(57)【要約】  本発明は、細胞型とは独立した、細胞の不死化のための方法及びベクターに関する。本発明は、本発明の方法又はベクターを用いて産生される細胞又は細胞株に更に関する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途及び疾患の治療における本細胞又は細胞株の使用にも関する。【選択図】図１
2014503190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有限寿命の細胞を不死化する方法であって、
（ｉ）有限寿命の細胞を準備する工程と、
（ｉｉ）前記細胞に、以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
のうち少なくとも２つのカテゴリーの各々からの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、
を含む、有限寿命の細胞を不死化する方法。
【請求項２】
前記ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子又は遺伝子産物が、ＤＮＡ結合阻害因子（Ｉｄ）ファミリーのメンバーであり、該ＩｄファミリーメンバーがＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物が、その標的遺伝子（複数の場合もあり）が多能性の維持に関与し、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４及びＵｔｆ１からなる群から選択される転写調節因子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物がＬｉｎ２８、ｍｉＲ２９０クラスター、Ｅｃａｔ１、Ｄｐｐａ５、ＥＲａｓ、Ｅｃａｔ８、Ｇｄｆ３、Ｔｃｌ１及びＤｐｐａ３からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞周期の進行を促進する遺伝子が腫瘍抑制因子ｐ５３、ｐ２１、ｐＲＢ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１９ＡＲＦ、ｐ１４ＡＲＦ又はｐ２７のうち少なくとも１つの不活性化を介して作用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞周期の進行を促進する遺伝子が細胞起源又はウイルス起源である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子がＦｏｓ、Ｊｕｎ、Ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｈ−ｒａｓ、ｒａｆ、ｋ−ｒａｓ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｌｍｏ２、Ｍｄｍ２、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、サイクリンＡ、サイクリンｂ、サイクリンｄ、Ｓｕｚ１２、Ｔｂｘ２、Ｔｂｘ３、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、Ｃｂｘ７及びＲｅｘからなる群から選択され、又は該選択がＦｏｓ、Ｍｙｃ、ＲｈｏＡ、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｓｕｚ１２、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１及び／又はＲｅｘからである、又はＦｏｓ、Ｍｙｃ及び／又はＥｚｈ２からである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子がＥ７、Ｃｏｒｅ、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ６、ｖＧＰＣＲ及び／又はＳｖ４０ラージＴ抗原からなる群から選択され、又は該選択がＥ７、Ｃｏｒｅ、Ｅ６及び／又はＳｖ４０ラージＴ抗原からである、又はＥ７及びｃｏｒｅからである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＨｏｘＢ４、Ｔｌｘ１、ＨｏｘＡ９、Ｈｏｘｂ８、Ｓｔａｔ３及びＺＦＰ２１７からなる群から選択される１つ又は複数の更なる遺伝子が前記細胞において発現され、又は該選択がＢｃｌ−２、ＨｏｘＡ９及び／又はＺＦＰ２１７からである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞周期の進行を促進する遺伝子又は遺伝子産物がＦｏｓ、Ｅ７、ｃｏｒｅ、Ｅｚｈ２及びＭｙｃからなる群から選択され、前記多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物がＮａｎｏｇ及びＫｌｆ４からなる群から選択され、前記ＩｄファミリーメンバーがＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記有限寿命の細胞が、特定の遺伝的背景を有する個体又は個体群に由来し、該特定の遺伝的背景が少なくとも１つの突然変異、欠失、重複、ＳＮＰ関連変異及び／又は染色体異常によって野生型と異なる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）の後に、不死化細胞において増殖を終了若しくは遅延させる、老化を誘導する、及び／又は分化を誘導する任意の工程（ｉｉｉ）を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の前記供給が細胞型特異的及び／又は調節性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子又は遺伝子産物を、工程（ｉ）の有限寿命の細胞のサブセットのみで供給し、及び／又は該遺伝子を該細胞のサブセットのみで発現させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を用いて産生可能な細胞又は細胞株。
【請求項１６】
少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクターセットであって、各々が以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、
のうち１つから選択される少なくとも２つの遺伝子、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物の発現を指向する、ベクター又はベクターセット。
【請求項１７】
前記細胞周期の進行を促進する遺伝子がＥ７、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、Ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｈ−ｒａｓ、ｒａｆ、ｋ−ｒａｓ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ６、ｖＧＰＣＲ、Ｓｖ４０ラージＴ抗原、Ｍｄｍ２、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、サイクリンＡ、サイクリンｂ、サイクリンｄ、Ｓｕｚ１２、Ｔｂｘ２、Ｔｂｘ３、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、Ｃｂｘ７及びＲｅｘからなる群から選択され、又は該選択がＥ７、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、ＲｈｏＡ、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、Ｅ６、Ｓｖ４０ラージＴ抗原、Ｙａｐ１、Ｓｕｚ１２、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１及び／又はＲｅｘからであり、又はＦｏｓ、Ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ、Ｅ７及び／又はＥｚｈ２からであり、前記多能性の維持に関与する遺伝子がＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ２９０クラスター、Ｅｃａｔ１、Ｄｐｐａ５、ＥＲａｓ、Ｅｃａｔ８、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１及びＤｐｐａ３からなる群から選択され、又は該選択がＮａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２からであり、又はＮａｎｏｇ及び／又はＫｌｆ４からである、及び／又は前記ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進するＩｄ遺伝子又は遺伝子産物がＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択され、任意でＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＨｏｘＢ４、Ｔｌｘ１、ｖＧＰＣＲ、ＨｏｘＡ９、Ｈｏｘｂ８、Ｓｔａｔ３及びＺＦＰ２１７からなる群から選択される１つ又は複数の更なる遺伝子を含み、又は該選択がＢｃｌ−２、ＨｏｘＡ９及び／又はＺＦＰ２１７からである、請求項１６に記載のベクター又はベクターセット。
【請求項１８】
細胞アッセイ、３ｄ細胞培養モデルの確立、組織工学、１つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び／又は細胞カプセル化のための請求項１５に記載の細胞若しくは細胞株、又は１６若しくは１７に記載のベクター若しくはベクターセットの使用。
【請求項１９】
変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷／機能不全、免疫系に関連する病態、がん、心理的病態、又は代謝性疾患、例えば肥満の治療又は予防に使用される、請求項１５に記載の細胞若しくは細胞株、又は１６若しくは１７に記載のベクター若しくはベクターセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞型とは独立した、細胞の不死化のための方法及びベクターに関する。本発明は、本発明の方法又はベクターを用いて産生される細胞又は細胞株に更に関する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途及び疾患の治療における本細胞又は細胞株の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞株は基礎研究、並びにタンパク質産生、創薬及び毒性試験といった応用分野において使用され、再生医療アプローチにおける療法にも使用されている。既存の細胞モデルの問題は、それらが生物学的関連性を欠いているか、又は細胞を十分な量で利用可能でないということである。一方で、分子過程の解明は好適な細胞株に大きく依存する。したがって、十分な量で産生することのできる、ｉｎ  ｖｉｖｏ特性を反映する細胞は、現代の生命科学の高い関心の的である。
【０００３】
基本的には、細胞は２つの異なる供給源に由来し得る。細胞は個体／動物から初代細胞として単離することができるか、又は細胞は細胞株によって供給される。初代細胞の利点は、それらがｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の特性を厳密に反映することである。残念ながら、この高い生物学的関連性は、時間のかかる単調な単離手順、高いバッチ間変動及び複雑な培養条件といった幾つかの欠点と関係する。初代細胞のより広範な使用を妨げる大きな制限は、増加を著しく制限するそれらの限られた増殖能である。一方、細胞株は腫瘍から単離されるか、又は初代細胞の自発的若しくは誘導的な不死化によって生成される。細胞株の細胞は無制限に利用可能であり、均一であり、一定の特性を示し、取扱い及び維持が容易である。しかしながら、これらの細胞は結果として、それらが単離された組織の多くの特徴及びマーカーを欠いている。
【０００４】
新たな細胞株の確立の大きな制限は、（ｉ）例えば初代細胞物質の自発的な不死化の予測が不可能であること、（ｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡｇ）又はパピローマウイルスのウイルスがん遺伝子Ｅ６／Ｅ７といった既知の不死化遺伝子のみを利用する従来の不死化計画が、細胞生理の劇的な変化につながること（したがって、これらの細胞株は、ｉｎ  ｖｉｖｏ状態の生理を反映するものではなくなり、したがって生物学的関連性はこれらの細胞系において失われている）、（ｉｉｉ）普遍的な系が存在しないこと、すなわち異なるドナー及び異なる種に由来する任意の細胞型から細胞株を確立することが可能な単一の不死化遺伝子が存在しないことである。
【０００５】
自発的な不死化は、腫瘍に由来する初代細胞物質から、又は稀に非悪性若しくは良性の初代細胞からも発生し得る。これらの細胞株は、確実に増殖する細胞株が確立されるまで維持及び増加させることが容易である。このプロセスの全体的な成功率は低く、したがって膨大な量の初代細胞物質が利用可能でなくてはならない。このプロセスのランダム性のために、得られる細胞株の特性に影響を与えることはできず、得られる細胞株の大半がその起源を適切に反映していない。
【０００６】
従来の不死化計画では通常、例えばヒトテロメラーゼの触媒サブユニット（ｈＴｅｒｔ）、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡｇ）、ポリコームタンパク質Ｂｍｉ１、又はヒトパピローマウイルスに由来するウイルスがん遺伝子Ｅ６／Ｅ７、ウイルスがん遺伝子Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂといったがん遺伝子の組換え発現が用いられる。よく使用されている不死化遺伝子は、多様な細胞型の増加に有用であることが証明されているｈＴｅｒｔである（非特許文献１）。ｈＴｅｒｔはテロメアの末端を維持することによって作用する。テロメアは直鎖状染色体の最末端にある反復ＤＮＡのストレッチである。これらのストレッチは複製時にＤＮＡポリメラーゼによって複製されることができず、したがって、テロメアは複製期間のたびに次第に短くなる。この「末端複製問題」はｈＴｅｒｔの組換え発現によって克服することができ、最終的に不死化をもたらすことができる。組織工学のために増加させ、使用する細胞型としては、例えばウシ副腎皮質細胞（参照）、ヒト皮膚内皮細胞（非特許文献２）及びヒト間葉系幹細胞（非特許文献３）が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、長期にわたるテロメラーゼの構成的発現は遺伝子発現の変化を誘導し、前がん状態の表現型をもたらす（非特許文献４）。加えて、ｈＴｅｒｔの使用は或る特定のヒト細胞型に制限されるが、これはそれ以外の細胞型が効率的な不死化に幾つかの遺伝子の協奏的作用を要するためである（非特許文献５）。さらに、ヒト細胞は、例えばマウス細胞のような他の哺乳動物に由来する細胞とは異なる不死化戦略を必要とする（非特許文献６）。これは、ｈＴｅｒｔではマウス細胞株が確立されないという事実につながる。不死化によく使用されている別の遺伝子はＴＡｇである。ＴＡｇは、多数のタンパク質の活性を調整することが知られるウイルスのがん遺伝子である。中でも、ｐ５３及びｐＲｂが不死化にとって最も重要であるとみなされる。ｐ５３へのＴＡｇの結合は、ｐ５３が媒介する成長制御を阻害する。しかしながら、ｐ５３の不活性化はＤＮＡ損傷応答の妨げにもつながり、これは宿主細胞染色体のＤＮＡ損傷をもたらす。ＴＡｇは、ｐＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）腫瘍抑制因子も妨げる。この相互作用／阻害によって、細胞の細胞周期の進行に関与する転写因子Ｅ２Ｆが活性化される。しかしながら、ＴＡｇは、齧歯動物細胞株の確立にしか用いることができない。ヒト細胞の不死化については、（ｉ）ＴＡｇ単独では十分ではなく、したがって第２のがん遺伝子（通常はｈＴｅｒｔである）を使用する必要があり、（ｉｉ）得られる細胞株は、恐らくはｐ５３駆動性のＤＮＡ損傷応答の不活性化のために大幅に変化した核型を特徴とすることが多い。
【０００８】
不死化を促進する他の遺伝子は、ヒトパピローマウイルスに由来するＥ６タンパク質及びＥ７タンパク質である。これらは、細胞周期制御及びアポトーシス調節を妨げる。Ｅ７はｐＲＢファミリーメンバーに結合することによってそれらの機能を阻害し、それによりｐＲｂ−Ｅ２Ｆ複合体を解離させることによって、細胞がＳ期に入る際の細胞周期の進行を促進する。一方、Ｅ６はｐ５３の分解を促進し、それによりｐ５３による成長制御を中断することが知られている。Ｅ６の別の機能は、テロメアの長さを維持することによって細胞の不死化を支持するテロメラーゼ活性の誘導である。ヒト細胞の不死化には、Ｅ６及びＥ７の両方のタンパク質が必要とされる。しかしながら、これらの遺伝子の組合せは、主に上皮細胞の不死化にしか有効でない。別の欠点は、これらの遺伝子がゲノムの不安定性を誘導し、確立された細胞株が倍数体となることである。
【０００９】
他のがん遺伝子は、或る特定の種の非常に限られた数の細胞型にしか有効でないため（例えばマウスマクロファージに対するＨｏｘＡ９／ＨｏｘＢ９）、細胞型特異的であると考えられる（非特許文献７）。他の例は、（ｉ）マウス／齧歯動物マクロファージの不死化を可能にするｖ−ｍｙｃがん遺伝子（非特許文献８）、（ｉｉ）ヒトＢリンパ球を容易に不死化するエプスタインバーウイルス（非特許文献９）、又は（ｉｉｉ）マウス胚内皮細胞を確立するポリオーマミドルＴ抗原（非特許文献１０）である。
【００１０】
要約すると、このような従来の不死化技法は非常に多くの場合、大幅に変化又は突然変異した細胞株をもたらす。この問題を回避するために、不死化遺伝子の効果が制御可能なアプローチがとられている。例えば特許文献１では、少なくとも２つの不死化遺伝子が転写調節の制御下に置かれる。この状況で、不死化遺伝子が初代細胞に導入され、それぞれの初代細胞の不死化をもたらす外部刺激によって活性化される。外部刺激の中止は不死化遺伝子の不活性化につながる。この工程は、これらの不死化細胞株において、老化表現型、すなわち完全な成長の停止を特徴とし、腫瘍抑制機構である細胞状態を効率的に誘導する。したがって、特許文献１に記載の技術は、非常に専門的な研究分野にしか有用でない細胞株を生成するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０００４９１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, et al. Science. Jan 16 1998; 279(5349):349-352.
【非特許文献２】Yang J et al., Nat Biotechnol. Mar 2001; 19(3):219-224
【非特許文献３】Simonsen JL et al., Nat Biotechnol. Jun 2002; 20(6):592-596
【非特許文献４】Milyavsky M, et al., Cancer Res. Nov 1 2003; 63(21):7147-7157
【非特許文献５】Kiyono T et al., Nature. Nov 5 1998; 396(6706):84-88
【非特許文献６】Rangarajan, A., et al., Cancer Cell, Aug; 6 (2):171-83, 2004
【非特許文献７】Wang et al., Nat Methods. 2006 Apr; 3(4):287-93.
【非特許文献８】Pirami et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Sep 1; 88(17):7543-7.
【非特許文献９】Henle et al., Science. 1967 Sep 1;157(792):1064-5.
【非特許文献１０】Williams et al., Cell. 1989 Jun 16;57(6):1053-63.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このため、当該技術分野においては、様々な初代細胞から細胞株を産生する、種及び細胞型に依存しない方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、有限寿命の細胞を不死化する方法であって、
（ｉ）有限寿命の細胞を準備する工程と、
（ｉｉ）上記細胞に、以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
のうち少なくとも２つのカテゴリーの各々からの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、
を含む、有限寿命の細胞を不死化する方法に関する。
【００１５】
本発明は、この方法を用いて産生可能な細胞又は細胞株にも関する。更に、本発明は、少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクターセットであって、各々が以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、
のうち１つから選択される少なくとも２つの遺伝子、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物の発現を指向する、ベクター又はベクターセットに関する。
【００１６】
本発明は、細胞アッセイ、例えば化合物に対する細胞の応答の試験、３ｄ細胞培養モデルの確立、組織工学、１つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び／又は細胞カプセル化のための上記の細胞若しくは細胞株、又は上記のベクター若しくはベクターセットの使用にも関する。さらに、本発明は、変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷／機能不全、感染性疾患、免疫系に関連する病態、がん、心理的病態、又は肥満の治療又は予防に使用される、上記の細胞若しくは細胞株、又は上記のベクター若しくはベクターセットに関する。
【００１７】
この発明の概要は必ずしも本発明の特徴を全て記載しているわけではない。
【００１８】
添付の図面は本発明を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲により示されるような本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】不死化カセットを形質導入する不死化レンチウイルスベクターの構成を示す図である。第三世代レンチウイルスベクターを、遺伝子発現カセットの骨格として使用した。レンチウイルスベクターは全て、感染時に５’プロモーター活性を破壊する３’ＬＴＲに欠失を有する自己不活性化ベクターである。不死化遺伝子をコードする発現カセットはＳＶ４０プロモーターと、単独（選択カセットを有しない）又は選択マーカーネオマイシンとの組合せ（選択カセットを有する）での不死化遺伝子とを含む。後者の場合、ネオマイシンの転写が内部リボソーム侵入部位（Ｐｏｌｉｏ−ＩＲＥＳ）を介して開始した。発現カセットの３’側にＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が位置する。確立された細胞株に存在する遺伝子をＰＣＲによって決定した。この目的で、フォワードプライマーとしてＳＶ４０プロモーターに結合するプライマーを使用し、リバースプライマーとしてそれぞれの不死化遺伝子を特異的に認識するプライマーを使用した。以下の遺伝子を、選択カセットを用いずに形質導入した：ＰｙｍＴ；ＨｏｘＡ９；Ｂｍｉ１；Ｉｄ３；Ｍｙｂ；ｃｏｒｅ；Ｋｌｆ４；Ｏｃｔ３／４；Ｒｅｘ１；Ｂｃｌ２。以下の遺伝子を、選択カセットを用いて形質導入した：Ｍｙｃ；β−ｃａｔ；Ｉｄ１；ＴＡｇ；Ｆｏｓ；Ｅ２ｆ１；Ｊｕｎ；Ｎｓ１；Ｓｏｘ２；Ｉｄ２；Ｌｍｏ２；Ｎａｎｏｇ；Ｎｆｅ２ｌ２；Ｙａｐ１；Ｅ７；Ｅ６；Ｇｌｉ１；Ｓｕｚ１２；Ｅｚｈ２；Ｚｆｐ２１７；ＲｈｏＡ；ｖ−Ｍｙｃ；Ｉｄ４。ＰＲＥ：Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント；ｃｐｐｔ：中央ポリプリントラクト；不死化遺伝子：上述の増加遺伝子の１つ；ＲＳＶ：ラウス肉腫ウイルスプロモーター；ＰＣＲ−Ｆｏｒ：フォワードプライマー；ＰＣＲ−Ｒｅｖ：リバースプライマー；Ｐｏｌｉｏ−ＩＲＥＳ：ポリオウイルスの内部リボソーム侵入部位；ＳＶ４０−Ｐｒｏ：ＳＶ４０プロモーター。
【図２Ａ】種々の細胞型の不死化を示す図である。指定のヒト初代細胞を感染させ、増加させた。確立された細胞株の累積集団倍加数の代表例を示す。いずれの場合も、模擬感染を対照として使用した。角膜上皮細胞及び骨芽細胞の場合、これらの細胞は感染の１４日後に分裂を停止したため、グラフ中に含まれない。
【図２Ｂ】同上
【図３】不死化のデジタルコードを示す図である。それぞれの細胞型の不死化をもたらす感染を示す。種々の細胞型について以下の略語を使用した：ヒト線維芽細胞−ヒト包皮線維芽細胞（ｄ１／ｄ２）及びヒト成体皮膚線維芽細胞；ヒトｏｓｔ−ヒト骨芽細胞；ｃｈｏｎｄｒｏ−ヒト軟骨細胞；ヒトｋｅｒａ−ヒトケラチノサイト（包皮ｄ２／ａｄ−成体ｄ１）；ｍａ−ウシマクロファージ；ｓｔｒｏ−ヒト骨髄間質細胞（ｄ１／ｄ２／ｄ３／ｄ４／ｄ５）；肺−肺上皮細胞（ｄ１／ｄ２）；線維芽細胞−マウス耳線維芽細胞；内皮細胞（幼若）−ヒト臍帯内皮細胞；ｅｎｄｏ細胞−ヒト成体微小血管内皮細胞；ｃｏｒ−ヒト角膜上皮細胞。異なるドナーに由来する細胞はｄ１、ｄ２等で示す。縦列は感染に使用した遺伝子を示す。永久細胞株が確立された後にゲノムＤＮＡを単離した（感染後に少なくとも３０という集団倍加数）。ＰＣＲ分析を用いて、不死化細胞株に組み込まれる遺伝子を決定した。不死化のデジタルマップを作成するために、検出された遺伝子を「１」と表示し、存在しない遺伝子を「０」に指定する。灰色の欄は、それぞれの感染に使用しなかった遺伝子を表す。図中英語訳は以下：humanfibroblast  ヒト線維芽細胞foreskin  包皮adult  成体human  ヒトlung  肺fibroblast  線維芽細胞murine  マウスendothelialcells  内皮細胞juvenile  幼若endo cells  ｅｎｄｏ細胞
【図４】特殊化内皮細胞株の確立を示す図である。ＨＵＶＥＣ細胞の不死化をもたらす感染を示す。縦列は感染に使用した遺伝子を示す。永久細胞株が確立された後にゲノムＤＮＡを単離した（感染後に少なくとも３０という集団倍加数）。ＰＣＲ分析を用いて、不死化細胞株に組み込まれる遺伝子を決定した。ＰＣＲによって検出された遺伝子を「１」に指定し、存在しない遺伝子を「０」に指定する。灰色の欄は、それぞれの感染に使用しなかった遺伝子を表す。１回目の感染には全ての遺伝子、又は少なくとも１０個の異なる遺伝子のランダム混合物を用いた。不死化遺伝子のＰＣＲ決定に加えて、細胞株を内皮特異的マーカーの発現についても分析した。不死化ＨＵＶＥＣに関与する遺伝子セットを絞り込むために、その後の感染段階で最も好適な細胞株（及び遺伝子の組合せ）を使用した。遺伝子セットの絞込みに加えて、確立された細胞株を内皮特異的マーカーの発現について特性化した。３回目に、全ての組合せがＨＵＶＥＣの不死化をもたらし、所望の表現型を有する細胞株が生じた。一例として、Ｍｙｃ、Ｉｄ１、Ｆｏｓを用いる感染を図６、図７及び図８に示す。図中英語訳は以下：genes  遺伝子first round  １回目second round  ２回目third round  ３回目
【図５】インターフェロンシグナル伝達の分析を示す図である。インターフェロンシグナル伝達を、トランスジェニックＭｘＬｕｃ２マウスから単離したマウス耳線維芽細胞においてモニタリングした（Pulverer et al., J Virol. 2010 Sep;84(17):8626-38.）。耳線維芽細胞は以前に記載のように単離した（May et al., J Biotechnol. 2005 Oct 17;120(1):99-110）。細胞株を従来の方法（ＳＶ４０ラージＴ抗原−ＴＡｇを用いる）、及び本明細書に記載の技術によって確立した。この目的で、以下の不死化の組合せを使用した（不死化遺伝子の組成についての例を参照されたい：１〜１０＝Ｉｎｆ１；１１〜２０＝Ｉｎｆ２；２１〜２９＝Ｉｎｆ３；ＭＢＧ＝Ｉｎｆ４；ＡＬＬ＝Ｉｎｆ５）。確立された細胞株、また初代細胞を、マウスインターフェロン（５００Ｕ／ｍｌ）を用いて又は用いずに培養した。２４時間後、細胞を採取してルシフェラーゼ活性について分析し、インターフェロンシグナル伝達をモニタリングした。
【図６】確立された内皮細胞株の特性化を示す図である。確立されたＨＵＶＥＣ細胞株及びＨＭＶＥＣ細胞株を、内皮特異的表面マーカー（Ｐｅｃａｍ−１−ＣＤ３１；Ｔｉｅ１；Ｔｉｅ２；ＶＥＧＦＲ２−ＣＤ３０９）の発現について分析した。代表的な細胞株のデータを示す。ＨＵＶＥＣ細胞株（ｅｘ．ＨＵＶＥＣ）はｆｏｓ、Ｉｄ１及びＭｙｃの感染によって確立し、９０を超える累積集団倍加数で分析した。ＨＭＶＥＣ細胞株（ｅｘ．ＨＭＶＥＣ）はＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、Ｇｌｉ１の感染によって確立し、４０を超える累積集団倍加数で分析した。比較として、初代ＨＵＶＥＣ（ｐｒｉｍ．ＨＵＶＥＣ）及び初代ＨＭＶＥＣ（ｐｒｉｍ．ＨＭＶＥＣ）の同じバッチをこの分析に含めた。それぞれのマーカータンパク質の発現をフローサイトメトリーによって決定した。染色した細胞を濃い灰色で示し、アイソタイプ対照を薄い灰色で示す。
【図７】活性化された内皮（endothel）の特性化を示す図である。確立されたＨＵＶＥＣ細胞株及びＨＭＶＥＣ細胞株を、ＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）を用いて又は用いずに活性化し、活性化された内皮のマーカーについて分析した。ＴＮＦαは内皮を活性化し、これは表面マーカーＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）及びＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）の上方調節によって測定することができる。代表的な細胞株のデータを示す。ＨＵＶＥＣ細胞株（ｅｘ．ＨＵＶＥＣ）はｆｏｓ、Ｉｄ１及びＭｙｃの感染によって確立し、４０を超える累積集団倍加数で分析した。ＨＭＶＥＣ細胞株（ｅｘ．ＨＭＶＥＣ）はＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、Ｇｌｉ１の感染によって確立し、４０を超える累積集団倍加数で分析した。比較として、初代ＨＵＶＥＣ（ｐｒｉｍ．ＨＵＶＥＣ）及び初代ＨＭＶＥＣ（ｐｒｉｍ．ＨＭＶＥＣ）の同じバッチをこの分析に含めた。それぞれのマーカータンパク質の発現をフローサイトメトリーによって決定した。非刺激細胞を薄い灰色で示し、刺激細胞を濃い灰色で示し、アイソタイプ対照を点線で表す。
【図８】内皮細胞機能の特性化を示す図である。確立されたＨＵＶＥＣ細胞株及びＨＭＶＥＣ細胞株、並びに初代ＨＭＶＥＣを内皮特異的な機能について分析した。分析の一環（正：Part）として、二次メッセンジャーである一酸化窒素を生じるｅＮｏｓ合成酵素の活性の決定（ｅＮＯＳ）、アセチル化低比重リポタンパク質の取込みの決定（ａｃＬＤＬ）及びマトリゲルアッセイによって分析される血管形成能の決定（管形成）を行った。代表的な細胞株のデータを示す。ＨＵＶＥＣ（ｅｘ．ＨＵＶＥＣ）細胞株はｆｏｓ、Ｉｄ１及びＭｙｃの感染によって確立し、４０を超える累積集団倍加数で分析した。ＨＭＶＥＣ細胞株（ｅｘ．ＨＭＶＥＣ）はＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、Ｇｌｉ１の感染によって確立し、４０を超える累積集団倍加数で分析した。比較として、初代ＨＭＶＥＣ（ｐｒｉｍ．ＨＭＶＥＣ）をこの分析に含めた。ｅＮｏｓ合成酵素の活性は、ｅＮｏｓ基質（ＤＡＦ−２  ＤＡ）を用いたフローサイトメトリーによって決定することができる。この基質は非蛍光性であり、ｅＮｏｓ合成酵素による変換後に蛍光性となる。したがって、この変換をフローサイトメトリーによって決定することができる（ｅＮｏｓの列−薄い灰色は未染色の細胞；濃い灰色はＤＡＦ−２  ＤＡとインキュベートした細胞）。ａｃＬＤＬの取込みは、蛍光標識したａｃＬＤＬを用いたフローサイトメトリーによって決定することができる。細胞はａｃＬＤＬを取り込むと、ａｃＬＤＬを蓄積するため蛍光性となる（ａｃＬＤＬの列−薄い灰色は未染色の細胞；濃い灰色は蛍光標識したａｃＬＤＬとインキュベートした細胞）。細胞の血管形成能は、マトリゲルコーティング上での管の形成によって測定することができる。この目的で、細胞培養皿をマトリゲルでコーティングした。このコーティング後に単一細胞溶液を添加した。細胞は血管形成能を有する場合、管様構造を構築する（管形成の列）。
【図９】細胞型特異的プロモーターを用いた細胞特異的な不死化を示す図である。マウス細胞を肝臓から単離し、レンチウイルスの混合物に感染させた。これらの自己不活性化レンチウイルスは、構成的であるが普遍的なＳＶ４０プロモーターから３３個の不死化遺伝子の発現を駆動する。対照的に、高感度緑色蛍光タンパク質をコードする自己不活性化レンチウイルスは、肝細胞特異的なアルブミンプロモーターを介した導入遺伝子の発現を駆動する（Ａ）。感染に続いて初代細胞を増加させ、累積集団倍加数を記録し、細胞株が不死化されていることを実証した。ｃ−ｍｙｃ及びＫｌｆ４（四角）及びＦｏｓ、Ｅ７、Ｋｌｆ４、Ｌｍｏ２（三角）を用いて確立された細胞株の累積集団倍加数を示す（Ｂ）。確立された細胞株をｅＧＦＰ発現について更に分析し、確立された細胞株が肝細胞起源であるか否かを決定した。この目的で、明視野像（Ｃ；Ｆ）、蛍光像（Ｄ；Ｇ）の撮影及びフローサイトメトリー分析（Ｅ；Ｈ）を行った。ｃ−ｍｙｃ及びＫｌｆ４によって確立された細胞株（Ｃ；Ｄ；Ｅ）は、均一なｅＧＦＰ蛍光シグナルを示した。このことは、この細胞株が初代肝細胞に由来し、肝細胞機能を示すことを証明している。Ｆｏｓ、Ｅ７、Ｋｌｆ４及びＬｍｏ２によって確立された細胞株（Ｆ；Ｇ；Ｈ）は不均一なｅＧＦＰシグナルを示し、この細胞株が肝細胞と別の細胞型とに由来することを実証している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明を以下で詳細に説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されない（なぜなら、これらの方法論、プロトコル及び試薬は変化し得るものであるためである）ことを理解するべきである。本明細書で用いられる専門用語は特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されず、該範囲は添付の特許請求の範囲でのみ限定されることも理解すべきである。他に特に規定されない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は全て、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
【００２１】
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、"A multilingual glossary ofbiotechnological terms: （IUPAC Recommendations）", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H.編（1995）, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）で記載されるように定義される。
【００２２】
幾つかの文献が本明細書の本文全体を通して引用されている。本明細書で引用される文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列寄託書等を含む）の各々は、上記又は下記に関わらず、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。本明細書のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを承認するものとしては解釈されない。
【００２３】
以下で本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態とともに挙げるが、付加的な実施形態を作り出すために任意の様式で及び任意の数で該要素を組み合わせることができることを理解すべきである。様々に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されるべきではない。本記載は明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持及び包含するものと理解されるべきである。さらに、本願において記載されたあらゆる要素の任意の並べ替え及び組合せは、文脈上他の意味を示していない限り、本願の記載により開示されているとみなすものとする。
【００２４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解する必要がある場合を除き、「含む（comprise）」という言葉、及びその変化形（variations such as "comprises"and "comprising"）は、記載の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を包含する意図はあるが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を排除する意図はないと理解される。
【００２５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、数量を特定していない単数形（the singular forms "a", "an",and "the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り複数の対象を含む。
【００２６】
本発明は、有限寿命の細胞を不死化する方法であって、
（ｉ）有限寿命の細胞を準備する工程と、
（ｉｉ）上記細胞に、以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
のうち少なくとも２つのカテゴリーの各々からの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、
を含む、有限寿命の細胞を不死化する方法に関する。
【００２７】
好ましい実施形態では、上記方法は工程（ｉｉ）の後に、不死化細胞において増殖を終了若しくは遅延させる、老化を誘導する、及び／又は分化を誘導する任意の工程（ｉｉｉ）を更に含む。好ましくは、これは例えばｃｒｅリコンビナーゼのようなＤＮＡリコンビナーゼ（Salmon et al., Mol Ther. 2000 Oct;2(4):404-14）、又は例えばＴｅｔＯＮ（商標）系若しくはＴｅｔＯＦＦ（商標）系のようにテトラサイクリンによってオンオフを切り替えることができるプロモーター系を用いる上記遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的等価物の部分的又は完全なサイレンシング、不活性化及び／又は除去によって達成される。
【００２８】
「有限寿命の細胞」という用語は非分裂細胞、すなわち一生の間に分裂しない細胞、及び／又はゆっくりと分裂する細胞、すなわちそれらの起源の生物において、細胞分裂によって他の細胞を産生するという主な若しくは唯一の目的を有しない細胞、及び／又は老化する細胞、すなわち組織からの単離後に限られた数の細胞分裂を経て、分裂を停止する初代細胞、及び／又はアポトーシスを起こす細胞、すなわち組織からの単離の直後にアポトーシスを起こすか、若しくは組織からの単離の後に限られた数の細胞分裂を経て、アポトーシスを起こす初代細胞を指す。したがって、この用語には胚性幹細胞は含まれない。好ましい実施形態では、この用語は外胚葉系、内胚葉系又は中胚葉系に由来する細胞を指す。上記細胞は、成長停止細胞（例えば細胞周期の様々な段階、すなわちＧ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、前期、前中期及び中期で進行を阻止された細胞）、非増殖細胞、有糸分裂後細胞又は非有糸分裂細胞、静止細胞、良性細胞、老化細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した胚性幹細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した人工多能性幹細胞、最終分化した細胞、好ましくは初代細胞であり得る。好ましい細胞は脂肪細胞、成体幹細胞、星状細胞、Ｂ細胞、心筋細胞、軟骨細胞、角膜上皮細胞、樹状細胞、内分泌細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、顆粒球、造血細胞、造血幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、腸上皮細胞、肝臓細胞、Ｉ型肺上皮細胞、ＩＩ型肺上皮細胞、リンパ球、マクロファージ、乳房上皮細胞、メラニン細胞、メサンギウム細胞、間葉系幹細胞、筋細胞、筋芽細胞、ナチュラルキラー細胞、神経細胞、神経幹細胞、好中球、骨芽細胞、膵β細胞、周皮細胞、前脂肪細胞、前駆細胞、前立腺上皮細胞、腎上皮細胞、腎近位尿細管細胞、網膜色素上皮細胞、セルトリ細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、幹細胞、間質細胞、Ｔ細胞、及び上記細胞型のサブセットからなる群から選択される細胞である。上記細胞は非哺乳動物細胞（例えば魚類又は鳥類に由来する）又は哺乳動物細胞（例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギに由来する）、好ましくはヒト細胞である。
【００２９】
本発明の好ましい態様では、上記有限寿命の細胞は、例えば疾患に関連し、治療に対して特異的な応答をもたらすことが知られる特定の遺伝的背景を有する個体又は個体群に由来し、該特定の遺伝的背景は好ましくは少なくとも１つの突然変異、欠失、重複、ＳＮＰ関連変異及び／又は染色体異常によって野生型と異なる。言及した機構の１つによって変化し得る遺伝子には、薬物代謝に関連する遺伝子がある。これには、例えばアイソフォームＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｅ１のようなシトクロムＰ４５０酵素の種々のアイソフォームが含まれる。
【００３０】
他の可能性のある疾患遺伝子は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのトランスポータのような薬物輸送に関与する遺伝子である。全部で４８個の既知のＡＢＣ遺伝子が存在し、最も知られるものは、ＡＢＣＢ１（Ｐ糖タンパク質、多剤耐性（ＭＤＲ）１）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）、ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ、ＭＸＲ、ＡＢＣＰ）、及びＡＢＣＣ２（ＭＲＰ２）である。加えて、有機アニオン輸送タンパク質（ＯＡＴＰ）、例えばＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３のような取込みトランスポータの機能を、上述の機構により変化させることができる。
【００３１】
遺伝的背景へのかかる依存は、例えばチオプリンｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリーポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）、エステラーゼ、チオールメチルトランスフェラーゼ、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、アルデヒドヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼＢ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、トリメチルアミンＮ−オキシダーゼ、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのような薬物代謝に関与する他の遺伝子においても知られている。
【００３２】
さらに、治療応答も遺伝子型特異的であり得る。このことは、例えばＧプロテイン共役受容体、イオンチャネル、キナーゼ又は酵素のような疾患関連の標的遺伝子の発現を、例えば単一ヌクレオチド多型のような突然変異により調整することができることによるものである。例としてはアルツハイマー病があり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の変異体がアルツハイマー病を発症するリスクを決定する。ＡＰＯＥ−４対立遺伝子がアルツハイマー病を発症するリスクに関連するのに対し、ＡＰＯＥ−２対立遺伝子はアルツハイマー病になるのを防ぐとされる。別の例はアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）であり、これは降圧薬として現在使用されているＡＣＥ阻害因子ファミリーの薬物（カプトプリル、エナラプリル）の標的である。これらのＡＣＥ関連の多型変異体は、高血圧、アテローム性動脈硬化、脳卒中、左室肥大、心筋梗塞に対する感受性、糖尿病性腎症、アルツハイマー病のような徴候に関連付けられている。また喘息では、遺伝子型による影響を受ける幾つかの薬物応答経路が特定されている。その中には、グルココルチコイド受容体（ベクロメタゾン）、β２−アドレナリン受容体（アルブテロール）、５−リポキシゲナーゼ酵素（ジレウトン）、システインロイコトリエン１受容体拮抗薬（ザフィルルカスト）又はムスカリン受容体３（イプラトロピウム）を標的とする薬物がある。
【００３３】
がんにおいて、チオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）又はジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのような幾つかの遺伝子は抗がん剤の代謝に関与する。がんは或る生物が所与の遺伝子の異なる遺伝的変異体を保有する可能性があることも明らかにする。がん細胞を非悪性細胞と比較することで、これらの差が明らかになる。かかる差を標的療法に利用することができ、かかる遺伝的変異体の例はヒト上皮成長因子受容体２、融合タンパク質ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２又はＫ−ｒａｓである。
【００３４】
「細胞を不死化する」という用語は、例えばその起源の生物内で、又は単離し、細胞培養物中に維持する場合に、１つ又は複数の細胞にその天然の、すなわち本来の増殖能を超える程度まで分裂又は増殖する能力を与えることを指す。好ましい実施形態では、上記細胞は無制限に分裂又は増殖する能力を獲得する。「不死化細胞」という用語は、不死化後の細胞、すなわち本発明の方法によって不死化されているが、増殖を終了又は減速させ、及び／又は上記方法の上述した任意の工程（ｉｉｉ）に従って老化及び／又は分化を誘導した細胞も含む。したがって、「細胞を不死化する」という用語の代わりに、「細胞を増加させる」という用語が代替的に使用される場合もある。本発明の意味の範囲内の不死化細胞は形質転換細胞ではない、すなわち腫瘍形成性ではない。不死化細胞は好ましくは非腫瘍形成性であり、非腫瘍形成性細胞は好ましくは以下の特徴の少なくとも１つ、２つ又は３つ全てを示す細胞である：（ｉ）軟寒天中で成長しない、（ｉｉ）接触阻害を示さない、及び／又は（ｉｉｉ）ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ２γｃマウス若しくはヌードマウスのような免疫不全マウスにおいて腫瘍成長を引き起こさない。より好ましくは、上記不死化細胞は、不死化細胞の元となる上記有限寿命の細胞の分化特異的な生理的特性を本質的に保持する。分化特異的な生理的特性を本質的に保持するとは、細胞又は細胞株が、不死化細胞を用いた調査の対象である有限寿命の細胞の少なくとも１つの特性を保持することを意味する。主に、このことは有限寿命の細胞の主要機能（複数の場合もあり）に関連する。上記特性は細胞型に明らかに依存し、以下の非限定的な例は別にして、当業者は当該技術分野において既知の細胞特性を検査する方法を参照するしかない。元となる内皮細胞の少なくとも１つの特性を保持する不死化した内皮細胞株は、起源（originator）細胞（すなわち有限寿命の細胞）と比較して、以下のマーカー：ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ−１）、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２（ＣＤ３０９）、ＣＤ１０５、フォンヴィレブランド因子、及び凝固第ＶＩＩＩ因子、好ましくはＣＤ３１、ＣＤ１０５の１つ又は複数の発現を特徴とし得る。さらに、内皮細胞はＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）及びＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）の誘導性発現を特徴とし得る。この誘導は例えばＴＮＦαによって達成することができる。内皮細胞株は、内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性を検出するか、低比重リポタンパク質のアセチル化形態（ａｃＬＤＬ）の取込みを検出するか、又は細胞株が細胞外マトリックス（例えばマトリゲル）上に管様構造を形成することを実証する機能アッセイによっても特性化することができる。加えて、内皮細胞株は例えば免疫不全マウスへの移植後の血管形成を特徴とし得る。
【００３５】
不死化した軟骨細胞株は、転写因子Ｓｏｘ９又はＳｏｘ１０の発現を特徴とし得る。加えて、この軟骨細胞株は、例えば種々のコラーゲン（コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＸ）、プロテオグリカン、又はコンドロイチン４−硫酸（sulfat）のような細胞外タンパク質の産生を特徴とし得る。
【００３６】
不死化した上皮細胞株、例えば肺、ケラチノサイト、腸又は腎臓の上皮細胞は、５０Ω／ｃｍ２を超える値の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を発生することにより機能的に特徴付けることができる。加えて又は代替的に、上皮細胞は、それぞれの上皮細胞の単層を介した物質の透過性をアッセイすることにより機能的に特徴付けることができる。加えて又は代替的に、上皮細胞は、例えばｐ糖タンパク質、多剤耐性遺伝子１ａ（Ｍｄｒ１ａ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５、又はＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）のような排出系トランスポータによっても特徴付けることができる。神経細胞株は、βＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ）、コリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１、β（ＬＭＸ１Ｂ）、及び微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）の発現により特徴付けることができる。神経細胞は、活動電位を測定することによっても特徴付けることができる。確立された心筋細胞株は、自発的な拍動によって機能的に特徴付けることができる。加えて、これらは、トロポニンＴタイプ２（心臓）（ＴｎＴｃ）、筋細胞エンハンサー因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）、ミオシン、軽鎖７、調節（ＭＹＬ２Ａ）、ミオシン、重鎖７、心筋、β（ＭＹＨ７）、又はＮＫ２転写因子関連、遺伝子座５（ＮＫＸ２．５）も発現する。確立された肝細胞は、アルブミン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、肝細胞核因子４、α（ＨＮＦ４ａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、Ｓｏｘ１７、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＰＢａ）、α−１−抗トリプシン、又はＭｒｐ２の発現により特徴付けることができる。加えて、肝細胞の細胞株は、薬物代謝（シトクロムｐ４５０、例えばＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、又はＣＹＰ２Ｅ１の１つによる薬物代謝）の第Ｉ相成分及び薬物代謝（例えばＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、又はアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼによる薬物代謝）の第ＩＩ相成分の活性、又はＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１１（ＡＢＣＢ１１）による胆汁流出（export）を測定することにより機能的に特徴付けることができる。膵β細胞から確立された細胞株は、ＩＳＬ  ＬＩＭホメオボックス１（Ｉｓｌ−１）、Ｐａｘ  ６、Ｎｋｘ  ６．１、Ｐｄｘ−１、プロホルモンコンバーターゼ１／３、又はプロホルモンコンバーターゼ２の発現により特徴付けることができる。これらは、グルコースに応じたインスリンの分泌により機能的に特徴付けることができる。Ｔリンパ球細胞株は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、又はＴ細胞受容体の発現により特徴付けることができる。これらは、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシンのような細胞毒素の放出を測定することにより機能的に特徴付けることができる。Ｂリ��パ球細胞株は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、又はＩＬ７受容体の発現により特徴付けることができる。加えて、これらは、抗体の産生により機能的に特徴付けることができる。間葉系幹細胞から確立された細胞株は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、又はＣＤ２７１の発現により特徴付けることができる。これらは、骨芽細胞、脂肪細胞、又は軟骨細胞へと分化するそれらの能力により機能的に特徴付けることができる。造血（正：hematopoietic）幹細胞又は造血前駆細胞から確立された細胞株は、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａｌ、ＣＤ３４、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、又はＣＤ２４４の発現により特徴付けることができる。これらは、骨髄細胞（単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、又は樹状細胞）、及びリンパ球系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞）のような全ての種の血液細胞型に分化するそれらの能力により機能的に特徴付けることができる。加えて、これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコロニーを形成するそれらの能力（ＣＦＵ、すなわちコロニー形成単位）により機能的に特徴付けることができる。これらは、Ｘ線照射又は宿主骨髄を破壊する他の処理、例えばシクロホスファミドによる処理後に個体（例えばマウス）をレスキューする（rescue）それらの能力によっても特徴付けることができる。
【００３７】
したがって、本発明は、本発明の方法により産生可能な細胞又は細胞株にも関する。好ましくは、上記細胞は、以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
のうち少なくとも２つのカテゴリーの各々からの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を含む。
【００３８】
本発明は、少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクターセットであって、各々が以下のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、
のうち１つから選択される少なくとも２つの遺伝子、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物の発現を指向する、ベクター又はベクターセットにも関する。
【００３９】
「操作可能に連結した」という用語は、組換え遺伝子又はコード配列と１つ又は複数の発現制御配列とが、細胞に導入した場合に核酸配列の発現が可能となるように接続していることを意味し、この場合、発現の時間及び量は発現制御配列によって決まる。「発現カセット」という用語は、組換え遺伝子又はコード配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、細胞内で遺伝子若しくはコード配列によってコードされるタンパク質産物の発現が達成されるか、又はＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのような調節因子として作用するＲＮＡ分子の発現が達成されるように、１つ又は複数の組換え遺伝子又はコード配列に操作可能に連結した１つ又は複数の発現制御配列を含む。好ましくは、上記のカテゴリーの各々から選択される少なくとも２つ又は３つの遺伝子が１つのベクター上に、好ましくは１つの発現制御配列の制御下で含まれる。後者の実施形態では、少なくとも２つ又は３つの遺伝子が１つのｍＲＮＡとして転写されるが、別々に翻訳されることが好ましい。これは、いわゆる内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の導入によって達成することができる。
【００４０】
様々な実施形態において、上記ベクターはウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクター；非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、細菌人工染色体若しくはコスミド；及び／又はエピソームベクター、ミニサークル、若しくは非組込み型（non-integrating）レトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクターのような非組込み型ベクターである。更なる実施形態では、上記発現カセットは、それに含まれる遺伝子の除去、調節又はサイレンシングを可能にする系を含む。かかる系の例は、ｃｒｅリコンビナーゼ（Salmon et al., Mol Ther. 2000 Oct;2(4):404-14）、Ｆｌｐリコンビナーゼ、Ｐｈｉ３１インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ若しくは改変ジンクフィンガーヌクレアーゼのようなＤＮＡ修飾酵素の使用、又はＴｅｔ系、Ｔ−Ｒｅｘ系、ＡＩＲ系、エリスロマイシン系、ＰＩＰ系、Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ系、クメート（cumate）系、クーママイシン系、ＮＩＣＥ系のような転写調節系の使用である。
【００４１】
発現カセットを含むベクターは、当該技術分野で既知の形質導入法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション若しくはリポフェクション、又はウイルスベクターによる細胞感染等によって達成され得るプラスミド形質導入によって細胞に導入することができる。発現カセットは染色体内に組み込まれていても、組み込まれていなくてもよく、又は染色体外に（extra chromosomally）例えばミニサークルとして、若しくは例えばエプスタインバーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）若しくはＳＶ４０ラージＴ抗原によって維持され得る他のエピソーム形態で存在していてもよい。別の例は、アデノウイルスのようなウイルスによって送達される染色体外の発現カセットの送達である。
【００４２】
上述した方法、それを用いて産生される細胞又は細胞株、及び上記ベクター又はベクターセットのいずれに関しても、上記遺伝子又は遺伝子産物は、一実施形態では細胞の遺伝子又は遺伝子産物である。また、少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体がカテゴリー（ａ）のものであることが好ましい、すなわちカテゴリー（ａ）とカテゴリー（ｂ）との組合せ及びカテゴリー（ａ）とカテゴリー（ｃ）との組合せが特に好ましい。少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体が、カテゴリー（ａ）、カテゴリー（ｂ）及びカテゴリー（ｃ）の各々から選択されることが更に好ましい。
【００４３】
「ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子」という用語は、例えばＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ３）及びＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ６）が属する、ＢＭＰ受容体Ｉ型（ＢＭＰＲ−Ｉ）を介したシグナル伝達を誘導する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。これらの受容体は、例えばＢＭＰ２又はＢＭＰ４のような内因性リガンドを介して活性化することができる。ＢＭＰＲ−Ｉ受容体の下流シグナル伝達は、Ｒ−ＳＭＡＤタンパク質を活性化する。ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ８は、共通パートナーＳＭＡＤ（ｃｏ−ＳＭＡＤ；ＳＭＡＤ４）と複合体を形成するＢＭＰシグナル伝達のＲ−ＳＭＡＤである。このＲ−ＳＭＡＤとｃｏ−ＳＭＡＤとの複合体は、続いて核内に移行して、標的遺伝子の転写を調節する（Miyazono et al., J Biochem. 2010 Jan;147(1):35-51.）。したがって、「ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子産物」という用語はコードされるタンパク質を指す。かかる遺伝子の好ましい例は、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）ドメインを含有するが、基本的ドメインを含有しない転写調節因子であるＤＮＡ結合阻害因子（Ｉｄ）ファミリーメンバーをコードする。これらのタンパク質は、したがってドミナントネガティブヘリックスループヘリックスタンパク質である。ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子との関連で、「その機能的置換体」という用語は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８をコードする遺伝子を指す。好ましくは、「Ｉｄ遺伝子又はＩｄタンパク質の機能的置換体」という用語は、Ｉｄ遺伝子ファミリーメンバーの発現を調節する遺伝子又はコードされるタンパク質である。上記Ｉｄファミリーメンバーは好ましくはＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択される。Ｉｄ遺伝子ファミリーメンバーの機能的置換体は、好ましくは１つ又は複数のＩｄ遺伝子ファミリーメンバーを上方調節する遺伝子である。Ｉｄファミリーメンバーは、例えばβカテニン／Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）シグナル伝達経路、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達、Ｅｒｋ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）経路、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２シグナル伝達、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５シグナル伝達、アクチビン、ＨｉＦ−１、ｈ−ｒａｓ、Ｓｐ１、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、ｎ−Ｍｙｃ又はｃ−Ｍｙｃに関与する遺伝子によって上方調節される。加えて、Ｉｄ遺伝子ファミリーメンバーは突然変異ｐ５３経路によって上方調節される。
【００４４】
「多能性の維持に関与する遺伝子」という用語は、（ｉ）多能性回路（pluripotency circuit）（Loh et al., CellCycle. 2008 Apr 1;7(7):885-91. Molecular framework underlying pluripotency.）及び／又は（ｉｉ）体細胞の再プログラム化（Maherali and Hochedlinger, Cell Stem Cell. 2008 Dec 4;3(6):595-605.Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.）に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。したがって、「多能性の維持に関与する遺伝子産物」という用語はコードされるタンパク質を指す。好ましい実施形態では、多能性の維持に関与する上記遺伝子又は遺伝子産物は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ２９０クラスター、Ｅｃａｔ１、Ｄｐｐａ５、ＥＲａｓ、Ｅｃａｔ８、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１及びＤｐｐａ３からなる群から選択される。かかる遺伝子産物の好ましい例は、その標的遺伝子が多能性の維持に関与する転写調節因子である。この群の好ましいメンバーは、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４及びＵｔｆ１を含む。その選択がＮａｎｏｇ、Ｋｌｆ４及び／又はＳｏｘ２、より好ましくはＮａｎｏｇ；Ｓｏｘ２；又はＮａｎｏｇ及びＳｏｘ２を含むことが好ましい。代替的には、Ｋｌｆ４が特に好ましい。
【００４５】
「細胞周期の進行を促進する遺伝子産物」という用語は、細胞周期の相：Ｇ１／Ｇ０期、Ｓ期、Ｇ２期及びＭ期の１つの進行を促進する遺伝子を指す（The Cell, 2nd edition, A Molecular Approach, by Geoffrey M Cooper.Boston University, Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000）。好ましくは、かかる遺伝子は腫瘍抑制遺伝子ｐ５３、ｐ２１、ｐＲＢ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１９ＡＲＦ、ｐ１４ＡＲＦ若しくはｐ２７、又はコードされるタンパク質の少なくとも１つの不活性化を介して作用する遺伝子産物をコードする。好ましくは、細胞周期の進行を促進する上記遺伝子又は遺伝子産物は、直接的又は間接的に少なくとも１つのサイクリンを活性化するか、又はその抑制を阻害する。好ましい実施形態では、細胞周期の進行を促進する遺伝子は細胞起源又はウイルス起源である。細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子の好ましい例は、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、Ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｈ−ｒａｓ、ｒａｆ、ｋ−ｒａｓ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｌｍｏ２、Ｍｄｍ２、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、サイクリンＡ、サイクリンｂ、サイクリンｄ、Ｓｕｚ１２、Ｔｂｘ２、Ｔｂｘ３、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、Ｃｂｘ７及びＲｅｘからなる群から選択され、上記選択は、好ましくはＦｏｓ、Ｍｙｃ、ＲｈｏＡ、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｓｕｚ１２、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、及び／又はＲｅｘ、より好ましくはＦｏｓ、Ｍｙｃ、及び／又はＥｚｈ２を含む。ウイルス起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子の好ましい例は、Ｅ７、Ｃｏｒｅ、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ６、ｖＧＰＣＲ、Ｓｖ４０ラージＴ抗原からなる群から選択され、上記選択は、好ましくはＥ７、Ｃｏｒｅ、Ｅ６及び／又はＳｖ４０ラージＴ抗原、より好ましくはＥ７及びｃｏｒｅを含む。
【００４６】
各々の場合において、言及されるタンパク質がウイルスタンパク質、例えばＥ７又はＳｖ４０ラージＴ抗原ではない限りは、指定の遺伝子それぞれの哺乳動物、より好ましくはヒト、類人猿又は齧歯動物のホモログを使用するのが好ましい。カテゴリー（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）による遺伝子のそれぞれの能力を保持する指定の遺伝子の変異体が含まれ、それぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質は、以下の表１に示されるそれぞれの遺伝子によってコードされるヒト、マウス又はウイルスのタンパク質と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は更には１００％のアミノ酸同一性を共有する。好ましくは、同一性のレベルをそれぞれの参照タンパク質の全長にわたって決定した。
【００４７】
特に好ましい実施形態において、上記細胞周期の進行を促進する遺伝子又は遺伝子産物は、Ｆｏｓ、Ｅ７、Ｅｚｈ２、及びＭｙｃからなる群から選択され、最も好ましくはＭｙｃであり、多能性の維持に関与する上記遺伝子又は遺伝子産物は、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２からなる群から選択され、上記ＩｄファミリーメンバーはＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、及びＩｄ４からなる群から選択される。
【００４８】
別の実施形態において、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＨｏｘＢ４、Ｔｌｘ１、ｖＧＰＣＲ、ＨｏｘＡ９、Ｈｏｘｂ８、Ｓｔａｔ３、ＺＦＰ２１７からなる群から選択される１つ又は複数の更なる遺伝子は上記細胞において発現され、上記選択は、好ましくはＢｃｌ−２、ＨｏｘＡ９、及び／又はＺＦＰ２１７を含む。
【００４９】
特に、好ましい組合せは、（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｎａｎｏｇ、及び（ｃ）ＥＺＨ２；又は（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｎａｎｏｇ、及び（ｃ）Ｆｏｓ；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｎａｎｏｇ、及び（ｃ）Ｍｙｃ；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｎａｎｏｇ、及び（ｃ）Ｅ７；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｓｏｘ２、及び（ｃ）ＥＺＨ２；又は（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｓｏｘ２、及び（ｃ）Ｆｏｓ；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｓｏｘ２、及び（ｃ）Ｍｙｃ；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｓｏｘ２、及び（ｃ）Ｅ７；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｋｌｆ４、及び（ｃ）ＥＺＨ２；又は（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｋｌｆ４、及び（ｃ）Ｆｏｓ；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｋｌｆ４、及び（ｃ）Ｍｙｃ；（ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３若しくはＩｄ４、好ましくはＩｄ２、（ｂ）Ｋｌｆ４、及び（ｃ）Ｅ７を少なくとも含む。
【００５０】
カテゴリーａ）、ｂ）及び／又はｃ）の更に好ましい遺伝子組合せは、以下の遺伝子の組合せを含むか又はそれらからなる：
（ｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｂｃｌ２、Ｃｏｒｅ、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、及びＲｅｘ；
（ｉｉ）Ｉｄ３、Ｅ７、Ｃｏｒｅ、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、Ｅｚｈ２、及びＲｅｘ；
（ｉｉｉ）ｃｏｒｅ、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、及びＮａｎｏｇ；
（ｉｖ）ＲｈｏＡ、及びＥｚｈ２；
（ｖ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｅ７、ｃｏｒｅ、Ｉｄ１、及びＭｙｃ；
（ｖｉ）Ｅ７、及びＭｙｃ；
（ｖｉｉ）Ｍｙｂ、Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｃｏｒｅ、及びＭｙｃ；
（ｖｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、βｃａｔ、ＴＡｇ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｅ６、ＨｏｘＡ９、Ｂｍｉ１、ｃｏｒｅ、Ｋｌｆ４、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｌｍｏ２、及びＮａｎｏｇ
（ｖｉｉｉ）Ｓｏｘ２、ＲｈｏＡ、Ｅｚｈ２、及びＲｅｘ；
（ｉｘ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、ｃｏｒｅ、Ｋｌｆ４、Ｉｄ１、Ｎａｎｏｇ、Ｅｚｈ２、及びＩｄ４；
（ｘ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、及びＩｄ３；
（ｘｉ）Ｋｌｆ４、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、及びＮａｎｏｇ；
（ｘｉｉ）Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、Ｒｅｘ；
（ｘｉｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｍｙｂ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｅｚｈ２、及びＲｅｘ；
（ｘｉｖ）Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｂｍｉ１、Ｙａｐ１、及びＮａｎｏｇ；
（ｘｖ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、及びＩｄ３；
（ｘｖｉ）Ｓｕｚ１２、Ｉｄ４、及びＲｅｘ；
（ｘｖｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、βｃａｔ、ＴＡｇ、Ｅ７、Ｅ６、Ｉｄ１、及びＭｙｃ；
（ｘｖｉｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ１、及びＭｙｃ；
（ｘｉｘ）Ｉｄ２、Ｉｄ１、及びＭｙｃ；
（ｘｘ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、及びＩｄ１；
（ｘｘｉ）Ｆｏｓ、Ｉｄ１、及びＭｙｃ；
（ｘｘｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ；
（ｘｘｉｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｍｙｂ、Ｉｄ３、及びＢｃｌ２；
（ｘｘｉｖ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、ＨｏｘＡ９、Ｉｄ１、Ｎａｎｏｇ、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｖ）Ｉｄ１、Ｉｄ３、Ｆｏｓ、Ｅｚｈ２、及びＮａｎｏｇ；
（ｘｘｖｉ）Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｓｏｘ２、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｖｉｉ）Ｉｄ１、Ｉｄ３、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｖｉｉｉ）ＴＡｇ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｅ６、Ｌｍｏ２、Ｎａｎｏｇ、Ｅｚｈ２、及びＺＦＰ２１７；
（ｘｘｘｉｘ）Ｉｄ２、ＴＡｇ、Ｅ７、及びＭｙｃ；
（ｘｘｘ）Ｆｏｓ、βｃａｔ、ＴＡｇ、Ｅ７、Ｉｄ１、及びＭｙｃ；
（ｘｘｘｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｅ７、及びＭｙｃ；
（ｘｘｘｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｅ７、ｃｏｒｅ、Ｋｌｆ４、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｘｉｉｉ）Ｆｏｓ、Ｎａｎｏｇ、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｘｉｖ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、ＴＡｇ、Ｉｄ３、ｃｏｒｅ、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、及びＮａｎｏｇ；
（ｘｘｘｖ）Ｉｄ３、Ｅ７、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｘｖｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ１、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｘｖｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｅ７、ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、及びＮａｎｏｇ；
（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、βｃａｔ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、及びＥｚｈ２；
（ｘｘｘｉｘ）Ｉｄ２、Ｅ７、Ｎａｎｏｇ、及びＥｚｈ２；
（ｘｌ）Ｉｄ２、Ｍｙｂ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｅ６、Ｍｙｃ、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、及びＥｚｈ２；
（ｘｌｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｅ６、ｃｏｒｅ、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及びＥｚｈ２；
（ｘｌｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｅ７、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２；
（ｘｌｉｉｉ）Ｅ７、Ｅ６、Ｂｍｉ１、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２；
（ｘｌｉｖ）Ｉｄ２、Ｅ７、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及びＥｚｈ２；
（ｘｌｖ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｅ６、Ｂｃｌ２、ＨｏｘＡ９、Ｂｍｉ１、Ｋｌｆ４、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、及びＧｌｉ１
（ｘｌｖｉ）Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｅ７、Ｉｄ１、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２
（ｘｌｖｉｉ）Ｉｄ２、Ｆｏｓ、Ｉｄ３、Ｅ７、ＨｏｘＡ９、Ｉｄ１、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｚｈ２、及びＧｌｉ１
（ｘｌｖｉｉｉ）Ｉｄ３、ＨｏｘＡ９、Ｍｙｃ、及びｃｏｒｅ
（ｘｌｉｘ）Ｍｙｂ、Ｉｄ３、ｃｏｒｅ、及びＭｙｃ
（ｌ）Ｉｄ３、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、Ｂｍｉ１、及びＨｏｘＡ９
（ｌｉ）ＰｙｍＴ、Ｂｃｌ２、Ｍｙｃ、Ｉｄ３、及びＨｏｘＡ９
（ｌｉｉ）ＰｙｍＴ、Ｍｙｃ、ｃｏｒｅ、及びβｃａｔ
（ｌｉｉｉ）Ｉｄ１、及びＭｙｃ
（ｌｉｖ）Ｉｄ２、及びＭｙｃ
（ｌｖ）Ｉｄ３、及びＭｙｃ
（ｌｖｉ）Ｉｄ４、及びＭｙｃ
（ｌｖｉｉ）βｃａｔ、及びＭｙｃ
（ｌｖｉｉｉ）βｃａｔ、及びＰｙｍＴ、Ｍｙｃ
（ｌｉｘ）βｃａｔ、及びＭｙｃ、Ｂｍｉ１
（ｌｘ）Ｍｙｃ、ＢｃＬ２、及びβｃａｔ
（ｌｘｉ）Ｍｙｃ、ＨｏｘＡ９、及びＩＤ３
（ｌｘｉｉ）βｃａｔ、及びＭｙｃ
（ｌｘｉｉｉ）ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ、及びＩＤ３。
（ｌｘｉｖ）Ｉｄ３、ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、及びＥｚｈ２
（ｌｘｖ）Ｉｄ３、Ｅ７、Ｅ６、Ｙａｐ１、及びＮａｎｏｇ
（ｌｘｖｉ）Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４
（ｌｘｖｉｉ）Ｆｏｓ、Ｅ７、Ｋｌｆ４、Ｌｍｏ２
（ｌｘｖｉｉｉ）ＴＡｇ、Ｋｌｆ４
（ｌｘｉｘ）ＴＡｇ、ｃｏｒｅ、Ｋｌｆ４
（ｌｘｘ）Ｉｄ３、Ｋｌｆ４、Ｉｄ４
（ｌｘｘｉ）Ｆｏｓ、Ｅ７、Ｋｌｆ４
（ｌｘｘｉｉ）Ｆｏｓ、Ｅ７、Ｋｌｆ４、ＩＤ４
（ｌｘｘｉｉｉ）ＴＡｇ、ｃｏｒｅ
（ｌｘｘｉｖ）ＩＤ２、ＩＤ３、ｃｏｒｅ
（ｌｘｘｖ）Ｂｃｌ２、ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ、Ｒｅｘ
（ｌｘｘｖｉ）Ｉｄ３、Ｂｃｌ２、ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ
（ｌｘｘｖｉｉ）ＴＡｇ、Ｍｙｂ、ＩＤ３、ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ
（ｌｘｘｖｉｉｉ）ＩＤ２、Ｂｃｌ２、ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ
（ｌｘｘｉｘ）ＴＡｇ、ＩＤ３、Ｂｃｌ２、ｃｏｒｅ、Ｒｅｘ
（ｌｘｘｘ）ＴＡｇ、Ｅ６、Ｂｃｌ２、ｃｏｒｅ、ＩＤ４、Ｒｅｘ
（ｌｘｘｘｉ）ＴＡｇ、ＩＤ３、Ｂｃｌ２、ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ、Ｒｅｘ
【００５１】
所与の遺伝子又は遺伝子産物の「機能的置換体」とは、とりわけ所与の遺伝子又は遺伝子産物に拮抗する別の遺伝子又は遺伝子産物のノックダウン又はノックアウトを指す。遺伝子又は遺伝子産物のノックアウトは、当該技術分野で既知の好適な全ての方法、例えばジンクフィンガー法又は相同組換えによって達成することができる。遺伝子又は遺伝子産物のノックダウンは、例えばＲＮＡｉ（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ｍｉＲＮＡ法、モルホリノ、リボザイム及びタンパク質競合によって達成することができる。好ましくは、タンパク質競合は、所与の遺伝子若しくは遺伝子産物に拮抗する遺伝子若しくは遺伝子産物に特異的に結合する抗体を用いて、又は所与の遺伝子若しくは遺伝子産物に拮抗する遺伝子若しくは遺伝子産物のドミナントネガティブ突然変異体によって達成される。所与の遺伝子又は遺伝子産物の機能的置換体は、化学物質、例えばカテゴリー（ａ）、カテゴリー（ｂ）若しくはカテゴリー（ｃ）の１つに分類される遺伝子の活性化をもたらすか、又はカテゴリー（ａ）、カテゴリー（ｂ）及び／又はカテゴリー（ｃ）の所与の遺伝子若しくは遺伝子産物に拮抗する遺伝子若しくは遺伝子産物を阻害若しくは下方調節する低分子量分子の付加によっても達成することができる。
【００５２】
形質導入細胞の選択を促進する遺伝子又は遺伝子産物は、細胞の生存及び／又は分裂に有害な環境における細胞の生存及び／又は分裂を促進するもの、又は細胞の同定及び／又は分離を促進するものであり得る。好ましくは、形質導入細胞の選択を促進する上記任意の遺伝子又は遺伝子産物は、抗生物質（例えばクロラムフェニコール、ブラストサイジンＳ、ピューロマイシン、ヒスチジノール、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン、ゼオシン、ブレオマイシン）、蛍光マーカー（例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ＨｃＲｅｄ１のような長波長赤色蛍光タンパク質）、表面マーカー（例えば切断型ＣＤ３４、低親和性神経成長因子受容体）、及び遺伝的にコードされたタグ（例えばビオチンタグ、ｈａｌｏ  ｔａｇ、ｓｎａｐ  ｔａｇ）、又は非蛍光性分子を蛍光性分子に変換する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ）からなる群から選択される。
【００５３】
概して、上述の全ての遺伝子の発現は構成的、調節性及び／又は誘導性である。この発現は、例えば当該技術分野で既知の適切なプロモーターを用いて調節することができる。構成的発現については、ハウスキーピング遺伝子の既知のプロモーター、又は構成的ウイルスプロモーターが特に好適である。例としては構成的ウイルスＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＭＬＶ及びＳＦＦＶプロモーターが挙げられる。構成的哺乳動物プロモーターの例はＰＧＫプロモーター、ユビキチンプロモーター及びＥＦ１αプロモーターである。調節性プロモーター又は誘導性プロモーター（そのうち数百種が同様に当業者に既知である）は、好ましくは物理的因子（例えば光、温度等）又は生物学的／化学的因子（タンパク質、化合物等）によって誘導される。
【００５４】
例えば、調節性／誘導性発現については、転写調節系、例えばｔｅｔ調節系をベースとする転写調節系を用いることができる。ｔｅｔ調節系は当該技術分野で既知であり、例えばCorbel,S.Y. et al. (2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13: 448-452)に記載されている。典型的には、ｔｅｔ系に適切なリガンドとして分子テトラサイクリン又はドキソサイクリンが使用される。他の転写系としては、ＡＩＲ系、エリスロマイシン系、ＰＩＰ系、Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ系、クメート系、クーママイシン系、ＮＩＣＥ系及びＴ−Ｒｅｘ系が挙げられるが、これらに限定されない。この調節アプローチの付加的な変形形態は、小分子の結合時の二量化及び／又は核内移行を媒介するドメインとの転写活性化因子の融合である。その例はラパマイシン調節系、ビオチンの融合、又は転写活性化因子とのステロイド結合ドメインの融合である。
【００５５】
発現の調節のための他の系はＤＮＡ修飾酵素の使用に依存する。かかる状況では、発現カセットにそれぞれのＤＮＡ修飾酵素の認識部位が隣接する。かかる目的で使用することのできる酵素としては、例えばｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、Ｐｈｉ３１インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ又は改変ジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。
【００５６】
発現を調節するための別の系は、小分子への結合を促進するドメインとのそれぞれの遺伝子の融合である。このアプローチの例はエストロゲン結合ドメインである。
【００５７】
不死化遺伝子の機能を調節するための別の方法は組換えタンパク質の制御分解である。この状況では、不安定化ドメインを組換え遺伝子と融合させる。かかる構築物を哺乳動物細胞に導入した場合、遺伝子は発現するが、タンパク質は急速に分解される。また、不安定化ドメインを安定化させる小分子の付加は、それぞれの組換えタンパク質の安定化をもたらす。タンパク質レベルでのこの調節を可能にする幾つかの系が、例えばIwamoto et al., Chem Biol. 2010 Sep 24;17(9):981-8 and Banaszynskiet al., Cell. 2006 Sep 8;126(5):995-1004に記載されている。
【００５８】
調節性又は誘導性の遺伝子発現は、本発明の方法の上述した任意の工程（ｉｉｉ）に特に有用である。遺伝子発現は細胞型特異的であってもよく、これは細胞型特異的なプロモーター若しくは細胞型特異的なエンハンサー、又はプロモーター及びエンハンサーの両方の組合せ、例えば心筋細胞のαＭＨＣプロモーター若しくはＭｙｈ６プロモーター、内皮細胞のｔｉｅ２プロモーター若しくはＩＣＡＭ２プロモーター、樹状細胞のＣＤ１１ｃプロモーター、肝細胞のアルブミンプロモーター若しくはα１アンチトリプシンプロモーター若しくはαフェトプロテインプロモーター、腸上皮細胞のｖｉｌｉｎプロモーター若しくはサイトケラチン１８プロモーター、神経細胞のｔａｕプロモーター若しくはネスチンプロモーター、又は膵β細胞のインスリンプロモーターによって達成することができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、上記遺伝子、遺伝子産物又は機能的等価物は、（ｉ）工程の有限寿命の細胞のサブセットのみで供給され、及び／又は（ｉｉ）上記細胞のサブセットのみで発現される。ここで、上記遺伝子、遺伝子産物又は機能的等価物を供給する細胞のサブセットは、同じものが発現又は産生される細胞のサブセットよりも大きくてもよい。この実施形態の利点の１つは、例えば細胞数が少な過ぎるために他の細胞から分離されておらず、及び／又は分離可能でない特定の（正：particular）細胞型を不死化することができることである。このタイプの細胞は他の細胞に物理的に接着しているか（分離が不便、困難又は不可能となる）、又は既知の細胞分離手段が細胞に到達しにくい。この実施形態の根底にある原理は、１つ又は複数の他の細胞型のうち１つの細胞型が他の細胞よりも速く分裂し、したがって上記他の細胞を打ち負かすか（outcompetes）、又は上記他の細胞より成長し、不死化の前には不便、困難又は不可能であった可能性がある、その単離が促進される。
【００６０】
本発明は、細胞アッセイ、例えば化合物に対する細胞の応答の試験、３ｄ細胞培養モデルの確立、組織工学、１つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び／又は細胞カプセル化、すなわち（ｉ）免疫抑制を要することなく移植（同種移植又は異種移植）を可能にし得る、又は（ｉｉ）例えば急性肝不全に応答した解毒を可能にする、又は（ｉｉｉ）糖尿病のような疾患における代謝を可能にする人工半透膜による免疫拒絶からの移植細胞の保護のための本発明の細胞若しくは細胞株、又はベクター若しくはベクターセットの使用に更に関する。
【００６１】
本発明は、変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷／機能不全（例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、ニューマンピック病、アテローム性動脈硬化症、進行性核上麻痺、がん、テイサックス病、糖尿病、心疾患、円錐角膜、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、ハンチントン病、肝硬変（正：Liver Cirrhosis）、加齢性黄斑変性症、急性肝不全、認知症、脳卒中、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨損傷、貧血、喘息、高血圧、癲癇、慢性疼痛）、炎症性疾患（例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザ）、免疫系に関連する病態（例えば移植片対宿主反応、アレルギー、全身性エリテマトーデス、敗血症、多発性硬化症、乾癬）、がん、心理的病態（例えばトラウマ、うつ病、統合失調症）、又は肥満の治療又は予防に使用される本発明の細胞若しくは細胞株、又はベクター若しくはベクターセットにも関する。
【実施例】
【００６２】
以下の例は例示のみを目的とし、上記の本発明を何ら限定するものではない。
【００６３】
実施例１：不死化遺伝子の同定
本発明の技術の目的は、生物学的に関連した哺乳動物細胞を無制限な数で提供することである。現行の細胞株確立プロセスの制限を解決するために、哺乳動物細胞の不死化を誘導することのできる３３個の異なる遺伝子を同定した。この遺伝子セットには、ウイルスがん遺伝子、哺乳動物がん遺伝子、腫瘍細胞において過剰発現される遺伝子、及び分化を阻害する遺伝子が含まれる。採用した不死化遺伝子を表１に挙げる。表１には本明細書で使用される略語を示す。加えて、ＮＣＢＩデータベースから引用した正式な遺伝子名、遺伝子ＩＤ及び遺伝子記号、並びに遺伝子が由来する種／生物を記載する。採用した細胞遺伝子はヒト又はマウスのいずれかに由来するものであった。しかしながら、他の種に由来するホモログも本発明に使用することができる。
【００６４】
表１  採用した遺伝子の概要
【表１】
2014503190.tif 000003
＊Ｃ型肝炎（正：Hepatitis）ウイルスのコアタンパク質については、遺伝子Ｉｄは存在しない。ＨＣＶコアタンパク質は複数の遺伝子からなるｍＲＮＡから切断され、採用される遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿７５１９１９．１に相当する。
【００６５】
実施例２：初代細胞における不死化遺伝子の組換え発現
初代細胞の不死化を達成するためには、初代哺乳動物細胞において不死化遺伝子を組換え発現しなくてはならない。この目的で、不死化遺伝子の組換え発現を可能にする任意の遺伝子又はタンパク質の形質導入法を用いることができる。さらに、不死化遺伝子の発現を誘導することが可能な任意の遺伝子発現カセット（宿主細胞ゲノムに組み込まれるか否かを問わない）を用いることができる。
【００６６】
以下の実施例では、初代細胞に形質導入するためにレンチウイルス粒子を使用し、不死化遺伝子の発現を駆動するためにＳＶ４０プロモーターを使用した。使用したレンチウイルスベクターは第三世代自己不活性化レンチウイルスベクターである。続いてこれらのレンチウイルスプラスミドにおいてウイルス配列を減少させた。このベクター生成では、アクセサリー遺伝子ｖｐｒ、ｎｅｖ、ｒｅｖ及びｇａｇ／ｐｏｌを欠失させるだけでなく、ウイルスプロモーター／エンハンサー配列が欠失するようにウイルスＬＴＲを修飾する。さらに、５’ＬＴＲには、ｗｔＨＩＶプロモーターの代わりにＲＳＶプロモーターが含まれる。力価を増大させるために、付加的なエレメント（１）中央ポリプリントラクト（ｃｐｐｔ）及び（２）Ｂ型肝炎ウイルスに由来する翻訳後調節エレメント（ＰＲＥ）をレンチウイルスベクターに組み入れた。これらのエレメントは発現カセットの５’側（ｃｐｐｔ）及び３’側（ＰＲＥ）に配置された。
【００６７】
発現カセットは、ＳＶ４０プロモーターと、単独（選択カセットを有しない）又は選択マーカーネオマイシンとの組合せ（選択カセットを有する）での不死化遺伝子（複数の場合もあり）とを含むものであった。後者の場合、ネオマイシンの転写が内部リボソーム侵入部位（Ｐｏｌｉｏ−ＩＲＥＳ）を介して開始した。発現カセットの３’側にＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が位置する。使用した種々のベクター構成の概略図を図１に示す。
【００６８】
以下の遺伝子を、選択カセットを用いずに形質導入した：
ＰｙｍＴ；ＨｏｘＡ９；Ｂｍｉ１；Ｉｄ３；Ｍｙｂ；ｃｏｒｅ；Ｋｌｆ４；Ｏｃｔ３／４；Ｒｅｘ１；Ｂｃｌ２。
以下の遺伝子を、選択カセットを用いて形質導入した：
Ｍｙｃ；β−ｃａｔ；Ｉｄ１；ＴＡｇ；Ｆｏｓ；Ｅ２ｆ１；Ｊｕｎ；Ｎｓ１；Ｓｏｘ２；Ｉｄ２；Ｌｍｏ２；Ｎａｎｏｇ；Ｎｆｅ２ｌ２；Ｙａｐ１；Ｅ７；Ｅ６；Ｇｌｉ１；Ｓｕｚ１２；Ｅｚｈ２；Ｚｆｐ２１７；ＲｈｏＡ；ｖ−Ｍｙｃ；Ｉｄ４。
【００６９】
肝細胞特異的アルブミンプロモーターをコードする発現カセットを、同様に自己不活性化レンチウイルス骨格に組み込んだ。この発現カセットはマウスアルブミンエンハンサー及びプロモーター領域と、続いてレポーター遺伝子である高感度緑色蛍光タンパク質と、ウッドチャック肝炎ウイルスに由来する翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とからなる。
【００７０】
ウイルス粒子の産生のために、４つの異なるプラスミドのリン酸カルシウム沈殿をベースとする一過性トランスフェクションプロトコルを使用した。レンチウイルス粒子の産生は、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）のレンチウイルスヘルパープラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において行った。トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ｃｍ２当たり約２００００細胞の細胞密度でプレーティングした。リン酸カルシウム沈殿のために、ヘルパー機能をコードする４つのプラスミドｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＬＰ１）、ｒｅｖ（ｐＬＰ２）及びＶＳＶｇ（ｐＶＳＶｇ）表面タンパク質を、運搬プラスミド（上述の発現構築物のリストを参照されたい）の１つとともに混合した。面積１４０ｃｍ２の培養皿のトランスフェクションのために、以下の量の種々のプラスミドを使用した：１４μｇのｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ）、４．６μｇのｐＬＰ２（ｒｅｖ）；７．８μｇのｐＬＰ／ＶＳＶｇ（ＶＳＶｇ）、２０μｇの運搬プラスミド（不死化遺伝子を保有する発現構築物又はアルブミンレポーター構築物）。
【００７１】
種々のプラスミドを５００μｌの２５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液に再懸濁した後、この混合物を５００μｌのＨＥＢＳ溶液に連続ボルテックス下で滴加し、その後室温で１０分間維持して沈殿させた。この懸濁液をＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地に添加した。翌日、培地を吸引し、１５ｍｌの新鮮培地を添加した。２４時間後、レンチウイルス粒子を含有する上清を回収した。２回目の産生のために、再び１５ｍｌの新鮮培地を産生細胞に添加し、２４時間後にレンチウイルス粒子を含有する上清を回収した。レンチウイルス含有上清を０．４５μｍのフィルターで濾過して細胞残屑を除去し、使用時まで−７０℃で保管した。
【００７２】
それぞれのレンチウイルスの力価をＮｉＨ３Ｔ３細胞を用いて評価した。１２ウェルプレートで滴定を行った。この目的で、５００００個の細胞を感染前日にプレーティングした。感染当日に培地を吸引し、ウイルス含有上清を細胞に１２時間添加した。総感染容量は４００μｌであり、４つの異なる濃度のウイルス含有上清を使用した（１μｌ、４μｌ、４０μｌ、４００μｌ）。加えて、ポリブレンを感染に８μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。発現構築物に応じて、感染したＮｉＨ３Ｔ３細胞をＧ４１８耐性（選択カセットを有する）、又はＰＣＲによって形質導入／組込み（選択カセットを有しない）について滴定した。
【００７３】
Ｇ４１８耐性についての滴定は、感染の２日後に１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地を用いて開始した。２週間の選択後、細胞のコンフルエンシーをスコアリングした。更なる実験では、コンフルエントなプレートを生じたウイルスストックのみを４００μｌ、４０μｌ及び４μｌのＨＥＫ２９３細胞培養上清の希釈液で使用した。選択カセットを有しない発現構築物の形質導入／組込みについての滴定は、感染したＮｉＨ３Ｔ３細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲによって行った。この目的で、感染したＮｉＨ３Ｔ３細胞のゲノムＤＮＡを感染の２日後に単離し、ＰＣＲによって不死化遺伝子の組込みについてアッセイした。ＤＮＡ単離及びＰＣＲの詳細については下記に示す。更なる実験では、不死化遺伝子の組込みを示したウイルスストックのみをＨＥＫ２９３細胞培養上清の１μｌの希釈液で使用した。
【００７４】
哺乳動物細胞系の確立のために、種々の不死化遺伝子を保有するレンチウイルスを混合した。この目的で、十分な力価を有するウイルスストックを予混合した。これらのマスターミックスを使用時まで−７０℃、１ｍｌアリコートで保管した。特に他に指定のない限り、以下のマスターミックスを調製し、感染のために使用した：
Ａｌｌ−全ての不死化遺伝子（表１に挙げられる）を含めた；
ＭＢＧ−ＴＡｇ、Ｅ６、Ｅ７及びＭｙｃを除く全ての不死化遺伝子（表１に挙げられる）；
１〜１０−Ｉｄ２、Ｆｏｓ、ＮＳ１、Ｊｕｎ、Ｅ２Ｆ１、βＣａｔ、Ｍｙｂ、Ｉｄ３、Ｂｃｌ２、ＨｏｘＡ９；
１１〜２０−Ｂｍｉ１、ＰｙｍＴ、Ｃｏｒｅ、Ｏｃｔ３、Ｋｌｆ４、Ｉｄ１、Ｌｍｏ２、Ｎｆｅ２Ｌ２、Ｙａｐ１、Ｎａｎｏｇ；
２１〜２９−Ｓｏｘ２、ＲｈｏＡ、Ｅｚｈ２、Ｇｌｉ１、ｖ−Ｍｙｃ、Ｓｕｚ１２、ＺＦＰ２１７、Ｉｄ４、Ｒｅｘ。
【００７５】
実施例３：哺乳動物細胞系の確立
記載の技術はドナーの種、細胞型、遺伝子型、又はドナーの年齢とは独立して新規の哺乳動物細胞株の確立を可能にする。この目的で、対象の初代細胞に３３個の不死化遺伝子の全セット、又は好適な不死化遺伝子のより小さなサブセットを形質導入することができる。以下の実施例では、この技術の有用性を種々の種（マウス、ウシ、ヒト）、種々の細胞型（線維芽細胞、骨髄間質細胞、マクロファージ、内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、肺上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞）、種々の遺伝子型（線維芽細胞、骨髄間質細胞）、並びに幼体（ヒト臍帯内皮細胞及びケラチノサイト）及び成体（ヒト成体ケラチノサイト、ヒト成体微小血管内皮細胞）に由来する新規の哺乳動物細胞株の確立によって証明した。しかしながら、本発明の技術は言及した例に限定されず、任意の細胞型及び任意の哺乳動物種の細胞に適用することができる。また、試験したものと同等の機能を有する種々の遺伝子を使用することができる。
【００７６】
全ての初代細胞又は初代細胞株は５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下、３７℃で維持した。以下の初代細胞型を不死化手順に使用した：初代ヒト包皮線維芽細胞ＦＳ４（Gupta et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Oct;76(10):4817-21.）及びｈＤＰ（単離についてはMujaj S et al., Tissue Eng Part A. 2010 Apr;16(4):1407-20.に詳述されている）；ヒト成体皮膚線維芽細胞（Promocell GmbH）；ＭｘＬｕｃ２  ｂａｃトランスジェニックマウス成体耳線維芽細胞（Pulverer etal., J Virol. 2010 Sep;84(17):8626-38；単離についてはMay etal., 2005 Oct 17;120(1):99-110に詳述されている）；ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Pro Vitro GmbH製）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ、ProVitro GmbH製）；ヒト表皮成体ケラチノサイト（Pro Vitro GmbH製）及びヒト包皮ケラチノサイト（単離についてはAasen and Belmonte, Nat Protoc. 2010;5(2):371-82.に記載されている）；ウシマクロファージ（単離についてはWerling et al., Immunology. 2004 Jan;111(1):41-52.に記載されている）；成体ヒト骨芽細胞（単離についてはHernandez et al., Arthritis Rheum. 2008 Jun;58(6):1696-700に詳述されている）；成体ヒト軟骨細胞（単離についてはFay et al., Arthritis Res Ther. 2006;8(6):R189に詳述されている）；成体ヒト肺上皮細胞（単離についてはElbert et al., 1999, Pharm Res. 1999 May;16(5):601-8.に詳述されている）、成体ヒト骨髄間質細胞（単離についてはZhang et al., Ann Hematol. 1999 Jul;78(7):305-14.に詳述されている）、角膜上皮細胞（Cell Systems GmbH製）、成体マウス肝細胞（単離についてはHaridasset al. Am J Pathol. 2009 Oct;175(4):1483-92に詳述されている）。
【００７７】
線維芽細胞、骨髄間質細胞、ウシマクロファージ及び骨芽細胞は１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１００Ｕのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ中で培養した。肝細胞は１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ基本培地中で培養した。軟骨細胞及び角膜上皮細胞は、ＨａｍＦ１２とＤＭＥＭ基本培地との１対１混合物中で培養した。この混合物には１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１００Ｕのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した。成人肺上皮細胞は、ＳＡＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ（Lonza）を添加したＳＡＢＭ基本培地中で培養した。ケラチノサイトは、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）基本培地と添加物（ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒｓ  Ｋ、CellSystems GmbH）とを含むＤｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｋ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｋｉｔ中で培養した。ＨＵＶＥＣは、ＥＧＭ−ＭＶ  ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ（Lonza）を添加した内皮細胞基本培地ＥＢＭ（Lonza）中で培養した。ＨＭＶＥＣは、ＥＧＭ−２  ＭＶ  ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ（Lonza）を添加した内皮細胞基本培地ＥＢＭ−２（Lonza）中で培養した。内皮細胞は、ゼラチンコート組織培養フラスコ内で培養した。この目的で、細胞培養プレートを３７℃で３０分間、０．１％（ＨＵＶＥＣ）又は１％（ＨＭＶＥＣ）のゼラチン溶液で被覆した。ゼラチンを吸引し、内皮細胞をプレーティングした。ケラチノサイトは通常の組織培養フラスコ、又はコラーゲンＩでコーティングしたフラスコ内で培養した。
【００７８】
不死化のために、初代細胞を６ウェルプレートに播種し、それぞれのウイルスの組合せに感染させた（マスターミックス又は規定の感染）。細胞を感染当日に８０％コンフルエンシーに達するまでプレーティングした。感染のために、培養培地を吸引し、１ｍｌのレンチウイルスマスターミックス及び２００μｌのそれぞれの培養培地を細胞に添加した。１０個未満の不死化遺伝子による感染の場合、１００μｌの各々のレンチウイルスストックを使用し、感染容量はそれぞれの培養培地を用いて１ｍｌに設定した。肝細胞の場合、感染混合物は、５００μｌのレンチウイルス不死化マスターミックス及び５００μｌのアルブミンｅＧＦＰレポーターレンチウイルス、並びに２００μｌの培養培地からなるものであった。全ての感染について、ポリブレンを８μｇ／ｍｌという最終濃度で添加した。初代細胞を湿潤雰囲気、３７℃で８時間〜１２時間感染させた。いずれの場合も、初代細胞が死（crisis）に陥る時点を決定するために非感染対照を加えた。
【００７９】
細胞株の確立のために以下の２つの戦略を使用した。感染した細胞を０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択するか、又は不死化遺伝子の発現によるそれらの成長利点について選択した。ＦＳ４細胞について両方の戦略を比較したが、確立された細胞株の増殖パターン及び組み込まれた不死化遺伝子のパターンに関して同様の結果が得られた。したがって、初代細胞が確実に増殖すると判断される場合（例えば線維芽細胞、内皮細胞）には選択戦略を適用したが、初代細胞が増殖しないか、又は僅かにしか増殖しない場合（例えば角膜上皮細胞、成体皮膚ケラチノサイト）には選択圧を加えなかった。細胞株の確立のために、Ｇ４１８耐性又は増殖利点とは独立して、コロニーをプールし、更に増加させた。細胞株の確立のために、細胞をコンフルエンシーに達するまで継代した。不死化プロセスの開始時に、細胞を１対３の比率で分割した。細胞が確実な増殖挙動を取った後（プレーティング後３日以内にコンフルエンシーに達したことを意味する）、分割比を細胞型に応じて１対５又は１対１０に調整した。種々のヒト初代細胞の不死化の結果を図２に示す。指定のヒト初代細胞を感染させ、増加させた。幾つかの確立された細胞株の累積集団倍加数を示す。
【００８０】
実施例４：不死化に関与する遺伝子の同定
次の工程では、初代細胞の不死化に関与する遺伝子を同定した。この目的で、不死化細胞株のゲノム中に存在する遺伝子を検出するＰＣＲ戦略を開発した。不死化遺伝子又はより良好には遺伝子の組合せが感染細胞に与えられるという選択的利点のために、ゲノムＤＮＡを単離する前に長い増加期間を選択した（３０を超える累積集団倍加数）。これにより、検出される遺伝子が実際に不死化に関与することが確実となるはずである。
【００８１】
ゲノムＤＮＡを以下の手順で単離した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当たり５００μｌ（６ウェル）の溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、及び１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（新たに添加））を添加した。溶解した細胞を１．５ｍｌ容プラスチックチューブに移し、６０℃で一晩インキュベートした。翌日、７５ｍＭ酢酸ナトリウム（エタノール中）を添加した（１ｍｌ）。チューブを室温で２時間インキュベートした後、ゲノムＤＮＡペレットが見えるように、ゆっくりと転倒させた。次いで、ＤＮＡ溶液を５０００ｒｐｍで５分間、卓上遠心分離機で遠心分離した。その後上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで２回洗浄した。最後の洗浄の後、ペレットを乾燥させ、３０μｌ〜５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、又は代替的にはＨ２Ｏに溶解し、４℃で保管した。
【００８２】
不死化遺伝子を検出するＰＣＲ戦略の概略図を図１に示す。両方のプライマーが、レンチウイルスカセットによって形質導入される発現カセット内に結合する。５’プライマーはＳＶ４０プロモーター内に配置され、３’プライマーはそれぞれの不死化遺伝子に特異的である（表２）。
【００８３】
表２：不死化遺伝子の検出に使用されるプライマーのリスト
【表２】
2014503190.tif 000004
【００８４】
ＰＣＲは、Ｍａｎｇｏ−Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｋｉｔ（Bioline）を用いて行った。アニーリング温度は５８℃、伸長時間は３０秒間とした。ＰＣＲに続いて、９４℃で１分間の変性工程（３０サイクル反復する）を行った。鋳型として、感染細胞のゲノムＤＮＡを０．１μｇ使用した。各遺伝子を別個のＰＣＲで分析した。ＰＣＲを１％アガロースゲルで分析し、遺伝子を非存在又は存在としてスコアリングした。
【００８５】
これらの分析の結果を、ヒートマップにまとめた（図３）。この不死化のヒートマップでは、指定の細胞型の不死化をもたらした感染を示す。縦列は感染に使用した遺伝子を示す。永久細胞株が確立された後にゲノムＤＮＡを単離した（感染後に少なくとも３０という集団倍加数）。ＰＣＲ分析を用いて、不死化細胞株に組み込まれる遺伝子を決定した。不死化のデジタルマップを作成するために、検出された遺伝子を「１」と表示し、存在しない遺伝子を「０」に指定する。灰色の欄は、それぞれの感染に使用しなかった遺伝子を表す。
【００８６】
種々の細胞型、様々な種に由来する細胞、種々のドナーに由来する細胞、並びに幼若細胞及び成体細胞をこの分析に用いた（図３）。線維芽細胞株をマウス及びヒト起源から確立した。ヒト細胞については、包皮線維芽細胞（幼若）及び皮膚線維芽細胞（成体）を使用した。加えて、２人の異なるドナー（ｄ１及びｄ２）に由来する包皮線維芽細胞を使用した。ヒト内皮細胞株をヒト臍帯静脈内皮細胞（内皮細胞−幼若）及びヒト微小血管内皮細胞（ｅｎｄｏ細胞−成体）から確立した。加えて、ヒト角膜上皮細胞（ｃｏｒ）、成体（ａｄ）及び幼若（包皮由来）のヒトケラチノサイト（ヒトｋｅｒａ）、５人の異なるドナーに由来するヒト骨髄間質細胞（ｓｔｒｏ）、ヒト肺上皮細胞（肺）、ウシマクロファージ（ｍａ）、ヒト骨芽細胞（ヒトｏｓｔ）及びヒト軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏ）を確立した。
【００８７】
ヒートマップの結果から、それぞれの遺伝子の頻度を算出した。これは種々の不死化遺伝子をランク付けるために行った。この目的で、遺伝子が使用された感染の数を検出数で除算した。このランク付けを全ての細胞型について行い、また別個に線維芽細胞の感染のみについても行った。０．５以上の頻度を示す遺伝子をストライプで強調する（表３）。
【００８８】
表３：確立された細胞株における遺伝子の頻度
【表３】
2014503190.tif 000005
１ｉｎｆ．＝感染；２ｄｅｔ．＝検出された；３ｆｒｅ．＝頻度
【００８９】
ランク付けによって、（ｉ）新規の哺乳動物細胞株の確立に特に好適な遺伝子セット（これらの遺伝子はＩｄ２；Ｆｏｓ、βｃａｔ；ＴＡｇ、Ｍｙｂ；Ｉｄ３；Ｅ７；Ｅ６；Ｂｃｌ２；ＨｏｘＡ９；Ｂｍｉ１；ｃｏｒｅ；Ｋｌｆ４；Ｉｄ１；Ｍｙｃ；Ｌｍｏ２；Ｙａｐ１；Ｎａｎｏｇ；Ｓｏｘ２；ＲｈｏＡ；Ｅｚｈ２；Ｇｌｉ１；Ｓｕｚ１２；ＺＦＰ２１７、Ｉｄ４；Ｒｅｘであり、中でも、ａ）Ｉｄ１、Ｉｄ２及びＩｄ３はＩｄ遺伝子ファミリー（正：family）メンバーであり、ｂ）Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４は多能性の維持に関与する遺伝子であり、ｃ）Ｅ７、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、βｃａｔ、ＲｈｏＡ、Ｍｙｂ、Ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、Ｅ６、Ｓｖ４０ラージＴ抗原、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｓｕｚ１２、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１及びＲｅｘは細胞周期の進行を促進する遺伝子であり、これらの遺伝子を同じカテゴリーの他の遺伝子（すなわち、これらのリストに挙げられていないもの、例えば他の種に由来するホモログ、又は同じ遺伝子ファミリーに由来する他の遺伝子）に置き換えることができると考えるのは妥当である）；（ｉｉ）０．５以上の頻度を示し、したがって感染の５０％超で不死化に関与する不死化遺伝子のコアセットが同定される。重要なことには、この遺伝子のコアセットは細胞型に応じて変化し得る。これは、線維芽細胞及び肝細胞の不死化のランク付けを全ての不死化と比較することで明らかである。この遺伝子のコアセットは、Ｉｄ２；Ｆｏｓ；ＴＡｇ；Ｉｄ３；Ｅ７；ｃｏｒｅ；Ｉｄ１；Ｍｙｃ；Ｌｍｏ２；Ｎａｎｏｇ；Ｅｚｈ２；Ｒｅｘである。
【００９０】
この技術の重要な特徴は、その優れた効率である。種々の初代細胞から確立された全ての細胞株は最初の試行で、１回の感染サイクルのみによって確立された。それぞれの細胞株の生成に必要とされる時間が細胞型に依存することに留意することが重要である。データから、より幼若な細胞（例えばＨＵＶＥＣ）又はより大きい固有の増殖能を有する細胞（例えば骨芽細胞、線維芽細胞）が、６０日以内に３０という累積集団倍加数に達するのに対し、成体の個体から単離された細胞（例えばＨＭＶＥＣ）又は高度に分化した細胞（例えば角膜上皮細胞）が、３０という累積集団倍加数に達するのにより長い期間（約８０日間〜９０日間）を必要とすると結論付けることができる（表４）。
【００９１】
表４：新規の細胞株の生成に必要とされる時間
【表４】
2014503190.tif 000006
＊マウス成体耳線維芽細胞は、累積ＰＤＬ  ３０まで増加しなかった。それらは、それぞれの模擬感染対照が５継代後に約１０という累積ＰＤＬで増殖を停止し、感染したＭＡＥＦが累積ＰＤＬ  ２５まで確実な増殖を示したために不死であると判断された
【００９２】
別の重要な態様は、それぞれの細胞株を不死化する遺伝子の単一の可能な組合せだけでなく、様々な異なる組合せが初代細胞の不死化について同定されたことである。これらの組合せの幾つかの例を表５に挙げる。
【００９３】
表５：不死化をもたらす遺伝子の組合せ
【表５−１】
2014503190.tif 000007
【表５−２】
2014503190.tif 000008
【００９４】
原則として、細胞の不死化に好適な遺伝子の組合せは、各々大半がＩｄ遺伝子ファミリーメンバー、多能性の維持に関与する遺伝子及び細胞周期の進行を促進する遺伝子を含むことが表５から明らかである。したがって、或る特定の個々の遺伝子ではなく、これらのカテゴリーの遺伝子が細胞の不死化に必要とされることが予測される。したがって、遺伝子は同じカテゴリーの他の遺伝子と置き換えることが可能である。Ｉｄ遺伝子ファミリーの好適な遺伝子は、Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、及びＩｄ４であり、多能性の維持に関与する好適な遺伝子は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ２９０クラスター、Ｅｃａｔ１、Ｄｐｐａ５、ＥＲａｓ、Ｅｃａｔ８、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｄｐｐａ３であり、細胞周期の進行を促進する好適な遺伝子は、Ｅ７、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、Ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｈ−ｒａｓ、ｒａｆ、ｋ−ｒａｓ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ６、Ｓｖ４０ラージＴ抗原、Ｍｄｍ２、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、サイクリンＡ、サイクリンｂ、サイクリンｄ、Ｓｕｚ１２、Ｔｂｘ２、Ｔｂｘ３、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、Ｃｂｘ７及びＲｅｘである。
【００９５】
これらのカテゴリーのいずれにも分類されない不死化に有用な遺伝子は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＨｏｘＢ４、Ｔｌｘ１、ｖＧＰＣＲ、ＨｏｘＡ９、Ｈｏｘｂ８、Ｓｔａｔ３、ＺＦＰ２１７である。これらの遺伝子を用いて、遺伝子カテゴリーの上述の組合せを補完することができる。
【００９６】
この技術の特徴は、デザイナー細胞株を確立するために使用することができる。これは不死化遺伝子の全組合せが、それぞれの細胞株に僅かに異なる特性を与えるためである。この特徴を用いて、例えば特別な表面コーティングでの増殖に最適化された、又は特別な培養培地中での増殖に最適化された細胞株を確立することができる。内皮細胞について、記載の技術のこの特徴を、遺伝子の組合せを同定し、それにより内皮細胞の全ての機能及び特徴を保持する細胞株を同定するために使用した（データについては図６、図７、図８を参照されたい）。それぞれの遺伝子を同定するために、この技術を用いて１回目の感染で不死化をもたらす遺伝子を同定した。２回目の感染では、これらの遺伝子又は遺伝子のサブセットを不死化に使用した。重要なことには、得られた細胞株をそれらの内皮特異的な機能及び特徴に関して分析した。最も有望な細胞株から、不死化遺伝子の組合せを、ＨＵＶＥＣを再度不死化する３回目の感染に使用した（不死化遺伝子の種々の組合せの概要については図４を参照されたい）。この感染の段階の全ての組合せが所望の特性を示し、その例を図６、図７及び図８に示す。
【００９７】
実施例５：確立された細胞株の生物学的関連性の決定
細胞株の最も重要な特性はその生理であり、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで示すその生理に可能な限り厳密に似るべきである。したがって、確立された細胞株をそれらの生物学的関連性について試験した。不死化が多くの場合、細胞シグナル伝達経路を妨げることが知られている。
【００９８】
一例として、インターフェロンシグナル伝達を調査した。種々のインターフェロンα又はインターフェロンβのようなＩ型インターフェロンは、ウイルス、細菌又は寄生生物のような病原体に応答して誘導される分泌タンパク質である。Ｉ型インターフェロンは、自己分泌的に（分泌細胞に対する）又は周囲分泌的に（隣接細胞に対する）作用する。インターフェロンはインターフェロン受容体に結合し、Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ２及びＩＲＦ９からなる三量体複合体による下流シグナル伝達を誘導する。この複合体は核内に移行してインターフェロン誘導性遺伝子のプロモーターに結合し、それによりそれらの発現を活性化する。これまでに、およそ２０００個のインターフェロン誘導性遺伝子が同定されている。十分に特性化されているインターフェロン誘導性遺伝子はＭＸ２遺伝子である。したがって、インターフェロンシグナル伝達の活性化は、レポーター遺伝子ルシフェラーゼの発現を駆動するＭｘ２−プロモーターからなるレポーター系を用いて、間接的に測定することができる。
【００９９】
かかる遺伝子レポーター構築物を利用してレポーターマウスを生成した。このマウスはインターフェロン、また種々のウイルスに応答してルシフェラーゼレポーター遺伝子の強い誘導を示す。重要なことには、誘導因子の非存在下でのレポータータンパク質の発現は、ほとんど検出可能ではない（Pulverer et al., 2010, J Virol. 2010 Sep;84(17):8626-38）。初代細胞をこのマウスから単離し、インターフェロンを用いて及び用いずに処理した場合に、同じ誘導プロファイルが観察される。しかしながら、これらの初代細胞に由来する細胞株を、ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いた不死化のような従来の方法によって確立する場合、発現特徴は強く影響を受ける（図５）。ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて不死化した細胞株は、誘導因子インターフェロンの非存在下でレポータールシフェラーゼのより高い基本的発現を示す。インターフェロンを添加すると、ルシフェラーゼの発現は増大する。しかしながら、誘導係数は初代細胞と比較してはるかに小さい（図５）。このことは、従来の不死化がインターフェロンシグナル伝達を強く妨げることを証明している。
【０１００】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況と同等の特性を示す新規の細胞株を確立するために、本明細書に記載の技術を適用した。生成した種々の細胞株を、インターフェロンの存在下及び非存在下でのレポーター遺伝子ルシフェラーゼの発現について試験した。インターフェロン処理時に強く誘導可能なルシフェラーゼ発現がインターフェロンの非存在下で低いことを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況と同様のインターフェロン系の誘導特徴を示す幾つかの細胞株が確立された（図５）。種々の細胞株及び初代細胞の誘導係数の比較によって、インターフェロンシグナル伝達が従来の不死化（Ｓｖ４０ラージＴ抗原を用いる）によって確立された細胞株では変化するが、初代細胞及び本明細書に記載の技術を用いて生成した細胞株では影響を受けないことが実証される（図５）。
【０１０１】
内皮細胞は血管の内側を覆う（line）特殊化細胞である。内皮細胞は、表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３０９、Ｔｉｅ１又はＴｉｅ２のようなマーカータンパク質を利用して包括的に特性化することができる。本明細書に記載の技術を用いて確立された内皮細胞株を、これらのマーカーの発現について分析した。この分析では、確立された細胞株がそれぞれのマーカーの同様の発現パターンを示すか否かを決定するために初代細胞も含めた（図６）。結果から、確立された内皮細胞株が初代細胞、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏ状況と同様であることが実証される。
【０１０２】
内皮細胞の機能には、血圧、血液凝固及び炎症過程の制御がある。これは主に、物質、小分子、細菌、また免疫細胞の通過を制限するそれらのバリア機能によって媒介される。感染又は炎症の部位から、内皮を活性化するＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインが分泌される。この活性化は或る特定の表面分子の上方調節につながり、免疫細胞の結合、最終的には内皮細胞層を通る免疫細胞の移動を促進する。このプロセスに関与する表面分子は、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）及びＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）である。したがって、確立された内皮細胞株を、これらの表面分子の発現についてＴＮＦ−αの非存在下及び存在下で分析した。比較として、初代細胞をこの分析に含めた。この分析から、炎症性サイトカインの非存在下では表面分子はほとんど検出不可能であり、ＴＮＦ−αによる刺激がそれぞれの表面分子の増加をもたらすことが明らかとなった（図７）。初代細胞から得られた結果と、確立された細胞株から得られた結果とを比較することによって、全細胞集団がＴＮＦ−αに対して一様に反応することではなく、内皮細胞のサブセットが活性化されることから、両方の細胞系が同様に振る舞うことが明らかとなる（図７）。
【０１０３】
また、血管形成と呼ばれるプロセスである新たな血管の発生、二次メッセンジャーである一酸化窒素の産生、又はアセチル化低比重リポタンパク質の取込みのような内皮細胞の他の機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって決定することができる。これらのアッセイを、確立された内皮細胞株及び初代細胞に対して行った。種々のアッセイから、確立された内皮細胞株が正常な内皮の全ての機能を保持することが実証される（図８）。
【０１０４】
表面マーカーの分析のために、内皮細胞をトリプシン／ＥＤＴＡによって解離させた後、特異的内皮細胞マーカー：ＣＤ３１；Ｔｉｅ１；Ｔｉｅ２；ＣＤ３０９；ＣＤ５４；ＣＤ６２ｅ；ＣＤ１０６に対するモノクローナル抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清中、室温で３０分間、蛍光標識した初代抗体（ＣＤ３１、ＣＤ３０９、ＣＤ５４；ＣＤ６２ｅ、ＣＤ１０６）とともにインキュベートした。抗体の濃度はメーカーの使用説明書に従って使用した。非標識初代抗体（Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２）については、細胞を最初のインキュベーション（室温で３０分間）後にＰＢＳで洗浄し、続いて蛍光標識した二次抗体とともに室温で３０分間、再度インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清で洗浄し、遠心分離し、最後に細胞ペレットをＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１０５】
ａｃＬＤＬの取込みのために、細胞を３７℃で４時間、４μｇ／ｍｌのａｃＬＤＬ（Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＩＴＣ（Molecular Probes）で標識した）とともに培養した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡによって解離させ、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。ｅＮｏｓ合成酵素の活性の決定のために、細胞を室温で３０分間、ＤＡＦ−２  ＤＡ（１μＭ）とともにインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡによって解離させ、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーによる分析については、ＳＳＣ／ＦＳＣドットブロットを適用して細胞残屑（ＦＳＣ＜２００）を排除した。残りのゲート細胞（gated cells）をそれぞれの蛍光シグナルについて分析し、ヒストグラムとしてプロットした。
【０１０６】
標準的なマトリゲルアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成をモニタリングした。マトリゲルは、主成分がラミニンであるＥｎｇｅｌｂｅｒｔ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞のマトリックスに富んだ産物である。マトリゲルアッセイのために、９６ウェルを３７℃で３０分間、マトリゲルでコーティングした。１ウェル当たり４×１０４個の細胞を播種し、一晩培養した。管構造形成を顕微分析によって評価した。
【０１０７】
初代細胞は種々の細胞型からなる組織から単離される。そのため、新たに単離された初代細胞の培養物は細胞型に関して不均一であることが非常に多い。特定の細胞型の不死化が望まれる場合、かかる細胞型混合物は不死化を困難とする。これは、異なる細胞型が異なる増殖能を有するという事実に起因する。加えて、不死化及び形質導入の効率は異なる細胞型間で大きく異なる。そのため、組織から直接単離した初代細胞に対して行われる不死化によって、形質導入が容易であり、最も強い増殖を示す細胞起源に由来する細胞株が選択的に確立される。ほとんどの組織で、この細胞型は線維芽細胞である。細胞型混合物に由来する特定の細胞型の不死化を促進するために、本明細書に記載の技術を、レポーター遺伝子の発現を駆動する細胞型特異的なプロモーターと組み合わせることができる。
【０１０８】
この目的で、Haridass et al. Am J Pathol. 2009 Oct;175(4):1483-92に詳述されるように、初代マウス肝細胞を肝臓組織から単離した。単離後、この細胞型混合物を一晩培養し、その後感染を行った。レンチウイルス不死化ミックスに加えて、肝細胞特異的なアルブミンプロモーターからのレポーター遺伝子ｅＧＦＰの発現を駆動するレンチウイルスを含めた。実施例３に記載の細胞株が確立された。重要なことには、アルブミンによって駆動されるｅＧＦＰは、実験全体にわたって肝細胞株と非肝細胞株とを区別することを可能にする。この目的で、それぞれの細胞株を蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析については、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡによって解離させ、遠心分離した後、細胞ペレットを再懸濁した。フローサイトメトリーによる分析では、ＳＳＣ／ＦＳＣドットブロットを適用して細胞残屑（ＦＳＣ＜２００）を排除した。残りのゲート細胞をｅＧＦＰ蛍光シグナルについて分析し、ヒストグラムとしてプロットした。蛍光顕微鏡分析については、細胞を組織培養プレートにプレーティングし、ｅＧＦＰ可視化用のOmegaOptical製のフィルターセットを備える蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５ＴＶ）を用いて分析した。
【図１】
2014503190.tif 000009
【図２Ａ】
2014503190.tif 000010
【図２Ｂ】
2014503190.tif 000011
【図３】
2014503190.tif 000012
【図４】
2014503190.tif 000013
【図５】
2014503190.tif 000014
【図６】
2014503190.tif 000015
【図７】
2014503190.tif 000016
【図８】
2014503190.tif 000017
【図９】
2014503190.tif 000018
【配列表】
2014503190000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月5日(2013.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有限寿命の細胞を不死化するインビトロ方法であって、
（ｉ）有限寿命の単離された細胞を準備する工程と、
（ｉｉ）前記細胞に、以下の（ａ）〜（ｃ）のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
のうち少なくとも２つのカテゴリーの各々からの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体を供給する工程、及び
任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、
を含む、有限寿命の細胞を不死化するインビトロ方法。
【請求項２】
ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子又は遺伝子産物が、ＤＮＡ結合阻害因子（Ｉｄ）ファミリーのメンバーであり、該ＩｄファミリーメンバーがＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物が転写調節因子であり、該転写調節因子の標的遺伝子が多能性の維持に関与し、転写調節因子がＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４及びＵｔｆ１からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物がＬｉｎ２８、ｍｉＲ２９０クラスター、Ｅｃａｔ１、Ｄｐｐａ５、ＥＲａｓ、Ｅｃａｔ８、Ｇｄｆ３、Ｔｃｌ１及びＤｐｐａ３からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
細胞周期の進行を促進する遺伝子が腫瘍抑制因子ｐ５３、ｐ２１、ｐＲＢ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１９ＡＲＦ、ｐ１４ＡＲＦ又はｐ２７のうち少なくとも１つの不活性化を介して作用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞周期の進行を促進する遺伝子が細胞起源又はウイルス起源である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子がＦｏｓ、Ｊｕｎ、Ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｈ−ｒａｓ、ｒａｆ、ｋ−ｒａｓ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｌｍｏ２、Ｍｄｍ２、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、サイクリンＡ、サイクリンｂ、サイクリンｄ、Ｓｕｚ１２、Ｔｂｘ２、Ｔｂｘ３、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、Ｃｂｘ７及びＲｅｘからなる群から選択され、又はＦｏｓ、Ｍｙｃ、ＲｈｏＡ、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｌｍｏ２、Ｙａｐ１、Ｓｕｚ１２、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１及びＲｅｘから選択され、又はＦｏｓ、Ｍｙｃ及びＥｚｈ２から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子がＥ７、Ｃｏｒｅ、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ６、ｖＧＰＣＲ及びＳｖ４０ラージＴ抗原からなる群から選択され、又はＥ７、Ｃｏｒｅ、Ｅ６及びＳｖ４０ラージＴ抗原から選択され、又はＥ７及びＣｏｒｅから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＨｏｘＢ４、Ｔｌｘ１、ＨｏｘＡ９、Ｈｏｘｂ８、Ｓｔａｔ３及びＺＦＰ２１７からなる群から選択され、又はＢｃｌ−２、ＨｏｘＡ９及びＺＦＰ２１７から選択される、１つ又は複数の更なる遺伝子が細胞において発現される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞周期の進行を促進する遺伝子又は遺伝子産物がＦｏｓ、Ｅ７、ｃｏｒｅ、Ｅｚｈ２及びＭｙｃからなる群から選択され、多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物がＮａｎｏｇ及びＫｌｆ４からなる群から選択され、ＩｄファミリーメンバーがＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
有限寿命の細胞が、特定の遺伝的背景を有する個体又は個体群に由来し、該特定の遺伝的背景が少なくとも１つの突然変異、欠失、重複、ＳＮＰ関連変異及び／又は染色体異常によって野生型と異なる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）の後に、不死化細胞において増殖を終了若しくは遅延させる、老化を誘導する、及び／又は分化を誘導する任意の工程（ｉｉｉ）を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子の供給が細胞型特異的及び／又は調節性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子又は遺伝子産物を、工程（ｉ）の有限寿命の細胞のサブセットのみで供給し、及び／又は該遺伝子を該細胞のサブセットのみで発現させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を用いて産生可能な細胞又は細胞株。
【請求項１６】
少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクターセットであって、
各々が以下の（ａ）〜（ｃ）のカテゴリー：
（ａ）ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、
（ｂ）多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、
（ｃ）細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、
のうち１つから選択される少なくとも２つの遺伝子、及び
任意で形質導入細胞の選択を促進する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物
の発現を指向する、ベクター又はベクターセット。
【請求項１７】
細胞周期の進行を促進する遺伝子がＥ７、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、Ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｈ−ｒａｓ、ｒａｆ、ｋ−ｒａｓ、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ６、ｖＧＰＣＲ、Ｓｖ４０ラージＴ抗原、Ｍｄｍ２、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｙａｐ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、サイクリンＡ、サイクリンｂ、サイクリンｄ、Ｓｕｚ１２、Ｔｂｘ２、Ｔｂｘ３、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１、Ｃｂｘ７及びＲｅｘからなる群から選択され、又はＥ７、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、ＲｈｏＡ、Ｍｙｂ、βカテニン、Ｃｏｒｅ、Ｌｍｏ２、Ｅ６、Ｓｖ４０ラージＴ抗原、Ｙａｐ１、Ｓｕｚ１２、Ｅｚｈ２、Ｂｍｉ１及びＲｅｘから選択され、又はＦｏｓ、Ｃｏｒｅ、Ｍｙｃ、Ｅ７及びＥｚｈ２から選択され、
多能性の維持に関与する遺伝子がＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ２９０クラスター、Ｅｃａｔ１、Ｄｐｐａ５、ＥＲａｓ、Ｅｃａｔ８、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ２、Ｓａｌｌ４、Ｏｃｔ３／４、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１及びＤｐｐａ３からなる群から選択され、又はＮａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２から選択され、又はＮａｎｏｇ及びＫｌｆ４から選択され、及び／又は
ＢＭＰシグナル伝達の活性化を促進するＩｄ遺伝子又は遺伝子産物がＩｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３及びＩｄ４からなる群から選択され、
任意でＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＨｏｘＢ４、Ｔｌｘ１、ｖＧＰＣＲ、ＨｏｘＡ９、Ｈｏｘｂ８、Ｓｔａｔ３及びＺＦＰ２１７からなる群から選択され、又はＢｃｌ−２、ＨｏｘＡ９及び／又はＺＦＰ２１７から選択される１つ又は複数の更なる遺伝子を含む、請求項１６に記載のベクター又はベクターセット。
【請求項１８】
細胞アッセイ、３ｄ細胞培養モデルの確立、組織工学、１つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び／又は細胞カプセル化のための請求項１５に記載の細胞若しくは細胞株、又は請求項１６若しくは１７に記載のベクター若しくはベクターセットの使用。
【請求項１９】
変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷／機能不全、免疫系に関連する病態、がん、心理的病態、又は肥満を含む代謝性疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１５に記載の細胞若しくは細胞株、又は１６若しくは１７に記載のベクター若しくはベクターセット。
【国際調査報告】
2014503190.tif 000019
2014503190.tif 000020
2014503190.tif 000021
2014503190.tif 000022
2014503190.tif 000023
2014503190.tif 000024
2014503190.tif 000025
2014503190.tif 000026