(57)【要約】二酸化炭素、水素、および／または水からブタノールおよび関連高級アルコールを独立栄養で生産するための、デザイナ・カルビン回路チャンネルバイオ燃料生産経路および水素化バイオ燃料生産経路、関連するデザイナ遺伝子、およびデザイナ遺伝子組み替え有機体が実現される。ブタノールおよび関連高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および、６−メチル−１−ヘプタノールを含む。デザイナ遺伝子組み替えオキシホトバクテリアおよび藻類のようなデザイナ独立栄養有機体は、水からブタノールおよび関連高級アルコールを二酸化炭素および水から独立栄養で生産するための、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび水素化経路遺伝子と、バイオセーフティ防御機構とを有する。【選択図】図１
2014501109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタノールおよび関連高級アルコールを独立栄養で生産する方法において、
カルビン回路の中間生成物に作用して、または、水素化経路を付与するように作用して、少なくとも４個の炭素原子を有する高級アルコールを生産するように構成された一組の酵素のために遺伝子組み換えコードを有する遺伝子組み換え独立栄養有機体を、リアクタのシステム中に導入するステップと、
上記遺伝子組み換え独立栄養有機体に関連して、光合成水分解、または水素化プロセスから取得される、ＮＡＤＰＨ、還元フェレドキシン、およびエネルギーＡＴＰを利用して、生物学的な上記リアクタ内で二酸化炭素および水から上記高級アルコールを合成するステップと、
生産物分離プロセスを使用して合成した上記アルコールを光バイオリアクタから収穫するステップとを有することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
上記遺伝子組み替え独立栄養有機体は、上記高級アルコールを独立栄養生産するための、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路、および水素化経路の少なくとも１つを有する、遺伝子組み換え光合成植物、遺伝子組み換え光合成細胞、および遺伝子組み換えバクテリアの少なくとも１つを有し、上記高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、６−メチル−１−ヘプタノール、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される、請求項１記載の上記方法。
【請求項３】
上記遺伝子組み替え独立栄養有機体は、藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）、水素化バクテリア、メタン細菌、水性植物、植物細胞、緑藻類、紅藻類、褐藻類、珪藻、海藻類、淡水藻類、耐塩性藻類株、耐冷温藻類株、耐熱性藻類株、アンテナ色素欠失変異体、耐ブタノール性藻類株、耐高級アルコール性藻類株、耐ブタノール性オキシホトバクテリア、耐ブタノール性水素化バクテリア、耐ブタノール性メタン細菌、耐高級アルコール性オキシホトバクテリア、耐高級アルコール性水素化バクテリア、耐高級アルコール性メタン細菌、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択された、遺伝子組み替えデザイナ植物、遺伝子組み替えデザイナ植物細胞、またはバクテリア細胞の少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項４】
上記遺伝子組み換え独立栄養有機体は、デザイナ嫌気性水素化ブタノール生産経路を表現する一組のデザイナ遺伝子を有し、この一組のデザイナ遺伝子は、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）、原生または（異種の）溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）、ホルミルメタノフランデヒロゲナーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンレダクターゼ、メチル−Ｈ４−メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項５】
上記遺伝子組み換え独立栄養有機体は藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）およびバクテリアを有し、これらは、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７００２、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＥＤ４、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＮＡＴＬＩＡ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＳ１２０、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  （Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌｅ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  （ＭＣ−Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｓｐ．、Ｒｉｃｈｅｌｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ７８０３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｉｔｉｓ  ＰＣＣ  ６７１４  ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ＰＤ−１、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｔｒａｉｎ  ５１１４２、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｉｍｏｓａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ  ｄｉｄｅｍｎｉ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  （ＭＣ−Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｓｐ．、Ｒｉｃｈｅｌｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＳ１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、ｃｒｙｏｐｈｉｌｉｃ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．−ｌ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ  ｐａｒｉｅｔｉｎａ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ  ｌａｍｉｎｏｓｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ  ｆｒｉｔｓｃｈｉｉ  ＰＣＣ  ６９１２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＭＡ４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＭＡＩ  ９、Ｍｅｔｈａ���ｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ  ＳＡＮＡＥ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＡＢＮＩＨ３、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＡＢＮＩＨ４、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＤＲｌ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＩ  ３−３；  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  Ｓ４、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．、ＡＵｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  Ｓ６９９、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ  ＷＫ１、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ４３０４、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ  ＳＮＰ６、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．  Ｂ５１０、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  ＨＩ２４２４、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ  ＤＳＭ  ６７２５、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｉ  ＤＳＭ  ２７７８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ  ＤＳＭ  ５１９、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｎ−ｌ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｃａ  ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ  ＤＳＭ  １１１０９、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴ  ｌｂ、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ  ＤＳＭ  ９７９９、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｌａｃｉｄｕｓ  ＤＳＭ  １０６４２、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＴＡ４２６、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ４３８７９、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ  ＳｍＲｌ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ−６、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ  Ａｔ−２２、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＷＡＮ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ  ＡＧ８６、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ  ＭＥ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＦＳ４０６−２２、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓ  Ｍ７、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  Ｎａｎｋａｉ−３、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｃ６、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ  Ａ３、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｌａｂｒｅａｎｕｍ  Ｚ、ＭｅｔｈａｎｏｃｕＵｅｕｓ  ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉ  ＪＲＩ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏ��ｈｉｌｕｓ  ｍａｈｉｉ  ＤＳＭ  ５２１９、Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｅａ  ｔａｒｄａ  ＮＯＢＩ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  １１５７１、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ  Ａ  ＶＩ  ９、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ  ６Ａ８、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  ６Ａｃ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ  ｚｈｉｌｉｎａｅ  ＤＳＭ  ４０１７、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ  ｓｔｒ．  Ｆｕｓａｒｏ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏｌ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ  ＪＦ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ  ｓｔｒ．  Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｋｉｎａｗｅｎｓｉｓ  ＩＨ１、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ２０８８、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｋｅｎｙｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ  ＭＣ０９、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＬＷ１３、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐ．  ＬＷ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ  ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＪＬＷ８、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ３０１、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅｔｒｏｐｈｕｓ  ＳＩＰ  ３  −４、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＯＭ５、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ  ＨＰＬ−００３、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  ＳＩ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ５３０５、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｙａｙａｎｏｓｉｉ  ＣＨＩ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＨＩ  ６、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｓｐ．、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａ  ＡＴＣＣ  ４３５４１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＢＡ１７５、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＫＡ  １４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＪＡ−２−３Ｂ'ａ（２−１３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＪＡ−３−３Ａｂ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ  ＥＪ３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ  １、  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ  ＮＡ１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ４５５７、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆａｔａｔｏｒ  ｉｎｄｉｃｕｓ  ＤＳＭ  １５２８６、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ  ｐｅｎｄｅｎｓ  Ｈｒｋ  ５、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ  ＴＭＯ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ  ＲＫＵ−１、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ、Ｔｈｉｏｍｏｎａｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  Ｋ１２、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ａｎｔｉｑｕａ、および、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓから成るグループから選択される、請求項１記載の上記方法。
【請求項６】
上記遺伝子組み換え独立栄養有機体は、予め定められた誘導条件で誘導可能なデザイナプロトンチャンネル遺伝子、予め定められた誘導条件で誘導可能なデザイナ細胞分裂周期ｉＲＮＡ遺伝子、デザイナ細胞分裂制御可能な独立栄養有機体を形成するためにデザイナバイオ燃料生成経路遺伝子を形質転換するためのホスト有機体としての高ＣＯ２要求突然変異体、およびこれらの組み合わせから成るグループから選択されるバイオセーフティ防護機構を有し、
上記遺伝子組み替え独立栄養有機体は、耐酸素溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、耐酸素膜束縛ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ（Ｍｔｒ）、メチル−コエンザイムＭレダクターゼ（Ｍｃｒ）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）、Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼ、１０−ホルミル−Ｈ４−葉酸シンターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−葉酸デヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−葉酸レダクターゼ、メチル−Ｈ４−葉酸：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ、ホルミルトランスファラーゼ、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンレダクターゼ、メチル−Ｈ４−メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ、３−メチルブタナールレダクターゼ、ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、オクタノールデヒドロゲナーゼ、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼから成るグループから選択される酵素のうちの少なくとも１つを表現する、配列表に示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１９８の事例的なデザイナＤＮＡコンストラクトに例示される一組のデザイナ遺伝子を有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項７】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シトラマル酸シンターゼ、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項８】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンアンモニアラーゼ、２−イソプロピルリンゴ酸、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項９】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シトラマル酸シンターゼ、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１０】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンアンモニアラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１１】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１２】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１３】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、デザイナ３−ケトチオラーゼ、デザイナ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、デザイナエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、デザイナ２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、デザイナアシル−ＣｏＡレダクターゼ、および、ヘキサノールデヒロゲナーゼ；ならびに、デザイナ３−ケトチオラーゼ、デザイナ２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、デザイナアシル−ＣｏＡレダクターゼ、およびオクタノールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１４】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シトラマル酸シンターゼ、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびデザイナ短鎖アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１５】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンアンモニアラーゼ、２−イソプロピルリンゴ酸、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびデザイナ短鎖アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１６】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シトラマル酸シンターゼ、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびデザイナ短鎖アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１７】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンアンモニアラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびデザイナ短鎖アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１８】
上記一組の酵素は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびデザイナ短鎖アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された酵素のうちの少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項１９】
上記デザイナ独立栄養有機体は、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、６−メチル−１−ヘプタノール、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される上記高級アルコールのうちの少なくとも１つを生産するためのデザイナ・カルビン回路チャンネル経路、および水素化経路の少なくとも１つを有する、請求項１記載の上記方法。
【請求項２０】
デザイナ独立栄養有機体の上記デザイナ遺伝子組み替え有機体は、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−ＭメチルトランスフェラーゼＭｔｒ、Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ、メチル−コエンザイムＭレダクターゼＭｃｒ、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）、溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）、蟻酸デヒドロゲナーゼ、１０−ホルミル−Ｈ４−葉酸シンターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−葉酸デヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−葉酸レダクターゼ、メチル−Ｈ４−葉酸：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および、ブタノールデヒドロゲナーゼを有するデザイナメタン生成水素化ブタノール生産経路システムを表現する一組の遺伝子を有し、
上記独立栄養有機体は、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ  Ｍｔｒ、原生または（異種の）Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ、メチル−コエンザイムＭレダクターゼＭｃｒ、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）、原生または（異種の）溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ、ホルミルトランスファラーゼ、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンレダクターゼ、メチル−Ｈ４−メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および、ブタノールデヒドロゲナーゼを有するデザイナメタン生成水素化ブタノール生産経路システムを表現する一組の遺伝子を有る、請求項１記載の上記方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願のクロスリファレンス】
【０００１】
この出願は２０１１年３月２９日に提出された米国特許出願第１３／０７５，１５３号に関する利益を主張し、これは２０１０年８月２０日に提出された、同一出願人に係る米国特許出願第１２／９１８，７８４号の部分継続出願であり、これは２００９年２月２１日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４８０１号の米国国内段階の出願であり、これは、２００８年２月２３日に提出された米国仮出願第６１／０６６、８４５号および２０１０年１２月２２日に提出された米国仮出願第６１／４２６，１４７号に関する利益を主張する。これらの出願の内容は参照してここに組み入れる。
【技術分野】
【０００２】
この発明は、全般的には、バイオセーフティ防護されたバイオ燃料エネルギー生産技術に関する。よる詳細には、この発明は、ブタンまたは関連する高級アルコールを二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から独立栄養合成するためのフォトシステムおよび／または水素化（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）プロセスから得られる、還元力（ＮＡＤＰＨ）または水素（Ｈ２）、およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用するために生成されるデザイナ遺伝子組み替え植物、例えば、遺伝子組み替え藻、藍藻（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリア）、植物細胞、またはバクテリア細胞に基づく、先進バイオ燃料生産手法を実現する。
【配列表の参照】
【０００３】
この発明は、２０１１年１２月１８日に”ＪＷＬ＿００４＿ＵＳ１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇＦｕｌｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”、ファイルサイズ４２９ＫＢのｅｆｉｌｅで更新された、米国特許商標長の電子出願システムを用いる電子フォーマットで２０１１年３月２９日に系列リストテキストファイル"ＪＷＬ＿００４＿ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇＦｕｌｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ"として同時に提出されているアミノ酸配列および／または核酸配列への参照を含む。上述の配列リストは、世界知的所有権機関標準（ＷＩＰＯ）ＳＴ．２５および関連する合衆国（ＵＳ）最終規則に特定されたフォーマット要件に適合するＰａｔｅｎｔＩｎ３．５により準備され、これは適用可能な場合には参照して３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１．５２（ｅ）（５）に従ってここに組み入れる。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールおよび／または関連する高級アルコールは、車のようなエンジンを走行させる液体燃料として利用可能である。ブタンはガソリンを置換でき、２つの燃料のエネルギー量はほぼ同じである（ブタンは１１０，０００Ｂｔｕパーガロンであり、ガソリンは１１５，０００Ｂｔｕパーガロンである）。ブタノールはエタノールと比較したときに代替燃料としても多くの優れた特徴を伴う。これらは、（１）ブタノールが大きなエネルギー量を有すること（１ガロンブタノール当たり１１０，０００Ｂｔｕ）、（２）ブタノールはエタノールに較べて６倍も低「蒸発性」で、ガソリンに較べて１３倍も低「蒸発性」であり、酸化剤（ｏｘｙｇｅｎａｔｅ）としての使用をより安全にでき、夏および冬の季節に間の極めて特別なブレンドを必要としなくなること、（３）ブタンは、ガソリンパイプラインを含み既存の燃料設備基盤を通じて搬送可能であり、これに対してエタノールはレール、荷船、またはトラックを通じて出荷されなければならず、（４）ブタンはガソリンの代替品としてガロン対ガロンで例えば１００％または他のパーセントで利用でき、他方、エタノールはガソリンに約８５％（Ｅ−８５）まで添加物として利用できるだけであり、しかも、エンジンに顕著な修正を加えておく必要がある（ブタノールは現行の車のエンジンに修正を加える必要無しに１００％代替品として機能可能である）。
【０００５】
ブタノールおよび／または関連する高級アルコールの液体燃料としての顕著な潜在的な市場は、現在の交通およびエネルギーシステムにおいてすでに存在する。ブタノールはまた産業的な溶剤としても利用される。合衆国においては、ブタンは主に石油から製造される。歴史的には（１９００年代〜１９５０年代）、バイオブタノールが、トウモロコシおよび糖蜜から発酵によって製造されており、この発酵は、アセトンおよびエタノールも製造するものであり、典型的には所定のブタノール製造バクテリア、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉを用いるＡＢＥ（アセトン、ブタノール、エタノール）発酵として知られていた。ＵＳＡは１９５４ごろキューバからの低コストの砂糖供給を失ったとき、しかしながら、発酵によりブタノール製造は、石油の値段が砂糖の値段より下がったことに主に起因して、減少した。最近、バイオマス、例えばトウモロコシ澱粉からクロストリジウムおよび／または酵母発酵プロセスを用いてブタノールおよび／またはエタノールを製造する研究開発についての関心が更新されている。しかしながら、「トウモロコシ澱粉エタノール製造」プロセスの状況と同様に、「トウモロコシ澱粉ブタノール製造」プロセスも多くのエネルギー消費ステップを必要とし、これは、農業トウモロコシ作物栽培、トウモロコシ粒収穫、トウモロコシ粒澱粉処理、および澱粉・糖類・ブタノール発酵を含む。「トウモロコシ澱粉ブタノール製造」プロセスは、ほぼ、その製造ブタノールのエネルギー値と同じくらいのエネルギーのコストを伴うであろう。これは驚くに値せず、理解できるように、現在の技術が利用できるトウモロコシ澱粉は、茎、葉、および根を含むトウモロコシ作物バイオマスの小さな部分しか表さないからである。トウモロコシ茎葉は農場において通常では破棄され、ここで、ゆっくりとＣＯ２に分解される。これは、それらが多くはリグノセルロースバイオマスであり、現行のバイオ精製産業ではそれを利用して効率的にエタノールまたはブタノールを製造できないからである。リグノセルノースからエタノールまたはブタノールを製造する試みが研究されており、この概念は、「セルロースエタノール」または「セルロースブタノール」と呼ばれている。しかしながら、植物バイオマスは、微生物または動物の王国からその細胞膜構造の糖類への攻撃を防御するための有効な機構を発展させてきた。この特徴は、自然の反抗であり、これがリグノセルロースバイオマスから、発酵可能な糖類へのコスト効率のよい変換へのバリケードを形成する。したがって、「リグノセルロース抵抗」として知られるこの問題の１つは植物バイオマスから発酵可能な糖類へのコスト効率のより変換に対する骨の折れる技術バイアである。すなわち、抵抗問題によって、リグノセルロースバイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、木性植物材料）は、メタノールまたはブタノールを製造するために、前処理なしに容易に、発酵可能な糖類に変換できず、この前処理がしばしば高処理コストと関連している。リグノセルロースバイオマス前処理および発酵ブタノール製造処理における５０年を超える研��開発努力にもかかわらず、抵抗リグノセルロースの問題は、依然排除されていない骨の折れる技術バリアとして依然として存在する。さらに、リグノセルロースバイオマス栽培、収穫、前処理、およびセルロース・糖類・ブタノール発酵のステップはすべてエネルギーを消費する。したがって、バイオマス技術のボトルネックの問題をバイパスできるなんらかの新しい技術が有益である。
【０００６】
オキシホトバクテリア（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含む藍藻としても知られている）および藻（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、および、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）は、約１０％の最大理論ソーラー・バイオマスエネルギー変換で液体培養媒体で水からのＯ２展開でＣＯ２を光合成同化することができ、クリーンかつ再生可能エネルギー源として多大なポテンシャルを有する。しかしながら、野生型の酸素発生型光合成の緑色植物、例えば藍藻、真核藻類は、ＣＯ２およびＨ２Ｏから直接にブタノールを製造する能力を持たない。野生型の光合成は、藻類チラコイド膜システムを通じる、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子転送プロセスからの還元力（ＮＡＤＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を用いて、藻類、または緑色植物のクロロプラスト中のストロマ領域において「カルビン回路」と集合的に呼ばれる一連の酵素を用いてＣＯ２を炭水化物（ＣＨ２Ｏ）ｎ、例えば澱粉に変換する。野生型の光合成プロセスの正味の結果は、太陽光エネルギーを用いた、ＣＯ２およびＨ２Ｏから炭水化物（ＣＨ２Ｏ）およびＯ２への変換であり、つぎのプロセス反応に従う。
ｎＣＯ２＋ｎＨ２Ｏ  →  （ＣＨ２Ｏ）ｎ＋ｎＯ２        ［１］
炭水化物（ＣＨ２Ｏ）ｎは、さらに、タンパク質、脂質、およびセルロースならびに他の細胞壁物質を含む、すべての複雑な細胞（バイオマス）物質へと、細胞代謝および新生の間に、変換される。
【０００７】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのような所定の藻においては、有機貯蔵、例えば澱粉のいくらかは、ゆっくりと代謝されて第２の発酵代謝経路を通じてエタノールになる。藻類発酵代謝経路は酵母発酵プロセスと類似であり、澱粉が小さな糖類、例えばブドウ糖に分解され、これが解糖プロセスでピルビン酸塩に変換される。ピルビン酸塩はつぎに蟻酸塩、酢酸塩（アセテート）およびエタノールに多くの付加的な代謝ステップにより変換される（ＧｆｅｌｌｅｒおよびＧｉｂｂｓ（１９８４）「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ」、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５：２１２−２１８）。この第２の代謝プロセスの効率は極めて限定的であり、これは、多分、藻類の細胞中の澱粉のような限定された有機貯蔵物のほんの一部しか使用しないからである。さらに、生来の藻類の第２の代謝プロセスはどのようなブタノールも生産しない。上述のとおり、ブタノール（および／または関連高級アルコール）は燃料としてガソリンの代替として働く多くの優れた特性を有している。したがって、高エネルギー変換効率の、光生物および／または水素化ブタノール（および／または関連高級アルコール）生産機構が必要である。
【０００８】
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４８０１号は、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）からブタノールを光生物学的に製造するための、デザイナ光合成有機体（例えば、デザイナ遺伝子組み換え植物、植物細胞、藻類およびオキシホトバクテリア）に関する一組の方法を開示する。
【発明の開示】
【０００９】
この発明は、ブタノールおよび／または関連する高級アルコールを独立栄養生産するための、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび／または水素化の経路、関連するデザイナ遺伝子、および、デザイナ遺伝子組み替え有機体を開示し、これら関連高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、６−メチル−１−ヘプタノール、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００１０】
デザイナ遺伝子組み換えオキシホトバクテリアおよび藻類のようなデザイナ独立栄養有機体は、ブタノールおよび関連高級アルコールを二酸化炭素および水から増強された光生物学的生産を行うためのデザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の遺伝子およびバイオセーフティ防護技術を有する。
【００１１】
他の実施例によれば、遺伝子組み替え独立栄養有機体は、水性植物、植物細胞、緑藻類、紅藻類、褐藻類、藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）、珪藻、海藻類、淡水藻類、耐塩性藻類株、耐冷温藻類株、耐熱性藻類株、アンテナ色素欠失変異体、耐ブタノール性藻類株、耐高級アルコール性藻類株、耐ブタノール性オキシホトバクテリア、耐高級アルコール性オキシホトバクテリア、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択された、遺伝子組み替えデザイナ植物または植物細胞を有する。
【００１２】
種々の実施例のうちの１実施例によれば、デザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強経路は、カルビン回路の中間生成物、３−ホスホグリセリン酸塩を取り、これを１−ブタノールに変換するものであり、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シトラマル酸シンターゼ、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された１組の酵素を有する。
【００１３】
種々の実施例のうちの１実施例によれば、他のデザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強の１−ブタノール生産経路は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンアンモニアラーゼ、２−イソプロピルリンゴ酸、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された１組の酵素を有する。
【００１４】
他の実施例によれば、デザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強経路は、カルビン回路の中間生成物、３−ホスホグリセリン酸塩を取り、これを２−メチル−１−ブタノールに変換するものであり、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シトラマル酸シンターゼ、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼからなるグループから選択された１組の酵素を有する。
【００１５】
他の実施例によれば、デザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強の２−メチル−１−ブタノール生産経路は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンアンモニアラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼからなるグループから選択された１組の酵素を有する。
【００１６】
他の実施例によれば、デザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強のイソブタノール生産経路は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドラターゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、ＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ、および、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼからなるグループから選択された１組の酵素を有する。
【００１７】
同様に、ブタノール、および／または、関連する高級アルコール、例えば、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および／または、６−メチル−１−ヘプタノールを光生物学的に生産するための種々の実施例のうちの１つに従う、多くの他のデザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強経路も開示される。
【００１８】
種々の実施例のうちの１つによれば、光生物学的にブタノールおよび関連する高級アルコールを生産し採取する方法は：（ａ）カルビン回路の中間体生成物に作用してこれおブタノールおよび／または関連する高級アルコールに変換するよう構成された１組の酵素のための遺伝子組み換えコード有する遺伝子組み換え光合成有機体を光合成リアクタシステム中に導入し；（ｂ）遺伝子組み換え光合成有機体に関連して光バイオリアクタにおいて光合成ミス分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスから得られた還元力ＮＡＤＰＨおよびエネルギーＡＴＰを用いてブタノールおよび／または関連する高級アルコールを二酸化炭素および水から合成し；さらに、（ｃ）生成物分離プロセスを利用して、合成ブタノールおよび／または関連する高級アルコールを光バイオリアクタから抽出するステップを有する。
【００１９】
他の実施例によれば、ブタノールおよび関連する高級アルコールの化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）生産のための、デザイン水素駆動カルビン回路チャンネルのバイオ燃料生産有機体は、デザイナ・カルビン回路チャンネルのバイオ燃料生産経路と組み合わせて一組の耐酸素溶解性ヒドロゲナーゼおよび膜拘束ヒドロゲナーゼを有する。
【００２０】
他の実施例によれば、デザイナ有機体は、９１％程度に高い、Ｈ２からブタノールへの最大エネルギー変換効率で、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を水素駆動で化学合成独立栄養生産するための、デザイナ嫌気性水素化システムおよび還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を有する。このデザイナ独立栄有機体はデザイナ嫌気性水素化のブタノール生産経路システムを表現する一組のデザイナ遺伝子（具体的にはデザイナＤＮＡコンストラクト）を有し、これは、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）、原生（または異種の）溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ、ホルミルトランスファラーゼ、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンレダクターゼ、メチル−Ｈ４−メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼを有する。
【００２１】
種々の実施例のうちの１実施例によれば、デザイナ独立栄養有機体は、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）およびメタン（ＣＨ４）の双方を嫌気性化学合成独立栄養生産するための、デザイナメタン生成水素化システムおよび還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を有する。このデザイナ独立栄有機体はデザイナメタン生成水素化ブタノール生産経路システムを表現する一組のデザイナ遺伝子を有し、これは、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ  Ｍｔｒ、原生または（異種の）Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ、メチル−コエンザイムＭレダクターゼＭｃｒ、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）、溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）、蟻酸デヒドロゲナーゼ、１０−ホルミル−Ｈ４−葉酸シンターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−葉酸デヒドロゲナーゼ、１０−メチレン−Ｈ４−葉酸レダクターゼ、メチル−Ｈ４−葉酸：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスファラーゼ、コリノイド鉄硫黄タンパク質、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼを有する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応でブタノールＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨへと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、カルビン回路から分岐したデザイナ・ブタノール生産経路を表す図である。
【図２Ａ】デザイナブタノール生産経路遺伝子のためのＤＮＡコンストラクトを表す図である。
【図２Ｂ】ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨの相互変換のためのＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換デザイナ遺伝子のためのＤＮＡコンストラクトを表す図である。
【図２Ｃ】デザイナｉＲＮＡデンプン／グリコーゲン−合成のためのＤＮＡコンストラクトを表す図である。
【図２Ｄ】デザイナデンプン分解・解糖遺伝子のＤＮＡコンストラクトを表す図である。
【図２Ｅ】デザイナブタノール生産経路遺伝子のＤＮＡコンストラクトを表す図である
【図２Ｆ】総合的な遺伝子変換のための２つの再組み合わせを伴うデザイナブタノール生産経路遺伝子のＤＮＡコンストラクトを表す図である
【図２Ｇ】デザイナバイオセーフティ制御遺伝子のＤＮＡコンストラクトを表す図である
【図２Ｈ】デザイナプロトンチャンネル遺伝子のＤＮＡコンストラクトを表す図である
【図３Ａ】２つのキーとなる機能、すなわち、デザイナバイオセーフティ機構およびデザイナバイオ燃料生産経路を含む細胞分割制御可能なデザイナ有機体を示す図である。
【図３Ｂ】デザイナバイオセーフティ機構で二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）からブタノールＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨを光生物学的に生産するための細胞分割制御可能なデザイナ有機体を示す図である。
【図３Ｃ】二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）からエタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ）のような他のバイオ燃料をバイオセーフティ防護で光生物学的に生産するための細胞分割制御可能なデザイナ有機体を示す図である。
【図４】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応で１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図５】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応で２−メチル−１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図６】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応でイソブタノール（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＯＨ）および３−メチル−１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図７】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応で１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）および１−オクタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図８】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応で１−ペンタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、および１−ヘプタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図９】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応で３−メチル−１−ペンタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、４−メチル−１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、および５−メチル−１−ペプタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図１０】二酸化炭素（ＣＯ２）を一連の酵素反応で４−メチル−１−ペンタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、５−メチル−１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、および６−メチル−１−ペプタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）へと還元するための、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を利用する、デザイナ・カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表す図である。
【図１１】水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および水（Ｈ２Ｏ）からブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）のようなバイオ燃料を嫌気性化学合成独立栄養生産するための、デザイナ耐酸素ヒドロゲナーゼを伴うデザイナ有機体を表す図である。
【図１２】水素（Ｈ２）、および二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を嫌気性化学合成独立栄養生産するための、還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を伴う、デザイナ嫌気性水素化システムを有するデザイナ有機体を表す図である。
【図１３】一連の酵素反応によって二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を嫌気性化学合成独立栄養生産するための、デザイナ還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を表す図である。
【図１４】一連の酵素反応によって二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を嫌気性水素化生産するための、デザイナＡＴＰ必須還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を表す図である。
【図１５】水素（Ｈ２）、および二酸化炭素（ＣＯ２）からブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）およびメタン（ＣＨ４）の双方を嫌気性化学合成独立栄養生産するため還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を伴うデザイナメタン生成水素化システムを有するデザイナ有機体を表す図である。
【図１６】一連の酵素反応によって二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）およびメタン（ＣＨ４）の双方を嫌気性水素化生産するための、デザイナ還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を表す図である。
【図１７】一連の酵素反応によって二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）およびメタン（ＣＨ４）の双方を嫌気性水素化生産するための、デザイナＡＴＰ必須還元アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
この発明は、デザイナ独立栄養有機体、例えば、デザイナ遺伝子組み替え植物（例えば藻類およびオキシホトバクテリア）、植物細胞、またはバクテリアに基づく、独立栄養のブタノールおよび関連するアルコールを生産する技術に向けられている。この明細書の全体を通じる文脈において「高級アルコール」または「関連する高級アルコール」は少なくとも４個の炭素原子を有するアルコールを指し、これは直鎖または分岐アルコールの双方、例えば１−ブタノールおよび２−メチル−１−ブタノールを含む。カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路は、ブタノールおよび関連する高級アルコールを光生物学的に生産する、藻類およびオキシホトバクテリア（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含む）のようなホスト光合成有機体中のデザイナ遺伝子の利用を通じて表現されるデザイナ酵素により構築される。上述のブタノールおよび関連する高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および、６−メチル−１−ヘプタノールからなるグループから選択される。デザイナ植物および植物細胞は、内因性光合成制御機構を調整するように遺伝子工学技術を用いて生成され、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスから取得される還元力（ＨＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を用いて高級アルコール、例えば、１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）および２−メチル−１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）を、二酸化炭素（ＣＯ２）、および水（Ｈ２Ｏ）から以下の一般なプロセス反応（ただしｍ、ｎ、ｘおよびｙはそのモル係数である）で、この発明に従って直接に合成することができる。
ｍ（ＣＯ２）＋ｎ（Ｈ２Ｏ）→  ｘ（高級アルコール）＋ｙ（Ｏ２）          ［２］
この発明の光瀬物学的な高級アルコール生産方法は、バイオマス技術のボトルネックの問題を迂回することにより、やっかいなリグノセルロースの問題を完全に除去する。図１に示すように、例えば、デザイナ有機体が、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスからの還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を有効に利用して、極めて硬くしばしば植物精製業界で有益に利用困難な望ましくないリグノセルロース材料の、合成のための他の経路に導入することなしに、二酸化炭素（ＣＯ２）、および水（Ｈ２Ｏ）から直接に直ちに、ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を合成する。このアプローチは「トウモロコシデンプン生産」プロセスとも異なる。この発明によれば、トウモロコシ作物栽培、トウモロコシ粒収穫、トウモロコシ粒澱粉処理、および澱粉・糖類・ブタノール発酵を含む、トウモロコシ澱粉ブタノール生産プロセスで対処しなければならない、多くのエネルギー消費のステップを実行すること無しに、ブタノールを直接に二酸化炭素（ＣＯ２）、および水（Ｈ２Ｏ）から製造できる。この結果、この発明の光合成ブタノール生産技術では、現行の技術に較べてかなり（１０倍より大きい）高い、太陽光・ブタノールのエネルギー変換効率が期待できる。ここに提案の光合成ブタノール生産プロセスが１０％の太陽光エネルギー変換効率であるとすると、最大理論生産性（収率）は１年、１エーカーあたり約７２７００ｋｇのブタノールであり、これは約７０台の車をサポートできるであろう（１年１エーカーあたり）。この発明は、地球を危険なＣＯ２の累積から守るのにも役立つであろう。なぜならば、この方法はＣＯ２を直接にクリーンなブタノールエネルギーに変換するからである。
【００２４】
この技術の基本的な特徴は、野生型の光合成経路の最終生成物としての澱粉および他の複雑な細胞（バイオマス）材料を製造するのに代えて、植物（例えば藻類またはオキシホトバクテリア）または植物細胞を用い、植物または植物細胞中に、図１に説明される、カルビン回路の中間体生産物に作用してこの中間体生産物をブタノールに変換する一組の酵素のための核酸分子エンコーディングを、植物または植物細胞に導入することである。したがって、この発明は、その中でも、デザイナ植物（例えばデザイナ藻類およびデザイナオキシホトバクテリア）、デザイナ植物組織、またはデザイナ植物細胞に基づいてブタノールおよび／または関連の高級アルコールを生産する方法、デザイナブタノールおよび／または関連する高級アルコールの生産経路のＤＮＡコンストラクト・エンコーディング遺伝子、さらには、精製された、デザイナ藻類、デザイナオキシホトバクテリア（デザイナシアノバクテリアを含む）、デザイナ植物、デザイナ植物組織、およびデザイナｓｙ九物細胞を提供する。この発明の種々の側面は以下にさらに詳細に説明される。
【００２５】
この発明によれば、この発明の光合成ブタノールおよび／または関連高級アルコール生産のためのデザイナ有機体または細胞は、ホストとして、光合成能力を有する、すなわち、光合成を通じて光エネルギーを捕獲し、このエネルギーを用いて無機物質を有機物質に変換する光合成装置および酵素経路を具備する、任意の植物（藻類およびオキシホトバクテリアを含む）、植物組織、または植物細胞を使用して形成できる。好ましくは、ホスト有機体は、例えば、少なくとも、１エーカー、１年当たり、約１，４５０ｋｇのブタノール、より好ましくは１エーカー、１年当たり、７，２７０ｋｇのブタノール、さらに好ましくは、１エーカー、１年当たり、７２，７００ｋｇのブタノールをＣＯ２およびＨ２Ｏから生産する光合成ブタノール（および／または関連高級アルコール）の生産をサポートする、適切な光合成ＣＯ２固定率を伴わなければならない。
【００２６】
好ましい実施例において、デザイナ植物を形成するために水性植物（ａｑｕａｔｉｃ  ｐｌａｎｔ）を採用する。水性植物はヒドロフィティック植物とも呼ばれ、水中（水面に接すること、または水面中であることを含む）または永久飽和土の中のような、水性環境中またはそれに接して生きる植物である。ここで用いるように、水性植物は、例えば、藻類、ブルー・グリーン藻類（シアノバクテリアおよびオキシホトバクテリア）、沈水水性ハーブ（Ｈｙｄｒｉｌｌａ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ，Ｅｌｏｄｅａ  ｄｅｎｓａ，Ｈｉｐｐｕｒｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ａｐｏｎｏｇｅｔｏｎ  Ｂｏｉｖｉｎｉａｎｕｓ  Ａｐｏｎｏｇｅｔｏｎ  Ｒｉｇｉｄｉｆｏｌｉｕｓ，Ａｐｏｎｏｇｅｔｏｎ  Ｌｏｎｇｉｐｌｕｍｕｌｏｓｕｓ，Ｄｉｄｉｐｌｉｓ  Ｄｉａｎｄｒａ，Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉａ  Ｄｕｂｙａｎａ，Ｈｙｇｒｏｐｈｉｌｉａ  Ａｕｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ，Ｍｉｃｒａｎｔｈｅｍｕｍ  Ｕｍｂｒｏｓｕｍ，Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａ  Ａｚｕｒｅａ，Ｓａｕｒｕｒｕｓ  Ｃｅｒｎｕｕｓ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｒｙｎｅ  Ｌｉｎｇｕａ，Ｈｙｄｒｏｔｒｉｃｈｅ  Ｈｏｔｔｏｎｉｉｆｌｏｒａ，Ｅｕｓｔｒａｌｉｓ  Ｓｔｅｌｌａｔａ，  Ｖａｌｌｉｓｎｅｒｉａ  Ｒｕｂｒａ，Ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ  Ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ，Ｃｙｐｅｒｕｓ  Ｈｅｌｆｅｒｉ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｒｙｎｅ  Ｐｅｔｃｈｉｉ，Ｖａｌｌｉｓｎｅｒｉａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ，Ｖａｌｌｉｓｎｅｒｉａ  Ｔｏｒｔａ，Ｈｙｄｒｏｔｒｉｃｈｅ  Ｈｏｔｔｏｎｉｉｆｌｏｒａ，Ｃｒａｓｓｕｌａ  Ｈｅｌｍｓｉｉ，Ｌｉｍｎｏｐｈｉｌａ  Ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ，Ｐｏｔａｍｏｇｅｔｏｎ  Ｐｅｒｆｏｌｉａｔｕｓ，Ｒｏｔａｌａ  Ｗａｌｌｉｃｈｉｉ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｒｙｎｅ  Ｂｅｃｋｅｔｉｉ，Ｂｌｙｘａ  Ａｕｂｅｒｔｉｉ，Ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ  Ｄｉｆｆｏｒｍｍｉｓ）、ダックウィード（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ  ｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ，Ｗｏｌｆｆｉａ  ｇｌｏｂｏｓａ，Ｌｅｍｎａ  ｔｒｉｓｕｌｃａ，Ｌｅｍｎａ  ｇｉｂｂａ，Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ，Ｌａｎｄｏｌｔｉａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、ウォーターキャベツ（Ｐｉｓｔｉａ  ｓｔｒａｔｉｏｔｅｓ）、パターカップ（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、オニビシ（ｗａｔｅｒ  ｃａｌｔｒｏｐ）（Ｔｒａｐａ  ｎａｔａｎｓおよびＴｒａｐａ  ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、ウォーターリリー（Ｎｙｍｐｈａｅａ  ｌｏｔｕｓ，ＮｙｍｐｈａｅａｃｅａｅおよびＮｅｌｕｍｂｏｎａｃｅａｅ）、ホテイアオイ（ｗａｔｅｒ  ｈｙａｃｉｎｔｈ）（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａ  ｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、Ｂｏｌｂｉｔｉｓ  ｈｅｕｄｅｌｏｔｉｉ、Ｃａｂｏｍｂａ  ｓｐ．、海草（Ｈｅｔｅｒａｎｔｈｅｒａ  Ｚｏｓｔｅｒｉｆｏｌｉａ，Ｐｏｓｉｄｏｎｉａｃｅａｅ，Ｚｏｓｔｅｒａｃｅａｅ，Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｃｅａｅ，およびＣｙｍｏｄｏｃｅａｃｅａｅ）を含む。水性植物から生産されたブタノール（および／または関連高級アルコール）は水中に拡散して、植物の通常の成長を許容し、さらに、植物からブタノールのより堅牢な生産を許容する。水性植物組織（これに限定されないが多細胞藻類を含む）または細胞（これに限定されないが単細胞藻類を含む）の液体培養物は使用して大変好ましい。なぜならば、デザイナブタノール（および／または関連高級アルコール）生産経路から生産されたブタノール（および／または関連高級アルコール）の分子は、容易に細胞または組織から液体性の水媒体へ拡散することができ、これが、ブタノール（および／または関連高級アルコール）を貯蔵するための大きなプールとして働き、こののち、フィルタリング、および／または蒸留／蒸発技術によって抽出可能であるからである。
【００２７】
水性植物または細胞は、この発明の方法において使用するホスト有機体として好ましいけれども、光合成を行え、液体培養媒体中で培養可能である、非水性植物の組織および細胞も光合成ブタノール（および／または高級アルコール）生産のためのデザイナ組織または細胞を生成するのに使用できる。例えば、以下の、非水性植物の組織または細胞もこの発明のホスト有機体として使用するのに選択可能である。すなわち、ウッドリンゴの木の光合成独立栄養新芽（ｓｈｏｏｔ）組織培養、Ｆｅｒｏｎｉａ  ｌｉｍｏｎｉａ、トウモロコシ植物のクロロフィル細胞培養、Ｚｅａ  Ｍａｙｓ、キク科およびナス科の種のグリーンルート培養、サトウキビの茎の柔らかい部分の組織培養、コケ植物の組織培養、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、大豆植物の光合成細胞懸濁培養（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、グリーンタバコ（Ｎｉｃｏｆｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．）の細胞の光合成独立栄養および光混合栄養培養、Ｇｉｓｅｋｉａ  ｐｈａｒｎａｃｅｏｉｄｅｓ（Ｃ４植物）の細胞懸濁培養、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｐｏｗｅｌｌｉｉ  Ｗａｔｓ．，Ｄａｔｕｒａ  ｉｎｎｏｘｉａ  Ｍｉｌｌ．，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｌ．，およびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｘ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ  Ｌ．  ｆｕｓｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄの光合成懸濁液培養ラインである。
【００２８】
「液体媒体」は、光合成独立栄養培養のための、液体の水に比較的少量の無機栄養素（例えば、塩の形態で広くある、Ｎ、Ｐ、Ｋ）を加えたものを意味し、ときどき、光混合栄養および／または光従属栄養の培養のための所定の有機サブストレート（例えば、スクロース、グルコース、またはアセテート）を含む。
【００２９】
とくに好ましい実施例においては、この発明のブタノール（および／または関連高級アルコール）生産方法で使用される植物は、藻類、または藍藻類である。藻類、または藍藻類を使用するといくつかの利点が有る。これらは開放された池で大量に低コストで成長可能である。ブタノール（および／または関連高級アルコール）の水相からの収穫および精製も、蒸留／蒸発または隔膜分離により簡単に行うことができる。
【００３０】
この発明に使用して好適な藻類は、単細胞藻類およびマルチ−単細胞藻類の双方を含む。この発明に使用するのに選択できる多細胞藻類は、これに限定されないが、海藻、例えば、Ｕｌｖａ  ｌａｔｉｓｓｉｍａ（アオサ）、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ、Ｃｏｄｉｕｍ  ｆｒａｇｉｌｅ、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎｔｉｆｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒａ  ｔｅｎｅｒａを含む。適切な藻類は以下の藻類のディビジョンからも選択できる。すなわち、緑藻類（緑色植物門：Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅藻類（紅色植物門：Ｐｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻類（褐藻植物門：Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）、珪藻（珪藻門：Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、および藍藻類（藍色植物門ＣｙａｎｏｐｈｙｔａおよびＰｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａを含むオキシホトバクテリア）である。適切な緑藻類のオーダーは、Ｕｌｖａｌｅｓ、Ｕｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｇｏｎｉａｌｅｓ、Ｏｅｄｏｇｏｎｉａｌｅｓ、Ｚｙｇｎｅｍａｔａｌｅｓ、Ｃｌａｄｏｐｈｏｒａｌｅｓ、Ｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ、およびＤａｓｙｃｌａｄａｌｅｓを含む。適切な紅色植物門のジーナスは、Ｐｏｒｐｈｙｒａ、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ、Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ、Ｇｅｌｉｄｉｕｍ、およびＡｇａｒｄｈｉｅｌｌａである。適切な褐藻植物門のジーナスは、Ｌａｍｉｎａｒｉａ、Ｕｎｄａｒｉａ、Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、およびＤｉｃｔｙｏｓｉｐｈｏｎである。適切な藍色植物門（シアノバクテリアとしても知られている）のジーナスは、これに限定されないが、Ｐｈｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、およびＡｎａｂａｅｎａを含む。適切なＰｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（オキシクロロバクテリアとしても知られている）のジーナスは、これに限定されないが、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ，  Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ，およびＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓを含む。適切な珪藻門のジーナスは、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、およびＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍである。この発明に使用して好適な藻類の種（スピーシー）は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、’Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ’  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．，  Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄｏｗｉｌ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ；Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ  ｇｅｌａｔｉｎｕｍ、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓ、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇｅｌｉｄｉｅｌｌａ  ａｃｅｒｏｓａ、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈａｎｇｉｉ、Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｍｉｎｉａｔａ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｓｐｐ．，  Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ｓｐｐ．，  Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓｐｐ．，  Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ  ｓｐｐ．，  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｓｐｐ．，  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，  Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ、Ｕｌｖａ  ｓｐｐ．，  Ｕｎｄａｒｉａ  ｓｐｐ．，  Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  Ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｔｉｃｕｍ、Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、およびＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓを含む。
【００３１】
この発明に使用して好ましい藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）の種は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１，Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ７１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７００２、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＥＤ４、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＮＡＴＬ１Ａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＳ１２０、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  （Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌｅ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．，  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．，  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  （ＭＣ−Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｒｉｃｈｅｌｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ７８０３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｉｔｉｓ  ＰＣＣ  ６７１４  ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ＰＤ−１、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｔｒａｉｎ  ５１１４２、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｉｍｏｓａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ  ｄｉｄｅｍｎｉ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  （ＭＣ−Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｒｉｃｈｅｌｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＳ１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、ｃｒｙｏｐｈｉｌｉｃ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．，  Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．−ｌ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ  ｐａｒｉｅｔｉｎａ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ  ｌａｍｉｎｏｓｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ  ｆｒｉｔｓｃｈｉｉ  ＰＣＣ  ６９１２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＭＡ４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＭＡ１９、およびＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏ���ｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓを含む。
【００３２】
遺伝子の背景および所定の特別な特徴に対して、ホスト光合成有機体を適切に選択することも有益である。例えば、雪や氷の中で成長できる好冷性藻類（好冷性細菌）、および／または、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ冷性ストレインＣＣＭＧ１６１９のような冷耐性ホストストレインから形成された光合成ブタノール生産デザイナ藻類は、寒冷な季節またはカナダのような地域においてさえ光生物学的ブタノール生産を許容し、これは、４°Ｃ程度で光合成水分解を行える能力として特徴付けられてきた（Ｌｅｅ，ＢｌａｎｋｉｎｓｈｉｐおよびＧｒｅｅｎｂａｕｍ（１９９５），"Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｂｙ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｌｄ  ｓｔｒａｉｎ  ＣＣＭＰ１６１９  ａｎｄ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  １３７ｃ"Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５１１／５２：３７９−３８６）。他方、好熱性藻類Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａのような好熱性／耐熱性光合成有機体、および／または、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１  および  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓのような好熱性シアノバクテリア（藍藻類）は、熱い季節、または、しばしば熱い、メキシコや、ネバダ、カリフォルニア、アリゾナ、ニューメキシコを含む合衆国の南西地域へとこの発明の実施を十分に適用可能にする。さらに、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓのような海洋藻類から形成される、光合成ブタノール生産デザイナ藻類は海水を使用してこの発明を実施することを可能にする。ただし、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのような淡水藻類から形成されたデザイナ藻類は淡水を使用可能にする。さらに、光合成ブタノール（および／または関連高級アルコール）生産デザイナ藻類の付加的な特徴は、クロロフィルアンテナの寸法を小さくできるという利点であり、これによって、より大きな生産性を実現することが実証されており（Ｌｅｅ，Ｍｅｔｓ，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ（２００２）．"Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｌｉｇｈｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａｎｔｅｎｎａ  ｓｉｚｅ，"Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９８−１００：３７−４８）、また、より堅牢で効率のよい、ＣＯ２およびＨ２Ｏからのブタノール（および／または関連する高級アルコール）の光合成生産を可能にするブタノール耐性（（および／または関連する高級アルコールの耐性）の利点である。光採取色素の量を減少させても光抑制を減殺させることができることが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ＰＣＣ  ６７１４のフィコシアニン欠損突然変異体を使用して実験的に示された（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔｓｕｚｕｋｉ，およびＵｅｄａ（１９９９）"Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−ｄｅｆｉ��ｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ＰＣＣ  ６７１４"，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ  １０：４４７−４５２）。例えば、デザイナブタノール生産経路遺伝子で遺伝子組み換えを行うために、ホスト有機体としてブタノール耐性および／またはクロロフィルアンテナ欠損突然変異体（例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＳ５２１）を使用することにより、これらオプションの特徴をデザイナ藻類に組み込むことができる。したがって、種々の実施例の１つにおいて、ホスト藻類は、緑藻類、紅藻類、褐藻類、藍藻類（シアノバクテリアおよびプロクロロファイトを含むオキシホトバクテリア）、珪藻、海藻類、淡水藻類、単細胞藻類、多細胞藻類、海藻、耐冷温藻類株、耐熱性藻類株、光収集アンテナ色素欠失変異体、耐ブタノール性藻類株、耐高級アルコール性藻類株、および、これらの組み合わせからなるグループから選択される。
【００３３】
［ホストにおけるデザイナブタノール生産経路の形成］
［適切なデザイナ酵素の選択］
この発明のキーとなる特徴の１つは、直接に、ＣＯ２およびＨ２Ｏからブタノールを所望なように合成するために、野生の光合成メカニズムを制御して働くデザイナブタノール生産経路を形成することである。野生の光合成メカニズムは、（１）還元力（ＮＡＤＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を生成するための、藻類チラコイド膜システムを通じる、光合成水分解およびプロトン勾配結合電子転送のプロセス、および、（２）の還元力（ＮＡＤＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を消費して、ＣＯ２を還元する、カルビン回路を含む。
【００３４】
この発明によれば、一連の酵素が、図１に示すような、カルビン回路の中間体生産物を取り出し、この中間体生産物をブタノールに変換するデザイナブタノール生産経路を形成するために使用される。「デザイナブタノール生産経路酵素」は、ここでは、デザイナブタノール生産経路中の（複数ステップの少なくとも１つのための触媒として働く酵素として定義される。この発明によれば、多くのカルビン回路の中間体生産物がデザイナブタノール生産経路を形成するのに使用でき、デザイナブタノール生産経路に必要とされる酵素はカルビン回路のどの中間体生成物からデザイナブタノール生産経路が分岐するかに依存する。
【００３５】
一例において、グリセルアルデヒド三リン酸を取りだしてブタノールに変換するデザイナ経路が形成され、これは、例えば、図に参照番号０１〜１２で示されるような、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ０１、ホスホグリセリン酸キナーゼ０２、ホスホグリセリン酸ムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、ピルビン酸フェレドキシンオシシドレダクターゼ０６、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドヒドロゲナーゼ１１、および、ブタノールヒドロゲナーゼ１２からなる一組の酵素を使用する。このグリセルアルデヒド酸リン酸の分岐のデザイナ経路において、２分子のグリセルアルデヒド三リン酸をブタノールに変換するために、２分子のＮＡＤＨが、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ０１の触媒下のグリセルアルデヒド三リン酸から１，３−ジホスホグリセリン酸へのステップでＮＡＤ＋から生成され；他方、２分子のＮＡＤＨが、１つは、アセトロアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡに還元する３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８の触媒下で、他の１つは、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに還元するブチリル−ＣｏＡヒドロゲナーゼ１０の触媒下で、ＮＡＤ＋に変換する。この結果、このグリセルアルデヒド三リン酸分岐のデザイナ経路（０１〜１２）では、消費されるＮＡＤＨ分子の数は、生成されるＮＡＤＨの数とバランスしている。さらに、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１（ブチリル−ＣｏＡをブチルアルデヒドに還元する）による触媒下の経路ステップと、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２（ブチルアルデヒドをブタノールに還元する）の触媒下の経路ステップとがＮＡＤＨを使用でき、これは、光合成の水分解およびプロトン勾配結合電子伝達プロセスにより再生成できる。したがって、このグリセルアルデヒド三リン酸分岐デザイナブタノール生産経路は連続して作動できる。
【００３６】
他の例において、中間体生産物、３−ホスホグリセリン酸を取りだしてブタノールに変換するデザイナ経路が形成され、これは、例えば、（図に参照番号０３〜１２で示されるような）ホスホグリセリン酸ムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、ピルビン酸フェレドキシンオシシドレダクターゼ０６、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドヒドロゲナーゼ１１、および、ブタノールヒドロゲナーゼ１２からなる一組の酵素を使用する。グリセルアルデヒド三リン酸分岐ブタノール生産経路（０１〜１２）の最後の１０個の酵素は、３−ホスホグリセリン酸分岐デザイナ経路に用いられる酵素と同一であることに留意することは有益である。換言すると、グリセルアルデヒド三リン酸分岐経路のデザイナ酵素（０１〜１２）はカルビン回路の３−ホスホグリセリン酸の点、および、グリセルアルデヒド三リン酸の点の双方からブタノールを生産できる。しかしながら、これら２つの経路は異なる特徴を有する。グリセルアルデヒド三リン酸分岐ブタノール生産経路と異なって、３−ホスホグリセリン酸分岐経路は１０個の酵素（０３〜１２）の活性しか有さず、それ自体は、２つの場所、すなわち、１つはアセトロアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡに還元する、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８の触媒下のステップと、他の１つは、クロトン−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに還元する、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０の触媒下のステップのために必要ないずれのＮＡＤＨもそれ自体は発生できなかった。すなわち、厳格に、ＮＡＤＰＨではなくＮＡＤＨのみを使用できる、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、および／または、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが採用されるならば（採用されるとき）、３−ホスホグリセリン酸分岐経路（０３〜１２）を動作させるためにはＮＡＤＨを供給する必要がある。したがって、３−ホスホグリセリン酸分岐ブタノール生産経路を動作させるためには、光駆動電子伝達プロセスによって供給できるＮＡＤＰＨを利用することができる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、およびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０を利用することが重要である。したがって、この３−ホスホグリセリン酸分岐デザイナブタノール生産経路（図１の０３〜１２）のためには、ＨＡＤＰＨ、または、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの双方（すなわちＨＡＤ（Ｐ）Ｈ）を使用することができる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを使用することが好ましいプラクティスである。代替的には、ＮＡＤＨのみ使用できる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを使用するときには、デザイナ有機体にＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機能（ＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換してＮＡＤＨを供給すること。詳細は後述する）を付与して、３−ホスホグリセリン酸分岐デザイナ経路でブタノールの光合成生産をできるようにする、付加的な実施例を使用することが好ましい。
【００３７】
さらに他の例において、フルクトース−１，６−二リン酸を取りだしてブタノールに変換するデザイナ経路が形成され、これは、図１に参照番号２０〜３３で示されるような、アルドラーゼ２０、トリオースリン酸イソメラーゼ２１、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２２、ホスホグリセリン酸キナーゼ２３、ホスホグリセリン酸ムターゼ２４、エノラーゼ２５、ピルビン酸キナーゼ２６、ピルビン酸−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（またはピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ）２７、チオラーゼ２８、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２９、クロトナーゼ３０、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ３１、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ３２、およびブタノールデヒドロゲナーゼ３３からなる一組の酵素を使用し、アルドラーゼ２０、および、トリオースリン酸イソメラーゼ２１が、グリセルアルデヒド三リン酸分岐のデザイナ経路に対してたった２つの付加的な酵素である。ピルビン酸分子をアセチル−ＣｏＡに触媒変換する、ピルビン酸−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ２７（ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼに代えて）は、ＮＡＤＰＨの生産が可能であり、これは、ブタノール生産経路のいくつかの他のステップで使用可能である。デザイナ有機体中にさらにもう１つの酵素、ホスホフルクトースキナーゼ１９を付加することにより、ブタノール生産のためにカルビン回路のフルクトース−６−リン酸の点から分岐する他のデザイナ経路の生成が可能になる。グリセルアルデヒド三リン酸分岐のブタノール生産経路と同様に、フルクトース−１，６−二リン酸分岐経路（２０〜２３）、および、フルクトース−６−リン酸分岐経路（１９〜３３）は、経路中において、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２９の触媒でアセトロアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに還元するステップと、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ３１の触媒でクロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに還元するステップとで使用するために、ＮＡＤＨをそれ自体で生成できる。これらデザイナブタノール生産経路の各々において、消費されるＮＡＤＨの数は、生成されるＮＡＤＨの数とバランスしており、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ３２（ブチリル−ＣｏＡをブチルアルデヒドに還元するステップで触媒となる）およびブタノールデヒドロゲナーゼ３３（ブチルアルデヒドをブタノールに還元する最後のステップで触媒となる）の双方はすべてのＮＡＤＰＨを使用でき、これらは光合成水分解およびプロトン勾配結合電子伝達プロセスによって再生成できる。したがって、これらデザイナブタノール生産経路は連続して作動できる。
【００３８】
表１は、デザイナブタノール生産経路の構築のために先に特定した酵素例を含む酵素の例を列挙する。この明細書において、酵素、例えば表１中に列挙した任意の酵素を参照するときには、これは、イソ酵素、機能的アナログ、およびデザイナ変更酵素、ならびに、これらの組み合わせを含む。それらの酵素は、デザイナブタノール生産経路（例えば、図１に示すようなもの）を構築するために選択して使用される。「イソ酵素および機能的アナログ」は、同一の触媒機能を伴うが、まったく同一のタンパク質構造を伴って、あるいは伴わなくてよいものを指す。酵素の最も基本的な特徴は、酵素反応を触媒する活性サイトである。したがって、そのような活性触媒サイトを含む所定の酵素タンパク質片またはサブユニットを選択してこの発明に使用できる。種々の理由によって、天然の酵素のいくつかは、必須の触媒構造の他に、所望の用途に必要でなくても必要であっても良い他の構造要素を含む。生物情報学（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ）支援の分子設計技術を用いて、所望のデザイナ酵素をエンコードするデザイナＤＮＡコンストラクトを構築するのに使用する必須触媒構造を選択することができる。したがって、種々の実施例の１つにおいて、デザイナ酵素遺伝子は、生物情報学支援の分子配列設計に従ってＤＮＡコンストラクトの人工的な合成によって形成される。コンピュータ支援の合成生物学アプローチを用いて、デザイナ酵素のＤＮＡ配列（したがってそのタンパク質配列も）は選択的に修正されて、そのデザインにより、さらに好ましい結果を実現する。したがって、用語「デザイナ修正配列」および「デザイナ修正酵素」は、生物情報学支援分子設計によって修正された、ＤＮＡ配列、および酵素タンパク質として定義される。例えば、デザイナクロロプラスト対象化酵素がミトコンドリア酵素の配列から設計されるとき、所定に用途に適切でないミトコンドリアのトランジットペプチド配列のような所定の構造要素を選択的に切りはずすことにより、および／または、デザイナタンパク質のクロロプラスト対象化挿入について能力を付与するために必要な外来的なクロロプラストのトランジットペプチド配列（例えば、１３５−ｂｐ  Ｒｕｂｉｓｃｏ小規模サブユニットのトランジットペプチド（ＲｂｃＳ２））のような所定のペプチド配列を付加することにより、タンパク質構造のいくつかを修正することが、好ましいプラクティスである。したがって、種々の実施例の１つは、デザイナブタノール生産経路の構築に際して、柔軟に、酵素、イソ酵素、機能的アナログ、デザイナ修正酵素、および／またはこれらの組み合わせを採用する。
【００３９】
表１に示されるように、先に特定して酵素の多くの遺伝子は種々の有機体からクローン化および／または配列化されてきた。遺伝子ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ配列データは、光生物学的ブタノール生産（図１）のためのデザイナ有機体を生成するためにホストの藻類、オキシホトバクテリア、植物、植物組織または細胞を変形させるためのデザイナＤＮＡコンストラクトを設計し、合成するために使用できる。しかしながら、ブタノール生産経路がカルビン回路とともに設計される個別のホスト有機体、および、そのクロロプラスト／チラコイド環境に関連して、しばしば多くのバリエーションが種々のソール有機体および細胞区画が関連づけ可能であるので、コドン利用最適化および配列修正を含むＤＮＡコンストラクト設計における所定の分子エンジニアリングの従来の作業が、ＤＮＡコンストラクト（図２）を充分に機能させるためにしばしば必要となる。例えば、ブタノール生産デザイナ真核藻類を生成する際に、ソース配列が細胞質内酵素（配列）に由来するならば、デザイナ核瞭遺伝子エンコード酵素がホストクロロプラストに挿入されてデザイナブタノール生産経路が付与されるようにする能力を与えるために、機能的クロロプラスト対象化配列が付加されてよい。さらに、デザイナブタノール生産経路にスイッチ可能性を実現するために、機能的誘導プロモータ、例えば、ヒドロゲナーゼのプロモータ（Ｈｙｄｌ）または硝酸塩レダクターゼ（Ｎｉａｌ）遺伝子、または亜硝酸塩レダクターゼ（ｎｉｒＡ）遺伝子を図２に示すような所定のデザイナＤＮＡコンストラクトに含ませてデザイナ遺伝子の表現を制御することも重要である。さらに、先に述べたように、これら酵素（配列）、クルロプラスト対象化トランジットペプチド配列、および誘導プロモータ配列の所定の機能的誘導体またはフラグメントが、充分に、部分的に、または、それらが組み合わされて使用すべく選択されて、この発明の種々の実施例に従うデザイナ有機体を形成してもよい。このデザイナ有機体を生成し、利用する手法についてはさらに以下に説明する。
【００４０】
［クロロプラストのストロマ領域のデザイナ酵素の対象化］
先に検討してデザイナ酵素のいくつか、例えば、ピリジン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのような所定の特別なバクテリア中で機能することが知られているけれども、野生型の植物のクロロプラストは一般的にはカルビン回路とともに機能するこれらの酵素を保持していない。したがって、ブタノール生産真核デザイナ有機体を生成する種々の実施例の１つにおいて、これら酵素のためのデザイナ核酸エンコードはホスト細胞のクルロプラスト中に表現される。これは、典型的には、遺伝子銃（ｇｅｎｅｇｕｎ）を用いて真核ホスト細胞のクロロプラストゲノム中にデザイナブタノール生産経路遺伝子を搬送することにより達成されて良い。所定に場合には、クロロプラストの分子遺伝的とくちょうはシアノバクテリアのそれと類似である。図２Ｆに示されるように１対の適切な組み換えサイトを含む、デザイナＤＮＡコンストラクトは、クロロプラスト中に搬送された後、相同ＤＮＡ二重組み換えの天然のプロセスを通じてゲノム中に組み込まれてよい。
【００４１】
他の実施例において、これらの酵素の核酸エンコードが遺伝子学的に処理されて、表現された酵素がクロロプラスト中に挿入されて、そこでカルビン回路とともに作動するようになされる。具体的なホスト有機体の遺伝的背景に依存して、先に検討したデザイナ酵素のいくつか、例えば、ホスホグリセリン酸ムターゼおよびエノラーゼは、野生型のクロロプラスト中に生来の形態でいくつかの背景レベルに存在してよい。しかしながら、制御可能性の欠如を含む、種々の理由のために、クロロプラスト背景酵素のいくつかは、デザイナブタノール生産経路の顕著な部分として機能するのに充分であったり、充分でなかったりする。さらに、多くの有益な誘導プロモータは核ゲノム中でたまたま機能することもある。例えば、デザイナブタノール生産経路の表現を制御する、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄｌ）プロモータおよび硝酸塩レダクターゼ（Ｎｉａｌ）プロモータの双方は、ゲノムが、最近、配列されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核ゲノム中に配置される。したがって、種々の実施例の１つにおいて、核ゲノムエンコード可能なデザイナ遺伝子を用いてスイッチ可能なブタノール生産経路を付与することが好ましい。したがって、これら酵素の核酸エンコードは、適切な配列修正を伴って遺伝子操作され、酵素が制御可能に表現され、クロロプラスト中に挿入されてデザイナブタノール生産経路を形成するようになっている必要もある。
【００４２】
種々の実施例の１つによれば、デザイナブタノール生産経路酵素がクロロプラスト（ストロマ領域）中のみに表現されるのが最も良く、酵素の動作がまさにそこにおいてブタノールの光合成生産を可能にするのに必要とされる。酵素がクロロプラスト対象化挿入メカニズムなしに表現されるならば、酵素は細胞質ゾル中に滞在して直接には、ブタノールを生産するためには、カルビン回路と相互作用することはできない。したがって、経路設計および関連するアプローチにおける明瞭に顕著な特徴に加えて、他の顕著な区別は、種々の実施例の１つが、多くのデザイナブタノール生産経路酵素をクロロプラスト中に遺伝子的に挿入するために革新的クロロプラスト対象化機構を革新的に採用するということである。
【００４３】
クロロプラスト・ストロマ対象化メカニズムでは、細胞はブタノールを生成できるだけでなく、デザイナ経路がターンオフされる所定の状態に復帰するとき成長し再生成することができ、これは、例えば、デザイナヒドロゲナーゼプロモータ制御のブタノール生産経路遺伝子が利用される好気性状態下である。通常のミトコンドリアを含むデザイナ藻類、植物、または植物細胞は、有機体リザーブ（および／またはアセテートまたは糖類のようないくつかの外来有機体基体）からの還元力（ＮＡＤＨ）を利用して有酸素状態に復帰した直後に細胞にパワーを付与することができなければならない。この結果、デザイナ藻類、植物、または植物細胞が、嫌気性状態での光合成ブタノール生産の利用の後に、好気性状態に復帰するときに、細胞は、新たな機能的なクロロプラストを合成して、ブタノール生産経路の酵素を停止し、通常の光独立栄養能力を再生する。したがって、そのような遺伝子学的なエンジニアリング処理されたデザイナ藻類／植物を使用して、通常の好気性状態での光独立栄養的な成長と、Ｎｉａｌプロモータ制御のブタノール生産経路が使用されるときの、嫌気性状態のような、および／または、硝酸エステルの存在下のような、所定の特別なデザイナブタノール生産状態のもとでの、ＣＯ２およびＨ２Ｏからの直接かつ効率のよいブタノール生産とを繰り返すサイクルを実現することができる。
【００４４】
デザイナブタノール生産経路の酵素の対象への挿入は、ストロマ「信号」ペプチドをエンコードするためのＤＡＮ配列を使用して実現できる。ストロマ−タンパク質信号（トランジット）ペプチドは、新たな合成されたンパク質をストロマに伝達して挿入するよう指示する。種々の実施例の１つにおいて、特定のターゲットＤＮＡ配列は、好ましくは、デザイナＤＮＡコンストラクト（図２Ａ）中に示されるように、プロモータおよびデザイナブタノール生産経路の酵素配列の間に配置される。このターゲット配列は、細胞質ゾル中の酵素のアポタンパク質の一部として合成される信号（トランジット）ペプチドをエンコードするためのものである。トランジットペプチドはデザイナブタノール生産経路の酵素のアポタンパク質を細胞質ゾルからクロロプラストへ挿入するのを案内する。アポタンパク質がクロロプラスト中に挿入された後に、トランジットペプチドはアポタンパク質から分離して、この後、活性な酵素になる。
【００４５】
多くのトランジットペプチドがクロロプラスト中にデザイナブタノール生産経路酵素をターゲット化して挿入するために使用して好適であり、これに限定されないが、ヒドロゲナーゼアポタンパク質（例えば、ＨｙｄＡ１（Ｈｙｄｌ）およびＨｙｄＡ２、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号ＡＪ３０８４１３、ＡＦ２８９２０１、ＡＹ０９０７７０）、フェレドキシンアポタンパク質（Ｆｒｘ１、受入番号Ｌ１０３４９、Ｐ０７８３９）、チオレドキシンｍアポタンパク質（Ｔｒｘ２、Ｘ６２３３５）、グルタミンシンターゼアポタンパク質（Ｇｓ２、Ｑ４２６８９）、ＬｈｃＩＩアポタンパク質（ＡＢ０５１２１０、ＡＢ０５１２０８、ＡＢ０５１２０５）、ＰＳＩＩ−Ｔアポタンパク質（ＰｓｂＴ）、ＰＳＩＩ−Ｓアポタンパク質（ＰｓｂＳ）、ＰＳＩＩ−Ｗアポタンパク質（ＰｓｂＷ）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−γアポタンパク質（ＡｔｐＣ）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−δアポタンパク質（ＡｔｐＤ、Ｕ４１４４２）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−ＩＩアポタンパク質（ＡｔｐＧ）、ホトシステムＩ（ＰＳＩ）アポタンパク質（例えば、遺伝子ＰｓａＤ、ＰｓａＥ、ＰｓａＦ、ＰｓａＧ、ＰｓａＨ、およびＰｓａＫ）、ＲｕｂｉｓｃｏＳＳＵアポタンパク質（例えば、ＲｂｃＳ２、Ｘ０４４７２）を含む。この明細書を通じて、上述のトランジットペプチド配列のいずれかのような、トランジットペプチドを参照するときには、これは、それらの機能的アナログ、修正デザイナ配列、およびそれらの組み合わせを含む。この文脈において、「機能的アナログ」（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｏｇ）または「修正デザイナ配列」（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、さきに特定したような、生来のトランジットペプチド配列をベースにして、誘導され、または修正されれ（例えば、同類置換、アミノ酸のモデレート除去または付加、またはアミノ酸の側鎖の修正による）、生来のトランジットペプチドと同一の機能を伴う、すなわち、所望の酵素のターゲット挿入を有効にするペプチド配列を指す。
【００４６】
所定の具体的な実施例において、以下のトランジットペプチド配列が、デザイナブタノール生産経路酵素をクロロプラストのストロマ領域に挿入する際のガイドとして使用される。すなわち、Ｈｙｄｌトランジットペプチド（アミノ酸配列ｍｓａｌｖｌｋｐｃａ  ａｖｓｉｒｇｓｓｃｒ  ａｒｑｖａｐｒａｐｌ  ａａｓｔｖｒｖａｌａ  ｔｌｅａｐａｒｒｌｇ  ｎｖａｃａａ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）を伴うもの）、ＲｂｃＳ２トランジットペプチド（アミノ酸配列ｍａａｖｉａｋｓｓｖ  ｓａａｖａｒｐａｒｓ  ｓｖｒｐｍａａｌｋｐ  ａｖｋａａｐｖａａｐ  ａｑａｎｑ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）を伴うもの）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−δトランジットペプチド（アミノ酸配列ｍｌａａｋｓｉａｇｐ  ｒａｆｋａｓａｖｒａ  ａｐｋａｇｒｒｔｗ  ｖｍａ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）を伴うもの）、これらのアナログ、機能的誘導体、デザイナ配列、およびこれらの組み合わせである。
【００４７】
［デザイナブタノール生産経路の表現を制御する遺伝子スイッチの使用］
この発明の他の重要な特徴は、図１に示すように、デザイナブタノール生産経路の表現を制御する遺伝子スイッチの適用である。このスイッチ可能性は、デザイナ導入遺伝子が所定の具体的な誘導条件かで誘導的に表現されるように内部的誘導プロモータを使用することにより実現される。好ましくは、ホストにおいてデザイナ遺伝子の表現を制御するように採用されるプロモータは、ホストそれ自体、または緊密に関連する有機体を起源とする。ホスト細胞中のプロモータの活性および誘導性は、リポータ遺伝子の前にプロモータを配置し、このレポータコンストラクトをホスト細胞または組織に、任意の既知のＤＮＡ搬送技術で導入し、レポータ遺伝子の表現を評価することによりテストすることができる。
【００４８】
好ましい実施例において、デザイナ遺伝子の表現を制御するために使用される誘導可能なプロモータは、嫌気生活により誘導され、すなわち、嫌気性条件で活性となり、好気性条件で非活性になるプロモータである。デザイナ藻類／植物有機体は好気性条件下でＣＯ２を炭素源として使用して独立栄養の光合成を実行でき、デザイナ有機体培養が成長して光合成ブタノール生産の準備ができたときに、嫌気性条件が適用されてプロモータ、および、デザイナブタノール生産経路をエンコードするデザイナ遺伝子がオンとなる。
【００４９】
嫌気性条件下で活性になる多くのプロモータがこの発明に使用されて好適である。例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのヒドロゲナーゼプロモータ（ＨｙｄＡ１（Ｈｙｄｌ）およびＨｙｄＡ２、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号ＡＪ３０８４１３、ＡＦ２８９２０１、ＡＹ０９０７７０）は、嫌気性条件下で活性であり、好気性条件下で非活性であり、ホスト藻類、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの中のデザイナ遺伝子の表現を制御する有効な遺伝子スイッチとして利用できる。実際、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ細胞は、嫌気性条件下で調和的に誘導されるいくつかの核遺伝子を含む。これらは、ヒドロゲナーゼ構造遺伝子（Ｈｙｄｌ）自体、シトロクロムＣ６のアポタンパク質をエンコードするＣｙｃ６遺伝子、およびコプロゲンオキシナーゼをエンコードするＣｐｘ１遺伝子を含む。最後の２つのための調整領域は良好に特徴付けられており、約１００ｂｐの領域が合成遺伝子コンストラクト中で嫌気性による調整を実現するのに充分であることが証明されている（Ｑｕｉｎｎ，Ｂａｒｒａｃｏ，ＥｒｉｃｋｓｓｏｎおよびＭｅｒｃｈａｎｔ  （２０００）、"Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｃｏｐｐｅｒ−  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｃｙｃ６  ａｎｄ  Ｃｐｘｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ"、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：６０８０−６０８９）。さきの誘導可能な藻類のプロモータが他の植物ホスト、とくに、藻類に緊密に関連する植物ホストにおいて使用されて好適であるけれども、これら他の植物からの同一の遺伝子のプロモータは、高度の植物も含め、これら植物中のデザイナ遺伝子の表現を制御するために獲得し、または採用して良い。
【００５０】
他の実施例において、この発明に使用される誘導可能プロモータは、藻類のニトレートレダクターゼ（Ｎｉａｌ）プロモータであり、これは硝酸塩を含有する媒体中で成長により誘導可能であり、硝酸塩欠損でアンモニア含有媒体中で抑制的である（ＬｏｐｐｅｓおよびＲａｄｏｕｘ（２００２）、"Ｔｗｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ"、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６８：４２−４８）。したがって、Ｎｉａｌ（遺伝子受入番号ＡＦ２０３０３３）プロモータは、培養媒体中の硝酸塩およびアンモニアの濃度レベルに応じて藻類中のデザイナ遺伝子の表現を制御して使用するので選択できる。この発明に使用するために選択されても良い付加的な誘導プロモータは、例えば、熱ショックタンパク質プロモータＨＳＰ７０Ａ（受入番号：ＤＱ０５９９９９、ＡＹ４５６０９３、Ｍ９８８２３；Ｓｃｈｒｏｄａ，Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｂｅｅｋ（２０００）、"Ｔｈｅ  ＨＳＰ７０Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ"、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１：１２１−１３１）、ＣａｂＩＩ−１遺伝子のプロモータ（受付番号Ｍ２４０７２）、Ｃａ１遺伝子のプロモータ（受入番号Ｐ２０５０７）、および、Ｃａ２遺伝子のプロモータ（受入番号Ｐ２４２５８）を含む。
【００５１】
藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）の場合では、この発明に使用するよう選択可能な多くの誘導可能プロモータも存在する。例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０（ジェンバンク：ＢＡ００００１９）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ（ジェンバンク：Ｕ８８４００；ｈｏｘＵＹＨ  オペロンプロモータ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ストレインＰＣＣ  ６８０３（ＣｙａｎｏＢａｓｅ：ｓｌｌｌ２２０およびｓｌｌｌ２２３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１（ＣｙａｎｏＢａｓｅ：ｓｙｃｌ２３５＿ｃ）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＣ２６９０６）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０（ジェンバンク：ＺＰ  ０１７２７４１９）およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７００２（ジェンバンク：ＡＡＮ０３５６６）の嫌気性応答双方向性ホメオボックス（ｈｏｘ）遺伝子は嫌気性条件下で活性であり、好気性条件下で非活性であり（Ｓｊｏｈｏｌｍ、Ｏｌｉｖｅｉｒａ、およびＬｉｎｄｂｌａｄ（２００７）、"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０，"Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７３（１７）：５４３５−５４４６）、オキシホトバクテリア、例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、または、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７００２の中のデザイナ遺伝子の表現を制御する有効な遺伝子スイッチとして使用できる。
【００５２】
スイッチ可能デザイナオキシホトバクテリアのようなスイッチ可能ブタノール生産デザイナ有機体を生成する他の実施例において、ニトライトレダクターゼ（ｎｉｒＡ）プロモータは、硝酸塩を含む媒体中の成長により誘導可能であり、硝酸塩欠損、アンモニア含有媒体中で抑制される（Ｑｉ、Ｈａｏ、Ｎｇ、Ｓｌａｔｅｒ、Ｂａｓｚｉｓ、Ｗｅｉｓｓ、およびＶａｌｅｎｔｉｎ（２００５）、"Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｉｒＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｏ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  ｐａｔｈｗａｙ"、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７１（１０）：５６７８−５６８４；Ｍａｅｄａ、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ、Ｏｈｅ、およびＯｍａｔａ（１９９８）、"ｃｉｓ−  Ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＮｔｃＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  ｎｉｔｒｉｔｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｏｐｅｒｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２"、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８０（１６）：４０８０−４０８８）。したがって、ｎｉｒＡプロモータが、培養媒体中の硝酸塩およびアンモニアの濃度レベルに応じて多くのオキシホトバクテリア中のデザイナ遺伝子の表現を制御するために使用されるよう選択される。使用するために選択され修正されて良いＮｉｒＡプロモータ配列は、（これに限定されない）以下のオキシホトバクテリアのｎｉｒＡプロモータを含む。すなわち、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１（ジェンバンク：ＡＰ００８２３１、ｒｅｇｉｏｎ  ３５５８９０−２５５９５０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ジェンバンク：Ｘ６７６８０．１、Ｄ１６３０３．１、Ｄ１２７２３．１、およびＤ００６７７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３（ジェンバンク：ＮＰ＿４４２３７８、ＢＡ００００２２、ＡＢ００１３３９、Ｄ６３９９９−Ｄ６４００６、Ｄ９０８９９−Ｄ９０９１７）、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．（ジェンバンク：Ｘ９９７０８．１）、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０（ジェンバンク：ＢＡ００００１９．２、およびＡＪ３１９６４８）、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｂｏｒｙａｎｕｍ（ジェンバンク：Ｄ３１７３２．１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（ジェンバンク：Ｐ３９６６１、ＣＰ０００１００．１）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１（ジェンバンク：ＢＡＣ０８９０１、ＮＰ  ６８２１３９）、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｌａｍｉｎｏｓｕｍ（ジェンバンク：ＣＡＡ７９６５５、Ｑ５１８７９）、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ  ｌａｍｉｎｏｓｕｓ（ジェンバンク：ＡＢＤ４９３５３、ＡＢＤ４９３５１、ＡＢＤ４９３４９、ＡＢＤ４９３４７）、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３（ジェンバンク：ＹＰ  ３２５０３２）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９３０３（ジェンバンク：ＹＰ  ００１０１８９８１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０３（ジェンバンク：ＡＡＣ１７１２２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ７８０５（ジェンバンク：ＺＰ  ０１１２４９１５）、およびＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０（ジェンバンク：ＺＰ  ０１７２７８６１）である。
【００５３】
さらに他の実施例において、使用するよう選択される誘導プロモータは、光および熱応答性シャペロン遺伝子ｇｒｏＥプロモータであり、これは熱および／または光によって誘導可能である（ＫｏｊｉｍａおよびＮａｋａｍｏｔｏ（２００７）、"Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｇｈｔ−  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏＥ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＨｒｃＡ  ｏｒ  ＣＩＲＣＥ  ｉｎ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ"、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１：１８７１−  １８８０）。多くのｇｒｏＥプロモータ、例えば、ｇｒｏＥＳ、およびｇｒｏＥＬ（シャペロン）プロモータは、デザイナブタノール生産経路酵素の表現を制御するための誘導可能なプロモータとして入手可能である。種々の実施例の１つにおいて選択され修正されて良いｇｒｏＥプロモータ配列は、（これに限定されないが）以下のオキシホトバクテリアのｇｒｏＥＳおよび／またはｇｒｏＥＬプロモータを含む。すなわち、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ジェンバンク：Ｄ１２６７７．１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３（ジェンバンク：ＢＡ００００２２．２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１（ジェンバンク：ＡＰ００８２３１．１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ（ジェンバンク：Ｍ５８７５１．１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（ジェンバンク：ＣＰ０００１００．１）、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０（ジェンバンク：ＢＡ００００１９．２）、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３（ジェンバンク：ＣＰ０００１１７．１）、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．  Ｌ−３１（ジェンバンク：ＡＦ３２４５００）；Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１（ＣｙａｎｏＢａｓｅ：ｔｌｌ０１８５，ｔｌｌＯｌ  ８６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｕｓ（ジェンバンク：Ｄ７８１３９）、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．  ＮＫＢＧ０９１６００（ジェンバンク：ＡＦ０５４６３０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ９３１３（ジェンバンク：ＢＸ５７２０９９）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９３０３（ジェンバンク：ＣＰ０００５５４）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９２１１（ジェンバンク：ＺＰ  Ｏ  １００６６１３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ８１０２（ジェンバンク：ＢＸ５６９６９０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＣ９６０５（ジェンバンク：ＣＰ０００１１０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１３７５（ジェンバンク：ＡＥ０１７１２６）、およびＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＥＤ４（ジェンバンク：ＢＸ５４８１７４）である。
【００５４】
この発明に使用するのに選択可能な付加的な誘導可能プロモータは、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（Ｅｒｂｅ、Ａｄａｍｓ、ＴａｙｌｏｒおよびＨａｌｌ  （１９９６）、"Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  ｓｍｔ−ｌｕｘ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｓ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｖｙ  ｍｅｔａｌ  ｃａｔｉｏｎｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７：８０−８３）の金属（亜鉛）誘導可能なｓｍｔプロモータ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（Ｍｉｃｈｅｌ、Ｐｉｓｔｏｒｉｕｓ、およびＧｏｌｄｅｎ（２００１）、"Ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｄｉＡ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２"、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８３（１７）：５０１５−５０２４）の鉄応答ｉｄｉＡプロモータ；レドックス応答シアノバクテリアｃｒｈＲプロモータ（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ−Ｆｏｒｔｉｎ、Ｃｏｌｖｉｎ、およびＯｗｔｔｒｉｍ（２００６）、"Ａ  ＬｅｘＡ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｒｅｄｏｘ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒ  Ａ  ｈｅｌｉｃａｓｅ，  ｃｒｈＲ"、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４（１２）：３４４６−３４５４）；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３（Ｆａｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｕｍ  （２００４）、"Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅ  ｈｓｐｌ  ６．６  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３"、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４９：１９２−１９８）の熱ショック遺伝子ｈｓｐ１６．６プロモータ；小熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）プロモータ、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｕｓ  ｇｅｎｅ  ｈｓｐＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎａｋａｍｏｔｏ、Ｓｕｚｕｋｉ、およびＲｏｙ（２０００）、"Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｉｎ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ"、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８３：１６９−１７４）；オキシホトバクテリアカルボン酸−アンヒドラーゼ遺伝子（ジェンバンク：ＥＡＺ９０９０３、ＥＡＺ９０６８５、ＺＰ  ０１６２４３３７、ＥＡＷ３３６５０、ＡＢＢ  １７３４１、ＡＡＴ４１９２４、ＣＡ０８９７１１、ＺＰ  ００１１１６７１、ＹＰ  ４００４６４、ＡＡＣ４４８３０；およびＣｙａｎｏＢａｓｅ：ａｌｌ２９２９、ＰＭＴ１５６８  ｓｌｒ００５１、ｓｉｒ  １３４７、およびｓｙｃ０１６７＿ｃ）のＣ０２−応答プロモータ；ニトレートレダクターゼ遺伝子（ｎａｒＢ）プロモータ（例えば、ジェンバンク受入番号：ＢＡＣ０８９０７、ＮＰ＿６８２１４５、ＡＡ０２５１２１；ＡＢＩ４６３２６、ＹＰ＿７３２０７５、ＢＡＢ７２５７０、ＮＰ＿４８４６５６）；緑／赤色光応答プロモータ、例えば、Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ  ｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎ（ＣａｓｅｙおよびＧｒｏｓｓｍａｎ  （１９９４）、"Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｐｃＢ２Ａ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ  ｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎｔ"、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７６（２０）：６３６２−６３７４）の光調整ｃｐｃＢ２Ａ２プロモータ；および、シアノバクテリア遺伝子ｌｅｘＡ、ｒｅｃＡ、およびｒｕｖＢ（Ｄｏｍａｉｎ、Ｈｏｕｏｔ、Ｃｈａｕｖａｔ、およびＣａｓｓｉｅｒ−Ｃｈａｕｖａｔ（２００４）、"Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｌｅｘＡ，  ｒｅｃＡ  ａｎｄ  ｒｕｖＢ：  ＬｅｘＡ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｃｉｎｇ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ"、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ５３（１）：６５−８０）の紫外線光応答プロモータを含む。
【００５５】
さらに、種々の実施例の１つにおいて、所定の「準誘導可能」または構造性プロモータも、デザイナブタノール生産経路の構築のために誘導可能プロモータと組み合わせて使用するように選択できる。例えば、ｒｂｃＬ遺伝子（ジェンバンク：Ｘ６５９６０、ＺＰ＿０１７２８５４２、Ｑ３Ｍ６７４、ＢＡＦ４８７６６、ＮＰ＿８９５０３５、０９０７２６２Ａ；ＣｙａｎｏＢａｓｅ：ＰＭＴ１２０５、ＰＭＭ０５５０、Ｐｒｏ０５５１、ｔｌｌｌ５０６、ＳＹＮＷ１７１８、ｇｌｒ２１５６、ａｌｒｌ５２４、ｓｌｒ０００９）のようなオキシホトバクテリアのＲｕｂｉｓｃｏオペロンは、光依存性を持つけれども、ほぼ構造性プロモータとして考えることができ、デザイナブタノール生産経路の構築のためのｎｉｒＡ、ｈｏｘ、および／またはｇｒｏＥプロモータのような誘導可能プロモータと組み合わせて使用するようにも選択して良い。
【００５６】
この明細書を通じて、例えば先に説明した誘導可能プロモータのいずれかのような誘導可能プロモータを参照する場合には、これは、これらのアナログ、機能的誘導体、デザイナ配列、およびこれらの組み合わせを含む。この文脈において、「機能的アナログ」または「修正デザイナ配列」は、生来のプロモータ配列、例えば、先に特定したものをベースにして誘導または修正された（例えば、ヌクレオチドの置換、モデレート削除または付加、または修正による）、プロモータ配列を指し、これは将来のプロモータ配列の機能を維持する。
【００５７】
［ＤＡＮコンストラクトおよびホスト有機体への形質転換］
ＤＮＡコンストラクトが、すなわち、デザイナブタノール生産経路遺伝子をホスト藻類、植物、植物組織、または植物細胞に導入するために構築される。デザイナブタノール生産経路酵素をエンコードするヌクレオチド配列がベクター中に配置され、適切なクロロプラスト対象化トランジットペプチド配列のためのヌクレオチド配列コードへの作動可能にリンクされる。好ましい実施例において、核酸コンストラクトは、５'（上流）から３'（下流）へ続く配向で要素を配置するように、すなわち、外部誘導可能プロモータ、トランジット対象化配列、およびデザイナブタノール生産経路酵素をエンコードする核酸、ならびに好ましくは、適切な転写州蹴る配列を配置するように、製造される。１または複数のデザイナ遺伝子（ＤＮＡコンストラクト）は１つの遺伝子ベクター中に配置できる。このようなコンストラクトの例は図２Ａに示される。図２Ａで図説される実施例に示されるように、デザイナブタノール生産経路の導入遺伝子は、（ａ）ＰＣＲフォワードプライマー、（ｂ）外部誘導可能プロモータ、（ｃ）トランジット対象化配列、（ｄ）適切な転写終結配列を伴うデザイナブタノール生産経路酵素エンコード配列、および（ｅ）ＰＣＲリバースプライマーを有する核酸コンストラクトである。
【００５８】
種々の実施例によれば、このＤＮＡコンストラクトの要素（ａ）〜（ｅ）のいずれも所定の特別な条件に低号するように調整される。実施には、より望ましい結果が実現されるように、ＤＮＡコンストラクトの要素（ａ）〜（ｅ）のいずれも、充分にまたは部分的に、および／または、任意の調整された組み合わせで適用される。例えば、藻類のヒドロゲナーゼプロモータがデザイナブタノール生産経路ＤＮＡコンストラクトにおいて使用されるときには、このＤＮＡコンストラクトを含む導入遺伝子デザイナ藻類は、環境空気ＣＯ２を炭素源として使用して独立栄養光合成を実行して、開放した池のような、好気性条件下で通常通り成長することができる。藻類培養が成長してブタノール生産の準備ができると、デザイナ導入遺伝子が、ヒドロゲナーゼプロモータの使用に起因して、嫌気性条件下の誘導によって表出可能になる。デザイナ遺伝子が表出されると、意図組のデザイナブタノール生産経路酵素が生成されて光生物学的ブタノール生産（図１）のためにカルビン回路と協働する。
【００５９】
２つのＰＣＲプライマーは、ＤＮＡコンストラクトの始端（５'端）に配置されるＰＣＲフォワードプライマー（ＰＣＲ  ＦＤプライマー）、および、他の端部（３'端）に配置されるＰＣＲリバースプライマー（ＰＣＲ  ＲＥプライマー）であり、これを図２Ａに示す。このＰＣＲプライマーの対は、デザイナＤＮＡコンストラクトの比較的容易なＰＣＲ増幅が必要なときに所定の便宜を提供するように設計され、これは、デザイナＤＮＡ構築が遺伝子形質転換のための準備において号される際、またはその後のみでなく、デザイナＤＮＡコンストラクトが、形質転換体においてデザイナ遺伝子を検証するために、ホスト藻類の遺伝子に搬入されたのちにも役に立つ。例えば、デザイナ遺伝子の形質転換が、電子穿孔法およびアルギニノこはく酸リアーゼ（ａｒｇ７）総補正スクリーニングの技法を用いてＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ−ａｒｇ７のホスト細胞において達成された後、結果物の形質転換体は、この一対のＰＣＲプライマーを用いてそれらの核ＤＮＡのＰＣＲ  ＤＮＡ分析により解析されて、完全なデザイナブタノール生産経路の遺伝子（ＤＡＮコンストラクト）が成功裏に所与の形質転換体の遺伝子中に組み込まれているかどうかを検証できる。形質転換体の核ＤＮＡ  ＰＣＲ分析が、デザイナＤＮＡコンストラクトに応じて予想されるＤＮＡサイズおよび配列とマッチするＰＣＲ生成物を発生できたときに、デザイナ遺伝子を形質転換体に成功裏に組み込めたと検証される。
【００６０】
したがって、種々の実施例も、光生物学的ブタノール生産のためのデザイナ遺伝子組み換えの藻類、植物、または植物細胞を効率的に形成するための関連する方法を教示する。実施例の１つにおいて、この方法は、（ａ）適切なホストの藻類、植物、植物組織、または植物細胞を、それらの遺伝子学的バックグラウンドおよびブタノール生産に関連する特別な性質の観点から選択するステップ；（ｂ）デザイナ遺伝子の核酸コンストラクトを上述のホストの藻類、植物、植物組織、または植物細胞に導入するステップ；（ｃ）形質転換された藻類、植物、植物組織、または植物細胞へのデザイナ遺伝子の組み込みを、デザイナＤＮＡコンストラクトの先のＰＣＲプライマー（複数）を利用したＤＮＡ  ＰＣＲ分析により検証するステップ；（ｄ）二酸化炭素および水からの光合成ブタノール生産のためのデザイナブタノール経路の誘導可能な表現のようなデザイナ有機体の特徴を、ＤＮＡコンストラクト（図２Ａ）の具体的なデザイナ特徴に応じたｍＲＮＡ、タンパク質、および、ブタノール生産特性の分析によって、測定し、また検証するステップを含む。
【００６１】
光生物学的なブタノール生産のためのデザイナ遺伝子組み換え有機体を製造する方法の先の実施例は、複数の動作サイクロで繰り返し適用され、より望ましい結果を実現して良い。種々の実施例において、上述の方法のステップ（ａ）〜（ｄ）は、所定の具体的な条件に適合するように調整される。種々の実施例において、この方法のステップ（ａ）〜（ｄ）は充分にまたは部分的に適用され、および／または任意の調整された組み合わせで適用される。
【００６２】
デザイナブタノール生産経路遺伝子（ＤＮＡコンストラクト）の例（複数）は配列表に示される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、デザイナブタノールデヒドロゲナーゼ（１８０９ｂｐ）の詳細なＤＮＡコンストラクトを表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２８３−４１７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼ（ＡＢ２５７４３９）から選択され修正された酵素エンコード配列（４１８−１５６６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５６７−１７８９）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７９０−１８０９）を含む。２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（ＤＮＡ配列２１−２８２）は、ブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＮＡ配列４１８−１５６６）の表出を制御するための誘導可能プロモータの例とし使用される。１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（ＤＮＡ配列２８３−４１７）は、デザイナ酵素（ＤＮＡ配列２８３−４１７）をホスト有機体のクロロプラスト中に案内するための例として使用される。ＲｂｃＳ２ターミネータ（ＤＮＡ配列１５６７−１７８９）は、デザイナ遺伝子の転写または翻訳が適切に終了して所望のようにアポタンパク質（ＲｂｃＳ２トランジットペプチド−ブタノールデヒドロゲナーゼ）を生産するように採用される。Ｎａｉ１プロモータは、核遺伝子のみのための表現を制御できる核ＤＮＡであるので、この例の合成ブタノール生産経路はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ核遺伝子のゴトン利用に従って設計されている。したがって、この場合、デザイナ酵素遺伝子は核内に転写される。このｍＲＮＡは自然に細胞質ゾル中に移行させられ、ここで、ｍＲＮＡは、ＲｂｃＳ２トランジットペプチド（ＤＮＡ配列２８３−４１７に対応する）を有するアポタンパク質へと変換され、そのＣ末端がブタノールデヒドロゲナーゼタンパク質（ＤＮＡ配列４１８−１５６６に対応する）のＮ末端に一緒にリンクされる。アポタンパク質のトランジットペプチドは、クロロプラスト膜を横切ってストロマ領域への移行を案内し、トランジットペプチドはそこでアポタンパク質から切りはずされる。その後、結果物のブタノールデヒドロゲナーゼは、デザイナブタノール生産経路のための酵素としての機能をクロロプラスト内で開始する。２つのＰＣＲプライマー（配列１−２０および１７９０−１８０９）は人間のアクチン遺伝子の配列から選択され修正され、相互に対になることができる。クラミドモナスジェンバンクに対する配列の突き合わせでそれらの同一の配列は発見されなかった。したがって、これらは、形質転換された藻類中のデザイナ遺伝子を検証するためのＤＮＡ  ＰＣＲ分析において、適切なＰＣＲプライマーとして使用できる。
【００６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、デザイナブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（２０６７ｂｐ）を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２８３−４１７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ配列（ＡＹ２５１６４６）から選択され修正されたブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼエンコード配列（４１８−１８２４）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１８２５−２０４７）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０４８−２０６７）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と類似であり、ただ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼエンコード配列（４１８−１８２４）が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ配列（ＡＹ２５１６４６）から選択され修正されている点で異なる。
【００６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、デザイナブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのコンストラクト（１８１５ｂｐ）を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（２８３−２９１）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２９２−４２６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正されたブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（４２７−１５６３）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１５６４−１５７２）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５７３−１７９５）、および３'端におけるＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７９６−１８１５）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と類似であり、ただ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正されたブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（４２７−１５６３）が使用される点、Ｘｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩおよびＸｂａＩサイトが付加されてキー要素、例えば、対象化配列（２９２−４２６）およびデザイナ酵素配列（４２７−１５６３）を、必要なときに柔軟に置き換えて遺伝子合成のコストを削減して生産性を増強させるモジュラー単位として扱えるようにしている点で異なる。酵素はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしなくてもよいことに留意されたい。すなわち、他のソース、例えば、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｌ２−５０、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのイソ酵素、デザイナ修正酵素、および機能アナログを含む多くのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼも選択して使用できる。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、デザイナクロトナーゼＤＮＡコンストラクト（１４８２ｂｐ）の例４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（２８３−２９１）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２９２−４２６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉのクロトナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正されたクロトナーゼ配列（４２７−１２０９）、２１−ｂｐのルミオ（Ｌｕｍｉｏ）・タグ・エンコード配列（１２１０−１２３０）、停止コドンを含む、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１２３１−１２３９）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１２４０−１４６２）、および３'端におけるＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４６３−１４８２）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と類似であり、ただ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉのクロトナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正されたクロトナーゼ配列（４２７−１２０９）が使用される点、および、Ｌｕｍｉｏタグ・エンコード配列（１２１０−１２３０）がエノラーゼ配列のＣ終端に付加されている点で異なる。２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ・エンコード配列（１２１０−１２３０）は、ここではＬｕｍｉｏペプチド配列Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓをエンコードするために採用され、これは、現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）から商業的に入手可能なＬｕｍｉｏ試薬とともに扱われるときに蛍光となることができる。Ｌｕｍｉｏ分子タグ技術は、エンジニアリング処理されたテトラシステイン配列に結合する蛍光色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）の、ＥＤＴ（１，２−エタンジチオール）結合二砒素（ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ）誘導体（Ｌｕｍｉｎｏ試薬）をベースにしている（（Ｋｅｐｐｅｔｉｐｏｌａ、Ｃｏｆｆｍａｎ、その他（２００３）、Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｌｕｍｉｏ（ＴＭ）  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、２５．３：７−１１）。テトラシステイン配列は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓを有し、ここで、Ｘａａは、この例では、ＰｒｏまたはＧｌｙのような任意の非システインアミノ酸である。ＥＤＴリンクＬｕｍｉｎｏ試薬により、砒素原子が自由に回転できるようになり、蛍光色素の蛍光を抑制する。Ｌｕｍｉｏ砒素基のチオールとテトラシステインとの間の共有結合構成により砒素原子の自由な回転が阻止され、蛍光色素の蛍光を開放する（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａｄａｍｓ、およびＴｓｉｅｎ（１９９８）、"Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ"、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：２６９−２７２）。これにより、蛍光分子画像によりテトラシステイン・タグ・タンパク質の視覚化も実現できる。したがって、このよ��にしてＬｕｍｉｏタグを用いることにより、デザイナクロトナーゼが表出されているときにこれを監視し、追跡すれば、デザイナブタノール生産経路酵素が実際にホスト有機体のクロロプラスト中に所望のように運ばれたかどうかを検証できる。Ｌｕｍｉｏタグ（短い７−ｂｐのアミノ酸ペプチド）はこの例ではクロトナーゼのＣ−終端にリンクされており、デザイナ酵素の機能に最小限の影響しか与えないようにすべきであるけれども、Ｌｕｍｉｎｏ試薬とともに処理されることによりデザイナ酵素分子を可視化することが可能になる。Ｌｕｍｉｎｏタグの使用は完全にオプションである。Ｌｉｍｉｎｏタグが何らかの悪影響をデザイナ酵素に与えるときには、タグはＤＮＡ配列設計中で除去できる。
【００６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、デザイナ３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＤＮＡコンストラクト（１３６７ｂｐ）の例５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−１０４）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０５−１１３）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１１４−２４８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ配列（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）から選択され修正された３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（２４９−１０９４）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ配列（１０９５−１１１５）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１１１６−１１２４）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１１２５−１３４７）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３４８−１３６７）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と類似であり、ただ、８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−１０４）、および、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ配列（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）から選択され修正された３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（２４９−１０９４）が使用される点で異なる。８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータは、生来のＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータの２つの部分的に同一な配列領域（転写の開始点を参照して−２３１から−２０１および−７７から−２５）を結合することにより人工的に形成される。実験による検討によれば、８４−ｂｐの配列は生来のＮｉａｌより活性があることが示された（Ｌｏｐｐｅｓ、およびＲａｄｏｕｘ（２００２）、"Ｔｗｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ"、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６８：４２−４８）。したがって、これは、合成８４−ｂｐ配列のような機能的な合成配列、アナログ、機能的誘導体、および／またはデザイナ修正配列がこの発明における種々の実施例に従って選択して使用できる例でもある。
【００６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、デザイナチオラーゼＤＮＡコンストラクト（１７２１ｂｐ）の例６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−１０４）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０５−１１３）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１１４−２４８）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓのチオラーゼ配列（ＡＢ１９０７６４）から選択され修正されたチオラーゼエンコード配列（２４８−１４４８）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ配列（１４４９−１４６９）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１４７０−１４７８）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４７９−１７０１）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７０２−１７２１）を含む。このＤＮＡコンストラクトも例４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と類似であり、ただ、チオラーゼエンコード配列（２４９−１４４８）、および、８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−１０４）が使用される点で異なる。これは、機能液合成配列がデザイナＤＮＡコンストラクトにも選択されて使用される他の例である。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、デザイナピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼＤＮＡコンストラクト（４２１１ｂｐ）の例７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−１８８）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１８９−１９７）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１９８−３３２）、Ｍａｓｔｉｇａｍｏｅｂａ  ｂａｌａｍｕｔｈｉのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ジェンバンク：ＡＹ１０１７６７）の配列から選択され修正されたピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼエンコード配列（３３３−３９３８）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ配列（３９３９−３９５９）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（３９６０−３９６８）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（３９６９−４１９１）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（４１９２−４２１１）を含む。このＤＮＡコンストラクトも例４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と類似であり、ただ、２×８４−ｂｐのＮｉａｌプロモータおよびＭａｓｔｉｇａｍｏｅｂａ  ｂａｌａｍｕｔｈｉのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ジェンバンク：ＡＹ１０１７６７）の配列から選択され修正されたピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼエンコード配列（３３３−３９３８）が使用される点で異なる。２×８４−ｂｐのＮｉａｌプロモータは、先のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表された８４−ｂｐの合成Ｎｉａｌプロモータ配列のタンデム複写として構築される。実験テストによれば、２×８４−ｂｐのＮｉａｌプロモータは、生来のＮｉａｌプロモータより活性がある８４−ｂｐの配列よりもさらに強力であることがわかった（ＬｏｐｐｅｓおよびＲａｄｏｕｘ  （２００２）、"Ｔｗｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ"、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６８：４２−４８）。この種の誘導可能プロモータを種々のプロモータ長で使用すると、ブタノール生産経路用のデザイナ酵素の表出レベルを調整するのに役立つ。
【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、デザイナピルビン酸キナーゼＤＮＡコンストラクト（２０２１ｂｐ）の例８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８４−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−１０４）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０５−１１３）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１１４−２４８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピルビン酸キナーゼ配列（ジェンバンク：ＡＹ９４９８７６）から選択され修正されたピルビン酸キナーゼエンコード配列（２４９−１７４８）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ配列（１７４９−１７６９）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１７７０−１７７８）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１７７９−２００１）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２００２−２０２１）を含む。このＤＮＡコンストラクトも例６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と類似であり、ただ、ピルビン酸キナーゼエンコード配列（２４９−１７４８）が使用される点で異なる。
【００７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、デザイナエノラーゼ遺伝子（１８１５ｂｐ）の例９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−２８２）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（２８３−２９１）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２９２−４２６）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのエノラーゼ（ジェンバンク：Ｘ６６４１２、Ｐ３１６８３）から選択され修正されたエノラーゼエンコード配列（４２７−１５４２）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ・エンコード配列（１５０７−１５２７）、停止コドンを含む９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１５４３−１５５１）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５５２−１７９５）、および３'端におけるＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７９６−１８１５）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と類似であり、ただ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのエノラーゼの配列から選択され修正されたエノラーゼエンコード配列（４２７−１５４２）が使用される点で異なる。
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、デザイナホスホグリセレートムターゼＤＮＡコンストラクト（２３４９ｂｐ）の例１０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼプロモータ（２１−２８２）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（２８３−２９１）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２９２−４２６）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのホスホグリセレートムターゼ（ジェンバンク：ＪＧＩ  Ｃｈｌｒｅ２タンパク質ＩＤ１６１６８９、ジェンバンク：ＡＦ２６８０７８）から選択され修正されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（４２７−２０９７）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（２０９８−２１０６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（２１０７−２３２９）、および３'端におけるＰＣＲ  ＲＥプライマー（２３３０−２３４９）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と類似であり、ただ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのホスホグリセレートムターゼの配列から選択され修正されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（４２７−２０９７）が使用される点で異なる。
【００７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、デザイナホスホグリセレートキナーゼＤＮＡコンストラクト（１９０８ｂｐ）の例１１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、そのクロロプラスト信号ペプチドおよび成熟酵素配列を含むＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのクロロプラストのホスホグリセレートキナーゼ配列（ジェンバンク：Ｕ１４９１２）から選択され修正されたホスホグリセレートキナーゼエンコード配列（２８３−１６６５）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１６６６−１８８８）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８８９−１９０８）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と類似であり、ただ、そのクロロプラスト信号ペプチドおよび成熟酵素配列を含むＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのクロロプラストのホスホグリセレートキナーゼ配列から選択され修正されたホスホグリセレートキナーゼエンコード配列（２８３−１６６５）が使用される点で異なる。したがって、これも、Ｎｉａｌプロモータ（ＤＮＡ配列２１−２８２）のような適切な誘導可能プロモータと一緒に使用することが適切なときに、ｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのクロロプラストのホスホグリセレートキナーゼのような核エンコードクロロプラスト酵素の配列も使用できる例である。
【００７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、デザイナグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（１６７７ｂｐ）の例１２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２８３−４１７）、Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａ  ｖｉｒｉｄｅの細胞質ゾルのグリセルアルデヒド三リン酸ヒドロゲナーゼ（ｍＲＮＡ）配列（ジェンバンク受入番号ＤＱ８７３４０４）から選択され修正された酵素エンコード配列（４１８−１４３４）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４３５−１６５７）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６５８−１６７７）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と類似であり、ただ、Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａ  ｖｉｒｉｄｅの細胞質ゾルのグリセルアルデヒド三リン酸ヒドロゲナーゼ（ｍＲＮＡ）配列（ジェンバンク受入番号ＤＱ８７３４０４）から選択され修正された酵素エンコード配列（４１８−１４３４）が使用される点で異なる。
【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・ホスホグリセレートムターゼＤＮＡコンストラクト（２３５１ｂｐ）の例１３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのホスホグリセレートムターゼ（ＪＧＩ  Ｃｈｌｒｅ２タンパク質ＩＤ１６１６８９、ジェンバンク：ＡＦ２６８０７８）から選択され修正されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（４３８−２１０８）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（２１０９−２３３１）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２３３２−２３５１）を含む。このＤＮＡコンストラクトは例１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と極めて類似であり、ただ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのホスホグリセレートムターゼから選択され修正されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（４３８−２１０８）が使用される点で異なる。
２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）は発明者の実験室における実験分析により活性であることが判明した。ＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）を使用すると、嫌気性培養媒体条件を用いることによりデザイナ酵素表出の活性が可能になる。
【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示す配列と同一の、誘導可能嫌気性プロモータおよびクロロプラスト対象化配列を用いる原理を伴って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜２３はデザイン遺伝子例１４〜２３を示す。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・エノラーゼＤＮＡコンストラクト（１７９６ｂｐ）の例１４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのエノラーゼ（ジェンバンク：Ｘ６６４１２、Ｐ３１６８３）から選択され修正されたエノラーゼエンコード配列（４３８−１５５３）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５５４−１７７６）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７７７−１７９６）を含む。
【００７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ制御ピルビン酸キナーゼＤＮＡコンストラクト（１７９６ｂｐ）の例１５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞質ゾルのピルビン酸キナーゼ配列（ＪＧＩ  Ｃｈｌｒｅ２タンパク質ＩＤ１３８１０５）から選択され修正されたピルビン酸キナーゼエンコード配列（４３８−１５８９）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５９０−１８１２）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８１３−１８３２）を含む。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼＤＮＡコンストラクト（４３７６ｂｐ）の例１６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ配列（ジェンバンク受入番号Ｙ０９７０２）から選択され修正されたピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼエンコード配列（４３８−４１３３）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（４１３４−４３５６）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（４３５７−４３７６）を含む。
【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・ピルビン酸ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼＤＮＡコンストラクト（６０９２ｂｐ）の例１７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓのピルビン酸ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの配列（ジェンバンク受入番号ＡＢ０２１１２７）から選択され修正されたピルビン酸ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼエンコード配列（４３８−５４８９）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（５８５０−６０７２）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（６０７３−６０９２）を含む。
【００７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・チオラーゼＤＮＡコンストラクト（１８５６ｂｐ）の例１８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのチオラーゼ（ジェンバンク：Ｚ９２９７４）から選択され修正されたチオラーゼエンコード配列（４３８−１６１３）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１６１４−１８３６）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８３７−１８５６）を含む。
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＤＮＡコンストラクト（１５５０ｂｐ）の例１９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ジェンバンクＺ９２９７４）の配列から選択され修正された３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（４３８−１３０７）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３０８−１５３０）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５３１−１５５０）を含む。
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・クロトナーゼＤＮＡコンストラクト（１４５７ｂｐ）の例２０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのクロトナーゼ（ジェンバンクＺ９２９７４）の配列から選択され修正されたクロトナーゼエンコード配列（４３８−１２１４）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１２１５−１４３７）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４３８−１４５７）を含む。
【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＤＮＡコンストラクト（１８１７ｂｐ）の例２１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ジェンバンクＺ９２９７４）の配列から選択され修正されたブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（４３８−１５７４）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５７５−１７９７）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７９８−１８１７）を含む。
【００８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼＤＮＡコンストラクト（２０８４ｂｐ）の例２２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ジェンバンクＡＹ２５１６４６）の配列から選択され修正されたブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼエンコード配列（４３８−１８４１）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１８４２−２０６４）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０６５−２０８４）を含む。
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ・リンク・ブタノールデヒドロゲナーゼＤＮＡコンストラクト（１７３３ｂｐ）の例２３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（３０３−４３７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼ（ＧジェンバンクＡＦ１５７３０７）の配列から選択され修正されたブタノールデヒドロゲナーゼエンコード配列（４３８−１４９０）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４９１−１７１３）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７１４−１７３３）を含む。
【００８５】
さきに述べたのと同一の、２×８４合成Ｎｉａｌプロモータおよびクロロプラスト対象化配列を用いる原理を伴って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４〜２６はデザイン酵素ＤＮＡコンストラクトのさらなる例を示す。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４は、デザイナフルクトースジホスフェートアルドラーゼのＤＮＡコンストラクトの例２４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのクロロプラストのフルクトース−１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ配列（ジェンバンク：Ｘ６９９６９）から選択され修正されたフルクトースジホスフェートアルドラーゼエンコード配列（１８９−１３１３）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３１４−１５３６）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５３７−１５５６）を含む。
【００８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５は、デザイナトリオースホスフェートイソメラーゼのＤＮＡコンストラクトの例２４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのクロロプラストトリオースホスフェートイソメラーゼ配列（ジェンバンク：ＡＦ２４７５５９）から選択され修正されたトリオースホスフェートイソメラーゼエンコード配列（１８９−１１３６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１１３７−１３５９）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３６０−１３７９）を含む。
【００８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６は、デザイナホスホフルクトースキナーゼのＤＮＡコンストラクトの例２６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの６−ホスホフルクトキナーゼ配列（ジェンバンク：ＮＭ＿００１０３７０４３））から選択され修正されたホスホフルクトースキナーゼエンコード配列（３２４−１９１３）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１９１４−２１３６）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１３７−２１５６）を含む。
【００８８】
先の例に示されるような、核酸コンストラクトは、付加的な適切な配列、例えば、選択マーカー遺伝子、およびオプションの生体タグ配列（例えば例４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で説明したＬｕｍｉｏタグ）を含んで良い。コンストラクト中に選択され使用されて良い選択可能なマーカーは、カナマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルホニル尿素、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、その他への耐性を提供するマーカーを含み、これらはすべて、クローン化され、当業者は入手可能である。代替的には、選択的マーカーは、ホスト有機体において欠乏を補足できる栄養素マーカー遺伝子である。例えば、遺伝子エンコード・アルギノこはく酸リアーゼ（ａｒｇ７）は、デザイナコンストラクト中において選択マーカーとして使用でき、これは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ａｒｇ７−（マイナス）細胞がホスト細胞として使用されるときに形質転換体を特定することができる。
【００８９】
デザイナ遺伝子を担持する核酸コンストラクトは、利用可能な遺伝子形質転換技術、例えば、ＤＮＡの電子穿孔、ＰＥＧ誘導吸引、およびバリスティック搬送、ならびにアグロバクテリウムによる形質転換を利用して、ホストである藻類、藍藻類、または植物の組織または細胞に搬送できる。デザイナコンストラクトを藻類細胞中に搬送するためには、電子穿孔、ガラス玉、およびバイオリスティック遺伝子銃が好ましい方法として選択して使用でき、単細胞または単純な葉状体（ｔｈａｌｌｕｓ）が形質転換に利用して好ましい。
【００９０】
種々のデザイナ遺伝子をホスト細胞中に、ステップごと順次的に、または同時に、１つのコンストラクトまたは１の形質転換を利用して、案内できる。例えば、１０種類の酵素のホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路のための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜１６（または１７）および１８〜２３で示される１０個のＤＮＡコンストラクトを、単一の選択マーカー（Ａｒｇ７）とともにｐ３８９−Ａｒｇ７のような遺伝子ベクター中に配置できる。したがって、この態様でプラスミドを使用することによって、３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路（図１の０３−１２）のための１つの形質転換においてすべての１０種類のＤＮＡコンストラクト（デザイナ遺伝子）をアルギニン要求Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ−ａｒｇ７ホスト（ＣＣ−４８）に搬送することができる。必要な場合には、１０種類のＤＮＡコンストラクトを含む形質転換体をさらに形質転換させて、より多くのデザイナ遺伝子を付加的な選択マーカー例えばストレプトマイシンとともに遺伝子ＤＮＡを取得させて良い。適切なホスト有機体における遺伝子形質転換において種々のデザイナ酵素ＤＮＡコンストラクト、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２６において提示されたものを組み合わせることにより、種々のブタノール生産経路、例えば図１に示されるものを構築できる。例えば、グリセルアルデヒド三リン酸分岐ブタノール生産経路（図１の０１〜１２）のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１２のデザイナＤＮＡコンストラクトを選択でき；フルクトース−１，６−ジホスフェート分岐ブタノール生産経路（図１の２０〜３３）のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１２、２４および、２５のデザイナＤＮＡコンストラクトを選択でき；さらに、フルクトース−６−ホスフェート分岐ブタノール生産経路（図１の１９〜３３）のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１２、および２４〜２６のデザイナＤＮＡコンストラクトを選択できる。
【００９１】
［光合成ブタノール生産を増強するための付加的なホスト修正］
［ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構］
光合成ブタノール生産経路によれば、１分子のブタノールを、４ＣＯ２および５Ｈ２Ｏから製造するために、１４個のＡＴＰおよび１２個のＮＡＤＰＨを必要とすると考えられ、これら双方は、水分解およびチラコイド膜を横切る光リン酸化によって生成される。３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路（図１の０３−１２）を動作させるためには、光駆動電子搬送プロセスにより生成されるＮＡＤＰＨを使用できるブタノール生産経路酵素を使用するのが好ましいプラクティスである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク受入番号：ＡＢ２５７４３９）およびブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＹ２５１６４６）は、ＮＡＤＰ（Ｈ）またはＮＡＤ（Ｈ）のいずれかを受容できるブタノール生産経路酵素の例である。ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ（すなわちＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の双方を利用できるようなブタノール生産経路酵素も、この３−ホスホグリセレート分岐のデザイナブタノール生産経路、および任意の他のデザイナブタノール生産経路（図１）にも選択して使用できる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）は、ＮＡＤ（Ｈ）のみを銃猟できるブタノール生産経路酵素の例である。ＮＡＤＨのみを使用できるブタノール生産経路酵素を採用するときには、３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路を動作させるためにＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構が必要となるであろう。しかしながら、ホスト有機体の遺伝子バックグラウンドに応じて、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの間の変換機構は、有機体においてＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨが交換可能に使用できるように、そのホスト中に存在するかもしれない。さらに、ＮＡＤＰＨはＮＡＤＰＨホスファターゼ活性によりＮＡＤＨに変換できることが知られており（ＰａｔｔａｎａｙａｋおよびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ（１９９８）、"Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｄａｒｋ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒａｔｅ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉａ"、Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ  ４１（１）：７５−８４）、また、ＮＡＤがＮＡＤキナーゼ活性によりＮＡＤＰに変換できることが知られている（Ｍｕｔｏ、Ｍｉｙａｃｈｉ、Ｕｓｕｄａ、Ｅｄｗａｒｄｓ、およびＢａｓｓｈａｍ（１９８１）、"Ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔ  ｌｅａｖｅｓ"、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６８（２）：３２４−３２８、およびＭａｔｓｕｍｕｒａ−Ｋａｄｏｔａ、Ｍｕｔｏ、Ｍｉｙａｃｈｉ（１９８２）、"Ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤ＋  ｔｏ  ＮＡＤＰ＋  ｉｎ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｓ"、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、６７９（２）：３００−３００）。したがって、増強ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換が必要な場合には、ホストは遺伝子的に修正されてＮＡＤＰＨホスファターゼおよびＮＡＤキナーゼ活性を増強させて良い。このため、種々の実施例の１つにおいて、光合成ブタノール生産デザイナ植物、デザイナ藻類または植物細胞は、ＮＡＤＰＨホスファターゼおよびＮＡＤキナーゼ（ジェンバンク：ＸＭ  ００１６０９３９５、ＸＭ  ００１３２４２３９）のようなＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ内変換を実施するための、さらに付加的な導入遺伝子（図２Ｂ）を、藻類クロロプラストのストロマ中に、含む。
【００９２】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構を提供できる他の実施例は、デザイナブタノール生産経路のためのカルビン回路の適切な分岐点を正しく選択することによる。この実施例に従って経路設計と行うことによりＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構を付与するためには、図１に示されるようなカルビン回路のグリセルアルデヒド三リン酸の点またはその後方でデザイナブタノール経路を分岐するのが好ましいプラクティスである。これらの経路設計において、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換は、基本的には２ステップの機構により実現される。すなわち。（１）ＮＡＤＨを使用して１，３−ジホスホグリセレートをグリセルアルデヒド−３−ホスフェートに還元する、カルビン回路のグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼのステップを使用すること、および、（２）グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを３−ジホスホグリセレートに酸化する際にＮＡＤＨを生成する、デザイナ経路のＮＡＤ＋依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ０１のステップを使用することである。上述した２つのステップの正味の結果は、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへの変換であり、これはデザイナブタノール生産経路のためにＮＡＤＨを形成する所望の還元力を供給できる。ステップ（１）については、ホスト有機体中に自然にあるカルビン回路のＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼで通常充分である。この結果、カルビン回路のＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼと協働するためのデザインＮＡＤ＋依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ０１を導入すると、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構の機能を付与でき、これが、３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路（図１の０３−１２）が良好に動作するためには必要となる。この理由のために、デザインＮＡＤ＋依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（例１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換遺伝子（図２Ｂ）としても、使用されて、種々の実施例の１つにおいて、３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路（図１の０３−１２）をサポートする。これは、デザイナブタノール生産経路のためにこの２ステップのＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構を付与するためにＮＡＤ＋依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ０１を使用することがなぜ重要であるかの説明となる。したがって、種々の実施例の１つにおいて、図１に示すようなデザイナブタノール生産経路中で、ＮＡＤ＋依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、そのイソ酵素、機能的誘導体、アナログ、デザイナ修正酵素、および／またはそれらの組み合わせを使用することが好ましいプラクティスでもある。
【００９３】
［光合成調整機能をさらに管理するためのｉＲＮＡ技術］
この発明の他の実施例において、ホスト植物または細胞がされに修正されて、ホストが、デンプン（オキシクロロバクテリアの場合グリコーゲン）、セルロース、生物精製所産業がしばしば効率的に使用することが非効率または困難なリグロセルロースを合成する代わりに、直接に液体の燃料ブタノールを製造できるようにするようにカルビン回路を管理するようにされる。種々の実施例の１つにおいて、カルビン回路（図１）に連結するデンプン合成経路のデンプンシンターゼ（オキシクロロバクテリアの場合グリコーゲンシンターゼ）１３、グルコース−１−ホスフェート（Ｇ−１−Ｐ）アデニリルトランスフェラーゼ１４、ホスホグルコムターゼ１５、およびヘキソースホスフェートイソメラーゼ１６のようなキーとなる酵素のいずれかの表出を抑制する余とによって、デンプン合成活性が不活性化される。
【００９４】
カルビン回路生産物についてデザイナブタノール生産経路と競合するデンプン合成活性を禁止できる遺伝子的に搬送可能なファクタを導入すると光合成ブタノール生産をさらに助長できる。具体的な実施例において、競合的なデンプン合成経路に対する遺伝子的にエンコード可能なインヒビター（図２Ｃ）は、図１にラベル１３〜１６で示される、デンプンシンターゼ１６、グルコース−１−ホスフェート（Ｇ−１−Ｐ）アデニリルトランスフェラーゼ１５、ホスホグルコムターゼ１４、および／またはヘキソース−ホスフェート−イソメラーゼ１３のようなデンプン合成経路の酵素を個別的に阻害する干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子である。ＤＮＡ配列エンコードデンプン合成ｉＲＮＡ、グルコース−１−ホスフェート（Ｇ−１−Ｐ）アデニリルトランスフェラーゼｉＲＮＡ、ホスホグルコムターゼｉＲＮＡ、および／またはＧ−Ｐ−イソメラーゼｉＲＮＡは、それぞれ、当業界で知られているＲＮＡ干渉技術に基づいて設計され、合成できる（Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ（Ｊｕｎｅ  １，２００３）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、Ｖｏｌ．２３、ｎｕｍｂｅｒ１１、ｐｐ．１−５９）。全般的に述べれば、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子は、アンチセンスであるが、個々のタンパク質（遺伝子）の通常のｍＲＮＡと相補的であり、そのようなｉＲＮＡ分子は個別的に個々の遺伝子の通常のｍＲＮＡとバインドして、それゆえ、遺伝子固有のｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるのを阻害（ブロック）するようになっている（Ｆｉｒｅ、Ｘｕ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｋｏｓｔａｓ、Ｄｒｉｖｅｒ、Ｍｅｌｌｏ（１９９８）、"Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ"、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１（６６６９）：８０６−１１；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ、Ｎｏｖｉｎａ、Ｓｈａｒｐ（２００３）、"Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ：  ｓｈｏｒｔ  ＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（６）：４５７−６７）。
【００９５】
デザイナデンプン合成ｉＲＮＡのＤＮＡコンストラクト（図２Ｃ）はリストのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８に示される。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御デンプンシンターゼｉＲＮＡのＤＮＡコンストラクト（８６０ｂｐ）の例２７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのＮａｉｌプロモータ（２１−２８２）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのデンプンシンターゼｍＲＮＡ配列（ジェンバンク：ＡＦ０２６４２２）の２つの固有な配列断片のコドンタグおよび逆相補配列を有する、デンプンシンターゼｉＲＮＡ配列（２８３−６１７）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（６１８−８５０）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（８５１−８６０）を含む。Ｎｉａｌプロモータ（２１−２８２）を使用しているので、このデザイナデンプン合成ｉＲＮＡ遺伝子は、特別な誘導因子、ニトレート（ＮＯ３）の存在下で光合成ブタノール生産が増強される必要があるときにのみ表出されるように設計され、これはデザイナ有機体を導入するための肥料（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ）として培養媒体中に付加されて良い。デンプンシンターゼｉＲＮＡ系列（２８３−６１７）はデンプンシンターゼ遺伝子の通常のｍＲＮＡとバインドするように設計され、そのため機能的なデンプンシンターゼにそれが翻訳されるのを阻害する。このような態様でデンプン／グリコーゲンシンターゼの活性が１６において阻害されるので、カルビン回路のより多くの光合成生成物が図１にしめすようなカルビン回路分岐ブタノール生産経路、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェート分岐ブタノール生産経路０１−１２に案内される。
【００９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８は、デザイナＨｙｄＡｌプロモータ制御デンプンシンターゼｉＲＮＡのＤＮＡコンストラクト（１３２８ｂｐ）の例２８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２８２−ｂｐのＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）、デザイナデンプンシンターゼｉＲＮＡ配列（３０３−１０８５）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１０８６−１３０８）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３０９−１３２８）を含む。デザイナデンプンシンターゼｉＲＮＡ配列（３０３−１０８５）は：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのデンプンシンターゼｍＲＮＡ配列（ジェンバンク：ＡＦ０２６４２２）の最初の３００−ｂｐの固有なコード配列から選択された３００−ｂｐのセンス断片（３０３−６０２）、１８３−ｂｐのデザイナ・イントロン状ループ（６０３−７８５）、および、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのデンプンシンターゼｍＲＮＡ配列（ジェンバンク：ＡＦ０２６４２２）の最初の３００−ｂｐと相補的な、３００−ｂｐのアンチセンス配列を有する。このデザイナデンプンシンターゼｉＲＮＡ配列（３０３−１０８５）は以下の２つの機構によって、デンプンシンターゼの合成を阻害するように設計されている。第１に、３００−ｂｐのアンチセンス相補的ｉＲＮＡ配列（ＤＮＡ配列７８６−１０８５に対応する）が、デンプンシンターゼ遺伝子の通常のｍＲＮＡとバインドして、これが機能的デンプンシンターゼに翻訳されるのを阻止する。第２に、３００−ｂｐのアンチセンス相補的ｉＲＮＡ配列（ＤＮＡ配列７８６−１０８５に対応する）が、同一のデザイナｉＲＮＡ分子中の３００−ｂｐのセンス・カウンターパート（ＤＮＡ系列３０３−６０２に対応する）にもバインドしてループとしての１８３−ｂｐのデザイナ・イントロン状配列（６０３−７８５）を伴ってヘアーピン状の二重螺旋ＲＮＡ構造を形成する。実験的な検討によれば、このタイプのヘアーピン状二重螺旋ＲＮＡも翻訳後遺伝子サイレンシングをトリガーすることがわかっている（Ｆｕｈｒｍａｎｎ、Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、Ｇｏｖｏｒｕｎｏｖａ、Ｒａｎｋ、および、Ｈｅｇｅｍａｎｎ（２００１）、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１４：３８５７−３８６３）。ＨｙｄＡｌプロモータ（２１−３０２）を使用しているので、デザイナデンプン合成ｉＲＮＡ遺伝子は、図１において説明する０１−１２、０３−１２、および／または２０−３３のようなブタノール生産経路中に、より多くの光合成生成物を送り込むことにより光生物学的なブタノール生産を増強することが必要なときに、嫌気性条件下のみで、表出するように設計される。
【００９７】
［デザイナデンプン分解および解糖の遺伝子］
この発明の他の実施例において、光生物学的ブタノール生産は、デザイナブタノール生産遺伝子（図２Ａ）に組み合わせて、デンプン／グリコーゲンを分解するのを助長できる付加的な１組のデザイナ遺伝子（図２Ｄ）を組み入れることにより増強される。デンプン分解のためのそのような付加的なデザイナ遺伝子は、例えば、１７：アミラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、および１８：グルコース−ホスフェート−イソメラーゼ（Ｇ−Ｐ−イソメラーゼ）を含み、これは図１に示すとおりである。デザイナ解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）遺伝子はクロロプラスト対象化解糖酵素：グルコセホスフェートイソメラーゼ１８、ホスホフルクトースキナーゼ１９、アルドラーゼ２０、トリオースホスフェートイソメラーゼ２１、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ２２、ホスホグリセレートキナーゼ２３、ホスホグリセレートムターゼ２４、エノラーゼ２５、およびピルビン酸キナーゼ２６をエンコードする。デザイナデンプン分解および解糖遺伝子は図１に示される任意のブタノール生産経路と組み合わせて、デンプン／グリコーゲンからブタノールへの付加的な経路を形成できる（１７−３３）。この結果、デンプン分解および解糖の遺伝子をブタノール生産経路遺伝子とともに表出して光生物学的ブタノールの生産も増強させることができる。したがって、この実施例は、増強した光生物学的ブタノール生産のためにカルビン回路を管理するための他のアプローチを実現する。この場合、この場合では、カルビン回路の生成物のいくつかが、デンプン合成経路（１３−１６）に流れ出て、この後に、デンプン／グリコーゲンからブタノールへの経路（１７−３３）が続き、これは図１に示すとおりである。この場合、デンプン／グリコーゲンはカルビン回路生成物の一時的な貯蔵プールとして働き、そののち、これらはブタノールに変換できる。この機構は、所定の場合には、ブタノール生産収率を最大化させる上で極めて有益である。例えば、正午付近の極めて大きな太陽光強度で、カルビン回路のＣＯ２固定の速度が大きくてブタノール生産経路の最大速度許容値を超えるときには、このデンプン合成機構を使用して過剰な光合成生産物の一時的な貯蔵を可能にし、のちにブタノール生産にも使用できる。
【００９８】
図１は、デザイナデンプン／グルコーゲンブタノール経路をデザイナ酵素（１７から３３でラベル付けされている）とともにカルビン回路分岐デザイナブタノール生産経路、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェート分岐ブタノール生産経路０１−１２と組み合わせて使用して光生物学的なブタノール生産を増強させることも示す。カルビン回路分岐のブタノール生産経路を使用する際の利点と同様に、デザイナデンプン／グリコーゲンブタノール経路（１７−３３）を使用すると、糖類が、生物精製所産業によって容易に利用できないリグノセルロースバイオマスのような複雑な生体分子に変換されるまえに、光合成生成物をブタノールに変換するのを支援できる。したがって、カルビン回路分岐のデザイナブタノール生産経路（例えば、０１−１２、０３−１２、および／または２０−３３）、および／またはデザイナデンプン／グリコーゲンブタノール経路（１７−３３）は「手に負えないリグノセルロース」問題を含む現行のバイオマス技術のボトルネックの問題を有効にバイパスすることができる、とりわけ革新的な技術を提供できる。
【００９９】
他の特徴は、カルビン回路分岐デザイナブタノール生産経路活性（例えば０１−１２、０３−１２、および／または２０−３３）が光がある日中に支配的に起こるということである。なぜならば、それが、チラコロイド膜システムを通じた光合成水分解および光駆動プロトン転地結合電子運搬プロセスにより発生させられる還元力（ＮＡＤＰＨ）およびエネルギー（ＡＴＰ）の供給を必要とするカルビン回路の中間生成物を利用するからである。デザイナデンプン／グリコーゲンブタノール経路（１７−３３）は光合成を通じてデンプン／グリコーゲンとして貯蔵された過剰な糖類を利用でき、日中だけでなく、夜も動作可能である。この結果、図１に示すように、カルビン回路分岐デザイナブタノール生産経路（例えば、０１−１２、０３−１２、および／または２０−３３）をデザイナデンプン／グリコーゲンブタノール経路（１７−３３）とともに使用すると、日中および夜の双方でブタノールを生産できるようになる。
【０１００】
デザイナデンプン／グリコーゲンブタノール経路およびカルビン回路分岐デザイナブタノール生産経路の双方の表出は誘導可能プロモータ例えば嫌気性ヒドロゲナーゼプロモータを利用して制御できるので、このタイプのデザイナ有機体は、嫌気性（通常）条件下で独立栄養で成長可能である。デザイナ光合成有機体が成長して光生物学的ブタノール生産の準備ができたときに、細胞は、嫌気性条件下のような特別な誘導条件下に置かれ（あるいは、デザイナＮｉａｌ／ｎｉｒＡプロモータ制御ブタノール生産経路が利用されるならば、アンモニアニトレートファーティライザ利用シフトで）、図１および図３に示すようにブタノール生産を増強する。
【０１０１】
デザイナデンプン（グリコーゲン）分解遺伝子は、リストのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３３に示される。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９は、デザイナアミラーゼのＤＮＡコンストラクト（１８８９ｂｐ）の例２９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１８９−１９７）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１９８−３３２）、Ｂａｒｌｅｙ  ａｌｐｈａアミラーゼ（ジェンバンク：アリューロン細胞中でテストされたＪ０４２０２Ａ  ｍｙ４６表現）から選択され修正されたアミラーゼエンコード配列（３３３−１６１６）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグ配列（１６１７−１６３７）、９−ｂｐのＸｂａＩサイト（１６３８−１６４６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１６４７−１８６９）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８７０−１８８９）を含む。
【０１０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０は、デザイナデンプンホスホリラーゼのＤＮＡコンストラクト（３０３９ｂｐ）の例３０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｉｔｒｕｓの根のデンプンホスホリラーゼ配列（ジェンバンク：ＡＹ０９８８９５、Ｃｉｔｒｕｓの根においてテストされた表現）から選択され修正されたデンプンホスホリラーゼエンコード配列（３２４−２８４６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（２８４７−３０６９）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（３０７０−３０８９）を含む。
【０１０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１は、デザイナヘキソースキナーゼのＤＮＡコンストラクト（１９４９ｂｐ）の例３１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのヘキソキナーゼｍＲＮＡ配列（ジェンバンク：ＸＭ＿００１５４１５１３）から選択され修正されたヘキソキナーゼエンコード配列（３２４−１７０６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１７０７−１９２９）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９３０−１９４９）を含む。
【０１０４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２は、デザイナホスホグルコムターゼのＤＮＡコンストラクト（２２４９ｂｐ）の例３２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓのホスホグルコムターゼ配列（ジェンバンク：ＸＭ＿００１３８３２８１）から選択され修正されたホスホグルコムターゼエンコード配列（３２４−２００６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（２００７−２２２９）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２２３０−２２４９）を含む。
【０１０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３は、デザイナグルコセホスフェートのＤＮＡコンストラクト（２２３１ｂｐ）の例３３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＮＲプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのホスホグルコイソメラゼ配列（ジェンバンク：Ｍ２１６９６）から選択され修正されたグルコセホスフェートイソメラーゼエンコード配列（３２４−１９８８）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（１９８９−２２１１）、およびＰＣＲ  ＲＥプライマー（２２１２−２２３１）を含む。
【０１０６】
デザイナデンプン分解遺伝子、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９−３３のものは、図１に示す経路のような種々のデンプン分解ブタノール生産経路を構築するために種々のデザイナブタノール生産経路と組み合わせて選択して使用できる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１２、２４−２６、および２９−３３に示すデザイナ遺伝子は、以下のデザイナ酵素を有する、Ｎｉａｌプロモータ制御デンプンブタノール生産経路を構築するために選択できる。すなわち、アミラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコセホスフェートイソメラーゼ、ホスホフルクトースキナーゼ、フルクトースジホスフェートアルドラーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸−ＮＡＤＰ＋オシシドレダクターゼ（またはピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ）、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼである。このデンプン／グリコーゲンブタノール経路１７−３３は単独で利用しても良いし、図１に示されるような３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路０３−１２のような他のブタノール生産経路と組み合わせて使用しても良い。
【０１０７】
［クロロプラストおよび細胞質の間のデザイナブタノール生産経路の分散］
この発明の他の実施例において、光生物学的ブタノール生産活性は、デザイナブタノール生産経路を真核植物細胞中のクロロプラストおよび細胞質の間に選択的に分散させることにより増強される。すなわち、デザイナブタノール生産経路（図１）のすべてがクロロプラスト中で動作する必要はなく、望まれるときには、デザイナブタノール生産経路の部分が細胞質で動作できても良い。例えば、種々の実施例の１つにおいて、ジヒドロキシアセトンホスフェートブタノール（２１−３３）からデザイナデンプンブタノール経路活性の重要な部分は、細胞質で起こり、他方、デンプンからジヒドロキシアセトンホスフェートへのステップ（１７−２０）はクロロプラストであるように設計される。この例では、デザイナ経路のクロロプラスト部分と細胞質部分の間のリンクは、トリオースホスフェート−ホスフェートトランスロケータを使用して達成され、これは、ジヒドロキシアセトンをクロロプラスト膜を横切って転置されるのを容易にする。トリオースホスフェート−ホスフェートトランスロケータを使用することで、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート分岐デザイナブタノール生産経路がクロロプラストのみでなく、細胞質においても動作可能になる。デザイナブタノール生産経路の細胞質部分は、デザイナブタノール生産経路遺伝子（図２ＡのＤＮＡコンストラクト）を、それらのクロロプラスト対象化配列を省略して使用することにより構築でき、これは図２Ｅに示すとおりである。
【０１０８】
［デザイナブタノール生産経路を細胞質中に伴うデザイナオキシホトバクテリア］
藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）のような原核光合成有機体は、典型的には光合成チラコイド膜を有しクロロプラスト構造を有さず、この原核光合成有機体では、カルビン回路は細胞質に位置決めされる。この特殊な場合には、これに限定されないが、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート分岐ブタノール生産経路（０１−１２）、３−ホスホグリセレート分岐ブタノール生産経路（０３−１２）、フルクトース−１，６−ジホスフェート分岐経路（２２−３３）、フルクトース−６−ホスフェート分岐経路（１９−３３）、およびデンプン（またはグリコーゲン）−ブタノール経路（１７−３３）をふっ組む、完全なデザイナブタノール経路（図１）が藍藻類の細胞質中でカルビン回路とともに動作するように、設計上、調整される。細胞質デザイナブタノール生産経路の構築は、デザイナブタノール生産経路遺伝子（図２ＡのＤＮＡコンストラクト）を、クロロプラスト対象化配列をすべて省略したうえで、使用して実現できる。図２Ｅに示すように、デザイナＤＮＡコンストラクトにおいてクロロプラスト対象化配列を省略するとき、デザイナ遺伝子は細胞質中の酵素へ転写、翻訳され、これにより、デザイナブタノール生産経路が付与される。デザイナ遺伝子はホストの藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）中の染色体および／またはプラスミドのＤＮＡに、当業者に知られている遺伝子形質転換の技術を用いて組み込むことができる。デザイナ遺伝子は、統合的な形質転換（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて、デザイナ遺伝子に対してより良好な遺伝子的安定性を通常では実現する染色体ＤＮＡ中に一体化させることが好ましいプラクティスである。シアノバクテリアのようなオキシホトバクテリアにおいては、統合的な形質転換は同種のＤＮＡ二重リコンビネーションをホスト染色体ＤＮＡにデザイナＤＮＡコンストラクトを使用して組み入れるプロセスを通じて実現でき、これを図２Ｆに示し、これは、典型的には５'の上流から３'の下流へ、リコンビネーションサイト１、デザイナブタノール生産経路遺伝子、およびリコンビネーションサイト２を有する。このタイプのＤＮＡコンストラクト（図２Ｆ）は、電子穿孔、自然形質転換、および／または、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を含む、多くの利用可能な遺伝子形質転換手法で、オキシホトバクテリア（藍藻類）に搬出可能である。藍藻類から形成された遺伝子組み替えデザイナ有機体はデザイナ藍藻類（デザイナシアノバクテリアおよびデザイナオキシクロロバクテリアを含むデザイナオキシホトバクテリア）とも呼ばれる。
【０１０９】
デザイナオキシホトバクテリアブタノール生産経路遺伝子の例は、リストのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４および４５に示される。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４は、デザイナオキシホトバクテリアのブタノールデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１７０９ｂｐ）の例３４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの４００−ｂｐのニトライトレダクターゼ（ｎｉｒＡ）プロモータ（２１−４２０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼ配列（ＡＢ２５７４３９）から選択され修正された酵素エンコード配列（４２１−１５６９）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１５７０−１６８９）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６９０−１７０９）を含む。
【０１１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５は、デザイナオキシホトバクテリアのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１９６７ｂｐ）の例３５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、４００−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−４２０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ配列（ＡＹ２５１６４６）から選択され修正された酵素エンコード配列（４２１−１８２７）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１８２８−１９４７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６９０−１７０９）を含む。
【０１１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６は、デザイナオキシホトバクテリアのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１６０２ｂｐ）の例３６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、３０５−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のニトライトレダクターゼプロモータ（２１−３２５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正されたブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（３２６−１４２２）、１２０−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１４２３−１５８２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６９０−１７０９）を含む。
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７は、デザイナオキシホトバクテリアのクロトナーゼのＤＮＡコンストラクト（１２４８ｂｐ）の例３７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、３０５−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のニトライトレダクターゼプロモータ（２１−３２５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのクロトナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正されたクロトナーゼエンコード配列（３２６−１１０８）、１２０−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のｒｂｃＳターミネータ（１１０９−１２２８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６９０−１７０９）を含む。
【０１１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８は、デザイナオキシホトバクテリアの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１３１１ｂｐ）の例３８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、３０５−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−３２５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ配列クロトナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）から選択され修正された３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼエンコード配列（３２６−１１７１）、１２０−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１１７２−１２９１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１２９２−１３１１）を含む。
【０１１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９は、デザイナオキシホトバクテリアのチオラーゼのＤＮＡコンストラクト（１６６５ｂｐ）の例３９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、３０５−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｎｉｒＡプロモータ（２１−３２５）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓのチオラーゼ配列（ＡＢ  １９０７６４）から選択されたチオラーゼエンコード配列（３２６−１５２５）、１２０−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１５２６−１６４５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６４６−１６６５）を含む。
【０１１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０は、デザイナオキシホトバクテリアのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼのＤＮＡコンストラクト（４０７１ｂｐ）の例４０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの３０５−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−３２５）、Ｍａｓｔｉｇａｍｏｅｂａ  ｂａｌａｍｕｔｈｉのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ジェンバンク：ＡＹ１０１７６７）から選択され修正されたピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼエンコード配列（３２６−３９３１）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（３９３２−４０５１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（４０５２−４０７１）を含む。
【０１１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１は、デザイナオキシホトバクテリアのピルビン酸キナーゼのＤＮＡコンストラクト（１８０６ｂｐ）の例４１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓからの３０５−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−３２５）、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘのピルビン酸キナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ０６５８９０）から選択され修正されたピルビン酸キナーゼエンコード配列（３２６−１６６６）、１２０−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１６６７−１７８６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７８７−１８０６）を含む。
【０１１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２は、デザイナオキシホトバクテリアのエノラーゼのＤＮＡコンストラクト（１６９６ｂｐ）の例４２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓからの２３１−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓの細胞質エノラーゼ（ジェンバンク：Ｘ６６４１２、Ｐ３１６８３）の配列から選択され修正されたエノラーゼエンコード配列（２５２−１５５６）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓからの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１５５７−１６７６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６７７−１６９６）を含む。
【０１１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３は、デザイナオキシホトバクテリアのホスホグリセレートムターゼのＤＮＡコンストラクト（２０２９ｂｐ）の例４３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの２３１−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  ＳＩのホスホグリセレートムターゼ（ジェンバンク：ＹＰ  ００１２１３２７０）の配列から選択され修正されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（２５２−１８８９）、１２０−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１８９０−２００９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０１０−２０２９）を含む。
【０１１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４は、デザイナオキシホトバクテリアのホスホグリセレートキナーゼのＤＮＡコンストラクト（１６８７ｂｐ）の例４４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からの２３１−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  ＳＩのホスホグリセレートキナーゼ（ジェンバンク：ＢＡＦ６０９０３）から選択され修正されたホスホグリセレートキナーゼエンコード配列（２５２−１４３３）、２３４−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のｒｂｃＳターミネータ（１４３４−１６６７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６６８−１６８７）を含む。
【０１２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５は、デザイナオキシホトバクテリアのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１５１４ｂｐ）の例４５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１の３０５−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−３２５）、Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｖｉｒｉｄｉｓのＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＣＡＣ８０９９３）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２６−１２６０）、２３４−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１からのｒｂｃＳターミネータ（１２６１−１４９４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４９５−１５１４）を含む。
【０１２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４〜４５に示すようなデザイナオキシホトバクテリア遺伝子は、充分に、または部分的に、および／または、種々の他のデザイナブタノール生産経路遺伝子と組み合わせて、選択して使用して、図１に示すような種々のデザイナオキシホトバクテリアブタノール生産経路を構築できる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４〜４５に示されるデザイナ遺伝子は、オキシホトバクテリアｎｉｒＡプロモータ制御で、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート分岐ブタノール生産経路（０１−１２）を構築するために使用でき、これは以下のデザイナ酵素を有する。すなわち、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ０１、ホスホグリセレートキナーゼ０２、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（またはピルビン酸−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ）０６、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、および、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２である。好熱性または耐熱性のシアノバクテリア中にこれらデザイナオキシホトバクテリアブタノール生産経路遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４〜４５）を使用すると、好熱性または耐熱性ブタノール生産オキシホトバクテリアを実現できる。例えば、これらデザイナ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４〜４５）を、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のような好熱性／耐熱性シアノバクテリア中に使用することにより、デザイナブタノール生産Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのようなデザイナ好熱性／耐熱性ブタンール生産シアノバクテリアを実現できる。
【０１２２】
［バイオセーフティを確実にするためのホストのさらなる修正］
この発明は、細胞分裂制御可能なデザイナ遺伝子組み換え植物（例えば藻類およびオキシホトバクテリア）または植物細胞に基づく、バイオセーフティ防護光合成バイオ燃料（例えばブタノールおよび／または関連する高級アルコール）生産方法も実現する。例えば、細胞分裂制御可能なデザイナ号合成有機体（図３）は、細胞分裂およびメーティング機能（ｍａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が制御可能に停止されてより良好なバイオセーフティ特性が実現されるように、デザイナバイオセーフティ制御遺伝子（図２Ｇ）を、デザイナブタノール生産経路遺伝子（図２Ａ〜２Ｆ）との関係で、デザイナバイオセーフティ制御遺伝子（図２Ｇ）を使用することにより、形成される。
【０１２３】
種々の実施例の１つにおいて、基本的な特徴は、デザイナ細胞分裂制御可能な光合成有機体（例えば、藻類、植物細胞、またはオキシホトバクテリア）が２つのキーとなる機能（図３Ａ）を含むことである。すなわち、デザイナバイオセーフティ機能およびデザイナバイオ燃料生産経路である。図３Ｂに示すように、デザイナバイオセーフティ特徴は多くのメカニズムにより付与され、これは、（１）デザイナプロトンチャンネルを細胞質膜に誘導可能に挿入してどのような細胞分裂もメーティング能力も永久に不能にすること、（２）デザイナ細胞分裂サイクル制御タンパク質または干渉ＲＮＡを選択的に適用して細胞分裂サイクルを永久に阻害し、好ましくは細胞をＧ１相またはＧ０状態に保持すること、および、（３）デザイナバイオ燃料生産経路を表出のために高ＣＯ２要求ホスト光合成有機体を革新的に使用することを含む。デザイナバイオ燃料生産経路の例は、デザイナブタノール生産経路を含み、これは、カルビン回路と協働して二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から直接にブタノールのようなバイオ燃料を合成する。デザイナ細胞分裂制御技術は、光合成バイオ燃料生産のためのデザイナ有機体に使用してバイオセーフティが確実になるように支援できる。したがって、この実施例は、細胞分裂制御可能デザイナーバイオ燃料生産藻類、シアノバクテリア、オキシクロロバクテリア、植物、または植物細胞をベースにして、とりわけ、バイオセーフティ防護されたバイオ燃料（例えばブタノールおよび／または関連する高級アルコール）生産方法を実現する。
【０１２４】
種々の実施例の１つにおいて、細胞分裂制御可能なデザイナブタノール生産真核藻類または植物細胞が、デザイナプロトンチャンネル遺伝子（図２Ｈ）をホスト藻類または植物細胞（図３Ｂ）に導入することにより、形成される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６は、デザイナＮｉａｌポロモータ制御プロトンチャンネル遺伝子（６０９ｂｐ）の詳細なＤＮＡコンストラクトの例４６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２６２−ｂｐのニトレートレダクターゼＮｉａｌプロモータ（２１−２８２）、メリチンプロトンチャンネルエンコード配列（２８３−３６６）、２２３−ｂｐのＲｂｃＳ２ターミネータ（３６７−５８９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（５９０−６０９）を含む。
【０１２５】
デザイナプロトンチャンネル遺伝子（図２Ｈ）の表出は、誘導可能プロモータ、例えば、ニトレートレダクターゼ（Ｎｉａｌ）によって制御され、これは、デザイナバイオ燃料生産毛糸遺伝子の表出を制御するためにも使用されて良い。したがって、デザイナ遺伝子の表出が誘導される前に、デザイナ有機体が、野生型の有機体とまったく同様に、光独立栄養で、ＣＯ２を炭素源とし、Ｈ２Ｏを電子源として利用する。デザイナ有機体培養が成長してバイオ燃料の光合成生産の準備ができたときに、細胞培養は、特別な誘導条件下（例えば、ニトレートレダクターゼ（Ｎｉａｌ）プロモータが誘導プロモータとして使用されるならばニトレートを培養に付加することによって）に配置されて、デザイナプロトンチャンネル遺伝子およびデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子の双方の表出が誘導される。プロトンチャンネル遺伝子の表出は核の中にそれが転写され、細胞質にそれが翻訳されることを通じて起こるように設計される。特別な分子設計のために、表出されたプロトンチャンネルは自動的に細胞質膜に挿入されるが、光合成チラコイド膜は完全なままに置かれる。デザイナプロトンチャンネルが細胞質膜に挿入されると、細胞質膜を横切るプロトン勾配が崩壊させられて細胞分裂およびメーティング機能が永久的に不活性となる。しかしながら、クロロプラスト内の光合成チラコイド膜は（機能的に）完全な状態に維持されてストロマ領域に表出されたデザイナバイオ燃料精製経路酵素がカルビン回路と協働してＣＯ２およびＨ２Ｏからバイオ燃料を生産できるようになっている。すなわち、デザイナプロトンチャンネル遺伝子、およびデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子の双方がターンオンするときに、デザイナ有機体は、バイオ燃料を専門的に光合成生産するための再生産不可能な細胞となる。この段階で、細胞分裂およびメーティング機能は永久的に不活性化（死滅）されているので、デザイナ有機体培養は、ＣＯ２およびＨ２Ｏをバイオ燃料に光化学的に変換するための触媒機能を除けば、もはや生命体ではない。事故による環境への開放がかりに起こり野生型の西郷と接触するようなことになっても、どのような遺伝子物質をも他のどのような細胞との間で、係合し、交換することがもはや不可能である。
【０１２６】
種々の実施例の１つによれば、ニトレートレダクターゼ（Ｎｉａｌ）プロモータまたはニトライトレダクターゼ（ｎｉｒＡ）プロモータは、デザイナ遺伝子の表出を制御するのに使用して好ましい誘導可能プロモータである。培養媒体中にアンモニア（ただしニトレートではない）があるときには、Ｎｉａｌプロモータ制御デザイナプロトンチャンネル遺伝子およびバイオ燃料生産経路遺伝子を伴う、デザイナ有機体は、野生型の有機体とまったく同様に、光独立栄養で、ＣＯ２を炭素源とし、Ｈ２Ｏを電子源として利用して成長できる。デザイナ有機体培養が成長してバイオ燃料の光合成生産の準備ができたときに、デザイナプロトンチャンネル遺伝子およびデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子の双方の表出を、いくらかのニトレートファーティライザを培養媒体に付して誘導することが可能になる。ニトレートは、土壌中に、また地球上のほとんどすべての地表水に広く存在する。したがって、Ｎｉａｌプロモータ制御デザイナ有機体が事故により自然環境に放出されても、それは直ちに死滅してしまう。なぜならば、環境中の二兎レートがＮｉａｌプロモータ制御デザイナプロトンチャンネル遺伝子の表出をトリガーして、これが、プロトンチャンネルを細胞質膜に挿入し、もって、細胞を死滅させるからである。すなわち、Ｎｉａｌプロモータ制御プロトンチャンネル遺伝子を伴うデザイナ光合成有機体は、環境中のニトレートと遭遇するやいなや死滅するようにプログラムされている。Ｎｉａｌプロモータ制御プロトンチャンネル遺伝子を伴う細胞分裂制御可能デザイナ有機体の、この特徴により、付加的なバイオセーフティ特徴が実現される。
【０１２７】
プロトンチャンネル遺伝子（図２Ｈ）をチラコイド膜対象化配列に関連して構築する技術が最近開示された（Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｌｅｅ（２００７）、Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｐｒｏｔｏｎ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｌｇａｅ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、ＰＣＴ国際出願公開番号第ＷＯ２００７／１３４３４０Ａ２）。細胞分裂制御花王デザイナ有機体を製造する、この発明においては、チラコイド膜対象化配列はプロトンチャンネル遺伝子設計から省略しなければならない。例えば、Ｎｉａｌプロモータ制御デザイナプロトンチャンネル遺伝子の基本的な要素は、プロトンチャンネルが細胞質膜に挿入するけれども光合成チラコイド膜には挿入しないように、単純に、プロトンチャンネルエンコード配列（どのようなチラコイド膜対象化配列もない）とリンクしたＮｉａｌプロモータであってよい。
【０１２８】
種々の実施例の１つによれば、デザイナプロトンチャンネル遺伝子およびデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子の双方の表出を制御するために同一のプロモータ例えばＮｉａｌプロモータを知要することが好ましいプラクティスである。このようにすると、デザイナバイオ燃料生産経路は、細胞分裂およびメーティングを含む所定の細胞機能を終了させるデザイナプロトンチャンネル遺伝子と同時に誘導的に表出させることができる。
【０１２９】
種々の実施例の１つにおいて、このデザイナバイオセーフティ実施例において使用可能な誘導可能プロモータは、ヒドロゲナーゼプロモータ（ＨｙｄＡｌ（Ｈｙｄｌ）およびＨｙｄＡ２、受入番号：ＡＪ３０８４１３、ＡＦ２８９２０１、ＡＹ０９０７７０）、Ｃｙｃ６遺伝子プロモータ、Ｃｐｘｌ遺伝子プロモータ、熱ショックタンパク質プロモータＨＳＰ７０Ａ、ＣａｂＩＩ−１遺伝子（受入番号Ｍ２４０７２）プロモータ、Ｃａｌ遺伝子（受入番号Ｐ２０５０７）プロモータ、Ｃａ２遺伝子（受入番号Ｐ２４２５８）プロモータ、ニトレートレダクターゼ（Ｎｉａｌ）プロモータ、ニトライト−レダクターゼ遺伝子（ｎｉｒＡ）プロモータ、双方向ヒドロゲナーゼ−遺伝子ｈｏｘプロモータ、光−および熱−応答ｇｒｏＥプロモータ、Ｒｕｂｉｓｃｏ−オペロンｒｂｃＬプロモータ、金属（亜鉛）誘導可能ｓｍｔプロモータ、鉄−応答ｉｄｉＡプロモータ、レドックス−応答ｃｒｈＲプロモー、熱ショック遺伝子ｈｓｐｌ６．６プロモータ、小熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）プロモータ、Ｃ０２−応答カルボニックアンヒドラーゼ遺伝子プロモータ、緑色／赤色光応答ｃｐｃＢ２Ａ２プロモータ、ＵＶ光応答ｌｅｘＡ、ｒｅｃＡ、およびｒｕｖＢプロモータ、ニトレートレダクターゼ遺伝子（ｎａｒＢ）プロモータ、および、これらの組み合わせからなるグループから選択される。
【０１３０】
他の実施例において、細胞分裂制御デザイナ光合成有機体は、カルボニックアンヒドラーゼ欠損突然変異体、または高ＣＯ２要求突然変異体をホスト有機体として使用してデザイナバイオ燃料生産有機体を形成することにより、形成される。この発明で選択して利用可能な高ＣＯ２要求突然変異体は、（これに限定されないが）Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉカルボニックアンヒドラーゼ欠損突然変異体１２−１Ｃ（ＣＣ−１２１９  ｃａｌ  ｍｔ−）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｃｉａ３突然変異体（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００３、１３２：２２６７−２２７５）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２の高Ｃ０２要求突然変異体Ｍ３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３のカルボキシソーム欠損細胞（Ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｌ  （Ｓｔｕｔｔｇ）  ２００５、７：３４２−３４７）を含み、これはＣＯ２濃縮機構を欠いて０．２〜３％のＣＯ２のような高い濃度の下でのみ光独立栄養で成長できる。
【０１３１】
環境ＣＯ２濃度レベル（３８０ｐｐｍ）下では、カルボニックアンヒドラーゼ欠損または高ＣＯ２要求突然変異体は一般には生き残れない。したがって、ここでのキーとなる考え方は、ＣＯ２濃縮機構を欠く、高Ｃ０２要求デザイナバイオ燃料生産有機体は、ＣＯ２供給を伴う封視されたバイオリアクタ内で、常に、高いＣＯ２濃度レベル（０．２〜５％ＣＯ２）の下で、成長し、光生物学的にバイオ燃料を生産するのに使用されるということである。そのようなデザイナ遺伝子組み替え有機体は、それが環境ＣＯ２濃度レベル（３８０ｐｐｍ＝０．０３８％ＣＯ２）に露呈すると生き残れない。なぜならば、有効な光合成ＣＯ２固定のためのＣＯ２濃縮機構（ＣＣＭ）が突然変異によって壊されているからである。そのようなデザイナ有機体が事故により自然環境に放出されても、その細胞は直ちに分裂またはメーティングができなくなり、炭素の欠乏によりすぐに死滅してしまう。なぜならば、それは、環境ＣＯ２濃度レベル（３８０ｐｐｍ）で光合成ＣＯ２固定を有効に行えないからである。したがって、そのような高ＣＯ２要求突然変異体を、デザイナバイオ燃料生産経路遺伝子の組み換え用ホストとして使用すれば、ＣＯ２およびＨ２Ｏからバイオセーフティ防護光生物学的にバイオ燃料を生産するために提案された細胞分裂制御可能デザイナ有機体を形成する他の方法が提供可能になる。
【０１３２】
他の実施例において、細胞分裂制御可能デザイナ有機体（図３Ｂ）は、デザイナ細胞分裂サイクル調整遺伝子をバイオセーフティ制御遺伝子（図２Ｇ）として使用することにより形成され、これは、ホスト有機体において細胞分裂サイクル（ｃｄｃ）遺伝子の表出を制御して、デザイナ遺伝子の特別な誘導に基づいてその再生産機能を誘導的にターンオフし、例えば、細胞分裂およびメーティング能力を永久に遮断できるようにするものである。
【０１３３】
生物学的には、シアノバクテリア、藻類、および高級植物細胞において細胞成長および細胞分裂サイクルを制御するのは自然のｃｄｃ遺伝子の表出である。細胞周期の最も基本的な機能は、染色体中の膨大な量のＤＮＡをＳフェーズ（Ｓは合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を表す）で正確に複写して、つぎにこれらコピーをＭフェーズ（Ｍは有糸分裂（ｍｉｔｏｓｉｓ）を表す）で厳格に２つの遺伝子的に同一な娘細胞へと分けていくことである。有糸分裂は典型的には染色体濃度に依存して開始する。複製されたＤＮＡストランドは長尺化された染色体中にパッケージ化され、濃縮されてセグレゲーションに必要なよりコンパクトな染色体となる。つぎに隔膜が破裂し、各々、一対の姉妹染色分体を有する複製染色体が、有糸分裂紡錘体の微小管に結合するようになる。有糸分裂が進むと、細胞はメタフェーズ（中期）で少し止まり、このとき、染色体は有糸分裂の紡錘体の赤道面に整合させられて分離に準備をする。娘染色分体の急激な分離がアナフェーズ（後期）の初めを表し、この間に、両染色体が、紡錘体の対向する両極に移動し、ここで脱濃縮されて完全な核を再構成する。細胞はつぎに細胞質分裂（サイトキネシス：ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）によって２つに絞られ、細胞分裂が完了する。ここで、ほとんどの細胞は、プロテインの質量および細胞小器官を成長させ倍加するのに、ＤＮＡを複製し（Ｓフェーズ）、分裂する（Ｍフェーズ）のにようする時間より多くの時間を必要とすることに留意されたい。したがって、２つのギャップフェーズがある。すなわち、ＭフェーズおよびＳフェーズの間のＧ１ギャップと、Ｓフェーズおよび有糸分裂の間のＧ２ギャップである。この結果、真核細胞の細胞周期は、伝統的には、４つの順次的なフェーズである、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、およびＭに分割される。生理学的には、２つのギャップフェーズは、細胞がＳフェーズおよび有糸分裂の大きな激動に対処可能であることを約束する前に、内部および外部の環境を監視して環境が適切で準備が整っているかどうかを、細胞が確かめるための時間も提供する。Ｇ１フェーズは、この点でとくに重要である。その長さは、外部環境、および他の細胞からの細胞外信号に多分に左右される。細胞外環境が好ましくないならば、例えば、細胞はＧ１を通じてプロセスを遅延させ、さらには、Ｇ０（Ｇゼロ）で知られる特別な休止状態に入り、この期間、細胞は数日、数週間、数年さえも止まって、その後、増殖を再開する。実際、多くの細胞は死滅するまで永久的にＧ０状態に止まる。
【０１３４】
種々の実施例の１つにおいて、デザイナｃｄｃ規制タンパク質をコード化するデザイナ遺伝子、または特殊なｃｄｃ−ｉＲＮＡが使用されて、デザイナ遺伝子が特別な誘導条件によってトリガーされるときに、所定のｃｄｃ遺伝子の表出を阻害して細胞分裂を停止させ、メーティング能力を不能にする。細胞分裂制御可能なデザイナ培養が成長してバイオ燃料の生産の準備ができたときに、例えば、デザイナバイオ燃料生産経路遺伝子の誘導とともに、特別なデザイナｃｄｃ−ｉＲＮＡの表出を誘導して細胞がＧ１フェーズまたはＧ０状態に永久的に滞留するようになすのが好ましいプラクティスである。このようにして、成長したデザイナ有機体細胞はＣＯ２およびＨ２Ｏからバイオ燃料を光合成生産するための完全な触媒になる反面、細胞分裂およびメーティングの機能はＧ１フェーズまたはＧ０状態で永久的に遮断されてバイオセーフティが確実になるように支援される。
【０１３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４５（５８−１６５）においてリストされた種々のデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子を伴うバイオセーフティ実施例を使用して種々のバイオセーフティ防護の光生物学的バイオ燃料生産物（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）を形成できる。ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、および１−１２（例１−１２）は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御プロトンチャンネル遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、および一組のデザイナＮｉａｌプロモータ制御ブタノール生産経路遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１２）を含む、細胞分裂制御可能デザイナ藻類（例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）のような細胞分裂制御可能デザイナ真核有機体の例を示すことに留意されたい。デザイナプロトンチャンネル遺伝子およびデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子はすべて同一のＮｉａｌプロモータ配列によって制御されるので、これらは、図３Ｂに示すように、ニトレートファーティライザを培養媒体中に付加してバイオセーフティ防護光合成バイオ燃料生産能力を付与することにより、同時に表出できる。高ＣＯ２要求ホスト光合成有機体、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉカルボニックアンヒドラーゼ欠損突然変異体ｌ２−ｌＣ（ＣＣ−１２１９  ｃａｌ  ｍｔ−）、または、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｃｉａ３突然変異体の中に、デザイナＮｉａｌプロモータ制御ブタノール生産経路遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１２）を使用すると、デザイナ細胞分裂制御可能光合成有機体を形成してバイオセーフティを確実にする他の例を表現する。
【０１３６】
このデザイナバイオセーフティの特徴は他のバイオ燃料、例えば、バイオオイル、バイオ水素、エタノール、および中間生成物を生産する上でも有益である。例えば、このバイオセーフティ実施例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７−５３に示される一組のデザイナエタノール生産経路遺伝子を組み合わせて、細胞分裂制御可能エタノール生産装置（図３Ｃ）を表現できる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７は、ｎｉｒＡプロモータ制御デザイナＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（１３６０塩基対（ｂｐ））の例４７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（淡水シアノバクテリア）ニトライトレダクターゼ遺伝子プロモータ配列から選択された８８−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍの細胞質ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ配列（ジェンバンク受入番号：ＣＡＣ８５９１７）から選択され修正された酵素エンコード配列（１０９−１０３２）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１０３３−１３４０）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３４１−１３６０）を含む。
【０１３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ホスホグリセレートキナーゼのＤＮＡコンストラクト（１６２１ｂｐ）の例４８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２のニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓのホスホグリセレートキナーゼ配列（ジェンバンク：ＢＡＤ７７３４２）から選択されたホスホグリセレートキナーゼエンコード配列（１０９−１２９３）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１２９４−１６０１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６０２−１６２１）を含む。
【０１３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ホスホグリセレートムターゼのＤＮＡコンストラクト（１９９０ｂｐ）の例４９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２のニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０９−１１７）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ８９０３のホスホグリセレートムターゼ（ジェンバンク：ＡＢＰ６７５３６）の配列から選択されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（１１８−１６５３）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎのｒｂｃＳターミネータ（１６６３−１９７０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９７１−１９９０）を含む。
【０１３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御エノラーゼのＤＮＡコンストラクト（１７６５ｂｐ）の例５０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２のニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０９−１１７）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０のエノラーゼ（ジェンバンク：ＺＰ  ０１７２７９１２）の配列から選択されたエノラーゼエンコード配列（１１８−１４０７）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグエンコード配列（１４０８−１４２８）、停止コドンを含む、９−ｂｐのＢｂａＩサイト（１４２９−１４３７）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１４３８−１７４５）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７４６−１７６５）を含む。
【０１４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ピルビン酸キナーゼのＤＮＡコンストラクト（１８８８ｂｐ）の例５１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０９−１１７）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍのピルビン酸キナーゼ配列（ジェンバンク：ＡＢ０３７１８２）から選択されたピルビン酸キナーゼエンコード配列（１１８−１５３０）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグエンコード配列（１５３１−１５５１）、９−ｂｐのＢｂａＩサイト（１５５２−１５６０）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１５６１−１８６８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９７１−１９９０）を含む。
【０１４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ピルビン酸デカルボキシラーゼのＤＮＡコンストラクト（２１８８ｂｐ）の例５２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、９−ｂｐのＸｈｏ  Ｉ  ＮｄｅＩサイト（１０９−１１７）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓのピルビン酸デカルボキシラーゼ配列（ジェンバンク：ＸＭ  ００１３８７６６８）の配列から選択されたピルビン酸デカルボキシラーゼエンコード配列（１１８−１８３０）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグエンコード配列（１８３１−１８５１）、９−ｂｐのＢｂａＩサイト（１８５２−１８６０）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１８６１−２１６８）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９７１−１９９０）を含む。
【０１４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存アルコールデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１５１０ｂｐ）の例５３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ３）遺伝子（ジェンバンク：Ｘ６２７６６）から選択され修正された（ミトコンドリア信号ペプチド配列は除去されている）、ＡＤ（Ｐ）Ｈ依存アルコールデヒドロゲナーゼエンコード配列（１０９−１１６１）、２１−ｂｐのＬｕｍｉｏタグエンコード配列（１１６２−１１８２）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１１８３−１４９０）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４９１−１５１０）を含む。
【０１４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７−５３（ＤＮＡコンストラクト例４７−５３）は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ストレインＰＣＣ  ７９４２のようなオキシホトバクテリアに使用できる一組のデザイナｎｉｒＡプロモータ制御エタノール生産経路遺伝子を表すことに留意されたい。この一組のデザイナエタノール生産経路遺伝子をＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ストレインＰＣＣ  ７９４２突然変異体Ｍ３のような高ＣＯ２要求シアノバクテリアに利用することにより、ＣＯ２およびＨ２Ｏからバイオ燃料をバイオセーフティ防御光合成生産するための、細胞分裂制御可能デザイナシアノバクテリアの他の例を表現する。
【０１４４】
［デザイナ・カルビン回路チャンネルのブタノールおよび関連高級アルコールの生産に関するその他の事項］
この発明は、二酸化炭素および水からブタノールおよび関連高級アルコールを光生物学的に生産する、デザイナＤＮＡコンストラクト（デザイナ遺伝子）およびデザイナ遺伝子組み換え光合成有機体に関連して、デザイナ・カルビン回路チャンネルで、光合成ＮＡＤＰＨ（還元されたニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドホスフェート）増強された、経路をさらに開示する。明細書のこの文脈を通じて、さきに述べたように、「高級アルコール」または「高級アルコール」または「関連する高級アルコール」は少なくとも４個の炭素原子を有するアルコールを指し、これは直鎖または分岐アルコールの双方、例えば１−ブタノールおよび２−メチル−１−ブタノールを含む。カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路は、ブタノールおよび関連する高級アルコールを光生物学的に生産する、藻類およびオキシホトバクテリア（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含む）のようなホスト光合成有機体中のデザイナ遺伝子の利用を通じて表現されるデザイナ酵素により構築される。上述のブタノールおよび関連する高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および、６−メチル−１−ヘプタノールからなるグループから選択される。藻類およびオキシホトバクテリア（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含む）のようなデザイナ光合成有機体は、二酸化炭素および水から増強された光生物学的対応でブタノールおよび関連高級アルコールを生産するための、カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路のデザイナ遺伝子、およびバイオセーフティ防護技術を含む。
【０１４５】
光合成水分解および関連するプロトン勾配結合電子搬送プロセスが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で化学エネルギーを生成し、還元ニコチアンアミドアデニン三リン酸（ＮＡＤＰＨ）の形態で還元力を生成する。しかしながら、所定のブタノール関連代謝経路酵素、例えば、ＮＡＤＰＨ依存ブタノールヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿１４８７７８、ＮＰ＿５６１７７４、ＡＡＧ２３６１３、ＺＰ  ０５０８２６６９、  ＡＤ０１２１１８、ＡＤＣ４８９８３）は、ＮＡＤＰＨでなく、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）しか使用できない。したがって、ブタノールおよび関連高級アルコールを生産するためにデザイナ経路をカルビン回路に実際に結合するには、この発明に従って、有効なＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構、および／またはＮＡＤＰＨ利用酵素（例えばＮＡＤＰＨ依存酵素）を用いて、互換性のあるデザイナ経路を光合成／カルビン回路プロセスに結合することが、好ましいプラクティスである。
【０１４６】
種々の実施例の１つにおいて、二酸化炭素および水からブタノールおよび高級アルコールを生産するために、所定のアミノ酸対処経路に組み合わせてＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構を使用して多くの種々のデザイナ・カルビン回路チャンネル経路を形成できる。カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路は、典型的には、ブタノールおよび高級アルコールを生産するためのホスト藻類またはオキシホトバクテリアのようなホスト光合成有機体の中にデザイナ遺伝子を使用することにより選択的に表現されるデザイナ酵素を用いて構築される。カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の構築に使用するために選択できる事例的な酵素のリストは表１に表される。図４〜１０に示されるように、カルビン回路とともに動作する、カルビン回路チャンネルおよび光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰ（アデノシン三リン酸）およびＮＡＤＰＨ（還元ニコチアンアミドアデニン三リン酸）を利用した、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）からのブタノールおよび関連する高級アルコールの生産である。特筆すべき特徴は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、および、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５を使用してＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構として働かせ、これが、所定の量の、光合成により製造されたＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換でき、これが、ＮＡＤＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４３（このエンコード遺伝子の例は、ジェンバンク受入番号：ＢＡＢ５９５４０、ＣＡＡ８９１３６、ＮＰ＿１４８４８０である）のような、ＮＡＤＨ要求経路酵素に使用され、ブタノールおよび高級アルコールを生産する。
【０１４７】
より具体的には、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４（例えば、ジェンバンク受入番号：ＡＤＣ３７８５７、ＡＤＣ８７３３２、ＹＰ＿００３４７１４５９、ＺＰ＿０４３９５５１７、ＹＰ  ００３２８７６９９、ＺＰ＿０７００４４７８、ＺＰ＿０４３９９６１６）は、ＮＡＤＰＨを利用して１，３−ジホスホグリセレート（１，３−ＤｉＰＧＡ）を３−ホスホスルセルアルデヒド（３−ＰＧＡｌｄ）および無機のホスフェート（Ｐｉ）に還元する以下の反応の触媒として働く。
１，３−ＤｉＰＧＡ  ＋  ＮＡＤＰＨ  ＋  Ｈ＋  →  ３−ＰＧＡｌｄ  ＋  ＮＡＤＰ＋  ＋  Ｐｉ          ［３］
他方、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５（例えば、ジェンバンク受入番号：ＡＤＭ４１４８９、ＹＰ＿００３０９５１９８、ＡＤＣ３６９６１、ＺＰ＿０７００３９２５、ＡＣＱ６１４３１、ＹＰ＿００２２８５２６９、ＡＤＮ８０４６９、ＡＣＩ６０５７４）は、酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を１，３−ＤＰＧＡに戻すことによる、３−ＰＧＡｌｄを酸化するときの触媒として働く。
３−ＰＧＡｌｄ  ＋  ＮＡＤ＋  ＋  Ｐｉ  →  １，３−ＤｉＰＧＡ  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋          ［４］
酵素反応［３］および［４］の正味の結果は、光合成により生成されたＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換することであり、ＮＡＤＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４３のような種々のＮＡＤＨ要求デザイナ経路酵素は、ブタノールおよび関連高級アルコールを生産する際に、このＮＡＤＨを利用できる。過剰なＮＡＤＨがあるときには、このＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換システムが逆に動作してＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの供給をバランスさせる。したがって、ブタノールおよび関連高級アルコールの堅牢な（ｒｏｂｕｓｔ）生産を実現することが必要なとき、あるいはこれが必要であれば、デザイナスイッチ可能プロモータ、例えばｎｉｒＡ（または真核系についてはＮｉａｌ）プロモータの制御の下で、このようなＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換システムを革新的に採用することが好ましいプラクティスである。光生物学的にブタノールおよび関連高級アルコールを生産するために、所定のアミノ酸代謝関連経路とともに、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構と組み合わせられるカルビン回路チャンネル経路が、さらに以下に説明される。
表１は、ブタノールおよび関連高級アルコールを生産するためにデザイナ・カルビン回路リンク付け経路を構築する酵素の例を列挙する。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【０１４８】
［デザイナ・カルビン回路チャンネル・１−ブタノール生産経路］
種々の実施例の１つにおいて、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図４の数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−４３で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、シトラマレートシンターゼ３６、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ３７、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ３８、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ依存）４３を有する１組の酵素を利用して、１−ブタノールに変換する、カルビン回路チャンネル経路が形成される。この経路設計において、上述したとおり、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４およびＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構として働き、これは、光合成により生成されたＮＡＤＰＨの所定の量をＮＡＤＨに変換でき、ＮＡＤＨ要求アルコールヒドロゲナーゼ４３（このエンコード遺伝子の例は以下のジェンバンク受入番号：ＢＡＢ５９５４０、ＣＡＡ８９１３６、ＮＰ＿１４８４８０）がこのＮＡＤＨを利用でき、ブチルアルデヒドの還元により１−ブタノールが生成できる。
【０１４９】
種々の実施例の１つにおいて、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４も利用することが好ましいプラクティスであり、このデヒドロゲナーゼは、還元剤のソースとしてＮＡＤＰＨを利用でき、ブタノールおよび他のアルコールの増強された光生物学的生産のためのＮＡＤＨ供給の要求を軽減する。表１に列挙されるように、ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４は（これに限定されないが）、ジェンバンク受入番号ＹＰ＿００１２１１０３８、ＺＰ＿０４５７３９５２、ＸＰ＿００２４９４０１４、ＣＡＹ７１８３５、ＮＰ＿４１７４８４、ＥＦＣ９９０４９、およびＺＰ＿０２９４８２８７のいずれかを伴う酵素を含む。
【０１５０】
２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２（例えば、ＡＡＳ４９１６６、ＡＤＡ６５０５７、ＣＡＧ３４２２６、ＡＡＡ３５２６７、ＣＡＡ５９９５３、Ａ０ＱＢＥ６、Ａ０ＰＬ１６）、および、アルコールデヒドロゲナーゼ４３（および／または４４）は極めて広い基質特異性を有する。この結果、これらを使用することにより、１−ブタノールのみでなく、ホスト光合成有機体の遺伝子または代謝上の背景に基づいてプロパノールのような他のアルコールも生産できるようになる。これは、すべての２−ケト酸が、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２およびアルコールデヒドロゲナーゼ４４により、それらの広い基質特異性に起因して、アルコールに変換されるからである。したがって、他の実施例によれば、１−ブタノールが所望のときには、または所望されるならば、基質特異性酵素、例えばブタノールデヒドロゲナーゼ１２を利用するのが好ましいプラクティスである。表１に列挙されるように、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２はＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ジェンバンク：ＹＰ＿１４８７７８、ＮＰ＿５６１７７４、ＡＡＧ２３６１３、ＺＰ＿０５０８２６６９、ＡＤ０１２１１８）、および／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＮＰ＿５６２１７２、ＡＡＡ８３５２０、ＥＦＢ７７０３６、ＥＦＦ６７６２９、ＺＰ＿０６５９７７３０、ＥＦＥ１２２１５、ＥＦＣ９８０８６、ＺＰ＿０５９７９５６１）である。
【０１５１】
種々の実施例の１つにおいて、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（数字ラベル３４、３５、０３、０４、４５−５２、４０−４３（４４／１２）で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ４５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ４６、アスパルトキナーゼ４７、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ４８、ホモセリンデヒドロゲナーゼ４９、ホモセリンキナーゼ５０、トレオニンシンターゼ５１、トレオニンアンモニアリアーゼ５２、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、およびアルコールデヒドロゲナーゼ４３（および／またはＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４またはブタノールデヒドロゲナーゼ１２）を有する１組の酵素を利用して、１−ブタノールに変換する、他のカルビン回路チャンネル経路が形成される。
【０１５２】
他の実施例によれば、アミノ酸代謝関連の１−ブタノール生産経路（数字ラベル０３−０５、３６−４３；および／または０３、０４、４５−５２、および３９−４３（４４／１２））は、他の光生物学的ブタノール生産経路と組み合わせて、および／または並行して、動作可能である。例えば、図４に示すように、フルクトース−６−ホスフェート分岐の１−ブタノール生産経路（数字ラベル１３−３２および４４／１２は、ピルビン酸、および／またはホスホエノールピルビン酸を結合点として、アミノ酸代謝関連経路（数字ラベル３６−４２および／または４５−５２および４０−４２）の部分とともに動作可能である。
【０１５３】
デザイナ・カルビン回路チャンネルの１−ブタノール生産経路遺伝子（ＤＮＡコンストラクト）の例は、ＤＮＡ配列表に示される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−７０は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１のようなホストオキシホトバクテリア中の、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御カルビン回路チャンネルの１−ブタノール生産経路（図４に数字ラベル３４、３５、０３−０５、および３６−４３に示すような）のための一組のデザイナ遺伝子を示す。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３４）のＤＮＡコンストラクト（１４１７ｂｐ）の例５８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ０４−０２９８１のＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＤＣ３７８５７）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２７７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２７８−１３９７）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３９８−１４１７）を含む。
【０１５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３５）のＤＮＡコンストラクト（１３８７ｂｐ）の例５９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ  ＦＬ６−６０のＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＤＭ４１４８９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２４７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２４８−１３６７）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３６８−１３８７）を含む。
【０１５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のホスホグリセレートムターゼ（０３）のＤＮＡコンストラクト（１６２７ｂｐ）の例６０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ  ＤＳＭ  １４９７７のホスホグリセレートムターゼ（ジェンバンク：ＡＤＲ３５７０８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４８７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４８８−１６０７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６５９−１６７８）を含む。
【０１５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のエノラーゼ（０４）のＤＮＡコンストラクト（１６７８ｂｐ）の例６１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓのエノラーゼ（ジェンバンク：ＡＤＩ０２６０２）の配列から選択された酵素エンコード配列（２５２−１５３８）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１５３９−１６５８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６５９−１６７８）を含む。
【０１５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のピルビン酸キナーゼ（０５）のＤＮＡコンストラクト（２１３７ｂｐ）の例６２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓのピルビン酸キナーゼ（ジェンバンク：ＡＤＩ０２４５９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１９９７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１９９８−２１１７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１１８−２１３７）を含む。
【０１５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のシトラマレートシンターゼ（３６）のＤＮＡコンストラクト（２１６３ｂｐ）の例６３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、３０５−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−３２５）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ−６のシトラマレートシンターゼ（ＹＰ＿００３４３３０１３）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２６−１９０９）、ＢＰ１からの２３４−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１９１０−２１４３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１４４−２１６３）を含む。
【０１５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−２−メチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（３７）のＤＮＡコンストラクト（２８７８ｂｐ）の例６４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍの３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−２−メチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの大サブユニット（ＹＰ  ００２９３０８１０）の配列から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−２−メチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの大サブユニットエンコード配列（２５２−２０１２）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２０１３−２２４３）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍの３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−２−メチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの小サブユニット（ＹＰ  ００２９３０８０９）の配列から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−２−メチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの小サブユニットエンコード配列（２２４４−２７３８）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（２７３９−２８５８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２８５９−２８７８）を含む。
【０１６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（３８）のＤＮＡコンストラクト（２３８０ｂｐ）の例６５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａの  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの大サブユニット（ＡＢＱ４６６４１）の配列から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの大サブユニットエンコード配列（２５２−１５０８）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（１５０９−１７３９）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの小サブユニット（ＡＢＱ４６６４０）の配列から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの小サブユニットエンコード配列（１７４０−２２４０）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（２２４１−２３６０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２３６１−２３８０）を含む。
【０１６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（３９）のＤＮＡコンストラクト（１４５６ｂｐ）の例６６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＣＰ０００７０２領域３４９９８３．．３５１０４７）の配列から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼエンコード配列（２５２−１３１６）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１３１７−１４３６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４３７−１４５６）を含む。
【０１６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（４０、ＥＣ４．１．３．１２）のＤＮＡコンストラクト（１９３３ｂｐ）の例６７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓからのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａの  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＣＰ０００７０２領域：３５２８１１．．３５４３５２）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１７９３）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１７９４−１９１３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４３７−１４５６）を含む。
【０１６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（４１）のＤＮＡコンストラクト（２６３２ｂｐ）の例６８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓの３−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの大サブユニット（（ＹＰ＿１４８５０９）の配列から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの大サブユニットエンコード配列（２５２−１６６７）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓからのｎｉｒＡプロモータ（１６６８−１８９８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓの３−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの小サブユニット（ＹＰ＿１４８５０８）の配列から選択された３−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの小サブユニットエンコード配列（１８９９−２４９２）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（２４９３−２６１２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２６１３−１６３２）を含む。
【０１６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２）のＤＮＡコンストラクト（２０３５ｂｐ）の例６９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの分岐鎖αケト酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＳ４９１６６）の配列から選択され修正された２−ケト酸デカルボキシラーゼエンコード配列（２５２−１８９５）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１８９６−２０１５）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０１６−２０３５）を含む。
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ（４３）のＤＮＡコンストラクト（１４２６ｂｐ）の例７０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋｌの依存アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＰ＿１４８４８０）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２８６）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２８７−１４０６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４０７−１４２６）を含む。
【０１６６】
先に述べたように、還元剤のソースとしてＮＡＤＰＨを使用できるＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４を使用すると、増強した光生物学的なブタノールおよび他のアルコールの生産に必要なＮＡＤＨの供給要求を緩和するのに役立つ。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ（４４）のＤＮＡコンストラクト（１４６８ｂｐ）の例７１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、広範な基質特異性を伴う、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＮＡＤＰＨ依存中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ＸＰ  ００２４９４０１４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１３２８）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１３２９−１４５８）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０１６−２０３５）を含む。例の１つにおいて、このタイプのＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）はカルビン回路チャンネルブタノール生産経路の構築にも使用できる。
【０１６７】
ただし、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０；または４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）は広範な基質特異性を伴うので、デザイナ遺伝子ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１（および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）によって表出された経路では、単一のアルコールが生産されるのでなくアルコール混合物が生産されることになる。なぜならば、すべての２−ケト酸は、２つの広範な基質の酵素によってアルコールに変換できるからである。したがって、１−ブタノールの特異性を向上させるには、より基質特異性があるブタノールデヒドロゲナーゼ１２を使用することが好ましいプラクティスである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ａ）のＤＮＡコンストラクト（１５５５ｂｐ）の例７２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓのＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿１４８７７８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４１５）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４１６−１５３５）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５３６−１５５５）を含む。
【０１６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ｂ）のＤＮＡコンストラクト（１５５８ｂｐ）の例７３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ＮＰ  ５６２１７２）の配列から選択され修正されたＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼエンコード配列（２５２−１４１８）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４１９−１５２８）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５２９−１５５８）を含む。
【０１６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および／または７３（１２ａおよび／または１２ｂ）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５８−６９とともに使用すると、図４において３４、３５、０３−０５、３６−４２、および１２の数字ラベルで示すような特別なカルビン回路チャンネル・１−ブタノール生産経路が表現される。
【０１７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４−８１は、代替的な（アミノ酸代謝関連）経路（図４の４５−５２）を表し、これは、カルビン回路チャンネル・１−ブタノール生産経路において、ホスホエノールピルビン酸の点から分岐して２−ケトブチレートの点で一緒になる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（４５）のＤＮＡコンストラクト（３６４６ｂｐ）の例７４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ  ＤＳＭ  １３９６５のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＦＲ６１４３９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−３５０６）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（３５０７−３６２６）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（３６２７−３６４６）を含む。
【０１７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（４６）のＤＮＡコンストラクト（１５９１ｂｐ）の例７５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＹＰ＿００１４７０１２６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４５１）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４５２−１４７１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４７２−１５９１）を含む。
【０１７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のアスパラギン酸キナーゼ（４７）のＤＮＡコンストラクト（１５８８ｂｐ）の例７６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅのＴＭＯアスパラギン酸キナーゼ（ＹＰ＿００１４７０３６１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４４８）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４４９−１５６８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５６９−１５８８）を含む。
【０１７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（４８）のＤＮＡコンストラクト（１４１１ｂｐ）の例７７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅのＴＭＯアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿００１４７０９８１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２７１）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２７２−１３９１）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３９２−１４１１）を含む。
【０１７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のホモセリンデヒドロゲナーゼ（４９）のＤＮＡコンストラクト（１６８４ｂｐ）の例７８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ  ＤＳＭ  １２６８０のホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＡＤＩ０２２３１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１５４４）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１５４５−１６６４）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６６５−１６８４）を含む。
【０１７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のホモセリンキナーゼ（５０）のＤＮＡコンストラクト（１２３７ｂｐ）の例７９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ  ＲＫＵ−１のホモセリンキナーゼ（ＹＰ＿００１２４３９７９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１０９７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１０９８−１２１７）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１２１８−１２３７）を含む。
【０１７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のトレオニンシンターゼ（５１）のＤＮＡコンストラクト（１４３８ｂｐ）の例８０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａのトレオニンシンターゼ（ＹＰ＿００１２４３９７８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２９８）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２９９−１４１８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４１９−１４３８）を含む。
【０１７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のトレオニンアンモニアリアーゼ（５２）のＤＮＡコンストラクト（１６００ｂｐ）の例８１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓのトレオニンアンモニアリアーゼ（ＢＡＤ７５８７６）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａの配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４６０）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４６１−１５８０）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５８１−１６００）を含む。
【０１７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６１、７４−８１、６６−６９、および７２（および／または７３）は、３４、３５、０３、０４、４５−５２、４０、４１、３９、４２、および１２のカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ブタノール生産経路を表現し、他方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９および７２（および／または９３）は、図４において、３４、３５、０３−０５、３６−４２、および１２として数字ラベル付けされる、他のカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ブタノール生産経路を表現することに留意されたい。カルビン回路と協働するデザイナ光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰ（アデノシン三リン酸）およびＮＡＤＰＨ（還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）を用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
４ＣＯ２  ＋  ５Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ６Ｏ２        ［５］
【０１７９】
［デザイナ・カルビン回路チャンネル・２−メチル−１−ブタノール生産経路］
種々の実施例の１つにおいて、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図５において数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、４２、４３、または４４／５６で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、シトラマレートシンターゼ３６、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ３７、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ３８、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、およびＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４３（またはＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４；より好ましくは、２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ５６）を有する１組の酵素を例えば利用して、２−メチル−１−ブタノールに変換する、カルビン回路チャンネル・２−メチル−１−ブタノール生産経路が形成される。
【０１８０】
他の実施例において、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図５において数字ラベル３４、３５、０３、０４、４５−５５、４２、４３、または４４／５６で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ４５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ４６、アスパルトキナーゼ４７、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ４８、ホモセリンデヒドロゲナーゼ４９、ホモセリンキナーゼ５０、トレオニンシンターゼ５１、トレオニンアンモニアリアーゼ５２、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、およびＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４３（またはＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４；より好ましくは、２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ５６）を有する１組の酵素を例えば利用して、２−メチル−１−ブタノールに変換する、カルビン回路チャンネル・２−メチル−１−ブタノール生産経路が形成される。
【０１８１】
これら経路（図５）は、図４の経路と極めて類似している。ただし、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、および、２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ５６を使用する点で異なる。
【０１８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のアセト乳酸シンターゼ（５３）のＤＮＡコンストラクト（２１０７ｂｐ）の例８２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．  １６８のアセト乳酸シンターゼ（ＣＡＢ０７８０２）の配列から選択され修正されたアセト乳酸シンターゼエンコード配列（２５２−１９６７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１９６８−２０８７）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０８８−２１０７）を含む。
【０１８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のケトール酸レダクトイソメラーゼ（５４）のＤＮＡコンストラクト（１４０５ｂｐ）の例８３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ  ＤＳＭ  １２６８０のケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＡＤＩ０２９０２）の配列から選択され修正されたケトール酸レダクトイソメラーゼエンコード配列（２５２−１２６５）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２６６８−１３８５）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３８６−１４０５）を含む。
【０１８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（５５）のＤＮＡコンストラクト（２０５６ｂｐ）の例８４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＹＰ  ００１２４３９７３）の配列から選択された酵素エンコード配列（２５２−１９１６）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１９１７−２０３６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０３７−２０５６）を含む。
【０１８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ（５６）のＤＮＡコンストラクト（１３６０ｂｐ）の例８５を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓの２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ（ＸＰ＿００２１７３２３１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２２０）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２２１−１３４０）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３４１−１３６０）を含む。
【０１８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６６、８２−８４、６９、および８５は、３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、４２、および５６として数字ラベル付けされたカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・２−メチル−１−ブタノール生産経路を表現できるサンプルデザイナ遺伝子の他の組を表現することに留意されたい。ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６６、８２−８４、６９、および８５は、図５における、３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、４２、および５６の他のカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・２−メチル−１−ブタノール生産経路を表現できる一組のサンプルデザイナ遺伝子を表現する。これらのデザイナ遺伝子は、図５において１３−２６、３６−３９、５３−５５、４２、および５６（および／または、１３−２５、４５−５５、４２、および５６として）として数字ラベル付けされたカルビン回路フルクトース−６−ホスフェート分岐２−メチル−１−ブタノール生産経路のような所定の他の経路を表出するために他の経路遺伝子と組み合わせて使用しても良い。カルビン回路と協働するデザイナ光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から２−メチル−１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
１０ＣＯ２  ＋  １２Ｈ２Ｏ  →  ２ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ  ＋  １５Ｏ２        ［６］
【０１８７】
［イソブタノールおよび３−メチル−１−ブタノールを生産するカルビン回路チャンネル経路］
種々の実施例の１つによれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図６において数字ラベル３４、３５、０３−０５、５３−５５、４２、４３（または４４）で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、およびＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４３（またはＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４）を有する１組の酵素を例えば利用して、イソブタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。カルビン回路と協働するこの経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）からイソブタノール（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
４ＣＯ２  ＋  ５Ｈ２Ｏ  →  （ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＯＨ  ＋  ６Ｏ２          ［７］
【０１８８】
他の実施例によれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図６において数字ラベル３４、３５、０３−０５、５３−５５、４０、３８、３９、４２、４３（または４４／５７）で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ３８、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、およびＮＡＤ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４３（またはＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ４４；または、より好ましくは、３−メチルブタナールレダクターゼ５７）を有する１組の酵素を例えば利用して、３−メチル−１−ブタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。カルビン回路と協働するこの経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から３−メチル−１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
１０ＣＯ２  ＋  １２Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  １５Ｏ２          ［８］
【０１８９】
これらデザイナ経路（図６）では図４および５のデザイナ経路酵素の番号を流用する。ただし、３−メチルブタナールレダクターゼ５７は好ましくは３−メチル−１−ブタノールの生産に使用される。これらはすべて、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４およびＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５を、光合成により生成されたＨＡＤＰＨの所定の量をＮＡＤＨに変換するＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構として使用し、このＮＡＤＨをＮＡＤＨ要求アルコールデヒドロゲナーゼ４３のようなＮＡＤＨ要求経路酵素に使用させることができるという共通の特徴を伴う。
【０１９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の３−メチルブタナールレダクターゼ（５７）のＤＮＡコンストラクト（１４２０ｂｐ）の例８６を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ｃの３−メチルブタナールレダクターゼ（ＤＡＡ１０６３５）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１２８０）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１２８０−１４００）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４０１−１４２０）を含む。
【０１９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６６、８２−８４、６９、７０（７１）は、カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強イソブタノール生産経路（３４、３５、０３−０５、５３−５５、４２、４３または４４）を表現できる一組のサンプルデザイナ遺伝子を表現する。他方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６２、８２−８４、６５−６７、６９、および８６は、他のカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・３−メチル−１−ブタノール生産経路（図６における、３４、３５、０３−０５、５３−５５、４０、３８、３９、４２、および５７）を表現できる他の一組のサンプルデザイナ遺伝子を表現する。
【０１９２】
これらのデザイナ遺伝子は、図６において１３−２６、５３−５４、３９−４０、４２、および５７（または４３／４４）で示されるカルビン回路フルクトース−６−ホスフェート分岐３−メチル−１−ブタノール生産経路のような所定の他の経路を表出するために他の経路遺伝子と組み合わせて使用しても良い。カルビン回路と協働するデザイナ光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）からイソブタノール（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＯＨ）および／または３−メチル−１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を生産することでもある。
【０１９３】
［１−ヘキサノールおよび１−オクタノールを生産するカルビン回路チャンネル経路］
種々の実施例の１つによれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図７において数字ラベル３４、３５、０３−１０、０７'−１２'で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ０６、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、デザイナ３−ケトチオラーゼ０７'、デザイナ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８'、デザイナエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ０９'、デザイナ２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ１０'、デザイナアシル−ＣｏＡレダクターゼ１１'、およびヘキサノールデヒロゲナーゼ１２'を有する１組の酵素を例えば利用して、１−ヘキサノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。カルビン回路と協働するこの経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
６ＣＯ２  ＋  ７Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ９Ｏ２          ［９］
【０１９４】
他の実施例によれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図７において数字ラベル３４、３５、０３−１０、０７'−１０'、および０７''−１２''で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ０６、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、デザイナ３−ケトチオラーゼ０７'、デザイナ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８'、デザイナエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ０９'、デザイナ２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ１０'、デザイナ・３−ケトチオラーゼ０７''、デザイナ・３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８''、デザイナエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ０９''、デザイナ・２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ１０''、デザイナアシル−ＣｏＡレダクターゼ１１''、および、オクタノールデヒドロゲナーゼ１２''を有する１組の酵素を例えば利用して、１−ヘキサノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。
【０１９５】
これら経路は、さきに開示した１−ブタノール生産経路（０３−１０）の部分を伴う経路設計において著しく品質を向上させる。キーとなる特徴は、１−ヘキサノールを生産するために（図７において０７'−１２'で示す）、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４およびＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５を、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機能として採用してＮＡＤＰＨ要求デザイン炭化水素鎖伸長経路（０７'ー１０'）を駆動する点である。
【０１９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７−９２は、一組の１−ヘキサノールを生産するためにデザイナ炭化水素鎖伸長経路（図７において０７'−１２'で示す）を表す。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の３−ケトチオラーゼ（０７'）のＤＮＡコンストラクト（１５４０ｂｐ）の例８７を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓの３−ケトチオラーゼ（ＹＰ＿１４７１７３）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４００）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４０１−１５２０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５２１−１５４０）を含む。
【０１９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（０８'）のＤＮＡコンストラクト（１２３１ｂｐ）の例８８を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓの３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿００３７０２７４３）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１０９１）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１０９２−１２１１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１２１２−１２３１）を含む。
【０１９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（０９'）のＤＮＡコンストラクト（１１６２ｂｐ）の例８９を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｔｒｉｉのエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＣＡＰ４１５７４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１０２２）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１０２３−１４４２）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４４３−１１６２）を含む。
【０１９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（１０'）のＤＮＡコンストラクト（１５６１ｂｐ）の例９０を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＡＰ５３７０９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１４２１）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１４２２−１５４１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５４２−１５６１）を含む。
【０２００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（１１'）のＤＮＡコンストラクト（１７４７ｂｐ）の例９１を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＹＰ＿００３８４５６０６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１６０７）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１６０８−１７２７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７２８−１７４７）を含む。
【０２０１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のヘキサノールデヒドロゲナーゼ（１２'）のＤＮＡコンストラクト（１４５０ｂｐ）の例９２を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｕｂｕｅｎｓｅのヘキサノールデヒドロゲナーゼ（ＡＣＺ５６３２８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−１３１０）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（１３１１−１４３０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４３１−１４５０）を含む。
【０２０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御のオクタノールデヒドロゲナーゼ（１２''）のＤＮＡコンストラクト（１０７４ｂｐ）の例９３を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｕｂｏｂｓｃｕｒａのオクタノールデヒドロゲナーゼの配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−９３４）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（９３５−１０５４）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１０５５−１０７４）を含む。
【０２０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７−９１のデザイナ酵素は所定の広範な基質特異性を伴うことに留意されたい。この結果、これらは、デザイナ・３−ケトチオラーゼ０７''、デザイナ・３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８''、デザイナエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ０９''、デザイナ・２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ１０''、および、デザイナアシル−ＣｏＡレダクターゼ１１''としても使用できる。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７−９１および９３は、１−オクタノール生産のための他のデザイナ炭化水素鎖伸長経路（図７において０７'−１０'および０７''ー１２''で示す）を表現することができる１組のデザイナ遺伝子を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３（オクタノールデヒドロゲナーゼ１２''をエンコードする）はこの経路において１−オクタノールを生産可能にするキーとなるデザイナ遺伝子である。カルビン回路と協働するこの経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から１−オクタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
８ＣＯ２  ＋  ９Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  １２Ｏ２        ［１０］
【０２０４】
［１−ペンタノール、１−ヘキサノールおよび１−ヘプタノールを生産するカルビン回路チャンネル経路］
種々の実施例の１つによれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図８において数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−４１、３９、３９'−４３'、３９'ー４３'、１２'、および３９''ー４３''で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、シトラマレートシンターゼ３６、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ３７、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ３８、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、ヘキサノールデヒドロゲナーゼ１２'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、およびデザイナアセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、および、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''を有する１組の酵素を例えば利用して、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、および／または、１−ヘプタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。この経路は、カルビン回路と協働して、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から１−ペンタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、および／または１−ヘプタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
１０ＣＯ２  ＋  １２Ｈ２Ｏ  →  ２ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  １５Ｏ２              ［１１］
６ＣＯ２  ＋  ７Ｈ２Ｏ      →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ９Ｏ２            ［１２］
１４ＣＯ２  ＋  １６Ｈ２Ｏ  →  ２ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ２１Ｏ２    ［１３］
【０２０５】
他の実施例によれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図８において数字ラベル３４、３５、０３−０５、４５−５２、４０、４１、３９、３９'−４３'、１２'、および３９''ー４３''で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ４５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ４６、アスパルトキナーゼ４７、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ４８、ホモセリンデヒドロゲナーゼ４９、ホモセリンキナーゼ５０、トレオニンシンターゼ５１、トレオニンアンモニアリアーゼ５２、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、ヘキサノールデヒドロゲナーゼ１２'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''を有する１組の酵素を例えば利用して、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、および／または、１−ヘプタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。
【０２０６】
これら経路（図８）は、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４およびＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５を、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構として使用し、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路をデザイナ炭化水素鎖伸長経路（４０'、４１'、３９'）と組み合わせて、１−ペンタノール、１−ヘキサノールおよび／または１−ヘプタノールの生産を推進するという共通の特徴を伴う。この実施例は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３が、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''として機能できるようにして、これらの広範な基質特異性の利点も有する。
【０２０７】
この場合、所定の混乱性を伴って適切に短鎖アルコールデヒドロゲナーゼを選択するも重要である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼのＤＮＡコンストラクト（１０９６ｂｐ）の例９４を表し、これはＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２３１−ｂｐのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ１からのｎｉｒＡプロモータ（２１−２５１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ３６３８の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＡＣ２５５５６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（２５２−９５６）、ＢＰ１からの１２０−ｂｐのｒｂｃＳターミネータ（９５７−１０７６）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１０７７−１０９６）を含む。
【０２０８】
したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９および９４は、図８において数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−４１、３９、３９'−４３'、３９''−４３''で示されるカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ペンタノール、１−ヘキサノールおよび／または１−ヘプタノール生産経路を表現できる一組のデザイナ遺伝子を表現する。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６１、７４−８１、６６−６９、および９４は、図８において数字ラベル３４、３５、０３、０４、４５−５２、４０、４１、３９、３９'−４３'、３９''−４３''で示されるカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ペンタノール、１−ヘキサノールおよび／または１−ヘプタノール生産経路を表現できる他の一組のサンプルデザイナ遺伝子を表現する。ここで、これら２つの経路は、ともに、単一のアルコールではなく異なる鎖長のアルコール混合物を生成することに留意されたい。なぜならば、混雑性を伴う、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'およびデザイナ短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'を利用して、２−ケト酸（例えば２−ケトヘキサノエート、２−ケトヘプタノエート、および２−ケトオクタノエート）がアルコールに変換されるからである。
【０２０９】
生成物の特定性を向上させるには、基質特異性のあるデザイナ酵素を使用することが好ましいプラクティスである。例えば、混雑性の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（４３'）の代わりに基質特異性のあるデザイナ１−ヘキサノールデヒドロゲナーゼ１２'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）を使用すれば、１−ヘキサノールについての生成物特定性が向上する。この結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９および９２は、図８において数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−４１、３９、３９'−４３'、３９''−４２''および１２'で示されるカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ヘキサノール生産経路を表現できる一組のサンプルデザイナ遺伝子を表現する。
【０２１０】
［３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および５−メチル−１−ヘプタノールを生産するカルビン回路チャンネル経路］
種々の実施例の１つによれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図９において数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、３９'−４３'、３９'ー４３'、および３９''ー４３''で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、シトラマレートシンターゼ３６、２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ３７、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ３８、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクターゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''を有する１組の酵素を例えば利用して、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および／または、５−メチル−１−ヘプタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。
【０２１１】
他の実施例によれば、この中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図９において数字ラベル３４、３５、０３、０４、４５−５５、３９、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''ー４３''で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ４５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ４６、アスパルトキナーゼ４７、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ４８、ホモセリンデヒドロゲナーゼ４９、ホモセリンキナーゼ５０、トレオニンシンターゼ５１、トレオニンアンモニアリアーゼ５２、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''を有する１組の酵素を例えば利用して、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および／または、５−メチル−１−ヘプタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。
【０２１２】
これら経路（図９）は、図８に示す経路と類似である。ただし、これらは、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、および、２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ５６を、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および／または、５−メチル−１−ヘプタノールの生産経路の一部として使用する点で異なる。これらは、すべて、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４およびＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５を、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構として使用し、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路をデザイナ炭化水素鎖伸長経路（４０'、４１'、３９'）と組み合わせて、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および／または、５−メチル−１−ヘプタノールの生産を推進するという共通の特徴を伴う。この実施例は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３が、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''として機能できるようになし、これらの広範な基質特異性の利点も有する。
【０２１３】
したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９、８２−８４、および９４は、図９において数字ラベル３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''で示されるカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および／または、５−メチル−１−ヘプタノール生産経路を表現できる一組のデザイナ遺伝子を表現する。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６１、７４−８１、８２−８４、６６−６９、および９４は、図９において数字ラベル３４、３５、０３、０４、４５−５５、３９'−４３'、３９'−４３'、３９''−４３''で示されるカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および／または、５−メチル−１−ヘプタノール生産経路を表現できる他の一組のサンプルデザイナ遺伝子を表現する。カルビン回路と協働するデザイナ光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から３−メチル−１−ペンタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、４−メチル−１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、および５−メチル−１−ヘプタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を生産することである。
６ＣＯ２  ＋  ７Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ９Ｏ２              ［１４］
１４ＣＯ２  ＋  １６Ｈ２Ｏ      →  ２ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ２１Ｏ２            ［１５］
８ＣＯ２  ＋  ９Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  １２Ｏ２    ［１６］
【０２１４】
［４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および６−メチル−１−ヘプタノールを生産するカルビン回路チャンネル経路］
種々の実施例の１つによれば、カルビン回路の中間生成物である、３−ホスホグリセレートを採って、これを、（図１０において数字ラベル３４、３５、０３−０５、５３−５５、４０、３８、３９、３９'−４３'、３９'ー４３'、および３９''ー４３''で示すように）ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４、ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５、ホスホグリセレートムターゼ０３、エノラーゼ０４、ピルビン酸キナーゼ０５、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクターゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ３８、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''を有する１組の酵素を例えば利用して、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および／または、６−メチル−１−ヘプタノールに変換する、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路が形成される。
【０２１５】
これら経路（図１０）は、図８に示す経路と類似である。ただし、これらは、シトラマレートシンターゼ３６、および２−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ３７を使用せず、アセト乳酸シンターゼ５３、ケトール酸レダクトイソメラーゼ５４、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ５５を、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および／または、６−メチル−１−ヘプタノールの生産経路の一部として使用する点で異なる。これらは、すべて、ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３４およびＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３５を、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ変換機構として使用し、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路をデザイナ炭化水素鎖伸長経路（４０'、４１'、３９'）と組み合わせて、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および６−メチル−１−ヘプタノールの生産を推進するという共通の特徴を伴う。この実施例は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９、２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３が、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０'、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１'、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９'、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２'、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３'、デザイナイソプロピルリンゴ酸シンターゼ４０''、デザイナイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ４１''、デザイナ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ３９''、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ４２''、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ４３''として機能できるようになし、これらの広範な基質特異性の利点も有する。
【０２１６】
したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６２、８２−８４、６５−６９、および９４は、図１０において数字ラベル３４、３５、０３−０５、５３−５５、４０、３８、３９、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''で示されるカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および／または、６−メチル−１−ヘプタノール生産経路を表現できる一組のデザイナ遺伝子を表現する。カルビン回路と協働するデザイナ光合成ＮＡＤＰＨ増強経路の正味の結果は、光合成により生成されたＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを用いて、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から４−メチル−１−ペンタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、５−メチル−１−ヘキサノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、および６−メチル−１−ペプタノール（ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を生産することである。
６ＣＯ２  ＋  ７Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ９Ｏ２              ［１７］
１４ＣＯ２  ＋  １６Ｈ２Ｏ      →  ２ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ２１Ｏ２            ［１８］
８ＣＯ２  ＋  ９Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  １２Ｏ２    ［１９］
【０２１７】
［ブタノールおよび関連高級アルコールを生産するカルビン回路チャンネル経路を伴うデザイナオキシホトバクテリア］
種々の実施例の１つによれば、所定のオキシホトバクテリアホストの遺伝子形質探検においてデザイナＤＮＡを使用することにより、二酸化炭素および水からブタノールおよび関連高級アルコールを光生物学的に生産するカルビン回路チャンネル経路を伴う種々の遺伝子組み替えオキシホトバクテリアを形成できる。デザイナ遺伝子組み替え光合成有機体ベースのバイオ燃料生産に使用する際にバイオセーフティを確実にするには、バイオセーフティ防護された特徴をデザイナ遺伝子組み換え光合成有機体にも組み込むことが好ましいプラクティスである。したがって、この発明によれば、デザイナ遺伝子組み替えオキシホトバクテリアを含む種々のデザイナ光合成有機体が、細胞分裂制御可能なデザイナ遺伝子組み替え古豪性有機体をベースにしてバイオセーフティ防護された光生物学的バイオ燃料生産技術を用いて形成される。細胞分裂制御可能なデザイナ高暴政有機体は２つのキーとなる機能を含む。すなわち、デザイナバイオセーフティ機能およびデザイナバイオ燃料生産経路である。デザイナバイオセーフティ特徴は多くのメカニズムにより付与され、これは、（１）デザイナプロトンチャンネルを細胞質膜に誘導可能に挿入してどのような細胞分裂もメーティング能力も永久に不能にすること、（２）デザイナ細胞分裂サイクル制御タンパク質または干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）を選択的に適用して細胞分裂サイクルを永久に阻害し、好ましくは細胞をＧ１相またはＧ０状態に保持すること、および、（３）デザイナバイオ燃料生産経路を表出のために高ＣＯ２要求ホスト光合成有機体を革新的に使用することを含む。デザイナ細胞分裂制御技術は、光合成バイオ燃料生産のためのデザイナ有機体に使用してバイオセーフティが確実になるように支援できる。
【０２１８】
光生物学的にブタノールおよび関連高級アルコールを生産するためにデザイナ遺伝子組み替えオキシホトバクテリアを形成する際にホスト有機体として選択して使用できるオキシホトバクテリア（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含む）は（これに限定されないが）以下を含む。すなわち、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−ｌ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ６３０１、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７００２、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＥＤ４、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３，  Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＮＡＴＬＩＡ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＳ１２０、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌｅ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．，  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（ＭＣ−Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｓｐ．、Ｒｉｃｈｅｌｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ７８０３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｓｙｎｃｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｉｔｉｓ  ＰＣＣ  ６７１４  ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ＰＤ−ｌ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｔｒａｉｎ  ５１１４２、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹＯ１１  ０、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｉｍｏｓａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ  ｄｉｄｅｍｎｉ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＳＳ１２０、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＷＨ８１０２、Ｌｙｎｇｂｙａｍａｊｕｓｃｕｌａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ，  ｃｒｙｏｐｈｉｌｉｃ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．−ｌ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ  ｐａｒｉｅｔｉｎａ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｉｇｒａｎｕｌａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ  ｌａｍｉｎｏｓｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ  ｆｒｉｔｓｃｈｉｉ  ＰＣＣ  ６９１２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＭＡ４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＭＡＩ９、および  Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓを含む。
【０２１９】
例の１つによれば、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のような所定のオキシホトバクテリアホストを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−９４のようなデザイナＤＮＡコンストラクトを使用して、遺伝子形質転換すると、ブタノールおよび関連高級アルコールを生産するカルビン回路チャンネル経路と伴う一連のデザイナ遺伝子オキシホトバクテリアを形成できる。この結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６１、７４−８１、６６−６９、および７２（および／または７３）は、二酸化炭素および水から１−ブタノールを光生物学的に生産するカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ブタノール生産経路（図４において３４、３５、０３、０４、４５−５２、４０、４１、３９、４２、および１２として数字ラベル付けされる）のデザイナ遺伝子を有するデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのようなデザイナ遺伝子組み換えオキシホトバクテリアを表現する。また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９、および７２（および／または７３）は、二酸化炭素および水から１−ブタノールを光生物学的に生産するカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・１−ブタノール生産経路（図４において３４、３５、０３−０５、３６−４２、および１２として数字ラベル付けされる）のデザイナ遺伝子を有するデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのような他のデザイナ遺伝子組み換えオキシホトバクテリアを表現する。
【０２２０】
同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６６、８２−８４、６９、および８５は、二酸化炭素および水から２−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生産するカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・２−メチル−１−ブタノール生産経路（図５において３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、４２、および５６として数字ラベル付けされる）を伴うデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのような他のデザイナ遺伝子組み換えオキシホトバクテリアを表現する。他方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６１、７４−８４、６９および８５は、二酸化炭素および水から２−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生産するカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・２−メチル−１−ブタノール生産経路（図５において３４、３５、０３、０４、４５−５５、４２、および５６として数字ラベル付けされる）を伴う他のデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。
【０２２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６３、８２−８４、６９、７０（または７１）は、カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強イソブタノール生産経路（３４、３５、０３−０５、５３−５、４２、４３、または４４）を伴うデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのような他のデザイナ遺伝子組み換えオキシホトバクテリアを表現する。他方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６２、８１−８３、６５−６７、６９、および８６は、カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強・３−メチル−１−ブタノール生産経路（図６において３４、３５、０３−０５、５３−５５、４０、３８、３９、４２、および５７として数字ラベル付けされる）を伴う他のデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。
【０２２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７−８９は、光生物学的に１−ヘキサノールを生産するためのデザイナ炭化水素鎖伸長経路（図７に０７'−１２'で示される）を伴う他のデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。他方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７−９１、および９３は、光生物学的に１−オクタノールを生産するためのデザイナ炭化水素鎖伸長経路（図７に０７'−１０'、および０７''−１２''で示される）を伴う他のデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。
【０２２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９、および９２は、二酸化炭素および水から１−ヘキサノールを光生物学的に生産するデザイナ・カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路（図９の３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、３９'−４０'、３９'−４２'、および１２'）を伴う他のデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。
【０２２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９、８２−８４、および９４は、二酸化炭素および水から３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および５−メチル−１−ヘプタノールを光生物学的に生産するデザイナ・カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路（図９の３４、３５、０３−０５、３６−３９、５３−５５、３９'−４３'、３９'−４３'、３９''−４３''）を伴うデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６１、７４−８１、８２−８４、６６−６９、および９４）は、二酸化炭素および水から３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および５−メチル−１−ヘプタノールを光生物学的に生産するカルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路（図９の３４、３５、０３、０４、４５−５５、３９'−４３'、３９'−４３'、３９''−４３''）を伴う他のデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。
【０２２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６２、８２−８４、および９４は、二酸化炭素および水から４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および／または６−メチル−１−ヘプタノールを光生物学的に生産するデザイナ・カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路ラベル（図１０の３４、３５、０３−０５、５３−５５、４０、３８、３９、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''）を伴うデザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表現する。
【０２２６】
適切なデザイナＤＮＡコンストラクト（遺伝子）を利用して遺伝子形質転換を行うために、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のようなホストオキシホトバクテリアを利用すると、ブタノールおよび高級アルコールを光生物学的に生産する他のデザイナオキシホトバクテリアを形成できる。例えば、ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：９５−９８（および／または９９）を利用する遺伝子形質転換に、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２をホスト有機体として用いると、１−ブタノールを光生物学的に生産するデザイナ遺伝子組み替えＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを形成できる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５は、デザイナＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３４）の遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（１４３８塩基対（ｂｐ））の例９５を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２（淡水シアノバクテリア）のニトライトレダクターゼ遺伝子プロモータ配列から選択された、８８−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートヒドロゲナーゼ配列（ジェンバンク受入番号：ＹＰ＿００３４７１４５９）から選択され修正された酵素エンコード配列（１０９−１１１０）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１１１１−１４１８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４１９−１４３８）を含む。
【０２２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６は、デザイナＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３５）の遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（１４７７ｂｐ）の例９６を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼ遺伝子プロモータ配列から選択された、８８−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ配列（ジェンバンク受入番号：ＡＤＣ３６９６１）から選択され修正された酵素エンコード配列（１０９−１１１９）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１１２０−１４２７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４２８−１４４７）を含む。
【０２２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７は、デザイナ２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２）の遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（２０８０ｂｐ）の例９７を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼ遺伝子プロモータ配列から選択された、８８−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの分岐鎖アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク受入番号：ＡＡＳ４９１６６）から選択され酵素エンコード配列（１０９−１７５２）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１７５３−２０６０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０６０−２０８０）を含む。
【０２２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８は、デザイナＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ａ）の遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（１６０３ｂｐ）の例９８を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼ遺伝子プロモータ配列から選択された、８８−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク受入番号：ＡＤＯＩ２１１８）から選択され酵素エンコード配列（１０９−１２７５）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１２７６−１５８３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５８４−１６０３）を含む。
【０２３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９は、デザイナＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ｂ）の遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（１６５４ｂｐ）の例９９を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのニトライトレダクターゼ遺伝子プロモータ配列から選択された、８８−ｂｐのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０８）、ＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏのＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＥＦＦ６７６２９）から選択され酵素エンコード配列（１０９−１３２６）、３０８−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１３２７−１６３４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６３５−１６５４）を含む。
【０２３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５−９８（および／または９９）により表現されるデザイナ遺伝子組み替えＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓにおいては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの生来の酵素０３−０５、３６−４１、および、４５−５２は、３４、３５、４２、および１２のデザイナｎｉｒＡプロモータ制御酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５−９８（および／または９９）によりエンコードされる）と組み合わせて利用され、二酸化炭素および水から１−ブタノールを光生物学的に生成する（図４）カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を付与する。
【０２３２】
同様に、ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１００−１０２（および／または１０３）を利用する遺伝子形質転換に、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３をホスト有機体として用いると、１−ブタノールを光生物学的に生産するデザイナ遺伝子組み替えＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓを形成できる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００は、デザイナＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３５）の遺伝子の詳細なＤＮＡコンストラクト（１４４０ｂｐ）の例１００を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のニトライトレダクターゼのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００２２８５２６９）から選択された酵素エンコード配列（１１０−１０１１）、４０９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のｒｂｃＳターミネータ（１０１２−１４２０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４２１−１４４０）を含む。
【０２３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２）のＤＮＡコンストラクト（２１８０ｂｐ）の例１０１を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のニトライトレダクターゼのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０９）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの分岐鎖アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク：ＡＡＳ４９１６６）から選択された酵素エンコード配列（１１０−１７５３）、４０９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のｒｂｃＳターミネータ（１７５４−２１６２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１６３−２１８２）を含む。
【０２３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ａ）のＤＮＡコンストラクト（１７０５ｂｐ）の例１０２を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のニトライトレダクターゼのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７のＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＤ０１２１１８）から選択された酵素エンコード配列（１１０−１２７６）、４０９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のｒｂｃＳターミネータ（１２７７−１６８５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６８６−１７０５）を含む。
【０２３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ｂ）のＤＮＡコンストラクト（１７５６ｂｐ）の例１０３を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、８９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のニトライトレダクターゼのｎｉｒＡプロモータ（２１−１０９）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｒｏｓｓｏｔｕｓのＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＥＦＦ６７６２９）から選択された酵素エンコード配列（１１０−１３２７）、４０９−ｂｐのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ６８０３のｒｂｃＳターミネータ（１３２８−１７３６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７３７−１７５６）を含む。
【０２３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００−１０２（および／または１０３）のデザイナ遺伝子を含むデザイナ遺伝子組み換えＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓにおいては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの正味の酵素３４、０３−０５、３６−４１、および４５−５２は、３５、４２、および１２のデザイナｎｉｒＡプロモータ制御酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００−１０２（および／または１０３）によりエンコードされる）と組み合わせて利用され、二酸化炭素および水から１−ブタノールを光生物学的に生成する（図４）カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を付与することに留意されたい。
【０２３７】
ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１０４−１０９を利用する遺伝子形質転換に、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０をホスト有機体として用いると、２−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生産する（図５）デザイナ遺伝子組み替えＮｏｓｔｏｃを形成できる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４は、デザイナｈｏｘプロモータ制御ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３５）のＤＮＡコンストラクト（１６５５ｂｐ）の例１０４を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＮＺ１３１のＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００２２８５２６９）から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１２０３）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０のｇｏｒターミネータ（１２０４−１６３５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６３６−１６５５）を含む。
【０２３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５は、デザイナｈｏｘプロモータ制御アセト乳酸シンターゼ（５３）のＤＮＡコンストラクト（２３０３ｂｐ）の例１０５を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１のアセト乳酸シンターゼ（ジェンバンク：ＮＰ＿６８２６１４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１８５１）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０のｇｏｒターミネータ（１８５２−２２８３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２２８４−２３０３）を含む。
【０２３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６は、デザイナｈｏｘプロモータ制御ケトール酸レダクトイソメラーゼ（５４）のＤＮＡコンストラクト（１６６１ｂｐ）の例１０６を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｃａｌｄｉｔｅｒｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｅｅｎｓのケトール酸レダクトイソメラーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００４０５０９０４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１２０９）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０のｇｏｒターミネータ（１２１０−１６４１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６４２−１６６１）を含む。
【０２４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７は、デザイナｈｏｘプロモータ制御ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（５５）のＤＮＡコンストラクト（２３２４ｂｐ）の例１０７を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍａｒｉｖｉｒｇａ  ｔｒａｅｔｕｏｓａ  ＤＳＭ  ４１２６のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００４０５３７３６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１８７２）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０のｇｏｒターミネータ（１８７３−２３０４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２３０５−２３２４）を含む。
【０２４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８は、デザイナｈｏｘプロモータ制御分岐鎖アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２）のＤＮＡコンストラクト（２２８８ｂｐ）の例１０８を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの分岐鎖アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク：ＡＡＳ４９１６６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１８３６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０のｇｏｒターミネータ（１８３７−２２６８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２２６９−２２８８）を含む。
【０２４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９は、デザイナｈｏｘプロモータ制御２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ（５６）のＤＮＡコンストラクト（１６１３ｂｐ）の例１０９を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓの２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ  （ジェンバンク：ＸＰ＿００２１７３２３１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１４６１）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０のｇｏｒターミネータ（１４６２−１８９３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８９４−１６１３）を含む。
【０２４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４−１０９のデザイナｈｏｘプロモータ制御遺伝子を含むデザイナ遺伝子組み換えＮｏｓｔｏｃにおいては、Ｎｏｓｔｏｃの正味の酵素３４、０３−０５、３６−３９、および４５−５２は、３５、５３−５５、４２、および５６のデザイナｈｏｘプロモータ制御酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４−１０９のＤＮＡコントラクトによりエンコードされる）と組み合わせて利用され、二酸化炭素および水から２−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生成する（図５）カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を付与することに留意されたい。
【０２４４】
ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１１０−１２２を利用する遺伝子形質転換に、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３をホスト有機体として用いると、イソブタノール、および／または、３−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生産する（図６）デザイナ遺伝子組み替えＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓを形成できる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３５）のＤＮＡコンストラクト（１３００ｂｐ）の例１１０を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＭＪ−１２３６ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＣＱ６１４３１）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１１５９）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３のｒｂｃＳターミネータ（１１６０−１２８０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１２８１−１３００）を含む。
【０２４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御ホスホグリセレートムターゼ（０３）のＤＮＡコンストラクト（１４９８ｂｐ）の例１１１を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  Ｓ１のホスホグリセレートムターゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００１２１２１４８）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１３５７）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１３５８−１４７８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４７９−１４９８）を含む。
【０２４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御エノラーゼ（０４）のＤＮＡコンストラクト（１５８８ｂｐ）の例１１２を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａのエノラーゼ（ジェンバンク：ＡＢＱ４６０７９）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１４４７）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１４４８−１５６８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５６９−１５８８）を含む。
【０２４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御ピルビン酸キナーゼ（０５）のＤＮＡコンストラクト（１７１７ｂｐ）の例１１３を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ  ＴＭＯのピルビン酸キナーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００１４７１５８０）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１５７６）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３のｒｂｃＳターミネータ（１５７７−１６９７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６９８−１７１７）を含む。
【０２４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御アセト乳酸シンターゼ（５３）のＤＮＡコンストラクト（２０１７ｂｐ）の例１１４を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  １４５８０のアセト乳酸シンターゼ（ジェンバンク：ＡＡＵ４２６６３）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１８７６）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３のｒｂｃＳターミネータ（１８７７−１９９７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９９８−２０１７）を含む。
【０２４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御ケトール酸レダクトイソメラーゼ（５４）のＤＮＡコンストラクト（１５８８ｂｐ）の例１１５を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ  ＲＫＵ−１のケトール酸レダクトイソメラーゼ（ジェンバンク：ＡＢＱ４６３９８）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１１６８）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３のｒｂｃＳターミネータ（１１６９−１５６８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５６９−１５８８）を含む。
【０２５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（５５）のＤＮＡコンストラクト（１９６０ｂｐ）の例１１６を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓの熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｅａｌｉｄｕｓ  ＤＳＭ  １２６８０のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ジェンバンク：ＡＤＩ０２９０５）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１８１９）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１８２０−１９４０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９４１−１９６０）を含む。
【０２５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２）のＤＮＡコンストラクト（１９４５ｂｐ）の例１１７を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓの熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  アルファ−ケト吉草酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク：ＡＤＡ６５０５７）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１８０４）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１８０５−１９２５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９２６−１９４５）を含む。
【０２５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御アルコールデヒドロゲナーゼ（４３／４４）のＤＮＡコンストラクト（１１３８ｂｐ）の例１１８を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２５１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓのｎｉｒＡプロモータ（２１−２７１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓの短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿１４６８３７）から選択された酵素エンコード配列（２７２−９９７）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓのｒｂｃＳターミネータ（９９８−１１１８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１１１９−１１３８）を含む。
【０２５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０−１１８のデザイナ遺伝子を含むデザイナ遺伝子組み換えＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓにおいては、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓの正味の遺伝子（酵素）３４は、３５、０３−０５、５３−５５、４２、および４３／４４のデザイナｇｒｏＥおよびｎｉｒＡプロモータ制御遺伝子（酵素）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０−１１８のＤＮＡコントラクトによりエンコードされる）と組み合わせて利用され、二酸化炭素および水からイソブタノールを光生物学的に生成する（図６）カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を付与することに留意されたい。以下の４つのデザイナｇｒｏＥプロモータ制御遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９−１２２）を加えると、二酸化炭素および水からイソブタノールおよび３−メチル−１−ブタノールの双方を生成することができる（図６に３５、０３−０５、５３−５５、４２、４３／４４、さらに加えて、３８−４０、および５７で示す）他のデザイナ遺伝子組み換えＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓを得る。
【０２５４】
簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（４０）のＤＮＡコンストラクト（１８１６ｂｐ）の例１１９を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  Ｓ１の２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００１２１１０８１）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１６７５）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１６７６−１７９６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７９７−１８１６）を含む。
【０２５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（３８）のＤＮＡコンストラクト（２１９９ｂｐ）の例１２０を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  ＳＩの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット（ジェンバンク：ＹＰ＿００１２１１０８２）から選択された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニットエンコード配列（１５８−１４２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（１４２１−１５５７）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  ＳＩの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ小サブユニット（ジェンバンク：ＹＰ＿００１２１１０８３）から選択された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ小サブユニットエンコード配列（１５５８−２０５８）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓのｒｂｃＳターミネータ（２０５９−２１７９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１８０−２１９９）を含む。
【０２５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（３９）のＤＮＡコンストラクト（１３７８ｂｐ）の例１２１を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ  ＤＳＭ  １２６８０の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＤＩ０２８９８）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１２３７）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓのｒｂｃＳターミネータ（１２３８−１３５８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３５９−１３７８）を含む。
【０２５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２は、デザイナｇｒｏＥプロモータ制御３−メチルブタナールレダクターゼ（５７）のＤＮＡコンストラクト（１３２７ｂｐ）の例１２２を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１３７−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ  ９３１３の熱および光応答ｇｒｏＥプロモータ（２１−１５７）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ｃの３−メチルブタナールレダクターゼ（ジェンバンク：ＤＡＡ１０６３５）から選択された酵素エンコード配列（１５８−１１８６）、１２１−ｂｐのＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ９３１３のｒｂｃＳターミネータ（１１８７−１３０７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３０８−１３２７）を含む。
【０２５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０−１１７および１１９−１２２をＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ９３１３の遺伝子形質転換に利用すると、ｇｒｏＥプロモータ制御デザイナ・カルビン回路チャンネル経路（図６において３４（正味）、３５、０３−０５、５３−５５、３８−４０、４２、および５７として特定される）を利用して、二酸化炭素および水から３−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生成する他の遺伝子組み換えＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓを形成することに留意されたい。
【０２５９】
ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１２８を利用する遺伝子形質転換に、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２をホスト有機体として用いると、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、および／または、１−ヘプタノールを光生物学的に生産する（図８）デザイナ遺伝子組み替えＣｙａｎｏｔｈｅｃｅを形成できる。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（４０）のＤＮＡコンストラクト（２００４ｂｐ）の例１２３を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅのｎｉｒＡプロモータ（２１−２２３）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ配列（ジェンバンク：ＢＡＩ６９２７３）から選択された酵素エンコード配列（２２４−１７８３）、２０１−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．のｒｂｃＳターミネータ（１７８４−１９８４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９８５−２００４）を含む。
【０２６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４は、デザイナｎｉｅＡプロモータ制御イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（３８）の大／小サブユニットのＤＮＡコンストラクト（２６４８ｂｐ）の例１２４を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｎｉｒＡプロモータ（２１−２２３）、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ  ＷＫ１のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの大サブユニットの配列（ジェンバンク：ＹＰ＿００２３１４９６２）から選択されたイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ大サブユニットエンコード配列（２２４−１６３９）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｎｉｒＡプロモータ（１６４０−１８４２）、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ  ＷＫ１のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの小サブユニットの配列（ジェンバンク：ＹＰ＿００２３１４９６３）から選択されたイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ小サブユニットエンコード配列（１８４３−２４２７）、２０１−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｒｂｃＳ（２４２８−１６２８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２６２９−２６４８）を含む。
【０２６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（３９）のＤＮＡコンストラクト（１５３０ｂｐ）の例１２５を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｎｉｒＡプロモータ（２１−２２３）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの配列（ジェンバンク：ＢＡＣ０９１５２）から選択された酵素エンコード配列（２２４−１３０９）、２０１−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｒｂｃＳターミネータ（１３１０−１３１０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３１１−１５３０）を含む。
【０２６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２'）のＤＮＡコンストラクト（２０８８ｂｐ）の例１２６を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅのｎｉｒＡプロモータ（２１−２２３）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク：ＡＡＳ４９１６６）から選択された酵素エンコード配列（２２４−１８６７）、２０１−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅのｒｂｃＳターミネータ（１８６８−２０６８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０６９−２０８８）を含む。
【０２６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御ヘキサノールデヒドロゲナーゼ（１２'）のＤＮＡコンストラクト（１５０３ｂｐ）の例１２７を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅのｎｉｒＡプロモータ（２１−２２３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｕｂｕｅｎｓｅのヘキサノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＣＺ５６３２８）から選択された酵素エンコード配列（２２４−１２８２）、２０１−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅのｒｂｃＳターミネータ（１２８３−１４８３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４８４−１５０３）を含む。
【０２６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８は、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（４３'、４３''）のＤＮＡコンストラクト（１１４９ｂｐ）の例１２８を表し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２０３−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｎｉｒＡプロモータ（２１−２２３）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ３６３８の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＡＣ２５５５６）から選択された酵素エンコード配列（２２４−９２８）、２０１−ｂｐのＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２のｒｂｃＳターミネータ（９２９−１１２９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１１３０−１１４９）を含む。
【０２６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１２７のデザイナｎｉｒＡプロモータ制御遺伝子を含むデザイナ遺伝子組み換えＣｙａｎｏｔｈｅｃｅにおいては、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅの正味の酵素３４、０３−０５、３６−３８、および４５−５２は、３５、３９−４１（３９'−４１'、３９'−４１'）、４２'、および１２'のデザイナｎｉｒＡプロモータ制御酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１２７のＤＮＡコントラクトによりエンコードされる）と組み合わせて利用され、二酸化炭素および水から１−ヘキサノールを光生物学的に生成する（図８）カルビン回路・３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を付与することに留意されたい。乱雑性を伴う、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）を加えると、二酸化炭素および水からイソブタノールおよび１−ペンタノール、１−ヘキサノール、および、１ヘキサノールを生成することができる（図８に３５、３９−４１、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''で示す）カルビン回路チャンネル経路を含む、他のデザイナ遺伝子組み換えＣｙａｎｏｔｈｅｃｅを得る。
【０２６６】
［ブタノールおよび関連高級アルコールを生産するカルビン回路チャンネル経路を伴うデザイナ高度光合成有機体］
種々の実施例の１つによれば、植物細胞、真核水性植物（例えば、真核藻類、沈水性水草、浮草（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、ウォーターキャベツ、ワーターリリー、ホテイアオイ、Ｂｏｌｂｉｔｉｓ  ｈｅｕｄｅｌｏｔｉｉ、Ｃａｂｏｍｂａ  ｓｐ．、および海草を含む）のような真核光合成有機体を遺伝子形質変換する際に、所定のデザイナＤＮＡコンストラクトを使用すると、二酸化炭素および水からブタノールおよび関連高級アルコールを生成するためのデザイナ遺伝子組み換え真核光合成有機体を形成できる。二酸化炭素および水からブタノールおよび関連高級アルコールを光生物学的に生産するためのデザイナ藻類を形成するためにホスト有機体として選択できる真核藻類は（これに限定されないが）つぎのものを含む。すなわち、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄｏｗｉｌ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｆｕｓｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、'Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ'  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ；Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ  ｇｅｌａｔｉｎｕｍ、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓ、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇｅｌｉｄｉｅｌｌａ  ａｃｅｒｏｓａ、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈａｎｇｉｉ、Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｍｉｎｉａｔａ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｍｉｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ、Ｕｌｖａ  ｓｐｐ．、Ｕｎｄａｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  Ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｔｉｃｕｍ、  Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｋｉ  ｓａｕｎａ、およびＳｔｅｐｈａｎｏｐｔｅｒａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ��ある。
【０２６７】
他の実施例によれば、遺伝子組み替え光合成有機体は、水性植物、植物細胞、緑藻類、紅藻類、褐藻類、藍藻類（シアノバクテリアおよびオキシクロロバクテリアを含むオキシホトバクテリア）、珪藻、海藻類、淡水藻類、耐塩性藻類株、耐冷温藻類株、耐熱性藻類株、アンテナ色素欠失変異体、耐ブタノール性藻類株、耐高級アルコール性藻類株、耐ブタノール性オキシホトバクテリア、耐高級アルコール性オキシホトバクテリア、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択された、遺伝子組み替えデザイナ植物または植物細胞を有する。
【０２６８】
他の実施例によれば、上述の遺伝子組み替え光合成有機体は、予め定められた誘導条件の下で誘導可能なデザイナプロトンチャンネル遺伝子、予め定められた誘導条件の下で誘導可能なデザイナ細胞分裂周期ｉＲＮＡ遺伝子、デザイナ細胞分裂制御可能な光合成有機体を形成する際にデザイナバイオ燃料生産経路遺伝子を用いて形質転換するためのホストとしての高ＣＯ２要求突然変異、および、これらの組み合わせからなるグループから選択されるバイオセーフティ防護機構を有する。
【０２６９】
真核植物細胞はより複雑で局在化しているので、水および二酸化炭素からブタノールおよび／または高級アルコールを生産するために区画上隔離された、広範な範囲の光生物学的に活性なデザイナ有機体および新規な代謝経路を形成できる。真核藻類細胞においては、例えば、デザイナ角遺伝子の翻訳は、細胞質ゾルで起こり、他方、光合成／カルビン回路は藻類の葉緑体の内部に位置づけられる。藻類の葉緑体光合成は、細胞質膜、細胞質ゾル、およびミトコンドリアのような他の細胞内器官と明確に隔離されるので、バイオセーフティ防護デザイナ藻類を、デザイナプロトンチャンネルを誘導可能に細胞質に挿入してどのような細胞分裂、および／または、メーティング能力も永久的に不能にしつつ、それでいて、ブタノールおよび関連高級アルコールを生産するデザイナバイオ燃料生産経路を伴う藻類葉緑体機能を維持することを通じて、バイオセーフティ防護のデザイナ藻類を形成できるという利点がもたらされる。ただし、デザイナ酵素を遺伝子的に葉緑体に搬入してカルビン回路を付与してＣＯ２およびＨ２Ｏからの直接的なブタノールへの同化作用を方向づけることが基本である。このため、所望の結果を得るにはより複雑な遺伝子設計が必要となる。
【０２７０】
種々の実施例の１つにおいて、デザイナ不明遺伝子を用いてエンコードしたデザイナ回路チャンネル経路酵素は、トランジット信号ペプチド配列を利用して藻類葉緑体中に対象化されて表現される。その信号ペプチドは、ヒドロゲナーゼトランジットペプチド配列（ＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２）フェレドキシントランジットペプチド配列（Ｆｒｘ１）、チオレドキシンｍトランジットペプチド配列（Ｔｒｘ２）、グルタミンシンターゼトランジットペプチド配列（Ｇｓ２）、ＬｈｃＩＩトランジットペプチド配列、ＰＳＩＩ−Ｔトランジットペプチド配列（ＰｓｂＴ）、ＰＳＩＩ−Ｓトランジットペプチド配列（ＰｓｂＳ）、ＰＳＩＩ−Ｗトランジットペプチド配列（ＰｓｂＷ）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−γトランジットペプチド配列（ＡｔｐＣ）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−δトランジットペプチド配列（ＡｔｐＤ）、ＣＦ０ＣＦ１サブユニット−Ｉトランジットペプチド配列（ＡｔｐＧ）、ホトシステムＩ（ＰＳＩ）、ＲｕｂｉｓｃｏＳＳＵトランジットペプチド配列、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される。
【０２７１】
ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１６５は、ブタノールおよび関連高級アルコールを光生物学的に生産するためにカルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強された経路を知要するデザイナ藻類のようなデザイナ真核光合成有機体を形成するためのデザイナ葉緑体対象化酵素のデザイナＤＮＳコンストラクトの例を表す。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ホスホグリセレートムターゼ（０３）のＤＮＡコンストラクト（１９１０ｂｐ）の例１２９を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌ（ニトレートレダクターゼ）プロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｎｏｓｔｏｃ  ａｚｏｌｌａｅのホスホグリセレートムターゼ（ＡＤＩ６５６２７）から選択されたホスホグリセレートムターゼエンコード配列（３２４−１６６７）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１６６８−１８９０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８９１−１９１０）を含む。
【０２７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化エノラーゼ（０４）のＤＮＡコンストラクト（１８５６ｂｐ）の例１３０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｎｏｓｔｏｃ  ａｚｏｌｌａｅのエノラーゼ（ＡＤＩ６３８０１）から選択され修正されたエノラーゼエンコード配列（３２４−１６１３）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１６１４−１８３６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８８３７−１８５６）を含む。
【０２７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ピルビン酸キナーゼ（０５）のＤＮＡコンストラクト（１９８５ｂｐ）の例１３１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８８０２のピルビン酸キナーゼ（ＹＰ＿００３１３８０１７）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１７４２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１７４３−１９６５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１９６６−１９８５）を含む。
【０２７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３４）のＤＮＡコンストラクト（１５６８ｂｐ）の例１３２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐの  ＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＣ８７３３２）から選択され修正されたＮＡＤＰＨ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼエンコード配列（３２４−１３２５）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３２６−１５４８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５４９−１５６８）を含む。
【０２７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３５）のＤＮＡコンストラクト（１５７１ｂｐ）の例１３３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌ（ニトレートレダクターゼ）プロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍのＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿００３０９５１９８）から選択され修正されたＮＡＤ依存グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼエンコード配列（３２４−１３２８）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３２９−１５５１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５５２−１５７１）を含む。
【０２７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化シトラマレートシンターゼ（３６）のＤＮＡコンストラクト（２１５０ｂｐ）の例１３４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌ（ニトレートレダクターゼ）プロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒのシトラマレートシンターゼ（ＡＤ０４５７３７）から選択されたシトラマレートシンターゼエンコード配列（３２４−１９０７）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１９０８−２１３０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０１３１−２１５０）を含む。
【０２７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ（３７）の大／小サブユニットのＤＮＡコンストラクト（３１２５ｂｐ）の例１３５を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓの３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−メチルリンゴ酸デヒドラターゼの大サブユニット（ＹＰ＿００２９３０８１０）から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−メチルリンゴ酸デヒドラターゼの大サブユニットのエンコード配列（３２４−２０８４）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２０８５−２２５２）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（２２５３−２３８７）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓの３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−メチルリンゴ酸デヒドラターゼの小サブユニット（ＹＰ＿００２９３０８０９）から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸／（Ｒ）−メチルリンゴ酸デヒドラターゼの小サブユニットのエンコード配列（２３８８−２８８２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（２８８３−３１０５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（３１０６−３１２５）を含む。
【０２７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（３８）の大／小サブユニットのＤＮＡコンストラクト（２８７９ｂｐ）の例１３６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット（ＹＰ＿００３８８６４２７）から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニットのエンコード配列（３２４−１７２７）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（１７２７−１８９４）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９５−２０２９）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの小サブユニット（ＹＰ＿００３８８９４５２）から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの小サブユニットのエンコード配列（２０３０−２６３６）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（２６３７−２８５９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２８６０−２８７９）を含む。
【０２７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（３９）のＤＮＡコンストラクト（１６６１ｂｐ）の例１３７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌ（ニトレートレダクターゼ）プロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅの３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿００３８８８４８０）から選択され修正された３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼエンコード配列（３２４−１４１８）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４１９−１６４１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６４２−１６６１）を含む。
【０２８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（４０）のＤＮＡコンストラクト（２１７４ｂｐ）の例１３８を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅの２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＹＰ＿００３８９０１２２）から選択され修正された２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼエンコード配列（３２４−１９３１）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１９３２−２１５４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１５５−２１７４）を含む。
【０２８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（４１）の大／小サブユニットのＤＮＡコンストラクト（２８８２ｂｐ）の例１３９を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの大サブユニット（ＹＰ＿３２４４６７）から選択され修正されたイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの大サブユニットのエンコード配列（３２４−１７２７）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（１７２８−１８９５）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９６−２０３０）、Ａｎａｂａｅｎａのイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの小サブユニット（ＹＰ＿３２４４６６）から選択され修正されたイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの小サブユニットの小サブユニットのエンコード配列（２０３１−２６３９）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（２６４０−２８６２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２８６３−２８８２）を含む。
【０２８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化２−ケト酸デカルボキシラーゼ（４２）のＤＮＡコンストラクト（２２１０ｂｐ）の例１４０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓの２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＳ４９１６６）から選択された２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼエンコード配列（３２４−１９６７）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１９６８−２１９０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２１９１−２２１０）を含む。
【０２８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ＮＡＤＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ（４３）のＤＮＡコンストラクト（１７２４ｂｐ）の例１４１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉのＮＡＤＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ（ＺＰ＿０６８３４５４４）から選択され修正されたＮＡＤＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼのエンコード配列（３２４−１４８１）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４８２−１７０４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７０５−１７２４）を含む。
【０２８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ（４４）のＤＮＡコンストラクト（１６７６ｂｐ）の例１４２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、ＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼ（ＺＰ＿０４５７３９５２）から選択され修正されたＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼのエンコード配列（３２４−１４３３）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４３４−１６５６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６５７−１６７６）を含む。
【０２８５】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１４１（および／または１４２）を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に１−ブタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図４の０３−０５、３４−４３／４４）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。
【０２８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（４５）のＤＮＡコンストラクト（３６２９ｂｐ）の例１４３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７８２２のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＹＰ＿００３８８７８８８）から選択され修正されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのエンコード配列（３２４−３３８６）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２ターミネータ（３３８７−３６０９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（３６１０−３６２９）を含む。
【０２８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（４６）のＤＮＡコンストラクト（１７４５ｂｐ）の例１４４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＹＰ＿１７２２７５）から選択され修正されたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのエンコード配列（３２４−１５０２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５０３−１５２５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５２６−１７４５）を含む。
【０２８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化アスパルトキナーゼ（４７）のＤＮＡコンストラクト（２３６６ｂｐ）の例１４５を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅのアスパルトキナーゼ（ＹＰ＿００３１３６９３９）から選択され修正されたアスパルトキナーゼのエンコード配列（３２４−２１２３）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（２１２４−２３４６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２３４７−２３６６）を含む。
【０２８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（４８）のＤＮＡコンストラクト（１６０４ｂｐ）の例１４６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ１０１のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＢＧ５００３１）から選択され修正されたアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼのエンコード配列（３２４−１３６１）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３６２−１５８４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５８５−１６０４）を含む。
【０２９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ホモセリンデヒドロゲナーゼ（４９）のＤＮＡコンストラクト（１８６８ｂｐ）の例１４７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅのホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿００３８８７２４２）から選択されたホモセリンデヒドロゲナーゼのエンコード配列（３２４−１６２５）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１６２６−１８４８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８４９−１８６８）を含む。
【０２９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ホモセリンデキナーゼ（５０）のＤＮＡコンストラクト（１４７２ｂｐ）の例１４８を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅのホモセリンキナーゼ（ＹＰ＿００３８８６６４５）から選択され修正されたホモセリンキナーゼのエンコード配列（３２４−１２２９）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１２３０−１４５２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４５３−１４７２）を含む。
【０２９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化トレオニンシンターゼ（５１）のＤＮＡコンストラクト（１６５５ｂｐ）の例１４９を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅのトレオニンシンターゼ（ＹＰ＿００２４８５００９）から選択され修正されたトレオニンシンターゼのエンコード配列（３２４−１４１２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４１３−１６３５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６３６−１６５５）を含む。
【０２９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化トレオアンモニアリアーゼ（５２）のＤＮＡコンストラクト（２０７８ｂｐ）の例１５０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのトレオアンモニアリアーゼ（ＺＰ＿０５０３５０４７）から選択され修正されたトレオアンモニアリアーゼのエンコード配列（３２４−１８３５）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１８３６−２０５８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０５９−２０７８）を含む。
【０２９４】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９、１３０、１３２、１３３、１４３−１５０、１３７−１４１（および／または１４１）を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に１−ブタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図４の０３−０５、３４、３５、４５−５２、３９−４３／４４）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。
【０２９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化アセトラクテートシンターゼ（５３）のＤＮＡコンストラクト（２２８２ｂｐ）の例１５１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアセトラクテートシンターゼ（ＣＡＢ０７８０２）から選択されたアセトラクテートシンターゼのエンコード配列（３２４−２０３９）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（２０４０−２２６２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２２６３−２２８２）を含む。
【０２９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ケトール酸レダクトイソメラーゼ（５４）のＤＮＡコンストラクト（１５６２ｂｐ）の例１５２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅのケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＹＰ＿００３８８５４５８）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１３１９）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３２０−１５４２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５４３−１５６２）を含む。
【０２９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（５５）のＤＮＡコンストラクト（２２５２ｂｐ）の例１５３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＹＰ＿００３８８７４６６）から選択されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼのエンコード配列（３２４−２００９）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（２０１０−２２３２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２２３３−２２５２）を含む。
【０２９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ（５６）のＤＮＡコンストラクト（１４９６ｂｐ）の例１５４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＳ１１５の２−メチルブチルアルデヒドレダクターゼ（ＸＰ＿００２４９００１８）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１２５３）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１２５４−１４７６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４７７−１４９６）を含む。
【０２９９】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１３７、１４０、および１５１−１５４を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に２−メチル−１−ブタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図５の０３−０５、３４−３９、５３−５５、４２、および、５６）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。
【０３００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化３−メチルブタナールレダクターゼ（５７）のＤＮＡコンストラクト（１５９５ｂｐ）の例１５５を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ｃの３−メチルブタナールレダクターゼ（ＤＡＡ１０６３５）から選択され修正された３−メチルブタナールレダクターゼのエンコード配列（３２４−１３５２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３５３−１５７５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５７６−１５９５）を含む。
【０３０１】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１３３、１５１−１５３、１４０、および１４１（または１４２）を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的にイソブタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図６の０３−０５、３４、３５、５３−５５、４２、および、４３（４４））を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。他方、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１３３、１５１−１５３、１３６−１３８、１４０、および１５５を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に３−メチル−１−ブタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図６の０３−０５、３４、３５、５３−５５、４０、３８、３９、４２、および、５７）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できる。
【０３０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ａ）のＤＮＡコンストラクト（１７３９ｂｐ）の例１５６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ＮＰ＿５６１７７４）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１４９６）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４９７−１７１９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７２０−１７３９）を含む。
【０３０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２ｂ）のＤＮＡコンストラクト（１７３９ｂｐ）の例１５７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのＮＡＤＰＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ＡＡＡ８３５２０）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１４９０）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４９１−１７１３）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７１４−１７３３）を含む。
【０３０４】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１４０、および１５６（および／または１５７）を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的にイソブタノールをより特定的に生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図４の０３−０５、３４−４２、および１２）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９、１３０、１３２、１３３」、１４３−１５０、１３７−１４０、および１５６（および／または１５７）は、二酸化炭素および水から光生物学的に１−ブタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図４の０３、０４、３４、３５、４５−５２、３９−４２、および１２）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような他のデザイナ真核光合成有機体を表す。
【０３０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化３−ケトチオラーゼ（０７'）のＤＮＡコンストラクト（１７４５ｂｐ）の例１５８を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌ（ニトレートレダクターゼ）プロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓ  ｌａｔａの３−ケトチオラーゼ（ＡＡＤＩ０２７５）から選択され修正された３−ケトチオラーゼのエンコード配列（３２４−１５０２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５０３−１７２５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７２６−１７４５）を含む。
【０３０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（０８'）のＤＮＡコンストラクト（１４７９ｂｐ）を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓの３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＤＲ３６３２５）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１１９６）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１１９７−１４１９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４２０−１４３９）を含む。
【０３０７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（０９'）のＤＮＡコンストラクト（１３３７ｂｐ）の例１６０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｔｒｉｉのエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＹＰ＿００１６２９８４４）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１０９４）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１０９５−１３１７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１３１８−１３３７）を含む。
【０３０８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（１０'）のＤＮＡコンストラクト（１７３６ｂｐ）の例１６１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＹＰ＿００１９０５７４４）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１４９３）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１４９４−１７１６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７１７−１７３６）を含む。
【０３０９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化アシル−ＣｏＡレダクターゼ（１１'）のＤＮＡコンストラクト（２０３６ｂｐ）の例１６２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ  ａｇｇｒｅｇａｎｓのアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＹＰ＿００３６４９５７１）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１７９３）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１７９４−２０１６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０１７−２０３６）を含む。
【０３１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化ヘキサノールデヒドロゲナーゼ（１２'）のＤＮＡコンストラクト（１６２５ｂｐ）の例１６３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｕｂｕｅｎｓｅのヘキサノールデヒドロゲナーゼ（ＡＣＺ５６３２８）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１３８２）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１３８３４−１６０５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１６０６−１６２５）を含む。
【０３１１】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８−１６３を、他の適切な、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２、および１３３のようなＤＮＡコンストラクトとともに使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に１−ヘキサノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図７の３４、３５、０３−１０、０７'−１２'）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。
【０３１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化オクタノールデヒドロゲナーゼ（１２''）のＤＮＡコンストラクト（１２４９ｂｐ）の例１６４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｕｂｏｂｓｃｕｒａのオクタノールデヒドロゲナーゼ（ＡＢ０６５２６３）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１００６）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１００７−１２２９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１２３０−１２４９）を含む。
【０３１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２、１３３、および、１５８−１６３は、光生物学的に１−ヘキサノールを生産するためのデザイナ炭化水素鎖伸長経路（図７の３４、３５、０７'−１２'）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２、１３３、１５８−１６２、および１６４は、光生物学的に１−オクタノールを生産するためのデザイナ炭化水素鎖伸長経路（図７の３４、３５、０７'−１０'、および０７''−０１２''）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような他のデザイナ真核光合成有機体を表す。
【０３１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５は、デザイナＮｉａｌプロモータ制御葉緑体対象化短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（４３''）のＤＮＡコンストラクト（１７６９ｂｐ）を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、２×８４−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＮｉａｌプロモータ（２１−１８８）、１３５−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２トランジットペプチド（１８９−３２３）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＢ０５６６２６）から選択され修正された酵素エンコード配列（３２４−１５２６）、２２３−ｂｐのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのＲｂｃＳ２ターミネータ（１５２７−１７４９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７５０−１７６９）を含む。
【０３１５】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１４０、および１６５を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に１−ペンタノール、１−ヘキサノール、および、１−ヘプタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図８の０３−０５、３４−４１、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できることに留意されたい。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１４０、および、１６３は、二酸化炭素および水から光生物学的に１−ヘキサノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図８の０３−０５、３４−４１、３９'−４１'、３９'−４２'、および、１２'）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような他のデザイナ真核光合成有機体を表す。
【０３１６】
同様に、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１３７、１５１−１５３、１３８−１４０、および１６５を使用すると、二酸化炭素および水から光生物学的に３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および、５−メチル−１−ヘプタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図９の０３−０５、３４−３９、５３−５５、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''）を伴うデザイナＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなデザイナ真核光合成有機体を形成できる。ホストＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような真核光合成有機体における、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９、１３０、１３２、１３３、１４３−１５０、１５１−１５３、１３７−１４０、および１６５の表現は、二酸化炭素および水から光生物学的に３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および、５−メチル−１−ヘプタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図９の０３、０５、３４、３５、４２−５５、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''）を伴う他のデザイナ真核光合成有機体を表す。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのようなホスト真核光合成有機体における、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９−１３３、１５１−１５３、１３６−１４０、および１６５の表現は、二酸化炭素および水から光生物学的に４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、および、６−メチル−１−ヘプタノールを生産するためのカルビン回路チャンネル・３−ホスホグリセレート分岐ＮＡＤＰＨ増強経路（図１０の０３−０５、３４、３５、５３−５５、４０、３８、３９、３９'−４３'、３９'−４３'、および３９''−４３''）を伴う、さらに他のデザイナ真核光合成有機体を表す。
【０３１７】
［ブタノールおよび関連高級アルコールを生産・収穫するために光バイオリアクタを伴うデザイナ光合成有機体の利用］
デザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強経路（図１、および図４−１０）を伴うデザイナ光合成有機体は、ブタノールおよび／または関連高級アルコールを生産・収穫するために、光バイオリアクタと一緒に使用することができる。上述のブタノールおよび／または関連高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、６−メチル−１−ヘプタノール、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される。
【０３１８】
デザイナ遺伝子組み換えオキシホトバクテリアおよび藻類のような上述のデザイナ光合成有機体は、二酸化炭素および水からのブタノールおよび関連高級アルコールの生産を増進するために、デザイナ・カルビン回路チャンネルの光合成ＮＡＤＰＨ増強された経路遺伝子と、バイオセーフティ防護技術とを有する。種々の実施例の１つによれば、無機栄養素を含む培養媒体とともに、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）を炭素および電子のソースとして用いて、デザイナ光合成有機体を、光独立栄養の態様で成長させることが好ましいプラクティスである。酸素光合成有機体成長に一般的に必要とされる栄養素の元素は、約１−１０ｍＭの濃度のＮ、Ｐ、およびＫと、約０．５〜１．０ｍＭの濃度のＭｇ、Ｃａ、Ｓ、およびＣｌと、μＭの濃度レベルの微量元素（ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）のＭｎ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｂ、Ｃｏ、Ｍｏ、その他である。鉱物栄養素のすべては、水（デザイナ淡水藻類に対しては淡水、耐塩性デザイナ海洋藻類に対しては海水）、および、比較的少量の廉価な肥料、および、鉱物、例えば、重炭酸アンモニア（ＮＨ４ＨＣＯ３）（または硝酸アンモニア、塩化アンモニア）、リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム７水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、蓚酸鉄（ＩＩ）７水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、およびホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、その他を用いる、充分に確立した処方の水素光合成有機体（例えば藻類）の培養媒体を利用して製造できる、水最小の媒体中に供給できる。すなわち、大量のデザイナ藻類（またはオキシホトバクテリア）の細胞を短期間で廉価に成長させることができる。なぜならば、デザイナ藻類は、野生型の親株と同様の速さで空気のＣＯ２を利用してそれ自体が光独立栄養で池のような好気性条件下で成長できるからである。再生可能な太陽エネルギー生産のための光活性なバイオ触媒（デザイナ藻類またはオキシホトバクテリアのようなデザイナ光合成バイオ燃料生産有機体）を生産する費用効率の予期解決手段を実現できるという点がこの発明の特質すべき特徴（利点）である。
【０３１９】
種々の実施例の１つによれば、デザイナ光合成有機体が成長してブタノールおよび／または関連高級アルコールを光合成生産する準備ができたとき、デザイナ光合成有機体細胞は、二酸化炭素および水からブタノールおよび／または関連高級アルコールを生産するために、デザイナ・カルビン回路チャンネル光合成ＮＡＤＰＨ増強経路を表出するように誘導される。例えば、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路遺伝子、例えば、二酸化炭素および水から１−ブタノールを生産するためのカルビン回路３−ホスホグリセレート分岐光合成ＮＡＤＰＨ増強経路（図４に３４、３５、０３−０５、３５−４２、および１２で数字でラベル付けされる）のデザイナ遺伝子を有する、デザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓを表すＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９、および７２（および／または７３）のようなデザイナ・カルビン回路チャンネル経路遺伝子を制御するためにｎｉｒＡプロモータを使用するとき、または使用するならば、デザイナ遺伝子組み替えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓは、アンモニア（ただし硝酸塩はない）および他の無機栄養素を含む水最小の培養媒体中で成長させられる。デザイナ遺伝子組み換えＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓが成長してバイオ燃料のブタノールを光合成生産する準備ができたとき、硝酸塩肥料が培養媒体に加えられてデザイナｎｉｒＡ制御カルビン回路チャンネル経路の表現が誘導されてこの例では二酸化炭素および水から１−ブタノールが生産されるようになる。
【０３２０】
デザイナホメオボックス（ｈｏｘ）プロモータ制御カルビン回路３−ホスホグリセレート分岐経路遺伝子のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４−１０９を含む、デザイナ遺伝子組み替えＮｏｓｔｏｃのような嫌気性プロモータ制御経路を具備するデザイナ光合成有機体については、二酸化炭素および水から光生物学的に２−メチル−１−ブタノールを生産する（図５）ためのデザイナ経路遺伝子の表出を誘導するために、嫌気性条件を採用できる。すなわち、デザイナ遺伝子組み替えＮｏｓｔｏｃ培養が成長して光生物学的にバイオ燃料を生産する準備ができたときに、そのセルは所定の嫌気性条件内に配され（シールされ）、二酸化炭素および水から２−メチル−１−ブタノールを光生物学的に生産するためにデザイナｈｏｘ制御経路遺伝子の表出を誘導する。
【０３２１】
一組のデザイナｇｒｏＥプロモータ制御およびｎｉｒＡプロモータ制御のカルビン回路３−ホスホグリセレート分岐経路遺伝子のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０−１１８を含む、デザイナ遺伝子組み替えＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓのような熱および光応答プロモータ制御およびｎｉｒＡプロモータ制御の経路を具備するデザイナ光合成有機体については、二酸化炭素および水から光生物学的にイソブタノールを生産する（図６）ためのデザイナ経路遺伝子の表出を誘導するために、光および熱を、硝酸塩添加とともに採用できる。
【０３２２】
他の実施例において、デザイナ海洋藻類または海洋オキシホトバクテリアを使用すると、淡水またな農業土壌を必要とすることなく海水および／または地表水を利用してバイオ燃料の光生物学的な生産が可能になる。例えば、デザイナ遺伝子のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０−１１７および１１９−１２２を含むデザイナＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓは、ｇｒｏＥプロモータ制御デザイナ・カルビン回路チャンネル経路（図６において、３４（ネイティブ）、３５、０３−０５、５３−５５、３８−４０、４２、および５７で特定される）を用いて、海水および／または所定の地表水を用いて、光独立栄養で成長して、また、二酸化炭素および水から３−メチル−１−ブタノールを生産できる。デザイナ光合成有機体は、高効率に水を使用してイソブタノールを生産するため、砂漠で作動する光バイオリアクタ内に封止されて使用されてもよい。蒸発および／または発散により水のロスがほとんど、またはまったくないからである。通常の作物システムは耐えることができないであろう。すなわち、この実施例は、耕作地または淡水源を必要とすることなく再生可能なエネルギー（ブタノールおよび関連高級アルコール）を新たに生成することが可能になる。
【０３２３】
他の実施例によれば、窒素固定のデザイナオキシホトバクテリアを利用して、窒素肥料を必要とすることなく、光生物学的にバイオ燃料を生産できる。例えば、デザイナｈｏｘプロモータ制御遺伝子のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４−１０９を含むデザイナ遺伝子組み替えＮｏｓｔｏｃは窒素（Ｎ２）固化、および、二酸化炭素および水からの２−メチル−１−ブタノールの生産の双方を実施できる（図６）。したがって、デザイナ遺伝子組み替えＮｏｓｔｏｃを使用すると、光独立栄養で成長するとともに２−メチル−１−ブタノールを二酸化炭素および水から光合成で生産できる。
【０３２４】
所定のオキシホトバクテリアは複数の機能を実現するように設計される。例えば、デザイナｎｉｒＡプロモータ制御遺伝子のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１２７を含むデザイナ遺伝子組み替えＣｙａｎｏｔｈｅｃｅは。（１）海水を使用でき、（２）窒素Ｎ２を固定し、二酸化炭素および水から１−ヘキサノールを光生物学的に生産できる（図８）。このタイプのデザイナオキシホトバクテリアを使用すると、窒素肥料を必要とすることなく海水を使用して１−ヘキサノールのような高度なバイオ燃料を光生物学的に生産できる。
【０３２５】
種々の実施例の１つによれば、ブタノールおよび関連高級アルコールを光生物学的に生産・収穫する方法は：（ａ）カルビン回路の中間生成物に作用して中間生成物をブタノールおよび関連高級アルコールに変換するように構成された一組の酵素のための遺伝子組み換えコードを有する遺伝子組み換え光合成有機体を、光生物学的リアクタシステムに導入し；（ｂ）遺伝子光合成有機体に関連して光合成水分解およびプロトン勾配結合電子搬送プロセスから取得される還元力およびエネルギーを光バイオリアクタ中で利用して二酸化炭素および水からブタノールおよび関連高級アルコールを合成し；（ｃ）精選物分離プロセスを利用して合成ブタノールおよび／または関連高級アｋルコールを光バイオリアクタから収穫することを有する。
【０３２６】
まとめると、どのようにデザイナ有機体が使用されて光生物学的にブタノール（および／または関連高級アルコール）を生産するかについて多くの実施例がある。好ましい実施例の１つは、光生物学的に直接にＣＯ２およびＨ２Ｏからブタノールを生産するためのデザイナ有機体を、光生物学的リアクタおよびブタノール収穫（フィルタリングおよび蒸留／蒸発）システムとともに使用することであり、これは、以下のステップとして記述される具体的な操作プロセスを含み、これらステップは、（ａ）デザイナブタノール生産経路遺伝子の表出を誘導する前に、好気性（通常）条件の下で、空気のＣＯ２を炭素源として用いる、最小培養媒体中で光独立栄養でデザイナ遺伝子組み換え有機体を成長させ；（ｂ）デザイナ有機体が成長してブタノール生産の準備ができたときに、培養を特別な条件下に封止または配置してデザイナ・カルビン回路チャンネル経路遺伝子の表出を誘導し；（ｃ）デザイナ経路酵素が表出されたときに、太陽光のような可視光エネルギーを供給してデザイナ遺伝子表出細胞が触媒として働きブタノールおよび／または関連高級アルコールがＣＯ２およびＨ２Ｏから生産されるようになし；（ｄ）当業者に知られている任意の方法を使用して生産物のブタノールおよび／または関連高級アルコールを収穫する。例えば、光生物学的なリアクタからのブタノールおよび／または関連高級アルコールの収穫は、膜フィルタリングおよび蒸留／蒸発のブタノール収穫技法を組み合わせて実現できる。
【０３２７】
デザイナ有機体を使用して光生物学的にブタノールおよび関連高級アルコールを生産し収穫する上述のプロセスは、複数の操作サイクルだけ繰り返してより所望の結果を実現して良い。上述のプロセスのステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれかを所定の特別な条件に適合化させるためにこの発明に従って調整されても良い。実際には、このプロセスのステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれかが全面的に、または部分的に適用され、および／または任意の調整された組み合わせで適用され、この発明に従うブタノールおよび高級アルコールの光生物学的な生産が増進されるようにして良い。
【０３２８】
ブタノールおよび／または関連高級アルコールの生産に加えて、デザイナ有機体、または、そのデザイナブタノール生産経路の一部を利用して所定のデザイナ・カルビン回路チャンネル経路（図１、および４−１０）の所定の中間生成物を生成することも可能であり、この中間生成物は（これに限定されないが）、ブチルアルデヒド、ブチリル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、アセトロアセチル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、ピルビン酸エステル、ホスホエノールピルビン酸エステル、２−ホスホグリセレート、１，３−ジホスホグリセレート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、フルクトース−１，６−ジホスフェート、フルクトース−６−ジホスフェート、グルコース−６−ホスフェート、グルコース、グルコース−１−ホスフェート、シトラマレート、シトラコネート、メチル−Ｄ−リンゴ酸、２−ケトブチレート、２−ケトバレレート、オクサロアセテート、アスパラギン酸エステル、ホモセリン、トレオニン、２−ケト−３−メチルバレレート、２−メチルブチルアルデヒド、３−メチルブチルアルデヒド、４−メチル−２−オクソペンタノエート、３−イソプロピルリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、２−オクソイソバレレート、２，３−ジヒドロキシ−イソバレレート、２−アセトラクテート、イソブチルアルデヒド、３−ケト−Ｃ６−アシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−Ｃ６−アシル−ＣｏＡ、Ｃ６−エノイル−ＣｏＡ、Ｃ６−アシル−ＣｏＡ、３−ケト−Ｃ８−アシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−Ｃ８−アシル−ＣｏＡ、Ｃ８−エノイル−ＣｏＡ、Ｃ８−アシル−ＣｏＡ、オクタナール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ケトヘキサノエート、２−ケトヘプタノエート、２−ケトオクタノエート、２−エチルリンゴ酸、３−エチルリンゴ酸、３−メチル−１−ペンタナール、４−メチル−１−ヘキサナール、５−メチル−１−ヘプタナール、２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オクソブタノエート、２，３−ヒドロキシ−３−メチル−ペンタノエート、２−ケト−４−メチル−ヘキサノエート、２−ケト−５−メチル−ヘプタノエート、２−ケト−６−メチル−オクタノエート、４−メチル−１−ペンタナール、５−メチル−１−ヘキサナール、６−メチル−１−ヘプタナール、２−ケト−７−メチルオクタノエート、２−ケト−６−メチル−ヘプタノエート、および、２−ケト−５−メチル−ヘキサノエートを含む。したがって、種々の実施例の１つによれば、さらなる実施例は、誘導された遺伝子組み換えデザイナ有機体からも生産されて良い中間生成物を収穫する付加的なステップを有する。中間的な生成物の生産は、デザイナ経路でその消費を触媒として増進させるデザイナ酵素活性をスイッチ・オフすることにより、選択的に増強させることができる。その中間生成物の生産は、１またはいくつかのデザイナ酵素をデザイナブタノール生産経路から省力したデザイナ有機体を使用することよっても増強させることができる。例えば、図１のデザイナ経路からブタノールデヒドロゲナーゼまたはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを省略したデザイナ有機体を使用してブチルアルデヒドまたはブチリル−ＣｏＡをそれぞれ生産できる。
【０３２９】
［デザイナ・カルビン回路チャンネル好気性水素化バイオ燃料経路］
種々の実施例の１つによれば、水素（Ｈ２）、酸素（Ｏ２）、および二酸化炭素（ＣＯ２）を取得してブタノールおよび関連高級アルコールを含む高度なバイオ燃料をデザイナ・カルビン回路チャンネル経路（図１、および図４−１０）を通じて生産するデザイナ水素化カルビン回路チャンネル経路（図１１）が形成される。図１１に示すように、種々の実施例の１つは、ここでは、シアノバクテリアのようなデザイナ微生物細胞において水素の消費からＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＡＴＰを形成するデザイナ酸素（Ｏ２）耐性ヒドロゲナーゼの表現である。膜束縛ヒドロゲナーゼ（表１に列挙されるＭＢＨ７０、およびその付属タンパク質７２）は、吸気性電子搬送チェーン（ＥＴＣ）システムを通じてＨ２の酸化を可能にし、プロトン（Ｈ＋）を細胞膜を横切ってポンプで引き上げＡＴＰ合成のための膜横断電気化学ポテンシャルを形成し、他方、溶解可能なヒドロゲナーゼ（ＳＨ７１、およびその付属タンパク質７２）を使用すると、Ｈ２によるＮＡＤ（Ｐ）＋のＳＨ仲介還元を通じてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形成が可能になる。ＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを利用すると、デザイナ・カルビン回路チャンネル経路（図１、および図４−１０）が駆動されて、ＣＯ２が固定され、バイオ燃料ブタノールおよび関連高級歩きオールが生産される。したがって、これは、デザイナ・カルビン回路チャンネルのバイオ燃料生産経路を革新的な応用を表現する。
【０３３０】
例えば、膜束縛ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ７０およびその付属タンパク質７２）と、溶解可能ヒドロゲナーゼ（ＳＨ７１およびその付属タンパク質７２）が、すでにデザイナブタノール生産経路遺伝子であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−６９、および７２（および／または７３）を含むデザイナ遺伝子組み換えシアノバクテリア中に表現されると、図４において数字の３４、３５、０３−０５、３６−４２、および１２でラベル付けされる水素化カルビン回路３−ホスホグリセレート分岐１−ブタノール生成経路を形成できる。このデザイナ水素化経路の正味の結果は、次のプロセス反応に従って、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
（１２＋２ｎ）Ｈ２  ＋  ４ＣＯ２  ＋  ｎＨ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  （７＋ｎ）Ｏ２        ［２０］
吸気性電子搬送結合リン酸化反応により水素（Ｈ２）を酸化して１−ブタノールを生産するために使用される酸素（Ｏ２）分子の数は、この例では、約５であると見積もられた。
【０３３１】
デザイナ遺伝子がオンに切り換えられる前には、遺伝子組み換えシアノバクテリア（図１１）は、ＣＯ２、Ｈ２Ｏ、および太陽光を利用して野生型の親株と同様に成長できることに留意されたい。それらは、成長して利用準備が整うと、Ｈ２（約８５％）、およびＣＯ２（約１０％）の供給を受け、Ｏ２（約５％）を制限されたバイオリアクタ中に配置されて、高級アルコール、例えば１−ブタノールを、例えば図１のカルビン回路チャンネルブタノール生産経路を通じて、光合成または太陽光を必要とすることなく、水素化合成してよい。Ｈ２は、水の電気分解を含む多数のソースから製造できるので、デザイナ水素化カルビン回路チャンネル経路技術（図１１）を用いると、廉価な産業性ＣＯ２と太陽電池、風力、および原子力発電所からの電気とを利用して、耕作値または光合成を何ら必要とすることなく、ブタノールのような「ドロップインレディ」（ｄｒｏｐ−ｉｎ−ｒｅａｄｙ）の液体搬送燃料を生産できるようになる。
【０３３２】
［デザイナ嫌気性水素化還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路］
種々の実施例の１つによれば、デザイナ水素化還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路技術（図１２）が形成され、これは、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）を取得してブタノールおよび関連高級アルコールを含む高度なバイオ燃料を嫌気性条件下で生産する。図１２に示すように、種々の実施例の１つは、ここでは、シアノバクテリアのようなデザイナ微生物細胞においてデザイナ嫌気性水素化システム、および、還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路（図１３）を付与する一組のデザイナ遺伝子の表現である。デザイナ嫌気性水素化システムは、例えば、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（表１中のＥｃｈ、９１）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ  Ｍｖｈ（９５）、コエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ、９６）、野生型（または異種）の溶解性ヒドロゲナーゼ（ＦＨ、７１）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、還元フェレドキシン（ＦＤｒｅｄ２−）、ＨＳ−ＣｏＭ、ＨＳ−ＣｏＢ、および、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ；９４）を含み、他方、デザイナ還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路（図１３において数字８３−９０、および０７−１２／４３で示される）は、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇａｎｓｅ）８３、ホルミルトランスフェラーゼ８４、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ８５、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンデヒドロゲナーゼ８６、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンレダクターゼ８７、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ８８、コリノイド鉄硫黄タンパク質８９、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ９０、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ４３を有する。この例では、デザイナ嫌気性水素化還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路技術（図１２および図１３）の正味の結果は、次のプロセス反応に従って、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）を光生物学的に生産することである。
１２Ｈ２  ＋  ４ＣＯ２  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  ７Ｏ２        ［２１］
この全体的な還元のための標準的な自由エネルギー変化（ΔｒＧ０）は、−２４４．７ｋＪ／ｍｏｌ・１−ブタノールであり、これは、この水素駆動のブタノール生産技術が熱力学の法則に反しないことを示す。この等式は、１２分子（２４電子）の水素（Ｈ２）が４分子の二酸化炭素（ＣＯ２）から１分子の１−ブタノールを生成できることを示す。１２分子のＨ２を水の電気分解から生成するためにはこれは電気から２４個の電子を使用する。したがって、水の電気分解が水素源として使用されるならば、２４個の電子（電気からの）が、デザイナ嫌気性水素化還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路技術（図１２および図１３）を通じて４分子の二酸化炭素（ＣＯ２）から１分子の１−ブタノールを生成するために十分である。
【０３３３】
したがって、種々の実施例の１つにおいて、デザイナ独立栄養有機体は、一組のデザイナ遺伝子（例えば、デザイナＤＮＡコンストラクト）を有し、これらは、デザイナ嫌気性水素化ブタノール生産経路システム（図１２および図１３に示す）を付与する一組の酵素を表現し、これらは、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）９１、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）９５、コエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ９６）９６、野生型（または異種）の溶解性ヒドロゲナーゼ（ＦＨ）７１、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）９４、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇａｎｓｅ）８３、ホルミルトランスフェラーゼ８４、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ８５、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンデヒドロゲナーゼ８６、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンレダクターゼ８７、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ８８、コリノイド鉄硫黄タンパク質８９、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ９０、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ４３を有する。
【０３３４】
デザイナ遺伝子がオンに切り換えられる前には、遺伝子組み換えシアノバクテリア（図１２）は、ＣＯ２、Ｈ２Ｏ、および太陽光を利用して野生型の親株と同様に成長できる。それらは、成長して利用準備が整うと、バイオリアクタ中に配置されて、嫌気性条件下で、どのような光合成も必要とすることなく、また、どのようなＨ２の酸素分子（Ｏ２）による吸気酸化も必要とすることなく、Ｈ２およびＣＯ２からブタノールを生産する。このデザイナ還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路（図１３）の固有の特徴は、何らＡＴＰを必要としない点である。この経路は、還元フェレドキシン（ＦＤｒｅｄ２−）、Ｆ４２０Ｈ２、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用し、このデザイナ嫌気性水素化システム（図１２）は、これらを、Ｈ２から供給でき、その際、所定の電子−プロトン結合バイオエネルギー二分岐機構を採用する。種々の実施例の１つによれば、このデザイナ経路（図１３）は現時点では最もエネルギー効率のよいブタノール生産プロセスの１つを表す。この具体的な嫌気性水素化ブタノール生産プロセス［式  ２１］の標準的な自由エネルギー変化（ΔｒＧ０）は、使用Ｈ２あたり、−２０．４ｋＪ／ｍｏｌである。その最高水素（Ｈ２）−ブタノールエネルギー変換効率は約９１．４％と見積もられる。
【０３３５】
種々の実施例の１つによれば、デザイナ水素化還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路技術（図１４において数字ラベル７４−８１、および０７−１２／４３で示される）が形成され、これは、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）を取得して１−ブタノールを一組の酵素から生産し、この一組の酵素は、葉酸デヒドロゲナーゼ７４、１０−ホルミル−Ｈ４ホレートシンターゼ７５、メテニルテトラヒドロホレートシクロヒドロラーゼ７６、１０−メチレン−Ｈ４ホレートデヒドロゲナーゼ７７、１０−メチレン−Ｈ４ホレートレダクターゼ７８、メチル−Ｈ４ホレート：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ７９、コリノイド鉄硫黄タンパク質８０、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ８１、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ４３を有する。
【０３３６】
このデザイナ経路は、１０−ホルミル−Ｈ４ホレートシンターゼ７５（図１４）のステップにおいてＡＴＰ消費を必要とする点を除いて図１３の経路と類似している。したがって、これは、動作するために他の細胞プロセスからのＡＴＰ供給を必要とする。種々の実施例の１つにおいて、この経路（図１４）は、ＡＴＰ、（ＦＤｒｅｄ２−）、ＦＤｒｅｄ２−、Ｆ４２０Ｈ２、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成するデザイナメタン生成水素化細胞システム（図１５）によりサポートできる。このデザイナ独立栄養有機体は、一組のデザイナ遺伝子（例えば、デザイナＤＮＡコンストラクト）を有し、これらは、デザイナメタン生成水素化ブタノール生産経路システム（図１４および図１６に示す）を表現する一組の酵素を有し、これらは、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ  Ｍｔｒ９２、原生または（異種の）Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ９７、メチル−コエンザイムＭレダクターゼＭｃｒ９３、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）９１、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）９５、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６、原生または（異種の）溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）７１、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）９４、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇａｎｓｅ）８３、ホルミルトランスフェラーゼ８４、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ８５、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンデヒドロゲナーゼ８６、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンレダクターゼ８７、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ８８、コリノイド鉄硫黄タンパク質８９、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ９０、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ４３を有する。
【０３３７】
例えば、デザイナメタン生成水素化システム（図１５）は、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ  Ｍｔｒ９２、Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ９７、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ；表１の９１）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼＭｖｈ（９５）、コエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ、９６）、野生型（または異種）の溶解性ヒドロゲナーゼ（ＦＨ、７１）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、還元フェレドキシン（Ｆｄｒｅｄ２−）、ＨＳ−ＣｏＭ、ＨＳ−Ｃ０Ｍ、メチル−コエンザイムＭレダクターゼ  Ｍｃｒ９３、およびヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ、９４）を含む。このシステム中のＭｔｒ９２は、ＣＨ３−Ｈ４ＭＰＴ中間体の一部を採ってメタンを生産し、ＡＴＰ合成用に膜透過電気化学ポテンシャルを形成し、これは、図１４のＡＴＰ要求嫌気性還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路を支持する。したがって、メタン生成水素化システム（図１５）とＡＴＰ要求嫌気性還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路を組み合わせると、ブタノールおよびメタンの双方を生産する組み合わせ経路（図１６）が得られる。この正味の結果は、次のプロセス反応に従って、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）からブタノールおよびメタン（ＣＨ４）を生産することである。ここで、ｍは、生産される１−ブタノール当たり、ともに生成されるＣＨ４分子の数である。
（１２＋４ｍ）Ｈ２  ＋  （４＋ｍ）ＣＯ２  →  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  ＋  （７＋ｍ）Ｈ２Ｏ  ＋  ｍＣＨ４      ［２２］
【０３３８】
非ＡＴＰ要求嫌気性還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路（図１３）も、もちろん、このデザイナメタン生成水素化システム（図１５）とともに動作でき、ブタノールおよびメタンの双方を生産する他の組み合わせ経路をもたらす（図１７）。したがって、種々の実施例の１つにおいて、デザイナ独立栄養有機体は、一組のデザイナ遺伝子（例えば、デザイナＤＮＡコンストラクト）を有し、これらは、デザイナメタン生成水素化嫌気性水素化ブタノール生産経路システム（図１５、図１３、および図１７に示す）を表現する一組の酵素を有し、これらは、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ  Ｍｔｒ９２、原生または（異種の）Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ９７、メチル−コエンザイムＭレダクターゼＭｃｒ９３、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）９１、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）９５、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６、原生または（異種の）溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）７１、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）９４、葉酸デヒドロゲナーゼ７４、１０−ホルミル−Ｈ４ホレートシンターゼ７５、メテニルテトラヒドロホレートシクロヒドロラーゼ７６、１０−メチレン−Ｈ４ホレートデヒドロゲナーゼ７７、１０−メチレン−Ｈ４ホレートレダクターゼ７８、メチル−Ｈ４ホレート：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ７９、コリノイド鉄硫黄タンパク質８０、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ８１、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ４３を有する。
【０３３９】
これら酵素のいくつかは、ホスト有機体のいくつかの中にその遺伝的な背景に依存して自然に存在する。これら原生の酵素のいくつかは、デザイナ遺伝子とともに、デザイナ経路（図１２〜図１７）の非恥部を構築するのに使用してよい。したがって、種々の実施例の１つによれば、嫌気性水素化還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を通じてブタノールのようなバイオ燃料を生産するためのデザイナ独立栄養有機体は、以下のグループから選択された少なくとも１つの酵素を表現できるデザイナ遺伝子を有し、このグループは、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）９１、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイム−Ｍメチルトランスフェラーゼ  Ｍｔｒ９２、メチル−コエンザイムＭレダクターゼＭｃｒ９３、ヘテロジスルフィドレダクターゼ（Ｈｄｒ）９４、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｍｖｈ）９５、コエンザイムＦ４２０還元ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６、溶解性ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）７１、Ａ１Ａ０−ＡＴＰシンターゼ９７、葉酸デヒドロゲナーゼ７４、１０−ホルミル−Ｈ４ホレートシンターゼ７５、メテニルテトラヒドロホレートシクロヒドロラーゼ７６、１０−メチレン−Ｈ４ホレートデヒドロゲナーゼ７７、１０−メチレン−Ｈ４ホレートレダクターゼ７８、メチル−Ｈ４ホレート：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ７９、コリノイド鉄硫黄タンパク質８０、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ８１、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇａｎｓｅ）８３、ホルミルトランスフェラーゼ８４、１０−メテニル−テトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ８５、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンデヒドロゲナーゼ８６、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリンレダクターゼ８７、１０−メチレン−Ｈ４メタノプテリン：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ８８、コリノイド鉄硫黄タンパク質８９、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ９０、チオラーゼ０７、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ０８、クロトナーゼ０９、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１０、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ１１、ブタノールデヒドロゲナーゼ１２、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ４３からなる。
【０３４０】
ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１６６−１９８は、還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路を伴う、デザイナシアノバクテリアのようなデザイナ水素化バイオ燃料生産有機体を形成するためのデザイナ酵素のデザイナＤＮＡコンストラクトの例を表す。簡単に説明すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ（Ｆｍｄ；８３）のＤＮＡコンストラクト（６１１０ｂｐ）の例１６６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼのサブユニットＢ、Ｃ、Ｅ（ジェンバンク：ＡＤＬ５８８９５、ＡＤＬ５８８９４、ＡＤＬ５８８９３）、およびＭｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅのホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼのサブユニットＡ、Ｄ、およびＧ（ジェンバンク：ＡＢＣ５６６６０、ＡＢＣ５６６５８、ＡＢＣ５６６５７）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−５６５９）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（５６５９−６０９０）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（６０９１−６１１０）を含む。
【０３４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ホルミルトランスフェラーゼ（８４）のＤＮＡコンストラクト（１５３８ｂｐ）の例１６７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのホルミルメタノフランテトラヒドロメタノプテリンホルミルトランスフェラーゼ（ジェンバンク：ＡＤＬ５９２２５）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１０８６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１０８７−１５１８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５１９−１５３８）を含む。
【０３４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御５，１０−メテニルテトラヒドロメタノプテリン（Ｈ４メタノプテリン）シクロヒドロラーゼ（８５）のＤＮＡコンストラクト（１６３１ｂｐ）の例１６８を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅのＮ（５），Ｎ（１０）−メテニルテトラヒドロメタノプテリンシクロヒドロラーゼ（ジェンバンク：ＡＢＣ５７６１５）の配列から選択された酵素エンコード配列（１９３−１１７９）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１１８０−１１６１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１１６２−１６３１）を含む。
【０３４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御５，１０−メチレン−Ｈ４−メタノプテリンヒドロゲナーゼ（８６）のＤＮＡコンストラクト（１４７５ｂｐ）の例１６９を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのＦ４２０依存メチレン−５，６，７，８−テトラヒドロメタノプテリンヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＤＬ５７６６０）の配列から選択された酵素エンコード配列（１９３−１０２３）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１１８０−１１６１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１１６２−１６３１）を含む。
【０３４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、および／またはメチレン−Ｈ４−メタノプテリンレダクターゼ（７８、８７）のＤＮＡコンストラクト（２５９４ｂｐ）の例１７０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのメチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿４３００４８）およびＭｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓのＦ４２０依存Ｎ（５），Ｎ（１０）−メテニルテトラヒドロメタノプテリンレダクターゼ（ジェンバンク：ＡＤＮ３６７５２）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２１４２）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（２１４３−２５７４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２５７５−２５９４）を含む。
【０３４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御メチルテトラヒドロホレート：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ（７９、８８）のＤＮＡコンストラクト（２８１９ｂｐ）の例１７１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのメチレンテトラヒドロホレート：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿４３０９５０）およびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのアセチル−ＣｏＡデカルボニラーゼ／シンターゼのサブユニットガンマ（ジェンバンク：ＡＤＬ５７９００）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２４６７）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（２４６８−２８９９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２５７５−２５９４）を含む。
【０３４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御コリノイド鉄硫黄タンパク質（８０、８９）のＤＮＡコンストラクト（２７７１ｂｐ）の例１７２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの小サブユニットコリノイド鉄硫黄タンパク質（ジェンバンク：ＡＡＡ２３２５５）およびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのアセチル−ＣｏＡデカルボニラーゼ／シンターゼのサブユニットデルタ（ジェンバンク：ＡＤＬ５７８９９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２３１９）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（２３１９−２７５１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２７５２−２７７１）を含む。
【０３４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（８１、９０）のＤＮＡコンストラクト（７０６１ｂｐ）の例１７３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのアセチル−ＣｏＡデカルボニラーゼ／シンターゼベータサブユニット／アセチル−ＣｏＡデカルボニラーゼ／シンターゼアルファサブユニット（ジェンバンク：ＡＢＣ１９５１６）、およびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのアセチル−ＣｏＡデカルボニラーゼ／シンターゼのサブユニットアルファ、ベータ、イプシロンデルタ（ジェンバンク：ＡＤＬ５７８９５、ＡＤＬ５９００６、ＡＤＬ５７８９７）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−６６０９）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（６６１０−７０４１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（７０４２−７０６１）を含む。
【０３４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御チオラーゼ（０７）のＤＮＡコンストラクト（１８４７ｂｐ）の例１７４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓのチオラーゼ（ジェンバンク：ＡＢ１９０７６４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１３９５）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１３９６−１８２７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１８２８−１８４７）を含む。
【０３４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（０８）のＤＮＡコンストラクト（１５１４ｂｐ）の例１７５を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：Ｚ９２９７４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１０６２）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１０６３−１４９４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４９５−１５１４）を含む。
【０３５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御クロトナーゼ（０９）のＤＮＡコンストラクト（１４３０ｂｐ）の例１７６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｔｊｅｒｉｎｃｋｉｉのクロトナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）の配列から選択された酵素エンコード配列（１９３−９７８）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（９７９−１４１０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４１１−１４３０）を含む。
【０３５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（１０）のＤＮＡコンストラクト（１７８４ｂｐ）の例１７７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｔｊｅｒｉｎｃｋｉｉのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＦ４９４０１８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１３３２）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１３３３−１７６４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７６５−１７８４）を含む。
【０３５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（１１）のＤＮＡコンストラクト（２０５１ｂｐ）の例１７８を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＹ２５１６４６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１５９９）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１６００−２０３１）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２０３２−２０５１）を含む。
【０３５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（１２）のＤＮＡコンストラクト（１８０８ｂｐ）の例１７９を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓのＮＡＤＨ依存ブタノールデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿１４８７７８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１３５６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（１３５７−１７８８）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７８９−１８０８）を含む。
【０３５４】
シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のような微生物細胞（これに限定されないが）を含む微生物ホスト細胞を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６−１７９を使用すると、光合成すなわち太陽光を必要とすることなく、水素および二酸化炭素から１−ペンタノールを生産するためのデザイナ還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路（図８に８３−９０、および０７−１２として数字でラベル付けされる）を伴うデザイナＡｎａｂａｅｎａのようなデザイナシアノバクテリアを形成できることに留意されたい。すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６−１７９は、Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のようなバクテリアの中において、デザイナ水素化還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路（図１３において８３−９０、および０７−１２）を伴うデザイナ有機体を表し、この経路は、完全に真っ暗な中でも、水素および二酸化炭素からブタノールを嫌気性条件で化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）により生産するように動作可能である。
【０３５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）（９１）のＤＮＡコンストラクト（１０５３８ｂｐ）の例１８０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ  ＤＳＭ  ３０９１のエネルギー変換ヒドロゲナーゼサブユニット（ＥｃｈＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ）（ジェンバンク：ＡＢＣ５７８０７、およびＡＢＣ５７８１２−ＡＢＣ５７８２７）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１００８６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１００８７−１０５１８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１０５１９−１０５３８）を含む。
【０３５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼＭｖｈＡＤＧ（９５）のＤＮＡコンストラクト（３４１６ｂｐ）の例１８１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼＭｖｈＡＤＧ（ジェンバンク：ＡＤＬ５９０９６、ＡＤＬ５９０９８、ＡＤＬ５９０９７）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２９６４）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（２９６５−３３９６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（３３９７−３４１６）を含む。
【０３５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ヘテロジスルフィドレダクターゼ（ＨｄｒＡＢＣ、ＨｄｒＤＥ）（９４）のＤＮＡコンストラクト（６６９５ｂｐ）の例１８２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａのヘテロジスルフィドレダクターゼ（ＨｄｒＡＢＣ、ＨｄｒＤＥ）（ジェンバンク：ＡＥＴ６３９８５、ＡＥＴ６３９８２、ＡＥＴ６３９８３、ＡＥＴ６４１６６、ＡＥＴ６４１６５）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−６２４３）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（６２４４−６６７５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（６６７６−６６９５）を含む。
【０３５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御コエンザイムＦ４２０還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）（９６）のＤＮＡコンストラクト（３４０７ｂｐ）の例１８３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ  ＳＡＮＡＥＭｅのコエンザイムＦ４２０還元性ヒドロゲナーゼ（ＦｒｈＢ１−３）（ジェンバンク：ＹＰ＿００３３５７２２９、ＹＰ＿００３３５７４６７、ＹＰ＿００３３５７５０９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２９５５）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（２９５６−３３８７）、および、３'端のＰＣＲ  ＲＥプライマー（３３８８−３４０７）を含む。
【０３５９】
シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のようなバクテリア細胞（これに限定されないが）を含む微生物ホスト細胞を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−１８３を使用すると、デザイナ還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路（図１３において８３−９０、０７−１２）のサポートの下で、Ｈ２から還元力（Ｆｄｒｅｄ２−およびＦ４２０Ｈ２）を生成する嫌気性化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）水素利用システムを付与することができ、このシステムは図１２に示すように、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）（９１）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼＭｖｈＡＤＧ（９５）、コエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６、およびコエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６を有する。したがって、Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のようなバクテリアにおける、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−１８３の表現は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６−１７９を伴うと、光合成または好気性の吸気を必要とすることなく水素および二酸化炭素からブタノールを嫌気性条件で化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）により生産することができる、フルデザイナ還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路システム（図１２および図１３）を伴うデザイナ有機体（デザイナＡｎａｂａｅｎａのような）を表す。この例の正味の結果は、反応式［２１］に示されるように水素および二酸化炭素からブタノールを嫌気性条件で化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）により生産することである。
【０３６０】
また、これらデザイナ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６−１８３）はデザイナｈｏｘ嫌気性プロモータによって制御されることに留意されたい。したがって、開放された池の大規模培養中のような、嫌気性条件下で、この例のデザイナＡｎａｂａｅｎａは、野生型の親株とまったく同様に空気の二酸化炭素および水を炭素および電子のソースとして利用して急速に光独立栄養で成長する。デザイナＡｎａｂａｅｎａ細胞培養が成長して使用（この用途における触媒として）の準備ができると、これらは、暗所で嫌気性化学合成独立栄養でブタノールを生産する（図１２および図１３に示す）ためのデザイナ遺伝子表現を誘導するために、産業ＣＯ２およびＨ２ガスの供給を受ける、嫌気性リアクタ中へと配置できる。
【０３６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイムＭメチルトランスフェラーゼ（ＭｔｒＡ−Ｈ）（９２）のＤＮＡコンストラクト（５４１７ｂｐ）の例１８４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅのメチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイムＭメチルトランスフェラーゼ（ＭｔｒＡ−Ｈ）（ジェンバンク：ＡＢＣ５６７１４、ＡＢＣ５６７１３、ＹＰ＿４４７３６０、ＹＰ＿４４７３５４、ＹＰ＿４４７３５９、ＹＰ＿４４７３５５）、および、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａおよびＭｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉのｍｔｒＥＦ（ＡＥＴ６５４４５、ＮＣ＿００９０５１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−４９６５）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（４９６６−５３９７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（５３９８−５４１７）を含む。
【０３６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御メチルコエンザイムＭレダクターゼ（Ｍｃｒ）（９３）のＤＮＡコンストラクト（５０４２ｂｐ）の例１８５を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅのメチルコエンザイムＭレダクターゼのサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ、Ｇ（ジェンバンク：ＣＡＥ４８３０６、ＣＡＥ４８３０３、ＡＢＣ５６７０９、ＣＡＥ４８３０５）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−４５９０）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（４５９１−５０２２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（５０２３−５０４２７）を含む。
【０３６３】
シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のようなバクテリア細胞を含む微生物ホスト細胞を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４および１８５をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−１８３とともに使用すると、メタン生成水素化システムを付与でき、このシステムは、図１５に示すように、メチル−Ｈ４ＭＰＴ：コエンザイムＭメチルトランスフェラーゼ（ＭｔｒＡ−Ｈ）（９２）、メチルコエンザイムＭレダクターゼ（Ｍｃｒ）（９３）、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（Ｅｃｈ）（９１）、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼＭｖｈＡＤＧ（９５）、コエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６、およびコエンザイム  Ｆ４２０−還元性ヒドロゲナーゼ（Ｆｒｈ）９６を有する。これら酵素は、原生のＡＴＰアーゼ９７と一緒に、デザイナ還元性アセチル−ＣｏＡメタン生成ブタノール生産経路（図１６および図１７）のサポートの下で、Ｈ２からＡＴＰおよび還元力（Ｆｄｒｅｄ２−およびＦ４２０Ｈ２）を生成できる。したがって、Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のようなバクテリアにおける、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−１８５の表現は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６−１７９を伴うと、光合成を必要とすることなく水素および二酸化炭素からブタノールおよびメタンを嫌気性条件で生産するように動作することができる、デザイナ水素化還元性アセチル−ＣｏＡメタン生成バイオ燃料生産経路システム（図１５および図１７）を伴うデザイナ有機体（デザイナＡｎａｂａｅｎａのような）を表す。この例の正味の結果は、反応式［２２］に示されるように水素および二酸化炭素からブタノールおよびメタンを嫌気性条件で化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）により生産することである。
【０３６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御葉酸デヒドロゲナーゼ（７４）のＤＮＡコンストラクト（５４５０ｂｐ）の例１８６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの葉酸デヒドロゲナーゼのアルファおよびベータサブユニット（ジェンバンク：ＡＡＢ１８３３０、ＡＡＢ１８３２９）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−４９９８）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（４９９９−５４３０）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（５４３１−５４５０）を含む。
【０３６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御１０−ホルミル−Ｈ４ホレートシンターゼ（７５）のＤＮＡコンストラクト（２３２４ｂｐ）の例１８７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの１０−ホルミルテトラヒドロホレートシンセターゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿４２８９９１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１８７２）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（１８７３−２３０４）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２３０５−２３２４）を含む。
【０３６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御１０−メテニル−Ｈ４ホレートシクロヒドロラーゼ（７６）のＤＮＡコンストラクト（１４８７ｂｐ）の例１８８を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのメテニルテトラヒドロホレートシクロヒドロラーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿４３０３６８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１０３５）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１０３６−１４６７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４６８−１４８７）を含む。
【０３６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御１０−メチレン−Ｈ４ホレートデヒドロゲナーゼ（７７）のＤＮＡコンストラクト（１４８７ｂｐ）の例１８９を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのメテニルテトラヒドロホレートシクロヒドロラーゼ／５，１０−メチレンテトラヒドロホレートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＢＣ１９８２５）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１０３５）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１０３６−１４６７）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１４６８−１４８７）を含む。
【０３６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御１０−メチレン−Ｈ４ホレートレダクターゼ（７８）のＤＮＡコンストラクト（１５６５ｂｐ）の例１９０を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのメテニルテトラヒドロホレートレダクターゼ（ジェンバンク：ＡＢＣ１５０５）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１１１３）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１１１４−１５４５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１５４６−１５６５）を含む。
【０３６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御メチレン−Ｈ４ホレート：コリノイド鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ（７９）のＤＮＡコンストラクト（１４４２ｂｐ）の例１９１を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのメチルテトラヒドロホレート：コリノイド／鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿４３０１７４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−６９０）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（６９１−１１２２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１１２３−１４４２）を含む。
【０３７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御コリノイド鉄硫黄タンパク質（８０）のＤＮＡコンストラクト（２９４２ｂｐ）の例１９２を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのコリノイド鉄硫黄タンパク質の大および小サブユニット（ジェンバンク：ＡＥＩ９０７４５、ＡＥＩ９０７４６）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２４９０）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（２４９１−２９２２）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（２９２３−２９４２）を含む。
【０３７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（８１）のＤＮＡコンストラクト（４８５９ｂｐ）の例１９３を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの一酸化炭素デヒドロゲナーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニットト（ジェンバンク：ＡＡＡ２３２２９、ＡＡＡ２３２２８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−４４０７）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（４４０８−４８３９）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（４８４０−４８５９）を含む。
【０３７２】
シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のような微生物ホスト細胞を遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６−１９３をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４−１７９とともに使用すると、ＡＴＰ要求還元性アセチル−ＣｏＡブタノール生産経路（図１４の７４−８１、および０７−１２／４２）を付与できる。同様に、シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のようなバクテリアを遺伝子形質転換する際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６−１９３をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−１８５とともに使用すると、ＡＴＰ要求還元性アセチル−ＣｏＡメタン生成バイオ燃料生産経路および水素化メタン生成結合ＡＴＰ生成システム（図１５および図１６）を伴うデザイナ有機体（デザイナＡｎａｂａｅｎａのような）を表すことができ、これらシステムは水素および二酸化炭素からブタノールおよびメタンの双方を生産するように動作できる。この例の正味の結果は、反応式［２２］に示されるように水素および二酸化炭素からブタノールおよびメタンを嫌気性条件で化学合成独立栄養（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）により生産することである。
【０３７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御Ｆ４２０合成酵素（９９）のＤＮＡコンストラクト（６４２８ｂｐ）の例１９４を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ  ＣｏＡ（ジェンバンク：ＡＤＣ４６５２３）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓの２−ホスホ−１−ラクテートグアニリルトランスフェラーゼ（ジェンバンク：ＡＤＬ５８５８８）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓの２−ホスホ−Ｌ−ラクテートトランスフェラーゼ（ジェンバンク：ＮＰ＿９８７５２４）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｌａｂｒｅａｎｕｍのコエンザイムＦ４２０−０ガンマ−グルタミルリガーゼ（ＹＰ＿００１０３０７６６）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａｍのＦＯシンターゼのサブユニット１および２（ＹＰ＿００３３５７５１３、ＹＰ＿００３３５７５１１）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−４９７６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（４９７７−６４０８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（６４０９−６４２８）を含む。
【０３７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御ピリドキサールホスフェート依存Ｌ−チロシンデカルボキシラーゼ（ｍｆｎＡはメタノフラン合成を表す）（１００）のＤＮＡコンストラクト（１７７８ｂｐ）の例１９５を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａのＬ−チロシンデカルボキシラーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿００３３５５４５４）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−１３２６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（１３２７−１７５８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（１７５９−１７７８）を含む。
【０３７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御メタノプテリン合成酵素（１０１）のＤＮＡコンストラクト（３２１５ｂｐ）の例１９６を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ  ＤＳＭ  ３０９１のＧＴＰシクロヒドロラーゼ（ジェンバンク：ＹＰ＿４４７３４７）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｃ５の環状ホスホジエステラーゼ  ＭｐｔＢ（ＡＢ０３５７４１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ  ＳＡＮＡＥのベータ−リボフラノシラミノベンゼン  ５'−ホスフェートシンターゼ（ＹＰ＿００３３５６６１０）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−２７６３）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（２７６４−３１９５）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（３１９６−３２１５）を含む。
【０３７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御コエンザイムＭ合成酵素（１０２）のＤＮＡコンストラクト（４２２６ｂｐ）の例１９７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０）のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓのホスホスルホラクテートシンターゼ、２−ホスホスルホラクテートホスファターゼ、およびスルホラクテートデヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＤＬ５７８６１、ＹＰ＿００３８５０４５１、ＡＤＬ５９１６２）、およびＭｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ  ＳＡＮＡＥのスルホピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＹＰ＿００３３５７０４８）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−３７７４）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７１２０のｇｏｒターミネータ（３７７５−４０２６）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（４０２７−４２２６）を含む。
【０３７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８は、デザイナｈｏｘｌプロモータ制御コエンザイムＢ合成酵素（１０３）のＤＮＡコンストラクト（５１９８ｂｐ）の例１９７を示し、これは、ＰＣＲ  ＦＤプライマー（配列１−２０）、１７２−ｂｐのＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のｈｏｘプロモータ（２１−１９２）、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉのノイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ジェンバンク：ＡＡＭ０１６０６、ＮＰ＿６１４４９８）、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓのイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの大および小サブユニット（ＡＤＰ９８３６３、ＡＤＰ９８３６２）の配列から選択され修正された酵素エンコード配列（１９３−４７４６）、４３２−ｂｐのＮｏｓｔｏｃのｇｏｒターミネータ（４７４７−５１７８）、および、ＰＣＲ  ＲＥプライマー（５１７９−５１９８）を含む。
【０３７８】
シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ  ＰＣＣ  ７１２０のような微生物ホスト細胞中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４−１９８の表現は、デザイナ水素化還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路（図１３、１４、１６、および１７の経路）が動作するために必要な、Ｆ４２０、メタノフラン、メタノプテリン、コエンザイムＭ、およびコエンザイムＢのようなコファクターのいくつかを合成する能力を実現する。シアノバクテリアのような種々のホスト細胞の遺伝子バックグラウンドに左右されて、それらの多くは、これら酵素のいくつかを処理してこの種の特別なコファクターを合成してもよいし、しなくてもよい。したがって、種々の実施例の１つにおいて、これらの例で示すように、この種のデザイナコファクター酵素（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４−１９８）を水素化デザイナ還元性アセチル−ＣｏＡバイオ燃料生産経路遺伝子と一緒に表現するのが好ましいプラクティスである。
【０３７９】
Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ  ＳＡＮＡＥのような水素化バクテリアおよびメタン細菌の多くは、自然に、所定の水素化、および／または、還元性アセチル−ＣｏＡ経路、ならびに、Ｆ４２０、メタノフラン、メタノプテリン、コエンザイムＭ、およびコエンザイムＢを含む関連するコファクターを合成する能力を保持する。したがって、水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）から１−ブタノールのような高度なバイオ燃料を化学合成独立栄養で生産するための水素化、および／またはメタン生成ホスト細胞中に、バイオ燃料生産経路（図１、４、５、６、７、８、１０、１３、および１４）例えばＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１７４−１７９を、所定のデザイナ遺伝子中に表現することも好ましいプラクティスである。種々の実施例の１つによれば、この具体的な適用のための水素化、および／またはメタン生成ホスト有機体は、次のグループから選択され、このグループは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ  ＳＡＮＡＥ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＡＢＮｌＨ３、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＡＢＮｌＨ４、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＤＲ１、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｈ１３−３；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  Ｓ４、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  Ｓ６９９、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ  ＷＫ１、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ４３０４、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ  ＳＮＰ６、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．  Ｂ５１０、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  ＨＩ２４２４、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ  ＤＳＭ  ６７２５、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｉ  ＤＳＭ２７７８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ  ＤＳＭ５１９、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｎ−１、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｃａ  ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ  ＤＳＭ  １１１０９、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴ１ｂ、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ  ＤＳＭ９７９９、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｌａｃｉｄｕｓ  ＤＳＭ  １０６４２、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＴＡ４２６、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ４３８７９、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ  ＳｍＲ１、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ−６、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏ��ａ  Ａｔ−２２、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＷＡＮ−Ｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｖｅｎｓ  ＡＧ８６、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｍｕｓ  ＭＥ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＦＳ４０６−２２、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓ  Ｍ７、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  Ｎａｎｋａｉ−３、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｃ６、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ  Ａ３、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｌａｂｒｅａｎｕｍ  Ｚ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉ  ＪＲ１、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｈｉｉ  ＤＳＭ５２１９、Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｅａ  ｔａｒｄａ  ＮＯＢｌ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  １１５７１、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ  ＡＶ１９、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ  ６Ａ８、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  ６Ａｃ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ  ｚｈｉｌｉｎａｅ  ＤＳＭ  ４０１７、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ  ｓｔｒ．  Ｆｕｓａｒｏ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏ１、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ  ＪＦ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ  ｓｔｒ．  Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｋｉｎａｗｅｎｓｉｓ  １Ｈ１、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓｆｅｒｖｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ２０８８、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｋｅｎｙｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ  ＭＣ０９、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＬＷ１３、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐ．  ＬＷ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＪＬＷ８、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ３０１、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅｔｒｏｐｈｕｓ  Ｓ１Ｐ３−４、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＯＭ５、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ  ＨＰＬ−００３、Ｐｅ��ｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  Ｓ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ５３０５、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｙａｙａｎｏｓｉｉ  ＣＨＩ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｓｐ．、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａ  ＡＴＣＣ  ４３５４１、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＢＡ１７５、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＫＡＩ４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＪＡ−２−３Ｂ'ａ（２−１３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＪＡ−３−３Ａｂ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ  ＥＪ３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ  ＮＡ１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ４５５７、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆａｔａｔｏｒ  ｉｎｄｉｃｕｓ  ＤＳＭ  １５２８６、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ  ｐｅｎｄｅｎｓ  Ｈｒｋ  ５、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ  ＴＭＯ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ  ＲＫＵ１、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ、Ｔｈｉｏｍｏｎａｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  Ｋ１２、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ａｎｔｉｑｕａ、およびこれらの組み合わせから成る。
【０３８０】
この発明はいくつかの実施例により説明され、また説明した実施例は非常に詳細に説明されたけれども、この出願は、添付の特許請求の範囲のスコープをその詳細な程度にまで制限し、その他、どのような態様でもその詳細な程度にまで制限する意図はない。付加的な利点および変更は当業者には容易に理解できる。したがって、この発明は、その最も広い側面では具体的な詳細、対応する装置および方法、ならびに、図示され、説明された、図説の例に限定されない。したがって、この出願の全体的な発明概念の精神または範囲から逸脱することなく、そのような詳細からに変更できる。
【図１】
2014501109.tif 000031
【図２Ａ】
2014501109.tif 000032
【図２Ｂ】
2014501109.tif 000033
【図２Ｃ】
2014501109.tif 000034
【図２Ｄ】
2014501109.tif 000035
【図２Ｅ】
2014501109.tif 000036
【図２Ｆ】
2014501109.tif 000037
【図２Ｇ】
2014501109.tif 000038
【図２Ｈ】
2014501109.tif 000039
【図３Ａ】
2014501109.tif 000040
【図３Ｂ】
2014501109.tif 000041
【図３Ｃ】
2014501109.tif 000042
【図４】
2014501109.tif 000043
【図５】
2014501109.tif 000044
【図６】
2014501109.tif 000045
【図７】
2014501109.tif 000046
【図８】
2014501109.tif 000047
【図９】
2014501109.tif 000048
【図１０】
2014501109.tif 000049
【図１１】
2014501109.tif 000050
【図１２】
2014501109.tif 000051
【図１３】
2014501109.tif 000052
【図１４】
2014501109.tif 000053
【図１５】
2014501109.tif 000054
【図１６】
2014501109.tif 000055
【図１７】
2014501109.tif 000056
【国際調査報告】
2014501109.tif 000057
2014501109.tif 000058