(57)【要約】  本開示の実施形態は、糖化工程前のｐＨ調整なしに、デンプン含有基質から高密度グルコースシロップ及び高グルコース発酵原料といった下流生成物を生成するプロセスに関する。糖化は、ｐＨ  ５．２〜５．６の範囲においてグルコアミラーゼによって効果的に触媒される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ調整なしにグルコアミラーゼの存在下でデンプン基質をグルコ−スに糖化することを含むデンプンの処理方法であって、糖化が、ｐＨ  ５．２〜５．６、及び約５８〜約６２℃の温度範囲で実施され、該グルコアミラーゼが、配列番号３を含む親フミコーラグリセアグルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）及びその変異体からなる群から選択され、該変異体は、該親グルコアミラーゼと少なくとも９９％の同一性を有する、処理方法。
【請求項２】
糖化が、プルラナーゼの存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異体グルコアミラーゼが、前記親グルコアミラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記グルコアミラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨｇＧＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記グルコアミラーゼが、トリコデルマレーシ宿主細胞内で生成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記グルコアミラーゼが、少なくとも約０．１５ＧＡＵ／ｇ量の乾燥物質デンプンで添加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記グルコアミラーゼが、少なくとも約０．２０ＧＡＵ／ｇ量の乾燥物質デンプンで添加される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
糖化が、ｐＨ  ５．３５〜５．５にて実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記デンプン基質が液化デンプンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
糖化が、約７０時間で少なくとも９５％のＤＰ１濃度に達する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記デンプン基質が、約３０〜約５０％の乾燥固体（ＤＳ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記デンプン基質が、約３０〜約３５％の乾燥固体（ＤＳ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記デンプン基質が顆粒デンプンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
糖化が、約２８時間で少なくとも９５％のＤＰ１濃度に達する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記デンプン基質のデンプン溶解度が少なくとも９０％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
糖化が、約５０時間で少なくとも９６％のＤＰ１濃度に達する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記デンプン基質のデンプン溶解度が少なくとも９７％である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
高糖含有量が１％未満である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記デンプン基質が、約２８％の乾燥固体（ＤＳ）である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は２０１１年４月２９日出願の米国特許仮出願６１／４８１，０８４号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
配列番号１〜３を含む配列表を添付し、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【０００３】
（発明の分野）
液化と糖化との間でのｐＨ調整なしに、（例えば穀物などの）デンプン含有材料から高密度グルコースシロップ及び発酵原料といった下流生成物を生成するためのプロセスが開示される。
【背景技術】
【０００４】
典型的に、グルコースはデンプン処理の生成物である場合があり、デンプン処理は、液化と糖化とを含む２段階の酵素処理で、デンプンの分解を触媒する工程である場合がある。液化中、不溶性顆粒デンプンは一般的に水中でスラリー状になり、加熱により糊化し、熱安定性α−アミラーゼにより加水分解される。商業的なほとんどの液化プロセスに現在用いられているα−アミラーゼは、ｐＨ  ４．８〜５．２の酸性レベルにおいて安定しないため、（例えば水酸化ナトリウム若しくは水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、又はアンモニアなどの）好適なアルカリを使用してスラリーのｐＨをｐＨ  ５．６〜６．０に調整する。したがって、液化は通常、約５．６〜６．０のｐＨで実施される。
【０００５】
糖化中、液化で生成された可溶性デキストリンは、グルコアミラーゼで更に加水分解されて糖を生成する。グルコアミラーゼはエキソ作用型カルボヒドラーゼであり、デンプンの直鎖状及び分枝状両方のグリコシド結合（例えばアミロース及びアミロペクチン）を加水分解することが可能である。市販のグルコアミラーゼは通常、酸性ｐＨ範囲（５．０未満）において最適なｐＨを有する。その結果、液化物のｐＨは、糖化を実施するために、例えば希釈酸（例えば硫酸）を用いて、典型的に約４．２〜４．５の範囲の酸性に調整される。したがって、現在、高密度グルコースシロップ及び高グルコース発酵原料などの所望の最終生成物を得るための液化及び糖化プロセスは、異なるｐＨレベルで実施される。例えばグルコースといった低分子糖類などの発酵性糖は、続いて他の酵素（例えばグルコースイソメラーゼ）によってフルクトースに転換することができ、結晶化することができ、又は発酵に使用されて多くの最終生成物（例えば、アルコール類、グルタミン酸モノナトリウム、コハク酸、ビタミン類、アミノ酸類、１，３−プロパンジオール、及び乳酸）を生成することができる。
【発明の概要】
【０００６】
ｐＨレベルを液化後及び糖化前に調整する必要があるために、現在利用可能なデンプン含有材料の処理方法は追加の化学物質の使用を必要とし、そのため生成原価が増大する。糖化に適した条件を提供するために液化工程後に必要なｐＨ調整は、反応媒質中に高い塩蓄積及び高い硫黄含量をももたらして、廃棄の環境的な問題を生む可能性がある。したがって、商業上、異なるｐＨレベルでの液化及び糖化の実施が不要な、高密度グルコースシロップ及び高グルコース発酵原料といった最終生成物を生成する方法に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、液化後及び糖化前にｐＨを調整する必要なしに、単一ｐＨプロセスにより高密度グルコースシロップ及び高グルコース発酵原料を生成する方法を提供する。本方法は、特定のグルコアミラーゼの際立った特性を利用する。フミコーラグリセアグルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）及びその変異体などのグルコアミラーゼは、例えば、アスペルギルスニガー（ＡｎＧＡ）及びタラロマイセスエマーソニー（Talaromyces emersonii）（ＴｅＧＡ）からのグルコアミラーゼ（ＧＡ）といった既知のグルコアミラーゼよりも高い最適ｐＨを有する。したがって、本方法で使用されるグルコアミラーゼは、５．２〜５．６の範囲のｐＨ、及び約５８〜約６２℃の範囲の温度の条件下で、デンプン基質を糖化して高密度グルコースシロップ及び高グルコース発酵原料を効果的に生成することが可能である。ＨｇＧＡグルコアミラーゼはこの特性のために、高密度グルコースシロップ及び高グルコース発酵原料を生成するためにデンプンの液化及び糖化のための単一ｐＨプロセスで使用できる。今回開示する方法はまた、グルコアミラーゼをプルラナーゼと組み合わせることでプロセスの効率を向上させることも可能である。
【０００８】
一態様では、グルコアミラーゼは、配列番号３を含む親フミコーラグリセアグルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）、及び親グルコアミラーゼと少なくとも９９％の同一性を有する変異体からなる群から選択される。別の態様では、グルコアミラーゼは親グルコアミラーゼと比較して１つのアミノ酸の修飾を有する。更なる態様では、グルコアミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨｇＧＡである。任意で、グルコアミラーゼは、トリコデルマレーシ宿主細胞内で生成される。
【０００９】
一実施形態において、グルコアミラーゼは、少なくとも約０．１５ＧＡＵ／ｇ量、又は少なくとも約０．２０ＧＡＵ／ｇ量の乾燥物質デンプンで添加される。
【００１０】
一態様では、糖化は、ｐＨ  ５．３５〜５．５にて実施される。別の態様では、糖化に使用されるデンプン基質は、液化デンプンである。更なる態様では、糖化は、約７０時間で少なくとも９５％のＤＰ１濃度に達する。
【００１１】
一実施形態において、デンプン基質は、約３０〜約５０％、又は約３０〜約３５％の乾燥固体（ＤＳ）である。
【００１２】
別の態様では、デンプン基質は顆粒デンプンであり、糖化は、約２８時間で少なくとも９５％のＤＰ１濃度に達し、デンプン基質のデンプン溶解度は少なくとも９０％である。
【００１３】
一実施形態において、糖化は、約５０時間で少なくとも９６％のＤＰ１濃度に達し、デンプン基質のデンプン溶解度は少なくとも９７％である。
【００１４】
加えて、高糖含有量は１％未満であり得る。更に、デンプン基質は、約２８％の乾燥固体（ＤＳ）であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
添付図面が本明細書に組み込まれるが、多様な実施態様の説明を限定するものではない。図面は次の通りである。
【図１】糖化プロセス中に蓄積したグルコース（ＤＰ１）濃度の経時変化。実施例１及び表１に記載の通り、単一ｐＨ糖化は、０．１８グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇ量の乾燥物質デンプンでＨｇＧＡを使用して実施された。
【図２】単一ｐＨ（α−活性（α-live））糖化プロセス中に蓄積したＤＰ１濃度の経時変化。糖化は、実施例２及び表２（フラスコ１〜４）に記載される酵素濃度を使用して、実施例２及び表２（フラスコ１〜４）に記載される条件で、ＨｇＧＡ、又はプルラナーゼの存在下のＨｇＧＡを用いて実施された。
【図３】糖化プロセス中に蓄積したＤＰ１濃度の経時変化。ここで糖化前に液化物のｐＨを４．０未満に低下させることによりα−アミラーゼを不活性化した（α−不活性（α-killed））。糖化は、実施例２及び表２（フラスコ５〜８）に記載される酵素濃縮を使用して、実施例２及び表２（フラスコ５〜８）に記載される条件で、ＨｇＧＡ、又はプルラナーゼの存在下でのＨｇＧＡを用いて実施された。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、液化工程後のｐＨ調整なしに、ｐＨ約５．２〜５．６にてデンプン基質を効果的に糖化できるグルコアミラーゼに関する。
【００１７】
いつくかの態様では、本開示の実施形態は、遺伝子工学及び分子生物学の分野で日常的な技術及び方法に依拠する。以下の文献は、本開示に従った有用な一般的手法の説明を含む：ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．，１９８９）、ＫｒｅｉｇｌｅｒのＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）。本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示の属する技術分野の業者により一般に同じ意味を持つ。ＳｉｎｇｌｅｔｏｎらのＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ  ＆  ＭａｒｋｈａｍのＴｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示に使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。本開示を実施又は試験する上で、本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、代表的な方法及び材料が以下に記載される。数範囲は、範囲を定義する数を含む。本開示で提供される見出しは、様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本開示において参照として用いられ得るものである。
【００１８】
１．定義及び略記
この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義を適用する。本明細書で使用するとき、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある酵素」への言及には、複数のそのような酵素が含まれる。
【００１９】
１．１．定義
本明細書で使用する時、「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義であり、場合によっては、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【００２０】
本明細書で使用する時、用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」とは、ゲノム、合成又は組み換え起源に由来する配列を意味し、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかで、二本鎖又は一本鎖であることができる。本明細書で使用する時、用語「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを指す。核酸の残基は、当該分野で一般的に知られかつ用いられる任意の化学的修飾を含み得る。
【００２１】
「単離される」とは、材料が、自然に結合している及び自然に見られる少なくとも１つの他の成分から少なくとも実質的に遊離することを指す。
【００２２】
「精製される」とは、材料が、例えば少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度と、比較的純粋な状態であることを指す。
【００２３】
「オリゴ糖」とは、３〜２０の単糖類から構成される炭水化物分子を指す。
【００２４】
本明細書で使用する時、「形質転換細胞」とは、組み換えＤＮＡ技術を用いて形質転換された細胞を含む。典型的に形質転換は、細胞への１つ以上のヌクレオチド配列の挿入により起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、非相同のヌクレオチド配列、すなわち融合タンパク質のような、形質転換されるべき細胞が本来有していない配列であり得る。
【００２５】
本明細書で使用する時、「デンプン」とは、アミロース及びアミロペクチンで構成され、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、ここで「Ｘ」が任意の数字であり得る、植物の複合多糖炭水化物からなる材料を指す。特に、この用語は、穀類、草類、塊茎類及び根類、より具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、サトウモロコシ、糠、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカを含むがそれらに限定されない植物系材料を指す。
【００２６】
本明細書で使用する時、「顆粒デンプン」とは、糊化を受けていない非加熱（生）のデンプンを指す。
【００２７】
本明細書で使用する時、「デンプン糊化」とは、デンプン分子が可溶化して粘性の懸濁液を形成することを指す。
【００２８】
本明細書で使用する時、「糊化温度」とは、デンプン基質の糊化が発生する最低温度を指す。正確な温度は特定のデンプン基質によって決定され、更に、デンプンが得られた植物種の特定の種類及び増殖条件によって決定され得る。
【００２９】
「ＤＥ」及び「デキストロース当量」とは、還元糖に転換された総固形分の割合として算出した、総還元糖の濃度を測定するための業界基準である。加水分解されていない顆粒デンプンのＤＥは約ゼロ（０）であり、Ｄ−グルコースのＤＥは約１００である。
【００３０】
本明細書で使用する時、「デンプン基質」とは、精製デンプン、全粉砕穀類（whole ground grains）、又は破片化穀類（fractionated grains）を使用した顆粒デンプン又は液化デンプンである。
【００３１】
本明細書で使用する時、「液化デンプン」とは、例えば、従来型のデンプン液化処理などの可溶化処理で処理されたデンプンを指す。
【００３２】
「重合度（ＤＰ）」とは、所定のサッカリド中に含まれるアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例は、グルコ−ス及びフルクトースといった単糖類である。ＤＰ２の例は、マルトース及びスクロースといった二糖類である。ＤＰ４＋（＞ＤＰ４）は、４を超える重合度のポリマーを指す。
【００３３】
本明細書で使用する時、「発酵性糖」とは、発酵条件下で代謝可能なサッカリド類を指す。これらの糖は通常、グルコース、マルトース、及びマルトトリオースを指す（ＤＰ１、ＤＰ２、及びＤＰ３）。
【００３４】
本明細書で使用する時、用語「総糖含量」は、デンプン組成物中に存在する総糖含量を指す。
【００３５】
本明細書で使用する時、「ｄｓ」とは、溶液中に溶解した固形分を指す。
【００３６】
本明細書で使用する時「デンプン液化酵素」とは、顆粒デンプンの加水分解又は分解を触媒する酵素を指す。代表的なデンプン液化酵素としては、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）が挙げられる。
【００３７】
「アミラーゼ」とは、とりわけ、デンプンの分解を触媒することが可能な酵素を指す。
【００３８】
「α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）」とは、デンプン分子内のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合をランダムな方式で開裂するエンド作用型酵素を指す。一方で、β−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２、α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）及びマルトジェニックα−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）といった、生成物特異的アミラーゼなどのエキソ作用型デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を開裂する。これらの酵素は、１，４−α−結合Ｄ−グルコース単位を含有する多糖中の１，４−α−Ｄ−グリコシド結合のエキソ作用型又はエンド作用型加水分解に作用するものとしても報告されている。これらの酵素を記載するのに使用される別の用語は、グリコゲナーゼである。代表的な酵素としては、α−１，４−グルカン４−グルカノヒドロラーゼが挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用する時、「グルコアミラーゼ」とは、アミログルコシダーゼクラスの酵素（ＥＣ  ３．２．１．３、グルコアミラーゼ、α−１，４−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）を指す。これらはエキソ作用型の酵素であり、アミロース及び／又はアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を遊離する。これらの酵素はまた、α−１，６及びα−１，３結合を加水分解することも可能であるが、α−１，４結合の加水分解よりもはるかに遅い速度で加水分解する。
【００４０】
本明細書で使用する時、「最大活性」とは、例えば最適ｐＨにおいてなどの最も有利な条件下で測定された酵素活性を指す。本明細書で使用する時、「最適ｐＨ」とは、他の条件が等しいときに、酵素が最も高い活性を示すｐＨ値を指す。
【００４１】
タンパク質又はポリペプチドの「成熟型」という用語は、タンパク質又はポリペプチドの最終機能形態を指す。グルコアミラーゼの成熟型は、例えばシグナルペプチド及び／又は開始メチオニンが欠失されている場合がある。グルコアミラーゼの成熟型は、例えば内因性発現によって、その天然の宿主から生成することができる。あるいは、グルコアミラーゼの成熟型は、例えば外因性発現によって、その非天然の宿主から生成することができる。外因的に発現されたグルコアミラーゼは、内因的に発現された対応物と比較して多様なグリコシル化パターンを有し得る。
【００４２】
用語「親」又は「親配列」とは、天然の又は天然に発生した配列を指す。
【００４３】
本明細書で使用する時、用語「変異体」とは、親グルコアミラーゼの配列に対してある程度のアミノ酸配列の同一性を有するグルコアミラーゼに関して使用される。変異体は親配列と類似しているが、そのアミノ酸配列に少なくとも１つの置換、欠失、又は挿入を有して、親グルコアミラーゼと異なる配列を有する。場合によっては、変異体は操作及び／又は改変されて、そのアミノ酸配列に少なくとも１つの置換、欠失、又は挿入を含んで、親と異なる配列を有する。加えて、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの機能特徴を保持、例えば、親グルコアミラーゼの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のグルコアミラーゼ活性を維持し得る。
【００４４】
本明細書で使用する時、「デンプンの加水分解」は、水分子の添加によるグリコシド結合の開裂を指す。
【００４５】
本明細書で使用する時、「最終生成物」又は「所望の最終生成物」とは、酵素及び／又は微生物によってデンプン基質が転換した後の分子又は化合物を指す。
【００４６】
本明細書で使用する時、「接触」又は「混合」とは、（１つ又は複数の）酵素が基質を最終生成物に転換することができるために、それぞれの（１つ又は複数の）酵素をそれぞれの基質に十分に近接させて設置することを指す。当業者は、酵素溶液をそれぞれの基質と混ぜることが接触又は混合に影響を与え得ることを理解するであろう。
【００４７】
１．２．略語
別途記載のない限り、以下の略号を使用する。
【００４８】
【表１】
2014512829.tif 000003
【００４９】
２．デンプン処理における酵素
２．１．グルコアミラーゼ
２．１．１．所望のｐＨプロファイルを有するグルコアミラーゼ
グルコアミラーゼは、多くの細菌類、菌類、酵母、及び植物の菌株から生成される。多くの真菌グルコアミラーゼは、例えばアスペルギルス（ＳｖｅｎｓｓｏｎらのＣａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５２９〜５４４（１９８３）、ＢｏｅｌらのＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７〜１１０２（１９８４）、ＨａｙａｓｈｉｄａらのＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３〜９２９（１９８９）、米国特許第５，０２４，９４１号、米国特許第４，７９４，１７５号及びＰＣＴ公報ＷＯ  ８８／０９７９５号）、タラロマイセス（米国特許第４，２４７，６３７号、米国特許第６，２５５，０８４号、及び米国特許第６，６２０，９２４号）、リゾプス（ＡｓｈｉｋａｒｉらのＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：９５７〜９６４（１９８６）、ＡｓｈｉｋａｒｉらのＡｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：１２９〜１３３（１９８９）及び米国特許第４，８６３，８６４号）、フミコーラ（ＰＣＴ公報ＷＯ  ０５／０５２１４８号及び米国特許第４，６１８，５７９号）、並びにムコール（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ−ＬａｒｓｅｎらのＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６２：２１０〜２１７（２００３））の菌株からなど、細胞外で生成される真菌酵素である。これらの酵素をコード化する遺伝子の多くがクローン化され、酵母、真菌、及び／又は細菌の細胞内で発現される。
【００５０】
商業的に、グルコアミラーゼは、（例えば、デンプンからグルコース及びその他の単糖類を生成するために）非常に重要な酵素であり、デンプンの加水分解を必要とする多様な用途に使用されてきた。グルコアミラーゼは、米国の甘味料市場で５０％超を占める高フルクトーストウモロコシ甘味料の生産に使用される。一般的に、グルコアミラーゼは、デンプンをデキストリンに、次いでグルコ−スに加水分解するために、デンプン加水分解プロセスにおいてα−アミラーゼとともに使用される可能性があり、通常は使用される。続いてグルコ−スを他の酵素（例えば、グルコースイソメラーゼ）によってフルクトースに転換し、結晶化し、又は発酵に使用して（例えば、エタノール、クエン酸、コハク酸、アスコルビン酸中間体、グルタミン酸、グリセロール、１，３−プロパンジオール、及び乳酸などの）多くの最終生成物を生成することができる。
【００５１】
本開示の実施形態は、例えばｐＨ  ５．２〜５．６でデンプン基質を効果的に糖化することが可能なグルコアミラーゼを使用する。所望のｐＨプロファイルを有するグルコアミラーゼには、フミコーラグリセアグルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
ＨｇＧＡは配列番号３のアミノ酸配列を含むグルコアミラーゼであってよく、これは米国特許第４，６１８，５７９号及び同第７，２６２，０４１号に詳述されている。このＨｇＧＡは、顆粒状のデンプンを加水分解することが可能であるため、顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥ）とも記載される。フミコーラグリセア種サーモイデアからＨｇＧＡをコード化するゲノム配列は、配列番号１として表され、３つの推定イントロンを含有する（位置２３３〜３０７、７５２〜８１７、及び９５０〜１００６）。フミコーラグリセア種サーモイデア由来の天然ＨｇＧＡは配列番号２のアミノ酸配列を有し、３０のアミノ酸残基（配列番号２の位置１〜３０）を含有するシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドの開裂は、配列番号３のアミノ酸配列を有する成熟ＨｇＧＡをもたらす。本開示の実施形態はまた、例えばトリコデルマレーシ細胞などのトリコデルマ宿主細胞から生成したＨｇＧＡも含む。米国特許第７，２６２，０４１号を参照されたい。
【００５３】
２．１．２．構造及び機能
本開示の実施形態のグルコアミラーゼは、ＨｇＧＡの変異体であってもよい。変異体は、親グルコアミラーゼと少なくとも９９％の配列同一性を有する。任意で、変異体は、親グルコアミラーゼの成熟型と比較して、１、２、３、４、５、又は６のアミノ酸の修飾を有する。一実施形態において、グルコアミラーゼは、配列番号３を含む親ＨｇＧＡの変異体であり、変異体は、親グルコアミラーゼと少なくとも９９％の同一性を有する。変異体は、所望のｐＨプロファイル、及び５．２〜５．６の範囲のｐＨでデンプン基質を糖化する能力を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、改善された熱安定性及び改良された特異性などの、その他の改善された特性を有することができる。
【００５４】
グルコアミラーゼは３つもの異なる構造ドメインからなる：すべてのグルコアミラーゼ内に構造的に保存されたおよそ４５０の残基からなる触媒ドメイン、通常は続いて３０〜８０の残基からなるリンカー領域、それがおよそ１００の残基からなるデンプン結合ドメインと連結する。３つ領域のいずれも損なわれていないトリコデルマレーシグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の構造を１．８オングストローム分解能で決定した。ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００９／０４８４８８号及び同第ＷＯ  ２００９／０４８４８７号を参照されたい。決定した座標を用いて、構造体を、先に決定されたアスペルギルスアワモリ株Ｘ１００由来のグルコアミラーゼの触媒ドメインの座標に合わせて配置した（Ａｌｅｓｈｉｎ，Ａ．Ｅ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．，Ｆｉｒｓｏｖ，Ｌ．Ｍ．，及びＨｏｎｚａｔｋｏ，Ｒ．Ｂ．のＲｅｆｉｎｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．Ｘ１００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５７５〜５９１（１９９４））。番号を参照されたい。ＴｒＧＡ及びアスペルギルスアワモリグルコアミラーゼの触媒ドメインの構造は非常に一致する点が多く、この構造的重複を基にして、等価の残基を同定することが可能である。番号を参照されたい。すべてのグルコアミラーゼが、基本構造を共有すると更に考えられる。番号を参照されたい。
【００５５】
グルコアミラーゼの周知の構造及び機能の関連性を考慮して、変化した特性を有するグルコアミラーゼ変異体が成功裡に作り出され、特徴づけられてきた。変異体は、親グルコアミラーゼと比較して改善された特性を示す場合がある。改善された特性には、向上した熱安定性及び向上した比活性が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、変化した特性を備えるＴｒＧＡ変異体を調製及び特徴づけする方法は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００９／０６７２１８号に記載されている。機能性ＴｒＧＡ変異体は、１つ以上の特異的な配列修飾を有することが確認されている。いくつかのＴｒＧＡ変異体は、例えば、複数の配列修飾を有する。ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００９／０６７２１８号は、例えば、６つ以上のアミノ酸修飾を有するＴｒＧＡ変異体を開示している。これらのＴｒＧＡ変異体は、少なくとも親ＴｒＧＡと同量の活性を示し、多くの場合は向上した特性を示す。ＨｇＧＡ内の対応する残基を変更することによりグルコアミラーゼ活性を備える変異体が生み出されることが期待される。本方法で有用なグルコアミラーゼ変異体は、５．２〜５．６の範囲のｐＨでデンプンを効率的に加水分解することができる。
【００５６】
２．１．３．グルコアミラーゼの生成
本開示の実施形態に適したグルコアミラーゼは、様々な宿主細胞における組み換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌、真菌、植物、及び酵母の細胞から選択される。用語「宿主細胞」には、細胞及び細胞の子孫の両方、並びに本開示の変異グルコアミラーゼを生成するのに使用される細胞から作り出されたプロトプラストが含まれる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真菌細胞であり、典型的には糸状真菌宿主細胞である。用語「糸状真菌」は、ユーミコチナ（Eumycotina）下位部門のすべての糸状形態を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖類からなる細胞壁を有する栄養菌糸により特徴づけられる。本開示の糸状真菌は、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に、酵母とは区別される。糸状真菌による栄養成長は菌糸の伸長によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。本開示の実施形態において、糸状真菌親細胞は、トリコデルマ（例えばトリコデルマレーシ、ハイポクレアジェコリナの無性変異型であり、以前はトリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマビリデ、トリコデルマコニンギ、トリコデルマハルジアナムとして分類）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓら、（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４６〜５３、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５、及びＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）、ペニシリウム種、フミコーラ種（例えば、フミコーラインソレンス、フミコーララヌギノーサ、及びフミコーラグリセア）、クリソスポリウム種（例えば、クリソスポリウムラクノウェンス）、グリオクラジウム種、アスペルギルス種（例えば、アスペルギルスオリザエ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスソジャエ、アスペルギルスジャポニクス、アスペルギルスニデュランス、及びアスペルギルスアワモリ）（Ｗａｒｄら、（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、（２００２）Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９〜９８）、フサリウム種（例えば、フサリウムロゼウム、フサリウムグラミナム、フサリウムセレアリス、フサリウムオキシスポリウム、フサリウムベネナタム）、ニューロスポラ種（ニューロスポラクラッサ）、ハイポクレア種、ムコール種（ムコールミエヘイ）、リゾプス種、及びエメリセラ種の細胞であってよいが、それらに限定されない（Ｉｎｎｉｓら、（１９８５）Ｓｃｉ．２２８：２１〜２６も参照されたい）。用語「トリコデルマ」、「トリコデルマ種（Trichoderma sp.）」又は「トリコデルマ種（Trichoderma spp.）」は、従来又は現在リコデルマとして分類されている任意の真菌属を指す。他の実施形態においては、宿主細胞は、遺伝子組み換えされた宿主細胞となり、例えば真菌細胞を欠失させるなどして、天然の遺伝子が不活性化される。１つ以上の不活性化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることが望ましい場合、既知の方法を用いることができる（例えば、米国特許第５，２４６，８５３号、及び同第５，４７５，１０１号、並びにＰＣＴ公報ＷＯ  ９２／０６２０９号で開示される方法）。遺伝子の不活性化は、完全な又は部分的な欠失により、挿入による不��性化により、又は（遺伝子が機能性タンパク質の発現を阻害されるように）意図される目的のために遺伝子を非機能的にする任意の他の手段により、実行できる。いくつかの実施形態において、宿主細胞がトリコデルマ細胞、特にトリコデルマレーシ宿主細胞である場合、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２遺伝子が不活性化及び／又は典型的には欠失される。典型的には、クアッド欠失タンパク質を有するトリコデルマレーシ宿主細胞に関しては、米国特許第５，８４７，２７６号、及びＰＣＴ公報ＷＯ  ０５／００１０３６号に記載の上説明されている。他の実施形態において、宿主細胞はプロテアーゼ欠乏、又はプロテアーゼ欠損株である。
【００５８】
組み換えＤＮＡ技術を用いて本開示の実施形態のグルコアミラーゼを生成するために、指定されたグルコアミラーゼのアミノ酸配列をコード化する核酸を含むＤＮＡ構築体を、例えば、トリコデルマレーシ宿主細胞に構築及び転換することができる。ベクターは、トリコデルマレーシ宿主細胞に導入したとき、宿主細胞ゲノムに統合されかつ複製され得る任意のベクターであってよい。ベクターの一覧は、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ＜ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ＞）で参照される。好適な発現ベクター及び／又は統合ベクターの追加例は、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、上述のＡｕｓｕｂｅｌ（１９８７）、及びｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌら（１９９１）（Ｂｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅ編）、Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３９６〜４２８、並びに米国特許第５，８７４，２７６号に提供される。グルコアミラーゼをコード化する核酸は、トリコデルマレーシ宿主細胞内の転写活性を示す好適なプロモーターに操作可能に連結することができる。プロモーターは、宿主細胞に相同な又は非相同なタンパク質をコード化する遺伝子から得られるものであり得る。プロモーターの好適な非限定例には、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２が挙げられる。一実施形態において、プロモーターは天然のトリコデルマレーシプロモーターであり得る。典型的には、プロモーターは、誘導性プロモーターであり、登録番号Ｄ８６２３５でジェンバンク（GenBank）に預けられる、トリコデルマレーシｃｂｈ１であってよい。「誘導性プロモーター」は、環境的な又は発生的調節下で活性なプロモーターを指す場合がある。別の実施形態において、プロモーターはトリコデルマレーシ宿主細胞に非相同なプロモーターであってよい。有用なプロモーターの他の例には、アスペルギルスアワモリ及びアスペルギルスニガーグルコアミラーゼ遺伝子が挙げられる（例えば、Ｎｕｎｂｅｒｇら、（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４、２３０６〜２３１５及びＢｏｅｌら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３、１５８１〜１５８５を参照されたい）。また、トリコデルマレーシｘｌｎ１遺伝子及びセロビオヒドラーゼ１遺伝子のプロモーターも有用であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、グルコアミラーゼコード配列はシグナル配列と操作可能に連結することができる。シグナル配列は、グルコアミラーゼの天然のシグナルペプチドであり得る（例えば、ＨｇＧＡでは配列番号２の残基１〜２０）。あるいは、シグナル配列は、天然のシグナル配列に対して少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。追加の実施形態において、トリコデルマレーシ宿主細胞に導入されるＤＮＡ構築体又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、同じ供給源に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、シグナル配列は、ｃｄｈｌプロモーターと操作可能に連結するｃｄｈｌシグナル配列であり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、終止配列も含む場合がある。一実施形態において、終止配列及びプロモーター配列は、同じ供給源由来であり得る。別の実施形態では、終止配列は宿主細胞と相同であり得る。特に好適なターミネーター配列は、トリコデルマレーシ由来のｃｂｈ１であり得る。他の代表的な真菌ターミネーターとしては、アスペルギルスニガー、又はアスペルギルスアワモリのグルコアミラーゼ遺伝子由来のターミネーターが挙げられる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、選択マーカーを含み得る。代表的な選択マーカーの例としては、抗菌性耐性を付与するものが挙げられる（例えば、ハイグロマイシン及びフレオマイシン）。当技術分野においてａｍｄＳ、ａｒｇＢ、及びｐｙｒ４として知られるマーカーを含む栄養選択マーカーは、本開示においても有用である。ベクター系においてトリコデルマの形質転換に有用なマーカーは、当該技術分野において既知である（例えば、ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ第６章、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら編のＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９９２）第６章、及びＫｉｎｇｈｏｒｎら（１９９２）のＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎを参照されたい）。代表的な実施形態では、選択マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコード化して窒素源としてアセトアミド上で形質転換細胞を増殖させるａｍｄＳ遺伝子であってよい。選択マーカーとしてのアスペルギルスニデュランスａｍｄＳ遺伝子の使用に関しては、例えばＫｅｌｌｅｙら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４、４７５〜４７９、及びＰｅｎｔｔｉｌａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１、１５５〜１６４に説明されている。
【００６２】
グルコアミラーゼをコード化するポリヌクレオチドを有するＤＮＡ構築体を含む発現ベクターは、所定の真菌宿主生物内で自己複製可能な、又は宿主のＤＮＡに統合可能な、任意のベクターであってよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターはプラスミドであり得る。典型的な実施形態では、遺伝子を発現させるための２種類の発現ベクターが考えられる。
【００６３】
第１の発現ベクターは、プロモーター、グルコアミラーゼコード化領域、及びターミネーターのすべてが発現する遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝子トランケーションは、望ましくないＤＮＡ配列（例えば、不要なドメインをコード化するＤＮＡ）を欠失させて、それ自体の転写及び翻訳制御配列の制御下でドメインの発現を維持することで得ることができる。
【００６４】
第２のタイプの発現ベクターは、予め組み立てられ、かつ高レベルの転写に必要とされる配列及び選択マーカーを含有することができる。いくつかの実施形態において、グルコアミラーゼ遺伝子又はその一部に関するコード領域は、発現構築プロモーター配列及びターミネーター配列の転写制御下にあるよう、この汎用発現ベクターに挿入することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子又はその一部は、強力なｃｂｈ１プロモーターといった強力なプロモーターの下流に挿入することができる。
【００６５】
グルコアミラーゼ、プロモーター、ターミネーター、及び他の配列をコード化するポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ構築体を連結させ、かつそれらを好適なベクターに挿入するのに使用される方法は、当該技術分野において周知である。連結は、概して一般的な制限部位でライゲーションさせることで実行できる。このような部位が存在しない場合、従来法に従って、合成オリゴヌクレオチドリンカーを使用する。（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、及びＢｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅのＭｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）ｐｐ  ７０〜７６を参照されたい。）加えて、ベクターは、既知の組み換え法（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により構築することができる。
【００６６】
宿主細胞へのＤＮＡ構築体又はベクターの導入には、形質転換、電気穿孔法、核微量注入法、形質導入、トランスフェクション、（例えば、リポフェクションを介した、及びＤＥＡＥ−デキストリンを介したトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いたインキュベーション、ＤＮＡコーティングされた微粒子銃による高速導入、及びプロトプラスト融合といった技術が含まれる。一般的な形質転換技術は当該技術分野において既知である（例えば、上述のＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８７）、第９章、及び上述のＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、及びＣａｍｐｂｅｌｌら（１９８９）のＣｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６を参照されたい）。トリコデルマ内での非相同タンパク質の発現に関しては、米国特許第６，０２２，７２５号、同第６，２６８，３２８号、Ｈａｒｋｋｉら（１９９１）のＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７〜２３３、Ｈａｒｋｋｉら（１９８９）のＢｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：５９６〜６０３、欧州特許第２４４，２３４号、欧州特許第２１５，５９４号、及びＮｅｖａｌａｉｎｅｎらの「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、Ｌｅｏｎｇ及びＢｅｒｋａ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）ｐｐ．１２９〜１４８）に記載されている。
【００６７】
いくつかの実施形態において、遺伝子的に安定な形質転換体はベクター系により構築されることができ、それによってグルコアミラーゼをコード化している核酸を宿主株の染色体に安定的に統合する。続いて形質転換体を既知の技術で精製する。
【００６８】
１つの非限定的な例では、ａｍｄＳマーカーを含む安定的な形質転換体は、アセトアミドを含有する固体培地上で、そのより迅速な増殖速度、及び輪郭がでこぼこしておらず滑らかな円形コロニーの形成により、不安定な形質転換体から区別される。更に、場合によっては、非選択型の固体培地（すなわち、アセトアミドを欠く培地）で形質転換体を増殖させ、この培地から胞子を回収し、続いて出芽させかつアセトアミドを含有する選択培地で増殖するこれらの胞子の割合を判定することで、安定性を更に試験することができる。あるいは、当該技術分野において既知の他の方法を使用して形質転換体を選択することもできる。
【００６９】
宿主トリコデルマ種株へのＤＮＡ取り込みは、カルシウムイオン濃度に依存する。一般的に、約１０〜５０ｍＭのＣａＣｌ２が取り込み用溶液に使用され得る。取り込み溶液中にカルシウムイオンが必要とされるのに加えて、一般的に含まれる他の化合物は、ＴＥ緩衝液（トリス１０ｍＭ（ｐＨ  ７．４）、ＥＤＴＡ  １ｍＭ）又は１０ｍＭのＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ  ６．０）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの緩衝系である。ポリエチレングリコールが細胞膜を融合させるよう作用し、そうして培地の内容物をトリコデルマ種株の細胞質へ送達することで、プラスミドＤＮＡが核に移行されるものと考えられる。この融合は、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを高頻度に残す。
【００７０】
通常、密度１０５〜１０７／ｍＬ、典型的には２×１０６／ｍＬで透過処理を施したトリコデルマ種のプロトプラスト又は細胞を含有する懸濁液が、形質転換に使用される。適切な溶液（例えば、ソルビトール１．２Ｍ、ＣａＣｌ２  ５０ｍＭ）中の１００μＬの体積のこれらのプロトプラスト又は細胞を、所望のＤＮＡと共に混合する。一般的に、高濃度のＰＥＧを取り込み用溶液に添加することができる。０．１〜１体積の２５％のＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。プロトプラスト懸濁液に約０．２５体積を加えることも、典型的である。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、及び塩化カリウムなどの添加剤も形質転換時に取り込み用溶液に加えることができ、形質転換の助けとなり得る。同様の手順が他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号及び同第６，２６８，３２８号を参照されたい。
【００７１】
一般的に、続いて１０〜３０分間にわたり混合物をおよそ０℃でインキュベートすることができる。続いて追加のＰＥＧを混合物に添加して、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列の取り込みを更に高めることができる。形質転換混合物の５〜１５倍の体積の、２５％のＰＥＧ  ４０００を一般に添加することができるが、これよりも多量及び少量で添加することが好適な場合もある。２５％のＰＥＧ  ４０００は、通常、形質転換混合物の約１０倍の体積であり得る。ＰＥＧが添加された後、形質転換混合物を続いて室温で又は氷上のいずれかでインキュベートし、その後、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加することができる。続いて、プロトプラスト懸濁液を、増殖培地の溶融アリコートに更に添加することができる。この増殖培地は、形質転換体のみを増殖させるものである。
【００７２】
一般的に、細胞は、生理的食塩及び栄養物を含む標準培地内で培養される（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．らのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１  ８６，１９８８、及びＩＩｍｅｎ，Ｍ．ら（１９９７）のＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６を参照されたい）。一般的に商業的に調製される培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＹＭ）ブロス、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、及びＳａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス）も、本実施形態で有用である。
【００７３】
培養条件もまた標準であり、例えば、培養物は振とう培養液又は発酵装置内の適した培地にて、所望のレベルのグルコアミラーゼ発現が達成されるまで、およそ２８℃でインキュベートされる。真菌の増殖を確立した後、細胞を、グルコアミラーゼの発現を引き起こす、又は可能にするのに有効な条件に曝露する。グルコアミラーゼをコード化する配列が、誘導性プロモーターの制御下にある場合、グルコアミラーゼの発現を誘導するのに有効な濃度で誘導剤（例えば、糖、金属塩又は抗菌剤）を培地に添加することができる。
【００７４】
一般的に、細胞培養物内で生成されたグルコアミラーゼは培地に分泌され、また例えば、細胞培地から不要な成分を除去することで精製又は単離することができる。場合によっては、グルコアミラーゼは、細胞形態で生成され得、その場合は細胞溶解物から回収する必要がある。このような場合、酵素は、当業者により慣習的に使用される技術を用い、それを生成した細胞から精製することができる。これらの技術の例には、親和性クロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈら（１９８４）のＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１６：２１５）、イオン交換クロマトグラフィー（Ｇｏｙａｌら（１９９１）のＢｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３６：３７、Ｆｌｉｅｓｓら（１９８３）のＥｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１７：３１４、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉら（１９８４）のＪ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：３３６、及びＥｌｌｏｕｚら（１９８７）のＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３９６：３０７）、例えば高い分解能を有する材料を使用したイオン交換法（Ｍｅｄｖｅら、（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ８０８：１５３）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ及びＱｕｅｉｒｏｚ（１９９９）のＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ８６５：１２３を参照されたい）、二相分離法（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒら（１９９９）のＢｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ７：２８７を参照されたい）、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥといったカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマト分画法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、硫酸アンモニウム沈殿法、及びゲル濾過法（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
２．２．α−アミラーゼ
α−アミラーゼは、微生物及び動植物の組織内に存在する酵素の群を構成する。α−アミラーゼは、グリコーゲン、デンプン、関連する多糖類、及び一部のオリゴ糖のα−１，４−グリコシド結合を加水分解できる。すべてのα−アミラーゼは同じ触媒作用を有するが、それらのアミノ酸配列は大きく異なる。異なるアミラーゼ間の配列同一性は、例えば２５％未満であり、実質的には存在しない。アミノ酸配列にかなりの差があるにもかかわらず、α−アミラーゼは共通した全体の幾何学的構造を共有し、それは、異なる種からのα−アミラーゼの三次元構造が決定した後に識別されている。共通する三次元構造では、（１）ドメインＡとして知られる「ＴＩＭ」バレル、（２）ドメインＡ内に挿入される、ドメインＢとして知られる長いループ領域、及び（３）ギリシャキーモチーフを有する固有のβ−構造を備え、ドメインＣとして知られるＣ−末端に近い領域、の３つのドメインが明らかにされる。
【００７６】
「ターマミル様」α−アミラーゼとは、デンプン処理産業において広く使用されるα−アミラーゼの群を意味する。米国特許第６，４４０，７１６号に記載される、配列番号２のアミノ酸配列を有するバチルスリケニフォルミスα−アミラーゼは、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）として市販されている。ターマミル様α−アミラーゼとは一般に、バチルス種により生成された極めて相同性のα−アミラーゼの群を指す。群の他のメンバーは、ゲオバチルスステアロサーモフィルスのα−アミラーゼ（従来はバチルスステアロサーモフィルスとして知られており、どちらの名称も本開示内で互換的に使用される）、及びバチルスアミロリケファシエンス、並びにバチルス種由来のＮＣＩＢ  １２２８９、ＮＣＩＢ  １２５１２、ＮＣＩＢ  １２５１３、及びＤＳＭ  ９３７５が含まれ、これらのすべてが米国特許第６，４４０，７１６号及び公報ＰＣＴ  ＷＯ  ９５／２６３９７号に詳細に説明される。
【００７７】
α−アミラーゼは例外なく上記の３つのドメインを含有しているが、バチルスズブチルスのＡｍｙＥなどの一部のα−アミラーゼの三次元構造は、ターマミル様α−アミラーゼとは異なる。これらの酵素は、非ターマミル様α−アミラーゼと総称される。本開示の目的のための「ＡｍｙＥ」とは、自然に発生するバチルスズブチルス由来のα−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１、１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ）を意味する。代表的なＡｍｙＥ酵素及びその変異体は、ともに２００９年６月４日出願の米国特許出願第１２／４７８，２６６号及び同第１２／４７８，３６８号、並びに２００９年６月５日出願の同第１２／４７９，４２７号に開示される。
【００７８】
２．３．その他の酵素
本開示の実施形態では、（１つ又はそれ以上の）その他の酵素も、糖化及び／又は発酵中にデンプン処理に加えることができる。補助的な酵素には、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、及び／又はα−グルコシダーゼが含まれ得る。例えばＰＣＴ公報ＷＯ  ２００９／０９９７８３号を参照されたい。当業者は、上記の酵素を使用する方法をよく理解している。
【００７９】
３．デンプンの処理
３．１．デンプン基質及び原材料
当業者は、本開示のプロセスで使用するデンプン基質の調製に使用し得る、利用可能な方法をよく理解している。例えば、有用なデンプン基質は、特に塊茎類、根類、茎類、豆類、穀類又は未精製の穀物から得ることができる。より具体的には、顆粒デンプンは、多量のデンプンを産出する植物から得られる。例えば、顆粒デンプンは、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得ることができる。トウモロコシは約６０〜６８％のデンプンを含有し、大麦は約５５〜６５％のデンプンを含有し、キビは約７５〜８０％のデンプンを含有し、小麦は約６０〜６５％のデンプンを含有し、精白米は約７０〜７２％のデンプンを含有する。具体的に考慮されるデンプン基質は、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、及び大麦デンプンである。穀物由来のデンプンは粉末状でも未精製でもよく、穀粒、糠、及び／又は穂軸といったトウモロコシ固形分を含む。デンプンは、高精製した生デンプン、又はデンプン精製プロセスで得られる原材料であってよい。様々なデンプンもまた市販されている。例えば、トウモロコシデンプンは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ，Ｓｉｇｍａ，ａｎｄ  Ｋａｔａｙａｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、小麦デンプンはＳｉｇｍａから、サツマイモデンプンはＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、そしてジャガイモデンプンはＮａｋａａｒｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から入手可能であり得る。
【００８０】
３．２．粉砕
デンプン基質は、粉砕した未精製の穀物から得た粗デンプンであってよく、非デンプン分画、例えば胚芽残渣及び繊維を含む。粉砕は、湿式粉砕法又は乾式粉砕法のどちらを含んでもよい。湿式粉砕法では、未精製の穀物を水又は希酸に浸して、穀物をその構成部分（例えば、デンプン、タンパク質、胚芽、油、穀粒繊維）に分離することができる。湿式粉砕法は胚芽と穀粉（meal）（すなわち、デンプン顆粒とタンパク質）を効率的に分離し、シロップの調製に特に好適となり得る。乾式粉砕法では、未精製の穀粒を挽いて細かい粉末にし、穀物をその構成部分に分画せずに処理する。そのため、乾式粉砕された穀物は、デンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。エタノールの大半は乾式粉砕によりもたらされる。あるいは、加工処理されるデンプンは、高度に精製された、例えば少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９．５％の純度のデンプン品質であり得る。
【００８１】
３．３．糊化及び液化
本明細書で用いる用語「液化」又は「液化する」は、デンプンが、より低い粘性及び可溶性の短鎖デキストリンに転換するプロセスを意味する。このプロセスは、α−アミラーゼの添加を同時に又は続けて行う、デンプンの糊化を伴う。追加の液化誘導酵素、例えばフィターゼを、任意に添加してもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、上記の通りに調製したデンプン基質を、水でスラリー状にしてもよい。デンプンスラリーは、約１０〜５５重量％、約２０〜４５重量％、約３０〜４５重量％、約３０〜４０重量％、又は約３０〜３５重量％の乾燥固体のデンプンを含有し得る。α−アミラーゼの安定性及び活性を最適化するために、スラリーのｐＨをα−アミラーゼの最適ｐＨに調節してもよい。液化後にスラリー中に残ったα−アミラーゼを、続く反応工程でｐＨを低下することによって、又はスラリーからカルシウムを除去することによって、不活性化することができる。
【００８３】
α−アミラーゼを加えたデンプンスラリーは、約８５〜最高約１０５℃に蒸気加熱できるジェットクッカーから連続して圧送することができる。これらの条件下では、糊化は非常に急速に発生し、また酵素活性が有意なせん断力と組み合わされて、デンプン基質の加水分解を開始する。ジェットクッカー内に滞留する時間は非常に短くてよい。部分的に糊化したデンプンを、約８５〜１０５℃に維持された一連の保持管に注入した後、約５分間保持して、糊化プロセスを完了することができる。逆混合を防ぐために、これらの槽はバッフルを備えてもよい。本明細書で使用するとき、用語「第２液化」とは、第１液化に続く液化工程を意味し、このときスラリーは室温に冷やされる。この冷却工程は、約３０〜約１８０分であってよく、例えば約９０分〜１２０分である。粉砕及び液化された穀物は、マッシュとしても知られる。
【００８４】
３．４．糖化
液化に続き、マッシュを糖化することで更に加水分解し、下流用途において容易に使用できる高密度グルコースシロップにすることができる。本実施形態の糖化は、上述のグルコアミラーゼを使用することにより、５．２〜５．６の範囲のｐＨにおいて実施することができる。グルコアミラーゼは、約０．１５〜２．０ＧＡＵ／ｇ  ｄｓｓ、約０．２０〜１．５ＧＡＵ／ｇ  ｄｓｓ、又は１．０〜１．５ＧＡＵ／ｇ  ｄｓｓの範囲で投与してよい。糖化は約５８〜約６２℃で実施し得る。
【００８５】
糖化の全工程は、典型的に２４〜９６時間、２４〜７２時間、又は２４〜４８時間にわたる。
【００８６】
３．５．発酵
本開示のいくつか実施形態において、発酵性糖をバッチ又は連続発酵条件に晒すことができる。標準的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、培地組成は発酵処理の開始時に設定され、発酵処理中に人工的な改変は加えられない。したがって、発酵処理の開始時に、培地に所望の（１つ又は複数の）生物を植菌することができる。この方法では、システムにいかなる成分も追加することなく発酵を起こすことができる。典型的には、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」としての要件を満たしており、ｐＨ及び酸素濃度などの要素を制御する試みがしばしば行われている。バッチシステムの代謝物及びバイオマス組成物は、発酵処理が停止する時間まで絶え間なく変化する。バッチ培養内で、細胞は、静的遅滞期を経て高対数増殖期へと進行していき、最終的に静止期に至って、そこで成長速度が減衰又は停止する。処理されなければ、静止期にある細胞は最終的に死滅する。一般的に、対数期にある細胞が最終生成物の生成の容量を左右する。
【００８７】
標準的なバッチシステムの変種に「フェドバッチ発酵」システムがあり、これは本開示のいくつかの実施形態で使用され得る。典型的なバッチシステムのこの変種において、発酵の進行とともに基質を徐々に添加することができる。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあって、培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に、特に有用である。フェドバッチシステムにおける基質の実濃度の測定は困難であり得るため、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの廃棄ガスの分圧などの測定可能な因子の変化を基に推量される。バッチ及びフェドバッチ発酵の両方が、当該技術分野において一般的であり、かつ周知である。
【００８８】
一方、連続発酵は開放システムであり、処理のために、確定した発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加することができ、また、同量の調整培地を同時に除去することができる。連続発酵は一般的に、培養物を一定の高密度に維持し、ここで細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞増殖及び／又は最終生成物の濃度に影響を与える１つの因子又は任意の数の因子を調節することができる。例えば、一実施形態においては、他のすべてのパラメーターを調整可能としながらも、炭素源又は窒素源といった制限栄養因子を一定率に維持することができる。他のシステムでは、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に維持しながらも、増殖に影響を与える多数の因子を連続的に変更することができる。連続システムは、定常状態増殖条件を維持するように努める。したがって、培地の除去による細胞損失は、発酵における細胞増殖率と均衡が取れていなければならない。連続発酵プロセスの栄養物及び増殖因子を調節する方法、並びに生成物形成率を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【００８９】
当該技術分野において既知の適切な発酵性微生物を使用する更なる実施形態では、発酵最終生成物には、非限定的にアルコール、１，３−プロパンジオール、コハク酸、乳酸、アミノ酸、タンパク質、機能性オリゴ糖、及びそれらの誘導体を挙げることができる。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００８／０８６８１１号（メタノール、エタノール、プロパノール、及びブタノールの発酵）、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００３／０６６８１６号、米国特許第５，２５４，４６７及び６，３０３，３５２号（１，３−プロパンジオールの発酵）、米国再発行特許第３７，３９３号、同第６，２６５，１９０号、及び同第６，５９６，５２１号（コハク酸の発酵）、米国特許第５，４６４，７６０号、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００３／０９５６５９号、ＭｅｒｃｉｅｒらのＪ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５５：１１１〜１２１、Ｚｈａｎｇ及びＣｈｅｒｙａｎのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３：７３３〜７３８（１９９１）、Ｌｉｎｋｏ及びＪａｖａｎａｉｎｅｎのＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１８〜１２３（１９９６）、並びにＴｓａｉ及びＭｏｏｎのＡｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０〜７２：４１７〜４２８（１９９８）（乳酸の発酵）、米国特許第７，３２０，８８２号、同第７，３３２，３０９号、及び同第７，６６６，６３４号、並びにＺｈａｎｇらのＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：３５５〜３６６（２００７）（様々なアミノ酸の発酵）を参照されたい。
【００９０】
上記に列挙した一覧は例に過ぎず、当業者は、所望の最終生成物を得るために適切に使用できる多くの発酵性微生物を理解するであろう。
【実施例】
【００９１】
実施例１：フミコーラグリセアグルコアミラーゼを使用した単一のｐＨ液化及び糖化
ｐＨ調整なしにｐＨ  ５．６でフミコーラグリセアグルコアミラーゼ（ＨｇＧＡ）がデンプン基質（液化物）を加水分解する能力を評価した。従来型のベンチクッキングプロセスに従い、ＣＬＥＡＲＦＬＯＷ（登録商標）ＡＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を使用して、トウモロコシデンプンを液化してＤＥ  １０の液化物を得た。液化物（３５％  ＤＳ）をｐＨ調整なしに「そのままの状態で」５０ｍＬのガラス製フラスコ内に設置して、液化物（すなわちα−活性液化物）内に存在するα−アミラーゼを不活性化した。ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００プルラナーゼ（１１２９ＡＳＰＵ／ｇ）の存在下でＨｇＧＡを用いて、ガラス製フラスコを６０℃の水浴内で６９．５時間インキュベートすることにより、液化物の糖化を実施した。ＨｇＧＡを下記の投与量で使用した：０．１８ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ、０．１６ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ、及び０．１４ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ。糖化反応混合物の０．５ｍＬ試料を異なる時間間隔で取り出し、４．５ｍＬのＲＯ水と合わせ、０．２μｍのＷｈａｔｍａｎフィルタで濾過した。続いて試料をバイアル瓶の中に入れ、ＨＰＬＣ分析にかけた。ＨＰＬＣ分析は、Ｒｅｚｅｘ  ＲＣＭ−単糖カラムをＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）脱灰ガードカラムとともに使用して実施した。糖化反応混合物内の様々な糖の組成を表１に示す。
【００９２】
表１．糖化中の糖の組成
【表２】
2014512829.tif 000004
【００９３】
液化物の糖化のために、ｐＨ調整なしに、プルラナーゼの存在下で、０．１８ＧＡＵ／ｇ  ｄｓの投与量でＨｇＧＡを使用すると、ＤＰ１含有量は２８時間のインキュベーション後に８８％に達し、その一方で高糖の含有量は５．６％に低下した。４４．５時間後、ＤＰ１含有量は９３．６％に上昇し、高糖含有量は約２％に低下した。６９．５時間後にＤＰ１濃度は９５．２％に達し、一方で高糖はわずか１．１５％であった。表１のデータは、ＨｇＧＡが単一ｐＨプロセスで可溶化デンプンをグルコ−スに加水分解するのに効果的であり得ることを示している。
【００９４】
実施例２：フミコーラグリセアグルコアミラーゼを使用した単一ｐＨ液化及び糖化、並びに比較対象
ｐＨ調整なしにｐＨ  ５．３５でＨｇＧＡがデンプン液化物を加水分解する能力を評価した。単一ｐＨプロセス中のＨｇＧＡの性能（α−活性）を、糖化工程前に液化物のｐＨを調整した時のＨｇＧａがデンプン液化物を加水分解する能力（α−不活性）と比較した。ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を使用した従来型のベンチクッキングプロセスにより、トウモロコシデンプン液化物（１２．１５  ＤＥ、３２％  ｄｓ）を調製した。
【００９５】
単一ｐＨ糖化（α−活性）のために、液化物をいっさいのｐＨ調整なしに「そのままの状態で」５０ｍＬのガラス製フラスコ内に設置し、酵素を投与した。使用した酵素は、表２に記載の投与量のＨｇＧＡ、又はプルラナーゼ（ＯＰＴＩＭＡ（登録商標）Ｌ−１０００）プルラナーゼ、１１２９ＡＳＰＵ／ｇ）の存在下で同じ投与量のＨｇＧＡのいずれかであった。非単一ｐＨ糖化（α−不活性）のためには、液化物を５０ｍＬのフラスコ内に設置し、そのｐＨを約３．５〜４．０に調整してα−アミラーゼの活性を不活性化した。続いて対照としての糖化のために、液化物のｐＨを５．３５に上昇させた。表２に示す通り、液化物の入った各フラスコに酵素を添加した。６０℃の水浴内で７５．３時間フラスコをインキュベートすることにより糖化反応を実施した。０．５ｍＬの反応混合物の試料を異なる時間間隔で取り出し、４．５ｍＬのＲＯ水と合わせて希釈し、０．２μｍのＷｈａｔｍａｎフィルタで濾過した。続いて、ＨＰＬＣ分析のために試料をバイアル瓶内に設置した。ＨＰＬＣ分析は、Ｒｅｚｅｘ  ＲＣＭ−単糖カラムをＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）脱灰ガードカラムとともに使用して実施した。糖化反応混合物中の様々な糖の組成を表２に示す。
【００９６】
表２．糖化中の糖の組成（ＨｇＧＡ）
【表３−１】
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【００９７】
（表２の続き）
【表３−２】
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【００９８】
（表２の続き）
【表３−３】
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【００９９】
プルラナーゼの存在下で、ＨｇＧＡを０．２０ＧＡＵ／ｇ  ｄｓの投与量で、ｐＨ調整なしに糖化を実施した時、２７．３時間後のＤＰ１含有量は９３％に達し、一方で高糖含有量は２．１３％に低下した。７５．３時間の糖化の後、ＤＰ１含有量は９５．６％に上昇し、高糖含有量は０．６５％に低下した。表２のデータは、単一ｐＨプロセスでＨｇＧＡを使用したとき、その性能（例えばＤＰ１及びＤＰ２の達成濃度）は、α−不活性プロセスにおけるＨｇＧＡの性能と同等であったことを示している（図２及び図３を参照されたい）。
【０１００】
実施例３：フミコーラグリセアグルコアミラーゼを使用した単一ｐＨ顆粒デンプン
ｐＨ調整なしにｐＨ  ５．５にてＨｇＧＡが顆粒デンプンを加水分解する能力を評価した。ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ及びＨｇＧＡの存在下で、トウモロコシデンプンの液化及び糖化を同時に行った。２８％  ＤＳの顆粒トウモロコシデンプンスラリーをガラス製フラスコ内で調製し、ｐＨ  ５．５に調整して、６０℃の水浴内に設置した。ＨｇＧＡ（０．２  ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ、０．２５  ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ、０．３  ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ）及び２ＡＡＵ／ｇ  ｄｓのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡを使用して、ガラス製フラスコを６０℃の水浴内で５５時間インキュベートすることにより、顆粒デンプンの同時液化及び糖化を実施した。０．５ｍＬの液化／糖化反応物の試料を異なる時間間隔で取り出し、４．５ｍＬのＲＯ水と合わせ、１０分間沸騰させた。試料を冷却し、続いて０．２μｍのディスクフィルタ（Ｔｉｔａｎ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＴＦＥ）を使用してＨＰＬＣ分析前に濾過した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＲＨＭカラムを使用してＨＰＬＣ分析を実施した。様々な糖の組成及び液化／糖化混合物におけるデンプンの可溶化を表３に示す。
【０１０１】
表３．糖の組成及びＨｇＧＡを使用した２８％  ＤＳの顆粒デンプンの同時液化／
糖化中のデンプンの可溶化。
【表４】
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【０１０２】
表３に示される通り、単一ｐＨでの顆粒トウモロコシデンプンの同時液化／糖化は、試験されたＨｇＧＡ投与量すべてに関して２８時間インキュベーションした後、９５＋％のグルコースシロップ（ＤＰ１）及び、９０＋％のデンプン溶解度という結果となった。５０時間後、すべてのＨｇＧＡ投与量で、グルコースシロップ（ＤＰ１）含有量は９６＋％に上昇し、デンプン溶解度は９７％となり、高糖（ＨＳ）含有量は１％未満となった。表３のデータは、同時液化／糖化が、単一のｐＨ及び温度プロセスで、α−アミラーゼと組み合わせたＨｇＧＡを用いて効果的に達成できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014512829.tif 000014