(57)【要約】  本発明は、増殖分化因子タンパク質を含有する、新規の不織布を対象とするものである。前記新規の不織布は、哺乳動物組織の組織再生及び創傷治癒プロセスを加速するために、特別に設計されたものである。更に、本発明は、かかる新規の不織布を含む、創傷被覆材、（創傷）パッド、又はインプラントを提供するものである。（具体的には、生体吸収性及び／又は生体適合性ポリマーを含む繊維原料でできており、繊維内に少なくとも１種の生物活性物質が分布した繊維を含み、前記生物活性物質はＧＤＦ−５関連タンパク質である不織布に関する。）【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性及び／又は生体適合性ポリマーを含む繊維原料からなり、繊維内に少なくとも１種の生物活性物質が分布した繊維を含み、前記生物活性物質はＧＤＦ−５関連タンパク質である不織布。
【請求項２】
繊維上に、更に生物活性タンパク質が分布している請求項１に記載の不織布。
【請求項３】
ＧＤＦ−５関連タンパク質が、配列番号２に示すヒトＧＤＦ−５のアミノ酸配列４００位〜５０１位における、１０２のアミノ酸シスチンノットドメインに対して、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列のシスチンノットドメインを含むタンパク質である請求項１又は請求項２に記載の不織布。
【請求項４】
ＧＤＦ−５関連タンパク質が、ヒトＧＤＦ−５における１０２のアミノ酸シスチンノットドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列のシスチンノットドメインを含む請求項３に記載の不織布。
【請求項５】
繊維原料が、修飾され又は修飾されていない、天然ポリマー、合成ポリマー、及び化石原料由来ポリマー、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１〜請求項４のいずれかに記載の不織布。
【請求項６】
天然ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、カゼインのようなポリペプチド、又はデキストラン、セルロース、デンプン、キチン、キトサン、アルギネートやヒアルロン酸のような多糖、又はポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、
合成ポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエステル、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項５に記載の不織布。
【請求項７】
物質がフィラメント中に分散している請求項１〜請求項６のいずれかに記載の不織布。
【請求項８】
分散している物質が、ヒドロキシルアパタイト及び／又はβ−リン酸三カルシウムのような無機物質の群から選択される請求項７に記載の不織布。
【請求項９】
回転紡糸方法によって作製し、又は作製される請求項１〜請求項８のいずれかに記載の不織布。
【請求項１０】
繊維の少なくともいくつかが互いに撚り合わされ、又は、互いに絡み合わされたものであり、撚り合わさった構造を有し、繊維の少なくともいくつかが互いに絡み合っており、少なくとも１つの繊維束を形成している請求項１〜請求項９のいずれかに記載の不織布。
【請求項１１】
繊維の少なくともいくつかがナノ繊維である請求項１〜請求項１０のいずれかに記載の不織布。
【請求項１２】
０．０１〜１００Ｌ／ｍｉｎ・ｃｍ２の通気性を有する開いた細孔構造を含む請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の不織布。
【請求項１３】
生理的条件下（ＰＢＳ緩衝液、１０％ウシ胎仔血清、３７℃）で、生物活性物質の少なくとも１０％が３〜７日以内に放出する請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の不織布。
【請求項１４】
糖尿病性潰瘍及び他の潰瘍、熱傷、皮膚傷害及び／若しくは皮膚グラフトを含めた創傷の治癒の改善、神経成長を誘導する若しくは神経細胞死の予防、血管新生の促進、又は、前駆細胞及び／若しくは骨髄細胞の増殖の誘導のため、又は、
臓器若しくは組織を移植するための組織若しくは細胞の処理若しくは保存、増殖若しくは分化の状態を維持するため、又は、
骨格要素に対する関節に係わる変性障害の治療、並びに／又は半月板及び／若しくは脊椎／椎間板の修復のために用いられる請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の不織布。
【請求項１５】
皮膚組織、結合組織、骨、軟骨、結合組織性付着、腱、靭帯、脊椎／椎間板、半月板、歯の組織、象牙質、歯根膜、毛髪、感覚系の組織、肝臓組織、膵臓組織、心臓組織、血管組織、腎臓組織、子宮組織、甲状腺組織、粘膜、内皮、上皮又は神経組織からなる群から選択される組織の再生を促進するために用いられる請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の不織布。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１５のいずれかに記載の不織布を含む創傷被覆材、創傷パッド又はインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖分化因子タンパク質を含有する新規の不織布を対象とする。この布は、哺乳動物組織の組織再生及び創傷治癒プロセスを加速するために特別に設計されている。更に、本発明は、かかる新規の不織布を含む創傷被覆材、（創傷）パッド、及びインプラントを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＦ−５（Ｈｏｅｔｔｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４巻、６４６〜６５２頁）は、いくつかの組織において細胞増殖、分化及び／又は組織形成を促進することが示されているモルフォゲンである。このタンパク質は、形態形成タンパク質ＭＰ５２、骨形成タンパク質−１４（ＢＭＰ−１４）又は軟骨由来形態形成タンパク質−１（ＣＤＭＰ−１）としても公知である。ＧＤＦ−５は、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７と密接に関連する。これらの３つのタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの別個のサブグループを形成するため、同等の生物学的性質及び特に高いアミノ酸配列同一性を示す（Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００巻、３２１〜３３０頁を参照のこと）。ファミリーメンバーは全て、まず、大きな前駆体タンパク質として合成された後、Ｃ末端からおよそ１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターにおいてタンパク質分解性の切断を受けて、Ｎ末端プロドメインよりＣ末端成熟タンパク質部位が放出される。成熟ポリペプチドは構造的に関連し、これらのタンパク質は、特徴的な三次元の「シスチンノット」モチーフに関与する６つ又は７つの正準システイン残基を含む保存された生理活性ドメインを含有する。生来（ネイティブ）のＧＤＦ−５関連タンパク質はホモ二量体分子であり、主に、Ｉ型及びII型セリン／トレオニン受容体キナーゼで構成される特異的な受容体複合体と、相互作用することによって作用する。その後、受容体キナーゼによりＳｍａｄタンパク質が活性化され、次いで、それにより核内にシグナルが伝播されて標的遺伝子の発現が調節される。
【０００３】
ＧＤＦ−５／−６／−７サブグループのメンバーが、最も重要な骨及び軟骨の誘導因子及び調節因子であることは、繰り返し実証されている（Ｃｈｅｎｇら、２００３年、Ｊ．Ｂｏｎｅ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．８５Ａ巻、１５４４〜１５５２頁；Ｓｅｔｔｌｅら、２００３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ．Ｂｉｏｌ．２５４巻、１１６〜１３０頁）。ＧＤＦ−５は、神経系における天然の増殖因子である（例えば、国際公開第９７／０３１８８号パンフレット；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎら、（１９９５年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．４２巻、７２４〜７３２頁；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、（１９９７年）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２３３巻、７３〜７６頁；Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９８年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０巻、３６８１〜３６８８頁を参照されたい）。更に、ＧＤＦ−５は、例えば、皮膚関連組織の成長を調節するため（国際公開第０２／０７６４９４号パンフレット；Ｂａｔｔａｇｌｉａら、２００２年、Ｔｒａｎｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．２７巻、５８４頁）、及び血管新生のプロセスを誘導するため（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９７年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５巻、２１８〜２６頁）に有用である。
【０００４】
ＧＤＦ−５等の増殖因子タンパク質は、上記した独特の組織誘導活性が発見された後、治療的研究及び再生外科手術に上手く適用されており、種々の損傷を受けた組織について、生来の治癒プロセスを単独又は特定のマトリックス材料との組み合わせのいずれかにより促進し、補助している。生物活性のある成熟ＧＤＦ−５関連タンパク質を含むいくつかの医薬組成物が開発されてきたが（例えば、国際公開第９６／３３２１５号パンフレットを参照されたい）、それにもかかわらず、成熟タンパク質は生理的条件下でいくつかの固体材料と相互作用し、例外的に溶解性が乏しくなる傾向があり、このため、ＧＤＦ−５の処方及び取扱いには未だに問題がある。成熟ＧＤＦ−５／ＭＰ５２のｐＨ依存性の溶解性プロファイル（欧州特許出願公開第１４６２１２６号明細書）には、このタンパク質が、ｐＨ４．２５を超える水溶液中で沈殿し始め、ｐＨ５〜ｐＨ９でほとんど不溶性になることが示されている。
【０００５】
一方、創傷治癒のために、種々の形態、サイズ、材料の、ローション状の外科用被覆材や、固体状の外科用被覆材が開発されている。それらは、主に、半滅菌（ｓｅｍｉ−ｓｔｅｒｉｌｅ）条件下で、創傷を確実に閉じるために設計されている。これらの被覆材のいくつかは、例えばコラーゲン等の有機材料で構成されており、他のデバイス（材料）としては、例えば非結晶熱可塑性ポリマー等の合成材料から構成されている。最新鋭の創傷被覆材のいくつかは、追加の薬物送達機能を有する点を特徴としており、上皮増殖因子（ＥＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ／ベカプレルミン）のような、抗生物質、サイトカイン等の生理活性物質を投与できる。例えば、遺伝子操作されたＰＤＧＦにより、皮下組織内又はそれを越えて広がる糖尿病性足潰瘍を治療するために認可された、局部（０．０１％）創傷治癒ゲルとして、商品名Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）が市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９７／０３１８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０７６４９４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９６／３３２１５号パンフレット
【特許文献４】欧州特許出願公開第１４６２１２６号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｏｅｔｔｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４巻、６４６〜６５２頁
【非特許文献２】Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００巻、３２１〜３３０頁
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇら、２００３年、Ｊ．Ｂｏｎｅ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．８５Ａ巻、１５４４〜１５５２頁
【非特許文献４】Ｓｅｔｔｌｅら、２００３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ．Ｂｉｏｌ．２５４巻、１１６〜１３０頁
【非特許文献５】Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎら、（１９９５年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．４２巻、７２４〜７３２頁
【非特許文献６】Ｓｕｌｌｉｖａｎら、（１９９７年）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２３３巻、７３〜７６頁
【非特許文献７】Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９８年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０巻、３６８１〜３６８８頁
【非特許文献８】Ｂａｔｔａｇｌｉａら、２００２年、Ｔｒａｎｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．２７巻、５８４頁
【非特許文献９】Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９７年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５巻、２１８〜２６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
創傷治癒や、他の組織再生のために特に望ましいのは、増殖分化因子タンパク質をヒトの体に送り届けるための新規の布である。従って、本発明の目的は、新規の創傷治癒材料及びデバイスをもたらすことにより、ＧＤＦ−５及び関連するタンパク質の、治療用途における利用しやすさを改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
欧州特許出願公開第２０４２１９９号明細書に、生分解性創傷被覆材が記載されている。この創傷被覆材は、繊維原料でできた繊維を含む不織布で構成されており、この繊維は、少なくとも１種の生物活性物質を含む。生物活性物質として、特に抗菌物質又は抗生物質が提案されている。
【００１０】
ＧＤＦ−５及び関連するタンパク質に関する、治療用途での利用しやすさを改善する研究において、本出願の発明者等は、驚いたことに、欧州特許出願公開第２０４２１９９号明細書に記載されている繊維原料でできた繊維を含む不織布が、増殖分化因子タンパク質をヒトの体に送り届けるために特に適していることを見いだした。ＧＤＦ−５と生体吸収性不織物の組み合わせは、ＧＤＦ−５の適用において、予想外の有益な効果を示した。生分解性不織物により取扱い性が良好となり、併せて、成熟タンパク質の放出（ｅｌｕｔｅ）を増加させるＧＤＦ−５の基質（基材）となる。この組み合わせにより、ＧＤＦ−５について、局所的なやり方で投与を制御することが可能になる。従って、薬理学的作用を得たい部位に対して、増殖因子の効果を得ることが可能になる。この空間（局所）的な制御に加えて、生分解性不織物から溶出する生理活性ＧＤＦ−５の量が、所望の期間、例えば数日にわたって増加する。ＧＤＦ−５を不織布に組み込むことにより、ｐＨに依存して生じる沈殿の問題が解決され、固体材料との相互作用が最小限になるためである。
【００１１】
従って、本発明の主題は、生体吸収性ポリマーを含む繊維原料でできた繊維を含む不織布であって、繊維内にＧＤＦ−５関連タンパク質である少なくとも１種の生物活性物質が分布している不織布である。
【００１２】
定義
誤解及び多義性を回避するために、本明細書において頻繁に使用されるいくつかの用語を以下の通り定義し、例示する。
【００１３】
「シスチンノットドメイン（モチーフ）」という用語は、本明細書で使用される場合、即ちヒトＧＤＦ−５等のＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質の成熟部位に存在し、シスチンノットとして公知の三次元タンパク質構造を形成する、周知の保存されたシステインリッチアミノ酸領域を意味する。このドメイン（モチーフ）では、システイン残基同士の各配置が重要であるものの、生物活性を失わないように、わずかな変更しか許されない。シスチンノットドメインは、単独で十分に、タンパク質の生物学的機能があると実証されている（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒら（２００５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３２９巻、１０７６〜８６頁）。シスチンノットドメインのコンセンサス配列は、最先端技術分野において周知である。本明細書における定義によると、タンパク質のシスチンノットドメインは、それぞれのタンパク質のシスチンノットに関与する最初のシステイン残基で始まり、それぞれのタンパク質のシスチンノットに関与する最後のシステインの次の残基で終わる。例えば、ヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質のシスチンノットドメイン（配列番号２）は、アミノ酸（配列の）４００（位）〜５０１（位）からなる（図１も参照されたい）。
【００１４】
「ＧＤＦ−５関連タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト成長／分化因子５（ｈＧＤＦ−５）と非常に密接に関連し、天然に存在する任意のタンパク質、又は人工的に創出されたタンパク質を意味する。全てのＧＦＤ−５関連タンパク質の一般的な特徴は、ヒトＧＤＦ−５における１０２（個）のアミノ酸シスチンノットドメイン（配列番号２のアミノ酸（配列）の４００（位）〜５０１（位））に対し、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列のシスチンノットドメインが存在し、タンパク質の生物学的機能ために十分なことである。「ＧＤＦ−５関連タンパク質」という用語は、ヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインとの関係で上記した百分率を示す限り、脊椎動物種又は哺乳動物種由来のＧＤＦ−５タンパク質、ＧＤＦ−６タンパク質、及びＧＤＦ−７タンパク質の群に属するタンパク質、並びに、その組換え変異体を包含する。６０％の制限値は、タンパク質のＧＤＦ−５／−６／−７群のメンバー並びにその変異体を、関連性の低いＧＤＦ及びＢＭＰ等の、異なるタンパク質と分離するため非常に好適である。ヒトＧＤＦ−５、ヒトＧＤＦ−６及びヒトＧＤＦ−７の１０２のアミノ酸シスチンノットドメインの比較（図２を参照されたい）では、これらのタンパク質は、アミノ酸配列の同一性が高い。ヒトＧＤＦ−６は、ヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインと８７（８５％）の同一残基を共有し、ヒトＧＤＦ−７はヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインと８３（８１％）の同一残基を共有する。これまでに同定されている他の脊椎動物種由来及び哺乳動物種由来のＧＤＦ−５／−６／−７分子の各ドメインも、ヒトＧＤＦ−５と比較して、少なくとも７５％（７９％〜９９％）の非常に高い同一性の百分率を示す。対照的に、ＧＤＦ−５／−６／−７サブグループに属さないＧＤＦ及びＢＭＰは、６０％を下回る、はるかに低い同一性の値を示す（図３を参照されたい）。
【００１５】
関連するアミノ酸配列において、対応するアミノ酸位の決定並びに同一性の百分率は、周知のアラインメントアルゴリズムか、場合により、これらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラムを利用して容易に算出できる。例えば、本特許出願におけるアミノ酸同一性（即ち図２）は、フリーウェアプログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン１．８１）を初期状態のパラメータで用いて配列をアラインメントし、その後、同一の残基を目視カウントして算出したものである。ペアワイズアラインメント（遅い−正確（ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ））の初期設定は、ギャップオープニングパラメータ：１０．００；ギャップ伸長パラメータ０．１０；タンパク質重み行列：Ｇｏｎｎｅｔ２５０である。ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｐｌｅｗｎｉａｋ，Ｆ．、Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ，Ｆ．及びＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．（１９９７年）：ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４巻：４８７６〜４８８２頁に詳細に記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＸは、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントプログラム用のウインドウズインターフェースであり、即ち、種々の情報源から、即ち、ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ、ｆｔｐ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ、ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋからの作者不明のｆｔｐから、又は以下のウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ＢｉｏＩｎｆｏ／からダウンロードすることによって入手可能である。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム及びアルゴリズムは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．及びＧｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．（１９９４年）：ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２巻：４６７３〜４６８０頁にも詳細に記載されている。
【００１６】
ＧＤＦ−５関連タンパク質としては、ヒトＧＤＦ−５における１０２のアミノ酸シスチンノットドメインに対して少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を示すアミノ酸配列のものが、特に好ましい。
【００１７】
脊椎動物及び哺乳動物のＧＤＦ−５関連タンパク質について、非限定的な例としては、ヒトＧＤＦ−５の前駆体及び成熟タンパク質（国際公開第９５／０４８１９号パンフレットにおいてＭＰ５２として、及びＨｏｅｔｔｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４巻、６４６〜６５２頁においてヒトＧＤＦ−５として開示されている）、組換えヒト（ｒｈ）ＧＤＦ−５／ＭＰ５２（国際公開第９６／３３２１５号パンフレット）、ＭＰ５２Ａｒｇ（国際公開第９７／０６２５４号パンフレット）；ＨＭＷヒトＭＰ５２（国際公開第９７／０４０９５号パンフレット）、ＣＤＭＰ−１（国際公開第９６／１４３３５号パンフレット）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＧＤＦ−５（米国特許第５８０１０１４号明細書）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ＧＤＦ−５（Ｓａｎｙａｌら、２０００年、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、２０３〜２１０頁）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）ＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９８９６６９）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）ＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＴ９９３０３）、単量体ＧＤＦ−５（国際公開第０１／１１０４１号パンフレット及び国際公開第９９／６１６１１号パンフレット）、ヒトＧＤＦ−６／ＢＭＰ−１３（米国特許第５６５８８８２号明細書）、マウスＧＤＦ−６（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３８５５４）、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−２（国際公開第９６／１４３３５号パンフレット）、ヒトＧＤＦ−７／ＢＭＰ−１２（米国特許第５６５８８８２号明細書）、マウスＧＤＦ−７（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＰ９７７２１）、ＧＤＦ−７／ＣＤＭＰ−３（国際公開第９６／１４３３３５号パンフレット）である。置換、付加及び欠失等の追加的な突然変異を有するＧＤＦ−５関連タンパク質も、これらの追加的な突然変異によってタンパク質の生物活性が完全に無効にならない限りは、本発明に包含される。生物活性が改善されたＧＤＦ−５関連タンパク質の突然変異体は、好ましい変異体である。これらの突然変異体では、例えば、通常はヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質に存在する１つ又は複数の残基（図１を参照されたい）が、他のアミノ酸によって置換されている。ヒトＧＤＦ−５前駆体の４３８位のアルギニンがグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン又はアスパラギンで置き換えられており、且つ／又は、４３９位のセリンがアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、又はイソロイシンで置き換えられており、且つ／又は、４４５位のアスパラギンがセリン又はトレオニンで置き換えられている。別の高活性突然変異体では、４５３位のメチオニン及び／又は４５６位のメチオニンが、アラニン、バリン、又はイソロイシンで置き換えられている。４４１位のロイシンがプロリンで置き換えられている突然変異体も、特別興味深い。
【００１８】
「変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、以下のポリペプチドのいずれかを意味する。
ａ）タンパク質の生物活性断片、少なくともシスチンノットドメインを含むことが好ましい。
ｂ）アミノ酸置換を含有するタンパク質又は構成物の元の配列に対して、追加的な配列を過剰に含有する（生物学的機能の付加を伴う、又は伴わない）生物活性タンパク質構成物。
ｃ）ａ）及びｂ）の任意の組み合わせ。
【００１９】
「生物活性」は、例えば、実施例８又はＴａｋｕｗａら（１９８９年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５７巻、Ｅ７９７〜Ｅ８０３頁）に記載の通り一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）によって測定される。例えば、ＧＤＦ−５関連タンパク質を含めた化合物の活性を意味する。そのようなＡＬＰアッセイにおいて使用することができる適切な細胞株は、例えば、ＡＴＤＣ−５細胞又はＭＣＨＴ１／２６細胞である。
【００２０】
本発明の不織布は種々の形態、形状、スタイル又はデザインを有してよい。例えば、不織布は、創傷被覆材、創傷パッド、インプラント又は綿詰めした布（詰め綿）であってよい。
【００２１】
本発明の主題は、生体吸収性及び／又は生体適合性ポリマーを含む繊維原料でできた繊維を含む不織布であって、繊維が少なくとも１種の生物活性物質を含み、生物活性物質がＧＤＦ−５関連タンパク質である不織布である。ＧＤＦ−５関連タンパク質は繊維内に分布している。場合によって、追加的なＧＤＦ−５関連タンパク質が、繊維上に存在してもよい。
【００２２】
本発明者等は、ＧＤＦ−５関連タンパク質は、疎水性が比較的高いにも関わらず、繊維の内側に組み込めることを見いだした。また、意外にも、グリコシル化されていないＧＤＦ−５関連タンパク質でさえ、生体吸収性及び／又は生体適合性ポリマーを含む繊維原料でできた繊維内にうまく組み入れることができた。
【００２３】
ＧＤＦ−５関連タンパク質を繊維の内部に組み込むことにより、タンパク質の安定性が増大する。例えば、特にγ−放射線を用いた滅菌プロセスに繊維を供する場合において、タンパク質が保護（分解抑制）される。繊維の内部におけるその位置に起因して、タンパク質のプロテアーゼによる分解からも保護（抑制）される。更に、長期保管能が増大する。特に、ＧＤＦ−５関連タンパク質を表面に含む繊維と比較して、高い温度、例えば室温におけるタンパク質の保管能が良好となる。更に、原料として適切なポリマーを選択することにより、繊維の内部からのＧＤＦ−５関連タンパク質の放出を制御できる。例えば、活性物質を速く放出させること、又は（それよりも）ゆっくりと放出させることができる。
【００２４】
本発明によると、繊維原料は、天然ポリマー、合成ポリマー及び化石原料に由来するポリマーからなる群から選択されることが好ましい。これらの材料は、それぞれが修飾されていても修飾されていなくてもよい。
【００２５】
「天然ポリマー」は、本発明に関しては、生物学的供給源、例えば、植物、動物、真菌又は細菌に基づく材料等、に由来するものである。この用語は、後処理されたポリマー及び化学修飾されたポリマーを包含する。本発明の好ましい実施形態によると、天然ポリマーは、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシエステル及びポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２６】
（繊維原料としては、）コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、カゼインのようなポリペプチド、デキストランのような多糖、又は、セルロース、デンプン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸及びアルギネートのような天然ポリマー、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）のような合成ポリマー、並びにそれらの任意の組み合わせ、が特に適切である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態によると、不織布は「生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）」を有する。これは、不織布が体内又は体の上で分解されることを意味する。そのような材料は、完全に再吸収された後に除去する必要がなく、多くの場合、体と特によく適合することが好ましい。
【００２８】
「生体適合性」材料とは、本発明に関しては、特定の適用において、適切な宿主応答を果たすことができる材料である。そのような材料は、与えられた生物体において、免疫応答をほとんど又は全く引き出さないこと、又は特定の細胞型又は組織に組み込むことができることが好ましい。
【００２９】
更に好ましい実施形態では、不織布は生体吸収性又は／且つ生体適合性を有する。
【００３０】
生分解性又は生体吸収性ポリマーとしては、例えば、藻類由来のアルギネート、植物体由来のデキストラン、ポリマーデンプン及びセルロースのような天然多糖、コラーゲン、ゼラチン、キチン、カゼイン、ポリデプシペプチドのような動物（由来）ポリマー、ポリヒドロキシエステル、特にポリヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシ吉草酸のような細菌（由来）ポリマー、植物油に基づく合成ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又は、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリエチレンサクシネート、ポリエチレンオキサレート、ポリエステルアミド、及びポリジオキサノンのような化石原料（由来）のポリマーがある。
【００３１】
更に不溶性の物質をポリマーマトリックス（基材）内に分散させることができる。特に、ヒドロキシルアパタイト又は／及びｂ−リン酸三カルシウム粒子等の無機物質がこの目的に適することが示された。
【００３２】
本発明における布は不織物材料である。これらは、圧縮されていないことが好ましい。
【００３３】
繊維の直径は、欧州特許出願公開第２０４２１９９号明細書に記載されている回転紡糸方法によって、シャープな分布より決定できる。直径が、平均で０．１〜５００μｍ、好ましくは３〜３００μｍ、より好ましくは５〜１００μｍの繊維を作製することができる。繊維は、互いに部分的な網目状組織（ネットワーク）を形成する。繊維の直径が均一（分布がシャープ）であることにより、費用のかかる追加的な結合処理（措置）を行わずに、不織布を均一且つ安定した構造とすることが可能になる。同時に、ＧＤＦ−５のような生理活性物質（繊維上又はその内側に均一に分布している）の放出を制御することも可能になる。
【００３４】
いくつかの繊維は、互いに撚り合わさって又は絡み合っていてもよく、撚り合わせた構造を有してもよい。撚り合わせること又は絡み合わせることにより、不織布の強度及び伸縮挙動が更に良好となる。
【００３５】
いくつかの繊維を互いに絡み合わせ、１つ又は複数の繊維束を形成することができる。個々の繊維を絡み合わせ、これらの組み合わせにより繊維束とすることができ、互いに可逆的に入れ替えることができる。この結果、不織布を破壊せずに伸長させる（伸ばす）ことができる。伸長させることにより、個々の繊維が実際に引っ張られ、他の繊維と入れ替わる。撚り合わせること及び絡み合わせることにより、伸ばす前のそれらの位置に繊維が戻ることは、更に促進される。従って、不織布は、湿った状態でさえ、高い寸法安定性を示す。
【００３６】
布は、特性を変更するために、化学的手段、放射線照射又は物理的処理、例えば、脱水熱処理（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（ＤＨＴ）等のいずれかによって、改変することができる。そのような改変は、布の特徴、例えば、安定性、分解又は生体再吸収（ｂｉｏｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）等を制御するために、繊維又はポリマーを架橋させることを伴ってよい。
【００３７】
ＧＤＦ−５関連タンパク質は、繊維内に均一に分布させることができる。この結果として、ＧＤＦ−５関連タンパク質の段階的な放出を、長期的に持続させる効果を確立できる。
【００３８】
ＧＤＦ−５関連タンパク質は、繊維内にナノスケールのレベルで存在してよい。ナノスケールの構造とは、空間において少なくとも一方向にナノメートル範囲の寸法を有する任意の形態の領域を意味するものと理解される。この結果、ＧＤＦ−５関連タンパク質は、高い移動性を有する。ナノスケールのレベルで存在するＧＤＦ−５関連タンパク質は、特に高い反応性を示す。更に、不織布は、メディア（媒体、培地）に接触すると、その中にＧＤＦ−５タンパク質を非常に容易に放出する。この点で、不織布は、ＧＤＦ−５関連タンパク質に関する高い放出能によって区別される。
【００３９】
本発明の別の実施形態によると、追加的なＧＤＦ−５関連タンパク質が繊維上に分布していてよい。これにより、ヒトの体への速放性を確実にするために、不織布にＧＤＦ−５関連タンパク質を吹き付けることが可能になる。ＧＤＦ−５関連タンパク質は繊維内と繊維上の両方に存在することが、特に好ましい。
【００４０】
ＧＤＦ−５関連タンパク質は、下記の適切な担体、安定剤又はさらなる補充物と組み合わせて不織布に組み込むことが好ましい。
【００４１】
繊維の少なくとも一部は、ナノ繊維の形態であってよい。この形態の不織布は、特に軽く薄くすることができる。
【００４２】
不織布は、０．０１〜１００Ｌ／ｍｉｎ×ｃｍ２の通気性を有する開いた細孔構造を有してよく、このパラメータは、ＤＩＮ９２３７に従って決定される。そのような不織布は、皮膚が水分を放出し、息をすることを可能にするので、被覆材料として特に適切である。
【００４３】
本発明の不織布の作製は、例えば欧州特許出願公開第２０４２１９９号明細書に記載されている回転紡糸方法に従って実施することが好ましい。回転紡糸方法を実行するために、デバイス又は容器を独国特許出願公開第１０２００５０４８９３９号明細書に記載の通り使用することが好ましい。
【００４４】
ＧＤＦ−５関連タンパク質を含む本発明の不織布は、布の構造及び材料の組成を、非常に容易に改変可能であるので、医療分野での使用に特に適している。従って、本発明の別の実施形態は、不織布、好ましくは、本発明による不織布を含む創傷被覆材、創傷パッド又はインプラントである。
【００４５】
一般に、本発明の布は、保管及び／又は送達することが有用である全ての状況において、上記の組換えＧＤＦ−５型及びワイルドタイプ（非組換え）ＧＤＦ−５型を、生体吸収性ポリマーを含む繊維原料でできた繊維を含む不織布で構成されたデバイスと、組み合わせて適用できる。従って、本発明を用いて、様々な組織及び臓器の再生を容易にすることができる。例えば、ＧＤＦ−５は、骨及び軟骨の形成並びに結合組織の形成（例えば、国際公開第９５／０４８１９号パンフレット、Ｈｏｅｔｔｅｎら、１９９６年、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １３巻、６５〜７４頁；Ｓｔｏｒｍら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻、６３９〜６４３頁；Ｃｈａｎｇら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、２８２２７〜２８２３４頁を参照されたい）、並びに結合組織性付着の形成（欧州特許出願公開第０８３１８８４号明細書）の非常に有効なプロモーターであると考えられる。この場合、ＧＤＦ−５は、骨格要素間の関節への適用に有用である（例えば、Ｓｔｏｒｍ＆Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  １９９６年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２巻、３９６９〜３９７９頁を参照されたい）。結合組織の１つの例は、腱及び靭帯である（Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００巻、３２１〜３３０頁；Ａｓｐｅｎｂｅｒｇ＆Ｆｏｒｓｌｕｎｄ  １９９９年、Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ  ７０巻、５１〜５４頁；国際公開第９５／１６０３５号パンフレット）。該タンパク質は、半月板及び脊椎／椎間板の修復（Ｗａｌｓｈら、２００４年、Ｓｐｉｎｅ２９巻、１５６〜６３頁）及び脊椎固定への適用（Ｓｐｉｒｏら、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２８巻、３６２〜３６８頁）に役立つ。ＧＤＦ−５は、歯（歯及び歯周）への適用、例えば、象牙質又は歯根膜の再生等に有益に適用できる（例えば、国際公開第９５／０４８１９号パンフレット；国際公開第９３／１６０９９号パンフレット；Ｍｏｒｏｔｏｍｅら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２４４巻、８５〜９０頁を参照されたい）。ＧＤＦ−５は、任意の種類の創傷修復にも有用である。
【００４６】
ＧＤＦ−５は、神経細胞系における組織の成長、及び、例えばドーパミン作動性ニューロンの生存を促進するためにも有益である。この場合、ＧＤＦ−５は、例えば、パーキンソン病、及びほぼ同様なアルツハイマー病又はハンチントン舞踏病組織のような神経変性障害を治療するために使用できる（例えば、国際公開第９７／０３１８８号パンフレット；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎら、（１９９５年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．４２巻、７２４〜７３２頁；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、（１９９７年）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２３３巻、７３〜７６頁；Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９８年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０巻、３６８１〜３６８８頁を参照されたい）。ＧＤＦ−５により、神経の機能を維持すること、又は既に損傷を受けた組織において神経の機能を保持することが可能になる。従って、ＧＤＦ−５は、一般に適用可能な神経栄養因子であると考えられる。ＧＤＦ−５は、眼、特に網膜、角膜及び視神経の疾患にも有用であり（例えば、国際公開第９７／０３１８８号パンフレット；Ｙｏｕら（１９９９年）、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖ  ｉｓ  Ｓｃｉ  ４０巻、２９６〜３１１頁を参照されたい）、毛髪の成長並びに皮膚に関連する障害の治療及び診断にも有用であり、（国際公開第０２／０７６４９４号パンフレット；Ｂａｔｔａｇｌｉａら、２００２年、Ｔｒａｎｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．２７巻、５８４頁）、また、血管新生の誘導にも有用である（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９７年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５巻、２１８〜２６頁）。
【００４７】
そのように、本発明を適用できる適応症としては、創傷治癒が好ましい。本発明は、熱傷、皮膚病変、皮膚傷害又は皮膚グラフト、糖尿病性創傷及び糖尿病性潰瘍、例えば、糖尿病性足潰瘍の治療を容易にするために特に適している。
【００４８】
更に、本発明を適用できる非限定的な例として、以下が挙げられる。骨及び／若しくは軟骨の損傷に関連する疾患の予防又は療法、骨及び／若しくは軟骨の疾患に影響を及ぼすこと、軟骨及び／若しくは骨形成が望ましい一般的な状況、脊椎固定、腱及び／若しくは靭帯を含めた結合組織、歯科インプラントを含めた歯周組織若しくは歯の組織、ＣＮＳ組織を含めた神経組織及び神経病理学的状況、感覚系の組織、肝臓組織、膵臓組織、心臓組織、血管組織、腎臓組織、子宮組織、甲状腺組織、粘膜、内皮、上皮に関連する損傷を受けた又は疾患組織の予防又は療法、神経成長、組織再生、血管新生の促進若しくは誘導、前駆細胞及び／若しくは骨髄細胞の増殖の誘導、臓器若しくは組織を移植するための組織若しくは細胞を処理若しくは保存するための増殖若しくは分化の状態の維持、胃腸管の内層の完全性、稔性、避妊若しくは妊娠における障害の治療である。眼のような感覚器官にかかわる疾患も本発明による医薬組成物の好ましい適応症に含まれる。神経細胞疾患として、例として再度パーキンソン病及びアルツハイマー病に言及することができる。
【００４９】
ＧＤＦ−５関連タンパク質の生物活性は、確立されている試験系を利用して、容易に決定できる。最も有用であり好ましいものは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイとして公知の一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験である（Ｔａｋｕｗａら、１９８９年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５７巻、Ｅ７９７〜Ｅ８０３頁）。ＧＤＦ−５関連タンパク質により、即ちＲＯＢ−Ｃ２６細胞において（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１年、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．４９巻、２２１〜２２５頁）、国際公開第９５／０４８１９号パンフレットに記載の通り、胚ＡＴＤＣ５細胞において、（Ｒｉｋｅｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ、ＲＯＢ０５６５）、マウス間質ＭＣＨＴ−１／２６細胞において、及び、Ｎａｋａｍｕｒａら、２００３年、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．３８巻、５９７〜６０５頁に示されているようにＨＰＤＬ細胞において、アルカリホスファターゼ活性が増大することが実証されている。
【００５０】
本発明の組成物中のＧＤＦ−５関連タンパク質の濃度は、適用の様式及び期間に応じて選択するべきである。基本的に、ＧＤＦ−５関連タンパク質は、わずかな分量でも効果を引き出すことができる非常に強力なサイトカインである。即ち本明細書に記載のアルカリホスファターゼアッセイ等の種々の生物学的検定（系）により容易に決定される通り、それぞれの溶液１ｍｌ当たり０．１ｐｇのＧＤＦ−５の濃度があれば、生物学的作用を引き起こすために十分である。従って、本発明の組成物を繰り返し投与する場合、低濃度、即ち０．１ｐｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌの範囲又はそれ以下が好ましい。しかし、最大の効果は、それよりも高い１〜１００ｎｇ／ｍｌの増殖因子濃度で実現可能である。広範囲に段階希釈し、ＧＤＦ−５作用の（独立した）用量反応分析では（０．３〜８０ｎｇ／ｍｌ、Ｆａｒｋａｓら、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２３６巻、１２０〜１２２頁）、１ｍｌ当たり２０ｎｇのＧＤＦ−５の濃度で最適な結果が得られた。ｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚モデルでは、一般に、１〜１０μｇ／ｍｌの高用量を用いる。従って、本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＧＤＦ−５関連タンパク質を０．１ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する。１回投与の場合のＧＤＦ−５関連タンパク質の好ましい総用量は、１０ｎｇ〜１０μｇにわたる。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されている追加的な成分及び構成成分に関する。
【００５２】
更に、布は、天然脂質及び合成脂質を含んでよい。生体適合性である限りは、全ての種類の天然油／脂質及び合成油／脂質、例えば、合成油又は飽和エステル、例えば、パルミチン酸エチル、パルミチン酸イソプロピル、イソプロピル、ブチル及びセチル等のミリスチン酸アルキル、ステアリン酸ヘキシル、トリグリセリド（即ちオクタン酸又はデカン酸の、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２等の中鎖トリグリセリド）、リシノール酸セチル、オクタン酸ステアリル（ピュアセリンオイル）等、並びに水素化ポリイソブテン、又は天然油、例えば、綿実油、ダイズ油、ゴマ油、サンフラワー油、ベニバナ油、オリーブ油、アボカド油、ピーナッツ油、クルミ油、アーモンド油及びヘーゼルナッツ油等を使用することができる。
【００５３】
布は、乳化剤、例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質、蒸留モノグリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの酢酸エステル、モノグリセリドの有機エステル、脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のプロピレングリコールエステル及び脂肪酸のポリグリセロールエステルも含んでよい。
【００５４】
ＧＤＦ−５関連タンパク質に加えて、他の生理活性タンパク質（複数可）も本発明の布の一部であってよい。ＴＧＦ−βにより、再生される真皮のサイズが増大し、真皮上皮接合部（ｄｅｒｍｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が安定化することが示されている（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ及びＲｏｓｅｎ、Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｌａｓｅｒ  Ｔｈｅｒ、５巻：２５〜３４頁（２００３年））。新生児の包皮線維芽細胞に由来する７種のサイトカイン（ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ａ、ＧＣＳＦ、及びＴＧＦ−β１）を含有する反応混液（ＴＮＳ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＳｋｉｎＭｅｄｉｃａ、Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、多施設試験において試験した。評価により、皮膚テクスチャーの改善が示され、しわが減少した（Ｒｏｋｈｓａｒ、Ｃ．Ｋ．ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．３１巻：１１６６〜１１７８頁（２００５年））。組換え上皮増殖因子（ＲｅＶｉｖｅ  Ｓｋｉｎｃａｒｅ）、及びＮ−フルフリルアデニン（キネチン）植物増殖因子も市販されている。これらのタンパク質は全て、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質と一緒に使用することができる。ＧＤＦ−５関連タンパク質と組み合わせた場合に相乗的に作用する他のタンパク質は、文献／特許、即ち国際公開第９９／１５１９１号パンフレットに開示されている。好ましいものは、ニューロトロフィン、ヘッジホッグタンパク質、並びに、これらだけに限定されないが、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、ＢＭＰ及びＧＤＦを含めた形質転換増殖因子ファミリーのタンパク質である。ＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＮＧＦ及び／又はＧＤＮＦのうちの任意の１つとの組み合わせが特に好ましい。
【００５５】
布中の他の許容できる構成成分としては、以下が挙げられる。
粘膜／上皮表面の完全性を保存するレチノイド（ビタミンＡ誘導体）。
表皮脱落を増強するヒドロキシ酸（アルファヒドロキシ酸（ＡＨＡ）及びベータヒドロキシル酸（ＢＨＡ）に更に分類される有機カルボン酸）、即ち、グリコール酸、乳酸、クエン酸、マンデル酸、リンゴ酸、及び酒石酸。
フリーラジカルの有害作用を打ち消す抗酸化剤、即ち、ビタミンＣ、ビタミンＥ、パンテノール、リポ酸、ユビキノン、ナイアシンアミド、ジメチルアミノエタノール、スピントラップ、メラトニン、カタラーゼ、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコピラノシド、ポリフェノール、システイン、アラントイン、フルフリルアデニン、尿酸、及びカルノシン。
色素沈着過度を緩和する色素脱失剤、即ち、Ｎ−アセチル−４−Ｓ−システアニミルフェノール、コウジ酸、アルブチン、アゼライン酸、カジノキ化合物、ケミカルピーリング剤（レゾルシノール、サリチル酸）、Ｋｌｉｇｍａｎ処方（Ｋｌｉｇｍａｎ’ｓ  ｆｏｒｍｕｌａ）、Ｐａｔｈａｋ処方（Ｐａｔｈａｋ’ｓ  ｆｏｒｍｕｌａ）、及びＷｅｓｔｅｒｈｏｆ処方（Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ’ｓ  ｆｏｒｍｕｌａ）。
植物性薬品、即ち、カモミール、チョウセンニンジン、Ｇｉｎｇｋｏｂｉｌｏｂａ、クルクミン、グリチルリジン、カプサイシン、及びａｌｏｅ  ｖｅｒａ。
表皮の再生を支持するグリコサミノグリカン、即ち、ヒアルロン酸；
脂肪分解を媒介する抗セルライト剤（Ａｎｔｉｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）、即ち、ベータ−アドレナリン作動性刺激物質、例えば、テオブロミン、テオフィリン、アミノフィリン、カフェイン、エピネフリン等、及びアルファ１−アドレナリン作動性刺激物質、例えば、ヨヒンビン、ピペロキサン、及びフェントラミン等。
ホルモン、即ち、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、及び成長ホルモン。
抗菌性剤、即ち、トリクロサン、クロルヘキシジン、ポピドンヨード、過酸化水素、フケ防止調合剤、ピリチオン亜鉛。
化学的ＵＶフィルター、即ち、３−ベンジリデンカンファー（３−ＢＣ）又は４−メチルベンジリデンカンファー（４−ＭＢＣ）。
更に緩衝液、安定剤、防腐剤、還元剤、抗酸化キレート化剤、等張性を改変する作用剤、脱臭剤、麻酔薬、アジュバント（免疫増強剤）及び溶解性増強添加物。
【００５６】
これらは、単に可能性のある添加物の非限定的な例であり、現在使用されており、一般に当業者において安全とされている他の賦形剤を、容易に加えることができる。医薬組成物を製剤化するための方法、及び薬学的に許容される物質の選択方法に関し、さらなる情報は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｌｕｔｈ編；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９９０年）、Ｗａｎｇら（１９８０年）、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｄｒｕｇ  Ａｓｓｎ．３４巻（６号）：４５２〜４６２頁（１９８０年）；Ｗａｎｇら（１９８８年）、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．及びＴｅｃｈ．４２巻：４〜２６頁；Ｌａｃｈｍａｎら（１９６８年）、Ｄｒｕｇ及びＣｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  １０２巻（１号）：３６〜３８頁、４０頁及び１４６〜１４８頁；並びにＡｋｅｒｓ（１９８８年）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．３６巻（５号）：２２２〜２２８頁を参照されたい。
【００５７】
体液、血漿、培地（メディア）又は緩衝溶液と接触させてから３〜７日の間に、不織布から生物活性物質の１％〜１００％が溶出することが好ましい。生理的条件下（ＰＢＳ緩衝液、１０％ウシ胎仔血清、３７℃）で、前記生理活性物質の１０％〜１００％が放出されることが、最も好ましい。
【００５８】
以下の図面、実施例及び配列プロトコルは、本発明を更に例示することを意図している。
【００５９】
配列番号１は、ヒトＧＤＦ−５前駆体のＤＮＡ配列を示し、配列番号２はタンパク質配列を示す。
【００６０】
配列番号３はヒト成熟単量体ＧＤＦ−５のＤＮＡ配列を示し、配列番号４はタンパク質配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】配列番号２に記載されているヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質について、追加的な特徴を示す図である。アミノ酸配列００１位〜３８１位はプレプロドメインである（太字）。アミノ酸配列００１位〜０２７位はシグナルペプチドである（太字及び下線）。アミノ酸配列３８２位〜５０１位は成熟タンパク質部位である。アミノ酸配列４００位〜５０１位はシスチンノットドメインである（下線）。
【図２】ヒトＧＤＦ−５における１０２（個）のアミノ酸シスチンノットドメイン（配列番号２）と、ヒトＧＤＦ−６（米国特許第５，６５８，８８２号の配列２６）及びヒトＧＤＦ−７（米国特許第５，６５８，８８２号の配列２）との比較を示す図である。３種の分子全てにおいて同一のアミノ酸残基を、縁取り（背景黒、文字白）で強調表示した。
【図３】いくつかの公知のＢＭＰ及びＧＤＦのシスチンノットドメインと、ヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインとの配列同一性を示す表である。
【図４】ｒｈＧＤＦ−５を伴う、ガンマ滅菌したゼラチン／ヒアルロン酸不織物の顕微鏡画像である（スケールバー２００μｍ）。
【図５】ガンマ滅菌したゼラチン／ヒドロキシルアパタイト不織物の顕微鏡画像である（スケールバー２００μｍ）。
【図６】速放性不織物材料であるゼラチン、ゼラチン／ヒアルロン酸及びゼラチン／Ｉ型コラーゲンから放出されたＧＤＦ−５の生物活性を示す図である。ＧＤＦ−５の生物活性を、実施例１に記載の通り、マウス間質ＭＣＨＴ１／２６細胞におけるアルカリホスファターゼ活性アッセイを用いて測定した。１０ｍＭのＨＣｌに溶解させたＧＤＦ−５、４．８〜１２００ｎｇ／ｍｌで、ＭＣＨＴ１／２６細胞を刺激した（検量線）。不織物材料からのＧＤＦ−５放出は、不織物をＭＣＨＴ１／２６細胞と直接接した状態に置き、また同時進行で、３７℃で３日間にわたり細胞培養培地で、ＧＤＦ−５放出により作製される馴化培地を用いて分析した。（波長）４０５ｎｍにおいて、ｐ−ニトロフェノールホスフェートがｐ−ニトロフェノレートに変換することにより、ＡＬＰ活性を測定した。データは３回の独立した測定の平均値である。別表には、対応する不織物から放出されたＧＤＦ−５（ｎｇ／ｍｌ）の算出濃度及び％で示されたＧＤＦ−５の回収率が示されている。算出において、不織物上にコーティングした２μｇのＧＤＦ−５が細胞培養培地１６０μｌに完全に放出されたと仮定した。これは、１２５００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−５濃度（細胞と直接接した状態で不織物を試験したアッセイについての１００％放出値）に対応する。細胞と接した馴化培地を定量化する際は、放出細胞培養培地４０μｌが、２５００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−５濃度（細胞と接した馴化細胞培養培地を試験したアッセイについての１００％放出値）に対応する。
【図７】徐放性不織物材料であるポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシド及びゼラチン／ヒドロキシルアパタイトから放出されたＧＤＦ−５の生物活性を示す図である。ＧＤＦ−５の生物活性を、実施例１に記載の通り、マウス間質ＭＣＨＴ１／２６細胞におけるアルカリホスファターゼ活性アッセイを用いて測定した。ＭＣＨＴ１／２６細胞を、１０ｍＭのＨＣｌに溶解させたＧＤＦ−５、４．８〜１２００ｎｇ／ｍｌで刺激した（検量線）。不織物材料からのＧＤＦ−５放出は、不織物をＭＣＨＴ１／２６細胞と直接接した状態に置き、また同時進行で、３７℃で３日間にわたり、細胞培養培地において、ＧＤＦ−５放出によって作製された馴化培地を用いて分析した。（波長）４０５ｎｍにおいて、ｐ−ニトロフェノールホスフェートがｐ−ニトロフェノレートに変換することにより、ＡＬＰ活性を測定した。データは３回の独立した測定の平均値である。別表には、対応する不織物から放出されたＧＤＦ−５（ｎｇ／ｍｌ）の算出濃度及び％で示されたＧＤＦ−５の回収率が示されている。算出の際、２μｇのＧＤＦ−５が不織物から細胞培養培地１６０μｌ中に完全に放出されたと仮定した。これは、１２５００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−５濃度（細胞と直接接した状態で不織物を試験したアッセイについての１００％放出値）に対応する。細胞と接した馴化培地の定量化の場合は、放出細胞培養培地４０μｌが、２５００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−５濃度（細胞と接した馴化細胞培養培地を試験したアッセイについての１００％放出値）に対応する。
【図８】ガンマ線照射による滅菌の前後に不織物材料から放出されたＧＤＦ−５の生物活性及び回収率を示す表である。生物活性を、マウス間質ＭＣＨＴ１／２６細胞におけるアルカリホスファターゼ活性アッセイを用いて測定した。不織物から放出されたＧＤＦ−５の回収率を、ＧＤＦ−５特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。不織物材料からのＧＤＦ−５放出を、不織物を細胞培養培地中に３７℃で２４時間置くことによって分析した。不織物材料を伴わない等量のＧＤＦ−５を、細胞培養培地において同一の条件下でインキュベートした。これは、陽性対照としての機能を果たした。（波長）４０５ｎｍにいて、ｐ−ニトロフェノールリン酸が、ｐ−ニトロフェノレートに変換することにより、ＡＬＰ活性を測定した。データは少なくとも３回の独立した測定の平均値である。ＥＬＩＳＡでは、ビオチン化した二次抗体に結合したストレプトアビジン−西洋ワサビ−ペルオキシダーゼの量によって、ＧＤＦ−５の回収率を定量化した。基質テトラメチルベンジジンジヒドロクロリドの酵素による変換、その後の４５０ｎｍにおける測光法によって検出を行った。表には、ＡＬＰ活性アッセイで測定し、算出した生物活性を％で示した（陽性対照のＯＤ値を１００％とした）。ＥＬＩＳＡデータに関して、表には、不織物材料からのＧＤＦ−５回収率を％で示した。算出において、不織物材料に組み入れた２００ｎｇのＧＤＦ−５が細胞培養培地２００μｌ中に完全に放出されたと仮定した。これは、１０００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−５濃度（１００％値）に対応する。
【図９】不織物に組み入れた滅菌ＧＤＦ−５を、室温、４℃、及び−８０℃において、１日〜３ヶ月の期間にわたって保管した安定性試験の結果を示す表である。０日目は安定性試験の開始点である。ＧＤＦ−５の安定性は、滅菌不織物から放出されるＧＤＦ−５の回収率を、ＧＤＦ−５特異的サンドイッチＥＬＩＳＡで測定することによって調査した。不織物材料からのＧＤＦ−５放出を、不織物を細胞培養培地中に３７℃で２４時間置くことによって分析した。定義済みの量の放出培地をＥＬＳＩＡ系に移し、ここでビオチン化した二次抗体に結合したストレプトアビジン−西洋ワサビ−ペルオキシダーゼの量によってＧＤＦ−５の回収率を定量化した。基質テトラメチルベンジジンジヒドロクロリドの酵素による変換、その後の４５０ｎｍにおける測光法によって検出を行った。表には、放出されたＧＤＦ−５から算出した、不織物材料に対するＧＤＦ−５回収率を％で示した。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６２】
ＧＤＦ−５速放性プロファイルを示す不織物
純粋なゼラチン、ゼラチンとヒアルロン酸、又はゼラチンとＩ型コラーゲンからなる、ＧＤＦ−５速放性を示す不織物を以下の通り作製した。
【００６３】
Ａ型ＰＩＧＳＫＩＮゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ  ＡＧ、Ｅｂｅｒｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の２２．５％（ｗ／ｗ）水溶液を、ゼラチンと水とを混合して調製した。この混合物を膨張させるため、室温で１時間保存した。その後、ゼラチン溶液を６０℃で１時間超音波処理し、８０℃に加熱した。溶液を２時間８０℃に保ち、再度６０℃まで冷却した。所望の不織物組成物に応じて、（ゼラチン重量当たりの重量で）１２．５％のヒアルロン酸（ｃｒｉｓｔａｌｈｙａｌ、Ｓｏｌｉａｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）又はＩ型コラーゲンゲル（ＤＭ０４、Ｄｅｖｒｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を溶液中に混合し、溶解又は分散させるために、１分間へらで撹拌した。ゼラチンベースの溶液をシリンジポンプによってＤＥ  １０  ２００５  ０４８  ９３９  Ａに記載の紡糸デバイスに供給した。
【００６４】
増殖因子のフィラメントへの組み込みは、ＧＤＦ−５溶液（１２００μｇ／ｍｌ、５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液）を溶液中に直接混合した後、紡糸デバイスの容器に入れた。容器を５０℃まで加熱し、３５００ｒｐｍで回転させた。向心力により、液体材料が開口部から液体ジェットとして噴出し、繊維が形成された。これらの繊維を、紡糸デバイスの容器の下にある吸引装置によって伸ばし、不織物として収集した。不織物を収集し、叩いて、最終的な試料サイズ（３×３ｍｍ）にした。ＧＤＦ−５速放性を示す不織物試料を得て、その後、ガンマ滅菌した（照射線量２５ｋＧｙ）。
【００６５】
不織物試料からのＧＤＦ−５放出を、マウス間質ＭＣＨＴ１／２６細胞（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．、Ｋａｗａｇｏｅ、Ｊａｐａｎ）におけるＧＤＦ−５感受性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイ（分析）を用いて測定した。不織物材料の放出の性質及び細胞適合性を（ａ）直接細胞と接した状態で、及び（ｂ）馴化培地を用いて試験した。馴化培地を作製するために、不織物試料を、細胞を伴わない細胞培養培地（２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清を補充したアルファＭＥＭ）２００μｌ中、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。インキュベート期間後に、馴化培地及び不織物試料をＭＣＨＴ１／２６細胞において分析した。
【００６６】
ＭＣＨＴ１／２６細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した細胞培養培地（アルファＭＥＭ、（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、９６マルチウェルプレートのウェル当たりに、細胞４．５×１０３個をプレーティングした。２４時間後に、新鮮な細胞培養培地１２０μｌを補充した馴化放出培地４０μｌとともに、細胞をインキュベートした。上記と同時進行で、不織物試料を、細胞培養培地１６０μｌを伴う細胞と直接接した状態で置いた。７２時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ９．６（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＺｎＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するアルカリ性リン酸緩衝液１を用いて抽出した。徹底的な細胞溶解を実現するために、細胞を３７℃で１５〜１８時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ酵素活性を、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ９．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＺｎＣｌ２中、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を基質として用いてアッセイした。３７℃で３０分インキュベートした後、自動マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｒａｉｎｂｏｗ、ＴＥＣＡＮ、Ｃｒａｉｌｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、ブランク値減算を考慮し、４０５ｎｍにおける吸収を測定した。図６に結果を示した。
【００６７】
不織物試料は、全てマーカー細胞株ＭＣＨＴ１／２６による耐容性がよかった。ＧＤＦ−５を伴う不織物は、ゼラチン材料を用いると速放性を示し、不織物試料を直接細胞に接した状態で置いた場合は２２％であり、馴化培地については１０％であった。ゼラチン／ヒアルロン酸の組み合わせ不織物については、直接細胞と接した状態のＧＤＦ−５放出は３６％であり、馴化培地を用いた放出は３２％であった。ゼラチン／Ｉ型コラーゲンの組み合わせ不織物については、直接細胞と接した状態のＧＤＦ−５放出は５４％であり、馴化培地を用いた放出は５５％であった。
【００６８】
ＧＤＦ−５速放性を示すこれらの試料は、最初の３日間で、高用量の活性増殖因子を創傷環境内に放出するため、創傷治癒、神経保護及び血管新生のために使用できる。
【実施例２】
【００６９】
ＧＤＦ−５徐放性プロファイルを示す不織物
ポリビニルピロリドン（Ａ．）、ポリエチレンオキシド（Ｂ．）、又は、ゼラチンとヒドロキシルアパタイト（Ｃ．）からなり、ＧＤＦ−５徐放性を示す不織物を以下の通り作製した。
【００７０】
まず、液体前駆溶液を調製した。
（Ａ．）ポリビニルピロリドン（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  Ｆ  ９０、ＢＡＳＦ  ＡＧ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）４０ｇをビーカーに満たし、磁気攪拌器及び水１６０ｇを加えた。その後、混合物を室温で２４時間撹拌し、８０℃まで加熱した。最後に溶液を１時間超音波処理した後、冷却して６０℃とした。
【００７１】
（Ｂ．）ポリエチレンオキシド（分子量１０００ｋＤａ、ＢＡＳＦ  ＡＧ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）１５ｇを室温で水１８５ｇに溶解させ、６０℃まで加熱した。
【００７２】
（Ｃ．）Ａ型ＰＩＧＳＫＩＮゼラチンの２２．５％（ｗ／ｗ）水溶液を、ゼラチンと水を混合することによって調製した。この混合物を、膨張させるために室温で１時間保存した。その後、ゼラチン溶液を６０℃で１時間にわたって超音波処理した。（ゼラチンの重量当たりの重量で）２．５％ヒドロキシルアパタイトナノ粒子（製品番号６７７４１８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、へらを使用して溶液中に混合した。その後、混合物を８０℃まで加熱し、この温度で２時間保ち、その後、再度６０℃まで冷却した。
【００７３】
上記の溶液又は分散液を、シリンジポンプによって独国特許出願公開第１０２００５０４８９３９号明細書に記載の紡糸デバイスに供給した。増殖因子をフィラメントに組み込む場合には、ＧＤＦ−５溶液（１２００μｇ／ｍｌ、５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液）を溶液中に直接混合した後に、紡糸デバイスの容器に入れた。容器を６０℃まで加熱し、４５００ｒｐｍで回転させた。向心力に起因して、液体材料が開口部から液体ジェットとして噴出し、繊維が形成された。これらの繊維を、紡糸デバイスの容器の下にある吸引装置によって伸ばし、不織物として収集した。不織物を収集し、叩いて、３×３ｍｍのサイズにした。ＧＤＦ−５徐放性を示す不織物試料を得て、その後ガンマ滅菌した（照射線量２５ｋＧｙ）。
【００７４】
ＧＤＦ−５を伴う不織物試料の測定を、実施例１に記載の通り実施した。不織物試料からのＧＤＦ−５放出を、マウス間質ＭＣＨＴ１／２６細胞におけるアルカリホスファターゼ活性アッセイを用いて測定した。不織物プロトタイプの放出の性質及び細胞適合性を、（ａ）直接細胞と接した状態で、及び（ｂ）馴化培地を用いて試験した。徐放性不織物試料ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシド及びゼラチン／ヒドロキシルアパタイトについての結果を、図７に示した。
【００７５】
ＧＤＦ−５を伴う不織物は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を用いると徐放性を示し、不織物試料を直接細胞に接した状態で置いた場合は１％であり、馴化培地については１２％であった。不織物材料ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）については、直接細胞と接した状態のＧＤＦ−５放出は１％であり、馴化培地を用いた放出は６％であった。ゼラチン／ヒドロキシルアパタイトの組み合わせ不織物については、直接細胞と接した状態のＧＤＦ−５放出は５％であり、馴化培地を用いた放出は１９％であった。
【００７６】
ＧＤＦ−５徐放性を示す上記試料では、最初の３日間で放出する活性増殖因子が、ごく少量のため、骨又は軟骨の再生用途に使用できる。
【実施例３】
【００７７】
不織物技術により、組み入れられたＧＤＦ−５が、滅菌により不安定化することを抑制できる。
【００７８】
不織物材料に組み入れられたＧＤＦ−５の安定性に対する滅菌の影響を調査した。従って、不織物に組み入れられたＧＤＦ−５の回収率及び生物活性を、滅菌プロセスの前後に試験した。この目的のため、ＧＤＦ−５を組み入れた不織物を、実施例１に記載の通り作製した。簡単に述べると、２００μｇ／ｍｌ、５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液のＧＤＦ−５溶液をゼラチン／Ｉ型コラーゲン混合物中に混合し、２００ｎｇのＧＤＦ−５／３×３ｍｍの不織物を得た。不織物を叩いて３×３ｍｍの試料サイズにし、ガンマ滅菌した（照射線量２５ｋＧｙ）。
【００７９】
不織物から放出されたＧＤＦ−５の回収率をＥＬＩＳＡによって定量化し、ＧＤＦ−５の生物活性をアルカリホスファターゼの誘導（ＡＬＰ活性アッセイ）によって測定した。
【００８０】
ＡＬＰアッセイを用いた非滅菌不織物及び滅菌不織物のＧＤＦ−５生物活性の測定は、実施例１に記載されている。滅菌の前後の不織物から放出されるＧＤＦ−５の量を、以下の通り測定した。
【００８１】
ＧＤＦ−５が組み入れられた不織物を、細胞培養培地（２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清を補充したアルファＭＥＭ）２００μｌ中、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。陽性対照として、不織物材料を伴わない２００ｎｇのＧＤＦ−５を同一の条件下でインキュベートした。インキュベート期間後に、放出培地及び陽性対照を１：２５００希釈及び１：４０００希釈し、ＧＤＦ−５特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。ＥＬＩＳＡは、ＧＤＦ−５に対する２種のモノクローナル抗体に基づく。酵素ストレプトアビジン−西洋ワサビ−ペルオキシダーゼをビオチン化した二次抗体に結合させた。基質テトラメチルベンジジンジヒドロクロリドの酵素による変換によって検出を行い、それを、４５０ｎｍにおける側光法によって決定した。ＧＤＦ−５を伴う放出試料及び陽性対照を、５０〜５００ｐｇ／ｍＬにわたるＧＤＦ−５標準物質の試験系列を用いることによって定量化した。図８に結果を示した。
【００８２】
ＧＤＦ−５が組み入れられた不織物をガンマ滅菌（照射線量２５ｋＧｙ）した後、ＧＤＦ−５の９５％超が生物学的に活性であり、これはＭＣＨＴ１／２６細胞におけるＡＬＰ活性アッセイによって実証された。更に、滅菌後の、不織物材料からの組み入れられたＧＤＦ−５の回収率は９５％であり、これはＧＤＦ−５特異的ＥＬＩＳＡ法によって定量化された。
【実施例４】
【００８３】
不織物に組み入れたＧＤＦ−５は、低い保管温度及び高い保管温度で長期安定性を示した。
【００８４】
不織物材料に組み入れたＧＤＦ−５の安定性について、保管の持続期間及び保管温度の影響を調査した。ＧＤＦ−５を組み入れた不織物を室温、４℃、及び−８０℃で、最大３ヶ月保管した。
【００８５】
不織物に組み入れたＧＤＦ−５の安定性を試験するために、０日目に不織物試料を調製し、室温、４℃、及び−８０℃で保管した。１日、３日、２週間、４週間及び３ヶ月の保管期間後、それぞれの温度条件の試料について、ＥＬＩＳＡ法により安定性を分析した。
【００８６】
ＧＤＦ−５を組み入れた不織物を実施例１に記載の通り作製した。簡単に述べると、２００μｇ／ｍｌ、５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液のＧＤＦ−５溶液をゼラチン／Ｉ型コラーゲン混合物中に混合し、２００ｎｇのＧＤＦ−５／３×３ｍｍの不織物を得た。不織物を叩いて３×３ｍｍの試料サイズにし、ガンマ滅菌した（照射線量２５ｋＧｙ）。ＧＤＦ−５の安定性は、不織物から細胞培養培地に放出された活性なＧＤＦ−５の回収率を測定することにより分析した。ＧＤＦ−５が組み入れられた不織物を、細胞培養培地（２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清を補充したアルファＭＥＭ）２００μｌにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベート期間後に、放出培地を１：２５００希釈及び１：４０００希釈し、ＧＤＦ−５特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。ＧＤＦ−５を伴う放出試料を、５０〜５００ｐｇ／ｍｌにわたるＧＤＦ−５標準物質の試験系列を用いることによって定量化した。ＥＬＩＳＡの結果を図９に示した。
【００８７】
０日目（安定性試験の開始点）では、滅菌不織物からのＧＤＦ−５回収率が９０％を超えた。不織物に組み入れられたＧＤＦ−５の安定性は、調査温度条件（室温、４℃及び−８０℃）でほぼ同一であった。室温で３ヶ月の保管期間後、安定性の損失は観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月19日(2013.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性及び／又は生体適合性ポリマーを含む繊維原料からなり、繊維内に少なくとも１種の生物活性物質が分布した繊維を含み、前記生物活性物質はＧＤＦ−５関連タンパク質であり、
ＧＤＦ−５関連タンパク質が、配列番号２に示すヒトＧＤＦ−５のアミノ酸配列４００位〜５０１位における、１０２のアミノ酸シスチンノットドメインに対して、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列のシスチンノットドメインを含むタンパク質である不織布。
【請求項２】
繊維上に、更に生物活性タンパク質が分布している請求項１に記載の不織布。
【請求項３】
ＧＤＦ−５関連タンパク質が、ヒトＧＤＦ−５における１０２のアミノ酸シスチンノットドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列のシスチンノットドメインを含む請求項２に記載の不織布。
【請求項４】
繊維原料が、修飾され又は修飾されていない、天然ポリマー、合成ポリマー、及び化石原料由来ポリマー、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１〜請求項３のいずれかに記載の不織布。
【請求項５】
天然ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、カゼインのようなポリペプチド、又はデキストラン、セルロース、デンプン、キチン、キトサン、アルギネートやヒアルロン酸のような多糖、又はポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、
合成ポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエステル、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項４に記載の不織布。
【請求項６】
物質がフィラメント中に分散している請求項１〜請求項５のいずれかに記載の不織布。
【請求項７】
分散している物質が、ヒドロキシルアパタイト及び／又はβ−リン酸三カルシウムのような無機物質の群から選択される請求項６に記載の不織布。
【請求項８】
回転紡糸方法によって作製し、又は作製される請求項１〜請求項７のいずれかに記載の不織布。
【請求項９】
繊維の少なくともいくつかが互いに撚り合わされ、又は、互いに絡み合わされたものであり、撚り合わさった構造を有し、繊維の少なくともいくつかが互いに絡み合っており、少なくとも１つの繊維束を形成している請求項１〜請求項８のいずれかに記載の不織布。
【請求項１０】
繊維の少なくともいくつかがナノ繊維である請求項１〜請求項９のいずれかに記載の不織布。
【請求項１１】
０．０１〜１００Ｌ／ｍｉｎ・ｃｍ２の通気性を有する開いた細孔構造を含む請求項１〜請求項１０のいずれかに記載の不織布。
【請求項１２】
生理的条件下（ＰＢＳ緩衝液、１０％ウシ胎仔血清、３７℃）で、生物活性物質の少なくとも１０％が３〜７日以内に放出する請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の不織布。
【請求項１３】
糖尿病性潰瘍及び他の潰瘍、熱傷、皮膚傷害及び／若しくは皮膚グラフトを含めた創傷の治癒を改善するため、神経成長を誘導する若しくは神経細胞死を予防するため、血管新生を促進するため、前駆細胞及び／若しくは骨髄細胞の増殖を誘導するため；
臓器若しくは組織を移植するための組織若しくは細胞を処理若しくは保存するために、増殖若しくは分化の状態を維持するため；
骨格要素に対する関節に係わる変性障害を治療するため、並びに／又は半月板及び／若しくは脊椎／椎間板を修復するための請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の不織布。
【請求項１４】
皮膚組織、結合組織、骨、軟骨、結合組織性付着、腱、靭帯、脊椎／椎間板、半月板、歯の組織、象牙質、歯根膜、毛髪、感覚系の組織、肝臓組織、膵臓組織、心臓組織、血管組織、腎臓組織、子宮組織、甲状腺組織、粘膜、内皮、上皮又は神経組織からなる群から選択される組織の再生を促進するための請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の不織布。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の不織布を含む創傷被覆材、創傷パッド又はインプラント。
【国際調査報告】
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