(57)【要約】    本明細書中において開示されるのは、基質（例えば、ポリマー基質）上において播種および培養された幹細胞（例えば、幹細胞由来網膜色素上皮細胞）の低温保存のための方法および組成物である。このような低温保存された幹細胞は、細胞療法（例えば、眼の損傷または疾患の治療）において有用である。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質上で幹細胞を低温保存する方法であって、
冷却速度約１０℃／１０秒〜約１０℃／１２０秒である温度低下フェーズに、幹細胞が播種された基質を曝す工程であって、 
前記基質がパリレンを含み、 
前記基質が前記播種幹細胞の生存能力を向上させる１つ以上の特性を有する工程と、
前記細胞播種基質を、第１の期間、約０℃〜約−１００℃の温度に移す工程と、
前記幹細胞を、保存温度で、第２の期間維持することにより、低温保存幹細胞を得る工程とを有することを特徴とする方法。 
【請求項２】
前記基質を前記温度低下フェーズに曝すことで、前記幹細胞播種基質の温度を約０℃にする、請求項１に記載の方法。
前記第１の期間は、約６〜４８時間である、請求項１に記載の方法。  
【請求項３】
前記第１の期間は、約２４時間である、請求項３に記載の方法。  
【請求項４】
前記第２の期間は、約６時間よりも長い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の期間は、約72時間よりも長い、請求項5に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の期間は、約４８時間〜約１週間である、請求項５に記載の方法。 
【請求項７】
前記基質は、前記基質への前記幹細胞の付着力を向上させるコーティングをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コーティングは、マトリゲル、ビトロネクチンおよびレトロネクチンのうちの１つ以上を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
前記コーティングは、低温保存時、低温保存後またはこれら両方の場合において、前記幹細胞の生存能力を向上させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質の特性は、前記基質の熱膨張係数、基質弾性パラメータまたは基質厚さのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記特性は、基質厚さを含み、前記厚さは、栄養素が基質を通過できるように選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記厚さは、前記播種細胞への悪影響が低減するような前記基質の熱膨張係数が得られるように、選択される、請求項１２に記載の方法。  
【請求項１３】
前記播種幹細胞は、ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞を含む、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記播種幹細胞は、完全に分化したｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞の単分子層を含む、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記播種幹細胞は、胚性幹細胞を含む、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記播種幹細胞は、成体幹細胞を含む、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記播種幹細胞は、人工多能性幹細胞を含む、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記パリレン基質は、非多孔性でありかつ浸透性である、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記基質上で前記低温保存された幹細胞を、温度上昇加熱速度を用いて、前記細胞播種基質を目標温度まで加熱して、前記基質上に播種された解凍幹細胞を得る工程を具備する方法によって解凍する工程をさらに含み、
【請求項２０】
前記解凍幹細胞は、解凍後において生存能力および／または機能性を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記解凍幹細胞は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびＦＧＦ補助剤のうちの１つ以上を含む培地中において培養される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記解凍幹細胞は、患者の眼への直接移植に適している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
幹細胞を低温保存する方法であって、
所定の低下冷却速度の温度低下フェーズを用いて、パリレン基質上に播種された幹細胞を冷却する工程と、 
前記播種幹細胞を中間保存温度へ移す工程と、
前記幹細胞を、長期保存温度範囲内において、所定の期間維持することにより、低温保存幹細胞を得る工程とを有し、前記播種幹細胞は、生存能力を実質的に維持することを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記所定の低下冷却速度は、約２０℃／分を超えない冷却速度を含む、請求項２３に記載の方法。  
【請求項２５】
前記所定の低下冷却速度は、約７℃／分〜約１７℃／分の範囲の冷却速度を含む、請求項２３に記載の方法。 
【請求項２６】
前記所定の低下冷却速度は、約１０℃／１０秒〜約１０℃／２００秒の範囲の冷却速度を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
幹細胞を低温保存する方法であって、
急速冷凍温度低下フェーズを用いて、幹細胞播種基質を凍結させる工程で、前記基質がポリマーを含む工程と、
前記播種幹細胞を保存温度へ移すことにより、低温保存幹細胞を得る工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記ポリマーは、生物分解性ポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。  
【請求項２９】
前記ポリマーは、非生物分解性ポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。 
【請求項３０】
細胞を低温保存する方法であって、
基質上に播種された細胞を低温環境に曝す工程であって、 
前記低温環境が前記細胞および前記基質を凍結させるのに充分であり、 
前記基質が非多孔性かつ浸透性である工程と、
前記低温環境に曝した後、前記細胞播種基質を約０℃〜約−１００℃の温度へ移す工程とを有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国仮出願シリアル番号第６１／４８１，０１５号（出願日：２０１１年４月２９日）の利益を主張する。同文献の内容全体が参照によって、本明細書に明確に組み込まれる。 
【技術分野】
【０００２】
本出願は、主に、基質上に成長した幹細胞の低温保存のための方法および組成物に関する。詳細には、ポリマー基質上に成長した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の低温保存のための方法および組成物に関する。 
【背景技術】
【０００３】
細胞の損失または損傷を招くヒト疾患の範囲は、極めて広範囲にわたり、例を非限定的に挙げると、眼疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、癌および心臓血管疾患がある。細胞療法においては、罹患組織または損傷組織の治療において細胞が用いられ、症例によっては幹細胞が用いられる。多くの疾患の治療に応える最先端技術（特に、従来の薬理学的治療に反応しない症例に影響を与えるもの）が急速に普及してきている。  
【０００４】
実際には、細胞療法の適用候補となる多くの疾患は、致命的なものではなく、通常の生理機能の損失を伴う。例えば、眼疾患の場合、多様な眼組織の機能変性に起因して視力に影響が発生することが多く、その結果、多数の症例の生活の質に影響が出る。  
【０００５】
哺乳類の目は、特殊な感覚器官であり、前方光学系（角膜およびレンズ）によって集束された入射光子を神経化学的な信号に変換することができる。このような光シグナル伝達プロセスにより、活動電位を視神経を介して高次の皮質中枢へ送ることにより、視覚が可能になる。眼の網膜には、多様なレベルの光を感知する光受容体と、光受容体からの信号を網膜ガングリオン細胞へリレーする介在ニューロンとが含まれる。これらの光受容体は、（身体ではなく）眼において最も代謝的に高活性の細胞であり、代謝的かつ機能的に網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）によって支援される。これらのＲＰＥ細胞は、眼の単分子層中に存在し、視力にとって極めて重要である。  
【０００６】
多数の病状に起因して、症例の視覚映像を把握する能力が低下するかまたは全く失われる場合がある（例えば、眼の外傷、感染、変性、血管異常および炎症性疾患）。網膜の中央部は、黄斑として知られており、中心視、微細な視覚化および色の区別の責任を担う。黄斑の機能は、病状の中でも、加齢黄斑変性症（湿潤または乾燥）、糖尿病性黄斑浮腫、特発性脈絡膜血管新生、高度近視黄斑変性症、または進行した網膜色素変性症に起因して悪影響を受け得る。  
【０００７】
加齢黄斑変性症が発生すると、網膜損傷に起因して、視野中心（黄斑）における視力が失われる原因となることが多い。黄斑変性症は、高齢者（＞５０歳）の視力障害の主な原因となっている。黄斑変性症の発生形態としては、「湿潤」形態および「乾燥」形態がある。乾燥形態においては、細胞残屑（ドルーゼン）が網膜と脈絡膜との間に蓄積して網膜を押圧し、場合によっては、網膜剥離および視力損失に繋がり得る。より深刻な湿潤形態の場合、脈絡膜からの新生血管が黄斑の後側の空間に浸潤する結果、光受容体およびその支持細胞が死滅する。眼において機能細胞が損失すると、新生血管が脆弱になり、血液および間質液の漏洩が頻繁に発生し、その結果、黄斑へさらなる損傷が発生し得る。  
【０００８】
特定の細胞または組織に対する損傷の原因となる疾患は、細胞療法の対象として明確な候補ではあるものの、当該分野において、細胞療法の優れた手法が未だ必要とされている。この細胞療法の手法は、細胞療法の有効性を向上させる方法、基質および器具を含み、また、このような治療において用いられる機能細胞および生存細胞の長期保存を可能にする方法および組成物を含む。 
【発明の概要】
【０００９】
細胞療法において用いられる細胞含有組成物の向上した長期保存の必要性に対処するため、いくつかの実施形態において、基質上の幹細胞を低温保存する方法が提供される。この方法は、所望の温度低下速度での温度低下フェーズに、幹細胞が播種された基質を曝す工程と、細胞播種基質を第１の期間、所望の中間温度範囲へ移す工程と、幹細胞を第２の期間、所望の保存温度範囲において維持することにより、長期保存および細胞治療における将来の使用に適する低温保存された幹細胞を基質上に得る工程とを含む。  
【００１０】
いくつかの実施形態において、温度低下フェーズ速度は、約１０℃／１０秒〜約１０℃／１２０秒の温度低下である。他の実施形態において、低温保存すべき細胞型、基質材料、基質寸法および細胞の耐久性（例えば、温度変化の速度に対する感度）の少なくとも一部に基づいて、より高い速度またはより低い速度を用いてもよい。いくつかの実施形態において、所望の中間温度範囲は、約０℃〜約−１００℃（例えば、約０℃〜約−１０℃、約−１０℃〜約−２０℃、約−２０℃〜約−３０℃、約−３０℃〜約−４０℃、約−４０℃〜約−５０℃、約−５０℃〜約−６０℃、約−６０℃〜約−７０℃、約−７０℃〜約−８０℃、約−８０℃〜約−９０℃、約−９０℃〜約−１００℃、およびこれらの重複範囲）である。いくつかの実施形態において、幹細胞播種基質が約０℃の温度に到達するように、温度低下フェーズを調節する。この調節も、細胞型、基質、および各温度変化の速度に対する感度の少なくとも一部に基づいて行われる。いくつかの実施形態において、温度低下プロファイルを個別調整することにより、基質および細胞間の応答の類似性を最大化させる。例えば、いくつかの実施形態において、温度低下プロファイルを比較的穏やか（例えば、経時的により低い低下速度）にすることにより、温度変化に対してより感度が高い細胞または基質材料を提供する。このような実施形態において、穏やかな低下プロファイルにより、細胞／基質が温度の継続的低下に「順応」することが可能になり、その結果、いくつかの実施形態において長期保存性が向上し、解凍後の生存能力および／または機能が増大する。
【００１１】
中間温度における保存期間は、短期間（例えば、数分間〜数時間）からより長期間（例えば、数日間〜数週間）とすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、第１の期間は、約６〜４８時間（例えば、約２４時間）である。   
【００１２】
いくつかの実施形態において、保存温度は、中間温度以下である。いくつかの実施形態において、保存温度範囲は、約−５０℃〜約−６０℃、約−６０℃〜約−７０℃、約−７０℃〜約−８０℃、約−８０℃〜約−９０℃、約−９０℃〜約−１００℃、およびこれらの重複範囲である。いくつかの実施形態において、低温保存細胞の保存（例えば、維持）のために、より低温が用いられる。いくつかの実施形態において、細胞保存のために、液体窒素（または他の類似の冷却液）が用いられる。いくつかの実施形態において、第２の期間（例えば、保存期間）は、約６時間よりも長い。いくつかの実施形態において、第２の期間は、約７２時間よりも長い。いくつかの実施形態において、第２の期間は、約４８時間〜約１週間である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、基質は、パリレンを含む。いくつかの実施形態において、基質は、パリレンを他の材料と共に含む。他の材料は、生物分解性または非生物分解性である。いくつかの実施形態において、播種幹細胞の生存能力を向上させる１つ以上の特性を基質が有するように、基質を処理する。例えば、いくつかの実施形態において、基質は、基質への幹細胞の付着力を向上させるためのコーティングをさらに含む。いくつかの実施形態において、コーティングは、マトリゲル、ビトロネクチンおよびレトロネクチンのうちの１つ以上を含む。他の実施形態において、他のコーティングまたは表面改質を用いて、基質への細胞の優れた付着力を達成および／または低温保存プロセス時および低温保存プロセス後における細胞の耐久性および／または生存能力を向上させる。例えば、いくつかの実施形態において、コーティングは、低温保存時、低温保存後またはこれら両方における幹細胞の生存能力を向上させる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、基質の特性は、基質の熱膨張係数、基質弾性パラメータまたは基質厚さのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、基質は、パリレンを含み、非多孔性かつ浸透性であり、その特性は、基質厚さを含み、その厚さは、栄養素が基質を通過することができるように選択される。よって、解凍後に標的部位に移植した際に、基質を介して、細胞へ栄養素が適切に通過することおよび／または基質から遠ざかる方向へ細胞老廃物が適切に通過することが可能になる。いくつかの実施形態において、播種細胞への悪影響が低下するような基質の熱膨張係数が得られるように、厚さが選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、播種幹細胞は、ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞を含む。いくつかのこのような実施形態において、播種幹細胞は、完全に分化したｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞の単分子層を含む。いくつかの実施形態において、播種幹細胞は、胚性幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、播種幹細胞は、成体幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、播種幹細胞は、人工多能性幹細胞を含む。さらなる実施形態において、非幹細胞が任意選択的に用いられ得る。  
【００１６】
いくつかの実施形態において、幹細胞を低温保存する工程に加えて、本明細書中に開示される方法は、温度上昇速度を用いて細胞播種基質を目標温度まで加熱して、基質上に播種された解凍幹細胞を得る工程を具備する方法により、基質上で低温保存された幹細胞を解凍する工程をさらに含む。なお、解凍幹細胞は、解凍後も生存能力および／または機能性を保持する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、解凍幹細胞は、成長補助剤を含む培地中において培養される。いくつかの実施形態において、成長補助剤は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびＦＧＦ補助剤のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、成長補助剤は用いられない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、解凍幹細胞は、（例えば、その後の培養を必要とせず）患者の眼に直接移植するのに適している。
【００１９】
いくつかの実施形態において、幹細胞を低温保存する方法が提供される。この方法は、所定の低下冷却速度の温度低下フェーズを用いて、パリレン基質上に播種された幹細胞を冷却する工程と、播種幹細胞を中間保存温度へ移し、幹細胞を所定の期間、長期保存温度範囲内に維持することにより、低温保存幹細胞を得る工程とを含む。なお、播種幹細胞は、解凍後も生存能力を維持する。  
【００２０】
いくつかの実施形態において、所定の低下冷却速度は、約２０℃／分を超えない温度低下率を含む。いくつかの実施形態において、所定の低下冷却速度は、約７℃／分〜約１７℃／分の範囲の温度低下速度を含む。いくつかの実施形態において、所定の低下冷却速度は、約１０℃／１０秒〜約１０℃／２００秒の範囲内の温度低下速度を含む。
【００２１】
さらに、幹細胞を低温保存する他の方法が提供される。この方法は、急速冷凍温度低下フェーズを用いて、幹細胞播種基質を凍結する工程であって、基質がポリマーを含む工程と、播種幹細胞を保存温度へ移すことにより、低温保存幹細胞を得る工程とを含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは、生物分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは、非生物分解性ポリマーを含む。 
【００２２】
いくつかの実施形態において、細胞を低温保存する方法が提供される。この方法は、基質上に播種された細胞を低温環境に曝す工程であって、低温環境が細胞および基質を凍結させるのに充分であり、基質が非多孔性でありかつ浸透性である工程と、低温環境に曝した後に、細胞播種基質を約０℃〜約−１００℃の温度へ移すことで、低温保存細胞を得る工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】凍結解凍サイクル後にパリレン基質上に成長したｈＥＳＣ−ＲＰＥを示す。
【００２４】
【図２】ｈＥＳＣ−ＲＰＥが播種された低温保存パリレン基質の移植１週間後のラットの眼の組織構造を示す。これらの細胞は、形成されたＲＰＥの分極単分子層によって示されるように、生存しておりかつ機能している。
【００２５】
【図３Ａ−３Ｆ】細胞解凍後の細胞の生存能力を示す。図３Ａは、予め低温保存された細胞播種基質の解凍１日後を示す。図３Bは、予め低温保存された細胞播種基質の解凍１日後を示す。図３Ｃ〜図３Ｆは、解凍１日後の基質の４つの代表的な領域についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞の生存能力分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
細胞療法とは、疾患治療のために、組織中に新規細胞を導入することであり、罹患組織を健全な組織で修復または置換することが可能な方法を意味する。細胞（例えば、幹細胞）を標的組織へ導入するための多くのアプローチがあるものの、低い保持率や、移植された細胞の低い長期維持を生じることが多い。その原因として、多様な要因（例えば、（標的組織からの）細胞流出および／または導入培地（または標的組織）中での低い細胞生存率）がある。しかし、いくつかの疾患の場合、導入細胞自体の完全な生着は不要であり、むしろ成長因子、化学信号または導入細胞との他の相互作用が必要となる。このような疾患の治療は、細胞を標的組織へ導入することにより、達成される。いくつかの治療において、導入細胞は、先ず生体適合性基質上に成長させた後、生体適合性基質ごと導入される。本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態は、このような細胞播種移植片の低温保存に関連し、これにより、長期保存が可能になり、将来における有効な細胞療法において利用可能となる。有利なことに、開示の方法によれば、「市販の」治療薬の調製が可能になり、外科医は、細胞が播種され、低温保存された複数の基質から、患者の標的組織への移植に最適な基質を決定することができる。その結果、疾病の発見（あるいは症状または損傷の発現）から始まる長期の中間段階の必要性が無くなる。このような中間段階が、他の細胞治療アプローチでは、治療効果を得るための充分な量の細胞を成長させるために必要となる。
【００２７】
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態により、基質上に播種された細胞の長期保存のための低温保存と、大規模生産におけるスケールアップとが可能になる。基質播種細胞を個々に調製する場合と対照的に、基質播種細胞の大規模生産により、品質制御および簡便な利用が促進される。
【００２８】
胚性および人工多能性幹細胞は、細胞置換療法のための分化細胞の無限の供給源となり得る。幹細胞由来網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）は、萎縮性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の後期の細胞療法のための治療用細胞の１つの供給源である。ＲＰＥ細胞は、分化した分極単分子層として機能する。幹細胞由来の分化および分極ＲＰＥ単分子層の低温保存を成功させた場合、臨床製品の均一性、製品収量の最大化、臨床製品ロット内における品質制御の保証、および遠隔地の臨床現場への類似の最終製品の分配において利益がある。臨床医薬品製造品質管理基準（ｃＧＭＰ）およびヒト細胞・組織医薬品製造品質管理基準（ＧＴＰ）に従ってスケールアップを行うためには、製造業者が実行可能なロット試験および最終出荷試験を行うことが必要になる。凍結および解凍の低温プロセスは、成人の臍帯血、および多能性胚由来幹細胞株および非分極胚性幹細胞由来ＲＰＥ（ｈＥＳＣ−ＲＰＥ）のために現在用いられているが、出願人は、（本明細書中に開示されるような）生体適合性基質上に播種された分極ｈＥＳＣ−ＲＰＥ由来単分子層を成功裏に保存するための方法を現在まで認識していなかった。本明細書中に開示される方法が無い場合において解消できていなかった主な障壁としては、生存率および収率の低下と、細胞の分極単分子層の導入に必要なポリマー基質への誘導ＲＰＥの付着力の欠如とがある。よって、本発明のいくつかの実施形態は、機能、生存能力および制御が試験された細胞を基質上に成長させ、保存し（かつ後の移植に利用可能とする）ために、長期間感じられてきた必要性を解消する。
基質
【００２９】
いくつかの実施形態において、移植可能基質上における細胞の低温保存により、細胞療法のいくつかの局面が向上する。本明細書中で用いられる「基質」という用語は、通常の意味を与え、「移植片」および／または「デバイス」という用語と相互交換可能に用いられる。しかし、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態において、移植そのものが不要である場合（例えば、「標的組織表面へ当てるパッチ」として機能するもの）もあることが理解される。
【００３０】
多様な異なる種類の基質を多様な疾患の治療において用いることが可能であり、本明細書中に開示される低温保存方法において利用可能である。例えば、いくつかの実施形態において、基質は、三次元であってもよいし、平坦であってもよいし、実質的に平面であってもよいし、または他の適切な寸法、形状、サイズまたは特性を持っていてもよい。本明細書中で用いられる「三次元」および「３Ｄ」という用語は、通常の意味を与え、ケージに類似するデバイス（例えば、１つ以上の内部ルーメンまたは空洞を含むもの）を含む。本明細書中に開示される基質の設計は、このように変動するため、以下の開示は、他に明記無き限り、このような多様な基質へ適用可能なものとして理解されるべきである。さらに、本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態は柔軟であるため、寸法、形状、数（例えば、単一または複数の接続された基質あるいは複数の分離された基質）は、これらの方法の適用可能性を制限しない。例えば、本明細書中に開示される方法によれば、微視的な組織領域の治療のための幹細胞が播種された基質（例えば、例えば寸法が約１〜約１５ｍｍであり厚さが約１〜約１５ｍｍである黄斑変性症治療のための基質）の場合と同様に容易に、大きな組織領域の治療のための幹細胞が播種された基質（例えば、整骨グラフト）を低温保存することができる。いくつかの実施形態において、基質の特定の特性（例えば、孔径および密度（ただし、基質が多孔性である場合）、基質材料、基質厚さ、基質浸透性）に起因して、基質の熱力学特性に影響が発生し得ることが理解される。さらに、実施形態に応じて、これらの同じ特性を移植片の機能に合わせて個別調整することができる。よって、いくつかの実施形態において、パラメータ（例えば、基質直径、長さ、幅、厚さ、空孔率（ただし、基質が多孔性である場合）の選択および／または調節と、基質を含む材料の処方設計の調節とにより、基質の熱力学特性を個別調整することができる。さらに、当業者であれば、特定の基質の材料、厚さ、空孔率、浸透性などに起因する温度傾斜プロファイル（例えば、温度上昇または温度低下に対する温度変化速度および物理的反応）を過度の実験の必要無く容易に理解できる。  
【００３１】
いくつかの実施形態において、低温保存された細胞播種基質は、多孔性基質を含む。いくつかの実施形態において、基質は、非多孔性であり、さらなる別の実施形態において、基質は、非多孔性でありかつ浸透性である。いくつかの実施形態において、基質の浸透性は、基質材料中に意図的に生成された孔または経路によってではなく、少なくともある程度は、その寸法（例えば、厚さ）によって規定される。いくつかの実施形態において、このような非多孔性および浸透性基質は、パリレンを含む。いくつかの実施形態において、基質は、生物分解性であり、他の実施形態において、基質は、非生物分解性である。いくつかの実施形態において、基質は、生物分解性および非生物分解性部分の組み合わせを含む。例示目的のために、基質が生物分解性である一実施形態において、基質は、ＰＬＧＡコポリマーを含む。このような実施形態において、コポリマー中におけるグリコール酸単位に対する乳酸の比率を変更することにより、ＰＬＧＡコポリマーの生物分解率を制御する。いくつかの実施形態は、非生物分解性材料および生物分解性材料の組み合わせを含む。生物分解性材料により、基質中に例えばさらなる構造的かつ機械的支持が得られ、これにより、細胞播種および培養時および／または組織（例えば、網膜下腔）への外科的挿入時における基質の取り扱いが補助される。いくつかの実施形態において、材料を用いて、基質に質量を付加することで、細胞播種および培養時および／または組織中の外科的挿入における取り扱いが支援されおよび／または基質の方向付けが支援される。これらの基質は、金属、ポリマー、プラスチックまたはこれらの組み合わせによって形成され得る。いくつかの実施形態において、材料により、基質において充分な弾性、可撓性および伸長性が得られ、これにより、移植時および移植後における標的生体構造への適合だけでなく、移植時および移植後における捻れ、引き裂きおよび損傷も防止する。基質のいくつかの実施形態は、細胞播種基質の性能の向上のための表面改質（例えば、細胞の生存能力および基質への細胞の付着力の促進のためのもの）を含む。例えば、表面改質は、表面の機能化によって達成され得る。いくつかの実施形態において、基質の表面へコーティングを付加または他の任意の適切な方法により、基質表面の機能化を達成することができる。いくつかの実施形態において、表面の機能化により、表面への細胞の付着力が向上し、その結果、いくつかの実施形態において、基質上に播種された細胞の成長が向上および／または低温保存プロセス時および低温保存プロセス後の細胞の生存能力が向上する。基質に適した材料の例示を挙げると、パリレンポリプロピレン、ポリイミド、ガラス、ニチノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、化学処理コラーゲン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（ポリグリセロールセバシン酸）ＰＧＳ、ポリ（スチレン−イソブチル−スチレン）、ポリウレタン、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、Ｋｙｎａｒ（ポリビニリデンフッ化物；ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、Ｐｅｂａｘ、アクリル、ポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）および他のシリコーンエラストマー、ポリプロピレン、ハイドロキシアパタイト、チタン、金、銀、白金、他の金属および合金、セラミック、プラスチックならびにこれらの混合物または組み合わせがある。基質の特定の実施形態を構成するさらなる適切な材料を非限定的に挙げると、ポリ−パラ−キシリレン（例えば、パリレン（例を非限定的に挙げると、パリレンＡ、パリレンＡＭ、パリレンＣ、アンモニア処理パリレン、ポリドーパミン処理パリレンＣ））、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリエチレン−ビニルアセテート、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレン炭酸塩）、コラーゲン、ヘパリン化コラーゲン、変性コラーゲン、改質コラーゲン（例えば、ゼラチンを含むシリコーン）、他の細胞成長マトリックス（例えば、ＳＹＮＴＨＥＭＡＸ（登録商標））、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）、および／または他のポリマー、コポリマー、またはブロックコポリマー、ポリ（カプロラクトン）含有環状アルギニン−グリシン−アスパラギン、環状または直鎖状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ＰＥＧ）との混合物、熱可塑性ポリウレタン、シリコーン−改質ポリエーテルウレタン、ポリ（炭酸塩ウレタン）またはポリイミドがある。熱可塑性ポリウレタンは、ポリマーまたはコポリマーであり、脂肪族ポリウレタン、芳香族ポリウレタン、ポリウレタンヒドロゲル形成材料、親水性ポリウレタンまたはこれらの組み合わせを含み得る。非限定的例を挙げると、ｅｌａｓｔｈａｎｅ（ポリ（エーテルウレタン））（例えば、Ｅｌａｓｔｈａｎｅ（登録商標）８０Ａ）、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ、Ｔｅｃｏｐｈｉｌｉｃ（登録商標）、ペレットｈａｎｅ（登録商標）、ｃａｒｂｏｔｈａｎｅ（登録商標）、Ｔｅｃｏｔｈａｎｅ（登録商標）、Ｔｅｃｏｐｌａｓｔ（登録商標）、およびＥｓｔａｎｅ（登録商標）がある。シリコーン改質ポリエーテルウレタンを挙げると、Ｃａｒｂｏｓｉｌ（登録商標）２０またはＰｕｒｓｉｌ（登録商標）２０８０Ａなどがある。ポリ（炭酸塩ウレタン）を挙げると、Ｂｉｏｎａｔｅ（登録商標）８０Ａまたは類似のポリマーがある。さらに、いくつかの実施形態において、基質（および／または細胞）は、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける基質の視覚化を可能にし、かつ基質および細胞の低温保存（および解凍）による影響を受けない材料（または化学物質）を含む。適切な基質のさらなる非限定的実施形態について、米国仮出願第６１／３６３，６３０号（出願日：２０１０年７月１２日）、および代理人整理番号ＵＳＣ０２１．００１ＰＲ２で特定される出願番号６１／４８１，００４（出願日：２０１１年４月２９日）および代理人整理番号ＵＳＣ０２１．００１ＰＲ３で特定される出願番号６１／４８１，０３７号（出願日：２０１１年４月２９日）の仮出願中に記載がある。同文献全体が参考によって、本明細書中に組み込まれる。
【００３２】
さらに、いくつかの実施形態において、複数の個々の基質が、例えばフォトリソグラフィー技術、射出成形などを用いて単一の大型の基質フレームから作製される。   その後、フレーム内の個々の基質上に細胞を播種し、本明細書中に開示される低温保存方法に従って処理することができる。他の実施形態において、複数の単一の基質が低温保存される。
細胞型
【００３３】
基質上の低温保存幹細胞は、多様な疾患の治療において有用である。例えば、いくつかの実施形態において、眼細胞は、眼疾患（例を非限定的に挙げると、加齢黄斑変性症（湿潤または乾燥）、糖尿病性黄斑浮腫、特発性脈絡膜血管新生または高度近視黄斑変性症）の治療において用いられる。いくつかの眼の実施形態において、ＲＰＥ細胞が用いられる。いくつかの実施形態において、心臓幹細胞を用いて、心臓血管疾患（例えば、心筋梗塞、虚血性心臓組織損傷、鬱血性心不全、動脈瘤、アテローム性動脈硬化症に起因する発作、脳血管発作（脳卒中）、および冠動脈疾患）の治療を行う。いくつかの実施形態において、肝臓幹細胞を用いて、肝臓疾患（例えば、肝炎、肝硬変、癌）の治療を行う。例えば、他の組織（例えば、腎臓、肺、膵臓、腸、骨および／または軟骨ならびに神経組織）における疾患を、本明細書中に開示される方法およびデバイスによって治療することができる。いくつかの実施形態において、採取された骨髄幹細胞を用いて、白血病、癌または血球数を低減させる治療に起因して低減した造血細胞を再配置することができる。  
【００３４】
細胞損傷または細胞死滅の原因となる多様な疾患に対し、治療効果を達成するために、多様な細胞型を、本明細書中に記載の基質中または基質上に播種することができる。いくつかの実施形態において、培養細胞が用いられる。いくつかの実施形態において、保存細胞が用いられる。   いくつかの実施形態において、培養細胞は、幹細胞を含む。幹細胞は、多能性細胞であり、多様な異なる細胞型に分化することができる。いくつかの実施形態において、胚性幹細胞が用いられる。他の実施形態において、成体幹細胞が用いられる。いくつかの実施形態において、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。胚性幹細胞は、典型的には初期胚から誘導され、身体の任意の型の細胞に成長することができる。いくつかの実施形態において、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、ＳＨＥＦ−１または他の類似のＦＤＡによる認可幹細胞株が用いられる。いくつかの実施形態において、胚性幹細胞は、胚の破壊無しに得られる。成体幹細胞は、典型的には多能性であり、より限定された数の細胞型（典型的には、細胞が単離された組織型に関連するもの）に成長し得る。いくつかの実施形態において、幹細胞は、移植者と同種異系である（例えば、特定の胚性幹細胞の場合）。いくつかの実施形態において、幹細胞は、移植者自己由来である。他の実施形態において、同系細胞が用いられる。さらに他の実施形態において、異種細胞が用いられる。いくつかの実施形態において、新鮮単離細胞を培養し、基質中または基質上に成長させて、個々の移植者へ移植する。他の実施形態において、予め低温保存された細胞が用いられる（例えば、本明細書中に開示されるような基質上に播種され、低温保存された保存細胞）。いくつかの実施形態において、人工多能性幹細胞が用いられる。いくつかの実施形態において、胎児幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤由来幹細胞、成体幹細胞、人工（誘導）幹細胞またはヒト胚性幹細胞および／またはその部分または完全に分化した細胞誘導体が用いられる．いくつかの実施形態におおいて、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ＲＰＥと光受容体との混合物、ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞、Ｍ&uuml;ｌｌｅｒ  ｇｌｉａｌ細胞、ガングリオン細胞、Ｍ&uuml;ｌｌｅｒ  ｇｌｉａｌ細胞とガングリオン細胞との混合物、角膜内皮細胞、角膜内皮細胞とコラーゲンとの混合物、角膜上皮細胞、角膜上皮細胞とコラーゲンとの混合物、内皮細胞、周皮細胞、および／または内皮細胞と周皮細胞との混合物を含む。
低温保存方法
【００３５】
この低温保存方法は、未分化胚性幹細胞の細胞懸濁液に対して行われることが多い。多くの細胞型（例えば、ｈＥＳＣ−ＲＰＥ）の懸濁液を凍結させる方法は、基質上に成長させた場合、同一幹細胞の低温保存に適していない。多くの場合において、これは、哺乳類の血清（例えば、胎児ウシ血清）の濃度を高くする必要があることに起因する。矛盾したことに、出願人は、懸濁液細胞の凍結を補助する物質そのものに起因して、このような細胞が基質表面に付着する能力に悪影響が出ることを発見した。よって、いくつかの実施形態において、低温保存条件を最適化することにより、基質への細胞の付着力を保持し、その結果、有利なことに、細胞の生存だけでなく、基質上の細胞の治療効果も向上する。   
【００３６】
いくつかの実施形態において、高度（または完全）に分化したｈＥＳＣ−ＲＰＥをポリマー基質（例えば、上記に開示したもの）上に播種し、かつ細胞により分極単分子層を形成することにより、ｈＥＳＣ−ＲＰＥ移植の安定性が向上する。有利なことに、この段階における低温保存により、通常のＲＰＥ単分子層と同様に機能する最終臨床製品が提供される。   いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法により、基質上の細胞に対する追加の操作または変更を実質的に行うこと無く、低温保存された細胞播種基質の治療での使用が可能になる。外科医は、解凍された１つ以上の細胞播種移植片を選択し、遅滞無く移植に進むだけでよい。   いくつかの実施形態において、播種細胞は、ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞である。いくつかの実施形態は、Ｈ９ＥＳＣ細胞株からの基質播種ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞の低温保存に関する。  
【００３７】
いくつかの実施形態において、約１〜５時間、５〜１２時間、１２〜２４時間、２４〜４８時間、４８時間〜１週間、１週間〜２週間、２〜３週間、３〜４週間以上およびこれらの重複範囲の間、（付着力、機能または生存能力への悪影響が無い状態で）基質付着ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞を凍結させる。いくつかの実施形態において、１ヶ月よりも長く、１年よりも長く、またはこれよりも長く、細胞播種基質を低温保存および保存する。いくつかの実施形態において、低温保存細胞をパリレン基質上に成長させる。いくつかの実施形態において、パリレン基質上に成長させた低温保存細胞を、制御された解凍後に、対象の網膜下腔または他の任意の適切な標的移植部位に移植する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、基質は、基質上に付着した細胞の完全性または機能性を向上させるように、選択されるパラメータを含む。基質の特性は、基質上に付着した細胞が低温保存後に、完全性または機能性を実質的に維持できるように、選択される。例えば、基質の特性は、基質の熱力学特性に影響を与える場合があり、移植片の機能に応じて個別調整することができる。いくつかの実施形態において、パラメータ（例えば、基質直径、長さ、幅、厚さ、密度、（多孔性基質の）空孔率ならびに基質材料の処方）を選択および／または調節することにより、基質の熱力学特性（例えば、熱膨張係数および弾性）を個別調整して、基質上に成長した幹細胞の低温保存を最適化する。いくつかの実施形態において、基質パラメータを最適化することにより、温度上昇および低下速度が細胞単分子層の完全性を妨害せず、かつ解凍後の細胞の生存能力または機能に悪影響を与えないようにする。さらに、いくつかの実施形態において、（同様に、基質への細胞の付着力の妨害および／または解凍後の細胞の生存能力の妨害を低減するために）、温度変化に起因する基質の物理的歪みを低減する。例えば、ポリマー基質への付着力ならびにポリマー基質の膨張または収縮により、隣接するＲＰＥ細胞間の密着結合が妨害されると、解凍後の細胞の生存能力に悪影響が出る場合がある。いくつかの実施形態において、基質は、パラメータ（例えば、熱膨張係数および弾性）および仕様（例えば、形状および厚さ）を有するポリマー材料を含み得る。これらのパラメータおよび仕様を制御することにより、基質上に成長した幹細胞の低温保存性（および解凍後の細胞の生存能力）を最適化する。いくつかの実施形態において、１つ以上の選択された基質パラメータにより、基質解凍後の細胞単分子層が実質的に無傷となる。  
【００３９】
さらに、本明細書中に開示される方法が有利である理由として、細胞播種基質の低温保存により、単分子層の完全性の妨害の危険性が無い状態で、臨床現場または手術室への最終製品のｃＧＭＰに準拠した搬送が可能となるため、治療の進展が促進される点がある。いくつかの実施形態において、基質上に播種され、低温保存された細胞は、解凍後に治療薬として直接用いられる。本明細書中に開示される方法を用いれば、細胞の低温保存により、機能性を実質的に維持することも可能になり、有利である。例えば、本明細書中に開示される方法を用いれば、細胞が低温保存後の生存能力を実質的に維持することが可能となるため、細胞／基質を解凍した後、細胞を患者の標的部位に直接移植することが可能になる。いくつかの実施形態において、標的移植部位は、眼の前部、眼の後部またはこれらの組み合わせを含む。例えば、いくつかの実施形態において、標的部位は、網膜下腔、脈絡膜上腔、前房、硝子体液、または他の適切な眼内腔またはこれらの組み合わせのうち１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法により、完全に分化したｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞の単分子層が付着し、低温保存された基質を標的部位に直接移植することが可能になる。さらに、本明細書中に開示される方法により、基質上に播種され、低温保存された細胞のバルク製造を制御された状態で行うことがさらに可能になる。これらの細胞は、解凍後に機能性または生存能力を実質的に維持するので、患者への直接移植に適している。 
【００４０】
いくつかの実施形態において、幹細胞を基質上に播種し、所望の最終密度になるまで培養し、洗浄し、凍結培地（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎ社製のＣｒｙｏＳｔｅｍ）を収容したｃｒｙｏｖｉａｌ中に移して、制御された温度低下に供する。さらに、いくつかの実施形態において、細胞を培養で分化させた後、低温保存を行う。いくつかの実施形態において、ポリマー材料または非ポリマー材料またはこれらの組み合わせを含む基質上において細胞を培養する。いくつかの実施形態において、基質は、パリレンである。いくつかの実施形態において、特に細胞の成長または付着のために設計された基質の一部の上をコーティングする。例えば、基質の細胞付着面を処理することで、細胞付着面上への細胞の付着力を促進するかまたは細胞付着面に付着した細胞の生存能力を向上させる。いくつかの実施形態において、細胞の付着力を促進するかまたは細胞の生存能力を支援するように、マトリゲル（登録商標）または他の類似の薬剤によって、基質をコーティングする。いくつかの実施形態において、ビトロネクチン、レトロネクチンまたはこれらの組み合わせを含むコーティングによって、基質を処理することができる。他の実施形態において、市販の化合物（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＣｅｌｌＳｔａｒｔ）により、膜をコーティングする。いくつかの実施形態において、細胞が集密化するまで（または所望の集合を形成するまで）、幹細胞が播種された基質をＦＧＦ（または他の成長因子）の存在下において培養する。いくつかの実施形態において、幹細胞の分化を促進する条件下において、幹細胞が播種された基質を培養する。いくつかの実施形態において、基質付着細胞を、血清およびタンパク質を含有しない凍結培地中で低温保存する。いくつかの実施形態において、細胞播種基質をｃｒｙｏｖｉａｌ（または凍結／保存に適した他の容器）中に供給した後、低温保存する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、選択された温度低下速度の温度低下フェーズにおいて、細胞を冷却する。いくつかの実施形態において、温度低下フェーズにおける温度低下速度は、約１０℃／分である。いくつかの実施形態において、他の変化速度（例えば、約１℃／分、約２℃／分、約５℃／分、約７℃／分、約１２℃／分、約１５℃／分、約１７℃／分、約２０℃／分、または上記数値内の速度）が用いられる。いくつかの実施形態において、温度低下フェーズは、急速冷凍（例えば、最大温度低下）工程を含み得る。例えば、急速冷凍工程は、より高い温度低下速度を有する急速冷凍温度速度を含み得る。この速度は、有利なことに、細胞の完全性または細胞の生存能力を向上させるように選択される。これとは対照的に、従来技術のいくつかの実施形態において、急速冷凍工程は用いられない。出願人らの発見によれば、特定の実施形態において、特定の緩除な低下速度と同様に最大温度低下速度も損傷を与えるが、特定の中間速度により、低温保存の品質および／または細胞の生存能力が予期せぬほど向上する。いくつかの実施形態において、温度低下フェーズは、基質付着細胞を、およそ１０℃／１０秒、１０℃／２０秒、１０℃／３０秒、１０℃℃／４０秒、１０℃／５０秒、１０℃／６０秒、１０℃／７０秒、１０℃／８０秒、１０℃／９０秒、１０℃／１００秒、１０℃／１１０秒、１０℃／１２０秒、１０℃／１３０秒、１０℃／１４０秒、１０℃／１５０秒、１０℃／１６０秒、１０℃／１７０秒、１０℃／１８０秒、１０℃／１９０秒または１０℃／２００秒の速度で冷却する工程を含み得る。温度低下フェーズにおける冷却速度は、いくつかの実施形態において、細胞の生存能力を向上させるように構成される。例えば、温度低下フェーズにおける特定の冷却速度により、低温保存後の細胞の機能性が向上する。いくつかの実施形態において、温度低下フェーズにおける冷却速度は、細胞の完全性または安定性を向上させるように構成される。いくつかの実施形態において、低温保存細胞は、低温保存後に治療効果を実質的に維持する。例えば、細胞は、低温保存細胞の解凍後の患者の標的部位への直接移植に適しており、また、低温保存されなかった細胞とほぼ同等であるか（または上回る）治療効果を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、基質付着細胞を所望の期間、任意選択的に中間保存温度に供する。中間保存温度は、いくつかの実施形態において、約０℃および−１００℃（例えば、約−５０℃〜約−６０℃、約−６０℃〜約−７０℃、約−７０℃〜約−８０℃、約−８０℃〜約−９０℃、約−９０℃〜約−１００℃、およびこれらの重複範囲）である。いくつかの実施形態において、細胞を所定の期間、中間保存温度で保存した後、より長期の保存へ移す。例えば、細胞を中間保存温度において一晩または他の適切な期間だけ維持した後、長期保存のために液体窒素へ移すことができる。他の実施形態において、他の温度が用いられ得る（例えば、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃などでの保存）。この中間保存は、温度を「段階的に低下」させる役割を果たし、これにより、基質上に播種された細胞の解凍後の安定性、生存能力および機能がさらに向上する。いくつかの実施形態において、多段階で「段階的に低下」させる手順が用いられる。  
【００４３】
いくつかの実施形態において、低温保存された基質付着細胞を使用（例えば、移植）のために解凍する。この解凍は、体温（例えば、約３７℃の温度）または他の任意の適切な温度の浴槽に、低温保存された基質付着細胞を収容したｃｒｙｏｖｉａｌを移すことにより、行われる。他の実施形態において、加熱速度を「段階的に上昇」させる解凍プロセスを用いる。例えば、いくつかの実施形態において、徐々に温度を上昇させる一連の保存環境に、ｃｒｙｏｖｉａｌを配置した後、体温に近い温度（例えば、約３７℃の温度の浴槽）または他の任意の適切な温度へ移す。   いくつかの実施形態において、最終恒温器を手術室に配置することで、外科医は、細胞播種基質を迅速に選択および移植することができる。いくつかの実施形態において、基質付着細胞を解凍した後、これらの細胞を培養皿に移し、およそ３０分間、１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、８６時間、１１０時間、１週間、２週間、または３週間よりも長い期間、適切な条件下において培養する。その後、所望の位置（例えば、患者への導入（移植）が行われる手術室）へと搬送される。いくつかの実施形態において、基質付着細胞培地は、ＦＧＦ２が補われる。   あるいは、いくつかの実施形態において、解凍された細胞播種基質を、直接患者に移植する。以下に示す実施例は、本発明の非限定的な実施形態を意図する。同等の試薬または代替的試薬、培養時間／温度が本開示の範囲内であることが理解される。
実施例１
【００４４】
培養容器からの解離２時間前に、保存Ｈ９−ＲＰＥ細胞の培地を、新鮮なＸ−ＶＩＶＯ１０培地と交換した。その後、分化Ｈ９−ＲＰＥ細胞を、ｐＨ７．４のカルシウムおよびマグネシウムを含有しないＤＰＢＳ（バージニア州のＭｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．社製）で１回洗浄し、０．５３ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．０５％のトリプシン（バージニア州のＭｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ社製）で５分間、３７℃で解離した。その後、ピペット（培養プレートまたは皿）で、細胞を覆うトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を上下に緩やかにポンピングするかまたは細胞をピペットを用いて培養フラスコへ移すことにより、これらの細胞を完全に解離した。その後、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製または他の無異物中和試薬）を含有するＸ−ＶＩＶＯ１０培地（Ｌｏｚａｎ社製）を等量用いて、トリプシンを中和した。殺菌された４０μｍろ過器を通して細胞懸濁液を濾過することにより、非解離細胞を除去し、解離細胞をＨｉｒｍｌｅＺ３００ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（イリノイ州のＲＰＩＣｏｒｐ．社製）によってペレット化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。 
【００４５】
その後、細胞ペレットをＸ−ＶＩＶＯ１０培地で２回洗浄し、血球計でカウントした。パリレン膜または他のポリマー膜でコーティングされたＣＥＬＬＳＴＡＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはマトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上に、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）が補われたＸ−ＶＩＶＯ１０培地で密度105/cm2となるように、細胞を播種した。これらの細胞を、ＦＧＦを含有するＸ−ＶＩＶＯ１０培地中において、膜上で１週間で培養した後、ＦＧＦを含有しないＸ−ＶＩＶＯ１０溶媒中において、３週間培養した。培地を１週間に２回交換した。
【００４６】
培養１週間後、播種細胞を集密に成長させた。培養２週間後、細胞は、ＲＰＥの典型的な形態を形成し始め、丸石形で色素沈着を呈した。
【００４７】
培養４週間後、基質の膜上に成長し、完全に分化したＲＰＥ細胞を、Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地で１回洗浄した後、１ｍｌのＣｒｙｏＳｔｅｍ凍結培地（Ｓｔｅｍｇｅｎ社製）を収容したｃｒｙｏｖｉａｌに移した。凍結培地と共に細胞を収容したｃｒｙｏｖｉａｌを、ＣＯＯＬＣＥＬＬ（登録商標）容器（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ社製）に配置した。細胞の温度を、１０℃／分の速度でおよそ０℃の最終温度になるまで低下させた。その後、基質付着細胞を−８０℃冷凍庫で一晩保存した。その後、凍結したｃｒｙｏｖｉａｌを、ＣＲＹＯＢＯＸ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）へ移し、液体窒素中に保存した。
【００４８】
上述したように、いくつかの実施形態において、基質上のＲＰＥ細胞を収容したｃｒｙｏｖｉａｌを、患者に移植するために解凍した。低温保存された移植片を、液体窒素容器中から取り出した直後、３７℃の浴槽（または他の相当する環境）中に配置した。解凍後、ＲＰＥ細胞播種基質をｃｒｙｏｖｉａｌから３５ｍｍの組織培養皿へ注意深く取り出し、３ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ１０培地中において２回洗浄し、２４ウェルプレートの培養ウェル中へ移し、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が補われたＸ−ＶＩＶＯ１０培地中において培養した。培地を１日おきに交換しつつ、１週間、細胞を培養した。１週間後、ＦＧＦ補助剤を含有するＸ−ＶＩＶＯ１０中に回収したところ、基質膜付の細胞は、動物への移植に適した状態であり、あるいは、ＦＧＦ２補助剤を含有しないＸ−ＶＩＶＯ１０培地中において連続的に培養することもできた。他の実施形態において、解凍後の培養は不要である（例えば、解凍完了後すぐに移植を行うことができる）。図１に示すように、「凍結および解凍」後、ＲＰＥ細胞は、パリレン基質に付着したままであり、無傷の単分子層を有する（例えば、温度変化に起因するＲＰＥ密着結合の低下は無い）。また、図３Ａ〜図３Ｂに示すように、１日後（３Ａ）および１週間後（３Ｂ）、解凍後の細胞損失も限られている。さらに、基質上に細胞が残留しているだけでなく、解凍後も細胞は生存していた。図３Ｃ〜図３Ｆは、生存能力の分析を示し、解凍後の生存細胞の比率が死滅細胞よりも実質的に高いことを示す（図３Ｃ〜図３Ｆは、４つの異なる領域を示す）。さらに、ラットの網膜下腔への移植１週間後に組織学的分析を行ったところ、基質膜上の予め低温保存されたＲＰＥ細胞は、生存していただけでなく、分極単分子層（図２）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける形成および維持から確認できるように、機能性も維持していた。  
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【国際調査報告】
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