(57)【要約】  蛍光標識され、ビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を起こすタンパク質の同定および使用が記載される。システイン残基またはリシン残基において標識されたプローブが開示され、また、システインおよびリシンの両方において２つの異なるフルオロフォアで標識されたプローブも開示される。これらのプローブは、体液試料中の非結合ビリルビンレベルを決定するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）と、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン置換へと付着させたフルオロフォアとを含み、ビリルビンには結合するが脂肪酸に有意には結合しないプローブ。
【請求項２】
置換１４Ｒ、１８Ｌ、２５Ｃ、２７Ａ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｌ、１１５Ｒ、１１７Ｄをさらに含み、ローダミンＢと組み合わせてもよい、請求項１に記載のプローブ（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１）。
【請求項３】
置換１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１５Ｒ、および１１７Ｄをさらに含み、ローダミンＢと組み合わせてもよい、請求項１に記載のプローブ（Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７）。
【請求項４】
細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）を含み、該ｉＬＢＰが、１４、１８、２３、２５、２７、３１、３６、３８、５５、６０、７２、７３、７４、７８、１０２、１０４、１０６、１１５、および１１７位から選択される位置において１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記フルオロフォアが、システイン置換へと付着し、該システイン置換が、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、および９８位からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
前記フルオロフォアが、リシン置換へと付着し、該リシン置換が、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、および９８位からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項７】
置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項９】
Ｎ末端のＭＡＦＤがＭＧＩＦＤで置換されている、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１０】
Ｎ末端のＭＡＦＤがＭＧＣＦＤで置換されている、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１１】
Ｎ末端のＭＡＦＤがＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換されている、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１２】
少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１３】
【化１】
2014526055.tif 000030
およびこれらの組合せから選択される１または複数のリンカーをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のプローブを含む組成物。
【請求項１５】
２つのフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアが、リシン置換へと付着し、第２のフルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、および９８位からなる群から選択されるシステイン置換へと付着している、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１６】
第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアで標識されたｉＬＢＰムテインを含み、第２のフルオロフォアが、溶液中に遊離しているかまたはビリルビンに結合しないタンパク質へと付着しており、第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとが同じ波長で励起することが可能であり、第１のフルオロフォアの発光波長と第２のフルオロフォアの発光波長とが異なり、第２のフルオロフォアが、ビリルビンのｉＬＢＰムテインへの結合に応答して影響されない（その発光を変化させない）組成物。
【請求項１７】
前記第１のフルオロフォアが、アクリロダンであり、前記第２のフルオロフォアが、ローダミンＢ、ＮＢＤ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ色素、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１のフルオロフォアが、ＬｉＣｏｒ  ７００ＤＸであり、前記第２のフルオロフォアが、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、またはＢｏｄｉｐｙ色素である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
蛍光指数比の変化を、２つの異なる波長において測定し、非結合ビリルビン濃度を決定するのに用いる、請求項１６〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
フルオロフォアの発光強度が、ビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光により影響されない、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ、または請求項１６〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
第２のフルオロフォアをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項２２】
第１のフルオロフォアが、システインへと付着し、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、および４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）からなる群から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群から選択される、請求項２１に記載のプローブ。
【請求項２３】
第１のフルオロフォアが、リシンへと付着し、アクリロダン、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＣＦ７５０ＳＥ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ  ＩＲ  Ｄｙｅ  ６８０  ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ  ＩＲ  Ｄｙｅ７００ＤＸからなる群から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群から選択される、請求項２１に記載のプローブ。
【請求項２４】
第２のフルオロフォアが、溶液中に遊離しているか、またはプローブのアクセプタータンパク質もしくはペプチドドメインへと付着している、請求項２１に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記アクセプタータンパク質またはペプチドドメインが、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、およびＡＣＰタグから選択される、請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）をさらに含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項２７】
置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）をさらに含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項２８】
Ｎ末端のＭＡＦＤがＭＧＩＦＤで置換されている、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項２９】
Ｎ末端のＭＡＦＤがＭＧＣＦＤで置換されている、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項３０】
Ｎ末端のＭＡＦＤがＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換されている、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項３１】
少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項３２】
【化２】
2014526055.tif 000031
およびこれらの組合せから選択される１または複数のリンカーをさらに含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項３３】
請求項１５、２０〜３２のいずれかから選択される少なくとも１つのプローブを含む組成物。
【請求項３４】
固体基質へと付着させた請求項１〜４のいずれかに記載のプローブを含み、場合により、鉄のコアおよび／またはマイクロ流体デバイスもしくはマルチウェルプレートを伴う、好ましくは、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、Ｎｉ−アガロースビーズである固体基質。
【請求項３５】
プローブのＮ末端のＭＡＦＤがＭＧＩＦＤで置換されている、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項３６】
プローブのＮ末端のＭＡＦＤがＭＧＣＦＤで置換されている、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項３７】
プローブのＮ末端のＭＡＦＤがＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換されている、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項３８】
前記プローブが、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）をさらに含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項３９】
前記プローブが、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）をさらに含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項４０】
前記プローブが、少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項４１】
前記プローブが、
【化３】
2014526055.tif 000032
およびこれらの組合せから選択される１または複数のリンカーをさらに含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項４２】
前記プローブが、固体基質への付着のためにタグづけされ、タグが、Ｈｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、および金属アフィニティータグのうちの１または複数を含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項４３】
場合により、ビリルビンに結合しないタンパク質へと付着させた第２のフルオロフォアをさらに含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項４４】
前記プローブがタグを含み、前記固体基質がタグのためのレセプターを含む、請求項３４に記載の固体基質。
【請求項４５】
前記タグがポリヒスチジンタグであり、前記固体基質が固定化金属キレートを含む、請求項４４に記載の固体基質。
【請求項４６】
前記フルオロフォアが、システイン残基へと付着し、フルオロフォアが、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ２−マレイミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗヨードアセトアミド、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ６８０マレイミド、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ２−マレイミド、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ５−ブロモアセトアミド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０  Ｃ５−マレイミド、およびＢＯＤＩＰＹ  ５７７／６１８からなる群から選択される、請求項３４〜４２のいずれかに記載の固体基質。
【請求項４７】
前記フルオロフォアが、リシン残基へと付着し、フルオロフォアが、アクリロダン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＣＦ７５０  ＳＥ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ６８０  ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ７００ＤＸからなる群から選択される、請求項３４〜４２のいずれかに記載の固体基質。
【請求項４８】
プローブのＣ末端またはＮ末端において、固体支持体への付着のための１または複数のリンカーと組み合わせた２つ以上のタグをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項４９】
２５位にＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸで標識されたリシンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５０】
２つのＨｉｓタグおよび２つのリンカーを用いて固体支持体へと付着している、請求項４９に記載のプローブ。
【請求項５１】
１または複数のタグをさらに含み、タグがＨｉｓタグおよびＰＳタグから選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５２】
少なくとも１つのリンカーをさらに含み、該リンカーが、
【化４】
2014526055.tif 000033
からなる群から選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５３】
固体支持体が、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５４】
ビリルビンプローブをキャリブレートして、Ｋｄを決定する方法であって、
プローブを、ビリルビン濃度Ｂｔが既知である水性試料と混合するステップと、
蛍光を測定するステップと、
キャリブレーションパラメータを、以下の式２または３：
【数１】
2014526055.tif 000034
［式中、Ｉλｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、Ｉ０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、ＰＴは、総ビリルビンプローブ濃度であり、ＢＴは、総ビリルビン濃度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）［式中、Ｉλ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブのΙλ２／Ιλ１比であり、Ｋｄは、解離定数である］
でフィッティングすることにより測定された蛍光から決定するステップと
を含む方法。
【請求項５５】
遊離ビリルビン濃度［Ｂｆ］を測定する方法であって、
場合により、試料の蛍光を測定するステップと、
プローブを、試料と混合するステップと、
蛍光を測定するステップと、
場合により、試料を伴うプローブの蛍光から試料の蛍光を減じるステップと、
濃度［Ｂｆ］を、測定された蛍光から決定するステップと
を含む方法。
【請求項５６】
以下の式４〜５：
【数２】
2014526055.tif 000035
［式中、Ｉλｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、Ｉ０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）［式中、Ｉλ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブのΙλ２／Ιλ１比であり、Ｋｄは、解離定数であり、Ｉｓは、プローブのビリルビン飽和時における発光強度である］
のうちの少なくとも１つを用いて、プローブをキャリブレートし、かつ／または［Ｂｆ］を測定する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記プローブが、２つのフルオロフォア、または１つのフルオロフォアと、溶液中に遊離している第２のフルオロフォアもしくはビリルビンに結合しないタンパク質へと付着させた第２のフルオロフォアとを含むプローブの組合せを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記プローブが、単一のフルオロフォアを含み、内部フィルターの励起について補正するステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
試料を、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、およびシクロデキストリンからなる群から選択されるビリルビンの担体高分子と混合する、請求項５４〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記プローブが固体支持体へと付着している、請求項５４〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
Ｂｆ濃度を、場合により、希釈されていない血液試料の測定を可能とする、ディスポーザブルのマイクロ流体デバイスを用いて決定する、請求項５４〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記試料が、ヒト、動物、または植物由来である、請求項５４〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記試料が、全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液、およびリンパからなる群から選択される、請求項５４〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記試料が、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者由来である、請求項５４〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記試料が、ビリルビンをアルブミンから排除する薬物を施されている患者、および／または注入された油エマルジョン、疾患、もしくはストレスから、ビリルビンをアルブミンから排除する分子を産生している可能性がある患者由来である、請求項５４〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記試料が、光線療法、輸血、またはビリルビンレベルを低減する他の療法を受けている患者由来である、請求項５４〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者由来の血液試料中の非結合ＦＦＡの濃度を測定するための方法であって、
場合により、試料の蛍光を測定するステップと、
試料とＦＦＡｕプローブとを混合するステップと、
プローブの蛍光を測定するステップと、
場合により、試料を伴うプローブの蛍光から試料の蛍光を減じるステップと、
ＦＦＡｕ濃度を計算するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
ＦＦＡｕ濃度に基づき、患者に対する損傷を決定するステップと、処置を提供して損傷を是正するステップとをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
試料を患者から回収するための１または複数の回収デバイスと、
請求項１〜１４のいずれかに記載の１もしくは複数のプローブ、または適切な担体中に１もしくは複数のプローブを含む請求項１５に記載の組成物と、
場合により、既知濃度の非結合ビリルビンを含む参照標準物質と
を含むキット。
【請求項７０】
表２、３、４、５、６、７、８、および１０のうちのいずれかにおいて規定されたプローブ。
【請求項７１】
脂肪エマルジョン（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標））を施されている患者における非結合ビリルビンおよび／または非結合ＦＦＡの毒性の危険性を決定する方法であって、
試料を患者から得るステップと、
試料を、ＡＤ１ＦＡＢ２、Ｌ１９ＣＰ１０Ｃ７、Ｌ１３８Ｐ１Ｈ８Ｎ２４Ｃ、Ｌ２２Ｐ５Ｅ１１、Ｌ６１Ｐ８Ｂ１２、Ｌ４ＢＰ４Ｂ９、およびＬ１１９Ｐ３Ｅ５からなる群から選択される１または複数のプローブと接触させて、１または複数のＦＦＡｕのレベルを決定するステップと、
非結合ビリルビンのレベルを決定するステップと、
ＦＦＡｕレベルおよび非結合ビリルビンレベルを、正常な集団から得られるレベルと比較して、毒性の危険性を決定するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応するｉＬＢＰと、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン置換へと付着させたフルオロフォアとを含むプローブを含み、プローブが、固体基質へと付着させた脂肪酸に結合し、場合により、鉄のコア、マイクロ流体デバイス、またはマルチウェルプレートを伴う、好ましくは、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、Ｎｉ−アガロースビーズである固体基質。
【請求項７３】
プローブのＮ末端のＭＡＦＤがＭＧＩＦＤで置換されている、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項７４】
プローブのＮ末端のＭＡＦＤがＭＧＣＦＤで置換されている、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項７５】
プローブのＮ末端のＭＡＦＤがＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換されている、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項７６】
前記プローブが、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）をさらに含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項７７】
前記プローブが、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）をさらに含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項７８】
前記プローブが、少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項７９】
前記プローブが、
【化５】
2014526055.tif 000036
およびこれらの組合せから選択される１または複数のリンカーをさらに含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項８０】
前記プローブが、固体基質への付着のためにタグづけされ、該タグが、Ｈｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、および金属アフィニティータグのうちの１または複数を含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項８１】
場合により、ＦＦＡｕに結合しないタンパク質へと付着させた第２のフルオロフォアをさらに含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項８２】
前記プローブがタグを含み、固体基質がタグのためのレセプターを含む、請求項７２に記載の固体基質。
【請求項８３】
前記タグがポリヒスチジンタグであり、前記固体基質が固定化金属キレートを含む、請求項８２に記載の固体基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年８月２６日に出願された米国仮出願第６１／５２７，８４９号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府により援助されるＲ＆Ｄに関する言明
この研究は、米国国立衛生研究所からのＲｏａｄｍａｐ助成金第Ｒ３３ＤＫ０７０３１４号およびＳＢＩＲ助成金第Ｒ４４ＤＫ０７３５３５号により部分的に支援された。結果として、米国連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有しうる。
【０００３】
配列表への言及
配列表は、本明細書の末尾に含まれる。
【０００４】
発明の分野
本発明の分野は、ビリルビンに結合すると蛍光の変化を起こす蛍光標識されたタンパク質であり、非結合ビリルビンのレベルを測定するのに用いられる、非結合ビリルビンのプローブの同定および使用に関する。これらのプローブは、非結合ビリルビンレベルが決定される体液中に一般に存在する他の解析物の存在下で著しく結合せず、または著しい蛍光の変化を起こさない。これらの非結合ビリルビンのプローブを、高ビリルビン血症および高ビリルビン血症を結果としてもたらす疾患の診断および処置において用いることができる。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
ビリルビンとは、ヘモグロビンの代謝回転の産物であって、水中の可溶性が低く、したがって、血漿中では大部分がアルブミンと会合している。しかし、総血漿ビリルビンの小さな画分は、水相中で可溶性である。この非結合画分または遊離画分は、血液脳関門を高レベルで透過することが可能であり、神経毒性である［Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｗｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、Ｏｓｔｒｏｗ  ＪＤ、およびＴｉｒｉｂｅｌｌｉ  Ｃ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ  （ｆｒｅｅ）  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５５：  １２８８〜１２９９、２００９］。正常な条件下では、総血清ビリルビンが、ビリルビンの産生と排出との間で調節されるバランスにより、低レベルで維持される。しかし、新生児では、調節機構が十分に成熟していない可能性があるために、産生−排出バランスが、蓄積に好適となることが多く、新生児のうちの約６０％において黄疸の黄色をもたらす［Ｍａｉｓｅｌｓ  ＭＪおよびＭｃＤｏｎａｇｈ  ＡＦ、「Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５８：  ９２０〜９２８、２００８］。大半の場合、このバランスの失調は良性であるか、または、実のところ有益な場合もあり、大半の新生児では、自発的に消散する［Ｗｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｂｈｕｔａｎｉ  ＶＫ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＬＨ、およびＳｈａｐｉｒｏ  ＳＭ、「Ｔｏｗａｒｄ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｋｅｒｎｉｃｔｅｒｕｓ：  ａ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｊａｕｎｄｉｃｅｄ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１７：  ４７４〜４８５、２００６；  Ｇｏｐｉｎａｔｈａｎ  Ｖ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＮＪ、Ｍｉｌｎｅｒ  ＡＤ、およびＲｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ  ＣＡ、「Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｐｌａｓｍａ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、３４９：  １９７〜２００、１９９４］。しかし、非結合ビリルビン濃度は、神経毒性となるレベルまで上昇する可能性があり、可逆性の難聴から、核黄疸のより重度の神経学的後遺症であって、稀な場合には死亡が含まれる後遺症にわたる欠損が結果としてもたらされる［Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｗｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、Ｏｓｔｒｏｗ  ＪＤ、およびＴｉｒｉｂｅｌｌｉ  Ｃ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ  （ｆｒｅｅ）  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５５：  １２８８〜１２９９、２００９］。
【０００６】
光線療法または交換輸血を用いる早期の介入により、新生児におけるビリルビンを媒介する神経毒性を処置することができる［Ｍａｉｓｅｌｓ  ＭＪおよびＭｃＤｏｎａｇｈ  ＡＦ、「Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５８：  ９２０〜９２８、２００８；  Ｍｏｒｒｉｓ  ＢＨ、Ｏｈ  Ｗ、Ｔｙｓｏｎ  ＪＥ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ  ＴＭ、ＭｃＤａｖｉｄ  ＧＥ、Ｐｅｒｒｉｔｔ  ＲＬ、Ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  ＫＰ、Ｖｏｈｒ  ＢＲ、Ｇｒｉｓｂｙ  Ｃ、Ｙａｏ  Ｑ、Ｐｅｄｒｏｚａ  Ｃ、Ｄａｓ  Ａ、Ｐｏｏｌｅ  ＷＫ、Ｃａｒｌｏ  ＷＡ、Ｄｕａｒａ  Ｓ、Ｌａｐｔｏｏｋ  ＡＲ、Ｓａｌｈａｂ  ＷＡ、Ｓｈａｎｋａｒａｎ  Ｓ、Ｐｏｉｎｄｅｘｔｅｒ  ＢＢ、Ｆａｎａｒｏｆｆ  ＡＡ、Ｗａｌｓｈ  ＭＣ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＭＲ、Ｓｔｏｌｌ  ＢＪ、Ｃｏｔｔｅｎ  ＣＭ、Ｄｏｎｏｖａｎ  ＥＦ、Ｅｈｒｅｎｋｒａｎｚ  ＲＡ、Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｒ、およびＨｉｇｇｉｎｓ  ＲＤ、「Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖｓ．  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５９：  １８８５〜１８９６、２００８；  Ｋｕｚｎｉｅｗｉｃｚ  ＭＷ、Ｅｓｃｏｂａｒ  ＧＪ、およびＮｅｗｍａｎ  ＴＢ、「Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｅ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２４：  １０３１〜１０３９、２００９］。介入のためのガイドラインは、妊娠期間および危険性因子を考慮に入れながらも、総ビリルビンレベルに主に依存している［Ｂｈｕｔａｎｉ  ＶＫ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｌ、およびＳｉｖｉｅｒｉ  ＥＭ、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｅｄｉｓｃｈａｒｇｅ  ｈｏｕｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｒｕｍ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｎｅａｒ−ｔｅｒｍ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１０３：  ６〜１４、１９９９］。しかし、根底的な生化学的証拠および増大しつつある臨床的証拠からは、総ビリルビンではなく、非結合ビリルビンが、ビリルビンを媒介する神経毒性とより正確に相関することが予測される［Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｗｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、Ｏｓｔｒｏｗ  ＪＤ、およびＴｉｒｉｂｅｌｌｉ  Ｃ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ  （ｆｒｅｅ）  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５５：  １２８８〜１２９９、２００９；  Ｗｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、およびＡｒａｖｋｉｎ  ＡＹ、「Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ：  ａｎ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｑｕａｇｍｉｒｅ」、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ、１５  ：  ２��３９〜２９４５、２００９；  Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ａｍｉｎ  ＳＢ、およびＰａｒｋｅｒ  ＡＥ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｂｒａｉｎｓｔｅｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、２９：  ３０５〜３０９、２００９；  Ｏｈ  Ｗ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、Ｔｙｓｏｎ  ＪＥ、Ｍｏｒｒｉｓ  ＢＨ、Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｂｅｎｄｅｒ  ＧＪ、Ｗｏｎｇ  ＲＪ、Ｐｅｒｒｉｔｔ  Ｒ、Ｖｏｈｒ  ＢＲ、Ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  ＫＰ、Ｖｒｅｍａｎ  ＨＪ、Ｄａｓ  Ａ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ  ＴＭ、およびＨｉｇｇｉｎｓ  ＲＤ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｌａｓｍａ  ｔｏｔａｌ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎｆａｎｔｓ」、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ、９９：  ６７３〜６７８、２０１０］。したがって、ビリルビンの神経毒性に対する危険性がある新生児を同定するためには、非結合ビリルビンが総ビリルビンより優れている［Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｊａｕｎｄｉｃｅｄ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ、２２：  １２９〜１３３、２０１０］。
【０００７】
早産児における侵襲的光線療法は、総ビリルビンを５ｍｇ／ｄＬより低く維持するようにデザインされる［Ｍｏｒｒｉｓ  ＢＨ、Ｏｈ  Ｗ、Ｔｙｓｏｎ  ＪＥ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ  ＴＭ、ＭｃＤａｖｉｄ  ＧＥ、Ｐｅｒｒｉｔｔ  ＲＬ、Ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  ＫＰ、Ｖｏｈｒ  ＢＲ、Ｇｒｉｓｂｙ  Ｃ、Ｙａｏ  Ｑ、Ｐｅｄｒｏｚａ  Ｃ、Ｄａｓ  Ａ、Ｐｏｏｌｅ  ＷＫ、Ｃａｒｌｏ  ＷＡ、Ｄｕａｒａ  Ｓ、Ｌａｐｔｏｏｋ  ＡＲ、Ｓａｌｈａｂ  ＷＡ、Ｓｈａｎｋａｒａｎ  Ｓ、Ｐｏｉｎｄｅｘｔｅｒ  ＢＢ、Ｆａｎａｒｏｆｆ  ＡＡ、Ｗａｌｓｈ  ＭＣ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＭＲ、Ｓｔｏｌｌ  ＢＪ、Ｃｏｔｔｅｎ  ＣＭ、Ｄｏｎｏｖａｎ  ＥＦ、Ｅｈｒｅｎｋｒａｎｚ  ＲＡ、Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｒ、およびＨｉｇｇｉｎｓ  ＲＤ、「Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖｓ．  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５９：  １８８５〜１８９６、２００８］。しかし、Ｍｏｒｒｉｓらは、総ビリルビンを５ｍｇ／ｄＬ未満に維持するように処置された患者と、８ｍｇ／ｄＬ未満に維持された患者とで、転帰（死亡および神経発達障害）の差違を見出さなかった。しかし、これらの研究者による追跡研究からは、転帰が、非結合ビリルビンとは十分に相関するが、総ビリルビンとは相関しないことが見出された［Ｏｈ  Ｗ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、Ｔｙｓｏｎ  ＪＥ、Ｍｏｒｒｉｓ  ＢＨ、Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｂｅｎｄｅｒ  ＧＪ、Ｗｏｎｇ  ＲＪ、Ｐｅｒｒｉｔｔ  Ｒ、Ｖｏｈｒ  ＢＲ、Ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  ＫＰ、Ｖｒｅｍａｎ  ＨＪ、Ｄａｓ  Ａ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ  ＴＭ、およびＨｉｇｇｉｎｓ  ＲＤ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｌａｓｍａ  ｔｏｔａｌ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎｆａｎｔｓ」、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ、９９：  ６７３〜６７８、２０１０］。これは、総ビリルビンレベルが、ビリルビンの毒性画分である非結合ビリルビンと連動していなかったために、光線療法をいつ送達するかを決定するために総ビリルビンを用いれば、誤解を招きかねなかったことを示唆する。総ビリルビンと非結合ビリルビンとを切り離すことは、ビリルビンのアルブミンへの結合に著しく干渉する分子の存在から生じうる。例えば、総ビリルビンが１ｍｇ／ｄＬという低量であっても、干渉分子により総ビリルビンのうちのわずか０．２％が置換されれば、非結合ビリルビン＝３４ｎＭが結果としてもたらされるであろう。これは、正期産児に毒性であると考えられる非結合ビリルビンレベルを超える非結合ビリルビンレベルであり、一般に、はるかに低い非結合ビリルビンレベルでも、Ｍｏｒｒｉｓら［Ｍｏｒｒｉｓ  ＢＨ、Ｏｈ  Ｗ、Ｔｙｓｏｎ  ＪＥ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ  ＴＭ、ＭｃＤａｖｉｄ  ＧＥ、Ｐｅｒ���ｉｔｔ  ＲＬ、Ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  ＫＰ、Ｖｏｈｒ  ＢＲ、Ｇｒｉｓｂｙ  Ｃ、Ｙａｏ  Ｑ、Ｐｅｄｒｏｚａ  Ｃ、Ｄａｓ  Ａ、Ｐｏｏｌｅ  ＷＫ、Ｃａｒｌｏ  ＷＡ、Ｄｕａｒａ  Ｓ、Ｌａｐｔｏｏｋ  ＡＲ、Ｓａｌｈａｂ  ＷＡ、Ｓｈａｎｋａｒａｎ  Ｓ、Ｐｏｉｎｄｅｘｔｅｒ  ＢＢ、Ｆａｎａｒｏｆｆ  ＡＡ、Ｗａｌｓｈ  ＭＣ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＭＲ、Ｓｔｏｌｌ  ＢＪ、Ｃｏｔｔｅｎ  ＣＭ、Ｄｏｎｏｖａｎ  ＥＦ、Ｅｈｒｅｎｋｒａｎｚ  ＲＡ、Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｒ、およびＨｉｇｇｉｎｓ  ＲＤ、「Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖｓ．  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５９：  １８８５〜１８９６、２００８］による試験における早産児などの早産児には毒性であろうと考えられる。
【０００８】
多くの薬物および代謝物は、アルブミンに結合することが可能であり、結果として、ビリルビンは、そのアルブミンへの結合状態から排除され、これにより、総ビリルビン濃度が上昇するのであれ、しないのであれ、非結合ビリルビン濃度は上昇する［Ｓｐｅａｒ  ＭＬ、Ｓｔａｈｌ  ＧＥ、Ｐａｕｌ  ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ  ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ  ＧＲ、およびＰｏｌｉｎ  ＲＡ、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  １５−ｈｏｕｒ  ｆａｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｏｓａｇｅ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、９：  １４４〜１４７、１９８５；  Ａｍｉｎ  ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、３４：  ４１４〜４２０、２０１０］。とりわけ、重要なビリルビン置換代謝物は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）である。ＦＦＡは常に存在するが、低レベルで維持され、健常な正期産児に対しては著しい影響を及ぼさない。しかし、例えば、敗血症に起因するストレス条件下では、ＦＦＡレベルが著しく上昇しうる［Ｎｏｇｕｅｉｒａ  ＡＣ、Ｋａｗａｂａｔａ  Ｖ、Ｂｉｓｅｌｌｉ  Ｐ、Ｌｉｎｓ  ＭＨ、Ｖａｌｅｒｉ  Ｃ、Ｓｅｃｋｌｅｒ  Ｍ、Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｗ、Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＧ、Ｂｅｒｎｉｋ  ＭＭ、ｄｅ  Ａｎｄｒａｄｅ  Ｍａｃｈａｄｏ  ＪＢ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＭＢ、Ｌｏｔｕｆｏ  ＰＡ、Ｃａｌｄｉｎｉ  ＥＧ、Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｅ、Ｃｕｒｉ  Ｒ、およびＳｏｒｉａｎｏ  ＦＧ、「Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｒａｔｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ」、Ｓｈｏｃｋ、２９：  ３４２〜３４８、２００８］。疾患およびストレスに加えて、ＮＩＣＵ内の早産児は、非経口栄養法により、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）などの油エマルジョンを施される結果として、ＦＦＡレベルの極度に大きな上昇をもたらしうる［Ｓｐｅａｒ  ＭＬ、Ｓｔａｈｌ  ＧＥ、Ｐａｕｌ  ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ  ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ  ＧＲ、およびＰｏｌｉｎ  ＲＡ、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  １５−ｈｏｕｒ  ｆａｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｏｓａｇｅ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、９：  １４４〜１４７、１９８５；  Ａｍｉｎ  ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、３４：  ４１４〜４２０、２０１０］。ＦＦＡは、アルブミンに、ビリルビンと同様の高アフィニティーで結合する。ビリルビンと異なり、ＦＦＡは、複数の高アフィニティー結合部位を有するので、アルブミンへの結合部位のうちのかなりの部分がＦＦＡにより占有される場合に限り、ビリルビン置換が著しいものとなる［Ｓｐｅａｒ  ＭＬ、Ｓｔａｈｌ  ＧＥ、Ｐａｕｌ  ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ  ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ  ＧＲ、およびＰｏｌｉｎ  ＲＡ、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  １５−ｈｏｕｒ  ｆａｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｏｓａｇｅ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、９：  １４４〜１４７、１９８５；  Ａｍｉｎ  ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、３４：  ４１４〜４２０、２０１０］。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）を施されているいずれの新生児が十分に大きな量のＦＦＡをもたらすのかは、それが、妊娠期間に依存し、おそらくは、酵素活性、脂肪症、および他の因子などの要因に依存するために、容易に予測することはできない［Ｓｐｅａｒ  ＭＬ、Ｓｔａｈｌ  ＧＥ、Ｐａｕｌ  ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ  ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ  ＧＲ、およびＰｏｌｉｎ  ＲＡ、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  １５−ｈｏｕｒ  ｆａｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｏｓａｇｅ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、９：  １４４〜１４７、１９８５；  Ａｍｉｎ  ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、３４：  ４１４〜４２０、２０１０］。高ＦＦＡｕレベルは、免疫抑制、心損傷、および心拍変動の低減、ならびに非結合ビリルビンレベルの上昇を引き起こしうるために、脂質注入時におけるＦＦＡの非結合濃度（ＦＦＡｕ）をモニタリングすることはきわめて重要である。加えて、これらの代謝物の非結合レベルは、多くの患者特異的因子に依存するために、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の注入時における非結合ビリルビンの直接的モニタリングだけで、ビリルビンの神経毒性に対する危険性がある乳児を同定することができる。これは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）濃度の上昇によりＦＦＡの血漿レベルが上昇すると、総ビリルビン濃度を変化させることなく、非結合ビリルビン濃度が上昇するために、特にビリルビンについて当てはまる。
【０００９】
細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）とは、低分子量単鎖ポリペプチドのファミリーである。４つのサブファミリーが認知されている。サブファミリーＩは、レチノイン酸およびレチノールなど、ビタミンＡ誘導体に特異的なタンパク質を含有する。サブファミリーＩＩは、胆汁酸、エイコサノイド（ｅｉｃｏｎｓａｎｏｉｄｓ）、およびヘムに対して特異的なタンパク質を含有する。サブファミリーＩＩＩは、腸型脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）を含有し、サブファミリーＩＶは、ビリルビンに低いアフィニティーで結合するＦＡＢＰ［Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ  ＳＭおよびＳａｎｔｏｍｅ  ＪＡ、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１４７８：  １８６〜２００、２０００］を含めた、他の全ての種類の脂肪酸結合タンパク質を含有する［Ｈａｕｎｅｒｌａｎｄ  ＮＨおよびＳｐｅｎｅｒ  Ｆ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ」、Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、４３：  ３２８〜３４９、２００４］。ファミリーの全体は、共通の三次元折り畳み構造を特徴とする。異なるサブファミリーのリガンド結合特性は、大幅に重なり合う。サブファミリーＩの野生型のタンパク質［Ｒｉｃｈｉｅｒｉ  ＧＶ、Ｏｇａｔａ  ＲＴ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＡＷ、Ｖｅｅｒｋａｍｐ  ＪＨ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｓｈｏｗ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：  ７１９７〜７２０４、２０００］およびサブファミリーＩＩの野生型のタンパク質のいずれも、脂肪酸のほか、それらの天然のリガンドにも結合する。さらに、単一のアミノ酸置換により、サブファミリーＩおよびＩＩのタンパク質のリガンド結合特性を相互転換することが可能である［Ｊａｋｏｂｙ  ＭＧ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＫＲ、Ｔｏｎｅｒ  ＪＪ、Ｂａｕｍａｎ  Ａ、Ｃｈｅｎｇ  Ｌ、Ｌｉ  Ｅ、およびＣｉｓｔｏｌａ  ＤＰ、「Ｌｉｇａｎｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｇｏｖｅｒｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｌ−  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：  ８７２〜８７８、１９９３］。
【００１０】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７０，７１４号(特許文献１)、Ｕ．Ｓ．６，４４４，４３２、ＵＳ７，６０１，５１０、および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号(特許文献２)は、プローブを生成させるための方法および非結合解析物を決定するためのプローブについて記載している。これらのプローブは、ｉＬＢＰファミリー由来の天然形態または突然変異体形態のタンパク質を用いて構築された。上記で論じた通り、このファミリーは、ＦＡＢＰを含む［Ｂａｎａｓｚａｋ  Ｌ、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎ、Ｘｕ  Ｚ、Ｂｅｒｎｌｏｈｒ  ＤＡ、Ｃｏｗａｎ  Ｓ、およびＪｏｎｅｓ  ＴＡ、「Ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ、４５：  ８９〜１５１、１９９４；  Ｂｅｒｎｌｏｈｒ  ＤＡ、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＭＡ、Ｈｅｒｔｚｅｌ  ＡＶ、およびＢａｎａｓｚａｋ  ＬＪ、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｇｅｎｅｓ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ、１７：  ２７７〜３０３、１９９７］。ＦＡＢＰとは、分子量約１５ｋＤａの細胞内タンパク質であり、野生型のタンパク質中に、１つまたは２つのＦＦＡのほか、他の代謝物に結合する結合部位を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５４７０７１４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の実施形態は、非結合ビリルビンに高度に特異的なプローブの同定、および単純な水溶液からヒト体液（血液、ＣＳＦ、尿、間質液）を含めた複雑な生物学的試料にわたる試料中の非結合ビリルビン濃度を決定するのにこれらのプローブを用いるための方法であって、以下のステップ：
ＵＳ７，６０１，５１０および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号の方法、ならびに第２の遊離フルオロフォアまたは、例えば、タンパク質、ポリデキストラン、もしくはポリスチレンなど、固体基質もしくはポリマーへと付着させもしくはこれに包埋させた第２のフルオロフォアを用いることにより、比についてのビリルビンプローブを生成させる方法を用いてプローブを生成させ、式（１〜３）を用いてプローブを修正して、解離定数を決定するステップ、
プローブを固体基質へと連結するための方法を同定し、デバイス内のこのようなプローブの特性［決定される特性には、プローブの解離の影響、アルブミンの緩衝の影響、ビリルビンのプローブではなくてビーズへの結合の影響、溶液と比較したビーズにおける平衡速度、溶液における測定値の固体における測定値に対する関係が含まれる］について記載し、このようなデバイスにおける非結合ビリルビンレベルの確度および精度の高い決定のための方法について記載するステップ、
一般的な代謝物、薬物、ビリルビン光異性体、および抱合型ビリルビンを含めた、潜在的な干渉物質ならびにさらなる突然変異のパネルに照らして、規定された水溶液中の試験を組み合わせることにより、ビリルビンプローブの特異性を洗練させて、１ｎＭ未満の非結合ビリルビンまたは何らかの医学的に適切なレベルと同等な他の解析物寄与と符合する特異性を達成するステップ、
ビリルビンでスパイクした、規定されたヒト血漿中の非結合ビリルビンを測定することにより定量化を試みて、ヒト血液試料中の非結合ビリルビンに対する特異性を確認するステップ、
溶液中のプローブまたは固体表面へと結合させたプローブを用い、式（４および５）において記載される通りに非結合ビリルビン濃度を計算するステップ
のうちの１または複数を含む方法を対象とする。
【００１３】
好ましい実施形態は、１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する脂質結合タンパク質などのｉＬＢＰとフルオロフォアとに基づくプローブを対象とする。フルオロフォアは、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン置換へと付着させることが好ましい。プローブは、ビリルビンには結合するが、脂肪酸に著しくは結合しないことが好ましい。
【００１４】
好ましい実施形態では、プローブが、場合により、ローダミンＢと組み合わせて、置換１４Ｒ、１８Ｌ、２５Ｃ、２７Ａ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｌ、１１５Ｒ、１１７Ｄを含む（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１）。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、プローブが、場合により、ローダミンＢと組み合わせて、置換１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１５Ｒ、および１１７Ｄを含む（Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７）。
【００１６】
好ましい実施形態では、プローブが、１４、１８、２３、２５、２７、３１、３６、３８、５５、６０、７２、７３、７４、７８、１０２、１０４、１０６、１１５、および１１７位から選択される位置において１または複数のアミノ酸置換を伴う、配列番号３の脂質結合タンパク質に対応する。
【００１７】
一部の好ましい実施形態では、フルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位において、システイン置換へと付着している。
【００１８】
一部の好ましい実施形態では、フルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位において、リシン置換へと付着している。
【００１９】
一部の好ましい実施形態では、プローブが、７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ位において置換され（ＫＲ６）、より好ましくは、７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ位において置換される（ＫＲ１４）。
【００２０】
好ましい実施形態では、プローブが、少なくとも１つのリンカーを含む。（１または複数の）リンカーは、
【００２１】
【化１】
2014526055.tif 000002
【００２２】
およびこれらの組合せから選択される１または複数でありうる。
【００２３】
ポリヌクレオチド鋳型は、切断可能であるかまたは切断不可能なアフィニティータグを有する、ｉＬＢＰムテインをコードすることが好ましい。ポリヌクレオチド鋳型は、ポリヒスチジンアフィニティータグを有するｉＬＢＰムテインをコードし、固体マトリックスは、固定化金属キレートを含むことがより好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、フルオロフォアが、システイン側鎖と優先的に反応するように、ｉＬＢＰムテインが、８未満のｐＨで、単一のフルオロフォアにより標識される。フルオロフォアは、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ２−マレイミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗヨードアセトアミド、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ６８０マレイミド、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃ５−ブロモアセトアミド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０  Ｃ５−マレイミド、またはＢＯＤＩＰＹ  ５７７／６１８が好ましい。
【００２５】
第２の好ましい実施形態では、フルオロフォアが、タンパク質のアミノ末端またはリシン側鎖など、アミンと優先的に反応するように、ｉＬＢＰムテインが、８を超えるｐＨで、単一のフルオロフォアにより標識される。好ましくは、フルオロフォアは、アクリロダンであるか、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＣＦ７５０  ＳＥ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ６８０  ＬＴ、もしくはＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ７００ＤＸなど、長波長で吸収および発光するフルオロフォアである。
【００２６】
代替的な好ましい実施形態では、ｉＬＢＰムテインが、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアで標識される。１つのフルオロフォアは、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、または４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）であることが好ましい。他のフルオロフォアは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄなど、長波長で吸収および発光するフルオロフォアであることが好ましい。一部の好ましい実施形態では、標識化は、システインを８以下のｐＨで第１のフルオロフォアと反応させるステップと、リシンを８を超えるｐＨで第２のフルオロフォアと反応させるステップとを含む。他の好ましい実施形態では、標識化は、システインを８以下のｐＨで第１のフルオロフォアと反応させるステップと、ｉＬＢＰムテインのアミノ末端を８を超えるｐＨで第２のフルオロフォアと反応させるステップとを含む。
【００２７】
本発明の一部の実施形態では、アクセプタータンパク質またはペプチドドメインを、ｉＬＢＰムテインの各々へと付加することにより、第２のフルオロフォアを提供する。アクセプタータンパク質またはペプチドドメインが、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、およびＡＣＰタグなどから選択されることが好ましい。一部の実施形態では、ライブラリー内のポリヌクレオチドの突然変異体が、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチドセグメントを含有する。アクセプタータンパク質ドメインまたは蛍光タンパク質は、ビリルビンへと曝露したときに発光する蛍光の強度および／または波長による応答が、プローブのｉＬＢＰムテイン部分の蛍光と比較してゼロであるか著しく低減されることが好ましい。
【００２８】
一部の実施形態では、第１のフルオロフォアがリシン置換へと付着し、第２のフルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位から選択されるシステイン置換へと付着している。
【００２９】
本発明の実施形態は、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアで標識されたｉＬＢＰムテインを有する組成物を対象とする。第２のフルオロフォアは、溶液中に遊離しているか、またはビリルビンに結合しないタンパク質へと付着していることが好ましい。第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとは、同じ波長で励起することが可能であり、第１のフルオロフォアの発光波長と、第２のフルオロフォアの発光波長とは異なることが好ましい。第２のフルオロフォアは、ビリルビンのｉＬＢＰムテインへの結合に応答して影響されない（その発光を変化させない）ことが好ましい。第１のフルオロフォアは、アクリロダンであり、第２のフルオロフォアは、ローダミンＢ、ＮＢＤ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ色素、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素から選択されることが好ましい。第１のフルオロフォアは、ＬｉＣｏｒ  ７００ＤＸであり、第２のフルオロフォアは、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、またはＢｏｄｉｐｙ色素であることがより好ましい。
【００３０】
好ましい実施形態では、蛍光指数比の変化を、２つの異なる波長において測定し、非結合ビリルビン濃度を決定するのに用いる。
【００３１】
好ましい実施形態では、本明細書で記載されるプローブへと付着させた（１または複数の）フルオロフォアの発光強度が、ビリルビンおよびヘモグロビンなどの血液成分の吸光（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）により影響されない。
【００３２】
一部の実施形態では、第１のフルオロフォアが、システインへと付着し、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、および４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄから選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、第１のフルオロフォアが、リシンへと付着し、アクリロダン、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＣＦ７５０ＳＥ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ６８０  ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ７００ＤＸから選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄから選択される。
【００３４】
本明細書で記載される本発明の他の好ましい実施形態では、第２の異なるフルオロフォアが、溶液中に遊離している可溶性分子として提供される。このようなプローブは、２つの異なる波長において測定される蛍光指数の比の変化により、ビリルビンの、プローブのタンパク質部分への結合に応答する。これは、ビリルビンに対する著しい応答を明示しない、第２のフルオロフォアであるが付着していないフルオロフォアを用いることにより、ビリルビンの結合に応答して蛍光指数の比の変化を明示するのではないプローブを、比についてのプローブへと容易に変換することを可能とする。第２の遊離フルオロフォアの発光波長は、第１の（タンパク質に結合した）フルオロフォアより長い場合もあり、短い場合もあるが、いずれのフルオロフォアも、共通の励起波長を有さなければならない。例えば、一部の実施形態では、第１の（タンパク質に連結された）フルオロフォアが、アクリロダンであり、第２のフルオロフォアの例には、溶液中に遊離しているか、または別のポリマーもしくは固体基質へと付着させもしくはこれに包埋されたローダミンＢ、ＮＢＤ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが含まれるがこれらに限定されない。この配置は、第２のフルオロフォアの最大の励起波長が、第１のフルオロフォアの場合とは異なる場合であっても、両方のフルオロフォアの発光強度が同様となるように、遊離フルオロフォアの濃度を調整しうる利点を有する。プローブへと付着させていない第２の異なるフルオロフォアを用いる、この種の比についてのプローブにより、典型的には両方のフルオロフォアがタンパク質などの同じ高分子上に配置される場合における、２つのフルオロフォアのうちの一方の他方による、エネルギー移動消光の問題が消滅する。
【００３５】
一部の実施形態では、第２のフルオロフォアが、プローブのアクセプタータンパク質またはペプチドドメインへと付着している。アクセプタータンパク質またはペプチドドメインは、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、およびＡＣＰタグから選択されることが好ましい。プローブが、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）を含むことが好ましい。プローブが、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）を含むことがより好ましい。
【００３６】
一部の実施形態では、上記のプローブのうちのいずれかについて、Ｎ末端のＭＡＦＤを、例えば、ＭＧＩＦＤ、ＭＧＣＦＤまたはＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換することができる。
【００３７】
一部の実施形態では、プローブは、
【００３８】
【化２】
2014526055.tif 000003
【００３９】
またはこれらの組合せなど、少なくとも１つのリンカーを含む。
【００４０】
本発明の実施形態は、フルオロフォアが、システイン残基へと付着させたプローブを対象とする。フルオロフォアは、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ２−マレイミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗヨードアセトアミド、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ６８０マレイミド、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ２−マレイミド、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｃ５−ブロモアセトアミド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０  Ｃ５−マレイミド、およびＢＯＤＩＰＹ  ５７７／６１８から選択されることが好ましい。
【００４１】
本発明の実施形態は、フルオロフォアが、リシン残基へと付着させたプローブを対象とする。フルオロフォアは、アクリロダン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＣＦ７５０  ＳＥ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｓｉｇｈｔ  ６７０  ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ６８０  ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ  ＩＲＤｙｅ７００ＤＸから選択されることが好ましい。
【００４２】
一部の実施形態では、上記のプローブのうちのいずれかは、プローブのＣ末端またはＮ末端において、固体支持体への付着のための１または複数のリンカーと組み合わせた２つ以上のタグを含むことができる。
【００４３】
好ましい実施形態では、プローブは２５位にＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸで標識されたリシンを含む。
【００４４】
一部の好ましい実施形態では、プローブが、２つのＨｉｓタグおよび２つのリンカーを用いて、固体支持体へと付着している。
【００４５】
一部の好ましい実施形態では、プローブが、好ましくは、ＨｉｓタグおよびＰＳタグから選択される、１または複数のタグを含む。
【００４６】
本発明の実施形態は、上記の１または複数のプローブを含有する組成物を対象とする。
【００４７】
他の好ましい実施形態は、表面へと固定化しうるポリスチレンビーズまたはラテックスビーズビーズが含まれるがこれらに限定されない固体基質へと付着させたビリルビンプローブを含む。このような固定化された粒子の使用の例には、ハイスループットの測定のためのマルチウェルプレートの底面またはディスポーザブルのマイクロ流体デバイスのチャネルに接着させた粒子が含まれるがこれらに限定されない。表面上に固定化されるようにデザインされたビリルビンプローブの例には、システインまたはリシンとの化学反応を介して固体支持体表面上の適切な基へと連結されるプローブ（表８の最初の２つの群）のほか、非共有結合的相互作用を介して連結されるプローブ（表８の第３群ならびに例６および７）も含まれる。加えて、第２のフルオロフォアは、固体支持体表面へと付着させることもでき、この中に包埋することもでき、これにより、２つのフルオロフォアを分離して、エネルギー移動を消失させ、これにより、ビリルビンの結合に対する比の応答を得ることができる。加えて、第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合しないかまたはこれに対して不応答性である、ｉＬＢＰなどの別のタンパク質、またはデキストランなどの別の型のポリマーへと付着させることもできる。
【００４８】
本発明の実施形態は、固体基質へと付着させた上記のプローブのうちのいずれかを含む固体基質を対象とする。固体基質は、場合により、鉄のコアおよび／またはマイクロ流体デバイスもしくはマルチウェルプレートを伴う、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、Ｎｉ−アガロースビーズであることが好ましい。固体基質へと付着させるために選択されるプローブは、Ｎ末端の修飾、リンカー、および表面リシンの置換（ＫＲ６およびＫＲ１４）が含まれるがこれらに限定されない上記の修飾のうちのいずれかを単独または組合せで含有しうる。
【００４９】
好ましい実施形態では、プローブが、固体基質への付着のためにタグづけされる。好ましい実施形態では、タグには、Ｈｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、および金属アフィニティータグのうちの１または複数が含まれる。
【００５０】
一部の実施形態では、固体基質は、第２のフルオロフォアを含む。第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合しないタンパク質へと付着させることができる。
【００５１】
好ましい実施形態は、プローブがタグを有し、固体基質がタグのためのレセプターを含む固体基質を対象とする。タグが、ポリヒスチジンタグであり、固体基質が、固定化金属キレートを含むことが好ましい。
【００５２】
本発明の実施形態は、蛍光色素で標識された単一のシステインまたはリシンを有するｉＬＢＰムテインを対象とする。システイン／リシン特異的な標識化条件下において蛍光標識化活性を伴う任意の表面リシンまたは他の任意のシステインを、別のアミノ酸、好ましくは、アラニンまたはアルギニンで置きかえることが好ましい。配列番号３に対応するｉＬＢＰムテイン鋳型を使用する好ましい実施形態では、２７位におけるリシンが高度に反応性であり、典型的にはアラニンへと突然変異させる。
【００５３】
好ましい実施形態では、ビリルビンを、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、またはシクロデキストリンなどの担体高分子と複合体化させる。ビリルビンと担体高分子との複合体は、非結合ビリルビンの濃度を緩衝し、非結合ビリルビンのレベルのクランピングをもたらす。好ましい実施形態では、担体高分子がアルブミンである。さらなる好ましい実施形態では、アルブミンが、ビリルビンに対するアフィニティーが例えばウシ血清アルブミンより大きく、したがって、一部の実施形態ではビリルビンに対するより好ましいアルブミン緩衝液である、ヒト血清アルブミンである。
【００５４】
一部の実施形態では、ビリルビンによる吸光が、ビリルビンプローブのフルオロフォアの励起波長と重複し、内部フィルターによる吸光が著しいものとなる程度に経路長ｄが十分に長いキュベット内で検定を実施する。この場合、励起波長におけるビリルビンによる吸光に起因して、そして、おそらくは発光波長におけるビリルビンによる吸光に起因して、校正式を、ビリルビンプローブの滴定データへと適合する前に、または遊離（非結合）ビリルビン濃度［Ｂｆ］を、式４もしくは５により決定するときに、フルオロフォアの発光強度を、内部フィルターによる吸光について補正しなければならない。発光強度
【００５５】
【数１】
2014526055.tif 000004
【００５６】
を補正するための式は、
【００５７】
【数２】
2014526055.tif 000005
【００５８】
［式中、Ｉλｅｍは、波長λｅｍにおいて測定された蛍光発光強度であり、ＢＴは、総ビリルビン濃度であり、ε（λｅｘ）は、励起波長または発光波長（λｅｘ）におけるビリルビンの減衰係数であり、ｄは、キュベット経路長である］
である。式（１）により示される通り、内部フィルター補正は、［Ｂｆ］を決定するためにもまた測定しなければならない、総ビリルビン濃度（ＢＴ）について知ることを要求する。内部フィルター励起の補正は、単一のフルオロフォアによる、比についてではないビリルビンプローブに重要であり、これについては、式（２）を校正に用いる。
【００５９】
本発明の実施形態は、プローブを、ビリルビンの水性試料と混合し、蛍光を測定し、キャリブレーションパラメータを、以下の式１および２または３：
【００６０】
【数３】
2014526055.tif 000006
【００６１】
［式中、Ｉλｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、Ｉ０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、ＰＴは、総ビリルビンプローブ濃度であり、ＢＴは、総ビリルビン濃度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）［式中、Ｉλ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブのΙλ２／Ιλ１比であり、Ｋｄは、解離定数である］
で適合して、測定された蛍光から決定することにより、ビリルビンプローブをキャリブレートする方法を対象とする。
【００６２】
本発明の実施形態は、以下のステップの組合せに従うことにより、遊離ビリルビン濃度［Ｂｆ］を測定する方法であって、場合により、試料の蛍光を測定するステップと、プローブを、試料と混合するステップと、蛍光を測定するステップと、場合により、試料を伴うプローブの蛍光から試料の蛍光を減じるステップと、濃度［Ｂｆ］を、測定された蛍光から決定するステップとを含む方法を対象とする。
【００６３】
好ましい実施形態では、以下の式４〜６：
【００６４】
【数４】
2014526055.tif 000007
【００６５】
［式中、Ｉλｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、Ｉ０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）［式中、Ｉλ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブのΙλ２／Ιλ１比であり、Ｋｄは、解離定数であり、Ｉｓは、プローブのビリルビン飽和時における発光強度である］
のうちの少なくとも１つを用いて、プローブをキャリブレートし、かつ／または［Ｂｆ］を測定する。
【００６６】
一部の実施形態では、プローブが、溶液中に遊離しているか、またはビリルビンに結合しないタンパク質などのポリマーへと付着している、２つのフルオロフォアまたは１つのフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアを伴うプローブの組合せを有する。一部の実施形態では、ビリルビンに結合するかまたはこれに応答する１つのフルオロフォアを伴うプローブが、固体基質へと付着し、第２のフルオロフォアが、別のタンパク質へと付着し、これもまた固体基質へと付着しているが、ビリルビンには結合または応答しない。
【００６７】
一部の実施形態では、プローブが単一のフルオロフォアを有し、方法が、内部フィルターの励起について補正するための１または複数のステップを含む。
【００６８】
好ましい実施形態では、試料が、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、またはシクロデキストリンなど、ビリルビンの担体高分子を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、プローブが固体支持体へと付着している。一部の好ましい実施形態では、マイクロ流体装置(Microfluidics)は、希釈されていない血液試料の測定を可能とする。
【００７０】
試料は、ヒト、動物または植物由来であることが好ましい。好ましい実施形態では、試料が、全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパ由来である。一部の実施形態では、試料が、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者由来である。一部の実施形態では、試料が、疾患またはストレスにより、ビリルビンをアルブミンから排除する分子を産生している可能性がある患者由来である。一部の実施形態では、試料が、光線療法、輸血またはビリルビンレベルを低減する他の療法を受けている患者由来である。
【００７１】
本発明の実施形態は、以下のステップ：
場合により、試料の蛍光を測定するステップ、
試料とＦＦＡｕプローブとを混合するステップ、
プローブの蛍光を測定するステップ、
ＦＦＡｕ濃度を計算するステップ、
のうちの１または複数により、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者由来の血液試料中の非結合ＦＦＡの濃度を測定するための方法を対象とする。
【００７２】
一部の実施形態では、患者に対する損傷の危険性をＦＦＡｕ濃度に基づき決定し、処置を施して、損傷の危険性を防止、処置または軽減する。
【００７３】
本発明の実施形態は、試料を患者から回収するための１または複数の回収デバイスと、上記の１または複数のプローブまたは適切な担体中に１もしくは複数のプローブを含有する組成物と、場合により、既知濃度の非結合ビリルビンを含む参照標準物質とを含みうるキットを対象とする。
【００７４】
本発明の実施形態は、表２、３、４、５、６、７、８および１０のうちのいずれかにおいて規定されたプローブを対象とする。
【００７５】
本発明の実施形態は、脂肪エマルジョン（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標））を施されている患者における非結合ビリルビンおよび／または非結合ＦＦＡの毒性の危険性を決定する方法であって、以下のステップ：
試料を患者から得るステップ、
試料を、ＡＤＩＦＡＢ２、Ｌ１９ＣＰ１０Ｃ７、Ｌ１３８Ｐ１Ｈ８Ｎ２４Ｃ、Ｌ２２Ｐ５Ｅ１１、Ｌ６１Ｐ８Ｂ１２、Ｌ４ＢＰ４Ｂ９、およびＬ１１９Ｐ３Ｅ５など、１または複数のプローブと接触させて、１または複数のＦＦＡｕのレベルを決定するステップ、
非結合ビリルビンのレベルを決定するステップ、
ＦＦＡｕレベルおよび非結合ビリルビンレベルを、正常な集団から得られるレベルと比較して、毒性の危険性を決定するステップ、
のうちの１または複数を含む方法を対象とする。
【００７６】
本発明の実施形態は、１または複数のアミノ酸置換を有する配列番号３に対応する脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）などのプローブとフルオロフォアとを含む固体基質を対象とする。フルオロフォアは、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン置換へと付着していることが好ましい。プローブは、脂肪酸に結合し、固体基質へと付着していることが好ましい。固体基質が、場合により、鉄のコア、マイクロ流体デバイス、またはマルチウェルプレートを伴う、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、Ｎｉ−アガロースビーズであることが好ましい。
【００７７】
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブが、プローブのＭＡＦＤがＭＧＩＦＤ、ＭＧＣＦＤ、またはＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換された修飾Ｎ末端を有する。
【００７８】
固体基質へと付着させたプローブは、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６）、より好ましくは、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ１４）など、表面リシンの修飾を有することが好ましい。
【００７９】
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブが、
【００８０】
【化３】
2014526055.tif 000008
【００８１】
およびこれらの組合せなど、少なくとも１つのリンカーを含む。
【００８２】
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブが、固体基質への付着のためにタグづけされる。好ましくは、タグは、Ｈｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグおよび金属アフィニティータグの１または複数を含む。
【００８３】
一部の好ましい実施形態では、固体基質が、場合により、ＦＦＡｕに結合しないタンパク質へと付着させた第２のフルオロフォアを含む。
【００８４】
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブがタグを含み、固体基質がタグのためのレセプターを有する。タグがポリヒスチジンタグであり、固体基質が固定化金属キレートを含むことが好ましい。
【００８５】
本発明のさらなる態様、特色および利点は、後出する好ましい実施形態の詳細な説明から明らかとなろう。
【００８６】
ここで、本発明のこれらの特色および他の特色を、本発明を例示することを意図するものであり、限定することを意図するものではない、好ましい実施形態についての図面との関連で記載する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１Ａは、プローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７について、Ｉ５２５／Ｉ０を、ビリルビン濃度と対比して示す。図１Ｂは、ビリルビン（３μΜ）の存在下および非存在下におけるプローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７について、測定された遊離ビリルビン濃度［Ｂｆ］を、オレイン酸濃度と対比して示す。図１Ｃは、プローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７について、遊離ビリルビン濃度［Ｂｆ］を、添加されるビリルビンの上昇する濃度と対比して示す。
【図２】プローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７−Ｘｃ（Ｘｃは、アクリロダンで標識された異なる単一のシステイン位置を表示する）について、Ｉ５２５／Ｉ０を、ビリルビン濃度と対比して示す。
【図３】スパイクされた成人血清中の結果を示す。プローブＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１について、Ｉ５２５／Ｉ０が、添加されるビリルビンの上昇する濃度と対比して示される。
【図４】総ビリルビンを上昇に伴うＩ５２５／Ｉ５７５比を測定することにより実行されるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈプローブのキャリブレーションを示す。滴定曲線を式（３）に適合してＫｄを決定する。
【図５】抱合型ビリルビンのモデルであるジタウロビリルビンの、ビリルビンプローブであるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈへの結合（Ｋｄ＝３００ｎＭ）が、非抱合型ビリルビンの結合の約１９分の１（Ｋｄ＝１６ｎＭ）であることを示す。
【図６】ビリルビンの、４６０ｎｍの照射への曝露を増大に伴い、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈにより、非結合ビリルビンの減少がモニタリングされることを示す。これは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈが、４６０ｎｍでの放射時に生成するビリルビンの光酸化生成物および光異性体の存在に対して低感度であり、したがって、ビリルビン毒性を処置するための光線療法の有効性を正確にモニタリングするための方法を提供することを含意する。
【図７】ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈを用いて、１０×１０ｍｍのキュベットを用いるＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３（ＪＹ  Ｈｏｒｉｂａ）（黒塗りのダイア形）内、または発光フィルターを５２５および５８０ｎｍを中心とするフィルターで置きかえることにより非結合ビリルビンを測定するために改変されたＦＦＡｕ  Ｍｅｔｅｒ（ＦＦＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（○、丸形）内で行われた［Ｂｆ］の測定を示す。［Ｂｆ］の測定はまた、同じ試料に対して、ペルオキシダーゼ法を用いても実施された［Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２０：７８３、１９７４］（黒塗りの三角形）。結果は、３回の測定全てについて事実上同一の結果を示し、ビリルビンの単一のヒトアルブミン部位への結合についてＫｄ＝２０ｎＭで、測定される結果と予測される結果との良好な一致を示す。
【図８】蛍光分析測定のためにデザインされたマイクロチャネル型のディスポーザブルカートリッジセットの「ウェル」内に固定化されたＮｉ−アガロースビーズ上に固定化されたプローブＰＳ１９−１について、ビリルビンによる消光結果を示す。ビリルビンをスパイクした成人ヒト血漿試料であって、２０μＬの希釈されていない試料を、カートリッジへと添加し、非結合ビリルビンによるＤＸ７００蛍光の消光を、式（５）を用いてデータへと適合して、Ｋｄを決定した。
【図９】総ビリルビンを上昇に伴うＩ５２５／Ｉ６１５比を測定することにより実行される、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄプローブのキャリブレーションを示す。滴定曲線を式（３）に適合してＫｄを決定する。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
記載される実施形態は、本発明の好ましい実施形態を表すが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなしに、工程を改変しうることを理解されたい。
【００８９】
本開示の目的で、「解析物」とは、それらの分子量が約２０００Ｄａ以下の分子であり、非結合解析物とは、水溶液中のこれらの分子である。これらには、ヒトまたは動物の生理または病態生理の過程で自然発生する代謝物および生理学的に重要な分子、ならびに薬物分子およびそれらの代謝産物、ならびに栄養物分子およびそれらの代謝産物が含まれる。それらの溶解度に応じて、各解析物の一画分は、水溶液中で単量体として存在する（帯電しているかまたは中性である）。この画分を、「遊離解析物または非結合解析物」画分と称し、非結合代謝物（ＭＥＴｕ）を含む。
【００９０】
本開示の目的では、ビリルビンが、非抱合型ビリルビンＩＸα［ＭｃＤｏｎａｇｈ  ＡＦ、Ｖｒｅｍａｎ  ＨＪ、Ｗｏｎｇ  ＲＪ、およびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、「Ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｓ：ｏｂｆｕｓｃａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ？」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２３：６７〜７６、２００９］である。非結合ビリルビンとは、血漿中で一般にアルブミンに結合して見出されるビリルビンとは異なる非抱合型ビリルビンＩＸαの水性単量体である。
【００９１】
本開示の目的では、「脂質」という用語を、その通常で慣用的な意味を有すると理解し、有機溶媒中の可溶性が最も高いが、水性相（非結合の画分）中でもあるレベルの溶解度を示す化合物と定義する。したがって、「脂質結合タンパク質」は、本明細書で定義される脂質に結合することが可能な任意のタンパク質を含む。
【００９２】
例えば、ビリルビン、脂肪酸を含めた脂質、ホルモン、および代謝産物など、非結合分子のレベルは、適切なヒトまたは動物の体液中で測定されると、健康および疾患についての診断情報を提示しうる。このような分子の非結合濃度（また、「水性相」濃度または「遊離」濃度としても知られている）の決定は、生理学的ホメオスタシスについてのきわめて重要な情報をもたらすことがますます明らかである。多くの代謝物は、水性溶解度および非結合濃度が低い（バルクの「全体」がタンパク質または細胞に結合しうるそれらの「総」濃度よりはるかに低い）疎水性分子である。生体液中では、非結合分子の濃度が、正常な生理学的条件下で比較的一定の非結合濃度を維持するように調節されることが多い。この調節は、分子の、例えば、アルブミンなどの担体タンパク質との相互作用を介して生じる。したがって、大半の分子は一般に、アルブミンまたは他の担体に結合する。しかし、小画分の分子は、アルブミンから水性相へと解離（および再結合）し、これらが非結合分子となる。
【００９３】
本開示の目的で、「ビリルビンプローブ」とは、１または複数のシステイン残基またはリシン残基において蛍光標識され、ビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を起こすｉＬＢＰである。ビリルビンプローブはまた、ビリルビンに結合したとき、フルオロフォアのうちの一方だけの蛍光が変化すれば、２つの波長における蛍光指数の比が異なるように、システイン残基において１つのフルオロフォアにより蛍光標識され、異なる残基、好ましくはリシン残基において異なるフルオロフォアにより蛍光標識されたｉＬＢＰでもありうる。ビリルビンプローブはまた、システイン残基またはリシン残基において、プローブタンパク質へと付着させていない第２のフルオロフォアによりもたらされるさらなる蛍光で蛍光標識されたｉＬＢＰも含む。この場合も、ビリルビンに結合したとき、フルオロフォアのうちの一方だけの蛍光が変化すれば、２つの波長における蛍光指数の比が異なる。第２のフルオロフォアは、水溶液中に遊離した蛍光分子の場合もあり、ｉＬＢＰなど、ビリルビンに対して応答性でなく、かつ／またはビリルビンに結合しない大型の分子へと付着している場合もあり、第２のフルオロフォアは、表面へと付着している場合もあり、第２のフルオロフォアへと付着させた非応答性分子が表面へと付着している場合もある。このようなプローブを用いると、非結合ビリルビンの水性濃度を特異的に決定することができるが、これは、とりわけ、水溶液中のその溶解度特性が低いために、かつ、他の代謝物、とりわけ、遊離脂肪酸が存在するために、他の方途では困難である。蛍光応答の比の変化は、とりわけ、非結合ビリルビンの細胞内濃度を正確に決定するために重要であり、非結合ビリルビンの細胞外濃度の決定の確度および精度を改善するためにも重要である。
【００９４】
残念ながら、タンパク質構造および対象のリガンドとの共複合体構造が利用可能であるにもかかわらず、分子理論についての当技術分野の現況は、任意の所望の代謝物特異性および新規の感度を伴うプローブをデザインするのに十分でない。したがって、所望の特異性で結合するだけでなく、また、要求されるシグナルの変化であって、リガンド結合を示すシグナルの変化ももたらす突然変異体のタンパク質プローブを見出すには、膨大な実験が要求されることが典型的である。単一のタンパク質を、そのビリルビンへの結合親和性およびある範囲のさらなる解析物に対する特異性についてスクリーニングする場合であってもなお、タンパク質精製、様々な解析物の結合を測定する方法の開発、および各解析物の結合等温線の測定には莫大な時間が要求される［一般に、蛍光標識を伴わない突然変異体タンパク質は、解析物と結合しても測定可能なシグナルを誘起しないために、突然変異体タンパク質の体系的なハイスループットスクリーニングは不可能である］。タンパク質−解析物間相互作用を特徴づけても、フルオロフォア化学反応およびプローブ蛍光応答の特徴づけのためにさらなる実験が要求される。さらには一般に、解析物−タンパク質間の結合特性は、解析物−プローブ間相互作用の結合特性と異なる。したがって、膨大な実験後にビリルビンに対する所望の結合特異性を有することが見出されるタンパク質を用いて開発されたプローブが、ビリルビンには結合しても、著しい蛍光の変化を発生させない場合もある。必要とされるのは、そうではなくて、結果として得られる何千もの突然変異体プローブを迅速に生成させてスクリーニングする方法である。
【００９５】
参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号、ならびに［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｚｈｕ  Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６３〜１４２７４、２００６］は、プローブをハイスループット生成させるための方法であって、非結合解析物を決定するために高度の特異性を伴うプローブの開発を可能とする方法について記載している。米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号のいずれもが、ビリルビン特異的プローブの開発について記載している。本発明は、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号において記載されるビリルビン法であって、非結合ビリルビンレベルを決定するための確度および精度を改善し、これを異なる測定装置フォーマットにおいて用いることを可能とする技法のきわめて重要な改善に関する。重要なことは、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号において記載されるこれらの先願のビリルビンプローブが、比についてのプローブではなかったことである。本発明は、第１のフルオロフォアが付着している、ビリルビンに高感度なプローブへと付着させていない第２のフルオロフォアを用いることにより、比についてのプローブを生成させる新規の方法に関する。本発明はまた、ビリルビンによる、長波長プローブの驚くべき消光にも関する。加えて、本発明は、ビリルビンおよびＦＦＡｕプローブを固体表面へと付着させ、このような組成物を、マイクロ流体デバイス内およびディスポーザブルの試料カートリッジ内で非結合ビリルビンおよびＦＦＡｕを測定するために用いる方法にも関する。
【００９６】
ビリルビンプローブを用いて、血液試料中の非結合ビリルビンレベルを決定する場合、脂肪酸は、ビリルビンと類似の特性を有する血液中で最も豊富な代謝物である。脂肪酸は、アルブミンへの結合についてビリルビンと競合し、ビリルビンと類似の非結合濃度を示す。ビリルビンプローブは、脂肪酸に対して一般に高アフィニティーを示すｉＬＢＰの突然変異体から出発して開発されている。したがって、ｉＬＢＰムテインプローブからビリルビンプローブを発見する第１のステップは、最大１１の最も豊富な脂肪酸により３００，０００を超えるこのようなプローブをスクリーニングして、脂肪酸に著しくは応答しないプローブを同定することである。１０，０００を超えるこのような脂肪酸不応答体（「不応答体ライブラリー」）が、ΔＲ／ΔＲＡＤＩＦＡＢ２＜０．１（米国特許第７，６０１，５１０号）により同定されている。この定量基準により、これらのプローブの脂肪酸に対するアフィニティーは、一般に、ＡＤ１ＦＡＢ２基準プローブの場合の少なくとも１０分の１であることが示される。これらの不応答プローブを、ビリルビンによりスクリーニングすることにより、潜在的なビリルビンプローブおよび／または鋳型が同定され、これらを新たに同定された鋳型タンパク質をさらに突然変異誘発することにより、新たなムテインプローブライブラリーを生成させるのに用いる。この新たなライブラリーを、脂肪酸およびビリルビンに対する応答についてスクリーニングし、ビリルビンに対する応答性が最も大きく脂肪酸に対する応答性が最も小さいプローブとして同定されるプローブを、ビリルビンプローブとして同定するか、またはさらなるラウンドの突然変異誘発およびスクリーニングに用いることができる。
【００９７】
ビリルビンに対する著しい応答および脂肪酸に対する応答なしから低い応答を含めた有用な特性を有することが、これらの方法により同定されたビリルビンプローブをさらに特徴づける。ＦＦＡに対して著しくは応答しないプローブとは、ＦＦＡへの結合がビリルビンへの結合の１０分の１であることを意味する。ＦＦＡへの結合は、ビリルビンへの結合の１００分の１であることが好ましい。これは、プローブのビリルビンに対する結合アフィニティーおよび蛍光特徴を決定するためのキャリブレーションのほか、脂肪酸との潜在的な競合を同定するために、ビリルビンおよびヒト血清アルブミンを含有する水溶液中の非結合ビリルビンレベルをモニタリングすることも含む。脂肪酸がプローブに結合しても蛍光の変化を発生させない、非応答性プローブが生成する場合もあろう。この場合、血液試料中の脂肪酸は、プローブへの結合についてビリルビンと競合し、これにより、非結合ビリルビンレベルの不正確な決定を結果としてもたらしうるであろう。脂肪酸との競合は、ビリルビンを伴うビリルビンプローブの蛍光応答が、脂肪酸を添加することにより変化するかどうかを決定することにより評価する。
【００９８】
上記の方法により見出されるビリルビンプローブであって、ビリルビンおよびアルブミンを伴う溶液中で正確なビリルビン濃度をもたらし、脂肪酸との検出可能な競合を呈示しないビリルビンプローブを、ヒト血液試料中のさらなる試験について選択する。個別のドナー由来の血漿試料のほか、市販の販売元によりプールされた試料を用いて、ビリルビンプローブが、ヒト血液試料中に一般に存在する本質的に未知のレベルの解析物を有する試料中の正確な血漿中非結合ビリルビン濃度をもたらすかどうかを決定する。これは、各試料中のアルブミン濃度を決定し、ビリルビンを伴う血液試料を滴定して、十分に明確なビリルビン：アルブミン比を得ることにより達成される。次いで、非結合ビリルビン濃度をプローブにより測定し、結果を、ａ）ビリルビン：アルブミン比が同じビリルビン−アルブミン水溶液中で測定される非結合ビリルビン濃度、ｂ）ペルオキシダーゼアッセイ［Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２０：７８３、１９７４］を用いて決定される非結合ビリルビン濃度と比較する。プローブにより決定された血漿中非結合ビリルビン濃度が、ビリルビン−アルブミン溶液中でペルオキシダーゼアッセイにより決定された非結合ビリルビン濃度と同等であれば、非結合ビリルビン以外の血液成分は、プローブの性能に対して検出可能な影響を及ぼさないことが確認される。
【００９９】
米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号の重要な態様は、かつては必要であり、極めて時間のかかった、ビリルビンのタンパク質への結合の特徴づけを省くことが可能となり、プローブ自体だけを特徴づけることである。これは、タンパク質を特徴づけるステップを回避するために重要なだけでなく、また、プローブの特性が、リガンド−タンパク質間結合特徴から予測可能でないことが多いために重要でもある。例えば、異なるタンパク質は、極めて類似の結合アフィニティーを有しうるが、それらの誘導体プローブの蛍光応答は、全く異なりうる。
【０１００】
既に記載されているビリルビンプローブは、主に配列番号３のリシン２７において、アクリロダンだけで標識された（米国特許第７，６０１，５１０号）。さらなるビリルビンプローブは、２つの異なるフルオロフォアである、配列番号３のリシン２７におけるアクリロダンと、一方はアクリロダンによる多重標識化を低減する（米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号）ＫＲ１４（「ＫＲ１４」とは、配列番号３における以下の１４の表面リシン：７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒの、アルギニンへの突然変異を指す略記である）置換を伴わず、他方はＫＲ１４置換を伴う、２つの変化形のＮ末端のＭＧＣＦＤ付加物のシステインにおけるＴｅｘａｓ  Ｒｅｄマレイミドとで標識された。これらのプローブは、ビリルビンに対する良好なアフィニティーおよび応答を示し、ヒト血液試料中の非ビリルビン代謝物により著しくは影響されなかった。しかし、アクリロダンだけのプローブは、重度の新生児高ビリルビン血症における状態である、ビリルビン濃度の高い試料中のビリルビンを媒介する励起内部フィルター効果［Ｂｈｕｔａｎｉ  ＶＫおよびＪｏｈｎｓｏｎ  Ｌ、「Ｔｈｅ  Ｊａｕｎｄｉｃｅｄ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ：  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｒｎｉｃｔｅｒｕｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｐｅｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ、９：１４９〜１５９、２００８］、および血液試料中のヘモグロビンの存在から有害な影響を受ける可能性がある。アクリロダンに加えてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄなど、長波長のフルオロフォアで二重標識されたプローブでは、アクリロダンと第２のフルオロフォアとの間のエネルギー移動のために、アクリロダンの蛍光強度が大きく低減されうる。
【０１０１】
これらの欠陥を克服し、ビリルビンプローブを用いうる測定器の範囲を拡張するために、本発明は、非結合ビリルビンレベルを決定するための新たなプローブおよび新たなアッセイの形態について記載する。ビリルビンにより消光されるフルオロフォアが、単一のシステイン側鎖またはリシン側鎖を標識し、この側鎖の位置が、ビリルビンに結合したときの蛍光の変化を最適化するのに重要であることが見出される、新たなムテインライブラリーを同定した。また、ビリルビンにより消光されるフルオロフォアが、１または複数のシステイン側鎖またはリシン側鎖を標識するが、側鎖のうちの一方の位置が、ビリルビンに結合したときの蛍光の変化を最適化するのに重要であることが見出されるビリルビンプローブも同定される。また、ビリルビンにより消光可能なフルオロフォアであって、フェルスター型のエネルギー移動によるビリルビン消光が生じないとされる長波長で吸収および発光するフルオロフォアも発見される。ビリルビンの結合は、アクリロダン、およびその発光が約３８０ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲で生じる他のフルオロフォアの事実上完全な消光をもたらすが、これは、アクリロダンおよび他のフルオロフォアの発光が、ビリルビンによる吸光と大きく重複することに起因する、高度なフェルスター型のエネルギー移動のために予測されることである。ビリルビンにより、赤外へと広がるフルオロフォアを含めた、極めて長波長のフルオロフォアの蛍光が消光されるという発見（表５および７）は、全く予測外であった。それらの長波長の吸光および蛍光がなされるために、このようなフルオロフォアが、ビリルビンもしくはヘモグロビンの吸光または血液試料中に潜在的に存在する事実上任意の他の発色団の吸光に影響されることはない。
【０１０２】
本明細書で記載される本発明のさらなる実施形態は、タンパク質上の単一のフルオロフォアと、（ａ）溶液中に遊離しているか、（ｂ）ビリルビンに対して応答性でなく、かつ／もしくはビリルビンに結合しない、ポリマーなどの大型の分子へと付着しているか、（ｃ）樹脂もしくはポリマーに包埋されているか、または（ｄ）表面へと直接的または間接的に付着させた第２の異なるフルオロフォアとにより生成する、ビリルビン比プローブを生成させる方法である。このようなプローブは、ビリルビンの、プローブのタンパク質部分への結合に対して、２つの異なる波長において測定される蛍光指数の比の変化で応答する。これはまた、ビリルビンへの結合に応答して蛍光指数比の変化を明示しないプローブを、ビリルビンに対する著しい応答を明示しない、第２のフルオロフォアではあるが、非付着のフルオロフォアを用いることにより、比についてのプローブへと容易に変換することも可能とする。独立の第２のフルオロフォアを用いるプローブである、この種の比についてのプローブは、フルオロフォアの間のエネルギー移動による消光の問題であって、両方のフルオロフォアが、タンパク質などの同じ高分子上に配置される場合に典型的に観察される問題を消滅させる。この消光は、シグナル強度を大きく低減し、これにより、非結合ビリルビン濃度の測定の確度および精度を減殺する。このエネルギー移動の回避は、両方のフルオロフォアを同じプローブ分子へと付着させないことにより達成される。第２のフルオロフォアを同じ小型のタンパク質へと付着させる場合、他の方途では、フルオロフォアを空間的に制限することによりエネルギー移動の回避を達成することが必要となろう。
【０１０３】
また、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズなど、固体基質へと付着させることができ、これらのビーズをディスポーザブルのマイクロ流体デバイスにおいて用いられる表面上に固定化しうる、ビリルビンプローブも記載される。加えて、第２のフルオロフォアを、ビーズに付着させるかまたはこの中に包埋し、これにより、２つのフルオロフォアを分離して、エネルギー移動を消失させ、これにより、ビリルビンの結合に対する比の応答を得ることもできる。代替的に、第２のフルオロフォアを、ビリルビンに対して応答性でなく、かつ／またはビリルビンに結合しない、ｉＬＢＰまたは他の任意のポリマーへと付着させ、このｉＬＢＰまたは他のポリマーを固体基質へと付着させて、２つのフルオロフォアが十分な分離を維持し、エネルギー移動を著しいものでなくすることもできる。
【０１０４】
また、ビリルビンプローブをキャリブレートし、用いるための解析的／数学的方法も記載される。その中の非結合ビリルビン濃度を知ることが所望される試料に対応する温度、ｐＨ、および溶液の組成などの条件下において、ビリルビンプローブをキャリブレートして、ビリルビンに対するそれらの結合アフィニティー（解離定数Ｋｄ）を決定する。結合等温線は、ビリルビン濃度の上昇に応答するビリルビンプローブの蛍光の変化を測定すること（「滴定データ」）により、水性緩衝液中で実施する。各ビリルビン濃度における蛍光応答のセットを、ビリルビン濃度、プローブ濃度、特異的分光光度特徴、およびＫｄの関数としての蛍光応答について適正に記載する適切な式（「校正式」）で適合する。
【０１０５】
一部の実施形態では、ビリルビンによる吸光が、ビリルビンプローブのフルオロフォアの励起波長と重複し、内部フィルターによる吸光が著しいものとなる程度に経路長ｄが十分に長いキュベット内でキャリブレーションを実施する。この場合、励起波長におけるビリルビンによる吸光に起因して、そして、おそらくは発光波長におけるビリルビンによる吸光に起因して、キャリブレーション式を、ビリルビンプローブの滴定データへと適合する前に、フルオロフォアの発光強度を、内部フィルターによる吸光について補正しなければならない。発光強度
【０１０６】
【数５】
2014526055.tif 000009
【０１０７】
を補正するための式は、
【０１０８】
【数６】
2014526055.tif 000010
【０１０９】
［式中、Ｉλｅｍは、波長λｅｍにおいて測定された蛍光発光強度であり、ＢＴは、総ビリルビン濃度であり、ε（λｅｘ）は、励起波長または発光波長（λｅｘ）におけるビリルビンの減衰係数であり、ｄは、キュベット経路長である］
である。式（１）により示される通り、内部フィルター補正は、［Ｂｆ］を決定するためにもまた測定しなければならない総ビリルビン濃度（ＢＴ）について知ることを要求する。
【０１１０】
内部フィルター励起の補正は、単一のフルオロフォアによる、比についてではないビリルビンプローブに重要であり、これについてのキャリブレーション式は、
【０１１１】
【数７】
2014526055.tif 000011
【０１１２】
［式中、Ｉλｅｍは、ブランク（ビリルビンプローブを伴わない試料）の蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、内部フィルターによる吸光が著しい場合は、式（１）による
【０１１３】
【数８】
2014526055.tif 000012
【０１１４】
で、式（２）のＩλｅｍを置き換えなければならず、Ｉ０はビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、ＰＴは総ビリルビンプローブ濃度であり、ＢＴは総ビリルビン濃度である］
である。
【０１１５】
内部フィルター励起の補正は、単一フルオロフォアプローブには重要であるが、２つの波長λ１およびλ２における蛍光発光の比（Ιλ１／Ιλ２）の変化によりビリルビンに応答する、比についてのビリルビンプローブの応答には影響しない。この比またはＲ値は、Ιλ１／Ιλ２と等しい。Ｋｄを決定するための、比についてのプローブによるビリルビン滴定は、以下のキャリブレーション式（３）：
【０１１６】
【数９】
2014526055.tif 000013
【０１１７】
［式中、Ｒは、測定された蛍光比（Ιλ１／Ιλ２）であり、Ｒ０は、ビリルビンの非存在下における（Ιλ１／Ιλ２）比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下におけるプローブの（Ιλ２／Ιλ１）比であり、ＢＴ、ＰＴ、およびＫｄは、式（２）におけるＢＴ、ＰＴ、およびＫｄと同じである］
により十分に記載される。
【０１１８】
遊離ビリルビン濃度（［Ｂｆ］）は、［Ｂｆ］がＨＳＡの結合平衡により緩衝され、したがって、ビリルビンプローブの存在により摂動しない試料中で決定する。以下の式：
【０１１９】
【数１０】
2014526055.tif 000014
【０１２０】
および
【０１２１】
【数１１】
2014526055.tif 000015
【０１２２】
は、単一（４）フルオロフォアプローブおよび比（５）プローブのそれぞれについての式である。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態は、非結合解析物の濃度を決定するのに用いられうる、蛍光タンパク質分子の開発に関する。より詳細に述べると、本発明は、１）参照により本明細書に組み込まれ、これらの方法の改変もまた記載される、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号の方法により生成させたビリルビンプローブの同定、２）臨床医学および基礎科学のためのこのようなプローブの使用、３）異なる体液中の非結合ビリルビン濃度を決定するためのこれらのプローブの例に関する。
【０１２４】
ビリルビンプローブとは、ビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を呈示する１または複数の蛍光分子（（１または複数の）フルオロフォア）の共有結合的付加を介して「標識された」ｉＬＢＰタンパク質である。好ましい実施形態では、プローブが、フルオロフォアが共有結合で付着させた単一のシステインまたは単一の到達可能なリシンを含有する。他の好ましい実施形態では、プローブが、システインへと付着させた１つのフルオロフォアと、ビリルビンに結合するタンパク質上の異なる部位、好ましくは、リシン部位へと付着させた第２のフルオロフォアとを含む。他の好ましい実施形態では、プローブが、システインへと付着させた１つのフルオロフォアと、ビリルビンに結合するタンパク質上の異なる部位、好ましくは、末端のアミノ基へと付着させた第２のフルオロフォアとを含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、好ましくは、システインおよびリシン、またはシステインおよびＮ末端のアミノ基へと付着させた２つの異なるフルオロフォアが用いられる。２つのフルオロフォアのうちの一方が、ビリルビンの結合に対して応答性である、すなわち、ビリルビンがプローブへと結合すると、蛍光指数の変化を顕示する。第２のフルオロフォアは、ビリルビンの結合に対して高感度でありうるが、第２のフルオロフォアがビリルビンの結合に対して応答性であることは必要でない。第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合すると、２つの異なる波長における蛍光比の差が観察されるような基準点をもたらす。第２のフルオロフォアは、ビリルビンの結合に対して反応しない場合もあり、第１のフルオロフォアとは異なる形で反応する場合もある。第２のフルオロフォアは、第１のフルオロフォアと比べて、異なる波長において発光点を有することが好ましい。本発明に従い第２のフルオロフォアとして用いられうる化学的色素の例には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、第２のフルオロフォアはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄである。
【０１２６】
一部の実施形態では、１つのフルオロフォアは、システインまたはリシンまたはＮ末端のアミノ基へと付着し、このフルオロフォアが、ビリルビンの結合に対して応答性である、すなわち、ビリルビンが蛍光標識されたｉＬＢＰムテインへと結合すると、蛍光指数の変化を顕示し、第２のフルオロフォアは、ｉＬＢＰムテインへと化学的ではない形で連結され、ビリルビンのｉＬＢＰムテインへの結合に対して高感度ではない、２つの異なるフルオロフォアが用いられる。第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合すると２つの異なる波長における蛍光比の差が観察されるような基準点をもたらす。一実施形態では、第２のフルオロフォアが、可溶性であり、蛍光標識されたｉＬＢＰムテインの、第２の可溶性フルオロフォアに対する明確な化学量論比で併せて混合される。この混合物は、溶液中で維持することもでき、必要な場合は、乾燥または凍結乾燥させ、次いで、再構成することもできる。この混合物は、２つの異なる波長における蛍光比の差により応答するビリルビンプローブを構成する。この可溶性の第２のフルオロフォアを伴うビリルビンプローブの構成は、第２の長波長フルオロフォアの吸光スペクトルが、第１の短波長フルオロフォアの発光と重複しうるために有利である。両方のフルオロフォアが同じｉＬＢＰタンパク質へと化学的に付着している場合、この構成は、第１のフルオロフォアの蛍光を著しく消光させ、これにより、プローブ応答シグナルの質を減殺しうる。さらなる利点は、第１のフルオロフォアの、第２のフルオロフォアに対する化学量論比が、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアの、ｉＬＢＰムテインとの２つの別個の化学反応に依存する化学量論比の場合より、調節が容易であり、調製が簡便なことである。第２のフルオロフォアは、第１のフルオロフォアと比べて長波長に発光点を有することが好ましい。第１のフルオロフォアとして用いられうる化学的色素の例には、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、または４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従い第２のフルオロフォアとして用いられうる化学的色素の例には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、第１のフルオロフォアが、システインまたはリシンにおいて標識されたアクリロダンであり、第２のフルオロフォアが、ローダミンＢである。
【０１２７】
代替的に、タンパク質を、高アフィニティーで固体支持体に結合するように「タグづけ」することもできる。これには、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープもしくはｃ−ｍｙｃエピトープもしくはＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、または６×Ｈｉｓタグなどの金属アフィニティータグによるタグづけが含まれるが、これらに限定されない。アフィニティータグを固体支持体材料と特異的に会合させることにより、マルチウェルプレートおよびマイクロ流体デバイスが含まれるが、これらに限定されない平坦な表面構成における非結合ビリルビンの測定が容易となる。それらを固体支持体へと付着させることにより、プローブを、制限された有効な二次元領域内に濃縮することができる。これにより、有効な二次元領域へと閉じ込められたプローブ間の流動が可能となった試料溶液の薄層内での非結合ビリルビンの測定が可能となる。これは、ビリルビンおよびヘモグロビンに起因する吸光を低減し、全血中の測定を容易とする、前面における蛍光測定を有効に可能とする。この構成はまた、二次元領域へと閉じ込められたプローブ間で試料を連続的に流動させることにより、反復的であるか、試料を洗浄用ボーラスと交互に流過させるか、または連続的な非結合ビリルビンの測定の可能性ももたらす。例えば、表８で示される通り、（１または複数の）アフィニティータグを、ＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端に融合させることもでき、両方の末端に同時に融合させることもできる。好ましい実施形態では、６×ヒスチジンタグを、タンパク質のビリルビン結合特性を著しく変化させることなく、ＦＡＢＰのＮＨ２末端もしくはＣＯＯＨ末端に融合させるか、または両方の末端に同時に融合させた。好ましい実施形態では、融合ペプチドが、プローブのＣＯＯＨ末端における２つの隔てられたヒスチジン領域からなる。好ましい実施形態ではまた、プローブが、鉄のコアを伴うかまたは伴わないＮｉ−ポリスチレンビーズが含まれるがこれらに限定されない固体支持体上に固定化される。鉄のコアは、マルチウェルプレート、マイクロ流体グローブ、または有効な二次元領域からの蛍光測定と適合する他のデバイスの有効な二次元領域内でプローブビーズを磁気的に濃縮することを容易とする。
【０１２８】
一部の実施形態では、ビリルビンプローブ固体支持体上の固定化タンパク質が、同じ波長において励起されるが、２つの異なる波長において発光する、異なるフルオロフォアで標識された２つのタンパク質の組合せである。２つのタンパク質のうちの一方が、ビリルビンの結合に対して応答性である、すなわち、２つのタンパク質のうちの一方が、ビリルビンがタンパク質へと結合すると蛍光指数の変化を顕示する。異なるフルオロフォアで標識された第２のタンパク質は、ビリルビンの結合に対して高感度でありうるが、第２のタンパク質がビリルビンの結合に対して応答性であることは必要でない。第２のタンパク質のフルオロフォアは、ビリルビンに結合すると２つの異なる波長における蛍光比の差が観察されるような基準点をもたらす。好ましい実施形態では、第１のビリルビンに高感度なタンパク質を、７００ＤＸで標識し、第２のビリルビンに低感度なタンパク質を、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ色素またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素で標識する。
【０１２９】
プローブの使用
本発明の好ましい実施形態では、非結合ビリルビンを決定するために用いられる試料が、ヒト、動物または植物に由来する体液試料である。体液は、全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパであることが好ましい。他の実施形態では、プローブを、細胞へと、微量注入もしくは他の形でトランスフェクトすることにより、非結合ビリルビンの決定を、細胞の細胞質内で実施するか、または細胞の細胞外媒体内で実施する。
【０１３０】
非結合ビリルビンの正常範囲は健常者の集団から決定し、この正常範囲からの逸脱は疾患を示しうる。
【０１３１】
式１〜５を用いて、［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｚｈｕ  Ｂ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｈｅｇｙｉ  Ｔ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｂｏｕｎｄ  Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５８：８６９〜８７６、２０１２］において記載される通りに［Ｂｆ］を測定するために、非結合ビリルビンプローブを、キャリブレートして用いる。
【０１３２】
非結合ビリルビンプローブは、過剰なビリルビンを消失させる肝機能が不十分な新生児のうちの６０％など、ビリルビンを媒介する毒性に対する危険性がある患者における［Ｂｆ］を測定するために用いる［Ｍａｉｓｅｌｓ  ＭＪおよびＭｃＤｏｎａｇｈ  ＡＦ、「Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５８：９２０〜９２８、２００８］。
【０１３３】
非結合ビリルビンプローブは、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者のほか、未熟新生児において一般であり、ＦＦＡレベルを上昇させる敗血症など、ビリルビンのアルブミンに対する結合アフィニティーを低下させることにより［Ｂｆ］を増大させうる疾患を伴う患者における［Ｂｆ］を測定するために用いる［Ｎｏｇｕｅｉｒａ  ＡＣ、Ｋａｗａｂａｔａ  Ｖ、Ｂｉｓｅｌｌｉ  Ｐ、Ｌｉｎｓ  ＭＨ、Ｖａｌｅｒｉ  Ｃ、Ｓｅｃｋｌｅｒ  Ｍ、Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｗ、Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＧ、Ｂｅｒｎｉｋ  ＭＭ、ｄｅ  Ａｎｄｒａｄｅ  Ｍａｃｈａｄｏ  ＪＢ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＭＢ、Ｌｏｔｕｆｏ  ＰＡ、Ｃａｌｄｉｎｉ  ＥＧ、Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｅ、Ｃｕｒｉ  Ｒ、およびＳｏｒｉａｎｏ  ＦＧ、「Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｒａｔｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ」、Ｓｈｏｃｋ、２９：３４２〜３４８、２００８］。
【０１３４】
非結合ビリルビンプローブは、ビリルビン毒性を軽減するようにデザインされた光線療法、輸血または他の療法を施されている患者における［Ｂｆ］を測定するために用いる。
【０１３５】
総ビリルビンではなくて非結合ビリルビンが毒性であるために、光線療法時における総ビリルビンではなくて非結合ビリルビンをモニタリングして、非結合ビリルビンが著しく減少することを確認すべきである。総ビリルビンは、ＦＦＡなど、ビリルビン置換分子の存在下において、光線療法に応答して減少することが示されているが、総ビリルビンと非結合ビリルビンとは、ほとんど完全に切り離すことができる。これらの条件下において、総ビリルビンが事実上完全に破壊されれば、非結合ビリルビンレベルを、非毒性と考えられるレベルまで低下させることが要求されるであろう。したがって、積極的療法についてもなお、現在達成されているレベルよりはるかに低い総ビリルビンレベルが要求されるであろう。さらに、ペルオキシダーゼアッセイは、この試験では、光分解生成物（および抱合型ビリルビン）と「天然の」非抱合型ＩＸ−ａ異性体とが識別されないために、光線療法時における非結合ビリルビンをモニタリングするのに用いることができない。これに対し、本出願において記載されるプローブにより測定される非結合ビリルビンは、天然の非抱合型ＩＸ−ａに特異的である。
【０１３６】
非結合ビリルビンを決定するために現在用いられる唯一の方法は、西洋ワサビペルオキシダーゼによるビリルビンの酸化に基づく［Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２０：７８３、１９７４］。ペルオキシダーゼアッセイの実装は、ＦＤＡで承認された測定器（株式会社アローズ、大阪府、日本）を用いて実現可能である。黄疸に罹った新生児の一般的なスクリーニングのためのこの方法の採用は、正確な非結合ビリルビンの決定を複雑化させる、アローズ法に伴う問題のために限定されている［Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７９：１３０〜１３５、２０００；Ａｈｌｆｏｒｓ  ＣＥ、Ｖｒｅｍａｎ  ＨＪ、Ｗｏｎｇ  ＲＪ、Ｂｅｎｄｅｒ  ＧＪ、Ｏｈ  Ｗ、Ｍｏｒｒｉｓ  ＢＨおよびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＤＫ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ，  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、４０：２６１〜２６７、２００７］。最も重要なことは、アローズ法を用いて平衡非結合ビリルビン濃度を決定するには、複数の比較的大きな試料容量の測定が要求され、干渉物質および試料希釈率についての補正が必要とされることである。
【０１３７】
本発明の実施形態は、非結合ビリルビンを測定するための新たな方法であって、ペルオキシダーゼ−アローズ法の欠点を克服する方法を提供する。この新たな方法では、平衡非結合ビリルビン濃度の直接的なモニタリングを可能とする、蛍光標識された脂肪酸結合タンパク質（非結合ビリルビンプローブ）を用いる。プローブは、非抱合型ビリルビンに特異的であり、ビリルビンに高アフィニティーで結合する。さらに、非結合ビリルビンプローブは、非結合ビリルビンに高度に特異的であり、血液中に存在する遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、他の代謝物、および薬物に有意には応答または結合しない。非結合ビリルビンプローブを用いて、新生児を含め、黄疸に罹った患者における非結合ビリルビンレベルを決定し、潜在的なビリルビンの神経毒性を診断し、これにより、処置を正確に方向付けて、このような毒性の帰結を防止する。
【実施例】
【０１３８】
以下の定義は、配列番号３と関連する
「ＫＲ６」とは、以下の６つの表面リシン：７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１３０Ｒのアルギニンへの突然変異を指す
「ＫＲ１４」とは、以下の１４の表面リシン：７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、１３０Ｒのアルギニンへの突然変異を指す
「ＭＧＩ」とは、野生型のＮＨ２末端配列であるＭＡＦＤからＭＧＩＦＤへの突然変異を指す。いずれの場合も、細胞によりＮ末端のメチオニンが除去されて、成熟タンパク質が生成する
「ＭＧＣＦＤ」とは、野生型のＮＨ２末端配列であるＭＡＦＤからＭＧＣＦＤへの突然変異を指す。いずれの場合も、細胞によりＮ末端のメチオニンが除去されて、成熟タンパク質が生成する
「ＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤ」とは、野生型のＮＨ２末端配列であるＭＡＦＤからＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤへの突然変異を指す。いずれの場合も、細胞によりＮ末端のメチオニンが除去されて、成熟タンパク質が生成する。
【０１３９】
例１：Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７
ビリルビンプローブは、非結合ＦＦＡ（ＦＦＡｕ）プローブについて、ＵＳ７，６０１，５１０、米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号、および［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｚｈｕ  Ｂ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｈｅｇｙｉ  Ｔ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｂｏｕｎｄ  Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５８：８６９〜８７６、２０１２；  Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｚｈｕ  Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６３〜１４２７４、２００６］において既に記載される通り、ラット腸型脂肪酸結合タンパク質（ｒＩ−ＦＡＢＰ）に由来する。まず、コンビナトリアル突然変異誘発を用いて、突然変異体プローブを生成させ、ＦＦＡｕに対する応答についてスクリーニングする。これらのプローブのうち、約１０％は、ＦＦＡｕに対して著しく応答せず、それらの非抱合型ビリルビンに対する応答についてさらにスクリーニングされる。このスクリーニングからのヒットを、非結合ビリルビンに対するアフィニティーおよび選択性を増大させるさらなる突然変異誘発について選択する。これらの方法の結果による例は、アクリロダンで標識され、配列番号３と関連する（ｗｈｉｃｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ）、Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７であり、突然変異：１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１５Ｒ、および１１７Ｄを有する（表５）。ｐＨ９．３におけるアクリロダン反応は、主にＫ２７側鎖において、Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７を標識する。Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７を、２２℃で、水性ビリルビンによりキャリブレートし、式（５）に適合することにより、飽和に近いビリルビン濃度で、２２ｎＭのＫｄおよび事実上完全な消光（残存画分強度（Ｑｓ）＝０．００４２）をもたらした（図１Ａ）。Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に対して応答性ではない。ビリルビンの存在下または非存在下においてＬ２４Ｐ１９Ｃ７を非結合オレイン酸で滴定しても、その蛍光またはこれと等価の非結合ビリルビン濃度の変化はもたらされない（図１Ｂ）。図１Ｂにおける非結合オレイン酸（ヒト血漿中で最も豊富なＦＦＡ）のＦＦＡ濃度は、ヒト血漿中濃度の１０倍超である。そのＦＦＡに対する応答の欠如に加えて、Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７はまた、ヒト血漿中に存在する他の代謝物に対しても応答性でない。ビリルビンでスパイクした６例の異なる成人血漿試料における非結合ビリルビンの測定は、ビリルビンの非存在下における非結合濃度が１ｎＭ未満であり、非結合ビリルビンの増大がビリルビンと血清アルブミンとの平衡について予測される挙動に従うことを裏付ける。
【０１４０】
例２：Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７−ＸＣ
単一のシステインが２２位と３０位との間の側鎖位置において置換されたＬ２４Ｐ１９Ｃ７の突然変異体を合成して、安定で本質的に固有なアクリロダン標識部位を伴うプローブを生成させ、ビリルビンのプローブとの相互作用を最適化した（図２）。結果は、ビリルビン結合についてのＫｄが、１９〜８９ｎＭの範囲にわたり、アクリロダン蛍光の消光度（Ｑｓ）が、約１．７〜６％の範囲にわたることを裏付ける。２５位または２６位におけるシステインにより、最適のプローブ性能が得られた。これは、プローブ性能の調整には、その基礎構造が同定された後で、最小限の実験が要求されることを裏付ける。
【０１４１】
例３：ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１
【０１４２】
【表１】
2014526055.tif 000016
【０１４３】
ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１とは、単一のフルオロフォア（この場合は、１４の表面リシン（ＫＲ１４）、２７位におけるリシン、および、Ｌ２４Ｐ１９Ｃと比べて、１０６位におけるシステインを除去することにより、２５位におけるアクリロダン）だけで標識されたビリルビンプローブである。したがって、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、配列番号３と比べて、構造：ＭＧＩ−ＫＲ１４−１４Ｒ  １８Ｌ  ２５Ｃ  ２７Ａ  ３８Ｖ  ６０Ｒ  ７３Ｆ  １０６Ｌ  １１５Ｒ  １１７Ｄを有する。固有で単一の蛍光標識を保有することに加えて、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、プローブのビリルビン飽和時において、ビリルビンに対して例外的に大きなアフィニティー（Ｋｄ＝１６ｎＭ）を有し、アクリロダン蛍光の事実上完全な消光を明示する（Ｑｓ＝０．００６）（図３）。ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、脂肪酸に対する応答を事実上示さず、最も豊富なＦＦＡに対するＫｄは、３〜７５μＭの範囲である（表１）。Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７と同様にまた、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１も、ヒト血漿中でビリルビンだけを検出し、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１により決定される［Ｂｆ］は、ビリルビンをスパイクした血漿におけるビリルビン−アルブミン平衡から予測されるばらつきと符合する（例えば、図５を参照されたい）。
【０１４４】
例４：ビリルビンの比についてのプローブであるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈおよびＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ
ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、総ビリルビンが低い試料について、ヒト血液試料を含めた水溶液中の正確な［Ｂｆ］値を提供する。しかし、総ビリルビン濃度が上昇するにつれ、励起時および発光時におけるビリルビンに起因する内部フィルターによる吸光は著しく増大する可能性があり（式（１））、したがって、総ビリルビン濃度および吸光の幾何学的配置（式（１）における「ｄ」）について正確に知らなければ、見かけの［Ｂｆ］に大きな誤差が生じうる。この不確実性の源泉を克服し、総ビリルビン濃度を決定する必要を消失させるため、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１などの単一波長によるプローブの比の形態を用いる。これは、単一波長によるプローブと同じ波長で励起され、その発光が単一波長によるプローブとは異なる波長においてなされる第２のフルオロフォアを添加することにより達成される。アクリロダンで標識されたＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１では、適切な水溶性フルオロフォアが、アクリロダンと同様の波長、例えば、３７５ｎｍで励起され、その発光が、アクリロダンより著しく長いローダミンＢであり、ローダミンは５７５ｎｍで蛍光発光し、５２５ｎｍにおけるアクリロダン蛍光への寄与が無視できる程度である。したがって、Ｉ５２５／Ｉ５７５の強度比の測定を用いて、［Ｂｆ］を決定する（式（５））。励起時における、ビリルビンに起因する内部フィルターによる吸光は、アクリロダンおよびローダミンＢについて同じであり、Ｉ５２５およびＩ５７５の強度は、常に比として現れるために、ビリルビンによる吸光が、経路長「ｄ」を十分に低減することによりほとんど常に達成されうる十分な透過を可能とする限りにおいて、励起時における内部フィルターによる吸光は、［Ｂｆ］の測定に影響しない。励起時における、ビリルビンに起因する内部フィルターによる吸光を消失させることに加えて、５２５および５７５ｎｍにおける強度比の測定により、発光時における、ヘモグロビンおよびビリルビンに起因する内部フィルターによる吸光も有効に消滅する。この種の比についてのプローブは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１を、ローダミンＢと、明確な分子比で併せて混合し、次いで、混合物を、−２０℃以下で保管するために凍結乾燥させることにより調製するか、または調製し、４℃において溶液として保管する。いずれの場合にも、ビリルビンの非存在下における蛍光比であるＲ０を決定することにより、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１／ローダミンＢ分子比が正確に決定される。ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈプローブのキャリブレーションは、総ビリルビンを上昇させるときのＩ５２５／Ｉ５７５比を測定することにより実行する。滴定曲線の式（３）による適合を用いてＫｄを決定し、図４に示される結果により、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈプローブのＫｄ（１６ｎＭ）が、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１のＫｄと同一であることが裏付けられる通り、ローダミンの存在が、ビリルビン−プローブ間相互作用に対して影響を及ぼさないことが示される。
【０１４５】
比についてのプローブはまた、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１を、明確な量のＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）で標識されたデキストラン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄ−３３２９）と併せて混合することによっても生成させた。新たな比についてのプローブをキャリブレートし、凍結乾燥させ（図９）、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で再懸濁させた後でもキャリブレートした。キャリブレーションは、総ビリルビンを上昇させるときのＩ５２５／Ｉ６１５比を測定することにより実行した。図９で観察される通り、比についてのＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン  Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄプローブのＫｄは１６ｎＭであり、これは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１およびＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈのＫｄと同じである。したがって、第２のフルオロフォアは、溶液中に遊離させる（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈ）こともでき、プローブ−ビリルビン間相互作用を著しく変化させることなく、大型の不活性ポリマーへと付着させる（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）こともできる。
【０１４６】
ビリルビンプローブと抱合型ビリルビンの潜在的な干渉は、ジタウロビリルビンのＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈに対する結合アフィニティーを測定することにより推定した。測定は、ジタウロビリルビンの濃度を上昇させるときに滴定されるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈの蛍光応答の変化を測定することにより実施した。Ｒ値は、全ての濃度について計算し、結合等温線を式（３）で適合して、ジタウロビリルビンのＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈへの結合について３０１±９ナノモル／ＬのＫｄを得た（図５）。
【０１４７】
光退色（光酸化および／または光異性化）の、ビリルビンプローブを用いるＢｆの決定に対する影響を、回数を増大させる４６０ｎｍの光へと曝露されたビリルビン溶液由来の試料中のＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈでＢｆを測定することにより評価した。Ｂｆ値は、式（６）を用いて決定した。総ビリルビン濃度（ＢＴ）は、式（６）により測定されたＲ値を用いて計算した。
【０１４８】
【数１２】
2014526055.tif 000017
【０１４９】
結果は、Ｂｆが７８％低下し（図６）、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈが、光酸化生成物またはより豊富な光異性化生成物に対してほとんどまたは全く感度を有さないことを示す。
【０１５０】
例５：ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈによる、ビリルビンをスパイクしたヒト血漿中の［Ｂｆ］の測定
プールされたヒト血漿（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であって、［アルブミン］が６２０μＭであるヒト血漿を、ビリルビンでスパイクして、ビリルビン／アルブミン比を約０〜０．９とする血漿試料を作製した。［Ｂｆ］の測定は、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１−Ｒｈを、１０×１０ｍｍのキュベットを用いるＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３（ＪＹ  Ｈｏｒｉｂａ）内、または発光フィルターを、３２５および３８０ｎｍを中心とするフィルターで置きかえることにより、非結合ビリルビンを測定するために改変されたＦＦＡｕ  Ｍｅｔｅｒ（ＦＦＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）内で用いて実行した。［Ｂｆ］の測定はまた、同じ試料に対して、ＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ［Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ  ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２０：  ７８３、１９７４］のペルオキシダーゼ法を用いても実施した。結果は、３回の測定全てについて事実上同一の結果を示し、ビリルビンの単一のヒトアルブミン部位への結合について、Ｋｄ＝２０ｎＭで、測定される結果と予測される結果との良好な一致を示す（図７）。これらの結果は、ビリルビンプローブの応答が、ビリルビンとの相互作用に完全に起因し、ビリルビンプローブが、ヒト血液試料中に存在する他の代謝物に対して応答性ではないことを裏付ける。さらにまた、ペルオキシダーゼ法およびビリルビン−アルブミン平衡の予測との一致も、プローブが、正確な非結合ビリルビン濃度をもたらすことを裏付ける。
【０１５１】
例６：ビーズの標識化の例、ならびに解離およびＢｆ測定に対する影響
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０およびＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸによる標識化を最適化し、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するために、ビリルビンプローブの突然変異体を生成させた。突然変異体は、血漿ビリルビンアッセイまたは全血ビリルビンアッセイによる使用に適する蛍光色素による標識化のために、ビリルビンプローブであるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１から誘導した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０色素を、多様な標識化位置において単一のシステインを含有する突然変異体について調べたところ、２５Ｃ位における標識化が、ビリルビンに結合すると、最大の蛍光の消光（約４０％）を呈示した。プローブをポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するために、２５Ｃ位におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０色素と反対側に単一反応性または多重反応性のリシン残基を伴う突然変異体を開発した（表６）。好ましい実施形態では、ＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸ（Ｌｌ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、多様な標識化位置において単一のリシンを含有する突然変異体を標識したところ、２５Ｋ位における標識化が、ビリルビンに結合すると、最大の蛍光の消光（≧６０％）を呈示した（表６）。プローブをポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するために、２５Ｋ位におけるＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸ色素と反対側に単一反応性または多重反応性のシステイン残基を伴う突然変異体を開発した。ＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸで標識されたビリルビンプローブを、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するための２つのアフィニティーベースの方法である、二重ＨｉｓタグおよびＰＳタグ（ポリスチレン結合ペプチド）を用いて、固定化のためのさらなる改善を達成した（表８）。Ｃ末端の二重Ｈｉｓタグを１１アミノ酸残基（ＳＲＡＷＲHＰＱＦＧＧ）からなるリンカーで隔てた突然変異体（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘ）は、Ｎｉ共役ＤｙｎａポリスチレンビーズまたはＮｉ共役Ｄｙｎａラテックスビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する結合アフィニティーが高く、ビリルビンによる消光が許容可能である（約５０％）ことが見出された。また、そのＣ末端のＨｉｓタグの直後にＰＳタグ（ＰＳ１９−１、ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰ）を伴う別の突然変異体（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿ＰＳ１９）も、単一のＨｉｓタグを伴う鋳型（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ）より高いアフィニティーを示した。ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズに高アフィニティーで結合するプローブをもたらした他のＰＳタグには、ＰＳ１９−６Ｌ（ＲＬＬＬＲＲＬＲＲ）およびＰＳ１９−６Ｉ（ＲＩＩＩＲＲＩＲＲ）が含まれた（表８）。さらに、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿ＰＳ１９プローブは、おそらく、さらなるＰＳタグが存在するために、遊離溶液中およびビーズ上の両方において最も高度な（＞６０％）ビリルビン消光を呈示した。いずれのプローブからも、標準的な蛍光光度計による消光曲線と同様のビリルビン消光曲線が作成された。
【０１５２】
より好ましい実施形態では、ビリルビン突然変異体プローブを、ＬＩ−ＣＯＲ  ７００ＤＸで標識されたＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘ鋳型に基づくリンカーライブラリーを構築およびスクリーニングすることにより生成させた（表８）。新たな突然変異体プローブは、タンパク質の発現が高度であり、多重標識化を伴わず、Ｎ末端におけるアミンの標識化をほとんどまたは全く伴わず、プローブ収率が高く、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズに対するアフィニティーが高い。例えば（表４）、ＰＳ１９プローブのうちの約１２％は、［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｚｈｕ  Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：  １４２６３〜１４２７４、２００６］において記載される場合など、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で６０分間にわたるインキュベーション後において、ビーズから解離する。この解離したプローブは、総蛍光強度のうちの約６０％を占める（表４）。Ｃ２ＸＦＦＡ３Ｐ１Ｈ１１プローブは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋと第１のＨｉｓタグとの間に挿入された固有の３アミノ酸のリンカー（ＡＡＳ）を有し、第１のＨｉｓタグと第２のＨｉｓタグとの間の新規の１１アミノ酸（ＳＨＲＡＴＰＮＴＳＰＨ）のリンカーでＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘ内の元のリンカーを置きかえた。両方のクローンを調べたところ、ＰＳ１９およびＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘを上回る著しい改善が示された（表２〜４）。いずれの突然変異体も、それらを大スケールのプローブ作製および商品化に理想的な選択肢とする以下の特性を有する：タンパク質発現収率の高さ；７００ＤＸによるＮ末端のアミンに対する反応性または結合可能性の低さ；標識化後にＥＤＴＡによりＮｉビーズから溶出するプローブの収率の約１００％という高さ；ＰＳ１９と同等であるかまたはこれより良好なビリルビンによる消光の高度さ；プローブのビリルビンによる７００ＤＸの蛍光の消光が、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化されたプローブについて、遊離溶液中のプローブの場合と同じであること；ビーズに対するアフィニティーがＰＳ−１９ならびに固有のリンカーおよびスペーサーの１０倍（遊離プローブによる強度の約５％に対して約６０％）であること。
【０１５３】
Ｎｉ共役ＤｙｎａポリスチレンビーズまたはＮｉ共役Ｄｙｎａラテックスビーズ上に固定化されたＣ２ＸＦＦＡ３Ｈ１１、Ｃ２ＸＦＦＡ３Ｂ３、およびＰＳ１９についてのタイムコースを２つの異なる日に実行し、これらを表２〜４に示すが、ここで、ビリルビンによるＬｉＣｏｒ  ７００ＤＸの蛍光の消光は、総ビリルビン／アルブミンを約０．９とするビリルビン−アルブミン複合体に媒介された。
【０１５４】
【表２】
2014526055.tif 000018
【０１５５】
【表３】
2014526055.tif 000019
【０１５６】
【表４】
2014526055.tif 000020
【０１５７】
例７：ディスポーザブルカートリッジ内の、固定化されたビリルビンプローブをスパイクした血漿の測定
ＬｉＣｏｒ  ＤＸ７００で標識されたＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋであり、６×Ｈｉｓタグに加えて、Ｃ末端においてＰＳタグであるＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰを有するプローブであるＰＳ１９−１（表８）を、Ｎｉ−アガロースビーズ上に固定化した。これらの標識されたビーズを、蛍光分析測定のためにデザインされた、マイクロチャネル型のディスポーザブルカートリッジセットの「ウェル」内に固定化した。ビリルビンをスパイクした成人ヒト血漿試料であって、２０μＬの希釈されていない試料を、カートリッジへと添加し、非結合ビリルビンによるＤＸ７００蛍光の消光を、［Ｂｆ］値が上昇した試料について決定した。これらの測定を用いて、固定化されたＰＳ１９−１のＫｄを決定し、このようなカートリッジにおけるビリルビンプローブの再現性を評価した。これらの測定から決定されたＫｄが、遊離ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈプローブから得られる値と符合する（図８）ことから、固定化が、プローブとビリルビン−アルブミン間相互作用との平衡には影響しないことが示される。さらに、調製後２カ月間超にわたり保管されたカートリッジを用いても、事実上同じ結果が得られた。
【０１５８】
例８：単一のシステインプローブ
【０１５９】
【表５−１】
2014526055.tif 000021
【０１６０】
【表５−２】
2014526055.tif 000022
【０１６１】
例９：蛍光標識された単一のリシンプローブ
【０１６２】
【表６−１】
2014526055.tif 000023
【０１６３】
【表６−２】
2014526055.tif 000024
【０１６４】
例１０：２つのフルオロフォアビリルビンプローブ
【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
例１１：固定化ビリルビンプローブ
【０１６７】
【表８−１】
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【０１６８】
【表８−２】
2014526055.tif 000027
【０１６９】
例１２
非結合ビリルビンおよび非結合ＦＦＡの測定は、生誕時体重が極度に軽い（＜２０００ｇ）新生児であって、３〜３．５ｇ／ｋｇ／日の脂肪エマルジョン（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標））で処置された新生児５例から得られた、そうでなければ廃棄される血液試料中で実施した。非結合ビリルビンの測定は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で２５倍に希釈された血漿試料中で、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈを用いて実施した。ＦＦＡｕ濃度は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で５０倍に希釈された血漿中で決定した。測定は、［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｚｈｕ  Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：  １４２６３〜１４２７４、２００６］において記載される通りに実施した。蛍光強度は、ＦＦＡｕについては、［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｚｈｕ  Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：  １４２６３〜１４２７４、２００６］において記載される通りに、ＦＦＡｕ  Ｍｅｔｅｒを用いて測定し、Ｂｆ用には、５２５および５７５ｎｍにおける発光用に改変された同じＦＦＡｕ  Ｍｅｔｅｒを用いて測定した。非結合ビリルビン濃度は、式（６）を用いて、５２５／５７５ｎｍにおける蛍光比から決定した。非結合ＦＦＡは、ＡＤＩＦＡＢ２を、Ｃａｎｔｏｒら［Ｃａｎｔｏｒ  ＷＪ、Ｈｏｅ  Ｋｉｍ  Ｈ、Ｊｏｌｌｙ  Ｓ、Ｍｏｅ  Ｇ、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ＪＭ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ａ、Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、およびＦｉｔｃｈｅｔｔ  Ｄ、「Ｂ−Ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｕｎｂｏｕｎｄ  Ｆｒｅｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｌｅｖｅｌｓ  ａｆｔｅｒ  Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２０：  １８６〜１８８、２００８］において記載される通りに用いて実施した。［Ｒｉｃｈｉｅｒｉ，  ＧおよびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ，  ＡＭ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３６：  ２２９〜２４０、１９９５］の手法を用いて、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の注入について、ＦＦＡｕ種の分布を推定した。
【０１７０】
【表９】
2014526055.tif 000028
【０１７１】
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）は、総ＦＦＡを増大させ、これにより、非結合ビリルビンを増大させうることが知られているが、例１２の結果は、非結合ＦＦＡ（ＦＦＡｕ）が、総ＦＦＡよりはるかに大きな倍数で増大しうることを裏付ける。総ＦＦＡのアルブミンに対する比は、直線的に増大する（Ａｍｉｎの研究では約１０倍［Ａｍｉｎ  ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ、３４：  ４１４〜４２０、２０１０］）が、ＦＦＡのアルブミンに対する比が１０００倍を超えて大きいときには、ＦＦＡｕが本質的に指数関数的に増大する（表９）ために、この結果が得られる。例１２では、患者のうちの２例のＦＦＡｕのレベルが６００および１２００ｎＭであるのに対し、正常レベルは、１〜２ｎＭである［Ａｐｐｌｅ  ＦＳ、Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、およびＡｄａｍｓ  ＪＥ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ  Ｆｒｅｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  Ａｒｅ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１：  ４１〜４４、２００４］。６００ｎＭよりはるかに低いレベルであってもなお、多くの研究により、心毒性、免疫反応の遮断のほか、多くの細胞機能に対する有害作用を含め、ＦＦＡ（またはＦＦＡｕ）の毒性作用が裏付けられている［Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭおよびＯｋａｄａ  Ｃ、「Ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ」、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、４６：  １９８３〜１９９０、２００５；  Ｏｌｉｖｅｒ  ＭＦ、「Ｓｕｄｄｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅａｔｈ：  ｔｈｅ  ｌｏｓｔ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ」、ＱＪＭ、９９、７０１〜７０９、２００６］。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）注入時においてＦＦＡｕレベルをモニタリングすることによるだけで、ＦＦＡｕ毒性の危険性がある乳児を同定しうる。
【０１７２】
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）から生成する主要な（＞７５％）ＦＦＡ種は、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびリノレン酸のＦＦＡである。ＡＤＩＦＡＢ２は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）が１．５〜５．５％の間でだけ含有するステアリン酸に最も特異的であるために、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびリノレン酸のＦＦＡに対して特異的なＦＦＡｕプローブによれば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の加水分解に起因する血漿中のＦＦＡｕの上昇が、より正確かつ高感度に検出されるであろう。このようなＦＦＡｕプローブが、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号、ならびに［Ｈｕｂｅｒ  ＡＨ、Ｋａｍｐｆ  ＪＰ、Ｋｗａｎ  Ｔ、Ｚｈｕ  Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ  ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：  １４２６３〜１４２７４、２００６］において記載されている方法を用いて作製されている（表１０）。高感度なＦＦＡｕプローブは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の滴定早期における患者のＦＦＡｕレベルの上昇を検出する（これは、非結合ビリルビンおよびＦＦＡｕが毒性レベルに達することを防止するためにきわめて重要である）のに必要である。
【０１７３】
【表１０】
2014526055.tif 000029
【０１７４】
当業者により、本発明の精神から逸脱しない限りにおいて、多数で多様な改変を施しうることが理解されるであろう。したがって、本発明の形態は、例示的なものであるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを明確に理解されたい。
【図１】
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【図２】
2014526055.tif 000038
【図３】
2014526055.tif 000039
【図４】
2014526055.tif 000040
【図５】
2014526055.tif 000041
【図６】
2014526055.tif 000042
【図７】
2014526055.tif 000043
【図８】
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【図９】
2014526055.tif 000045
【配列表】
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【国際調査報告】
2014526055.tif 000046
2014526055.tif 000047
2014526055.tif 000048
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