(57)【要約】イオンの質量スペクトルを得るためのイオントラップ質量分析計および方法は、周波数帯域幅全体にわたって駆動周波数を周波数増分ずつステップ走査する。各ステップの特定の周波数は、完全な周期の一定数分の間維持される。特定の周波数それぞれは次のステップの周波数に連続的に変化され、各ステップにおける特定の周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる。
2014526046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元四重極型イオントラップ質量分析計を用いてイオンの質量スペクトルを得る方法であって、
周波数帯域幅全体にわたってイオントラップのトラッピング周波数を周波数増分ずつステップ走査し、
各ステップの特定の周波数が完全な周期の一定数分の間維持され、
特定の周波数それぞれが次のステップの周波数に連続的に変化され、
各ステップにおける特定の周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる、方法。
【請求項２】
さらに、
周波数帯域幅全体にわたってイオントラップの軸方向の励起ＲＦ周波数を周波数増分ずつステップ走査し、
各ステップの特定の軸方向周波数が完全な周期の一定数分の間維持され、
特定の軸方向周波数それぞれが次のステップの軸方向周波数に連続的に変化され、
各ステップにおける特定の軸方向周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる、請求項１の方法。
【請求項３】
完全な周期の一定数が、１０から１，０００，０００までである、請求項１の方法。
【請求項４】
周波数増分が、１から２５６Ｈｚまでである、請求項１の方法。
【請求項５】
イオンが、イオン化分子、または大きい分子の一部、あるいは高分子、生体分子、有機ポリマー、ナノ粒子、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、共役タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、ウイルス、細胞、および生物学的細胞小器官から選択された構造体である、請求項１の方法。
【請求項６】
イオンの質量が、約１ｋＤａから約２００ｋＤａまでである、請求項１の方法。
【請求項７】
イオンの質量スペクトルを得る方法であって、
センターリング電極と２つのエンドキャップ電極とを有する四重極型イオントラップ内でイオンをトラップし、
第１の特定の周波数のＲＦを、第１の特定の周波数のＲＦの完全な周期の第１の個数分の間、センターリング電極に印加し、
第２の特定の周波数のＲＦを、第２の特定の周波数のＲＦの完全な周期の第２の個数分の間、センターリング電極に印加し、
第２の特定の周波数のＲＦが位相のゼロから始まるように印加され、
周波数について、第２の特定の周波数のＲＦが第１の特定の周波数のＲＦに対してΔｆ１異なる、方法。
【請求項８】
Δｆ１が１から２５６までである、請求項７の方法。
【請求項９】
完全な周期の第１および第２の個数が、互いに独立し、１０から１，０００，０００までである、請求項７の方法。
【請求項１０】
さらに、複数の付加的な特定の周波数のＲＦを、その特定の周波数のＲＦの完全な周期の複数個分の間、センターリング電極に印加し、
各付加的な特定の周波数のＲＦが位相のゼロから始まるように印加され、
周波数について、各付加的な特定の周波数のＲＦがその前の特定の周波数のＲＦに対してΔｆｎ異なる、請求項７の方法。
【請求項１１】
Δｆｎが１から２５６までである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
さらに、
第１の特定の軸方向周波数のＲＦを、第１の特定の軸方向周波数のＲＦの完全な周期の第１の個数分の間、エンドキャップ電極に印加し、
第２の特定の軸方向周波数のＲＦを、第２の特定の軸方向周波数のＲＦの完全な周期の第２の個数分の間、エンドキャップ電極に印加し、
第２の特定の軸方向周波数のＲＦが位相のゼロから始まるように印加され、
周波数について、第２の特定の軸方向周波数のＲＦが第１の特定の周波数のＲＦに対してΔｆ１異なる、請求項７の方法。
【請求項１３】
イオンが、イオン化分子、または大きい分子の一部、あるいは高分子、生体分子、有機ポリマー、ナノ粒子、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、共役タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、ウイルス、細胞、および生物学的細胞小器官から選択された構造体である、請求項７の方法。
【請求項１４】
イオンの質量が、約１ｋＤａから約２００ｋＤａまでである、請求項７の方法。
【請求項１５】
イオンが、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーイオン化、レーザーイオン化、サーモスプレーイオン化、熱イオン化、電子イオン化、化学イオン化、誘電結合プラズマによるイオン化、グロー放電イオン化、電界脱離イオン化、高速原子衝突イオン化、スパークイオン化、またはイオン付着イオン化によって発生される、請求項７の方法。
【請求項１６】
イオンの質量スペクトルを得るためのイオントラップ質量分析計であって、
三次元四重極型イオントラップと、
シーケンスコントローラとを有し、
シーケンスコントローラが、
周波数帯域幅全体にわたり、周波数増分ずつ異なるトラッピング周波数のステップ走査波形を合成するためのプログラム可能な波形発生器と、
電荷検出器とを備え、
線形波形発生器において、
各ステップの特定の周波数が完全な周期の一定数分の間維持され、
特定の周波数それぞれが次のステップの周波数に連続的に変化され、
各ステップにおける特定の周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる、イオントラップ質量分析計。
【請求項１７】
プログラム可能な波形発生器が、周波数帯域幅全体にわたり、周波数増分ずつ異なる軸方向ＲＦ周波数のステップ走査波形を合成するためにプログラム可能であり、
各ステップの特定の軸方向周波数が完全な周期の一定数分の間維持され、
特定の軸方向周波数それぞれが次のステップの軸方向周波数に連続的に変化され、
各ステップにおける特定の軸方向周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる、請求項１６のイオントラップ質量分析計。
【請求項１８】
完全な周期の一定数が、１０から１，０００，０００までである、請求項１６のイオントラップ質量分析計。
【請求項１９】
各周波数増分が、互いに独立し、１から２５６Ｈｚまでである、請求項１６のイオントラップ質量分析計。
【請求項２０】
イオンが、イオン化分子、または大きい分子の一部、あるいは高分子、生体分子、有機ポリマー、ナノ粒子、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、共役タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、ウイルス、細胞、および生物学的細胞小器官から選択された構造体である、請求項１６のイオントラップ質量分析計。
【請求項２１】
イオンの質量が、約１ｋＤａから約２００ｋＤａまでである、請求項１６のイオントラップ質量分析計。
【請求項２２】
イオンが、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーイオン化、レーザーイオン化、サーモスプレーイオン化、熱イオン化、電子イオン化、化学イオン化、誘電結合プラズマによるイオン化、グロー放電イオン化、電界脱離イオン化、高速原子衝突イオン化、スパークイオン化、またはイオン付着イオン化によって発生される、請求項１６のイオントラップ質量分析計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析およびプロテオミクスの分野に関する。特に、本願は、高速プロテオミクスのための方法であって、質量分析において大きい生体分子イオンを検出する方法に関する。さらに、本願は、周波数ステップ走査式のデバイスおよび巨大分子や生体分子を検出するイオントラップ質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析は、質量対電荷比によって分子やイオンを特定するための強力なツールである。質量分析には、質量対電荷比が高い生体分子や巨大分子の測定を素早く行うことが困難である点で限界がある。大きい生体分子の検出については近年進歩しており、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）やエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）などがある。
【０００３】
質量分析は、分子量を明らかにするために、タンパク質、細胞小器官、および細胞の研究において利用されるとともに、タンパク消化、プロテオーム解析、メタボロミクス、ペプチド配列などの生成の研究にも利用されている。三次元四重極型イオントラップなどのイオントラップデバイスおよび方法は、一般的に、トラップからイオンを質量選択的に放出させることができるため、プロテオミクスには有益である。
【０００４】
手短に言えば、トラップからイオンを質量選択的に放出させるために、イオントラップがキャパシタで構成されている質量分析計の共振ＬＣ回路は周波数走査される。その周波数掃引は、検出するイオンの質量対電荷比の範囲に対応するように行われる。
【０００５】
周波数走査法によるトラップからのイオンの質量選択的な放出の欠点は、周波数範囲全体にわたって掃引するときに、次の周波数に変化する前に、完全な周期で終了する周波数が存在しないことである。さらには、掃引において次に続く周波数が任意の位相で始まることである。これらの欠点は、質量スペクトルの解像度や質量対電荷比に対する周波数の対応度を低下させる。
【０００６】
質量分析計を用いたタンパク質や生体分子の検出は連続的に行う必要がある。また、大きい生体分子イオンを検出することができる質量分析計のための装置や配置が必要である。さらに、プロテオミクスの研究のために、高解像度で素早く生体分子を検出することができる質量分析装置や方法が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の実施の形態は、タンパク質および生体分子を質量分析計を用いて検出する方法を提供する。また、本開示によれば、大きな生体分子を検出することができる質量分析計のための装置や配置が提供される。本開示の実施の形態はさらに、プロテオミクスの研究のために、高解像で素早く生体分子を検出することができる質量分析装置や方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、イオントラップ質量分析計を用いてイオンの質量スペクトルを得るための方法であって、周波数帯域幅全体にわたってトラッピング周波数を周波数増分ずつステップ走査し、各ステップの特定の周波数が完全な周期の一定数分の間維持され、特定の周波数それぞれが次のステップの周波数に連続的に変化され、各ステップにおける特定の周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる、方法を提供する。いくつかの実施の形態においては、完全な周期の一定数は１０から１，０００，０００までである。ある実施の形態においては、周波数増分は１から２５６Ｈｚまでである。
【０００９】
さらなる実施の形態において、方法は、周波数帯域幅全体にわたってイオントラップの軸方向の励起ＲＦ周波数を周波数増分ずつステップ走査し、各ステップの特定の軸方向周波数が完全な周波数の一定数分の間維持され、特定の軸方向周波数それぞれが次のステップの軸方向周波数に連続的に変化され、各ステップにおける特定の軸方向周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる、ことを含んでいる。
【００１０】
さらなる実施の形態においては、イオンが、イオン化分子、または大きい分子の一部、あるいは高分子、生体分子、有機ポリマー、ナノ粒子、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、共役タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、ウイルス、細胞、および生物学的細胞小器官から選択された構造体であってもよい。ある実施の形態においては、イオンの質量は約１ｋＤａから約２００ｋＤａまでであってもよい。
【００１１】
本発明の実施の形態はさらに、イオンの質量スペクトルを得る方法であって、センターリング電極と２つのエンドキャップ電極とを有する四重極型イオントラップ内でイオンをトラップし、第１の特定の周波数のＲＦを、第１の特定の周波数のＲＦの完全な周期の第１の個数分の間、センターリング電極に印加し、第２の特定の周波数のＲＦを、第２の特定の周波数のＲＦの完全な周期の第２の個数分の間、センターリング電極に印加し、第２の特定の周波数のＲＦが位相のゼロから始まるように印加され、周波数について、第２の特定の周波数のＲＦが第２の特定の周波数のＲＦに対してΔｆ１異なる、方法を提供する。
【００１２】
その方法ではさらに、複数の付加的な特定の周波数のＲＦを、その特定の周波数のＲＦの完全な周期の複数個分の間、センターリング電極に印加し、各付加的な特定の周波数のＲＦが位相のゼロから始まるように印加され、周波数について、各付加的な特定の周波数のＲＦがその前の特定の周波数のＲＦに対してΔｆｎ異なる。いくつかの実施の形態においては、第１および第２の個数が、互いに独立し、１０から１，０００，０００までであってもよい。ある実施の形態においては、増分量Δｆ１およびΔｆｎは、互いに独立し、１から２５６Ｈｚまでであってもよい。
【００１３】
さらなる実施の形態においては、イオンが、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーイオン化、レーザーイオン化、サーモスプレーイオン化、熱イオン化、電子イオン化、化学イオン化、誘電結合プラズマによるイオン化、グロー放電イオン化、電界脱離イオン化、高速原子衝突イオン化、スパークイオン化、またはイオン付着イオン化によって発生されてもよい。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明は、イオンの質量スペクトルを得るためのイオントラップ質量分析計を含んでいる。イオントラップ質量分析計は、三次元四重極型イオントラップと、シーケンスコントローラとを有する。シーケンスコントローラは、周波数帯域幅全体にわたり、周波数増分ずつ異なる駆動またはトラッピング周波数のステップ走査波形を合成するためのプログラミング可能な波形発生器と、電荷検出器とを備える。波形発生器において、各ステップにおける特定の周波数それぞれが次のステップの周波数に連続的に変化され、各ステップにおける特定の周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる。
【００１５】
方法はさらに、第１の特定の軸方向周波数のＲＦを、第１の特定の軸方向周波数のＲＦの完全な周期の第１の個数分の間、エンドキャップ電極に印加し、また、第２の特定の軸方向周波数のＲＦを、第２の特定の軸方向周波数のＲＦの完全な周期の第２の個数分の間、エンドキャップ電極に印加し、第２の特定の軸方向周波数のＲＦが位相のゼロから始まるように印加され、周波数について、第２の特定の軸方向周波数のＲＦが第１の特定の周波数のＲＦに対してΔｆ１異なる。
【００１６】
以下の説明は、その一部を構成する添付の図面を参照しつつ行う。添付の図面は、実行されうる具体的ないくつかの実施の形態を例示する目的のために示されている。これらの実施の形態は当業者が発明を実施可能に詳細に説明され、当然ながら他の実施の形態にも利用可能である。また、当然ながら、本発明の範囲を逸脱することなく、構造的、論理的、および電気的に変更可能である。それゆえ、実施例の以下の説明は意味を制限するものではない。また、本発明の範囲は添付のクレームによって定義されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】イオントラップのセンターリング電極がトラッピングＲＦ周波数Ωで駆動され、イオントラップのエンドキャップ電極が補助的な軸方向励起を受け、電圧ランプ関数発生器が周波数スキャニングのための分析ＲＦと軸方向の共鳴励起ＲＦ周波数走査とを提供している、質量分析計における三次元イオントラップの実施の形態を示す図
【００１８】
【図２】イオントラップのセンターリング電極がトラッピングＲＦ周波数Ωで駆動され、イオントラップのエンドキャップ電極が補助的な軸方向励起を受け、ステップ関数発生器が分析ＲＦステップ周波数走査と軸方向の共鳴励起ＲＦステップ周波数走査とを提供している、本開示の質量分析計における三次元イオントラップの実施の形態を示す図
【００１９】
【図３】任意の関数発生器を用いたときの実験的な線形掃引モードの例を示す図
【００２０】
【図４】質量分析計のシーケンスコントローラのタイミング図
【００２１】
【図５】本開示の実験的なステップ周波数走査の例を示し、走査における特定の周波数それぞれが完全な周期の一定数分の間維持され、走査における特定の周波数それぞれが次のステップの周波数に連続的に変化し、走査における特定の周波数それぞれが位相のゼロ位置から始まる図
【００２２】
【図６】３００ｋＨｚから１００ｋＨｚまでのステップ走査を用いることによって得られたアンジオテンシン（Ｍ．Ｗ．１２９６Ｄａ）の実験的な質量スペクトルを示す図
【００２３】
【図７】ステップ走査法を用いることによって得られた免疫グロブリンＧ（Ｍ．Ｗ．１５０ｋＤａ）の実験的な質量スペクトルを示す図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施の形態は、質量分析において、タンパク質、細胞小器官、および細胞の研究のために、分子量、タンパク消化、プロテオーム解析、メタボロミクス、ペプチド配列などを明らかにするための新しい方法を提供する。
【００２５】
本開示は、プロテオミクスの研究に有益な、三次元四重極型イオントラップを用いる質量分析のための新しいイオントラッピング、イオン放出、およびイオン検出方法を提供する。
【００２６】
三次元（３Ｄ）四重極型イオントラップは、双曲面を備える２つのエンドキャップと、双曲面を備える１つのセンターリングとを有する。トラップスペースに導入されたイオンは、センターリングとエンドキャップとの間にトラップされる。ポール（Ｐａｕｌ）四重極型イオントラップにおいてトラップされたイオンの軌道が安定する条件は、数式１で表現される。
【００２７】
【数１】
2014526046.tif 000003
【００２８】
Φ０はセンターリング電極に印加されている電位であり、ＶｃｏｓΩｔはＲＦ電位であり、Ωは交流電圧源の角駆動周波数であり、Ｖはセンターリング電極上のＡＣ振幅（０ピーク）であり、Ｕはセンターリング電極上のＤＣ電位である。
【００２９】
【数２】
2014526046.tif 000004
【００３０】
ｑｚはマシュー方程式から導出されたイオンの無次元数パラメータであり、ｍはイオンの質量であり、ｒ０はリング電極の内接半径によって与えられるイオントラップの幾何学的サイズであり、２ｚ０は２つのエンドキャップ電極の間の距離である。
【００３１】
トラップされたイオンの質量分析の場合、イオンが選択的に放出されるプロセスにおいて、正弦曲線の電圧Ｖを増加してもよく、それによりｑｚが不安定点に向かって増加する。
【００３２】
図１は、３Ｄイオントラップ質量分析計の共振回路を示している。電圧ランピングプロセスにおいて、正弦波形Ｖを、ＬＣ回路を用いることによって増幅することができる。ＬＣ回路は、インダクタとキャパシタから構成される共振回路または同調回路である。接続されている場合、電流は、この回路におけるこれらの間を行ったり来たりすることができる。それにより、特定の周波数で最大信号が発生する。質量分析計の共振回路の場合、３Ｄイオントラップはキャパシタであって、円筒状の空芯コイルに接続されている。
【００３３】
空芯コイルのインダクタンスは、強磁性コアコイルに比べて低い。空芯コイルは高周波数で有益である。なぜなら、それらは、強磁性コアの場合に起こる周波数の増加に伴うエネルギー損失や磁心損失がないからである。ＬＣ回路は、共振周波数で振動する電気エネルギを蓄えることができる。キャパシタは、印加された電圧に対応するエネルギを、それらのプレート間の電場内に蓄える。インダクタは、通過する電流に対応するエネルギをその磁界内に蓄える。
【００３４】
マシュー方程式によれば、ＬＣ共振回路のランプ電圧を、ｑｚが不安定領域に達してトラップからイオンが放出されるポイントまで増加することができる。なぜなら、ｑｚはイオンの質量に反比例し、その質量が増加するにしたがって、放出ポイントまでｑｚを上昇させるために必要な電圧が増加するからである。大きい生体分子および高分子量の検体の場合、ＬＣ回路の電圧は、イオントラップのセンタ―リングとエンドキャップとの間で電気絶縁破壊が生じるような極端に高い電圧に上昇させなければならない。
【００３５】
電気絶縁破壊を回避するために、イオントラップの場合、周波数走査方法が行われてもよい。特定の共振周波数に同調させる場合、イオントラップは可変キャパシタに接続される。可変キャパシタのキャパシタンスは、ＬＣ回路の共振周波数を得るために機械的または電気的に制御することができる。インダクタの値が一定の場合、可変キャパシタのキャパシタンスを、ステップ走査において、特定の共振周波数を得るために利用することができる。しかしながら、機械的なコントローラを用いる場合、特定の周波数を、周期の一定数分の間維持することは困難である。また、特定の周波数を次の共振周波数にステップさせることが困難である。また、機械的なコントローラを用いる場合、ある共振周波数を次の共振周波数にステップさせ、各ステップを位相のゼロ位置から開始させることは困難である。
【００３６】
このＬＣ回路の問題を解消するために、周波数掃引走査方法を利用することができる。線形チャープの正弦波形を、周波数が時間とともに線形的に増加するまたは減少するように設定することができる。チャープ信号は、電圧制御発振器を介するアナログ電子機器と、制御周波数を線形的にまたは指数関数的に変化させることとによって生成することが可能である。それは、デジタル−アナログコンバータ（ＤＡＣ）によってデジタル的に発生させることができる。
【００３７】
一般に、イオントラップの場合、Ｕの値はゼロに等しくされる。
【００３８】
本開示の周波数掃引走査方法において、正弦波の高電圧は、４００ボルトまたは８００ボルトに固定される。これにより、有利に、高圧力条件下において電極間の放電破壊が回避される。
【００３９】
図２は、本開示の三次元イオントラップ質量分析計の実施の形態を示している。イオントラップのセンターリング電極をトラッピングＲＦ周波数Ωで駆動することができ、またイオントラップのエンドキャップ電極は軸方向の補足的な励起を受けることができる。ステップ関数発生器は、分析ＲＦステップ周波数走査と軸方向の共鳴励起ＲＦステップ周波数走査とを提供する。
【００４０】
関数発生器を用いることにより、調整可能な短時間の間、周波数は、線形掃引的に減少方向に掃引されることができる。イオンは、高い開始周波数を用いるによってトラップされ、低い周波数に減少させる方向に掃引することにより、小さい質量から大きい質量まで放出される。したがって、関数発生器は、Ωｔ（Ω＝２πｆ）の周波数を発生させることができる。無線周波数は、分子イオンの質量に対応する。
【００４１】
関数発生器の出力電圧は、イオンを直接トラップするには低すぎるかもしれない。関数発生器の出緑電圧は、高圧電力用演算増幅器を用いて増幅することができる。演算増幅器の出力電圧は、低周波数から高周波数までほとんど同じである。
【００４２】
マシュー方程式の解によれば、ＲＦ電圧（Ｖ）が掃引走査に適合する場合、分子イオンの質量はＲＦ周波数（Ω）に対応する。
【００４３】
例えば、ＤＳ３４５任意関数発生器は、図３に示すような周波数掃引を実行することができる。掃引によって周波数が減少するまたは増加してもよく、線形的または対数的な掃引が実行されてもよい。ある複数の周波数での掃引中は、不連続部すなわちバンドスイッチングアーチファクトが存在しない。全周波数範囲にわたって滑らかに位相が連続する掃引を実行することができる。この周波数掃引の欠点は、位相の制御に欠ける、すなわち、連続する特定の周波数それぞれが任意の位相で始まり、位相のゼロから始まらないことである。この周波数掃引の別の欠点は、周波数の変化の制御が掃引時間の設定に限定されることである。
【００４４】
図３に示す線形掃引モードは、全周波数範囲の掃引に限定される。さらに、特定の周波数では、次の周波数に変化する前に、完全な周期で終了しない。したがって、周波数の変化を明確に定義することができない。
【００４５】
こららの欠点のために、特定の周波数の観測される波形は、次の周波数に変化する前に、一周期を完全に終了しない。したがって、イオン放出信号が、正確な周波数に対応していない可能性がある。これは、高解像度質量分析計にとっては重大な欠点である。
【００４６】
この問題を解決するために、また駆動ＲＦの周波数および位相に対する最高の制御を提供するために、本開示は質量分析計用のシーケンスコントローラを提供する。シーケンスコントローラは、図４に示すようなイオン検出のためのタイミング図を提供する。いくつかの実施の形態において、シーケンスコントローラは、一般的な汎用コンピュータ（ＰＣ）とステップ関数発生器を含んでいる。
【００４７】
図４に示す実験的な実施の形態において、検出器が動作中の期間はイオン検出期間である。検出器の動作中、軸方向の共鳴励起の周波数が１５０ｋＨｚから５０ｋＨｚに向かって段階的に減少され、分析ＲＦの周波数が３００ｋＨｚから１００ｋＨｚに向かって段階的に減少される。イオンを発生させるためのレーザー発射は、検出期間前に発生する。
【００４８】
本開示の方法において、ステップ周波数走査は、シーケンスコントローラを用いた波形の直接デジタル合成によって実行される。全ての時間で、特定の周波数および位相を備える波形を生成することができる。正弦波形の周波数の変化を正確に制御することができ、特定の周波数を、一定数の完全な周期の間、正確に維持することができる。本開示のステップ走査法は、個々の周波数ステップそれぞれにおいて、質量分析データの獲得を正確に制御することができる。
【００４９】
本開示のいくつかの実施の形態において、正弦波形は、ＡＤ５９３０波形発生器を用いることによって発生される。ＡＤ５９３０は、周波数領域および時間領域の両方においてデジタル的にプログラム可能な波形シーケンスを提供することができる一般的な汎用の波形発生器である。このデバイスには、周波数制御を向上させることができ、ユーザによるプログラム可能な周波数プロファイルの繰り返し掃引を提供するデジタル処理が内蔵されている。このデバイスがプログラム可能であることにより、特定の波形の発生において、ＤＳＰからの連続的な書き込みサイクルが取り除かれる。このＡＤ５９３０を用いることにより、波形は、既知の位相から開始することができ、位相シフトを容易に判定するために位相が連続するように増加する。
【００５０】
本開示のある実施の形態において、周波数プロファイルが開始周波数（Ｆｓｔａｒｔ）、周波数増分（Δｆ）、および１スキャンあたりの増分の回数（Ｎｉｎｃ）によって定義されているステップ走査が行われる。例えば、図５は、ＦｓｔａｒｔからＦｓｔａｒｔ＋（Ｎｉｎｃ×Δｆ）まで増分したステップ走査を示している。特定の周波数それぞれは周期の数個分の間維持され、検出器はその信号を集積し、それにより、それぞれの特定の周波数において、次の周波数に変化する前に、検出されるイオンを完全に放出することができる。このステップ走査の利点は、放出周波数とイオン信号との関係を正確に定義することができる点である。さらに、本開示のステップ走査法は、有利に、各周波数ステップの開始時の位相を制御することができる。
【００５１】
一例において、正弦波形発生器のクロック周波数は５０ＭＨｚである。ＡＤ５９３０は、２４ビットのデジタル出力を備える。Ｎｉｎｃは、４０９６ポイントに設定される。特定の周波数それぞれを維持するための周期の数は１２０（Ｎｃｙｃｌｅ）である。開始周波数Ｆｓｔａｒｔは３００ｋＨｚである。フォームウェア周波数ステップＤＦｒｅｑは、（３０００００−１０００００）／［４０９６｛５０Ｅ＋６／（２Ｅ＋２４−１）｝＝１６．３８Ｈｚであり、四捨五入すると１６Ｈｚである。差分周波数ステップは、１６＊｛５０Ｅ＋６／（２Ｅ＋２４−１）｝＝４７．６８Ｈｚである。最終周波数は、３０００００−［１６＊｛５０Ｅ＋６／（２Ｅ＋２４−１）｝＊４０９６］＝１０４６８７．５Ｈｚである。
【００５２】
さらに、増分量Δｆは、各ステップにおいて正または負でもよく、また、ステップ走査の周波数が大きいまたは小さい任意の大きさずつ増加するまたは減少するように任意の大きさであってもよい。
【００５３】
本開示の周波数走査法は、粗いまたは細かい異なる差分周波数ステップを正確に制御することができる。本開示の周波数走査法は、高解像度で高速に走査することができる。
【００５４】
本開示の周波数走査法は、イオン信号と走査周波数との間の関係を正確に確立することができる。
【００５５】
さらなる実施の形態においては、トラッピング周波数が一定の電圧振幅で減少されてもよい。
【００５６】
さらなる別の実施の形態においては、正弦波形が、高圧電力用演算増幅器を用いることによって増幅される。例えば、最大１００ｍＡの連続的な出力電流と容量性負荷に供給される最大２００ｍＡのパルス電流とを駆動するように構成された、高電圧用のＭＯＳＦＥＴ演算増幅器であるＡＰＥＸ  ＰＡ９４が使用されてもよい。
【００５７】
図６に示す実施例においては、アンジオテンシンの質量スペクトルが、ＭＡＬＤＩ源に接続されたステップ走査によって得られた。周波数差分は４０９６ステップに分割され、各ステップは、１２０個の周期分の間維持される。したがって、この開示は、大きい生体分子の質量スペクトルを得るための方法を提供する。
【００５８】
図７に示すさらなる実施例においては、ステップ走査法を用いることにより、免疫グロブリンＧ（Ｍ．Ｗ．１５０ｋＤａ）の質量スペクトルが得られた。したがって、この開示は、非常に大きい生体分子の質量スペクトルを得るための方法を提供する。
【００５９】
共鳴励起に関して、イオントラップの軸方向に沿って補助的な周期的に振動するＡＣ電場が加えられる。補助的な周期的に振動する電場の周波数はイオンの長期周波数（ωｚ）と等しい。周波数は、イオンの運動エネルギが増加するとともにイオンの軌道が拡大するように、軸方向のイオンの長期運動と共鳴する。最終的に、イオンは、イオントラップのエンドキャップの穴を通過する。基本周波数は、長期周波数に関連し、ωｚ＝（１／２）βｚΩで表すことができる。
【００６０】
ステップ走査法によって質量分析を実行するために、基本周波数は線形的に変化されてもよく、ｑｚはある値に固定される。それゆえ、補助ＡＣの周波数は、共鳴励起式によって基本周波数に比例して変化されてもよい。この方法は、ＰＡ９４によって増幅される２つの正弦波形を生成するために、２つの波形発生器、例えば２つのＡＤ５９３０を使用する。基本トラッピングＲＦはセンターリングに印加されてもよく、共鳴励起ＲＦは、双極子カップリング放出（ｄｉｐｏｌｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ）であるエンドキャップに印加される。βｚが１と等しい場合、全ての周波数ステップ走査の間、長期周波数は基本周波数の半分に設定される。
【００６１】
本開示の周波数走査法は、基本トラッピング周波数と補助周波数との間の比を正確に確立することができる。
【００６２】
付加的な態様において、本発明は、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、共役タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖などの生体分子を、高い検出効率および高解像度で検出可能な質量分析装置および方法を提供してもよい。
【００６３】
いくつかの実施の形態において、本発明の方法は、ナノ粒子、ウイルス、および他の生物学的構造と、最大約５０ナノメートルの大きさまたはそれ以上の大きさの細胞小器官の質量スペクトルを得るために使用してもよい。
【００６４】
いくつかのバリエーションにおいては、本開示の装置および方法は、小さい分子イオンの質量スペクトルを提供することができる。
【００６５】
質量分析におけるイオン化の方法の例として、レーザーイオン化、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーイオン化、サーモスプレーイオン化、熱イオン化、電子イオン化、化学イオン化、誘導結合プラズマによるイオン化、グロー放電イオン化、電界脱離イオン化、高速原子衝突イオン化、スパークイオン化、イオン付着イオン化が挙げられる。
【００６６】
別段定義されていなければ、本明細書で使用されている全ての技術的用語および化学的用語は、本発明の分野の当業者によって通常理解される意味を持つ。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等の任意の方法や材料が本発明の実行や試験において用いることができるが、本明細書に記載されている方法や材料が好ましい。
【００６７】
本明細書で具体的に言及されている出版物、特許、および文献の全ては、全ての目的のための参照することにより組み込まれている。先行発明による開示に対して本発明が先行しないと解釈されるものが、本明細書内には存在しない。
【００６８】
記載されている特定の方法、プロトコル、材料、および試薬は変更可能であるため、これらによって本発明は限定されないと理解される。また、本明細書で使用されている専門用語は、特定の実施の形態を説明する目的のみに使用され、添付のクレームによって包含されうる本発明の範囲を制限する意図はない。
【００６９】
本明細書および添付のクレームにおいて使用されている、単数形”ａ”、”ａｎ”、および”ｔｈｅ”は、その文脈が明確に断らないかぎり、複数の意味を含んでいることに留意すべきである。その上、用語”ａ”（または”ａｎ”）、”１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）”、および”少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）”は、本明細書においては同じ意味で使用されている。また、用語”有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、”有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、”含む（ｃｏｎｔａｉｎｇ）”、”含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”、および”備える（ｈａｖｉｎｇ）”は同じ意味で使用されている。
【００７０】
さらなる詳細なしに、当業者であれば、上述に基づいて、本発明を最大限の範囲で利用することができると考えられる。それゆえ、以下の特定の実施の形態は、単なる例示にすぎず、いかなる何らかの残りの開示を限定するものではないと解釈される。
【００７１】
本明細書で開示されている全ての特徴は、いかようにも組み合わせることができる。本明細書で開示されている特徴それぞれは、同一、または均等、あるいは類似の目的を果たす代わりの特徴と替わることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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