(57)【要約】  本願発明は、既知の遺伝的要素を含有する微生物を単離する方法に関する。当該方法は、１）選択された微生物を含有する混合培養物を幾つかの複製物に希釈する工程、２）当該複製物を増殖させる工程、３）当該１つ以上の複製物中の当該微生物を検出する工程、及び当該微生物が標準的な手順により単離出来るまで、工程１）〜３）を反復する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の混合培養物から選択された微生物を単離する方法であって、以下の工程：
ａ）当該選択された微生物を含有する微生物の混合培養物を提供する工程、ここで、当該選択された微生物は、１つ以上の核酸分子を含有し、ここで当該核酸分子は、１５核酸塩基対以上の既知の特異的な連続配列を有し、かつここで当該選択された微生物の頻度が１０−３未満である；
ｂ）当該混合培養物を増殖培地で連続的に希釈して、希釈培養物を提供する工程；
ｃ）当該希釈培養物をインキュベートして当該微生物を増殖させる工程；
ｄ）工程（ｃ）で取得した希釈培養物中の当該核酸配列の存在又は非存在を検出することにより、当該混合培養物中の当該選択された微生物の頻度を判定して、内部に当該核酸分子が検出される最大の希釈培養物（Ｐ）を同定し、そして内部に当該核酸分子が検出されない最少の希釈培養物（Ｎ）を同定し、ここでＰとＮとの間の希釈係数がＤであり、希釈されない混合培養物に対する希釈培養物Ｎの全体の希釈係数がＤｔである；
ｅ）希釈Ｄｔを有する複製希釈培養物を調製及びインキュベートする工程；
ｆ）工程（ｅ）で取得した複製培養物中の当該核酸分子の存在又は非存在を検出する工程、ここで、当該複製希釈培養物中の当該選択された微生物の頻度は、培養物Ｐと比較して増大している；
ｇ）当該核酸分子を含有する複製希釈培養物を選択して、当該選択された培養物を使用して、工程（ｅ）〜（ｇ）を反復する工程、ここで、当該複製希釈培養物の全体の希釈係数（Ｄｔ）が係数Ｄにより増大しており、かつ工程（ｅ）〜（ｇ）が、当該核酸分子を含有する当該選択された微生物の頻度が１０−３、好ましくは１０−１を超えるまで反復される；
ｈ）工程（ｇ）で取得された複製希釈培養物の単一のコロニーをスクリーニングし、そして当該核酸分子を含有する当該選択された微生物を単離する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
工程ａ）における選択された微生物の頻度が、１０−４〜１０−７である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された微生物が、欠失及び／又は挿入突然変異の微生物である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記選択された微生物が細菌細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌細胞が、テルモアンエアロバクテリアカエ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌細胞が、テルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子が酵素をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、マレイン酸、アスパラギン酸、マロン酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸、クエン酸、酢酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、アコチン酸、グルカル酸、グルコン酸及び乳酸、アミノ酸、アルコール、アセトン、フルフラール及びレボグルコサンの生産に必要な代謝工程を触媒する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸分子がＰＣＲにより検出される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子が、当該核酸分子に対するハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の核酸分子が、２つ以上の核酸分子を含んでおり、ここで当該２つ以上の分子のそれぞれが、１５核酸塩基対以上の既知の特異的な連続配列を有し、そして当該２つ以上の分子が、５０〜１００００核酸塩基対の、好ましくは１５０〜３０００核酸塩基対の、より好ましくは１５０〜１５００核酸塩基対の、より大きな核酸分子内に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｄが１０である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｅ）において調製される複製培養物の数が２〜５００個である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物の突然変異が、相同組換えにより取得される、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の遺伝的要素を含有する微生物を単離する方法に関し、当該微生物は、例えば、抗生物質マーカーを有しない細菌細胞や、所望の遺伝子断片を含有するスクリーニング試験における微生物等である。
【背景技術】
【０００２】
マーカーを用いない遺伝子の欠失
抗生物質耐性マーカーや他の選択マーカー遺伝子は、異種遺伝子の染色体挿入や相同組換えによる既存の遺伝子の欠失により樹立された新しい細菌株を選択するために、一般的に使用される。宿主染色体中の抗生物質耐性遺伝子の存在は、細胞内で伝播し得るプラスミドの多様性を減少させる。これらはしばしば選択及び維持において同一の遺伝子に依存しているためである。染色体中に抗生物質耐性遺伝子を含有する遺伝子改変細菌は生物学的生産に利用するのに望ましくない。当該染色体中のＤＮＡが最終生成物に微量混入した場合、ヒト又は環境に対する病原性微生物に抗生物質耐性遺伝子が移動する危険性があるからである。恒常発現マーカーの挿入も、同様に、隣接する染色体遺伝子の発現に影響を与える可能性がある。従って、抗生物質耐性遺伝子又は他の選択マーカー遺伝子を用いずに、細菌染色体への遺伝子の挿入、又は細菌染色体からの遺伝子の欠失を検出する方法は、顕著な長所となる［１］。
【０００３】
無標識（即ち選択マーカーを使用しない）染色体遺伝子導入の１つの方策は、単一の相同組換えイベントによるプラスミドの挿入、その後の第二の組換えイベントによる当該プラスミドの除去（分解）により、所望の遺伝子型の株を生産する［１−３］。かかるアプローチの主要な短所は、挿入又は欠失が細胞の適合性を低下させる場合、前記分解イベントは、突然変異遺伝子型よりも野生型を優勢に再生産するため、非効率である点である。
【０００４】
他の方法としては、染色体の相同性の領域により挟まれた抗生物質耐性遺伝子を挿入することであり、当該方法において、部位特異的組換え酵素（ＳＳＲ）の認識部位が、抗生物質耐性遺伝子に隣接している（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｆｌａｎｋ）。染色体導入手段には、古典的なＲｅｃＡ−誘導相同組換え及びＰＣＲ産物を使用する組換え、及びファージにコードされた組換え機能、例えばバクテリオファージＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ又はバクテリオファージλＲｅｄ組換えを利用するＥＴクローニングを含む［４］。抗生物質遺伝子の切除に使用されるＳＳＲ／ｔａｒｇｅｔの例として、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰ、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＸｅｒ（Ｒｉｐ）／ｃｉｓ［１、６］、バクテリオファージλのＸｉｓ／ａｔｔＰ［７］、及び酵母サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びザイゴサッカロマイケス・ルーキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）にそれぞれ由来するＦＬＰ／ＦＲＴ［８］及びＲ／ＲＳ［９］が挙げられる。バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のＴｎ４４３０等のトランスポゾン［１０］やバチルス・アミロリクエファシエンスのローリングサークルプラスミド［１１］の組換え機能も採用出来る。
【０００５】
これらの系の使用は、改変される微生物のこれらの因子の機能性に依存する。微生物によっては、そのようなシステムは、最適な温度が高い、又は低いことにより、あるいは要求されるｐＨが高い又は低いことにより、あるいは組換え酵素の機能性を阻害し得る塩又は他の因子の存在により、動作し得ない。トランスポゾン又はプラスミド等の要素を使用する場合、それらは、関心のある微生物において機能するものであるべきである。そのような要素は多くの微生物において未だに同定されていないので、遺伝子導入イベントを検出する他の方法の需要が尚も存在する。代替的な方策として、ハロアセテート又は５―フルオロ―オロチン酸等のハロゲン化化合物に対する微生物の感受性の利用が挙げられる。５―フルオロ―オロチン酸は、ｐｙｒＦ遺伝子の存在により反選択（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔ）するのに使用され得る。ｐｙｒＦの産物は、５―フルオロ―オロチン酸を毒性の５−フルオロウラシルに変換するためである。ｐｙｒＦ遺伝子が標的微生物の染色体から除去されると、ｐｙｒＦ遺伝子は、プラスミド上又は染色体上の異なる場所への導入の選択マーカーとして使用され得る。この方法は、酵母において広く使用されており、クロストリジウム・テルモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）においても実証された［１２］。この方法が有効であるためには、選択される微生物は、ハロゲン化化合物に感受性である必要がある。テルモアンエアロバクター・マツラニイＢＧ１（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ  ＢＧ１）［１３］等の幾つかの産業用の微生物は、ハロゲン化化合物等の毒性化合物に対して高度な耐性を有しているため、上記方法は利用出来ない。一般に、微生物は、反応中間体の生産を避ける新しい経路を使用することにより、あるいは、そのような化合物の毒性を減少させる改変酵素を生産することにより［１４］、ハロゲン化化合物の毒性作用に対する感受性を減少させ得る。また、ｐｙｒＦ遺伝子が使用されると、それらが第二の突然変異において再び選択マーカーとして使用される前に、それらは除去されなければならない。
【０００６】
植物において、抗生物質耐性マーカーの除去は非常に重要である。選択マーカー遺伝子を回避する、又は除去する方法は、いくつか存在する。ＤＮＡの導入と同程度の効率で植物中のＤＮＡを除去出来る方法として、部位特異的組換え、転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）及び相同組換え等の使用が挙げられる。また、研究者は、有害な生物的活性を有しない代替的マーカー遺伝子を記載している。そのような非細菌性遺伝子の存在は、植物が非毒性薬剤を代謝して有害な物質を生産することを可能とする［１５］。
【０００７】
酵素等の商業的に重要な生産物をコードする遺伝子を含む株の単離
現在、微生物は、食糧部門（ｆｅｅｄ  ｓｅｃｔｏｒ）における産業的酵素の主要な供給源である［１６］。商業的に重要な酵素を生産する細胞の単離は、目的の細胞を見つけるための夥しい数の微生物細胞のスクリーニングを含む、退屈なプロセスである。スクリーニングは、例えば酵素の保存モチーフ等の公知のＤＮＡ配列に基づくものであってもよく、又は培養上澄中の酵素の活性の検出に基づくものであってもよい。原料は植物性であっても動物性であってもよく、又は原核微生物（例えば細菌及び古細菌）や真核微生物（例えば酵母及び真菌）であってもよい［１６］。
【０００８】
スクリーニングプロセスの早期にしばしば直面する問題は、天然の単離微生物がごく低濃度で商業的に重要な酵素を生産することである。そのような場合、酵素活性に基づくスクリーニング方法は成功しない［１６］。
【０００９】
他の通常知られるスクリーニング方法として、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲ又は酵素アッセイが挙げられる。いずれの場合も、細胞は、スクリーニングされる前に、プレート上のコロニーとして、又は純粋な液体培養物として単離される。このスクリーニングプロセスは、土壌、植物材料等、及び微生物叢のランダムな単離及びスクリーニングの数千の試料の試験を含む。高度な自動化が可能であったとしても、スクリーニング進行の速度は処理容量に大幅に依存する［１６］。
【００１０】
代替的なアプローチは、所望の遺伝子を混合細胞集団から宿主細胞に直接クローニングすることである。しかしながら、外来の宿主中で生産物が発現可能であるとは限らないため、そのような試みはほとんど無益である［１６］。
【００１１】
過去５０年間、医薬産業における主要なブレークスルーの半分以上は、天然の生産物に関するものであった。現在、臨床試験の後期に入っている化学治療剤の６０％は、微生物由来である。医薬、生物化学物質又は化学的成分を生産する微生物を同定及び単離する方法は、酵素を生産する株の単離に関する報告と同じ位多く報告されている。故に、細胞集団から特定の微生物細胞を単離する改善された方法であって、特定の代謝又は酵素産物の検出に依存せず、効率的なものの需要が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、公知の遺伝的要素を含有する微生物を単離する方法を提供し、当該微生物は、例えば、抗生物質マーカーを有しない細菌細胞や、所望の遺伝子断片を含有するスクリーニング試験における微生物等である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、所望のＤＮＡ断片を含有する微生物の頻度を段階的に増大させる技術に関し、当該技術は、１）選択された微生物を含有する培養物を幾つかの複製物に希釈する工程、２）それらの複製物を培養する工程、３）当該複製物の１つ以上の中の微生物を検出し、これらの工程１）〜３）を、標準的な手順により微生物が単離出来るまで反復する工程、を数ラウンド実施する。
【００１４】
前記発明は、希釈された微生物集団中に存在する選択された微生物が、それを見出す確率が１未満である濃度で見出される場合、当該選択された微生物の頻度は、より希釈率が低い集団中の頻度よりも高いはずであるという概念に基づいている。選択の各ラウンドにおいて、関心のある微生物の頻度は、プレーティングや、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション又は他のアッセイによる単離された微生物中のＤＮＡ断片の検出等の、標準的な方法により検出出来るまで、増大させられる。
【００１５】
本発明の方法を使用するとき、スクリーニング試験は、驚くべきことに、数千の単離された細胞のスクリーニングから、数百のスクリーニングにまで減少させられ得る。
【００１６】
本発明は、微生物の混合培養物から選択された微生物を単離する方法を提供し、当該方法は、以下の工程：
ａ）当該選択された微生物を含有する微生物の混合培養物を提供する工程、ここで、当該選択された微生物は、１つ以上の核酸分子を含有し、ここで当該核酸分子は、１５核酸塩基対以上の既知の特異的な連続配列を有し、かつここで当該選択された微生物の頻度が１０−３未満である；
ｂ）当該混合培養物を増殖培地で連続的に希釈して、希釈培養物を提供する工程；
ｃ）当該希釈培養物をインキュベートして当該微生物を増殖させる工程；
ｄ）工程（ｃ）で取得した希釈培養物中の当該核酸配列の存在又は非存在を検出することにより、当該混合培養物中の当該選択された微生物の頻度を判定して、内部に当該核酸分子が検出される最大の希釈培養物（Ｐ）を同定し、そして内部に当該核酸分子が検出されない最少の希釈培養物（Ｎ）を同定し、ここでＰとＮとの間の希釈係数がＤであり、希釈されない混合培養物に対する希釈培養物Ｎの全体の希釈係数がＤｔである；
ｅ）希釈Ｄｔを有する複製希釈培養物を調製及びインキュベートする工程；
ｆ）工程（ｅ）で取得した複製希釈培養物中の当該核酸分子の存在又は非存在を検出する工程、ここで、当該複製希釈培養物中の当該選択された微生物の頻度は、培養物Ｐと比較して増大している；
ｇ）当該核酸分子を含有する複製希釈培養物を選択して、当該選択された培養物を使用して、工程（ｅ）〜（ｇ）を反復する工程、ここで、当該複製希釈培養物の全体の希釈係数（Ｄｔ）が係数Ｄにより増大しており、かつ工程（ｅ）〜（ｇ）が、当該核酸分子を含有する当該選択された微生物の頻度が１０−３、好ましくは１０−１を超えるまで反復される；
ｈ）工程（ｇ）で取得された複製希釈培養物の単一のコロニーをスクリーニングし、そして当該核酸分子を含有する当該選択された微生物を単離する工程；
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】微生物のゲノム内に遺伝子断片を導入するのに使用される送達ベクターの模式図を示す。ＰＡＲ断片（ｐａｒＭ−ｅｘｔ）は、上流フランク（ＬＤＨ−Ｕｐ）と下流フランク（ＬＤＨ−Ｄｏｗｎ）の間に時計回りで配置されている。ＮｄｅＩは、当該ベクターが形質転換の前に直線化される部位を示している。ｐａｒＭ−ｅｘｔ−Ｒｅ（１００％）及びｐａｒＭ−ｅｘｔ−ｆｗ３（１００％）は、スクリーニングに使用されるプライミング部位である。ＬＤＨ−Ｄｏｗｎの下流からＬＤＨ−Ｕｐの上流は、ｐＵＣ１９に由来する。
【００１８】
【図２】１０−５混合物（５Ａｍ〜５Ｄｍ）並びに関連する陰性及び陽性対照のスクリーニング結果を示すアガロースゲルを示す。四角は選択された試料５Ｃｍを示し、個別の試料の分化に選択された。
【００１９】
【図３】混合物５Ｃｍ（図２）の個別試料のＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。５Ｃ１は、ゲノム中にｐａｒＭ−ｅｘｔが挿入された１つの試料であることが判明した。
【００２０】
【図４】混合物６Ｄｍ（１０−６）の個別試料のＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。６Ｄ４は、ゲノム中にｐａｒＭ−ｅｘｔが挿入された４つの試料の１つであることが判明した。
【００２１】
【図５】混合物７Ｄｍ（１０−７）の個別試料のＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。７Ｄ５は、ゲノム中にｐａｒＭ−ｅｘｔが挿入された試料であることが判明した。
【００２２】
【図６】混合物８Ａｍ（１０−８）の個別試料のＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。８Ａ５は、ゲノム中にｐａｒＭ−ｅｘｔが挿入された試料であることが判明した。
【００２３】
【図７】混合物９Ａｍ（１０−９）の個別試料のＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。９Ａ２は、ゲノム中にｐａｒＭ−ｅｘｔが挿入された試料であることが判明した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、抗生物質耐性マーカー遺伝子等のマーカーベースの選択技術を要さずに微生物の混合培養物から選択された微生物を単離する方法に関する。
【００２５】
微生物の混合培養物は、集団内の個々の微生物がＤＮＡ（例えば染色体又はプラスミドＤＮＡ分子）中の１５塩基対以上の公知の保存配列に関して相違する微生物の集団である。当該混合培養物中の微生物の集団は、「選択された微生物」を含む。
【００２６】
「選択された微生物」とは、微生物の混合培養物中に存在する特定の微生物であって、当該特定の微生物の細胞は、１つ以上の核酸分子（例えば染色体又はプラスミドＤＮＡ）を含み、当該分子は、当該培養系中の他の微生物の細胞内に存在しない１５核酸塩基対以上の公知の保存配列（又はヌクレオチド）を含む。当該特定の微生物は、この１５塩基対以上の保存核酸を含む微生物細胞を選択することにより、前記微生物の混合培養物から選択されてもよい。また、当該特定の微生物は、１５塩基対以上の核酸分子を２つ以上含む微生物細胞を選択することにより前記微生物の混合培養物から選択されてもよく、ここで当該２つ以上の分子は、５０〜１０，０００核酸塩基対、好ましくは１５０〜３，０００核酸塩基対、尚もより好ましくは１５０〜１５００核酸塩基対の、より大きな核酸分子内に含まれる。
【００２７】
本発明の方法を使用して微生物の混合培養物中に存在する選択された微生物を単離することは、当該混合培養物中の選択された微生物の頻度が１０−３未満である場合、特に適している。また、本発明の方法は、当該混合培養物中の選択された微生物の頻度が１０−４、１０−５、１０−６、又は１０−７未満である場合にも適している。
【００２８】
この選択された微生物を単離する方法は、表１に図示した驚くほど有効な技術を採用する。表１において、各チューブは容器を示すもので、前記微生物はその中で増殖する。この容器は、マイクロタイタープレート中のウェル、又は液体培養培地を含有する他の何らかの閉鎖空間であってもよい。
【００２９】
液体状態の増殖培地は、微生物の混合培養物を培養し、そして当該培養物を希釈するのに使用される。当該増殖培地は、当該微生物の増殖を支持するものであり、当該培地の組成は、各微生物の増殖に必要な全ての必須栄養素を提供するように適合させられている。当該方法は、当該増殖培地が選択される特定の微生物の増殖を選択的に促進することに依存せず、必要ともせず、故に非選択的増殖培地であってもよい。
【００３０】
（ａ）において、１つのチューブが微生物の混合培養物を含有することが示され、当該培養物は、選択された微生物を含有する。
【００３１】
工程（ｂ）において、当該混合培養物は、液体培養培地中に連続的に移されることにより希釈される。希釈の回数は、混合培養物の細胞密度に依存し得るが、典型的には、１０−２〜１０−９の範囲の希釈が想定され；より典型的には、最低で１０−６の希釈範囲が適している。希釈係数は好ましくは１：１０であるが、これよりも小さい又は大きい希釈係数も想定される。前記混合培養物の各希釈が１つの希釈培養により代表されることは想定されるし有効である。
【００３２】
工程（ｂ）における希釈培養物は、その後の検出工程に十分な細胞量が得られるまで増殖させられる。前記微生物の増殖を支持するのに採用されるインキュベーション条件は、各微生物の増殖の要求に適合するように調整される。増殖温度、好気培養の場合の空気供給量、嫌気培養条件、撹拌条件は、各微生物の既知の増殖要求に基づいて増殖を支持するように全て最適化される。インキュベーションの期間は、各微生物の増殖速度に基づいて選択されるが、通常は、増殖培地の栄養分が消耗する場合等の、増殖培地が微生物の増殖に適した条件を提供し続けられなくなるまで続行される。
【００３３】
検出工程は、１５核酸塩基対以上の公知の保存配列を有し、混合培養物の希釈物の１つ以上の中の選択された微生物に特異的な、１つ以上の核酸分子の存在を検出するために使用される。当該検出工程は、工程（ｂ）において調製及び培養される混合培養物の２つ以上、好ましくは３つ以上の希釈物に対して実施され、スクリーニングされる各希釈物は、１つの希釈培養物により代表される。当該核酸検出方法は、通常、各微生物に最適化され得る。ＤＮＡ検出のための細胞からの核酸分子（ＤＮＡ）の放出は、通常、細胞の破壊又は細胞の透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を必要とする。好ましくは、各希釈培養物の試料から、全ＤＮＡが抽出される。選択された微生物に特有の１つ以上の核酸分子を検出する方法として、当該１つ以上の核酸分子を特異的に増幅し得る核酸プライマーを採用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。他の核酸分子検出方法として、核酸分子と特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブ又はその相補鎖とのハイブリダイゼーションを含む。ＤＮＡ抽出やＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによるＤＮＡ検出の適切な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ等の標準的な教科書に詳細が記載されている［１７］。ＤＮＡ検出工程は、いずれの希釈物が選択された微生物を含有するかを同定するのに利用される。
【００３４】
前記混合培養物中の前記選択された微生物の頻度は、当該微生物が検出され得る希釈培養物の希釈率を、混合微生物培養物の増殖が観察される希釈系列中の最大の希釈試料の希釈率で割ることにより導き出される。
【００３５】
前記選択された微生物に特有の１つ以上の核酸分子が検出された混合培養物の最大の希釈試料を起源とする培養物を、Ｐと呼ぶ。前記選択された微生物に特有の１つ以上の核酸分子が検出出来なくなった混合培養物の最少の希釈試料を起源とする培養物を、Ｎと呼ぶ。Ｐ及びＮが期限とする希釈試料の間の希釈係数をＤと呼び、ここでＤは１より大きく、好ましくは１０であり；希釈されない混合培養物に対する希釈培養物Ｎを取得するための全体の希釈係数がＤｔである。
【００３６】
工程（ｃ）において、希釈培養物Ｎの２〜５００個の複製物（Ｐから出発して希釈係数Ｄｔを有する）が培養培地により作製されて、これらの複製物の１つ以上に選択された微生物が見出される確率を増大させる。もし希釈培養物Ｎが、Ｐを起源とする希釈試料の１０倍の希釈に由来する場合、希釈培養物Ｎの最低１０〜２０個の複製物が作製されるであろう。当該希釈培養物Ｎの複製物は、工程（ｄ）において、その後の検出工程（ｅ）を実施するのに十分な細胞量が取得されるまで増殖させられる。典型的には、複製物は工程（ｂ）と同一の条件で希釈物の元となった細胞培養物（Ｐ）と概ね同一の細胞密度となるまで増殖させられる。選択された微生物に特有の１つ以上の核酸分子の存在は、工程（ｅ）において、Ｎの複製培養物に対して検出が行われる。Ｎの複製希釈培養物の一部のみが、選択された微生物の核酸分子を含有し得る。しかしながら、選択された微生物の核酸分子が現在検出される培養物において、当該培養物中の他の微生物に対する選択された微生物の頻度は高くなり得る。例えば前記選択された微生物が２０個の培養物中２個において検出される場合、選択された微生物の頻度は、当該希釈物の元となった希釈培養物（Ｐ）の約１０倍高いこととなる。工程（ｆ）において、選択された微生物が検出されたＮの複製希釈培養物を、希釈及び選択の第二のサイクルにおける新しい工程（ｃ）を実施するための培養物Ｐとして使用する。このサイクルは、選択された微生物の頻度が、１０−３、好ましくは１０−２、尚もより好ましくは１０−１を超えるまで反復され得る。工程（ｃ）〜（ｆ）の反復回数は、一般的には１回以上であるが、大抵は、２、３、４、５又は６回以上であり、その後、選択された微生物が、選択された微生物の１つ以上の核酸分子の検出後の、固形増殖培地上のプレーティング、インキュベーション、及び単一細胞コロニーの培養等の、単一細胞コロニーを単離する標準的な技術を使用することにより、選択された微生物を含有する複製希釈培養物（Ｎ）から単離される。
【００３７】
本発明の方法は、スクリーニング実験の数を、数千の単離された細胞のスクリーニングから数百のスクリーニングに減少させるという、驚くべき利点を有する。当該方法は、核酸配列の欠失（例えば遺伝子欠失突然変異）又は核酸配列の挿入（例えば遺伝子挿入突然変異）により特徴付けられる、選択された微生物を単離するのに使用され得る。また、当該方法は、前記混合培養物中の他の微生物中に存在しない天然の特有の核酸配列を含有することにより特徴付けられる選択された微生物を単離するのに使用されてもよい。
【００３８】
前記方法は、液体培養で単細胞増殖が可能な任意の微生物、特に単細胞増殖が可能な細菌及び真菌（例えば酵母）細胞に適している。当該方法は、マーカーを有しない欠失又は挿入を作製するのに特に有用であり、例えば以下のような微生物に利用できる。
・好酸性古細菌スルフォロバレス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、テルモプラスマタレス（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、ＡＲＭＡＮ（Ａｒｃｈａｅａｌ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｍｉｎｅ  Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｃ  Ｎａｎｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、アシヂアヌス・ブリエルレイ（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ）、Ａ．インフェルヌス（Ａ．  ｉｎｆｅｒｎｕｓ）及びメタロスファエラ・セドゥラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）、並びに好酸性細菌アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びアシディチオバチラレス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、チオバチスル・プロスペルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｓｐｅｒｕｓ）、チオバチルス・アシドフィルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）チオバチスル・オルガノボルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｒｇａｎｏｖｏｒｕｓ）、チオバチルス・クプリヌス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｐｒｉｎｕｓ）及びアセトバクター・アセティ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）。
・好塩基性細菌ゲオアルカリバクター・フェリヒドリティクス（Ｇｅｏａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｉｃｕｓ）、バチルス・オクヘンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｋｈｅｎｓｉｓ）、及びアルカリバクテリウム・イブリエンセ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｂｕｒｉｅｎｓｅ）。
・ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のファミリーに属する好塩性古細菌及び好塩性細菌ハロバクテリウム・ハロビウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｏｂｉｕｍ）及びクロモハロバクター・ベイジェリンキイ（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）。
・超好熱性古細菌メタノパイルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、パイロフォブス・フマリイ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉ）、パイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、並びに超好熱性細菌ゲオテルモバクテリウム・フェリレドゥケンス（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）及びアクイフェクス・アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）。
・バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種及びテルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する好熱性細菌。
【００３９】
前記方法は、生産物を生産する微生物を選択手順を用いずに単離するのに特に有用であって、例えば単離される細胞は、以下のような化学的成分を生産する。
・酸（マレイン酸、アスパラギン酸、マロン酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸、クエン酸、酢酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、アコチン酸、グルカル酸、グルコン酸及び乳酸）、
・アミノ酸（セリン、リシン、スレオニン等）、
・アルコール（エタノール、ブタノール、プロパンジオール、ブタンジオール、アラビトール）又は
・他の高価値産物（アセトニン、フルフラル及びレボグルコサン等）、又は
・選択手段に不十分な量の酵素を生産する細胞。
【００４０】
前記方法は、発現される微生物の酵素の活性を検出するのに不十分な頻度で微生物の混合培養物中に存在する微生物細胞を単離するのに特に有用である。
【００４１】
本願発明は、選択のための何らかの形のマーカー遺伝子を要さず、かつ選択される微生物に、完全遺伝子［１８］、ヘテロ組換え酵素、抗生物質耐性マーカー、プラスミド又はトランスポゾン等を導入することを要さずに、選択された微生物をいかにして単離するかという問題を解決するものである。
【表１】
2014519835.tif 000002
【表２】
2014519835.tif 000003
【実施例】
【００４２】
材料及び方法
下記の実施例において、以下の材料及び方法が利用される。
【００４３】
酵素及び試薬
特に断りのない限り、酵素はＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  （Ｇｅｒｍａｎｙ）製のものを、供給者の推奨する条件で使用した。ＰＣＲは、（９４℃／６０℃／７２℃）の温度を（１５秒／１５秒／１５秒）ｘ２５のサイクルで行った。当該産物は、ＰＣＲ緩衝剤（１６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；  ６７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．８）；  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０，  １ｍＭ  Ｃｒｅｓｏｌ  Ｒｅｄ，  ０．１２５，  ０．１２５Ｍ  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００）中で、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤｒｅａｍＴａｑポリメラーゼを使用してＴｅｃｈｎｅ  ＰＣＲ装置を用いて増幅させられた。
【００４４】
ゲル電気泳動
ＰＣＲ産物は、ＢｉｏＲａｄ  ＳｕｂＣｅｌｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔを使用したアガロースゲル電気泳動に基づいて評価された。泳動は、８０Ｖで、１％アガロース中、２０〜３０分間行われた。泳動バンドは、ゲルに鋳込まれたエチジウムブロマイドにより可視化された。
【００４５】
回転培養管（ｒｏｌｌ  ｔｕｂｅ）単離
Ｈｕｎｇａｔｅロールチューブ［１９］を、固体表面培養からの無菌培養物の単離に使用された。単離されたクローンは、液体ＢＡ培地［２０］に移された。
【００４６】
複数の試料のマトリックススクリーニング
同時に複数の試料をスクリーニングするシステムを樹立するために、試料のプーリングを使用した。４列（Ａ〜Ｄ）ｘ５行（１〜５）のマトリックスに、２０個の試料を配置した。各試料（Ａ〜Ｄの各列）から、４００μｌを１つのチューブにプーリングし、この混合物から取得したＤＮＡを、ＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲで陽性であった列の個別の試料を抽出し、ＰＣＲで増幅した。
【００４７】
実施例１  テルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）株における、マーカーを用いない遺伝子欠失及び挿入
１．１  株及び増殖条件
テルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）株ＢＧ１０は、寄託番号２３０１５でＤＳＭＺ  （ＤＳＭＺ  −  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。全ての微生物株は、特に言及しない限り、２ｇ／Ｌ酵母抽出物を添加した最少培地（ＢＡ）で、嫌気的に、７０℃で培養した。固体培地においては、１１ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ及び３．８ｇ／ＬのＭｇＣｌ２／６Ｈ２Ｏを添加したＢＡ培地を含有する回転培養管を用いてクローニングを行った。必要に応じて１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地［１７］において、Ｔｏｐ１０を３７℃で培養した。
【００４８】
１．２  テルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ＢＧ１０Δｌｄｈ株の構築
テルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ＢＧ１０ｗｔ株（ＤＳＭ２３０１５）から、［１３］に記載される相同組換えにより、ＬＤＨ遺伝子を欠失させて、ＬＤＨ欠損株ＢＧ１０ＸＬを作製した。
【００４９】
１．３  ｐａｒＭ−ｅｘｔ挿入カセットの構築
ｐａｒＭ−ｅｘｔ断片をＢＧ１０ＸＬゲノムの乳酸デヒドロゲナーゼに挿入するのに使用されるＤＮＡ断片を、ベクターｐ３ｄｅｌ−ＰａｒＶ２−Ｋ１３中にクローニングした（図１）。当該ベクターは、以下の構造を有する。
【００５０】
１）ＢＧ１０のｌ−ｌｄｈ遺伝子の上流のＤＮＡ断片、プライマーｌｄｈｕｐ１Ｆ  （［配列番号１］；  ５’  -  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＣＧＣ  ＴＡＡ  ＡＧ  -  ３’）及びｌｄｈｕｐ２Ｒ  （［配列番号２］；  ５’  -ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＣＣ  -  ３’）を使用して増幅される。
２）単一で同定に使用される非コーディングｐａｒＭ−ｅｘｔ断片、プライマーｐａｒＭ−ｅｘｔ−Ｆｗ  （［配列番号３］；  ５’  -  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧ  -  ３’）及びｐａｒＭ−ｅｘｔ−ｒｅ  （［配列番号４］；  ５’  -  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧ  -  ３’）を使用して増幅される。
３）ＢＧ１０のｌ−ｌｄｈ遺伝子の下流のＤＮＡ断片、プライマーｌｄｈｄｏｗｎ３Ｆ  （［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］；  ５’  -  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  Ａ  -  ３’）及びｌｄｈｄｏｗｎ４Ｒ  （［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］；  ５’−  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｃ  -  ３’）を使用して増幅される。
【００５１】
上記ｐ３ｄｅｌ−ＰａｒＶ２−ｋ１３ベクターは、［２１］に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＭ２１６３（ＣＧＳＣ６５８１）中で増幅され、ミディサイズプレパレーション（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ）を使用して単離された。
【００５２】
１．４  ｐａｒＭ−ｅｘｔ挿入カセットを含有するベクターｐ３ｄｅｌ−ＰａｒＶ２−Ｋ１３の直鎖化
消化に先立ち、「ＤＮＡ  ｄｓ定量」を内蔵するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して、ベクターの定量を実施した。制限酵素ＮｄｅＩを用いて、１００μｌの反応系に５μｌのＮｄｅＩ  ｆａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｅｎｚｙｍｅを使用して、５０μｌのベクターｐ３ｄｅｌ−ＰａｒＶ２−Ｋ１３を消化した。消化は、一昼夜３７℃でＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ｆａｓｔ  ｄｉｇｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ中で実施された。直鎖化は、０．７％アガロースゲル上で評価された。
【００５３】
１．５  直鎖化ｐ３ｄｅｌ−ｐａｒＭ−ｅｘｔによるテルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ＢＧ１０ＸＬの形質転換
上記ＮｄｅＩ消化ベクター（〜１０μｇ／μｌ）（ｐ３ｄｅｌ−ｐａｒＭ−ｅｘｔ）を０℃まで冷却し、１００μｌのテルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ＢＧ１０ＸＬの完全に増殖した培養系に混合した。当該混合物を予冷した増殖培地に写し、７０℃で１６時間インキュベーションした。形質転換及び１６時間のインキュベーションに続いて、４つの連続的培養工程が、１％の接種材料を使用して適用された。連続的移動は、実際に予定通りに挿入された断片ではなく、ＮｄｅＩ消化形質転換鋳型を起源とする偽陽性シグナルを排除するために行われた。
【００５４】
１．６  ｐａｒＭ−ｅｘｔ断片のＰＣＲ検出
スクリーニングで利用したＰＣＲ条件は、９４℃の解離（１５秒）、６０℃のアニーリング（１５秒）、７２℃の延長（１５秒）であった。Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｅ  ＰＣＲ装置を用いて、ＰＣＲサイクルを２５回反復した。ポリメラーゼはＤｒｅａｍＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用し、スクリーニングにおけるプライマーは、ｐａｒＭ−ｅｘｔ−Ｆｗ３  （［配列番号７］    ５’  -  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  -  ３’）、ｐａｒＭ−ｅｘｔ−Ｒｅ  （［配列番号８］    ５’  -  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧ  -  ３’）を使用した。
【００５５】
１．７  ｐａｒＭ−ｅｘｔ挿入カセットで形質転換したテルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ＢＧ１０ＸＬのマーカーを用いない検出及び単離
ｐａｒＭ−ｅｘｔ挿入カセットで形質転換したテルモアンエアロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ＢＧ１０ＸＬを単離及び同定するために、以下の工程を実施した。４回目の移動直後に取得した完全に増殖した培養物からの出発はうまく達成し、培養培地で最初の１０倍希釈系列が作製され、同一の培養条件下でインキュベートされた（表２）。
【００５６】
１０−９の希釈培養物まで、増殖が検出された。各培養物からＤＮＡが単離され、ｐａｒＭ−ｅｘｔ断片の存在についてＰＣＲスクリーニングが行われた。当該断片は、１０−１〜１０−４の希釈物においてのみ検出された。同一の培養物の１０−５の希釈物の２０個の複製物が調製され、完全に増殖した培養物を得るために一昼夜インキュベートした。
【００５７】
５つの個別の希釈複製物を含有する４つの混合物（全部で２０個）におけるＰＡＲ−Ｍ−ｅｘｔ配列の存在を、ＰＣＲで解析した（図２）。図２において、４つの混合物（プールされた１０−５希釈培養物からなる）の少なくとも２つが、ｐａｒＭ−ｅｘｔを含有することが示されている（５Ｃｍ及び５Ｄｍ）。混合物５Ｄｍからの個別の５つの培養物の更なる解析により、５Ｃｍ混合物中の４つの個別の培養物の１つが、挿入されたｐａｒＭ−ｅｘｔ配列を含有することが明らかになった（５Ｃ１、図３）。
【００５８】
完全に増殖した培養物５Ｃ１を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（５Ｃ１）に関して１０−６となる。当該培養物を、一昼夜培養した。当該１０−６希釈培養物のプールされた試料の混合物において、ｐａｒＭ−ｅｘｔ断片の存在を解析し、単一の培養物６Ｄ１、６Ｄ２及び６Ｄ４において同定された（図４）。
【００５９】
チューブ６Ｄ４を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（６Ｄ４）に関して１０−７となる。当該培養物を、一昼夜培養した。図５に示すように、ｐａｒＭ−Ｅｘｔ断片の存在を培養物７Ｄ５において同定した。
【００６０】
７Ｄ５を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（７Ｄ５）に関して１０−８となる。当該培養物を、一昼夜培養した。図６に示すように、ｐａｒＭ−Ｅｘｔ断片の存在を培養物８Ａ５において同定した。
【００６１】
８Ａ５を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（８Ａ５）に関して１０−９となる。当該培養物を、一昼夜培養した。図７に示すように、ｐａｒＭ−Ｅｘｔ断片の存在を培養物９Ａ２において同定した。
【００６２】
ｐａｒＭ−ｅｘｔのゲノム挿入を有する純粋な培養物を単離するために、９Ａ２からロールチューブを調製した。インキュベーションの２日後、５つの単一コロニーを、Ｈｕｎｇａｔｅロールチューブから取り出し、それぞれ１０ｍｌの液体培地中でインキュベートした。５つの単一培養物中２つがｐａｒＭ−ｅｘｔ断片を含んでいた。正しいｐａｒＭ−ｅｘｔ断片の挿入（配列番号９）は、乳酸デヒドロゲナーゼの上流及び下流の領域におけるプライマーを使用した評価した。
【００６３】
取得されたＰＣＲ陽性培養物を、相同組換えに使用した領域の外側とアニーリングするプライマーを使用するＰＣＲによりチェックした。そのようにすると、組換えが起こっていないｌｄｈ遺伝子座も増幅されるが、その断片の長さが異なる。プライマーとして、ＬＤＨ−ｏｕｔ−Ｕｐ  （［配列番号：１０］  ５’  -  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  Ｇ  −  ３’）及びＬＤＨ−ｏｕｔ−Ｄｎ３  （［配列番号：１１］  ５’  -  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  −  ３’）が使用される。ＰＣＲの条件は、「ｐａｒＭ−ｅｘｔ断片のＰＣＲ検出」で記載したのと同一であるが、伸長時間を長くした（２分３０秒）。
【００６４】
細菌のゲノムに抗生物質耐性遺伝子又は他の機能的ＤＮＡ配列を導入することを要さずに、前記乳酸デヒドロゲナーゼは効率的に除去され、ｐａｒＭ−ｅｘｔに置換された。選択された微生物を見つけ出すのに全部で１５０個の培養物とＰＣＲ反応が使用され、その頻度は１０−４であった。選択された微生物の頻度を増大させる本発明を用いずにこの同定が行われたとしたら、少なくとも１０，０００個の単一の培養物を増殖及びＰＣＲ解析しなければならなかったであろう。
【００６５】
取得された株は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  （ＤＳＭＺ）に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ  Ｐｅｎｔｏｃｒｏｂｅ  ３１００−４０１の名で、寄託番号ＤＳＭ  ２４７２５で寄託された。
【００６６】
実施例２−牛糞肥料（ｃｏｗ  ｍａｎｕｒｅ）からの潜在的２，３−ブタンジオール生産細菌株の単離
２．１  増殖条件
還元ＬＢ（ｒｅｄｕｃｅｄ  ＬＢ）（５０％酵母抽出物及び５０％トリプトン）にバイオマス由来Ｃ５糖（２５ｇ／ｌキシロース）を添加した増殖培地に、牛糞肥料を播種した。当該培養物を、大気を遮断して維持した。これを、３７℃の定常温度で１７５ｒｐｍで撹拌してインキュベーションした。固体培地上での培養のため、工業グレードのキシロースを、１５ｇ／ｌ寒天を添加した還元ＬＢ培地に添加した。
【００６７】
２．２  潜在的な２，３−ブタンジオール生産株のスクリーニング
２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４）は、２，３−ブタンジオールの生産にのみ使用される酵素である。２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードするｂｕｄＣ遺伝子（配列番号１４）の存在を検出するのに、プライマーｂｕｄＣ＿ｄｅｔ＿２４７＿ｆｏｒｗａｒｄ  （（配列番号１２）５’-  ＡＡＣ  ＧＴＳ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＧＣＭ  ＧＧ  -  ３’）及びｂｕｄＣ＿ｄｅｔ＿６８４＿ｒｅｖｅｒｓｅ  （（配列番号１３）５’  -  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＮＧＡ  ＮＡＧ  ＧＣ  -  ３’）を用いたＰＣＲが行われた。ＰＣＲの条件は、「ｐａｒＭ−ｅｘｔ断片のＰＣＲ検出」に記載したものと同一とした。
【００６８】
混合培養物（環境培養（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）に由来する）を完全に増殖させ、増殖培地に連続的に移動させて、当該培養物の１０倍希釈系列を作製した。当該希釈物を「増殖条件」に記載の条件下でインキュベーションして、完全に増殖した培養物を取得した。
【００６９】
各希釈培養物から、ＤＮＡを単離した。２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの断片の存在は、４８３塩基対の増幅断片を形成するｂｕｄＣ＿ｄｅｔ＿２４７＿ｆｏｒｗａｒｄ及びｂｕｄＣ＿ｄｅｔ＿６８４＿ｒｅｖｅｒｓｅを用いたＰＣＲにより検出された。
【００７０】
１０−９に希釈したものまで増殖が検出されたが、ｂｕｄＣ断片が（ＰＣＲスクリーニングにより）検出された希釈物は、１０−１〜１０−５までであった。同一の培養物の１０−６希釈物の複製が２０個調製され、培養物が完全に増殖するまでインキュベーションされた。
【００７１】
１０−６希釈培養物の２０個の複製のＰＣＲスクリーニングは、「複数の試料のマトリックススクリーニング」に記載されたスクリーニングマトリックスを使用して実施された。６Ａｍ、６Ｂｍ及び６Ｃｍの３つの混合物がｂｕｄＣ断片の存在においてＰＣＲ陽性であったが、６Ｄｍは陰性であった。６Ａｍの個別の５つの培養物について更に解析を行い、１つの６Ａ１がＢｕｄＣ断片を含有していることが判明した。
【００７２】
そして完全に増殖した６Ａ１の培養物を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（６Ｃ１）に関して１０−７となる。当該培養物を、完全に増殖するまでインキュベーションした。ｂｕｄＣ断片の存在は、７Ｃ４を含む２０個の培養物中４個において検出された。
【００７３】
チューブ７Ｃ４を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（７Ｃ４）に関して１０−８となる。当該培養物を、完全に増殖するまでインキュベーションした。ｂｕｄＣ断片の存在は、８Ｄ３おいて検出された。
【００７４】
８Ｄ３を用いて２０個の希釈培養物を作製し、それぞれ１０倍の追加係数（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）で希釈されて、全体の希釈は、希釈前の出発培養物（８Ｄ３）に関して１０−９となる。当該培養物を、完全に増殖するまでインキュベーションした。ｂｕｄＣ断片の存在は、２０個の培養物中９Ａ５及び他の２つにおいて検出された。
【００７５】
９Ａ５から、培養プレートを、「増殖条件」の記載と同様に調製した。当該プレート上にコロニーが出現したとき、２５個の単一のコロニーを拾った。拾ったコロニーを２０μｌのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＦｒｅｅ水に懸濁して、コロニーＰＣＲを実施した。各懸濁コロニー１μｌを。上記ｂｕｄＣ検出プライマーを用いたＰＣＲの鋳型とした。全体で、２５個の単一コロニー中６個において、ｂｕｄＣ断片の存在が検出された。
【００７６】
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２     Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｕｎｌａｂｅｌｌｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５３，  ２１７−２２４，  （１９９６）．
３     Ｌｉｎｋ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｄ．  ＆  Ｃｈｕｒｃｈ，  Ｇ．  Ｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９，  ６２２８−６２３７，  （１９９７）．
４     Ｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｓａｗｉｔｚｋｅ，  Ｊ．  Ａ．  ＆  Ｔｈｏｍａｓｏｎ，  Ｌ．  Ｃ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６，  ３６１−３８８，  （２００２）．
５     Ｌｅｓｌｉｅ，  Ｎ．  Ｒ．  ＆  Ｓｈｅｒｒａｔｔ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆ．  Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４，  １５６１−１５７０，  （１９９５）．
６     Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ａｒａ，  Ｋ．，  Ｏｚａｋｉ，  Ｋ．  ＆  Ｇａｓａｗａｒａ，  Ｎ．  Ａ  ｎｅｗ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ８４，  ３１５−３１８，  （２００９）．
７     Ｚｕｂｋｏ，  Ｅ．，  Ｓｃｕｔｔ，  Ｃ．  ＆  Ｍｅｙｅｒ，  Ｐ．  Ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｔｔＰ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，  ４４２−４４５，  （２０００）．
８     Ｄａｔｓｅｎｋｏ，  Ｋ．  Ａ．  ＆  Ｗａｎｎｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７，  ６６４０−６６４５，  （２０００）．
９     Ｓｕｇｉｔａ，  Ｋ．，  Ｋａｓａｈａｒａ，  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｎａｇａ，  Ｅ．  ＆  Ｅｂｉｎｕｍａ，  Ｈ．  Ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２，  ４６１−４６９，  （２０００）．
１０   Ｓａｎｃｈｉｓ，  Ｖ．，  Ａｇａｉｓｓｅ，  Ｈ．，  Ｃｈａｕｆａｕｘ，  Ｊ．  ＆  Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，  Ｄ．  Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６３，  ７７９−７８４，  （１９９７）．
１１   Ｚａｋａｔａｅｖａ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｎｉｋｉｔｉｎａ，  Ｏ．  Ｖ．，  Ｇｒｏｎｓｋｉｙ，  Ｓ．  Ｖ．，  Ｒｏｍａｎｅｎｋｏｖ，  Ｄ．  Ｖ．  ＆  Ｌｉｖｓｈｉｔｓ，  Ｖ．  Ａ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｂｌｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８５，  １２０１−１２０９，  （２０１０）．
１２   Ｔｒｉｐａｔｈｉ，  Ｓ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｙｒＦ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｔａ  Ｍｕｔａｎｔ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７６，  ６５９１−６５９９，  （２０１０）．
１３   Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｊｕｓｔ  （Ｓｔｅｎｌｏｓｅｖｅｊ  ５２，  Ｂｒｏｎｓｈｏｊ，  ＤＫ−２７００，  ＤＫ）  ＆  Ａｈｒｉｎｇ，  Ｂ．，  Ｋｉｅｒ  （Ｆｒｕｅｒｈｏｊ  ４３，  Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，  ＤＫ−２９７０，  ＤＫ）．  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ  Ｓｔｒａｉｎ  ＢＧ１．  （２００７）．
１４   Ｖｌｉｅｇ，  Ｊ．，  Ｐｏｅｌａｒｅｎｄｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｍａｒｓ，  Ａ．  Ｅ．  ＆  Ｊａｎｓｓｅｎ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，  ２５７−２６２，  （２０００）．
１５   Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｒｉ−ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （ＩＳＡＡＡ）．  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｋ  Ｎｏ．  ３６：  Ｍａｒｋｅｒ−Ｆｒｅｅ  ＧＭ  Ｐｌａｎｔｓ．  （２００９）．
１６   Ｌｏｒｅｎｚ，  Ｐ．  ＆  Ｅｃｋ，  Ｊ．  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏ  ３，  ５１０−５１６，  （２００５）．
１７   Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｗ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）．
１８   Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ：  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐａｒｅｎｔ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４８，  １７１−１７７，  （１９８４）．
１９   Ｈｕｎｇａｔｅ，  Ｒ．  Ｅ．  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｓ  Ｊ．  Ｒ．  Ｎｏｒｒｉｓ  ＆  Ｄ．  Ｗ．  Ｒｉｂｂｏｎｓ）  Ｃｈ．  ４，  １１８−１３２  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９６９）．
２０   Ａｎｇｅｌｉｄａｋｉ，  Ｉ．，  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｓ．  Ｐ．  ＆  Ａｈｒｉｎｇ，  Ｂ．  Ｋ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ−Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｕｐｏｎ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，  ４６９−４７２，  （１９９０）．
２１   Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｊｕｓｔ  （Ｓｔｅｎｍａｇｌｅｖｅｊ  １３，  Ｂｒｏｎｓｈｏｊ，  ＤＫ−２７００，  ＤＫ）  ＆  Ｙａｏ，  Ｓ．  Ｇ．  Ｐ．，  ｓｔ．  ｔｈ，  Ｓｏｂｏｒｇ，  ＤＫ−２８６０，  ＤＫ）．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  （２０１０）．
【図１】
2014519835.tif 000004
【図２】
2014519835.tif 000005
【図３】
2014519835.tif 000006
【図４】
2014519835.tif 000007
【図５】
2014519835.tif 000008
【図６】
2014519835.tif 000009
【図７】
2014519835.tif 000010
【配列表】
2014519835000001.app
【国際調査報告】
2014519835.tif 000011
2014519835.tif 000012
2014519835.tif 000013