(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、独特のCDR3アミノ酸配列に関し、更に前記配列を含む抗体に関する。更に、インフルエンザ感染の治療又は予防において使用する前記抗体の治療的応用と、インフルエンザウイルスの検出において使用する前記抗体の診断的応用と、インフルエンザウイルスワクチンの有効性試験と、ユニバーサルインフルエンザワクチンを設計する際に使用する前記抗体のスクリーニングへの応用とを提供する。【選択図】図1a
2014527065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列を含む抗体であって、前記アミノ酸配列は、NからCの方向に、以下の構造ドメインを含み:
N - FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - C
FRは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、CDRは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記CDR3は、アルパカCDR3 VHHドメインアミノ酸配列を含み、かつ、
H1N1インフルエンザウイルスに結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、H1及びH5インフルエンザウイルスサブタイプに対して抗原交差反応性を示す、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、H2及びH9インフルエンザウイルスサブタイプに対して抗原交差反応性を示す、請求項1又は請求項2記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、H2、H5、H6、H9、H11、H13、H16、H8、及びH12インフルエンザウイルスサブタイプの1つ又は全部に対して抗原交差反応性を示す、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項５】
前記CDR3は、配列番号1乃至19からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号1乃至19の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項６】
前記CDR3は、配列番号20乃至38からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号20乃至38の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項７】
前記CDR2は、配列番号39乃至57からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号39乃至57の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項８】
前記CDR2は、配列番号58乃至76からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号58乃至76の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項９】
前記CDR1は、配列番号77乃至95からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号77乃至95の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記CDR1は、配列番号96乃至114からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号96乃至114の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体は、配列番号115乃至133からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1乃至10の何れかに記載の抗体。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列は、請求項5又は請求項6に定めたCDR3アミノ酸配列を含む、請求項11記載の抗体。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列は、請求項7又は請求項8に定めたCDR2アミノ酸配列及び/又は請求項9又は請求項10に定めたCDR1アミノ酸配列を含む、請求項11又は請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体は、単一ドメイン抗体又はタンパク質足場抗体からなるか、或いはこれを含む、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、請求項1乃至13の何れかに定めた2個又は3個又は4個以上のVHHドメインを含むか、或いはこれらからなり、前記2個又は3個又は4個以上のVHHドメインは同一であるか或いは異なり、
好ましくは、前記2個又は3個又は4個以上のVHHドメインは異なり、前記異なるドメインは、異なるインフルエンザウイルスのタイプ又はサブタイプを結合及び/又は中和する、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、ヒト化抗体からなるか、或いはこれを含む、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、請求項5又は請求項6に定めたCDR3アミノ酸配列を含む、請求項16記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体は、請求項7又は請求項8に定めたCDR2アミノ酸配列及び/又は請求項9又は請求項10に定めたCDR1アミノ酸配列を含む、請求項16又は請求項17記載の抗体。
【請求項１９】
FR1、FR2、FR3、及びFR4から選択されるFRアミノ酸配列の1つ以上は、非ヒトアミノ酸配列であり、1つ以上のアミノ酸改変(例えば、置換、欠失、又は挿入)を含み、
前記アミノ酸改変は、前記非ヒトアミノ酸配列を、対応するヒト抗体アミノ酸配列にアライメントすることにより選択され、前記改変は、前記抗体の非ヒトアミノ酸配列上に存在する同じアミノ酸位置とは異なる、ヒト抗体アミノ酸配列上に存在する特定のアミノ酸位置に存在する(又は存在しない)アミノ酸残基を構成する、請求項16乃至18の何れかに記載の抗体。
【請求項２０】
多くとも20個、又は多くとも15個、又は多くとも10個、又は多くとも5個のアミノ酸改変を含む、請求項19記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体は、1つ以上のヒトCDR3 VHHアミノ酸配列が欠如しており、その代わりに、請求項5又は請求項6に定めた1つ以上のCDR3 VHHアミノ酸配列からなるか、或いはそれらを含むヒト抗体である、請求項1乃至15の何れかに記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体は、1つ以上のヒトVHHアミノ酸配列が欠如しており、その代わりに、請求項1乃至13に定めた1つ以上のVHHアミノ酸配列からなるか、或いはそれらを含む、請求項21記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体は、H1(例えば、H1N1)インフルエンザウイルス、例えば、A/California/06/09及び/又はA/California/7/2009及び/又はA/Brisbane/59/2007株に対して中和活性を示す、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体は、H5(例えば、H5N1又はH5N3)インフルエンザウイルス、例えば、A/Vietnam/1203/2004及び/又はA/Vietnam/1194/04及び/又はA/Vietnam/119/2004及び/又はHongKong/213/2003及び/又はA/turkey/Turkey/1/2005及び/又はA/Indonesia/05/2005及び/又はA/Duck/Singapore-Q/119-3/97株に対して中和活性を示す、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体は、H2インフルエンザウイルス(例えば、H2N2又はH2N3)、例えば、A/Japan/305/1957及び/又はA/Mallard/Eng/727/06株に対して中和活性を示す、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体は、H9インフルエンザウイルス(例えば、H9N2)、例えば、A/HongKong/1073/99株に対して中和活性を示す、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体は、H1、H2、H5、H6、H11、H13、H16、H9、H8、及び/又はH12インフルエンザウイルスからなる群から選択されるグループIヘマグルチニンインフルエンザウイルスの1つ以上又は全てに対して中和活性を示す、何れかの先行請求項に記載の1つ以上の抗体。
【請求項２８】
インフルエンザウイルス感染の予防又は治療において使用するための、何れかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項２９】
a.H1及びH5サブタイプ、又は
b.H1及びH5及びH2及びH9サブタイプ、又は
c.H1及びH5及びH6及びH11及びH13及びH16及びH8及びH12サブタイプ、又は
d.グループIヘマグルチニンインフルエンザウイルスサブタイプ、から選択されるインフルエンザウイルスサブタイプの存在を検出する試薬、或いは、
a.H3及びH7サブタイプ
b.グループIIヘマグルチニンインフルエンザウイルスサブタイプ、から選択されるインフルエンザウイルスサブタイプの不在を確認する試薬、
として使用するための請求項1乃至27の何れかに記載の1つ以上の抗体。
【請求項３０】
インフルエンザウイルスワクチンの有効性を評価するためのアッセイにおいて試薬として使用される、請求項1乃至27の何れかに記載の1つ以上の抗体。
【請求項３１】
インフルエンザウイルスの異なるタイプ及び/又はサブタイプに対するインフルエンザウイルスワクチンの交差反応性を評価するためのアッセイにおいて試薬として使用される、請求項1乃至27の何れかに記載の1つ以上の抗体。
【請求項３２】
試料中に存在するヘマグルチニンの量を濃縮及び/又は定量するために試薬として使用される、請求項1乃至27の何れかに記載の1つ以上の抗体。
【請求項３３】
抗イディオタイプヘマグルチニン抗体を単離するために試薬として使用される、請求項1乃至27の何れかに記載の1つ以上の抗体。
【請求項３４】
ユニバーサルインフルエンザワクチンを設計するために試薬として使用される、請求項1乃至27の何れかに記載の1つ以上の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体組成物に関し、更にインフルエンザ感染の予防又は治療のためのその使用に関する。本発明は、更に、ワクチン有効性アッセイにおいてインフルエンザワクチンの交差反応性及びヘマグルチニン抗原含量を評価するための前記抗体組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高病原性インフルエンザウイルス株の出現は、公衆衛生にとって世界規模での深刻な脅威となっている。感染制御の中心となるのはワクチンであるが、新たなウイルス株の出現と臨床的に承認されたワクチンとの間のギャップは、特にオセルタミビルTM及びザナミビルTMのような既存の抗ウイルス薬に対する耐性が増加するにつれ、深刻な問題となっている。
【０００３】
現在の一手法は、回復期患者からの血清による受動免疫療法である。しかしながら、この手法には、極めて高いコスト、毒性のリスクの高さ、不確かな用量、及び投与の難しさ等、人口全体での実施には大きな制限がある。
【０００４】
別の手法は、新たなパンデミックの脅威が出現した際の即時配備用に組換えモノクローナル抗体を備蓄することである。一例として、最近の報告では、1918年のインフルエンザパンデミックの生存者(Kashyap et al., 2008)、季節性ワクチン接種個体(Ekiert et al., 2009)、及びナイーブヒト抗体ライブラリ(Sui et al., 2009)からの機能的ヒト抗体の分離が記載されている。しかしながら、従来のモノクローナル抗体は、一般に、成功した薬物のクラスと考えられているが、高いコスト及び複雑性が大きな制限となる。更に、インフルエンザウイルスの疫学的な変化の早さを考えると、こうしたモノクローナル抗体のアプローチでは、異なるウイルスサブタイプに渡って反応性を示すモノクローナル抗体を提供することが必要となる。この問題は、現在、モノクローナル抗体技術にとって大きな課題となっている。
【０００５】
パンデミックインフルエンザは、新たなウイルスが出現し、既存の免疫を殆ど又は全く有しない世界全体の人口集団に感染する際に発生する。最近のH1N1の2009年の大流行は、 経済的に大きな負担とはなったが、世界全体で推定5千万人が死亡した1918年の「スペイン風邪」の大流行のような過去の大流行と同様の死亡率にはつながらなかった。高病原性鳥H5N1インフルエンザウイルスは、感染したヒトにおいて60％の死亡率を示しており、パンデミックインフルエンザがもたらすリスクを浮き彫りにしている。
【０００６】
現在の治療の選択肢は、2つのカテゴリ、即ち、抗ウイルス薬とワクチンとの何れかに含まれる。現在の抗ウイルス薬が標的としているのは、ウイルスノイラミニダーゼ(例えば、オセルタミビルTM)又はM2イオンチャネル(ザナミビルTM)であり、何れも耐性の増加のため、やがて効果が無くなる恐れがある。ワクチンは、感染制御の基礎であるが、新たなウイルス株の出現時にワクチンを開発するために多くの時間を要する点、作用が迅速ではない点、全ての人口集団で効果がある訳ではない点(例えば、免疫不全患者)、予防が主に株特異性である点、更に世界全体での生産能力が限定されている点において、制限を有する。したがって、更なる治療の選択肢が必要なことは明らかである。
【０００７】
当該技術分野における他の問題は、季節性及びパンデミックインフルエンザワクチンの標準化及び管理の必要性である。現在、一元放射免疫拡散法(single radial immunodiffusion assay, SRD)は、インフルエンザワクチン中のHA抗体の含有量を判定する上で「至適基準」となる試験と見做されている。このアッセイには、新たなウイルス株毎に基準抗血清の作成が必要となり、これによりワクチン開発パイプラインには、一般に2乃至3ヶ月が追加される場合がある。必然的に、この遅延を取り除くことは、パンデミックによる緊急事態への迅速な対応を開始する上で極めて有益となる。そのため、SRDアッセイ、或いは、例えばELISA、表面プラズモン共鳴(SPR)、又は質量分析に基づく他の関連アッセイ形式において使用し得る交差反応性抗体を含む「ユニバーサル抗体」試薬が必要である。
【０００８】
したがって、強固なインフルエンザウイルス検出アッセイ、及び/又はインフルエンザウイルス抗原に基づくワクチン有効性アッセイのために、他のインフルエンザウイルス治療の選択肢が緊急に必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jones P.T. et al. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse; Nature, 321 (6069): pp. 522-525
【非特許文献２】Vincke et al, 2008, J. Biol. Chem., 284(5), pp. 3273-3284
【非特許文献３】Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991
【非特許文献４】Chothia, C. et al, J. MoI. Biol. 196:901-917, 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、本明細書に記載の抗体を提供することにより、上述した問題の1つ以上に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の抗体の主な特徴は、アルパカVHH単一ドメイン抗体からの相補性決定領域(CDR)、例えばCDR3アミノ酸配列を有することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】pNIBS-1の図である。
【図１ｂ】pNIBS-1の図である。
【図２】選択ストラテジーの図である。
【図３−１】96ウェルELISA形式における未精製可用性VHH抗体を用いた一次ELISAスクリーニングの例である(その1)。
【図３−２】96ウェルELISA形式における未精製可用性VHH抗体を用いた一次ELISAスクリーニングの例である(その2)。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一実施形態において、本発明は、ラクダ科単一ドメイン (例えば、アルパカ単一ドメイン抗体)を含むか、或いは、これにより構成され、前記抗体は、非常に単純且つ強固なタンパク質足場を有し、従来のモノクローナル抗体と比較して、(i)サイズ(単一ドメイン抗体は、モノクローナル抗体の約1/10のサイズである。結果として、前記抗体は、通常はヒト免疫系に対してサイレントである、埋め込まれた又は隠れたエピトープにアクセスする能力を有する(例えば、ヘマグルチニンのストーク領域に埋め込まれた保全性の高いエピトープにアクセスする))、(ii)従来のモノクローナル抗体より著しく低いコストでの生産、(iii)二重又は多重特異性抗体へ操作するための簡易な方法、(iv)抗原表面のクレフト及び溝への高度なアクセスを促進する、従来の抗体より長いCDR3ループ、及び/又は(v)高い構造安定性等、幾つかの利点を示す。
【００１４】
一実施形態において、本発明の抗体は、H1インフルエンザウイルス(例えば、H1N1インフルエンザウイルス)、例えば、パンデミックH1(例えば、H1N1)インフルエンザウイルスと結合する。一実施形態において、抗体は、A/California/06/09、及び/又はA/California/07/2009、及び/又はA/Brisbane/59/2007株と結合する。
【００１５】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号1乃至19からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含むCDR3を有し、前記変異アミノ酸配列は、配列番号1乃至19の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。この点において、配列番号1乃至19は、従来のKabatの命名法により定められる。
【００１６】
他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号20乃至38からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含むCDR3を有し、前記変異アミノ酸配列は、配列番号20乃至38の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。この点において、配列番号20乃至38は、従来の免疫グロブリン又は抗体に対する国際ImMunoGeneTics情報システム(IMGT)の命名法により定められる。
【００１７】
本発明の抗体は、更にCDR2を含んでもよく、前記CDR2は、配列番号39乃至57からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号39乃至57の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。この点において、配列番号39乃至57は、従来のKabatの命名法により定められる。或いは、前記CDR2は、配列番号58乃至76からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号58乃至76の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。この点において、配列番号58乃至78は、従来のIMGTの命名法により定められる。
【００１８】
単なる例示として、本発明の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、上記に定めたCDR3とCDR2の組み合わせを含み得る:
1と39又は58、20と39又は58、
2と40又は59、21と40又は59、
3と41又は60、22と41又は60、
4と42又は61、23と42又は61、
5と43又は62、24と43又は62、
6と44又は63、25と44又は63、
7と45又は64、26と45又は64、
8と46又は65、27と46又は65、
9と47又は66、28と47又は66、
10と48又は67、29と48又は67、
11と49又は68、30と49又は68、
12と50又は69、31と50又は69、
13と51又は70、32と51又は70、
14と52又は71、33と52又は71、
15と53又は72、34と53又は72、
16と54又は73、35と54又は73、
17と55又は74、36と55又は74、
18と56又は75、37と56又は75、
19と57又は76、38と57又は76。
【００１９】
上述したCDR3の特徴に加え(更に随意で、上述したCDR2の特徴に加え)、本発明の抗体は、更にCDR1を含んでもよく、前記CDR1は、配列番号77乃至95からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号77乃至95の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。この点において、配列番号77乃至95は、従来のKabatの命名法により定められる。或いは、前記CDR1は、配列番号96乃至114からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号96乃至114の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。この点において、配列番号96乃至114は、従来のIMGTの命名法により定められる。
【００２０】
単なる例示として、本発明の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、上記に定めたCDR3とCDR1の組み合わせを含み得る:
1と77又は96、20と77又は96、
2と78又は97、21と78又は97、
3と79又は98、22と79又は98、
4と80又は99、23と80又は99、
5と81又は100、24と81又は100、
6と82又は101、25と82又は101、
7と83又は102、26と83又は102、
8と84又は103、27と84又は103、
9と85又は104、28と85又は104、
10と86又は105、29と86又は105、
11と87又は106、30と87又は106、
12と88又は107、31と88又は107、
13と89又は108、32と89又は108、
14と90又は109、33と90又は109、
15と91又は110、34と91又は110、
16と92又は111、35と92又は111、
17と93又は112、36と93又は112、
18と94又は113、37と94又は113、
19と95又は114、38と95又は114。
【００２１】
更に、単なる例示として、本発明の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、上記に定めたCDR3とCDR2とCDR1との組み合わせを含み得る:
1と39と77、20と58と96、
2と40と78、21と59と97、
3と41と79、22と60と98、
4と42と80、23と61と99、
5と43と81、24と62と100、
6と44と82、25と63と101、
7と45と83、26と64と102、
8と46と84、27と65と103、
9と47と85、28と66と104、
10と48と86、29と67と105、
11と49と87、30と68と106、
12と50と88、31と69と107、
13と51と89、32と70と108、
14と52と90、33と71と109、
15と53と91、34と72と110、
16と54と92、35と73と111、
17と55と93、36と74と112、
18と56と94、37と75と113、
19と57と95、38と76と114。
【００２２】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号115乃至133からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。関連する実施形態において、前記抗体は、上記に定めた正確なCDR3アミノ酸配列を保持し、更に随意で、上記に定めた正確なCDR1アミノ酸配列及び/又は正確なCDR2アミノ酸配列を保持する。
【００２３】
関連する第2の態様において、本発明の抗体は、H1インフルエンザウイルス(上述したもの)だけでなく、H5インフルエンザウイルス(例えば、H5N1又はH5N3)、例えば、パンデミックH5インフルエンザウイルスと結合する。一実施形態において、抗体は、A/Vietnam/1203/2004、及び/又はA/Vietnam/1194/2004、及び/又はA/Vietnam/119/2004、及び/又はA/HongKong/213/2003、及び/又はA/turkey/Turkey/1/2005、及び/又はA/Indonesia/05/2005、及び/又はA/Duck/Singapore-Q/119-3/97株と結合する。この態様の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号3乃至4、6乃至7、10、13、又は15からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含むCDR3を有し、前記変異アミノ酸配列は、配列番号3乃至4、6乃至7、10、13、又は15の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR3は、配列番号22乃至23、25乃至26、29、32、又は34からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号22乃至23、25乃至26、29、32、又は34の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００２４】
第2の態様の抗体は、更にCDR2を含んでもよく、前記CDR2は、配列番号41乃至42、44乃至45、48、51、又は53からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号41乃至42、44乃至45、48、51、又は53の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR2は、配列番号60乃至61、63乃至64、67、70、又は72からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号60乃至61、63乃至64、67、70、又は72の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００２５】
単なる例示として、第2の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第2の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2の組み合わせを含み得る:
3と41又は60、22と41又は60、
4と42又は61、23と42又は61、
6と44又は63、25と44又は63、
7と45又は64、26と45又は64、
10と48又は67、29と48又は67、
13と51又は70、32と51又は70、
15と53又は72、34と53又は72。
【００２６】
第2の態様の抗体は、上述したCDR3の特徴に加え(更に随意で、上述したCDR2の特徴に加え)、更にCDR1を含んでもよく、前記CDR1は、配列番号79乃至80、82乃至83、86、89、又は91からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号79乃至80、82乃至83、86、89、又は91の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR1は、配列番号98乃至99、101乃至102、105、108、又は110からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号98乃至99、101乃至102、105、108、又は110の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００２７】
単なる例示として、第2の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第2の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR1の組み合わせを含み得る:
3と79又は98、22と79又は98、
4と80又は99、23と80又は99、
6と82又は101、25と82又は101、
7と83又は102、26と83又は102、
10と86又は105、29と86又は105、
13と89又は108、32と89又は108、
15と91又は110、34と91又は110。
【００２８】
更に、単なる例示として、第2の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第2の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2とCDR1との組み合わせを含み得る:
3と41と79、22と60と98、
4と42と80、23と61と99、
6と44と82、25と63と101、
7と45と83、26と64と102、
10と48と86、29と67と105、
13と51と89、32と70と108、
15と53と91、34と72と110。
【００２９】
第2の態様の抗体は、配列番号117乃至118、120乃至121、124、127、又は129からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。関連する実施形態において、前記抗体は、上記に定めた正確なCDR3アミノ酸配列を保持し、更に随意で、上記に定めた正確なCDR1アミノ酸配列及び/又は正確なCDR2アミノ酸配列を保持する。
【００３０】
関連する第3の態様において、本発明の抗体は、H1インフルエンザウイルス及びH5インフルエンザウイルス(上述したもの)だけでなく、1)H2インフルエンザウイルス(例えば、H2N2又はH2N3)、 例としてパンデミックH2インフルエンザウイルス(例えば、H2N2又はH2N3)と、2)H9インフルエンザウイルス(例えば、H9N2)、例としてパンデミックH9インフルエンザウイルス(例えば、H9N2)と結合する。例えば、抗体は、H2インフルエンザウイルス株A/Japan/305/1957、及び/又はA/Mallard/Eng/727/06と結合する。例えば、抗体は、H9インフルエンザウイルス株A/HongKong/1073/99と結合する。この態様の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号3、4、7又は10からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含むCDR3を有し、前記変異アミノ酸配列は、配列番号3、4、7又は10の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR3は、配列番号22、23、26、又は29からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号22、23、26、又は29の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００３１】
第3の態様の抗体は、更にCDR2を含んでもよく、前記CDR2は、配列番号41、42、45、又は48からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号41、42、45、又は48の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR2は、配列番号60、61、64、又は67からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号60、61、64、又は67の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００３２】
単なる例示として、第3の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第3の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2の組み合わせを含み得る:
3と41又は60、22と41又は60、
4と42又は61、23と42又は61、
7と45又は64、26と45又は64、
10と48又は67、29と48又は67。
【００３３】
第3の態様の抗体は、上述したCDR3の特徴に加え(更に随意で、上述したCDR2の特徴に加え)、更にCDR1を含んでもよく、前記CDR1は、配列番号79、80、83、又は86からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号79、80、83、又は86の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR1は、配列番号98、99、102、又は105からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号98、99、102、又は105の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００３４】
単なる例示として、第3の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第3の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR1の組み合わせを含み得る:
3と79又は98、22と79又は98、
4と80又は99、23と80又は99、
7と83又は102、26と83又は102、
10と86又は105、29と86又は105。
【００３５】
更に、単なる例示として、第3の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第3の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2とCDR1との組み合わせを含み得る:
3と41と79、22と60と98、
4と42と80、23と61と99、
7と45と83、26と64と102、
10と48と86、29と67と105、
15と53と91、34と72と110。
【００３６】
第3の態様の抗体は、配列番号117、118、121、又は124からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。関連する実施形態において、前記抗体は、上記に定めた正確なCDR3アミノ酸配列を保持し、更に随意で、上記に定めた正確なCDR1アミノ酸配列及び/又は正確なCDR2アミノ酸配列を保持する。
【００３７】
関連する第4の態様において、本発明の抗体は、H1インフルエンザウイルス及びH5インフルエンザウイルス(上述したもの)だけでなく、H2インフルエンザウイルス(例えば、H2N2又はH2N3)、例えば、パンデミックH2インフルエンザウイルス(例えば、H2N2又はH2N3)と結合する。特定のH2インフルエンザウイルスの例として、抗体は、A/Japan/305/1957、及び/又はA/Mallard/Eng/727/06株と結合する。この態様の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号6又は15からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含むCDR3を有し、前記変異アミノ酸配列は、配列番号6又は15の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR3は、配列番号25又は34からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号25又は34の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００３８】
第4の態様の抗体は、更にCDR2を含んでもよく、前記CDR2は、配列番号44又は53からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号44又は53の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR2は、配列番号63又は72からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号63又は72の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００３９】
単なる例示として、第4の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第4の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2の組み合わせを含み得る:
6と44又は63、25と44又は63、
15と53又は61、34と53又は61。
【００４０】
第4の態様の抗体は、上述したCDR3の特徴に加え(更に随意で、上述したCDR2の特徴に加え)、更にCDR1を含んでもよく、前記CDR1は、配列番号82又は91からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号62又は91の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR1は、配列番号101又は110からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号101又は110の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００４１】
単なる例示として、第4の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第4の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR1の組み合わせを含み得る:
6と82又は101、25と82又は101、
15と91又は110、34と91又は110。
【００４２】
更に、単なる例示として、第4の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第4の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2とCDR1との組み合わせを含み得る:
6と44と82、25と63と101、
15と53と91、34と72と110。
【００４３】
第4の態様の抗体は、配列番号120又は129からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。関連する実施形態において、前記抗体は、上記に定めた正確なCDR3アミノ酸配列を保持し、更に随意で、上記に定めた正確なCDR1アミノ酸配列及び/又は正確なCDR2アミノ酸配列を保持する。
【００４４】
関連する第5の態様において、本発明の抗体は、H1インフルエンザウイルス及びH5インフルエンザウイルス(上述したもの)だけでなく、H9インフルエンザウイルス(例えば、H9N2)、例えば、パンデミックH9インフルエンザウイルス(例えば、H9N2)と結合する。特定のH2インフルエンザウイルスの例として、抗体は、A/HongKong/1073/99株と結合する。この態様の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含むCDR3を有し、前記変異アミノ酸配列は、配列番号13の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。或いは、前記CDR3は、配列番号32からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号32の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００４５】
第5の態様の抗体は、更にCDR2を含んでもよく、前記CDR2は、配列番号51又は70からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号51又は70の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００４６】
単なる例示として、第5の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第5の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2の組み合わせを含み得る:13と51又は70、32と51又は70。
【００４７】
第5の態様の抗体は、上述したCDR3の特徴に加え(更に随意で、上述したCDR2の特徴に加え)、更にCDR1を含んでもよく、前記CDR1は、配列番号89又は108からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその変異アミノ酸配列を含み、前記変異アミノ酸配列は、配列番号89又は108の対応するアミノ酸配列と比較して、最大で1又は2個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する。
【００４８】
単なる例示として、第5の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第5の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR1の組み合わせを含み得る:13と89又は108、32と89又は108。
【００４９】
更に、単なる例示として、第5の態様の抗体は、次の配列番号の組み合わせに基づいて、第5の態様に対して上記に定めたCDR3とCDR2とCDR1との組み合わせを含み得る:13と51と89、32と70と108。
【００５０】
第5の態様の抗体は、配列番号127からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。関連する実施形態において、前記抗体は、上記に定めた正確なCDR3アミノ酸配列を保持し、更に随意で、上記に定めた正確なCDR1アミノ酸配列及び/又は正確なCDR2アミノ酸配列を保持する。
【００５１】
一実施形態において、本発明の抗体は、全てのグループIヘマグルチニンインフルエンザウイルス(例えば、H1、H2、H5、H6、H11、H13、H16、H9、H8、及び/又はH12インフルエンザウイルス)と結合し、好ましくは中和する。一実施形態において、本発明の抗体は、A/California/07/09(H1N1)及び/又はA/Vietnam/1194/04(H5N1)と結合し、好ましくは中和する。
【００５２】
一実施形態において、抗体は、ヒト化し得る。従来のヒト化手法の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とした、Jones P.T. et al. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse; Nature, 321 (6069): pp. 522-525に記載されている。一実施形態において、本発明のCDR3のVHHアミノ酸配列は、ヒト抗体上に存在する対応するCDR3のVHHアミノ酸配列に挿入(例えば、置換)し得る。或いは、本発明の抗体のVHHアミノ酸配列全体は、対応するヒト抗体と配列アライメントを行い、アミノ酸の違いをマッピングし得る。前記マッピング後、本発明の抗体配列上で特定された、存在するアミノ酸の違いは、対応するヒト配列を模倣するために改変し得る。これに関して、CDR領域は、改変されないことが好ましい。例えば、随意により「ホールマーク」残基(出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたVincke et al, 2008, J. Biol. Chem., 284(5), pp. 3273-3284)として扱われる、本発明の抗体のFR領域において特定された違いは、対応するヒト配列を模倣するために改変し得る。単なる例示の目的で、ヒト化プロトコルの1つを、実施例10として説明する。
【００５３】
純粋に例示の目的で、本発明のヒト化抗体は、ヒトVH抗体、例えば、VH3生殖細胞系遺伝子DP51又はDP53によりコードされたもの等のヒトVH3抗体に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００５４】
一実施形態において、本発明の(随意でヒト化された)抗体は、単一ドメイン抗体からなるか、或いはこれを含む。
【００５５】
他の実施形態において、本発明の(随意でヒト化された)抗体は、上記に定めた2つ以上の単一ドメインを含み得る。前記単一ドメインは、同じものであっても異なっていてもよい。第1及び第2の(又は更に多くの)異なる単一ドメインを利用する際には、第1の単一ドメインは、通常、第2の単一ドメインのものとは異なる結合親和性、結合活性、及び/又は特異性を有する。
【００５６】
一実施形態において、本発明の(随意でヒト化された)抗体は、二重特異性又は多重特異性抗体からなるか、或いはこれを含む。
【００５７】
本発明の他の態様によれば、インフルエンザウイルス感染の予防又は治療において使用するための、上記に定めた抗体が提供される。関連する態様において、本発明は、上記に定めた抗体の予防有効量又は治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。こうした態様は、上記に定めた前記抗体を2つ以上使用することを含む。
【００５８】
上述した「受動免疫療法」の態様から恩恵を受ける一般的な患者には、新たなインフルエンザウイルス株(例えば、新たなグループ1インフルエンザ株等の新たな広域流行株)の出現時に「危険に晒される」個体を含む。こうした「リスクのある」患者の例には、ワクチン非応答者、免疫不全患者、及び医療従事者が含まれる。本発明の受動免疫療法の特別な利点は、深刻化が進む抗ウイルス耐性に関する問題を増大させないことである。
【００５９】
一実施形態において、本発明の抗体又は抗体の組み合わせは、インフルエンザH1、H1とH5サブタイプ、及び/又はH1とH2とH5とH9サブタイプ、及び/又は全てのグループIヘマグルチニンサブタイプ(例えば、H1、H2、H5、H6、H11、H13、H16、H9、H8、及び/又はH12インフルエンザウイルス)に対するヘテロサブタイプ交差反応性及び/又は中和を提供する。
【００６０】
本発明の他の態様は、ヘテロサブタイプ免疫反応を引き出す「ユニバーサルワクチン」を設計する方法を提供する。単なる例示の目的で、適切なプロトコルは、実施例14において説明する。
【００６１】
本発明の更に他の態様は、頑強な「現場」診断アッセイ及び試薬を提供する。単なる例示の目的で、適切なプロトコルは、実施例13において説明する。
【００６２】
本発明の他の態様は、ワクチンの有効性を判定するための交差反応性抗体を提供する。単なる例示の目的で、適切なプロトコルは、実施例13において説明する。
【００６３】
抗体の送達
【００６４】
使用時、本発明は、通常は、静脈内である非経口投与に適した形態で本発明の抗体組成物を含む医薬組成物を利用する。精製された完全な抗体又はそのフラグメントを、こうした送達用に処方する。例えば、抗体又はそのフラグメントは、5乃至50又は15乃至50又は25乃至50g/リットルの濃度で、緩衝液中に処方し得る。適切な緩衝液成分の例には、クエン酸ナトリウム及び/又はクエン酸等の生理食塩が含まれる。好適な緩衝液は、100乃至200又は125乃至175又は約150(例えば、153)mMの塩化ナトリウム等の生理食塩を含む。好適な緩衝液は、医薬組成物を患者の生理的pHに近いpH、例えば、pH5.5乃至6.4、又はpH5.6乃至6.3、又はpH5.7乃至6.2、又はpH5.8乃至6.2に維持する。患者において前記抗体に対する免疫反応を刺激することは望ましくないため、本発明の抗体含有組成物では、アジュバント(群)を除外することが好ましい。
【００６５】
本発明の抗体は、限定では無いが、筋肉内、皮下、鼻腔内、又は静脈内での送達用に処方し得る。筋肉内、皮下、又は静脈内注射に適した組成物には、無菌水溶液が含まれる。こうした水溶液は、必要であれば適切に緩衝化するべきであり、液体希釈剤は、十分な食塩水又はグルコースにより等張化するべきである。本発明の抗体組成物は、経口製剤として個別に処方し得る。
【００６６】
注射に適した組成物は、溶液、懸濁液、或いは使用前に適切なビヒクルに溶解又は懸濁させる乾燥粉末の形態にし得る。
【００６７】
調製の際、抗体又はそのフラグメントの溶液は、ビヒクルに溶解させることが可能であり、溶液は、必要であれば、塩化ナトリウムを添加して等張化し、無菌操作を用いた細菌濾過器による濾過により滅菌した後、適切な無菌バイアル又はアンプルに充填して、封止する。有利なことに、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤又は殺菌剤又は懸濁剤、及び/又は局所麻酔剤等の添加剤は、ビヒクルに溶解し得る。
【００６８】
使用前に適切なビヒクルに溶解又は懸濁させる乾燥粉末は、事前に殺菌した材料を、無菌区域において、無菌操作を用いて無菌容器に充填することにより調製し得る。或いは、材料は、無菌区域において、無菌操作を用いて、適切な容器中で溶解させ得る。製品は、その後、乾燥凍結させ、容器を無菌状態で封止する。
【００６９】
本発明の抗体を投与するための投与量の範囲は、所望の治療効果を生み出す投与量とする。必要な投与量の範囲は、抗体又は組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、範囲、又は重症度、存在する場合は禁忌、及び主治医の判断により決まることは理解されよう。こうした投与量レベルの変化は、最適化のための標準の実験的ルーチンを用いて調整することができる。
【００７０】
適切な1日投与量は、体重1kg当たり5乃至20mgの範囲である。単位投与量は、100mg未満から変化し得るが、一般には1用量当たり250乃至2000mgの領域となり、これを毎日、或いはより低い頻度(例えば、1週間までに亘って隔日)で投与し得る。
【００７１】
インフルエンザ感染を予防又は治療するための治療方法において、本発明の抗体を、互いに組み合わせて、或いは、インフルエンザウイルス感染の予防又は治療において通常用いられる他の確立された療法の補助剤として、又はこうした療法と併せて使用することも、本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の抗体は、適切な抗ウイルス剤(例えば、オセルタミビルTM、リマンタジンTM、ザナミビルTM、及び/又はアマンタジンTM)と併せて投与し得る。
【００７２】
併用治療は、当業者が必要又は簡便と考える任意の形で実施してよく、本明細書の目的では、組み合わせて使用するべき化合物の順序、量、反復、又は相対量に関して、制限は無いと考えられる。
【００７３】
定義セクション
【００７４】
興味の対象のインフルエンザウイルスに結合する抗体は、抗体が治療剤及び/又はワクチン有効性の試薬として有用となるような十分な親和性で前記ウイルスと結合可能なものである。一例として、興味の対象のインフルエンザウイルスに結合する抗体は、少なくとも104Mの親和性(Ka)でインフルエンザウイルスに結合し得るものである。
【００７５】
治療有効量とは、インフルエンザ感染、又はインフルエンザ感染の臨床症状の少なくとも1つを治療又は予防するために、単独又は組み合わせて患者に投与された際に、こうした疾患又は症状の治療又は予防に影響を与える上で十分な抗体の量を示す。治療有効量は、例えば、抗体、感染、及び/又は感染の症状、感染及び/又は感染の症状の重症度、治療対象の患者の年齢、体重、及び/又は健康状態、及び処方医師の判断に応じて変化し得る。任意の特定の事例における適切な治療有効量は、当業者又は日常的な実験で決定が可能な者により確認し得る。治療有効量は、抗体の何らかの毒性又は有害作用を、有益作用が上回る量でもある。
【００７６】
予防有効量は、単独又は組み合わせて患者に投与した際に、インフルエンザウイルス感染、又はインフルエンザウイルス感染の臨床症状の少なくとも1つの発生又は再発の阻害又は遅延をもたらす抗体の任意の量である。一部の実施形態において、予防有効量は、インフルエンザウイルス感染の発生又は再発を完全に防止する。発生を阻害するとは、感染の発生の可能性を低減すること、或いは発生を完全に防止することを意味する。
【００７７】
配列比較のために、通常、1つの配列は、試験配列を比較し得る基準配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、後続の座標(subsequent coordinates)を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、基準配列に対する試験配列(群)の配列同一性パーセンテージを、指定されたプログラムパラメータに基づいて計算する。
【００７８】
本明細書全体において、少なくとも80％の配列同一性への言及は、少なくとも81、少なくとも82、少なくとも83、少なくとも84、少なくとも85、少なくとも86、少なくとも87、少なくとも88、少なくとも89、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、及び/又は100％の配列同一性の1つ以上と相互に交換可能に用いられる。
【００７９】
比較のための適切な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman[Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)]の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch[J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]のアルゴリズム、Pearson & Lipman[Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]の類似性検索方法、こうしたアルゴリズムのコンピュータによる実施(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA-ウィスコンシン大学バイオテクノロジセンター遺伝学コンピューターグループの配列分析ソフトウェアパッケージ(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705))、或いは目視検査[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In. And John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照]により実施し得る。
【００８０】
配列類似性パーセントの判定に適したアルゴリズムの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである[Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: pp. 403-410、及び国立生物工学情報センターの「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/」を参照]。
【００８１】
好適な相同性比較において、同一性は、少なくとも5個の隣接アミノ酸残基、又は少なくとも10個の隣接アミノ酸残基、又は少なくとも15個の隣接アミノ酸残基、又は少なくとも20個の隣接アミノ酸残基、又は少なくとも25個の隣接アミノ酸残基、又は少なくとも30個の隣接アミノ酸残基の長さである配列の領域に渡って存在する。
【００８２】
「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、所望の生物活性を示す限り、抗体及び抗体フラグメントを含む。例えば、抗体は、少なくとも1つ又は2つの重鎖(H鎖)可変領域(本明細書ではVHCと略す)と、少なくとも1つ又は2つの軽鎖(L鎖)可変領域(本明細書ではVLCと略す)とを含むタンパク質である。VHC及びVLC領域は、「相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる超可変性の複数の領域と、その間に点在する保存性の高い「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる複数の領域に更に分割することができる。フレームワーク領域及びCDRの範囲は、正確に定められている(出典を明記することにより本願明細書の一部とした、Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991、及びChothia, C. et al, J. MoI. Biol. 196:901-917, 1987を参照)。好ましくは、VHC及びVLCは、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端までに次の順序で配置される3つのCDRと4つのFRにより構成される:FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【００８３】
抗体のVHC又はVLC鎖は、更に、重鎖又は軽鎖定常領域の全部又は一部を含むことができる。一実施形態において、抗体は、2本の重免疫グロブリン鎖及び2本の軽免疫グロブリン鎖の四量体であり、重及び軽免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合により相互接続される。重鎖定常領域は、3つのドメインとして、CH2及びCH3、更に随意でCH1を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第1の成分(CIq)を含む、宿主組織又は因子に対する抗体の結合を仲介する。「抗体」という用語は、IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型(及びそのサブタイプ)の完全型免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型又はラムダ型になり得る。
【００８４】
抗体という用語は、本明細書での使用において、更に、インフルエンザウイルスに結合する抗体の一部、例えば、1本以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが、インフルエンザウイルスに結合する分子を示す。抗体という用語に包含される結合部分の例には、(i)VLC、VHC、CL、及びCHlドメインからなるFabフラグメントと、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントである、F(ab’)2フラグメントと、(iii)VH及びCHlドメインからなるFdフラグメントと、(iv)抗体の単一アームのVLC及びVHCドメインからなるFvフラグメントと、(v)VHCドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al, Nature 341:544-546, 1989)と、(vi)結合に十分なフレームワークを有する単離相補性決定領域(CDR)、例えば可変領域の抗原結合部分、とが含まれる。軽鎖可変領域の抗原結合部分及び重鎖可変領域の抗原結合部分(例えば、Fvフラグメントの2つのドメインであるVLC及びVHC)は、VLC及びVHC領域が対を為して一価の分子(単鎖Fv(scFv)として知られる。例えば、Bird et al. (1988) Science lAl-ATi-Alβ; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883参照)を形成する単一のタンパク質鎖にすることが可能な合成リンカーにより、組換え方法を用いて結合させることができる。こうした単鎖抗体も、抗体という用語に含まれる。これらは、当業者に公知の従来の手法を用いて得られ、完全な抗体と同様の手法で、有用性に関して一部が選別される。
【００８５】
同様に、抗体という用語は、タンパク質足場を含む。
【００８６】
タンパク質足場は、scFvs、Fab分子、dAbs(単一ドメイン抗体)、ダイアボディ、及びミニボディ等、治療的モノクローナル抗体及び誘導体の拡大するレパートリを補完する普遍的な結合フレームワークを提供する。足場系は、新規の足場の形成又は公知のタンパク質結合ドメインの改変により、公知のタンパク質認識ドメインを形成又は改変する。こうした足場には、限定では無いが、以下が含まれる。
(i)プロテインAに基づく足場-アフィボディ(affibody)(Nord, K. et al 1997 “Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain”. Nat Biotechnol 15, 772-777)、
(ii)リポカリンに基づく足場-アンチカリン(anticalin)(Skerra 2008 “Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities”. FEBS J. 275:2677-83)、
(iii)フィブロネクチンに基づく足場-アドネクチン(adnectin)(Dineen et al 2008 “The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer”. BMC Cancer 8:352)、
(iv)アビマー(avimer)(Silverman et al 2005 “Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains”. Nat Biotechnol 23:1556-61)、
(v)アンキリンに基づく足場-ダルピン(darpins)(Zahnd et al 2006 “Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins”. J Biol Chem. 281:35167-75)、及び
(vi)センチリン(centyrin)足場-CDRに類似したループを備えたIgドメインとの有意な構造的相同性を有するタンパク質フォールドに基づく。Igドメインは、ヒトタンパク質における基本モジュールであり、代替足場タンパク質として広く応用されてきた。上記の「足場」の文献のそれぞれは、出典を明記することにより(その開示内容全体を)本願明細書の一部とする。
【００８７】
予防する或いは治療するという用語への言及は、抑制するという用語と同じ意味で用いられる場合がある。
【００８８】
本明細書に記載のアミノ酸配列は、1個以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加を含み得る。こうした変化は、軽微な性質のもの、例えば、保存的アミノ酸置換(下記参照)及び抗体のフォールディング又は活性に有意な影響を与えない他の置換であることが好ましい。
保存的アミノ酸置換
塩基性:
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:
グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:
グルタミン
アスパラギン
疎水性:
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型:
グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
【００８９】
20個の標準アミノ酸に加え、非標準アミノ酸(4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリシン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα-メチルセリン等)により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換してもよい。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸により、天然ポリペプチドアミノ酸残基を置換してもよい。本発明のポリペプチドは、非自然発生アミノ酸残基を含むこともできる。
【００９０】
非自然発生アミノ酸は、限定では無いが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシ-プロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチル-トレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシメチルホモ-システイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニル-アラニン、4-アザフェニル-アラニン、β-ナフチルアラニン、β-ピリジルアラニン、N-グアニジノ-(ブチル)-ホモアルギニン、N、N’-グアニジノ-(ジメチル)-ホモアルギニン、N、N’-グアニジノ-bis-(2,2,2,-トリフルオロエチル)-ホモアルギニン、N、N’-グアニジノ-(メチル,ヘキシル)- ホモアルギニン、Ne-メチルリシン、Ne-イソプロピルリシン、アミノメチルフェニルアラニン、アミノシクロヘキシルアラニン、α-アミノ酪酸、4-チアプロリン、N-メチルロイシン、オルニチン、ノルロイシン、5-ブロモ-トリプトファン、5-フルオロ-トリプトファン、5-ニトロ-トリプトファン、γ-アミノ酪酸、J-メルカプトプロピオニル、アセチル、ペニシラミン、及び4-フルオロフェニルアラニンを含む。
【００９１】
非自然発生アミノ酸残基をタンパク質に組み込むための幾つかの方法が当該技術分野において知られている。例えば、化学的アミノアシル化サプレッサーtRNAを用いることでナンセンス変異が抑制されるインビトロ系を利用することができる。アミノ酸を合成する方法及びtRNAをアミノアシル化する方法は、当該技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌S30抽出物と市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィにより精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991、Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991、Chung et al., Science 259:806-9, 1993、及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993を参照されたい。第2の方法において、翻訳は、アフリカツメガエル卵母細胞において、変異mRNA及び化学的アミノアシル化サプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより実施される(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。第3の方法では、大腸菌細胞を、置換対象の天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)が存在せず、所望の非自然発生アミノ酸(群)(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、又は4-フルオロフェニルアラニン)が存在する状態で培養する。非自然発生アミノ酸は、天然の対応物の代わりに、ポリペプチドに組み込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。自然発生アミノ酸残基は、インビトロでの化学修飾により非自然発生種に変換することができる。化学修飾は、部位特異的突然変異誘発と組み合わせ、置換の範囲を更に拡大することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
【００９２】
多数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、非自然発生アミノ酸、及び非天然アミノ酸により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換してもよい。
【００９３】
本発明のポリペプチド内の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発等、当該技術分野において公知の手順により同定可能である(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物学的相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識等の手法により決定されるような構造の物理解析により、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて判定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992、Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須アミノ酸の同一性は、関連する抗体配列との相同性の解析から推測することもできる。
【００９４】
複数のアミノ酸置換を、Reidhaar-Olson及びSauer(Science 241:53-7, 1988)又はBowie及びSauer((Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されたもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて作成及び試験することができる。簡単に言うと、これらの著者は、ポリペプチド内の2つ以上の位置を同時に無作為化し、機能性ポリペプチドを求めて選択し、その後、突然変異誘発ポリペプチドの配列を決定し、各位置で許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。他の使用可能な方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409、Huse, WIPO Publication WO 92/06204)及び領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986、Ner et al., DNA 7:127, 1988)が含まれる。
【００９５】
複数のアミノ酸置換を、Reidhaar-Olson及びSauer(Science 241:53-7, 1988)又はBowie及びSauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されたもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて作成及び試験することができる。簡単に言うと、これらの著者は、ポリペプチド内の2つ以上の位置を同時に無作為化し、機能性ポリペプチドを求めて選択し、その後、突然変異誘発ポリペプチドの配列を決定し、各位置で許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。他の使用可能な方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409、Huse, WIPO Publication WO 92/06204)及び領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986、Ner et al., DNA 7:127, 1988)が含まれる。
【００９６】
配列番号
【００９７】
CDR3 (Kabat)
配列番号1 = STTTPPYEY
配列番号2 = RRDWRDY
配列番号3 = NPPGNLY
配列番号4 = DPLSTGWGQYSY
配列番号5 = STTTPPHEF
配列番号6 = RDGFFNRYDY
配列番号7 = SGPGGLNV
配列番号8 = TRWVPTMKADEYNY
配列番号9 = ASWVASLWSPSEYDY
配列番号10 = DPPGILY
配列番号11 = DPVCTAGWYRPSRFDL
配列番号12 = STLTPPHEY
配列番号13 = GNTGSSDRSSSYVH
配列番号14 = KSPLVDNEY
配列番号15 = KGFAPFLIGCPWGKAEYDY
配列番号16 = TKAFGIATITADYEL
配列番号17 = SSTVAPHEY
配列番号18 = SGPGGVEV
配列番号19 = SGPGGVIL
【００９８】
CDR3 (IMGT)
配列番号20 = KTSTTTPPYEY
配列番号21 = NTRRDWRDY
配列番号22 = NLNPPGNLY
配列番号23 = NADPLSTGWGQYSY
配列番号24 = KCSTTTPPHEF
配列番号25 = NARDGFFNRYDY
配列番号26 = MASGPGGLNV
配列番号27 = AGTRWVPTMKADEYNY
配列番号28 = AAASWVASLWSPSEYDY
配列番号29 = NLDPPGILY
配列番号30 = AADPVCTAGWYRPSRFDL
配列番号31 = KISTLTPPHEY
配列番号32 = GAGNTGSSDRSSSYVH
配列番号33 = HAKSPLVDNEY
配列番号34 = AVKGFAPFLIGCPWGKAEYDY
配列番号35 = AATKAFGIATITADYEL
配列番号36 = KFSSTVAPHEY
配列番号37 = KASGPGGVEV
配列番号38 = KASGPGGVIL
【００９９】
CDR2 (Kabat)
配列番号39 = VIGNYGNTNYADSVKR
配列番号40 = DIASTRGTTNYADSVKG
配列番号41 = GITYDDSTNYAGSVKG
配列番号42 = AITSGESTNYADSVKG
配列番号43 = VIGNYGNTNYADSVKG
配列番号44 = AVTTDGSTSYADYAKG
配列番号45 = VIGNGGNTNYAESVKG
配列番号46 = FITSTSAVTKYADSVKG
配列番号47 = CRASDGNTYYAESLKG
配列番号48 = SIAYDGSTSYADPVKG
配列番号49 = CISPSDSFTEYGDSVKG
配列番号50 = VIGNNDNTVYGDSVQG
配列番号51 = AIDWGDGPTTYADSVKG
配列番号52 = SIDGRGTPMYADSVKG
配列番号53 = CMNSRDGTTNYADSVKG
配列番号54 = AITAGGNTYYADSAKA
配列番号55 = VIGNYGNTNYADSVKG
配列番号56 = VIGNGGNTNYADSVKG
配列番号57 = VIGNGGTNYADSVKG
【０１００】
CDR2 (IMGT)
配列番号58 = IGNYGNT
配列番号59 = IASTRGTT
配列番号60 = ITYDDST
配列番号61 = ITSGEST
配列番号62 = IGNYGNT
配列番号63 = VTTDGST
配列番号64 = IGNGGNT
配列番号65 = ITSTSAVT
配列番号66 = RASDGNT
配列番号67 = IAYDGST
配列番号68 = ISPSDSFT
配列番号69 = IGNNDNT
配列番号70 = IDWGDGPT
配列番号71 = IDGRGTP
配列番号72 = MNSRDGTT
配列番号73 = ITAGGNT
配列番号74 = IGNYGNT
配列番号75 = IGNGGNT
配列番号76 = IGNGGNT
【０１０１】
CDR1 (Kabat)
配列番号77 = IVTMG
配列番号78 = WYDVG
配列番号79 = RYRMG
配列番号80 = LYTMG
配列番号81 = IVTMG
配列番号82 = TYPMS
配列番号83 = FYTMG
配列番号84 = NYAIG
配列番号85 = GYAIA
配列番号86 = RYRMG
配列番号87 = AYAIA
配列番号88 = IITMG
配列番号89 = LYRVG
配列番号90 = MYMID
配列番号91 = NNAIG
配列番号92 = INAMG
配列番号93 = IVTMG
配列番号94 = FYTMG
配列番号95 = FYTMG
【０１０２】
CDR1 (IMGT)
配列番号96 = GSISRIVT
配列番号97 = GFTFSWYD
配列番号98 = GSFFSRYR
配列番号99 = GSAFSLYT
配列番号100 = GSISRIVT
配列番号101 = GSAVLFSTYP
配列番号102 = NDIFSFYT
配列番号103 = GFSLDNYA
配列番号104 = GFPFDGYA
配列番号105 = GSFFSRYR
配列番号106 = GFTLGAYA
配列番号107 = GSMSRIIT
配列番号108 = VLTFSLYR
配列番号109 = GDIFVMYM
配列番号110 = GSTLNNNA
配列番号111 = GSAFSINA
配列番号112 = GSISSIVT
配列番号113 = DNIFSFYT
配列番号114 = TNIASFYT
【０１０３】
全長VHH
配列番号115 =
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSISRIVTMGWYRQASGKERELVAVIGNYGNTNYADSVKGRFTVSRDNAKDTAYLQMNGLNVEDTAIYYCKTSTTTPPYEYWGQGTQVTVSS
配列番号116 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYDVGWYRRAPGKERELVADIASTRGTTNYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLKPEDTAVYYCNTRRDWRDYWGQGIQVTVSS
配列番号117 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFFSRYRMGWYRQAPGEQRELVAGITYDDSTNYAGSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCNLNPPGNLYWGQGTQVTVSS
配列番号118 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLASGSAFSLYTMGWYRQAPGNQRELVAAITSGESTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNADPLSTGWGQYSYWGQGTQVTVSS
配列番号119 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSISRIVTMGWYRQGPGKERELVAVIGNYGNTNYADSVKGRFTVSRDNAKDTAYLQMNNLNVEDTAMYYCKCSTTTPPHEFWGQGTQVTVSS
配列番号120 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGSAVLFSTYPMSWYRQAPGKQRELVAAVTTDGSTSYADYAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARDGFFNRYDYWGQGTQVTVSS
配列番号121 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASNDIFSFYTMGWYLQAIGKQREPVAVIGNGGNTNYAESVKGRFTISRDGAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCMASGPGGLNVWGQGTQVTVSS
配列番号122 =
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLDNYAIGWFRRAPGEEREGVSFITSTSAVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCAGTRWVPTMKADEYNYWGQGTQVTVSS
配列番号123 =
QLQLVESGGGLVQVGGSLRLSCAASGFPFDGYAIAWFRQAPGKEREGVSCRASDGNTYYAESLKGRLTMSTDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAASWVASLWSPSEYDYWGQGTQVTVSS
配列番号124 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFFSRYRMGWYRQAPGEQRELVASIAYDGSTSYADPVKGRFTISRDNANTVHLQMYSLKPDDTAVYYCNLDPPGILYWGQGTQVTVSS
配列番号125 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGAYAIAWFRQAPGKEREGVSCISPSDSFTEYGDSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCAADPVCTAGWYRPSRFDLWGQGTQVTVSS
配列番号126 =
QVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGSMSRIITMGWYRQAPGMERELVAVIGNNDNTVYGDSVQGRFTVSRDNAKNTAYLQMNSLNAEDTAMYYCKISTLTPPHEYWGQGTQVTVSS
配列番号127 =
QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASVLTFSLYRVGWFRQAPGKEREFVAAIDWGDGPTTYADSVKGRFTISRDNAERTAYLQINSLKPEDTAVYYCGAGNTGSSDRSSSYVHWGQGTQVTVSS
配列番号128 =
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGDIFVMYMIDWYRQAPGKQRELVASIDGRGTPMYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYSCHAKSPLVDNEYWGQGTQVTVSS
配列番号129 =
QLQLAESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTLNNNAIGWFRQAPGKEREGVSCMNSRDGTTNYADSVKGRFTISRDVAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCAVKGFAPFLIGCPWGKAEYDYWGQGTQVTVSS
配列番号130 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAFSINAMGWYRQAPGEEREFVAAITAGGNTYYADSAKARFTISRDNAKNMLYLQMNSLKPEDTAMYYCAATKAFGIATITADYELWGQGTQVTVSS
配列番号131 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGSISSIVTMGWYRQAPGKERELVAVIGNYGNTNYADSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLNVEDTAMYVCKFSSTVAPHEYWGQGTQVTVSS
配列番号132 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDNIFSFYTMGWYRQSPGKERELVAVIGNGGNTNYADSVKGRFTISRDNGKNKAHLQMNSLKPEDTAVYYCKASGPGGVEVWGQGTQVTVSS
配列番号133 =
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTNIASFYTMGWYRQTPGQQRDVVAVIGNGGNTNYADSVKGRFTISRDGAKNTAHLQMNSLKPEDTDVYYCKASGPGGVILWGQGTQVTVSS
【実施例】
【０１０４】
実施例1:免疫手順及びインフルエンザに対する免疫反応の解析
【０１０５】
若齢のオスのアルパカを、イギリス、ハートフォードシャー州の英国王立獣医科大学においてHome Office licence 80/2117に従って維持した。免疫化前の血液試料を、頸静脈から取得した後、4回の筋肉内注射を0日、21日、43日、及び71日の間隔を空けて4本の脚に分割して実施した。一次免疫は、400μlの無菌PBS中の50μgの組換えH1(A/California/07/09(H1N1pdm)(Protein SciencesTM)からなり、800μlの完全フロイントアジュバント(Sigma)により免疫化直前に乳化した。同様に、不完全フロイントアジュバント(Sigma)中の50μgの組換えH1(A/California/07/09(H1N1 pdm)のブースタ注射を個別に3回行った。各注射の約3日後に、10mlの血液試料を採取し、血液を一晩4℃で凝固させた後、血清を調製した。免疫スケジュールの各段階でのA/California/07/09に対する血清反応を、ELISA、不活化ウイルス株のパネル上での血液凝集阻害アッセイ(HIアッセイ)、及びパンデミックH1N1ウイルス株A/California/07/09を用いたマイクロ中和アッセイ(MNアッセイ)により評価した(表1)。免疫原(H1N1 pdm)に対する明確な反応が、後続の免疫化毎に増加した。
【０１０６】
【表１】
2014527065.tif 000003
【０１０７】
実施例2: ファージディスプレイされた単一ドメインVHH抗体ライブラリの構築
【０１０８】
抗体ライブラリの構築のため、免疫化したアルパカ(実施例1)から約10mlの血液試料をヘパリンチューブに採取した。末梢血リンパ球は、Ficoll-Hypaque遠心分離手順(Sigma)を用いて精製した。RNAは、RiboPureTM RNA抽出キット(Novagen)を用いて、製造業者の指示に従って抽出し、cDNA合成前に-70℃で保管した。第1鎖cDNA合成は、製造業者の指示(Invitrogen)に従って行った。簡単に言うと、それぞれ200ngまでの全RNAを用いて、オリゴdTプライマーによるcDNA合成反応を50分間に亘り50℃で行った後、85℃で5分間インキュベートして反応を停止させ、反応物を氷上に置いた。反応物を短時間の遠心分離により採取し、1μlのRNase Hをチューブ毎に添加し、20分間、37℃でインキュベートした。結果的に生じたcDNAは、-20℃で保管するか、或いは一次PCR反応に直ぐに使用して、抗体遺伝子配列を増幅した。
【０１０９】
一次PCRは、哺乳類免疫グロブリン遺伝子のCH2ドメインにおいて、更にアルパカVHH遺伝子(Harmsen et al., 2000)の5’末端のシグナル配列内において普遍的に開始するように設計された2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。高忠実度のtaqポリメラーゼ (Roche)を全てのDNA増幅に用いた。
Alp-CH2_Rev
5’ CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA
AlpL-Fw_VHH
5’ GGT GGT CCT GGC TGC
【０１１０】
これにより、600bp及び900bpの抗体遺伝子産物が共に増幅される。600bpの産物は、重鎖のみの抗体群に対応し、CH1ドメインを含まない。900bpの遺伝子産物は、従来の抗体重鎖群に対応しており、必要ではない。600bpの重鎖のみの遺伝子産物は、ゲル精製(QIAGEN)を行い、二次PCRステップを施して、VHH抗体遺伝子群(450bpまで)のみを増幅し、ファージディスプレイベクターpNIBS-1(実施例3)へのクローニングのための適切な制限部位を付加した。二次PCR用のプライマーは、抗体のFR1及びFR4領域に対するアニーリングにより全てのVHH遺伝子を増幅するように設計した。Sfi1及びNot1制限部位は、抗体遺伝子内での切断の頻度が低いことから、クローニング用に選択された。
Alp_FR1_Sfi1
5’ CTG CAG GGA TCC GTT AGC AAG GCC CAG CCG GCC ATG GCA CAG KTG CAG CTC GTG GAG TCN
Alp_FR4back_Not1
5’ GCT AGT GCA TGG AGC TCA TGC GGC C
【０１１１】
約5μgのVHH抗体DNAを、SfiI制限酵素(New England Biolabs)により、200μlの反応物中において一晩50℃で消化した。更に精製後(QIAGEN)、VHH遺伝子を、Not1により、100μlの反応物中において37℃で6時間に亘り消化した。消化したVHH遺伝子を、Sfi1及びNot1制限酵素により同様に消化したファージディスプレイベクターpNIBS-1(実施例3)内に連結した。連結は、各反応物が約100ngのベクターを含有する状態で、20μlの反応物中において、挿入物対ベクターが4:1の比となるように設定した。T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)の添加後、反応物を一晩16℃でインキュベートした。個々の連結物を、製造業者の指示に従ってプールして精製した(QIAGEN)。精製した連結混合物を、エレクトロポレーション(BIO-RAD)を用いてTG1エレクトロコンピテントセル(Agilent)にトランスフォームした。細胞を、37℃に予熱した1mlのSOC培地(Sigma)によりエレクトロポレーションキュベットから回収した後、振盪しながら37℃で1時間インキュベートして、抗生物質耐性を発現させた。ライブラリを、2TY寒天アンピシリン(100μg/ml)及び20％v/vグルコースを入れた22cmディッシュに広げた。ライブラリのサイズは、成長可能なコロニーを集計する希釈系列を作成することにより決定し、5×107の独立クローンとした。22cmディッシュを一晩37℃でインキュベートした後、プレートに2TY寒天カルベニシリン(100μg/ml)及び20％v/vグルコースを満たし、コロニーを掻き取ることによりライブラリを採取した。その後、抗体ライブラリを示す再懸濁させたコロニーを、20％v/vグルコース中において-70℃で保管した。
【０１１２】
実施例3:ファージディスプレイベクターpNIBS-1の構築
【０１１３】
1782bpのポリリンカー配列を、次の主要な特徴を含めて設計した。
(i)発現抗体をペリプラズムへ分泌させると共に、C末端アミノ酸及びDNA配列がSfi1制限部位のコード化に対応するpelBシグナル配列。
(ii)クローン化VHH抗体のC末端に融合し、発現抗体の精製及び検出の両方を促進するヘキサヒスチジンタグ。
(iii)ヘキサヒスチジンタグの後でクローン化抗体のC末端に付着し、発現抗体の検出を促進するc-Mycエピトープタグ
(iv)M13バクテリオファージコートタンパク質3をコードし、抗体カセットと同じフレームに存在し、ファージの表面に提示可能な抗体-gene III融合産物の生産を促進するGene III配列。
(v)c-Mycエピトープタグとgene IIIファージコートタンパク質との間のアンバーDNA停止コドン。このコドンは、大腸菌において停止コドンとして読み取られるが、突然変異サプレッサーtRNA遺伝子を有する株では、コードするアミノ酸として読み取られる場合が多く、読み取りにより抗体-gene3融合産物が生産される。これにより、抗体-gene3融合物がファージ上に提示される。アンバーコドンの抑制は、一般に効率が低く、これは、gene3と融合しない可溶性抗体を、同じ大腸菌クローン細胞から、gene3配列を除去するためのサブクローニングを行わずに生産することができるという利点を有する。
(vi)抗体遺伝子をクローン化するためのSfi1及びNot1制限部位は、抗体遺伝子内での切断の頻度が低く、機能性発現カセットを維持しつつDNA配列内に配置することができることから含まれた。Mfe1及びBstEIIのような他の制限部位も、抗体の生殖細胞系遺伝子における保存性が高く、選択した抗体を他の形態にクローニングする上で有用となり得ることから組み込まれた。
【０１１４】
ポリリンカー配列は、オリゴヌクレオチドからHind111/EcoR1フラグメントとして合成し(GeneartTM)、標準的なファージミドベクターpUC119内へクローン化してpNIBS-1を精製した(図1a及び図1b)。
【０１１５】
実施例4:ファージ抗体ライブラリ選択ストラテジー
【０１１６】
ファージディスプレイ抗体ライブラリ(実施例2)を50mlの2×TY培地にカルベニシリン100μg/ml(w/v)及び2％v/vグルコースを加えたもの(2×TY AG)に接種した。ライブラリサイズより10倍大きな種菌を用いて、ファージ救出手順中にライブラリの多様性を確保する[ライブラリサイズは5×107の大きさ。従って、5×108個の細胞をグリセロールストックから開始種菌として用いた]。培養物を、37℃で、OD600が0.5となるまで培養し、M13KO7ヘルパファージ(New England Biolabs)を含む50ml滅菌チューブに培養物5ml(約7.5×108個のバクテリアに対応する)を移した。感染多重度(MOI)は、ファージ対バクテリアを約20:1とし、約1.5×1010個のファージを用いてバクテリア培養物に感染させた。バクテリア培養物を適切な量のM13KO7ヘルパファージに追加した後、ウォーターバス中において37℃で30分間インキュベートした。感染細胞を10分間、4000gで遠心分離し、上清を除去し、バクテリアペレットを、25mlの予熱した2×TYに25μg/mlカナマイシン及び100μg/mlアンピシリンを加えたもの(2×TY AK)に再懸濁させ、一晩30℃で振盪しながらインキュベートした。翌日、細胞を15分間4,000gの遠心分離によりペレットとし、ファージディスプレイ抗体ライブラリを含む上清を回収した。ファージを精製するため、1/5の体積の20％ポリエチレングリコール6000、2.5M NaCl(PEG)を氷上で1時間インキュベートした。その後、ファージを微量遠心管においてペレットとし、1mlの無菌PBSに再懸濁した。残りのバクテリアは、短時間の遠心分離により除去し、ファージ上清を新しいチューブに移した。2回目の精製は、200μlのPEGを加え、氷上で20分間インキュベートすることにより行った。ファージを5分間の4℃での遠心分離により回収した。次に、ペレットにしたファージを1mlの無菌PBSに再懸濁させ、他の全ての汚染バクテリアを更に短時間遠心分離することにより除去した。その後、精製したファージを選択に用いた。
【０１１７】
ファージ抗体ライブラリの選択は、1mlの10μg/ml組換えヘマグルチニンをコーティングしたイムノチューブ(Nunc)により、PBS中において一晩に亘り4℃で行った[組換えH1[A/California/07/2009(パンデミックH1N1)、組換えH5(A/Vietnam/1203/2004)、protein sciencesTM](図2)。選択ストラテジーは、H1特異的抗体と、更にH1/H5交差反応性抗体との両方を、H1及びH5をコーティングしたイムノチューブの間で交互に選択することで回収するように設計した(図2)。空のイムノチューブによる並列選択を更に用いて、ファージ抗体ライブラリの抗原特異的濃縮をモニタした。翌日、イムノチューブと対照チューブとは、無菌PBS中の2％w/v粉乳(M-PBS)を完全に満たした後、室温で2時間インキュベートすることでブロックした。500μlの精製済み濃縮ファージ(1012乃至1013個のファージ)を、0.5mlの4％MPBSに加え、室温で1時間、ファージをブロックした。その後、イムノチューブをPBS Tween20(0.1％v/v)及び2×PBSにより洗浄し、ファージ混合物を、パラフィンで覆ったイムノチューブに移して、ローテータ上で30分、その後、室温で1.5時間静置してインキュベートした。次に、イムノチューブをPBS Tween(0.1％v/v)により20回、その後PBSにより20回洗浄した[抗原特異ファージ抗体の回収パーセンテージを最大にするため、第1の選択ラウンドでは10回の洗浄を用いた]。特異ファージ抗体は、1mlの100mMトリエチルアミンをチューブに加え、新しいパラフィンで覆った後、10分間ローテータ上において室温でインキュベートすることにより溶出させた。溶出ファージは、その後、0.5mlの1M Tris HCl pH7.5を含む新しいマイクロチューブに移すことにより中和した。次に、溶出ファージを、選択の第2のラウンド用のファージの調製と、連続する選択ラウンド間で回収されたファージの量の滴定との両方ために、大腸菌に感染させた。
【０１１８】
大腸菌ER2378細胞の培養物を、OD600が約0.5となるまで培養した。次の選択ラウンド用の選択ファージを増幅するために、1mlの溶出ファージを、5mlのER2738培養及び4mlの2×TY培地に混合した。その後、これをウォーターバス中において37℃で30分間インキュベートした。次に、2×TY AG及びテトラサイクリン(20μg/ml)を入れた22cmのバイオアッセイ用ディッシュにこれを広げ、30℃で一晩培養した。その後、バイオアッセイ用ディッシュから掻き取り、回収した細胞を上述したように第2の選択ラウンドに用いた。連続する選択ラウンド間での選択の進捗をモニタするために、入力ファージ及び出力ファージの力価を判定した。ファージの段階希釈を、500μlの対数期ER2738培養物を加えた500μlの2TY中で作成し、ウォーターバス中において37℃で30分間インキュベートした。感染細胞を、2×TY AGテトラサイクリン(20μg/ml)寒天プレートに広げ、一晩30℃でインキュベートした後、コロニーを集計した。3ラウンドの選択前後のファージ力価をpfu/mlを単位として計算し、特異ファージ抗体の抗原選択濃縮を示すファージ回収量の増加を明らかにした(表2)。
【０１１９】
【表２】
2014527065.tif 000004
【０１２０】
実施例5:組換えH1(A/California/07/09)及び組換えH5(A/Vietnam/1203/2004)に結合する抗体のための選択ライブラリのスクリーニング
【０１２１】
選択抗体の一次スクリーニングは、96ウェル形式で誘導した未精製の可溶性VHH抗体を用いて行った。各選択ラウンドからの個々のコロニーを、96ウェル平底プレート(Costar)において、無菌爪楊枝を用いて100μlの2×TY AG(2％)に接種した。プレートを255rpmで回転させながら一晩30℃でインキュベートした。翌日、35mlの60％v/vグリセロールを各ウェルに加え、マスタプレートを-70℃で保管した。このマスタプレートから、120μlの2×TYアンピシリン0.1％w/vグルコースを入れた新しい96ウェル丸底プレート(Costar)への接種を行い、6時間に亘り37℃で、OD600が約0.9となるまで培養した。その後、30μlの2×TYアンピシリン100μg/ml及び5mMのIPTG(最終濃度1mM)を加え、37℃で一晩、継続的に振盪した。次に、プレートを600gで10分間遠心分離し、可溶性VHH抗体を含む上清を用いて、ELISAにおいて抗原特異反応を試験した。
【０１２２】
96ウェルプレート(Nunc)を、組換えヘマグルチニンにより1μg/mlでコーティングし、一晩4℃でPBS中に置いた。プレートをPBSにより3回洗浄し、120μl/ウェルの2％w/v粉乳PBS(M-PBS)により1時間、室温でブロックした。その後、プレートをPBS0.1％(v/v)Tween及びPBSにより、それぞれ2回ずつ洗浄した。各ウェルに、50μlの4％(w/v)粉乳PBSを加えた後、可溶性VHHを含む50μlの培養上清を加えた。ELISAプレートを振盪プラットフォーム上において室温で1.5時間インキュベートした。このインキュベート後、このプレートをPBS0.1％(v/v)Tween20によりそれぞれ3回、PBSにより3回洗浄した。抗体の結合を検出するため、2％MPBS中の100μlの抗myc9E10-HRP(1/1000希釈)(Roche)を各ウェルに加え、振盪プラットフォーム上において室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS0.1％(v/v)Tween20によりそれぞれ3回、PBSにより3回洗浄し、標準的なTMB染色を用いて抗体結合を発色させた。50μlの1M硫酸により反応停止後、プレートを450nMで読み取った。96ウェルELISA形式における未精製可用性VHH抗体を用いた一次ELISAスクリーニングの例を図3に示す。陽性クローンは、少なくとも2倍のバックグラウンド信号を有するものとして採点し、更に、配列多様性、具体的には、特定のクローンがスクリーニングしたクローン中で回収された回数を分析するために特徴付けした(表3)。配列解析及びELISAによる評価を用いて、組換えH1及び/又は組換えH5に対する特異性を備えた独特のVHH CDR3配列を有する19の抗体を単離し、更に詳細な二次スクリーニングへ進めた(実施例6)。
【０１２３】
【表３】
2014527065.tif 000005
【０１２４】
実施例6:異なるインフルエンザサブタイプに対する精製単一ドメインVHH抗体の解析
【０１２５】
抗体特異性の更に詳細なスクリーニングのために、精製可溶性VHH抗体を大腸菌ペリプラズムから精製した。実施例4において同定した19種類の抗体それぞれを、2mlの2YT培地に100μg/ml(w/v)アンピシリン、2％(w/v)グルコース、Tet(5μg/ml)を補ったものに対して、10mlチューブ内で接種し、振盪しながら一晩37℃で培養した。このスタータから、50μlの接種物を取り出し、50mlの2×TY培地に100μg/mlアンピシリン、0.1％(v/v)グルコースを補ったものに入れ、ODが最大0.6となるまで37℃で培養した。可溶性抗体の発現は、1mMのIPTGを添加後、更に一晩30℃でインキュベートすることにより誘導した。50mlの培養物を20分間遠心分離し、バクテリアペレットを2.5mlのペリプラズム緩衝液(200mM Tris HCl、pH7.5、20％(v/v)スクロース、1mM EDTA)に再懸濁した後、ローテータ上で1時間、4℃でインキュベートした。細胞破片を2回の遠心分離により取り除き、バクテリアペリプラズムから回収した可溶性VHH抗体に対応する上清の透析(Pierce)をPBSに対して、緩衝液を2回交換して行った。透析によるEDTAの除去後、抗体を金属キレートクロマトグラフィ(Clontech)により製造業者の指示に従って精製した。約1mlの精製樹脂を抗体毎に用いた。樹脂のペリプラズム調製物とのインキュベート後、重力カラム(Biorad)へ移し、製造業者の指示に従って洗浄した。精製抗体を2ベッド体積の100mMイミダゾールを含む溶出緩衝液中へ溶出させた。抗体は、更にPBSに対して、緩衝液を2回交換して透析し、抗体濃度をOD280により判定した。
【０１２６】
不活化ウイルス調製物を1ml PBS中で再構成し、96ウェルELISAプレートにおいて、10mlの0.5M重炭酸塩緩衝液pH9.6中に50μlの抗原を再懸濁して一晩4℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003、及び0.0001μg/mlの精製抗体の段階希釈を使用したことを除き、実施例4と同様に処理した。アッセイは二重に行った。用量反応曲線をプロットし、GraphPad Prismを用いてEC50値を計算した(表4)。この解析から、交差反応性抗体は、R2b-E8、R2b-D9、R1a-A5、R1a-C5、R1a-B6、R1a-H6、及びR2a-G8となった。
【０１２７】
【表４】
2014527065.tif 000006
【０１２８】
実施例7:異なるインフルエンザウイルスサブタイプからの組換えヘマグルチニンに対する単一ドメイン抗体の親和性
【０１２９】
精製VHH抗体(実施例5)の親和性を、BIAcore T100装置上でシングルサイクルカイネティクス手順を用いて判定した(Karlsson et al., 2006)。手順には、抗体の濃度系列のヘマグルチニン表面に対する連続的な注入を、注入間の再生無しに行うことが含まれる。様々なサブタイプの精製組換えヘマグルチニン(Protein Sciences、E enzymes)を約3000レゾナンスユニット(RU)までCM5チップ上に固定化した。100nM、50nM、25nM、10nM、5nMの一連の抗体希釈物を、再生無しで異なる抗原表面に流す。基準表面は、センサグラムの評価前に減算した。抗体親和性は、1:1適合モデルを用いたBIA評価ソフトウェア(GE healthcare)のシングルサイクルカイネティクス手順を使用して判定した(表5)。組換えヘマグルチニン及びウイルス調製物(実施例6)の解析から、R2b-E8、R2b-D9、R1a-A5、R1a-C5、R1a-B6、R1a-H6、及びR2a-G8が交差反応性抗体となることが明らかとなった。
【０１３０】
【表５】
2014527065.tif 000007
【０１３１】
実施例8:エピトープマッピング
【０１３２】
ヘマグルチニンの球状頭部に抗体が結合したかの評価をBIAcoreにおいて行った。組換えヘマグルチニンHA1ドメイン(18-344)(A/California/06/09)H1N1及びヘマグルチニン全体(18-530)(E Enzymes)をCM5 BIAcoreチップ(GE Healthcare)に固定化した。親和性は、シングルサイクルカイネティクス手順(実施例7)を用いて判定し、交差反応性抗体は、球状頭部ドメインHA1に結合しないことが明らかとなり、HA2ストーク領域に結合する可能性が高いと推測された。HA2ストーク領域は、ウイルスサブタイプ間での保存性が高く、そのため、こうした抗体の交差反応性と合致する。
【０１３３】
交差反応性抗体が保存性の高いヘマグルチニンストーク領域に位置することの更なる証拠は、HA分子において不可逆的な配座変化を引き起こす酸処理を用いて得られた。H1N1(A/California/06/09)のウイルス調製物を、1mlのPBSに再懸濁させ、200μlをPBSにおいて20mlに希釈し、1.5mlの1M HClにより、pHを2.83まで低下させた。2.5時間の室温でのインキュベート後、抗原を20mlの0.5M重炭酸塩緩衝液により中和し、最終のpHを9.0までとした。次に、この酸処理抗原を用いて、ELISAプレートを一晩4℃でコーティングした。翌日、ELISAプレートをブロックし、抗原の結合を実施例6のように判定した。酸により処理していない抗原との並列アッセイも行った。全ての抗体は、酸により処理していないH1N1との結合を示す一方、幾つかの抗体は、交差反応性抗体R2b-E8、R2b-D9、R1a-A5、R1a-C5、R1a-B6、及びR1a-H6を含め、処理後に結合しないことが分かった。球状頭部に結合する抗体は、一般に酸処理後も結合を維持した。これは、交差反応性抗体が保存性の高いヘマグルチニンのストーク領域に結合していることの更なる証拠となる。
【０１３４】
交差反応性抗体が保存的なストーク領域に結合していることの更なる証拠は、シチメンチョウ赤血球の血液凝集の阻害を測定することにより得られる。ヘマグルチニン(HA)は、球状頭部ドメイン(HA1)を介した細胞表面のシアル酸との結合を仲介する主要なウイルスコートタンパク質である。血液凝集阻害アッセイは、Harmon et al., (1988)に従って行い、どの抗体がインフルエンザウイルスのシチメンチョウ赤血球への付着をブロックすることが可能かを判定すると共に、抗体エピトープの球状頭部ドメイン(HA1)への局在を示すために使用した。簡単に言うと、免疫したアルパカからの血清又は精製VHH抗体の段階希釈を250μg/mlから調製した。段階希釈物を、1ウェル当たり8HA単位のウイルスと共にインキュベートし、シチメンチョウ赤血球を濃度0.5％まで添加し、プレートを室温で30分間インキュベートした。球状頭部(HA1)ドメインとの結合を示した全ての抗体は、R2a-G8を除き血液凝集の阻害についても陽性となった。全てのH1/H5交差中和抗体のうち、R1a-C5のみが血液凝集の何らかの阻害を示した(表6)。
【０１３５】
【表６】
2014527065.tif 000008
【０１３６】
実施例9-VHH抗体のヒト化(ラクダ配列VHH R2a-F9による例示)
【０１３７】
R2a-F9のフレームワーク領域(FR)のヒト生殖細胞系配列データベースとのアライメントを、ClustalWを使用すると共に、V base(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok)から取り出した配列を用いて行った(表7参照)。最も近いヒト生殖細胞系配列は、DP53となった。R2a-F9のFR4をJH配列とアライメントし、JH1を選択した。FR及びCDR領域は、Kabat et al., (1991)に従って定めた。IMGT番号方式(http://cines.fr)は、異なる境界を定めており、例えば、システイン92は、この命名法によるCDR3の開始を定める。
【０１３８】
生殖細胞系VH-DP53配列とは異なるR2a-F9内のフレームワーク残基は、青で強調表示している(下線)。フレームワーク領域での配列同一性は79％となった。アルパカ及びヒト生殖細胞系可変遺伝子DP53間で異なるフレームワーク内の残基は合計17個である。
【０１３９】
ヒト化ストラテジーには、抗原の結合及び安定性にとって必須ではないFR内の残基を置き換えることが含まれる。これには、公知の一般的なラクダ残基、例えば「ホールマーク残基」(出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたVincke et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 284(5), 3273-3284)を選択し、最終的な配列において保持することが含まれる。R2a-F9では、5個のホールマーク残基が確認されており、そのうち4個は、FR2内に存在する。一連の変異体を作成し、抗原の結合及び安定性に対する各ラマ残基の重要性を評価する。
【０１４０】
12種類全ての構築物を、BIAcoreにおいて、H1との結合、発現量、及び熱安定性について試験する(表8参照)。抗原結合に影響しないヒト生殖細胞系への突然変異を、構築物の第2のラウンドに組み込み、フレームワーク領域内のアルパカ抗体配列の量が最小となる最終的なヒト化構築物が得られるまで試験を繰り返す。
【０１４１】
機能及び安定性に影響を与えない全ての突然変異を最終的な構築物に組み込み、フレームワーク領域でのヒト配列の含量が最大となる抗体遺伝子を形成する。合計13個のアルパカ残基が、表9に示すようにヒト生殖細胞系へ変換される。
【０１４２】
【表７】
2014527065.tif 000009
【０１４３】
【表８】
2014527065.tif 000010
【０１４４】
【表９】
2014527065.tif 000011
【０１４５】
実施例10:CDR3 VHH配列のヒト抗体への導入
【０１４６】
VHH CDR3は結合特異性の重要な決定要因であるため、このループは、完全ヒトVH遺伝子に、機能性を維持しつつ容易に組み込み得る。結果的に生じた抗体は、アルパカに由来するVHH CDR3ループを除き、ヒトCDR1及びCDR2を有する完全にヒトのものとなる。こうした抗体は、実施例9で誘導した抗体と比較してヒト配列の含量が増加しているため、治療用モノクローナル抗体として投与した際に有害な免疫反応を引き起こすリスクが低い。
【０１４７】
一例として、VHH CDR3ループは、個別のヒトVH配列又はヒトVH配列の集合のFR3及びFR4に対応するヒト抗体生殖細胞系配列により挟まれたVHH CDR3に対応するオリゴヌクレオチドアレイを設計することにより、適切なヒトV遺伝子に移植する。以下に示した例では、全てのヒトVH3遺伝子ファミリーメンバーを開始するように設計された縮重配列を付加したR2a-F9のVHH-CDR3(配列番号36)に対応する3’オリゴヌクレオチドを含む。VH3遺伝子を選択したのは、単に、ラクダVHH抗体がヒトVH3ファミリーとの最も高い相同性を示すためである。対応する5’プライマーは、全てのヒトVH3遺伝子メンバーのFR1をアニーリングするように設計された縮重オリゴヌクレオチドである。これら2つのオリゴヌクレオチドを、確立された方法を用いて、例えば、ナイーブドナーの末梢血リンパ球から調製したcDNAに由来するヒトVH遺伝子とのPCR反応において使用する。以下に示した設計は、Sfi1及びBstEII制限部位を付加し、ファージディスプレイベクターpNIBS-1(実施例3)へのクローニングを容易にする。
【化１】
2014527065.tif 000012
【０１４８】
R2a-F9のVHH-CDR3を移植したヒトVH遺伝子のファージディスプレイライブラリの構築後、ライブラリは、実施例4のように組換えH1上で選択され、実施例5のようにヒト化抗体がスクリーニングされる。
【０１４９】
実施例11:生体内での有効性の評価
【０１５０】
受動免疫療法用の交差反応性抗体の有効性は、マウスチャレンジモデルにおいて評価する。7つのH1/H5交差中和抗体(R2b-E8、R2b-D9、R1a-A5、R1a-C5、R1a-B6、R1a-H6、R2a-G8)は、予防的な場面においてH1N1(A/California/07/09)及びH5N1(A/Vietnam/1203/2004)ウイルスによるチャレンジからBALB/cマウスを保護する能力について試験する。VHH抗体を発現させ、精製し(実施例6)、致死量のウイルスによるチャレンジの24時間前に一価の作用物質として5mg/kgで鼻腔内投与する。関係しないVHH抗体及びPBSのみの試験群を対照として含めた。生存と、体重と、肺及び他の組織におけるウイルス力価をモニタし、H1N1及びH5N1ウイルスによる致死チャレンジから保護する抗体の能力を評価する。前記抗体は、こうした致死チャレンジからの保護を示す。抗体は、H1N1及びH5N1の感染後24時間に抗体を投与する治療的場面においても評価する。同じく、生存と、体重と、肺及び他の組織におけるウイルス力価をモニタする。前記抗体は、こうした致死チャレンジからの保護を示す。
【０１５１】
実施例12:H1N1及びH5N1に対する組換えVHH抗体の中和活性
【０１５２】
インフルエンザ中和アッセイは、基本的にHarmon et al., (1988)と同様に行った。簡単に言うと、免疫したアルパカからの血清又は精製VHH抗体(開始濃度5μg/ml)を、96ウェル平底プレート(Costar)内の重複カラム1乃至10とした体積50μlのアッセイ希釈物(DMEMに2mMグルタミン、Pen/Strep1/100、アンホテリシン1/100、非必須アミノ酸及びFCS 1/200を添加)中で2倍ずつ段階希釈した。逆遺伝学的リアソータントNIBRG-14(A/Vietnam/1194/04、H5N1)及びリアソータント弱毒ウイルス(reassorted attenuated virus) X-181(A/California/07/09;H1N1)をウイルス中和アッセイに用いた。X-181ウイルス及びNIBRG-14ウイルスは、アッセイ希釈物50μl当たり102TCID50のウイルス量で使用した。全てのアッセイに、「ウイルスのみ」(VC)の対照と、「細胞のみ」(CC)の対照とを含めた。プレートを室温で1時間インキュベートし、100μlの1.5×105/ml MDCK細胞(Madin-Darbyイヌ腎臓細胞)を全てのウェルに添加した。プレートを18時間、30℃で、5％CO2においてインキュベートした。細胞を1ウェル当たり100μlの0.6％w/vメタノール/過酸化水素により固定し、20分間室温で放置した。その後、プレートをPBS Tween-20(0.05％w/v)で3回洗浄した。インフルエンザウイルスの増殖と、核タンパク質の放出とを、一次抗インフルエンザA核タンパク質(Serotec)マウスモノクローナル抗体を用いて。この抗体100μlを各ウェルに、6salt PBS/Tween-20(0.1％)、5％w/v Marvelミルク中において1:3000の希釈度で添加した。これを100μl全てのウェルに添加し、プレートを1時間37℃でインキュベートした。ウサギ抗マウスIgGポリクローナルHRPコンジュゲート(DAKO)を、6salt PBS/Tween-20(0.1％v/v)、5％(w/v)Marvelミルクパウダー、1％(v/v)ウシ血清アルブミン中において1:5000の希釈度で使用して、1時間、37℃でインキュベートした。プレートを4回洗浄し、TMB染色を用いて発色させた。100μlの0.5M HClを各ウェルに添加して反応を停止させ、450nm及び620nmで読み取った。620nmの値を450nmの値から減算して、プレートの吸光度を補正した。50％のウイルス中和が見られた抗体濃度を、次の式を用いて決定した。
【数１】
2014527065.tif 000013
ここで、xは、MDCK細胞の50％が感染したODである。
【０１５３】
全ての抗体クローンは、R2b-D8、R1a-F4、R1a-E5、R1a-F5、及びR1a-E6を除き、H1N1の実験室適応株であるX-181を中和することができた(表10)。H1N1中和抗体のうち、R2b-E8、R2b-D9、R1a-A5、R1a-C5、R1a-B6、R1a-H6、及びR2a-G8は、NIBRG-14(H5N1)を中和することも可能であり、交差中和抗体であると考えられた(表10)。これは、実施例5、6、及び7に示した交差反応性データと一致した。抗体R2b-E8、R2b-D9、R1a-A5、R1a-B6、及びR1a-H6について、これは、血液凝集阻害活性の欠如と、ヘマグルチニンの保存ストーク領域における酸感受性エピトープに対する特異性と一致した(表6)。
【０１５４】
【表１０】
2014527065.tif 000014
【０１５５】
実施例13:ワクチン有効性に関する「ユニバーサル抗体」としての評価
【０１５６】
本発明の交差反応性抗体は、弱毒インフルエンザワクチンのための有効性アッセイに使用される。本願の交差反応性抗体は、(1)インフルエンザウイルスの1サブタイプ/タイプの多く/全てのヘマグルチニン、又は(2)インフルエンザAウイルスの2つ以上のサブタイプで、その全てがインフルエンザHAの2つの認識されている系統発生群の一方に属するもののヘマグルチニン、又は(3)両方の系統発生群であるグループ1及びグループ2からのHAと交差反応する。
【０１５７】
(1)のような交差反応性を有する抗体は、多価の、好ましくは 三価及び四価であるインフルエンザワクチンの有効性試験に有用となる。(2)のような交差反応性を有する抗体は、多価の、好ましくは 三価及び四価であるインフルエンザワクチンの有効性試験、インフルエンザAウイルスの単一のサブタイプを含むパンデミック又はプレパンデミックインフルエンザワクチンの有効性試験、及び、2つ以上のサブタイプ/タイプを含み、各ウイルス構成体が異なる系統発生群に属するワクチンの有効性試験に有用となる。(3)のような交差反応性を有する抗体は、一価のインフルエンザワクチンであり、好ましくは、パンデミック及びプレパンデミックインフルエンザワクチンの有効性試験に有用となる。
【０１５８】
こうした交差反応性抗体の有効性試験における使用により、現在用いられている方法の場合のように抗体試薬を頻繁に交換する必要性がなくなる。現在用いられている方法では、株の変更が発表及び実施される度に特異ヒツジ抗血清を生成する必要があり、インフルエンザワクチンに用いられる全ての抗原ドリフトしたウイルスに対する新たな抗血清の生成は、ウイルス株の変更から最新インフルエンザワクチンによるワクチン接種までの経路において潜在的なボトルネックとして同定されている。この問題を解決するために、本発明の交差反応性抗体を事前に生成することにより、常に利用可能とし、インフルエンザワクチンの生産における株の変更後、(a)株特異抗体が利用可能となるまでのリードタイム無しに、交差反応性抗体/抗体群を即座に使用することができる。
【０１５９】
一例として、交差反応性抗体は、一元放射免疫拡散(SRID又はSRD)アッセイにおいて使用される。SRDの標準プロトコルに従って、交差反応性抗体をゲルマトリクスに組み込み、アッセイに使用する。インフルエンザヘマグルチニンがゲル内に拡散される時に沈降輪が形成され、SRDの輪/帯の視覚化のための標準プロトコルに従って測定することができる。
【０１６０】
他の例において、交差反応性抗体は、ELISAアッセイにおいて、ワクチンと、一価バルク等のワクチン以前の試料との有効性を定量的に測定するために使用される。様々な形態のELISAアッセイを使用し得る。例えば、固体表面にコーティングされた抗体を用いてヘマグルチニン及び抗体を捕獲し、捕獲したHAを検出するサンドウィッチELISAを使用し得る。捕獲及び検出抗体は、同じ抗体にしてよく、或いは異なる抗体としてもよい。2つの抗体の一方又は両方を、本発明の交差反応性抗体にし得る。他の形態では、競合ELISAが使用される。HAを固体表面にコーティングし、本発明の交差反応性抗体/抗体群と反応させる。基準抗原、又は測定対象の試料を、競合試薬として用いる。コーティングしたHAに対する交差反応性抗体の結合の減少を用いて、基準抗原試薬から生成された標準曲線を使用して溶液中のHAを定量化することができる。他の形態のELISAを類似作用に対して利用してもよく、全ての場合において、一つの交差反応性抗体、又は複数の交差反応性抗体は、HAを捕獲及び/又は検出する特異的試薬として用いられる。
【０１６１】
他の例では、表面プラズモン共鳴(SPR)技術を用いて、弱毒インフルエンザワクチンの有効性アッセイを確立する。交差反応性抗体は、HAタンパク質/抗原の検出及び定量化に用いる。様々な形式のSPRに基づくアッセイを使用し得る。好適な実施形態では、競合アッセイを、特定の装置に応じて、チップにコーティングされたHAとの結合において競合する基準抗原及び交差反応性抗体と共に利用する。
【０１６２】
他の実施形態において、交差反応性抗体/抗体群は、膜に固定化したタンパク質(特にHA)を用いる方法に使用される。膜は、ニトロセルロース膜、PVDF膜、又は他の適切な膜にし得る。タンパク質及びHAの膜上での固定は、様々な装置を使用するウェスタンブロッティング、スロットブロッティング、膜上へのスポッティング等、様々な処理を介して行われる。
【０１６３】
他の例において、交差反応性抗体は、ワクチン又は一価バルク等の試料からHAを濃縮するために使用される。濃縮は、通常は溶解したHAを含有する液体である試料から、HAの結合及び濃縮が可能な免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィ、磁気分離(抗体を何らかの手段で、常磁性ビーズ等の磁性体に結合させる)、或いは、他の任意の免疫学的方法における交差反応性抗体の使用を介したものとなり得る。アジュバント等の物質に吸収されたHAも、未処理の試料において、或いはHAを脱離する処理後に、こうした濃縮を施し得る。濃縮されたHAは、任意の適切な方法を用いて定量し得る。適切な方法には、限定では無いが、質量分析、特に「免疫捕獲同位体希釈質量分析」(Pierce et al., Analytical Chemistry, 2011 dx.doi.org/10.1021/ac2006526)において用いられる同位体希釈質量分析、及びHPLCが含まれる。
【０１６４】
実施例14:将来のグループ1インフルエンザ株に対する交差防御免疫反応を引き出すインフルエンザワクチンの設計
【０１６５】
交差反応性抗体は、異なるウイルスサブタイプ間で構造的に保存されたヘマグルチニン上のエピトープを定めるために使用される。その後、こうしたエピトープを使用し、患者への投与時に将来のウイルスサブタイプに対する防御的免疫反応引き出すため、進化を続けるインフルエンザウイルスに対する反復的な季節性ワクチン接種の必要性を排除するワクチンを設計する。
【０１６６】
本発明の交差反応性抗体のエピトープのマッピングは、ヘマグルチニンと複合した交差反応性抗体の共結晶化と、その後のX線結晶解析とにより行われる。或いは、交差反応性抗体は、パンデミックH1N1(例えば、A/California/07/2009)等のインフルエンザウイルスのHA遺伝子に由来する遺伝子フラグメントファージディスプレイライブラリとして構築される。H1-HA遺伝子を合成し、DNAアーゼにより消化し、ファージディスプレイベクターpNIBS-1へクローニングする。この遺伝子フラグメントファージディスプレイライブラリは、その後、本発明において説明した精製交差反応性単一ドメイン抗体により選択される。次に、選択された遺伝子フラグメントの配列解析を用いて、交差中和エピトープ(群)を描写し、公開データベース内の利用可能なHA配列に対してマッピングして、全16HAサブタイプ間での保存の範囲を決定する。更に「微調整した」エピトープマッピングでは、ファージに提示されたHA遺伝子フラグメントのアラニンスキャニング突然変異誘発を使用し、その後、ファージ上の提示を維持しつつ、特異的抗体結合の喪失に関するスクリーニングを行う。交差反応性抗体エピトープに対応する正しく折り畳まれた産物を生成することが可能な最小のヘマグルチニン遺伝子フラグメントを、その後、異種遺伝子発現系において発現及び精製するか、或いは、確立された化学手順を用いてペプチドとして合成する。この組換えHAエピトープは、BALB/cマウスを免疫し、H5N1及びH1N1ウイルスサブタイプを含む異なるウイルス株による致死チャレンジから保護するために使用する。
【０１６７】
或いは、本発明の交差反応性抗体は、ヘマグルチニン上の関連する交差反応性エピトープの構造的模倣を意味する抗イディオタイプ抗体の単離に用いることができる。こうした抗イディオタイプ抗体は、ワクチンとして使用した場合、ウイルスヘマグルチニン上の関連エピトープと交差反応する免疫反応を引き起こす。本発明において説明した単一ドメインVHH抗体を用いることの利点は、パラトープの形成にVH及びVL領域の両方との安定した会合を要する従来の抗体よりも、構造的に遙かに単純なことである。一例として、交差反応性単一ドメイン抗体(例えば、R1a-B6)を使用して、実施例1のようにアルパカを免役し、ファージディスプレイ抗体ライブラリを実施例2のように構築する。ライブラリは、その後、免疫化に使用された最初の交差反応性抗体について選択される(実施例4)。抗イディオタイプ抗体は、免疫化に使用した交差反応性抗体(R1a-B6)に結合すると共に、類似するフレームワーク領域を有するが、異なるCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する他の抗体に対して陰性となるものとして説明される。
【符号の説明】
【０１６８】
[図1a]及び[図1b]
His tag: Hisタグ
Myc tag: Mycタグ
amber stop: アンバー停止
Gene III protein: Gene IIIタンパク質
f1 Origin: f1開始点
[図2]
library: ライブラリ
Round: ラウンド
図3
CLONE NUMBER: クローン番号
INPUT: 入力
【図１ａ】
2014527065.tif 000015
【図１ｂ】
2014527065.tif 000016
【図２】
2014527065.tif 000017
【図３−１】
2014527065.tif 000018
【図３−２】
2014527065.tif 000019
【配列表】
2014527065000001.app
【国際調査報告】
2014527065.tif 000020
2014527065.tif 000021
2014527065.tif 000022
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