(57)【要約】  本開示は、インターロイキン-1レセプター1（IL-1R1）、IL-1ベータとIL-1R1との相互作用、又はIL-1R1とインターロイキン-1レセプター付属タンパク質（IL-1RaCP）との間の相互作用を遮断又は阻害するポリペプチドに関する。特に本開示は、腫瘍細胞、癌幹細胞及び化学療法又は放射線療法耐性癌幹細胞上に存在するIL-1R1を特に標的とする治療用ポリペプチドに関する。特に本開示は、前記阻害物質が結合するIL-1R1を発現する癌幹細胞（CSC）に関する。最後に、本開示は、標準的な化学療法又は放射線療法の手段によって腫瘍原性分化癌細胞を殺滅する工程、及び前記工程の前又は前記工程に続いて特にCSCを標的とするIL-1R1阻害物質を適用して癌細胞子孫を生じるその能力を腫瘍から取り除く工程を含む併用療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の癌細胞及び／又は癌幹細胞（CSC）の治療に使用される、IL1ベータとIL1R1との結合及び／又はIL1R1とIL1RaCPとのヘテロダイマー形成を阻害するポリペプチド。
【請求項２】
CSCの治療に使用される請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
CSCが、CSCでない他の腫瘍細胞を含む、CSCの治療に使用される請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
癌細胞がさらにCSCを含む、癌細胞の治療に使用される請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
IL1RがCSCの表面で発現されるが、CSCではない腫瘍細胞では発現されないか又は本質的に発現されない、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−4のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
癌幹細胞が少なくとも化学療法及び／又は放射線療法に耐性を有する、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−5のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
治療されるべき癌が、大腸癌（CRC）、非小細胞肺癌（NSCLC）及び乳癌から成る群から選択される、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
細胞増殖抑制性薬剤、細胞傷害性薬剤又は放射線療法と併用して個体に投与される、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−7のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
細胞増殖抑制性又は細胞傷害性薬剤が抗腫瘍抗体又は化学療法剤である、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
細胞増殖抑制性若しくは細胞傷害性薬剤処置又は放射線療法処置の前、前記処置と同時又は前記処置の後で適用される、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項8又は9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ヒト、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体である、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−10のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、抗IL1R1抗体、抗IL1ベータ抗体、抗IL1RaCP抗体、又はIL1R1及びIL1RaCPを標的とする二特異性抗体である、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
組換え体の天然又は改変IL1RAである、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−10のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
IL1R1-IL1RaCP融合タンパク質である、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−10のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
医薬的に有効な量の前記ポリペプチドを医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に含む医薬組成物の成分である、癌細胞及び／又はCSCの治療に使用される請求項1−14のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
細胞系ex-vivoアッセイで癌に対する薬剤の効果を評価及び予測するためのバイオマーカーの使用であって、（i）バイオマーカーがIL1R1であり、（ii）細胞が、その表面にIL1R1を発現する薬剤耐性又は放射線耐性癌幹細胞（CSC）であり、さらに（iii）前記薬剤が請求項1−15のいずれかに特定される治療用ポリペプチドである、前記バイオマーカーの使用。
【請求項１７】
CSCが、腫瘍組織サンプルを化学療法剤及び／又は放射線照射で処置することによって個体の腫瘍組織サンプルの細胞亜集団として入手される、請求項16に記載のバイオマーカーの使用。
【請求項１８】
細胞系アッセイの癌細胞が、NSCLC、CRC又は乳癌を罹患する個体のサンプルに由来する、請求項16又は17に記載のバイオマーカーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン-1レセプター1（IL-1R1）を遮断若しくは阻害する、IL-1ベータとIL-1R1との相互作用又はIL-1R1とインターロイキン-1レセプター付属タンパク質（IL-1RaCP）との間の相互作用を遮断若しくは阻害するポリペプチドに関する。特に本発明は、腫瘍細胞、癌幹細胞及び化学療法又は放射線療法耐性癌幹細胞に存在するIL-1R1を特に標的とする治療用ポリペプチドに関する。特に本発明は、前記阻害物質が結合するIL-1R1を発現する癌幹細胞（CSC）に関する。最後に、本発明は、通常的に分化する癌細胞を標準的な化学療法又は放射線療法の手段によって殺滅する工程、及び前記工程の前又は後に特にCSCを標的とするIL-1R1阻害物質を適用する工程を含む併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍はその細胞組成において均一ではない。1つの腫瘍中の全ての細胞が腫瘍原性であるというわけではないことは今日判明している。小さな亜集団のみが新規な腫瘍を再形成することができる。この細胞集団は、自己復元し異常分化子孫を生じることができる。これらの特色は幹細胞で共有されるので、前記集団は癌幹細胞（CSC）と称された（T. Reya et. al., Nature, 2001. 414(6859):105-11）（前記はまた腫瘍開始細胞とも称される）。
腫瘍を形成するバルク細胞は癌幹細胞（CSC）亜集団に由来するという考え方は近年広く認知されてきた。CSCは、少数を実験動物に移植したとき失敗なく新規腫瘍を播種する能力、in vivoでの数回の継代にわたって前記播種を再現する能力、及び最初の腫瘍の形態を再現する能力によって、腫瘍細胞のバルク集団から区別される。対照的に、非CSC集団は、多数を移植したときでさえもin vivoで腫瘍増殖を開始させることはできない。規定によれば、CSC亜集団は新規な腫瘍の増殖を開始させることができる腫瘍細胞のみを表すので、CSCは転移の成立に中心的な役割を果たすと期待されよう。
一般にCSCは、それらが同定された環境及び腫瘍タイプに応じて腫瘍集団の1−10％を構成する。それらは以下の特性によりその作用を基準にして定義される：（i）腫瘍及び新形成性増殖を開始させる選択的性能、（ii）自己復元能力、及び（iii）細胞分化によってより成熟した非幹性細胞子孫を生じる潜在能力。さらにまた、CSCは化学療法及び放射線療法に対する耐性の増加を特徴とする。したがって、それらは主として休止性又は休眠性であり、したがって分裂中の腫瘍細胞を標的とする通常的な治療レジメンをすり抜ける。CSCは体内を活発に遊走し、骨髄中の骨芽細胞ニッシェに残存し、さらに新規腫瘍を再形成できる多様な器官に帰巣するので、CSCは転移の供給源であると考えられる（A. Trumpp and O.D. Wiestler, Nat Clin Pract Oncol, 3008, 5(6):337-47）。
【０００３】
帰巣は主として、ケモカインシグナル勾配に向かってこれらの細胞を遊走させる表面分子によって媒介される。したがって、サイトカイン及びケモカインシグナル（例えば間質由来因子-1（SDF-1）/ケモカインレセプター-4（CXCR-4）、オステオポンチン/CD44又は同様なシグナル）はCSCにおいて重要な役割を果たすと考えられる（A.K. Croker and A.L. Allan, J Cell Mol Med, 2008, 12(2):374-90）。論理的帰結として、体内遊走のプロセスは、これらの細胞が免疫監視をすり抜けた時にのみ可能である（T. Schatton and M.H. Frank, ンN Y Acad Sci, 2009, 1176:154-69）。いくつかの細胞表面マーカーが、固形腫瘍中のCSCで同定され（例えばCD133+、CD44+、ABCB5+）、一方、血液学的悪性腫瘍（例えばAML及び多発性骨髄腫）では特にCD34+、CD38+7が見出された。
【０００４】
癌幹細胞を規定するためのゴールデンスタンダードは、in vivoでは単離又は濃縮細胞を免疫抑制マウスに注入し原型腫瘍の新しい表現型コピーが形成されたときに与えられる。最初の表現型コピーは原型腫瘍と同じ量のCSCを含む（ただし腫瘍を連続的に再移植するときわずかな濃縮を伝播し得る）。極低接着性（ULA）プレートで接着させずに、無血清下である種のサイトカイン（例えばEGF及び／又はbFGF）を添加して増殖させたとき、CSCは三次元（3D）構造物を形成できる。前記構造物は胚性幹細胞（ESC）によって形成される類球状体に類似し、腫瘍球と称される。接着性喪失時に、分化細胞はアノイキス（脱離誘発アポトーシス）によって死滅し、したがって腫瘍球アッセイはCSC及び腫瘍原性潜在能力を有する未成熟先駆細胞を濃縮する（G. Dontu and M.S. Wicha, j Mammary Gland Biol Neoplasia, 2005, 10(1):75-86）。腫瘍球形成後に、酵素カクテルを用いてコンパクトな凝集物を分解し再プレートすることができる。連続的再プレートは自己復元特性をin vitroで模倣し、プレートした細胞の幹細胞性能を示唆し得る。
通常的な腫瘍治療法は、主として、限定的な自己復元能力及び分裂能力を示す腫瘍バルク集団を死滅させることによって最初は腫瘍を退縮させることができるが、CSC仮説にしたがえば、耐性を有するCSCは治療後に生命活性を維持し腫瘍増殖を再確立させることができ、再発及び新形成性疾患の進行をもたらす。
【０００５】
通常的な腫瘍治療法とは対照的に、CSCを指向しこれを標的とする新規な治療方法は、癌細胞子孫を生じる腫瘍の能力を低下させることができる（前記は腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍の退化をもたらす可能性がある）。好ましいCSC標的物及び治療法は、生理学的幹細胞とは対照的に悪性幹細胞で優先的に誘発されるか又は作動する分子又は経路を含むであろう。
癌療法の有効性は、細胞傷害性薬剤又はイオン化誘発照射に対する腫瘍の先天的又は後天的耐性によってしばしば損なわれる。
したがって、CSCを巻き込むことによって癌疾患を治療する新規で有効な方法の開発が希求される。
IL-1サイトカインファミリーは、3つのメンバー、IL1α（IL1A）、IL1β（IL-1B）及びIL1レセプターアンタゴニスト（IL1RA）から成り、前記はそれぞれ別個の遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子は前駆体タンパク質を生成し、前記前駆体タンパク質はタンパク質分解により切断されて活性なサイトカインを生じる。前記サイトカインの2つのアゴニスト型はIL-1α及びIL-βである。IL1αは主として膜に結合し稀に循環中に見出されるが、逆にIL-βは主として分泌される。IL-1α及びIL-1βは、IL-1対応細胞で同じ下流作用を媒介する。第三のサイトカインメンバー、IL-1RAは下流のシグナリングを活性化することができず、さらにIL-1α及びIL-1βの活性を競合的に阻害する。
【０００６】
IL-1α、IL-1β及びIL-1RAはいずれもIL1レセプター1型（IL1R1）と結合することによってそれらの作用を媒介する。IL-1α又はIL-1βとの結合時に、IL1R1はIL1R3（IL1レセプター付属タンパク質（IL1RAcP）としても知られている）と結合して活性なシグナリング複合体の形成をもたらす（前記複合体は、IRAK、MAPK p38、p42/44、ERK、JNK、STAT3及びNF-κB活性化を巻きこむリン酸化カスケードを誘発する）。IL1R2は、細胞内シグナリングを促進しないおとりレセプターとして同定された[1]。IL-1応答の強さは、当該経路のアンタゴニスト物質及びアゴニスト物質のバランスによって厳格に調節される。
炎症応答は、多数の細胞タイプ及びサイトカインを巻き込む複雑なシグナリングカスケードである。病原体に対する炎症応答は通常ではマクロファージによって開始され、マクロファージはそれらの活性化時にIL-1βを分泌する。このIL-1βは、感染に対する初期の生理学的応答の始動に必要な急性期サイトカインとして機能する。IL-1βは、多様な追加的サイトカイン及びケモアトラクタント（IL8、IL6、MCP-1及びVEGFを含む）の生成を必要とする炎症カスケードの頂点に位置する。さらにまた、IL-1駆動Cox-2活性化は、PGE2生成の増加をもたらす。正常な条件下では、炎症は感染が終結するまで持続する。この反応が障害されると、慢性的炎症が生じ前記は癌と密接に連関する。
腫瘍は進行するにつれ、腫瘍付随マクロファージ（TAM）及び腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の他に間質線維芽細胞及び血管内皮細胞を含む炎症性細胞の密集浸潤物を蓄積する。これらの細胞タイプは、腫瘍の増殖、転移及び新規血管形成を支援する腫瘍のミクロ環境を創出する。このオーケストラの主要構成員はIL-1βである。
【０００７】
病原体に対する正常な応答は、細菌の副生成物（例えばLPS（前記はIL-1βの強力な誘発物質である））によるIL-1βの活性化を必要とする。LPSのセンサー細胞はIL-1βを分泌するマクロファージである。IL1R1発現細胞（例えば内皮細胞（EC）、上皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞及びリンパ球）はIL-1βに応答し、炎症促進媒介因子（IL-1βそのもの、IL6、IL8、MCP-1、MKP-1及びCox-2）の分泌を開始する。このプロセスを制御し、ホメオスタシスを調節するために、いくつかの生理学的なIL-1R1阻害物質（特にIL1レセプターアンタゴニスト及びIL1R2レセプター）が存在し、前記はおとりレセプターとして機能する。右パネル。腫瘍炎症促進は複雑な腫瘍のミクロ環境（間質線維芽細胞、腫瘍付随マクロファージ（TAM）及び腫瘍細胞そのものから成る）の産物である。3つの細胞タイプはいずれもIL-1βを分泌し、それらの膜上にIL-1αを発現する。IL-1応答細胞は、腫瘍細胞、TAM、線維芽細胞、EC及びリンパ球である。前記は多様な炎症促進性タンパク質（例えばIL6、IL8、VEGF、MCP-1及びCOX-2）の発現をもたらす。総合すれが、これらの媒介因子は、腫瘍増殖及び免疫抑制を支援するSTAT3を誘発することによって癌の病理発生を促進する。好中球の補充、COX-2発現及びMCP-1もまた免疫抑制を促進し、さらにVEGFは腫瘍の血管形成を駆動する。
【０００８】
IL-1βがIL1R1と結合すると、IL1R1はIL1R付属タンパク質（IL1RaCP）とヘテロダイマーを形成してリン酸化カスケードを始動させる。前記リン酸化カスケードは、IL1R関連キナーゼ（IRAK）、MAPK及びERK/JNKを巻き込み、STAT3及びNF-κBの転写活性化で頂点に達する。したがって、抗腫瘍免疫を阻害し、腫瘍の血管形成を促進し、さらに腫瘍間質を強化する炎症促進分子が発現され、最終的に分泌される。
したがって、IL-1とIL-1R1との相互作用が、いくつかの疾患、好ましくは免疫疾患及び炎症疾患（例えば関節炎（例えば慢性関節リウマチ、変形性関節症）及び炎症性腸疾患）の病理発生において暗示されてきた。IL-1R1と結合してその活性を中和するある種の薬剤（モノクローナル抗体を含む）が、ある種の炎症状態の有効な治療薬であることが証明された。前記ある種の炎症状態は、例えばセリアック病、クローン病；潰瘍性結腸炎；特発性胃不全麻痺；膵炎（慢性膵炎を含む）；急性膵炎、炎症性腸疾患及び潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍を含む）、並びに中等度から重度に活動性の慢性関節リウマチ（抗IL-1R1抗体AMG108（Amgen）により治療できるもの）である。
【０００９】
IL-1アルファ又はベータに対する他のキメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体（例えばCDP-484（Celltech））、又はIL-1レセプターに対する抗体（例えばAMG-108（Amgen）、R-1599（Roche））、又はIL-1Raに対する抗体（アナキンラ（Amgenn））が周知である。
記載されているように、これらの抗体の大半は炎症疾患の治療に用いられる。いくつかの事例では、そのような抗IL-1R1抗体は、以下を含むリンパ球増殖性異常の治療に使用できるかもしれないと報告されている：自己免疫リンパ球増殖性症候群（ALPS）、慢性リンパ芽球性白血病、ヘアリー・セル白血病、慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、組織球性リンパ腫及びホジキン病。しかしながら、証拠は提示されなかった。さらにまた、非リンパ種由来癌の治療にIL-1R1阻害物質の使用に関する信頼に足る報告もない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、IL-1R1は化学物質耐性及び／又は放射線耐性癌細胞（好ましくは癌幹細胞（CSC））の表面で発現又は過剰発現されるが、このレセプターは、正常な分化増殖非腫瘍原性腫瘍細胞又は化学毒性薬剤若しくは放射毒性薬剤に耐性でない腫瘍細胞またはCSCでない細胞では発現されないか又はわずかしか発現されないという発見に基づく。
本発明にしたがって、種々の癌患者（例えば非小細胞肺癌（NSCLC）及び大腸癌（CRC）患者）の初代CSCを特殊化in vitro系（球体アッセイ）で分析し、それらを分化誘導条件下で増殖させたCSCと比較した。さらにまた、本発明者らは、高用量化学療法処置によってNSCLC細胞株から耐性を有する腫瘍細胞を選別し、サイトカインIL1ベータ及びその対応するレセプターを弁別的調節遺伝子として同定した。ILベータは、多様な細胞タイプでそのシグナルを提示するサイトカインである。腫瘍という環境では、IL1ベータは腫瘍細胞で生成され、内皮細胞、線維芽細胞及び浸潤免疫細胞上で機能することによって腫瘍のミクロ環境を作り出す。それによって、IL1ベータは、多数のタンパク質（例えばマトリックスメタロプロテアーゼ、VEGF、bFGF、IL8、IL6及び他のものを含む）の発現を誘導する。下流のプロセスは免疫監視を妨害することによって防護をもたらし、さらに腫瘍の増殖及び転移を支援する。モノクローナル抗体又は小化学物質の手段によるIL-1R1の阻害は腫瘍の増殖を低下させることができ（前記は腫瘍球体を用いて示される）、前記はCSC表現型の減少と密接に関係する。本明細書では、適切な腫瘍を標的とし対応する腫瘍疾患を治療するために、治療用抗体によるIL-1R1の阻害を利用できることを記載する。
【００１１】
本発明は以下の結果を提供する：
1．IL1/IL1R1シグナリングをCSC関連経路として同定。
2．IL-1β及びIL1R1遺伝子の発現は、癌患者における無腫瘍生存及び生存全期間の低下と密接に関係する。
3．IL1R1は原発性CRC及びNSCLC腫瘍細胞で発現され、腫瘍球連続増殖によるCSCの富化に続いてアップレギュレートされる。
4．IL1R1はヒトの腫瘍由来原発性CRC及びNSCLC細胞株で発現され、その発現はCSC富化腫瘍球でアップレギュレートされる。
5．IL1R1の抗体による遮断はin vitroでの腫瘍球形成を阻害する。
6．IL1R1遮断は、IL-1β刺激MAPKp38及びSTAT3リン酸化を阻害する。
7．組換えIL-1βは腫瘍球でIL1R1の発現を誘発するが、IL1R1の抗体による遮断はIL1R1発現をダウンレギュレートする。
8．CSC富化腫瘍球はIL1-応答サイトカインhIL8及びhVEGFを分泌し、これらのサイトカインの生成はIL1R1遮断によって阻害され得る。
9．IL1RA薬キネレット（Kineret, Amgen）はCSC由来異種移植腫瘍の増殖を阻害し、さらにin vivoで血清サイトカインを調節する。
10．腫瘍関連マクロファージ（TAM）は、IL-1を必要とするメカニズムによりin vitroで腫瘍球形成を促進する。
【００１２】
要約および更に一般化すれば、本発明は以下の主題に関する：
−個体の癌細胞及び／又は癌幹細胞（CSC）、好ましくはCSCの治療で使用される、IL1ベータとIL1R1との相互作用を阻害する薬剤、好ましくはポリペプチド、より好ましくはモノクローナル抗体。本発明の癌細胞は癌幹細胞（CSC）の亜集団を含むことができる。本発明のCSCは、CSCでない他の腫瘍細胞を含むことができる。本発明のポリペプチドは、好ましくは前記CSCの表面で発現されるが他の腫瘍細胞（当該腫瘍組織の主要集団を形成し、さらに癌幹細胞ではない）では発現されないか又は本質的に発現されないIL1R1を標的とする。好ましくは、治療されるべき癌は、通常的な化学療法及び／又は放射線療法及び／又は他のターゲティング療法に耐性又はほとんど耐性を示す。
−癌細胞及び／又はCSCの治療で使用される、IL1ベータとIL1R1との相互作用を阻害する対応する薬剤、ポリペプチド又はモノクローナル抗体、ここで治療されるべき癌は乳癌、大腸癌（CRC）又は非小細胞肺癌（NSCLC）、好ましくはCRCである。
−癌細胞及び／又はCSCの治療で使用される、IL1ベータとIL1R1との相互作用を阻害する対応する薬剤、ポリペプチド又はモノクローナル抗体、ここで前記薬剤（好ましくは抗体）は、細胞増殖抑制性若しくは細胞傷害性薬剤又は放射線療法と併用して適用される。前記細胞増殖抑制性又は細胞傷害性薬剤は、好ましくは抗腫瘍抗体（例えばハーセプチン、リツキサン又はエルビタクス）又は化学療法剤であり、それらは、前記薬剤（好ましくは前記モノクローナル抗体）の前若しくは後で、又は前記薬剤（好ましくは前記抗体）と同時に当該個体に適用される。
【００１３】
−癌疾患の治療に適切な医薬組成物。前記医薬組成物は、治療的に有効な量で抗IL-1R1薬剤、好ましくはポリペプチド、より好ましくは上記に規定の抗IL-1R1抗体を医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に含む。
−少なくとも1つの第一のパッケージ及び1つの第二のパッケージを含む医薬キット、ここで（i）第一のパッケージは、対応する抗IL-1R1薬剤、好ましくはポリペプチド若しくは記載の抗IL-1R1抗体、又はそのような薬剤/抗体を含む医薬組成物を含み；さらに（ii）第二のパッケージは、細胞傷害性及び／又は細胞増殖抑制性薬剤、又は前記薬剤を含む医薬組成物を含み、ここで前記第二のパッケージは、第一のパッケージの投与の前又は後で、好ましくは第一のパッケージの前記投与の前に投与することが意図される。
−個体で癌細胞及び癌組織及び／又は癌幹細胞（CSC）だけを、又はCSC若しくはCSC組織ではない他の腫瘍細胞若しくは腫瘍組織と一緒に治療する医薬を製造するための、IL1ベータとIL1R1との相互作用を阻害する薬剤、好ましくはポリペプチド、より好ましくはモノクローナル抗体の使用、ここで癌細胞又は組織は癌幹細胞（CSC）の亜集団を含むことができ、さらに前記CSCは、CSCでない他の腫瘍細胞を含むことができる。前記ポリペプチド又は抗体又は融合タンパク質はIL1R1を標的とし、前記IL1R1は、好ましくは前記CSCの表面でもっぱら発現されるが、当該腫瘍組織の主要集団を形成しさらにCSCではない他の腫瘍細胞では発現されないか又は本質的に発現されない。本発明の特定の実施態様では、癌細胞及び／又はCSCは、通常的な化学療法及び／又は放射線療法及び／又は他のターゲティング療法に広範囲に耐性を示す。
【００１４】
−対応する薬剤、ポリペプチド又はモノクローナル抗体、ここで前記癌には細胞増殖抑制性若しくは細胞傷害性薬剤又は放射線療法が一緒に適用される。
−個体に抗IL-1R1薬剤又は抗体を投与する工程を含む、前記個体で薬剤難治性及び／又は放射線難治性癌を治療する方法、ここで前記薬剤難治性及び／又は放射線難治性癌は、前記個体で以前の化学療法及び／又は放射線療法によって引き起こされた。
−個体で癌細胞集団を治療する医薬を製造するための、IL1ベータとIL1R1との結合及び／又はIL1R1とIL1RaCPとのヘテロダイマー形成を阻害するポリペプチドの使用、ここで前記癌細胞集団は癌幹細胞（CSC）のみ又は他のバルク腫瘍細胞を含み、さらにここで場合によって前記CSCは標準的な化学療法及び／又は放射線療法及び／又は標準的なターゲティング療法に耐性を有する（i）。
−個体で癌を治療する医薬を製造するための、IL1ベータとIL1R1との結合及び／又はIL1R1とIL1RaCPとのヘテロダイマー形成を阻害するポリペプチドの使用、ここで前記癌細胞集団は癌幹細胞（CSC）及び場合によって通常のバルク腫瘍細胞を含み、ここでIL1Rは前記CSCの表面で発現されるが、非CSC腫瘍細胞では発現されないか又は本質的には発現されない（ii）。
−対応する（i）（ii）のポリペプチドの使用、ここで前記癌は、大腸癌（CRC）、非小細胞肺癌（NSCLC）及び乳癌（iii）から成る群から選択される。
−対応する（i）（ii）（iii）のポリペプチドの使用、ここで前記ポリペプチドは当該個体に細胞増殖抑制性薬剤、細胞傷害性薬剤又は放射線療法と併用して与えられ、ここで、例えば細胞増殖抑制性薬剤又は細胞傷害性薬剤は抗腫瘍抗体（例えばハーセプチン、リツキサン又はエルビタクス）又は化学療法剤であり、さらにここで、例えば前記ポリペプチドは、前記細胞増殖抑制性薬剤又は前記細胞傷害性薬剤又は前記放射線療法の処置の前、同時又は後で当該個体に適用される。
【００１５】
−個体で癌を治療する医薬の製造のための、IL1ベータとIL1R1との結合を阻害又は遮断する、及び／又はIL1R1とIL1RaCPとのダイマー形成を遮断又は阻害するポリペプチドの使用、ここで前記癌は大腸癌（CRC）、非小細胞肺癌（NSCLC）又は乳癌であり、さらにここで前記ポリペプチドはCSC及び／又は他の腫瘍細胞上のIL1R1を標的とし、ここでIL1R1は好ましくはCSCの表面で発現され、通常のバルク腫瘍組織細胞では発現されないか若しくは本質的に発現されないか、又は（CSC上のIL1R1発現と比較して）50％、60％、70％若しくは80％未満で発現される（iv）。
−癌細胞及び／又はCSCを治療する医薬の製造のための対応する（iv）のポリペプチドの使用、ここで前記CSCは少なくとも標準的な化学療法及び／又は放射線療法に耐性を有し、前記耐性は、場合によって化学療法薬、好ましくは細胞傷害性及び／又は細胞増殖抑制性薬剤による以前の治療によって引き起こされる（v）。
−癌細胞及び／又はCSCを治療する医薬の製造のための対応する（iv）（v）のポリペプチドの使用、ここで前記ポリペプチドは、細胞増殖抑制性薬剤又は細胞傷害性薬剤と併用して、及び／又は放射線療法と併用して当該患者に与えられる（vi）。
−癌細胞及び／又はCSCを治療する医薬の製造のための、対応する（i）−（vi）のポリペプチド又は治療的に有効な量で前記ポリペプチドを含む医薬組成物の使用、ここで前記ポリペプチドは、（a）げっ歯類、ヒト化、キメラ又はヒトモノクローナル抗体、好ましくは抗IL1R抗体、抗IL1ベータ抗体、抗IL1RaCP抗体（抗IL-1レセプター付属タンパク質抗体）、又はIL1R及びIL1RaCPを標的とする二特異性抗体；（b）組換え体の天然又は改変IL1RA（インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト）、（c）IL-1ベータのトラップとして機能し、IL-1ベータがIL-1R1との相互作用に利用されるのを防ぐIL1R1-IL1RaCP融合タンパク質から成る群から選択される（vii）。
−細胞ベースのex-vivoアッセイで癌に対する薬剤の効果を評価及び予測するためのバイオマーカーの使用であって、ここで（a）バイオマーカーはIL-1R1であり、（b）細胞は、その表面にIL1R1を発現する薬剤耐性又は放射線耐性癌幹細胞（CSC）であり、さらに（c）前記薬剤は（i）−（vii）で特定した治療用ポリペプチドであり、ここで好ましくは、前記CSCは、腫瘍組織サンプルを化学療法剤及び／又は放射線照射で処置することによって個体の腫瘍組織サンプルの細胞亜集団として入手され、さらに本発明の好ましい実施態様では、前記細胞系アッセイの癌細胞は、NSCLC、CRC又は乳癌を罹患する個体のサンプルに由来する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】CSCマーカーは高用量化学療法選別細胞で富化される  A．ABC-トランスポーターはCSCで高度に富むことが判明している。それらは、一般的治療レジメンに対する耐性を生じる急速な薬剤の排出を招く。A549 NSCLC細胞株の高用量化学療法選別時に、多様なABC-トランスポーターがアップレギュレートされる。  B．CSCが一般的治療レジメンに対する耐性を獲得するさらに別のメカニズムは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）のような解毒化酵素の発現上昇である。ALDHの多様なアイソフォームもまた高用量化学療法選別時にアップレギュレートされる。
【図２】CSCマーカーは、NSCLC及びCRC患者由来の初代患者材料の再プレート腫瘍球でアップレギュレートされる  A．腫瘍球アッセイはCSCを富化し、対照的に接着性条件は主として分化を駆動する。接着継代細胞を再プレート腫瘍球と比較してマイクロアレイで分析し、ABCG2及びALDH-1（公知のCSCマーカーである）の発現上昇が示された。  B．ALDH1発現増加がアルデフルアー（Aldefluor）アッセイで機能的に示された。最初のプレート細胞と比べ再プレート腫瘍球で約10倍の増加。  C．ABCG2発現増加は副集団の細胞数を増加させる。SP細胞の増加は再プレート腫瘍球で示すことができた。最初のプレート細胞と比べて約10倍の増加。
【図３】再プレート初代腫瘍球及び化学療法選別細胞で弁別的にアップレギュレートされる標的としてのIL1ベータ及びその対応するレセプターIL1R1の同定  A．IL1ベータは接着（分化）条件下で安定であるが、患者由来初代NSCLC細胞の腫瘍球ではアップレギュレートする。  B．IL1ベータは、接着条件と比較したとき再プレート腫瘍球で顕著にアップレギュレートする。対応するレセプターIL1R1の発現もまた患者由来初代NSCLC細胞の再プレート腫瘍球で上昇した。  C．IL1ベータ発現は患者由来初代CRC細胞の腫瘍球でアップレギュレートする。  D．IL1ベータ発現は、接着条件と比較したとき再プレートCRC腫瘍球でアップレギュレートする。対応するレセプターIL1R1の発現は患者由来初代CRC細胞の再プレート腫瘍球で顕著に上昇した。  E．IL1ベータは、高用量パクリタキセル（Pac）及びドキソルビシン（Dox）選別細胞で顕著にアップレギュレートされる。
【図４】IL1R1は腫瘍細胞で発現され、その発現は再プレート腫瘍球で増加する  A．患者由来初代NSCLC細胞を用いて免疫抑制マウスで皮下異種移植腫瘍を誘発した。腫瘍誘発後に単一細胞を単離し、さらにIL1R1の標的発現について分析した。CSCマーカーCD133はこれらの集団であまり多くはない。  B．皮下異種移植片由来単一細胞（A）を腫瘍球アッセイで再プレートした。IL1R1の発現は約７倍増加し、CSCマーカーCD133の発現は約15倍増加した。したがって、IL1R1はCSC付随表面分子であると思われる。
【図５】無症状生存及び生存全期間は、肺線癌I期及びCRCの患者でIL1ベータ及びIL1R1発現レベルと相関性を有する  A．IL1ベータのためのプローブセット215561_s_atは、肺線癌1期の患者の生存全期間で生存に関する利点を、さらにCRC患者の無症状生存で利点を示す。CRCでは生存全期間は有意には相関性を示さない。  B．IL1RAのためのプローブセット39402_atは、肺線癌1期のより良好な生存とわずかな相関性を示し、CRCでは無症状生存及び生存全期間において生存に関する利点と相関性を示す。
【図６】中和抗体によるIL1R1の阻害は腫瘍球形成を用量依存態様で低下させる  A．B．腫瘍球アッセイで患者由来初代細胞を0.5及び10μg/mLのコントロールIgG（正常ヤギIgG）又は抗ヒトIL1R1抗体と一緒にプレートした。未処理細胞を球体形成の陽性コントロールとして用いた。  A．抗IL1R1処理は、初代NSCLCで腫瘍球形成を用量依存態様で低下させた。B．初代CRCで腫瘍球形成の用量依存低下が観察された。実験はトリプリケートで実施し、棒グラフはコントロールに対する腫瘍球誘発の倍数を示す。誤差バーはSDを表す。
【図７】IL1R1は原発性CRC及びNSCLC腫瘍由来細胞株で発現され、その発現は腫瘍球としてプレートした後にアップレギュレートされる  患者由来初代NSCLC及びCRC細胞を分化接着条件下にin vitroで培養し、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いてIL1R1発現について染色し、発現をフローサイトメトリーによって検出した。同じ細胞株をまた腫瘍球として１ラウンド培養に付した。NSCLC（上部パネル）及びCRC（下部パネル）のヒストグラムの重ね合わせ（接着＝赤、球体＝青）で示すように、腫瘍球でのIL1R1の発現を接着細胞と比較した。両抗体がNSCLC球体培養対接着培養でIL1R1の実質的アップレギュレーションを検出したが、CRC球体ではポリクローナル抗体のみがIL1R1アップレギュレーションを検出できた。
【図８】2つの異なる抗体を用いる初代NSCLC及びCRCのIL1R1検出  患者由来初代NSCLC及びCRC細胞を分化性接着条件下にin vitroで培養し、機能等級のAPC標識PABヤギAF269（R&D System）及びMAB hIgG4 15C4（特許WO20040227のAPC標識Amgen Mabと一致する）を用いてIL1R1発現について染色した。対応するアイソタイプコントロールとしてヤギIgG1-APCを用いたところ、左及び中央のパネルの上から下において青線で示すようにシグナルは全く生じなかった。同じパンネルで赤線は両抗体によるIL1R1標的認識を示す。2つの抗IL1R1抗体を用いて得られた結果を右のパネル（上及び下）で比較すると、ポリクローナル抗体AF269（赤色ヒストグラム）はモノクローナル抗体15C4抗体（青色ヒストグラム）よりも強い標的認識を有することを示す（おそらく多数のエピトープを認識することによる）。
【図９】pMAPKp38及びpSTAT3のIL-1βによる活性化並びにこの経路における15C4 Mabの阻害作用  患者由来初代NSCLC細胞を球体としてさらに増殖因子の非存在下でプレートした。37℃/5％CO2で一晩インキュベートした後：A．C．組換えIL1を0.1pg/mLから100pg/mLまで濃度を増加させながら添加した。細胞を20分インキュベートし、続いてHGNT緩衝液で溶解させた。コントロールとして、分化表現型を示す接着増殖NSCLC細胞を溶解させた。B．D．別の球体部分を1pg/mLの組換えIL-1ベータで誘発し、続いて抗IL1R1 hIgG4 15C4 Mabの濃度を増加させながら添加して24時間インキュベートし、引き続いて更なる分析のために溶解させた。A．B．C．D．製造業者の指示にしたがって、Pathscan ELISAを用いてそれぞれpSTAT3又はpMAPKp38について溶解物を分析した。随意単位のOD450nmとして結果を示す。結果は予備的であり、結果の確認はまだ終わっていない。
【図１０】組換えIL-1βによる刺激又は抗IL1R1抗体による処理後のウェスタンブロットによるIL1R1レベルの検出  患者由来原発性NSCLC腫瘍球を37℃/5％CO2で増殖因子の非存在下にて一晩プレートした。A．C．組換えIL1βを0.1pg/mLから100pg/mLまで濃度を増加させながら添加した。細胞を20分インキュベートし、続いてHGNT緩衝液で溶解させた。接着増殖NSCLC由来溶解物（分化表現型を示す）をコントロールとして用いた。B．D．腫瘍球体を1pg/mLの組換えIL-1βで刺激し、続いて濃度を増加させながら15C4抗IL1R1抗体を添加した。24時間後に細胞の溶解物を調製した。A．B．C．D．溶解物をウェスタンブロットにより分析した。膜を5％牛乳で遮断し、TBS中で1：1000の抗IL1R1ウサギIgG（Millipore）一次抗体とともにインキュベートした。検出はTBS中で1：2000の抗ウサギPOD二次抗体を用いて実施した。VersaDoc装置を用いて膜を画像化した。クオンティティーワンソフトウェアを用いてデンシトメーター分析を実施し、その結果を上記の随意単位で棒グラフとして表す。結果は予備的であり、結果の確認はまだ終わっていない。
【図１１】IL1応答性サイトカインhIL8及びhVEGFのin vitro分泌は抗IL1R1抗体によって遮断できる  患者由来初代NSCLC細胞を腫瘍球としてプレートし、37℃/5％CO2で増殖因子の非存在下にて一晩培養した。A．C．球体及び接着増殖細胞の上清を24時間後に収集し、定量性ELISA（R&D Systems）を用いてhIL8及びhVEGFレベルについて分析した。結果はサイトカイン濃度（pg/mL）の棒グラフとして示される。C．D．球体を1pg/mLの組換えIL-1βで30分間刺激し、続いて濃度を増加させながら15C4抗IL1R1 Mabを添加した。6時間インキュベートした後で上清を収集し、hIL8及びhVEGFレベルをELISAによって測定した。結果はサイトカイン濃度（pg/mL）の棒グラフとして示される。これらの結果は予備的であり、結果の確認はまだ終わっていない。
【図１２】IL1RA薬キネレット（Amgen）を用いる初代CRC及びNSCLC-CSC腫瘍の腫瘍増殖阻害  アルデフルアーアッセイによって決定されるALDH活性を基にして腫瘍由来原発性NSCLC及びCRC細胞株培養からCSCをFACS濃縮した。104細胞/マウスをNOD/SCIDマウスにマトリゲルと一緒に皮下移植した。ローディング用量5μg/mLのキネレット（Kineret、組換えIL1RA（Amgen））をマトリゲルに適用し、引き続き5又は10mgのキネレットの皮下処置を移植後1日目から毎日実施した。腫瘍体積を毎週モニターし、更なる分析のために各グループから3匹のマウスを76日目にCRCモデル（A）のために、さらに91日目にNSCLCモデル（B）のためにサクリファイスした。残りの動物については、キネレット処置を停止し、腫瘍進行を持続的にモニターした。腫瘍が2000mm3を超えたとき、マウスをサクリファイスした。サクリファイス時にサイトカイン分析のために血清を収集した。A．CRC腫瘍モデル実験の腫瘍増殖曲線。B．NSCLCモデル実験の増殖曲線。曲線は10マウス/グループの平均腫瘍体積（mm3）を表す。誤差バーはSEMである。各モデルについて示されるデータはn=2の同様な実験の典型例である。
【図１３】CSC異種移植片腫瘍を移植したNOD/SCIDマウスの血清中のhIL8及びhVEGFの検出  本分析は図18に記載の腫瘍モデル実験から収集した血清で実施した。血清の分析は、R&Dシステムズから入手した高感度ELISAアッセイキットを用いて実施した。A．C．76日目（CRC）（青色）及び91日目（NSCLC）（赤色）に3匹のマウスから得た血清をhIL8及びhVEGF血清レベルについて分析した。結果は棒グラフで示され、前記グラフは、各グループでn=3のマウスから得た平均サイトカイン濃度（pg/mL +/-SD）を表す。B．D．CRCモデルでキネレット処置を停止した後、本発明者らは、腫瘍の進行速度を基準にキネレットに対し高応答、中等度応答及び低応答動物と分類した3匹の各マウスのサイトカインレベルを比較した。全ての条件下で、hVEGFレベルは安定なままであったが、hIL8レベルはキネレット処置マウスで劇的に下降し、腫瘍負荷と正比例することが観察された。これらの結果は第二のin vivo実験の血清を用いて確認されるであろう。
【図１４】中和抗体によるIL1R1の阻害は、TAM支援腫瘍球形成を用量依存態様で低下させる  A．HER/neuトランスジェニックマウスから自発性乳房腫瘍を単離し、腫瘍細胞を単離した。全造血細胞性マーカーCD45と一緒にCD11b及びF4/80を用いて腫瘍付随マクロファージ（TAM）を仕分けした。A．B．HER2/neu細胞を腫瘍球として単独で及びTAMと一緒にプレートした。TAM単独をコントロールとして供した。トリプリケートから得たウェル当たりの腫瘍球数の平均及びSDを棒グラフとして示す。TAMは HER/neu球体増殖をTAM細胞数依存態様で支援した。C．抗ネズミIL1R1ハムスターIgG MabをHER/neu腫瘍球に0.5μg/mL及び10μg/mL（左パネル）で加えるとともに、HER/neu＋TAM同時培養にも加えた。腫瘍球数をトリプリケートから得た平均及びSDの棒グラフとして示す。TAM支援球体増殖は、抗IL1R1処置下で用量依存態様で阻害される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
特段の指摘がなければ、本発明で用いられる用語及語句は、好ましくは以下に示す意味及び定義を有する。さらにまた、これらの定義及び意味は、本発明を（含まれている好ましい実施態様及び／又は特徴を）より詳細に記述する。
“癌幹細胞（CSC）”：アメリカ癌研究協会が招集した統一見解審査委員会は、CSCを“自己を復元する能力及び腫瘍を構成する不均質な癌細胞系列を生じさせる能力を有する腫瘍内の細胞”と定義した。この定義はこれらの細胞の源を示すものではないことに留意されるべきである（これらの腫瘍形成細胞は仮説的に幹細胞、前駆細胞又は分化細胞から発し得よう）。したがって、“腫瘍開始細胞”又は“癌開始細胞”という用語が、時に混乱を避けるために“癌幹細胞”の代わりに用いられる。腫瘍は遺伝的改変の蓄積を介して正常細胞の形質転換から生じるが、幹細胞がCSCの起源であるということが明確に確立されたわけではない。したがってCSC仮説は、癌が常に幹細胞によって引き起こされることを暗示するものではなく、また、例えば心疾患又は糖尿病のような症状の治療に対する幹細胞の潜在的適用が、本報告の他の章で考察するように腫瘍形成を将来もたらすということを暗示するものでもない。逆に、腫瘍開始細胞は、幹細胞との類似を保証するために十分な程度に幹細胞様の特徴を有し、転移性癌細胞の観察された実験的及び臨床的態様は、幹細胞の古典的特性を強く連想させる。
したがって、本発明のCSCは、腫瘍組織（固形腫瘍及び転移を含む）内の細胞の亜集団（1−10％、好ましくは2−5％）とみなすことができ、前記は、標準的な腫瘍組織の細胞とは機能的に及び場合によって表現型的に異なる。CSCは腫瘍原性であり、これはそれらが新しい腫瘍細胞を生じることができることを意味する。CSCは長期的な自己復元能力を示し、分化した腫瘍バルク集団を生じる。CSCはまた化学療法及び／又は放射線療法に対し耐性を示す能力の強化を特徴とする。さらにまた、別個の器官への疾患の拡大を駆動することによって転移を支援することができる。CSCの起源の説明を試みるいくつかの仮説が存在する。CSCは（i）幹細胞からから、（ii）子孫細胞から、及び（iii）分化成熟細胞から生じ得る。本発明のCSCは他の腫瘍細胞（CSCではない）を0−30％の範囲で含むことができる。
【００１８】
“腫瘍細胞”又は“癌細胞”という用語は、弁別的に規定しない場合には非制御増殖細胞（前記は癌幹細胞ではない）を意味する。腫瘍細胞又は癌細胞はCSCを0−30％の範囲で含むことができる。腫瘍細胞は通常の腫瘍組織のバルク集団である。
“癌”という用語は、非制御細胞増殖、隣接組織への細胞浸潤、及び十分に初期の段階で治療されない場合には転移する潜在能力を特徴とする一群の疾患を表す。これらの細胞異常は、重要な遺伝子配列の変異又は後成的変化（遺伝子配列自体に影響を与えない、例えば遺伝子の活性化又はDNA活性化タンパク質の改変）による蓄積された遺伝的改変から生じる。癌は、固形器官（例えば肺、脳又は肝）で腫瘍を形成するか、又は組織（例えば血液又はリンパ液）で悪性疾患として存在することができる。異常な細胞増殖から生じる腫瘍及び他の構造物は、多様な生物学的特徴及び潜在能力を有する不均質な細胞集団を含む。実際、癌性組織は、同じ標本に由来するいくつかの組織間で研究者がその遺伝的プロフィールの相違をほとんど同定できないほど十分に不均質である。いくつかの遺伝子群は、研究者が器官特異的又は組織特異的癌を、最終的に治療を特徴づけて予想情報を提供し得る下位カテゴリーに分類することを可能にするが、癌生物学の甚だしい複雑さは治療努力を打ち砕き続けている。
本発明の医薬組成物の手段によって、腫瘍（例えば乳房、心臓、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部及び頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸及び肝臓の腫瘍）を治療することができる。より具体的には、腫瘍は以下から成る群から選択される：腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、胚芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫及び奇形腫。より好ましくは、腫瘍/癌は以下から成る群から選択される：脳内の癌、頭部及び頸部の癌、直腸癌、星状細胞腫（好ましくはII度、III度又はIV度星状細胞腫）、神経膠芽細胞腫（好ましくは多形型神経膠芽細胞腫（GBM））、小細胞肺癌（SCLC）及び非小細胞肺癌（NSCLC）（好ましくは非小細胞肺癌（NSCLC））、転移性メラノーマ、転移性アンドロゲン依存前立腺癌（ADPCa）、乳癌及び大腸癌（CRC）。
【００１９】
“レセプター”又は“レセプター分子”は、好ましくは可溶性又は膜結合性若しくは膜関連タンパク質又は糖タンパク質で、前記は1つ以上のドメインを含み、前記ドメインにリガンドが結合してレセプター-リガンド複合体を形成する。リガンド（アゴニスト又はアンタゴニストであり得る）と結合することによって、レセプターは活性化又は不活性化されてシグナリング経路を開始又は遮断することができる。
“リガンド”又は“レセプターリガンド”とは、レセプター分子に結合してレセプター-リガンド複合体を形成する、好ましくは天然又は合成の化合物を意味する。リガンドという用語は、、アンタゴニスト及び部分的アゴニスト/アンタゴニスト活性を有する化合物を含む。
“アゴニスト”又は“レセプターアゴニスト”は好ましくは、レセプターと結合する天然又は合成化合物であってレセプター-アゴニスト複合体を形成し、レセプターおよびレセプター-アゴニスト複合体をそれぞれ活性化することによってシグナリング経路及び更なる生物学的プロセスを開始する。
“アンタゴニスト”又は“レセプターアンタゴニスト”とは好ましくは、アゴニストの作用と反対の生物学的作用を有する天然又は合成化合物を意味する。アンタゴニストはレセプターと結合し、レセプターに対応するアゴニストと競合することによってレセプターアゴニストの作用を遮断する。アンタゴニストはアゴニストの作用を遮断するその能力によって定義される。レセプターアンタゴニストはまた抗体又は免疫治療薬として有効なそのフラグメントであり得る。本発明の好ましいアンタゴニストを下記に示し考察する。
【００２０】
本明細書の“抗体”又は“免疫グロブリン”という用語は、好ましくはもっとも広い意味で用いられ、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの完全な抗体から形成されるマルチ特異的抗体（例えば二特異的抗体）、及び抗体フラグメント（例えばFc、Fab、F(ab’)2、scFvなど）（ただしそれらが所望の生物学的活性を示す場合に限られる）をカバーする。前記用語は一般的にはヘテロ抗体を含み、前記抗体は、一緒に連結された異なる結合特異性を有する2つ以上の抗体又はそのフラグメントを含む。前記用語はさらに、抗体融合タンパク質（抗体又は抗体フラグメント及び前記抗体又は抗体フラグメントに組換えにより融合させたポリペプチド又はタンパク質を含む）及び免疫結合物（抗体又は抗体フラグメントが化学物質と化学的に結合されている）を含む。前記用語はさらにヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む。
本明細書で用いられる“細胞傷害性薬剤”という用語は、細胞機能を障害又は妨害し、最終的には細胞破壊及び細胞死、特に腫瘍細胞死を生じる物質を指す。前記用語は、好ましくは放射性同位元素、化学療法剤、及び毒素（例えば細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）を含むことが意図される。前記用語はまた、サイトカインファミリーのメンバー、好ましくはIFNγとともに抗新形成因子（これもまた細胞傷害性活性を有する）を含むことができる。
本明細書で用いられる“細胞増殖抑制性薬剤”という用語は、細胞の機能を阻害若しくは妨害するか、又は細胞の活動及び分裂を遅延させ、最終的にそれらを死滅させることなく細胞増殖妨害を引き起こす物質を指し、抗体、抗体フラグメント、免疫結合物又は抗体融合タンパク質が含まれる。
【００２１】
“化学療法剤”、“化学療法系薬剤”又は“抗新形成薬剤”という用語は、本発明にしたがって好ましくは上記に規定した“細胞傷害性薬剤”又は“細胞増殖抑制性薬剤”クラスのメンバーとみなされ、腫瘍細胞に対して直接的に例えば細胞増殖抑制作用又は細胞傷害作用によって（例えば生物学的応答の改変のようなメカニズムによって間接的にではなく）抗新形成作用を示す、すなわち新形成細胞の発育、成熟又は拡散を妨害する化学薬剤が含まれる。本発明の適切な化学療法剤は、好ましくは天然の又は合成された化合物であるが、生物学的分子（例えばタンパク質、ポリペプチドなど）も明確に排除されるわけではない。多数の抗新形成薬剤が産業的使用、臨床評価、前臨床開発で入手可能であるが、本発明では前記には腫瘍/新形成の治療用が含まれ得る。化学療法薬又は薬剤の例には、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート及びアルキル化作用を有する他の化合物、例えばニトロソウレア、シスプラチン及びダカルバジン；抗代謝薬、例えば葉酸、プリン又はピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤、例えばビンカアルカロイド及びポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害性抗生物質及びカンプトテシン誘導体が含まれる。好ましい化学療法剤又は化学療法には以下が含まれる：アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（BCNU）、ロムスチン（CCNU）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、ゲムシタビン（ゲムザー）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、5-フルオロウラシル（5-FU）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイ    シン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT-11、10-ヒドロキシ-7-エチル-カンプトテシン（SN38）、ダカルバジン、フロキシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレビン、クロラムブシル及び前記の組合せ。本発明の任意の操作抗体と併用される好ましい化学療法剤は、例えばメトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含まないクロロエチルニトロソウレア、5-フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラギリン、メグラミンGLA、バルルビシン、カルムステイン、UFT（テガフール/ウラシル）、ZD9331、タキソテア/デセタキセル、フルオロウラシル（5-FU）、ビンブラスチ��及びこのクラスの他の良好な化合物である。
【００２２】
“治療的に有効な”又は“治療的に有効な量”という用語は、好ましくは哺乳動物で疾患又は異常を治療するために有効な医薬の量を指す。癌の場合、医薬の治療的に有効な量は癌細胞数を減少させるか、腫瘍サイズを減少させるか、周辺器官への癌細胞浸潤を阻害するか（すなわちある程度遅らせ、さらに好ましくは停止させる）、腫瘍の転移を阻害するか（すなわちある程度遅らせ、さらに好ましくは停止させる）、ある程度腫瘍増殖を阻害するか、及び／又は癌に付随する徴候の1つ以上をある程度緩和することができる。医薬が増殖を妨害及び／又は既存の癌細胞を殺滅できる程度に、前記医薬は細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。癌療法について、有効性は、例えば疾患進行時間（TTP）の判定及び／又は応答速度（RR）の決定によって測定できる。本発明で用いられる抗体（抗IL1R1ポリペプチドを含む）の治療的に有効な量は、約70kgの成人については約50から4000ミリグラム/用量の範囲で、好ましい範囲は約100から1000ミリグラム/用量である。もっとも好ましい用量は、1ヶ月に1回又は2回治療される70kgの成人について約200−500ミリグラムである。
本明細書に記載の化学療法剤の治療的に有効な量は一般に10mg/kgから100mg/kgの間の用量である。
好ましくは、投与は2週間に1回又は1ヶ月に1回であるが、対応する薬剤のある個体における薬力学的態様応じて頻度は増減し得る。
【００２３】
本発明の“放射線療法”という用語及び関連用語は巣状イオン化照射の投与又はデリバリーを意味し、ここで20から50グレイ（Gy）、好ましくは25から40Gy、より好ましくは28から25Gy、例えば約28Gy、約30Gy又は約35Gyが、各投与又はデリバリーにつき好ましくは0.5から5Gy、より好ましくは0.8から3Gy、特に好ましくは1から2.5Gy、例えば約1.0Gy、約1.3Gy、約1.6Gy、約1.8Gy、約2.0Gy、約2.5Gy又は約3.0Gyに分割して患者に投与又はデリバリーされ、前記線量はまた、好ましくは照射の投与又はデリバリーを実施する日の1日当たりの照射量である。したがって1日当たり0.7から1.3Gy、好ましくは0.9から1.2Gyを1週間のうちに3から6日間、好ましくは5日間、より好ましくは連続して5日間投与又はデリバリーすることがまた好ましい。一般的には、1日当たり1.0から3.0Gy、好ましくは約1.0、約2.0Gy又は約3.0Gyを1週間のうちに2又は3日間投与又はデリバリーすることが特に好ましい。小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（好ましくは非小細胞肺癌）、乳癌、転移性メラノーマ、前立腺癌及び大腸癌から成る群から選択される癌タイプの治療では、上記に記載の種類の巣状放射線療法の適用が好ましい。
【００２４】
本発明の“医薬組成物”は、意図する投与ルートに適合するように処方される。投与ルートの例には非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内又は皮下適用に用いられる溶液又は懸濁液は以下の成分を含むことができる：無菌的希釈剤、例えば注射水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；及び張度調節剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。pHは、酸又は塩基（例えば塩酸又は水酸化ナトリウム）を用いて調節できる。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射筒又はマルチ用量バイアルに封入できる。
“IL-1R阻害物質”：本発明の適切なIL-1R阻害物質は、ポリペプチド、好ましくはヒト、キメラ又はヒト化抗体とともにIL-1Rレセプターアンタゴニスト（IL-1RA）（前記はIL-1R1の天然の阻害物質である）である。適切な抗体は、抗IL-1R1抗体若しくは抗IL-1ベータ抗体、又はIL-1R付属タンパク質（IL-1RaP）に対向するか若しくはIL-1Rap及びIL-1R1の両方に対抗する抗体（二特異性抗体が含まれる）である。本発明の適切なIL-1R阻害物質には、他のターゲッティング分子又は機能的に有効な分子と上記に規定した抗体とのさらに別の融合分子とともに、天然のIL-1R1リガンドIL-1ベータのためのトラップとして機能する（したがってIL-1ベータとIL-1レセプターとの結合を妨害する）融合分子が含まれる。
本発明のそのようなポリペプチドの例は当業界で公知である、WO2004/039951及びWO2000/018932は、IL-1RaPと融合したIL-1R1から成るIL-1ベータトラップ（Acralyst）を記載している。WO1989/011540及びWO2001/042305は、組換え体の天然及び改変IL-1RA（anakinra/Kineret）を記載している。WO2004/022718は、抗IL-1R抗体（AMG-108）を開示している。さらに別の抗IL-1R抗体がWO2005/023872（2D8）に記載されている。WO2002/016436はヒト抗IL-1ベータ抗体（canakinumab/Ilaris）を記載し、WO2007/002261はIL-1ベータに対する別のヒト化抗体を開示している。WO2010/052505では、さらに別の抗IL-1R1抗体が開示されている。
上記記載のこれらポリペプチド/抗体の全てが、過去でも現在でも実際のところ炎症性疾患の治療にのみ用いられている。
【００２５】
本発明によって提供され本発明者らが下記で詳細に明らかにするデータは、IL-1ベータ/IL-1R1を軸とするシグナリングはCSC、腫瘍維持及び転移において重要な役割を演じることを示している。したがって、CSCにおけるIL-1R1の阻害は、原発性及び転移性腫瘍疾患の治療の有効で有望な目的である。
高用量化学療法は増殖性バルク腫瘍細胞を根絶させ固有の耐性を有する細胞のみを残存させるであろうと仮定して、本発明者らはヒトA549非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株を高用量のドキソルビシン及びパクリタキセルで処理し、生存細胞を密度勾配遠心分離によって回収し、アフィメトリックス（Affymetrix）マイクロアレイプラットフォームでの更なる遺伝子発現分析のためにRNA抽出物を調製した。前記サンプルを遺伝子発現マイクロアレイhuU133 2.0plus（Affymetrix）によって分析し、続いて弁別的発現についてさらに分析した。未処理/野生型（WT）細胞をパクリタキセルドキソルビシン濃縮A549と比較した。下記に示すように、ABC-トランスポーターとしての幹細胞マーカー（図1A）並びに急速排出及び代謝のためのALDH-アイソフォーム（図1B）が、高用量化学療法選別腫瘍細胞でアップレギュレートされる。
【００２６】
第二のステップで、本発明者らはCSC対分化バルク腫瘍細胞の比較分析のためにモデル系を構築した。腫瘍球アッセイを用い連続再プレートによってCSCを濃縮し、一方でより大量の分化細胞を含むように血清を用いる接着条件を採用した。図2Aに示すように、幹細胞マーカーABCG2及びALDH1A1は、接着条件と比較して腫瘍球アッセイでアップレギュレートした。これらの結果は、幹細胞のための2つのゴールデンスタンダード機能アッセイ（アルデフルアー（AF）-アッセイ（Stem Cell Technologies（SCT））及び副集団（SP）アッセイ（M.A. Goodell et al., J Exp Med, 1996. 183(4):1797-806））で立証することができた。両CSCマーカーが細胞を腫瘍球としてプレートしたときにアップレギュレートされ、このことは、腫瘍球アッセイはCSCを機能的に濃縮するための真性の幹細胞アッセイであることを示している（図2B及びC）。
RNAをプレート前の最初の細胞（P0）から、続いて腫瘍球の連続再プレートラウンドから、或いは連続接着継代から調製した。大腸癌（CRC）又はNSCLC由来の初代患者材料をこの方法で培養した。
【００２７】
サンプルはまた遺伝子発現マイクロアレイhuU133 2.0plus（Affymetrix）によって分析し、続いて弁別的発現についてさらに分析した。接着継代を腫瘍球プレーティングと比較し、同定した弁別的発現遺伝子の直線性にもまた注意した。直線性は、接着継代と比較して腫瘍球における不変的なアップ又はダウンレギュレーションを意味する。
本発明者らは弁別的に発現される多様な遺伝子を同定し、それら遺伝子から細胞の表面に分泌されるか又は局在する遺伝子を選択した。IL-1ベータは初代NSCLCでもっとも厳重に調節される遺伝子の1つであり（図3A及びB）、CRCでもまたアップレギュレートされた（図3C及びD）。IL-1ベータの発現は接着/分化継代では低くかつ安定であるが、接着/分化状態と比較したとき腫瘍球で顕著にアップレギュレートされる。したがって、分化条件下では、IL-1ベータは主要な役割を果たさないことは明白であるが、CSC条件を表す腫瘍球ではIL-1ベータはアップレギュレートされ、前記は極めて重要であると思われる。IL-1のレセプター（IL-1レセプター1（IL-1R1））はNSCLC球でわずかにアップレギュレートされることもまた見出された（図3B）。初代CRCでは、IL1ベータはわずかにレギュレートされるが、IL-1R1は顕著にアップレギュレートされた（図3D）。サイトカインIL-1ベータは化学療法選別した細胞でもまたアップレギュレートされ、このことはCSC濃縮のための機能的選別方法の有効性をさらに立証した（図3E）。
【００２８】
IL-1ベータ及びその対応するレセプターのmRNAレベルは機能的濃縮CSCでアップレギュレートされた。タンパク質レベルにおける関連性をさらに評価するために、本発明者らは患者材料由来初代NSCLCサンプルを分析した。患者材料を免疫抑制マウスの皮下（s.c.）異種移植片としてin vivoで調製した。腫瘍をバラバラにしてさらに分析するとともに腫瘍球アッセイとして再プレートした。IL-1R1のタンパク質発現が親の患者腫瘍細胞に存在し（図4A）、腫瘍球を派生させた。当該表面のIL-1R1タンパク質発現もまた腫瘍球の再プレート時にアップレギュレートされ、これはRNA/マイクロアレイレベルでの我々の発見と一致する。CSCマーカーCD133もまた同じ再プレート腫瘍球でアップレギュレートされ、このことは、IL-1R1がCSC付随表面分子であることを示している（図4B）。
IL-1ベータ及びその対応するレセプターが腫瘍の維持及び転移で主要な役割を果たしていると仮定して、本発明者らはコンピュータによるアプローチを用いて、無症状生存及び生存全期間に対するIL-1ベータ及びIL-1R1の影響を評価した。IL-1ベータのための215561_s_at及びIL-1R1のための39402_atのプローブセットについて、本発明者らは、どちらかのIL-1ベータの低発現は、肺腺癌I期患者では生存に関する利点と、CRCでは無症状生存の延長と相関することを見出した。
CRCにおける生存全期間はIL-1Bの高発現又は低発現で有意な相違を示さなかった（図5A）。IL-1R1の高発現は、肺腺癌I期の生存ではわずかな生存に関する利点を、さらにCRCでは無症状生存及び生存全期間において明瞭な利点を示した（図5B）。
【００２９】
IL-1R1 RNA及び当該表面におけるタンパク質発現は腫瘍球再プレート時にアップレギュレートされるが、接着条件下でのRNA発現は安定である。腫瘍球アッセイを確立しCSC及びCSC様子孫細胞が濃縮されることを示したが、分化細胞は死滅した。したがって、IL-1ベータ/IL-1R1シグナリングはCSC表現型の発達又は維持で重要な役割を示し得ると仮定できる。IL-1ベータ/IL-1R1シグナリングが腫瘍球で重要であるか否かを試験するために、本発明者らは初代NSCLC又はCRCを腫瘍球アッセイでプレートし、これらの細胞を0.5、5及び10/50μg/mLの用量範囲の正常ヤギIgG1又はヤギ抗ヒトIL-1R1中和抗体で処理した。ここで本発明者らは、中和抗体によるIL-1R1の阻害は、NSCLC（図6A）及びCRC患者由来細胞（図6B）でプレート細胞の球体形成能力を用量依存態様で低下させることを示す。
図7及び8は、CRC及びNSCLC腫瘍におけるIL-1R1発現のアップレギュレーション及び種々の抗体によるその検出を示す。
IL-1ベータにおける抗IL-1R1抗体の阻害作用もまた示された（図9、10、14）。
【実施例１】
【００３０】
IL1/IL1R1シグナリングのCSC関連経路としての同定
CSCは、薬剤排出トランスポーター及び解毒酵素の高発現を特徴とする。したがって、本発明者らは、高生理学的な高用量化学療法を用いて癌細胞株を処理することによって固有のCSC様特性を有する細胞を選別できると仮定した。このアプローチは高増殖性バルク細胞を根絶して生来の（後天的ではない）耐性を有する細胞を残存させる。本発明者らは、A549非小細胞性肺癌（NSCLC）細胞株を高用量のドキソルビシン及びパクリタキセルで処理し、生存細胞を密度勾配遠心分離によって回収し、アフィメトリックスマイクロアレイプラットフォームでの更なる遺伝子発現分析のためにRNA抽出物を調製した。前記サンプルを遺伝子発現マイクロアレイhuU133 2.0plus（Affymetrix）によって分析し、続いて未処理/野生型（WT）細胞との比較によって弁別的発現についてさらに分析した。下記に示すように、ABC-トランスポーター（薬剤排出ポンプ）（図１A）及びALDH-アイソフォーム（解毒酵素）（図1B）の発現は高用量化学療法選別細胞でアップレギュレートされた。したがって、本発明のアプローチは、高レベルの公知CSCマーカーを発現する細胞集団を上手く濃縮することができた。
【００３１】
CSCの別の特徴は、非接着培養条件に置いたとき球体様構造物として増殖するそれらの能力である。腫瘍球アッセイはCSC自己復元をin vitroで促進し分化を妨げる。したがって、腫瘍球の連続再プレートはCSCをさらに濃縮する。比較すれば、接着条件下では培養細胞バルクは分化腫瘍細胞を表す。ヒト初代NSCLC腫瘍材料に由来する癌細胞を用いて、本発明者らは、連続的に再プレートした腫瘍球と接着培養とで遺伝子発現パターンの弁別的分析を実施した。図2Aに示すように、幹細胞マーカーABCG2及びALDH1A1は、分化接着細胞と比較したとき腫瘍球でアップレギュレートした。球体増殖細胞のCSC特性を幹細胞のための以下の2つの‘ゴールドスタンダード’機能アッセイを用いて実証した：アルデフルアー（AF）-アッセイ（Stem Cell Technologies（SCT））及び副集団（SP）アッセイ（M.A. Goodell et al., J Exp Med, 1996. 183(4):1797-806）。AF+及びSP+分画をともに腫瘍球体として実質的に増加させ、腫瘍球アッセイはCSCの機能的濃縮のための真性アッセイであることを確認した（図2B及び2C）。
ヒト原発性CRC及びNSCLC腫瘍材料を用いて、本発明者らは、プレート前の最初の細胞（P0）、腫瘍球として連続継代した細胞及び接着培養として連続継代した細胞を比較する、遺伝子発現の弁別的分析を実施した。サンプルは遺伝子発現マイクロアレイhuU133 2.0plus（Affymetrix）によって分析した。分析は同定した弁別的発現遺伝子の直線性に注意し、直線性は接着継代に比して腫瘍球における不変的なアップ又はダウンレギュレーションと定義される。
弁別的に発現される多様な遺伝子を同定し、それらから細胞表面に分泌されるか又は局在するタンパク質をコードする遺伝子を選択した。なぜならば、そのようなタンパク質がもっとも容易に医薬化できる標的を表すと考えたからである。接着/分化継代ではIL-1ベータの発現は低くかつ安定であり、さらに初代NSCLC（図3A及びB）ではもっとも高度にアップレギュレートされる遺伝子の1つとして同定され、CRC（図3C及びD）ではまた軽度にアップレギュレートされた。このことは、IL-1ベータはCSCの生物学で重要な役割を果たし得ることを我々に示唆した。この仮説を支持するものとして、我々は、IL1レセプター1（IL1R1）はNSCLC球でわずかにアップレギュレートすることを見出した（図3B）。初代CRCでは、IL-1ベータはわずかにアップレギュレートするだけであったが、IL1R1は顕著にアップレギュレートした（図3D）。IL1ベータはまた、高用量化学療法による選別によってCSC様特徴について濃縮された細胞でアップレギュレートされることが見出された（図3E）。
【実施例２】
【００３２】
IL-1β及びIL1R1遺伝子の発現は癌患者の無腫瘍生存及び生存全期間の低下と密接に関係する
IL-1β又はその対応するレセプターは腫瘍の維持及び転移で重要な役割を果たすと仮定して、本発明者らはコンピュータによるアプローチを用いて、無症状生存及び生存全期間に対するIL-1ベータ及びIL-1R1の影響を評価した。IL-1R1のための215561_s_at及びIL-1ベータのための205067_at又は39402_atのプローブセットを用いて、IL-1R1の低発現は、肺腺癌I期患者では生存に関する利点、及びCRCでは無症状生存の延長と相関することが見出された。CRCにおける生存全期間は、IL-1R1発現レベルの相違によって変化しなかった（図5A）。IL1βの高発現は、肺腺癌I期では生存に関する利点を示す傾向があり、CRCでは無症状生存及び生存全期間で明瞭な利点を示した（図5B）。CSCでのIL-1β及びIL1R1発現における我々の最初の認定がCRC及びNSCLCの腫瘍タイプを有する患者由来の初代材料を用いて為されたという事実に基づいて、前記のCRC及びNSCLCに関する指標を分析のために選択した。
【実施例３】
【００３３】
IL1R1は初代CRC及びNSCLC腫瘍細胞上で発現され、連続腫瘍球増殖によるCSCの濃縮に続いてアップレギュレートされる
IL-1β及びその対応するレセプターのRNAレベルは機能的濃縮CSC又はCSC様細胞でアップレギュレートされた。タンパク質レベルでのIL1R1の発現を決定するために、患者由来初代NSCLC腫瘍サンプルのFACS分析を実施した。分析の前に、患者材料を免疫抑制マウスの皮下（s.c.）異種移植としてin vivo増殖させた。この異種移植腫瘍を酵素により単一細胞に分解し、IL1R1の表面分泌を市場で入手できる発蛍光団結合抗体を用いて検出した。異種移植腫瘍から直接得た細胞のIL1R1発現を、腫瘍球として連続継代した異種移植由来細胞と比較した。IL1R1のタンパク質発現は、親の異種移植腫瘍細胞（図4A）及び異種移植由来腫瘍球の両方に存在した。しかしながら、IL1R1タンパク質発現は親細胞と比較して腫瘍球で高かった。これは、mRNA発現レベルに関する発見と一致し、CSCがIL1経路に関して特別な依存を示していることを提唱している。CSCマーカーCD133はまた腫瘍球でアップレギュレートされ、IL1R1はCSC付随表面分子であるという更なる証拠を提供する（図4B）。
【実施例４】
【００３４】
IL1R1はヒト腫瘍由来初代CRC及びNSCLC細胞株上で発現され、その発現はCSC濃縮腫瘍球でアップレギュレートされる
原発性NSCLC及びCRC細胞の表面のIL1R1発現をさらに評価するために、市場で入手できるポリクローナル抗体（AF269；R&D systems）及びAmgen特許WO2004022718A2に由来するモノクローナル抗体（15C4）を用いた。後者の抗体はモノクローナルhIgG4として製造された。両抗体をAPCで標識し、発現はフローサイトメトリーで検出した。図7で見ることができるように、両抗体は、接着細胞培養条件下で増殖させた細胞と比較したとき、1回の球体プレーティング後にNSCLC細胞でIL1R1発現のアップレギュレーションを検出することができた（図7、上段パネル）。一方、CRC細胞株では、球体のIL1R1アップレギュレーションは弱く、ポリクローナル抗体だけが検出可能でモノクローナル抗体では検出できなかった（図7、下段パネル）。
これらの結果は図4に示す結果と一致し、図4では、新しくバラバラにした異種移植腫瘍細胞と比較して、IL1R1発現は連続継代異種移植片由来腫瘍球でアップレギュレートされることが見出された。
図8は、図10（左及び中央パネルの上下）に示すヒストグラムと一致する、NSCLC及びCRC原発性腫瘍由来株についての対応するアイソタイプコントロールを示す。両方の抗IL1R1抗体を比較するとき、ポリクローナル抗体は、おそらく複数のエピトープの認識により標的認識についてはるかに高い感度を有することがはっきりと認められる（図7、右パネルの上下）。
【実施例５】
【００３５】
IL1R1の抗体遮断はin vitroで腫瘍球形成を阻害する
本発明にしたがい、患者由来原発性腫瘍から作成したCSC濃縮腫瘍球は、IL1B及びIL1R1遺伝子発現並びにIL1R1タンパク質発現のアップレギュレーションを特徴とすることが観察された。本発明者らはしたがって、IL-1経路はCSC表現型の発達及び／又は維持で重要な役割を果たすという仮説にたどりついた。IL-1シグナリングがin vitroで腫瘍球形成を促進するか否かを試験するために、初代NSCLC及びCRC細胞株を腫瘍球培養条件下でプレートし、これら細胞をある範囲の濃度のヤギ抗ヒトIL1R1中和抗体又はアイソタイプ適合陰性コントロールIgGで処理した。ここにおいて、中和抗体によるIL1R1の阻害は、プレート細胞の球体形成能力を用量依存態様で、NSCLC（図6A）及びCRC患者由来細胞株（図6B）の両方で低下させることが示された。これらの結果は、CSC増殖を阻害する手段としてIL-1経路に対抗する治療方法を使用することを支持する。
【実施例６】
【００３６】
IL1R1遮断はIL-1β刺激MAPKp38及びSTAT3リン酸化を阻害する
IL1R1の抗体遮断は、ヒト原発性腫瘍由来細胞株で腫瘍球形成を部分的に抑制した。したがって本発明者らは、IL1シグナリングの阻害はCSC機能を阻害する固有の潜在能力を有する、癌の治療的介入の強力な手段であると考える。IL1経路阻害剤の薬理動態評価の情報として用いることができる潜在的バイオマーカーを評価するために、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）p38及びシグナルトランスデューサー及び転写活性化因子（STAT）3の状態を分析した（前記はIL1/IL1R1カスケードでリン酸化されることが知られている）。pMAPKp38及びpSTAT3の検出はPathscan ELISA（Cell Signaling）を用いて実施した。増殖因子を欠く培養液に腫瘍球を一晩プレートし、続いて組換えIL-1βをある用量範囲で添加し、続いて20分インキュベートした。図9A及びCで見ることができるように、IL1刺激時の初期事象としてMAPKp38及びSTAT3の両方が用量依存態様でリン酸化される。IL-1βによる刺激が存在しないとき、pMAPKp38は腫瘍球培養で既に検出可能であるが、接着増殖細胞では検出されず、潜在的なオートクライン活性化ループはCSCで機能下にある得ることを示している（図9A及びB）。同じアッセイ条件下で、抗IL1R1 15C4抗体による処理はpMAPKp38及びpSTAT3の両方のリン酸化を用量依存態様で低下させることが観察され（図9B及びD）、IC50はpMAPKp38及びpSTAT3についてそれぞれ0.69nM及び4.42nMであった。
両タンパク質のリン酸化状態は、IL-1経路を阻害しさらにin vitro及びin vivoでの薬理学的試験のための基部バイオマーカーである化合物の同定に向けられるスクリーニングカスケードの情報として用いることができると結論できる。図9の結果は予備的な性質のものであるので、安定なスクリーニングカスケードを構築するためにこれらの結果の確認を得ることが必要である。
【実施例７】
【００３７】
組換えIL-1βは腫瘍球でIL1R1の発現を誘発するが、IL1R1の抗体遮断はIL1R1発現をダウンレギュレートする
基部バイオマーカーの確立に関して、上記記載と同じサンプル（図9）をIL1R1発現レベルについてウェスタンブロットにより分析した。図10A及びCで見ることができるように、IL1R1の発現は腫瘍球に存在し、組換えIL-1βによる刺激に際してさらに増加した。CRC由来腫瘍球ではIL1R1の誘発は明瞭な用量依存傾向にしたがったが、NSCLC球では、我々は1pg/mLを超える濃度ではIL1R1発現の低下を観察した。これは、初代NSCLC細胞の高い固有のIL1β産生の結果としての負のフィードバックループを示しているのかもしれない。これは、初代NSCLC球は顕著に高レベルのIL-1βmRNAを有することを示したマイクロアレイ分析における我々の発見と一致する。IL-1β刺激IL1R1表面発現は15C4抗IL1R1抗体による処理の後で低下し、抗体結合はレセプター分解の引き金であることを示している（図10B及びD）。
【実施例８】
【００３８】
CSC富化腫瘍球はIL-1応答性サイトカインhIL8及びhVEGFを分泌し、これらのサイトカインの産生はIL1R1遮断によって阻害できる
IL-1の生物学的活性はMAPKp38及びSTAT3のリン酸化をモニターすることによって細胞株で検出できることは上記で既に示した。しかしながら、臨床での解釈を促進するために、容易に収集できる液体生物材料（例えば尿又は血液）で検出できるバイオマーカーを同定することが重要であろう。サイトカインはELISAを用いて血清で容易に測定できる。IL-1β自体は、血清サンプルで容易にモニターできるサイトカインである。IL-1はさらに別のサイトカイン（例えばIL8及びVEGFα）の分泌を刺激することが明確に確立されている。
これらのサイトカインを用いて抗IL1R1抗体に対する応答をモニターできるか否かを試験するために、IL8及びVEGFレベルをCSC富化腫瘍球培養の上清で測定した。分化（接着）培養及び腫瘍球培養の上清を比較したとき、腫瘍球の上清で約1.7倍のIL8の誘発（図11A）及び著しいVEGFの誘発（図11B）が見出された。この観察に基づいて、抗IL1R1 Mab処理腫瘍球の上清のIL8及びVEGFレベルを測定した（図11C及びD）。以下で見ることができるように、IL1R1の遮断は用量依存態様でIL8レベルを低下させ（図11C）、さらにVEGFレベルもまた実質的に低下させた（図11D）。
これらのデータは、IL8及びVEGFの両方を、IL-1経路阻害物質の薬理学的活性をin vivoで評価するために有用であり得るバイオマーカー候補と認定する。図9及び10のデータと同様に、前記データは反復実験で立証されていないので予備的であると考えられる。
【実施例９】
【００３９】
IL1RA薬キネレット（Amgen）はCSC由来異種移植腫瘍の増殖を阻害し、さらにin vivoで血清サイトカインを調節する
抗IL1R1抗体はin vitroで腫瘍球形成を阻害するという本発明者らの観察に基づいて、in vivo CSC異種移植モデルでIL-1経路の阻害についてさらに試験した。そのようなin vivo試験のためにもっとも適切で容易に入手できる分子はヒトIL1R-アンタゴニスト（IL1RA）で、前記はmIL1R1と交差反応することが知られている。この設定では、CSC区画と同様に腫瘍のミクロ環境（炎症性浸潤細胞、間質線維芽細胞など）に対するIL1R1阻害の影響と抗腫瘍活性を関連付けられると期待できる。IL1RAはキネレットの商品名で市販され、特許はAmgenが所有する（WO1989/011540）。現在、キネレットは慢性関節リウマチの治療のために承認されている。
CRC（図12A）及びNSCLC（図12B）の患者から得られた原発性腫瘍に由来するヒト細胞培養物を、蛍光活性化細胞分類（FACS）を用いてアルデフルアー陽性集団について分類した。アルデフルアーは高アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーであり、前記活性は正常な幹細胞及びCSC表現型の両方に付随する。分類したアルデフルアー陽性（AF+）細胞をマトリゲルに懸濁し、非常に低い細胞数（2ｘ104細胞/マウス）でNOD/SCID免疫不全マウスの皮下に注入した。このマトリゲルは5μg/mLのローディング用量のキネレットを含み、この用量は、毎日皮下に投与した後の報告されたキネレット血清レベルと一致する。AF+細胞の接種の1日後から開始して、マウスに5mg又は10mgのキネレット（Biovitrum）又は前記医薬の賦形剤を毎日処置した。投与ルートは、病院でのキネレットの標準である皮下投与であった。
腫瘍体積は、CRCモデルでは76日間、NSCLCモデルでは91日間毎週モニターした。我々は、両モデルにおいて図12で見ることができるように腫瘍増殖の用量依存阻害を認めた。CRCでは、5及び10mgの両用量で強い阻害が認められ（図12A）、一方、NSCLCでは応答は10mgの高い用量でのみ生じた。マウスは両用量に十分に耐性を示した。
【００４０】
各試験グループから3匹のマウスを76日目（CRC）又は91日目（NSCLC）にサクリファイスした。腫瘍を摘出し、単一細胞に分解し、生存能力を保持させて凍結保存した。サイトカインの検出のために血清も収集した。残りのマウスについては、キネレット処置を停止し、腫瘍増殖についてこれらマウスをさらにモニターした。腫瘍が倫理的な腫瘍負荷限界に達したとき、これらのマウスをサクリファイスし腫瘍細胞及び血清を収集した。キネレット処置を停止した後、CRC試験では1匹のマウスが腫瘍進行をほぼ停止してこれをキネレット高応答動物（図中では高応答動物）と称し、さらにゆっくりと増殖する腫瘍をもつ1匹のマウスを中間的応答動物（図中では中等度応答動物）と称し、急速に増殖する腫瘍をもつ1匹のマウスを低応答動物（図中では低応答動物）と称した。サクリファイスした全ての動物から、大腿骨及び脛骨由来骨髄細胞を可能な分析のために収集し凍結保存した。
ELISAによる血清サイトカイン分析は、CRC及びNSCLCの両モデルの賦形剤コントロールグループで容易に検出できるレベルのヒトIL8及びヒトVEGFを示した（図13）。キネレット処置はマウス血清ではhVEGFレベルを変化させなかった（図13C）。しかしながら、hIL-8は検出不能レベルに低下することが見出された（図13A）。
処置グループの腫瘍の増殖が阻害されたので、hIL8レベルの低下は腫瘍サイズの減少の直接的影響であると考えねばならない。したがって、hIL8レベルは、異種移植モデルで薬理動態応答バイオマーカーとして有効であるとすることはできない（図13A）。CRCモデルの応答動物における3つの異なる分類で、hIL8の量は腫瘍サイズと密接に対応することもまた観察され（図13B）、VEGFレベルでは変化は認められなかった（図13D）。
これらの予備的な薬理学的試験は、IL1R1阻害はCRC及びNSCLCのCSC由来異種移植片モデルに対してin vivoで有効であることを示している。ネズミ血清中のヒトIL8レベルを腫瘍サイズと相関性を示すこれらモデルの疾患応答バイオマーカーとして用いることができ、これは、腫瘍体積を直接測定できない正常位モデルにおける腫瘍負荷の代用情報として将来有用であろう。ヒトVEGFは、IL1R1阻害がhVEGF血清レベルに対し何ら影響を示さなかったので、これらモデルのin vivoバイオマーカーとして価値をもたない。
【実施例１０】
【００４１】
腫瘍付随マクロファージ（TAM）はIL-1を必要とするメカニズムによりin vitroで腫瘍球形成を促進する
腫瘍はいわゆる腫瘍付随マクロファージ（TAM）によって激しく浸潤される（TAMは腫瘍細胞増殖、腫瘍免疫回避、転移及び血管形成を促進することが示された）。マクロファージは炎症応答時の分泌IL-1の主要な供給源であり、この事実を我々のCSCを支援するIL-1の役割の発見と併せて、本発明者らは、マクロファージ由来IL-1は腫瘍内のCSCニッシェを支援する最重要因子であり得ると仮説を立てた。
この仮説を実験的に証明するために、上記に記載しさらに発展させたHer2/neu腫瘍球/TAM同時培養モデルを用いた。Her2/neuマウスはラットHer2/neuオンコジーンについてトランスジェニックであり、前記はマウス乳房腫瘍ウイルス（MMTV）プロモーターの転写制御下にある。Her2/neuマウスは約4ヶ月齢で偶発的に乳房腫瘍を生じる。Her2/neu腫瘍からTAMを単離する方法は確立されてあり、前記は原発性乳房腫瘍の摘出、腫瘍の単一細胞への酵素的分解、並びに磁性ビーズ分離による線維芽細胞、内皮細胞及び赤血球系列の枯渇を必要とする。腫瘍細胞及びTAMを続いてFACSにより別個の集団に分類する。最後に、Her2/neu腫瘍細胞と一緒にTAMを腫瘍球促進培養条件下に置く（図14A）。
培養中のTAMは球体様構造を形成できないが、HER2/neu腫瘍細胞は容易に乳房腫瘍性乳房球体を形成する（図14B）。マルチラウンドの同時培養実験で、我々は、TAMの存在は常にHER2/neu腫瘍球形成を促進することを示した。さらにまた、腫瘍球の数は、同時にプレートしたTAM数の増加に対応して直線的に増加する（図14B）。
TAM支援腫瘍球増殖におけるIL-1シグナリングの可能な役割を究明するために、2つの異なる用量の抗ネズミIL1R1 Mab でHER2/neu-TAM同時培養を処理した。IL1R1遮断は、TAMのみ又はHER2/neu腫瘍細胞のみを含む培養に対しては有意な影響を与えなかった。しかしながら、同時培養条件下では、IL1R1遮断は、Her2/neu腫瘍球形成で明瞭な用量依存低下をもたらし（図14C）、TAM媒介CSC支援におけるIL-1経路に対する役割を支持した。
したがって、IL1R1阻害は癌幹細胞及びそれらの防御性ミクロ環境に影響を及ぼすということができる。
【図２Ａ】
2014519480.tif 000002
【図２Ｂ】
2014519480.tif 000003
【図２Ｃ】
2014519480.tif 000004
【図３】
2014519480.tif 000005
【図４】
2014519480.tif 000006
【図６】
2014519480.tif 000007
【図７】
2014519480.tif 000008
【図８】
2014519480.tif 000009
【図１２】
2014519480.tif 000010
【図１】
2014519480.tif 000011
【図５Ａ】
2014519480.tif 000012
【図５Ｂ】
2014519480.tif 000013
【図９】
2014519480.tif 000014
【図１０】
2014519480.tif 000015
【図１１】
2014519480.tif 000016
【図１３】
2014519480.tif 000017
【図１４Ａ】
2014519480.tif 000018
【図１４Ｂ−Ｃ】
2014519480.tif 000019
【国際調査報告】
2014519480.tif 000020
2014519480.tif 000021
2014519480.tif 000022
2014519480.tif 000023