(57)【要約】アッセイのための方法、組成物およびキットを、本明細書において提供し、アッセイのうちの多くは、デジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲなどの増幅反応を伴う。上記アッセイを、配列決定、コピー数変動分析などのような適用のために使用することができる。場合によっては、上記アッセイは、試料を、複数の区画（例えば、液滴）に細分すること、およびそれらの区画を、バーコードを有するアダプターを含むその他の区画と合体させることを伴う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、
ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも大きいステップと、
ｃ．該第１の区画のうちの少なくとも１つを、該第２の区画のうちの少なくとも１つと合体させて、合体区画を形成するステップと、
ｄ．該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。
【請求項２】
ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、
ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも小さいステップと、
ｃ．該第１の区画のうちの少なくとも１つを、該第２の区画のうちの少なくとも１つと合体させて、合体区画を形成するステップと、
ｄ．該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記第１の区画が液滴である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の区画が液滴である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記液滴が、不混和性の流体内にある、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記タグを付けるステップが、前記アダプターのうちの１つを含む少なくとも１つの第１の液滴を、前記ポリヌクレオチドのうちの１つを含む少なくとも１つの第２の液滴と合体させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第２の液滴が、少なくとも１つの該第１の液滴を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第２の液滴が、少なくとも１つの該第１の液滴を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第１の液滴が、少なくとも１つの該第２の液滴を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の区画が第１の液滴であり、前記第２の区画が第２の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第１の液滴が、少なくとも１つの該第２の液滴を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の体積が、前記第１の体積の前記体積の少なくとも２倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の体積が、前記第２の体積の前記体積の少なくとも２倍である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記液滴の温度を改変するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記合体させるステップが、前記第１の液滴のそれぞれが前記第２の液滴のそれぞれと合体するような制御器の使用を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記合体させるステップが、ポリヌクレオチドを含む液滴を、アダプターを含む液滴とランダムに合体させるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片をプールするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片を分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析するステップが、前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片の配列を決定するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片が、同じ区画に位置したかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記配列を決定するステップにより得られた任意の２つの配列の読取りが、同じまたは異なる区画から生じた可能性を推定するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
所与の区画が、異なる染色体由来であるが、同じ遺伝子座由来の２つ以上のポリヌクレオチドまたはそれらの断片を含む可能性がないように、前記試料を区画化する、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ゲノムＤＮＡが、高分子量ＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の区画内の前記ポリヌクレオチドを断片化して、ポリヌクレオチドの断片を形成するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドの断片が、前記ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼを用いて断片化することによって生成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アダプターを、複数の前記合体区画内の前記ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって、該ポリヌクレオチドにタグを付ける、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記タグを付けるステップが、トランスポゾンを使用して達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記タグを付けたポリヌクレオチドが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドが、タグを付ける前に増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の区画のそれぞれが平均して５つ未満のアダプターを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の区画のそれぞれが平均して５つ未満の、前記複数のポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料を前記細分するステップが、該試料を前記第２の区画と乳化させるステップまたは混合するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のアダプターを前記細分するステップが、該複数のアダプターを前記第２の区画と乳化させるステップまたは混合するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅が、多置換増幅である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
ａ．オルガネラを複数の区画に区画化するステップであって、各区画が平均して１つの区画当たり５つ未満のオルガネラを含む、ステップと、
ｂ．該複数の区画中の細胞外の該オルガネラを溶解するステップであって、該溶解するステップにより、該オルガネラからＲＮＡが放出される、ステップと、
ｃ．該複数の区画中の該放出されたＲＮＡから、バーコードを含むアダプターを用いて、タグを付けたｃＤＮＡを生成するステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記オルガネラが、細胞外のオルガネラである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記オルガネラが、エキソソームである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記タグを付けたｃＤＮＡを生成するステップが、前記放出されたＲＮＡの、区画特異的バーコードを付けたプライマーを用いての逆転写を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記タグを付けたｃＤＮＡの配列を決定するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記タグを付けたｃＤＮＡが、同じオルガネラ由来であるかを決定するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ａ．微生物を複数の区画に区画化するステップと、
ｂ．該複数の区画中の該微生物からポリヌクレオチドを得るステップと、
ｃ．該複数の区画中の該ポリヌクレオチドに、バーコードを含むアダプターを用いてタグを付けるステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップと
を含む方法。
【請求項４３】
前記区画のそれぞれが平均して５つ未満の微生物を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記タグを付けたポリヌクレオチドの配列を決定するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記タグを付けたポリヌクレオチドの断片が、同じ区画由来であるかを決定するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１１年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４７８，７７７号（この出願は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
次世代の配列決定は、多くの有用な適用例（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有し、複数の試料を分析するために使用することができる。次世代の配列決定の適用例のために、試料を多重化する方法の改善が求められている。また、区画化したポリヌクレオチドにバーコードタグ付けする方法の改善、および該バーコードタグ付けされたポリヌクレオチドを分析する方法の改善も求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
標的配列のコピー数の決定は、多くの有用な適用例を有し得る。標的配列のコピー数を決定する方法の改善が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、配列決定およびその他の適用例において使用することができる方法を提供する。いくつかの事例では、本開示は、ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも大きいステップと、ｃ．該第１の区画のうちの少なくとも１つを、該第２の区画のうちの少なくとも１つと合体させて、合体区画を形成するステップと、ｄ．該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップとを含む方法を提供する。
【０００５】
この方法は、ａ．複数のアダプターを複数の第１の区画に細分するステップであって、該第１の区画のそれぞれが平均して第１の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、ｂ．複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第２の区画に細分するステップであって、該第２の区画のそれぞれが平均して第２の体積を有し、該第２の体積が、該第１の体積よりも小さいステップと、ｃ．該第１の区画のうちの少なくとも１つを、該第２の区画のうちの少なくとも１つと合体させて、合体区画を形成するステップと、ｄ．該複数のポリヌクレオチドのうちの１つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも１つを用いてタグを付けるステップとを含む場合がある。
【０００６】
しばしば、本明細書に開示する方法において、上記第１の区画は液滴である。いくつかの事例では、上記第２の区画は、液滴である。場合によっては、上記液滴は、不混和性の流体内にある。
【０００７】
場合によっては、上記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡである。例えば、上記ゲノムＤＮＡは、高分子量ＤＮＡであり得る。場合によっては、所与の区画が、異なる染色体由来であるが、同じ遺伝子座由来の２つ以上のポリヌクレオチドまたはそれらの断片を含む可能性が低いように、ゲノムＤＮＡの試料を区画化する。
【０００８】
場合によっては、上記第１の区画が第１の液滴であり、上記第２の区画が第２の液滴であり、上記合体させるステップの前に、少なくとも１つの上記第２の液滴が、少なくとも１つの上記第１の液滴を含む。その他の場合には、上記第１の区画が第１の液滴であり、上記第２の区画が第２の液滴であり、上記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第２の液滴が、少なくとも１つの第１の液滴を含まない。場合によっては、上記第１の区画が第１の液滴であり、上記第２の区画が第２の液滴であり、上記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第１の液滴が、少なくとも１つの該第２の液滴を含む。場合によっては、上記第１の区画が第１の液滴であり、上記第２の区画が第２の液滴であり、上記合体させるステップの前に、少なくとも１つの該第１の液滴が、少なくとも１つの該第２の液滴を含まない。
【０００９】
上記試料を含有する区画の体積が、上記アダプターを含有する区画の体積と異なる場合がある。例えば、上記第２の体積は、上記第１の体積の少なくとも２倍の体積である。その他の場合には、上記第１の体積は、上記第２の体積の少なくとも２倍の体積である。本明細書において開示する方法は、上記液滴の温度を改変するステップをさらに含むことができる。
【００１０】
場合によっては、この方法は、上記第１の液滴のそれぞれが上記第２の液滴のそれぞれと合体するような制御器の使用を含む方法により、液滴を合体させるステップをさらに含む。場合によっては、合体させるステップは、ポリヌクレオチドを含む液滴を、アダプターを含む液滴とランダムに合体させることを含む。こうした方法は、上記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片をプールするステップをさらに含むことができる。
【００１１】
しばしば、この方法は、上記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片を分析するステップをさらに含む。上記分析するステップは、上記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片の配列を決定することを包含し得る。上記分析するステップは、上記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドもしくはそれらの断片が、同じ区画に位置したかどうかを決定すること、または場合によっては、配列決定により得られた任意の２つの配列読取りが、同じもしくは異なる区画から生じた可能性を推定することを含むことができる。
【００１２】
場合によっては、この方法は、上記第２の区画内のポリヌクレオチドを断片化して、ポリヌクレオチドの断片を形成するステップをさらに含む。上記ポリヌクレオチドの断片は、上記ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼを用いて断片化することによって生成することができる。
【００１３】
場合によっては、上記アダプターを、複数の上記合体区画内の上記ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって、該ポリヌクレオチドにタグを付ける。タグを付けるステップは、複数の手段により達成することができる；例えば、タグを付けるステップは、トランスポゾンを使用して達成することができる。
【００１４】
しばしば、本明細書の方法は、増幅反応を含む。しばしば、上記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を含むか、または該増幅は、異なるタイプの反応、例として、多置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。しばしば、タグを付けたポリヌクレオチドを増幅し、場合によっては、タグを付ける前に増幅する。
【００１５】
場合によっては、上記第１の区画のそれぞれが平均して５つ未満のアダプターを含む。しばしば、上記第２の区画のそれぞれが平均して５つ未満の複数の上記ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、上記試料を細分するステップは、該試料を上記第２の区画と乳化させることまたは混合することを含む。しばしば、複数の上記アダプターを細分するステップは、複数の上記アダプターを上記第２の区画と乳化させることまたは混合することを含む。
【００１６】
いくつかの態様では、本開示は、ａ．オルガネラを複数の区画に区画化するステップであって、各区画が平均して１つの区画当たり５つ未満のオルガネラを含むステップと、ｂ．上記複数の区画中の細胞外のオルガネラを溶解するステップであって、該溶解するステップにより、該オルガネラからＲＮＡが放出されるステップと、ｃ．該複数の区画中の放出されたＲＮＡから、バーコードを含むアダプターを用いて、タグを付けたｃＤＮＡを生成するステップであって、複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップとを含む方法を提供する。場合によっては、上記オルガネラは、細胞外のオルガネラ、例として、エキソソームである。場合によっては、上記タグを付けたｃＤＮＡを生成するステップは、上記放出されたＲＮＡの、区画特異的バーコードを付けたプライマーを用いる逆転写を含む。この方法は、上記タグを付けたｃＤＮＡの配列を決定するステップ、および／または上記タグを付けたｃＤＮＡが、同じオルガネラ由来であるかを決定するステップをさらに含むことができる。
【００１７】
また、本開示は、ａ．微生物を複数の区画に区画化するステップと、ｂ．該複数の区画中の該微生物からポリヌクレオチドを得るステップと、ｃ．該複数の区画中の該ポリヌクレオチドに、バーコードを含むアダプターを用いてタグを付けるステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップとを含む方法も提供する。場合によっては、上記区画のそれぞれが平均して５つ未満の微生物を含む。この方法は、タグを付けた上記ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ、および／またはタグを付けた上記ポリヌクレオチドの断片が、同じ区画由来であるかを決定するステップをさらに含むことができる。
【００１８】
参照による組込み
本明細書において言及する刊行物、特許および特許出願は全て、個々の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ、参照により組み込まれていることを具体的かつ個々に示すのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【００１９】
添付の特許請求の範囲において、新規の特徴を詳細に記載する。原理を活用する例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付随する図面を参照することにより、特徴および利点がより良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、試料を含む液滴を、バーコードを有するアダプターを含む液滴と合体させる方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試料を含む液滴を、バーコードを有するアダプターを含む液滴と合体させる方法を示す。
【図２】図２は、高いコピー数の標的のコピー数を、共通の標識を用いて検出される基準を使用して決定する方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一般に、ポリヌクレオチドの配列を決定するためのライブラリーの調製のための方法、組成物およびキットを本明細書に記載する。これらの方法、組成物およびキットを使用して、ポリヌクレオチドの試料を複数の区画に分離することができ、該複数の区画のそれぞれに、バーコードを含むアダプターの独自のセットを提供することができる。ライブラリーの調製を、上記複数の区画（例えば、液滴）のそれぞれの中で実施することができる。上記区画の内容物を、プールし、配列を決定して、配列読取りを得ることができ、上記バーコードを使用して、どの配列読取りが、同じ区画から生じたかを同定することができる。方法、組成物、システムおよびキットのいくつかの実施形態を、本明細書において提供する。
【００２２】
概説
一般に、バーコード付け（または「タグ付け」）により、１つの試料当たりの配列決定のコストを低下させるために、核酸の試料をプールし、さらにまた、どの試料から、配列読取りが得られるかを決定する能力を保持することが可能になり得る。別個のライブラリーの調製物を、各試料について調製することができ、各試料は、それ自体の独自のバーコードを有し得る。次いで、独自のバーコードを有する、別個に調製したライブラリーを、プールし、配列を決定することができる。結果として得られるデータセットのそれぞれの配列読取りから、該配列読取り中のバーコードを介して、元々の試料に遡ることができる。
【００２３】
本明細書において提供する方法では、試料中のポリヌクレオチドを、複数の区画、例えば、液滴に分離することができる。独自のバーコード（または「タグ」）を有するアダプターを、ポリヌクレオチドを含む複数の区画のそれぞれに供給することができる。バーコードアダプターを有するポリヌクレオチドの配列を決定することができ、上記バーコードを使用して、２つ以上の配列読取りが、同じ区画中の１つまたは複数のポリヌクレオチドから得られたかを決定することができる。
【００２４】
バーコードアダプターを、区画、例えば、エマルジョンの水相、例えば、液滴内に束ねることができる。アダプターが充填されている区画（例えば、液滴）を、試料のポリヌクレオチドを含有する区画（例えば、液滴）と合体させることによって、バーコードタグ付けを達成することができる。場合によっては、アダプターが充填されている区画は、試料のポリヌクレオチドを含有する区画よりも小さい（例えば、図１Ａを参照されたい）。バーコードを付けたアダプターを、試料のポリヌクレオチドを含有する区画よりも小さいサイズの複数の区画に分離することができる。より大きい、試料のポリヌクレオチドを含有する区画が形成され得る。バーコードを付けたアダプターが充填されている区画を、試料のポリヌクレオチドを含有する区画と合体させることができ、アダプターを、ポリヌクレオチドに結合することができる。例えば、試料のポリヌクレオチドを含有する区画は平均して、上記アダプターを含有する区画の平均サイズの１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍よりも大きい場合がある。試料のポリヌクレオチドを含有する区画は平均して、上記アダプターを含有する区画の平均体積の１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍よりも大きい場合がある。場合によっては、試料のポリヌクレオチドを含有する区画は、アダプターが充填されている区画を含有するように形成される。例えば、アダプターが充填されている区画（例えば、液滴）を、ポリヌクレオチドの試料と乳化させることができ、その結果、試料のポリヌクレオチドを含有する区画（例えば、液滴）が、アダプターが充填されている区画を含有するようになる。上記アダプターが充填されている液滴を、（例えば、温度調節を通して）破裂させて、ライブラリーの調製のために使用することができる反応構成成分（例えば、ＰＣＲまたはライゲーションの構成成分）を放出させることができる。いくつかの実施形態では、上記温度調節は、その温度を、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃まで、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃超まで、または少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃まで、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分間かけて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分超かけて、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分間かけて上昇させることを含む。いくつかの実施形態では、上記温度調節は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間にわたり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間超にわたり、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間にわたり続き得る。場合によっては、上記アダプターが充填されている液滴は、試料を含有する液滴内に含有されない。かかる場合には、別個の液滴を、一緒にして合体させることができる。
【００２５】
場合によっては、アダプターが充填されている区画は、試料のポリヌクレオチドを含有する区画よりも大きい（例えば、図１Ｂを参照されたい）。バーコードを付けたアダプターを、試料のポリヌクレオチドを含有する区画よりも大きいサイズの複数の区画に分離することができる。より小さい、試料のポリヌクレオチドを含有する区画が形成され得る。バーコードを付けたアダプターが充填されている区画を、試料のポリヌクレオチドを含有する区画と合体させることができ、アダプターを、ポリヌクレオチドに結合することができる。例えば、アダプターを含有する区画は平均して、上記試料を含有する区画の平均サイズの１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍よりも大きい場合がある。上記アダプターを含有する区画は平均して、上記試料を含有する区画の平均体積の１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍よりも大きい場合がある。場合によっては、アダプターを含有する区画は、試料を含有する区画を含有するように形成される。例えば、いくつかの実施形態では、試料のポリヌクレオチドが充填されている区画（例えば、液滴）を、アダプターと乳化させることができ、その結果、アダプターを含有する区画（例えば、液滴）が、試料を含有する区画を覆うようになる。かかる場合には、上記試料を含有する液滴を、（例えば、温度調節を通して）破裂させることができ、その結果、異なるタイプの液滴の内容物を合体させることができる。いくつかの実施形態では、上記温度調節は、その温度を、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃まで、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃超まで、または少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃まで、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分間かけて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分超かけて、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分間かけて上昇させることを含む。いくつかの実施形態では、上記温度調節は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間にわたり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間超にわたり、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間にわたり続き得る。場合によっては、上記試料のポリヌクレオチドが充填されている液滴は、上記アダプターを含有する液滴内に含有されない。かかる場合には、別個の液滴を、一緒にして合体させることができる。
【００２６】
マイクロ流体デバイスを使用して、試料のポリヌクレオチドの区画全てが、アダプター試薬を含むように予め作製したアダプター試薬を、複数の、試料のポリヌクレオチドの区画と合体させることができる。例えば、１０００×１０００（１００万）個の区画を有する四角の形状のデバイスを使用することができ、各ポリヌクレオチドに、２つのバーコードを用いてタグを付けることができる。１００万個の独自の識別子を、２，０００個の異なるバーコードを用いて構築することができる。１，０００個の異なるバーコードを有する試薬を、上記デバイスの水平チャネル中に装填することができ、別のセットの１，０００個の異なるバーコードのための試薬を、該デバイスの垂直チャネル中に装填することができる。上記１００万個の区画のいずれもが、それ自体の独自の組合せのバーコードを有し得る。
【００２７】
場合によっては、試料のポリヌクレオチドを含有する区画（例えば、液滴）とアダプターが充填されている区画（例えば、液滴）とを、制御された様式で、例えば、試料のポリヌクレオチドの１つの液滴と独自のアダプターの１つの液滴とを合体させる。場合によっては、アダプターが充填されている区画を、試料のポリヌクレオチドを含有する区画とランダムに合体させる。
【００２８】
以下の例により、方法のある実施形態を示す。（Ｎ）個のタイプの液滴の大きいセットを作製することができる。それぞれのタイプの液滴に、それ自体のバーコードを装填することができる。１つには、値Ｎは、バーコードの長さ（Ｌ）により決定することができる。例えば、Ｎは、４＾Ｌ程の大きさであり得る。したがって、Ｌ＝１０の場合、およそ１００万個の異なる液滴のタイプを生成することができる。各区画内で、標準的な配列決定ライブラリーの調製を実施することができる。上記ライブラリーを調製したら、全ての上記区画の内容物を、（例えば、液滴を破壊することによって）合体させ、核酸シーケンサーに装填することができる。シーケンサーにより、上記ライブラリーのポリヌクレオチドのうちの多くについて、配列読取りを得ることができる。同じ液滴内に調製されたポリヌクレオチドは、同じバーコードを含有することができる。上記バーコードの数が十分に多い場合、同じバーコードを含有する分子は、同じ区画から生じたと推量することができる。Ｎが十分に大きい（例えば、本実験で実際に使用する、アダプターが充填されている区画の数よりも大きい）場合、任意の２つの、試料のポリヌクレオチドを含有する区画に、異なるアダプターが充填されている区画によりタグを付けることができることが予想され得る。しかし、Ｎがあまり大きくない場合には、試料のポリヌクレオチドの区画に、同じアダプターを用いてタグを付ける場合がある。そうした場合には、任意の２つの読取りが、同じまたは異なる、試料を含有する区画から生じた可能性を、確率論の使用によって推定することができる。多くの適用例の場合、確率に基づく評価で十分であることがある。
【００２９】
いくつかの実施形態では、例えば、配列決定反応において多重化することができる、異なる試料の数は、約１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個の試料、約１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個超の試料、約１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個未満の試料、または少なくとも約１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個の試料であり得る。いくつかの実施形態では、約１０００〜約１０，０００個、約１０，０００〜約１００，０００個、約１０，０００〜約５００，０００個、約１００，０００〜約５００，０００個、約１００，０００〜約１，０００，０００個、約５００，０００〜約１，０００，０００個、約１，０００，０００〜約５，０００，０００個、または約１，０００，０００〜約１０，０００，０００個の試料を、本明細書に記載する方法において多重化する。
【００３０】
バーコードタグ付けのいくつかの方法が、例えば、米国特許出願公開第２０１１００３３８５４号に記載されている。
【００３１】
より小さい液滴（例えば、内側の液滴）の、より大きい液滴（例えば、外側の液滴）との融合
より小さい液滴（例えば、内側の液滴）を、より大きい液滴（例えば、外側の液滴）と融合させるためのいくつかの方法が、例えば、米国特許出願公開第２０１１００５３７９８号に開示されている。場合によっては、加熱／冷却して温度を変化させること、圧力を加えること、（例えば、化学添加剤を介して）組成を変更すること、（例えば、音波処理を介して）音響エネルギーを加えること、（例えば、光化学反応を刺激するための）光に対する曝露、電場を適用すること、または任意のそれらの組合せにより、内側の液滴（または区画）を、外側の液滴（または区画）と融合させることができる。場合によっては、上記内側の液滴を、外側の液滴に自発的に融合させることができる。処理は、連続的であってもよく、または時間的に変動してもよい（例えば、拍動性、ショックおよび／または反復処理）。上記処理により、エマルジョンのパラメータを、徐々にまたは迅速に変化させて、液滴の融合の定常状態または一過性の開始をもたらすことができる。上記区画の安定性、および液滴の融合を引き起こすための処理に対するそれらの応答性を、それらの形成の間に、内側／外側の区画の１つまたは複数の相に適当な界面活性剤のタイプ、界面活性剤の濃度、臨界ミセル濃度、イオン強度等を選択することによって決定することができる。
【００３２】
融合により、融合型のエマルジョンを得ることができる。融合は、自発的に発生する場合があり、したがって、融合した液滴をプロセシングする前に、十分な時間の遅延以外の処理は必要としない（または遅延も必要としない）。それに代わって、上記内側／外側の液滴を処理し、液滴の融合を制御可能な様式で引き起こして、アッセイ混合物を形成することもできる。
【００３３】
融合型のエマルジョンをプロセシングすることができる。プロセシングは、上記融合型のエマルジョンを、少なくとも１つの目的の反応が発生し得る（かつ／または停止される）任意の条件または条件のセットに、任意の適切な期間にわたり付すことを含むことができる。したがって、プロセシングは、とりわけ、上記融合型のエマルジョンの温度を予め定義した設定点付近に維持すること、上記融合型のエマルジョンの温度を２つ以上の予め定義した設定点の間で変動させること（例として、上記融合型のエマルジョンを熱サイクリングすること）、上記融合型のエマルジョンを光に曝露すること、上記融合型のエマルジョンに及ぼす圧力を変化させること、少なくとも１つの化学物質を上記融合型のエマルジョンに添加すること、上記融合型のエマルジョンに電場を加えること、または任意のそれらの組合せを含むことができる。
【００３４】
シグナルを、プロセシングの後および／またはその間に、上記融合型のエマルジョンから検出することができる。検出について、本明細書のその他のセクションにさらに記載する。上記シグナルを、とりわけ、光学的、電気的、化学的にかまたはそれらの組合せにより検出することができる。上記検出されるシグナルは、上記融合型のエマルジョン中で実施する、少なくとも１つの目的の反応に対応する試験シグナルを含むことができる。それに代わってまたはそれに加えて、検上記出されるシグナルは、上記融合型のエマルジョンに存在するコードに対応するコードシグナルを含むこともできる。試験シグナルおよびコードシグナルは一般に、区別可能であり、同じまたは明確に異なる検出器を使用して検出することができる。例えば、上記試験シグナルおよびコードシグナルをそれぞれ、蛍光シグナルとして検出することができ、その蛍光シグナルは、とりわけ、励起波長（もしくはスペクトル）、放射波長（もしくはスペクトル）、および／または融合した液滴中の明確に異なる位置（例えば、融合した液滴に関しては、コードシグナルは、試験シグナルよりも局在しているシグナルとして検出可能である場合がある）に基づいて区別可能である場合がある。別の例として、上記試験シグナルおよびコードシグナルは、明確に異なる光学的な特性、例として、蛍光として検出される試験シグナル、および光学的反射率として検出されるコードシグナルとして検出することもできる。さらなる例として、上記試験シグナルを光学的に検出し、上記コードシグナルを電気的に検出してもよく、または逆であってもよい。
【００３５】
アダプター
バーコードは、アダプター上に存在し得、バーコードを有するアダプターを、ライゲーションによりポリヌクレオチドに結合することができる。多様なタイプのアダプターを、本明細書に記載する方法、組成物、システムおよびキットにおいて使用することができる。例えば、アダプターは、二本鎖配列を含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、１つの平滑末端を含むことができる。場合によっては、二本鎖配列を有するアダプターは、２つの平滑末端を含む。二本鎖配列を有するアダプターは、１つの３’オーバーハングを含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、２つの３’オーバーハングを含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、１つの５’オーバーハングを含むことができる。場合によっては、二本鎖配列を有するアダプターは、２つの５’オーバーハングを含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、５’オーバーハングおよび３’オーバーハングを含むことができる。場合によっては、アダプターは、一本鎖核酸のみを含む。
【００３６】
アダプターが、１つまたは複数のオーバーハングを有する場合、該オーバーハングは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個超の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個未満の塩基、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基であり得る。例えば、３’オーバーハングは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個超の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個未満の塩基、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基であり得る。５’オーバーハングは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個超の塩基、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個未満の塩基であり得る。アダプターが、２つのオーバーハングを含む場合、該オーバーハングは、同じまたは異なる数の塩基を含むことができる。
【００３７】
アダプターの最も長い鎖は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個超の塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個未満の塩基、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個の塩基であり得る。アダプターが、二本鎖部分を含む場合、該二本鎖部分は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個の塩基対、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個超の塩基対、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個の塩基対、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個未満の塩基対であり得る。
【００３８】
アダプターは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことができる。場合によっては、アダプターは、ＤＮＡを含む。場合によっては、アダプターは、ＲＮＡを含む。場合によっては、アダプターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【００３９】
アダプターは、二本鎖核酸を含むことができる。場合によっては、アダプターは、二本鎖ＤＮＡを含む。場合によっては、アダプターは、二本鎖ＲＮＡを含む。場合によっては、アダプターは、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド二重鎖を含む。
【００４０】
アダプターは、一本鎖核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、一本鎖ＲＮＡを含む。場合によっては、アダプターは、一本鎖ＤＮＡを含む。場合によっては、アダプターは、一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡを含む。
【００４１】
アダプターが、二本鎖配列を含む場合、該アダプターの１つの鎖は、ＤＮＡのみを含むことができ、該アダプターの１つの鎖は、ＲＮＡのみを含むことができる。第１の鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができ、第２の鎖は、ＤＮＡのみを含むことができる。第１の鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができ、第２の鎖は、ＲＮＡのみを含むことができる。アダプターの鎖が、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む場合、該ＤＮＡは該ＲＮＡの５’であり得るか、または該ＤＮＡは該ＲＮＡの３’であり得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、一本鎖であり、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、該ＤＮＡは、該ＲＮＡの５’または該ＲＮＡの３’である。
【００４２】
アダプターは、ヘアピン（またはヘアピンループ）を含むことができる。ヘアピンは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことができる。ヘアピンのループにおける、塩基対をなさない塩基の数は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の塩基、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個超の塩基、または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の塩基であり得る。ヘアピンのループにおける、塩基対をなさない塩基の数は、約４〜約８個、約４〜約１０個、約４〜約１４個、約４〜約１６個、約４〜約２０個、約４〜約２４個、約４〜約２６個または約４〜約３０個の塩基であり得る。上記アダプターのステム（塩基対をなす部分）の長さは、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の塩基対、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個超の塩基対、または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の塩基対であり得る。
【００４３】
場合によっては、ヘアピンアダプターを、ポリヌクレオチドの一方の末端のみにライゲーションする。場合によっては、第１のヘアピンアダプターを、ポリヌクレオチドの一方の末端にライゲーションし、第２のヘアピンアダプターを、該ポリヌクレオチドの他方の末端にライゲーションする。ポリヌクレオチドの各末端にライゲーションするヘアピンアダプターは、同じ核酸配列または異なる核酸配列を含むことができる。ポリヌクレオチドの各末端にライゲーションするヘアピンアダプターは、バーコードを有する場合があり、該バーコードは、同じであってもまたは異なっていてもよい。ポリヌクレオチドの一方の末端にライゲーションするヘアピンアダプターは、バーコードを有する場合があり、ポリヌクレオチドの他方の末端にライゲーションするヘアピンアダプターは、バーコードを欠く場合がある。
【００４４】
場合によっては、複数のアダプターおよびポリヌクレオチドが散在するように、アダプターを、ポリヌクレオチドにライゲーションする。
【００４５】
バーコード
アダプターは、１つまたは複数のバーコード（タグ）配列を含むことができる。バーコード配列は、独自の識別子となり得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個の塩基もしくは塩基対、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個超の塩基もしくは塩基対、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個未満の塩基もしくは塩基対、または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個の塩基もしくは塩基対である。いくつかの実施形態では、バーコードは、約４〜約６個の塩基もしくは塩基対（ｂｐ）、約４〜約７個の塩基もしくは塩基対、約４〜約８個の塩基もしくは塩基対、約４〜約９個の塩基もしくは塩基対、約４〜約１０個の塩基もしくは塩基対、約４〜約１２個の塩基もしくは塩基対、約４〜約１４個の塩基もしくは塩基対、約４〜約１６個の塩基もしくは塩基対、約４〜約１８個の塩基もしくは塩基対、約４〜約２０個の塩基もしくは塩基対、約５〜約１０個の塩基もしくは塩基対、約５〜約１５個の塩基もしくは塩基対、約５〜約２０個の塩基もしくは塩基対、約５〜約２５個の塩基もしくは塩基対、約５〜約３０個の塩基もしくは塩基対、約５〜約３５個の塩基もしくは塩基対、約５〜約４０個の塩基もしくは塩基対、または約５〜約５０個の塩基もしくは塩基対である。いくつかの実施形態では、バーコード中の塩基は、近接する。いくつかの実施形態では、バーコード中の塩基は、近接しない。いくつかの実施形態では、アダプターは、バーコードを含まない。
【００４６】
バーコードは、アダプター中で二本鎖であり得る。場合によっては、バーコードは、アダプター中で一本鎖である。バーコードは、アダプター中に、二本鎖および一本鎖の配列を含むことができる。アダプターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の異なるバーコード、約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個超の異なるバーコード、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の異なるバーコード、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個未満の異なるバーコードを含むことができる。アダプターが、２つ以上のバーコードを含む場合、該バーコードを、該アダプター上で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基もしくは塩基対、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個超の塩基もしくは塩基対、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の塩基もしくは塩基対により相互に分離することができる。
【００４７】
バーコードを有するアダプターを含む商業的に入手可能なキットを、本明細書に記載する方法において使用することができる。例えば、バーコードを有するアダプターを含むキットとして、３８４個の分子的にバーコードを付けたライブラリーアダプターを含むことができるＥＮＣＯＲＥ（商標）３８４  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＵＧＥＮ（登録商標））を挙げることができる。ＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ（商標）用のＥＮＣＯＲＥ（商標）ＮＧＳ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍは、断片にライゲーションすることができる、バーコードを有するアダプターを含むことができる。ＥＮＣＯＲＥ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＩＬ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ  １−８（ＮＵＧＥＮ（登録商標））、およびＥＮＣＯＲＥ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＩＬ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９−１６（ＮＵＧＥＮ（登録商標））は、多重化配列決定のために、バーコードを付けたアダプターを提供することができる。ＥＮＣＯＲＥ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＤＲ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ  １−８（ＮＵＧＥＮ（登録商標））、およびＥＮＣＯＲＥ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＤＲ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ９−１６（ＮＵＧＥＮ（登録商標））は、専用の読取り（ＤＲ）バーコードの設計を提供することができる。ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（商標）製の、バーコードを有するアダプターを用いるキットの例として、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  １−１６、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  １−９６、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  １７−３２、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  ３３−４８、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  ４９−６４、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  ６５−８０、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒｓ  ８１−９６、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ、５５００  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｄａｐｔｏｒｓ、５５００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ用のＬＩＢＲＡＲＹ  ＢＵＩＬＤＥＲ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  １−９６、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  １７−３２、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  ３３−４８、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  ４９−６��、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  ６５−８０、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  ８１−９６、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  １−１６、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  １−４８、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  １−９６、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  １７−３２、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  ３３−４８、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  ４９−６４、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  ４９−９６、ＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  ６５−８０、またはＳＯＬｉＤ（商標）ＲＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｍｏｄｕｌｅ  ８１−９６を挙げることができる。
【００４８】
バーコードを有するアダプターを用いる、他の商業的に入手可能なキットとして、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＡＢ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＡＧＩＬＥＮＴ  ＴＥＣＨＯＮＯＬＯＧＩＥＳ）、Ｂｉｏｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＡＩＲ（商標）Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ａｄａｐｔｅｒｓ、ＮＥＸＴＦＬＥＸ（商標）ＤＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｅｓ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＴＲＵＳＥＱ（商標）ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ、ＲＡＩＮＤＡＮＣＥ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＤＥＥＰＳＥＱ（商標）ＦＦＰＥ溶液、ＩＬＬＵＭＮＩＡ（登録商標）（Ｉｎｄｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  １−１２）用のＮＥＢＮＥＸＴ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ、またはＩＬＬＵＭＮＩＡ（登録商標）（Ｉｎｄｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  １−１２）用のＮＥＢＮＥＸＴ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐセットが挙げられる。
【００４９】
ポリヌクレオチドは、バーコードを含むアダプターにライゲーションすることによって、バーコードを受け取ることができる。上記ライゲーションは、１つまたは複数のリガーゼの使用を包含し得る。バーコードを含むプライマーを用いて増幅することによって、バーコードをポリヌクレオチドに結合することができる。
【００５０】
バーコードは、プライマー結合部位に隣接することができる。バーコードは、プライマー結合（アニーリング、ハイブリダイゼーション）部位の０または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基だけ３’にあり得る。
【００５１】
プライマー／プローブの結合部位
アダプターは、１つまたは複数のプライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの部位を含むことができる。１つまたは複数のプライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの部位は、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個の塩基、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個超の塩基、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個未満の塩基、または少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個の塩基であり得る。プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの部位を使用して、増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーを上記アダプターにアニールさせること、または配列決定反応のために、プライマーを該アダプターにアニールさせることができる。アダプターは、２つ以上のオリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個以上のオリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブのアニーリングのための配列を含むことができる。アダプターは、配列決定プライマーおよび増幅プライマーをアニールさせるための部位を有し得る。アダプターにアニールするプライマーまたはプローブの長さは、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の塩基、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個超の塩基、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個未満の塩基、または少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の塩基であり得る。
【００５２】
制限酵素部位
アダプターは、１つまたは複数の制限酵素の結合部位および／または切断部位を含むことができる。アダプターに結合することまたはアダプターを切断することができる制限酵素は、例えば、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｈｏＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、Ｔ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩまたはＺｒａＩであり得る。
【００５３】
アダプターは、ＩＩＳ型制限酵素の結合部位を含むことができる。ＩＩＳ型制限酵素は、ＤＮＡを、非回帰性構造であり非対称性である認識部位からの定義された距離において切断することができる。ＩＩＳ型制限酵素の例として、ＡａｒＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡｃｃＢＳＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＷＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｏＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＡｌｗＩ、ＡｓｕＨＰＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＡＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓａＸＩ、Ｂｓｅ１Ｉ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｐＴＮＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＳＩ、ＢｓｓＳＩ、Ｂｓｔ２ＢＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｔＭＡＩ、ＢｓｔＶ１Ｉ、ＢｓｔＶ２Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＣｓｐＣＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＬｗｅＩ、ＭｂｉＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｃｔＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｐｓＩ、ＰｓｒＩ、ＳａｐＩ、ＳｃｈＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｍｕＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩまたはＴａｑ  ＩＩが挙げられる。制限酵素は、アダプター内の認識配列に結合し、該アダプターの外側（例えば、ポリヌクレオチド中）の配列を切断することができる。
【００５４】
上記制限酵素は、メチル化感受性の制限酵素であり得る。上記メチル化感受性の制限酵素は、メチル化ＤＮＡを特異的に切断することができる。上記メチル化感受性の制限酵素は、非メチル化ＤＮＡを特異的に切断することができる。メチル化感受性の酵素として、例えば、ＤｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＡｐａＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＭｂｏＩ、ＢｓｐＯＩ、ＮｈｅＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＳｍａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＲｓａＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭｖａＩ、ＨｐａＩＩ、ＭＳｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｎＥＩ、ＤｐｎＩＩ、ＭｃｒＢｃまたはＭｓｐＩを挙げることができる。
【００５５】
アダプターは、１つまたは複数のニッキングエンドヌクレアーゼ、Ｉ型エンドヌクレアーゼまたはＩＩＩ型エンドヌクレアーゼのための１つまたは複数の認識部位を含むことができる。ニッキングエンドヌクレアーゼは、二重鎖の一方の鎖のみを加水分解して、切断ではなく、「ニックを入れた（ｎｉｃｋｅｄ）」ＤＮＡ分子をもたらすことができる。ニックを入れることにより、３−ヒドロキシルおよび５’−ホスフェートが生じ得る。ニッキング酵素の例として、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩまたはＮｔ．ＢｓｔＮＢＩが挙げられる。Ｉ型エンドヌクレアーゼは、上記認識部位とは異なり、該認識部位からランダムに離れた距離にある部位において切断することができる。ＩＩＩ型エンドヌクレアーゼは、逆に配向している、２つの別個の非回帰性構造の配列を認識することができる。ＩＩＩ型制限酵素の例として、ＥｃｏＰ１５およびＥｃｏＰ１が挙げられる。
【００５６】
本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットにおいて使用する、１つまたは複数の制限酵素は、ハイブリッドまたはキメラのタンパク質の構成成分であり得る。例えば、酵素活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を含む、制限酵素のドメインを、別のタンパク質、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質に融合させることができる。上記ＤＮＡ結合タンパク質は、上記ハイブリッドを、ＤＮＡ上の特定の配列に向かわせることができる。酵素活性を有するドメインの核酸切断活性は、配列特異的である場合もあり、または配列非特異的である場合もある。例えば、上記ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の非特異的な切断ドメインを、ハイブリッドヌクレアーゼの酵素（切断）ドメインとして使用することができる。上記酵素活性を有するドメインが切断することができる配列は、上記ハイブリッドの、ＤＮＡに対するＤＮＡ結合ドメインによる物理的な係留によって限定される場合がある。上記ＤＮＡ結合ドメインは、真核生物または原核生物の転写因子由来であり得る。上記ＤＮＡ結合ドメインは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個の塩基もしくは塩基対の連続的な核酸配列、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個の塩基もしくは塩基対の連続的な核酸配列を認識することができる。上記ＤＮＡ結合ドメインは、約９〜約１８個の塩基もしくは塩基対の配列を認識することができる。上記ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであり得る。上記ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するタンパク質由来であり得る。上記ＤＮＡ結合ドメインを、任意の所望のヌクレオチド配列に特異的に結合するように工学的に操作することができる。上記ハイブリッドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）であり得る。上記ハイブリッドタンパク質は、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体等）として機能する場合がある。
【００５７】
改変
アダプターは、１つまたは複数の末端の改変を含むことができる。アダプターは、１つの５’ホスフェートを含むことができる。アダプターは、２つの５’ホスフェートを含むことができる。アダプターは、１つの３’ヒドロキシルを含むことができる。アダプターは、２つの３’ヒドロキシルを含むことができる。アダプターは、３’ヒドロキシルを欠く場合がある。
【００５８】
アダプターは、１つまたは複数の３’末端の改変を含むことができる。上記３’末端の改変は、例えば、３’−アミノ、３’−ブラックホールクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２）、３’−ビオチン、３’−コレステロール（３’−ｃｈｌｏｅｓｔｅｒｏｌ）、３’−ダブシルＣＰＧ（３’−ｄａｂｃｙｌ  ＣＰＧ）、３’ダブシルＣＰＧ（３’ｄａｂｓｙｌ  ＣＰＧ）、３’−色素（例えば、フルオレセイン−ＣＧＰ、Ｔａｍｒａ−ＣＰＧ、Ｒｏｘ−ＣＰＧ、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ５６０−ＣＰＧ、Ｑｕａｓａｒ５７０（Ｃｙ３置換）−ＣＧＰ、Ｑｕａｓａｒ６７０（Ｃｙ５置換）−ＣＰＧ、Ｑｕａｓａｒ７０５（Ｃｙ５．５置換）−ＣＰＧ、Ｐｕｌｓａｒ６５０−ＣＰＧ、Ｅｐｏｃｈ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｒｅｄ−ＣＰＧ、Ｅｐｏｃｈ  Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ−ＣＰＧ、アクリジン−ＣＰＧ、（支持体に結合する５’−ＯＨ、および鎖の伸長に利用することができる３’−ＯＨを有する）３’−反転連結、３’−ホスフェートであり得る。アダプターは、本明細書に記載する任意の蛍光色素を含むことができる。
【００５９】
アダプターは、１つまたは複数の５’末端の改変を含むことができる。上記５’末端の改変は、例えば、５’−アミノ基、５’−ビオチン、５’−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、５’リン酸基または５’−チオールであり得る。アダプターは、５’アルデヒド、５’アルカリホスファターゼ、５’アミン、５’西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、５’フルオレセイン、５’ＨＥＸ、５’ＲＯＸ、５’ＴＥＴまたは５’ＴＡＭＲＡを含むことができる。上記５’改変は、分子プローブ色素、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒｏ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６９、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）色素、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８−Ｘ、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）色素、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）色素、ＲＨＯＤＯＬ  ＧＲＥＥＮ（商標）色素、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−Ｘ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）−Ｘ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）またはＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−Ｘであり得る。
【００６０】
改変を、リンカー、例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０を通して核酸鎖にもたらすことができる。リンカーは、例えば、ＰＣ（光切断可能な）スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９（トリエチレングリコールスペーサー）、スペーサー１８（１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサー）、１’，２’ジデオキシリボース（ｄｓｐａｃｅｒ）またはＩ−リンカー（Ｅｘｉｑｏｎ製）であり得る。
【００６１】
アダプターは、１つまたは複数のメチル基を含むことができる。
【００６２】
アダプターは、規範ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を用いて合成することができる。アダプターは、１つまたは複数の非規範ヌクレオチドにより作製することができる。上記非規範ヌクレオチドは、ｄＵＴＰであり得る。アダプターは、デオキシウラシルまたはデオキシイノシンを含むことができる。
【００６３】
アダプターは、１つまたは複数のＲＮＡ様ヌクレオシド、例えば、ＡＮＡ（アラビノ）、ＬＮＡ（ロックド）、２’−ＯメチルＲＮＡ、ＦＡＮＡ（２’−フルオロアラビノ）または２’−フルオロＲＮＡを含むことができる。アダプターは、ＤＮＡ様ヌクレオシド、例えば、β−Ｄ−ＤＮＡ、β−Ｌ−ＤＮＡまたはα−Ｄ−ＤＮＡを含むことができる。
【００６４】
アダプターは、１つまたは複数の５’−３ホスホロチオエート連結または反転連結（５’−５’もしくは３’−３’）を含むことができる。アダプターは、Ａ−ホスホロチオエート、Ｃ−ホスホロチオエート、Ｇ−ホスホロチオエート（Ｇ−ｐｈｏｓｐｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはＴ−ホスホロチオエートを含むことができる。
【００６５】
アダプター中の改変塩基として、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸）、２−アミノプリン、トリマー（ｔｒｉｍｅｒ）−２０、フルオロ塩基、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、反転ｄＴ、ジデオキシＣ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｌｎｏｓｉｎｅ）、５−ニトロインドール、リボＡ、リボＣ、リボＧ、リボＵまたは−＋２’Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を挙げることができる。アダプターは、本明細書に記載する核酸の改変の任意のタイプを有し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、アダプターを、化学的に合成する。いくつかの実施形態では、アダプターを、化学的に合成しない。
【００６７】
本明細書に記載する改変は、試料のポリヌクレオチドに見出される場合がある。
【００６８】
区画
区画を、デジタルＰＣＲのために使用することができる、分離の任意のモードにより形成することができる。区画は、マイクロ流体チャネル、ナノもしくはマイクロ流体デバイスまたはマイクロタイタープレートのウェル、あるいはマイクロ流体デバイスの反応チャンバーであり得る。区画は、アレイ表面上の領域であり得る。区画は、エマルジョンの水相（例えば、液滴）であり得る。液滴を生成する方法を、本明細書に記載する。
【００６９】
液滴の生成
本開示は、例えば、液滴デジタルＰＣＲを使用して、液滴中の遺伝物質を操作するための組成物、方法およびキットを含む。本明細書に記載する液滴は、米国特許第７，６２２，２８０号に記載されているエマルジョン組成物（または２つ以上の不混和性の流体の混合物）、および国際出願公開第ＷＯ／２０１０／０３６３５２号、第１発明者：Ｃｏｌｓｔｏｎに記載されている、デバイスにより生成される液滴を含むことができ、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。エマルジョンという用語は、本明細書で使用する場合、不混和性の液体の混合物（例として、油と水）を指すことができる。油相および／または油中水型のエマルジョンにより、水性の液滴内の反応混合物の区画に分けることが可能になり得る。いくつかの実施形態では、上記エマルジョンは、連続的な油相内に、水性の液滴を含むことができる。その他の実施形態では、本明細書において提供するエマルジョンは、水中油型エマルジョンであり、ここで、上記液滴が、連続的な水相内の油の液滴である。本明細書において提供する液滴を使用して、コンパートメント間の混合を阻止することができ、各コンパートメントは、その内容物を、蒸発、およびその他のコンパートメントの内容物との合体（ｃｏａｌｅｓｃｉｎｇ）から保護することができる。１つまたは複数の酵素反応が、液滴中で発生し得る。
【００７０】
本明細書に記載する混合物またはエマルジョンは、安定であっても、または不安定であってもよい。上記エマルジョンは、比較的安定であり、最低限の合体を有し得る。小さい液滴が組み合わさって、次第により大きい液滴を形成する場合に、合体が発生し得る。液滴生成器から生成した液滴の約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％未満が、その他の液滴と合体する場合がある。また、上記エマルジョンは、限定された凝集、すなわち、その分散相が、懸濁液からフレーク状となって現れるプロセスを有することもできる。
【００７１】
本明細書に記載するように試料を小さい反応体積に分割することによって、使用する試薬の量を低減することが可能になり、それにより、その分析の材料コストを低くすることができる。また、区画化することによって、試料の複雑性が低下すると、検出のダイナミックレンジも改善され得、その理由は、より高い存在量の分子と低い存在量の分子とを、異なるコンパートメントに分離することができ、それにより、より低い存在量の分子が、反応試薬により大きい比率で接近することが可能になり、これに続いて、より低い存在量の分子の検出が増強され得るからである。
【００７２】
約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン、約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン超、約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン未満、または少なくとも約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロンの平均直径を有する液滴を生成することができる。上記液滴の平均直径は、約０．００１ミクロン〜約０．０１ミクロン、約０．００１ミクロン〜約０．００５ミクロン、約０．００１ミクロン〜約０．１ミクロン、約０．００１ミクロン〜約１ミクロン、約０．００１ミクロン〜約１０ミクロン、約０．００１ミクロン〜約１００ミクロン、約０．００１ミクロン〜約５００ミクロン、約０．０１ミクロン〜約０．１ミクロン、約０．０１ミクロン〜約１ミクロン、約０．０１ミクロン〜約１０ミクロン、約０．０１ミクロン〜約１００ミクロン、約０．０１ミクロン〜約５００ミクロン、約０．１ミクロン〜約１ミクロン、約０．１ミクロン〜約１０ミクロン、約０．１ミクロン〜約１００ミクロン、約０．１ミクロン〜約５００ミクロン、約１ミクロン〜約１０ミクロン、約１ミクロン〜約１００ミクロン、１ミクロン〜約５００ミクロン、約１０ミクロン〜約１００ミクロン、約１０ミクロン〜約５００ミクロンまたは約１００ミクロン〜約５００ミクロンであり得る。
【００７３】
液滴の体積は、約０．００１ｎＬ、０．０１ｎＬ、０．１ｎＬ、１ｎＬ（１００μｍ３）、１０ｎＬもしくは１００ｎＬ、約０．００１ｎＬ、０．０１ｎＬ、０．１ｎＬ、１ｎＬ（１００μｍ３）、１０ｎＬもしくは１００ｎＬ超、約０．００１ｎＬ、０．０１ｎＬ、０．１ｎＬ、１ｎＬ（１００μｍ３）、１０ｎＬもしくは１００ｎＬ未満、または少なくとも約０．００１ｎＬ、０．０１ｎＬ、０．１ｎＬ、１ｎＬ（１００μｍ３）、１０ｎＬもしくは１００ｎＬであり得る。例えば、ＲＡＩＮＳＴＯＲＭ（商標）（ＲＡＩＮＤＡＮＣＥ（商標））、ＡＤＶＡＣＥＤ  ＬＩＱＵＩＤ  ＬＯＧＩＣ製のマイクロ流体技術、またはｄｄＰＣＲ（商標）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して、液滴を生成することができる。
【００７４】
マイクロチャネル直交流絞込みまたは物理的攪拌を使用して、エマルジョン液滴を生成する、マイクロ流体による方法により、単分散エマルジョンまたは多分散エマルジョンのいずれかを生成することができる。上記液滴は、単分散液滴であり得る。上記液滴のサイズが、該液滴の平均サイズの±５％を超えて変動しないように、該液滴を生成することができる。上記液滴のサイズが、該液滴の平均サイズの±２％を超えて変動しないように、該液滴を生成することができる。液滴生成器により、単一試料から、液滴の集団を生成することができ、該液滴はいずれも、そのサイズが、該液滴の集団全体の平均サイズの±０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または１０％を超えて変動し得ない。
【００７５】
液滴生成器中の流速および試料中の核酸の長さの両方が、液滴の生成に影響を及ぼす場合がある。伸長を減少させるための１つの方法が、流速を減少させることであるが、しかし、この方法は、より低い処理量という望ましくない副作用を有し、また、液滴サイズの増加をももたらす恐れがある。長い核酸は、極端な場合には、液滴の形成を妨害し、結果として、個別の液滴ではなく、一様の流れをもたらす恐れがある。核酸の装填量が高い場合には、試料中の核酸のサイズを低下させることによって、液滴の形成を改善することができる。高い核酸の装填量（例えば、高いＤＮＡの装填量、高いＲＮＡの装填量等）を有する試料を使用することができる。（例えば、消化、音波処理、熱処理またはせん断により）試料中の核酸の長さを低下させることによって、液滴の形成を改善することができる。
【００７６】
より高い機械的安定性は、マイクロ流体による操作および（例えば、マイクロ流体キャピラリー中の、または９０度の回転、例として、流体パス中のバルブを通る）より高いせん断を伴う流体プロセシングに有用であり得る。熱処理される前および後の液滴またはカプセルは、標準的なピペット操作および遠心分離に対して機械的に安定であり得る。
【００７７】
油相を、水性の試料を通して流すことによって、液滴を形成することができる。区画、例えば、エマルジョンの水相は、増幅反応、例えば、ＰＣＲ反応を実施するための緩衝溶液および試薬を含むことができ、それらには、ヌクレオチド、プライマー、蛍光検出のためのプローブ（複数可）、鋳型核酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素および／または逆転写酵素が含まれる。
【００７８】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、固体状態のビーズ、例として、磁気ビーズを用いない酵素反応（例えば、ＰＣＲ）を実施するための緩衝溶液および試薬を含むことができる。上記緩衝溶液は、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭのＴｒｉｓ、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭ超のＴｒｉｓ、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭのＴｒｉｓ、または約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭ未満のＴｒｉｓを含むことができる。区画、例えば、エマルジョンの水相は、１つまたは複数の緩衝剤を含むことができ、それらとして、例えば、ＴＡＰＳ、ビシン、Ｔｒｉｓ、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジレート、ＳＳＣ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、コラミンクロリド（ｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アセトアミドグリシン、グリシンアミド、マレアート、ホスフェート、ＣＡＢＳ、ピペリジン（ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ）、グリシン、シトレート、グルシルグリシン、マレート、ホルメート、スクシネート、アセテート、プロピオネート、ピリジン、ピペラジン、ヒスチジン、ビス−ｔｒｉｓ、エタノールアミン、カーボネート、ＭＯＰＳＯ、イミダゾール、ビス−ＴＲＩＳプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＢＳ、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ヒドラジン、Ｔｒｉｚｍａ（ｔｒｉｓ）、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ビシン、ＨＥＰＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ボレート、ＣＨＥＳ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、水酸化アンモニウム、メチルアミンまたはＭＥＳが挙げられる。上記区画、例えば、エマルジョンの水相のｐＨは、約２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２または１２．５であり得る。上記区画、例えば、エマルジョンの水相のｐＨは、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約６．５〜約８、約６．５〜約７．５、約６〜約７、約６〜約９または約６〜約８であり得る。
【００７９】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、塩、例えば、酢酸カリウム、塩化カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含むことができる。塩化カリウムの濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ超、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ未満であり得る。上記緩衝溶液は、約１５ｍＭのＴｒｉｓおよび約５０ｍＭのＫＣｌを含むことができる。
【００８０】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、ヌクレオチドを含むことができる。上記ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含めた、デオキシリボヌクレオチド三リン酸分子をそれぞれ、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭ、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭ超、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭ未満、または少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭの濃度で含むことができる。ｄＵＴＰを、区画、例えば、エマルジョンの水相内に、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００μＭ、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００μＭ未満、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００μＭ超、または少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００μＭの濃度まで添加することができる。区画、例えば、エマルジョンの水相中のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰの比は、約１：１０００、１：５００、１：２５０、１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：５、１：４、１：３、１：２または１：１であり得る。
【００８１】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、１つまたは複数の二価のカチオンを含むことができる。上記１つまたは複数の二価のカチオンは、例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋またはＺｎ２＋であり得る。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を、区画、例えば、エマルジョンの水相に、約１．０、２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭ、約１．０、２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭ超、少なくとも約１．０、２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭ、または約１．０、２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭ未満の濃度で添加することができる。ＭｇＣｌ２の濃度は、約３．２ｍＭであり得る。塩化マグネシウムの代わりに、硫酸マグネシウムを類似の濃度で用いてもよい。区画、例えば、エマルジョンの水相は、塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムの両方を含むことができる。緩衝溶液の代わりに、様々な供給業者から得られる広い範囲の一般的な商業的ＰＣＲバッファを用いることができる。
【００８２】
非イオン性のエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを、区画、例えば、エマルジョンの水相に、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１．０％、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１．０％超、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１．０％未満、または少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１．０％の濃度で添加することができる。区画または水相は、生物系界面活性剤（ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を含むことができる。一般的な生物系界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例として、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮを含む。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は、約０．５％ｗ／ｖの濃度で存在し得る。
【００８３】
添加剤
区画、例えば、エマルジョンの水相は、１つまたは複数の添加剤を含むことができ、それらの添加剤として、これらに限定されないが、非特異的なバックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオプリザバティブ（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲエンハンサー（例えば、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン；［カルボキシメチル］トリメチルアンモニウム）、トレハロース等）、および／または阻害剤（例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤）が挙げられる。例えば、ベタインおよびＤＭＳＯを含む、ＧＣに富む添加剤を、本明細書において提供する方法中でアッセイする試料に添加することができる。
【００８４】
上記１つまたは複数の添加剤は、非特異的なブロッキング剤、例として、ＢＳＡまたはウシの皮膚由来のゼラチンを含むことができる。上記ゼラチンまたはＢＳＡは、およそ０．１〜約０．９％ｗ／ｖの濃度範囲で存在し得る。その他のブロッキング剤として、ベータラクトグロブリン、カゼイン、乾燥乳、またはその他の一般的なブロッキング剤を挙げることができる。場合によっては、ＢＳＡおよびゼラチンの濃度は、約０．１％ｗ／ｖである。
【００８５】
上記１つまたは複数の添加剤は、２−ピロリドン、アセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｂ−ヒドロキシエチルピロリドン（ＨＥＰ）、プロピオンアミド、ＮＮ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルホルムアミド（ＭＭＰ）、ＮＮ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド（ＭＭＡ）、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、グリセロール、または非イオン性洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｗｅｅｎ４０、ＳＤＳ（例えば、約０．１％ＳＤＳ））、サケ精子ＤＮＡ、アジ化ナトリウム、ホルムアミド、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）（ＴＣＥＰ）、システイン−ＨＣｌ、または植物性多糖を含むことができる。上記１つまたは複数の添加剤は、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはスファラン（ｓｕｐｈａｌａｎｅ）であり得る。
【００８６】
プライマー
区画、例えば、エマルジョンの水相は、オリゴヌクレオチドプライマーを含むことができる。上記オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅のために使用することができる。区画、例えば、エマルジョンの水相内における増幅のためのプライマーは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１．０μＭ、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１．０μＭ超、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１．０μＭ未満、または少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１．０μＭの濃度を有し得る。各プライマーの濃度は、約０．５μＭであり得る。プライマーを、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパラメータに従って設計することができる。異なるプライマー対は、別のプライマー対とほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃以内でアニールおよび融解することができる。場合によっては、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００または１０，０００個以上よりも多いプライマーを、最初に使用する。かかるプライマーは、本明細書に記載する遺伝子標的にハイブリダイズすることが可能であり得る。約２〜約１０，０００個、約２〜約５，０００個、約２〜約２，５００個、約２〜約１，０００個、約２〜約５００個、約２〜約１００個、約２〜約５０個、約２〜約２０個、約２〜約１０個または約２〜約６個のプライマーを使用することができる。
【００８７】
プライマーを、多様な方法により調製することができ、それらの方法には、これらに限定されないが、当技術分野で周知の方法（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８巻：９０頁（１９７９年）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８巻：１０９頁（１９７９年））を使用する適当な配列のクローニングおよび直接的な化学的合成が含まれる。また、プライマーは、商業的供給元、例として、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳｉｇｍａまたはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手することもできる。上記プライマーは、同一の融解温度を有し得る。プライマーの融解温度は、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４または８５℃であり得る。プライマーの融解温度は、約３０〜約８５℃、約３０〜約８０℃、約３０〜約７５℃、約３０〜約７０℃、約３０〜約６５℃、約３０〜約６０℃、約３０〜約５５℃、約３０〜約５０℃、約４０〜約８５℃、約４０〜約８０℃、約４０〜約７５℃、約４０〜約７０℃、約４０〜約６５℃、約４０〜約６０℃、約４０〜約５５℃、約４０〜約５０℃、約５０〜約８５℃、約５０〜約８０℃、約５０〜約７５℃、約５０〜約７０℃、約５０〜約６５℃、約５０〜約６０℃、約５０〜約５５℃、約５２〜約６０℃、約５２〜約５８℃、約５２〜約５６℃または約５２〜約５４℃であり得る。
【００８８】
上記プライマーの長さを、５’末端または３’末端において伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プライマー対の一方のプライマーが、他方のプライマーよりも長い場合がある。上記プライマーの３’においてアニールする長さが、プライマー対内で異なる場合がある。また、上記プライマー対の配列および長さにより、所望の融解温度が得られるように、各プライマー対のアニーリング位置を設計することもできる。２５個未満の塩基対のプライマーの融解温度を決定するための式が、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒｕｌｅ（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。また、これらに限定されないが、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ製のＤＮＡｓｉｓを含めた、コンピュータープログラムを使用して、プライマーを設計することもできる。各プライマーのＴＭ（融解温度またはアニーリング温度）を、ソフトウエアプログラム、例として、Ｎｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌの無料のウェブベースのプログラム）を使用して計算することができる。これらに限定されないが、約サイクル１、２、３、４、５、約サイクル６〜約サイクル１０、約サイクル１０〜約サイクル１５、約サイクル１５〜約サイクル２０、約サイクル２０〜約サイクル２５、約サイクル２５〜約サイクル３０、約サイクル３０〜約サイクル３５、または約サイクル３５〜約サイクル４０を含めた、増幅の任意のサイクルの後に、上記プライマーのアニーリング温度を、再計算し、増加させることができる。増幅の最初のサイクルの後に、上記プライマーの５’側半分が、目的の各遺伝子座由来の産物中に組み込まれ得、したがって、上記ＴＭを、各プライマーの５’側半分および３’側半分の配列の両方に基づいて再計算することができる。
【００８９】
これらに限定されないが、約サイクル１、２、３、４、５、約サイクル６〜約サイクル１０、約サイクル１０〜約サイクル１５、約サイクル１５〜約サイクル２０、約サイクル２０〜約サイクル２５、約サイクル２５〜約サイクル３０、約サイクル３０〜約３５、または約サイクル３５〜約サイクル４０を含めた、増幅の任意のサイクルの後に、上記プライマーのアニーリング温度を、再計算し、増加させることができる。増幅の最初のサイクルの後に、上記プライマーの５’側半分が、目的の各遺伝子座由来の産物中に組み込まれ得、したがって、上記ＴＭを、各プライマーの５’側半分および３’側半分の配列の両方に基づいて再計算することができる。
【００９０】
プローブ
区画、例えば、エマルジョンの水相は、蛍光検出のための１つまたは複数のプローブを含むことができる。上記１つまたは複数のプローブのそれぞれの濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４もしくは０．５μＭ、約０．１、０．２、０．３、０．４もしくは０．５μＭ超、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４もしくは０．５μＭ、または約０．１、０．２、０．３、０．４もしくは０．５μＭ未満であり得る。蛍光検出のための上記１つまたは複数のプローブの濃度は、約０．２５μＭであり得る。ＰＣＲにおける標的核酸の濃度についての妥当な範囲は、約１ｐｇ〜約５００ｎｇの間であり得る。プローブは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長超、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長未満、または少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長であり得る。プローブは、約８〜約４０個、約１０〜約４０個、約１０〜約３５個、約１０〜約３０個、約１０〜約２５個、約１０〜約２０個、約１５〜約４０個、約１５〜約３５個、約１５〜約３０個、約１５〜約２５個、約１５〜約２０個、約１８〜約４０個、約１８〜約３５個、約１８〜約３０個、約１８〜約２５個または約１８〜２２個の塩基であり得る。プローブ（例えば、Ｔａｑｍａｎプローブ）上で使用する標識（蛍光団、色素）は、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ）、４，７，２’−トリクロロ−７’−フェニル−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テトラメチルローダミン、ＲＯＸ、ならびにＪＯＥ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６６０、６８０、７００および７５０；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８−Ｘ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ、ならびにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘであり得���。上記標識は、上記プローブの５’末端、上記プローブの３’末端、プローブの５’末端および３’末端の両方、または上記プローブの内部にあり得る。独自の標識を使用して、実験において異なる遺伝子座をそれぞれ検出することができる。プローブ、例えば、Ｔａｑｍａｎプローブは、クエンチャー、例えば、上記３’クエンチャーを含むことができる。３’クエンチャーは、例えば、ＴＡＭＡＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２またはＢＨＱ−３であり得る。場合によっては、本明細書で提供する方法において使用するクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）である。場合によっては、上記クエンチャーは、マイナーグローブバインダー（ＭＧＢ）である。場合によっては、上記クエンチャーは、蛍光クエンチャーである。その他の場合には、上記クエンチャーは、非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）である。
【００９１】
ポリメラーゼ
区画、例えば、エマルジョンの水相は、ポリメラーゼを含むことができる。上記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであり得る。上記ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ  ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＯＮＧＡＭＰ（登録商標）Ｔａｑ、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＯＮＧＡＭＰ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  ＬＯＮＧＡＭＰ（登録商標）Ｔａｑ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＮＥＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＱＵＩＣＫ−ＬＯＡＤ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫＬＥＮＴＡＱ（登録商標）、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｓｅ  ２９）、ＲＥＤＴＡＱ（商標）、またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼであり得る。上記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含むことができる。上記ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含むことができる。上記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を含むことができる。上記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性も５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も含まない場合がある。上記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を含むことができる。場合によっては、上記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を含まない。上記ＤＮＡポリメラーゼの誤り率は、１×１０−６個未満の塩基であり得る。
【００９２】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、逆転写酵素を含むことができる。上記逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素またはＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。ＲＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含むことができる。上記逆転写酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を含むことができる。上記逆転写酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性も５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も含まない場合がある。上記逆転写酵素は、鎖置換活性を含むことができる。いくつかの実施形態では、上記逆転写酵素は、鎖置換活性を含まない。
【００９３】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。上記ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、ｐｈｉ６ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、区画、例えば、エマルジョンの水相は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む。
【００９５】
油相
油相は、フッ素化ベースオイルを含むことができ、それは、フッ素化界面活性剤、例として、過フッ素化（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ）ポリエーテルと組み合わせることによってさらに安定化させることもできる。上記ベースオイルは、ＨＦＥ７５００、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０または別の一般的なフッ素化油のうちの１つまたは複数であり得る。アニオン性界面活性剤は、アンモニウムＫｒｙｔｏｘ（Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＭ）、Ｋｒｙｔｏｘ  ＦＳＨのアンモニウム塩、またはＫｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体であり得る。Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳは、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗ、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗ超、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗ未満、または少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗの濃度で存在し得る。Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳの濃度は、約１．８％であり得る。Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳの濃度は、約１．６２％であり得る。Ｋｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗ、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗ超、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗ未満、または少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％ｗ／ｗの濃度で存在し得る。Ｋｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体の濃度は、約１．８％であり得る。いくつかの実施形態では、Ｋｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体の濃度は、約１．６２％である。
【００９６】
上記油相は、蒸気圧または粘度または表面張力などの油の性質を調整するための添加剤を含むことができる。非限定的な例として、ペルフルオロ−オクタノールおよび１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールを、約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．００％、１．２５％、１．５０％、１．７５％、２．００％、２．２５％、２．５０％、２．７５％または３．００％ｗ／ｗの濃度まで添加する。いくつかの実施形態では、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールを、０．１８％ｗ／ｗの濃度まで添加する。
【００９７】
マイクロカプセル
いくつかの実施形態では、上記エマルジョンを、液体様の界面薄膜を有する、高度に単分散性の液滴を生成するように製剤化し、それは、加熱することによって、固体様の界面薄膜を有するマイクロカプセルに変換することができる；かかるマイクロカプセルは、反応プロセス、例として、ＰＣＲ増幅を通して、それらの内容物を保持することが可能なバイオリアクターとして挙動することができる。マイクロカプセル形態への変換は、加熱の際に起こり得る。例えば、かかる変換は、約５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５℃を上回る温度、約５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５℃超の温度、または少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５℃の温度で起こり得る。いくつかの実施形態では、この加熱は、サーモサイクラーを使用して行なう。加熱プロセスの間、流体または鉱油のオーバーレイを使用して、蒸発を阻止することができる。過剰な、連続相の油を、加熱の前に、除去してもまたは除去しなくてもよい。生体適合性のカプセルは、広い範囲の熱的および機械的なプロセシングにわたって合体および／または凝集に対して抵抗性であり得る。
【００９８】
変換の後に、上記カプセルを、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃超、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃未満、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃で保存することができ、一実施形態は、カプセルを約２５℃未満で保存することを含む。いくつかの実施形態では、これらのカプセルは、生物医学的な適用、例として、巨大分子、特に、核酸もしくはタンパク質のミックスまたはそれらの両方を一緒にしたミックスを含有する、水性の生物学的流体の安定な、デジタル化したカプセル化（ｄｉｇｉｔｉｚｅｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｎ）；薬物およびワクチンの送達；生体分子ライブラリー；臨床画像への適用などにおいて有用である。
【００９９】
上記マイクロカプセルは、１つまたは複数の核酸プローブ（例えば、分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）、ライゲーションプローブ等）を含有することができ、合体、特に、高い温度における合体に抵抗することができる。したがって、ＰＣＲ増幅反応は、非常に高い密度（例えば、単位体積当たりの反応の数）で起こり得る。いくつかの実施形態では、１ｍｌ当たり、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００または１０，０００，０００を上回る別個の反応が起こり得る。いくつかの実施形態では、単一のウェル、例えば、マイクロタイタープレートのウェル中で、反応体積間の混合なしに、上記反応が起こる。また、上記マイクロカプセルは、酵素反応（例えば、ＰＣＲ反応）が発生するのを可能にするのに必要なその他の構成成分、例えば、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、制限酵素等も含有することができる。これらのカプセルは、広い範囲の熱的および機械的なプロセシングにわたって合体および凝集に対して抵抗性を示す。
【０１００】
本明細書に記載する組成物は、あるタイプの核酸プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、分子反転プローブ、ライゲーションプローブ等）を含有する２つ以上の不混和性の流体の混合物、例として、油と水を含む組成物を含むことができる。場合によっては、上記組成物は、本明細書に記載する制限酵素、例えば、制限酵素（例えば、メチル化感受性の酵素）を含む液滴を含む。その他の実施形態では、本明細書に記載する組成物は、あるタイプの核酸（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、分子反転プローブ、ライゲーションプローブ等）を含有するマイクロカプセルを含む。かかるマイクロカプセルは、合体、特に、高い温度における合体に抵抗することができ、したがって、増幅反応が、非常に高い密度（例えば、単位体積当たりの反応の数）で起こるのを可能にする。
【０１０１】
断片化
区画（例えば、液滴）内におけるライブラリーの調製には、試料中のポリヌクレオチドの断片化およびアダプターのライゲーションを包含し得る。一般に、上記断片化は、区画（例えば、液滴）内で起こるが、しかし、いくつかの適用例では、上記断片化は、区画化する前におこる場合がある。断片化を、酵素的に、例えば、エンドヌクレアーゼを使用して達成することができる。上記エンドヌクレアーゼは、例えば、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｈｏＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、Ｔ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩまたはＺｒａＩであり得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、上記断片化は、機械的な断片化である。いくつかの実施形態では、溶解または抽出の間に生じるせん断力により、ポリヌクレオチドを機械的に断片化することができる。断片化を、例えば、音波処理、熱処理またはせん断により達成することができる。いくつかの実施形態では、機械的な断片化は、噴霧化による。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、上記エンドヌクレアーゼは、メチル化感受性の制限酵素である。いくつかの実施形態では、上記メチル化感受性の制限酵素が、メチル化ポリヌクレオチドを特異的に切断する。いくつかの実施形態では、上記メチル化感受性の制限酵素が、非メチル化ポリヌクレオチドを特異的に切断する。メチル化感受性の酵素として、例えば、ＤｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＡｐａＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＭｂｏＩ、ＢｓｐＯＩ、ＮｈｅＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＳｍａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＲｓａＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭｖａＩ、ＨｐａＩＩ、ＭＳｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｎＥＩ、ＤｐｎＩＩ、ＭｃｒＢｃまたはＭｓｐＩを挙げることができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中に、１つまたは複数の非規範ヌクレオチド（例えば、ｄＵＴＰ）を導入し、非規範ヌクレオチドの塩基を、（例えば、例えば、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用して）切断することによって、１つまたは複数の無塩基部位を生成し、該ポリヌクレオチドを、該１つまたは複数の無塩基部位において断片化することによって、ポリヌクレオチドの断片化を達成する。上記断片化は、酵素剤または化学薬品により行うことができる。上記化学薬品は、例えば、ポリアミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）であり得る。上記酵素剤は、例えば、脱プリン／脱ピリミジン部位（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ１）であり得る。いくつかの実施形態では、断片化を、米国特許出願公開第２０１１００３３８５４号または同第２０１０００２２４０３号に記載されているように達成することができる。
【０１０５】
ライゲーション
断片化に続いて、アダプターをポリヌクレオチドにライゲーションするステップを行うことができる。いくつかの実施形態では、ライゲーションのステップが、断片化のステップに続かない。区画、例えば、エマルジョンの水相は、リガーゼを含むことができる。上記リガーゼは、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（ｓｓＲＮＡリガーゼ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ｄｓＲＮＡリガーゼ）、またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２、切断型（ＮＥＢ）であり得る。
【０１０６】
区画、例えば、エマルジョンの水相は、ライゲーション反応のための試薬、例えば、バッファ、塩および／または還元剤を含むことができる。ポリヌクレオチドを含む区画、例えば、エマルジョンの水相とは別個の区画、例えば、エマルジョンの水相中に、リガーゼおよびその他の試薬を供給することができる。リガーゼを含む区画、例えば、エマルジョンの水相を、ポリヌクレオチドを含む区画、例えば、エマルジョンの水相と合体させることができる。
【０１０７】
上記ライゲーション反応は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃超、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃未満、または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃の温度で起こり得る。上記ライゲーションは、約４℃〜約１６℃、約１６℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約４５℃、約３７℃〜約５０℃または約５０℃〜約６５℃で起こり得る。
【０１０８】
上記ライゲーション反応は、約５分間、１５分間、３０分間、４５分間もしくは６０分間、約５分間、１５分間、３０分間、４５分間もしくは６０分間超、約５分間、１５分間、３０分間、４５分間もしくは６０分間未満、または少なくとも約５分間、１５分間、３０分間、４５分間もしくは６０分間の期間にわたり起こり得る。上記ライゲーション反応は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８時間、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８時間超、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８時間未満、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８時間の期間にわたりおこり得る。上記ライゲーション反応は、約５分間〜約１５分間、約５分間〜約３０分間、約５分間〜約４５分間、約５分間〜約６０分間、約３０分間〜約６０分間、約３０分間〜約９０分間、約３０分間〜約１２０分間、約１時間〜約２時間、約１時間〜約６時間、約１時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間または約１２時間〜約４８時間にわたり続き得る。
【０１０９】
トランスポゾンに基づくアプローチ、例として、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）が提供するアプローチを使用することができ、この場合、単一ステップの反応において、ＤＮＡが断片化され、アダプターをライゲーションすることができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｂｉｏ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ／１６−３＿４−６．ｐｄｆを参照されたい）。ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ（商標）複合体は、遊離のトランスポゾン末端およびトランスポゼースを含むことができる。ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ（商標）複合体を、標的の二本鎖ＤＮＡと共にインキュベートすることができ、上記標的を断片化することができる。移入される鎖の、トランスポゾン末端のオリゴヌクレオチドを、標的断片の５’末端に共有結合的に結合することができる。トランスポゾンの組込みおよび鎖の移入は、標的ポリヌクレオチド内の、一方が突出した（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）、ｄｓＤＮＡの切断を介して起こり得る。結果として得られる断片は、一本鎖のギャップを有することができる。ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ（商標）複合体の濃度を変動させて、断片化し、タグを付けたＤＮＡライブラリーのサイズ分布を制御することができる。上記トランスポゾン末端は、バーコードを含むことができる。アダプターのライゲーションに続き、ライゲーション産物のＰＣＲ増幅を行って、それらの濃度を増加させることができる。
【０１１０】
上記ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）技術を使用して、二重にタグを付けたライブラリーを生成することができる。必要に応じて、上記ライブラリーにバーコードを付けることもできる。上記ライブラリーは、例えば、Ｒｏｃｈｅ／４５４またはＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）／ＳＯＬＥＸＡ（登録商標）の配列決定プラットフォームに適合し得る。プラットフォームに特異的なライブラリーを生成するために、遊離のトランスポゾン末端または追加のトランスポゾン末端を使用することができる。プラットフォームに特異的なタグおよび任意選択のバーコード付けを、例えば、ＰＣＲにより導入することができる。増幅を、例えば、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）またはブリッジＰＣＲ（ｂＰＣＲ）により行うことができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、アダプターをポリヌクレオチドにライゲーションする方法は、米国特許第５，７８９，２０６号、またはＡｒｎｅｓｏｎら（２００８年）Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｄａｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ＰＣＲ  ｏｆ  Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ｓｈｅａｒｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  （ＰＲＳＧ）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されている方法である。
【０１１２】
生成することができるポリヌクレオチドの断片のサイズは、約１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個の塩基もしくは塩基対、約１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個超の塩基もしくは塩基対、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個の塩基もしくは塩基対、または約１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００個未満の塩基もしくは塩基対であり得る。いくつかの実施形態では、断片化したポリヌクレオチドのサイズは、約５０〜約１００個、約５０〜約１５０個、約５０〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約３００個、約１５０〜約２００個、約１５０〜約２５０個、約２００〜約３００個、約２００〜約４００個、約３００〜約４００個、約３００〜約５００個、約４００〜約５００個、約４００〜約６００個、約５００〜約６００個、約５００〜約７００個、約６００〜約７００個、約６００〜約８００個、約７００〜約８００個、約７００〜約９００個、約８００〜約１０００個、約５０〜約５００個、約１００〜約５００個、約１００〜約１０００個、約５０〜約１５００個、約５０〜約２０００個、約１０００〜約２０００個または約１５００〜約２０００個の塩基または塩基対である。いくつかの実施形態では、断片化したポリヌクレオチドのサイズは、約１０００〜約５０００個、約１０００〜約１０，０００個、約１０，０００〜約２０，０００個、約１０，０００〜約５０，０００個、約１０，０００〜約１００，０００個、約５０，０００〜約１００，０００個、約１００，０００〜約２００，０００個、約１００，０００〜約５００，０００個、約１００，０００〜約１，０００，０００個、約２００，０００〜約１，０００，０００個、約３００，０００〜約１，０００，０００個、約４００，０００〜約１，０００，０００個、約５００，０００〜約１，０００，０００個または約７５０，０００〜約１，０００，０００個の塩基または塩基対である。
【０１１３】
増幅
ポリヌクレオチドを、区画化する前に増幅することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画（例えば、エマルジョンの水相、例えば、液滴）中にある間に増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中での断片化の前に増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中での断片化の後に増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中での断片化の前にも断片化の後にも増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中でアダプターをポリヌクレオチドにライゲーションする前に、区画中で増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中でアダプターを該ポリヌクレオチドにライゲーションした後に、該区画中で増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、アダプターを該ポリヌクレオチドにライゲーションし、異なる区画からのポリヌクレオチドをプールした後に増幅する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、上記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、等温増幅、線形増幅、または等温線形増幅、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュポロニー（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ（ｂＰＣＲ）、ピコタイターＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）を含む。その他の適切な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ（オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅（ＯＬＡ））、転写増幅、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、分子反転プローブ（ＭＩＰ）ＰＣＲ、自家持続配列複製、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、恣意的プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＡＰ−ＰＣＲ）、転写媒介型増幅（ＴＭＡ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）を含む。本明細書において使用することができる、その他の増幅方法には、米国特許第５，２４２，７９４号；同第５，４９４，８１０号；同第４，９８８，６１７号；および同第６，５８２，９３８号に記載されている方法が挙げられる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、捕捉したポリヌクレオチドのより多くをカバーするために、ポリヌクレオチドの断片化およびアダプターのライゲーションの前に、多置換増幅（ＭＤＡ）のステップを、区画（例えば、液滴）内で実施して、各液滴中のＤＮＡの量を増幅することができる。ＭＤＡは、ＰＣＲに基づかない増幅技法であり得、この技法は、複数のプライマー（例えば、六量体プライマー）をポリヌクレオチド鋳型にアニーリングさせ、（例えば、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼを使用して）ＤＮＡ合成を開始することを包含し得る。ＤＮＡ合成が、次の合成開始部位まで進行すると、上記ポリメラーゼが、新たに生じたＤＮＡ鎖を置き換え、その鎖伸長を継続することができる。鎖置換により、新たに合成された一本鎖ＤＮＡ鋳型を生成することができ、この鋳型に、他のプライマーがアニールすることができる。上記新たに合成された鋳型上における、さらなるプライマーのアニーリングおよび鎖置換により、高度に分枝したＤＮＡのネットワークが生じ得る。増幅の間の配列の脱分枝により、高い収量の産物を得ることができる。ＤＮＡ分枝ネットワークを別々にするために、１つまたは複数のＳ１ヌクレアーゼを使用して、置換部位において上記断片を切断することができる。結果として得られるＤＮＡ断片上のニックを、ＤＮＡポリメラーゼＩにより修復することができる。生成したＤＮＡ断片は、分析のために直接使用すること、またはさらなる配列決定による分析のために、ライゲーションして、ゲノムライブラリーを生成することができる。ＭＤＡは、例えば、米国特許第７，０７４，６００号に記載されている。
【０１１６】
ポリヌクレオチドの増幅を、ビーズ上で行うことができる。その他の実施形態では、増幅を、ビーズ上で行わない。ホットスタートＰＣＲを実施することができ、反応物を、上記ポリメラーゼの添加の前に、９５℃まで２分間かけて加熱するか、またはポリメラーゼを、サイクル１における第１の加熱ステップまで不活性な状態で保つことができる。ホットスタートＰＣＲを使用して、非特異的な増幅を最小化することができる。本明細書に記載する方法において使用するのに適している増幅のためのその他の戦略およびそうした増幅の態様が、２０１０年７月８日公開の米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４Ａ１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１７】
任意の数のＰＣＲサイクルを使用して、ＤＮＡを、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５サイクル、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５サイクル超、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５サイクル、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５サイクル未満増幅することができる。増幅サイクルの数は、約１〜約４５、約１０〜約４５、約２０〜約４５、約３０〜約４５、約３５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１０〜約２０、約１０〜約１５、約２０〜約３５、約２５〜約３５、約３０〜約３５または約３５〜約４０であり得る。
【０１１８】
サーモサイクリング反応は、液滴中に含有される試料に対して実施することができる。上記液滴は、サーモサイクリングの間、完全な状態のままであり得る。液滴は、サーモサイクリングの間、完全な状態のままで、約１０，０００個の液滴／ｍＬ、１００，０００個の液滴／ｍＬ、２００，０００個の液滴／ｍＬ、３００，０００個の液滴／ｍＬ、４００，０００個の液滴／ｍＬ、５００，０００個の液滴／ｍＬ、６００，０００個の液滴／ｍＬ、７００，０００個の液滴／ｍＬ、８００，０００個の液滴／ｍＬ、９００，０００個の液滴／ｍＬ、または１，０００，０００個の液滴／ｍＬを上回る密度であり得る。液滴は、サーモサイクリングの間、完全な状態のままで、約１０，０００個の液滴／ｍＬ〜約１００，０００個の液滴／ｍＬ、１０，０００個の液滴／ｍＬ〜約１，０００，０００個の液滴／ｍＬ、または約１００，０００個の液滴／ｍＬ〜約１，０００，０００個の液滴／ｍＬを上回る密度であり得る。その他の場合には、２つ以上の液滴が、サーモサイクリングの間に合体する場合がある。その他の場合には、約１００個を上回る液滴または約１，０００個を上回る液滴が、サーモサイクリングの間に合体する場合がある。
【０１１９】
ポリヌクレオチド
本明細書中に記載される方法は、ポリヌクレオチドを操作および分析するために使用され得る。ポリヌクレオチドという用語または文法的等価物は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指し得る。本明細書中に記載される核酸は、ホスホジエステル結合を含み得るが、ある場合には、（例えば、プライマーおよび標識プローブなどのプローブの構築において）本明細書中に概略されるように、例えば以下を含む代替的骨格を有し得る核酸アナログが含まれる：ホスホルアミド（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９巻（１０号）：１９２５頁（１９９３年）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３５巻：３８００頁（１９７０年）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８１巻：５７９頁（１９７７年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４巻：３４８７頁（１９８６年）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ８０５頁（１９８４年）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１０巻：４４７０頁（１９８８年）；ならびにＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６巻：１４１  ９１９８６）を参照のこと）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９巻：１４３７頁（１９９１年）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１１巻：２３２１頁（１９８９年）、Ｏ−メチルホスホロアミデート（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）結合（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）ならびにペプチド核酸（本明細書中で「ＰＮＡ」ともいう）骨格および結合（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４巻：１８９５頁（１９９２年）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３１巻：１００８頁（１９９２年）；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５巻：５６６頁（１９９３年）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０巻：２０７頁（１９９６年）を参照のこと。これらは全て、参照により組み込まれる）。他のアナログ核酸には、以下を含む二環式構造を有するものが含まれる：本明細書中で「ＬＮＡ」ともいうロックド核酸（ＬＮＡは、リボース環が、２’−Ｏ原子を４’−Ｃ原子と連結するメチレン橋架けによって「ロックされた」核酸アナログのクラスである）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０．１３２５２  ３頁（１９９８年）を参照のこと）；陽性骨格（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：６０９７頁（１９９５年）；非イオン性骨格（例えば、米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０巻：���２３頁（１９９１年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１０巻：４４７０頁（１９８８年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３巻：１５９７頁（１９９４年）；第２章および第３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、編者Ｙ．  Ｓ．  ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．  Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ４巻：３９５頁（１９９４年）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４巻：１７頁（１９９４年）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３７巻：７４３頁（１９９６年）を参照のこと）、ならびに米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号ならびに第６章および第７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、編者Ｙ．  Ｓ．  Ｓａｎｇｈｕｉ  およびＰ．  Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ中に記載されるものを含む非リボース骨格。１つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（例えば、Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．（１９９５年）１６９〜１７６頁を参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５頁中に記載されている。これらの参考文献は全て、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は、生理学的環境中でのかかる分子の安定性および半減期を増加させるために実施され得る。例えば、ＰＮＡ：ＤＮＡおよびＬＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、より高い安定性を示し得、従って、いくつかの実施形態で使用され得る。上記標的核酸は、特定されたように一本鎖または二本鎖であり得、あるいは二本鎖配列または一本鎖配列の両方の一部分を含み得る。その適用に依存して、上記核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびｃＤＮＡが含まれる）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡが含まれる）またはハイブリッドであり得、この核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）、ヒポキサタニン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組合せを含み得る。
【０１２０】
本明細書中に提供される方法、組成物およびキットは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）を分析するために使用され得る。これらの方法、組成物およびキットは、第２のポリヌクレオチドの量と比較して、第１のポリヌクレオチドの量を評価するために使用され得る。この方法は、溶液中の合成プラスミドの量を分析するため；被験体から得られたまたは環境から得られた試料内の病原性生物（例えば、微生物、細菌、ウイルス、寄生生物、レトロウイルス、レンチウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、インフルエンザウイルスなど）を検出するために、使用され得る。この方法は、ポリヌクレオチドの稀な集団がポリヌクレオチドのより大きな集団内に存在する他の適用においても使用され得る。ポリヌクレオチドは、クローニング、例えば、プラスミド、酵母または細菌の人工染色体中へのクローニングによって得られ得る。ポリヌクレオチドは、単離されたｍＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡが分析される。いくつかの実施形態では、上記ゲノムＤＮＡは、哺乳動物、例えばヒト由来である。上記ゲノムＤＮＡは、正常な体細胞組織、胚組織または罹患組織（例えば、腫瘍組織）から得られ得る。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００超の、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００の、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００未満のゲノム当量が使用される。ゲノム当量は、単一コピーのゲノム中のＤＮＡの量であり得る（例えば、単一の二倍体細胞は、２ゲノム当量のＤＮＡを有する）。いくつかの実施形態では、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約１〜約３５、約１〜約４０、約１〜約４５、約１〜約５０、約１〜約５５、約１〜約６０、約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約５〜約５０、約５〜約５５、約５〜約６０、約１０〜約２０、約１０〜約３０、約１０〜約４０、約１０〜約５０または約１０〜約５０のゲノム当量が使用される。いくつかの実施形態では、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００の、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００超の、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００の、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００未満のゲノム当量が使用される。いくつかの実施形態では、約１００〜約１０００、約１００〜約１０，０００、約１００〜約１００，０００、約１００〜約１，０００，０００、約１００〜約１０，０００，０００、約１０００〜約１０，０００、約１０００〜約１００，０００、約１０００〜約１，０００，０００、約１０００〜約１０，０００，０００、約１０，０００〜約１００，０００、約１０，０００〜約１，０００，０００、約１０，０００〜約１０，０００，０００、約１００，０００〜約１，０００，０００、約１００，０００〜約１０，０００，０００または約１，０００，０００〜約１０，０００，０００のゲノム当量が使用される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、せん断から保護される。せん断からポリヌクレオチドを保護し得る添加剤には、例えば、スペルミジン、スペルミン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）４０（ＰＶＰ４０）またはＣｏ（ＮＨ３）６Ｃｌ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えばポリヌクレオチドを１つの容器から別の容器に移す場合に、ポリヌクレオチドのせん断を回避するために広孔ピペットが使用される。せん断からポリヌクレオチドを保護するための方法および組成物は、例えば、Ｋｏｖａｃｉｃら（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３巻：３９９９〜４０００頁ならびにＧｕｒｒｉｅｒｉ  ＳおよびＢｕｓｔａｍａｎｔｅ  Ｃ．（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３２６巻：１３１〜１３８頁中に記載されている。
【０１２３】
本明細書中に記載されるように（例えば液滴中に）区画化され得るポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片の長さは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、３０，０００，０００、４０，０００，０００、５０，０００，０００、６０，０００，０００、７０，０００，０００、８０，０００，０００、９０，０００，０００、１００，０００，０００、１１０，０００，０００、１２０，０００，０００、１３０，０００，０００、１４０，０００，０００、１５０，０００，０００、１６０，０００，０００、１７０，０００，０００、１８０，０００，０００、１９０，０００，０００、２００，０００，０００、２１０，０００，０００、２２０，０００，０００、２３０，０００，０００、２４０，０００，０００もしくは２５０，０００，０００ヌクレオチド長もしくは塩基対長、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、３０，０００，０００、４０，０００，０００、５０，０００，０００、６０，０００，０００、７０，０００，０００、８０，０００，０００、９０，０００，０００、１００，０００，０００、１１０，０００，０００、１２０，０００，０００、１３０，０００，０００、１４０，０００，０００、１５０，０００，０００、１６０，０００，０００、１７０，０００，０００、１８０，０００，０００、１９０，０００，０００、２００，０００，０００、２１０，０００，０００、２２０，０００，０００、２３０，０００，０００、２４０，０００，０００もしくは２５０，０００，０００ヌクレオチド長もしくは塩基対長超、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、３０，０００，０００、４０，０００，０００、５０，０００，０００、６０，０００，０００、７０，０００，０００、８０，０００，０００、９０，０００，０００、１００，０００，０００、１１０，０００，０００、１２０，０００，０００、１３０，０００，０００、１４０，０００，０００、１５０，０００，０００、１６０，０００，０００、１７０，０００，０００、１８０，０００，０００、１９０，０００，０００、２００，０００，０００、２１０，０００，０００、２２０，０００，０００、２３０，０００，０００、２４０，０００，０００もしくは２５０，０００，０００ヌクレオチド長もしくは塩基対長、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、３０，０００，０００、４０，０００，０００、５０，０００，０００、６０，０００，０００、７０，０００，０００、８０，０００，０００、９０，０００，０００、１００，０００，０００、１１０，０００，０００、１２０，０００，０００、１３０，０００，０００、１４０，０００，０００、１５０，０００，０００、１６０，０００，０００、１７０，０００，０００、１８０，０００，０００、１９０，０００，０００、２００，０００，０００、２１０，０００，０００、２２０，０００，０００、２３０，０００，０００、２４０，０００，０００もしくは２５０，０００，０００ヌクレオチド長もしくは塩基対長未満であり得る。
【０１２４】
個々の染色体が、個々の区画中に分離され得る。本明細書中に記載されるように区画化され得るヒト染色体には、第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体が挙げられ得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、穏やかなプロセシングステップが、試料から大きいポリヌクレオチドを取得するために使用される。上記穏やかなプロセシングステップには、例えば、低速遠心分離、プロテイナーゼＫおよび／もしくはＲＮａｓｅ消化を使用したゲノムＤＮＡの放出、または透析が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ボルテックス、高速遠心分離またはエタノール沈殿などのステップは実施されない。
【０１２６】
次世代配列決定
本明細書中に記載される方法、組成物およびキットは、新世代の配列プラットフォームと共に使用され得る。例えば、バーコードを有するアダプターがポリヌクレオチドにライゲーションされ得、異なるバーコードを有するポリヌクレオチドの異なる試料がプールされ得、該プールされたポリヌクレオチドが、次世代配列決定を使用して配列決定され得、どの配列読取りが同じ区画（例えば、液滴）中のポリヌクレオチドから生成されたかを決定するためにバーコードが使用され得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定技術は、４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）である（例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｍら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３７巻：３７６〜３８０頁を参照のこと）。４５４配列決定は、２つのステップを含み得る。第１のステップでは、ＤＮＡが、およそ３００〜８００塩基対の断片へとせん断され得、これらの断片は平滑末端化され得る。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターが、これらの断片の末端にライゲーションされ得る。上記アダプターは、上記断片の増幅および配列決定のためのプライマーをハイブリダイズするための部位として機能し得る。これらの断片は、例えば、５’−ビオチンタグを含み得るアダプターＢを使用して、ストレプトアビジン被覆ビーズなどのＤＮＡ捕捉ビーズに結合され得る。これらの断片は、ハイブリダイゼーションを介してＤＮＡ捕捉ビーズに結合され得る。ビーズ１つ当たり単一の断片が捕捉され得る。上記ビーズに結合した結合断片は、油−水エマルジョンの液滴内でＰＣＲ増幅され得る。各ビーズ上のクローン性増幅されたＤＮＡ断片の複数のコピーがその結果であり得る。このエマルジョンは、増幅された結合断片がそれらの特定のビーズに結合したままで、破壊され得る。第２のステップでは、上記ビーズがウェル（ピコリットルサイズの；ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（ＰＴＰ）デバイス）中で捕捉され得る。その表面は、１ウェル当たり１つのビーズだけが嵌まるように設計され得る。上記ＰＴＰデバイスは、配列決定用の装置中に充填され得る。ピロシーケンシングが、各ＤＮＡ断片に対して並行して実施され得る。１つまたは複数のヌクレオチドの付加が、配列決定装置中のＣＣＤカメラによって記録され得る光シグナルを生成し得る。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数と比例し得る。ピロシーケンシングは、ヌクレオチド付加の際に放出され得るピロホスフェート（ＰＰｉ）を使用し得る。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホスルフェートの存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換され得る。ルシフェラーゼは、ＡＴＰを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し得、この反応は光を生成し得、その光が検出および分析される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定技術は、ＳＯＬｉＤ技術である（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＳＯＬｉＤ配列決定では、ゲノムＤＮＡが断片へとせん断され得、アダプターが、該断片の５’末端および３’末端に結合されて、断片ライブラリーを生成し得る。あるいは、上記断片の５’末端および３’末端にアダプターをライゲーションし、その断片を環化し、環化断片を消化して内部アダプターを生成し、得られた断片の５’末端および３’末端にアダプターを結合させてメイトペアライブラリを生成することによって、複数の内部アダプターが導入され得る。次に、クローン性ビーズ集団が、ビーズ、プライマー、鋳型、およびＰＣＲ成分を含むマイクロリアクター中で調製され得る。ＰＣＲ後、上記鋳型が変性され得、ビーズが富化されて、伸長した鋳型を有するビーズを分離し得る。選択されたビーズ上の鋳型は、ガラススライドへの結合を可能にする３’改変に供され得る。配列決定プライマーが、アダプター配列に結合し得る。４つの蛍光標識二塩基プローブのセットは、上記配列決定プライマーへのライゲーションについて競合し得る。上記二塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応においてあらゆる第１および第２の塩基を調査することによって達成され得る。鋳型の配列は、特異的蛍光団によって同定され得る決定された塩基（または塩基の対）を有する部分的にランダムなオリゴヌクレオチドの、逐次的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションによって決定され得る。色を記録した後、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドは切断および除去され得、次いでこのプロセスが繰り返され得る。一連のライゲーションサイクル後、伸長産物が除去され得、上記鋳型は、第２ラウンドのライゲーションサイクルのために、ｎ−１位に相補的なプライマーでリセットされ得る。５ラウンドのプライマーリセットが、各配列タグについて完了され得る。上記プライマーリセットプロセスを介して、殆どの塩基が、２つの異なるプライマーによる２つの独立したライゲーション反応において調査され得る。最大９９．９９％までの正確さが、多塩基コードスキームを使用してさらなるプライマーを用いて配列を決定することによって達成され得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定技術は、ＳＯＬＥＸＡ配列決定である（Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）。ＳＯＬＥＸＡ配列決定は、フォールドバックＰＣＲおよびアンカーされたプライマーを使用した固体表面上でのＤＮＡの増幅に基づき得る。ＳＯＬＥＸＡ配列決定は、ライブラリー調製ステップを含み得る。ゲノムＤＮＡが断片化され得、せん断された末端が修復され、アデニル化され得る。アダプターが、上記断片の５’末端および３’末端に付加され得る。上記断片は、サイズ選択され精製され得る。ＳＯＬＥＸＡ配列は、クラスター生成ステップを含み得る。ＤＮＡ断片は、フローセルチャネルの表面に結合したローン（ｌａｗｎ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、該フローセルチャネルの表面に結合され得る。これらの断片は、伸長され、ブリッジ増幅によってクローン性増幅されて、独自のクラスターを生成し得る。上記断片は二本鎖になり、該二本鎖分子が変性され得る。固相増幅およびその後の変性の複数のサイクルにより、フローセルの各チャネル中に、同じ鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子およそ１，０００コピーのクラスターが、数百万個創出され得る。リバース鎖は、切断され、洗浄により除去され得る。末端がブロッキングされ得、プライマーが、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされ得る。ＳＯＬＥＸＡ配列決定は、配列を決定するステップを含み得る。数億ものクラスターが同時に配列決定され得る。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび４つの蛍光団標識された可逆的に終結させるヌクレオチドが、逐次的配列決定を実施するために使用され得る。４塩基全てが、上記鋳型について互いに競合し得る。ヌクレオチド取込みの後、レーザーを使用して上記蛍光団を励起させ、画像を捕捉し、第１の塩基の正体を記録する。各取り込まれた塩基から３’ターミネーターおよび蛍光団が除去され、上記取込み、検出および同定のステップが繰り返される。単一塩基が各サイクルで読み取られ得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術を含む。ＳＭＲＴでは、４つのＤＮＡ塩基の各々が、４つの異なる蛍光色素のうちの１つに結合され得る。これらの色素はリン酸基に結合され（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）得る。単一のＤＮＡポリメラーゼが、ゼロモードウェーブガイド（ＺＭＷ）の底において、単一分子の鋳型一本鎖ＤＮＡと共に固定化され得る。ＺＭＷは、ＺＭＷから外れた場所で迅速に（マイクロ秒で）拡散し得る蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、ＤＮＡポリメラーゼによる単一ヌクレオチドの取込みの観察を可能にする、拘束構造であり得る。成長中の鎖中にヌクレオチドを取り込むには、数ミリ秒かかり得る。この時間の間に、蛍光標識が励起されて蛍光シグナルを生成し得、蛍光タグが切断され得る。ＺＭＷは、下方から光を当てられ得る。励起ビームから減衰した光は、各ＺＭＷの下端２０〜３０ｎｍを貫通し得る。２０ゼプトリットル（１０−２１リットル）の検出限界を有する顕微鏡が創出され得る。僅かな検出体積は、バックグラウンドノイズの低下において１０００倍の改善を提供し得る。色素の対応する蛍光の検出は、どの塩基が取り込まれたかを示し得る。このプロセスは反復され得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定はナノポア配列決定である（例えば、Ｓｏｎｉ  ＧＶおよびＭｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７年）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３巻：１９９６〜２００１頁を参照のこと）。ナノポアは、直径が約１ナノメートルのオーダーの小さい孔であり得る。伝導流体中でのナノポアの浸漬およびそれを横切る電位の印加は、ナノポアを通るイオンの伝導に起因して、僅かな電流を生じ得る。流れる電流の量は、上記ナノポアのサイズに対して感受性であり得る。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際に、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、異なる程度まで該ナノポアを詰まらせ得る。従って、上記ＤＮＡ分子が上記ナノポアを通過する際の、該ナノポアを通過する電流における変化は、そのＤＮＡ配列の読取りを示し得る。上記ナノポア配列決定技術は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのもの；例えば、ＧｒｉｄＩＯＮシステムであり得る。単一のナノポアは、マイクロウェルの上部の全域で、ポリマーメンブレン中に挿入され得る。各マイクロウェルは、個々の検知のための電極を有し得る。上記マイクロウェルは、１チップ当たり１００，０００以上のマイクロウェルを有するアレイチップへと組み上げられ得る。装置（またはノード）が、上記チップを分析するために使用され得る。データはリアルタイムで分析され得る。１つまたは複数の装置が、同時に操作され得る。上記ナノポアは、タンパク質ナノポア、例えば、タンパク質アルファ−ヘモリシン、ヘプタマータンパク質ポアであり得る。上記ナノポアは、固体状態ナノポアでできた、例えば、合成メンブレン（例えば、ＳｉＮｘまたはＳｉＯ２）に形成されたナノメートルサイズの孔であり得る。上記ナノポアは、ハイブリッドポアであり得る（例えば、固体状態メンブレンへのタンパク質ポアの組込み）。上記ナノポアは、組み込まれたセンサー（例えば、トンネル電極検出器、容量検出器、またはグラフェンベースのナノギャップもしくはエッジ状態検出器（例えば、Ｇａｒａｊら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  ６７巻、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３７９を参照のこと））を有するナノポアであり得る。ナノポアは、特定の型の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）を分析するために機能化され得る。ナノポア配列決定は、インタクトなＤＮＡポリマーがタンパク質ナノポアを通過し得、ここで、該ＤＮＡがタンパク質ナノポアをトランスロケーションする際にリアルタイムで配列を決定する「鎖配列決定」を含み得る。酵素が、二本鎖ＤＮＡの鎖を分離し、ナノポアを介して鎖を供給し得る。上記ＤＮＡは、一方の端でヘアピンを有し得、このシステムは、両方の鎖を読み取り得る。いくつかの実施形態では、ナノポア配列決定は、個々のヌクレオチドが前進型エキソヌクレアーゼによってＤＮＡ鎖から切断され、該ヌクレオチドがタンパク質ナノポアを通過し得る、「エキソヌクレアーゼ配列決定」である。上記ヌクレオチドは、上記ポア中の分子（例えば、シクロデキストラン）に一過的に結合し得る。電流における特徴的な破壊が、塩基を同定するために使用され得る。ＧＥＮＩＡまたはＮＡＢｓｙｓのナノポア配列決定技術が使用され得る。ＧＥＮＩＡの技術では、���学的に操作されたタンパク質ポアが脂質二重膜中に埋め込まれ得、「Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」技術が、効率的なナノポア−メンブレンアセンブリと、チャネルを介したＤＮＡの移動の制御とを可能にし得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定は、イオン半導体配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）の技術を使用する）を含む。イオン半導体配列決定は、ヌクレオチドがＤＮＡの鎖に取り込まれる際にイオンが放出され得るという事実を利用し得る。イオン半導体配列決定を実施するために、微細機械加工したウェルの高密度アレイが形成され得る。各ウェルは、単一のＤＮＡ鋳型を保持し得る。上記ウェルの下はイオン感受性層であり得、該イオン感受性層の下はイオンセンサーであり得る。ヌクレオチドがＤＮＡに付加されるときに、Ｈ＋が放出され、これはｐＨの変化として測定され得る。そのＨ＋イオンは、電圧に変換され、半導体センサーによって記録され得る。アレイチップには、ヌクレオチドが次々に連続して送り込まれ得る。走査も光もカメラも必要とされ得ない。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定は、ＤＮＡナノボール配列決定であり得る（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって実施されるような；例えば、Ｄｒｍａｎａｃら（２０１０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７巻：７８〜８１頁を参照のこと）。ＤＮＡは、単離され、断片化され、サイズ選択され得る。例えば、ＤＮＡは、約５００ｂｐの平均長へと（例えば音波処理によって）断片化され得る。アダプター（Ａｄ１）が、上記断片の末端に結合され得る。上記アダプターは、配列決定反応のためのアンカーにハイブリダイズするために使用され得る。各末端に結合したアダプターを有するＤＮＡが、ＰＣＲ増幅され得る。そのアダプター配列は、相補的一本鎖末端が互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように、改変され得る。上記ＤＮＡは、後続のステップで使用されるＩＩＳ型制限酵素による切断から該ＤＮＡを保護するために、メチル化され得る。アダプター（例えば、右側アダプター）は、制限酵素認識部位を有し得、この制限酵素認識部位は、メチル化されないままであり得る。上記アダプターにおける非メチル化制限酵素認識部位は、制限酵素（例えば、ＡｃｕＩ）によって認識され得、該ＤＮＡは、上記右側アダプターの右側に対し１３ｂｐでＡｃｕＩによって切断されて、直鎖二本鎖ＤＮＡを形成し得る。第２ラウンドの右側および左側アダプター（Ａｄ２）が、上記直鎖ＤＮＡのいずれかの末端にライゲーションされ得、両方のアダプターが結合した全てのＤＮＡが、（例えばＰＣＲによって）ＰＣＲ増幅され得る。Ａｄ２配列は、互いに結合して環状ＤＮＡを形成できるように、改変され得る。上記ＤＮＡはメチル化され得るが、制限酵素認識部位は、上記左側Ａｄ１アダプター上ではメチル化されないままであり得る。制限酵素（例えば、ＡｃｕＩ）が適用され得、上記ＤＮＡが、上記Ａｄ１の左側に対し１３ｂｐで切断されて、直鎖ＤＮＡ断片を形成し得る。第３ラウンドの右側および左側アダプター（Ａｄ３）が、上記直鎖ＤＮＡの右側および左側にライゲーションされ得、得られた断片がＰＣＲ増幅され得る。これらのアダプターは、互いに結合して環状ＤＮＡを形成し得るように改変され得る。ＩＩＩ型制限酵素（例えば、ＥｃｏＰ１５）が添加され得る；ＥｃｏＰ１５は、Ａｄ３の左側に対し２６ｂｐおよびＡｄ２の右側に対し２６ｂｐで、該ＤＮＡを切断し得る。この切断は、ＤＮＡの大きいセグメントを除去し得、該ＤＮＡを再度線状化し得る。第４ラウンドの右側および左側アダプター（Ａｄ４）が上記ＤＮＡにライゲーションされ得、該ＤＮＡが（例えばＰＣＲによって）増幅され得、互いに結合して完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように改変され得る。ローリングサークル複製（例えば、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを使用する）が、ＤＮＡの小さい断片を増幅するために使用され得る。４つのアダプター配列は、ハイブリダイズし得るパリンドローム配列を含み得、一本鎖は、それ自体折り畳まって、直径が平均しておよそ２００〜３００ナノメートルであり得るＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（商標））を形成し得る。ＤＮＡナノボールは、（例えば吸着によって）マイクロアレイ（配列決定フローセル）に結合され得る。上記フローセルは、二酸化ケイ素、チタンおよびヘキサメチルジシラザン（ｈｅｘａｍｅｈｔｙｌｄｉｓｉｌａｚａｎｅ）（ＨＭＤＳ）ならびにフォトレジスト材料で被覆されたケイ素ウエハであり得る。配列決定は、蛍光プローブをＤＮＡにライゲーションすることによって、非鎖状配列決定によって実施され得る。調査した位置の蛍光の色は、高解像度カメラによって可視化され得る。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性が決定され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、上記次世代配列決定技術は、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）である（例えば、Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ．  Ｄ．ら（２００８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０巻：１０６〜１０９頁を参照のこと）。上記ｔＳＭＳ技術では、ＤＮＡ試料は、およそ１００〜２００ヌクレオチドの鎖へと切断され得、ポリＡ配列が、各ＤＮＡ鎖の３’末端に付加され得る。各鎖は、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加によって標識され得る。次いで、そのＤＮＡ鎖は、フローセル表面に固定化された数百万のオリゴＴ捕捉部位を含み得るフローセルにハイブリダイズされ得る。鋳型は、約１億鋳型／ｃｍ２の密度であり得る。次いで、上記フローセルは、装置、例えば、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）シーケンサー中に装填され得、レーザーが上記フローセルの表面を照射して、各鋳型の位置を明らかにし得る。ＣＣＤカメラが、上記フローセル表面上の鋳型の位置をマッピングし得る。次いで、上記鋳型蛍光標識が切断されて、洗浄により除去され得る。その配列決定反応は、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたヌクレオチドを導入することによって開始し得る。オリゴＴ核酸はプライマーとして機能し得る。上記ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型指向性の様式で、上記標識されたヌクレオチドを上記プライマーに取り込み得る。上記ＤＮＡポリメラーゼおよび取り込まれていないヌクレオチドは除去され得る。上記蛍光標識されたヌクレオチドを取り込むように誘導された鋳型は、上記フローセル表面を画像化することによって検出され得る。画像化後、切断ステップがその蛍光標識を除去し得、このプロセスは、所望の読取り長さが達成されるまで、他の蛍光標識されたヌクレオチドを用いて繰り返され得る。その配列情報は、各ヌクレオチド付加ステップで収集され得る。上記配列決定は非同期であり得る。配列決定は、１日当たりまたは１時間当たり、少なくとも１０億塩基を含み得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、上記配列決定技術は、フォワードおよびリバース鋳型鎖の両方が配列決定され得るペアードエンド配列決定を含み得る。いくつかの実施形態では、この配列決定技術は、メイトペアライブラリ配列決定を含み得る。メイトペアライブラリ配列決定では、ＤＮＡは断片であり得、２〜５ｋｂの断片が、（例えばビオチン標識されたｄＮＴＰで）末端修復され得る。そのＤＮＡ断片は、環状化され得、非環状化ＤＮＡは消化によって除去され得る。環状ＤＮＡは断片化され、（例えば、ビオチン標識を使用して）精製され得る。精製された断片は、末端修復され、配列決定アダプターにライゲーションされ得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、配列読取りは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００もしくは３０００個の塩基、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００もしくは３０００個超の塩基、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５
、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００もしくは３０００個未満の塩基、または少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００もしくは３０００個の塩基である。いくつかの実施形態では、配列読取りは、約１０〜約５０塩基、約１０〜約１００塩基、約１０〜約２００塩基、約１０〜約３００塩基、約１０〜約４００塩基、約１０〜約５００塩基、約１０〜約６００塩基、約１０〜約７００塩基、約１０〜約８００塩基、約１０〜約９００塩基、約１０〜約１０００塩基、約１０〜約１５００塩基、約１０〜約２０００塩基、約５０〜約１００塩基、約５０〜約１５０塩基、約５０〜約２００塩基、約５０〜約５００塩基、約５０〜約１０００塩基、約１００〜約２００塩基、約１００〜約３００塩基、約１００〜約４００塩基、約１００〜約５００塩基、約１００〜約６００塩基、約１００〜約７００塩基、約１００〜約８００塩基、約１００〜約９００塩基または約１００〜約１０００塩基である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、上記配列決定の深度は、約１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１１Ｘ、１２Ｘ、１３Ｘ、１４Ｘ、１５Ｘ、１６Ｘ、１７Ｘ、１８Ｘ、１９Ｘ、２０Ｘ、２１Ｘ、２２Ｘ、２３Ｘ、２４Ｘ、２５Ｘ、２６Ｘ、２７Ｘ、２８Ｘ、２９Ｘ、３０Ｘ、３１Ｘ、３２Ｘ、３３Ｘ、３４Ｘ、３５Ｘ、３６Ｘ、３７Ｘ、３８Ｘ、３９Ｘ、４０Ｘ、４１Ｘ、４２Ｘ、４３Ｘ、４４Ｘ、４５Ｘ、４６Ｘ、４７Ｘ、４８Ｘ、４９Ｘ、５０Ｘ、５１Ｘ、５２Ｘ、５３Ｘ、５４Ｘ、５５Ｘ、５６Ｘ、５７Ｘ、５８Ｘ、５９Ｘ、６０Ｘ、６１Ｘ、６２Ｘ、６３Ｘ、６４Ｘ、６５Ｘ、６６Ｘ、６７Ｘ、６８Ｘ、６９Ｘ、７０Ｘ、７１Ｘ、７２Ｘ、７３Ｘ、７４Ｘ、７５Ｘ、７６Ｘ、７７Ｘ、７８Ｘ、７９Ｘ、８０Ｘ、８１Ｘ、８２Ｘ、８３Ｘ、８４Ｘ、８５Ｘ、８６Ｘ、８７Ｘ、８８Ｘ、８９Ｘ、９０Ｘ、９１Ｘ、９２Ｘ、９３Ｘ、９４Ｘ、９５Ｘ、９６Ｘ、９７Ｘ、９８Ｘ、９９Ｘ、１００Ｘ、１１０Ｘ、１２０Ｘ、１３０Ｘ、１４０Ｘ、１５０Ｘ、１６０Ｘ、１７０Ｘ、１８０Ｘ、１９０Ｘ、２００Ｘ、２１０Ｘ、２２０Ｘ、２３０Ｘ、２４０Ｘ、２５０Ｘ、２６０Ｘ、２７０Ｘ、２８０Ｘ、２９０Ｘ、３００Ｘ、３５０Ｘ、４００Ｘ、４５０Ｘ、５００Ｘ、５５０Ｘ、６００Ｘ、６５０Ｘ、７００Ｘ、７５０Ｘ、８００Ｘ、８５０Ｘ、９００Ｘ、９５０Ｘ、１０００Ｘ、２０００Ｘ、３０００Ｘ、４０００Ｘ、５０００Ｘ、６０００Ｘ、７０００Ｘ、８０００Ｘ、９０００Ｘ、１０，０００Ｘ、約１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１１Ｘ、１２Ｘ、１３Ｘ、１４Ｘ、１５Ｘ、１６Ｘ、１７Ｘ、１８Ｘ、１９Ｘ、２０Ｘ、２１Ｘ、２２Ｘ、２３Ｘ、２４Ｘ、２５Ｘ、２６Ｘ、２７Ｘ、２８Ｘ、２９Ｘ、３０Ｘ、３１Ｘ、３２Ｘ、３３Ｘ、３４Ｘ、３５Ｘ、３６Ｘ、３７Ｘ、３８Ｘ、３９Ｘ、４０Ｘ、４１Ｘ、４２Ｘ、４３Ｘ、４４Ｘ、４５Ｘ、４６Ｘ、４７Ｘ、４８Ｘ、４９Ｘ、５０Ｘ、５１Ｘ、５２Ｘ、５３Ｘ、５４Ｘ、５５Ｘ、５６Ｘ、５７Ｘ、５８Ｘ、５９Ｘ、６０Ｘ、６１Ｘ、６２Ｘ、６３Ｘ、６４Ｘ、６５Ｘ、６６Ｘ、６７Ｘ、６８Ｘ、６９Ｘ、７０Ｘ、７１Ｘ、７２Ｘ、７３Ｘ、７４Ｘ、７５Ｘ、７６Ｘ、７７Ｘ、７８Ｘ、７９Ｘ、８０Ｘ、８１Ｘ、８２Ｘ、８３Ｘ、８４Ｘ、８５Ｘ、８６Ｘ、８７Ｘ、８８Ｘ、８９Ｘ、９０Ｘ、９１Ｘ、９２Ｘ、９３Ｘ、９４Ｘ、９５Ｘ、９６Ｘ、９７Ｘ、９８Ｘ、９９Ｘ、１００Ｘ、１１０Ｘ、１２０Ｘ、１３０Ｘ、１４０Ｘ、１５０Ｘ、１６０Ｘ、１７０Ｘ、１８０Ｘ、１９０Ｘ、２００Ｘ、２１０Ｘ、２２０Ｘ、２３０Ｘ、２４０Ｘ、２５０Ｘ、２６０Ｘ、２７０Ｘ、２８０Ｘ、２９０Ｘ、３００Ｘ、３５０Ｘ、４００Ｘ、４５０Ｘ、５００Ｘ、５５０Ｘ、６００Ｘ、６５０Ｘ、７００Ｘ、７５０Ｘ、８００Ｘ、８５０Ｘ、９００Ｘ、９５０Ｘ、１０００Ｘ、２０００Ｘ、３０００Ｘ、４０００Ｘ、５０００Ｘ、６０００Ｘ、７０００Ｘ、８０００Ｘ、９０００Ｘ、１０，０００Ｘ超、少なくとも約１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１１Ｘ、１２Ｘ、１３Ｘ、１４Ｘ、１５Ｘ、１６Ｘ、１７Ｘ、１８Ｘ、１９Ｘ、２０Ｘ、２１Ｘ、２２Ｘ、２３Ｘ、２４Ｘ、２５Ｘ、２６Ｘ、２７Ｘ、２８Ｘ、２９Ｘ、３０Ｘ、３１Ｘ、３２Ｘ、３３Ｘ、３４Ｘ、３５Ｘ、３６Ｘ、３７Ｘ、３８Ｘ、３９Ｘ、４０Ｘ、４１Ｘ、４２Ｘ、４３Ｘ、４４Ｘ、４５Ｘ、４６Ｘ、４７Ｘ、４８Ｘ、４９Ｘ、５０Ｘ、５１Ｘ、５２Ｘ、５３Ｘ、５４Ｘ、５５Ｘ、５６Ｘ、５７Ｘ、５８Ｘ、５９Ｘ、６０Ｘ、６１Ｘ、６２Ｘ、６３Ｘ、６４Ｘ、６５Ｘ、６６Ｘ、６７Ｘ、６８Ｘ、６９Ｘ、７０Ｘ、７１Ｘ、７２Ｘ、７３Ｘ、７４Ｘ、７５Ｘ、７６Ｘ、７７Ｘ、７８Ｘ、７９Ｘ、８０Ｘ、８１Ｘ、８２Ｘ、８３Ｘ、８４Ｘ、８５Ｘ、８６Ｘ、８７Ｘ、８８Ｘ、８９Ｘ、９０Ｘ、９１Ｘ、９２Ｘ、９３Ｘ、９４Ｘ、９５Ｘ、９６Ｘ、９７Ｘ、９８Ｘ、９９Ｘ、１００Ｘ、１１０Ｘ、１２０Ｘ、１３０Ｘ、１４０Ｘ、１５０Ｘ、１６０Ｘ、１７０Ｘ、１８０Ｘ、１９０Ｘ、２００Ｘ、２１０Ｘ、２２０Ｘ、２３０Ｘ、２４０Ｘ、２５０Ｘ、２６０Ｘ、２７０Ｘ、２８０Ｘ、２９０Ｘ、３００Ｘ、３５０Ｘ、４００Ｘ、４５０Ｘ、５００Ｘ、５５０Ｘ、６００Ｘ、６５０Ｘ、７００Ｘ、７５０Ｘ、８００Ｘ、８５０Ｘ、９００Ｘ、９５０Ｘ、１０００Ｘ、２０００Ｘ、３０００Ｘ、４０００Ｘ、５０００Ｘ、６０００Ｘ、７０００Ｘ、８０００Ｘ、９０００Ｘ、１０，０００Ｘ、または約１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１１Ｘ、１２Ｘ、１３Ｘ、１４Ｘ、１５Ｘ、１６Ｘ、１７Ｘ、１８Ｘ、１９Ｘ、２０Ｘ、２１Ｘ、２２Ｘ、２３Ｘ、２４Ｘ、２５Ｘ、２６Ｘ、２７Ｘ、２８Ｘ、２９Ｘ、３０Ｘ、３１Ｘ、３２Ｘ、３３Ｘ、３４Ｘ、３５Ｘ、３６Ｘ、３７Ｘ、３８Ｘ、３９Ｘ、４０Ｘ、４１Ｘ、４２Ｘ、４３Ｘ、４４Ｘ、４５Ｘ、４６Ｘ、４７Ｘ、４８Ｘ、４９Ｘ、５０Ｘ、５１Ｘ、５２Ｘ、５３Ｘ、５４Ｘ、５５Ｘ、５６Ｘ、５７Ｘ、５８Ｘ、５９Ｘ、６０Ｘ、６１Ｘ、６２Ｘ、６３Ｘ、６４Ｘ、６５Ｘ、６６Ｘ、６７Ｘ、６８Ｘ、６９Ｘ、７０Ｘ、７１Ｘ、７２Ｘ、７３Ｘ、７４Ｘ、７５Ｘ、７６Ｘ、７７Ｘ、７８Ｘ、７９Ｘ、８０Ｘ、８１Ｘ、８２Ｘ、８３Ｘ、８４Ｘ、８５Ｘ、８６Ｘ、８７Ｘ、８８Ｘ、８９Ｘ、９０Ｘ、９１Ｘ、９２Ｘ、９３Ｘ、９４Ｘ、９５Ｘ、９６Ｘ、９７Ｘ、９８Ｘ、９９Ｘ、１００Ｘ、１１０Ｘ、１２０Ｘ、１３０Ｘ、１４０Ｘ、１５０Ｘ、１６０Ｘ、１７０Ｘ、１８０Ｘ、１９０Ｘ、２００Ｘ、２１０Ｘ、２２０Ｘ、２３０Ｘ、２４０Ｘ、２５０Ｘ、２６０Ｘ、２７０Ｘ、２８０Ｘ、２９０Ｘ、３００Ｘ、３５０Ｘ、４００Ｘ、４５０Ｘ、５００Ｘ、５５０Ｘ、６００Ｘ、６５０Ｘ、７００Ｘ、７５０Ｘ、８００Ｘ、８５０Ｘ、９００Ｘ、９５０Ｘ、１０００Ｘ、２０００Ｘ、３０００Ｘ、４０００Ｘ、５０００Ｘ、６０００Ｘ、７０００Ｘ、８０００Ｘ、９０００Ｘ、１０，０００Ｘ未満である。いくつかの実施形態では、上記配列決定の深度は、約１Ｘ〜約４Ｘ、約１Ｘ〜約５Ｘ、約１Ｘ〜約８Ｘ、約１Ｘ〜約１０Ｘ、約２Ｘ〜約４Ｘ、約２Ｘ〜約８Ｘ、約２Ｘ〜約１０Ｘ、約５Ｘ〜約１０Ｘ、約３Ｘ〜約６Ｘ、約１０Ｘ〜約１５Ｘ、約１０Ｘ〜約２０Ｘ、約１５Ｘ〜約２０Ｘ、約１５Ｘ〜約２５Ｘ、約１５Ｘ〜約３０Ｘ、約２０Ｘ〜約３０Ｘ、約２５Ｘ〜約３０Ｘ、約２５Ｘ〜約５０Ｘ、約２５Ｘ〜約７５Ｘ、約２５Ｘ〜約１００Ｘ、約５０Ｘ〜約１００Ｘ、約１００Ｘ〜約２００Ｘ、約１００Ｘ〜約５００Ｘ、約１００Ｘ〜約１０００Ｘ、約２００Ｘ〜約５００Ｘ、約５００Ｘ〜約７５０Ｘ、約５００Ｘ〜約１０００Ｘ、約７５０Ｘ〜約１０００Ｘ、約１０００Ｘ〜約２０００Ｘ、約１０００Ｘ〜約５０００Ｘ、約１０００Ｘ〜約１０，０００Ｘ、約２０００Ｘ〜約５０００Ｘまたは約５０００Ｘ〜約１０，０００Ｘである。配列決定の深度は、配列（例えばゲノム）が配列決定される回数であり得る。いくつかの実施形態では、Ｌａｎｄｅｒ／Ｗａｔｅｒｍａｎ方程式が、カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を計算するために使用される。一般方程式はＣ＝ＬＮ／Ｇであり得、式中、Ｃ＝カバレッジ；Ｇ＝一倍体ゲノム長；Ｌ＝読取り長さ；およびＮ＝読取りの数である。
【０１３８】
適用
長い読取り、相特定およびデノボ配列決定
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法、組成物およびキットは、ハプロタイプ相特定のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＡＢＩが製造するものなどの短い読取りのシーケンサーは、相特定情報を提供できない場合がある。これらのシーケンサーは、１００〜２００塩基の読取りおよび３０塩基の短さの読取りを生じ得る。４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）は、約４００塩基の配列読取りを生じ得る。いくつかの実施形態では、４００塩基は、充分な相特定情報を得るには短すぎる場合がある。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの技術を使用する配列決定は、約１０００塩基の配列読取りを生じ得る。いくつかの実施形態では、１０００塩基は、相特定情報を提供するには短すぎる。
【０１３９】
短い配列読取りは、大きいゲノムをデノボで配列決定するのを難しくし得る。短い配列読取りは、非常に小さい画分以外の全ての多型に関する相特定情報を決定するのを困難にし得る。本明細書中に記載される区画化およびバーコード化スキームは、既存の配列決定アプローチを使用しつつも、長い範囲のアセンブリを使用してより長い読取りを再構成し、相特定情報を供給するために使用され得る。
【０１４０】
次世代配列決定プラットフォームは、ライブラリー調製ステップを包含し得る。ゲノムＤＮＡは、断片化され得、必要に応じてサイズ決定され得、共通のプライマーセットに対するハイブリダイゼーション部位を提供し得る核酸配列（例えば、アダプター）にライゲーションされ得る。共通のプライマーセットは、例えば溶液中または固体支持体上での、大規模なクローン性増幅のために使用され得る。いくつかの実施形態では、厳密に制限された空間における大量の同一配列の存在は、配列決定反応によって放射される蛍光（または他の）シグナルの増幅を可能にし得るので、これらのクローンは次いで、配列を決定され得る。
【０１４１】
共通のバーコードが特定の試料由来のあらゆる配列にライゲーションされ得るように、タグ配列が、プライマーに対する結合部位として機能する領域に付加され得る。異なる試料由来のライブラリーが混合され得、単一の実施で配列を決定され得る。あらゆる読取りがバーコードを含み得るので、どの試料が任意の所与の配列読取りを生じたかを決定することができる。このプロセスは、試料多重化として公知であり得、多くの配列決定適用のために、試料１つにつきはるかにコスト効率のよい価格設定を可能にし得る。いくつかの実施形態では、あらゆる配列読取りの一部が、バーコード配列を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、同じ遺伝子座由来であるが異なる染色体由来の２つの断片を所与の区画が含む可能性がないように、高分子量ＤＮＡ試料が区画化され得る。いくつかの実施形態では、高分子量ＤＮＡは、約１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００または２００，０００，０００塩基または塩基対より大きいポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、同じ区画中の母系および父系の両方のポリヌクレオチドのゲノムの任意の所与の領域を有することが稀な事象となるように、ポリヌクレオチドが分離される。いくつかの実施形態では、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％または０．００１％未満の区画が、同じ遺伝子座由来であるが異なる染色体由来の２つの断片を有する。いくつかの実施形態では、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％もしくは０．００１％の、または約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％もしくは０．００１％未満の一倍体ゲノムが区画（例えば、液滴）１つ当たりに見出されるように、試料が区画化される。いくつかの実施形態では、約０．１％〜約１％、約０．５％〜約１％、約０．２５％〜約０．７５％、約１％〜約５％、約１％〜約２％、約１％〜約１０％または約５％〜約１０％の一倍体ゲノムが区画（例えば、液滴）１つ当たりに見出されるように、試料が区画化される。
【０１４３】
ライブラリー調製は、本明細書中に記載される区画（例えば、液滴）内で実施され得る。ゲノム中で互いに幾分近接してマッピングされ、同じ区画由来（例えば同じ液滴中）であることが決定される配列読取りは、互いに連鎖している可能性があり、従って、同じ染色体上に存在する可能性がある。この様式では、個々の短い読取りは、一緒に結び付けられて、より長い配列断片にされ得る。例えば、実施例１を参照のこと。
【０１４４】
単一細胞分析
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、細胞、例えば個々の細胞を分析するために使用され得る。例えば、個々の細胞は、独自の区画へと分離され得、独自にバーコード化されたアダプターが各区画に付加され、各区画内のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片が、アダプターを上記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片にライゲーションさせることによってバーコード化され得、各区画由来のバーコード化されたポリヌクレオチドがプールされ得、そのプールされたポリヌクレオチドが配列決定され得、同じまたは異なる区画中で、および従って同じ細胞または異なる細胞中で配列読取りが生成されたかを決定するために、バーコードが使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、単一細胞トランスクリプトーム配列決定、単一細胞ゲノム配列決定または単一細胞メチローム配列決定のために使用される。
【０１４５】
ヒト身体中には、およそ２１０の異なる型の細胞が存在する。区画化される個々の細胞は、上記ヒト身体中の任意の型の細胞であり得る。細胞は、例えば、ホルモン分泌細胞、外分泌上皮細胞、角質化上皮細胞、湿性重層バリア上皮細胞（ｗｅｔ  ｓｔａｒｔｉｆｉｅｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、感覚伝達細胞、自律神経細胞、感覚器もしくは末梢神経支持細胞、中枢神経系の神経細胞もしくはグリア細胞、水晶体細胞、代謝もしくは貯蔵細胞、腎臓細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞、血液もしくは免疫系の細胞、色素細胞、生殖細胞、栄養細胞または間質細胞であり得る。上記血液もしくは免疫系の細胞は、例えば、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））、巨核球（血小板前駆体）、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球または幹細胞であり得る。
【０１４６】
個々の細胞は、本明細書中に記載される他の型の試料に由来し得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、上記個々の細胞は、環境試料由来である。いくつかの実施形態では、環境試料は、複数の区画へと分離される。上記環境試料は、例えば、空気、水、農業試料または土壌であり得る。上記環境試料は、例えば、小川（ｃｒｅｅｋ）、川（ｒｉｖｅｒ）、池（ｐｏｎｄ）、湖、潟（ｌａｇｏｏｎ）、水路（ｒｕｎ）、三角州、湿地（ｍａｒｓｈ）、塩性湿地、湿地（ｓｗａｍｐ）、マングローブの湿地、水車用池、周縁凹地、海（ｓｅａ）、海岸の潟（ｂａｒａｃｈｏｉｓ）、海盆（ｂａｓｉｎ）、緩流河川、小川（ｂｅｃｋ）、ボイル（ｂｏｉｌ）、運河（ｃａｎａｌ）、コーブ（ｃｏｖｅ）、河口（ｅｓｔｕａｒｙ）、湾（ｇｕｌｆ）、港、入り江（ｉｎｌｅｔ）、大洋（ｏｃｅａｎ）、湾（ｂａｙ）、下水処理施設、スラフ（ｓｌｏｕｇｈ）、海峡（ｓｏｕｎｄ）、泉、小川（ｓｔｒｅａｍ）、潮溜まり、ウォッシュ（ｗａｓｈ）、湿原（ｗｅｔｌａｎｄ）、スーパーファンド（ｓｕｐｅｒｆｕｎｄ）用地、炭鉱、農場（ｆａｒｍ）、野原（ｆｉｅｌｄ）、砂漠、氷河、山または沼（ｍｅｒｅ）由来であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、プール（例えば、水泳プール）、体育館、学校、仕事場、オフィス、ロビー、エレベーター、化粧室、病院、診療所、通気孔またはレストラン由来である。いくつかの実施形態では、環境試料は、表面、例えば、床、テーブル、皮膚、キーボード、コンピューター、ラップトップ、犯罪審査の証拠（例えば、武器、例えば、銃またはナイフ）またはドアノブ由来であり得る。いくつかの実施形態では、上記試料は、バイオテロリストの攻撃由来である。いくつかの実施形態では、上記試料は細菌および／またはウイルスを含む。いくつかの実施形態では、上記試料は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００の、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００の、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００超の、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００未満の異なる種および／または型のウイルスを含む。いくつかの実施形態では、環境試料は、約１０〜約１００、約１０〜約１０００、約１００〜約１０００、約１００〜約１０，０００、約１０００〜１０，０００、約１０，０００〜約５０，０００または約１０，０００〜約１００，０００の異なる種および／または型のウイルスを含む。
【０１４８】
単一細胞トランスクリプトーム配列決定
一態様では、単一細胞は、別個の区画（例えば、液滴）内に捕捉され得、この単一細胞が溶解され得る。各区画（例えば、液滴）中の個々の細胞由来のメッセンジャーＲＮＡが、区画特異的バーコード化プライマーを用いて逆転写され得る。いくつかの実施形態では、適切な試薬（例えば、逆転写酵素、ヌクレオチド）が、より大きい液滴の内側にある区画（例えば、液滴）中に隔離され得る。上記逆転写酵素をメッセンジャーＲＮＡと接触させることが望まれる場合、上記内部液滴を、（例えば加熱によって）破裂させ得る。逆転写（ＲＴ）反応の後には、独自のバーコードを取り込み得るライブラリー調製が続き得る。
【０１４９】
単一細胞トランスクリプトーム配列決定において使用される液滴およびバーコードの数の計算は、相特定を分析するために実施例１に記載された計算と同様であり得る。例えば、２，０００細胞を分析するために、充分な区画化が、別個の液滴中に各細胞を捕捉するために実施され得る。例えば、上記２，０００細胞は、２０，０００の区画（例えば、液滴）中に区画化され得る。細胞を有する区画（例えば、液滴）のそれぞれが独自のバーコード（例えば、アダプター上の）を受け取ることを確実にするためのステップが取られ得る。この目的は、例えば、１０，０００の異なるバーコードを使用することによって達成され得る。
【０１５０】
区画化、溶解、バーコード化および配列決定の後、配列読取りデータは、どの転写物が同じ細胞由来かを決定するために分析され得る。この方法で、単一細胞解像度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を維持しながら、次世代配列決定の大きな能力が、細胞の大きい収集物に適用され得る。
【０１５１】
単一細胞ゲノム配列決定
いくつかの例では、個々の細胞は、別個の区画（例えば、液滴）に捕捉され得、単一細胞を有する区画由来のゲノムＤＮＡが、（例えばアダプターを使用して）独自にバーコード化され得る。異なる区画由来のバーコード化されたゲノムＤＮＡは、プールされ、配列を決定され得、そのバーコードは、どの配列読取りが同じ細胞由来かを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、区画中で断片化される。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、バーコードを有するアダプターを付加する前および／または後に増幅される。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、アダプターがゲノムＤＮＡにライゲーションされる前にも後にも増幅されない。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、細胞１つ当たりの配列カバレッジは、浅い場合がある（例えば、１遺伝子座当たり数個の読取り）。いくつかの実施形態では、単一細胞ゲノムＤＮＡ配列決定は、コピー数変動（ＣＮＶ）を決定するために使用され得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＭＤＡが、断片化およびアダプターライゲーションの前に、細胞のゲノムに対して液滴内で実施される。いくつかの実施形態では、ＭＤＡを実施することは、細胞由来のより多くの遺伝物質を配列に提供し得る。いくつかの実施形態では、ＭＤＡは、バイアスを導入し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、いくつかのコピー数変動（ＣＮＶ）情報の喪失を生じ得る。いくつかの実施形態では、ＭＤＡは、断片化およびアダプターライゲーションの前に、細胞のゲノムに対して液滴内で実施されない。
【０１５４】
単一細胞メチローム配列決定
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、ゲノムのメチル化を分析するために使用され得る。例えば、本明細書中に記載される方法は、単一細胞メチローム配列決定のために使用され得る。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、例えば液滴へと区画化される。これらの区画は、メチル感受性酵素（例えばエンドヌクレアーゼ）から構成され得る。いくつかの実施形態では、このメチル感受性酵素は、メチル化された部位を消化する。これらの区画の各々は、独自にバーコード化されたアダプターを含み得る。例えば、メチル感受性酵素を含む区画（例えば、液滴）は、試料ポリヌクレオチドを含む区画と合体される。上記アダプターは、上記メチル感受性酵素による消化の前または後に上記区画中でポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。バーコードでタグを付けたポリヌクレオチドがプールされ得、該ポリヌクレオチドが配列決定され得る。同じ区画由来の配列読取りが決定され得る。配列読取りの非存在は、区画中のポリヌクレオチドの消化を示し得る。いくつかの実施形態では、上記メチル感受性酵素は、メチル化されたＤＮＡを消化しないが、メチル化されていないＤＮＡを消化する。
【０１５５】
ゲノムのメチル化
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、ゲノムのメチル化分析のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ビスルファイトで処理され得る。ビスルファイト（ｂｉｆｓｕｌｆｉｔｅ）は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換し得る。ビスルファイトは、メチル化シトシンをウラシルに変換しない。処理されたおよび未処理のポリヌクレオチドは、複数の区画（例えば、液滴）へと区画化され得る。ポリヌクレオチドは上記区画中で断片化され得る。独自にバーコード化されたアダプターが、各区画に提供され得、ビスルファイト処理されたポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。タグを付けたポリヌクレオチドがプールされ得、同じ区画および異なる区画由来の核酸のメチル化状態を決定するために配列決定され得る。
【０１５６】
エキソソーム配列決定
エキソソームは一般に、ＲＮＡを含み得る、小さい細胞外小胞などのオルガネラである。エキソソームは、ｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、個々のエキソソームは、別個の区画（例えば、液滴）へと区画化される。エキソソームは、各区画が平均して約５、４、３、２または１未満のエキソソームを含むように、区画化され得る。逆転写が、エキソソーム中のＲＮＡをｃＤＮＡに変換するために使用され得る。独自にバーコード化されたアダプターが、区画化されたエキソソーム由来のポリヌクレオチドに付加され得る。これらの区画由来のポリヌクレオチドはプールされ得、そのプールされたポリヌクレオチドは配列決定され得、どの配列読取りが同じエキソソーム由来かを決定するために、上記バーコードが使用され得る。分析され得る他の型のオルガネラには、ミトコンドリアが含まれ得る（例えば、ミトコンドリアＤＮＡが分析され得る）。
【０１５７】
メタゲノミクス配列決定
別の態様では、本明細書中に記載される方法および組成物は、メタゲノム分析のために使用され得る。メタゲノミクスは、環境試料中の遺伝物質の研究であり得る。いくつかの実施形態では、試料、例えば環境試料中の個々のウイルスおよび／または細菌は、複数の区画へと区画化され得、独自のバーコードを有するアダプターが各区画に付加され得、個々の生物またはウイルスは、そのゲノムおよび／またはトランスクリプトームが配列決定され得る。同じバーコードを有する配列読取りは、生物および／またはウイルスのゲノムまたはトランスクリプトームの配列を決定するためにアセンブルされ得る。
【０１５８】
マイクロ流体工学
別の態様では、あらゆる細胞が、それら自身のバーコードのセットを有する独自の区画（例えばチャンバー）で終わるように、細胞を含む試料を区画化し得るマイクロ流体工学デバイスが工夫され得る。各細胞について個別に全ゲノムまたはトランスクリプトームを増幅することを可能にするために、各チャンバーの内容物は次いで個別に処理されて、希釈され、（例えば、エマルジョンを介して）さらに区画化され得る。全ゲノム増幅または他の増幅スキームは、ゲノムまたはトランスクリプトームの異なる部分間での競合の低下に起因して、区画化から利益を得うる。
【０１５９】
スラグ
別の態様では、個々の細胞を捕捉し、（例えば、独自のバーコードを有するアダプターをライゲーションすることによって）それらに自身のバーコードを供給するために、スラグが作製され得る。スラグは、フローチューブの直径を完全に塞ぐ試薬の連続スラグであり得る。これらのスラグは、液滴中でのバイアスなしの全ゲノム／トランスクリプトーム増幅を実施するために、多くの（例えば、数千以上の）より小さい液滴へと分割され得る。いくつかの実施形態では、スラグは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１０，０００の、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１０，０００の、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１０，０００超の、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１０，０００未満の液滴へと分割され得る。いくつかの実施形態では、スラグは、約１００〜約５００、約１００〜約１０００、約５００〜約１０００、約１０００〜約１５００、約１０００〜約２０００、約１０００〜約５０００、約１０００〜約１０，０００または約５，０００〜約１０，０００の液滴へと分割され得る。いくつかの実施形態では、全ゲノム増幅は、バルク中よりも液滴中でよりよく機能し得る。全ての上記スラグ由来の液滴は、既に独自のバーコードを有するアダプターが液滴に提供されているので、一緒に混合され得る。配列決定情報は、どの読取りがどのスラグ由来であるかを決定するために使用され得る。
【０１６０】
タンパク質発現および核酸情報
別の実施形態では、本明細書中に記載される方法は、特定の細胞表面マーカーを有する細胞を捕捉し、該細胞由来のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を分析するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体が、独自のバーコードを有する短いＤＮＡ断片で被覆されたビーズに連結され得る。各抗体は、それ自身の独自の配列と会合され得る。上記抗体はまた、適切に破裂され得る、ＤＮＡ断片を含む液滴に連結され得る。細胞は、これらの抗体で予め被覆され得、次いで、液滴／細胞特異的バーコードアダプターと共に、より大きい液滴に捕捉され得る。ライブラリー調製が、本明細書中に記載されるように結果として起こり得、液滴の内容物が配列を決定され得、どの読取りがどの細胞に由来するかが、バーコードによって推察され得る。従って、この技術は、細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを配列決定することに加えて、それらのタンパク質に関する情報を得ることを可能にする。いくつかの実施形態では、同じ情報のいくつかは、ＦＡＣＳを介して捕捉され得る。
【０１６１】
抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにかかる抗体の抗原結合断片が含まれ得る。抗体、またはかかる抗体の抗原結合断片は、少なくとも約１×１０５Ｍ−１の、ポリペプチド部分またはそのペプチド部分に対する特異的結合活性を有することを特徴とし得る。ポリペプチドに対する特異的結合活性を保持する、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片などが使用され得る。ポリペプチドに対する抗体の特異的結合活性は、例えば、特定のポリペプチドに対する抗体の結合活性を、特定のポリペプチドではない対照ポリペプチドに対する抗体の結合活性に対して比較することによって、当業者により容易に決定され得る。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製する方法は、当業者に周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）を参照のこと）。
【０１６２】
抗体には、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体が含まれ得、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合断片が含まれる。かかる天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得るか、組換え産生され得るか、または例えば、Ｈｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年））に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって取得され得る。機能的抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １４巻：２４３〜２４６頁（１９９３年）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８年）；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２年）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５年））。
【０１６３】
試料
本明細書中に提供される方法、組成物およびキットを使用して分析される試料は、核酸を含む非細胞実体（例えば、ウイルス）または細胞ベースの生物（例えば、古細菌、細菌または真核生物の（ｅｕｋａｒｙａ）領域のメンバー）に由来し得る。上記試料は、いくつかの場合には、病院、実験室、臨床実験室または医学実験室から取得され得る。試料は、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。上記試料は、無細胞核酸を含み得る。いくつかの場合には、上記試料は、ドアまたはベンチ上部などの表面のスワブから取得される。
【０１６４】
上記試料は、被験体、例えば、植物、真菌、真正細菌、古細菌（ａｒｃｈｅａｂａｃｔｅｒｉａ）、原生生物（ｐｒｏｔｅｓｔ）または動物由来であり得る。上記被験体は、単細胞生物または多細胞生物のいずれかの生物であり得る。上記被験体は、とりわけ、初代細胞または樹立された細胞系由来の細胞であり得る、培養細胞であり得る。上記試料は、任意の適切な形態で多細胞生物から最初に単離されたものであり得る。上記動物は、魚、例えばゼブラフィッシュであり得る。上記動物は、鳥、例えばニワトリであり得る。上記動物は哺乳動物であり得る。上記哺乳動物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラットまたはブタであり得る。上記哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒト、チンパンジー、オランウータンまたはゴリラであり得る。上記ヒトは、男性または女性であり得る。上記試料は、ヒト胚またはヒト胎児由来であり得る。いくつかの実施形態では、上記ヒトは、乳幼児、小児、ティーンエイジャー、成人または高齢者であり得る。上記女性は、妊娠中であり得るか、妊娠の疑いがあり得るか、妊娠する予定があり得る。いくつかの実施形態では、上記試料は植物由来である。いくつかの実施形態では、上記試料は、１つまたは複数のウイルスを含む。
【０１６５】
上記試料は、健康な被験体（例えばヒト被験体）由来であり得る。いくつかの実施形態では、上記試料は、妊娠の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６週目の被験体（例えば、妊婦）から採取される。いくつかの実施形態では、上記被験体は、遺伝性疾患に罹患している、遺伝性疾患のキャリアである、または遺伝性疾患を発症もしくは伝える危険性があり、ここで、遺伝性疾患は、変異、挿入、付加、欠失、転座、点変異、三塩基反復障害および／または一塩基多型（ＳＮＰ）などの遺伝子バリエーションと連鎖し得る任意の疾患である。
【０１６６】
上記試料は、特定の疾患、障害もしくは状態を有するか、または特定の疾患、障害もしくは状態を有すると疑われる（または特定の疾患、障害もしくは状態を有する危険性のある）被験体由来であり得る。例えば、上記試料は、がん患者、がんを有することが疑われる患者、またはがんを有する危険性がある患者に由来し得る。上記がんは、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、カポジ肉腫、肛門がん、基底細胞癌腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、頭蓋咽頭腫、脳室上衣芽細胞腫、脳室上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫（ｍｅｄｕｌｌｏｅｐｔｉｔｈｅｌｉｏｍａ）、松果体実質腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚部がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、上皮内腺管癌、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼がん、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、口唇がん、口腔（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）がん、肺がん、非小細胞癌腫、小細胞癌腫、黒色腫、口腔（ｍｏｕｔｈ）がん、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、髄芽腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、神経芽腫、鼻咽頭がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、非黒色腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症またはウィルムス腫瘍であり得る。上記試料は、がん患者由来のがん組織および／または正常組織由来であり得る。
【０１６７】
上記試料は、遺伝性の疾患、障害または状態を有することが既知の被験体由来であり得る。いくつかの場合には、上記被験体は、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、ベータグロビン、血色素症（ｈｅｍａｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、ベータアミロイドまたはピルビン酸キナーゼ遺伝子などの遺伝子または遺伝子の一部について、野生型または変異体であることが既知である。いくつかの場合には、上記被験体の状態は、既知または未知のいずれかであり、該被験体は、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、ベータグロビン、血色素症、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、ベータアミロイドまたはピルビン酸キナーゼ遺伝子などの遺伝子の変異または遺伝子バリエーションの存在について試験される。
【０１６８】
他の実施形態では、上記試料は、出産可能年齢の女性患者から採取され、いくつかの場合には、この女性患者は、妊娠していない、または妊娠状態が未知である。なお他の場合には、上記被験体は、男性患者、男性の妊婦の夫、または特定の遺伝子異常の危険性がある、特定の遺伝子異常を有すると診断された、もしくは特定の遺伝子異常を有する男性患者である。いくつかの場合には、上記女性患者は、遺伝性疾患もしくは遺伝子バリエーションに罹患していることが既知であるか、または遺伝性疾患もしくは遺伝子バリエーションのキャリアであるか、または特定の遺伝子異常の危険性がある、特定の遺伝子異常を有すると診断された、もしくは特定の遺伝子異常を有する。いくつかの場合には、遺伝性疾患または遺伝子バリエーションに関する上記女性患者の状態は、既知でない場合がある。さらなる実施形態では、上記試料は、遺伝子配列のコピー数変動に関して既知または未知の状態の、任意の小児または成人の患者から採取される。いくつかの場合には、上記小児または成人の患者は、遺伝性疾患もしくは遺伝子バリエーションに罹患していること、または遺伝性疾患もしくは遺伝子バリエーションのキャリアであることが既知である。
【０１６９】
上記試料は、眼房水、硝子体液、胆汁、全血、血清、血漿、母乳、脳脊髄液、耳垢、内リンパ（ｅｎｏｌｙｍｐｈ）、外リンパ、胃液、粘液、腹水、唾液、皮脂、精液、汗（ｓｗｅａｔ）、汗（ｐｅｒｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、涙、膣分泌物、嘔吐物、糞便または尿であり得る。上記試料は、病院、実験室、臨床実験室または医学実験室から取得され得る。上記試料は被験体から採取され得る。上記試料は核酸を含み得る。上記核酸は、例えば、ミトコンドリアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。上記試料は無細胞核酸を含み得る。上記試料は、細胞系、ゲノムＤＮＡ、無細胞血漿、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料または急速冷凍試料であり得る。ホルマリン固定パラフィン包埋試料は、核酸を抽出する前に脱パラフィン化され得る。上記試料は、臓器、例えば、心臓、皮膚、肝臓、肺、乳房、胃、膵臓、膀胱、結腸、胆嚢、脳などに由来し得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、上記試料は、環境試料、例えば、空気、水、農業試料または土壌である。
【０１７１】
上記核酸がＲＮＡである場合、該ＲＮＡの供給源は、本明細書中に記載される任意の供給源であり得る。例えば、上記ＲＮＡは、無細胞ｍＲＮＡであり得、組織生検、コア生検、細針吸引、急速凍結またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料由来であり得る。上記ＦＦＰＥ試料は、上記ＲＮＡを抽出する前に脱パラフィン化され得る。抽出された上記ＲＮＡは、分析前に、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃まで、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃超まで、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃未満まで、または少なくとも約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９℃まで加熱され得る。抽出された上記ＲＮＡは、約１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間もしくは１０時間にわたり、または少なくとも約１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間もしくは１０時間にわたり、これらの温度のいずれかに加熱され得る。
【０１７２】
ＲＮＡは、種々の下流の適用のために使用され得る。例えば、上記ＲＮＡは、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換され得、該ｃＤＮＡは、ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＰＣＲに必要に応じて供され得る。上記ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、等温増幅反応、例えば、等温線形増幅反応で使用され得る。上記ＲＮＡ、得られたｃＤＮＡまたはそれらから増幅された分子は、マイクロアレイ実験、遺伝子発現実験、ノーザン分析、サザン分析、配列決定反応、次世代配列決定反応などで使用され得る。特定のＲＮＡ配列が分析され得るか、またはＲＮＡ配列が全体的に分析され得る。
【０１７３】
核酸は、当業者に利用可能な手段によって試料から抽出され得る。
【０１７４】
上記試料は、増幅能があるようにするために処理され得る。例示的な試料処理には、該試料の細胞を溶解して核酸を放出すること、該試料を精製すること（例えば、増幅を阻害し得る他の試料成分から核酸を単離すること）、該試料を希釈／濃縮すること、および／あるいは該試料を、増幅のための試薬、例えば、とりわけＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰＣＲ増幅のための熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（および／またはｄＵＴＰ））、増幅される各対立遺伝子配列もしくは多型遺伝子座に対するプライマーセット、増幅される各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ（例えば、とりわけＴＡＱＭＡＮプローブもしくは分子ビーコンプローブなどの蛍光プローブ）、Ｍｇ２＋、ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、バッファまたはそれらの任意の組合せと組み合わせることが含まれ得る。いくつかの例では、上記試料は、制限酵素、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、逆転写酵素または任意の他の核酸処理酵素と組み合わせることができる。
【０１７５】
コンピューター
コンピューターが、データを保存および処理するために使用され得る。コンピューターに実行可能なロジックが、バーコード配列によって配列読取りを群分けするかかる機能を実行するために使用され得る。コンピューターは、分子プロファイリングからの診断結果を表示、保存、検索もしくは計算するために；ゲノムもしくは核酸発現分析からの生データを表示、保存、検索もしくは計算するために；または本明細書中に記載される方法において有用な任意の試料もしくは患者の情報を表示、保存、検索もしくは計算するために、有用であり得る。本明細書中に記載される方法を実施するためのコンピューター読取り可能な命令を含むシステムが、本明細書中で提供される。コンピューターによって実行される場合に本明細書中に記載される方法をコンピューターに実施させる命令を含む、コンピューター読取り可能な媒体が、本明細書中で提供される。
【０１７６】
キット
本明細書中に記載される方法を実施するためのキットが、本明細書中で提供される。上記キットは、１つまたは複数の制限酵素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、バッファ、塩、金属イオン、還元剤、ＢＳＡ、スペルミン、スペルミジン、グリセロール、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブまたは標識（例えば、蛍光標識）を含み得る。上記キットは、１つまたは複数のセットの指示を含み得る。
【０１７７】
濃度が異なる標的のダイナミックレンジを整列させる（ａｌｉｇｎ）ためおよび参照遺伝子の生物学的バリエーションを取り除くための多重化
コピー数変動（ＣＮＶ）を推定するための方法もまた、本明細書中で提供される。１つまたは複数の標的配列のコピー数変動は、多数の疾患および障害において役割を果たし得る。標的配列のコピー数変動を分析する１つの方法は、デジタル分析、例えば、デジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲを介した方法である。しかし、標的配列のコピー数のデジタル分析は、標的核酸配列の複数のコピーが試料中の同じポリヌクレオチド上に存在する場合、試料中の標的核酸配列のコピー数を過小評価し得る。例えば、複数のコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）（例えば、区画（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）、空間的に隔離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）領域）を有するデジタルＰＣＲアッセイでは、試料中の核酸は、それぞれのコンパートメントが平均して約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドを受け取るように、区画化され得る。各区画は、平均して、１区画（例えば、液滴）当たり５、４、３、２もしくは１コピー未満の標的核酸を有し得る。いくつかの場合には、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）が、ゼロコピーの標的核酸を有する。ポリヌクレオチドを含むコンパートメントの数が数えられ得る。しかし、２コピーの標的核酸配列が単一ポリヌクレオチド上に存在する場合、そのポリヌクレオチドを含むコンパートメントは、標的配列を１つだけ有するとカウントされ得る。
【０１７８】
ＣＮＶを分析する方法は、例えば、２０１２年２月９日出願の米国特許出願第１３／３８５，２７７号中に開示されている。例えば、標的核酸配列を物理的に分離するための方法が使用され得る。しばしば、この方法は、単一ポリヌクレオチド上の複数のコピーの標的配列の存在に起因して該標的配列のコピー数を過小評価することを回避し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の試料が取得され；この第１の試料は、例えば、ゲノムＤＮＡ試料であり得る。上記第１の試料中の上記標的核酸配列は、（例えば、該第１の試料を１つまたは複数の制限酵素と接触させることによって）物理的に分離され得る。この第１の試料は、複数の区画中に分離され得る。上記標的配列を有する区画の数が数えられ得る。次いで、上記標的のコピー数が推定され得る。
【０１７９】
上記標的核酸は同一であり得るか、または他の場合には、該標的核酸は異なり得る。いくつかの場合には、上記標的核酸は、同じ遺伝子内に位置している。いくつかの場合には、上記標的核酸は、遺伝子の異なるコピー（同一またはほぼ同一のコピー）中にそれぞれ位置している。なお他の場合では、上記標的配列は、イントロン内または遺伝子間領域中に位置している。時々、１つの標的配列が１つの遺伝子中に位置し、第２の標的配列が、その遺伝子の外側に位置している。いくつかの場合には、標的配列はエクソン内に位置している。
【０１８０】
試料内の異なる標的は、しばしば異なるコピー数で存在し得る。かかる場合、より低いコピー数レベルで存在する標的が、上記標的配列を有する異なる遺伝子座または領域をそれぞれ認識する複数のプローブで探索され得る。例えば、標的Ａは、コピー数３で存在し得、一方で標的Ｂは、コピー数１で存在する。かかる場合、標的Ｂは、３つのプライマー／プローブ対で探索されて、Ｂ陽性液滴の数を増加させ得る、または標的Ｂを含む液滴からのシグナルを増大させ得る。上記プローブは、標的Ｂ内の異なる領域に指向され得る。しばしば、標的Ｂを標的化するプローブは、同じ標識で標識されるが、いくつかの場合には、異なる標識が使用され得る。従って、かかる方法は、異なるコピー数を有する標的のダイナミックレンジの整列を可能にする。標的Ｂは、異なる標的であり得るか、または本明細書中にさらに記載されるような参照試料であり得る。従って、かかる方法は、参照試料との標的のダイナミックレンジの整列もまた可能にし得る。
【０１８１】
いくつかの場合には、ゲノムは１つの標的配列を含む。いくつかの場合には、ゲノムは２つ以上の標的配列を含む。ゲノムが２つ以上の標的配列を含む場合、これらの標的配列は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一または約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％を上回って同一であり得る。
【０１８２】
２つの標的配列を分離することは、核酸配列上の特定の部位を切断することによって上記標的配列を分離することを含み得る。いくつかの場合には、その標的核酸配列を分離することは、上記第１の試料を１つまたは複数の制限酵素と接触させることを含み得る。上記標的核酸配列を分離することは、該標的核酸配列間に位置する部位でポリヌクレオチドを消化することを含み得る。いくつかの場合には、上記標的核酸配列は、それぞれ１つの遺伝子内に位置している。いくつかの場合には、消化のために標的化される部位は、その２つの遺伝子間に位置している。いくつかの場合には、消化のために選択される部位は、１つの遺伝子中に位置し、いくつかの場合には、この遺伝子は、上記標的配列を含む遺伝子と同じ遺伝子である。他の場合では、消化のために選択される部位は、上記標的配列の遺伝子とは異なる遺伝子中に位置している。いくつかの場合には、標的配列および消化のために標的化される部位は、同じ遺伝子中に位置し、この標的配列は、消化のために標的化される部位の上流に位置している。他の場合には、標的配列および消化のために標的化される部位は、同じ遺伝子中に位置するが、この標的配列は、消化のために標的化される部位の下流に位置している。いくつかの場合には、標的核酸は、１つまたは複数の制限酵素による核酸試料の処理によって分離され得る。いくつかの場合には、標的核酸はせん断によって分離され得る。いくつかの場合には、標的核酸は、音波処理によって分離され得る。
【０１８３】
分離ステップ（例えば、１つまたは複数の制限酵素による消化）の後に、上記試料は、複数の（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）区画へと区画化され得る。複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）の区画のそれぞれは、約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合には、各区画は、平均して、１区画（例えば、液滴）当たり５、４、３、２もしくは１コピー未満の標的核酸を有し得る。いくつかの場合には、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の液滴が、ゼロコピーの標的核酸を有する。
【０１８４】
しばしば、標的核酸は、上記区画中で増幅される。いくつかの場合には、その増幅は、１つまたは複数のＴａｑＭａｎプローブの使用を含む。
【０１８５】
別の実施形態では、この方法はさらに、参照核酸配列を含む区画の数を数えるステップを含む。参照核酸配列は、１ゲノム当たりある特定の数のコピーで存在することが既知であり得、試料中の標的核酸配列のゲノムコピー数を推定するために使用され得る。コピー数を推定することは、上記標的配列を含む区画の数を、上記参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含み得る。別の場合には、ＣＮＶ推定は、参照配列に対する標的核酸配列の濃度の比によって決定される。
【０１８６】
別の実施形態では、この方法はさらに、第２の試料を分析するステップを含み、ここで、該第２の試料および第１の試料は、同じ試料由来である（例えば、核酸試料は、該第１の試料および該第２の試料に分割される）。この方法はさらに、上記第２の試料を１つまたは複数の制限酵素と接触させないことを含み得る。いくつかの場合には、この方法はさらに、上記第２の試料を複数の区画へと分離することを含む。この方法はさらに、上記標的配列を含む上記第２の試料の区画の数を数えることを含み得る。別の実施形態では、この方法はさらに、参照配列を含む第２の試料の区画の数を数えることを含む。別の実施形態では、この方法は、上記第２の試料中の上記標的配列のコピー数を推定することを含む。別の実施形態では、上記第２の試料中の上記標的配列のコピー数を推定することは、該標的配列を有する該第２の試料由来の区画の数と上記参照配列を有する上記第２の試料由来の区画の数とを比較することを含む。
【０１８７】
上記第１の試料由来の上記標的配列のコピー数と上記第２の試料中の上記標的配列のコピー数とは、該第２の試料中の該標的配列のコピー数が過小評価されたかどうかを決定するために比較され得る。上記コピー数が過小評価された程度は、調査されたコピーが全て１つの染色体上に存在したかどうか、または少なくとも１つのコピーが１つの相同染色体上に存在し、少なくとも１つのコピーが他の相同染色体上に存在したかどうかを、示し得る。二倍体ゲノム当たり１つにより近い値は、第１の場合を示し得、２つにより近い値は、第２の場合を示し得る。
【０１８８】
増幅によりコピー数の差異を決定するさらなる方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１００２０３５３８号中に記載されている。コピー数変動を決定するための方法は、米国特許第６，１８０，３４９号およびＴａｙｌｏｒら（２００８年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３巻（９号）：ｅ３１７９頁に記載されている。
【０１８９】
本明細書中に記載されるコピー数変動は、核酸配列の喪失または獲得を含み得る。コピー数変動は、遺伝され得るか、またはデノボ変異によって引き起こされ得る。ＣＮＶは、１つまたは複数の異なるクラスで存在し得る。例えば、Ｒｅｄｏｎら（２００６年）Ｇｌｏｂａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４４巻、４４４〜４５４頁を参照のこと。ＣＮＶは、単純なデノボ欠失から、単純なデノボ重複から、または欠失および重複の両方から生じ得る。ＣＮＶは、多対立遺伝子バリアントの組合せから生じ得る。ＣＮＶは、デノボ獲得を有する複雑なＣＮＶであり得る。ＣＮＶは、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の隣接遺伝子、または約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０より多い隣接遺伝子を含み得る。ＣＮＶは、約１〜約１０、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、約１〜約２、約０〜約１０、約０〜約５または約０〜約２の隣接遺伝子を含み得る。コピー数変動は、約１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、５，０００，０００もしくは１０，０００，０００個の塩基対の、または約１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、５，０００，０００もしくは１０，０００，０００個超の塩基対の獲得または喪失を含み得る。いくつかの場合には、コピー数変動は、約１，０００〜約１０，０００，０００個、約１０，０００〜約１０，０００，０００個、約１００，０００〜約１０，０００，０００個、約１，０００〜約１００，０００個または約１，０００〜約１０，０００個の塩基対の核酸配列の獲得または喪失を含み得る。コピー数変動は、核酸配列の欠失、挿入または重複であり得る。いくつかの場合には、コピー数変動は、タンデム重複であり得る。
【０１９０】
別の実施形態では、ＣＮＶハプロタイプは、区画化された試料のリアルタイムＰＣＲまたはｄｄＰＣＲによって生成された蛍光シグナルから推定され得る。リアルタイムＰＣＲまたはｄｄＰＣＲ実験の後期段階の前に試薬が限定的になり得る場合、より高いコピー数の標的配列を有する区画は、より低いコピー数の上記標的配列を有する区画よりも高いシグナルを有し得る。一実施形態では、試料（例えば、連鎖実験に使用される試料のサブ試料）が区画化され得、ＰＣＲが該区画（例えば、液滴）に対して実施され得る。上記区画の平均蛍光強度が、その区画が標的および／または参照核酸配列について指数関数的増幅を受ける際に決定され得る。上記平均強度は、上記標的の出発コピー数に対応し得る。複数の標的が単一のポリヌクレオチド鎖と連鎖する場合、この鎖を捕捉する区画（例えば、液滴）における上記強度は、単一コピーのみの標的を有する鎖を捕捉する区画（例えば、液滴）の強度よりも高い場合がある。より高い平均振幅を有する陽性液滴の過剰な存在は、複数のＣＮＶコピーを有するハプロタイプの存在を示唆し得る。逆に、低い平均振幅のみを有する陽性液滴の存在は、単一のＣＮＶコピーを有するハプロタイプだけが試料中に存在することを示唆し得る。別の実施形態では、ＣＮＶを推定するために使用されるサイクルの数は、上記区画のサイズおよび該区画中の試薬の量に基づいて最適化され得る。例えば、より低い量の試薬を有するより小さい区画は、より高い量の試薬を有すると予測されるより大きい区画よりも、少ない増幅サイクルを必要とし得る。
【０１９１】
この方法は、ポリヌクレオチド上で互いに近い、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、５、２、１、０．７、０．５、０．３、０．２、０．１、０．０５もしくは０．０１メガ塩基未満離れた標的コピーさえも、または該ポリヌクレオチド上で互いに非常に近い、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１キロ塩基未満離れた標的コピーさえも分析するために使用され得るので、有用であり得る。いくつかの場合には、この方法は、上記ポリヌクレオチド上で互いに非常に近接した、例えば、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは９５０塩基対（ｂｐ）以内離れた標的コピーを分析するのに有用である。いくつかの場合には、この方法は、ゼロ（０）塩基対離れた標的コピーを分析するのに有用である。いくつかの場合には、この方法は、同一の標的、ほぼ同一の標的および完全に異なる標的に適用され得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ゲノムにおける標的のコピー数は、一倍体ゲノムまたは二倍体ゲノム当たり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００コピー、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００コピー超、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００コピー未満、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００コピーである。いくつかの実施形態では、標的のコピー数は、一倍体ゲノムまたは二倍体ゲノム当たり、約２〜約５、約２〜約１０、約２〜約２０、約２〜約３０、約２〜約４０、約２〜約５０、約２〜約１００、約５〜約１０、約５〜約２５、約５〜約５０、約５〜約１００、約１０〜約２０、約１０〜約５０、約１０〜約１００、約２５〜約５０、約２５〜約７５、約２５〜約１００、約１００〜約２００、約１００〜約５００、約１００〜約１０００、約５００〜約１０００、約１０００〜約５０００、約１０００〜約１０，０００、約１０，０００〜約２０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約１０，０００〜約１００，０００または約５０，０００〜約１００，０００である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＣＮＶは、標的に対する１つの蛍光色素および参照に対するもう１つの蛍光色素を有するプローブを使用して、単一反応で該標的および該参照の量を測定することによって分析され得る。いくつかの実施形態では、例えば上記標的のコピー数が高い場合、該標的の濃度（または量）は、上記参照の濃度（または量）よりも高い場合がある。その場合、デジタルＰＣＲのダイナミックレンジは限定され得るので、単一のデジタル反応（例えば、デジタルＰＣＲ）において上記標的および上記参照の両方を測定することは、困難であり得る。例えば、標的は、ゲノム中に１０，０００コピーで存在し得るが、参照は、ゲノム当たり２コピーだけで存在し得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、それぞれ同じ蛍光色素を有するプローブを使用して検出可能である、上記参照についてのいくつかの異なる標的が、多重化され得る（例えば、図２を参照のこと）。しばしば、これらの異なる参照標的は、同じ参照ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）内の異なる領域または遺伝子座を示すが、いくつかの場合には、異なる参照ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）が使用され得る。複数の参照の使用は、上記参照のカウントを上昇させ得、該参照のカウントを上記標的のカウントにより近いものにし得る。いくつかの実施形態では、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００の、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００超の、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００の、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００未満の異なる参照が使用される。いくつかの実施形態では、約２〜約５、約２〜約１０、約２〜約２０、約２〜約３０、約２〜約４０、約２〜約５０、約２〜約１００、約５〜約１０、約５〜約２５、約５〜約５０、約５〜約１００、約１０〜約２０、約１０〜約５０、約１０〜約１００、約２５〜約５０、約２５〜約７５、約２５〜約１００、約１００〜約２００、約１００〜約５００、約１００〜約１０００、約５００〜約１０００、約１０００〜約５０００、約１０００〜約１０，０００、約１０，０００〜約２０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約１０，０００〜約１００，０００または約５０，０００〜約１００，０００の異なる参照が使用される。上記参照は、本明細書中に記載される任意の参照配列であり得る。一般に、上記参照は、上記標的配列とは異なるコピー数で存在し得る。例えば、上記標的は、上記参照の数（ｔｈｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｎｕｍｂｅｒ）のコピー数の、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７００倍の、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７００倍超の、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７００倍未満の、または少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７００倍のコピー数を有し得る。他の場合には、上記標的のコピー数は上記参照のコピー数と等しい。なお他の場合には、上記参照は、上記標的配列の��ピー数の、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍もしくは１００倍の、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍もしくは１００倍超の、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍もしくは１００倍未満の、または少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍もしくは１００倍のコピー数を有する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、上記参照のそれぞれにアニーリングするプローブは、同じ標識、例えば、蛍光色素を含み得る。多重化される標的の数に依存して、ユニバーサルプローブ、ＬＮＡプローブまたはライゲーションアプローチを使用し得る。本明細書中に記載される任意の型のプローブが、参照を多重化するために使用され得る。
【０１９６】
本明細書中に記載される方法は、単一反応で数種の遺伝子発現標的を測定するために使用され得る。最も低く発現される遺伝子を標的化し、測定されたカウントを、より高く発現された遺伝子（複数可）のカウントに近づけるために、数種のアッセイが設計され得る。
【０１９７】
例えばｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換することによって、同じ遺伝子上の２つ以上の異なる標的の発現の存在量が調べられている場合、所与の遺伝子上の異なる標的が異なる区画（例えば、液滴）で終わることを確実にするために、該ｃＤＮＡに対する制限消化が実施され得る。本明細書中に記載される核酸を断片化する他の方法が、上記標的を分離するために使用され得る。
【０１９８】
本明細書中に記載される方法は、単一の反応でウイルス負荷レベルを測定するためにも適用され得る。ウイルス負荷は、体液中のウイルスの量を推定することによって測定され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス負荷の決定は、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲまたは核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ））を含み得る。例えば、ＰＣＲは、組み込まれたＤＮＡ（例えば、細胞の染色体中に組み込まれたＤＮＡ）を定量化するために使用され得る。逆転写ＰＣＲは、ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換することによって、該ウイルスＲＮＡを定量化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＮＡＳＢＡは、ウイルスＲＮＡをＤＮＡに変換するために使用され、このＤＮＡは、ＲＮＡへと転写され得る。ＮＡＳＢＡは、プライマーをＲＮＡ鋳型の３’末端にアニーリングさせること、該ＲＮＡ鋳型を逆転写すること、該ＲＮＡ鋳型をＲＮＡｓｅＨで分解すること、プライマーを該ＤＮＡ鎖の５’末端にアニーリングさせること、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して相補的ＲＮＡ鎖を生成することを含み得る。上記相補的ＲＮＡ鎖は、その反応サイクルにおいて再使用され得る。いくつかの実施形態では、試料中のウイルス核酸および参照核酸の量が、上記ウイルス負荷を決定するために使用される方法のダイナミックレンジ内に入るように、複数の参照が使用される。いくつかの実施形態では、上記異なる参照を検出するために使用されるプローブは、同じ標識を使用する。いくつかの実施形態では、上記参照を検出するために使用されるプローブは、異なる標識を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、多重化することは、参照のコピー数が個体毎に変動する場合の、生物学的バリエーションを一定にするためにも有用であり得る。複数の標的および／または参照配列にわたって平均することによって、上記バリエーションの影響が低下され得る。コピー数の変更を測定するために使用される方法を含むこの方法は、例えば診断試験のために使用され得る。
【０２００】
いくつかの実施形態では、二倍体ゲノム当たり２コピーで存在する参照配列、例えば、ハウスキーピング遺伝子（例えば、基本的な細胞機能の維持に必要な遺伝子）が使用され得る。上記標的の濃度または量を上記参照の濃度または量で除算することにより、ゲノム当たりの標的コピー数の推定値が得られ得る。
【０２０１】
本明細書中に記載される方法において参照として使用され得るハウスキーピング遺伝子には、転写因子、転写リプレッサー、ＲＮＡスプライシング遺伝子、翻訳因子、ｔＲＮＡシンテターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質、リボソームタンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質プロセシングタンパク質、熱ショックタンパク質、ヒストン、細胞周期調節因子、アポトーシス調節因子、がん遺伝子、ＤＮＡ修復／複製遺伝子、炭水化物代謝調節因子、クエン酸回路調節因子、脂質代謝調節因子、アミノ酸代謝調節因子、ヌクレオチド合成調節因子、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ミトコンドリアタンパク質、リソソームタンパク質、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍａｌ）タンパク質、リボヌクレアーゼ、オキシダーゼ／レダクターゼ、細胞骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、チャネルまたはトランスポーター、受容体、キナーゼ、増殖因子、組織壊死因子などをコードする遺伝子が挙げられ得る。記載される方法において使用され得るハウスキーピング遺伝子の具体例には、例えば、ＨＳＰ９０、ベータ−アクチン、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＡＴＦ４、ＲＰＰ３０およびＲＰＬ３が挙げられる。
【０２０２】
単一コピーの参照核酸（例えば、遺伝子）が、コピー数変動を決定するために使用され得る。多コピーの参照核酸（例えば、遺伝子）は、コピー数を決定してダイナミックレンジを拡張するために使用され得る。例えば、その多コピーの参照遺伝子は、ゲノム中に、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００コピー、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００コピー超を含み得る。
【０２０３】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして、本明細書中で表され得る。かかる範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表される場合、先行詞「約」の使用により、上記特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。上記範囲の各々の端点が、他の端点に関連して、かつ他の端点とは独立して、有意であることがさらに理解される。用語「約」は、本明細書中で使用する場合、特定の用途の関連で、述べられた数値から１５％プラスまたはマイナスである範囲を指す。例えば、約１０は、８．５〜１１．５の範囲を含む。
【実施例】
【０２０４】
（実施例１）
１０００ゲノム当量（約６ｎｇのＤＮＡ）を、１００Ｘの深度で配列決定し得る。１０００ゲノム当量から、２，０００コピーのあらゆる（正常コピー数の）標的が存在し得る。あらゆる遺伝子座について、大部分の断片が別個の区画で終わるように、ステップが取られ得る。上記２，０００の断片の殆どが、独自のバーコードでタグを付けられることを確実にするためのステップもまた取られ得る。
【０２０５】
その第１の目的は、区画の数を増加させることによって達成され得る。例えば、１００，０００の区画では、異なる染色体由来の特定の遺伝子座において、断片の約０．５％だけが、同じ区画で終わると予測される。かかる場合の多くは、同じバーコードを有するヘテロ接合性ＳＮＰからの区別できる対立遺伝子の出現によって、ならびにバーコードによる遺伝子座のカバレッジの増大によって、容易に同定されることに留意のこと。
【０２０６】
区別できるバーコードで殆どの断片がタグを付けられることを確実にするために、多数の異なるバーコードが使用され得、任意の所与の区画に少数の（好ましくは１つの）バーコード含有液滴が提供されるようにバーコードを分布させるアプローチが、使用され得る。上記分布は、ある区画がバーコードを受け取らず、ある区画が１つのバーコードを受け取り、ある区画が複数のバーコードを受け取るように、ランダムであり得る。従って、１００，０００の区画について、１００，０００のバーコード化液滴が供給され得る。この場合、上記区画の３７％がアダプターを受け取らず、従って、配列決定には利用可能でないことが理解される。バーコード化液滴の数は、試料の保存が目的である場合には増加され得る。上記区画の３７％が単一のバーコードでバーコード化され得、最大で２５％までの区画が、潜在的に異なるバーコードでコードされ得る。上記の場合、７４０の断片が配列決定には利用可能でなく、７４０がそれら自身のバーコードで隔離され、５００が複数のバーコードで隔離される。特定の断片と関連する区画中の７４０＊１＋３６０＊２＋…＝２，０００バーコードの理想的には全てが、独自である。１０，０００の異なるバーコード型が存在する場合、上記断片の８０％超が、独自にタグを付けられる。
【０２０７】
ゲノム当量の数がより低い場合、より少ない区画およびバーコードが使用され得る。
【０２０８】
任意の所与のゲノム位置由来の小さいサブセットのＳＮＰのみが相特定情報を得るために捕捉され得るので、この適用には必ずしも完成の必要がないことに留意のこと。断片のかなりの部分が情報を与えない場合、受容可能であり得る。
【０２０９】
各区画が制御された様式でバーコードを供給される場合、試料処理のより高い効率を達成し得る。例えば、試料含有区画およびバーコード含有区画は、ＲＡＩＮＤＡＮＣＥ（商標）（ＲＡＩＮＳＴＯＲＭ（商標））からの液滴合体技術を使用して合体され得る。液滴合体は、ＦＬＵＩＤＩＧＭのアレイ設計と類似したマイクロ流体回路を使用して実施され得る。所与の区画が正確に１つのＡＤＦを受け取ることが保証され得る場合、より少ないＡＤＦおよびより少ないＡＤＦ型が使用され得る。
【０２１０】
マイクロ流体チップは、区画化と類似の様式で使用され得る。試料区画には、上記のように、チャネルの２次元配置を介して、それら自身のバーコードが供給され得る。多数の独自のバーコードは、垂直バーコードおよび水平バーコードを組み合わせることによって、容易に供給され得る。
【０２１１】
本明細書中に記載される方法、組成物、システムおよびキットの好ましい実施形態を本明細書中に示し記載してきたが、かかる実施形態が例示として提供されているに過ぎないことは、当業者に明らかである。当業者は、多数のバリエーション、変化および置換を、本明細書中に記載される方法、組成物、システムおよびキットから逸脱することなしに想到する。本明細書中に記載される方法、組成物、システムおよびキットの実施形態に関する種々の代替が、その方法、組成物、システムおよびキットを実施する際に使用され得ることを、理解すべきである。以下の特許請求の範囲が、これらの特許請求の範囲およびそれらによってカバーされる等価物の範囲内の方法、組成物、システムおよびキットの範囲を規定するものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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