(57)【要約】遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のレプリコンが提供される。これらのレプリコンは、インビトロにおいて複製するＨＣＶの能力を引き出す適応変異を含む。遺伝子型４レプリコンを調製する方法、および抗ウイルス剤をスクリーニングするためにこれらのレプリコンを用いる方法もまた提供される。一実施形態において、遺伝子型４のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、上記の実施形態のいずれかにおける細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下または上記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法もさらに提供される。
2014522647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞で複製することができる遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物であって、該ＲＮＡ配列が５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂの１つまたは複数をコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む、構築物。
【請求項２】
請求項１に記載のＲＮＡ構築物であって、該ＲＮＡの野生型と比較して、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂに適応変異を含む、請求項１に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３】
前記変異が２２０４位でのイソロイシンを含む、請求項２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項４】
前記変異が、ＮＳ３において、残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項５】
前記変異が、ＮＳ４Ａにおいて、残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項６】
前記変異が、ＮＳ５Ａにおいて、残基１７９でのプロリンを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項７】
ＮＳ３において少なくとも１つの適応変異、およびＮＳ４Ａにおいて少なくとも１つの適応変異を含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項８】
ＮＳ３において少なくとも１つの適応変異、およびＮＳ５Ａにおいて少なくとも１つの適応変異を含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項９】
ＮＳ４Ａにおいて少なくとも１つの適応変異、およびＮＳ５Ａにおいて少なくとも１つの適応変異を含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１０】
ＮＳ３において少なくとも１つの適応変異、ＮＳ４Ａにおいて少なくとも１つの適応変異、およびＮＳ５Ａにおいて少なくとも１つの適応変異を含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１１】
前記遺伝子型４のＨＣＶが遺伝子型４ａのＨＣＶである、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１２】
選択のためのマーカー遺伝子をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１３】
前記マーカー遺伝子がネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項１２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１４】
レポーター遺伝子をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１５】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１４に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１６】
５’から３’方向に、前記５’ＮＴＲと、前記ＩＲＥＳと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、前記３’ＮＴＲとを含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１７】
Ｃ、Ｅ１またはＥ２の１つまたは複数をコードする配列をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項１８】
先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物に転写され得る一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子。
【請求項２０】
請求項１から１７のいずれかに記載のＲＮＡ構築物または請求項１８に記載のＤＮＡを含む単離された細胞。
【請求項２１】
残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せを含む、ＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ３タンパク質。
【請求項２２】
残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せを含む、ＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ４Ａタンパク質。
【請求項２３】
残基１７９でのプロリンを含むＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ５Ａタンパク質。
【請求項２４】
残基１７９でのプロリン、および２２０４位でのイソロイシンを含むＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ５Ａタンパク質。
【請求項２５】
請求項２１から２４のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチドを含むＲＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
請求項２５もしくは２６に記載のポリヌクレオチド、または請求項２７に記載のＲＮＡ構築物もしくはＤＮＡ構築物を含む細胞。
【請求項２９】
請求項２１から２４のいずれかに記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項３０】
単離された細胞であって、該細胞において複製する遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む細胞。
【請求項３１】
前記細胞において、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が存在しない、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＲＮＡの少なくとも１０コピーを含む、請求項３０または３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記ＲＮＡがサブゲノムＨＣＶ配列を含む、請求項３０から３２のいずれかに記載の細胞。
【請求項３４】
前記ＲＮＡが、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記ＲＮＡが全ゲノムＨＣＶ配列を含む、請求項３０から３４のいずれかに記載の細胞。
【請求項３６】
前記ＲＮＡが２２０４位でのイソロイシンを含む、請求項３０から３５のいずれかに記載の細胞。
【請求項３７】
前記ＲＮＡが遺伝子型４ａである、請求項３０から３６のいずれかに記載の細胞。
【請求項３８】
前記ＲＮＡが、残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せを含むＮＳ３をコードする配列を含む、請求項３０から３７のいずれかに記載の細胞。
【請求項３９】
前記ＲＮＡが、残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せを含むＮＳ４Ａをコードする配列を含む、請求項３０から３８のいずれかに記載の細胞。
【請求項４０】
前記ＲＮＡが、残基１７９でのプロリンを含むＮＳ５Ａをコードする配列を含む、請求項３０から３９のいずれかに記載の細胞。
【請求項４１】
哺乳動物細胞である、請求項３０から４０のいずれかに記載の細胞。
【請求項４２】
ヘパトーマ細胞である、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
（ａ）ＮＳ３の残基２００をグルタミン酸で置換する工程；
（ｂ）ＮＳ３の残基３４３をリシンもしくはアルギニンで置換する工程；
（ｃ）ＮＳ３の残基５１１をアルギニンで置換する工程；
（ｄ）ＮＳ４Ａの残基３４をリシンもしくはアルギニンで置換する工程；
（ｅ）ＮＳ４Ａの残基５２をバリンで置換する工程；または
（ｆ）ＮＳ５Ａの残基１７９をプロリンで置換する工程
の１つまたは複数を含む、遺伝子型４のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法。
【請求項４５】
遺伝子型４のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、請求項１から１７のいずれかに記載の細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下または前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質が該ＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法。
【請求項４６】
前記タンパク質がプロテアーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＮＡの複製または該ＲＮＡによってコードされる前記タンパク質の活性を測定する工程をさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
遺伝子型４のＨＣＶの活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、請求項１から１７のいずれかに記載の細胞の溶解物を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質が該ＨＣＶの活性を阻害することを示す方法。
【請求項４９】
前記タンパク質がプロテアーゼである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＲＮＡの複製または該ＲＮＡによってコードされる前記タンパク質の活性を測定する工程をさらに含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１１年７月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５０４，８５３号、２０１１年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／５０９，９８４号、および２０１２年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／５８９，７８９号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々の内容は、本開示に参考として援用される。
【０００２】
開示の分野
本開示は、遺伝子型４のＣ型肝炎レプリコンおよび該レプリコンを調製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
先行技術
慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、依然として世界の重大な健康（ｈｅａｔｈ）負担であり、世界中で推定１億６千万人が感染患者している。現在の標準治療は、ＰＥＧ化インターフェロン＋リバビリンの２４〜４８週にわたる投与である。このレジメンの有効性は部分的であり、忍容性に乏しいため、新規抗ウイルス薬の発見および開発が熱心に探求されている。最近では、これらの努力は、遺伝子型１の慢性ＨＣＶ感染の処置に関してＰＥＧ化インターフェロンとリバビリンの組合せの使用について、２つのＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（ボセプレビルおよびテラプレビル）のＦＤＡ承認に至っている。他の多くの阻害剤は先進臨床開発中であるが、しかしながら、その大部分は遺伝子型１の感染症を処置するために開発されている。
【０００４】
ＨＣＶは、非常な遺伝的多様性を示すプラス鎖のＲＮＡウイルスである。６つの主な遺伝子型（すなわち、遺伝子型１〜６）と複数のサブタイプ（例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃなど）が報告されている。遺伝子型１、２および３は世界中に分布している。遺伝子型１ａまたは１ｂは、概して、北米、南米、ヨーロッパおよびアジアにおいて優勢である。しかしながら、遺伝子型２および３が一般的であり、これらの地域の多くにおいて２０〜５０％の感染を構成し得る。遺伝子型４ａは、中東およびアフリカの多くの国において優性である；エジプトの人口の最大１５％がＨＣＶに感染し、感染の９３％が遺伝子型４である。遺伝子型５は南アフリカで蔓延し、一方、遺伝子型６はアジアで最も一般的である。ほとんどの大陸および国は「支配的な」遺伝子型を有するが、感染した集団は、ほぼ普遍的に、複数の遺伝子型の混合で構成される。さらに、ＨＣＶ感染の地理的分布および多様性（疫学）は、大規模な移住および蔓延した静脈薬物使用に起因して、絶えず拡大している。例えば、遺伝子型４ａは、中央および北ヨーロッパに顕著に広がっている。これは、個々の遺伝子型が、現在の標準治療を含む、直接的な抗ウイルス薬および免疫調節療法の両方に個別に応答することが十分に実証されているため、臨床的なチャレンジを提示する。
【０００５】
ＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶゲノムに由来する自己複製ＲＮＡ配列であり、分子ウイルス学研究と創薬の両方について大いに貢献するものとして役立つ。今日まで、レプリコンは、２つの遺伝子型と３つのサブタイプ（遺伝子型１ａ、１ｂおよび２ａ）から樹立されている。これらのレプリコンは、新規阻害剤クラスの同定、臨床候補物の最適化および臨床的耐性の特徴付けを含む創薬および医薬品開発の複数の局面において重要視されてきた。最近では、すべての主なＨＣＶ遺伝子型に対して活性である次世代医薬品の開発に関心が高まっている。理想的には、「全遺伝子型」薬物およびレジメンの承認が、ＨＣＶの処置を大いに簡素化する。
【０００６】
全遺伝子型の処置レジメンの探求における重要なステップは、すべての主要な遺伝子型およびサブタイプの研究を可能にするインビトロでのツールを開発することである。しかしながら、さらなる主な遺伝子型（すなわち、遺伝子型１ａ、１ｂまたは２ａ以外の遺伝子型）の配列に由来するレプリコンは生成されていない。特に、中東、北アフリカおよび欧州における遺伝子型４のＨＣＶの世界的な蔓延にもかかわらず、遺伝子型４のレプリコンは記載されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
遺伝子型４レプリコンを安定に複製するクローン細胞系は、サブゲノム遺伝子型４のｃＤＮＡを転写し、ＨＣＶ許容細胞系にエレクトロポレーションによって導入することによって得られたことは予期せずに発見された。野生型ウイルスと比較して、適応変異はこれらのクローンから同定されている。これらの変異は、部位特異的変異誘発によって工学的に作製され、これらの細胞系に導入された場合、ＨＣＶ遺伝子型４複製が結果として生じた。
【０００８】
遺伝子型４に関するこれらの適応変異は、ＮＳ３（Ｔ３４３Ｋ／Ｒ、Ａ２００ＥもしくはＴ５１１Ｋ）、ＮＳ４Ａ（Ｑ３４Ｋ／ＲもしくはＥ５２Ｖ）、またはＮＳ５Ａ（Ｌ１７９Ｐ）に位置した。ロバストな遺伝子型４レプリコン系の樹立は、創薬および医薬品開発の努力を促進する強力なツールを提供する。
【０００９】
したがって、本開示の一実施形態は、真核細胞において複製することができる遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物を提供し、ここで、該ＲＮＡ配列は、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂの１つまたは複数をコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む。
【００１０】
一態様において、該構築物は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂにおいて１つまたは複数の適応変異を含む。非限定的な例としては、（１）２２０４位でのイソロイシン、（２）ＮＳ３において残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せ、（３）ＮＳ４Ａにおいて残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せ、あるいは（４）ＮＳ５Ａにおいて残基１７９でのプロリンが挙げられる。また、該構築物は、少なくとも２つ、あるいは３つまたは４つの適応変異を含むことが意図される。一態様において、適応変異は、異なる遺伝子によってもたらされる。いくつかの態様において、該構築物は、サブゲノムまたは全長ＨＣＶレプリコンである。
【００１１】
さらに、該ＲＮＡ構築物に転写するＤＮＡ、該ＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子、およびこのようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む細胞もまた提供される。
【００１２】
また、一実施形態において、対応する適応変異の１つまたは複数を含む個々のＮＳ３、ＮＳ４ＡまたはＮＳ５Ａタンパク質が提供される。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および該タンパク質を特異的に認識する抗体もまた提供される。
【００１３】
別の実施形態において、本開示は、単離された細胞であって、前記細胞において複製する遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む細胞を提供する。一態様において、該細胞において、該ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物は存在しない。別の態様において、該細胞は、該ＲＮＡの少なくとも１０コピー、あるいは少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、または１×１０９コピーを含む。このような態様のいずれかにおいて、該ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列または全長ＨＣＶ配列であってもよく、上記の適応変異の１つまたはそれより多くを含んでもよい。
【００１４】
一態様において、細胞は、例えばヘパトーマ細胞、特にＨｕｈ７  １Ｃ細胞であり得る哺乳動物細胞である。
【００１５】
また、遺伝子型４のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法であって、（ａ）ＮＳ３の残基２００をグルタミン酸で置換する工程；（ｂ）ＮＳ３の残基３４３をリシンもしくはアルギニンで置換する工程；（ｃ）ＮＳ３の残基５１１をアルギニンで置換する工程；（ｄ）ＮＳ４Ａの残基３４をリシンもしくはアルギニンで置換する工程；（ｅ）ＮＳ４Ａの残基５２をバリンで置換する工程；または（ｆ）ＮＳ５Ａの残基１７９をプロリンで置換する工程の１つまたは複数を含む方法も提供される。
【００１６】
一実施形態において、遺伝子型４のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、上記の実施形態のいずれかにおける細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下または上記ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法もさらに提供される。あるいは、該方法は、上記実施形態のいずれかにおける細胞の溶解物を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、該ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの活性を阻害することを示す。
【００１７】
本開示は、添付の図面と併せて以下の詳細な記載を読めば非常に良く理解される。図面に含まれるものは以下の図である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、遺伝子型４ａレプリコン構築物の概略図である。新規な遺伝子型４ａの安定なレプリコン細胞系を生成するために使用されたＨＣＶレプリコン。ＥＤ４３  ４ａ株レプリコンは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Ａ）またはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ融合レポーター（Ｂ）のいずれかをコードする。合成されたレプリコンは、５’から３’方向に、以下の要素：ＥＤ４３  ５’ＵＴＲ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｅｏ）またはＲｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子；脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ；ＮＳ５Ａ適応変異（Ｓ２２０４Ｉ）を含むＥＤ４３のＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、およびＥＤ４３の３’ＵＴＲを組み込んだ。黒塗りのボックスはＨＣＶコア配列を示す。点影付きボックスはＨＣＶポリタンパク質の配列を示す。「＋」はＳ２２０４Ｉ適応変異を示す。５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが示される。
【００１９】
【図２】図２は、遺伝子型４ａレプリコン樹立戦略の概略図である。
【００２０】
【図３】図３は、３つの異なる細胞系における生存コロニー数を示す。材料および方法に記載されるように、Ｈｕｈ−７  Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃおよび１Ｃ細胞は、それぞれＧＴ４ａレプリコンＲＮＡでトランスフェクトされた。生存コロニー数を各々の選択についてカウントした。データは、少なくとも６つの独立したトランスフェクションの平均を表す。Ｈｕｈ７−ｌｕｎｅｔをＲｅＢＬｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。５１Ｃ細胞の誘導は、従前に記載された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４巻：３０９９〜１０６頁（２０１０年））。１Ｃ細胞は、５１Ｃ細胞から誘導されたＧＳ−５８８５耐性の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒することによって誘導された。ＧＳ−５８８５はＮＳ５Ａ阻害剤であり、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能である。図は、Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞が、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔまたは５１Ｃ細胞よりも、ＧＴ４ａレプリコン複製に対してより許容的であったことを示す。
【００２１】
【図４】図４は、選択されたＧＴ４ａレプリコンのクローンが、適応遺伝子変化を獲得したことを示す。全細胞ＲＮＡを初代遺伝子型４ａレプリコンの細胞クローンから抽出し、次に、指定量でＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。トランスフェクトされた細胞を完全ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、１００ｍｍ径のディッシュに２×１０５〜２×１０６細胞の範囲の複数の密度で播種した。播種の４８時間後、培地は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。３週間後、コロニープレートを４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈ２Ｏ中の０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。インビトロで転写されたＧＴ４ａレプリコンのＲＮＡを対照として並行してトランスフェクトした。初代遺伝子型４レプリコンから抽出されたＲＮＡの大幅に増強されたコロニー形成効率は、そのクローンにおけるレプリコンが、インビトロにおいてロバストな複製を可能にする適応変化を獲得したことを示す。
【００２２】
【図５】図５は、ＧＴ４ａレプリコン細胞系におけるロバストなＮＳ５ＡおよびＮＳ３発現を示す（Ａ）。ＧＴ４ａレプリコン細胞プールは、抗ＮＳ５Ａ抗体（Ａｐａｔｈ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；上段パネル、ライトグレー）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１μｇ／ｍｌ）（下段パネル、濃いグレーは核を示す）で染色された。１Ｃ細胞を陰性対照として染色した（下段パネル）。ＧＴ４ａレプリコン細胞は、ＮＳ５Ａについて明確に陽性であり、これは活性な複製を示した。（Ｂ）選択されたＧＴ４ａレプリコン細胞系は、材料および方法に記載されるように、これらの細胞内ＮＳ３プロテアーゼ活性について測定された。ＧＴ１ａおよびＧＴ１ｂの安定なレプリコン細胞は、ＮＳ３プロテアーゼ活性を比較するために含められた。１Ｃ細胞を陰性対照として含めた。ロバストなレプリコン活性を示すロバストなＮＳ３活性は、ＧＴ４ａレプリコン細胞系において観察され、いくつかのＧＴ４ａレプリコン細胞系は、標準的なＧＴ１ａおよび１ｂレプリコン細胞によって生成されるＮＳ３シグナルを超えた。
【００２３】
【図６】図６はＧＴ４ａレプリコン細胞系におけるロバストなＮＳ５Ａ発現を裏付ける。各々０．５×１０６個である安定なＧＴ４ａおよびＧＴ１ｂレプリコン細胞をペレットにし、１００μｌのＳＤＳ泳動緩衝液に完全に溶解した。１２μｌの溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。ブロットは、一次抗ＮＳ５Ａ抗体（Ａｐａｔｈ；１：１００００希釈）および二次抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて染色された。次に、染色をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＬＩ−ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）により分析した。また、ブロットは、泳動対照として、抗ＢｉＰ抗体（Ａｂｃａｍ、１：１０００希釈）および二次抗ウサギ抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：１０，０００希釈）を用いて共染色された。ＮＳ５Ａの強い発現がＧＴ４ａレプリコン細胞クローンにおいて検出され、これは、これらの細胞が、標準的なＧＴ１ｂレプリコン細胞によるＮＳ５Ａ発現レベルを超えるまたはそれに匹敵して、安定およびロバストにこのレプリコンを複製することが確認された。
【００２４】
【図７】図７は、ＮＳ４ＡのＱ３４ＲがＧＴ４ａ複製について細胞培養適応変異であることを示す。ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ｎｅｏ構築物のＮｅｏ遺伝子をＲｌｕｃ−ｎｅｏ融合レポーターで置き換え、細胞培養物におけるレプリコン複製の測定を促進した（ルシフェラーゼによる）。次に、ＮＳ４Ａ遺伝子におけるＱ３４Ｒ変異は、部位特異的変異誘発によって、ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ＲｌｕｃＮｅｏ構築物に導入された。３つすべてのレプリコンＲＮＡをそれぞれＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞（左パネル）および１Ｃ（右パネル）細胞にトランスフェクトした。生存コロニー数を各選択についてカウントした。データは、少なくとも２つの独立したトランスフェクションの平均を表す。Ｑ３４Ｒ変異は、ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ＲｌｕｃＮｅｏがコロニーを樹立するのを可能にした。一方、この変異を含まない同じレプリコンはコロニーを樹立しない。ＧＴ４ａ  ＲｌｕｃＮｅｏＱ３４Ｒのクローンは、そのより高いＲｌｕｃシグナルに起因して選択され、抗ウイルスアッセイのために増幅させた。
【００２５】
【図８】図８は、ＮＳ３のＡ２００Ｅ、Ｔ３４３ＲとＴ３４３Ｋ、およびＮＳ４ＡのＱ３４Ｒ、Ｑ３４ＫとＥ５２Ｖ変異がＧＴ４ａ複製のための細胞培養適応変異であることを示すデータを提示する。ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ｎｅｏ構築物のＮｅｏ遺伝子をＲｌｕｃ−ｎｅｏ融合レポーターで置き換え、細胞培養物におけるレプリコン複製の測定を促進した（ルシフェラーゼによる）。次に、ＮＳ３遺伝子における変異Ａ２００Ｅ、Ｔ３４３ＲとＴ３４３Ｋ、およびＮＳ４Ａ遺伝子におけるＱ３４Ｋ、Ｑ３４ＲとＥ５２Ｖは、部位特異的変異誘発によって、それぞれＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ＲｌｕｃＮｅｏ構築物に導入された。すべてのレプリコンＲＮＡを個別に１Ｃ細胞にトランスフェクトし、１×１０４個のトランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートのウェルに播種した。トランスフェクション後の４時間および１日目〜８日目の毎日、細胞は、ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性について分析された。細胞を４日目に継代し、再度播種した。各時間点で、四重のウェルを各トランスフェクションについてアッセイし、データは、誤差バーを有する２つの独立した実験の平均を表す。試験されたすべての変異であるＮＳ３遺伝子におけるＡ２００Ｅ、Ｔ３４３ＲとＴ３４３Ｋ、およびＮＳ４Ａ遺伝子におけるＱ３４Ｋ、Ｑ３４ＲとＥ５２Ｖは、ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ＲｌｕｃＮｅｕ複製を有意に増大させ、これは、ＲＮＡ複製とは独立した、挿入ＲＮＡの直接的翻訳から誘導されるシグナルの初期低下後の２日目からのＲｌｕシグナルの増加によって裏付けられた。対照的に、変異を含まない同じレプリコンは、いかなる意味のある複製を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本開示をより詳細に記載する前に、初めに以下の用語を定義する。
【００２７】
本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、従って、当然に変更されてもよいことを理解するべきである。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的とするためのものであり、限定することを意図していないことも理解するべきである。
【００２８】
本明細書で使用するとき、および添付の特許請求の範囲において、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「スレッド（ｔｈｒｅａｄ）」への言及は、複数のスレッドを含む。
１．定義
【００２９】
他に定義がなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００３０】
本明細書において使用するとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、組成物および方法が、列挙されている要素を含み、他のものを排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために用いるときの「から本質的になる」は、所期の目的のための組合せに対して、任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。このようにして、本明細書において定義されるように要素から本質的になる組成物は、請求される開示の基本的および新規の特徴（単数または複数）に物質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量を超える要素および実質的方法工程を除外することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【００３１】
範囲を含む数字表示、例えば、温度、時間、量、および濃度の前に使用されるときの用語「約」は、（＋）または（−）１０％、５％または１％変化してもよい近似値を示す。
【００３２】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に用いられ、およびこれらの最も広い意味で、２つもしくはそれより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチドミメティックの化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に対してかけられる制限はない。本明細書において使用するとき、用語「アミノ酸」とは、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体を含む天然および／もしくは非天然または合成のいずれかのアミノ酸、アミノ酸類似体、ならびにペプチドミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸の１文字および３文字略語を下記に列挙する。３個もしくはそれより多くのアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にはオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、一般にはポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【化１】
2014522647.tif 000003
【００３３】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を果たし得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリ前または後にもたらすことができる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分を割り込ませることができる。重合後、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって、ポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方も指す。他に指定または要求されていない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるまたは予期される各々２本の相補的一本鎖形態の両方を含む。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特異的配列で構成される。このようにして、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示を、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースにインプットし、機能性ゲノム解析および相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。
【００３５】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２ペプチド間または２核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインすることができる各々の配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めるときには、これらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列が共有するマッチング位置または相同位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。一実施形態において、相同ペプチドは、適応変異の１つまたは複数を含む、記載されているものと同じ機能的特徴を共有するものである。
【００３６】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列との一定の百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するということは、アラインさせたとき、これら２つの配列を比較して同じである塩基（またはアミノ酸）の百分率を意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性またはパーセント配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータをアラインメントに用いる。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。具体的には、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート手段＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ（２０１１年７月１５日に最終アクセス）で見出すことができる。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、特定のパーセント相同性を有するポリヌクレオチド、および同じまたは同様な生物活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３７】
用語「核酸のホモログ」とは、核酸のヌクレオチド配列またはその相補体との一定程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、その相補体との一定程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有するまたはその相補体を有する核酸を含むことが意図される。一態様では、核酸のホモログは、核酸またはその相補体にハイブリダイズすることができる。
【００３８】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後の、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のいずれかを使用して、それらが関係づけられる遺伝子のより大きな断片または全長コード配列を同定することができる。より大きな断片配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００３９】
用語「発現する」とは、遺伝子産物の産生を指す。
【００４０】
本明細書において使用するとき、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
【００４１】
ポリヌクレオチドに適用される場合の用語「コードする」とは、その本来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されたとき、ポリヌクレオチドを、ポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生するように転写および／または翻訳することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補体であり、コードする配列をこれらから推定することができる。
【００４２】
「真核細胞」は、モネラを除く生物界のすべてを含む。これらは、膜に包まれた核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、真核生物であり、または細胞が内膜および細胞骨格によって複雑な構造に構成されている生物である。最も特徴的な包膜構造は核である。真核生物宿主としては、例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞、または代替的に上に記載した原核細胞由来のものが挙げられる。非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類およびヒトが挙げられる。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合断片または一本鎖を含む。このようにして、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。このようなものの例としては、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられる。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、任意の適切な生物源、例えばマウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。
【００４４】
用語「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用されるとき、異なるＢ細胞系に由来する抗体の調製物を指す。これらは、各々が異なるエピトープを認識する、特異的抗原に対して分泌された免疫グロブリン分子の混合物である。
【００４５】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用するとき、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性をあらわす。
【００４６】
用語「単離された」とは、本明細書において使用するとき、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的材料もしくは細胞材料を指し、あるいはタンパク質またはポリヌクレオチドに言及する場合、天然の環境からタンパク質またはポリヌクレオチドを除くために共有結合の破壊を意味する。一態様では、用語「単離された」とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官であって、天然源に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官から各々分離されるものを指す。また、用語「単離された」とは、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、細胞材料、ウイルス材料もしくは培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、あるいは化学合成される場合、化学前駆体または他の化合物を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態で見出されない核酸断片を含むことを意味する。また、用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指し、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味するものとして本明細書において使用される。他の実施形態において、用語「単離されたまたは組換えの」とは、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（単数もしくは複数）が自然界で通常会合している、細胞のまたは別の構成成分から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、自然または天然環境において、例えば染色体上で通常会合している３’および５’の連続ヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（単数もしくは複数）は、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。また、用語「単離された」は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すために本明細書で使用され、培養された細胞または組織および工学的に作製された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
【００４７】
Ｃ型肝炎ウイルスまたは「ＨＣＶ」は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科の小さい（サイズが５５〜６５ｎｍ）、エンベロープを有した、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃ型肝炎ウイルスは、ヒトにおけるＣ型肝炎の原因である。Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、タンパク質の２０面体保護殻に囲まれ、さらに細胞起源の脂質（脂肪）エンベロープに包まれた遺伝物質（ＲＮＡ）のコアからなる。２つのウイルスエンベロープ糖タンパク質であるＥ１およびＥ２は、脂質エンベロープに埋め込まれている。
【００４８】
Ｃ型肝炎ウイルスは、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ゲノムは、長さが９６００ヌクレオチド塩基である単一のオープンリーディングフレームからなる。この単一のオープンリーディングフレームは翻訳され、単一のタンパク質産物を産生し、これは次に、プロセッシングされてより小さな活性タンパク質を産生する。
【００４９】
ＲＮＡの５’末端および３’末端には、タンパク質に翻訳されないが、ウイルスＲＮＡの翻訳および複製に重要であるＵＴＲがある。５’ＵＴＲは、約３，０００個のアミノ酸を含む非常に長いタンパク質の翻訳を開始するリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ−内部リボソーム進入部位）を有する。この大きなプレタンパク質は、後に細胞およびウイルスのプロテアーゼによって、宿主細胞内でウイルス複製を可能にし、または成熟ウイルス粒子にアセンブルする１０個のより小さいタンパク質に切断される。
【００５０】
Ｃ型肝炎ウイルスによって作製される構造タンパク質は、コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２を含む；非構造タンパク質は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂを含む。
【００５１】
ＨＣＶ分離株間の遺伝的差異に基づいて、Ｃ型肝炎ウイルス種は、６種の遺伝子型（１〜６）に分類され、各遺伝子型にいくつかのサブタイプ（文字で表される）を有する。サブタイプは、さらにこれらの遺伝的多様性に基づいて準種に分類される。ＨＣＶ遺伝子型の優勢と分布は世界的に異なる。例えば、北米では、遺伝子型１ａが優勢であり、続いて１ｂ、２ａ、２ｂ、および３ａである。欧州では、遺伝子型１ｂが優勢であり、続いて２ａ、２ｂ、２ｃ、および３ａである。遺伝子型４および５はアフリカでほぼ排他的に見出される。遺伝子型は、インターフェロンに基づく治療およびこのような治療の必要な期間に対する応答の可能性を決定する上で臨床的に重要である。遺伝子型１および４は、他の遺伝子型（２、３、５および６）よりもインターフェロンに基づく処置に対する応答が小さい。遺伝子型１および４に関する標準的なインターフェロンに基づく治療期間は４８週間であり、一方、遺伝子型２および３に関する処置は２４週間で完了する。
【００５２】
異なるＨＣＶ遺伝子型由来の配列は、全ウイルスゲノムにわたって、３３％程度異なり得、配列変異性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）は、高度に保存された５’ＵＴＲおよびコア領域および超可変エンベロープ（Ｅ）領域は別にして、ウイルスゲノム全体で均等に分布している。
【００５３】
ＨＣＶ遺伝子型は、当該技術分野で公知の種々の方法を用いて同定することができる。遺伝子型特異的なプライマーを用いたＰＣＲに基づく遺伝子型決定は、特にコア領域を標的としたプライマーを用いて、最初に１９９２年に導入された。市販のキット（例えば、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｚｗｉｊｉｎｄｒｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるＩｎｎｏＬｉｐａ（登録商標））も利用可能である。直接的な配列決定は、その特性において、より信頼性が高く、感受性の遺伝子型決定のために使用することができる。
【００５４】
血清学的な遺伝子型決定は、遺伝子型特異的な抗体を使用し、間接的に遺伝子型を同定する。２つの市販の血清学的な遺伝子型決定アッセイが導入され、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．からのＲＩＢＡ  ＳＩＡアッセイ、およびＮｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．からのＭｕｒｅｘ  ＨＣＶセロタイピング酵素免疫アッセイが挙げられる。
【００５５】
遺伝子型４のＨＣＶの配列は同定されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１４２６６は、ＥＤ４３感染性クローンに基づいたサブゲノム遺伝子型４ａレプリコンを表す。遺伝子型４およびこれらの配列が臨床的に影響があるとするさらなる論考は、Ｚｅｉｎ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  １３巻（２号）：２２３〜３５頁（２０００年）に見出すことができる。
【００５６】
用語「レプリコン」とは、単一の複製起点から複製されるＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの領域を指す。大部分の原核生物の染色体については、レプリコンは染色体全体である。いくつかの態様において、レプリコンは、インビトロにおける細胞内で複製するＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物を指す。一態様において、レプリコンは複製して、インビトロにおける細胞内でそのレプリコンの少なくとも約１０コピー、あるいは代替的に、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーを産生することができる。あるいは、レプリコンの複製効率は、細胞ＲＮＡを含む総ＲＮＡ中の一定量のウイルスＲＮＡを産生することによって測定することができる。一態様において、レプリコンは、総ＲＮＡまたは細胞ＲＮＡの１μｇあたりのレプリコンの少なくとも約１０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２コピーを産生することができる。
【００５７】
「サブゲノム」ＨＣＶ配列とは、野生型ＨＣＶのすべての配列を含まないＨＣＶ配列を指す。一態様において、サブゲノムＨＣＶまたはサブゲノムＨＣＶレプリコンは、Ｅ１、Ｅ２およびＣ領域を含まない。別の態様において、サブゲノムＨＣＶまたはサブゲノムＨＣＶレプリコンは、５’ＵＴＲ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂおよび３’ＵＴＲ配列のすべてまたは一部を含む。対照的に、「全長」または「全ゲノム」ＨＣＶまたはＨＣＶレプリコンはＥ１、Ｅ２およびＣ領域を含む。いくつかの態様では、サブゲノムＨＣＶレプリコンと全長ＨＣＶレプリコンの両方は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）、マーカー遺伝子（例えば、Ｎｅｏ）、およびＩＲＥＳ（例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）配列の１つまたは複数を含むことができる。
【００５８】
ウイルス粒子（またはビリオン）は、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから作製される遺伝物質、および該遺伝物質を保護するタンパク質被覆からなる。一態様において、脂質のエンベロープは、これらが細胞の外側にあるときにタンパク質被覆を取り囲む。
【００５９】
特定の遺伝子型のＨＣＶレプリコンの「適応変異」なる用語は、該遺伝子型の野生型ＨＣＶ配列と比較して、野生型レプリコンを細胞内で、特に真核細胞、例えば哺乳動物細胞およびインビトロにおいて複製することができ、またはＨＣＶレプリコンの複製する能力を増大させる変異を指す。適応変異は、好適には、宿主細胞特異的タンパク質とのレプリカーゼ複合体のアセンブリに影響を及ぼすことができ、または代替的に、適応変異を含むタンパク質（例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａなど）と、宿主細胞の抗ウイルス防御と関連する細胞タンパク質との相互作用を促進することができることが意図される。
【００６０】
「レポーター遺伝子」とは、細胞培養物、動物または植物において対象とする別の遺伝子の調節配列に結合し、この他の遺伝子の同定を促進し得る遺伝子を指す。レポーター遺伝子は、多くの場合、特定の遺伝子が、細胞または生物集団によって取り込まれまたはそれにおいて発現されたかどうかの指標として使用される。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、ルシフェラーゼ遺伝子および緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられる。
【００６１】
「マーカー遺伝子」または「選択マーカー」は、通常は生物を死滅させるまたはその増殖を妨げる選択剤から生物を保護する遺伝子を指す。一つの非限定的な例は、発現に応じて、ゲンタマイシンＢ１と類似した構造を有するアミノグリコシド抗生物質であるＧ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）である。
ＨＣＶ遺伝子型４レプリコン構築物
【００６２】
本開示は、概して、遺伝子型４レプリコンを安定に複製するクローン細胞系が、サブゲノム遺伝子型４のｃＤＮＡを転写し、ＨＣＶ許容細胞系にエレクトロポレーションによって導入することによって得ることができるという予想外の発見に関する。次に、クローン細胞から適応変異が同定される。
【００６３】
これらの適応変異は、ＮＳ３（Ｔ３４３Ｋ／Ｒ、Ａ２００ＥもしくはＴ５１１Ｋ）、ＮＳ４Ａ（Ｑ３４Ｋ／ＲもしくはＥ５２Ｖ）またはＮＳ５Ａ（Ｌ１７９Ｐ）に位置した。Ｓ２２０４Ｉ変異もまたいずれの遺伝子型においても適用可能である。これらの変異の同定は、これらの変異が、インビトロでの細胞において複製するＨＣＶの能力に寄与することを示唆し、これは野生型ＨＣＶ遺伝子型４のＲＮＡでは観察されない現象である。このような寄与は、遺伝子型４のＲＮＡに部位特異的変異誘発によって変異を工学的に作製し、これらを細胞系に導入することによって確認された。このような変異を有する遺伝子型４のＨＣＶ  ＲＮＡは細胞系において首尾よく複製された。したがって、本出願人は、本出願人が、インビトロにおいて複製し得るＨＣＶ遺伝子型４レプリコンを調製し、このような能力をもたらす適応変異を同定したことを実証した。
【００６４】
したがって、一実施形態において、本開示は、宿主細胞で複製することができる遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを提供する。別の態様において、複製はインビトロである。一態様において、複製は生産的である。別の態様において、細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞などの真核細胞である。さらに別の態様において、細胞はヘパトーマ細胞である。いくつかの態様において、ＲＮＡは複製して、細胞中にＲＮＡの少なくとも１０コピーを産生することができる。別の態様において、コピー数は、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９である。
【００６５】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列であってもよい。具体的には、このような適応変異のいずれかまたはそれより多くを含む全長ＨＣＶレプリコンもまた複製できることが意図される。さらになお、適応変異（単数または複数）を含む対応する遺伝子型の全ＨＣＶウイルスは感染性であり、複製することができる。いずれかのこのような場合において、ＲＮＡは、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとのうちの１つまたは複数を含んでもよい。一態様において、ＲＮＡは、プラス鎖の核酸上で５’から３’方向に、最端の５’末端の保存配列を含む機能的ＨＣＶ５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ）；ＨＣＶポリタンパク質コード領域；および最端の３’末端の保存配列を含む機能的ＨＣＶ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）を含む。
【００６６】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、該ＲＮＡが細胞において複製し得る適応変異を含むことができる。このような適応変異は、ＮＳ５Ａの２２０４位にイソロイシンを含むことができる。
【００６７】
また、遺伝子型４に関する適応変異の非限定的な例としては、ＮＳ３について残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せ、あるいはＮＳ４Ａについて残基３４でのリシンまたはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せ、あるいはさらにＮＳ５Ａについて残基１７９でのプロリンが挙げられる。
【００６８】
また、遺伝子型４に関する適応変異の非制限的な例としては、ＮＳ３について残基６０７でのセリンが挙げられる。
【００６９】
一実施形態において、表１に列挙されたレプリコンが提供される。特に、ＨＣＶ  ＲＮＡは、記載された変異の１つまたは複数を含み得ることが意図される。一態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＮＳ３に少なくともある適応変異およびＮＳ４Ａに少なくともある適応変異を含む。別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＮＳ３に少なくともある適応変異およびＮＳ５Ａに少なくともある適応変異を含む。さらに別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＮＳ４Ａに少なくともある適応変異およびＮＳ５Ａに少なくともある適応変異を含む。
【００７０】
また、ＨＣＶ  ＲＮＡは、対応する適応変異（単数または複数）および／または活性が保持される限り、開示された配列のいずれかと少なくとも約７５％、または約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または約９９．５％の配列同一性を有するＲＮＡ配列であり得ることが意図される。
【００７１】
このようにして、一態様において、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む遺伝子型４のＨＣＶ  ＲＮＡ構築物が提供され、ここで、該構築物は真核細胞において複製することができる。一態様において、該構築物は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂにおいて適応変異を含む。
【００７２】
一態様において、変異はＮＳ５Ａにおいて２２０４位のイソロイシンを含む。別の態様において、変異は、ＮＳ３において残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せを含む。さらに別の態様において、変異は、ＮＳ４Ａにおいて残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せを含む。さらなる態様において、変異は、ＮＳ５Ａにおいて残基１７９でのプロリンを含む。いくつかの態様において、遺伝子型４は遺伝子型４ａである。
【００７３】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＨＣＶ  ＲＮＡは、選択用のマーカー遺伝子をさらに含むことができる。このようなマーカー遺伝子の非限定的な例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。他の例は当該技術分野において周知である。
【００７４】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＨＣＶ  ＲＮＡは、レポーター遺伝子をさらに含むことができる。このようなマーカー遺伝子の非限定的な例は、ルシフェラーゼ遺伝子である。他の例は当該技術分野において周知である。
【００７５】
上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物は、Ｃ、Ｅ１またはＥ２の１つまたは複数をコードする配列をさらに含むことができる。一態様において、該ＲＮＡ構築物は、全長ＨＣＶレプリコンである。
【００７６】
本開示はまた、上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物に転写され得る一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子、または上記の実施形態のいずれかのＲＮＡ構築物を含む単離された細胞を提供する。
【００７７】
一実施形態において、本開示は、残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せを含むＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ３タンパク質を提供する。
【００７８】
一実施形態において、本開示は、残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せを含む、ＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ４Ａタンパク質を提供する。
【００７９】
一実施形態において、本開示は、残基１７９でのプロリンを含むＨＣＶ遺伝子型４のＮＳ５Ａタンパク質を提供する。
【００８０】
いずれかのこのような実施形態の一態様において、遺伝子型４は遺伝子型４ａである。なお別の態様では、このような実施形態のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。別の態様において、該ポリヌクレオチドを含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物が提供される。なお別の態様において、該ポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。さらに一態様において、上記の実施形態のいずれかのタンパク質を特異的に認識する抗体が提供される。
ＨＣＶ遺伝子型４レプリコンおよび該レプリコンを含む細胞
【００８１】
本開示の別の実施形態は、遺伝子型４Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む単離された細胞を提供し、ここで、該ＨＣＶ  ＲＮＡは該細胞内で複製する。一態様において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が該細胞内に存在せず、したがって、ＨＣＶ  ＲＮＡのコピーは、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ構築物から転写されない。
【００８２】
一態様において、該細胞は、該ＲＮＡの少なくとも１０コピーを含む。別の態様において、該細胞は、該ＲＮＡの少なくとも１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーを含む。
【００８３】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列または全長ＨＣＶ配列であってもよい。いずれかの場合において、ＲＮＡは、５’ＮＴＲと、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲとのうちの１つまたは複数を含むことができる。
【００８４】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、該ＲＮＡが細胞において複製し得る適応変異を含むことができる。このような適応変異は、ＮＳ５Ａの２２０４位でのイソロイシンを含むことができる。
【００８５】
また、遺伝子型４に関する適応変異の非限定的な例としては、ＮＳ３について残基２００でのグルタミン酸、残基３４３でのリシンもしくはアルギニン、残基５１１でのアルギニン、またはこれらの組合せ、あるいはＮＳ４Ａについて残基３４でのリシンもしくはアルギニン、残基５２でのバリン、またはこれらの組合せ、あるいはさらにＮＳ５Ａについて残基１７９でのプロリンが挙げられる。
【００８６】
一実施形態において、表１に列挙されたレプリコンが提供される。具体的には、ＨＣＶ  ＲＮＡは、記載された変異の１つまたは複数を含み得ることが意図される。一態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＮＳ３に少なくともある適応変異およびＮＳ４Ａに少なくともある適応変異を含む。別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＮＳ３に少なくともある適応変異およびＮＳ５Ａに少なくともある適応変異を含む。さらに別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＮＳ４Ａに少なくともある適応変異およびＮＳ５Ａに少なくともある適応変異を含む。
【００８７】
また、ＨＣＶ  ＲＮＡは、対応する適応変異（単数または複数）が保持される限り、本開示された配列のいずれかと少なくとも約７５％、または約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または約９９．５％の配列同一性を有するＲＮＡ配列であり得ることが意図される。
【００８８】
一態様において、細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞などの真核細胞である。別の態様において、細胞は、限定されないが、Ｈｕｈ７細胞（例えば、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃおよび１Ｃ）などのヘパトーマ細胞である。驚くべきことに、本明細書において、Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞は、遺伝子型４レプリコンに特に許容性であることが発見され、したがって、一態様において、細胞はＨｕｈ７  １Ｃ細胞である。いくつかの態様において、細胞は、インビトロまたはエクスビボの条件で置かれる。
遺伝子型４レプリコンを調製する方法
【００８９】
ＨＣＶ遺伝子型４レプリコンが、実施例１に示されるように同定された後、対応する遺伝子型ＨＣＶ  ＲＮＡへの関連する適応変異の導入は、特にインビトロでの哺乳動物細胞において該ＲＮＡが複製する能力を結果としてもたらすことができる。したがって、本開示は、遺伝子型４のＨＣＶウイルスＲＮＡが真核細胞で複製する能力を改善する方法であって、
（ａ）ＮＳ３の残基２００をグルタミン酸で置換する工程；
（ｂ）ＮＳ３の残基３４３をリシンもしくはアルギニンで置換する工程；
（ｃ）ＮＳ３の残基５１１をアルギニンで置換する工程；
（ｄ）ＮＳ４Ａの残基３４をリシンもしくはアルギニンで置換する工程；
（ｅ）ＮＳ４Ａの残基５２をバリンで置換する工程；または
（ｆ）ＮＳ５Ａの残基１７９をプロリンで置換する工程
の１つまたは複数を含む方法を提供する。一態様において、該方法は、（ａ）〜（ｆ）のうち少なくとも２つの置換を含む。
【００９０】
上記方法のいずれかにおいて、さらにＳ２２０４Ｉ変異を該ＲＮＡに導入することができる。
遺伝子型４を標的とするＨＣＶ阻害剤をスクリーニングする方法
【００９１】
多数の公知および未知のＨＣＶ阻害剤は、遺伝子型１ｂ（実施例１）と比較して、遺伝子型４のＨＣＶを阻害するこれらの効率について試験された。いくつかは遺伝子型４についてより高い有効性を示し、いくつかは有効ではなかった。したがって、新たに同定された遺伝子型４レプリコンの有用性は、十分に実証される。
【００９２】
このようにして、本開示はまた、一実施形態において、遺伝子型４のＨＣＶの複製または活性を阻害する作用物質を同定する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の細胞を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、複製の低下またはＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法を提供する。いくつかの態様では、該タンパク質は、例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかまたはそれより多くのプロテアーゼである。該ＲＮＡの複製は、一態様では、ルシフェラーゼ遺伝子などの該ＲＮＡ上のレポーター遺伝子によって測定することができる。
【００９３】
別の実施形態において、遺伝子型４のＨＣＶの活性を阻害する作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ４  ＨＣＶ）を同定する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の細胞の溶解物を候補作用物質と接触させる工程を含み、ここで、そのＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性の低下は、該作用物質が該ＨＣＶの活性を阻害することを示す方法が提供される。一態様において、該タンパク質は、例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかまたはそれより多くのプロテアーゼである。別の態様において、該方法は、該ＲＮＡの複製または該ＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性を測定する工程をさらに含む。
【００９４】
ＨＣＶ阻害剤（または「候補作用物質」）は、有機化合物、抗体などのペプチドもしくはタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの核酸系である低分子薬物であってもよい。２０１１年５月に、食品医薬品局（ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、Ｃ型肝炎のための２つの薬物であるボセプレビルおよびテラプレビルを承認した。両薬物は、ウイルスの再生を支援する酵素をブロックする。ボセプレビルは、Ｃ型肝炎遺伝子型１上のＨＣＶ  ＮＳ３活性部位に結合するプロテアーゼ阻害剤である。テラプレビルは、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３．４Ａセリンプロテアーゼを阻害する。
【００９５】
より従来型のＨＣＶ処置は、ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ａまたはＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ｂ（ブランド名ＰｅｇａｓｙｓまたはＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ）と抗ウイルス薬リバビリンの併用を含む。無作為化対照試験の系統的精査によれば、ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ａ＋リバビリンは、ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ−２ｂ＋リバビリンと比較して、慢性Ｃ型肝炎の患者間で持続的なウイルス学的応答を増大させ得る。
【００９６】
これらのＨＣＶ阻害剤のすべて、ならびに任意の他の候補作用物質は、ＨＣＶ遺伝子型４の阻害におけるこれらの有効性について、本開示された方法を用いて試験することができる。次に、細胞は、細胞においてレプリコンが複製し得るのに適切な温度、期間でインキュベートされる。レプリコンは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むことができ、このような場合において、インキュベーション期間の終了時点で、細胞は、レプリコンレベルに関するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイを用いて定量化することができる。
【００９７】
あるいは、ＨＣＶ阻害剤の有効性は、レプリコンによってコードされるタンパク質の発現または活性によって測定することができる。このようなタンパク質の一例はＮＳ３プロテアーゼであり、タンパク質の発現または活性の検出は、当該技術分野において公知の方法、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年）を用いて行うことができる。
【００９８】
次に、ルシフェラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼの活性レベルは、未処理またはＨＣＶを阻害する公知の活性を有する作用物質で処理され得る、対照におけるレベルと比較した百分率に変換される。未処理の対照と比較した場合、ＨＣＶ複製の低下またはＮＳ３活性の低下は、候補作用物質が、ＨＣＶの対応する遺伝子型を阻害することができることを示す。同様に、対照の作用物質と比較した場合、ＨＣＶ複製のより大きな低下またはＮＳ３活性のより大きな低下は、候補物が対照の作用物質よりも有効であることを示す。
【実施例】
【００９９】
本開示は、以下の実施例を参照することによってさらに明確になる。スレッドと方法の両方に対しての多くの変更は、現在の開示の範囲から逸脱することなく実施できることが当業者に明らかである。
省略形
【０１００】
他に記載がなければ、すべての温度は摂氏温度（℃）である。また、これらの実施例および他の場所において、省略形は以下の意味を有する。
【化２】
2014522647.tif 000004
（実施例１）
ロバストな遺伝子型４のＣ型肝炎ウイルスサブゲノムレプリコンの生成
【０１０１】
この実施例は、適応変異がＨｕｈ７細胞において複製し得る遺伝子型４のＨＣＶウイルスレプリコンから同定されること、およびこれらの適応変異を有するＨＣＶレプリコンが抗ウイルス薬のスクリーニングに対して有用なツールであることを示す。
材料および方法
細胞培養
【０１０２】
３つのＨＣＶ許容細胞系は、これらの試験中に使用された：Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃ、および１Ｃ。Ｈｕｈ７−ｌｕｎｅｔをＲｅＢＬｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した（Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９巻：３８０〜９２頁（２００５年））。５１Ｃ細胞、ならびに安定な遺伝子型１ａ  Ｈ７７および遺伝子型１ｂ  Ｃｏｎ−１  Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコン細胞の誘導は、従前に記載されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４巻：３０９９〜１０６頁（２０１０年）参照）。１Ｃ細胞は、５１Ｃ細胞（同上）から誘導されたＧＳ−５８８５耐性の遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒することによって誘導された。このクローン株は、スクリーニングされた５０個のクローンのうち、ＧＴ１ａおよび１ｂレプリコンに対して最も高い許容性を示し、全体としてＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞および５１Ｃ細胞よりも５〜１０倍許容性が高かった。すべての細胞系は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１単位／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充され、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖された；この培地調合物を完全ＤＭＥＭと称する。レプリコン細胞系は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（アミノグリコシド系抗生物質であるＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎとしても公知である）を含む完全ＤＭＥＭ中で選択され、維持された。
遺伝子型４ａのＨＣＶサブゲノムレプリコンをコードするプラスミドの構築
【０１０３】
ＥＤ４３感染性クローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１４２６６）（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８巻（Ｐｔ  ６）：１３４１〜７頁（１９９７年）；Ｇｏｔｔｗｅｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４巻：５２７７〜９３頁（２０１０年））に基づくサブゲノム遺伝子型４ａレプリコンをコードするプラスミド（ｐＧＴ４ａＥＤ４３ＳＧ）は、ＤＮＡ合成およびクローニング（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって調製された。合成されたレプリコンに５’から３’方向に以下の要素を組み込んだ（図１）：（１）コアの最初の４８ヌクレオチドに伸長する、ＥＤ４３  ５’ＵＴＲ、（２）ＡｓｃＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列
【化３】
2014522647.tif 000005
（配列番号１）を有するリンカー、（３）ｎｅｏ遺伝子、（４）ＦｓｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列
【化４】
2014522647.tif 000006
（配列番号２）を有するリンカー、（５）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、（６）ＭｌｕＩ制限部位（下線）、およびＨＣＶポリタンパク質発現のためのＡＴＧ開始コドンを導入するヌクレオチド配列
【化５】
2014522647.tif 000007
（配列番号３）を有するリンカー、（７）ＮＳ５Ａ適応変異（Ｓ２２０４Ｉ）を含むＥＤ４３のＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、ならびに（８）ＥＤ４３の３’ＵＴＲ。ＥＤ４３レプリコンをコードする合成ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩ制限部位間のＰＵＣ１９に挿入した。
【０１０４】
ヒト化ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込んだサブゲノムレプリコンをコードする別のプラスミド（ｐＧＴ４ａＥＤ４３ＲｌｕｃＳＧ）を以下のように生成させた：ｐＧＴ４ａＥＤ４３ＳＧプラスミド（上記）をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ制限酵素（ｎｅｏ遺伝子を除くため）を用いて切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ＥＭＣＶ領域とともにｎｅｏ遺伝子と融合させたヒト化ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子をコードする遺伝子断片は、下記に記載されるｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａプラスミドからの以下のプライマー：２ａＲｌｕｃＮｅｏＡｓｃＩＦｏｒ：
【化６】
2014522647.tif 000008
（配列番号４、ＡｓｃＩ部位はプライマーによって導入され、下線が付される）、２ａＥＭＣＶＩＲＥＳＭｌｕＩＲｅｖ：
【化７】
2014522647.tif 000009
（配列番号５、ＭｌｕＩ部位に下線を付す）を用いたＡｃｃｕｐｒｉｍｅスーパーミックスＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用によってＰＣＲ増幅された。
【０１０５】
プラスミドｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａは、プラスミドｐＬｕｃＮｅｏ２ａ（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年））から誘導された。ｈウミシイタケルシフェラーゼ−ネオマイシン融合遺伝子（ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ）は、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｆｅＩ  ｈＲＬｕｃ  ＦｗｄとＮｏｔＩ  Ｎｅｏ  Ｒｅｖのプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ｐＦ９  ＣＭＶ  ｈＲｌｕｃ−ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅された。これらの２つのプライマーは、以下の配列を有し、その後のクローニングのために制限部位が導入された：ＡｆｅＩ  ｈＲＬｕｃ：
【化８】
2014522647.tif 000010
（配列番号６、ＡｆｅＩ部位に下線を引く）、ＮｏｔＩ  Ｎｅｏ  Ｒｅｖ：
【化９】
2014522647.tif 000011
（配列番号７、ＮｏｔＩ部位に下線を引く）。ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。得られたプラスミドをＡｆｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、切り出された断片（ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ）は、同じ酵素で消化されたｐＬｕｃＮｅｏ２ａにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲーションされた。得られたベクターのｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａを配列決定し、ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ融合遺伝子の正しい配向および配列を確認した。
【０１０６】
続いてＰＣＲ断片をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ベクターおよび挿入片は、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてライゲーションされた。得られたベクターｐＧＴ４ａＥＤ４３ＲｌｕｃＳＧを配列決定し、ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏの正しい配向および配列を確認した。
変異レプリコンの構築
【０１０７】
適応変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いた部位特異的変異誘発によってｐＧＴ４ａＥＤ４３ＲｌｕｃＮｅｏＳＧレプリコンに導入された。すべての変異は、ＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によるＤＮＡ配列決定によって確認された。
ＲＮＡ転写
【０１０８】
遺伝子型４ａのサブゲノムＨＣＶレプリコンをコードするプラスミドを、ＸｂａＩを用いて線形化し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｔ７  ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＲＮｅａｓｙキットを用いて、それぞれ合成し、精製した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍの光学濃度を用いて測定され、０．８％アガロースゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確認された。
ＲＮＡトランスフェクションおよび安定なレプリコン細胞系の単離
【０１０９】
インビトロ転写されたＲＮＡの１０μｇは、従前に記載の通り（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４巻：３０９９〜１０６頁（２０１０年））、エレクトロポレーションによってＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃ、または１Ｃ細胞にトランスフェクトされた。要約すると、細胞をトリプシン処理および遠心分離によって回収し、次に、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０７細胞／ｍｌの濃度のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。レプリコンＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）キュベット（０．４ｃｍのギャップ）中の４００μｌの細胞懸濁液に添加された。細胞に２７０Ｖおよび９６０μＦでエレクトロポレーションを施し、室温にて１０分間インキュベートし、３０ｍｌの完全ＤＭＥＭ中に再懸濁し、次に、１００ｍｍ径のディッシュに播種した。播種の４８時間後、培地は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。Ｇ４１８選択の約３週間後に細胞クローンを単離し、増殖させ、初期の継代で凍結保存した。
レプリコンコロニー形成アッセイ
【０１１０】
Ｇ４１８耐性コロニー形成の効率を測定するために、細胞に指定した量のレプリコンＲＮＡまたは細胞ＲＮＡ抽出物をエレクトロポレーションによって導入し、２×１０５〜２×１０６細胞／１００ｍｍディッシュの範囲の複数の密度で播種した。播種の４８時間後、培地は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した完全ＤＭＥＭと交換し、１週間に２回新鮮なものにされた。３週間後、コロニープレートを細胞増殖のために使用し、またはＧ４１８耐性の細胞増殖巣（ｆｏｃｉ）を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈ２Ｏ中の０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。
ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出、増幅、および遺伝子型分析
【０１１１】
ＨＣＶ  ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲ、および配列決定をＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって行った。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、ＨＣＶレプリコン細胞ＲＮＡを抽出し、精製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われた。ＰＣＲ産物をＴＡＣＧｅｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって配列決定した。
間接免疫蛍光法によるＮＳ５Ａタンパク質の検出
【０１１２】
レプリコン細胞をウェルあたり１×１０４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間培養後、次に、細胞は、従前に記載の通り（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年））、ＮＳ５Ａタンパク質について染色された。要約すると、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定した。続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％ＦＢＳでブロッキングし、次に、抗ＮＳ５Ａ抗体で染色した。染色は、マウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ａｐａｔｈ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ）の１：１０，０００希釈を用いて行われた。ＰＢＳ中で３回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５にコンジュゲートされた二次抗マウス抗体を用いて、抗ＮＳ５Ａ抗体で標識された細胞を検出した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核を１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて画像化した。
レプリコンＲＮＡ複製についてのレプリコン細胞ＮＳ３プロテアーゼアッセイ
【０１１３】
遺伝子型４ａクローンレプリコン細胞をウェルあたり１×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートし、その後、培養培地を除去した。次に、レプリコン細胞は、プレートシェーカー上で室温にて２０分間、１５０ｍＭのＮａＣｌを補充した１×Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ溶解緩衝液の９０μｌを用いて溶解された。上記の溶解緩衝液中で１μＭユーロピウム標識ＮＳ３基質の１０μｌを各ウェルに添加した。プロテアーゼ活性データを収集し、従前に記載の通り（Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年））に分析した。
レプリコン抗ウイルスアッセイ
【０１１４】
２，０００細胞／ウェルは、Ｇ４１８を除いた９０μｌのＤＭＥＭ培地を含む３８４ウェルプレートに播種された。ＨＣＶ阻害剤（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な化合物Ａ〜Ｅ）を１：２２５希釈で細胞に添加し、９０．４μｌの総体積で最終濃度を０．４４％とした。１０種の濃度の３倍連続薬物希釈液を使用し、開始濃度は、すべての試験された化合物について４．４μＭまたは０．４４μＭであり、ただし、化合物Ａの開始濃度は４４．４ｎＭであった。細胞プレートを３７℃にて３日間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞をレプリコンレベルに対するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量化された。ルシフェラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼ活性レベルは、未処理の対照のレベル（１００％として定義される）と比較した百分率に変換され、データは、ＸＬＦｉｔ４ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いてロジスティック用量応答式ｙ ａ／［１ （ｘ／ｂ）ｃ］に適合させた（ｙは正規化されたルシフェラーゼシグナルの量であり、ｘは薬物濃度であり、ａは曲線の振幅であり、ｂはその転移中心でのｘ値［ＥＣ５０］であり、ｃは転移幅を定義するパラメータである）。
結果
適応変異
【０１１５】
図２に示される戦略を用いて、いくつかのＧＴ４ａコロニーを得た。次に、ＲＮＡをこれらのコロニーから抽出した。図３に示されるように、Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞は、ＧＴ４ａレプリコン複製に対して、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞または５１Ｃ細胞よりも許容的であった。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞を用いて、ＧＴ４ａレプリコンのコロニー形成能を試験し、元のＧＴ４ａのＲＮＡと比較した。図４に示されるように、ＧＴ４ａコロニーから抽出されたＲＮＡの大幅に高められたコロニー形成効率は、レプリコンが、インビトロにおいてロバストな複製を可能にする適応変化を獲得したことを示す。
【０１１６】
次に、ＮＳ５ＡおよびＮＳ３タンパク質の発現を調べ、ＧＴ４ａレプリコンの複製を確認した。抗ＮＳ５Ａ抗体で染色した場合、ＧＴ４ａレプリコン細胞は、ＮＳ５Ａについて明らかに陽性であり、これは盛んな複製を示した（図５Ａ）。同じ状態において（ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｖｅｉｎ）、ロバストなレプリコン活性を示す、ロバストなＮＳ３活性は、ＧＴ４ａレプリコン細胞系に観察され、数種のＧＴ４ａレプリコン細胞系では、陽性対照として用いられた標準的なＧＴ１ａおよび１ｂレプリコン細胞によって生成されたＮＳ３シグナルを超えていた（図５Ｂ）。明らかに、ＧＴ４ｂレプリコンは、該細胞において盛んに複製していた。
【０１１７】
さらに、ＧＴ４ａコロニーを溶解した場合、細胞溶解物においてＮＳ５Ａの強い発現が検出され（図６）、これは、これらの細胞が、標準のＧＴ１ｂレプリコン細胞のＮＳ５Ａ発現レベルを超えている、またはそれに匹敵しているかのいずれかで、ＧＴ４ａレプリコンを安定およびロバストに複製することを裏付けた。
【０１１８】
選択されたＧＴ４ａレプリコン細胞系またはプールされた細胞系を増殖させ、遺伝子型分析に供した。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、総ＲＮＡを抽出し、精製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われた。ＰＣＲ産物をＴＡＣＧｅｎによって配列決定した。ＧＴ４レプリコンの適合中に出現した新規な変異を表１に示す。
表１．ＧＴ４ａレプリコン細胞において同定された変異
【表１】
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【０１１９】
次に、これらの変異は、部位特異的変異誘発によって、元のＧＴ４ａのＲＮＡに導入することによって試験された。図７は、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞（左パネル）および１Ｃ細胞（右パネル）の両方において、Ｑ３４Ｒ変異を有するＧＴ４ａのＲＮＡは、ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ＲｌｕｃＮｅｏがコロニーを樹立できるようにしたことを、一方、この変異を含まない同じレプリコンはコロニーを樹立しないことを示す。
【０１２０】
同様に、ＧＴ４ａがコロニーを樹立し得るようにするＮＳ３のＡ２００Ｅ、Ｔ３４３ＫとＴ３４３Ｒ、およびＮＳ４ＡのＱ３４Ｒ、Ｑ３４ＫとＥ５２Ｖ変異の能力もまたＨｕｈ７  １Ｃ細胞において確認された（図８）。図８は、ＲＮＡ複製とは独立した挿入ＲＮＡの直接的な翻訳由来のシグナルの初期低下後の第２日からＲｌｕｃシグナルの増加によって証明されるように、試験されたすべての変異であるＮＳ３遺伝子におけるＡ２００Ｅ、Ｔ３４３ＲとＴ３４３Ｋ、およびＮＳ４Ａ遺伝子におけるＱ３４Ｋ、Ｑ３４ＲとＥ５２Ｖは、ＧＴ４ａ  ＥＤ４３−ＲｌｕｃＮｅｏ複製を有意に増強したことを示す。対照的に、変異を含まない同じレプリコンは、いかなる意味のある複製も示さなかった。
【０１２１】
適応変異を含む遺伝子型４レプリコンの同定後、抗ウイルス剤のスクリーニングにおけるこれらのレプリコンの有用性が、種々の抗ＨＣＶ剤を用いて評価された。ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ活性部位、ＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ５Ｂ非活性部位、ＮＳ４Ａおよび宿主因子を標的とする、異なるクラスのＨＣＶ阻害剤が、ＮＳ４ＡのＱ３４Ｒ変異を担持する安定な遺伝子型１ｂおよび遺伝子型４ａのＲｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコン細胞に対するこれらの抗ウイルス活性について評価された。
【０１２２】
安定な遺伝子型１ｂレプリコン細胞の場合と同様に、遺伝子型４ａレプリコンに対するＥＣ５０値は、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性を測定することによって、ハイスループットの３８４ウェルフォーマットにおいて、すべての阻害剤について首尾よく得られた。阻害データを表２に列挙し、化合物Ｂが、匹敵するＥＣ５０値を有して遺伝子型１ｂと４ａレプリコンの両方に対して効力があったことを示す。さらに、化合物ＡはＧＴ４ａに対して５０倍の効力を喪失したが、効力を保持していた。
【０１２３】
しかしながら、化合物Ｄおよび化合物Ｅは、それぞれ約１０００倍および１０倍、その活性を喪失した。化合物Ｃは、遺伝子型４ａレプリコンに対して効力を保持しており、遺伝子型１ｂレプリコンに対するその活性と比較して、これらの効力をわずかに（１．５〜３倍）喪失させた。
【０１２４】
これらの結果は、この新規な遺伝子型４ａのＲｌｕｃ−Ｎｅｏレプリコンが、ＨＣＶ遺伝子型４ａに対する創薬およびリード化合物の最適化のための貴重なツールとして役立ち得ることを実証する。
表２．遺伝子型１ｂおよび４ａレプリコンに対する抗ウイルス活性またはＨＣＶ阻害の比較
【表２】
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【０１２５】
ここで、本出願人は、インビトロにおいて効率的に複製する最初の遺伝子型４レプリコンの単離を報告する。ロバストな複製は、ＮＳ５ＡとともにＮＳ３またはＮＳ４Ａにおける適応変異を必要とすることが実証される。適応変異をルシフェラーゼをコードする構築物に組み込むことによって、出願人は、抗ウイルス化合物をプロファイルすることを可能にする遺伝子型４レプリコン細胞クローンを生成することができた。これらのレプリコン細胞はまた、分子ウイルス学研究、およびＨＣＶ遺伝子型４の患者において明らかになりつつある耐性変異の特徴付けのための貴重なツールとして役立つはずである。
【０１２６】
要約すると、遺伝子型４ａのＥＤ４３株に基づくサブゲノムレプリコンのｃＤＮＡを合成し、クローニングし、転写し、ＨＣＶ許容細胞系にエレクトロポレーションによって導入した。遺伝子型４ａレプリコンを安定に複製するクローン細胞系をＧ４１８で選択した。適応変異は、ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によって同定され、部位特異的変異誘発によって親のレプリコンへと工学的に作製した。
【０１２７】
複数の異なる許容細胞系への多数のエレクトロポレーションは、遺伝子型４レプリコンを複製するいくつかのコロニーの同定を可能にした。これらのレプリコンクローンの増殖および配列決定は、ウイルスタンパク質における適応変異を明らかにした。これらの適応変異は、ＮＳ３（Ｔ３４３Ｋ／Ｒ、Ａ２００ＥもしくはＴ５１１Ｋ）、ＮＳ４Ａ（Ｑ３４Ｋ／ＲもしくはＥ５２Ｖ）またはＮＳ５Ａ（Ｌ１７９Ｐ）に位置した。これらの適応変異は、工学的に作製されて親のＥＤ４３株に戻され、複製およびコロニー形成効率を大幅に増大させることができた。
【０１２８】
ロバストな遺伝子型４レプリコン系の樹立は、創薬および医薬品開発の努力を促進するための強力なツールを提供する。他の遺伝子型に由来するものと併せたこれらの新規レプリコンの使用は、汎遺伝子型のＨＣＶレジメンの開発を支援する。
（実施例２）
遺伝子型４に関する新規ＨＣＶ阻害剤のスクリーニング
【０１２９】
実施例１は、遺伝子型１などの他の遺伝子型に対するＨＣＶ阻害剤であることが公知である作用物質が、遺伝子型４のＨＣＶの阻害におけるこれらの有効性について遺伝子型４レプリコンを用いて試験することができることを示す。また、ＨＣＶに阻害性であることが未だ知られていない作用物質が、これらの遺伝子型４レプリコンを用いて同様にスクリーニングされ得ることが意図される。
【０１３０】
候補ＨＣＶ阻害剤は、低分子薬物、抗体などのペプチドもしくはタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの核酸系であってもよい。候補ＨＣＶ阻害剤は、細胞においてレプリコンが複製し得るのに適切な温度、期間で、遺伝子型４レプリコンを含む細胞とともにインキュベートされる。レプリコンは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むことができ、このような場合において、インキュベーション期間の終了時点で、細胞は、レプリコンレベルに関するマーカーとしてルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイを用いて定量化することができる。あるいは、ＨＣＶ阻害剤の有効性は、レプリコンによってコードされるタンパク質の発現または活性によって測定することができる。このようなタンパク質の一例はＮＳ３プロテアーゼであり、タンパク質の発現または活性の検出は、当該技術分野において公知の方法、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年）を用いて行うことができる。
【０１３１】
次に、ルシフェラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼの活性レベルは、未処理またはＨＣＶを阻害する公知の活性を有する作用物質で処理することができる対照におけるレベルと比した百分率に変換される。未処理の対照と比較した場合、ＨＣＶ複製の低下またはＮＳ３活性の低下は、候補作用物質が、ＨＣＶの対応する遺伝子型を阻害することができることを示す。同様に、対照の作用物質と比較した場合、ＨＣＶ複製のより大きな低下またはＮＳ３活性のより大きな低下は、候補物が対照の作用物質よりも有効であることを示す。
【０１３２】
当業者には、本明細書では明確に記載されていないまたは示されていないが、本開示の原理を具現化し本開示の趣旨および範囲内に包含されている種々の構成を案出し得ることが理解される。さらに、本明細書で挙げたすべての条件付き用語は、基本的には、読者が、本開示の原理および当該技術を促進させようとする本発明者が寄与する概念を理解する助けとなるようにするものであり、そうした具体的に挙げられた条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本開示の原理、態様および実施形態に言及する本明細書のすべての記述は、その構造的均等物と機能的均等物の両方を包含するものとする。さらに、そうした均等物は現時点で公知の均等物と将来開発される均等物、すなわち構造に関係なく、同じ機能を遂行する開発された任意の要素の両方を包含するものとする。したがって、本開示の範囲は、本明細書で示し記載した例示としての実施形態に限定されるものではない。むしろ、本開示の範囲および趣旨は添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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