(57)【要約】本発明は、抗体、抗体フラグメントおよび／もしくは抗体成分の混合物を迅速かつ効率的に分離して、上記混合物から所望の抗体生成物を単離するために、種々の抗体特異的精製媒体を使用して抗体を精製するための方法を提供する。本発明は、免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を有する二重特異的モノクローナル抗体（例えば、単一の重鎖および２つの異なる軽鎖（一方は、κ定常ドメインを含み、他方は、λ定常ドメインを含む）から構成される抗体（共通の重鎖を共有する異なる特異性の抗体を含む））の精製に関する。本発明はまた、遊離軽鎖を含むインタクトでない抗体からインタクトな抗体を分離することによって、インタクトな抗体を効率的に精製するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各結合部位において異なる特異性を有し、２コピーの単一の重鎖ポリペプチド、ならびにκ定常領域を含む第１の軽鎖およびλ定常領域を含む第２の軽鎖からなる二重特異的モノクローナル抗体を精製する方法であって、該方法は、
（ａ）各結合部位において異なる特異性を有し、２コピーの単一の重鎖ポリペプチド、ならびにκ定常領域を含む第１の軽鎖およびλ定常領域を含む第２の軽鎖からなる１種以上の該二重特異的モノクローナル抗体（二重特異的ＭＡｂ）；２個のλ軽鎖もしくはその一部を有する１種以上の単一特異的モノクローナル抗体（λ−ＭＡｂ）；ならびに２個のカッパ軽鎖もしくはその一部を有する１種以上の単一特異的モノクローナル抗体（κ−ＭＡｂ）を含む混合抗体組成物を提供する工程；
（ｂ）κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して特異的親和性を有する分離手段を提供する工程；
（ｃ）該分離手段と該混合抗体組成物とを、該κ−ＭＡｂのκ軽鎖定常領域によるかもしくは該λ−ＭＡｂのλ軽鎖定常領域による該分離手段への結合と比較して、該二重特異的ＭＡｂによる該分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程；ならびに
（ｄ）該κ−ＭＡｂのκ軽鎖定常領域の脱離もしくは該λ−ＭＡｂのλ軽鎖定常領域の脱離と比較して、該二重特異的ＭＡｂの優先的脱離を可能にする条件下で、該分離手段から抗体を溶離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離手段は、κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分離手段は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂もしくはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ含有樹脂である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドは、抗λモノクローナル抗体もしくは抗κモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記結合および／もしくは溶離条件は、ｐＨレベルにおける段階的変化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結合および／もしくは溶離条件は、前記組成物中のアミノ酸の濃度の変化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび／もしくはグリシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを混合物から精製する方法であって、該方法は、
（ａ）１種以上のインタクトな抗体および少なくとも１種のインタクトでない抗体分子を含む混合抗体組成物を提供する工程であって、ここで該インタクトでない抗体分子は、１種以上の抗体成分、抗体成分の１種以上のダイマー、１種以上の抗体フラグメント、およびこれらの組み合わせを含む、工程；
（ｂ）インタクトな抗体とインタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程；
（ｃ）該分離手段と該混合抗体組成物とを、該インタクトでない抗体分子による該分離手段への結合と比較して、該１種以上のインタクトな抗体による該分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程；ならびに
（ｄ）該１種以上のインタクトな抗体を、該分離手段から分離し、該１種以上のインタクトな抗体を保持する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離手段は、インタクトな抗体分子に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離手段は、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ樹脂である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）は、前記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、前記分離手段から、前記インタクトでない抗体分子の脱離と比較して、該分離手段からの該１種以上のインタクトな抗体の優先的脱離を可能にする条件下で溶離する工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）は、前記分離手段を、該分離手段への前記１種以上の抗体の結合を可能にするが、該分離手段への前記インタクトでない抗体分子の結合を可能にしない条件下で接触させる工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）は、前記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、該１種以上のインタクトな抗体の脱離を可能にする条件下で、前記分離手段から溶離する工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）は、任意の結合していない、インタクトでない抗体分子を、前記組成物から除去する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、混合物から精製する方法であって、該方法は、
（ａ）１種以上のインタクトな抗体および少なくとも１種のインタクトでない抗体分子を含む混合抗体組成物を提供する工程であって、ここで該インタクトでない抗体分子は、１種以上の抗体成分、抗体成分の１種以上のダイマー、１種以上の抗体フラグメント、およびこれらの組み合わせを含む、工程；
（ｂ）インタクトな抗体とインタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程；
（ｃ）該分離手段と該混合抗体組成物とを、該インタクトでない抗体分子による該分離手段への結合を可能にするが、該１種以上のインタクトな抗体による該分離手段への結合を可能にせず、その結果、該１種以上のインタクトな抗体が、結合していない画分中に残る条件下で接触させる工程；ならびに
（ｄ）１種以上のインタクトな抗体を含む該結合していない画分を保持する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離手段は、インタクトでない抗体分子に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分離手段は、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ樹脂である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１１年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５４８，９５８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗体、抗体フラグメントおよび／もしくは抗体成分の混合物を迅速にかつ効率的に分離して所望の抗体生成物を上記混合物から単離するための、種々の抗体特異的アフィニティー媒体を使用して抗体を精製するための方法を提供する。本発明は、免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を有する二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）モノクローナル抗体（例えば、単一の重鎖および２つの異なる軽鎖（一方は、κ定常ドメインを含み、他方は、λ定常ドメインを含む）から構成される抗体（共通の重鎖を共有する異なる特異性の抗体を含む）の精製に関する。本発明はまた、インタクトな抗体を、抗体細胞培養発現プロセスの間に生成された遊離軽鎖から分離することによって、インタクトな抗体を効率的に精製するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
抗体は、４つのポリペプチド：２個の重鎖および２個の軽鎖、から構成される。抗体の抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）によって形成される。これらドメインの１つの末端において、６つのループが抗原結合部位を形成し、相補性決定領域（ＣＤＲ）ともいわれる。３個のＣＤＲが上記ＶＨドメインに位置し（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）、他の３個が、上記ＶＬドメインにある（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）。
【０００４】
免疫グロブリンの大部分は、２個の同一の重鎖ポリペプチドおよび２個の同一な軽鎖ポリペプチドから構成されるので、両方のアーム上で同じ特異性を有する二価でありかつ単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子である。
【０００５】
モノクローナル抗体は、ヒト疾患のいくつかの領域において、治療的介入のための成功したかつ魅力的な分子のクラスとして出現した。しかし、単一のタンパク質を標的化もしくは中和することは、モノクローナル抗体の治療的使用を制限する特定の疾患において効力を達成するには、常に十分であるわけではない。多くの適応症において、生物学的系の１つの成分を中和することが効力を達成するには十分でないということは、ますます明らかである。この問題の１つの解決法は、いくつかのモノクローナル抗体を同時に投与することである。しかし、このアプローチは、組み合わされる予定の抗体が、以前から個々に承認されていない場合には、規制的側面から複雑である。さらに、組み合わせアプローチはまた、製造の観点からコストがかかる。よって、複数の抗原を単一の分子で標的化することを可能にする抗体および治療剤、ならびにこれら多重特異的抗体を効率的に精製および単離することが必要である。また、抗体、抗体フラグメントおよび／もしくは抗体成分を含む混合物からインタクトな抗体を効率的に精製および単離することが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、抗体特異的精製媒体および関連試薬を使用して、所望の抗体生成物もしくは所望の抗体生成物の組み合わせを、抗体、抗体フラグメント、抗体成分（例えば、遊離軽鎖）、およびこれらの組み合わせの混合物から、分離および単離する種々の技術を提供する。本明細書で提供される方法は、所望の抗体生成物もしくは所望の抗体生成物の組み合わせを、抗体および／もしくはそのフラグメントの混合物から迅速にかつ効率的に分離する。例えば、いくつかの実施形態において、上記方法は、インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、抗体成分（例えば、抗体製造プロセスの副生成物である遊離軽鎖）から単離するように設計される。本明細書で使用される場合、用語「インタクト」な抗体分子とは、全長抗体のフラグメントおよび／もしくは他の部分（これらは、「インタクトでない」抗体として、本明細書でまとめて言及される）とは対照的に、全長抗体を意味する。上記インタクトな抗体は、任意のインタクトな抗体であり得、非限定的例によれば、インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体（例えば、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体および／もしくは他のインタクトなキメラ抗体）が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記方法は、二重特異的抗体（例えば、単一の重鎖および少なくとも１個のカッパ（κ）軽鎖領域（もしくはκ軽鎖に由来する軽鎖領域）および少なくとも１個のラムダ（λ）軽鎖領域（もしくはλ軽鎖由来の軽鎖領域）を有する二重特異的抗体を単離するように設計されている。
【０００７】
上記精製媒体は、いくつかの実施形態において、κ軽鎖（もしくはその一部）を含む抗体およびそのフラグメントを単離するアフィニティー媒体（例えば、κ軽鎖およびその一部に対して特異的な樹脂もしくは他の分離手段（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂および／もしくはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ含有樹脂）である。上記精製媒体は、いくつかの実施形態において、λ軽鎖（もしくはその一部）を含む抗体およびそのフラグメントを単離するアフィニティー媒体（例えば、λ軽鎖およびその一部に対して特異的な樹脂もしくは他の分離手段（例えば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂））である。上記精製媒体は、抗体フラグメントおよび他の抗体成分（遊離軽鎖を含む）からインタクトなＩｇＧ抗体を単離する、例えば、混合モードクロマトグラフィー作用物質（例えば、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭクロマトグラフィー吸着剤）である。上記精製媒体は、いくつかの実施形態において、これら媒体のうちの１種以上の組み合わせである。
【０００８】
一局面において、本発明は、標準的抗体から連続して区別できない二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントの精製を可能にする。上記精製される抗体およびその抗原結合フラグメントの改変されていない性質は、上記抗体およびその抗原結合フラグメントに、標準的モノクローナル抗体に類似の都合のよい製造特性を提供する。
【０００９】
本明細書で提供される方法は、種々の二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメント、特に、２つの独立した標的に対する特異性を駆動する、共通のＩｇＧ重鎖および２種の異なる軽鎖（一方は、カッパ（κ）定常領域を有し、他方は、ラムダ（λ）定常領域を有する）を有する「κλ−ボディ（κλ−ｂｏｄｙ）」と本明細書でいわれる二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントを精製するために有用である。
【００１０】
精製される予定である上記二重特異的抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、種々の方法のうちのいずれかを使用して生成され得る。例えば、上記二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントは、（ｉ）異なる特異性を有し、そして同じ重鎖可変ドメインを共有するが、異なる可変軽鎖を有する（例えば、固定した重鎖を有する抗体ライブラリーもしくは単一のＶＨ遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用することによって）２種の抗体を単離する工程；（ｉｉ）上記重鎖可変ドメインを重鎖の定常領域に融合し、一方の軽鎖可変ドメインをκ定常ドメインに融合し、そして他方の軽鎖可変ドメインをλ定常ドメインに融合する工程；ならびに（ｉｉｉ）宿主細胞もしくは細胞株（例えば、哺乳動物細胞および／もしくは哺乳動物細胞株）において上記３種の鎖を同時発現し、３種の抗体（２種の単一特異的抗体および２個の異なる軽鎖を有する１種の二重特異的抗体）の混合物の上清中でアセンブリおよび分泌をもたらす工程によって生成され得る。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、第１の軽鎖の少なくとも第１の部分は、κタイプであり、上記第２の軽鎖の少なくとも一部は、λタイプである。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第１の軽鎖は、少なくともκ定常領域を含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第１の軽鎖は、κ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第１の軽鎖は、λ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第２の軽鎖は、少なくともλ定常領域を含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第２の軽鎖は、λ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第２の軽鎖は、κ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第１の軽鎖は、κ定常領域およびκ可変領域を含み、上記第２の軽鎖は、λ定常領域およびλ可変領域を含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記定常および可変フレームワーク領域配列は、ヒトのものである。
【００１１】
この方法もしくは当該分野で公知の任意の他の適切な方法を使用して生成された上記二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗体精製に使用される標準的クロマトグラフィー技術を使用して精製される。この方法もしくは当該分野で公知の任意の他の適切な方法を使用して生成される上記二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、他の分離技術を使用して（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、膜濾過技術およびタンパク質沈殿技術によって）精製され得る。好ましい実施形態において、上記二重特異的抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーもしくはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌアフィニティークロマトグラフィーを使用して、精製される。
【００１２】
本発明は、各結合部位において異なる特異性を有し、２コピーの単一の重鎖ポリペプチドならびにκ定常領域を含む第１の軽鎖およびλ定常領域を含む第２の軽鎖からなる二重特異的モノクローナル抗体を精製するための方法を提供する。これら方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）各結合部位において異なる特異性を有し、２コピーの単一の重鎖ポリペプチドならびにκ定常領域を含む第１の軽鎖およびλ定常領域を含む第２の軽鎖からなる１種以上の二重特異的モノクローナル抗体（二重特異的ＭＡｂ）；２個のλ軽鎖もしくはその一部を有する１種以上の単一特異的モノクローナル抗体（λ−ＭＡｂ）；ならびに２個のκ軽鎖もしくはその一部を有する１種以上の単一特異的モノクローナル抗体（κ−ＭＡｂ）を含む混合抗体組成物を提供する工程；（ｉｉ）κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して特異的な親和性を有する分離手段を提供する工程；（ｉｉｉ）上記分離手段と上記混合抗体組成物とを、上記κ−ＭＡｂのκ軽鎖定常領域によるかもしくは上記λ−ＭＡｂのλ軽鎖定常領域による上記分離手段への結合と比較して、上記二重特異的ＭＡｂによる上記分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程；ならびに（ｉｖ）上記κ−ＭＡｂのκ軽鎖定常領域の脱離もしくは上記λ−ＭＡｂのλ軽鎖定常領域の脱離と比較して、上記二重特異的ＭＡｂの優先的脱離を可能にする条件下で、上記分離手段から抗体を溶離する工程。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）であり、いくつかの実施形態において、上記分離手段は、κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂、もしくはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ樹脂である。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、抗λモノクローナル抗体もしくは抗κモノクローナル抗体である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、上記結合および／もしくは溶離条件は、ｐＨレベルにおける段階的変化を含む。いくつかの実施形態において、上記結合および／もしくは溶離条件は、無機塩濃度（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度もしくは他の無機塩（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、ホフマイスターシリーズのイオンからの無機塩組み合わせ）の濃度）における段階的変化を含む。いくつかの実施形態において、上記結合および／もしくは溶離条件は、組成物中のアミノ酸の濃度（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび／もしくはグリシンの濃度）における段階的変化を含む。いくつかの実施形態において、上記結合および／もしくは溶離条件は、１種以上の温和な変性剤（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール８０００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０、ならびに他のイオン性、非イオン性および／もしくは双性イオン性界面活性剤）を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、溶離した画分中の二重特異的抗体、κ−ＭＡｂおよび／もしくはλ−ＭＡｂの純度および割合を決定するためのさらなる工程を包含する。この工程は、種々の当該分野で認識された技術のうちのいずれか（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））を使用して達成され得る。
【００１６】
本明細書で提供される実施例は、より高いｐＨ段階的溶離を使用すると、より低いｐＨで溶離する単一特異的κ−ＭＡｂより二重特異的κλ−ボディ生成物をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー樹脂から優先的に溶離するという実行可能性を実証する。なぜなら、上記単一特異的ＭＡｂは、上記単一特異的形式中の２個のκ鎖の存在のおかげで、上記κλ−ボディ中の単一のκ鎖とは対照的に、上記樹脂に対してより高い親和性を有するからである。本明細書で記載される方法は、上記軽鎖に対する親和性が上記単一特異的および／もしくは二重特異的生成物を差次的に結合するために使用される他のクロマトグラフィー支持体（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ、イオン交換、疎水性相互作用、および混合モード樹脂（例えば、ヒドロキシアパタイト）ならびに他のクロマトグラフィー技術）において有用である。当業者は、このカテゴリー内に入る他の当該分野で認識された技術を容易に理解する。上記異なる生成物を分離する溶離ストラテジーは、ｐＨ変化に限定されるべきではなく、非限定的かつ非網羅的な例によれば、塩濃度（例えば、ＮａＣｌ濃度もしくは他の無機塩（例えば、ホフマイスターシリーズのイオンからの無機塩の組み合わせ）の濃度）、アルギニンおよび他のアミノ酸の濃度（例えば、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびグリシンの濃度）の段階的変化を使用するカチオン交換分離技術、温和な変性剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール８０００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０、ならびに他のイオン性、非イオン性および／もしくは双性イオン性界面活性剤など）の使用をも包含し得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、インタクトな抗体（単一特異的抗体、二重特異的抗体およびインタクトな抗体の混合物を含む）からの遊離軽鎖の効率的除去に関する。特に、クロマトグラフィー条件は、インタクトな二重特異的もしくは単一特異的モノクローナル抗体、またはインタクトな二重特異的もしくは単一特異的モノクローナル抗体の組み合わせを、遊離軽鎖から単離するために適用可能であることが同定された。
【００１８】
本明細書で提供される実施例は、遊離軽鎖を含む混合物からの、インタクトなＩｇＧ分子の上記混合モードアフィニティー単離のために二重特異的抗体を使用する。これは、例に過ぎず、本明細書で提供される方法が、モノマーもしくはポリマーとして、および天然のもしくは変化したコンホメーションにおいて存在し得る不完全な抗体成分（すなわち、インタクトでない抗体）を生成する任意の抗体製造プロセスと組み合わせて有用であることは、理解されるべきである。さらに、本明細書で提供される実施例が、インタクトなＩｇＧ抗体を同定する精製媒体を使用するが、これら方法が他のインタクトな抗体分子を同定する任意の精製媒体とともに使用され得ることは、理解されるべきである。
【００１９】
当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して生成された上記インタクトな抗体分子は、本明細書で提供される混合モードクロマトグラフィー分離技術単独で、もしくは任意の他の適切な分離技術（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、膜濾過技術およびタンパク質沈澱技術）と組み合わせて使用して、精製され得る。
【００２０】
本発明は、インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、インタクトでない抗体（抗体成分、抗体成分のダイマー、抗体フラグメントおよび／もしくはこれらの組み合わせを含む）を含む混合物から精製するための方法を提供する。上記インタクトな抗体の組み合わせは、インタクトな抗体の１種以上の異なるタイプ（同じ標的もしくは異なる標的を結合する抗体を含む）を含み得る。上記インタクトな抗体は、任意のインタクトな抗体（非限定的例によれば、インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体（例えば、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体、および／もしくは他のインタクトなキメラ抗体）が挙げられる）であり得る。上記インタクトな抗体の組み合わせは、同じ標的もしくは異なる標的に対する任意のインタクトな抗体の組み合わせ（非限定的例によれば、以下：インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体および／もしくは他のインタクトなキメラ抗体のうちの１種以上を含む組み合わせが挙げられる）を含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、これら方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせおよび１種以上のインタクトでない抗体分子（１種以上の抗体成分（例えば、遊離軽鎖）、抗体成分（例えば、遊離軽鎖）の１種以上のダイマー、および／もしくは１種以上の抗体フラグメントを含む）のうちの１種以上を含む混合抗体組成物を提供する工程；（ｉｉ）上記インタクトでない抗体分子と比較して、インタクトな抗体分子の間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程；（ｉｉｉ）上記分離手段と上記混合抗体組成物とを、インタクトでない抗体分子（例えば、１種以上の抗体成分（例えば、遊離軽鎖）、抗体成分（例えば、遊離軽鎖）の１種以上のダイマー、および／もしくは１種以上の抗体フラグメント）による上記分離手段への結合と比較して、上記インタクトな抗体分子もしくはインタクトな抗体の組み合わせによる上記分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程；ならびに（ｉｖ）上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、上記分離手段から分離し、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを保持し、それによって、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、上記混合抗体組成物から精製する工程。いくつかの実施形態において、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせは、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、上記分離手段から、上記インタクトでない抗体分子（例えば、１種以上の抗体成分（例えば、遊離軽鎖）、抗体成分（例えば、遊離軽鎖）の１種以上のダイマー、および／もしくは１種以上の抗体フラグメント）の脱離と比較して、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせの優先的脱離を可能にする条件下で溶離することによって、上記分離手段から分離される。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、上記分離手段への上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせによる結合を可能にするが、上記インタクトでない抗体分子と上記分離手段との間の結合を可能にしない条件下で、上記抗体混合組成物によって接触させられる。いくつかの実施形態において、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせは、任意の結合していない、インタクトでない抗体を上記混合抗体組成物から除去することによって、または上記結合していない、インタクトでない抗体を上記分離手段から流し去って上記結合していない画分を廃棄するかもしくはさもなければ除去することによって、上記インタクトでない抗体画分から分離される。いくつかの実施形態において、上記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、インタクトでない抗体分子と比較して、インタクトな抗体分子に対して差次的な特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー媒体（例えば、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）もしくはイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ））である。いくつかの実施形態において、上記混合モードクロマトグラフィー媒体は、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭである。他の混合モードクロマトグラフィー媒体としては、例えば、ＣａｐｉｏＴＭ  ＭＣ、ＣａｐｔｏＴＭ  ａｄｈｅｒｅ、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ、ＣＨＴＴＭセラミックヒドロキシアパタイト、およびＮｕｖｉａＴＭ  ｃＰｒｉｍｅＴＭが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、抗・抗体モノクローナル抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体）である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記溶離された画分における上記インタクトな抗体の純度および割合を決定するさらなる工程を包含する。この工程は、種々の当該分野で認識された技術のうちのいずれか（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）、もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））を使用して達成され得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、これら方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）１種以上の上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせおよび１種以上のインタクトでない抗体分子（１種以上の抗体成分（例えば、遊離軽鎖）、抗体成分（例えば、遊離軽鎖）の１種以上のダイマー、および／もしくは１種以上の抗体フラグメントを含む）を含む混合抗体組成物を提供する工程；（ｉｉ）インタクトな抗体分子と比較して、インタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程；（ｉｉｉ）上記分離手段と上記混合抗体組成物とを、上記インタクトでない抗体分子による上記分離手段への結合を可能にするが、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせによる上記分離手段への結合を可能にせず、その結果、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせが結合されていない画分の中に残る条件下で接触させる工程；ならびに（ｉｖ）上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを含む結合されていない画分を保持する工程。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記インタクトでない抗体分子を上記分離手段から分離するさらなる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、インタクトな抗体分子に対して差次的な特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー媒体（例えば、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）もしくはイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ））である。いくつかの実施形態において、上記混合モードクロマトグラフィー媒体は、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭである。他の混合モードクロマトグラフィー媒体としては、例えば、ＣａｐｔｏＴＭ  ＭＭＣ、ＣａｐｔｏＴＭ  ａｄｈｅｒｅ、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ、ＣＨＴＴＭセラミックヒドロキシアパタイト、およびＮｕｖｉａＴＭ  ｃＰｒｉｍｅＴＭが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、抗・抗体モノクローナル抗体抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体）である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記溶離した画分における上記インタクトな抗体の純度および割合を決定するさらなる工程を包含する。この工程は、種々の当該分野で認識された技術のうちのいずれか（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）、もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））を使用して達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、２コピーの特有の重鎖ポリペプチドならびに２個の異なる軽鎖ポリペプチドから構成される異なるκλ−ボディ二重特異的抗体の構造の模式図である。これら図に示される上記κ軽鎖および上記λ軽鎖（もしくはこれらの一部）の位置および／もしくは構成は、限定ではないことが意図される。当業者は、上記κ軽鎖および上記λ軽鎖（もしくはこれらの一部）がまた、図１Ａ〜１Ｃに示される二重特異的抗体の鏡像を生じるように配置され得ることを認識する。当業者はまた、図１Ａ〜１Ｃにおける完全ＩｇＧ形式で表されている二重特異的抗体がまた、他の免疫グロブリンアイソタイプを使用して、もしくはＦ（ａｂ’）２のような他の免疫グロブリン形式において生成され得ることを認識する。図１Ａ．κ定常ドメインに融合されたκ可変ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたλ可変ドメイン。図１Ｂ．κ定常ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたκ可変ドメイン。図１Ｃ．κ定常ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたλ可変ドメイン。
【図２】図２は、ＣＨＯ細胞における３シストロン発現ベクター（ｔｒｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）の発現が、３種の抗体生成物を、ＩｇＧ生成物（「ＩｇＧ」と表示された中央パネル）および遊離軽鎖（ＦＬＣ）の混合物、ならびにこれらＦＬＣのダイマー（「ＦＬＣ」と表示された下側のパネル）に関して、理論上２５：５０：２５の比で生じることを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、段階的ｐＨ溶離を使用するＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーの代表的ＵＶトレースプロフィールを示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶離画分の非還元型および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶離画分のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、段階的ｐＨ溶離を使用するＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーの代表的ＵＶトレースプロフィールを示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ溶離画分の非還元型および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ溶離画分のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、段階的ｐＨ溶離を使用するＭｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ混合モードクロマトグラフィーの代表的ＵＶトレースプロフィールを示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ溶離画分の非還元型および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ溶離画分のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（詳細な説明）
本発明は、抗体特異的アフィニティー媒体および関連試薬を使用して、所望の抗体生成物を、抗体、抗体フラグメント、抗体成分（例えば、遊離軽鎖）、およびこれらの組み合わせの混合物から分離および単離する種々の技術を提供する。本明細書で提供される方法は、所望の抗体生成物を、抗体および／もしくはこれらのフラグメントの混合物から迅速にかつ効率的に分離する。
【００２９】
本発明は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一な二重特異的抗体を精製するための方法を提供する。この分子タイプは、２コピーの特有の重鎖ポリペプチド、定常κドメインに融合された第１の軽鎖可変領域および定常λドメインに融合された第２の軽鎖可変領域から構成される。各結合部位は、上記重鎖および軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を示す。上記軽鎖可変領域は、λファミリーもしくはκファミリーのものであり得、好ましくは、それぞれ、λ定常ドメインおよびκ定常ドメインに融合される。これは、非天然のポリペプチド接合部の生成を回避するために好ましい。しかし、κ軽鎖可変ドメインを第１の特異性のために定常λドメインに融合し、λ軽鎖可変ドメインを第２の特異性のために定常κドメインに融合することによって、本発明の二重特異的抗体を得ることもまた可能である（図１）。本明細書で記載される二重特異的抗体は、ＩｇＧκλ抗体もしくは「κλ−ボディ」（完全ヒト二重特異的ＩｇＧ形式）ともいわれる。このκλ−ボディ形式は、標準的モノクローナル抗体、例えば、標準的ＩｇＧ分子から区別不能である二重特異的抗体のアフィニティー精製を可能にし、従って、以前の形式と比較して都合がよい。
【００３０】
上記κλ−ボディは、同じ重鎖可変ドメインを共有する、異なる抗原特異性を有する２種の抗体Ｆｖ領域（各々、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインによって構成される）を同定することによって生成される。
【００３１】
本発明はまた、インタクトでない抗体分子（例えば、抗体成分、抗体成分のダイマー、抗体フラグメントおよび／もしくはこれらの組み合わせを含む）を含む混合物からインタクトな抗体を精製するための方法を提供する。
【００３２】
本発明の方法を使用して精製される予定である上記κλ−ボディおよび／もしくはインタクトな抗体は、抗体を生成するための種々の方法のうちのいずれかを使用して生成される。モノクローナル抗体およびそのフラグメントの生成について多くの方法が記載されてきた（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，  １９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。完全ヒト抗体は、軽鎖および重鎖（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含む）両方の配列が、ヒト遺伝子から生じる抗体分子である。ＣＤＲ３領域は、ヒト起源のものであり得るか、または合成手段によって設計され得る。このような抗体は、「ヒト抗体」もしくは「完全ヒト抗体」と本明細書でいわれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：  ７２を参照のこと）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術を使用して、ヒトモノクローナル抗体（Ｃｏｌｅら、１９８５  Ｉｎ：  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６を参照のこと）を生成することによって、調製され得る。ヒトモノクローナル抗体が利用され得、それは、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅら、１９８３．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：  ２０２６−２０３０を参照のこと）もしくはヒトＢ細胞をインビトロで、エプスタイン・バー・ウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、１９８５  Ｉｎ：  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６を参照のこと）生成され得る。
【００３３】
モノクローナル抗体は、例えば、動物を標的抗原、またはその免疫原性フラグメント、誘導体もしくは改変体で免疫化することによって生成される。あるいは、上記動物は、上記標的抗原をコードする核酸分子を含むベクターでトランスフェクトされた細胞で免疫化され、その結果、上記標的抗原が発現され、上記トランスフェクトされた細胞の表面と会合する。異種の非ヒト動物を生じるための種々の技術が当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（これはその全体が本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００３４】
あるいは、上記抗体は、上記標的抗原に結合するための抗体もしくは抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。このライブラリーは、例えば、組み立てられたファージ粒子の表面で発現されるバクテリオファージコートタンパク質へのタンパク質もしくはペプチド融合物および上記ファージ粒子内に含まれるコードＤＮＡ配列としてバクタリオファージにおいて、調製される（すなわち、「ファージディスプレイライブラリー」）。
【００３５】
次いで、骨髄腫／Ｂ細胞融合物から生じるハイブリドーマは、上記標的抗原への反応性についてスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）によって記載されるもの）を使用して調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、もしくは他の適切な宿主動物が、代表的には、免疫化因子で免疫化されて、上記免疫化因子に特異的に結合する抗体を生成するかもしくは生成し得るリンパ球が誘発される。あるいは、上記リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
【００３６】
厳密には不可能ではないものの、同じ重鎖可変ドメインを有するが、異なる抗原に対して指向される異なる抗体の思いがけない同定は、非常に可能性が低い。実際に、大部分の場合には、重鎖は、抗原結合表面に主に寄与し、配列の中で最も可変性も高い。特に、重鎖のＣＤＲ３は、配列、長さおよび構造において最も多様なＣＤＲである。従って、異なる抗原に対して特異的な２種の抗体は、異なる重鎖可変ドメインをほぼ常に有する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、精製される予定の上記κλ−ボディおよび／もしくはインタクトな抗体は、例えば、上記重鎖可変ドメインが全てのライブラリーメンバーに関して同一であり、従って、多様性が上記軽鎖可変ドメインに制限されている抗体ライブラリーを使用して、生成される。このようなライブラリーは、例えば、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５６１９（２０１０年５月２０日出願およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１０／１３５５５８として２０１０年１１月２５日公開）および同時係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５７７８０（２０１０年１１月２３日出願およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１１／０８４２５５として２０１１年７月１４日公開）（これらの各々が、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。しかし、上記軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと組み合わせて発現されるので、両方のドメインが抗原結合に寄与し得る。上記プロセスをさらに促進するために、同じ重鎖可変ドメインおよび多様なλ可変軽鎖もしくはκ可変軽鎖のいずれかを含む抗体ライブラリーが、異なる抗原に対する抗体のインビトロ選択のために並行して使用され得る。このアプローチは、本発明の完全な免疫グロブリン形式にある二重特異的抗体の生成のための構成要素として使用され得る、共通の重鎖を有するが、一方はλ軽鎖可変ドメインを、他方はκ軽鎖可変ドメインを有する２つの抗体の識別を可能にする。本発明の方法を使用して精製される予定の上記二重特異的抗体は、異なるアイソタイプのものであり得、それらのＦｃ部分は、異なるＦｃレセプターへの結合特性を変化させるために改変され得、このようにして、上記抗体のエフェクター機能ならびにその薬物動態特性を改変し得る。上記Ｆｃ部分の改変のための多くの方法が記載されてきており、本発明の抗体に適用可能である（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９  （６）：６８５−９１；米国特許第６，５２８，６２４号；米国特許出願公開番号２００９／０１９１１９９（２００９年１月９日出願）を参照のこと）。本発明の方法はまた、上記Ｆｃ部分を欠くＦ（ａｂ’）２形式において二重特異的抗体および抗体混合物を精製するために使用され得る。
【００３８】
好ましくは、上記精製される予定のκλ−ボディは、本発明の二重特異的抗体の組み立てを可能にするために、単一細胞への上記共通の重鎖および２個の異なる軽鎖の同時発現のために最適化されてきた。上記ポリペプチドの全てが、同じレベルで発現されかつ免疫グロブリン分子を形成するために等しく十分に組み立てられるようにするのであれば、単一特異的（同じ軽鎖）および二重特異的（２個の異なる軽鎖）の比は、５０％であるはずである。しかし、異なる軽鎖が異なるレベルで発現され、そして／または同じ効率で組み立てられないことは、あり得ることである。さらに、インタクトなＩｇＧ分子への組み立てから逃れた軽鎖は、「遊離軽鎖」（ＦＬＣ）として細胞培養培地に分泌され得る。上記異なるポリペプチドの相対的発現を調節して、それらの本質的な発現特性もしくは共通な重鎖と会合する傾向が異なることを補償する手段としては、非限定的例示によれば、種々の強度を有するプロモーターの使用、異なる効率を特徴とする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用、または転写レベルもしくは翻訳レベルにおいて作用し得る、ならびにｍＲＮＡ安定性に対して作用する調節エレメントの他のタイプの使用が挙げられる。上記発現の調節はまた、一方のもしくは他方の軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増大させ、従って、それらの相対的発現を改変するために、細胞の複数の逐次的なトランスフェクションによって達成され得る。
【００３９】
上記重鎖および２個の軽鎖の同時発現は、細胞培養上清へと分泌される３種の異なる抗体：２種の単一特異的二価抗体および１種の二重特異的二価抗体の混合物を生じる。後者は、上記目的のκλ−ボディを得るために、上記混合物から精製されなければならない。本明細書に記載される精製法は、上記κ軽鎖もしくはλ軽鎖の定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティークロマトグラフィー媒体（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー媒体、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティー媒体、ならびに／もしくはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂ  ＫａｐｐａおよびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂ  Ｌａｍｂｄａアフィニティーマトリクス）の使用による精製手順を大いに促進する。このアフィニティークロマトグラフィー精製アプローチは効率的であり、二重特異的抗体（κλ−ボディを含む）に一般的に適用可能である。これは、抗体混合物を発現するクアドローマもしくは他の細胞株から得られる各二重特異的抗体のために開発され最適化されなければならない特定の精製法とは際だって対照的である。実際に、上記混合物中の異なる抗体の生化学的特性が類似している場合には、標準的クロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）を使用するそれらの分離は、困難であり得るかもしくは全く不可能であり得る。
【００４０】
上記３個の鎖の同時発現は、３種の異なる抗体：２種の単一特異的抗体および１種の二重特異的抗体、の組み立てをもたらした。それらの理論的相対比は、発現レベルおよび組み立て速度が両方の軽鎖に関して類似であるとするならば、１：１：２であるはずである。上記二重特異的抗体を、上記二重特異的抗体（例えば、上記κλ−ボディ）を、アフィニティー樹脂を使用して優先的に溶離するアフィニティークロマトグラフィー手順を使用して精製した。
【００４１】
上記３つの鎖の同時発現はまた、細胞培養上清中に過剰な遊離軽鎖の生成をもたらした。このような遊離軽鎖は、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを省略する精製プロセスにおいて除去するのは潜在的に問題があり得る。遊離軽鎖は、本明細書中で示されるとおり、混合モードクロマトグラフィーを使用して上記インタクトな抗体ミックスから効率的に分離され得る。
【００４２】
異なる抗体操作アプローチを使用して均質な二重特異的分子の生成を無理矢理行うことを目指して二重特異的抗体形式を生成および精製する以前のアプローチは、上記生成物の生産性、拡張性および安定性を犠牲にして行われた。本明細書に記載される方法は、上記二重特異的抗体を、一価のモノクローナル抗体および遊離軽鎖を含む混合物から精製する効率的かつ包括的な手段を提供する。
【実施例】
【００４３】
実施例１：λ軽鎖およびκ軽鎖を有する二重特異的抗体の精製
上記κλ−ボディは、２種の独立した標的に対する特異性を駆動する、共通のＩｇＧ１重鎖および２個の異なる軽鎖を含む新規な二重特異的ＩｇＧ形式である。大規模産業プロセスに適用可能な効率的精製プロトコルを可能にするために、その形式は、一方の軽鎖がκ定常領域を含むと同時に、他方がλ定常領域を含むことが必要である（図１を参照のこと）。
【００４４】
κλ−ボディを生成するために、上記共通の重鎖および２個の軽鎖を、ＣＨＯ細胞において、３シストロン発現ベクターを使用して発現させる。このベクター形式は、３種の生成物：単一特異的κモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、二重特異的κλ−ボディおよび単一特異的λ−ＭＡｂ、の構築を可能にする。κ軽鎖とλ軽鎖との間で類似の発現レベルおよび上記重鎖との組み立てを仮定すると、理論的生成物比は、遊離軽鎖を加えて２５：５０：２５である（図２を参照のこと）。
【００４５】
このκλ−ボディ形式の精製は、例えば、同時係属中の米国特許出願第１３／２１０，７２３号（２０１１年８月１６日出願）に記載されるように、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー樹脂およびＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティー樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への逐次的結合によって行われ得る。これら樹脂は、上記κ定常領域もしくはλ定常領域のいずれかに対して高い特異性および親和性を有するドメインリガンドとカップリングされる。しかし、上記κλ−ボディおよび他の二重特異的抗体の大規模精製を可能にする、改善されかつコスト効率的精製プロセスが必要である。遊離軽鎖が、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーおよびＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーより前に上記混合物から除去され得る限りにおいて、プロテインＡアフィニティー上清捕捉工程の除去が想定され、可能である。
【００４６】
上記精製プロセスを合理化することを目的として、上記κλ−ボディが、その対応する、単一特異的κ−ＭＡｂ（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔに対して）もしくは単一特異的λ−ＭＡｂ（ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔに対して）の副生成物より弱い親和性で、上記モノクローナル形式（κもしくはλのいずれか）に関して、双方ではなく各軽鎖のうちの一方のみを含むという事実に起因して、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂もしくはＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂のいずれかに結合すると仮定した。さらに、遊離軽鎖が、上記上清から組換えタンパク質を直接捕捉するために、混合モードクロマトグラフィーを使用してインタクトな抗体から分離され得ると仮定した（図２を参照のこと）。
【００４７】
本明細書中で提供される研究から、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーもしくはＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーのいずれかの間に段階的ｐＨ溶離を使用して、κλ−ボディを単一特異的κＡｂから成功裏に分離することが示される。
【００４８】
出発材料：ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに関しては、κλ二重特異的発現ベクター（１つのγ１重鎖ｃＤＮＡ、１つのκ軽鎖ｃＤＮＡ、および１つのλ軽鎖ｃＤＮＡを含む）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の清澄にした２５Ｌウェーブバッグ発酵上清を、精製のための出発材料として使用した。ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔおよび混合モードクロマトグラフィーに関しては、κλ二重特異的発現ベクター（１つのγ１重鎖ｃＤＮＡ、１つのκ軽鎖ｃＤＮＡおよび１つのλ軽鎖ｃＤＮＡを含む）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＢＩＯＳＴＡＴ  ＣｕｌｔｉＢａｇ  ＳＴＲ  １００Ｌ発酵の清澄にした上清を、精製のための出発材料として使用した。
【００４９】
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー工程：  抗ＩＦＮγ／ＩＬ−６ＲＣ（すなわち、ＩＬ−６ＲＣは、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間で形成された複合体である）κλ−ボディ二重特異的ＩｇＧ抗体を、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。上記抗ＩＦＮγ／ＩＬ−６ＲＣ  κλ−ボディ二重特異的ＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、以下に示す：
【００５０】
【化１】
2014530848.tif 000002
１０ｍｇ／ｍＬでのカラムへのローディングならびに５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０（５カラム容積）での洗浄工程の後、ｐＨ段階的溶離（ｐＨ３．０、続いて、ｐＨ２．５およびｐＨ２．０）を、この関連するｐＨに調節した５０ｍＭ  グリシン緩衝液を使用して行った。フロースルー（Ｆ／Ｔ）画分および溶離した画分を集め、生成物回収を決定するために２８０ｎｍでの吸光度測定（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用）によって、上記サンプルの純度および組成を決定するために還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（製造業者のガイドラインに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  １２ウェル  ４〜２０％  勾配ゲルを使用）によって、そして上記精製プロセスが上記κλ−ボディ二重特異的ＩｇＧを上記２種の単一特異的抗体副生成物から分離する能力を決定するためにイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ；以下に記載される方法）によって分析した。
【００５１】
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法：このイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）法を、精製サンプル中の単一特異的抗体および二重特異的抗体の割合を決定するために使用した。上記ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法は、タンパク質改変体の分離をそれらの電荷分布に従って可能にする。サンプルを調製して、Ａ  ＢｉｏＭａｂ  ＮＰ５−ＳＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）の上に５０μｇをローディングし、流量０．８ｍＬ／分での１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５（０％〜１００％  ＮａＣｌ濃度）の直線勾配を、上記異なる抗体生成物を分離するために適用した。２１４ｎｍでのＵＶ検出を使用して、サンプル溶離をモニターした。３つの集団を（参照標準に従って）同定し、それらのパーセンテージ相対面積に従って分析した。各アイソフォームのパーセンテージを、総ピーク面積に対する各成分のピーク面積を計算することによって決定した。
【００５２】
図３Ａ中のＵＶトレース（青色）によって示されるように、上記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー樹脂に適用した３つのｐＨ段階的溶出は、３つの結合画分の逐次的単離を可能にした。非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３Ｂに示される）から、認識されるように、組み立てられた全長抗体を含む高純度の溶離した画分が明らかになった。いくつかの遊離軽鎖生成物（モノマーおよびダイマー形態）もまた、検出された。還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、逐次的ｐＨ溶離工程は、軽鎖組成に基づいて、上記２種の単一特異的抗体に対して上記κλ−ボディの差次的保持をもたらすことが示唆された。ｐＨ３．０での溶離画分は、両方の軽鎖を等しいレベルで含んだのに対して、上記ｐＨ２．５画分およびｐＨ２．０画分は、最小のもしくは検出不能なレベルのλ軽鎖を示した。上記３つの結合画分を、上記ＩＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積を積分することによってさらに特徴付けた（図３Ｃ）。表１にまとめた結果は、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致し、このことは、ｐＨ３．０における第１の溶離画分中の上記κλ−ボディの量が非常に豊富である（７０．１０％）ことを示す。ｐＨ２．５およびｐＨ２．０でのその後の溶離工程は、上記単一特異的κ抗体の溶離を生じた。上記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂でのｐＨ段階的溶離ストラテジーは、従って、二重特異的κλ−ボディを、単一特異的なκ−ＭＡｂおよびλ−ＭＡｂから効率的に分離することを示した。
【００５３】
【表１】
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このデータから、より低いｐＨで溶離する単一特異的κ−ＭＡｂより、二重特異的κλ−ボディ生成物をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー樹脂から優先的に溶離するために、より高いｐＨ段階的溶離を使用することの実行可能性が実証される。このことは、おそらく、上記κλ−ボディ中の単一のκ鎖とは対照的に、上記単一特異的形式における２個のκ鎖の存在のため、上記樹脂へのより高い親和性に起因する。
【００５４】
従って、この分離はまた、上記軽鎖に対する親和性が上記単一特異的および／もしくは二重特異的生成物を差次的に結合するために使用される他のクロマトグラフィー支持体（例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔイオン交換、疎水性相互作用、および混合モード樹脂（例えば、ヒドロキシアパタイト））において有用である。当業者は、このカテゴリー内に入る他の当該分野で認識された技術を容易に認識する。上記異なる生成物を分離するための溶離ストラテジーは、ｐＨ変化に限定されるべきでないのみならず、非限定的かつ非網羅的な例によれば、塩濃度（例えば、ＮａＣｌ濃度もしくは他の無機塩（例えば、ホフマイスターシリーズのイオンからの無機塩組み合わせ）の濃度）の段階的変化、アルギニンおよび他のアミノ酸（例えば、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびグリシンの濃度）を使用するカチオン交換分離技術、温和な変性剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール８０００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０、ならびに他のイオン性、非イオン性および／もしくは双性イオン性界面活性剤）の使用などをも含み得る。
【００５５】
ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｋｃｔクロマトグラフィー工程：  抗ＩＬ−６Ｒｃ／ＩＬ−６ＲＣ  κλ−ボディ二重特異的ＩｇＧ抗体を、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。上記抗ＩＬ−６Ｒｃ／ＩＬ−６ＲＣ  κλ−ボディ二重特異的ＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、以下に示す：
【００５６】
【化２】
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２０ｍｇ／ｍＬでのカラムへのローディング、ならびに５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０（５カラム容積）での洗浄工程の後に、ｐＨ段階的溶離を、ｐＨ３．０に調節した５０ｍＭ  グリシン緩衝液を使用して行った。フロースルー画分および溶離した画分を集め、生成物回収を決定するために２８０ｎｍでの吸光度測定（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用）によって、上記サンプルの純度および組成を決定するために還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（製造業者のガイドラインに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  １２ウェル  ４〜２０％  勾配ゲルを使用）によって、そして上記精製プロセスが上記κλ−ボディ二重特異的ＩｇＧを上記２種の単一特異的抗体副生成物から分離する能力を決定するために疎水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ；以下に記載される方法）によって、分析した。
【００５７】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法：サンプル混合物中の上記λ−ＭＡｂ、κ−ＭＡｂおよび上記κλ−ボディの相対的割合を決定するために、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０カラムを使用するＨＩＣ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）アッセイを使用した。硫酸アンモニウムの８５〜２５％の間の下降勾配を、高分離能で上記３種（上記κ−ＭＡｂの溶離が最初、続いて、上記κλ−ボディ、最後に、上記λ−ＭＡｂ）を溶離するために、上記サンプルのローディングの後に、上記カラムに適用した。２８０ｎｍでモニターしたＵＶトレースのピーク面積積分を、各種の量を決定するために行った。
【００５８】
図４Ａ中のＵＶトレースによって示されるように、上記ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー樹脂に適用されたｐＨ段階的溶離は、上記κλ−ボディの精製を可能にした。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４Ｂに示される）から、認識されるように、組み立てられた全長抗体を含む精製画分が高純度であることが明らかにされた。いくつかの遊離軽鎖生成物（モノマーおよびダイマー形態）もまた、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した。上記精製画分を、上記ＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積を積分することによってさらに特徴付けた（図４Ｃ）。表２にまとめた結果は、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致し、このことは、ｐＨ３．０での溶離画分において上記κλ−ボディの量が非常に豊富である（８９．４％）ことを示す。
【００５９】
【表２】
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Ｍｅｐ  ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ混合モードクロマトグラフィーを使用する遊離軽鎖減少：製造コストを減らすために、生物工学／製薬産業は、最初のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程を省略する精製プロセスを開発中である。代替の精製解決策は、従って、現在探索されている最中である。特に、混合モードクロマトグラフィーは、細胞培養夾雑物からの抗体の選択的単離を可能にするイオン性相互作用および疎水性相互作用両方の組み合わせの新規な選択的活用を提供する。これら夾雑物としては、宿主細胞タンパク質、細胞ＤＮＡ、エンドトキシン、ウイルス、ならびに抗体フラグメントが挙げられ得る。上記のように、組換え抗体を発現する哺乳動物細胞はまた、組み立てられていない遊離軽鎖を上清へと分泌する。
【００６０】
本発明は、遊離軽鎖を、単一特異的抗体および二重特異的抗体から効率的に除去することに関する。特に、二重特異的抗体もしくは単一特異的モノクローナル抗体および遊離軽鎖に適用可能なクロマトグラフィー条件が、同定された。本発明は、遊離軽鎖夾雑物を、κλ−ボディを発現するＣＨＯ細胞株の上清から減らすための方法によって示される（図５Ａ〜５Ｃを参照のこと）。上記方法は、以下の工程を包含する：ａ）上記細胞培養上清を、固体のクロマトグラフィー混合モード樹脂（例えば、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）に適用する工程、ｂ）上記モノクローナル抗体を酢酸緩衝溶離バッファー（ｐＨ５．０）（溶離液）で溶離する工程、およびｃ）ｐＨ２．１において上記樹脂に強く結合している遊離軽鎖を除去する工程（ストリップ）。
【００６１】
図５Ａは、非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（図５Ｂ）によって決定されるように、上記ストリップ中のＦＬＣの存在を示す代表的ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌクロマトグラムを示す。ＳＥＣ  ＨＰＬＣ分析から、上記細胞培養上清中の６０％から下がって上記抗体溶離画分中の３３％へと、効率的ＦＬＣ除去が確認された（図５Ｃおよび以下の表３）。
【００６２】
【表３】
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他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は、本発明の範囲を例示し、限定しないと解釈される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2014530848.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際調査報告】
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