(57)【要約】  本開示内容は、細胞内抗原を特異的に結合するリガンド、細胞膜浸透性カチオン性ペプチドおよび、細胞内の分泌経路との相互作用に適合するアミノ酸配列を含むペプチドを含む磁性粒子と、不均一な細胞集団から細胞を選別する際における該粒子の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内抗原を特異的に結合するリガンドと、細胞膜透過性カチオン性ペプチドと、細胞内の分泌経路との相互作用に適合するアミノ酸配列を含むペプチドとを含んでなる磁性粒子。
【請求項２】
前記細胞内抗原が実質的に核抗原である、請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項３】
前記核抗原が、ＦｏｘＯファミリーメンバー、ＴＡＲＰ、ｐ５３、Ｒｂ、Ｅ２Ｆ、ｈＫ４、ＢＲＣＡ１、Ｃｄｋ２、ＳＡＴＢ１、ＴＰ５３ＩＮＰ１、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎからなる群から選択される、請求項２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
前記細胞内抗原が実質的に細胞質抗原である、請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項５】
前記細胞質抗原が、Ｊａｋ３、ＧＡＴＡ  １−４、Ｓｔａｔｓ  １−６、ＣＢＰ、ＮＦｋＢ、ＩＫＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、Ｂ−ＲＡＦ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＶＥＧＦ、ＥＢＩ３、ｅＩＦ２α、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ＩＡＰ、Ｈｓ、Ｈｓｐ、ＦＡＫ、Ｒａｆ、Ｒａｓ、ＴＮＦ、Ｓｒｃ、Ｗｎｔ、Ａｂｌからなる群から選択される、請求項４に記載の磁性粒子。
【請求項６】
前記のカチオン性細胞膜浸透性ペプチドが天然の細胞浸透性ペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項７】
前記の細胞膜浸透性ペプチドが合成配列である、請求項１から５のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項８】
前記の細胞膜浸透性ペプチドが哺乳動物細胞への浸透に適合している、請求項６または７に記載の磁性粒子。
【請求項９】
前記細胞膜浸透性ペプチドが、YARKKRRQRRR、YARKARRQARR、YARAAARQARA、YARAARRAARR、YARAARRAARA、YARRRRRRRRR、YAAARRRRRRR、PLSSIFSRIGDP、RQIKIWFQNRRMKWKK、WEIEDEDER、GRKKRRQRRRPQ、RRRRRRRRRRRRからなる群から選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項１０】
前記細胞膜浸透性ペプチドが基本的に、アミノ酸配列：GRKKRRQRRRPQからなる、請求項９に記載の磁性粒子。
【請求項１１】
前記細胞膜浸透性ペプチドがアミノ酸配列：GRKKRRQRRRPQからなる、請求項１０に記載の磁性粒子。
【請求項１２】
前記細胞膜浸透性ペプチドが基本的に、アミノ酸配列：RRRRRRRRRRRRからなる、請求項９に記載の磁性粒子。
【請求項１３】
前記細胞膜浸透性ペプチドがアミノ酸配列：RRRRRRRRRRRRからなる、請求項１２に記載の磁性粒子。
【請求項１４】
前記の哺乳動物分泌経路との相互作用に適合するペプチドが、MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA、MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA、MYRMQLLSCIALSLALVTNSまたはMGVKVLFALICIAVAEからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項１５】
前記ペプチドが基本的にアミノ酸配列：MGVKVLFALICIAVAEからなる、請求項１４に記載の磁性粒子。
【請求項１６】
前記ペプチドがアミノ酸配列：MGVKVLFALICIAVAEからなる、請求項１５に記載の磁性粒子。
【請求項１７】
前記ペプチドが基本的にアミノ酸配列：MYRMQLLSCIALSLALVTNSからなる、請求項１４に記載の磁性粒子。
【請求項１８】
前記ペプチドがアミノ酸配列：MYRMQLLSCIALSLALVTNSからなる、請求項１７に記載の磁性粒子。
【請求項１９】
前記の細胞内抗原を結合するリガンドが抗体断片である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項２０】
前記抗体断片がｓｃＦｖである、請求項１９に記載の磁性粒子。
【請求項２１】
前記の細胞内抗原を結合するリガンドがペプチドまたはペプチドアプタマーである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項２２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項２３】
前記哺乳動物細胞が幹細胞である、請求項２２に記載の磁性粒子。
【請求項２４】
前記磁性粒子がさらに核移出ペプチドを含んでなる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の磁性粒子。
【請求項２５】
前記核移出ペプチドが、アミノ酸配列：NELALKLAGLDINKTEGEEDAQを含むか、基本的にこれからなる、請求項２４に記載の磁性粒子。
【請求項２６】
細胞の不均一集団から哺乳動物細胞を選別および単離するための方法であって、
i）哺乳動物細胞の不均一集団を含む第一調製物を形成し、
ii）該集団を、請求項１から２５のいずれか一項に記載の磁性粒子を含む第二調製物と接触させて組み合わせた調製物を提供し、細胞内抗原への該磁性粒子の浸透と結合を可能にする条件を提供し、
iii）該哺乳動物細胞の分泌経路によって、場合によっては磁場を用いて、前記の組み合わせた調製物をインキュベートして結合していない磁性粒子を除去し、そして
iv）磁場を前記の組み合わせた調製物に適用して、細胞内抗原に結合した磁性粒子を含む哺乳動物細胞を選択および単離する、
ことを含む方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物細胞が幹細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞が癌幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
YARKKRRQRRR、YARKARRQARR、YARAAARQARA、YARAARRAARR、YARAARRAARA、YARRRRRRRRR、YAAARRRRRRR、PLSSIFSRIGDP、RQIK IWFQNRRMKWKK、WEIEDEDER、GRKKRRQRRRPQ、RRRRRRRRRRRRの群から選択される選ばれた細胞膜浸透性カチオン性ペプチドと、MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA、MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA、MYRMQLLSCIALSLALVTNSまたはMGVKVLFALICIAVAEの群から選択される選ばれた分泌タンパク質と、活性化、洗浄およびブロッキング／貯蔵用緩衝液とを具備する、磁性粒子のカスタマイズ修飾のためのキット。
【請求項３０】
前記キットがさらに、核移出ペプチドを具備する、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記核移出ペプチドが、アミノ酸配列：NELALKLAGLDINKTEGEEDAQを含むか、基本的にこれからなる、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記キットがさらに、前記カスタマイズされた磁性粒子の使用のための磁石を具備する、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示内容は、細胞内抗原の、リガンド、概して抗体断片との親和性結合による哺乳動物細胞の不均一集団から哺乳動物細胞を選別および単離すること、および前記細胞を選別するための磁性粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
選択的な細胞分離は実験生物学および医学において重要な手法である。それは、方法の感度、選択性、収率、時間および経済性について益々需要が高まっている重要な方法である。細胞分離の最も主要な目的は、細胞混合物から標的集団を完全に取り除くことである。しかしながら、いくつかの用途では、二次目的が、付加的な操作のための研究のために選択された細胞を回収することとなっている。さらに、分離の純度は選択された細胞の収率よりも重要、またはその逆であることもある。よって、細胞分離の目的は、分離を達成するために選択される方法を決定する。分離技術を選択する際に考慮すべき他の要因は、処理時間、残留細胞の生存能力、および非医学的に承認された試薬への暴露である。
【０００３】
多くの細胞分離技術があり、これらは広義的に、サイズおよび密度に基づく技術と親和性（化学的、電気的または磁気的）に基づく技術の２つのカテゴリーに分類できる(Radisic et al, 2006)。
【０００４】
磁気性分離技術は、多くの研究室で一般的な方法であり、選択的細胞分離、抗体精製、タンパク質親和性精製、免疫沈降、タンパク質分画、細胞小器官単離、全核酸精製およびポリアデニル化ｍＲＮＡ精製などにおいてバイオ分離、画像法および標的薬物送達のために広く用いられている(Saiyed et al., 2003；Nord et al., 2001；Stark et al., 1988；Suzuki et al., 1996；Weissleder et al., 1997)。
【０００５】
磁気性細胞分離技術は、所望の細胞上の細胞表面抗原に特異的な抗体でコートした磁性ビーズからなる。抗体−磁性ビーズを混合細胞集団に曝露すると、それらは抗体−抗原相互作用を介して所望の細胞の表面に付着する。その後、所望の細胞亜集団は、強力な磁場の存在下で分離することができる。これらの用途に使用される抗体は、典型的には、細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体である。しかしながら、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片もまた、正常に磁性ビーズに結合され、ｓｃＦｖのファージディスプレイライブラリーのような種々の用途および腫瘍の画像法に用いられている（McConnell et al., 1999；Nord et al., 2001；Han et al., 2006）。
【０００６】
単一のＶＨおよびＶＬドメインは、抗原結合に必要な抗体の最小の機能モジュールである。ｓｃＦｖは１０〜２５アミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合である。その小さいサイズのものは抗体全体よりも際だった利点を有し、特に、完全なＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂよりも早い薬物動態、大きい腫瘍浸透および低い免疫原性を有する（Yokota et al., 1992）。それらはまた、腫瘍への放射性核種の選択的送達を含む臨床用途において特に有用であることが示されている(Huston et al., 1996；Reisfeld et al., 1996；Laske et al., 1997)。ｓｃＦｖは、特定のモノクローナル抗体の可変領域から組み立てられるか(Huston et al., 1988；Brinkmann et al., 1991)、またはファージディスプレイライブラリからデノボで作製されうる(Winter et al., 1994；Chester et al., 1994)。ｓｃＦｖは、元の免疫グロブリンの特異性を保持し、細菌発現系で容易に発現させることができるので、多くの用途において製造速度、収率および操作適応性の面で全体ＩｇＧの性能より優れている。実際、多くのｓｃＦｖは細菌内で良好な収率で製造されており、大腸菌内の不溶性封入体として(Huston et al., 1988)、あるいは周辺質に分泌されて(Skerra et al., 1993)、あるいは培養上清中(Takkinen et al., 1991)に製造される。
【０００７】
磁気性細胞分離の主な注意点は、それらの特定の表面抗原により分離されうる細胞にのみ適用可能であることである。これは、特に、細胞特異的マーカーが主に細胞内に見られ、細胞表面上で容易に利用可能でない場合には利用が制限される。実際、ほとんどの癌において、対象の癌マーカーは主に細胞内で発現されるので、細胞分離に使用することができない。抗体の細胞内在化を取り巻く固有の問題が、これまでの細胞分離における細胞内で発現する抗原の使用を難しくしていた。全モノクローナル抗体は、細胞の還元環境に応じて内在化することも発現させることもできない。
【０００８】
しかし、ｓｃＦｖは、通常安定して細胞内で発現され、伝達ペプチドのようなキャリア媒介システムの助けにより細胞内に内部移行することができていることが報告されている（Futaki et al., 2001；Avignolo et al., 2008；Niesner et al., 2002；Ma et al., 2011）。また、磁性粒子を用いた最近の研究により、外部の磁気を用いてそれら粒子を細胞内に内在化し、その位置を制御することができることが示された(Tseng et al., 2009)。さらに、外部の磁場を用いて癌細胞上の所望の位置に抗癌剤を含む細胞を向かわせる手段として磁性粒子が癌治療に用いられており、作用部位での治療化合物の生物学的利用能を増加させ、薬物動態を改善することによって薬剤の細胞毒性作用を低減することに繋がっている(Cinti et al., 2011)。磁性ビーズもまた、核酸(magnetofection) (Scherer et al., 2002)および小ペプチド(Han et al., 2006)を細胞内に内部移行させる手段として用いられ、カチオン性ペプチド(Smith et al., 2002)に結合してそのインビボ取り込みを向上させ、ＭＲＩ画像法への利用を可能としている(Stark et al., 1988；Suzuki et al., 1996；Weissleder et al., 1997)。さらに、それらは、固形腫瘍を有する患者における薬物の磁性標的化のために薬物に結合されている(Lubbe et al., 1996；Alexiou et al., 2000)。また、これら磁性粒子は、細胞取り込みのために受容体や他の細胞膜結合タンパク質に依存せず、通常は非許容である細胞をトランスフェクトすることができる(Scherer et al., 2002)。つまり、トランスフェクトすることが困難であることが知られている一次細胞でも同様である(Krotz et al., 2003)。
【発明の概要】
【０００９】
本開示内容は、細胞内マーカーの発現に基づいて細胞混合物から標的集団を分離し、次いで、更なる研究のためにこれらの細胞の回収を可能にするための方法を提供することによって、磁気性細胞分離の欠陥を克服すること、そして治療上の利益を達成することを目的とする。
【００１０】
本開示内容は、細胞表面マーカーではなくむしろ細胞内マーカーを使用して、異なる細胞種の混合集団から特定の細胞を単離するための方法に関する。この方法は、細胞内で発現される対象のマーカーに特異的である抗体断片を磁性粒子へ結合させることを含む。
【００１１】
本発明の態様によると、細胞内抗原を特異的に結合するリガンドと、細胞膜透過性カチオン性ペプチドと、細胞内の分泌経路との相互作用に適合するアミノ酸配列を含むペプチドとを含んでなる磁性粒子が提供される。
【００１２】
本発明の好適な実施形態では、前記細胞内抗原は実質的に核抗原である。
【００１３】
本発明の好適な実施形態では、前記核抗原は、ＦｏｘＯファミリーメンバー、ＴＡＲＰ、ｐ５３、Ｒｂ、Ｅ２Ｆ、ｈＫ４、ＢＲＣＡ１、Ｃｄｋ２、ＳＡＴＢ１、ＴＰ５３ＩＮＰ１、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、Ｅｔｓ、ＳＲＦ、ＦＡＫ、Ｐａｘ６、Ｃａｌｐａｉｎ、Ｅｌｋ１、Ｓｔａｔｓ１−３、Ａｋｔ、ｐ２１からなる群から選択される。
【００１４】
本発明の他の好適な実施形態では、前記細胞内抗原は実質的に細胞質抗原である。
【００１５】
本発明の好適な実施形態では、前記細胞質抗原は、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｔｙｋ２、Ｊａｋ３、ＧＡＴＡ１−４、Ｓｔａｔｓ１−６、ＣＢＰ、ＮＦｋＢ、ＩＫＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、Ｂ−ｒａｆ、ＥＢＩ３、ｅＩＦ２α、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ＩＡＰ、Ｈｓｐ、ＦＡＫ、Ｒａｆ、Ｒａｓ、ＴＮＦ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、カスパーゼ１−１２からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の好適な実施形態では、前記のカチオン性細胞膜浸透性ペプチドは天然の細胞浸透性ペプチドである。
【００１７】
本発明の他の好適な実施形態では、前記の細胞膜浸透性ペプチドは合成配列である。
【００１８】
本発明の好適な実施形態では、前記の細胞膜浸透性ペプチドは哺乳動物細胞に浸透するように適合されている。
【００１９】
本発明の好適な実施形態では、前記細胞膜浸透性ペプチドは、YARKKRRQRRR、YARKARRQARR、YARAAARQARA、YARAARRAARR、YARAARRAARA、YARRRRRRRRR、YAAARRRRRRR、PLSSIFSRIGDP、RQIKIWFQNRRMKWKK、WEIEDEDER、GRKKRRQRRRPQ、RRRRRRRRRRRRからなる群から選択される。
【００２０】
本発明の好適な実施形態では、前記細胞膜浸透性ペプチドは基本的に、アミノ酸配列：GRKKRRQRRRPQからなる。
【００２１】
好ましくは、前記細胞膜浸透性ペプチドは、アミノ酸配列：GRKKRRQRRRPQからなる。
【００２２】
本発明の好適な実施形態では、前記細胞膜浸透性ペプチドは基本的に、アミノ酸配列：RRRRRRRRRRRRからなる。
【００２３】
好ましくは、前記細胞膜浸透性ペプチドは、アミノ酸配列：RRRRRRRRRRRRからなる。
【００２４】
細胞浸透性ペプチドと分泌ペプチドはＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲ３領域に組み込まれてよい。
【００２５】
本発明の好適な実施形態では、前記の哺乳動物分泌経路と相互作用するように適合されているペプチドは、MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA、MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA、MYRMQLLSCIALSLALVTNSまたはMGVKVLFALICIAVAEからなる群から選択される。
【００２６】
本発明の好適な実施形態では、前記ペプチドは基本的にアミノ酸配列：MGVKVLFALICIAVAEからなる。
【００２７】
本発明の好適な実施形態では、前記ペプチドはアミノ酸配列：MGVKVLFALICIAVAEからなる。
【００２８】
本発明の好適な実施形態では、前記ペプチドは基本的にアミノ酸配列：MYRMQLLSCIALSLALVTNSからなる。
【００２９】
本発明の好適な実施形態では、前記ペプチドはアミノ酸配列：MYRMQLLSCIALSLALVTNSからなる。
【００３０】
本発明の好適な実施形態では、前記の細胞内抗原と結合するリガンドは抗体断片である。
【００３１】
抗体の様々な断片は、当技術分野で知られており、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ｓｃＦｖｓなどがある。Ｆａｂ断片は、互いに共有結合した免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的活性部分からなる多量体タンパク質であり、抗原に特異的に結合することができる。Ｆａｂ断片は、完全な免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断（例えば、パパインによるもの）を介して生成される。Ｆａｂ２断片は、２つの接合したＦａｂ断片を含む。これら２つの断片を免疫グロブリンヒンジ領域で接合すると、Ｆ（ａｂ’）２断片となる。Ｆｖ断片は、互いに共有結合した免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、抗原に特異的に結合することができる。また、断片は、結合する重鎖可変領域を含まない、唯一つの軽鎖可変領域を含有する単鎖ポリペプチド、または軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片、または、結合する軽鎖部分を含まない、重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片であってよく、抗体断片から多重特異性抗体が形成されうる。これは例として米国特許第６２４８５１６号に記載されている。Ｆｖ断片または単一領域（ドメイン）断片は、典型的には、関連する特定された領域の宿主細胞株での発現によって生成される。これらおよび他の免疫グロブリンまたは抗体断片は、本発明の範囲内であり、William E. Paul, Fundamental Immunology やJaneway et al. Immunobiology (上掲)などの標準的な免疫学の教科書に記載されている。分子生物学は現在、これら断片の直接合成（細胞中での発現を介して、あるいは化学的に）、ならびにそれらの組み合わせの合成を可能としている。抗体または免疫グロブリンの断片は、上記のように、二重特異性機能を有することができる。
【００３２】
細胞内で抗体断片を細胞へ送達する方法は当分野で知られており、例えば出典明記によりそれぞれその全体が援用される、国際公開２００７／０６４７２７；国際公開２００４／０３０６１０；国際公開０３／０９５６４１；国際公開０２／０７６７１；国際公開０１／４３７７８；国際公開９６／４０２４８；および国際公開９４／０１１３１を参照のこと。
【００３３】
本発明の好適な実施形態では、抗体断片は、ＳｃＦｖまたは、単一のＶＨないしはＶＬドメインである。
【００３４】
本発明の他の好適な実施形態では、細胞内抗原を結合するリガンドはペプチドまたはペプチドアプタマーである。
【００３５】
標的抗原に対して結合親和性を有するペプチド、例えば、抗体および抗体断片の結合親和性を模するペプチドは本発明の範囲内である。Chattophadayay, A, Tate, S., Beswick, R., Wagner, S.D. and Ko Ferrigno, P. A peptide aptamer to antagonise BCL-6 function. Oncogene, 25 2223-2233 (2006)を参照のこと。
【００３６】
本発明の好適な実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
【００３７】
本発明の他の好適な実施形態では、磁性粒子はさらに核移出ペプチドを含む。
【００３８】
本発明の好適な実施形態では、核移出ペプチドは、アミノ酸配列：NELALKLAGLDINKTEGEEDAQを含むか、基本的にこれからなる。
【００３９】
本発明の更なる態様によると、本発明は、細胞の不均一集団から哺乳動物細胞を選別および単離するための方法であって、
i）哺乳動物細胞の不均一集団を含む第一調製物を形成し、
ii）該集団を、本発明による磁性粒子を含む第二調製物と接触させて組み合わせた調製物を提供し、細胞内抗原への該磁性粒子の浸透と結合を可能にする条件を提供し、
iii）該哺乳動物細胞の分泌経路によって、場合によっては磁場を用いて、前記の組み合わせた調製物をインキュベートして結合していない磁性粒子を除去し、
iv）磁場を前記の組み合わせた調製物に適用して、細胞内抗原に結合した磁性粒子を含む哺乳動物細胞を選択および単離する、
ことを含む方法が提供される。
【００４０】
本発明の好適な方法では、哺乳動物細胞は幹細胞である。
【００４１】
好ましくは幹細胞は癌幹細胞である。
【００４２】
正常な分化の異常型としての分化した腫瘍塊中の癌幹細胞の概念は、腫瘍形成の現在の確率モデルにより受け入れられつつある。このモデルにおいては、すべての腫瘍細胞の増殖および腫瘍開始能の両方が同等である（Hamburger et al., 1977；Pardal et al., 2003）。例えば、白血病では、ＣＤ３４＋ＣＤ３８表面抗原の発現によって定義される腫瘍細胞の稀な表現型サブセット(Bonnet et al., 1997)には、新たに腫瘍増殖を開始する能力があり、白血病幹細胞（ＬＳＣ）と呼ばれている。また、前立腺癌（Collins et al., 2005）、乳癌（AlHajj et al., 2003）、脳の癌（Singh et al., 2004）、肺癌（Kim et al., 2005）、大腸癌（O'Brien et al., 2007；Ricci Vitiani et al., 2007）および胃癌（Houghton et al., 2004）などの「固体」の癌にも同様な腫瘍開始細胞が見られる。細胞内の癌幹細胞マーカーを表１に列挙する。
【００４３】
本発明の態様によると、YARKKRRQRRR、YARKARRQARR、YARAAARQARA、YARAARRAARR、YARAARRAARA、YARRRRRRRRR、YAAARRRRRRR、PLSSIFSRIGDP、RQIKIWFQNRRMKWKK、WEIEDEDER、GRKKRRQRRRPQ、RRRRRRRRRRRRの群から選択される選ばれた細胞膜浸透性カチオン性ペプチドと、MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA、MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA、MYRMQLLSCIALSLALVTNSまたはMGVKVLFALICIAVAEの群から選択される選ばれた分泌タンパク質と、活性化、洗浄およびブロッキング／貯蔵用緩衝液とを含む、磁性粒子のカスタマイズ修飾のためのキットが提供される。
【００４４】
本発明の好適な実施形態では、キットはさらに、前記カスタマイズされた磁性粒子の使用のための磁石を含む。
【００４５】
磁性粒子は、抗体断片（ｓｃＦｖ、単一ドメイン、ジボディ）、細胞透過性ペプチドおよび分泌ペプチドに対して、または抗体断片および分泌ペプチドに対して結合することができる。
【００４６】
細胞透過性ペプチドおよび分泌ペプチドは、融合タンパク質としての発現によりあるいは抗体とペプチドとの化学的カップリングにより磁性粒子または抗体断片に直接結合させるか、あるいは既に記載されている(Jeong et al. 2011)ようにＶＨまたはＶＬドメインのＣＤＲ３領域内に移植してもよい。
【００４７】
磁性抗体断片は、細胞と共にインキュベートし、送達ビヒクルとしてカチオン性ペプチドや磁性粒子の陽性荷電を用いて細胞内へ内部移行させる。抗体磁性粒子の細胞内部移行が達成された後、細胞を細胞培地内で一定期間インキュベートし、磁性抗体断片をその標的に結合させる。次いで、結合しなかった磁性抗体断片を、外部磁石の有無にかかわらず、分泌ペプチドによって細胞から分泌させる。それぞれの標的に結合した抗体断片のみを含む細胞は、外部磁石を用いて選別することができる。この段階で未結合細胞が洗い流される。次いで、選別した細胞は、その後の利用のためにさらにインキュベートされうる（図１）。
【００４８】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、「含む」および「含有する」なる語句およびこれら語句の変形、例えば「含んでいる」および「含み」は、「含むがこれらに限定しない」ことを意味し、他の部分、付加物、成分、整数または工程を除くことを意図しない（または除かない）。
【００４９】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の必要性がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、文脈上別段の必要性がない限り、複数形および単数形を考慮しているものと理解される。
【００５０】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分、または基は、本明細書において記載されている任意の他の態様、実施形態、または実施例と矛盾しない限り、それらに適用可能であると理解される。
【００５１】
表１  細胞内癌幹細胞マーカー
2014527180.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】磁性細胞内細胞分離技術（ＭＩＣＥＬＳ）における一連の順序を示す図。磁性粒子（１）は、細胞浸透性陽性荷電ペプチド（２）、細胞移出ペプチド（３）およびｓｃＦｖ抗体断片（４）にカップリングする。ステップ１。磁気−タンパク質複合体は、完全に細胞内に内部移行するまで、混合細胞集団と共に相当時間インキュベートする。ステップ２。ｓｃＦｖ抗体断片は、細胞内で利用可能なそれらの標的抗原（Ａｇ）に特異的に結合し、それによって、これらの細胞の内部に固定される。ステップ３。特定の標的抗原に結合しなかった任意の磁気−タンパク質複合体は、細胞分泌経路を介して移出ペプチドにより細胞外環境に分泌される。このステップは、特定の標的抗原を発現しない細胞の選択を回避するものである。ステップ４。外部磁場を細胞に適用して、磁性複合体を含有する細胞のみを磁石に結合させる。細胞集団の残りは洗い流すことができる。選択された細胞についてさらに以降の用途に使用することができる。
【図２】ｓｃＦｖ磁気−タンパク質複合体によるＣＨＯおよびＡ５４９細胞のＭＩＣＥＬＳ選別。（Ａ）段階的に希釈したｓｃＦｖ磁気−タンパク質複合体（４０μｇ〜２．５μｇ）を含む２４ウェルプレートでのＡ５４９細胞のＭＩＣＥＬＳ選別。青色矢印は選別した細胞ペレットの位置を示す。磁気−タンパク質複合体の濃度が減少するにつれ選択細胞の量も減少した。４０μｇの磁気−タンパク質複合体のときに最も良好な細胞選別が得られた。（Ｂ）ｓｃＦｖ磁気−タンパク質複合体と４．５時間インキュベートした後のＣＨＯ（Ａ、Ｂ）およびＡ５４９（Ｃ、Ｄ）細胞の共焦点画像解析。細胞は画像解析の前にＰＢＳにて十分に洗浄した。細胞膜、核周辺膜および細胞質に位置する緑色の磁気−タンパク質複合体は、Ａ５４９肺癌細胞株内の活性化Ｒａｓの細胞内位置と一致する。４．５時間インキュベートした後のＣＨＯ細胞では磁気−タンパク質複合体は観察されなかった。
【図３】４０μｇのｓｃＦｖ磁気−タンパク質によるＡ５４９およびＣＨＯ細胞のＭＩＣＥＬＳ選別。ＭＩＣＥＬＳを用いて選別したＡ５４９細胞（Ａ）およびＣＨＯ細胞（Ｂ）の画像は１０倍対物レンズで撮影した。ＰＢＳにて十分に洗浄し、トリプシン処理を行い、磁石にて細胞を選別した後に撮像した。ＣＨＯ細胞の最小バックグラウンドが選別後に観察された。（Ｃ、Ｄ）選別後に得られたＡ５４９細胞ペレットの蛍光および明視野共焦点画像。（Ｅ、Ｆ）ＭＩＣＥＬＳ選別の後に培養物に戻したＡ５４９細胞の合併共焦点画像。２４時間時に撮像したが、有意な細胞毒性は観察されなかった。
【実施例】
【００５３】
材料および方法
Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ  ｓｃＦｖの製造
変異型Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ(Tanaka et al., EMBO Journal 2007)に特異的なｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ＃６）の配列を鋳型としてGeneArt（登録商標）(Life Technologies)によるｓｃＦｖ＃６の合成に用い、５’および３’末端にそれぞれＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１を隣接させた。ｐＲＳＥＴａ細菌発現ベクター(Life Technologies)のＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１部位に遺伝子をサブクローニングし、６×ヒスチジンタグを有するインフレーム融合ｓｃＦｖタンパク質を生成した。ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌細胞(Merck-Millipore)にプラスミドを形質移入し、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して５００ｍｌの培養物中でＯＤ６０００．５５でｓｃＦｖ＃６断片の発現を誘導し、３７℃で３時間インキュベートした。４℃、５０００×ｇで遠心分離して細胞を回収し、最終の細胞ペレットをｓｃＦｖ精製まで−８０℃に保存した。
【００５４】
２５ｍｌのＢ−ＰＥＲ細菌溶解緩衝液中、プロテアーゼインヒビターの混合溶液（１．５μｇ／ｍｌのキモトリプシン、０．８μｇ／ｍｌのサーモリシン、１ｍｇ／ｍｌのパパイン、１．５μｇ／ｍｌのプロナーゼ、１．５μｇ／ｍｌの膵臓抽出物、０．００２μｇ／ｍｌのトリプシン）(Roche)の存在下にて、室温で３０分、細菌ペレットからｓｃＦｖタンパク質を抽出した。溶解物を４℃で１５０００×ｇで遠心分離し、上清を２５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に希釈した。Ｈｉｓ−タグ付加  ｓｃＦｖ＃６タンパク質を１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース(Qiagen)重力フロースルーにて精製し、その後２０ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール）にて洗浄し、５ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール）に溶出させた。その後、溶出させたタンパク質を０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０に対して透析し、凍結させて、１．４ｍｇ／ｍｌのパパイン濃度で−８０℃に保存した。
【００５５】
磁性粒子
１００ｎｍの平均サイズを有する生分解性磁性ナノ粒子（動的光散乱によるもの）はChemicell、ベルリン、ドイツから購入した。この粒子は、ナノスクリーンＭＡＧ−ＡＲＡに拡張されるナノスクリーンＭＡＧ粒子と称され、生体分子への結合に用いられるグルクロン酸により酸化鉄コアが表面コーティングされていることを指し、緑色の範囲の光を放つ親油性蛍光色素に覆われている（Ｅｘｃ．＝４７６ｎｍ／Ｅｍｍａｘ＝４９０ｎｍ）。
【００５６】
蛍光磁性粒子のタンパク質へのカップリング
ＦＩＴＣ標識Ｔａｔ細胞浸透性ペプチド５（６）−カルボキシフルオセイン-GRKKRRQRRRPQとガウシアフシフェラーゼ分泌ペプチド５（６）−カルボキシフルオセイン-MGVKVLFALICIAVAEAは、ＪＰＴペプチドテクノロジーズＧＭｂＨによって合成した。凍結乾燥させたペプチドは、１００μｌのＤＭＳＯに再懸濁し、次いで１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４にて１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、十分に凍結させ、一定分量で−８０℃に保存した。
【００５７】
磁性粒子は、ＭａｇｎｅｔｏＰｕｒｅ(Chemicell, ベルリン、ドイツ)磁性分離器を用いて１ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０にて２回洗浄して活性化した。２度洗浄した後、粒子を０．２５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０に再懸濁した。緑色蛍光磁性ビーズであるナノスクリーンＭＡＧ／Ｇ−ＡＲＡ上のカルボキシル基を、０．２５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中に１０ｍｇのＥＤＣを溶解することによって、新たに調製したＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（Sigma）にて活性化した。ＥＤＣ緩衝液を粒子に加え、１０分間室温でゆっくりと混合した。このインキュベートの後、磁性粒子を１ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０にて２回洗浄し、０．２５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０に再懸濁した。
【００５８】
２００μｇのｓｃＦｖ＃６精製タンパク質を、０．２５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０中の１５０μｇのＴａｔ細胞浸透性ペプチドおよび２００μｇのガウシアフシフェラーゼ移出ペプチドと混合した。このタンパク質混合物を１０ｍｇの活性化粒子に加え、２時間室温でゆっくりと混合して磁気−タンパク質複合体を生成した。この粒子は、１ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄し、５００μｌのブロッキング／貯蔵緩衝液（１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム)に再懸濁した。
【００５９】
細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＡ５４９ヒト肺癌細胞株（変異体Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ抗原を構造的に発現するもの）は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２９ｍｇのＬグルタミンを添加したＧｉｂｃｏ（登録商標）のハムＦ１２選択栄養混合培地(Life Technologies)中で３７℃、５％ＣＯ２の加湿大気下で維持した。
【００６０】
磁性細胞内細胞分離技術（ＭＩＣＥＬＳ）
ＣＨＯおよびＡ５４９細胞株は、磁性選別の前日に、１ｍｌの成長培地を含む２４ウェルガラス底プレート(In Vitro Scientific)中に２×１０５細胞／ウェルで播き、磁性細胞分離時に細胞の密集度を９０〜９５％にした。翌日、予め３７℃に温めた新鮮成長培地に培地を交換した。磁気−タンパク質混合物の４０μｇから２．４μｇまでの段階希釈物を、１００μｌの無血清ハムＦ１２培地とゆっくりと混合し、細胞へ液滴添加した。この細胞を、５％ＣＯ２の加湿大気下、３７℃で１．５時間、磁気−タンパク質複合体とインキュベートし、これらを細胞へ形質導入した。次いで、この細胞をＰＢＳにて５回十分に洗浄し、さらに３時間インキュベートした。３時間インキュベートした後、結合しなかった磁気−タンパク質複合体を細胞分泌経路を介して細胞から分泌させる。次いで細胞をＰＢＳにて５回十分に洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ(Invitrogen)にて２４ウェルプレート中でトリプシン処理した。０．５ｍｌの新鮮Ｆ１２成長培地を各ウェルに添加してトリプシンを不活性化し、細胞選別のために２４ウェルプレートをＭａｇｎｅｔｏＰＵＲＥ (Chemicell, ベルリン、ドイツ)磁性分離器上に置いた。この時点で、磁気−タンパク質複合体を含まない細胞は、磁性分離器上で５００μｌのＰＢＳにて３回ゆっくりと洗い流された。次いで、磁性分離器を取り除き、Ｒａｓの活性化型に結合した磁気−ｓｃＦｖ複合体を含む残りの細胞をさらに、５％ＣＯ２の加湿大気下、３７℃で４８時間、５００μｌの成長培地中でインキュベートした。
【００６１】
画像取得レーザー走査共焦点顕微鏡
１０倍、２０倍および４０倍／１．３ＮＡ油浸レンズを用いた倒立Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ共焦点顕微鏡により、レーザー走査共焦点顕微鏡を行った。アルゴン４８８ｎｍレーザーおよび５０５−５３０ｎｍのＢＰ発光フィルターを用いてＦＩＴＣを撮像した。
【００６２】
実施例
細胞表面タンパク質よりもむしろ細胞内タンパク質を用いて全生細胞を分離する方法（ＭＩＣＥＬＳ磁性細胞内細胞分離）は、ｓｃＦｖ抗体断片と細胞浸透性ペプチドおよび細胞移出ペプチドとに磁性粒子をカップリングさせることによって開発された（図１）。本研究では癌原遺伝子変異体ＲａｓＧ１２Ｖをモデル系として用いてＭＩＣＥＬＳ技術を試験した。Ｒａｓタンパク質は、低分子量ＧＴＰアーゼとして知られるタンパク質のクラスに属し、分子スイッチとしてシグナル伝達に重要な役割を果たしている。これらタンパク質は、活性化（ＧＴＰ結合型）状態と非活性化（ＧＤＰ結合型）状態との間で構造的な差異を表す２つのスイッチ領域を介して相互作用する（Vetter and Wittinghofer, 2001）。 時に、これらＲａｓタンパク質に変異（Ｋ、ＨまたはＮＲＡＳ）が起こり、シグナルに依存しない様式で細胞形質転換を促す構造的に活性化されたＧＴＰ結合型となり(Adjei, 2001)、これにより、細胞増殖やアポトーシスからの保護が促される。ヒトの癌のおよそ３０％は発癌性Ｒａｓ変異を含み、高い確率で膵臓、大腸および肺の腺癌となる(Grewal et al., 2011)。Ｒａｓアイソフォーム（Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓ）は主に内部細胞膜に位置するが、近年、それと同時にゴルジ体、ＥＲ、エンドソームおよびミトコンドリアなどの細胞内小器官とも関連していることが示された(Grewal et al., 2011)。
【００６３】
特定のＲＡＳ変異体よりもむしろ、Ｒａｓの活性化型に特異的に結合することが既に示されているｓｃＦｖ抗体断片（ｓｃＦｖ＃６）(Tanaka et al., EMBO Journal 2007)を本研究に用いた。遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ（Life Technologies）にて合成し、続いて細菌発現系ｐＲＳＥＴにサブクローニングしてＨｉｓタグ付加ｓｃＦｖを生成した。タンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌中で発現させ、ＦＩＴＣ標識Ｔａｔ浸透性ペプチドと共に緑色蛍光磁性ビーズにカップリングさせて、細胞内への複合体の移送を容易にした。ＦＩＴＣ標識ガウシアルシフェラーゼ移出ペプチドも同様にカップリングさせてＭＩＣＥＬＳ複合体を生成した。移出ペプチドは、古典的または非従来型の細胞分泌経路(Nickel, 2005)によって細胞外環境へ磁気複合体を向かわせる。活性化Ｒａｓタンパク質に固定しなかった複合体は分泌される。
【００６４】
磁気−タンパク質複合体の４０μｇから２．４μｇまでの段階希釈物は、２４ウェルプレート中でＣＨＯおよびＡ５４９細胞と共に１．５時間インキュベートし、それらを細胞内に形質導入した。次いで細胞をＰＢＳにて十分に洗浄し、細胞に導入しなかった複合体を除去した。さらに３時間インキュベートして、移出ペプチドが細胞内の複合体を再局在化できるようにし、細胞移出系を介してそれらを排出させた。これによりＲａｓ抗原を認識しなかった複合体が確実に除去された。次に、トリプシン処理の前に細胞を再度十分に洗浄し、磁石にて選別した（図２）。
【００６５】
磁気−タンパク質複合体を含む細胞はゆっくりと磁石に向かって移動した。これらを磁性分離によってＰＢＳにてゆっくりと洗浄し、磁気−タンパク質複合体を含まない細胞を確実に除去した。上清を取り除き、活性化Ｒａｓを含む全生細胞をＭＩＣＥＬＳ法を用いて選別し、培養物中へ戻した（図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。２４時間後、細胞は、磁気−タンパク質複合体を含む培養物に細胞を分けた（図３Ｅ、Ｆ）。親油性蛍光色素及び磁気−タンパク質複合体の多糖グルクロン酸コーティングは、最終的に、細胞に毒性がない磁気ビーズの酸化鉄コアのみを残して細胞内部で分解する。これは、酸化鉄ナノ粒子がリソソームの内部に存在し(Becker et al., 2007)、最終的には酵素加水分解を介して鉄イオンに分解されると考えられている(Shuayev et al., 2009)。
【００６６】
磁気−タンパク質複合体は細胞内区画に局在化する
細胞内で生じる細胞シグナル伝達事象に応じて、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓアイソフォームはすべて細胞膜並びにＥＲ、ゴルジ、エンドソームなどの多くの他の細胞小器官および核周辺膜に局在化することが示されている(Grewal et al., 2011)。本研究では、Ａ５４９肺癌細胞株中の活性化Ｒａｓの局在化パターンと一致して、ｓｃＦｖ磁気−タンパク質複合体は、細胞膜、核周辺膜および細胞質内の異なる細胞内小胞に局在化した。４０μｇの複合体を用いた場合に細胞選別について最適な結果が得られた。選別された細胞の数は、複合体の濃度の減少と共に減少した（図２Ａ）。
【００６７】
抗原特異的抗体断片を磁性ビーズにカップリングさせることと、これら複合体の細胞内取り込みを促すための細胞浸透性ペプチドおよび、細胞分泌経路を介して結合しなかった複合体を分泌させるための細胞移出ペプチドを用いることによって、細胞内タンパク質を用いて細胞を選別するための簡便な方法を本明細書中に記載する。
【００６８】
本方法は迅速かつ簡便であり、最小限の作業を必要とするのみである。さらに、細胞毒性が無いので、細胞をそれ以降の利用に供することができる。
【００６９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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