＲＮＡを用いた６回のトランスフェクション試行後に、安定なレプリコンコロニーは出現しなかった（表５）。また、同様の結果は、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞に由来する遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒させることによって選択された５１Ｃ細胞で認められ、これは、これらの２つの高い遺伝子型１レプリコン許容性細胞系において、遺伝子型３ａレプリコンの非常に低いコロニー形成効率を示した。対照的に、５１Ｃ細胞に由来するＧＳ−５８８５耐性の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒させることによって選択された１Ｃ細胞において、３つの安定なコロニーが、５回のトランスフェクションから選択することができた（表５）。この結果は、遺伝子型３のＨＣＶが細胞培養において非常に低い複製効率を有するが、５１ＣおよびＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞よりも遺伝子型１ａレプリコン複製に対して高い許容性を示した１Ｃ細胞は、遺伝子型３のＨＣＶ複製により良好な支持を与え、安定なＧ４１８耐性コロニーの樹立を可能にすることを示唆する。
表５．１Ｃ細胞はＧＴ３ａレプリコン複製に対してＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞よりも許容性がある
【表５】
2014522648.tif 000024
Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃおよび１Ｃ細胞は遺伝子型３ａレプリコンＲＮＡを用いてトランスフェクトされた。生存コロニー数は、１０μｇのＲＮＡを用いてトランスフェクトされた各選択についてカウントされた。
【０１３６】
安定な遺伝子型３ａレプリコンクローンの特徴付け。選択したコロニーが複製している遺伝子型３ａレプリコンを保持することを確認するために、免疫組織化学分析およびウェスタン分析を行った。安定な遺伝子型３ａレプリコン細胞系をＳＤＳ泳動緩衝液で溶解し、ウェスタンブロットによって分析した。抗ＮＳ５Ａ抗体は、遺伝子型１ｂレプリコン細胞系よりもほんの僅かに低いレベルで、３つすべての遺伝子型３ａレプリコン細胞系においてＮＳ５Ａタンパク質を容易に検出した（図５Ａ；データは、単離され、後に分析される遺伝子型３ａの＃３クローンについて示していない）。遺伝子型１ｂと同様に、ＮＳ５Ａタンパク質のｐ５６形態だけが、これらのレプリコンクローンにおいて検出され、これは、ＮＳ５Ａタンパク質におけるＳ２２１０Ｉ（遺伝子型１のＳ２２０４Ｉと同等）変異の存在に起因しているようであった。さらに、抗ＮＳ５Ａ抗体を用いた遺伝子型３ａレプリコン細胞系の免疫組織化学的分析によって、特に核周辺領域において、ＮＳ５Ａの予期された発現パターンが確認された。対照的に、トランスフェクトされていない親の１Ｃ細胞は検出可能なＮＳ５Ａタンパク質を示さなかった（図５Ｂ）。
【０１３７】
１Ｃ細胞においてさえ、遺伝子型３ａレプリコンＲＮＡの非常に低いコロニー形成効率は、適応変異が、出現したコロニーにおいて取得された可能性があることを示唆する。遺伝子型３ａレプリコンコロニーのウイルスゲノムにおいて適応変化があるかどうかを調べるために、全細胞ＲＮＡを遺伝子型３ａレプリコンクローン＃１から抽出し、ナイーブＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞にエレクトロポレーションによって再び導入した。次に、トランスフェクトされた細胞をＧ４１８存在下で培養し、コロニー形成をモニターした。インビトロで転写された遺伝子型３ａレプリコンＲＮＡは、比較のために並行してトランスフェクトされた。表５におけるデータと一致して、１６μｇの親レプリコンＲＮＡは、Ｌｕｎｅｔ細胞に生存コロニーを生じさせなかった。対照的に、遺伝子型３の細胞系から抽出された１μｇの全細胞ＲＮＡのトランスフェクションは、そのほんの一部がＨＣＶ  ＲＮＡであったが、２００個を超えるコロニーを生じさせた（図６）。また、同様の結果が、レプリコンクローン＃２および＃３で認められた（データを示さず）。これらの結果は、選択された遺伝子型３ａレプリコンクローンが適応変異（単数または複数）を取得し、インビトロにおいて効率的に複製することができるようになることを裏付ける。
【０１３８】
遺伝子型３ａレプリコンクローンの遺伝子型分析。適応変異を同定するために、遺伝子型３ａレプリコンクローンを遺伝子型の分析に供した。全細胞ＲＮＡを抽出し、その後、ＨＣＶレプリコンＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。全ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域を包含するＰＣＲ産物は、集団配列決定によって配列決定された。各クローンにおけるアミノ酸変化を表２にまとめる。すべてのクローンは、ウイルス性ＮＳ３プロテアーゼドメイン内の残基８９位でプロリンによるロイシンのアミノ酸置換（Ｐ８９Ｌ）を有した。クローン＃３は、同様にＮＳ３プロテアーゼドメインに位置する追加の変異Ｑ４１Ｒを有した。いくつかの個々のクローンまたはプールはまた、図６に示された全細胞ＲＮＡの再トランスフェクション研究から選択され、遺伝子型の変化について分析された。いくつかの変異は個々のクローンにおいて同定され、ウイルス性ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、またはＮＳ５Ａタンパク質全体に分布したが、これらはすべて、Ｐ８９Ｌと一緒に出現した（表７）。これらの結果は、Ｐ８９Ｌが、細胞培養におけるＨＣＶ遺伝子型３のＲＮＡ複製に対する一次適応変異として機能することを示す。
表６．ＧＴ３ａレプリコン細胞系において同定された変異
【表６】
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表７．遺伝子型３ａ−ｎｅｏレプリコン細胞系において同定された変異
【表７】
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【０１３９】
ルシフェラーゼをコードする遺伝子型３ａレプリコンを安定に複製する細胞系の生成。出現する変異がレプリコン複製を増大させるかどうかを調べるために、ＮＳ３における変異Ｐ８９Ｌを親の遺伝子型３ａレプリコン配列に導入した（図４）。細胞培養における複製の測定を促進させるために、親の遺伝子型３ａレプリコン構築物（図４Ａ）におけるＮｅｏ遺伝子が、図４Ｂに示されるウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）−ｎｅｏ融合レポーターで置き換えられた。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔまたは１Ｃ細胞は、ＮＳ３における適応変異Ｐ８９ＬをコードするＲｌｕｃ−ｎｅｏレプリコンＲＮＡでトランスフェクトされ、Ｇ４１８存在下で培養された。並行して、親の遺伝子型３ａ  ｎｅｏおよびＲｌｕｃ−ｎｅｏ構築物もまたトランスフェクトし、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔまたは１Ｃ細胞において選択した。表１の結果と一致して、Ｎｅｏレプリコンは、１Ｃ細胞における１回の選択あたり平均１個のコロニーを生じさせ、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞においてはコロニーが生じなかった（図７）。興味深いことに、適応変異を含まないＲｌｕｃ−ｎｅｏレプリコンは、いずれの細胞系においてもＧ４１８選択後にいずれのコロニーも生じさせなかったが、これは、おそらく、レプリコンに大きなルシフェラーゼ配列を挿入したためであった。対照的に、変異Ｐ８９Ｌの導入は、遺伝子型３ａのＲｌｕｃ−ｎｅｏコロニー形成効率を劇的に増大させ、それぞれＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔおよび１Ｃ細胞における１回の選択あたり平均３０または５０個のコロニーをもたらした（図７）。これらのデータは、変異Ｐ８９Ｌが遺伝子型３ａ適応変異であることを裏付ける。
【０１４０】
これらの安定に複製するレプリコンクローンをさらに特徴付けるために、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔおよび１Ｃ細胞からの１２個の個々のＲｌｕｃ−ｎｅｏレプリコンコロニーおよびコロニープールを単離し、増殖させた。ルシフェラーゼ活性を用いて、これらの安定な遺伝子型３ａのＲｌｕｃレプリコン細胞系における複製レベルを評価した。図８に示すように、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔまたは１Ｃ細胞のいずれかからのプールされた細胞系および本質的にすべての単離されたクローンは、非常に適応された遺伝子型１ａまたは１ｂレプリコンと比較して、同等であるまたは僅かに小さい（＜５倍）のルシフェラーゼ活性を示し、これは、細胞培養における遺伝子型ＨＣＶ３ａの効率的な複製を示唆した。レプリコンクローンの間のＨＣＶ  ＲＮＡ複製の高い効率と僅かな変化をＮＳ５Ａタンパク質発現の免疫組織化学的分析によってさらに確認した（データを示さず）。遺伝子型分析は、すべてのプールおよびクローン細胞においてＰ８９Ｌの存在を裏付けた。ウイルス性ＮＳ３タンパク質におけるＡ１６６ＫまたはＫ５８３Ｅなど追加の変異を同定したが、複製に必要ではなく、単離されたクローンの半分において生じただけであった（表８）。まとめると、これらのデータは、ＮＳ３プロテアーゼドメインにおけるＰ８９Ｌ置換が遺伝子型３ａのＨＣＶ複製を有意に刺激し、安定に複製するルシフェラーゼをコードする遺伝子型３ａレプリコンを樹立することができたことを実証する。
表８．ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌ−Ｒｌｕｃ−ｎｅｏレプリコン細胞系において同定された変異
【表８】
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【０１４１】
一過性トランスフェクションで複製するルシフェラーゼをコードする遺伝子型３ａレプリコンの生成。抗ウイルス活性アッセイおよび臨床的耐性研究における遺伝子型３ａレプリコンの複製効率および動態の測定を促進させるために、親のＧＴ３ａ−Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコン構築物（図４Ｂ）中のＲｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子は、ポリオウイルスＩＲＥＳの下流にあるＲｌｕｃレポーター遺伝子をコードする２シストロン性レプリコン（図４Ｃ）で置換された。１Ｃ細胞にＧＴ３ａ−Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏ−Ｐ８９ＬおよびＰｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌをトランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション後の４時間、および７日間毎日測定された。図９に示すように、Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌレプリコンのルシフェラーゼ活性は、バックグラウンドを僅かに上回るレベル（約１００相対発光単位（ＲＬＵ））まで連続して低下し、これは、該レプリコンが一過性アッセイにおいて効率的に複製しなかったことを示唆し、大きなサイズのＲｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子の挿入に起因している可能性があった。Ｐｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌは、意味のある高レベルの複製を付与した。挿入されたＲＮＡの分解に起因したトランスフェクション後の最初の２日間にわたるルシフェラーゼ活性における一次傾斜後、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製は、Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌで達成されたレベルよりも二桁高いレベルに達した。これらの結果は、Ｐｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌレプリコンが、遺伝子型３ａレプリコンの複製効率および動態を測定するための有用なツールであることを示す。
【０１４２】
一過性トランスフェクションツールを用いて、本発明者らは、ウイルス性ＮＳ５Ａタンパク質における変異Ｓ２２１０Ｉ（遺伝子型１におけるＳ２２０４Ｉと同等）が、Ｐ８９Ｌと組み合わさって遺伝子型３ａのＲＮＡ複製に必要であるかどうかを決定した。Ｐｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌレプリコンにおける変異Ｓ２２１０Ｉは、イソロイシンをセリンで置換することによって復帰し、得られたレプリコン構築物を１Ｃ細胞にトランスフェクトした。Ｓ２２１０Ｉがない場合では、レプリコンウイルスＲＮＡレベルは増大せず、該レプリコンは、トランスフェクション後の７日間、複製しなかった（図９）。この結果は、ＮＳ５Ａの変異Ｓ２２１０Ｉが、効率的な遺伝子型３ａレプリコン複製を支持するために、適応変異Ｐ８９Ｌに必要とされることを示す。
【０１４３】
遺伝子型３ａのＨＣＶ  ＲＮＡ複製を改善するための高度に許容性の細胞系の樹立。Ｐｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌの複製は一過性トランスフェクションアッセイにおいて容易に測定することができるが、創薬および開発研究のために使用されるハイスループットアッセイについては十分にロバストなものではない。２つのアプローチが、複製効率をさらに改善するために取られた。第一のアプローチは、遺伝子型３のＲＮＡ複製を支持するためにより許容性のある細胞系を樹立することであった。本発明者らは、親の遺伝子型３ａ  ｎｅｏレプリコンを用いて選択された３つの安定なクローンを治癒させ（表５）、これらのクローン細胞が、低頻度の選択のために遺伝子型３ａ複製に固有であり得ると推測した。３つのレプリコン細胞系（表６）は、ＩＦＮおよび３つの直接的抗ウイルス剤の高用量のカクテルを用いて４週間治癒された。得られた治癒された細胞系は、３ａ−Ｃ１、３ａ−Ｃ２および３ａ−Ｃ３と命名され、検出可能なＨＣＶ複製を欠いた。遺伝子型３ａ複製を支持する治癒された細胞系の能力を評価するために、これらをＰｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌレプリコンでトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を４日間毎日測定した。重要なことには、３ａ−Ｃ１ではなく、２つの治癒したレプリコンクローンの３ａ−Ｃ２および３ａ−Ｃ３は、１Ｃ細胞よりも、遺伝子型３ａ複製に対して約１０倍高い許容性を示した（図１０Ａ）。治癒された細胞系がまた他のＨＣＶ遺伝子型複製に対してより高い許容性を示すかどうかを決定するために、遺伝子型１ａおよび１ｂレプリコンを１Ｃおよび３ａ−Ｃ３細胞系にトランスフェクトした。興味深いことに、１Ｃ細胞と治癒細胞系の間に遺伝子型１ａおよび１ｂレプリコン複製の顕著な差はなかった（図１０Ｂ）。したがって、これらの結果は、特に遺伝子型３のＨＣＶに対して有意により高い複製を支持し得た、３ａ−Ｃ３細胞のような細胞系が首尾よく樹立されたことを示した。
【０１４４】
遺伝子型３ａのＨＣＶ  ＲＮＡ複製を改善するための二次適応変異の特徴付け。第二のアプローチは、遺伝子型３のＨＣＶ複製をさらに増強させる、二次適応変異を同定することであった。いくつかの追加の変異がＰ８９Ｌと一緒に同定された（表７および８に概要される）。これらの変異がＰ８９Ｌ依存性のＨＣＶ  ＲＮＡ複製をさらに増大させ得るかどうかを決定するために、これらの安定なクローンにおいて少なくとも２回出現した６つの個々の変異を選択し、部位特異的変異誘発によってＰｉ−Ｒｌｕｃ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌに導入した（表９）。２つの変異であるＱ４１ＲおよびＡ１６６ＴはＮＳ３プロテアーゼドメインに位置し、３つの変異はＮＳ３ヘリカーゼドメインのＡ３７９Ｔ、Ｓ５３４ＧおよびＫ５８３Ｅに位置し、Ｓ１ＣはＮＳ４Ａタンパク質に位置した。追加の変異のすべては、Ｐ８９Ｌ単独と比較して、遺伝子型３ａのＨＣＶ  ＲＮＡ複製をさらに増強した（図１１Ａ）。例えば、Ｐ８９Ｌ／Ａ１６６Ｔの二重変異レプリコンは、Ｐ８９Ｌの単一変異レプリコンよりも１９倍高いピーク複製レベルを達成した。さらに、Ｐ８９Ｌ／Ａ１６６ＴまたはＰ８９Ｌ／Ｋ５８３Ｅの二重変異レプリコンを遺伝子型３ａの許容性３ａ−Ｃ３細胞にトランスフェクトしたとき、レプリコン複製効率は、高度に適応した遺伝子型１ａまたは１ｂレプリコンに匹敵する約５倍のレベルまでさらに刺激された（図１１Ｂ）。まとめると、選択された宿主細胞（例えば、３ａ−Ｃ３細胞）と二次適応変異（例えば、ＮＳ３におけるＡ１６６Ｔ）の組合せは、遺伝子型１についてのそれと匹敵する細胞培養における遺伝子型３のＨＣＶ複製を支持するための効率的なシステムを樹立した。
表９．Ｒｌｕｃ−ネオ−ＧＴ３ａ−Ｐ８９Ｌレプリコン細胞系において分析された変異
【表９】
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【０１４５】
遺伝子型３ａに対するＨＣＶ阻害剤の抗ウイルス活性の評価。遺伝子型３ａに対する抗ウイルス活性を調べるために、５つの異なるクラスのＨＣＶ阻害剤が、遺伝子型３ａのＰｉ−Ｒｌｕｃレプリコン：ＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ活性部位、ＮＳ５Ｂ非活性部位、および宿主因子阻害剤の一過性アッセイにおいて試験された。標準的な遺伝子型１ｂのＰｉ−Ｒｌｕｃレプリコンを並行して試験した。一過性レプリコン複製アッセイは、化合物の抗ウイルス活性における宿主細胞差の潜在的な影響を最小限にするために、１Ｃ細胞において行われた。遺伝子型１ｂと遺伝子型３ａレプリコンの両方に対するＥＣ５０値は、Ｒｌｕｃ活性を測定するハイスループットの３８４ウェルアッセイを用いて、すべての阻害剤について首尾よく生じさせた（表１０）。
表１０．遺伝子型１ｂおよび３ａレプリコンに対するＨＣＶ阻害剤の抗ウイルス活性
【表１０】
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第一列に列挙された５つの異なるクラスのＨＣＶ阻害剤は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することによって、一過性トランスフェクションのハイスループットの３８４ウェルフォーマットにおいて、ＧＴ１ｂとＧＴ３ａのＰｉ−Ｒｌｕｃレプリコンに対するこれらの抗ウイルス活性について評価された。表に示されるデータは、少なくとも２つの独立した実験の平均値を表す。
【０１４６】
宿主因子を標的とする阻害剤（ＣｓＡおよびＳＣＹ−６３５）は、遺伝子型１ｂと３ａレプリコンの両方に対して同等の効力を有した。ＮＳ５Ｂ活性部位を標的とする阻害剤（２−ＣＭｅＡまたはＧＳ−７９７７）は、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型３ａに対して３〜６倍高い活性であった。ＮＳ５Ｂポリメラーゼの非活性部位を標的にする抗ウイルス剤であるＮＳ５Ｂ母指部位Ｉ阻害剤ＭＫ−３２８１および手のひら部位ＩＩ  ＮＳ５Ｂ阻害剤ＨＣＶ−７９６は、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型３ａに対してそれぞれ約２倍および７倍高い活性であった。対照的に、ＮＳ５Ｂ母指部位ＩＩ阻害剤フィリブビルとＧＳ−９６６９、および手のひら部位１／２阻害剤ＧＳ−９１９０は、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型３ａに対してそれぞれ約１７倍、６０倍および１７倍低い活性であった。ＮＳ５Ａ阻害剤ＢＭＳ−７９００５２は遺伝子型３ａに対して１１倍低い活性であったが、これはなおも遺伝子型３ａに対して非常に強力であり、ＥＣ５０値は０．３１〜０．４５ｎＭであった。別のＮＳ５Ａ阻害剤ＧＳ−５８８５（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）は、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型３ａに対して約１０，０００倍低い活性であった（遺伝子型３ａに対するＥＣ５０値：４０〜９２ｎＭ）。ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤ボセプレビルとテラプレビルは、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型３ａに対して僅かに低い効力（１．５〜３．３倍）であった。しかしながら、プロテアーゼ阻害剤ＢＩＬＮ−２０６１、ＧＳ−９４５１、およびＭＫ−５１２７は、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型３ａに対して２８〜４７８倍低い効力であった。全体として、これらの結果は、遺伝子型３ａのレプリコン系の一過性トランスフェクションがロバストであり、創薬、リード化合物の最適化、および臨床ウイルス学への応用のための価値あるツールとして役立ち得ることを実証する。
【０１４７】
当業者には、本明細書では明確に記載されていないまたは示されていないが、本開示の原理を具現化し本開示の趣旨および範囲内に包含されている種々の構成を案出し得ることが理解される。さらに、本明細書で挙げたすべての条件付き用語は、基本的には、読者が、本開示の原理および当該技術を促進させようとする本発明者が寄与する概念を理解する助けとなるようにするものであり、そうした具体的に挙げられた条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本開示の原理、態様および実施形態に言及する本明細書のすべての記述は、その構造的均等物と機能的均等物の両方を包含するものとする。さらに、そうした均等物は現時点で公知の均等物と将来開発される均等物、すなわち構造に関係なく、同じ機能を遂行する開発された任意の要素の両方を包含するものとする。したがって、本開示の範囲は、本明細書で示し記載した例示としての実施形態に限定されるものではない。むしろ、本開示の範囲および趣旨は添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2014522648.tif 000031
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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