(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症およびＤ型肝炎ウイルス感染症の治療における、場合によってインターフェロンまたはテルビブジン、ラミブジン、エムトリシタビン、エンテカビル、アデホビルもしくはテノホビルと組み合わせる、シクロフィリンインヒビター（アリスポリビルまたはＤＥＢ０２５など）の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＢ型肝炎ウイルス感染症の治療に使用するためのアリスポリビル。
【請求項２】
患者におけるＤ型肝炎ウイルス感染症の治療に使用するためのアリスポリビル。
【請求項３】
直接的な抗ウイルス剤と組み合わせて投与する、請求項１または２に記載の使用のためのアリスポリビル。
【請求項４】
直接的な抗ウイルス剤がテルビブジン、ラミブジン、エムトリシタビン、エンテカビル、アデホビルおよびテノホビルから本質的になる群から選択される、請求項１または２に記載の使用のためのアリスポリビル。
【請求項５】
インターフェロンと組み合わせて投与する、請求項１または２に記載の使用のためのアリスポリビル。
【請求項６】
患者におけるＢ型肝炎ウイルス感染症およびＤ型肝炎ウイルス感染症の治療に使用するためのアリスポリビル。
【請求項７】
直接的な抗ウイルス剤またはインターフェロンと組み合わせて投与する、請求項６に記載の使用のためのアリスポリビル。
【請求項８】
有効量のアリスポリビルを投与することおよび場合によりインターフェロンまたは直接的な抗ウイルス剤を患者へ投与することを含む、患者のＢ型肝炎ウイルス感染症を治療するための方法。
【請求項９】
有効量のアリスポリビルを投与することおよび場合によりインターフェロンまたは直接的な抗ウイルス剤を患者へ投与することを含む、患者のデルタ肝炎ウイルス感染性感染症を治療するための方法。
【請求項１０】
アリスポリビルを投与することを含む、患者の肝疾患の進行の予防のための方法。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれかに記載の使用のためのアリスポリビルを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、シクロフィリンインヒビターである、シクロフィリン結合性の非免疫抑制性シクロスポリン類似体に関し、特に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）単独の感染症（infection）またはデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）との複合（combination）感染症およびこうした感染症によって引き起こされる肝疾患の治療におけるその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景
シクロスポリンおよびその非免疫抑制性類似体は、構造的に特徴的な環状のポリ−Ｎ−メチル化ウンデカペプチド類を含み、通常これらは、薬理学的、特に免疫抑制的または抗炎症的活性を有する。最初に単離されたシクロスポリンは、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）としても知られる、真菌の代謝産物である天然起源のシクロスポリン（Ciclosporin）またはシクロスポリン（Cyclosporine）であった。シクロフィリンに強く結合するが免疫抑制的でないシクロスポリンが同定されている。ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９８０４、ＷＯ２００５／０２１０２８またはＷＯ２００６／０７１６１９（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に阻害性作用を有することも見出された、シクロフィリンに結合性の非免疫抑制性シクロスポリンを開示している。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０３８０８８は、ＨＣＶ治療でアリスポリビル（alisporivir）を使用するための方法および組成物を記載している。アリスポリビル（ＤＥＢ０２５またはＤｅｂｉｏ−０２５）は、シクロフィリン（Ｃｙｐ）インヒビターであり、抗ＨＣＶ薬剤としてのその作用様式は、宿主タンパク質の阻害、特にＨＣＶの複製に直接的に関与するシクロフィリンＡの阻害によるものである。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、最小のヒトＤＮＡウイルスである（１）。ＨＢＶゲノムは、ＨＢＶタンパク質：外被タンパク質、すなわちｉ）小、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；ｉｉ）中−プレＳ２＋ＨＢｓＡｇ；ｉｉｉ）大−プレＳ１＋プレＳ２＋ＨＢｓＡｇ；ヌクレオカプシドタンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードするオーバーラップした読み枠を有する、部分的に二本鎖の環状ＤＮＡである。Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、ＨＢＶ複製中に産生される非構造タンパク質であり、ヌクレオカプシドＨＢｃＡｇと９０％のアミノ酸をともにする。ＡからＨと命名されたＨＢＶの８種の遺伝子型が決定されており、それぞれが別々の地理的分布を有する。このウイルスは非細胞変性であり、ウイルス特異的な細胞性免疫が、ＨＢＶへの曝露、すなわち６カ月で肝疾患が消散する急性感染症またはしばしば進行性の肝損傷を伴う慢性ＨＢＶ感染症の転帰の主要決定要因である。従来の診断イムノアッセイによる血清中のＨＢｓＡｇの検出はＨＢＶ感染の重要な診断マーカーであり、６カ月を超える持続的な血清中のＨＢｓＡｇの検出は慢性ＨＢＶ感染症の証明となる（２、３、４）。臨床的に意味のあるＨＢＶ複製の最良のマーカーは、高感度なポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）ベースのアッセイで検出されるような、血清中のＨＢＶ  ＤＮＡのレベルである。
【０００４】
世界中で３．５億人を超える人々が慢性的にＨＢＶに感染しており、それにより重篤な肝疾患、例えば慢性肝炎、肝硬変、肝不全および肝細胞癌（ＨＣＣ）などを発症する危険性が高まる。慢性ＨＢＶ感染症の自然な推移は以下の４つの連続したフェーズを含む。（１）初期の「免疫耐性」フェーズ（高レベルのウイルス複製および極微の肝炎）；（２）免疫反応フェーズ（著しい肝炎および血清アミノトランスフェラーゼの上昇）；いくらかの患者が進行する（３）「非複製」フェーズ（抗ＨＢｅへのセロコンバージョン；検出限界以下または低レベルのウイルス血症（ＰＣＲベースのアッセイで２０００ＩＵ／ｍｌ未満）；肝炎の消散）；および（４）ＨＢｅＡｇ陰性のＢ型慢性肝炎（ＨＢｅＡｇの産生を妨げるがウイルス複製を妨害しない特異的なウイルス変異の出現が原因である）。この種類のＣＨＢは、血清ＨＢＶ  ＤＮＡおよび血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）のレベルが変動することならびに進行性の肝疾患を特徴とする。Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）がＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）陽性またはＨＢｅＡｇ陰性のＣＨＢのいずれかとして存在し得ることに注意することは重要である。ＣＨＢ患者の縦断的研究は、肝硬変発症の５年累積発生率が８から２０％に及ぶことを示す。肝代償不全の５年累積発生率は約２０％である（２）。ＨＣＣの世界的な発生率は増加しており、現在５番目に多い癌となっている（２、３、４）。肝硬変になった場合、ＨＢＶに関連するＨＣＣの年間発生率は高く、２〜５％に及ぶ（２）。
【０００５】
ＣＨＢ治療の第一目標は、ＨＢＶの複製を永続的に抑制することおよび肝疾患を改善することである。臨床的に重要な短期的目標は、ＨＢｅＡｇ−セロコンバージョン、血清のＡＬＴおよびＡＳＴの正常化、肝炎の消散を達成することならびに肝代償不全を予防することである（２）。治療の最終目的は、持続的反応を達成して、肝硬変、肝癌の発症を予防することおよび生存期間を延長することである。ＨＢＶ感染症は、感染した肝細胞の核内に特定の種類のウイルス性共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃ  ＨＢＶ  ＤＮＡ）が残存することが原因で完全に根絶することができない。しかし、血清ＨＢｓＡｇの治療誘導性クリアランスは慢性ＨＢＶ感染症の終結のマーカーであり、最良の長期転帰と関連づけられている（２、３）。
【０００６】
７種の薬物がＣＨＢ治療に現在利用可能であり、それらは従来のインターフェロン、ペグ化インターフェロンおよび直接的な抗ウイルス剤（direct antiviral agent）である。直接的な抗ウイルス剤（ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体）は、次の３クラスに属する。Ｌ−ヌクレオシド（ラミブジン、テルビブジンおよびエムトリシタビン）；デオキシグアノシン類似体（エンテカビル）およびヌクレオシドホスホネート（アデホビルおよびテノホビル）。これらは、主として連鎖停止剤としてＨＢＶのＤＮＡ複製を直接的に妨げる（２、３、４）。ＨＢｅＡｇ陽性患者では、１年でのウイルス学的な治療応答率（検出限界以下の血清ＨＢＶ  ＤＮＡ）は、ペグインターフェロンで治療した場合は２５％、ラミブジンの場合は３６〜４０％、エンテカビルの場合は６７％、テルビブジンの場合は６０％、テノホビルの場合は７４％である（２）。１年後のＨＢｓＡｇの消失は非常に低く、０から３％である。ＨＢｅＡｇ陰性のＣＨＢを罹患する患者では、１年での検出限界以下のＨＢＶ  ＤＮＡの割合は、ペグインターフェロンで治療した場合は６３％、ラミブジンの場合は７２％、エンテカビルの場合は９０％、テルビブジンの場合は８８％、テノホビルの場合は９１％である。ＨＢｓＡｇの減少は、直接的な抗ウイルス剤のいずれを用いても０％であった。現在利用可能な治療法は最適以下であり、ＣＨＢの治療目標を達成するために、より良い療法が必要である。インターフェロン治療に対する重要な制限は、大きな副作用、ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制が低率であることおよびＡＬＴの正常化が低率であることであり、直接的な抗ウイルス剤を用いる治療の重要な制限は、耐性発現；長期の生涯にわたる治療を要する治療を中止した後のＨＢＶ複製の跳ね返り、非常に低率のＨＢｓＡｇクリアランス、長期の生涯にわたる治療に伴って増大する有害事象の危険性である。
【０００７】
慢性ＨＢＶ感染症（血清ＨＢｓＡｇ陽性）患者の一部は、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）に共感染する。ＨＤＶは、一本鎖の環状ＲＮＡゲノムを有する欠陥ウイルスであり、Ｂ型肝炎ウイルスとともにのみ急性または慢性の肝疾患を引き起こす（１）。ＨＤＶ  ＲＮＡによって発現される唯一のタンパク質は、デルタ肝炎抗原であり、これはこのウイルスのヌクレオカプシドである。ＨＤＶは自身の外被タンパク質（ＨＢｓＡｇ）をコードせず、これをＢ型肝炎ウイルスから「借り」なければならない。したがって、ＨＤＶへの感染は、ＨＢＶと同時に（共感染）またはそれに続いてＨＢＶの存在下でのみで起こり、感染の持続時間はＨＢｓＡｇ陽性の持続時間によって決められる。ＨＢｓＡｇ陽性患者では、ＨＤＶの活動性感染は、血清中のＨＤＶ  ＲＮＡの検出、肝細胞中のデルタ肝炎抗原に対する免疫組織化学染色または血清中の抗ＨＤＶ  ＩｇＭの検出によって確認される（２）。
【０００８】
ＨＤＶは世界的に分布しており、地中海諸国、南および中央アフリカの一部ならびに南アメリカで最も流行している。Ｂ型肝炎ウイルスキャリア全体の５％がＨＤＶに感染していると推定される（５）。北アメリカおよび北ヨーロッパなどのＨＢＶ有病率が低い国では、ＨＤＶ感染は、静注薬物使用者のような、非経口のＨＢＶ曝露の危険性がある集団に大体限られている。ＨＤＶの流行が激しい地域からの移民がいくつかのヨーロッパの国々で有病率を最近増大させており、慢性ＨＢＶ患者の約１０％に至る。
【０００９】
Ｄ型慢性肝炎の承認された治療は、インターフェロンアルファだけであり、その結果は満足するものではない。インターフェロンへのリバビリンの添加は、応答を改善しなかった。ＨＢＶ複製を遮断する直接的な抗ウイルス剤は、ＨＤＶの複製に対して効果がないことが示された。インターフェロン＋ラミブジンまたはインターフェロン＋アデホビルの組合せは、インターフェロン単独と比較して応答を改善しなかった（２、３、６）。したがって、ＨＤＶ誘導性肝損傷が肝硬変、肝代償不全および場合によっては肝不全による死亡につながるため、Ｄ型慢性肝炎治療には、大きなアンメットメディカルニーズが残されている。
【発明の概要】
【００１０】
したがって、Ｂ型肝炎ウイルス感染症のみに罹患している患者またはＢ型肝炎ウイルスおよびデルタ肝炎ウイルスに感染した患者ならびに慢性肝炎、肝硬変、肝代償不全およびＨＣＣなど、こうした感染症によって誘導される肝疾患または肝障害を治療するための新規な方法を提供することが、本開示の一目的である。
【００１１】
驚いたことに、本発明者等は、シクロフィリンインヒビター、特にアリスポリビルが、ＨＢＶ感染症の治療で効果的に使用することができるという、Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス特性を有することを発見した。特に本発明者等は、アリスポリビルは肝細胞でのＨＢＶの複製を抑止（または妨害）し、ＨＢｓＡｇの産生を減少させることを発見した。さらに、シクロフィリンインヒビター、特にアリスポリビルは、Ｄ型慢性肝炎治療でも使用することができる。
【００１２】
したがって、本発明はアリスポリビルを用いる新規の抗ＨＢＶおよび抗ＨＤＶ治療法を提供する。
【００１３】
さらに本開示は、有効量のシクロフィリンインヒビター、特にアリスポリビルを単独または直接的な抗ウイルス剤もしくはインターフェロンアルファとの組合せのいずれかで投与することを含む、患者のＨＢＶおよび／またはＨＤＶ感染症ならびに誘導性肝疾患の治療のための方法を提供する。本開示は、ＨＢＶ感染症および付随する肝疾患の治療に使用するための、さらにＨＢＶおよびＨＤＶに感染した患者ならびに付随する肝疾患の治療に使用するためのアリスポリビルをさらに提供する。
【００１４】
本開示の概要
さらに以下を記載する。
１．１  患者にアリスポリビルを投与することを含む、該患者のＢ型肝炎ウイルス感染症およびＨＢＶ誘導性障害を治療するための方法。
１．２  アリスポリビルを投与することを含む、ＨＢＶの複製およびＨＢｓＡｇの産生を阻害するための方法。
１．３．  患者にアリスポリビルを投与することを含む、該患者のデルタ肝炎ウイルス感染症およびＨＤＶ誘導性障害を治療するための方法。
１．４．  アリスポリビルを投与することを含む、ＨＤＶの複製およびＨＢｓＡｇの産生を阻害するための方法。
１．５．  アリスポリビルを投与することを含む、ＨＢＶまたはＨＤＶ誘導性肝損傷を緩和させるための方法および肝細胞死を減少させるための方法。
１．６．  アリスポリビルを投与することを含む、血清ＡＬＴレベルを正常化するための方法。
１．７．  アリスポリビルを投与することを含む、肝炎を緩和または消散するための方法。
２．  上記で定義されたいずれかの方法で使用するための医薬組成物の調製における、アリスポリビルの使用。
３．  上記で定義されたいずれかの方法で使用するための医薬の調製における、アリスポリビルの使用。
４．  上記で定義されたいずれかの方法で使用するための医薬の調製における、ＨＢＶの複製を阻害する直接的な抗ウイルス剤と組み合わせる、アリスポリビルの使用。
５．  ＨＢＶ感染症患者および付随する肝疾患の治療をするための、ならびにＨＢＶおよびＨＤＶに感染した患者および付随する肝疾患に対する治療をするための、インターフェロンと組み合わせる、アリスポリビルの使用。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、５マイクログラム／ｍＬの濃度のアリスポリビルで、細胞内のＨＢＶ  ＤＮＡレベルの著しい低下（７２時間で１０倍）が観察されたことを示す。
【図２】図２から分かるように、ＮＩＭ８１１の効果と比較した場合、５．０マイクログラム／ｍＬの濃度のアリスポリビルが、細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルを低下させるのにより大きな効果を示した。
【図３】図３は、ＤＥＢ０２５の存在下での、一過的にトランスフェクトした細胞（Ｈｕｈ７）または安定的にトランスフェクトした（ＨｅｐＧ２２１５）細胞から分泌されるＨＢＶ  ＤＮＡの用量依存的減少を示す。
【図４】図４は、ＤＥＢ０２５の存在下での、Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２２１５細胞の細胞質のＨＢＶ  ＤＮＡの用量依存的減少を示す。
【図５】図５は、ＤＥＢ０２５（ＤＥＢ）、テルビブジン（ＴＥＬＢ）およびＤＥＢ＋ＴＥＬＢの存在下での、ＨｅｐＧ２２１５細胞の分泌性ＨＢＶ  ＤＮＡの減少を示す。
【図６】図６は、ＤＥＢ０２５（ＤＥＢ）、テルビブジン（ＴＥＬＢ）およびＤＥＢ＋ＴＥＬＢの存在下での、ＨｅｐＧ２２１５細胞の細胞性ＨＢＶ  ＤＮＡの減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示の説明
本明細書で使用する場合、「Ｂ型肝炎ウイルス感染患者」は、任意のＢ型肝炎ウイルス遺伝子型、例えば遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどに感染した患者を意味する。幾つかの実施形態では、患者はデルタ肝炎ウイルスに感染している。幾つかの実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス感染患者はデルタ肝炎ウイルスにも感染していてもよい。
【００１７】
本発明では、インターフェロンはペグ化でも非ペグ化でもよく、以下のようなインターフェロンが含まれ得る。Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）、インターフェロンアルファ−２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）；ＰＥＧ−ｌｎｔｒｏｎ（登録商標）、ペグインタフェロン（peginteferon）アルファ−２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）；Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）、組換えインターフェロンアルファ−２ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）；Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）；Ｂｅｒｅｆｏｒ（登録商標）、利用可能なインターフェロンアルファ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｌｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ、ＣＴ）；Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ（登録商標）、天然アルファインターフェロンの精製混合物（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ、日本）；Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）、リンパ芽球インターフェロンアルファｎ１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）、コンセンサスアルファインターフェロン（ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、ＣＡおよびＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｂｕｒｙ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）；Ａｌｆｅｒｏｎ（登録商標）、天然アルファインターフェロンの混合物（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＰｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃｏ．、ＣＴ）；Ｖｉｒａｆｅｒｏｎ（登録商標）；およびこれらのインターフェロンの組合せ。
【００１８】
使用可能なコンジュゲートインターフェロン（conjugated interferon）には、例えばヒトアルブミンにコンジュゲートされたＡｌｂｕｆｅｒｏｎ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。水溶性のポリマーまたはポリアルキレンオキシドホモポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール）、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのコポリマーおよびこれらのブロックコポリマーにコンジュゲートされたインターフェロン。ポリアルキレンオキシドベースのポリマーの代わりに、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマーなどの非抗原性の材料を効果的に使用することができる。インターフェロン−ポリマーコンジュゲートは、ＵＳ４７６６１０６、ＵＳ４９１７８８８、ＥＰＡ０２３６９８７、ＥＰＡ０５１０３５６およびＷＯ９５／１３０９０に記載されている。ポリマー修飾が抗原反応を十分に低減するので、外来性インターフェロンは完全に自家性である必要はない。ポリマーコンジュゲートを調製するのに用いるインターフェロンは、ヒト、反芻動物またはウシのインターフェロンなどの哺乳動物抽出物から調製してもよいし、組換えで産生してもよい。インターフェロンの他の形態には、ＳｅｒｏｎｏのＲｅｂｉｆ（インターフェロンベータ１ａ）、ＶｉｒａｇｅｎのＯｍｎｉｆｅｒｏｎ（天然インターフェロン）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＯｍｅｇａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎなどの、インターフェロンベータ、ガンマ、タウおよびオメガが含まれる。Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの経口インターフェロンアルファなどの経口インターフェロン。
【００１９】
使用してもよいインターフェロンのさらなる例には、ペグ化インターフェロンアルファ、例えばペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ペグ化コンセンサスインターフェロンまたはペグ化精製インターフェロン−α製品が含まれる。ペグ化インターフェロンα−２ａは欧州特許５９３，８６８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、例えばＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）の商品名で市販品として入手可能である。ペグ化インターフェロン−α−２ｂは例えば欧州特許９７５，３６９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、例えばＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ  Ａ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）の商品名で市販品として入手可能である。ペグ化コンセンサスインターフェロンはＷＯ９６／１１９５３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用されるインターフェロンはペグ化インターフェロンである。他の実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、コンセンサスインターフェロン、精製インターフェロンアルファ製品またはペグ化インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂおよびペグ化コンセンサスインターフェロン、天然アルファの混合物ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２１】
好ましくはインターフェロンアルファを用いる方法はペグ化インターフェロンアルファ−２ｂを使用し、ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂの量は週１回、週３回、隔日または１日１回単位で１週間につき０．５から２．０マイクログラム／キログラムである。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「マイクログラム／キログラム」は、ヒトを含めた治療される哺乳動物のキログラム体重あたりのマイクログラムの薬物を意味する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「治療」または「治療する」は、罹患の危険性があるまたは罹患したことが疑われる患者および病気であるまたは疾患もしくは医学的状態を患っていると診断された患者の治療を含めた、予防的または防止的治療と根治的または疾患を緩和する治療との両方を指し、臨床的再発の抑制を含む。治療は、障害もしくは再発障害の１種もしくは複数の症状の予防、治癒、発病の遅延、重症度の緩和もしくは寛解のために、またはこうした治療がない場合の予想を超える対象の生存時間の延長のために、医学的障害を有するまたは最終的に障害になり得る対象に施してもよい。
【００２４】
「治療レジメン（therapeutic regimen）」は、病気の治療パターン、例えばＨＢＶ治療中に用いられる投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメンおよび維持レジメンを含んでもよい。
【００２５】
語句「導入レジメン（induction regimen）」または「導入期」は、疾患の初期治療に用いられる治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの初期中に高レベルの薬物を患者へ提供することである。導入レジメンは（一部または全部に）「負荷レジメン（loading regimen）」を採用してもよく、負荷レジメンは、維持レジメン中に医師が採用するよりも大きな用量の薬物投与、維持レジメン中に医師が薬物を投与するよりも高頻度な薬物投与、またはその両方を含んでもよい。
【００２６】
語句「維持レジメン（maintenance regimen）」または「維持期」は、例えば長期間（月または年）にわたって患者を寛解状態に保つために病気治療中の患者の維持のために用いられる治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、持続的療法（例えば、週１回、月１回、年１回などの規則的な間隔での薬物投与）または断続的療法（例えば中断された治療、間欠的治療、再発での治療またはあらかじめ決められた特定の基準［例えば疼痛、疾患の発現など］）への到達に基づく治療）を採用してもよい。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、文脈において別段示さない限り、＋または−１０％の範囲を意味するのに使用される。
【００２８】
他の実施形態では、インターフェロンアルファはペグ化インターフェロンアルファ−２ａであり、投与するペグ化インターフェロンアルファ−２ａの量は、週１回、週３回、隔日または１日１回単位で、１週間につき２０から２５０マイクログラム／キログラムである。好ましくは、インターフェロンペグ−ＩＦＮａ２ａを１８０マイクログラムの量で週１回投与する。
【００２９】
特定の実施形態では、本明細書の方法で使用する例示的なインターフェロンは、ｌｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）；ＰＥＧ−ｌｎｔｒｏｎ（登録商標）；Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）；Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）；Ｂｅｒｅｆｏｒ（登録商標）；Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ（登録商標）；Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）；Ａｌｆｅｒｏｎ（登録商標）；Ｖｉｒａｆｅｒｏｎ（登録商標）；Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｒｅｂｉｆ；Ｏｍｎｉｆｅｒｏｎ；Ｏｍｅｇａおよびこれらの組合せからなる群から選択されるインターフェロンである。
【００３０】
幾つかの実施形態では、患者のＢ型肝炎ウイルス感染症の治療および／または患者のＤ型肝炎ウイルス感染症の治療でアリスポリビルを使用する。さらに別の態様では、直接的な抗ウイルス剤またはインターフェロンと組み合わせてアリスポリビルを投与する。
【００３１】
幾つかの他の実施形態では、有効量のアリスポリビルを投与することおよび場合により患者にインターフェロンまたは直接的な抗ウイルス剤を投与することを含む、患者のＢ型肝炎ウイルス感染症を治療するための方法が記載されている。さらに他の態様では、アリスポリビルは、肝炎の改善、（ＡＬＴレベルによって評価されるような）肝細胞死の減少および肝疾患の進行の予防に用いる。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書で開示する方法のうちのいずれかによって使用するためのアリスポリビルを含む医薬組成物および前記組成物を投与するための説明書と一緒に前記医薬組成物を含むパッケージが記載されている。
【００３３】
別の実施形態では、アリスポリビルは、療法・治療の抗ウイルス効果を促進する、標準ケアのさらなる薬剤とともに投与してもよい。
【００３４】
直接的な抗ウイルス剤は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製サイクルの特定のステップを妨害する薬剤を意味するのに本明細書で使用される。ＨＢＶの複製を阻害する直接的な抗ウイルス剤は、例えばＨＢＶの治療で現在承認されている抗ＨＢＶ薬剤、すなわちテルビブジン、ラミブジン、エムトリシタビン、エンテカビル、アデホビルおよびテノホビルのうちのいずれかでもよい。
【００３５】
上記の治療では、有効投薬量の標準ケア薬剤を組成物に入れて投与する。すなわちこれらは一緒に（すなわち同時に）投与してもよいが、別々にまたは連続して投与してもよい。概して併用療法は、典型的には一緒に投与するが、これは、こうした同時投与がウイルスに多数のストレスを同時に誘導するという理論的根拠が理由である。与える特定の用量は、薬物の吸収、不活性化および排泄率ならびに他の要因によって決まる。投薬量の値は緩和すべき状態の重症度によっても変動することに留意されたい。本明細書で使用する「同時投与」または「併用投与」または「組み合わせて投与する」などの用語は、一人の患者に対して選択された治療剤の投与を含むことを意味し、薬剤を同一投与経路でまたは同時に投与する必要がない治療レジメンを含むことを意図する。固定の組合せも本開示の範囲内である。本開示の医薬併用投与は、その医薬として活性な成分のうちの一つのみを投与する単剤療法と比較してまたは現在の標準的なケア療法と比較すると、有益な効果、例えば相乗的または相加的な治療効果をもたらす。本明細書に記載の方法で用いる治療は、任意の従来の経路によって投与してもよい。１種または複数の成分を非経口的に、例えば注射液剤もしくは懸濁剤の形でまたは注射可能なデポジット製剤（deposit formulation）の形で投与してもよい。好ましくは、アリスポリビルはカプセル剤、錠剤または液剤もしくは飲用懸濁剤の形で経口的に投与する。アリスポリビルを含む経口投与用の医薬組成物は、典型的には、１種または複数の医薬的に許容可能な担体物質をさらに含む。典型的には、こうした組成物は濃縮され、適切な希釈剤、例えば水と投与前に組み合わせる必要がある。非経口投与用の医薬組成物は、典型的には、１種または複数の賦形剤も含む。随意の賦形剤には、等張剤、緩衝液または他のｐＨ調整剤および防腐剤が含まれる。こうした賦形剤は、組成物を維持するためならびに好ましいｐＨ範囲（約６．５〜７．５）およびモル浸透圧濃度（約３００ｍｏｓｍ／Ｌ）を達成するために加えてもよい。
【００３６】
本明細書に記載のアリスポリビルの投与は単回用量形態または１回より多い投薬量形態であり、１種または複数の経口投与剤形を１日あたり毎回投与してもよい。幾つかの実施形態では、２００ｍｇから１０００ｍｇの用量でアリスポリビルを投与する。
【００３７】
治療レジメンの有効性を標準的なプロトコールでモニターしてもよい。治療に続いて血清中のＨＢＶレベルを決定してもよく、血清ＡＬＴレベルを測定してもよい。例えば、患者の血清中のＨＢＶ  ＤＮＡの存在について患者を評価してもよい。治療中の規則的な間隔で、例えば１日目（投与前ならびに投与後４、８および１２時間目）および（該当する場合）２日目、３日目、８日目、１５日目、２９日目および１２週目、２４週目、３６週目、４８週目、７２週目の投与前ならびに経過観察で、ＨＢＶ  ＤＮＡ（ＩＵ／ｍＬ）を測定することができる。
【００３８】
療法の有効性は、国際的に認められたパラメーターを用いてモニターする（２、３、４）。
１．１．Ｂ型肝炎ウイルス患者の応答のモニタリング
ａ）ウイルス複製への効果を評価するために、高感度な定量的ＰＣＲベースのアッセイを用いて血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルをモニターする。
ｂ）ＨＢｅＡｇ陽性患者では、ＨＢｅ−セロコンバージョンが起こったかを判定するために、対応する抗ＨＢｅとともにＨＢｅＡｇをモニターする。
ｃ）肝炎および肝細胞死に対する影響を評価するために、ＡＬＴおよび／またはＡＳＴの血清レベルをモニターする。
ｄ）ＨＢｓＡｇクリアランスが至適な治療転帰を示すと思われるため、血清ＨＢｓＡｇを質的および量的にモニターする。
ｅ）用いる治療に対して耐性を与えるＨＢＶゲノム中の変異の発生。
１．２デルタ肝炎ウイルス患者における応答のモニタリング。上記の列挙したＨＢＶ感染症に関するマーカーに加えて、以下のＨＤＶ特異的な試験を用いる。
ａ）デルタ肝炎ウイルスの複製への効果を評価するために、血清ＨＤＶ  ＲＮＡレベルをモニターする。
ｂ）肝組織の免疫組織化学的検査によるデルタ抗原の検出は、ＨＤＶの複製が進行中であることを示すさらなる情報を提供し得る。
【００３９】
以下の実施例は、上文に記載の本発明を例示する。
【実施例】
【００４０】
実験計画およびヒト細胞系統：
本実験は、Ｂ型肝炎ウイルスまたはデルタ肝炎ウイルスの生活環のインビトロ研究用モデルとして、ならびにウイルス複製およびウイルスタンパク質の産生へのさまざまな化合物の影響を調べる目的で確立された、いくつかのヒトヘパトーマ由来細胞系統、すなわちＨｅｐＧ２およびＨｕＨ−７（ＨＢＶ陰性）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＨＢＶ陽性、ＨＢｓＡｇのみを産生する）ならびにＨｅｐＧ２．２．１５（ＨＢＶ陽性、完全なＨＢＶ複製を支持する）を使用した。
【００４１】
［Ａ）Ｂ型肝炎ウイルス複製およびＨＢｓＡｇ産生に対するシクロフィリンインヒビター、特にＤＥＢ０２５（アリスポリビル）の抗ウイルス活性の調査。］
【００４２】
ＨｅｐＧ２細胞に由来するＨｅｐＧ２２１５細胞系統はＨＢＶ  ＤＮＡで安定的にトランスフェクトされ、感染性ビリオンおよびＨＢｓＡｇの産生を伴う完全なＨＢＶ複製を支持した。既述（７、８）のように、ＨｅｐＧ２２１５細胞を、シクロフィリンインヒビター添加前に７日間１２ウェルプレート中で培養した。
【００４３】
細胞を０．２５、１．０または５．０マイクログラム／ｍＬのＮＩＭ８１１またはＤＥＢ０２５で処理し、ベースライン、ＮＩＭ８１１またはＤＥＢ０２５をそれぞれに添加してから６、２４、４８および７２時間後に細胞および上清を別々に収集した。
【００４４】
ＨＢＶ複製におけるシクロフィリンＡの役割を評価するために、ＨｅｐＧ２２１５細胞をシクロフィリンＡに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトして、培地のみまたはＮＩＭ８１１もしくはＤＥＢ０２５を添加してインキュベートした。同様に、ＣｙｐＢ、ＣおよびＤに対して特異的なｓｉＲＮＡによって、ＨＢＶおよびＨＤＶの複製におけるシクロフィリンＢ、ＣおよびＤの役割を調べる。
【００４５】
ＨｕＨ−７細胞を、サブタイプａｄｗ２の１．５ＨＢＶ  ＤＮＡゲノムを有するｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）ベクターを含むプラスミドでトランスフェクトして使用した。１０μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて、直径６０ｍｍのディッシュあたり５μｇのプラスミドＤＮＡでサブコンフェルトのＨｕＨ−７細胞をトランスフェクトした。既述（７）のように、トランスフェクションしてから１８時間後に、１０％ＦＣＳを補充した培地で上清を交換して、細胞を３日間培養した。
【００４６】
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ細胞系統）はＨＢＶ  ＤＮＡ断片が組み込まれており、ＨＢｓＡｇのみを産生するが完全なＨＢＶ複製を支持しない（９）。これは、不活性なＨＢｓＡｇのキャリア（すなわち慢性ＨＢＶ感染症の非複製フェーズ）である患者の肝細胞と類似している。この細胞系統を用いて、完全なビリオン産生とは独立したＨＢｓＡｇ産生へのシクロフィリンインヒビターの影響を特異的に評価した。
【００４７】
結果
１）図１：シクロフィリンインヒビターのＮＩＭ８１１とＤＥＢ０２５の両方が、細胞内のＨＢＶヌクレオカプシド関連ＨＢＶ  ＤＮＡのレベルを低下させた。ＨＢＶ  ＤＮＡの減少は、ＮＩＭ８１１またはＤＥＢ０２５が存在しないＨｅｐＧ２２１５細胞と比較した場合、２から１０倍であった。最も顕著な細胞内のＨＢＶ  ＤＮＡレベルの低下（７２時間で１０倍）は、ＤＥＢ０２５（５マイクログラム／ｍＬ）で観察され、これはＮＩＭ８１１の７２時間で観察された低下よりも大きかった。
【００４８】
２）図２：ＮＩＭ８１１の効果と比較した場合、ＤＥＢ０２５（５．０マイクログラム／ｍＬ）は、細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルを低下させるのにより大きな効果を示した。
【００４９】
［Ｂ）デルタ肝炎ウイルス複製に対するシクロフィリンインヒビター、特にＤＥＢ０２５（アリスポリビル）の抗ウイルス活性の調査。］
【００５０】
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）での感染は、ヘルパーウイルスであるＢ型肝炎ウイルスの存在を常に伴う。この依存性の基礎となることは、肝細胞へのＨＤＶの侵入と新しいＨＤＶ粒子の構築の両方にＨＢＶ外被タンパク質が必要とされることである。一旦感受性細胞の中に入ると、ＨＤＶの一本鎖環状ＲＮＡゲノムは、宿主のＲＮＡポリメラーゼのリダイレクション（redirection）によるＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成によって複製することができる。インビトロでは、ＨＤＶのゲノム複製を、ヘルパーＨＢＶなしで、培養細胞系で研究することができる。例えば、ｃＤＮＡバージョンのＨＤＶ配列で細胞をトランスフェクトすると複製が開始する（１０）。加えてその要求は、ＨＤＶ  ＲＮＡとδＡｇに対するｍＲＮＡを同時にトランスフェクトすることによって満たすことができる（１１）。
【００５１】
［Ｃ）Ｂ型肝炎ウイルス複製に対するシクロフィリンインヒビター、特にＨＢＶ−ＤＮＡポリメラーゼを標的化する直接的な抗ウイルス剤（テルビブジン）と組み合わせたＤＥＢ０２５（アリスポリビル）の抗ウイルス活性の調査。］
【００５２】
完全なＨＢＶビリオンおよびＨＢｓＡｇ粒子を産生する、安定的にトランスフェクトされた細胞（ＨｅｐＧ２２１５）および一過的にトランスフェクトされた細胞（ＨＵＨ−７）を、さまざまな濃度（０．２５、１．０  ５．０または２０マイクログラム／ｍｌ）のアリスポリビル単独、テルビブジン単独またはアリスポリビルとテルビブジンとの組合せで処理した。各シクロフィリンの関与を判定するために、ＨｅｐＧ２２１５細胞をシクロフィリン（Ｃｙｐ）Ａ、ＣまたはＤに対して特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトして、アリスポリビルでさらに処理した。細胞質抽出物および上清を、ベースライン、処理してから２４、４８および７２時間後に収集した。抗ウイルス活性の動態を、細胞内および分泌性のＨＢＶ−ＤＮＡ（リアルタイムｑＰＣＲ）およびＨＢｓＡｇレベル（ＥＬＩＳＡ）を定量化することによって評価した。
【００５３】
ＨｅｐＧ２２１５細胞とＨＵＨ−７細胞の両方で、アリスポリビル処理は細胞内および分泌性のＨＢＶ−ＤＮＡの用量依存的な減少を全ての時点でもたらし、未処理のコントロールと比較して、それぞれ７０％（ｐ＝０．００４）および６３％（ｐ＜０．００１）の減少であった。アリスポリビルとテルビブジンとの組合せは、細胞内（ｐ＝０．００１）および分泌性（ｐ＝０．０２８）のＨＢＶ−ＤＮＡを減少させるのにより大きな効果を有しており、アリスポリビルまたはテルビブジン単独のいずれかに対して＞３倍のＨＢｓＡｇの減少であった。ＣｙｐＡ、ＣまたはＤの発現は、対応するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした後に著しく減少し、これはＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇレベルの著しい低下（ｐ＜０．００１）を伴った。ＣｙｐＡ、ＣまたはＤについて発現抑制した細胞のアリスポリビル処理は、ＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇレベルをさらに低下させ、ＣｙｐＡを発現抑制した細胞と比較して、ＣｙｐＣまたはＣｙｐＤを発現抑制した細胞で抗ウイルス効果がより大きかった（ｐ＜０．００１）。
【００５４】
これらの結果は、アリスポリビルがＨＢＶ複製の複数個所を妨害し、その抗ウイルス活性は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼを標的化するテルビブジンなどの直接的な抗ウイルス剤と相乗的であることを示唆する。
【００５５】
１．細胞培養およびトランスフェクション
既述（１２）のように、ヒトヘパトーマ細胞系統であるＨｕＨ７を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イーグル培地で培養して、５％ＣＯ２中の３７℃でインキュベートした。トランスフェクション研究のために、細胞培養物を６ウェルプレートまたは直径６０ｍｍのペトリディッシュに一晩播種して、それぞれ５および１０μｇのＨＤＡｇ  ｍＲＮＡとＨＤＶ  ＲＮＡ（ゲノム長の１．２倍）の５０：５０混合物で、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、培養物を一晩インキュベートし、培地を交換して、さらに２から７日までインキュベーションを続けた。
【００５６】
２．細胞質および細胞上清中のＨＢＶ  ＤＮＡの定量化
既述（８、９）のように、細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルおよびウイルスのヌクレオカプシド関連ＨＢＶ  ＤＮＡ（細胞質）の両方を定量化することによって、ＨＢＶ複製を評価した。ヌクレオカプシドのＨＢＶ  ＤＮＡを抽出して、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００）によって定量化した。ハウスキーピング遺伝子としてｂ−アクチンを用いて、細胞内のＨＢＶ  ＤＮＡを標準化した。分泌性のＨＢＶ  ＤＮＡをＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を用いて抽出して、ＴａｑＭａｎによって定量化も行った。既述（９、１０）のように、段階希釈したＨＢＶ  ＤＮＡのプラスミドおよびＥｕｒｏＨｅｐのＨＢＶ  ＤＮＡ標準を用いて、ＨＢＶ  ＤＮＡの定量化の感度を各実施において検証した。
【００５７】
３．ＨＢｓＡｇの定量化
段階希釈した既知の量のＨＢｓＡｇを使用したＥｌｉｓａ（Ａｂａｚｙｍｅ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）を用いて、（２２１５およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞由来の）細胞培養上清中のＨＢｓＡｇレベルを定量化した（９）。
【００５８】
４．ＳｉＲＮＡのトランスフェクション
ＨｅｐＧ２２１５細胞をｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）とともに５０％の密度で播種して、４８時間インキュベートした。続いて細胞を洗浄して、ＮＩＭ８１１またはＤＥＢ０２５を添加した（ＢＬ）。細胞試料および上清試料を６時間、２４時間（培地を交換した）および４８時間目に回収した。上記のように、全ＤＮＡを試料から抽出して、リアルタイムＰＣＲによってＨＢＶ  ＤＮＡを定量化した。フェノール、クロロホルムを用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写し、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を使用して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔキットを用いてｃＤＮＡを定量化した。
【００５９】
５．ＨＢｓＡｇに対する免疫ブロット解析
４８時間後に、細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５またはＨｅｐＧ２２１５細胞）をトリプシン処理し、リン酸緩衝食塩水中で２回洗浄して、溶解バッファーに再懸濁した。既述（７）のように、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞内のヒトＩｇＧおよびＨＢｓＡｇの存在を、モノクローナル抗ＨＢｓ  ＩｇＧが存在するまたは存在しない条件で培養した細胞内のウェスタンブロットによって解析した。
【００６０】
６．デルタ肝炎ＲＮＡのインビトロ転写
既述（１３）のように、ゲノム長の１．２倍のＨＤＶ  ＲＮＡを、制限酵素のＮｏｔＩで直鎖状にした後のプラスミドｐＢＳδ１．２Ｇ、ｐＢＳδ１．２ＡＧ、ｐＢＳδ１．２Ｇ（２ｘＳ）およびｐＢＳδ１．２ＡＧ（２ｘＳ）から、Ｔ７  ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて転写する。ＨＤＡｇのキャップ化ｍＲＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状にした後のプラスミドｐＸ９−Ｉ／ＩＩから、Ｔ７  ｍ−Ｍｅｓｓａｇｅ  ｍ−Ｍａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて転写する。未標識のモノマーゲノムのおよびアンチゲノムのＨＤＶ  ＲＮＡを、ＰｓｔＩ消化によって直鎖状にした後のｐＴＭδＳａｌＡおよびｐＴＭδＳａｌＢからＴ７  ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いて転写する。
【００６１】
７．ＨＤＶ  ＲＮＡのノーザン解析
接種材料（inocula）由来または血清由来のウイルスＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて製造者の使用説明に従って精製する（１４，１５）。次いでさまざまな量のＲＮＡを、１．９Ｍグリオキサール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、Ｎ．Ｊ．）−７．１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）−４．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−３５％ＤＭＳＯの存在下で５５℃で５０分間インキュベートする。次いで試料を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８を含む１．５％アガロースゲルにロードして、１５０ｍＡで４時間電気泳動にかける。上清に関してはＲＮＡの半分を用いるが、細胞性ＲＮＡに関しては５μｇをロードする。ＲＮＡを、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆ．）膜へ一晩キャピラリートランスファーする。トランスファー後、膜をベーキングする、またはＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってＵＶ架橋する。詳述（１５）されているように、このブロットをハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後に、このブロットを、４００ｍｌの２×ＳＳＰＥ−０．１％ＳＤＳ、次いで４００ｍｌの１×ＳＳＰＥ−０．１％ＳＤＳ、次いで２００ｍｌの０．１×ＳＳＰＥ−０．１％ＳＤＳを用いて７０℃で洗浄する。この膜を７０℃で乾燥して、オートラジオグラフィーおよびホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）解析にかける。
【００６２】
８．（既述（１６）の通りの）血清試料のリアルタイムＰＣＲによる定量化
ＨＤＶ  ＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｕｕｍ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて２５０μｌの血清または血漿から抽出する。既述のようにｃＤＮＡを合成して、Ｍｏｎｔａｇｅ  ＰＣＲ遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）を用いて精製する。
【００６３】
フォワードプライマーはゲノムのリボザイム領域を標的にするように選択し、リバースプライマーはアンチゲノムリボザイムの領域Ｉを標的にする。リバースプライマーと同一の領域にハイブリダイズするプローブは、リバースプライマーとの塩基対合を回避する目的で、アンチゲノムの配列にアニールするように設計する。プライマーおよびプローブの名前および配列は次の通りである。デルタ−Ｆ（フォワードプライマー）、５’−ＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣ−３’；デルタ−Ｒ（リバースプライマー）、５’−ＴＣＴＴＣＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧ−３’およびデルタ−Ｐ（プローブ）、５’−ＦＡＭ−ＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＧＧＡＣ−ＭＧＢ−３’である。ＨＤＶ−３のゲノム配列とのミスマッチが１つ存在するために、次の第二のダイレクトプライマー、すなわちＴ３−デルタ−Ｆ、５’−ＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣ−３’を、ＨＤＶ−３単離体の増幅用に特異的に設計する。
【００６４】
ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施する。反応は、５０℃で２分、それに続く９５℃で１０分の１回の開始ステップ、次に９５℃で１５秒および６０℃で１分を含む、４５サイクルの増幅からなる。反応、データ取得および解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて実施する。
【００６５】
（参考文献）
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【図１】
2014509630.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2014509630.tif 000010
2014509630.tif 000011
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