(57)【要約】本開示は、バイオマーカーとしてＳＰ１７を利用する、患者が卵巣癌を経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法を提供する。本開示はまた、卵巣癌のリスクがあると同定された、あるいはより不良な予後を有すると同定された患者を処置するための方法および治療を提供する。患者が卵巣癌を経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法が提供され、この方法は、上記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、ここでＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、上記患者を、卵巣癌を経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または上記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、上記患者を、卵巣癌を経験する可能性が低いものとして同定する。
2014527816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が卵巣癌を経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法であって、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、ここでＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、前記患者を、卵巣癌を経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、前記患者を、卵巣癌を経験する可能性が低いものとして同定する、方法。
【請求項２】
前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、
ａ．ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、卵巣癌を経験する可能性がより高いものとして同定し、
ｂ．ＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＣＡ１２５レベルかつＳＰ１７レベルの非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７レベルが、前記患者を、卵巣癌を経験する可能性が低いものとして同定する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
卵巣癌患者がより長いまたはより短い全生存期間を経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法であって、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、ここでＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、前記患者を、より短い全生存期間を経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、前記患者を、より長い全生存期間を経験する可能性が高いものとして同定する、方法。
【請求項４】
前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、
ａ．ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、より長い全生存期間の可能性がより低いものとして同定し、
ｂ．ＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＣＡ１２５レベルかつＳＰ１７レベルの非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７レベルが、前記患者を、より長い全生存期間の可能性がより高いものとして同定する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
処置を必要とする卵巣癌患者を処置するための方法であって、有効量の適した治療を前記患者に投与するステップを含み、ここで前記患者が、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定することを含む方法によって前記処置を必要とするものとして同定され、ここでＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、前記患者を、前記処置を必要とするものとして同定する、方法。
【請求項６】
前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、前記処置を必要とするものとして同定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子発現レベルが、前記試料における、前記遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を決定するステップ、および／またはＳＰ１７タンパク質の量を決定するステップを含む方法により決定される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現レベルが、ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたはマイクロアレイのうち１種または複数種を含む方法により決定される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子発現レベルが、免疫組織化学によりポリペプチドを検出するステップを含む方法により決定される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、ヒト患者である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、血液、血清または尿から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
卵巣癌患者の診断、予後および／または処置において用いるためのキットであって、患者試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルおよび任意選択でＣＡ１２５遺伝子の発現レベルの決定に適した試薬と、前記患者の診断、予後および／または処置のための説明書とを含む、キット。
【請求項１３】
前記患者が、動物、哺乳動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、イヌ、ウマまたはヒト患者である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ある量の、前記卵巣癌患者を処置するために有効な治療をさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１１年９月１５日に出願された米国仮出願第６１／５３５，３０９号（この内容は、参考として本開示へ援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開特許明細書が、それを特定する引用、または代替的にアラビア数字により参照されている。これらの引用の完全な文献目録情報は、特許請求の範囲の直前の参考文献の節に見ることができる。本文において参照またはアラビア数字により参照されているあらゆる刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、これにより本開示において、本発明が属する技術の水準をより十分に説明するために、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。
【０００３】
卵巣がんは、女性にとって最も重大な健康上の懸念の一つであり、雌性におけるがん関連死の主要原因において５番目にランク付けされ、婦人科系悪性疾患関連死全体の２番目にランク付けされる（１（非特許文献１））。現在、血清ＣＡ１２５は、良性および悪性卵巣病変の間を識別し、再発を検出し、処置に対する応答をモニターするために最も広範に用いられているバイオマーカーである（２（非特許文献２））。しかし、初期卵巣がんの最大５０％および進行期卵巣がんの１０％は、正常ＣＡ１２５レベルを有するため、このマーカーは限界を示す（２、３（非特許文献２、３））。この疾患の死亡率は、過去１０年間有意に変化しなかったため（４（非特許文献４））、卵巣がんの診断および予後のための革新的なツールに対する差し迫った必要がある。
【０００４】
初期の無症状期に疾患を検出することのできる検査は、大半の患者を救うであろうが、多大な努力にもかかわらず、この方向に向けた進歩は不十分であり、現在のスクリーニング技法が、卵巣がん死亡率を低下させることの証拠はない（５）。ＣＡ１２５は、治療に対する応答および再発の評価に有用であるが、その低い特異性（約２０％、試験に依存する）のために診断目的には不適である（６〜８）。ＣＡ１２５検査の改善を目標とし、卵巣がんの新規バイオマーカーを同定するために莫大な努力が為されている（９）。現在のところ、同定されたバイオマーカーのいずれも、その臨床応用が正当であると証明するために必要とされる感度および特異性のレベルを達成すると示されていない（９、１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ  Ａら、Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１０．  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２０１０；６０：２７７〜３００
【非特許文献２】Ｓｔａｎｙ  ＭＰら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｍａｋｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．  ＡＪＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ（２０１０）；１９４：３３７〜４２
【非特許文献３】Ｓｔａｆｆ  ＡＣら、Ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１５  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ（２０１０）；１１８：２３７〜４３
【非特許文献４】Ｂｅｒｒｉｎｏ  Ｆら、Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｏｒ  ｅｉｇｈｔ  ｍａｊｏｒ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｌｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｉｎ  １９９５−９９：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＵＲＯＣＡＲＥ−４  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ（２００７）；８：７７３〜８３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）は、卵巣がんにおける疾患および処置応答のモニターに唯一利用できるバイオマーカーである。本出願人らは、がん／精巣抗原（ＣＴＡ）ファミリーのメンバーであるＳＰ１７（１１）が、卵巣がん細胞から正常卵巣の識別（１２、１３）および異種移植マウスモデルにおける卵巣がん疾患の追跡（１４）を可能にする有望なバイオマーカーであることを以前に示した。未だにほんの数例の研究しか、腫瘍バイオマーカーとしてのＳＰ１７の潜在能力および有用性を調査しておらず（１４〜１８）、そのいずれも末梢血におけるＳＰ１７発現を評価しなかった。そこで、本出願人らは、ステージＩ〜ＩＶ卵巣がん患者、良性卵巣病変および健康な女性のコホートにおける予後および診断ツールとして、自由に循環している血清ＳＰ１７レベル測定値の統計的有意性を評価した。本出願人らの試験に基づき、腫瘍関連抗原、精子タンパク質１７（ＳＰ１７）が、卵巣がんにおいて異常に発現されるが、正常な卵巣組織には存在せず、これにより卵巣がんの新規予後および診断バイオマーカーとなることが開示される。
【０００７】
本明細書においてより詳細に記述する通り、本出願人らは、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学により、卵巣がん患者、良性卵巣病変および健康な被験体由来の原発性卵巣組織におけるＳＰ１７発現を解析した。同一被験体の血清におけるＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。この解析から、本開示は、患者が卵巣がんを経験する可能性が高いか（即ち、卵巣がんを発症するリスクがあるか）その可能性が低いかを決定するための方法であって、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルが、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性が低いものとして同定する、方法を提供する。さらなる態様において、この方法は、前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性がより高いものとして同定し、ＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＣＡ１２５レベルかつＳＰ１７レベルの非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７レベルが、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性が低いものとして同定する。
【０００８】
卵巣がん患者がより長いまたはより短い全生存期間を経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法であって、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、前記患者を、より短い全生存期間を経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、前記患者を、より長い全生存期間を経験する可能性が高いものとして同定する、方法もまた提供される。さらなる態様において、この方法は、前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、より長い全生存期間の可能性がより低いものとして同定し、ＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＣＡ１２５レベルかつＳＰ１７レベルの非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７レベルが、前記患者を、より長い全生存期間の可能性がより高いものとして同定する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、原発性卵巣がん細胞におけるＳＰ１７発現を示す。図１Ａ。様々な試料においてＰＣＲを行い、正常卵巣、良性卵巣腫瘍状態、卵巣がん患者およびＳｋｏｖ−３卵巣がん細胞株におけるＳＰ１７の存在を解析した。精巣は、内部陽性対照であった。陽性バンドシグナルは、精巣、卵巣がん患者の試料およびＳｋｏｖ−３細胞株において検出可能であった。図１Ｂ。様々な卵巣試料におけるＩＨＣ。正常卵巣および良性卵巣腫瘍状態は、染色なしであったが、一方、陽性褐色染色は、全卵巣がんステージにおいて示される。表示されている写真は、全ステージにおける様々な腫瘍の代表である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、カプラン・マイヤー生存曲線を示す。両方のマーカーに対するログランク検定（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）ｐ＜０．００１。
【図３】図３Ａから図３Ｅは、ＳＰ１７およびＣＡ１２５検査の診断性能を例証する。ＡからＤは、ＳＰ１７およびＣＡ１２５のＲＯＣ曲線を示す。ｚ検定により各設定におけるＳＰ１７のＡＵＣをＣＡ１２５  ＡＵＣと比較した。Ａ。ＳＰ１７  ＡＵＣ＝０．９８５、ＣＡ１２５  ＡＵＣ＝０．８６９、ｚ検定ｐ＝０．０４７；Ｂ。ＳＰ１７  ＡＵＣ＝０．９８８、ＣＡ１２５  ＡＵＣ＝０．９６９、ｚ検定ｐ＝０．９９２；Ｃ。ＳＰ１７  ＡＵＣ＝０．９９１、ＣＡ１２５  ＡＵＣ＝０．９４１、ｚ検定ｐ＝０．９９７；Ｄ。ＳＰ１７  ＡＵＣ＝０．９９２、ＣＡ１２５  ＡＵＣ＝０．９８２、ｚ検定ｐ＝０．９１７；Ｅ。卵巣がんの初期検出のためのＣＡ１２５およびＳＰ１７検査を組み合わせたアルゴリズム。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施は、他に断りがなければ、当該分野の技術の範囲内で分子生物学（組換え技法を包含）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は、文献において、例えば、次の刊行物において十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版（２００１年）；シリーズＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；ＰＣＲ  １：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年））；ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５年））；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９９９年））；ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ第５版（２００５年））；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ編（１９８４年））；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年））；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｍ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年））；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年））；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年））；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４年）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編（１９８７年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＩＮ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｓ．Ｃ．  Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３年））ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７年））；ＷＥＩＲ’Ｓ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｌ．Ａ．  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６年））を参照されたい。
【００１１】
定義
本明細書において、ある特定の用語は、次に定義される意義を有し得る。本明細書および特許請求の範囲において、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、単数および複数の言及を包含する。例えば、用語「（単数の）細胞」は、単一の細胞と共に複数の細胞を包含し、これらの混合物を包含する。
【００１２】
本明細書において、用語「を含む」は、組成物および方法が、列挙されている要素を包含するが、その他を除外しないことを意味するように企図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するよう用いられる場合、係る組成物または方法にとっていずれかの本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。「からなる」は、請求されている組成物の他の成分の微量を上回る要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これら移行部の用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内に収まる。従って、方法および組成物が、追加的なステップおよび構成成分を包含し得る（を含む）こと、または代替的に重要性がないステップおよび組成物を包含する（から本質的になる）ことが企図される、または代替的に記述されている方法ステップもしくは組成物のみを企図する（からなる）。
【００１３】
範囲を包含するあらゆる数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、０．１の増分で（＋）または（−）変動される近似値である。常に明確に記されているとは限らないが、あらゆる数字表示の前に用語「約」があると理解されたい。用語「約」は、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ−０．１」等、正確な値「Ｘ」とそれに加えて「Ｘ」の僅かな増分も包含する。常に明確に記されているとは限らないが、本明細書に記載されている試薬は、単なる例示であり、その均等物が当該分野において公知であることも理解されたい。
【００１４】
用語「同定する」または「同定すること」とは、患者を、処置に対し同一または同様の臨床応答を経験する可能性が高い患者の群または集団に密接に関連または参入させることである。
【００１５】
用語「アジュバント」がん患者は、外科手術による腫瘍の除去後に治療または化学療法レジメン（通例、アジュバント化学療法と呼ばれる）の投与がなされた患者を指す。アジュバント治療は、通常、可能性のあるがん再発生を最小化または予防するために与えられる。代替的に、「ネオアジュバント」治療は、通常、外科手技に先立ち腫瘍を縮小させて、係る手技において除去される組織の程度を最小化する試みにおける、外科手術前の治療または化学療法レジメンの投与を指す。
【００１６】
本明細書において、用語「患者」は、動物、哺乳動物、またはさらにはヒト患者を企図する。単なる例証目的のため、哺乳動物として、ヒト、サル、マウス、ウシ、ウマ、ブタまたはヒツジが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
精子タンパク質１７（ＳＰ１７）は、精巣および精子における高度に保存された哺乳動物タンパク質であり、種々のヒト悪性疾患における腫瘍関連抗原として特徴付けられてきた。
【００１８】
用語「遺伝マーカー」または「バイオマーカー」は、目的の遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体および／または目的の遺伝子の発現レベルを指す。
【００１９】
用語「野生型対立遺伝子」は、被験体において２コピーで存在する場合、野生型表現型を生じる遺伝子の対立遺伝子を指す。遺伝子におけるある種のヌクレオチド変化は、このヌクレオチド変化を有する遺伝子を２コピー有する被験体の表現型に影響を与えない可能性があるため、特定の遺伝子の数種の異なる野生型対立遺伝子が存在し得る。
【００２０】
用語「多型性」は、遺伝子またはその一部の２種以上の形態の共存を指す。少なくとも２種の異なる形態、即ち、２種の異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と称される。多型領域は、単一のヌクレオチドであってよく、その正体は、異なる対立遺伝子において異なる。
【００２１】
「多型遺伝子」は、少なくとも１個の多型領域を有する遺伝子を指す。
【００２２】
「ハプロタイプ」は、一単位として通例受け継がれる、密接に連鎖した遺伝子群の対立遺伝子のセットである。用語「目的の遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体」は、他の個体における目的の遺伝子のある領域に見られる複数のヌクレオチド配列のうち１種を有する、目的の遺伝子の領域を指す。
【００２３】
用語「遺伝子型」は、細胞全体またはある特定の遺伝子の特異的対立遺伝子組成を指し、一部の態様においては該遺伝子に関連する特異的多型性を指し、一方、用語「表現型」は、特異的遺伝子型の検出可能な外向きの顕在化を指す。
【００２４】
遺伝子に適用される「発現」は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたは遺伝子にコードされるタンパク質産物の産生を指す。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。一態様において、遺伝子の発現レベルは、内部対照としてのハウスキーピング遺伝子と比較した相対レベルにより表される。別の一態様において、ある一試料由来の遺伝子の発現レベルは、サンプリング誤差を除くために内部対照を用いて、異なる試料由来の該遺伝子の発現レベルと直接的に比較することができる。
【００２５】
「内部対照」または「ハウスキーピング」遺伝子は、いずれかの構成的にまたは全体的に発現される遺伝子を指す。係る遺伝子の例として、β−アクチン、トランスフェリン受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子またはこれらの等価物が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の一態様において、内部対照遺伝子は、β−アクチンである。
【００２６】
「過剰発現」または「過小発現」は、対照試料における遺伝子の発現レベルと比較した、試験試料における該遺伝子の発現の増大もしくは減少、または差次的発現を指す。一態様において、試験試料は病的細胞であり、対照試料は正常細胞である。別の一態様において、試験試料は、実験的に操作されたまたは生物学的に変更された細胞であり、対照試料は、実験操作または生物学的変更の前の細胞である。また別の一態様において、試験試料は、患者由来の試料であり、対照試料は、健康な個体由来の同様の試料である。またさらなる態様において、試験試料は、患者由来の試料であり、対照試料は、所望の臨床成績を持たない患者由来の同様の試料である。一態様において、差次的発現は、対照試料において検出される発現レベルよりも約１．５倍、または代替的に約２．０倍、または代替的に約２．５倍、または代替的に約３．０倍、または代替的に約５倍、または代替的に約１０倍、または代替的に約５０倍、またはまたさらに代替的に約１００倍を超えて高いまたは低い。代替的に、遺伝子は、「過剰発現される」または「過小発現される」と称される。代替的に、遺伝子は、「上方制御される」または「下方制御される」と言ってもよい。
【００２７】
本明細書における遺伝子の「所定の値」は、所定の値よりも高い該遺伝子の発現レベルを有する患者が、所定の値よりも低い同遺伝子の発現レベルを有する患者よりも望ましいもしくは望ましくない臨床成績を経験する可能性が高いように、またはその逆となるように選ばれる。本発明に開示されている遺伝子等、遺伝子の発現レベルは、臨床成績に関連する。当業者であれば、より望ましい臨床成績を有する患者における遺伝子の発現レベルを、より望ましくない臨床成績を有する患者と比較することにより、遺伝子の所定の値を決定することができる。一態様において、所定の値は、患者をより望ましい臨床成績を有する群と、より望ましくない臨床成績を有する群とに最も良く分ける遺伝子発現値である。係る遺伝子発現値は、当該分野において周知の方法により数学的にまたは統計的に決定することができる。
【００２８】
代替的に、所定の値よりも高い遺伝子発現が単純に「高発現」と称される、または所定の値よりも低い遺伝子発現が単純に「低発現」と称される。
【００２９】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書において互換的に用いられる用語である。このような用語は、特定の対象細胞のみを指すのではなく、係る細胞の後代または潜在的な後代を指すことが理解される。変異または環境影響のいずれかによりある特定の改変が後の世代で起こり得るため、係る後代は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、依然として、本明細書におけるこの用語の範囲内に包含される。
【００３０】
語句「ポリヌクレオチドの増幅」は、ＰＣＲ、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）および増幅方法等の方法を包含する。これらの方法は、公知のものであり、当該分野で広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０年（ＰＣＲに関して）；およびＷｕ，  Ｄ．Ｙ．ら（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４巻：５６０〜５６９頁（ＬＣＲに関して）を参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（またはライブラリ）内の特異的遺伝子へのプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを用いた複数ラウンドのアニーリング、伸長および変性を伴う、その後の増幅、ならびに（ｉｉｉ）正確なサイズのバンドについてのＰＣＲ産物のスクリーニング、で構成される遺伝子増幅方法を記載する。用いられるプライマーは、重合の開始を提供するのに十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドである、即ち、各プライマーは、増幅しようとするゲノム遺伝子座の各鎖に相補的となるよう特異的に設計される。
【００３１】
ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは、市販されている。特定の遺伝子領域由来の配列の増幅に有用なプライマーは、好ましくは、標的領域またはその隣接領域における配列に相補的であり、これに特異的にハイブリダイズする。増幅により作製される核酸配列は、直接的に配列決定することができる。代替的に、増幅された配列（複数可）は、配列解析前にクローニングすることができる。酵素により増幅されたゲノムセグメントの直接クローニングおよび配列解析のための方法は、当該分野において公知のものである。
【００３２】
本明細書における用語「単離された」は、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的もしくは細胞材料を指す。一態様において、用語「単離された」は、天然の供給源に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質もしくはポリペプチドまたは細胞もしくは細胞小器官または組織もしくは器官からそれぞれ分離された、ＤＮＡもしくはＲＮＡ等の核酸またはタンパク質もしくはポリペプチドまたは細胞もしくは細胞小器官または組織もしくは器官を指す。用語「単離された」は、組換えＤＮＡ技法により産生される場合は細胞材料、ウイルス材料もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、天然の状態では見いだされない核酸断片の包含を意図する。用語「単離された」はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すよう本明細書において用いられ、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方の網羅を意図する。用語「単離された」はまた、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すよう本明細書において用いられ、培養および操作された細胞または組織の両方の網羅を意図する。
【００３３】
遺伝子もしくは遺伝マーカーの発現レベルまたは多型性が、本明細書に記載されている処置のために患者を選択するための基盤として用いられる場合、遺伝マーカーの発現レベルまたは多型性は、処置の前および／または間に測定され、得られた値は、臨床医により次のいずれかの評価において用いられる：（ａ）個体が処置（複数可）を初めて受けるのに適切である可能性があるもしくはその可能性が高い；（ｂ）個体が処置（複数可）を初めて受けるのに不適切である可能性があるもしくはその可能性が高い；（ｃ）処置に対する応答性；（ｄ）個体が処置（複数可）を受け続けるのに適切である可能性があるもしくはその可能性が高い；（ｅ）個体が処置（複数可）を受け続けるのに不適切である可能性があるもしくはその可能性が高い；（ｆ）投薬量の調整；（ｇ）臨床的利益の尤度の予測；または（ｈ）毒性。当業者であれば十分に理解できる通り、臨床背景における遺伝マーカーまたは多型性の測定値は、このパラメータが、本明細書に記載されている処置の投与を開始、継続、調整および／または中断するための基盤として用いられたことの明らかな指標である。
【００３４】
本明細書における用語「処置すること」は、状態または疾患の少なくとも１種の症状の治癒と共に寛解を網羅するよう企図される。例えば、がんの場合、処置に対する応答は、国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）および米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）による新薬承認のための標準設定によりそれぞれ測定される、悪液質の低下、生存時間の増大、腫瘍進行までの時間の伸長、腫瘍体積の低下、全身腫瘍組織量の低下および／または腫瘍転移までの時間、腫瘍再発までの時間の延長、腫瘍応答、完全応答、部分応答、安定病態、進行性疾患、無増悪生存期間、全生存期間を包含する。Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００３年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２１巻（７号）：１４０４〜１４１１頁を参照されたい。
【００３５】
「有効量」は、処置に対し所望の応答をもたらす可能性が最もある、患者に投与または送達される化合物または薬剤の量を示すことを企図する。量は、疾患ステージ、年齢、性別、組織学および腫瘍再発尤度等が挙げられるがこれらに限定されない、患者の臨床パラメータにより経験的に決定される。
【００３６】
用語「臨床成績」、「臨床パラメータ」、「臨床応答」または「臨床エンドポイント」は、治療に対する患者の反応に関係する任意の臨床所見または尺度を指す。臨床成績の非限定的な例として、腫瘍応答（ＴＲ）、全生存期間（ＯＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間、腫瘍再発までの時間（ＴＴＲ）、腫瘍進行までの時間（ＴＴＰ）、相対リスク（ＲＲ）、毒性または副作用が挙げられる。
【００３７】
用語「応答する可能性が高い」は、ある遺伝子型の患者が、同様の状態に置かれた該遺伝子型がない患者よりも完全応答または部分応答を経験する可能性が相対的に高いことを意味することを企図する。代替的に、用語「応答する可能性が低い」は、ある遺伝子型の患者が、同様の状態に置かれた該遺伝子型がない患者よりも完全応答または部分応答を経験する可能性が相対的に低いことを意味することを企図する。
【００３８】
用語「治療に適している」または「治療により適宜処置される」は、同一疾患を有し、同一治療を受けるが、比較目的のために考慮されている異なる特徴を持つ患者（単数または複数）と比較して、患者が、１種または複数種の望ましい臨床成績を提示する可能性が高いことを意味するものである。一態様において、考慮されている特徴は、遺伝的多型または体細胞変異である。別の一態様において、考慮されている特徴は、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルである。一態様において、より望ましい臨床成績は、腫瘍負荷低下等、相対的により高い腫瘍応答の尤度または相対的により優れた腫瘍応答である。別の一態様において、より望ましい臨床成績は、相対的により長い全生存期間である。また別の一態様において、より望ましい臨床成績は、相対的により長い無増悪生存期間または腫瘍進行までの時間である。また別の一態様において、より望ましい臨床成績は、相対的により長い無病生存期間である。さらなる態様において、より望ましい臨床成績は、腫瘍再発の相対的な低下または遅延である。別の一態様において、より望ましい臨床成績は、相対的に減少した転移である。別の一態様において、より望ましい臨床成績は、相対的により低い相対リスクである。また別の一態様において、より望ましい臨床成績は、相対的に低下した毒性または副作用である。一部の実施形態において、２種以上の臨床成績が同時に考慮される。係る一態様において、遺伝的多型の遺伝子型等の特徴を持つ患者は、同一疾患を有し、同一治療を受けるが、この特徴を持たない患者（単数または複数）と比較して、２種以上のより望ましい臨床成績を提示し得る。本明細書に定義されている通り、患者は、治療に適しているとみなされる。別の係る一態様において、ある特徴を持つ患者は、１種または複数種のより望ましい臨床成績を提示し得るが、１種または複数種のより望ましくない臨床成績を同時に提示し得る。そこで、臨床成績は、総合的に考慮され、従って、患者の特異的な状況および臨床成績の関連性を考慮に入れつつ、患者が治療に適しているかに関する決定が為されることになる。一部の実施形態において、無増悪生存期間または全生存期間は、総合的意思決定において腫瘍応答よりも重きを置かれる。
【００３９】
「同一のがんを有すること」は、ある患者を別の患者と、または代替的にある患者集団を別の患者集団と比較する場合に用いられる。例えば、この２つの患者または患者集団はそれぞれ、結腸がんを有するまたはこれを患っている。
【００４０】
治療に対する「完全応答」（ＣＲ）は、その腫瘍およびあらゆる疾患エビデンスが消失した、評価可能であるが測定不可能な疾患を有する患者を定義する。
【００４１】
治療に対する「部分応答」（ＰＲ）は、部分応答を実証するとして単純にカテゴリー化される、完全応答に満たない患者を定義する。
【００４２】
「安定病態」（ＳＤ）は、患者が安定的であることを示す。
【００４３】
「進行性疾患」（ＰＤ）は、処置後に腫瘍が成長し（即ち、大きくなり）、拡散した（即ち、別の組織または器官へと転移した）こと、またはがん全体が悪化したことを示す。例えば、処置開始以来２０パーセントを超える腫瘍成長は通常、進行性疾患を示す。「無病生存期間」は、患者ががんまたは腫瘍の徴候なしで生存する、がんまたは腫瘍の処置後の時間の長さを示す。
【００４４】
治療に対する「無応答」（ＮＲ）は、腫瘍または疾患エビデンスが、一定のままである、または進行した患者を定義する。
【００４５】
「全生存期間」（ＯＳ）は、無処理または未処置個体または患者と比較した、平均余命の延長を企図する。
【００４６】
「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）または「腫瘍進行までの時間」（ＴＴＰ）は、処置の間および後におけるがんが成長しない時間の長さを示す。無増悪生存期間は、患者が完全応答または部分応答を経験した時間の量と共に、患者が安定病態を経験した時間の量を包含する。
【００４７】
「相関なし」は、多型領域の対立遺伝子改変体または遺伝子発現レベルと、臨床パラメータとの間に関係性を示さない統計解析を指す。
【００４８】
本明細書における、また、国立がん研究所により定義されている「腫瘍再発」は、通例、がんが検出できなかった期間の後に再発した（再び起きた）がんである。がんは、本来の（原発性）腫瘍と同じ場所または身体の別の場所に再び起きうる。これは、再発性のがんとも呼ばれる。
【００４９】
「腫瘍再発までの時間」（ＴＴＲ）は、がんの診断の日付から最初の再発、死亡の日付までの時間、または患者が最後の接触時にいかなる腫瘍再発もない場合は、最後の接触までの時間として定義される。患者が再発しなかった場合、ＴＴＲは死亡時にまたは最後の経過観察時に審査される。
【００５０】
統計および数学的疫学において、「相対リスク」（ＲＲ）は、曝露に対するイベントの（または疾患を発症する）リスクを指す。相対リスクは、曝露群対非曝露群におけるイベントが起こる確率の比である。
【００５１】
本明細書において、用語「ステージＩがん」、「ステージＩＩがん」、「ステージＩＩＩがん」および「ステージＩＶ」は、ＴＮＭ分類によるがんの分類法を指す。ステージＩがんは通常、原発性腫瘍が、起始器官に限定されることを同定する。ステージＩＩは、原発性腫瘍が、周囲の組織および腫瘍領域に直接流出するリンパ節へと拡散したことを企図する。ステージＩＩＩは、原発性腫瘍が大きく、より深部構造に固着することを企図する。ステージＩＶは、原発性腫瘍が大きく、より深部構造に固着することを企図する。ＣＡＮＣＥＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）２０および２１頁を参照されたい。
【００５２】
「腫瘍」は、制御されない進行性の細胞増殖に起因する、生理機能に寄与しない組織の異常成長である。「腫瘍」は、新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）としても公知のものである。
【００５３】
用語「血液」は、赤血球、白血球、血漿、凝固因子、小分子タンパク質、血小板および／または寒冷沈降物等を包含するがこれらに限定されない、被験体中を循環する血液のあらゆる構成成分を包含する血液を指す。これは通常、ヒト患者が血を与える際に献血される種類の血液である。
【００５４】
記述的実施形態
本発明は、少なくとも一部には、本明細書において同定された目的の遺伝子の発現レベルの決定に基づく、診断、予後および治療方法をさらに提供する。
【００５５】
例えば、本明細書に記載されている診断アッセイを用いて得られる情報は、被験体が所定の種類のがん処置に適しているか、または腫瘍再発もしくはより長い全生存期間を経験する可能性が高いかを決定するのに有用である。予後情報に基づき、医師は、患者における悪性腫瘤（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍａｓｓ）もしくは腫瘍の低下または個体におけるがんの処置に有用な治療プロトコールを推奨することができる。
【００５６】
代替的に、被験体が、より長いまたはより短い全生存期間を経験する可能性がより高いまたはより低いと決定することは、被験体を、腫瘍再発を経験する可能性がより高いと同定すること、または被験体を、腫瘍再発を経験する可能性がより低いと同定することと表現することができる。
【００５７】
本明細書に記載されている診断アッセイを用いて得られる情報は、単独で用いても、被験体の他の遺伝子の遺伝子型もしくは発現レベル、臨床化学的パラメータ、病理組織学的パラメータまたは年齢、性別および体重等が挙げられるがこれらに限定されない、他の情報と組み合わせて用いてもよいことを理解されたい。単独で用いる場合、本明細書に記載されている診断アッセイを用いて得られる情報は、処置の臨床成績の決定もしくは同定、処置のための患者の選択または患者の処置等に有用である。他方では、他の情報と組み合わせて用いる場合、本明細書に記載されている診断アッセイを用いて得られる情報は、処置の臨床成績の決定もしくは同定に役立つ、処置のための患者の選択に役立つまたは患者の処置に役立つため等に有用である。特定の態様において、本明細書に開示されている１種または複数種の遺伝子の遺伝子型または発現レベルは、そのそれぞれが最終診断、予後または処置に寄与する遺伝子のパネルにおいて用いられる。
【００５８】
患者が卵巣がんを経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法であって、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、または代替的にこれから本質的になる、またはさらにまたこれからなる、ＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性が低いものとして同定するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。さらなる態様において、この方法は、前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性がより高いものとして同定し、ＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＣＡ１２５レベルかつＳＰ１７レベルの非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７レベルが、前記患者を、卵巣がんを経験する可能性が低いものとして同定する。
【００５９】
卵巣がん患者がより長いまたはより短い全生存期間を経験する可能性が高いかその可能性が低いかを決定するための方法であって、前記患者から単離された試料におけるＳＰ１７遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７遺伝子発現レベルの存在または所定の第１の値よりも高いレベルが、前記患者を、より短い全生存期間を経験する可能性がより高いものとして同定し、ＳＰ１７遺伝子発現の非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７遺伝子発現が、前記患者を、より長い全生存期間を経験する可能性が高いものとして同定する、方法も提供される。さらなる態様において、この方法は、前記患者から単離された試料におけるＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含み、または代替的にこれから本質的になり、またはさらにまたこれからなり、ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルが、前記患者を、より長い全生存期間の可能性がより低いものとして同定し、ＣＡ１２５レベルの存在または所定の第１の値よりも高いＣＡ１２５レベルかつＳＰ１７レベルの非存在または前記所定の第１の値よりも低いＳＰ１７レベルが、前記患者を、より長い全生存期間の可能性がより高いものとして同定する。
【００６０】
簡潔に説明すると、また、単なる例証目的のため、当業者は、より望ましい臨床パラメータを有する患者における遺伝子の発現値を、より望ましくない臨床パラメータを有する患者の値と比較することにより、所定の値を決定することができる。一態様において、所定の値は、より望ましい臨床パラメータを有する群と、より望ましくない臨床パラメータを有する群とに患者を最も良く分ける遺伝子発現値である。係る遺伝子発現値は、当該分野において周知の方法により、数学的にまたは統計的に決定することができる。
【００６１】
本発明の方法における使用に適した試料として、血液試料、尿試料または血清試料が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
遺伝子発現レベルを決定するための方法は、当該分野において公知のものであり、本明細書に簡潔に記載されている。これらの方法の非限定的な例として、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を決定するステップを含む、または代替的にこれから本質的になる、またはまたさらにこれからなる方法、ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたはマイクロアレイが挙げられる。この方法は、動物、哺乳動物またはさらにはヒト患者等の患者の補助において有用である。単なる例証目的のため、哺乳動物として、サル、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ、ウシ、ブタまたはヒト患者が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
上に記す発明それぞれの代替的な実施形態として、適した患者試料は、非転移性腫瘍組織、非転移性腫瘍細胞、転移性腫瘍組織または転移性腫瘍細胞から選択される組織または細胞を含む、または代替的にこれから本質的になる、またはさらにまたこれからなる。別の一態様において、患者試料は、腫瘍に近接して単離される正常組織となり得る。
【００６４】
ＳＰ１７およびＣＡ１２５タンパク質に対する抗体も、疾患診断および予後において用いることができる。係る診断方法は、ペプチド発現レベルにおける異常、またはペプチドの構造および／もしくは組織、細胞もしくは細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）の位置における異常の検出に用いることができる。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光定量的検出と合わせた、蛍光標識した抗体を用いた免疫蛍光技法により達成することができる。本発明において有用な抗体（またはその断片）は、さらに、ペプチドまたはその対立遺伝子改変体のｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡検査下で組織学的に用いることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、そこに本発明の標識抗体を添加することにより達成することができる。抗体（または断片）は、好ましくは、標識抗体（または断片）を生物試料上に重層することにより添加される。このような手順の使用により、対象ポリペプチドの存在のみならず、試験されている組織におけるその分布を決定することも可能になる。本発明を用いて、当業者であれば、このようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成するために、多種多様な組織学的方法（染色手順等）のいずれかを改変してよいことを容易に認知するであろう。
【００６５】
一実施形態において、試料における目的の遺伝子の多型領域の同定に先立ち、目的の遺伝子の少なくとも一部を最初に増幅することが必要である。増幅は、例えば、当該分野において公知の方法に従ったＰＣＲおよび／またはＬＣＲにより行うことができる。ＰＣＲの様々な非限定的な例として、本明細書に記載されている方法が挙げられる。
【００６６】
アセンブリＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）は、短い重複セグメントを有する長いオリゴヌクレオチドのプールにおいてＰＣＲを行うことによる、長いＤＮＡ配列の人工合成である。オリゴヌクレオチドは、センス方向とアンチセンス方向とで交互になっており、重複セグメントは、ＰＣＲ断片の順序を決定し、これにより選択的に最終的な長いＤＮＡ産物を作製する（Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５年）Ｇｅｎｅ  １６４巻（１号）：４９〜５３頁および米国特許第６，３３５，１６０号、同第７，０５８，５０４号または同第７，３２３，３３６号を参照）。
【００６７】
非対称ＰＣＲは、本来のＤＮＡの一方の鎖を他方の鎖よりも優先的に増幅するために用いられる。これは、２本の相補鎖のうち一方のみを有することが要求される、ある種の配列決定およびハイブリダイゼーション探索における用途が見出される。ＰＣＲは、選んだ鎖のプライマーを大幅に過剰に用いる以外は通常通り行われる。制限プライマーを使い切った後の反応後半のゆっくりした増幅のため、余分なＰＣＲサイクルが要求される（Ｉｎｎｉｓら（１９８８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８５巻（２４号）：９４３６〜９４４０頁および米国特許第５，５７６，１８０号、同第６，１０６，７７７号または同第７，１７９，６００号を参照）。指数関数後比例（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）−ＰＣＲ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）として公知であるこのプロセスの近年の改正版は、反応効率を維持するために過剰プライマーよりも高い融解温度（Ｔｍ）を有する制限プライマーを用いるが、その理由として、制限プライマー濃度は、中間反応（ｍｉｄ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）を減少させるためである（Ｐｉｅｒｃｅら（２００７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．１３２巻：６５〜８５頁）。
【００６８】
コロニーＰＣＲは、例えばＥ．  ｃｏｌｉの細菌コロニーを用い、これは、正確なＤＮＡベクター構築物のＰＣＲにより迅速にスクリーニングすることができる。選択された細菌コロニーは、滅菌楊枝により採取され、ＰＣＲマスターミックスまたは滅菌水中に軽く塗りつけられる。このＰＣＲは、標準ポリメラーゼが用いられる場合、延長した時間の９５℃で開始され、または短縮された１００℃の変性ステップと特殊なキメラＤＮＡポリメラーゼを用いて開始される（Ｐａｖｌｏｖら（２００６年）「Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｗｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  ＴｏｐｏＴａｑ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ」、Ｋｉｅｌｅｃｚａｗａ  Ｊ：  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＩＩ：  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｎｕｐ．  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔにおける、２４１〜２５７頁）。
【００６９】
ヘリカーゼ依存性増幅は、変性およびアニーリング／伸長サイクルによるサイクリングではなく一定温度を用いる以外は、伝統的ＰＣＲと同様のものである。ＤＮＡを巻き戻す酵素であるＤＮＡヘリカーゼが、熱変性の代わりに用いられる（Ｍｙｒｉａｍら（２００４年）ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ５巻（８号）：７９５〜８００頁および米国特許第７，２８２，３２８号を参照）。
【００７０】
ホットスタートＰＣＲは、ＰＣＲの初期セットアップ段階における非特異的増幅を低下させる技法である。この技法は、ポリメラーゼを添加する前に融解温度（例えば、９５℃）まで反応構成成分を加熱することにより、手作業で行うことができる（Ｃｈｏｕら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：１７１７〜１７２３頁ならびに米国特許第５，５７６，１９７号および同第６，２６５，１６９号）。抗体の結合（Ｓｈａｒｋｅｙら（１９９４年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２巻：５０６〜５０９頁）、または高温活性化ステップ後に初めて解離する共有結合した阻害剤の存在のいずれかにより周囲温度におけるポリメラーゼ活性を阻害する、特殊化された酵素系が開発された。ホットスタート／コールドフィニッシュ（ｃｏｌｄ−ｆｉｎｉｓｈ）ＰＣＲは、周囲温度では不活性であり、伸長温度で即座に活性化される新たなハイブリッドポリメラーゼにより達成される。
【００７１】
配列間（Ｉｎｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）特異的（ＩＳＳＲ）ＰＣＲは、いくつかの単純配列反復間の領域を増幅して、増幅断片長の独自のフィンガープリントを作製する、ＤＮＡフィンガープリントのための方法である（Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚら（１９９４年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０巻（２号）：１７６〜８３頁）。
【００７２】
インバースＰＣＲは、一内部配列のみが公知である場合にＰＣＲを達成するために用いられる方法である。これは、様々なゲノムインサートに隣接する配列の同定において特に有用である。これは、未知の配列のいずれかの末端に公知の配列をもたらす、一連のＤＮＡ消化およびセルフライゲーションを伴う（Ｏｃｈｍａｎら（１９８８年）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０巻：６２１〜６２３頁および米国特許第６，０１３，４８６号、同第６，１０６，８４３号または同第７，１３２，５８７号）。
【００７３】
ライゲーション媒介ＰＣＲは、目的のＤＮＡにライゲーションされた小型のＤＮＡリンカーおよびＤＮＡリンカーにアニーリングする複数のプライマーを用いる。これは、ＤＮＡ配列決定、ゲノムウォーキングおよびＤＮＡフットプリンティングのために用いられてきた（Ｍｕｅｌｌｅｒら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：７８０〜７８６頁）。
【００７４】
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）は、ゲノムＤＮＡにおけるＣｐＧアイランドのメチル化の検出に用いられる（Ｈｅｒｍａｎら（１９９６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３巻（１３号）：９８２１〜９８２６頁および米国特許第６，８１１，９８２号、同第６，８３５，５４１号または同第７，１２５，６７３号）。ＤＮＡは、先ず亜硫酸水素ナトリウムで処理され、これにより、非メチル化シトシン塩基を、ＰＣＲプライマーによりチミンとして認識されるウラシルへと変換する。続いて、このように改変されたＤＮＡにおいて、プライマー配列内の任意のＣｐＧアイランドにおける配列以外は同一のプライマーセットを用いた２通りのＰＣＲが行われる。これらの点において、一方のプライマーセットは、シトシンを有するＤＮＡを認識してメチル化ＤＮＡを増幅し、もう一方のセットは、ウラシルまたはチミンを有するＤＮＡを認識して非メチル化ＤＮＡを増幅する。ｑＰＣＲを用いたＭＳＰを行って、メチル化に関する定性的ではなく定量的な情報を得ることもできる。
【００７５】
マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）は、単一のプライマー対のみを用いて複数の標的が増幅されることを可能にし、これによりマルチプレックスＰＣＲの分解能限界を回避する（後述を参照）。
【００７６】
マルチプレックスＰＣＲは、単一ＰＣＲ混合物内の複数の独自のプライマーセットを用いて、異なるＤＮＡ配列に特異的な変動するサイズのアンプリコンを作製する（米国特許第５，８８２，８５６号、同第６，５３１，２８２号または同第７，１１８，８６７号を参照）。複数の遺伝子を一度に標的化することにより、他の方法では数倍の試薬とさらなる実施時間が必要となる追加的な情報を１回のテストランから獲得することができる。プライマーセットそれぞれのアニーリング温度は、単一の反応で正確に働くよう最適化しなければならず、アンプリコンサイズ、即ち、それらの塩基対の長さは、ゲル電気泳動により可視化した際に別個のバンドを形成するよう十分に異なっている必要がある。
【００７７】
ネステッドＰＣＲは、ＤＮＡの非特異的増幅によるバックグラウンドを低下させることにより、ＤＮＡ増幅の特異性を増大させる。２回の連続的ＰＣＲにおいて２セットのプライマーが用いられている。第１の反応において、１対のプライマーが用いられて、企図される標的に加えて非特異的に増幅されたＤＮＡ断片からなる可能性もあるＤＮＡ産物を作製する。続いて、その結合部位が、第１の反応において用いたプライマーとは完全にまたは部分的に異なり、第１の反応において用いたプライマーそれぞれの３’に位置するプライマーセットを用いた第２のＰＣＲにおいて、この産物（複数可）を用いる（米国特許第５，９９４，００６号、同第７，２６２，０３０号または同第７，３２９，４９３号を参照）。ネステッドＰＣＲは多くの場合、長いＤＮＡ断片の特異的な増幅に従来のＰＣＲよりも成功を収めるが、この手法は、標的配列のより詳細な知識を必要とする。
【００７８】
重複伸長ＰＣＲは、最長の実用的プライマー長の限界を超えて挿入された変更を有するＤＮＡ配列の構築を可能にする遺伝子操作技法である。
【００７９】
ＲＱ−ＰＣＲ、ＱＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴＱ−ＰＣＲとしても公知の定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）は、反応後のまたはリアルタイムでのＰＣＲ産物の量の測定に用いられる。米国特許第６，２５８，５４０号、同第７，１０１，６６３号または同第７，１８８，０３０号を参照されたい。Ｑ−ＰＣＲは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの出発量を定量的に測定するための選択方法である。Ｑ−ＰＣＲは一般に、ＤＮＡ配列が試料中に存在するかを決定、また、試料中のそのコピー数を決定するために用いられる。現在最高レベルの精度を備える方法は、米国特許第６，４４０，７０５号；米国特許出願公開第２００７／０２０２５２５号；Ｄｒｅｓｓｍａｎら（２００３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００巻（１５号）：８８１７〜８８２２頁およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら（１９９９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．９６巻（１６号）：９２３６〜９２４１頁に記載されているデジタルＰＣＲである。より一般には、ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写ＰＣＲ（後述を参照）を指し、多くの場合Ｑ−ＰＣＲと併せて用いられる。ＱＲＴ−ＰＣＲ方法は、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ等の蛍光色素またはＴａｑＭａｎ等のフルオロフォア含有ＤＮＡプローブを用いて、リアルタイムで増幅産物の量を測定する。
【００８０】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、細胞または組織ＲＮＡから公知配列の増幅、単離または同定に用いるための方法である（米国特許第６，７５９，１９５号、同第７，１７９，６００号または同第７，３１７，１１１号を参照）。ＰＣＲに先行して、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応が行われる。ＲＴ−ＰＣＲは、発現プロファイリングに広く用いられて、遺伝子の発現を決定する、または転写開始および終結部位を包含するＲＮＡ転写産物の配列を同定し、遺伝子のゲノムＤＮＡ配列が公知であれば、該遺伝子におけるエクソンおよびイントロンの位置をマッピングする。遺伝子の５’端（転写開始部位に相当する）は通常、ｃＤＮＡ端の急速増幅（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）と命名されるＲＴ−ＰＣＲ方法により同定される。
【００８１】
熱非対称インターレース（Ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）ＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）は、公知の配列に隣接する未知の配列の単離に用いられる。公知の配列内において、ＴＡＩＬ−ＰＣＲは、異なるアニーリング温度を有する入れ子状態のプライマー対を用いる。縮重プライマーが用いられて、未知の配列から他の方向を増幅する（Ｌｉｕら（１９９５年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５巻（３号）：６７４〜８１頁）。
【００８２】
タッチダウンＰＣＲは、ＰＣＲサイクリングが進行するにつれアニーリング温度を徐々に低減させることによる、非特異的バックグラウンドの低下を目標とするＰＣＲの変法である。初期サイクルにおけるアニーリング温度は通例、用いるプライマーのＴｍを数度（３〜５℃）上回るが、一方、より後期のサイクルでは、プライマーＴｍを数度（３〜５℃）下回る。より高い温度は、プライマー結合のためにより優れた特異性を与え、より低い温度は、初期サイクルにおいて形成された特異的産物からのより効率的な増幅を可能にする（Ｄｏｎら（１９９１年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９巻：４００８頁および米国特許第６，２３２，０６３号）。
【００８３】
本発明の一実施形態において、プローブは、いわゆる「分子ビーコン」を形成するための２種の蛍光色素分子で標識される（Ｔｙａｇｉ，  Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，  Ｆ．Ｒ．（１９９６年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻：３０３〜８頁）。係る分子ビーコンは、オリゴヌクレオチドプローブの両端に結合した色素間の分子内蛍光クエンチングの除去により、相補的核酸配列への結合の証拠となる。同時的な複数ビーコンの使用（Ｍａｒｒａｓ，  Ｓ．Ａ．（１９９９年）Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．１４巻：１５１〜６頁）と同様に、遺伝子型判定をするための分子ビーコンの使用が記載された（Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ，  Ｌ．Ｇ．（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９巻：１２２８〜９頁）。分子ビーコンにおける等、クエンチング分子とフルオロフォアが互いに近位に保持されている場合、または約１〜約２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブの両端に付着している場合、クエンチング分子は、特定のフルオロフォアの蛍光を実質的に阻害するのに十分なスペクトル重複を有するのであれば、そのフルオロフォアと併用するのに有用である。
【００８４】
遺伝子の増幅または目的の抗体と併せて標識プローブを用いることもできる（Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．８８巻：７２７６〜７２８０頁）。Ｇｅｌｆａｎｄらによる米国特許第５，２１０，０１５号は、ＰＣＲの間に増幅産物のリアルタイム測定を提供する蛍光に基づくアプローチについて記載する。係るアプローチは、存在する二本鎖ＤＮＡの量を示すためにインターカレート色素（エチジウムブロマイド等）を用いた、または、増幅の間にプローブが切断されて、蛍光分子を放出し、その濃度が存在する二本鎖ＤＮＡの量に比例する、蛍光−クエンチャー対を含有するプローブを用いた（「Ｔａｑ−Ｍａｎ」アプローチとも称される）。増幅の間に、プローブは、標的配列にハイブリダイズするとポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により消化されて、クエンチャー分子から蛍光分子を分離させ、これによりレポーター分子から蛍光を出現させる。Ｔａｑ−Ｍａｎアプローチは、多型性を含有する標的ポリヌクレオチドの領域に特異的にアニーリングする、レポーター分子−−クエンチャー分子対を含有するプローブを用いる。
【００８５】
プローブは、「遺伝子チップ」として用いるために表面に固定することができる。係る遺伝子チップは、当業者に公知の多数の技法による遺伝的変動の検出に用いることができる。米国特許第６，０２５，１３６号および同第６，０１８，０４１号に概要を述べたもの等、一技法において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアプローチにより配列決定してＤＮＡ配列を決定するために遺伝子チップ上に整列される。本発明のプローブは、遺伝的配列の蛍光検出のために用いることもできる。係る技法は、例えば、米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号において記載されている。プローブは、Ｋａｙｅｍらによる米国特許第５，９５２，１７２号およびＫｅｌｌｅｙ，  Ｓ．Ｏ．らによる（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７巻：４８３０〜４８３７頁の記載等、核酸配列の電気化学的検出のために電極表面に固定することもできる。
【００８６】
本発明は、本明細書において同定される目的の遺伝子から選択されるがこれらに限定されない遺伝マーカーの予後パネルも提供する。予後パネルは、単独でまたはＣＡ１２５と組み合わせてＳＰ１７の増幅に用いるおよび／またはその分子構造を決定するために用いることができるプローブまたはプライマーを含む。プローブまたはプライマーは、遺伝子チップまたはマイクロアレイ等が挙げられるがこれらに限定されない固相支持体に付着するまたはこれに支持させることができる。プローブまたはプライマーは、検出可能に標識することができる。
【００８７】
一態様において、パネルは、本明細書において同定されるプローブまたはプライマーと共に、他のプローブまたはプライマーを含有する。代替的な態様において、パネルは、上に記すプローブまたはプライマーのうち１種または複数種およびその他を包含する。さらなる態様において、パネルは、上に記すプローブまたはプライマーのみからなる。
【００８８】
プライマーまたはプローブは、「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」として用いるために表面に固定することができる。係る遺伝子チップまたはマイクロアレイは、当業者に公知の多数の技法により遺伝的変動の検出に用いることができる。米国特許第６，０２５，１３６号および同第６，０１８，０４１号において概要を述べたもの等、一技法において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアプローチにより配列決定してＤＮＡ配列を決定するために遺伝子チップ上に整列される。本発明のプローブは、遺伝的配列の蛍光検出のために用いることもできる。係る技法は、例えば、米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号において記載されている。プローブは、Ｋａｙｅｍらによる米国特許第５，９５２，１７２号およびＫｅｌｌｅｙらによる（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７巻：４８３０〜４８３７頁の記載等、核酸配列の電気化学的検出のために電極表面に固定することもできる。
【００８９】
様々な「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」および同様の技術は、当該分野において公知のものである。係る技術の例として、ＬａｂＣａｒｄ（ＡＣＬＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）；ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃ，Ｉｎｃ）；ＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ）；電気化学的センシングを備える低密度アレイ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）；ＬａｂＣＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇａｍｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．）；Ｏｍｎｉ  Ｇｒｉｄ（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）；Ｑ  Ａｒｒａｙ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）；液相発現技術によるハイスループット自動質量分析システム（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；サーマルジェットスポッティングシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；Ｈｙｓｅｑ  ＨｙＣｈｉｐ（Ｈｙｓｅｑ，Ｉｎｃ．）；ＢｅａｄＡｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＭ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；複数のスライドグラスに１２〜６４スポットを分注することができるハイスループットマイクロアレイシステム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＮａｎｏＣｈｉｐ  （Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；マイクロ流体ガラスチップ（Ｏｒｃｈｉｄ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；４個のＰｉｅｚｏＴｉｐ圧電気ドロップ・オン・デマンド先端部を備えるＢｉｏＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）；ＦｌｅｘＪｅｔ（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃ，Ｉｎｃ．）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機（Ｓｅｑｕｎｏｍｅ）；ＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ２およびＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ３（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨｅｌｌｅｒ（２００２年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．４巻：１２９〜１５３頁に同定および記載されているＧｅｎｏＳｅｎｓｏｒ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるがこれらに限定されない。「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」の例は、米国特許出願公開第２００７／０１１１３２２号、同第２００７／００９９１９８号、同第２００７／００８４９９７号、同第２００７／００５９７６９号および同第２００７／００５９７６５号ならびに米国特許第７，１３８，５０６号、同第７，０７０，７４０号および同第６，９８９，２６７号にも記載されている。
【００９０】
一態様において、目的の遺伝子のためのプローブまたはプライマーを含有する「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」は、単独で、または他のプローブおよび／もしくはプライマーと組み合わせて提供される。適した試料は、患者からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらのいずれかの組合せの抽出から得られ、必要であれば増幅される。ＤＮＡまたはＲＮＡ試料は、遺伝子チップまたはマイクロアレイ上に含有されるプローブ（複数可）またはプライマー（複数可）への目的の遺伝子（複数可）のハイブリダイゼーションに適した条件下で、遺伝子チップまたはマイクロアレイパネルに接触させられる。プローブまたはプライマーを検出可能に標識し、これにより目的の遺伝子（複数可）における多型性を同定することができる。代替的に、化学的または生物学的反応を用いて、目的の遺伝子（複数可）のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしたプローブまたはプライマーを同定することができる。続いて、前述の装置および方法の助けにより、患者の遺伝的プロファイルが決定される。
【００９１】
治療方法
本発明は、本明細書に開示されている方法により、卵巣がんを有する可能性が高い、または卵巣がんを有しており、相対的により短い全生存時間等、より予後不良であると同定された患者の処置も提供する。本明細書に記載されている方法を反復することにより、有効量の適した治療が患者に投与され、患者の予後をモニターすることができる。「有効量」は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与することができる。処置のために承認された薬物は、ウェブサイト上に収載されている：ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｄｒｕｇｉｎｆｏ／ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ、最終アクセス、２０１１年９月１２日。係る薬物の非限定的な例として、アドリアマイシンＰＦＳ、アドリアマイシンＲＤＦ、ＢＥＰおよびカルボプラチンが挙げられる。これらは、本明細書における方法により、治療に適していると同定された被験体または個体に投与することができ、治療量は、経験的に決定することができ、処置されている疾病、処置されている被験体ならびに薬剤の有効性および毒性により変動し得る。
【００９２】
キット
本明細書に表記されている通り、本発明は、ＳＰ１７の発現レベルを単独でまたはＣＡ１２５と組み合わせて決定するための診断方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、目的の遺伝子と相補的なヌクレオチド配列を含むプローブまたはプライマーを用いる。従って、本発明は、これらの方法を行うためのキットと共に、本発明の方法を実施するための説明書を提供する。よって、一態様において、本発明は、卵巣がん患者ならびに別々に、腫瘍再発および／またはより長いもしくはより短い全生存期間を有する可能性がより高い卵巣がん患者の同定において用いるためのキットであって、ＳＰ１７の発現レベルを単独でまたはＣＡ１２５と組み合わせて決定するために適したプライマーもしくはプローブまたはマイクロアレイと、そこで用いるための説明書とを含む、または代替的にこれから本質的になる、またはさらにまたこれからなるキットも提供する。
【００９３】
一態様において、ＳＰ１７発現レベルが、検出されるもしくは所定の第１の値よりも高い場合、または、ＣＡ１２５およびＳＰ１７遺伝子発現レベルが、存在するまたは所定の値よりも高い場合、キットの構成成分および説明書は、腫瘍再発またはより短い全生存期間を経験する可能性がより高いと患者を同定する。一態様において、処置プロトコールおよび／または治療が、キットにさらに提供される。
【００９４】
特定の一態様において、キットの構成成分および説明書は、本明細書に記載されている方法を行うために適した試薬と、使用説明書とを含む、または代替的にこれから本質的になる、またはさらにまたこれからなる、患者における卵巣がんの診断に用いられる。一態様において、処置プロトコールおよび／または治療が、キットにさらに提供される。
【００９５】
さらなる態様において、ＳＰ１７遺伝子発現が、存在しないもしくは所定の第１の値よりも低い場合、またはＣＡ１２５レベルが、存在するまたは所定の値よりも高いが、ＳＰ１７レベルが、存在しないまたは所定の値よりも低い場合、キットの構成成分および説明書は、腫瘍再発またはより長い全生存時間を経験する可能性がより低いと患者を決定するために用いられる。
【００９６】
簡潔に説明すると、また、単なる例証目的のため、当業者は、より望ましい臨床パラメータを有する患者における遺伝子の発現値を、より望ましくない臨床パラメータを有する患者の値と比較することにより、第１および第２の所定の値を決定することができる。一態様において、所定の値は、より望ましい臨床パラメータを有する群と、より望ましくない臨床パラメータを有する群とに患者を最も良く分ける遺伝子発現値である。係る遺伝子発現値は、当該分野において周知の方法により数学的にまたは統計的に決定することができる。
【００９７】
本方法は、動物、哺乳動物、さらにはヒト患者の補助において有用である。単なる例証目的のため、哺乳動物として、サル、マウス、ウシ、ウマ、ブタまたはヒツジが挙げられるがこれらに限定されない。卵巣がんは、転移性となることができ、がんは、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩまたはステージＩＶとなることができる。
【００９８】
キットの方法における使用に適した試料として、血液、血清もしくは尿またはこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９９】
キットは、ＳＰ１７に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１種のプローブもしくはプライマー単独、またはＣＡ１２５遺伝子の発現レベルを決定するためのプローブおよび／またはプライマーと組み合わせた該プローブまたはプライマーと、使用説明書とを含むことができる。キットは、好ましくは、上述の核酸のうち少なくとも１種を含む。目的の遺伝子のうち少なくとも一部を増幅するための好ましいキットは、その少なくとも一方が対立遺伝子改変体配列とハイブリダイズすることができる、２種のプライマーを含む。係るキットは、例えば、蛍光検出による、電気化学的検出によるまたは他の検出による遺伝子型の検出に適している。
【０１００】
キットに含有されるオリゴヌクレオチドは、プローブとして用いるのであれプライマーとして用いるのであれ、検出可能に標識することができる。標識は、例えば蛍光標識のため直接的に、または間接的に検出することができる。間接的検出は、ビオチン−アビジン相互作用、抗体結合その他等、当業者に公知のいずれかの検出方法を包含することができる。蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、クエンチング分子を含有することもできる。オリゴヌクレオチドは、表面に結合していてよい。一実施形態において、好ましい表面は、シリカまたはガラスである。別の一実施形態において、表面は、金属電極である。
【０１０１】
本発明のさらに他のキットは、アッセイの実施に必要な少なくとも１種の試薬を含む。例えば、キットは、酵素を含むことができる。代替的に、キットは、バッファーまたはその他の任意の必要な試薬を含むことができる。
【０１０２】
試験試料と核酸プローブをインキュベートするための条件は、アッセイに用いられる型式、使用される検出方法ならびにアッセイに使用される核酸プローブの種類および性質に依存する。当業者であれば、一般に利用されるハイブリダイゼーション、増幅または免疫学的アッセイ型式のいずれか１種を、本発明における使用のための核酸プローブを用いるために容易に適応できることを認識するであろう。係るアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，  Ｔ．（１９８６年）ＡＮ  ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ  ＡＮＤ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｂｕｌｌｏｃｋ，  Ｇ．Ｒ．ら、ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ  １巻（１９８２年）、２巻（１９８３年）、３巻（１９８５年）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｐ．（１９８５年）ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＯＲＹ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ：  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにおいて見出すことができる。
【０１０３】
診断キットにおいて用いられる試験試料は、細胞、細胞のタンパク質もしくは膜抽出物または痰、血液、血清、血漿もしくは尿等の生体液を包含する。上述の方法において用いられる試験試料は、アッセイ型式、検出方法の性質およびアッセイされる試料として用いる組織、細胞または抽出物に基づき変動するであろう。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法は、当該分野において公知のものであり、利用されるシステムと適合する試料を得るために容易に適応させることができる。
【０１０４】
キットは、目的の遺伝子の発現レベルを決定するための本明細書に記載されている陽性対照、陰性対照、試薬、プライマー、配列決定マーカー、プローブおよび抗体の全てまたは一部を包含することができる。
【０１０５】
容認される通り、これらの示唆されるキット構成成分は、当業者による使用に習慣的な様式で包装することができる。例えば、これらの示唆されるキット構成成分は、溶液においてまたは液体分散物その他として提供することができる。
【０１０６】
遺伝子発現レベルを決定するための方法は、当該分野において公知であり、本明細書に簡潔に記載されている。これらの方法の非限定的な例として、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を決定するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはさらにまたそれからなる方法、ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、遺伝子チップもしくはマイクロアレイの使用、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたはマイクロアレイが挙げられる。本方法は、動物、哺乳動物またはさらにはヒト患者等、患者の補助において有用である。単なる例証目的のため、哺乳動物として、サル、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ、ウシ、ブタまたはヒト患者が挙げられるがこれらに限定されない。一態様において、患者は、ステージ２がん患者であり、外科手術または外科的切除後にいかなる追加的な治療も未だ受けていない。代替的な態様において、患者は、ステージ３がん患者であり、外科手術もしくは外科的切除後に追加的な治療を受けることになる、またはそれを受けた。
【０１０７】
様々な「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」および同様の技術は、当該分野において公知のものである。係る技術の例として、ＬａｂＣａｒｄ（ＡＣＬＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）；ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃ，Ｉｎｃ）；ＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ）；電気化学的センシングを備える低密度アレイ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）；ＬａｂＣＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇａｍｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．）；Ｏｍｎｉ  Ｇｒｉｄ（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）；Ｑ  Ａｒｒａｙ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）；液相発現技術によるハイスループット自動質量分析システム（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；サーマルジェットスポッティングシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；Ｈｙｓｅｑ  ＨｙＣｈｉｐ（Ｈｙｓｅｑ，Ｉｎｃ．）；ＢｅａｄＡｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＭ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；１２〜６４スポットを複数のスライドグラス上に分注することができるハイスループットマイクロアレイシステム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＮａｎｏＣｈｉｐ（Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；マイクロ流体ガラスチップ（Ｏｒｃｈｉｄ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；４個のＰｉｅｚｏＴｉｐ圧電気ドロップ・オン・デマンド先端部を備えるＢｉｏＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）；ＦｌｅｘＪｅｔ（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃ，Ｉｎｃ．）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機（Ｓｅｑｕｎｏｍｅ）；ＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ２およびＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ３（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨｅｌｌｅｒ（２００２年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．４巻：１２９〜１５３頁において同定および記載されているＧｅｎｏＳｅｎｓｏｒ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるがこれらに限定されない。「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」の例は、米国特許出願公開第２００７／０１１１３２２号、同第２００７／００９９１９８号、同第２００７／００８４９９７号、同第２００７／００５９７６９号および同第２００７／００５９７６５号ならびに米国特許第７，１３８，５０６号、同第７，０７０，７４０号および同第６，９８９，２６７号にも記載されている。
【０１０８】
一態様において、目的の遺伝子のプローブまたはプライマーを含有する「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」は、単独で、または他のプローブおよび／もしくはプライマーと組み合わせて提供される。適した試料は、患者からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらのいずれかの組合せの抽出から得られ、必要であれば増幅される。ＤＮＡまたはＲＮＡ試料は、遺伝子チップまたはマイクロアレイ上に含有されるプローブ（複数可）またはプライマー（複数可）への目的の遺伝子（複数可）のハイブリダイゼーションに適した条件下で、遺伝子チップまたはマイクロアレイパネルと接触させられる。プローブまたはプライマーを検出可能に標識し、これにより目的の遺伝子（複数可）における多型性を同定することができる。代替的に、化学的または生物学的反応を用いて、目的の遺伝子（複数可）のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしたプローブまたはプライマーを同定することができる。続いて、前述の装置および方法の助けにより、患者の遺伝的プロファイルが決定される。
【０１０９】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、次の実施例を参照することにより、より容易に理解できよう。実施例は、本発明のある特定の態様および実施形態の単なる例証目的のために包含されており、本発明の限定を企図しない。
【実施例】
【０１１０】
実験方法
ヒト被験体の登録
本出願人らは、ステージＩ〜ＩＶ  ＯＣ、良性卵巣腫瘍および健康対照を包含する、３２３名の被験体の集団を試験した。
【０１１１】
施設内審査委員会承認
あらゆる臨床材料は、地域倫理委員会（フローニンゲン大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）およびテキサス工科大学健康科学センター（Ｔｅｘａｓ  Ｔｅｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ））の承認ならびに患者の同意のもとに得た。
【０１１２】
ＲＴ−ＰＣＲ
以前に記載された標準技法１９、２０により逆転写ＰＣＲを行った。ＳＰ１７転写産物のためのプライマーは、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号２）であった。
【０１１３】
免疫組織化学
脱パラフィンおよび再水和後に、以前に記載された通りに１９、２１組織切片に対し抗原賦活化および染色を行った。ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で対比染色した後に、光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＬＡ、ＩＬ、ＵＳＡ）により写真を撮った。
【０１１４】
ＳＰ１７のＥＬＩＳＡ
１μＬの血清を５０μＬの標準カーボネート緩衝食塩水（コーティングバッファー）において希釈することにより、ＥＬＩＳＡを行った。希釈した血清を、９６ウェルプレートに３連で添加し、一晩４℃でインキュベートした。ＰＢＳ中１％Ｗ／Ｖ  ＢＳＡと共にプレートを２時間、室温にてインキュベートすることにより、非特異的部位を飽和させた。ＢＳＡを除去し、５０μＬのマウス抗ＳＰ１７一次抗体（本出願人らの研究室で開発し、ＰＢＳにおいて１：５０希釈した。この抗体は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５９１２１．１のヒトＳＰ１７タンパク質に対して産生された）１３を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−ｔ）で３回洗浄し、ＨＲＰに連結した抗マウス二次抗体（Ａｂｃａｍ、ＰＢＳにおいて１：４０００希釈、５０μＬ／ウェル）と共に２時間インキュベートした。ＰＢＳ−ｔ（３００μＬ／ウェル）による３回の洗浄ステップの後、発色性基質を添加し、５分間暗所でインキュベートさせた。続いて、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。精製した抗原の系列希釈を用いて、血清におけるＳＰ１７濃度を決定した。
【０１１５】
ＣＡ１２５のＥＬＩＳＡ
ＦＤＡ認定の方法ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ＣＡ  １２５  ＩＩ（商標）アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示書に従ってＣＡ１２５を測定した。
【０１１６】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ  ５統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、０．０５に等しい有意性レベルを設定して統計解析を行った。
【０１１７】
結果
試験コホートの特徴
本出願人らは、合計３２３名の被験体（１３６名の卵巣がん患者、４５名の良性卵巣腫瘍および１４２名の年齢を合わせた（ａｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）健康なボランティア）を試験した。被験体の分布は次のようであった。１３％ステージＩ、６％ステージＩＩ、２０％ステージＩＩＩ、４％ステージＩＶ、４４％健康、１３％良性卵巣腫瘍。卵巣がんの４４％は、グレードＩ／ＩＩであり、５５％はグレードＩＩＩであった。卵巣がん患者、卵巣良性腫瘍患者および健康な対照の年齢中央値は、５９歳であった。
【０１１８】
ＳＰ１７は、健康な被験体、良性卵巣腫瘍および卵巣がん病変由来の初代細胞において異なるレベルで発現する
正常卵巣、良性卵巣腫瘍試料および卵巣がん初代細胞におけるＳＰ１７  ｍＲＮＡを評価した（図１Ａ）。陽性バンドは、卵巣がん患者由来の試料において検出可能であったが、良性卵巣腫瘍試料および健康な対照においてこの転写産物は存在しなかった。タンパク質レベルでは、ＳＰ１７は、ステージＩ〜ＩＶに及ぶ全卵巣がん試料において検出可能であったが、一方、正常卵巣において（図１Ｂ）、または４５個の解析した良性卵巣病変のいずれにおいても（図１Ｂ）タンパク質発現は示されなかった。
【０１１９】
血清ＳＰ１７濃度は、年齢を合わせた健康な女性または良性卵巣腫瘍を有する女性と比較して、卵巣がん患者において有意により高い
表Ｉは、診断時に健康な対照、良性卵巣腫瘍または卵巣がん患者において測定された平均ＳＰ１７およびＣＡ１２５血清濃度を示す。一元配置ＡＮＯＶＡにより確認される通り、平均ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルは、群間で有意に異なっていた。Ｄｕｎｎの多重比較検定は、ＳＰ１７およびＣＡ１２５が、卵巣がん患者と比較して健康および良性群において有意により低いことを明らかにした（表Ｉ）。卵巣がんステージ間に、または健康および良性群の間に有意差は検出されなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１２０】
ＳＰ１７血清濃度は、全生存期間に関連する
ＳＰ１７血清測定値が、生存時間の適した予後指標たり得るか評価するため、カプラン・マイヤー生存曲線を作成し（図２Ａおよび図２Ｂ）、ログランク検定を行った（α＝０．０５）。ＣＡ１２５レベルが生存時間と相関することは公知であるため、陽性対照としてＣＡ１２５値を用いて同等の解析を行った。全生存期間は、最初の外科手術から卵巣がんによる死亡または最後の経過観察の日付までの時間として定義した。本出願人らは、健康な対照群における平均ＳＰ１７血清濃度プラス２標準偏差（９５位のパーセンタイル）として、４．７ｎｇ／ｍＬのカットオフレベルを確立した。ＣＡ１２５の平行解析を行い、４０Ｕ／ｍＬのカットオフ値を得た。その４．７ｎｇ／ｍＬを上回るまたは下回るＳＰ１７値、または４０Ｕ／ｍＬよりも高いまたは低いＣＡ１２５値に従って、卵巣がん患者を２群にクラスタリングした。ＳＰ１７レベルおよびＣＡ１２５レベルの両方が、全生存時間と関連した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０１２１】
ＳＰ１７検査は、初期卵巣がんおよび良性卵巣腫瘍の間の識別においてＣＡ１２５よりも優れた感度を表示する
初期または進行期卵巣がん（それぞれステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶ）の正確な診断におけるＳＰ１７およびＣＡ１２５検査の性能を比較するため、次の４種の異なる設定でＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を作成した（図３Ａ〜図３Ｄ）。ＳＰ１７およびＣＡ１２５検査を、初期または進行期卵巣がんから良性腫瘍の識別（図３Ａおよび図３Ｂ）および初期または進行期卵巣がんから健康な対照の識別（図３Ｃおよび図３Ｄ）において評価した。良性腫瘍およびステージＩ／ＩＩ卵巣がんの間を識別する場合、ＳＰ１７曲線下面積（ＡＵＣ）は、ｚ検定により比較すると、ＣＡ１２５の曲線下面積よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。検査した他のあらゆる条件において、ＳＰ１７およびＣＡ１２５は、同様のＡＵＣを生じた（ｐ＞０．０５）。９９．９％に等しい固定された特異性にて検査を比較する場合、ＳＰ１７感度は、ステージＩ／ＩＩ卵巣がんから良性卵巣腫瘍の識別において、ＣＡ１２５よりも４０倍高かった（ＳＰ１７感度＝８８．３％、ＣＡ１２５感度＝２．２％）。感度における統計的有意差は、他のあらゆる検査した設定において検出されなかった。
【０１２２】
組み合わせたＣＡ１２５およびＳＰ１７検査は、良性卵巣腫瘍または健康な対照から初期卵巣がんの識別において高い特異性および感度を生じる
組み合わせたＣＡ１２５およびＳＰ１７検査の特異性および感度を、異なる閾値を用いて計算した。ＣＡ１２５の３５ＫＵ／ＬカットオフおよびＳＰ１７の４．６ｎｇ／ｍＬカットオフにより、検査の最適な性能が得られた。図３Ｅは、組み合わせた検査のアルゴリズムを表示する。生存解析において用いられるレベルとは異なるカットオフレベルを用いることにより、組み合わせた検査の最高の特異性および感度が得られた（ＣＡ１２５の３５対４０ＫＵ／ＬおよびＳＰ１７の４．６対４．７ｎｇ／ｍＬ）。ＣＡ１２５レベルが、３５ＫＵ／Ｌよりも高ければ、被験体は、潜在的卵巣がん患者として分類され、ＳＰ１７評価を行う。ＳＰ１７レベルが、４．６ｎｇ／ｍＬよりも高ければ、診断が確認され、それ以外であれば、被験体は、健康または良性卵巣腫瘍を有する可能性があると分類される。本出願人らは、次の通り異なる群間の識別における検査性能を評価した。ステージＩ／ＩＩ卵巣がん対良性腫瘍、ステージＩ／ＩＩ卵巣がん対健康、ステージＩ／ＩＩ卵巣がん対悪性疾患なし（良性腫瘍および健康な対照）。進行期（ＩＩＩ／ＩＶ）卵巣がんに対し、また全ステージ（Ｉ〜ＩＶ）卵巣がんに対しても同等な解析を行った。ＣＡ１２５およびＳＰ１７を組み合わせる診断検査の性能を評価するため、特異性、感度、陽性適中度（ＰＰＶ）および陰性適中度（ＮＰＶ）を計算した（表ＩＩ）。
【０１２３】
考察
本報告は、ＣＴＡ  ＳＰ１７が、卵巣がん患者における予後および診断目的のための信頼できるバイオマーカーであることを実証する。本出願人らは、ＣＴＡ  ＳＰ１７が、予後が良好な良性卵巣腫瘍および卵巣癌の間を識別することを示す。最後に、本出願人らは、ＣＡ１２５と組み合わせたＳＰ１７が、悪性病変の初期検出を可能にすることのエビデンスを提供する。
【０１２４】
現在、卵巣がんスクリーニングは、疾患有病率が合理的に高い場合にのみ、即ち、ＢＲＣＡ１／２変異を保有するまたは乳がんもしくは卵巣がんの家族歴を有する女性に対してのみ臨床的に検証されている（９）。疾患の経過をモニターするための潜在的なバイオマーカーとして１９８１年に発見されて以来（２２）、単独でまたは経膣超音波検査（ＴＶＵ）と共に行うＣＡ１２５測定は、卵巣がんの初期検出の診断検査として広く調査されてきており、ある程度の成功を収めた（２３〜２５）。ＣＡ１２５検査の特異性および感度を改善するための新規腫瘍バイオマーカーの同定のために、益々の努力が為されている（８）。３０種を超える血清バイオマーカーが、単独でまたはＣＡ１２５と組み合わせて試験されており（９）、そのうち最も有望なものは、ＨＥ４（２６）、メソテリン（２７）およびＩＬ−７（２８）である。ＣＡ１２５と共に行う血清ＨＥ４アッセイは、健康な対照、子宮内膜症および卵巣がんを包含するコホートにおいて９２．９％感度および９５％特異性を生じると報告された（２６）。評価されているコホートにおける卵巣がん有病率に基づき、予想されるＰＰＶは、５７．２％であった。卵巣がん患者を健康な対照と比較すると、ＣＡ１２５と組み合わせたメソテリン検査は、予想される８９．５％ＰＰＶで、８６．５％感度および９８％特異性を有していた（２７）。本出願人らは、ステージＩ〜ＩＶ卵巣がんを、年齢を合わせた良性卵巣腫瘍を保有する女性と比較する場合、ＩＬ−７およびＣＡ１２５に基づく検査が、１００％の予想されるＰＰＶで、６９％感度および１００％特異性を生じたことを以前に示した（２８）。
【０１２５】
免疫組織化学およびＲＴ−ＰＣＲにより行われた独立的解析は、ＳＰ１７が、悪性卵巣がんにおいて選択的に発現されることを確認した。高い発現特異性は、ＳＰ１７染色が、生検組織試料における良性状態および卵巣がんの間の信頼できる識別の助けになり得ることを示した。ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＢＡＧＥ等、ＳＰ１７以外のＣＴＡも検出され、卵巣がんにおける可能な予後マーカーとして提案された（２９）。近年、Ｅ−カドヘリン（３０）、ＣＤ１５７（３１）、ステロイドおよび生体異物受容体（ＳＸＲ）（３２）、ＨＭＧ−コエンザイムＡ還元酵素（３３）、ＲＣＡＳ１（３４）、マンマグロビンＢ（３５）、グリピカン−３（３６）およびＩＬ−７（２８）等、組織学的評価および卵巣がんの予後のための多数の有望な非ＣＴＡバイオマーカーも報告されている。これらは、腫瘍ステージまたは分化グレードと関連することが示されてきたが、そのいずれも、完全な特異性を生じなかった。したがって、ＳＰ１７を包含するマーカーのパネルが、卵巣腫瘍における最高の予後指数をもたらす最良の免疫組織学的ツールであることが判明する可能性が高い。ＳＰ１７が、卵巣がん試料のみに選択的に発現されたという知見は、以前の試験と一致し、ＳＰ１７が、この疾患のマウスモデルにおける卵巣がんの追跡を可能にすること（１４）、また、原発性卵巣腫瘍の８３％において発現されるが、卵巣の正常細胞によっては発現されない（２０）ことを示す。これらの結果に基づき、本出願人らは、卵巣がんおよび良性卵巣腫瘍患者、または健康な対照の末梢血における自由に循環するＳＰ１７タンパク質の存在を調査した。データは、血清ＳＰ１７レベルが、健康または良性群よりも卵巣がんにおいて有意に高いことを明らかに示した。ＣＡ１２５に対し同様の結果が得られ、ＣＡ１２５は、検証された血清学的予後指標であるため、本試験を通じて参照として用いた（３７、３８）。健康な個体およびがん患者の血清においてＳＰ１７タンパク質が解析されたのは、初めてのことである。
【０１２６】
生存曲線は、ＳＰ１７が、全生存期間の独立的予後指標であったことを示す。卵巣がんの管理のための臨床決定プロセスにおける重要な点は、悪性疾患のリスク指数（ＲＭＩ）に基づく（３９）、またはＡＣＯＧ−ＳＧＯ指針に基づく（４０）悪性疾患のリスクの決定である（３７）。どちらの基準も、ＣＡ１２５の測定を包含するため、本出願人らは、この見積もりの陽性適中度を改善するためのＳＰ１７検査の使用を保証する。
【０１２７】
ＳＰ１７が、悪性卵巣がん細胞において発現されるが、健康な卵巣組織においては発現されないことを実証する以前の試験に基づき（１２、２０）、また、本明細書に提示される予後検証に基づき、本出願人らは、ＥＬＩＳＡによる卵巣がんの初期検出のための新規血清バイオマーカーとしてＳＰ１７を評価した。このデータは、初期卵巣がんおよび良性卵巣腫瘍または健康な被験体の差次的診断のため、ＣＡ１２５検査と組み合わせたＳＰ１７が、ＩＬ−７を例外として（そうであるにもかかわらず、これはＣＡ１２５／ＳＰ１７検査の感度と比較してより低い感度を生じた２８）、記述されている血清バイオマーカーの中で最高ＰＰＶを生じた（それぞれ６９％対８３．３％）ことを示す。
【０１２８】
要約すると、本出願人らは、ＥＬＩＳＡアッセイによるＳＰ１７血清濃度の測定が、異なる予後を有する被験体の間、特に、良性卵巣腫瘍および卵巣癌の間に有意な識別を生じることを示し、本出願人らは、ＳＰ１７血清レベルが、無増悪生存期間および全生存期間の両方の予後指標であることのエビデンスを提供する。本出願人らは、大規模スクリーニングにおいて潜在的に適用可能な、初期卵巣がんの診断に適した血清バイオマーカーを初めて示す。
【０１２９】
【表１】
2014527816.tif 000003
【０１３０】
【表２】
2014527816.tif 000004
【０１３１】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書に詳細に記載されているが、当業者であれば、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、これに変更を行ってよいことを理解されよう。
【０１３２】
本明細書に例証的に記載されている本発明は、本明細書において特に開示されていない要素（単数または複数）、限定（単数または複数）なしで適宜実施することができる。よって、例えば、用語「を含む」「を包含する」「を含有する」等は、広く、限定せずに解釈されたい。さらに、本明細書に用いられている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、係る用語および表現の使用において、示され記載されている特色のいかなる均等物またはその一部も除外する意図はないが、請求されている本発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。
【０１３３】
よって、本発明を好ましい実施形態および任意選択の特色により特に開示してきたが、そこに具体化され、本明細書において開示される本発明の改変、改善および変更が、当業者により用いられてよいこと、また、係る改変、改善および変更が、本発明の範囲内に収まると考慮されることを理解されたい。本明細書に提供されている材料、方法および実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲に関する限定として企図されていない。
【０１３４】
本発明は、本明細書において広範かつ包括的に記載されてきた。属（ｇｅｎｅｒｉｃ）の開示の内に収まるより狭い種（ｓｐｅｃｉｅｓ）および亜属（ｓｕｂｇｅｎｅｒｉｃ）のグループ分けのそれぞれもまた、本発明の一部を構成する。これは、切り取られた材料が本明細書において特に列挙されているか否かに関わりなく、属（ｇｅｎｕｓ）からいずれかの主題を除去する条件付きまたは否定による限定（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）による本発明の属の記載を包含する。
【０１３５】
加えて、本発明の特色または態様が、マーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本発明が、これによりマーカッシュ群のいずれかの個々のメンバーまたはメンバーの部分群の観点からも記載されることを認識するであろう。
【０１３６】
本明細書において言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、あたかもそのそれぞれが参照により個々に援用されているのと同じ程度まで、参照によりその全内容を明確に援用する。矛盾する場合は、定義を包含する本明細書が調節するであろう。
【０１３７】
【化１】
2014527816.tif 000005
【０１３８】
【化２】
2014527816.tif 000006
【０１３９】
【化３】
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【０１４０】
【化４】
2014527816.tif 000008
【図１】
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【図２】
2014527816.tif 000010
【図３】
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【国際調査報告】
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2014527816.tif 000013
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