(57)【要約】  本発明は、組織因子（凝固因子Ｆ３）シグナル伝達を阻害することができるが、組織因子に対する第ＶＩＩ因子結合又は第ＦＸ因子結合を妨げず、かつ凝固時間を長引かせない抗体のヒト化形態に関する。本発明の抗体は、関連細胞が組織因子を発現して、組織因子シグナル伝達が生じる、腫瘍進行などの疾患の治療に有用である。
2014509856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子への結合に関してマウス抗体１０Ｈ１０と競合する単離された抗体であって、前記抗体結合ドメインが、ヒトフレームワーク（ＦＲ）領域に適合され、かつＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３の構造を有し、前記ＦＲアミノ酸配列が、ＩＭＧＴデータベースで認証されているヒト生殖系列遺伝子配列によってコードされたアミノ酸配列から変更されず、ＣＤＲ配列が、配列番号６〜１１及び２７で表されるマウス１０Ｈ１０  ＣＤＲと５０％以上の配列同一性を有する、単離された抗体。
【請求項２】
前記抗体が、組織因子結合に関してＦＶＩＩａと競合せず、かつ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのサイトカインＩＬ−８放出によって測定すると、ＴＦ−ＶＩＩａ複合体の凝固促進活性、アミド分解活性を実質的に阻害しないが、ＴＦ−ＶＩＩａによって媒介されるシグナル伝達を阻害する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
前記ＣＤＲ配列の１つ又は２つ以上が、配列番号６〜１１及び２７の配列から選択される、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記３つの軽鎖ＣＤＲ配列であるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、及びＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号９〜１１によって表わされる、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記３つの重鎖ＣＤＲ配列であるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、及びＨ−ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号６〜８によって、又はそれぞれ配列番号６、２７、及び８によって表わされる、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、及びＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号９〜１１によって表わされ、前記３つの重鎖ＣＤＲ配列であるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、及びＨ−ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号６〜８によって、又はそれぞれ配列番号６、２７及び８によって表わされる、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
前記ヒトＨＣ可変領域フレームワークが、前記ＩＭＧＴデータベースによって表わされるＩＧＨＶファミリーの１、３、又は５メンバー由来である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１２〜２１から選択されるＨＣ可変領域を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記ヒトＬＣ可変領域フレームワークが、ヒトＩＧＫＶファミリー２又は４メンバー由来である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号２２〜２６から選択されるＬＣ可変領域を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ヒトＨＣ可変領域フレームワークが、ＩＧＨＶ５及びＩＧＫＶ２から選択されるヒト生殖系列遺伝子ファミリー由来である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号１２〜２１から選択されるＨＣ可変領域と、配列番号２２〜２６から選択されるヒトＬＣ可変領域と、を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号８のＨ−ＣＤＲ３と、配列番号６、６２〜８３から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ１と、配列番号７、２７、及び８４〜１０７から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ２と、任意にＩＧＶＪ４（配列番号６０）又はその変異体から選択されるＨＣ  ＦＲ４領域と、を有するＨＣ可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号９、１０８〜１１６から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ１と、配列番号１０及び１１７〜１２０から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ２と、配列番号１１及び１２１〜１２８から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ３と、任意にＩＧＫＪ２（配列番号６１）又はその変異体から選択されるＬＣ  ＦＲ４領域と、を有するＬＣ可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号８のＨ−ＣＤＲ３と、配列番号６、６２〜８３から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ１と、配列番号７、２７、及び８４〜１０７から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ２と、任意にＩＧＶＪ４（配列番号６０）又はその変異体から選択されるＨＣ  ＦＲ４領域と、を有するＨＣ可変領域、並びに、配列番号９、１０８〜１１６から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ１と、配列番号１０及び１１７〜１２０から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ２と、配列番号１１及び１２１〜１２８から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ３と、任意にＩＧＫＪ２（配列番号６１）又はその変異体から選択されるＬＣ  ＦＲ４領域と、を有するＬＣ可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ＨＣヒトフレームワーク配列が、ＩＧＨＶ５＿ａ由来であり、前記ＨＣ可変領域が、配列番号１９、１２９〜１５５から選択される配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
前記ＬＣヒトＦＲ配列が、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１由来であり、前記ＬＣ可変領域が、配列番号２３、１５７〜１６４から選択される配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
前記ＨＣヒトフレームワーク配列が、ＩＧＨＶ５＿ａ由来であり、前記ＨＣ可変領域が、配列番号１９、１２９〜１５５から選択される配列を有し、前記ＬＣヒトＦＲ配列が、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１由来であり、前記ＬＣ可変ドメインが、配列番号２３、１５７〜１６４から選択される配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
ＩＧＨＶ５＿ａフレームワーク由来の、ＣＤＲでない位置と定義される結合ドメインを有し、Ｈ−ＣＤＲ３が、配列ＳＧＹＹＧＮＳＧＦＡＹ（配列番号８）を有し、Ｈ−ＣＤＲ−１及び／又はＨ−ＣＤＲ−２位置の配列が、下記式：
Ｈ−ＣＤＲ１        ＧＹＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＩＥ  （Ｉ）（配列番号８３）
（式中、Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹから選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｓ、及びＴから選択され、Ｘ３は、Ｆ、Ｈ、及びＹから選択され、又は配列はＧＦＴＦＩＴＹＷＩＡ（配列番号８１）であってもよい）；及び
Ｈ−ＣＤＲ２        ＤＩＸ１ＰＧＸ２ＧＸ３ＴＸ４  （ＩＩ）（配列番号１０７）
（式中、Ｘ１はＩ及びＬから選択され、Ｘ２はＳ及びＴから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｈ、及びｗから選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、及びＮから選択され、又は、Ｈ−ＣＤＲ２はＤＩＬＰＡＳＳＳＴＮ（配列番号１０５）である）によって与えられる、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
結合ドメインを有し、前記ＣＤＲでない位置が、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１フレームワーク由来であり、Ｌ−ＣＤＲ−１及び／又はＬＣＤＲ−２、並びにＬ−ＣＤＲ３の配列が、下記式：
Ｌ−ＣＤＲ１        ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑ  Ｘ５ＮＹＬＴ  （ＩＩＩ）（配列番号１１６）
（式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、及びＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、及びＶから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｎ、及びＴから選択され、Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、及びＳから選択される）；
Ｌ−ＣＤＲ２        Ｘ１ＡＳＴＲＸ２Ｓ    （ＩＶ）（配列番号１２０）
（式中、Ｘ１は、Ｈ及びＷから選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＳから選択される）；
Ｌ−ＣＤＲ３        ＱＮＤＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ      （Ｖ）（配列番号１２８）
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、及びＬから選択され、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、及びＹから選択され、Ｘ３は、Ｗ及びＹから選択され、Ｘ４は、Ｌ及びＭから選択される）によって与えられる配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
疾患を患う被験者を治療する方法であって、ＴＦ発現、及び該ＴＦ発現により生じる局所生物活性が、治療を必要としている被験者に、請求項１、３、１９、又は２０に記載の抗体を投与することを含む、治療すべき前記疾患に直接又は間接的に関連している、方法。
【請求項２２】
前記疾患が癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、原発固形腫瘍、転移癌、細胞腫、腺癌、メラノーマ、液性腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、軟部組織癌、悪性腫瘍、骨肉腫、胸腺腫、リンパ肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪腫、神経膠芽腫、星状細胞腫（astrosarcoma）、前立腺、乳腺、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、頸、子宮、子宮内膜、甲状腺、肺、腎臓、又は膀胱の癌から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患が、良性腫瘍、血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫；動脈硬化斑；眼球血管新生疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎及び眼の翼状片（異常な血管成長）；リウマチ性関節炎；乾癬；創傷治癒遅延；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；肥厚性瘢痕（ケロイド）；癒着不能骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋血管新生；冠側副；脳側副；動静脈奇形；虚血肢血管新生；オースラー・ウェーバー症候群；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷肉芽形成；クローン病；及びアテローム性動脈硬化症から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
薬学的に許容可能な調製物中に請求項１、３、１９、又は２０に記載の抗体を含む、被験者を治療するのに有用な医薬組成物。
【請求項２６】
安定な形態の請求項１、３、１９、又は２０に記載の抗体と、使用説明書と、を含む、キット。
【請求項２７】
請求項１、３、１９、又は２０に記載の抗体の前記抗体結合ドメインの１つ以上をコードする、単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３０】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１、３、１９、又は２０に記載の単離された抗体又は断片。
【請求項３１】
Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１アイソタイプを含み、Ｋａｂａｔ位置２３９及び３３２（これらは配列番号１６７の２４２及び３３５である）が、該Ｆｃ領域の変異により、野生型残基Ｓ及びＤから、Ｄ及びＥに改変されている、請求項３０に記載の単離された抗体又は断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／４５２，６７４号に対する優先権を請求し、この内容は参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、組織因子介在血液凝固を阻害することなく、腫瘍細胞などの血管外組織上に存在する抗原であるヒト組織因子に結合する、ヒトに適合した抗体にする。本発明はまた、ヒト組織因子の存在及び受容体機能に関連した、癌などの疾患を治療するための抗体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
凝固因子ＩＩＩ（Ｆ３）、組織トロンボプラスチン、又はＣＤ１４２としても知られる組織因子（ＴＦ）は、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む２１９アミノ酸の細胞外領域と、リン酸化され得る１つのセリン残基を有する短い細胞内ドメインとを有する膜貫通糖タンパク質である。ＴＦは、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの細胞受容体である。
【０００４】
ＴＦは、細胞受容体の形で、正常脳、肺、及び胎盤では高レベル、並びに脾臓、胸腺、骨格筋、及び肝臓では低レベルの組織特異的分布を呈する。ＴＦはまた、細胞由来微小粒子中に、及び選択的スプライシング可溶型として見出される。正常組織における発現に加え、ＴＦは、最も主要な腫瘍型において、及び多くの腫瘍由来の細胞株において過剰発現されることが報告されている（Ｒｕｆ  Ｗ  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．５：１５８４〜１５８７，２００７；Ｍｉｌｓｏｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２９：２００５〜２０１４，２００９）。
【０００５】
損傷に応答した血清タンパク質の凝固は、損傷に対する重要な生理応答である。血液が、コラーゲン（内因性経路）及び組織因子（外因性経路）を含むタンパク質に暴露されると、血小板及び血漿タンパクであるフィブリノゲン（凝固因子）への変化を起こす。血管損傷の後、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は循環を離れ、組織因子保有細胞（間質線維芽細胞及び白血球）上に発現される組織因子（ＴＦ）と接触し、活性化されたＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体を形成する。ＴＦ−ＦＶＩＩａは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化する。ＦＶＩＩは、ＴＦによってアロステリックに活性化され、かつトロンビン、ＦＸＩａ、プラスミン、ＦＸＩＩ及びＦＸａによって活性化され得る。ＴＦ−ＦＶＩＩａは、ＦＸａと共に三元複合体を形成する。
【０００６】
非血管細胞によって発現される組織因子（ＴＦ）は、血液凝固を活性化することによって止血に重要な役割を担う。ＴＦは、止血と異なるプロセスに更に関与し、その上にＴＦが発現される細胞表面の機能に直接関連する。血管及び非血管細胞上の凝固プロテアーゼのＴＦ依存性アセンブリは、Ｇタンパク質共役受容体であるプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）を活性化する。したがって、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、ＰＡＲ、主にＰＡＲ２を介して細胞シグナルを誘発し（Ｃａｍｅｒｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５２５５〜５２６０，２０００；Ｒｉｅｗａｌｄ  ＆  Ｒｕｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：７７４２〜７７４７，２００１；Ｒｕｆら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １：１４９５〜４５０３，２００３；Ｃｈｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８６：３３４〜４５，２００１）、腫瘍形成、血管新生、腫瘍進行、及び転移に寄与することができる。
【０００７】
三元複合体ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａは、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体がＦＸに作用することによって直接的に、又は、ＦＸをＦＸａに変換することができるＴＦ：ＶＩＩａによるＦＩＸとＦＩＸａの変換後に間接的に形成される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の形成は、シグナル伝達を引き起こすか、又はＰＡＲ１〜４などの他の受容体を活性化することができる。ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の形成は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）の誘導をもたらし、腫瘍細胞移動を刺激することができる（Ｈｊｏｒｔｏｒら、血液１０３：３０２９〜３０３７，２００４）。ＰＡＲ１及びＰＡＲ２は共に、腫瘍転移に関与するが（Ｓｈｉら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：３９５〜４０２，２００４）、活性化された二元及び三元複合体（ＴＦ−ＶＩＩａ及びＴＦ−ＶＩＩａ−ＦＸａ）は、同様に細胞シグナル伝達をもたらすＰＡＲ２の活性化因子である（Ｒａｏ  ＆  Ｐｅｎｄｕｒｔｈｉ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４７〜５６，２００５）。したがって、組織因子の発癌性の役割を、腫瘍の移動、溢血、及び転移メカニズムに関与することもまた長い間疑われてきた凝血の役割から分離させることができるかどうかを決めることは興味深かった。
【０００８】
リガンド結合部位の機能的側面及び免疫学的側面を研究するために、組織因子に対する、Ｍｏｒｒｉｓｅｙ（１９８８，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ５２（３）：２４７〜２６１；ＵＳ５２２３４２７）及びＭａｇｄｏｌｅｎ（１９９６  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３７９：１５７〜１６５）に記載されているもののようなモノクローナル抗体が用いられてきた。ＴＦ−ＶＩＩａ複合体を形成する又は維持するＴＦの能力を妨げることによって、又はＦＸを活性化する複合体の能力を阻害することによって、血栓事象を阻害するために、組織因子に結合することが可能なモノクローナル抗体を用いることができる。組織因子に結合し、かつ凝固を阻害しない抗体もまた知られている。第ＶＩＩａ因子開始ＴＦシグナル伝達を阻害するが、凝固を阻害しない、抗体１０Ｈ１０などの抗体もまた記載されており（Ａｈａｍｅｄら、２００６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（３８）：１３９３２〜１３９３７）、かかる抗体は、かかる活性を有する剤の、固形腫瘍の治療における役割及び実用性を研究する機会を提供してきた（Ｖｅｒｓｔｅｅｇら、２００８  Ｂｌｏｏｄ  １１１（１）：１９０〜１９９）。Ｒｕｆらは、国際公開特許第２００７０５６３５２Ａ３号において、患者のうっ血を妨げずに、組織因子シグナル伝達を阻害するための方法及び組成物を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌の進行は多角的プロセスであるので、患者の止血を妨げないと同時に、腫瘍細胞に対する発癌、転移、血管生成、及び抗アポトーシス機能を阻害することができるＴＦ結合抗体である治療候補物質が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、マウス抗体１０Ｈ１０の結合エピトープを保持する、ヒトの治療法として使用される、ヒト適合坑ヒト組織因子特異抗体を提供し、その抗体は、ＦＶＩＩａ結合に関して組織因子と競合せず、したがって、ＴＦ−ＶＩＩａ複合体の凝固促進活性、アミド分解活性を実質的に阻害しないが、ＴＦ−ＶＩＩａによって媒介されるシグナル伝達、及びサイトカインＩＬ−８放出などの下流の発癌作用を阻害する。
【００１１】
ヒトに適合した本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ可変ドメインフレームワークと、１０Ｈ１０マウス抗体ＣＤＲ配列の配列を参照することによって決定され、かつ配列番号６〜１１及び２７で表されるＣＤＲ変異体残基との組み合わせで構築される。ヒトフレームワークＦＲ１及びＦＲ２及びＦＲ３と、ＣＤＲ及びＣＤＲ変異体と、ＦＲ４との組み合わせが提供され、これらの組み合わせは、抗体結合ドメインの、マウス抗体１０Ｈ１０の免疫特異性とのアセンブリを可能にする。本発明の一実施形態では、配列番号６〜１１で表される、又は配列番号６、８〜１１、及び２７で表されるグループとしての６つのＣＤＲ配列は、ヒトＩｇＧ可変ドメインのＣＤＲでない位置と定義され、ヒトＴＦに対する１０Ｈ１０の結合親和性が保持されるように選択される、ヒト生殖細胞系ＦＲと組み合わされる。一態様では、ヒトＨＣ可変領域ＦＲは、ＩＭＧＴデータベースによって表わされるＩＧＨＶ遺伝子ファミリーの１、３、又は５メンバー由来である。一態様では、ヒトＬＣ可変領域ＦＲは、ヒトＩＧＫＶ遺伝子ファミリーの２又は４メンバー由来である。一実施形態では、抗体Ｆｖ（ＬＣ可変領域と対をなすＨＣ可変領域）は、配列番号１２〜２１から選択されるＨＣ可変領域と、配列番号２２〜２６から選択されるＬＣ可変ドメインとを含む。
【００１２】
特定の実施形態では、抗体Ｆｖ（ＬＣ可変領域と対をなすＨＣ可変領域）を形成するヒトＦＲは、ＩＧＨＶ５と、ＩＧＫＶ２  ＦＲとを含む。本発明の抗体は、配列番号８のＨ−ＣＤＲ３、配列番号６、及び６２〜８３から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ１、配列番号７、２７、及び８４〜１０７から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ２、並びに、任意にＩＧＶＪ４（配列番号６０）又はその変異体から選択されるＨＣ  ＦＲ４領域を有するＨＣ可変ドメインを含む。本発明の抗体は、配列番号９、１０８〜１１６から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ１、配列番号１０及び１１７〜１２０から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ２、配列番号１１及び１２１〜１２８から選択される配列を有するＬ−ＣＤＲ３、並びに、任意にＩＧＫＪ２（配列番号６１）又はその変異体から選択されるＬＣ  ＦＲ４領域を有するＬＣ可変ドメインを有する抗体を更に含む。特定の実施形態では、ヒトフレームワーク配列は、ＩＧＨＶ５＿ａに由来し、形成された可変ドメインは、配列番号１９、１２９〜１５５から選択される配列を含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１由来であり、形成された可変ドメインは、配列番号２３、１５６〜１６３から選択される配列を含む。
【００１３】
本発明の抗体は、ＩＧＨＶ５＿ａフレームワーク由来の、ＣＤＲでない位置と定義される結合ドメインを有し、Ｈ−ＣＤＲ３が、配列ＳＧＹＹＧＮＳＧＦＡＹ（配列番号８）を有し、Ｈ−ＣＤＲ−１位置の配列が、下記式：
Ｈ−ＣＤＲ１        ＧＹＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＩＥ  （Ｉ）        （配列番号８３）
（式中、Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹから選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｓ、及びＴから選択され、Ｘ３は、Ｆ、Ｈ、及びＹから選択され、又は配列はＧＦＴＦＩＴＹＷＩＡ（配列番号８１）であってもよい）；及びＨ−ＣＤＲ２位置の配列が次式によって与えられ：
Ｈ−ＣＤＲ２        ＤＩＸ１ＰＧＸ２ＧＸ３ＴＸ４  （ＩＩ）        （配列番号１０７）
（式中、Ｘ１はＩ及びＬから選択され、Ｘ２はＳ及びＴから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｈ、及びｗから選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、及びＮから選択され；ただし、Ｈ−ＣＤＲ２がＤＩＬＰＡＳＳＳＴＮ（配列番号１０５）であるＨ１８９は除く）によって与えられる、抗体としての一形態で表されることができる。
【００１４】
本発明の抗体は、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１フレームワーク由来の、ＣＤＲでない位置と定義される結合ドメインを有し、Ｌ−ＣＤＲ−１及び／又はＬＣＤＲ−２、並びにＬ−ＣＤＲ３の配列が、下記式：
Ｌ−ＣＤＲ１        ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑ  Ｘ５ＮＹＬＴ  （ＩＩＩ）  （配列番号１１６）
（式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、及びＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、及びＶから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｎ、及びＴから選択され、Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、及びＳから選択される）；
Ｌ−ＣＤＲ２        Ｘ１ＡＳＴＲＸ２Ｓ    （ＩＶ）    （配列番号１２０）
（式中、Ｘ１はＨ及びＷから選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＳから選択される）；
Ｌ−ＣＤＲ３        ＱＮＤＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ    （Ｖ）    （配列番号１２８）
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、及びＬから選択され、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、及びＹから選択され、Ｘ３は、Ｗ及びＹから選択され、Ｘ４は、Ｌ及びＭから選択される）によって与えられる配列を有する、抗体として表わされる。
【００１５】
こうして、抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ残基は、実質的に１０Ｈ１０のマウスＣＤＲから改変される。例えば、上述の説明によると、抗体重鎖は、１０Ｈ１０のマウスＣＤＲと、７０％（ＣＤＲ１で３／１０の残基が変更された場合）及び６０％（ＣＤＲ２で４／１０の残基が変更された場合）だけ類似し得る（ＣＤＲ  ３は変更されない場合）。軽鎖ＣＤＲ残基は、１０Ｈ１０のマウスＣＤＲと、７１％（５／１７が変更された場合）、（７１％）（２／７が変更された場合）、又は５５％（４／９が変更された場合）だけ類似する。
【００１６】
本発明は、ヒト組織因子に対する結合で競合し、したがって、マウス１０Ｈ１０抗体と実質的に同じヒトＴＦ−ＥＣＤ上のエピトープと結合する、ヒトに適合した抗体を更に提供する。本発明は、ＴＦ発現、及びそのＴＦ発現により生じる局所生物活性が、治療すべき疾患に直接又は間接的に関連している疾患を患う被験者を治療するために、かかる抗体を使用する方法を更に提供する。
【００１７】
本発明は、抗体、並びに抗体の薬学的に許容可能な調製物を調製する方法、調製物を含む容器、及び、本発明の抗体が被験者を治療するために使用する方法に利用される、その容器を含むキット、を更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】１０Ｈ１０  Ｆａｂの共結晶のＸ線回折分析によって、又はヒト適合変異体（Ｍ１５９３  Ｆａｂ）及びヒトＴＦ−ＥＣＤ残基５〜２０８を用いて明らかにされたエピトープを示し、Ｍ１５９３  Ｈ−ＣＤＲ１（Ｔ３１Ｐ）及びＨＣＤＲ−２（Ｓ５７Ｆ）において改変された２つの接触残基が示されている。
【図２】ヒト（配列番号１、１〜２１９）、カニクイザル（配列番号２、１〜２２０）、及びマウスＴＦ−ＥＣＤ（配列番号３、１〜２２１）のアミノ酸残基のアライメントであり、マウス抗体ＴＦ８−５Ｇ９（Ｈｕａｎｇら、１９９８  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７５：８７３〜９４）及び１０Ｈ１０が接触する残基位置を示しており、これら残基は、凝固因子ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ及びＦＸが接触することで知られている。
【図３】５Ｇ９及び１０Ｈ１０のパラトープ、並びに凝固因子ＦＶＩＩ及びＦＸが接触して示されている領域を有する、ヒトＴＦ−ＥＣＤの三次元映像を示し、残基Ｌ１０４及びＴ１９７のみに１０Ｈ１０及びＦＸの両方が接触している。
【図４】マウス抗体１０Ｈ１０の重鎖（上方のアライメント）及び軽鎖（下方のアライメント）可変ドメインのアミノ酸配列（それぞれ配列番号４及び５）、抗体Ｍ５９のヒトフレームワーク適合配列（それぞれ配列番号１９及び２３）、並びに２つの選択された親和性成熟可変ドメイン配列Ｈ１１６（配列番号１３３）及びＨ１７１（配列番号１３９）のアライメントを示す。
【図５】アイソタイプ対照Ｂ３７と比較した、ＭＤＢ−ＭＢ−２３１乳癌細胞による０．２４μｇ／ｍＬでの、ＦＶＩＩａ誘発ＩＬ−８放出に対する２７個の親和性成熟ｍＡｂによる相対的阻害百分率を示す。
【図６】免疫無防備状態のマウスにＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞を埋め込んだ後の、数日にわたる腫瘍容積のプロットを示し、Ｍ１５９３を投与された群は、定着腫瘍の成長を低減させた。
【図７】免疫無防備状態のマウスにＡ４３１ヒト扁平上皮癌細胞を埋め込んだ後の、数日にわたる腫瘍容積のプロットを示し、Ｍ１５９３を投与された群は、定着腫瘍の成長を低減させた。
【図８】マウス可変ドメインヒトＩｇＧ１（Ｍ１）、位置２３４及び２３５がアラニン置換されているマウス可変ドメインヒトＩｇＧ４、未修飾ＣＨＯで産生された野生型ＩｇＧ１としてのＭ１５９３、低フコース含有量でグリカンを生成するように選択されたＣＨＯ株で産生されたＭ１５９３−ＬＦ、並びにＳ２３９Ｄ及びＩ３３２ＥにＫａｂａｔ位置置換を有するＭ１５９３−ＤＥに関する、ヒトＰＢＭＣによる標的細胞溶解（ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞）のパーセンテージと、ＭＡｂ濃度とを対比したプロットを示す。
【００１９】
配列リストの説明（１）
2014509856.tif 000003
【００２０】
配列リストの説明（２）
2014509856.tif 000004
【００２１】
配列リストの説明（３）
2014509856.tif 000005
【００２２】
配列リストの説明（４）
2014509856.tif 000006
【００２３】
配列リストの説明（５）
2014509856.tif 000007
【発明を実施するための形態】
【００２４】
略語
ＴＦ＝組織因子、ｈｕＴＦ＝ヒト組織因子、ｍｕＴＦ＝マウス組織因子、ｃｙｎｏＴＦ＝カニクイザル組織因子、ＴＦ−ＦＶＩＩａ＝組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、ＴＦ／ＦＶＩＩａ＝組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖、ｖ−領域＝可変領域、ＶＨ＝重鎖可変領域、ＶＬ＝軽鎖可変領域、ＣＣＤ＝電荷結合素子、ＣＤＲ＝相補的決定領域、ＣＨＥＳ＝２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＥＣＤ＝細胞外ドメイン、ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、ＨＥＫ＝ヒト胎児腎臓細胞、ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ＰＡＲ＝プロテアーゼ活性化受容体、ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞、ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＰＤＢ＝プロテインデータバンク、ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＥＣ＝サイズ排除クロマトグラフィ、ＭＡｂ＝モノクローナル抗体、ＦＲ＝抗体のフレームワーク、ＨＦＡ＝ヒトフレームワーク適合。
【００２５】
定義＆用語の説明
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に組み込むことのできる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補的決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域若しくはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などが挙げられるが、これらに限定されない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を更に含むことを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、あるいは抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分又はその特定断片若しくは一部を含み、単鎖並びに単一ドメイン抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ、ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ、ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕（single arm）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、これらの領域は組換え方法を用いて合成リンカーにより連結することができ、合成リンカーは、ＶＬ及びＶＨ領域を対にして、一価分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６、及びＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）として作製することを可能にする。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、ｓｃＦｖコンストラクトのライブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のＤＮＡにスプライスしてもよい。そのようなライブラリの１つの例は、「ＨｕＣＡＬ：ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」（Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０００）２９６（１）：５７〜８６）である。
【００２６】
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与する、又はその原因である、抗体の相補的決定領域又は高頻度可変領域アミノ酸残基を指す。抗体のヒトＩｇＧサブタイプの高頻度可変領域、即ちＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）に記載されているように、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）と、重鎖可変ドメイン内の３１〜３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）とからのアミノ酸残基、並びに／又は高頻度可変ループ（即ち、（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）に記載されているように、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）、及び９５〜１０１（Ｈ３））からのアミノ酸残基を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保存されている高頻度可変ループを「カノニカル構造」と呼ぶ。フレームワーク又はＦＲ１〜４残基は、高頻度可変領域以外の、それを一括する可変ドメイン残基である。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋの付番システムは、小文字表記、例えば３０ａ、３０ｂ、３０ｃ等で表される特定の残基の拡張を示すことにより、ループ内の残基の数の相違を考慮する。最近では、共通の付番システムであるｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）（ＬａＦｒａｎｃら、２００５．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ５９３〜Ｄ５９７）が開発され、広く採用されている。
【００２７】
本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、連番による軽鎖又は重鎖内の位置との両方の観点において意味される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」が、種間で保存され、ループと呼ばれる構造に存在するとき、構造上の特徴により可変ドメイン配列を整合する付番システムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は、容易に同定される。この情報は、１種の免疫グロブリンから、典型的にヒト抗体からのアクセプターフレームワークの中へのＣＤＲ残基のグラフト化及び置換に使用される。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」、又は「Ｆｃ含有分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、単量体、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を意味する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タンパク質／分子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる。
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な分子表面基で構成されており、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。構造的及び非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するという点で区別される。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、ＫＤは、解離定数、詳細には既定の抗原についての抗体の解離定数ＫＤを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は、既定の抗原について、有するＫＤが１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、更に好ましくは１０−１０Ｍ以下である。ＫＤの逆数は、ＫＡ、会合定数である。本明細書で使用されるとき、用語「ｋｄｉｓ」又は「ｋ２」又は「ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すよう意図されている。「ＫＤ」は、解離速度（ｋ２）（「オフ速度（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる）の結合速度（ｋ１）（又は「オン速度（ｋｏｎ）」）に対する比である。よってＫＤは、ｋ２／ｋ１又はｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表現される。ここで、ＫＤが小さくなるほど、結合は強くなる。よって、ＫＤが１０−６Ｍ（又は１マイクロＭ）とは、１０−９Ｍ（又は１ｎＭ）と比べ、弱い結合を表わす。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成物の抗体分子の調製を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。この用語はまた、「組み換え抗体」及び「組み換えモノクローナル抗体」も含み、（ａ）動物、又は抗体分泌動物細胞と融合パートナーとの融合により調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組み換えの、ヒト又は他の種のコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びに（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを含む任意の他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体、などの全ての抗体は、組み換え手段により調製、発現、作製又は単離される。本明細書で使用されるとき、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に有さない抗体を指すことが意図される。しかしながら、ヒトＴＦのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する、単離された抗体は、他の関連した抗原、例えば、他の種（例えば、ＴＦ種ホモログ）由来の抗原に対して、交差反応性を有する場合がある。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。本発明の一実施形態では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確に規定された組成物中で混ぜ合わせる。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「特異的な結合」、「免疫特異的な結合」及び「免疫特異的に結合する」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。通常、抗体の結合における解離定数（ＫＤ）は１０−７Ｍ以下であり、抗体が所定の抗原と結合する際のＫＤは、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド）と結合する際のＫＤと比較して、少なくとも１／２以下である。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。本明細書で使用されるとき、「高度に特異的な」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対的なＫＤが、他のリガンドに対する抗体の結合に関するＫＤの少なくとも１０倍小さいことを意味する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ）を指す。いくつかの抗体クラスは更にサブクラスを包含し、そのサブクラスも重鎖定常領域によりコードされ、更に定常領域ドメイン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）内の特定の残基においてオリゴ糖により装飾され、抗体に生物学的機能が更に付与されている。例えば、ヒト抗体アイソタイプにおいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びわずかながらＩｇＧ２は、マウスＩｇＧ２ａ抗体と同様、エフェクター機能を呈する。
【００３３】
「エフェクター」機能又は「エフェクターポジティブ（effector positive）」は、抗体が抗原特異的結合領域から区別されるドメインを含み、そのドメインは、受容体、又は補体などの他の血液成分と相互作用して、例えばマクロファージの動員、及び抗体の抗原結合ドメインに結合された細胞の破壊をもたらす事象を引き起こすことができる。抗体は、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、抗体に対する補体のＣ１成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソニン作用と、細胞の病原体の溶解に重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、多数の重要で多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、又はＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。
【００３４】
用語「組織因子タンパク質」、「組織因子」、及び「ＴＦ」は、以下に記載されるように、天然ヒト組織因子又は組み換え組織因子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すために用いられる。天然ＴＦは、人類並びに他の動物種、例えば、ウサギ、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、ウマ、マウス、及び羊の組織因子を包含する（例えば、Ｈａｒｔｚｅｌｌら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：２５６７〜２５７３；Ａｎｄｒｅｗｓら、（１９９１）Ｇｅｎｅ，９８：２６５〜２６９；及びＴａｋａｙｅｎｉｋら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８１：１１４５〜１１５０を参照のこと）。ヒト組織因子のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１３７２６（配列番号１）、カニクイザル（配列番号２）、及びＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２０３５２で示されるマウス（配列番号３）で示される。他の哺乳類組織因子タンパク質のアミノ酸配列は、一般に知られているか、又は従来技術を通じて取得できる。
【００３５】
本発明の抗体は、ＴＦシグナル伝達によりもたらされる細胞、組織、又は器官上に発現したヒトＴＦの機能を阻害することが望ましい場合、また、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の形成によりもたらされるＴＦの凝血原機能を実質的に変化させないことが望ましい場合に、被験者に投与する又はヒト組織と接触させるのに有用である。そうした用途は、腫瘍、特に、胸部、前立腺、肺、膵臓、及び卵巣の原発又は二次性固形腫瘍の治療に見出すことができる。
【００３６】
本発明はまた、培養液中、生体内原位置、及び生体内などで形成されるのが望ましい環境において、組換え手段、又は抗体の発現情報の伝達を介して構築及び製造するのが有用であることが当該技術分野において周知である配列と組み合わされることができる、本発明の抗体配列をコードする核酸を包含する。本発明の抗体を産生する目的でかかる核酸を操作する手段は、当業者に周知である。
【００３７】
本発明は、更に、本発明の抗体を単離された形態で投与及び貯蔵するための調製物、例えば、薬学的に許容可能な又は安定した調製物を提供する。
【００３８】
１．抗体の組成物
特性
本発明は、１０Ｈ１０（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎら、米国特許第５，２２３，４２７号）として知られるヒトＴＦに結合する、凝固を阻害しないマウス抗体は、特定の細胞におけるＴＦのシグナル伝達を抑制することができるという予想外の発見に基づいている（Ａｈｍｅｄら、２００６、先に引用、ＰＣＴ国際公開特許第２００７／０５６３５２Ａ２号）。したがって、本発明の抗体は、マウス抗体１０Ｈ１０の結合エピトープを保持するものであり、このマウス抗体１０Ｈ１０は、ＦＶＩＩａ結合に関して組織因子と競合せず、ＴＦ−ＶＩＩａ複合体の凝固を促進するアミド分解活性を実質的に阻害し、並びに、ＴＦ−ＶＩＩａによって媒介されるシグナル伝達、及びサイトカインＩＬ−８の放出などの下流の発癌作用を阻害する。本発明の抗体は、ＩＭＧＴデータベースに記載されているヒト生殖細胞系列ＩｇＧ遺伝子に適合し、ヒト血漿中のカルシウムの存在下で凝固を開始させるＴＦの能力を妨げずに、ヒトＴＦに結合し続ける。
【００３９】
マウス抗体１０Ｈ１０の結合エピトープを保持する抗体は、一般に、抗体のＴＦに結合する能力、及びヒトＴＦへの結合に関して１０Ｈ１０と競合する能力の評価によって評価され得、一方でそれと同時に、ヒト血漿の存在下でＴＦを含む試料中に存在する場合、抗体の不在下でのヒト血漿の同様の試料と比べて、ＴＦが開始する血漿凝固に必要な時間を実質的に長引かせない。別の意味では、抗体のエピトープは、抗体によって結合されたＴＦの欠失突然変異誘発、置換変異誘発、制限タンパク質分解後のペプチド断片の同定、並びにＴＦの一次構造及び抗体結合ドメインの原子構造の近くをマッピングし、それによって抗体とヒトＴＦとの間の三次元結合を定義するための、共結晶化及びＸ線回折法を含むが、これらに限定されない当該技術分野において既知の技術によって、物理的にマッピングされ得る（図１）。
【００４０】
したがって、エピトープは、ＦＶＩＩａ結合部位と重ならないとして定義することができる（図２及び図３）。より詳細には、本発明の抗体によって結合されるエピトープは、ヒト血漿中のカルシウムの存在下で凝固を開始させるＴＦの能力を妨げずに、ＦＶＩＩによって接触されないＴＦのＮドメインの１つ以上の残基（配列番号１で示される成熟鎖の残基１〜１０４）、例えば残基６５〜７０と接触し、基質結合にとって重要なＣドメインのＫ１６５及びＫ１６６と接触しなくてもよい（Ｋｉｒｃｈｏｆｅｒら、２０００  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔａｔ  ８４：１０７２〜８１）。
【００４１】
一実施形態では、抗体の結合速度（ｋａ（１／Ｍ・ｓ））は１×１０−５より大きい。別の実施形態では、ＴＦに関する抗体の解離速度（ｋｄ（１／ｓ））は１．０×１０−５未満であり、得られるＫＤは、１×１０−９Ｍ未満（１ｎＭ未満）である。特定の実施形態では、抗体は、ＫＤが０．５×１０−９Ｍ未満であるヒト生殖系列遺伝子適応抗体である。一実施形態では、抗体は、表１１に示される重鎖及び軽鎖ペアのドメイン、例えば、Ｍ１６３９、Ｍ１６４５、Ｍ１６４７、Ｍ１６５２、Ｍ１６４１、Ｍ１６４４、Ｍ１５８７、Ｍ１６０４、Ｍ１５９３、Ｍ１６０６、Ｍ１５８４、Ｍ１６１１、Ｍ１５９６、Ｍ１６０１、Ｍ１５８８、Ｍ１５９４、Ｍ１６０７、Ｍ１６１２、Ｍ１５９５、Ｍ１５９９、Ｍ１５８９、Ｍ１５９２、Ｍ１５８３、及びＭ１６１０から選択される結合ドメインを有する。
【００４２】
抗体組成物は、配列番号６〜１６６で示されるアミノ酸配列の１つ以上から選択される結合ドメインのアミノ酸残基の配列を含むとして更に特徴付けることができる。
【００４３】
変化したＦｃ機能を有する抗体変異体
組換え方法によって生産された治療用モノクローナル抗体の使用が広がるにつれて、こうした複合体組成物の特徴及び特性が探求されてきた。免疫特異性及び抗原標的化の特徴は、一般に、ＣＤＲとしても知られる高頻度可変領域のループ末端などの可変ドメイン及びサブドメインに存在するが、複合体は、ＩｇＧのＦｃ部分などの定常ドメインによって形成される構造体によって提供される他の受容体及び血清成分と相互作用する。
【００４４】
抗体及び他のＦｃ含有タンパク質は、いくつかのよく知られた生体外アッセイによって機能性を比較することができる。具体的には、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩファミリーのメンバーに対する親和性が対象となる。これらの測定値は、受容体の組み換え可溶型又は受容体の細胞結合型を使用して形成することができる。更に、ＦｃＲｎに対する親和性、ＩｇＧの延長された循環半減期に応答可能な受容体は、組み換え可溶型ＦｃＲｎを使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定することができる。ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイ等の細胞ベースの機能性アッセイは、特定の変異型構造の可能な機能性の結果に関する見識を提供する。一実施形態において、ＡＤＣＣアッセイは、主要なエフェクター細胞であるＮＫ細胞を有するように構成され、それによって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体上で機能的効果を反映させる。過酸化物又は炎症媒介物放出等の細胞応答を測定できるように、食作用アッセイを使用して、異なる変異型の免疫エフェクター機能を比較することもできる。インビボモデルも同様に、例えば、抗ＣＤ３抗体の変異型を使用して、マウスにおけるＴ細胞活性を測定する場合に使用することができ、活性は、Ｆｃγ受容体等の特定リガンドを係合するＦｃドメインに依存する。
【００４５】
２．組織因子シグナル阻害抗体の産生
本出願に記載される抗体の特徴及び生物活性を有する抗体は、任意の哺乳類、例えば、非限定的にヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、ヤギ、若しくはそれらの任意の組み合わせを含むか、又はそれらに由来することができ、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト又は霊長類適応抗体、免疫グロブリン、開裂生成物、及び他の特定部分、並びにそれらの変異型を含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜４９７）、及びＢ細胞と融合する不死化融合パートナーを用いる関連方法など、当該技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。本発明で用いる抗体はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３〜７８４８１、国際公開特許第９２／０２５５１号、同第２００４／０５１２６８号、及びＰＣＴ国際特許出願第２００４／１０６３７号に記載される方法による特異抗体の生成に関して選択される１個のリンパ球から生成する免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡｓのクローニング及び発現に基づいた単一リンパ球抗体法を用いて産生することもできる。
【００４６】
標的結合ドメイン又はサブドメイン、定常ドメイン、並びに本明細書に記載されるＦｃドメインなどの機能的非標的結合ドメインを含む抗体は、当該技術分野において周知のいくつかの方法によって誘導され得る。一態様では、天然抗体ドメインの配列は、例えば、Ｖ−ｂａｓｅ（ｔｈｅ  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇから供給される）、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ  Ｉｇ  ｂｌａｓｔ）、又はｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）より供給されるｔｈｅ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｄａｔａｂａｓｅなどの、刊行された又はオンラインの文書又はデータベースから好都合に得られる。
【００４７】
ヒト抗体
本発明は更に、ヒトＴＦに結合するヒト免疫グロブリン（又は抗体）を提供する。これらの抗体はまた、遺伝子操作を受けた又は適応されたとして特徴付けされ得る。免疫グロブリンは、実質的にヒト生殖系列免疫グロブリンからの可変領域（複数可）を有し、抗原認識に関与することが知られる残基において、指向された変形、例えば、ＫａｂａｔのＣＤＲ又は構造的に画定されるような高頻度可変ループを含む。存在する場合、定常領域（１つ以上）も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト抗体は、少なくとも約１０−６Ｍ（１マイクロＭ）、約１０−７Ｍ（１００ｎＭ）、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下のＴＦに対するＫＤを示す。親和性の変化に影響を及ぼす、例えば、ＴＦに対するヒト抗体の親和性を改善する、又はそのＫＤを減少させるために、ＣＤＲ残基又は他の残基のいずれかの置換が行われ得る。
【００４８】
ＴＦに結合するヒト抗体の産生源は、好ましくは、本明細書では、配列番号１２９〜１６３から選択される配列、配列番号２８〜６１から選択されるＦＲ、及び、ヒトＴＦに結合することができ、かつ繊維状ファージ粒子上にディスプレイされるヒト由来Ｆａｂのレパートリーを用いて、カニクイザルＴＦと交差反応することができるとして特定される、配列番号６〜１１、２７、６２〜１２８の１つ以上から選択されるＣＤＲを含む可変領域として提供される配列である。
【００４９】
いずれかのヒト可変ドメインＦＲへのいずれかの非ヒトＣＤＲの置換は、ＣＤＲの由来となった親可変ＦＲに対する適合から提供されるのと同じ空間的定位を可能とし得ない。最終ＭＡｂに対合される重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然ヒト抗体の配列であってもよく、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来してもよく、又は数種のヒト抗体及び／若しくは生殖系列配列のコンセンサス配列であってもよい。
【００５０】
好適なヒト抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列と、既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定される。比較は重鎖と軽鎖とで別々に行われるが、原理はそれぞれに関して類似している。
【００５１】
経験的方法に関しては、所望の活性、結合親和性又は特異性をスクリーニングし得る変異体配列のライブラリを形成することが特に簡便であることが見出されている。そのような変異体のライブラリを形成するための１つのフォーマットは、ファージディスプレイベクターである。あるいは、変異体は、可変ドメイン内の標的残基をコードする核酸配列を多様化させる他の方法を用いて生成することができる。
【００５２】
更なる置換が必要であるか否かを決定する別の方法と、置換されるアミノ酸残基の選択とは、コンピュータモデリングを用いて達成することができる。免疫グロブリン分子の３次元画像を生成するコンピュータハードウェア及びソフトウェアは、広く入手可能である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインに関する解明された構造から出発して生成される。モデリングされる鎖のアミノ酸配列の、解明された３次元構造の鎖又はドメインとの類似性が比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが分子モデル構成の出発点として選択される。解明された出発構造は、モデリングされている免疫グロブリン鎖又はドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の差異を許容するよう変更される。次いで、変更された構造は、複合体免疫グロブリンに組み立てられる。最終的に、モデルは、エネルギーを最小化し、また全部の原子が互いから適切な距離内に存在し、結合の長さと角度とが化学的に許容し得る限界内にあることを検証することにより精密化される。
【００５３】
コードの縮重により、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするであろう。所望の核酸配列は、新規の固相ＤＮＡ合成、又は所望のポリヌクレオチドの早期に調製された変異体のＰＣＲ突然変異誘発により生成され得る。本願に記載される抗体をコードする全ての核酸は、本発明に明白に含まれる。
【００５４】
本明細書に記載されるように生成されたヒト抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に結合される。抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、更にＣＨ４ドメインを含むことがある。
【００５５】
ヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む抗体の任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）からの任意のタイプの定常ドメインを含んでもよい。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、定常ドメインは通常、補体結合性定常ドメインであり、クラスは一般にＩｇＧ１である。かかる細胞傷害活性が望ましくないとき、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスであってもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含んでもよい。
【００５６】
場合により定常領域に結合されたヒト化軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクター内に挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（１つ以上）内の制御配列に操作可能に結合される。そのような制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結配列を含む（全ての目的に関して引用によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９（１９８９）；国際公開特許第９０／０７８６１号；Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９（１９９２）を参照のこと）。
【００５７】
抗体若しくはＦｃ又はその成分及びドメインは、そのようなドメイン又は成分のライブラリ、例えば、ファージライブラリから選択することにより得られてもよい。ファージライブラリは、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリ又は目的とする配列を含むポリヌクレオチドのライブラリを挿入することによって、例えば、免疫化動物又はヒトのＢ細胞から作製することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３７１〜８）。抗体ファージライブラリは、１つのファージに重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖可変領域対を含み、単鎖Ｆｖ断片又はＦａｂ断片の発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００  ｓｕｐｒａ）。ファージミドライブラリの多様性は、ライブラリのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大及び／又は変化させ、追加の望ましいヒトモノクローナル抗体を産生しその後同定するように、操作され得る。例えば、遺伝子をコードする重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の免疫グロブリン分子は、組み立てられた免疫グロブリン分子における新規のＨＬ対を作成するように、無作為に混合（入れ替え）され得る。更に、遺伝子をコードするＨ鎖及びＬ鎖の一方又は双方は、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）において変異誘発され、かつその後に望ましい親和性及び中和能力について篩分けされ得る。抗体ライブラリはまた、１つ以上のヒトＦＲ配列を選択し、かつヒト抗体レパートリー由来か又は設計された変異を通じて得られるＣＤＲカセットの収集物を導入することによって合成的に作製され得る（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｒｕｄｅｎ  ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置はＣＤＲに限定されず、可変領域のＦＲセグメントも含み得、又は抗体可変領域以外、例えばペプチド等を含み得る。
【００５８】
抗体可変領域以外を含み得る標的結合成分又は非標的結合成分の他のライブラリは、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、及び細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質のＲＮＡとの付着を保ちつつ、ｍＲＮＡをそれらの同属タンパク質へと翻訳する方法である。核酸コーディング配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって回復される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接着受容体、ａｇａ１及びａｇａ２（接合型系の一部）の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌ディスプレイは、細胞膜又は細胞壁に関係している、標的と排出された細菌タンパク質との融合に基づく（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ２００２  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。
【００５９】
本発明はまた、本発明の組成物をコードする核酸を、単離したポリヌクレオチドとして、又は、組成物若しくはその定方向突然変異の原核、真核、若しくは繊維状ファージ発現、分泌及び／若しくは表示に適合性のベクターを含む発現ベクターの一部分として提供する。
【００６０】
３．本発明の抗体の産生方法
本発明の抗体分子が、本明細書に記載される構造及び機能特性に従って特定されたら、抗体鎖の所望の部分又は抗体鎖全体をコードする核酸配列は、クローン化、コピー、又は化学的に合成されることができ、かつ常法によって抗体を発現させるために単離及び使用されることができる。本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野において周知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度差によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。更に、本発明の抗体及びその断片は、精製を容易にするために、本明細書に記載される、さもなければ当該技術分野において既知の異種ポリペプチド配列と融合することができる。
【００６１】
宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本明細書で説明されるように、組換えＦｃ含有タンパク質又はモノクローナル抗体の発現のために選択される宿主細胞は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン内でタンパク質を修飾するオリゴ糖部分の組成物における変化を含むが、これに限定されず、最終的な組成物にとって重要な寄与因子である。したがって、本発明の１つの態様は、所望の治療用タンパク質を発現する産生細胞の使用及び／又は開発のために、適切な宿主細胞の選択を含む。
【００６２】
更に、宿主細胞は、哺乳類起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化細胞、若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。
【００６３】
あるいは、別の方法としては、宿主細胞は、ポリペプチドのグリコシル化が不可能である種又は有機体、例えば、原核細胞又は有機体、及び天然又は工学的大腸菌ｓｐｐ、クレブシェラｓｐｐ、又はシュードモナスｓｐｐから選択されてもよい。
【００６４】
４．抗ＴＦ抗体の使用方法
上述された方法のうちのいずれかによって生成される組成物（抗体、抗体変異体、又は断片）は、ヒトの疾患、又は細胞、組織、器官、体液、若しくは、一般に宿主における特定の病理を、診断、治療、検出、又は調節するために使用され得る。本明細書において教示されるように、抗体が元のターゲッティング性を保持した状態で、標的結合後のエフェクター機能のより特異的に適した範囲をもたらすための、抗体のＦｃ部分、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｃ断片の修飾は、特定応用及び治療指標のための抗体の変異体を産生する。
【００６５】
本明細書によって提供される組成物を用いて治療可能であり得る疾患又は症状としては、原発固形腫瘍及び転移癌などの癌、細胞腫、腺癌、メラノーマ、リンパ腫、白血病及び骨髄腫などの液性腫瘍、並びに癌の進行につれて形成される浸潤性腫瘤、軟部組織癌；悪性腫瘍、骨肉腫、胸腺腫、リンパ肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪腫、神経膠芽腫、星状細胞腫（astrosarcoma）、前立腺、乳腺、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、頸、子宮、子宮内膜、甲状腺、肺、腎臓、又は膀胱の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明の抗体が、炎症性サイトカインＩＬ−８などのサイトカインの下流放出に関与するＴＦの能力を阻害することによって、組織内の発癌促進環境を低減する限りにおいて、本発明の抗体は、予防的に、又は腫瘍の増殖及び血管新生を抑制することを目的とする他の治療と共に用いられ得る。ほとんどの加齢による癌は、再生可能な組織の上皮細胞に由来する。上皮組織の重要な要素は、細胞外基質、及び線維芽細胞、マクロファージ、及び内皮細胞などのいくつかの細胞型から成る上皮下部の層である間質である。癌性腫瘍において、間質は、腫瘍の成長及び進行にとって重要であり、ＴＦは、間質細胞並びに癌性上皮細胞上に発現され得る。したがって、間質内のＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達によりもたらされる下流因子の存在は、腫瘍性組織の形成を駆動する発癌突然変異と相乗作用する癌促進組織環境を作り出す可能性がある。
【００６７】
同様に、ＴＦが脂肪組織で発現されると、肥満症、メタボリックシンドローム、及び糖尿病などの状態の組織の機能を変更することができる。本発明の抗体は、ＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達を阻害することによって、こうした疾患を治療するのに有用であり得る。例えばＩＬ−８及びＩＬ−６などのＴＦ：ＦＶＩＩａシグナル伝達の下流で生成される因子のいくつかは、強力な炎症メディエーターである。本発明の抗体の付加的用途は、したがって、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、及び喘息などであるが、これらに限定されない炎症性疾患の治療が挙げられる。
【００６８】
本発明の抗体は、ＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達を阻害し、かつ血管新生を促進する下流効果を低減するので、本発明の抗体は、癌に加えて、血管新生を伴う他の疾病、疾患、及び／又は病状を治療するのに有用であり得る。こうした疾病、疾患、及び／又は病状としては、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫など；動脈硬化斑；眼球血管新生疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎及び眼の翼状片（異常な血管成長）など；リウマチ性関節炎；乾癬；創傷治癒遅延；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；肥厚性瘢痕（ケロイド）；癒着不能骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着：心筋血管新生；冠側副；脳側副；動静脈奇形；虚血肢血管新生；オースラー・ウェーバー症候群；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷肉芽形成；クローン病；及びアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明の抗体がＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達を阻害する限りにおいて、その抗体を用いて、新生物などであるが、これに限定されない、過剰増殖性の疾病、疾患、及び／又は病状を治療及び／又は診断することができる。抗体は、直接的又は間接的相互作用を介して、疾患の拡散を阻害することができる。本発明の抗体によって治療することができる、及び／又は診断することができる過剰増殖性の疾病、疾患、及び／又は病状の例としては、高ガンマグロブリン血、リンパ増殖性疾患、キャッスルマン病などの疾病、及び／又は病状、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｎマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増加症、並びに器官、組織、又は体液区画における任意のその他の過剰増殖性疾患などの過剰増殖性の疾病、疾患、及び／又は病状が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の抗体が治療上使用され得る更なる手段としては、例えば、補体（ＣＤＣ）によって又はエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって介在されるような抗体の直接的細胞毒性、又は、例えば免疫複合体としての抗体の間接的細胞毒性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。実験的記述では、特定の試薬及び手順を用いて、タンパク質、又は抗体、又は特定の断片を産生した。抗体を特性化するために定常的に用いた解析法を以下に記載する。
【００７２】
材料及び方法
タンパク質及び抗体スタンダード
ヒトＴＦの組み換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅを基礎とする直接的な結合アッセイ用に２つの形態で構築し、ＴＦ（配列番号１）の成熟鎖のアミノ酸１〜２１９を、Ｃ末端Ｈｉｓ６−ｔａｇペプチドを有する哺乳類系で発現させ、共結晶構造解析に関しては、配列番号１のアミノ酸５〜２１３を、Ｃ末端Ｈｉｓ６−ｔａｇペプチドを有する細菌系で発現させた。タンパク質のアミン残基を標的にするＮＨＳ−ｅｓｔｅｒ化学分析を用いて、ヒトＴＦ１−２１９をビオチン化した。凝固アッセイでは、Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．カタログ番号Ｂ４２１２）（診断用途用の、リン脂質、カルシウム、緩衝液、及び安定剤と混合された凍結乾燥された組み換えヒト組織因子）を用いた。
【００７３】
カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴＦ−ＥＣＤ（配列番号２）を、ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手したカニクイザルの精巣組織から単離したｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローン化した。
【００７４】
いくつかの抗体を参照抗体として用いた：ｉ）元のハイブリドーマＴＦ９．１０Ｈ１０−３．２．２からクローン化した１０Ｈ１０（米国特許第７２２３４２７号）；ｉｉ）ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ定常領域に配列番号４及び配列番号５を含む１０Ｈ１０マウス−ヒトキメラ、Ｍ１と指定；ｉｉｉ）Ｍ５９、１０Ｈ１０の６つのＣＤＲを含み、かつ親和性成熟のための親抗体としての役割を果たす、ヒトＩｇＧ１及びヒトＫａｐｐａ定常領域に配列番号１９及び配列番号２３を含むヒトＦＲ適応抗体；ｉｖ）マウスの抗ヒト組織因子抗体ＴＦ８−５Ｇ９（米国特許第７２２３４２７号）；ｖ）抗体５Ｇ９からヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａとしてヒト化した、ＣＮＴＯ  ８６０として知られる抗体（米国特許第７６０５２３５号）、並びにｖｉ）Ｂ３７と呼ばれる無関係な抗原（ＲＳＶ）に結合するアイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１／ｋａｐｐａ）抗体。
【００７５】
抗体の発現及び精製
常法を用いて、開示される抗体を発現及び生成した。一次スクリーニングでは、これら分子をコードするＤＮＡを、９６ウェルプレートの中のＨＥＫ  ２９３Ｅ細胞の中で一時的に発現させ、トランスフェクションの後９６時間後に、上清を活性（結合）に関して試験した。パイロットスケールでの発現及び精製の該当点を特定して選択した。パイロットスケールでの発現は、７５０ｍＬの量のＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞又はＣＨＯ−Ｓ中で一時的に行われた。採取した上清をタンパク質Ａクロマトグラフィで精製し、精製タンパク質を、それらの親和性及び機能活性について評価した。更に、精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及び相互作用クロマトグラフィ（ＣＩＣ）による生物物理学的特徴付けに供した。理論的等電点（ｐＩ）を、各変異体についても計算した。パイロットスケールでの特徴付けから、最終的な有力候補の組をＷＡＶＥ生物反応器にトランスフェクトし、タンパク質Ａクロマトグラフィ（chromatorgraphy）で精製した。
【００７６】
Ｆａｂ産生及びモノクローナルＦａｂのＥＬＩＳＡ
ファージパニングラウンドからのグリセロールストックをミニプレップし、ｐＩＸ遺伝子をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化により除去した。再連結の後、ＤＮＡをＴＧ−１細胞に転換し、ＬＢ／寒天平板培地で一晩増殖させた。次の日、コロニーを採取し、一晩増殖させ、この培養物を、（ｉ）Ｖ領域のコロニーＰＣＲ及びシークエンシング、並びに（ｉｉ）Ｆａｂ産生の誘発で用いた。Ｆａｂを産生するため、一晩培養物を新しい培地で１０〜１００倍に希釈し、３７℃で５〜６時間にわたって増殖させた。Ｆａｂ産生は、ＩＰＴＧを含有する新鮮培地を加えることによって誘発され、培養物を３０℃にて一晩増殖させた。次の日、培養物を回転沈降させ、可溶性のＦａｂタンパク質を含有する上清を、ＦａｂのＥＬＩＳで用いた。
【００７７】
ＦａｂのＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂは、多クローン性抗Ｆｄ（ＣＨ１）抗体によってプレートの上に捕捉された。適切な洗浄及び阻害の後、ビオチン化ｈＴＦを０．２ｎＭ濃度で添加した。この濃度は、全プレートに対照として存在する親Ｆａｂを１００％結合と定義した場合の親の結合百分率として定義された、Ｆａｂ変異体のランク付けを可能にする。ビオチン化ｈＴＦは、ＨＲＰ共役ストレプトアビジン及びプレートリーダーの化学発光読取値によって検出された。
【００７８】
ＴＦ−ＥＣＤ結合ＭＡｂベースのＥＬＩＳＡ
化学発光による検出を用いた溶液相直接ＴＦ結合ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトフフレームワーク適応ライブラリから最も良く結合するもののランク付けを行った。９６ウェルｂｌａｃｋ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液で希釈した１００ｕＬの４ｕｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＦＣで、ｐＨ  ９．４、４℃にて一晩コーティングした後、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０溶液を有するＰＢＳ）で３回洗浄し、３００μＬの１％  ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液で１時間にわたって阻害し、その後、先と同様に洗浄した。試料又は標準物質をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０５％  Ｔｗｅｅｎ中１％  ＢＳＡ）で５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを室温にて１時間にわたり振盪させながらアッセイプレートに添加した。これらプレートを３回洗浄し、１ウェル当たり１００ｕＬの、Ｈｉｓタグのついたヒト又はカニクイザルＴＦ−ＥＣＤを、アッセイ緩衝液で希釈して１００ｎｇ／ｍＬで添加し、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、アッセイ緩衝液で１：２０００に希釈したＱｉａｇｅｎペルオキシダーゼ共役ｐｅｎｔａ−ｈｉｓを１ウェル当たり１００ｕＬで添加し、室温で１時間にわたり振盪させながらインキュベートした。ＢＭ  ＣｈｅｍｉＬｕｍ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍ，ＰＯＤ，Ｒｏｃｈｅ）を緩衝液中１：１００の希釈で新たに調製し、最終洗浄後に１００ｕＬをプレートに添加した。１０分後に、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅａｄｅｒ，ＢＭ  ＣｈｅｍｉＬｕｍ  ｐｒｏｇｒａｍでプレートを読み取る。
【００７９】
ＦＡＣＳによる坑組織因子ｍＡｂのＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞結合
このアッセイは、乳癌細胞に発現した内在性ヒトＴＦに対する抗体の直接結合を検出するために用いられる。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％  ＦＢＳ）中の試験ｍＡｂの４点滴定を２組調製する。滴定を１：４希釈にて１，０００ｎｇ／ｍＬで開始する。親分子であるＭ１を陽性対照として用い、坑ＲＳＶ  ｍＡｂであるＢ３７を陰性／アイソタイプ対照として用いる。無染色細胞及び二次抗体である、ＦＡＣＳ緩衝液１：２００中のＣｙ−５共役ヤギ坑ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を対照として用い、使用直前に調製した。
【００８０】
標準的な組織培養技術を用いて、培養瓶の中の接着ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＰＢＳ（ｗ／ｏ  Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）で１回すすぐ。Ｖｅｒｓｅｎｅで細胞を持ち上げ、細胞を計数し、１ウェル当たり２００，０００個の細胞をポリスチレン製Ｖ底プレートに播種する。ＦＡＣＳ解析プロトコル：組織因子結合。Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ遠心機の中の細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％  ＦＢＳ）中に再懸濁し、１ウェル当たり２００，０００個の細胞を２００μＬの中に蒔く。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て、１００μＬ／ウェルの試験又は対照ｍＡｂを指定されたウェルに添加し、氷上又は４℃で１時間（＋／−１０分）にわたってインキュベートする。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄する。２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を再懸濁し、細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て、１００μＬ／ウェルの二次抗体を指定されたウェルに添加し（倍散）、氷上で１時間（＋／−１０分）にわたってインキュベートする。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を再懸濁する前に（倍散）、ＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を２回洗浄する。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て、１００μＬ／ウェルのＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液中に細胞を再懸濁する。反応をフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ）で解析する。無染色対照のウェル中の主要な細胞集団をゲーティングし、このゲートを全データセットに適用することによって、ＦＡＣＳデータ解析にＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いる。データは、適用したゲートに関する赤チャンネルの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）の表としてエクスポートされる。
【００８１】
Ｔｈｅｒｍａｆｌｕｏｒアッセイ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ技術は、加熱されたときの分子アンフォールディングの反応速度測定である。分子が加熱されると、分子が展開するときに、色素（ＡＮＳ）は分子に結合することができる。色素は分子に結合すると蛍光を発し、この蛍光が経時的に測定される。このアッセイでは、抗体の展開は３７℃〜９５℃で測定され、０．５℃毎に検出される。アッセイ対照として用いられる既知のＴｍｓを有する２つのｍＡｂ（Ｅｍｍｐ  ４Ａ５、及びＥｍｍｐ  ５Ｆ６）と同様に、マウス及びキメラ形態（１０Ｈ１０、Ｍ１、５Ｇ９、及びＣＮＴＯ８６０）の両方の親分子のＴｍｓも測定した。
【００８２】
ヒトフフレームワーク適応ライブラリ変異体の耐熱性を予測するために、このアッセイを用いた。精製抗体をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２ｕＬの試料を各ウェルに添加し、１ウェル当たり合計で１ｕｇの試料とする。各試料を２重で加える。ストックＡＮＳは、ＤＭＳＯ中５００ｍＭである。ストックＡＮＳをＤＭＳＯで１：１２に（４０ｍＭまで）希釈し、２０ｕＬの４０ｍＭ  ＡＮＳ溶液、２．８ｕＬの１０％  Ｔｗｅｅｎ、及び１．９８ｍＬのＰＢＳを混合して色素／Ｔｗｅｅｎ溶液を形成し、２ｕＬの色素／Ｔｗｅｅｎ溶液及び２ｕＬの油を加える。プレートを遠心する（４５０ｒｐｍで２分）。Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ設定：シャッターは手動に設定、勾配温度０．５℃／秒、連続勾配、温度勾配：５０〜９５℃。高温で１５秒保持を選択、露出時間１０秒／１反復、ゲイン標準値＝２、「単一ＳＣ画像／プレート」を選択。
【００８３】
相互作用クロマトグラフィ（ＣＩＤ）
種々の抗体と他のヒト抗体との相互作用を判定するために、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）結合カラムを用いてクロマトグラフィ実験を行った。簡潔に言うと、５０ｍｇのヒトＩｇＧを、メーカーの説明書に従って、１ｍＬのＮＨＳ−セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。結合されなかったＩｇＧを、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄することによって取り除き、非反応ＮＨＳ群を同じ緩衝液によりブロックした。結合効率は、Ｐｉｅｒｃｅ’ｓ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、非反応結合緩衝液及び洗浄液中に残っているタンパク質濃度を測定し、固定化の前のタンパク質の量から減算することによって決定された。タンパク質を樹脂に添加しなかったこと以外は、同じプロトコルを用いて対照カラムも調製した。
【００８４】
最初に対照カラムを、ＰＢＳ、ｐＨ７で平衡化した後のＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣに、０．１ｍＬ／分の流量で通した。非特異的結合部位がブロックされるのを確実にするために、最初に２０Ｌのタンパク質ストック溶液を注入し、続いて２０Ｌの１０％アセトンを注入して、カラムの完全性をチェックした。
【００８５】
分析されるべき試料を、ＰＢＳ、ｐＨ７で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。各試料の２０マイクロリットルを各カラムに注入し、０．１ｍＬ／分で３０分にわたって通した。保持時間を記録し、各変異体の保持係数（ｋ’）を計算した。
ｋ’の計算は、タンパク質誘導体化カラム（ＩｇＧ結合カラム）での保持時間（ｔＲ）と、タンパク質が結合していないカラムでの保持時間（ｔ０）の差である。計算は、カラムを標準化するために、両方のカラムでのアセトンの保持時間も考慮に入れる。ｋ’の許容値は０．３未満である。
【００８６】
溶解性
種々の抗体の室温での溶解性を判定するため、遠心濾過装置を使用して濃度実験を行った。簡潔に言うと、ＰＢＳ中の抗体調製物を、室温にてＶｉｖａｓｐｉｎ−１５（１５ｍＬ）遠心濾過装置（３０，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に加えた。フィルタを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ１５−Ｒ遠心機の中でスインギングバケットローターを使用して、３０００×ｇで２０分間隔で回転させた。体積が約２ｍＬまで減少したら、上清をＶｉｖａｓｐｉｎ−４（４ｍＬ）濾過装置（３０，０００ＭＷＣＯ）に移し、２０分間隔で４，０００×ｇで遠心分離した。体積が５００Ｌまで減少したら、サンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ−５００濾過装置に移し、１５分間Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４２４遠心機で１５，０００×ｇにて遠心分離した。タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上に達するまでこれを繰り返した。タンパク質濃度は、適切な希釈を用い、ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ（商標）分光光度計上での２８０ｎｍ及び３１０ｎｍにおける吸光度により決定された。この時点で、遠心分離を停止させ、試料を一晩室温で保持して、平衡に達した。次の朝、試料の沈殿の兆候をチェックした。濃度が１００ｍｇ／ｍＬ超であった場合、プロセスを中止した。
【００８７】
第ＶＩＩＡ因子誘発ＩＬ−８阻害アッセイ
このアッセイを用いて、ＴＦ結合抗体が、ＴＦを発現するヒト細胞からのＦＶＩＩａ誘発ＩＬ−８放出をなくすかどうかを試験した。ＤＭＥＭ及び１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ：カタログ番号１１９９５及びカタログ番号１６１４０）中で成長するように適合されたヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−２６）を、９６ウェルの細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ：カタログ番号１６７００８）に、１ウェル当たり２００００個の細胞（１００，０００個の細胞／ｍＬ）の密度で、標準的細胞培養技術を用いて蒔いた。２μｇ／ｍＬで開始し、ＦＢＳを有さないＤＭＥＭで１：２又は１：４のいずれかで連続希釈される抗体処理の前に、細胞を２日にわたって回収した。抗体は、ＦＢＳを有さないＤＭＥＭ中最終濃度５０ｎＭのヒトＦＶＩＩａ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：カタログ番号ＩＨＦＶＩＩａ、ロット：２８２４）で処理する１時間前に加えられた。細胞をインキュベータに２４時間入れた。処理の後、上清を収集し、ＩＬ−８の量を、メーカーのプロトコル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：カタログ番号Ｄ８０００Ｃ）にしたがってＥＬＩＳＡによって検出した。簡単に言えば、各処理試料の光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍ及び５４０ｎｍにて読み取った。アッセイプレートの光学的不完全性を補正するために、５４０ｎｍにおける読み取り値を用いたが、一方で、メーカーのプロトコルに従って作製したＩＬ−８標準曲線を用いて処理試料中のＩＬ−８含有量を計算するために、４５０ｎｍにおける補正された読み取り値（ＯＤ  ４５０マイナスＯＤ  ５４０）を用いた。抗体及びＦＶＩＩａ処理を受けていない細胞を有するウェルを用いて、内因性ＩＬ−８レベルを決定する一方で、ＦＶＩＩａのみを受けた細胞を有するウェルを用いて、「非阻害」ＩＬ−８レベルを決定し、それによって、最小及び最大ＩＬ−８レベルをそれぞれ定義した。ＭＡｂ滴定処理試料を、上で定義された最大及び最小ＩＬ−８レベルに対して正規化し、阻害百分率で表した。正規化データは、棒グラフで表されるか、又は各ＭＡｂのＥＣ５０値を抽出するようにフィットする４パラメータのロジスティック曲線に当て嵌められるかのいずれかであった。
【００８８】
凝固アッセイ
このアッセイは、カルシウム及び添加された組み換えヒトＴＦ調製物（Ｉｎｎｏｖｉｎ，Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ）の存在下でヒト血漿を使用して、坑ヒトＴＦ抗体が生体外での凝固を阻害するかどうかを判定するために用いた。坑ヒトＴＦ抗体をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１７５）で２ｍｇ／ｍＬ抗体まで希釈する。クエン酸ナトリウムを有するプールされたヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）を、１０００ｒｐｍにて５分にわたり回転沈降させ、透明な血漿を新しい管に移す。透明な９６ウェルアッセイプレート（ＮＵＮＣ、カタログ番号４３９４５４）の各ウェルの中で、２５ｕＬの希釈した抗体を１００ｕＬのヒト血漿に加える。２２ｍＭのＣａＣＬ２を有するＨＢＳＳで１：５００に希釈した１２５μＬのＩｎｎｏｖｉｎ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ４２１２）を、抗体を有する又は有する血漿を収容しているウェルに添加することによって、反応を開始させる。凝固反応は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、反応開始直後及び３０分にわたり３７℃にて、ＯＤ  ４０５で速度論的に監視する。各抗体のＴ１／２  Ｍａｘは、最大光学密度の５０％に達するまでにかかる時間（秒）として、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて決定される。試料の時間（秒）は各プレートの参照に対して正規化されたが、統計的には、抗体を有さない試料、１０Ｈ１０、及び全て１０Ｈ１０由来でヒトに適合した変異体の平均時間である１５０秒及び２００秒と記載している試料の間に差はなかった。
（実施例）
【００８９】
実施例１：１０Ｈ１０のシークエンシング
Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ（米国特許第５２２３４２７号、Ｍｏｒｒｉｓｅｙら、１９８８  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．５２（３）：２４７〜２６１）で産生された１０Ｈ１０として知られるマウス抗体を、ハイブリドーマＴＦ９．１０Ｈ１０−３．２．２によって産生する。１０Ｈ１０ハイブリドーマクローンからの抗体の配列は、以前に報告されていない。
この配列は、２つの抗体鎖、ＶＨ及びＶＬを、５’ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、プライマー、並びにマウスＩｇＧ１定常領域及びマウスＫａｐｐａ定常領域内の配列にそれぞれ相補的な３’コンセンサスプライマーを用いて増殖せる、５’ＲＡＣＥ法（Ｆｏｃｕｓ  ２５（２）：２５〜２７，２００３；Ｍａｒｕｙａｍａ  １９９４  Ｇｅｎｅ  １３８，１７１〜１７４）を用いて特定された。配列解析により適したＶＬ生成物を生成するために、５’ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｎｅｓｔｅｄプライマー及び３’コンセンサスプライマーを用いるＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ増幅を用いた。
【００９０】
各鎖の可変領域を特定するために、少なくとも１６個のクローンが選択された。挿入の未知の領域の配列決定のためにプライマーを用いた。配列解析のため、生配列データをＡＢＩ  ＤＮＡ  ＳｅｑｕｅｎｃｅｒからＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｘ）にダウンロードした。１つの機能的ＶＨ及び１つの機能的ＶＬを特定した。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は共に、それらの自然シグナル配列、ＦＲ、ＣＤＲ、及びＪセグメントを見つけるために更に解析された。
【００９１】
ＶＨのＣＤＲ−１に対応する領域を除き、１０Ｈ１０、ＦＲ及びＣＤＲは順次的に番号が付けられ、Ｋａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔら、５ｔｈ  ｅｄｉｔ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９１）に従って分割された。この領域では、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との組み合わせが用いられた（Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ，Ｇ．，ＵＳ２００９／０１１８１２７  Ａ１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６（４）：９０１〜１７，１９８７）。
【００９２】
【表１】
2014509856.tif 000008
【００９３】
クローン化したＶ領域は、ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ定常領域を用いて操作され、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞株の組み換え発現のために哺乳類発現ベクターにクローニングされ、Ｍ１と指定されるマウス−ヒトキメラ抗体を産生し、これを参照抗体としてアッセイ開発で用いた。結晶構造解析で用いる１０Ｈ１０Ｆａｂを産生するために、ＨＣ  Ｖ領域もまた、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのみ、及びＣ末端ヘキサヒスチジンを用いて操作された。
【００９４】
実施例２：非凝固性組織因子抗体のエピトープマッピング
ヒトＴＦ  ＥＣＤと、対応するＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造決定により、１０Ｈ１０のエピトープマッピングを行った。Ｈｉｓタグ付きヒトＴＦ  ＥＣＤ（配列番号１の残基５〜２１３）を大腸菌内で発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＱ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をそれぞれ用いて、親和性及びイオン交換クロマトグラフィによって精製した。１０Ｈ１０  ＦａｂのＨｉｓタグ付きキメラバージョン（マウスＶ領域、ヒト定常ドメイン）をＨＥＫ細胞内で発現させ、親和性（ＴＡＬＯＮカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びサイズ排除（ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィを用いて精製した。
【００９５】
ＦａｂとヒトＴＦ  ＥＣＤを１：１．２のモル比で混合することにより、複合体を調製した（過剰なＴＦ）。混合物を２０分間室温でインキュベートし、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．５、及び０．１Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。主ピークに対応するフラクションをプールし、１０ｍｇ／ｍＬとなるまで濃縮し、結晶化で使用した。複合体は、蒸気拡散法により２０℃で結晶化された。１０Ｈ１０：ＴＦ複合体は、０．１ＭのＣＨＥＳ、ｐＨ  ９．５中１８％のＰＥＧ  ８０００を含有する溶液から結晶化された。Ｘ線データ収集のために、複合体の１つの結晶を、２０％グリセロールを補充した母液に数秒間浸漬し、３８℃（１００Ｋ）の窒素流中で急速冷凍した。Ｓａｔｕｒｎ  ９４４  ＣＣＤ検出器を装備したＲｉｇａｋｕ  ＭｉｃｒｏＭａｘＴＭ−００７ＨＦ微小焦点Ｘ線発生装置、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００循環冷却システム（Ｒｉｇａｋｕ）を用いて、Ｘ線回折強度を測定した。構造は、高分子結晶学のＣＣＰ４プログラムスーツ（CCP4 suite of programs）を用いて、分子置換によって決定された（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ  ４．１９９４．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０〜７６３）。
【００９６】
ＴＦ  ＥＣＤは、免疫グロブリンフォールドを有する２つの位相的に同一のドメインから成る。Ｎ末端ドメインは（ＥＣＤ、配列番号１の）残基１〜１０３に及び、Ｃ末端ドメインは残基１０４〜２１０に及ぶ。１０Ｈ１０エピトープは、ＥＣＤの残基Ｋ１４９〜Ｄ１５０を中心とし、１０Ｈ１０の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの間の深いポケットに至ることが見出された。１０Ｈ１０とＴＦとの間の接点は広範囲であり、６つのＣＤＲループ全てが関与する（図１）。
【００９７】
注目すべき発見は、１０Ｈ１０のＴＦエピトープがＦＶＩＩ及びＦＸ結合部位と重なり合わないことである（図２及び図３）。また、１０Ｈ１０及び５Ｇ９（凝固を阻害する能力を有する別のマウスヒトＴＦ結合抗体であり、このエピトープは従前公表されている、Ｈｕａｎｇら、１９９８  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７５：８７３〜９４）のエピトープは、部分的に重なり合っており、これら２つの抗体とヒトＴＦとの間の競合的結合を説明している（図２及び図３）。
【００９８】
ヒトＴＦ  ＥＣＤ：１０Ｈ１０接点
１０Ｈ１０は、ＥＣＤのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の接点でＴＦに結合する。ＴＦの凸面は、抗体の凹状ＣＤＲ表面に合致する。複合体形成の際に覆われる総面積は、相互作用分子のそれぞれの上で１，１００Å２を超える。６つのＣＤＲの全てが、ＴＦとの直接接触に関与する（接触は４Å原子間距離と定義される）。合計で、２４個のエピトープ残基及び２５個のパラトープ残基が存在する。ＣＤＲ  Ｌ１、Ｈ１、及びＨ３は、接触の大部分を形成する。１０Ｈ１０：ＴＦ複合体のエピトープ及びパラトープを形成する残基は、図１に概略的に示されている。
【００９９】
１０Ｈ１０エピトープは、ＴＦ  ＥＣＤのＮドメインからの２つのセグメントと、Ｃドメインからの３つのセグメントとを含む。Ｎドメインからの２つのセグメントは抗体と相互作用する、つまり、残基６５〜７０はＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ３と相互作用し、残基１０４はＨ−ＣＤＲ１と相互作用する。Ｃドメインの３つのセグメントは抗体と相互作用する、つまり、残基１９５及び１９７は、Ｈ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２と相互作用し、残基１７１〜１７４は、Ｌ−ＣＤＲ１及びＬ−ＣＤＲ３と相互作用し、残基１２９〜１５０は、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ３と相互作用し、ＴＦ残基Ｋ１４９〜Ｄ１５０は、エピトープの中心にあり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間に形成される深いポケットに達し、それらの主なパートナーはそれぞれ、１０Ｈ１０のＬＣ可変領域（配列番号５）のＤ９７、及びＨＣ可変領域（配列番号４）のＷ３３である。
【０１００】
Ｂ．抗体特異性
ヒト、カニクイザル（配列番号２）、及びマウスＴＦ  ＥＣＤ（配列番号３）のアミノ酸配列が、図２に整列配置されている。ヒトの配列とカニクイザルＴＦ  ＥＣＤの配列の類似性は高く、これら２つが１０Ｈ１０接触残基において異なるのは、配列番号１の位置１９７の１つ残基だけであり、この位置はカニクイザル配列ではＲ（Ａｒｇ）である。ヒト配列のＴ１９７は、単一Ｈ−ＣＤＲ２残基によって接触されるので、１０Ｈ１０由来の抗体の現在の組で見られる高レベルの交差反応性の説明がつく。
【０１０１】
ヒト及びマウスＴＦ配列を並べることにより、有意なアミノ酸の相違がエピトープ残基において生じるので、１０Ｈ１０の種特異性を決定するエピトープ残基は明白であった、つまり、配列番号１と配列番号３とを対比すると、１０Ｈ１０がヒトＴＦと接触する２４個の残基のうち、ヒト配列とマウス配列とは、Ｎドメインにおいて位置６８、６９、７０、及び１０４で異なり、Ｃドメインにおいて位置１３６、１４２、１４５、及び１９７で異なっている。この相違は、マウスＴＦに対する１０Ｈ１０の低い結合親和性と一致する。
【０１０２】
図２はまた、三元複合体への会合を説明する理論的３Ｄモデル（図３）に基づいた、ＦＶＩＩ及びＦＸに関するヒトＴＦ上の相互作用部位を示す（Ｎｏｒｌｅｄｇｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５３：６４０〜６４８，２００３）。抗体５Ｇ９は、ＦＸ結合部位と部分的に重なっているエピトープにおいてＴＦに結合する。したがって、５Ｇ９はＦＸと競合し、これにより凝固カスケードの阻害が引き起こされる。１０Ｈ１０は、凝固を阻害しないが、ＴＦ関連ＰＡＲを介したシグナル伝達を効果的に遮断するという点で、５Ｇ９と異なる。三元ＴＦ／ＦＶＩＩ／ＦＸ複合体のモデルに基づき、１０Ｈ１０エピトープはＴＦの自由表面上にあり、残基Ｋ１４９〜Ｄ１５０を中心としていることが予想された。突然変異誘発によりマッピングされた１０Ｈ１０の結合及びペプチドエピトープマッピングは、これが事実であるということを初期に証明した。
【０１０３】
ＴＦ  ＥＣＤと１０Ｈ１０  Ｆａｂとの間の複合体の本発明の結晶構造は、ＦＶＩＩ及びＦＸがＴＦと又は互いに相互作用するのを妨げることなく、抗体がＴＦに結合できる方法の空間マッピングを提供する。この構造によって明らかにされるような１０Ｈ１０エピトープは、三元複合体に理論的に存在する場合、ＴＦの自由表面を覆う。更に、１０Ｈ１０エピトープは、凝固阻害ＭＡｂ（５Ｇ９）エピトープと部分的に重なり（Ｈｕａｎｇ  １９９８、上記）、共通の残基はＫ１４９及びＮ１７１である。１０Ｈ１０又は５Ｇ９はいずれも、ＴＦに対するＦＶＩＩの結合を阻害しない。１０Ｈ１０及びＦＸのエピトープもまた重ならないが、現行モデルのＦａｂの定常ドメインとＦＸのプロテアーゼ（球状）ドメインとの間に立体衝突が生じる。しかしながら、ＦＸの配向は実際にはモデルと異なり、ＦＸとＴＦとの間の会合は、プロテアーゼドメインにおけるいくらかの柔軟性を可能にすることに留意されたい。Ｆａｂの可変ドメインと定常ドメインとの間の肘角度にもかなりの柔軟性があり、これは、１０Ｈ１０が三元複合体に結合する際の衝突を回避できるようにし得る。
【０１０４】
実施例３：結合ドメインをヒトで用いるために適合させる
治療用タンパク質の有効性は、望ましくない免疫反応によって制限され得る。非ヒトモノクローナル抗体は、ヒトでの免疫応答を誘発することができる、かなりの線形アミノ酸配列鎖と、局所的な構造コンフォメーションを有し得る。非ヒトＭＡｂの標的結合の免疫特異性に関与している残基のヒト抗体骨格への移動は、しばしば、標的抗原に対する結合親和性の大きな損失をもたらす。したがって、ヒトに注入されたときに、親非ヒト分子の結合及び生物物理学的プロファイルを保持すると同時に、最小免疫原性反応を誘発する抗体分子を作成するための、しっかりした設計原理を用いることが極めて重要である。
【０１０５】
米国特許出願第２００９０１１８１２７Ａ１号において前述されたように、またＦｒａｎｓｓｏｎら、２０１０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９８：２１４〜２３１で例示されたように、ヒトＴＦと結合するとマウス抗体１０Ｈ１０の標的効果を示す、本発明の抗体種を産生するために、結合親和性をヒト化しかつ回復又は強化させるために、２工程プロセスを用いた。ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）と呼ばれる２工程プロセスは、１）ヒトフレームワーク選択、及び２）親和性成熟工程から成る。
【０１０６】
ＨＦＡプロセスにおいて、結合部位残基（ＣＤＲ）は、配列相同性及び構造的考察に基づいて選択されたヒト生殖系列遺伝子と結合される。抗体のＣＤＲ割り当てのための２つの体系は、抗体配列の可変性に基づいているＫａｂａｔの定義、及び抗体の３次元構造の解析に基づいているＣｈｏｔｈｉａの定義である。６個のＣＤＲの間で、それらが異なる場合には、一方又は他方の体系が用いられる場合がある。軽鎖ＣＤＲの場合、Ｋａｂａｔの定義を使用する。
【０１０７】
重鎖ＣＤＲ３の場合、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両定義は同一である。重鎖ＣＤＲ１の場合、Ｃｈｏｔｈｉａの定義を使用して開始を定義し、Ｋａｂａｔの定義を使用して終結を定義する（パターンは、Ｗの後にＶ、Ｉ、又はＡのような疎水性アミノ酸が続くことによって定義される）。ＶＨ−ＣＤＲ２の場合、Ｋａｂａｔの定義を使用した。しかしながら、ほとんどの抗体構造において、この配列に基づく定義は、ＣＤＲ２に属するようにＦＲ３の一部に割り当てる。即ち、このＣＤＲのより短い変更体（これはこのＣＤＲのＣ末端領域について７残基前に終了する）も使用することができ、本明細書ではＫａｂａｔ−７と呼ばれる。
【０１０８】
ヒトＦＲ選択
抗原結合部位に含まれないＶ領域内の領域であると定義されるヒトＦＲ領域は、機能的ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ及びＩＧＨＪ遺伝子のレパートリーから選択された。ヒト生殖系列遺伝子配列のレパートリーは、ＩＭＧＴデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ  ２００５）を検索し、「０１」対立遺伝子を一括してコンパイルすることによって得た。このコンパイルから、重複遺伝子（アミノ酸レベルで１００％同一）及び対を成さないシステイン残基を有する遺伝子はコンパイルから除外された。遺伝子コンパイルの最終更新は、２００７年１０月１日に行われた。
【０１０９】
ＶＨのＨＦＡのヒト配列の最初の選択は、ＦＲ−１〜３、並びにＨ−ＣＤＲ−１及びＨ−ＣＤＲ−２を含むマウスＶＨ領域の全長に対する、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子の配列相同性に基づいた。次の段階で、選択されたヒト配列は、ＣＤＲの長さ、及びマウスのＣＤＲとヒト配列との間の配列類似性の両方を考慮したスコアを用いてランク順序付けされた。ＢＬＯＳＵＭ  ６２置換マトリックスのような標準突然変異マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  １９９２  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １５；８９（２２）：１０９１５〜９）を、マウス及びヒト配列のＣＤＲのアライメントを採点するために使用し、そして挿入及び／又は欠失がＣＤＲループにある場合、大きなペナルティを適用する。ヒトＦＲ−４は、ＩＧＨＪ生殖系列遺伝子（Ｌｅｆｒａｎｃ  ２００５）とマウス１０Ｈ１０配列、ＩＧＨＪ４（配列番号６０）の配列相同性に基づいて選択された。
【０１１０】
ＶＬのヒトＦＲの選択にも同様の方法を用いた。この場合、ＩＧＨＶ遺伝子で使用されたのと同じ手順で選択された生殖系列遺伝子ＩＧＶＫは、ＦＲ  １〜３及びＬ−ＣＤＲ  １〜３を選択するための遺伝子としての役割を果たした。ヒトＩＧＪ−Ｋ２遺伝子（配列番号６１）は、全ての変異体のＦＲ４として選択された。
【０１１１】
１１個のＶＨ及び７つのＶＬ生殖細胞系列鎖が選択された。選択したＶＨ遺伝子は、主にＩＧＶＨ−１遺伝子ファミリーから選択され、６個の配列はＩＧＶＨ１からであり、ＩＧＶＨ１−６９及びＩＧＶＨ１−ｆはより長い及びより短いＨ−ＣＤＲ２と共に用いられ、２個の配列はＩＧＶＨ３からであり、１個の配列はＩＧＶＨ５遺伝子からであり、長い及び短いＨ−ＣＤＲ２共に用いられた。ＶＬ遺伝子は、６個がＩＧＶＫ２遺伝子ファミリーのものであり、１個がＩＧＶＫ４遺伝子ファミリーのものであった。
【０１１２】
したがって、より長いＨ−ＣＤＲ２（配列番号７）を有するＶＨ変異体Ｈ１５、Ｈ１９、及びＨ２１は、それぞれ、より短いマウスＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２７）を用いたＨ２２、Ｈ２３、及びＨ２４に対応した。接頭辞「ｓ」は、β鎖領域により少ないマウス残基及びよい多くのヒト残基を有する試験変異体を意味する。用いたＶ領域表記及び用いた遺伝子配列は、下記の表２及び３に示されている。
【０１１３】
【表２】
2014509856.tif 000009
【０１１４】
【表３】
2014509856.tif 000010
【０１１５】
１１本の重鎖及び７つの軽鎖ヒトＦＲ変異体、更にはマウス１０Ｈ１０キメラ鎖を示す９６のＭＡｂのライブラリを、一次スクリーニング用の上清を提供するために、９６ウェル形式においてＨＥＫ  ２９３Ｅ細胞で発現させた。一次スクリーニング用に、９６ウェルプレートのＨＥＫ  ２９３Ｅ細胞において一時的に発現する完全ＭＡｂを形成するために、標準的な組換え方法を用いて、選択された可変ドメインをコードするＤＮＡを組み換えた。培養物からの上清液を、トランスフェクションから９６時間後に活性（結合）に関して試験した。
【０１１６】
一次スクリーニングの結果に基づき、１９個の変異体を、ＨＥＫ  ２９３−Ｆ細胞におけるパイロットスケールでの発現及び精製用に選択した。パイロットスケールでの発現は、７５０ｍＬの量のＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞又はＣＨＯ−Ｓ中で一時的に行われた。採取した上清をタンパク質Ａクロマトグラフィで精製し、精製タンパク質を、それらの親和性及び機能活性について評価した。更に、精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及び相互作用クロマトグラフィ（ＣＩＣ）による生物物理学的特徴付けに供した。理論的等電点（ｐＩ）を、各変異体についても計算した。パイロットスケールでの特徴付けから、最終的な有力候補の組をＷＡＶＥ生物反応器にトランスフェクトし、タンパク質Ａクロマトグラフィ（chromatorgraphy）で精製した。
【０１１７】
結合性評価
ヒト及びカニクイザルＴＦの両方に対する親キメラ抗体、Ｍ１、及びＨＦＡ変異体の結合は、化学発光による検出を用いる直接ＥＬＩＳＡ形式として行われた。粗上清中のライブラリ変異体の一次スクリーニングでは、試料又は対照は、消費ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  ＨＥＫ培地（Ｇｉｂｃｏ）内で５０ｎｇ／ｍＬに正規化され、単一濃度測定で検定された。本発明のアッセイでは、抗体の濃度は５ｎｇ（０．１ｍＬ使用）であり、ＴＦ  ＥＣＤ及び抗原は、Ｈｉｓ６−ＴＦ−ＥＣＤ１−２１９であり、最終濃度１０ｎｇ／ウェルで用いられた。
【０１１８】
全コンビナトリアルライブラリのスクリーニングの結果は、Ｈ１４を除いて他の全てのＶＨが、様々な強度でｈＴＦに結合したことを示した。親１０Ｈ１０（Ｈ１３、Ｌ１）、特に一部のＬ３及びＬ５の組み合わせよりも強い結合シグナルを与えたいくつかのＨＦＡ変異体が存在する。Ｈ１８及びＨ２１は、ヒト抗原及びＶＨに結合せず、カニクイザル抗原に対するわずかな結合を示した。ＶＬの中でも、Ｌ６及びＬ８はいずれの抗原にも結合せず、他のＶＬは検出可能レベルで結合した。Ｈ１４及びＬ８もまた、任意のＶＬと組み合わされると低発現を示した。表４に示されるように、ＴＦ結合を示したのは、７７個の抗体（ＶＨ、ＶＬの組み合わせ）のうち５０個であった。
【０１１９】
【表４−１】
2014509856.tif 000011
【０１２０】
【表４−２】
2014509856.tif 000012
【０１２１】
ＥＬＩＳＡを用いたＴＦに対する相対結合親和性に基づき、発現の増強及び精製のための１０個の変異体を選択した。ＢＩＡｃｏｒｅにより測定したＫＤの要約、ＥＬＩＳＡアッセイデータ、全細胞結合、５０ｎＭのＦＶＩＩａ及び２ｕｇ／ｍＬのＭＡｂによるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞からのＩＬ−８誘導の阻害、及びＴｈｅｒｍｏｆｌｏｕｒアッセイにより測定されたＴｍが、表５に示されている。
【０１２２】
【表５】
2014509856.tif 000013
【０１２３】
新規ヒトＭＡｂ変異体のいくつかは、Ｍ１（１０Ｈ１０可変鎖：Ｈ１３及びＬ１を有する）よりもＴＦに対して高い親和性を示し、いくつかは低かった。Ｍ６１のＫＤ（０．２１ｎＭ）は、マウス親ＭＡｂ（ＫＤ＝０．５６ｎＭ）のＫＤより２．５倍低い。表５のデータは、共に同じ生殖系列遺伝子（ＩＧＨＶ５−ａ）から構築された、Ｈ１５を含む４つのＭａｂと、Ｈ２２を含む４つのＭａｂとを含む。Ｈ２２、及びより短いＨ−ＣＤＲ２を有するＭａｂは概ね、対応するＨ１５を有する分子よりも高い結合親和性を示した。新規変異体の多くはカニクイザルＴＦに結合したが、カニクイザル結合親和性のランクは、ヒトＴＦに対する結合のランクと異なった。
【０１２４】
マウス１０Ｈ１０  ＭａｂのＴｍは７４．２℃であった。選択された分子のＴｍは、７５〜８２．２℃のＴｍの範囲であった。このように、ＨＦＡプロセスは、ヒト及び非ヒト霊長類ＴＦに対する高い結合親和性を有する新規Ｆｄ領域を有する抗体構築物の産生をもたらし、更に、ヒトドメインを有する安定した完全抗体変異体を産生させた。
【０１２５】
新規抗体構築物の追加的特徴付けは、その抗体が、ヒト腫瘍組織由来の細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌由来細胞）の天然ＴＦを認識することができ、また、ＭＤＡ−ＭＢ２３１からのＩＬ−８の誘導抑制によって測定した場合、ＶＩＩａの存在下でＴＦシグナル伝達を低減することができることを立証した。
【０１２６】
更なる生物物理学的特徴（溶解度及び相互作用クロマトグラフィ）及びアッセイの結果から、可変領域Ｈ２２及びＬ３から成るＭ５９を、親和性成熟のために選択するよう導かれた。
【０１２７】
実施例４：抗体成熟
Ｆａｂライブラリは、米国特許第６，４７２，１４７号（Ｓｃｒｉｐｐｓ）及び、国際公開特許第２００９／０８５４６２号として発行された本出願人による同時継続中の出願に記載されている、ｐＩＸファージディスプレイシステムにおいて、制限酵素部位に若干の変更を加えて構築された。
【０１２８】
ｈＴＦ複合体を形成する１０Ｈ１０の実験的構造に基づいて、ＶＬ及びＶＨの両方の多様化のため、Ｈ１１６（配列番号１９）及びＬ３（配列番号２３）の対合であるＭ５９で開始する２つのライブラリを設計した。これらライブラリは、多様化の標的となる位置に関して異なり、並びに標的位置を多様化するために用いられるアミノ酸が異なっていた。一方のライブラリは、以前にＴＦと接触していることが示された各ＣＤＲを示す合計で８つの位置を多様化した。設計する際には、Ｌ１、Ｌ３、Ｈ１、及びＨ２に重点が置かれた。Ｌ２の接触位置は多様化されず、Ｈ３の位置のほとんども多様化されなかった。Ｃｙｓ及びＭｅｔなどの不安定な又は反応性のアミノ酸は避けた。
【０１２９】
２つ目のライブラリは、結合及び非結合Ｆａｂ結晶構造の溶媒接触性を算定することによって決定された抗原結合部位の周囲のアミノ酸を多様化するように設計された。結合すると埋もれるが、なおも溶媒分子と接触している残基は、多様化の標的となった。合計で１２個の残基（ＶＬで６及びＶＨで６）を、この方法を用いて特定し、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、及びＴｙｒ（Ｙ）を含む８個のアミノ酸の縮小集合で多様化した。結合したライブラリのサイズは、８１２又は１０１０個の変異体であると予想され、標準的ライブラリ限定クローニング技術を用いてカバーされ得る。
【０１３０】
ＣＤＲ接触残基ライブラリでは、位置は、ヌクレオチド二量体（Ｎ−二量体）合成法を用いて、１５個のアミノ酸（全てＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、及びＧｌｕを除く）で多様化された。
【０１３１】
遅い解離速度（解離速度値の増加）又は早い結合速度（結合速度値の減少）を選択するか、又はその両方を用いることによって親和性を高めることを目的として、ファージコートタンパク質ＩＸにディスプレイされるＦａｂライブラリを、当該技術分野において周知のパニング法に従って、ビオチン化ｈＴ−ＥＣＤに対してパニングした。パニングは、ヒト及びカニクイザルＴＦの両方を標的抗原として用いた。ファージは、ヘルパーファージ感染によって生成された。バインダーは、ビーズ／抗原／ファージ複合体を形成するＳＡビーズの添加により回収された。最終洗浄の後、対数増殖期ＴＧ−１大腸菌細胞の感染により、ファージをレスキューした。ファージを再度生成し、更なる一連のパニングに供した。
【０１３２】
ｐＩＸ遺伝子をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化によって、選択したクローンから切除し、再連結の後、ＤＮＡをＴＧ−１細胞に転換し、ＬＢ／寒天平板培地で一晩増殖させた。一晩培養物は、（ｉ）コロニーＰＣＲ及びＶ−領域のシークエンシング、並びに（ｉｉ）可溶性Ｆａｂ産生で用いられる。可溶性のＦａｂタンパク質を、多クローン性抗Ｆｄ（ＣＨ１）抗体によりプレート上に捕捉した。適切な洗浄及び阻害の後、ビオチン化ｈＴＦを０．２ｎＭ濃度で加え、ビオチン化ｈＴＦを、上記と同様に、ＨＲＰ共役ストレプトアビジン及び化学発光読取値によって検出した。このｈＴＦ濃度で、親の結合百分率として定義される（全てのプレートに対照として存在する親Ｆａｂを１００％結合と定義する）Ｆａｂ変異体のランク付けが可能である。
【０１３３】
この基準により、Ｍ５９  Ｆａｂと比べて１００％以上の高さでヒトＴＦに結合する３８１  Ｆａｂが選択された。
【０１３４】
Ｖ領域（配列番号４又は１９）の位置２７及び３０〜３２に対応する重鎖ＣＤＲ１（配列番号６）のＹ２、Ｉ５、Ｔ６、及びＹ７に一定の改変を示した、選択したクローンの解析は、成功であった。接触残基ではないが、位置２７のみが芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ及びＰｈｅ）を受容した。１０Ｈ１０  ＦａｂにおけるヒトＴＦ配列番号１（図１）のＫ６８、Ｔ１０１、Ｙ１０３、及びＬ１０４と直接接触する位置３０〜３２に関し、位置３０は比較許容性であるが、３１及び３２は制限的であった（表６）。
【０１３５】
１０Ｈ１０  ＦａｂのヒトＴＦ配列番号１（図１）のＰ１９４、Ｓ１９５、及びＴ１９７と直接接触する残基である、配列番号４又は１９の位置Ｌ５２、Ｓ５５、及びＳ５７に対応するＬ３、Ｓ６、及びＳ８（配列番号７）におけるＬ−ＣＤＲ２の改変では、置換許容がいくぶん制限された組が存在した。
【０１３６】
Ｈ−ＣＤＲ３では、ヒトＴＦ−ＥＤ（配列番号１）のＦ１４７、Ｇ１４８、及びＫ１４９と直接接触する、配列番号４又は１９のＮ１０４に対応するＮ６位置（配列番号８）は、制限されていることが明らかであった。
【０１３７】
ファージパニング、及び０．２ｎＭのヒトＴＦ−ＥＣＤ１〜２１９を用いる固相捕捉アッセイにおける同等な結合親和性のスクリーニングによって選択されたライブラリ位置のそれぞれで、可能となるアミノ酸改変が表６に示されている。
【０１３８】
【表６】
2014509856.tif 000014
【０１３９】
選択されたクローンのＶＬに関し、エピトープマッピングではヒトＴＦ配列番号１（図１）のＥ１７４、Ｄ１２９、Ｓ１４２、Ｒ１４４、及びＤ１４５と接触して示される、ＬＣ可変領域（配列番号５又は２３）の位置３２、３３、３４及び３６に対応するＬ−ＣＤＲ１（配列番号９）のＳ９、Ｇ１０、Ｎ１１、及びＫ１３における改変が、比較的許容性であるとして図７に示されている。Ｌ−ＣＤＲ２に関し、配列番号５又は２３の残基Ｗ１、位置５６（Ｋａｂａｔ残基番号５０）は接触残基である一方、残基Ｅ６１は、置換に対する制限された許容性を示した。ヒトＴＦ配列番号１（図１）のＫ１４９、Ｄ１５０、Ｎ１７１、及びＴ１７２と直接接触する、配列番号５又は２３の残基位置９７〜１００に対応する軽鎖ＣＤＲ３（配列番号９）では、位置Ｄ９７（Ｋａｂａｔ位置９１）は制限された。ヒトＴＦ−ＥＣＤ１〜２１９クローン許容性アミノ酸使用に対する親和性結合に基づく選択が、表７にまとめられている。
【０１４０】
【表７】
2014509856.tif 000015
【０１４１】
要約すると、一連の親和性が改善されたＦａｂ変異体は、可変ドメインＨ２２（配列番号１９）及びＬ３（配列番号２３）に対する、抗原ヒトＴＦとの接触位置にあるアミノ酸のＣＤＲ位置の直接多様化、それに続くパニング、及び出発配列と比べて同等又はそれ以上の結合のスクリーニングアッセイにおける親和性を有する種の選択に基づくファージライブラリの構築を通して特定された。
【０１４２】
全体的としては、設計されたＨＦＡライブラリから選択されるＶＨ及びＶＬの対に対する親和性の穏やかな増加が得られた。しかしながら、接触残基が多様化されたＶＨライブラリから、ストリンジェントなファージパニングの後に親アミノ酸が再度選択された。構造解析から説明されるように、２つのパラトープ位置だけが有意に改変された。親和性成熟中にＣＤＲに導入されたこれら２つのアミノ酸置換、Ｔ３１Ｐ及びＳ５７Ｆは、接触残基に関与する。５倍の親和性改善は、ＴＦのＳ１９５と接触するＦ５７の接点が増加したことに起因し得る。ＶＬとＴＦの相互作用は塑性であり、接触残基並びに隣接残基に対する多くの改変を可能にするように思われる。
【０１４３】
３８１個のＶＨとＶＬの対の中から、４３個を更なる特徴付けのために選択した。選択した４３個のＭＡｂは、２７個の異なるＶＨ、及び８個のＶＬを示し（重鎖及び軽鎖配列の対に関しては表８を参照のこと）、３つのサブグループに分類することができる。グループ１は、同じ軽鎖を有する変異体であり（Ｌ３、配列番号２３）、グループ２及びグループ３は、２つの異なる重鎖と対になった８つの軽鎖によって示される（それぞれ、Ｈ１１６及びＨ１７１、配列番号１３１及び６７）。
【０１４４】
【表８−１】
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【０１４５】
【表８−２】
2014509856.tif 000017
【０１４６】
Ｍ５９のような同じ軽鎖を有する２７個の抗体のグループのうち（Ｌ３、配列番号２３）、２７の重鎖は、Ｈ−ＣＤＲ１の３つの位置で異なっており（ＧＹＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＩＥ）（配列番号８３）、ここで、Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙから選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｓ、及びＴから選択され、Ｘ３は、Ｆ、Ｈ、及びＹから選択される；（Ｈ−ＣＤＲ１がＧＦＴＦＩＴＹＷＩＡ（配列番号８１）であるＨ１８９を除く）、Ｈ−ＣＤＲ２は４つの位置で異なっており（ＤＩＸ１ＰＧＸ２ＧＸ３ＴＸ４）（配列番号１０７）、ここで、Ｘ１はＩ及びＬから選択され、Ｘ２はＳ及びＴから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｈ、及びｗから選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、及びＮから選択される；（Ｈ−ＣＤＲ２がＤＩＬＰＡＳＳＳＴＮ（配列番号１０５）であるＨ１８９を除く）、一方、Ｈ−ＣＤＲ３及びＦＲは、Ｈ２２配列（配列番号１９）から変更されず、ＳＧＹＹＧＮＳＧＦＡＹ（配列番号８）であった。これら２７個のＭＡｂの重鎖の特有の組成は次の通りである（表９）。
【０１４７】
【表９】
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【０１４８】
Ｈ１７１（配列番号１３９）は、Ｈ１１６と比べるとＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２に更なる改変を含み、Ｉ３１Ａ及びＳ５５Ｔである。
【０１４９】
Ｍａｂの２つのグループは、２つの異なるＨＣ、つまり、Ｈ２２（配列番号１９）又は重鎖Ｈ１７１（配列番号１３９）の一方と対になる８つのＬＣによって表わされる（表１０）。８つの軽鎖は全て、Ｌ３のＲＦを有し（ＩＧＫＶ２４０＿Ｏ１由来）、並びに、Ｌ−ＣＤＲ１の５つの位置で配列改変を有し（ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５ＮＹＬＴ（配列番号１１６）、ここで、Ｘ１は、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、及びＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、及びＶから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｎ、及びＴから選択され、Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、及びＳから選択される）、Ｌ−ＣＤＲ２の２つの位置で改変を有し（Ｘ１ＡＳＴＲＸ２Ｓ（配列番号１２０）、ここで、Ｘ１は、Ｈ及びＷから選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｅ及びＳから選択される）、またＬ−ＣＤＲ３の４つの位置で改変を有する（ＱＮＤＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ（配列番号１２８）、ここで、Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、及びＬから選択され、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、及びＹから選択され、Ｘ３は、Ｗ及びＹから選択され、Ｘ４は、Ｌ及びＭから選択される）。８つのＬＣの組成は表１０に示されている。
【０１５０】
【表１０】
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【０１５１】
これらＭＡｂのいくつかを、更なる特徴付けに供し、生体内異種移植モデルで試験した（実施例５）。
【０１５２】
実施例５：ＭＡＢの特徴付け
単一ＬＣ可変領域（Ｌ３、配列番号２３）及び単一ＨＣ可変領域（Ｈ２２、配列番号１９）を含み、いくつかのＣＤＲ残基に異なる残基を有する、Ｍ５９に基づく変異体の、ヒトフフレームワーク適応及びライブラリ再選択の後、この新規Ｍａｂを、生物物理学的及び生理活性アッセイに供し、また、異なるパラトープ残基を有する一対（paring）、Ｍ１５８７を用いて、ＴＦ−ＥＣＤに対する１０Ｈ１０  Ｆａｂの結合に関して初めに特徴付けされたエピトープ（実施例２）が変わったどうかを再度調べた。
【０１５３】
ヒトＴＦ  ＥＣＤ：Ｍ１５８７接点
１０Ｈ１０  ＣＤＲ、Ｍ１５８７（Ｌ３及びＨ１１６）に基づいたヒトに適合しかつ親和性の成熟抗体と、ＴＦ  ＥＣＤとの共結晶化を、Ｍ１５８７−Ｆａｂ：ＴＦ複合体が、１６％のＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍの酢酸アンモニウム、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ４．５を含有する溶液から結晶化されたことを以外は、１０Ｈ１０（実施例３）と同様の方法で行った。
【０１５４】
ヒトＴＦ  ＥＣＤの共結晶構造と親和性成熟Ｍ１５８７  Ｆａｂの共結晶構造との比較は、１０Ｈ１０のヒト適合及び親和性成熟は、図２に示される抗体エピトープのフットプリントを変化させず、またＣＤＲのコンフォメーションも変化させなかったことを示す。３つのアミノ酸置換（Ｔ３１Ｐ、Ｓ５７Ｆ、及びＮ５９Ｔ）は、Ｈ１１６（配列番号１３３）の残基３１及び５７に接触残基（Ｔ３１Ｐ及びＳ５７Ｆである）を含む、ヒトフレームワーク適合及び親和性成熟（配列番号６及び７は配列番号６３及び８６で置き換えられた）の間に、Ｈ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２（それそれ、配列番号６及び２７、実施例２に記載のＣＤＲ定義を使用）に導入された。親和性改善は５倍であり、これは、ＴＦのＳ１９５と接触するＦ５７の接点が増加したことに起因し得る。たとえＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２パラトープ残基に変更がなされたとしても、ＨＦＡ及び親和性成熟中にエピトープが保存されることが、ヒトＴＦ  ＥＣＤとＭ１５８７  Ｆａｂのとの構造により確認された。
【０１５５】
生物物理学的及び生物学的アッセイの結果
これら抗体の、ＢｉａｃｏｒｅによるＫＤ分析（表１１）、ヒトＴＦによるヒト血漿の凝固時間（表１２）、及びＦＶＩＩａで刺激されたＭＤ−ＭＢ−２３１細胞からのＩＬ８放出に関するＥＣ５０（表１３、１４、及び図５）に関する要約データが、以下に示されている。
【０１５６】
４３個の選択された親和性成熟Ｍａｂに関し、マウス１０Ｈ１０、及びＭＡｂ（Ｍ１）と、１０Ｈ１０からの非修飾ＣＤＲを有する選択されたヒトフレームワーク適合変異体とのキメラバージョンのために生成されたデータを含むＫＤが（Ｍ数は１００未満）、表１１に示されている。したがって、ヒトフレームワーク選択とＣＤＲ残基置換との組み合わせは、ＫＤが８０〜９５０ｐＭの範囲であり、解離速度（Ｋｏｆｆ）が２．２×１０−５秒−１〜２．６×１０−３秒−１の範囲であり、結合速度（Ｋｏｎ）が１０４Ｍ−１秒−１〜２．３×１０５Ｍ−１秒−１の範囲である、ヒト抗体を産生させた。新規Ｍａｂは、最初のマウス１０Ｈ１０又はキメラ構築物の値と比べて、最大で１０倍も小さい平衡解離定数（ＫＤ）（０．７７ｎＭ〜０．０８ｎＭ）を有し、より速い結合速度（Ｋｏｎ＞１０５Ｍ−１秒−１）を有し、又はより遅い解離速度（Ｋｏｆｆ＝１０５秒−１）を示す。これら特性を用いて、滞留時間又は組織を通過する能力のいずれかが所望される、特定用途用のＭＡｂを選択する際に利益をもたらすことができる。
【０１５７】
【表１１−１】
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【０１５８】
【表１１−２】
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【０１５９】
凝固
新規Ｍａｂは、カルシウム及び外から加えられたヒトＴＦの存在下で、生体外で測定した場合に、ヒト血漿の凝固を阻害せずにヒトＴＦに結合する能力によって特徴付けられる（表１２）。１７個のＨＦＡ（Ｍ数は１００未満）変異体及び３８個の親和性成熟変異体（Ｍ１５８３以上）を検定し、Ｔ１／２最大（最大光学密度の５０％に達する時間（秒））を報告した。
全て、１０Ｈ１０（表１２）で観察されたのと同様の応答を示し、Ｔ１／２最大の値は２０５秒未満であり、このことは、１５９±１７（ｎ＝１４）であった抗体のない溶媒対照群と比較した場合に、これら抗体が凝固時間を長引かせないことを示している。前述したヒトＴＦ結合抗体であり（米国特許第７６０５２３５  Ｂ２号）、ＴＦに対するＦＸの結合を阻害するマウス抗体５Ｇ９由来のＣＮＴＯ８６０は、凝固を長引かせ、同じアッセイで１８００秒以内に決して凝固に達しない。実施例４において変化したＣＤＲを有すると記載された４３個のＭＡｂのうち５個は、２ｍｇ／ｍＬ未満の開始濃度を有したので、凝固アッセイで試験しなかった。Ｍ１、Ｍ５９、及びＣＮＴＯ８６０の値は、複数回の試験にわたって平均化された。
【０１６０】
【表１２】
2014509856.tif 000022
【０１６１】
シグナル阻害活性
新規ＭＡｂは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体を介してシグナル伝達を阻害する能力の観点からも説明され得る。乳癌細胞のＴＦ／ＶＩＩａ／ＰＡＲ２シグナル伝達は、ＶＥＧＦ２５、Ｃｙｒ６１、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１、及びＩＬ−８などの血管新生促進因子の広範なレパートリーを誘導する。ＦＶＩＩａが、ＴＦを発現するヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１？？？において検出可能なＩＬ−８を誘導することは、既に報告されている（Ａｌｂｒｅｋｔｓｅｎら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ５：１５８８〜１５９７，２００７）。したがって、このアッセイをバイオアッセイとして用いて、ＴＦ／ＶＩＩａの誘導によるＩＬ−８の産生を阻害する変異体抗体の能力を評価した。
【０１６２】
このアッセイの詳細は本明細書において上記されており、実施例３のＨＦＡ（Ｍ１０〜Ｍ６８）変異体のうちの１９、及び実施例４のＣＤＲ変異体のうちの２９を試験した結果を、単一濃度（０．５マイクログラム／ｍＬ）のＴＦにてＩＬ−８産生を阻害する能力について検証した。組織因子に結合しない坑ＲＳＶ抗体（Ｂ３７）を、陰性対照として用いた。ＨＦＡ  Ｍａｂの多くは、この濃度で、ＩＬ−８誘導を６７％を超えて阻害することができた（表１３）。図５は、１０Ｈ１０のＭＡｂ（それぞれ配列番号６及び７）と比較した場合の、Ｌ３軽鎖（配列番号２３）を共有し、かつＨ−ＣＤＲ１又はＨ−ＣＤＲ２に置換を有する２７のＭＡｂによるＩＬ８放出の相対的阻害を示す。更に、これらのうち４つ（Ｍ１５８４、Ｍ１６１１、ＴＦ７Ｍ１６１２、及びＴＦ７Ｍ１６０７）は、Ｍと共に十分な滴定ＩＬ−８誘導アッセイに供された。計算された相対ＩＣ５０値は、親和性が改善した変異体が、１０Ｈ１０のマウス−ヒトキメラであるＭ１と比べてより強力であるという知見を支持している（表１４）。実施例４に記載された親和性成熟抗体の他の親和性成熟群は、同様の結果をもたらした。
【０１６３】
【表１３】
2014509856.tif 000023
【０１６４】
【表１４】
2014509856.tif 000024
【０１６５】
実施例６：抗体の抗腫瘍活性
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を有するマウス異種移植モデル
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のＬＮＮを有するＤＭＥＭ培地で培養し、トリプシン処理によって対数期に採取し、滅菌無血清ＤＭＥＭ培地に５×１０７細胞／ｍＬで再懸濁させた。２０匹の雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄ−ｂｇＢＲ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、実験に先立って１４日間順応させた。生後約８週目に、マウスの右腋窩乳腺脂肪体に２．５×１０６  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を埋め込んだ。腫瘍のサイズが約１００ｍｍ３になったとき、マウスを腫瘍サイズによって治療群に階層化した（Ｎ＝１０／群）。階層化した日に、１０ｍｇ／体重１ｋｇのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）又はＭ１５９３による腹腔内投与治療を開始し、週１回投与を続けて合計６回投与した。腫瘍及び体重を週１回記録した。各群の平均腫瘍容積が１５００ｍｍ３に達した時点で研究を終了した。適用した統計検定は、反復測定二元配置分散分析（ＰＲＩＺＭ  ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）であった。
【０１６６】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおいて、Ｍ１５９３は、２２日目（＊Ｐ＜０．０１）に始まり、対照（ＤＰＢＳ処理）群を安楽死させた２９日目（＊＊Ｐ＜０．００１）まで続いた腫瘍成長を、有意に阻害した。Ｍ１５９３処理群は、３６日目に安楽死させた。Ｍ１５９３は、腫瘍成長を２９日目で約４９％阻害した。ＤＰＢＳ処理対照群と比較して、Ｍ１５９３処理群における腫瘍成長遅延は約１１日であった（図６）。
【０１６７】
Ａ４３１を有するマウス異種移植モデル
Ａ４３１ヒト扁平上皮癌細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のＬＮＮを有するＤＭＥＭ培地で培養し、トリプシン処理によって対数期に採取し、滅菌ＨＢＳＳに１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁させた。２０匹の雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄ−ｂｇＢＲ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、実験に先立って１４日間順応させた。生後約８週目に、マウスの右脇腹に２×１０６  Ａ４３１細胞を埋め込んだ。腫瘍のサイズが約１１８ｍｍ３になったとき、マウスを腫瘍サイズによって治療群に階層化した（Ｎ＝１０／群）。階層化した日に、１０ｍｇ／体重１ｋｇのＤＰＢＳ又はＭ１５９３による腹腔内投与治療を開始し、週１回投与を続けて合計６回投与した。腫瘍及び体重を週２回記録した。各群の平均腫瘍容積が１０００ｍｍ３に達した時点で研究を終了した。適用した統計検定は、反復測定二元配置分散分析（ＰＲＩＺＭ  ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）でった。
【０１６８】
Ｍ１５９３は、対照（ＤＰＢＳ処理）群を安楽死させた２２日目（＊Ｐ＝０．００６７）における腫瘍成長を、有意に阻害した。ＣＮＴＯ５９２処理群は、３９日目に安楽死させた。ＣＮＴＯ５９２は、腫瘍成長を２２日目で約５４％阻害した。ＤＰＢＳ処理対照群と比較して、Ｍ１５９３処理群における腫瘍成長遅延は約１７日であった（図７）。
【０１６９】
実施例７：変化したＦＣを有する抗体組成物
天然ヒトＦｃ受容体変異体は、ヒト抗体のＦｃタンパク質に対して実質的に異なる親和性を有する。更に、臨床研究で、Ｆｃ操作されたｍＡｂで治療された後、強力結合Ｆｃ遺伝子型を有する患者の奏効率及び生存率が改善したことが立証されている（Ｍｕｓｏｌｉｎｏら２００８  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１７８９〜１７９６（２００８）；Ｂｉｂｅａｕら２００９  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：１１２２〜１１２９）。
【０１７０】
ＴＦシグナル伝達の阻害は、細胞応答を減少させ、腫瘍増殖、移動、及び転移性の広がりをもたらすと予想されるが、ＴＦ抗原が腫瘍細胞上に提示されるという事実は、抗体ＦｃによるＦｃ受容体結合に関連する機序により、標的細胞の選択的殺傷手段を提供する。抗体のＦｃドメインの表面特徴は、グリカン組成物、並びに重鎖の一次配列の影響を受けることが知られており、それらの一方又は両方による修飾は、Ｆｃ受容体結合を変化させることができる。
【０１７１】
Ｍ１５９３として特定されるＭＡｂは、低フコースグリカン修飾ＩｇＧ１として、及び更にはＩｇＧ１−ＣＨ２ドメイン変異体として産生された（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅの付番は、Ｋａｂａｔ  ＥＵシステムのものである）。
【０１７２】
ＭＡｂ組成物及び製造方法
フコース含有量が少ない抗体（Ｍ１５９３−ＬＦ）は、シグナルペプチドを有する以下に示されるＭ１５９３（ＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ）鎖をコードするベクターを、ＣＨＯ宿主細胞株からタンパク質の低フコシル化のために選択されたＣＨＯ宿主細胞亜系統中に電気穿孔することによって産生された。配列番号１６５は、可変ドメイン、残基１〜１１３（配列番号２３及びＦＲ４、配列番号６１、下線）、及びヒトｋａｐｐａ定常軽鎖ドメインを含む完全な軽鎖を示す。可変ドメイン残基１〜１２０（配列番号１３９及びＦＲ４、配列番号６０を含む、下線）、並びにＫａｂａｔ位置２３９及び３３２（配列番号１６７の２４２及び３３５）である野生型ヒトＩｇＧアイソタイプ１  ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む重鎖は、変異体Ｍ１５９３−ＤＥを産生するために、野生型残基Ｓ及びＤからそれぞれ、Ｄ及びＥに変更された。
【０１７３】
Ｍ１５９３−軽鎖
（配列表１）
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【０１７４】
Ｍ１５９３−Ｋａｂａｔ位置Ｓ２３９がＤであり、Ｉ３３２がＥである重鎖
（配列表２）
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【０１７５】
ＣＨＯ細胞は、宿主細胞株として用いられるべき天然低フコース細胞のプールを単離するために、陰性レクチン選択（フコース結合レクチンに対する非結合の選択）及びＦＡＣＳソートを４回繰り返した後に、サブクローニングすることによって生成された。この細胞株は、Ｍ１５９３を産生するのに用いたのと同じ宿主細胞由来であったので、その細胞は、全く同じやり方で培養及び処理された。トランスフェクトされた細胞は、検出用タンパク質Ｇを用いてメチルセルロース播種によってスクリーニングされ、コロニーを採取して９６ウェルプレートに入れた。培養を振盪フラスコに拡大し、力価測定した。上部の親クローンは、バッチ振盪フラスコ培養でＭ１５９３−ＬＦを最高７０８ｍｇ／Ｌ（標準培地中）産生した。
【０１７６】
フコシル化パーセントを決定し、グリコシル化プロファイルの経時的安定性及び産生プロセスを評価するために、２つのＭ１５９３−ＬＦ産生クローン（Ｃ２４５２Ｂ及びＣ２４５２Ｄ）にＬＣ−ＭＳ糖ペプチドマッピングを行った（表１５）。試料は、継代１フェドバッチ及び継代１０バッチ培養物から安定性試験中に収集され、精製された。バイオリアクター評価からの精製された試料を更に分析した。糖ペプチドマッピングは好ましいグリコシル化パターンを示し、Ｃ２４５２Ｂ及びＣ２４５２Ｄのフコシル化の割合は全体的に低かった。重要なことに、フコシル化パーセントは時間とともに有意に増加せず、これは宿主細胞のフコシル化が安定的であることを示唆している。このように、Ｍ１５９３−ＬＦのフコース含有量は、１０％未満、一般には５％未満、及び一部の調製物では２％未満である。レクチンを選択しない宿主ＣＨＯ細胞で産生されるＭａｂは、８０％超過がフコシル化されるグリカン群を含んだ。
【０１７７】
【表１５】
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Ｍ１５９３のＦｃ突然変異体（Ｍ１５９３−ＤＥ）では、Ｍ１５９３を発現するプラスミドが特定部位の突然変異誘発に供された。
【０１７８】
生物活性
３つの抗ヒトＴＦ  Ｆｃ変異体（Ｍ１５９３、Ｍ１５９３−ＬＦ、及びＭ１５９３−ＤＥ）は、ヒト及びカニクイザルＦｃ受容体の両方に対して親和性である（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）。これらアッセイは、本出願人による同時継続中の出願（米国特許出願第６１／４２６６１９号）に記載される通りに、又はプラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）に基づく結合アッセイ（？）を用いて行われた。
【０１７９】
これらアッセイの結果は、両方のＦｃ修飾抗ＴＦ抗体が、未修飾の親ＩｇＧ１  Ｍ１５９３抗体よりもはるかに緊密に、１８倍（Ｍ１５９３−ＬＦ）及び４０倍（Ｍ１５９３−ＤＥ）の強さで組み換えヒトＦｃγＩＩＩａ受容体に結合することを実証した（表１６）。
【０１８０】
【表１６】
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ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合により刺激される。ＡＤＣＣアッセイを、前述の通りに行った（Ｓｃａｌｌｏｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：１５２４〜１５３４  ２００７）。
【０１８１】
改善されたＦｃ受容体結合は、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を標的細胞として用いる機能的生体外ＡＤＣＣアッセイに反映された（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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