(57)【要約】  発酵工程におけるタンパク質の生産収量を増加させるためには、宿主細胞からのタンパク質の分泌を改良しなければならない。これはａ）１つのプロモーター配列、およびｂ）１つのタンパク質をコードする１つの核酸配列を含む発現ベクターによって達成される。該タンパク質はシグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列を含み、該シグナルペプチドは配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、または該シグナルペプチドはこれらの配列の少なくとも１つと構造相同性であるアミノ酸配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プロモーター配列および
ｂ）タンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質はシグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列を含み、前記シグナルペプチドは配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、または前記シグナルペプチドはこれらの配列の少なくとも１つと構造相同性であるアミノ酸配列を含む核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２】
前記核酸配列ｂ）によってコードされたシグナルペプチドが配列番号２、配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列を示すことを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記タンパク質の追加のアミノ酸配列は、酵素、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、タンナーゼ、キシラナーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、ペクチン分解性酵素、カラギナーゼ、ペルヒドロラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼもしくはリパーゼのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記シグナルペプチドは、前記核酸配列ｂ）によってコードされるタンパク質内の追加のアミノ酸配列のＮ末端に配置されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記核酸配列ｂ）によってコードされたタンパク質は、前記シグナルペプチドと前記タンパク質の追加のアミノ酸配列との間に配置されている結合配列をさらに含むことを特徴とし、このとき特に前記結合配列は１〜５０アミノ酸の長さを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記タンパク質の追加のアミノ酸配列はプロテアーゼのアミノ酸配列を含むが、
このとき前記プロテアーゼの前記アミノ酸配列は
配列番号７と少なくとも８０％同一である、または
配列番号８と少なくとも８０％同一である、または
配列番号９と少なくとも８０％同一である、または
配列番号１０と少なくとも８０％同一でありかつ配列番号１０に記載の番号付けにおける第９９位でアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）を有する、または
配列番号１０と少なくとも８０％同一でありかつ配列番号１０に記載の番号付けにおける第９９位でアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）を有し、かつ配列番号１０に記載の番号付けにおいて以下のアミノ酸：
（ａ）第３位のトレオニン（３Ｔ）、
（ｂ）第４位のイソロイシン（４Ｉ）、
（ｃ）第６１位のアラニン、トレオニンもしくはアルギニン（６１Ａ、６１Ｔもしくは６１Ｒ）、
（ｄ）第１５４位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（１５４Ｄもしくは１５４Ｅ）、
（ｅ）第１８８位のプロリン（１８８Ｐ）、
（ｆ）第１９３位のメチオニン（１９３Ｍ）、
（ｇ）第１９９位のイソロイシン（１９９Ｉ）、
（ｈ）第２１１位のアスパラギン酸、グルタミン酸もしくはグリシン（２１１Ｄ、２１１Ｅもしくは２１１Ｇ）、
（ｉ）前記アミノ酸（ａ）〜（ｈ）の組み合わせ
のうちの少なくとも１つをさらに有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、細菌である、好ましくはエシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、バシラス属（Bacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebakterium）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）およびシュードモナス属（Pseudomonas）の群から選択される細菌、さらに好ましくは、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・レンツス（Bacillus lentus）、バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）、バシラス・グロビギイ（Bacillus globigii）、バシラス・ギブソニイ（Bacillus gibsonii）、バシラス・クラウジイ（Baccilus clausii）、バシラス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バシラス・プミルス（Bacillus pumilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxidans）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）の群から選択される細菌、特にバシラス・リケニホルミスであることを特徴とする宿主細胞。
【請求項９】
タンパク質を製造するための方法であって、方法工程：
（ａ）請求項７または８に記載の宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記タンパク質を前記培養培地もしくは前記宿主細胞から単離する工程
を含む前記方法。
【請求項１０】
タンパク質を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項７または８の一項に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、特に微生物タンパク質合成の分野にある。本発明は、タンパク質を製造するための発現ベクターに特に関し、さらにそのような発現ベクターを含有する宿主細胞を提案する。本発明は、タンパク質製造のための方法ならびにそのような発現ベクターおよび宿主細胞の使用にさらに関する。
【０００２】
タンパク質の製造には、宿主細胞、特に重要なタンパク質の遺伝子を発現する微生物を使用することができる。重要なタンパク質の遺伝子（トランス遺伝子）は、通例、これらから発現する種類の宿主細胞内へ導入される。該遺伝子は、いわゆる発現ベクター上に、それによって遺伝子発現が可能になる１つ以上のプロモーター配列（プロモーター）とともに存在することが多い。
【０００３】
工業的バイオテクノロジー製造のためには、当該の宿主細胞は細胞の代謝特性にしたがって構成される発酵培地中で培養される。宿主細胞は、培養中に供給された基質を代謝して望ましい生成物を形成するが、該生成物は発酵工程の終了後に通常は生産生物から取り出され、発酵ブロスおよび／または発酵培地から精製および／または濃縮される。
【０００４】
基本的には、発酵工程においてできる限り高い生産収量を得ることが望ましい。このとき生産収量は多数の因子に左右され、例えば宿主細胞は、実際の望ましい生成物とともに通常は多数の、通例は全く重要ではないまた別の物質も形成する。さらに、トランス遺伝子の発現およびそれとともに生産収量は、使用される発現系に本質的に依存する。例えば、国際特許公開第９１／０２７９２号パンフレットは、最適化されたリケニホルミス菌におけるバシラス・レンタスからの、リケニホルミス菌、特にリケニホルミス菌プロモーターの遺伝子調節配列の制御下でのアルカリ性プロテアーゼの改良された発酵生産について開示している。
【０００５】
好ましくは、タンパク質、例えば加水分解酵素を工業生産するためには、大量のタンパク質を培養上清中に分泌可能な宿主細胞が使用されるが、これは細胞内生産において必要である費用のかかる細胞分解を無用にさせる。このためには、好ましくはそのような宿主細胞、例えば効率的な高細胞密度発酵工程において費用効果的栄養培地を用いて培養することができ、標的タンパク質１Ｌ当たり多数のグラム数を培養上清中に分泌可能なバシラス種が使用される。通例は、分泌させるタンパク質は、宿主細胞内に導入され、分泌させるタンパク質をコードする発現ベクターから発現させる。発現したタンパク質は、通例は、宿主細胞からのそれらの輸送を誘発するシグナルペプチド（シグナル配列）を含んでいる。該シグナルペプチドは通例、宿主細胞内で翻訳されたポリペプチド鎖の一部であるが、該シグナルペプチドは該タンパク質から翻訳後ではあるが該宿主細胞の内外で分割され得る。
【０００６】
この非相同タンパク質の細胞外生産には、多数の障壁およびそれに応じて分泌の経過を最適化する必要性が高い。これらの障壁の１つは、該宿主細胞からの標的タンパク質の効率的輸送を可能にするシグナルペプチドの選択である。シグナルペプチドは、基本的にはタンパク質、特に酵素と新たに組み合わせることができる。例えば、Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒらの刊行物（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３６２，  Ｓ．３９３−４０２（２００６））には、クチナーゼを例とするシグナルペプチドライブラリーのスクリーニング戦略が記載されている。だが全てのシグナルペプチドが発酵条件下での、特に工業的もしくは大規模発酵条件下でのタンパク質の十分な輸送に影響を及ぼせる訳ではない。
【０００７】
そこで本発明の課題は、宿主細胞からのタンパク質の分泌を改良し、それにより発酵工程におけるタンパク質の生産収量を増加させることである。
【０００８】
本発明の主題は、
ａ）１つのプロモーター配列、および
ｂ）１つのタンパク質をコードする１つの核酸配列であって、このとき該タンパク質は１つのシグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列を含み、該シグナルペプチドは配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、または該シグナルペプチドはこれらの配列の少なくとも１つと構造相同性である１つのアミノ酸配列を含む核酸配列を含む発現ベクターである。
【０００９】
驚くべきことに、そのようなシグナルペプチドを１つの備えるタンパク質をコードする発現ベクターによって、該発現ベクターを含有し、該核酸配列ｂ）を発現する宿主細胞からの該タンパク質の改良された分泌が達成されることが見いだされた。これにより本発明の好ましい実施形態では、発酵工程におけるタンパク質の生産収量を増加させることができる。
【００１０】
発現ベクターは、宿主細胞内、特に微生物内でタンパク質を発現させられるように作用する核酸配列である。発現ベクターは、遺伝情報、したがって該タンパク質をコードする当該の核酸配列（遺伝子）ｂ）を含んでいる。
【００１１】
核酸配列の発現は、この配列によってコードされる遺伝子産物、さらに１つのポリペプチド（タンパク質）もしくは多数のポリペプチド（タンパク質）へのこれらの核酸配列の翻訳である。これらの用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本出願では同義語として使用する。そこで本発明の目的では、「発現」は、遺伝情報からのリボ核酸（ＲＮＡ）およびタンパク質の生合成を意味する。通例は、発現は、転写、したがってメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の遺伝子のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列の合成および場合によってはさらに翻訳後修飾可能な対応するポリペプチド鎖への翻訳を含んでいる。そこでタンパク質の発現は、本発明によって発現ベクター上に提供される遺伝情報からのタンパク質の生合成を意味する。
【００１２】
ベクターは、核酸、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から構成される遺伝要素であり、バイオテクノロジーの分野の当業者には公知である。ベクターは、特に細菌における使用においては、特殊なプラスミド、したがって環状遺伝要素である。ベクターには、例えば細菌プラスミド、ウイルスもしくはバクテリオファージに由来するベクター、または主として様々な起源の要素を備える合成ベクターもしくはプラスミドが属する可能性がある。さらにその他の存在する遺伝要素を用いて、ベクターは、好ましくは翻訳によって導入される宿主細胞内で何世代にもわたって安定性単位として樹立することができる。このとき本発明の目的では、固有単位が染色体外で樹立されるのか、染色体内もしくは染色体ＤＮＡ内に組み込まれるのかは重要ではない。無数の系の内のいずれを選択するかは、個々の場合による。決定的に重要な可能性があるのは、例えば達成可能なコピー数、利用できる分泌系、その下で特に抗生物質耐性、またはベクターを採取可能な宿主細胞の培養可能性である。
【００１３】
発現ベクターは、さらに例えば細胞密度もしくは一定の化合物の添加などの培養条件の変更によって調節することができる。そのような化合物の１つの例は、細菌ラクトース−オペロン（ｌａｃ−オペロン）のアクチベーターとして使用されるガラクトース誘導体であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）である。
【００１４】
発現ベクターは、少なくとも１つの核酸配列、好ましくはＤＮＡを、該タンパク質をコードしている核酸配列ｂ）（いわゆる遺伝子調節配列）を発現させるための制御配列とともにさらに含んでいる。遺伝子調節配列は、このとき各宿主細胞内のそれらの存在は該タンパク質をコードする核酸配列ｂ）の転写頻度に影響を及ぼし、好ましくは上昇させる。好ましくは、重要なのはプロモーター配列であるが、それはプロモーター配列が核酸配列ｂ）を発現させるために極めて重要であるからである。しかし本発明による発現ベクターは、また別の遺伝子調節配列、例えば１つ以上のエンハンサー配列をさらに含むことができる。本発明の範囲内にある発現ベクターは、このとき核酸配列ｂ）および１つのプロモーターから構成される少なくとも１つの機能的単位（発現カセット）を含んでいる。だが発現ベクターは、物理的単位として存在し得るが、必ずしも物理的単位として存在する必要はない。該プロモーターは、該宿主細胞内での核酸配列ｂ）の発現に作用を及ぼす。発現ベクターは、本発明の範囲内において１つの純粋な発現カセット上でプロモーターおよび発現させる核酸配列ｂ）へ制限することができるが、このとき該発現カセットは染色体外に存在してよい、またはさらに染色体内に組み込まれてよい。本発明による発現ベクターのこのような実施形態は、そのつど本発明の特別な実施形態を示している。
【００１５】
少なくとも１つのプロモーターの存在は、そこで本発明による発現ベクターにとって極めて重要である。したがって、プロモーターは、遺伝子の調節された発現を可能にするＤＮＡ配列であると理解される。当然ながら、プロモーター配列は遺伝子の構成成分であり、その５’末端、したがってＲＮＡコーディング領域の前方に存在する。好ましくは、本発明による発現ベクター内のプロモーター配列は、該タンパク質をコードしている核酸配列ｂ）から５’方向に存在する。プロモーターの最も重要な特性は、該遺伝子の転写開始をＲＮＡ−ポリメラーゼによって媒介して転写因子と称される少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質もしくはポリペプチドとの特異的相互作用である。多数の転写因子および／またはその他のタンパク質がＲＮＡ−ポリメラーゼによる転写の開始に関与することが多い。そこでプロモーターは、好ましくはプロモーター活性を備えるＤＮＡ配列、つまり遺伝子の転写を開始するための少なくとも１つの転写因子に少なくとも一過性で結合するＤＮＡ配列である。プロモーターの強度は、発現した遺伝子の転写頻度、したがって時間単位当たり発生したＲＮＡ分子数、特にｍＲＮＡ分子数で測定することができる。
【００１６】
好ましくは、プロモーター配列（ａ）および核酸配列（ｂ）は該発現ベクター上に連続して存在する。さらに好ましくは、プロモーター配列（ａ）は、核酸分子上で核酸配列（ｂ）の前方に存在する（５’→３’方向）。同様に好ましくは、２つの核酸配列（ａ）および（ｂ）の間には該タンパク質をコードしている核酸配列（ｂ）の転写頻度を減少させる核酸配列は存在しない。上述の記載全ては、該タンパク質をコードする核酸配列（ｂ）を含んでいるそのようなＤＮＡ鎖（該コードされた鎖）に関するが、関連するコーディングＤＮＡ鎖には関していない。該タンパク質をコードする核酸配列（ｂ）から推定すると、そこでプロモーター配列（ａ）は好ましくはさらに上流に、つまり個のＤＮＡ鎖上の５’方向に位置する。
【００１７】
核酸配列ｂ）は、分泌させるタンパク質をコードする。このとき重要なのは、本発明による発現ベクターを用いて製造されるタンパク質（標的タンパク質）である。
【００１８】
核酸配列ｂ）によってコードされるタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、もしくは配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるシグナルペプチドを含んでいる。そこでこのようなシグナルペプチドは、含有しているタンパク質、特に組み換えタンパク質の効率的分泌に影響を及ぼすことが確証された。いっそう好ましくは、該シグナルペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、および極めて特に好ましくは１００％同一である、または配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、および極めて特に好ましくは１００％同一である、または配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、および極めて特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいる。特に好ましくは、該シグナルペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、および極めて特に好ましくは１００％同一である、または配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、および極めて特に好ましくは１００％同一である、または配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、および極めて特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいる。
【００１９】
極めて特に好ましいのは、そのつど１００％まで同一の配列であるので、適切に好ましい発現ベクターは、核酸配列ｂ）によってコードされたシグナルペプチドが配列番号２、配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする。このようなシグナルペプチドをコードする特に好ましい核酸配列は、配列番号１、配列番号３および配列番号５に記載されている。
【００２０】
さらに、該タンパク質の分泌を可能にする上述のシグナルペプチドの代わりに、これらの配列と構造相同性の配列を使用することができる。構造相同性配列とは、そのアミノ酸配列が配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６に記載のアミノ酸配列を備えるシグナルペプチドに匹敵する空間的折り畳み（ｓｐａｔｉａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ）を有すると理解される。この空間的折り畳みは、該宿主細胞によって分泌シグナル配列として認識されるようにし、そこで構造相同性であるシグナル配列を含有するタンパク質が該宿主細胞から除去される。好ましくは、該宿主細胞によって使用された転座系との相互作用が生じる。そこで該構造相同性アミノ酸配列は、好ましくは該宿主細胞の転座系の少なくとも１つの成分に直接的もしくは間接的に結合する。直接的結合とは直接的相互作用であると理解され、間接的結合は、アダプターと機能する、およびそれに応じて構造相同性アミノ酸配列と該宿主細胞の転座系の１つの成分との間の架橋機能を有する、１つ以上のまた別の成分、特にタンパク質もしくは別の分子を介して発生可能であると理解される。
【００２１】
核酸もしくはアミノ酸配列の同一性は、配列比較によって決定される。そのような比較は、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列内の類似の連続が相互にマッピングされることによって行われる。この配列比較は、好ましくは確立された最新技術および通例利用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて行われ（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｇｉｓｈ，  Ｗ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．，  Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  ＤＪ．（１９９０）  ‘‘Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．’’  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｆ．，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．  Ｍａｄｄｅｎ，  Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，  Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，  Ｈｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）：‘‘Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ’’；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５，  Ｓ．３３８９−３４０２を参照されたい）、原理的にはヌクレオチドもしくはアミノ酸の類似の配列が核酸もしくはアミノ酸配列内に相互に割り当てられることによって行われる。当該の位置の表形式にまとめた割り当ては、アラインメントと称される。さらに最新技術で使用可能なアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡ−アルゴリズムである。配列比較（アラインメント）、特に多数の配列比較は、通例はコンピュータプログラムを用いて行われる。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌシリーズ（例えば、Ｃｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１，  ３４９７−３５００を参照されたい）、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ（例えば、Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）：Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０２，  ２０５−２１７を参照されたい）またはこれらのプログラムもしくはアルゴリズムに基づくプログラムが利用されることが多い。本発明の範囲内では、配列比較およびアラインメントは、好ましくは規定の標準（デフォルト）パラメータを用いるコンピュータプログラムＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ  １０．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールズバッド１６００ファラデー大通り）を用いて行われる。
【００２２】
そのような比較は、比較対象の配列の相互の類似性についての陳述を可能にする。配列類似性は、通例は、同一もしくは１つのアラインメント内で相互に合致する位置にある同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の割合である同一性率で記載される。相同性の広い意味での概念は、アミノ酸配列を保存しているアミノ酸交換、したがって類似の特性を備えるアミノ酸においても考察されるが、それはこれらがタンパク質内で極めて類似する活性もしくは機能を果たすからである。したがって比較対象の配列の類似性は相同性率（％）または類似性率（％）も指示することができる。同一性および／または相同性に関する指示は、完全ペプチドもしくは遺伝子に、または個別領域にのみ該当する場合がある。そこで様々な核酸もしくはアミノ酸配列のホモロジーもしくは同一領域は、配列内の一致によって規定される。同一もしくは類似の機能を示すことが多い。小さい場合、および極めて小数のヌクレオチドもしくはアミノ酸しか含んでいない場合がある。そのような小さな領域が該タンパク質の全活性にとって本質的機能を果たすことが多い。そこで配列一致が個々の、場合によっては小さな領域にしか関連しないことが重要な場合がある。他に特に記載しない限り、本出願における同一性もしくは相同性に関する指示は、そのつど指示された核酸もしくはアミノ酸配列の全長に関連している。
【００２３】
核酸配列ｂ）によってコードされたタンパク質は、追加のアミノ酸配列をさらに含んでいる。したがってこのアミノ酸配列で重要であるのは、シグナルペプチドを含まない該タンパク質の固有のアミノ酸配列である。好ましくは、重要であるのは成熟タンパク質のアミノ酸配列である。成熟タンパク質とは、１つの対応する遺伝子によって翻訳後にはじめて成熟形に処理される未成熟形態がコードされ得るため、タンパク質の完全に処理済みの形態であると理解される。例えば、該タンパク質の未成熟形態は、シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドまたはもはや成熟形態では存在していないＮ末端および／またはＣ末端での伸長を含み得る。例えば、プロテアーゼ、特にスブチラーゼおよびさらに特にスブチリシンの未成熟形態は、シグナルペプチドならびに該プロテアーゼの成熟（ｍａｔｕｒｅ）形態ではもはや存在していないプロペプチドを含んでいる。または、追加のアミノ酸配列では、１つのプロペプチドを含む未成熟タンパク質のアミノ酸配列が重要である。このような実施形態は、特にプロテアーゼ、特にスブチラーゼおよびさらに特にスブチリシンも考慮する。特に好ましい実施形態では、追加のアミノ酸配列は他のシグナルペプチドを全く含んでいない。したがってこのような本発明による実施形態では、本発明によるシグナルペプチドだけが１つの宿主細胞からの該タンパク質の分泌を誘発する。
【００２４】
特に好ましくは、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、酵素、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、タンナーゼ、キシラナーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、ペクチン分解性酵素、カラギナーゼ、ペルヒドロラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼもしくは１つのリパーゼ、特に以下に記載のような酵素のアミノ酸配列を含んでいる。極めて特に好ましくは、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、プロテアーゼおよび特にスブチリシンのアミノ酸配列を含んでいる。
【００２５】
例えば、以下に挙げる酵素の１つは、有益にも本発明による発現ベクターを用いて製造することができる。
【００２６】
プロテアーゼの中では、スブチリシンが好ましい。これについての例は、スブチリシンＢＰＮ’およびＣａｒｌｓｂｅｒｇ、プロテアーゼＰＢ９２、スブチリシン１４７および３０９、バシラス・レンツス由来のアルカリ性プロテアーゼ、スブチリシンＤＹおよびスブチラーゼに属するが、もはや狭い意味ではスブチリシンには属していない酵素テルミターゼ、プロテイナーゼＫならびにプロテアーゼＴＷ３およびＴＷ７である。スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇは、商標名Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）でＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ社（デンマーク国バウスヴェア）から精製形で入手可能である。スブチリシン１４７および３０９は、商標名Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、もしくはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社からＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）の名称で販売されている。ＤＳＭ５４８３は、バシラス・レンツス由来のプロテアーゼから、名称ＢＬＡＰ（登録商標）の下で誘導されるプロテアーゼ変異体を引き出すことができる。その他の好ましいプロテアーゼは、さらに例えば名称ＰＵＲの下で誘導された酵素である。その他のプロテアーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社の商標名Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｎａｆｉｚｙｍ（登録商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）およびＯｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社の商標名Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）ＯｘＰ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）およびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（インド国ターネー）の商標名Ｐｒｏｔｏｓｏｌ（登録商標）、Ｗｕｘｉ  Ｓｎｙｄｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社（中国）の商標名Ｗｕｘｉ（登録商標）、Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（日本国名古屋）の商標名Ｐｒｏｌｅａｔｈｅｒ（登録商標）およびＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ（登録商標）、ならびにＫａｏ社（日本国東京）から入手可能な酵素である名称プロテイナーゼＫ−１６である。好ましいのは、さらにバシラス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびバシラス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）由来のプロテアーゼであり、これらは国際公開第２００８／０８６９１６号パンフレットおよび同第２００７／１３１６５６号パンフレットに開示されている。
【００２７】
アミラーゼについての例は、バシラス・リケニホルミスもしくはバシラス・アミロリケファシエンスもしくはバシラス・ステアロサーモフィラス由来のα−アミラーゼ、ならびに特に洗剤もしくは浄化剤中で使用するために改良された改良品である。バシラス・リケニホルミス由来の酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社の名称Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）、およびＤａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社の名称Ｐｕｒａｓｔａ（登録商標）ＳＴが入手可能である。このα−アミラーゼの改良品は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社の商標名Ｄｕｒａｍｙｌ（登録商標）およびＴｅｒｍａｍｙ（登録商標）ｕｌｔｒａ、Ｄａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社の名称Ｐｕｒａｓｔａｒ（登録商標）ＯｘＡｍおよびＤａｉｗａ  Ｓｅｉｋｏ社（日本国東京）のＫｅｉｓｔａｓｅ（登録商標）が入手可能である。バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社からＢＡＮ（登録商標）の名称で販売されており、バシラス・ステアロサーモフィラスのα−アミラーゼの誘導変異体はＢＳＧ（登録商標）およびＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）の名称で同様にＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社から販売されている。さらにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）由来のα−アミラーゼおよびバシラス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈｅｒｅｎｓ）（ＤＳＭ９９４８）由来のシクロデキストリン−グルカのトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）が挙げられる。同様に、あらゆる上述の分子の融合タンパク質を使用することができる。さらに、商標名Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）でＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社から入手可能なアスペルギルス・ニガーおよびＡ．オリザエ由来のα−アミラーゼの改良品が適合する。その他の有益な製品は、例えばＤａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社のアミラーゼＰｏｗｅｒａｓｅ（登録商標）およびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社のアミラーゼＡｍｙｌａｓｅ−ＬＴ（登録商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（登録商標）およびＳｔａｉｎｚｙｍｅ  ｐｌｕｓ（登録商標）である。さらにこれらの酵素の点突然変異によって入手可能な変異体は、本発明によって製造することができる。また別の好ましいアミラーゼは、国際公開第００／６００６０号パンフレット、同第０３／００２７１１号パンフレット、同第０３／０５４１７７号パンフレットおよび同第０７／０７９９３８号パンフレットに開示されており、開示内容およびそれらに関係する開示内容全体が参考として本出願で援用される。本発明により製造可能なアミラーゼは、さらに好ましくはα−アミラーゼである。
【００２８】
リパーゼもしくはクチナーゼの例は、元来はフミコーラ・ラヌギノーサ（サーモマイセス・ラヌゲノウス）から入手することができ、例えば改良されたリパーゼ、特にアミノ酸交換Ｄ９６Ｌを備えるリパーゼである。リパーゼもしくはクチナーゼは、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社から商標名Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、ＬｉｐｏＰｒｉｍｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｉｐｅｘ（登録商標）で販売されている。さらに例えば、元来はフサリウム・ソラニ・ピシおよびフミコラ・インソレンスから単離可能なクチナーゼを製造することができる。それらの出発酵素は元来、シュードモナス・メンドシナおよびフサリウム・ソラニイから単離されているリパーゼ、もしくはクチナーゼであり、例えばＤａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社が製造する。また別の重要な製品として、元来はＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社（現在はＤａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社）によって販売されている製剤Ｍ１  Ｌｉｐａｓｅ（登録商標）およびＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）ならびにＭｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ社（日本国）によって名称Ｌｉｐａｓｅ  ＭＹ−３０（登録商標）、Ｌｉｐａｓｅ  ＯＦ（登録商標）およびＬｉｐａｓｅ  ＰＬ（登録商標）で販売されている酵素、さらにＤａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社の製品Ｌｕｍａｆａｓｔ（登録商標）を挙げることができる。
【００２９】
セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、ＥＧ）の例は、一連の真菌性エンドグルカナーゼ（ＥＧ）富裕セルラーゼ製剤、したがってＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社によって登録商標Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（登録商標）で提供されている改良品を含んでいる。同様にＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社から入手可能な製品であるＥｎｄｏｌａｓｅ（登録商標）およびＣａｒｅｚｙｍｅ（登録商標）は、５０ｋＤ−ＥＧ、もしくはヒューミコラ・インソレンスＤＳＭ１８００由来の４３ｋＤ−ＥＧをベースとしている。この企業のその他の製造可能な製品は、Ｃｅｌｌｕｓｏｆｔ（登録商標）、Ｒｅｎｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）である。その他に製造可能であるのは、例えばＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（フィンランド国）から商標名Ｅｃｏｓｔｏｎｅ（登録商標）およびＢｉｏｔｏｕｃｈ（登録商標）で入手でき、少なくとも一部にはメラノカルパス由来の２０ｋＤ−ＥＧをベースとするセルラーゼである。ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ社のまた別のセルラーゼは、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）およびＥｃｏｐｕｌｐ（登録商標）である。その他の適切なセルラーゼは、バシラス種由来のＣＢＳ６７０．９３およびＣＢＳ６６９．９３であるが、バシラス種由来ＣＢＳ６７０．９３はＤａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社から商標名Ｐｕｒａｄａｘ（登録商標）で入手可能である。Ｄａｎｉｓｃｏ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社のその他の製造可能な製品は、「Ｇｅｎｅｎｃｏｒ洗剤セルラーゼＬ」およびｌｎｄｉＡｇｅ（登録商標）Ｎｅｕｔｒａである。
【００３０】
さらにこれらの酵素の点突然変異によって入手可能な変異体は、本発明によって製造することができる。特に好ましいセルラーゼは、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットに開示されているＴｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓセルラーゼ変異体、メラノカルパス、特に国際公開第９７／１４８０４号パンフレットに開示されているメラノカルパス・アルボマイセス由来のセルラーゼ、欧州特許出願第１３０５４３２号明細書に開示されているトリコデルマ・リーゼイ由来のＥＧＩＩＩ型のセルラーゼ、もしくはこれから入手可能な変異体、特に欧州特許出願第１２４０５２５号明細書および同第１３０５４３２号明細書に開示されている同一物、ならびに国際公開第１９９２００６１６５号パンフレット、同第９６／２９３９７号パンフレットおよび同第０２／０９９０９１号パンフレットに開示されているセルラーゼである。そのつど開示内容を参照のこと。また、開示内容全体は参考として本特許出願で援用される。
【００３１】
さらに、概念ヘミセルラーゼの下に統合されているまた別の酵素も製造することができる。これには、例えばマンナナーゼ、キサンタンリアーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン分解性酵素およびβ−グルカナーゼが属する。バシラス・サブチリスから得られたβ−グルカナーゼは、名称Ｃｅｒｅｆｌｏ（登録商標）でＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社から入手可能である。本発明によって特に好ましいヘミセルラーゼは、例えば商標名Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）でＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社から、またはＰｕｒａｂｒｉｔｅ（登録商標）でＧｅｎｅｎｃｏｒ社から販売されているマンナナーゼである。ペクチン分解性酵素として、本発明の範囲内では同様に名称ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンデメトキシラーゼ、ペクチンメトキシラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクターゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチノエステラーゼ、ペクチンペクチルヒドラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、ペクトラーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン−ポリガラクツロナーゼ、エンド−ポリガラクツロナーゼ、ポリ−α−１，４−ガラクツロニドグリカノヒドロラーゼ、エンドガラクツロナーゼ、エンド−Ｄ−ガラクツロナーゼ、ガラクツラン１，４−α−ガラクツロニダーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ポリ（ガラクツロナート）ヒドロラーゼ、エキソ−Ｄ−ガラクツロナーゼ、エキソ−Ｄ−ガラクツロナーゼ、エキソポリ−Ｄ−ガラクツロナーゼ、エキソ−ポリ−α−ガラクツロノシダーゼ、エキソポリガラクツロノシダーゼもしくはエキソポリガラクツロノシダーゼを有する酵素が挙げられる。これに関連する適切な酵素の例として、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社から名称Ｇａｍａｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｅｋｔｉｎｅｘ  ＡＲ（登録商標）、Ｘ−Ｐｅｃｔ（登録商標）もしくはＰｅｃｔａｗａｙ（登録商標）で、ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ社から名称Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＵＦ（登録商標）、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＴＰＬ（登録商標）、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＰＴＥ１００（登録商標）、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＭＰＥ（登録商標）、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＭＡ  ｐｌｕｓ  ＨＣ、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＤＡ１２Ｌ（登録商標）、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  １０Ｌ（登録商標）、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  Ｂ１Ｌ（登録商標）で、Ｄｉｖｅｒｓａ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から名称Ｐｙｒｏｌａｓｅ（登録商標）が入手可能である。
【００３２】
さらに、酸化還元酵素、例えばオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばハロ−、クロロ−、ブロモ−、リグニン−、グルコース−もしくはマンガンペルオキシダーゼ、ジオキシゲナーゼもしくはラッカーゼ（フェノロキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ）も製造することができる。適切な製品としては、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＤｅｎｉｌｉｔｅ（登録商標）１および２が挙げられる。また別の酵素は、国際特許出願公開第９８／４５３９８号パンフレット、同第２００５／０５６７８２号パンフレット、同第２００４／０５８９６１号パンフレットならびに同第２００５／１２４０１２号パンフレットに開示されている。
【００３３】
本発明のまた別の実施形態では、追加のアミノ酸配列は微生物中のポリペプチド鎖内のシグナルペプチドとともに自然に存在することはない。結果として、核酸配列ｂ）によってコードされたタンパク質においては組み換えタンパク質が重要である。自然に存在しないというのは、２つのアミノ酸配列が微生物の固有のタンパク質の構成成分ではないことを意味する。該シグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列を含むタンパク質は、結果としてその野生型形にある微生物の染色体ＤＮＡの部分である核酸配列によって該微生物中で発現されることはあり得ない。そのようなタンパク質および／またはこれをコードする核酸配列は、結果として該微生物の野生型形では存在しない、および／または該微生物の該野生型形から単離することはできない。そこで両方の配列であるシグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列には、微生物の野生型形において、それらが両方とも当然ながら微生物の野生型形で存在する限り、もしくは存在しうる限り、２つの異なるポリペプチド鎖が割り当てられなければならない。そこで本発明のこの実施形態の範囲内では、シグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列もしくはそれらがコードする核酸が遺伝子工学的方法を用いて新たに組み合わせられ、シグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列のこの組み合わせは自然には存在しない。微生物の野生型形では、シグナルペプチドと追加のアミノ酸配列とのこのような結合は、結果として存在しない、つまりＤＮＡレベルにおいてもタンパク質レベルにおいても存在しない。しかし該シグナルペプチド例えば追加のアミノ酸配列もしくはこれをコードする核酸配列は、そのつど自然起源である可能性があるが、それらの組み合わせは自然には存在しない。しかしシグナルペプチドおよび追加のアミノ酸配列単独は、同一微生物から、または相違する微生物から発生する可能性がある。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明による核酸は、天然核酸ではないことを特徴とする。当然ながら、本発明による核酸を自然に発生する生物からその野生型形では単離できないことは重要ではない。詳細には、本発明による核酸は野生型細菌に関するが、細菌固有の核酸には関連しない。好ましくは、配列（ａ）および（ｂ）は同一の生物、特に細菌には由来せず、むしろ異なる生物、特に細菌に由来する。異なる細菌は、例えば、異なる菌株もしくは種もしくは属に属する細菌である。
【００３５】
本発明のまた別の実施形態では、該発現ベクターは、該シグナルペプチドが該核酸配列ｂ）によってコードされるタンパク質内の追加のアミノ酸配列のＮ末端に配置されていることを特徴とする。核酸配列ｂ）によってコードされたタンパク質は、そこで以下の構造：Ｎ末端−シグナルペプチド−（追加のアミノ酸配列であってよい）−追加のアミノ酸配列−Ｃ末端を示す。発現させるタンパク質のそのような構造は、特に有益であると強調されている。
【００３６】
本発明のまた別の実施形態では、該発現ベクターは、核酸配列ｂ）によってコードされたタンパク質がさらに該シグナルペプチドと該タンパク質の追加のアミノ酸配列との間に配置されている結合配列を含むことを特徴とする。核酸配列ｂ）によってコードされたタンパク質は、そこで以下の構造：Ｎ末端−シグナルペプチド−結合配列（「カップリング」もしくは「スペーサー」も）−追加のアミノ酸配列−Ｃ末端を示す。発現させるタンパク質のそのような構造は、同様に特に有益であると強調されている。好ましくは、該結合配列は、１〜５０アミノ酸、２〜２５アミノ酸、２〜１５アミノ酸、３〜１０アミノ酸および特に好ましくは３〜５アミノ酸の長さを有する。特に好ましい結合配列の例は、アミノ酸配列であるアラニン、グルタミン酸およびフェニルアラニン（Ｎ末端からＣ末端へ）である。
【００３７】
本発明のまた別の実施形態では、該発現ベクターは、該タンパク質の追加のアミノ酸配列が１つのプロテアーゼのアミノ酸配列を含み、このとき該プロテアーゼの該アミノ酸配列は配列番号７と少なくとも８０％同一であることを特徴とする。好ましくは、該プロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号７と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および極めて特に好ましくは１００％同一である。
【００３８】
または、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも８０％同一であるプロテアーゼのアミノ酸配列を含んでいる。好ましくは、該プロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および極めて特に好ましくは１００％同一である。
【００３９】
または、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％同一であるプロテアーゼのアミノ酸配列を含んでいる。好ましくは、該プロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および極めて特に好ましくは１００％同一である。
【００４０】
または、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるプロテアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号１０に記載の番号付けにおいて第９９位では該アミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）を示す。好ましくは、該プロテアーゼのアミノ酸配列は、配列番号１０と配列番号１０に記載の番号付けにおいて第１位〜９８位において少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および極めて特に好ましくは完全に同一である。
【００４１】
または、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％同一であり、配列番号１０に記載の番号付けにおいて第９９位では該アミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）を有し、さらに配列番号１０に記載の番号付けにおいてさらに以下のアミノ酸：
（ａ）第３位のトレオニン（３Ｔ）、
（ｂ）第４位のイソロイシン（４Ｉ）、
（ｃ）第６１位のアラニン、トレオニンもしくはアルギニン（６１Ａ、６１Ｔもしくは６１Ｒ）、
（ｄ）第１５４位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（１５４Ｄもしくは１５４Ｅ）、
（ｅ）第１８８位のプロリン（１８８Ｐ）、
（ｆ）第１９３位のメチオニン（１９３Ｍ）、
（ｇ）第１９９位のイソロイシン（１９９Ｉ）、
（ｈ）第２１１位のアスパラギン酸、グルタミン酸もしくはグリシン（２１１Ｄ、２１１Ｅもしくは２１１Ｇ）、
（ｉ）該アミノ酸（ａ）〜（ｈ）の組み合わせのうちの少なくとも１つを有するプロテアーゼのアミノ酸配列である。
【００４２】
好ましくは、該プロテアーゼのアミノ酸配列は、全ての変化していない、または１つの変化について予測されない位置にある配列番号１０と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および極めて特に好ましくは同一である。そこで極めて特に好ましくは、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも２つの位置において変化したアミノ酸配列を示すが、このとき配列番号１０に記載の番号付けにおいて第１の変化は第９９位のグルタミン酸であり、配列番号１０に記載の番号付けにおいて第２の変化は：
（ａ）第３位のトレオニン（３Ｔ）、
（ｂ）第４位のイソロイシン（４Ｉ）、
（ｃ）第６１位のアラニン、トレオニンもしくはアルギニン（６１Ａ、６１Ｔもしくは６１Ｒ）、
（ｄ）第１５４位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（１５４Ｄもしくは１５４Ｅ）、
（ｅ）第１８８位のプロリン（１８８Ｐ）、
（ｆ）第１９３位のメチオニン（１９３Ｍ）、
（ｇ）第１９９位のイソロイシン（１９９Ｉ）、
（ｈ）第２１１位のアスパラギン酸、グルタミン酸もしくはグリシン（２１１Ｄ、２１１Ｅもしくは２１１Ｇ）、
（ｉ）該アミノ酸（ａ）〜（ｈ）の組み合わせから成る群から選択される。
【００４３】
同様に極めて特に好ましくは、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、そこで配列番号１０に対して少なくとも２つの位置において変化したアミノ酸配列を示すが、このとき配列番号１０に記載の番号付けにおいて該第１の変化は第９９位のグルタミン酸であり、配列番号１０に記載の番号付けにおいて第２の変化は：
（ａ）第３位のトレオニン（３Ｔ）、
（ｂ）第４位のイソロイシン（４Ｉ）、
（ｃ）第６１位のアラニン、トレオニンもしくはアルギニン（６１Ａ、６１Ｔもしくは６１Ｒ）、
（ｄ）第１５４位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（１５４Ｄもしくは１５４Ｅ）、
（ｅ）第１８８位のプロリン（１８８Ｐ）、
（ｆ）第１９３位のメチオニン（１９３Ｍ）、
（ｇ）第１９９位のイソロイシン（１９９Ｉ）、
（ｈ）第２１１位のアスパラギン酸、グルタミン酸もしくはグリシン（２１１Ｄ、２１１Ｅもしくは２１１Ｇ）、
（ｉ）該アミノ酸（ａ）〜（ｈ）の組み合わせから成る群から選択される。
【００４４】
本発明による発現ベクターを備える上述したプロテアーゼもまた有益に製造可能なことが確認された。本発明のこのような実施形態については、シグナルペプチドとスブチリシンのそのような組み合わせを用いると特に良好な生産収量を発酵工程において達成できることが判明した。これに関して、成熟プロテアーゼ、したがって最終処理された製品のアミノ酸配列が提示されている。本発明による発現ベクターには、これに関して未成熟プロテアーゼ、特に例えばプロペプチドのまた別の配列を含めることができる。そのような場合には、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、該プロテアーゼおよび該プロペプチドのアミノ酸配列である。したがって、本発明のまた別の実施形態は、該タンパク質の追加のアミノ酸配列が、１つのプロテアーゼ、特に例えば上記のようなプロテアーゼのアミノ酸配列をもしくは１つのプロテアーゼもしくはそのプロペプチドとともに含むことを特徴とする。
【００４５】
一般には、該タンパク質の追加のアミノ酸配列は、単に成熟タンパク質のアミノ酸配列しか含むものではないと言える。むしろ追加のアミノ酸配列、例えばこのアミノ酸配列のプロペプチドをともに含む可能性がある。これはプロテアーゼに対してだけではなく、全てのタンパク質、特に他の種類の酵素にも当てはまる。
【００４６】
本発明による核酸および発現ベクターは、核酸を変化させるための公知の方法を介して発生させることができる。そのような核酸および発現ベクターは、関連する手引き書、例えばＦｒｉｔｓｃｈ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｕｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓによる‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ’’，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９に記載されており、バイオテクノロジーの当業者には周知である。そのような方法の例として、場合によりまた別の分子バイオロジーおよび／または化学もしくは生化学的標準方法と結び付けてもよい化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。
【００４７】
全ての上述の本発明の主題および実施形態には、本発明によるベクターをまた別の本発明の主題として含む非ヒト宿主細胞、適切な宿主細胞内で使用される製造方法ならびに適切なベクターもしくは宿主細胞の使用が結び付いている。そこで、上述の実施形態は、これらの発明の主題に適切に該当する。
【００４８】
本発明のまた別の主題は、本発明による発現ベクターを含む非ヒト宿主細胞である。本発明による発現ベクターは、好ましくは宿主細胞内へそれらの形質転換によって導入される。本発明によると、これは、好ましくは微生物内においてその後に発明による宿主細胞を提示する本発明によるベクターが形質転換させられることによって行われる。または、個別成分、つまり核酸の部分もしくはフラグメント、例えば本発明によるベクターの成分（ａ）および／または（ｂ）は、結果として生じる宿主細胞が本発明によるベクターを含有するように宿主細胞内に持ち込むことができる。このアプローチは、特に、該宿主細胞が既に本発明によるベクターの１つ以上の構成成分を含有していて、また別の構成成分がその後に適切に補給される場合に適合する。細胞を形質転換させるための方法は、最新技術において確立されており、当業者には周知である。宿主細胞としては、原則的には全ての細胞、つまり原核細胞もしくは真核細胞が適合する。好ましくは、例えばベクターを用いた形質転換およびそれらの安定性株化に関係して遺伝学的に有益に取り扱うことのできるそのような宿主細胞は、例えば単細胞真菌もしくは細菌である。さらに好ましい宿主細胞は、良好な微生物学上および生物工学上の取り扱い易さによって識別される。これは例えば、容易な培養可能性、高い増殖率、培養培地への低い要求および異種タンパク質についての優れた生産率および分泌率にも当てはまる。様々な最新技術において利用可能な豊富な系から、個々の場合のための最適の発現系は、実験によって得なければならないことが多い。
【００４９】
その他の好ましい実施形態は、例えばベクター上で自由に使用可能な遺伝的調節エレメントに基づいて、これらの細胞内で最初から存在し得、それらの活性を調節可能である宿主細胞である。例えば、アクチベーターとして機能する化合物の制御された添加によって、培養条件の変更によって、もしくは一定の細胞密度に達した場合は、これらは発現のために活性化することができる。これは該タンパク質の経済的生産を可能にする。
【００５０】
好ましい宿主細胞は、原核細胞もしくは細菌細胞である。細菌は、短い世代時間および培養条件についての少ない要求を特徴とする。これによって、費用効果的方法を確立することができる。さらに当業者であれば、発酵技術における細菌においては内容豊富な経験に基づく知識を利用することができる。特別な生産のためには、極めて様々な、個々の場合に実験によって確認しなければならない理由、例えば栄養源、製品形成率、時間需要などから、グラム陰性もしくはグラム陽性細菌が適合する可能性がある。
【００５１】
グラム陰性細菌、例えばエシェリキア・コリでは、多数のポリペプチドが細胞周辺腔内に、さらに該細胞を取り囲んでいる２つの膜の間の区画内にも分泌させられる。これは特定の使用のためには有益な可能性がある。さらに、グラム陰性菌は、発現したポリペプチドを細胞周辺腔内だけではなく該細菌を取り囲む培地内にも放出されるように仕上げることもできる。これに対してグラム陽性細菌、例えばバシラスもしくは放線菌または他の放線菌目の代表菌は外膜を有していないので、分泌されたタンパク質は直ちに該細菌を取り囲む培地中、通例は栄養培地中へ送達され、発現したポリペプチドは該培地から精製することができる。グラム陽性細菌は、培地から直接に単離することができる、またはさらに処理することができる。さらに、グラム陽性細菌は、技術的に重要な酵素にとって大多数の起源生物と類似もしくは同一であり、大抵は匹敵する酵素だけを形成するので、該酵素は類似のコドン使用頻度およびそれらのタンパク質合成機構を介して自然に適切に調整される。
【００５２】
コドン使用頻度とは、アミノ酸内の遺伝コードの翻訳である、つまりどのヌクレオチド配列（三重項もしくは塩基三重項）がどのアミノ酸もしくはどの機能、例えば様々なタンパク質に対する結合部位である該翻訳されなければならない領域の開始および終了などをコードすると理解されている。そこで、各々の生物、特に各々の生産菌株は一定のコドン使用頻度を有する。タンパク質合成においては、宿主細胞内でトランス遺伝子核酸上に存在するコドンが比較的に少数の装填されたｔＲＮＡに遭遇すると、困った状況に陥る可能性がある。これに対して同義語のコドンは、同一のアミノ酸をコードし、宿主に依存してより良好に翻訳することができる。したがって場合によっては必要になるこの翻訳は、発現系の選択に左右される。特に未知の、場合によっては培養不能である生物のプローブでは、適切な適応が必要になることがある。
【００５３】
本発明は、主として微生物、特に全ての発酵可能な微生物、特に好ましくはバシラス属の微生物上で使用することができ、このためそのような微生物を生産生物として使用することによって発酵工程における生産収量の増加に影響を及ぼすことができる。そのような微生物は、本発明の目的において好ましい宿主細胞を意味する。
【００５４】
そこで本発明のまた別の実施形態では、該宿主細胞は、該宿主細胞が細菌である、好ましくはエシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、バシラス属（Bacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebakterium）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）およびシュードモナス属（Pseudomonas）の群から選択され、さらに好ましくは、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・レンツス（Bacillus lentus）、バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）、バシラス・グロビギイ（Bacillus globigii）、バシラス・ギブソニイ（Bacillus gibsonii）、バシラス・クラウジイ（Baccilus clausii）、バシラス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxidans）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）の群から選択される細菌であることを特徴とする。極めて特に好ましくは、バシラス・リケニホルミスである。
【００５５】
該宿主細胞は、さらにそれが１つの細胞核を有することを特徴とする真核細胞である可能性がある。そこで本発明のまた別の主題は、それが１つの細胞核を有することを特徴とする宿主細胞である。
【００５６】
原核細胞とは対照的に、真核細胞は、形成されたタンパク質を翻訳後に修飾可能な状況にある。これについては、真菌、例えばアクチノマイセス種または酵母、例えばサッカロミセスもしくはクリベロマイセス種が例として挙げられる。これは例えば、特に該タンパク質がそれらの合成に関連してそのような系を可能にする特異的修飾が可能な場合は有益な可能性がある。真核系を特に該タンパク質合成と関連付けて実施する修飾には、例えば、低分子量化合物、例えば膜アンカーもしくはオリゴ糖の結合が含まれる。このようなオリゴ糖修飾は、例えば発現したタンパク質のアレルゲン性を低下させるために望ましい場合がある。当然ながらこのような細胞から形成された酵素、例えばセルラーゼとの共発現もまた有益な場合がある。さらに、例えば好熱性真菌性発現系は、特に温度抵抗性変異体を発現させるために適合する可能性がある。
【００５７】
発酵工程中に形成される生成物としては、本発明の範囲内では、核酸配列（ｂ）にコードされるタンパク質、特に上述したようなタンパク質が考慮の対象となる。好ましくは、それは酵素、特に好ましくはプロテアーゼおよび極めて特に好ましくはスブチリシンである。
【００５８】
宿主細胞は、さらにその他の、もしくは追加の選択マーカーを有する、またはその他の、もしくは追加のタンパク質を発現するそれらの培養条件についての要求事項に関して変化させることができる。特に、多数のタンパク質もしくは酵素を発現するような宿主細胞が問題となる。好ましくは、宿主細胞は、これらのタンパク質もしくは酵素を該宿主細胞を取り囲む培地中へ分泌する。
【００５９】
本発明による宿主細胞は、例えば不連続的もしくは連続的システム内でそれ自体は公知の方法で培養および発酵させられる。最初の場合、適切な栄養培地に該宿主細胞が接種され、生成物は該培地から実験的に検出されなければならない時間後に収穫される。継続的発酵は、比較的長い時間にわたって細胞は一部死滅するがその他は後に増殖し、同時に該培地からの生成物を採取可能な定常状態の達成を特徴とする。
【００６０】
本発明による宿主細胞は、好ましくは、核酸配列（ｂ）にコードされるタンパク質を製造するために使用される。そこで本発明のまた別の主題は、
ａ）本発明による宿主細胞を培養する工程、
ｂ）該タンパク質を該培養培地もしくは該宿主細胞から単離する工程を含む、タンパク質を製造するための方法である。
【００６１】
本発明によるこの主題は、好ましくは発酵方法を含んでいる。発酵方法自体は最新技術から公知であり、通例は製造された生成物、例えばタンパク質の精製方法によって行われる適切な本来の大規模生産工程を意味している。１つのタンパク質を製造するための適切な方法に基づく全ての発酵方法は、本発明の主題の実施形態を表している。
【００６２】
このとき製造方法のためのそのつど最適な条件、特に利用された宿主細胞に対する最適な培養条件は、例えば発酵容量および／または培地組成および／または酸素供給量および／または撹拌速度に関して当業者の判断にしたがい実験によって確認されなければならない。
【００６３】
発酵が供給戦略を通して実施されることを特徴とする発酵方法が特に考慮の対象となる。このとき、連続的培養によって消費される培地構成成分は補給される。これは補給戦略とも呼ばれる。これによって細胞密度においても細胞質量もしくは乾燥質量および／または特に重要なタンパク質、好ましくは酵素の活性においても相当に大きな増大を達成することができる。
【００６４】
さらに発酵工程は、望ましくない代謝産物がろ過して除去される、またはバッファーもしくはそのつど適切な対イオンの添加によって中和されるように仕上げることができる。
【００６５】
製造されたタンパク質は、発酵培地から収穫することができる。そのような発酵方法は、該宿主細胞からの該ポリペプチドの単離、つまり該細胞質量（乾燥質量）からの生成物精製に対して有益である。本発明によると、シグナルペプチドを用いると、これに関して適切な分泌マーカーを自由に使用することができる。
【００６６】
上述した全ての事情は、タンパク質を製造するための方法に結び付けることができる。これに関して、方法工程の多数の組み合わせの可能性が考えられる。この最適な方法は、あらゆる具体的な個々の場合について確認されなければならない。
【００６７】
本発明のまた別の主題は、本発明による発現ベクターまたは本発明による宿主細胞のタンパク質を製造するための使用である。既に上述した全ての事情、主題および実施形態は、この実施形態の主題上でも使用することができる。そこで本開示では明示的にここで、この開示を本発明による使用（該ベクターもしくは宿主細胞の使用）に対しても該当するという備考を用いて適切な場所を参照するように指示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、バシラス発現ベクターｐＢＳＭｕｌ５内のクローニング戦略のスキームを示す。
【図２】図２は、配列番号８に記載のプロテアーゼおよびｐＢＳＭｕｌ５内の３種の相違するシグナルペプチドを用いたバシラス・リケニホルミスの培養残渣内の相対プロテアーゼ活性を示す。
【図３】図３は、配列番号９に記載のプロテアーゼおよびｐＢＳＭｕｌ５内の２種の相違するシグナルペプチドを用いたバシラス・リケニホルミスの培養残渣内の相対プロテアーゼ活性を示す。
【００６９】
実施例
全ての分子学的作業手順は、例えばＦｒｉｔｓｃｈ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｕｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ’’，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９または匹敵する関連する研究に記載されている標準方法に従う。酵素および構築ブロック（キット）は、そのつどの製造業者の指示にしたがって使用した。
【００７０】
実施例１：本発明にしたがった発現ベクターの製造
プラスミドｐＢＳＭｕＬ３（Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）は、Ｓａｃｌ制限および引き続いてのＥ．ｃｏｌｉ部分についての再連結（ｒｅｌｉｇａｔｉｏｎ）によって短縮させた。結果として生じたプラスミドｐＢＳＭｕＬ５（図１を参照）は、プロペプチドを含むプロテアーゼを切断部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ内へクローニングするためのベクターとして役立った。これに加えて配列番号８に記載のプロテアーゼの遺伝子は配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマーを用いて、および配列番号９に記載のアルカリ性プロテアーゼは配列番号１３および配列番号１４に記載のプライマーを用いて増幅させた。結果として生じたプラスミドは、該シグナルペプチドを該切断部位ＨｉｎｄｉｌｌおよびＥｃｏＲＩ内へクローニングするためのベクターとして機能した。「ベンチマーク」としてのコントロール−シグナルペプチドＳｕｂＣ（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，  ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）アクセス番号：Ｘ９１２６０．１）のＤＮＡフラグメントは、配列番号１５および配列番号１６に記載のプライマーを用いて増幅させ、該プラスミドのＨｉｎｄｉｌｌおよびＥｃｏＲＩ切片にクローニングしたので、タンパク質を配列番号８（プラスミド１）もしくは配列番号９（プラスミド２）に記載のプロテアーゼと結び付けてシグナルペプチドＳｕｂＣを備えるタンパク質をコードする核酸配列ｂ）を備えるプラスミドが生じた。これらのプラスミドは、以下ではコントロールもしくは「ベンチマーク」として役立った。配列番号２に記載のシグナルペプチドのＤＮＡフラグメントは配列番号１９および配列番号２０に記載のプライマーを用いて、配列番号４に記載のシグナルペプチドのＤＮＡフラグメントは配列番号１７および配列番号１８に記載のプライマーを用いて、ならびに配列番号６に記載のシグナルペプチドのＤＮＡフラグメントは配列番号２１および配列番号２２に記載のプライマーを用いて増幅させた。配列番号２および４に記載の該シグナルペプチドのＤＮＡフラグメントはそのつど配列番号８に記載のプロテアーゼをコードする該ベクター内へクローニングされるが（プラスミド３および４）、配列番号６に記載の該シグナルペプチドのＤＮＡフラグメントは配列番号９に記載のプロテアーゼをコードする該ベクター内に挿入された（プラスミド５）。クローニングに誘発されて、そのつどのシグナルペプチドのＤＮＡ配列と該そのつどのプロテアーゼのプロペプチドのＤＮＡ配列との間には、アミノ酸配列ＡＦＫをコードする９ヌクレオチドの配列が導入された（図１を参照されたい）。このいわゆる結合配列は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの認識配列を含んでいる。
プライマーとして使用される全てのオリゴヌクレオチドは、以下の第１表に列挙した。
【００７１】
第１表：
【表１】
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【００７２】
実施例２：タンパク質の発現
バシラス・リケニホルミス菌株は、プラスミド１〜５を用いて、様々なプロテアーゼ生産菌株を得るために形質転換させた。培養を接種するためには、一晩インキュベートした寒天プレートの単一コロニーを使用した。分泌効率を定量的に決定するために、単一コロニーをディープウエル−ＭＴＰ（マイクロタイタープレート；各１ｍＬの選択的ＬＢ培地を含む９６ウエル）内の寒天プレートから直接的に移した。このとき各単一コロニーは同時に少なくとも２つのウエル内に、そのつどのクローンの複数回培養によって２回もしくは３回の測定を行うために移した。ディープウエル−ＭＴＰを接種するためには、３７℃で一晩インキュベーションしたクローンだけを使用した。マイクロタイタープレート攪拌器（Ｔｉｍｉｘ  ５、Ｅｄｍｕｎｄ−Ｂｕｅｈｌｅｒ社、ヘッヒンゲン）内で３７℃にて２０時間培養した後、全てのクローンをＬＢ寒天プレート上で複製し、引き続いて遠心を用いて細胞を沈降させた（４０００ＵｐＭ、２０分間、４℃）。その後の全てのピペッティング工程は、マルチチャネルピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ）を用いて実施したが、このとき「リバースピペッティング」モードを使用し、１５μＬ以上の容量だけをピペッティングした。そのつど最少容量をＭＴＰ内へ配置し、より多量の容量をこれに加え、ＭＴＰをあらゆる希釈工程において１０秒間、分光光度計「Ｓｐｅｋｔｒａｍａｘ  ２５０」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国サニーベール）内で混合した。適切な希釈液を調製するために、マルチチャネルピペット１本当たりの培養残渣を取り出し、マイクロタイタープレート（９６ウエル、Ｆ床、ガラスのように透明、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社、フリッケンハウゼン）内へ移した。
【００７３】
引き続いて、培養残渣もしくは希釈液内のタンパク質分解活性は基質ｓｕｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）由来の発色団であるパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の遊離を介して測定した。該プロテアーゼは、基質を分割し、ｐＮＡを遊離させる。該ｐＮＡの遊離は、４１０ｎｍでの消光の増加を誘発し、その時間的経過は酵素活性にとっての尺度である（Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ９９：３１６−３２０，  １９７９を参照）。
【００７４】
様々な菌株の分泌効率を確認するために、あらゆるＭＴＰ培養内で内部コントロール構築体プラスミド１もしくはプラスミド２を援用した。該コントロール構築体を用いて該菌株の培養残渣中で確認されたタンパク質分解活性は、１００％であると規定した。
【００７５】
本発明によるプラスミド３および４を備える菌株は、該プラスミド１を含有する該コントロールに比較して、１９４％±４８もしくは２３０％±３８上昇したプロテアーゼ活性に達した（図２を参照）。
【００７６】
本発明によるプラスミド５を備える菌株は、該プラスミド２を含有する該コントロールに比較して、４４％±１０上昇したプロテアーゼ活性に達した（図３を参照されたい）。
【００７７】
図面の説明
図１：バシラス発現ベクターｐＢＳＭｕｌ５内のクローニング戦略のスキーム（Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６にしたがって修正）。（Ａ）該シグナルペプチドのＤＮＡフラグメントは、スペーサー領域によって行われ、およびメチオンのための標準化開始コドンが続く標準化リボソーム結合部位（ＲＢＳ）であるＨｉｎｄｌｌｌ制限切断部位を備えるＮ末端で増幅させられる。シグナルペプチドと分泌させる該プロテアーゼのＮ末端との間では、「＋１」位のアラニンおよびＥｃｏＲＩ−制限切断部位とのカップリングが付加された。（Ｂ）Ｈｐａｌｌプロモーター、そのつどの分泌標的（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを介してクローニングされた）ならびにカナマイシン耐性カセットおよびバシラスに対する複製タンパク質ｒｅｐＢを備える、バシラス−ベクターｐＢＳＭｕｌ５。
【００７８】
図２：配列番号８に記載のプロテアーゼおよびｐＢＳＭｕｌ５内の３種の相違するシグナルペプチドを用いたバシラス・リケニホルミスの培養残渣内の相対プロテアーゼ活性。構築体プラスミド１のタンパク質分解活性は、１００％であると定義した（コントロール）。これらの数値は、少なくとも２つの相互に依存しない培養において確認された。エラーバーは、標準偏差を表示している。
【００７９】
図３：配列番号９に記載のプロテアーゼおよびｐＢＳＭｕｌ５内の２種の相違するシグナルペプチドを用いたバシラス・リケニホルミスの培養残渣内の相対プロテアーゼ活性。構築体プラスミド２のタンパク質分解活性は、１００％であると定義した（コントロール）。これらの数値は、少なくとも２つの相互に依存しない培養において確認された。エラーバーは、標準偏差を表示している。
【図１】
2014519327.tif 000003
【図２】
2014519327.tif 000004
【図３】
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【配列表】
2014519327000001.app
【国際調査報告】
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