(57)【要約】  本発明は、標的脂肪族鎖長および／または好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸および誘導体の組成物を生成する、ポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列、組換え微生物および組換え微生物培養物を含めた組成物に関する。さらに、本発明は、組成物を作製および使用する方法に関する。組成物および方法は、脂肪酸およびその誘導体の高力価、高収率および高生産性を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物培養物であって、組換え微生物培養物が組換え微生物を含み、
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え微生物が、
ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含み、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする５’および３’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＤ）と、ＯＲＦＤの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＤ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＤ）の発現によって生成されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードするＳＰＳＤの１種または複数の変異体を含み、１種または複数の変異体は、それぞれ、ＯＲＦＤまたはＮＣＤに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＤおよび／または変異体ＮＣＤを含み、
組換え微生物培養物によって生成された、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、ＳＰＳＤを発現する組換え微生物と同じ種類の微生物の培養物によって生成された脂肪酸誘導体組成物よりも高力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を含む、組換え微生物培養物。
【請求項２】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＤが、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３】
ＯＲＦＤが、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、請求項２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＤが、ＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項５】
ＯＲＦＤが、配列番号１２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、請求項４に記載の組換え微生物培養物。
【請求項６】
変異体ＮＣＤが、ＮＣＤの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項７】
好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物培養物であって、組換え微生物培養物が組換え微生物を含み、
好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え微生物が、
ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含み、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（ＦａｂＡ／Ｚ）をコードする５’および３’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＥ）と、ＯＲＦＥの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＥ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＳＰＥ）の発現によって生成される、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、１種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＥまたはＮＣＥに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＥおよび／または変異体ＮＣＥを含み、
組換え微生物培養物によって生成された好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物が、ＳＰＳＥを発現する組換え微生物と同じ種類の微生物の培養物によって生成された脂肪酸誘導体組成物よりも高力価の、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を含む、組換え微生物培養物。
【請求項８】
ＯＲＦＥが、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＥが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、請求項７に記載の組換え微生物培養物。
【請求項９】
変異体ＮＣＥが、ＮＣＥの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項７または８に記載の組換え微生物培養物。
【請求項１０】
組換え微生物が、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項１１】
組換え微生物が、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項１２】
組換え微生物が、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項１３】
さらなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項１４】
組換え微生物が細菌である、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項１５】
細菌がエシェリキア・コリである、請求項１４に記載の組換え微生物培養物。
【請求項１６】
高力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物培養物であって、組換え微生物培養物が、組換え微生物を含み、
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え微生物が、
ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の修飾された活性であって、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードする５’および３’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＡ）と、ＯＲＦＡの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＡ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＡ）の発現によって生成されたβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、１種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＡまたはＮＣＡに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＡおよび／または変異体ＮＣＡを含む、修飾された活性と、
ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼの修飾された活性であって、（ｉ）修飾された活性は、組換え微生物と同じ種類の微生物における、チオエステラーゼをコードする５’および３’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＢ）と、ＯＲＦＢの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＢ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＢ）の発現によって生成されるチオエステラーゼの活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物は、チオエステラーゼおよび作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、１種または複数のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、ＯＲＦＢまたはＮＣＢに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＢおよび／または変異体ＮＣＢを含む、修飾された活性と
を含み、
組換え微生物培養物が、約３０ｇ／Ｌから約２５０ｇ／Ｌの間の高力価で脂肪酸誘導体組成物を生成し、組成物が標的脂肪族鎖長を有する、組換え微生物培養物。
【請求項１７】
組換え微生物が、
ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性をさらに含み、（ｉ）修飾された活性が、組換え微生物と同じ種類の微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする５’および３’末端を有するオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＣ）およびＯＲＦＣの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＣ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＣ）の発現によって生成されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なり；（ｉｉ）組換え微生物が、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、１種または複数のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、ＯＲＦＣまたはＮＣＣに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＣおよび／または変異体ＮＣＣを含む、請求項１６に記載の組換え微生物培養物。
【請求項１８】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、好ましい飽和パーセントをさらに有する、請求項１７に記載の組換え微生物培養物。
【請求項１９】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、飽和および不飽和脂肪族鎖を含み、標的脂肪酸誘導体の少なくとも約９０％が、飽和脂肪族鎖を有する、請求項１８に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２０】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２１】
ＯＲＦＣが、配列番号１４に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、請求項２０に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２２】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項２０に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２３】
ＯＲＦＣが、配列番号１２に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、請求項２２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２４】
変異体ＮＣＣが、ＮＣＣの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２５】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの組成物である、請求項１６から２４のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２６】
組換え微生物培養物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を１０％〜４０％の収率で生成する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２７】
組換え微生物培養物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の７００ｍｇ／Ｌ／時間〜３０００ｍｇ／Ｌ／時間の生産性を特徴とする、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２８】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするＯＲＦＡが、ＥＣ２．３．１．４１の酵素番号を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質およびＥＣ２．３．１．１７９の酵素番号を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項２９】
ＯＲＦＡが、配列番号２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＢ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡが、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質（配列番号２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードする、請求項２８に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３０】
ＯＲＦＡが、配列番号４に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＦ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡが、エシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質（配列番号４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードする、請求項２８に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３１】
変異体ＮＣＡが、ＮＣＡの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項１６から３０のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３２】
チオエステラーゼをコードするＯＲＦＢが、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するｔｅｓＡタンパク質をコードする、請求項１６から３１のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３３】
ＯＲＦＢが、配列番号６に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号６）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、チオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項３２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３４】
ＯＲＦＢが、配列番号８に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、チオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項３２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３５】
ＯＲＦＢが、配列番号１７に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号１７）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項３２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３６】
ＯＲＦＢが、配列番号１９に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号１９）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項３２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３７】
変異体ＮＣＢが、ＮＣＢの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項１６から３６のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３８】
組換え微生物が、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含む、請求項１６から３７のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項３９】
カルボン酸レダクターゼタンパク質が、マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＢタンパク質（配列番号１０）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスｆａｄＤ９タンパク質（配列番号２１）およびマイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＡタンパク質（配列番号２３）からなる群から選択されるカルボン酸レダクターゼタンパク質に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項３８に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４０】
組換え微生物が、ＥＣ１．１．−．−、ＥＣ１．１．１．１またはＥＣ１．２．１．１０の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組換え微生物培養物。
【請求項４１】
標的脂肪族鎖長が、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０およびそれらの組合せからなる脂肪族鎖長の群から選択される、請求項１６から４０のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４２】
２つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）を使用して、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および標的脂肪族鎖長を特性決定し、比が、ＣＹの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対する、ＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価であり、ＸおよびＹが整数値であり、ＸがＹより小さい、請求項１６から４０のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４３】
ＣＸ／ＣＹが、２から４の間の値を有する、請求項４２に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４４】
ＸおよびＹが、Ｘ＝８、Ｙ＝１０；Ｘ＝１２、Ｙ＝１４；Ｘ＝１４、Ｙ＝１６；およびＸ＝１８、Ｙ＝２０からなる群から選択される、請求項４２または４３に記載の組換え微生物。
【請求項４５】
組換え微生物が細菌である、請求項１６から４４のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４６】
細菌がエシェリキア・コリである、請求項１６から４５のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４７】
１種または複数のさらなるタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１６から４６のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物。
【請求項４８】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え微生物を作製する方法であって、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）からなる群から選択される２つの工程を含み、２つの工程は同一工程ではなく、２つの工程は、組換え微生物を作製するために任意の順序で実施され：
工程（Ａ）は：
５’および３’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＡ）と、ＯＲＦＡの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＡ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＡ）を使用して組換え微生物の出発群を調製することであって、各組換え微生物は、ＳＰＳＡの１種または複数の変異体を含み、（ｉ）ＯＲＦＡは、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＡは、それぞれ、ＯＲＦＡまたはＮＣＡに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＡおよび／または変異体ＮＣＡを含むことと、
組換え微生物の群から得られるクローンを炭素供給源の存在下で培養することと、
クローンをスクリーニングして、各クローンによって生成される脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および脂肪酸誘導体の力価を決定することであって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の最大力価を生成するクローンがあることと、
組換え微生物の群から得られるクローンを選択することであって、選択されるクローンは、最大力価より少ない力価で、標的脂肪族鎖長より長い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成し、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＡ（ＯＲＦＶＡ）および／または変異体ＮＣＡ（ＮＣＶＡ）を含む変異体ＳＰＳＡ（ＳＰＳＶＡ）を含むことと
を含み、
ただし、（ｉ）工程（Ａ）が、方法において、工程（Ｂ）に先行する場合には、工程（Ａ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＢをさらに含む、または（ｉｉ）工程（Ａ）が、方法において、工程（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ａ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＣをさらに含み；
工程（Ｂ）は：
５’および３’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＢ）と、ＯＲＦＢの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＢ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＢ）を使用して組換え微生物の出発群を調製することであって、各組換え微生物は、ＳＰＳＢの１種または複数の変異体を含み、（ｉ）ＯＲＦＢは、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＢは、それぞれ、ＯＲＦＢまたはＮＣＢに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＢおよび／または変異体ＮＣＢを含むことと、
組換え微生物の群から得られるクローンを炭素供給源の存在下で培養することと、
クローンをスクリーニングして、各クローンによって生成される脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および脂肪酸誘導体の力価を決定することであって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の最大力価を生成するクローンがあることと、
組換え微生物の群から得られるクローンを選択することであって、選択されるクローンは、最大力価にほぼ匹敵する力価で標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成し、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＢ（ＯＲＦＶＢ）および／または変異体ＮＣＢ（ＮＣＶＢ）を含む変異体ＳＰＳＢ（ＳＰＳＶＢ）を含むことと
を含み、
ただし、（ｉ）工程（Ｂ）が、方法において、工程（Ａ）に先行する場合には、工程（Ｂ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＡをさらに含む、または（ｉｉ）工程（Ｂ）が、方法において、工程（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ｂ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＣをさらに含み；
工程（Ｃ）は：
５’および３’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＣ）と、ＯＲＦＣの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＣ）とを含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＣ）を使用して組換え微生物の出発群を調製することであって、各組換え微生物は、ＳＰＳＣの１種または複数の変異体を含み、（ｉ）ＯＲＦＣは、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＣは、それぞれ、ＯＲＦＣまたはＮＣＣに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＣおよび／または変異体ＮＣＣを含むことと、
組換え微生物の群から得られるクローンを炭素供給源の存在下で培養することと、
クローンをスクリーニングして、各クローンの、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和パーセントおよび脂肪酸誘導体の力価を決定することであって、標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の最大力価を生成するクローンがあることと、
組換え微生物の群から得られるクローンを選択することであって、選択されるクローンは、最大力価にほぼ匹敵する力価で標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を生成し、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＣ（ＯＲＦＶＣ）および／または変異体ＮＣＣ（ＮＣＶＣ）を含む変異体ＳＰＳＣ（ＳＰＳＶＣ）を含むことと
を含み、
ただし、（ｉ）工程（Ｃ）が、方法において、工程（Ａ）に先行する場合には、工程（Ｃ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＡをさらに含み、または（ｉｉ）工程（Ｃ）が、方法において、工程（Ｂ）に先行する場合には、工程（Ｃ）の出発群の各組換え微生物は、ＳＰＳＶＢをさらに含む、方法。
【請求項４９】
２つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）を使用して、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および標的脂肪族鎖長を特性決定し、比が、ＣＹの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対する、ＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価であり、ＸおよびＹが整数値であり、ＸがＹより小さい、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
標的脂肪族鎖長ＣＸ／ＣＹ比が、少なくとも約２の値を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
標的脂肪族鎖長ＣＸ／ＣＹ比が、２から４の間の値を有する、請求項４９または５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ＸおよびＹが、Ｘ＝８、Ｙ＝１０；Ｘ＝１２、Ｙ＝１４；Ｘ＝１４、Ｙ＝１６；およびＸ＝１８、Ｙ＝２０からなる群から選択される、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
標的脂肪族鎖長が、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０およびそれらの組合せからなる脂肪族鎖長の群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
変異体ＮＣＶＺ（式中、Ｚ＝Ａ、ＢまたはＣ）が、ＮＣＶＺの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる、請求項４８から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
無作為化が、プロモーター配列のものである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
無作為化が、翻訳制御配列のものである、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
変異体ＯＲＦＶＺ（式中、Ｚ＝Ａ、ＢまたはＣ）が、ＯＲＦＶＺの突然変異誘発によって得られる、請求項４８から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）を含む、請求項４８から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）とそれに続く工程（Ｂ）を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）とそれに続く工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ｃ）を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ｃ）を含む、請求項４８から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することによって、標的脂肪族鎖長および３０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌの組成物の力価を有する脂肪酸誘導体組成物が生成される、請求項４８から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することによって、１０％〜４０％の収率の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が生成される、請求項４８から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することによって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の７００ｍｇ／Ｌ／時間〜３０００ｍｇ／Ｌ／時間の生産性が提供される、請求項４８から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、好ましい飽和パーセントも有する、請求項４８から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
好ましい飽和パーセントが、少なくとも約９０％である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの組成物である、請求項４８から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするＯＲＦＡが、ＥＣ２．３．１．４１の酵素番号を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質およびＥＣ２．３．１．１７９の酵素番号を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項４８から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ＯＲＦＡが、配列番号２に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＢ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡが、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質（配列番号２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ＯＲＦＡが、配列番号４に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＦ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＡがエシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質（配列番号４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
ＯＲＦＢが、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼタンパク質である、請求項４８から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
ＯＲＦＢが、配列番号６に示された配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号６）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＯＲＦＢが、配列番号８に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、チオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
ＯＲＦＢが、配列番号１７に示される配列を有する、エシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号１７）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
ＯＲＦＢが、配列番号１９に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢが、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（配列番号１９）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項４８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
ＯＲＦＣが、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣが、ＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するタンパク質をコードする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
ＯＲＦＣが、配列番号１２に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣが、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
組換え微生物が、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４８から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
カルボン酸レダクターゼタンパク質が、マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＢタンパク質（配列番号１０）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスｆａｄＤ９タンパク質（配列番号２１）およびマイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＡタンパク質（配列番号２３）からなる群から選択されるカルボン酸レダクターゼタンパク質に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
組換え微生物が、ＥＣ１．１．−．−、ＥＣ１．１．１．１またはＥＣ１．２．１．１０の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４８から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
組換え微生物が、１種または複数のさらなるタンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるタンパク質が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項４８から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
組換え微生物が細菌である、請求項４８から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
細菌がエシェリキア・コリである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
請求項４８から８５のいずれか一項に記載の方法によって作製された組換え微生物。
【請求項８７】
標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する方法であって、請求項１から４７のいずれか一項に記載の組換え微生物培養物を炭素供給源の存在下で培養すること、または請求項８６に記載の組換え微生物を炭素供給源の存在下で培養することを含む、方法。
【請求項８８】
培養することが、発酵を含む、請求項８７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、選択された脂肪族鎖長および／または飽和特徴を有する脂肪酸およびその誘導体を生成する方法ならびに当該脂肪酸およびその誘導体の組成物に関する。さらに、本発明は、組換え宿主細胞（例えば、微生物）、組換え宿主細胞の培養物および例えば、選択された脂肪族鎖長および飽和特徴を有する脂肪酸およびその誘導体の発酵生成において組換え宿主細胞の培養物を使用して組換え宿主細胞を作製および使用する方法に関する。
【０００２】
本願は、その全文が参照により明確に本明細書に組み込まれる、２０１１年８月３日に出願された米国仮出願番号第６１／５１４，８６１号の優先権の利益を主張する。
【０００３】
電子的に提出された材料の参照による組み込み
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含有し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。２０１２年７月２７日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＬＳ００３６ＰＣＴ．ｔｘｔと名づけられ、７４，９３４バイトの大きさである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ほとんどの生物における脂肪酸の生合成は、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡ前駆体に対する一連の酵素の作用を含む。脂肪酸生合成における２種の重要な補因子として、補酵素Ａ（ＣｏＡ）およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）がある。これらの２種の補因子は、長くなっていくアシル鎖を酵素から酵素へと運ぶことおよび縮合反応のための前駆体を供給することに関与している。
【０００５】
エシェリキア・コリ(Escherichia coli)(E. coli)における脂肪酸生合成サイクルは、このサイクルの考察のための参考の好都合な枠組みを提供する。Heath, R.J., et al., ［J Biol. Chem. 271(44):27795-801 (1996)］は、エシェリキア・コリ脂肪酸生合成の概観を提供している。縮合酵素によって使用されるマロニル−ＡＣＰは、マロニル−ＣｏＡからマロニル−ＡＣＰへのトランスアシル化によって生成し、これはマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ｆａｂＤ）によって触媒される。脂肪酸伸長の各サイクルには、基本的に４つの反応がある。このサイクルは、マロニル−ＡＣＰをアセチル−ＣｏＡと縮合するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ｆａｂＨ）によって開始される。
【０００６】
伸長サイクルの以下の説明は、図１を参照して示されている。伸長サイクルは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ｆａｂＢ）およびβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ｆａｂＦ）によって触媒されるマロニル−ＡＣＰおよびアシル−ＡＣＰの縮合で始まり、β−ケト−アシル−ＡＣＰが生成する。
【０００７】
第２に、β−ケト−アシル−ＡＣＰが、ＮＡＤＰＨ依存性β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＧ）によって還元されて、β−ヒドロキシ−アシル−ＡＣＰが生成する。
【０００８】
第３に、β−ヒドロキシ−アシル−ＡＣＰが、ｆａｂＡまたはｆａｂＺ  β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素のいずれかによって脱水されて、トランス−２−エノイル−アシル−ＡＣＰとなる。ＦａｂＡはまた、トランス−２−エノイル−アシル−ＡＣＰを、シス−３−エノイル−アシル−ＡＣＰに異性化することもでき、これによって、ｆａｂＩを迂回することができ、ｆａｂＢによって使用され（通常、最大でＣ１６の脂肪族鎖長のために）、β−ケト−アシル−ＡＣＰを生成し得る。
【０００９】
各サイクルにおける第４の工程は、トランス−２−エノイル−アシル−ＡＣＰをアシル−ＡＣＰに変換する、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＨＰＨ依存性エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）によって触媒される。
【００１０】
本明細書に記載された方法では、脂肪酸合成の終結は、アシル−ＡＣＰからアシル基をチオエステラーゼ除去して、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を放出することによって起こる。チオエステラーゼ（例えば、ｔｅｓＡ）は、スルフィドリル結合によってアシル鎖およびＡＣＰの間で生じるチオエステル結合を加水分解する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
本発明は、概して、組換え宿主細胞、組換え宿主細胞の培養物、組換え宿主細胞を作製する方法および特定の脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞が得られる、広範囲な脂肪族鎖長の脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞を使用する方法に関する。本発明は、当業者に、所望の標的脂肪族鎖長および所望のレベルの飽和を有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞を選択する能力を提供する。本発明の方法、組換え微生物および培養物は、本発明に先んじて報告された力価、収率および生産性よりも大きな、力価、収率および生産性で脂肪酸誘導体を生成するための方法において使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の態様において、本発明は、高力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体組成物を生成するよう操作された組換え宿主細胞培養物に関し、高力価とは、通常、約３０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌの間である。
【００１３】
本発明の組換え宿主細胞の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。コード配列は、組換え宿主細胞においてタンパク質の発現を促進する調節配列と作動可能に連結している。組換え宿主細胞におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性は、対応する宿主細胞における野生型遺伝子から発現されるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性に対して修飾されている。さらに、培養物中の組換え宿主細胞は、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、１種または複数のポリヌクレオチド配列を含む。コード配列は、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する調節配列と作動可能に連結している。組換え宿主細胞におけるチオエステラーゼの活性は、対応する宿主細胞における対応する野生型遺伝子から発現されるチオエステラーゼの活性に対して修飾されている。
【００１４】
本発明の組換え培養物は、通常、標的脂肪族鎖長および対照培養物と比較して好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の高力価、高収率および／または高生産性をもたらす。
【００１５】
本発明の組換え宿主細胞および宿主細胞培養物は、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードする１種または複数のヌクレオチド配列と、作動可能に連結している調節配列とをさらに含み得る。
【００１６】
本発明の第２の態様は、所望の飽和度の脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）の脂肪族鎖を提供することに関する。この態様では、本発明の組換え宿主細胞は、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列をさらに含む。組換え宿主細胞におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性は、対応する宿主細胞における野生型遺伝子から発現されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性に対して修飾されている。
【００１７】
本発明の第３の態様は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞培養物に関する。組換え宿主細胞は、通常、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を有する。組換え宿主細胞におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性は、対応する宿主細胞における野生型遺伝子から発現されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性に対して修飾されている。
【００１８】
本発明の第４の態様は、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞培養物に関する。組換え宿主細胞は、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するイソメラーゼ活性を欠く、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含む。組換え宿主細胞におけるイソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性は、対応する宿主細胞における野生型遺伝子から発現されるイソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性に対して修飾されている。
【００１９】
本発明の組換え宿主細胞培養物において、組換え宿主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞または細菌細胞であり得る。
【００２０】
本発明の培養物の組換え宿主細胞の実施形態は、１種または複数のさらなるタンパク質をコードする１種または複数のヌクレオチド配列と、作動可能に連結している調節配列とをさらに含み得る。このようなさらなるタンパク質の例として、それだけには限らないが、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質およびＥＣ１．１．−．−、ＥＣ１．１．１．１またはＥＣ１．２．１．１０の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質が挙げられる。このようなさらなるタンパク質は、基質としてのアシル−ＡＣＰからの特定の脂肪酸誘導体の生成を促進する組換え宿主細胞において発現され得る。
【００２１】
本発明の第５の態様は、本発明の組換え宿主細胞および組換え宿主細胞培養物を作製する方法に関する。組換え宿主細胞は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）の組成物を生成する本発明の方法によって作製され得る。本方法は、一般に、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）からなる群から選択される２つの中核工程を含む。通常、２つの工程は、同一工程ではなく、２つの工程は、組換え宿主細胞を作製するために任意の順序で実施され得る；例えば、工程（Ａ）とそれに続く工程（Ｂ）、工程（Ａ）とそれに続く工程（Ｃ）、工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ａ）、工程（Ｂ）とそれに続く工程（Ｃ）、工程（Ｃ）とそれに続く工程（Ｂ）または工程（Ｃ）とそれに続く工程（Ａ）。
【００２２】
簡潔には、方法工程（Ａ）は、標的脂肪族鎖長より長い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞を選択することに関する。方法工程（Ｂ）は、高力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞を選択することに関する。方法工程（Ｃ）は、高力価の、標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞を選択することに関する。
【００２３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、組換え宿主細胞は、カルボン酸レダクターゼタンパク質をコードする１種または複数のヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列とをさらに含む。カルボン酸レダクターゼタンパク質は、通常、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するタンパク質である。
【００２４】
本発明の方法のさらなる実施形態では、組換え宿主細胞は、１種または複数のさらなるタンパク質をコードする１種または複数のヌクレオチド配列と、作動可能に連結している調節配列とをさらに含む。このようなさらなるタンパク質の例として、それだけには限らないが、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。このようなさらなるタンパク質は、基質としてのアシル−ＡＣＰからの特定の脂肪酸誘導体の生成を促進するよう組換え宿主細胞において発現され得る。
【００２５】
第６の態様では、本発明は、より詳しくは、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞および組換え宿主細胞培養物を作製する方法に関する。これらの組換え宿主細胞は、通常、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を有する。これらの組換え宿主細胞を作製するために使用される本発明の方法は、通常、少なくとも工程（Ｃ）または工程（Ａ）の変法を使用する。
【００２６】
第７の態様では、本発明は、より詳しくは、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞および組換え宿主細胞培養物を作製する方法に関する。これらの組換え宿主細胞は、通常、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を有する。これらの組換え宿主細胞を作製するために使用される本発明の方法は、通常、少なくとも工程（Ｃ）または工程（Ａ）の変法を使用する。
【００２７】
第８の態様では、本発明は、より詳しくは、例えば、本明細書に記載されるような組換え宿主細胞を炭素供給源の存在下で培養することによって、標的脂肪族鎖長および／または好ましい程度の飽和を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する方法に関する。この方法の一実施形態では、培養は、発酵を含む。
【００２８】
第９の態様では、本発明は、本発明の組換え宿主細胞培養物を使用して生成される、標的脂肪族鎖長および／または好ましい程度の飽和を有する脂肪酸誘導体の実質的に精製された組成物に関する。
【００２９】
本発明のこれらおよびその他の態様および実施形態は、本明細書における開示を考慮すれば当業者には容易に思い浮かぶであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、エシェリキア・コリに由来する遺伝子産物に関する脂肪酸生合成経路の一例の概観を示す。
【００３１】
【図２】図２は、脂肪酸誘導体に変換する酵素の基質としてのアシル−ＡＣＰの概略図を示す。
【００３２】
【図３】図３は、パネルＡからＤにおいて、本発明の実施形態を例示するために使用されるいくつかの発現コンストラクトの模式図を示す。
【００３３】
【図４】図４は、組換え微生物におけるチオエステラーゼの活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼ活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対する脂肪種％（「ＦＡ」＝遊離脂肪酸および脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコール）」であり、Ｘ軸は、Ｃ１２／Ｃ１４比である。図中の各データ点は、培養されたクローンまたは培養された対照株に対応する。
【００３４】
【図５】図５は、組換え微生物におけるチオエステラーゼの活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼ活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対するＦＡ％」であり、Ｘ軸は、Ｃ１６／Ｃ１８比である。図中の各データ点は、培養されたクローンまたは培養された対照株に対応する。
【００３５】
【図６】図６は、組換え微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性が、対照微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対するＦＡ％」であり、Ｘ軸は、Ｃ１２／Ｃ１４比である。図中の各データ点は、培養されたクローンまたは培養された対照株に対応する。
【００３６】
【図７】図７は、組換え微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性が、対照微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対するＦＡ％」であり、Ｘ軸は、Ｃ１６／Ｃ１８比である。図中の各データ点は、培養されたクローンまたは培養された対照株に対応する。
【００３７】
【図８】図８は、組換え微生物におけるチオエステラーゼの活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼ活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対するＦＡ％」であり、Ｘ軸は、Ｃ１２／Ｃ１４比である。図中の各データ点は、培養されたクローンまたは培養された対照株に対応する。
【００３８】
【図９】図９は、組換え微生物におけるチオエステラーゼの活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼ活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対するＦＡ％」であり、Ｘ軸は、Ｃ１６／Ｃ１８比である。図中の各データ点は、培養されたクローンまたは培養された対照株に対応する。
【００３９】
【図１０】図１０は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ１２／Ｃ１４比の対応するデータ点が示されている。
【００４０】
【図１１】図１１は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ８およびＣ１０脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ８／Ｃ１０比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ８／Ｃ１０比の対応するデータ点が示されている。
【００４１】
【図１２】図１２は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ１２／Ｃ１４比の対応するデータ点が示されている。
【００４２】
【図１３】図１３は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１６およびＣ１８脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１６／Ｃ１８比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ１６／Ｃ１８比の対応するデータ点が示されている。
【００４３】
【図１４】図１４は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質）の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ８およびＣ１０脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ８／Ｃ１０比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ８／Ｃ１０比の対応するデータ点が示されている。
【００４４】
【図１５】図１５は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質）の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ１２／Ｃ１４比の対応するデータ点が示されている。
【００４５】
【図１６】図１６は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質）の活性が修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１６およびＣ１８脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１６／Ｃ１８比である。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られたクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ１６／Ｃ１８比の対応するデータ点が示されている。
【００４６】
【図１７】図１７は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書において、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性が修飾された株のスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。Ｘ軸上の図の底部に２種の株が示されている：「ＡＬＣ４８７」および「Ｄ１７８  ＰＴ５＿ｆａｂＡ／ｐＡＬＣ４８７」。図中、２種の株の各々について、菱形によってＣ１２／Ｃ１４比が示されており、棒グラフによって飽和種％が示されている。
【００４７】
【図１８】図１８は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性が修飾された株のスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ８およびＣ１０脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ８／Ｃ１０比である。Ｘ軸上の図の底部に２種の株が示されている：「ＡＬＣ４８７」および「Ｄ１７８  ＰＴ５＿ｆａｂＡ／ｐＡＬＣ４８７」。図中、２種の株の各々について、菱形によってＣ８／Ｃ１０比が示されており、棒グラフによって飽和種％が示されている。
【００４８】
【図１９】図１９は、脂肪族鎖長および飽和に対する効果を評価するよう、組換え微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書において、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性が修飾された株のスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、「飽和種％」であり、右のＹ軸は、Ｃ１６およびＣ１８脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１６／Ｃ１８比である。Ｘ軸上の図の底部に２種の株が示されている：「ＡＬＣ４８７」および「Ｄ１７８  ＰＴ５＿ｆａｂＡ／ｐＡＬＣ４８７」。図中、２種の株の各々について、菱形によってＣ１６／Ｃ１８比が示されており、棒グラフによって飽和種％が示されている。
【００４９】
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、ｃａｒＢオペロンへのＦａｂＢの付加によって修飾された脂肪アルコール生成株から得られた５５時間の時点での脂肪種（「ＦＡＳ」；脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸）生成の鎖長分布を示す。データは、親株（Ａｌｃ−２８７；図２０Ａ）および細胞において発現されるｆａｂＢのさらなるコピーを有する変異体（Ａｌｃ−３８３；図２０Ｂ）について示されている。
【００５０】
【図２１】図２１Ａ〜Ｄは、ｃａｒＢオペロンへのＦａｂＡの付加によって修飾された脂肪アルコール生成株から得られた５８時間の時点での脂肪種（「ＦＡＳ」；脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸）生成の鎖長分布を示す。データは、親株（ＬＣ−３０２；図２１Ａ）および細胞において発現される種々の量のｆａｂＡを有する３種の変異体（ＬＣ−３６９；図２１Ｂ、ＬＣ−３７２；図２１Ｃ、ＬＣ−３７５；図２１Ｄ）について示されている。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書において引用されたすべての特許、刊行物および特許出願は、個々の特許、刊行物または特許出願が各々、具体的に、個別に、すべての目的のために参照によりその全文が組み込まれるよう示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
定義
本明細書において使用される技術用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであって、制限となるよう意図されるものではないということは理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別に明確に示さない限り複数の言及を含む。したがって、例えば、「組換え微生物」への言及は、２以上のこのような組換え微生物を含み、「脂肪酸誘導体」への言及は、１種または複数の脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体の混合物を含み、「ポリヌクレオチド配列」への言及は、１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、「酵素」への言及は、１種または複数の酵素を含み、「制御配列」への言及は、１種または複数の制御配列などを含む。
【００５３】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等のその他の方法および材料も、本発明の実施において使用されてもよいが、好ましい材料および方法は、本明細書に記載されている。
【００５４】
本発明の説明および特許請求において、以下の技術用語が、以下に示される定義に一致して使用される。
【００５５】
本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、複素環式塩基、糖および１つまたは複数のリン酸基からなるポリヌクレオチドの単量体単位を指す。天然に存在する塩基（グアニン、（Ｇ）、アデニン、（Ａ）、シトシン、（Ｃ）、チミン、（Ｔ）およびウラシル（Ｕ））は、通常、プリンまたはピリミジンの誘導体であるが、天然に存在するおよび天然に存在しない塩基類似体も含まれることは理解されなくてはならない。天然に存在する糖は、ペントース（五炭糖）デオキシリボース（ＤＮＡを形成する）またはリボース（ＲＮＡを形成する）であるが、天然に存在するおよび天然に存在しない糖類似体も含まれるということは理解されなくてはならない。核酸は、通常、リン酸結合を介して連結して、核酸またはポリヌクレオチドを形成するが、多数のその他の連結が当技術分野で公知である（例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェートなど）。
【００５６】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得るリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造を指し、従って、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これらの用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体ならびに限定されないが、メチル化および／またはキャップドポリヌクレオチドなどの修飾されたポリヌクレオチドから作製されたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、それだけには限らないが、プラスミド、ウイルス性、染色体性、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含めた任意の形態であり得る。
【００５７】
本明細書において、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用される。用語「組換えポリペプチド」とは、一般に、発現されるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが、適した発現ベクター中に挿入されており、順に、発現ベクターが宿主細胞を形質転換してポリペプチドを生成するために使用される組換え技術によって生成されるポリペプチドを指す。
【００５８】
本明細書において、用語「相同体」および「相同の」とは、対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも約５０％同一である配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対応するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の相同性を有するポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。本明細書において、用語配列「相同性」および配列「同一性」は、同義的に使用される。
【００５９】
当業者ならば、２種以上の配列間の相同性を決定する方法はよく承知している。手短には、２種の配列間の「相同性」の算出は、以下のとおりに実施され得る。配列は、最適比較目的でアラインされる（例えば、最適アラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、比較目的のために非相同配列を無視してもよい）。好ましい実施形態では、比較目的でアラインされる第１の配列の長さは、第２の配列の長さの少なくとも約３０％、好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である。次いで、第１および第２の配列の対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合には、分子はその位置で同一である。２種の配列間の相同性パーセントは、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【００６０】
２種の配列間の配列の比較および相同性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ［Altschul,et al., J. Mol. Biol., 215(3): 403-410 (1990)］などの数学アルゴリズムを使用して達成され得る。２種のアミノ酸配列間の相同性パーセントはまた、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３，４、５または６の長さ加重を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定され得る［Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)］。２種のヌクレオチド配列間の相同性パーセントはまた、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。当業者は、初期相同性算出を実施し、それに応じてアルゴリズムパラメータを調整できる。パラメータの好ましいセット（および実施者が、分子が特許請求の範囲の相同性制限内にあるかどうかを調べるために、どのパラメータが適用されるべきかについて不確かである場合に使用されるべきもの）として、１２のギャップペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティーおよび５のフレームシフトギャップペナルティーを有するＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスがある。配列アラインメントのさらなる方法が、バイオテクノロジーの技術分野で知られている［例えば、Rosenberg, BMC Bioinformatics, 6: 278 (2005); Altschul, et al., FEBS J., 272(20): 5101-5109 (2005)を参照のこと］。
【００６１】
本明細書において、用語「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまたは極めて高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6に見出すことができる。水性および非水性方法は、その参考文献中に記載されており、いずれかの方法が使用され得る。本明細書において言及される特定のハイブリダイゼーション条件とは以下のとおりである：１）低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件−−約４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）と、それに続く、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー条件のために、洗浄の温度は、５５℃に増大され得る）で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの２回の洗浄；２）中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件−−約４５℃で６Ｘ  ＳＳＣと、それに続く、６０℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄；３）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件−−約４５℃で６Ｘ  ＳＳＣと、それに続く６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄および４）極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件−−６５℃で０．５Ｍ  リン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳと、それに続く６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄。極めて高いストリンジェンシーの条件（４）は、特に断りのない限り好ましい条件である。
【００６２】
本明細書において、用語「異種」とは、通常、生物中に天然に存在しないヌクレオチド配列またはタンパク質を指す。例えば、植物にとって内因性であるポリヌクレオチド配列が、組換え法によって細菌細胞中に導入され得、その結果、植物ポリヌクレオチドは、細菌細胞において異種ポリヌクレオチドである。
【００６３】
本明細書において、用語ポリペプチドの「断片」とは、４個のアミノ酸残基から全アミノ酸配列から１個のアミノ酸残基を引いたものの大きさの範囲の、全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を指す。本発明の特定の実施形態では、断片とは、ポリペプチドまたはタンパク質のドメインの全アミノ酸配列（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）を指す。
【００６４】
本明細書において、用語「突然変異体」および「変異体」ポリペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸によって対応する野生型ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すよう本明細書において同義的に使用される。いくつかの実施形態では、突然変異体ポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多いアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。例えば、突然変異体は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００６５】
ポリペプチドまたは断片ポリペプチドの好ましい変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能（例えば、酵素活性）の一部またはすべてを保持する。いくつかの実施形態では、変異体または断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）を保持する。その他の実施形態では、変異体または断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の約１００％を保持する。なおさらなる実施形態では、変異体または断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の１００％超を有する。どのアミノ酸残基が、生物活性に影響を及ぼさずに置換、挿入または欠失され得るかの決定におけるガイダンスは、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン）を使用して見出され得る。
【００６６】
本明細書に記載されたポリペプチドは、ポリペプチド機能に対して実質的な効果を有さないさらなる保存的置換または非必須アミノ酸置換を有し得るということが理解される。特定の置換が許容される（すなわち、カルボン酸レダクターゼ活性またはチオエステラーゼ活性などの所望の生物学的機能に悪影響を及ぼさない）か否かは、Bowie, et al.［Science, 247: 1306-1310 (1990)］に記載されるように決定され得る。
【００６７】
本明細書において、タンパク質をコードする「野生型遺伝子に由来するオープンリーディングフレーム」として、それだけには限らないが、以下：遺伝子によってコードされる野生型タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム；遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の変異体（例えば、野生型タンパク質の修飾によって得られた異なる配列を有する変異体タンパク質）をコードするオープンリーディングフレーム；およびオープンリーディングフレームが最適化されたコドンである野生型タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが挙げられる。野生型遺伝子に由来するオープンリーディングフレームのいくつかの例が、本明細書に例示されている［例えば、野生型、マイコバクテリウム・スメグマチス（mycobacterium smegmatis）ｃａｒＢ、脂肪酸レダクターゼタンパク質の最適化されたヌクレオチド配列（配列番号１５）；エシェリキア・コリｔｅｓＡ（１２Ｈ０８：配列番号１８）、チオエステラーゼタンパク質に由来する変異体タンパク質コード配列を参照のこと］。
【００６８】
本明細書において、用語「突然変異誘発」とは、生物の遺伝情報が安定した方法で変更されるプロセスを指す。タンパク質コーディング核酸配列の突然変異誘発は、突然変異体タンパク質をもたらす。突然変異誘発はまた、修飾されたタンパク質活性をもたらす非コーディング核酸配列における変更も指す。
【００６９】
本明細書において、用語「遺伝子」とは、ＲＮＡ産物もしくはタンパク質産物のいずれかをコードする核酸配列ならびにＲＮＡもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす作動可能に連結している核酸配列（例えば、このような配列として、それだけには限らないが、プロモーターまたはエンハンサー配列が挙げられる）またはＲＮＡもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす配列をコードする作動可能に連結している核酸配列（例えば、このような配列として、それだけには限らないが、リボソーム結合部位または翻訳制御配列が挙げられる）を指す。
【００７０】
本明細書において、「アシル−ＣｏＡ」とは、アルキル鎖のカルボニル炭素と補酵素Ａ（ＣｏＡ）の４’−ホスホパンテチオニル部分のスルフィドリル基の間に形成されたアシルチオエステルを指し、これは、式  Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｓ−ＣｏＡ（式中、Ｒは、少なくとも４個の炭素原子を有する任意のアルキル基である）を有する。
【００７１】
本明細書において、「アシル−ＡＣＰ」とは、アルキル鎖のカルボニル炭素とアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）のホスホパンテテイニル部分のスルフィドリル基の間に形成されたアシルチオエステルを指す。ホスホパンテテイニル部分は、ホロ−アシルキャリアタンパク質シンターゼ（ＡＣＰＳ）、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの作用によって、ＡＣＰ上の保存されたセリン残基と翻訳後結合される。いくつかの実施形態では、アシル−ＡＣＰは、完全に飽和されたアシル−ＡＣＰの合成における中間体である。その他の実施形態では、アシル−ＡＣＰは、不飽和アシル−ＡＣＰの合成における中間体である。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個の炭素を有する。これらのアシル−ＡＣＰの各々は、それらを図２に記載されるものなどの脂肪酸誘導体に変換する酵素の基質である。
【００７２】
本明細書において、「脂肪アルデヒド」とは、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を特徴とする式ＲＣＨＯを有するアルデヒドを意味する。いくつかの実施形態では、脂肪アルデヒドは、脂肪酸または脂肪酸誘導体から作製される任意のアルデヒドである。特定の実施形態では、Ｒ基は、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個または少なくとも１９個の炭素の長さである。あるいは、またはさらに、Ｒ基は、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下または６個以下の炭素の長さである。したがって、Ｒ基は、上記の終点のいずれか２種によって結合しているＲ基を有し得る。例えば、Ｒ基は、６〜１６個の炭素の長さ、１０〜１４個の炭素の長さまたは１２〜１８個の炭素の長さであり得る。いくつかの実施形態では、脂肪アルデヒドは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５またはＣ２６脂肪アルデヒドである。特定の実施形態では、脂肪アルデヒドは、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７またはＣ１８脂肪アルデヒドである。
【００７３】
本明細書において、「脂肪アルコール」とは、式ＲＯＨを有するアルコールを意味する。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールは、脂肪酸または脂肪酸誘導体から作製された任意のアルコールである。特定の実施形態では、Ｒ基は、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個または少なくとも１９個の炭素の長さである。あるいは、またはさらに、Ｒ基は、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下または６個以下の炭素の長さである。したがって、Ｒ基は、上記の終点のいずれか２種によって結合しているＲ基を有し得る。例えば、Ｒ基は、６〜１６個の炭素の長さ、１０〜１４個の炭素の長さまたは１２〜１８個の炭素の長さであり得る。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５またはＣ２６脂肪アルコールである。特定の実施形態では、脂肪アルコールは、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７またはＣ１８脂肪アルコールである。脂肪アルデヒドを生成するよう操作された微生物は、脂肪アルデヒドの一部を脂肪アルコールに変換し得る。脂肪アルコールを生成する微生物が、エステルシンターゼをコードするポリヌクレオチドを発現するよう操作される場合には、ワックスエステルが生成される。好ましい実施形態では、脂肪アルコールが、脂肪酸生合成経路から作製される。一例として、アシル−ＡＣＰは、チオエステラーゼ（例えば、エシェリキア・コリｔｅｓＡ）の作用によって脂肪酸に変換され得、これが、カルボン酸レダクターゼ［例えば、マイコバクテリア（Mycobacterium）ｃａｒＢ、ｃａｒＡまたはｆａｄＤ９］の作用によって脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールに変換される。脂肪アルデヒドの脂肪アルコールへの変換は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ［例えば、エシェリキア・コリＹｑｈＤまたはアシネトバクター（Acinetobacter）ａｌｒＡａｄｐ１］の作用によってさらに促進され得る。
【００７４】
本明細書において、用語「脂肪酸」とは、式ＲＣＯＯＨを有するカルボン酸を意味する。Ｒは、脂肪族基、好ましくは、アルキル基を表す。Ｒは、約４から約２２個の間の炭素原子を含み得る。脂肪酸は、飽和または一不飽和であり得る。好ましい実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸生合成経路から作製される。
【００７５】
本明細書において、用語「脂肪酸生合成経路」とは、アシルチオエステルを生成する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、アシルチオエステルを生成するよう操作され得る、いくつかの実施形態では、所望の炭素鎖特徴を有する脂肪酸を生成するようさらなる酵素とともに発現され得る脂肪酸シンターゼを含む。脂肪酸が、「酸」としてではなく、アシルチオエステルとして生合成されること、すなわち、酸が、チオエステルとしてＡＣＰまたはＣｏＡの４−ホスホパンテチオニル補欠分子族と結合していることは当業者には理解される。脂肪酸アシル基は、細胞において、膜、細胞壁、脂肪を構築するために使用され、脂肪酸に加水分解され得、脂肪酸誘導体、例えば、アルデヒド、アルコール、アルケン、アルカン、エステルなどを生成するようさらに生化学的に修飾され得る。
【００７６】
本明細書において、用語「脂肪酸誘導体」とは、幾分かは、脂肪酸生合成経路によって作製される生成物を意味する。用語「脂肪酸誘導体」は、本明細書において、用語「脂肪酸またはその誘導体」と同義的に使用され得、幾分かは、アシル−ＡＣＰまたはアシル−ＡＣＰ誘導体から作製された生成物を含む。例示的「脂肪酸誘導体」として、例えば、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、短鎖および長鎖アルコール、炭化水素（例えば、アルカン、アルケンまたは末端もしくは内部オレフィンなどのオレフィン）、脂肪アルコール、エステル［例えば、ワックスエステル、脂肪酸エステル（例えば、メチルまたはエチルエステル）］およびケトンが挙げられる。
【００７７】
本明細書において、用語「アルカン」とは、飽和炭化水素または炭素（Ｃ）および水素（Ｈ）のみからなり、これらの原子が一重結合によって一緒に連結している（すなわち、それらは飽和化合物である）化合物を意味する。
【００７８】
本明細書において、用語「オレフィン」および「アルケン」は、同義的に使用され、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する（すなわち、それらは不飽和化合物である）炭化水素を指す。
【００７９】
本明細書において、用語「末端オレフィン」、「α−オレフィン」、「末端アルケン」および「１−アルケン」は、炭化水素鎖の直線性および第１のまたはα位置の二重結合の位置によって同様の分子式を有するその他のオレフィンから区別されて、化学式ＣｘＨ２ｘを有するα−オレフィンまたはアルケンに関連して本明細書において同義的に使用される。
【００８０】
本明細書において、用語「脂肪エステル」とは、脂肪酸から作製された任意のエステル、例えば、脂肪酸エステルを指す。いくつかの実施形態では、脂肪エステルは、Ａ側およびＢ側を含有する。本明細書において、エステルの「Ａ側」とは、エステルのカルボン酸酸素と結合している炭素鎖を指す。本明細書において、エステルの「Ｂ側」とは、エステルの親カルボン酸を含む炭素鎖を指す。脂肪エステルが、脂肪酸生合成経路に由来する実施形態では、Ａ側は、アルコール（例えば、エタノールまたはメタノール）によって提供され、Ｂ側は、脂肪酸によって提供される。
【００８１】
脂肪エステルのＡ側を形成するために、任意のアルコールが使用され得る。例えば、アルコールは、脂肪酸生合成経路に由来するものであり得る。あるいは、アルコールは、非脂肪酸生合成経路によって生成されてもよい。さらに、アルコールは、外因的に提供され得る。例えば、アルコールは、生物によって脂肪エステルが生成される場合には、発酵ブロス中に供給され得る。あるいは、アルコールも生成し得る生物によって脂肪エステルが生成される場合には、脂肪酸または酢酸などのカルボン酸が外因的に供給され得る。
【００８２】
Ａ側またはＢ側を含む炭素鎖は、任意の長さであり得る。一実施形態では、エステルのＡ側は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６または１８個の炭素の長さである。脂肪エステルが、脂肪酸メチルエステルである場合は、エステルのＡ側は、１個の炭素の長さである。脂肪エステルが、脂肪酸エチルエステルである場合は、エステルのＡ側は、２個の炭素の長さである。エステルのＢ側は、少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６個の炭素の長さであり得る。さらに、Ａ側および／またはＢ側は、飽和または不飽和であり得る。
【００８３】
一実施形態では、脂肪エステルはワックスである。ワックスは、長鎖アルコールおよび長鎖脂肪酸に由来するものであり得る。別の実施形態では、脂肪エステルは、脂肪酸チオエステル、例えば、アシル−ＡＣＰである。脂肪エステルは、例えば、バイオ燃料または界面活性剤として使用され得る。
【００８４】
本明細書において、用語「組換え宿主細胞」とは、例えば、宿主細胞中に天然に存在する新規の遺伝要素の計画的な導入および／または遺伝要素の計画的な修飾によって、遺伝子構造が、対応する野生型宿主細胞に対して変更されている宿主を指す。このような組換え宿主細胞の子孫もまた、これらの新規のおよび／または修飾された遺伝要素を含有する。本明細書に記載された本発明の態様のいずれかにおいて、宿主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞［例えば、カンジダ（Candida）種などの糸状菌類またはサッカロミセス（Saccharomyces）種などの出芽酵母］、藻類細胞および細菌細胞からなる群から選択される。好ましい実施形態では、組換え宿主細胞は、「組換え微生物」である。
【００８５】
本明細書において、「組換え宿主細胞と同種の宿主細胞」とは、通常、組換え宿主細胞について記載された組換え修飾を有さない同種の宿主細胞を意味する。例えば、「組換え微生物と同じ種類の微生物」とは、通常、組換え微生物について記載された組換え修飾を含まない、組換え微生物と同種の（例えば、エシェリキア・コリ）および同株（例えば、エシェリキア・コリＫ−１２）の微生物を指す。
【００８６】
微生物である宿主細胞の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性菌細胞である。その他の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性菌細胞である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ザイモモナス（Zymomonas）、ロドコッカス（Rhodococcus）、シュードモナス（Pseudomonas）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ニューロスポラ（Neurospora）、フザリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、リゾムコール（Rhizomucor）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophtora）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、プレウロツス（Pleurotus）、トラメテス（Trametes）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、サッカロミセス、ステノトロファモナス（Stenotrophamonas）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、ヤロウイア（Yarrowia）またはストレプトマイセス（Streptomyces）属から選択される。
【００８８】
特定の好ましい実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア・コリ細胞である。いくつかの実施形態では、エシェリキア・コリ細胞は、株Ｂ、株Ｃ、株Ｋまたは株Ｗエシェリキア・コリ細胞である。
【００８９】
その他の実施形態では、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）細胞、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）細胞、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）細胞、バチルス・リケノフォルミス（Bacillus lichenoformis）細胞、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）細胞、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）細胞、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）細胞、バチルス・プミリス（Bacillus pumilis）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞、バチルス・クラウジー（Bacillus clausii）細胞、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）細胞、バチルス・サブリチス（Bacillus subtilis）細胞またはバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）細胞である。
【００９０】
その他の実施形態では、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギー（Trichoderma koningii）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）細胞、アスペルギルス・フミガテス（Aspergillus fumigates）細胞、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）細胞、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）細胞、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）細胞、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）細胞、ヒューミコラ・ラヌギノセ（Humicola lanuginose）細胞、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）細胞、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）細胞またはムコール・ミーヘイ（Mucor michei）細胞である。
【００９１】
さらにその他の実施形態では、宿主細胞は、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞またはストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus）細胞である。
【００９２】
さらにその他の実施形態では、宿主細胞は、アクチノミセテス（Actinomycetes）細胞である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ細胞である。
【００９４】
その他の実施形態では、宿主細胞は、真核生物植物、藻類、ラン藻類、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、藻類、それらの操作された生物または合成生物に由来する細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、光依存性であるか、炭素を固定する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、光依存性であるか、炭素を固定する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、光の存在下などで光独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、光の不在下で、従属栄養性であるか、または混合栄養性である。特定の実施形態では、宿主細胞は、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、パニカム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミスカンサス・ギガンテウス（Miscanthus giganteus）、ゼア・メイズ（Zea mays）、ボトリオコッカセ・ブラウニー（Botryococcuse braunii）、クラミドモナス・レインハードティー（Chlamydomonas reinhardtii）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliela salina）、シネココッカス（Synechococcus）種PCC 7002、シネココッカス（Synechococcus）種PCC 7942、シネコシスチス（Synechocystis）種PCC 6803、サーモシネココッカス・エロンガテス（Thermosynechococcus elongates）BP−1、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロロフレクサス・アウランチカス（Chloroflexus auranticus）、クロマチウム・ヴィノサム（Chromatiumm vinosum）、ロドスピリルム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）、ロドシュードモナス・パルスリス（Rhodopseudomonas palusris）、クロストリジウム・ルジュングダーリー（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）またはザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）に由来する細胞である。
【００９５】
その他の宿主細胞の例として、それだけには限らないが、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞またはＰＣ１２細胞が挙げられる。
【００９６】
本明細書において、用語「クローン」とは、通常、単一の共通の祖先、例えば、単一の細菌細胞から生じたクローニングされた細菌コロニーの細菌の子孫であり、それと本質的に遺伝的に同一である細胞または細胞の群を指す。
【００９７】
本明細書において、用語「培養物」は、通常、生存細胞を含む液体培地を指し、好ましい実施形態では、細胞は、クローンから得られる。一実施形態では、培養物は、制御された条件下で所定の培養培地中で複製する細胞、例えば、選択された炭素供給源および窒素を含む液体培地中で増殖された組換え微生物のクローンを含む。
【００９８】
本明細書において、用語「発酵」とは広く、宿主細胞による有機材料の標的物質への変換、例えば、炭素供給源を含む培地中で組換え微生物の培養物を増殖させることによる、組換え微生物による炭素供給源の脂肪酸またはその誘導体への変換を指す。
【００９９】
本明細書において、組換え微生物における、タンパク質、例えば、酵素の「修飾された」活性とは、親微生物に関連して決定される活性における１種または複数の遺伝的特徴の相違を指す。通常、活性の相違は、修飾された活性を有する組換え微生物と対応する野生型微生物の間で決定される（例えば、野生型エシェリキア・コリに対する、クローニングされた、組換えエシェリキア・コリの培養物の比較）。修飾された活性は、例えば、組換え微生物によって発現されたタンパク質の修飾された量（例えば、増大したかもしくは減少したコピー数のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、増大したかもしくは減少した数のタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物および／またはｍＲＮＡからのタンパク質の増大したかもしくは減少した量のタンパク質翻訳の結果のような）；タンパク質の構造の変化（例えば、基質特異性の変化をもたらすタンパク質のコード配列の変化などの一次構造の変化、観察された動態パラメータの変化）；およびタンパク質安定性の変化（例えば、タンパク質の増大したかまたは減少した分解）の結果であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されたポリペプチドのいずれかの突然変異体または変異体である。
【０１００】
本明細書において、用語「調節配列」とは、通常、タンパク質の発現を最終的に制御する、ＤＮＡ中の塩基の配列などのエレメントを指す。調節配列の例として、それだけには限らないが、ＤＮＡプロモーター配列、転写因子結合配列、転写終結配列、転写のモジュレーター（エンハンサーエレメントなど）、ＲＮＡ安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列および翻訳調節配列（リボソーム結合部位、開始コドン、終結コドンなど）が挙げられる。
【０１０１】
本明細書において、語句「前記ヌクレオチド配列の発現が、野生型ヌクレオチド配列に対して修飾されている」とは、内因性ヌクレオチド配列の発現および／もしくは活性または異種もしくは非天然ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および／もしくは活性のレベルの増大または減少を意味する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする内因性または異種ポリヌクレオチドの発現を制御する外因性調節エレメントは、宿主細胞のゲノム中への組換え組込みによって内因性または異種ポリヌクレオチドと作動可能に連結している発現制御配列である。いくつかの実施形態では、発現制御配列は、当技術分野で公知の方法を使用して相同組換えによって宿主細胞染色体中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドコード配列は、本明細書に記載されたポリペプチドコード配列のいずれかの突然変異体または変異体である。
【０１０２】
本明細書において、用語「オキソアシルＡＣＰシンターゼ」および「β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質」は、マロニル−ＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質）から２炭素単位を、脂肪酸アシル−ＡＣＰの別の分子に付加し、二酸化炭素の放出とともにβ−ケトアシル−ＡＣＰ、例えば、ＥＣ２．３．１．４１酵素をもたらす、長鎖脂肪酸合成の酵素を指すよう同義的に使用される。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）ＩＩＩ型は、最初の縮合反応を触媒する；本明細書において、語句「最初の縮合β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ」とは、これらの型のポリペプチドを指す。ＫＡＳ  Ｉ型およびＩＩ型は、脂肪酸生合成における伸長工程の触媒に関与している；本明細書において、語句「伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ」とは、これらの型のポリペプチドを指す。この群の酵素は、それだけには限らないが、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩ（ＥＣ２．３．１．４１）および３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩ（ＥＣ２．３．１．１７９）および国際生化学分子生物学連合（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）の酵素番号ＥＣ２．３．１．−の数値分類によって同定される酵素を含む。名称ＥＣ２．３．１．−は、ＥＣ２．３．１．Ｘ（ここで、Ｘは、整数である）、ＥＣ２．３．１．ｎＸ（ここで、Ｘは、整数である）［予備ＥＣ番号は、Ｘ＝ｎ１である場合、第４の（一連の）数字の一部として「ｎ」を含む］および分類ＥＣ２．３．１を有する酵素を含む。このような酵素をコードする遺伝子によってコードされるタンパク質の例として、それだけには限らないが、ｆａｂＢタンパク質、エシェリキア・コリ［J Biol. Chem. 13;279(33):34489-95 (2004)］;ｆａｂＦタンパク質、エシェリキア・コリ［J Bacteriol. 169(4):1469-73 (1987)］;ＣＥＭ１タンパク質、Ｓ．セレビシエ(cerevisiae)、［Mol. Microbiol. 9(3):545-55 (1993)］；ＫＡＳ２タンパク質、アラビドプシス(Arabidopsis)［Plant J 29(6):761-70 (2002)］;およびｆａｂＦタンパク質、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)［J Biol. Chem. 13;279(33):34489-95 (2004)］が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質は、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩ（ＥＣ２．３．１．４１）または３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩ（ＥＣ２．３．１．１７９）である。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質のさらなる例は、以下の表１に列挙されている。
【０１０３】
本明細書において、用語「アシル−ＡＣＰ加水分解酵素」タンパク質とは、脂肪酸上のアシル基を加水分解することによって脂肪酸アシル基伸長を終結させる、長鎖脂肪酸合成の酵素、通常、１−アシル結合を加水分解するチオエステル結合に作用する酵素を指す。この群の酵素として、それだけには限らないが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼおよび国際生化学分子生物学連合（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）の酵素番号ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の数値分類によって同定される酵素が挙げられる。名称ＥＣ３．１．２．−は、ＥＣ３．１．２．Ｘ（ここで、Ｘは、整数である）、ＥＣ３．１．２．ｎＸ（ここで、Ｘは、整数である）（予備ＥＣ番号は、Ｘ＝ｎ１である場合、第４の（一連の）数字の一部として「ｎ」を含む）および分類ＥＣ３．１．２を有する酵素を含む。このような酵素をコードする遺伝子によってコードされるタンパク質の例として、それだけには限らないが、ｔｅｓＡタンパク質、エシェリキア・コリ［J Biol. Chem. 268: 9238-45 (1993)］;ｆａｔＢタンパク質、ポピュラス・トメントサ(Populus tomentosa)［J. Genet. Genomics 34:267-273 (2007)］およびアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、バクテロイデス・シータイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)［Science 299:2074-2076 (2003)］が挙げられる。チオエステラーゼのさらなる例は、以下の表１に列挙されている。
【０１０４】
本明細書において、用語「β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素」とは、一般に、β−ヒドロキシアシルアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の脱水を触媒する長鎖脂肪酸合成の酵素を指す。この群の酵素として、それだけには限らないが、国際生化学・分子生物学連合（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）の酵素番号ＥＣ４．２．１．−またはＥＣ４．２．１．６０を含む；名称ＥＣ４．２．１．−は、ＥＣ４．２．１．Ｘ（ここで、Ｘは、整数である）、ＥＣ４．２．１．ｎＸ（ここで、Ｘは、整数である）（予備ＥＣ番号は、Ｘ＝ｎ１である場合、第４の（一連の）数字の一部として「ｎ」を含む）および分類ＥＣ４．２．１を有する酵素を含む。このような酵素をコードする遺伝子によってコードされるタンパク質の例として、それだけには限らないが、ｆａｂＡタンパク質、エシェリキア・コリ［Heath、R.J., et al., J Biol. Chem. 271(44):27795-801 (1996)］;およびｆａｂＺタンパク質、エシェリキア・コリ［Heath, R.J., et al., J Biol. Chem. 271(44):27795-801 (1996)］が挙げられる。β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質のさらなる例は、以下の表１に列挙されている。タンパク質によってコードされるエシェリキア・コリｆａｂＡおよびｆａｂＺは、図１に示されるようにβ−ヒドロキシアシルＡＣＰの脱水を触媒する。ｆａｂＡおよびｆａｂＺの基質特異性におけるわずかな相違が報告されている。例えば、ｆａｂＡは、イソメラーゼとして機能するのに対し、ｆａｂＺは機能しないと報告されている。本明細書において、用語「力価」とは、宿主細胞培養物の単位容量あたりの生成された脂肪酸または脂肪酸誘導体の量を指す。本明細書に記載された組成物および方法の任意の態様において、脂肪酸またはその誘導体は、約２５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１２５ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１７５ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約２２５ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約２７５ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ、約３２５ｍｇ／Ｌ、約３５０ｍｇ／Ｌ、約３７５ｍｇ／Ｌ、約４００ｍｇ／Ｌ、約４２５ｍｇ／Ｌ、約４５０ｍｇ／Ｌ、約４７５ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約５２５ｍｇ／Ｌ、約５５０ｍｇ／Ｌ、約５７５ｍｇ／Ｌ、約６００ｍｇ／Ｌ、約６２５ｍｇ／Ｌ、約６５０ｍｇ／Ｌ、約６７５ｍｇ／Ｌ、約７００ｍｇ／Ｌ、約７２５ｍｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約７７５ｍｇ／Ｌ、約８００ｍｇ／Ｌ、約８２５ｍｇ／Ｌ、約８５０ｍｇ／Ｌ、約８７５ｍｇ／Ｌ、約９００ｍｇ／Ｌ、約９２５ｍｇ／Ｌ、約９５０ｍｇ／Ｌ、約９７５ｍｇ／Ｌ、約１０００ｍｇ／Ｌ、約１０５０ｍｇ／Ｌ、約１０７５ｍｇ／Ｌ、約１１００ｍｇ／Ｌ、約１１２５ｍｇ／Ｌ、約１１５０ｍｇ／Ｌ、約１１７５ｍｇ／Ｌ、約１２００ｍｇ／Ｌ、約１２２５ｍｇ／Ｌ、約１２５０ｍｇ／Ｌ、約１２７５ｍｇ／Ｌ、約１３００ｍｇ／Ｌ、約１３２５ｍｇ／Ｌ、約１３５０ｍｇ／Ｌ、約１３７５ｍｇ／Ｌ、約１４００ｍｇ／Ｌ、約１４２５ｍｇ／Ｌ、約１４５０ｍｇ／Ｌ、約１４７５ｍｇ／Ｌ、約１５００ｍｇ／Ｌ、約１５２５ｍｇ／Ｌ、約１５５０ｍｇ／Ｌ、約１５７５ｍｇ／Ｌ、約１６００ｍｇ／Ｌ、約１６２５ｍｇ／Ｌ、約１６５０ｍｇ／Ｌ、約１６７５ｍｇ／Ｌ、約１７００ｍｇ／Ｌ、約１���２５ｍｇ／Ｌ、約１７５０ｍｇ／Ｌ、約１７７５ｍｇ／Ｌ、約１８００ｍｇ／Ｌ、約１８２５ｍｇ／Ｌ、約１８５０ｍｇ／Ｌ、約１８７５ｍｇ／Ｌ、約１９００ｍｇ／Ｌ、約１９２５ｍｇ／Ｌ、約１９５０ｍｇ／Ｌ、約１９７５ｍｇ／Ｌ、約２０００ｍｇ／Ｌ（２ｇ／Ｌ）、３ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌまたは前記値のうち任意の２種によって境界される範囲の力価で生成される。その他の実施形態では、脂肪酸または脂肪酸誘導体は、１００ｇ／Ｌ超、２００ｇ／Ｌ超、３００ｇ／Ｌ超またはそれより高い、５００ｇ／Ｌ、７００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ、１２００ｇ／Ｌ、１５００ｇ／Ｌまたは２０００ｇ／Ｌなどの力価で生成される。本発明のいくつかの実施形態によれば、組換え宿主細胞によって生成される脂肪酸またはその誘導体の好ましい力価は、５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌまたは３０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌである。
【０１０５】
本明細書において、用語「宿主細胞によって生成される脂肪酸またはその誘導体の収率」とは、投入炭素供給源が宿主細胞によって生成物（すなわち、脂肪アルコールまたは脂肪エステルなどの脂肪酸または脂肪酸誘導体）に変換される効率を指す。本発明の方法の実施形態にしたがって脂肪酸および脂肪酸誘導体を生成するよう操作された宿主細胞は、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％または少なくとも４０％または上記の値のいずれか２種によって境界される範囲の収率を有し得る。その他の実施形態では、脂肪酸または脂肪酸誘導体は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を超える収率で生成される。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、収率は、約４０％以下、約３７％以下、約３５％以下、約３２％以下、約３０％以下、約２７％以下、約２５％以下または約２２％以下である。したがって、収率は、上記の終点のいずれか２種によって境界され得る。例えば、本発明の方法に従って組換え宿主細胞の実施形態によって生成される脂肪酸またはその誘導体の収率は、５％〜１５％、１０％〜２５％、１０％〜２２％、１５％〜２７％、１８％〜２２％、２０％〜２８％、２０％〜３０％、１５％〜３０％、１０％〜３０％または１０％〜４０％であり得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法に従って組換え宿主細胞によって生成される脂肪酸またはその誘導体の収率は、１０％〜３０％または１０％〜４０％である。
【０１０６】
本明細書において、用語「生成された脂肪酸またはその誘導体の生産性」とは、単位時間あたり宿主細胞培養物の単位容量あたりの生成された脂肪酸または脂肪酸誘導体の量を指す。本明細書に記載された組成物および方法のいずれかの態様では、組換え宿主細胞によって生成された脂肪酸または脂肪酸誘導体の生産性は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも９００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１９００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２９００ｍｇ／Ｌ／時間または少なくとも３０００ｍｇ／Ｌ／時間である。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、生産性は、３５００ｍｇ／Ｌ／時間以下、３０００ｍｇ／Ｌ／時間以下、２５００ｍｇ／Ｌ／時間以下、２０００ｍｇ／Ｌ／時間以下、１５００ｍｇ／Ｌ／時間以下、１２０ｍｇ／Ｌ／時間以下、１０００ｍｇ／Ｌ／時間以下、８００ｍｇ／Ｌ／時間以下または６００ｍｇ／Ｌ／時間以下である。したがって、生産性は、上記の終点のいずれか２種によって境界され得る。例えば、いくつかの実施形態では、生産性は、３０〜３０００ｍｇ／Ｌ／時間、６０〜２０００ｍｇ／Ｌ／時間または１００〜１０００ｍｇ／Ｌ／時間であり得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法にしたがって組換え宿主細胞によって生成された脂肪酸またはその誘導体の生産性は、１５０ｍｇ／Ｌ／時間〜１５００ｍｇ／Ｌ／時間、５００ｍｇ／Ｌ／時間〜２５００ｍｇ／Ｌ／時間または７００ｍｇ／Ｌ／時間〜３０００ｍｇ／Ｌ／時間である。
【０１０７】
本明細書において、用語「過剰発現する」とは、同一条件下で、対応する野生型細胞において普通に発現されるものよりも高い濃度で細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するか、または発現されるようにすることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドが、同一条件下で同一種の非組換え宿主細胞におけるその濃度と比較して組換え宿主細胞においてより高い濃度で存在する場合に、ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞において「過剰発現され」得る。
【０１０８】
本明細書において、用語「作動可能に連結された」とは、適当な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が発現制御配列（単数または複数）と結合している場合に、遺伝子発現を可能にするような方法で接続しているポリヌクレオチド配列および発現制御配列（単数または複数）を指す。作動可能に連結しているプロモーターは、転写および翻訳の方向の点で選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。作動可能に連結しているエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、その内部またはその下流に位置し得る。作動可能に連結している翻訳制御エレメントは、ポリヌクレオチドのタンパク質コード配列の外側、内部またはその下流に位置し得る。
【０１０９】
本明細書において、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸、すなわち、ポリヌクレオチド配列を輸送できる核酸分子を指す。有用なベクターの１種として、エピソーム（すなわち、染色体外複製できる核酸）がある。有用なベクターは、連結している核酸の自己複製および／または発現が可能であるものである。作動可能に連結している遺伝子の発現を指示できるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、一般に、そのベクターの形態では、染色体と結合していない環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」の形態であることが多い。用語「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、ベクターの最も一般的に使用される形態であるが、本明細書において同義的に使用される。しかし、同等の機能を果たし、続いて、当技術分野で公知となるような発現ベクターのその他の形態も含まれる。
【０１１０】
ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含めた外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の当技術分野において認識される技術を指すよう同義的に使用される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適した方法は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Third Edition), Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に見出すことができる。
【０１１１】
本明細書において、用語「前記異種ヌクレオチド配列を発現するのに有効な条件下」とは、宿主細胞が所望の脂肪酸または脂肪酸誘導体を生成するのを可能にする任意の条件を意味する。適した条件は、例えば、発酵条件を含む。発酵条件は、温度範囲、通気のレベルおよび培地組成などの多数のパラメータを含み得る。これらの条件の各々は、個別に、組み合わせて、宿主細胞が増殖するのを可能にする。例示的培養培地は、ブロスまたはゲルを含む。一般に、培地は、宿主細胞によって直接的に代謝され得る炭素供給源を含む。発酵は、組換え微生物などの生成宿主による炭素供給源の使用を示す。発酵は、好気性、嫌気性またはその変法（微好気性など）であり得る。当業者には理解されるであろうが、組換え微生物が、炭素供給源をアシル−ＡＣＰまたは所望の脂肪酸もしくはその誘導体（例えば、脂肪エステル、アルカン、オレフィンまたはアルコール）に処理できる条件は、特定の微生物に基づいて幾分かは変わる。いくつかの実施形態では、このプロセスは、好気性環境において起こる。いくつかの実施形態では、このプロセスは、嫌気性環境において起こる。いくつかの実施形態では、このプロセスは、微好気性環境において起こる。
【０１１２】
本明細書において、用語「炭素供給源」とは、原核細胞または単純な真核細胞増殖のための炭素の供給源として使用されるのに適した基質または化合物を指す。炭素供給源は、それだけには限らないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドおよびガス（例えば、ＣＯおよびＣＯ２）を含めた種々の形態であり得る。例示的炭素供給源として、それだけには限らないが、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロースおよびアラビノースなどの単糖；フルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖などのオリゴ糖；デンプン、セルロース、ペクチンおよびキシランなどの多糖；スクロース、マルトース、セロビオースおよびツラノースなどの二糖類；ヘミセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース系物質および変異体；飽和または不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテートおよびアセテート；エタノール、メタノールおよびグリセロールまたはそれらの混合物などのアルコールが挙げられる。炭素供給源はまた、グルコースなどの光合成の産物であり得る。特定の好ましい実施形態では、炭素供給源は、バイオマスである。その他の好ましい実施形態では、炭素供給源は、グルコース、スクロース、フルクトースまたはそれらの組合せである。その他の好ましい実施形態では、炭素供給源は、サトウキビ、スイートソルガム、スイッチグラス、サトウダイコンなどの天然供給原料に直接的または間接的に由来する。
【０１１３】
本明細書において、用語「バイオマス」とは、炭素供給源が由来する任意の生物学的材料を指す。いくつかの実施形態では、バイオマスは、生物変換に適している炭素供給源に処理される。その他の実施形態では、バイオマスは、炭素供給源にさらに処理することを必要としない。炭素供給源は、脂肪酸または脂肪酸誘導体の任意の組合せに変換され得る。バイオマスの例示的供給源として、トウモロコシ、サトウキビまたはスイッチグラスなどの植物性物質または草木がある。バイオマスの別の例示的供給源として、動物性物質（例えば、牛糞肥料）などの代謝廃棄物がある。バイオマスのさらなる例示的供給源として、藻類およびその他の海草が挙げられる。バイオマスはまた、それだけには限らないが、発酵廃棄物、エンシレージ、藁、木材、汚水、ごみ、セルロース性都市廃棄物および食品廃棄物を含めた工業、農業、林業および家庭からの廃棄物を含む。用語「バイオマス」はまた、炭水化物（例えば、単糖、二糖類または多糖）などの炭素の供給源を指し得る。
【０１１４】
本明細書において、生成物（脂肪酸およびその誘導体など）に関連して、用語「単離された」とは、細胞成分、細胞培養培地または化学もしくは合成前駆体から分離されている生成物を指す。本明細書に記載された方法によって生成された脂肪酸およびその誘導体は、発酵ブロスにおいて、ならびに細胞質において比較的非混和性であり得る。したがって、脂肪酸およびその誘導体は、細胞内にまたは細胞外にのいずれかで有機相に集まり得る。有機相中に生成物が集まることによって、細胞機能に対する脂肪酸誘導体、脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールの影響を減少され得、組換え微生物がより多くの生成物を生成することを可能にし得る。本発明の方法によって生成された脂肪酸およびその誘導体は、一般に、組換え微生物が培養されている液体培地から単離される。
【０１１５】
本明細書において、用語「精製する」、「精製された」または「精製」とは、例えば、単離または分離による分子のその環境からの回収または単離を意味する。「実質的に精製された」分子は、関連しているその他の成分を少なくとも約６０％含まない（例えば、少なくとも約７０％含まない、少なくとも約７５％含まない、少なくとも約８５％含まない、少なくとも約９０％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９９％含まない）。本明細書において、これらの用語はまた、サンプルからの夾雑物の除去を指す。例えば、夾雑物の除去は、サンプル中の脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールのパーセンテージの増大をもたらし得る。例えば、組換え微生物において脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールが生成される場合には、脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールは、組換え微生物タンパク質の除去によって精製され得る。精製後、サンプル中の脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールのパーセンテージは増大する。用語「精製する」、「精製された」および「精製」は、絶対的な純度を必要としない相対的な用語である。したがって、例えば、組換え微生物において脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールが生成される場合には、精製された脂肪アルデヒドまたは精製された脂肪アルコールは、その他の細胞成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物またはその他の炭化水素）から実質的に分離されている脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールである。
【０１１６】
本明細書において、「現代（modem）炭素の割合」またはｆＭは、それぞれ、シュウ酸標準ＨＯｘＩおよびＨＯｘＩＩとして知られる、国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology）（ＮＩＳＴ）標準物質（Standard Reference Materials）（ＳＲＭｓ）４９９０Ｂおよび４９９０Ｃによって定義されるものと同じ意味を有する。基礎的定義は、０．９５×１４Ｃ／１２Ｃ同位体比ＨＯｘＩに関する（ＡＤ１９５０に対して参照される）。これはおよそ減衰補正された産業革命前の木材に相当する。現在生存している生物圏（植物材料）については、ｆＭはおよそ１．１である。
【０１１７】
本発明の全体的な概要
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の種類の組換え宿主細胞、特定のポリヌクレオチド配列、特定の突然変異、特定のタンパク質などに制限されないがこれは、このような詳細の使用は、本明細書の教示を考慮して選択され得るからであるということは理解されなければならない。本明細書において使用される技術用語は、単に本発明の特定の実施形態を説明することを目的とするものであって、制限であるよう意図されないということも理解されなければならない。
【０１１８】
組換え宿主細胞および組換え宿主細胞培養物
第１の態様において、本発明は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の高力価を生成するよう操作された組換え宿主細胞培養物に関し、力価は、通常、約３０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌの間である。それだけには限らないが、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、短鎖および長鎖アルコール、炭化水素（例えば、アルカン、アルケンまたは末端もしくは内部オレフィンなどのオレフィン）、脂肪アルコール、エステル（例えば、ワックスエステル、脂肪酸エステル（例えば、メチルまたはエチルエステル）およびケトンを含めた多数の脂肪酸誘導体が、本発明の組換え宿主細胞によって生成され得る。一実施形態では、本発明は、脂肪アルコールの生成に関する。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え宿主細胞によって生成された脂肪酸誘導体の高力価とは、野生型宿主細胞の対照培養物によって生成された同一脂肪酸誘導体の力価に対して、選択された脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体のより高い力価である。このような高い力価の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：組換え宿主細胞培養物は、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって生成されたＣ８の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの力価に対して、Ｃ８の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールのより高い力価を生成する；対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって生成されたＣ８およびＣ１０の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの力価に対して、Ｃ８およびＣ１０の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールのより高い力価を生成する；組換え宿主細胞培養物は、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって生成されたＣ１２の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの力価に対して、Ｃ１２の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールのより高い力価を生成する；組換え宿主細胞培養物は、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって生成されたＣ１２およびＣ１４の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの力価に対して、Ｃ１２およびＣ１４の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールのより高い力価を生成する；組換え宿主細胞培養物は、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって生成されたＣ１２、Ｃ１４およびＣ１８の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの力価に対して、Ｃ１２、Ｃ１４およびＣ１８の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールのより高い力価を生成する。本発明のその他の実施形態では、脂肪酸誘導体のより高い力価は、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって生成された同一脂肪酸誘導体の力価に対して、特定の種類の脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール、脂肪酸エステルまたは炭化水素）のより高い力価である。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび組換え宿主細胞においてタンパク質の発現を促進する作動可能に連結している調節配列を含む。組換え宿主細胞では、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードする対応する野生型遺伝子に対して修飾されている。組換え宿主細胞におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性は、対応する宿主細胞において野生型遺伝子から発現されるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性に対して修飾されている。さらに、培養物中の組換え宿主細胞は、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む１種または複数のポリヌクレオチド配列および組換え宿主細胞においてタンパク質の発現を促進する作動可能に連結している調節配列を含む。組換え宿主細胞では、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、チオエステラーゼをコードする対応する野生型遺伝子に対して修飾されている。組換え宿主細胞におけるチオエステラーゼの活性は、対応する宿主細胞において対応する野生型遺伝子から発現されたチオエステラーゼの活性に対して修飾されている。
【０１２１】
修飾された酵素活性を有するタンパク質を作製する方法が、以下に記載されている。さらに、このような修飾された活性を有するタンパク質を発現する例示的組換え宿主細胞は、実施例に記載されている。
【０１２２】
本発明の一実施形態は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の高力価を生成する組換え宿主細胞培養物を対象とする。組換え宿主細胞培養物は、組換え宿主細胞を含む。組換え宿主細胞は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作される。組換え宿主細胞は、通常、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の修飾された活性を含む。修飾された活性は、組換え宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞が由来する野生型宿主細胞）と同種の宿主細胞における、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＡ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＡ）、５’および３’末端を有するＯＲＦＡ、ならびにＯＲＦＡの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＡ）の発現によって生成されるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性とは異なる。出発ポリヌクレオチド配列は、例えば、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードする野生型遺伝子であり得る。さらに、組換え宿主細胞は、それぞれ、ＯＲＦＡまたはＮＣＡに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＡおよび／または変異体ＮＣＡを含むβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列を含む。さらに、組換え宿主細胞は、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼの修飾された活性を含む。修飾された活性は、組換え宿主細胞と同種の宿主細胞における、チオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＢ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＢ）、５’および３’末端を有するＯＲＦＢならびにＯＲＦＢの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＢ）の発現によって生成されたチオエステラーゼの活性とは異なる。出発ポリヌクレオチド配列は、例えば、チオエステラーゼをコードする野生型遺伝子であり得る。さらに、組換え宿主細胞は、ＯＲＦＢまたはＮＣＢに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＢおよび／または変異体ＮＣＢを含む、チオエステラーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列を含む。
【０１２３】
組換え宿主細胞培養物は、通常、高力価（約３０ｇ／Ｌから約２５０ｇ／Ｌの間）を有し、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体組成物を生成する。
【０１２４】
組換え培養物は、通常、組換え培養物と同一条件下で増殖された対照培養物によって生成される脂肪酸誘導体の力価より少なくとも約３倍多い、少なくとも約５倍多い、少なくとも約８倍多いまたは少なくとも約１０倍多い脂肪酸誘導体の力価を生成する。組換え培養物は、通常、突然変異誘発されたポリヌクレオチド配列（タンパク質の発現を促進する調節配列と作動可能に連結しているタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する）を含む組換え宿主細胞を含む。対照培養物は、通常、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質およびチオエステラーゼをコードする野生型遺伝子を発現する宿主細胞を含む。あるいは、対照培養物は、本発明の組換え宿主細胞への導入の前の突然変異誘発のための出発ポリヌクレオチド配列として使用されたポリヌクレオチド配列（タンパク質の発現を促進する調節配列と作動可能に連結しているタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する）を含む宿主細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞培養物は、約３０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌの脂肪酸誘導体の力価を生成する。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え宿主細胞培養物は、組換え培養物と同一条件下で増殖された対照培養物によって生成される脂肪酸誘導体の力価よりも少なくとも約３倍多い、約５倍多い、約８倍多いか、または約１０倍多い脂肪酸誘導体の収率をもたらす。脂肪酸誘導体収率の例として、約１０％から約４０％の間の脂肪酸誘導体の組換え宿主細胞培養物による生成が挙げられる。通常、力価および収率は、正の相関を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体の組換え宿主細胞培養物の生産性は、組換え培養物と同一条件下で増殖された場合の対照培養物の生産性よりも少なくとも約３倍多い、約５倍多い、約８倍多いまたは約１０倍多い。組換え宿主細胞培養物による脂肪酸誘導体生産性の例として、約７００ｍｇ／Ｌ／時間から約３０００ｍｇ／Ｌ／時間の間が挙げられる。通常、力価および生産性は、正の相関を有する。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、組換え宿主細胞培養物は、炭素供給源を含む培地中で増殖される。適した炭素供給源として、それだけには限らないが、単糖（例えば、グルコース）、二糖類（例えば、スクロース）、オリゴ糖、多糖（例えば、セルロースまたはデンプン）、セルロース性材料およびバイオマスが挙げられる。
【０１２８】
前記の実施形態のいずれかの組換え宿主細胞培養物では、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例として、それだけには限らないが、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質［酵素番号ＥＣ２．３．１．４１］または３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質［酵素番号ＥＣ２．３．１．１７９］をコードする配列が挙げられる。３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質を使用する好ましい実施形態では、シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、配列番号２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＢ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、変異体シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質（配列番号２）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードする。３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質を使用する好ましい実施形態では、シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、配列番号４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＦ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードし、変異体シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、エシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質（配列番号４）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードする。さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＡが、例えば、ＮＣＡの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＡ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＡ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１２９】
前記の実施形態のいずれかの組換え宿主細胞培養物では、チオエステラーゼをコードするヌクレオチド配列は、それだけには限らないが、チオエステラーゼタンパク質［ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号］をコードする配列を含む。チオエステラーゼタンパク質を使用する好ましい実施形態では、チオエステラーゼタンパク質ＯＲＦＢは、配列番号６、配列番号８、配列番号１７または配列番号１９に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢは、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１７または配列番号１９）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする。さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＢが、例えば、ＮＣＢの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＢ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＢ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１３０】
本発明の培養物の組換え宿主細胞は、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードする１種または複数のヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み得る。好ましい実施形態では、カルボン酸レダクターゼタンパク質とは、マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＢ脂肪酸レダクターゼタンパク質（配列番号１０）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。その他の実施形態では、カルボン酸レダクターゼタンパク質とは、（ｉ）マイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Mycobacterium tuberculosis）ｆａｄＤ９タンパク質（配列番号２１；米国特許公報第２０１００１０５９６３号も参照のこと）に対して、または（ｉｉ）マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＡタンパク質（配列番号２３；米国特許公報第２０１００１０５９６３号も参照のこと）に対して、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。
【０１３１】
さらに、本発明の組換え宿主細胞は、ＥＣ１．１．−．−、ＥＣ１．１．１．１またはＥＣ１．２．１．１０の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み得る。このようなアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質の例として、それだけには限らないが、エシェリキア・コリＡｄｈＥ、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質またはエシェリキア・コリｙｑｈＤ、アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質が挙げられる。
【０１３２】
本発明の組換え宿主細胞培養物では、脂肪酸誘導体の高力価は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０およびそれらの組合せからなる脂肪族鎖長の群から選択される脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の高力価であり得る。脂肪酸誘導体の高力価は、例えば、Ｃ８の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価、Ｃ１０の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価、Ｃ１２の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価、Ｃ１４の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価、Ｃ１６の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価、Ｃ１８の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価、Ｃ２０の脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの高力価ならびにそれらの組合せであり得る。一実施形態では、２つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）は、脂肪族鎖長を特性決定するために使用される。ＣＸ／ＣＹ比は、Ｃｙの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対するＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価である。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＸ／ＣＹは、約１．５〜約６の間の値を有する（ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい）。本発明のその他の実施形態では、ＣＸ／ＣＹは、少なくとも約２の値を有する（ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい）。好ましい実施形態では、ＣＸ／ＣＹは、約２から約４の間の値を有する（ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい）。ＸおよびＹの値の例として、それだけには限らないが：Ｘ＝８、Ｙ＝１０；Ｘ＝１２、Ｙ＝１４；Ｘ＝１４、Ｙ＝１６；およびＸ＝１８、Ｙ＝２０が挙げられる。ＸおよびＹの値のその他の組合せは、本明細書の教示を考慮すれば当業者には容易にわかる。
【０１３３】
本発明の第２の態様は、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）の脂肪族鎖の所望の飽和度を提供することに関する。この態様では、上記のような組換え宿主細胞は、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む１種または複数のポリヌクレオチド配列および組換え宿主細胞においてタンパク質の発現を促進する作動可能に連結している調節配列さらに含む。組換え宿主細胞では、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする対応する野生型遺伝子に対して修飾されている。組換え宿主細胞におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性は、対応する宿主細胞における野生型遺伝子から発現されたβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性に対して修飾されている。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、修飾された活性は、組換え宿主細胞と同種の宿主細胞における、５’および３’末端を有する、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＣ）およびＯＲＦＣの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＣ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＣ）の発現によって生成されたβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なる。組換え宿主細胞は、通常、それぞれ、ＯＲＦＣまたはＮＣＣに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＣおよび／または変異体ＮＣＣを含むβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＯＲＦＣは、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣは、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＯＲＦＣは、配列番号１２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣは、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする。
【０１３６】
さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＣは、例えば、ＮＣＣの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＣ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＣ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１３７】
一実施形態では、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物は、好ましい飽和パーセントをさらに有する。例えば、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物は、飽和および不飽和脂肪族鎖を含み、標的脂肪酸誘導体の少なくとも約９０％は、飽和脂肪族鎖を有する。本明細書の教示に従って、当業者ならば、標的脂肪酸誘導体の所望の飽和パーセントを容易に選択できる。
【０１３８】
本発明の第３の態様は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞培養物に関する。組換え宿主細胞培養物は、組換え宿主細胞を含む。組換え宿主細胞は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作される。組換え宿主細胞は、通常、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を有する。修飾された活性は、組換え宿主細胞と同種の宿主細胞における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＤ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＤ）、５’および３’末端を有するＯＲＦＤ、ならびにＯＲＦＤの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＤ）の発現によって生成されるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なる。組換え宿主細胞は、それぞれ、ＯＲＦＤまたはＮＣＤに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＤおよび／または変異体ＮＣＤを含む、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および作動可能に連結している調節配列をコードするＳＰＳＤの１種または複数の変異体を含む。組換え宿主細胞培養物によって生成される標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物は、ＳＰＳＤを発現する組換え宿主細胞と同種の宿主細胞の培養物によって生成される脂肪酸誘導体組成物よりも高い、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価を含む。出発ポリヌクレオチド配列は、例えば、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする野生型遺伝子であり得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＯＲＦＤは、配列番号１４に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤは、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＯＲＦＤは、配列番号１２に示される配列を有する、エシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＤは、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする。
【０１４０】
さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＤは、例えば、ＮＣＤの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＤ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＤ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１４１】
本発明のこの第３の態様の組換え宿主細胞は、本明細書に記載されるようなさらなる要素、例えば、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子、アシル−ＡＣＰ加水分解酵素遺伝子、カルボン酸レダクターゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などをさらに含み得る。
【０１４２】
第４の態様では、本発明は、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞培養物に関する。組換え宿主細胞培養物は、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成するよう操作された組換え宿主細胞を含む。組換え宿主細胞は、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を含む。修飾された活性は、組換え宿主細胞と同種の宿主細胞における、５’および３’末端を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦＥ）およびＯＲＦＥの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＥ）を含む出発ポリヌクレオチド配列（ＳＳＰＥ）の発現によって生成されるイソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性とは異なる。組換え宿主細胞は、それぞれ、ＯＲＦＥまたはＮＣＥに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＥおよび／または変異体ＮＣＥを含む、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列を含む。組換え宿主細胞培養物によって生成される好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物は、ＳＰＳＥを発現する組換え宿主細胞と同種の宿主細胞の培養物によって生成される脂肪酸誘導体組成物よりも高い、好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の力価を含む。出発ポリヌクレオチド配列は、例えば、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする野生型遺伝子であり得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＯＲＦＥは、配列番号１４に示された配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＥは、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする。
【０１４４】
さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＥは、例えば、ＮＣＥの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＥ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＥ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１４５】
本発明の第４の態様の組換え宿主細胞は、本明細書に記載されるようなさらなる要素、例えば、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子、アシル−ＡＣＰ加水分解酵素遺伝子、カルボン酸レダクターゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などをさらに含み得る。
【０１４６】
本明細書に記載された組換え宿主細胞培養物では、組換え宿主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞または細菌細胞であり得る。一実施形態では、組換え宿主細胞は、微生物（例えば、細菌または真菌）である。好ましい実施形態では、組換え宿主細胞は、細菌である。好ましい実施形態では、細菌は、エシェリキア・コリである。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態では、「脂肪酸誘導体」は、脂肪アルコールである。
【０１４８】
組換え宿主細胞および本発明の培養物のいくつかの実施形態では、作動可能に連結している調節配列は、オープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質の構成的または調節可能な発現をもたらす、作動可能に連結しているオープンリーディングフレームの構成的発現または調節可能な発現を付与し得る。例えば、宿主細胞におけるタンパク質の発現は、構成的プロモーターによって、または誘導可能／抑制可能プロモーターによって媒介され得る。誘導可能／抑制可能プロモーターの例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）またはアロラクトース（天然誘導物質）などのｌａｃオペロンの誘導因子が、ｌａｃレプレッサーと結合し、もはや、プロモーターに作用できず、プロモーターの制御下の遺伝子の転写を抑制するエシェリキア・コリｌａｃオペロンプロモーター；およびＧＡＬ４−誘導プロモーター。
【０１４９】
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列は、組換え宿主細胞の染色体中に組み込まれる、組換え宿主細胞にある１種または複数のプラスミド発現系に組み入れられる、またはその両方であり得る。実施例では、本発明の実施形態を例示するために、通常、プラスミド発現系が使用される。
【０１５０】
本発明の培養物の組換え宿主細胞の実施形態は、１種または複数のさらなるタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み得る。このようなさらなるタンパク質の例として、それだけには限らないが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。このようなさらなるタンパク質は、基質としてのアシル−ＡＣＰからの特定の脂肪酸誘導体の生成を促進するよう組換え宿主細胞において発現され得る（例えば、図２および表１を参照のこと）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態では、タンパク質をコードする野生型遺伝子は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）およびＯＲＦの発現およびコードされるタンパク質の生成を媒介するＯＲＦの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣ）を含むポリヌクレオチド配列を含む。ＯＲＦは、５’および３’末端を有し、野生型遺伝子では、天然の作動可能に連結している調節配列は、ＯＲＦの５’末端に隣接しており；すなわち、ＯＲＦの５’末端に天然に隣接している作動可能に連結している調節配列は、野生型遺伝子の５’非コード配列のゲノム配列からわかる調節配列である。例えば、野生型エシェリキア・コリゲノムでは、天然の作動可能に連結している調節配列は、ＯＲＦに隣接しているとわかるものである［例えば、エシェリキア・コリＫ−１２の完全ゲノム配列；Blattner, F.R., et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997);Riley, M., et al., Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006)；受託番号Ｕ０００９６．２を参照のこと］。本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＯＲＦおよび／または変異体ＮＣは、それぞれ、野生型ＯＲＦまたは野生型ＮＣに対して、１００％未満の配列同一性を有する。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列は、野生型遺伝子においてＯＲＦの５’末端に天然に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む野生型５’非コーディングポリヌクレオチド配列と比較した場合；すなわち、変異体配列が天然配列と同一ではない場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１５２】
ＯＲＦの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列に加えて、一般に本明細書に記載された方法に従って、さらなる調節配列が修飾され得る。このようなさらなる調節配列として、それだけには限らないが、ＯＲＦの３’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列またはイントロンポリヌクレオチド配列中に位置する作動可能に連結している調節配列を含む３’非コーディングポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１５３】
本発明の組換え宿主細胞および組換え宿主細胞培養物を作製する方法は、本明細書においてさらに詳細に記載される。
【０１５４】
組換え宿主細胞および培養物を作製する方法
本発明の第５の態様は、本発明の組換え宿主細胞および組換え宿主細胞培養物を作製する方法に関する。標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）の組成物を生成する組換え宿主細胞が、本発明の方法によって作製され得る。この態様では、本方法は、一般に、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）からなる群から選択される２つの中核工程を含み、２つの工程は同一工程ではなく、２つの工程は、組換え宿主細胞を作製するために任意の順序；例えば、工程（Ａ）とそれに続いて工程（Ｂ）、工程（Ａ）とそれに続いて工程（Ｃ）、工程（Ｂ）とそれに続いて工程（Ａ）、工程（Ｂ）とそれに続いて工程（Ｃ）、工程（Ｃ）とそれに続いて工程（Ｂ）または工程（Ｃ）とそれに続いて工程（Ａ）で実施される。
【０１５５】
本方法は、これら２つの中核工程に加えて、それだけには限らないが、さらなる工程（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）ならびにその他の宿主細胞操作（例えば、突然変異誘発工程）を含めたその他の工程を含み得る。さらに、任意の工程が、１回または複数回反復され、ならびに任意の順序（例えば、（Ａ）とそれに続いて（Ａ）とそれに続いて（Ｂ）；（Ｂ）とそれに続いて（Ａ）とそれに続いて（Ｂ）；（Ａ）とそれに続いて（Ｂ）とそれに続いて（Ａ）とそれに続いて（Ｂ）とそれに続いて（Ｃ）など）で実施され得る。
【０１５６】
工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の以下の説明では、出発ポリヌクレオチドは、例えば、活性が修飾されるタンパク質をコードする野生型遺伝子であり得る。その他の実施形態では、出発ポリヌクレオチド配列は、このような野生型遺伝子から導かれ得る（例えば、野生型遺伝子のポリヌクレオチド配列の変異体を使用して）。
【０１５７】
工程（Ａ）は、一般に、以下を含む。組換え宿主細胞の出発群は、出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＡ）、５’および３’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＡ）およびＯＲＦＡの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＡ）を含むＳＰＳＡを使用して調製される。各組換え宿主細胞は、（ｉ）ＯＲＦＡが、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＡが、それぞれ、ＯＲＦＡまたはＮＣＡに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＡおよび／または変異体ＮＣＡを含む、ＳＰＳＡの１種または複数の変異体を含む。
【０１５８】
組換え宿主細胞の群から得られるクローンは、炭素供給源の存在下で培養される。次いで、クローンは、各クローンによって生成された脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および脂肪酸誘導体の力価を決定するためにスクリーニングされる。クローンの中で、最大力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成するクローンが同定される。
【０１５９】
最大力価（すなわち、最大力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成すると同定されたクローンの最大力価）未満の力価で標的脂肪族鎖長より長い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞の群から得られるクローン（または１種もしくは複数のクローン）が選択される。選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＡ（ＯＲＦＶＡ）および／または変異体ＮＣＡ（ＮＣＶＡ）を含む変異体ＳＰＳＡ（ＳＰＳＶＡ）を含む。代替実施形態では、例えば、工程（Ａ）が実施される最終工程である場合には、最大力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成すると同定されたクローンが選択され得る。
【０１６０】
上記で示されるように、本方法の中核の２つの工程は、任意の順序で実施され得る。したがって、（ｉ）本方法において工程（Ａ）が工程（Ｂ）に先行する場合には、工程（Ａ）のための出発群の各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＶＢ（通常、少なくとも変異体ＯＲＦＢ（ＯＲＦＶＢ）および／または変異体ＮＣＢ（ＮＣＶＢ））をさらに含むか、または（ｉｉ）本方法において工程（Ａ）が工程（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ａ）のための出発群の各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＶＣ［通常、少なくとも変異体ＯＲＦＣ（ＯＲＦＶＣ）および／または変異体ＮＣＣ（ＮＣＶＣ）］をさらに含む。
【０１６１】
工程（Ｂ）は、以下を一般に含む。組換え宿主細胞の出発群が、出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＢ）、５’および３’末端を有する、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦＢ）およびＯＲＦＢの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＢ）を含むＳＰＳＢを使用して調製され、各組換え宿主細胞は、（ｉ）ＯＲＦＢが、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼをコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＢが、それぞれ、ＯＲＦＢまたはＮＣＢに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＢおよび／または変異体ＮＣＢを含む、ＳＰＳＢの１種または複数変異体を含む。
【０１６２】
組換え宿主細胞の群から得られるクローンは、炭素供給源の存在下で培養される。次いで、クローンは、各クローンによって生成された脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および脂肪酸誘導体の力価を決定するためにスクリーニングされる。クローンの中で、最大力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成するクローンが同定される。
【０１６３】
最大力価（すなわち、最大力価の、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成すると同定されたクローンの最大力価）にほぼ匹敵する力価で標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞の群から得られるクローン（または１種もしくは複数のクローン）が選択される。選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＢ（ＯＲＦＶＢ）および／または変異体ＮＣＢ（ＮＣＶＢ）を含む変異体ＳＰＳＢ（ＳＰＳＶＢ）を含む。
【０１６４】
通常、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する選択されるクローンは、最大力価にほぼ匹敵する力価で脂肪酸誘導体を生成する。本発明の方法のその他の実施形態では、選択されるクローンは、最大力価の約２％内、最大力価の約５％内、最大力価の約１０％内、最大力価の約２０％内または最大力価の約３０％内の力価で標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する。
【０１６５】
上記で示されるように、本方法の中核の２つの工程は、任意の順序で実施され得る。したがって、（ｉ）本方法において工程（Ｂ）が工程（Ａ）に先行する場合には、工程（Ｂ）のための出発群の各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＶＡ［通常、少なくとも変異体ＯＲＦＡ（ＯＲＦＶＡ）および／または変異体ＮＣＡ（ＮＣＶＡ）］をさらに含むか、または（ｉｉ）本方法において工程（Ｂ）が工程（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ｂ）のための出発群の各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＶＣ［通常、少なくとも変異体ＯＲＦＣ（ＯＲＦＶＣ）および／または変異体ＮＣＣ（ＮＣＶＣ）］をさらに含む。
【０１６６】
工程（Ｃ）は、一般に以下を含む。組換え宿主細胞の出発群が、出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＣ）、５’および３’末端を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦＣ）およびＯＲＦＣの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＣ）を含むＳＰＳＣを使用して調製される。各組換え宿主細胞は、（ｉ）ＯＲＦＣが、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＣが、それぞれ、ＯＲＦＣまたはＮＣＣに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＣおよび／または変異体ＮＣＣを含む、ＳＰＳＣの１種または複数の変異体を含む。
【０１６７】
組換え宿主細胞の群から得られるクローンは、炭素供給源の存在下で培養される。次いで、クローンは、各クローンの脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和パーセントおよび脂肪酸誘導体の力価を決定するためにスクリーニングされる。クローンの中で、最大力価の、標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を生成するクローンが同定され、また
【０１６８】
最大力価にほぼ匹敵する力価で標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体を生成する組換え宿主細胞の群から得られるクローン（または１種もしくは複数のクローン）が選択され、選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＣ（ＯＲＦＶＣ）および／または変異体ＮＣＣ（ＮＣＶＣ）を含む変異体ＳＰＳＣ（ＳＰＳＶＣ）を含む。本発明の方法のその他の実施形態では、選択されるクローンは、最大力価の約２％内、最大力価の約５％内、最大力価の約１０％内、最大力価の約２０％内または最大力価の約３０％内の力価で標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体を生成する。
【０１６９】
上記で示されるように、本方法の中核の２つの工程は、任意の順序で実施され得る。したがって、（ｉ）本方法において工程（Ｃ）が工程（Ｂ）に先行する場合には、工程（Ｃ）のための出発群の各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＶＢ［通常、少なくとも変異体ＯＲＦＢ（ＯＲＦＶＢ）および／または変異体ＮＣＢ（ＮＣＶＢ）］をさらに含むか、または（ｉｉ）本方法において工程（Ｃ）が工程（Ａ）に先行する場合には、工程（Ｃ）のための出発群の各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＶＡ［通常、少なくとも変異体ＯＲＦＡ（ＯＲＦＶＡ）および／または変異体ＮＣＡ（ＮＣＶＡ）］をさらに含む。
【０１７０】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物は、好ましい飽和パーセントをさらに有する。例えば、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物は、飽和および不飽和脂肪族鎖を含み、通常、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の好ましい飽和パーセントは、飽和脂肪族鎖を有する標的脂肪酸誘導体の約９０％またはそれ以上である。しかし、当業者は、本発明の方法に従って、任意の値の好ましい飽和パーセント、例えば、約５％の好ましい飽和パーセント（すなわち、脂肪族鎖の約９５％が不飽和である）、約６０％の好ましい飽和パーセント（すなわち、脂肪族鎖の約４０％が不飽和である）などを選択できる。
【０１７１】
工程（Ａ）は、通常、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の生成の最適化のために使用される。工程（Ｂ）は、通常、標的脂肪族鎖長および／または好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の力価の最適化のために使用される。工程（Ｃ）は、通常、標的脂肪族鎖長および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の生成の最適化のために使用される。工程（Ｃ）の代替実施形態では、組換え宿主細胞の出発群は、ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳＦ）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦＦ）を含むＳＰＳＦ、５’および３’末端を有するＯＲＦＦならびにＯＲＦＦの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣＦ）を使用して調製される。各組換え宿主細胞は、ＳＰＳＦの１種または複数の変異体を含み、ここで、（ｉ）ＯＲＦＦが、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質、例えば、ＥＣ２．３．１．４１の酵素番号を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、（ｉｉ）各変異体ＳＰＳＦが、それぞれ、ＯＲＦＦまたはＮＣＦに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦＦおよび／または変異体ＮＣＦを含む、ＳＰＳＦの１種または複数変異体を含む。培養、スクリーニングおよび選択は、工程（Ｃ）について上記で記載されるように実施される。
【０１７２】
総脂肪酸誘導体力価、種々の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価および脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和パーセントは、当業者に公知のいくつかの方法（例えば、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号）、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー／フレームイオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）および質量分析法（ＭＳ）によって決定され得る。
【０１７３】
本発明の一実施形態では、２つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）が、脂肪族鎖長および標的脂肪族鎖長を特性決定するために使用され、ＣＸ／ＣＹ比は、ＣＹの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対する、ＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価であり、ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい。
【０１７４】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０およびそれらの組合せからなる脂肪族鎖長の群から選択される脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体であり得る。標的脂肪酸誘導体は、例えば、Ｃ８の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体、Ｃ１０の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体、Ｃ１２の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体、Ｃ１４の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体、Ｃ１６の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体、Ｃ１８の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体、Ｃ２０の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体ならびにそれらの組合せであり得る。一実施形態では、２つの選択された脂肪族鎖長の比（ＣＸ／ＣＹ）が、脂肪族鎖長を特性決定するために使用される。ＣＸ／ＣＹ比は、ＣＹの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価に対する、ＣＸの脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価である。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＸ／ＣＹは、約１．５〜約６の間の値を有し、ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい。本発明のその他の実施形態では、ＣＸ／ＣＹは、少なくとも約２の値を有し、ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい。好ましい実施形態では、ＣＸ／ＣＹは、約２から約４の間の値を有し、ここで、ＸおよびＹは、整数値であり、Ｘは、Ｙより小さい。ＸおよびＹの値の例として、それだけには限らないが、Ｘ＝８、Ｙ＝１０；Ｘ＝１２、Ｙ＝１４；Ｘ＝１４、Ｙ＝１６；およびＸ＝１８、Ｙ＝２０が挙げられる。ＸおよびＹの値のその他の組合せは、本明細書における教示を考慮すれば当業者には容易に思い浮かぶであろう。
【０１７５】
変異体ポリヌクレオチド配列を作製することは、本明細書における教示を考慮して当業者の公知の方法によって実施され得る。通常、変異体ポリヌクレオチド配列は、それだけには限らないが、プロモーター配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位）をコードするポリヌクレオチド配列；翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位または翻訳開始部位）をコードするポリヌクレオチド配列；タンパク質をコードするオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド配列；およびそれらの組合せ中の１種または複数の突然変異を含めた、遺伝子中の１種または複数の突然変異をもたらす突然変異誘発によって生成される。例示的突然変異誘発方法は、以下に記載される。
【０１７６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、変異体ＮＣＶＺ（式中、Ｚ＝Ａ、ＢまたはＣ、）（すなわち、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列）は、ＮＣＶＺの無作為化によって作製されたライブラリーから得られる。無作為化され得る非コーディングポリヌクレオチド配列として、それだけには限らないが、プロモーター配列、翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位）、エンハンサー配列および遺伝子アクチベーターまたはレプレッサーの結合部位が挙げられる。
【０１７７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、変異体ＯＲＦＶＺ（式中、Ｚ＝Ａ、ＢまたはＣ）（すなわち、ポリヌクレオチド配列のタンパク質コーディングオープンリーディングフレーム）は、ＯＲＦＶＺの突然変異誘発によって得られる。
【０１７８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするＯＲＦＡは、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質［酵素番号ＥＣ２．３．１．４１］または３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質［酵素番号ＥＣ２．３．１．１７９］をコードする。３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質を使用する好ましい実施形態では、シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、配列番号２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＢ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードし、変異体シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質（配列番号２）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードする。３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質を使用する好ましい実施形態では、シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、配列番号４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＦ由来３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードし、変異体シンターゼタンパク質ＯＲＦＡは、エシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質（配列番号４）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩタンパク質をコードする。さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＡが、例えば、ＮＣＡの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＡ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＡ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１７９】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、チオエステラーゼをコードするＯＲＦＢとして、それだけには限らないが、チオエステラーゼタンパク質［ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号］をコードする配列が挙げられる。チオエステラーゼタンパク質を使用する好ましい実施形態では、チオエステラーゼタンパク質ＯＲＦＢは、配列番号６、配列番号８、配列番号１７または配列番号１９に示される配列を有するエシェリキア・コリｔｅｓＡ由来チオエステラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＢは、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質（それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１７または配列番号１９）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するチオエステラーゼタンパク質をコードする。さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＢが、例えば、ＮＣＢの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＢ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＢ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１８０】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＯＲＦＣは、ＥＣ４．２．１．−またはＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するタンパク質をコードする。好ましい実施形態では、ＯＲＦＣは、配列番号１４に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＺ由来（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣは、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質（配列番号１４）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有する（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＯＲＦＣは、配列番号１２に示される配列を有するエシェリキア・コリｆａｂＡ由来β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードし、変異体ＯＲＦＣは、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質（配列番号１２）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するβ−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードする。
【０１８１】
さらに、変異体５’非コーディングポリヌクレオチド配列、変異体ＮＣＣは、例えば、ＮＣＣの無作為化によって作製されたライブラリーから提供され得る。変異体非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、変異体ＮＣＣ）は、通常、出発非コーディングポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＣ）と比較した場合に、０パーセントの配列同一性から＜１００％パーセントの配列同一性を有する。
【０１８２】
本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞は、ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２の酵素番号を有するカルボン酸レダクターゼタンパク質をコードする１種または複数のヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、カルボン酸レダクターゼタンパク質とは、マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＢ脂肪酸レダクターゼタンパク質（配列番号１０）に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。その他の実施形態では、カルボン酸レダクターゼタンパク質とは、（ｉ）マイコバクテリウム・ツベルキュロシスｆａｄＤ９タンパク質（配列番号２１；米国特許公報第２０１００１０５９６３号も参照のこと）に対して、または（ｉｉ）マイコバクテリウム・スメグマチスｃａｒＡタンパク質（配列番号２３；米国特許公報第２０１００１０５９６３号も参照のこと）に対して、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、好ましくは、約９０％または約９５％またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。
【０１８３】
さらに、本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞は、ＥＣ１．１．−．−、ＥＣ１．１．１．１またはＥＣ１．２．１．１０の酵素番号を有するアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み得る。このようなアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質の例として、それだけには限らないが、エシェリキア・コリＡｄｈＥ、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質またはエシェリキア・コリｙｑｈＤ、アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質が挙げられる。
【０１８４】
本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞の実施形態は、１種または複数のさらなるタンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列をさらに含み得る。このようなさらなるタンパク質の例として、それだけには限らないが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；および補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。このようなさらなるタンパク質は、基質としてのアシル−ＡＣＰからの特定の脂肪酸誘導体の生成を促進するよう組換え宿主細胞において発現され得る（例えば、図２および表１を参照のこと）。
【０１８５】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、作動可能に連結している調節配列は、オープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質の構成的または調節可能な発現をもたらす、作動可能に連結しているオープンリーディングフレームの構成的発現または調節可能な発現を付与し得る。例えば、宿主細胞におけるタンパク質の発現は、構成的プロモーターによってか、または誘導可能／抑制可能プロモーターによって媒介され得る。誘導可能／抑制可能プロモーターの例は、当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、以下：エシェリキア・コリｌａｃオペロンプロモーター；およびサッカロミセス・セレビシエＧＡＬ４−誘導プロモーターが挙げられる。
【０１８６】
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列は、組換え宿主細胞の染色体中に組み込まれる、組換え宿主細胞にある１種または複数のプラスミド発現系に組み入れられる、またはその両方であり得る。実施例では、本発明の実施形態を例示するために、プラスミド発現系が使用される。
【０１８７】
本明細書に記載されるような方法工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）では、工程の説明を簡単にするために下付き文字の使用が使用され、例えば、「ＳＰＳＡ」、「ＳＰＳＢ」、「ＳＰＳＣ」、「選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＡ（ＯＲＦＶＡ）および／または変異体ＮＣＡ（ＮＣＶＡ）を含む変異体ＳＰＳＡ（ＳＰＳＶＡ）を含む」、「選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＢ（ＯＲＦＶＢ）および／または変異体ＮＣＢ（ＮＣＶＢ）を含む変異体ＳＰＳＢ（ＳＰＳＶＢ）を含む」、および「選択されるクローンは、変異体ＯＲＦＣ（ＯＲＦＶＣ）および／または変異体ＮＣＣ（ＮＣＶＣ）を含む変異体ＳＰＳＣ（ＳＰＳＶＣ）を含む」。工程の説明におけるこのような下付き文字の使用は、制限であるよう意図されない。工程が実施され得る順序に関しては、当業者ならば、例えば、以下のとおりに、本明細書における教示を考慮して、工程を適宜修飾できる。任意の工程が、特定の方法工程（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に先行する場合には、工程（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のための「組換え宿主細胞の出発群を調製すること」は、通常、続く特定の方法工程（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の組換え宿主細胞の出発群を調製する場合に使用される先行する工程から得られる１種または複数の変異体ポリヌクレオチド配列を進めることを含む。
【０１８８】
組換え宿主細胞は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）の組成物を生成する本発明の方法によって作製され得る。本方法は、通常、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）からなる群から選択される２つの中核工程を含み、２つの工程は同一工程ではなく、２つの工程は、組換え宿主細胞を作製するために任意の順序；例えば、工程（Ａ）とそれに続いて工程（Ｂ）、工程（Ａ）とそれに続いて工程（Ｃ）、工程（Ｂ）とそれに続いて工程（Ａ）、工程（Ｂ）とそれに続いて工程（Ｃ）、工程（Ｃ）とそれに続いて工程（Ｂ）または工程（Ｃ）とそれに続いて工程（Ａ）で実施される。
【０１８９】
本発明の方法の一実施形態では、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物は、標的脂肪族鎖長を有する脂肪アルコールの組成物である。
【０１９０】
本発明の一実施形態では、炭素供給源の存在下で、本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞を培養することによって、標的脂肪族鎖長および３０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌの組成物の力価を有する脂肪酸誘導体組成物が生成される。
【０１９１】
本発明のさらなる実施形態では、炭素供給源の存在下で、本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞を培養することによって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の１０％〜４０％の収率がもたらされる。
【０１９２】
本発明の別の実施形態では、炭素供給源の存在下で、本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞を培養することによって、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物の７００ｍｇ／Ｌ／時間〜３０００ｍｇ／Ｌ／時間の生産性がもたらされる。
【０１９３】
本発明の組換え宿主細胞およびその培養物は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、藻類細胞、真菌細胞または細菌細胞であり得る。一実施形態では、組換え宿主細胞は、微生物（例えば、細菌または真菌）である。好ましい実施形態では、組換え宿主細胞は細菌である。好ましい実施形態では、細菌は、エシェリキア・コリである。
【０１９４】
本発明は、本発明の方法によって作製された組換え宿主細胞（例えば、組換え微生物）ならびに組換え宿主細胞の培養物を含む。このような組換え宿主細胞は、通常、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体および／または好ましい飽和の脂肪族鎖を有する脂肪酸誘導体を生成する。
【０１９５】
変異体ポリヌクレオチド配列を作製するための突然変異誘発の方法
本発明の方法の態様では、スクリーニングのための組換え宿主細胞の群を調製するために、突然変異誘発が使用される。通常、組換え宿主細胞は、タンパク質のオープンリーディングならびに作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の方法の実施において有用なタンパク質の多数の例が、本明細書に記載されており、それだけには限らないが、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質、チオエステラーゼ、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質およびカルボン酸レダクターゼタンパク質が挙げられる。本発明の方法の実施において有用な調節配列の例、例えば、ＲＮＡプロモーター配列、転写因子結合配列、転写終結配列、転写のモジュレーター、ＲＮＡ安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列および翻訳調節配列も本明細書に記載されている。このようなポリヌクレオチド配列の突然変異誘発も、部位特異的突然変異誘発、ランダム化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失手順または標準クローニング技術などの遺伝子工学技術を使用して実施され得る。あるいは、ポリヌクレオチド配列中の突然変異は、化学合成または修飾手順を使用して作製され得る。
【０１９６】
突然変異誘発方法は、当技術分野で周知であり、例えば、以下が挙げられる。エラープローンＰＣＲ（例えば、Leung et al., Technique 1:11-15, 1989;およびCaldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992を参照のこと）、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低く、その結果、ＰＣＲ産物の全長に沿って高率の点突然変異が得られる条件下で実施される。手短には、このような手順では、ＰＣＲ産物の全長に沿った高率の点突然変異を達成するために、突然変異誘発される予定のポリヌクレオチド（例えば、図３のＲ２、Ｒ４およびＲ６などの調節配列；またはｃａｒ、ｔｅｓＡ、ｆａｂＢ、ｆａｂＦ、ｆａｂＡおよびｆａｂＺなどのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド）を、ＰＣＲプライマー、反応バッファー、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼおよび適当な濃度のｄＮＴＰと混合する。例えば、反応は、突然変異誘発される２０ｆｍｏｌｅの核酸、３０ｐｍｏｌｅの各ＰＣＲプライマー、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３）および０．０１％ゼラチン、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ユニットのＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、１ｍＭ  ｄＣＴＰおよび１ｍＭ  ｄＴＴＰを含む反応バッファーを使用して実施され得る。ＰＣＲは、９４℃で１分間、４５℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクルの間実施され得る。これらのパラメータは、必要に応じて変更され得ることが理解されよう。次いで、突然変異誘発されたポリヌクレオチドを適当なベクターにクローニングし、突然変異誘発されたものによってコードされる影響を受けたポリペプチドの活性を評価する。
【０１９７】
突然変異誘発はまた、対象とする任意のクローニングされたＤＮＡ中に部位特異的突然変異を作製するためにオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発（例えば、Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57, 1988を参照のこと）を使用して実施され得る。手短には、このような手順では、クローニングされるＤＮＡ中に導入される予定の１つまたは複数の突然変異を有する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、突然変異誘発される予定のクローニングされるＤＮＡ中に挿入する。突然変異誘発されたＤＮＡを含有するクローンを回収し、影響を受けたポリペプチドの活性を評価する。
【０１９８】
ポリヌクレオチド配列変異体を作製するための別の突然変異誘発方法として、アセンブリーＰＣＲがある。アセンブリーＰＣＲは、小さいＤＮＡ断片の混合物から得たＰＣＲ産物のアセンブリーを含む。多数の異なるＰＣＲ反応が、同一バイアル中で並行して起こり、１つの反応の産物が別の反応の産物をプライミングする。アセンブリーＰＣＲは、例えば、例えば、米国特許第５，９６５，４０８号に記載されている。
【０１９９】
ポリヌクレオチド配列変異体を作製するさらに別の突然変異誘発方法として、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発（Stemmer, PNAS, USA 91:10747-10751, 1994）がある。セクシャルＰＣＲ突然変異誘発では、配列相同性に基づくＤＮＡ分子のランダム断片化の結果として、インビトロ（in vitro）で、異なるが高度に関連しているＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間で強制的な相同組換えが起こる。これに、ＰＣＲ反応におけるプライマー伸長による交差の固定が続く。
【０２００】
ポリヌクレオチド配列変異体はまた、インビボ（in vivo）突然変異誘発によっても作製され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列中のランダム突然変異が、１種または複数のＤＮＡ修復経路に突然変異を有するエシェリキア・コリ株などの細菌株においてポリヌクレオチド配列を増幅することによって作製される。このような「ミューテーター」株は、野生型株のものよりも高いランダム突然変異率を有する。これらの株の１種においてＤＮＡ配列を増幅することによって、最終的にＤＮＡ内にランダム突然変異が生じる。インビボ突然変異誘発のために使用するのに適したミューテーター株は、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／１６４２７に記載されている。
【０２０１】
ポリヌクレオチド配列変異体はまた、カセット突然変異誘発を使用して作製され得る。カセット突然変異誘発では、二本鎖ＤＮＡ分子の小さい領域が、出発ポリヌクレオチド配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換される。オリゴヌクレオチドは、出発ポリヌクレオチド配列の完全におよび／または部分的に無作為化されたものを含有することが多い。カセット突然変異誘発の多数の適用がある；例えば、カセット突然変異誘発による突然変異体タンパク質の調製［例えば、Richards, J. H., Nature 323, 187 (1986);Ecker, D.J., et al., J. Biol. Chem. 262:3524-3527 (1987)を参照のこと］；個々のコドンを挿入または置換するためのコドンカセット突然変異誘発［例えば、Kegler-Ebo, D.M., et al., Nucleic Acids Res. 22(9): 1593-1599 (1994)参照のこと］；調節配列（例えば、リボソーム結合部位）を含む非コーディングポリヌクレオチド配列の無作為化によって変異体ポリヌクレオチド配列を調製すること［例えば、Barrick, D., et al., Nucleic Acids Res. 22(7): 1287-1295 (1994); Wilson, B.S., et al., Biotechniques 17:944-953 (1994)を参照のこと］。
【０２０２】
再帰的アンサンブル突然変異誘発（例えば、Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992を参照のこと）もまた、ポリヌクレオチド配列変異体を作製するために使用され得る。再帰的アンサンブル突然変異誘発は、メンバーがアミノ酸配列において異なっている、表現型的に関連している突然変異体の多様な集団を生成するために開発されたタンパク質操作（すなわち、タンパク質突然変異誘発）のためのアルゴリズムである。この方法は、コンビナトリアルカセット突然変異誘発の連続ラウンドを制御するためのフィードバック機構を使用する。
【０２０３】
ポリヌクレオチド配列変異体を作製するために、指数関数的アンサンブル突然変異誘発（例えば、Delegrave et al.、Biotech. Res. 11:1548-1552、1993を参照のこと）もまた使用され得る。指数関数的アンサンブル突然変異誘発は、機能的タンパク質につながるアミノ酸を各変更された位置で同定するために、残基の小さい群が並行して無作為化される、高いパーセンテージのユニークな機能的突然変異体を有するコンビントリアルライブラリーを作製するためのプロセスである。ランダムおよび位置指定突然変異誘発もまた使用され得る（例えば、Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993を参照のこと）。
【０２０４】
さらに、インビボ突然変異誘発の標準方法が使用され得る。例えば、タンパク質のオープンリーディングフレームならびに作動可能に連結している調節配列を含む１種または複数のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、放射線照射（例えば、ＵＶ光またはＸ線）に対する曝露または化学物質（例えば、エチル化剤、アルキル化剤または核酸類似体）に対する曝露による突然変異誘発に付され得る。いくつかの宿主細胞タイプ、例えば、細菌、酵母および植物では、転位因子もまたインビボ突然変異誘発のために使用され得る。
【０２０５】
１種または複数のポリヌクレオチド配列の突然変異誘発を使用する本発明の方法の態様では、結果として得られた発現されたタンパク質産物は、タンパク質が生物学的機能の修飾された活性を示すとしても、通常、同一の生物学的機能を保持する。例えば、（ｉ）エシェリキア・コリｔｅｓＡチオエステラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、（ｉｉ）作動可能に連結している調節配列とを含む１種または複数のポリヌクレオチド配列の突然変異誘発によって組換え微生物の群を調製する場合には、得られた突然変異誘発されたポリヌクレオチド配列から発現されたタンパク質は、チオエステラーゼ生物学的機能を維持するが、組換え微生物においては、チオエステラーゼの修飾された活性が観察される。
【０２０６】
本発明の方法の態様では、組換え宿主細胞および対応する野生型宿主細胞の間の活性の相違が決定される。例えば、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む１種または複数の出発ポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列を、突然変異誘発に付す（すなわち、「出発」ポリヌクレオチド配列は、突然変異誘発される予定のポリヌクレオチド配列であり、「突然変異誘発された」ポリヌクレオチド配列を生じさせる）。１種または複数の突然変異誘発されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞におけるタンパク質の活性が、１種または複数の出発ポリヌクレオチド配列を含む対応する野生型宿主細胞におけるタンパク質の活性に対して比較される。例示として、本明細書に記載されるように、方法工程（Ｂ）の実施形態では、組換え微生物の群が調製され、これらの組換え微生物は、チオエステラーゼをコードし、調節配列と作動可能に連結しているオープンリーディングフレームを含む１種または複数のポリヌクレオチド配列を含み、組換え微生物におけるチオエステラーゼの活性が修飾される。組換え微生物の群を調製するために、チオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む１種または複数の出発ポリヌクレオチド配列および作動可能に連結している調節配列の突然変異誘発が使用される。１種または複数の突然変異誘発されたポリヌクレオチド配列を含む組換え微生物におけるチオエステラーゼの活性が、１種または複数の出発ポリヌクレオチド配列を含む対応する野生型微生物におけるチオエステラーゼの活性に対して比較される。
【０２０７】
本発明の方法の一実施形態では、タンパク質の修飾された活性が以下のとおりに決定され得る。組換え宿主細胞によって生成された脂肪酸誘導体の特徴；例えば、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長、脂肪酸誘導体の力価、脂肪酸誘導体の収率、脂肪酸誘導体の生産性、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和ならびにそれらの組合せを同定するために、組換え宿主細胞（タンパク質をコードする１種または複数の突然変異誘発されたポリヌクレオチド配列を含む）が培養され、スクリーニングされる。タンパク質の修飾された活性は、対応する野生型宿主細胞（タンパク質をコードする１種または複数の出発ポリヌクレオチド配列を含む）によって生成される脂肪酸誘導体の同一特徴（単数または複数）の比較および特徴の相違の同定によって決定される。
【０２０８】
本明細書の教示、脂肪酸生合成（本明細書に記載されるような）に関与しているタンパク質のＥＣ名称および酵素活性およびこれらのタンパク質の利用可能な構造／機能情報を考慮して、当業者は、コード配列の突然変異誘発を実施して、修飾された活性を有するタンパク質を得るために、本明細書の教示を考慮して十分なガイダンスを有する。
【０２０９】
組換え宿主細胞を作製するための宿主細胞の遺伝子操作
本明細書に記載されるような脂肪酸誘導体を生成するために、種々の組換え宿主細胞が使用され得る。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に記載されたポリペプチド（例えば、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質、チオエステラーゼ、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質および／またはカルボン酸レダクターゼタンパク質）をコードする遺伝子は、細菌細胞（例えば、エシェリキア・コリ）、昆虫細胞、藻類、酵母または哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ１細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞またはＰＣ１２細胞）において発現され得る。その他の例示的宿主細胞は上記に記載された。好ましい実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア・コリ細胞、サッカロミセス・セレビシエ細胞またはバチルス・サブチルス細胞である。より好ましい実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア・コリ株Ｂ、Ｃ、ＫまたはＷ由来である。その他の適した宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２１０】
本明細書に記載された方法において使用され得るさらなる宿主細胞は、公開米国特許出願第２０１１０００８８６１号および同２００９０２７５０９７号に記載されている。
【０２１１】
宿主細胞を遺伝子操作して、組換え細胞を提供するために、当技術分野で周知の種々の方法が使用され得る。本方法は、本明細書に記載されたタンパク質のコード配列を含有するベクター、好ましくは、発現ベクターの使用を含み得る。
【０２１２】
本発明において使用するための組換え発現ベクターは、タンパク質をコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列ならびに宿主細胞におけるコードされるタンパク質の発現を提供するのに適している作動可能に連結している調節配列を含み得る。組換え発現ベクターは、発現に使用される予定の宿主細胞に基づいて選択された１種または複数の調節配列を含み得る。このような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列は、多数の種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される予定の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどといった因子に応じて変わり得ることが当業者には理解されよう。本明細書に記載された発現ベクターは、本明細書に記載された核酸によってコードされるポリペプチドを生成するよう宿主細胞に導入され得る。
【０２１３】
原核生物、例えば、エシェリキア・コリにおいてポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、ほとんどの場合、ポリペプチドの発現を指示する構成的または誘導プロモーターを含有するベクターを用いて実施される。融合ベクターは、コードされているポリペプチドにいくつかのアミノ酸を、普通、組換えポリペプチドのアミノ末端に付加し得る。このような融合ベクターは、例えば、このような開始コドンを欠く配列のために開始ＡＴＧを提供し得る。
【０２１４】
誘導可能なエシェリキア・コリ発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ［Amann et al., Gene (1988) 69:301-315］およびｐＥＴ  １１ｄ［Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89］が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたＴ７ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ  １）によって媒介されるＴ７遺伝子１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存している。このウイルスポリメラーゼは、例えば、ｌａｃＵＶ−５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎ１  遺伝子を有するレジデントλプロファージから、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０２１５】
別の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞である。この実施形態では、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ.セレビシエにおける発現のためのベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１［Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234］、ｐＭＦａ［Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943］、ｐＪＲＹ８８［Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123］、ｐＹＥＳ２(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、ＣA)およびｐｉｃＺ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カールスバッド、ＣA)が挙げられる。
【０２１６】
別の実施形態では、本明細書に記載されたタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、例えば、ｐＡｃシリーズ［Smith et al., Mol. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165］およびｐＶＬシリーズ［Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39］が挙げられる。
【０２１７】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載された核酸が、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞において発現され得る。哺乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８［Seed, Nature (1987) 329:840］およびｐＭＴ２ＰＣ［Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195］が挙げられる。哺乳類細胞において使用される場合には、発現ベクターの制御機能が、ウイルス調節エレメントによって提供され得る。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来するものである。原核細胞および真核細胞両方のためのその他の適した発現系が記載されている（例えば、Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照のこと）。
【０２１８】
ベクターは、それだけには限らないが、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含めた核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための種々の当技術分野において認識される技術を含めた従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞中に導入され得る。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適した方法は、例えば、Sambrook et al.（前掲）中に見出され得る。
【０２１９】
細菌細胞の安定な形質転換のために、発現ベクターおよび使用される形質転換技術に応じて、ごく一部の細胞のみが発現ベクターを受け入れ、複製することがわかっている。これらの形質転換体を同定し、選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、対象とする遺伝子とともに宿主細胞中に導入され得る。選択マーカーとして、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載されたポリペプチドをコードするものと同一のベクターで宿主細胞中に導入されてもよく、別個のベクターで導入されてもよい。導入される核酸を用いて安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存し、一方、その他の細胞は死滅する）。
【０２２０】
染色体外発現ベクター（プラスミドなど）に加えて、ポリヌクレオチド発現ベクターは、標準技術に従って、例えば、相同組換えおよび組込みによって、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０２２１】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、ごく一部の細胞のみが、外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得るということがわかっている。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、対象とする遺伝子とともに宿主細胞中に導入され得る。好ましい選択マーカーとして、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載されたポリペプチドをコードするものと同一のベクター上で、宿主細胞中に導入され得るか、または別個のベクター上で導入され得る。導入された核酸を用いて安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る。
【０２２２】
本発明のさらなる態様
本発明のさらなる態様は、以下を含む：第６の態様では、本発明は、より詳しくは、組換え宿主細胞および標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞を作製する方法に関する。
【０２２３】
これらの組換え宿主細胞は、通常、ＥＣ４．２．１．−または４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を有する。これらの組換え宿主細胞を作製するために使用される本発明の方法は、通常、少なくとも工程（Ｃ）または工程（Ａ）の変法を使用し、出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳ）は、５’および３’末端を有する、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦ）およびＯＲＦの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣ）を含む。組換え宿主細胞は、それぞれ、ＯＲＦまたはＮＣに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦおよび／または変異体ＮＣを含む、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードする、ＳＰＳの１種または複数の変異体ならびに作動可能に連結している調節配列を含む。標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価のさらなる最適化が必要とされるか、または望まれる場合には、工程（Ｃ）または工程（Ａ）の変法に、例えば、工程（Ｂ）が続き得る。
【０２２４】
第７の態様では、本発明は、より詳しくは、組換え宿主細胞および好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する組換え宿主細胞を作製する方法に関する。これらの組換え宿主細胞は、通常、イソメラーゼ活性を欠き、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の修飾された活性を有する。これらの組換え宿主細胞を作製するために使用される本発明の方法は、通常、少なくとも工程（Ｃ）または工程（Ａ）の変法を使用し、出発ポリヌクレオチド配列（ＳＰＳ）は、５’および３’末端を有する、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（ＯＲＦ）およびＯＲＦの５’末端に隣接する作動可能に連結している調節配列を含む５’非コーディングポリヌクレオチド配列（ＮＣ）を含む。組換え宿主細胞は、イソメラーゼ活性を欠く、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするＳＰＳの１種または複数の変異体ならびにそれぞれ、ＯＲＦまたはＮＣに対して１００％未満の配列同一性を有する変異体ＯＲＦおよび／または変異体ＮＣを含む作動可能に連結している調節配列を含む。好ましい飽和パーセントを有する脂肪酸誘導体の力価のさらなる最適化が必要とされるか、または望まれる場合には、工程（Ｃ）または工程（Ａ）の変法に、例えば、工程（Ｂ）が続き得る。
【０２２５】
第８の態様では、本発明は、より詳しくは、標的脂肪族鎖長および／または好ましい程度の飽和を有する脂肪酸誘導体の組成物を生成する方法に関する。本方法は、通常、炭素供給源の存在下で、本明細書に記載されるような組換え宿主細胞を培養することを含む。この方法の一実施形態では、培養することは、発酵を含む。好ましい実施形態では、発酵が使用され、本方法は、脂肪酸誘導体の実質的な精製をさらに含む。
【０２２６】
第９の態様では、本発明は、本発明の組換え宿主細胞培養物を使用して生成された脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）の実質的に精製された組成物に関する。
【０２２７】
脂肪酸誘導体の発酵生成および単離
本明細書に記載された組換え宿主細胞培養物を使用する脂肪酸誘導体の生成および単離は、発酵技術を使用して達成され得る。費用を低減しながら脂肪酸誘導体の生成を最大化するための１つの方法は、炭化水素産物に変換される炭素供給源のパーセンテージを高めることである。
【０２２８】
正常な細胞のライフサイクルの間に、炭素は、脂質、糖類、タンパク質、有機酸および核酸の生成などの細胞機能において使用される。増殖に関連している活性に必要な炭素の量を低減することは、産物への炭素供給源の変換効率を高め得る。これは、例えば、まず、宿主細胞を所望の密度（例えば、増殖の対数期のピークで達成される密度）に増殖させることによって達成され得る。
【０２２９】
宿主細胞は、公開米国特許出願第２０１１００９７７６９号に記載されるものなどの組換えセルロソームを発現するようさらに操作され得る。これらのセルロソームは、宿主細胞が炭素供給源としてセルロース系物質を使用するのを可能にし得る。例えば、宿主細胞は、インベルターゼ（ＥＣ３．２．１．２６）を発現するようさらに操作され得、その結果、スクロースが炭素供給源として使用され得る。同様に、宿主細胞は、宿主細胞が、炭素を効率的に同化し、炭素供給源としてセルロース系物質を使用できるよう、米国特許第５，０００，０００号；同５，０２８，５３９号；同５，４２４，２０２号；同５，４８２，８４６号；および同５，６０２，０３０号に記載された教示を使用して操作され得る。
【０２３０】
小規模生成には、操作された宿主細胞は、例えば、約１００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌまたは１０Ｌのバッチで増殖され、発酵され、適当なプラスミド中にコードされているか、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれている特定の遺伝子に基づいて所望の脂肪酸誘導体生合成遺伝子を発現するよう誘導され得る。大規模生成には、操作された宿主細胞は、約１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、１，０００，０００Ｌまたはそれより大きなバッチで増殖され、発酵され、適当なプラスミド中にコードされているか、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれている特定の遺伝子に基づいて所望の脂肪酸誘導体生合成遺伝子を発現するよう誘導され得る。
【０２３１】
発酵中に生成された脂肪酸誘導体は、発酵培地から分離され得る。脂肪酸誘導体を水性培地から分離するために任意の公知の技術が使用され得る。１つの例示的分離プロセスとして、２相（two-phase）［２相性（bi-phsic）］分離プロセスがある。このプロセスは、遺伝子操作された宿主細胞を、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）を生成するのに十分な条件下で発酵し、脂肪酸誘導体が有機相中に集まることを可能にし、有機相を水性発酵ブロスから分離することを含む。この方法は、バッチおよび連続発酵プロセスの両方で実施され得る。
【０２３２】
組換え宿主細胞、培養物および本発明の方法によって提供される利点および改善点
本発明の１つの様相は、組換え宿主細胞によって生成された脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長を調節する方法としての、ＥＣ４．２．１．６０の酵素番号を有するβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素／イソメラーゼタンパク質（例えば、エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質）の活性の修飾に関する。これは、本開示の前に、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素／イソメラーゼタンパク質が、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の伸長に関与しているとは考えられていなかったので予想外のことであった。
【０２３３】
本発明の別の様相は、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性の修飾に関し、ＥＣ４．２．１．−の酵素番号を有するタンパク質（例えば、エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質）は、組換え宿主細胞によって生成される脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長を調節する方法を提供する。さらに、イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質の活性の修飾は、組換え宿主細胞によって生成される脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和を調節する方法を提供すると本発明を支持して実施された実験によって実証された。これらの発見は、本開示の前には、（ｉ）イソメラーゼ活性を欠くβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質が、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の伸長に関与していると考えられていなかった、および（ｉｉ）これらのタンパク質が、イソメラーゼ活性を欠き、従って、それらは飽和に影響を及ぼすと考えられなかったので予想外のものであった。
【０２３４】
本発明のさらに別の様相は、組換え宿主細胞における、（ｉ）脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の伸長［例えば、ＥＣ２．３．１．−の酵素番号を有する伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質；エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質およびエシェリキア・コリｆａｂＦタンパク質など］に関与しているタンパク質ならびに（ｉｉ）脂肪酸誘導体合成の終結に関与しているタンパク質（例えば、ＥＣ３．１．１．５またはＥＣ３．１．２．−の酵素番号を有するチオエステラーゼ；エシェリキア・コリｔｅｓＡチオエステラーゼタンパク質など）の活性のバランスをとることは、標的とされる脂肪族鎖長を有する高力価の脂肪酸誘導体をもたらす方法を提供するという発見に関する。本発明のこの様相は、標的とされる脂肪族鎖長を有する高力価の脂肪酸誘導体をもたらす組換え宿主細胞を作製および使用する手段を提供し、これは、石油化学供給源への依存を低減するための再生可能な供給源からの脂肪酸誘導体の生成の分野における重要な進歩である。
【実施例】
【０２３５】
以下の実施例は、当業者に、本発明の実施方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであって、本発明者らが本発明と考えるものの範囲を制限しようとするものではない。使用される数字（例えば、量、濃度、パーセント変化など）の正確性を確実にするために努力がなされたが、幾分かの実験誤差および偏差は説明されなければならない。別に示さない限り、温度は、摂氏度であり、圧力は、大気または大気付近である。
【実施例１】
【０２３６】
発現コンストラクトの実施例
図３は、本発明の特定の実施形態の組換え微生物、培養物および方法を例示するために使用される種々の遺伝子構築を示す。図中で指定された遺伝子は、表１中に見ることができる。遺伝子は、タンパク質産物をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節領域（Ｒ）を含んでいた。Ｒ２からＲ６は、リボソーム結合部位および翻訳終結シグナルを含む異なる調節エレメントである。
【０２３７】
ベースプラスミドＯＰ−８０は、市販のプラスミドｐＣＬ１９２０［Lerner et al., Nucleic Acids Res. 18: 4631 (1990)］から作製した。ｐＣＬ１９２０プラスミドを、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、ＣＡ）から得られたＰＴＲＣプロモーターおよびｌａｃＩ配列を含むよう修飾した。図３に図式的に例示される構築を、Ｐｔｒｃプロモーターに隣接し、作動可能に連結しているＯＰ−８０ベースプラスミドに組み込んだ。
【実施例２】
【０２３８】
細菌株の実施例
表２は、図３（実施例１）の発現コンストラクトを含有するプラスミドが、以下に記載されるように導入されるいくつかのエシェリキア・コリＫ１２株の遺伝子特性決定を示す。これらの株およびプラスミドを使用して、本発明の特定の実施形態の組換え微生物、培養物および方法を実証した。表２中の遺伝子名称は、当業者に公知の標準名称である。
【０２３９】
【表２】
2014526237.tif 000010
【実施例３】
【０２４０】
脂肪酸誘導体の生成および脂肪族鎖長を最適化すること
この実施例中のデータは、標的とされる脂肪族鎖長を有する高力価の脂肪酸誘導体をもたらすよう操作された組換え宿主細胞を作製するための本発明の方法の実施形態の有用性の明確な例示を提供する。実施例は、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質）およびチオエステラーゼ（本明細書では、エシェリキア・コリｔｅｓＡタンパク質）両方の発現／活性を最適化することによって脂肪酸誘導体生成を最適化するための、本明細書に記載された方法の結果を示す。
【０２４１】
Ａ．脂肪酸誘導体の力価を最適化すること
以下のデータは、本明細書に記載された方法工程（Ｂ）の一例を提供する。本発明を支持して実施された実験は、チオエステラーゼ（本明細書では、エシェリキア・コリｔｅｓＡ、チオエステラーゼタンパク質）の発現の操作が、脂肪酸誘導体の最適な生成を促進し得ることを実証した。
【０２４２】
ＴｅｓＡ発現を、調節配列の無作為化によってｔｅｓＡ遺伝子（図３、パネルＡ、Ｒ２）のオープンリーディングフレームの５’末端に隣接する５’非コーディングポリヌクレオチド配列（作動可能に連結している調節配列を含む）の活性を調節することによって最適化した。領域Ｒ２、チオエステラーゼコード配列と作動可能に連結している調節配列を、非コーディングポリヌクレオチド配列の無作為化によって修飾して、プラスミドライブラリーを作製した。プラスミドライブラリーは、ベースプラスミドＯＰ−８０中で運ばれる、図３、パネルＡに例示された、無作為化された発現コンストラクトを含んでいた。このライブラリーを、クローニング株（ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中に形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートを使用してコロニーを選択した。生存コロニーをプールし、標準プロトコールを使用してＤＮＡを抽出して、ライブラリーを提供した。
【０２４３】
得られたライブラリーを、株ＤＶ２（実施例２）に形質転換して、スクリーニングのための組換え微生物の群を調製した。外因性プラスミドＤＮＡの選択を維持するよう、すべての培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含めた。
【０２４４】
簡潔には、コロニー（クローン）を選び取り、２ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を含有するガラス培養チューブ中に播種した。一晩増殖させた後、各チューブの５０μＬを、新鮮なＬＢ培地の新しいチューブに移した。クローンを３時間培養し、その後、各培養物を使用して、１２５ｍＬのフラスコ中の２０ｍＬのＶ−９培地に播種した。Ｖ−９培地は、抗生物質、１μｇ／Ｌチアミンおよび表３に記載された微量元素溶液の１：１０００希釈物を補給した２％グルコースを有するＭ９培地である。
【表３】
2014526237.tif 000011
【０２４５】
１．０のＯＤ６００で、培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２０時間発酵させた後、培養物を、スクリーニングのための調製において酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物を、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド）を用いて誘導体化し、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸（組み合わされた）の力価を、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて測定した。
【０２４６】
図中のデータは、本方法が、対照微生物に対して、操作された組換え微生物によって生成された脂肪誘導体の力価が３倍の増大を超える（例えば、図４、３００％のラインを超えるデータ点）高力価クローンを提供したことを実証する。
【０２４７】
図５は、組換え微生物におけるチオエステラーゼタンパク質の活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼタンパク質の活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、図４について記載されたような「対照株に対するＦＡ％」である。Ｘ軸は、Ｃ１６およびＣ１８脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１６／Ｃ１８比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは対照株に対応する。図中、１００％付近に集まった４つのデータ点は、対照株の培養物に対応する。
【０２４８】
図中のデータは、本方法が、対照微生物に対して、操作された組換え微生物によって生成された脂肪誘導体の力価が３倍の増大を超える（例えば、図５、３００％のラインを超えるデータ点）高力価クローンを提供したことを実証する。
【０２４９】
これらのデータは、本発明の方法を使用して、対照微生物に対して力価の大幅な増大を提供した組換え微生物を得たことを実証した。さらに、ＣＸ／ＣＹの範囲を考慮すると、本発明の操作された組換え微生物を培養することは、脂肪酸誘導体の適合した標的脂肪族鎖長の範囲を提供する。
【０２５０】
最大力価を生成した操作された組換え微生物を、以下の方法において使用するために選択した。
【０２５１】
Ｂ．脂肪酸誘導体の力価および脂肪族鎖長を最適化すること
以下のデータは、本明細書に記載されるような方法工程（Ａ）の一例を提供する。本発明を支持して実施した実験は、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ  タンパク質（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）の発現の操作が、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の最適生成を促進し得ることを実証した。
【０２５２】
上記のライブラリーに由来する最高生成株から得たプラスミドＤＮＡを精製し、Ｒ２−ｔｅｓＡ遺伝子を含むポリヌクレオチドを単離した。ｔｅｓＡタンパク質コード配列を、ｔｅｓＡ（１３Ｇ０４）タンパク質をコードするヌクレオチド配列（図５Ｃ；配列番号１７）で置換した。Ｒ２−ｔｅｓＡ（１３Ｇ０４）を、図９、パネルＢに例示されるコンストラクト（すなわち、出発ポリヌクレオチド）中に組み込んだ。したがって、以下のデータもまた、方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ａ）の一例を提供する。
【０２５３】
ＦａｂＢ発現を、調節配列の無作為化によって、ｆａｂＢ遺伝子（図９、パネルＢ、Ｒ４）のオープンリーディングフレームの５’末端に隣接する５’非コーディングポリヌクレオチド配列（作動可能に連結している調節配列を含む）の活性を調節することによって最適化した。領域Ｒ４、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質コード配列に作動可能に連結している調節配列を、非コーディングポリヌクレオチド配列の無作為化によって修飾して、プラスミドライブラリーを作製した。プラスミドライブラリーは、ベースプラスミドＯＰ−８０中で運ばれる、図９、パネルＢに例示された無作為化された発現コンストラクトを含んでおり、コンストラクトのｔｅｓＡ（１３Ｇ０４）コード配列と関連しているＲ２は、上記の最高生成株から単離されたＲ２とした。このライブラリーを、クローニング株（例えば、ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中に形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートを使用してコロニーを選択した。生存コロニーをプールし、標準プロトコールを使用してＤＮＡを抽出して、エシェリキア・コリｆａｂＢ遺伝子のライブラリーを提供した。
【０２５４】
得られたライブラリーを、株Ｄ１７８（実施例２、表２）に形質転換して、スクリーニングのための組換え微生物の群を調製した。外因性プラスミドＤＮＡの選択を維持するよう、すべての培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含めた。手短には、コロニー（クローン）を選び取り、これを使用して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を含有する９６ウェルプレートのウェルに播種した。一晩増殖させた後、プレート中の各ウェルから４０μＬを、新鮮なＬＢを有する新しいプレート中の新しいウェルに移した。３時間増殖させた後、４０μＬの各培養物を使用して、９６ウェルプレート中の４００μＬのＦＡ２培地に播種した。ＦＡ２培地は、抗生物質、１μｇ／Ｌチアミン、１０μｇ／Ｌクエン酸鉄および表３に記載された微量元素溶液の１：１０００希釈物を補給した３％グルコースを有するＭ９培地である。
【０２５５】
５時間増殖させた後、１．０のＯＤ６００で、培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２０時間発酵させた後、培養物を、スクリーニングのための調製において酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物を、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド）を用いて誘導体化し、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸（組み合わされた）の力価を、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて測定した。
【０２５６】
図６は、組換え微生物における、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）の活性が、対照微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質活性（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）に対して修飾されているクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、「対照株に対するＦＡ％」であり、ＦＡ％は、「対照株」のすべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の合計の測定された力価によって除された、各クローンのすべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の合計の測定された力価である。本明細書において、「対照株」は、脂肪酸誘導体の良好な力価を生成するようこれまでに操作されているエシェリキア・コリ株であり、したがって、１００％ラインは、「対照株」に対して匹敵する力価を生成したクローンを示す。Ｘ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは「対照株」に対応する。１００％付近に集まった４つのデータ点は、「対照株」の培養物に対応し、これらは、対照および比較のための点として使用された。
【０２５７】
図中のデータは、本方法が、「対照株」と比較して、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価が大幅に増大した（例えば、図６、約３．１のＣ１２／Ｃ１４比および１６０％の力価、従って、１．５倍の改善を特徴とする、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体）操作された組換え微生物の高力価クローンを提供したことを実証する。
【０２５８】
図７は、組換え微生物における、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）の活性が、対照微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質活性（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）に対して修飾されているクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、図６について記載されるような「対照株に対するＦＡ％」である。Ｘ軸は、Ｃ１６およびＣ１８脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１６／Ｃ１８比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは「対照株」に対応する。１００％付近に集まった４つのデータ点は、「対照株」に対応する。１００％付近に集まった４つのデータ点は、「対照株」の培養物に対応し、これらは、対照および比較のための点として使用された。
【０２５９】
図中のデータは、本方法が、「対照株」と比較して、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価が大幅に増大した（例えば、図７、約４．０のＣ１６／Ｃ１８比および１６０％の力価、従って、１．５倍の改善を特徴とする標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体）操作された組換え微生物の高力価クローンを提供したことを実証する。
【０２６０】
これらのデータは、本発明の方法を使用して、種々の脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価の大幅な増大を提供した組換え微生物を得たことを実証し、従って、多数の標的脂肪族鎖長のいずれかを有する脂肪酸誘導体を提供するための方法の柔軟性を示す。
【０２６１】
Ｃ．脂肪酸誘導体の力価および脂肪族鎖長のさらなる最適化
以下のデータは、本明細書に記載されるような方法工程（Ｂ）の別の例を提供する。本発明を支持して実施された実験は、チオエステラーゼ（本明細書では、エシェリキア・コリｔｅｓＡ、チオエステラーゼタンパク質）の発現の操作が、脂肪酸誘導体の最適生成を促進し得ることを実証した。例えば、先の工程（Ａ）から選択された組換え微生物を使用して工程（Ｂ）を反復することは、先の工程（Ａ）から得られた組換え微生物の生産性に対して、脂肪酸誘導体の生産性の増大したさらなる組換え微生物を単離する方法を提供する。
【０２６２】
実施例３ＢのｆａｂＢライブラリーから得た２種の異なるクローンを使用して、新規ｔｅｓＡライブラリーを作製した。これらの株のいずれも、ライブラリー中の最高生成株ではなかった。すなわち、これらの株は、それらが選択された組換え微生物の群の最大力価未満の力価を有していた。さらに、Ｃ１２／Ｃ１４およびＣ１６／Ｃ１８の両方の比によって測定される、より長い脂肪族鎖長を生成するものから２種のクローンが選択された。例えば、図６および図７を参照すると、２種のクローンは、最大力価未満の力価を有していた（図６および図７、１６０％のデータ点は明確に最大力価である）。２種のクローンの各々は、以下の実施例標的脂肪族鎖長ＣＸ／ＣＹ比より小さいＣＸ／ＣＹ比を有していた：Ｃ１２／Ｃ１４約３．２のＣ１２／Ｃ１４実施例標的比（図６、Ｘ軸上３．１およびＹ軸上１６０％のデータ点）について、１６０％未満の力価および約３．１未満のＣ１２／Ｃ１４比を有していた２種のクローンを選択し、Ｃ１６／Ｃ１８約４．０のＣ１６／Ｃ１８実施例標的比（図７、Ｘ軸上４．０およびＹ軸上１６０％のデータ点）について、１６０％未満の力価および約４．０未満のＣ１６／Ｃ１８比を有していた２種のクローンを選択した。
【０２６３】
実施例３ＢのｆａｂＢライブラリーから得た２種のクローンの各々からプラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドＤＮＡを使用して、出発ポリヌクレオチド（図９、パネルＢ、Ｒ４）を構築した。出発ポリヌクレオチドを新規ｔｅｓＡライブラリーの作製のために使用した。したがって、以下のデータはまた、方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ａ）とそれに続く方法工程（Ｂ）の一例を提供する。
【０２６４】
ＴｅｓＡ発現を、調節領域の無作為化によって、ｔｅｓＡ遺伝子（図９、パネルＢ、Ｒ２）のオープンリーディングフレームの５’末端に隣接する５’非コーディングポリヌクレオチド配列（作動可能に連結している調節配列を含む）の活性を調節することによって最適化した。ｔｅｓＡタンパク質コード配列は、ｔｅｓＡ（１２Ｈ０８）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（図５Ｄ；配列番号１９）であった。領域Ｒ２、チオエステラーゼコード配列と作動可能に連結している調節配列を、非コーディングポリヌクレオチド配列の無作為化によって修飾して、プラスミドライブラリーを作製した。プラスミドライブラリーは、ベースプラスミドＯＰ−８０中で運ばれる、図９、パネルＢに例示された無作為化された発現コンストラクトを含む。このライブラリーを、クローニング株（ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中に形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートを使用してコロニーを選択した。生存コロニーをプールし、標準プロトコールを使用してＤＮＡを抽出して、ライブラリーを提供した。
【０２６５】
得られたライブラリーを、株ＥＧ１４９（実施例２、表２）に形質転換して、スクリーニングのための組換え微生物の群を調製した。外因性プラスミドＤＮＡの選択を維持するよう、すべての培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含めた。手短には、コロニー（クローン）を選び取り、これを使用して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を含有する９６ウェルプレートに播種した。一晩増殖させた後、プレート中の各ウェルから４０μＬを、新鮮なＬＢを有する新しいプレート中の新しいウェルに移した。３時間増殖させた後、４０μＬの各培養物を使用して、９６ウェルプレート中の４００μＬのＦＡ２培地に播種した。
【０２６６】
５時間増殖させた後、１．０のＯＤ６００で、培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２０時間発酵させた後、培養物を、スクリーニングのための調製において酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物を、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド）を用いて誘導体化し、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸（組み合わされた）の力価を、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて測定した。
【０２６７】
図８は、組換え微生物における、チオエステラーゼタンパク質の活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼタンパク質の活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、図６について記載されたような「対照株に対するＦＡ％」である。Ｘ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは「対照株」に対応する。
【０２６８】
図中のデータは、本方法が、「対照株」と比較して、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価が大幅に増大した（例えば、約１．５から約２．０の間のＣ１２／Ｃ１４比を特徴とする、例示的標的脂肪族鎖長を使用する図８）操作された組換え微生物の高力価クローンを提供したことを実証する。
【０２６９】
図９は、組換え微生物における、チオエステラーゼタンパク質の活性が、対照微生物におけるチオエステラーゼタンパク質の活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、Ｙ軸は、図６について記載されたような「対照株に対するＦＡ％」である。Ｘ軸は、Ｃ１６およびＣ１８脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１６／Ｃ１８比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは「対照株」に対応する。図中のデータは、本方法が、「対照株」と比較して、標的脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の力価が大幅に増大した（例えば、約４．０から約５．０の間のＣ１６／Ｃ１８比を特徴とする、例示的標的脂肪族鎖長を使用する図９）操作された組換え微生物の高力価クローンを提供したことを実証する。
【０２７０】
これらのデータは、本発明の方法を使用して、多数の異なる脂肪族鎖長の力価の大幅な増大を提供した組換え微生物を得たことを実証し、従って、多数の標的脂肪族鎖長のいずれかを有する脂肪酸誘導体を提供するための方法の柔軟性を示す。
【実施例４】
【０２７１】
脂肪酸誘導体の脂肪族鎖の飽和を最適化すること
この実施例におけるデータは、標的とされる脂肪族鎖長および所望のレベルの飽和を有する脂肪酸誘導体を生成するよう操作された組換え宿主細胞を作製するための本発明の方法の実施形態の有用性の明確な例示を提供する。実施例は、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質（本明細書では、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質）およびβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質、エシェリキア・コリＦａｂＡタンパク質および（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質、エシェリキア・コリＦａｂＺタンパク質）両方の発現／活性を最適化することによって脂肪酸誘導体生成を最適化するために本明細書に記載された方法の結果を示す。
【０２７２】
Ａ．エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質
３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質をコードするエシェリキア・コリｆａｂＢ遺伝子を使用して、脂肪酸誘導体の飽和および鎖長両方が最適化され得る。
【０２７３】
実施例３Ａにおいて上記のライブラリーに由来する最高生成株から得たプラスミドＤＮＡを精製し、Ｒ２−ｔｅｓＡ遺伝子を含むポリヌクレオチドを単離した。ｔｅｓＡタンパク質コード配列を、ｔｅｓＡ（１３Ｇ０４）タンパク質をコードするヌクレオチド配列（図５Ｃ；配列番号１７）で置換した。したがって、以下のデータもまた、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む１種または複数のポリヌクレオチド配列の代替物として、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む１種または複数のポリヌクレオチド配列を使用する、方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ｃ）の一例を提供する。
【０２７４】
ＦａｂＢ発現を、ｆａｂＢ遺伝子（図９、パネルＢ、Ｒ４）のオープンリーディングフレームの５’末端に隣接する５’非コーディングポリヌクレオチド配列（作動可能に連結している調節配列を含む）を無作為化することによって調節した。領域Ｒ４、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質コード配列に作動可能に連結している調節配列を、非コーディングポリヌクレオチド配列の無作為化によって修飾して、プラスミドライブラリーを作製した。プラスミドライブラリーは、ベースプラスミドＯＰ−８０中で運ばれる、図９、パネルＢに例示された突然変異誘発された発現コンストラクトを含んでおり；ここでは、コンストラクトのＲ２−ｔｅｓＡ遺伝子は、上記のように単離されたＲ２−ｔｅｓＡ（１３Ｇ０４）遺伝子であった。このライブラリーを、クローニング株（ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中に形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートを使用してコロニーを選択した。生存コロニーをプールし、標準プロトコールを使用してＤＮＡを抽出して、エシェリキア・コリｆａｂＢ遺伝子のライブラリーを提供した。
【０２７５】
得られたライブラリーを、株Ｄ１７８（実施例２、表２）に形質転換して、スクリーニングのための組換え微生物の群を調製した。外因性プラスミドＤＮＡの選択を維持するよう、すべての培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含めた。手短には、コロニー（クローン）を選び取り、これを使用して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を含有する９６ウェルプレートのウェルに播種した。一晩増殖させた後、プレート中の各ウェルから４０μＬを、新鮮なＬＢを有する新しいプレート中の新しいウェルに移した。３時間増殖させた後、４０μＬの各培養物を使用して、９６ウェルプレート中の４００μＬのＦＡ２培地に播種した。
【０２７６】
５時間増殖させた後、１．０のＯＤ６００で、培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２０時間発酵させた後、培養物を、スクリーニングのための調製において酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物を、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド）を用いて誘導体化し、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸（組み合わされた）の力価を、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて測定した。
【０２７７】
図１０は、組換え微生物における、伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）の活性が、対照微生物における伸長β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼタンパク質の活性（本明細書では、エシェリキア・コリｆａｂＢ、３−オキソアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩタンパク質）に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、すべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の合計の測定された力価によって除された、各クローンの、飽和脂肪族鎖を有し、すべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の測定された力価である「飽和種％」である。右のＹ軸は、Ｃ１２およびＣ１４脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ１２／Ｃ１４比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは対照に対応する。４つのデータ点は、「対照株」の培養物（上記の図６におけるように）に対応し、それらは対照および比較のための点として使用された。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られるクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ１２／Ｃ１４比の対応するデータ点が示されている。
【０２７８】
図中のデータの分析によって、本発明の方法が、広範囲な脂肪族鎖長の脂肪酸誘導体を生成する操作された組換え微生物を提供することが実証され、当業者ならば、それから、所望の標的脂肪族鎖長および所望のレベルの飽和を選択できる。本発明の方法、組換え微生物および培養物は、当業者に、所望の結果を達成するよう脂肪族鎖長および飽和を目的に合わせるためのツールを与える。
【０２７９】
Ｂ．エシェリキア・コリｆａｂＡタンパク質
脂肪酸誘導体の飽和および鎖長の両方が、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードするエシェリキア・コリｆａｂＡ遺伝子を使用して最適化され得る。
【０２８０】
実施例３Ｃにおいて上記のライブラリーから得たプラスミドＤＮＡを精製し、Ｒ２−ｔｅｓＡ（１２Ｈ０８）遺伝子およびＲ４−ｆａｂＢ遺伝子を含むポリヌクレオチドを単離した。したがって、以下のデータはまた、方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ａ）とそれに続く方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ｃ）の一例を提供する。
【０２８１】
ＦａｂＡ発現を、ｆａｂＡ遺伝子（図９、パネルＣ、Ｒ６）のオープンリーディングフレームの５’末端に隣接する５’非コーディングポリヌクレオチド配列（作動可能に連結している調節配列を含む）の無作為化によって調節した。領域Ｒ６、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質コード配列に作動可能に連結している調節配列を、非コーディングポリヌクレオチド配列を無作為化することによって修飾して、プラスミドライブラリーを作製した。プラスミドライブラリーは、ベースプラスミドＯＰ−８０中で運ばれる、図９、パネルＣに例示された無作為化された発現コンストラクトを含み、ここでは、コンストラクトのＲ２−ｔｅｓＡおよびＲ４−ｆａｂＢ遺伝子は、実施例３Ｃにおいて得られたＲ２−ｔｅｓＡ（１２Ｈ０８）遺伝子およびＲ４−ｆａｂＢ遺伝子であった。このライブラリーを、クローニング株（ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中に形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートを使用してコロニーを選択した。生存コロニーをプールし、標準プロトコールを使用してＤＮＡを抽出して、ライブラリーを提供した。
【０２８２】
得られたライブラリーを、株Ｖ６６８（実施例２、表２）に形質転換して、スクリーニングのための組換え微生物の群を調製した。外因性プラスミドＤＮＡの選択を維持するよう、すべての培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含めた。手短には、コロニー（クローン）を選び取り、これを使用して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を含有する９６ウェルプレートのウェルに播種した。一晩増殖させた後、プレート中の各ウェルから４０μＬを、新鮮なＬＢを有する新しいプレート中の新しいウェルに移した。３時間増殖させた後、４０μＬの各培養物を使用して、９６ウェルプレート中の４００μＬのＦＡ２培地に播種した。
【０２８３】
５時間増殖させた後、１．０のＯＤ６００で、培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２０時間発酵させた後、培養物を、スクリーニングのための調製において酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物を、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド）を用いて誘導体化し、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸（組み合わされた）の力価を、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて測定した。
【０２８４】
図１１は、組換え微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリＦａｂＡタンパク質）の活性が、対照微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質エシェリキア・コリＦａｂＡタンパク質）の活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、すべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の合計の測定された力価によって除された、各クローンの、飽和脂肪族鎖を有し、すべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の測定された力価である「飽和種％」である。右のＹ軸は、Ｃ８およびＣ１０脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ８／Ｃ１０比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは対照に対応する。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られるクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ８／Ｃ１０比の対応するデータ点が示されている。
【０２８５】
それぞれ、Ｃ１２／Ｃ１４およびＣ１６／Ｃ１８によって特性決定される標的脂肪族鎖長について、同様のデータ分析が図１２および図１３に示されている。
【０２８６】
図中のデータの分析によって、本発明の方法が、広範囲な脂肪族鎖長の脂肪酸誘導体を生成する操作された組換え微生物を提供することが実証され、当業者ならば、それから、所望の標的脂肪族鎖長および所望のレベルの飽和を選択できる。本発明の方法、組換え微生物および培養物は、当業者に、所望の結果を達成するよう脂肪族鎖長および飽和を目的に合わせるためのツールを与える。
【０２８７】
Ｃ．エシェリキア・コリｆａｂＺタンパク質
脂肪酸誘導体の飽和および鎖長の両方が、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質をコードするエシェリキア・コリｆａｂＺ遺伝子を使用して最適化され得る。
【０２８８】
実施例３Ｃにおいて上記のライブラリーから得たプラスミドＤＮＡを精製し、Ｒ２−ｔｅｓＡ（１２Ｈ０８）遺伝子およびＲ４−ｆａｂＢ遺伝子を含むポリヌクレオチドを単離した。したがって、以下のデータはまた、方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ａ）とそれに続く方法工程（Ｂ）とそれに続く方法工程（Ｃ）の一例を提供する。
【０２８９】
ＦａｂＺ発現を、ｆａｂＺ遺伝子（図９、パネルＤ、Ｒ６）のオープンリーディングフレームの５’末端に隣接する５’非コーディングポリヌクレオチド配列（作動可能に連結している調節配列を含む）の無作為化によって調節した。領域Ｒ６、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質コード配列と作動可能に連結している調節配列を、非コーディングポリヌクレオチド配列の無作為化によって修飾して、プラスミドライブラリーを作製した。プラスミドライブラリーは、ベースプラスミドＯＰ−８０中で運ばれる、図９、パネルＤに例示された無作為化された発現コンストラクトを含み、ここでは、コンストラクトのＲ２−ｔｅｓＡ遺伝子およびＲ４−ｆａｂＢ遺伝子は、実施例３Ｃにおいて得られたｔｅｓＡ（１２Ｈ０８）遺伝子およびＲ４−ｆａｂＢ遺伝子であった。約１．７〜１．８のＣ１２／Ｃ１４比を特徴とする標的脂肪族鎖長に基づいて高生成株を選択し；この標的脂肪族鎖長について、高生成株が約１４０％の力価を作製した（図８４；実施例３Ｃ）。このライブラリーを、クローニング株（ＴＯＰ１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア）に形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートを使用してコロニーを選択した。生存コロニーをプールし、標準プロトコールを使用してＤＮＡを抽出して、ライブラリーを提供した。
【０２９０】
得られたライブラリーを、株Ｖ６６８（実施例２、表２）に形質転換して、スクリーニングのための組換え微生物の群を調製した。外因性プラスミドＤＮＡの選択を維持するよう、すべての培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含めた。手短には、コロニー（クローン）を選び取り、これを使用して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を含有する９６ウェルプレートのウェルに播種した。一晩増殖させた後、プレート中の各ウェルから４０μＬを、新鮮なＬＢを有する新しいプレート中の新しいウェルに移した。３時間増殖させた後、４０μＬの各培養物を使用して、９６ウェルプレート中の４００μＬのＦＡ２培地に播種した。
【０２９１】
５時間増殖させた後、１．０のＯＤ６００で、培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２０時間発酵させた後、培養物を、スクリーニングのための調製において酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物を、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミド）を用いて誘導体化し、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸（組み合わされた）の力価を、２０１０年１０月７日に公開された米国特許公報第２０１００２５１６０１号に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて測定した。
【０２９２】
図１４は、組換え微生物における、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質、エシェリキア・コリＦａｂＺタンパク質）が、対照微生物におけるβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストールアシルキャリアタンパク質脱水酵素タンパク質、エシェリキア・コリＦａｂＺタンパク質）の活性に対して修飾されたクローンのスクリーニングデータを示す。図中、左のＹ軸は、すべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の合計の測定された力価によって除された、各クローンの、飽和脂肪族鎖を有し、すべての脂肪族鎖長を含む脂肪酸誘導体（本明細書では、組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の測定された力価である「飽和種％」である。右のＹ軸は、Ｃ８およびＣ１０脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体（組み合わされた遊離脂肪酸および脂肪アルコール）の力価のＣ８／Ｃ１０比である。図中のデータ点は各々、培養されたクローンまたは対照に対応する。組換え微生物のスクリーニングされた群から得られるクローンが、その飽和種％に基づいてＸ軸に沿って並べられ、そのＣ８／Ｃ１０比の対応するデータ点が示されている。
【０２９３】
それぞれ、Ｃ１２／Ｃ１４およびＣ１６／Ｃ１８によって特性決定される標的脂肪族鎖長について、同様のデータ分析が図１５および図１６に示されている。
【０２９４】
図中のデータの分析によって、本発明の方法が、広範囲な脂肪族鎖長の脂肪酸誘導体を生成する操作された組換え微生物を提供することが実証され、当業者ならば、それから、所望の標的脂肪族鎖長および所望のレベルの飽和を選択できる。本発明の方法、組換え微生物および培養物は、当業者に、所望の結果を達成するよう脂肪族鎖長および飽和を目的に合わせるためのツールを与える。
【実施例５】
【０２９５】
ＦａｂＡを使用して脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長を最適化すること
この実施例におけるデータは、標的とされる脂肪族鎖長および所望のレベルの飽和を有する脂肪酸誘導体を生成するよう操作された組換え宿主細胞を作製するための本発明の方法の実施形態の有用性の明確な例示を提供する。実施例は、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素タンパク質（本明細書では、β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質、エシェリキア・コリＦａｂＡタンパク質）の発現／活性を最適化することによって脂肪酸誘導体生成を最適化するための、本明細書に記載された方法の結果を示す。
【０２９６】
β−ヒドロキシデカノイルチオエステル脱水酵素／イソメラーゼタンパク質をコードするエシェリキア・コリｆａｂＡ遺伝子を使用して、脂肪産物の飽和および鎖長の両方が最適化され得る。
【０２９７】
すべてＰＴＲＣプロモーターの制御下で発現されるｃａｒＢ、ｔｅｓＡ（１２Ｈ０８）、ａｌｒＡａｄｐ１およびｆａｂＢ（Ａ３２９Ｇ）を含む発現プラスミドを構築した。ｆａｂＢ（Ａ３２９Ｇ）は、エシェリキア・コリｆａｂＢタンパク質のアミノ酸位置３２９のアラニン置換についてグリシンであった。発現プラスミド（ＡＬＣ４８７と呼ばれる）を、株ＥＧ１４９（表２）中に形質転換した。
【０２９８】
ＦａｂＡ発現は、株Ｄ１７８においてＰＴ５プロモーターの制御下におかれており、発現プラスミドＡＬＣ４８７をこの株に導入した。
【０２９９】
これらの２種の株を、選択された脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の飽和パーセントについてスクリーニングした。このスクリーニングから得られたデータは、ｆａｂＡの活性の調節が、脂肪酸誘導体の脂肪族鎖長および飽和の両方に影響を及ぼすことを実証した。
【０３００】
図１７では、発現プラスミドＡＬＣ４８７を含有する株ＥＧ１４９のスクリーニングから得られたデータが「ＡＬＣ４８７」として示されている。発現プラスミドＡＬＣ４８７を含有し、ＰＴ５プロモーターの制御下にｆａｂＡ発現を有する株Ｄ１７８のスクリーニングから得られたデータが、「Ｄ１７８  ＰＴ５＿ｆａｂＡ／ｐＡＬＣ４８７」として示されている。図中のデータからわかるように、ｆａｂＡの発現の調節が、より長い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の飽和種および生成の増大をもたらした（Ｃ１２／Ｃ１４比に基づいて）。
【０３０１】
図１８では、発現プラスミドＡＬＣ４８７を含有する株ＥＧ１４９のスクリーニングから得られたデータが、「ＡＬＣ４８７」として示されている。発現プラスミドＡＬＣ４８７を含有し、ＰＴ５プロモーターの制御下にｆａｂＡ発現を有する株Ｄ１７８のスクリーニングから得られたデータが、「Ｄ１７８  ＰＴ５＿ｆａｂＡ／ｐＡＬＣ４８７」として示されている。図中のデータからわかるように、ｆａｂＡの発現の調節が、より長い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の飽和種および生成の増大をもたらした（Ｃ８／Ｃ１０比に基づいて）。
【０３０２】
図１９では、発現プラスミドＡＬＣ４８７を含有する株ＥＧ１４９のスクリーニングから得られたデータが、「ＡＬＣ４８７」として示されている。発現プラスミドＡＬＣ４８７を含有し、ＰＴ５プロモーターの制御下にｆａｂＡ発現を有する株Ｄ１７８のスクリーニングから得られたデータが、「Ｄ１７８  ＰＴ５＿ｆａｂＡ／ｐＡＬＣ４８７」として示されている。図中のデータからわかるように、ｆａｂＡの発現の調節が、より短い脂肪族鎖長を有する脂肪酸誘導体の飽和種および生成の増大をもたらした（Ｃ１６／Ｃ１８比に基づいて）。
【０３０３】
図中のデータの分析によって、ｆａｂＡの活性の調節が、当業者に、所望の結果を達成するよう脂肪族鎖長および／または飽和を目的に合わせるための別のツールを提供することが実証される。
【実施例６】
【０３０４】
開発用バイオリアクターのための脂肪アルコール株種培養増殖
選択されたエシェリキア・コリ株の凍結細胞バンクバイアルを使用して、１１５μｇ／ｍＬの濃度のスペクチノマイシン抗生物質を含有する、１２５ｍＬバッフル付き振盪フラスコ中の２０ｍＬのＬＢブロスに播種した。この振盪フラスコを、３２℃のオービタルシェーカー中でおよそ６時間インキュベートし、１．２５ｍＬのブロスを、５００ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤー振盪フラスコ中の、１２５ｍＬの低Ｐ  ＦＡ２種培地（２ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、３０ｇ／Ｌグルコース、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／ＬのＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３および１０ｍＬ／Ｌの濃ＨＣｌ）、１０ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄、１００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）および１１５μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン）に移し、シェーカー上で３２℃で一晩インキュベートした。
【０３０５】
Ａ．バイオリアクター発酵手順
この低Ｐ  ＦＡ２種培養物の  １００ｍＬを使用して、１．９Ｌの滅菌Ｆ１バイオリアクター発酵培地を含有する５Ｌ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ａｐｌｕｓ  バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ）に播種した。この培地は、最初に、３．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物、１０ｇ／Ｌの滅菌濾過グルコース、８０ｍｇ／Ｌ  クエン酸鉄、５ｇ／Ｌのカザミノ酸、１０ｍＬ／Ｌの滅菌濾過微量元素溶液、１．２５ｍＬ／Ｌの滅菌濾過ビタミン溶液（０．４２ｇ／Ｌのリボフラビン、５．４ｇ／Ｌのパントテン酸、６ｇ／Ｌのナイアシン、１．４ｇ／Ｌのピリドキシン、０．０６ｇ／Ｌのビオチンおよび０．０４ｇ／Ｌの葉酸）および種培養において使用されたものと同濃度のスペクチノマイシンからなっていた。培養物のｐＨは、２８％ｗ／ｖのアンモニア水を使用して６．９で、ＤＯコントローラーおよび酸素補給へと次々につながった撹拌ループを使用して、３３℃の温度、１ｌｐｍ（０．５ｖ／ｖ／ｍ）の通気速度および３０％の飽和の溶存酸素圧で維持した。起泡は、シリコンエマルジョンベースの消泡剤（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  １４１０）の自動添加によって制御した。
【０３０６】
初期培地中のグルコースがほとんど枯渇した時点（播種後およそ４〜６時間）で、０．３ｈｒ−１の指数関数的供給速度で、２Ｌの名目上の発酵容量に基づいて１０〜１２ｇ／Ｌ／ｈｒの一定最大グルコース供給速度に、３．９ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４七水和物および６００ｇ／Ｌのグルコースからなる栄養供給を開始した。バイオリアクター中での脂肪アルコールの生成は、培養物が５ＡＵのＯＤに達した時点（播種後およそ３〜４時間）で、１Ｍ  ＩＰＴＧ保存溶液を１ｍＭの最終濃度に添加することによって誘導した。その後、１日あたり２回バイオリアクターをサンプリングし、播種のおよそ７２時間後に回収した。
【０３０７】
Ｂ．サンプル抽出および脂肪アルコール／遊離脂肪酸濃度分析
十分に混合した発酵ブロスの０．５ｍＬのサンプルを、１５ｍＬのコニカルチューブ（ＶＷＲ）中に移し、５ｍＬの酢酸ブチルと十分に混合した。チューブを数回反転して混合し、およそ２分間激しくボルテックス処理し、次いで、５分間遠心分離して、有機層および水層を分離した。有機層の部分を、ガスクロマトグラフィー分析のためにガラスバイアル中に移した。
【０３０８】
Ｃ．Ａｌｃ−２８７基本株に対するさらなるＦａｂＢの効果
（Ａｌｃ−３８３）を用い、（Ａｌｃ−２８７）天然の遺伝子コピーに加えたプラスミドオペロン上のエシェリキア・コリｆａｂＢのさらなるコピーを用いない２種の株を、同一条件下のバイオリアクター中で試験して、発酵結果および得られた生成物プロフィールに対するさらなる脂肪酸生合成能の効果を確認した。株Ａｌｃ−３８３は、ｆａｂＢのさらなるプラスミド由来コピーを有するＡｌｃ−２８７基本株である。ｆａｂＢのコピー数のこの増大に基づいて観察された主な効果は、Ａｌｃ−２８７と比較してＡｌｃ−３８３の、生成された生成物の量およびグルコースに対する収率の増大ならびにより長い鎖のアルコールの生成に向かう生成物プロフィールの変化であった。鎖のこの延長は、脂肪アルコール生成物プールの全体的な飽和を低下させるというさらなる効果を有する。
【表４】
2014526237.tif 000012
【０３０９】
図２０Ａ〜Ｂは、Ａｌｃ−２８７基本株中にＦａｂＢを含むことに起因する観察された鎖長分布の相違を示す。
【０３１０】
Ｄ．ＬＣ−３０２株へのさらなるＴｅｓＡの効果
プラスミド上に組み込まれたものに加えて染色体上の１２Ｈ０８チオエステラーゼのさらなるコピーを用いる２種の株を、同一条件下のバイオリアクター中で試験して、発酵結果および得られる生成物プロフィールに対するさらなるチオエステラーゼの「引き（pull）」の効果を確認した。株ＬＣ３４１は、さらなる染色体１２Ｈ０８チオエステラーゼを有するＬＣ−３０２基本株である。チオエステラーゼ活性のこの増大を用いて観察された主な利益は、それが、特定の株の生成される生成物の量およびグルコースに対する収率を増加させることである。
【表５】
2014526237.tif 000013
【０３１１】
オペロンへのｆａｂＡの付加の効果
ＬＣ−３０２親株は、オペロンの末端に付加されたｆａｂＡ遺伝子を有しており、ＩＧＲライブラリーの３種の変異体（ＬＣ−３６９、ＬＣ−３７２、ＬＣ−３７５）を試験し、得られる生成物プロフィールを検討するために試験した。これら３種の株の遺伝子間領域が異なることが、細胞において発現されるｆａｂＡタンパク質の量の相違をもたらす。以下で使用されるＦＡＳ頭字語は、脂肪アルコールおよび遊離脂肪酸の組合せである「脂肪種」を示す。
【表６】
2014526237.tif 000014
【０３１２】
図２１Ａ〜Ｄは、オペロン中にＦａｂＡを含むことに起因する鎖長分布の観察された相違を示す。
【０３１３】
当業者には明らかであろうが、上記の態様および実施形態の種々の修飾および変法が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得る。このような修飾および変法は、本発明の範囲内である。
【図１】
2014526237.tif 000015
【図２】
2014526237.tif 000016
【図３Ａ）】
2014526237.tif 000017
【図３Ｂ）】
2014526237.tif 000018
【図３Ｃ）】
2014526237.tif 000019
【図３Ｄ）】
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【図４】
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【図５】
2014526237.tif 000022
【図６】
2014526237.tif 000023
【図７】
2014526237.tif 000024
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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