(57)【要約】  本発明は、免疫保護のための、および生体物質または治療薬の長期的機能のための、アルギン酸塩系マイクロカプセル化を含むカプセル化方法に関する。生体物質または治療薬は、アルギン酸塩ポリマーをゼリー化することによって形成された膜に包まれる。具体的には、排他的であることを意味するのではないが、カプセル化システムは、同種または異種移植における使用を対象としている。膜は、長期の寿命を確保し、障壁の外部からの、炎症反応および免疫反応などの望ましくない影響を防ぐ、カプセル化物質の保護障壁を提供する。さらに本発明は、細胞療法において使用するためのカプセル化生成物を製造し提供する方法に関する。カプセル化方法によって得られる治療薬は、様々な状態の治療を改善するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質をカプセル化するための方法であって、
ａ）前記生体物質と生体適合性マトリックス組成物との混合物を形成する工程と、
ｂ）前記混合物を、カルシウムおよびバリウムのカチオン性架橋剤を含む溶液に加える工程と、
ｃ）前記生体適合性マトリックス組成物のゼリー化によって、ｂ）工程において得られる混合物中に微小液滴を形成する工程と、
ｄ）前記微小液滴を水性緩衝液中ですすぎ、前記微小液滴を無血清栄養緩衝液（serum-free nutrient buffer）中で移植まで維持する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記生体適合性マトリックス組成物は、寒天、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、エポキシ樹脂、光架橋性樹脂、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリスチレンまたはポリウレタン、ポリエチレングリコールを含む群から選択され、
好ましくは、前記生体適合性マトリックス組成物は、少なくとも、アルギン酸塩またはアルギン酸複合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小液滴は、顆粒、球体、または繊維として、より好ましくは、繊維として形成されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微小液滴は、２００〜８００μｍの間のサイズであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞小器官、ホルモン、生組織および／または生細胞、ならびに抗体、免疫タンパク質およびペプチドなどのタンパク質を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記生体物質は、生細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、前駆細胞および前駆細胞由来の細胞、幹細胞および幹細胞由来の細胞、または遺伝子操作された細胞を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、膵島細胞、肝細胞、神経細胞、下垂体細胞、髄質細胞、軟骨細胞、または好ましくはインスリンである因子を分泌することができる任意の他の細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微小液滴は、１ｍｌのアルギン酸塩あたり１０×１０６〜３０×１０６細胞の間の細胞密度を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって得ることができることを特徴とするカプセル化生成物。
【請求項１０】
繊維状の形態であることを特徴とする請求項９に記載の生成物。
【請求項１１】
ヒトを含む動物の状態を、改善または治療するために好適な治療薬としての、請求項９または１０に記載の生成物であって、
好ましくは、治療または改善されるべき前記状態は、糖尿病であり、好ましくはヒトにおける糖尿病であることを特徴とする生成物。
【請求項１２】
埋込み可能、移植可能、または注入可能な形態であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１３】
前記生体物質は、哺乳動物由来の膵臓内分泌細胞を含むことを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１４】
膵臓内分泌細胞は、好ましくは分泌因子インスリンを産生することができる、未成熟ブタ膵臓に由来することを特徴とする請求項１３に記載の生成物。
【請求項１５】
埋込み部位または移植部位は、皮下、筋肉内、臓器内、静脈内、臓器の動脈内／静脈内、脳脊髄液、およびリンパ液からなる群から選択されることを特徴とする、埋込み物質または移植物質としての、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞または治療薬の免疫保護および長期的機能のためのアルギン酸塩系マイクロカプセル化を含むカプセル化方法に関する。具体的には、排他的であることを意味するものではないが、カプセル化システムは、同種および異種移植における使用のためのものである。また、本発明は、カプセル化システムの作製および使用方法と、細胞治療におけるカプセル化細胞生成物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞移植は、実験的および臨床的にますます成功しつつある。マイクロおよびマクロカプセル化細胞療法の基盤を発展させるために、材料科学、細胞生物学、および薬物送達の発展が利用されている。これらの構築物は、急性および慢性疾患の治療のための治療用分子の制御された送達を可能にするが、その広範な使用は、侵食性物質のための頻繁な投与の必要性と、非分解性物質の、回復および長期的生体適合性の問題とによって妨げられている。生分解性物質の場合には、カプセル化細胞療法の成功は、一度移植された物質の安定性と、最終的に、その安定性が、どのように移植片の能力に影響を与え、細胞の生存、タンパク質分泌および拡散、免疫分離、生体適合性、物理的配置および固定、劣化、ならびに分泌物の有効性および薬力学を支援するかとの理解にかなりの程度依存する。細胞（マイクロ）カプセル化は、細胞療法、細胞バイオセンサー、タンパク質および抗体産生のための細胞の固定化、食品業界または栄養補給食品によるプロバイオティックカプセル化などの多くの用途のために実施することができる十分に確立された概念である。病理学的状態を治療するための生細胞の使用である細胞療法は、治療用タンパク質送達において遭遇する困難を解決するかもしれない。事実、タンパク質の製造および管理は、それらの物理化学的および生物学的特性のために魅力的である。
【０００３】
マイクロカプセル化は、生物起源などからの小さな分離物質が、好ましくは、それが投与されるレシピエントに相性の良い膜によって包まれる処理である。作製された膜は、半透過性であり、細胞代謝のために必須の分子（栄養素、酸素、成長因子など）の流入と、治療用タンパク質および廃棄物の外方拡散とを可能にする。同時に、免疫系の、細胞および大きな分子は隔離され、非常に有害な免疫抑制剤への生涯にわたる曝露を回避する。多くの種類の装置が提案されたが、マトリックスにおけるカプセル化は、細胞の生存とシグナルへの迅速な分泌応答とに重要である、表面対内部の高い体積比によって、大量の輸送を最適化する装置などの顕著な利点を示す。そのような人工装置は、宿主の体と臓器（血管装置）とに直接接続されていないが、それらは、捕捉された細胞の、代謝、増殖および分化を支援することが示された。さらに、特定の体内部位におけるマトリックス埋込み物質の蓄積は、潜在的な副作用を減少させる、タンパク質の高い、持続的な、局所濃度をもたらす。マトリックスおよび中空球は、薬物送達およびその他の非薬理学的な用途について十分に記載された多くの技術によって効率よく製造することができる。しかしながら、細胞のカプセル化用途において、複雑で相反する要件が満たされなければならない。非常に正確なパラメータ（透過性、サイズ、表面）を有する装置の作製のために非常に再現性のある方法が必要とされるだけではなく、これらの方法は、カプセル化処理の間、および移植後の細胞の完全性と生存能力とをさらに補助するべきである。最後に、作製方法は、細胞の生存および機能と、関連する炎症反応（効果的な血管新生を含む）を生じることのない、宿主組織への長期的な生体適合性とのために、粒子膜を通る適正な流れを確保する必要がある。
【０００４】
レシピエントの体内において、そのようなカプセル化物質をその物質の特定の機能を実行するために患者に移植する試みが部分的に成功したが、多くの場合、患者の体は、体内での、線維芽細胞、または他の炎症に関連するこの物質の過剰増殖によって装置の活性を損なう方法で反応する。線維芽細胞の誘導のための潜在的な機構は、マクロファージの活性化、および粒子物質によるサイトカインの合成刺激である。サイトカインは、抗原の新しいセットに応答して身体によって分泌される分子であり、多くの場合、カプセル化細胞に有害である。数種のサイトカインは、患者の免疫系を次々に刺激する。したがって、免疫応答は、依然としてカプセル化物質の有効期間中における制限要因となる。また、線維芽細胞は、新たに放出されたサイトカインに応じて、装置を過剰増殖させる傾向がある。この線維芽細胞の増殖は、装置の多孔性の損失をもたらす。その結果、装置内部の細胞物質は、栄養素を受け取ることができず、細胞物質の生成物は、装置の壁を透過することができない。このことは、カプセル化された生体物質の死をもたらす可能性があり、送達システムとしての装置の有効性を損なう可能性がある。
【０００５】
生体物質の性質は、移植された装置の生存のために重要である。様々な生体適合性物質は、カプセル化細胞におけるそれらの使用に好適であるべきであると記載されている。例としては、たとえば、寒天、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、エポキシ樹脂、光架橋性樹脂、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリスチレンおよびポリウレタン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０００６】
広い範囲の作業は、細胞マイクロカプセル化のための非常に効率的な生体物質であると考えられるアルギン酸塩を使用して行われる。アルギン酸塩は、藻類から抽出することができる天然高分子である。
【０００７】
アルギン酸塩は、１−４結合β−Ｄ−マンヌロン酸と、そのＣ−５エピマーα−Ｌ−グルロン酸との直鎖２共重合体の不均一な基を含む。アルギン酸塩は、様々な、生理的および治療的用途で生体物質として長い間研究されてきた。その生体適合性インプラント材料としての可能性は、血漿量を人工的に増加させる外科的役割において１９６４年に最初に調べられた（Murphy et al., Surgery. 56: 1099-108, 1964）。過去２０年間にわたって、とりわけ糖尿病などの疾患の治療のためにアルギン酸細胞マイクロカプセル化の著しい進歩があった。
【０００８】
多数の動物モデル、および臨床的同種移植の成功にもかかわらず、拡散、免疫分離に影響を与え、最終的に移植片の生存の損失と拒絶とを導く変わりやすい分解速度が見られる。正確な物質の観点からの、インビボにおけるアルギン酸粒子の安定性に関する一般的な知識は限られており、このことがその使用を制限している。
【０００９】
粒子の性能を最適化するために、それらの生体適合性および安定性を改善することによっていくつかの試みがなされてきた（Sun et al., (1987)など）が、アルギン酸粒子の主なポリマー成分の、分子構造とサイズとを得られた粒子の機能特性に関連付けるために行われているものはほとんどない。
【００１０】
いくつかの特許および特許出願は、カプセル化物質および方法を完成することを試みた。ＷＯ９１／０９１１９は、生体物質をカプセル化する方法を開示しており、より具体的には、アルギン酸ゲルを有するビーズにおいて、第２層、好ましくはポリ−Ｌ−リジンと、アルギン酸塩からなる第３層とによってカプセル化される膵島細胞である。
ＵＳ５，０８４，３５０は、マイクロカプセルの液化に続いて、生物学的に活性な物質を大きなマトリックス中にカプセル化するための方法を提供する。
【００１１】
ＵＳ４，６６３，２８６は、マイクロカプセルのゲル化と、それに続くカプセルの浸透性を制御するための水和によるマイクロカプセルの増殖とによってマイクロカプセルを作製する方法を開示している。
【００１２】
先行技術のカプセルは、それらの寿命に影響を与えるいくつかの問題に悩まされている。なぜなら、コアの液化の必要性は、カプセルの構造的な完全性を損なうからである。また、脱ゼリー化（dejellying）は、生きている細胞にとって過酷な処理である。さらに、曝露されれば線維症を引き起こす可能性があるポリ−リジンコーティングは、それが可能であるようにアルギン酸カルシウム内層に堅固に結合されない。さらに、カプセルコアの脱ゼリーは、マイクロカプセルに線維形成反応をもたらし、未結合のポリ−リジンまたは可溶化アルギン酸塩の浸出をもたらす可能性がある。さらに、装置の形状および構造は、移植後におけるカプセル化生体物質の生存に重要な役割を果たしている。カプセル化システムから生じる重大な合併症は、装置の内および外に拡散する酸素、栄養素および代謝廃棄物によって効果的に減少させられる。球体は、体腔内に大きな凝集体を形成する傾向があるので、これらの凝集体の中心部の細胞は、栄養素の不足のために細胞死および壊死しやすい。最終的には、移植片の想定効果は顕著に低減されるか、失われる。本発明は、従来技術における上述の問題の少なくとも一部を克服することを目的としている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、アルギン酸系生体装置の安定性を改良し、インビボ用途に使用することができるこれらの生体装置に基づく治療薬を製造することである。
【００１４】
従来技術のアルギン酸ポリカチオンカプセルに比べて、本発明のカプセル化処理は、いくつかの改良された特性、すなわち（ｉ）より高い機械的および化学的安定性、（ｉｉ）レシピエントにおいて、全く炎症反応を生じないか、または非常に低い炎症反応を生じる、（ｉｉｉ）移植のための外科的処置への影響を低くすることができる、（ｉｖ）壊死の危険性を低減することによって移植後にマイクロデバイスの耐久性を強化することを示す。
【００１５】
本発明のアルギン酸系カプセル化（改良された、機械的および化学的な安定性および生体適合性を有する）は、所望の、化学構造および分子サイズに応じてカプセル化（およびイオンのゲル化のため）に使用される物質を選択することによって、ならびにマトリックス形成の動態を制御することによってなされる。本発明の装置は、好ましくはグルロン酸に富んだアルギン酸塩から作製される。装置は、アルギン酸カルシウム／バリウムの規定された割合によってさらに特徴付けられる。アルギン酸装置の様々な形状を作製することができる。好ましい実施形態において、装置は繊維状の形状からなる。繊維状の形態でカプセル化細胞を用いることによって、移植片の寿命が確保される。本発明者らは、繊維が、従来技術における他の形状に知られているような大きな凝集体を移植後に形成する傾向を有さないので、繊維状の形態での微粒子の移植が、カプセル化細胞に細胞死および壊死を生じにくいという利点を有することを見出した。大きい凝集体の形成は、凝集体の内側の細胞への栄養素の流入を阻害し、これらの内側の細胞の飢餓、最終的には損失をもたらす。さらに、繊維は、より容易に扱うことができ、脂肪、網、または皮下などの腹膜以外の部位に外科医によって外科的に、または腹腔鏡下でより容易に移植することができる。臨床的合併症の場合、それらは、一般的なアルギン酸カプセルよりも容易に取り除かれるであろう。
【００１６】
多くの従来技術の装置とは異なり、本発明の粒子のアルギン酸コアの脱ゼリー化はないので、細胞の生存を損なわない。
【００１７】
また、好ましい実施形態において、内側コアのアルギン酸塩は、バリウムおよびカルシウムイオン架橋されたアルギン酸塩で作製されるので、従来技術のアルギン酸カルシウムよりも安定であり、従来技術のアルギン酸バリウムより低毒性である。
【００１８】
バリウムは強い親和性を有するが、多量で有毒であるので、望ましくない安全上の問題を生じる。しかしながら、本発明によれば、特定の濃度範囲内のバリウムおよびカルシウムの組み合わせが、毒性の危険性が高いという欠点なしに高親和性の利点を有することを予期せず見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】２．９Ｍのカプセル化ヒトベータ細胞で処置された糖尿病のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウスにおける非空腹時血糖値を、未処置の糖尿病動物と未処置の非糖尿病コントロールと比較した。データは、平均（適切な場合はいつでも）±ＳＤを表している。
【図２】２．９Ｍのカプセル化ヒトベータ細胞を糖尿病ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスに移植した後の、実験群と対照群とにおけるヒトＣ−ペプチドレベル。
【図３】マウスの体重における処置効果。
【図４】繊維の形態でカプセル化細胞を得るために使用されるノズルの例。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
本発明は、カプセル化細胞および治療薬がレシピエントに移植されたとき、改良された生体安定性を有する、生細胞および治療薬のためのカプセル化システムに関する。この改良された製剤は、改良された治療薬送達と治療効果とをもたらす現在の事例よりも、カプセル化細胞および治療薬が生体内で機能を長期間にわたって維持することを可能にする。
【００２１】
別途定義しない限り、技術的および科学的用語を含む本発明の開示において使用されるすべての用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらなる導きによって、用語の定義は、本発明の教示をより好適にすることに含まれる。
【００２２】
本明細書において、生体物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細胞小器官、抗体、免疫タンパク質、ペプチド、ホルモン、生組織、または生存している、原核細胞もしくは真核細胞を含む。
【００２３】
本明細書において、生体適合性マトリックスは、寒天、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、エポキシ樹脂、光架橋性樹脂、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリスチレンおよびポリウレタン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の群から選択される化合物を含む。
【００２４】
本明細書において、アルギン酸共役体は、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン−ラミニン、またはヒアルロン酸がアルギン酸塩に共有結合している（または結合していない）、アルギン酸−コラーゲン、アルギン酸−ラミニン、アルギン酸−エラスチン、アルギン酸−フィブロネクチン、アルギン酸−コラーゲン−ラミニン、およびアルギン酸−ヒアルロン酸を含み、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書において、「Ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかでない限り単数形と複数形と両者を表す。たとえば、「ａ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ」は、１以上の区画を表す。
【００２６】
本明細書において、「約」は、パラメータ、量、一時的な期間などの測定可能な値が、本発明の実施に好適である限り、具体的な値から＋／−２０％以下、好ましくは＋／−１０％以下、より好ましくは＋／−５％以下、特に好ましくは＋／−１％以下、さらに好ましくは＋／−０．１％以下の変化を包含することを意味する。しかしながら、修飾語「約」が表す値は、それ自体も具体的に開示されることを理解されたい。
【００２７】
本明細書において、「Ｃｏｍｐｒｉｓｅ」，「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」，および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」，ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ」は、「ｉｎｃｌｕｄｅ」，「ｉｎｃｌｕｄｅｉｎｇ」，「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」，または「ｃｏｎｔａｉｎ」，「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」，「ｃｏｎｔａｉｎｓ」の同義語であり、当技術分野において知られているか、または本明細書に開示された、付加的な、記載されていない構成、特徴、要素、部材、工程の存在を、排除または除外しない、構成などの存在を特定する包括的な、または制限のない用語である。
【００２８】
端点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての、数字および分数だけではなく、記載された端点も含む。
【００２９】
表現「重量％」（重量パーセント）は、本明細書において別途定義されていない限り、製剤の全重量に基づく各成分の相対的な重さを表す。
【００３０】
第１の態様において、本発明は、グルロン酸に富むアルギン酸塩を含むカプセル化システムを提供する。アルギン酸塩は、（１→４）結合β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）、およびそのＣ−５エピマーα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）からなる直鎖多糖である。モノマーは、連続したＧ−残基（Ｇ−ブロック）、連続したＭ−残基（Ｍ−ブロック）、ＭおよびＧ−残基が交互の（ＭＧ−ブロック）、または無作為に組織されたブロックのホモポリマーブロックで現れる。アルギン酸塩の純度は、アルギン酸系粒子の生体適合性を決定することが示されたので、純度の詳細を規定することは必須である。装置の埋込みのためのＦＤＡの要件によると、エンドトキシンの含有量は、患者あたり３５０ＥＵ以下（ＣＮＳ用途のためには１５ＥＵ以下）でなければならない。エンドトキシンの化学的性質は、アルギン酸塩と非常によく似ているので、それらの除去は困難な作業であったが、現在では、１００ＥＵ／ｇ以下の指定エンドトキシン含有量の精製されたアルギン酸塩が市販されている。ＧＭＰは、アルギン酸塩は、ＡＳＴＭガイド２０６４に従った検証方法によって特徴付けられることを要求している。バッチごとに証明書が交付されるであろう。本発明は、少なくとも６０％のグルロン酸含量とカチオンとを有する、高グルロン酸アルギン酸塩を含む組成物を提供する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、カプセル化方法論を用いる生体適合性アルギン酸塩系マトリックスは、微小液滴生成器と、ゲル化緩衝液とを組み合わせ、標的の生体物質を不均一なアルギン酸塩−Ｃａ２＋／Ｂａ２＋微粒子にカプセル化する。微小液滴発生器を通る押出し時において、液滴は、蠕動ポンプによる、空気せん断力と機械的圧力との組み合わせによって製造される。また、静電ビーズ発生器は、液滴を製造するために使用することができる。微小液滴を含む生体物質は、続いて緩衝液（ｐＨ７．２〜７．４）を有するカチオン性架橋溶液中に集められる。この緩衝液に接触させられたとき、微小液滴はゼリー化される。カチオン性架橋剤は、Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｈ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、Ｎｉ２＋、Ｐｂ２＋、Ｓｎ２＋およびＺｎ２+からなる群の塩から選択することができる。好ましくは、カチオン性架橋剤は、塩化バリウムと塩化カルシウムとの組み合わせである。架橋剤は、好ましくは過剰量であり、たとえば１ｍＭ〜２０ｍＭの塩化バリウム、および１ｍＭ〜２０ｍＭの塩化カルシウムである。より好ましくは、１０ｍＭの塩化バリウムおよび１０ｍＭの塩化カルシウムである。
【００３２】
その後、微小液滴は、リンゲル溶液で３回洗浄され、無血清のＨａｍ  Ｆ−１０培地において３７℃、５％ＣＯ２で移植されるまで維持される。微小液滴のサイズは、２００〜８００μｍの間で変化する。微小液滴は、顆粒、球体、薄板、繊維状構造などの多くの形態であってもよい。最も好ましい実施形態では、微小液滴は、わずかに変更された処理を使用することによって、アルギン酸塩系繊維の形態をとる。
【００３３】
形成された微小液滴は、約１か月以上にわたってインビトロの生理的条件下に置かれたとき、約１０％以上膨らむ。これらのアルギン酸塩マトリックスの膨潤は、水吸収につながる浸透勾配を生じる余剰２価の陽イオンによって引き起こされると考えられる。本発明の球体および繊維は、非常に安定である。本発明の微小液滴は、顕著に長期間、確実に４か月以上の期間にわたり、対象においてインビボで機能を維持することができると期待される。
【００３４】
さらに好ましい実施形態において、カプセル化生体物質は、膵島細胞、肝細胞、神経細胞、下垂体細胞、髄質細胞、軟骨細胞、生殖系列細胞、および因子を分泌することができる細胞を含み、これらに限定されない。細胞は、好適な方法（たとえば、膵島細胞についてＥＰ１１４６１１７および関連において記載された方法）に従って処理され、１．８％滅菌超純アルギン酸塩溶液に混合され、１０〜３０×１０６細胞／ｍＬアルギン酸塩の間の最終細胞密度が得られる。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、カプセル化生体物質は、糖尿病の治療に有用なインスリンの分泌が可能なである未熟なブタ膵臓に由来する、膵臓および内分泌細胞のプールを含む。また、細胞は、肝疾患または障害の治療において有用な肝分泌因子を分泌することができる、肝細胞または非肝細胞を含み得る。また、細胞は、脈絡叢、下垂体細胞、髄質細胞、軟骨細胞、およびパーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、ハンチントン病、脳卒中、ライターニューロン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、老化、血管疾患、メンケスちぢれ毛症候群、ウィルソン病、神経系への外傷または損傷などの神経疾患の治療に有用な神経因子を分泌することができる任意の他の細胞を含み得る。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、カプセル化生体物質は、エリスロポエチン、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＬ−２、シトクロムＰ４５０、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＢＭＰ類、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、血液凝固因子、インターフェロン、ドーパミン、エンドスタチン、ニューロピリン−１、ＧＨ３、および抗体などの治療タンパク質を製造する、遺伝的に設計された細胞であってもよい。
【００３７】
別の実施形態では、カプセル化生体物質は、幹細胞または前駆細胞を含み得る。幹細胞および前駆細胞は、様々な細胞系に分化する能力を有するので、再生医療における細胞治療において大きな可能性を有する。しかしながら、組織再生および改変の不全は、外来因子に対する、幹細胞および前駆細胞の保護の欠如に部分的に起因する。マイクロカプセル化は、幹細胞を固定することができ、幹細胞の生存および機能に好ましい微小環境をもたらし、したがって正常な幹細胞ニッチの特定の物理化学的および生化学的特性に似た生物学的人工幹細胞ニッチを生じる。
【００３８】
さらに本発明は、本発明の細胞含有アルギン酸マトリックスの有効量を動物に移植することを含む、ヒトを含む動物の、疾患または状態を改善または治療する方法を提供し、前記細胞は、前記疾患または状態を改善または治療するのに効果的である治療薬を分泌する。
【００３９】
さらに本発明は、細胞含有免疫保護膜で被覆された本発明の非分解性細胞送達構築物の有効量を動物に移植することを含む、ヒトを含む動物における疾患または状態を改善または治療する方法を提供し、前記細胞は、前記疾患または状態を改善または治療するのに効果的である治療薬を分泌する。
【００４０】
さらに本発明は、本発明の治療薬含有アルギン酸マトリックスの有効量を動物に移植することを含む、ヒトを含む動物における疾患または状態を改善または治療する方法を提供し、前記治療薬は、前記疾患または状態を改善または治療するのに効果的である。
【００４１】
これらの治療方法において、本発明の、マトリックスまたは被覆された送達構築物は、疾患に対して有効になるように十分な治療薬を送達するであろう量で投与することができる。たとえば、糖尿病の治療において、レシピエントの体重キログラムあたりの細胞を製造する１００万のカプセル化されたインスリンの最小量が埋め込まれる。
【００４２】
当業者は、インビトロでのアルギン酸マトリックスから特定の治療薬の分泌速度を試験することができ、任意の特定の患者の必要性に応じて、特定の患者を効果的に治療するためにどれだけの球体または繊維が必要かを計算することができるであろう。
【００４３】
本発明のマトリックスは、生細胞および／または治療薬の源に応じて、同種または異種移植のために処方されてもよい。本発明のマトリックスは、体の組織内、または体の液体で満たされた空間内に移植することができ、どちらも、接近性および有効性の点で最も適切である。より具体的には、埋込みまたは移植部位は、皮下、筋肉内、臓器内、静脈内、臓器の動脈／静脈血管、脳脊髄液、およびリンパ液であってもよい。たとえば、マトリックス内の生細胞がベータ細胞であれば、それらは腹腔内に移植されてもよい。好ましい実施形態では、カプセル化細胞は、腹腔内で高度に血管が発達した構造である大網に埋め込まれる。アルギン酸マトリックスの安全性に問題がある場合には、容易な大網切除を実行することができ、安全に大綱を取り除くことができる。他の移植部位は、脂肪および皮下部位を含む。さらに、臨床的な合併症の場合、それらは容易に取り除かれてもよい。
【００４４】
一実施形態において、装置は、容易な、埋込みまたは移植を可能にする挿入可能形態で提供されてもよい。また、装置は、抗生物質などの治療性生物活性剤を含有するときは特に、経口または局所投与用に製剤化することができる。
【００４５】
本発明は、限定的でない実施例を参照しながら、以下に詳細に説明される。
［実施例］
実施例１：アルギン酸微粒子にカプセル化されたヒト膵島−マウスにおける正常化
バリウム／カルシウムゲル化緩衝液と組み合わせた同軸気流装置（微小液滴生成器）は、不均一なアルギン酸−Ｃａ２+／Ｂａ２＋微粒子中のヒト膵島をカプセル化するために使用される。
【００４６】
ａ）カプセル化前の細胞の調製
−ヒト膵島懸濁液は、２７０ｇ（ベックマンＧＳ−６Ｒで１１００ＲＰＭ），３分，１５〜３０℃で遠心分離される。
−上清（Ｈａｍ  Ｆ１０）は、取り除かれる。
−細胞は、中程度の遠心分離で、０．９％ＮａＣｌを用いて２回洗浄される。２７０ｇ（ベックマンＧＳ−６Ｒで１１００ＲＰＭ），３分，１５〜３０℃。
−細胞沈殿物は、均質な懸濁液が得られるまで、ピペットを用いてアルギン酸塩１．８％に穏やかに混合される。ヒト膵島は、５０ｍｌのファルコンチューブにおいて、５〜５０×１０６細胞／ｍｌアルギン酸塩の間の最終細胞密度を得るために、１．８％滅菌超純アルギン酸塩溶液に混合される。
−この混合物は、少なくとも５分間、氷上で冷却される。
【００４７】
ｂ）カプセル化
上述の細胞−アルギン酸塩混合物は、その後、以下の設定を用いて、同軸空気流装置によって処理される。
−流量ポンプ：０．５〜１．５ｍｌ／ｍｉｎ
−エアフローメータ：２．５〜３Ｌ／ｍｉｎ
−圧バルブ１：０．２ＭＰａ
−圧バルブ２：０．１ＭＰａ
これらの設定は、製造したい粒子のサイズに応じて変化する（より高くまたはより低く）。
【００４８】
蠕動ポンプを使用して、細胞−アルギン酸塩混合物は、金属ハブ針（１６ゲージ）を用いて５０ｍｌのファルコンチューブから吸引され、２２ゲージの空気ジェット針に向かって管を通って進められる。２２ゲージのエアジェット針を通る押出し時に、液滴は、蠕動ポンプによる、空気せん断力と機械的圧力との組み合わせによって製造される。アルギン酸塩に膵島を含む液滴は、２２ゲージのエアジェット針（空気流２．５〜３ｌ／ｍｉｎ）を通って押出成形（０．５〜１．５ｍｌ／ｍｉｎ）によって製造される。
【００４９】
液滴は、５０ｍＭのＣａＣｌ２と１ｍＭのＢａＣｌ２の溶液（１０ｍＭのＭＯＰＳ、０．１４Ｍのマンニトール、および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２〜７．４）をゲル化溶液として含む２０ｍｌのビーカーに２ｃｍ低く落ちる。この緩衝液との接触時に、微小液滴はゼリー化する（Qi et al.; 2008）。液滴サイズは、ポンプ流量と、使用される空気の流れとに応じて、２００〜８００μｍの間で変化する。
【００５０】
液滴は、ＢａＣｌ２ゲル化溶液中で７分間放置される。その後、カプセルは、底部に２２メッシュグリッドを有する円筒状のふるい上でゲル化溶液を含むこのカプセルを注ぐことによってゲル化溶液から取り除かれる。
【００５１】
その後、カプセルは、リンゲルまたはハンクス平衡塩類溶液で満たされたガラス容器に粒子を含有する円筒状のふるいを繰り返し浸漬して穏やかに洗浄される。この工程は、３回繰り返され、洗浄液は毎回完全に新しくされる。
【００５２】
ＱＣのための試料を採取した後、カプセルは、アルブミンなし、またはアルブミン含有、またはＨａｍ  Ｆ−１０培地中において３７℃、５％ＣＯ２で移植まで培養される。
また、静電ビーズ発生器は、液滴を製造するために使用することができる。
【００５３】
ｃ）移植および結果：移植後の正常化
糖尿病は、５０ｍｇ／ｋｇのアロキサン一水和物（２，４，５，６−テトラオキシピリミジン、２，４，５，６−ピリミジンテトロン、グルコース類似体）を用いる処理によって免疫不全Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウスに誘導された。動物は、実験に入る前に安定した糖尿病状態を観察された。コントロールして、健常マウスを用いた。移植は、アロキサン処理の２日後に行った。５匹の動物は、２９０万のアルギン酸塩カプセル化ヒトベータ細胞／動物を腹腔に埋め込まれた（１９Ｍのベータ細胞／ｍｌアルギン酸塩）。小切開は、白線（linea alba）に沿って動物の腹壁と腹膜とにおいて行われた。その後、カプセル化細胞は、４ｍｌの緩衝液で満たされた５ｍｌピペットを用いて腹腔内に移植された。２匹の糖尿病動物は、移植を受けなかった。その後、動物は、最大２５８日間観察された。血中グルコースの測定は、非絶食条件下で行われた。
【００５４】
実験は３つの実験群に分割された。
・グループ１（図中において三角形で示されている）：腹腔内にカプセル化ヒトベータ細胞を移植された糖尿病マウス（ｎ＝５）
・グループ２（図中において四角形で示されている）：ヒトベータ細胞を移植されていない糖尿病マウス（ｎ＝２）
・グループ３（図中において菱形で示されている）：非糖尿病マウス、陰性コントロール（ｎ＝１）。このグループについて十分な過去のデータがあるので、１匹の動物のみがこのグループに含まれた。
【００５５】
血液は、動物から採取され、血中グルコース、Ｃ−ペプチド、およびプロインスリンレベルを測定された。動物の体重も測定された。動物の犠牲（第５週および第３７週）に続いて、浮遊カプセルが回収され、細胞およびカプセルの両方について、光学顕微鏡（Ｈ＆Ｅ）、半薄切片、超薄切片および電子顕微鏡を用いて分析し、細胞生存率、インスリン生産、およびグルカゴン生産を測定した。
【００５６】
電子顕微鏡は、（１０００細胞を数えることによって）細胞の生存率を評価するために使用され、カプセル化されてない細胞の８８％に比べて、カプセル化後の生存率は８１％であった。また、生存率は、移植の直後に測定され、９４％の生存を示す同様の方法で処理された非カプセル化細胞に比べて６２％であることが見出された。カプセルの平均粒径は、埋込み前において６２０μｍであった。動物の犠牲に続いて、３５日目および２５８日目の両方でカプセルの大部分が腹腔内に浮遊していることが見出され、腹腔を洗い流すことによって集められた。埋込み後のカプセルのサイズは、カプセルの直径が、３５日目および２５８日目でそれぞれ７および８％わずかに減少した。生細胞の割合は動物間で大きく変化するようであったが、２５８日後でも常に５７％よりも高かった。生細胞の割合が変化するにもかかわらず、インスリンおよびグルカゴン陽性細胞の割合は、それぞれ５５および１５．５％で一定のままであった。カプセル化細胞の総数を定量化することはできなかった。
【００５７】
埋込み前に、両方の糖尿病グループ（グループ１および２）は、非糖尿病コントロール（グループ３）に比較して、高い血糖値のレベルを示した。これは、糖尿病患者において観察される血糖制御の喪失の特徴である。埋込み後の最初の血糖測定は、２４時間後に行われ、（カプセル化ヒトベータ細胞で処置された）グループ２の５匹全ての動物が、正常な非糖尿病コントロールに観察されるものに匹敵するレベルまで血糖値の顕著に有意な減少を示した（図１）。血糖の正常化は、少なくとも１１０日の期間にわたって維持された。この初期期間後、血糖値の変動は、動物間および時点間において観察され、ヒトベータ細胞の治療上の利点が徐々に失われることを示唆した。しかしながら、血糖値は、糖尿病コントロール（グループ２）のそれよりも有意に低いままであった。ヒトベータ細胞を埋め込まれなかった糖尿病動物について、非空腹時血糖値は、高いままであった。
【００５８】
さらに血糖値の正常化を特徴付けるために、ヒトＣ−ペプチドおよびヒトプロインスリンの循環レベルを観察した。使用されるアッセイは、げっ歯類のオリゴペプチドからヒトを区別することが可能であるので、ヒトベータ細胞の機能性の直接の指標をもたらす。循環ヒトＣ−ペプチドは、カプセル化ヒトベータ細胞を埋め込まれた全ての５匹の動物で試験した最初の時点（１週間）で検出された。埋込み後の最初の８週後にＣペプチドが徐々に増加することが示される。循環ヒトＣ−ペプチドのレベルは、研究の残りの期間に顕著な変動を示し、３ｎｇ／ｍｌを超えたままである。このデータは、２における血糖データに一致している。Ｃ−ペプチドは、ヒトベータ細胞を埋め込まれていないマウスでは検出されなかった。このことは、ヒトＣ−ペプチドについての試験の特異性を確認する。この実験で観察されたヒトＣ−ペプチドのレベルは、それらが通常の健康なヒトにおける循環ヒトＣ−ペプチドのレベル（０．９〜１．８ｎｇ／ｍｌ）を超えているので、生理学的に適切であると考えられる。
【００５９】
ヒトプロインスリンの循環レベルを特徴付ける際に同様のデータが見られる。ヒトベータ細胞によって処置された全５匹の糖尿病動物は、最初の一週間の時点でプロインスリンの定量可能なレベルを示す。埋め込まれたカプセル化ヒト細胞を含むグループ１の動物のみが、試験の検出限界を超える一貫性のあるプロインスリン発現を示す（試験期間を通じて１４ｐｍｏｌ／ｌより大きい）（図２）。
【００６０】
また、動物の体重も、糖尿病状態および／または治療に関連する任意の毒性を測定するために試験期間を通して観察された（図３）。カプセル化ヒトベータ細胞で処置された全ての動物（グループ１）は、それらの体重を維持し、またはわずかに増加し、埋込みに関連する毒性効果がなかったことを示唆した。非処置糖尿病群（グループ２）は、実験の大部分において体重を維持したが、糖尿病病態に関連したその後の実験において体重の減少を示した。驚くべきことに、正常なコントロール動物（グループ３）は、初期の実験において体重の減少を示し、除外された。これは、以前の履歴データで観察されておらず、この実験とは無関係であると考えられる。有害事象の他の徴候は、この実験において観察されなかった。
【００６１】
実施例２：アルギン酸塩繊維における細胞のカプセル化
ヒトまたはブタのベータ細胞は、均質な懸濁液が得られるまで、ピペットを用いてアルギン酸塩１．８％に混合される。ヒト膵島は、５０ｍｌのファルコンチューブ内で５〜５０×１０６細胞／ｍｌアルギン酸塩の間の最終細胞密度を得るために１．８％滅菌超純アルギン酸塩溶液に混合される。この混合物は、少なくとも５分間、氷上で冷却される。蠕動ポンプを用いて、細胞アルギン酸塩混合物は、金属ハブ針（１６ゲージ）を用いて５０ｍｌファルコンチューブの外に吸引され、２２ゲージの針に向かって管を通って前進させられる。針の先端は、ゲル化溶液に挿入される。
【００６２】
２２ゲージの針を通る押出し時において、アルギン酸塩は、直ちにゲル化溶液（１０ｍＭのＭＯＰＳ中における５０ｍＭのＣａＣｌ２と１ｍＭのＢａＣｌ２と、０．１４Ｍマンニトール、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２〜７．４）に接触させられ、直ちに細胞を含む円筒状の繊維を形成する。したがって、数メートルの長さの途切れない繊維を生成することができる。
【００６３】
繊維の滑らかな表面を得るために、好ましくは、丈の高いビーカー（好ましくは２０ｃｍ以上）がゲル溶液の容器として使用される。
【００６４】
繊維の直径は、ポンプ流量と使用される針のゲージまたは内径とに応じて、５０〜１２００μｍの間で変化させることができる。好ましくは、繊維の直径は、栄養素およびガスの交換に負の影響を与えないように８００μｍ未満に維持される。
【００６５】
繊維は、ＢａＣｌ２ゲル化溶液中で７分間放置される。その後、繊維は、底部における２２メッシュグリッドの円筒状のふるいの上に、ゲル溶液を含むこの繊維を注ぐことによってゲル化溶液から除去される。
【００６６】
その後、繊維は、繊維を含む円筒形のふるいをリンゲルまたはハンクス平衡塩類溶液で満たされたガラス容器に繰り返し浸漬して穏やかに洗浄される。この工程は、洗浄液を毎回完全に新しくして３回繰り返される。
【００６７】
ＱＣのための試料を採取した後、粒子は、３７℃、５％ＣＯ２で、アルブミン非含有またはアルブミン含有またはＨａｍ  Ｆ−１０培地において移植まで培養される。
【００６８】
針の代わりに、「自社内で」開発されたノズルを使用することができる（図４）。このノズルは、チューブの末尾（２）に挿入することができる、円筒形プラスチックまたはプレキシガラス片（１）から構成される。レーザーを用いて、長方形または卵形の穴（３）を、このプラスチックまたはプレキシガラス片に焼き付けた。チューブの先端（プレキシまたはプラスチックノズルを含む）がバリウム／カルシウムゲル化緩衝液の液面の下方に配置されたとき、およびアルギン酸塩、または細胞−アルギン酸塩混合物が、（蠕動ポンプを使用して）このノズル片（４）を押し通されたときに、繊維を製造することができる。繊維の形状は、前記片に穿孔されたレーザーの幅に応じて、円筒形から薄板（ビーム）などまで変化する。
【００６９】
繊維形状自体に固有の利点がある。それらは、より容易に扱われ、脂肪、大網、皮下などの腹膜以外の部位に、外科的に、または腹腔鏡下で移植することができる。臨床合併症の場合、それらは、一般的なアルギン酸カプセルよりも容易に除去される。
【００７０】
実施例３：連続カプセル化による２重壁カプセルの生成
細胞を２重壁アルギン酸カプセルにカプセル化することができる。そうすると、第１段階のカプセル化の後、カプセルの壁の近辺または壁内に捕捉された、細胞または細胞集合体は、第２段階のカプセル化の間に、アルギン酸塩の第２層によって覆われる。そうすることによって、カプセル化細胞の身体への直接の曝露は、さらに制限される。したがって、単一の段階のカプセル化の後、カプセルから細胞に押し出される直接的な免疫応答は、除外することができる。
【００７１】
カプセル化細胞の第１段階において、以下のようにカプセル化することができる。蠕動ポンプを使用して、細胞−アルギン酸塩混合物が、金属ハブ針（ゲージ１６）を用いて５０ｍｌファルコンチューブの外に吸引され、２５ゲージの空気噴射針に向かってチューブを通って進められる。２５ゲージの空気噴射針を通る押出時において、液滴は、蠕動ポンプによる、空気せん断力と機械的圧力との組み合わせによって作製される。アルギン酸塩に膵島を含む液滴が、２２ゲージの空気噴射針を通って（空気流２．５〜３ｌ／ｍｉｎ）押出成形によって製造される（１．２〜１．５ｍｌ／ｍｉｎ）。
【００７２】
液滴は、（１０ｍＭのＭＯＰＳ、０．１４Ｍのマンニトール、および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２〜７．４中に）５０ｍＭのＣａＣｌ２と１ｍＭのＢａＣｌ２とをゲル化溶液として含む２０ｍｌビーカーに２ｃｍ低く落ちる。この緩衝役に接触すると微小液滴は、ゼリー化する（Qi et al.; 2008）。粒径は、ポンプ流量、および使用される空気の流れに応じて、２００〜８００μｍの間で変化する。
【００７３】
粒子は、ＢａＣｌ２溶液中で７分間放置される。その後、粒子は、底部の２２メッシュグリッドを有する円筒状のふるいの上にゲル溶液を含むこの粒子を注ぐことによってゲル化溶液から除去される。
【００７４】
その後、粒子は、リンゲルまたはハンクス平衡塩類溶液で満たされたガラス容器に、粒子を含有する円筒状のふるいを繰り返し浸漬して穏やかに洗浄される。この工程は、洗浄液を毎回完全に新しくして３回繰り返される。
【００７５】
この方法で得られるカプセルに、続いてカプセル化の第２段階が行われる。したがって、カプセル化の第１段階の間に作製されるカプセルは、均質な懸濁液が得られるまで、ピペットを用いてアルギン酸塩１．８％に再び混合される。
【００７６】
カプセル化の第２段階は、第２段階のためのアルギン酸塩を加えた粒子混合物が、２２ゲージの針を通して押し出されることを除いて第１段階と同様の方法で行われる。
【００７７】
針のゲージサイズは、上述において利用された組み合わせ（２５ゲージ、および２２ゲージ）に限定されるものではない。第１カプセル化段階後に製造される粒子の直径と、第２アルギン酸塩層（第２カプセル化段階の間に製造される）の厚みとは、両者の針の内径によって主に決定される。
【００７８】
第１カプセル化段階の間に使用されるアルギン酸塩は、Ｇ−アルギン酸塩またはＭ−アルギン酸塩を多く含んでいてもよい。第２カプセル化段階の間に使用されるアルギン酸塩は、Ｇ−アルギン酸塩またはＭ−アルギン酸塩を多く含んでいてもよい。
【００７９】
第１および第２のカプセル化段階の間のアルギン酸塩濃度は、１．４〜２％の間で変化させることができる。
【００８０】
実施例４：アルギン酸塩マトリックス中における細胞の成熟
周産期ブタ膵島は、１０〜２００μｇ／ｍｌの総タンパク質濃度で、個々に組み合わせて基底膜タンパク質コラーゲンＩＶ型およびラミニンを含有するアルギン酸マトリックス中にカプセル化することができる。膵島インスリン分泌は、これらの基底膜タンパク質なしで、アルギン酸粒子中にカプセル化された膵島と比較して増加することが予想される。
【００８１】
コラーゲン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン−ラミニンまたはヒアルロン酸がアルギン酸塩に共有結合されている（または結合していない）、アルギン酸−コラーゲン、アルギン酸−ラミニン、アルギン酸−エラスチン、アルギン酸−フィブロネクチン、アルギン酸−コラーゲン−ラミニン、およびアルギン酸−ヒアルロン酸などのアルギン酸塩複合体が含まれる。アルギン酸塩構築物をゲル化するために使用できる塩の例は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化バリウム（ＢａＣｌ２）、または塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）などであり、これらに限定されない。
フィブロネクチンは、細胞増殖の増加をもたらすことができるが、ラミニンおよびＩ型コラーゲンは、蓄積されるインスリン分泌を増加させることができる。
【００８２】
実施例５：機能性を向上させるための、ベータ細胞および脂肪細胞のカプセル化
結果は、脂肪組織内の移植が、ベータ細胞の機能のために有益である可能性があることを示している。Chenら（Chen et al. (2009)）は、ストレプトゾトシン誘導糖尿病ＦＶＢ／ＮＪマウスが、精巣上体脂肪体に埋め込まれた同系膵島の治療量に続く、若齢（３か月）または老齢（２４か月）マウスに由来する２５膵島の治療量以下の腎臓カプセル埋込みによって正常血糖になることを示した。第２の移植の３週間後、脂肪体を含む膵島は、高血糖を再導入するために取り除かれた。
【００８３】
脂肪細胞は、コラゲナーゼ消化による組織分解、１５０μｍのナイロン膜を通る濾過、および遠心分離（５分、３００ｒｐｍ）後、精巣上体脂肪体から作製された。分離された脂肪細胞は、ストレプトマイシン／ペニシリン（それぞれ１００μｇ／ｍｌ）を補充した最小ＤＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社）において３７℃で培養することができる。
【００８４】
ベータ細胞と、新たに単離または培養された脂肪細胞との異なる割合の混合物は、続いて、５〜５０×１０６細胞／ｍｌアルギン酸塩の間の最終細胞密度を得るために、１．８％滅菌超純アルギン酸塩溶液中でカプセル化することができる。そうすると、ベータ細胞とともにカプセル化された脂肪細胞は、ベータ細胞のための適切なマトリックスをもたらすことができ、インビボにおけるこれらのカプセル化ベータ細胞の機能を誘導するか、または刺激することができる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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