(57)【要約】最終混合物中の生物学的製剤の濃度を増進または増加させるための方法が開示され、該生物学的製剤は、１つ以上の選択された特性を有し、該方法は、（ａ）該選択された特性を伴う、および伴わない生物学的製剤の初期混合物が、クロマトグラフィ媒体に接触することを可能にすることであって、該初期混合物中の生物学的製剤の数量は、該クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超える、可能にすることと、（ｂ）該１つ以上の選択された特性を持たない生物学的製剤が、該クロマトグラフィ媒体によって分離されることを可能にすることと、（ｃ）該クロマトグラフィ媒体から生物学的製剤の最終混合物を回収することであって、該最終混合物は、該初期混合物中の生物学的製剤の濃度と比較して、１つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の増進または増加した濃度を含む、回収することとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
最終混合物中の生物学的製剤の濃度を増進または増加させるための方法であって、前記生物学的製剤は、１つ以上の選択された特徴を有し、前記方法は、
（ａ）前記選択された特性を伴う、および伴わない生物学的製剤の初期混合物が、クロマトグラフィ媒体に接触することを可能にすることであって、前記初期混合物中の生物学的製剤の数量は、前記クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超える、可能にすることと、
（ｂ）前記１つ以上の選択された特性を持たない生物学的製剤が、前記クロマトグラフィ媒体によって分離されることを可能にすることと、
（ｃ）前記クロマトグラフィ媒体から生物学的製剤の最終混合物を回収することであって、前記最終混合物は、前記初期混合物中の生物学的製剤の濃度と比較して、１つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の増進または増加した濃度を含む、回収することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィ媒体は、
ａ）イオン交換媒体、
ｂ）アニオン交換媒体、
ｃ）カチオン交換媒体、
ｄ）ヒドロキシアパタイト媒体、
ｅ）疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体、
ｆ）抗体親和性媒体、
ｇ）免疫グロブリンＦｃ領域親和性媒体、
ｈ）リガンド親和性媒体、
ｉ）受容体親和性媒体、
ｊ）混合モード媒体、
ｋ）任意の順序で連続的に行われるａ）からｊ）のうちのいずれか２つ以上の使用、
から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力は、
ａ）１０％以上、
ｂ）２０％以上、
ｃ）３０％以上、
ｄ）４０％以上、
ｅ）５０％以上、
ｆ）１００％以上、
ｇ）２００％以上、
ｈ）５００％以上、および
ｉ）１０００％以上、
から成る群より選択される量だけ超えられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力は、
ａ）１．５倍以上、
ｂ）２倍以上、
ｃ）３倍以上、
ｄ）４倍以上、
ｅ）５倍以上、
ｆ）６倍以上、
ｇ）７倍以上、
ｈ）８倍以上、
ｉ）９倍以上、
ｊ）１０倍以上、
ｋ）２０倍以上、
ｌ）３０倍以上、
ｍ）４０倍以上、
ｎ）５０倍以上、
ｏ）１００倍以上、および
ｐ）５００倍以上、
から成る群より選択される量だけ超えられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記初期混合物中の生物学的製剤の量と比較した、前記最終混合物中の生物学的製剤の量は、
ａ）約１０％から約８０％回収された、
ｂ）約２０％から約６０％回収された、
ｃ）約３０％から約６０％回収された、
ｄ）約３０％から約５０％回収された、
ｅ）約３５％から約５０％回収された、
ｆ）約３５％から約４５％回収された、
ｇ）約４０％から約４５％回収された、
ｈ）約４０％から約５０％回収された、
ｉ）約４５％から約５０％回収された、
ｊ）約１０％回収された、
ｋ）約１５％回収された、
ｌ）約２０％回収された、
ｍ）約２５％回収された、
ｎ）約３０％回収された、
ｏ）約３５％回収された、
ｐ）約４０％回収された、
ｑ）約４５％回収された、
ｒ）約５０％回収された、
ｓ）約５５％回収された、
ｔ）約６０％回収された、
ｕ）約６５％回収された、
ｖ）約７０％回収された、
ｗ）約７５％回収された、および
ｘ）約８０％回収された、
から成る群より選択される量である、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の選択された特性を伴う前記生物学的製剤の濃度は、前記生物学的製剤の初期混合物と比較して、
ａ）少なくとも約５％、
ｂ）少なくとも約１０％、
ｃ）少なくとも約２０％、
ｄ）少なくとも約３０％、
ｅ）少なくとも約４０％、
ｆ）少なくとも約５０％、
ｇ）少なくとも約６０％、
ｈ）少なくとも約７０％、
ｉ）少なくとも約８０％、および
ｊ）少なくとも約９０％、
から成る群より選択される量だけ増加または増進させられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記選択された特性（または複数の特性）は、
ａ）設定ｐＨ値における正味負電荷の程度、
ｂ）設定ｐＨ値における正味正電荷の程度、
ｃ）疎水性の程度、
ｄ）親水性の程度、
ｅ）炭水化物含量の数量および／または種類、
ｆ）Ｎ結合型糖鎖付加含量の数量および／または種類、
ｇ）Ｏ結合型糖鎖付加含量の数量および／または種類、
ｈ）全シアル酸含量、および
ｉ）ａ）からｈ）のうちのいずれか１つ以上、
から成る群より選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的製剤は、
ａ）タンパク質、
ｂ）抗体またはその断片、
ｃ）細胞外受容体リガンド結合ドメインを含む、ポリペプチド
ｄ）受容体リガンド、
ｅ）異種融合タンパク質、
ｆ）免疫グロブリンＦｃ領域を含む、融合タンパク質、および
ｇ）細胞外受容体リガンド結合ドメインと、免疫グロブリンＦｃ領域とを含む、融合タンパク質、
から成る群より選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法はさらに、製造規模で前記生物学的製剤の回収を含む、請求項１から８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法はさらに、治療的に有用な生物学的製剤の回収を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複雑な混合物からの生体分子の分離における改良型方法に関する。より具体的には、本発明は、分子の不均質混合物から得られる生体分子の均質性を選択的に増加させるための改良型方法に関し、具体的には、そのような方法は、大規模調製および製造プロセスに使用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、他の以前に開示された方法と比較して、生体分子の精製において改良型方法を提供する。そのような他の以前に開示された方法のいくつかの実施例は、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，特許文献１（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８９１９）、２００６年９月２１日公開の「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｗｅａｋ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」；  Ｐｌｉｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，特許文献２、１９９５年８月８日公開の「Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」；  Ｐｌｉｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，特許文献３，１９９６年８月１３日公開の「“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｂｙ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」，；非特許文献１；非特許文献２で見出されてもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００６／０９９３０８号
【特許文献２】米国特許第５，４３９，５９１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５４５，３２８号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｗｅａｋ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  （２００８）  １０１（３）：５５３−６６
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｇ  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０１０）  ５６：５９−７０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
少なくとも部分的に、以前の方法は、不純物および望ましくない生成物形態（または「アイソフォーム」）が吸収剤に結合し、望ましい生成物がカラム貫流の中で収集される、貫流動作モードを説明するため、本発明は、前述の方法とは異なる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＳＥ  ＨｉＣａｐ上での線形勾配実行である。
【図２】ＳＥ  ＨｉＣａｐのＴＳＡ結果である。
【図３】ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上での線形勾配実行である。
【図４】ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐのＴＳＡ結果である。
【図５】Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ上での線形勾配実行である。
【図６】Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥのＴＳＡ結果である。
【図７】ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ上での線形勾配実行である。
【図８】ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩのＴＳＡ結果である。
【図９】Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）のＴＳＡ結果である。
【図１０】異なるｐＨ条件でのオーバーレイした線形勾配溶出ピークである。
【図１１】蓄積回収対勾配溶出ｐＨである。
【図１２】蓄積シアル化対勾配溶出ｐＨである。
【図１３】蓄積ＨＭＷ対勾配溶出ｐＨである。
【図１４】蓄積Ｏ−グリカン占有対勾配溶出ｐＨである。
【図１５】末端ＧａｌＮＡｃ蓄積％対勾配溶出ｐＨである。
【図１６】異なる負荷ｐＨ条件でのオーバーレイした破過曲線である。
【図１７】ｐＨ５．５での生成物分割である。
【図１８】ｐＨ６．５での生成物分割である。
【図１９】ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ負荷としての５Ｘ希釈生物学的製剤を用いて行われた実験について得られた代表的クロマトグラムである。
【図２０】ＴＳＡの残余の通常プロットである。
【図２１】スチューデント化された残余帯対ＴＳＡの予測値のプロットである。
【図２２】スチューデント化された残余帯対ＴＳＡの実行数のプロットである。
【図２３】ＴＳＡの予測値対実測値のプロットである。
【図２４】ＴＳＡのＢＯＸ  ＣＯＸプトットである。
【図２５】荷重および負荷ｐＨの関数としてのＴＳＡの等高線図である。
【図２６】負荷ｐＨおよび負荷伝導度の関数としてのＴＳＡの等高線図である。
【図２７】ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスの動作範囲の判定である。
【図２８】溶出ＨＭＷ対負荷濃度である。
【図２９】単量体の多成分等温線である。
【図３０】ＨＭＷの多成分等温線である。
【図３１】ＥｘｃＲ−Ｆｃ  ＴＳＡの富化のためのＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ過負荷結合および溶出プロセスの代表的クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
少なくとも部分的に、本方法は、生物学的製剤が、クロマトグラフィ媒体（または他の基質）の静的または動的結合能力を超える濃度または量で、クロマトグラフィ媒体（または他の基質）に接触することを許可される、「過負荷結合および溶出」動作モードを利用するため、本発明は、前述の方法と比べた改良である。これは、本発明の「過負荷および結合」部分を構成する。過負荷および結合ステップ中に、選択された特性（高い全体正味負電荷または高いシアル酸含量等）を有する生物学的製剤が、優先的にクロマトグラフィ媒体（または他の基質）に結合する一方で、選択された特性を持たない、または（より低い全体正味負電荷、またはより低いシアル酸含量を有する生物学的製剤等の）選択された特性をあまり持たない生物学的製剤（ならびに他の不純物）は、媒体（または基質）から除外または分離される。過負荷および結合ステップの後に、結合された標的生成物が、クロマトグラフィ媒体（または他の基質）から溶出され（あるいは別様に解離または分離され）、回収される。したがって、得られる生物学的製剤混合物は、過負荷結合および溶出精製ステップの適用前の生成物の混合物と比較して、選択された（標的）特性を有する、より高い濃度の生成物で富化されている。
【０００８】
本発明の方法は、任意の数の物理的、生物学的、および／または化学的特性に基づいて、生物学的製剤の分離／精製に適合および適用することができる。例えば、適切な吸着材（例えば、電荷に基づいた分離のための強または弱アニオンまたはカチオン交換樹脂、および疎水性に基づく分離のための疎水性吸着材等）を使用することによって、生成物アイソフォームが、電荷および／または疎水性に基づいて選択的に分離されてもよい。加えて、本発明の方法は、２つの直交生成物属性（例えば、電荷および疎水性）に基づく分離のための混合モードクロマトグラフィ（混合モード媒体）を使用して適用されてもよい。
【０００９】
一実施形態では、生成物は、例えば、ピーク生成物ｐＩ値に基づいて、選択的に富化／分離されてもよく、例えば、より高いｐＩのアイソフォームは、より低いｐＩから分離されてもよく、カチオン交換吸着材上の脱アミド化生成物アイソフォームである。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、生物学的製剤アイソフォーム（または「糖型」）を選択的に富化するために有用であり、選択された、または所望の生成物特性は、シアル酸含量の増加または増進した全体（全）レベルを有するものである。一実施形態では、全生成物の濃度がクロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超えるように、生物学的製剤の混合物でアニオン交換クロマトグラフィ媒体（例えば、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ）に過負荷をかけることによって、増加した全シアル酸含量を伴う生物学的製剤が得られる。過負荷を受けた望ましくない生成物（例えば、より低いシアル酸含量を伴う生成物、および他の不純物）は、クロマトグラフィ媒体を貫流することを許可され、次いで、（高シアル酸含量を伴う）選択された結合生成物が溶出される（あるいは別様にクロマトグラフィ媒体から分離または解離される）。
【００１１】
本発明の実施形態は、多種多様な生物学的製剤の高度に均質の混合物を得るために有用である。そのような生物学的製剤のいくつかの実施例は、制限なく、タンパク質およびタンパク質断片（すなわち、全長および部分長ポリペプチド／ペプチド）、抗体（免疫グロブリン）、異種融合タンパク質等を含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明の方法は、免疫グロブリン（またはそのドメイン、領域、断片）と融合された非免疫グロブリンタンパク質（またはその断片）の分離／精製に使用されてもよい。一実施形態では、例えば、本発明の方法は、免疫グロブリンのＦｃ領域（ＩｇＧ分子のＦｃ領域等）と結合された（すなわち、「融合された」）細胞外受容体リガンド結合ドメインを含む、融合タンパク質の分離／精製に使用される。本発明の方法が適用されてもよい、抗体融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）は、当技術分野で周知であり、例えば、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｍ．  Ｃｈａｒｎｏｗ  ＆  Ａｖｉ  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ  （１９９９）  （ＩＳＢＮ  ０−４７１−１８３５８−Ｘ）；  および“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”  ｂｙ  Ｍｅｇ．  Ｌ．  Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”  ３７８：  ３３−５２  （２００７），  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．  Ａｌｂｉｔａｒ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ  （ＤＯＩ：  １０．１００７／９７８−１−５９７４５−３２３−３＿３）を参照されたい。本発明の方法が適用されてもよい、Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの具体的実施例は、制限なく、例えば、Ｆｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第７，２９４，４８１号（２００７年１１月１３日発行）；  Ｄｒａｐｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第７，３００，７７３号（２００７年１１月２７日発行）；  およびＲｙｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，５２８，２８６号（２００３年３月４日発行）で説明されているもの等を含む。
【００１３】
本発明の実施形態は、制限なく、最終混合物中の生物学的製剤の濃度を増進または増加させるための方法を含み、該生物学的製剤は、１つ以上の選択された特徴を有し、該方法は、
（ａ）選択された特性を伴う、および伴わない生物学的製剤の初期混合物が、クロマトグラフィ媒体に接触することを可能にすることであって、該初期混合物中の生物学的製剤の数量は、該クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超える、可能にすることと、
（ｂ）該１つ以上の選択された特性を持たない生物学的製剤が、該クロマトグラフィ媒体から解離または分離されることを可能にすることと、
（ｃ）該クロマトグラフィ媒体から生物学的製剤の最終混合物を回収することであって、該最終混合物は、該初期混合物中の生物学的製剤の濃度と比較して、１つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の増進または増加した濃度を含む、回収することと、
を含む。
本発明の実施形態は、任意の既知である、あるいは後に開示または開発される、クロマトグラフィ媒体または基質の使用を含む。そのような媒体の実施例は、制限なく、イオン交換媒体、アニオン交換媒体、カチオン交換媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体、抗体親和性媒体（例えば、タンパク質Ａまたはその変異形）、免疫グロブリンＦｃ領域親和性媒体（例えば、Ｆｃ受容体親和性媒体）、およびリガンド親和性媒体、受容体親和性媒体、および混合モード媒体を含む。
【００１４】
本発明の実施例は、クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、１００％以上、２００％以上、５００％以上、および１０００％以上超えられる、方法を含む。本発明の実施形態は、該クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、および５００倍以上超えられる、方法を含む。
【００１５】
本発明の実施形態は、初期混合物中の生物学的製剤の量と比較した、最終混合物中で回収される生物学的製剤の量は、約１０％から約８０％回収された、約２０％から約６０％回収された、約３０％から約６０％回収された、約３０％から約５０％回収された、約３５％から約５０％回収された、約３５％から約４５％回収された、約４０％から約４５％回収された、約４０％から約５０％回収された、約４５％から約５０％回収された、約１０％回収された、約１５％回収された、約２０％回収された、約２５％回収された、約３０％回収された、約３５％回収された、約４０％回収された、約４５％回収された、約５０％回収された、約５５％回収された、約６０％回収された、約６５％回収された、約７０％回収された、約７５％回収された、および約８０％回収された、方法を含む。
【００１６】
本発明の実施形態は、１つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の濃度が、生物学的製剤の初期混合物と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、および少なくとも約９０％増加または増進させられる、方法を含む。
【００１７】
本発明の実施形態は、選択された特性（または複数の特性）が、設定ｐＨ値における正味負電荷の程度、設定ｐＨ値における正味正電荷の程度、疎水性の程度、親水性の程度、炭水化物含量の数量および／または種類、Ｎ結合型糖鎖付加含量の数量および／または種類、Ｏ結合型糖鎖付加含量の数量および／または種類、全シアル酸含量のうちのいずれか１つ以上を含む、方法を含む。
【００１８】
本発明の実施形態は、生物学的製剤が、タンパク質、抗体またはその断片、細胞外受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、受容体リガンド、異種融合タンパク質、免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、細胞外受容体リガンド結合ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を含む、方法を含む。
【００１９】
本発明の実施形態は、製造規模で選択された生物学的製剤を回収するための方法を含み、選択された生物学的製剤は、治療的に有用または有益な化合物である。
定義および略称：
【００２０】
動的結合能力（ＤＢＣ）：クロマトグラフィ媒体の動的結合能力は、非結合標的生成物の破過が起こる前に実際の流動条件下で媒体が結合する、標的生成物の量である。このパラメータは、流速が増加させられるにつれて生じ得る質量移動制限の影響を反映するため、飽和または静的結合能力の単純な判定よりも、実際のプロセス性能を予測する際にはるかに有用である。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｒｉｅｆ，  Ｌｉｔ．  Ｎｏ．  ＴＢ１１７５ＥＮ００  （２００５）を参照されたい。一般に、流速が低くなるほど、動的能力が高くなる。動的結合能力は、当業者によって日常的に判定される。例えば、ＤＢＣは、標的生成物の既知の濃度を含有するサンプルを装填し、サンプルを適用しながらカラム貫流の中の生成物を監視することによって判定することができる。例えば、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｓｅｃｔ．  １．４．３  （ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇａｎａｐａｔｈｙ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  ＫＧａＡ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）  ２ｎｄ  Ｅｄ．；  ２００７を参照されたい。
【００２１】
結合能力／静的結合能力：静的（非貫流）条件下で媒体が結合する標的生成物の量。
【００２２】
過負荷／過負荷をかける／過負荷を受ける：吸着材あるいは他の親和性または生成物捕捉媒体または樹脂の結合能力または動的結合能力を超えること。
ＡＥＸ：      アニオン交換クロマトグラフィ
ＣＥＸ：      カチオン交換クロマトグラフィ
ｃＨＴ：      カルシウムヒドロキシアパタイト
ＣＶ：        カラム体積
ＤＦ：        透析濾過
ＤｏＥ：      実験計画
ＨＩＣ：      疎水性相互作用クロマトグラフィ
ＨＭＷ：      高分子量
ＰＳ：        パイロット規模
ＯＤ：        光学密度
ＴＳＡ：      全シアル酸
ＵＦ：        限外濾過
ＷＦＩ：      注射用蒸留水
【００２３】
当技術分野の技能の範囲内の知識を適用することによって、本発明の実施形態は、本発明の一般的概念から逸脱することなく、必要以上の実験なしで、種々の用途のために修正および／または適合されてもよい。したがって、そのような適合および修正は、本明細書で提示される教示および誘導に基づいて、開示された実施形態の同等物の意味および範囲内にあることを目的としている。
【実施例】
【００２４】
実施例１
概要
同じ初期混合物中に存在する、減少したレベルまたはより低いレベルのシアル化を伴う生物学的製剤と比較して、増進または増加したレベルのシアル化を伴う生物学的製剤の単離／精製／富化のために、クロマトグラフィプロセスが開発された。
１  はじめに
【００２５】
本実施例で利用された生物学的製剤は、ヒトヒト免疫グロブリンのＦｃドメインに結合された細胞外受容体リガンド結合ドメイン（以降では「ＥｘｃＲ−Ｆｃ」）を含む、Ｆｃ融合タンパク質であった。生物学的製剤は、１３０〜１５０ｋＤａの見掛けの分子量および７．１５の理論的ｐＩを有する。それは、組み換えＤＮＡ技術によって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ほ乳類発現系において産生された。生成物は、細胞外ドメインおよびＦｃ領域の中に複数の潜在的Ｎグリカンを伴う複雑な炭水化物プロファイルを有する。加えて、生成物は、細胞外ドメインの中に複数の潜在的Ｏグリカンを有する。翻訳後修飾のためのこれらの複数の潜在的部位は、様々な程度のＮおよびＯグリカン占有ならびに様々なレベルのシアル化を伴う分子を含有する、不均質生成物プールをもたらす。
【００２６】
生物学的製剤の高度にシアル酸化した形態は、極めて望ましい部類の治療的に有利なタンパク質アイソフォームを表すことができる。本実施例は、許容可能な生成物回収および収率を維持しながら、生物学的製剤の回収／単離された高度にシアル酸化した形態の含量を富化することが可能である、堅調なプロセスの開発を説明する。この特定の実施例では、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐクロマトグラフィが、Ｆｃ融合タンパク質の高度にシアル酸化した形態を回収／単離するために使用された、プロセスが開発された。
【００２７】
最初に、多くの異なる吸着材およびクロマトグラフィモード（すなわち、ＣＥＸ、ＡＥＸ、ＨＩＣ、およびｃＨＴ）が、シアル化の程度の差に基づいてタンパク質アイソフォームを分離する能力について選別された。ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐが、他の試験された吸着材と比較して、生成物糖型の向上した分解能およびより高い生成物収率を提供したため選択された。貫流モードでのＥｘｃＲ−Ｆｃの動的結合能力および糖型の分割を測定するために、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上で破過実験が行われた。これらの結果に基づいて、「過負荷」結合および溶出プロセスが開発され、より高度にシアル酸化した糖型が、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ吸着材上で優先的に吸着および濃縮された一方で、ＥｘｃＲ−Ｆｃの低シアル酸化または非シアル酸化糖型がカラムを貫流した。後に、生成物プールの中で富化した高シアル酸化糖型を回収するように、カラムが溶出された。
【００２８】
荷重条件を最適化して、生成物のシアル化および回収の増進を最大限化するように、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラム上で結合および溶出実験が行われた。プロセスのロバスト性を評価するため、ならびに生成物品質および収率への主要プロセスパラメータの影響を識別するために、実験計画（ＤｏＥ）アプローチが採用された。加えて、所望の生成物品質条件を一貫して満たすプロセスの能力を検査するために、例示的な「最悪」条件下で精製の実行が行われた。
２  材料
クロマトグラフィ吸着材
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）  ＥＭＤ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  ６ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）
カラム
Ｃ０９６９：ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ、０．６６ｃｍ内径×１５．７ｃｍ層高（１ＣＶ＝５．４６ｍＬ）
Ｃ１０２１：ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ、０．６６ｃｍ内径×１４．５ｃｍ層高（１ＣＶ＝４．９６ｍＬ）
Ｃ１０６３：ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ、０．６６ｃｍ内径×１５．３ｃｍ層高（１ＣＶ＝５．２３ｍＬ）
Ｃ１０９９：ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ、０．６６ｃｍ内径×１５．３ｃｍ層高（１ＣＶ＝５．２３ｍＬ）
Ｃ１１０４：ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ、０．４６ｃｍ内径×１０．０ｃｍ層高（１ＣＶ＝１．６６２ｍＬ）
Ｃ１００５：ＳＥ  ＨｉＣａｐ、０．６６ｃｍ内径×１６．２ｃｍ層高（１ＣＶ＝５．５４ｍＬ）
Ｃ０９８１：ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ、０．６６ｃｍ内径×１６．１ｃｍ層高（１ＣＶ＝５．５１ｍＬ）
Ｃ１０２８：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、０．６６ｃｍ内径×１６．１ｃｍ層高（１ＣＶ＝５．５１ｍＬ）
機器
AＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）
３  方法
【００２９】
以下の項は、ＥｘｃＲ−Ｆｃ生成物のシアル化の全体的レベルを高めるためにクロマトグラフィプロセスを開発および最適化するように行われる、実験の詳細な説明を提供する。初期の開発実験（第４．１〜４．３項）は、酵素ベースの脱シアル化を採用し、その後に、放出されたシアル酸の蛍光標識およびＴＳＡ含量の定量のための蛍光分析（すなわち、ＤＭＢ方法）が続いた。しかしながら、この検定は、低い精度および感度を有した。したがって、脱シアル化のために酸加水分解を採用し、その後に放出されたシアル酸のＵＶ−ＨＰＬＣ分析が続いた、新しく、より正確なＴＳＡ検定が開発され、後続の開発研究に採用された（第４．４項および４．５項）。各分析では、プロセスステップおよび／または研究で評価されている実験条件によって提供された相対的ＴＳＡ増進の判定を可能にした、内部検定対照として、対照サンプルが実行された。
３．１  吸着材選別
【００３０】
開発の開始時に、シアル化のレベルに基づいて、生成物糖型の良好な分解能を提供したクロマトグラフィモードおよび吸着材を識別するように、線形勾配実験が、カチオン交換（ＳＥ  ＨｉＣａｐ）、アニオン交換（ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐおよびＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥ）、およびヒドロキシアパタイト（ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）クロマトグラフィに行われた。これらの実験は、中和されたＰｒｏｓｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ溶出緩衝液（すなわち、７５ｍＭ酢酸塩、ｐＨ３．３が２．４Ｍトリスベースを使用してｐＨ５．０に中和された）に透析濾過された初期パイロット規模実行（ＰＳ４）から得られた、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦカラム溶出液を使用した。
【００３１】
加えて、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）上の疎水性相互作用クロマトグラフィも、ＥｘｃＲ−Ｆｃのシアル化のレベルを高める能力について評価された。したがって、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィの開発中に行われた実験からの溶出液サンプルも、全シアル酸（ＴＳＡ）分析のために評価された。
【００３２】
いったんＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐが、さらなるプロセスの開発のために吸着材として選択されると、種々の生成物糖型の分解能へのｐＨ（すなわち、ｐＨ５．５、６．５、７．５、および８．５）の影響を評価するように、付加的な線形勾配実験が行われた。これらの実施形態は、出発材料として、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸塩溶液に透析濾過されたパイロット規模実行（ＰＳ１０）から得られた、生物学的製剤を使用した。以下の方法は、２８０、３００、および３１３ｎｍで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は１５０ｃｍ／ｈｒの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。
１．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス／３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが事前に平衡化された。
２．それぞれ、５．５、６．５、７．５、および８．５の負荷ｐＨレベルについて、ｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．５である５０ｍＭビストリス、ｐＨ７．５である５０ｍＭトリス、およびｐＨ８．５である５０ｍＭトリスの５ＣＶで、カラムが平衡化された。
３．２．４Ｍトリスベースで適切なｐＨに調整された出発材料を用いて、カラムが２０ｍｇ／ｍＬまで装填された。
４．平衡溶液の３ＣＶでカラムが洗浄された。
５．対応する平衡溶液中で、３０ＣＶにわたって０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌの線形塩勾配でカラムが溶出された。勾配の終わりに、高食塩水でカラムを洗浄するように、％Ｂが２ＣＶにわたって１００％で維持された。カラム溶出液が２ＣＶ留分で収集された。
６．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス＋３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが揮散された。
７．０．５Ｍ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが浄化された。
８．ｐＨ２．５である５０ｍＭ酢酸塩＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが再生された。
９．ｐＨ３．２である１％ベンジルアルコール＋０．５Ｍ酢酸＋１６ｍＭ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが保管された。
３．２  破過および分割実験
【００３３】
負荷ｐＨ、すなわち、ｐＨ５．５、６．５、７．５、および８．５の関数として、糖型の分割ならびにＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上の動的結合能力（ＤＢＣ）を評価するように、実験が行われた。これらの実験は、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸塩に透析濾過され、ＤＦ緩衝液で約５ｍｇ／ｍＬに希釈され、２．４Ｍトリスベースで適切なｐＨに調整された、パイロット規模実行（ＰＳ１０）からの生物学的製剤を採用した。各負荷ｐＨ条件について、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラムが１５０ｍｇ／ｍＬまで装填され、貫流留分が１０ｍｇ／ｍＬ増分で収集され、ＴＳＡレベルについて分析された。以下の方法は、２８０、３００、および３１３ｎｍで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は１５０ｃｍ／ｈｒの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。
１．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス／３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが事前に平衡化された。
２．それぞれ、５．５、６．５、７．５、および８．５の負荷ｐＨレベルについて、ｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．５である５０ｍＭビストリス、ｐＨ７．５である５０ｍＭトリス、およびｐＨ８．５である５０ｍＭトリスの５ＣＶで、カラムが平衡化された。
３．平衡の終わりに、ＵＶモニタが自動的にゼロにされた。
４．適切なｐＨにある負荷プールを用いて、カラムが１５０ｍｇ／ｍＬまで装填された。
５．平衡溶液の３ＣＶでカラムが洗浄された。
６．３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、対応する平衡溶液の３ＣＶで、カラムが溶出された。
７．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス＋３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが揮散された。
８．０．５Ｍ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが浄化された。
９．ｐＨ２．５である５０ｍＭ酢酸塩＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが再生された。
１０．ｐＨ３．２である１％ベンジルアルコール＋０．５Ｍ酢酸＋１６ｍＭ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが保管された。
３．３  予備開発
【００３４】
分割実験の結果に基づいて、シアル酸化した生成物糖型を富化する目的で、過負荷モードでＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐを使用することの実行可能性を判定するように、予備結合および溶出実験が行われた。これらの実験は、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸塩に透析濾過され、ＤＦ緩衝液で約５ｍｇ／ｍＬに希釈され、２．４ＭトリスベースでｐＨ５．５に調整された、ＰＳ１０生物学的製剤を採用した。１００および１５０ｍｇ／ｍＬのカラム搭載が調査され、対応する溶出液プールがＴＳＡおよびＳＥＣ検定によって分析された。以下の方法は、２８０、３００、および３１３ｎｍで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は１５０ｃｍ／ｈｒの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。
１．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス／３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが事前に平衡化された。
２．ｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩の５ＣＶで、カラムが平衡化された。
３．適切なｐＨにある負荷プールを用いて、カラムが標的装填状態まで装填された。
４．平衡溶液の３ＣＶでカラムが洗浄された。
５．ｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩＋３００ｍＭ  ＮａＣｌの８ＣＶで、カラムが溶出された。溶出液プール収集が溶出ステップの開始時に開始され、≦０．１ＡＵのＯＤ２８０に達した時に完結された。
６．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス＋３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが揮散された。
７．０．５Ｍ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが浄化された。
８．ｐＨ２．５である５０ｍＭ酢酸塩＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが再生された。
９．ｐＨ３．２である１％ベンジルアルコール＋０．５Ｍ酢酸＋１６ｍＭ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが保管された。
【００３５】
以前のＵＦ／ＤＦステップを必要とすることなく、カラム装填材料として希釈生物学的製剤を採用するというオプションを評価するために、過負荷結合および溶出実験が、カラム性能への負荷組成の影響を評価するように希釈生物学的製剤を用いて実行された。この目的を果たすために、ｐＨ５．５に調整されたＰＳ１０生物学的製剤が、（ｉ）ＷＦＩで５倍、（ｉｉ）ＷＦＩで１０倍、および（ｉｉｉ）ＷＦＩで５Ｘに希釈され、その後にｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩での２倍希釈が続いた。上記で説明される方法を使用して、各負荷調製について、１００ｍｇ／ｍＬ装填時の結合および溶出実行が行われた。
３．４  実験計画（ＤｏＥ）研究
【００３６】
過負荷結合および溶出ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップに対する好適な動作条件を識別して、許容生成物収率を維持しながら、生成物のシアル化の所望のレベルの富化を提供するように、実験計画（ＤｏＥ）研究が行われた。主要プロセスパラメータおよびそれらの調査された範囲は、カラム装填（９０〜１６０ｍｇ／ｍＬ）、負荷ｐＨ（５．２〜５．８）、および負荷伝導度（２．４〜４．４ｍＳ／ｃｍ）であった。Ｓｔａｔ−Ｅａｓｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  ｖ８．０（Ｓｔａｔ−Ｅａｓｅ，  Ｉｎｃ．，  ミネアポリス，  ミネソタ州）ソフトウェアを使用して、１８回の実行（４回の中心点実験を含む）から成る中心複合設計が作成された。各ＤＯＥ実行について、動作パラメータはＤｏＥ実験計画表（表１）の通りに様々であった。
【表１】
2014503495.tif 000002
【００３７】
ＤｏＥ実験に採用された装填材料は、ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸塩に透析濾過され、ＤＦ緩衝液で約５ｍｇ／ｍＬに希釈された、プロトタイプ実行（ＰＳ１４）から得られた生物学的製剤から生成された。各ＤｏＥ実行について、１Ｍビストリスまたは２Ｎ酢酸で滴定することによって、負荷が所望のｐＨに調整された一方で、ＷＦＩまたはｐＨ５．５の５００ｍＭ酢酸塩溶液を使用して、負荷伝導度が調整された。
【００３８】
ＴＳＡおよび％ＨＭＷといった、２つの主要プロセス出力が、各溶出液プールについて測定され、データを分析し、各応答のモデルを構築するために、ソフトウェアが採用された。加えて、プロセス回収も分析され、モデル化された。上記で説明されるクロマトグラフィ方法が、これらのＤｏＥ実験に採用された。
３．５  付加的なプロセス特性化
【００３９】
以下のために、付加的な一点結合および溶出実験（表２）がＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上で行われた。
１．ＤｏＥモデルの予測能力を立証し、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセス性能への負荷ロット可変性の影響を調べる（実行２、５、８）。
２．大規模産生で使用するためのＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ吸着材ロットの性能を評価する（実行２、５、８）。
３．プロセス性能への流速の影響を検討する（実行１〜３および１１〜１３）。
４．生成物品質および収率への負荷濃度の影響を調べる（実行４〜６および７〜９）。
５．負荷ＴＳＡ（実行１２）および負荷ＨＭＷ（実行１０）の最悪条件下で得られる、シアル酸（ＳＡ）富化および溶出液ＨＭＷレベルを評価する。
【表２】
2014503495.tif 000003
【００４０】
ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸塩に別々に透析濾過されたＰＳ１０およびＰＳ１６生物学的製剤が、これらの実験に採用された。各実行について、１Ｍビストリスまたは２Ｎ酢酸で滴定することによって、負荷が所望のｐＨに調整された一方で、ＷＦＩおよび／またはｐＨ５．５の５００ｍＭ酢酸塩溶液を使用して、負荷伝導度が調整された。以下の方法は、２８０、３００、および３１３ｎｍで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は１５０ｃｍ／ｈｒの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。
１．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス／３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが事前に平衡化された。
２．ｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩の５ＣＶで、カラムが平衡化された。
３．適切な濃度、ｐＨ、および伝導度に調整された負荷プールを用いて、カラムが標的装填状態まで装填された。
４．平衡溶液の３ＣＶでカラムが洗浄された。
５．ｐＨ５．５である５０ｍＭ酢酸塩＋３００ｍＭ  ＮａＣｌの８ＣＶで、カラムが溶出された。溶出液プール収集が溶出ステップの開始時に開始され、≦０．１ＡＵのＯＤ２８０に達した時に完結された。
６．ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス＋３Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが揮散された。
７．０．５Ｍ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが浄化された。
８．ｐＨ２．５である５０ｍＭ酢酸塩＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ＣＶで、カラムが再生された。
９．ｐＨ３．２である１％ベンジルアルコール＋０．５Ｍ酢酸＋１６ｍＭ  ＮａＯＨの３ＣＶで、カラムが保管された。
【００４１】
後に、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスステップの負荷濃度をさらに最適化するように、付加的な一点実験が行われた。２〜３０ｍｇ／ｍＬの負荷濃度が評価された。ｐＨ５．３の５５ｍＭ酢酸塩に透析濾過されたＰＳ１６生物学的製剤が、これらの実験用の出発材料として採用された。透析濾過されたプールは、ＨＭＷの最悪負荷ｐＨおよび伝導度条件（すなわち、ｐＨ５．１および３．９ｍＳ／ｃｍ）に調整され、ｐＨ５．１および３．９ｍＳ／ｃｍに調整された５５ｍＭ酢酸塩を使用して、適切な標的負荷濃度に希釈された。上記で説明されるクロマトグラフィ方法を使用して、１００ｃｍ／ｈｒの線流速において、１．６６ｍＬ（０．４６×１０ｃｍ）スクリーニングカラム上で実験が行われた。注記：これらの実行の速度は、１５ｃｍ層高開発カラム上の滞留時間に合致するために低減された。
４  結果および考察
４．１  吸着材選別
【００４２】
生成物のシアル化の富化のための好適なクロマトグラフィステップを識別するために、線形勾配実験が、種々のクロマトグラフィモードおよび吸着材を選別するように行われた。この目的を果たすために、カチオン交換（ＳＥ  ＨｉＣａｐ）、アニオン交換（ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐおよびＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥ）、ヒドロキシアパタイト（ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）、およびＨＩＣ（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ）吸着材が評価された。各実行の溶出液留分について行われたＴＳＡ分析に結果が、以下に示される。これらの結果は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐが、この研究で評価された他の吸着材と比較して、比較的高いプロセス収率で最高量のＳＡ富化を提供したことを明確に示した。
４．１．１  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ
【００４３】
図１は、ＳＥ  ＨｉＣａｐ上で行われた線形勾配実行について得られたクロマトグラムを示す。結果は、ＳＥ  ＨｉＣａｐがシアル化の限定された富化を提供し、全ての留分中のＴＳＡレベルが対照サンプルレベルを下回ったことを示した（図２）。
４．１．２  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ
【００４４】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上の線形勾配クロマトグラムが、図３に示されている。溶出液留分のＴＳＡ分析は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐがシアル酸化した生成物糖型の良好な分解能を提供したことを示した（図４）。予想通りに、高シアル酸化種が、より強力に結合し、勾配の後期で溶出した。後期溶出留分（すなわち、留分９から１１）の蓄積ＴＳＡレベルは、対照サンプルのレベルと合致した。
４．１．３  Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ
【００４５】
図５は、Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ上で行われた線形勾配実行のクロマトグラムを示す。溶出液留分の分析は、この吸着材が糖型の限定された分離を提供したことを示した（図６）。
４．１．４  ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ
【００４６】
ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ上で行われた実験の線形勾配クロマトグラムが、図７に示されている。図８に示されるように、この吸着材は、生成物のシアル化の富化をほとんど全く提供しなかった。
４．１．５  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）
【００４７】
ＥｘｃＲ−Ｆｃ精製プロセスにおける第３のステップとして、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの開発の経過中に４００〜７００ｍＭの硫酸アンモニウムの異なる溶出条件を使用して生成された、溶出液プールが、ＴＳＡ検定によって分析された。図９に示されるように、提供されたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、種々の糖型の非常に限定された分解能を提供した。
４．１．６  糖型分離へのｐＨの影響
【００４８】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上でのＥｘｃＲ−Ｆｃの糖型の分離へのｐＨの影響を評価するために、付加的な分離が行われた。この目的を果たすために、ｐＨ５．５、６．５、７．５、および８．５で実験が行われ、溶出液留分がＴＳＡ分析によって分析された。図１０は、これらの線形勾配実行のオーバーレイしたクロマトグラムを示す。これらの結果は、同等生成物収率（図１１）およびシアル酸化した糖型の分解能（図１２）が、これらのプロット中の平行な曲線によって示されるように、異なるｐＨ条件で得られたことを示した。予想通りに、高シアル酸化糖型のより優れた結合親和性により、生成物のシアル化のレベルが、分数の増加とともに増加した。注記：異なるｐＨ条件での曲線は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ吸着材上でのより強力な結合により、ｐＨの増加とともにより高い分数に向かって移動し、相互からわずかにオフセットされた。
【００４９】
加えて、溶出液サンプルはまた、ＳＥＣによってＨＭＷ（図１３）、無傷質量分析によってＯグリカン占有（図１４）、およびＣＥ−ＬＩＦによって末端ＧａｌＮＡｃ（図１５）についても分析された。ＨＭＷレベルは、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上のＨＭＷ種のより高い結合親和性により、ＴＳＡについて見られた傾向と同様に、分数の増加とともに増加した。同様に、無傷質量およびＣＥ−ＬＩＦの結果はそれぞれ、分数の増加とともに、Ｏグリカン占有が増加し、末端ＧａｌＮＡｃの割合が減少し、対照サンプル材料でのレベルに近づいたことを示した。再度、これらの生成物品質属性の相対的変化は、これらの図中の平行な曲線によって示されるように、異なるｐＨで同等であった。したがって、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップは、生成物の全体的グリカンプロファイル（Ｏグリカン占有および末端ＧａｌＮＡｃ）の同時向上を提供しながら、対照サンプル材料のレベルに合致する、またはレベルを超えるように、ＴＳＡレベルを増進させることができた。同時に、これらの結果は、溶出ｐＨ条件を変化させることによって、糖型分解能および／または選択性の向上がＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上で得られなかったことを示した。
４．２  破過および分割実験
【００５０】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ吸着材上の異なってシアル酸化された生成物糖型の分割を評価するように、異なる負荷ｐＨ条件で破過実験が行われた。図１６は、異なる負荷ｐＨで得られた、オーバーレイした破過曲線を示す。図に示されるように、急な生成物破過がｐＨ７．５および８．５で得られた一方で、より浅い破過曲線がｐＨ５．５および６．５で観察され、これらの条件下での固定および移動相の間の生成物分割を示唆した。表３は、異なる負荷ｐＨ条件で計算された動的破過能力値（すなわち、１０％ＤＢＣ）を示す。
【表３】
2014503495.tif 000004
【００５１】
ｐＨ５．５および６．５での実行に対するカラム貫流留分のＴＳＡ結果は、より負に帯電した、高シアル酸化生成物形態が、低シアル酸化または非シアル酸化種と比較して、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ吸着材へのより優れた結合親和性を有したことを示した。カラム装填および貫流留分の生成物濃度およびＴＳＡ含量に基づいて、カラム装填の関数として吸着された生成物の質量（すなわち、回収）およびＴＳＡを判定するように、質量平衡が行われた（図１７および１８）。これらの図に示されるように、これらの条件下での動作は、カラムに過負荷をかけ、後にカラムから吸着されたタンパク質を溶出して、高度にシアル酸化した生成物プールを得ることによって、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ吸着材上でシアル酸化した糖型を濃縮することにより、生成物のＴＳＡレベルを高める独自の機会を提供した。結果はまた、ｐＨ６．５負荷条件と比較して、比較的高い生成物収率での有意に優れたＴＳＡ富化がｐＨ５．５で得られたことを示した。したがって、≧１００ｍｇ／ｍＬのカラム装填でのｐＨ５．５／約３．２ｍＳ／ｃｍ負荷条件が、さらなる開発のために選択された。
４．３  予備開発
【００５２】
上記の破過／分割研究で識別された負荷条件下、すなわち、ｐＨ５．５／約３．２ｍＳ／ｃｍで、過負荷結合および溶出モードで操作することによって、生成物のシアル化を増加させるＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラムステップの能力を評価するように、概念実証実験が行われた。１００および１５０ｍｇ／ｍＬカラム装填で行われた一点実験の結果が、表４で要約される。結果は、このモードで操作された時に、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐがシアル化の有意な富化を提供し、ＴＳＡレベルが、負荷中の１１．３ｍｏｌＳＡ／ｍｏｌＥｘｃＲ−Ｆｃから溶出液プール中の１４．３〜１５．４ｍｏｌ／ｍｏｌまで増加させられたことを示した。加えて、溶出液ＴＳＡレベルは、カラム貫流中のより高い生成物損失による回収の同時低下を伴って、負荷の増加とともに増加する。したがって、対照サンプルシアル化のレベル（すなわち、１４．６〜１５．２ｍｏｌ／ｍｏｌ）に合致するＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップの能力の実証が成功した。ＳＥＣ分析は、ＨＭＷレベルが負荷中の２．２％から溶出液プール中の２．９〜３．１％までわずかに増加したことを明らかにした。しかしながら、カラム溶出液中のＨＭＷレベルは、生物学的製剤の放出に対する≦３．５％の作用限界を下回った。
【表４】
2014503495.tif 000005
【００５３】
全ての以前のＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ開発実験は、パイロット規模で生成されたＥｘｃＲ−Ｆｃ生物学的製剤からＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ装填材料を調製するために、ＵＦ／ＤＦシステムで行われた透析濾過ステップを採用した。生物学的製剤の再処理がシアル化を富化するために必要とされる単位動作の数を削減するために、カラム装填材料として希釈生物学的製剤を採用することの実行可能性を評価するように実験が行われた。図１９に示されるように、生物学的製剤の単純５倍希釈で行われた実験は、非定型の不規則な負荷破過曲線を示し、処方緩衝液構成要素からの潜在的な干渉および／または装填材料におけるｐＨ干渉能力の欠如を示唆した。生物学的製剤がＷＦＩで１０倍に希釈された時に、非定型破過曲線ならびに有意な生成物結合（より低い負荷伝導度による）が得られた（データは示されていない）。これらの条件下でのプロセス制御の欠如により、これらのオプションは考慮から除外され、サンプルは分析試験のために提出されなかった。
【００５４】
ＷＦＩで５倍に希釈され、その後に緩衝液（５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５）による２倍希釈が続いた、生物学的製剤を用いて行われた実験は、より典型的な破過挙動（クロマトグラムは示されていない、６）を示した。加えて、この場合に得られた（負荷ＴＳＡに対する）ＴＳＡ富化は、同等のカラム装填ならびに負荷ｐＨおよび伝導度（すなわち、表５の３．１ｍｏｌ／ｍｏｌ富化対表４の３．０ｍｏｌ／ｍｏｌ富化）で透析濾過された生物学的製剤を用いて得られたものと同等であった。しかしながら、この場合、透析濾過された生物学的製剤を使用して行われた実行に対して、より優れた生成物結合および結果的により低い収率が得られた（すなわち、表５の５６％対表４の６５％）。したがって、上記の結果は、より良好なプロセス制御およびＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップからのより高い生成物収率を確保するように、ＥｘｃＲ−Ｆｃ生物学的製剤を適切な負荷緩衝液に透析濾過するためのＵＦ／ＤＦステップの必要性を明確に実証する。
【表５】
2014503495.tif 000006
４．４  実験計画（ＤｏＥ）研究
【００５５】
表６は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ過負荷結合および溶出クロマトグラフィプロセスの動作のための好適な条件を判定するように行われた、ＤｏＥ実験の結果を示す。ＴＳＡ、ＨＭＷ、および回収が測定され、主要プロセス出力としてモデル化された。全ての他の純度標的がプロセスによって十分制御されたことを確実にするように、還元性または非還元性ＬＣ９０／ＧＸＩＩによる宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルおよび生成物純度も監視された。表に示されるように、全てのＤｏＥ実行の溶出液プールは、同等の高い純度、ならびに非常に低いレベルのＨＣＰ、すなわち、検定ＬＯＱまたはその付近にあるレベルを有した。
【表６】
2014503495.tif 000007
【００５６】
実験実行からの結果は、Ｓｔａｔ−Ｅａｓｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  ｖ８．０ソフトウェアにインポートされ、分析された。各出力の分析は、その出力へのプロセスパラメータの影響を表した数学的モデルの選択を伴った。データは、最良モデル方程式によって適合され、あらゆる有意でないパラメータを除去するように分散分析（ＡＮＯＶＡ）が行われた。これは、後続の項で各出力について概説される。以下の方法が、各応答の分析に利用された。
【００５７】
適合概要プログラムが、回帰計算を行って、多項式モデルの全てを選択された応答に適合させるために活用された。適合概要プログラムは、全てのモデル項に対する影響を計算し、最良モデル（複数可）を比較して選択するために、Ｐ値、不適合度、およびＲ２統計を生じた。選択されたモデルは、付加的な項が有用であり、モデルがエイリアス作成されず、不適合度が最小限化され、調整および予測されたＲ２値が最大限化された、最上位多項式であった。
【００５８】
応答への影響が雑音のみによるものとなり得る５％未満の可能性があった（より大きいＦ値［Ｐｒｏｂ＞Ｆ］＜０．０５の確率、ｐ値＜０．０５）場合に、プロセス変数のみが残るまで、後方選択を介して１度に１つの入力パラメータを除去することによって、各応答の分散分析を使用して、有意なパラメータが判定された。これらの要因は、応答に影響を及ぼす有意な要因であると見なされた。要因は、階級を支持するためにＰ値≧０．０５である時に、モデルに含まれた。
【００５９】
モデルが有意であり、不適合度が有意でなかった（ｐ値≧０．０５）ことを確実にするように、かつ調整および予測されたＲ２値を調べるように、付加的な分散分析が調べられた。≧０．５の予測されたＲ２値は、モデルがプロセスモデル化のために十分であるかどうかを判定するために利用された。予測および調整されたＲ２値は、相互の０．２以内となるべきである。
【００６０】
データが残余の異常値、非正常性、または不均一分散性を含有するか、あるいは変換を必要とするかを調べるために、診断ツールが利用された。変換が適用された、異常値が調査された後に、有意な要因が識別され、モデルが生成された。
【００６１】
表７は、各応答に影響を及ぼす有意な要因を識別する分散分析からの結果を要約し（ｐ値＜０．０５）、二乗誤差計算の合計および不適合度の有意性を通して、モデル適合および予測能力を調べる。ＨＣＰおよび純度率に影響を及ぼした有意なモデルまたは有意なパラメータは識別されなかった。個々の応答の分析は、第５．４．１項〜５．４．６項で見出すことができる。
【表７】
2014503495.tif 000008
【００６２】
以下の方程式の形態で、各応答についてモデルが生成された。各応答の係数が表８に記載される。
【数１】
2014503495.tif 000009
【表８】
2014503495.tif 000010
【００６３】
ＴＳＡ、ＨＭＷ、回収応答について、対応する応答レベルを予測するように、動作空間内の入力パラメータの所与の組み合わせに対して９９％予測区間が生成された。いずれのモデルも識別されなかった応答、すなわち、ＨＣＰ、最高単一不純物、および純度について、応答レベルを予測するために、平均値の周囲の３つの標準偏差が利用された（表９）。
【表９】
2014503495.tif 000011
４．４．１  全シアル酸（ＴＳＡ）
【００６４】
ＴＳＡの増進は、ＥｘｃＲ−Ｆｃ下流精製プロセスにおけるＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐクロマトグラフィステップの主要な機能である。したがって、溶出液プール中のＴＳＡレベルは、このステップの設計およびモデル化のための主要な応答であった。これらのデータの適合概要が、図１０〜１２に示される。連続モデル二乗和の表（表１０）は、高次モデル項が追加されるにつれて、モデル適合の蓄積向上を示す。例えば、線形対ブロックは、線形およびブロック項を計上した後の線形項の有意性を示す。同様に、２ＦＩ対線形は、２因子交互作用項をモデルに追加することの有意性を生じ、二次対２ＦＩは、二次項を線形、ブロック、および２ＦＩ項に追加することの有意性を示す等である。表中の各行は、完全モデルの統計ではなく、付加的な項の統計のみを含有する。
【００６５】
モデル項の追加と関連付けられる有意性は、モデルの二乗和（ＳＳ）ならびに残余誤差を使用して計算される。モデルに含まれなかった全ての影響に対する二乗和は、ともに統合され、残余誤差の推定値として使用された。二乗和を自由度で割ることによって（ＳＳ／ｄｆ）、平均二乗誤差が計算された。平均二乗の比（ＭＳＭｏｄｅｌ／ＭＳＲｅｓｉｄｕａｌ）が、モデルのＦ値を判定するために使用され、次いで、Ｆ値は、モデルの分散を残余誤差の分散と比較するために使用された。Ｆ値が大きくなるほど、モデルが有意である尤度が大きかった。所与の危険率について、Ｆ値を既知のＦ分布表と比較することによって、モデル有意性の定量的尺度を得ることができる。これらの表の上で挙げられる臨界値よりも大きいＦ値は、規定された危険率以内で有意と見なされる。加えて、確率＞Ｆ値（すなわち、ｐ値）が計算された。この値は、観察されたＦ値を超えるＦ分布の曲線の下の分数領域に等しい。例えば、＜０．０５のｐ値は、モデルが有意であり、実験の雑音によるものではないという９５％信頼があることを示す。一般に、＜０．０５のｐ値を有するモデル項は、有意であると見なされる。付加的な項が有意であり、エイリアシングが存在しなかった高次モデルが、「提案」モデルとして表に示された。ＴＳＡデータの分析は、二次モデルがこの応答を最も良く表したことを示唆した（表１０）。
【表１０】
2014503495.tif 000012
【００６６】
適合概要で編纂された第２の表は、不適合度試験の表（表１１）である。この表は、各モデルがどれだけ良くデータに適合するかを比較する。不適合度試験は、残余誤差を複製設定点からの純粋誤差と比較する。純粋誤差よりも有意に大きい不適合度誤差は、モデルによって予測される値とは有意に異なる実験点があることを示す。したがって、より適切なモデルが、データに適合するために使用されるべきである。ｐ値は、不適合度を測定するために使用される。ｐ値が高くなるほど、実験点とモデル点との間の差が実験の雑音によるものであるという尤度が大きくなる。一般に、０．１よりも大きいｐ値が所望される。ＴＳＡ応答については、二次モデルが非エイリアス作成モデルに対して最高ｐ値を有し、それがデータへの最良適合を有することを示唆した。
【表１１】
2014503495.tif 000013
【００６７】
表１２は、ＴＳＡ応答のモデル概要統計を含有する。各完全モデルタイプのＲ二乗、調整Ｒ二乗、予測Ｒ二乗、およびＰＲＥＳＳ統計が示されている。表に示されるように、二次モデルが、最高Ｒ二乗および調整Ｒ二乗値を有し、それが実験データに最も良く適合することを示した。
【表１２】
2014503495.tif 000014
【００６８】
次いで、ＴＳＡの二次モデルは、有意ではなかったモデル項を除去するように削減された。これは、後方選択プロセスを使用し、モデルのＡＮＯＶＡ（分散分析）の計算を伴い、最小有意モデル項を除去し、項が除去されたモデルのＡＮＯＶＡを計算し、再度、最小有意項を除去することによって行われた。このプロセスは、ｐ値＞０．０５を有する全てのモデル項がモデルから除去されるまで繰り返された。溶出液ＴＳＡモデルのＡＮＯＶＡ結果が表１３に示される。
【表１３】
2014503495.tif 000015
【００６９】
ＡＮＯＶＡ結果は、ＴＳＡのモデルが高いＲ２値（＞０．９）を有したことを示し、モデルがデータの分散の９０％以上を捕捉したことを示した。加えて、予測Ｒ２値は、調整Ｒ２値とほぼ一致し、このモデルが良好な予測能力を有することを示した。信号対雑音比を測定する、適正精度は、４４．２８という値を有し、モデルが適正信号を有し、設計空間を進むために使用されてもよいことを示した。
【００７０】
ＡＮＯＶＡの仮定（残余の正規分布、誤差の独立性、および定数分散）を検証するために、いくつかの診断プロットが評価された。診断プロットにおける全ての残余が、比較の目的でスチューデント化された（すなわち、残余がそれらの推定標準偏差で割られた）。正規分布プロット（図２０）は、残余が正常に分布しているかどうかを示す。図に示されるように、ＴＳＡ応答に対する残余は、正常に分布しているように思われ、特有のパターンがデータに見出されなかった。
【００７１】
図２１は、ＡＮＯＶＡ計算における定数分散の仮定を調べる、スチューデント化された残余対予測値のプロットを示す。このＴＳＡ応答のプロットは、有意な傾向を示さず、ＡＮＯＶＡ計算における定数分散の仮定の有効性を確認した。
【００７２】
ＴＳＡ残余対実行数のプロット（図２２）における傾向の欠如は、結果に有意な影響を及ぼした潜伏変数がなかったことを示した。
【００７３】
予測溶出液ＴＳＡレベル対実測値のグラフ（図２３）は、スクリーニングＤＯＥの探索範囲内で、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液中のＴＳＡレベルの実験値と予測値との間の妥当な一致があったことを示す。
【００７４】
図２４は、ＴＳＡ応答のＢｏｘ  Ｃｏｘ応答を示す。Ｂｏｘ−Ｃｏｘプロット内の垂直の青い線は、現在のデータのべき変換に対応する（ラムダが変換のパラメータである）。垂直の緑の線は、最低ＳＳＥをもたらす変換に対応する。最良適合線の両側の垂直の赤い線によってプロット上で示される、９５％信頼区間も計算された。現在の変換が最良適合の９５％信頼内にある場合には、変換が推奨されない。図に示されるように、ＴＳＡデータが正常に分布していることが分かった。したがって、いずれの変換も推奨されなかった。
【００７５】
図２５および２６は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ過負荷結合および溶出クロマトグラフィステップに対するカラム搭載、負荷ｐＨ、および負荷伝導度といった主要なプロセスパラメータの関数として、溶出液ＴＳＡレベルの変化を示す、Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアによって生成された等高線図を示す。これらの図に示されるように、ＴＳＡレベルは、装填の増加とともに、および／または負荷ｐＨの減少とともに、および／または負荷伝導度の増加とともに増加した。
４．４．２  ＨＭＷ
【００７６】
以前の開発結果は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液が対応する装填材料よりも高いＨＭＷレベルを有したことを示した。これは、単量体に対するＨＭＷのより高い結合親和性により予期され、吸着材上のＨＭＷの蓄積および集中、それに対応してより高い溶出液中のレベルをもたらした。この挙動は、高シアル酸化糖型によって示されるものと類似し、ＨＭＷ種の共同富化につながる。したがって、溶出液ＨＭＷは、モデル化および特性化され、（必要であれば）制御されなければならない、別の主要なプロセス出力である。
【００７７】
Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔソフトウェア内のＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液プールのＨＭＷの分析結果は、線形モデルがこの応答を最も良く表したことを示唆した（表は示されていない、７）。有意な要因を識別するように、アルファ＝０．０５を用いた後方選択を適用した後に、モデルのＡＮＯＶＡ表は、有意な要因としてＡ、Ｂ、およびＣを識別した（表１４）。
【表１４】
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【００７８】
上記のモデルの不適合度は、有意ではなく、モデルは、高いＲ２および調整Ｒ２値を有した。また、予測Ｒ２値は、調整Ｒ２と十分一致し、モデルが良好な予測能力を有したことを示した。診断プロットは、残余の分布が正常であり、分散が一定であり、潜伏変数による応答への影響がなかったことを明らかにし、ＡＮＯＶＡが有効であったことを確認した（プロットは示されていない、７）。モデルプロットの分析（図示せず、７）は、ＴＭＡＥ溶出液中のＨＭＷレベルが、カラム装填の増加、負荷ｐＨの減少、および／または負荷伝導度の増加とともに増加したことを示した。これらの実験に採用された装填材料が約０．９％ＨＭＷを有したため、全ての実行の溶出液ＨＭＷレベルは、＞３．５％ＨＭＷの作用限界を十分下回った（表６）。したがって、溶出液ＨＭＷが、最高負荷ＨＭＷレベルで、かつＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐに対する最悪の動作条件下で許容できることを確実にするように行われた、付加的な一点実験があった（第４．５項および５．５項）。
４．４．３    回収
【００７９】
回収データの分析は、この応答が２因子交互作用（２ＦＩ）モデルによって最も良く表されたことを示した（データは示されていない）。有意な要因を識別するように、アルファ＝０．０５を用いた後方選択を適用した後に、モデルのＡＮＯＶＡ表は、有意な要因としてＡ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、およびＡＣを識別した（表１５）。付加的な詳細を他の場所で見出すことができる。
【表１５】
2014503495.tif 000017
【００８０】
全体で、モデルは、高いＲ２および調整Ｒ２値を有し、予測Ｒ２値は、調整Ｒ２と十分一致し、モデルが良好な予測能力を有したことを示した。不適合度は、上記のモデルでは有意ではなかったが、ｐ値は、わずか＞０．０５しかなく、すなわち、雑音により、この大きさの不適合度値が生じ得るという５．１６％の確率があった。典型的には、ｐ値＞０．１が、モデルの有意ではない不適合度に望ましい。しかしながら、比較的大きい不適合度値が、複製から計算されるわずかな純粋誤差のアーチファクトであり、実験データとモデル予測との間の任意の不適合度の真の指示ではなかった場合がある。診断プロットは、残余の分布が正常であり、分散が一定であり、潜伏変数による応答への影響がなかったことを明らかにし、ＡＮＯＶＡが有効であったことを確認した（データは示されていない）。モデルプロットの分析（データは示されていない）は、プロセス回収が、装填の減少、負荷ｐＨの増加、および／または負荷伝導度の減少とともに増加したことを示した。
４．４．４    還元性および非還元性ＬＣ９０／ＧＸＩＩによる純度、および最高単一不純物
【００８１】
還元性および非還元性ＬＣ９０／ＧＸＩＩ検定の結果の精査は、ＤｏＥ実行に対する純度率の値と最高単一不純物（ＨＩＳ）率の値との間の差が、それぞれの検定の可変性の範囲内であったことを示した。したがって、平均±３標準偏差が、これらの応答の最良の予測因子であると判定され、いずれのモデルも作成されなかった。
４．４．５    ＨＣＰ
【００８２】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液プール中のＨＣＰレベルの分析は、全ての値が検定の定量限界（ＬＯＱ）に非常に近かった、またはそれを下回ったことを示した。したがって、この応答にはいずれのモデルも作成されなかった。
４．４．６    ＤｏＥ研究概要
【００８３】
ＴＳＡおよび回収率に対して作成された予測モデルは、許容生成物収率を維持しながら、所望のレベルのＴＳＡ富化を達成するために、カラム装填ならびに負荷ｐＨおよび伝導度の好適な範囲を識別するように採用された。より低いＳＡ富化が、より低いカラム装填で得られるため、この条件は、生成物品質にとっての最悪の場合を表す。したがって、図２７のＴＳＡモデルプロットに示されるように、プロセスのロバスト性および良好な製造適合のために負荷ｐＨ（５．２〜５．５）および伝導度（２．９〜３．９ｍＳ／ｃｍ）の妥当な範囲を提供しながら、１６．０〜１６．５ｍｏｌ／ｍｏｌの対照サンプルＴＳＡレベルに合致する、またはそれを超えるために、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップに対する最小カラム装填は、１５０ｍｇ／ｍＬに設定された。
【００８４】
他方では、前述のように（第５．４．３項）、プロセス回収はカラム装填の増加とともに減少する。したがって、妥当なプロセス収率を維持するように、製造におけるカラム装填の上限範囲を特定する必要があった。製造カラムサイズ決定の検討に基づいて、ならびに出発材料（すなわち、ＥｘｃＲ−Ｆｃ生物学的製剤）の質量の可変性および上流ＵＦ／ＤＦステップのステップ収率を考慮して、１８０ｍｇ／ｍＬの最大装填がＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐに対して判定された。最大装填条件での回収率モデルから生成された等高線図に示されるように、約３６％の最小ステップ収率が予測された。全体で、カラム装填ならびに負荷ｐＨおよび伝導度の特定動作範囲内のＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスに対して、３６〜５９％の間のステップ収率を期待することができる。注記：負荷ｐＨ範囲は、製造の対称動作範囲、すなわち、５．３±０．２を提供するために、後に５．１〜５．５に変更された。以下の予測プロットに基づいて、この変化は、プロセス性能に悪影響を及ぼすことが見込まれない。
４．５  付加的なプロセス特性化
【００８５】
初期のＤｏＥ研究で調べられなかった他の入力パラメータ（例えば、負荷濃度および流速）の影響を評価するため、ならびにプロセスのロバスト性をさらに評価するために、付加的な一点実験が、ＤｏＥ研究から判定された動作範囲内のＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップに行われた。これらの実験の結果は、表１６で要約される。
【表１６】
2014503495.tif 000018
【００８６】
第５．４項で論議されたＤｏＥ実験は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラム用の装填材料として、ＰＳ１４からの透析濾過された生物学的製剤を採用した。装填材料における可変性との関連でＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップのロバスト性を評価するために、異なる生物学的製剤ロット（すなわち、ＰＳ１６）を使用して、実験（実行２、５、８）が行われた。これらの実行の結果は、ＤｏＥモデルの予測能力を立証するための試験点として使用された。図１７に示されるように、回収率およびＴＳＡの実測値は、対応するモデルの９９％予測区間内であった。したがって、これらのＤｏＥモデルの立証が成功した。したがって、測定されたＨＭＷ値は、予測範囲よりも高かった。これは、ＤｏＥ実験に使用された材料（ＰＳ１４負荷における０．９％ＨＭＷ）と比較して、立証実行に採用された装填材料におけるより高いＨＭＷレベル（ＰＳ１６負荷における１．５％ＨＭＷ）によるものであった。全体で、１つのロットの装填材料を使用して生成されたＤｏＥモデルは、異なるロットのカラム装填材料に対するＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセス性能の予測に成功することができた。したがって、装填材料におけるロット間可変性に対するＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスのロバスト性を、これらの結果から推測することができる。加えて、これらの実行に採用された吸着材は、プロセス開発に使用されたロットとして同等の性能を有することが示された。したがって、この吸着材ロットは、２０１１  ２Ｋ  ＧＭＰ製造キャンペーンで使用するために好適であると見なされた。
【表１７】
2014503495.tif 000019
【００８７】
２０１０  ２Ｋ  ＧＭＰ製造キャンペーン中に産生されたＥｘｃＲ−Ｆｃ生物学的製剤は、代表的なプロトタイプ実行（ＰＳ１４および１６を含む）について観察されたものよりも低いＴＳＡレベルを有した。したがって、ＴＳＡ富化の最悪の条件（実行１２）下で得られた生成物品質を判定するために、ＧＭＰバッチについて観察されたものと同等であるＴＳＡレベルを有するＰＳ１０材料を用いて、実験が行われた。実行１０に対する溶出液プールの分析は、ＴＳＡレベルが、対照サンプル対照について測定されたＴＳＡレベル、すなわち、１６．０〜１６．５ｍｏｌ／ｍｏｌと同等であった、１６．０ｍｏｌ／ｍｏｌであったことを示した。したがって、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスは、これらの最悪条件下でさえも、対照サンプルに合致するようにＥｘｃＲ−Ｆｃ生物学的製剤のＳＡ含量を富化することが可能であることが分かった。
【００８８】
加えて、代表的なプロトタイプおよびＧＭＰ生物学的製剤ロットにおけるＨＭＷレベルは、≦１．６％であった。ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液において期待することができる最高ＨＭＷレベルを評価するために、実行１２は、２．０％ＨＭＷを有したＰＳ１０負荷を採用し、ＨＭＷに対する最悪の動作条件下で行われた。表１６に示されるように、実行１０に対する溶出液ＨＭＷレベルは、３．３％であり、生物学的製剤に対して特定された＞３．５％の作用限界よりも小さかった。≦１．６％ＨＭＷを伴うＧＭＰ材料の使用は、溶出液ＨＭＷレベルに対する十分な安全範囲を提供することが見込まれる。したがって、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐステップにわたって観察されたＨＭＷ増加は、許容できると見なされ、生物学的製剤におけるＨＭＷレベルをさらに低減するために、いずれの付加的なプロセスステップの必要とされなかった。
【００８９】
ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスの流速は、生成物品質への影響を評価するように、７５〜２５０ｃｍ／ｈｒの間で変化させられた（実行１〜３および１１〜１３）。これらの実行の結果は、溶出液におけるＨＭＷレベルが流速の増加とともに低下した一方で、生成物収率およびＴＳＡレベルが検定可変性の限界内で同等であったことを示した。観察されたＨＭＷの増加は、より大きいＨＭＷ種が流速の増加とともにカラム上に結合するために利用可能である、より短い滞留時間によるものである可能性が高かった。したがって、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラム溶出液におおけるＨＭＷレベルを最小限化するように、より高い負荷速度で動作することが有利である。したがって、カラム装填ステップに対する１５０〜２５０ｃｍ／ｈｒの流速範囲が、製造に推奨された。
【００９０】
実行４〜６および７〜９は、プロセス性能への負荷濃度の影響を検討するために行われた。表１６に示されるように、ＨＭＷレベルは、負荷濃度が３ｍｇ／ｍＬから７ｍｇ／ｍＬに増加するにつれて減少することが観察された。加えて、溶出液ＨＭＷレベルの減少は、負荷濃度が３ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬに増加するにつれて、５ｍｇ／ｍＬから７ｍｇ／ｍＬまでの負荷濃度の増加について観察されるものと比較して、より有意であることが観察された。同時に、プロセス回収および溶出液ＴＳＡレベルは、異なる負荷濃度で同等であった。これらの結果に基づいて、最適負荷濃度を判定して溶出液ＨＭＷレベルを最小限化するように、付加的な一点実験が行われた。図２８に示されるように、ＨＭＷレベルは最初に、負荷濃度が約７ｍｇ／ｍＬまで増加するにつれて増加し、それは以前の結果と一貫していた。しかしながら、７〜３０ｍｇ／ｍＬの負荷濃度のさらなる増加は、ＨＭＷレベルの有意な低減を提供しなかった。これらのサンプルのＴＳＡ分析は、異なる負荷濃度で同等のＳＡ富化が得られたことを示した（データは示されていない）。
【００９１】
この挙動をさらに調査するために、バッチ実験が、上記の実験（９）に使用された同じ装填材料を用いて、単量体およびＨＭＷの等温線を測定するように行われた。これらの実験に対する入力負荷濃度は、２〜４５ｍｇ／ｍＬ（負荷ＨＭＷ約１．６％）の間で変化させられ、それは、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラムに対する実行可能な動作範囲全体を表した。図２９は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上のＥｘｃＲ−Ｆｃ単量体の多成分吸着等温線を示す。図に示されるように、０〜約５ｍｇ／ｍＬおよび約５〜約８ｍｇ／ｍＬの単量体濃度範囲は、それぞれ、等温線の線形および非線形領域を表す。これらの領域内で、単量体結合が、濃度の増加とともに増加する。吸着材は、Ｃｍｏｎｏｍｅｒ≧８ｍｇ／ｍＬで飽和し、いずれの付加的な単量体結合も起こることができない。同時に、ＨＭＷ等温線は、非常に低いレベルの吸着を示し、調べられた負荷濃度の範囲内のＨＭＷ結合に有意な変化はなかった（図３０）。総合すれば、これらの結果は、０〜８ｍｇ／ｍＬの負荷濃度の間で、カラム上のＱｍｏｎｏｍｅｒが増加した一方で、ＱＨＭＷは有意に変化しなかったことを実証する。これは、負荷濃度が約８ｍｇ／ｍＬまで増加させられるにつれて、溶出液ＨＭＷレベルの観察された減少をもたらした。単量体飽和が負荷濃度≧８ｍｇ／ｍＬで達成され、ＱＨＭＷが大部分は不変のままであったため、溶出液ＨＭＷレベルのさらなる低減が、負荷濃度の増加とともに得られなかった。これらの結果に基づいて、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐカラム溶出液におけるＨＭＷレベルを最小限化するように、１０±２ｍｇ／ｍＬの負荷濃度が製造に推奨された。
５  終わりに
【００９２】
ＥｘｃＲ−Ｆｃ生物学的製剤のシアル酸（ＳＡ）レベルの富化のために、第Ｉ相ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐクロマトグラフィプロセスの開発が成功した。最初に、シアル化の程度の差に基づいて、種々のＥｘｃＲ−Ｆｃアイソフォームを分離するクロマトグラフィの異なる吸着材およびモードの能力を評価するように、実験が行われた。この目的を果たすために、カチオン交換（ＳＥ  ＨｉＣａｐ）、アニオン交換（ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐおよびＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥ）、疎水性相互作用（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、およびヒドロキシアパタイト（ｃＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）クロマトグラフィが、線形勾配または段階溶出実験によって評価された。対照サンプルロットの全シアル酸（ＴＳＡ）レベルに合致する、およびそれを超越しさえする可能性がある、最高度のＳＡ富化を提供したため、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐがさらなる開発のために選択された。
【００９３】
後に、新規の「過負荷」結合および溶出プロセスが開発され、より高い正味負電荷およびＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐへの結合親和性を有する、高シアル酸化糖型は、より低い親和性の低シアル酸化または非シアル酸化糖型と、結合部位を求めて有効に競争し、したがって、これらのより低い親和性の種を変位させた。これは、カラム装填の増加とともに、吸着材表面上での高シアル酸化ＥｘｃＲ−Ｆｃ分子の蓄積をもたらした。後に、カラムは、生成物プール中の高シアル酸化糖型を回収するように溶出された。主要なプロセスパラメータ、すなわち、装填、負荷ｐＨ、および負荷伝導度の動作範囲を最適化するように、ＤｏＥ研究が行われた。これらの研究の結果は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液におけるＴＳＡレベルが、調べられた設計空間内で、装填の増加、負荷ｐＨの減少、および／または負荷伝導度の増加とともに増加したことを示した。他方で、生成物収率および溶出液ＨＭＷレベルは、同じ動作空間内で逆の傾向を示した。したがって、妥当なプロセス収率を維持しながら、生成物品質標的が達成されたことを確実にするように、動作範囲がカラム装填ならびに負荷ｐＨおよび伝導度に対して確立された。加えて、負荷濃度および流速を最適化して、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ溶出液における生成物品質（具体的にはＨＭＷレベル）を向上させるように、単一点実験もＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐに行われた。
【００９４】
最終的に、最悪の動作条件下でＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスのロバスト性を試験するように、一点実験が行われた。これらの実行は、全体的なプロセス能力を試験するために、低いＴＳＡレベルおよび高いＨＭＷレベル（すなわち、最悪の場合の負荷ＰＱ）を有するパイロット規模材料を採用した。これらの実験の結果は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐプロセスが、最悪の動作条件下でさえも一貫して機能し、全ての所定の品質標的を満たした生成物を送達したことを明確に実証した。
６  ＴＭＡＥ  ＨＩＣＡＰクロマトグラフィプロセスの説明
１）下降流において≦７５ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス／３Ｍ  ＮａＣｌの≧３ＣＶを使用して、カラムが平衡化される。
２）下降流において≦１５０ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ５．３である５５ｍＭ酢酸塩の≧５ＣＶを使用して、カラムが平衡化される。
３）下降流において負荷プールを用いて１５０〜２５０ｃｍ／ｈｒにて、カラムが１５０〜１８０ｍｇ／ｍＬの間まで装填される。  ［注記：負荷プールｐＨ＝５．３±０．２および伝導度＝３．４±０．５ｍＳ／ｃｍ］
４）下降流において１５０〜２５０ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ５．３である５５ｍＭ酢酸塩の３ＣＶでカラムが洗浄される。
５）下降流において≦７５ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ５．３である５０ｍＭ酢酸塩＋３００ｍＭ  ＮａＣｌを使用して、カラムが溶出される。溶出収集が、溶出ブロックの開始時に即時に開始され、その後、溶出プールが８ＣＶ収集される。
６）下降流において≦１５０ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ８．０である５０ｍＭトリス＋３Ｍ  ＮａＣｌの≧３ＣＶで、カラムが揮散される。
７）下降流において≦１５０ｃｍ／ｈｒにて、０．５Ｎ  ＮａＯＨの≧３ＣＶで、カラムが浄化される。
８）下降流において≦１５０ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ２．５である５０ｍＭ酢酸塩＋１Ｍ  ＮａＣｌの≧３ＣＶで、カラムが浄化される。
９）下降流において≦１５０ｃｍ／ｈｒにて、ｐＨ３．２である１％ベンジルアルコール＋０．５Ｍ酢酸＋１６ｍＭ  ＮａＯＨの≧３ＣＶで、カラムが保管される。
図３１は、ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ上のＥｘｃＲ−Ｆｃに対して開発された過負荷結合および溶出プロセスの代表的なクロマトグラムを示す。クロマトグラフィプロセスにおける異なるステップは、このクロマトグラムで明確に概説される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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