(57)【要約】  本発明は、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するための方法、ならびに免疫療法を受けているおよび/またはワクチンが投与された患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するための方法、ならびに免疫療法に対する応答を決定する方法、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞サブセットを決定するin vitro方法であって、少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)、STAB1、もしくはTable 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙されるマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの検出を含む、方法。
【請求項２】
樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するための、請求項1に記載の方法であって、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの、試験される樹状細胞による発現レベルを決定するステップを含む、方法。
【請求項３】
樹状細胞がエフェクター樹状細胞「DC1」サブセットに属するか否かを決定するための、請求項1または2に記載の方法であって、Table 1.E(表5)およびTable 2.E(表10)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定される、方法。
【請求項４】
樹状細胞がエフェクター樹状細胞「DC17」サブセットに属するか否かを決定するための、請求項1または2に記載の方法であって、Table 2.C(表8)およびTable 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定される、方法。
【請求項５】
樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか否かを決定するための、請求項1または2に記載の方法であって、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定される、方法。
【請求項６】
a)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するステップ;
b)発現レベルをコントロールの発現レベルと比較するステップ;
c)コントロールとの比較に基づいて、試験される樹状細胞が、樹状細胞のどのサブセットに属するかを同定するステップ、
を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
コントロールが、免疫寛容誘発性サブセットまたはエフェクターサブセットに向けて極性化していない未成熟樹状細胞からなり、ステップc)が、
Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞を、免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するとして同定すること;ならびに/または
Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過小発現する樹状細胞、および/またはTable 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞を、エフェクター樹状細胞サブセットに属するとして同定すること、
を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ステップ(a)において、Table 1.E(表5)およびTable 2.E(表10)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、ステップ(c)が、Table 1.E(表5)およびTable 2.E(表10)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞を、エフェクター樹状細胞「DC1」サブセットに属するとして同定することを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ステップ(a)において、Table 2.C(表8)およびTable 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、ステップ(c)が、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過小発現する樹状細胞、および/またはTable 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞を、エフェクター樹状細胞「DC17」サブセットに属するとして同定することを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するための、請求項1に記載の方法であって、患者由来の生物学的サンプル中の、Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するステップを含む、方法。
【請求項１１】
患者が、免疫療法を受けているおよび/またはワクチンが投与された患者である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
a)患者由来の生物学的サンプル中の、Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するステップ;
b)発現レベルを、コントロールと比較するステップ;
c)コントロールとの比較に基づいて、患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答、特にTh1、Th2またはTh17応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するステップ、
を含む、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
コントロールが、免疫寛容誘発性サブセットまたはエフェクターサブセットに向けて極性化していない未成熟樹状細胞からなる、または適切な場合には、患者が免疫療法を受ける前および/またはワクチンが投与される前に得られた患者由来の生物学的サンプルからなり、ステップc)が、以下:
Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルがコントロールの発現レベルよりも高い場合に、患者が制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているとして同定すること;ならびに/または
Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが、前記コントロールの発現レベルよりも低い場合、および/またはTable 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが、前記コントロールの発現レベルよりも高い場合に、前記患者がエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているとして同定すること、
である、請求項9から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
免疫療法および/またはワクチンが、感染性病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導することを目的としており、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)およびTable 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、(i)コントロールの発現レベルよりも高いTable 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベル、および/または(ii)コントロールの発現レベルよりも低いTable 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが、免疫応答がエフェクターT細胞応答に向けられていることを示し、および患者を免疫療法および/またはワクチンに対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
免疫療法および/またはワクチンが、自己免疫疾患またはアレルギーを処置することを目的としており、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、コントロールの発現レベルよりも高い少なくとも1つのこれらのマーカータンパク質またはそれらのmRNAの発現レベルが、免疫応答がレギュレーターT細胞応答に向けられていることを示し、および患者を免疫療法および/またはワクチンに対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
アレルギーを処置することを目的とする前記免疫療法が減感作療法であり、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)およびSTAB1の少なくとも1つ、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、前記コントロールの発現レベルよりも高いC1Qおよび/もしくはSTAB1、またはそれらのmRNAの発現レベルが、免疫応答がレギュレーターT細胞応答に向けられていることを示し、および患者を、減感作療法に対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するためのキットであって、
a)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段;ならびに
b)任意選択で、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定する際のキットの使用のための指示書、
を含む、キット。
【請求項１８】
患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するためのキットであって、
a)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段;ならびに
b)任意選択で、免疫応答が制御性T細胞応答に向けられているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられているかを決定する際のキットの使用のための指示書、
を含む、キット。
【請求項１９】
患者が、アレルギーを処置することを目的とする免疫療法に応答しているか否かを決定するためのキットであって、
a)C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)(配列番号45、46および47)およびSTAB1(配列番号51)の少なくとも1つ、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段;ならびに
b)任意選択で、患者が免疫療法に応答しているか否かを決定する際のキットの使用のための指示書、
を含む、キット。
【請求項２０】
免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットまたはエフェクター樹状細胞サブセットに向けて樹状細胞を極性化させるのに適した化合物についてスクリーニングするためのin vitro方法であって、
d)試験化合物を用意するステップ;
e)未成熟樹状細胞を試験化合物と接触させるステップ;
f)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの、樹状細胞による発現レベルを決定するステップ、
を含み、ここで、
(i)試験化合物と接触させた樹状細胞が、試験化合物と接触させていない未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルのレベルよりも高いレベルで、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを発現するという決定が、試験化合物が樹状細胞を免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに向けて極性化させるのに適していることを示し;一方
(ii)試験化合物と接触させた樹状細胞が、試験化合物と接触させていない未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルのレベルよりも低いレベルで、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを発現するという決定、ならびに/または、試験化合物と接触させていない未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルのレベルよりも高いレベルで、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを発現するという決定が、試験化合物が樹状細胞をエフェクター樹状細胞サブセットに向けて極性化させるのに適していることを示す、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するための方法、免疫療法を受けているおよび/またはワクチンが投与された患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するための方法、および免疫療法に対する応答を決定する方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞(本明細書中で以下「DC」と略す)は、適応免疫応答を組織化するための種々の入力シグナルを統合する、特化した抗原提示細胞である。
【０００３】
これらの細胞は、独特の相反する能力を有し、従って、2つの主要な異なる特化をしたサブポピュレーションに弁別することができる:一方は、エフェクター炎症促進性DC(炎症促進性DCとも呼ばれる)であり、もう一方は免疫寛容誘発性DC(制御性またはDCregとも呼ばれる)である。
【０００４】
エフェクターDCは、活性化された場合、Tリンパ球およびBリンパ球に対するペプチドおよびタンパク質の提示に重要であり、ナイーブT細胞を刺激するその能力のために、プロフェッショナルな抗原提示細胞(APC)として広く認識されている。
【０００５】
このサブポピュレーションは、感染性病原体および腫瘍に対する応答に関与する。遭遇する病原体または抗原の型ならびに関与する同時刺激分子のプロファイルに依存して、エフェクターDCは、Tヘルパーリンパ球の異なる極性化を誘導する能力、即ち、Th1、Th2またはTh17エフェクターCD4+T細胞の発生を導く能力を有する。
【０００６】
エフェクターDCサブポピュレーションは、それらが刺激できるヘルパーT細胞に関連して、少なくとも3つの異なる細胞サブセットに分割できる:Th1細胞(1型サイトカインIFN-γおよびIL-2を産生する細胞)の発生を導くDC1細胞サブセット、Th2細胞(2型サイトカインIL-4、IL-5およびIL-13を産生する細胞)の発生を導くDC2細胞サブセット、およびTh17細胞(IL-17を産生する細胞)の発生を導くDC17細胞サブセット。
【０００７】
対照的に、免疫寛容誘発性DCは、制御性(抑制性とも呼ばれる)CD4+T細胞の誘導、T細胞アネルギーおよびT細胞のクローン除去を介して、抗原(Ag)特異的免疫応答の抑制を媒介する。従って、免疫寛容誘発性DCは、臨床および/または免疫寛容を促進および維持すること、ならびに過剰な免疫応答および望ましくない免疫応答を制御することに、決定的に関与している。制御性T細胞は、自己免疫、慢性炎症を含むのに重要であるが、同種間幹細胞移植を促進し、固形組織同種移植片に対する寛容を媒介するためにも重要な免疫抑制機能を発揮する(Gregori. S、Tissue Antigens、77:89〜99、2011による総説を参照のこと)。さらに、制御性/免疫寛容誘発性DCは、吸入されたアレルゲンに対する炎症応答を抑制することが示されている(SwieckiおよびColonna、Eur. J. Immunol.、40:2094〜2098、2010;Kuipers、Vaccine、23(37):4577〜4588、2005;Lambrecht、Allergy、60(3):271〜282、2005)。
【０００８】
従って、DCとT細胞との間の双方向的な相互作用は、制御されない炎症および免疫応答を防止しつつ、適切な防御機構を確立するのに重要なエフェクター応答または免疫寛容誘発性応答のいずれかを惹起する。
【０００９】
しかし、異なるTh特異的極性化が、腫瘍、病原体、アレルゲンに対する免疫応答、および自己免疫または移植片拒絶に関与しているので、不適切なTヘルパーリンパ球の極性化は有害であり得る。例えば、制御性T細胞機能の不全は、多くの自己免疫疾患の発症に関与している(Roncaroloら、Nat. Rev. Immunol.、7:585〜598、2007)。さらに、感染性疾患または腫瘍の場合におけるエフェクター応答とは反対に、DCが免疫寛容誘発性応答を惹起する場合、制御性T細胞は、病原体または腫瘍細胞の免疫回避に寄与し得る。逆に、DCが免疫寛容誘発性応答ではなくエフェクター応答を惹起する場合、自己免疫反応、慢性炎症またはアレルゲン性応答が観察される。
【００１０】
減感作に関して、アレルゲン特異的免疫療法の臨床的効力を説明するための広く受け入れられたパラダイムは、Th2から制御性T細胞応答へ向かうシフトを特徴とするCD4+T細胞機能の制御である。これに関して、かかるエフェクターまたは制御性T細胞応答を開始および方向付けるDCの能力は、これらの細胞が、アレルギー性炎症およびその解決の両方に寄与し得ることを示唆している。例えば、DCが、アレルゲン特異的Th2応答を惹起および維持する能力を介して、アレルギー感作において役割を果たすという証拠が増加しつつある(Lambrecht、Allergy、60(3):271〜282、2005)。対照的に、免疫寛容誘発性DCは、口腔粘膜において検出されており、それ自体、舌下免疫療法後の寛容誘導への寄与において重要であると思われる。
【００１１】
今日、抗原特異的適応免疫応答の方向性を評価するために、および免疫療法プロトコルの効力をモニタリングするために、これらの極性化したDC(即ち、それぞれDC1、DC2、DC17と称される、Th1、Th2またはTh17エフェクターCD4+Tの発生を導くエフェクターDCサブセット、ならびに抑制性/制御性CD4+T細胞の発生、T細胞アネルギーの誘導およびT細胞のクローン除去を導く免疫寛容誘発性DCサブセット)を識別することは、大変興味深い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gregori. S、Tissue Antigens、77:89〜99、2011
【非特許文献２】SwieckiおよびColonna、Eur. J. Immunol.、40:2094〜2098、2010
【非特許文献３】Kuipers、Vaccine、23(37):4577〜4588、2005
【非特許文献４】Lambrecht、Allergy、60(3):271〜282、2005
【非特許文献５】Roncaroloら、Nat. Rev. Immunol.、7:585〜598、2007
【非特許文献６】Cheong, C.ら(Cell、143:416〜429、2010)
【非特許文献７】SallustoおよびLanzavecchia、J Exp Med、179:1109〜1118、1994
【非特許文献８】Wisniewskiら  Nat. Methods、6:359〜362、2009
【非特許文献９】Zimmer, A.ら、J. Immunol. 186:3966〜3976、2011
【非特許文献１０】Asselin-Labatら、Blood、104:215-223、2004
【非特許文献１１】Horak Fら(J. Allergy Clin. Immunol. 124:471〜477、2009)
【非特許文献１２】Moingeonら、Int. Arch. Allergy Immunol,. 146:338〜342、2008
【非特許文献１３】Ferreiraら、Proteomics Clin. Appl.、2:1349〜1360、2008
【非特許文献１４】Wataraiら、Proteomics、5:4001〜4011、2005
【非特許文献１５】Montiら、Transplantation、75:137〜145、2003
【非特許文献１６】Steinbrinkら、Blood、99:2468〜2476、2002
【非特許文献１７】Van Kooten, C.およびGelderman, K.A.、Methods Mol. Biol.、677:149〜159、2011
【非特許文献１８】Pennaら、J. Immunol.、178:145〜153、2007
【非特許文献１９】Ohtaniら、Immunology、126:485〜499、2009
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、本明細書中で、DC極性化を識別するための新規バイオマーカーを同定し、これらのバイオマーカーは、免疫療法/ワクチン接種プロトコル、特にアレルゲン特異的免疫療法を追跡するために使用することができた。
【００１４】
具体的には、Cheong, C.ら(Cell、143:416〜429、2010)によって示されたような、血液中においてアクセス可能な単球由来DCが種々の分化パターンに関連する機能的に適切なマーカーを発現するという証拠に合わせて、本発明者らは、適応免疫応答の初期の方向付けを調査するために、これらの細胞に焦点を当てた。
【００１５】
従って、本発明者らは、エフェクターヒトDCおよび免疫寛容誘発性ヒトDCの種々のサブセットをin vitroで発生させた後、2つの相補的定量プロテオミクス戦略、即ち、ディファレンシャルゲル電気泳動(DiGE)および無標識質量分析技術を使用して、これらの異なるサブセットの細胞全体プロテオームを比較した。
【００１６】
本発明者らは、エフェクター樹状細胞サブセットに対する(特にDC1、DC17に対する)ならびに免疫寛容誘発性樹状細胞についての種々のマーカータンパク質を同定した。
【００１７】
本発明者らはまた、マーカータンパク質が処置に対する応答の型式を示すこと、特に、C1Q(補体C1q)および/またはSTAB1(スタビリン-1(Stabilin-1))の過剰発現が、免疫寛容誘発性DCに関連すること、従って、アレルゲン特異的免疫療法によって誘導される臨床応答を示すことを実証した。実際に、かかる免疫寛容誘発性DCマーカーの発現は、発現を全体的に減退させたノンレスポンダーまたはプラセボで処置した患者とは反対に、舌下免疫療法の間に好首尾な臨床的応答を示すイネ科植物花粉アレルギー患者由来のPBMCにおいて増加した。
【００１８】
その最も広い態様において、本発明は、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するための、ならびに免疫療法下にあるおよび/またはワクチン接種された患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するための、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2.A(表6)〜Table 2.F(表11)に開示された、任意の1つまたは複数のマーカータンパク質、またはこれらのタンパク質のmRNAの使用に関する。別の実施形態において、このマーカーは、免疫療法処置/ワクチン接種の効力を決定するため(即ち、治療レスポンダー患者とノンレスポンダー患者との間を識別するため)に使用される。
【００１９】
従って、本発明の第1の態様は、樹状細胞サブセットを決定するin vitro方法を提供し、この方法は、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2.A(表6)〜Table 2.F(表11)に列挙されるマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの検出を含む。好ましい実施形態において、この少なくとも1つのマーカータンパク質(またはそれらのmRNA)は、好ましくは以下からなる群から選択される:
C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)(免疫寛容誘発性DCによって過剰発現され、エフェクターDCによって過小発現されるバイオマーカー、Table 1A(表1)およびTable 2A(表6)に列挙される);
TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、ラミン-A/C(配列番号32)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1D(表4)および/またはTable 2D(表9)に列挙される);
ITAM(CD11bとも呼ばれる)(配列番号15)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過小発現されるバイオマーカー、Table 1B(表2)およびTable 2B(表7)に列挙される);
MX1(配列番号41/42)(DC1サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1E(表5)およびTable 2E(表10)に列挙される);
PGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)(DC17サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 2F(表11)に列挙される)。
【００２０】
第2の態様において、このin vitro方法は、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するためのものであり、この方法は、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2.A(表6)〜Table 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの、試験される樹状細胞による発現レベルを決定するステップを含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、この少なくとも1つのマーカータンパク質(またはそれらのmRNA)は、好ましくは以下からなる群から選択される:
C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)(免疫寛容誘発性DCによって過剰発現され、エフェクターDCによって過小発現されるバイオマーカー、Table 1A(表1)およびTable 2A(表6)に列挙される);
TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、ラミン-AC(配列番号32)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1D(表4)および/またはTable 2D(表9)に列挙される);
ITAM(CD11bとも呼ばれる)(配列番号15)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過小発現されるバイオマーカー、Table 1B(表2)およびTable 2B(表7)に列挙される);
MX1(配列番号41/42)(DC1サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1E(表5)およびTable 2E(表10)に列挙される);
PGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)(DC17サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 2F(表11)に列挙される)。
【００２２】
別の実施形態において、この方法は、樹状細胞がエフェクター樹状細胞「DC1」サブセット(即ち、Th1 CD4+T細胞の発生を導くエフェクターDC)に属するか否かを決定するためのものである。この実施形態において、Table 1.E(表5)およびTable 2.E(表10)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは少なくともMX1(配列番号41/42)、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定される。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、この方法は、樹状細胞がエフェクター樹状細胞「DC17」サブセット(即ち、Th17 CD4+T細胞の発生を導くエフェクターDC)に属するか否かを決定するためのものである。この実施形態において、Table 2.C(表8)およびTable 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくはPGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定される。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、この方法は、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか否かを決定するためのものであり、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定される。より好ましい実施形態において、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)からなる群から選択される。有利には、このマーカータンパク質は、少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)および/またはSTAB1である。
【００２５】
さらなる好ましい実施形態において、この方法は、以下のステップを含む:
a)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するステップ;
b)この発現レベルを、コントロール標準またはコントロールサンプルの発現レベルと比較するステップ;
c)コントロールとの比較に基づいて、試験される樹状細胞が、樹状細胞のどのサブセットに属するかを同定するステップ。
【００２６】
コントロールサンプルが未成熟樹状細胞からなる場合、ステップc)は以下を含む:
Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNA、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、有利には、少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)および/またはSTAB1、またはそれらのmRNA、を過剰発現する樹状細胞を、免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するとして同定すること;ならびに/または
Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)およびITAM(配列番号15)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過小発現する樹状細胞;および/もしくは
Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、MX1(配列番号41/42)、ラミン-A/C(配列番号32)およびPGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞
を、エフェクター樹状細胞サブセットに属するとして同定すること。
【００２７】
さらに、コントロールサンプルが、免疫寛容誘発性サブセットまたはエフェクターサブセットに向けて極性化していない未成熟樹状細胞からなる場合、Table 1.E(表5)およびTable 2.E(表10)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、少なくともMX1(配列番号41/42)、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞が、エフェクター樹状細胞「DC1」サブセットに属するとして同定される。
【００２８】
未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルの発現レベルと比較して、Table 2.C(表8)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを過小発現する樹状細胞、および/またはTable 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、PGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)、またはそれらのmRNAを過剰発現する樹状細胞が、エフェクター樹状細胞「DC17」サブセットに属するとして同定される。
【００２９】
本発明の第3の態様において、このin vitro方法は、患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するためのものであり、この方法は、患者由来の生物学的サンプル中の、Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するステップを含む。好ましい実施形態において、この少なくとも1つのマーカータンパク質(またはそれらのmRNA)は、好ましくは以下からなる群から選択される:
C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)(免疫寛容誘発性DCによって過剰発現され、エフェクターDCによって過小発現されるバイオマーカー、Table 1A(表1)およびTable 2A(表6)に列挙される);
TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、ラミン-A/C(配列番号32)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1D(表4)および/またはTable 2D(表9)に列挙される);
ITAM(CD11bとも呼ばれる)(配列番号15)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過小発現されるバイオマーカー、Table 1B(表2)およびTable 2B(表7)に列挙される);
MX1(配列番号41/42)(DC1サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1E(表5)およびTable 2E(表10)に列挙される);
PGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)(DC17サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 2F(表11)に列挙される)。
【００３０】
本発明の第3の態様において、患者は、感染性疾患、腫瘍、自己免疫疾患、アレルギーなどの疾患に罹患している患者、または移植を受けた患者であり得る。さらに、患者は、上記疾患または移植片拒絶に対して処置されていてもいなくてもよい。
【００３１】
好ましい実施形態において、患者は、免疫療法を受けているおよび/またはワクチンが投与された患者である。
【００３２】
この方法が非処置患者から得られたサンプルに対して実施される場合、疾患に罹患している患者がどの型のT細胞応答を発生させているかを評価することが可能となる。
【００３３】
好ましくは、この方法は以下のステップを含む:
a)患者由来の生物学的サンプル中の、Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するステップ;
b)この発現レベルを、コントロール標準またはコントロールサンプルと比較するステップ;
c)コントロールとの比較に基づいて、患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させるか、またはエフェクターT細胞応答、特にTh1、Th2またはTh17応答に向けられた免疫応答を発生させるかを決定するステップ。
【００３４】
患者が処置されない場合、コントロールは、免疫寛容誘発性サブセットまたはエフェクターサブセットに向けて極性化していない未成熟樹状細胞からなってもよい。あるいは、コントロールは、試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質の健康な患者由来の生物学的サンプル(例えば、試験される生物学的サンプルが末梢血である場合には末梢血など)であってもよい。
【００３５】
患者が処置される場合、コントロールは、処置の開始前に得られたサンプルからなってもよく、この生物学的サンプルは、試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質のものである。
【００３６】
どの患者の型(即ち、処置されるまたは処置されない)でも、上で列挙したコントロールが使用される場合、ステップc)は以下のとおりである:
Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルがコントロールの発現レベルよりも高い場合に、患者を、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているとして同定することであって、より好ましくは、少なくとも1つのマーカータンパク質が、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)からなる群から選択され;有利には、マーカータンパク質は、少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)および/もしくはSTAB1である;
Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)およびITAM(配列番号15)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルがコントロールの発現レベルよりも低い場合;ならびに/または
Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、MX1(配列番号41/42)、ラミン-A/C(配列番号32)およびPGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルがコントロールの発現レベルよりも高い場合に、
患者を、エフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているとして同定すること。
【００３７】
さらに、患者が、エフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているとして同定される場合、エフェクター応答の型(特にTh1およびTh17応答)は、異なるエフェクター樹状細胞サブセットによるマーカータンパク質の発現レベルを決定することによって容易に評価できるが、これは、DC1細胞サブセットがTh1細胞(1型サイトカインIFN-γおよびIL-2を産生する細胞)の発生を導き、DC17細胞サブセットがTh17細胞(IL-17を産生する細胞)の発生を導くことが公知だからである。
【００３８】
Table 1.E(表5)およびTable 2.E(表10)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは少なくともMX1(配列番号41/42)、またはそれらのmRNAが、患者由来の生物学的サンプル中で過剰発現される場合、このエフェクター応答はTh1応答である。
【００３９】
他方、Table 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくはPGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)、またはそれらのmRNAが、患者由来の生物学的サンプル中で過剰発現される場合、このエフェクター応答はTh17応答である。
【００４０】
一実施形態において、患者は、感染性疾患または腫瘍に対する免疫応答を誘導することを目的として免疫療法を受けているおよび/またはワクチンが投与された患者である。この実施形態では、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)およびTable 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、(i)コントロールの発現レベルよりも高いTable 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、MX1(配列番号41/42)、ラミン-A/C(配列番号32)およびPGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベル、ならびに/または(ii)コントロールの発現レベルよりも低いTable 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)およびITAM(配列番号15)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルは、この免疫応答がエフェクターT細胞応答に向けられていることを示し、および患者を、この免疫療法および/またはワクチンに対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする。この実施形態において、コントロールは、好ましくは、処置の開始前に回収されたサンプルからなり、この生物学的サンプルは、試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質のものである。
【００４１】
別の実施形態において、患者は、自己免疫疾患またはアレルギーを処置することを目的として免疫療法を受けているおよび/またはワクチンが投与された患者である。この実施形態では、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙されるタンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、コントロールの発現レベルよりも高いこれらのマーカータンパク質の少なくとも1つ、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、有利には少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)および/もしくはSTAB1、またはそれらのmRNAの発現レベルは、この免疫応答がレギュレーターT細胞応答に向けられていることを示し、および患者を、この免疫療法および/またはワクチンに対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする。この実施形態において、コントロールは、好ましくは、処置の開始前に回収されたサンプルからなり、この生物学的サンプルは、試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質のものである。
【００４２】
特に好ましい実施形態において、患者は、アレルギーを処置することを目的とする免疫療法を受けており、好ましくは、この免疫療法は減感作療法であり、この免疫療法は、(i)アレルギーを誘発するアレルゲンに対する免疫応答を低減すること、および/または(ii)アレルギーの臨床症状の顕在化を低減することを目的としている。コントロール(処置の開始前に回収された、試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質の生物学的サンプル)の発現レベルよりも高いTable 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙されるタンパク質からなる群から選択されるマーカータンパク質の少なくとも1つ、またはそれらのmRNAの発現レベルは、この免疫応答が制御性T細胞応答に向けられていることを示し、および患者を、この免疫療法および/またはワクチンに対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする。有利には、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)(配列番号45、46および47)およびSTAB-1(配列番号51)の少なくとも1つ、またはそれらのmRNAの発現レベルが決定され、コントロールの発現レベルよりも高いC1QのサブユニットA、Bおよび/もしくはC、ならびに/またはSTAB1、またはそれらのmRNAのいずれかの発現レベルは、この免疫応答が制御性T細胞応答に向けられていることを示し、および患者を、この減感作療法(即ち、アレルギーを誘発するアレルゲンに対する免疫応答および/または(ii)アレルギーの臨床症状の顕在化が低減される)に対するレスポンダーである可能性が高いとの同定もする。
【００４３】
本発明はさらに、上記方法において有用なキットを開示する。
【００４４】
従って、本発明の第4の態様は、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定するためのキットに関し、このキットは以下を含む:
a)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段;ならびに
b)任意選択で、樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属するか、またはエフェクター樹状細胞サブセットに属するかを決定する際のキットの使用のための指示書。
【００４５】
本発明の第5の態様はまた、患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するためのキットに関し、このキットは以下を含む:
a)Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段;ならびに
b)任意選択で、免疫応答が制御性T細胞応答に向けられているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられているかを決定する際のキットの使用のための指示書。
【００４６】
本発明の第4および第5の態様について、このキットは、以下:
C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)(免疫寛容誘発性DCによって過剰発現され、エフェクターDCによって過小発現されるバイオマーカー、Table 1A(表1)およびTable 2A(表6)に列挙される);
TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、ラミン-A/C(配列番号32)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1D(表4)および/またはTable 2D(表9)に列挙される);
ITAM(CD11bとも呼ばれる)(配列番号15)(エフェクターDC DC1およびDC17の両方によって過小発現されるバイオマーカー、Table 1B(表2)およびTable 2B(表7)に列挙される);
MX1(配列番号41/42)(DC1サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 1E(表5)およびTable 2E(表10)に列挙される);
PGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)(DC17サブセットによって過剰発現されるバイオマーカー、Table 2F(表11)に列挙される)
からなる群から選択される、少なくとも1つの、および好ましい順で少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16もしくは17のマーカータンパク質(またはそれらのmRNA)の発現レベルを決定するための手段を好ましくは含む。
【００４７】
本発明の第6の態様は、患者が、アレルギーを処置することを目的とする免疫療法に応答しているか否かを決定するためのキットに関し、このキットは以下を含む:
a)C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)(配列番号45、46および47)および/もしくはSTAB1(配列番号51)の少なくとも1つ、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段;ならびに
b)任意選択で、患者が免疫療法に応答しているか否かを決定する際のキットの使用のための指示書。
【００４８】
有利には、このキットは、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙された少なくとも1つの他のタンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段をさらに含む。
【００４９】
任意選択で、本発明の第4、第5および第6の態様のキットは、いくつかのハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定するための手段をさらに含み得る。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明に従うキットは、少なくとも列挙されたマーカータンパク質の発現レベルを決定するための手段またはそれらのmRNAの発現を決定するための手段に加えて、既知の量の測定されるマーカータンパク質を含むコントロールサンプルを含む。
【００５１】
本発明の第4の態様に従うキットは、以下をさらに含み得る:
i.サンプル中のマーカータンパク質の濃度と試験される樹状細胞が属する起こり得るサブセット(即ち、免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットまたはエフェクター樹状細胞サブセット);帰結(短い平均余命、転移の発生、再発...)との間の関連性を示す標準コントロール曲線;
ii.未成熟樹状細胞中の測定されるマーカータンパク質の発現レベルを示すコントロールサンプル。
【００５２】
本発明の第5の態様に従うキットは、以下をさらに含み得る:
i.生物学的サンプル中のマーカータンパク質の濃度と制御性T細胞応答またはエフェクターT細胞応答に向けられたT細胞応答の起こり得る発生との間の関連性を示す標準コントロール曲線;
ii.健康な患者由来の同じ性質の生物学的サンプル中の測定されるマーカータンパク質の発現レベルを示すコントロールサンプル。
【００５３】
本発明の第6の態様に従うキットは、以下をさらに含み得る:
i.生物学的サンプル中のマーカータンパク質C1Qおよび/またはSTAB1の濃度とアレルギーの起こり得る帰結(レスポンダーまたはノンレスポンダー患者)との間の関連性を示す標準コントロール曲線;
ii.レスポンダー患者と同じ性質の生物学的サンプル中の測定されるマーカータンパク質の発現レベルを示すコントロールサンプル、および/またはノンレスポンダー患者と同じ性質の生物学的サンプル中の測定されるマーカータンパク質の発現レベルを示すコントロールサンプル。
【００５４】
Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2.A(表6)〜Table 2.F(表11)に列挙されるマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの発現レベルを決定するための手段は、当該分野で周知である。かかる手段には、例えば、リアルタイム定量PCRによるmRNAの検出を可能にする試薬、例えば、測定されるマーカータンパク質に特異的なプライマー、が含まれる。このキットが、リアルタイム定量PCR mRNA検出のための手段を含む場合、このキットは、PCRの間に合成されたmRNAに結合する、検出可能な化合物で標識された第2の試薬、例えば、SYBER GREEN試薬またはTaqMan試薬などをさらに含み得る。
【００５５】
マーカータンパク質の発現レベルを決定するための手段には、測定されるマーカータンパク質に特異的に結合する抗体もまた含まれ得る。かかる手段は、検出可能な化合物、例えば、フルオロフォアまたは放射性化合物で標識され得る。例えば、マーカータンパク質に特異的に結合するプローブまたは抗体は、検出可能な化合物で標識され得る。あるいは、キットが抗体を含む場合、このキットは、測定されるマーカータンパク質に特異的に結合する未標識の抗体に結合する、検出可能な化合物で標識された二次抗体をさらに含み得る。
【００５６】
マーカータンパク質の発現レベルを測定するための手段は、例えば、反応緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液および/または洗浄緩衝液などの試薬もまた含み得る。この手段は、例えばバイアルまたはマイクロタイタープレート中に存在し得、またはプライマーおよびプローブの場合に当てはまり得るように、マイクロアレイなどの固体支持体に結合され得る。
【００５７】
本発明の第7の態様は、免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットまたはエフェクター樹状細胞サブセットに向けて樹状細胞を極性化させるのに適した化合物についてスクリーニングするためのin vitro方法に関し、この方法は、以下:
a)試験化合物を用意するステップ;
b)未成熟樹状細胞をこの試験化合物と接触させるステップ;
c)Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2.A(表6)〜Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAの、樹状細胞による発現レベルを決定するステップ、
を含み、
ここで、コントロールが未成熟樹状細胞からなる場合:
(i)試験化合物と接触させた樹状細胞が、その試験化合物と接触させていない未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルのレベルよりも高いレベルで、Table 1.A(表1)およびTable 2.A(表6)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、有利には少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)および/もしくはSTAB1、またはそれらのmRNAを発現するという決定が、その試験化合物が樹状細胞を免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに向けて極性化させるのに適していることを示し;一方
(ii)試験化合物と接触させた樹状細胞が、その試験化合物と接触させていない未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルのレベルよりも低いレベルで、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 2.B(表7)、Table 2.C(表8)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、C1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC、それぞれ配列番号45、46、47)、CATC(配列番号48)、MRC1(配列番号50)、STAB1(配列番号51)、TPP1(配列番号5)およびITAM(配列番号15)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを発現するという決定、ならびに/またはその試験化合物と接触させていない未成熟樹状細胞からなるコントロールサンプルのレベルよりも高いレベルで、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)、Table 2.D(表9)、Table 2.E(表10)、Table 2.F(表11)に列挙される少なくとも1つのマーカータンパク質、より好ましくは、TFR1(CD71としても公知)(配列番号72)、NMES1(配列番号68)、TRAF1(配列番号75)、FSCN1(配列番号23)、IRF4(配列番号35)、MX1(配列番号41/42)、ラミン-A/C(配列番号32)およびPGRP1(配列番号108に示されるウシ配列)からなる群から選択される少なくとも1つのマーカータンパク質、またはそれらのmRNAを発現するという決定が、その試験化合物が樹状細胞をエフェクター樹状細胞サブセットに向けて極性化させるのに適していることを示す。
【００５８】
マーカータンパク質
用語「マーカータンパク質」には、これらのタンパク質の全てのアイソフォームが含まれる。従って、上記マーカータンパク質について、用語「マーカータンパク質」は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその全てのアイソフォームを含む。「アイソフォーム」は、タンパク質の全ての代替的な形態、例えば、アミノ酸置換形態、選択的スプライシングバージョンおよび翻訳後修飾形態、例えばグリコフォームを指す。翻訳後修飾アイソフォームには、アセチル化、ホルミル化、リポイル化、ミリストイル化、パルミトイル化、アルキル化、メチル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ニトロシル化、リン酸化、硫酸化、ポリシアル酸化およびシアル酸付加形態が含まれ得る。アイソフォームには、そのタンパク質の、天然に存在するバリアント、対立遺伝子バリアント、SNP(一塩基多型)、選択的スプライシングバリアントおよび短縮形態または分泌形態が含まれる。選択的スプライシングおよび短縮された、マーカータンパク質をコードするmRNAもまた、検出され得る。
【００５９】
マーカータンパク質の「発現レベル」の検出は、このタンパク質の任意の個々のアイソフォームの発現レベル;このタンパク質の選択されたアイソフォームの集合的な発現レベル;または参照配列および全てのアイソフォームを含む、このタンパク質の発現の総レベル、を指し得る。
【００６０】
一実施形態において、このマーカータンパク質は、Table 1(表1〜5)およびTable 2(表6〜11)に列挙されるUni-Prot/Swiss-Protアクセッション番号に対応する配列を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Table 1.A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2.A(表6)〜Table 2.F(表11)に列挙される単一のマーカータンパク質もしくはタンパク質のタンパク質アイソフォーム、またはそれらのmRNAの検出を含む。他の実施形態において、Table 1A(表1)、Table 1.B(表2)、Table 1.D(表4)、Table 1.E(表5)およびTable 2A(表6)〜Table 2F(表11)に列挙される1よりも多いタンパク質もしくはタンパク質アイソフォーム、またはそれらのmRNA、例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは少なくとも30のタンパク質もしくはタンパク質アイソフォーム、またはそれらのmRNAが、検出される。
【００６２】
特定の実施形態において、少なくともC1Q(サブユニットA、Bおよび/またはC)および/またはSTAB1を含むバイオマーカーのセットが使用される。
【００６３】
補体C1q(C1Q)は、血清補体系に関与する。ヒトにおいて、C1Qは、18のポリペプチド鎖:6つのAサブユニット(UniProt/Swiss-Protアクセッション番号C1QA_HUMAN、245アミノ酸長)、6つのBサブユニット(UniProt/Swiss-Protアクセッション番号C1QB_HUMAN、253アミノ酸長)および6つのCサブユニット(UniProt/Swiss-Protアクセッション番号C1QCA_HUMAN、245アミノ酸)から構成される。C1Qは、1:2:2のモル比でプロ酵素C1rおよびC1sと会合して、血清補体系の第1の構成要素であるC1を生じる。
【００６４】
スタビリン1(STAB1)は、1回膜貫通I型タンパク質であり、ヒトでは2570残基長である(前駆体形態)。スタビリン1は、アセチル化された低密度リポタンパク質のスカベンジャーレセプターとして機能し、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に結合し、細菌感染に対する防御において役割を果たし得る。2つのアイソフォームがヒトにおいて同定されている。
【００６５】
タンパク質アイソフォームまたはそれらのmRNAの発現レベルにおける増加または減少が、以下に詳述するように、コントロールと比較して生物学的サンプルにおいて検出され得る。コントロールと比較した患者サンプルにおける変化倍率は、少なくとも1.2倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.8倍、少なくとも2倍、少なくとも2.2倍、少なくとも2.4倍、少なくとも2.6倍、少なくとも2.8倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍または少なくとも8倍であり得る。
【００６６】
本明細書を通じて使用する場合、Table 1(表1〜5)およびTable 2(表6〜11)の「マーカータンパク質」に対する任意の言及は、ヒトによって天然にコードされる、このマーカータンパク質の任意の天然に存在するアイソフォームを包含するが、他の動物の相同およびオルソロガスな対応物もまた包含する意味である。患者は、好ましくは哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌまたは霊長類であり、好ましくはヒト、特に小児、女性、男性である。
【００６７】
試験されるサンプルの起源(例えば、げっ歯類、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌまたは霊長類...)に依存して、当業者は、一般に公知の配列データベースを参考にして、どのマーカーの配列が検出されるかを容易に決定し、従って、これらのマーカーを検出するのに適した手段を選択する。
【００６８】
例えば、患者がヒトである場合、用語「マーカータンパク質」は、Table 1(表1〜5)およびTable 2(表6〜11)に列挙されるアクセッション番号の配列に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質、Table 1(表1〜5)およびTable 2(表6〜11)に列挙される非ヒト配列のヒト等価物、その対立遺伝子バリアントおよびそのスプライスバリアントを含む、ヒトゲノムによって天然にコードされるマーカータンパク質の任意の天然に存在するアイソフォームを意味する意図である。
【００６９】
生物学的サンプル
生物学的サンプルは、血液(例えば、末梢血、PBMC)、血漿、血清、粘膜(例えば、鼻分泌物、唾液)、気管支肺胞脳脊髄液または尿であり得るがこれらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織、最も具体的には粘膜表面由来のものであり得る。いくつかの実施形態において、この生物学的サンプルは、抗原提示細胞(即ち、単球、マクロファージおよび/または樹状細胞)、より好ましくは樹状細胞を含む。しかし、マーカータンパク質は、体抗原提示細胞自体を含まない体液または組織中に分泌され得そこで検出され得るので、サンプルは必ずしも抗原提示細胞を含まなくてもよい。
【００７０】
生物学的サンプルは好ましくは、治療の開始前または治療の計画された開始前に採取される。サンプルは、治療の開始後、例えば、さらなるラウンドに進めるかどうかを決定するために、1ラウンドの治療が完了した後にも、採取され得る。特に、この方法が、免疫療法を受けている患者のモニタリングを含む場合、治療の開始前、治療の間、および/または治療の終了時に採取されたサンプルが、必要とされ得る。
【００７１】
アレルギーに関連する本発明の全ての態様において、この生物学的サンプルは、好ましくは末梢血もしくはPBMC、鼻分泌物、唾液または気管支肺胞液である。
【００７２】
コントロール
試験される樹状細胞による、または適切な場合には患者の生物学的サンプル中のマーカータンパク質の発現は、コントロール標準値と、および/または上で説明されたコントロールサンプル、例えば同じ性質のコントロールサンプル中のマーカーの発現と、比較され得る。
【００７３】
標準値は、例えば、所与のサブセットの樹状細胞(例えば、未成熟樹状細胞、エフェクター樹状細胞または免疫寛容誘発性樹状細胞)または所与の群の対象(例えば、健康な対象、制御性T細胞応答もしくはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させている患者、処置に対するレスポンダーとして以前に同定された患者、または処置に対するノンレスポンダーとして以前に同定された患者)における発現レベルを検出し、平均または中央値の数値を得ることによって、得られ得る。
【００７４】
コントロールサンプルは、未成熟樹状細胞からなり得る。本発明の文脈において、用語「未成熟樹状細胞」は、樹状細胞が活性化されておらず、免疫寛容誘発性サブセットまたはエフェクターサブセットに向けて極性化していないことを意味する意図である。未成熟樹状細胞は、当業者に周知の方法によって末梢血から(例えば、PBMCから)ソートされた単球から得られ得る。かかる方法は、例えば、SallustoおよびLanzavecchia、J Exp Med、179:1109〜1118、1994中、および本出願の実施例において開示されている。DCの他の供給源には、形質細胞様DC(血液、PBMC、組織から)、真皮DCおよびランゲルハンス細胞(皮膚または粘膜組織から)が含まれる。
【００７５】
当業者に明らかなように、試験される樹状細胞の、または適切な場合には試験される患者の生物学的サンプル中の樹状細胞の、コントロールとの比較の性質、ならびに導かれる結論は、コントロールの性質に依存する。
【００７６】
例えば、マーカータンパク質が、免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットにおいて過剰発現されるタンパク質として本明細書中で開示され、コントロールが、未成熟樹状細胞またはエフェクター樹状細胞サブセットに基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも低い値は、試験される樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属さないことを示し得るが、コントロールよりも高い値は、試験される樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属することを示し得る。逆に、コントロールが免疫寛容誘発性樹状細胞に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも高い値は、試験される樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属することを示し得、コントロールよりも低い値は、試験される樹状細胞が免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに属さないことを示し得る。
【００７７】
同様に、マーカータンパク質が、エフェクター樹状細胞サブセットにおいて過剰発現されるタンパク質として本明細書中で開示され、コントロールが、未成熟樹状細胞または免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも低い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属さないことを示し得るが、コントロールよりも高い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属することを示し得る。逆に、コントロールがエフェクター樹状細胞に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも高い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属することを示し得、コントロールよりも低い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属さないことを示し得る。
【００７８】
同様に、マーカータンパク質が、エフェクター樹状細胞サブセットにおいて過小発現されるタンパク質として本明細書中で開示され、コントロールが、未成熟樹状細胞または免疫寛容誘発性樹状細胞サブセットに基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも高い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属さないことを示し得るが、コントロールよりも低い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属することを示し得る。逆に、コントロールがエフェクター樹状細胞に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも低い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属することを示し得、コントロールよりも高い値は、試験される樹状細胞がエフェクター樹状細胞サブセットに属さないことを示し得る。
【００７９】
同じ型の論法が、患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定するために適用される。
【００８０】
例えば、上で例示されたように、患者が処置されていない実施形態に関して、コントロールは、免疫寛容誘発性サブセットもしくはエフェクターサブセットに向けて極性化していない未成熟樹状細胞、または試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質の健康な患者由来の生物学的サンプルであり得る。コントロールはまた、エフェクター樹状細胞、免疫寛容誘発性樹状細胞、制御性T細胞応答を発生させている患者の生物学的サンプル、エフェクターT細胞応答を発生させている患者の生物学的サンプルであり得る。試験されるDCがどの樹状細胞サブセットに属するかについての決定に関して、上記と類似の論法に基づいて、コントロールの型に依存して、当業者は、患者が、制御性T細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているか、またはエフェクターT細胞応答に向けられた免疫応答を発生させているかを決定することができる。
【００８１】
上で例示されるように、患者が処置されている実施形態に関して、コントロールは、試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質の患者または患者の群由来の生物学的サンプルであり得、サンプルは、処置が開始する前に得られたものである(本発明の第3の態様を参照のこと)。好ましくは、コントロールは、処置を受けている患者から取得された、処置前サンプルである。コントロールはまた、エフェクター樹状細胞、免疫寛容誘発性樹状細胞、制御性T細胞応答を発生させている患者由来の生物学的サンプル、エフェクターT細胞応答を発生させている患者由来の生物学的サンプルであり得る。さらに、患者が処置に対するレスポンダーである可能性が高いかノンレスポンダーである可能性が高いかを決定することを望む場合、コントロールは、健康な患者由来の生物学的サンプル、処置に対するレスポンダーとして以前に同定された患者由来の生物学的サンプル、処置に対するノンレスポンダーとして以前に同定された患者由来の生物学的サンプル(試験される生物学的サンプルの性質と同じ性質の生物学的サンプルであって、サンプルは、処置の開始前に得られた患者サンプルである)であり得る。
【００８２】
マーカータンパク質が、レスポンダー対象において過剰発現されるタンパク質として本明細書中で開示され、コントロールが、ノンレスポンダー対象またはかかる対象の群に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも低い値は、治療に対する非応答性を示し得、コントロールよりも高い値は、治療に対する応答性を示し得る。逆に、コントロールがレスポンダー対象またはかかる対象の群に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも高い値は、治療に対する応答性を示し得、コントロールよりも低い値は、治療に対する非応答性を示し得る。コントロールが、対象のランダム群から得られた平均値または中央値に基づく場合、コントロールよりも高い値は、治療に対する応答性を示し得る。好ましくは、この方法は、患者が治療に対して応答しているか否かを確立するために、治療の間に患者をモニタリングすることを意図し、治療の間のマーカータンパク質発現における増加または減少は、処置に対する応答性を示す。
【００８３】
同様に、マーカータンパク質が、レスポンダー対象において過小発現されるタンパク質として本明細書中で開示され、コントロールが、ノンレスポンダー対象またはかかる対象の群に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも高い値は、治療に対する非応答性を示し得、コントロールよりも低い値は、治療に対する応答性を示し得る。コントロールがレスポンダー対象またはかかる対象の群に基づいている場合、コントロールと同じ値またはコントロールと類似の値またはコントロールよりも低い値は、治療に対する応答性を示し得、コントロールよりも高い値は、治療に対する非応答性を示し得る。コントロールが、対象のランダム群から得られた平均値または中央値に基づく場合、コントロールよりも低い値は、治療に対する応答性を示し得る。この方法が、患者が治療に対して応答しているか否かを確立するために、治療の間に患者をモニタリングすることを意図している場合、治療の間のマーカータンパク質発現における低減は、処置に対する応答性を示す。
【００８４】
本発明の文脈において、用語「過剰発現」および「過剰発現する」は、コントロールの発現レベルよりも高い所与のタンパク質マーカーまたはそれらのmRNAの発現レベルを意味する意図である。他方、用語「過小発現」および「過小発現する」は、コントロールの発現レベルよりも低い所与のタンパク質マーカーまたはそれらのmRNAの発現レベルを意味する意図である。
【００８５】
マーカータンパク質の検出/マーカータンパク質の発現レベルの決定
マーカータンパク質の発現レベルは、サンプルまたはそのタンパク質含有抽出物に対して実施されるゲル電気泳動(SDS-PAGE)、特に1次元および2次元ゲル電気泳動(1D-PAGE、2D-PAGE)によって決定され得る。2D-PAGEは、タンパク質が等電点電気泳動によって1つの次元で最初に分離され、第2の次元に沿ってSDS-PAGEによってさらに分離される、十分に確立された技術である。タンパク質発現は、標識されたタンパク質の可視化によって、またはウエスタンブロッティング(即ち、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用する)によって分析され得る。2D-PAGEによるタンパク質定量は、2D-DiGEによって通常実施され、この方法では、コントロールサンプル由来のタンパク質と試験サンプル由来のタンパク質とが、異なる色素で標識される。標識されたタンパク質が、ゲル上の同じ位置に移動し、単一のゲル内で定量を実施することが可能になるように、これらの色素は、類似の質量および同一の電荷の色素である。
【００８６】
タンパク質発現は、質量分析アッセイ(LC-MSまたはLC-MS/MS)によっても決定され得る。定性的質量分析技術および定量的質量分析技術は、当該分野で公知であり、使用されている。この目的のために、マーカータンパク質に特異的な標的ペプチドが選択され、安定な同位体で標識された合成ペプチドを用いて確立された較正曲線に基づいて定量される。規定された量の同位体標識された標的ペプチドで急上昇した酵素消化は、質量分析と連結された液体クロマトグラフィーによって分析される。標識された標的ペプチドと非標識標的ペプチドとの間の比率が、標的ペプチド濃度、および従ってタンパク質マーカー濃度を評価するために測定される。
【００８７】
発現は、このタンパク質に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、抗体バリアントまたは断片、例えば単鎖抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体(minibody)、単鎖Fv断片(sc(Fv))、Sc(Fv)2抗体、Fab断片もしくはF(ab')2断片、VHH抗体または単一ドメイン抗体を使用して決定することもできる。抗体は、1価、2価、3価または多価であり得る。抗体は、固体支持体上に固定化され得る。抗体は、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学/免疫蛍光(即ち、固定された細胞または組織でのタンパク質検出)、ラジオイムノアッセイ、例えばRIA(放射性結合(radio-linked)イムノアッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、例えば、FIA(蛍光結合(fluorescence-linked)イムノアッセイ)、化学発光イムノアッセイ、ECLIA(電気化学発光イムノアッセイ)およびプロテインAイムノアッセイなどの技術を使用する競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系を含む、広範な免疫学的アッセイにおいてタンパク質発現を決定するために使用され得る。かかるアッセイは、当業者にとって慣用的および周知である。
【００８８】
発現は、タンパク質特異的アプタマーを使用して代替的に決定され得る。アプタマーは、特定のタンパク質配列に特異的に結合することが可能な短いペプチドであり、タンパク質足場に対して両端で結合した可変性のペプチドループからなる。タンパク質アプタマーを作製するための方法は、当該分野で周知であり、最も一般に使用される方法は、酵母ツーハイブリッド系である。かかるアプタマーは好ましくは、タンパク質-リガンド相互作用の検出を可能にするために、標識され得る。ナノ技術ベースのアッセイも使用され得る。
【００８９】
マーカータンパク質のmRNAの検出/マーカータンパク質のmRNAの発現レベルの決定
mRNAの発現レベルは、測定されるマーカータンパク質に特異的なプライマーを使用して、リアルタイム定量RT-PCRによって決定され得る。この方法は、少なくとも1つのプライマーを使用して逆転写によってcDNAを生成し;こうして生成されたcDNAを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして遺伝子特異的ポリヌクレオチドを使用して増幅し;当業者に周知の方法によって、増幅されたcDNAの存在を決定することによって、生物学的サンプル中のmRNAの検出を可能にする。これには、SYBR GREEN試薬またはTaqman試薬を使用する、予め設計された特異的プライマーを用いたcDNA増幅が含まれる。
【００９０】
治療的適用
「治療」、「治療的」、「処置」または「処置すること」には、疾患(例えば、感染性疾患、腫瘍、自己免疫疾患)の症状または病的状態(例えば、アレルギーおよび移植片拒絶)の症状を低減、軽減または阻害または排除すること、ならびにこれらの症状を低減、軽減、阻害または排除することを意図した処置が含まれる。これらの用語は、さらなる症状を低減、軽減、阻害または排除することを意図した、またはさらなる症状を低減、軽減、阻害または排除する効果を有する、予防的処置もまた含み得る。これらには、進行中の症状の処置もまた含まれ得る。
【００９１】
「腫瘍」は、任意の型のがん性(悪性)腫瘍を意味する。
【００９２】
悪性腫瘍は、例えば癌腫、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、中皮腫、芽腫であり得る。癌腫または腺癌は、例えば、膀胱、結腸、腎臓、卵巣、前立腺、肺、子宮、乳房または前立腺の癌腫または腺癌に対応し得る。芽腫は、例えば、神経芽腫、膠芽腫または網膜芽細胞腫に対応し得る。がんは、好ましくは、前立腺がん(例えば、前立腺腺癌)、肺がん(例えば、扁平上皮癌腫)、乳がん(例えば、浸潤した腺管癌腫)、卵巣がん(例えば、漿液性乳頭状癌腫)、子宮がん(扁平上皮癌腫)、脳がん(例えば、星状細胞腫)、結腸がん(例えば、結腸腺癌)、結腸直腸がん、直腸がん(例えば、直腸腺癌)、横紋筋のがん(例えば、横紋筋肉腫)、甲状腺がん、精巣がんからなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、がんは、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮がん、脳がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がんおよび横紋筋のがん、膀胱がん、肝臓がん、腎臓がん、甲状腺がんからなる群から選択される。
【００９３】
伝染性(contagious)疾患または伝播性(transmissible)疾患としても公知の「感染性(infectious)疾患」は、1つの対象から別の対象に広がり得る生物学的因子に起因する任意の疾患を意味する。この生物学的因子は、ウイルス、細菌、真菌、原生生物および多細胞寄生生物であり得る。
【００９４】
「自己免疫疾患」は、健康な身体組織を免疫系が誤って攻撃し破壊する場合に生じる状態である。自己免疫(または自己免疫関連)障害の例には、アジソン病、セリアック病-スプルー(グルテン過敏性腸症)、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスおよびI型糖尿病が含まれる。
【００９５】
「移植片拒絶」は、レシピエントによる移植片(臓器、組織または細胞)の拒絶である。この拒絶は、移植片の細胞に対する細胞媒介性および抗体媒介性の両方の免疫に基づき得る。この移植片は、例えば、異種移植片(即ち、1つの種から別の種に移植される組織)または同種移植片(即ち、レシピエントと同じ種のものではあるが遺伝的にレシピエントと異なるドナーから得られた組織の移植片)であり得る。
【００９６】
「アレルギー」は、特定のアレルゲン、通常はタンパク質に対する応答におけるアレルゲン特異的IgEの産生を特徴とする状態である。アレルギーの臨床的顕在化および症状には、鼻閉、鼻そう痒症、眼そう痒症、流涙、鼻漏、副鼻腔炎、鼻炎、くしゃみ、喘鳴、結膜炎、皮膚そう痒、皮膚炎、皮膚刺激および喘息が含まれ得る。
【００９７】
「アレルゲン」は、素因のある個体におけるIgE抗体の産生を惹起する物質、通常はタンパク質である。アレルゲンには、花粉アレルゲン(例えば、樹木、草本、雑草およびイネ科植物花粉アレルゲン)、昆虫アレルゲン(例えば、吸入抗原、唾液および毒液アレルゲン、例えば、ゴキブリ、小昆虫およびチリダニアレルゲンおよびハチ目毒液アレルゲン)、動物の毛およびフケアレルゲン(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス、ウサギ由来)ならびに食物アレルゲンが含まれ得る。好ましい実施形態において、患者は、イネ科植物花粉アレルギーを有し、免疫療法はイネ科植物花粉アレルゲンを使用する。
【００９８】
例えば、タンパク質アレルゲンは、ヒョウダニ(Dermatophagoides)属のタンパク質アレルゲン;フェリス(Felis)属のタンパク質アレルゲン;アンブロシア(Ambrosia)属のタンパク質アレルゲン;ロリウム(Lolium)属のタンパク質アレルゲン;スギ(Cryptomeria)属のタンパク質アレルゲン;アルテルナリア(Alternaria)属のタンパク質アレルゲン;ハンノキ(Alder)属のタンパク質アレルゲン、ベチュラ(Betula)属のタンパク質アレルゲン;ブロミア(Blomia)属のタンパク質アレルゲン;ケルクス(Quercus)属のタンパク質アレルゲン;オリーブ(Olea)属のタンパク質アレルゲン;アルテミシア(Artemisia)属のタンパク質アレルゲン;プランタゴ(Plantago)属のタンパク質アレルゲン;ヒカゲミズ(Parietaria)属のタンパク質アレルゲン;イヌ(Canine)属のタンパク質アレルゲン;チャバネゴキブリ(Blattella)属のタンパク質アレルゲン;アピス(Apis)属のタンパク質アレルゲン;イトスギ(Cupressus)属のタンパク質アレルゲン;クロベ(Thuya)属のタンパク質アレルゲン;ヒノキ(Chamaecyparis)属のタンパク質アレルゲン;ペリプラネタ(Periplaneta)属のタンパク質アレルゲン;アグロピロン(Agropyron)属のタンパク質アレルゲン;セカレ(Secale)属のタンパク質アレルゲン;トリチカム(Triticum)属のタンパク質アレルゲン;シノドロン(Cynorhodon)属のタンパク質アレルゲン;ジュニペルス(Juniperus)属のタンパク質アレルゲン;カモガヤ(Dactylis)属のタンパク質アレルゲン;フェスツカ(Festuca)属のタンパク質アレルゲン;ポア(Poa)属のタンパク質アレルゲン;ロリウム(Lolium)属のタンパク質アレルゲン;アベナ(Avena)属のタンパク質アレルゲン;ホルクス(Holcus)属のタンパク質アレルゲン;アントキサンタム(Anthoxanthum)属のタンパク質アレルゲン;アレナテルム(Arrhenatherum)属のタンパク質アレルゲン;アグロスチス(Agrostis)属のタンパク質アレルゲン;フレウム(Phleum)属のタンパク質アレルゲン;クサヨシ(Phalaris)属のタンパク質アレルゲン;スズメノヒエ(Paspalum)属のタンパク質アレルゲン;およびソルガム(Sorghum)属のタンパク質アレルゲンからなる群から選択され得る。
【００９９】
上で特定した属のいくつかから誘導される種々の公知のタンパク質アレルゲンの例には以下が含まれる:ベチュラ(ベルコサ(verrucosa))Bet v I;Bet v II;ブロミアBlo 1 1;Blo t III;Bio t V;Bio t XII;シノドロンCyn d I;ヒョウダニ属(ヤケヒョウダニ(pteronyssinus)またはコナヒョウダニ(farinae))Der p I;Der p II;Der p III;Der p VII;Der f I;Der f II;Der f III;Der f VII;フェリス(ドメスティクス(domesticus))Fel d I;アンブロシア(アルテミイスフォリア(artemiisfolia))Amb a 1.1;Amb a 1.2;Amb a 1.3;Amb a 1.4;Amb a II;ロリウム(Lolium)(ホソムギ(perenne))Lol p I;Lot p II;Lol p III;Lot p IV;Lol p IX(Lol p VまたはLol p Ib);スギ属(スギ(japonica))Cry j I;Cry j II;カニス(Canis)(イエイヌ(familiaris))Can f I;Can f II;ジュニペルス(サビノイデス(sabinoides)またはビルギニアナ(virginiana))Jun s I;Jun v I;ジュニペルス(アシェイ(ashei))Jun a I;Jun a II;カモガヤ属(グロメラタ(glomerata))Dae g I;Dae g V;ポア(プラテンシス(pratensis))Poa p I;Phl p I;Phl p V;Phl p VIおよびソルガム(ハレペンシス(halepensis))Sor h I。
【０１００】
「免疫療法」は、物質(例えば、アレルゲン、免疫調節剤、例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン、イミキモド、細菌由来の細胞膜画分、サイトカイン/インターロイキン(例えば、IL-2、IL-7、IL-12)、種々のケモカイン)または細胞(例えば、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、細胞傷害性Tリンパ球)の投与によって免疫応答を誘導、増強または抑制することによる、疾患の処置を意味する意図である。
【０１０１】
「ワクチン」は、抗原と、任意選択で、個体の免疫系を刺激してその抗原に対する適応免疫を発生させるアジュバントとを含む医薬組成物を指す。この抗原は、例えば、生物学的因子(例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生生物および多細胞寄生生物)もしくはそれら由来のペプチド、または腫瘍抗原であり得る。
【０１０２】
ワクチンは、予防的(例えば、病原体生物学的因子によるさらなる感染の影響を予防または寛解させるため)または治療的(例えば、がんに対するワクチン)であり得る。
【０１０３】
免疫療法およびワクチンにおいて使用される物質は、非経口経路を介して、例えば、皮下もしくは静脈内に、例えば、注射を介して、または代替的経路を介して、例えば、鼻腔内、皮膚免疫化、例えば、経皮、リンパ内投与または粘膜(粘膜表面、例えば、舌下、口腔、頬、眼、直腸、泌尿器(urinal)、膣、肺もしくは耳鼻咽喉(otolar)表面への投与)を介して、投与され得る。
【０１０４】
アレルギーに関して、免疫療法は、例えば、現在の免疫応答もしくは将来の免疫応答、例えばIgE応答、および/またはアレルギーの臨床症状の顕在化を低減する目的で、患者にアレルゲンを投与することからなり得る。免疫療法は、それを必要とする患者に、単一用量または増分用量のアレルゲンを繰り返し投与し、それにより、アレルゲンに対して減感作される患者の適応免疫応答を生じることによって、慣用的に実施されている。免疫療法は、粘膜表面、任意選択で、舌下、口腔、頬、眼、直腸、泌尿器、膣、肺または耳鼻咽喉表面へのアレルゲンの投与を含み得る。特に、免疫療法は舌下免疫療法であり得る。あるいは、免疫療法は、非経口経路を介した投与、例えば皮下もしくは静脈内の、例えば、注射を介した、または代替的経路を介した投与、例えば、鼻腔内、皮膚免疫化、例えば、経皮もしくはリンパ内投与を含み得る。
【０１０５】
免疫療法に使用されるアレルゲンは、単一のアレルゲン性物質またはかかる物質の混合物、例えば、タンパク質の混合物であり得る。アレルゲンは、部分的にまたは完全に精製された抽出物、例えば、花粉抽出物、組換えタンパク質、低アレルゲン(hypoallergen)またはそれらから誘導されるペプチドであり得る。例えば、免疫療法がイネ科植物花粉アレルギーを処置するために使用される場合、免疫療法のために投与されるアレルゲンは、カモガヤ属、ポア属、ロリウム属、アントキサンタム属およびフレウム属などの、イネ科植物の1つまたはいくつかの属の花粉由来のイネ科植物花粉抽出物であり得る。アレルゲンは、アレルゴイド(allergoid)、即ち、(例えばアルデヒド化(aldehydation)によって)化学的に改変された、天然に存在するアレルゲンの化学的に改変された形態であってもよい。アレルゲンは、アジュバントと合わせて投与され得る。
【０１０６】
処置に対する患者の「応答」は、その患者が、臨床症状における低減を顕在化することを示す。臨床症状は、処置の過程にわたって評価され得る、即ち、処置前の症状が、処置の間および処置後の症状と比較され得る。あるいは、症状における低減は、処置前に確立されたベースラインレベルに対する比較によって決定され得る。アレルギーに関して、このアプローチは、例えば、現在症状を経験していない患者において免疫療法が実施される場合に特に有用であるが、同様に、花粉の季節の前に処置され得る季節性イネ科植物花粉アレルギー罹患者の場合に当てはまり得る。症状は、患者の自己評価、または必要とされる薬物療法の量の記録などの標準的な方法によって評価され得る。処置に対する患者の応答の程度は、例えば、以下の実験の項に記載されるように、症状における重症度の低減の程度を測定することによって評価され得る。「レスポンダー」対象は、本明細書中で規定されるように、臨床症状における改善、好ましくは、プラセボを受けている患者または処置を受けていない患者と比較したときに統計的に有意な改善で、免疫療法に応答する対象である。好ましくは、レスポンダー対象は、対象のランダムサンプルにおいて見られる平均または中央値の改善よりも大きい、臨床症状における改善を実証する。「ノンレスポンダー」対象は、免疫療法後の臨床症状における改善をいずれも顕在化させない対象、または症状における統計的に有意でない改善を実証する対象、または対象のランダムサンプルにおいて見られる平均または中央値の改善よりも小さい、臨床症状における改善を実証する対象である。例えば、アレルギーがイネ科植物花粉アレルギーである場合、臨床症状における改善は、鼻閉、鼻そう痒症、眼そう痒症、流涙、鼻漏、副鼻腔炎、鼻炎、くしゃみ、喘鳴および/または結膜炎の頻度または重症度における低減によって検出され得る。
【０１０７】
「患者」には、現在治療を受けていない個体を含む、免疫療法またはワクチンの候補である任意の個体が含まれる。
【０１０８】
アレルギーに関して、ほとんどの場合、患者は、アレルギーの臨床症状および/またはアレルゲンに対する感作および/またはアレルゲン特異的IgE応答を有する個体、または過去の任意の時点においてアレルギーの臨床症状および/またはアレルゲンに対する感作および/またはアレルゲン特異的IgE応答を有した個体、またはかかる症状を発症する危険性のある個体である。アレルゲンに対する感作は、患者の血清中のこの供給源由来のアレルゲンに対するIgEを検出すること、または対応するアレルゲンを含む調製物を用いて皮膚試験することによって、評価され得る。アレルゲンには、本明細書中に開示される任意のアレルゲン、特にイネ科植物花粉アレルゲンが含まれ得るが、それらに限定されない。
【０１０９】
【表１】
2014526678.tif 000002
【０１１０】
【表２】
2014526678.tif 000003
【０１１１】
【表３】
2014526678.tif 000004
【０１１２】
【表４】
2014526678.tif 000005
【０１１３】
【表５】
2014526678.tif 000006
【０１１４】
【表６】
2014526678.tif 000007
【０１１５】
【表７】
2014526678.tif 000008
【０１１６】
【表８】
2014526678.tif 000009
【０１１７】
【表９Ａ】
2014526678.tif 000010
【０１１８】
【表９Ｂ】
2014526678.tif 000011
【０１１９】
【表１０】
2014526678.tif 000012
【０１２０】
【表１１Ａ】
2014526678.tif 000013
【０１２１】
【表１１Ｂ】
2014526678.tif 000014
【０１２２】
【表１１Ｃ】
2014526678.tif 000015
【０１２３】
【表１２Ａ】
2014526678.tif 000016
【０１２４】
【表１２Ｂ】
2014526678.tif 000017
【０１２５】
【表１２Ｃ】
2014526678.tif 000018
【０１２６】
【表１３Ａ】
2014526678.tif 000019
【０１２７】
【表１３Ｂ】
2014526678.tif 000020
【０１２８】
本出願において与えられるアクセッション番号を有する全ての配列は、出願日において引用されたデータベース中に存在する配列である。本明細書中で言及される全ての文献は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１２９】
本発明は、樹状細胞サブセットのマーカーの特徴付け、および抗アレルギー免疫療法を受けている患者の臨床応答を評価する際のそれらの役割を説明する例に言及する以下のさらなる説明および図面によってさらに説明される。しかし、これらの例は、本発明の説明のみを目的として与えられたものであり、決してその限定として解釈されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】研究方法論の模式的概略を示す図である。総タンパク質を、処置されたDC(Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DC)から抽出し、2D-DIGEまたは無標識MS定量のいずれかに供した(FASP、Filter Aided Sample Preparation;Wisniewskiら  Nat. Methods、6:359〜362、2009)。次いで、示差的に発現されたタンパク質スポットまたはペプチドを、MS/MS分析後に同定した。免疫寛容誘発性DCの候補マーカーを、Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DC(モデルA)、6つの異なる免疫寛容誘発性DC型(モデルB)、ならびにアレルゲン特異的免疫療法を受けているアレルギー患者から得られた臨床サンプル(PBMC)におけるウエスタンブロッティング(WB)ならびに/またはqPCRによって、検証した。モデルAでは、WBを、プロテオミクス実験において使用した全細胞溶解物から実施し、さらなる処置されたDCサンプルを、qPCR検証のために8人のドナーから収集した。モデルBでは、DCサンプルを、WBおよびqPCR検証の両方のために使用した。臨床研究において、PBMC(n=328)を、免疫療法の前および後に82人の患者から収集し、イネ科植物花粉アレルゲン抽出物でex vivoで再刺激したか、またはしなかった。
【図２Ａ】LPS、PGNまたはDEXによるDCのin vitro処置の結果を示す図である。この図は、LPS、PGNまたはDEXによるDCの処置が、それぞれ炎症促進性DC(DC1、DC17)および免疫寛容誘発性DCを誘導したことを示している。単球を、ネガティブ選択によってPBMCから単離し、IL-4およびGM-CSFの存在下で6日間培養して、moDCを生成した。細胞を、LPS(1μg/ml)、PGN(10μg/ml)またはDEX(1μg/ml)のいずれかによって24時間処置した。細胞表面表現型を、CD80、CD83、CD86、ILT2、ILT3およびILT4に対するAbによる染色の後に、フローサイトメトリーによって評価した(破線:アイソタイプコントロール、通常の線:Ctrl-DC、灰色の塗り潰し:処置されたDC)。4人のうちの代表的なドナーをAに示し、4人の独立したドナーの平均±SEM値をB〜Eに示す。
【図２ＢＣＤＥ】LPS、PGNまたはDEXによるDCのin vitro処置の結果を示す図である。この図は、LPS、PGNまたはDEXによるDCの処置が、それぞれ炎症促進性DC(DC1、DC17)および免疫寛容誘発性DCを誘導したことを示している。単球を、ネガティブ選択によってPBMCから単離し、IL-4およびGM-CSFの存在下で6日間培養して、moDCを生成した。細胞を、LPS(1μg/ml)、PGN(10μg/ml)またはDEX(1μg/ml)のいずれかによって24時間処置した。（Ｂ）免疫寛容誘発性遺伝子の発現(GILZ、IDO、RALDH1およびRALDH2)を、qPCR分析によって評価した。（Ｃ）サイトカイン産生を、ELISAまたはCBAによって分析した(IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-23およびTNF-a)。（Ｄ）DCを、ナイーブCD4+T細胞と共に5日間共培養し、極性化サイトカインを、qPCRまたはCBAによって分析した(IFN-g、IL-4、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A)。（Ｅ）DCを、ナイーブCD4+T細胞と共に5日間共培養し、極性化サイトカインを、qPCRまたはCBAによって分析した(IFN-g、IL-4、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A)。4人のうちの代表的なドナーをAに示し、4人の独立したドナーの平均±SEM値をB〜Eに示す。
【図３ＡＢ】2D-DIGEによって同定された免疫寛容誘発性DCのマーカーを示す図である。タンパク質は、FDR p値≦0.05および体積における少なくとも1.2倍の変化で、DEX-DC中で有意に示差的に発現されたとみなした(Table 1(表1〜5)を参照のこと)。（Ａ）示差的に過剰発現されたタンパク質スポットの局在を有する2DDIGEゲルから得られた代表的Cy2画像。全細胞抽出物を、第1次元において狭い範囲のpH勾配ゲル(5.3〜6.5のpI範囲、1pH単位/24cm)を使用して分画し、第2次元において11% SDS PAGEで分画した。矢印を付したタンパク質スポットは、DEX-DCにおいて上方制御され、補足でTable 1(表1〜5)に記載される。（Ｂ）Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DCにおける標的タンパク質のウエスタンブロット分析。2人の代表的ドナーをBに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをCに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなし(Wilcoxon検定)、β-アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【図３ＣＤ】2D-DIGEによって同定された免疫寛容誘発性DCのマーカーを示す図である。タンパク質は、FDR p値≦0.05および体積における少なくとも1.2倍の変化で、DEX-DC中で有意に示差的に発現されたとみなした(Table 1(表1〜5)を参照のこと)。（Ｃ）Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DCにおける標的タンパク質のウエスタンブロット分析。2人の代表的ドナーをBに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをCに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなし(Wilcoxon検定)、β-アクチンをローディングコントロールとして使用した。（Ｄ）qPCRによるmRNAレベルでの免疫寛容誘発性遺伝子の検証。データは、Ctrl-DCと比較した、処置されたDCにおけるmRNAの相対量として表す。データをβ-アクチンの量に対して正規化し、平均±SEMとして示す。
【図４ＡＢ】プロテオミクスアプローチによって同定された示差的に発現された炎症タンパク質を示す図である。2D-DIGE(FDR p値≦0.05および少なくとも1.2倍の変化、Table 1(表1〜5)もまた参照のこと)および無標識MS(FDR p値≦0.01および少なくとも1.5倍の変化、Table 2(表6〜11))で検出された、エフェクターDCにおいて有意に上方制御されたタンパク質。（Ａ）示差的に発現されたタンパク質スポットの局在を有する、2D-DIGEゲルから得られたCy2画像。全細胞抽出物を、第1次元において狭い範囲のpH勾配ゲル(5.3〜6.5のpI範囲、1pH単位/24cm)を使用して分画し、第2次元において11% SDS PAGEで分画した。矢印を付したタンパク質スポットは、LPS-DCおよび/またはPGN-DCにおいて上方制御され、Table 1(表1〜5)に記載される。（Ｂ）Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DCにおける標的タンパク質のウエスタンブロット分析。2人の代表的ドナーをBに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをCに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなした(Wilcoxon検定)。β-アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【図４ＣＤ】プロテオミクスアプローチによって同定された示差的に発現された炎症タンパク質を示す図である。2D-DIGE(FDR p値≦0.05および少なくとも1.2倍の変化、Table 1(表1〜5)もまた参照のこと)および無標識MS(FDR p値≦0.01および少なくとも1.5倍の変化、Table 2(表6〜11))で検出された、エフェクターDCにおいて有意に上方制御されたタンパク質。（Ｃ）Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DCにおける標的タンパク質のウエスタンブロット分析。2人の代表的ドナーをBに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをCに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなした(Wilcoxon検定)。β-アクチンをローディングコントロールとして使用した。（Ｄ）qPCRによるmRNAレベルでの炎症促進性遺伝子の検証。データは、Ctrl-DCと比較した、処置されたDCにおけるmRNAの相対量として表す。データをβ-アクチンの量に対して正規化し、平均±SEMとして示す。
【図５】無標識MSによって同定された制御性DCのマーカーを示す図である。(A/B)FDR p値≦0.01および存在量における少なくとも1.5倍の変化で、DEX-DCにおいて上方制御されたタンパク質のウエスタンブロット分析(Table 2(表6〜11)もまた参照のこと)。2人の代表的ドナーをDに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをEに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなした(Wilcoxon検定)。β-アクチンをローディングコントロールとして使用した。(C)qPCRによるmRNAレベルでの免疫寛容誘発性遺伝子の検証。データは、Ctrl-DCと比較した、処置されたDCにおけるmRNAの相対量として表す。データをβ-アクチンの量に対して正規化し、平均±SEMとして示す。
【図６Ａ】免疫寛容誘発性DCの新規in vitroモデルの特徴付けを示す図である。DEX-DCをコントロールとして使用し、分化工程の間の薬理学的因子または生物学的因子[IL-10(10ng/ml)、TGFb(20ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、1,25ジヒドロキシ-ビタミンD3(10nM)]による処置の後で生成されたASP-DC(24時間の処置)、DEX、IL-10、RAPA、VitD3またはTGFb-DCに対して比較した。細胞表面表現型を、CD11c、CD14、ILT2、ILT3およびILT4に対するAbによる染色の後に、フローサイトメトリーによって評価した。4人のうち代表的なドナーをAに示し、6人の独立したドナーの平均±SEM値をBおよびCに示す。
【図６Ｂ】免疫寛容誘発性DCの新規in vitroモデルの特徴付けを示す図である。DEX-DCをコントロールとして使用し、分化工程の間の薬理学的因子または生物学的因子[IL-10(10ng/ml)、TGFb(20ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、1,25ジヒドロキシ-ビタミンD3(10nM)]による処置の後で生成されたASP-DC(24時間の処置)、DEX、IL-10、RAPA、VitD3またはTGFb-DCに対して比較した。示差的に処置されたDCにおけるLPS誘導された共刺激分子群の発現の阻害百分率。100%は、その分子の発現/分泌の完全な阻害を示す。4人のうち代表的なドナーをAに示し、6人の独立したドナーの平均±SEM値をBおよびCに示す。
【図６Ｃ】免疫寛容誘発性DCの新規in vitroモデルの特徴付けを示す図である。DEX-DCをコントロールとして使用し、分化工程の間の薬理学的因子または生物学的因子[IL-10(10ng/ml)、TGFb(20ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、1,25ジヒドロキシ-ビタミンD3(10nM)]による処置の後で生成されたASP-DC(24時間の処置)、DEX、IL-10、RAPA、VitD3またはTGFb-DCに対して比較した。示差的に処置されたDCにおけるLPS誘導されたサイトカイン分泌の阻害。100%は、その分子の発現/分泌の完全な阻害を示す。4人のうち代表的なドナーをAに示し、6人の独立したドナーの平均±SEM値をBおよびCに示す。
【図７Ａ】免疫寛容誘発性DCの異なるモデルにおける候補マーカーの検証を示す図である。処置されたDCにおける標的タンパク質のウエスタンブロット分析。2人の代表的ドナーをAに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをBに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなした(Wilcoxon検定)。GAPDHをローディングコントロールとして使用した。
【図７ＢＣ】免疫寛容誘発性DCの異なるモデルにおける候補マーカーの検証を示す図である。（Ｂ）処置されたDCにおける標的タンパク質のウエスタンブロット分析。2人の代表的ドナーをAに示し、6回の独立した実験の平均±SEMをBに示す。*p値≦0.05、**p値≦0.01を有意とみなした(Wilcoxon検定)。GAPDHをローディングコントロールとして使用した。（Ｃ）qPCRによるmRNAレベルでの免疫寛容誘発性遺伝子の検証。データは、Ctrl-DCと比較した、処置されたDCにおけるmRNAの相対量として表す。データをGAPDHの量に対して正規化し、平均±SEMとして示す(n=6)。
【図７Ｄ】免疫寛容誘発性DCの異なるモデルにおける候補マーカーの検証を示す図である。qPCRによるmRNAレベルでの免疫寛容誘発性遺伝子の検証。データは、Ctrl-DCと比較した、処置されたDCにおけるmRNAの相対量として表す。データをGAPDHの量に対して正規化し、平均±SEMとして示す(n=6)。
【図８Ａ】82人の患者由来のPBMCにおけるC1QA、C1QB、C1QCおよびSTAB1のmRNA発現が、アレルゲン特異的免疫療法の臨床的効力と相関することを示す図である。プラセボ群またはレスポンダー(%ARTSS≧43.9)対ノンレスポンダー(%ARTSS<43.9)(Mann-Whitney検定)と比較した、活性群における82人の患者由来の再刺激していないPBMCにおけるC1QA、C1QB、C1QCおよびSTAB1のmRNA発現。データは、免疫療法前のPBMCと比較した、処置後のPBMCにおけるmRNAの相対量として表す。データをb-アクチンの量に対して正規化し、各群について平均±SEMとして示す。
【図８Ｂ】82人の患者由来のPBMCにおけるC1QA、C1QB、C1QCおよびSTAB1のmRNA発現が、アレルゲン特異的免疫療法の臨床的効力と相関することを示す図である。活性群およびプラセボ群における、臨床的改善(%ARTSS)を有する各個々の患者のmRNA発現の相関。RはSpearman相関係数を示す。1は完全な相関を示し、0と1との間のスコアは、2つの変数が、一緒に増加または減少することを示す(AR:活性レスポンダー、ANR:活性ノンレスポンダー、PR:プラセボレスポンダー、PNR:プラセボノンレスポンダー)。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１３１】
材料および方法
単球由来DCの極性化
ヒトPBMCを、Ficoll-Paque plus gradient(PAA、Les Mureaux、France)での遠心分離によって、健康なボランティア(Etablissement Francais du Sang、Rungis、France)から得たバフィーコートから分離した。単球を、アンタッチト(untouched)ヒト単球キット(Dynal、Invitrogen、Cergy Pontoise、France)を用いたネガティブ選択によって精製した。単球由来DCを生成するために、5〜8.107細胞を、それぞれ250ng/mlおよび100ng/mlの濃度を使用して、ヒトrGM-CSFおよびrlL-4(Gentaur)の存在下で10μg/mlゲンタマイシン、50μΜ  2-ME、1%非必須アミノ酸(全てInvitrogenから)および10%胎仔ウシ血清(Gentaur、Brussels、Belgium)を補充した、安定なグルタミンを含むRPMI培地中で、37°C、5%CO2で培養した。6日後、FC500サイトメーターおよびCXP分析ソフトウェア(Beckman Coulter、Villepinte、France)またはFlowjoソフトウェア(TreeStar、Olten、Switzerland)を使用するフローサイトメトリーによって検出された95%よりも多いCD14-CD11c+細胞で、DCの純粋な集団を得た。最大107のDCを、培地、デキサメタゾン、(DEX、1μg/ml[2.5μΜ]、Sigma-Aldrich、Saint-Quentin Fallavier、France)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来の高度に精製されたリポポリサッカリド(LPS)(1μg/ml、InvivoGen、Toulouse、France)またはスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のペプチドグリカン(PGN、10μg/ml、InvivoGen)のいずれかの存在下で、37°Cおよび5%CO2で24時間プレートした(モデルA、図1)。免疫寛容誘発性DCモデル(モデルB、図1)のために、細胞を、他の文献(Zimmer, A.ら、J. Immunol. 186:3966〜3976、2011を参照のこと)に記載されたように、DEXまたはアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)由来のプロテアーゼ(ASP、20μg/ml、Sigma-Aldrich)のいずれかと共に24時間培養したか、あるいはDEX、IL-10(10ng/ml、R&D Systems、Lille、France)、TGFb(20ng/ml、R&D Systems)、ラパマイシン(10nM、Sigma-Aldrich)または1,25ジヒドロキシ-ビタミンD3(10nM、Sigma-Aldrich)のいずれかによる分化工程の間にインキュベートした。薬物を1日目に培養物に添加し、新たな培地を1日おきに供給した。潜在的な抗炎症効果をモニタリングするために、処置されたDCを、24時間の間LPS(1μg/ml)で刺激した。
【０１３２】
エフェクターDCおよび制御性DCの特徴付け
免疫蛍光染色のために、細胞を回収し、PBS中で洗浄し、以下のmAb FITC抗CD14、FITC抗CD80、PE抗CD86、PC5抗CD83(Beckman coulter)、FITC抗ILT2、PE抗ILT4、PC5抗ILT3(R&D systems)またはPE-CD11c(Miltenyi Biotec、Paris、France)と共に4℃で20分間インキュベートした。細胞を、対応するアイソタイプが一致したコントロールmAbを用いて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１３３】
サイトカイン測定を、サイトメトリービーズアレイ技術またはELISAキットを使用して上清中で実施した。IFN-g、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-23、IL-17AおよびTNF-αを、ヒト炎症CBAキットまたはCBA flex set(BD Biosciences、Le Pont de Claix、France)を使用して測定し、FACS Array機器およびFCAP Software(BD Biosciences)を使用して、製造業者の指示に従ってフローサイトメトリーによって分析した。IL-23濃度を、製造業者の指示通りにELISAキット(Ebiosciences、Paris、France)を用いて測定した。
【０１３４】
DC/T共培養実験を、他の文献に記載されたように実施した(Zimmer, A.ら  J. Immunol. 186:3966〜3976、2011を参照のこと)。簡潔に述べると、処置されたDCを、1:10のDC/T比で同種ナイーブCD4+T細胞と共に5日間培養した。ナイーブCD4+T細胞を、製造業者の指示に従って、MACSナイーブCD4単離キットII(Miltenyi Biotec)を使用するネガティブ選択によって、PBMCから単離した。かかるナイーブT細胞は、フローサイトメトリーによって評価したCD3、CD4およびCD45RAの発現に基づいて、>95%純粋であることが確認された。
【０１３５】
上清を、上記のようにサイトカイン放出について分析した。
【０１３６】
DCサブタイプのディファレンシャルゲル電気泳動分析
極性化したDCを、冷PBSで3回洗浄し、細胞ペレットを、8.3M尿素、2Mチオ尿素、4%CHAPS、50mM DTTおよび24mMスペルミン(全てSigma-Aldrichから得た)を含む緩衝液A中で溶解させた。遠心分離(16000g、1時間、20℃)後、上清を回収し、-80℃で保存した。次いで、タンパク質を、Bradfordアッセイ(Biorad、Marnes La Coquette、France)を使用して定量し、4〜12%の勾配プレキャストゲル(NuPAGE、Invitrogen)上で分画して、タンパク質の質を制御した。
【０１３７】
2D-DIGE分析のために、100μgのタンパク質を、GBiosciencesのPerfectFocusキットを使用して沈殿させ、8.3M尿素、2Mチオ尿素、4%CHAPSおよび30mM Tris pH8.8を含むDIGE標識化緩衝液中に再懸濁し、Cy2/3/5色素(CyDye DIGE Fluors、GE Healthcare、Velizy、France)で標識し、Ettan IPGphorシステム(GE Healthcare)を使用する等電点電気泳動(IEF)によって24cm Immobiline pH5.3〜6.5 Drystripゲル上で分離した。分析的および調製的実験のために、IEFを、それぞれ合計132kVhおよび145kVhにわたり実施した。次いで、条片を還元緩衝液およびアルキル化緩衝液(6M尿素、50mM Tris pH8.8、30%グリセロール、2%SDS、および1%DTTまたは5%ヨードアセトアミドのいずれかを含む)中で平衡化し、その後、Ettan DALT Six Electrophoresis System(GE Healthcare)を使用した分子量に従う分離のために、11% SDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードした。DIGEゲルを、製造業者の指示に従ってEttan DIGE Imager(GE Healthcare)を使用してスキャンした。示差的に発現されたスポットを、SameSpotsソフトウェア(Non linear Dynamics、Newcastle、England)を用いた画像分析によって決定し、自動スポット選別のために選択した(FDR p値≦0.05および変化倍率≧1.2)。主成分分析(PCA)およびデンドログラムプロットもまた、SameSpotsソフトウェアを使用して実施した。PCAプロットにおけるサンプルの相対的近さは、タンパク質の存在量における類似性を示すが、サンプル間の大きい距離は、タンパク質の存在量における非類似性を示す。相関分析(デンドログラムプロット)を、log正規化したタンパク質存在量レベルに対して実施した。次いで、タンパク質を、それらがどれだけ密に相関したかに従ってクラスター化した。
【０１３８】
SYPRO Ruby(Invitrogen)で染色した調製的ゲルを、示差的に発現されたタンパク質スポットの自動スポット選別(EXQuestスポットカッター、Bioradを使用する)に使用した。次いで、ゲルプラグを200μlの100mM NH4HO3/50%アセトニトリル(ACN)で37℃で45分間洗浄し、次いでACN中で脱水した。各スポットをトリプシン(10ng/μlの40mM NH4HCO3/10%ACN、Sigma-Aldrich)で37℃で一晩消化し、引き続いて、6μlのACNをこの混合物に添加し、その後30℃で45分間超音波処理した。NanoLC-MS/MS分析を、Bruker Daltonics(Wissembourg、France)のESI-Qq-TOF MS(Maxis 3G)に連結したUltimate 3000 RS nano LCシステム(Dionex、Voisins le Bretonneux、France)を使用して達成した。H2O/ACN/FA(それぞれ100/0/0.1の体積比)を溶媒Aとして使用し、H2O/ACN/FA(それぞれ20/80/0.1の体積比)を溶媒Bとして使用した。0.1%FA中に希釈したトリプシンペプチドを注入し、12μl/分の流速で(2%ACN、0.1%FA)、Acclaim PepMap100(100μm×2cm、C18、5μm、100Å、Dionex)上で捕捉した。分離を、450μl/分の流速および線形勾配(5〜45%のBで45分間、45〜95%のBで1分間および95%のBで15分間)で、Acclaim PepMap RSLC(75μm×15cm、C18、2μm、100Å、Dionex)を使用して実施した。データベース検索を、Swiss-ProtデータベースおよびNCBInrデータベースに対して、社内Mascotサーバー(Matrix Science、バージョン2.3)を使用して実施した。データを、15ppmの前駆体質量許容差および0.05Daの断片質量偏差で、ホモ・サピエンスまたは哺乳動物データベースに対して検索した。この検索は、固定修飾(fixed modification)としてシステインカルバミドメチル化(carbamidomethylation)および可変修飾(variable modification)としてメチオニン酸化を含んでいた。最大2つの失われた切断を、プロテアーゼ消化のために許容した。全ての同定は、1よりも多いペプチドの配列決定に基づいたものであり、p≦0.05でMascotスコアを有するタンパク質だけを、同定のために考慮した。タンパク質スコアは、個々のイオンのスコアから誘導した。
【０１３９】
DCサブタイプの無標識MS分析
消化された総タンパク質溶解物(上記のように、緩衝液A中に可溶化した)の無標識MSを実施して、コントロールDCサブセット、エフェクターDCサブセットおよび制御性DCサブセットのプロテオームを比較した。簡潔に述べると、一般的な限外濾過デバイスを界面活性剤除去(CHAPS)に使用して、引き続くプロテオーム分析(フィルター支援サンプル調製(Filter-aided sample preparation)、FASP)を可能にした。100μgのタンパク質を、フィルターユニット(Amicon Ultra-0.5 ml、Ultracel-10 kDa Membrane、Millipore、Molsheim、France)中で尿素含有緩衝液と混合し、20mM DTTで還元し、50mMヨードアセトアミドでアルキル化し、Lys-Cで消化し(37°C、5時間、比率1/50、Sigma-Aldrich)、次いでトリプシンで消化した(37°C、一晩、比率1/50)。消化後、ペプチドを、RPC18 Dynal磁気ビーズ(Invitrogen)を使用して脱塩し、FAで酸性化し、1.5〜2μgのトリプシンペプチドを、nanoLC-MSまたはnanoLC-MS/MSによって分析した。
【０１４０】
NanoLC-MS分析を、Bruker DaltonicsのESI-Qq-TOF MS(Maxis 3G)に連結したUltimate 3000 RS nano LCシステム(Dionex)を使用して達成した。H2O/ACN/FA(それぞれ100/0/0.15の体積比)を溶媒Aとして使用し、H2O/ACN/FA(それぞれ20/80/0.15の体積比)を溶媒Bとして使用した。1.5〜2μgのトリプシンペプチドを注入し(36μl±3μl)、12μl/分の流速で(2%ACN、0.15%FA)、Acclaim PepMap100(100μm×2cm、C18、5μm、100Å、Dionex)上で10分間捕捉した。次いで、分離を、270μl/分の流速、2つの線形勾配区画(5〜25%のBで180分、25〜45%のBで50分)で、および95%のBでさらに10分間維持し、その後20分かけて5%Bに戻して、Acclaim PepMap RSLC(75μm×50cm、C18、2μm、100Å、Dionex)を使用して実施した。MSモードにおいて、フルスキャンMSスペクトルを、270分間の間に280から1500までのm/z(0.8sの1MSスペクトル)で、獲得した。LC-MSデータにおいて記録されたイオン強度を、Progenesis LC-MS v3.1ソフトウェア(Non Linear Dynamics)を使用して分析して、サンプルにわたってペプチド(特徴)存在量の信頼性のある測定を提供した。内部較正を、MSモードにおけるロックマスオプション(lock mass option)(最小強度>200および質量±0.015Da)を可能にすることによって実施した。ペプチド検出に使用したパラメータは、ペプチド強度>300、ペプチド存在量>2000および2+≦ペプチド電荷≦6+であった。次いで、データを、「全ての特徴に対する正規化(normalize to all features)」法によって正規化し、4つの群(それぞれCtrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DCから得た)間の比較を実施して、どのペプチドが統計的に示差的に示されたかを選択した(FDR p値≦0.01および変化倍率≧1.5)。PCAおよびデンドログラムプロットもまた、Progenesis LC-MSソフトウェアを使用して実施した。標的化されたnanoLC-MS/MSを、MS instrument法における算入質量リスト(inclusion mass list)によって達成した。算入リストを、示差的に発現されたペプチドから生成し、MS獲得ソフトウェア(質量±0.02Daおよび保持時間±3分)中にインポートした。LCMS/MSデータを、UniProt/Swiss-Protデータベース、分類学ホモ・サピエンスまたは哺乳動物に対して、社内Mascotサーバー(Matrix Science、バージョン2.3)を使用して分析して、トリプシン消化または半トリプシン消化を推測した。同定パラメータは、2D-DIGE分析について記載したパラメータと同一であった。ペプチド同定を、Mascotソフトウェアで特定したときに95%よりも高い確率で確立された場合に受け入れた。正確な質量測定のために、ロックマスオプションを、MSモードおよびMS/MSモードにおいて可能にした。周囲空気からのエレクトロスプレープロセスにおいて発生したm/z 299.2945のイオン(メチルステアレート、Sigma-Aldrich)およびm/z 1221.9906のイオン(Chip cube high mass reference、Agilent、Massy、France)の両方を、内部再較正に使用した。
【０１４１】
ウエスタンブロット分析
NuPAGE-ウエスタンブロッティングを、標準的な手順(NuPAGEテクニカルガイド、Invitrogen)に従って実施した。サンプルを、標的タンパク質の分子量に依存して、4〜12%のMES、3〜8%のTrisアセテートまたは10〜20%のTrisグリシンNuPAGE上で分離した。以下の一次抗体を、イムノブロッティング分析に使用した:Cell Signaling Technology(Danvers、MA)の抗ANXA1(カタログ番号3299、1/1000)、抗GAPDH(カタログ番号14C10、1/1000)、抗GPX1(カタログ番号3286、1/1000)、抗IRF4(カタログ番号4964、1/1000)および抗TRAF1(45D3、1/1000)、Neomarkers(Labvision、Cheshire、England)の抗β-アクチン(カタログ番号MS-1295、1/2000)および抗第XIIIA因子(カタログ番号RB-1464、1/1000)、Abnova(Taipei、Taiwan)の抗FKBP5(カタログ番号H00002289-M02、1/250)および抗MX1(カタログ番号H00004599-B01P、1/500)、Origene(Rockville、MD)の抗CD71(カタログ番号TA307375、1/1000)、Santa Cruz(Santa Cruz、CA)の抗CATC(カタログ番号sc-74590、1/500)、抗NMES1(カタログ番号sc-138479、1/500)および抗STAB1(カタログ番号sc-98788、1/500)、Proteintech group(Manchester、England)の抗MRC1(カタログ番号18704-1-AP、1/1000)、Abeam(Paris、France)の抗C1Q(カタログ番号ab71089、1/1000)。GILZに対して惹起したウサギポリクローナル血清は、以前に記載されている(Asselin-Labatら、Blood、104:215-223、2004を参照のこと)。ペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体および抗ウサギ二次抗体は共にJackson Immunoresearch Laboratories(Sufflok、England)から得たものであり、化学発光検出キットは、Pierceのものであった(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate、Fisher Scientific、Illkirch、France)。ウエスタンブロットシグナルを、CCDカメラ(Fusion FX7、Vilber-Lourmat、Marnes La Vallee、France)で取得し、バンドの体積を、Bio-1Dソフトウェア(Vilber-Lourmat)を使用して定量した。β-アクチンまたはGAPDHをローディングコントロールとして使用した。
【０１４２】
RNA単離および定量リアルタイムPCR分析
総RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen、Courtaboeuf、France)を使用して、処置されたDCまたはPBMCから抽出し、cDNAを、TaqMan逆転写試薬(Applied Biosystems、Les Ulis、France)を製造業者の指示通りに使用して得た。メッセンジャーRNA発現を、製造業者の指示に従って、予め設計されたTaqman遺伝子発現アッセイおよび試薬を用いて7900HTリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で定量PCRによって評価した。以下の遺伝子の発現を、DCまたはPBMCにおいて評価した:GILZ(Hs00608272_m1)、IDO(Hs00158032_m1)、RALDH-1(Hs00167445_m1)、RALDH-2(Hs00180254_m1)、ANXA1(Hs00167549_m1)、CLIC2(Hs01574555_m)1、FKBP5(Hs01561001_m1)、F13A(Hs00173388_m1)、GPX1(Hs00829989_gH)、IMDH2(Hs00168418_m1)、OSF1(Hs00273458_m1)、TPP1(Hs00166099_m1)、C1QA(Hs00381122_m1)、C1QB(Hs00608019_m1)、C1QC(Hs00757779_m1)、CATB(Hs00947433_m1)、CATC(Hs00175188_m1)、STAB1(Hs01109068_m1)、MRC1(Hs00267207_m1)、CD71(Hs00951083_m1)、FSCN1(Hs00979631_g1)、IRF4(Hs01056533_m1)、MX1(Hs00895608_m1)、NMES1(Hs00260902_m1)、TRAF1(Hs01090170_m1)。以下の遺伝子の発現をT細胞において評価した:IFNg(Hs00989291_m1)、IL-4(Hs00174122_m1)、IL-10(Hs00961622_m1)およびIL-17A(Hs00174383_m1)。データを、コントロールとしての内因性β-アクチン(Hs99999903_m1)またはGAPDH(Hs03929097_g1)と比較して、各標的遺伝子について解釈した。各サンプル中の標的遺伝子の相対量
を、ΔΔCtを使用してキャリブレーターサンプルと比較して計算した。遺伝子誘導の大きさを、式2-ΔΔCt=2(刺激された細胞についての-ΔCt、刺激していない細胞についての-ΔCt)を使用して計算した。
【０１４３】
統計的分析
データを平均±SEMとして表す。群間の統計的差異を、Wilcoxon検定を使用して評価した。処置をコントロールと比較し、p値≦0.05または0.01を有意とみなした。統計的分析およびグラフィック分析を、Prism 5ソフトウェア(GraphPad、La Jolla、CA)を使用して実施した。タンパク質発現の変化における有意な差異を、0.05のFDR(偽陽性率)調整したp値(またはFDR p値)閾値を使用して、2D-DIGE分析において決定した(http://www.nonlinear.com/support/progenesis/samespots/faq/pq-values.aspx#qvalues)。無標識MS実験において、0.01の閾値でFDR p値を使用して、ペプチド存在量における有意な変化を決定した。1.2(2D-DIGE)または1.5(無標識MS)の倍率変化(fold change)フィルターを選択して、ウエスタンブロッティングを使用して容易に検出可能な示差的発現レベルを有するタンパク質を標的化した。
【０１４４】
VO56.07A花粉チャンバー研究からの臨床サンプル
アレルゲン特異的免疫療法研究の設計およびプロトコルは、Horak Fら(J. Allergy Clin. Immunol. 124:471〜477、2009)に記載されている。この臨床試験により、チャレンジチャンバーにおいて提供される制御されたアレルゲン曝露条件下で舌下投与されたイネ科植物花粉錠剤の効力および作用の開始を評価した。簡潔に述べると、適格の患者は、少なくとも先行する2年間にわたり中程度から重症の季節性イネ科植物花粉関連のアレルギー性鼻炎結膜炎の報告された病歴を有する、18歳と50歳との間の男性および女性であった。5種イネ科植物花粉抽出物(Stallergenes SA)に対する陽性特異的皮膚プリックテスト応答(膨疹直径>3mm)ならびにオオアワガエリに対する少なくとも0.70kU/lの特異的血清IgEレベル(UniCAP system、Phadia、Uppsala、Swedenで評価した)に基づいて、患者を算入のために選択した。さらに、患者は、くしゃみ、鼻汁、鼻の痒み、鼻閉、涙眼および眼の痒みを包含する鼻炎結膜炎総症状スコア(rhinoconjunctivitis total symptom score)(RTSS)として規定される、ベースライン(即ち、任意の処置の投与の前)におけるアレルゲンチャレンジ試験に対する確認された症候性反応を有した。この研究は、花粉の季節の外側で実施された、ランダム化二重盲検並行群プラセボ対照単施設試験であった。最初のスクリーニング来診後、82人の適格の患者を、舌下経路を介してイネ科植物花粉またはプラセボ錠剤のいずれかを受けるように、1:1でランダム化した。チャレンジを、処置の前ならびに処置の1週間後、1か月後、2か月後および4か月後に実施した。調査製品は、食べるまたは飲む前に1日1回、好ましくは4か月の処置期間を通じて日の同じ時間に摂取される、5種イネ科植物花粉SLIT錠剤(カモガヤ、イチゴツナギ、ペレニアルライグラス、ハルガヤおよびオオアワガエリ;Stallergenes SA)であった(Moingeonら、Int. Arch. Allergy Immunol,. 146:338〜342、2008を参照のこと)。全血を、血清測定および細胞アッセイのために、4か月の処置の前および後に収集した。PBMCを、血液サンプルから精製し、凍結した。研究の最後に、PBMCを解凍し、培養物中で24時間維持し、引き続いて、イネ科植物花粉アレルゲン抽出物(300IR、Stallergenes, SA)でさらに24時間再刺激したまたは再刺激しなかった。培養したPBMCを洗浄し、上記のように、RNA単離およびPCR分析に使用した。全てのサンプルは、オペレーターが盲検様式でコード化し、処理した。
【０１４５】
患者は、処置前(来診2での)チャレンジしたので、ベースライン(V2でのチャレンジ)と処置の最後でのチャレンジ(4か月後の来診7)後との間の平均鼻炎結膜炎総症状スコア(Average Rhinoconjunctivitis Total Symptom Score)(ARTSS)における改善百分率:(V2でのARTSS-V7でのARTSS)/V2でのARTSS×100を計算することによって、個々の臨床応答を評価することが可能であった。
【０１４６】
免疫学的パラメータにおける変化と臨床応答における変化との間の潜在的な関連を分析するために、処置後のARTSSの少なくとも43.9%の減少に対応する、活性群におけるARTSSの改善百分率の中央値を、閾値とみなした。この閾値以上のARTSS改善を有する対象をレスポンダーとみなし、閾値より低いARTSS改善を有する対象をノンレスポンダーとみなした。免疫学的結果を、活性レスポンダー:AR、活性ノンレスポンダー:ANR、プラセボレスポンダー:PRおよびプラセボノンレスポンダー:PNRを含む4つのサブグループについて要約統計量を使用して記述した。結果を、4つのサブグループからの患者についての個々のプロットとして表した。
【実施例２】
【０１４７】
結果
エフェクターヒトDC(DC1およびDC17)および免疫寛容誘発性ヒトDCの確立
およそ40種の生物学的因子および薬理学的因子の最初のスクリーニング後、未成熟単球由来DCからエフェクターDCまたは免疫寛容誘発性DCのいずれかを誘導することが可能な3種の分子を選択した。細菌LPSは、エフェクターDC1(即ち、CD4+Th1細胞の分化を支持するDC)の最も強力な誘導因子であり、スタフィロコッカス・アウレウス壁由来のペプチドグリカン(PGN)は、DC17(即ち、CD4+Th17細胞を惹起することが可能なDC)の最良の誘導因子であった。図2Aに示すように、それぞれLPS-DCおよびPGN-DCと称するこれらの処置されたDCは、共刺激分子群(即ち、CD80、CD83、CD86)の発現は上方制御したが、LPS処置によって誘導されたILT4を除き、阻害分子は上方制御しなかった。かかる処置されたDCは、IDO遺伝子の発現を上方制御し、高い量のIL-6およびIL-8を分泌した(図2Bおよび図2C)。LPS-DCは、IL-1βおよびIL-23を産生したPGN-DCとは対照的に、IL-12p70およびTNF-αもまた分泌した(図2C)。重要なことに、ナイーブCD4+T細胞との共培養により、LPS-DCとのインキュベーションは、T細胞において5日目にIFN-g分泌を誘導したが、IL-17A遺伝子の発現は、PGN-DC/CD4+T細胞共培養において増強された(図2Dおよび図2E)という点で、それぞれ別個のDC1およびDC17極性化が確認された。本発明者らによって以前に報告されたように、DEXによるDCの処置は、免疫寛容誘発性DCの生成、ILT2およびILT4、ならびにGILZ、IDOまたはRALDH1などの免疫寛容誘発性遺伝子の発現の上方制御を導いた(図2Aおよび図2B)。DEX-DCと共培養したCD4+T細胞は、IL-10を上方制御した(図2Dおよび図2E)。示してはいないものの、これらの細胞は真正の制御性T細胞(Tr1)であることが確認されたが、これは、これらの細胞が第三者の実験においてFoxp3-であり、抑制活性を示すからである(Zimmerら、J. Immunol.、186:3966〜3976、2011)。つまるところ、4人の健康なドナー由来のサンプルに対して実施されたこれらの細胞アッセイは、エフェクターDC1、DC17および免疫寛容誘発性(即ち、制御性)DCが、かかるin vitro細胞培養条件下でヒトmoDCから得られ得ることを、一義的に確認した。
【０１４８】
2D-DIGEによるエフェクターヒトDCおよび免疫寛容誘発性ヒトDCについての分子マーカーの同定
6人の独立したドナーから生成したコントロール(Ctrl-DC)、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DC間のタンパク質発現における潜在的な差異を、引き続いて調査した(図1)。この目的のために、DCプロテオームの定量的比較のための2D-DIGEに最初に頼った。全細胞抽出物を、第1次元において狭い範囲のpH勾配ゲル(5.3〜6.5のpI範囲、1pH単位/24cm)を使用して2Dゲル電気泳動によって分画して、広い範囲の勾配と比較して、分析の深度を増加させた(データ示さず)。24のサンプルを包含する、Cy2蛍光色素で標識されたプールされた標準を使用して、ゲルと実験との間の差異を正規化した。これらの分析において、合計1250のタンパク質スポットを、代表的な2Dパターンに示されるように、高分解能「ウルトラズーム(ultra-zoom)」2Dゲルを使用して、ヒトDCにおいて正確に定量することができた(図3A)。これら1250のスポットのうち、52は、FDR p値≦0.05および体積における少なくとも1.2倍の変化で、少なくとも1つの条件下で示差的に発現された。Table 1(表1〜5)に示すように、48のスポット(92.3%)を、インゲル(in-gel)トリプシン消化後に質量分析によって、40の非重複タンパク質に対応すると同定した。17のタンパク質が、Ctrl-DC、LPS-DCまたはPGN-DCと比較した場合、免疫寛容誘発性DCにおいて無制御であることが見出された(Table 1A(表1)およびTable 1B(表2))。対照的に、23のタンパク質の発現レベルは、Ctrl-DCまたはDEX-DCと比較して、LPS-DCおよび/またはPGN-DCにおいて改変された(Table 1C(表3)〜Table 1E(表5))。同定されたタンパク質を、類似の発現プロファイルに基づいて、さらにクラスター化した。MX1を含む3つのタンパク質は、LPS-DCにおいて特異的に上方制御されたが、20のタンパク質は、DC1およびDC17の両方のエフェクター細胞において上方制御された(例えば、FSCN1、HLAクラスIIおよびIRF4)。6つのタンパク質は、LPS-DCおよびPGN-DCにおいてむしろ下方制御されたが(例えば、ITAM/CD11b)、FKBP5タンパク質は、3つ全てのエフェクター条件および制御性条件で上方制御された。注目すべきことに、8つのタンパク質が、DEX-DCにおいて特異的に過剰発現された(即ち、ANXA1、CLIC2、FKBP5、F13A、GPX1、IMDH2、OSF1、TPP1、Table 1(表1〜5)および図3)。以前の知見をさらに検証するために、エフェクターDCまたは免疫寛容誘発性DCについてのいくつかの候補マーカーを選択し、その発現レベルを、市販の抗体を使用するウエスタンブロッティングによって直接評価した。さらに、処置されたDC由来のさらなるサンプルを、8人のドナーから収集して、qPCRによってマーカー遺伝子発現を評価した。
【０１４９】
代表的なプロテオミクスおよび遺伝子発現データを、エフェクターDCの選択された候補マーカー(即ち、FSCN1、IRF4およびMX1)について、図4に示す。FSCN1およびIRF4遺伝子は、両方のエフェクター条件においてより高いレベルの発現を示したが、MX1だけが、Ctrl-DC、DEX-DCおよびPGN-DCと比較した場合、LPS-DCにおいて強く過剰発現された(例えば、10倍増加したmRNAレベルで)(図4B〜図4D)。DC1およびDC17条件下でのITAM/CD11bの発現の下方制御もまた、ウエスタンブロッティング分析およびフローサイトメトリーによって確認した(データ示さず)。制御性DCの8つの潜在的なマーカーのうち、4つをタンパク質レベルで確認した(即ち、ANXA1、FKBP5、F13AおよびGPX1)。具体的には、ウエスタンブロッティング分析により、Ctrl-DCと比較した場合、DEX-DCにおける有意により高いレベルのANXA1、ならびにFKBP5の誘導(それぞれ1.4倍および2.6倍)が示された。F13AおよびGPX1は、Ctrl-DCと比較して、DEX-DCにおいて僅かな増加を示した(p値≦0.1、図3Bおよび図3C)。CLIC2、IMDH2、OSF1またはTPP1のいずれかに対する抗体が入手できないことまたはかかる抗体の貧弱な親和性に起因して、後者のタンパク質は、イムノブロッティングによってマーカーとして評価することができなかった。それにもかかわらず、全てのかかる候補マーカーを、mRNAレベルで検証した(図3D)。これに関して、FKBP5およびF13A遺伝子の発現における最大15倍の増加が、エフェクター条件下での付随する減少を伴って、Ctrl-DCに対してDEX-DCにおいて観察された。免疫/寛容における制御性DCの各潜在的なマーカーの既知の機能をTable 3(表12、表13)にまとめる。集合的に、データは、高い発現レベルのANXA1、CLIC2、FKBP5、F13A、GPX1、IMDH2、OSF1およびTPP1が、免疫寛容誘発性DEX-DCの妥当な分子シグネチャーを示すことを示している。
【０１５０】
無標識MSによるエフェクターヒトDCおよび免疫寛容誘発性ヒトDCについての分子マーカーの同定
2D-DIGEは、異なるpIまたは分子量でタンパク質種を分離できるが、このアプローチは、極端なpIおよび分子量を有するタンパク質、ならびに高度に疎水性のタンパク質を見過ごす。従って、これらの制限を克服するための無標識MSベースのアプローチを惹起し、Ctrl-DC、LPS-DC、DEX-DCおよびPGN-DC間のタンパク質発現プロファイルをさらに比較した(図1および図5)。酵素消化後、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析(nanoLC-MS)を使用して、ペプチド分析を実施した。全DC溶解物などの複雑な混合物の徹底的な分析のために、クロマトグラフィー解像度、再現性およびペプチド定量の両方を増加させるために50cmの延長カラム長で、超高圧LCを使用した。270分の勾配におけるDCペプチドの分析を実施したところ、33500の同位体パターン(即ち、保持時間および質量電荷(mass over charge)(m/z)比を特徴とする特徴)の検出が得られ、これを、Progenesis LC-MSソフトウェアを使用してさらに定量した。高分解能MSデータの分析で達成された高いLC再現性および非常に高い質量精度が、異なる試行間のイオン存在量の比較を可能にした。最大945の特徴が、少なくとも1つの条件下で示差的に発現されるとして有意に検出された(FDR p値≦0.01および倍率≧1.5で)。Ctrl-DC、LPS-DCおよびPGN-DCと比較して、DEX-DCにおけるm/z 865.70の分子イオンのより高い存在量(16300対それぞれ8700、5800および6095の存在量)が見出された。示差的に制御されたペプチドを引き続いてMS/MSモードで断片化し、配列データベースにさらに一致したタンパク質の同定を導いた。945の示差的に発現された特徴のうち、354(37.5%)を、合計190の非重複タンパク質を示すと同定した(≧1のペプチド、データ示さず)。MS/MSスペクトルのいくつかを解釈することが困難であるのは、同時溶出する成分によって引き起こされるシグナル干渉、翻訳後修飾されたペプチド(例えば、糖ペプチド)の存在、未知のペプチド配列、およびさらには比較的低い強度のいくつかのイオン前駆体に起因する可能性があった。タンパク質定量のストリンジェンシーおよび精度を増加させるために、2つ以上のペプチドで同定されたタンパク質のみを最終分析に含め、合計77の示差的に発現されたタンパク質を示した。68のタンパク質は、エフェクターDCにおいて顕著に無制御であり、9つのタンパク質は、免疫寛容誘発性DCにおいて特異的に上方制御された。かかるデータを、ペプチド/タンパク質同定に関する具体的詳細と共に、Table 2(表6〜11)にまとめる。この表に含めたものは、エフェクターDCにおいて上方制御されることが以前に示された2つのタンパク質(ITAM/CD11bおよびMX1、1ペプチド)、ならびにPGN条件下で>90倍の増加を示す、「ペプチドグリカン認識タンパク質」としても公知のPGRP1(1ペプチド)であった。タンパク質を、各DC条件内で存在量に基づいてクラスター化した。50のタンパク質を含む1つのクラスターは、PGN-DCにおいて特異的に上方制御または下方制御されることが示されたが(Table 2C(表8)およびTable 2F(表11))、4つのタンパク質は、LPS-DCにおいて高度に発現された(即ち、ANXA6、EF1A1、MX1およびPSA7、Table 2E(表10))。LPS-DCにおけるMX1の過剰発現もまた、プロテオミクスDIGE分析によって確認した。14のタンパク質(例えば、FSCN1、ICAM1、NMES1、TRAF1およびTFR1/CD71)の上方制御および3つの他のタンパク質(CYTC、GELSおよびITAM)の下方制御が、DC1細胞およびDC17細胞の両方において観察された(Table 2B(表7))。興味深いことに、2つのプロテオミクスアプローチにより、エフェクターDCにおけるFSCN1の上方制御およびITAM/CD11bの下方制御が確認された。他の研究者によってエフェクターDCにおいて上昇することが以前に示されたいくつかのタンパク質(Ferreiraら、Proteomics Clin. Appl.、2:1349〜1360、2008;Wataraiら、Proteomics、5:4001〜4011、2005を参照のこと)が、本研究において確認された(例えば、ICAM1およびTRAF1)。さらに、無標識MS実験により、9つのタンパク質が、Ctrl-DC、LPS-DCおよびPGN-DCと比較した場合、免疫寛容誘発性DEX-DCにおいて一貫して増加したことが明らかになった(Table 2A(表6))。これに関して、これらのタンパク質のうち4つ(ANXA1、CLIC2、F13AおよびFKBP5)は、上記DIGE分析において同定されたが、他の5つのタンパク質(C1QB、C1QC、CATC、MRC1およびSTAB1)は、LC-MSアプローチを使用した場合にDEX-DCにおいて検出され、上方制御されることが示されただけであった。これらのうち、C1QC特異的ペプチドの分析により、免疫寛容誘発性DEX-DCにおける最大5倍の増加が明らかになった。次に、ウエスタンブロッティングおよびqPCRの両方を使用する無標識MSによって同定された候補マーカーについての検証実験を実施した。これらの分析に基づき、Ctrl-DCまたはDEX-DCのいずれかと比較した場合、LPS-DCおよびPGN-DCの両方において上方制御が確認された、エフェクターDCについての3つのマーカー(CD71、NMES1およびTRAF1)(図1)を選択した。重要なことに、ウエスタンブロッティング分析により、制御性DEX-DCにおける有意により高いレベルのC1Q、CATC、MRC1およびSTAB1が確認された(それぞれ12倍、1.5倍、1.4倍および2.2倍、図5Aおよび図5B)。さらに、図5Cに示されるように、C1Q(サブユニットA、BおよびCを含む)、CATC、MRC1およびSTAB1のmRNAレベルは、Ctrl-DCと比較した場合、C1QA、C1QBおよびSTAB1遺伝子の発現における最大12倍の増加で、DEX-DCにおいて有意に上昇した。エフェクター免疫/寛容における免疫寛容誘発性DEX-DCのこれら潜在的なマーカーの各々の機能を、Table 3(表12、表13)にまとめる。つまるところ、これらのデータは、C1QA、C1QB、C1QC、CATC、MRC1およびSTAB1が、DEXによって誘導された制御性DCの妥当な候補マーカーであることを実証している。
【０１５１】
免疫寛容誘発性DCの別個のサブタイプにおける候補マーカー発現の評価
さらに、別個の細胞培養条件下でmoDCから得られた種々の型の制御性DCにおける最も見込みのある候補マーカーの発現を調査した。免疫寛容誘発性DCを生成するために、単球由来iDCを、アスペルギルス・オリゼー由来のプロテアーゼで24時間の間処理した(Zimmer, A.らJ. Immunol. 186:3966〜3976、2011に記載されたとおり)、または他の研究者によって報告されたとおり(Montiら、Transplantation、75:137〜145、2003;Steinbrinkら、Blood、99:2468〜2476、2002;Van Kooten, C.およびGelderman, K.A.、Methods Mol. Biol.、677:149〜159、2011;Pennaら、J. Immunol.、178:145〜153、2007;Ohtaniら、Immunology、126:485〜499、2009)、DEX、IL-10、ラパマイシン、1,25ジヒドロビタミン(dihydrovitamin)D3もしくはTGFbのいずれかによる分化工程の間に7日間の間単球を培養した。CD11c、CD14、ILT2、ILT3およびILT4抗体による染色により、本発明者らは、表面表現型に基づいて種々の免疫寛容誘発性DCを識別することができた(図6A)。より具体的には、ASP-DCは、むしろCD11chighである全ての他のDC型とは対照的に、CD11clow表現型を示す。DEX24h(24時間の処置)-DCおよびTGFb-DCはCD14neg細胞であるが、VitD3-DCおよびRapa-DCはCD14medであり、DEXdiff(分化工程の間の処置)およびIL-10-DCはCD14highであるので、CD14発現はDCを3つの群にクラスター化する。DEX24hおよびTGFb-DCは、それぞれLT2low細胞およびILT2med細胞としてさらに識別できる。Rapa-DCとVitD3-DCとは、それぞれILT3lowおよびILT3highであるという点で異なっている。最後に、DEXdiff-DCはILT4medであるが、IL-10-DCはILT4highである。かかる生成されたDCの抗炎症プロファイルを確認するために、これらのDCを、24時間の間LPSで刺激し、共刺激分子群の発現およびサイトカイン分泌を評価した。図6Bに示すように、全ての免疫寛容誘発性DCサブタイプは、LPS誘導された共刺激分子群の上方制御が鈍麻していた。LPS誘導されたサイトカイン分泌もまた、全ての制御性DC型において阻害された。IL-6、IL-8およびTNF-αの分泌がLPS刺激後に未阻害のままであったのは、VitD3-DCのみにおいてであった(図6C)。
【０１５２】
定量プロテオミクス研究を通じて同定された候補マーカー(Table 3(表12、表13)およびTable 1(表1〜5)およびTable 2(表6〜11)に列挙される)および文献から同定した候補マーカー(GILZ、IDO、RALDH1およびRALDH2)の発現を、抗体の入手可能性に基づいてqPCRならびにウエスタンブロッティングによって、6つの型の免疫寛容誘発性DCにおいて評価した。代表的データを図7に示す。具体的には、制御性DCについての候補マーカーの5つのサブグループが規定された。ANXA1、CATCおよびGILZは、全てのモデルにおいて発現されたので、汎制御性DCマーカーとみなすことができる。CATCタンパク質の過剰発現は、例えば、Rapa-DCを除く全ての条件において検出されたが、CATC遺伝子の誘導は、DEX24h/diff、IL-10およびRapa-DCの両方において検出された。驚くべきことに、Rapa-DCにおけるANXA1、C1Q、CATCおよびGPX1の上方制御は、おそらくはかかるマーカーについての遺伝子誘導の動態に関する差異に起因して、mRNAレベルでより容易に見られた。ANXA1、CATCおよびGILZだけがTGFb-DCにおいて上方制御されたタンパク質であり、このことは、免疫寛容誘発性DCの表現型上の不均一性を強調する。第2の群のマーカーは、ASP-DCおよびTGFb-DCを除く殆どの免疫寛容誘発性DCと関連する、C1QおよびTPP1を包含する。これらの実験により、DEX24h-DCがDEXdiff-DCと非常に類似しており、後者はより高い量の免疫寛容誘発性マーカーを示すことが示された。CLIC2、FKBP5、GPX1およびIMDH2タンパク質を含む第3の群は、DEX24h/diffおよびRapa-DCにおいて上方制御された。これらのマーカーは、免疫抑制剤誘導されたタンパク質のファミリーを示し得る。さらに、F13A、MRC1およびSTAB1タンパク質は、IL-10-DCおよびDEX24h/diff-DCにおいて一貫して、および両方一緒に上方制御された。最後に、IDO、RALDH1およびRALDH2タンパク質の過剰発現は、以前の報告(Zimmer, A.ら  J. Immunol. 186:3966〜3976、2011を参照のこと)と一致して、ASP24h-DCおよびDEX24h/diff-DCに限定された。集合的に、データは、i)既知の免疫寛容誘発性DCの間での実質的な表現型上の不均一性を一義的に確立する、ii)共有される制御性DCマーカーとしてのANXA1、C1Q、CATC、GILZ、STAB1およびTPP1分子の広い適切さを強調する。
【０１５３】
アレルゲン特異的免疫療法を受けている患者由来のPBMCにおけるエフェクター/免疫寛容誘発性DCについてのマーカーの評価
本発明者らは、エフェクターDCおよび制御性DCのマーカーが、アレルゲン特異的免疫療法の間にアレルギー患者において誘導される免疫変化(例えば、Th2からTh1/Tregへの移行)、従って、エフェクターDCから免疫寛容誘発性DCへの潜在的なシフトを調査するために有用であり得ると仮説を立てた。この文脈において、本発明者らは、候補アレルギーワクチンを評価するために、アレルゲンチャレンジチャンバーにおいて実施されたプラセボ対照臨床研究の間に収集された血液サンプルに頼った。具体的には、本発明者らは、「材料および方法」に記載されたように、イネ科植物花粉錠剤による舌下免疫療法を受けているイネ科植物花粉アレルギー患者由来のPBMCにおける候補マーカーのmRNA発現を評価した。この目的のために、PBMCは0.5〜1%未満のDCを含むので、本発明者らは、別個の制御性DCモデルにおける発現の以前のパターンに基づいて最初に候補マーカーを選択したが(図7)、種々の血液細胞集団では文献中に報告された遺伝子発現データにも基づいた(BioGPS resource、データ示さず)。後者のステップは、T細胞、B細胞、NK細胞、内皮細胞または多核細胞のいずれかによって顕著に発現される遺伝子を排除するために重要である。結果として、本発明者らは、さらなる研究のために15の候補マーカー遺伝子を選択した。たとえ異なる血液細胞集団間で遍在して発現されるとしても、ANXA1、CATC、GILZは汎制御性DCマーカーを示すので、これらを選択した。例えば、CATCは、B細胞、DC、骨髄細胞およびNK細胞ならびに単球の両方において発現される。対照的に、C1QC、CLIC2、F13A、IDO、MRC1およびRALDH1の発現は、PBMCにおいて僅かに観察されたに過ぎず、STAB1の発現レベルは、DC、骨髄細胞および単球においてのみ顕著であった。同じ原理で、5つのマーカー(CD71、FSCN1、MX1、NMES1およびTRAF1)を選択して、エフェクターDC集団における変化をモニタリングした。これらのマーカーを、以下の群:活性レスポンダー(AR、n=6)、活性ノンレスポンダー(ANR、n=6)、プラセボレスポンダー(PR、n=4)およびプラセボノンレスポンダー(PNR、n=4)のそれぞれに属する20人の臨床患者由来の80のPBMCサンプル(即ち、イネ科植物花粉アレルゲンによる再刺激ありまたはなしで、処置の前および後にex vivoで培養されたPBMC)において評価した。
【０１５４】
免疫寛容誘発性DCのマーカーとして同定されたANXA1、CATC、F13A、GILZ、IDO、MRC1、RALDH1およびCLIC2は、それぞれプラセボ群もしくは活性群における患者、または臨床レスポンダーおよびノンレスポンダーを比較した場合、PBMCにおける発現のパターンには任意の有意な変動を示さなかった(データ示さず)。同様に、エフェクターDCマーカーにおける有意な変化は、再刺激していないPBMCまたは再刺激したPBMCのいずれにおいても群レベルでは検出されなかったが、何人かの個々の患者は、全てのエフェクター遺伝子の付随する上方制御を示した(データ示さず)。制御性DCの2つのマーカーC1Q(サブユニットA、BおよびC)およびSTAB1の発現におけるかなりの増加が、プラセボ群と比較して活性群において、イネ科植物花粉抽出物で再刺激したまたは再刺激していないPBMCにおいて検出された。この知見を確認するために、mRNAレベルを、臨床研究のコホート全体においてこれら4つの遺伝子について評価した(即ち、248のPBMCサンプルに対応する62人のさらなる患者)。4つのエフェクター遺伝子(CD71-FSCN1-MX1-TRAF1)もまた、コントロールとしてこれらの患者において評価した。
【０１５５】
これらの実験により、再刺激していないPBMC(図8A)または再刺激したPBMC(データ示さず)のいずれかにおいてプラセボ群と比較した場合、活性群におけるC1QおよびSTAB1の統計的に有意な上方制御が確認された。なおより興味深いことに、C1QA、C1QBおよびC1QCは、これらの遺伝子がむしろ下方制御されるノンレスポンダー(列「ANR」)とは対照的に、処置に対する確認された臨床応答を有する患者の群(列「AR」)において、特異的に上方制御された。STAB1もまた、STAB1がむしろ下方制御される他の群と比較して、ARにおいて誘導されたと確認された(図8A)。C1QおよびSTAB1のmRNA発現を、臨床効力スコア(%ARTSS)に対してプロットしたところ、2つの変数間の有意な相関が、C1QサブユニットおよびSTAB1について確立できた(C1QAについて0.41のPearson相関、p=0.009、およびSTAB1について0.32のPearson相関、p=0.037)(図8B)。群間でエフェクター遺伝子のmRNA発現における差異は検出されず(データ示さず)、これらの遺伝子について臨床効力との相関は確立できなかったが(データ示さず)、これは、アレルゲン特異的免疫療法の臨床効力がエフェクターDCマーカーにおける有意な変化と相関しないことを示している。
【０１５６】
集合的に、これらのデータは、アレルゲン特異的免疫療法の短期効力と関連する寛容の2つの潜在的なマーカー、即ちC1QおよびSTAB1を記載している。
【０１５７】
つまるところ、本発明者らは、極性化したエフェクターDCまたは制御性DC特異的な新規マーカーを発見したのであり、そのうちいくつかは、ヒトPBMCにおいて容易に検出できる。重要なことに、種々の型の制御性DCによって発現される2つのマーカーC1QおよびSTAB1の誘導は、アレルゲン特異的免疫療法の臨床効力と相関する。短期効力についての候補バイオマーカーのかかる同定は、患者の臨床的追跡およびアレルゲン性抽出物に基づく新たなワクチン候補の開発への新たな道筋を提供するものである。
【図１】
2014526678.tif 000021
【図２Ａ】
2014526678.tif 000022
【図２ＢＣＤＥ】
2014526678.tif 000023
【図３ＡＢ】
2014526678.tif 000024
【図３ＣＤ】
2014526678.tif 000025
【図４ＡＢ】
2014526678.tif 000026
【図４ＣＤ】
2014526678.tif 000027
【図５】
2014526678.tif 000028
【図６Ａ】
2014526678.tif 000029
【図６Ｂ】
2014526678.tif 000030
【図６Ｃ】
2014526678.tif 000031
【図７Ａ】
2014526678.tif 000032
【図７ＢＣ】
2014526678.tif 000033
【図７Ｄ】
2014526678.tif 000034
【図８Ａ】
2014526678.tif 000035
【図８Ｂ】
2014526678.tif 000036
【配列表】
2014526678000001.app
【国際調査報告】
2014526678.tif 000037
2014526678.tif 000038
2014526678.tif 000039
2014526678.tif 000040