(57)【要約】本開示は、ＣＸＣＲ４に高い親和性で特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。この開示はまた、ＣＸＣＲ４を発現する癌、特に多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病または非ホジキンリンパ腫などの血液悪性腫瘍に罹患した対象を処置するための方法であって、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体を含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示はさらに、対象の癌を処置するためのキットであって、投与１回分の抗ＣＸＣＲ４抗体および本開示の治療方法において抗ＣＸＣＲ４抗体を使用するための指示書を含むキットを提供する。
2014533279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞表面で発現したＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する抗体またはその断片の治療有効量を対象に投与することを含む、ＣＸＣＲ４を発現する癌に罹患した対象を処置するための方法。
【請求項２】
対象がヒトであり、抗体またはその断片がヒトＣＸＣＲ４受容体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌が血液悪性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
血液悪性腫瘍が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血液悪性腫瘍が、再発したかまたは難治性の多発性骨髄腫、再発した急性骨髄性リンパ腫、再発した慢性リンパ球性白血病、再発した濾胞性リンパ腫または難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはその断片が、ＣＸＣＲ４発現細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体またはその断片が、単独療法として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗体またはその断片が、その配列が配列番号２５に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含み、その配列が配列番号２９に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗ＣＸＣＲ４抗体またはそれらの断片が、配列番号１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗体またはその断片が、ＣＸＣＲ４受容体の活性を阻害し、化学療法剤に対する癌細胞の感受性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の化学療法剤を抗体またはその断片と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、
（ａ）多発性骨髄腫であり、少なくとも１種の化学療法剤がレナリドミドおよび／またはデキサメタゾンである、
（ｂ）多発性骨髄腫であり、少なくとも１種の化学療法剤がボルテゾミブおよび／またはデキサメタゾンである、
（ｃ）急性骨髄性白血病であり、少なくとも１種の化学療法剤がミトキサントロン、エトポシドおよび／またはシタラビンである、
（ｄ）濾胞性リンパ腫であり、少なくとも１種の化学療法剤がベンダムスチンおよび／またはプラスリツキシマブである、
（ｅ）慢性リンパ性白血病であり、少なくとも１種の化学療法剤がベンダムスチンおよび／またはプラスリツキシマブである、および／または
（ｆ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）であり、少なくとも１種の化学療法剤がリツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチンおよび／またはエトポシドである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象の癌を処置するためのキットであって、
（ａ）投与１回分の抗ＣＸＣＲ４抗体、および
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において抗ＣＸＣＲ４抗体を使用するための指示書、
を含むキット。
【請求項１４】
抗ＣＸＣＲ４抗体が、配列番号２５に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを、配列番号２９に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願全体にわたって、様々な刊行物は、著者名および日付または特許番号または公開番号を括弧内に記載する。これらの刊行物の完全な引用は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見出すことができる。本明細書で説明し、特許請求した本発明の日付時点で当業者に公知の技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。しかし、本明細書の参照文献の引用は、このような参照文献が本発明の従来技術であることを承認するものと解釈すべきではない。
【０００２】
発明の分野
本発明の開示は、細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、ならびに癌、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）やびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含めた血液悪性腫瘍の処置方法におけるこれらの抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ケモカインは、細胞輸送および血管新生を調節し、腫瘍の微小環境においても重要な役割を果たす約５０種類の小タンパク質のファミリーである（Ｖｉｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。その構造に応じて、ケモカインはＣ−Ｃケモカイン（システイン−システインモチーフを含有する）またはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（システイン−Ｘ−システインモチーフを含有する）に分類される。したがって、このようなケモカインに結合する受容体は、それぞれＣＣＲファミリーまたはＣＸＣＲファミリーのメンバーとして分類される。
【０００４】
ＣＸＣＲファミリーの１メンバーはＣＸＣＲ４受容体（ＣＸＣＲ４）で、ＣＤ１８４としても知られており、１つの細胞外Ｎ末端尾部および３つの細胞外ループからなる７回膜貫通型ドメインＧタンパク質共役受容体である。ＣＸＣＲ４の細胞内カルボキシ末端は、βおよびγサブユニットおよび百日咳毒素感受性Ｇｉαサブユニットからなるヘテロ３量体Ｇタンパク質に結合している（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。現在のところ、ＣＸＣＲ４のリガンドの１つ、ＣＸＣＬ１２として知られているケモカイン（間質細胞由来因子１またはＳＤＦ−１としても知られており、本明細書では、同義に使用されている）のみが同定されている（Ｂｌｅｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｏｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合は、ホスホリパーゼＣの活性化を刺激し、その後、細胞質遊離カルシウムの上昇を引き起こす。ＣＸＣＲ４の連結は最終的に、走化性および遊走の誘導を招く（Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＣＸＣＲ４はまた、胚形成、恒常性維持および炎症において役割を果たす。ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＬ１２を欠損するように操作されたマウスによる研究によって、臓器の脈管化ならびに免疫および造血系におけるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路の関与が示されている（Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。さらに、ＣＸＣＲ４は、Ｔリンパ増殖性ＨＩＶ−１単離物の共受容体としての機能が示されたことがある（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。
【０００５】
健康な成人では、ＣＸＣＲ４はＢおよびＴ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫおよび樹状細胞ならびにＣＤ３４＋骨髄（ＢＭ）前駆細胞を含む造血系細胞で主に発現する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＣＸＣＲ４はまた、内皮および上皮細胞、星状膠細胞ならびに神経細胞において低レベルで発現する（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＣＸＣＬ１２は、内皮細胞の遊走および増殖を誘導することが示され、ＶＥＧＦと一緒に新血管新生を増強することが示された（Ｇｕｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。ＣＸＣＲ４の過剰発現はまた、白血病、リンパ腫、膵臓、乳腺、卵巣、肺、前立腺および結腸直腸腫瘍を含む癌の７５％で見出され、ＣＸＣＬ１２との相互作用は、ＢＭ微小環境内での造血幹細胞のホーミングおよび維持に必須である（Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＣＸＣＲ４のバイサイクラムアンタゴニストであるプレリキサホル（ＡＭＤ３１００；Ｍｏｚｏｂｉｌ）は、幹細胞を血流に動員することが示された（Ｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。別のＣＸＣＲ４アンタゴニストバイサイクラムであるＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３４６５は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２シグナル伝達をブロックすることによってＡＭＬ腫瘍細胞の薬剤感受性を増加させる（Ｎｅｒｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０００６】
ＡＭＬは、ＢＭに蓄積し、正常な血液細胞の産生を妨害する異常な白血球細胞の迅速な増殖を特徴とする、骨髄系血液細胞の急激に成長する癌である。ＡＭＬでは、ＣＸＣＲ４はＢＭ細胞のＣＤ３４＋画分で強く発現する。ＡＭＬ細胞におけるＣＸＣＲ４レベルの低さは、無再発および全生存期間を長くする良好な予後と相関する。ＣＸＣＲ４受容体の発現が低いと、ＢＭの化学的に保護された環境において発現したＣＸＣＬ１２に向かう原発性ＡＭＬ細胞の遊走が減衰する（Ｔａｖｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【０００７】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、形質細胞の悪性増殖から生じる癌の１形態である。非ホジキンリンパ腫後に、２番目に多く頻発する血液の癌で、毎年世界中で約８０，０００の新たな症例があり（米国では２０，０００例）、約６２，０００の死亡例がある（米国では１０，５００の死亡例／年）（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  ２００９）。ＭＭ細胞は、ＢＭで優先的に増殖し、正常な血液細胞および正常な抗体の産生を妨害し、免疫不全、骨格破壊、低カルシウム血症、ＢＭおよび腎不全を引き起こす。ＡＭＬに加えて、ＣＸＣＬ１２の血清レベルは、ＭＭの患者で上昇し、ＣＸＣＲ４発現はＭＭの進行期の徴候である髄外性形質細胞腫において増加する。さらに、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸の遮断は、ＭＭ細胞の遊走およびこれらの細胞のＢＭへのホーミングを減衰させる（Ａｌｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
【０００８】
非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ球の癌のどの異なる群も含む。ＮＨＬは、いかなる年齢でも発生でき、正常より大きなリンパ節、発熱および体重減少がしばしば特徴的である。ＮＨＬの多くの異なる種類では、高悪性度（増殖が速い）から低悪性度（増殖が遅い）型まで重症度が著しく異なり、Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれかから形成され得る。Ｂ細胞ＮＨＬには、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫が含まれる。Ｔ細胞ＮＨＬには、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。２０１２年に米国ではＮＨＬの新たな症例が約７０，０００例に上り、約１９，０００例が亡くなるものと推定される。高レベルのＣＸＣＲ４発現が試験した１９種類の原発性ＮＨＬ細胞株のうち１８種類で示された（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ＣＸＣＬ１２が濾胞性ＮＨＬ細胞の遊走を促進し（Ｃｏｒｃｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、ＣＸＣＲ４−ＣＸＣＬ１２回路網がＣＬＬ細胞の遊走に重要であるらしいことも示された（Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。
【０００９】
数多くの望ましい特性を示すヒト抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体は、２００６年１０月２日に出願された米国特許仮出願第６０／８２７，８５１号の優先権を主張するＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００８／０６０３６７号（出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２１１５２）に既に記載されている。これらの両出願の開示は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。ＷＯ２００８／０６０３６７に開示したように、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）研究では、これらのモノクローナル抗体がＣＸＣＲ４発現細胞に低いナノモル親和性で結合し、ＣＸＣＬ１２がＣＸＣＲ４発現細胞に結合するのをブロックし、ＣＸＣＬ１２誘導性遊走およびカルシウム流を低いナノモルＥＣ５０値で阻害することが示されている。前臨床試験で予期しない有利な抗固形腫瘍特性を示した、完全なヒトモノクローナル抗体の１つ、ＢＭＳ−９３６５６４（ＷＯ２００８／０６０３６７ではＦ７と称されており、以前にはＭＤＸ−１３３８とも称されており、３つの呼び方は全て本明細書では同義に使用されている）はさらに調査するために選択され、インビボにおいて（ｉｎ  ｖｉｖｏ）血液癌に対するその活性が測定され、その抗癌活性の基礎となる機構がさらに解明された。ＢＭＳ−９３６５６４抗体はまた、再発／難治性ＡＭＬ、ＭＭおよびＮＨＬの患者における第１相治験に入った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明の開示は、ヒトＣＸＣＲ４に結合し、治療用抗体に望ましい数多くの特性を示す単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性には、細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４に低ｎＭ親和性で結合し、ヒトＣＸＣＲ４に結合するＳＤＦ−１を阻害ＥＣ５０５０ｎＭ以下で阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるＳＤＦ−１誘導性カルシウム流を阻害ＥＣ５０３ｎＭ以下で阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走を阻害ＥＣ５０５０ｎＭ以下で阻害し、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）による毛細管形成を阻害し、ＣＸＣＲ４を発現する多種多様な細胞においてアポトーシスを誘導し、インビトロにおいて腫瘍細胞増殖を阻害し、インビボにおいて腫瘍増殖を阻害し、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移を阻害し、かつ／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍を有する対象の生存期間を延長させる能力が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
好ましい態様では、本開示は、単離されたモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部分に関し、前記モノクローナル抗体は、
（ａ）細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４に結合し、
（ｂ）ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）のヒトＣＸＣＲ４への結合を阻害し、
（ｃ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるＳＤＦ−１誘導性カルシウム流を阻害し、
（ｄ）ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走を阻害し、かつ
（ｅ）ヒト臍帯静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害する。
さらにより好ましくは、この抗体はまた、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のアポトーシスを誘導し、インビボにおいて腫瘍細胞アポトーシスを誘導し、かつ／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【００１２】
本開示はまた、血液悪性腫瘍を含むＣＸＣＲ４を発現する癌に罹患した対象を処置するための方法であって、細胞表面で発現したヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗ＣＸＣＲ４抗体の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＣＸＣＲ４の活性を阻害する。好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＣＸＣＲ４発現標的細胞のアポトーシスを誘導する。したがって、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ある種の実施形態では、単独療法として使用される。その他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、その他の抗癌剤と組み合わせて使用される。好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、ＭＭ、ＡＭＬまたはＮＨＬである。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体である。より好ましくは、抗体はＢＭＳ−９３６５６４である。
【００１３】
本開示はさらに、血液悪性腫瘍を含む癌に罹患した対象を処置するための医薬組成物を調製するためのＣＸＣＲ４抗体の使用を提供する。
【００１４】
本開示はまた、対象の癌を処置するためのキットであって、（ａ）投与１回分の抗ＣＸＣＲ４抗体、および（ｂ）本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて抗ＣＸＣＲ４抗体を使用するための指示書を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＢＭＳ−９３６５６４である。
【００１５】
本開示のその他の特性および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるだろうが、それらは限定するものと解釈すべきではない。本出願全体にわたって引用した全参照文献、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）登録、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１は、Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ａ）のヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号５）およびＣＤＲ３（配列番号９）領域を描写し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列由来を指示する。Ｆ７の軽鎖可変領域（Ｂ）のヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号２９）も示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１７）およびＣＤＲ３（配列番号２１）領域を描写し、ＶおよびＪ生殖系列由来を指示する。
【図１−２】図１−１に同じ。
【００１７】
【図２】図２は、ヒト抗ＣＸＣＲ４抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の細胞表面に天然ヒトＣＸＣＲ４を発現するＣＥＭ細胞への結合を示す。
【００１８】
【図３】図３はＦＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ４抗体Ｆ９と一連の未標識ヒト抗ＣＸＣＲ４抗体との間のＣＥＭ細胞への結合の抗体競合を示す。
【００１９】
【図４−１】図４は、ＢＭＳ−９３６５６４結合のフローサイトメトリー分析を示す。抗体は、ＡＭＬ細胞株Ｎｏｍｏ−１およびＨＬ−６０（Ａ）、ＣＸＣＲ４トランスフェクトＲ１６１０、ＣＥＭおよびＲａｍｏｓ細胞株（Ｂ）、ＭＭ細胞株、ＪＪＮ−３ＲおよびＭＯＬＰ８（Ｃ）ならびに原発性ＡＭＬ患者血液細胞（Ｄ）に結合する。
【図４−２】図４−１に同じ。
【図４−３】図４−１に同じ。
【図４−４】図４−１に同じ。
【００２０】
【図５】図５は、１２５Ｉ標識ＣＸＣＬ１２のＣＥＭ細胞で発現したＣＸＣＲ４への結合の抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）、Ｆ９およびＤ１による阻害を示す。Ｅ２抗体は、ＣＸＣＬ１２のＣＥＭ細胞への結合を阻害しない。
【００２１】
【図６−１】図６は、１２５Ｉ標識ＣＸＣＬ１２のＣＥＭ細胞への結合の抗ＣＸＣＲ４抗体ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）（Ａ）または抗ＣＸＣＬ１２抗体（Ｂ）による阻害ならびに１２５Ｉ標識ＣＸＣＬ１２のＲａｍｏｓ細胞への結合のＭＤＸ−１３３８（６Ｃ）による阻害を示す。リガンド結合アッセイは、ＭＤＸ−１３３８、抗ＣＸＣＬ１２またはアイソタイプ対照抗体の増加する濃度の存在下で１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２  １００ｐＭをＣＥＭ細胞とインキュベートすることによって実施した。非特異的結合（ＮＳＢ）を確認するために、未標識ＣＸＣＬ１２を１０００倍モル過剰（１００ｎＭ）で添加した。達成可能な全結合（全体）を確認するために、抗体または未標識競合物を含めずに１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２を添加した。
【図６−２】図６−１に同じ。
【図６−３】図６−１に同じ。
【００２２】
【図７】図７は、ＣＥＭ細胞におけるＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）誘導性カルシウム流の抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）、Ｆ９およびＤ１による阻害を示す。Ｅ２は、ＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流をあまり阻害しない。
【００２３】
【図８−１】図８は、ＣＸＣＲ４＋細胞におけるＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流の抗ＣＸＣＲ４抗体ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）または抗ＣＸＣＬ１２抗体による阻害を示す。カルシウム流アッセイは、試験抗体またはアイソタイプ対照の存在下または非存在下で、Ｒａｍｏｓ細胞（Ａ）またはＣＥＭ細胞（Ｂ）のいずれかをカルシウム４色素とインキュベートすることによって実施した。色素を添加した細胞を、Ｒａｍｏｓ細胞は５０ｎＭ、ＣＥＭ細胞は５ｎＭのＣＸＣＬ１２と共に室温でインキュベートした。２０秒から２００秒の間の蛍光の曲線下面積を定量して、ＥＣ５０を算出した。
【図８−２】図８−１に同じ。
【００２４】
【図９】図９は、ＣＥＭ細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走の抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）およびＦ９による阻害を示し、一方、抗体Ｄ１およびＥ２はあまり遊走を阻害しない。
【００２５】
【図１０−１】図１０は、ＣＸＣＲ４＋細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走の抗ＣＸＣＲ４抗体ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）または抗ＣＸＣＬ１２抗体による阻害を示す。Ｒａｍｏｓ（Ａ）およびＣＥＭ（Ｂ）細胞による遊走アッセイは、それぞれＣＸＣＬ１２  １．２５ｎＭおよび０．０５ｎＭの存在下で実施した。下の区画に遊走した標識細胞の数は、Ｆｕｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）プレートリーダーで測定した。各点は、ｎ＝３を表す。
【図１０−２】図１０−１に同じ。
【００２６】
【図１１−１】図１１は、抗ＣＸＣＬ１２による無阻害と比較した（Ａ）インビトロにおけるＲａｍｏｓ腫瘍細胞増殖の抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）、Ｆ９およびＥ２による阻害、および（Ｂ）Ｒａｍｏｓ細胞増殖のＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）による阻害を示す。（Ｂ）では、様々なペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストの効果も示す。
【図１１−２】図１１−１に同じ。
【００２７】
【図１２−１】図１２は、皮下腫瘍モデルにおけるインビボでのＲａｍｏｓ腫瘍細胞増殖の抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）およびＦ９による阻害を示す。図１２Ａは、平均腫瘍容量増殖曲線を示し、図１２Ｂは腫瘍容量増殖中央値曲線を示し、図１２Ｃは％体重変化の中央値を示す。
【図１２−２】図１２−１に同じ。
【図１２−３】図１２−１に同じ。
【００２８】
【図１３−１】図１３は、Ｒａｍｏｓ全身性腫瘍細胞モデルにおける抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体Ｆ９（Ａ）または抗ＣＸＣＲ４抗体、ＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２抗体（Ｂ）で処置したマウスの生存パーセントを示す。ＢＭＳ−９３６５６４は、このＲａｍｏｓ全身性モデルにおいて高度に有効であり、一方、抗ＣＸＣＬ１２Ａｂは有効性を示さない。
【図１３−２】図１３−１に同じ。
【００２９】
【図１４−１】図１４は、Ｒａｍｏｓ細胞をＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）１０μｇ／ｍＬまたはアイソタイプ対照と３７℃で２４時間インキュベートすることによって実施したアポトーシスアッセイの結果を示す。細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムで染色した（Ａ）。アネキシンＶのみに陽性またはアネキシンＶおよびＰＩの両方に２重陽性の細胞のパーセントを測定した（Ｂ）。
【図１４−２】図１４−１に同じ。
【００３０】
【図１５】図１５は、ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）によるアポトーシスの誘導がＣＸＣＲ４特異的であることを示す。ＭＤＸ−１３３８またはアイソタイプ対照をＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞（Ａ）またはＲ１６１０親細胞（Ｂ）に添加し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色した。アネキシンＶのみに陽性またはアネキシンＶおよびＰＩの両方に２重陽性であった細胞のパーセントを例示する。
【００３１】
【図１６】図１６は、ブロッキングＣＸＣＲ４抗体、ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）およびリツキシマブ（キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）陽性対照によるＲａｍｏｓ細胞リンパ腫異種移植のインビボにおける腫瘍増殖阻害ならびにブロッキング抗ＣＸＣＬ１２抗体による腫瘍増殖の無阻害を示す。
【００３２】
【図１７−１】図１７は、ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）によるＨＬ６０細胞（Ａ）およびＮｏｍｏ−１（Ｂ）急性骨髄性白血病異種移植のインビボにおける腫瘍増殖阻害を示す。シタラビンは、予測通りシタラビン耐性Ｎｏｍｏ−１腫瘍の腫瘍増殖を阻害しなかった。
【図１７−２】図１７−１に同じ。
【００３３】
【図１８−１】図１８は、ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）による様々なＣＸＣＲ４＋多発性骨髄腫細胞異種移植のインビボにおける腫瘍増殖阻害を示す。Ａ、ＭＤＸ−１３３８単独でまたはレナリドミドもしくはボルテゾミブと組み合わせて処置したＭＯＬＰ８細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｂ、ＭＤＸ−１３３８またはレナリドミドもしくはボルテゾミブで処置したＪＪＮ−３Ｒ細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｃ、ＭＤＸ−１３３８単独でまたはボルテゾミブと組み合わせて処置した親ＪＪＮ−３細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｄ、ＭＤＸ−１３３８単独でまたはレナリドミドと組み合わせて処置した親ＪＪＮ−３細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｅ、ＭＤＸ−１３３８単独またはレナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））との組合せによるＲＰＭＩ−８２２６細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｆ、ＭＤＸ−１３３８単独またはボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））との組合せによるＲＰＭＩ−８２２６細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｇ、ＭＤＸ−１３３８単独またはレナリドミドとの組合せによるＭＭ．１Ｓ細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｈ、ＭＤＸ−１３３８単独またはボルテゾミブとの組合せによるＯＭＰ−２細胞異種移植の腫瘍増殖阻害；Ｉ、ＭＤＸ−１３３８単独またはレナリドミドとの組合せによるＯＰＭ−２細胞異種移植の腫瘍増殖阻害。
【図１８−２】図１８−１に同じ。
【図１８−３】図１８−１に同じ。
【図１８−４】図１８−１に同じ。
【図１８−５】図１８−１に同じ。
【図１８−６】図１８−１に同じ。
【図１８−７】図１８−１に同じ。
【図１８−８】図１８−１に同じ。
【図１８−９】図１８−１に同じ。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明の開示は、細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。ある種の実施形態では、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列から得られ、かつ／または特定のアミノ酸配列を含む可変領域もしくはＣＤＲなどの特定の構造特色を含む。本開示はまた、癌、特に、血液悪性腫瘍、腫瘍転移、ＨＩＶ感染、炎症および血管新生などのＣＸＣＲ４の発現が関連した、またはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路が関与する疾患または障害におけるＣＸＣＲ４活性を調節するために、またはその他の形でそれらを処置するために、この抗体を使用する方法に関する。
【００３５】
用語
本開示をより容易に理解できるように、ある種の用語を最初に定義する。本出願で使用したように、本明細書で別段明白に規定しない限り、以下の用語はそれぞれ、以下に記載した意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体にわたって記載する。
【００３６】
「投与」とは、当業者に公知の様々な方法および送達系のいずれかを使用した治療薬を含む組成物の対象への物理的導入を意味する。本発明の抗体のための好ましい投与経路には、例えば、注射もしくは注入による静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄またはその他の非経口投与経路が含まれる。本明細書では、「非経口投与」という表現は、経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を意味し、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入、ならびにインビボエレクトロポレーションが含まれる。あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮または粘膜投与経路などの非経口経路によって、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸、舌下または局所的に投与することができる。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１回または複数の長期間にわたって実施することができる。
【００３７】
「抗体」（Ａｂ）には、限定はしないが、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質イムノグロブリンまたはそれらの抗体結合部分が含まれるものとする。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する領域が分散した相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域に細区分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順番、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、イムノグロブリンが、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または要素に結合するのを媒介することができる。
【００３８】
抗体は通常、同種（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に高い親和性で特異的に結合し、１０−５から１０−１１Ｍ−１以下の解離定数（ＫＤ）に反映される。約１０−４Ｍ−１より大きなＫＤは一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書では、抗原に「特異的に結合する」抗体とは、抗原および実質的に同一の抗原に、ＫＤが１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは１０−８Ｍと１０−１０Ｍ以下の間であることを意味する高い親和性で結合するが、関連のない抗原には高い親和性では結合しない抗体を指す。抗原は、所与の抗原に対して高い程度の配列同一を示すならば、例えば、所与の抗原の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９配列同一性を示すならば、所与の抗原に対して「実質的に同一」である。例として、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体はまた、ある種の霊長類種のＣＸＣＲ４抗原と交差反応し得るが、ある種のげっ歯類種のＣＸＣＲ４抗原またはＣＸＣＲ４以外の抗原、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１抗原とは交差反応することはない。
【００３９】
イムノグロブリンは、限定はしないが、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む通常公知のアイソタイプのいずれかから得ることができる。ＩｇＧサブクラスはまた、当業者には周知で、限定はしないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を意味する。「抗体」には、例として、天然に生じるおよび天然には生じない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトまたは非ヒト抗体、完全に合成された抗体ならびに１本鎖抗体が含まれる。非ヒト抗体は、ヒトにおける免疫原性を低下させるために組換え法によってヒト化することができる。明白に記載されていないならば、また文脈上別段に指示していないならば、「抗体」という用語はまた、前述のイムノグロブリンのいずれかの抗原結合断片または抗原結合部分を含み、１価および２価断片または部分を含み、１本鎖抗体を含む。
【００４０】
「単離された抗体」とは、様々な抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＸＣＲ４以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する単離された抗体は、様々な種のＣＸＣＲ４分子などのその他の抗原との交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、その他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４１】
「抗抗原抗体」、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と同義に使用する。
【００４２】
「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）という用語は、単一な分子組成物の抗体分子、すなわち、１次配列が本質的に同一で、単一な結合特異性および特定のエピトープに親和性を示す抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、トランスジェニックまたは当業者に公知のその他の技術によって生成することができる。
【００４３】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列イムノグロブリン配列から得られた可変領域を有する抗体を意味する。さらに、抗体が定常領域を含有するならば、この定常領域はまた、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列から得られる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでいてもよい（例えば、インビトロにおけるランダムまたは部位特異的変異誘発によって、またはインビボにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかし、本明細書では、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列から得られたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に接合された抗体は含まないものとする。「ヒト」抗体および「完全なヒト」抗体という用語は、同義に使用される。
【００４４】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体のＣＤＲドメインの外側のアミノ酸のいくつか、ほとんどまたは全てをヒトイムノグロブリンから得られた対応するアミノ酸で置換した抗体を意味する。ヒト化形態の抗体の一実施形態では、ＣＤＲドメインの外側のアミノ酸のいくつか、ほとんどまたは全てがヒトイムノグロブリンのアミノ酸と置換しているが、一方、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のいくつか、ほとんどまたは全てのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の小さな添加、欠失、挿入、置換または改変は、抗体が特定の抗原に結合する能力を阻害しない限り、許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。
【００４５】
「キメラ抗体」とは、可変領域が１つの種から得られ、定常領域は別種から得られる抗体、例えば、可変領域がマウス抗体から得られ、定常領域がヒト抗体から得られる抗体を意味する。
【００４６】
抗体の「抗原結合部分」（「抗原結合断片」とも呼ばれる）は、全抗体に結合した抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１種または複数の断片を意味する。
【００４７】
「癌」とは、体内の異常細胞の無秩序な増殖を特徴とする様々な疾患の大きな群を意味する。未制御の細胞分裂および増殖分裂および増殖は、近隣の組織に侵入し、リンパ系または血流を通って身体の遠い部分に転移することもある悪性腫瘍の形成を引き起こす。
【００４８】
「ＣＸＣＲ４」（「Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４」）という用語には、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログが含まれる。例えば、ＣＸＣＲ４に特異的な抗体は、ある種の場合では、ヒト以外の種のＣＸＣＲ４と交差反応することができる。その他の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４に特異的な抗体は、ヒトＣＸＣＲ４に完全に特異的であってもよく、種またはその他の種類の交差反応性を示さなくてもよい。「ヒトＣＸＣＲ４」という用語は、ジェンバンク（登録商標）受入番号Ｐ６１０７３（配列番号５１）を有するヒトＣＸＣＲ４の完全なアミノ酸配列などのヒト配列ＣＸＣＲ４を意味する。ＣＸＣＲ４はまた、当技術分野では、例えば、ＬＥＳＴＲ、フーシンまたはＣＤ１８４として知られている。ヒトＣＸＣＲ４配列は、例えば、非保存領域に保存された突然変異または突然変異を有することによって配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４とは異なっていてもよいが、ＣＸＣＲ４は配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＣＸＣＲ４の生物学的機能は、ＣＸＣＲ４の細胞外ドメインに本開示の抗体が特異的に結合するエピトープを有することであるか、あるいはヒトＣＸＣＲ４の生物学的機能は、ケモカインが結合することまたは転移プロセスにおいて関与することである。
【００４９】
特定のヒトＣＸＣＲ４配列は一般的に、アミノ酸配列が配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と少なくとも９０％同一であり、その他の種（例えば、マウス）のＣＸＣＲ４アミノ酸配列と比較したとき、アミノ酸配列がヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。ある種の場合では、ヒトＣＸＣＲ４は、アミノ酸配列が配列番号５１のＣＸＣＲ４と少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であってもよい。ある種の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４配列は、配列番号５１のＣＸＣＲ４と１０個以下のアミノ酸の違いを示す。ある種の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４は、配列番号５１のＣＸＣＲ４と５個以下、またはさらに４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の違いを示してもよい。パーセント同一性は、本明細書で説明したように測定することができる。
【００５０】
「ＣＸＣＲ４を発現する癌」または「ＣＸＣＲ４＋癌」は、この癌を特徴付ける悪性腫瘍細胞が、細胞表面にＣＸＣＲ４を発現する、好ましくは高レベルのＣＸＣＲ４を発現する癌である。
【００５１】
本明細書では、「血液悪性腫瘍」という用語には、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ性悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌が含まれる。本発明で開示した抗ＣＸＣＲ４抗体による処置に適しているリンパ腫の例には、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両方が含まれる。Ｂ細胞リンパ腫には、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方が含まれる。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的例には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞型リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ球性白血病と重複する）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が含まれる。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的例には、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫が含まれる。血液悪性腫瘍にはまた、限定はしないが、二次性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ−ＰＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および骨髄形成異常症（ＭＤＳ）などの白血病が含まれる。血液悪性腫瘍にはさらに、限定はしないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）およびくすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）などの骨髄腫が含まれる。その他の血液および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連癌は、血液悪性腫瘍という用語に包含される。例えば、血液悪性腫瘍にはまた、樹状細胞、血小板、赤血球、ナチュラルキラー細胞、ならびに、例えば、好塩基球、好酸球、好中球および単球などの多型核白血球を含む他の造血細胞の癌が含まれる。これらの前悪性腫瘍および悪性腫瘍は、分類の仕方を変えることによって異なる名称を有することが多く、異なる名称に分類されたリンパ腫を有する患者も本発明の治療計画によって利益を得ることができることは、当業者には明らかであろう。
【００５２】
「ＳＤＦ−１」という用語は、ＣＸＣＲ４のリガンドである間質細胞由来因子１を意味する。「ＳＤＦ−１」という用語は、ＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βなどのＳＤＦ−１の様々なアイソフォームを包含する。ヒトＳＤＦ−１αのアミノ酸配列は、ジェンバンク（登録商標）受入番号ＮＰ＿９５４６３７を有する。ヒトＳＤＦ−１βのアミノ酸配列は、ジェンバンク（登録商標）受入番号ＮＰ＿０００６００を有する。ヒトＳＤＦ−１はまた、米国特許第５，７５６，０８４号に記載されている。ＳＤＦ−１はまた、ＣＸＣＬ１２として知られている。ヒトＳＤＦ−１のアミノ酸配列は、本明細書でＣＸＣＲ４について記載したＮＰ＿９５４６３７またはＮＰ＿０００６００のＳＤＦ−１とは異なっていてもよい。
【００５３】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一部から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を意味する。本明細書では、「細胞表面受容体」という表現には、例えば、細胞の細胞膜を横断するシグナルおよびこのようなシグナルの伝達を受けることができる分子および分子の複合体が含まれる。本開示の細胞表面受容体の１例は、ＣＸＣＲ４受容体である。
【００５４】
「対象」には、いかなるヒトまたは非ヒト動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語には、限定はしないが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類、ニワトリなどの鳥類、両生類ならびには虫類などの脊椎動物が含まれる。好ましい実施形態では、対象は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットまたはげっ歯類などの哺乳類である。より好ましい実施形態では、対象はヒトである。「対象」、「患者」および「個体」という用語は、本明細書では同義に使用する。
【００５５】
本発明の抗体などの薬物または治療薬の「治療有効量」または「治療有効用量」とは、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用したとき、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および長さの増加、または疾患苦痛による機能障害または身体障害の防御によって明らかな疾患の退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の治療有効量または用量には、疾患を発症するかまたは疾患を再発する危険性がある対象に単独で、または別の治療薬と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻害する薬物の任意の量である「予防的に有効な量」または「予防的に有効な用量」が含まれる。治療薬が疾患退縮を促進する能力は、当業者に公知の様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、またはインビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによって評価することができる。
【００５６】
例として、抗癌剤は、対象における癌退縮を促進する。好ましい実施形態では、薬物の治療有効量は、癌を排除する点まで癌退縮を促進する。「癌退縮の促進」とは、単独で、または抗悪性腫瘍薬と組み合わせて薬物の有効量を投与すると、腫瘍増殖またはサイズの低下、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の減少、疾患症状がない期間の頻度および長さの増加、疾患苦痛による機能障害または身体障害の防御、そうでなければ患者における疾患症状の改善がもたらされることを意味する。さらに、処置に関する「有効な」および「有効性」という用語には、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方が含まれる。薬理学的有効性とは、患者における癌退縮を促進する薬物の能力を意味する。生理学的安全性とは、薬物の投与によって生じる細胞、器官および／または生物レベルでの毒性またはその他の有害な生理学的効果（有害作用）のレベルを意味する。
【００５７】
腫瘍の処置の例として、治療有効量または用量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を未処置対象に対して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害することが好ましい。最も好ましい実施形態では、治療有効量または用量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害し、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物が細胞増殖を阻害する能力を調べることによって評価することができ、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロにおいて測定することができる。本発明のその他の好ましい実施形態では、腫瘍退縮が認められ、少なくとも約２０日間、より好ましくは少なくとも約４０日間、またはさらにより好ましくは少なくとも約６０日間継続し得る。
【００５８】
対象の「処置」または「治療」とは、疾患に関連した症状、合併症、状態または生化学的徴候の逆行、軽減、改善、阻害、減速または発生、進行、発症、重症度もしくは再発の予防を目的とした対象に実施する任意の種類の介入もしくは方法または活性剤の投与を意味する。
【００５９】
本開示の様々な態様を以下の項でさらに詳細に説明する。
【００６０】
抗ＣＸＣＲ４抗体
本開示のヒトモノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを使用して生成することができる。本明細書では、これらのトランスジェニックマウスにはＨＵＭＡＢ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）、およびこれらのトランスクロモソミックマウスにはＫＭ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）（ＷＯ０２／４３４７８）と呼ばれるマウスが含まれる。本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体例の生成は、ＷＯ２００８／０６０３６７に詳細に記載されている。本開示の抗体は、特定の機能的特色または特質が特徴である。例えば、抗体は、細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、ＣＸＣＲ４に高い親和性、例えば、ＫＤ１×１０−７Ｍ以下で結合する。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、好ましくは、以下の特徴、
（ａ）細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４への結合、
（ｂ）ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合の阻害、
（ｃ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるＳＤＦ−１誘導性カルシウム流の阻害、
（ｄ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走の阻害、
（ｅ）ヒト臍帯静脈内皮細胞による毛細管形成の阻害、
（ｆ）ヒトＣＸＣＲ４へのＫＤ１×１０−７Ｍ以下での結合、
（ｇ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるアポトーシスの誘導、
（ｈ）インビトロにおけるＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞増殖の阻害、
（ｉ）インビボにおけるＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞増殖の阻害および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞アポトーシスの誘導、
（ｊ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移の阻害、および／または
（ｋ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍を有する対象の生存時間の延長、
の１つまたは複数を示す。
【００６１】
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＸＣＲ４にＫＤ５×１０−８Ｍ以下で結合し、ヒトＣＸＣＲ４にＫＤ２×１０−８Ｍ以下で結合し、ヒトＣＸＣＲ４にＫＤ５×１０−９Ｍ以下で結合し、ヒトＣＸＣＲ４にＫＤ４×１０−９Ｍ以下で結合し、ヒトＣＸＣＲ４にＫＤ３×１０−９Ｍ以下で結合し、またはヒトＣＸＣＲ４にＫＤ２×１０−９Ｍ以下で結合する。
【００６２】
好ましくは、抗体は、ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４への結合を、阻害のＥＣ５０が５０ｎＭ以下、より好ましくは３０ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または３ｎＭ以下（例えば、阻害のＥＣ５０が２８．６０ｎＭ以下、または１２．５１ｎＭ以下、または２．２５６ｎＭ以下）で阻害する。
【００６３】
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるＳＤＦ−１誘導性カルシウム流を阻害のＥＣ５０が３ｎＭ以下、より好ましくは２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．９ｎＭ以下、または０．８ｎＭ以下、または０．７ｎＭ以下、または０．６ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下（例えば、０．９０４６ｎＭ以下、０．５６８４以下、または０．３２１９ｎＭ以下）で阻害する。
【００６４】
好ましくは、本開示の抗体は、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走を阻害のＥＣ５０が５０ｎＭ以下、より好ましくは３０ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下（例えば、１８．９９ｎＭ以下、または１２．４４以下）で阻害する。
【００６５】
細胞表面で発現した天然ヒトＣＸＣＲ４に対する抗体の結合能力を評価する標準的アッセイは、当技術分野では公知で、例えば、天然に天然ＣＸＣＲ４を発現するか、または天然ＣＸＣＲ４を発現するようにトランスフェクトされた細胞株を使用したフローサイトメトリー分析が含まれる。適切なアッセイを実施例で詳細に説明する。天然ＣＸＣＲ４を発現する好ましい細胞株は、ＣＥＭ  Ｔ細胞株である。ＳＤＦ−１の結合の阻害、ＳＤＦ−１誘導性カルシウム流の阻害、ＳＤＦ−１誘導性細胞遊走の阻害、ＨｕＶＥＣによる毛細管形成の阻害、インビトロおよび／またはインビボにおけるＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるアポトーシスの誘導、インビトロおよび／またはインビボにおけるＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞増殖の阻害、および／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移の阻害を評価するために適切なアッセイはまた、実施例において詳細に説明する。抗体の結合親和性はまた、スキャッチャード分析などの標準的方法によって測定することができる。
【００６６】
本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体はまた、前記抗体の抗原結合部分を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によっても実施され得ることは十分に示されてきた。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結した２個のＦａｂ断片を含む２価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、ならびに（ｉｖ）抗体の１腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片が含まれる。
【００６７】
最初、パパインおよびペプシンなどの酵素によるタンパク質分解によって得られたこれらの断片は、その後、単価および多価抗原結合断片に操作された。例えば、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わさって１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として知られる１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖になることを可能にする合成リンカーペプチドによって一緒にすることができる。２価（Ｄｉｖａｌｅｎｔ）または２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖまたはバイ−ｓｃＦｖ）は、２個のＶＨおよび２個のＶＬ領域を含有する直列型ｓｃＦｖとして知られるように単一のペプチド鎖内に２個のｓｃＦｖを連結することによって操作することができる。ＳｃＦｖダイマーおよびより大きなマルチマーはまた、２つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎ、ｓｃＦｖｓを二量体化し、ダイアボディを生成するか、またはその他のマルチマーを形成する１０個未満のアミノ酸のリンカーペプチドを使用して生成することができる。ダイアボディは、対応するｓｃＦｖよりもずっと高い親和性で同種抗原に結合し、ｓｃＦｖのＫＤ値よりも最大で４０倍低い解離定数を有することが示された。非常に短いリンカー（≦３アミノ酸）は、ダイアボディよりも抗原に対してさらに高い親和性を示す３価トライアボディまたは４価テトラボディの形成をもたらす。その他の変異体には、ｓｃＦｖ−ＣＨ３二量体であるミニボディおよびより大きなｓｃＦｖ−Ｆｃ断片（ｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３二量体）が含まれ、単離されたＣＤＲであっても抗原結合機能を示すことができる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の組換え技術を使用して操作し、断片は完全な抗体と同じ方法で有用性をスクリーニングする。前記のタンパク質分解され、操作された抗体断片および関連変異体（さらに詳細についてはＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０を参照）は全て、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。
【００６８】
モノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２
本開示の好ましい抗体は、実施例１および２に記載されているように単離し、構造的に特徴付けたヒトモノクローナル抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２である。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨアミノ酸配列を配列番号２５、２６、２７および２８それぞれに示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＬアミノ酸配列を配列番号２９、３０、３１および３２それぞれに示す。さらに、ある種のフレームワーク残基が生殖系列残基で置換されているＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の代替型を作出し、本明細書では、Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬと称する。Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬのＶＨアミノ酸配列を配列番号４１、４２、４３および４４それぞれに示す。Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬのＶＬアミノ酸配列を配列番号４５、４６、４７および４８それぞれに示す。本開示のその他の抗ＣＸＣＲ４抗体には、ＷＯ２００８／０６０３６７に記載されているようなＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体を作出するために、様々なＶＨおよびＶＬ領域、または様々なＣＤＲを「混合し、合致させる」ことによって生じる抗体が含まれる。
【００６９】
したがって、一態様では、本開示は、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１もしくはＥ２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組合せを含む抗体を提供する。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１〜４それぞれに示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号５〜８それぞれに示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号９〜１２それぞれに示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶｋＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１３〜１６それぞれに示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶｋＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号１７〜２０それぞれに示す。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＫＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２１〜２４それぞれに示す。前記で同定したＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）を使用して描写された。
【００７０】
一態様では、本開示は、ＣＸＣＲ４、好ましくはヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合し、ＶＨおよびＶＬ領域の組合せを含み、それぞれが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号２５もしくは４１に記載されている配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号２９もしくは４５に記載されている配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、
（ｂ）配列番号２６もしくは４２に記載されている配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０もしくは４６に記載されている配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、
（ｃ）配列番号２７もしくは４３に記載されている配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１もしくは４７に記載されている配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、または
（ｄ）配列番号２８もしくは４４に記載されている配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３２もしくは４８に記載されている配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、
を含む。
【００７１】
その他の好ましい実施形態では、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１０に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１４に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号３に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２３に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、あるいは
（ｄ）配列番号４に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１６に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２４に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００７２】
さらなる実施形態では、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号２５もしくは４１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域および配列番号２９もしくは４５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２６もしくは４２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域および配列番号３０もしくは４６に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号２７もしくは４３に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域および配列番号３１もしくは４７に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域、あるいは
（ｄ）配列番号２８もしくは４４に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む重鎖可変領域および配列番号３２もしくは４８に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸またはそれらの保存的改変物を含む軽鎖可変領域、
を含む。
【００７３】
好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはそれらの抗原結合部分は、
（ａ）配列番号１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１３に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１７に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはそれらの抗原結合部分は、
（ａ）配列番号２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１４に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１８に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号２２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００７５】
抗ＣＸＣＲ４抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本開示は、本開示の抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体のいずれかと同じ、ヒトＣＸＣＲ４上のエピトープ領域（すなわち、同じかまたは重複するエピトープ）に結合する抗体またはそれらの抗原結合部分を提供する（すなわち、ＣＸＣＲ４への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）。好ましい実施形態では、交差競合研究用の参照抗体は、モノクローナル抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）（配列番号２５および配列番号２９でそれぞれ示したＶＨおよびＶＬ配列を有する）またはモノクローナル抗体Ｆ９（配列番号２６および配列番号３０でそれぞれ示したＶＨおよびＶＬ配列を有する）またはモノクローナル抗体Ｄ１（配列番号２７および配列番号３１でそれぞれ示したＶＨおよびＶＬ配列を有する）またはモノクローナル抗体Ｅ２（配列番号２８および配列番号３２でそれぞれ示したＶＨおよびＶＬ配列を有する）であってもよい。したがって、本開示は、ヒトＣＸＣＲ４への結合に対して参照抗体またはその参照抗原結合部分と交差競合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、参照抗体またはその部分は、
（ａ）配列番号２５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号２９に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２６に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号３０に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号２７に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号３１に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域、または
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号３２に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
を含む。
【００７６】
好ましい態様では、本発明の交差競合する抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体は、配列番号４９に記載されているヒトＶＨ３〜４８生殖系列配列から得られた配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含むＶＨ領域および／または配列番号５０に記載されているヒトＶＫＬ１５生殖系列配列から得られた配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含むＶＬ領域を含む。
【００７７】
交差競合する抗体は、標準的ＣＸＣＲ４結合アッセイにおいて、例えば、参照抗体をＦＩＴＣで標識し、試験抗体がＦＩＴＣ標識参照抗体のＣＥＭ細胞への結合を阻害する能力を評価するＣＥＭ細胞によるフローサイトメトリーにおいて、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、Ｅ２または本発明の任意のその他の参照抗ＣＸＣＲ４抗体と交差競合する能力に基づいて同定することができる。
【００７８】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、本開示のモノクローナル抗体の１種または組合せ、あるいはそれらの抗原結合部分を含有し、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。本明細書では、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合したありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、この担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。本発明の医薬組成物には、１種または複数の薬学的に許容される塩、抗酸化剤、水性および非水性担体および／または保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含めることができる。
【００７９】
投与計画は、最適な所望する応答、例えば、治療応答または最小有害作用を実現するために調節する。
【００８０】
ヒト抗ＣＸＣＲ４抗体の投与では、投薬量は、対象体重の約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１から約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、０．１、０．３、１、３、５または１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、より好ましくは０．３、１、３または１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。投与計画は通常、抗体の一般的な薬物動態特性に基づいた持続的な受容体占有を引き起こす曝露を実現するように計画する。処置計画の例には、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヵ月に１回または３から６ヵ月に１回の投与が含まれる。ＩｇＧ４抗体は通常２〜３週間の半減期を有することを考慮すると、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の好ましい投与計画には、０．３〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重で、応答が完了するか、または進行性疾患を確認するまで、７または１４日毎を６週、８週または１２週サイクルまで抗体を静脈内投与により与えることが含まれる。
【００８１】
投薬量および投与計画は、処置期間中変化することがある。例えば、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の投与計画には、１、３または１０ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内投与（ＩＶ）が含まれ、抗体は以下の投薬計画、（ｉ）７日毎を６週サイクルまで、（ｉｉ）２週毎を６投与まで、その後は３ヵ月毎、（ｉｉｉ）３週毎、（ｉｖ）１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重を１回、以後は２〜３週毎に１ｍｇ／ｋｇ体重のうちの１つを使用して投与する。
【００８２】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与した各抗体の投薬量は、指示した範囲内である。抗体は通常、何度も投与される。１回の投薬の間隔は、例えば、１週間、１ヵ月、３ヵ月毎または一年であってもよい。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって指定されるので、不規則であってもよい。いくつかの方法では、投薬量は、血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌを実現するように調節する。
【００８３】
あるいは、抗体は、より少ない頻度での投与が必要とされる場合では、徐放製剤として投与することができる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般的に、ヒト抗体の半減期は最長を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の投薬量および頻度は、処置が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変化させることができる。予防適用では、比較的低用量が比較的少ない頻度の間隔で、長期間にわたって投与される。患者によっては、残りの人生の間ずっと処置を受け続ける。治療適用では、疾患の進行が抑えられるか、または停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされることが時々ある。その後、患者は予防的投与計画を受けることができる。
【００８４】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性を有さず、特定の患者、組成物および投与様式について所望する治療応答を実現するために有効な活性成分の量を得るために変化させることができる。選択した用量レベルは、使用した本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、処置の持続期間、使用した特定の組成物と併用したその他の薬物、化合物および／または物質を含む様々な薬物動態因子、処置する患者の年齢、性別、体重、症状、一般的健康状態および既往歴などの医薬分野で周知の要素によって左右されよう。本発明の組成物は、当技術分野で周知の様々な方法の１つまたは複数を使用して、１種または複数の投与経路を介して投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望する結果に応じて変化するものである。
【００８５】
この活性化合物は、移植物、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などの化合物が迅速に放出されるのを防止する担体と共に調製できる。生分解性生体適合ポリマー、例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の多くの調製方法は、特許権が与えられ、または一般に当業者に知られている。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  （１９７８）を参照のこと。
【００８６】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療装置によって投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本開示の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号または第４，９４１，８８０号で開示された装置などの無針皮下注射装置で投与することができる。これらの特許の対象物は、参照により本明細書に組み込まれる。多くのその他のこのような移植物、送達系およびモジュールが当業者には公知である。
【００８７】
本発明の使用および方法
本開示の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、細胞表面で発現したＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体またはその断片の治療有効量を対象に投与することを含む、ＣＸＣＲ４を発現する癌に罹患した対象を処置するための方法を含むＣＸＣＲ４関連障害の診断および処置に関するインビトロおよびインビボにおける数多くの診断上および治療上の有用性を有する。好ましい対象には、ＣＸＣＲ４活性が関係するか、媒介または調節するか、またはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路が関与する血液悪性腫瘍などの障害を有するヒト患者が含まれる。癌患者を処置するためのこれらの方法のある種の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片を単独療法として投与し、一方、その他の実施形態では、抗悪性腫瘍化学療法剤などの別の薬剤と組み合わせて投与する。ＣＸＣＲ４に対する抗体を別の薬剤と組み合わせて投与するとき、この２つは、いずれかの順番で、または同時に投与することができる。
【００８８】
ＣＸＣＲ４は、様々な種類の腫瘍細胞上で発現することが知られており、腫瘍転移に関与することも知られている。さらに、Ｔ細胞へのＨＩＶの侵入のための共受容体として、ＣＸＣＲ４はＨＩＶ感染に関与することが知られている。さらに、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路は、炎症症状に関与することが示されたことがある。さらに、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路は、血管新生または新血管新生に関与することが示されたことがある。したがって、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体（および免疫複合体および二特異性分子）は、以下を含む様々な臨床症状で使用することができる。
【００８９】
Ａ．癌
ＣＸＣＲ４の過剰発現はまた、癌の約７５％で示されており、ある種の場合では、ＣＸＣＲ４発現と患者の予後または生存の間には逆相関が立証されたことがある。ＣＸＣＲ４発現またはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路が関与した癌の種類の非限定的な例には、乳癌（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、卵巣癌（Ｓｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、前立腺癌（Ｔａｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、非小細胞肺癌（Ｓｐａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、膵癌（Ｋｏｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、結腸直腸癌（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、腎癌（Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）および甲状腺癌（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、鼻咽頭がん（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、黒色腫（Ｓｃａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、腎細胞がん（Ｓｔａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、神経芽細胞腫（Ｇｅｍｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、神経膠芽腫（Ｒｅｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、横紋筋肉腫（Ｌｉｂｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）および骨肉腫（Ｌａｖｅｒｄｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）などの固形腫瘍ならびに急性リンパ芽球性白血病（Ｃｒａｚｚｏｌａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、急性骨髄性白血病  （Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、多発性骨髄腫（Ａｌｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、慢性リンパ性白血病（Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；  Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、慢性骨髄性白血病（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）および非ホジキンリンパ腫（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）などの血液悪性腫瘍が含まれる。
【００９０】
さらに、この経路は、複数の新生物における転移プロセスの刺激に関係する（Ｍｕｒｐｈｙ，  ２００１）。臨床研究では、ＣＸＣＲ４は、転移する傾向の増加および生存率の減少に関与することがあり、急性骨髄性白血病、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、卵巣がんおよび膵がんの予後指標と同定されたことがあり、ＣＸＣＲ４の発現がより多さは疾患の重症度に相関する（Ｓｐｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｈｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｏｔｔａｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｓｐａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；  ２００６；  Ｍａｒｅｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【００９１】
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）はＣＸＣＬ１２を分泌し、ＣＸＣＲ４との相互作用は、ＢＭ微小環境内における造血幹細胞のホーミングおよび維持に必須である（Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。白血病細胞は、ＣＸＣＲ４を高レベルで発現し、その経路は白血病細胞のＢＭへの遊走において重要な役割を果たし、その結果として、白血病細胞の増殖および生存を支持する。ＣＸＣＲ４は、ＣＸＣＬ１２を発現するＢＭなどの器官に広がる転移に必須である。まとめると、ＣＸＣＲ４はＢＭにおける造血幹細胞のホーミングおよび維持の両方において重要な役割を果たし、ＮＨＬおよびＭＭ患者における自己移植において顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせて使用するためにＦＤＡによって承認された低分子ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＡＭＤ３１００（プレリキサホル；モゾビル）で示されたように、ＣＸＣＲ４のアンタゴニストは、幹細胞を血流中に動員する（Ｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。別のＣＸＣＲ４阻害剤、ＡＭＤ３４６５は、ＣＸＣＬ１２およびストロマ誘導性化学走性と拮抗することが示され、白血病細胞における生存促進性シグナル伝達経路のＣＸＣＬ１２誘導性活性化を阻害した（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。さらに、ＡＭＤ３４６５は、単独で、または顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせて、ＡＭＬ細胞および前駆細胞の循環への動員を誘導し、化学療法およびソラフェニブの抗白血病効果を増強し、動物の白血病の苦しみの著しい減少および生存期間の延長を引き起こすことが示された（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。このような発見は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２相互作用の遮断を使用して、防御された骨髄微小環境を標的とすることによって、化学療法に対して白血病細胞を感受性にすることができることを示唆している。
【００９２】
実施例で説明するように、ＣＸＣＲ４を対象とした新規のファーストインクラスのヒト治療用モノクローナル抗体を開発した。これらのモノクローナル抗体がＣＸＣＲ４発現細胞に低いナノモル親和性で結合し、ＣＸＣＬ１２がＣＸＣＲ４発現細胞に結合するのをブロックし、ＣＸＣＬ１２誘導性遊走およびカルシウム流を低いナノモルＥＣ５０値で阻害する。注目すべきことに、ＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流および遊走をブロックすることに加えて、実施例で示されたデータはまた、ＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを抗体依存的に誘導することがこれらのヒト抗ＣＸＣＲ４抗体の作用機構であることを示している。抗体誘導性のアポトーシスは、複数の造血器腫瘍異種移植モデルに対してインビボにおいて着実な有効性をもたらした。ＢＭからのＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の動員を増加させ、それによって薬剤感受性を増加させるが、このような腫瘍細胞を直接殺滅しない低分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストの作用に基づくと、癌細胞を殺滅する本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体の有効性は驚くべきものであり、予期せぬものであった。
【００９３】
ＣＸＣＲ４は増殖、遊走／浸潤および血管新生を含む癌の複数の基本的な局面において役割を果たすので、アンタゴニストは、ＣＸＣＲ４が発現する悪性腫瘍に干渉する多種多様な手段となる可能性がある。経路の詳細な検討を開始するために、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＬ１２それぞれに対する完全なヒトモノクローナル抗体を開発した。抗ＣＸＣＲ４および抗ＣＸＣＬ１２抗体は両方とも、リガンドがＣＸＣＲ４に結合するのを阻害し、カルシウム流および遊走などのリガンド誘導性細胞応答の阻害を引き起こす（実施例４〜６）。これらの機能に加えて、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２軸は、血管新生の促進に関係することがある（Ｇｕｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）；  Ｐｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。抗ＣＸＣＲ４（実施例７）および抗ＣＸＣＬ１２（データは示さず）抗体は両方とも、インビトロにおける血管新生の証拠である内皮管形成も阻害した。
【００９４】
ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２相互作用の遮断の効果を調べるために、腫瘍増殖の減衰における抗体の有効性を様々なインビボにおける異種移植モデルにおいて試験した。ＮＨＬ（バーキットリンパ腫）のモデルでは、Ｒａｍｏｓ細胞をＳＣＩＤマウスに移植し、リツキシマブを陽性対照として使用した。驚くべきことに、抗ＣＸＣＬ１２抗体は腫瘍増殖を制御せず、ビヒクルおよびアイソタイプ対照と区別することはできないものと考えられた。対照的に、抗ＣＸＣＲ４抗体ＢＭＳ−９３６５６４は、リツキシマブと同様の活性で腫瘍増殖のほとんど完全な制御を示した（実施例１４）。化学走性のインビトロにおける阻止は、２種類の抗体の間では類似していたので（実施例６）、抗腫瘍制御がＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸の阻止に左右されるとは考えにくい。したがって、ＢＭＳ−９３６５６４の直接的な細胞傷害性効果を、Ｒａｍｏｓ細胞増殖アッセイにおいて試験した。ＣＸＣＬ１２は、細胞増殖を促進する自己分泌因子とされてきており、別の研究では、ＣＸＣＬ１２ｓｉＲＮＡはＢＲ５−１増殖を阻害した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｒｉｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。増殖の阻害は部分的であったが、抗ＣＸＣＲ４による増殖の用量に依存した阻害が認められ、一方、ＡＭＤ３１００および抗ＣＸＣＬ１２抗体は効果を有さなかった（実施例８）。最近、ＣＸＣＲ４の特異的アンタゴニストであることが報告された１４残基ポリペプチド（ＢＫＴ１４０）が、多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害することが示された（Ｂｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ＡＭＤ３１００は弱い部分的な作動薬であり、一方、ＢＫＴ１４０は逆作動薬として作用することが示唆された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【００９５】
前記のことを考慮して、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、癌細胞の表面で発現したＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する抗体またはその断片の治療有効量を対象に投与することを含む、ＣＸＣＲ４を発現する癌に罹患した対象を処置するための方法で使用することができる。ある種の実施形態では、この処置方法は、以前に癌に罹患した対象、または癌になる危険性がある対象に予防的に使用する。好ましい実施形態では、対象はヒトであり、抗体またはその断片はヒトＣＸＣＲ４受容体に結合する。その他の好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４受容体に結合する抗体またはその断片は、受容体の活性を阻害する。したがって、抗体またはその断片は、ＢＭ微小環境内での造血幹細胞のホーミングおよび維持を遮断し、かつ／またはＢＭから末梢への細胞の動員を増加させ、それによって造血癌細胞の化学療法剤に対する感受性を増加させる。その他の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体およびその断片は、ＣＸＣＲ４発現細胞のアポトーシスを誘導する。標的癌細胞のアポトーシスは、単独療法としての抗体の使用を可能にする。
【００９６】
ある種の実施形態では、抗体またはその断片は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体またはその断片である。好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、ヒト抗体またはその断片である。その他の好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、その配列が配列番号２５に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを、その配列が配列番号２９に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【００９７】
ある種の実施形態では、ＫａｂａｔシステムによるＣＤＲ配列の描写にしたがって、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片は、その配列が配列番号１に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、その配列が配列番号５に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、その配列が配列番号９に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、その配列が配列番号１３に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、その配列が配列番号１７に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびその配列が配列番号２１に記載されている連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００９８】
本発明の方法のその他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片は、配列番号２５に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号２９に記載されている配列を有する連続的に連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体またはその断片である。より好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、ＢＭＳ−９３６５６４またはそのＣＸＣＲ４結合断片である。
【００９９】
本明細書に記載されている処置方法に適している癌には、固形腫瘍および血液悪性腫瘍が含まれる。ある種の実施形態では、固形腫瘍は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、結腸直腸癌および腎癌、鼻咽頭がん、黒色腫、腎細胞がん、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、横紋筋肉腫および骨肉腫から選択される。その他の実施形態では、血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫、急性骨髄性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫から選択される。好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ性白血病である。
【０１００】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、悪性腫瘍の蓄積、イムノグロブリン分泌、骨髄内の形質細胞を特徴とする形質細胞悪性腫瘍で、骨の破壊、骨髄機能不全、腎機能障害および末梢神経障害を引き起こし得る。従来処置の後の生存中央値は、３〜４年で、高用量の処置に続いて自己造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を行うことによって５〜７年に延長することができる（Ｒａａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０１０１】
ＭＭのために通常使用される最近承認された治療計画には、導入用のメルファランをベースにした治療計画ならびに導入用および再発した対象用のボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））またはサリドマイドもしくはレナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））を含む免疫調節剤（ＩＭｉＤ）をベースにした治療計画が含まれる。再発した、または難治性ＭＭを有する対象では、処置選択肢にはＨＳＣＴ、以前の化学療法処置計画の反復または新たな治療計画が含まれる。ＨＳＣＴには、処置に関連した罹患の高い危険性が伴う。さらに、対象によっては、パフォーマンスステータスの乏しさまたは合併症のために、ＨＳＣＴに適さない者もいる。現在のところ、完治はせず、現在の療法では、疾患の進行を遅らせ、生存期間を延長させ、症状を最小限に抑えることしかできない。初期治療を乗り切ったＭＭ対象のほとんど全てが、一連の治療にも関わらず再発するか、または難治性になり、さらなる治療を必要とする（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。したがって、ＭＭの対象には、未だに満たされていない重大な医療上のニーズがある。本処置方法の好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫で、再発したかまたは難治性のＭＭが含まれる。
【０１０２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人における最も一般的な急性白血病で、症例の８０％を占める。米国では、毎年１３，０００人超の患者がＡＭＬと診断され、８，８２０人超が亡くなっている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ，  ２００８）。成人ＡＭＬの処置には、寛解を実現するための導入化学療法および再発を回避するための寛解後化学療法（幹細胞移植を行うかまたは行わない）が含まれる。寛解導入率は、５０％から８５％の範囲である。疾患は、対象の大部分で再発する。再発したＡＭＬの処置に伴う寛解率は比較的低く、永続的な利益を得る患者はほとんどいない（Ｂｒｅｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【０１０３】
再発したかまたは難治性ＡＭＬの成人を処置するための現在の選択肢には、化学療法およびＨＳＣＴが含まれる。同種ＨＳＣＴは、初回導入不成功または初回完全寛解（ＣＲ）を越えた場合に選択される処置と考えられており、患者の約２０％においてのみ長期健存率がもたらされる。しかし、ＨＳＣＴは、様々な理由から多数の患者に適切ではなく、利用不可能である（例えば、早期再発、移植施設の利便性の悪さ）。このことから、再発したかまたは従来の化学療法では難治性の患者は予後が悪く、新たに急性白血病と診断された患者と比較して化学療法に対する応答性が悪いという事実と共に、このような患者集団のために新たな標的化剤を開発する必要があることが要求される。本処置方法の好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病で、再発したＡＭＬが含まれる。
【０１０４】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、西洋諸国における最も一般的な白血病で、米国における白血病全体の３０％を占める。２０１１年では、約１４，５７０例が新たにＣＬＬと診断され（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、４，４００人の患者が亡くなる。この疾患は、機能不全の進行、モノクローナルリンパ球が特徴で、リンパ節腫大、脾腫大、肝腫大、ならびに末梢血および骨髄における著しいリンパ球増加症を引き起こす。ほとんどのＣＬＬ患者は最初、化学療法に対して完全なまたは部分的な寛解を示すが、ＨＳＣＴによって処置された患者以外は、ほとんど全てが処置の中断後再発するか、または難治性疾患を発症する。現在のＣＬＬのための最初の処置には、従来の化学療法および／またはモノクローナル抗体（リツキシマブ）療法が含まれる。ほとんどの患者の生存は、５〜１０年で、徐々に罹患率が増加する。再発／難治性ＣＬＬの患者では、現在の処置選択肢では疾患は治癒せず、生存中央値は１６ヵ月と推定されている。本処置方法の好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病で、再発したＣＬＬが含まれる。
【０１０５】
濾胞性リンパ腫（ＦＬ）は、米国および西欧における２番目に最も一般的なリンパ腫で、ＮＨＬ（全体）の約２０％および低級リンパ腫の大部分を占める。ほとんどの患者は最初の療法に応答するという事実にもかかわらず（約４０〜８０％が完全に寛解する）、使用した治療計画に応じて、ほとんど全ての患者が後に進行性疾患を発症する。また、最高１０％が最初の処置に対して難治性である。したがって、新たな、より効果的な療法が必要とされている。本処置方法の好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、濾胞性リンパ腫で、再発したＦＬが含まれる。
【０１０６】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、ＮＨＬの最も一般的な種類で、成人の症例の２５〜３０％を占める（７５歳を上回る患者のＮＨＬの４０％）。ＤＬＢＣＬにはいくつかのサブタイプがあり、限定はしないが、胚中心Ｂ（ＧＣＢ）型、活性化Ｂ細胞型（ＡＢＣ）および縦隔原発型が含まれる（Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。処置した患者の３年全生存率（ＯＳ）はＧＣＢで８４％、ＡＢＣで５６％である。ほとんどのＤＬＢＣＬ患者は、従来の療法で治癒しない。再発後、患者の少なくとも６０％が従来の処置に感受性を保持しており、一方第２の処置計画で１０％未満が長期間の健存率を示す（Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。化学感受性疾患の患者サブセットの場合、再発したかまたは難治性の（ｒ／ｒ）ＤＬＢＣＬは、その後の高用量化学療法および移植を目的とした化学療法（リツキシマブを用いるかまたは用いない）で処置する。第２の化学療法計画、その後のＨＳＣＴに応答した約５０％は、２年後に応答性を維持している。第２の療法に失敗したか、または移植後に再発した移植を行っていない候補では、治療は姑息的である。移植を行わない場合、ｒ／ｒＤＬＢＣＬにおいて化学療法でもたらされる疾患制御は短期間である。原発性難治性患者は、第２の化学療法計画でＣＲが実現される見込みはなく、再発後、２回目の寛解は通常長続きしない（Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）。ＤＬＢＣＬは最初、化学物質反応性の疾患なので、化学感受性を回復させるために本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体などの薬剤を添加することがこの疾患を処置するための堅実な戦略である。本処置方法の好ましい実施形態では、血液悪性腫瘍は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫で、再発したかまたは難治性のＤＬＢＣＬが含まれる。
【０１０７】
ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＸＣＲ４への結合によってＣＸＣＲ４媒介アポトーシスを示すＨＩＶ−１研究のデータがきっかけとなって（Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｂｅｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体ＢＭＳ−９３６５６４がＣＸＣＲ４発現細胞株のアポトーシスを誘導する能力を測定した。ＢＭＳ−９３６５６４誘導性アポトーシスは、２０種類を上回る異なるＣＸＣＲ４発現細胞株で示され（実施例１１および表３および４を参照のこと）、この機構が１つの細胞種に限定されないことが確認された。
【０１０８】
アポトーシスはまた、慢性リンパ球性白血病の微小残存病変（ＭＲＤ）のインビトロモデルにおいて示された（Ｋａｓｈｙａｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。ＭＲＤの根絶は、ＣＬＬの処置の最も困難な目標の１つである。このＭＲＤモデルでは、ＣＸＣＬ１２を発現して分泌し、ＣＬＬ患者の原発性白血病細胞の生存を支持する間質細胞の共培養をベースにしており、ＣＬＬ細胞は生存能の増加を示し（４８時間で２０〜６０％）、化学療法剤に対して耐性を示した。しかし、ＢＭＳ−９３６５６４のナノモル濃度（２〜２００ｎＭ）は、単独で培養したＣＬＬ細胞ならびにＭＲＤモデルを使用してインキュベートしたＣＬＬ細胞の細胞死を誘導した。アポトーシスは１７ｐ欠失患者のＣＬＬ細胞およびインビトロにおけるフルダラビン耐性のＣＬＬ細胞において認められたので、ＢＭＳ−９３６５６４のアポトーシス促進活性は、Ｐ５３非依存性と考えられる。ＢＭＳ−９３６５６４はまた、ＣＬＬ細胞においてＣＸＣＬ１２媒介Ｆ−アクチン重合を、低分子ＣＸＣＲ４阻害剤ＡＭＤ−３１００よりも低濃度で阻害した。これらのデータは、ＢＭＳ−９３６５６４がＭＲＤの一因となり得るインビボでの腫瘍微小環境に存在するＣＬＬ細胞を効果的に標的化できることを示唆している（Ｋａｓｈｙａｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【０１０９】
開示した抗ＣＸＣＲ４抗体のアポトーシス効果は、低分子ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ３１００では示されない特性で、これらの抗体は、癌患者を処置するために単独で、単独療法として使用することができることを示している。インビボＡＭＬおよびＭＭ腫瘍モデルにおけるＣＸＣＲ４アンタゴニストの効果に関する以前の研究によって、これらのアンタゴニストは、化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を増強するのに有効であることが示唆された（Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。対照的に、本明細書において実施例で示したデータは、多種多様なＡＭＬ、ＮＨＬおよびＭＭモデルにおいてＢＭＳ−９３６５６４を単独療法として投与すると、統計学的に有意な腫瘍増殖阻害が実現したことを示唆している。したがって、本処置方法のある種の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片は単独療法として投与する。好ましい実施形態では、この抗体またはその断片は、ＣＸＣＲ４発現細胞のアポトーシスを誘導する。したがって、本開示は、細胞表面で発現したＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する抗体またはその断片の治療有効量を癌に罹患した対象に投与することを含む、血液悪性腫瘍の大部分の細胞を含むＣＸＣＲ４を発現する癌細胞のアポトーシスの誘導方法を提供する。
【０１１０】
ＢＭＳ−９３６５６４はＩｇＧ４抗体なので、インビボにおける有効性はＡＤＣＣまたはＣＤＣで説明することはできない。しかし、抗体がＣＸＣＲ４発現細胞に一旦結合すると、抗原提示細胞上で発現したＦｃγＲ１受容体に結びつき、食作用を誘導することができる。ＢＭＳ−９３６５６４の有効性がインビボで認められた細胞株は、インビトロにおいてアポトーシスを誘導するためにＢＭＳ−９３６５６４に対する抗Ｆｃ２次抗体を必要とした（実施例１１）。これは、それらの特定の細胞株ではＣＸＣＲ４の発現が低いためであり得る。アポトーシス開始の機構が近隣にＣＸＣＲ４分子をもたらすことに依存し、細胞表面上のＣＸＣＲ４の密度が、抗ＣＸＣＲ４抗体が及ぶ結合距離よりも低ければ、このギャップを架橋し、受容体を引き合わせてアポトーシスシグナルを発するために高親和性抗Ｆｃ２次抗体が必要であり得る。インビボでは、これはＦｃγＲ１受容体によって達成することができる。
【０１１１】
本明細書に記載されているデータは、細胞動員における役割に加えて、ＣＸＣＲ４発現標的細胞のアポトーシスに関与する抗ＣＸＣＲ４抗体の新たな作用機構を示唆している。これらのデータは、ＢＭＳ−９３６５６４がＭＭ、ＡＭＬならびにＦＬおよびＤＬＢＣＬなどの様々なＮＨＬを含む血液悪性腫瘍、ならびに固形腫瘍の悪性腫瘍の効果的な治療法を提供できることを示唆している。しかし、本発明の方法は、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体の作用の任意の特定の機構に必ずしも限定されない。例えば、ＢＭＳ−９３６５６４がＥＭＴ関連タンパク質Ｔｗｉｓｔ、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇを阻害し、Ｅ−カドヘリンを上方制御することが示されたことからも明らかなように、ＣＸＣＲ４は、ＭＭ細胞における間葉転換（ＥＭＴ）に対して上皮を調節することができ、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体はＥＭＴを阻害することができる（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。これらのデータは、ＣＸＣＲ４がＥＭＴを調節する能力によって妥当な治療標的になり得るという見解を実証している。
【０１１２】
ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２軸がＭＭ細胞のＢＭへのホーミングおよび輸送において主要な役割を果たし、腫瘍細胞とＢＭとの相互作用の遮断が治療薬に対する高い感受性をもたらすことが以前に示されたことがある（Ａｌｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。これらの発見は、新規抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体、ＢＭＳ９３６５６４がＭＭ細胞のＢＭへのホーミングおよび接着を妨げ、これらの細胞を治療薬に対して感受性にすることができることを示唆している。特に、ＣＸＣＲ４を標的化するこの原理の妥当性はさらに、原発性ＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋）、ＭＭ細胞株（ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ．８２２６）および原発性ＭＭ骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を使用してＣＸＣＬ１２およびＢＭＳＣへの遊走を評価したＲｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって報告されたインビボデータによって実証される。細胞傷害性はＭＴＴによって測定し、ＤＮＡ合成はチミジン取り込みによって測定した。インビボ黒色腫マウスモデルを使用して、抗ＣＸＣ４の腫瘍細胞転移調節に対する効果を検証した。（１）ＢＭＳ−９３６５６４で処置したマウスは、ビヒクル処置マウスと比較して遠位骨髄ニッチへのＭＭ細胞の少ない内転移を呈し、ＣＸＣＲ４が腫瘍細胞内転移の重要な調節作用を示し得るという仮説を支持しており、（２）黒色腫異種移植モデルにおいて、ＢＭＳ−９３６５６４処置マウスはビヒクル処置マウスと比較して減少した数の転移の数を示し、（３）ＢＭＳ−９３６５６４はインビトロにおいて遊走、接着および生存に関してＭＭ細胞を機能的に標的化することが示された（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【０１１３】
ＢＭＳ９３６５６４は、ＭＭ細胞のＣＸＣＬ１２および原発性ＭＭのＢＭＳＣへの遊走を用量依存的に阻害することがさらに示された。原発性ＭＭ細胞のＢＭＳＣへの接着はまた、ＢＭＳ９３６５６４によって用量依存的に阻害されるが、原発性ＢＭ由来ＣＤ１３８＋細胞に対する細胞傷害性も誘導した。ＢＭＳ９３６５６４抗体は、ＢＭ環境の場合、腫瘍細胞のＢＭＳＣ誘導性増殖を抑えることによってＭＭ細胞を標的化した。さらに、ＢＭＳ９３６５６４はＭＭ細胞においてボルテゾミブ誘導性細胞傷害性を相乗的に増強した（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。実施例１１に記載されているように、ＭＭ細胞におけるアポトーシス経路のＢＭＳ９３６５６４依存性活性化は、カスパーゼ−９およびＰＡＲＰの切断によって示された。ＣＸＣＬ１２誘導性ＥＲＫ、ＡｋｔおよびＳｒｃリン酸化は、ＢＭＳ９３６５６４によって用量依存的に阻害された。重要なことに、実施例１６に記載されているように、ＢＭＳ９３６５６４は、インビボにおいて異種移植マウスモデルのＭＭ細胞増殖を阻害した。
【０１１４】
全体として、これらのデータは、ＭＭ細胞上のＣＸＣＲ−４の抗ＣＸＣＲ４抗体による標的化は、おそらく多様な機構を使用して、一般的に癌の、具体的にはＭＭの処置のために有効な手段をもたらすことを明らかに示している。
【０１１５】
本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体はまた、手術および／または放射線照射などのその他の癌の処置と組み合わせて使用することができ、かつ／または抗ＣＸＣＲ４抗体の治療効果を増強または増大する１種またはその他の複数の治療薬、例えば、細胞傷害性薬物、放射毒性剤または免疫抑制剤と共に共投与することができる。抗体は、薬剤に連結するか（免疫複合体として）、または薬剤とは別に投与することができる。後者の場合（別々の投与）、抗体は、その薬剤の前、後または同時に投与することができ、あるいは従来の化学療法薬および腫瘍関連抗原または免疫調節標的と結合する抗体を含むその他の公知の治療薬と共投与することができる。化学療法薬には、特に、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、ブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、レナリドミド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン、ベンダムスチン、リツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチンおよびエトポシドが含まれる。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合断片と化学療法薬との共投与は、ヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害性効果を生じる様々な機構を介して影響を及ぼす２種類の抗癌剤を提供する。このような共投与によって、腫瘍細胞の薬剤に対する耐性の発現または腫瘍細胞を抗体に反応させなくする抗原性の変化による問題を解決することができる。
【０１１６】
その他の実施形態では、対象はさらに、例えば、対象をサイトカインで処置することによって、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節、例えば、増強または阻害する薬剤で処置することができる。多特異的分子で処置する間に投与するために好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
【０１１７】
本開示の抗体はまた、Ｉｇ融合タンパク質などの１種または複数の追加的治療用抗体またはその他の結合剤と組み合わせて使用することができる。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体と組み合わせて投与することができるその他の抗体または結合剤の非限定的例には、ＣＴＬＡ−４、ＰＳＭＡ、ＣＤ３０、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−γ、ＣＤ７０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＫＩＲ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＣＣＲ５、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ５２、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ−２、ＣＤ２５、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１１ａ、α４インテグリン、ＩＦＮαおよびＩＦＮＡＲ１に対する抗体または結合剤が含まれる。
【０１１８】
ＣＸＣＲ４経路の遮断およびＭＭ細胞などの血液癌細胞とそれらの骨髄微小環境との間の相互作用の遮断が、ＭＭについてのレナリドミドおよびボルテゾミブなどでの抗癌治療に対する感受性化をより大きくするという証拠がますます増加している。実施例に記載されているように、ＭＭ細胞株において単独療法として、および化学療法と組み合わせたＢＭＳ−９３６５６４に関する非臨床データおよび異種移植研究によって、ＢＭＳ−９３６５６４はＭＭにおいて活性があり、レナリドミド／デキサメタゾンおよびボルテゾミブなどの治療計画の有効性を増強することができることが示される。前臨床試験によってまた、ＡＭＤ３１００によるＣＸＣＲ４阻害は、骨髄間質細胞からのＭＭ細胞の脱接着およびこれらの細胞の末梢への動員を引き起こし、ボルテゾミブに対する感受性の増加をもたらすことが示された（Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。同様に、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＢＭの防御環境から悪性腫瘍細胞を放出する能力によって化学療法の効果を高める。ＭＭ細胞の動員およびそれらの薬剤感受性の増加に加えて、これらの抗体は、その他の可能性のある機構の中でもアポトーシスによってＭＭ細胞を直接殺滅するさらなる効果を有する（実施例１１）。ＢＭＳ−９３６５６４は、単独で、またはレナリドミドもしくはボルテゾミブと組み合わせて投与すると、インビボにおいてＭＭ腫瘍増殖を阻害することが示された（実施例１６）。
【０１１９】
本明細書に記載されている治療方法のある種の実施形態では、この方法はさらに、少なくとも１種の化学療法剤を抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片と組み合わせて対象に投与することを含む。ある種の実施形態では、癌はＭＭで、少なくとも１種の化学療法剤は、レナリドミドプラス低用量デキサメタゾンまたはボルテゾミブプラスデキサメタゾンである。これらの化学療法の組合せは、再発したかまたは難治性ＭＭの対象における治療価値が確認されている標準的な治療計画で、これらの化学療法剤の安全特性はよく特徴付けられている。ある種の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体はサイクル１では最初の２週間は単独療法として毎週投与し、その後はレナリドミドプラス低用量デキサメタゾンまたはボルテゾミブプラスデキサメタゾンを含む化学療法計画と組み合わせる。
【０１２０】
例えば、レナリドミドおよびデキサメタゾンと組み合わせたＢＭＳ−９３６５６４によるＭＭの処置では、投薬治療計画の例は、（１）１、８、１５、２２、２９および３６日目（サイクル１）ならびに１、８、１５および２２日目（サイクル２およびその後のサイクル）に単回６０分ＩＶ注入として投与されたＢＭＳ−９３６５６４（１、３または１０ｍｇ／ｋｇ）；（２）２１日間（１５〜３５日目；サイクル１）および１〜２１日目（サイクル２およびその後のサイクル）に投与されたレナリドミド（２５ｍｇ経口）；ならびに（３）１５、２２、２９および３６日目（サイクル１）および１、８、１５および２２日目（サイクル２およびその後のサイクル）に投与されたデキサメタゾン（４０ｍｇ）を含む。
【０１２１】
ボルテゾミブおよびデキサメタゾンと組み合わせたＢＭＳ−９３６５６４によるＭＭの処置では、投薬治療計画の例は、（１）１、８、１５、２２および２９日目（サイクル１）ならびに１、８および１５日目（サイクル２およびその後のサイクル）に単回６０分ＩＶ注入として投与されたＢＭＳ−９３６５６４（１、３または１０ｍｇ／ｋｇ）；（２）１５、１８、２２および２５日目（サイクル１）ならびに１、４、８、１１日目（サイクル２およびその後のサイクル）にＩＶプッシュとして３〜５秒投与されたボルテゾミブ（１．３ｍｇ／ｍ２）；ならびに（３）１５、１６、１８、１９、２２、２３、２５および２６日目（サイクル１）ならびに１、２、４、５、８、９、１１および１２日目（サイクル２およびその後のサイクル）に投与されたデキサメタゾン（２０ｍｇ）を含む。
【０１２２】
ある種の実施形態では、この治療計画は、再発した、難治性ＡＭＬ患者のための標準治療と考えられているので、癌はＡＭＬで、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片と組み合わせて癌患者に投与した少なくとも１種の化学療法剤は、ミトキサントロン、エトポシドおよび／またはシタラビンである（Ａｍａｄｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。ある種の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体はサイクル１では最初の２週間は単独療法として毎週投与し、その後はミトキサントロン、エトポシドおよびシタラビンを含む化学療法計画と組み合わせる。
【０１２３】
例えば、単独療法としてのＢＭＳ−９３６５６４によるＡＭＬの処置では、治療計画の一例は、サイクル１で１日目およびその後のサイクルで１、８および１５日目に単回６０分ＩＶ注入としてＢＭＳ−９３６５６４（０．３、１、３または１０ｍｇ／ｋｇ）を投与することを含む。
【０１２４】
化学療法と組み合わせたＢＭＳ−９３６５６４によるＡＭＬの処置では、投薬計画の一例は、（１）化学療法１日目の１回目の化学療法の前にＢＭＳ−９３６５６４を投与することを含む。ＢＭＳ−９３６５６４は、サイクル２およびその後のサイクルでは１、８および１５日目に投与する。さらに、サイクル２〜１３では、化学療法は以下の計画から構成される（２８日サイクル）：（２）１から５日目に１５分に亘るミトキサントロン（８ｍｇ／ｍ２ＩＶ）（３）１から５日目に１時間に亘るエトポシド（１００ｍｇ／ｍ２ＩＶ）、および（４）１から５日目に１時間に亘るシタラビン（Ａｒａ−Ｃ；１ｇ／ｍ２ＩＶ）。
【０１２５】
ある種の実施形態では、癌はＣＬＬまたはＦＬで、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片と組み合わせて癌患者に投与した少なくとも１種の化学療法剤は、ベンダムスチンおよび／またはリツキシマブである。前臨床試験では、いくつかの白血病およびリンパ腫細胞株においてベンダムスチンとリツキシマブの間には抗腫瘍相乗作用があることが示され（Ｒｕｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、その結果、後者は、ベンダムスチンを含む化学療法によって誘導されるアポトーシスに対してＢ細胞リンパ腫を感受性にした（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ベンダムスチンプラスリツキシマブ（ＢＲ）の組合せは、未処置、リツキシマブで予め処置した、またはリツキシマブでは難治性のリンパ腫患者において有効性を示した（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。ある種の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。
【０１２６】
ＤＬＢＣＬの処置方法の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、リツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチンおよび／またはエトポシドと組み合わせて使用する（Ｋｅｗａｌｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。どんな化学療法計画も、再発したかまたは難治性ＤＬＢＣＬにおいて優位性を示さなかった。Ｒ−ＩＣＥ（リツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチンおよびエトポシド）は、その他の治療計画と同程度の有効性があり、応答性患者におけるＲ−ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビン、シスプラチン）それに続く高用量化学療法および自己由来ＨＳＣＴよりも毒性が少ないため、ｒ／ｒＤＬＢＣＬにおいて最も一般的に使用される治療計画の１つである（Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。ある種の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、リツキシマブ、イホスファミド、カルボプラチンおよびエトポシドと組み合わせて投与する。
【０１２７】
例えば、単独療法としてＢＭＳ−９３６５６４でＦＬ、ＤＬＢＣＬおよびＣＬＬ対象を処置する場合、好ましい治療計画には、１サイクルの１日目ならびにその後のサイクルの１、８、１５、２２、２９、３６、４３および５０日目に単回６０分ＩＶ注入としてＢＭＳ−９３６５６４（０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ）を投与することが含まれる。
【０１２８】
ＣＬＬ、ＦＬおよびＤＬＢＣＬ対象を処置するために化学療法と組み合わせて投与する場合、実施形態の一例には、化学療法１日目の１回目の化学療法の前のＢＭＳ−９３６５６４の投与、およびＢＭＳ−９３６５６４の注入が完了して少なくとも１時間後の化学療法の投与が含まれる。ＢＭＳ−９３６５６４は、サイクル２およびその後のサイクルでは１および８日目に投与する。
【０１２９】
ＣＬＬのための化学療法は、以下の治療計画（２８日サイクル）：サイクル２およびその後のサイクルの１日目にリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２ＩＶ）、次いでその後のサイクルの１日目に５００ｍｇ／ｍ２ならびにサイクル２の１日目に６０分に亘るベンダムスチン（７０ｍｇ／ｍ２ＩＶ）から構成される。
【０１３０】
ＦＬのための化学療法は、以下の治療計画（２８日サイクル）：サイクル２およびその後のサイクルの１日目にリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２ＩＶ）、次いでその後のサイクルの１日目に５００ｍｇ／ｍ２ならびにサイクル２の１日目に６０分に亘るベンダムスチン（９０ｍｇ／ｍ２ＩＶ）から構成される。
【０１３１】
ＤＬＢＣＬのための化学療法は、以下の治療計画（２８日サイクル）：サイクル２およびその後のサイクルの１日目にリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２ＩＶ）；サイクル２およびその後のサイクルの４日目に開始するメスナ（２−メルカプトエタンスルホン酸Ｎａ；５０００ｍｇ／ｍ２）の２４時間に亘る連続ＩＶ注入と共に４日目のイホスファミド（５０００ｍｇ／ｍ２）連続ＩＶ注入；サイクル２およびその後のサイクルの４日目のカルボプラチン（カルバート式によって計算された標的ＡＵＣ５ｍｇ／ｍＬ・分を生じる投薬量；最大用量＝８００ｍｇ）；サイクル２およびその後のサイクルの３〜５日目の毎日のエトポシド（１００ｍｇ／ｍ２ＩＶ）から構成される。
【０１３２】
本発明の一態様は、ＣＸＣＲ４＋癌に罹患した対象を処置する医薬品を調製するための本開示の任意の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分の使用である。医薬品を調製するための本開示の任意の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分の使用は、本明細書で開示した癌の全範囲に広く適用することができる。これらの使用の好ましい実施形態では、癌には、血液悪性腫瘍、例えば、再発したかまたは難治性の多発性骨髄腫、再発した急性骨髄性リンパ腫、再発した慢性リンパ球性白血病、再発した濾胞性リンパ腫あるいは難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫が含まれる。この開示はまた、本明細書に記載されている抗ＣＸＣＲ４抗体を使用する処置方法の全実施形態に対応する本開示の任意の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分の医学的使用を提供する。
【０１３３】
本開示の範囲内にはまた、本開示の任意の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合断片またはそれらの組成物および使用指示書を含むキットがある。したがって、本開示は、対象の癌を処置するためのキットであって、（ａ）投与１回または複数回分の本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはそれらのＣＸＣＲ４結合断片のいずれか、および（ｂ）本明細書に記載されている治療方法のいずれかにおいて抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片を使用するための指示書を含むキットを提供する。例えば、ある種の実施形態では、キットの抗ＣＸＣＲ４抗体は、配列番号２５に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを、および配列番号２９に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＢＭＳ−９３６５６４である。このキットはさらに、免疫抑制試薬、化学療法剤または放射性毒性薬物、または異なる抗原を標的とする１種または複数の追加的抗体などの本明細書に記載されている１種または複数の追加的治療用試薬を含有していてもよい。
【０１３４】
キットは通常、キットの内容物の企図する使用を指示した標識および使用指示書を含む。標識という用語には、キット上で、もしくはキットと一緒に供給され、もしくは別の方法でキットに付属する任意の文書または記録物質が含まれる。医薬キットのある種の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、単位投与形態でその他の治療薬と一緒に同梱してもよい。
【０１３５】
Ｂ．ＨＩＶ感染を含むウイルス感染
ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶがＴ細胞に侵入するための共受容体であることが示され、さらに、ある種のマウス抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＨＩＶ単離物がＴ細胞に侵入するのを阻害できることが示された（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｃａｒｎｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５を参照のこと）。したがって、ＣＸＣＲ４は、ウイルスが細胞に侵入するための受容体として使用することができ、ＣＸＣＲ４に対する抗体は、ＣＸＣＲ４を受容体として使用するこのようなウイルスの細胞侵入を阻害するために使用することができる。ＨＩＶ−１外被糖タンパク質ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４に結合することによるＣＸＣＲ４媒介性アポトーシスが報告された（Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０１３６】
研究によって、ＣＸＣＲ４に架橋結合した抗体はｇｐ１２０誘導によって認められる細胞死を模倣することができることが明らかになり（Ｂｅｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、それによってＨＩＶ−１感染を防御するために抗ケモカイン受容体抗体を使用すると、受容体発現Ｔ細胞の効率的および迅速な破壊が生じ得ることが示唆された。したがって、本開示のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体は、ウイルスが細胞に侵入するのを阻害するために使用することができ、そこではウイルスはＣＸＣＲ４を細胞侵入のための受容体として使用し、したがって、ウイルス感染が阻害される。好ましい実施形態では、抗体はＨＩＶがＴ細胞に侵入するのを阻害するため、例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置または予防において使用される。抗体は、単独で、またはその他の抗ウイルス剤、例えば、ＡＺＴまたはプロテアーゼ阻害剤などの抗レトロウイルス薬と組み合わせて使用することができる。
【０１３７】
Ｃ．炎症症状
ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路は、限定はしないが、炎症性肝疾患（Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、自己免疫関節炎（Ｍａｔｔｈｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、アレルギー性気道疾患（Ｇｏｎｚａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）および歯周病（Ｈｏｓｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）を含む様々な炎症症状において役割を果たすことが示された。
【０１３８】
したがって、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害する本開示のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体は、炎症性肝疾患、自己免疫関節炎、アレルギー性気道疾患、歯周病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、炎症性皮膚障害（例えば、乾癬、扁平苔癬）、自己免疫甲状腺疾患、シェーグレン症候群、肺炎症（例えば、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ球性肺胞炎）および炎症性腎疾患（例えば、ＩｇＡ腎障害、糸球体腎炎）からなる群から選択された障害を含む炎症障害における炎症を阻害するために使用することができる。抗体は、単独で、または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、メトトレキセート、ＣＯＸ−２阻害剤、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ）および免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、アザチオプリンおよびシクロスポリンＡなど）などのその他の抗炎症薬と組み合わせて使用することができる。
【０１３９】
Ｄ．血管新生
ＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＲ４発現造血前駆細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｃｙｔｅ）の動員によって新血管新生を誘導することが示された（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。さらに、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路の阻止は、ＶＥＧＦに依存しない方法で血管新生を阻害することによってインビボにおける腫瘍増殖を減衰させることができる（Ｇｕｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。さらに、実施例７で示したように、本開示の抗体は、インビトロにおいて毛細管形成を阻害することができる。したがって、ＣＸＣＬ１２がＣＸＣＲ４に結合するのを阻害する本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路を妨害することによって血管新生を阻害するために使用することができる。血管新生の阻害は、例えば、腫瘍増殖または腫瘍転移を阻害するために使用することができる（腫瘍がＣＸＣＲ４＋であるかどうかに関わらない）。抗体は、単独で、または抗ＶＥＧＦ抗体などのその他の抗血管新生薬と組み合わせて使用することができる。
【０１４０】
Ｅ．自家幹細胞移植
末梢血幹細胞は、例えば、ある種の血液悪性腫瘍の処置において、自家幹細胞移植に使用するための好ましい幹細胞源である。末梢血からの幹細胞の収集には、ＢＭから末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員が必要である。様々なサイトカイン、ケモカインおよび接着分子が、ＣＸＣＲ４およびＳＤＦ−１の相互作用を含めて、このプロセスの調節に関与してきた（Ｇａｚｉｔｔ，  ２００１に概括されている）。さらに、低分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＢＭから末梢へのＣＤ３４＋幹細胞の迅速な動員を刺激することが示された（例えば、Ｄｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５を参照のこと）。したがって、ＣＸＣＲ４活性を阻害する本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体（すなわち、アンタゴニスト抗体）は、例えば、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫などの血液障害の処置において、移植（例えば、自家移植）におけるＣＤ３４＋幹細胞の使用を可能にするために、ＢＭから末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員を刺激するために使用することができる。この抗体は、単独で、またはＧ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦなどの幹細胞の動員を刺激するために使用されるその他の薬剤と組み合わせて使用することができる。したがって、別の実施形態では、本発明は、対象においてＢＭから末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員を刺激する方法を提供し、この方法には、ＢＭから末梢血へのＣＤ３４＋幹細胞の動員が刺激されるように、対象に本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体を投与することが含まれる。この方法はさらに、自家幹細胞移植で使用するためなどに、末梢血からＣＤ３４＋幹細胞を収集することを含むことができる。
【０１４１】
本発明はさらに、以下の実施例によって例示されるが、実施例はさらに限定するものと解釈すべきではない。本出願全体にわたって引用した全図面および全参照文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例１】
【０１４２】
ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＬ１２に対するヒトモノクローナル抗体の生成
抗ＣＸＣＲ４ヒトモノクローナル抗体は、第一に、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックトランスクロモソミックマウス（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／４３４７８および米国特許第７，０４１，８７０号に記載されたＭｅｄａｒｅｘ  ＫＭ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）を、ヒトＣＸＣＲ４をトランスフェクトしたＲ１６１０細胞で免疫して、ヒトＣＸＣＲ４に特異的なヒトイムノグロブリンのレパートリーをマウスで生じさせ、その後、第二に、ヒト抗体ライブラリーをマウスの脾細胞から調製し、ファージにディスプレイし、したがって、次いでこのファージを磁気プロテオリポソームに組み込まれたヒトＣＸＣＲ４（ＣＸＣＲ４−ＭＰＬ）でパニングすることによって、ＣＸＣＲ４に親和性を有する可変領域断片の発現についてスクリーニングする組合せアプローチを使用して生成した。関心のある可変領域断片は、Ｆａｂ発現ベクターに再クローニングし、ＦａｂはトランスフェクトしたＣＸＣＲ４発現細胞に対する抗原結合について再度試験した。ＦａｂクローンＦ７（後にＭＤＸ−１３３８またはＢＭＳ−９３６５６４に名称変更）、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２をさらに分析するために選択した。全抗体は、標準的な分子生物学技術を使用してＦａｂから生成した。この組合せアプローチは一般的に、米国特許第６，７９４，１３２号に記載されており、詳細はＷＯ２００８／０６０３６７に具体的に記載されている
【０１４３】
抗ＣＸＣＬ１２抗体を生成するために、Ｍｅｄａｒｅｘ  ＫＭ（登録商標）トランスジェニックマウスを組換えヒトＣＸＣＬ１２で免疫した（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）。脾臓溶解物をプールし、以前に記載したように処理した（米国特許第６，７９４，１３２号）。適切なファージディスプレイ手法を使用して、Ｂｉｏｓｉｔｅは抗体断片を生成した（Ｆａｂライブラリー）。ＣＸＣＬ１２に結合したファージは、ビオチン化ＣＸＣＬ１２を使用して選択した。選択した抗原反応性Ｆａｂは、完全長ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）に変換し、ＣＨＯ細胞で再度発現させた。
【０１４４】
半抗体形成を低下させるために、Ｓ２２８Ｐヒンジ突然変異を含有するアイソタイプ対照抗体ＩｇＧ４（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）をＢｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡで生成した。
【実施例２】
【０１４５】
ヒト抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の構造特性
実施例１に記載されているようにファージディスプレイライブラリースクリーニングから得られたＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２Ｆａｂクローンの重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列は、標準的ＤＮＡ配列決定技術を使用して配列決定した。
【０１４６】
Ｆ７の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１Ａならびに配列番号３３および２５にそれぞれ示す。Ｆ７の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１Ｂならびに配列番号３７および２９にそれぞれ示す。
【０１４７】
Ｆ７重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン重鎖配列に対して比較することによって、Ｆ７重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３〜４８のＶＨ区域、ヒト生殖系列４〜２３のＤ区域およびヒト生殖系列ＪＨ６ＢのＪＨ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＦ７ＶＨ配列をさらに分析することによって、図１Ａならびに配列番号１、５および９それぞれに示したように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が描写された。Ｆ７軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン軽鎖配列に対して比較することによって、Ｆ７軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫＬ１５のＶＬ区域およびヒト生殖系列ＪＫ１のＪＫ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＦ７ＶＬ配列をさらに分析することによって、図１Ｂならびに配列番号１３、１７および２１それぞれに示したように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が描写された。
【０１４８】
Ｆ９の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号３４および２６にそれぞれ示す。Ｆ９の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号３８および３０にそれぞれ示す。Ｆ９重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン重鎖配列に対して比較することによって、Ｆ９重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３〜４８のＶＨ区域、ヒト生殖系列４〜２３のＤ区域およびヒト生殖系列ＪＨ６ＢのＪＨ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＦ９ＶＨ配列をさらに分析することによって、配列番号２、６および１０それぞれに示したように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が描写された。Ｆ９軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン軽鎖配列に対して比較することによって、Ｆ９軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫＬ１５のＶＬ区域およびヒト生殖系列ＪＫ１のＪＫ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＦ９ＶＬ配列をさらに分析することによって、配列番号１４、１８および２２それぞれに示したように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域が描写された。
【０１４９】
Ｄ１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号３５および２７にそれぞれ示す。Ｄ１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号３９および３１にそれぞれ示す。Ｄ１重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン重鎖配列に対して比較することによって、Ｄ１重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３〜４８のＶＨ区域、ヒト生殖系列４〜２３のＤ区域およびヒト生殖系列ＪＨ６ＢのＪＨ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＤ１ＶＨ配列をさらに分析することによって、配列番号３、７および１１それぞれに示したように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域が描写された。Ｄ１軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン軽鎖配列に対して比較することによって、Ｄ１軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫＬ１５のＶＬ区域およびヒト生殖系列ＪＫ１のＪＫ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＤ１ＶＬ配列をさらに分析することによって、配列番号１５、１９および２３それぞれに示したように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域が描写された。
【０１５０】
Ｅ２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号３６および２８にそれぞれ示す。Ｅ２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号４０および３２にそれぞれ示す。Ｅ２重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン重鎖配列に対して比較することによって、Ｅ２重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３〜４８のＶＨ区域、ヒト生殖系列４〜２３のＤ区域およびヒト生殖系列ＪＨ６ＢのＪＨ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＥ２ＶＨ配列をさらに分析することによって、配列番号４、８および１２それぞれに示したように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域が描写された。Ｅ２軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖系列イムノグロブリン軽鎖配列に対して比較することによって、Ｅ２軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫＬ１５のＶＬ区域およびヒト生殖系列ＪＫ１のＪＫ区域を利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用してＥ２ＶＬ配列をさらに分析することによって、配列番号１６、２０および２４それぞれに示したように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域が描写された。
【０１５１】
Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨおよびＶＬ領域のフレームワーク配列の分析では、それらが得られた生殖系列配列と比較すると、生殖系列とは異なる様々なフレームワークアミノ酸残基が同定された。生殖系列配列にフレームワーク残基を回復させるために、ＶＨおよびＶＬ区域のＮ末端領域のある種のフレームワーク残基を「逆突然変異」用に選択した。なぜならば、Ｎ末端部分のこれらの非生殖系列残基は、実施例１に記載されているファージディスプレイライブラリーを作製するために使用したプライマーによってコードされたからである。特に、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２のＶＨおよびＶＬ区域の改変された形態（生殖系列では、「ＧＬ」型と称する）は、標準的分子生物学技術を使用して、指示したフレームワーク位置の生殖系列アミノ酸残基を置換して生成する。特異的に逆突然変異したアミノ酸およびＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の元の可変領域の配列を有するＧＬ変異体の配列の配列比較は、ＷＯ２００８／０６０３６７に提供されている。
【０１５２】
Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２Ｆａｂ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して完全長抗体に変換する。例えば、Ｆａｂ断片の１つのＶＨおよびＶＫ領域をコードするＤＮＡは、可変領域が定常領域に操作可能に連結するように、重鎖および軽鎖定常領域を有する発現ベクターにクローニングすることができる。  あるいは、完全長重鎖および完全長軽鎖を発現するために別々のベクターを使用することができる。完全長抗体の生成における使用に適した発現ベクターの非限定的な例には、米国特許第７，６７４，６１８号に記載されたｐＩＥベクターが含まれる。Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）Ｆａｂ断片は、完全長ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）抗体に変換し、ＣＨＯ細胞で再発現させた。
【実施例３】
【０１５３】
抗ＣＸＣＲ４ヒトモノクローナル抗体の結合の特徴
この実施例では、抗ＣＸＣＲ４抗体の結合の特徴は、フローサイトメトリーによって調べた。
【０１５４】
細胞表面上に天然ヒトＣＸＣＲ４を発現するヒトＴ細胞株ＣＥＭは、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２抗体が天然の細胞表面ＣＸＣＲ４に結合する能力を調べるために使用した。完全長Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２は、３００ｎＭから５ｐＭの濃度範囲をもたらす１：３連続希釈系列で滴定した。次に、抗体をＣＥＭ細胞と混合し、結合させてからＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ２次抗体で検出した。細胞は次に、蛍光サイトメトリーによって分析した。得られた平均蛍光強度を図２のグラフに示すが、４種類の抗ＣＸＣＲ４抗体全てがＣＥＭ細胞に結合することを示している。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の結合のＥＣ５０はそれぞれ、２１ｎＭ、１４ｎＭ、８０ｎＭおよび２９０ｎＭであった。
【０１５５】
一連の抗ＣＸＣＲ４抗体がＣＸＣＲ４への結合に対して競合する能力を測定するために、競合実験を実施した。４種類のヒト抗ＣＸＣＲ４抗体、Ｆ９、Ｆ７、Ｅ２およびＤ１を、４種類の市販のマウスモノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体（１２Ｇ５、７０８、７１６および７１７；それぞれＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ１７０、ＭＡＢ１７１、ＭＡＢ１７２およびＭＡＢ１７３）と共に使用した。抗ＣＸＣＲ４抗体は、一定濃度のＦＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ４抗体Ｆ９の存在下で、３００ｎＭから５ｐＭの濃度範囲をもたらす１：３連続希釈系列で滴定した。次に、抗体の混合物をＣＥＭ細胞に添加し、結合させた。各抗体がＣＥＭ細胞への結合に対してＦ９と競合する能力を蛍光サイトメトリーおよびＦＩＴＣの検出によって評価した。得られた平均蛍光強度を図３のグラフに示すが、これによって、Ｅ２抗体だけはその他の抗体と比較して高濃度で部分的な阻害を示したが、調べた７種の抗体（Ｆ７、Ｅ２、Ｄ１、１２Ｇ５、７０８、７１６および７１７）全てがＣＥＭ細胞への結合に対してＦ９と競合することができることを示している。
【０１５６】
別の一連の実験では、ＢＭＳ−９３６５６４ｍＡｂが様々な異なる細胞株に結合する能力をフローサイトメトリーによってＦＡＣＳ滴定を実施することによって調べた。ｍＡｂの量を増加させて（０．００１μｇ／ｍｌ未満から１００μｇ／ｍｌ超まで）１００，０００細胞とインキュベートし、結合をフローサイトメトリーによって評価した。どれだけのＣＸＣＲ４分子が各細胞に存在するかを大体示すＢｍａｘ値も測定した。結合曲線に基づいて、抗体結合のＥＣ５０を決定した。その結果を以下の表１にまとめて示す。
【０１５７】
【表１】
2014533279.tif 000003
【０１５８】
結果は、Ｆ７ｍＡｂ（ＢＭＳ−９３６５６４）は試験した６種類の細胞株それぞれに効果的に結合することができ、ＲａｍｏｓおよびＲａｊｉ細胞株で認められるＥＣ５０が最低であることを示している。これらのデータはまた、ＣＸＣＲ４受容体の発現が最高なのはＲａｍｏｓおよびＮａｍａｌｗａ細胞で、最低なのはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＤＭＳ７９細胞であることを示している。
【０１５９】
別の結合実験では、ＢＭＳ−９３６５６４ｍＡｂがヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の様々なサブセットに結合する能力を調べた。ヒトＰＢＭＣは、標準的方法によって単離し、様々な細胞サブセットはＦＡＣＳによって単離した。特に、以下の細胞サブセット（ｉ）ＣＤ３＋、（ｉｉ）ＣＤ２０＋、（ｉｉｉ）ＣＤ１１ｂ＋および（ｉｖ）ＣＤ１４＋を単離した。ＢＭＳ−９３６５６４ｍＡｂ（３３μｇ／ｍｌ）で実施したフローサイトメトリー実験は、アイソタイプを一致させた対照抗体と比較して、４種類のサブセットそれぞれに効果的に結合することが可能であることを示した。
【０１６０】
別の実験では、様々な一連のヒトＣＸＣＲ４＋細胞株のＢＭＳ−９３６５６４結合についてフローサイトメトリーを使用して評価した。細胞を裸（ｎａｋｅｄ）ＢＭＳ−９３６５６４またはビオチン化ＢＭＳ−９３６５６４の指示した濃度と共に懸濁し、その後抗体および細胞の混合物をヤギ抗ヒトＦＣγ−ＰＥまたはＰＥ結合ストレプトアビジンとインキュベートすることによって、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）染色用に調製した。細胞は、ＦＡＣＳによって、ＦＳＣおよびＳＳＣによって同定した生きた細胞集団にゲートをかけることによって分析した。用量に依存した結合が、細胞株Ｒ１６１０−ｈｕＣＸＣＲ４（ヒトＣＸＣＲ４でトランスフェクトし、Ｇ４１８選択で維持したＲ１６１０ハムスター線維芽細胞）；Ｒａｍｏｓ（ヒトＢリンパ芽球性バーキットリンパ腫）；ＣＥＭ（ヒトＴリンパ芽球性急性リンパ芽球性白血病）；Ｎｏｍｏ−１（ヒト急性骨髄性白血病）；ＨＬ−６０（ヒト前骨髄芽球）；ＭＯＬＰ８（ヒトＭＭ）；およびＪＪＮ−３Ｒ（ボルテゾミブに対する耐性で選択したヒトＭＭ細胞株）で認められた。図４参照のこと。Ｒ１６１０親細胞に対する結合は検出されなかった。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）に基づいて、ＣＸＣＲ４レベルはＲ１６１０−ｈｕＣＸＣＲ４およびＲａｍｏｓ細胞で最高で、ＣＥＭ（図４Ｂ）、Ｎｏｍｏ−１およびＨＬ６０（図４Ａ）がそれに続いた。多発性骨髄腫細胞株ＭＯＬＰ−８およびＪＪＮ−３Ｒの発現する受容体数は最低であった（図４Ｃ）。結合のＥＣ５０値を表２に示す。さらに、ＢＭＳ−９３６５６４は、健康なドナーＰＢＭＣ（データは示さず）ならびにＡＭＬ患者から収集したＰＢＭＣ試料７／８に様々なＧＭＦＩで結合した（図４Ｄ）。これらのデータは、ＣＸＣＲ４が複数の造血細胞株で発現し、ＡＭＬ患者では変化に富んで発現することを示している。
【０１６１】
【表２】
2014533279.tif 000004
【実施例４】
【０１６２】
抗ＣＸＣＲ４および抗ＣＸＣＬ１２抗体によるＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合の阻害
ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体が阻害する能力を測定するために、１２５Ｉ標識ＣＸＣＬ１２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および天然にＣＸＣＲ４を発現するＣＥＭ細胞を使用して競合試験を実施した。ＣＥＭ細胞に結合するＣＸＣＬ１２のブロックに関する抗ＣＸＣＲ４抗体の比較は、標準的な放射標識リガンド結合アッセイによって実施した。抗ＣＸＣＲ４抗体は、１：３に連続希釈して、３００ｎＭから１３７ｐＭの濃度範囲を作製した。抗体を１００μｌ中において比活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅの１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２  １００ｐＭの存在下で（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＩＭ３１４−２５ＵＣＩ）、７５０，０００ＣＥＭ細胞に添加した。同じアイソタイプの関係の無い抗体を陰性対照として使用した。結合した可能性のある全放射標識リガンドは、１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２を抗体非存在下で４℃で２時間ＣＥＭ細胞に結合させることによって測定した。放射標識リガンドの非特異的結合は、未標識ＣＸＣＬ１２  １μＭの存在下で１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２を結合させることによって測定した（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−２８Ａ）。細胞に関連した１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２の量は、標準的方法によって測定した。結果は、図５に示すが、Ｆ７抗体（ＢＭＳ−９３６５６４）はＣＸＣＬ１２がＣＥＭ細胞で発現したＣＸＣＲ４に結合するのを最も効果的に阻止することを示している。Ｆ９およびＤ１抗体はまた、Ｆ７よりも控えめではあるが、ＣＸＣＬ１２結合をブロックした。Ｅ２抗体は、ＣＥＭ細胞のＣＸＣＲ４に結合するが（実施例３に示した通り）、ＣＸＣＬ１２がＣＥＭ細胞のＣＸＣＲ４に結合するのを効果的にブロックしなかった。Ｆ７、Ｆ９およびＤ１によるＣＸＣＬ１２阻止のＥＣ５０はそれぞれ、２．３ｎＭ、１２．５ｎＭおよび２８．６ｎＭであった。
【０１６３】
別の実験では、ＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２抗体によるＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合の阻止を比較した。ＢＭＳ−９３６５６４、抗ＣＸＣＬ１２および対照抗体の連続希釈を、１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４＋ＣＥＭ細胞への結合の阻止について試験した。１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のＣＥＭ細胞上のＣＸＣＲ４への結合の競合は、固定した濃度の１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２（１００ｐＭ）および５ｐＭから３００ｎＭのＢＭＳ−９３６５６４の滴定を使用して示した。アイソタイプ抗体は、陰性対照として使用し、未標識ＣＸＣＬ１２は陽性対照として使用した。プレートは室温で１時間インキュベートし、フィルターを洗浄し、取り出して、カウント毎分（ＣＰＭ）は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＷＩＺＡＲＤ（登録商標）ガンマカウンタ−（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって読み取った。インビトロの試験全てについて、データはグラフにして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、非線形回帰およびＳ字型用量反応曲線を使用して分析した。
【０１６４】
飽和結合試験は、放射標識ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４ｈｉＣＥＭ細胞を使用して実施した。１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２のＣＥＭ細胞への結合のＫＤは、４．３ｎＭと測定された（データは示さず）。３．０から５．４ｎＭの範囲である報告されたＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４へのＫＤと同等である（ＤｉＳａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。最適以下の固定した濃度の１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２（１００ｐＭ）を使用して、ＢＭＳ−９３６５６４を滴定すると、用量依存的な１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２結合の阻害が認められ、ＥＣ５０値は約２ｎＭであった（図６Ａ）。興味深いことに、抗ＣＸＣＬ１２抗体はより強力で、１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２のＣＥＭ細胞への結合の用量依存的な阻害を引き起こし、ＥＣ５０値は約９０ｐＭであった（図６Ｂ）。
【０１６５】
ＢＭＳ−９３６５６４はまた、１２５Ｉ−ＣＸＣＬ１２のＲａｍｏｓ細胞への結合を用量依存的にブロックすることが示され、ＥＣ５０値は約１１ｎＭであった（図６Ｃ）。
【実施例５】
【０１６６】
抗ＣＸＣＲ４および抗ＣＸＣＬ１２抗体によるＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流の阻害
抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がＣＸＣＬ１２によって誘導されたＣＥＭ細胞におけるカルシウム流を阻害する能力を測定するために、まずＣＥＭ細胞を蛍光色素カルシウム３で標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）。抗ＣＸＣＲ４抗体は１００ｎＭから１ｐＭの濃度範囲をもたらす１：３連続希釈系列で滴定し、２００μｌ中で２００，０００個のＣＥＭ細胞に結合させ、室温で１０分間インキュベートしてからＦＬＥＸＳＴＡＴＩＯＮ（登録商標）機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に添加した。陰性対照として、同じアイソタイプの関係の無い抗体を使用した。次に、細胞を最終濃度５０ｎＭの組換えヒトＣＸＣＬ１２α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で刺激し、２２μｌ容量中５００ｎＭとして最終容量２２２μｌで添加した。得られたカルシウム流は、ウェル当たり２００秒間測定した。陽性対照として、抗体非存在下で細胞をＣＸＣＬ１２α（０．１％ＢＳＡまたはＨＢＳを含むハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）で作製）で刺激し、可能な限り最大なカルシウム流シグナルを実現した。ベースラインを測定するために、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳで刺激した。カルシウムのＣＸＣＬ１２α刺激による放出は、経時的なカルシウム依存性蛍光の発生によって測定した。得られた蛍光トレースの曲線下面積は、カルシウム流の指標として報告した。抗ＣＸＣＲ４抗体によって得られたカルシウム流の阻害を図７に表す。データをプロットし、ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアおよび非線形曲線フィット、Ｓ字型用量反応式を使用して計算した。抗体Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）、Ｆ９およびＤ１はＣＸＣＬ１２α誘導性カルシウム流を阻害した。抗体Ｅ２はＣＸＣＲ４に結合したが（実施例３に示した通り）、ＣＸＣＬ１２α誘導性カルシウム流をあまり阻害しなかった。Ｆ７、Ｆ９およびＤ１によるＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流の阻害のＥＣ５０はそれぞれ、０．９０ｎＭ、０．３２ｎＭおよび０．５７ｎＭであった。
【０１６７】
別の実験では、ＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２がＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流を阻害する能力を比較した。ＲａｍｏｓおよびＣＥＬＬ細胞にＦＬＩＰＲ（登録商標）カルシウム４色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を添加し、固定濃度のＣＸＣＬ１２を使用してカルシウム流を刺激した。ＢＭＳ−９３６５６４または抗ＣＸＣＬ１２の５０ｐＭから１００ｎＭの滴定を使用して応答を阻害した。最大カルシウム応答はＣＸＣＬ１２マイナス抗体で設定した。ベースライン応答は、ＣＸＣＬ１２を有さない細胞のバッファー刺激で確立した。カルシウム流は、ＦＬＥＸＳＴＡＴＩＯＮ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。ＣＸＣＬ１２は、細胞内のカルシウムの用量依存的な上昇を誘導することが示され、ピークカルシウム流はＲａｍｏｓ細胞で５０ｎＭ、ＣＥＭ細胞で５ｎＭに達した。カルシウム流を刺激するＣＸＣＬ１２の最適濃度を用いて、ＢＭＳ−９３６５６４または抗ＣＸＣＬ１２の滴定を使用して応答を阻害した（図６Ｃおよび６Ｄ）。ＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２はいずれも、用量依存的にＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流をブロックした。ＢＭＳ−９３６５６４は、ＲａｍｏｓにおいてＥＣ５０約１０ｎＭ、ＣＥＭにおいて８ｎＭでブロックしたが（図８Ａおよび８Ｂ）、一方、抗ＣＸＣＬ１２はＥＣ５０約３５ｎＭ（Ｒａｍｏｓ）および２ｎＭ（ＣＥＭ）細胞でブロックした（図８Ａおよび８Ｂ）。
【実施例６】
【０１６８】
抗ＣＸＣＲ４および抗ＣＸＣＬ１２抗体によるＣＥＭ細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走の阻害
抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がＣＸＣＬ１２によって誘導されたＣＥＭ細胞の遊走を阻害する能力を測定するために、まずＣＥＭ細胞をＢＡＴＤＡ（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２”−テルピリジン−６，６”−ジカルボキシレート）化学ルミネセンス遊走試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識した。抗ＣＸＣＲ４抗体は、１００ｎＭから１ｐＭの濃度範囲をもたらす１：３連続希釈系列で滴定し、１ｍｌ当たり１０００万個の細胞密度で標識ＣＥＭ細胞に結合させた。陰性対照として、同じアイソタイプの関係の無い抗体を使用した。組換えヒトＣＸＣＬ１２α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）５ｎＭをウェル当たり３０μｌで、ウェル毎に直径５．７ｍｍのフィルターを入れた９６ウェルＮｅｕｒｏｐｒｏｂｅ遊走プレートの下部チャンバーに添加した。各ウェルは、５μＭの細孔を有する。標識ＣＥＭ細胞は、抗体と共に、または抗体無しで、ウェル当たり５０万個の細胞の濃度で、容量５０μｌでフィルター上に添加した。遊走プレートは３７℃で２．５時間インキュベートした。遊走した細胞は、プレートの下部チャンバーで補足され、溶解されて、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ユーロピウム検出溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出された。化学ルミネセンスシグナルは、融合機器（Ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で記録した。抗ＣＸＣＲ４抗体によって得られたＣＸＣＬ１２α誘導性遊走の阻害を図９に示す。結果によって、抗体Ｆ７およびＦ９は遊走を効果的に阻害するが、抗体Ｄ１およびＥ２は遊走をあまり阻害しないことが示された。Ｆ７およびＦ９によるＣＸＣＬ１２誘導性ＣＥＭ細胞遊走の阻害のＥＣ５０は、それぞれ１２．４４ｎＭおよび１８．９９ｎＭであった。
【０１６９】
別の実験では、ＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２がＲａｍｏｓおよびＣＥＭ細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走を阻害する能力を比較した。細胞をＢＡＴＤＡに添加した。固定濃度のＣＸＣＬ１２を使用して、Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の遊走プレート上の５μｍ細孔を含有するフィルターを通る細胞の遊走を刺激した。ＢＭＳ−９３６５６４または抗ＣＸＣＬ１２の２０ｐＭから３００ｎＭの滴定量を細胞に添加した。最大遊走を確立するために、抗体を含まないＣＸＣＬ１２を使用した。ＣＸＣＬ１２を含まない培地のみへの遊走は、バックグラウンド遊走を測定するために使用した。３７℃で２時間インキュベーションした後、遊走した細胞は、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を溶解した細胞に添加することによって検出し、融合機器で時間分解蛍光によって検出した。Ｒａｍｏｓ遊走を誘導するためのＣＸＣＬ１２の最適濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ（１．２５ｎＭ）であることが立証されたが、ＣＥＭ細胞はＣＸＣＬ１２に対してより敏感で、ＣＸＣＬ１２  ０．０５ｎＭで最大遊走が示された。ＢＭＳ−９３６５６４は、およそのＥＣ５０値がＲａｍｏｓ細胞では１ｎＭおよびＣＥＭ細胞では４ｎＭでＣＸＣＬ１２誘導性遊走をブロックすることが示された（図１０Ａおよび１０Ｂ）。抗ＣＸＣＬ１２は、およそのＥＣ５０値が０．９ｎＭ（Ｒａｍｏｓ）および０．１３ｎＭ（ＣＥＭ）細胞でＣＸＣＬ１２誘導性遊走を阻害した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【実施例７】
【０１７０】
抗ＣＸＣＲ４抗体によるＨｕＶＥＣ毛細管形成の阻害
この実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）による毛細管形成を阻害する能力を調べた。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をＲＰＭＩで１：１に希釈して、９６ウェルプレートのウェルに入れ、３７℃で３０分間重合化させた。８０％コンフルエンスのＨｕＶＥＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ製、カタログ番号ＣＣ−２５１９）をトリプシン処理して、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで１ｍｌ当たり１×１０６細胞で再懸濁した。抗体を最終濃度３μｇ／ｍｌでＨｕＶＥＣと共に十分混合し、室温で３０分間インキュベートした。同じアイソタイプの関係の無い抗体または媒体のみを陰性対照として使用した。管形成阻害の陽性対照として、マウス抗ヒトαｖβ３（ＣＤ５１／ＣＤ６１）抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ３０５０）を使用した。抗体を有するかまたは有さないＨｕＶＥＣをＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングしたウェルに入れ、３７℃で１８時間インキュベートした。
【０１７１】
培地単独またはアイソタイプが一致した対照抗体と共にインキュベートしたＨｕＶＥＣは、毛細管を形成し、細胞当たり３〜５箇所の連結または分枝点によって細胞が連結し、プレート中に広がる様相を呈した。抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体または抗αｖβ３抗体のいずれかと共にインキュベートしたＨｕＶＥＣは、毛細管は形成しなかった。細胞は離れ離れになっており、分岐点はほとんどないかまたは全くなかった。ＣＸＣＬ１２結合、ＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流およびＣＸＣＬ１２誘導性遊走を最も効果的にブロックする抗ＣＸＣＲ４抗体、すなわちＦ７およびＦ９はまた、最も効果的に毛細管形成を阻害した。ＣＸＣＲ４には結合するが、ＣＸＣＬ１２結合またはＣＸＣＬ１２誘導性効果をブロックしない抗ＣＸＣＲ４抗体Ｅ２は、毛細管形成を阻害しなかった。
【実施例８】
【０１７２】
抗ＣＸＣＲ４抗体はＣＸＣＲ４発現細胞のインビトロ増殖を阻害するが、抗ＣＸＣＬ１２は阻害しない
この実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がインビトロにおいてＲａｍｏｓ腫瘍細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）の増殖を阻害する能力を調べた。アッセイにおいて、１×１０４細胞／ウェルを、用量を増加させた（１０−３から３００ｎＭ）Ｆ７ＩｇＧ４抗体、Ｆ９ＩｇＧ１抗体、Ｅ２ＩｇＧ１抗体、Ｆ９Ｆａｂ’抗体またはアイソタイプ対照とインキュベートした。細胞を抗体と７２時間インキュベートし、３Ｈ−チミジンをインキュベーションの最後の２４時間に添加して、細胞増殖をモニターした。インキュベーション後、細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを標準的技術によって測定した。結果を図１１Ａのグラフに示す。結果によって、Ｆ７ＩｇＧ４、Ｆ９ＩｇＧ１およびＥ２ＩｇＧ１抗体はそれぞれ、これらの抗体と共にインキュベートしたときの３Ｈ−チミジン取り込みの減少によって示されるように、Ｒａｍｏｓ細胞増殖を阻害することができたが、Ｆ９Ｆａｂ’断片は細胞増殖を阻害しなかったことが示される。これらの結果は、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がインビトロにおいて腫瘍細胞に対して直接的な抗増殖効果を有することを示しており、したがって、抗増殖効果を実現するために２次架橋結合を必要としない。
【０１７３】
別の実験では、ＭＤＸ−１３３８、抗ＣＸＣＬ１２および低分子ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＡＭＤ３１００およびＢＫＴ１４０のＲａｍｏｓ細胞の増殖に対する効果を比較した。Ｒａｍｏｓ細胞は増殖培地に１×１０５細胞／ｍＬで懸濁し、アイソタイプ対照を含む関連のある抗体およびその他の試験薬剤と共にインキュベートし、３７℃で７２時間培養した。Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加して、混合し、室温で１０分間インキュベートした。プレートをＧｌｏＭａｘルミノメータ−（Ｐｒｏｍｅｇａ）で読み取った。結果を図１１Ｂに示す。アイソタイプ対照と比較して、Ｒａｍｏｓ細胞増殖の最大約５０％の阻害がＢＭＳ−９３６５６４  ４０ｎＭ処置で認められたが、抗ＣＸＣＬ１２は細胞増殖を阻害しなかった。さらに、ＡＭＤ３１００、低分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストは増殖を阻害しなかった。最近記載された１４残基ペプチドアンタゴニスト、ＢＫＴ１４０は、増殖を阻害したが、さらに高い濃度においてであった（１００μＭ）。カンプトテシン（ＣＰＴ）は、１０μＭで完全に細胞増殖を阻害した。
【実施例９】
【０１７４】
抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビボにおける固形腫瘍細胞増殖の阻害
この実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がインビボにおいて確立された固形腫瘍の増殖を阻害する能力を、Ｒａｍｏｓ皮下腫瘍細胞モデルを使用して調べた。このアッセイでは、１０×１０６Ｒａｍｏｓ細胞／マウスを各マウスの側腹部領域に移植し、腫瘍の長さ×幅×高さ／２によって計算した平均サイズ４０ｍｍ３まで増殖させた。次に、マウスに１回目投与の抗体を腹腔内（ＩＰ）注射によって投与し（処置０日目とする）、２回目投与の抗体ＩＰ投与を７日目に行った。Ｆａｂ’断片抗体で処置したマウスも、３日目および１０日目に抗体ＩＰ投与を行った。マウスの群（ｎ＝８）を（ｉ）ビヒクル；（ｉｉ）アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｉｉ）Ｆ７ＩｇＧ４（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｖ）Ｆ９ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｖ）Ｆ９Ｆａｂ’（１０ｍｇ／ｋｇ）または（ｖｉ）抗ＣＤ２０陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置した。腫瘍容量およびマウス体重を投与後０日目と３０日目との間に一定間隔で測定した（約２〜３回／週）。実験の結果は、図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃに示しており、平均腫瘍容量（図１２Ａ）、腫瘍容量中央値（図１２Ｂ）および％体重変化中央値（図１２Ｃ）を示している。結果によって、陽性対照のように、Ｆ７ＩｇＧ４およびＦ９ＩｇＧ１抗体は、腫瘍容量増加によって測定すると腫瘍細胞増殖を著しく阻害するが、Ｆ９Ｆａｂ’断片は、アイソタイプ対照と比較して、腫瘍細胞増殖を阻害しなかったことが示された。体重変化があまりないことによって示されるように、処置は全て良好な耐容性を示した。処置間の体重の違いは、腫瘍の重さによるものである可能性が最も高い。結果によって、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体はインビボにおいて確立された固形腫瘍の増殖を阻害できることが示される。
【実施例１０】
【０１７５】
抗ＣＸＣＲ４抗体で処置することによってマウスの全身性腫瘍細胞モデルの生存時間が増加するが、抗ＣＸＣＬ１２抗体では増加しない
この実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がマウスの生存時間を増加させる能力を、Ｒａｍｏｓ全身性腫瘍細胞モデルを使用して調べた。このアッセイでは、０日目に１×１０６Ｒａｍｏｓ細胞／マウスを各マウスに静脈内注射（ＩＶ）した。次に、１日目（すなわち、腫瘍細胞をＩＶ投与してから１日目）に、マウスに１回目投与の抗体を腹腔内（ＩＰ）注射し、５、８、１５および２２日目にさらに４回抗体をＩＰ投与した（陽性対照抗体で処置したマウスは１日目のみ処置した）。マウスの群（ｎ＝８）を（ｉ）ビヒクル；（ｉｉ）アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｉｉ）Ｆ９ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）または（ｉｖ）抗ＣＤ１９陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置した。用量応答試験によって既に、１５ｍｇ／ｋｇが抗ＣＤ１９の効果的な用量であることが見出されている（データは示さず）。生存パーセントは、投与後０日目と５０日目の間で一定間隔で測定した（後肢麻痺は実験のエンドポイントとして使用した）。実験の結果を図１３Ａに示しており、経時的な生存パーセントを示している。ビヒクルかまたはアイソタイプ対照のいずれかで処置したマウスの生存日数の中央値はそれぞれ２３日および２５．５日であるが、抗ＣＤ１９陽性対照投与で１回処置したマウスの生存日数の中央値は３９日であった。注目に値すべきことに、Ｆ９ＩｇＧ１抗体の５回投与で処置した群のマウスの１００％が実験の終了まで生存した。これらの結果は、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体は全身腫瘍細胞モデルにおいてマウスの生存時間を増加させることができることを示している。
【０１７６】
ＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２抗体がマウスの生存時間を増加させる能力を比較するために、同様の実験を実施した。全身性Ｒａｍｏｓ腫瘍異種移植を有するＳＣＩＤマウスを、前述したように、１５ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９３６５６４、抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗ＣＤ１９陽性対照、ヒトＩｇＧ４もしくはＩｇＧ１アイソタイプ対照またはビヒクル（ＰＢＳ）対照で処置した。ＢＭＳ−９３６５６４は、このＲａｍｏｓ全身性モデルにおいてマウスの生存時間を延長するのに非常に効果的で、抗ＣＤ１９陽性対照よりもずっと効果的であることが見出された（図１３Ｂ参照）。ビヒクルかまたはアイソタイプ対照で処置したマウスの生存日数の中央値は２３〜２４日であるが、抗ＣＤ１９陽性対照の１回投与で処置したマウスの生存日数の中央値は３９日であった。注目に値すべきことに、移植後１２０日の実験終了時に、ＢＭＳ−９３６５６４を５回投与して処置した群のマウスの１００％が生存した。対照的に、抗ＣＸＣＬ１２抗体は、驚くべきことに全く有効性を示さず、ビヒクルおよびアイソタイプ対照の生存時間とほとんど同じ生存時間であった。これらのデータは、インビボにおいては、ＣＸＣＬ１２誘導性効果の阻止以外の、またはそれに加えた機構が使用されるにちがいないことを示唆している。
【実施例１１】
【０１７７】
ＢＭＳ−９３６５６４はＣＸＣＲ４発現細胞のアポトーシスを誘導する
インビボにおけるＢＭＳ−９３６５６４の確かな抗腫瘍活性は、ＢＭＳ−９３６５６４の作用機構を理解しようとする研究をさらに促した。具体的に、一連の実験は、抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂ  Ｆ７（ＢＭＳ−９３６５６４）が様々な細胞株においてアポトーシスを誘導する能力に注目した。アポトーシスアッセイでは、Ｆ７ｍＡｂ１０μｇ／ｍｌをＲａｍｏｓ細胞（５００，０００細胞）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（５００，０００細胞）またはＣＸＣＲ４を発現するようにトランスフェクトしたＲ１６１０細胞（１００，０００細胞）のいずれかと共にインキュベートした。トランスフェクトしていないＲ１６１０細胞は陰性対照として使用した。抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂ  Ｆ７またはアイソタイプ対照抗体は、細胞と共に３７℃でインキュベートし、試料２５０μｌを２４、４８および７２時間目に取り出した。アポトーシスを検討するために、様々な時点の細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ−ＦＬ１およびヨウ化プロピジウム−ＦＬ３と共にインキュベートし、その後フローサイトメトリーを行った。ＦＬ１、ＦＬ３およびＦＬ１−ＦＬ３の２重陽性４分割領域（ｑｕａｄｒａｎｔ）で収集された細胞を一緒にした割合は、アポトーシスされていると見なされた。バックグラウンドを取り除くために、アイソタイプ抗体誘導性アポトーシス細胞のパーセントをＢＭＳ−９３６５６４誘導性アポトーシス細胞のパーセントから差し引いた。
【０１７８】
以下の表３にまとめて示した結果は、Ｆ７ｍＡｂはＲａｍｏｓ、ＮａｍａｌｗａおよびＲ１６１０−ＣＸＣＲ４細胞でアポトーシスを誘導することができるが、Ｆ７は親Ｒ１６１０細胞のアポトーシスの誘導に全く影響を与えなかったことを示し、応答はＣＸＣＲ４特異的であったことを示している。
【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
別の実験では、ＢＭＳ−９３６５６４が様々な細胞株（表４参照）でアポトーシスを誘導する能力を調べた。細胞（５×１０５細胞／ｍＬ）を１０ｎＭ〜３３０ｎＭのＢＭＳ−９３６５６４またはアイソタイプ対照と３７℃で２４時間インキュベートした。細胞のサブセットに対して（表４参照）、架橋結合抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナルＡｂ）を６倍過剰で添加した。全種の細胞に対して、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩを阻害する細胞傷害性キノリンアルカロイドであるカンプトテシン（ＣＰＴ）１０μＭをアポトーシス誘導の陽性対照として３７℃で２４時間添加した。その後、細胞をアネキシンＶ結合バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ）に再懸濁し、アネキシンＶ−ＡＰＣおよび７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。細胞を洗浄し、アネキシンＶ結合バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳアレイシステム、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）によって分析した。
【０１８１】
ＲａｍｏｓヒトＢリンパ芽球性バーキットリンパ腫（Ｃａｔ．ＣＲＬ−１５９６）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭヒトＴリンパ芽球性急性リンパ芽球性白血病（ＣＣＬ−１１９）、ＨＬ−６０ヒト前骨髄芽球（ＣＣＬ−２４０）、ＮａｍａｌｗａヒトＢリンパ芽球性バーキットリンパ腫（ＣＲＬ−１４３２）、ＲａｊｉヒトＢリンパ芽球性バーキットリンパ腫（ＣＣＬ−８６）、ＲＰＭＩ８２２６ヒト骨髄腫（ＣＣＬ−１５５）、ＭＭ．１ＳヒトＢリンパ芽球性ＭＭ（ＣＲＬ−２９７４）、Ｕ２２６Ｂ１ヒト骨髄腫（ＴＩＢ−１９６）、ＭＶ−４−１１ヒト混合型Ｂ骨髄単球性白血病（ＣＲＬ−９５９１）、ＭＪヒトＴ細胞リンパ腫（ＣＲＬ−８２９４）、ＨＨヒトＴ細胞リンパ腫（ＣＲＬ−２１０５）、ＨｕＴ７８ヒトリンパ芽球性皮膚リンパ腫（ＴＩＢ−１６１）、ＮＫ９２ヒトＮＫ細胞非ホジキンリンパ腫（ＣＲＬ−２４０７）細胞株は、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した。
【０１８２】
Ｎｏｍｏ−１ヒト急性骨髄性白血病（ＡＣＣ５４２）、ＭＯＬＰ−８ＭＭ（ＡＣＣ５６９）、ＳＵ−ＤＨＬ６ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＡＣＣ５７２）、Ｌ５４０ヒトホジキンリンパ腫（ＡＣＣ７２）、ＫＧ−１ヒトＡＭＬ（ＡＣＣ１４）、ＭＯＬＰ−８ヒトＭＭ（ＡＣＣ５６９）、ＯＰＭ−２ヒトＭＭ（ＡＣＣ５０）、Ｌ−３６３ヒト形質細胞白血病（ＡＣＣ４９）細胞株は、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。
【０１８３】
【表４−１】
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【０１８４】
【表４−２】
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【０１８５】
ＡＴＣＣから購入したＲ１６１０ハムスター線維芽細胞（ＣＲＬ−１６５７）を、ヒトＣＸＣＲ４でトランスフェクトし、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を使用して選択した。ＤＳＭＺから購入したＪＪＮ−３細胞（ＡＣＣ５４１）をボルテゾミブに対する耐性についてＢＭＳで選択した。ダナ−ファーバー癌研究所で認可されたＮＫＬヒトＮＫ細胞大顆粒球白血病細胞株；ＫＨＹＧ−１ヒトＮＫ細胞白血病細胞株（ＪＣＲＢ０１５６）は、ヒューマンサイエンス振興財団のヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入した。
【０１８６】
ＢＭＳ−９３６５６４がＣＸＣＲ４＋細胞のアポトーシスを誘導する能力を、低分子ＣＸＣＲ４−アンタゴニスト、ＡＭＤ３１００のアポトーシス能力と比較した。アポトーシスは、Ｒａｍｏｓ細胞を１０μｇ／ｍＬのＢＭＳ−９３６５６４またはアイソタイプ対照抗体と共に３７℃で２４時間インキュベートすることによって調べた。比較のために、Ｒａｍｏｓ細胞は、ＣＸＣＬ１２誘導性カルシウム流および遊走を阻害した濃度に対応するＡＭＤ３１００  ６μＭと共にインキュベートした。細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。アネキシンＶのみに陽性またはアネキシンＶおよびＰＩの両方に２重陽性の細胞のパーセントを測定した。ＢＭＳ−９３６５６４は、未処置（１．７％および４．１％）、アイソタイプ対照抗体（０．５％および２．８％）でインキュベートした、またはＡＭＤ３１００で処置した（２．０％および２．７％）細胞と比較して、アネキシンＶ（３１．２％）およびアネキシンＶ／ＰＩ２重陽性染色（２７．３％）の増加を誘導した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１８７】
ＢＭＳ−９３６５６４に対するアポトーシス応答の特異性を確認するために、ＢＭＳ−９３６５６４に結合しない親Ｒ１６１０細胞（データは示さず）およびＢＭＳ−９３６５６４に結合するヒトＣＸＣＲ４でトランスフェクトしたＲ１６１０（図４）を使用して、アポトーシスを測定した。ＭＤＸ−１３３８（ＢＭＳ−９３６５６４）またはアイソタイプ対照をＲ１６１０細胞およびＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞に３７℃で２４時間添加し、次いでアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。アネキシンＶのみに陽性またはアネキシンＶおよびＰＩの両方に２重陽性の細胞のパーセントを測定した。トランスフェクトした細胞Ｒ１６１０−ｈＣＸＣＲ４は、ＢＭＳ−９３６５６４とのインキュベーションに応答してアネキシンＶ染色およびアネキシンＶ／ＰＩ染色のレベルの増加を示したが（２４．３％および１１．４％）、アイソタイプ対照抗体（２．５％および０．９％）または未処置の場合（２．６％および０．９％）は極めてわずかな効果しか及ぼさなかった（図１５Ａ）。親Ｒ１６１０細胞は、ＢＭＳ−９３６５６４処置後にアポトーシスを示さず（図１５Ｂ）、ｈＣＸＣＲ４の特異性が示唆された。これらの結果の後、ＢＭＳ−９３６５６４はいくつかのＣＸＣＲ４＋細胞株ならびに正常ＰＢＭＣに対してアポトーシスを誘導することが示された（表４）。
【０１８８】
ＢＭＳ−９３６５６４対アイソタイプ対照によって誘導された様々なＣＸＣＲ４＋細胞株のアポトーシスに関するデータを表５にまとめて示す。
【０１８９】
【表５】
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【０１９０】
表４および５にまとめて示したデータは、ＢＭＳ９３６５６４がアポトーシスを誘導し、したがって、事実上ＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞全てにおいて、効果的な治療薬であり得ることを示している。
【実施例１２】
【０１９１】
抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビボにおける腫瘍細胞増殖の阻害を示す追加的試験
この実施例では、抗ＣＸＣＲ４ヒト抗体がインビボにおいて確立された固形腫瘍の増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を、実施例９で前述したＲａｍｏｓモデルと類似の他の腫瘍細胞モデルを使用して調べた。様々な腫瘍細胞株を調べた。代表的な実験および結果は以下の通りである。
【０１９２】
一実験では、７．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞／マウスを各マウスの側腹部領域に移植し、移植後７日目には、腫瘍の長さ×幅×高さ／２によって計算した平均サイズ１００ｍｍ３まで増殖させた。マウスは、様々な処置群に無作為化し、移植後７日目に１回目の抗体投与を腹腔内（ＩＰ）注射し、移植後１４日目に２回目ＩＰ投与の抗体を投与し、次いで移植後４６日目に３回目を投与した。マウスの群（ｎ＝９）を（ｉ）ビヒクル（ＰＢＳ）；（ｉｉ）ＩｇＧ１アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｉｉ）ＩｇＧ４アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｖ）Ｆ７ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）または（ｖ）Ｆ７ＩｇＧ４（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置した。腫瘍容量を一定間隔で測定し、各処置群の腫瘍容量の平均および中央値をそれぞれの間隔で測定した。この実験の結果を以下の表６にまとめて示し、移植後５２日目の平均腫瘍容量（ｍｍ３）および％腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）および５９日目の腫瘍容量中央値（ｍｍ３）および％ＴＧＩを示している。さらに、Ｆ７ＩｇＧ４処置群のマウスの１匹は５９日目に腫瘍がなかった。結果は、Ｆ７ｍＡｂはインビボにおいてＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞の増殖を阻害できることを示している。
【０１９３】
第２の実験では、５×１０６ＤＭＳ７９ヒト小細胞肺がん細胞／マウスを各マウスの側腹部領域に移植し、移植後７日目には、腫瘍の長さ×幅×高さ／２によって計算した平均サイズ１６０ｍｍ３まで増殖させた。マウスを異なる処置群に無作為化し、Ｑ３Ｄ×５（３日毎に５回）の投与計画で、抗体を腹腔内（ＩＰ）注射した。マウスの群（ｎ＝１０）を（ｉ）ビヒクル（ＰＢＳ）；（ｉｉ）ＩｇＧ４アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）または（ｉｉｉ）Ｆ７ＩｇＧ４（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置した。腫瘍容量を一定間隔で測定し、各処置群に腫瘍容量の平均および中央値をそれぞれの間隔で測定した。この実験の結果を以下の表７にまとめて示し、移植後３４日目の腫瘍容量の平均および中央値（ｍｍ３）ならびに％腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示している。結果は、Ｆ７ｍＡｂはインビボにおいてＤＭＳ７９ヒト小細胞肺がん細胞の増殖を阻害できることを示している。
【０１９４】
【表６】
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【０１９５】
【表７】
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【０１９６】
抗ＣＸＣＲ４抗体が腫瘍増殖を阻害する能力について、前述したものおよび実施例９と類似の実験で、皮下異種移植腫瘍モデルをさらに試験した。ＳＵ−ＤＨＬ−６Ｂ細胞リンパ腫細胞を使用する実験において、結果は、１５ｍｇ／ｋｇのＦ７ＩｇＧ４ｍＡｂによる処置によって、約６０％の腫瘍増殖阻害が引き起こされることを示した。同様に、Ｎａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞を使用する実験において、結果は、３ｍｇ／ｋｇのＦ７ＩｇＧ４ｍＡｂによる処置によって、約７０％の腫瘍増殖阻害が引き起こされることを示した。対照的に、ＮＩＨ−Ｈ２２６肺がん細胞またはＨＰＡＣヒト膵腺がん細胞を使用する実験において、Ｆ７ｍＡｂによる腫瘍増殖阻害は認められなかった。しかし、フローサイトメトリー実験においてＦ７ｍＡｂによってこれらの細胞を染色することによって、インビトロにおける発現は最小限であることが示された。インビボにおいて腫瘍細胞は免疫組織化学でｍＡｂによって染色可能であるが、腫瘍増殖のどの段階でＣＸＣＲ４が発現し始めるのかは明らかではない。これによって、これらの２つの細胞株によるＣＸＣＲ４の発現では、抗ＣＸＣＲ４処置による腫瘍増殖阻害またはインビボにおけるアポトーシスの誘導を可能にするには不十分であることが示唆される。
【実施例１３】
【０１９７】
抗ＣＸＣＲ４抗体によるインビボにおける肺転移の阻害
この実施例では、Ｆ７抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂが肺転移を阻害する能力を、Ｃ５７マウス全身性腫瘍モデルを使用して調べた。より具体的には、０．４×１０６個のＢ１６−ＣＸＣＲ４細胞（ヒトＣＸＣＲ４を発現するためにトランスフェクトされたＢ１６細胞）をＣ５７種のマウス３０匹それぞれに静脈内注射した。マウスは、マウス各１０匹の３つの群に無作為化し、次に、（ｉ）ビヒクル（ＰＢＳ）；（ｉｉ）ＩｇＧ４アイソタイプ対照（５ｍｇ／ｋｇ）または（ｉｉｉ）Ｆ７ＩｇＧ４（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置した。抗体またはビヒクルは、Ｂ１６−ＣＸＣＲ４細胞を静脈内注射した３０分後に腹腔内注射した。１４日目に肺を採取し、肺転移小結節の数を計数した。結果は、以下の表８にまとめて示し、各群の肺転移の数の平均および中央値を示す。これらの結果は、Ｆ７ｍＡｂによる処置は、肺転移小結節の平均数の５６％の低下を引き起こすが、アイソタイプ対照抗体による低下はほんの１５％であったことを示し、Ｆ７ｍＡｂは、全身性腫瘍モデルにおいて、肺転移を阻害することができることを示唆する。
【０１９８】
【表８】
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【実施例１４】
【０１９９】
ＢＭＳ−９３６５６４は、インビボにおいて非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）モデルの腫瘍増殖を阻害する
腫瘍増殖阻害におけるＢＭＳ−９３６５６４および抗ＣＸＣＬ１２のインビボにおける活性は、腫瘍異種移植を有するＳＣＩＤマウスで試験した。ＳＣＩＤマウスに、１ｃｍ３シリンジおよび２５ゲージ半インチ針を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．１ｍＬおよびＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）０．１ｍＬに溶かしたＲａｍｏｓ細胞（ヒトＢリンパ芽球性バーキットリンパ腫細胞株）１０００万個を皮下移植した。腫瘍のサイズの平均および中央値が８０ｍｍ３に達したとき、マウスを腫瘍容量にしたがって無作為化した（ｎ＝８）。０日目および７日目に、各動物に約２００μＬのＢＭＳ−９３６５６４（１５ｍｇ／ｋｇ／投与）、抗ＣＸＣＬ１２（１５ｍｇ／ｋｇ／投与），ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ／投与）、リツキシマブ（１５ｍｇ／ｋｇ／投与）またはＰＢＳ（ビヒクル対照）を０．３ｍＬ  ＩＰで腹腔内（ＩＰ）注射した。用量応答試験によって既に、１５ｍｇ／ｋｇがリツキシマブの効果的な用量であることが見出されている（データは示さず）。抗体用量は全て十分に耐性があり、体重損失は認められなかった。腫瘍重量および体重は週２回測定した。腫瘍容量は、Ｆｏｗｌｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｌｉｐｅｒ（モデル６２３７９−５３１；Ｆｒｅｄ  Ｖ．Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）で三次元（Ｌ×Ｗ×Ｈ／２）で測定し、データはＳｔｕｄｙＬｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）製のＳｔｕｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒソフトウェアを使用して電気的に記録した。動物は、姿勢、毛づくろいおよび呼吸変化ならびに嗜眠を毎日検査した。腫瘍が２０００ｍｍ３の終点に達するか、または潰瘍が出現したとき、マウスを安楽死させた。
【０２００】
ＢＭＳ−９３６５６４および陽性対照、リツキシマブは、ビヒクルおよびアイソタイプ対照と比較したとき、腫瘍増殖を阻害した。ＢＭＳ−９３６５６４による処置は、２１日目に増殖阻害中央値９９％をもたらし、この阻害は６０日間維持された（図１６）。対照的に、抗ＣＸＣＬ１２は腫瘍増殖を阻害せず、アイソタイプ対照抗体と同程度の性能であった。
【実施例１５】
【０２０１】
ＢＭＳ−９３６５６４は、インビボ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）モデルの腫瘍増殖を阻害する
ＡＭＬにおける抗体の有効性を検討するために、２種類のシタラビン耐性マウス異種移植モデル、ＨＬ−６０およびＮｏｍｏ−１を使用した。各細胞株におけるＣＸＣＲ４発現は、ＦＡＣＳ染色によって確認した（図４Ａ）。ＳＣＩＤマウスは、実施例１４に記載されているように、ＨＬ−６０細胞１０００万個を皮下に移植した。腫瘍容量が約１３６ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為化し（ｎ＝１０）、０、３、７、１０および１４日目にＢＭＳ−９３６５６４（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）またはＰＢＳ（ビヒクル対照）をＩＰ投与し、４１日間モニターした。２７日目に、腫瘍増殖阻害中央値は、アイソタイプおよびビヒクル群と比較して、それぞれ８８％および８３％であった（図１７Ａ）。
【０２０２】
Ｎｏｍｏ−１モデルでは（実施例１４のように、細胞７５０万個を皮下移植した）。腫瘍容量が約８４ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為化し（ｎ＝９）、０、３、７、１０および１４日目にＢＭＳ−９３６５６４（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）、ＩｇＧ４アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）、ＰＢＳ（ビヒクル対照）またはシタラビン（２０、６０もしくは９０ｍｇ／ｋｇ／投与）を投与し、５７日間モニターした。３４日目に、ＢＭＳ−９３６５６４処置マウスの腫瘍増殖阻害中央値は、アイソタイプまたはビヒクル対照と比較して、８８％と著しく遅延した（図１７Ｂ）。予測通り、シタラビン（アラビノフラノシルシチジンまたはＡｒａ−Ｃとしても知られている）は、腫瘍増殖を阻害しなかった（図１７Ｂ）。
【実施例１６】
【０２０３】
ＢＭＳ−９３６５６４は、インビボ多発性骨髄腫（ＭＭ）モデルの腫瘍増殖を阻害する
様々なＣＸＣＲ４＋骨髄腫細胞、すなわちＭＯＬＰ８、ＪＪＮ−３Ｒ、ＪＪＮ−３、ＲＰＭＩ−８２２６、ＭＭ．１ＳおよびＯＰＭ−２は、ＳＣＩＤ異種移植腫瘍モデルにおいてＢＭＳ−９３６５６４に対する感受性を試験した。実験全てにおいて、０および７日目に、マウスの腹腔内にＩｇＧ４アイソタイプ対照およびＰＢＳビヒクル対照を注射した。ＭＯＬＰ−８細胞（２５０万個）を実施例１４に記載されている通りに、ＳＣＩＤマウスに移植した。腫瘍容量が約１００ｍｍ３に達したとき、マウスをマウス８匹の群に無作為化し（ｎ＝８）、０、３、７、１０および１４日目にＢＭＳ−９３６５６４（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）を単独で、またはレナリドミド（レブリミド（登録商標））５０ｍｇ／ｋｇと組み合わせて、またはボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））０．８ｍｇ／ｋｇと組み合わせて投与した。ＢＭＳ−９３６５６４は、２５日目（各コホートのマウス全てが試験中残存した最後の日）にアイソタイプ抗体対照と比較したとき、平均腫瘍増殖を６６％および５６％と著しく遅延させた（図１８Ａ）。ＭＯＬＰ８腫瘍は、レナリドミドおよびボルテゾミブに対して比較的耐性で、ＢＭＳ−９３６５６４の有効性は、いずれかの薬剤と一緒にしても向上しなかった（図１８Ａ）。４２日目の試験終了時に、ＢＭＳ−９３６５６４群では８匹中５匹のマウスが残存したが、アイソタイプ処置群ではマウスは残存しなかった。
【０２０４】
ボルテゾミブ耐性ＪＪＮ−３Ｒ細胞（５００万個）を前述した通りにＳＣＩＤマウスに移植した。腫瘍容量が約１００ｍｍ３のとき、マウスを無作為化し（ｎ＝８）、０、４、７、１１および１４日目にＢＭＳ−９３６５６４（１０もしくは３０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰ投与）またはレナリドミド（５０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰ投与）またはボルテゾミブ（０．８ｍｇ／ｋｇ／ＩＶ投与）を投与し、２５日間モニターした。経時的な腫瘍増殖中央値を図１８Ｂに示す。レナリドミドもボルテゾミブも単独では腫瘍増殖を阻害しなかったが、２５日目のＢＭＳ−９３６５６４で処置したマウスの腫瘍増殖阻害中央値は、アイソタイプ対照で処置したマウスと比較して１００％であった。試験終了時に、ＢＭＳ−９３６５６４  ３０ｍｇ／ｋｇ群では、７匹中４匹のマウスには腫瘍がなかった。
【０２０５】
親ＪＪＮ−３細胞を使用すると、ボルテゾミブおよびレナリドミドはいずれも、腫瘍阻害効果を実質上全く示さなかった。５００万個のＪＪＮ−３細胞／マウスをＳＣＩＤマウスに移植し、腫瘍容量が約７７ｍｍ３に達したときマウスを８つの群に無作為化した。０、３、７、１０および１４日目に、マウスにＭＤＸ−１３３８（１０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰ投与）を単独で、またはボルテゾミブ（０．８ｍｇ／ｋｇ／ＩＶ投与）もしくはレナリドミド（５０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰ投与）と組み合わせて投与した。ＭＤＸ−１３３８は、ビヒクル対照で処置したマウスと比較して、２５日目に腫瘍増殖を５２％阻害した（図１８Ｃ）。ボルテゾミブは、このＪＪＮ−３細胞モデルにおける腫瘍増殖の阻害でわずかな効果を示したが、ＭＤＸ−１３３８と組み合わせると、ビヒクル対照と比較してＭＤＸ−１３３８誘導性阻害のレベルは２５日目に５８％へとわずかに増加した（図１８Ｃ）。レナリドミドは腫瘍増殖の阻害に効果が無く、レナリドミドとＭＤＸ−１３３８の組合せは同様に効果が無く、ＭＤＸ−１３３８単独より低い阻害を示した（図１８Ｄ）。
【０２０６】
ＲＰＭＩ−８２２６細胞（１０００万個）を、実施例１４に記載されている通りにＳＣＩＤマウスに移植した。腫瘍容量が約２０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為化し（ｎ＝８）、０、３、７、１０および１４日目にＭＤＸ−１３３８（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）を単独で、またはレナリドミド５０ｍｇ／ｋｇと組み合わせて、またはボルテゾミブ０．８ｍｇ／ｋｇと組み合わせて投与した。ＭＤＸ−１３３８は、４４日目にビヒクル対照と比較したとき、平均腫瘍増殖を５３％と著しく遅延させた（図１８Ｅ）。レナリドミド単独は、このＲＰＭＩ−８２２６モデルにおけるわずかな効果を示したが、ＭＤＸ−１３３８の効果を増強した、すなわち、ＭＤＸ−１３３８  １０ｍｇ／ｋｇと組み合わせたレナリドミド５０ｍｇ／ｋｇで認められる腫瘍増殖阻害は、４４日目にアイソタイプ対照と比較して７９％であった（図１８Ｅ）。ボルテゾミブは、４４日目の平均腫瘍増殖をアイソタイプ対照と比較して７０％阻害するのに良好な効果を示し（図１８Ｆ）、ＭＤＸ−１３３８の効果をわずかに増強し、４４日目の平均腫瘍増殖阻害をアイソタイプ対照と比較して６１％から８２％に増加させた（図１８Ｆ）。
【０２０７】
ＭＭ．１Ｓ細胞（１０００万個）をＳＣＩＤマウスに移植し、腫瘍容量が約３０ｍｍ３に達したときに無作為化し（ｎ＝８）、０、４、７、１１および１４日目にＭＤＸ−１３３８（１０ｍｇ／ｋｇ／投与）を単独で、またはレナリドミド１００ｍｇ／ｋｇと組み合わせて投与した。ＭＤＸ−１３３８は、２５日目にアイソタイプ対照と比較したとき、平均腫瘍増殖を６０％と著しく遅延させた（図２１）。レナリドミド単独ではさらに効果的で、２５日目に平均腫瘍増殖を７０％遅延させ、ＭＤＸ−１３３８とレナリドミドの組合せは、２５日目に平均腫瘍増殖を８６％阻害した（図１８Ｇ）。
【０２０８】
【表９】
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【０２０９】
ＯＰＭ−２細胞（１０００万個）を、前述の通りＳＣＩＤマウスに移植した。腫瘍容量が約７７ｍｍ３のとき、マウスを無作為化し（ｎ＝８）、０、４、７、１１および１４日目に、ＭＤＸ−１３３８（１０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰ投与）を単独で、またはボルテゾミブ（０．８ｍｇ／ｋｇ／ＩＶ投与）もしくはレナリドミド（５０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰ投与）と組み合わせて投与した。ＭＤＸ−１３３８は、ビヒクル対照で処置したマウスと比較して、２４日目に腫瘍増殖中央値を４５％阻害した（図１８Ｈ）。ボルテゾミブは、２４日目に腫瘍増殖を７５％阻害し、ＭＤＸ−１３３８とボルテゾミブの組合せは有効性が高く、２４日目に腫瘍増殖中央値を９９％阻害した（図１８Ｈ）。レナリドミドはこのＯＰＭ−２モデルにおける最小限の有効性を示し、ＭＤＸ−１３３８の有効性をあまり増強しなかった（図１８Ｉ）。
【０２１０】
これらのＭＭ細胞異種移植で得られた腫瘍増殖阻害結果は、ＣＸＣＲ４発現およびＭＤＸ−１３３８によって誘導されたアポトーシスに対する感受性と一緒に表９にまとめて示す。
【０２１１】
実施例１４〜１６は、確立された腫瘍に単独療法として投与すると、ＢＭＳ−９３６５６４は複数のＮＨＬ、ＡＭＬおよびＭＭ異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示すことを示唆している。ＢＭＳ−９３６５６４はＩｇＧ４抗体なので、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を惹起しない。実施例１１で示したデータは、ＢＭＳ−９３６５６４が腫瘍増殖阻害の１機構としてアポトーシスを誘導することを示唆している。
【０２１２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１８−９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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