(57)【要約】  本発明は、肺癌に罹患している個体において、早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するための方法であって、以下のステップを包含している方法に関する：ａ）肺癌に罹患している個体の試料を供与するステップ、ｂ）上記試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）のレベルを決定するステップ、ｃ）上記試料において決定されたＨＳＰ２７のレベルと、早期の肺癌を有する対照個体および／または進行期の肺癌を有する対照個体の試料において測定されたＨＳＰ２７の参照範囲と、を比較するステップ、ｄ）試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、進行期の肺癌を有する対照個体の試料におけるＨＳＰ２７の参照範囲を下回っている場合、または早期の肺癌を有する対照個体における上記参照範囲以内である場合に、早期の肺癌であると診断し、試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、早期の肺癌を有する対照個体の試料におけるＨＳＰ２７の参照範囲を上回っている場合、または進行期の肺癌である対照個体における上記参照範囲以内である場合に、進行期の肺癌であると診断するステップ。
2014501383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌に罹患している個体において、早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するための方法であり、以下のステップを包含している方法：
ａ）肺癌に罹患している個体の試料を供与するステップ、
ｂ）上記試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）のレベルを決定するステップ、
ｃ）上記試料において決定されたＨＳＰ２７のレベルと、早期の肺癌を有する対照個体および／または進行期の肺癌を有する対照個体の試料において測定されたＨＳＰ２７の参照範囲と、を比較するステップ、
ｄ）試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、進行期の肺癌を有する対照個体の試料におけるＨＳＰ２７の参照範囲を下回っている場合、または早期の肺癌を有する対照個体における上記参照範囲以内である場合に、早期の肺癌であると診断し、試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、早期の肺癌を有する対照個体の試料におけるＨＳＰ２７の参照範囲を上回っている場合、または進行期の肺癌を有する対照個体における上記参照範囲以内である場合に、進行期の肺癌であると診断するステップ。
【請求項２】
国際肺癌学会（ＩＡＳＣＬ）によって定義されているように上記早期の肺癌はステージＩａからＩＩｂであり、上記進行期の肺癌はステージＩＩＩａからＩＶであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記試料は、血液試料であり、好ましくは血清試料または血漿試料であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
免疫測定法によって、好ましくは競合免疫測定法または非競合免疫測定法によって、より好ましくはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、側方流動式免疫測定法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって、ＨＳＰ２７のレベルが決定されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
早期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、３０００〜４４００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは３５００〜４２００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
進行期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、少なくとも４６００ｐｇ／ｍｌであり、好ましくは４６００〜６０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは５０００〜５６００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、肺癌に罹患している個体において、早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するための方法に関する。
【０００２】
肺癌は、世界的な死亡率の観点から見れば、最も一般的な癌である。世界の一年あたりの罹患率は１２０万件、死亡率は１１０万件と推定されている。肺癌は、男性においては間違いなく最も一般的な癌であり、女性においては乳癌に次いで、二番目に多い悪性腫瘍である。
【０００３】
肺癌の予後はこの２０年間にほとんど改善されておらず、新しく発見された癌症例の多くは依然として致命的な経過をたどっている。現在、５年生存率は、男性で１０％、女性で１４％であるが、診断の時間に大きく依存する。限局期（local stage）において２９〜４３％である５年生存率は、それゆえ、局所期（regional stage）において１１〜１６％、遠隔期（distant stage）において１〜２％の生存率に直面する。
【０００４】
依然として予後不良である肺癌の増加は、一次予防、早期の検出および診断に対する適切なアプローチの重要性を示している。効果的な予防によって肺癌と同じくらいの死亡が防がれている癌の形態は他にない。
【０００５】
肺癌に罹患している患者は、手術、放射線治療、化学療法およびそれらの組み合わせを包含する様々な方法によって治療され得る。手術は、良好かつ一般的な健康状態にある早期癌患者に対する一次治療である。手術の目標は、全ての癌細胞を完全に除去し、その結果、治すことである。癌を除去しようと試みた後に癌が再発した場合であっても、再発した癌はしばしば二回目の手術によって除去される。放射線治療は一次治療として適用することができ、手術前には癌を縮小するために適用され、手術後には治療部位に残った癌細胞または体の他の部位に広がった癌細胞を除去するために適用され得る。化学療法は、癌細胞に対して毒性を有する薬剤を包含する。上記薬剤は通常、静脈に対して直接注射されるか、または大静脈に配置されたカテーテルを介して投与される。しばしば手術後に残存している癌細胞の小さな集団を除去するために行われるが、化学療法はまた、手術を受けることができない患者において癌の増殖を遅らせて症状を緩和し得る。
【０００６】
肺癌に罹患している患者に対して最適な治療法を適用するために、疾患がどのステージまで既に進行しているのかを知ることが重要である。もし患者が早期の肺癌に罹患しているのであれば、手術を任意で他の治療法と組み合わせることが、当該患者の体から癌を除去するために選択される方法である。もし患者が進行期の肺癌であると診断された場合、手術は当該患者を治療するための第一の方法とはならないであろう。当該ケースでは、他の方法を適用する必要がある。
【０００７】
初期の臨床症状を見誤ると、肺癌の早期検出はスクリーニング試験でしか達成することができない。スパイラルコンピュータ断層撮影（ＣＴ）および自家蛍光気管支鏡検査法等の技術によれば、ミリメートル未満の肺癌まで検出できる。しかしながら、たとえ長期喫煙者であっても、肺癌のリスクにおいては幅広いバリエーションがあるため、上記の高感度な技術は、一般集団におけるスクリーニング手段ほど実用的または費用対効果的ではないものになっている。肺癌になるリスクが最も高い喫煙者を特定するためのフィルターの適用によって、上記スクリーニング手段の陽性的中率は改善され得る。血液に基づいたバイオマーカーは魅力的なフィルターである。なぜなら血液は容易に利用することができ、測定が長期にわたって繰り返され得るためである。
【０００８】
いくつかの研究は、異なるバイオマーカーの発現が肺癌の細胞系において頻繁に起こることを示している。また、多くの著者が、血液における上記マーカーの存在を、疾患の進展、予後、および治療への応答の指標として考慮している。いくつかの腫瘍マーカー（ＮＳＥ、クロモグラニン、ＣＥＡ、ＴＰＡおよびＣＹＦＲＡ  ２１−１）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と同様に、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する多くの患者において評価されている。しかしながら、上記の病状の診断および追究は依然として満足できるものではない。
【０００９】
本発明の目的は、肺癌の様々なステージを識別するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明は、肺癌に罹患している個体において、早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するための方法であって、以下のステップを包含している方法に関する。
ａ）肺癌に罹患している個体の試料を供与するステップ、
ｂ）上記試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）のレベルを決定するステップ、
ｃ）上記試料において決定されたＨＳＰ２７のレベルと、早期の肺癌を有する対照個体および／または進行期の肺癌を有する対照個体の試料において測定されたＨＳＰ２７の参照範囲と、を比較するステップ、
ｄ）試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、進行期の肺癌を有する対照個体の試料におけるＨＳＰ２７の参照範囲を下回っている場合、または早期の肺癌を有する対照個体における上記参照範囲以内である場合に、早期の肺癌であると診断し、試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、早期の肺癌を有する対照個体の試料におけるＨＳＰ２７の参照範囲を上回っている場合、または進行期の肺癌を有する対照個体における上記参照範囲以内である場合に、進行期の肺癌であると診断するステップ。
【００１１】
ヒートショックプロテインは、その分子量によってファミリーに分類され、ストレスを受けた多くの細胞において発現が増加する高度に保存された分子である。実際に、ヒートショックプロテインは、細胞の生存および細胞保護に関連したいくつかの機能に関わっている。他の機能のなかでも、ＨＳＰはまた、細胞分裂に必要とされることが知られている。
【００１２】
癌における発現パターンは、通常の細胞において観察される発現パターンとしばしば異なる：いくつかのストレス誘導性ＨＳＰは、ほとんどの場合、構成的かつ高度に発現される。いくつかのＨＳＰの発現の増加は、肺癌を包含するいくつかのヒトの癌において記録されている。
【００１３】
肺癌に罹患している患者から得られる試料におけるＨＳＰ２７の決定により、上記疾患の様々なステージを識別することが可能となり、当該患者を治療するために最適な方法を内科医が適用することが可能となることが判明した。進行期の肺癌に罹患している患者におけるＨＳＰ２７のレベルは、早期の肺癌に罹患している患者におけるＨＳＰ２７のレベルに比べて有意に高い。後者の患者のグループは、健康な個体に比べて有意に高いＨＳＰ２７のレベルを示す。
【００１４】
内科医にとって、患者が早期の肺癌または進行期の肺癌のどちらに罹患しているのかを知ることは重要である。一般的に、早期の肺癌に罹患している患者は、進行期の肺癌に罹患している患者とは別の方法によって治療され得る。通常、早期の肺癌に罹患している患者は、まだ外科的方法によって治療され得るが、一方、進行期の肺癌に罹患している患者他の方法によって治療される。
【００１５】
「早期の肺癌に罹患している対照個体」および「進行期の肺癌に罹患している対照個体」とは、早期の肺癌および進行期の肺癌に罹患していると診断されている個体の集団を指す。当該個体の集団は、少なくとも５個体、好ましくは少なくとも１０個体、より好ましくは少なくとも２０個体、さらにより好ましくは３０個体を含んでおり、全ての個体は各ステージにおいて肺癌に罹患していると診断されている。
【００１６】
咳または胸の痛みを評価するために行われた胸部Ｘ線において異常な点が見つかった後、しばしば肺癌が疑われる。
【００１７】
肺癌が疑われる場合、まず、徹底的な病歴および身体検査が行われる。当該検査は、肺癌の症状および危険因子を評価するため、ならびに、肺癌を示唆する身体的徴候を探すために行われる。これらには、咳の特徴の変化、異常な肺音、喀血、呼吸困難またはリンパ節腫大が包含され得る。
【００１８】
胸部Ｘ線は通常、慎重な病歴および身体検査に基づいたあらゆる懸念事項を評価するために行われる最初の検査である。当該検査によって、肺の中の塊またはリンパ節腫大が示されるかもしれない。時には胸部Ｘ線では異常がなく、懸念されている肺癌を探すために更なる検査が必要とされる。塊が見出された場合であっても、当該塊は常に癌性であるわけではなく、更なる検査が必要とされる。
【００１９】
ＣＴスキャンはしばしば、胸部Ｘ線による異常な発見を引き続き調べるため、または胸部Ｘ線にて異常がなかった患者における厄介な症状を評価するための第二段階である。
【００２０】
ＣＴ／ＰＥＴ融合イメージングは、ＣＴスキャンの技術をＰＥＴ（ポジティブエミッショントモグラフィ(positive emission tomography)）スキャンの技術と組み合わせたものである。ＰＥＴスキャンは、糖をベースとした放射性医薬品を導入することを伴う。当該放射性医薬品は、体中を移動し、器官および組織に集まるものであり、代謝的に活性である。ＰＥＴスキャンは体の中の癌細胞を検出するために使用され、ＣＴスキャンは当該癌の位置およびサイズを決定し得る詳細な画像を提供する。上記タイプのスキャンは、活発に成長する腫瘍を定義する点で他のスキャンと異なる。
【００２１】
画像化に基づいて肺癌が疑われた後には、診断を確認するため、および、癌のタイプを決定するために組織の試料が必要とされる。喀痰細胞診は、これを行うための最も簡単な方法であるが、その使用は、気道へと拡大している腫瘍に限定される。喀痰細胞診は、常に正確であるとは限らず、いくつかの癌細胞を見逃し得る。
【００２２】
中心に位置するプロセス（central located processes）の場合、診断および組織学的検査は、気管支鏡検査法、気管支内病変の生検、気管支肺胞洗浄、または経気管支針生検によって確認され得る。
【００２３】
気管支鏡検査法または同様の手段によって腫瘍へ到達することができない場合、細針吸引（ＦＮＡ）またはビデオ補助胸腔鏡検査（ＶＡＴＳ）を行ってもよい。これらによって、腫瘍の試料を取得するために、胸壁を介して中空針が挿入され（ＦＮＡ）、それぞれ小さな切り口を介して胸腔鏡が挿入される。
【００２４】
一旦肺癌の診断が行われれば、遠隔転移を除外するために画像調査（例えば、ｘ線、ＣＴスキャン、骨のスキャン）を検討することによって、上記患者が手術の候補となるかどうかについて、腫瘍学のチームが決定する。
【００２５】
転移の証拠がない場合、上記患者は縦隔鏡検査法、縦隔の外科的検査を受けてもよい。
【００２６】
いくつかの肺癌のタイプがあり、最良の治療の選択肢を選択するために、肺癌の型を決定することが重要である。世界保健機関（ＷＨＯ）が提案している分類に従って、光学顕微鏡的基準によって病理学者が分類を行う。
【００２７】
治療法の選択は、肺癌に対する予後診断と同様に、特定の癌のタイプおよび診断された時点でのステージの両方に依存し、大きく異なり得る。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「参照範囲」は、上述の対照個体において決定されたＨＳＰ２７のレベルの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、特に１００％以内のＨＳＰ２７のレベルの範囲である。上記「参照範囲」は、ＨＳＰ２７の最小および最大のレベルを含む。当該レベルは、上記「参照範囲」の上限および下限を定義する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「参照範囲を下回っている」とは、決定されたレベルが全体として上記「参照範囲」を下回っている、または上記「参照範囲」より低いということを意味する。換言すれば、上記決定されたレベルは、上記「参照範囲」のＨＳＰ２７の最小レベルまたはより低いレベルを下回っているか、またはそれらに比べて低い。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「参照範囲を上回っている」とは、決定されたレベルが全体として上記「参照範囲」を上回っている、または上記「参照範囲」より高いということを意味する。換言すれば、上記決定されたレベルは、上記「参照範囲」のＨＳＰ２７の最大レベルまたはより高いレベルを上回っているか、またはそれらに比べて高い。
【００３１】
「上記参照範囲以内」とは、本発明に従って決定されたＨＳＰ２７のレベルが、上記のように定義された参照範囲の間にあることを意味する。
【００３２】
他の方法において、カットオフレベルを定義することもまた可能である。上記カットオフレベルは、定義されたＨＳＰ２７のレベルが当該カットオフ値を上回っている、または下回っている患者が、早期または進行期の肺癌に罹患しているかどうかを示すための境界としての機能を果たす。それゆえ、本発明はまた、肺癌に罹患している個体において、早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するための方法であって、以下のステップを包含している方法に関する。
ａ）肺癌に罹患している個体の試料を供与するステップ、
ｂ）上記試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）のレベルを決定するステップ、
ｃ）上記試料において決定されたＨＳＰ２７のレベルと、健康な個体（すなわち、癌、または、ＨＳＰ２７の発現率の増加に関連した他の疾患に罹患していない個体）、ならびに／または早期の肺癌および／もしくは進行期の肺癌に罹患している個体におけるＨＳＰ２７のカットオフレベルと、を比較するステップであって、上記カットオフレベルは早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するステップ、
ｄ）試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、進行期の肺癌を罹患していることを示すカットオフ値を少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、下回っている場合、および／または健康な個体のカットオフ値を上回っている場合に、上記個体において早期の肺癌であると診断し、試料ａ）におけるＨＳＰ２７のレベルが、早期の肺癌を罹患していることを示すカットオフ値を少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、上回っている場合に、上記個体において進行期の肺癌であると診断するステップ。
【００３３】
上記カットオフレベルは、少なくとも５個体、好ましくは少なくとも１０個体、より好ましくは少なくとも２０個体、さらにより好ましくは少なくとも３０個体におけるＨＳＰ２７のレベルの平均または中央値を決定することによって、決定され得る。上記個体は、それらの全てがそれぞれのステージにおいて肺癌に罹患していると診断されているか、または健康な個体である。早期の肺癌を診断するためのカットオフは、上述のように定義された進行期の肺癌に罹患している対照個体において決定されたＨＳＰ２７のレベルの最も低い平均もしくは中央値であってもよく、または多数の健康な個体において見出されたＨＳＰ２７のレベルの最も高い平均もしくは中央値であってもよい。進行期の肺癌を診断するためのカットオフは、上述のように定義された早期の肺癌に罹患している対照個体において決定されたＨＳＰ２７のレベルの最も高い平均もしくは中央値であってもよい。
【００３４】
本発明によれば、国際肺癌学会（the International Association for the Study of Lung Cancer）（ＩＡＳＣＬ）によって定義されているように、上記早期の肺癌はステージＩａからＩＩｂであり、上記進行期の肺癌はステージＩＩＩａからＩＶである。
【００３５】
肺癌のステージの定義は、どのタイプの治療法が適用される必要があるかを決定するために必要不可欠である。従って、多くの腫瘍に対して一般的に受け入れられるステージの分類システムの発展がもたらされている。国際対癌協会（ＵＩＣＣ）および対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）は、上記ステージ分類システムを定義し、定期的に再検討し、改良している公的機関としての機能を果たしている。
【００３６】
１９９８年に、国際肺癌学会（ＩＡＳＬＣ）が、多くの専門分野にわたるメンバーによる国際病期分類委員会(International Staging Commitee)（ＩＳＣ）を創設し、非小細胞肺癌を有する患者６８，４６３名および小細胞肺癌を有する患者１３，０３２名を集め、１９９０年〜２０００年まで登録または診断を行った。上記の記録は、腫瘍、結節、転移（ＴＮＭ）分類を分析するために十分な情報を有していた。Ｔ、Ｎ、Ｍ記述子は分析され、生存率の違いに基づいて、ＴＮＭ分類の第７版における変更が推奨されている（Goldstraw et al., J Thorac Oncol. Aug 2007;2(8):706-714）。
【００３７】
ＵＩＣＣ  ＴＮＭ悪性腫瘍の分類−第７版（UICC (International Union Against Cancer) TNM Classification of Malignant Tumors - 7th edition. Sobin LH, Gospodarowicz M, Wittekind C ISBN: 978-1-4443-3241-4, Dec 2009）
【００３８】
【表１】
2014501383.tif 000003
【００３９】
【表２】
2014501383.tif 000004
【００４０】
【表３】
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【００４１】
【表４】
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【００４２】
所定の患者に対して治療法の推薦を行う前に、腫瘍のサイズ、リンパ節の状態、および転移が存在する可能性を確認しなければならない。肺癌はしばしば門および縦隔において流入領域リンパ節まで広がる。縦隔の病変（Ｎ２）は、もしそれが重要な縦隔構造に近接している場合は、患者をより高度なステージに配置することになり、腫瘍を切除不能にし得る。
【００４３】
臨床病期分類は、ＣＴによって決定されたリンパ節のサイズに基づいている。ごく最近までは、１０〜１５ｍｍの通常の結節に対するカットオフを使用した場合、ほんの４０〜７０％のリンパ節転移を検出するための感度および特異度しか提供できなかった。しかし、当該アプローチが唯一の非侵襲型の選択肢であった。たとえ小さな末梢のＴ１病変であっても、しばしば低リスクの縦隔への拡大を伴うと考えられ、しばしば上記リンパ節に及ぶ。
【００４４】
陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）は、縦隔の評価のための重要な非侵襲的検査として現れた。当該アプローチは、腫瘍は画像化可能な放射性標識グルコースの取り込みを増加させるという原則に基づいて機能する。いくつかの試行からの既往のデータは、ＰＥＴを使用した縦隔における肺癌の病期分類に対して、それぞれ８５％の感度および８８％の特異度を示唆しており、プロスペクティブ研究の結果は上記発見を支持している。
【００４５】
ＰＥＴおよびＣＴの組み合わせは、いずれかの方法を単独で用いる場合に比べてさらに大きな感度および特異度を有すると考えられる。ＰＥＴおよびＣＴの両方の使用は、術前評価の一部として積極的に考慮されるべきである。
【００４６】
縦隔の評価において最も基準となる検査は、気管支鏡検査法（または、必要であればより侵襲的な縦隔鏡検査法）によるリンパ節生検である。治癒の可能性がある疾患を治療不能である疾患と区別するため、縦隔の疾患の存在を示す放射線検査に続いて、腫瘍が切除不能であるとみなされる前に、特定された結節の生検が行われるべきである。しかしながら、本発明の方法によれば、生検を行う必要はない。さらに、本発明の方法は、低減された期限の中で信頼できるデータを提供する。
【００４７】
完全な外科的切除は、ステージＩ−ＩＩの細胞の肺癌を有する個体に対する治療の選択肢として考えられる。手術は、切除（肺全摘除術または肺葉切除）および縦隔リンパ節のマッピングを包含するべきである。腫瘍が切除可能であり、縦隔リンパ節が病変している場合は、完全なリンパ節の解離が行われるべきである。
【００４８】
ステージＩＩＩの腫瘍、または重要な構造に浸潤している腫瘍は、しばしば切除不能またはわずかに切除可能であると表される。長年にわたり、上記腫瘍に対する治療法の中心は、放射線治療であった（総線量６０Ｇｙ）。限局的な再発のリスクは減少するが、長期的な生存率は依然として良くなかった（５パーセント）。いくつかの第２相試験の結果によって、放射線治療に化学療法を追加するための予備的なサポートが提供された。上記の組み合わせによるアプローチの画期的な試行によって、３年生存率（１１パーセントと比較して、２３パーセント）および長期的な生存率が増加することが実証された。
【００４９】
現在、ステージＩＩＩＢまたはＩＶまで疾患が進行している患者は事実上、治らないだろう。化学療法は、転移性の疾患に対する治療法の重要な要素であるが、反応率は低く、生存期間は良くない。以前は、治療の毒性が利点を上回ると考えられていたため、進行期の肺癌を有する多くの患者は治療を受けなかった。しかしながら現在は、治療が有益であり得ることは明らかである。いくつかのメタ分析によって、化学療法を用いた場合に、最良の対症療法に比べて生存率の穏やかな増加が報告されている。生存率の中央値の増加は、２〜４か月の範囲内であると考えられ、１年生存率の増加は１０〜２０パーセントの範囲であると考えられる。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記試料は、血液試料であり、好ましくは血清試料または血漿試料である。
【００５１】
ＨＳＰ２７のレベルは血液試料またはその画分において決定され得ることが判明した。このことは、迅速かつ信頼性のある診断を可能にするという点で特に有利である。
【００５２】
試料においてＨＳＰ２７のレベルを決定する方法は、当該技術分野においてよく知られている。本発明の好ましい実施形態においては、免疫測定法によって、好ましくは競合免疫測定法または非競合免疫測定法定によって、より好ましくはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、側方流動式免疫測定法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって、ＨＳＰ２７のレベルが決定される。
【００５３】
上述のアッセイは、ＨＳＰ２７に対して特異的に結合することが可能な分子を含んでいる。上記分子は、例えば、抗体または、ＨＳＰ２７に対して結合することが可能なその断片であってもよい。
【００５４】
用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体または抗原に結合可能なこれらの断片をいう。ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって選択される断片のみならず、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＦａｂもしくはＦｖ断片等の抗体断片等の、他の抗体および抗体断片等も、本明細書に記載された方法において有用である。
【００５５】
ポリクローナル抗体と同様、モノクローナル抗体の調製方法は十分に確立されている（Harlow E. et ah, 1988. Antibodies. New York: Cold Spring Harbour Laboratory）。ポリクローナル抗体は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダおよびウマを含む様々な種において、標準的な免疫および採血手段を用いて産生させられる。高い抗体価を有している動物の血液は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿等の所定の選択的な塩析手段によって分画される。そして特異的な免疫グロブリン画分は、標準的な方法に従って、プロテインＡセファロースおよびレプチンセファロースカラムにおける連続的な親和性クロマトグラフィーによって分離される。精製されたポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と同様に、その後、特異性に関して特徴付けられる。そのような特徴付けは、抗体結合に関する標識されていない潜在的な交差反応体のレベルを増加させた競合において、放射性同位体またはビオチン等のトレーサーを用いて標識されたタンパク質を用いた標準的な方法によって実施される。結合研究は、還元条件または非還元条件下における、十分に確立されたドデシルスルホン酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンイムノブロット法等の他の標準的な方法によってさらに評価される。
【００５６】
モノクローナル抗体は、十分に確立された標準的な実験手段に従って調製される。この技術は、免疫された動物から脾臓細胞を除去し、そしてミエローマ細胞との融合またはエプスタイン−バーウイルスを用いた形質転換によって抗体産生細胞を不死化し、そしてその後、所望の抗体を発現しているクローンをスクリーニングすることによって行われる。しかし、当該技術分野において公知の他の技術も用いられ得る。抗体は、限定されないが、特異的なＤＮＡを用いた免疫を含む、当業者にとって公知の他の方法によっても生産される。
【００５７】
好適に用いられる免疫測定法は、興味のある抗原または固相の支持体に結合された抗原に対して特異的に結合し得る捕捉抗体を利用する技術に基づいている。捕捉抗体は、必要とされる分析的要件および／または固相の分離要件に応じて、標準的な非共有結合法もしくは共有結合法を用いて、種々の固相の支持体と結合されているか、または連結されている。固相の支持体は、試験管、ビーズ、微粒子、濾紙、膜、ガラスフィルター、磁気粒子、ガラスもしくはシリコンチップ、または当業者に公知である他の材料およびアプローチの形態である。抗体を用いて直接被覆された微粒子、特に、磁化できる粒子（磁気粒子−捕捉抗体）または一般的な結合剤（例えば、アビジンまたは抗種抗体）を用いて標識された粒子の使用は、上記アッセイのインキュベーション時間を大幅に短縮するために有用である。当該技術分野において公知の他の代替的な方法を加えたこれらの方法は、必要な感度を制限することなく数分以内にアッセイを完了させることを可能にする。
【００５８】
興味がある抗原に対して特異的に結合し得る検出抗体は、抗原の検出のために用いられ、レポーター分子に直接連結されるか、または二次的な検出系によって間接的に検出される。後者は、標識された抗種抗体および免疫学的もしくは非免疫学的な架橋の他の形態による抗体認識、並びにシグナル増幅検出系（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン法）を含む、当該技術分野において公知のいくつかの異なる原理に基づいている。シグナル増幅の方法は、測定の感度および低レベルの再現性および性能を大幅に向上するために用いられる。直接的または間接的な抗体結合のために用いられる標識は、あらゆる検出可能なレポーター分子である。適切な標識の例は、酵素等の他の適切な薬剤によって検出され得た成分のみならず、蛍光体、発光標識、金属複合体および放射性標識等の免疫学的および非免疫学的な検出系の分野において広範に用いられているもの、または酵素等の直接的もしくは間接的な標識と発光性の基質との種々の組合せである。
【００５９】
早期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルは、好ましくは３０００〜４４００ｐｇ／ｍｌであり、好ましくは３５００〜４２００ｐｇ／ｍｌである。
【００６０】
進行期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルは、好ましくは少なくとも４６００ｐｇ／ｍｌであり、好ましくは４６００〜６０００ｐｇ／ｍｌであり、より好ましくは５０００〜５６００ｐｇ／ｍｌである。
【００６１】
健康な個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルは、好ましくは最大２５００ｐｇ／ｍｌであり、好ましくは５００〜２５００ｐｇ／ｍｌであり、より好ましくは１０００〜２１００ｐｇ／ｍｌである。
【００６２】
もちろん、上記値は、上記ＨＳＰ２７のレベルを決定するために使用される方法に応じて変化し得る。
【００６３】
ＨＳＰ２７のレベルはまた、治療の進展をモニタリングするために用いられ得る。本明細書において提示されるデータによって、肺癌の治療の成功をモニタリングすることも可能である。健康な個体におけるＨＳＰ２７のレベルは、肺癌に罹患している患者におけるＨＳＰ２７のレベルに比べて低いことが知られている。治療の進展をモニタリングするための方法は、治療の間の所定の時点におけるＨＳＰ２７の決定を含んでいてもよい。ＨＳＰ２７のレベルの低下は、治療が成功しているか、または上記個体の健康において治療に有利な効果を有していることを示している。
【００６４】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかし、これらに制限されることはない。
【００６５】
図１は、患者の血清試料におけるＨＳＰ２７の決定を示している。
【００６６】
図２は、患者の血清試料におけるＨＳＰ７０の決定を示している。
【００６７】
図３は、一変量ロジスティック回帰モデルを示している。
【００６８】
〔実施例〕
＜材料と方法＞
総数１８７名の患者および対照が、当該ケースコントロール研究に含まれた。
【００６９】
肺癌の臨床的徴候がない健康な有志の被験者（ｎ＝３６）、早期に診断された肺癌を有する患者（ｎ＝６３）、および進行期に診断された肺癌を有する患者（ｎ＝９９）を、３つの試験群において評価した。
【００７０】
早期、進行期それぞれの分類は組織学的な記述に基づき、ＩＡＳＣＬ肺癌病期分類プロジェクトに従う(Tsim S, et al. Respir Med. 104(2010):1767-1774) [Zitat in Ordnung?]。早期にはＩＡＳＣＬステージＩａからＩＩｂが包含され、進行期にはステージＩＩＩａからＩＶが包含される。
【００７１】
患者の特徴を表１に示す：
【００７２】
【表５】
2014501383.tif 000007
【００７３】
血液試料は、本研究への最初の参加の時点で採集された。血清は、遠心分離後に取得され、アリコートはさらなる試験まで−８０℃で冷凍保存された。
【００７４】
ヒートショックプロテイン２７の測定
ＨＳＰ２７の血清レベルは、適合させた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Duoset IC; R&D Systems, USA）を用いて決定された。
【００７５】
９６ウェルマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの濃度の捕捉抗体を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートのブロッキング後、異なる濃度の血清試料および標準タンパク質をウェルに加えた。洗浄工程の後、ビオチンによって標識された抗体を各ウェルに加え、２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加えた。テトラメチルベンジジン（TMB; Sigma, USA）を用いて着色反応を達成し、酸停止溶液を用いて当該反応を停止した。光学濃度をＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍにて測定した。
【００７６】
ヒートショックプロテイン７０の測定
ＨＳＰ７０の血清レベルは、適合させた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Duoset IC; R&D Systems, USA）を用いて決定された。
【００７７】
９６ウェルマイクロタイタープレートを、２μｇ／ｍｌの濃度の捕捉抗体を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートのブロッキング後、異なる濃度の血清試料および標準タンパク質をウェルに加えた。洗浄工程の後、ビオチンによって標識された抗体を各ウェルに加え、２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加えた。テトラメチルベンジジン（TMB; Sigma, USA）を用いて着色反応を達成し、酸停止溶液を用いて当該反応を停止した。光学濃度をＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍにて測定した。
【００７８】
＜結果＞
ヒートショックプロテイン２７
ＨＳＰ２７の血清レベルは、健康な対照群において１７５１ｐｇ／ｍｌ[±１１３．３１] (平均値[±SEM])、上述のように定義された早期に診断された癌を有する患者において３８５６ｐｇ／ｍｌ[±２１５．５７]、上述のように定義された進行期に診断された癌を有する患者において５３５０ｐｇ／ｍｌ[±２５４．２３]であった。３つの群の全ての間に、統計的に有意な差が見出された（各ケースにおいてｐ＜０．００１）（図１）。
【００７９】
ヒートショックプロテイン７０
ＨＳＰ７０の平均の血清レベルは、健康な対照群において４５１ｐｇ／ｍｌ[±４１．１９] (平均値[±SEM])、早期に診断された癌を有する患者において６７９ｐｇ／ｍｌ[±５３．９３]、進行期に診断された癌を有する患者において７７７ｐｇ／ｍｌ[±５７．９３]であった。統計的に有意な差は、健康な対照群と２つの癌グループとの間に見出されたが（ｐ＜０．００１）、異なるステージにおいて診断された癌を有する２つのグループの間には見出されなかった（図２）。
【００８０】
回帰モデル
健康な有志の被験者および肺癌であると診断された患者のみを含む一変量ロジスティック回帰モデルにおいて、ＨＳＰ２７は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線における曲線下面積（ＡＵＣ）が０．９２０（±０．０２７；ｐ＜０．００１）であった（図３）。
【００８１】
＜考察＞
ヒートショックプロテインは、細胞の保護および細胞の生存において鍵となる役割を果たしている。ヒートショックプロテインはまた、細胞分裂において必要とされていることも知られており、細胞増殖にも寄与し得る。
【００８２】
細胞質ゾルにおける保護的な役割とは別に、細胞外空間または原形質膜において存在する場合、ＨＳＰは免疫系の刺激において重要な役割を果たすことが見出されている。インビトロにおいて、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０ファミリーのメンバーは、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の媒質において検出されている。細胞外のＨＳＰおよび膜結合型ＨＳＰの免疫学的役割は明らかであると考えられるが、原形質膜への輸送、膜への固定、および搬出の機構は謎のままである。
【００８３】
いくつかの機構は、脂質成分との直接的な相互作用を介した、ホスファチジルセリンへの結合後のフリップフロップ機構を介した、またはネクローシスによる、ＨＳＰの細胞遊離の主な原因となり得る。当該細胞遊離は、シャトル機能（shuttle functions）を果たす膜貫通ドメインを有する他のタンパク質と呼応した媒質への搬出を包含する。
【００８４】
ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、およびＧｐ９６等のＨＳＰは、細胞外媒質において見出されている。
【００８５】
本実施例において、肺癌を有する患者の末梢血流に由来する血清試料におけるＨＳＰ２７の増加を示すことができた。さらに当該結果によって、血清ＨＳＰ２７濃度が疾患の重症度に伴って連続的に増加することが実証された。
【００８６】
それゆえ、ＨＳＰ２７の血清における含有量は、肺癌の発生を決定する診断の可能性を示しており、疾患の進行を診断および予測するためのマーカーとして機能し得る。さらに、肺癌を有する患者の血清におけるＨＳＰ２７のレベルは、特に根治目的の手術が可能であるかどうかについて疑問が生じた場合に、治療法の決定のための根拠を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、患者の血清試料におけるＨＳＰ２７の決定を示している。
【図２】図２は、患者の血清試料におけるＨＳＰ７０の決定を示している。
【図３】図３は、一変量ロジスティック回帰モデルを示している。
【図１】
2014501383.tif 000008
【図２】
2014501383.tif 000009
【図３】
2014501383.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月17日(2013.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌に罹患している個体において、早期の肺癌と進行期の肺癌とを識別するための方法であり、以下のステップを包含している方法：
ｂ）肺癌に罹患している個体の試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）のレベルを決定するステップ、
ｃ）上記試料において決定されたＨＳＰ２７のレベルと、早期の肺癌を有する対照個体および／または進行期の肺癌を有する対照個体の試料において測定されたＨＳＰ２７の参照範囲と、を比較するステップ。
【請求項２】
国際肺癌学会（ＩＡＳＬＣ）によって定義されているように上記早期の肺癌はステージＩａからＩＩｂであり、上記進行期の肺癌はステージＩＩＩａからＩＶであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記試料は、血液試料であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
免疫測定法によって、ＨＳＰ２７のレベルが決定されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
早期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、３０００〜４４００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
進行期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、少なくとも４６００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記試料は、血清試料または血漿試料であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
競合免疫測定法または非競合免疫測定法によって、ＨＳＰ２７のレベルが決定されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、側方流動式免疫測定法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって、ＨＳＰ２７のレベルが決定されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
早期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、３５００〜４２００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
進行期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、４６００〜６０００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
進行期の肺癌を有する対照個体における上記ＨＳＰ２７の参照レベルが、５０００〜５６００ｐｇ／ｍｌであることを特徴とすることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
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