(57)【要約】  本発明は、グラム陰性細菌及び／又はグラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素と、該酵素にＮ−又はＣ−末端で融合された少なくとも２つのペプチドストレッチとで構成された融合タンパク質であって、該ペプチドストレッチは異なるものであり、合成両親媒性ペプチド、合成カチオン性ペプチド、合成ポリカチオン性ペプチド、合成疎水性ペプチド、又は、スシペプチドやデフェンシンのような天然に存在する抗微生物ペプチドの群から選択されることを特徴とする、融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、及び、前記核酸分子又は前記ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。加えて、本発明は、医薬、診断手段、化粧料材料、殺菌剤、又は、食品添加物として使用するための、前記融合タンパク質に関する。本発明はまた、グラム陰性及び／又はグラム陽性細菌による食品の汚染、食品加工装置の汚染、食品加工工場の汚染、食品と接触する表面の汚染、医療機器の汚染、病院や手術室における表面の汚染の処置又は予防に関する。【選択図】          図１
2014507933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性細菌及び／又はグラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素と、該酵素にＮ−又はＣ−末端で融合された少なくとも２つのペプチドストレッチとで構成された融合タンパク質であって、
該ペプチドストレッチは異なるものであり、合成両親媒性ペプチド、合成カチオン性ペプチド、合成ポリカチオン性ペプチド、合成疎水性ペプチド、又は、スシペプチドやデフェンシンのような天然に存在する抗微生物ペプチドの群から選択されることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２】
前記酵素が、エンドリシン、オートリシン、又は、バクテリオシンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記合成ペプチド又は天然に存在するペプチドの長さが、６〜３９アミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記グラム陰性細菌が、
腸内細菌科、特にエシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、シトロバクター属、エドワードジエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、及びエルシニア属、
シュードモナス科、特にシュードモナス属、ブルクホルデリア属、ステノトロホモナス属、シュワネラ属、スフィンゴモナス属、及びコマモナス属、
ナイセリア属、モラクセラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、ブルセラ属、フランシセラ属、ボルデテラ属、レジオネラ属、バルトネラ属、コクシエラ属、ヘモフィルス属、パスツレラ属、マンヘミア属、アクチノバシラス属、ガードネレラ属、スピロヘータ科、特にトレポネーマ属及びボレリア属、
レプトスピラ科、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、スピリルム属、ストレプトバシラス属、バクテロイデス科、特にバクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属及びポリフィロモナス属、並びに、
アシネトバクター属、特にＡ．バウマンニから成る群から選ばれ、
前記グラム陽性細菌が、
リステリア菌、黄色ブドウ球菌、フェカリス菌、フェシウム菌、肺炎連鎖球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス菌、腺疫菌、クロストリジウム・ディフィシル、ボツリヌス菌、破傷風菌、ウェルシュ菌、炭疽菌、セレウス菌、アクネ菌、マイコバクテリウム・アビウム、結核菌、ジフテリア菌、マイコプラズマ・ニューモニエ、放線菌から成る群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記酵素が、配列番号１〜１８で示されるアミノ酸配列を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗微生物ペプチドが、配列番号４４〜６２及び７８〜９８で示されるアミノ酸配列を示すか、
前記スシペプチドが、配列番号６３で示されるアミノ酸配列を示すか、
前記疎水性ペプチドが、配列番号６５及び／若しくは６６で示されるアミノ酸配列を示すか、又は、
前記両親媒性ペプチドが、配列番号６４、６８及び／若しくは６９で示されるアミノ酸配列を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、配列番号７０〜７７及び１２７〜１４７で示されるアミノ酸配列を示す、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、細菌細胞又は酵母細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
医薬、診断手段、化粧料材料、殺菌剤、又は、食品添加物として使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に関連する障害、疾患、若しくは状態の治療及び／又は予防において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記障害、疾患、又は状態が、ヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種であるグラム陰性細菌、特に腸内細菌科（エシェリキア属、とりわけ大腸菌、サルモネラ属、シゲラ属、シトロバクター属、エドワードジエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、とりわけ肺炎桿菌、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、エルシニア属）、シュードモナス科（シュードモナス属、とりわけ緑膿菌、ブルクホルデリア属、ステノトロホモナス属、シュワネラ属、スフィンゴモナス属、コマモナス属）、ナイセリア属、モラクセラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、ブルセラ属、フランシセラ属、ボルデテラ属、レジオネラ属、バルトネラ属、コクシエラ属、ヘモフィルス属、パスツレラ属、マンヘミア属、アクチノバシラス属、ガードネレラ属、スピロヘータ科（トレポネーマ属及びボレリア属）、レプトスピラ科、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、スピリルム属、ストレプトバシラス属、バクテロイデス科（バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属、ポリフィロモナス属）、アシネトバクター属、とりわけＡ．バウマンニに起因するか、又は、ヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種であるグラム陽性細菌、特にリステリア菌、黄色ブドウ球菌、フェカリス菌、フェシウム菌、肺炎連鎖球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス菌、腺疫菌、クロストリジウム・ディフィシル、ボツリヌス菌、破傷風菌、ウェルシュ菌、炭疽菌、セレウス菌、アクネ菌、マイコバクテリウム・アビウム、結核菌、ジフテリア菌、マイコプラズマ・ニューモニエ、放線菌に起因する、請求項１３に記載の使用のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
融合タンパク質の製造方法であって、請求項１０又は１１に記載の宿主細胞を該融合タンパク質の発現をサポートする条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１７】
対象においてグラム陰性及び／又はグラム陽性細菌に起因する障害、疾患、又は状態を治療する方法であって、該対象に対して請求項１に記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記障害、疾患、又は状態が、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に起因する細菌感染である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
グラム陰性及び／又はグラム陽性細菌による食品の汚染、食品加工装置の汚染、食品加工工場の汚染、食品と接触する表面の汚染、医療機器の汚染、病院や手術室における表面の汚染を除去、低減、及び／又は予防する方法であって、該食品、食品加工装置、食品加工工場、食品と接触する表面、医療機器、又は、病院における表面を請求項１に記載の融合タンパク質に接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
対象からの試料中、食品若しくは飼料中、又は、環境試料中における、細菌を検出する方法であって、該試料を請求項１に記載の融合タンパク質に接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
グラム陰性及び／又はグラム陽性細菌による食品の汚染、食品加工装置の汚染、食品加工工場の汚染、食品と接触する表面の汚染、医療機器の汚染、病院や手術室における表面の汚染を処置又は予防するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２２】
医療、食品若しくは飼料、又は、環境の診断における診断手段としての、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性細菌及び／又はグラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素と、該酵素にＮ−又はＣ−末端で融合された少なくとも２つのペプチドストレッチとで構成された融合タンパク質であって、該ペプチドストレッチは異なるものであり、合成両親媒性ペプチド、合成カチオン性ペプチド、合成ポリカチオン性ペプチド、合成疎水性ペプチド、又は、スシペプチドやデフェンシンのような天然に存在する抗微生物ペプチドの群から選択されることを特徴とする、融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、及び、前記核酸分子又は前記ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。加えて、本発明は、医薬、診断手段、化粧料材料、殺菌剤、又は、食品添加物として使用するための、前記融合タンパク質に関する。本発明はまた、グラム陰性及び／又はグラム陽性細菌による食品の汚染、食品加工装置の汚染、食品加工工場の汚染、食品と接触する表面の汚染、医療機器の汚染、病院や手術室における表面の汚染の処置（又は処理）又は予防に関する。
【０００２】
グラム陰性細菌は外膜を持っており、顕著な特徴としてそれは特有の非対称二重層を有している。該外膜は、リン脂質（主としてホスファチジルエタノールアミン）を含む内側の単層と、主として単一の糖脂質、リポポリ多糖類（ＬＰＳ）からなる外側の単層とから構成されている。細菌界においては、ＬＰＳの構造に膨大な多様性があり、該ＬＰＳの構造は、広まっている環境条件に応じて修正され得る。ＬＰＳ層の安定性及び異なるＬＰＳ分子間の相互作用は、二価イオン（Ｍｇ2+、Ｃａ2+）とＬＰＳ分子のアニオン性成分（リピドＡのリン酸基並びにＫＤＯの内部コア及びカルボキシル基）との静電相互作用によって、主として達成される。さらに、不飽和脂肪酸の欠如によって支持されたリピドＡの疎水性部分の高密度で規則正しいパッキングは、高粘度の強固な構造を形成する。これは、脂溶性分子の透過性をより低くし、外膜（ＯＭ）に追加の安定性を与える。
【０００３】
グラム陰性細菌とは対照的に、グラム陽性細菌は外膜を持っていない。細胞膜は、細胞壁を形成する２５ｎｍまでの厚いペプチドグリカン層で囲われている（グラム陰性細菌では５ｎｍしかない）。グラム陽性細菌の細胞壁の主要な目的は、細菌の形状を維持すること、及び、細菌細胞の内部圧に対抗することである。ペプチドグリカン又はムレインは、糖及びアミノ酸から成るポリマーである。その糖成分は、β−（１，４）結合のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸の交互の残基から成っている。３〜５アミノ酸のペプチド鎖が、Ｎ−アセチルムラミン酸に取り付けられている。該ペプチド鎖は、他のストランドのペプチド鎖と架橋されて、３Ｄ網目様層を形成し得る。該ペプチド鎖はＤ−及びＬ−アミノ酸残基を含んでもよく、その組成は細菌によって異なってもよい。
【０００４】
殺菌又は静菌活性を有する種々の薬剤、例えば、抗生物質、エンドリシン、抗微生物ペプチド及びデフェンシンが知られている。しかしながら、抗生物質に対する微生物の耐性が増加することによって、細菌によって引き起こされる増々多くの感染症を治療することが困難となっている。とりわけ、緑膿菌及び腸内細菌科のようなグラム陰性細菌によって引き起こされる感染症、並びに、黄色ブドウ球菌、腸球菌、連鎖球菌、リステリア菌及びクロストリジウム・ディフィシルのようなグラム陽性細菌によって引き起こされる感染症、特に、例えばメシチリン耐性黄色ブドウ球菌及びバンコマイシン耐性腸球菌で困難が生じている。
【０００５】
エンドリシンは、バクテリオファージ（又は細菌ウイルス）によってコードされるペプチドグリカン加水分解酵素である。それらは、ファージ増殖の溶菌サイクルにおける後期遺伝子発現中に合成され、細菌のペプチドグリカンの分解を通じて、子孫ウイルス粒子の放出を媒介する。それらは、β（１，４）−グリコシラーゼ、トランスグリコシダーゼ、アミダーゼ、又はエンドペプチダーゼのいずれかである。エンドリシンの抗微生物性用途は、既に１９９１年にＧａｓｓｏｎによって示唆された（ＧＢ２２４３６１１）。エンドリシンの殺傷能力は長い間知られていたが、これらの酵素を抗菌剤として利用することは、抗生物質が成功し優勢だったため無視されていた。多剤耐性細菌が出現して初めて、ヒトの病原体にエンドリシンで対抗するというこの概念が関心を受けた。まったく新しいクラスの抗菌剤を開発するという切迫した要求が出現し、「酵素」と「抗生物質」の混成語である「エンザイバイオティクス（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃｓ）」として用いられたエンドリシンは、この要求を満たすように見える。２００１年にＦｉｓｃｈｅｔｔｉと共働者は、Ａ群連鎖球菌に対するバクテリオファージＣ１エンドリシンの治療可能性を初めて明らかにした（Ｎｅｌｓｏｎ他、２００１）。それ以来、多くの発表によって、エンドリシンが、細菌感染症、特にグラム陽性細菌による感染症を制御する魅力的で補完的な代替物として確立された。続いて、肺炎連鎖球菌（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ他、２００１）、炭疽菌（Ｓｃｈｕｃｈ他、２００２）、Ｓ．アガラクチア（ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｃｈｅｎｇ他、２００５）、及び黄色ブドウ球菌（Ｒａｓｈｅｌ他、２００７）などの他のグラム陽性病原体に対して、異なるエンドリシンが、そのエンザイバイオティクスとしての効果を証明した。最近では、外膜がエンドリシンの接近からペプチドグリカンを保護するので、エンドリシン治療における最も重要な課題は、外因性に働くエンドリシンに対するグラム陰性細菌の無反応性にある。現在このことが、重要なグラム陰性病原体に対する有効なエンドリシンの範囲の拡大を妨げている。しかしながら、いくつかのある条件（例えば高イオン強度）下では、エンドリシンは安定なプロトプラストを作り出すことができ、細菌細胞の内部圧によっては細胞破裂が引き起こされないことも知られている。これらの条件下では、細菌細胞壁が再建され得て、細菌は生き延びるだろう。これまでは、エンドリシンはこのように代替抗生物質に適さなかった。
【０００６】
抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）とは、実質的にすべての生物で見出され得る、短く、カチオン性又は両親媒性で、遺伝子にコードされた幅広いペプチド性抗微生物薬のことを意味している。異なるＡＭＰは異なる特性を示し、このクラスの多くのペプチドは、抗微生物薬としてだけでなく、細胞浸透ペプチドの鋳型としても、集中的に研究されている。数種類の共通の特徴（例えば、カチオン性、両親媒性及び短いサイズ）を共有しているにもかかわらず、ＡＭＰの配列は大きく変動し、少なくとも４つの構造群（αヘリックス、βシート、伸展したもの（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）、及びループ）が、観察されるＡＭＰの立体構造の多様性を説明するものとして提唱されている。同様に、抗微生物薬としてのいくつかの作用様式が提唱されており、例えば、これらのペプチドの多くについては、主要な標的は細胞膜であるが、他のペプチドについては、主要な標的が細胞質への侵入及び中核代謝機能の破壊であることが示された。ＡＭＰは、特異的な標的への結合がないにもかかわらず、例えば、大抵のＡＭＰの場合には膜の中で孔を形成することによって、共同作業を示すのに十分濃縮され得る。しかしながら、この現象は模範的なリン脂質二重層中でのみ観察され、場合によっては、６分子のリン脂質あたり１分子のペプチドほど高い膜中でのＡＭＰの濃度が、これらの事象が起こるのに必要とされた。これらの濃度は、完全な膜の飽和状態ではなくても、それに近いものである。ＡＭＰの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、典型的には低いマイクロモル範囲にあるので、これらの閾値とｉｎ ｖｉｖｏでの重要性との関連について、懐疑的な見方が生じている（Ｍｅｌｏ他、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９、２４５）。
【０００７】
デフェンシンは、小さく、カチオン性又は両親媒性で、システイン及びアルギニンに富んだ抗微生物ペプチドの大きなファミリーであり、脊椎動物及び無脊椎動物の両方に見出される。デフェンシンは、システインの間隔パターンに従って、植物、無脊椎動物、α−、β−、及びθ−デフェンシンという５つの群に分類される。後半の３つは、主として哺乳類に見られる。α−デフェンシンは、好中球及び腸管上皮に見られるタンパク質である。β−デフェンシンは、最も広く分布しており、白血球や多種の上皮細胞により分泌される。θ−デフェンシンは、例えばアカゲザルの白血球において見られたが、これまでまれにしか見られていない。デフェンシンは、細菌、真菌、並びに、多くのエンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに対して活性を有する。しかしながら、細菌の効率的な殺傷に必要とされる濃度は大抵高く、すなわちμモル範囲になる。多くのペプチドの活性は、生理学的塩状態、二価のカチオン及び血清の存在によって制限され得る。疎水性アミノ酸残基の含量に依存して、デフェンシンはまた溶血活性も示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、新しい抗微生物薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、本クレームに定義された要旨によって解決される。
以下の図は、本発明を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と比較した種々の濃度におけるＰＫという名のポリカチオン性ペプチド（配列番号２３）及び抗微生物ペプチド（ＡＭＰ＝ＳＭＡＰ−２９、配列番号４５）の抗菌活性を表す棒グラフを示す。抗菌活性は、ｙ軸上で対数単位の相対的不活性化度として示される。
【図２】図２は、バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と比較した種々の濃度におけるＰＫ２という名のポリカチオン性ペプチド（配列番号３４）及び抗微生物ペプチド（ＡＭＰ＝ＳＭＡＰ−２９、配列番号４５）の抗菌活性を表す棒グラフを示す。抗菌活性は、ｙ軸上で対数単位の相対的不活性化度として示される。
【図３】図３は、バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と比較した３μＭ／Ｌの濃度におけるＰＫという名のポリカチオン性ペプチド（配列番号２３）及びＰＫ２という名のポリカチオン性ペプチド（配列番号３４）の抗菌活性を表す棒グラフを示す。抗菌活性は、ｙ軸上で対数単位の相対的不活性化度として示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で用いられている用語「タンパク質」は、特定の配列でペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の直線状ポリマーのことをいう。該アミノ酸残基は、例えば、糖やリン酸などの種々の基の共有結合によって改変されてもよい。ヘム又は脂質のような他の物質がより緩やかにタンパク質と会合してもよく、そうすると本明細書で用いられる用語「タンパク質」にまた包含される複合タンパク質を生じる。タンパク質が折り畳む種々の様式が、とりわけαヘリックス及びβプリーツシートに関して明らかにされている。本明細書で用いられる用語「タンパク質」は、全α、全β、α／β、及びαプラスβの４つのすべての種類のタンパク質のことをいう。さらに、用語「タンパク質」は複合体のことをいい、該複合体はホモマーのことをいう。
【００１２】
本明細書で用いられている用語「融合タンパク質」は、３つの核酸配列の融合によって生じる発現産物のことをいう。そのようなタンパク質は、例えば組換えＤＮＡ発現システムにおいて、生産されてもよい。さらに、本明細書において用いられる用語「融合タンパク質」は、例えばエンドリシンである第一のアミノ酸配列と、第二及び第三のアミノ酸配列との融合物のことをいう。該第二及び第三のアミノ酸配列は、好ましくはペプチドストレッチであり、特に、カチオン性、ポリカチオン性、疎水性、両親媒性、スシ及び抗微生物ペプチドからなる群から選択される。好ましくは、該第二及び第三のアミノ酸配列は、第一のアミノ酸配列のどのドメインに対しても異質であり、実質的に相同でない。さらに、本発明の融合タンパク質はまた、少なくとも３つの核酸配列の融合物から生じる発現産物のこともいう。該融合タンパク質はまた、例えばエンドリシンである第一のアミノ酸配列と、ペプチドストレッチをコードする２つ以上のアミノ酸配列との融合物のこともいう。融合タンパク質のペプチドストレッチをコードするアミノ酸配列は、それぞれ異なっていても同じであってもよい。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「ペプチドストレッチ」は、エンドリシンのようなタンパク質に連結される任意の種類のペプチドのことをいう。特に、本明細書で用いられる用語「ペプチドストレッチ」は、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、及び／又は、抗微生物ペプチドのことをいう。しかしながら、本発明の意味におけるペプチドストレッチは、Ｈｉｓ−タグ、好ましくはＨｉｓ5−タグ、Ｈｉｓ6−タグ、Ｈｉｓ7−タグ、Ｈｉｓ8−タグ、Ｈｉｓ9−タグ、Ｈｉｓ10−タグ、Ｈｉｓ11−タグ、Ｈｉｓ12−タグ、Ｈｉｓ16−タグ及びＨｉｓ20−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ａｖｉ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｇｓｔ−タグ、ＪＳ−タグ、システイン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、若しくは、当技術分野において公知の他のタグ、チオレドキシン、又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のようなタグのことをいわない。本明細書で用いられる用語「ペプチドストレッチ」と対照的に、用語「タグ」は、ポリペプチドの発現及び／又はアフィニティー精製の手助け、ポリペプチドの表面への固定、又は、例えば、タグを上に列挙される用途のうちの１つに有用なものとする機能がペプチドの正電荷によって引き起こされるものではない限りは、種々のＥＬＩＳＡアッセイ形式における抗体結合によって検出されるようなポリペプチドのマーカー若しくは標識部分としての役割において有用であり得るようなペプチドを指す。しかしながら、Ｈｉｓ6−タグは、個別のｐＨに依存して正に荷電されることもあるが、固定化された二価カチオンに結合することから、アフィニティー精製の手段として利用され、本発明によるペプチドストレッチとしては使用されない。
【００１４】
本明細書で用いられる用語「第一のペプチドストレッチ」は、酵素のＮ−又はＣ−末端において該酵素と連結されているペプチドストレッチのことをいう。
本明細書で用いられる用語「第二のペプチドストレッチ」は、第一のペプチドストレッチのＮ−又はＣ−末端において該第一のペプチドストレッチと連結されているペプチドストレッチのことをいう。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、約２〜約１００個のアミノ酸残基、より好ましくは約４〜約５０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは約５〜約３０個のアミノ酸残基からなる短いポリペプチドのことをいい、一方のアミノ酸残基のアミノ基は他方のアミノ酸残基のカルボキシル基とペプチド結合で連結される。ペプチドは特定の機能を有していてもよい。ペプチドは、天然に存在するペプチド、又は、合成的に設計され生産されるペプチドであり得る。該ペプチドは、例えば、酵素的又は化学的切断によって天然タンパク質から由来又は除去され得るか、従来のペプチド合成技術（例えば、固相合成）又は分子生物学的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照）を用いて調製され得る。好ましい天然に存在するペプチドは、例えば、抗微生物ペプチド、デフェンシン、及びスシペプチドである。好ましい合成的に生産されたペプチドは、例えば、ポリカチオン性、両親媒性、又は疎水性ペプチドである。本発明の意味におけるペプチドは、タンパク質を精製又は位置付けるために用いられるＨｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、チオレドキシン若しくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、又は同様のもののことをいわない。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「エンドリシン」は、ペプチドグリカン分解作用を有し、バクテリオファージ又は細菌性ウイルスに天然にコードされており、細菌の細胞壁を分解するのに適した酵素のことをいう。「エンドリシン」は、少なくとも１つの「酵素的活性ドメイン」（ＥＡＤ）を含み、これは次の活性、すなわちエンドペプチダーゼ、Ｎ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ（アミダーゼ）、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、又はトランスグリコシラーゼのうち少なくとも１つの活性を有する。加えて、エンドリシンはまた、酵素的に不活性で宿主細菌の細胞壁に結合する領域を含んでもよく、該領域はＣＢＤ（細胞壁結合ドメイン）である。該エンドリシンは、２つ又はそれ以上のＣＢＤを含んでもよい。一般に、細胞壁結合ドメインは、細菌表面の様々な構成要素に結合することができる。好ましくは、細胞壁結合ドメインは、ペプチドグリカン結合ドメインであり、細菌のペプチドグリカン構造に結合する。エンドリシンの異なるドメインは、ドメインリンカーによって連結され得る。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「ドメインリンカー」は、単独のタンパク質ドメインを互いに連結するように機能するアミノ酸配列を指す。通例、ドメインリンカーは、αヘリックス又はβシートのような規則的な二次構造を形成しないか、わずかしか形成せず、それぞれの構造コンテクストとは異なる立体配座を占める。ドメインリンカーを検出する方法およびリンカー配列の特性は、例えば、Ｂａｅ他、２００５年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１、２２６４−２２７０、又は、Ｇｅｏｒｇｅ及びＨｅｒｉｎｇａ、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１５、８７１−８７９に記載されているように、当技術分野において周知である。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「欠失」は、１、２、３、４、５個又はそれ以上のアミノ酸残基を、それぞれの当初の配列から除去することをいう。
本明細書で用いられる用語「挿入」又は「付加」は、１、２、３、４、５個又はそれ以上のアミノ酸残基を、それぞれの当初の配列に挿入又は付加することを
本明細書で用いられる用語「置換」は、ある部位に配置されたアミノ酸残基を他のものと交換することをいう。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「細胞壁」は、グラム陽性及びグラム陰性細菌の細胞の外の囲いを形成しそれらの完全性を保証するすべての構成要素のことをいう。特に、本明細書で用いられる用語「細胞壁」は、ペプチドグリカン、リポポリ多糖を有するグラム陰性細菌の外膜、細菌細胞膜のことをいうが、例えば、莢膜、外側のタンパク質層、又は粘液のような、ペプチドグリカンの上にある追加的な層のこともいう。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ＥＡＤ」は、エンドリシンの酵素的活性ドメインのことをいう。該ＥＡＤは、細菌のペプチドグリカンの加水分解に関与している。これは、エンドリシンの少なくとも１つの酵素活性を呈する。該ＥＡＤはまた、１つより多い酵素学的活性モジュールを含み得る。用語「ＥＡＤ」は、「触媒ドメイン」と同義で本明細書において用いられる。
【００２１】
本明細書で用いられるように、用語「カチオン性ペプチド」は、正電荷を持つアミノ酸残基を有する合成ペプチドのことをいう。好ましくは、カチオン性ペプチドのｐＫａ値は、９．０又はそれ以上である。典型的には、該カチオン性ペプチドの少なくとも４つのアミノ酸残基が正電荷を持ち得て、例えばリシン又はアルギニンである。「正電荷を持つ」は、ほぼ生理的条件において正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖のことをいう。本明細書で用いられる用語「カチオン性ペプチド」はまた、ポリカチオン性ペプチドのこともいう。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「ポリカチオン性ペプチド」は、大部分は正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基から成る合成的に生産されたペプチドのことをいう。ペプチドは主に正電荷を持つアミノ酸残基から成っており、その少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は約１００％のアミノ酸残基が、正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基である。正電荷を持つアミノ酸残基でないアミノ酸残基は、中性電荷を持つアミノ酸残基及び／又は負電荷を持つアミノ酸残基及び／又は疎水性アミノ酸残基であり得る。好ましくは、正電荷を持つアミノ酸残基でないアミノ酸残基は、中性電荷を持つアミノ酸残基、特にセリン及び／又はグリシンである。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母、マイコプラズマ、及び原虫に対して殺菌及び／又は静菌作用を有する任意の天然に存在するペプチドのことをいう。このように、本明細書で用いられる用語「抗微生物ペプチド」は特に、抗菌性の、抗真菌性の（ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ）、抗真菌性の（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃ）、抗寄生虫性の、抗原虫性の、抗ウイルス性の、抗伝染性の（ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ）、抗感染性の（ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ）、及び／又は、殺菌性の（ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ）、殺藻性の、抗アメーバ性の、殺菌性の（ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄａｌ）、殺菌性の（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ）、殺真菌性の、殺寄生虫性の、殺原虫性の（ｐｒｏｔｏｚｏａｃｉｄａｌ）、殺原虫性の（ｐｒｏｔｏｚｏｉｃｉｄａｌ）特性を有する任意のペプチドのことをいう。該抗微生物ペプチドは、ＲＮＡｓｅ Ａスーパーファミリーの一員、デフェンシン、カテリシジン、グラニュライシン、ヒスタチン、プソリアシン（ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、ダームシジン（ｄｅｒｍｉｃｉｄｉｎｅ）、又はヘプシジンであってもよい。該抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物、又は哺乳動物中で天然に存在してもよい。好ましくは、該抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物、又は哺乳動物中で天然に存在してもよい。好ましくは、該抗微生物ペプチドは、ダイコン、カイコガ、コモリグモ、カエル、好ましくはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、ラナ属（Ｒａｎａ）のカエル、より好ましくはウシガエル（Ｒａｎａ ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエルＢｕｆｏ ｂｕｆｏ ｇａｒｇａｒｉｚａｎｓ、ハエ、好ましくはショウジョウバエ属、より好ましくはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ミツバチ、マルハナバチ、好ましくはボンバス・パスクオルム（Ｂｏｍｂｕｓ ｐａｓｃｕｏｒｕｍ）、ニクバエ、好ましくはセンチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）、サソリ、カブトガニ、ナマズ、好ましくはマナマズ（Ｐａｒａｓｉｌｕｒｕｓ ａｓｏｔｕｓ）、雌牛、ブタ（ｐｉｇ）、羊、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ウシ亜科の動物（ｂｏｖｉｎｅ）、サル、及びヒトの中で天然に存在してもよい。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「スシペプチド」は、短いコンセンサスリピートを有している補体制御タンパク質（ＣＣＰ）のことをいう。スシペプチドのスシモジュールは、数多くの異なるタンパク質において、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインとして機能する。スシドメインを含むペプチドは、抗微生物活性を有していることが示されている。好ましくは、スシペプチドは、天然に存在するペプチドである。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「両親媒性ペプチド」は、親水性及び疎水性官能基の両方を有する合成ペプチドのことをいう。好ましくは、本明細書で用いられる用語「両親媒性ペプチド」は、親水性及び疎水性基の規定の配列を有するペプチドのことをいい、例えば、両親媒性ペプチドは、例えばアルファヘリックスであって、該ヘリックスのある側面に沿って主に非極性側鎖を有し、その表面の残部に沿って極性側鎖を有してもよい。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「疎水性基」は、実質的に水に溶けないが油層に溶けて、油層中での溶解度が水中又は水層中よりも高いアミノ酸側鎖などの化学基のことをいう。水中では、疎水性側鎖を持つアミノ酸残基は互いに相互作用して、非水環境を作り出す。疎水性側鎖を持つアミノ酸残基の例としては、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及びグリシン残基がある。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「オートリシン」は、エンドリシンに関係しているが、細菌にコードされており、例えば細胞分裂に関与している酵素のことをいう。オートリシンの概説は、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ （ｍｕｒｅｉｎ） ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｗ、Ｊｏｒｉｓ Ｂ、Ｃｈａｒｌｉｅｒ Ｐ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｓ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２００８年３月、３２（２）：２５９−８６」に見られる。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「バクテリオシン」は、他の細菌の増殖を阻害することができるタンパク質様、ポリペプチド様、又はペプチド様物質のことをいう。ある種のバクテリオシンは、リソスタフィン（スタフィロコッカス属の細胞壁を分解する）、ムタノリシン（Ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）（ストレプトコッカス属の細胞壁を分解する）、及び、エンテロリシン（Ｅｎｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）（エンテロコッカス属の細胞壁を分解する）のように細菌の細胞壁を分解することができる。好ましくは、該阻害は、バクテリオリシンの特異的な受容体に該他の細菌が吸収することによる特異的なものである。一般には、バクテリオシンは、微生物によって生成される。しかしながら、本明細書で用いられる用語「バクテリオシン」は、微生物によって生成されて単離された種類又は合成的に生成された種類の両方のことをいい、また、実質的に元のバクテリオリシンの活性を保持しているが、その配列は１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入又は欠失によって改変された変異体のこともいう。
【００２９】
本発明は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に対する新規抗菌剤、特にグラム陽性及び／又はグラム陰性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素と２つ又はそれ以上のペプチドストレッチで構成される融合タンパク質に関する。これらのペプチドストレッチは、同一のものであっても異なったものであってもよい。これらのペプチドストレッチは、本発明に係る融合タンパク質の酵素のＮ−又はＣ−末端に連結されている。当業者は、本発明に係る融合タンパク質が２、３、４、５個又はそれ以上のペプチドストレッチを含むことを理解できる。
好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素と該酵素とＮ−又はＣ−末端で融合した２種のペプチドストレッチで構成される。好ましくは、該ペプチドストレッチは互いに異なるものであるか、同一のものである。
本発明者らは、効果のあった種のことを考慮すると、本発明に係る融合タンパク質は異なる薬効範囲を示すことを見出した。
【００３０】
本発明のある側面では、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素は、エンドリシン、オートリシン、又は、バクテリオシンである。本発明に係る融合タンパク質の酵素は、リゾチームではない。好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質の酵素は、バクテリオファージ又は細菌性ウイルスにコードされており、特にエンドリシンである。
【００３１】
配列番号７０〜７７及び１２７〜１４７で示される本発明に係る好ましい融合タンパク質は、Ｎ−末端に１又はそれ以上の追加のアミノ酸残基を含んでもよい。好ましくは、該追加のアミノ酸残基はメチオニンである。
【００３２】
好ましくは、エンドリシンは、グラム陰性細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、とりわけ大腸菌、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エドワードジエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、とりわけ肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ））、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）（シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、とりわけ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘミア属（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバシラス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、スピロヘータ科（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）（トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）及びボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ））、レプトスピラ科（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、スピリルム属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ストレプトバシラス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）（バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ポリフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ））、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、とりわけＡ．バウマンニ（ｂａｕｍａｎｉｉ）のような、ヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陰性細菌に特異的なバクテリオファージにコードされる。
【００３３】
好ましくは、オートリシンは、先に挙げたようなヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陰性細菌などのグラム陰性細菌にコードされる。
バクテリオシンは、好ましくは、先に挙げたようなグラム陰性細菌に特異的であるが、特異性が低くてもよい。
【００３４】
本発明に係る酵素は、先に挙げたようなヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陰性細菌に対して、細胞壁分解活性を有する。
他の好ましい態様では、エンドリシンは、以下の表に挙げられるようなヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陽性細菌などのグラム陽性細菌に特異的なバクテリオファージにコードされる。
【００３５】
（表１）
2014507933.tif 000003
2014507933.tif 000004
【００３６】
他の好ましい態様では、オートリシン又はバクテリオシンは、表１に挙げられるようなヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陽性細菌などのグラム陽性細菌にコードされる。
好ましい態様では、本発明に係る酵素は、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）のようなヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陽性細菌に対して、細胞壁分解活性を有する。
【００３７】
エンドリシン部分の例を以下の表に示す。
（表２）
2014507933.tif 000005
2014507933.tif 000006
2014507933.tif 000007
【００３８】
また、緑膿菌ファージΦＫＺ及びＥＬのエンドリシン、シュードモナス・プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ファージのエンドリシン、大腸菌ファージＮ４のエンドリシン、ファージＬＵＺ２４のエンドリシン、ｇｐ６１ムラミダーゼ、ＳＴＭ００１６エンドリシン、ＰＳＰ３エンドリシン、及びサルモネラ・エンテリティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）ファージＰＶＰＳＥ１のエンドリシンに由来するエンドリシン部分も好ましい。
【００３９】
さらに好ましいエンドリシンは、リステリア属ファージエンドリシンＰｌｙＡ１１８、ＰｌｙＡ５００、ＰｌｙＰＳＡ、ＰｌｙＡ５１１、ＰｌｙＰ３５、ＰｌｙＰ４０、スタフィロコッカス属ファージＰｈｉ１１エンドリシン、ＰｈｉＭＲ１１エンドリシン、ＬｙｓＫ、ウェルシュ菌ＰｌｙＳ６、Ｐｌｙ３６２６、クロストリジウム・ディフィシル：ＣＤ２７Ｌエンドリシン、ストレプトコッカス属：Ｂ３０エンドリシン、ファージＤｐ−１ Ｐａｌアミダーゼ、Ｃ１エンドリシン、Ｃｐｌ−１エンドリシン、ＰｌｙＧＢＳ、エンテロコッカス属：ＰｌｙＶ１２、炭疽菌：ファージガンマエンドリシンＰｌｙＧである。
【００４０】
好ましいオートリシンは、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ（ｍｕｒｅｉｎ）ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｗ、Ｊｏｒｉｓ Ｂ、Ｃｈａｒｌｉｅｒ Ｐ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｓ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２００８年３月、３２（２）：２５９−８６．Ｅｐｕｂ ２００８年２月１１日、総説」に記載されている。好ましいオートリシンの例は、ＡｔｌＡオートリシンである。
好ましいバクテリオシンは、リソスタフィン（スタフィロコッカス属の細胞壁を分解する）、ムタノリシン（ストレプトコッカス属の細胞壁を分解する）、及び、エンテロリシン（エンテロコッカス属の細胞壁を分解する）である。
【００４１】
エンドリシン部分のさらなる例は、配列番号１で示されるＣｐｌ−１、配列番号２で示されるＰｌｙ５１１、配列番号３で示されるＬｙｓＫ、配列番号４で示されるリソスタフィン、配列番号５で示されるＰＡ６−ｇｐ２０、配列番号６で示されるｐｈｉＫＺｇｐ１４４、配列番号７で示されるＥＬｇｐ１８８、配列番号８で示されるサルモネラ属エンドリシン、配列番号９で示される腸内細菌ファージＴ４エンドリシン、配列番号１０で示されるアシネトバクター・バウマンニ・エンドリシン、配列番号１１で示される大腸菌ファージＫ１Ｆエンドリシン、配列番号１２で示されるＯＢＰｇｐＬＹＳ、配列番号１３で示されるＰＳＰ３サルモネラ属エンドリシン（ＰＳＰ３ｇｐ１０）、配列番号１４で示される大腸菌ファージＰ２エンドリシン（Ｐ２ｇｐ０９）、配列番号１５で示されるネズミチフス菌ファージムラミダーゼＳＴＭ００１６、配列番号１６で示される大腸菌ファージＮ４ムラミダーゼＮ４−ｇｐ６１、及び、配列番号１７で示されるＮ４−ｇｐ６１ ｔｒｕｎｃ．、配列番号１８で示されるＫＺ１４４から成る群から選択される。
【００４２】
本発明の他の好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質であるエンドリシン、オートリシン、及びバクテリオシンは、アミノ酸配列の改変及び／又は変更を含む。そのような変更及び／又は改変は、欠失、挿入及び付加、置換、若しくは、それらの組み合わせなどの変異、及び／又は、アミノ酸残基の化学的変化、例えば、ビオチン化、アセチル化、ペグ化、アミノ基、ＳＨ基、若しくはカルボキシル基の化学的変化を含んでもよい。本発明に係る融合タンパク質である該エンドリシン、オートリシン、及びバクテリオシンは、それぞれの野生型エンドリシン、オートリシン、及びバクテリオシンの溶解活性を示す。しかしながら、該活性は、それぞれの野生型エンドリシン、オートリシン、及びバクテリオシンの活性と同じか、より高いか、又は、より低くなり得る。該活性は、それぞれの野生型エンドリシン、オートリシン、及びバクテリオシンの活性の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは約２００％、又はさらにそれ以上にもなり得る。活性は、例を挙げると、例えば、Ｂｒｉｅｒｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ、７０：５３１−５３３、（２００７）、若しくは、Ｄｏｎｏｖａｎ ＤＭ、Ｌａｒｄｅｏ Ｍ、Ｆｏｓｔｅｒ−Ｆｒｅｙ Ｊ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．、２００６年１２月、２６５（１）、又は、同様の刊行物に記載されているプレート溶解アッセイ又は液体溶解アッセイのような、当技術分野で当業者に周知の試験によって測定され得る。
【００４３】
本発明に係る融合タンパク質のペプチドストレッチは、例えばクローニングの理由のために、追加のアミノ酸残基によって酵素に連結されてもよい。本発明に係る融合タンパク質のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基によって互いに連結されてもよい。好ましくは、該追加のアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識及び／又は切断されないかもしれない。好ましくは、該ペプチドストレッチは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の追加のアミノ酸残基によって、互いに及び／又は酵素と連結されてもよい。好ましい態様では、第２のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基であるグリシン、セリン、及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、グリシン、アラニン、グリシン、及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、又は、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）によって、酵素のＮ−又はＣ−末端に融合した第１のペプチドストレッチに連結される。さらに、本発明に係る融合タンパク質の第１のペプチドストレッチのＮ−末端に融合した第２のペプチドストレッチは、さらにそのＮ−末端に追加のアミノ酸を含む。好ましくは、該ペプチドストレッチは、アミノ酸であるメチオニン（Ｍｅｔ）、又は、メチオニン、グリシン、及びセリン（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む。他の好ましい態様では、第１のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基、特にグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）によって酵素のＮ−末端に連結され、第２のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基、特にグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、又は、グリシン、セリン、及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）によって、第１のペプチドストレッチのＮ−末端に連結される。他の好ましい態様では、第２のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基であるグリシン、セリン、及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、グリシン、アラニン、グリシン、及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、又は、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）によって、第１のペプチドストレッチのＮ−又はＣ−末端に連結される。他の好ましい態様では、第１のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基、特にグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）によって、酵素のＣ−末端に連結され、第２のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基、特にグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）によって、第１のペプチドストレッチのＣ−末端に連結される。
【００４４】
本発明に係る融合タンパク質のペプチドストレッチは、好ましくは酵素に共有結合される。好ましくは、該ペプチドストレッチは、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は少なくとも１００個のアミノ酸残基で構成される。特に、約５〜約１００個のアミノ酸残基、約５〜約５０個又は約５〜約３０個のアミノ酸残基を含むペプチドストレッチが好ましい。約６〜約４２個のアミノ酸残基、約６〜約３９個のアミノ酸残基、約６〜約３８個のアミノ酸残基、約６〜約３１個のアミノ酸残基、約６〜約２５個のアミノ酸残基、約６〜約２４個のアミノ酸残基、約６〜約２２個のアミノ酸残基、約６〜約２１個のアミノ酸残基、約６〜約２０個のアミノ酸残基、約６〜約１９個のアミノ酸残基、約６〜約１６個のアミノ酸残基、約６〜約１４個のアミノ酸残基、約６〜約１２個のアミノ酸残基、約６〜約１０個のアミノ酸残基、又は、約６〜約９個のアミノ酸残基を含むペプチドストレッチがより好ましい。
【００４５】
好ましくは、ペプチドストレッチは、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ａｖｉ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｇｓｔ−タグ、ＪＳ−タグ、システイン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、又は、当技術分野で公知の他のタグなどのタグではなく、チオレドキシンやマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）でもない。しかしながら、本発明に係る融合タンパク質は、そのようなタグ又は複数のタグを追加で含んでもよい。
【００４６】
より好ましくは、ペプチドストレッチは、融合タンパク質を外膜まで導く機能を有しているが、酵素と融合されずに投与された場合には、活性があってもいいし、活性がない又は低い活性しかなくてもよい。融合タンパク質をグラム陰性細菌の外膜まで導く機能は、該ペプチドストレッチの外膜若しくはＬＰＳの破壊作用、透過化作用、又は、不安定化作用という潜在力に起因している。そのようなペプチドストレッチの外膜若しくはＬＰＳの破壊作用、透過化作用、又は、不安定化作用は、次のような方法で決定されてもよい。処置される細菌細胞は、液体培地中又は寒天プレート上で培養される。それぞれ次に、液体培地中の細菌細胞濃度はＯＤ６００ｎｍの光度計で決定され、寒天プレート上のコロニーは計数される。そして、液体培地中又はプレート上の細菌細胞は、本発明に係る融合タンパク質によって処置される。インキュベーション後、再び、培地中の細菌細胞濃度はＯＤ６００ｎｍの光度計で決定され、寒天プレート上のコロニーは計数される。もし、融合タンパク質がそのような外膜若しくはＬＰＳの破壊作用、透過化作用、又は、不安定化作用を示せば、細菌細胞は融合タンパク質の処置によって溶解されて、液体培地中の細菌細胞濃度又は寒天プレート上の細菌コロニー数は減少される。このように、融合タンパク質による処置後の細菌細胞濃度又は細菌コロニー数の減少は、該融合タンパク質の外膜若しくはＬＰＳの破壊作用、透過化作用、又は、不安定化作用の指標となる。
【００４７】
好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質のペプチドストレッチは、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、抗微生物ペプチド、スシペプチド、及び、両親媒性ペプチドから成る群から選択される。本発明に係る融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端における２つ又はそれ以上のペプチドストレッチは、異なったカチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、又は、疎水性ペプチドであってもよい。本発明に係る融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端における２つ又はそれ以上のペプチドストレッチは、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、抗微生物ペプチド、スシペプチド、及び、両親媒性ペプチドの任意の組み合わせであってもよい。
【００４８】
特に、少なくとも１つの配列番号１９で示されるモチーフ（ＫＲＫＫＲＫ）を含むカチオン性及び／又はポリカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。特に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個の配列番号１９で示されるモチーフ（ＫＲＫＫＲＫ）を含むカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。少なくとも１つのＫＲＫモチーフ（ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｙｓ）、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のＫＲＫモチーフを含むカチオン性ペプチドストレッチがより好ましい。
【００４９】
本発明の他の好ましい態様では、カチオン性ペプチドストレッチは、正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基の傍らに、中性電荷を持つアミノ酸残基、特にグリシン及び／又はセリン残基を含む。約７０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、又は、約８５％〜約９０％の正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン、アルギニン、及び／又は、ヒスチジン残基、より好ましくはリシン及び／又はアルギニン残基、並びに、約０％〜約３０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％の中性電荷を持つアミノ酸残基、特にグリシン及び／又はセリン残基で構成されているカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。約４％〜約８％のセリン残基、約３３％〜約３６％のアルギニン残基、及び、約５６％〜約６３％のリシン残基で構成されているポリペプチドストレッチが好ましい。少なくとも１つの配列番号２０で示されるモチーフ（ＫＲＸＫＲ）であって、Ｘがリシン、アルギニン、及びヒスチジン以外の任意のアミノ酸であるモチーフを含むポリペプチドストレッチが特に好ましい。少なくとも１つの配列番号２１（ＫＲＳＫＲ）で示されるモチーフを含むポリペプチドストレッチが特に好ましい。少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は約２０個の配列番号２０で示されるモチーフ（ＫＲＸＫＲ）又は配列番号２１で示されるモチーフ（ＫＲＳＫＲ）を含むカチオン性ストレッチがより好ましい。
【００５０】
また、約９〜約１６％のグリシン残基、約４〜約１１％のセリン残基、約２６〜約３２％のアルギニン残基、及び、約４７〜約５５％のリシン残基で構成されているポリペプチドストレッチも好ましい。少なくとも１つの配列番号２２で示されるモチーフ（ＫＲＧＳＧ）を含むポリペプチドストレッチが特に好ましい。少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は約２０個の配列番号２２で示されるモチーフ（ＫＲＧＳＧ）を含むカチオン性ストレッチがより好ましい。
【００５１】
本発明の他の好ましい態様では、カチオン性ペプチドストレッチは、正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基の傍らに、疎水性アミノ酸残基、特にバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及びグリシン残基、より好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又は、トリプトファン残基を含む。約７０％〜約１００％、約８０％〜約９５％、又は約８５％〜約９０％の正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基、並びに、約０％〜約３０％、約５％〜約２０％、又は約１０％〜約２０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及びグリシン残基、より好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又はトリプトファンで構成されるカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。
【００５２】
カチオン性及びポリカチオン性ペプチドストレッチの例を以下の表に示す。
（表３）
2014507933.tif 000008
【００５３】
本発明のさらなる側面では、融合されたペプチドストレッチのうち少なくとも１つが抗微生物ペプチドであり、それは正味の正電荷及び５０％前後の疎水性アミノ酸を含む。該抗微生物ペプチドは両親媒性であり、約１２〜約５０の長さのアミノ酸残基を有する。該抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物、又は哺乳動物中で天然に存在している。好ましくは、該抗微生物ペプチドは、ダイコン、カイコガ、コモリグモ、カエル、好ましくはアフリカツメガエル、ラナ属のカエル、より好ましくはウシガエル、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエルＢｕｆｏ ｂｕｆｏ ｇａｒｇａｒｉｚａｎｓ、ハエ、好ましくはショウジョウバエ属、より好ましくはキイロショウジョウバエ、ネッタイシマカ、ミツバチ、マルハナバチ、好ましくはボンバス・パスクオルム、ニクバエ、好ましくはセンチニクバエ、サソリ、カブトガニ、ナマズ、好ましくはマナマズ、雌牛、ブタ（ｐｉｇ）、羊、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ウシ亜科の動物、サル、及びヒトの中で天然に存在してもよい。
【００５４】
本発明の他の好ましい態様では、抗微生物ペプチドストレッチは、約０％〜約５％、約０％〜約３５％、約１０％〜約３５％、約１５％〜約４５％、又は、約２０％〜約４５％の正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基、並びに、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約５５％〜約７５％、又は、約７０％〜約９０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び、グリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又は、トリプトファン残基で構成される。
【００５５】
本発明の他の好ましい態様では、抗微生物ペプチドストレッチは、約４％〜約５８％の正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基、並びに、約３３％〜約８９％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び、グリシン残基、より好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又は、トリプトファン残基で構成される。
【００５６】
本発明に係る抗微生物ペプチドの例を以下の表に示す。
（表４）
2014507933.tif 000009
2014507933.tif 000010
【００５７】
本発明のさらなる側面では、融合されたペプチドストレッチのうち少なくとも１つが、Ｄｉｎｇ ＪＬ、Ｌｉ Ｐ、Ｈｏ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００８年４月、６５（７−８）：１２０２−１９、Ｔｈｅ Ｓｕｓｈｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａに記載されているスシペプチドである。配列番号６３で示されるスシ１ペプチドが特に好ましい。
好ましいスシペプチドは、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０００年９月、１４（１２）：１８０１−１３に記載されているスシペプチドＳ１及びＳ３並びにそれらの多重体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）である。
【００５８】
本発明のさらなる側面では、融合されたペプチドストレッチのうち少なくとも１つが疎水性ペプチドであり、それは少なくとも９０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び／又は、グリシンを含む。他の好ましい態様では、本発明の融合タンパク質に融合された疎水性ペプチドは、約９０％〜約９５％、約９０％〜約１００％、又は、約９５％〜約１００％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び／又は、グリシンで構成される。
好ましい疎水性ペプチドは、配列番号６５で示されるアミノ酸配列を有するワルマフ（Ｗａｌｍａｇｈ）１、及び、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号６６）を有する疎水性ペプチドである。
【００５９】
本発明のさらなる側面では、融合されたペプチドストレッチのうち少なくとも１つは両親媒性ペプチドであり、それは、１又はそれ以上の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び／又は、グリシンに結合された１又はそれ以上の正電荷を持つアミノ酸残基、リシン、アルギニン、及び／又は、ヒスチジンを含む。アミノ酸残基の側鎖は、カチオン性及び疎水性表面がペプチドの両側に集まるように方向づけられる。好ましくは、該ペプチド中の約３０、４０、５０、６０、又は７０％以上のアミノ酸が、正電荷を持つアミノ酸である。好ましくは、該ペプチド中の約３０、４０、５０、６０、又は７０％以上のアミノ酸残基が、疎水性アミノ酸残基である。有利には、両親媒性ペプチドは、細胞壁分解活性を有する酵素のＮ−末端又はＣ−末端に融合され、このようにして後者のタンパク質の両親媒性を高める。
【００６０】
本発明の他の態様では、両親媒性ペプチドは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のアミノ酸残基で構成される。好ましい態様では、両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約３０、４０、５０、６０、若しくは７０％は、アルギニンかリシン残基のどちらかであり、並びに／又は、両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約３０、４０、５０、６０、若しくは７０％は、疎水性アミノ酸、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び／若しくは、グリシンである。
【００６１】
本発明の他の好ましい態様では、両親媒性ペプチドストレッチは、正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基の傍らに、疎水性アミノ酸残基、特にバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び、グリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又は、トリプトファン残基を含む。約１０％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約４５％、又は、約５％〜約３０％の正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基、並びに、約５０％〜約８５％、約５０％〜約９０％、約５５％〜約９０％、約６０％〜約９０％、又は、約６５％〜約９０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び、グリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又は、トリプトファン残基で構成される両親媒性ペプチドストレッチが好ましい。他の好ましい態様では、両親媒性ペプチドストレッチは、１２％〜約５０％の正電荷を持つアミノ酸残基、特にリシン及び／又はアルギニン残基、並びに、約５０％〜約８５％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、及び、グリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及び／又は、トリプトファン残基で構成される。
好ましい両親媒性ペプチドは、配列番号６８で示されるＴ４リゾチームのα４−ヘリックス、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を有するＷＬＢＵ２−変異体、及び、配列番号６９で示されるワルマフ２である。
【００６２】
本発明の他の好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質のペプチドストレッチは、アミノ酸配列の改変及び／又は変更を含む。そのような変更及び／又は改変は、欠失、挿入及び付加、置換、若しくは、それらの組み合わせなどの変異、及び／又は、アミノ酸残基の化学的変化、例えばビオチン化、アセチル化、ペグ化、アミノ基、ＳＨ基、若しくはカルボキシル基の化学的変化を含んでもよい。
【００６３】
好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端における２つのペプチドストレッチは、両親媒性ペプチドと結合されたポリカチオン性ペプチドで構成される。該両親媒性ペプチドは、配列番号６８で示されるＴ４−リゾチームのα４−ヘリックス、配列番号６４で示されるＷＬＢＵ２−変異体、又は、配列番号６９で示されるワルマフ２であってもよい。好ましい態様では、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチド又は配列番号３４で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該両親媒性ペプチドは、配列番号６８で示されるＴ４−リゾチームのα４−ヘリックスであってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該両親媒性ペプチドは、配列番号６９で示されるワルマフ２であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該両親媒性ペプチドは、配列番号６４で示されるＷＬＢＵ２−変異体であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。本発明に係る融合タンパク質の両親媒性及びポリカチオン性ペプチドは、Ｎ−又はＣ−末端に連続して配置される。Ｎ−又はＣ−末端における両親媒性及びポリカチオン性ペプチドの順序は問題ではなく、例えば、融合タンパク質のＮ−末端から始まって、両親媒性ペプチドにポリカチオン性ペプチドが続いて酵素が続くか、又は、ポリカチオン性ペプチドに両親媒性ペプチドが続いて酵素が続く。あるいは、酵素にポリカチオン性ペプチドが続いて両親媒性ペプチドが続くか、又は、酵素に両親媒性ペプチドが続いてポリカチオン性ペプチドが続き、以て両ペプチドは酵素のＣ−末端に配置される。
【００６４】
他の好ましい態様では、両親媒性ペプチドである配列番号６８で示されるＴ４−リゾチームのα４−ヘリックスは、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。他の好ましい態様では、両親媒性ペプチドである配列番号６９で示されるワルマフ２は、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。他の好ましい態様では、両親媒性ペプチドである配列番号６４で示されるＷＬＢＵ２−変異体は、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。
【００６５】
好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端における２つのペプチドストレッチは、疎水性ペプチドと結合されたポリカチオン性ペプチドで構成される。好ましい態様では、該疎水性ペプチドは、配列番号６６で示されるペンタペプチド又は配列番号６５で示されるワルマフ１であってもよい。好ましい態様では、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチド又は配列番号３４で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該疎水性ペプチドは、配列番号６６で示されるペンタペプチドであってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該疎水性ペプチドは、配列番号６５で示されるワルマフ１であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。本発明に係る融合タンパク質の疎水性及びポリカチオン性ペプチドは、Ｎ−又はＣ−末端に連続して配置される。Ｎ−又はＣ−末端における疎水性及びポリカチオン性ペプチドの順序は問題ではなく、例えば、融合タンパク質のＮ−末端から始まって、疎水性ペプチドにポリカチオン性ペプチドが続いて酵素が続くか、又は、ポリカチオン性ペプチドに疎水性ペプチドが続いて酵素が続く。あるいは、酵素にポリカチオン性ペプチドが続いて疎水性ペプチドが続くか、又は、酵素に疎水性ペプチドが続いてポリカチオン性ペプチドが続き、以て両ペプチドは酵素のＣ−末端に配置される。
【００６６】
他の好ましい態様では、疎水性ペプチドである配列番号６６で示されるペンタペプチドは、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。他の好ましい態様では、疎水性ペプチドである配列番号６５で示されるワルマフ１は、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。
【００６７】
他の好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端における２つのペプチドストレッチは、抗微生物ペプチドと結合されたポリカチオン性ペプチドで構成される。好ましくは、該抗微生物ペプチドは、配列番号６２で示されるパラシン１、配列番号６１で示されるリコトキシン１、配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９、配列番号４４で示されるＬＬ３７、配列番号６０で示されるメリチン、配列番号５４で示されるザルコトキシンＩＡ、配列番号５８で示されるシュージン１、配列番号４６で示されるインドリシジン、配列番号５３で示されるブフォリンＩＩ、配列番号４９で示されるマガイニン、又は、配列番号５１で示されるセクロピンＡ（ネッタイシマカ）であってもよい。好ましい態様では、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチド又は配列番号３４で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、配列番号６２で示されるパラシン１であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、配列番号６１で示されるリコトキシン１であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号２３で示されるペプチドであってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、配列番号５１で示されるセクロピンＡ（ネッタイシマカ）であってもよく、該ポリカチオン性ペプチドは、配列番号３４で示されるペプチドであってもよい。本発明に係る融合タンパク質の抗微生物及びポリカチオン性ペプチドは、Ｎ−又はＣ−末端に連続して配置される。Ｎ−又はＣ−末端における抗微生物及びポリカチオン性ペプチドの順序は問題ではなく、例えば、融合タンパク質のＮ−末端から始まって、抗微生物ペプチドにポリカチオン性ペプチドが続いて酵素が続くか、又は、ポリカチオン性ペプチドに抗微生物ペプチドが続いて酵素が続く。あるいは、酵素にポリカチオン性ペプチドが続いて抗微生物ペプチドが続くか、又は、酵素に抗微生物ペプチドが続いてポリカチオン性ペプチド続き、以て両ペプチドは酵素のＣ−末端に配置される。
【００６８】
他の好ましい態様では、抗微生物ペプチドである配列番号６２で示されるパラシン１は、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。他の好ましい態様では、抗微生物ペプチドである配列番号６１で示されるリコトキシン１は、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。他の好ましい態様では、抗微生物ペプチドである配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９は、配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。他の好ましい態様では、抗微生物ペプチドである配列番号５１で示されるセクロピンＡ（ネッタイシマカ）は、配列番号３４で示されるポリカチオン性ペプチドと結合されてもよい。
【００６９】
他の好ましい態様では、本発明に係る融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端における２つのペプチドストレッチは、２つの異なる抗微生物ペプチドで構成される。好ましくは、該抗微生物ペプチドは、配列番号６２で示されるパラシン１、配列番号６１で示されるリコトキシン１、配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９、配列番号４４で示されるＬＬ３７、配列番号６０で示されるメリチン、配列番号５４で示されるザルコトキシンＩＡ、配列番号５８で示されるシュージン１、配列番号４６で示されるインドリシジン、配列番号５３で示されるブフォリンＩＩ、配列番号４９で示されるマガイニン、又は、配列番号５１で示されるセクロピンＡ（ネッタイシマカ）であってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドである配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９と結合された配列番号４４で示されるＬＬ３７であってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドである配列番号６０で示されるメリチンと結合された配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９であってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドである配列番号５４で示されるザルコトキシンＩＡと結合された配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９であってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドである配列番号４６で示されるインドリシジンと結合された配列番号５８で示されるシュージン１であってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドである配列番号４９で示されるマガイニンと結合された配列番号５３で示されるブフォリンＩＩであってもよい。他の好ましい態様では、該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドである配列番号４４で示されるＬＬ３７と結合された配列番号５８で示されるシュージン１であってもよい。
【００７０】
本発明に係る融合タンパク質の抗微生物ペプチドは、Ｎ−又はＣ−末端に連続して配置される。Ｎ−又はＣ−末端における抗微生物ペプチドの順序は問題ではなく、例えば、融合タンパク質のＮ−末端から始まって、抗微生物ペプチドに別の抗微生物ペプチドが続いて酵素が続くか、又は、該別の抗微生物ペプチドに該抗微生物ペプチドが続いて酵素が続く。あるいは、酵素に抗微生物ペプチドが続いて別の抗微生物ペプチドが続くか、又は、酵素に該別の抗微生物ペプチドが続いて該抗微生物ペプチドが続き、以て両ペプチドは酵素のＣ−末端に配置される。
【００７１】
本発明の好ましい態様では、融合タンパク質は、配列番号１９〜６９及び７８〜９８で示される２つ又はそれ以上のペプチドストレッチ、並びに、配列番号１〜１８で示される酵素で構成される。本発明の好ましい態様では、融合タンパク質は、配列番号１９〜６９及び７８〜９８で示されるペプチドストレッチの群から選択される２つ又はそれ以上のペプチドストレッチ、並びに、配列番号１〜１８で示される酵素の群から選択される酵素で構成される。本発明の他の好ましい態様では、融合タンパク質は、配列番号１９〜６９及び７８〜９８で示されるペプチドストレッチの群から選択される２つ又はそれ以上のペプチドストレッチ、並びに、配列番号１〜１８で示される酵素の群から選択される酵素で構成され、該ペプチドストレッチは、該酵素のＮ−又はＣ−末端と融合される。
【００７２】
本発明に係る融合タンパク質の具体的な例を以下の表に示す。
（表３）
2014507933.tif 000011
2014507933.tif 000012
【００７３】
本発明に係る融合タンパク質で、特に配列番号７０〜７７及び１２７〜１４７で示されるとりわけ好ましい融合タンパク質は、Ｎ−末端に追加でメチオニンを含んでもよい。
本発明に係る融合タンパク質で、特に配列番号７０〜７７及び１２７〜１４７で示されるとりわけ好ましい融合タンパク質は、例えば精製のために追加でタグを含んでもよい。好ましくは該融合タンパク質のＣ−末端及び／又はＮ−末端において、Ｈｉｓ6−タグが好ましい。該タグは、例えばクローニングの理由のために、追加のアミノ酸残基によって、該融合タンパク質に連結され得る。好ましくは、該タグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の追加のアミノ酸残基によって、該融合タンパク質に連結され得る。好ましくは、該追加のアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識及び／又は切断されないかもしれない。好ましい態様では、該融合タンパク質は、そのＣ−末端に、追加のアミノ酸残基であるリシン及びグリシン（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）、又は、ロイシン及びグルタミン酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）によって該融合タンパク質に連結されたＨｉｓ6−タグを含む。好ましくは、該追加のアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識又は切断されないかもしれない。他の好ましい態様では、該融合タンパク質は、そのＮ−末端に、追加のアミノ酸残基であるリシン及びグリシン（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）、又は、ロイシン及びグルタミン酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）によって該融合タンパク質に連結されたＨｉｓ6−タグを含む。他の好ましい態様では、該融合タンパク質は、そのＮ−及びＣ−末端に、追加のアミノ酸残基であるリシン及びグリシン（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）、又は、ロイシン及びグルタミン酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）によって該融合タンパク質に連結されたＨｉｓ6−タグを含む。
【００７４】
より好ましい態様では、融合タンパク質は、そのＣ−末端に、追加のアミノ酸残基であるロイシン及びグルタミン酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）によって、該融合タンパク質に連結されたＨｉｓ6−タグを含み、本発明に係る融合タンパク質の第２のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基であるグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、グリシン、セリン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、若しくは、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）によって、第１のペプチドストレッチのＮ−末端に連結され、並びに／又は、該融合タンパク質は、Ｎ−末端に追加のアミノ酸残基であるメチオニン（Ｍｅｔ）、メチオニン及びグリシン（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、若しくは、メチオニン、グリシン及びセリン（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む。他の好ましい態様では、融合タンパク質は、そのＣ−末端に、追加のアミノ酸残基であるロイシン及びグルタミン酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）によって、該融合タンパク質に連結されたＨｉｓ6−タグを含み、本発明に係る融合タンパク質の第２のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基であるグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、グリシン、セリン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、又は、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）によって、第１のペプチドストレッチのＮ−末端に連結され、該第１のペプチドストレッチは、追加のアミノ酸残基であるグリシン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、グリシン、セリン及びセリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）、若しくは、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）によって、酵素のＮ−末端に融合され、並びに／又は、該融合タンパク質は、Ｎ−末端に追加のアミノ酸残基であるメチオニン（Ｍｅｔ）、メチオニン及びグリシン（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、若しくは、メチオニン、グリシン及びセリン���Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む。
【００７５】
融合タンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載されているような標準的なクローニング技術を使用して、少なくとも３つの核酸配列を連結することによって構築される。そのようなタンパク質は、例えば、組換えＤＮＡ発現系において生成されてもよい。本発明に係るそのような融合タンパク質は、エンドリシン及び各ペプチドストレッチについての核酸を融合することによって取得され得る。
本発明に係る融合タンパク質は、他の追加のタンパク質に融合又は連結されてもよい。この他の追加のタンパク質の例は、チオレドキシンである。
本発明はさらに、本発明に係る融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関連する。本発明はさらに、本発明に係る核酸分子を含むベクターに関連する。該ベクターは、本発明に係る前記融合タンパク質の本質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）又は誘導的発現のために提供してもよい。
【００７６】
本発明はまた、前記融合タンパク質を発現する遺伝的に改変された適切な宿主細胞などの微生物から、該融合タンパク質を取得する方法にも関連する。該宿主細胞は、細菌や酵母などの微生物、又は、例えば哺乳類細胞、特にヒト細胞のような動物細胞であってもよい。本発明のある態様では、宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である。宿主は、例えば収率、溶解性、費用などの単なる生物工学的理由によって選択されてもよいが、医学的観点、例えば非病原性細菌又は酵母、ヒト細胞から選択されてもよい。本発明のある側面は、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を、該融合タンパク質の発現をサポートする条件下で培養することを含む、融合タンパク質の製造方法に及ぶ。
【００７７】
本発明の他の側面は、本発明に係る融合タンパク質の発現を得るために、適切な宿主細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、該宿主細胞が、該融合タンパク質をコードする遺伝物質の該宿主細胞への導入によって遺伝的に改変され、当業者に周知の遺伝子工学的方法によって翻訳及び発現を獲得することを特徴とする方法に関連する。
【００７８】
さらなる側面では、本発明は、本発明に係る融合タンパク質、及び／又は、核酸分子若しくは本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主を含む組成物、好ましくは医薬組成物に関連する。
【００７９】
本発明の好ましい態様では、前記組成物は、例えばＥＤＴＡ、ＴＲＩＳ、酪酸、ラクトフェリン、ポリミキシン、クエン酸、及び／又は、例えばＶａａｒａによって記載されている（Ａｇｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｖａａｒａ Ｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２年９月、５６（３）：３９５−４４１）ような他の物質などの、グラム陰性細菌の外膜を透過処理する薬剤を追加で含む。上記透過処理剤の組み合わせを含む組成物もまた好ましい。約１０μＭ〜約１００ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約５０μＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜約２ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜１ｍＭのＥＤＴＡを含む組成物が特に好ましい。しかしながら、約１０μＭ〜約０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む組成物もまた好ましい。約０．５ｍＭ〜約２ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約１ｍＭのＥＤＴＡ及び追加で約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴＲＩＳを含む組成物もまた好ましい。
【００８０】
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明に係る融合タンパク質、及び／又は、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸で形質転換された宿主にも関連する。さらなる側面では、本発明は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に関連する障害、疾患、若しくは状態の処置及び／又は予防のための医薬の製造における、本発明に係る融合タンパク質、及び／又は、本発明に係る改変型融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主の使用に関連する。特に、該障害、疾患、若しくは状態の処置及び／又は予防は、腸内細菌科（エシェリキア属、とりわけ大腸菌、サルモネラ属、シゲラ属、シトロバクター属、エドワードジエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、とりわけ肺炎桿菌、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、エルシニア属）、シュードモナス科（シュードモナス属、とりわけ緑膿菌、ブルクホルデリア属、ステノトロホモナス属、シュワネラ属、スフィンゴモナス属、コマモナス属）、ナイセリア属、モラクセラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、ブルセラ属、フランシセラ属、ボルデテラ属、レジオネラ属、バルトネラ属、コクシエラ属、ヘモフィルス属、パスツレラ属、マンヘミア属、アクチノバシラス属、ガードネレラ属、スピロヘータ科（トレポネーマ属及びボレリア属）、レプトスピラ科、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、スピリルム属、ストレプトバシラス属、バクテロイデス科（バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属、ポリフィロモナス属）、アシネトバクター属、とりわけＡ．バウマンニのような、ヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陰性細菌に起因してもよい。特に、該障害、疾患、若しくは状態の処置及び／又は予防は、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、フェカリス菌、フェシウム菌、肺炎連鎖球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス菌、腺疫菌、クロストリジウム・ディフィシル、ボツリヌス菌、破傷風菌、ウェルシュ菌、炭疽菌、セレウス菌、アクネ菌、マイコバクテリウム・アビウム、結核菌、ジフテリア菌、マイコプラズマ・ニューモニエ、放線菌のようなヒト若しくは動物に病原性がある株を含む細菌群、科、属若しくは種のグラム陽性細菌に起因してもよい。
【００８１】
本発明はさらに、本発明に係る融合タンパク質、及び／又は、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸で形質転換された宿主を含む医薬に関連する。
さらなる側面では、本発明は、処置及び／又は予防の必要な対象における障害、疾患、又は状態の処置方法であって、該対象に対して、本発明に係る融合タンパク質の有効量、及び／若しくは、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸で形質転換された宿主の有効量、又は、本発明に係る組成物を投与することを含む方法に関連する。該対象は、ヒト又は動物であってもよい。
【００８２】
特に、前記処置方法は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に起因する障害、疾患、又は状態、特にグラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に起因する細菌感染の処置及び／又は予防のためであってもよい。
特に、前記処置方法は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌、特に上記列挙したグラム陽性及び／又はグラム陰性細菌によって引き起こされる皮膚、軟組織、呼吸器系、肺、消化管、眼、耳、歯、鼻咽頭、口、骨、膣の感染、菌血症の創傷、及び／又は、心内膜炎の処置及び／又は予防のためであってもよい。
【００８３】
本発明に係る処置（又は予防）方法において使用される投与の用量及び経路は、処置される特定の疾患／感染部位に依存する。投与経路は、例えば経口的、局所的、鼻咽喉内、非経口的、静脈内、直腸内、又は他の任意の投与経路であってもよい。
【００８４】
本発明に係る融合タンパク質、及び／若しくは、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸で形質転換された宿主の有効量、又は、本発明に係る組成物を、感染部位又は感染の危険にさらされた部位に適用するために、それが感染部位に到達するまで、プロテアーゼ、酸化、免疫反応などの環境の影響から活性化合物を保護する製剤が使用されてもよい。したがって、該製剤は、カプセル、糖衣錠、錠剤、粉末剤、坐剤、乳剤、懸濁剤、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、注射可能な溶液、シロップ、スプレー、吸入剤、又は他の任意の医学的に妥当な生薬（ｇａｌｅｎｉｃ）製剤であってもよい。好ましくは、該生薬製剤は、適切な担体、安定化剤、着香料、緩衝剤、又は他の適切な化学物質を含んでもよい。例えば、局所適用のためには、製剤は、ローション、クリーム、ゲル、軟膏、又は硬膏でもよく、鼻咽喉適用のためには、製剤は、鼻にスプレーを介して適用される生理食塩水溶液であってもよい。経口投与のためには、特定の感染部位、例えば腸内の処置及び／又は予防の場合、感染部位に到達するまで、本発明に係る融合タンパク質を消化管の過酷な消化環境から保護することが必要であり得る。したがって、胃における消化の初期段階を生き延び、あとで本発明に係る融合タンパク質を腸内環境中に分泌する担体としての細菌が利用され得る。
【００８５】
本発明の特定の態様では、本発明に係る融合タンパク質、及び／又は、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列含む核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主は、シュードモナス属に起因する障害、疾患、又は状態、とりわけ緑膿菌に起因するもので特に腸疾患、特に幼児におけるもの、例えば出血性髄膜炎である髄膜感染、中耳の、皮膚(壊疽性膿瘡)の、特に熱傷の、尿路の感染、鼻炎、菌血症性肺炎の処置及び／又は予防のための医薬の製造において使用され、特に患者は、嚢胞性線維症若しくは白血病などの造血器腫瘍を患っているか、又は、免疫抑制療法による好中球減少症、敗血症、特に長期の静脈内若しくは尿路留置カテーテルによるもの、侵襲的な外科治療及び重度の熱傷、心内膜炎を有しており、特に該患者は、静注薬物使用者、又は、心臓切開手術による合併症、非常に破壊的な眼感染症、特に汚染眼科液剤の使用後のもの、重度の顔面熱傷、骨軟骨炎、特に汚染衣類による重度の外傷又は刺創の結果としてのものの患者である。
【００８６】
本発明の他の特定の態様では、前記障害、疾患、又は状態は、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）に起因し、特にホイットモア病（Ｗｈｉｔｍｏｒｅ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性肺炎、敗血症であり、特に患者は、外傷性皮膚損傷を有している。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及びサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）に起因し、特に急性胃腸炎、及び、局所の化膿過程、とりわけ骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎で、特にネズミチフス菌髄膜炎に起因するものであり、特に患者は、２歳未満である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）に起因し、特にチフスである。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）に起因し、特にパラチフスである。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）に起因し、特に気管支炎、肺炎、傷口感染、及び、敗血症、特に静脈内留置カテーテルの結果としてのものである。
【００８７】
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、大腸菌に起因しており、特に腸管外感染症、とりわけ虫垂炎、化膿性胆嚢炎、腹膜炎、化膿性髄膜炎及び尿路感染症、腸管内大腸菌感染症、とりわけ流行性腸炎、並びに、赤痢と同様の感染性疾患、敗血症、腸毒血症、乳腺炎及び赤痢である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に起因し、特に肺炎、菌血症、髄膜炎及び尿路感染である。
【００８８】
本発明の特定の態様では、本発明に係る融合タンパク質及び／又は本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列含む核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主は、リステリア菌に起因する障害、疾患、又は状態、特に乳児敗血症性肉芽腫症（新生児のリステリア症）、単核球症、結膜炎、髄膜炎、敗血症性肉芽腫症、及び、妊婦のリステリア症の処置及び／又は予防のための医薬の製造に使用される。
【００８９】
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、黄色ブドウ球菌に起因し、特に膿皮症、とりわけ毛嚢炎、フルンケル、カルブンケル、汗腺の膿瘍及び天疱瘡のような、並びに熱傷様皮膚症候群（ｓｃａｌｅｄ ｓｋｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような皮膚感染である。該熱傷様皮膚症候群は、剥脱性皮膚炎、水疱性膿痂疹、及び、猩紅熱様紅皮症の３つの臨床像において出現し得る。さらに、黄色ブドウ球菌に起因する障害、疾患、又は状態は、スタフィロコッカス肺炎、ホスピタリズム、特に手術創感染、産褥性乳腺炎（ｍａｓｔｉｔｉｓ ｐｕｅｒｐｅｒａｌｉｓ）及び腸炎、並びに食中毒である。
【００９０】
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、化膿性連鎖球菌に起因し、特に扁桃炎、咽頭炎、猩紅熱（ｓｃａｒｌｅｔ）、丹毒、リウマチ熱、及び、急性糸球体腎炎である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、肺炎連鎖球菌に起因し、特に肺炎、匐行性角膜潰瘍、中耳炎、髄膜炎、腹膜炎、乳様突起炎、及び、骨髄炎である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、ウェルシュ菌に起因し、特にガス壊疽、壊死性潰瘍性腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｎｅｃｒｏｔｉｃａｎｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ）、及び、食中毒である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、ボツリヌス菌に起因し、特にボツリヌス中毒症である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、クロストリジウム・ディフィシルに起因し、特に偽膜性腸炎（ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｅｓ ｅｎｔｅｒｏｋｏｌｉｔｉｓ）である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、炭疽菌に起因し、特に皮膚炭疽、吸入炭疽、及び、胃腸炭疽である。
【００９１】
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、フェカリス菌又はフェシウム菌に起因し、院内感染症及び心内膜炎などである。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、セレウス菌に起因し、特に食中毒、気管支肺炎、敗血症、及び、髄膜炎である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、マイコバクテリウム・アビウム、パラ結核菌、及び、結核菌に起因し、特に結核である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、マイコプラズマ・ニューモニエに起因し、特に肺炎、上気道の疾患、及び、鼓膜の炎症である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、放線菌に起因し、特にヒト、ウシ、ネコ、及び、イヌにおける放線菌症である。
本発明の他の特定の態様では、該障害、疾患、又は状態は、ジフテリア菌に起因し、特に扁桃腺、鼻、鼻咽頭又は中耳の限局性ジフテリア、咽頭、気管及び気管支の進行性ジフテリア、毒性又は悪性ジフテリア、皮膚及び創傷のジフテリアである。
【００９２】
好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、処置又は予防される感染症が、多剤耐性細菌株、特に次の抗生物質、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、セファロチン、ゲンタマイシン、セフォタキシム、セファロスポリン、セフタジジム、若しくはイミペネムのうち１つ又はそれ以上に対して耐性の株に起因する場合に、医学的処置のために使用される。さらに、本発明に係る融合タンパク質は、抗生物質、ランチビオティクス、バクテリオシン、又はエンドリシンなどの従来の抗菌剤との組み合わせで投与することによる処置方法で使用され得る。
【００９３】
本発明はまた、１つ又はそれ以上の区画を含む薬学的パックに関連しており、少なくとも１つの区画は、１つ若しくはそれ以上の本発明に係る融合タンパク質、及び／若しくは、１つ若しくはそれ以上の本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸で形質転換された宿主、又は、本発明に係る組成物を含む。
【００９４】
他の側面では、本発明は、医薬組成物を調製する工程に関連しており、該工程は、１つ若しくはそれ以上の本発明に係る融合タンパク質及び／又は１つ若しくはそれ以上の本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸で形質転換された宿主を、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は、担体と混合することを含む。
【００９５】
またさらなる側面では、本発明に係る組成物は、化粧料組成物である。いくつかの細菌種は、皮膚などの患者の身体の、環境に暴露された表面上に刺激を引き起こし得る。そのような刺激を予防するために、又は、該細菌の小症状を排除するために、既に存在しているか又は新しく定着する病原性グラム陰性及び／又はグラム陽性細菌を分解するのに十分な量の本発明に係る融合タンパク質を含む、特定の化粧料調製物が用いられてもよい。
【００９６】
さらなる側面では、本発明は、医療、食品若しくは飼料、又は、環境の診断における診断手段として、とりわけ、特にグラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に起因する細菌感染の診断のための診断手段として使用するための、本発明に係る融合タンパク質に関連する。この点においては、本発明に係る融合タンパク質は、病原性細菌、特にグラム陽性及び／又はグラム陰性病原性細菌を特異的に分解するための手段として使用されてもよい。本発明に係る融合タンパク質による細菌細胞の分解は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のような界面活性剤や、ポリミキシンＢのように細菌細胞のエンベロープを弱める他の添加剤によってサポートされ得る。特異的な細胞分解は、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション若しくはＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））のような核酸ベースの方法、ＩＭＳ、免疫蛍光法若しくはＥＬＩＳＡ技術のような免疫学的方法、又は、異なる細菌群若しくは種に特異的なタンパク質、例えば、腸内細菌についてβ−ガラクトシダーゼ、コアグラーゼ陽性株についてコアグラーゼを使用する酵素アッセイのような細菌細胞の細胞内容物に依拠する他の方法を使用する、その後の細菌の特異的な検出のための初期段階として必要とされる。
【００９７】
さらなる側面では、本発明は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌による、食品の汚染、食品加工装置の汚染、食品加工工場の汚染、棚及び食品貯蔵領域などの食品と接触する表面の汚染、及び、病原性、通性病原性又は他の望ましくない細菌が潜在的に食品材料に感染し得る他のすべての状況における汚染、医療機器の汚染、並びに、病院や手術室におけるすべての種類の表面の汚染の処置、除去、低減、又は予防のための、本発明に係る融合タンパク質の使用に関連する。
【００９８】
さらなる側面では、本発明は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌による、食品の汚染、食品加工装置の汚染、食品加工工場の汚染、棚及び食品貯蔵領域などの食品と接触する表面の汚染、及び、病原性、通性病原性又は他の望ましくない細菌が潜在的に食品材料に感染し得る他のすべての状況における汚染、医療機器の汚染、並びに、病院や手術室におけるすべての種類の表面の汚染の除去、低減又は予防方法に関連しており、該方法は、該食品、食品加工装置、食品加工工場、食品と接触する表面、医療機器、又は、病院における表面を本発明に係る融合タンパク質と接触させることを含む。
【００９９】
本発明の他の側面は、対象からの試料中、食品若しくは飼料中、又は、環境試料中で細菌を検出する方法に関連しており、該方法は、該試料を本発明に係る融合タンパク質と接触させることを含む。本発明の融合タンパク質で検出される細菌は、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌であってもよい。対象、特にヒト又は動物の試料は、血清及び尿のような任意の体液であっても、臓器や組織であってもよい。
【０１００】
特に、本発明の融合タンパク質は、消毒剤として予防的に使用されてもよい。該消毒剤は、手術の前若しくは後、又は、例えば血液透析の間に使用されてもよい。さらに、早産児及び免疫不全者、又は人工器官を必要とする対象が、本発明に係る融合タンパク質で処置されてもよい。該処置は、予防的又は急性感染の間のいずれかであってもよい。同様の状況において、院内感染症、とりわけ、緑膿菌（ＦＱＲＰ）、アシネトバクター属の種、及び、大腸菌、サルモネラ属、シゲラ属、シトロバクター属、エドワードジエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、エルシニア属などの腸内細菌科の種、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性フェカリス菌、バンコマイシン耐性フェシウム菌、肺炎連鎖球菌、アクネ菌、多剤耐性結核菌のような抗生物質耐性株によるものが、予防的又は急性期の間に本発明の融合タンパク質で処置されてもよい。したがって、本発明に係る融合タンパク質は、殺菌剤として、界面活性剤、テンシド、溶媒、抗生物質、ランチビオティクス、又はバクテリオシンのような、殺菌溶液中で有用な他の成分との組み合わせでも使用されてもよい。
【０１０１】
例えば病院、歯科手術、獣医学、厨房、又はトイレにおける殺菌剤として本発明に係る融合タンパク質を使用するために、該融合タンパク質は、例えば、液体、粉末、ゲル、又は、お手拭若しくは殺菌シート製品の成分の形態の組成物に調製され得る。該組成物は、追加で、各使用及び形態のために適切な担体、添加物、希釈剤、及び／又は、賦形剤をそれぞれ含んでもよいが、ＥＤＴＡのような抗微生物活性をサポートする薬剤、又は、該融合タンパク質の抗微生物活性を増強する薬剤もまた含んでもよい。該融合タンパク質はまた、アルコール、アルデヒド、酸化剤、フェノール類、四級アンモニウム化合物、又は、ＵＶ光のような一般的な殺菌剤と共に使用されてもよい。例えば表面、物体及び／又は機器の殺菌のために、該融合タンパク質は、該表面、物体及び／又は機器に適用され得る。該適用は、布又はぼろ切れなどの任意の手段で殺菌組成物を湿らすことによって、噴霧、注ぐことによって、行われてもよい。該融合タンパク質は、各用途及び完全な抗微生物活性を得るように意図される「反応時間」に依存して変動する濃度において、使用されてもよい。
他の側面では、本発明は、本発明に係る融合タンパク質の食品添加物としての使用に関連している。
【０１０２】
本発明の他の側面は、本発明がツールボックスのように使用され得ることであり、すなわち、上で開示された任意のペプチドストレッチ及び抗微生物ペプチドは、本明細書で開示された任意のエンドリシン、オートリシン、又はバクテリオシンと融合してもよい。そうすると、融合タンパク質がそれぞれの細菌に結合することを可能にする各ペプチドストレッチと、それぞれの細菌の成長を阻害するエンドリシン、オートリシン、又はバクテリオシンとを結合することが可能である。結果として、除去されるべき任意の細菌に対して適切な融合タンパク質を構築することが可能である。
【０１０３】
本発明のさらなる適用可能範囲は、後述の詳細な説明から明らかになるだろうが、本発明の精神と範囲内での種々の変更及び改変が、本詳細な説明から当業者にとって明らかになるだろうから、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例証としてのみ提供されることを理解すべきである。前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方とも、例示的かつ説明的であるのみであり、クレームのような本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定しようとするものであるとは見なされない。別に指示されていない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているような、分子生物学的な標準の方法が使用される。
【０１０５】
実施例１：抗菌ペプチドタグの、シュードモナス・プチダ・ファージＯＢＰのＰＫ改変型エンドリシン（ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓ）とのＮ−末端融合
Ｎ−末端に配列番号２３で示されるポリカチオン性ペプチドを有するＰ．プチダ・ファージＯＢＰの改変型エンドリシン変異体であるＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓを、抗グラム陰性活性を調べるために、天然の抗菌ペプチドタグ、両親媒性及び疎水性ペプチドストレッチ（表４）とＮ−末端で融合した。
【０１０６】
（表４）ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬＹＳと融合された抗菌ペプチドタグの一覧表
2014507933.tif 000013
＊Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．（１９７４）、Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１：４１７８−４１８２
＊＊Ｙｕｐ Ｐａｒｋ、Ｃｈａｎ Ｂａｅ Ｐａｒｋ、Ｍｉ Ｓｕｎ Ｋｉｍ、Ｓｕｎ Ｃｈａｎｇ Ｋｉｍ（１９９８）、Ｐａｒａｓｉｎ Ｉ，ａｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔｃｓｈ，Ｐａｒａｓｉｌｕｒｕｓ ａｓｏｔｕｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４３７：２５８−２６２
＊＊＊Ｙａｎ、Ｌ ａｎｄ Ａｄａｍｓ、Ｍ．Ａ．（１９９８）、Ｌｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｌｆ Ｓｐｉｄｅｒ，Ｌｙｃｏｓａ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７３：２０５９−２０６６
【０１０７】
ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓのタグ改変の方法
α４−、ワルマフ１−、ワルマフ２−、リコトキシン１−、及びパラシン１−ＰＫ−ＯＢＰｇｐｌｙｓのＯＲＦを取得するために、対応するペプチドストレッチ（プライマー対のハイブリダイゼーションによって作り出されたもの、表５参照）を、適合バージョンのライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）技術を利用して、ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬＹＳをコードするＯＲＦに融合した。まず、固有のＥｃｌ１３６ＩＩ制限酵素部位（太字）を、制限酵素部位をコードする特異的な設計された５’プライマー（５’GGAATGGGGAGCTCCTCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAGAAT ３’、配列番号１１９）、及び、ファージＯＢＰの純粋ゲノムＤＮＡ上の標準のＯＢＰｇｐＬｙｓリバースプライマー（５’AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT ３’、配列番号１２０）を用いた尾部（ｔａｉｌ）ＰＣＲによって、ＰＫ改変型ＯＢＰｇｐＬｙｓのＯＲＦの上流に挿入した。そして、この伸長断片を、メーカーのＴＡクローニングプロトコールに従って、ｐＥＸＰ５ＣＴ／ＴＯＰＯ(R)発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）へと連結した。純粋なプラスミドを一度切断し（Ｅｃｌ１３６ＩＩ）、該切断プラスミド内に、ハイブリッドペプチドカセットをライゲーション手順なしに挿入した。
【０１０８】
単独のタグ化α４−及びペンタペプチド−ＯＢＰｇｐＬｙｓのＯＲＦの前にＰＫ−ペプチドストレッチを融合するために、このＰＫペプチドストレッチ（ＰＫ−α４−ＯＢＰｇｐＬｙｓ用には、５’プライマーは、５’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAGGCTCCTCCCCGAACCGTGCA ３’、配列番号１２１であり、ＰＫ−ペンタペプチド−ＯＢＰｇｐＬｙｓ用には、５’プライマーは、５’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAGCCTCCTCCTTCTTCGTAGCA ３’、配列番号１２２である）をコードする伸長５’プライマー、及び、標準の３’ＯＢＰｇｐＬｙｓリバースプライマーを用いた尾部ＰＣＲを、精製したｐＥＸＰ５−ＣＴ／α４−ＯＢＰｇｐＬｙｓ及びｐＥＸＰ５−ＣＴ／ペンタペプチド−ＯＢＰｇｐＬｙｓプラスミドＤＮＡに、それぞれ適用した。そして、得られたＰＣＲ断片は、ｐＥＸＰ５ＣＴ／ＴＯＰＯ(R)発現ベクターに再クローン化した。該断片が発現ベクター内に正しく挿入されたことは、該構築物を適切な大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現株内に導入する前に、配列解析によって確認した。
【０１０９】
（表５）ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬＹＳをコードするＯＲＦにＮ−末端融合するために使用された抗菌ペプチドタグのハイブリダイゼーション用プライマー対
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【０１１０】
改変型ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬＹＳ融合変異体の大規模組換え体発現
標準的な発現は、溶原培地（ＬＢ）中、１ｍＭのイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導された指数関数的に増殖している細胞（ＯＤ600nm＝０．６）で行う。温度、時間、及び発現株のような発現パラメーターは、改変型エンドリシンの可溶性発現レベルを最適化するために、タンパク質特異的な基準で変化させた（表６参照）。
【０１１１】
精製のために、発現培養液（５００〜６００ｍｌ）から細胞を収集し（４５００ｒｐｍ、３０分、４℃）、１／２５容量の溶解バッファー（１０ｍＭ イミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。この懸濁液は、超音波処理（Ｖｉｂｒａ ＣｅｌｌＴＭ、Ｓｏｎｉｃｓ、Ｄａｎｄｕｒｒｙ、ＣＴ、ＵＳＡで、８×３０秒、振幅４０％）の前に３回凍結／融解し、０．４５及び０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を通してろ過した。Ｈｉｓ−タグ化融合タンパク質の精製は、メーカーの説明書に従い、Ｎｉ2+−アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍｌカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を利用したワンステップ・プロトコールによって行った。Ｎｉ2+アフィニティークロマトグラフィーは、すべて室温で次の４段階により行った。
１．  Ｈｉｓｔｒａｐ ＨＰ １ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１０カラム容量の洗浄バッファー（６０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍＭ ＮａＣｌ、及び、２０ｍＭ ＮａＨ2Ｐ０4−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）により、０．５ｍｌ／分の流速で平衡化。
２．  全溶解物（所望のエンドリシンを含む）を、Ｈｉｓｔｒａｐ ＨＰ １ｍｌカラムに、０．５ｍｌ／分の流速で添加。
３．  １５カラム容量の洗浄バッファーにより、１ｍｌ／分の流速で洗浄。
４．  結合したエンドリシンを、１０カラム容量の溶出バッファー（５００ｍＭ イミダゾール、５ｍＭ ＮａＣｌ、及び、２０ｍＭ ＮａＨ2Ｐ０4−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）により、０．５ｍｌ／分の流速でカラムから溶出。
【０１１２】
洗浄バッファーは、タンパク質のより高い純度を確保するために、タンパク質特異的な基準で変化する低濃度のイミダゾールを含んだ（表６参照）。大腸菌発現培養液１リットル当たりの組換えタンパク質の全収量も表６に示す。値は、精製されたストック溶液のタンパク質濃度及び総容積を、波長２８０ｎｍで分光光度測定することにより決定した。精製されたストック溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で視覚的に判定されたところによると、少なくとも９０％の純度であった。
【０１１３】
（表６）Ｎ−末端改変型ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓ変異体の発現パラメーターと発現培養液１リットル当たりで得られたタンパク質収量
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【０１１４】
改変型ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓ融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性及び宿主域
指数関数的に増殖しているグラム陰性細菌細胞（ＯＤ600nm＝０．６）を、最終密度が約１０6細胞／ｍｌとなるように５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４で１００倍希釈し、種々の改変型ＯＢＰｇｐＬＹＳ変異体（１５００ｎＭの終濃度で溶出バッファー中）と共に震盪せずに室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液及び改変型ＯＢＰｇｐＬＹＳ変異体が添加されていない対照としての未処理細菌細胞を、１×濃縮ＰＢＳバッファーで３回希釈し（それぞれ１０5−１０4−１０3細胞／ｍｌ）、各希釈液の１００μｌをＬＢ培地上にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、寒天プレート上の細菌コロニーを計数した。計数された細胞数に基づき、抗菌活性を、対数単位の相対的不活性化度（＝ｌｏｇ１０Ｎ0／Ｎi、Ｎ0＝未処理細胞数（対照のもの）、及び、Ｎi＝処理細胞数、両者ともインキュベーション後に計数）として計算した（表７）。細菌細胞は融合タンパク質での処理によって溶解されるので、該融合タンパク質での処理後における細菌コロニー数の減少は、種々の改変型ＯＢＰｇｐＬＹＳ変異体の抗微生物活性の指標となる。すべての試料は三重に再現された。平均＋／−標準偏差を示す。
【０１１５】
（表７）指数関数的に増殖しているグラム陰性の種に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加なし（Ａ）及びあり（Ｂ）での、種々のＮ−末端改変型ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬＹＳ融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を標準偏差（ｓｔｄｅｖ）と一緒に示す。
Ａ
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Ｂ
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【０１１６】
実施例２：シュードモナス・プチダ・ファージＯＢＰのエンドリシン（ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓ）と１つだけのペプチドストレッチの融合タンパク質と比較した、シュードモナス・プチダ・ファージＯＢＰのエンドリシン（ＰＫ−ＯＢＰｇｐＬｙｓ）と２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
１つのペプチドストレッチを有するＯＢＰｇｐＬｙｓの製造方法
ペンタペプチドを除いて、すべてのペプチドストレッチを、例えばＢｅｒｒｏｗ他、２００７年に記載されているような適合バージョンのライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）を利用して、ＯＢＰｇｐＬＹＳ誘導体をコードするＯＲＦに融合した。前述のように、固有のＥｃｌ１３６ＩＩ制限酵素部位を、特異的な設計された５’プライマー（５’−GGAATGGGGAGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG−３’、配列番号１２３）、及び、ファージＯＢＰの純粋ゲノムＤＮＡ上の標準のＯＢＰｇｐＬｙｓ誘導体リバースプライマー（５’−AACTATTCCGTGTGCTTTCTTTGT−３’、配列番号１２４）を用いた尾部ＰＣＲによって、ＷＴエンドリシン遺伝子の前に挿入した。そして、この伸長断片を、メーカーのＴＡクローニングプロトコールに従って、ｐＥＸＰ５ＣＴ／ＴＯＰＯ(R)発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）へと連結した。純粋なプラスミドをＥｃｌ１３６ＩＩ制限酵素消化で一度切断し、該切断プラスミド内に、ハイブリッドペプチドカセット（プライマー対のハイブリダイゼーションによって作り出されたもの、表８参照）を必要とされるライゲーション手順なしに挿入した（ＬＩＣ）。Ｎ−末端ペンタペプチドタグ融合のためには、このペンタペプチドをコードする伸長５’プライマー（５’−ATGGGATCCTTCTTCGTAGCA CCGGGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG−３’、配列番号１２５）、及び、標準のＯＢＰｇｐＬｙｓ誘導体リバースプライマー（５’−AACTATTCCGTGTGCTTTCTTTGT−３’、配列番号１２６）を用いた尾部ＰＣＲを、ファージＯＢＰのゲノムＤＮＡに適用した。該断片が発現ベクター内に正しく挿入されたことは、該構築物を適切な大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現株内に導入する前に、配列解析によって確認した。
【０１１７】
（表８）ＯＢＰｇｐＬｙｓ誘導体をコードするＯＲＦに使用された抗菌ペプチドタグのハイブリダイゼーション用プライマー対
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【０１１８】
２つのペプチドストレッチを有するＯＢＰｇｐＬｙｓの製造は、実施例１に上述されている。さらに、融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、すでに実施例１に記載されているように行った。該抗微生物活性アッセイの結果を表９に示す。
【０１１９】
（表９）指数関数的に増殖しているグラム陰性の種に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するＯＢＰｇｐＬＹＳ融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
2014507933.tif 000019
略語：＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１２０】
実施例３：緑膿菌バクテリオファージエンドリシンＫＺ１４４及びＥＬ１８８のエンドリシンと１つだけのペプチドストレッチ又はペプチドストレッチなしの融合タンパク質と比較した、緑膿菌バクテリオファージエンドリシンＫＺ１４４（ファージｐｈｉＫＺ）及びＥＬ１８８（ファージＥＬ）と２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、実施例１に記載されているように行った。抗微生物活性アッセイの結果を表１０に示す。
【０１２１】
（表１０）指数関数的に増殖しているシュードモナス属の細菌に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するＫＺ１４４及びＥＬ１８８融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
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略語：−：対数減少なし；＋／−：＜１ ｌｏｇ；＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１２２】
実施例４：エンドリシンＳＴＭ００１６と１つだけのペプチドストレッチ又はペプチドストレッチなしの融合タンパク質と比較した、エンドリシンＳＴＭ００１６と２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、実施例１に記載されているように行った。抗微生物活性アッセイの結果を表１１に示す。
【０１２３】
（表１１）指数関数的に増殖しているサルモネラ属の細菌に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するＳＴＭ００１６融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
2014507933.tif 000021
略語：−：対数減少なし；＋／−：＜１ ｌｏｇ；＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１２４】
実施例５：エンドリシンであるリソスタフィンと１つだけのペプチドストレッチ又はペプチドストレッチなしの融合タンパク質と比較した、エンドリシンであるリソスタフィンと２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、実施例１に記載されているように行った。抗微生物活性アッセイの結果を表１２に示す。
【０１２５】
（表１２）指数関数的に増殖しているスタフィロコッカス属の細菌に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するリソスタフィン融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
2014507933.tif 000022
略語：−：対数減少なし；＋／−：＜１ ｌｏｇ；＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１２６】
実施例６：エンドリシンＣｐｌ１と１つだけのペプチドストレッチ又はペプチドストレッチなしの融合タンパク質と比較した、エンドリシンＣｐｌ１と２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、実施例１に記載されているように行った。抗微生物活性アッセイの結果を表１３に示す。
【０１２７】
（表１３）指数関数的に増殖しているストレプトコッカス属の細菌に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するＣｐｌ１融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
2014507933.tif 000023
略語：−：対数減少なし；＋／−：＜１ ｌｏｇ；＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１２８】
実施例７：エンドリシンＰｌｙ５１１と１つだけのペプチドストレッチ又はペプチドストレッチなしの融合タンパク質と比較した、エンドリシンＰｌｙ５１１と２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、実施例１に記載されているように行った。抗微生物活性アッセイの結果を表１４に示す。
【０１２９】
（表１４）指数関数的に増殖しているリステリア属の細菌に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するPly511融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
2014507933.tif 000024
略語：−：対数減少なし；＋／−：＜１ ｌｏｇ；＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１３０】
実施例８：エンドリシンＬｙｓＫと１つだけのペプチドストレッチ又はペプチドストレッチなしの融合タンパク質と比較した、エンドリシンＬｙｓＫと２つのペプチドストレッチの融合タンパク質の抗微生物活性
融合タンパク質の精製及び抗微生物活性アッセイを、実施例１に記載されているように行った。抗微生物活性アッセイの結果を表１５に示す。
【０１３１】
（表１５）指数関数的に増殖しているスタフィロコッカス属の細菌に関する、外膜透過剤であるＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の追加添加ありでの、１つ又は２つのペプチドストレッチを有するＬｙｓＫ融合変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性。初期密度は１０6細胞／ｍｌであり、インキュベーションは震盪せずにＲＴで３０分間継続する。平均対数減少値を示す。
2014507933.tif 000025
略語：−：対数減少なし；＋／−：＜１ ｌｏｇ；＋：１ ｌｏｇ；＋＋：２〜３ ｌｏｇ；＋＋＋：４又はそれ以上のｌｏｇ
【０１３２】
実施例９：種々のペプチドストレッチの抗微生物活性
指数関数的緑膿菌ＰＡＯ１ｐ細胞（熱傷創分離株、Ｑｕｅｅｎ Ａｓｔｒｉｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ；Ｐｉｒｎａｙ ＪＰ他（２００３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１２６２４０５１？ｏｒｄｉｎａｌｐｏｓ＝３＆ｉｔｏｏｌ＝ＥｎｔｒｅｚＳｙｓｔｅｍ２．ＰＥｎｔｒｅｚ．Ｐｕｂｍｅｄ．Ｐｕｂｍｅｄ＿ＲｅｓｕｌｔｓＰａｎｅｌ．Ｐｕｂｍｅｄ＿ＤｅｆａｕｌｔＲｅｐｏｒｔＰａｎｅｌ．Ｐｕｂｍｅｄ＿ＲＶＤｏｃＳｕｍ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１（３）：１１９２−１２０２）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で１：１０に希釈した。細菌を、各ペプチド、配列番号２３で示されるＰＫという名のポリカチオン性ペプチド、配列番号３４で示されるポリカチオン性ペプチドＰＫ２、又は、配列番号４５で示されるＳＭＡＰ−２９という名の抗微生物ペプチドと、バッファー（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０μＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で、ポリカチオン性ペプチドについては０．３μｍｏｌ／Ｌ、３μｍｏｌ／Ｌ、３０μｍｏｌ／Ｌ、及び、１５０μｍｏｌ／Ｌの濃度で、そして抗微生物ペプチドについては３μｍｏｌ／Ｌの濃度で、室温でインキュベートした。３０分後、細胞懸濁液を連続希釈し（１：１０）、ＬＢ上にプレーティングした。加えて、陰性対照をバッファー（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０μＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いてプレーティングした。寒天プレート上の細菌コロニーを、３７℃で一晩インキュベーション後に計数した。計数された細胞数に基づき、抗菌活性を、対数単位の相対的不活性化度（＝ｌｏｇ１０Ｎ0／Ｎi、Ｎ0＝未処理細胞数（対照のもの）、及び、Ｎi＝処理細胞数、両者ともインキュベーション後に計数）として計算した。細菌細胞はペプチドストレッチでの処理によって溶解されるので、該ペプチドストレッチでの処理後における細菌コロニー数の減少は、該ペプチドストレッチの抗微生物活性の指標となる。すべての試料は四重に再現された。
【０１３３】
ポリカチオン性ペプチドであるＰＫ及びＰＫ２のどちらも、緑膿菌に対して使用されたペプチドの濃度に依存して上昇する抗微生物活性を示した。ＰＫ２は、緑膿菌に対してＰＫよりも高い抗微生物活性を示した。さらに、１５０μｍｏｌ／Ｌの濃度で使用されたＰＫ２は、緑膿菌に対して３μｍｏｌ／Ｌで使用されたＳＭＡＰ−２９と同じ抗微生物活性を示した。ＰＫとＰＫ２のどちらにとっても、緑膿菌に対してＳＭＡＰ−２９と同じ抗微生物活性を達成するためには、より多くのペプチドを利用しなければならない。同一モル濃度のＰＫ又はＰＫ２（３μＭ／Ｌ）を使用すると、ＡＭＰ又はＡｒｔｉｌｙｓｉｎと比較して、抗微生物作用を示さないか、軽微な抗微生物作用しか示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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