(57)【要約】  本発明は、細胞、特に細菌細胞の溶解方法および核酸の単離方法に関する。試料は、水に混和性でなくかつ発熱しない少なくとも１種の液体を含む溶解溶液で処理される。その後、混合物を冷却し、そして水を添加すると、冷却後に二相系が生成される。核酸は水相において見出すことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  細胞を含む試料を提供すること、
ｂ）  水非混和性液体を少なくとも含む溶解溶液を試料へと添加すること、
ｃ）  ステップｂ）で得られた混合物を８０℃より上の温度へと加熱すること、
ｄ）  ステップｃ）における温度が１００℃より上であった場合、試料を１００℃より下の温度へと冷却すること、
ｅ）  水または水性緩衝液を混合物へと添加し、それにより水非混和性液体相および水相を得ること、
によって、細胞を溶解する方法。
【請求項２】
細胞が細菌細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）において、混合物が１００〜１５０℃の温度へと加熱されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）において、試料が２０〜４０℃の温度へと冷却されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）において添加される溶解溶液が水非混和性イオン液体を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
イオン液体のアニオンがビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［Ｎｔｆ２］であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）において添加される溶解溶液がトリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスファート［Ｔｔｐ］［Ｆａｐ］および／または１−ブチル−１−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［ｂｍｐｙｒｒ］［Ｎｔｆ２］を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
溶解溶液を添加する前に、ステップｂ１）において、アンモニウムカチオン［ＮＲ４］＋
ここで
Ｒはそれぞれの場合において、互いに独立して、
Ｈ、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する直鎖または分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する直鎖または分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する飽和、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、
これは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、ここで１個または２個以上のＲは部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌにより、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよく、およびここでα位にないＲにおける１個または２個の非隣接の炭素原子は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択される原子および／または原子団により置換されていてもよく、ここでＲ’は＝Ｈ、非フッ素化、部分的にまたはパーフッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであってもよく、およびＸは＝ハロゲンであってもよい、
を含む少なくとも１種の物質で試料を前培養することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
溶解溶液を添加する前に、ステップｂ１）において、試料が少なくとも１種のＮ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＡＥ］をベースとしたイオン液体で前培養されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｅ）の後に、得られた混合物をプロテイナーゼで培養することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｅ）および任意にプロテイナーゼとともに培養した後に、水相がリアルタイムＰＣＲにより直接的に分析されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
水非混和性イオン液体または水非混和性油を備える容器およびプロテイナーゼを備える容器を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に細菌細胞の溶解（lysis）方法および核酸の単離方法に関する。試料を、水と混和せずかつ発熱しない、少なくとも１種の液体を含む溶解溶液で処理する。その後、混合物を冷却し、そして水を添加すると、冷却後に二相系が生成される。核酸は、水相に見出すことができる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡなどの核酸は、分子生物学の分野において、研究および臨床分析に対して広く用いられている。ＤＮＡの分析のための共通の方法は、サザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法による増幅、およびシークエンシングである。これらの方法を用いると、ＤＮＡ配列における差異が決定され、遺伝子同定、集団検診、病原菌同定および診断検査において手助けとなる。これらの分析の全ては、一貫したかつ正当な結果の基礎として、精製されたＤＮＡ試料を必要とする。
【０００３】
核酸の分析およびin vitro操作は、典型的には、引き続く加工手順を妨げうる、好ましからざる混入物質から核酸から取り除くための、核酸単離ステップが先行する。研究および診断分子生物学の両方における大多数の手順に対し、抽出された核酸が第１のステップとして必要とされる。典型的なＤＮＡ抽出プロトコールにおいては、対象の核酸を含有する細胞を採取し、そして溶解させる。
【０００４】
細胞溶解は、細胞膜を破壊することにより細胞から物質を放出させる方法であり、特に、ＰＣＲおよびクローン化技術などの核酸に基づく方法でのさらなる加工の前にＤＮＡまたはＲＮＡを単離するための、細胞から細胞内物質を抽出させる方法である。
【０００５】
細胞破壊による細胞溶解法は、機械的方法および非機械的方法に分類される。
【０００６】
機械的方法は、超音波処理、ホモジナイザーを用いる破壊、例えばフレンチプレスなどを用いる圧縮、減圧、粉砕などを含む。非機械的方法は、化学的方法、熱的方法、酵素法などを含む。
【０００７】
化学的方法は、非機械的方法であり、例えば、酸、塩基、洗剤、溶媒、カオトロピック試薬などを用いる。特に、洗剤を用いる化学的方法が広汎に用いられる。試薬は脂質二重膜を破壊し、細胞内容物を放出させ、膜タンパク質を溶解させる。洗剤は、動物細胞を溶解させるために、最も広汎に用いられる。しかし、細胞溶解のための試薬は別途添加され、それゆえかかる試薬を除去する後続のプロセスが必要とされる。ＰＣＲ阻害が生じ得ることがあり、プロセスは長い時間が掛かる。
酵素法は、リゾチーム、プロテアーゼなどを用いる。
【０００８】
熱的方法は、凍結融解、加熱、浸透圧効果、電気的効果などを含む。例えば細胞溶解は、細胞を高熱の対象、例えばホットプレートなどと接触させることにより、または−７０℃への凍結および室温への融解の周期を繰り返すことにより、達成される。
【０００９】
US 2006/0141556においては、マイクロ波を試料へと照射することによって、試料の温度を上昇させることにより、細胞溶解が実行される。蒸気圧の上昇が、両性イオン化合物またはイオン液体を試料に添加することにより阻害される。
それでもなお、迅速かつ効果的な溶解法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
細胞、特に細菌細胞は、水非混和性液体を含む溶解溶液を試料へと添加し、混合物を加熱し、そして冷却後に、水または水性緩衝液を添加して二相系を生成することにより、効果的に溶解させることができることが見出された。核酸は水相に見つけることができ、ＰＣＲなどのさらなる下流の操作へと直接的に移すことができる。
【００１１】
それゆえ本発明は、
ａ）  該細胞を含む試料を提供すること
ｂ）  水非混和性液体を少なくとも含む溶解溶液を該試料へと添加すること
ｃ）  ステップｂ）において得られた混合物を８０℃より上の温度へと加熱すること
ｄ）  ステップｃ）における温度が１００℃より上であった場合、試料を１００℃より下の温度へと冷却すること
ｅ）  水または水性緩衝液を該混合物へと添加し、水非混和性液体相および水相を生成させること
によって、細胞を溶解する方法を対象とする。
【００１２】
好ましい態様において、細胞は細菌細胞である。
好ましい態様において、混合物を１００〜１５０℃の温度へと加熱する。
好ましい態様において、ステップｄ）において、試料を２０〜４０℃の温度へと冷却する。
【００１３】
好ましい態様において、ステップｂ）において添加される溶解溶液は、少なくとも一種の油または少なくとも１種のイオン液体を含む。非常に好ましい態様において、少なくとも１種のイオン液体を含む。
好ましい態様において、ステップｂ）において添加される溶解溶液は、少なくとも１種のビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［ＮｔＦ２］をベースとしたイオン液体を含む。これは、イオン液体のアニオンがビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［ＮｔＦ２］であることを意味する。
【００１４】
好ましい態様において、ステップｂ）において添加される溶解溶液は、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスファート［Ｔｔｐ］［Ｆａｐ］および／または１−ブチル−１−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［ｂｍｐｙｒｒ］［Ｎｔｆ２］を含む。
【００１５】
グラム陽性細胞に対する特に好ましい一態様において、溶解溶液を添加する前に、ステップｂ１）において、試料を、少なくとも１種のＮ，Ｎ−ジメチル−エタノールアンモニウム［ＤＭＡＥ］をベースとしたイオン液体とともに前培養する。これは、かかるイオン液体のカチオンがＮ，Ｎ−ジメチル−エタノールアンモニウム［ＤＭＡＥ］であることを意味する。
【００１６】
一態様において、ステップｅ）の後に、得られた混合物をプロテイナーゼとともに培養する。
一態様においてステップｅ）の後および任意にプロテイナーゼとともに培養した後に、水相における核酸を、ＰＣＲ法、特にリアルタイムＰＣＲにより、電気泳動（アガロースまたはポリアクリルアミド）あるいはライゲーションまたは制限酵素消化などのクローン化技術により、直接的に分析する。
【００１７】
本発明はまた、水非混和性液体を有する１つの容器、およびプロテイナーゼを備える１つの容器を含むキットに関する。
【００１８】
発明の説明
本明細書において用いられる用語「核酸」は、当業者に公知の任意のタイプのＤＮＡまたはＲＮＡに言及する。例は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、プラスミドＤＮＡである。
【００１９】
本明細書中で用いられる用語「緩衝液」は、酸または塩基を溶液または組成物に加えた場合にｐＨの変化に抵抗する水溶液または組成物を指す。ｐＨ変化に対するこの抵抗は、かかる溶液の緩衝特性のためである。したがって、緩衝活性を示す溶液または組成物は、緩衝液または緩衝溶液と呼ばれる。緩衝液は、一般的に溶液または組成物のｐＨを維持せしめる無制限の能力は有しない。むしろ、それらは、典型的には、ある範囲内のｐＨ、例えばｐＨ７〜ｐＨ９を維持することが可能である。典型的には、緩衝液は、それらのｐＫａより１対数高い、および低い範囲内のｐＨを維持することが可能である（例えば、C . Mohan, Buffers, A guide for the preparation and use of buffers in biological systems, CALBIOCHEM, 1999を参照）。緩衝液および緩衝溶液は、典型的には緩衝塩から、または好ましくは非イオン性緩衝構成成分、例えばＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳから作製される。本発明において用いられる緩衝液は、好ましくは、リン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ＴＲＩＳ）緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＴＢＳ）およびＴＲＩＳ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）の群から選択される。
【００２０】
本発明の方法で溶解させる細胞は全てのタイプの細胞、好ましくは細胞壁を含む細胞、最も好ましくは細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞または植物細胞である。特に好ましい細胞はグラム陽性またはグラム陰性細菌細胞、特にListeria spp.、 S. aureus、P. paratuberculosis、Salmonella spp.、 C. jejuni、Penicillum roquefortiiおよびE. Coliからなる群から選択されるものである。
【００２１】
本発明によれば、試料は細胞を含む任意の試料であってもよい。試料は例えば、食品試料、体液、特に血液、血漿または血清、水または組織試料であってもよい。好ましい態様において、試料は以下のステップを含む方法を以って、複合試料から生成された：
ａ）  複合試料を提供する、
ｂ）  該試料を以下のものとともに培養する：
−  少なくとも１種のカオトロープ、
−  緩衝液、および
−  少なくとも１種の洗剤、
ｃ）  遠心分離またはろ過により、得られた混合物から該細胞を単離する。
複合試料から細胞を単離するこの手順に関する詳細は、EP 2049677に開示されている。
【００２２】
本発明による試料はまた、以下により複合試料から生成することができる。
ａ）  複合試料を提供する、
ｂ）  少なくともＭｇＣｌ２および／またはイオン液体を含む抽出溶液で該試料を培養する
ｃ）  ステップｂ）の混合物から、好ましくは遠心分離、親和結合および／またはろ過により、該細胞を単離する。
複合試料から細胞を単離するこの手順に関する詳細は、WO 2010145754に開示されている。
【００２３】
本発明によれば、複合試料は、例えば食品試料、体液、特に血液、血漿または血清、水または組織試料であってもよい。典型的には、複合試料は、複合マトリックス（つまり、とりわけ、タンパク質、脂質、炭水化物などを含む）および／または高度な粘性を有する。
本発明によれば、水非混和性液体は水非混和性油または水非混和性イオン液体である。
【００２４】
本発明による方法に好適な油は、室温において液体であり、かつ１５０℃より上の、より好ましくは２００℃より上の沸点ならびに引火点を有する、任意の油である。加えて、かかる油は水非混和性である必要がある。これは、本発明による方法に好適なかかる油は、２０〜８０℃の温度で水と混合される際に二相系を形成することを意味する。好適な油の例は、有機油、鉱油、シリコン油または精油である。
【００２５】
有機油は、少なくとも脂肪酸および／またはトリグリセリドを含む油である。室温で液体である有機油は、典型的には、６〜３０炭素原子の鎖長の一不飽和または多不飽和の脂肪酸を含む。好適な有機油の例は、菜種油およびヒマシ油である。
【００２６】
鉱油は、灯油および  またはナフテン油および／または芳香油を含む油である。好ましい鉱油は、重ホワイトオイル（CAS 8012-95-1）など、より重いアルカン類の混合物を含む灯油である。
【００２７】
好適なシリコン油は、一般式Ｒ（Ｒ２ＳｉＯ）ｎＳｉＲ３で表される線状のシリコン油であり、Ｒは、互いに独立するが、好ましくは全体の分子において同一で、直鎖または分枝のＣ１〜Ｃ８アルキル残基である。好適なシリコン油の一例は、ポリ（ジメチルシロキサン）（CAS 63148-62-9）である。
精油の例は、テルペン類またはテルペノイド類である。
【００２８】
本発明において用いられるイオン液体または液体塩は、典型的には有機カチオンおよびアニオンからなるイオン種である。それらはいかなる中性分子をも含まず、通常３７３Ｋより下の融点を有する。
【００２９】
イオン液体の領域は、その潜在的な用途は多種多様であるため、集約的に研究されている。イオン液体に関する総説は、例えば、以下のものである。
【数１】
2014512192.tif 000002
【００３０】
一般的に、当業者に公知の一般式Ｋ＋Ａ−で表される全てのイオン液体、特に水に非混和性であるものは、本発明による方法において好適である。
【００３１】
かかるイオン液体のアニオンＡ−は、典型的には、ハロゲン化物、テトラフルオロボラートまたは誘導体、ヘキサフルオロホスファートまたは誘導体、例えばＰＦ３（Ｒｆ）３など、一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−または一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−で表されるシアナミド、チオシナートまたはイミドの群から選択され、ここでＲｆは、１〜８個のＣ原子を有する部分的にまたは完全にフッ素置換されたアルキルを示し、およびＸはＳＯ２またはＣＯを示す。ここでハロゲン化物アニオンは、塩化物アニオン、臭化物アニオンおよびヨウ化物アニオンから、好ましくは塩化物アニオンおよび臭化物アニオンから選択することができる。
【００３２】
イオン液体のカチオンＫ＋の選択に関し、自体制限はない。しかし、好ましいのは有機カチオン、特に好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジニウムカチオンまたはピロリジニウムカチオンなどの複素環カチオンである。
【００３３】
アンモニウムカチオンは、例えば、式（１）により記載することができる。
［ＮＲ４］＋      （１）
式中
Ｒはそれぞれの場合において、互いに独立して
Ｈ、ここで全ての置換基Ｒは同時にＨであることはできない、
ＯＲ’、ＮＲ’２、但し式（１）における最大１つの置換基ＲがＯＲ’、ＮＲ’２である、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖のまたは分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する、直鎖のまたは分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する、直鎖のまたは分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、
これは１〜６個のＣ原子を有するアルキルにより置換されていてもよく、ここで１つまたは２つ以上のＲは部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌにより、あるいは部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびにここでＲにおける、α位にない１つまたは２つの非隣接の炭素原子は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択される原子および／または原子団により置換されていてもよい、
を示し、ここでＲ’は＝Ｈ、非フッ素化、部分的にフッ素化されたまたはパーフッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであってもよく、およびＸは＝ハロゲンであってもよい。
【００３４】
ホスホニウムカチオンは、例えば、式（２）により記載することができる。
［ＰＲ２４］＋      （２）
式中
Ｒ２はそれぞれの場合において、互いに独立して
Ｈ、ＯＲ’またはＮＲ’２、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖のまたは分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する直鎖のまたは分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する直鎖のまたは分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、これは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、ここで１つまたは２つ以上のＲ２は、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌにより部分的にまたは完全に、あるいは−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により部分的に置換されていてもよく、およびここでα位にないＲ２における１つまたは２つ以上の非隣接の炭素原子は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択される原子および／または原子団により置換されていてもよい、
を示し、ここでＲ’＝Ｈ、非フッ素化、部分的にフッ素化されたまたはパーフッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換のまたは置換されたフェニル、およびＸ＝ハロゲンである。
【００３５】
しかし、式中全ての４つのまたは３つの置換基ＲおよびＲ２がハロゲンにより完全に置換されている式（１）および（２）で表されるカチオン、例えばリス（トリフルオロメチル）メチルアンモニウムカチオン、テトラ（トリフルオロメチル）アンモニウムカチオンまたはテトラ（ノナフルオロブチル）アンモニウムカチオンは除外される。
【００３６】
ウロニウムカチオンは、例えば式（３）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋      （３）
により、およびチオウロニウムカチオンは式（４）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋      （４）
により記載されることができ、
【００３７】
式中、
Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ、互いに独立して、
水素、ここでＲ５に対して水素は除外される、
１〜２０個のＣ原子を有する、直鎖のまたは分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の二重結合を有する、直鎖のまたは分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１つまたは２つ以上の三重結合を有する、直鎖のまたは分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和の、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、これは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、ここで１つまたは２つ以上の置換基Ｒ３〜Ｒ７は部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌにより、あるいは部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよく、およびここでα位にないＲ３〜Ｒ７における１つまたは２つの炭素原子は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択される原子および／または原子団により置換されていてもよい、
を示し、ここでＲ’＝Ｈ、非フッ素化、部分的にフッ素化されたまたはパーフッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであり、およびＸ＝ハロゲンである。
【００３８】
グアニジニウムカチオンは、式（５）
［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋      （５）
により記載されることができ、
式中
Ｒ８〜Ｒ１３はそれぞれ、互いに独立して
水素、−ＣＮ、ＮＲ’２、−ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する、直鎖または分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、これは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、ここで置換基Ｒ８〜Ｒ１３の１個または２個以上はハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌにより部分的にまたは完全に、あるいは−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により部分的に置換されていてもよく、およびここでα位にないＲ８〜Ｒ１３における１個または２個以上の非隣接の炭素原子は群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団により置き換えられていてもよい
を示し、ここでＲ’＝Ｈ、非フッ素化、部分的にフッ素化またはパーフッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであり、およびＸ＝ハロゲンである。
【００３９】
さらに、一般式（６）
［ＨｅｔＮ］＋      （６）、
で表されるカチオンを採用することができ、ここで
ＨｅｔＮ＋は、以下の群から選択される複素環式カチオンを示す。
【００４０】
【化１】
2014512192.tif 000003
【００４１】
【化２】
2014512192.tif 000004
【００４２】
ここで置換基
Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ、互いに独立して
水素、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、 −Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する、直鎖または分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、これは１〜６個のＣ原子を有するアルキル、飽和、部分的にまたは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルにより置換されていてもよい
を示し、
【００４３】
ここで置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’はともに、また環系を形成してもよく、
ここで１個または２個以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、あるいは−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により部分的または完全に置換されていてもよく、しかしここで、Ｒ１’およびＲ４’は同時にはハロゲンにより完全に置換されることができず、およびここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロ原子へと結合しない１個または２個の非隣接の炭素原子は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団により置換されていてもよく、ここでＲ’＝Ｈ、非フッ素化、部分的またはパーフッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであり、およびＸ＝ハロゲンである。
【００４４】
本発明の目的に対し、完全に不飽和の置換基はまた、芳香族置換基を意味するものとする。
【００４５】
本発明による方法に対し好適である水非混和性イオン液体は、水と混和しないイオン液体である。これは、本発明による方法に好適なイオン液体は、２０〜８０℃の温度で水と混合される時に、二相系を形成することを意味する。水と混和しない疎水性イオン液体は、例えばUS 5,827,602に開示される。
【００４６】
本発明により用いられるイオン液体は、好ましくは液体であり、つまり好ましくはこれらは室温（約２５℃）において液体である。
【００４７】
好ましい態様において、水非混和性イオン液体のアニオンＡ−は、一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−で表されるまたは一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−で表されるイミドおよびＰＦ３（Ｒｆ）３を含む群から選択され、ここでＲｆは１〜８個のＣ原子を有する、部分的にまたは完全にフッ素置換されたアルキルを示し、およびＸはＳＯ２またはＣＯを示す。
【００４８】
非常に好ましい態様において、水非混和性イオン液体のアニオンＡ−は、トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスファート［Ｆａｐ］または特に好ましくはそれはビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［Ｎｔｆ２］である。
【００４９】
水非混和性イオン液体のアニオンＡ−は、カチオンよりも、イオン液体が本発明の方法に対し、より好適であるかどうか決定するために重要であることが見出された。トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスファート［Ｆａｐ］を有するイオン液体、および特にビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［Ｎｔｆ２］アニオンを有するものが、好適なカチオンと混合される際に水非混和性相を提供するだけでなく、水相における核酸の富化を提供することが見出された。
【００５０】
［Ｆａｐ］または［Ｎｔｆ２］アニオンを用いる際、水非混和性イオン液体のカチオンは好ましくは
【化３】
2014512192.tif 000005
を含む基、ここで置換基Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ、互いに独立して、水素または１〜２０個のＣ原子を含む直鎖または分枝のアルキルを示す、および
式（２）
［ＰＲ２４］＋      （２）
ここでＲ２はそれぞれの場合において、互いに独立して、
Ｈ、または１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝のアルキル
を示す、で表されるホスホニウムカチオンから選択される。
【００５１】
本発明において用いられる好ましい水非混和性イオン液体は、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスファート［Ｔｔｐ］［Ｆａｐ］、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−ブチルジエタノールアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドおよび特に好ましくは１−ブチル−１−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド［ｂｍｐｙｒｒ］［Ｎｔｆ２］である。
【００５２】
本発明は、少なくとも１種の水非混和性液体の存在下での、熱的溶解による細胞を溶解するための方法に関する。液体は、熱的溶解の間に用いられるだけでなく、−およびなおより重要には−溶解後の混合物から核酸を単離するために用いられる。好適な水非混和性液体の例は、油およびイオン液体である。
【００５３】
溶解させるべき細胞とともに、試料を、少なくとも１種の水混和性液体を含む溶解溶液と接触させる。典型的には、試料は、試料の容量に少なくとも等しい容量の溶解溶液に接触させる。これは、例えば、試料が５μｌの容量を有する場合、それは５μｌの溶解溶液に少なくとも接触させる。好ましい態様において、溶解溶液の容量は、試料の少なくとも３倍の容量である。非常に好ましい態様において、それは試料の少なくとも５倍の容量である。
【００５４】
好ましい態様において、溶解溶液は１種の水混和性溶液を含むが、それは、１種または２種以上の追加の水非混和性液体などの、追加の物質もまた含むことができる。好ましい態様において、溶解溶液は、１種の水混和性イオン液体を少なくとも含む。
【００５５】
試料および溶解溶液の混合物を、熱的溶解のために、次いで８０℃より上の温度へと加熱する。好ましい態様において、それは８０〜２００℃の温度へと加熱され、非常に好ましくはそれは１００〜１５０℃の温度へと加熱される。
【００５６】
加熱は、例えば加熱ブロックにおける、マイクロ波照射での、加熱マントルまたは超音波での、当業者に公知の任意の方法によりなすことができる。
【００５７】
典型的には、混合物を加熱される温度において、短時間培養させる。培養時間は、選択された時間、溶解させるべき細胞の種類および混合物の容量に依存して、典型的には２秒〜５分の範囲である。
【００５８】
核酸の抽出のために、混合物を次いで水または水性緩衝液に接触させる。試料および溶解溶液の混合物が１００℃より上の温度へと加熱される場合、混合物は水または水性緩衝液の添加前に１００℃より下の温度へと冷却されるべきである。
【００５９】
好ましい態様において、熱的溶解が起こる温度と関係なく、混合物をその後５０℃より下の温度へと、好ましくは４〜４０℃の温度へと、最も好ましくは２０〜４０℃の温度へと、水または水性緩衝液の添加前に冷却させる。
【００６０】
混合物への水または水性緩衝液の添加により、結果として二相系が形成され−１つの相は水非混和性液体を含み、１つの相は水または水性緩衝液を含む水相である。
【００６１】
添加される水または水性緩衝液のｐＨは、典型的にはｐＨ４〜ｐＨ１２である。好ましい態様において、ｐＨ６〜ｐＨ１０、最も好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８．５である。
【００６２】
典型的には、試料および溶解溶液の混合物へと添加される水または水性緩衝液の量に限定はない。好ましくは、水または水性緩衝液の量は、試料および溶解溶液の混合物の１０分の１〜１０倍の量である。これは、容量比が好ましくは１：１０〜１０：１であることを意味する。非常に好ましい態様において、それは１：２〜２：１である。
【００６３】
水または水性緩衝液の添加後に、混合物を好ましくは撹拌し、かかる二相の徹底した混合を提供する。これは、例えば振とうまたはボルテックスにより、なすことができる。
【００６４】
細胞残屑ならびに変性タンパク質が、水相および水非混和性液体相の相間に、しばしば見出される。水相を分離することができ、および核酸を水相から単離することができるか、または水相をさらなる評価のために、例えばリアルタイムＰＣＲのために直接用いることができる。
【００６５】
特に［Ｎｔｆ２］アニオンとのイオン液体が、水相における核酸の富化を提供することが見出された。本発明による他の水非混和性イオン液体または油を用いる場合、水相において見出すことができる核酸の量は、典型的には約５０％以上であるが、［Ｎｔｆ２］アニオンとのイオン液体を用いる場合、水相における核酸の量は、典型的には（混合物における核酸の合計量の）７０％よりも多くにまで拡大せしめることができる。
【００６６】
好ましい態様において、溶解溶液を添加する前に、試料を、溶解を支持する物質とともに前培養することができる。溶解を支持する物質は、例えば洗剤、カオトロピック物質または水混和性イオン液体である。アンモニウムカチオンを含む物質、特にアンモニウムカチオンを含む水混和性イオン液体との前培養が、特にグラム陽性細菌細胞を含む試料に対して好ましいことが見出された。
【００６７】
アンモニウムカチオンを含む好適な物質の例は、式（１）によるカチオン［ＮＲ４］＋を含むものであり、
ここで
Ｒはそれぞれの場合、互いに独立して、
Ｈ、
１〜２０個のＣ原子を有する、直鎖または分枝のアルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝のアルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝のアルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する飽和、部分的にまたは完全に不飽和のシクロアルキル、これは１〜６個のＣ原子を有するアルキルにより置換されていてもよい、を示し、ここで１個または２個以上のＲはハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌにより部分的にまたは完全に、あるいは−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により部分的に置換されていてもよく、およびここでα位にないＲにおける１個または２個の非隣接の炭素原子は群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団により置換されていてもよく、ここでＲ’は＝Ｈ、非フッ素化、部分的にフッ素化またはパーフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであってもよく、およびＸは＝ハロゲンであってもよい。
【００６８】
イオン液体でない式（１）によるカチオン［ＮＲ４］＋を含む好適な物質は、例えば水性アンモニア、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４ＣＯＯＨである。
【００６９】
非常に好ましい態様において、前培養を少なくとも１種のＮ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＡＥ］ベースのイオン液体とともに実行する。これらのイオン液体のカチオンは［ＤＭＡＥ］である。アニオンは好ましくはプロピオナート、アセタート、オクタノアート、２−ヒドロキシアセタート、トリフルオロアセタートおよび２−ヒドロキシブチラートの群から選択される。前培養に対し最も好ましいイオン液体は、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム−２−ヒドロキシブチラートおよび特にＮ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム−プロピオナートである。
【００７０】
前培養を典型的には、溶解を支持する物質、例えばイオン液体を試料に添加することにより実行する。溶解を支持する物質を、純粋な物質として、あるいは水または水性緩衝液とともに混合して添加することができる。添加される容量は、典型的には試料の容量の１０倍〜１０分の１である。イオン液体が溶解支持物質として用いられる場合、これらは好ましくは前もって水または水性緩衝液とともに混合され、次いで試料へと添加される。水相におけるイオン液体の量は、典型的には０．０５〜６Ｍ、好ましくは０．５〜２Ｍである。
【００７１】
溶解を支持する１種または２種以上の物質を試料へと添加することができる。溶解を支持する物質（単数）または物質（複数）（例えばＮ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム−プロピオナート）の添加後、混合物を典型的には５〜３０分、２０〜１００℃の温度で培養する。好ましい態様において、培養を１０〜２０分、７０〜９０℃の温度で実行する。
【００７２】
その後、本発明による熱的溶解を実行するために、水非混和性液体を試料および溶解を支持する物質とともに混合する。
【００７３】
もう１つの好ましい態様において、熱的溶解を実行したあとおよび水または水性緩衝液を添加した後に、二相系をプロテイナーゼとともに処置して、タンパク質または細胞残屑へとくっついた核酸を遊離させてもよい。これに対し好ましいプロテイナーゼは、プロテイナーゼＫである。典型的には二相混合物をプロテイナーゼとともに、２０〜６０℃の温度で、好ましくは５６℃近辺で、１０〜６０分間、好ましくは１０〜３０分間培養する。
【００７４】
その後、固形材料は、遠心により除去してもよい。核酸を伴う水相は、次いで単離し、およびさらに分析することができる。使用後にタンパク質を不活性化するために、試料を典型的には不活性化剤で処理するかまたは加熱する。プロテイナーゼを不活性化する方法は、当業者に公知である。好ましい方法は、試料を約１００℃へと加熱することによる熱不活性化である。プロテイナーゼ処置は、ゲノムＤＮＡを単離する場合、収率を改善するために特に有用である。これは、タンパク質または細胞残屑へと典型的には付着しないプラスミドまたはより短いオリゴヌクレオチドの単離に対し必要ではない。
【００７５】
典型的には、本発明による手順は、リアルタイムＰＣＲなどのＰＣＲ、電気得移動（アガロースまたはポリアクリルアミド）あるいはライゲーションまたは制限酵素消化などの典型的なクローン化技術を直接的に行うに十分な純度で核酸が存在する水相を提供する。
【００７６】
特に高純度を必要とするある適用のために、または元の試料が特定の不純物を含む場合、溶解および相分離後に第３の相を混合物へと添加することができる。
第３の相は、例えば、水相および水非混和性液体相の両方と混和しない、有機溶媒またはポリマー相であることができる。油が水非混和性液体として用いられる場合、第３の相もまた水非混和性イオン液体を含むことができ、水非混和性液体が水非混和性イオン液体を含む場合、第３の相は、例えば、油であることができる。第３の相は、もしそうでなければ核酸から分離することができない水相から不純物を抽出する追加の可能性を提供する。有機不純物は、例えば、有機溶媒で製造される第３の相を添加することにより抽出することができる。タンパク質は、例えば、ポリマーを含む相を添加することにより除去することができる。
【００７７】
核酸の純度をさらに改善するもう１つの可能性は、ｐＨを調整し、水相および水非混和性液体相を分離する前に濃度勾配または塩勾配を構築することにより、副生成物を沈殿させるか、または水相および水非混和性液体相の間の中間相を除去することである。特にイオン液体が水非混和性液体として用いられる場合、水相がイオン液体相の上端の上にあるため、遠心分離はまた水相から沈殿した副生成物を除去するのに役立つ。
【００７８】
本発明の方法を以って単離された核酸は、試料における細胞を量的にまたは質的に決定付けるために用いてもよい。これは、例えば、ＰＣＲ法、特にリアルタイムＰＣＲ、電気泳動（アガロースまたはポリアクリルアミド）あるいはライゲーションまたは制限酵素消化などの典型的なクローニング技術により達成されることができる。
単離手順の効率を決定付けるためにまたはモニターするために、試料を規定量の核酸でスパイクすることができる。
【００７９】
本発明による方法は、顕著に細胞溶解および核酸抽出を促進および迅速化する。全体の手順は、典型的には、前培養なしで１０〜２０分、または前培養ありで５０〜６０分かかる。加えて、二相系またはさらには三相系は、水非混和性液体相（水非混和性イオン液体を用いる場合の塩など）、水非混和性液体相および水相の間の中間相に止まる（大きなタンパク質および細胞残屑など）または第３の相の標的化された添加により除去されることができる（例えば、有機溶媒の添加による有機不純物）あるいは他の手段を以って為す、不純物の自動的な除去を提供する。
【００８０】
本発明の方法はさらに、水非混和性液体を有する少なくとも１つの容器およびプロテイナーゼを有する１つの容器を含む、細胞溶解を実行するためのキットを対象とする。好ましい態様において、プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。もう１つの好ましい態様において、水非混和性液体は水非混和性イオン液体である。キットは加えて、少なくとも１種のＮ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＡＥ］ベースのイオン液体を有する、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアンモニウム−プロピオナートを有する、１つの容器を含む。容器は、水非混和性液体、油またはプロテイナーゼを貯蔵および梱包するのに好適な任意の箱、ボトルまたは他の梱包手段である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
本発明による方法は、非常に迅速かつ効果的な溶解システムを提供する。本発明はさらに、以下の図面および例により説明されるが、しかし、そこにへと制限はされない。
【００８２】
【図１】図１は好ましいイオン液体の一部である、イオンの化学構造を示す図である。
【００８３】
【図２】図２は水非混和性イオン液体を含む溶解溶液を以ってのグラム陰性細胞溶解する場合に好ましく実行される手順ステップに対する例示的なフロースキームを示す図である。この場合、典型的には、前培養を要さない。
【００８４】
【図３】図３は水非混和性イオン液体を含む溶解溶液を以ってのグラム陽性細胞を溶解する場合に好ましく実行される手順ステップに対する例示的なフロースキームを示す図である。この場合、典型的には、前培養により核酸の収率が拡大せしめられる。
【００８５】
【図４】図４はネズミチフス菌の溶解のための標準的な技術−Macherey&Nagel NucleoSpin（登録商標）キット−と比較しての、異なる培養温度および異なる培養時間に対する結果を示す図である。
【００８６】
本明細書において引用される全ての出願、特許および出版物ならびに２０１１年４月２７日出願の対応ＥＰ出願EP 11003449.3の開示の全体を、ここに参照により組み入れる。
【００８７】
例
以下の例は、本発明の実用的適用を表す。
【００８８】
SalmonellaおよびEscherichia：
溶解：１−ブチル−１−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（ｂｍｐｙｒｒ  Ｎｔｆ２）中で１２０または１４０℃で１分
Listeria：
Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアンモニウムプロピオナート（ＤＭＡＥ  ｐｒｏｐ）とともに８０℃で１０分の前培養。
その後：プロテイナーゼＫとともに２０分
【００８９】
材料および方法：
他に示さなければ、全ての化学物質およびイオン液体（ＩＬ）は、Merck KgaA（Darmstadt, Germany）により提供される。
【００９０】
細菌株および培養条件。  リステリア菌（L. monocytogenes）EGDe（１／２ａ、内部番号２９６４）を、グラム陽性細菌に対するモデル生命体として用いる。ネズミチフス菌（S. Typhimurium）（NCTC 12023）、大腸菌（E.coli）TOP10F´および大腸菌（E.coli）TOP10F´, +ppl2/IAC （Fruehwirth et al., 2011）を、グラム陰性細菌に対するモデル生命体として用いる。全ての株を、MicroBank技術（Pro-Lab Diagnostics, Richmont Hill, Canada）を用いて−８０℃で維持する。リステリア菌EGDe、ネズミチフス菌および大腸菌TOP10F´, +ppl2/IACは、the Institute of Milk Hygiene, Department of Veterinary Public Health and Food Science, University of Veterinary Medicine, Vienna, Austriaにおける細菌株のコレクションの一部である。大腸菌TOP 10 F'は、Invitrogen GmbH（Lofer, Austria）により提供された。全ての細菌株は、０．６％（ｗ／ｖ）の酵母エキス（TSB-Y; Oxoid, Hampshire, United Kingdom）とともにトリプトン大豆ブイヨン中で終夜で、それらのそれぞれの最適な生育温度３７℃で生育させる。
【００９１】
細胞破壊実験のための装置。  小容量（１００μｌ）のＩＬのためのチューブ、ねじ山ボトル用の０．３ｍｌガラスマイクロカートリッジ（40 x 6mm; Fisherbrand, Fisher Scientific Austria GmbH, Vienna, Austria）、ＨＰＬＣ測定のための通常の装置を用いる。
それらを１００℃より上に加熱するために、マイクロカートリッジの寸法へと適合するドリル穴を有するアルミニウムブロックを製造し、そしてマグネチックスターラー（IKAMAG（登録商標）RCT; IKA-Labortechnik, Staufen i. Br., Germany）上に配置した。実際の温度は常に、それぞれのＩＬを含有する参照チューブ中に差し込んだ金属温度計（ama-digit ad14th, Amarell, Kreuzwertheim, Germany）で、直接測定する。
【００９２】
細菌および細胞破壊物の調製の実験。
グラム陰性
終夜の培養のネズミチフス菌および大腸菌細菌の調製物を５分、６，０００×ｇでの遠心により収穫し、ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、そしてｄｄＨ２Ｏ中に最初の容量の１／２０中に再懸濁させる。１０μｌの再懸濁培養物を１００μｌのｂｍｐｙｒｒ  Ｎｔｆ２中へと配置し、アルミ箔で覆い、そして異なる培養時間および温度を試験する。培養後、２×２５０μｌ  ｄｄＨ２ＯのＩＬへの添加により「懸濁液」を２ｍｌのチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）へと移し、そして数秒間ピペットで混合する。懸濁液を手短かにボルテックスし、そして上方の相をリアルタイムＰＣＲ測定のために直接的に用いる。
【００９３】
グラム陽性
終夜の培養のリステリア（L. monocytogenes.）細菌の調製物を５分、６，０００×ｇでの遠心により収穫し、ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、そしてＤＭＡＥプロピオナートの２０％溶液中に最初の容量の１／２０容量中に再懸濁させる（時間および温度は、表１を参照）。１０μｌの再懸濁培養物を１００μｌのｂｍｐｙｒｒ  Ｎｔｆ２へと配置し、そして異なる培養時間および温度を試験する。培養後、２×２５０μｌ  ｄｄＨ２ＯのＩＬへの添加により「懸濁液」を２ｍｌのチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）へと移し、そして数秒間ピペットで混合する。懸濁液を手短かにボルテックスし、そして上方の相をリアルタイムＰＣＲ測定のために直接的に用いる。
【００９４】
細胞破壊法に対する対照試料。  細胞破壊法で用いられた１０μリットルの同じ細菌懸濁液を、NucleoSpin（登録商標）組織キットおよびグラム陽性細菌に対するサポートプロトコールを用いるＤＮＡ単離に対して用いる。前溶解緩衝液（リゾチームを含む）でのステップを１時間実行し、プロテイナーゼＫのステップを終夜で実行する。プロトコールの最後のステップを修飾する。１００μの予め温めた（７０℃）溶出緩衝液ＢＥでの１回の洗浄の代わりに、予め温めたｄｄＨ２Ｏでの５０μｌの２回の洗浄をカラムからのＤＮＡの溶出に対して用いる（Meryl et al.,2009）。最後に、４００μｌのｄｄＨ２Ｏを添加して、細胞破壊実験においてと同じ容量に到達する。
【００９５】
リアルタイムＰＣＲ定量化のためのＤＮＡ標準。  それぞれの細菌種の１ミリリットルの純粋な終夜の培養物を、NucleoSpin（登録商標）組織キットおよびグラム陽性細菌に対するサポートプロトコールを用いて、ＤＮＡ単離に対して用いる。前溶解緩衝液（リゾチームを含む）でのステップを１時間、およびプロテイナーゼＫのステップを終夜で実行する。修正されたプロトコールを最終ステップで用いた。１００μｌの予め温めた（７０℃）溶出緩衝液ＢＥでの１回の洗浄の代わりに、予め温めたｄｄＨ２Ｏでの５０μｌの２回の洗浄を、カラムからのＤＮＡの溶出のための用いる。（Maryl et al., 2009）。ＤＮＡ濃度の決定を、Hoefer DyNA Quant 200装置（Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA）を用いる蛍光分析測定により実行する。
【００９６】
リアルタイムＰＣＲ。  従前の出版物（Mester et al., 2010; Roeder et al., 2010）に従い、ネズミチフス菌を分析する。リステリア菌に対するリアルタイムＰＣＲプロトコールは、従前出版されたように、リステリア菌のprfA遺伝子の２７４ｂｐ断片を標的化することにより実行する（D'Agostino et al., 2004；Rossmanith et al., 2006）。内部増幅対照を含有するプラスミドppl2/IACは、pLuc-LM5プローブを用いるリステリア菌に対するプロトコールに従い、リアルタイムＰＣＲにより分析する（Fruehwirth et al. 2011）。E. coliは、Kaclikova et. al. (2005)のプロトコールにより分析する。
【００９７】
図４は、溶解プロトコールの結果を、Salmonella Typhimuriumに関し、異なる培養温度および培養時間に対して表す。
表１は、異なる細菌株からのゲノムＤＮＡの抽出に関するいくつかの反応条件の概要を示す。
表２は、大腸菌からのプラスミドＤＮＡの抽出に対する反応条件の概要を示す。
両方の表において、平均の収率（Av.収率）は、NucleoSpin（登録商標）組織キットと比較して示す。
【００９８】
【表１】
2014512192.tif 000006
【００９９】
【表２】
2014512192.tif 000007
【０１００】
ＲＮＡ単離
試薬
Campylobacter jejuni DSMZ 4866の維持および増殖のため、ハートインフュージョンブイヨン、グリセロール、トリプシン大豆寒天、酵母エキス（Merck, Darmstadt, Germany）、コロンビア寒天およびウマ血液（laked horse blood）（Oxoid, Basingstoke, UK）を購入する。ＤＮＡ単離をNucleoSpin（登録商標）組織キット（Macherey-Nagel, Dueren, Germany）でおよびＲＮＡ単離をHigh Pure RNA単離キット（Roche, Mannheim, Germany）で実行する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために用いられる試薬（SuperScript（商標）III逆転写酵素、RNase（商標）OUT、SYTO9、PlatinumTaq（登録商標）DNAポリメラーゼ）をInvitrogen（Lofer, Austria）、ならびにプライマーおよびプローブをMWG Biotech（Ebersberg, Germany）から得る。
【０１０１】
Campylobacter jejuni（DSMZ 4688）の培養
１００μｌの凍結永久（２０％  ｖ／ｖグリセロール、２０％  ｖ／ｖウマ血液および６０％  ｖ／ｖブレインハートインヒュージョンブイヨン、−８０℃で維持）のC. jejuni DSMZ 4688株を、９ｍｌのブレインハートインヒュージョン（膜ろ過）中で植菌し、微好気的条件（３％  Ｏ２、１０％  ＣＯ２、８７％  Ｎ２）で４８ｈ、４２℃で増殖させる。培養物の純度を証明するために、それぞれ酵母エキスを添加した（０．６％  ｗ／ｖ）コロンビア寒天およびトリプトン大豆寒天の２つのプレートを追加的にストリークし、およびブレインインヒュージョンブイヨンの純度の証明のために１００μｌをそれぞれの場合において同じタイプのプレート上に配置する。
【０１０２】
ｂｍｐｙｒｒ  Ｎｔｆ２の使用によるC. jejuni DSMZ 4688からのＲＮＡ単離
それぞれの場合において、１ｍｌの４８ｈ培養物を６，０００×ｇでの５分の遠心分離により収穫し、２０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、全量を１００μｌのｂｍｐｙｒｒ  Ｎｔｆ２へと配置し、アルミ箔で覆い、そして１２０℃または１４０℃で１分間培養する。培養後、１００μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏまたは９０μｌのＤＮａｓｅ培養緩衝液および１０μｌのＤＮａｓｅ  Ｉ（High Pure RNA単離キットによるプロトコール）を試料へと添加し、全体の懸濁液を１．５ｍｌチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）へと移す。さらに、懸濁液を数秒間ボルテックスし、ＤＮａｓｅを含有する試料をまず、室温で攪拌下で５０分培養し、その後ＤＮＡ活性を７５℃１５分で停止させる。一方で、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏで処理された試料を、氷で冷ます。最終のボルテックス後、試料の上方の相を新しいチューブへと写し、−８０℃で貯蔵する。
【０１０３】
High Pure RNA単離キットによるC. jejuniからのＲＮＡ単離
夫々の試料に関し、１ｍｌの４８ｈ培養物を６，０００×ｇでの５分の遠心分離により収穫し、High Pure RNA単離キットのプロトコールにより処理する。ＤＮａｓｅ  Ｉの影響の推定のため、このステップを２つの試料で省略する。
【０１０４】
NucleoSpin（登録商標）組織キットを介するC. jejuniからのＤＮＡ抽出物に対するＤＮＡ単離および参照
１ミリリットルの４８ｈ培養物を５分６，０００×ｇでの遠心分離により収穫し、この試料をイオン液体法との比較のためのＤＮＡ含有量もまた得る参照として用いる。加えて、ＤＮＡ標準を作るために、試料をコロンビア寒天プレートから採取する。ＤＮＡ単離をグラム陽性細菌に対するNucleoSpin（登録商標）組織キットのプロトコールにより実行する（１ｈ  リゾチーム、プロテイナーゼ  終夜）。プロトコールの最終ステップを修飾する。１００μｌの前加温（７０℃）溶出緩衝液ＢＥでの１回の洗浄の代わりに、前加温したｄｄＨ２Ｏでの５０μｌの２回の洗浄を、カラムからのＤＮＡの溶出のために用いる（Maryl et al., 2009）。標準に関するＤＮＡ濃度は、Hoefer DyNA Quant 200装置（Pharmacia Biotech, San Francisco, CA）を用いることにより、蛍光分析により獲得する。
【０１０５】
定量化のための核酸の操作
ｃＤＮＡの合成およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を、Dzieciol et al. (2011)のプロトコールにより実行する。
【０１０６】
表３
本発明の方法のC. jejuniからのＲＮＡの単離のために用いられる参照方法（市販のKit RNA Isolation Kit）との比較を表３に示す。ゲノムＤＮＡ残基の消化および除去のための追加のＤＮＡｓｅステップを有する本発明のプロトコールの低減された回復は、ＤＮＡｓｅプロトコールの持続から生じるものであり、明示的な低いＲＮＡ含有量から生じるものではない。これは、低いＤＮＡ含有量提供するデータを表す表５において示される。それゆえ、本表において表される本プロトコールのＲＮＡ回復は顕著である。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
表４
表３に示される実験の間のゲノムＤＮＡの回復を、表４において参照することができる。
【表４】
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【０１０９】
表５
表３に示される実験のＲＴ（−）値。ＲＴ（−）値はプロトコール後の試料におけるＤＮＡの比率を実証する。実験に関し、２対数スケールの間隔は、試料における１％のＤＮＡ含有量を意味する。
【表５】
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【０１１０】
引用文献リスト：
【表６】
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【０１１１】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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