(57)【要約】  フェニレフリンなどの生物活性物質の腸内全身循環前代謝は、硫酸化の１種以上の阻害剤（例えばスルホトランスフェラーゼ酵素、別名ＳＵＬＴ）と併用して生物活性物質（例えばフェニレフリン）を被験体（ヒトまたは動物）に投与することによって回避される。このことはモノアミンオキシダーゼ、別名ＭＡＯ、およびウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ、別名ＵＧＴの阻害剤を併用投与することでも促進できる。阻害剤はＧＲＡＳ化合物であることが好ましい。１種以上の阻害剤化合物は、迅速な全身循環前代謝の原因である酵素を阻害し、これによって生物活性物質（例えばフェニレフリン）がより迅速に循環系に未変化で吸収されるようになる。
2014527999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性物質を、それを必要とする被験体に経口で提供する方法であって、前記生物活性物質の生物学的有用性を高めることを目的とし、１種以上のスルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）の１種以上の阻害剤と組み合わせて前記生物活性物質を前記被験体に経口で提供する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の１種以上の阻害剤を前記被験体に提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の１種以上の阻害剤を前記被験体に提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記生物活性物質がフェニレフリンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生物活性物質がフェニレフリンであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記生物活性物質がフェニレフリンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記１種以上のＳＵＬＴの阻害剤がＳＵＬＴ１Ａ３を阻害することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
フェニレフリンを、それを必要とする被験体に経口で提供する方法であって、フェニレフリンの生物学的有用性を高め、１種以上のフェノール類またはアルキル化カテコール類と組み合わせてフェニレフリンを前記被験体に経口投与で提供する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記フェノール類またはアルキル化カテコール類が、グアイアコール、イソオイゲノール、オイゲノール、ジンゲロン、バニリン、エチルバニリン、クルクミンおよびピペリンから選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記提供する工程には、アルキル化カテコール類ではない１種以上のフェノール化合物を経口投与する工程が含まれることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記１種以上のフェノール化合物が、トランス‐レスベラトロール、トランス‐プテロスチルベン、プロピルパラベン、メチルパラベン、クエルセチン、およびカフェー酸フェニルエーテルエステルを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記提供する工程には、ビタミンＣを経口投与する工程が含まれることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
フェニレフリンと、クルクミン、レスベラトロールおよびカフェー酸フェニルエチルエステルのうち１種以上とを含むことを特徴とする経口剤形のフェニレフリン。
【請求項１４】
フェニレフリンと、プロピルパラベンと、バニリンおよびオイゲノールのうち１種以上とを含むことを特徴とする経口剤形のフェニレフリン。
【請求項１５】
フェニレフリンと、クエルセチン、エチルバニリン、イソオイゲノール、プロピルパラベン、グアイアコール、プテロスチルベンおよびジンゲロンのうち１種以上とを含むことを特徴とする経口剤形のフェニレフリン。
【請求項１６】
フェニレフリンと、オイゲノール、プロピルパラベン、バニリンおよびアスコルビン酸のうち１種以上とを含むことを特徴とする経口剤形のフェニレフリン。
【請求項１７】
フェニレフリンと、クルクミン、プテロスチルベン、レスベラトロールおよびジンゲロンの組合せとを含むことを特徴とする経口剤形のフェニレフリン。
【請求項１８】
フェニレフリン、プテロスチルベンおよびジンゲロンを含むことを特徴とするフ経口剤形のフェニレフリン。
【請求項１９】
生物活性物質を、それを必要とする被験体に経口で提供する方法であって、前記生物活性物質の生物学的有用性を高めることを目的とし、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）、グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）ファミリーメンバー、カテコール‐ｏ‐メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、およびモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）から成る群より選択される１種以上の阻害剤と組み合わせて前記生物活性物質を前記被験体に経口で提供する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記生物活性物質が、フェニレフリン、アルブテロール、２‐メトキシエストラジオール、シリビン、ラズベリーケトン、ピノレジノール，マグノロール、α‐マンゴスチン、レスベラトロール、ラロキシフェン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、テルブタリン、エチレフリン、シネフリン、オクトパミン、プテロスチルベン、マンギフェリン、プエラリン、サルビアノール酸Ａ、チロソール、ホオノキオール、マルスプシン、イリゲニン、カフェー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）、ニンビジオール、クルクミン、プテロスチルベン、レスベラトロールおよびジンゲロン、ならびにこれらの組合せから成る群より選択されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
フェニレフリン、ピノレジノール，マグノロール、ラズケトン、α‐マンゴスチン、シリビン、アルブテロール、レスベラトロール、２‐メトキシエストラジオールから成る群より選択される１種以上の生物活性物質；
クエルセチン、バニリン、エチルバニリン、オイゲノール、イソオイゲノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、没食子酸プロピル、ナリンジン、アスコルビン酸、プテロスチルベン、レスベラトロール、ジンゲロン、グアイアコール、ピペリン、クルクミンおよびカフェー酸フェニルエチルエステル（ＣＡＰＥ）から成る群より選択される１種以上の酵素阻害剤：
を含むことを特徴とする経口投与組成物。
【請求項２２】
前記酵素阻害剤がクエルセチン、エチルバニリン、イソオイゲノールおよびプロピルパラベンの組合せを含むことを特徴とする経口投与組成物。
【請求項２３】
前記酵素阻害剤がレスベラトロール、クルクミン、ジンゲロンおよびプテロスチルベンの組合せを含むことを特徴とする経口投与組成物。
【請求項２４】
前記１種以上の生物活性物質は０．１ｍｇ〜２００ｍｇの用量範囲にあり、前記１種以上の酵素阻害剤は０．２５ｍｇ〜２２５ｍｇの用量範囲にあることを特徴とする請求項２１で請求した経口投与組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の一部は国立衛生研究所（ＮＩＨ／ＮＣＭＨＤ  認可番号１Ｐ６０‐ＭＤ００２２５６）からの資金援助によってなされたものであり、米国政府は本発明に一定の権利を有する。本発明は、概括的には、経口的に投与または服用する生物活性化合物の生物学的有用性の向上、特に、生物活性化合物の全身循環前もしくは全身の代謝またはクリアランスを防止または減少させるための「一般的に安全とみなされている」（ＧＲＡＳ）化合物、特に特定のフェノール化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な疾患を治療するために被験体に提供された化合物の生物活性を高めることは、長年にわたって集中的に研究されてきたテーマである。さらに、「一般的に安全とみなされている」（ＧＲＡＳ）化合物である物質と併用して薬品を含む組成物を使用してきたアプローチは多数ある。
【０００３】
Ｍａｊｅｅｄらが取得した米国特許第５，９７２，３８２号は、黒コショウ由来のアルカロイドであるピペリンと併用することによって栄養素および栄養補助食品の胃腸吸収と全身活用度を改善するための組成物および方法を教示している。Ｍａｊｅｅｄは薬品自体の伝達を記載しておらず、ピペリンはＧＲＡＳ化合物ではない。
【０００４】
Ｈａｒｒｉｓが取得した米国特許第７，５７６，１２４号は安全かつ効果的であると考えられているフロクマリン化合物を阻害する「初回通過」を記載している。フロクマリンは例えばグレープフルーツから調製した柑橘類由来物質である。Ｈａｒｒｉｓは全身循環前代謝の成分が阻害されることは特定していないが、酵素のチトクロムＰ４５０ファミリーは参照している。フロクマリンはＧＲＡＳとして記載されていない。
【０００５】
Ｃｈｅｎらが取得した米国特許第７，１２５，５６４号は、生物活性治療化合物の初回通過分解に関する問題を述べており、甘草根由来の主要な甘味化合物であるグリシルリジンとの水溶性複合体の使用を教示している。グリシルリジンはＧＲＡＳであると記述されている。Ｃｈｅｎはグリシルリジンが初回通過代謝を阻害できることは示さず；どちらかと言えばＣｈｅｎは初回通過効果を回避するために非経口投与した組成物を含んでいることを述べている。
【０００６】
Ｑａｚｉらが取得した米国特許第７，０７０，８１４号は生物学的増進／生物学的有用性促進性があると考えられている組成物を教示している。これらの組成物には、植物クミン（Ｃｕｍｉｎｕｍ  ｃｙｍｉｎｕｍ）（すなわちクミンスパイスの元となる植物）由来のエキスおよび／または少なくとも１つの生物活性画分が含まれている。このエキスは薬学的に許容できる添加物／賦形剤と共に、薬品、栄養素、ビタミン、栄養補助食品、ハーブ薬／製品、微小栄養素および抗酸化剤と併用している。Ｍａｊｅｅｄの特許と同様に、Ｑａｚｉでは、エキスの有益な効果を高めると考えられているピペリン（あるいはコショウ（ｐｉｐｅｒ  ｎｉｇｒｕｍ）またはヒハツ（ｐｉｐｅｒ  ｌｏｎｇｕｍ）のエキス／画分）を場合によって含むことが述べられている。特にＱａｚｉは薬品の全身循環前代謝の問題に注目し、特許に記載した組成物が肝臓または腸内における薬品の生体内変化率を増減することで機能し得ることを示唆している。Ｑａｚｉでは、そのエキスがＧＲＡＳ化合物を含むとは明言されていない。
【０００７】
Ｗａｃｈｅｒらが取得した米国特許第６，１８０，６６６は、対象となる化合物と、没食子酸オクチル、没食子酸プロピル、没食子酸ラウリルおよび没食子酸メチルなどの没食子酸エステルとを経口で併用投与することが記載されている。没食子酸は没食子、ウルシ、アメリカマンサク、茶葉および樫皮などの植物に見られる有機フェノール酸の１種であるトリヒドロキシ安息香酸である。没食子酸エステルは、例えばチトクロムＰ４５０によって起こる薬品の生体内変化を阻害するために存在すると考えられている。そのエステルはＧＲＡＳ化合物であると述べられている。
【０００８】
Ｂｅｎｅｔらが取得した米国特許第６，１２１，２３４号は、経口投与した疎水性医薬化合物の生物学的有用性を高め、個体間および個体内変動を抑えると考えられている方法を記載している。Ｂｅｎｅｔでは、医薬組成物は精油または精油成分と経口併用投与している。精油の役割は消化管での薬品の生体内変化を阻害することであるとＢｅｎｅｔは示唆している。精油はＧＲＡＳ化合物であると述べられている。
【０００９】
Ｗａｃｈｅｒらによる米国特許出願第２００３／０２１５４６２号では、経口投与した薬品の生物学的有用性を高めるためにＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）阻害剤を使用することが記載されている。その製剤は２‐メトキシエストラジオール、ラロキシフェン、イリノテカン、ＳＮ‐３８、エストラジオール、ラベタロール、ジレバロール、ジドブジン（ＡＺＴ）およびモルヒネと共に使用し得ることをＷａｃｈｅｒは示唆している。ＵＤＰ阻害剤は一般的に天然産物であり、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン、没食子酸オクチル、没食子酸プロピル、ケルセチン、タンニン酸、ベンゾインガム、カプサイシン、ジヒドロカプサイシン、オイゲノール、没食子酸ガロカテキン、ゲラニオール、メントール、酢酸メンチル、ナリンゲニン、オールスパイスベリーオイル、Ｎ‐バニリルノナンアミド、クローブ花芽油、ペパーミント油、シリビニンおよびシリマリンが挙げられる。Ｗａｃｈｅｒはレスベラトロールとフェニレフリンを薬品として例に挙げておらず、またＧＲＡＳ物質プロピルパラベン、バニリン、ビタミンＣおよびクルクミンはＷａｃｈｅｒでは有用であるとされていない。Ｗａｃｈｅｒの技術の目的が、相乗的に良好に作用する薬品と阻害剤との特定の組合せを同定することであることは明らかである。Ｗａｃｈｅｒは「・・・１種類の基質のグルクロン酸抱合を阻害する化合物はＵＧＴ基質すべてのグルクロン酸抱合を抑制するとは限らない・・・」と明記している。
【００１０】
Ｏｌｉｖｅｒらによる米国特許出願第２００６／００４０８７５号および第２００９／００９３４６７号は薬品の生物学的有用性を高めることが可能なＵＧＴ２Ｂ阻害剤を記載している。具体的に命名されている阻害剤にはカピラリシン、イソラムネチン、β‐ナフトフラボン、α‐ナフトフラボン、ヘスペレチン、テルピネオール、（＋）リモネン、β‐ミルセン、スウェルチアマリン、エリオジクチオール、シネオール、アピゲニン、バイカリン、ウルソール酸、イソビテキシン、ラウリルアルコール、プエラリン、トランス‐シンナムアルデヒド、３‐フェニルプロピルアセテート、イソリクイリチゲニン、ペオニフロリン、没食子酸、ゲニステイン、グリチルリジン、プロトカテク酸、エチルミリスチン酸塩およびウンベリフェロンなどの天然産物がある。生物学的有用性が高められると示唆されている薬品にはモルヒネ、ナロキソン、ナロルフィン、オキシモルフォン、ヒドロモルフォン、ジヒドロモルヒネ、コデイン、ナルトレキソン、ナルトリンドール、ナルブフィンおよびブプレノルフィンが挙げられる。Ｏｌｉｖｅｒの着目点は鎮痛剤の伝達にある。
【００１１】
Ｋａｉｖｏｓａａｒｉらによる米国特許出願第２０１０／００８７４９３号は、ＵＧＴ２Ｂ１０調節因子、例えばＵＧＴ２Ｂ１０（ＵＧＴ１Ａ４よりＵＧＴ２Ｂ１０を選択することが好ましい）の阻害剤を投与することでＵＤＰ‐グルクロノシルトランスフェラーゼアイソザイムＵＧＴ２Ｂ１０によってＮ‐グルクロン酸抱合を受ける薬理学的に活性な薬剤の生物学的有用性を高める方法を教示している。生物学的有用性を高められる可能性のある薬品は求核性窒素原子を有すると記述されており、第１級、第２級および第３級アリールおよびアルキルアミン、スルホンアミド、ならびにヘテロ原子として１つ以上の窒素原子を有する芳香族または脂肪族複素環式化合物が挙げられる。ニコチンは１例として特定されている。阻害剤は詳細には記載されておらず、レボメデトミジンのみ例示されている。
【００１２】
ＷＯ／２０１１／０２６１１２は、薬理活性のある薬剤をグルクロン酸抱合するＵＧＴの特異的阻害剤を使用することで薬理活性のある薬剤の生物学的有用性を高める方法を記載している。しかしＷＯ／２０１１／０２６１１２では、阻害剤はＮ‐アシルフェニルアミノアルコール残基と、スペーサーによって結合したウリジン部分とを含むと記載されている。よって、ＧＲＡＳ化合物の使用はＷＯ／２０１１／０２６１１２には記載されていない。
【００１３】
ＷＯ／２０１０／０１５６３６  ２０１００２１１は、ＵＧＴ類を阻害し、それによって抗生物質などの薬品の生物学的有用性を高めるベータ‐カルボリン誘導体を教示している。しかし、この目的のためにＧＲＡＳ化合物を使用することは述べられていない。
【００１４】
本発明に先立って、フェニレフリンの経口生物学的有用性を高める戦略に関する研究はほとんど無く、フェニレフリン代謝を狙う酵素を標的とし、毒性や悪影響の原因となり得る酵素を回避するアプローチも無かった。
【００１５】
【特許文献１】米国特許明細書ＵＳ５９７２３８２
【特許文献２】米国特許明細書ＵＳ７５７６１２４
【特許文献３】米国特許明細書ＵＳ７１２５５６４
【特許文献４】米国特許明細書ＵＳ７０７０８１４
【特許文献５】米国特許明細書ＵＳ６１８０６６６
【特許文献６】米国特許明細書ＵＳ６１２１２３４
【特許文献７】米国特許出願明細書ＵＳ２００３／０２１５４６２
【特許文献８】米国特許出願明細書ＵＳ２００６／００４０８７５
【特許文献９】米国特許出願明細書ＵＳ２００９／００９３４６７
【特許文献１０】米国特許出願明細書ＵＳ２０１０／００８７４９３
【特許文献１１】国際出願公開公報ＷＯ／２０１１／０２６１１２
【特許文献１２】国際出願公開公報ＷＯ／２０１０／０１５６３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
フェノール化合物は一般的に被験体の体内の活発な代謝プロセスのための基質であるか、排出輸送体の基質であるか、あるいは両プロセスのための基質として機能し得る。これらのフェノール化合物は全身循環前および／または全身クリアランスが速いか、あるいは組織分布が不十分であることが多い。結果として、代謝および輸送プロセスは薬剤としての多様なフェノール化合物の医療用途を制限することが多い。本発明の実施態様は迅速な全身循環前代謝の原因である酵素を阻害する１種以上の化合物を使用し、これによって薬品が未変化で体内に吸収されることが可能になる。当該化合物は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に「一般的に安全とみなされている」（「ＧＲＡＳ」）化合物であるか、あるいは自然食品であることが好ましい。化合物の例として、アスコルビン酸およびナイアシンなどのビタミンや栄養素、バニリンおよびオイゲノールなどのフェノール着香料、没食子酸プロピルおよびプロピルパラベンなどの抗酸化剤、クエルセチンなどの食物ポリフェノール、ならびにこれらの組合せが挙げられる。本発明を実行する際に有用な化合物、およびその組合せ、特にフェノール化合物を以下にさらに詳細に述べる。
【００１７】
受容者において生物活性物質（例えば、細胞内で目的の活性を起こして増減させる薬品、栄養補給食品または他の物質）を高全身レベルへ到達させる際に１つの障害となっていることは、分子が循環系に入る前に分子を迅速に改変する多数の酵素が身体（例えば消化系または消化管）に含まれていることである。この全身循環前代謝（「初回通過」効果としても知られている）によって、薬品は、生物学的に活性抑制された形態、不活性な形態、および／または、ほとんどの場合で生物学的有用性が低減された形態に変換される。このような酵素の例としてはスルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）、グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）ファミリーメンバー、カテコール‐Ｏ‐メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、およびモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）が挙げられる。これらの代謝酵素の阻害剤である本明細書に記載された１種以上のＧＲＡＳ化合物またはフェノール化合物または他の化合物と共に目的の薬品または薬剤を投与することによって、酵素の阻害が達成され、それらと共に提供される薬品または他の生物活性薬は改変されず（あるいは改変されてもわずかである）、全身循環に入るときにその活性形態は維持されている。
【００１８】
また、生物活性化合物の高用量に伴う可能性のある毒性は、１）ＧＲＡＳ化合物のみを使用すること、および２）各々の使用量が単独で投与する場合より少ない様々なＧＲＡＳ化合物の組合せを投与することによって抑制される。１つの組合せは、様々なＧＲＡＳカテゴリーにある化合物、例えばビタミン、フェノール着香料、抗酸化剤等を含み得る。この様式で首尾よく投与し得る薬品または生物活性物質の例として、フェニレフリン、アルブテロール、２‐メトキシエストラジオール、および（天然産物の）シリビン、ラズベリーケトン、ピノレジノール，マグノロール、α‐マンゴスチン、ならびにレスベラトロール）が挙げられるが；しかし本発明が多数の異なる生物活性剤で実行可能であることは当業者に認識されているものとする。
【００１９】
２００６年の「ストップ・メセドリン運動」によって、大量に店頭販売（ＯＴＣ）されていたプソイドエフェドリンをフェニレフリンに置き換えることとなった。不運にも、フェニレフリン製品に多くの患者が不満を持ち、これは経口生物学的有用性の低さが原因である可能性が高い。本発明の実施態様はフェニレフリン代謝を阻害する安全かつ選択的アプローチを利用してフェニレフリン吸収を改善する戦略に関するものである。処方箋なしで利用できたプソイドエフェドリンの購入が限定的になったことから、多くの風邪／インフルエンザ製品がフェニレフリンにとって代わった。しかし、フェニレフリンの経口での生物学的有用性は低く（＜３８％）、吸収は不安定である（Ｈｅｎｇｓｔｍａｎｎ およびＧｏｒｏｎｚｙ、１９８２年；Ｋａｎｆｅｒら、１９９３年；Ｓｔｏｃｋｉｓら、１９９５年）。フェニレフリンは３つの主な代謝経路：硫酸化（大半が消化管である）、酸化的脱アミノ反応およびグルクロン酸抱合によって、広範に全身循環前に代謝され、これらのうち硫酸化が主要な経路である（Ｈｅｎｇｓｔｍａｎｎ およびＧｏｒｏｎｚｙ、１９８２年）。経口生物学的有用性が低いことから、本発明の実施態様では、経口フェニレフリン製品の生物学的有用性、ひいては臨床的有効性を高める戦略を採用している。
【００２０】
ヒトでのフェニレフリン代謝の原因である特異的な酵素アイソフォームは、数十年も臨床的に利用されているにもかかわらず、明確に確立されていない。しかし、利用可能なデータから代謝経路を推測できるものが１つある。最初に、経口投与後のフェニレフリン（ＰＥ）の主な代謝物質はフェニレフリン‐３‐Ｏ‐硫酸塩（ＰＥ‐３Ｓ）であるが、静脈内投与すると、大部分が酸化的に脱アミノ化する（ＨｅｎｇｓｔｍａｎｎおよびＧｏｒｏｎｚｙ、１９８２年）。結果として、腸壁内のスルホトランスフェラーゼがフェニレフリンの硫酸化の主な原因であると推測される。フェノール性モノアミンとして、ＰＥは、ＳＵＬＴアイソフォーム１Ａ３（ＳＵＬＴ１Ａ３）に都合の良い基質であるドーパミン、セロトニンおよびテルブタリンなどの化合物と類似した構造を有している（ＰａｃｉｆｉｃｉおよびＣｏｕｇｈｔｒｉｃ、 ２００５年）。さらに、他のデータから、ＳＵＬＴ１Ａ３タンパク質は肝臓より小腸で高発現し、酵素活性が高く、肝臓では非常に低いか、全く無いことが示されている（Ｐａｃｉｆｉｃｉ およびＣｏｕｇｈｔｒｉｅ、２００５年、Ｒｉｃｈｅｓ ら、２００９年）。カテコールアミン以外に、ＳＵＬＴ１Ａ３もまた、セロトニンや、サルブタモール（アルブテロール）およびテルブタリンなどのβ‐アドレナリン作用アゴニストを含む多くのモノアミンと共役する（ＰａｃｉｆｉｃｉおよびＣｏｕｇｈｔｒｉｅ、２００５年）。実際、ＳＵＬＴ１Ａ３は、テルブタリンの非常に低い経口生物学的有用性（１４±２％）の原因因子と言われてきた（ＰｅａｒｓｏｎおよびＷｉｃｎｋｃｒｓ、２００９年）。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の実施態様では、１種以上の阻害化合物（例えばＳＵＬＴ、ＵＧＴ、ＣＹＰ、ＣＯＭＴおよび／またはＭＡＯ阻害剤）は生物活性物質（例えばフェニレフリン）と併用する。被験体（例えばヒトまたは動物）にその併用薬を経口投与すると、１種以上の阻害化合物によって迅速な全身循環前代謝の原因である酵素が阻害され、薬品が未変化で吸収されるようになる。阻害化合物はＧＲＡＳ化合物のＦＤＡのリスト、または食品添加物（ＥＡＦＵＳ）のＦＤＡのリスト、または他の栄養補助食品を含む食品化合物から選択されることが好ましい。阻害化合物の併用薬を使用し、使用した各化合物の毒性を最小限にしながら阻害効果に相乗的に作用することが可能となる。同一の、あるいは異なるカテゴリーから得た化合物（アスコルビン酸およびナイアシンなどのビタミンおよび栄養素；バニリンおよびオイゲノールなどのフェノール着香料；没食子酸プロピルおよびプロピルパラベンなどの抗酸化剤；ならびにクエルセチンなどの食物ポリフェノールが挙げられるが、これらに限定されるものではない）の組合せが使用できる。
【００２２】
本発明の例示的な実施態様では、１種以上の酵素阻害剤（スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）、グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）ファミリーメンバー、カテコール‐ｏ‐メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、およびモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ））と併用して生物活性物質を経口投与で被験体（ヒトまたは動物）に提供する。例示的な生物活性には、フェニレフリン、アルブテロール、２‐メトキシエストラジオール、シリビン、ラズベリーケトン、ピノレジノール，マグノロール、α‐マンゴスチン、レスベラトロール、ラロキシフェン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、テルブタリン、エチレフリン、シネフリン、オクトパミン、プテロスチルベン、マンギフェリン、プエラリン、サルビアノール酸Ａ、チロソール、ホオノキオール、マルスプシン、イリゲニン、カフェー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）、ニンビジオール、ドブタミン、プレナルテロール、リトドリン、ナドロール、ラベタロール、イソプロテレノール、Ｌ‐ドーパ、メチルドパ、サルソリノール、ホルデニン、ロスマリン酸、エラグ酸、エモジンおよびアメントフラボンが挙げられる。いくつかの実施態様では、１種以上の生物活性物質は０．１ｍｇ〜２００ｍｇの用量範囲にあり、前記１種以上の酵素阻害剤は０．２５ｍｇ〜２２５ｍｇの用量範囲にある。
【発明の効果】
【００２３】
経口投与される生物活性化合物の生物学的有用性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】合成手順の概略図である。
【図２Ａ−Ｂ】阻害剤治療併用薬ＡまたはＢ（実施例４参照）の非存在下あるいは存在下で上述のようにＬＳ１８０細胞と共にインキュベートした多様な化合物の試験結果を示すグラフである。
【図２Ｃ−Ｄ】阻害剤治療併用薬ＡまたはＢ（実施例４参照）の非存在下あるいは存在下で上述のようにＬＳ１８０細胞と共にインキュベートした多様な化合物の試験結果を示すグラフである。
【図２Ｅ−Ｆ】阻害剤治療併用薬ＡまたはＢ（実施例４参照）の非存在下あるいは存在下で上述のようにＬＳ１８０細胞と共にインキュベートした多様な化合物の試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ＳＵＬＴ１Ａ３は腸内で高度に発現する主要なアイソフォームであるが、肝臓での発現は低度（あるいは検出できない）である（Ｒｉｃｈｅｓら、２００９年）。さらに、ヒト胃腸ＳＵＬＴの活性の特徴が明らかにされてきており、ドーパミン硫酸化活性（ＳＵＬＴ１Ａ３および１Ａ１を含む）は胃または結腸より小腸で大幅に高く；また、肝臓の３倍高かった（Ｃｈｅｎら、２００３年）。これらのデータは考慮され、薬物動力学モデルに組み込まれており、このことは腸の硫酸化が（特にＳＵＬＴ１Ａ３によって媒介される）テルブタリンやサルブタモール（アルブテロール）の全身循環前代謝の主要な決定因子である（Ｍｉｚｕｍａら、２００５年；Ｍｉｚｕｍａ、２００８年）ことを主張するものである。
【００２６】
また、ＳＵＬＴ１Ａ１は小腸でも肝臓でも発現するが、肝臓で発現および活性が高く、またフェノールに対しては、より一般的な基質選択性を示す（ＰａｃｉｆｉｃｉおよびＣｏｕｇｈｔｒｉｅ、２００５年）。さらに、ＳＵＬＴ１Ｂ１はヒト腸において最も発現が高いアイソフォームであり、甲状腺ホルモンや、ｌ‐ナフトールおよびｐ‐ニトロフェノールなど他の原型ＳＵＬＴ基質を硫酸化することが可能である；これ以上その基質選択性はあまりよく知られていない（Ｒｉｃｈｅｓら、２００９年）。ＳＵＬＴ２Ａ１もヒト腸で発現し、フェノールを硫酸化する（Ｒｉｃｈｅｓら、２００９年）。他のＳＵＬＴの腸での発現は低レベルであり、かつ／あるいは基質としてフェノール／モノアミンを受容しない（ＰａｃｉｆｉｃｉおよびＣｏｕｇｈｔｒｉｅ、２００５年；Ｒｉｃｈｅｓ ら、 ２００９年）。
【００２７】
上記のデータから、本発明の発明者らは、ＳＵＬＴ（アイソフォーム１Ａ１、１Ｂ１、２Ａ１、特に１Ａ３を含む）がフェニレフリンの腸における全身循環前代謝で重要な役割を担っており、多数の他の生物活性物質の腸における全身循環前代謝でも重要な役割を担っている可能性があることを予測している。本明細書に記載のフェニレフリン（または他の生物活性物質）の生物学的有用性を高めるアプローチは、腸内ＳＵＬＴ活性がフェニレフリンの全身循環前代謝の主要な決定因子であり腸内ＳＵＬＴを阻害するとフェニレフリン（または他の生物活性物質、例えば２‐メトキシエストラジオール、レスベラトロール等）の経口生物学的有用性が有意に高まるという前提に影響を与えている。ある生物活性物質の生物学的有用性を高めるためには、十分な量の１種以上のＳＵＬＴ阻害剤をその生物活性物質と併用することが必要であり、そうすることでその併用薬を経口で服用したとき、ＳＵＬＴ阻害剤が含まれない場合と比較して、大量のＰＥが未変化のままで循環系に吸収される。
【００２８】
フェニレフリン‐３‐Ｏ‐グルクロニド（ＰＥ３Ｇ）を形成するために経口量のＰＥを実質的にグルクロン酸抱合する（Ｈｅｎｇｓｔｍａｎｎ およびＧｏｒｏｎｚｙ、１９８２年）。他の代謝経路と同様に、腸または肝臓のいずれかで、どのウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）のアイソフォームが最もＰＥのグルクロン酸抱合を引き起こすかは不明である。しかし、ＵＧＴ１Ａ１、１Ａ６および１Ａ９は、（それぞれ）フェノール、セロトニンおよびプロポフォールをグルクロン酸抱合することから（Ｃｏｕｒｔ、２００５年）、フェニレフリンに対するそれらの活性を予測することは可能である。小腸および／または肝臓のＵＧＴを阻害することはフェニレフリンの経口生物学的有用性の向上を促進する可能性があり、このアプローチも他の生物活性物質によって効果的になる可能性がある。いくつかの応用では、ＵＧＴの１種以上の阻害剤とＳＵＬＴの１種以上の阻害剤を併用することは生物活性物質の生物学的有用性を向上させる上で利点となる可能性がある。ある生物活性物質の生物学的有用性を高めるためには、十分な量の１種以上のＳＵＬＴ阻害剤および１種以上のＵＧＴ阻害剤をその生物活性物質（例えばＰＥ）と併用する必要があり、そうすることによってその併用薬を経口で服用したとき、ＳＵＬＴ阻害剤および／またはＵＧＴ阻害剤が含まれない場合と比較して、大量のＰＥが未変化のままで循環系に吸収される。
【００２９】
また、モノアミン酸化酵素アイソフォームＡおよびＢ（ＭＡＯ‐ＡおよびＭＡＯ‐Ｂ）はフェニレフリンの酸化的脱アミノ反応に関与している（Ｋａｎｆｅｒ ら、１９９３年）。結果として、多様な精神学的および神経学的条件でセレジリン、パルジリンおよびクロルジリンなどのモノアミン酸化酵素阻害剤を服用している患者にはフェニレフリンは禁忌である（Ｌｅｘｉ‐Ｃｏｍｐ社のサイト）。ＭＡＯ‐ＡおよびＭＡＯ‐Ｂがフェニレフリン代謝において重要な役割を担っているか否かは不明である。しかし、静脈内ＰＥ投与では、ＰＥ代謝は主に酸化的脱アミノ反応を介して起こり、３‐ヒドロキシマンデル酸（３ＨＭＡ）を形成し（ＨｅｎｇｓｔｍａｎｎおよびＧｏｒｏｎｚｙ、１９８２年）、これはこの経路における肝臓の役割を示唆している。結果として、腸内のみでＭＡＯ酵素を阻害してもフェニレフリン（または他の生物活性物質）の経口生物学的有用性は有意には向上しないことが考えられる。さらに、神経系に対する食物および生体アミンの悪影響が起こる可能性を最小限にするため、腸および肝臓でＭＡＯを阻害することは避けるべきである。したがって、１つの実施態様では、本明細書で説明された独創的な戦略はＭＡＯ阻害作用のある化合物を避けることである。しかし、いくつかの用途では、ＳＵＬＴの１種以上の阻害剤とＭＡＯの１種以上の阻害剤を組み合わせることは生物活性物質の生物学的有用性を高める利点になる可能性がある。ある生物活性物質の生物学的有用性を高めるためには、十分な量の１種以上のＳＵＬＴ阻害剤および１種以上のＭＡＯ阻害剤をその生物活性物質（例えばＰＥ）と併用することが必要であり、そうすることによってその併用薬を経口で服用するとき、ＳＵＬＴ阻害剤および／またはＭＡＯ阻害剤が含まれない場合と比較して、大量のＰＥが未変化のままで循環系に吸収される。
【００３０】
Ｈｅｎｇｓｔｍａｎｎによって発表されたデータを解釈すると、経口投与後の尿へ排泄された総放射活性の質量収支は静脈内投与後に回収された量の９２％であり、したがってフェニレフリンは「高浸透性」化合物であると考えられる（ＨｅｎｇｓｔｍａｎｎおよびＧｏｒｏｎｚｙ、１９８２年；Ａｍｉｄｏｎ ら、１９９５年）。これを高い水溶性と組み合わせると、フェニレフリンはＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＣＳ）クラス１化合物に分類される（Ａｍｉｄｏｎら、１９９５年）。ＢＣＳクラス１化合物として、ＰＥ排出は主に代謝に起因することが予想され、また溶解に影響しない製剤変化は生物学的有用性を変えることはないと予想される（Ａｍｉｄｏｎら、１９９５年；ＷｕおよびＢｅｎｅｔ、２００５年）。したがって、ＰＥの経口生物学的有用性を改善するには、代謝に向けたアプローチが最も有用である。
【００３１】
結果として、本明細書に記載のＰＥ（または他の生物活性物質）の生物学的有用性を向上させる独創的なアプローチの前提は、腸での全身循環前代謝を回避することである。その戦略の側面は、肝臓でのＰＥの活性に影響を及ぼすことなくＰＥを代謝する消化管で酵素を選択的に阻害することである。このような方法で、ＰＥの経口生物学的有用性を向上しながらも、一方で不良な薬品の相互作用または全身毒性は回避されるであろう。
【００３２】
好ましい阻害剤はＰＥと同様の溶解度を有し、自身では毒性のないものである。さらに、それら阻害剤は中枢神経系および心血管系への悪影響が回避できるように神経伝達物質（ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン）の全身代謝は阻害しない。ＦＤＡの「一般的に安全とみなされている」（ＧＲＡＳ）リストにある化合物、ならびに特定の食品添加物（「米国における食品添加物のすべて」ＥＡＦＵＳ）および栄養補助食品（ＤＳ）は安全である可能性が高く、規制上の承認が容易である。
【００３３】
本発明を実行する際に使用可能な阻害剤の範囲は広い。表１および２では、ＳＵＬＴ、ＭＡＯ、ＣＹＰ、ＣＯＭＴまたはＵＧＴ酵素の阻害剤として機能可能であるか、そうでなければ例示した生物活性物質フェニレフリンの生物学的有用性を高めるために使用可能である多数の異なる化合物における結果が示されている。表１には、ＰＥ消失の減少で表されたＰＥ代謝を阻害するフェノール化合物の組合せの効果が示され、表２には、ＰＥ硫酸塩形成の損失で表された同様の効果が示されている。表１および２では、ＰＥ代謝の阻害をスクリーニングするためにヒトＬＳ１８０腸細胞を使用した。表１の結果を導いた実験では、ＰＥ濃度は５０μＭであり；ビタミンＣ（存在する場合）の濃度は１ｍＭであり；他の阻害剤の総濃度は１００μＭであった。指示のとおり細胞を３７℃で１４〜１７．５時間インキュベートした。ＰＥ代謝に関し、ＬＳ１８０モデルはヒト腸を模倣した安価な方法を提供している。動物モデルまたは組み換え酵素とは異なり、この系の利点は、ヒト起源である（したがって種間差を避けられる）こと、および細胞膜を越えて酵素に到達する阻害剤の能力をいくらか検討したことである。ＬＳ１８０実験では、１２ウェルプレート中に１．９×１０５細胞個／ｍｌの濃度でＬＳ１８０細胞を播種する。細胞を１％の非必須アミノ酸（ｐＨ７．４）とフェニレフリン（５０μＭ）／阻害剤（１００μＭ）（アスコルビン酸以外であれば：１０００μＭ）とを含むＤＭＥＭ０．５ｍｌで、５％ＣＯ２下、３７℃で１４〜１７．５時間インキュベートする。インキュベート後、培地を除去し、分析するまで−８０℃で保存する。１２ウェルプレートを氷上に設置し、各ウェルを迅速に洗い流すことで代謝反応を終了させる。２％酢酸を含むメタノール溶液１ｍｌで代謝物質を細胞から抽出する。細胞を掻き集め、遠心チューブに回収する。懸濁液を２〜３分間混合し、１８，０００ｒｃｆで５分間遠心分離する。上清（８００μｌ）を回収する。掻き集めた後、上記と同様に各ウェルを洗浄する。洗浄液を上清と一緒に回収し、減圧下で乾燥させる。残渣を３５μｌの水に再懸濁し、ＨＰＬＣで分析する。流速０．７５ｍｌでフェニルカラム（１５０×３．２ｍｍ、５μｍ、５５℃）を使用するＨＰＬＣ（２０％メタノールおよび８０％（含水１％酢酸））によって、ＰＥについて試料すべてを分析し、蛍光（励起波長２７０ｎｍ、発光波長３０５ｎｍ）によって検出する。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでＤｕｎｎｅｔｔの事後テストによってデータを加工する；＊はｐ＜０．０５を表す。
【００３４】
【表１】
2014527999.tif 000003
2014527999.tif 000004
【００３５】
【表２】
2014527999.tif 000005
【００３６】
表１および２のこれらの結果から、ＬＳ１８０腸細胞培養モデルにおいて阻害剤の例示された組合せがフェニレフリン（ＰＥ）の代謝を阻害する程度が明らかになっている。若干の併用薬治療は単独薬剤治療よりもっと効果的であることに留意されたい。バニリンとオイゲノールは単独ではＰＥ代謝を阻害できなかったが、それらを組み合わせて、あるいは他の薬剤と合わせると、大幅かつ相乗的にそれを阻害した。クルクミンとレスベラトロールは組合せ（単数または複数）の形態では効果が高まった。
【００３７】
上記のデータに関連させて、図１はフェニレフリン３‐Ｏ‐硫酸塩の合成経路の例を説明している。フェニレフリン３‐Ｏ‐硫酸塩を２モル当量のトリフルオロ酢酸無水物中に溶解し、アルキルヒドロキシルおよび第２級アミンを保護するために室温で１５分間インキュベートした。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。その後それを加熱および攪拌しながら３〜４モル当量のピリジン‐硫黄三酸化物複合体を含むピリジン中に溶解した。ピリジンを蒸発させ、次いで重炭酸カリウム水溶液中、室温で一晩加水分解し、ＨＩＬＩＣ‐アミドクロマトグラフィーによって精製した。ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（ＥＳＩ‐）では２４６→１６６の質量変化が示され、これはＳＯ３がフェノールから消失したことを示すものである。表２に示されるとおり、この合成によって、フェニレフリンに対するＳＵＬＴ酵素活性の主要な代謝産物が検出可能となる。
【００３８】
阻害能を有し、よってその能力がＰＥ（ならびに他の生物活性物質）の生物学的有用性を高めるとして示された化合物、および化合物の組合せ以外に、経口投与された生物活性物質の生物学的有用性を高めるために使用され得る他の化合物は、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、（−）‐ホモエリオジクチオール；２，６‐ジメトキシフェノール；２‐イソプロピルフェノール；２‐メトキシ‐４‐メチルフェノール；２‐メトキシ‐４‐プロピルフェノール；４‐（１，１‐ジメチルエチル）フェノール；４‐アリルフェノール；４‐エチルグアヤコール；４‐エチルフェノール；アニスイルアルコール；ブチル化ヒドロキシアニソール；ブチル化ヒドロキシトルエン；カルバクロール；カルベオール；ジメトキシベンゼン；ジバニリン；精油＋エキス（例えばクローブ、シナモン、ナツメグ、ローズマリー、柑橘類、バニラ、ショウガ、グアヤク、ターメリック、ブドウの種、黒コショウ等）；エチルｐ‐アニス酸塩；酢酸オイゲニル；ギ酸オイゲニル；イソオイゲノール（酢酸塩、ギ酸塩または安息香酸塩）；Ｌ‐チロシン；アニス酸メチル；メチルフェニルエーテル；硫化メチルフェニル；Ｏ‐（エトキシメチル）フェノール；Ｏ‐クレゾール；Ｏ‐プロピルフェノール；レゾルシノール；サリチル酸塩（アミル、ベンジル、ブチル、エチル、メチル等）；チモール；トランス‐アネトール；バニリンプロピレングリコールアセタール；酢酸バニリル；バニリルアルコール；バニリルエチルエーテル；バニリリデンアセトン；ベラトルムアルデヒド；およびキシレノール（２，６‐；２，５‐；３，４‐）から選択できる。経口投与した生物活性物質の生物学的有用性を高めるために使用し得るＧＲＡＳ／ＥＡＦＵＳリストにない他のハーブ／天然化合物には、ヘスペレチン；エリオジクチオノン；５，３’‐ジヒドロキシ‐７，４’‐ジメトキシフラバノン；イソラムネトール；タマリキセチン；シリンゲチン；３’７‐ジメチルケルセチン；ならびにケルセチンのメチル化および／または脱ヒドロキシル化された類似体が挙げられる。
【００３９】
使用し得る他のフラボノイドには、限定するものではないが、フラバノール類（カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、没食子酸カテキン、没食子酸ガロカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン、ロイコアントシアニジンおよびプロアントシアニジンなど）、フラボン類（例えばルテオリン、アピゲニン、タンゲレチン）、フラボノール類（ケルセチン、ケンプフェロール、ミリセチン、フィセチン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジンなど）、フラバノン類（ヘスペレチン、ヘスペリジン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオールなど）、フラバノノール類（タキシフォリン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロケンペロールなど）、アントシアニジン類（アントシアニジン、シアニジン、デルフィジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジンなど）、イソフラボン類（ゲニステイン、ダイドゼイン、グリシテインなど）、イソフラバン類（エコール、ロンコカルパン、ラキシフロランなど）およびネオフラボノイド類（ダルベルギン、ニベチン、クタレアゲニン、ダルベルギクロメンなど）が挙げられる。フラバノール類、フラボノール類、フラボン類、フラバノン類、フラバノノール類、アントシアニジン類、イソフラボン類、イソフラバン類およびネオフラボノイド類の配糖体も使用できる。
【００４０】
フラボノリグナン類（シリビン、シリビニンＡ、シリビンＢ、シリジアニン、シリクリスチン、イソシリクリスチン、イソシリビンＡ、イソシリビンＢ、シリビニン、シリクリスチン、シリジアニン、デヒドロシリビン、デオキシシリシスチン、デオキシシリジアニン、シランドリン、シリビノム、シリヘルミンおよびネオシリヘルミン、シリアマンジン、ヒドノカルピン、スクテラプロスチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ；ヒドノウィチン、パルスタチン、サルコリンＡおよびサルコリンＢ、ロジオリンなど）およびそれらの配糖体も本発明を実行する際に使用できる。リグナン類（ピノレジノール、ステガナシン、エンテロジオール、エンテロラクトン、ラリシレジノール、セコイソラリシレジノール、マタイレジノール、ヒドロキシマタイレジノール、シリンガレジノールおよびセサミン）ならびにそれらの配糖体が挙げられる。キサントン類（アルファ‐マンゴスチン、ベータ‐マンゴスチン、ガンマ‐マンゴスチン、ガルシノン、ガルシノンＡ、ガルシノンＣ、ガルシノンＤ、マンゴスタノール、ガルタニン）およびそれらの配糖体は本発明を実行する際に使用できる。種々の天然フェノール化合物には、ヒドロキシ‐メトキシ‐クマリン、ヒドロキシ‐カルコン、ビオカニンＡ、プルネチン、カバラクトン類（１１‐ヒドロキシヤンゴニン；１１‐メトキシ‐１２‐ヒドロキシデヒドロカバイン；５‐ヒドロキシカバイン）、エラグ酸、ロズマリン酸、エモジンおよびアメントフラボンなどが挙げられる。
【００４１】
さらに、本発明を実行する際に使用するための好適な阻害化合物は酵素活性アッセイを使用して容易に同定することが可能である。例としてアッセイを以下に示す：
【００４２】
ＳＵＬＴ：選択された組み換えＳＵＬＴアイソフォーム（１Ａ１、１Ａ３、１Ｂ１、２Ａ１を含む）はＸｅｎｏｔｅｃｈ社など様々な供給元から購入可能である。適当な対照物質を使用することが好ましく；例えば、ＳＵＬＴ１Ａｌ および １Ｂ１には４‐メチルウンベリフェロン；ＳＵＬＴ１Ａ３には１‐ナフトール；ＳＵＬＴ２Ａ１にはエストラジオールがある（Ｐａｃｉｆｉｃｉ およびＣｏｕｇｈｔｒｉｅ、２００５年）。メーカー取扱説明書にしたがってアッセイを行うことが好ましい（Ｃｙｐｅｘ／Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、ＬＬＣ）。５ｍＭの塩化マグネシウムおよび１０ｍＭのジチオトレイトールを含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、３’‐ホスホアデノシン５’‐ホスホ硫酸塩（ＰＡＰＳ；２０μＭ）の存在下、または非存在下、３７℃で基質を短時間インキュベートすることが好ましい。初期の基質濃度は２μＭ、タンパク質濃度は２．５μｇ／ｍｌで、５〜６０分間インキュベートすることが好ましい。アセトニトリルで反応を停止させ、逆相ＨＰＬＣで分析し、対照の基質の消失（および／または代謝物質の形成）を判定し、ＰＥ（または他の生物活性物質）および／またはそれらの代謝物質を分析することが好ましい。
【００４３】
ＵＧＴ：選択した組み換えＵＧＴアイソフォーム（１Ａ１、１Ａ６、１Ａ９を含む）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社など様々な供給元から購入可能である。適当な対照基質を使用することが好ましく；例えば、ＵＧＴ１Ａ１、１Ａ６および１Ａ９にはそれぞれエストラジオール、１‐ナフトールおよびプロポフォールを対照基質として使用することが好ましい（Ｃｏｕｒｔ、２００５年）。８ｍＭの塩化マグネシウム、２５μｇ／ｍｌのアラメチシンを含有するＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ；ｐＨ７．５）で測定を行い、２ｍＭのウリジン５’‐ジホスホ‐グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）の存在下、または非存在下、３７℃でインキュベートすることが好ましい。初期の基質濃度は１μＭ、タンパク質濃度は２００μｇ／ｍｌで、５〜６０分間インキュベートすることが好ましい。
【００４４】
ＭＡＯ：組み換えＭＡＯアイソフォーム（ＡおよびＢ）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社など様々な供給元から購入可能である。適当な対照基質を使用することが好ましく；例えば、キヌラミンは酸化的脱アミノ反応によって蛍光生成物を形成する両アイソフォームの基質である（Ｈｅｒｒａｉｚ およびＣｈａｐａｒｒｏ、２００６年）。１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で測定を行い、３７℃でインキュベートすることが好ましい。初期の基質濃度は１μＭ、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌで、５〜６０分間インキュベートすることが好ましい。
【００４５】
特定の阻害化合物または化合物の組合せがフェニレフリンの代謝を防止できることを提示するという点では、特にデータは説得力のあるものであるが、本発明は以下のものを含む多様な他の生物活性物質で実施することも可能である：アルブテロール、ラロキシフェン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、テルブタリン、エチレフリン、シネフリン、オクトパミン、レスベラトロール、プテロスチルベン、マグノロール、マンギフェリン、プエラリン、レスベラトロール、サルビアノール酸Ａ、ラズケトン（別名「ラズベリーケトン」）、チロソール、ホオノキオール、マルスプシン、イリゲニン、カフェー酸フェネチルエステル（カフェ酸フェニルエチル；「ＣＡＰＥ」）およびニンビジオール。
【００４６】
臨床的に、本発明を実行する際に利用した阻害剤は規制機関（ＦＤＡなど）に承認されていて悪影響のないものであることが好ましい。例えば、オイゲノール、エチルバニリンおよびバニリンの許容１日摂取量はそれぞれ２．５、３．０および１０ｍｇ／ｋｇ／日である（Ｆｅｎａｒｏｌｉ、２０１０年）。別の例では、プテロスチルベンは用量３０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＲＡＳ化合物としてＦＤＡに承認されている。クエルセチンは用量５００ｍｇ／日に達する栄養補助食品としても市販されているＧＲＡＳ物質であり、他方、栄養補助食品としてのレスベラトロールおよびクルクミンはそれぞれ２５０ｍｇ、５００ｍｇ／日の用量で使用される。プロピルパラベンは、食用脂肪量が０．１％ｗ／ｗである抗酸化／防腐食品添加物としてＦＤＡに承認されており、したがって１０ｍｇを上回る単回の用量は許容可能であるものと予想される。阻害剤のおおよその分子量を１００〜３００ダルトンと仮定すれば、各阻害剤の用量は、ＧＩ液（〜２５０ｍｌ）に溶解したときに濃度が１０〜３０００μＭ：最低用量＝２．５μｍｏｌ（０．２５〜０．７５ｍｇ）；最大用量＝７５０μｍｏｌ（７５〜２２５ｍｇ）：になることが予測される。生物活性成分は、その化合物および治療用途にしたがって０．５〜２００ｍｇの範囲で投与する。
【００４７】
多くの天然フェノール化合物の経口生物学的有用性は非常に低く、よって医療用途には有益でないことが多い。この技術によって、全身循環前代謝を阻害してその経口生物学的有用性を向上することで、多くの天然フェノール化合物の生物学的活性が実現可能となる。臨床用途の例としては、糖尿病（特に糖尿病前症および２型糖尿病）、心疾患（高脂血症を含む）、肝疾患（胆汁うっ滞と肝保護を含む）、肥満、メタボリック症候群、様々な癌、炎症性疾患（関節炎を含む）および抗老化（酸化防止）活性が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
実施例１．フェノール食品化合物によるフェニレフリン（ＰＥ）硫酸化のインビトロ阻害
背景．本インビトロ試験はＰＥの全身循環前硫酸化を阻害できる実行可能性について調査することを目的としている。
【００４９】
方法．フェノール化合物を、ＦＤＡの「ＧＲＡＳ」リスト、承認済みの食品添加物または栄養補助食品から選択した。モデルとしてＬＳ１８０細胞を使用し、ＰＥの全身循環前硫酸化に対するこれらのフェノール化合物の効果を試験した。ＰＥ（５０μＭ）±阻害剤（１００μＭ）を含む０．５ｍｌの培地で細胞を一晩インキュベートした。細胞外緩衝液を回収し、メタノールで細胞を抽出した。蛍光検出法にて逆相ＨＰＬＣによってＰＥを測定した。ＰＥ硫酸塩の形成をＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによって分析した。一元配置ＡＮＯＶＡにＤｕｎｎｅｔｔの事後テストを追加して結果（１群当たりｎ＝３）を分析した（ｐ＜０．０５；Ｐｒｉｓｍ５）。
【００５０】
結果．ＰＥ消失の程度は（対照＝５０３±１２７ｐｍｏｌ／ｈｒ）、以下のように有意に（ｐ＜０．０５）低下した（平均±ＳＤ、対照に対する％）：クルクミン２４±２４％、グアヤコール５１±１４％、イソオイゲノール７４±８％、プテロスチルベン７１±７％、レスベラトロール１４±４８％、ジンゲロン５２±２５％、ならびに組合せではオイゲノール＋プロピルパラベン４３±１５％、バニリン＋プロピルパラベン３７±１９％、オイゲノール＋プロピルパラベン＋バニリン＋アスコルビン酸３１±１９％、オイゲノール＋バニリン５８±３６％、およびプテロスチルベン＋ジンゲロン３７±１２％。組合せのクルクミン＋レスベラトロールおよびクルクミン＋プテロスチルベン＋レスベラトロール＋ジンゲロンはＰＥ消失をほぼ完全に阻害していた。それに応じて、ＰＥ硫酸塩形成は、グアイアコールでは３３±７％まで（対照＝１００％；６６５０±２６０μＶ＊Ｓ）、プテロスチルベン＋ジンゲロンでは２８±４％まで阻害された。組合せのクルクミン＋レスベラトロールおよびクルクミン＋プテロスチルベン＋レスベラトロール＋ジンゲロンは≧９９％のＰＥ硫酸塩形成を阻害した。しかし、没食子酸プロピル、バニリンまたはオイゲノールを単独で使用したとき、ＰＥ消失に対する有意な効果は無く、バニリンまたはオイゲノールを他の化合物と併用した場合に相乗効果があることが示唆された。
【００５１】
結論．レスベラトロールを含む数種の化合物および組合せはＰＥの全身循環前硫酸化を阻害し、その経口生物学的有用性を向上させることが可能である。
実施例２．
【００５２】
レスベラトロール（ＲＥＳ；２５μＭ）をＬＳ１８０細胞と共に、下記に収載した阻害剤（１００μＭ）の非存在下、あるいは存在下で４時間インキュベートした（実施例１に記載のとおり）。アスタリスクで印を付けた化合物は、阻害剤の無い対照と比較してレスベラトロール代謝（消失）を有意に阻害したものを表す。メチルパラベンおよびエチルバニリンは最も広範なレスベラトロール代謝阻害を示し、一方、桂皮酸、ピペリン、オイゲノール、バニリン、没食子酸プロピルおよびプロピルパラベンも有意な阻害を示した。
【００５３】
【表３】
2014527999.tif 000006
実施例３．
【００５４】
２‐メトキシエストラジオール（２‐ＭＥ；１０μＭ）をＬＳ１８０細胞と共に、下記に収載した阻害剤（１００μＭ）の非存在下、あるいは存在下で４時間インキュベートした（上記に記載のとおり）。アスタリスクで印を付けた化合物は、阻害剤の無い対照と比較して２‐メトキシエストラジオール代謝（消失）を有意に阻害したものを表す。オイゲノール、バニリン、没食子酸プロピルおよびプロピルパラベンでは２ＭＥ代謝の有意な阻害が観察された。
【００５５】
【表４】
2014527999.tif 000007
実施例．４
【００５６】
化合物をＬＳ１８０細胞と共に、阻害剤治療併用薬ＡもしくはＢまたはレスベラトールの非存在下または存在下で上記と同様にインキュベートした。併用薬Ａはケルセチン５０μＭ、エチルバニリン２５μＭ、イソオイゲノール２５μＭおよびプロピルパラベン２５μＭを含み；併用薬Ｂはレスベラトロール、クルクミン、ジンゲロンおよびプテロスチルベンを各２５μＭ含み；第３の治療薬はレスベラトロール１００μＭである。化合物、濃度およびインキュベート時間は、４‐メチルウンベリフェロンで（１μＭ；１．５時間；図２Ａ）、１‐ナフトールで（１μＭ、０．５時間；図２Ｂ）、ラズベリーケトンで（２．５μＭ、１５時間；図２Ｃ）、ピノレジノール（１μＭ、１．５時間；図２Ｄ）、マグノロール（１μＭ、１．５時間；図２Ｅ）、およびα‐マンゴスチン（１μＭ、１．５時間；図２Ｆ）であった。化合物の安定性に対する阻害剤の効果を制御するため、ＬＳ１８０細胞を含まない溶液を同様の条件下でインキュベートし、代謝が無い状態で予測される化合物濃度を修正するために使用した。紫外線および／または蛍光検出で逆相ＨＰＬＣによって試料を分析し、一元配置ＡＮＯＶＡにＤｕｎｎｅｔｔの事後テストを追加して結果を比較した。図２Ａ〜２Ｆは、ＬＳ１８０細胞によって、阻害剤治療を加えない化合物（対照）を＞５０％代謝できたことを示している。データから、併用薬Ａは４‐メチルウンベリフェロン、１‐ナフトール、ピノレジノール、マグノロールおよびα‐マンゴスチンの代謝阻害に最も効果的な治療であり、一方、併用薬Ｂはラズベリーケトンの代謝阻害に最も効果的であったことが分かる。
【００５７】
ラズベリーケトン、ピノレジノール、マグノロールおよびα‐マンゴスチンなどの化合物は、高脂血症、糖尿病、肥満、癌および炎症などの疾患の治療または予防に有用である前臨床的生物活性を有する。しかしこれらの化合物も全身循環前代謝に起因して経口生物学的有用性は非常に低く、臨床的有用性が不明瞭になっている。我々のデータでは、本明細書に記載の阻害剤併用薬は、選択したフェノール化合物の腸内代謝を減少できることが示されている。これらのフェノール性天然化合物は経口生物学的有用性を高める我々の阻害剤併用薬と共に服用すると、もっと効果的に使用でき、臨床的有益性を達成することが可能となる。
実施例．５
【００５８】
シリビン（２０μＭ）およびアルブテロールヘミ硫酸塩（２０μＭ）を、併用薬Ａの存在下、または非存在下で実施例４の記載と同様にＬＳ１８０細胞と共に１５時間インキュベートした。アルブテロール代謝は併用薬Ａによって有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。シリビンの既知の代謝物質の出現は併用薬Ａに有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。
【００５９】
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（図面の符号などの対応訳）
［図１］
（１）フェニレフリン３‐Ｏ‐硫酸塩の合成
（２）フェニレフリン
１．ＴＦＡ２Ｏ、２０℃、１５分
２．ＳＯ３＊Ｐｙｒ；ピリジン
９０℃、１８０分
３．ａｑ．１ＭのＫＨＣＯ３
２６℃、一晩
（３）フェニレフリン３‐Ｏ‐硫酸塩
カリウム塩
［図２］Ａ    ４‐メチルウンベリフェロン代謝の阻害
（１）  ４‐メチルウンベリフェロン
（２）  代謝された４‐メチルウンベリフェロン（細胞の無い溶液に対する％）
（３）  対照
（４）  併用薬Ａ
（５）  併用薬Ｂ
（６）  レスベラトロール
［図２］Ｂ    １‐ナフトール代謝の阻害
（１）  １‐ナフトール
（２）  代謝された１‐ナフトール（細胞の無い溶液に対する％）
（３）  対照
（４）  併用薬Ａ
（５）  併用薬Ｂ
（６）  レスベラトロール
［図２］Ｃ    ラズベリーケトン代謝の阻害
（１）  ラズケトン（ラズベリーケトン）
（２）  代謝されたラズケトン（細胞の無い溶液に対する％）
（３）  対照
（４）  併用薬Ａ
（５）  併用薬Ｂ
（６）  レスベラトロール
［図２］Ｄ    ピノレジノール代謝の阻害
（１）  ピノレジノール
（２）  代謝されたピノレジノール（細胞の無い溶液に対する％）
（３）  対照
（４）  併用薬Ａ
（５）  併用薬Ｂ
（６）  レスベラトロール
［図２］Ｅ    マグノロール代謝の阻害
（１）  マグノロール
（２）  代謝されたマグノロール（細胞の無い溶液に対する％）
（３）  対照
（４）  併用薬Ａ
（５）  併用薬Ｂ
（６）  レスベラトロール
［図２］Ｆ    α‐マンゴスチン代謝の阻害
（１）  α‐マンゴスチン
（２）  代謝されたα‐マンゴスチン（細胞の無い溶液に対する％）
（３）  対照
（４）  併用薬Ａ
（５）  併用薬Ｂ
（６）  レスベラトロール
【図１】
2014527999.tif 000008
【図２Ａ−Ｂ】
2014527999.tif 000009
【図２Ｃ−Ｄ】
2014527999.tif 000010
【図２Ｅ−Ｆ】
2014527999.tif 000011
【国際調査報告】
2014527999.tif 000012
2014527999.tif 000013
2014527999.tif 000014