(57)【要約】本発明は、一般に、核酸分子（ＲＮＡ分子など）を送達させるために使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は油コアおよびカチオン性脂質を含む。エマルジョン粒子は約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径を有し、エマルジョンは少なくとも１．１：１のＮ／Ｐ比を有する。被験体に免疫応答を生じさせる方法であって、有効量の本発明の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを該被験体に投与するステップを含む、方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
油コアおよびカチオン性脂質を含むエマルジョン粒子ならびに該エマルジョン粒子と複合体形成される核酸分子を含む免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンであって、該エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、該エマルジョンのＮ／Ｐが少なくとも４：１であり、但し、該核酸分子が分泌型アルカリホスファターゼをコードしないことを条件とし、但し、該核酸分子がプラスミドＡ３１７によってコードされるＲＮＡではなく、該プラスミドＡ３１７の配列が米国特許出願第６１／３６１，８９２号の図７Ａに示されていることをさらに条件とする、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２】
前記核酸分子が抗原をコードする、請求項１に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項３】
前記核酸分子がＲＮＡである、請求項１または２に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項４】
前記ＲＮＡが自己複製ＲＮＡである、請求項３に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項５】
前記免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンが緩衝化されており、約６．０〜約８．０のｐＨを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項６】
前記免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンが、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるバッファーを含む、請求項５に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項７】
前記バッファーがクエン酸バッファーであり、前記ｐＨが約６．５である、請求項５または６に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項８】
無機塩をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項９】
前記無機塩の濃度が３０ｍＭ以下である、請求項８に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１０】
非イオン性張度調整剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１１】
前記非イオン性張度調整剤が糖、糖アルコール、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１２】
前記非イオン性張度調整剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、デキストロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１３】
水相中にポリマーをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１４】
前記ポリマーがポロキサマーである、請求項１３に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１５】
前記ポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７である、請求項１３または１４に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１６】
前記エマルジョンが約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１７】
前記エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１８】
前記エマルジョンのＮ／Ｐが４：１〜約２０：１である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項１９】
前記エマルジョンのＮ／Ｐが４：１〜約１５：１である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２０】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが等張性である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２１】
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、スクアラン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される油を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２２】
前記油がスクアレンである、請求項２１に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２３】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２４】
前記カチオン性脂質が４級アミンを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２５】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項２３に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２６】
前記粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２７】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項２６に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２８】
前記界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）、またはそれらの組み合わせである、請求項２７に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項２９】
前記エマルジョンが抗酸化剤をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョン。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンの作製方法であって、
（ｉ）油コアおよびカチオン性脂質を含むエマルジョン粒子を含むカチオン性水中油型エマルジョン、ならびに（ｉｉ）核酸を含む水性溶液を提供するステップと、
（ｉ）と（ｉｉ）とを合わせ、それにより、前記免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを作製するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
被験体に免疫応答を生じさせる方法であって、有効量の請求項１〜２９のいずれか１項に記載の免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年７月６日に出願された米国仮出願第６１／５０５，０９１号および２０１２年１月１１日に出願された米国仮出願第６１／５８５，６３９号の利益を主張し、上記特許出願の全内容は本明細書に参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含み、当該配列表はＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳ−Ｗｅｂによって提出し、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩのコピー（２０１２年７月５日に作成）のファイル名はＰＡＴ０５４７１９．ｔｘｔであり、３２，４２１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
核酸治療剤は、遺伝性障害から後天性状態の範囲の疾患、例えば、がん、感染性障害（ＡＩＤＳ）、心疾患、関節炎、および神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）などの処置に関して有望である。遺伝的欠損を修復するか、または外来遺伝子産物の発現を誘導するために機能遺伝子を送達することができるだけでなく、内在性遺伝子発現を阻害することによって、治療効果をもたらすために核酸を送達することもできる。遺伝子発現の阻害は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、またはリボザイムによって媒介され得る。
【０００４】
このような療法の重要なステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に核酸分子を送達することである。しかし、核酸分子、特に、ＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、いくつかの技術的なハードルに直面する。第１に、細胞性ヌクレアーゼおよび血清ヌクレアーゼのために、ｉｎ  ｖｉｖｏで注入されるＲＮＡの半減期は、わずか約７０秒である（例えば、非特許文献１を参照）。化学修飾を使用することによって、注入されるＲＮＡの安定性を増大させる努力が行われているが、化学的変化が細胞傷害作用を増大させるか、または機能を喪失もしくは低下させるいくつかの事例が存在する。一具体例では、細胞は、刻々とホスフェートがホスホロチオエートによって置換されるＲＮＡｉ二本鎖の投与に耐性ではない（非特許文献２）。したがって、治療応答を誘発するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏで十分な量であるが、宿主に対して毒性ではない核酸分子（特に、ＲＮＡ分子）を送達することができる送達システムを開発する必要がある。
【０００５】
核酸ベースのワクチンは、ワクチン接種に対する魅力的な手法である。例えば、抗原をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内（ＩＭ）免疫化は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導し、チャレンジから保護することができる。ＤＮＡワクチンは、タンパク質抗原を使用する従来のワクチン、または弱毒化病原体に勝るある特定の利点を提供する。例えば、タンパク質ワクチンと比較した場合、ＤＮＡワクチンは、そのネイティブコンホメーションにおいて適切に折り畳まれた抗原を産生させ、細胞性免疫応答を生じさせることにおいてより有効となり得る。ＤＮＡワクチンにはまた、死滅病原体または弱毒化病原体に付随するいくつかの安全性問題がない。例えば、死滅ウイルス調製物は、残留性の生存ウイルスを含有する場合があり、弱毒化ウイルスは、病原性表現型に変異または復帰する場合がある。
【０００６】
核酸ベースのワクチンの別の限界は、非ヒト霊長類およびヒトにおいて強力な免疫応答を得るために大用量の核酸が一般に必要とされることである。したがって、核酸ベースのワクチンの効力を増強させるための送達システムおよびアジュバントが必要とされる。細胞内に核酸分子を導入するための様々な方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン（ｐｏｌｙｐｒｅｎｅ）トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびリポフェクションなどが開発されている。
【０００７】
カチオン性脂質は、細胞内に遺伝子を送達するために、リポソームとして広く製剤化されている。しかし、血清はアニオン性物質を含有するので、少量の血清でさえ（約１０％）、リポソーム／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション活性を劇的に低減させ得る。最近、細胞内にＤＮＡ分子を送達するためのカチオン性脂質エマルジョンが開発された。例えば、非特許文献３を参照。
【０００８】
特許文献１および特許文献２には、カチオン性微粒子を使用して脊椎動物被験体に核酸分子を送達する方法が記載されている。微粒子は、ポリマー、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物などを含み、カチオン性界面活性剤を使用して形成される。核酸分子は、微粒子の表面に吸着される。
【０００９】
非特許文献４および非特許文献５は、ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション効率を増強するのに使用される様々な水中油型エマルジョン製剤を記載している。
【００１０】
非特許文献６は、ＤＮＡの送達システム／アジュバントとしてカチオン性サブミクロンエマルジョンを伴う手法を記載している。サブミクロンエマルジョン手法は、大規模に製造され、商業的に認可された製品（Ｆｌｕａｄ（登録商標））で使用されている、強力な水中スクアレンアジュバントであるＭＦ５９に基づく。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）が、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を促進するのに使用された。
【００１１】
ＤＮＡベースのワクチンは、疾患の予防および処置に関して、かなり有望であるが、その安全性に関して一般的な懸念が提起されている。導入されるＤＮＡ分子は、潜在的に、宿主ゲノム中に組み込まれる場合があり、またはこれらが様々な組織に分布するために、抗原の望ましくない持続発現に至る場合がある。さらに、ある特定のＤＮＡウイルスは、ＤＮＡ分子を送達するためのビヒクルとしても使用されている。その感染特性のために、このようなウイルスは、非常に高いトランスフェクション率を達成する。使用されるウイルスは、機能的な感染性粒子がトランスフェクション細胞内でまったく形成されないような様式で遺伝的に改変されている。しかし、これらの予防策にもかかわらず、例えば、潜在的な組換え事象のために、導入される遺伝子およびウイルス遺伝子の制御されない伝播のリスクを無視することはできない。これはまた、ＤＮＡが、例えば、組換えによって宿主細胞のゲノムのインタクトな遺伝子内に挿入されるリスクも必然的に伴い、その結果、上記遺伝子は、変異し、したがって完全もしくは部分的に不活化される場合があり、または誤情報を生じさせる場合がある。言い換えれば、細胞にとって不可欠な遺伝子産物の合成が完全に抑制される場合があり、または代わりに、改変された、もしくは誤った遺伝子産物が発現される。さらに、臨床グレードのウイルスベクターの製造および精製をスケールアップすることは、一般に困難である。
【００１２】
細胞増殖の調節に関与する遺伝子内にＤＮＡが組み込まれる場合、１つの特定のリスクが発生する。この場合、宿主細胞は、変性した状態になり、がんまたは腫瘍形成に至る場合がある。さらに、細胞内に導入されるＤＮＡを発現させる場合、対応するＤＮＡビヒクルが、ウイルス性ＣＭＶプロモーターなどの強いプロモーターを含有することが必要である。処置細胞のゲノム内にこのようなプロモーターが組み込まれると、細胞内の遺伝子発現の調節の望まれない変化がもたらされる場合がある。免疫応答を誘導するための作用物質として（例えば、ワクチンとして）ＤＮＡを使用することの別のリスクは、異質なＤＮＡが導入された患者内での病原性抗ＤＮＡ抗体の誘導であり、したがって、望ましくない免疫応答をもたらすことである。
【００１３】
抗原またはその誘導体をコードするＲＮＡ分子も、ワクチンとして使用することができる。ＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと比較した場合、ある特定の利点を提供する。第１に、ＲＮＡは、宿主ゲノム中に組み込まれず、したがって、悪性腫瘍のリスクをなくす。第２に、ＲＮＡは急速に分解されるために、異質な導入遺伝子の発現は長続きしないことが多く、抗原の制御されない長期間の発現を回避する。第３に、ＲＮＡ分子は、コードされる抗原を発現するのに細胞質に送達される必要があるだけであり、一方、ＤＮＡ分子は、核膜を透過しなければならない。
【００１４】
それにもかかわらず、ＤＮＡベースのワクチンと比較して、ＲＮＡベースのワクチンに寄せられる関心は相対的に軽微である。ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドは、親水性の負に荷電した分子であり、これらは、治療剤またはワクチンとして投与される場合、ヌクレアーゼによる分解に非常に感受性である。さらに、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドは、細胞内に能動的に輸送されない。例えば、非特許文献７を参照。
【００１５】
非特許文献８は、β−ガラクトシダーゼをコードする裸のＲＮＡが送達される自己複製ＲＮＡワクチンを記載し、ＣＤ８＋細胞の誘導が報告された。
【００１６】
非特許文献９は、遺伝子移入のために、ＲＮＡキャリアとしてカチオン性固体脂質ナノ粒子を使用することを記載している。固体脂質ナノ粒子は、ＲＮＡ分子を分解から保護することが示され、ＲＮＡ−粒子複合体をウニの卵内にマイクロインジェクションした後、リポータータンパク質（フルオレセイン）の発現が検出された。
【００１７】
特許文献３では、（ａ）両親媒性ペプチド、（ｂ）脂質、および（ｃ）少なくとも１つの免疫原性種を含むナノ脂質ペプチド粒子（Ｎａｎｏ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＮＬＰＰ））が開示されている。ある特定の実施形態では、ＮＬＰＰは、カチオン性脂質などの正に荷電した「捕捉剤」も組み入れる。捕捉剤は、負に荷電した免疫原性種（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）をつなぎ留めるのに使用される。ＮＬＰＰの調製には両親媒性ペプチドが必要であり、これは、脂質成分を可溶化し、ナノ粒子を形成するのに使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第６，７５３，０１５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，８５５，４９２号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１０／００９２７７号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈ．  （２００３年）２７０巻：１６２８〜４４頁
【非特許文献２】Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．  （２００３年）１３巻（２号）：８３〜１０５頁
【非特許文献３】Ｋｉｍら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、（２００５年）２９５巻、３５〜４５頁
【非特許文献４】Ｋｉｍら（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、１８巻、５４〜６０頁）
【非特許文献５】Ｃｈｕｎｇら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００１年、７１巻、３３９〜３５０頁）
【非特許文献６】Ｏｔｔら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００２年、７９巻、１〜５頁）
【非特許文献７】Ｖａｊｄｙ，  Ｍ．ら、Ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−，  ＤＮＡ−  ａｎｄ  ＲＮＡ  −ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００４年、８２巻（６号）：６１７〜２７頁
【非特許文献８】Ｙｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、５巻、８２３〜８２７頁）
【非特許文献９】Ｍｏｎｔａｎａら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００７年、１８巻、３０２〜３０８頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、核酸分子の送達システムを提供する必要がある。送達システムは、核酸ベースのワクチン、特に、ＲＮＡベースのワクチンに有用である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の概要
本発明は、一般に、核酸分子がエマルジョン粒子と複合体形成されるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョンを使用して、核酸分子（ＲＮＡ分子など）を細胞に送達させることができる。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。エマルジョン粒子は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径を有し、エマルジョンは少なくとも４：１のＮ／Ｐ比を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、エマルジョン粒子は約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径を有し、エマルジョンは少なくとも１．１：１、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、または少なくとも３．５：１のＮ／Ｐ比を有する。
【００２３】
本発明は、油コアおよびカチオン性脂質を含むエマルジョン粒子ならびにエマルジョン粒子と複合体形成される核酸分子を含む免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンであって、エマルジョン粒子の平均直径は約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐが少なくとも４：１であり、但し、核酸分子が分泌型アルカリホスファターゼをコードしないことを条件とし、但し、核酸分子がプラスミドＡ３１７によってコードされるＲＮＡではなく、プラスミドＡ３１７の配列が米国特許出願第６１／３６１，８９２号の図７Ａに示されていることをさらに条件とする、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸分子がＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原をコードしないことをさらに条件とし、そして／または核酸分子がＲＳＶタンパク質をコードしないことをさらに条件とする。好ましくは、核酸分子は抗原をコードし、核酸分子はＲＮＡ分子（自己複製ＲＮＡなど）である。
【００２４】
免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを緩衝化することができ（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーを使用）、約６．０〜約８．０、好ましくは約６．２〜約６．８のｐＨを有する。必要に応じて、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、無機塩を好ましくは３０ｍＭ以下の濃度でさらに含む。代わりにまたはさらに、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、非イオン性張度調整剤（糖、糖アルコール、またはそれらの組み合わせなど）および／またはポリマー（ポロキサマーなど）を水相にさらに含む。存在する場合、ポリマーは、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）で存在することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは等張性である。他の実施形態では、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、低張性または高張性である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、エマルジョン粒子（ｐａｒｔｉｅｓ）の油コアは、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、スクアラン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される油を含む。特定の実施形態では、油コアはスクアレンである。カチオン性脂質を、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８、およびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。好ましい実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。
【００２６】
エマルジョン粒子は、界面活性剤（非イオン性界面活性剤など）をさらに含むことができる。好ましくは、界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質ではない。界面活性剤は、約０．０１％〜約２．５％（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、水中油型エマルジョンは等量のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）およびＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を含み、例えば、各粒子の０．５％（ｗ／ｖ）が界面活性剤をさらに含む。
【００２７】
本発明はまた、油コアおよびカチオン性脂質を含むエマルジョン粒子ならびにエマルジョン粒子と複合体形成される核酸分子を含む免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンの作製方法であって、エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍであり、エマルジョンのＮ／Ｐが少なくとも４：１であり、但し、核酸分子が分泌型アルカリホスファターゼをコードしないことを条件とし、但し、核酸分子がプラスミドＡ３１７によってコードされるＲＮＡではなく、プラスミドＡ３１７の配列が米国特許出願第６１／３６１，８９２号の図７Ａに示されていることをさらに条件とする、作製方法に関する。本方法は、（ｉ）本明細書に記載される油コアおよびカチオン性脂質を含むエマルジョン粒子を含むカチオン性水中油型エマルジョン、ならびに（ｉｉ）核酸を含む水性溶液を提供するステップと、（ｉ）と（ｉｉ）とを合わせ、それにより、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを作製するステップとを含む。
【００２８】
本発明はまた、被験体に免疫応答を生じさせる方法であって、有効量の本明細書に記載される免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを該被験体に投与するステップを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａは、１０：１のＮ：Ｐ比でＣＮＥ１７と複合体形成した１μｇのＲＮＡレプリコンｖＡ３０６を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイの結果を示す。これらのデータは、粒子サイズが増加するにつれて、ＳＥＡＰ発現が減少し、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答が減少したことを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＮＥ１７と複合体形成したＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするＲＮＡレプリコンＡ３１７での免疫化後の２ｗｐ１および２ｗｐ２の時点でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける総ＩｇＧ力価を示す。これらのデータは、粒子サイズが増加するにつれて、ＳＥＡＰ発現が減少し、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答が減少したことを示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、粒子サイズに及ぼすＲＮＡ複合体形成および異なるバッファー組成の影響を示す。図２Ａは、ＲＮＡ複合体形成によってＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズが増加し、糖および／または低塩（ＮａＣｌ、１０ｍＭ）によって粒子サイズが減少したことを示す。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７の添加によって粒子サイズが複合体形成前のサイズに減少した。図２Ｂは、粒子サイズに及ぼすクエン酸バッファーの影響を示す。図２Ｃは粒子サイズに及ぼすポリマーの影響を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、粒子サイズに及ぼすＲＮＡ複合体形成および異なるバッファー組成の影響を示す。図２Ａは、ＲＮＡ複合体形成によってＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズが増加し、糖および／または低塩（ＮａＣｌ、１０ｍＭ）によって粒子サイズが減少したことを示す。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７の添加によって粒子サイズが複合体形成前のサイズに減少した。図２Ｂは、粒子サイズに及ぼすクエン酸バッファーの影響を示す。図２Ｃは粒子サイズに及ぼすポリマーの影響を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、粒子サイズに及ぼすＲＮＡ複合体形成および異なるバッファー組成の影響を示す。図２Ａは、ＲＮＡ複合体形成によってＣＮＥ１７エマルジョンの粒子サイズが増加し、糖および／または低塩（ＮａＣｌ、１０ｍＭ）によって粒子サイズが減少したことを示す。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７の添加によって粒子サイズが複合体形成前のサイズに減少した。図２Ｂは、粒子サイズに及ぼすクエン酸バッファーの影響を示す。図２Ｃは粒子サイズに及ぼすポリマーの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
１．概要
本発明は、一般に、核酸分子がエマルジョン粒子と複合体形成され、エマルジョン粒子が約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径を有し、エマルジョンが少なくとも４：１のＮ／Ｐ比を有するカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。エマルジョンを使用して、核酸分子（ＲＮＡ分子など）を細胞に送達させることができる。
【００３１】
本発明は、抗原をコードするＲＮＡ分子を含むカチオン性水中油型エマルジョンを個体に投与した場合、ＲＮＡによってコードされる抗原に対して惹起される免疫応答がエマルジョンの性質（エマルジョン粒子の平均直径およびエマルジョン粒子と複合体形成されるＲＮＡの量（すなわち、Ｎ／Ｐ比）が含まれる）によって影響されるという知見に基づく。本発明者らは、ＲＮＡ分子がエマルジョンと複合体形成する場合にエマルジョン粒子の平均直径は増加し、粒子の直径が大きいほど中和力価がより低くなると判断した。平均粒子直径が約８０ｎｍと約１８０ｎｍとの間であるエマルジョンは良好な中和力価を得られる。この範囲内でさえも、この範囲の上限の平均粒子サイズを有するエマルジョンはあまり好ましくなく、約１００ｎｍの平均粒子サイズが特に好ましい。約１００ｎｍと約１３０ｎｍとの間の平均粒子直径も好ましい。本発明者らは、驚いたことに、免疫応答がエマルジョンと複合体形成されるＲＮＡの量と直接的な直線的関係を持たないことを見出した。４：１のＮ／Ｐ比がコードされた抗原に対して良好な免疫応答を生じるが、より高いＮ／Ｐ比により、より高い中和力価が必ずしも生じるというわけではない。
【００３２】
ＲＮＡ分子がエマルジョンと複合体形成される場合にカチオン性水中油型エマルジョン粒子の平均直径が増加する。この影響を、エマルジョン中に無機塩を含めることによって低下させることができる。しかし、無機塩は、核酸分子のエマルジョン粒子への結合を阻害することができ、従って、無機塩は低濃度（例えば、約３０ｍＭ以下）でのみ存在すべきである。必要に応じて、親水性ポリマーを使用して、核酸複合体形成に原因する粒子サイズの増加を減少させることができる。また、親水性ポリマーは核酸分子のエマルジョン粒子への結合を阻害することができ、したがって、親水性ポリマーは低濃度（例えば、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ））でのみ存在すべきである。
【００３３】
抗原をコードするＲＮＡ分子を含むカチオン性水中油型エマルジョンを、個体に投与してコードされた抗原に対する免疫応答を誘導することができる。カチオン性水中油型エマルジョンをこの目的のために使用する場合、これらが等張性であることが好ましい。しかし、無機塩は核酸分子のエマルジョン粒子への結合を阻害することができるので、張度を非イオン性張度調整剤で調整することが好ましい。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子を含むカチオン性水中油型エマルジョンを、糖、糖アルコール、またはそれらの組み合わせを使用して２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水〜約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇに調整する。
【００３４】
２．定義
本明細書において、単数形の「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の指示をしていない限り、複数形への参照を含む。
【００３５】
用語「約」は、本明細書において使用される場合、値の＋／−１０％を指す。
【００３６】
用語「界面活性剤」は、専門用語であり、一般に、エネルギー的に水による溶媒和を選り好む親水性基（例えば、極性基）、および水によってあまり溶媒和にならない疎水性基の両方を有する任意の分子を指す。用語「非イオン性界面活性剤」は、当該技術分野で公知の用語であり、一般に、親水性基（例えば、極性基）が静電気的に荷電していない界面活性剤分子を指す。
【００３７】
用語「ポリマー」は、一緒に結合されている個々の化学物質部分（同じであっても異なっていてもよい）からなる分子を指す。本明細書において、用語「ポリマー」は、末端間で結合されて直鎖状分子を形成している個々の化学物質部分、ならびに分岐（例えば、「マルチアーム」または「星形」）構造の形態で一緒に結合された個々の化学物質部分を指す。例示的なポリマーには、例えば、ポロキサマーが含まれる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。
【００３８】
「バッファー」は、溶液のｐＨの変化に抵抗する水性溶液を指す。
【００３９】
本明細書において、「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））において、またはこの窒素塩基上に１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖類似体、もしくは開鎖糖類似体）において、もしくはこの糖部分上、またはホスフェートにおいて、もしくはホスフェート上にさらなる化学修飾を含有することができる。
【００４０】
本明細書において、「サッカリド」は、直鎖形態もしくは環形態での単糖、オリゴ糖、もしくは多糖、または糖鎖を形成するこれらの組合せを包含する。オリゴ糖は、２個以上の単糖残基を有するサッカリドである。サッカリドの例には、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、スクロース、およびトレハロースが含まれる。
【００４１】
用語「自己複製ＲＮＡ」、「ＲＮＡレプリコン」または「ＲＮＡベクター」は、専門用語であり、一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏで、一般的に標的細胞内で、それ自体の増幅または自己複製を指示することができるＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡレプリコンは、細胞内へのＤＮＡの導入、および転写が起こる核への輸送の必要性を伴うことなく、直接使用される。宿主細胞の細胞質内に直接送達するのにＲＮＡベクターを使用することによって、異種核酸配列の自律複製および翻訳が効率的に起こる。アルファウイルス由来自己複製ＲＮＡは、連続した順序で以下のエレメントを含有することができる：複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列（バックグラウンドでは５’ＣＳＥとも呼ばれる）、発現されると、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列（バックグラウンドでは３’ＣＳＥとも呼ばれる）、およびポリアデニレートトラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔｒａｃｔ）。アルファウイルス由来自己複製ＲＮＡは、ウイルスサブゲノムの「ジャンクション領域」プロモーター、１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子に由来する配列またはこれらの部分、組換えアルファウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なサイズの外来性核酸分子（複数可）、ならびに発現される異種配列（複数可）も含有することができる。
【００４２】
用語「アジュバント」は、それだけに限らないが、抗原に対する免疫応答を増大させ、かつ／または多様化させる免疫学的アジュバントを含めて、医薬品の作用を補助または改変する任意の物質を指す。したがって、免疫学的アジュバントは、抗原に対する免疫応答を強化することができる化合物を含む。免疫学的アジュバントは、体液性免疫および／または細胞性免疫を強化することができる。先天性免疫応答を刺激する物質は、本明細書の免疫学的アジュバントの定義内に含まれる。免疫学的アジュバントは、「免疫強化物質」と呼ばれる場合もある。
【００４３】
本明細書において、「抗原」は、１つまたは複数のエピトープ（例えば、直鎖状、コンフォメーション、または両方のいずれか）を含有する分子を指す。本明細書において、「エピトープ」は、その免疫学的特異性を決定する所与の種（例えば、抗原分子または抗原複合体）の一部である。エピトープは、抗原の本定義の範囲内である。用語「抗原」は、本明細書において、サブユニット抗原、すなわち、抗原が自然において会合している生物体全体から分離され、別々になっている抗原を含む。
【００４４】
「免疫応答（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」または「免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、抗原または免疫学的アジュバントに対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。
【００４５】
免疫応答には、先天性免疫応答および適応免疫応答が含まれる。先天性免疫応答は、免疫系の防御の第一線をもたらす即効性の応答である。対照的に、適応免疫は、所与の病原体または障害（例えば、腫瘍）に由来する抗原を認識する体細胞性再構成受容体遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体）を有する免疫細胞の選択およびクローン性増殖を使用し、それによって、特異性および免疫記憶がもたらされる。先天性免疫応答は、その多くの作用の中でも、炎症性サイトカインの急速なバースト、ならびにマクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化をもたらす。病原体を自己成分と区別するために、先天性免疫系は、病原体関連分子パターン、またはＰＡＭＰとして公知の病原体からのシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を検出する様々な相対的に不変の受容体を使用する。微生物成分を実験的なワクチンに添加すると、堅調で耐久性のある適応免疫応答が発生することが公知である。免疫応答のこの増強作用の背後の機構は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を伴うことが報告されており、ＰＲＲは、好中球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞を含めた様々な免疫細胞、ならびに上皮細胞および内皮細胞などのいくつかの非免疫細胞上で異なって発現される。ＰＲＲの関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、これらの細胞の一部の活性化、ならびにこれらのサイトカインおよびケモカインの分泌、ならびに他の細胞の成熟および遊走をもたらす。相前後して、これは、適応免疫応答を確立する炎症性環境を作り出す。ＰＲＲには、非食作用受容体、例えば、トル様受容体（ＴＬＲ）、およびヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質など、ならびに食作用を誘導する受容体、例えば、スカベンジャー受容体、マンノース受容体、およびβ−グルカン受容体などが含まれる。報告されたＴＬＲ（本発明の様々な実施形態おいて免疫原性分子として使用することができる、いくつかの報告されたリガンドの例とともに）として、とりわけ、以下のものが挙げられる：ＴＬＲｌ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ由来の細菌リポタンパク質）、ＴＬＲ２（ザイモサン酵母粒子、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポペプチド、糖脂質、リポ多糖）、ＴＬＲ３（ウイルス二本鎖ＲＮＡ、ポリ：ＩＣ）、ＴＬＲ４（細菌リポ多糖、植物生成物タキソール）、ＴＬＲ５（細菌性フラジェリン）、ＴＬＲ６（酵母ザイモサン粒子、リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、マイコプラズマ由来のリポペプチド）、ＴＬＲ７（一本鎖ＲＮＡ、イミキモド、レシミキモド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、ならびにロキソリビンおよびブロピリミンなどの他の合成化合物）、ＴＬＲ８（一本鎖ＲＮＡ、レシミキモド）、およびＴＬＲ９（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）。樹状細胞は、ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞のプライミングを開始し、ＣＤ８＋Ｔ細胞のキラー細胞への分化を誘導するための最も重要な細胞型の一部として認識される。ＴＬＲシグナル伝達は、例えば、観察される特定の型のＴＨ応答（例えば、ＴＨ１応答対ＴＨ２応答）を決定するＴＬＲシグナルの性質とともに、これらのヘルパーＴ細胞応答の質の決��において重要な役割を果たすことが報告されている。抗体（体液）および細胞性免疫の組合せが、ＴＨＩ型応答の一部として生成され、一方、ＴＨ２型応答は、大部分は抗体応答である。ＣｐＧ  ＤＮＡ（ＴＬＲ９）、およびイミダゾキノリン（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）などの様々なＴＬＲリガンドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫細胞からのサイトカイン産生を刺激することが立証されている。イミダゾキノリンは、ＴＬＲアゴニストであることが示された最初の小さな薬物様化合物である。さらなる情報については、例えば、Ａ．  Ｐａｓｈｉｎｅ、Ｎ．  Ｍ．  Ｖａｌｉａｎｔｅ、およびＪ．  Ｂ．  Ｕｌｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１巻、Ｓ６３〜Ｓ６８頁（２００５年）、Ｋ．  Ｓ．  ＲｏｓｅｎｔｈａｌおよびＤ．  Ｈ．  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３巻（８号）、８２１〜８２９頁（２００６年）、ならびにこれらに引用された参考文献を参照。
【００４６】
本発明の目的に関して、体液性免疫応答は、抗体分子によって媒介される免疫応答を指し、一方、細胞性免疫応答は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。細胞性免疫の重要な一様相は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を伴う。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞の表面上で発現されるタンパク質に会合して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導し、促すのを助ける。細胞性免疫の別の様相は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、その表面上でＭＨＣ分子と会合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的効果細胞の機能を刺激することを助けるように作用し、この細胞の活性に集中する。「細胞性免疫応答」は、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および他のこのような分子の産生も指す。
【００４７】
したがって、細胞性免疫応答を誘発する免疫原性組成物などの組成物またはワクチンは、細胞表面のＭＨＣ分子との会合における抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作させるように機能することができる。細胞媒介免疫応答は、その表面で抗原を提示する細胞に、またはこの細胞付近に向けられる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球を生成することによって、免疫化された宿主の将来の保護を可能にすることができる。特定の抗原または組成物の細胞媒介免疫応答を刺激する能力は、当該技術分野で公知のいくつかのアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイ、または抗原での再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生の測定などによって判定することができる。このようなアッセイは、当該技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１巻：４１８９〜４１９９頁；Ｄｏｅら（１９９４年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４巻：２３６９〜２３７６頁を参照。したがって、免疫応答は、本明細書において、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものである場合がある。目的の抗原は、抗体媒介免疫応答も誘発することができる。したがって、免疫応答として、例えば、とりわけ、以下の作用のうちの１つまたは複数を挙げることができる：例えば、Ｂ細胞による抗体の産生、ならびに／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する１つまたは複数の抗原に特異的に向けられるサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、例えば、感染力を中和するように、かつ／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された宿主に対して保護をもたらすように、機能することができる。このような応答は、当該技術分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して判定することができる。
【００４８】
本発明による組成物は、異なる組成物中の等価な量の抗原（例えば、抗原が可溶性タンパク質として投与される）に誘発される免疫応答より、免疫応答を誘発する能力が大きい場合、所与の抗原について「免疫原性の増強」を示す。したがって、例えば、組成物がより強い免疫応答を生じさせることによって、または抗原が投与される被験体において免疫応答を達成するのにより低い用量もしくはより少ない投与の抗原で済むことによって、組成物は、免疫原性の増強を示すことができる。このような免疫原性の増強は、例えば、動物に本発明の組成物および抗原対照を投与し、この２つのアッセイ結果を比較することによって判定することができる。
【００４９】
３．カチオン性水中油型エマルジョン
本明細書に開示されるカチオン性水中油型エマルジョンは、一般に、エマルジョンを調製するのに使用される成分の濃度によって、当該技術分野で慣例的な様式で記述される。滅菌および他の下流プロセスを含めたエマルジョンを生成するプロセスの間に、少量の油（例えば、スクアレン）、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）、または他の成分が失われる場合があり、最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン）中のこれらの成分の実際の濃度は、場合により、出発量よりわずかに低い場合があることが（最大約１０％または最大約２０％）、当該技術分野において理解されている。
【００５０】
カチオン性水中油型エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、静電気力、および疎水性／親水性相互作用を通じて核酸分子と相互作用し、それによって、核酸分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、核酸分子、例えば、抗原をコードするＲＮＡ分子、または低分子干渉ＲＮＡなどを、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達するのに特に適している。例えば、本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、ワクチンとして、自己複製ＲＮＡを含めた抗原をコードするＲＮＡを送達することについて利点をもたらす。
【００５１】
水中油型エマルジョンの粒子は、油の中心コアを有するミセルに類似するようである。油コアは、カチオン性脂質でコーティングされており、カチオン性脂質は、ミセル様液滴として水性（連続）相中に油滴を分散させる。以下に記載される界面活性剤および／またはリン脂質などの１つまたは複数の必要に応じた成分が、エマルジョン中に存在することができる。例えば、１つまたは複数の界面活性剤を、粒子形成を促し、かつ／またはエマルジョン粒子を安定化させるのに使用することができる。その場合、油コアは、カチオン性脂質ならびに界面活性剤（複数可）でコーティングされることによって、ミセル様液滴を形成する。同様に、１つまたは複数の脂質（例えば、中性脂質、グリコール脂質、またはリン脂質）も、このような脂質が油滴を分散させるための乳化剤として使用される場合、エマルジョン粒子の表面上に存在することができる。
【００５２】
水中油型エマルジョンの粒子は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１３０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜１２０ｎｍの平均直径（すなわち、数平均直径）を有する。特に好ましい平均粒子直径は約１００ｎｍである。
【００５３】
エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比（比を高くすると、液滴サイズが減少する）、均質化の運転圧（均質化の運転圧を上昇させると、一般的に、液滴サイズが低減する）、温度（温度を上昇させると、液滴サイズが減少する）を変化させることによって、油のタイプを変化させることによって、マイクロフルイダイザーを通過させる回数を増加させることによって、および本明細書に記載される他のプロセスパラメータによって、変更することができる。水相中にある特定のタイプのバッファーを含めると、粒子サイズに影響する場合もある。
【００５４】
本明細書にさらに詳述されるように、本明細書に記載されるエマルジョン粒子を核酸分子と複合体形成することができる。一般に、カチオン性水中油型エマルジョンを、１種または複数の核酸分子を含む水性溶液と組み合わせて、エマルジョン粒子と複合体形成される核酸分子を含むエマルジョンを形成する。核酸分子を含む水性溶液は、少なくとも４：１（例えば、４：１〜２０：１または４：１〜１５：１）のＮ／Ｐ比を有する複合体形成されたエマルジョンが得られる濃度の核酸を含む。エマルジョン中の窒素（Ｎ）量を任意の適切な方法（本明細書に記載されるＤＯＴＡＰを定量するために使用されるＨＰＬＣ法など）を使用して定量することができるので、これを容易に実施することができる。次いで、望ましいＮ／Ｐ比を達成するために必要なホスフェート（Ｐ）量を得るのに十分な量の核酸を含む核酸分子の水性溶液を調製することができる。
【００５５】
本発明の例示的なカチオン性エマルジョンは、ＣＮＥ１７である。ＣＮＥ１７の油コアは、スクアレン（４．３％  ｗ／ｖ）であり、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１．４ｍｇ／ｍＬ）である。ＣＮＥ１７は、界面活性剤のＳＰＡＮ８５（０．５％  ｖ／ｖの（ソルビタントリオレエート））およびＴｗｅｅｎ８０（０．５％  ｖ／ｖの（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート））も含む。したがって、ＣＮＥ１７の粒子は、ＳＰＡＮ８５、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＤＯＴＡＰでコーティングされたスクアレンのコアを含む。ＲＮＡ分子は、４：１のＮ／Ｐ比および１０：１のＮ／Ｐ比で効率的にＣＮＥ１７粒子と複合体を形成することが示された。本発明の別の例示的なカチオン性エマルジョンを、本明細書中で「ＣＭＦ３２」という。ＣＭＦ３２の油はスクアレン（４．３％  ｗ／ｖ）であり、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰ（３．２  ｍｇ／ｍＬ）である。ＣＭＦ３２はまた、界面活性剤のＳＰＡＮ８５（０．５％  ｖ／ｖのソルビタントリオレエート）およびＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；０．５％  ｖ／ｖ）を含む。したがって、ＣＭＦ３２のエマルジョン粒子は、スクアレン、ＳＰＡＮ８５、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＤＯＴＡＰを含む。ＲＮＡ分子は、４：１、６：１、８：１、１０：１、１２：１、および１４：１のＮ／Ｐ比でＣＭＦ３２粒子と効率的に複合体形成することが示された。他の例示的なカチオン性エマルジョンとして、例えば、本明細書中で「ＣＭＦ３４」（４．３％  ｗ／ｖスクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％  ＳＰＡＮ８５、および４．４ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰ）、「ＣＭＦ３５」（４．３％  ｗ／ｖ  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％  ＳＰＡＮ８５、５．０ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰ）と呼ばれるエマルジョン、および本明細書に記載される他のエマルジョンが挙げられる。
【００５６】
本発明の特定のカチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＡＰおよびスクアレンをそれぞれ２．１ｍｇ／ｍｌ〜２．８４ｍｇ／ｍｌ（好ましくは２．２３ｍｇ／ｍｌ〜２．７１ｍｇ／ｍｌ）および３０．９２ｍｇ／ｍｌ〜４１．９２ｍｇ／ｍｌ（好ましくは３２．８２ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含み、等量のＳＰＡＮ８５およびＴｗｅｅｎ８０（例えば、それぞれ約０．５％）をさらに含む。本発明の別の特定のカチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＡＰおよびスクアレンをそれぞれ２．７８ｍｇ／ｍｌ〜３．７６ｍｇ／ｍｌ（好ましくは２．９４ｍｇ／ｍｌ〜３．６ｍｇ／ｍｌ）および１８．６ｍｇ／ｍｌ〜２５．１６ｍｇ／ｍｌ（好ましくは１９．６９ｍｇ／ｍｌ〜約２４．０７ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含み、等量のＳＰＡＮ８５およびＴｗｅｅｎ８０（例えば、それぞれ約０．５％）をさらに含む。好ましくは、これらのエマルジョンの粒子は、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径を有する。
【００５７】
本発明の水中油型エマルジョンの個々の成分は、当該技術分野で公知であるが、このような組成物が、本明細書に記載される様式で組み合わされたことはない。したがって、個々の成分は、好適な実施形態のために一般に、および少し詳しくの両方で以下に記載されているが、当該技術分野で周知であり、本明細書で使用される用語、例えば、油コア、界面活性剤、リン脂質などは、さらなる説明なしで、十分に当業者に周知である。さらに、エマルジョンの個々の成分の量の好適な範囲が提供されているが、特定のエマルジョンの成分の実際の比は、所望のサイズおよび物理的特性のエマルジョン粒子が適切に形成され得るように調整される必要がある場合がある。例えば、特定の量の油が使用される場合（例えば、５％  ｖ／ｖの油）、界面活性剤の量は、安定なエマルジョンを形成するように水相中に油滴を分散させるのに十分なレベルであるべきである。水相中に油滴を分散させるのに必要とされる界面活性剤の実際の量は、エマルジョンに使用される界面活性剤のタイプおよび油コアのタイプに依存し、油の量も、液滴サイズによって変化する場合がある（これが、２つの相の間の表面積を変化させるので）。所望のエマルジョンの成分の実際の量および相対的な比率は、当業者によって容易に決定することができる。
【００５８】
Ａ．油コア
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、油コアを含む。
【００５９】
油は好ましくは１℃以上で液相であり、かつ水に不混和性である。
【００６０】
好ましくは、油は、代謝可能な無毒性の油であり、より好ましくは、それだけに限らないが、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにこれらの対応する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物を含めた、約６〜約３０炭素原子のうちの１つである。油は、エマルジョンが投与されることになる被験体の体によって代謝され得、被験体に毒性ではない任意の植物油、魚油、動物油、または合成的に調製された油とすることができる。被験体は、動物、一般的に、哺乳動物、好ましくは、ヒトとすることができる。
【００６１】
ある特定の実施形態では、油コアは、２５℃で液相である。油コアは、２５℃で貯蔵されるとき、流体の特性を示す場合（固体および気体から区別され、明確な容積を有するが、明確な形状を有さない場合）、２５℃で液相である。しかし、エマルジョンは、任意の適切な温度で貯蔵および使用することができる。油コアは、４℃で液相であることが好ましい。
【００６２】
油は、任意の長鎖のアルカン、アルケン、もしくはアルキン、または遊離酸、その塩もしくはエステルとしてのこれらの酸誘導体もしくはアルコール誘導体、例えば、トリグリセリド、および１，２−プロパンジオールまたは同様のポリヒドロキシアルコールのエステルなどのモノエステル、またはジエステル、またはトリエステルなどとすることができる。アルコールは、一官能性酸または多官能性酸、例えば、酢酸、プロパン酸、クエン酸などを使用してアシル化することができる。油であり、本明細書に示される他の基準を満たす長鎖アルコールに由来するエーテルも使用することができる。
【００６３】
個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般に、約６〜約３０炭素原子を有することになる。この部分は、直鎖または分岐鎖の構造を有することができる。これは、完全に飽和していても、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有していてもよい。モノエステルもしくはポリエステル、またはモノエーテルもしくはポリエーテルに基づく油が使用される場合、約６〜約３０炭素の制限は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用し、合計炭素数に適用しない。
【００６４】
油は、エマルジョンが投与される宿主によって代謝され得ることが特に望ましい。
【００６５】
動物、魚、または植物の供給源からの任意の適切な油を使用することができる。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀類が含まれ、適切な油には、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油などが含まれる。他の適切な種子油として、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類の群では、トウモロコシ油、および他の穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどの油も使用することができる。植物油を得るための技術は、十分に開発されており、周知である。これらの油および他の同様の油の組成は、例えば、メルクインデックス、および食品原料、栄養食品技術（ｓｏｕｒｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｏｎ  ｆｏｏｄｓ、ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に見出すことができる。
【００６６】
グリセロールと１，２−プロパンジオールの約６〜約１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。これらの製品は、ＰＶＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、４１６  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｂｏｏｎｇｏｎ、Ｎ．Ｊ．からＮＥＯＢＥＥＳの名称で、およびその他で市販されている。
【００６７】
動物油および動物性脂肪は、トリグリセリドとして存在し、魚または植物に由来する油より高い程度の飽和度を有するという事実のために、生理的温度で固相であることが多い。しかし、脂肪酸は、部分的または完全にトリグリセリドをけん化することによって動物性脂肪から得られ、このけん化は、遊離脂肪酸をもたらす。哺乳動物乳に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化、および他の手段の手順は、当該技術分野で周知である。
【００６８】
ほとんどの魚は、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書で使用することができる魚油のいくつかを例示する。いくつかの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般に、テルペノイドと呼ばれる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、分岐、不飽和のテルペノイドであり、本明細書で特に好適である。スクアレンの主要な供給源はサメ肝油であるが、アマランサス種子、米糠、コムギ胚芽、およびオリーブ油を含めた植物性油（ｐｌａｎｔ  ｏｉｌ）（主に植物油（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌ））も適切な供給源である。スクアレンもまた、酵母または他の適切な微生物から入手することができる。いくつかの実施形態では、スクアレンは好ましくは非動物性供給源から、例えば、オリーブ、オリーブ油または酵母から入手される。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好適である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当該技術分野で公知の方法によって得ることができる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、油コアは、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、スクアラン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む。例示的な実施形態では、油コアは、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアランまたはこれらの組合せを含む。スクアランも、油として使用することができる。例示的な実施形態では、油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む。
【００７０】
エマルジョンの油成分は、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の量で存在することができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約１５％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約９％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約８％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約７％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約６％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約５％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約４．３％（ｖ／ｖ）の油、約０．３％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．４％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．５％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約１％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約３％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約４％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約４．３％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約５％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、約０．５％（ｖ／ｖ）の油、約１％（ｖ／ｖ）の油、約１．５％（ｖ／ｖ）の油、約２％（ｖ／ｖ）の油、約２．５％（ｖ／ｖ）の油、約３％（ｖ／ｖ）の油、約３．５％（ｖ／ｖ）の油、約４％（ｖ／ｖ）の油、約４．３％（ｖ／ｖ）の油、約５％（ｖ／ｖ）の油、または約１０％（ｖ／ｖ）の油を含むことができる。
【００７１】
あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．２％〜約１０％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約９％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約７％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約６％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約５％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約４．３％（ｗ／ｖ）の油、または約４．３％（ｗ／ｖ）の油を含むことができる。
【００７２】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５％（ｖ／ｖ）の油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約４．３％（ｖ／ｖ）の油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約５％（ｖ／ｖ）油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約４．３％（ｗ／ｖ）のスクアレンを含む。
【００７３】
上記に言及したように、上述した油の百分率は、エマルジョンを調製するのに使用される油の最初の量に基づいて決定される。最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン）中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い場合があることが（最大約１０％または最大約２０％）、当該技術分野において理解されている。
【００７４】
Ｂ．カチオン性脂質
本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、カチオン性脂質を含み、これは、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。
【００７５】
カチオン性脂質は、ｐＨ約１２で、ｐＨ約１１で、ｐＨ約１０で、ｐＨ約９で、ｐＨ約８で、ｐＨ約７で、またはｐＨ約６で、正電荷を有し得る。
【００７６】
任意の適切なカチオン性脂質を使用することができる。一般に、カチオン性脂質は、生理的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。適切なカチオン性脂質として、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトリマイド（これは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ならびに場合により少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、１級アミン、２級アミン、それだけに限らないが、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパンを含めた３級アミン、他の４級アミン塩、例えば、それだけに限らないが、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、塩化デカメトニウム、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタ−ナミニウム（ｂｅｎｚｅｎｅｍｅｔｈａ−ｎａｍｉｎｉｕｍ）クロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、臭化セチルピリジニウムおよび塩化セチルピリジニウム）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォーム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミコハク酸コリンエステル、リポポリアミン、例えば、それだけに限らないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジドデシルエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ���）、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジテトラデシルエステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオン性誘導体、例えば、それだけに限らないが、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミン、および３γ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタンカルボモイル］コレステロール）（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【００７７】
本発明で使用するのに適した他のカチオン性脂質には、例えば、米国特許公開第２００８／００８５８７０号（２００８年４月１０日公開）および同第２００８／００５７０８０号（２００８年３月６日公開）に記載されたカチオン性脂質が含まれる。
【００７８】
本発明で使用するのに適した他のカチオン性脂質には、例えば、ＷＯ２０１１／０７６８０７の表６（１１２〜１３９頁）に開示された脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８またはＥ０１１９〜Ｅ０１８０が含まれる（ＷＯ２０１１／０７６８０７は、これらのカチオン性脂質を作製する方法、および使用する方法も開示している）。追加の適切なカチオン性脂質には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）が含まれる。
【００７９】
エマルジョンは、本明細書に記載されるカチオン性脂質の２つ以上の任意の組合せを含むことができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、四級アミンを含む。
【００８１】
好適な実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、ＷＯ２０１１／０７６８０７の表６（１１２〜１３９頁）に開示されている脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８もしくはＥ０１１９〜Ｅ０１８０、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
【００８２】
他の好適な実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ＷＯ２０１１／０７６８０７（本明細書に参考として援用される）の表６（１１２〜１３９頁）に開示されている脂質Ｅ０００１〜Ｅ０１１８もしくはＥ０１１９〜Ｅ０１８０、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＴＡＰを含むことができる。
【００８４】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含む。
【００８５】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールでＤＣコレステロールを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含むことができる。
【００８６】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、例えば、２．４６ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含む。
【００８７】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどでＤＤＡを含むことができる。あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌでＤＤＡを含むことができる。
【００８８】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、例えば、１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．３５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＴＭＡを含むことができる。
【００９０】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＭＡを含む。
【００９１】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＥＰＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＥＰＣを含むことができる。
【００９２】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、または１．８ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＥＰＣを含む。
【００９３】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＳＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのＤＳＴＡＰを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＳＴＡＰを含むことができる。
【００９４】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＳＴＡＰを含む。
【００９５】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＤＡＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．１５ｍｇ／ｍｌ、約１．１６ｍｇ／ｍｌ、約１．１７ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＤＡＣを含むことができる。
【００９６】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、例えば、１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＤＡＣを含む。
【００９７】
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＤＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＰを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２．５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌなどでＤＯＤＡＰを含むことができる。
【００９８】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＤＡＰを含む。
【００９９】
いくつかの場合では、油コアにおいて可溶性であるカチオン性脂質を使用することが望ましい場合がある。例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＴＭＡは、スクアレンまたはスクアラン中に可溶性である。他の場合では、油コアにおいて可溶性ではないカチオン性脂質を使用することが望ましい場合がある。例えば、ＤＤＡおよびＤＳＴＡＰは、スクアレン中に可溶性ではない。特定の脂質が油において可溶性であるか不溶性であるかを判定し、それに応じて適切な油と脂質の組合せを選ぶことは、当該技術分野の知識の範囲内である。例えば、溶解度は、脂質および油の構造に基づいて予想することができる（例えば、脂質の溶解度は、そのテールの構造によって決定され得る）。例えば、１つまたは２つの不飽和脂肪酸鎖（例えば、オレオイルテール）を有する脂質、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡなどは、スクアレンまたはスクアランにおいて可溶性であり、一方、飽和脂肪酸鎖（例えば、ステアロイルテール）を有する脂質は、スクアレンにおいて可溶性ではない。あるいは、溶解度は、所与の量の油中に溶解して飽和溶液を形成する脂質の量によって求めることができる。
【０１００】
上記に言及したように、上述した脂質の濃度は、エマルジョンを調製するのに使用される脂質の最初の量に基づいて求められる。最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン）中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い場合があることが（最大約２０％）、当該技術分野において理解されている。
【０１０１】
Ｃ．追加の成分
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、追加の成分をさらに含むことができる。例えば、エマルジョンは、粒子形成を促し、核酸分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、または核酸分子の安定性を増大させる（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防止する）ことができる成分を含むことができる。所望の場合、カチオン性水中油型エマルジョンは、抗酸化剤（例えば、シトレート、アスコルベートまたはそれらの塩）を含むことができる。
【０１０２】
界面活性剤
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、界面活性剤をさらに含む。
【０１０３】
相当な数の界面活性剤が医薬品科学において使用されている。これらには、天然に由来する材料、例えば、樹木からのゴム、植物タンパク質、アルギネートおよびセルロースなどの糖ベースのポリマーなどが含まれる。炭素主鎖上にヒドロキシドまたは他の親水性置換基を有するある特定のオキシポリマーまたはポリマー、例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグリコールエーテルベースの一官能性化合物および多官能性化合物は、界面活性剤活性を有する。長鎖脂肪酸由来化合物は、本発明で使用することができる乳化剤および懸濁剤の第３の実質的な群を形成する。
【０１０４】
適切な界面活性剤の具体例として、以下のものが挙げられる：
【０１０５】
１．高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）のナトリウム、カリウム、アンモニウム、およびアルカノール−アンモニウムの塩などの水溶性石けん、特に、ナトリウムタロウおよびカリウムタロウならびにココナツ石けん。
【０１０６】
２．その分子構造内に約８〜２２個の炭素原子を含有するアルキルラジカル、ならびにスルホン酸ラジカルおよび硫酸エステルラジカルからなる群より選択されるラジカルを有する有機硫酸反応生成物の水溶性塩によって代表され得るアニオン性合成非石けん界面活性剤。これらの例は、タロウまたはヤシ油に由来するナトリウムまたはカリウムアルキルスルフェート；ナトリウムまたはカリウムアルキルベンゼンスルホネート；ナトリウムアルキルグリセリルエーテルスルホネート；ナトリウムヤシ油脂肪酸モノグリセリドスルホネートおよびスルフェート；高級脂肪アルコール１モルとエチレンオキシド約１〜６モルとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩；１分子当たり１〜１０単位のエチレンオキシドを有し、アルキルラジカルが８〜１２個の炭素原子を含有するナトリウムまたはカリウムアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート；イセチオン酸でエステル化され、水酸化ナトリウムで中和された脂肪酸の反応生成物；メチルタウリド（ｍｅｔｈｙｌ  ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ３−スルホン化されたＣ１０〜Ｃ２４α−オレフィンのナトリウムまたはカリウム塩である。
【０１０７】
３．アルキレンオキシド基を有機疎水性化合物と縮合することによって作製される非イオン性合成界面活性剤。一般的な疎水性基には、プロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合生成物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミンの縮合生成物、８〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコール、および脂肪酸のアミドが含まれる。
【０１０８】
４．半極性特性を有する非イオン性界面活性剤、例えば、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、およびスルホキシドなど。長鎖３級アミンオキシドの具体例には、ジメチルドデシルアミンオキシド、およびビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンが含まれる。ホスフィンオキシドの具体例は、１９６７年２月１４日に発行された米国特許第３，３０４，２６３号に見出され、これらには、ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル−（２ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドが含まれる。
【０１０９】
５．式Ｒ１−ＳＯ−Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、置換または非置換のアルキル基であり、前者は、約１０〜約２８個の炭素原子を含有し、一方、Ｒ２は、１〜３個の炭素原子を含有する）に対応するものを含めた長鎖スルホキシド。これらのスルホキシドの具体例には、ドデシルメチルスルホキシド、および３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが含まれる。
【０１１０】
６．ナトリウム３−ドデシルアミノプロピオネート、およびナトリウム３−ドデシルアミノプロパンスルホネートなどの両性合成界面活性剤。
【０１１１】
７．３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート、および３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホネートなどの双性イオン性合成界面活性剤。
【０１１２】
さらに、以下のタイプの界面活性剤のすべてを、本発明の組成物中に使用することができる：（ａ）脂肪酸、ロジン酸、およびトールオイルの石けん（すなわち、アルカリ塩）；（ｂ）アルキルアレーンスルホネート；（ｃ）分岐鎖および直鎖疎水性基の両方、ならびに１級および２級スルフェート基を有する界面活性剤を含めたアルキルスルフェート；（ｄ）疎水性基と親水性基との間に中間連結を含有するスルフェートおよびスルホネート、例えば、脂肪アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリドなど；（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖の酸エステル、特にトールオイルエステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；（ｇ）長鎖アルコールとメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。界面活性剤は、１つを超える様式で分類することができるので、この段落で示した界面活性剤のいくつかのクラスは、以前に記載した界面活性剤のクラスと重複する。
【０１１３】
生物学的状況のために具体的に設計され、その状況において一般に使用されるいくつかの界面活性剤が存在する。このような界面活性剤は、４つの基本タイプ、すなわち、アニオン性、カチオン性、双性イオン性（両性）、および非イオン性に分けられる。例示的なアニオン性界面活性剤として、例えば、ペルフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡもしくはＰＦＯ）、ペルフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、アルキル硫酸塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、または硫酸ラウリルアンモニウム、硫酸ラウレスナトリウム（ナトリウムラウリルエーテルスルフェート、ＳＬＥＳとしても公知）、アルキルベンゼンスルホネート、および脂肪酸塩が含まれる。例示的なカチオン性界面活性剤には、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化タロウアミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）が含まれる。例示的な双性イオン性（両性）界面活性剤には、例えば、ドデシルベタイン、コカミドプロピルベタイン、およびココアンホ（ｃｏｃｏ  ａｍｐｈｏ）グリシネートが含まれる。例示的な非イオン性界面活性剤として、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（ポロキサマーまたはポロキサミンと商業的に呼ばれる）、アルキル（ａａｙｌ）ポリグルコシド（例えば、オクチルグルコシドまたはデシルマルトシド）、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、およびポリソルベート、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ドデシルジメチルアミンオキシド、およびビタミンＥトコフェロールプロピレングリコールコハク酸（ビタミンＥ  ＴＰＧＳ）が挙げられる。
【０１１４】
界面活性剤の特に有用な群は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ソルビトールを脱水して１，４−ソルビタンを得、次いでこれを、１つまたは複数の当量の脂肪酸と反応させることによって調製される。脂肪酸置換部分を、エチレンオキシドとさらに反応させることによって、第２の群の界面活性剤を得ることができる。
【０１１５】
脂肪酸置換４ルビタン界面活性剤は、１，４−ソルビタンを、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または同様の長鎖脂肪酸などと反応させて、１，４−ソルビタンモノエステル、１，４−ソルビタンセスキエステル、または１，４−ソルビタントリエステルを得ることによって作製される。これらの界面活性剤の一般名称には、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｅｓｔｅａｒａｔｅ）、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、およびソルビタントリオレエートが含まれる。これらの界面活性剤は、通常、様々なモノエステル、ジエステル、およびトリエステル置換ソルビタンを区別する文字または数値が指定されて、ＳＰＡＮ（登録商標）、またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名称で市販されている。
【０１１６】
ＳＰＡＮ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤は、親水性であり、一般に、油中に可溶性または分散性である。これらはまた、ほとんどの有機溶媒中に可溶性である。水中で、これらは、一般に不溶性であるが分散性である。一般に、これらの界面活性剤は、１．８〜８．６の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）数を有することになる。このような界面活性剤は、当該技術分野で公知の手段によって容易に作製することができ、または市販されている。
【０１１７】
界面活性剤の関係した群は、ポリオキシエチレン（ｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）ソルビタンモノエステル、およびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを含む。これらの材料は、１，４−ソルビタンモノエステル（ｍｏｎｅｓｔｅｒ）またはトリエステルにエチレンオキシドを付加することによって調製される。ポリオキシエチレンを付加すると、親油性のソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤が、一般に水中で可溶性または分散性であり、有機液体中で様々な程度に可溶性である親水性界面活性剤に変換される。
【０１１８】
これらの材料は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）の商標で市販されており、水中油型エマルジョンおよび分散物の調製、または油の可溶化、および水溶性または洗浄可能な無水軟膏の作製に有用である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、関係したソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤と合わせることによって、エマルジョン安定性を促すことができる。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、一般に、９．６〜１６．７に入るＨＬＢ値を有する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、市販されている。
【０１１９】
単独で、またはＳＰＡＮ（登録商標）、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤とともに使用することができる非イオン性界面活性剤の第３の群は、エチレンオキシドを長鎖脂肪酸と反応させることによって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイプの最も一般に入手可能な界面活性剤は、ＭＹＲＪ（登録商標）の名称で販売されており、ステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤のように、親水性であり、水中で可溶性または分散性である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、エマルジョンを形成するのに使用するために、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤と、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）もしくはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤の混合物とブレンドすることができる。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、当該技術分野で公知の方法によって作製することができ、または市販されている。
【０１２０】
ポリオキシエチレンベースの非イオン性界面活性剤の第４の群は、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、脂肪アルコールにエチレンオキシドを付加することによって、上記のように調製される。これらの界面活性剤の商業的な名称は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて、親水性または親油性となり得る。これらの化合物の調製物は、当該技術分野から利用可能であるが、これらは、商業的供給源からも容易に入手可能である。
【０１２１】
潜在的に使用することができる他の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜ろう誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステル、または他の１２〜２２炭素原子の長鎖脂肪酸のポリオキシエチレンの酸アルコールもしくはエーテル誘導体である。
【０１２２】
多相系であることが意図された本発明のエマルジョンおよび製剤として、約７〜１６の範囲内のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオン性界面活性剤を選ぶことが好ましい。この値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤などの単一の非イオン性界面活性剤の使用を通じて得ることができ、あるいはソルビタンモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルベースの界面活性剤などとの界面活性剤のブレンド；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン由来界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル；高ＨＬＢポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤、もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸を使用することによって達成することができる。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、エマルジョンは、エマルジョン安定化非イオン性界面活性剤として、単一の非イオン性界面活性剤、最も特にＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエートとして別に公知であるＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む。他の実施形態では、エマルジョンは、２つ以上の非イオン性界面活性剤、特に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤、およびＳＰＡＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０およびＳＰＡＮ（登録商標）８５を含む。
【０１２４】
水中油型エマルジョンは、約０．０１％〜約２．５％の界面活性剤（ｖ／ｖもしくはｗ／ｖ）、約０．０１％〜約２％の界面活性剤、０．０１％〜約１．５％の界面活性剤、０．０１％〜約１％の界面活性剤、０．０１％〜約０．５％の界面活性剤、０．０５％〜約０．５％の界面活性剤、０．０８％〜約０．５％の界面活性剤、約０．０８％の界面活性剤、約０．１％の界面活性剤、約０．２％の界面活性剤、約０．３％の界面活性剤、約０．４％の界面活性剤、約０．５％の界面活性剤、約０．６％の界面活性剤、約０．７％の界面活性剤、約０．８％の界面活性剤、約０．９％の界面活性剤、または約１％の界面活性剤を含有することができる。
【０１２５】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、０．０５％〜約１％、０．０５％〜約０．９％、０．０５％〜約０．８％、０．０５％〜約０．７％、０．０５％〜約０．６％、０．０５％〜約０．５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％のＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を含有することができる。
【０１２６】
例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、０．０８％のＴｗｅｅｎ８０を含有する。
【０１２７】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、０．０５％〜約１％、０．０５％〜約０．９％、０．０５％〜約０．８％、０．０５％〜約０．７％、０．０５％〜約０．６％、０．０５％〜約０．５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）を含有することができる。
【０１２８】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、本明細書に記載される界面活性剤の組合せを含有することができる。例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）とＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）の組合せを使用することができる。エマルジョンは、等しい量のこれらの界面活性剤を含めて、様々な量のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳＰＡＮ８５（例えば、上記に例示したもの）を含有することができる。例えば、水中油型エマルジョンは、約０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．０５％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．１％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．２％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．３％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．３％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．４％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．４％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．５％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．６％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．７％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．７％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．８％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．８％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、約０．９％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約０．９％のＳＰＡＮ（登録商標）８５、または約１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と約１．０％のＳＰＡＮ（登録商標）８５を含有することができる。
【０１２９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（ＰＥＧ−ＰＥ）もしくはいくつかの他のリン脂質（ＰＥＧ−リン脂質）とカップリングしたＰＥＧ、セラミドとコンジュゲートしたＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、またはこれらの組合せなども、界面活性剤として使用することができる（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号；米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、および同第２００６／００２５３６６を参照）。他の適切なＰＥＧ−脂質には、例えば、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）脂質、またはＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）脂質が含まれる。例示的なＰＥＧ−ＤＡＧ脂質として、例えば、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール（Ｃ１２）脂質、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４）脂質、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）脂質、またはＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（Ｃ１８）脂質が挙げられる。例示的なＰＥＧ−ＤＡＡ脂質として、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）脂質、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）脂質、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）脂質、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）脂質が挙げられる。
【０１３０】
ＰＥＧは、その分子量によって分類される。例えば、ＰＥＧ２０００は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ならびに他の会社から市販されており、これらには、例えば、以下のものが含まれる：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルコハク酸（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含めた、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートの調製に特に有用である。
【０１３１】
好ましくは、ＰＥＧは、約１０００〜約５０００ダルトンの平均分子量を有する（例えば、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ５０００）。ＰＥＧは、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基によって必要に応じて置換されている場合がある。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含めた、ＰＥＧを脂質にカップリングさせるのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。
【０１３２】
例示的な実施形態では、ＰＥＧ２０００ＰＥ、ＰＥＧ５０００ＰＥ、ＰＥＧ１０００ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００ＤＭＧ、ＰＥＧ３０００ＤＭＧ、またはこれらの組合せが、界面活性剤として使用される。ある特定の例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ２０００ＰＥ、ＰＥＧ５０００ＰＥ、ＰＥＧ１０００ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００ＤＭＧ、またはＰＥＧ３０００ＤＭＧを含有する。
【０１３３】
リン脂質
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、リン脂質をさらに含む。
【０１３４】
リン脂質は、分子のアルコール成分がホスフェート基を含有する脂肪酸のエステルである。リン脂質には、グリセロホスファチド（グリセロールを含有する）、およびスフィンゴミエリン（スフィンゴシンを含有する）が含まれる。例示的なリン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびスフィンゴミエリン；ならびにジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、およびジパルミトイルセリンを含む合成リン脂質が挙げられる。
【０１３５】
以下の例示的なリン脂質を使用することができる。
【表７−１】
2014522840.tif 000002
【表７−２】
2014522840.tif 000003
【表７−３】
2014522840.tif 000004
【０１３６】
ある特定の実施形態では、中性脂質を使用することが有利である場合がある。双性イオン性リン脂質、例えば、長さが約１２〜約２２炭素（例えば、約１２〜約１４、〜約１６、〜約１８、〜約２０、〜約２２炭素）の１つまたは複数のアルキルラジカルまたはアルケニルラジカルを含有し、このラジカルは、例えば、０〜１〜２〜３個の二重結合を含有していてもよいリン脂質を含めたリン脂質を使用することが有利である場合もある。双性イオン性リン脂質を使用することが有利である場合がある。
【０１３７】
好適なリン脂質として、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ＤＰＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルリノレイルホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、ＤＰｙＰＥ、またはこれらの組合せが挙げられる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、リン脂質はＤＯＰＥである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約７．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥでＤＯＰＥを含むことができる。
【０１３９】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥを含む。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、リン脂質は卵ＰＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣで卵ＰＣを含むことができる。
【０１４１】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．５５ｍｇ／ｍｌの卵ＰＣを含む。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、リン脂質はＤＰｙＰＥである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥでＤＰｙＰＥを含むことができる。
【０１４３】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＰｙＰＥを含む。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、エマルジョン粒子は、本明細書に記載される界面活性剤とリン脂質の組合せを含むことができる。
【０１４５】
Ｄ．水相（連続相）
水中油型エマルジョンの水相（連続相）は、緩衝化塩溶液（例えば、食塩水）または水である。緩衝化塩溶液は、塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）を含む水性溶液であり、重量オスモル濃度調整剤（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、サッカリド）、ポリマー、界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。水相は、抗酸化剤（例えば、シトレート、アスコルベートまたはそれらの塩）を含むことができる。エマルジョンが非経口投与用に製剤化される場合、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの望まれない投与後の結果を防止するために、張度、すなわち、重量オスモル濃度が正常な生理学的な液と本質的に同じであるように、最終的な緩衝化溶液を作製することが好ましい。正常な生理的条件と適合性のｐＨを維持するために、水相を緩衝化することも好ましい。また、ある特定の事例では、エマルジョンのある特定の成分の安定性を保証するために、ｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。
【０１４６】
例えば、等張性（すなわち、体の正常細胞および血液と同じ浸透性溶質（例えば、塩）濃度）であり、等浸透圧であるエマルジョンを調製することが望ましい場合がある。張度を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を約０．９％（ｗ／ｖ）（生理食塩水）で使用することができる。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。非イオン性張度調整剤も張度を制御するのに使用することができる。いくつかの非イオン性張度調整剤が、通常、当業者に公知である。これらは一般的に様々な分類の炭水化物である（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。アルドースとして分類される単糖、例えば、グルコース、マンノース、アラビノース、およびリボースなど、ならびにケトースとして分類されるもの、例えば、フルクトース、ソルボース、およびキシルロースなどを、本発明における非イオン性張度調整剤として使用することができる。二糖、例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースなども使用することができる。さらに、アルジトール（非環式ポリヒドロキシアルコール、糖アルコールとも呼ばれる）、例えば、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどは、本発明において有用な非イオン性張度調整剤である。非イオン性張度調整剤は、使用される作用物質に応じて、約０．１％〜約１０％または約１％〜約１０％の濃度で存在し得る。
【０１４７】
水相を、緩衝化することができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファー、コハク酸バッファーなどを、本明細書で使用することができる。水性成分のｐＨは、好ましくは、６．０〜８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８である。例示的な実施形態では、バッファーは、６．５のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、ＲＮａｓｅフリー水またはＤＥＰＣ処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。いくつかの場合では、バッファー中の高濃度の塩は、核酸分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉する場合があり、したがって、回避される。他の場合では、バッファーにおいてある特定の量の塩を含めることができる。
【０１４８】
例示的な実施形態では、バッファーは、６．５のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、ＲＮａｓｅフリー水またはＤＥＰＣ処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。
【０１４９】
水相は、追加の成分、例えば、水相の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の核酸分子を安定化させる分子なども含むことができる。水相の容量オスモル濃度は、非イオン性張度調整剤、例えば、糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど）、またはこれらの組合せなどを使用して調整していることが好ましい。必要に応じて、非イオン性ポリマー（例えば、ポリ（アルキルグリコール）、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど）、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。
【０１５０】
いくつかの場合では、エマルジョンが最初に調製される際、純水（ｕｎａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ）が、エマルジョンの水相として好適となり得る。例えば、塩濃度または糖濃度を上昇させると、望ましい粒子サイズ（例えば、約２００ｎｍ未満）を達成することがより困難になり得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの水相は、ポリマーもしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、商標名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーによっても公知である。ポロキサマーポリマーは、ＲＮＡ複合体形成後のＲＮＡ分子の安定性をより大きくし、ＲＮａｓｅ耐性を増大させることができる。
【０１５２】
代わりにまたはさらに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマー、または約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％〜約５％（ｗ／ｖ）でポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７などのポロキサマー）を含むことができる。
【０１５３】
例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約４％（ｗ／ｖ）、または約８％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む。
【０１５４】
これらの組成物中に使用される水性成分の量は、組成の値を１にするのに必要な量となる。すなわち、１００％にするのに十分な水性成分の量が、上記に列挙された他の成分と混合されることによって、その組成物の容積となる。
【０１５５】
４．核酸分子
いずれの特定の理論にも束縛されることを望まないが、核酸分子は、非共有結合性イオン電荷相互作用（静電気力）を通じてカチオン性脂質と相互作用し、複合体の強度、ならびに粒子と複合体を形成することができる核酸分子の量は、粒子中のカチオン性脂質の量に関係すると考えられる。さらに、核酸分子と粒子の表面との間の疎水性／親水性相互作用も、役割を果たす場合がある。
【０１５６】
エマルジョン粒子と複合体化され得る核酸分子としては、例えば、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡが挙げられる。好適な態様では、核酸分子は、自己複製ＲＮＡ分子、または低分子干渉ＲＮＡを含めた、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＲＮＡなどのＲＮＡ分子である。
【０１５７】
複合体は、当該技術分野で公知の技法を使用して形成することができ、その例は、本明細書に記載されている。例えば、核酸−粒子複合体は、例えば、ボルテックスすることによって、カチオン性エマルジョンを核酸分子と混合することによって形成することができる。核酸分子およびエマルジョン中のカチオン性脂質の量を調整または最適化することによって、所望の結合強度および結合能力をもたらすことができる。
【０１５８】
例えば、本明細書に記載され、例示されているように、例示的なＲＮＡ−粒子複合体は、ＲＮＡ：カチオン性脂質の比（「Ｎ／Ｐ比」で測定した場合）を変更することによって生成された。用語Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡ上のホスフェートの量（モル）によって除された、カチオン性脂質中のプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素原子の量（モル）を指す。Ｎ／Ｐ比は、少なくとも、例えば、４：１〜２０：１または４：１〜１５：１である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、１．１：１〜２０：１、１．１：１〜１５：１、１．５：１〜２０：１、１．５：１〜１５：１、２：１〜２０：１、２：１〜１５：１、２．５：１〜２０：１、２．５：１〜１５：１、３：１〜２０：１、３：１〜１５：１、３．５：１〜２０：１または３．５：１〜１５：１である。
【０１６０】
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、核酸ベースのワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン）を製剤化するのに特に適している。核酸−エマルジョン粒子複合体の形成は、核酸の宿主細胞への取り込みを促進し、核酸分子をヌクレアーゼ分解から保護する。次いで、トランスフェクション細胞は、核酸分子によってコードされる抗原を発現することができ、抗原への免疫応答を生じさせることができる。生ウイルスまたは弱毒化ウイルスのように、核酸ベースのワクチンは、ＭＨＣ−Ｉ経路およびＭＨＣ−ＩＩ経路の両方に有効に関与し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導を可能にすることができ、一方、組換えタンパク質などの可溶性形態で存在する抗原は、一般に、抗体応答のみを誘導する。
【０１６１】
核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の配列は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現について最適化または脱最適化された（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドンとすることができる。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、抗原（ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）をコードし、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＲＮＡベースのワクチンとして使用するのに適している。組成物は、抗原をコードする１つを超えるＲＮＡ分子、例えば、エマルジョン粒子と複合体を形成している２、３、５、または１０のＲＮＡ分子を含有することができる。すなわち、組成物は、それぞれが異なる抗原をコードする、１つまたは複数の異なる種のＲＮＡ分子を含有することができる。代わりにまたはさらに、１つのＲＮＡ分子、例えば、異なるかまたは同一の抗原をコードするバイシストロニックまたはトリシストロニックなＲＮＡ分子は、１つを超える抗原をコードすることもできる。したがって、カチオン性水中油型エマルジョンは、一価または多価であるＲＮＡベースのワクチンとして使用するのに適している。
【０１６３】
ＲＮＡ分子の配列は、例えば、ＲＮＡの発現もしくは複製の効率を増大させ、または分解に対する追加の安定性もしくは耐性をもたらすために、必要に応じて修飾することができる。例えば、ＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾することができる。ポリＡテール（例えば、約３０アデノシン残基またはそれより多くのもの（配列番号３））は、ＲＮＡの３’テールに結合することによって、ＲＮＡの半減期を増大させることができる。ＲＮＡの５’テールを、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）を有する修飾されたリボヌクレオチドまたはその誘導体でキャッピングすることができ、これは、ＲＮＡ合成の間に組み込むことができ、またはＲＮＡ転写後に酵素的に操作することができる（例えば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒するｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリル−トランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子の安定性および翻訳効率の維持に重要な役割を果たす。ＲＮＡ分子の５’キャップを、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾することができ、これは、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成をもたらし、この構造は、翻訳効率をさらに増大させることができる。
【０１６４】
必要に応じて、ＲＮＡ分子は、任意の５’キャップ構造に加えて、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。哺乳動物ＲＮＡに９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見つかっている。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオシドの調製は、例えば、米国特許第４３７３０７１号、同第４４５８０６６号、同第４５００７０７号、同第４６６８７７７号、同第４９７３６７９号、同第５０４７５２４号、同第５１３２４１８号、同第５１５３３１９号、同第５２６２５３０号、同第５７００６４２号から当該技術分野で周知であり、これらの特許のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。
【０１６５】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチド中に組み込むことができ、ＲＮＡ分子中に存在し得る修飾核酸塩基として、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホンニルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾未満（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クエウオシン）；ｏＱ（エポキシクエウオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル−クエウオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエウオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン）；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−ジメチル（ｄｅｍｅｔｈｙｌ）グアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（無塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕが挙げられる。これらの修飾核酸塩基およびこれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的供給者から入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１１／００５７９９を参照。
【０１６６】
本発明で使用されるＲＮＡは、ヌクレオシド同士間でホスホジエステル連結のみを含むことが理想的であるが、いくつかの実施形態では、これは、ホスホラミデート連結、ホスホロチオエート連結、および／またはメチルホスホネート連結を含有することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを含まず、例えば、修飾核酸塩基を含まず、ＲＮＡ分子中のヌクレオチドのすべては、例えば、７−メチルグアノシンを含むことができる必要に応じた５’キャップを例外として、従来の標準的なリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣである。他の実施形態では、ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含むことができ、最初の１、２、または３つの５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位でメチル化されている場合がある。
【０１６８】
Ａ．自己複製ＲＮＡ
いくつかの態様では、カチオン性水中油型エマルジョンは、自己複製ＲＮＡ分子を含有する。ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来し、またはこれに基づく。
【０１６９】
自己複製ＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、ウイルスの構造タンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と置換することによって生成することができる。自己複製ＲＮＡ分子は、一般的に、細胞に送達された後に直接翻訳され得る（＋）鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをもたらし、次いでこれは、送達されたＲＮＡからのアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。したがって、送達されたＲＮＡにより、複数の娘ＲＮＡが産生される。これらの娘ＲＮＡ、ならびに共線的な（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）サブゲノムの転写物は、これら自体が翻訳されて、コードされる抗原のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすことができ、または転写されて、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物をもたらすことができ、これらが翻訳されて、抗原のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらす。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンＲＮＡの数の大規模な増幅であり、コードされる抗原は、細胞の主なポリペプチド産物となる。自己複製ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、アポトーシス死を起こす前に、短期間、抗原を産生する。この死は、要求される二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ中間体の結果である可能性があり、これらはまた樹状細胞を超活性化することが示されている。したがって、自己複製ＲＮＡの増強された免疫原性は、炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）ｄｓＲＮＡの生成の結果である場合があり、これは宿主細胞のＲＮＡ−ウイルス感染を模倣する。
【０１７０】
有利には、細胞の機構が自己複製ＲＮＡ分子により使用されることによって、タンパク質または抗原などのコードされる遺伝子産物の指数関数的増加が生じ、これらは、細胞内に蓄積することができ、または細胞から分泌され得る。自己複製ＲＮＡ分子によるタンパク質の過剰発現は、ＲＮＡの複製および増幅、ならびにトランスフェクション細胞のアポトーシスを誘導する翻訳の産物による、トル様受容体（ＴＬＲ）３、７、および８、ならびに非ＴＬＲ経路（例えば、ＲＩＧ−１、ＭＤ−５）の刺激を含めた免疫賦活性アジュバント効果を活用する。
【０１７１】
自己複製ＲＮＡは、一般に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、５’−末端および３’−末端のシス活性複製配列、ならびに必要に応じて、所望のアミノ酸配列（例えば、目的の抗原）をコードする異種配列も含む。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターを、自己複製ＲＮＡ中に含めることができる。必要に応じて、異種配列（例えば、目的の抗原）を、自己複製ＲＮＡ中の他のコード領域にインフレームで融合することができ、かつ／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下とすることができる。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ウイルス様粒子内に被包されない。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができないように設計することができる。これは、例えば、自己複製ＲＮＡ中でウイルス粒子を産生するのに必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を除外することによって達成することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子がアルファウイルス、例えば、シンドビス（Ｓｉｎｅｂｉｓ）ウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などに基づく場合、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などをコードする１つまたは複数の遺伝子を除外することができる。
【０１７３】
必要に応じて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を、弱毒化された、もしくは伝染性の強い感染性ウイルス粒子の産生を誘導するように、またはその後に１ラウンド感染させることができるウイルス粒子を生成するように、設計することもできる。
【０１７４】
本様式において、自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。アルファウイルスは、トガウイスル科の一連の遺伝的、構造的、および血清学的に関係した節足動物媒介性ウイルスを含む。シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含めた２６の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、アルファウイルス属に分類されている。したがって、本発明の自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼを組み込むことができる。
【０１７５】
アルファウイルスベースの「レプリコン」発現ベクターを、本発明において使用することができる。レプリコンベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えレプリコン粒子を含めたいくつかの形式で利用することができる。このようなレプリコンベクターは、例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３巻：１１８８〜１１９１頁；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０巻：５０８〜５１９頁；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２巻：９５０〜９５８頁；Ｐｏｌｏら（１９９９年）ＰＮＡＳ  ９６巻：４５９８〜４６０３頁）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：１３５６〜１３６１頁；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６巻：５６２〜５６５頁）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９巻：３８９〜４０１頁）を含むアルファウイルスから得られている。アルファウイルス由来レプリコンは一般的に、全体的な特性（例えば、構造、複製）がかなり類似しており、個々のアルファウイルスは、ユニークであるいくつかの特性（例えば、受容体結合、インターフェロン感受性、および疾患プロファイル）を示すことができる。したがって、多岐にわたるウイルス科から作製されるキメラアルファウイルスレプリコンも有用となり得る。
【０１７６】
アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンは、一般的に、細胞に送達された後に、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−転写酵素）の翻訳をもたらす（＋）鎖ＲＮＡである。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは、自己切断して（＋）鎖で送達されたＲＮＡのゲノム（−）鎖コピーを作り出す複製複合体をもたらす。これらの（−）鎖転写物は、それ自体が転写されることによって、（＋）鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、また、抗原をコードするサブゲノム転写物を与えることができる。したがって、サブゲノム転写物が翻訳されると、感染細胞によって抗原がｉｎ  ｓｉｔｕで発現される。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【０１７７】
ＲＮＡレプリコンは、１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子を、目的の産物をコードする、選択された異種核酸配列と置換することによって修飾された、ピコルナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、黄熱病ウイルス、またはアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、もしくはロスリバーウイルス）に由来するＲＮＡゲノムを含むことが好ましい。
【０１７８】
好適なレプリコンは、（ｉ）レプリコンからＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）抗原をコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４の１つまたは複数を含むアルファウイルスレプリカーゼとすることができる。天然のアルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて、構造ビリオンタンパク質をコードするが、レプリコンは、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好適である。したがって、好適なレプリコンは、細胞内でそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらすことができるが、ＲＮＡ含有ビリオンの産生をもたらすことはできない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、好適なレプリコンは、感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスの永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、好適なレプリコンにはなく、その場所は、目的の抗原をコードする遺伝子（複数可）によって奪われており、その結果、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく抗原をコードする。
【０１７９】
本発明で有用なレプリコンは、２つのオープンリーディングフレームを有することができる。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、例えば、追加の抗原をコードするか、またはアクセサリーポリペプチドをコードするための追加の（例えば、下流）オープンリーディングフレームを有することができる。
【０１８０】
好適なレプリコンは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し、これは、多くの場合、ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳を増強することができる。いくつかの実施形態では、レプリコンの５’配列は、コードされるレプリカーゼとの適合性を保証するように選択される必要がある場合がある。
【０１８１】
レプリコンは、３’ポリＡテールを有することができる。これは、その３’末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）も含むことができる。
【０１８２】
レプリコンは、様々な長さを有することができるが、これらは一般的に、５０００〜２５０００ヌクレオチドの長さ、例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、または９０００〜１２０００ヌクレオチドである。
【０１８３】
レプリコンは、好都合なことには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって調製することができる。ＩＶＴは、細菌内で、プラスミド形態で作り出され、増幅させられるか、または合成的に（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）作り出される（ｃＤＮＡ）鋳型を使用することができる。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなど）を、ＤＮＡ鋳型からレプリコンを転写するのに使用することができる。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応を、必要に応じて使用することができる（しかし、レプリコンのポリＡは、通常、ＤＮＡ鋳型内でコードされる）。これらのＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチド（複数可）についてストリンジェントな要求事項を有する場合があり、いくつかの実施形態では、これらの要求事項は、ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己コードレプリカーゼの基質として効率的に機能することができることを保証するために、コードされるレプリカーゼの要求事項と整合されなければならない。具体例には、例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、および同第６，０１５，６８６号、ならびに国際公開第ＷＯ９７／３８０８７号、同第ＷＯ９９／１８２２６号、および同第ＷＯ０２／２６２０９号に記載された、ｐＳＩＮＣＰなどのシンドビスウイルスベースのプラスミド（ｐＳＩＮ）が含まれる。このようなレプリコンの構築物は、一般に、米国特許第５，８１４，４８２号、および同第６，０１５，６８６号に記載されている。
【０１８４】
他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、より好ましくは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリチウイルス、またはコロナウイルスから、またはこれらに基づいて得られる。適切な野生型アルファウイルス配列は、周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄなどの配列受託機関から入手可能である。適切なアルファウイルスの代表的な例として、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバッソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニアウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミドルバーグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）が挙げられる。
【０１８５】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを使用して調製された他のタイプのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）より大きい。一般的に、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも約４ｋｂを含有する。例えば、自己複製ＲＮＡは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂ超を含有することができる。ある特定の例では、自己複製ＲＮＡは、約４ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約７ｋｂ〜約１２ｋｂ、約８ｋｂ〜約１２ｋｂ、約９ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１１ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１１ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約１１ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約１１ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１１ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１１ｋｂである。
【０１８６】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数のタイプの修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含むことができる。
【０１８７】
自己複製ＲＮＡ分子は、単一の異種ポリペプチド抗原、または必要に応じて、配列のそれぞれが、アミノ酸配列として発現される場合に、その同一性を保持するように一緒に連結された（例えば、連続して連結された）２つ以上の異種ポリペプチド抗原をコードすることができる。次いで、自己複製ＲＮＡから生成される異種ポリペプチドを、融合ポリペプチドとして生成し、または別個のポリペプチドまたはペプチド配列をもたらす様式で操作することができる。
【０１８８】
本発明の自己複製ＲＮＡは、様々なエピトープを含有する１つまたは複数のポリペプチド抗原をコードすることができる。エピトープは、ヘルパーＴ細胞応答、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答、またはその両方を誘発することができることが好ましい。
【０１８９】
本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子を、２つ以上のオープンリーディングフレームから複数のヌクレオチド配列を発現するように操作することができ、それによって、免疫応答の生成を増強することができるサイトカインまたは他の免疫調節剤を伴った、２つ以上の抗原などのタンパク質の共発現を可能にする。このような自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、二価ワクチンまたは多価ワクチンとして、例えば、様々な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を同時に生成することにおいて特に有用となり得る。
【０１９０】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適切な方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するためのいくつかの適切な方法が当該技術分野で公知である。例えば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、またはＲＮＡ分子中への修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にする、これらのポリメラーゼの変異体を使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）することによって調製することができる。転写反応物は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、ならびに適切なバッファー、および適切な塩などの選択されたポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有することになる。自己複製ＲＮＡ中へのヌクレオチド類似体の組込みは、例えば、このようなＲＮＡ分子の安定性を変更し、ＲＮａｓｅに対する耐性を増大させ、適切な宿主細胞内に導入した後の複製（ＲＮＡの「感染力」）を確立し、かつ／または先天性免疫応答および適応免疫応答を誘導もしくは低減するように操作することができる。
【０１９１】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子を生成するために、適切な合成法を単独で、または１つもしくは複数の他の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術もしくは組換えＲＮＡ技術）と組み合わせて、使用することができる。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成のための適切な方法は、当該技術分野で周知であり、特定の用途に適応させることができる。例示的な方法には、例えば、ＣＥＭなどの適切な保護基を使用する化学合成（Ｍａｓｕｄａら（２００７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５１巻：３〜４頁）、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９巻：２６１９〜２２頁）が含まれる。これらの化学法を、市販されている自動核酸シンセサイザーとともに実施するか、またはこれとともに使用するのに適応させることができる。追加の適切な合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０巻：５４４〜８４頁、およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １巻：１６５頁に開示されている。核酸合成は、クローニング、プロセシング、ならびに／またはポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を含めた、当該技術分野で周知であり、慣例的である適切な組換え法を使用して実施することもできる。ランダム断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計および操作するのに使用することができる公知の技法の例である。核酸およびコードされるタンパク質を変更する、例えば、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選択を変化させ、スプライスバリアントを生成し、変異を導入するためなどに、部位特異的変異誘発を使用することができる。核酸配列の転写、翻訳、および発現のための適切な方法は、当該技術分野で公知であり、慣例的である。（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．、３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８２年；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ��ｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照）。
【０１９２】
自己複製ＲＮＡ分子中の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量を、任意の適切な方法を使用して判定することができる。例えば、自己複製ＲＮＡを消化してモノホスフェートにし（例えば、ヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化することができ（例えば、ＣＩＡＰなどの適切なホスファターゼを使用して）、得られるヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（例えば、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用して、勾配（３０％のＢ（０〜５分）から１００％のＢ（５〜１３分））および１００％のＢ（１３〜４０分）、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）、バッファーＡ（２０ｍＭの酢酸−酢酸アンモニウム  ｐＨ３．５）、バッファーＢ（２０ｍＭの酢酸−酢酸アンモニウム  ｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］）を使用して溶出する）によって分析することができる。
【０１９３】
必要に応じて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が、修飾ヌクレオチドを含有しない対応する自己複製ＲＮＡ分子と比較して、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）内に導入または進入した際により低い免疫調節活性を有することになるように、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０１９４】
必要に応じて、自己複製ＲＮＡ分子をスクリーニングまたは分析することによって、当業者に公知である様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試験法を使用して、その治療特性および予防特性を確認することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子を含むワクチンを、目的の特定のリンパ球型、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞クローンの増殖またはエフェクター機能の誘導に対する、ワクチンの効果について試験することができる。例えば、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を単離することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球の、ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する自己標的細胞を溶解する能力。さらに、Ｔヘルパー細胞分化を、ＥＬＩＳＡにより、ＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）サイトカインならびに／もしくはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの増殖もしくは産生を測定することによって、または細胞質サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞内で直接に分析することができる。
【０１９５】
ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、目的の抗原に特異的な抗体のＢ細胞産生の誘導によって立証されるような、体液性免疫応答を誘導する能力についても試験することができる。これらのアッセイは、例えば、免疫化された個体に由来する末梢Ｂリンパ球を使用して行うことができる。このようなアッセイ法は、当業者に公知である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子を特徴付けるのに使用することができる他のアッセイでは、標的細胞による、コードされる抗原の発現の検出を伴う場合がある。例えば、ＦＡＣＳを使用することによって、細胞表面上または細胞内で抗原発現を検出することができる。ＦＡＣＳ選択の別の利点は、異なるレベルの発現について選別することができることである。場合により、より低い発現が望まれる場合がある。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の適切な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を使用するパニング、またはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。
【０１９６】
Ｂ．抗原
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、抗原をコードする核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）である。適切な抗原には、それだけに限らないが、細菌性抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原生動物（ｐｒｏｔａｚｏａｎ）抗原、植物抗原、がん抗原、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１９７】
適切な抗原には、病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、植物、または腫瘍に由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るウイルス抗原ならびに免疫原として、それだけに限らないが、オルソミクソウイルス、例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣなど；パラミクソウイルス科ウイルス、例えば、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルス、および麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ））など；ニューモウイルス、例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウスの肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管支炎ウイルスなど；パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘニパウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなど；真正痘瘡（それだけに限らないが、大痘瘡および小痘瘡を含む）などのオルソポックスウイルスを含めたポックスウイルス科；メタニューモウイルス、例えば、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）およびトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）など；麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）などの麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）；ピコルナウイルス、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス、およびアフタウイルスなど；エンテロウイルス、例えば、ポリオウイルス１型、２型、または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２型および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス１〜９型、１１〜２７型、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８〜７１など、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルスを含めたブニヤウイルス；リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス；クリミアコンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルス；トガウイルス（風疹）、例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなど；フラビウイルス、例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱（１型、２型、３型、もしくは４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポーワッサン脳炎ウイルスなど；ペスチウイルス、例えば、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ熱（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）など；ヘパドナウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなど；ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス（狂犬病ウイルス）、およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）など、カリシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルスなど、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなど；コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）など；レトロウイルス、例えば、オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなど；レオウイルス、例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなど；パルボウイルスＢ１９などのパルボウイルス；デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）；Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）；Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；ヒトヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）など；パポバウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなど、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｅｓｓ）、ならびにアレナウイルスに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、抗原は、魚に感染するウイルス、例えば、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚のリンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケのピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀サケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）などに対する免疫応答を誘発する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、抗原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｏｖａｌｅなどに由来する寄生虫に対する免疫応答を誘発する。したがって、本発明は、マラリア対して免疫化するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生虫、例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどのフナムシに対する免疫応答を誘発する。
【０２００】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る細菌性抗原および免疫原として、それだけに限らないが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ（ボツリヌス中毒）、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、およびＢ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、およびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ（腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ；尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）など）、ならびに／または腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（腸チフス）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０２０１】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る真菌抗原および免疫原として、それだけに限らないが、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）、例えば、
【化１】
2014522840.tif 000005
【化２】
2014522840.tif 000006
に由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０２０２】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る原生動物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０２０３】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る植物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０２０４】
適切な抗原として、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（インフルエンザ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｏｒｕｓ）、ノロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス（例えば、エンテロウイルス７１）、エボラウイルス、およびウシ下痢症ウイルスなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域に由来するポリペプチドからなる群より選択されることが好ましい。本発明の他の好適な実施形態では、抗原は、細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどに由来するタンパク質またはペプチドである。
【０２０５】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るＨＩＶ抗原は、１９９０年３月９日に出願された米国出願第４９０，８５８号、公開された欧州出願第１８１１５０号（１９８６年５月１４日）、ならびに米国出願第６０／１６８，４７１号；同第０９／４７５，５１５号；同第０９／４７５，５０４号；および同第０９／６１０，３１３号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０６】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るサイトメガロウイルス抗原は、米国特許第４，６８９，２２５号、１９８９年６月１６日に出願された米国出願第３６７，３６３号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１４３号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０７】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るＣ型肝炎抗原は、ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４１２５、公開された欧州出願第３１８２１６号（１９８９年５月３１日）、１９８８年１１月１８日に出願された、公開された日本国出願第１−５００５６５号、カナダ国出願第５８３，５６１号、およびＥＰＯ３８８，２３２に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。異なるセットのＨＣＶ抗原は、１９９０年３月１６日に出願された欧州特許出願第９０／３０２８６６．０号、および１９８９年１２月２１日に出願された米国出願第４５６，６３７号、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、抗原は、アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草、および草の花粉アレルゲン）；昆虫またはクモ形類のアレルゲン（吸入アレルゲン、唾液アレルゲン、および毒液アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリおよび小昆虫のアレルゲン、膜翅目（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ）毒液アレルゲン）；動物の毛アレルゲンおよびフケアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからの）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）から得られる。樹木、草、ならびにハーブに由来する重要な花粉アレルゲンは、それだけに限らないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）、およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含めたＦａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐｈａｌａｒｉｓ属、Ｓｅｃａｌｅ属、およびＳｏｒｇｈｕｍ属の草を含むＰｏａｌｅｓ目、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属のハーブを含むＡｓｔｅｒａｌｅｓ目およびＵｒｔｉｃａｌｅｓ目が起源であるものである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のイエダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ、およびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓに由来するもの、ゴキブリ、小昆虫、およびノミ、例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ、およびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓに由来するもの、ならびに哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、およびウマなどに由来するもの、ミツバチ（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含む膜翅目の分類学上の目からのものなどの刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｏｒ  ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ）が起源であるものを含めた毒液アレルゲンである。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原もしくは抗原、またはがん免疫原もしくは抗原は、自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原および抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、例えば、ポリペプチド腫瘍抗原または糖タンパク質腫瘍抗原である。
【０２１０】
本明細書で使用するのに適した腫瘍免疫原および抗原は、（ａ）ポリペプチド（これは、例えば、長さが８〜２０アミノ酸の範囲とすることができるが、この範囲外の長さも一般的である）、リポポリペプチド、および糖タンパク質を含めたポリペプチド含有腫瘍抗原などの多種多様な分子を包含する。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原は、例えば、（ａ）がん細胞に関連する全長分子、（ｂ）欠失、付加および／または置換された部分を有する分子を含めた、この全長分子の相同体および修飾形態、ならびに（ｃ）この全長分子の断片である。腫瘍免疫原には、例えば、ＣＤ８＋リンパ球によって認識されるクラスＩ制限抗原、またはＣＤ４＋リンパ球によって認識されるクラスＩＩ制限抗原が含まれる。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、（ａ）がん精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２など（これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）、（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部のがんに関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵がん、および結腸直腸がんに関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんに関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱がんに関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんに関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんに関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳房、結腸、肺、および卵巣のがんに関連する）、アルファ−フェトプロテイン（例えば、肝細胞がんに関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガストリン（例えば、膵がん、および胃がんに関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がん、および卵巣がんに関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんに関連する）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんに関連する）、およびがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連する）、（ｄ）共通抗原、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１、およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２など（例えば、黒色腫に関連する）、（ｅ）例えば、前立腺がんに関連する前立腺関連抗原、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２など、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）が挙げられる。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含めたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、
【化３】
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（Ｍａｃ−２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。
【０２１４】
Ｃ．核酸分子についての水性溶液
核酸分子（ＲＮＡなど）は、一般に、水性溶液の形態、または水性溶液中に容易に溶解することができる形態（例えば、凍結乾燥した）で提供される。水性溶液は、水、または塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）、非イオン性張度調整剤（ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、サッカリド）、ポリマー、界面活性剤、もしくはこれらの組合せを含む水性溶液とすることができる。製剤がｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために意図されている場合、水性溶液は、正常な生理的条件と適合性であるｐＨを維持する生理学的に許容されるバッファーであることが好ましい。また、ある特定の場合では、製剤のある特定の成分の安定性を保証するために、ｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。
【０２１５】
例えば、等張性および／または等浸透圧である水性溶液を調製することが望ましい場合がある。高張性および低張性の溶液は、注入されたとき、組成物と生理学的な液との間でイオン濃度が異なるために、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの厄介な問題および望ましくない影響を場合により引き起こすことがある。張度を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、約０．９％（ｗ／ｖ）（生理食塩水）で使用することができる。存在する場合がある他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。例示的な実施形態では、水性溶液は、１０ｍＭのＮａＣｌ、および他の塩、または非イオン性張度調整剤を含む。本明細書に記載されるように、非イオン性張度調整剤も、張度を制御するのに使用することができる。ある実施形態では、一旦混合されると等張の溶液を形成するように、高張溶液と低張溶液とが混合される（例えば、高張ＲＮＡおよび低張エマルジョン；低張ＲＮＡと高張エマルジョン）。
【０２１６】
水性溶液を、緩衝化させることができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファーなどを本明細書で使用することができる。水性溶液のｐＨは、好ましくは、６．０〜８．０、好ましくは、約６．２〜約６．８となる。いくつかの場合では、ある特定の量の塩をバッファー中に含めることができる。他の場合では、バッファー中の塩は、核酸分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉し得、したがって、回避される。
【０２１７】
水性溶液は、追加の成分、例えば、水性溶液の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の核酸分子を安定化させる分子なども含むことができる。例えば、一般に炭水化物であるが、ポリマーとすることもできる非イオン性張度調整剤を使用して、重量オスモル濃度を調整することができる。（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。適切な非イオン性張度調整剤の例には、糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど）、およびこれらの組合せが含まれる。必要に応じて、非イオン性ポリマー（例えば、ポリ（アルキルグリコール）、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど）、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。これらのタイプの作用物質、特に、糖および糖アルコールは、凍結乾燥されたとき、ＲＮＡ、および他の核酸分子を保護することができる凍結保護物質でもある。例示的な実施形態では、バッファーは、約５６０ｎＭ〜６００ｍＭのトレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む。
【０２１８】
いくつかの場合では、高張性溶液として、核酸分子を含む水性溶液を調製し、純水または低張性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと核酸分子が合わされると、混合物は、等張性となる。例えば、ＲＮＡを含む水性溶液を２×高張性溶液とすることができ、カチオン性エマルジョンを、１０ｍＭのクエン酸バッファーを使用して調製することができる。ＲＮＡ溶液とエマルジョンが１：１（ｖ／ｖ）の比で混合されると、組成物は等張性となる。エマルジョンと核酸分子を含む水性溶液の所望の相対量（例えば、１：１（ｖ／ｖ）の混合、２：１（ｖ／ｖ）の混合、１：２（ｖ／ｖ）の混合など）に基づいて、等張性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の張度を容易に決定することができる。
【０２１９】
同様に、生理的な重量オスモル濃度を有する組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与にとって望ましい場合がある。生理的な重量オスモル濃度は、水１ｋｇ当たり約２５５ｍＯｓｍ〜水１ｋｇ当たり約３１５ｍＯｓｍである。場合により、高浸透圧性溶液として、核酸分子を含む水性溶液を調製し、純水または低浸透圧性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと核酸分子とが合わされると、生理的な重量オスモル濃度が達成される。もちろん、これはまた、低重量オスモル濃度（ｈｙｐｏｏｓｍｏｌａｒ）の核酸溶液と高重量オスモル濃度（ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｌａｒ）のバッファーとを用いて達成され得る。エマルジョンと核酸分子とを含む水性溶液の所望の相対量（例えば、１：１（ｖ／ｖ）の混合、２：１（ｖ／ｖ）の混合、１：２（ｖ／ｖ）の混合など）に基づいて、等浸透圧性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の重量オスモル濃度を容易に決定することができる。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、核酸分子を含む水性溶液は、ポリマー、もしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。特に、本発明者らは、カチオン性エマルジョン粒子との複合体形成の前に、ＲＮＡ水性溶液にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ分子の安定性がより大きくなり、ＲＮＡ分子のＲＮａｓｅ耐性が増大することを観察した。ＲＮＡ水性溶液にｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズが小さくなることも見出された。ポロキサマーポリマーはまた、ＲＮＡ分子の適切な脱複合体形成／放出を促進し、エマルジョン粒子の凝集を防止し、免疫調節効果を有することができる。使用することができる他のポリマーには、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、またはＰＥＧ３００が含まれる。
【０２２１】
代わりにまたはさらに、核酸分子を含む水性溶液は、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、０．０５％、０．５％、１％、または５％などで、ポリマー（例えば、ポロキサマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、またはＰＥＧ３００）を含むことができる。
【０２２２】
緩衝系は、２つ以上の上述した分子（塩、バッファー、サッカリド、ポリマーなど）の任意の組合せを含むことができる。好適な実施形態では、バッファーは、５６０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのクエン酸塩を含み、これを、本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンと混合することによって、２８０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのクエン酸塩を含む最終的な水相を生成することができる。他の実施形態では、バッファーは、約２〜２０ｍＭのクエン酸塩を含み、これは、本明細書中に記載のカチオン性水中油型エマルジョンと混合されて、約１〜１０ｍＭクエン酸塩を含む最終的な水相を生成し得る。
【０２２３】
５．調製方法
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンが、（１）約０．２％〜約２０％（ｖ／ｖ）の油、（２）約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤および（３）カチオン性脂質を含む、ステップと、核酸分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、核酸分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、少なくとも４：１のＮ／Ｐ比で、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均粒子直径を有するカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子を含む組成物を調製する方法を提供する。
【０２２４】
カチオン性水中油型エマルジョンを作製するための例示的な一アプローチは、（１）油およびカチオン性脂質を合わせて、エマルジョンの油相を形成するステップと、（２）水性溶液を提供して、エマルジョンの水相を形成するステップと、（３）例えば、均質化によって水相中に油相を分散させるステップとを含むプロセスによるものである。均質化は、任意の適した方法で、例えば、市販のホモジナイザー（例えば、ＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザー、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）で入手可能）を使用して達成され得る。
【０２２５】
カチオン性脂質を、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２，２，２トリフルオロエタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などといった適した溶媒に溶解させ、エマルジョンの油成分に直接的に添加してもよい。あるいは、カチオン性脂質を、適した溶媒に添加してリポソーム懸濁物を形成し、次いで、リポソーム懸濁物をエマルジョンの油成分に添加してもよい。カチオン性脂質はまた、油中に直接的に溶解させてもよい。
【０２２６】
脂質の溶解を促進するために、油を約３０℃〜約６５℃の温度に加熱することが望ましい場合がある。
【０２２７】
カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）の所望の量を測定し、本明細書において記載され、例示されるような所望の最終濃度に達するように、溶媒中、水中、または油中に直接的に溶解してもよい。
【０２２８】
クロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはジクロロメタン（ＤＣＭ）などの溶媒は、水相および油相を合わせる前に、または均質化の前に、例えば、蒸発によって油相から除去してもよい。あるいは、脂質溶解度が問題であり得る場合には、一次エマルジョンを依然として油相において溶媒（例えば、ＤＣＭ）を用いて作製してもよい。このような場合には、溶媒は、第２の均質化の前に一次エマルジョンから除去することができる（例えば、蒸発させる）。
【０２２９】
エマルジョンが１種または複数の界面活性剤を含む場合には、界面活性剤（複数可）は、当該技術分野における従来の慣例に従って油相に含まれる場合も、水相に含まれる場合もある。例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８５は、油相（例えば、スクアレン）に溶解させることができ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０は、水相（例えば、クエン酸バッファー）に溶解させてもよい。
【０２３０】
別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるようなカチオン性水中油型エマルジョンを提供するステップと、（ｉｉ）核酸分子（ＲＮＡなど）を含む水性溶液を提供するステップと、（ｉｉｉ）核酸分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、（ｉ）の水中油型エマルジョンと（ｉｉｉ）の水性溶液とを合わせるステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子（ＲＮＡなど）を含む組成物を調製する方法を提供する。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンを、核酸分子を含む水性溶液（例えば、ＲＮＡ水性溶液）と、任意の所望の相対量、例えば、約１：１（ｖ／ｖ）、約１．５：１（ｖ／ｖ）、約２：１（ｖ／ｖ）、約２．５：１（ｖ／ｖ）、約３：１（ｖ／ｖ）、約３．５：１（ｖ／ｖ）、約４：１（ｖ／ｖ）、約５：１（ｖ／ｖ）、約１０：１（ｖ／ｖ）、約１：１．５（ｖ／ｖ）、約１：２（ｖ／ｖ）、約１：２．５（ｖ／ｖ）、約１：３（ｖ／ｖ）、約１：３．５（ｖ／ｖ）、約１：４（ｖ／ｖ）、約１：１．５（ｖ／ｖ）または約１：１．１０（ｖ／ｖ）などで合わせてもよい。
【０２３１】
複合体形成後組成物（例えば、ＲＮＡ−エマルジョン複合体）の各成分の濃度は、使用される、複合体形成前水中油型エマルジョンおよび核酸分子を含む水性溶液（例えば、ＲＮＡ水性溶液）の相対量に従って、容易に決定できる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンが、１：１（ｖ：ｖ）比で核酸分子を含む水性溶液（例えば、ＲＮＡ水性溶液）と合わされる場合には、油およびカチオン性脂質の濃度は、複合体形成前エマルジョンのものの１／２となる。したがって、４．３％（ｗ／ｖ）スクアレン、１．４ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰ、０．５％  ｖ／ｖ  ＳＰＡＮ（登録商標）８５および０．５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むエマルジョン（本明細書において「ＣＮＥ１７」と呼ばれる）が、５６０ｍＭスクロース、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭクエン酸塩および１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含むＲＮＡ水性溶液と、１：１（ｖ：ｖ）で合わされる場合には、複合体形成後組成物は、２．１５％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．７ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰ、０．２５％  ｖ／ｖ  ＳＰＡＮ（登録商標）８５、０．２５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、２８０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭクエン酸塩および０．５％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含む。
【０２３２】
粒子形成を促し、核酸分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、核酸分子の安定性を増大し（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防ぎ）、核酸分子（ＲＮＡ分子など）の適切な脱複合体形成／放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防ぐ、さらなる必要に応じたステップが含まれてもよい。例えば、ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）または界面活性剤を、核酸分子（ＲＮＡなど）を含む水性溶液に添加してもよい。例示的一実施形態では、エマルジョン粒子との複合体形成の前に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７がＲＮＡ分子に添加される。
【０２３３】
エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比（比を増大すると、液滴のサイズが減少する）、運転圧力（運転圧力を増大すると、液滴のサイズが減少する）、温度（温度を高めると、液滴のサイズが減少する）およびその他の処理パラメータを変更することによって変えることができる。実際の粒子サイズは、使用される特定の界面活性剤、油およびカチオン性脂質によって、選択された特定の運転条件によっても変わる。エマルジョン粒子サイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造された、市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（モデルＮ４ＭＤ）などの分粒機器（ｓｉｚｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用することによって確認でき、粒子の平均直径が、８０ｎｍ〜１８０ｎｍの平均直径を有する。
【０２３４】
カチオン性水中油型エマルジョン（複合体形成前エマルジョン）または核酸分子−エマルジョン複合体を調製するための必要に応じたプロセスとして、例えば、滅菌、粒子サイズ選択（例えば、大きな粒子を除去すること）、充填、パッケージングおよび標識などが挙げられる。
【０２３５】
例えば、複合体形成前エマルジョンまたは核酸分子−エマルジョン複合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために製剤化される場合には、例えば、滅菌グレードフィルターを通した（例えば、０．２２ミクロンフィルターを通した）濾過によって滅菌され得る。その他の滅菌技術として、熱プロセスまたは放射線滅菌プロセスまたは滅菌組成物を製造するためにパルス光を使用することが挙げられる。
【０２３６】
本明細書に記載されたカチオン性水中油型エマルジョンを使用してワクチンを製造してもよい。ＭＦ５９について記載されたような同様の方法を使用して、滅菌および／または臨床グレードのカチオン性水中油型エマルジョンを調製できる。例えば、ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＤＪＵＶＡＮＴＳ（Ｏ’Ｈａｇａｎ編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ中の、Ｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００年、第４２巻、２１１〜２２８頁参照のこと。例えば、ＭＦ５９の製造プロセスと同様に、エマルジョンの油相および水相を合わせ、インラインホモジナイザーにおいて処理して、粗エマルジョンを得ることができる。次いで、粗エマルジョンをマイクロフルイダイザー中に送り、そこでさらに処理して、安定なサブミクロンエマルジョンを得ることができる。粗エマルジョンを、所望の粒子サイズが得られるまで、マイクロフルイダイザーの相互作用チャンバーに繰り返し通してもよい。次いで、バルクエマルジョンを濾過して（例えば、窒素下で０．２２μｍフィルターを通して）、大きな粒子を除去し、エマルジョンバルクを得、これを適した容器（例えば、ガラス瓶）中に充填してもよい。自己貯蔵（ｓｅｌｆ  ｓｔｏｒａｇｅ）について、水中油型エマルジョンの存在下での長期の安定性を実証したワクチン抗原については、抗原およびエマルジョンを合わせ、無菌濾過（例えば、０．２２μｍフィルターメンブランを通して）してもよい。合わせた単一バイアルワクチンを、単回用量容器中に充填してもよい。長期の安定性が実証されていないワクチン抗原については、エマルジョンを別個のバイアルとして供給することができる。このような場合には、エマルジョンバルクを濾過滅菌（例えば、０．２２μｍフィルターメンブランを通して）し、最終単回用量バイアルに充填し、パッケージングしてもよい。
【０２３７】
品質管理は、場合により、エマルジョンバルクまたは混合ワクチンの小サンプルで実施してもよく、サンプルが品質管理試験に合格する場合にのみ、バルクまたは混合ワクチンを用量にパッケージングする。
【０２３８】
６．医薬組成物および投与
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子を含む医薬組成物を提供し、１種または複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる免疫原性組成物である。
【０２３９】
本明細書において記載された組成物を使用して、核酸分子を細胞に送達してもよい。例えば、種々の目的のために、例えば、遺伝子療法などのために、所望の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の産生を誘導するために、遺伝子の発現を調節するために、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達することができる。また、本明細書に記載された組成物を使用して、治療目的で、例えば、がんまたは増殖性障害、代謝疾患、心血管疾患、感染、アレルギーなどの疾患を処置するために、免疫応答を誘導するなどのために、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達してもよい。例えば、標的遺伝子の発現を阻害するために、核酸分子を細胞に送達してもよい。このような核酸分子として、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡなどが挙げられる。低分子干渉ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ分子は、対応する標的遺伝子を特異的にサイレンシングする（遺伝子ノックダウン）ＲＮＡ干渉を引き起こし得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。一般に、アンチセンスＲＮＡは、特定のメッセンジャーＲＮＡ鎖のタンパク質翻訳を、それと結合することによって妨げることができる。アンチセンスＤＮＡを使用して、特異的な、相補的な（コーディングまたは非コーディング）ＲＮＡを標的とすることができる。したがって、本明細書に記載されたカチオン性エマルジョンは、例えば、がんの処置のために（腫瘍学標的の産生を阻害することによる）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡを送達するのに有用である。
【０２４０】
本明細書において提供された医薬組成物は、単独で投与しても、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。投与法として、それだけには限らないが、経口投与、直腸投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、眼部投与および耳への投与が挙げられる。
【０２４１】
本明細書に記載された組成物の治療上有効な量は、とりわけ、示された疾患、疾患の重篤度、被験体の年齢および関連のある健康状態、投与される化合物の効力、投与様式および所望の処置に応じて変わる。
【０２４２】
その他の実施形態では、本明細書に記載された医薬組成物は、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。さらなる治療薬として、それだけには限らないが、抗生物質、抗菌薬、制吐薬、抗真菌薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、サイトカイン、抗うつ剤、ホルモン、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞増殖抑制剤、抗浸潤薬（ａｎｔｉ−ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生薬、ウイルス複製の増殖因子機能阻害剤の阻害剤、ウイルス酵素阻害剤、抗がん剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、リバビリン、ホルモン、その他のトル様受容体モジュレーター、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＩｇ機能を調節する抗体（抗ＩｇＥ（オマリズマブ）など）が挙げられる。
【０２４３】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、性器疣贅、尋常性疣贅、足底疣贅、狂犬病、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、デングウイルス、黄熱病、単純ヘルペスウイルス（ほんの一例として、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶまたはＶＺＶ）、伝染性軟属腫、ワクシニア、痘瘡、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ライノウイルス、エンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１）、アデノウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス（ほんの一例として、ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルスおよびラッサ熱）およびフィロウイルス（ほんの一例として、エボラウイルスまたはマールブルグウイルス）などのウイルス性疾患をはじめとする、本明細書に開示された病原体によって引き起こされる疾患をはじめとする感染性疾患の処置において使用される。
【０２４４】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、マラリア、結核およびｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、ハンセン病；ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉ、クリプトスポリジウム症、ヒストプラスマ症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染、リーシュマニア症、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｈｌａｍｙｄｉａ属の細菌によって引き起こされる感染ならびにカンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症およびクリプトコッカス髄膜炎などの真菌感染症をはじめとする細菌感染症、真菌感染症および原生動物感染症の処置において使用される。
【０２４５】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、同種移植片拒絶、自己免疫およびアレルギー、がん、または瘢痕および皺などの損傷を受けた皮膚もしくは加齢皮膚をはじめとする、呼吸器疾患および／または障害、皮膚科障害、眼性疾患および／または障害、泌尿生殖器疾患および／または障害の処置において使用される。
【０２４６】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に開示された組成物を投与するステップを含む、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において、免疫応答を発生させるかまたは強化する方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体および／または細胞媒介性免疫を含む。本方法は、一次免疫応答を誘導するため、および／または免疫応答をブースト（ｂｏｏｓｔ）するために使用してもよい。
【０２４７】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、例えば、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を引き起こすかまたは増強することにおいて使用するための、医薬として使用してもよい。
【０２４８】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を発生させるかまたは強化するための医薬の製造において使用してもよい。
【０２４９】
本発明はまた、本明細書に開示された組成物またはワクチンを予め充填された送達デバイスを提供する。
【０２５０】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトであるが、本明細書の範囲内の病原体は、広範な種にわたって問題となり得るので、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ネコまたはイヌであってもよい。ワクチンが、予防的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児または乳児）、十代の若者または成人であり；ワクチンが、治療的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。小児を対象としたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。
【０２５１】
治療的処置の有効性を調べる１つの方法は、本明細書に開示された組成物またはワクチンの投与後に病原体感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を調べる１つの方法は、抗原に対する免疫応答を全身的にモニタリングすること（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生のレベルをモニタリングすることなど）および／または粘膜的にモニタリングすること（ＩｇＡ産生のレベルをモニタリングすることなど）を含む。通常、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後およびチャレンジ後に決定されるのに対し、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後であるが、チャレンジ前に決定される。
【０２５２】
核酸分子（例えば、ＲＮＡ）がタンパク質抗原をコードする、本明細書に開示された組成物またはワクチンの免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えによってタンパク質抗原を発現させることである。タンパク質と患者サンプルとの間の陽性反応は、患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法はまた、免疫優性抗原および／またはタンパク質抗原内のエピトープを同定するために使用してもよい。
【０２５３】
組成物の有効性はまた、目的の感染症の病原体の適切な動物モデルをチャレンジすることによってｉｎ  ｖｉｖｏで決定できる。
【０２５４】
投与量は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／またはブースタースケジュールにおいて使用してよい。複数回用量スケジュールでは、種々の用量を、同一または異なる経路、例えば、非経口の一次免疫および粘膜のブースト、粘膜の一次免疫および非経口のブーストなどによって与えてもよい。複数回用量は、通常、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔で投与する。
【０２５５】
１種もしくは複数の抗原を含むか、または１種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、小児および成人の両方を処置するために使用できる。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。組成物を受け取るのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、＞５０歳、＞６０歳、好ましくは、＞６５歳）、若年者（例えば、＜５歳）、入院患者、医療従事者、軍職員および軍人、妊婦、慢性疾患患者または免疫不全患者である。しかし、組成物は、これらの群にのみ適しているのではなく、集団においてより全般的に使用してもよい。
【０２５６】
１種もしくは複数の抗原を含むか、または１種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、その他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同一の医療相談または医療専門家もしくは予防接種センターへの訪問の際に）、例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．インフルエンザｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（四価Ａ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に患者に投与してもよい。
【０２５７】
特定の実施形態では、本明細書において提供された組成物は、１種もしくは複数のアジュバントなどの免疫調節剤を含むか、または場合により含んでもよい。例示的アジュバントとして、それだけには限らないが、以下でさらに論じるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書において提供された免疫原性組成物において使用されるアジュバントとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
１．ミネラル含有組成物；
２．油エマルジョン；
３．サポニン製剤；
４．ビロソームおよびウイルス様粒子；
５．細菌または微生物誘導体；
６．生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）；
７．リポソーム；
８．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；
９．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；
１０．ムラミルペプチド；
１１．イミダゾキノロン化合物；
１２．チオセミカルバゾン化合物；
１３．トリプタントリン化合物；
１４．ヒト免疫調節物質；
１５．リポペプチド；
１６．ベンゾナフチリジン；
１７．微粒子
１８．免疫賦活性ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡなど；例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド）。
【実施例】
【０２５８】
例示
ここで、一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。これらは、単に本発明の特定の態様および実施形態を例示する目的で含まれるのであって、本発明を制限しようとするものではない。
【０２５９】
（実施例１）
カチオン性水中油型エマルジョン
スクアレン、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、Ｌｉｐｏｉｄ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０２６０】
これらの研究で使用したエマルジョンの成分を、表１に示す。
【表１】
2014522840.tif 000008
【０２６１】
ＣＮＥを、以前に記載のように（Ｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７９巻、１−５頁、２００２年）、荷電ＭＦ５９と同様に調製した。前記プロセスの１つの大幅な修正を行ってＣＭＦ  ３２、３４、および３５を調製した。ＤＯＴＡＰをスクアレンに直接溶解し、有機溶媒を使用しなかった。１．６ｍｇ／ｍｌ超のＤＯＴＡＰを含むエマルジョン中に溶媒を含めることによって供給材料が泡状になり、エマルジョンを生成するための顕微溶液化が行うことができないことを見出した。スクアレンの３７℃への加熱によってＤＯＴＡＰをスクアレンに直接溶解することが可能であり、次いで、油相を（例えば、均質化によって）水相中に首尾よく分散させて、エマルジョンを作製することができる。ＤＯＴＡＰはスクアレンに可溶性であり、表１に列挙されるよりも高濃度のＤＯＴＡＰをスクアレン中で達成することができる。しかし、高用量のＤＯＴＡＰは有毒作用を有し得ることが報告されている。例えば、Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１１巻（８）：１１２７−３１頁（１９９４年）を参照のこと。
【０２６２】
簡潔に述べれば、スクアレンを３７℃に加熱し、ＤＯＴＡＰをＳＰＡＮ８５の存在下でスクアレンに直接溶解した。次いで、得られた油相を水相（Ｔｗｅｅｎ８０を含むクエン酸バッファー）と合わせ、直ちにＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザーを使用して２４Ｋ  ＲＰＭで２分間均質化して均質な供給原料（一次エマルジョン）を生成した。一次エマルジョンを、氷浴冷却コイルを備えたＭ−１１０ＳマイクロフルイダイザーまたはＭ−１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）におよそ１５Ｋ〜２０Ｋ  ＰＳＩの均質化圧力で３〜５回通した。２０ｍｌバッチサンプルをユニットから取り出し、４℃で保存した。
【０２６３】
ＣＮＥ成分の濃度は、表１に記載のように、エマルジョンを調製するために使用したこれらの成分の初期量にしたがって計算した濃度であることに留意すべきである。エマルジョン生成プロセス中または濾過滅菌プロセス中に、少量のスクアレン、ＤＯＴＡＰ、または他の成分が失われる場合があり、最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージングされ、滅菌されたエマルジョン）中のこれらの成分の実際の濃度は、わずかに低い場合がある（時折約２０％まで）ことが理解される。時折、最終生成物中の成分の実際の濃度は、約２５％または約３５％まで、わずかに低い場合がある。しかし、当該技術分野における従来の慣例により、最終生成物中の実際の濃度の代わりに、エマルジョンを調製するために使用される初期量に基づいた特定の成分の濃度を記載する。
【０２６４】
ＲＮＡ合成
アルファウイルスレプリコン（自己複製ＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡの合成のための鋳型として使用した。各レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要な遺伝子エレメントを含有するが、粒子アッセンブリに必要な遺伝子産物をコードする配列を欠く。アルファウイルスゲノムの構造遺伝子を異種タンパク質（その発現が、アルファウイルスサブゲノムプロモーターによって駆動される）をコードする配列によって置換した。レプリコンが真核細胞へ送達されると、プラス鎖ＲＮＡが翻訳されて、４種の非構造タンパク質が生じ、これはゲノムＲＮＡを一緒に複製し、異種タンパク質をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現がないために、レプリコンは、感染粒子を生成できない。バクテリオファージＴ７プロモーターを、アルファウイルスｃＤＮＡの上流に配置して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでレプリコンＲＮＡの合成を促進し、ポリ（Ａ）テールのすぐ下流に位置するデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムが、その自己切断活性によって正しい３’末端を作製する。
【０２６５】
適した制限エンドヌクレアーゼを用いて、ＨＤＶリボザイムの下流でプラスミドＤＮＡを線状化した後、Ｔ７またはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでランオフ転写物を合成した。転写は、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって提供された使用説明書に従って、７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）または５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）最終濃度の各ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の存在下、３７℃で２時間実施した。転写後、鋳型ＤＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて消化した。レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。非キャッピングＲＮＡを、ユーザーマニュアルに概説されるように、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してワクシニアキャップ形成酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）（ＶＣＥ）を用いて転写後にキャッピングした。転写後キャッピングＲＮＡをＬｉＣｌを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。あるいは、レプリコンを、６ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して）または４ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに対して）のｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、非可逆性キャップ構造類似体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を転写反応物に補充すること、およびグアノシン三リン酸の濃度を１．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して）または１ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに対して）に低下させることによってキャッピングしてもよい。次いで、転写物をＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）消化と、それに続くＬｉＣＬ沈殿および７５％エタノールでの洗浄によって精製してもよい。
【０２６６】
ＲＮＡサンプルの濃度は、２６０ｎｍで光学濃度を測定することによって決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物の完全性は、全長構築物の存在について変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２６７】
ＲＮＡ複合体形成
溶液中の窒素数を、カチオン性脂質濃度から算出した。例えば、ＤＯＴＡＰは、分子あたり１個のプロトン化され得る窒素を有する。ＲＮＡ濃度を使用し、ＲＮＡ１マイクログラムあたり３ｎｍｏｌのリン酸という推定値を使用して溶液中のリン酸量を算出した。ＲＮＡ：脂質の量を変えることによって、Ｎ／Ｐ比を改変することができる。ＲＮＡを様々な窒素／リン酸比（Ｎ／Ｐ）でＣＮＥと複合体形成させた。Ｎ／Ｐ比の算出は、１ミリリットルあたりのエマルジョン中のプロトン化できる窒素のモル数を算出することによって行った。リン酸数を算出するために、ＲＮＡ１マイクログラムあたり３ｎｍｏｌのリン酸という定数を使用した。値を決定した後、ＲＮＡに適切な割合のエマルジョンを添加した。これらの値を使用して、ＲＮＡを適切な濃度に希釈し、軽くボルテックス処理しながら等容積のエマルジョン中に直接添加した。溶液をおよそ２時間室温に放置した。複合体形成後、得られた溶液を適切な濃度に希釈し、１時間以内に使用した。
【０２６８】
粒子サイズアッセイ
エマルジョンの粒子サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。粒子サイズは、多分散指数（ｐｄｉ）とともにＺ平均（ＺＡｖｅ）として報告した。測定の前にすべてのサンプルを水で希釈した。さらに、エマルジョンの粒子サイズは、Ｈｏｒｉｂａ  ＬＡ−９３０粒子サイズ分析計（Ｈｏｒｉｂａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して測定した。測定の前にサンプルを水で希釈した。ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用し、希釈サンプルを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。
【０２６９】
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ
抗原産生の動態および量を評価するために、ＳＥＡＰをコードするＲＮＡレプリコンを、製剤化しておよび製剤化せずにマウス筋肉内に投与した。８〜１０週齢の、約２０ｇの体重の３または５匹の雌性のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を、ＳＥＡＰをコードするレプリコンＲＮＡと複合体を形成したＣＮＥを用いて免疫化した。裸のＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー１×ＰＢＳ中で製剤化した。各マウスに、四頭筋中に１００μｌ用量を投与した（部位あたり５０μｌ）。注射の１、３および６日後に血液サンプルを採取した。採取後直ちに血清を血液から分離し、使用まで−３０℃で保存した。
【０２７０】
化学発光ＳＥＡＰアッセイＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、血清を分析した。マウス血清を、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈バッファーで１：４希釈した。サンプルを水浴中に入れ、アルミニウム密閉ホイルで密閉し、６５℃で３０分間熱不活化した。氷上で３分間冷却し、室温に平衡化した後、ウェルに５０μＬのＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔアッセイバッファーを添加し、サンプルを室温で５分間静置した。次いで、１：２０  ＣＳＰＤ（登録商標）（化学発光アルカリホスファターゼ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）基質）基質を含有する５０μＬの反応バッファーを添加し、室温で２０分インキュベートした後、発光を測定した。発光は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０ルミノメーター（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）で、ウェルあたり１秒の積算を用いて測定した。各サンプル中のＳＥＡＰの活性は、２連で測定し、これら２回の測定値の平均が示されている。
【０２７１】
（実施例２）
免疫原性に対する粒子サイズの影響
この実施例は、粒子サイズが、ＣＮＥ／ＲＮＡ製剤の免疫原性に影響を及ぼすことを示す。
【０２７２】
Ａ．粒子サイズアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイのプロトコールは、実施例１に記載されている。マウス免疫原性研究のプロトコールは、実施例３に記載されている。図１Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＥＡＰアッセイの結果（算術平均）を示す。図１Ｂは、２ｗｐ１および２ｗｐ２の時点でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける個々の動物の全ＩｇＧ力価を示す。
【０２７３】
ＣＮＥ１７とＲＮＡの複合体形成は、約２２０ｎｍから約３００ｎｍへとエマルジョン粒子のサイズを増大させた。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、粒子サイズが増大するにつれ、ＳＥＡＰの発現レベルは低下し、宿主免疫応答も減少した。
【０２７４】
Ｂ．異なるサイズで調製したＣＭＦ３４を、７：１の理論上のＮ／Ｐ比でＲＳＶ−ＦをコードするＲＮＡと複合体形成し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの四頭筋の両側に注射した（０．０５ｍｌ／部位）。エマルジョン粒子サイズを、マイクロフルイダイザーの処理圧力の増加によって調整した。データ（表２）は、エマルジョン粒子サイズがより小さかった場合（１２０ｎｍおよび９０ｎｍの粒子を参照のこと）、最初の免疫化の２週間後に最も高い抗ＲＳＶ  Ｆ力価が得られたことを示す。
【表２】
2014522840.tif 000009
【０２７５】
（実施例３）
免疫原性および粒子サイズに対するバッファー組成の影響
この実施例では、ＣＮＥ１７をベースとするが、異なるバッファー成分を含む種々のエマルジョンを調製した。表３は、バッファーが改変されたエマルジョンの組成を示す。
【表３】
2014522840.tif 000010
【０２７６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、クエン酸バッファーの濃度の低減が、ＲＮＡをより緊密に結合させたことを示した。
【０２７７】
マウス免疫原性研究から得られた結果は、ＣＮＥ１７に糖を添加することは、ＣＮＥ１７を用いて製剤化されたＲＮＡの免疫原性に大きく影響を与えなかったことを示した（表４、群９〜１２）。ソルビトールおよびデキストロースの添加でＩｇＧ力価のわずかな増大が観察された。
【表４】
2014522840.tif 000011
【０２７８】
表５には、ＣＮＥ１７を用いて製剤化されたＲＮＡが種々のバッファー系を使用して調製された場合の、マウス免疫原性研究の結果が要約されている。
【表５】
2014522840.tif 000012
＊ｖＡ３７５レプリコン、＊＊ｖＡ３１７レプリコン。レプリコンは、ＨＥＰＥＳバッファー中で転写されたＡｍｂｉｏｎであり、次いで、（ｉ）ＬｉＣｌ沈殿され、（ｉｉ）トリスバッファー中でキャッピングされ、（ｉｉｉ）ＬｉＣｌ沈殿された。すべての群は、８匹の動物／群を有していた。
【０２７９】
種々のバッファー組成も粒子サイズに影響を及ぼした。図２Ａに示されたように、糖（スクロース）の添加は、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズを減少させ、低濃度の（１０ｍＭの）ＮａＣｌの添加もＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズを減少させた（図２Ａ）。クエン酸バッファーは、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズに影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。
【０２８０】
粒子サイズに対するポリマーの影響が、図２Ｃに示されている。特に、ＲＮＡバッファーへの０．５％  ｐｌｅｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７の添加は、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズを複合体形成前のサイズ（ＲＮＡを含まないＣＮＥ粒子）に減少させた。
【０２８１】
好ましいバッファー系、２８０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭクエン酸塩；または２８０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭクエン酸塩および０．５％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７におけるＣＮＥ１７の全抗体力価および中和抗体力価が、表５に示されている（群４および５）。
【０２８２】
（実施例４）
免疫原性に対するＮ／Ｐ比の影響
本実施例では、ＲＳＶ  Ｆ抗原をコードするＲＮＡレプリコンｖＡ３７５を、１０：１のＮ／ＰでＣＮＥ１７と複合体形成したリポソーム（ＲＶ０１）ならびに１２；１、１０：１、８：１、６：１、および４：１の理論上のＮ／ＰでＣＭＦ３２またはＣＭＦ３４と複合体形成したリポソーム（ＲＶ０１）として製剤化した。理論上のＮ／Ｐ比は、製剤を調製するために使用したＤＯＴＡＰおよびＲＮＡの初期量にしたがって計算したＮ／Ｐ比を反映する。エマルジョンの調製中に少量のＤＯＴＡＰが喪失したので、実際のＮ／Ｐ比は理論上のＮ／Ｐ比よりわずかに低かった。ＧＭＴデータは、各群内の各マウスの平均ｌｏｇ１０力価を反映している（８マウス／群）。全製剤を、免疫化前にスクロースを使用して３００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整した。ＣＭＦ３２製剤またはＣＭＦ３４製剤のいずれを使用しても、忍容性に関する明確な問題（例えば、体重、初期血清サイトカイン）は認められなかった。
【０２８３】
実際のＮ／Ｐ比を、荷電化粒子検出器（Ｃｏｒｏｎａ  Ｕｌｔｒａ、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ）を備えたＨＰＬＣを使用したＣＮＥバッチまたはＣＭＦバッチ中のＤＯＴＡＰ含有量の定量によって決定した。ＣＮＥおよびＣＭＦサンプルをイソプロパノールで希釈し、ＸＴｅｒａ  Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ  ３．５ｕｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に注入した。曲線下面積をクロマトグラム内のＤＯＴＡＰピークから取り、濃度をＤＯＴＡＰ検量線から内挿によって求めた。実際のＤＯＴＡＰ濃度を使用して、実際のＮ／Ｐ比を計算した。
【０２８４】
表６中の免疫原性データは、実際のＮ／Ｐ比が少なくとも４：１である場合に良好な力価が得られたことを示す。
【表６】
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【０２８５】
配列
Ａ３１７（配列番号１）
【０２８６】
Ａ３７５（配列番号２）
【０２８７】
本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示を踏まえると、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであって、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。当業者ならば、多数のその他の実施形態が、本発明によって包含されることは容易に認識しよう。本開示内容中に引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりその全文が組み込まれる。参照によって組み込まれる材料が、この明細書と相反するかまたは矛盾する範囲においては、本明細書が任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であると認めることではない。
【０２８８】
当業者ならば、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するだろうし、慣例的な実験程度を使用して確認できる。このような等価物は、以下の実施形態によって包含されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月6日(2014.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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