(57)【要約】  本発明は、非静脈内投与における第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加させるための、１つまたはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンを含む医薬製剤に関する。さらに、本発明は、出血障害の処置および防止のための、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの組合せ使用であって、これにより第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を向上させる使用、および硫酸化グリコサミノグリカンを共投与することによる、第ＶＩＩＩ因子の非静脈内投与後の生物学的利用能を増加させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
出血障害の処置または防止に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または防止は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの非静脈内注射を含む、上記第ＶＩＩＩ因子。
【請求項２】
出血障害の処置または防止に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または防止は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの非静脈内注射を含み、該第ＶＩＩＩ因子を５０ＩＵ／ｋｇ体重〜約１０００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で皮下投与したとき、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後２時間〜注射後４８時間の期間にわたって、持続的に、健常対象における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超である、上記第ＶＩＩＩ因子。
【請求項３】
第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンは、同時に投与される、請求項１または２に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子。
【請求項４】
第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンは、個別に投与される、請求項１または２に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子。
【請求項５】
硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子。
【請求項６】
第ＶＩＩＩ因子は、フォン・ウィルブランド因子と結合しており、硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子。
【請求項７】
処置対象は、ヒト個体であり、１回の投与の用量が５００ＩＵ／ｋｇ体重未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子。
【請求項８】
非静脈内注射は、皮下、経皮、または筋肉内注射である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子。
【請求項９】
出血障害の処置または防止における第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を改善するための硫酸化グリコサミノグリカンであって、該硫酸化グリコサミノグリカンおよび該第ＶＩＩＩ因子は、皮下、経皮、または筋肉内注射される、上記硫酸化グリコサミノグリカン。
【請求項１０】
硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項９に記載の使用のための硫酸化グリコサミノグリカン。
【請求項１１】
出血障害は、血友病Ａである、請求項９または１０に記載の使用のための硫酸化グリコサミノグリカン。
【請求項１２】
第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンは、同時に投与される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用のための硫酸化グリコサミノグリカン。
【請求項１３】
第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンは、個別に投与される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用のための硫酸化グリコサミノグリカン。
【請求項１４】
第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンを含む、出血障害の治療または予防のための医薬キット。
【請求項１５】
硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項１４に記載の医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非静脈内投与における第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加させるための、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンを含む医薬製剤に関する。さらに、本発明は、出血障害の処置および防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）のための、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの組合せ使用であって、これにより第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を向上させる使用に関する。また、本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンを共投与することによる、非静脈内投与後の第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）
ＦＶＩＩＩは、約２８０ｋＤａ分子質量の血漿糖タンパク質であり、哺乳動物の肝臓で産生される。ＦＶＩＩＩは、血液凝固を導く凝固反応カスケードの重要な因子である。このカスケードにある一過程で、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）が、活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）と共に、第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化形態（ＦＸａ）に変換させる。ＦＶＩＩＩａは、この過程で補因子として作用し、カルシウムイオンおよびリン脂質と共にあることを要件として、ＦＩＸａの活性を最大化させる。最も一般的な血友病性障害は、機能的ＦＶＩＩＩの不足に起因するもので、血友病Ａと呼ばれる。
【０００３】
血友病Ａの処置の重大な進展は、ヒトＦＶＩＩＩの２３５１個の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンが単離されたこと（特許文献１）、ならびにヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列およびその組換えによる製造方法が提供されたことである。
【０００４】
クローニングされたｃＤＮＡから決定されるヒトＦＶＩＩＩの推定一次アミノ酸配列の解析により、ヒトＦＶＩＩＩが、より大きな前駆体ポリペプチドからプロセシングされたヘテロダイマーであることが示される。このヘテロダイマーは、約８０ｋＤａのＣ−末端軽鎖が、金属イオン依存的に約２００ｋＤａのＮ−末端重鎖と結合して構成される（非特許文献１を参照）。このヘテロダイマーの生理学的活性化は、トロンビンによってタンパク質鎖がタンパク分解切断されることによって生じる。トロンビンは、重鎖を９０ｋＤａタンパク質へ、次いで５４ｋＤａおよび４４ｋＤａ断片へと切断する。またトロンビンは、８０ｋＤａの軽鎖を７２ｋＤａのタンパク質へと切断する。後者のタンパク質と２つの重鎖断片（上記の５４ｋＤａおよび４４ｋＤａ）がカルシウムイオンと一緒になって、活性なＦＶＩＩＩを構成する。不活性化は、４４ｋＤａのＡ２重鎖断片が分子から解離するとき、または７２ｋＤａおよび５４ｋＤａのドメインがトロンビン、活性化タンパク質ＣもしくはＦＸａによってさらに切断されるときに生じる。血漿において、ＦＶＩＩＩは、５０倍モル過剰のフォン・ウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）タンパク質と結合することによって安定化されるが、これは上記のようなＦＶＩＩＩのタンパク分解的破壊が阻害されているようである。
【０００５】
ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、３３０アミノ酸の三重化Ａドメイン、９８０アミノ酸の単一Ｂドメイン、および１５０アミノ酸の二重化Ｃドメインの３つの構造ドメインで構成されている。Ｂドメインは、他のタンパク質とホモロジーを有しておらず、このタンパク質の２５個の潜在的なアスパラギン（Ｎ）−結合糖鎖付加部位のうちの１８個を提供する。Ｂドメインは、凝固の機能は有していないようであり、欠失していてもよく、Ｂ−ドメインが欠失しているＦＶＩＩＩ分子は、依然として凝固促進活性を有している。
【０００６】
フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）
ＶＷＦは、哺乳類の血漿中に存在する多量体接着糖タンパク質であり、複数の生理学的機能を有している。一次的な止血の期間において、ＶＷＦは、血小板表面の特定の受容体と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの構成成分との間の媒介物質として作用する。さらに、ＶＷＦは、凝固促進因子ＦＶＩＩＩに対するキャリアおよび安定化タンパク質として機能する。ＶＷＦは、内皮細胞と巨核細胞において、２８１３個のアミノ酸の前駆体分子として合成される。この前駆体ポリペプチドであるプレプロＶＷＦは、２２残基のシグナルペプチドと、７４１残基のプロペプチドと、成熟血漿ＶＷＦにおいて見出される２０５０残基のポリペプチドとからなる（非特許文献２）。血漿へ分泌されると、ＶＷＦは、種々の分子サイズの様々な種類の形態で循環する。これらのＶＷＦ分子は、２０５０アミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマーおよびマルチマーからなる。ＶＷＦは通常、１つの二量体として、最大では５０〜１００の二量体からなる多量体として、血漿中に見出され得る（非特許文献３）。ヒト循環血中のヒトＶＷＦのインビボ半減期は、およそ１２時間である。
【０００７】
ヒトで最もよく見られる遺伝性出血障害は、フォン・ウィルブランド病（「ＶＷＤ」）である。出血症状の重症度に応じて、ＶＷＤは、一般にヒト血漿由来のＶＷＦを含有する濃縮物を用いる補充療法（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）によって処置され得るが、組換えＶＷＦも開発途上である。ＶＷＦは、例えば、特許文献２に記載されているように、ヒト血漿から調製することができる。特許文献３には、組換えＶＷＦを単離するための方法が記載されている。
【０００８】
ＶＷＦは、インビボでＦＶＩＩＩを安定化し、これによりＦＶＩＩＩの血漿レベルの制御に重要な役割を果たすことが知られており、結果的に、一次および二次止血を調節する中心的因子となっている。ＶＷＦを含有する医薬製剤をＶＷＤ患者に静脈内投与した後、２４時間で、内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃが、１ｍｌあたり１から３単位へ増加することが認められ得ることも知られており、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦのインビボでの安定化効果が示される。
【０００９】
患者は、一般的に、有効成分の特定の作用様式から利益を得るが、現在、商業的に利用可能な第ＶＩＩＩ因子調製物は全て静脈内投与によって投与され、この静脈内投与は、注射部位での感染リスクがあり、一般に、患者が、特に凝固系に欠陥のある小児の処置においては、回避したい手法である。
【００１０】
今日まで、血友病ＡとＶＷＤの標準的な処置には、ＦＶＩＩＩの調製物およびＶＷＦ濃縮物の頻繁な静脈内注入が含まれている。血友病Ｂの処置では、第ＩＸ因子を２週間に１度投与することを必要とし、ＦＶＩＩａを用いるインヒビター保有患者の処置においては、出血を阻害するために、１週間あたり複数回のＦＶＩＩａ投与が使用される。
【００１１】
しかしながら、これらの補充療法は、一般に有効であるものの、例えば、予防的処置を受けている重症の血友病Ａ患者においては、第ＶＩＩＩ因子の半減期が約１２時間と短いために、１週間に約３回、第ＶＩＩＩ因子を静脈内投与（ｉ．ｖ．）しなければならない。これまでに、ＦＶＩＩＩレベルを０．０１Ｕ／ｍｌまで上昇させることに対応する正常ヒト血漿の１％を超えるＦＶＩＩＩレベルを達成することにより、重度の血友病Ａが中程度の血友病Ａに転じている。予防療法においては、ＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルが、非血友病におけるＦＶＩＩＩ活性レベルの２〜３％未満に低下しないように投与レジメンが設定されている。
【００１２】
静脈内投与による第ＶＩＩＩ因子の投与は重荷であり、痛みがあり、特にこの投与のほとんどが患者自身または血友病Ａと診断された子供の親によって家庭で処置されていることから感染のリスクを伴う。さらに、頻繁な静脈内注射は、必然的に瘢痕形成をもたらし、将来的に輸注の妨げとなる。重度の血友病の予防的処置は、生涯のうちの早期に開始されることが多く、２歳未満の子供であることも少なくない。そのような小さい患者の静脈にＦＶＩＩＩを週に３回注射することは、より一層困難である。限られた期間においては、ポートシステムの埋め込みが選択肢となり得る。しかしながら、この場合、感染が繰り返して生じる可能性があり、ポートが身体活動に不具合を引き起こすこともある。
【００１３】
したがって、第ＶＩＩＩ因子の静脈内への輸注の必要性を回避することが、医学的に大きく要求されている。
【００１４】
第ＶＩＩＩ因子に対して、例えば、特許文献４および特許文献５に記載されるように、皮下投与が提唱されている。しかしながら、許容可能な生物学的利用能を達成するためには、非常に高用量の第ＶＩＩＩ因子を投与しなければならない。
【００１５】
非静脈内投与における生物学的利用能を改善するための別の手法としては、アルブミン融合第ＶＩＩＩ因子も使用されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第４，７５７，００６号
【特許文献２】ＥＰ０５０３９９１
【特許文献３】ＥＰ０７８４６３２
【特許文献４】ＷＯ９５／０１８０４Ａ１
【特許文献５】ＷＯ９５／０２６７５０
【特許文献６】ＷＯ２０１１／０２０８６６Ａ２
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄ．Ｒｅｖｓ．６：２３５（１９９２）
【非特許文献２】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：３４５−３４８，１９９４
【非特許文献３】Ｒｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５７６−５８４，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
第ＶＩＩＩ因子の非静脈内投与における生物学的利用能の改善に対する強い要望がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本出願の発明者は、驚くべきことに、第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能が、硫酸化グリコサミノグリカンと共に投与する場合に、大幅に増加することを見出した。
【００２０】
第１の態様において、本発明は、出血障害の処置または防止に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または防止は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの非静脈内注射を含む、上記第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、出血障害の処置または防止に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または防止は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの非静脈内注射を含み、該第ＶＩＩＩ因子を５０ＩＵ／ｋｇ体重〜１０００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で皮下投与したとき、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後２時間〜注射後４８時間の期間にわたって、持続的に、健常対象における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超である、上記第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００２２】
この態様の好ましい実施形態は、ヒト個体における血友病Ａの処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または予防は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの皮下、皮内、または筋肉内注射を含み、該第ＶＩＩＩ因子を５０ＩＵ／ｋｇ体重〜１，０００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で皮下投与したとき、ヒト個体における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後２時間〜注射後４８時間の期間にわたって、持続的に、健常対象における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超である、上記第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ヒト個体における出血障害の処置または予防に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または予防は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの皮下、経皮、または筋肉内注射による投与を含み、ヒト個体における第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能は、硫酸化グリコサミノグリカンを伴わないこと以外は同様の方法で投与された第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能より、少なくとも２０％超である、上記第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００２４】
この態様の好ましい実施形態は、ヒト個体における血友病Ａの処置または予防に使用するための第ＶＩＩＩ因子であって、該処置または予防は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンの皮下、皮内、または筋肉内注射による投与を含み、ヒト個体における第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能は、硫酸化グリコサミノグリカンを伴わないこと以外は同様の方法で投与された第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能より、少なくとも２０％超である、上記第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００２５】
第３の態様において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を改善するための硫酸化グリコサミノグリカンに関する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を改善するための硫酸化グリコサミノグリカンであって、該硫酸化グリコサミノグリカンおよび該第ＶＩＩＩ因子は、皮下、経皮、または筋肉内注射により投与される、上記硫酸化グリコサミノグリカンに関する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンを含む、出血障害の治療または予防のための医薬キットである。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、出血障害の処置または防止方法であって、必要とする対象に治療的有効量の第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンを投与して、第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加させることを含み、該投与は、皮下、経皮、または筋肉内注射を含む、上記方法である。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加させるための方法であって、皮下、皮内、または筋肉内注射により、硫酸化グリコサミノグリカンが該第ＶＩＩＩ因子と共投与される、上記方法である。
【００３０】
本発明の全ての態様において、第ＶＩＩＩ因子は、好ましくはヒト第ＶＩＩＩ因子である。好ましい硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリンであり、最も好ましくは、ヘパリンは、未分画ヘパリンである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、実施例１の結果を示す。ＦＶＩＩＩの生物学的利用能は、硫酸化グリコサミノグリカンを共投与する場合に増加している。図からわかるように、デキストラン硫酸は、プラスの効果を有しない。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、出血障害の処置および予防に関する。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「出血障害」には、家族性および後天性血友病Ａが含まれる。
【００３４】
本発明の第１の態様によれば、硫酸化グリコサミノグリカンの共投与を含む、第ＶＩＩＩ因子の治療的非静脈内使用が提供される。
【００３５】
第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであってもよく、変異を有し得る第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであってもよい。糖鎖付加または他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞および宿主細胞環境の性質に応じて変動し得る。特定のアミノ酸配列に言及するとき、そのような配列の翻訳後修飾は、この出願に包含される。
【００３６】
用語「第ＶＩＩＩ因子」および「ＦＶＩＩＩ」は、本明細書で交換可能に使用される。「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型第ＶＩＩＩ因子ならびに野生型第ＶＩＩＩ因子の凝固促進活性を有する野生型第ＶＩＩＩ因子の誘導体を含む。誘導体は、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列と比較して、欠失、挿入および／または付加を有する。用語第ＶＩＩＩ因子は、重鎖および軽鎖を含む第ＶＩＩＩ因子のタンパク分解的にプロセシングされた形態、例えば、活性化前の形態を含む。
【００３７】
用語「第ＶＩＩＩ因子」には、野生型第ＶＩＩＩ因子の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の生物学的活性を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントまたは変異体が含まれる。第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を決定するための適切な試験は、一段階もしくは二段階凝固アッセイ（Ｒｉｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．１９８２．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ａｎｄ  ＦＩＸａ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｍ  ｅｄ．Ｔｈｅ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ．ＮＹ  Ｃｈｕｒｃｈｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  １９９２）または発色基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｓ．Ｒｏｓｅｎ，１９８４．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ３３：１３９−１４５，ｓｕｐｐｌ．）である。これらの参照文献の内容は参照によって本明細書に組み入れる。
【００３８】
非限定的な例として、第ＶＩＩＩ因子分子としては、ＡＰＣ切断を阻止または低減する第ＶＩＩＩ因子変異体（Ａｍａｎｏ  １９９８．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：５５７−５６３）、アルブミン融合ＦＶＩＩＩ分子（ＷＯ２０１１／０２０８６６Ａ２）、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合分子（ＷＯ０４／１０１７４０Ａ）、Ａ２ドメインをさらに安定化する第ＶＩＩＩ因子変異体（ＷＯ９７／４０１４５）、発現増加をもたらすＦＶＩＩＩ変異体（Ｓｗａｒｏｏｐ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＪＢＣ  ２７２：２４１２１−２４１２４）、免疫原性が低下している第ＶＩＩＩ因子変異体（Ｌｏｌｌａｒ  １９９９．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５−５０８）、別々に発現した重鎖および軽鎖で再構成されたＦＶＩＩＩ（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５−１００）、ＦＶＩＩＩ様ＨＳＰＧ（ヘパランスルフェートプロテオグリカン）および／またはＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）の異化に導く受容体に対する結合が低下しているＦＶＩＩＩ変異体（Ａｎａｎｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００１．ＴＣＭ，１１：２５１−２５７）、ジスルフィド結合安定化ＦＶＩＩＩバリアント（Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．４：１３１５−１３２２）、改善された分泌特性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｂｌｏｏｄ  １０３：３４１２−３４１９）、増加した補因子比活性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１０２９８−３０４）、改善された生合成、および分泌、低下したＥＲシャペロン相互作用、改善されたＥＲ−ゴルジ輸送、増加した活性または不活性に対する耐性、および改善された半減期を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｐｉｐｅ  ２００４．Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３０：２２７−２３７において要約）、ならびにＢ−ドメインの全てまたは一部の欠失を有するＦＶＩＩＩ変異体（例えば、ＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１、ＷＯ０２／１０２８５０Ａ２、ＷＯ００／２４７５９Ａ１および米国特許第４，８６８，１１２号参照）が挙げられる。特に好ましくは、ＦＶＩＩＩ分子は「単鎖」ＦＶＩＩＩ分子である。単鎖ＦＶＩＩＩには、Ｂ−ドメインの全てまたは一部の欠失および酸性ａ３領域の全てまたは一部の欠失があり、したがって、Ａｒｇ１６４８での切断部位（通常、分泌の間に切断される）が欠失している。単鎖ＦＶＩＩＩ分子は、例えば、ＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１；ＵＳ２００２／１３２３０６  Ａ１；Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．１９５，ｎｏ．３，ｐａｇｅｓ  ６３７−６４４；Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６１，ｎｏ．３，ｐａｇｅｓ  １６５−１７３；Ｄｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｖｏｌ．３１２，ｐａｇｅｓ  ４９−５５に開示されている。
【００３９】
これらの第ＶＩＩＩ因子変異体およびバリアントは、その全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
【００４０】
成熟した野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。特定の配列におけるアミノ酸位置への言及は、ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質におけるアミノ酸の位置を意味し、言及する配列の他の位置に、変異（例えば、欠失、挿入および／または置換）が存在することを除外するものではない。例えば、配列番号２に言及する「Ｇｌｕ２００４」における変異は、修飾された同族体において、配列番号２の１〜２３３２位における１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失していることを除外するものではない。配列番号２をコードするＤＮＡ配列は、配列番号１で示される。
【００４１】
用語「グリコサミノグリカン」は、本明細書で使用するとき、特にアミノヘキソース単位を含むオリゴ糖または多糖を指す。硫酸化グリコサミノグリカンとしては、限定されないが、コンドロイチンスルフェート、デルマタンスルフェート、ケラタンスルフェート、ヘパリンおよびヘパランスルフェートが挙げられる。好ましくは、硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリンであり、最も好ましくは、硫酸化グリコサミノグリカンは、未分画ヘパリンである。
【００４２】
用語「ヘパリン」には、未分画ヘパリンおよび低分子量のヘパリンが含まれる。一実施形態において、本発明に従って使用されるヘパリンは、約８ｋＤａ〜約３０ｋＤａの平均分子量、好ましくは約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、最も好ましくは約１２ｋＤａ〜約１６ｋＤａ、例えば、約１５ｋＤａの平均分子量を有し得る「未分画ヘパリン」である。別の実施形態において、本発明に従って使用されるヘパリンは、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。ＬＭＷＨは、８０００Ｄａ未満の平均分子量を有するヘパリンまたはヘパリン塩であり、全ての鎖の少なくとも６０％が、８０００Ｄａ未満の分子量を有している。好ましくは、本発明に従って使用されたＬＭＷＨの分子量は、約２ｋＤａ〜約８ｋＤａ、より好ましくは約３ｋＤａ〜約６ｋＤａ、最も好ましくは約４ｋＤａ〜約５ｋＤａ、例えば約４．５ｋＤａである。ＬＭＷＨは、重合性ヘパリンの分画または脱重合などの様々な方法で得ることができる。ＬＭＷＨの例としては、アルデパリン（ａｒｄｅｐａｒｉｎ）［ノルミフロ（Ｎｏｒｍｉｆｌｏ）］、セルトパリン（ｃｅｒｔｏｐａｒｉｎ）［サンドパリン（Ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ）］、エノキサパリン（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）［ロベノックス（Ｌｏｖｅｎｏｘ）およびクレキサン（Ｃｌｅｘａｎｅ）］、パルナパリン（ｐａｒｎａｐａｒｉｎ）［フルクサム（Ｆｌｕｘｕｍ）］、チンザパリン（ｔｉｎｚａｐａｒｉｎ）［インノヘップ（Ｉｎｎｏｈｅｐ）およびロギパリン（Ｌｏｇｉｐａｒｉｎ）］、ダルテパリン（ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ）［フラグミン（Ｆｒａｇｍｉｎ）］、レビパリン（ｒｅｖｉｐａｒｉｎ）［クリバリン（Ｃｌｉｖａｒｉｎ）］およびナドロパリン（ｎａｄｒｏｐａｒｉｎ）［フラキシパリン（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）］が挙げられるが、これに限定されない。
【００４３】
用語「ヘパリン」には、天然に存在するヘパリンの切断または単離によるか、合成的手段によるヘパリン分子の低分子量断片も含まれる。例えば、合成的に製造された、ヘパリンに由来する構造を有する、商業的に入手可能な硫酸化五糖もある。これは、フォンダパリヌクスナトリウムとして入手可能である。
【００４４】
コンドロイチンスルフェートとしては、例えば、コンドロイチンスルフェートＡ（コンドロイチン−４−スルフェート）、コンドロイチンスルフェートＣ（コンドロイチン−６−スルフェート）、コンドロイチンスルフェートＤ（コンドロイチン−２，６−スルフェート）、およびコンドロイチンスルフェートＥ（コンドロイチン−４，６−スルフェート）が挙げられる。
【００４５】
デルマタンスルフェート（従前は、コンドロイチンスルフェートＢとも称されていた）は、市販されている別の硫酸化グリコサミノグリカンである。
【００４６】
ケラタンスルフェートは、別の硫酸化グリコサミノグリカンである。ケラタンスルフェートの構造は、例えば、Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１０  ｎｏ．１０  ｐｐ．９５１−９５８に記載されている。
【００４７】
ヘパランスルフェートは、ヘパリンとは異なるＮ−硫酸化多糖である（例えば、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｌｙｏｎ，Ｍ．（２０００）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｓ”．Ｉｎ  Ｉｏｚｚｏ，Ｍ，Ｖ．．Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．２７-５９、およびＧａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，Ａ．（１９８５）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｒｉｎ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ａｒｅ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ”．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３０  （３）：６６５−７４を参照）。
【００４８】
本発明の一実施形態によれば、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後５時間から注射後８時間の期間にわたって、持続して、健常対象者における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超、好ましくは５％超、より好ましくは８％超、最も好ましくは１０％超である。血漿レベルは、実施例１に示されるように、決定される。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後４時間から注射後１６時間の期間にわたって、持続して、健常対象者における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超、好ましくは５％超、より好ましくは８％超、最も好ましくは１０％超である。
【００５０】
本発明の別の実施形態によれば、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後３時間から注射後２４時間の期間にわたって、持続して、健常対象者における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超、好ましくは４％超、より好ましくは６％超、最も好ましくは８％超である。
【００５１】
本発明の別の実施形態によれば、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後２時間から注射後３２時間の期間にわたって、持続して、健常対象者における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超、好ましくは３％超、より好ましくは４％超、最も好ましくは５％超である。
【００５２】
さらに本発明の別の実施形態によれば、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射後１時間から注射後４８時間の期間にわたって、持続して、健常対象者における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超、好ましくは３％超、より好ましくは４％超、最も好ましくは５％超である。
【００５３】
上記血漿レベルは、好ましくは第ＶＩＩＩ因子（例えばＦＶＩＩＩ）を皮下注射で、１，０００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または８００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または６００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または４００ＩＵ／ｋｇ体重未満、例えば、約１０ＩＵ／ｋｇ体重から約１，０００ＩＵ／ｋｇ体重、または約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約８００ＩＵ／ｋｇ体重、または約３０ＩＵ／ｋｇ体重から約７００ＩＵ／ｋｇ体重、または約４０ＩＵ／ｋｇ体重から約６００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重、または約７５ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重、または約１００ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約１，０００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約８００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約７００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約６００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約２００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で投与するときに得られる。
【００５４】
一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンは、同じ組成物中に含有される。２つの成分を含むこの組成物は、１つの注射または同様の方法により患者に投与され得る。
【００５５】
別の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子および硫酸化グリコサミノグリカンは、同じ組成物中に存在しない。例えば、２つの成分はそれぞれ、医薬製剤において個別の投与形態で提供してもよい。
【００５６】
２つの成分が同じ組成物に存在しない場合、個別の組成物は、個別に投与してもよく、第ＶＩＩＩ因子と硫酸化グリコサミノグリカンとが同時に投与されるように投与の少し前に混合してもよい。個別に投与する場合、投与は、連続的、例えば、時間差方式（ｔｉｍｅ−ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で行われてもよい。一般的には、２つの成分が、単回投与、例えば注射により、同時に投与されることが好ましい。様々な投与経路を下記で議論する。それらは、上記に必要な変更を加えて適用される。
【００５７】
医薬製剤の成分は、従来の生理学的に適合する水性緩衝液に溶解させてもよく、場合により、医薬製剤を得るための医薬賦形剤を添加してもよい。医薬製剤の成分は、既に、医薬的、生理学的に適合する賦形剤を全て含有していてもよく、注射用水に溶解させて、医薬製剤を準備してもよい。
【００５８】
そのような医薬担体および賦形剤ならびに適切な医薬製剤の調製は、当該分野で周知である（例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  （２０００）  ｏｒ  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００）参照）。一定の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の添加剤、例えば、充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）、増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、緩衝剤、安定剤または賦形剤を含むことができる。標準的な製剤化技術は、当業者によく知られている（例えば、２００５  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００を参照）。適切な医薬添加剤としては、例えば、糖（マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロースなど）、アミノ酸（ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニンなど）、等張状態を達成するための添加剤（塩化ナトリウムまたは他の塩など）、安定剤（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、塩化カルシウムなど）、生理学的ｐＨ緩衝剤（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど）が挙げられる。一定の実施形態において、医薬組成物は、ｐＨ緩衝試薬、および湿潤剤または乳化剤を含有してもよい。さらなる実施形態において、組成物は、保存剤または安定剤を含有してもよい。特に、第ＶＩＩＩ因子を含む医薬製剤は、凍結乾燥形態または安定な可溶化形態で製剤化し得る。第ＶＩＩＩ因子は、当該分野で公知の様々な方法に従って凍結乾燥してもよい。また硫酸化グリコサミノグリカンおよび第ＶＩＩＩ因子を同じ組成物に含有させる場合も、そのような製剤は、凍結乾燥形態または安定な可溶化形態で製剤化し得る。凍結乾燥製剤は、使用前に、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、例えば、滅菌注射用水、滅菌生理食塩液、または適切な緩衝溶液を添加して再構成される。
【００５９】
本発明の医薬製剤に含有される組成物（複数可）は、任意の医薬的に適切な方法で、個体に送達させることができる。様々な送達系が公知であり、任意の都合のよい経路により組成物を投与するために使用することができる。好ましくは、本発明の医薬製剤に含有される組成物（複数可）は、非静脈内注射により、個体に送達される。より好ましくは、本発明の組成物（複数可）は、従来の方法に従って、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、皮内または経皮投与、最も好ましくは、皮下、筋肉内または経皮投与用に製剤化される。製剤は、輸注により連続的に、またはボーラス注射により、投与し得る。一部の製剤は、徐放機構も包含し得る。
【００６０】
本発明の医薬製剤の組成物（複数可）は、治療的有効量で患者に投与される。治療的有効量とは、忍容できない有害な副作用を生じさせる用量に達することなく、所望の効果を生じさせ、処置される病態または適応症を防止するか、処置される病態または適応症の重症度または拡大を低減するのに十分な用量を意味する。正確な用量は、例えば、適応症、処方、投与方式などの多くの因子に依存し、それぞれの適応症について前臨床および臨床試験で決定されなければならない。
【００６１】
第ＶＩＩＩ因子については、１回の投与の用量は、処置対象における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルが、注射後２時間から注射後４８時間の期間にわたって、持続して、健常対象者における第ＶＩＩＩ因子の正常血漿レベルの２％超、好ましくは３％超、より好ましくは４％超、最も好ましくは５％超であるように選択してもよい。
【００６２】
好ましくは、第ＶＩＩＩ因子の１回の投与の用量は、１，０００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または８００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または６００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または４００ＩＵ／ｋｇ体重未満、例えば、約１０ＩＵ／ｋｇ体重から約１，０００ＩＵ／ｋｇ体重、または約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約８００ＩＵ／ｋｇ体重、または約３０ＩＵ／ｋｇ体重から約７００ＩＵ／ｋｇ体重、または約４０ＩＵ／ｋｇ体重から約６００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重、または約７５ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重、または約１００ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約１，０００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約８００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約７００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約６００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約２００ＩＵ／ｋｇ体重の用量である。
【００６３】
第ＶＩＩＩ因子は、それ自体、硫酸化グリコサミノグリカンと共に投与することができる。あるいは、第ＶＩＩＩ因子は、ｖＷＦと結合させて、すなわちＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体として、硫酸化グリコサミノグリカンと共に投与することができる。
【００６４】
投与される硫酸化グリコサミノグリカンの量は、通常、適用製品１ｍＬあたり約０．００１〜約１００ｍｇ、適用製品１ｍＬあたり約０．０１〜約１０ｍｇ、および適用製品１ｍＬあたり約０．０５〜約１ｍｇである。
【００６５】
用語「生物学的利用能」は、本明細書で使用するとき、皮下、静脈内、または皮内投与後から最終時点までの所定の時間に、血漿中で検出できる第ＶＩＩＩ因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子またはＦＶＩＩＩ関連調製物）の、投与した用量に対する割合を意味する。典型的には、生物学的利用能は、実験動物において、調製物を１０ＩＵ／ｋｇ〜１０００ＩＵ／ｋｇの間の用量（例えば、４００ＩＵ／ｋｇ体重）で投与し、投与後、所定の時点で血漿サンプルを取得し、該サンプルにおける第ＶＩＩＩ因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子関連ポリペプチド）の量を、発色アッセイまたは凝固アッセイ（もしくは任意のバイオアッセイ）、イムノアッセイまたはそれらと同等の方法を１つまたはそれ以上用いて決定することにより測定される。生物学的利用能は、投与後から予め設定された最終時点までの、血漿中の第ＶＩＩＩ因子の濃度または活性をＹ軸、投与後の時間をＸ軸とする、曲線下面積（ＡＵＣ）として表される。好ましくは、この予め設定された時点は、投与後４８時間である。最も好ましくは、生物学的利用能は、下記実施例１に示されるように決定される。試験調製物の相対的生物学的利用能とは、試験調製物（例えば、第ＶＩＩＩ因子＋硫酸化グリコサミノグリカン）のＡＵＣと、試験調製物と同じ用量および同じ方法（例えば、静脈内、皮下、または皮内）で投与したときの参照調製物（例えば、第ＶＩＩＩ因子単独）のＡＵＣとの間の比を意味する。
【００６６】
本発明によれば、第ＶＩＩＩ因子（硫酸化グリコサミノグリカンと共投与するとき）の生物学的利用能は、第ＶＩＩＩ因子を単独で投与するときの生物学的利用能より高い。好ましくは、生物学的利用能は、少なくとも２０％まで、より好ましくは少なくとも５０％まで、より好ましくは少なくとも７５％まで、最も好ましくは少なくとも１００％まで増加する。生物学的利用能の増加は、好ましくは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を、１，０００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または８００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または６００ＩＵ／ｋｇ体重未満、または４００ＩＵ／ｋｇ体重未満、例えば、約１０ＩＵ／ｋｇ体重から約１，０００ＩＵ／ｋｇ体重、または約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約８００ＩＵ／ｋｇ体重、または約３０ＩＵ／ｋｇ体重から約７００ＩＵ／ｋｇ体重、または約４０ＩＵ／ｋｇ体重から約６００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重、または約７５ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重、または約１００ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約１，０００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約８００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約７００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約６００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重、または約５０ＩＵ／ｋｇ体重から約２００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で、皮下注射により投与するときに得られる。
【００６７】
本発明の医薬組成物（複数可）は、単独でまたは他の治療薬剤と組み合わせて投与することができる。これらの薬剤は、同じ医薬の一部として組み込むことができる。
【実施例】
【００６８】
〔実施例１〕
血友病Ａモデルにおけるｓ．ｃ．適用ＦＶＩＩＩおよび種々の添加剤の生物学的利用能の評価
材料および動物モデル
実験で使用した第ＶＩＩＩ因子は、Ｂ−ドメイン短縮単鎖組換え第ＶＩＩＩ因子（以下、“ｒＦＶＩＩＩ”と称する）であった。第ＶＩＩＩ因子は、Ａｓｎ７６４をＴｈｒ１６５３に直接融合して得た。第ＶＩＩＩ因子を細胞培養細胞により発現させ、細胞培養培地から精製した。
【００６９】
さらに使用した薬剤を表１にまとめる。
【００７０】
【表１】
2014530246.tif 000002
【００７１】
第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスを、血友病Ａの動物モデルとして使用した。これらのマウスは、エキソン１６および１７が欠失していることから、ＦＶＩＩＩを発現しない（Ｂｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，Ｖｏｌ  １０（１），１１９−１２１；Ｂｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，Ｖｏｌ  ８８（９），３４４６−３４５０）。これにより、ｋｏマウスの血漿におけるＦＶＩＩＩ活性の定量による処置後のＦＶＩＩＩレベルの解析が可能になる。
【００７２】
方法
血管外注射が、ｒＦＶＩＩＩ（ヒト）を用いる治療法の改善のための選択肢になり得るかを評価するために、代表的な血管外治療法である皮下注射を選択した。実施した非臨床的薬物動態研究の設定は、以下の表２および表３に詳述している。第ＶＩＩＩ因子活性の血漿レベルを、血友病Ａモデルにおいて、様々な添加物と共にｒＦＶＩＩＩを静脈内または皮下に単回注射（表２に処置群を詳述）した後に、測定した。
【００７３】
対応する群を、様々な異なる添加剤の存在下、同じ用量のＦＶＩＩＩで処置した（発色基質（ＣＳ）活性アッセイ）。単回適用については、各処置群について様々な異なる成分を、２００μＬの体積（全ての群で同じ体積）で混ぜ合わせた後、約２５ｇ重量のＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスに皮下投与した。処置群を表２にまとめる。
【００７４】
短期麻酔の後、血液サンプルを取り出し、クエン酸ナトリウムを使用して１０％クエン酸血液に抗凝固処置し、血漿に処理して、−７０℃で保存して、ＦＶＩＩＩ活性を測定した。サンプル採取の時点は、表３に詳述する。血漿におけるＦＶＩＩＩ活性の定量は、標準的なａＰＴＴに基づく手法（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅｒ）によって実施した。動物は、標準的な飼育条件で維持した。
【００７５】
【表２】
2014530246.tif 000003
【００７６】
結果
これらの結果を表３および図１にまとめる。４００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩを、様々な硫酸化グリコサミノグリカンの存在下で、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスに皮下注射すると、血漿レベルにおけるＦＶＩＩＩ活性が、ＦＶＩＩＩ単独またはＦＶＩＩＩ＋デキストランスルフェートを投与した場合と比較して、顕著に増加した。ヘパリンを共投与した場合の増加は、特に強力であった。
【００７７】
【表３】
2014530246.tif 000004
【００７８】
【表４】
2014530246.tif 000005
【図１】
2014530246.tif 000006
【配列表】
2014530246000001.app
【国際調査報告】
2014530246.tif 000007
2014530246.tif 000008
2014530246.tif 000009