(57)【要約】  本発明は、クレード1 H5N1のH5タンパク質は、特に単一回接種のワクチン接種によってH5N1 HAを有するインフルエンザウイルスに対してクレード間防御免疫応答を誘発するという驚くべき発見に基づく。したがってある特徴では、本発明は、異なるクレード、すなわちそれぞれクレード1とは異なるクレード又はクレード1を除く任意のクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法で使用されるクレード1 H5N1のH5タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なるクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療また予防する方法に使用するクレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質(1)であって、配列番号：1のポリペプチド配列と少なくとも98％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか又は前記から成る、前記H5タンパク質(1)。
【請求項２】
配列番号：1のポリペプチド配列と少なくとも98.1％、好ましくは少なくとも98.2％、より好ましくは少なくとも98.3％、もっとも好ましくは少なくとも98.4％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又は前記から成る、請求項1に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項３】
アミノ酸223N及び改変328K+を有し、H5タンパク質(1)のアミノ酸の位置のナンバリングが配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+が、H5タンパク質(1)のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する、請求項1又は2に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項４】
アミノ酸94Nを有する、請求項1から3のいずれか1項に記載の、H5タンパク質(1)。
【請求項５】
アミノ酸120Nを有する、請求項1から4のいずれか1項に記載の、H5タンパク質(1)。
【請求項６】
アミノ酸155Nを有する、請求項1から5のいずれか1項に記載の、H5タンパク質(1)。
【請求項７】
以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有する、請求項1から6のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)：
a．aa93−95：GNF
b．aa123−125：SDH
c．aa128−130：SSG
d．aa138−140：GSS
e．aa226−228：MDF
f．aa270−272：EVE
g．aa309−311：NKL。
【請求項８】
以下を含むペプチドを含む、請求項1から7のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)：
i．配列番号：5、配列番号：6、又は配列番号：7のアミノ酸配列；又は
ii．i）のポリペプチドと少なくとも85％の配列相同性を有し、標準的なヘマグルチニン阻害アッセイにおいてヘマグルチニン阻害を構成する任意のペプチド；又は
iii．i）又はii）のペプチドのいずれかの少なくとも8つの連続するアミノ酸を含み、さらに標準的なヘマグルチニン阻害アッセイにおいてヘマグルチニン阻害性を示す、i）又はii）のポリペプチドの任意の部分；又は
iv．アミノ酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120S、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263A又は263Tの1つを有するi）、ii）又はiii）の任意のペプチド；又は
v．以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するi）、ii）、iii）又はiv）の任意のペプチド： 
a．aa93−95：GNF
b．aa123−125：SDH
c．aa128−130：SSG
d．aa138−140：GSS
e．aa226−228：MDF
f．aa270−272：EVE
g．aa309−311：NKL。
【請求項９】
配列番号：5のアミノ酸配列を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１０】
組換えにより発現され、及び／又はバキュロウイルス発現系によって、好ましくは培養昆虫細胞で生成される、請求項1から9のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１１】
異なるクレードのH5N1ウイルスが、クレード0 H5N1ウイルス、クレード2 H5N1ウイルス、クレード3 H5N1ウイルス、クレード4 H5N1ウイルス、クレード5 H5N1ウイルス、クレード6 H5N1ウイルス、クレード7 H5N1ウイルス、クレード8 H5N1ウイルス、及びクレード9 H5N1ウイルスから成る群から選択される、請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１２】
異なるクレードのH5N1ウイルスが、クレード2.2 H5N1ウイルス又はクレード2.3 H5N1ウイルスである、請求項1から11のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１３】
異なるクレードのH5N1ウイルスが、クレード2.2.1 H5N1ウイルス又はクレード2.3.2 H5N1ウイルスである、請求項1から12のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１４】
異なるクレードのH5N1ウイルスが、北アフリカ人又はベトナム人由来のH5N1ウイルスである、請求項1から13のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１５】
北アフリカ人由来のH5N1ウイルスが、インフルエンザウイルスのH5タンパク質(2)を含むH5N1ウイルスであり、
前記H5タンパク質(2)が、
（a）アミノ酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T及び181N（改変145(-)はH5のアミノ酸145位は欠失していることを意味する）；又は
（b）アミノ酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G及び421K；又は
（c）アミノ酸145L、172T及び254Vを有し、
前記H5タンパク質(2)のアミノ酸の位置のナンバリングが配列番号：8で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応するか、又は
前記H5タンパク質(2)が、配列番号：9から46に示す配列のいずれか1つと少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、又は特に好ましくは100％のホモローグであるアミノ酸配列から成るか又は前記を含む、
請求項14に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１６】
異なるクレードのH5N1ウイルスがH5タンパク質(2)を含み、
前記H5タンパク質(2)が、
（a）アミノ酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T及び181N；又は
（b）アミノ酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G及び421K；又は
（c）アミノ酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H及び254V、
を有する、及び／又は、
前記H5タンパク質(2)が、
i．配列番号：9から46のアミノ酸配列のいずれか1つ；
ii．ｉ）のポリペプチドに対し少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも96％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、もっとも好ましくは100％の配列相同性を有し、さらに標準的ヘマグルチニン阻害アッセイでヘマグルチニン阻害を構成する任意のペプチド；又は
iii．i）又はii）のペプチドのいずれかの少なくとも334の連続するアミノ酸を含み、さらに標準的なヘマグルチニン阻害アッセイにおいてヘマグルチニン阻害性を示す、i）又はii）のポリペプチドの任意の部分、
を含むペプチドを含む、及び／又は、
前記H5タンパク質(2)が、配列番号：9から46に示す配列のいずれか1つと少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、もっとも好ましくは100％の配列同一性を有する連続アミノ酸配列から成るか又は前記を含む、
請求項1から15のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１７】
異なるクレードのH5N1ウイルスがH5タンパク質(2)を含み、前記H5タンパク質(2)が、配列番号：15又は20に示す配列のいずれか1つと少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、又は特に好ましくは100％のホモローグであるアミノ酸配列から成るか又は前記を含み、配列番号：20に示すアミノ酸配列を含むか又は前記から成るH5タンパク質(2)が特に好ましい、請求項1から16のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)。
【請求項１８】
以下の（A）又は（B）による感染症を治療又は予防する方法で使用する請求項1から17のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)：
（A）北アフリカ人由来のサブクレードA H5N1ウイルス、すなわち請求項13又は14の（a）に記載のアミノ酸を有するH5タンパク質(2)を含むH5N1ウイルス、又は配列番号：9から19又は42又は43に示す配列のいずれか1つに関する請求項16又は17に記載のH5タンパク質を含むH5N1ウイルスによる感染症；又は
（B）北アフリカ人由来のサブクレードB H5N1ウイルス、すなわち請求項13又は14の（b）又は（c）に記載のアミノ酸を有するH5タンパク質を含むH5N1ウイルス、又は配列番号：20から41又は44から46に示す配列のいずれか1つに関する請求項16又は17に記載のH5タンパク質を含むH5N1ウイルスによる感染症。
【請求項１９】
請求項1から18のいずれか1項に記載の方法で使用する、請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質及び不活化ニューカッスル病ウイルスの組合せ物。
【請求項２０】
不活化ニューカッスル病ウイルスが不活化全ニューカッスル病ビリオンである、請求項19に記載の組合せ物。
【請求項２１】
不活化ニューカッスル病ウイルスが、配列番号：51に示すポリヌクレオチド（既に不活化されてある）のRNAコピーと少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、又は特に100％の配列同一性を有するRNAポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルスの不活化によって得られる不活化ニューカッスル病ウイルスである、請求項19又は20に記載の組合せ物。
【請求項２２】
ニューカッスル病ウイルスがニューカッスル病ラソタ（LaSota）株ウイルスである、請求項19から21のいずれか1項に記載の組合せ物。
【請求項２３】
ニューカッスル病ウイルスが、ホルムアルデヒド、BEI、ベータ-プロピオ-ラクトン（BPL）及び前記の組合せから成る群から選択される試薬で不活化される、請求項19から22のいずれか1項に記載の組合せ物。
【請求項２４】
請求項1から18のいずれか1項に記載の方法で使用する、以下を含むワクチン：
a．請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質又は請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物；及び
b．医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤。
【請求項２５】
賦形剤が1つ以上のアジュバントである、請求項24に記載のワクチン。
【請求項２６】
アジュバントがエマルシゲン基剤アジュバントである、請求項25に記載のワクチン。
【請求項２７】
ワクチンが1つ以上のさらに別の抗原を含む、請求項24から26のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２８】
1つ以上のさらに別の抗原が家禽病原体の抗原である、請求項27に記載のワクチン。
【請求項２９】
1つ以上のさらに別の抗原がインフルエンザウイルスのH5、H7又はH9である、請求項28に記載のワクチン。
【請求項３０】
インフルエンザウイルスのH5が、クレード1と異なるクレードのH5N1ウイルスのH5タンパク質である、請求項29に記載のワクチン。
【請求項３１】
クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされる感染症の予防又は治療用医薬組成物、好ましくは単一回接種ワクチン又は1用量ワクチンの調製のための、請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)又は請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物の使用であって、前記クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスが、好ましくは請求項11から18のいずれか1項に示したクレードのH5N1ウイルスである、前記使用。
【請求項３２】
クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染症を治療又は予防する方法であって、前記クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスが、好ましくは請求項11から18のいずれか1項に示したクレードのH5N1ウイルスであり、当該方法が、請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)又は請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物の治療的に有効な量のそのような治療を必要とする対象動物への投与を含む、前記方法。
【請求項３３】
クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染症を治療又は予防する方法であって、前記クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスが、好ましくは請求項11から18のいずれか1項に示したクレードのH5N1ウイルスであり、当該方法が、請求項24から30のいずれか1項に記載のワクチンの治療的に有効な量のそのような治療を必要とする対象動物への投与から成るか又は前記を含む、前記方法。
【請求項３４】
投与が単一回投与又は1用量投与である、請求項32又は33に記載の方法。
【請求項３５】
以下を含むキット：
a．請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)、請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物、又は請求項24から30のいずれか1項に記載のワクチン；及び
b．クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされる感染症の治療又は予防についてa）のH5タンパク質(1)、組合せ物又はワクチンの使用を指示するパッケージリーフレットであって、前記クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスが、好ましくは請求項11から18のいずれか1項に記載の前記異なるクレードのH5N1ウイルスである、前記パッケージリーフレット。
【請求項３６】
家禽又は哺乳動物の病原体の少なくとも1つ以上のさらに別の抗原を含み、前記さらに別の抗原が好ましくは請求項27から29のいずれか1項に示した抗原である、請求項35に記載のキット。
【請求項３７】
単一回接種ワクチンとして又は1用量ワクチン接種で使用する、請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)、請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物、請求項24から30のいずれか1項に記載のワクチン、又は請求項35又は36に記載のキット。
【請求項３８】
請求項1に記載のタンパク質及び請求項19に記載の組合せ物から成る群から選択される組成物を投与する工程を含む、インフルエンザ感染症の発生率又は重篤度を緩和する方法。
【請求項３９】
対象動物のウイルスの排出を減少させる方法で使用する、請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)又は請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物であって、前記H5タンパク質(1)又は前記組合せ物が、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスに感染した又は前記によるウイルス感染症のリスクを有する対象動物に投与され、さらに、前記クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスが、好ましくは請求項11から18のいずれか1項に記載の前記異なるクレードのH5N1ウイルスである、前記H5タンパク質(1)又は前記組合せ物。
【請求項４０】
クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスに感染した又は前記によるウイルス感染症のリスクを有する対象動物でウイルス排出を減少させる医薬の製造のための請求項1から10のいずれか1項に記載のH5タンパク質(1)又は請求項19から23のいずれか1項に記載の組合せ物の使用であって、前記クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスが、好ましくは請求項11から18のいずれか1項に示したクレードのH5N1ウイルスである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野、好ましくは伝染性疾患の分野に関する。特に、本発明はインフルエンザタンパク質及びワクチンに関する。もっとも具体的には、本発明は、インフルエンザ感染症の治療及び予防のため、さらにまたインフルエンザウイルスの種内及び種間伝播の治療及び予防のためのそのようなタンパク質又はワクチンのいずれかの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ感染症は依然として動物及びヒトの重要な感染症である。インフルエンザは、絶え間ない抗原の変化／改変を受け、かつ動物レザバーを保有するウイルスによって引き起こされる。したがって、新規な流行及び大流行が将来発生する恐れがあり、当該疾病の撲滅を達成することは困難であろう。インフルエンザウイルスは当業界では周知であり、例えば以下の文献（P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, no. 12, pp. S 82 to S 86 of December 2004）でより詳細に更なる参考文献とともに記載されている。簡単に記せば、インフルエンザAウイルスのゲノムは8つの一本鎖セグメントから成り、ウイルス粒子はその表面に2つの主要な糖タンパク質、ヘマグルチニン（H）及びノイラミニダーゼ（N）を有する。少なくとも16の異なるヘマグルチニン（H1からH16）及び9つの異なるノイラミニダーゼ（N1からN9）サブタイプとともに、インフルエンザウイルス間には顕著な抗原多様性が存在する。
H5N1型トリペストウイルスのインフルエンザウイルスは、家禽、ブタ及びヒトに感染することが示された。このウイルスはまた、鳥類種からヒトに直接伝播され得ることが示された（Claas et al., Lancet 1998, 351: 472；Suarez et al., J. Virol. 1998, 72: 6678；Subbarao et al., Science 1998, 279: 393；Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1): S26-S29）。公知のヒト症例における死亡率は約50％に達する。
【０００３】
前世紀にはブタはインフルエンザ大流行の重要な病原媒介動物であった。ブタ、ラクダ及びアザラシ（好ましくはブタ）は、トリインフルエンザウイルスの‘ミキシングチャンバー’として機能し、したがって家禽（インフルエンザウイルスの天然のレザバー）から哺乳動物へと種の垣根を超える潜在的なリスク因子であり得る。前記は、感受性動物（例えばブタ）の既存の哺乳動物（ブタ）インフルエンザウイルスとトリインフルエンザウイルスの両ウイルスによる二重感染によって通常的に生じる。この二重感染は、ヒト又はブタの大流行の原因となり得る新規な組換えウイルスを創出し得る。しかしながら、最近の形跡は、従来のトリH5株の哺乳動物インフルエンザウイルスによる組換えは高度にビルレントな組換え体を生じないであろうということを示している。他方、トリインフルエンザウイルスはブタに感染し、偶発的変異によってブタに順化し得る。当該ウイルスがブタ（又は他の哺乳動物）集団内で水平感染を引き起こせば直ちに、この重要な種の垣根は打ち破られるであろう。
しかも、東南アジアのブタの大部分が、近隣の養鶏業に由来するトリ（H5）インフルエンザウイルス株に既に感染している。そのような感染はこれまでのところ前臨床状態であるので、検査室手法によってのみ診断が可能であり、したがってしばしば見逃される。そのような前臨床的感染を示すブタは、当該ウイルスが哺乳動物系に順化し、ブタ集団内で拡散し、さらにヒトにも感染する機会として機能するであろう。
【０００４】
従来のインフルエンザワクチンは、サブユニットワクチン（Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238；Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274；Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080）、弱毒ワクチン（Horimoto et al., Vaccine 2004, 22(17-18):2244-2247）、DNAワクチン（Watabe et al., Vaccine 2001, 19(31):4434-4444）、及び不活化インフルエンザワクチン（Cao et al., Vaccine 1992, 10(4):238-242）を含み、後者が商業的規模でもっとも広く用いられている（Lipatov et al., J Virol 2004, 78(17):8951-8959）。
サブユニットワクチン（組換えヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ（Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238；Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274；Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080））は、不活化ワクチンに対する有望な代替物であり得るが、ただしこれまでのところいずれも商業的ワクチンとして使用されていない。そのようなワクチンの製造は、不活化ワクチンの製造よりも明らかに安全である。さらにまた、サブユニットワクチンは、インフルエンザウイルス内部タンパク質に対する抗体応答をもたらさず、したがってワクチン接種動物と感染動物を区別できない（Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274）。
【０００５】
ヘマグルチニンタンパク質は、インフルエンザウイルスのレセプター結合及び膜融合糖タンパク質であり、さらに感染性中和抗体の標的である。H5N1の完全なヘマグルチニンタンパク質（HA）は586アミノ酸で構成され、分子量56kDaを有する。HA分子はHA1及びHA2サブユニットから成り、HA1サブユニットは細胞膜との最初の接触を媒介し、HA2は膜融合に必要である（Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63(1-2):129-136）。
バキュロウイルス/昆虫細胞系は、トリインフルエンザサブタイプから単離されたヘマグルチニン遺伝子の発現に用いられてきた（Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238；Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274；Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080)；Nwe et al., BMC Mircobiology 2006, 6(16):doi:10.1186/1471-2180-6-16）。しかしながら、それら組換えタンパク質はいずれの事例でも防御性をもたないか、又は少なくともいくつかの種については有効性が低いように思われる（Treanor et al., Vaccine 2001, 19: 1732-1737）。
Linらの論文（J Vet Med Sci., 2008 70(11):1147-52）は、クレード2 H5N1ウイルスA/アヒル/中国E319-2/03のH5タンパク質の製造でバキュロウイルス/昆虫細胞の使用を開示している（前記ウイルスは、クレード2 H5N1ウイルスA/アヒル/中国E319-2/03の感染予防のためのプライム-ブースターワクチン接種に使用できる）。
【０００６】
Brightら（PLoS One. 2008 30;3(1):e1501）は、クレード2 H5N1ウイルス由来のノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン及びマトリックス１タンパク質を含むウイルス様粒子（VLP）を生成し、マウスでクレード1 H5N1ウイルスA/VN/1203/2004よるチャレンジに対しクレード間防御免疫応答を誘発するためにバキュロウイルス/昆虫細胞系を使用することについて記載している。しかしながら、VLPの生成には問題がなくはない。なぜならば、本物のウイルスを有効に模倣する機能的なVLPを生成するためには、多数のウイルス構造タンパク質が必要であり、これらは続いて感染性ウイルスの外殻（キャプシド）の構造を再生する粒子に正確にアッセンブリングされなければならないからである。さらにまた、VLPのin vitroアッセンブリーは凝集と競合することが実験で明らかであった（Ding et al. Biotechnology and Bioengineering 107 (3): 550-560）。
したがって、インフルエンザ感染制御のためにさらに優れたアプローチを提供し、かつ疾病の負荷に対し対向力を有する改善されたワクチン及び新規なワクチン接種方法の利用性向上が希求される。特に、好ましくは単一回接種のワクチン接種によって、H5N1 HAを有するインフルエンザウイルスに対してクレード間防御免疫応答を誘発する簡単で効果的で操作が容易な系が強く希求される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の説明
本発明の態様の前に以下が特記されるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり複数の対応物を含む。したがって、例えば“調製物”という表示は複数のそのような調製物を含み、“担体”という表示は、1つ以上の担体及び当業者に公知のその等価物などを表示する。特段に規定されなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。与えられる全ての範囲及び値は、特段に指定されないかぎり又は当業者に異なる態様で理解されていないかぎり、1から5％で変動することが可能であり、したがって、“約”という用語は前記表現から省略された。本明細書に記載した方法及び材料と類似するか又は等価であるいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法、装置及び材料をこれから述べる。本明細書に記載する全ての刊行物は、当該刊行物で報告された物質、賦形剤、担体及び方法論（本発明の関連で用いることが可能である）を記載及び開示する目的のために、本明細書に参照により含まれる。本明細書へのいずれの参照も、先行発明のために本発明がそのような開示に先行する資格がないことを容認するものと解されるべきではない。
上記の技術的問題の解決は、特許請求の範囲で特徴付けられる記述及び実施態様によって達成される。
【０００８】
インフルエンザタンパク質及びそれらをコードする核酸分子
本発明は、クレード1 H5N1のH5タンパク質がH5N1 HAを有するインフルエンザウイルスに対してクレード間防御免疫応答を誘発する、特に単一回ワクチン接種によってそのような防御免疫応答を誘発する、という驚くべき発見に基づく。1つの特徴として、クレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質（前記は明瞭性の理由から本明細書では“H5タンパク質(1)”とも称される）は、配列番号：1に示すポリペプチド配列と少なくとも98％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか又は前記から成る。
“単一回ワクチン接種”とは、その1用量の後でブースターを必要とせず感染症の発生率又は重篤度の緩和に有効である免疫原性組成物を指す。
ある特徴では、本発明はしたがって、異なるクレードのH5N1ウイルス、すなわちそれぞれクレードとは異なるクレードのH5N1ウイルス又はクレード1を除く任意のクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法で使用する、クレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質(1)に関し、ここで前記H5タンパク質(1)は、配列番号：1のポリペプチド配列と少なくとも98％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか又は前記から成る。
【０００９】
本明細書で用いられる“クレード”という用語は、高度に病原性のトリインフルエンザウイルス（H5N1）のためのWHO命名システムのクレードに対応し、この命名システムは以下のWHOウェブサイトURLに要約されている：who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/nomenclature/en/ (12.08.2011)（前記は参照により本明細書に含まれる）。
ウイルスに関して10の別個の最初のクレード（0−9の番号が付けられている）が定義されており（WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group, 2008）、これらは第一次クレードと称される。クレードは、WHO/OIE/FAO H5N1進化担当グループによって作成された以下の3つの明確なクレード定義基準に適合するようにヌクレオチドレベルで厳密に規定される：
−共通の（クレード定義）ノードを共有すること；
−クレード定義ノードで（1000の近隣結合ブートストラップ反復後に）60以上のブートストラップ値を有する単系統群であること；
−クレード間及びクレード内のペアワイズヌクレオチドディスタンスの平均パーセンテージがそれぞれ＞1.5％及び＜1.5％であること。
これら10クレード内のウイルスが進化を続けるので、新規な亜系列（潜在的なH5N1クレード）がときどき出現する。これらの亜系列が最初の10クレード（0−9の番号を付けられている）と同じ上述の3つの明確なクレード定義基準に適合する場合、それらは別個のクレードに割り当てられる（WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008）。これら新規なクレードは第二次（又は第三次など）クレードと規定され、数字の‘アドレス’が割り当てられ、前記アドレスは階層性十進法ナンバリングシステムを用いて前記新規なクレードをそれらの元のクレードにリンクさせる。例えば、抗原的に別個のクレード2.3内では、クレード定義に適合する第三次クレードは、クレード2.3.1及び2.3.2などと割り当てられる。この論理的な階層性ナンバリングシステムはHAの系統発生と客観的関係を有する。
【００１０】
H5N1についてWHO命名システムにしたがえば、クレード指定に用いられる基準は以下のとおりである：
1．可能な場合には以前に指定されたクレード番号を維持（すなわちクレード2.2は2.2を維持し、クレード1は1を維持する）；
2．全ての利用可能な配列（大系統樹）から得られる系統樹を基にした新規なクレードの指定；
H5N1の先祖（Gs/Guangdong/1/96にもっとも近い）をクレード0に再割当て、
その後のクレードに3から始めて番号付与（すなわちクレード3−9）、
少なくとも4つの単離株が共有する別個の共通集合部の存在によるクレードの割当（単系グループ内で）、
単一クレードが2つ以上の別個の系列に進化するときには追加の分枝を指定（すなわちクレード2.2又はクレード2.3.1；共通ノードの共有及び単系統群による）
3．クレード間及びクレード内のペアワイズディスタンスの平均パーセンテージ（Kimura2-パラメーターを使用）；
別個のクレードは他のクレードとの間で1.5％を超える平均距離を有するべきである、
別個のクレードはクレード内では1.5％未満の平均距離を有するべきである（高度に進化したアウトライヤーを有するクレードではわずかに高いことがある；すなわちクレード7のCk/Shanxi/2/2006）
4．クレード定義ノードのブートストラップ値が60以上のブートストラップ（1000の近隣結合ブートストラップ反復に基づく）。
（以下の報告の表1から入手：WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008）。
【００１１】
各クレードのプロトタイプ株を下記の表に列挙する：
2014527526.tif 000002
（以下の報告の表2から入手：WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008）。
【００１２】
前記刊行物（WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008；前記文献は参照により本明細書に含まれる）は以下で見出される：CDCウェブサイトURL：cdc.gov/EID/content/14/7/e1.htm  (12.08.2011)
既知のH5N1ウイルスのクレード分類の概略は以下のWHOウェブサイトの系統樹で提供される、URL：who.int/csr/disease/avian_influenza/H5CompleteTree.pdf (15.08.2011)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
H5N1のH5タンパク質のクレードを決定するために、例えばウェブによるツール“高度に病原性のトリインフルエンザ（HPAI）H5N1 HAクレード予想（Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 HA clade prediction）”を用いることができる。前記は以下の論文に記載されている：Lu, Davis, Rowley, and Donis:“A Web-based tool for the clade designation of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses”in Options for the Control of Influenza VI. J.M. Katz, N. Cox & A.W. Hampson (Eds.) London: Blackwell, 2007（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。さらに前記は以下のウェブサイトでも見出される、URL：h5n1.flugenome.org/grouping.php (12.08.2011)。
【００１３】
例えば、クレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質（H5タンパク質(1)）はしたがって、H5N1について上記WHO命名システム記載のクレード1のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するHAである。
例えばクレード2.3.1 H5N1ウイルスは、したがってH5N1について上記WHO命名システム記載のクレード2.3.1の基準に収まる。
好ましい実施態様では、本発明のH5タンパク質(1)（すなわち本明細書に記載するクレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質）は、配列番号：1のポリペプチド配列と少なくとも98.1％、好ましくは少なくとも98.2％、より好ましくは少なくとも98.3％、もっとも好ましくは少なくとも98.4％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又は前記から成る。
【００１４】
本発明の関係における配列同一性は、タンパク質配列間で決定されるペアワイズ類似性によるものと理解される。2つの配列間のパーセント類似性の決定は、好ましくはコンピュータアルゴリズム、特に周知のベーシックローカルアラインメント検索ツール（Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ: Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990, 215(3):403-410）を用いて達成される。本発明の目的のために、アミノ酸配列のパーセント配列同一性はBLAST blastp相同性検索アルゴリズムにより以下のパラメーターを用いて決定される：予想閾値、10；ワードサイズ、3；BLOSUM62マトリックス、ギャップ開始ペナルティー、11；ギャップ伸長ペナルティー、1；及び条件構成スコアマトリックス調整。検索データベースは非重複タンパク質配列（nr）セットである。BLAST相同性検索アルゴリズムは以下に記載されている：Altschul SF (1990),J Mol Biol 1990, 215(3):403-410（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
変種は、例えば、シグナルペプチド（N-末端の16アミノ酸は配列番号：1では示されていない）をもたない参照分子（アクセッション番号BAE07201）と1から15アミノ酸残基だけ、1から10アミノ酸残基だけ（例えば6−10）、5アミノ酸残基だけ、4、3、2又は1アミノ酸残基だけ相違し得る。
【００１５】
ある例示的実施態様では、異なるクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法で使用する本発明のH5タンパク質配列(1)（すなわちクレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質）は、好ましくはH5タンパク質がアミノ酸223N及び改変328K+を有するインフルエンザH5タンパク質であり、ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置は配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらにここで、改変328K+は、H5タンパク質のアミノ酸328位で第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。好ましくは、そのようなH5タンパク質及び本発明のさらに別の任意のH5タンパク質は単離されたH5タンパク質である。
本明細書で用いられる“クレード1 H5N1のH5タンパク質(1)”という用語は、好ましくは“クレード1 H5N1ウイルスの単一抗原としてのH5タンパク質(1)”、又は特に“単一抗原としてのH5タンパク質(1)”を意味する。
本明細書で用いられる“ヘマグルチニン5（H5）”又は“トリインフルエンザウイルスのH5”又は“H5タンパク質”という用語は同意義であり、さらに、天然に存在する任意のH5タンパク質及びH5タンパク質の任意の改変型（H5タンパク質の任意の欠失、置換及び／又は挿入変異体を含む）を意味する（ただしこれらに限定されない）。
【００１６】
本明細書で用いられるH5タンパク質(1) Mut k+のアミノ酸の位置のナンバリングは、配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応する。配列番号：2は、アヒル/China/E319-2/03株のヘマグルチニンのアミノ酸配列を表すが、ただしアミノ末端の一ペプチドを欠いている。換言すれば、223位のアミノ酸（アミノ酸223）という場合、配列番号：2のアミノ酸223に対応するアミノ酸残基を意味する。しかしながら、このことは、本発明のH5タンパク質 Mut k+が配列番号：2と同一のアミノ酸配列を有することを意味しない。前記は、本発明のH5タンパク質の対応するアミノ酸が明示されたアミノ酸残基をコードすることを述べているだけである。この事例では、アミノ酸223はセリン（S）であろう。“223N”又は“155N”という用語は、それぞれ223位及び155位のアミノ酸（配列番号：2のアミノ酸の位置に対応するナンバリング）はアミノ酸アスパラギン（N）をコードするであろうということを例示的に示す。言い換えれば、“アミノ酸223Nを有するH5タンパク質(1)”という場合、アミノ酸223位で通常セリンをコードするH5アミノ酸分子（配列番号：2のアミノ酸の位置に一致するナンバリング）は、アスパラギン（N）によって置換されるであろう。“328K+”又は“改変328K+”という用語は、H5タンパク質の328位のアミノ酸で（配列番号：2のアミノ酸の位置に対応するナンバリング）、第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。328位及び329位のアミノ酸配列が天然でリジン-リジンをコードする事例では、更なるリジン（K）は挿入されないであろう。しかしながら、既知のH5配列の大半はアミノ酸328位及び329位でリジン-アルギニンをコードする。そのようないずれの事例でも、328K+改変という用語は、328位のリジンと329位のアルギニンの間に第二のリジン（K）が挿入されることを意味する。したがって改変された配列はリジン-リジン-アルギニン（KKR）と読めるであろう。
この例では、アヒル/China/E319-2/03株のヘマグルチニンがクレード1 H5N1のH5タンパク質(1)にシフトする。なぜならば、前記は、クレード1 H5N1ウイルスA/HongKong/213/2003（発生年/場所/宿主）のH5配列に類似し、クレード１特異的抗体との反応性を示すからである。したがって、Mut K+配列はクレード1 H5N1として分類される。本発明の文脈内では、したがってこの設計されたMut K+配列はクレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質と理解及び規定される。
したがって、本発明により、特に設計したH5タンパク質はいずれも、それが上記WHOのH5N1命名システムに一致するクレード1ヌクレオチド配列の基準を満たすヌクレオチド配列によってコードされるならば、クレード1 H5N1ウイルスのH5タンパク質として理解及び規定される。
【００１７】
したがってある実施態様では、本発明は、H5タンパク質及びH5タンパク質の任意の改変型（H5タンパク質の任意の欠失、置換及び／又は挿入変異体を含む）を提供し、ここで、それらH5タンパク質はアミノ酸223N及び改変328K+を有し、ここで、当該H5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+はH5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。本明細書で提供されるH5タンパク質のいずれも抗原性を有することは説明を要しない（前記は、それらが標準的なインフルエンザのヘマグルチニン阻害アッセイで抗原性特性を示すことを意味する）。
さらに別の実施態様にしたがえば、本発明はまたH5タンパク質(1)の任意の部分に関する。前記任意の部分は、標準的なヘマグルチニン阻害アッセイで抗原性を示す任意のペプチドフラグメントを意味し、ある実施態様では、前記は少なくともアミノ酸223N及び改変328K+を有し、ここで、当該H5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+はH5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。
【００１８】
H5タンパク質(1)は、（例えば実施例2で示す）標準的なヘマグルチニン阻害アッセイで血球凝集を阻害する場合、抗原性特性を示す。通常、前記H5タンパク質(1)の抗原性部分は、上記記載の改変又は非改変H5タンパク質をコードするアミノ酸配列の200、180、160、150、140、130、120、110又はもっとも好ましくは105の連続するアミノ酸を含む（前記は、実施例2に記載する標準的なヘマグルチニン阻害アッセイで抗原性特性を示す）。標準的なヘマグルチニン阻害アッセイはまた、例えば以下の文献（Stephenson et al., Virus Research vol. 103, pp. 91-95, 2004）に更なる参考文献とともに記載されている。しかしながら、実施例2に記載したHIアッセイは、本明細書に記載の本発明の全特徴に関係する対応参照アッセイであると理解されるであろう。
略記すれば、HIアッセイはHA特異的抗体の存在を検出するために実施される。HIアッセイでは異種H5N2ウイルス（A/ニワトリ/Mexico/232/94）が、4血球凝集単位（4HA単位）の濃度で用いられた。U底のマイクロタイタープレートで、PBS中の2倍連続血清希釈物を、続いて4HA単位のウイルスを含む等体積（25μL）と混合し、室温（約25℃）で30分インキュベートした。ニワトリ赤血球をPBS中で0.5％の濃度で血清-ウイルス含有ウェルに添加し、室温で40分インキュベートした。HI力価は、血球凝集阻害が観察される最高血清希釈の逆数として決定された。
【００１９】
特記すべきは、Haesebrouck and Pensaert（1986）は、“チャレンジウイルスに対するHI力価とチャレンジに対する防御との間に相関関係が存在し得る”ことを見出した。Haesebrouck and Pensaert（1986）はまた、40以上のHI力価を有するブタは、“チャレンジに対して完全に耐性を示し、チャレンジ時の気道でウイルスの複製は生じない”と決定した。したがって、ワクチン接種ブタで40以上のHI力価の上昇が防御と相関性を示すであろう（（F. Haesebrouck and M.B. Pensaert, 1986）。不活化インフルエンザH1N1ワクチンで以前に免疫した肥育豚の気管内チャレンジの効果（Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239-249）。等価又はほぼ等価のH5 HI力価はまたトリインフルエンザウイルスに対するブタの完全な免疫防御をもたらすと仮定しなければならない。これより低い力価は、少なくともワクチン接種動物の血清変換をもたらし、さらにこれら動物の部分的免疫防御をもたらし、このことはまた大流行のリスクを劇的に減少させ得る。
【００２０】
さらにまた、本発明のH5タンパク質(1)の抗原性部分はH5タンパク質の欠失変異体を含み（ただし前記に限定されない）、それらは、
i．アミノ酸223Nの周辺かつアミノ酸223Nを含むアミノ酸配列の少なくとも35、30、25、20、18、15、13、10、9、又はもっとも好ましくは8つの連続するアミノ酸；及び
ii．改変328K+アミノ酸の周辺かつ328K+を含むアミノ酸配列の少なくとも35、30、25、20、18、15、13、10、9、又はもっとも好ましくは8つの連続するアミノ酸を含み、さらに、
iii．ここで、H5タンパク質の上記抗原性部分のいずれも実施例2に記載の標準的なヘマグルチニン阻害アッセイでヘマグルチニン阻害を示す。
好ましくは、アミノ酸223N及び／又は328K+の周辺の上述のアミノ酸は、配列番号：2又は配列番号：5によってコードされる。
【００２１】
さらにまた、本発明の好ましいH5タンパク質(1)は以下である：
i．アミノ酸223N及び改変328K+を有する上記記載のもののいずれか；
ii．アミノ酸94N/223N及び改変328K+を有する上記記載のもののいずれか；
iii．アミノ酸223N及び改変328K+を有する鳥類由来の任意のH5タンパク質（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
iv．アミノ酸94N/223N及び改変328K+を有する鳥類由来の任意のH5タンパク質（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
v．アミノ酸155N/223N及び改変328K+を有する鳥類由来の任意のH5タンパク質（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
vi．アミノ酸120N/155N/223N及び改変328K+を有する鳥類由来の任意のH5タンパク質（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
vii．改変94N/223N及び改変328K+を有する任意のH5タンパク質；又は
viii．改変94N/155N/223N及び改変328K+を有する任意のH5タンパク質；又は
ix．改変94N/120N/155N/223N及び改変328K+を有する任意のH5タンパク質；又は
x．改変223N、改変328K+、及び以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有する任意のH5タンパク質：
a．aa93−95：GNF
b．aa123−125：SDH
c．aa128−130：SSG
d．aa138−140：GSS
e．aa226−228：MDF
f．aa270−272：EVE
g．aa309−311：NKL；又は
xi．アミノ酸 223N、及び改変328K+、及び以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有する任意のH5タンパク質：
a．aa93−95：GNF
b．aa128−130：SSG
c．aa138−140：GSS；又は
xii．配列番号：5のアミノ酸配列を有する任意のH5タンパク質。
【００２２】
さらにまた、本明細書で提供される好ましいH5タンパク質(1)は、Hoffmannら（PNAS, vol. 106, no.36, pp. 12915-12920 of September 6, 2005）が記載したH5タンパク質を含み、ここで当該H5タンパク質は上記に記載の改変の1つ以上、少なくともアミノ酸223N及び改変328K+を含み、ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+はH5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。
さらにまた、本明細書で提供される好ましいH5タンパク質(1)は、アミノ酸223N及び改変328K+を含むペプチド（ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+はH5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する）、並びに以下のi−viを含むH5タンパク質を含む：
i．配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、又は配列番号：7のアミノ酸配列；又は
ii．i）のポリペプチドと少なくとも85％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約90％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約95％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約97％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約98％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約99％の配列相同性を有し、上記に記載の標準的ヘマグルチニン阻害アッセイでヘマグルチニン阻害を有する任意のペプチド；又は
iii．i）又はii）のペプチドのいずれかの少なくとも35、30、25、20、18、15、13、10、9、又はもっとも好ましくは8つの連続するアミノ酸を含むi）又はii）のポリペプチドの任意の抗原性部分； 
iv．アミノ酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、223N、223N、又は120N/155Nを有するi）、ii）又はiii）の任意のペプチド；
v．以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するi）、ii）、iii）又はiv）の任意のペプチド； 
a．aa93−95：GNF
b．aa123−125：SDH
c．aa128−130：SSG
d．aa138−140：GSS
e．aa226−228：MDF
f．aa270−272：EVE
g．aa309−311：NKL；又は
vi．以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するi）、ii）、iii）又はiv）の任意のペプチド；
a．aa93−95：GNF
b．aa128−130：SSG
c．aa138−140：GSS。
【００２３】
本明細書で用いられる“配列相同性”は2つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、2つ以上の配列を最適にアラインメントさせ、必要な場合にはギャップを導入する。配列同一性とは対照的に、配列相同性を決定するときには保存的なアミノ酸置換がマッチとしてカウントされる。換言すれば、参照配列と95％の配列相同性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの85％、好ましくは90％、さらに好ましくは95％が、もう一方のアミノ酸又はヌクレオチドとマッチするか又は保存的置換を含まねばならず、或いは参照配列中の全アミノ酸残基又はヌクレオチドの15％まで、好ましくは10％まで、より好ましくは5％までの数のアミノ酸又はヌクレオチドを参照配列に挿入できる（保存的置換を含まない）。好ましくは、ホモローグ配列は、少なくとも50、より好ましくは100、さらに好ましくは250、さらに好ましくは500ヌクレオチドの一続きを含む。そのようなアラインメントに関して、配列相同性は1つずつ位置を確認される。例えば、個々の位置で当該ヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一であるならば、当該位置で配列は“ホモローグ”である。続いてそのような位置同一性の総数を参照配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基の総数で割って％配列相同性が得られる。配列相同性は公知の方法によって容易に計算できる。前記方法には以下の文献に記載されたものが含まれる（ただしこれらに限定されない）：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press, 1987;Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988（前記文献の教示は参照により本明細書に含まれる）。配列相同性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で最大のマッチを与えるように設計される。配列相同性を決定する方法は、与えられた配列間で配列同一性を決定する、公に利用可能なコンピュータプログラムとして集大成されている。そのようなプログラムの例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387, 1984）、BLASTP、BLASTN及びFASTA（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410, 1990）。BLASTXプログラムはNCBI及び他の供給源（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410, 1990（前記文献の教示は参照により本明細書に含まれる））から公開され利用可能である。これらのプログラムは、与えられた配列と参照配列との間で最高レベルの配列相同性を得るために、規定値ギャップ重を用いて最適に配列をアラインメントさせる。
さらにまた好ましいH5タンパク質(1)は、上記に記載の328K+改変及び表1に提供するアミノ酸配列又はその任意の免疫原性部分を含むH5タンパク質を含む：
【００２４】
表1：H5抗原
【００２５】
【表１】
2014527526.tif 000003
2014527526.tif 000004
【００２６】
#：表１で与えられるアミノ酸の位置は配列番号：2で例示として規定される位置である。換言すれば、表１のアミノ酸223は配列番号：2の配列のアミノ酸223を指す。
-：この位置のアミノ酸は参照配列と比較して変動性であることを示す。
【００２７】
さらに、本発明はまた、少なくともアミノ酸223N及び改変328K+を有するH5タンパク質(1)に関し（ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+は、H5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する）、さらにH5タンパク質(1)は以下のi）−v）を含む：
i．上記に記載の態様（上記記載の態様とは、野生型配列の部分ではない上記記載の223N及び328K+をこれらの配列が含むことを意味する）で改変された以下のNCBIアクセッション番号の配列を有するペプチド：AAT65209、CAJ32556、ABC47656、CAF21874、CAF21870、AAC58998、AAC58997、AAC58996、AAC58994、AAC58993、AAC58992、AAC58991、AAC58990、AAC58995、AAS45134、AAN17270、AAN17269、AAN17268、AAN17267、AAN17266、AAN17265、AAN17264、AAN17263、AAN17262、AAN17261、AAN17260、AAN17259、AAN17257、AAN17256、AAN17255、AAN17254、AAA43083、AAA43082、AAB19079、BAE48696、BAE48693、BAE48696、BAE48695、BAE48694、BAE48692、BAE48691、BAE48690、BAE48689、BAE48688、BAE48687、BAE48686、BAE48685、BAE48684、BAE48683、AAC58999、ABC72082、AAV91149、AAP71993、AAP71992、AAP71991、AAP71990、AAP71989、AAP72011、AAP72010、AAP72009、AAP72008、AAP72007、AAP72006、AAP72005、AAP72004、AAP72003、AAP72002、AAP72001、AAP72000、AAP71999、AAP71998、AAP71997、AAP71996、AAP71995、AAP71994、AAF9971、 ABF58847、AAG38534、AAC32102、AAC32099、AAL75847、AAC32101、AAC32098、AAC32088、AAC32078、AAR99628、AAC32100、AAM49555、AAL75843、AAL75839、AAD13573、AAD13568、AAF04720、AAF04719、AAC34263、AAR16155、AAD13574、AAD13570、AAD13575、AAD13572、AAD13569、AAD13567、AAD13566、AAK57506、AAG01225、AAG01215、AAG01205、AAG01195、若しくはABD83813；又は
ii．i）のポリペプチドと少なくとも85％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約90％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約95％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約97％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約98％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約99％の配列相同性を有し、上記に記載の標準的ヘマグルチニン阻害アッセイでヘマグルチニン阻害を有する任意のペプチド；
iii．アミノ酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263N、263T、又は120N/155Nを有するi）又はii）のペプチドのいずれか； 
iv．以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するi）、ii）又はiii）のそのようなペプチドのいずれか； 
a．aa93−95：GNF
b．aa123−125：SDH
c．aa128−130：SSG
d．aa138−140：GSS
e．aa226−228：MDF
f．aa270−272：EVE
g．aa309−311：NKL；又は
v．以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するi）、ii）、iii）又はiv）の任意のペプチド；
a．aa93−95：GNF
b．aa128−130：SSG
c．aa138−140：GSS。
【００２８】
好ましくは、異なるクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法で使用するH5タンパク質(1)は、組換えにより発現されるか、及び／又はバキュロウイルス発現系によって、好ましくは培養昆虫細胞で生成される。
したがって、本明細書に記載の“H5タンパク質(1)”という用語は、特に本明細書で用いられる“組換えH5タンパク質(1)”と同義である。
本明細書に記載する異なるクレードのH5N1ウイルスに関して、前記異なるクレードのH5N1ウイルスは、好ましくはクレード0 H5N1ウイルス、クレード2 H5N1ウイルス、クレード3 H5N1ウイルス、クレード4 H5N1ウイルス、クレード5 H5N1ウイルス、クレード6 H5N1ウイルス、クレード7 H5N1ウイルス、クレード8 H5N1ウイルス及びクレード9 H5N1ウイルスから成る群から選択される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、異なるクレードのH5N1ウイルスはクレード2.2 H5N1ウイルス又はクレード2.3 H5N1ウイルスである。
本発明の特に好ましい実施態様では、異なるクレードのH5N1ウイルスはクレード2.2.1 H5N1ウイルス又はクレード2.3.2 H5N1ウイルスである。
明瞭性という理由から、異なるクレードのH5N1ウイルスのH5タンパク質は、以降では“H5タンパク質(2)”と称する。したがって、本明細書に記載するH5タンパク質(2)は、特にクレード1を除く任意のクレードのH5N1のゲノムによってコードされるH5タンパク質である。
【００２９】
さらになお好ましい実施態様では、異なるクレードのH5N1ウイルスは、北アフリカ人又はベトナム人由来のH5N1ウイルスであり、ここで北アフリカ人由来の前記H5N1ウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスのH5タンパク質(2)を含むH5N1ウイルスであり、ここで前記H5タンパク質(2)は、
（a）アミノ酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T及び181N（改変145(-)はH5のアミノ酸145位は欠失していることを意味する）；又は
（b）アミノ酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G及び421K；又は
（c）アミノ酸145L、172T及び254Vを有し、
さらにここで、H5タンパク質(2)のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：8で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応するか、又は
前記H5タンパク質(2)は、配列番号：9から46に示す配列のいずれか1つと少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、又は特に好ましくは100％のホモローグであるアミノ酸配列から成るか又は前記を含む。
本発明の文脈では、（a）に対応する前記H5タンパク質(2)はサブクレードAタンパク質であり、さらに（b）又は（c）に対応する前記H5タンパク質はサブクレードBタンパク質である。
本発明の文脈では、“アミノ酸”という用語は特に、アミノ酸残基、又は2つのさらに別のアミノ酸とペプチド結合により共有結合されてあるアミノ酸、又は当該アミノ酸が当該ペプチド配列のN-末端又はC-末端に位置する場合はさらに別の１つのアミノ酸をそれぞれ指す。
【００３０】
本発明のさらにより好ましい実施態様では、異なるクレードのH5N1ウイルスはH5タンパク質(2)を含み、
前記H5タンパク質(2)は
（a）アミノ酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T及び181N；又は
（b）アミノ酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G及び421K；又は
（c）アミノ酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H及び254V、
を有する、及び／又は、
前記H5タンパク質(2)は、
i．配列番号：9から46のアミノ酸配列のいずれか1つ；
ii．I）のポリペプチドに対し少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも96％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、もっとも好ましくは100％の配列相同性を有し、さらに標準的ヘマグルチニン阻害アッセイでヘマグルチニン阻害を構成する任意のペプチド；又は
iii．i）又はii）のそのようなペプチドのいずれかの少なくとも334の連続するアミノ酸を含み、さらにそのようなペプチドのいずれも標準的なヘマグルチニン阻害アッセイにおいてヘマグルチニン阻害を構成する、i）又はii）のポリペプチドの任意の部分、
を含むペプチドを含む、及び／又は、
前記H5タンパク質(2)は、配列番号：9から46に示す配列のいずれか1つと少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、もっとも好ましくは100％の配列同一性を有する連続アミノ酸配列から成るか又は前記を含む。
より具体的には、異なるクレードのH5N1ウイルスは、好ましくは配列番号：15又は20に示す配列のいずれか1つと少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、又は特に好ましくは100％ホモローグであるアミノ酸配列から成るか又は前記を含むH5タンパク質(2)を含み、さらにここで、配列番号：20に示すアミノ酸配列を含むか又は前記から成るH5タンパク質(2)が特により好ましい。
【００３１】
特に本発明は、以下の（A）又は（B）の感染症を治療又は予防する本明細書に記載のH5タンパク質(1)に関する：
（A）北アフリカ人由来のサブクレードA H5N1ウイルスによる感染症、すなわち請求項13又は14の（a）に記載のアミノ酸を有するH5タンパク質(2)を含むH5N1ウイルス、又は配列番号：9から19又は42若しくは43に示す配列のいずれか1つに関連する請求項16又は17に記載のH5タンパク質を含むH5N1ウイルスによる感染症；又は
（B）北アフリカ人由来のサブクレードB H5N1ウイルスによる感染症、すなわち請求項13又は14の（b）若しくは（c）に記載のアミノ酸を有するH5タンパク質を含むH5N1ウイルス、又は配列番号：20から41又は44から46に示す配列のいずれか1つに関連する請求項16又は17に記載のH5タンパク質を含むH5N1ウイルスによる感染症。
【００３２】
さらに別の実施態様にしたがえば、本発明はまた、異なるクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法で使用する、上記に記載のH5タンパク質(1)のいずれかをコードする核酸分子に関する。好ましくは、これらの核酸分子はRNA、DNA又はcDNA分子である。したがって本発明は、核酸分子、好ましくはcDNA分子に関し、前記はH5タンパク質又はH5タンパク質の任意の改変型（任意の欠失、置換及び／又は挿入変異体を含む）をコードし、ここでこれらH5タンパク質はアミノ酸223N及び改変328K+を有し、H5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+は、H5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。
さらに別の実施態様にしたがえば、本発明はまた核酸分子、好ましくはH5タンパク質(1)の任意の部分をコードするcDNA分子に関し、前記任意の部分をコードするとは、上記記載の標準的ヘマグルチニン阻害アッセイで抗原性特性を示す任意のペプチドフラグメントをコードすること及び少なくともアミノ酸223N及び改変328K+を有することを意味し、ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+は、H5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。通常そのような核酸分子（H5タンパク質の抗原性部分をコードする）は、上記記載のH5タンパク質（改変又は非改変）をコードするヌクレオチド配列の600、540、480、450、420、390、360、330又はもっとも好ましくは315の連続するヌクレオチドを含み、当該H5タンパク質の抗原性部分は、本明細書に記載の標準的ヘマグルチニン阻害アッセイで抗原性特性を示す。
【００３３】
H5タンパク質(1)の抗原性部分のさらに別の実施態様は上記に記載されている。上記記載のH5タンパク質の抗原性部分をコードするそのような核酸分子、好ましくはcDNAを構築することは、当業者の一般的知識である。前記はまた、H5タンパク質の欠失変異体を含む上記記載のH5タンパク質の抗原性部分をコードする核酸分子（好ましくはcDNA分子）の構築を含み（ただし前記に限定されない）、前記核酸分子は、
i．アミノ酸223Nをコードするコード配列の周辺かつ前記を含むヌクレオチド配列の少なくとも105、90、75、60，48、45、39、30、27、又はもっとも好ましくは24の連続するアミノヌクレオチド；及び
ii．改変328K+をコードするコード配列の周辺かつ前記を含むヌクレオチド配列の少なくとも105、90、75、60，48、45、39、30、27、又はもっとも好ましくは24の連続するアミノヌクレオチドを含み、
iii．ここで、H5タンパク質のそのような抗原性部分のいずれも、実施例2に記載の標準的なヘマグルチニン阻害アッセイでヘマグルチニン阻害を示す。
好ましくは、アミノ酸223N及び／又は328K+をコードするヌクレオチドのこれら周辺ヌクレオチドは、配列番号：2又は配列番号：5をコードする。
【００３４】
さらにまた、本発明のH5タンパク質(1)をコードする好ましい核酸分子は以下である：
i．アミノ酸223N及び改変328K+をコードする上記記載のもののいずれか；
ii．アミノ酸94N/223N及び改変328K+をコードする上記記載のもののいずれか；
iii．アミノ酸223N及び改変328K+をコードする鳥類由来の任意の核酸分子（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
iv．アミノ酸94N/223N及び改変328K+をコードする鳥類由来の任意の核酸分子（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
v．アミノ酸155N/223N及び改変328K+をコードする鳥類由来の任意の核酸分子（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
vi．アミノ酸120N/155N/223N及び改変328K+を有する鳥類由来のH5タンパク質をコードする任意の核酸分子（ここで鳥類由来とは、H5配列が、トリインフルエンザウイルス5型に感染した家禽から最初に単離されたウイルス単離株に由来することを意味する）；又は、
vii．改変94N/223N及び改変328K+を有するH5タンパク質をコードする任意の核酸分子；又は
viii．改変94N/155N/223N及び改変328K+を有するH5タンパク質をコードする任意の核酸分子；又は
ix．改変94N/120N/155N/223N及び改変328K+を有するH5タンパク質をコードする任意の核酸分子；又は
x．改変223N、改変328K+、及び以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するH5タンパク質をコードする任意の核酸分子：
a．aa93−95：GNF
b．aa123−125：SDH
c．aa128−130：SSG
d．aa138−140：GSS
e．aa226−228：MDF
f．aa270−272：EVE
g．aa309−311：NKL；又は
xi．アミノ酸 223N、改変328K+、及び以下から成る群から選択されるアミノ酸クラスターの1つ以上を有するH5タンパク質をコードする任意の核酸分子：
a．aa93−95：GNF
b．aa128−130：SSG
c．aa138−140：GSS；又は
xii．配列番号：5のアミノ酸配列を有するH5タンパク質をコードする任意の核酸分子。
【００３５】
さらにまた、本明細書で提供される好ましいH5タンパク質(1)は、Hoffmannら（PNAS, vol. 106, no.36, pp. 12915-12920 of September 6, 2005）が記載したH5タンパク質を含み、ここで当該H5タンパク質は上記に記載の改変の1つ以上、少なくともアミノ酸223N及び改変328K+を含み、ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+はH5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する（前記引用文献の開示は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。したがってさらに別の実施態様にしたがえば、本発明はまた、任意の核酸分子、好ましくはHoffmannら（PNAS, vol. 106, no.36, pp. 12915-12920 of September 6, 2005）が記載したそのようなタンパク質のいずれかをコードするcDNA分子に関し、ここで当該H5タンパク質は上記に記載の改変の1つ以上、少なくともアミノ酸223N及び改変328K+を含み、ここでH5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+はH5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する。
インフルエンザウイルスのH5タンパク質のコード配列を含むヌクレオチド配列内に上記記載の改変のいずれかを導入する方法は当業界では周知である。例えば、更なる参考文献とともにUS6,951,754に記載された方法にしたがって、完全なインフルエンザウイルスのゲノム配列を本発明にしたがって改変することができる。
【００３６】
さらにまた当業界の通常的な分子生物学、微生物学及び組換えDNA技術を利用して、本明細書に記載の抗原をコードする核酸配列を改変できる。そのような技術は複数の刊行物で完全に説明されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994。
さらに別の実施態様にしたがえば、本発明はまた、上記に記載のそのような核酸分子のいずれかを含むベクターに関する。換言すれば、本発明は、上記記載の任意のH5タンパク質(1)又はその部分のコード配列を含むベクターに関する。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターであり、前記ベクターは上記記載の任意のH5タンパク質(1)又はその部分を発現させる。本発明のベクターは、in vitro又はin vivoでの細菌細胞、酵母細胞若しくは動物細胞へのトランスフェクション又は感染に適切なベクターである。
【００３７】
ベクター及び発現のためにベクターを作製及び／又は使用する方法は、以下の文献に開示された方法によるか、又はそれらと類似し得る（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）：米国特許4,603,112号、4,769,330号、5,174,993号、5,505,941号、5,338,683号、5,494,807号、4,722,848号、5,942,235号、5,364,773号、5,762,938号、5,770,212号、5,942,235号、382,425号、PCT公開公報WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virus vectors to vaccination: An update,”PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss,“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,”PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., 米国特許4,745,051号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39,“Baculovirus Expression Protocols”(1995 Humana Press Inc.)；Smith et al.,“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al.,“Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector,”Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406；EPA0 370 573；米国特許出願No. 920,197（1986年10月16日出願）；欧州特許出願公開公報No. 265785；米国特許4,769,331号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman,“The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,”PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al.,“The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,”PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al.“Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”,PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al.,“Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,”PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075,1991；米国特許5,591,439号、5,552,143号；WO 98/00166；受付米国特許出願08/675,556及び08/675,566（ともに1986年7月3日出願（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992,“Adenovirus as cloning vectors,”Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65；Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561；Science, 259: 1745-49,1993；及びMcClements et al.,“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”,PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996及び米国特許5,591,639号、5,589,466号及び5,580,859号、並びにWO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang et al., Nature and Furth et al. Analytical Biochemistry（特にDNA発現ベクターに関する）。さらにまた以下とともに本明細書に引用した他の記載を参照されたい：WO 98/33510；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739,1998（レンチウイルス発現系）；Sanford et al.,米国特許4,945,050号；Fischbachet al. (Intracel)WO 90/01543；Robinson et al., （セミナー）Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)（DNAベクター系）；Szoka et al.,米国特許（生細胞へのDNAの挿入方法）；McCormick et al.,米国特許5,677,178号（細胞傷害性ウイルスの使用）；及び米国特許5,928,913号（遺伝子デリバリー用ベクター）。
ウイルスベクター（例えば以下から選択される：ブタヘルペスウイルス（例えばオージェツキー（Aujeszky）病ウイルス）、ブタアデノウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、及びブタポックスウイルス）とともにDNAベクター（DNAプラスミド）が、本発明の実施には有利に用いられる。
【００３８】
本発明のHタンパク質(1)の生成方法
別の特徴にしたがえば、本発明は、：i）H5 DNAコード配列を含む組換えウイルスベクターで培養下の感受性細胞を感染させる工程（ここでH5タンパク質は組換えウイルスベクターによって発現される）及びii）その後、細胞培養からH5タンパク質を回収する工程によって、大量の組換えH5タンパク質を生成及び／又は回収する方法を提供する。大量のH5タンパク質とは、約20μg/mL細胞培養を超える、好ましくは約25μg/mLを超える、さらに好ましくは約30μg/mLを超える、さらに好ましくは約40μg/mLを超える、さらに好ましくは約50μg/mLを超える、さらに好ましくは約60μg/mLを超える、さらに好ましくは約80μg/mLを超える、さらに好ましくは約100μg/mLを超える、さらに好ましくは約150μg/mLを超える、もっとも好ましくは約190μg/mLを超える（ただし前記に限定されない）ことを意味する。
好ましい実施態様にしたがえば、H5タンパク質(1)は、H5タンパク質を発現するSF+細胞全体（すなわち無傷の細胞）を採集することによって回収される。
好ましい細胞は、H5 DNAを含みH5タンパク質(1)を発現する適切な組換えウイルスベクターによる感染に感受性を有する細胞である。好ましくは、当該細胞は昆虫細胞であり、より好ましくは、それらは商品名SF+細胞（Protein Sciences Corporation, Meriden, CT）として販売されている昆虫細胞を含む。好ましい細胞培養は、約0.3−2.0ｘ106細胞/mL、より好ましくは約0.35−1.9ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.4−1.8ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.45−1.7ｘ106細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5−1.5ｘ106細胞/mLの細胞数を有する。
【００３９】
好ましいウイルスベクターにはバキュロウイルス（例えばBaculoGold, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）が含まれるが、特に産生細胞は昆虫細胞であることを条件とする。バキュロウイルス発現系が好ましいが、他の発現系も本発明の目的のために（すなわち細胞培養の上清へのH5発現のために）機能することは当業者には理解されよう。そのような他の発現系は、培養液中へH5を発現させるためにシグナル配列の使用を必要とする。
適切な増殖培養液もまた当業者によって決定され、好ましい増殖培養液は無血清昆虫細胞培養液、例えばExcell420（JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS）などである。
H5 DNA配列を含む組換えウイルスベクターは、当該感受性細胞の感染に用いるときは約0.03−1.5、より好ましくは約0.05−1.3、さらに好ましくは約0.09−1.1、もっとも好ましくは約0.1−1.0の感染多重度（MOI）を有する。好ましくは、本明細書に記載の方法は、約0.03−1.5、より好ましくは約0.05−1.3、さらに好ましくは約0.09−1.1、もっとも好ましくは約0.1−1.0のMOI（感染の多重度）で、H5 DNAを含みH5タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを0.35−1.9ｘ106細胞/mL、より好ましくは約0.4−1.8ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.45−1.7ｘ106細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5−1.5ｘ106細胞/mLに感染させる工程を含む。
【００４０】
続いて、10日間までのある期間、より好ましくは約2日から約10日間、さらに好ましくは約4日から約9日間、もっとも好ましくは約5日から約8日間感染細胞をインキュベートする。好ましインキュベーション条件は、約22−32℃、より好ましくは約24−30℃、さらに好ましくは約25−29℃、さらに好ましくは約26−28℃、もっとも好ましくは約27℃の温度を含む。好ましくは、接種後SF+細胞は特徴的なバキュロウイルス誘発変化について観察される。そのような観察には、感染後期間における細胞密度の動向及び生存率の低下のモニタリングを含むことができる。ウイルス力価のピークは感染後3−5日に観察され、細胞内H5タンパク質発現のピークは5から8日の間、及び／又は細胞生存率が10％未満に低下するときに観察されることが見出された。
したがって、本発明のある特徴は、i）培養下の多数の感受性細胞（上記参照）を上記記載のMOIで組換えウイルスベクターに感染させ、ii）当該組換えウイルスベクターによってH5タンパク質を発現させ、さらにiii）その後感染から5から8日後に及び／又は細胞生存率が10％未満に減少したときに得られた細胞からH5タンパク質を回収することによって、組換えH5タンパク質を好ましくは上記に記載のレベルで生成及び／又は回収する方法を提供する。好ましくは、組換えウイルスベクターは、H5 DNAコード配列を含む組換えバキュロウイルスであり、細胞はSF+細胞である。さらにまた、培養は、感染後期間中に夾雑の巨視的又は顕微鏡的徴候について又は細胞形態学における非典型的な変化について周期的に試験することが好ましい。何らかの夾雑を示すいずれの培養も廃棄されるべきである。
【００４１】
免疫原性又は免疫学的組成物（例えばワクチン）で用いられるH5タンパク質(1)の回収のために、不活化工程を含むことはウイルスベクターの不活化のために好ましい。
“免疫原性又は免疫学的組成物”とは、問題の組成物又はワクチンに対して宿主で細胞性及び／又は抗体媒介性免疫応答を誘引する少なくとも1つの抗原を含む物質の組成物を指す。通常、“免疫学的応答”には1つ以上の以下の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：問題の組成物又はワクチンに含まれる1つに抗原又は複数の抗原に対して特異的に誘導される抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び／又は細胞傷害性T細胞及び／又はガンマ-デルタT細胞の生成又は活性化。好ましくは、新規な感染に対する抵抗性が強化され、及び／又は当該疾患の臨床的重篤度が低下するように、宿主は治療的又は防御的な免疫学的応答を示すであろう。そのような防御は、感染宿主が通常示す症状の緩和又は欠如、より短い回復期間及び／又は感染宿主におけるより低いウイルス力価によって示されるであろう。
【００４２】
本明細書で用いられるように、“ワクチン”とは、当業者が用いるそのままの用語を指す。より具体的には、“ワクチン”は、その必要がある動物に投与したとき、インフルエンザ感染症の発生率の低下又はその臨床徴候の重篤度の低下（そのような臨床徴候の完全な予防を含む）をもたらす免疫原性組成物を指す。好ましくは、発生率又は重篤度の低下は、本発明の組成物を与えられなかったが、感染性レベルのインフルエンザウイルス（通常は臨床徴候を出現させるインフルエンザ感染をもたらす）に曝露された動物又は動物グループと比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％である。
【００４３】
本発明はまた、以下の工程によって組換えH5タンパク質を、好ましくは上記記載の量で生成及び／又は回収する方法に関する：i）培養下の多数の感受性細胞（上記参照）を組換えウイルスベクターにより上記記載のMOIで感染させ、ii）当該組換えウイルスベクターによってH5タンパク質を発現させ、iii）感染から5から8日後に及び／又は細胞生存率が10％未満に低下したときに得られる細胞で発現されたH5を回収し、さらにiv）当該組換えウイルスベクターを不活化する。
好ましくは、この不活化はろ過工程直前又は直後に実施され、ろ過工程後が不活化の好ましい時期である。本発明の目的のためには、いずれの通常的不活化方法も用いることができる。したがって、不活化は、化学的及び／又は物理的処理によって実施できる。好ましい形態では、採集液の体積を測定し、温度は約32−42℃、より好ましくは34−40℃、もっとも好ましくは約35−39℃にする。好ましい不活化方法は、環状化バイナリーエチレンジアミン（BEI）の添加を含み、好ましくは、濃度は約1から約20mM、好ましくは約2から10mM、さらに好ましくは約2から約8mM、さらに好ましくは約3から約7mM、もっとも好ましくは約5mMである。例えば、不活化は、好ましくは約0.4Mの臭化水素酸2-ブロモエチレンアミン溶液（0.3NのNaOHで0.2Mのバイナリーエチレンイミン（BEI）に環状化されてある）の添加を含み、前記は液体に添加されて約5mMのBEIの最終濃度を生じる。続いて当該液体を持続的に72−96時間攪拌し、採集不活化液は-40℃以下又は1−7℃で保存できる。不活化完了後に、チオ硫酸ナトリウム溶液を好ましくは1.0Mで添加して残留BEIの一切を中和する。好ましくは、チオ硫酸ナトリウムは不活化前に添加したBEIに対して等量で添加される。例えば、BEIが5mMの最終濃度で添加される場合には、1.0Mのチオ硫酸ナトリウムは最終濃度5mMを生じるように添加され、一切の残留BEIが中和される。
【００４４】
したがって、本発明のさらに別のある特徴は、以下の工程によって組換えH5タンパク質を、好ましくは上記記載の量で生成する方法に関する：i）培養下の多数の感受性細胞（上記参照）を組換えウイルスベクターにより上記記載のMOIで感染させ、ii）当該組換えウイルスベクターによってH5タンパク質を発現させ、iii）感染から5から8日後に及び／又は細胞生存率が10％未満に低下したときに得られる細胞で発現されたH5を回収し、さらにiv）当該組換えウイルスベクターを不活化する。好ましくは、組換えウイルスベクターはH5 DNAコード配列を含むバキュロウイルスであり、細胞はSF+細胞である。好ましい不活化工程は上記記載の工程である。好ましくは、不活化は35−39℃で2から8mMのBEIの存在下で、より好ましくは約5mMのBEIの存在下で実施される。
本発明のさらに別のある特徴にしたがえば、上記記載の方法はまた工程iv）の後で中和工程を含む。この工程v）は、溶液内の不活化剤を中和する等量の薬剤の添加を含む。好ましくは、当該不活化剤がBEIであるならば、等量のチオ硫酸ナトリウムの添加が好ましい。したがって、さらに別の特徴にしたがえば、工程v）は、不活化剤がBEIであるときは、チオ硫酸ナトリウムの最終濃度約約1から約20mM、好ましくは約2から10mM、さらに好ましくは約2から約8mM、さらに好ましくは約3から約7mM、もっとも好ましくは約5mMへの添加を含む。
【００４５】
好ましい形態では、特に免疫原性組成物（例えばワクチン）で組換えH5タンパク質を使用する形態では、足場依存性バキュロウイルス感受性昆虫細胞（例えばSf9細胞）の継代によって採集H5タンパク質の各ロットが不活化について試験されるであろう。この試験の好ましい形態では、150cm2の適切な単層細胞培養に1.0mLの不活化H5液を接種し、少なくとも2継代して14日間25−29℃で維持する。この維持期間の終了時に、H5バキュロウイルスに典型的な細胞傷害効果（CPE）について単層細胞を調べる。好ましくは、陽性ウイルスコントロールも使用する。そのようなコントロールは、非不活化参照H5バキュロウイルスに感染させたSf9細胞の1つの培養及び未接種で維持したSf9細胞の1フラスコから成る。インキュベーション及び継代の後で、BEI処理ウイルス液でウイルス感染細胞が存在しなければ、満足な不活化試験を構成するであろう。参照ウイルスを接種されたコントロール細胞はH5バキュロウイルスに典型的なCPEを示すはずであり、非接種フラスコはH5バキュロウイルスCPEのいかなる徴候も示してはならない。或いは、前記維持期間の終了時に、上清サンプルを収集し、Sf9の96ウェルプレートに接種できよう（Sf9の96ウェルプレートはSf9細胞を加え、25−29℃で5−6日間維持されてある）。続いて前記プレートを固定し、FITC結合抗H5抗体又はバキュロウイルス特異的タンパク質（すなわちgp64）に対する任意の標識抗体で染色する。BEI処理ウイルス液で、CPE、H5発現、又はバキュロウイルス特異的タンパク質（すなわちgp64）の発現が存在しなければ、満足な不活化試験を構成する。参照ウイルスを接種されたコントロール細胞はCPE及びIFA活性を示すはずであり、非接種フラスコはH5バキュロウイルスCPEのいかなる徴候も示さず、IFA活性を含んではならない。
【００４６】
したがって、本明細書に記載のさらに別の特徴は、H5タンパク質(1)を発現する組換えウイルスベクターの不活化有効性を決定する不活化試験に関し、前記は以下の工程を含む：i）組換えウイルスベクターを含む培養液の少なくとも一部分を不活化剤（好ましくは上記記載の不活化剤）と接触させ、ii）中和剤（好ましくは上記記載の中和剤）を添加して前記不活化剤を中和し、さらにiii）上記記載のアッセイによって残留感染性を決定する。
不活化後に、サンプル中の組換えH5タンパク質の相対量を多数の態様で決定できる。好ましい定量方法にはSDS-PAGEデンシトメトリー、ELISA及び動物ワクチン接種試験が含まれる（前記は臨床所見（血清学など）に関して既知のワクチン定量と相関性を有する）。定量にSDS-PAGEを利用するとき、種々の既知量の組換えH5タンパク質を含むサンプルと一緒に未知量の組換えH5タンパク質を含むサンプル材料をゲルで泳動させる。続いて既知サンプルを基準にして標準曲線を作成し、未知サンプル中の組換えH5の量を標準曲線との比較により決定できる。ELISAは、抗原定量について概ね工業標準として認識されているので、定量には前記が好ましい。
【００４７】
H5タンパク質(1)又は前記をコードする核酸分子若しくはベクターを含むワクチン
本発明はさらに、異なるクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法で使用する、特に本明細書に記載する異なるクレードのH5N1ウイルスによる感染症を治療又は予防する任意の方法で使用する、（a）本明細書に記載のH5タンパク質(1)及び（b）不活化ニューカッスル病ウイルス、の組合せ物を提供する。
前記組合せ物はまた下記では“本明細書に記載の組合せ物”と称される。
本発明にしたがえば、本明細書に記載の組合せ物は多価混合ワクチンに含まれるか、又は本明細書に記載の組合せ物は、特に混合ワクチン、より具体的には本明細書に記載のH5タンパク質(1)及び不活化ニューカッスル病ウイルスの最大24時間以内の動物（特に家禽）又はその必要があるヒトへの投与に向けられることは理解されよう。
好ましくは、不活化ニューカッスル病ウイルスは不活化全ニューカッスル病ビリオンである。
別の好ましい実施態様では、不活化ニューカッスル病ウイルスは、配列番号：51に示すポリヌクレオチド（ラソタ（LaSota）ウイルス株のcDNA配列、既に不活化されてある）のRNAコピーと少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、又は特に100％の配列同一性を有するRNAポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルスの不活化によって得られる不活化ニューカッスル病ウイルスである。
【００４８】
特に不活化ニューカッスル病ウイルスは不活化ニューカッスル病ウイルスLaSota株のウイルスである。
ある好ましい実施態様では、不活化ニューカッスル病ウイルスは、ホルムアルデヒド、バイナリーエチレンイミン（BEI）、ベータ-プロピオ-ラクトン（BPL）及び前記の組合せから成る群から選択される試薬で不活化されてあるニューカッスル病ウイルスである。
本明細書に記載の組合せ物中の不活化ニューカッスル病ウイルスの量は、好ましくは102から1010の鶏卵感染用量（egg infectious dose；EID50）、好ましくは106から109、特に好ましくは107から109 EID50である。本明細書に記載の組合せ物中のH5タンパク質(1)の量は、好ましくは下記に記載する量である。
本発明のH5タンパク質(1)の量は、10−1000血球凝集単位(UAU)/用量、より好ましくは50−950 HAU/用量、さらに好ましくは100−900 HAU/用量、さらに好ましくは200−800 HAU/用量、さらに好ましくは300−700 HAU/用量、さらに好ましくは300−500 HAU/用量である。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は一般的に以下を含むワクチン又は医薬組成物に関する：
i．本明細書に記載のH5タンパク質(1)の1つ以上又は本明細書に記載の組合せ物；
ii．そのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードする、本明細書に記載の核酸分子の1つ以上；及び／又は
iii．そのような核酸分子のいずれかを含み、さらに本明細書に記載のH5タンパク質(1)のいずれかをコードする、本明細書に記載のベクターの1つ以上；及び
iv．医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤。
本明細書で用いられる“医薬組成物”、“医薬／ワクチン組成物”という用語は、感染の緩和又は予防のためのワクチン、又は感染の治療及び軽減のための物質の組成物を含む（ただしこれらに限定されない）。
インフルエンザヘマグルチニンをコードする核酸（好ましくはcDNA）を基剤とするワクチンの調製は、例えば以下に記載されている：Deck et al, Vaccine 1997; 15(1):71-78；Ulmer et al., Science 1993; 259:1745-1749；Ulmer et  al., Vaccine 1994;12(16):1541-1544。これらの方法のいずれも、本明細書に記載のインフルエンザH5タンパク質をコードする核酸（好ましくはcDNA）を基剤とするワクチンの製造に用いることができる。
【００４９】
さらにまた、ワクチン（本明細書に記載のH5タンパク質(1)またはその部分を含む）は、通常的なアプローチ、例えば組換え体発現技術又は生化学的精製及び分離技術によって製造してもよい。組換え体発現技術（昆虫細胞での発現を含む）は当業界では周知であり、例えば以下の文献に記載されている：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994。十分に確立された組換え体発現系のさらに別の例は、細菌発現系、例えば大腸菌（E. coli）又は枯草菌（B. subutilis）、酵母系発現系、例えばS.セレビシアエ（S. cerevisiae）又はS.ポンベ（S. pombe）、又は哺乳動物細胞発現系、例えばBHK、CHO及び／又はNS0系発現系である。そのような系は当業界で周知であり、例えば概ね業者（Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, USA）から市場で入手できる。さらに別の発現方法は、例えば以下に記載されている：Luschow et al., Vaccine no. 19 (2001), pp. 4249-4259；又はVeit et al., PNAS vol. 103 (2006), pp. 8197-8202。さらにまた、組換えアデノ関連ウイルス系が十分に確立され、例えばUS 5,436,146又はWO200203872に更なる参考文献とともに記載されている。さらにまた、ワクシニア（ポックス）ウイルス系の発現系（例えばUS 6,265,183に更なる参考文献とともに記載されている）もまた十分に確立され、本発明にしたがって使用される組換え体抗原、抗原性組成物の製造に適切である。さらに別の適切な発現系は組換えパポーバウイルス、例えばSV40、トリポックスウイルス、偽似狂犬病ウイルス及びレトロウイルスを利用する。
【００５０】
本明細書に記載する関連医薬／ワクチン組成物はまた、本明細書に記載のH5タンパク質(1)を含む不活化ウイルス、本明細書に記載のH5タンパク質(1)を含む生ウイルスの非病原性型、ウイルスの調製物及び／又はフラグメント（ここで前記調製物及び／又はフラグメントは本明細書に記載のH5タンパク質(1)を含む）を含むことができる。
当業者は、抗原と一緒に前記組成物／ワクチンに含まれ得る追加の成分を認識していよう（例えば以下を参照されたい：Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton）。当業者は公知の注射可能な生理学的に許容できる無菌的溶液を用いることができる。即席溶液を調製するために、等張な水溶液、例えば食塩水又は対応する血漿タンパク質溶液を容易に利用できる。当該医薬組成物／ワクチンは、凍結乾燥物又は乾燥調製物（無菌的条件下で既知の注射可能な溶液を用いて例えばキットの部分として使用直前に再構成できる）として存在し得る。
さらにまた、本発明の医薬／ワクチン組成物は獣医学的に許容できる1つ以上の担体を含むことができる。本明細書で用いられる“獣医学的に許容できる担体”には、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着延長剤などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれる。安定化剤にはとりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸が含まれる。
本明細書で用いられる保存料は、抗菌活性剤、例えばゲンタマイシン、マーチオレートなどを指す。特に保存料の添加は、マルチ用量組成物の調製にもっとも好ましい。これらの抗菌活性剤は、一切の微生物学的汚染について又は対象組成物内での一切の微生物学的増殖の抑制について当該対象組成物の保護に有効な濃度で添加される。
本明細書で用いられる“アジュバント”には、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンが含まれ得る。
【００５１】
エマルジョンは特に以下を基剤にできる：軽流動パラフィン油（欧州局方型）；イソプレノイド油、例えばスクァラン又はスクァレン；アルケン（特にイソブテン又はデセン）のオリゴマーから生じる油；酸のエステル又は鎖式アルキル基を含むアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ-(カプリレート/カプレート)、又はプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。油は乳化剤と一緒に用いられ、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特に以下のエステル：ソルビタン、マンニド(例えばオレイン酸アンヒドロマンニトール)、グリコール、プロピレングリコール、及びオレイン酸-、イソステアリン酸-、リシノール酸-又はヒドロキシステアリン酸（前記は場合によってエトキシル化される）、並びにポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック（Pluronic）の製品、特にL121である（以下を参照されたい：Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, pp51-94, 1995；及びTodd et al., Vaccine 15:564-570, 1997）。適切な水中油エマルジョンの例は、エマルシゲン（Emulsigenn）基剤アジュバント、例えばEMULSIGEN(商標)、EMULSIGEN-D(商標)、EMULSIGEN-P(商標)、EMULSIGEN-75(商標)（MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, USA）である。驚くべきことに、H5タンパク質、好ましくは本明細書に記載の組換えH5タンパク質を含む医薬／ワクチン組成物は、水中油エマルジョンとともに、好ましくはエマルシゲン系アジュバントとともに、より好ましくはEMULSIGEN(商標)及びEMULSIGEN-D(商標)とともに効果的にアジュバント添加されることが見出された。
さらにまた、以下の文献（“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995）の147ページに記載されているSPTエマルジョン、及び同書の83ページに記載されているMF59エマルジョンを使用することも可能である。
【００５２】
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー並びに無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーで、前記は、特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマーという名称で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462を参照することができる。前記文献はアクリルポリマーについて記載し、前記ポリマーは、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8つを超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されるポリヒドロキシル化化合物で架橋される。好ましいラジカルは、2から4つの炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。前記不飽和ラジカルはそれ自体他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポル（Carbopol；BF Goodrich, Ohio, USA）という名称で販売されている製品が特に適切である。前記はアリルシュクロース又はアリルペンタエリトリトールで架橋される。とりわけ、カルボポル974P、934P及び971Pを挙げることができる。カルボポル971Pの使用がもっとも好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中では、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーであるEMAコポリマー（Monsanto）。これらポリマーの水への溶解は酸性溶液を生じ、前記は、好ましくは生理学的pHに中和されて、免疫原性、免疫学的又はワクチン組成物自体がその中に取り込まれるアジュバント溶液をもたらすであろう。
【００５３】
さらに別の適切なアジュバントには、他の多くのものの中でとりわけ以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：RIBIアジュバント系（Ribi Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、大腸菌由来易熱性内毒素（組換え体又は他のもの）、コレラ毒素、又はムラミルジペプチド。 
好ましくは、アジュバントは約100μgから約10mg/用量の量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは約100μgから約10mg/用量の量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは約500μgから約5mg/用量の量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは約750μgから約2.5mg/用量の量で添加される。もっとも好ましくは、アジュバントは約1mg/用量の量で添加される。
さらにまた、医薬／ワクチン組成物は、1つ以上の他の免疫調節剤、例えばインターロイキン又は他のサイトカインを含むことができる。医薬／ワクチン組成物はまたゲンタマイシン及びマーチオレートを含むことができる。本発明の関係で有用なアジュバント及び添加物の量並びに濃度は当業者が容易に決定することができ、本発明は、約50μgから約2000μgのアジュバント、好ましくはワクチン組成物1mL用量当たり約250μgを含む組成物を意図する。別の好ましい実施態様では、本発明は、約1μg/mLから約60μg/mLの抗生物質、より好ましくは約30μg/mL未満の抗生物質を含むワクチン組成物を意図する。
【００５４】
したがってさらに別の実施態様によれば、本発明はまた以下を含む医薬／ワクチン組成物に関する：
i．本明細書に記載のインフルエンザウイルスのH5タンパク質のいずれか1つの治療的に有効な量（ここで、前記H5タンパク質はアミノ酸223N及び改変328K+を有し、H5タンパク質のアミノ酸の位置のナンバリングは配列番号：2で例示として与えられるアミノ酸の位置に対応し、さらに改変328K+は、H5タンパク質のアミノ酸328位に第二のリジン（K+）が挿入されることを意味する）；及び
ii．上記に記載の医薬的に許容できるアジュバント。
好ましくは、アジュバントは以下から成る群から選択される：
a）EMULSIGEN(商標)、水中油エマルジョン（o/w）；
b）EMULSIGEN-D(商標)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）を含む水中油（o/w）；
c）Polygen、コポリマー
d）EMULSIGEN-P(商標)、専有免疫刺激剤を含む水中油（o/w）；
e）Carbigen、架橋ポリマー；
f）EMULSIGEN-75(商標)、架橋ポリマーとともに水中油（o/w）を含むダブルアジュバント；
g）ISA 70、油中水（w/o）。
もっとも好ましくは、アジュバントは水中油エマルジョン、例えばEMULSIGEN(商標)、EMULSIGEN-D(商標)、EMULSIGEN-P(商標)、EMULSIGEN-75(商標)、EMULSIGEN(商標)及びEMULSIGEN-P(商標)から成る群から選択されるアジュバントである。もっとも好ましくは、EMULSIGEN(商標)及びEMULSIGEN-P(商標)が本発明の処方で用いられる。
【００５５】
さらに別の特徴にしたがえば、本明細書で提供される医薬／ワクチン組成物は1つ以上の抗原を含む。好ましくは、当該さらに別の抗原は家禽又は哺乳動物の病原体の抗原である。さらに別の実施態様にしたがえば、追加される抗原は、さらに別のインフルエンザ抗原、例えばヘマグルチニンH5、H7、H9又は任意の他のインフルエンザウイルスヘマグルチニンであり、ここで前記H5は、好ましくはクレード1とは異なるクレードのH5N1ウイルス（特に北アフリカ人由来のH5N1ウイルス）のH5タンパク質、例えば本明細書に記載のH5タンパク質(2)である。前記追加される抗原は精製形で、抗原調製物の部分として、殺滅微生物の形で、又は改変生微生物の形で添加することができる。
本明細書で用いられる“抗原”という用語は、免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン（抗体）又はT細胞抗原レセプターと特異的に相互作用して、前記抗原を投与される宿主で前記抗原に対して免疫応答を誘引、活性化又は刺激する能力を有するペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド又は多糖類を指す（ただしこれらに限定されない）。“抗原”という用語はまた、核酸分子（好ましくはDNA分子又はRNA分子）を指し、前記の各々はペプチド、ポリペプチド、又は糖ペプチド（それらは、免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン（抗体）又はT細胞抗原レセプターと特異的に相互作用して、前記核酸分子によってコードされる抗原に対して免疫応答を誘引、活性化又は刺激する能力を有する）をコード及び発現する。本発明にしたがって用いられる医薬組成物の調製に用いられる抗原は、微生物又は前記微生物の抗原性部分及び／又は調製物である。この関係では、本明細書で用いられる“免疫付与”という用語は、免疫応答の惹起又は強化（ただしこれらに限定されない）の一切を意味する。“免疫応答”という用語は上記で既に述べた。
【００５６】
インフルエンザワクチンの投与の仕方は当業界ではよく知られている。不活化及び弱毒化ウイルスワクチンの粘膜におけるワクチン接種手法が意図されている。粘膜はワクチンの局所デリバリーの標的であり得るが、粘膜に免疫原性タンパク質をデリバリーするために多様な手法が利用されてきた。
具体的な実施態様では、ワクチンは、コレラ毒素（例えばコレラ毒素B又はコレラ毒素A/Bキメラ）との混合物、又は前記とのコンジュゲート若しくはキメラ融合タンパク質として投与できる（Hajishengallis , J Immunol., 154:4322-32, 1995；Jobling and Holmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992）。コレラ毒素Bサブユニットの使用を基本とする粘膜ワクチンが報告されている（Lebens and Holmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994）。別の実施態様では、易熱性内毒素（LT）との混合物を粘膜ワクチン接種のために調製できる。
粘膜における他の免疫付与手法には、マイクロカプセルへのウイルス被包化（US 5,075,109、US 5,820,883、及びUS 5,853,763）及び免疫賦活膜性担体の使用（WO 98/0558）が含まれる。経口投与免疫原の免疫原性は、赤血球細胞（rbc）又はrbcゴーストを用いることによって（US 5,643,577）、又はブルータング抗原を用いることによって（US 5,690,938）強化できる。
【００５７】
別の特徴にしたがえば、本発明は、上記記載の医薬／ワクチン組成物を調製する方法、好ましくは、上記記載のバキュロウイルス発現組換え体H5タンパク質を含むワクチンを製造する方法に関する。概ねこの方法はウイルスに構築物をトランスフェクトする工程を含み、ここで前記構築物は以下を含む：i）本明細書に記載の組換え体H5 cDNA、ii）増殖媒体中で細胞にトランスフェクトウイルスを感染させる工程、iii）本明細書に記載の組換え体H5タンパク質を発現させる工程、iv）発現H5タンパク質を培養から回収する工程、及びv）発現H5タンパク質を適切なアジュバント及び／又は他の医薬的に許容できる担体とブレンドすることによって組成物を調製する工程。
好ましいアジュバントは上記に記載のアジュバントである。したがって、さらに別の特徴によれば、インフルエンザ感染症に対する免疫応答を呼び起こす抗原性組成物、例えばワクチンを調製する方法は、i）H5タンパク質を調製及び回収する工程、及びii）前記を適切なアジュバントと混合する工程を含む。
さらに、本発明のワクチン組成物はまた希釈剤、等張剤、安定化剤及び／又は保存料を含むことができる。希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、無機又は有機塩（例えば塩化ナトリウム）、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトース、糖類、トレハロース、マンニトール、サッカロースがとりわけ含まれ得る。安定化剤にはとりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。適切なアジュバントは上記記載のアジュバントである。
【００５８】
本明細書に記載のH5タンパク質(1)、核酸分子、ベクター、ワクチン及び組合せ物のいずれかの医薬としての使用
本明細書で提供されるH5タンパク質(1)、そのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードする核酸分子、本明細書に記載のそのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードするそのような核酸分子のいずれかを含むベクター、及びそのようなH5タンパク質(1)、本明細書に記載の核酸分子、又はベクター、又は組合せ物のいずれかを含む任意の医薬／ワクチン組成物は、医薬として好ましくは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の治療及び予防のために用いることができる。本明細書で提供されるH5タンパク質(1)、そのようなH5タンパク質のいずれかをコードする核酸分子、本明細書に記載のそのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードするそのような核酸分子のいずれかを含むベクター、及びそのようなH5タンパク質(1)、本明細書に記載の核酸分子若しくはベクター又は本明細書に記載の組合せ物のいずれかを含む任意の医薬／ワクチン組成物は、獣医薬の場合と同様に人間の治療又は予防にも用いることができる。獣医薬で用いるときには、家禽（好ましくは鳥、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなど）とともに哺乳動物（好ましくはブタ、ウシ、ウマ、アザラシ、ラクダ、イヌ、ネコ、ハムスター、マウスなど）の治療が所望される。
【００５９】
本発明の用語では、“予防”という用語は、インフルエンザ感染症の臨床徴候の発生率又は重篤度の低下（そのような臨床徴候の完全な予防までを含む）を指す。好ましくは、発生率又は重篤度の低下は、本発明の組成物を与えられなかったが感染性レベルのインフルエンザウイルス（通常は臨床徴候を出現させるインフルエンザ感染をもたらす）に曝露された動物又は動物グループと比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％である。
したがって別の特徴によれば、本発明は、本明細書で提供されるH5タンパク質(1)、そのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードする核酸分子、本明細書に記載のそのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードするそのような核酸分子のいずれかを含むベクター、及びそのようなH5タンパク質(1)、本明細書に記載の核酸分子若しくはベクター又は本明細書に記載の組合せ物のいずれかを含む任意の医薬／ワクチン組成物の医薬として、好ましくは人間用医薬として及び／又は獣医薬として、好ましくは家禽用、特にニワトリ用獣医薬としての使用に関する。
【００６０】
さらにまた、本明細書で提供されるH5タンパク質(1)、そのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードする核酸分子、本明細書に記載のそのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードするそのような核酸分子のいずれかを含むベクター、又は本明細書に記載の組合せ物は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされる感染症の予防又は治療用の、本明細書に記載の医薬組成物（好ましくは単一回接種ワクチン又は1用量ワクチン）の調製に用いることができ、ここで、クレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである。上記に記載したように、これら医薬／ワクチン組成物は、動物、例えば家禽（好ましくは鳥、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなど）とともに哺乳動物（好ましくはブタ、ウシ、ウマ、アザラシ、ラクダ、イヌ、ネコ、ハムスター、マウスなど）の治療及び／又は予防と同様に、人間の治療及び／又は予防に用いることができる。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染症を予防又は治療する方法に関し、ここで、クレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである。前記方法は、本明細書に記載のH5タンパク質(1)又は本明細書に記載の組合せ物の治療的に有効な量をそのような治療を必要とする対象動物に投与する工程を含む。さらにまた、本発明は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染症を予防又は治療する方法にも関し、ここで、クレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスであり、前記方法は、本明細書に記載の任意のH5核酸分子又はベクター（本明細書に記載の任意のH5タンパク質(1)をコードする）の治療的に有効な量をそのような治療を必要とする対象動物に投与する工程を含む。さらにまた、本発明は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染症を予防又は治療する方法にも関し、ここで、クレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスであり、前記方法は、本明細書に記載の任意のそのようなH5タンパク質(1)、核酸分子又はベクターを含むワクチンの治療的に有効な量をそのような治療を必要とする対象動物に投与する工程を含む。そのような必要性が有る対象動物は、人間とともに動物、好ましくは家禽、さらに好ましくは鳥、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、又は哺乳動物、好ましくはブタ、ウシ、ウマ、アザラシ、ラクダ、イヌ、ネコ、ハムスター、マウスなどである。
【００６１】
好ましくは、本明細書に記載の投与は単一回接種投与又は1用量投与である。
好ましくは、ニワトリにワクチンを接種するとき、本明細書に記載のH5タンパク質は、1日齢又はそれ以降（例えば10日）、又は1から10日、又は10日若しくはそれ以降でのワクチン接種に用いることができる。
好ましくは、本明細書に記載の任意のH5タンパク質(1)、そのようなH5タンパク質(1)のいずれかをコードする核酸分子又はベクター、又は任意の医薬／ワクチン組成物の投与によって治療できるインフルエンザ感染症は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされ、ここで、クレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルス、場合によってはまた別のトリ、ブタ若しくはヒトインフルエンザウイルスとの組み合わせ又は前記の任意の組合せ若しくはハイブリッドである。
本発明の更なる利点は、本発明が、ワクチン接種された人間又は動物とH5N1ウイルスに感染した人間又は動物とを弁別する特別なELISAキットに関する“DIVA”（感染動物とワクチン接種動物との弁別（Differentiation of Infected and Vaccinated Animals））概念に利益を与えるということである。
【００６２】
別の特徴にしたがえば、本発明はキットに関し、前記キットは、i）本明細書に記載のそのようなH5タンパク質(1)のいずれか、そのようなH5タンパク質のいずれかをコードする核酸分子又はベクター、又は本明細書に記載のそのようなH5タンパク質、核酸分子又はベクターのいずれかを含む任意の医薬／ワクチン組成物、及びii）クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされる感染症の治療又は予防のためにそのようなH5タンパク質、核酸分子、ベクター又はワクチンを使用することについて指示するパッケージリーフレットを含み、ここで、クレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである。ニワトリにワクチン接種するときは、本明細書に記載のH5タンパク質(1)を1日齢又はそれ以降でのワクチン接種に用いることができる。
したがって、本明細書に記載のキットは、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスによって引き起こされる感染症の治療又は予防のために、それぞれ使用を意図されるか又は使用されることは理解されよう（ここでクレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである）。
さらに別の実施態様にしたがえば、当該複数部分のキットは、家禽又は哺乳動物の病原体の少なくとも1つのさらに別の抗原、及び当該追加の抗原（特に上記に記載したさらに別の抗原）の人間又は獣医薬としての使用に関する指示情報を含む。
【００６３】
本発明はさらに対象動物でウイルス排出を減少させる方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のH5タンパク質(1)又は本明細書に記載の組合せ物を、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスに感染した対象動物又は前記によるウイルス感染症のリスクを有する対象動物に投与する工程を含む（ここでクレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである）。
本発明はまた、対象動物でウイルス排出を減少させる方法で使用する本明細書に記載のH5タンパク質(1)又は本明細書に記載の組合せ物に関し、ここで、前記H5タンパク質(1)又は前記組合せ物は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスに感染した対象動物又は前記によるウイルス感染症のリスクを有する対象動物に投与されることとなり、さらにクレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである。
さらに、本発明は、クレード1以外のクレードのH5N1ウイルスに感染した対象動物又は前記によるウイルス感染症のリスクを有する対象動物でウイルス排出を減少させる医薬の調製のために、本明細書に記載のH5タンパク質(1)又は本明細書に記載の組合せ物を使用することに関する（ここでクレード1以外のクレードの前記H5N1ウイルスは、好ましくは本明細書に記載した異なるクレードのH5N1ウイルスである）。
好ましくは、本発明のH5タンパク質(1)、本明細書に記載の組合せ物、本明細書に記載のワクチン又は本明細書に記載のキットは単一回接種ワクチン又は1用量ワクチンとして使用される。
実施例
以下の実施例は本発明の好ましい材料及び方法を説明する。しかしながら、これらの実施例は単なる例示として提供され、それら実施例におけるいずれも本発明の全体的範囲を制限するものとみなされるべきではないことは理解されよう。
【実施例１】
【００６４】
HA H5抗原をコードしこれを発現する組換えバキュロウイルスの構築
H5 HA抗原を含む組換えバキュロウイルスを以下のように作製した：H5 HAのコード配列（配列番号：3）を化学的に合成し、トランスファーベクターpVL1392（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）にサブクローニングした。オリゴヌクレオチドプライマー及びクィックチェンジ（QuikChange(商標)）部位特異的変異導入キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用いてH5 HA MutK+（配列番号：5）を作製し、トランスファーベクターpVL1392（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）にサブクローニングした。H5 HA抗原(配列番号：3)及びH5 HA MutK+（配列番号：5）をコードする遺伝子を含むpVL1392プラスミドを続いてダイアモンドバク（DiamondBac(商標)；Sigma）バキュロウイルスDNAとともにSf9昆虫細胞（BD Biosciences Pharmingen）に同時トランスフェクトして、配列番号：3をコードするH5 HA遺伝子及び配列番号：5をコードするH5 HA mutK+遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを作製した。H5 HA (配列番号：3)及びH5 HA MutK+（配列番号：5）をコードする遺伝子を含む前記組換えバキュロウイルスをプラーク精製し、マスターシードウイルス（MSV）をSF+細胞株で増殖させ、小分けにし、-70℃で保存した。MSV及びワーキングシードウイルスを生成するために上記記載のH5 HAバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞はH5 HA抗原（配列番号：3）及びH5 HA MutK+（配列番号：5）抗原を発現する（前記抗原はポリクローナル血清又はモノクローナル抗体により間接蛍光抗体アッセイ又はウェスタンブロットで検出される）。
適切な量の組換えバキュロウイルス（それぞれH5 HA及びH5 HA MutK+）とともにシードした後、続いてSF+細胞（Protein Sciences, Inc., Meriden, CT）を含むスピンナーフラスコを27±2℃で7日間、その間100rpmで攪拌しながらインキュベートした。フラスコに換気キャップを用いて空気の流通を可能にした。バキュロウイルス感染SF+細胞を含むクルードな全細胞培養及び各培養の細胞培養上清を採集した。
【実施例２】
【００６５】
HA H5抗原を含む医薬組成物（ワクチン）の調製
バキュロウイルス系の発現系によって昆虫細胞で発現されたクルードな全細胞H5 HAタンパク質及びH5 HA MutK+タンパク質を採集した。バキュロウイルスは、5mM（最終濃度）の環状化バイナリーエチレンイミン（BEI）の存在下で約32から39℃の間で96時間不活化させた。不活化完了後に、0.3Mのチオ硫酸ナトリウム溶液を最終濃度5mMで添加して、一切の残留BEIを中和した。中和後、多様なアジュバントを添加し、以下のワクチン／医薬組成物を生成した。
ワクチン：
2014527526.tif 000005
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【実施例３】
【００６６】
トリインフルエンザに対するニワトリのワクチン接種
H5 HA MutK+（画分1）及び不活化ニューカッスル病ウイルス（画分2）を含むコンビネーションワクチン（“BACULOAI+NDKV”と称する）を動物試験で評価した。このワクチンは、MutK+構築物を土台とするバキュロウイルス発現系（実施例1及び2）で生成されたヘマグルチニンH5を用いて処方された。ニューカッスル病（ND）ウイルス画分の供給源は全ウイルスである。
画分1：
バキュロウイルス発現、トリインフルエンザH5N1ウイルス由来の組換えH5ヘマグルチニン（H5 HA）。  トリインフルエンザ（AI）画分
AI画分はバイナリーエチレンイミン（BEI）で不活化される。バキュロウイルスベクターから生じる残留感染性は認められない。
画分2：
全ビリオン、ニューカッスル病（ND）ウイルス、Lasota株。ニューカッスル病画分
ND画分は、ホルムアルデヒド、BEI又はベータ-プロピオ-ラクトン（BPL）で不活化される。NDウイルスから生じる残留感染性は認められない。
処方物の組成：
H5 HAタンパク質及びND由来の不活化採集材料を水/油エマルジョン中でブレンドする。前記混合物はアジュバントとして鉱物油を含む。
ワクチンの有効性の評価のために、以下の3つの臨床パラメーターを考慮した：1）罹患率／死亡率；2）抗体レベル；3）ウイルス排出。
全ての実験で、SPF鶏にワクチンを接種し、ワクチンの投与は頸部背面の皮下ルートによった。特段の記載がなければ0.5mL用量を投与した。
実験の全期間を通してニワトリを隔離ユニット内で維持した。実験では、トリインフルエンザワクチン評価のOIE国際ガイドラインを順守した。
チャレンジを実施してトリインフルエンザ（AI）抗原性画分を評価した。ワクチン接種後3週間して、ニワトリに鼻内（50μL）及び経口（50μL）ルート投与によってチャレンジウイルスの106 EID50を含む合計100μLの尿嚢液を接種した。
HPAI H5N1のチャレンジに対する防御を評価するために、以下の1）、2）の2つの実験を実施した：
1）シングル又はダブルワクチン接種（追加免疫効果の評価）、1日齢又は10日齢（日齢効果の評価）及び0.5又は0.2mL用量（用量効果の評価）を用いるプロテクトタイプ実験。
この実験については以下の2つの異なるチャレンジ株を用いて：a）Aサブクレード2.2.2ベトナム人株（2006年に単離）（前記は東南アジア（中国、ベトナム）の家禽生産所で最近疾病を引き起こした）；b）Aサブクレード2.2.1グループB1エジプト人株（2010年に単離）（前記はエジプトの家禽生産所で最近疾病を引き起こした）。チャレンジ株はワクチンのバキュロウイルス構築物とは遺伝的に近縁ではない。結果は、類似する又は異なるワクチンによる2つの免疫に対して付与される防御の拡大としてプロテクトタイプの関係で解釈される。
結論：
1）80から100％の防御が日齢又は用量に応じて観察された。100％防御は、二価処方物の0.5mL用量として10日齢で投与したときに観察された。
2）BACULOAI+NDKVの0.5mL単一回免疫として10日齢で投与したとき、市販の不活化された伝統的製造Volvac AIKVワクチンの2回接種投与と同じ防御が観察された。
3）BACULOAI+NDKVの0.5mL単一回免疫として10日齢で投与したとき、市販の不活化された伝統的製造Volva cAIKVワクチンの2回接種投与と比較して類似レベルのH5特異的抗体が検出された。
4）ワクチンをBACULOAI+NDKVの0.5mL単一回免疫として10日齢で投与したとき、チャレンジ後3日まで低レベルのウイルス排出が観察された。
2）10日齢でただ1回のシングルワクチン接種を用いるBACULO有効性実験。
以下の3つの異なるチャレンジ株をこの実験で用いた：a）Aサブクレード2.2.1グループA1エジプト人株（2008年に単離）；b）Aサブクレード2.2.1グループA1エジプト人株（2010年に単離）；c）Aサブクレード2.2.1グループB1エジプト人株（2010年に単離）。最後の2つはエジプトの家禽生産所で最近疾病を引き起こした。
結論：
1）90から100％の防御が観察された。
2）ワクチンBACULOAI+NDVKは、鳥類におけるHPAIウイルスに対するワクチンについての欧州医薬局（European Medicine Agency, EMA）ガイドラインを順守する性能を示した。
3）これは、チャレンジに用いたウイルスのヘマグルチニンとは遺伝的に離れたヘマグルチニンを含むバキュロウイルス系ワクチンの単一回接種投与による有効性を示す、利用できる最初の報告である。
【実施例４】
【００６７】
1．実験設計
本実験は、以下のように上記実施例3と同様に設計及び実施された。
ワクチンの有効性の評価のために、以下の3つの臨床パラメーターを考慮した：1）罹患率／死亡率；2）抗体レベル；3）ウイルス排出。
全ての実験で、SPF鶏にワクチンを接種し、ワクチンの投与は頸部背面の皮下ルートによった。クレード1のH5タンパク質を含むワクチンプロトタイプを用い（MutK+と呼ぶ）、第二のND（ニューカッスル病ウイルス）抗原性画分とともに二価生成物として処方した。特段の記載がなければ0.5mL用量を投与した。動物には10日齢でワクチンを接種した。
実験の全期間を通してニワトリを隔離ユニット内で維持した。実験では、トリインフルエンザワクチン評価のOIE国際ガイドラインを順守した。
チャレンジを実施してトリインフルエンザ（AI）抗原性画分を評価した。ワクチン接種後3週間して、ニワトリに鼻内（50μL）及び経口（50μL）ルート投与によってチャレンジウイルスの106 EID50を含む合計100μLの尿嚢液を接種した。
これはまた下記の表（表A）に要約されている（ワクチン接種は10日齢で実施された：列1（適用ワクチンによる実験グループID）、列2（ワクチン用量）、及び列3（チャレンジ日齢））。チャレンジウイルスはA/ニワトリ/Egypt/1063/2010で、前記はサブクレード2.2.1.1 HP AIV H5N1サブタイプとして分類される。前記は、ワクチンバッチの評価のためにエジプトで用いられる公認チャレンジ株である。チャレンジ用量は106 EID50であった。
2．結果及びデータ分析
結果及びデータ分析は下記の表（表A）に要約されている：列4（ワクチン接種後3週間、チャレンジ前のHI GMT（相乗平均力価））、列5（チャレンジ後2週間の生存パーセンテージ）、及び列6（ウイルス排出の検出、RT-PCR陽性サンプル）
【００６８】
表A：実施例4の実験設計並びに結果及びデータ分析の概要
2014527526.tif 000019
【００６９】
3．結論
−ワクチン接種群はチャレンジに対して生存した。ワクチンプロトタイプは、同種抗原を用いるHI力価決定として測定したところによると有効な免疫応答を誘発した。
−MutK+ワクチンプロトタイプは、ウイルス排出を減少させる能力として測定したところによれば、良好なウイルス学的防御を提供した。RT-PCR値は感染性ウイルスを示すにははるかに低く、残存遺伝物質が示されただけであった。
【００７０】
配列リスト（配列番号：1から51）：
配列番号：1は、シグナルペプチドの無いA/Hong Kong/213/2003（H5N1）のH5に一致する。
配列番号：2−7は、国際出願PCT/US2007/082699の配列番号：1−6に対応する。
配列番号：8はH5N1“1709-6”のH5配列に対応する。
配列番号：9はH5N1“1553-1/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：10はH5N1“1553-15/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：11はH5N1“”のH5配列に対応する。
配列番号：12はH5N1“3982-2/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：13はH5N1“3982-5/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：14はH5N1“3982-7/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：15はH5N1“3982-8/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：16はH5N1“3982-9/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：17はH5N1“3982-12/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：18はH5N1“3982-20/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：19はH5N1“3982-44/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：20はH5N1“1553-2/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：21はH5N1“1553-6/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：22はH5N1“1553-13/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：23はH5N1“1553-26/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：24はH5N1“1553-28/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：25はH5N1“2095-39/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：26はH5N1“2095-46/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：27はH5N1“2095-49/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：28はH5N1“2095-65/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：29はH5N1“2095-68/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：30はH5N1“2095-70/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：31はH5N1“2095-73/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：32はH5N1“2095-75/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：33はH5N1“3982-3/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：34はH5N1“3982-4/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：35はH5N1“3982-13/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：36はH5N1“3982-14/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：37はH5N1“3982-19/B3”のH5配列に対応する。
配列番号：38はH5N1“3982-21/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：39はH5N1“3982-43/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：40はH5N1“3982-50/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：41はH5N1“3982-52/B1”のH5配列に対応する。
配列番号：42はH5N1“3982-55/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：43はH5N1“3982-56/A1”のH5配列に対応する。
配列番号：44はH5N1“3982-78/B2”のH5配列に対応する。
配列番号：45はH5N1“4794-17/B”のH5配列に対応する。
配列番号：46はH5N1“4794-18/B”のH5配列に対応する。
配列番号：47は、配列番号：50から翻訳されたH5配列に対応する。
配列番号：48はH5N1“3982-8/A1”（配列番号：15）のH5配列をコードする。
配列番号：49はH5N1“1553-2/B1”（配列番号：20）のH5配列をコードする。
配列番号：50は、配列番号：9から46をコードする38のH5 HA遺伝子配列の分析後に得られたコンセンサス配列に対応する。
配列番号：51はニューカッスル病ウイルスLaSota株のcDNAに対応する。
【配列表】
2014527526000001.app
【国際調査報告】
2014527526.tif 000020
2014527526.tif 000021
2014527526.tif 000022