(57)【要約】  本発明は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）および投与される対象における代謝プロフィールを改善することが知られている他の代謝レギュレーター（それらの変異体を含む）を含む新規タンパク質の同定に関する。ＦＧＦ２１関連障害、ＧＬＰ−１−関連障害およびエキセンディン−４−関連障害（代謝状態を含む）を処置するための方法も記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト領域およびＦＧＦ２１受容体アゴニスト領域を含む、デュアル(dual)機能性融合タンパク質。
【請求項２】
ＦＧＦ２１変異体に融合されたＧＬＰ−１受容体アゴニストペプチド、リンカー、および該ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはＦＧＦ２１変異体の生物学的機能を増強するような様式において結合されたＰＥＧ基を含む、請求項１に記載のデュアル機能性融合タンパク質。
【請求項３】
ＦＧＦ２１変異体が変異体７６である、請求項２に記載のデュアル機能性融合タンパク質。
【請求項４】
リンカーがＦｃである、請求項３に記載のデュアル機能性融合タンパク質。
【請求項５】
リンカーがＦｃ変異体である、請求項３に記載のデュアル機能性融合タンパク質。
【請求項６】
変異体２０８、変異体２０９、変異体２１１、変異体２１４、変異体２７２、変異体２７７または変異体３１１をさらに含む、請求項１に記載のデュアル機能性融合タンパク質。
【請求項７】
ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびＦＧＦ２１受容体アゴニストを含むデュアル機能性融合タンパク質を必要とする対象に投与することによる、代謝障害を処置する方法。
【請求項８】
該デュアル機能性融合タンパク質が、個々のＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびＦＧＦ２１受容体アゴニストの組み合わせての投与を超える、対象における代謝パラメーターを改善する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該デュアル機能性融合タンパク質が、変異体２０８、変異体２０９、変異体２１１、変異体２１４、変異体２７２、変異体２７７または変異体３１１をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、投与される対象における代謝プロフィールを改善することが知られている線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）および他の代謝レギュレーターを含む新規タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーは、７つのサブファミリーにグループ分けされる２２個の遺伝的に異なる同種リガンドにより特徴付けられる。ＦＧＦ−２１は、ＦＧＦ−１９およびＦＧＦ−２３に非常に近く、これらとサブファミリーを形成する。このＦＧＦサブファミリーは、古典的ＦＧＦに珍しい種々の生理学的プロセス、すなわちエネルギーおよび胆汁酸ホメオスタシス、グルコースおよび脂質代謝およびリン酸塩ならびにビタミンＤホメオスタシスを制御する。さらに、他のＦＧＦとは違って、該サブファミリーは、内分泌腺様式において作用する(Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8)(Beenkenら (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8, 235)。
【０００３】
ＦＧＦ２１は、２８個のアミノ酸リーダー配列（配列番号：１３２）を含む２０９個のアミノ酸ポリペプチドである。ヒトＦＧＦ２１は、マウスＦＧＦ２１と約７９％アミノ酸同一性、およびラットＦＧＦ２１と約８０％アミノ酸同一性を有する。線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、虚血性血管疾患、創傷治癒、および、肺、気管支または肺胞細胞機能の喪失と関連する疾患に対する処置として記載されている（Nishimuraら (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206；特許公報ＷＯ０１／３６６４０；および特許公報ＷＯ０１／１８１７２）。ＦＧＦ−２１がＦＧＦ受容体および下流シグナル伝達分子、例えば、ＦＲＳ２ａおよびＥＲＫを活性化するが、ＦＧＦＲおよびＦＧＦ−２１の直接的相互作用は検出されていない。試験は、ＦＧＦ−２１に対する細胞性応答の決定因子およびＦＧＦＲを介してＦＧＦ−２１シグナル伝達を介在する補因子として、肝臓、脂肪細胞および膵臓において高度に発現されるβ−クロトー(klotho)を同定した（Kurosu, Hら (2007) J Biol Chem 282, 26687-95）。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｃ）およびＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）β−クロトーシグナル伝達複合体の強力なアゴニストである。
【０００４】
ＦＧＦ−２１は、インスリン−依存性グルコース摂取を誘導することを示した。ＦＧＦ−２１はまた、種々の糖尿病齧歯動物モデルにおいて高血糖を改善することを示した。加えて、ＦＧＦ−２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、食餌性代謝異常に対して耐性であることが見出され、体重および脂肪塊の減少、およびインスリン感受性の増強を証明した（Badman, M.K.ら (2007) Cell Metab 5, 426-37）。糖尿病非ヒト霊長類へのＦＧＦ−２１の投与は、空腹時血漿グルコース、トリグリセリド、インスリンおよびグルカゴンレベルの減少を引き起こし、リポタンパク質プロフィールにおける有意な改善、例えば、ＨＤＬコレステロールの約８０％の増加をもたらした（Kharitonenkov, A.ら (2007) Endocrinology 148, 774-81）。ＦＧＦ２１作用の分子メカニズムを試験する最近の試験は、ＦＧＦ−２１を、空腹時状態への適応をコントロールすることを手助けする重要な内分泌腺ホルモンとして同定した（Badmanら (2009) Endocrinology 150, 4931)(Inagakiら (2007) Cell Metabolism 5, 415）。これは、これまでに不明なＰＰＡＲαの下流の関連性を提供し、それにより、肝臓が生物学的エネルギーホメオスタシスの制御において身体の他の部位と連絡する（Galmanら (2008) Cell Metabolism 8, 169)(Lundasenら (2007) Biochemical and Biophysical Research Communications 360, 437）。
【０００５】
ＦＧＦ２１は、ＡＭＰＫ／ＳＩＲＴ１／ＰＧＣ１α経路の活性化を介して脂肪細胞ホメオスタシスを制御し、ＰＰＡＲγ発現を阻害し、ミトコンドリア機能を増加させる（Chauら (2010) PNAS 107, 12553）。ＦＧＦ２１はまた、培養されたヒト筋管および単離されたマウス組織において測定されるとき、骨格筋によるグルコース摂取を増加させる（Mashiliら (2011) Diabets Metab Res Rev 27, 286-97）。齧歯動物の膵島細胞のＦＧＦ２１処置は、ＥＲＫ１／２およびＡｋｔ経路の活性化を介する改善された機能および生存をもたらす（Wenteら (2006) Diabets 55, 2470）。ＦＧＦ２１処置はまた、恐らくＨＮＦ４αおよびＦｏｘａ２シグナル伝達を介して、齧歯動物の肝臓における脂質生成および脂肪酸酸化酵素に対する遺伝子発現の変化をもたらす。しかしながら、最近の試験（Weiら (2012) PNAS 109, 3143-48）は、食餌性ｏｂｅｓｅマウスのＦＧＦ２１での処置が、（低減したスモイル化を介する）減少したＰＰＡＲγの不活性化によって骨量の減少を誘導する；骨芽細胞から脂肪細胞への間葉性幹細胞分化のシフトが、ＦＧＦ２１処置後の骨におけるＰＰＡＲγ活性の増加の存在下で見られることを示す。
【０００６】
生物学的薬物として直接的にＦＧＦ−２１を使用する問題は、その半減期が非常に短いことである（Kharitonenkov, Aら. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635）。マウスにおいて、ヒトＦＧＦ２１の半減期は０．５から１時間であり、カニクイザルにおいて、半減期は２から３時間である。ＦＧＦ２１は、多目的の滅菌医薬製剤として利用され得る。しかしながら、保存剤、例えば、ｍ−クレゾールが、これらの条件下でその安定性に対する有害な効果を有することが決定されている。
【０００７】
臨床においてすでに示されている別の強力な代謝レギュレーターは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である（Knudsenら (2004) Journal of Medicinal Chemistry 47, 4128）。ＧＬＰ−１は、哺乳動物の消化管のＬ−細胞により分泌される３６個のアミノ酸のインクレチンであり、アルファおよびベータ細胞の両方に対して作用し、インスリン分泌を刺激し、グルコース依存性様式においてグルカゴン放出を阻害する（Hareら (2010) Diabetes 59, 1765; Meierら (2005) Diabetes-Metabolism Research and Reviews 21, 91）。ＧＬＰ−１は、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のクラスＩＩファミリーの７回膜貫通ヘリックスタンパク質であるＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に結合し、活性化する（Mayoら (2003) Pharmacological Reviews 55:167）。ＧＬＰ−１受容体アゴニストとして、ＧＬＰ−１は、末梢組織におけるグルコース吸収を増加させるために膵臓からインスリン分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害し、肝臓グルコース放出の低減を引き起こすことにより、食後血糖レベルを減少させることにおいて重要な役割を有する。
【０００８】
第２の臨床的に重要なＧＬＰ−１受容体アゴニストは、エキセンディン−４である。エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲリザード(Gila Monster lizard)の唾液腺において生産される３９残基のポリペプチドである（Gokeら (1993) Diabetes 46:433-439; Fehmannら (1995) Endocrine Rev. 16:390-410）。それは、独自の非哺乳動物の遺伝子の産物であり、唾液腺においてのみ発現されるようであるが、エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と５２％アミノ酸配列相同性を共有し、哺乳動物においてＧＬＰ−１受容体と相互作用する（Gokeら; Thorensら (1993) Diabetes 42:1678-1682）。インビトロにおいて、エキセンディン−４は、インスリン生産細胞によるインスリン分泌を促進することが示されており、等モル量において与えられると、インスリン生産細胞からインスリン放出を引き起こすことにおいて、ＧＬＰ−１よりもさらに強力である。さらに、エキセンディン−４は、インスリン放出を強力に刺激し、齧歯動物およびヒトの両方において血漿グルコースレベルを低減し、ＧＬＰ−１よりも長く作用する。しかしながら、それは、哺乳動物において自然に生じないため、エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１を欠いている哺乳動物においてある潜在的な抗原特性を有する。
【０００９】
ヒトにおけるグルコースコントロールを改善するＧＬＰ−１およびエキセンディン−４類似体（例えば、リラグルチドおよびバイエッタ）の能力は、臨床的に確立されている（Idris (2010) Diabetes Obesity & Metabolism 12, 89; Monamiら (2009) European Journal of Endocrinology 160, 909）。ＧＬＰ−１はまた、誘導増殖およびアポトーシスの阻害の両方を介してベータ細胞量を増加させることが報告されている（Egan, Aら (2003) Diabetes-Metabolism Research and Reviews 19, 115;Farilla, Lら (2003) Endocrinology 144, 5149;Xu, Gら (1999) Diabetes 48, 2270）。それはまた、胃における酸分泌および胃内容物排出を阻害し、食欲を減少させる満腹シグナルを提供する腸管ホルモンとして作用する（Vilsbollら (2009) Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism 23, 453）。これらの効果は、恐らく、２型糖尿病患者へのＧＬＰ−１類似体の投与で観察される有益な体重減少を説明する。ＧＬＰ−１はまた、虚血後の齧歯動物の心臓において心臓保護することが示されている（Ossumら (2009) Pharmacological Research 60, 411; Sonne, D.P.ら (2008) Regulatory Peptides 146, 243;Nikolaidis, L. Aら (2004) Circulation 109, 962）。
【００１０】
さらに、ＧＬＰ−１は、ＰＰＡＲγの発現を低減することによりヒト間葉性幹細胞（ｈＭＳＣ）の脂肪細胞への分化を減少させることができ、ＧＬＰ−１は、ｈＭＳＣの細胞増殖および細胞保護作用を促進する（Sanzら (2010) Am J Physiol Endocrinol Metab 298, E634-E643）。
【００１１】
１型および２型糖尿病および他の代謝状態の処置における治療剤として使用するための変異体または類似体を含むＦＧＦ２１タンパク質を開発することにおいて、半減期および安定性における増加が望ましい。増強された半減期および安定性を有するＦＧＦ２１タンパク質は、該タンパク質を投与される患者のより少ない投与頻度を可能にする。明らかに、治療タンパク質ＦＧＦ２１に対する安定な水性タンパク質製剤を開発する必要性が存在する。
【００１２】
さらに、タンパク質医薬、例えば、代謝レギュレーターＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４の開発における重要な挑戦は、それらの物理化学的不安定性に対処することである。タンパク質の組成変化および特性は、特定の性質、例えば、フォールディング、立体配座安定性およびアンフォールディング／変性を定義する。このような特性は、タンパク質水溶液を利用する医薬製剤条件を開発する過程でタンパク質を安定化する目的であるとき、対処されるべきである（Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)）。興味ある治療タンパク質、例えば、本発明のタンパク質を安定化する所望の効果は、タンパク質分解および酵素分解に対する耐性を増加させ、それにより、タンパク質安定性を改善し、タンパク質凝集を減少させる。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要
本発明は、新規タンパク質、例えば、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）および他の代謝レギュレーター、例えば、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４を含む融合タンパク質の同定に関し、これは、医薬製剤条件下で構成成分の製剤を超える改善された医薬特性を有し、例えば、より安定であり、投与される対象に対する代謝パラメーターを改善する能力を有し、タンパク質分解および酵素分解されにくく、複合体を凝集および形成する可能性が低く、免疫原性が起こる可能性が低い。本発明のタンパク質は、ＦＧＦ２１受容体アゴニストおよびＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の両方を有し；該タンパク質は、ＦＧＦ２１の切断体および変異体を含み、例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、エキセンディン−４または他の代謝レギュレーターまたはそれらの変異体の１つ以上をさらに含む。
【００１４】
また、記載されていることは、ＦＧＦ２１関連およびＧＬＰ−１関連障害、ならびに他の代謝、内分泌腺および心疾患、例えば、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、急性心筋梗塞、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひ、インスリン受容体における重度の不活性化突然変異と関連する障害、ＨＩＶ関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィーおよび他の代謝障害を処置するための方法、ならびに重症患者の死亡率および罹患率を低下させる方法である。
【００１５】
本発明のタンパク質は、定期的に投与される（例えば、１日に１回、さらに好ましくは１週に１回、２週に１回または１月に１回）注射可能なものとして、単独で、または、１型および２型糖尿病患者の血糖コントロール、体重および脂質プロフィールを改善する経口用抗糖尿病剤と組み合わせて、使用され得る。該タンパク質はまた、肥満または他のＦＧＦ２１またはＧＬＰ−１関連状態の処置のために使用され得る。
【００１６】
本発明のタンパク質、例えば、本発明のＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１変異体およびエキセンディン−４−ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、医薬製剤条件下で野生型ＦＧＦ２１よりも、より安定であり、タンパク質分解および酵素分解されにくく、複合体を凝集および形成する可能性が低く、免疫原性が起こる可能性が低いため、タンパク質治療物、例えば、野生型ＦＧＦ２１の投与と関連する身体的不安定の大きな障害を克服する。
【００１７】
第１の局面において、本発明は、表１に記載されている配列およびさらに本明細書に記載されている配列の１つ以上を含む線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）タンパク質、例えば、融合タンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、野生型、切断型または突然変異体型またはそれらの変異体であっても、ＧＬＰ−１および／またはエキセンディン−４タンパク質をさらに含むことができる。表１に記載されているＦＧＦ２１配列は、野生型ＦＧＦ２１配列、例えば、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０６１９８６．１での野生型ＦＧＦ２１配列の変異体であり、交付済み特許、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに割り当てられているＵＳ６，７１６，６２６Ｂ１において見出される。表１に記載されているＧＬＰ−１およびエキセンディン−４配列は、野生型ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４配列の変異体、例えば、それぞれ、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００２０４５およびＡＡＢ２２００６．１での配列のものであり、特許公報、例えば、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．およびＧｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｏｒｐにそれぞれ割り当てられているＷＯ９８／１９６９８およびＷＯ８７／０６９４１Ａ（ＧＬＰ−１）ならびにＡｍｙｌｉｎに割り当てられているＵＳ  ５，４２４，２８６（エキセンディン−４）において見いだすことができる。
【００１８】
他の態様は、本発明のデュアル(dual)機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび該ベクターを有する宿主細胞を記載している。
【００１９】
本明細書において提供されるものは、本発明のタンパク質を作製するために使用される方法であって、例えば、野生型ＦＧＦ２１タンパク質内の興味ある位置でのアミノ酸の部位特異的取り込み、ならびに他の代謝レギュレーター、例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびエキセンディン−４またはＧＬＰ−１および／またはエキセンディン−４で修飾されたポリマーを有する複合体に対する分子のＦＧＦ２１部分間への融合を介する、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の修飾を含む方法である。該修飾体および融合体は、タンパク質（例えば、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４）の野生型と比較して本発明のタンパク質の生物学的特性を増強し、ならびに、いくつかの場合において、固体支持体の表面へ該変異体を付着させる目的のために、例えば、標識およびタンパク質半減期延長剤に対する付着点として役割を果たす。本発明の関連態様は、該本発明のタンパク質を生産することができる細胞を生産する方法、および該変異体および融合体をコードするＤＮＡを含むベクターを生産する方法である。
【００２０】
種々の態様において、本発明のタンパク質は、哺乳動物において血糖を低下させることができる、８−１２個の長さのアミノ酸残基と小さいフラグメントを含む、ＦＧＦ２１、エキセンディン−４および／またはＧＬＰ−１配列の１つ以上のフラグメントを含むことができる。種々の態様において、本発明のタンパク質は、例えば、野生型配列と比較して１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、付加または置換での、ＦＧＦ２１、エキセンディン−４および／またはＧＬＰ−１配列の１つ以上の変異体を含むことができる。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、野生型ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４と比較して作製される部位特異的アミノ酸修飾の位置にて、または一般的にこれらのタンパク質の野生型と共有されるアミノ酸の位置にて、１つ以上のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリシアル酸と共有結合させることができる。ＰＥＧ基は、本発明の融合タンパク質の構成部分、例えば、ＧＬＰ−１タンパク質変異体またはＦＧＦ２１タンパク質変異体の生物学的機能を増強し、および／またはそれを妨げないように結合される。他の態様において、本発明のポリペプチドは、異種アミノ酸配列に、所望によりリンカーを介して、例えば、ＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：８）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号：１２８）に融合することができる。異種アミノ酸配列は、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメント（例えば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合ポリペプチドであり得る。本明細書に記載されているこのような融合ポリペプチドもまた、多量体を形成することができる。
【００２２】
いくつかの態様において、異種アミノ酸配列（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃなど）は、本発明のタンパク質のアミノ末端に融合される。他の態様において、融合異種アミノ酸配列（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃなど）は、本発明のタンパク質のカルボキシル末端に融合される。さらに他のより好ましい態様において、異種アミノ酸配列（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃなど）は、本発明のデュアル機能性タンパク質の中央、すなわち、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４配列のＣ−末端残基とＦＧＦ２１配列のＮ−末端残基間に位置する。該好ましい態様は、例えば、最大ＧＬＰ−１（エキセンディン−４）活性のためにフリーな(free)Ｎ−末端および最大ＦＧＦ２１活性のためにフリーな無傷なＣ−末端のままである。
【００２３】
いくつかの態様において、ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、抗体の重鎖および軽鎖のＮ−末端に融合し、ＦＧＦ２１は、同じ抗体の重鎖および軽鎖のＣ−末端に同時に融合される（すなわち、本明細書に記載されているフソボディ(fusobody)）。該好ましい態様は、最大ＧＬＰ−１（エキセンディン−４）活性のためにフリーなＮ−末端および最大ＦＧＦ２１活性のためにフリーな無傷なＣ−末端のままである。好ましい態様は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０７６７８１に記載されている抗体配列を使用する。
【００２４】
いくつかの態様において、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４ペプチドは、ＦＧＦ２１に化学的に結合される。いくつかの態様において、該ペプチドは、ＦＧＦ２１アミノ酸残基側鎖に結合される。他の態様において、該ペプチドは、天然型化学的ライゲーションまたは当分野で知られている他の方法を介してＦＧＦ２１のＮ−末端に結合される。好ましい態様は、最大活性のためにＧＬＰ−１（エキセンディン−４）のフリーなＮ−末端および最大活性のためにＦＧＦ２１のフリーな無傷なＣ−末端のままである。
【００２５】
いくつかの態様において、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４ペプチドは、ＦＧＦ２１タンパク質変異体に同時に結合されるポリマー分子に共有結合される。好ましい態様において、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４ペプチドは、ＦＧＦ２１タンパク質変異体に同時に結合されるＰＥＧポリマーに結合される。該好ましい態様は、最大ＧＬＰ−１（エキセンディン−４）活性のためにフリーなＮ−末端および最大ＦＧＦ２１活性のためにフリーな無傷なＣ−末端のままである。本発明のいくつかの態様において、ＧＬＰ−１受容体アゴニストペプチドは、半減期延長を同時に提供するＰＥＧリンカーまたは他のポリマーリンカーならびに２つの受容体アゴニストに対する共有結合を介して、ＦＧＦ２１変異体に結合される。
【００２６】
さらに別の態様は、１つ以上のＦＧＦ２１関連障害またはＧＬＰ−１−関連障害、例えば、肥満、２型糖尿病、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、急性心筋梗塞、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひ、インスリン受容体における不活性化突然変異と関連する障害、ＨＩＶ関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィーおよび他の代謝障害を示す患者を処置する方法であって、治療有効量の１つ以上の本発明のタンパク質またはそれらの医薬組成物を処置の必要な該患者に投与することを含む、方法を記載している。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に記載されている本発明のデュアル機能性タンパク質および薬学的に許容される製剤を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、代謝障害を処置するための方法、および本発明の医薬組成物を必要とするヒト患者に投与することを含む方法において使用することができる。処置することができる代謝障害の非限定的な例は、１型および２型糖尿病および肥満を含む。
【００２８】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の発明の詳細な説明において解明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、異なるＮ−末端突然変異を有するＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質およびエキセンディン−４−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の活性を示す。図１Ａは、ＤＰＰ−４プロテアーゼによるプロセッシングを遅くするために加えられた突然変異体を示す（ＧＬＰ−１ペプチド（丸）または野生型（Ｖ２３１；白四角）、Ｇ０（Ｖ２５１；白丸）、Ａ８Ｇ（Ｖ２５８；白三角）、Ａ８Ｓ（Ｖ２３２；三角）もしくはＥ９Ｐ（Ｖ２７１；四角）ＧＬＰ−１を有するデュアル機能性タンパク質）。図１Ｂは、エキセンディン−４融合物（ＧＬＰ−１ペプチド（四角）またはエキセンディン−４  １−３９（Ｖ２３４；三角）、１−３０（Ｖ２６７；丸）もしくは１−３０／Ｅ１６Ｇ／Ｅ１７Ｑ（Ｖ２６８；白三角））を有するデュアル機能性タンパク質を示す。
【００３０】
【図２】図２は、ＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の薬物動態学的特性（ＰＫ）を示す（ＦＧＦ２１−ＰＥＧ（Ｖ２９４；白四角）、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３；白丸）または野生型ＧＬＰ−１（Ｖ２３７；丸）もしくはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）（Ｖ２３５；三角）ＧＬＰ−１を有するデュアル機能性タンパク質）。０．２５ｍｇ／ｋｇで注射された野生型非ＰＥＧ化ＦＧＦ２１のＰＫは、比較のために示される（四角）。
【００３１】
【図３】図３Ａ−３Ｃは、半減期延長ＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の有効性を測定するために、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を使用しての結果を示す。８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５）に、１ｍｇ／ｋｇ化合物またはビヒクル（均質の白色棒；三角）で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。血糖を投与後１および２４時間に測定し、ＧＬＰ−１の急性効果を評価し、これは、１時間で、野生型ＧＬＰ−１（Ｖ２３９；破線棒；四角）およびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）型（Ｖ２３２；黒色棒；丸）に対して類似であり、２４時間で、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）型がわずかに良く保持した。３回目の夜に、マウスを、投与７２時間後に、１．５ｇ／ｋｇの経口ブドウ糖の投与前に絶食させた。Ａ８Ｓ型を投与されたマウスは、野生型ＧＬＰ−１型と比較して、血糖の有意に改善されたコントロールを示し、Ａ８Ｓ突然変異が活性なＧＬＰ−１の長期レベルを増加させたことを示唆した。
【００３２】
【図４】図４は、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の有効性を示す。１０週齢オスｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝８）に、２週間、示される化合物を週に２回ｉ．ｐ．投与した。ＦＧＦ２１−ＰＥＧ（Ｖ２３８；斜め破線棒；四角）およびＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３９；水平破線棒；白四角）の等価投与は、ビヒクル処置群（丸）と比較したとき、血糖レベル、体重および肝臓健康状態（血清ＡＬＴレベルおよび肝臓重量により測定されるとき）において非常に類似の改善を示した。ＤＰＰ−４−耐性融合物、０．２ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５；垂直破線棒；白三角）は、他の化合物と同様の有効性を示したが、１ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５；黒色棒；三角）での等価投与は、血糖、体重、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および肝臓重量のさらなる低下を与えた。
【００３３】
【図５】図５Ａ−５Ｇは、ｏｂ／ｏｂマウスにおける、ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ＋ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧの共投与（垂直破線棒；白丸）、ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧの単回投与（Ｖ２３８；０．２ｍｇ／ｋｇ（薄い斜め破線棒）；１ｍｇ／ｋｇ（濃い斜め破線棒；四角））、およびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧの単回投与（Ｖ２５３；０．２ｍｇ／ｋｇ（薄い水平破線棒）；１ｍｇ／ｋｇ（濃い水平破線棒；白四角））に対する、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５；黒色棒；白三角）融合タンパク質の比較を示す。９週齢オスｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝８）に、４週間、示される化合物またはビヒクル（均質の白色棒；丸）を週に２回ｉ．ｐ．投与した。融合物は、ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ＋ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧの共投与と比較して、有意に改善された有効性を示した。中程度の体重減少のみがＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧおよびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧで観察されたが、他の群は、食物摂取量における違いによってある程度のみ、相当量の体重を得た。
【００３４】
【図６】図６Ａ−６Ｆは、ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５；濃い棒）とＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２；薄い棒）とを比較して、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の有効性を示す。９週齢オスｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝８）に、２週間、示される化合物またはビヒクル（均質の白色棒）を週に２回ｉ．ｐ．投与した。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧおよびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ融合物の両方は、グルコースコントロールおよび体重に対する０．０５から０．２ｍｇ／ｋｇの用量応答（０．０５  斜め破線棒；０．１  水平破線棒；０．２  垂直破線棒）を示した。０．２ｍｇ／ｋｇで、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧは、特にグルコースレベル、体重、血清トリグリセリドおよびコレステロールの低下に対して、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧよりも非常に有効であった。図６Ａ−６Ｃは、それぞれ、基礎グルコース（ＡＵＣ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および血清総コレステロールのレベルを示す。図６Ｄ−６Ｆは、それぞれ、Ｄ１２体重、肝臓脂質および血清トリグリセリドのレベルを示す。
【００３５】
【図７】図７Ａ−７Ｂは、個々の薬剤の組合せと比較して、膵臓機能を改善し、膵島インスリン量を増加させるＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ融合タンパク質の能力を示す。Ｄｂ／ｄｂマウスに、４週間、週に２回、個々のＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ＋ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧの組合せ（Ｖ７６＋Ｖ２５３；垂直破線棒）、ならびに本発明のＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧデュアル機能性融合タンパク質（Ｖ２７２；斜め破線棒；０．５ｍｇ／ｋｇについて薄い、および１ｍｇ／ｋｇについて濃い）、またはビヒクル（白色棒）を投与した。
【００３６】
【図８】図８Ａ−８Ｂは、個々の薬剤の組合せと比較して、グルコース低下および体重を改善するＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の能力を示す。Ｄｂ／ｄｂマウスに、２週間、週に２回、ビヒクル（白色棒；白丸）、個々のＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３；３ｍｇ／ｋｇ（薄い水平破線棒；白菱形）および５ｍｇ／ｋｇ（濃い水平バー；菱形））およびＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（３ｍｇ／ｋｇ（Ｖ７６；薄い斜め破線棒；白四角）および５ｍｇ／ｋｇ（濃い斜め破線棒；四角））の組合せ、ならびに本発明のＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧデュアル機能性融合タンパク質（Ｖ２７２；０．２ｍｇ／ｋｇ（小さい市松模様棒；白三角）；１ｍｇ／ｋｇ（大きい市松模様棒；三角））を投与した。図において示されているとおり、０．２ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１（７−３５；Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧデュアル機能性融合タンパク質（Ｖ２７２）は、５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧと同程度有効である。また、図において示されているとおり、１．０ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１（７−３５；Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧデュアル機能性融合タンパク質（Ｖ２７２）は、血糖および体重終点の両方について、ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ＋ＧＬＰ−１（７−３５；Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（１＋１ｍｇ／ｋｇ（薄い水平破線棒；Ｘ印(exe)）および３＋３ｍｇ／ｋｇ（濃い水平バー；星印）の最大に有効な組合せ投与よりも有効である。
【００３７】
【図９】図９は、ＦＧＦ２１活性に対するアッセイの結果を示す。ＥＲＫのリン酸化は、示される化合物でのＨＥＫ２９３−ベータ−クロトー細胞の処理後に測定される。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−Ｖ７６−ＰＥＧ（Ｖ２７２）の活性は、等モルエクセナチド(Exenatide)の存在または非存在下で、同じＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧと比較して、シグナルの大きさにおいて有意に高い。
【００３８】
【図１０】図１０は、適合された単一のアゴニストタンパク質またはペプチドと比較して、融合タンパク質の活性を測定するために使用された受容体薬理学的アッセイの結果を示す。ＧＬＰ−１ＲおよびＦＧＦＲ１ｃ／ベータ−クロトー（１０ａおよび１０ｂ）またはＧＬＰ−１Ｒ単独（１０ｃおよび１０ｄ）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、１時間、化合物で処置後に、ＧＬＰ−１Ｒへのベータ−アレスチン補充に対してアッセイした。アッセイにおいて試験された分子は、エキセンディン−４（四角）、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２；丸）、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３；三角）、Ｖ２５３＋ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（白菱形）、エキセンディン−４（１−３９）−Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｖ１０３）（Ｖ２１１；白丸）、エキセンディン−４（１−３９）−Ｆｃ（Ｖ２０１；白三角）およびＶ２０１＋ＦＧＦ２１（Ｖ１０１）（菱形）であった。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明のタンパク質は、当分野で知られている全長野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの修飾バージョンを示す。例えば、ＦＧＦ２１野生型配列とタンパク質変異体との間の比較が必要であるとき、ＦＧＦ２１野生型配列は、参照配列（配列番号：１）となる。ＦＧＦ２１野生型配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１を有し、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＵＳ６，７１６，６２６Ｂ１のような発行済み特許において見いだすことができる（配列番号：１）。
【表１】
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【００４０】
全長ＦＧＦ２１ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）をコードする対応するｍＲＮＡ配列は以下（配列番号：２）に示される：
【表２】
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【００４１】
成熟ＦＧＦ２１配列は、リーダー配列を欠いており、また、当業者により理解されるポリペプチドの他の修飾、例えば、アミノ末端（リーダー配列を有する、または該配列を有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解プロセッシング、より大きな前駆体からより小さいポリペプチドの開裂、Ｎ−連結および／またはＯ−連結グリコシル化および他の翻訳後修飾を含み得る。成熟ＦＧＦ２１配列の典型的な例は、以下の配列（全長ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸位置２９−２０９を示す配列番号：３）を有する：
【表３】
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【００４２】
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（配列番号：３）をコードする対応するｃＤＮＡ配列は、以下（配列番号：４）に示される：
【表４】
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【００４３】
本発明のタンパク質は、当分野で知られている全長の野生型ＧＬＰ−１ポリペプチドの修飾された型を示す。ＧＬＰ−１野生型配列は、例えば、ＧＬＰ−１野生型配列およびタンパク質変異体間の比較が必要であるとき、参照配列（配列番号：５）として役割を果たす。
【００４４】
ＧＬＰ−１野生型配列は、プレプログルカゴン(preproglucagon)野生型配列から翻訳後修飾されるか、さもなければ該配列に由来する。プレプログルカゴン配列（配列番号：５）は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２０４５を有し、例えば、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．およびＧｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｏｒｐ．にそれぞれ割り当てられているＷＯ９８／１９６９８およびＷＯ８７／０６９４１Ａのような特許公報において見出すことができる。例えば、Gokeら (1991) European Journal of Clinical Investigation 21, 135に記載されているとおり、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンに由来する３７ｍｅｒである（ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンの残基９２−１３８を構成し、以下の配列番号：５において下線が引かれている）。ＧＬＰ−１は、６個のＮ−ｔｅｒｍ残基の開裂により、活性な３１ｍｅｒにさらにプロセッシングされる。
【表５】
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【００４５】
プロセッシングされた野生型ＧＬＰ−１配列の例は、以下のとおりである（配列番号：１２９）：
【表６】
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【００４６】
活性なＧＬＰ−１配列の例は、以下のとおりである（配列番号：３０）： 
【表７】
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【００４７】
プレプログルカゴンＧＬＰ−１野生型配列（配列番号：５）をコードする対応するｍＲＮＡ配列は、以下に示される（配列番号：６）：
【表８】
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【００４８】
本発明のタンパク質は、当分野で知られている全長の野生型エキセンディン−４ポリペプチドの修飾された型を示す。エキセンディン−４野生型配列は、例えば、エキセンディン−４野生型配列およびタンパク質変異体間の比較が必要であるとき、参照配列（配列番号：７）として役割を果たす。
【００４９】
エキセンディン−４野生型配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ２２００６．１を有し、例えば、Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏに割り当てられているＵＳ５，４２４，２８６のような発行済み特許において見出すことができる。野生型配列の例は以下のとおりである（配列番号：７）：
【表９】
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【００５０】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載されている野生型タンパク質のタンパク質変異体または突然変異体、例えば、ＦＧＦ２１変異体、ＧＬＰ−１変異体および／またはエキセンディン−４変異体を含み得る。本明細書において使用される「タンパク質変異体」、「ヒト変異体」、「ポリペプチドまたはタンパク質変異体」、「変異体」、「突然変異体」なる用語、ならびにそれらのような用語またはそれらの特定の型（例えば、「ＦＧＦ２１タンパク質変異体」、「ヒトＧＬＰ−１変異体」、「エキセンディン−４ポリペプチドまたはタンパク質変異体」、「変異体」、「ＦＧＦ２１突然変異体」など）は、天然（すなわち、野生型）タンパク質またはポリペプチド対応物または対応する天然配列の修飾体、切断体、他の変異体を含むタンパク質またはポリペプチド配列を定義する。例えば、「変異体ＦＧＦ２１」または「ＦＧＦ２１突然変異体」は、本明細書に記載されている野生型（すなわち、天然）ＦＧＦ２１タンパク質と比較して記載されている。
本発明の典型的なデュアル機能性タンパク質配列は、表１に記載されている。該アゴニストの記載は、リンカーを適用する場合、個々の構成アゴニストを含む。変異体が構成アゴニストとして使用されるとき、作られる変化または置換は、それらの野生型対応物と比較して番号付けされる。一例として、「デュアル機能１−タンパク質」（配列番号：９）は、本明細書に記載されている野生型ＧＬＰ−１配列の残基７−３５（すなわち、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）、リンカー配列、および本明細書に記載されているＦＧＦ２１野生型配列（配列番号：１）に対する多くの挙げられている変化を有するＦＧＦ２１変異体（すなわち、ＦＧＦ２１受容体アゴニスト）を含む。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【００５１】
本発明のタンパク質において使用される変異体または突然変異体、例えば、野生型ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１および／またはエキセンディン−４の変異体は、野生型タンパク質と比較して、少なくとも１つの置換、付加および／または除去されたアミノ酸を特徴とする。さらに、変異体は、野生型タンパク質と比較してＮ−および／またはＣ−末端切断を含み得る。一般的に言えば、変異体は、野生型タンパク質のいくつかの修飾された特性、構造または機能を有する。例えば、変異体は、濃縮液中の増強または改善された物理的安定性（例えば、低い疎水性媒介凝集）、血漿とインキュベートしたとき増強または改善された血漿安定性、または免疫原性に対して減少された危険性、または好ましい生物活性プロフィールを維持して増強または改善された生物活性を有し得る。
【００５２】
本発明のタンパク質およびそれらの野生型比較タンパク質の部分間の違いを構成する許容されるアミノ酸置換および修飾は、１つ以上のアミノ酸置換、例えば、ピロリジン、ピロリン−カルボキシ(carbyoxy)−リジン（Ｐｃｌ）および非天然アミノ酸アナログとの置換、および切断を含むが、これらに限定されない。したがって、本発明のタンパク質（例えば、本発明の融合タンパク質）は、本明細書に記載されている部位特異的突然変異体、切断ポリペプチド、タンパク質分解−耐性突然変異体、凝集減少突然変異体、組合せ突然変異体および融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
タンパク質の発現の分野の当業者は、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が、大腸菌における発現のために、本発明のタンパク質のいずれかのＮ−末端に導入することができることを認識しており、本発明の文脈内に考慮される。
【００５４】
タンパク質の発現の分野の当業者は、発現レベル、精製または安定化を調節する目的のためのさらなるタグまたは融合ドメインが、任意の宿主細胞における発現のために、タグまたは融合ドメインの後の除去のために、特異的プロテアーゼによる消化を標的とするためのさらなるペプチドの有りまたは無しで、本発明のタンパク質のいずれかのＮ−末端に導入することができることを認識しており、本発明の文脈内に考慮される。
【００５５】
タンパク質の発現の分野の当業者は、ペリプラズムまたは細胞外間隙に発現されたタンパク質を標的化するリーダーペプチドは、大腸菌または他の細菌宿主における発現のために、本発明のタンパク質のいずれかのＮ−末端に導入することができることを認識しており、本発明の文脈内に考慮される。
【００５６】
タンパク質の発現の分野の当業者は、ＥＲ、分泌小胞または細胞外間隙に発現されたタンパク質を標的化するリーダーペプチドは、真核宿主細胞における発現のために、本発明のタンパク質のいずれかのＮ−末端に導入することができることを認識しており、本発明の文脈内に考慮される。
【００５７】
本発明のタンパク質は、医薬防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との増加した互換性を有し得、したがって、保存中にタンパク質の生理化学特性および生物学的活性を維持する保存された医薬製剤の調製を可能にする。したがって、野生型１と比較して増強された医薬安定性を有する変異体は、生理学的および保存された医薬製剤条件下で濃縮液中の改善された物理的安定性を有し、生物学的効力を維持している。非限定的な例のために、本発明のタンパク質は、それらの野生型対応物または対応する天然配列よりも、タンパク質分解および酵素分解に対してさらに耐性であり得；改善された安定性を有し得；凝集する可能性が低いかもしれない。本明細書において使用される、これらの用語は、相互排他的または限定的ではなく、全体に、挙げられた変異体が野生型タンパク質の１つ以上の修飾された特性を有することを可能にする。
【００５８】
本発明はまた、例えば、ＦＧＦ２１タンパク質変異体に対する望ましい特性、例えば、ＦＧＦ２１−受容体に対する改善された効力、タンパク質分解−耐性、増加した半減期または凝集−減少特性およびそれらの組合せを与える特定の残基がさらに修飾されていない、配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一である、ＦＧＦ２１アミノ酸配列を含む、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を含む。言い換えれば、タンパク質分解−耐性、凝集−減少または他の特性を与えるために修飾されているＦＧＦ２１突然変異体配列における残基を除いて、ＦＧＦ２１突然変異体配列における全ての他のアミノ酸残基の約５％（代替的に４％、代替的に３％、代替的に２％、代替的に１％）を修飾させることができる。このようなＦＧＦ２１突然変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。
【００５９】
同様に、本発明はまた、デュアル機能性タンパク質変異体に対する望ましい特性、例えば、タンパク質分解−耐性、増加した半減期または凝集−減少特性およびそれらの組合せを与える特定の残基がさらに修飾されていない、アミノ酸配列が、配列番号：３０および７のアミノ酸配列とそれぞれ、少なくとも約８５％同一、さらに好ましくは少なくとも約９０から９５％同一である、分子のＧＬＰ−１およびエキセンディン−４部分をコードする核酸分子を含む。
【００６０】
本発明はまた、コードされたタンパク質のタンパク質分解−耐性、凝集−減少または他の特性を与えるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドがさらに修飾されていない、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６のヌクレオチド配列および野生型エキセンディン−４をコードするｃＤＮＡ配列と少なくとも約８５％同一、さらに好ましくは少なくとも約９０から９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。言い換えれば、タンパク質分解−耐性、凝集−減少または他の特性を与えるために修飾されているＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４突然変異体配列における残基をコードするヌクレオチドを除いて、突然変異体配列における全ての他のヌクレオチドの約１５％、さらに好ましくは約１０から５％を修飾させることができる。このような核酸分子は、それらの野生型対応物の少なくとも１つの活性を有するタンパク質をコードする。
【００６１】
本明細書において提供されるものは、本発明のタンパク質を作製するために使用される方法であって、タンパク質の野生型（例えば、本明細書に記載されているＦＧＦ２１野生型タンパク質）の部位特異的修飾および非部位特異的修飾、例えば、野生型タンパク質の切断および野生型タンパク質内の興味ある位置でのアミノ酸の部位特異的取り込みを含む方法である。該修飾は、野生型タンパク質と比較して本発明のタンパク質の生物学的特性を増強し、ならびに、いくつかの場合において、固体支持体の表面へ該変異体を付着させる目的のために、例えば、標識およびタンパク質半減期延長剤に対する、付着点として役割を果たす。本発明の関連態様は、該本発明のデュアル機能性タンパク質を生産することができる細胞を生産する方法、および該変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを生産する方法である。
【００６２】
１つの態様において、例えば、半減期を延長する、またはそうではなく、該タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの生物学的特性を改善する目的のために、かかる修飾、例えば、部位特異的修飾は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドに、複合体、例えばＰＥＧ基を結合させるために使用される。該技術は、本明細書にさらに記載されている。
【００６３】
他の態様において、かかる修飾、例えば、部位特異的修飾は、本発明のタンパク質の半減期を延長する他のポリマー、小分子および組換えタンパク質配列に結合させるために使用される。１つのこのような態様は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへの脂肪酸または特定のアルブミン結合化合物の結合を含む。他の態様において、該修飾は、特定のアミノ酸型で作られ、タンパク質上の１つ以上の部位に結合され得る。
【００６４】
他の態様において、このような修飾、例えば、部位特異的修飾は、野生型および／または変異体多量体、例えば、二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）または三量体または四量体の生産のための結合手段として使用される。これらの多量体タンパク質分子は、さらに、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、他のタンパク質、例えば、Ｆｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などに結合または融合された基、例えば、ＰＥＧ、糖、および／またはＰＥＧ−コレステロール複合体を有し得る。
【００６５】
他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを生産するために使用され、部位特異的に組み込まれたピロリジン、ピロリン−カルボキシ−リジンまたはピロリジン類似体または非天然アミノ酸（パラ−アセチル−Ｐｈｅ、パラ−アジド−Ｐｈｅ）の位置が、制御配向および固体支持体の表面上へのこのようなタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの結合を可能にするか、または結合される基、例えば、ＰＥＧ、糖および／またはＰＥＧ−コレステロール複合体を有することを可能にする。
【００６６】
他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを部位特異的に架橋するために使用され、それにより、ヘテロ二量体およびヘテロ三量体を含むが、これらに限定されないヘテロ−オリゴマーを形成する。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを部位特異的に架橋するために使用され、それにより、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質−ポリペプチド複合体、タンパク質−ペプチド複合体、ポリペプチド−ポリペプチド複合体、ポリペプチド−ペプチド複合体またはペプチド−ペプチド複合体を形成する。他の態様において、部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの単一部位で２つ以上の分子の型を結合させることを可能にする分岐点を含み得る。
【００６７】
他の態様において、本明細書に記載されている修飾は、非部位特異的手段において行うことができ、本発明のタンパク質−タンパク質複合体、タンパク質−ポリペプチド複合体、タンパク質−ペプチド複合体、ポリペプチド−ポリペプチド複合体、ポリペプチド−ペプチド複合体またはペプチド−ペプチド複合体をもたらす。
【００６８】
定義
種々の定義が、本明細書を通して使用される。多数の用語は、当業者がそれらの用語に帰属すると考える意味を有する。下記で、または本明細書の他の場所で具体的に定義された用語は、全体として、本発明の文脈で提供される意味を有し、一般的には、当業者により理解されるものである。
【００６９】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１」なる用語は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーメンバーを示す。ＦＧＦ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸配列は、配列番号：１として記載されており、これと対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号：２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）として記載されている。。「ＦＧＦ２１変異体」、「ＦＧＦ２１突然変異体」および同様の用語は、例えば、欠失された、付加された、修飾された、または置換された構成アミノ酸残基を有する、ＦＧＦ２１タンパク質の修飾された型を示す。
【００７０】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１受容体」なる用語は、ＦＧＦ２１に対する受容体を示す（Kharitonenkov,Aら (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,Hら (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Yら (2007) PNAS 104:7432-7437）。
【００７１】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」なる用語は、ヒトにおいて発現される天然ポリペプチドを示す。この記載の目的のために、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」なる用語は、あらゆる全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば、２０９アミノ酸残基からなり、配列番号：２のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：１；全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端で２８アミノ酸残基（すなわち、これはシグナルペプチドを構成する）が除去されている１８１アミノ酸残基からなるあらゆる該ポリペプチドの成熟形態を互換的に示すために使用することができる。
【００７２】
本明細書において使用される「変異体７６」または「Ｖ７６」は、Ｃｙｓ１５４を介して結合される４０ｋＤａ分岐状ＰＥＧ、および１７７個のアミノ酸野生型タンパク質と比較して８個の点突然変異を特徴とするＦＧＦ２１タンパク質変異体である。変異体の合成は、本願明細書においてより詳細に記載されている。
【００７３】
本明細書において使用される「変異体１０１」または「Ｖ１０１」は、操作されたジスルフィド架橋、および１７７個のアミノ酸野生型タンパク質と比較して８個の点突然変異を特徴とするＦＧＦ２１タンパク質変異体であり、ＧＳリンカーでのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ−ドメインへの融合として発現される。変異体の合成は、本願明細書においてより詳細に記載されている。
【００７４】
本明細書において使用される「変異体１０３」または「Ｖ１０３」は、操作されたジスルフィド架橋、および１７７個のアミノ酸野生型タンパク質と比較して８個の点突然変異を特徴とするＦＧＦ２１タンパク質変異体であり、ＧＳリンカーでのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ−ドメインへの融合として発現される。変異体の合成は、本願明細書においてより詳細に記載されている。
【００７５】
本明細書において使用される「変異体１８８」または「Ｖ１８８」は、操作されたジスルフィド架橋、および１７７個のアミノ酸野生型タンパク質と比較して８個の点突然変異を特徴とするＦＧＦ２１タンパク質変異体であり、（ＳＧＧＧＧ）３リンカーでのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ−ドメインへの融合として発現される。変異体の合成は、本願明細書においてより詳細に記載されている。
【００７６】
「ＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧデュアルアゴニスト」、「デュアル機能性タンパク質」、「デュアル機能性融合タンパク質」、「デュアル活性タンパク質」、「融合産物」、「デュアルＦＧＦ２１受容体アゴニストおよびＧＬＰ−１受容体アゴニスト」、「本発明のデュアルＦＧＦ２１受容体アゴニストおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストタンパク質」、「ＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１融合タンパク質」、「本発明の融合タンパク質」、「本発明の融合物」および同様の用語は、別の代謝レギュレーター、例えば、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４に融合または連結した、少なくともＦＧＦ２１ポリペプチドまたはタンパク質変異体、突然変異体または切断型を含むタンパク質またはポリペプチド融合物を定義する。それらは、それらのそれぞれの構成要素の受容体に対するデュアル活性またはデュアル機能を有する単一の分子を含む、すなわち、それらは、ＦＧＦ２１受容体およびＧＬＰ−１受容体アゴナイズする能力を示す。該融合タンパク質の構成配列は、天然（すなわち、野生型）タンパク質またはポリペプチド対応物の修飾体、切断体、他の変異体を含み得、あらゆる種々の他の修飾、例えば、ＰＥＧ基を半減期延長のために使用され得る。
【００７７】
本発明のＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ融合タンパク質の特に好ましい態様は、ＦＧＦ２１変異体として、Ｖ７６（本願明細書において定義されているとおり）を含む。該好ましい態様はまた、本願明細書において「ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１−ＰＥＧ」と称され、野生型ＧＬＰ−１配列と比較して位置８にてアラニンからセリンへの置換（配列番号：５１２９）および野生型ＦＧＦ２１配列と比較して位置１５４にてアルギニンからシステインへの置換（配列番号：１）を特徴とする。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧの配列は以下のとおりである（配列番号：９）。
【表５８】
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【００７８】
「単離された核酸分子」なる用語は、（１）全核酸が供給源細胞から単離されるとき、天然に見出される少なくとも約５０パーセントのタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質から分離されている、（２）「単離された核酸分子」が天然に連結されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部に連結されていない、（３）天然に連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に起こらない、本発明の核酸分子を示す。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチド生産における使用または治療、診断、予防または研究の使用を妨げるであろう、天然環境において見られるあらゆる他の汚染核酸分子または他の汚染を実質的に含まない。
【００７９】
「ベクター」なる用語は、コード情報を宿主細胞に伝達するために使用されるあらゆる分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を示すために使用される。
【００８０】
「発現ベクター」なる用語は、宿主細胞の形質転換のために適当であり、挿入された異種核酸配列の発現を指向および／またはコントロールする核酸配列を含むベクターを示す。発現は、プロッセシング、例えば、転写、翻訳およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在するとき）を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
「作動可能に連結した」なる用語は、フランキング配列が通常の機能を行うように構成されるか、または集合される、フランキング配列の配置を示すために本明細書において使用される。融合タンパク質の要素は、融合タンパク質が、天然、内因性タンパク質であるときのように機能することができ、および／または相乗様式で該融合タンパク質の異種要素と結合することができるように、お互いに作動可能に連結され得る。
【００８２】
ヌクレオチドレベルにおいて、コード配列に作動可能に連結したフランキング配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を指向することができるとき、プロモーターに作動可能に連結している。正確に機能する限り、フランキング配列はコード配列と隣接する必要はない。したがって、例えば、介在するまだ翻訳されていない転写配列が、プロモーター配列とコード配列間に存在することができ、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結している」と考えることができる。
【００８３】
「宿主細胞」なる用語は、核酸配列で形質転換されているか、核酸配列で形質転換され、次に、選択される興味ある遺伝子を発現することができる細胞を示すために使用される。該用語は、選択される遺伝子が存在する限り、子孫が元の親と構成される形態または遺伝子において同一であるがなかろうと、親細胞の子孫に含む。
【００８４】
本明細書において使用される「アミノ酸」なる用語は、それらの構造がこのような立体異性体形態を可能にするとき、ＤおよびＬ立体異性体における全てにおいて、天然アミノ酸と同様の様式において機能する天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体およびアミノ酸模擬物を示す。アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される、それらの名前、それらの一般的に知られる３文字記号または１文字記号のいずれかにより示す。
【００８５】
生物学的物質、例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などに関連して使用されるとき、「天然」なる用語は、天然において見出され、ヒトにより操作されていない物質を示す。同様に、本明細書において使用される「非天然」は、天然において見出されないか、またはヒトにより構造的に修飾または合成されている物質を示す。ヌクレオチドに関連して使用されるとき、「天然」なる用語は、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を示す。アミノ酸に関連して使用されるとき、「天然」なる用語は、２０の慣用のアミノ酸（すなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ））、ならびにセレノシステイン、ピロリジン（Ｐｙｌ、またはＯ）、およびピロリン−カルボキシ−リジン（Ｐｃｌ、またはＺ）を示す。
【００８６】
ピロリジン（Ｐｙｌ）は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａファミリーのメタン生成古細菌のメチルアミンメチルトランスフェラーゼ内に天然に見出されるアミノ酸である。ピロリジンは、それぞれのｍＲＮＡにおいてインフレームのＵＡＧコドンで共翻訳的に組み込まれるリジン類似体であり、２２番目の天然アミノ酸と考えられる。
【００８７】
ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１０／４８５８２（出願人ＩＲＭ、ＬＬＣ）において少なくとも記載されているとおり、大腸菌においてピロリジン（Ｐｙｌ）を生物合成する試みは、ピロリン−カルボキシ−リジンまたはＰｃｌとして本明細書において称される「脱メチル化ピロリジン」の形成をもたらした。本明細書において使用される「Ｐｃｌ」は、Ｐｃｌ−ＡまたはＰｃｌ−Ｂのいずれかを示す。
【００８８】
本明細書において使用される「非天然(non-natural)アミノ酸」および「非天然(unnatural)アミノ酸」なる用語は、互換的に、同じか、または異なっている任意の生物体からの修飾されていない、または修飾された遺伝子を使用して、任意の生物体において生合成的に産生することができないアミノ酸構造を示すことが意図される。該用語は、天然（野生型）ＦＧＦ２１タンパク質配列または本発明の配列に存在しないアミノ酸残基を示す。これらは、２０天然アミノ酸の１つではない修飾されたアミノ酸および／またはアミノ酸類似体、セレノシステイン、ピロリジン（Ｐｙｌ）またはピロリン−カルボキシ−リジン（Ｐｃｌ、例えば、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１０／４８５８２に記載されている）を含むが、これらに限定されない。このような非天然アミノ酸残基は、天然アミノ酸の置換、および／または天然（野生型）ＦＧＦ２１タンパク質配列または本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入により導入することができる。非天然アミノ酸残基はまた、所望の機能性をＦＧＦ２１分子に与えるように組み込むことができる、例えば、機能性部分に連結する能力（例えば、ＰＥＧ）。アミノ酸に関連して使用されるとき、記号「Ｕ」は、本明細書において使用されるとき、「非天然(non-natural)アミノ酸」および「非天然(unnatural)アミノ酸」を意味するものとする。
【００８９】
加えて、このような「非天然アミノ酸」は、一般的に、タンパク質への取り込みのために、修飾されたｔＲＮＡおよび修飾されたｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を必要とすることが理解される。これらの「選択される」直交ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、Ｓｃｈｕｌｔｚらにより開発された選択プロセスまたはランダムもしくは標的化突然変異により作製される。一例として、ピロリン−カルボキシ−リジンは、ある生物体から宿主細胞に移動させられる遺伝子により生合成的により産生されるため、および天然ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を使用することによりタンパク質に組み込まれるため、「天然アミノ酸」であるが、ｐ−アミノフェニルアラニン（Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9参照）は、生合成的に産生されるが、「選択される」（すなわち、「天然」でない）直交ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼペアによりタンパク質に組み込まれるため、「非天然アミノ酸」である。
【００９０】
修飾されたコードアミノ酸は、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン(naphthalanine)、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンを含むが、これらに限定されない。「アミノ酸」なる用語はまた、特定の生物体における代謝産物であるが、タンパク質への取り込みのために遺伝子コードによってコードされない天然アミノ酸を含む。このようなアミノ酸は、オルニチン、Ｄ−オルニチンおよびＤ−アルギニンを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書において使用される「アミノ酸類似体」なる用語は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、一例のみとして、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されるα−炭素を有する化合物を示す。アミノ酸類似体は、可逆的にまたは不可逆的に、化学的にブロックされている天然および非天然アミノ酸、または化学的に修飾されているそれらのＣ−末端カルボキシ基、それらのＮ−末端アミノ基および／またはそれらの側鎖官能基を含む。このような類似体は、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホン、アスパラギン酸−（ベータ−メチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシンおよびメチオニンメチルスルホニウムを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書において使用される「アミノ酸模擬物」なる用語は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、天然アミノ酸と同様の様式において機能する構造を有する化合物を示す。
【００９３】
「生物学的に活性な変異体」なる用語は、ポリペプチド変異体に導入されている修飾の型または数にかかわらず、その野生型（例えば、天然）タンパク質またはポリペプチド対応物の活性、例えば、血糖、ＨｂＡ１ｃ、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベルを調節する；膵臓機能を増加させる；肝臓における脂質レベルを減少させる；体重を減少させる；および、グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を有する、本発明のデュアル機能性タンパク質において、例えば、融合物の構成タンパク質として、使用されるあらゆるポリペプチド変異体を示す。それらの野生型バージョンと比較して、若干減少したレベルの活性を有するポリペプチド変異体は、それでもなお、生物学的に活性なポリペプチド変異体と考えることができる。本発明の生物学的に活性なポリペプチド変異体の非限定的な典型的な例は、後に修飾され、野生型ＦＧＦ２１と比較して、同様の、または増強された生物学的特性を有するＦＧＦ２１変異体である。
【００９４】
「有効量」および「治療有効量」なる用語はそれぞれ、野生型ポリペプチドまたはタンパク質対応物の１つ以上の生物学的活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下させる；肝臓トリグリセリドもしくは脂質レベルを低下させる；体重を減少させる；または、グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力の観察できるレベルをサポートするために使用される本発明の融合タンパク質の量を示す。例えば、ＦＧＦ２１関連障害またはＧＬＰ−１−関連障害（例えば、１型もしくは２型糖尿病、肥満またはメタボリック・シンドローム）を示す、該障害に罹患している、または該障害に罹患しやすい患者に投与される「治療有効量」は、上記障害と関連する病理学的症状、疾患進行、生理学的状態における改善を誘導する、改善する、さもなければ引き起こす量、または該障害での死に対する抵抗力を誘導する、改善する、さもなければ引き起こす量である。本発明の目的のために、「対象」または「患者」は、好ましくはヒトであるが、動物、さらに具体的には、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００９５】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」なる用語は、本発明の融合タンパク質の送達を成し遂げるか、または増強するために適当な１つ以上の製剤物質を示す。
【００９６】
「抗原」なる用語は、抗体により結合することができ、さらに抗原のエピトープに結合することができる抗体を生産するように動物において使用することができる分子または分子の一部を示す。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００９７】
「天然Ｆｃ」なる用語は、単量体または多量体形態のいずれでも、全抗体の消化から得られる、または他の手段により生産される非抗原結合フラグメントの配列を含み、ヒンジ領域を含むことができる分子または配列を示す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源であり、任意の免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ分子は、共有（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合により二量体または多量体形態に連結することができる単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１およびＩｇＧＡ２）に依存して１から４の範囲である。天然Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合二量体である（Ellisonら 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9参照）。本明細書において使用される「天然Ｆｃ」なる用語は、単量体、二量体および多量体形態の総称である。「Ｆｃ変異体」なる用語は、天然Ｆｃから修飾されるが、サルベージ(salvage)受容体、ＦｃＲｎ（新生児のＦｃ受容体）に対する結合部位をまだ含む分子または配列を示す。国際公開ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８は、典型的なＦｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載しており、出典明示により包含させる。したがって、「Ｆｃ変異体」なる用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子または配列を含むことができる。さらに、天然Ｆｃは、本発明のタンパク質の融合分子に対して必要ではない構造的特徴または生物学的活性を提供するため、除去することができる領域を含む。したがって、「Ｆｃ変異体」なる用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択される宿主細胞との不適合性、（３）選択される宿主細胞における発現時のＮ−末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響するか、またはこれらと関与する、１つ以上の天然Ｆｃ部位または残基を欠いているか、または、１つ以上のＦｃ部位または残基が修飾されている、分子または配列を含む。Ｆｃ変異体は、以下にさらに詳細に記載されている。
【００９８】
「Ｆｃドメイン」なる用語は、上記定義のとおりの天然ＦｃおよびＦｃ変異体および配列を含む。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」なる用語は、全抗体から消化されるか、または他の手段により生産される単量体または多量体形態における分子を含む。本発明のいくつかの態様においては、Ｆｃドメインは、例えば、ＦｃドメインとＦＧＦ２１配列間の共有結合を介して、ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１突然変異体（ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１突然変異体の切断形態を含む）に融合することができる。このような融合タンパク質は、Ｆｃドメインの結合を介して多量体を形成することができ、これらの融合タンパク質およびこれらの多量体の両方が本発明の局面である。
【００９９】
本願明細書において使用される「フソボディ」なる用語は、２つのヘテロ二量体を含む抗体様可溶性タンパク質を示し、それぞれのヘテロ二量体は、例えば、１つ以上のジスルフィド結合を介して、互いに安定に結合されるアミノ酸の１つの重鎖および１つの軽鎖からなる。それぞれの重鎖または軽鎖は、フソボディの重鎖および軽鎖定常領域とそれぞれ称される抗体の定常領域を含む。重鎖定常領域は、少なくとも抗体のＣＨ１領域を含み、ヒンジ領域を含むＣＨ２およびＣＨ３領域をさらに含み得る。軽鎖定常領域は、抗体のＣＬ領域を含む。フソボディにおいて、抗体の可変領域は、異種可溶性結合ドメインにより置換される。非限定的な例の目的として、本発明のフソボディは、ＧＬＰ−１受容体アゴニストが抗体の重鎖および軽鎖のＮ−末端に融合し、ＦＧＦ２１が同じ抗体の重鎖および軽鎖のＣ−末端に同時に融合している、本発明のデュアル機能性融合タンパク質を含むことができる。
【０１００】
「異種」なる用語は、これらのドメインが、抗体の定常領域と結合されることが、天然に見られないことを意味する。特に、このような異種結合ドメインは、４つのフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４ならびに間に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる抗体可変ドメインの典型的な構造を有さない。したがって、フソボディのそれぞれのアームは、抗体の定常ＣＨ１重鎖領域のＮ−末端部分に共有的に連結される第１の結合ドメインを含む第１の一本鎖ポリペプチド、および抗体の定常ＣＬ軽鎖のＮ−末端部分に共有的に連結される第２の結合ドメインを含む第２の一本鎖ポリペプチドを含む。共有結合は、例えばペプチド結合を介して直接的、またはリンカー、例えばペプチドリンカーを介して間接的であり得る。フソボディの２つのヘテロ二量体は、抗体構造のように、例えば、これらのヒンジ領域にて少なくとも１つのジスルフィド架橋により、共有的に連結される。フソボディ構造を有する分子の例は、当分野に開示されており、特に、ヘテロ二量体受容体のリガンド結合領域を含むフソボディである（例えば、国際特許公報ＷＯ０１／４６２６１およびＷＯ１１／０７６７８１参照）。
【０１０１】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」なる用語は、カップリングまたは活性化部分に対してカップリング剤または誘導体化の有無にかかわらず、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を示す。
【０１０２】
「エクセナチド」なる用語は、エキセンディン−４の合成型を示す。バイエッタおよびビデュリオンとして販売されているエクセナチドは、２型糖尿病の処置のために２００５年４月に承認されたグルカゴン様ペプチド−１アゴニスト（ＧＬＰ−１アゴニスト）医薬である。それは、インクレチン模擬物のグループに属し、Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより製造される。
【０１０３】
エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲリザードの唾液腺において生産される３９個の残基のポリペプチドである（Gokeら (1993) Diabetes 46:433-439; Fehmannら (1995) Endocrine Rev. 16:390-410）。それは、独自の非哺乳動物の遺伝子の産物であり、唾液腺においてのみ発現されるようであるが、エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と５２％アミノ酸配列相同性を共有し、哺乳動物においてＧＬＰ−１受容体と相互作用する（Gokeら; Thorensら (1993) Diabetes 42:1678-1682）。
【０１０４】
「ＦＧＦ２１関連障害」、「ＧＬＰ−１−関連障害」、「エキセンディン−４−関連障害」なる用語および本明細書において同様に使用される用語、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、急性心筋梗塞、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひ、インスリン受容体における重度の不活性化突然変異と関連する障害、ＨＩＶ関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィー、および他の代謝障害を含む。
【０１０５】
「インスリン受容体における重度の不活性化突然変異と関連する障害」なる用語および本明細書において同様に使用される用語は、重度なインスリン耐性を引き起こすが、２型糖尿病において一般的な肥満なしで、しばしば（常にではないが）見られる、インスリン受容体（またはそれから直接的に下流である可能性があるタンパク質）における突然変異を有している対象における状態を示す。多くの点で、これらの状態に罹患している対象には、１型糖尿病および２型糖尿病の混合の症状が現れる。それに罹患された対象は、Ａ型インスリン耐性、Ｃ型インスリン耐性（ＡＫＡ  ＨＡＩＲ−ＡＮ症候群）、Ｒａｂｓｏｎ−Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群、および最後にＤｏｎｏｈｕｅ’ｓ症候群またはＬｅｐｒｅｃｈａｕｎｉｓｍを含む、おおよそ増加する重症度のいくつかのカテゴリーに分類される。これらの障害は、非常に高い内因性インスリンレベルと、および非常にしばしば高血糖と関連する。それに罹患された対象はまた、アンドロゲン過剰症、多嚢胞卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、多毛症、および皮膚のひだにおける黒色表皮症（過剰増殖および色素沈着）を含む「インスリン毒性」と関連する種々の臨床的特徴を示す。
【０１０６】
「ＨＩＶ関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィー」は、体脂肪の選択的(selective)喪失により特徴付けられる脂肪組織の障害である。リポジストロフィーを有する患者は、インスリン耐性、高インスリン血症、高血糖、高トリグリセリド血症および脂肪肝を発症する傾向を有する。遺伝的（遺伝性）または後天的である多数の型のリポジストロフィーで存在する。遺伝型のリポジストロフィーは、先天性全身型リポジストロフィー（Ｂｅｒａｒｄｉｎｅｌｌｉ−Ｓｅｉｐ症候群）および家族性部分型リポジストロフィーのいくつかの型（Ｄｕｎｎｉｇａｎ型、Ｋｏｂｂｅｒｌｉｎｇ型、ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉｓ型）を含む。後天型のリポジストロフィーは、後天性全身型リポジストロフィー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ症候群）、後天性部分型リポジストロフィー（Ｂａｒｒａｑｕｅｒ−Ｓｉｍｏｎｓ症候群）、およびＨＩＶを処置するために使用されるプロテアーゼ阻害剤およびヌクレオシド逆転写酵素阻害剤により誘導されるリポジストロフィーを含む。
【０１０７】
「２型糖尿病」は、インスリンの利用可能性にかかわらず過剰なグルコース生産により特徴付けられる状態であり、循環グルコースレベルが、不十分なグルコースクリアランスの結果として、過剰に高く維持される。
【０１０８】
「１型糖尿病」は、インスリンの完全な欠乏により引き起こされる高い血糖レベルにより特徴付けられる状態である。これは、身体の免疫系が膵臓におけるインスリンを生産するベータ細胞を攻撃し、それらを破壊するときに起こる。その結果、膵臓は、ほとんどあるいは全くインスリンを生産しない。
【０１０９】
「耐糖能障害」または耐糖能異常（ＩＧＴ）は、心臓血管病理学の危険性の増加と関連する血糖異常症の前糖尿病状態である。前糖尿病状態は、対象の、グルコースの細胞への効率的な移動およびそれを効率的な燃料源としての利用を防ぎ、血液中のグルコースレベルの上昇およびある程度のインスリン耐性を引き起こす。
【０１１０】
「高血糖」は、血中の糖（グルコース）の過剰として定義される。
【０１１１】
低い血糖とも称される「低血糖」は、血糖レベルが、身体の活性のために十分なエネルギーを提供するためにはあまりにも低く低下したときに起こる。
【０１１２】
「高インスリン血症」は、正常レベルよりも高い血液中のインスリンとして定義される。
【０１１３】
「インスリン耐性」は、正常量のインスリンが、正常以下の生物学的応答を生じる状態として定義される。
【０１１４】
「肥満」は、ヒト対象に関して、体重が２０パーセント、所定の集団に対する標準体重を超えるとして定義することができる（R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916）。
【０１１５】
「糖尿病性合併症」は、高い血糖レベルにより引き起こされる他の身体機能での問題、例えば、腎臓、神経（ニューロパシー）、足（足部潰瘍および循環不良）および眼（例えば網膜症）である。糖尿病はまた、心臓疾患および骨関節障害に対する危険性を増加させる。糖尿病の他の長期合併症は、皮膚問題、消化問題、性機能障害および歯と歯茎との問題を含む。
【０１１６】
「メタボリック・シンドローム」は、少なくとも３つの以下の兆候のクラスターとして定義することができる：腹部脂肪−−ほとんどの男性において、４０インチ以上のウエスト；絶食後、高い血糖−−少なくとも１１０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）；血流中の高いトリグリセリド−−少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低いＨＤＬ−−４０ｍｇ／ｄｌ未満；および、１３０／８５ｍｍＨｇまたはそれ以上の血圧。
【０１１７】
「膵炎」は膵臓の炎症である。
【０１１８】
「脂質異常症」は、リポタンパク質過剰生産または欠乏を含むリポタンパク質代謝の障害である。脂質異常症は、血液中の、総コレステロール、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の減少により明らかにされ得る。
【０１１９】
「非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）」は、アルコール消費と関連しない、肝細胞の脂肪変化により特徴付けられる肝臓疾患である。
【０１２０】
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」は、アルコール消費と関連せず、小葉内炎症および線維症を伴う肝細胞の脂肪変化により特徴付けられる肝臓疾患である。
【０１２１】
「高血圧」または「高い血圧」、すなわち、心臓血管損傷または他の悪影響を誘導する可能性のあるレベルへの全身動脈血圧の一時的または持続的上昇。高血圧は、１４０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧または９０ｍｍＨｇを超える拡張期血圧として独断的に定義されている。
【０１２２】
「心臓血管疾患」は、心臓または血管に関連する疾患である。
【０１２３】
「急性心筋梗塞」は、心臓部分への血液供給の妨害があるときに起こる。十分な期間処置されずに放置されると、虚血および酸素不足を起こし、心筋組織（心筋）の損傷または死（梗塞）を引き起こし得る。
【０１２４】
「末梢動脈疾患」は、プラークが頭、臓器および手足へ血液を運ぶ動脈において構築するときに起こる。時間とともに、プラークは、動脈を硬化し狭め、臓器および身体の他の部分への酸素を豊富に含む血液の流量を制限し得る
【０１２５】
「アテローム性動脈硬化症」は、大および中動脈の内膜における不規則に分散された脂質沈着により特徴付けられる血管疾患であり、動脈内腔の狭窄を引き起こし、結局は線維症および石灰化が始まる。病変は、通常病巣であり、ゆっくり、断続的に進行する。血流の制限は、病変の分布および重症度によって異なる多くの臨床症状の原因となる。
【０１２６】
「卒中」は、２４時間以上続く脳循環の損傷に関連するあらゆる急性臨床事象である。卒中は、循環が危険にさらされている脳組織の位置および程度に依存して、不可逆性脳損傷、症状の型および重症度に関連する。
【０１２７】
鬱血性心不全とも称される「心不全」は、心臓がもはや身体の他の部分へ血液を十分に供給することができない状態である。
【０１２８】
冠動脈疾患とも称される「冠動脈性心臓疾患」は、心臓へ血液および酸素を供給する少量の血管の狭窄である。
【０１２９】
「腎臓疾患」またはネフロパシーは、腎臓のあらゆる疾患である。糖尿病性腎症は、１型または２型糖尿病を有する人々における罹患率および死亡率の主な原因である。
【０１３０】
「ニューロパシー」は、脳神経または末梢もしくは自律神経系と関連するあらゆる疾患である。
【０１３１】
「胃不全まひ」は、腸の排出遅延をもたらす胃蠕動の低下である。
【０１３２】
「クリックケミストリー(Click chemistry)」は、高収率で広範であり、クロマトグラフィーなしで除去できる副産物のみを作り、立体特異性であり、実施が簡単であり、容易に除去できる、または温和な溶媒中で行うことができる反応を示すために、２００１年にＫ．  Ｂ．  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓにより導入された用語である。
【０１３３】
本発明によって包含される重症患者は、一般的に、不安定な代謝亢進状態を経験する。該不安定な代謝状態は、いくつかの栄養素における相対的な欠乏を引き起こし得る基質代謝における変化による。一般的に、脂肪および筋肉の両方の酸化の増加が存在する。
【０１３４】
さらに、重症患者は、好ましくは、全身性炎症反応症候群または呼吸困難を経験する患者である。罹患率における減少は、重症患者がさらなる病気、状態または症状を発症する可能性を減少すること、または、さらなる病気、状態または症状の重症度を減少することを意味する。例えば、罹患率を減少することは、菌血症もしくは敗血症または多臓器不全と関連する合併症の発症の減少に対応し得る。
【０１３５】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他の意味を示さない限り、複数の表示を含む。したがって、例えば、「抗体」に対する表示は、２つ以上のこのような抗体の混合物を含む。
【０１３６】
本明細書において使用される「約」なる用語は、値の＋／−２０％、さらに好ましくは＋／−１０％、またはよりさらに好ましくは＋／−５％を示す。
【０１３７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、互換的に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、天然および非天然アミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができるあらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態を示す。該用語は、融合タンパク質を含み、Ｎ−末端メチオニン残基を有していろうとなかろうと、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種および同種リーダー配列との融合物；免疫学的タグ化タンパク質などを含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」なる用語は、互換的に使用され、診断、処置または治療が望まれるあらゆる対象、特にヒトを示す。他の対象は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含み得る。いくつかの好ましい態様において、対象はヒトである。
【０１３９】
本明細書において使用される「サンプル」なる用語は、患者由来の生物学的材料を示す。本発明によりアッセイされるサンプルは、何ら特定の型に限定されない。サンプルは、限定的な例として、単一の細胞、複数の細胞、組織、腫瘍、生物学的液体、生物学的分子もしくは上清または前記のいずれかの抽出物を含む。例えば、生検のために取り出される組織、切除中に取り出される組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘液および糞便サンプルを含む。使用されるサンプルは、アッセイフォーマット、検出方法ならびにアッセイされる腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質に基づいて変化する。サンプルを調製するための方法は、当分野でよく知られており、容易に適合させ、利用される方法に適合するサンプルを得ることができる。
【０１４０】
本明細書において使用される「生物学的分子」なる用語は、ポリペプチド、核酸および糖類を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
本明細書において使用される「調節」なる用語は、遺伝子、タンパク質または細胞の内部、外部または表面に存在するあらゆる分子の質または量における変化を示す。該変化は、該分子の発現またはレベルにおける増加または減少であり得る。「調節する」なる用語はまた、限定はしないが、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下させる；肝臓脂質もしくは肝臓トリグリセリドレベルを減少させる；体重を減少させる；および、グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を含む生物学的機能／活性の質または量の変化を含む。
【０１４２】
本明細書において使用される「モジュレーター」なる用語は、ＦＧＦ２１関連障害、例えば、１型もしくは２型糖尿病または代謝状態様肥満と関連する１つ以上の生理学的または生化学的事象を調節する組成物を示す。該事象は、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下させる；肝臓脂質もしくは肝臓トリグリセリドレベルを減少させる；体重を減少させる；および、グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
「遺伝子産物」は、遺伝子により発現または生産されるバイオポリマー産物である。遺伝子産物は、例えば、つなぎ合わされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス変異体ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライス変異体ポリペプチドなどであり得る。また、該用語により含まれるものは、鋳型（すなわちＲＮＡのｃＤＮＡ）としてＲＮＡ遺伝子産物を使用して作製されるバイオポリマー産物である。遺伝子産物は、酵素的に、組換え的に、化学的に、または遺伝子が生来の細胞内で作製され得る。いくつかの態様において、遺伝子産物がタンパク性であるとき、それは生物学的活性を示す。いくつかの態様において、遺伝子産物が核酸であるとき、それは生物学的活性を示すタンパク性遺伝子産物に翻訳され得る。
【０１４４】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１活性の調節」、ＧＬＰ−１活性の調節」および「エキセンディン−４活性の調節」は、それぞれ、例えば、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの薬剤の相互作用、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４転写および／または翻訳の阻害（例えば、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１もしくはエキセンディン−４遺伝子またはＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１もしくはエキセンディン−４転写産物とのアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ相互作用を介して、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４発現を促進する転写因子の調節を介して）などの結果であり得るＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４活性における増加または減少を示す。例えば、生物学的活性の調節は、生物学的活性における増加または減少を示す。ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４活性は、限定はしないが、対象において、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベルをアッセイすること、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４ポリペプチドレベルを評価すること、または、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４転写レベルを評価することを含む方法により評価することができる。
【０１４５】
ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４活性の比較はまた、例えば、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４下流バイオマーカーのレベルを測定すること、およびＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４シグナル伝達における増加を評価することにより成し遂げることができる。ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４活性はまた、細胞シグナル伝達；キナーゼ活性；脂肪細胞へのグルコース摂取；血液インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベル変動；肝臓脂質または肝臓トリグリセリドレベル変化；ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４と受容体間の相互作用；または、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４受容体のリン酸化を測定することにより評価することができる。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４受容体のリン酸化はチロシンリン酸化であり得る。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４活性の調節は、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４−関連表現型の調節を引き起こすことができる。
【０１４６】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４下流バイオマーカー」は、遺伝子もしくは遺伝子産物または遺伝子もしくは遺伝子産物の測定可能な徴候である。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４の下流マーカーである遺伝子または活性は、発現の改変されたレベルを示す。いくつかの態様において、下流マーカーの活性は、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４モジュレーターの存在下で改変される。いくつかの態様において、下流マーカーは、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４シグナル伝達が本発明のデュアル機能性タンパク質でかき乱されるとき、発現の改変されたレベルを示す。例えば、ＦＧＦ２１下流マーカーは、グルコースまたは２−デオキシ−グルコース摂取、ｐＥＲＫおよび他のリン酸化またはアセチル化タンパク質またはＮＡＤレベルを含むが、これらに限定されない。
【０１４７】
本明細書において使用される「上方調節する」なる用語は、活性または量の増加、活性化または刺激を示す。例えば、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４モジュレーター、例えば、本発明のデュアル機能性タンパク質は、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４受容体の活性を増加またはアゴナイズさせ得る。１つの態様において、ＦＧＦＲ−１（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ−２（ＩＩＩｃ）、またはＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）および／またはβ−クロトーの１つ以上は、本発明のデュアル機能性タンパク質に応答して上方調節され得る。上方制御はまた、ＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４−関連活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する；肝臓脂質もしくはトリグリセリドレベルを減少する；体重を減少する；グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する；またはＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４受容体のリン酸化を引き起こす；またはＦＧＦ２１、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４下流マーカーを増加する能力を示すことができる。例えば、ＦＧＦＲ２１受容体は、ＦＧＦＲ−１（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ−２（ＩＩＩｃ）、またはＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）および／またはβ−クロトーの１つ以上であり得る。上方制御は、コントロールと比較して、ほぼ２５％から５００％の範囲であり得る。
【０１４８】
本明細書において使用される「Ｎ−末端」なる用語は、タンパク質の少なくとも最初の２０個のアミノ酸を示す。
【０１４９】
本明細書において使用される「Ｎ−末端ドメイン」および「Ｎ−末端領域」なる用語は、互換的に使用され、タンパク質の第１のアミノ酸で始まり、タンパク質のＮ−末端半分における任意のアミノ酸で終わるタンパク質のフラグメントを示す。例えば、ＦＧＦ２１のＮ−末端ドメインは、配列番号：１のアミノ酸１から配列番号：１のほぼアミノ酸１０から１０５の間の任意のアミノ酸までである。
【０１５０】
本明細書において使用される「Ｃ−末端」なる用語は、タンパク質の少なくとも最後の２０個のアミノ酸を示す。
【０１５１】
本明細書において使用される「Ｃ−末端ドメイン」および「Ｃ−末端領域」なる用語は、互換的に使用され、タンパク質のＣ末端半分における任意のアミノ酸で始まり、タンパク質の最後のアミノ酸で終わるタンパク質のフラグメントを示す。例えば、ＦＧＦ２１のＣ末端ドメインは、配列番号：１のアミノ酸１０５から約アミノ酸２００の間から任意のアミノ酸で始まり、配列番号：１のアミノ酸２０９で終わる。
【０１５２】
本明細書において使用される「ドメイン」なる用語は、生体分子の知られているまたは疑われる機能に寄与する該生体分子の構造部を示す。ドメインは、領域またはその一部と同一であってよく、領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と異なる生体分子の一部を組み込まれていてもよい。
【０１５３】
本明細書において使用される「シグナルドメイン」（「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とも称される）なる用語は、前駆体タンパク質（しばしば、膜結合または分泌タンパク質）のＮ−末端領域で一続きのアミノ酸配列にて存在するペプチドドメインを示し、翻訳後タンパク質輸送に関与する。多くの場合、シグナルドメインは、選別プロセスが完了した後、特異的シグナルペプチダーゼにより全長タンパク質から除去される。それぞれのシグナルドメインは、細胞中の前駆体タンパク質の特定の目標を指定する。ＦＧＦ２１のシグナルドメインは、配列番号：１のアミノ酸１−２８である。
【０１５４】
本明細書において使用される「受容体結合ドメイン」なる用語は、膜結合受容体タンパク質と接触し、細胞性応答、例えば、シグナル伝達事象を引き起こすタンパク質の任意の位置または領域を示す。
【０１５５】
本明細書において使用される「リガンド結合ドメイン」なる用語は、対応する天然配列の少なくとも１つの定性結合活性を保持する本発明の融合タンパク質の任意の部分または領域を示す。
【０１５６】
「領域」なる用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を示す。タンパク質の場合、領域は、タンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分により定義される。いくつかの態様において、「領域」は、生体分子の機能と関連する。
【０１５７】
本明細書において使用される「フラグメント」なる用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を示す。タンパク質の場合、部分は、タンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分により定義され、少なくとも３−５アミノ酸、少なくとも８−１０アミノ酸、少なくとも１１−１５アミノ酸、少なくとも１７−２４アミノ酸、少なくとも２５−３０アミノ酸および少なくとも３０−４５アミノ酸を示す。オリゴヌクレオチドの場合、部分は、オリゴヌクレオチドの核酸配列の隣接する部分により定義され、少なくとも９−１５ヌクレオチド、少なくとも１８−３０ヌクレオチド、少なくとも３３−４５ヌクレオチド、少なくとも４８−７２ヌクレオチド、少なくとも７５−９０ヌクレオチドおよび少なくとも９０−１３０ヌクレオチドを示す。いくつかの態様において、生体分子の部分は、生物学的活性を有する。本発明の文脈において、ＦＧＦ２１ポリペプチドフラグメントは、配列番号：１に記載されている全ＦＧＦ２１ポリペプチド配列を含まない。
【０１５８】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成手段により生産することができる。したがって、天然配列ポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
【０１５９】
本明細書において使用される「同種ヌクレオチド配列」もしくは「同種アミノ酸配列」またはそれらの変異なる句は、少なくとも特定のパーセントのヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列を示し、「配列同一性」と互換的に使用される。同種ヌクレオチド配列は、タンパク質のアイソフォームをコードする配列を含む。このようなアイソフォームは、例えば、ＲＮＡの代替スプライシングの結果として、同じ生物体の異なる組織において発現させることができる。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。同種ヌクレオチド配列は、限定はしないが哺乳動物を含む、ヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。同種ヌクレオチド配列はまた、限定はしないが、本明細書に記載されているヌクレオチド配列の天然対立遺伝子変異および突然変異を含む。同種アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含み、ポリペプチドが同じ結合および／または活性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、比較配列と少なくとも６０％以上、最大９９％同一性を有するとき、同種である。いくつかの態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、比較配列と１つ以上、最大６０個のヌクレオチド／アミノ酸置換、付加または欠失を有するとき、同種である。いくつかの態様において、同種アミノ酸配列は、最大５または最大３個の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１６０】
相同性または同一性パーセントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用する、デフォルト設定を使用してＧａｐプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）により決定することができる。いくつかの態様において、プローブと標的間の相同性は、約７５％から約８５％である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号：２またはその部分と少なくとも約９５％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％同種であるヌクレオチドを有する。
【０１６１】
相同性はまた、ポリペプチドレベルであり得る。いくつかの態様において、本発明のデュアル機能性タンパク質の構成ポリペプチドは、完全長野生型対応物もしくは対応する天然配列、またはそれらの部分と少なくとも９５％同種であり得る。本発明のデュアル機能性タンパク質またはその部分および異なるアミノ酸配列の同一性程度またはパーセントは、「本発明配列」または「外来配列」のどちらか小さい方の長さで割った２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数として計算する。結果は、同一性パーセントとして示される。
【０１６２】
本明細書において使用される「混合」なる用語は、同じ領域中で１つ以上の化合物、細胞、分子などを互いに合わせるプロセスを示す。これは、例えば、試験チューブ、ペトリ皿または１つ以上の化合物、細胞または分子を混合することが可能であるあらゆる容器中で行われ得る。
【０１６３】
本明細書において使用される「実質的に精製される」なる用語は、天然環境から取り出されており、天然に関連する他の成分を少なくとも６０％、少なくとも７５％、および少なくとも９０％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体のいずれか）を示す。
【０１６４】
「薬学的に許容される担体」なる用語は、治療剤、例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療剤の投与のための担体を示す。該用語は、組成物を受ける個体に有害な抗体の生産をそれ自体誘導せず、過度の毒性なく投与することができるあらゆる医薬担体を示す。適当な担体は、大型のゆっくり代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物および不活性ウイルス粒子であり得る。このような担体は、当業者によく知られている。治療組成物における薬学的に許容される担体は、液体、例えば、水、塩水、グリセロールおよびエタノールを含むことができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などもまた、このようなビヒクル中に存在することができる。
【０１６５】
システイン残基により提供される天然ジスルフィド結合は、一般的に、タンパク質の熱力学的安定性を増加させる。融解温度の増加において測定されるとき、熱力学的安定性の増加の成功例は、酵素Ｔ４リゾチーム（Matsumuraら PNAS 86:6562-6566 (1989)）およびバルナーゼ（Johnsonら J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997)）の多数のジスルフィド結合された突然変異体である。本発明の局面は、野生型ＦＧＦ２１の柔軟性を抑制し、それにより、タンパク質の疎水性コアへの保存剤のアクセスを制限する、変異体内のジスルフィド結合の存在によりなし遂げられた、保存剤の存在下でのＦＧＦ２１の物理的安定性の増強である。変異体内のジスルフィド結合の存在による本発明のタンパク質内のＦＧＦ２１の物理的安定性の増強は、保存剤の存在下または非存在下で、限定はしないが、環境条件、例えば、ｐＨおよび温度における彷徨変異に対する保護を含む、該タンパク質にさらなる保護を与えることができる。
【０１６６】
野生型タンパク質比較物およびその組合せに対する本発明のデュアル機能性タンパク質の改善
タンパク質医薬の開発における重要な挑戦が、タンパク質の物理化学的不安定性に取り組むことであることは、当分野でよく知られている。このことは、タンパク質医薬製剤が多数の使用を意図されるとき、さらになおさら明らかであり、注射製剤は、安定な濃縮された保存溶液を必要とすると同時に、好ましい生物活性プロフィールを維持する。文献における野生型ＦＧＦ２１の生物物理学特性化は、濃縮タンパク質溶液（＞５ｍｇ／ｍｌ）は、ストレス条件、例えば、高い温度または低いｐＨに暴露されたとき、加速された会合および凝集（すなわち、乏しい物理的安定性および生物医薬特性）を引き起こすことを確立した。医薬防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール）へのＦＧＦ２１の濃縮タンパク質溶液の暴露はまた、物理的安定性に対するネガティブな影響を有した。
【０１６７】
したがって、本発明の態様は、生理学的および保存製剤の両方の条件下で、化学安定性および生物学的効力を維持するが、濃縮溶液の物理的安定性を増強することである。所定のタンパク質濃度で、温度およびイオン強度が物理的安定性に対して大きな影響を有するため、会合および凝集が疎水性相互作用によって生じ得ることが考えられる。
【０１６８】
ほとんど、非保存的と推測される表面暴露アミノ酸残基を標的とする。これらの残基の局所環境を分析し、構造的に重要であると思われないものを突然変異誘発のために選択する。特定の変化を開始する１つの方法は、グルタミン酸残基を導入することにより、タンパク質のｐＩをさらに減少させることである（「グルタミン酸スキャン」）。電荷置換の導入が電荷−電荷反発を介して疎水性媒介凝集を阻害し、保存剤相溶性を改善する可能性がある。加えて、当業者はまた、十分な突然変異誘発で、負電荷の同時減少有りまたは無しでの正電荷の導入により、ｐＩを塩基性(basic)ｐＨ範囲にシフトさせ、したがって電荷−電荷反発を起こすことができることを認識している。
【０１６９】
生物学的薬物としての野生型ＦＧＦ２１の治療的適応と関連するさらなる困難性は、例えば、その半減期がインビボで非常に短い（マウスおよび霊長類においてそれぞれ約０．５および２時間）ことである。したがって、より高い効力またはより長い半減期のいずれかによりさらに有効である追跡(follow-up)化合物を開発する必要性が存在する。同様に、種々のメカニズムが、エキセンディン−４またはＤＰＰ４による開裂に対する耐性がある他の類似体ならびに化合物の延長半減期または持続放出のためのさらなる修飾物および製剤の使用によって、ＧＬＰ−１に対する血清半減期（内因性プロテアーゼ、特にペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）による迅速な開裂によって１−２分）を増強するために使用される。
【０１７０】
本発明のタンパク質、例えば、本発明のデュアルＦＧＦ２１受容体アゴニストおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストタンパク質は、より高い効力および半減期延長製剤で、ＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１処置の望ましい効果をなし遂げるための手段として開発された。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の共投与は、文献、例えば、肥満および２型糖尿病の処置のためのＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の共投与の付加または相乗効果を示唆するデータを有する特許公報ＷＯ２０１０／０６８７３５およびＷＯ２００９／０２０８０２に記載されている。しかしながら、単一の分子、例えば、本発明のタンパク質の形態における２つの受容体アゴニストの共局在化は、組織または細胞へのＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の両方のより良い接近を提供し、別々の存在物としての単一の共投与を超える増加した利益を提供する。それぞれの単一の共投与と比較しての単一の分子に２つのアゴニストを組み合わせるこの利点は、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１受容体の両方が同じ組織において発現される組織、例えば、脂肪細胞、膵臓β細胞、肝臓細胞および視床下部細胞に対して、とりわけ有利である。本発明のデュアルＦＧＦ２１受容体アゴニストおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストタンパク質および他の単一のデュアル活性存在物は、変化した受容体輸送、変化したシグナル変換効果および／またはエントロピー（親和性）効果によって、改善された生物学的特性を有する。
【０１７１】
ＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１（またはエキセンディン−４）が異なるメカニズムを介して作用するため、それらは、例えば、本発明のデュアル機能性タンパク質の形態において同時に投与されるとき、付加または相乗効果を有することが予期される。ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４は、食物摂取に応答してインスリン分泌を増加させるために主に作用するが、ＦＧＦ２１は身体をインスリンにより良く応答するように感受性にし、血糖レベルの管理において１型および２型糖尿病の両方に対して利益を提供し得る。改善されたベータ−細胞機能およびインスリン感受性と組み合わせられたベータ−細胞保護効果は、１型糖尿病においてさらに利益を提供する可能性を有する。
【０１７２】
別の例は体重減少である。ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４による満腹シグナルおよび胃内容物排出の遅延は、より少ない食欲になると予期され、ＦＧＦ２１は、脂肪および脂肪の低下を増加させることができる他の組織における代謝を増加させる。これらの２つの効果は、組合せ投与で、付加的またはさらに相乗的体重減少をもたらし得る。代謝的に活性な組織におけるＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１の両方に対する受容体の発現は、このような組織へのＦＧＦ２１受容体アゴニストおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストの同時送達が代謝疾患を処置するために有益であり得ることを示唆する。ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４の心臓保護効果およびＦＧＦ２１で見られる改善された脂質プロフィールの組合せはまた、肥満、２型および１型糖尿病と関連する心臓血管疾患に対して付加的利益をもたらし得る。
【０１７３】
ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１デュアルアゴニズムの別の恐らく利益は、改善された、すなわち、低減された副作用プロフィールである。最近の試験（Weiら (2012) PNAS 109, 3143-48）は、食餌性肥満マウスのＦＧＦ２１での処置が、（低減されたスモイル化を介して）ＰＰＡＲγの低下した不活性化によって、骨量の減少を誘導することを示す；骨芽細胞から脂肪細胞への間葉性幹細胞分化のシフトは、ＦＧＦ２１処置後の骨における増加したＰＰＡＲγ活性の存在において見られる。しかしながら、ＧＬＰ−１が、ＰＰＡＲγの発現を低減することによりヒト間葉性幹細胞の脂肪細胞への分化を低減することができることも報告されている（Sanzら (2010) Am J Physiol Endocrinol Metab 298, E634-E643）。したがって、ＧＬＰ−１が骨を保護する可能性があるため、ＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１融合タンパク質は、ＦＧＦ２１のみの処置と比較して、骨量の減少の危険性を低減する可能性がある。
【０１７４】
本発明の態様は、生理学的および保存医薬製剤の両方の条件下で物理化学的安定性に関与するが、例えば、野生型ＦＧＦ２１と比較して本発明のタンパク質の生物学的効力の維持が、同様に考慮される重要な因子である。したがって、本発明のタンパク質の生物学的効力は、本願明細書の実施例において示されるとおり、グルコース摂取および／または血漿グルコースレベルの低下に影響するタンパク質の能力により定義される。
【０１７５】
本発明にしたがって投与される本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、当分野で知られている任意の手段により作製および／または単離され得る。変異体を生産するための最も好ましい方法は、組換えＤＮＡ方法論を介することであり、当業者によく知られている。このような方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（John Wiley & Sons, Inc.）のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されており、これを出典明示により本明細書に包含させる。
【０１７６】
さらに、好ましい態様は、本明細書に記載されている変異体に由来する生物学的に活性なペプチドを含む。このようなペプチドは、記載されている少なくとも１つの置換を含み、該変異体は、生物学的活性を有する。ペプチドは、当業者に知られているあらゆる、および全ての手段により生産され得、この例は、酵素消化、化学合成または組換えＤＮＡ方法論を含むが、これらに限定されない。
【０１７７】
特定の線維芽細胞増殖因子のペプチドのフラグメントが生物学的に活性であることが当分野で確立されている。例えば、Bairdら Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988)およびJ. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987)参照。したがって、変異体のフラグメントまたはペプチドの選択は、当分野で知られている基準に基づく。例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶまたはＤＰＰ−４）が、神経ペプチド、内分泌腺ペプチドおよびサイトカインの不活性化に関与するセリン型プロテアーゼであることが知られている（Dammeら Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)）。ＦＧＦ２１のＮ−末端（ＨｉｓＰｒｏＩｌｅＰｒｏ）は、ＤＰＰ−ＩＶに対する基質となる可能性がある２つのジペプチドを含み、４個のアミノ酸によってＮ−末端で切断されたＦＧＦ２１のフラグメントをもたらし得る。予想外に、野生型ＦＧＦ２１の該フラグメントは、生物学的活性保持することが証明されており、したがって、最大４個のアミノ酸によってＮ−末端で切断された本発明のタンパク質は、本発明の態様である。
【０１７８】
本発明はまた、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってよい上記変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよい。本発明のタンパク質をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複または縮重の結果として変化し得る。
【０１７９】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下のものを含み得る：変異体に対するコード配列のみ、変異体に対するコード配列およびさらなるコード配列、例えば、機能性ポリペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列または前駆タンパク質配列；変異体に対するコード配列および非コード配列、例えば、イントロンまたは変異体に対するコード配列の５’および／または３’の非コード配列。したがって、「変異体をコードするポリヌクレオチド」なる用語は、さらなるコードおよび／または非コード配列を含む、変異体に対するコード配列だけでなく、ポリヌクレオチドもまた含み得るポリヌクレオチドを含む。
【０１８０】
本発明はさらに、示される置換を含む、ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする記載されているポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ヒトＦＧＦ２１配列の天然対立遺伝子変異体、非天然変異体、または上記切断変異体であり得る。したがって、本発明はまた、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに記載されている変異体のフラグメント、誘導体またはアナログをコードするこのようなポリヌクレオチドの変異体を含む。このようなヌクレオチド変異体は、第１または第２の態様の少なくとも１つの示されたアミノ酸置換が存在するかぎり、欠失変異体、置換変異体、切断変異体、および付加または挿入変異体を含む。
【０１８１】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現コントロール配列に作動可能に連結した（すなわち、発現コントロール配列の機能を保証するように位置する）後、宿主において発現する。これらの発現ベクターは一般的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物中で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを含み得る。デュアル機能性タンパク質またはそのフラグメントは、適当なプロモーターのコントロール下で、哺乳動物細胞、昆虫、酵母、細菌または他の細胞において発現させることができる。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を生産するために使用することができる。
【０１８２】
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするために特に有用な原核生物宿主である。使用のために適当な他の微生物宿主は、枯草菌(Bacillus subtilus)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ならびにセラチア、シュードモナス、連鎖球菌およびブドウ球菌の様々な種を含むが、他のものも当然選択肢として使用され得る。これらの原核生物宿主において、１つはまた、一般的に宿主細胞と適合性のある発現コントロール配列（例えば、複製起点）を含む発現ベクターを作ることができる。加えて、多くのよく知られているプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系またはファージラムダもしくはＴ７由来のプロモーター系が存在し得る。プロモーターは、一般的に、所望によりオペレーター配列にて、発現をコントロールし、転写および翻訳を開始および完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
【０１８３】
タンパク質の発現の当業者は、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が大腸菌における発現のために成熟配列（配列番号：３）のＮ−末端に導入され得ることを認識し、本発明の文脈において考慮される。したがって、特記されない限り、大腸菌において発現される本発明のタンパク質は、Ｎ−末端に導入されたメチオニン配列を有する。
【０１８４】
他の微生物、例えば、酵母または真菌もまた、発現のために使用され得る。メタノール資化酵母、出芽酵母、分裂酵母およびピチア・アングスタ(Pichia angusta)は、所望の、発現コントロール配列、例えば、プロモーター、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、および複製起点、終始配列などを有する適当なベクターと共に、好ましい酵母宿主の例である。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)；およびスエヒロタケ(Schizophyllum commune) は、真菌宿主の例であるが、他のものも当然選択肢として使用され得る。
【０１８５】
哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現および生産するために使用され得る。無傷な変異体を分泌することができる多くの適当な宿主細胞系が、当分野で開発されているため、真核細胞が実際に好ましく、ＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＮＳＯ細胞、Ｓｙｒｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ卵巣細胞系、ＨｅＬａ細胞またはヒト胚腎臓細胞系（すなわちＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ）を含む。
【０１８６】
これらの細胞のための発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現コントロール配列は、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、Ｒａｕｓ肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位は、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモンに由来する配列を含む。
【０１８７】
興味あるポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のタンパク質および発現コントロール配列）を含むベクターは、よく知られている方法により宿主細胞に移動させることができ、これは細胞性宿主の型に依存して変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞のために一般的に利用され、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞性宿主のために使用され得る。
【０１８８】
タンパク質精製の種々の方法が使用され得、このような方法は、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)において、当分野で知られており、記載されている。選択される精製工程は、例えば、本発明のタンパク質のために使用される生産プロセスの性質に依存する。
【０１８９】
本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド、例えば、本発明のデュアル活性融合タンパク質は、患者の臨床状態、タンパク質組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび専門家に知られている他の因子を考慮して、良い医療行為と一致する様式において処方および投与されるべきである。したがって、本明細書における目的のために本発明のタンパク質の「治療有効量」は、このような考えにより決定される。
【０１９０】
本発明のタンパク質の医薬組成物は、一般的に意図される目的をなし遂げる任意の手段により、１型および２型糖尿病、肥満、メタボリック・シンドロームまたは重症患者を処置するために投与され得る。非限定的な許容される投与手段は、例えば、吸入もしくは坐薬的により、または例えば膣、経直腸、尿道、経口内および舌下組織への洗浄により粘膜組織へ、経口的、経鼻的、局所的、鼻腔内、腹腔内、非経腸的、静脈内、筋肉内、胸骨内、関節内注射により、リンパ管内、間質的、動脈内、皮下的、滑液嚢内、経上皮的および経皮的にを含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、洗浄、経口的または動脈中により投与される。導入の他の適当な方法はまた、再充電可能または生分解性デバイスおよび徐放または持続放出ポリマーデバイスを含むことができる。本発明の医薬組成物はまた、他の既知の代謝剤との組合せ治療の一部として投与することができる。
【０１９１】
投与される用量は、年齢、健康状態およびレシピエントの体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物は、ＦＧＦ２１変異体が、１型または２型糖尿病、肥満またはメタボリック・シンドロームの処置のために所望の医療効果をなし遂げるために有効である量において存在する全ての組成物を含む。個々の必要性はある患者から別の患者で変化し得るが、全ての成分の有効量の最適範囲の決定は、通常の臨床医の能力の範囲内である。
【０１９２】
本発明のタンパク質は、薬学的に有用な組成物を調製するために、既知の方法にしたがって製剤化することができる。所望の製剤は、任意の薬学的に許容される担体、防腐剤、賦形剤または安定剤を有する高い純度の適当な希釈剤または水溶液で再構成された安定な凍結乾燥された産物である［Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)］。本発明のタンパク質は、薬学的に許容されるバッファーと組み合わされて、ｐＨを、許容される安定性および投与のために許容されるｐＨを提供するために調整され得る。
【０１９３】
非経口投与において、１つの態様において、本発明のタンパク質は、一般的に、単位用量の注射可能形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン）における所望の純度の程度の１つ以上の該タンパク質を、薬学的に許容される担体、すなわち、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性であるものと混合することにより製剤化される。好ましくは、１つ以上の薬学的に許容される抗微生物剤を加えてもよい。フェノール、ｍ−クレゾールおよびベンジルアルコールは、好ましい薬学的に許容される抗微生物剤である。
【０１９４】
所望により、１つ以上の薬学的に許容される塩は、イオン強度または緊張力(tonicity)を調整するために加えられ得る。１つ以上の賦形剤は、製剤の等張性をさらに調整するために加えられ得る。グリセリン、塩化ナトリウムおよびマンニトールは、等張性を調整する賦形剤の例である。
【０１９５】
当業者は、良い医療行為および個々の患者の臨床状態により決定されるとき、本発明のタンパク質を含む治療組成物に対する薬学的に有効な用量および投与レジメンを容易に最適化することができる。本発明のタンパク質に対する典型的な用量範囲は、成体に対して約０．０１ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約０．０５ｍｇ／週から約５０００ｍｇ／週）の範囲である。好ましくは、用量は、約０．１ｍｇ／日から約１００ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約０．５ｍｇ／週から約５００ｍｇ／週）、さらに好ましくは約１．０ｍｇ／日から約１０ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約５ｍｇ／週から約５０ｍｇ／週）の範囲である。より好ましくは、用量は、約１−５ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約５ｍｇ／週から約２５ｍｇ／週）である。投与されるＦＧＦ２１変異体の適当な用量は、より速く、より効率的なグルコース利用により血糖レベルの低下およびエネルギー消費の増加をもたらし、したがって、１型および２型糖尿病、肥満およびメタボリック・シンドロームの処置のために有用である。
【０１９６】
加えて、高血糖およびインスリン耐性が栄養補給を与えられた重症患者において一般的であるため、いくつかの集中治療室（ＩＣＵ）は、食事を与えられた重症患者において過剰高血糖を処置するためにインスリンを投与する。実際に、最近の試験は、糖尿病の病歴を有するか否かにかかわらず、デシリットルあたり１１０ｍｇよりも高くないレベルで血糖を維持するための外因性インスリンの使用が、外科的集中治療室における重症患者中の罹患率および死亡率を減少させることを立証している（Van den Bergheら N Engl J Med., 345(19):1359, (2001)）。したがって、本発明のタンパク質は、ユニークに、代謝的に不安定な重症患者において代謝安定性を回復させるための手助けに適している。本発明のタンパク質、例えば、ＦＧＦ２１の変異体を含むものは、グルコース摂取を刺激し、インスリン感受性を増強するが、低血糖を誘導しないという点でユニークである。
【０１９７】
本発明の別の局面において、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、急性心筋梗塞、インスリン受容体における重度の不活性化突然変異と関連する状態、ＨＩＶ関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィー、および他の代謝障害の処置のための医薬として使用するための本発明のタンパク質が考慮される。
【０１９８】
本発明は詳細に今回記載されており、これは、以下の実施例を参照することによりさらに明白に理解されるが、実施例は、説明のみの目的のためにここに含まれ、本発明を限定されることを意図しない。
【０１９９】
本発明の実施は、他に記載のない限り、当分野の技術内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の慣用の方法を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.);および Handbook of Experimental Immunology, Vols. I IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications);および Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)参照。
【０２００】
部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４のさらなる突然変異体、ＧＬＰ−１／グルカゴンハイブリッドペプチド、（ペグ化または他の目的のためにＤＰＰ−４耐性を与えるために）非天然アミノ酸を有するＧＬＰ−１類似体を含む。
【０２０１】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、以下の野生型ＦＧＦ２１のさらなる修飾の１つ以上を有するＦＧＦ２１アゴニストを含む：
【０２０２】
（ｉ）二量体化、例えば、Ｒ１５４Ｃでのジスルフィドの形成または別の部位でのシステインの導入、または融合されたＦｃドメインを介する二量体化、または架橋剤、例えば、二機能性ＰＥＧを介する二量体形成を容易にするためのさらなるジスルフィド、非天然アミノ酸または修飾；
【０２０３】
（ｉｉ）ＦＧＦ２１のフラグメント；
【０２０４】
（ｉｉｉ）ＦＧＦ２１活性（ベータ−クロトーへの結合ならびにＦＧＦＲの結合および活性化）を有するように選択されたタンパク質；および
【０２０５】
（ｉｖ）（種々の形態、例えば、Ｆａｂ、ユニボディ(unibody)、ｓｖＦｃなどの）ＦＧＦ２１模擬物抗体
【０２０６】
いくつかの態様において、本発明のデュアル活性タンパク質は、以下のリンカーの１つ以上を含む：単一のアミド結合、短ペプチド（特に、Ｓｅｒ／Ｇｌｙリピート）、ＦＧＦ２１翻訳配列からのさらなる残基、または最大でタンパク質全体の大型リンカー（例えば、Ｆｃドメイン、ＨＳＡ−結合ヘリックス束、ＨＳＡなど）。２つの部分はまた、他の化学的手段により、例えば、非天然アミノ酸または標準化学的リンカー（マレイミド−Ｃｙｓ、ＮＨＳ−Ｌｙｓ、「クリックケミストリー」など）を介して連結され得る。ＦＧＦ２１模倣抗体アプローチのための「リンカー」は、すでに記載されているものおよび後の開裂でＧＬＰ−１  Ｎ−末端を放出するようにループへの挿入も含む。
【０２０７】
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、１つ、２つまたはそれ以上の特定の部位で起こるペグ化を含む。好ましい態様において、ペグ化は、ＦＧＦ２１分子またはリンカー内で起こる。いくつかの態様において、ペグ化は、デュアル機能性タンパク質のＮ−末端の〜１０個のアミノ酸内でなく、好ましくはＦＧＦ２１の開始の〜１０個のアミノ酸内でない。ペグ化結合化学は、ＮＨＳ−Ｌｙｓ、マレイミド−Ｃｙｓ、非天然アミノ酸（アルデヒド、「クリックケミストリー」、Ｐｃｌなど）を含むことができ、反応の化学量論をコントロールするために適当なタンパク質変異体と結合させることができる。
【０２０８】
本発明の融合タンパク質のＰＥＧ基は、任意のサイズ（例えば、１、２、３．４、５、１０、２０、２４、２９、３０、４０ｋＤａ）であってよく、直線状、分岐状または櫛状構造であってよく、好ましくは４０ｋＤａ以上の全ペグ化である。最適なペグ化は、週１回の投与に対して十分な半減期延長をなし遂げる。タンパク質二量体、三量体、四量体などのペグ化は、より短いＰＥＧポリマーを使用して十分な血清半減期延長をもたらし得る。分岐状および櫛状ＰＥＧ構造は、より低い粘性に関して有益であり得る。
【０２０９】
本発明の融合タンパク質の好ましい半減期延長方法論は、リンカーへのＩｇＧ  ＦｃドメインまたはＨＳＡの組み込みを含み、ペグ化を必要としなくてもよい。さらに、Ｆｃドメイン融合物の使用は、二量体化をもたらし、半減期延長に加えて、増強された効力をもたらし得る。
【０２１０】
本発明の他の態様は、半減期延長のための以下の結合を含むが、これらに限定されない：融合物の単量体もしくは二量体型のいずれかに対するＨＳＡ−結合脂質もしくは小分子またはミセル。
【０２１１】
本発明の１つの態様において、他の結合が、半減期延長および他の改善された生物学的特性をなし遂げるために、本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに作られ得る。それらは、本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドにＰＥＧ−コレステロール複合体（ミセルおよびリポソームを含む）を結合すること、および／または本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに糖（グリコシル化）を結合することを含むことができる。さらに他の態様において、同様の技術を使用して、例えば、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンドまたは炭水化物保護物(shield)の複合体をタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドに加える。
【０２１２】
ＨＥＳ化技術は、例えば、還元的アルキル化を介して、分岐状のヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）鎖（コーンスターチ由来の６０ｋＤａまたは１００ｋＤａの高度に分岐状のアミロペクチンフラグメント）をタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドと結合する。ポリシアル化(Polysialation)は、ペグ化と同様の方法において、興味あるタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドをポリシアル酸（ＰＳＡ）ポリマーと結合する。ＰＳＡポリマーは、体内で天然に起こり、１０−５０ｋＤの分子量において利用できる負に帯電した非免疫原性ポリマーである。
【０２１３】
本発明のさらに他の態様において、他の結合または修飾は、半減期延長および他の改善された生物学的特性をなし遂げるように、本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに作られ得る。これらは、組換えＰＥＧ（ｒＰＥＧ）基の作製、および本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへのそれらの結合を含む。Ａｍｕｎｉｘ、Ｉｎｃ社により開発されたとおり、ｒＰＥＧ技術は、生物医薬に遺伝的に融合され、余分な化学的結合工程を回避するＰＥＧ様特性を有するタンパク質配列に基づく。ｒＰＥＧは、親水性アミノ酸の長い非構造化テールを含む延長された半減期のエクセナチド構築物であり、これは、タンパク質またはペプチドの血清半減期を増加およびその吸収速度を遅延の両方をすることができ、したがって有意にピークトラフ比率を減少させる。ｒＰＥＧは増加した流体力学的半径を有し、実際の分子量の約１５倍である見かけの分子量を示し、ペグ化が長い血清半減期をなし遂げる方法を模倣する。同様の組換えポリペプチド配列もまた、タンパク質の「ＰＡＳ化」に関してＸＬ−タンパク質ＧｍｂＨにより開発されている。
【０２１４】
化学的に修飾されたデュアル機能性タンパク質突然変異体
例えば、本明細書に記載されているデュアル機能融合タンパク質の切断および変異体形態を含む本明細書に記載されている融合タンパク質の化学的に修飾された形態は、本明細書に記載されている記載を考慮して、当業者により調製することができる。このような化学的に修飾されたデュアル機能性タンパク質は、化学的に修飾された突然変異体が、修飾されていない突然変異体と、突然変異体に天然に結合された分子の型または位置のいずれかにおいて異なるように改変される。化学的に修飾された突然変異体は、１つ以上の天然に結合された化学基の欠失により形成される分子を含むことができる。
【０２１５】
１つの態様において、本発明のタンパク質は、１つ以上のポリマーの共有結合により修飾することができる。例えば、選択されるポリマーは、一般的に、結合するタンパク質が水性環境、例えば、生理学的環境下で沈殿しないように、水溶性である。適当なポリマーの範囲内に含まれるものは、ポリマーの混合物である。好ましくは、最終産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容される。本発明のタンパク質に結合した非水溶性ポリマーもまた、本発明の局面を形成する。
【０２１６】
典型的なポリマーはそれぞれ、あらゆる分子量であってよく、分岐状または非分岐状であってよい。ポリマーはそれぞれ、一般的に、約２ｋＤａから約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」なる用語は、水溶性ポリマーの調製において、いくつかの分子が規定された分子量以上および未満の重さであることを示す）。それぞれのポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、さらに好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａ、より好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａである。
【０２１７】
適当な水溶性ポリマーまたはその混合物は、Ｎ−連結もしくはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの、例えば低分子量デキストラン）、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。共有的に結合されたデュアル機能性タンパク質変異体多量体を調製するために使用することができる二機能性架橋分子もまた、本発明により包含される。ポリシアル酸に共有結合されたデュアル機能性タンパク質変異体もまた、本発明により包含される。
【０２１８】
本発明のいくつかの態様において、デュアル機能性タンパク質変異体は、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む１つ以上の水溶性ポリマーを含むように共有的または化学的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２；および４，１７９，３３７号、参照。本発明のいくつかの態様においては、デュアル機能性タンパク質は、限定はしないが、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、またはこのようなポリマーの混合物を含む１つ以上のポリマーを含む。
【０２１９】
本発明のいくつかの態様において、デュアル機能性タンパク質は、ＰＥＧサブユニットで共有的に修飾される。いくつかの態様において、１つ以上の水溶性ポリマーは、デュアル機能性タンパク質突然変異体の１つ以上の特定の位置（例えば、Ｎ−末端）で結合される。いくつかの態様において、１つ以上の水溶性ポリマーは、デュアル機能性タンパク質突然変異体の１つ以上の側鎖にランダム的に結合される。いくつかの態様において、ＰＥＧは、デュアル機能性タンパク質突然変異体の治療的能力を改善するために使用される。特定のこのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号に記載されており、これを、あらゆる目的のために本明細書に出典明示により包含させる。
【０２２０】
ポリマーがＰＥＧである本発明の態様において、ＰＥＧ基はあらゆる適当な分子量であってよく、直線状または分岐状であってよい。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは、約２ｋＤから約１００ｋＤａ、さらに好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、例えば、１０、２０、３０、４０または５０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、一般的に、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオ−ルまたはエステル基）からデュアル機能性タンパク質突然変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）へ、アシル化または還元的アルキル化を介して、デュアル機能性タンパク質突然変異体に結合される。
【０２２１】
「Ｙ−形」ＰＥＧ誘導体としても知られている分岐状ＰＥＧ誘導体は、中核に結合される２つの直線状メトキシＰＥＧ鎖を含む。これらの「Ｙ形」ＰＥＧ誘導体の立体的バルキー(bulky)構造は、修飾分子の一点結合を容易にする。一例として、３つの種類の「Ｙ形」ＰＥＧ誘導体は、Ｙ−ＮＨＳ−４０Ｋ（アミンペグ化のために有用）；Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ（チオールペグ化のために有用）；およびＹ−ＡＬＤ−４０Ｋ（例えば、Ｙ−ＡＡＬＤ−４０ＫおよびＹ−ＰＡＬＤ−４０Ｋ）（Ｎ−末端ペグ化のために有用）である。アミンペグ化のために、「Ｙ形」ＮＨＳエステルは、生物学的活性分子におけるリジンまたはＮ−末端アミンのアミノ基と反応し、安定なアミド結合を生産する。該ＮＨＳエステルは、ｐＨ７−８．５で標的分子と結合する。チオールペグ化のために、「Ｙ形」マレイミドは、生物学的活性分子におけるチオール基と反応し、安定な３−チオスクシンイミジルエーテル結合を産生する。該マレイミドは、他の官能基の存在下でｐＨ約７．４で標的分子と結合する。Ｎ−末端ペグ化のために、「Ｙ形」アルデヒドは、好ましくは、生物学的活性分子におけるＮ−末端アミンと反応し、還元試薬、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で安定なアミン結合を生産する。該アルデヒドは、ｐＨ５−８で標的分子のＮ−末端アミンと結合する。分岐状ペグ化を形成するための試薬は、例えば、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを介して利用できる。
【０２２２】
本発明のタンパク質を含むポリペプチドのペグ化は、当分野で知られているペグ化反応のいずれかを使用して特異的に行うことができる。このような反応は、例えば、以下の文献：Francisら 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10；欧州特許第０  １５４  ３１６および０  ４０１  ３８４号；および米国特許第４，１７９，３３７号において記載されている。例えば、ペグ化は、本明細書に記載されている反応性ポリエチレングリコール分子（または類似反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行うことができる。アシル化反応のために、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化のために、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水安定であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドまたはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはそのアリールオキシ誘導体（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）である。
【０２２３】
本発明のいくつかの態様において、ポリペプチドへのＰＥＧ基の結合のために有用な戦略は、溶液中の複合体結合の形成を介して、それぞれが他方に対して相互に反応性の特別な機能性を有する、ペプチドおよびＰＥＧ部分を結合することを含む。ペプチドは、慣用の固相合成で容易に調製することができる。ペプチドは、特定の部位で適当な官能基で「前活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分での反応の前に、精製および完全に特性化される。ＰＥＧとペプチドのライゲーションは、通常、水相で行い、逆相分析ＨＰＬＣにより容易にモニタリングすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製し、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特徴付けることができる。
【０２２４】
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる別の型の水溶性ポリマーである。したがって、多糖類ポリマーに融合された本発明のタンパク質は、本発明の態様を形成する。デキストランは、アルファ１−６結合により主に連結されるグルコースの個々のサブユニットからなる多糖類ポリマーである。デキストランそれ自体は、広い分子量範囲において利用でき、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量において容易に利用できる。デキストランは、ビヒクルそれ自体または別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせての使用のための適当な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開ＷＯ９６／１１９５３参照。治療または診断免疫グロブリンへ結合されるデキストランの使用が報告されている。例えば、欧州特許公報第０  ３１５  ４５６号参照、これを出典明示により本明細書に包含させる。本発明は、本発明はまた、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランの使用を含む。
【０２２５】
一般的に、化学修飾は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の適当な条件下で行うことができる。化学的に修飾されたポリペプチドを調製するための方法は、一般的に、（ａ）条件下でポリペプチドを活性化ポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、それによって、ＦＧＦ２１タンパク質変異体が１つ以上のポリマー分子と結合するようになること、および（ｂ）反応産物を得ることの工程を含む。最適な反応条件は、既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比率が高くなれば、結合されるポリマー分子のパーセントが高くなる。本発明の１つの態様において、化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体は、アミノ−末端に単一のポリマー分子部分を有し得る（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号参照）。
【０２２６】
本発明の別の態様において、本発明のタンパク質は、ビオチンと化学的に結合させることができる。次に、本発明のビオチン化タンパク質はアビジンに結合し、本発明の四価アビジン／ビオチン／タンパク質をもたらすことができる。本発明のタンパク質はまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）と共有的に結合させ、得られる複合体を抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿させ、１０の価数で十量体複合体を形成させることができる。
【０２２７】
一般的に、本発明の化学的に修飾されたデュアル機能性タンパク質突然変異体の投与により緩和または調節することができる条件は、本発明のタンパク質に対して本明細書に記載されているものを含む。しかしながら、しかしながら、本明細書に記載されている化学的に修飾されたデュアル機能性タンパク質突然変異体は、非修飾デュアル機能性タンパク質突然変異体と比較して、さらなる活性、生物学的活性の増強または減少、または他の特性、例えば、半減期の延長または短縮を有し得る。
【０２２８】
デュアル機能性タンパク質の治療組成物およびその投与
本発明のデュアル機能性タンパク質を含む治療組成物は、本発明の範囲内であり、具体的には、増強された特性を示すいくつかの突然変異体デュアル機能性タンパク質配列の同定を踏まえて考慮される。このようなデュアル機能性タンパク質突然変異体医薬組成物は、投与様式との適合性に対して選択される薬学的または生理学的に許容される製剤との混合物中に治療有効量のデュアル機能性タンパク質タンパク質変異体を含むことができる。
【０２２９】
許容される製剤は、好ましくは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
【０２３０】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透性、粘性、明瞭さ、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、分解もしくは放出速度、吸着性または浸透を修飾、維持または保存するための製剤物質を含むことができる。適当な製剤物質は、限定はしないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、バッファー（例えば、ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、香味剤および賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパール(チロキサパール(tyloxapal))）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、緊張力増強剤（例えば、アルキル金属ハロゲン化物；好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム；またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバント（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)、およびこれの後版、参照、あらゆる目的のために出典明示により本明細書に包含させる）を含む。
【０２３１】
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式および所望の用量に依存して、当業者により決定される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、上記、参照）。このような組成物は、本発明の融合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。
【０２３２】
医薬組成物における主なビヒクルまたは担体は、実際、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のために適当なビヒクルまたは担体は、恐らく非経口投与のための組成物によく見られる他の物質を補った、水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な医薬組成物は、ソルビトールまたは適当な代替物をさらに含むことができる、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓバッファーまたは約ｐＨ４．０−５．５の酢酸バッファーを含む。本発明の１つの態様において、デュアル機能医薬組成物は、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態にて、所望の純度の程度を有する選択される組成物を任意の製剤と混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences、上記）、保存用に調製することができる。さらに、デュアル機能性タンパク質産物は、適当な賦形剤、例えば、スクロースを使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０２３３】
本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物は、非経口投与のために選択することができる。あるいは、組成物は、消化管を介する、例えば、経口的な、吸入または送達のために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当分野の技術の範囲内である。
【０２３４】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、バッファーは、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨで、一般的に約５から約８のｐＨ範囲内で、組成物を維持するために使用される。
【０２３５】
非経口投与が考慮されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のデュアル機能性タンパク質を含むピロゲン無し非経腸的に許容される水溶液の形態においてであり得る。非経口注射のために特に適当なビヒクルは、デュアル機能性タンパク質が適当に保存される滅菌等張液として製剤化される滅菌蒸留水である。さらに別の調製物は、デポー注射を介して送達される産物の制御または持続放出を提供する、薬剤を有する所望の分子の製剤、例えば、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームを含むことができる。ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環の持続期間を増進する効果を有することができる。所望の分子の導入のための他の適当な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２３６】
１つの態様において、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。例えば、本発明のデュアル機能性タンパク質は、吸入のための乾燥粉末として製剤化することができる。デュアル機能性タンパク質吸入溶液もまた、エアロゾル送達のために高圧ガスで製剤化することができる。さらに別の態様において、溶液は噴霧状にすることができる。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載している国際公開ＷＯ９４／２００６９にさらに記載されている。
【０２３７】
特定の製剤は経口的に投与することができることも考慮される。本発明の１つの態様において、この様式において投与される本発明のデュアル機能性タンパク質は、固体投与形態、例えば、錠剤およびカプセルの合成において習慣的に使用される担体の有無にかかわらず製剤化することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティを最大化し、前全身性分解を最小限にするとき、胃腸管部位に製剤の活性部分を放出するように設計することができる。さらなる薬剤を、本発明のデュアル機能性タンパク質の吸収を容易にするために含むことができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた、使用することができる。
【０２３８】
別の医薬組成物は、錠剤の製造のために適当である非毒性賦形剤との混合物中に有効な量の本発明のタンパク質を含むことができる。錠剤を滅菌水または別の適当なビヒクルに溶解することにより、溶液は単位用量形態において調製することができる。適当な賦形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、スターチ、ゼラチンまたはアカシア；または滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクを含むが、これらに限定されない。
【０２３９】
持続もしくは制御送達製剤において本発明のデュアル機能性タンパク質を含む製剤を含む、さらなる本発明のデュアル機能性タンパク質を含む医薬組成物が、当業者に明らかである。種々の他の持続もしくは制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた、当業者に知られている（例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー性微粒子の制御放出を記載している国際公開ＷＯ９３／１５７２２、およびミクロスフェア／微粒子調製および使用を記載しているWischke & Schwendeman, 2008, Int. J Pharm. 364: 298-327、およびFreiberg & Zhu, 2004, Int. J Pharm. 282: 1-18、参照）。
【０２４０】
持続放出調製物のさらなる例は、造形品の形態における半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルを含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０  ０５８  ４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidmanら 1983, Biopolymers 22: 547-56）、ポリ（２−メタクリル酸ヒドロキシエチル）（Langerら 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105）、エチレン酢酸ビニル（Langerら、上記）またはポリ−Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０  １３３  ９８８号）を含むことができる。持続放出組成物はまた、当分野で知られているいくつかの方法のいずれかにより調製することができるリポソームを含むことができる。例えば、Epsteinら 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92；および欧州特許第０  ０３６  ６７６、０  ０８８  ０４６および０  １４３  ９４９号、参照。
【０２４１】
インビボ投与のために使用される本発明の医薬組成物は、一般的に、滅菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を介する濾過により成し遂げることができる。組成物が凍結乾燥されるとき、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前、または後のいずれかに行うことができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液において保管することができる。加えて、非経口組成物は、一般的に、皮下注射針により貫通できるストッパーを有する滅菌点検口を有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたはバイアルに置かれる。
【０２４２】
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または無水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保管することができる。このような製剤は、すぐに使える形態、または、投与前に再構成する必要なる形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保管することができる。
【０２４３】
特定の態様において、本発明は、単回投与単位を生産するためのキットである。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含む。単一および多チャンバー型の充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジ(lyosyringe)）を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０２４４】
デュアル機能性タンパク質の用量およびその投与
治療に使用される本発明の医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に依存する。当業者は、したがって、処置に対して適当な用量レベルが、一部分において、送達される分子、融合タンパク質変異体が使用される適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的な健康状態）に依存することを理解している。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために用量を滴定し、投与経路を修飾することができる。典型的な用量は、上記因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。他の態様において、用量は、０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２４５】
投与の頻度は、使用される製剤におけるデュアル機能性タンパク質の薬物動態パラメーターに依存する。一般的に、臨床医は、用量が所望の効果をなし遂げるように達するまで、組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、時間とともに２またはそれ以上の投与として（同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、または、移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与することができる。適当な用量のさらなる改善は、当業者により日常的に行われており、当業者により日常的に行われる活動の範囲内である。適当な用量は、適当な用量−応答データの使用を介して確認することができる。
【０２４６】
医薬組成物の投与経路は、既知の方法にしたがって、例えば、経口的；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、動脈内、門脈内または病巣内経路による注射を介して；持続放出系（注射もされ得る）により；または、移植デバイスによりである。所望により、組成物は、ボーラス注射により、または連続的に注入により、または移植デバイスにより投与することができる。
【０２４７】
あるいは、またはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたは他の適当な物質の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスを使用するとき、デバイスは、任意の適当な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、定時放出ボーラスまたは連続的投与を介する送達であり得る。
【０２４８】
デュアル機能性タンパク質の治療的使用
本発明のタンパク質は、限定はしないが代謝障害を含む、多くの疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用することができる。１つの態様において、処置される代謝障害は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。別の態様において、代謝障害は肥満である。他の態様は、代謝状態または障害、例えば、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、高血圧、心臓血管疾患、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、インスリン受容体における重度の不活性化突然変異と関連する障害、ＨＩＶ関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィー、胃不全まひおよび他の代謝障害を含む。
【０２４９】
適用において、障害または状態、例えば、１型または２型糖尿病または肥満は、治療有効用量において本明細書に記載されているデュアル機能性タンパク質変異体を必要とする患者に投与することにより処置することができる。投与は、本明細書に記載されているとおり、例えば、ＩＶ注射、腹腔内注射、筋肉内注射または錠剤または液体製剤の形態における経口的に行うことができる。多くの場合、所望の用量は、本明細書に記載されているとおりに、臨床医により決定することができ、デュアル機能性タンパク質ポリペプチドの治療有効用量を示すことができる。治療有効用量のデュアル機能性タンパク質ポリペプチドが、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の投与単位、核酸分子またはポリペプチドが他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、レシピエントの免疫状態および健康状態に依存することは当業者に明白である。本明細書において使用される「治療有効用量」なる用語は、処置される疾患または障害の症状の緩和を含む、研究者、医師または他の臨床医により探求される組織系、動物またはヒトにおける生物学的または医学応答を引き起こすデュアル機能性タンパク質ポリペプチドの量を意味する。
【０２５０】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載されている本発明のデュアル機能性タンパク質または突然変異体の１つ以上および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで注射用として製造され；注射前に、液体ビヒクルでの溶液または懸濁液に対して適当な固体形態もまた製造することができる。リポソームは、薬学的に許容される担体の定義に含まれる。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸エステル塩などもまた、医薬組成物に存在することができる。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkinsで利用できる。
【０２５１】
融合タンパク質およびペプチド化合物
別の態様において、本発明のタンパク質は、本発明のデュアル機能性タンパク質アミノ酸配列に由来する融合タンパク質またはペプチド化合物に作り替えることができる。このような融合タンパク質およびペプチド化合物は、当分野で知られている標準技術を使用して作製することができる。例えば、ペプチド化合物は、標準ペプチド合成技術を使用する化学合成により作製し、次に、ペプチドを細胞（例えば、リポソームなど）に導入するための当分野で知られている種々の手段により細胞に導入することができる。
【０２５２】
本発明の融合タンパク質またはペプチド化合物のインビボ半減期は、ペプチド修飾、例えば、本発明のデュアル機能性タンパク質へＮ−連結グリコシル化部位を付加させること、または例えば、リジン−モノペグ化またはシステイン−モノペグ化を介する、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ；ペグ化）に本発明のデュアル機能性タンパク質を結合することにより改善することができる。このような技術は、治療タンパク質薬物の半減期を延長することにおいて有益であることが証明されている。本発明のタンパク質のペグ化が同様の医薬的利点をもたらし得ることが予期される。
【０２５３】
加えて、ペグ化は、本発明のポリペプチドの任意の部分における非天然アミノ酸の導入によりなし遂げることができる。特定の非天然アミノ酸は、Deitersら J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wangら Science 292:498-500, 2001; Zhangら Science 303:371-373, 2004または米国特許第７，０８３，９７０号に記載されている技術により導入することができる。簡潔には、これらの発現系のいくつかは、ナンセンス・コドン、例えば、アンバーＴＡＧを本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入するための部位特異的突然変異誘発を含む。次に、このような発現ベクターは、導入されるナンセンス・コドンに特異的なｔＲＮＡを利用することができる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸が負荷される(charged with)。本発明のポリペプチドへ部分を結合する目的のために有益である特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものを含む。次に、これらの新規アミノ酸を含む本発明のタンパク質は、タンパク質中のこれらの選択される部位でペグ化することができる。
【０２５４】
同様に、ペグ化は、Ｏｕら（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42. Epub 2011 Jun 13）により記載されているとおりピロリジンまたはピロリン−カルボキシ−リジンの導入により、本発明のタンパク質の任意の部分においてなし遂げることができる。
【実施例】
【０２５５】
実施例１：本発明のＧＬＰ−１／タンパク質の設計
ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１一緒の有効性を試験するために、融合分子を設計した。受容体結合および活性化のために、ＧＬＰ−１はフリーなＮ−末端を必要とし、ＦＧＦ２１はフリーなＣ−末端を必要とするため、２つをＮ−ＧＬＰ−１−リンカー−ＦＧＦ２１−Ｃの順にクローニングした。最初の構築物は、ＧＬＰ−１残基７−３５を有し、ＤＰＰ−４保護のためのＮ−末端へのいくつかの修飾を有するか、または該修飾を有さない構築物を作製した（以下で述べる）。ＧＬＰ−１のさらなる修飾（点突然変異または欠失）を試験し、インビトロ効力によりスコア化した。
【０２５６】
３、８、１０または２０個のアミノ酸のリンカーをクローンした。ＦＧＦ２１について、野生型ヒトタンパク質の残基３３−２０９を使用した。ペグ化部位を有する構築物およびペグ化部位を有さない構築物を製造した。ペグ化は、導入されるＣｙｓに対して反応性のマレイミド−ＰＥＧ試薬（４０ｋＤａ直線状および分岐状ＰＥＧ）を使用して成し遂げた。Ｃｙｓは、ＦＧＦ２１の位置Ｒ１５４ならびにＧＬＰ−１またはエキセンディン−４およびリンカーにおけるいくつかの部位に置かれた。構築物はまた、ＦＧＦ２１の位置Ｒ１５４またはＧＬＰ−１の位置Ｋ３４でタグ（ａｍｂｅｒ）コドンを導入することにより、Ｐｃｌ、Ｐｙｌ、Ｐｙｌアナログまたは反応性非天然アミノ酸の取り込みを介する修飾のために設計された。さらなる構築物は、Ｒ１５４またはＫ３４でのＣｙｓおよび他の部位でのＰｃｌ、Ｐｙｌ、Ｐｙｌアナログまたは反応性非天然アミノ酸の取り込みのためのタグコドンの包含により２つの異なる修飾のために設計された。構築物は、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１をヒト抗体のＦｃドメインに融合させて作製された。ＦＧＦ２１の変異体７６（Ｖ７６）配列を融合型に導入した。
【０２５７】
融合物の発現および精製：融合タンパク質は、一般的に、いくつかの取り外し可能なドメインの１つに対するコード配列を含むベクターに特定のデュアル機能変異体をコードするＤＮＡ配列をクローニングすることにより、大腸菌において発現させた（例えば、ＮＰｒｏまたはＨｉｓ６タグ有りまたは無しのＮＰｒｏ変異体、またはＴＥＶ−プロテアーゼ認識ペプチドを有するＨｉｓ６タグ、またはＨｉｓ６−ユビキチン、またはＨｉｓ６−Ｓｍｔ３）。ベクターは、タンパク質発現のためにｍＲＮＡ転写を開始するための誘導プロモーター、例えば、ｌａｃ、Ｔ７またはアラビノースプロモーターをさらに含んだ。簡潔には、ベクターは、ＤＨ１０ｂ由来の大腸菌細胞またはＢＬ２１（ＤＥ３）由来の細胞に形質転換し、標準条件下で培養し、培養培地に加えられた０．２％  アラビノースまたはＩＰＴＧでタンパク質を発現するするように誘導した。細胞を、誘導後３−４時間で回収し、回転し、冷凍した。ペレットを解凍し、超音波処理により溶解のために再懸濁し、不溶性タンパク質を遠心分離により単離した。次に、ペレットを６Ｍ  グアニジン中で可溶化し、溶解され浄化されたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムに負荷した。カラムを変性バッファー、次に非変性バッファーで洗浄し、標準的実施にしたがって非変性バッファーに溶離した。溶出液をバッファー交換してイミダゾールを除去し、タグの除去のための特異的プロテアーゼ（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、ユビキチナーゼＵｓｐ２、またはｓｍｔ３の特異的除去のためのＵｌｐ１）で消化し、Ｎｉ−ＮＴＡにより精製した。融合タンパク質を含む画分を、ペグ化（一般的に、ＮＯＦ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＬ２−４００ＭＡ  ４０ｋＤａ分岐状ＰＥＧマレイミドで）の前に、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。ＰＥＧ化タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離し、ＰＢＳに置き、種々のアッセイのために濃縮または保管した。
【０２５８】
Ｎ−末端の突然変異によるＧＬＰ−１の保護：ＤＰＰ−４によるＧＬＰ−１のＮ−末端のプロセッシングが、その一次受容体に対するペプチドを不活性化することが知られているため、文献において報告されたいくつかの突然変異体が、このプロセスを遅延することを検証した。Ｎ−末端への余分なグリシンの付加、Ｇｌｕ９のＰｒｏへの突然変異またはＡｌａ８のＧｌｙまたはＳｅｒへの突然変異を有する構築物を全て、ＧＬＰ−１活性の細胞ベースのアッセイにおいて試験した。ＦＧＦ２１とＦＧＦ２１に結合される４０ｋＤａＰＥＧとの融合物の文脈において、Ａｌａ８での突然変異体は、他のＮ−末端修飾体より優れた活性を保持し（図１ａ）、Ａ８Ｓ突然変異を後の設計において使用した。加えて、ＤＰＰ−４−耐性類似体において、エキセンディン−４もまた、インビボで延長された半減期を有する代替部分として融合物において試験した（図１ｂ）。［例えば、J. Y. Ohら (2009) Bulletin of the Korean Chemical Society 30, 2471-2474; K. Adelhorst, (1994) JBC 269, 6275; B. D. Greenら (2003) Biological Chemistry 384, 1543; J. C. Parkerら (1998) Journal of Peptide Research 52, 398; C. F. Deaconら (1998) Diabetologia 41, 271; R. Burcelinら (1999) Metabolism-Clinical and Experimental 48, 252; U. Ritzelら (1998) Journal of Endocrinology 159, 93．参照］
【０２５９】
Ａ８Ｓ突然変異体もまた、インビボにおける薬物動態学的特性について野生型ＧＬＰ−１と比較した。野生型ＧＬＰ−１（Ｖ３２９）を有する融合タンパク質およびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）突然変異（Ｖ２３２）を有する融合タンパク質を１ｍｇ／ｋｇでラットに静脈内に注射し、血清レベルを投与溶液で作製される標準曲線に対して測定した。ヒトＦＧＦ２１応答性ＥＬＩＳＡキットで測定されるとき、該分子は、結合される同じサイズ（４０ｋＤａ）ＰＥＧを有するＦＧＦ２１と、互いにおよび単独で、同様に機能するようであった（図２）。ＧＬＰ−１活性の半減期延長を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、野生型ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）のいずれかを有する同じ２つのデュアル機能性タンパク質変異体を注入した。両方が、投与後、食餌(fed)グルコースレベル急速に低下させたが、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）変異体は、投与後３日間、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）測定においてより良い活性を保持した（図３）。これらのデータは、Ａ８Ｓ突然変異が融合物のＧＬＰ−１部分の有効な半減期を増加させるが、ＦＧＦ２１部分のＰＫがＧＬＰ−１の付加によりあまり影響されないことを証明する。
【０２６０】
ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１間のペプチドリンカーの設計：３、８、１０または２０個のアミノ酸のリンカーを試験した。活性における有意な差異は、異なるリンカーを有する変異体について観察されなかったが、いくつかの融合状況において発現収量にて差異があった。さらに、構築物を、種々の長さのＧＬＰ−１（８から３１残基）またはエキセンディン−４（３０以上の残基）で試験し、ＧＬＰ−１Ｒ細胞ベースのアッセイにおいてインビトロ活性について試験した。
【０２６１】
実施例２：ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルにおける融合物の試験
ＦＧＦ２１は、２型糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて血糖レベル、肝臓脂質レベルおよび体重を改善することを示されている（Ｔ２Ｄ；例えば、A. Kharitonenkovら (2005) Journal of Clinical Investigation 115, 1627; T. Coskunら (2008) Endocrinology 149, 6018;およびE. D. Berglundら (2009) Endocrinology 150, 4084参照）。同様に、ＧＬＰ−１類似体は、この遺伝的マウス糖尿病モデルにおいてグルコースコントロール、ベータ細胞機能および肝臓健康状態を改善することを示されている（Gallwitz B., Glucagon-like peptide-1 as a treatment option for type 2 diabetes and its role in restoring beta-cell mass. Diabetes Technol Ther. 2005, 7:651-7）。
【０２６２】
ＧＬＰ−１とＦＧＦ２１との融合物がさらなる有効性を引き起こすかどうかを決定するために、ＷＴ  ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）型を、結合される同じ４０ｋＤａ分岐状ＰＥＧをそれぞれ有する等量のＦＧＦ２１分子に対して試験した。週に２回の投与の２週間試験において、ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３８）およびＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３９）は、（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）血清レベル、体重および外観により評価される）血糖、体重および肝臓健康状態に対して同様の効果を示した（図４）。グルコース測定は、最初の投与後、ＦＧＦ２１単独よりも融合物においてより速い改善を示した。２つが投与後１日以内の時点で収束し、ＧＬＰ−１によるさらなる利益がＦＧＦ２１有効性よりもより短い存在であったことを示唆した。
【０２６３】
ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５）融合物はまた、他の化合物に対して１ｍｇ／ｋｇで使用されるよりもむしろ、０．２ｍｇ／ｋｇで同様の効果を示した。この化合物はまた、一般的に、投与間でより一貫した結果を与え、ＤＰＰ−４−耐性が、ＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３９）のアップダウン(up-and-down)機能と比較して、有効性における全体的な改善に重要であることを示唆した。１ｍｇ／ｋｇでのＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５）が、グルコース、体重、ＡＬＴ／ＡＳＴおよび肝臓重量のさらなる低下を示すことも観察された。
【０２６４】
さらなる試験を、改善された有効性が、別々のＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１化合物の共投与で再現できるか否かを見るために行った。群間で同様のタンパク質の投与をさせるために、１４個のアミノ酸がＦＧＦ２１  Ｃ−末端から除去されているツール(tool)化合物を作製した。該分子（Ｖ２５３）は、他の融合物と比較してＧＬＰ−１Ｒアッセイにおいて同等の効力を保持するが、ＦＧＦ２１受容体アッセイにおいて少なくとも１０００倍弱く、野生型ＦＧＦ２１活性を阻害することができなかった。該化合物は、ＦＧＦ２１レベルにより評価されるとき、他の融合物と同様にラットにおける薬物動態学を有した（図２）。
【０２６５】
ｏｂ／ｏｂマウスがＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）の両方共に、またはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ融合物（Ｖ２７２）で処置された４週間試験の結果は、図５に示される。該融合物は、食餌グルコースＡＵＣ、ＯＧＴＴグルコースＡＵＣ、試験の最後の体重、肝臓脂質量およびＡＬＴ測定（全てについてｐ値＜０．０５）に対して個々のＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧおよびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ分子の共処置よりも、有意により有効であった。
【０２６６】
ヒトＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１の血清暴露は、種々の群における暴露を確認するために、最終的な血清サンプルにおいて確認した。ヒトＦＧＦ２１は、全ての処置群において検出され、活性なＧＬＰ−１における有意な増加は、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）またはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）で処置された全ての群において測定された。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）群は、０．２ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ基と同様のレベルのヒトＦＧＦ２１を示し、改善された有効性が動物における融合物のより高い全身的蓄積によってではないことを示唆した。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）分子は、インビトロで完全に活性であった（表８）。これらのデータは、融合物の有効性が単一の分子における両方の分子に依存し、例えば、細胞レベルで相乗効果をもたらすことを証明する。
【０２６７】
ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）  対  共投与をさらに試験するために、３つの試験をｄｂ／ｄｂマウスにおいて行った。それぞれの試験において、オスＤｂ／ｄｂマウス（８−１１週齢）を週に２回ｉ．ｐ．投与した。最初の３週間試験において、デュアル機能性融合タンパク質のＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）は、等用量での共投与のグルコース低下に匹敵し、単一の存在物の投与の有効性を勝った。デュアル機能性融合タンパク質はまた、優れた体重減少を示した。
【０２６８】
第２の２週間試験において、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）は、２５倍低い用量でＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧおよび５倍低い用量でＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）と比較して、同様のグルコース低下を示した。加えて、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）は、単剤療法または最大に有効な用量の共投与群よりも、有意に良くＨｂＡ１ｃを低下させ、有意に良く体重を低下させた（図８、表２）。予想外に、１：１よりも高い共処置の用量比率の変化は、観察される有効性を改善しなかった（表２）。これは、同数のＧＬＰ−１部分およびＦＧＦ２１部分を含むデュアル機能性タンパク質がインビボ処置中に最適な有効性をなし遂げることができるということを示唆する。
【表５９】
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【０２６９】
１ｐ値  対  ビヒクル  ＜０．０５。２ｐ値  対  共処置群＜０．０５
【０２７０】
表２は、２週間の投与でのＤｂ／ｄｂマウス試験におけるデュアル機能性タンパク質と比較して異なる用量での単剤療法および共処置の有効性を示す。報告された値は、８匹の動物において行われた測定の平均と標準偏差である。４週間試験において、オスＤｂ／ｄｂマウス（ｎ＝８）に、単剤療法、共処置またはデュアル機能性融合タンパク質を４週間、週に２回投与した。２７日目に、マウスを絶食させ、血中インスリンレベルを全ての動物に対して測定した。試験の最後に、膵臓インスリン量を取り出し、測定した（ｎ＝３）。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）は、１０倍以上低い用量でグルコースレベル、ＨｂＡ１ｃおよび体重においてＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧまたはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）単独と同等の、またはより良い有効性で０．１−１ｍｇ／ｋｇで強力な用量応答、ならびに最大に有効な用量の共投与を超える改善された有効性を示した。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）はまた、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）およびＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧの単一または組合せ処置よりも、血清における空腹時インスリンレベルを低下させたが、膵臓のインスリン量をより良い程度に増加させた（図７）。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）−処置動物は、食餌グルコース、ＨｂＡ１ｃおよび体重量において痩せた(lean)コントロールマウスに近かった。
【０２７１】
代謝速度および基質利用を概算するために、本発明者らは、Ｏｘｙｍａｘ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Columbus Instruments, Columbus, OH）を使用して酸素消費および二酸化炭素生産を測定した。マウスを２２−２４℃の環境温度において１２時間明／１２時間暗サイクルにてチャンバーに入れた。ＶＯ２およびＶＣＯ２比率を、Ｏｘｙｍａｘシステム設定およびプロトコール下で決定した。システムを、標準ガス混合物に対して調整し、消費されるＯ２（ＶＯ２、ｍｌ／ｋｇ／ｈ）および産生されるＣＯ２（ＶＣＯ２、ｍｌ／ｋｇ／ｈ）を測定した。代謝速度（ＶＯ２）および基呼吸交換率（ＲＥＲ）（ＶＣＯ２／ＶＯ２の比率）を、７２時間にわたって評価した。計算されたＲＥＲ値は、融合タンパク質で処置された動物が、ビヒクルまたは組合せ処置群と比較したとき、特に第２の投与後２４−７２時間に、脂質基質に多く依存することを示した（ほぼ０．７５−０．８５のＲＥＲ値）。この期間中、ビヒクルおよび組合せ処置群は、ＲＥＲ値がエネルギーに対してより多くの炭水化物基質利用およびエネルギー消費に対してより小さい程度に脂質基質利用を示唆するほぼ０．９であったことを示した。データは、融合タンパク質処置がｄｂ／ｄｂマウスにおける体重減少効果に寄与し得る脂肪酸酸化の増加を引き起こしたことを示唆する。
【０２７２】
デュアル機能性融合タンパク質は、組合せと比較したとき、インビボでベータ−細胞機能の改善を示した。デュアル機能性タンパク質ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）またはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）プラスＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧのいずれかの４回投与後、Ｄｂ／ｄｂマウスにグルコースおよびアルギニンを経口投与した。デュアル機能性タンパク質処置群のグルコース周遊(excursion)（ビヒクルよりも７２％低い）は、組合せ処置群（ビヒクルよりも５６％低い）よりも有意に低かった。実験中、分泌されるインスリンの量はまた、組合せ処置群（ビヒクルよりも１２２％高い）よりもデュアル機能性タンパク質処置群（ビヒクルよりも２７９％高い）において高かった。
【０２７３】
全体として、本明細書に示されていない図および表ならびにデータは、本発明のデュアル機能性融合タンパク質、例えば、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）が、個々のＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１（例えば，ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧおよびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３））の組合せと比較したとき、インビトロおよびインビボにて糖尿病の齧歯動物モデルにおいて代謝パラメーターを改善する能力を証明する。該改善されたパラメーター（本明細書において使用される「代謝パラメーター」）は、食餌グルコース（ＡＵＣ）、体重、肝臓トリグリセリド、血漿ＨｂＡ１ｃ、血清トリグリセリドレベル、総コレステロールレベル、経口ブドウ糖負荷試験血清グルコース測定（ＡＵＣ）、空腹時血清インスリン、膵臓インスリン量、および体脂肪率を含むが、これらに限定されない。
【０２７４】
実施例３：ＦＧＦ２１変異体からの本発明のＧＬＰ−１／タンパク質の設計
融合物を、本明細書において「変異体７６」または「Ｖ７６」と称される以下のＦＧＦ２１変異体配列で作製した：
【表６０】
2014527986.tif 000061
【０２７５】
ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧは、Ｃｙｓ１５４を介して結合される４０ｋＤａ分岐状ＰＥＧ、および１７７個のアミノ酸野生型タンパク質と比較して８個の点突然変異（Ｑ５６Ｅ、Ｄ７４Ｈ、Ｑ８２Ｅ、Ｒ１０５Ｋ、Ｋ１５０Ｒ、Ｒ１５４Ｃ、Ｒ１５９Ｑ、Ｓ１９５Ａ、全て全長ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１）と比較して作られる）を特徴とする。該分子に対する臨床免疫原性の危険性は、ヒトＴ細胞応答のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ経時的アッセイに基づいて低いと考えられる。該分子は、マウスおよびラットにおいて３０時間以上の血清半減期時間を有し、１ｍｇ／ｋｇの週２回の注射でｏｂ／ｏｂマウスにおいてグルコースＡＵＣを有意に低下させる。
【０２７６】
ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）分子を、３つの用量（０．０５、０．１および０．２ｍｇ／ｋｇ）でＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５）融合物に対して試験した。両方の融合物は、グルコースＡＵＣ、体重、食物摂取量およびＡＬＴの低下において用量応答を示した（図６）。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）は、概して同等またはより良く、０．２ｍｇ／ｋｇ用量で全てのパラメーターに対してより高い有効性を示した。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）はまた、０．１および０．２ｍｇ／ｋｇの両方で血清トリグリセリドおよびコレステロールの低下を示した。これらのデータに基づいて、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）分子は、最初の融合物と同様の、または改善された特性を示し、さらなる試験および開発のために適当である。
【０２７７】
Ｅｘ４（１−３０）−Ｌ２０−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７７）はまた、グルコースコントロール、体重および脂質レベルに対して２週試験においてｏｂ／ｏｂにおいてＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）と同様の有効性を示した。
【０２７８】
半減期延長のためのペグ化部位の選択。例えば図２において示されるとおり、ペグ化は、ラットにおいて測定されるとき、ＧＬＰ−１に対して数分またはＦＧＦ２１に対して１時間未満から３０時間以上に分子の半減期を延長するために使用された。融合物の２つの部分がＰＥＧの配置により調節することができるかを見るために、ＦＧＦ２１配列においてではなく、ＧＬＰ−１またはリンカーにおいて、余分なシステインを有する一連の構築物を、作製した。これらの構築物は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１活性の両方に対して試験した。実験は、ペグ化がいずれかの活性に大して影響しない融合タンパク質配列内の位置の範囲を示す。該範囲のＮ−末端でのＰＥＧの注意深い配置は、ノックダウンされたＧＬＰ−１活性を有する分子を作製するために使用することができ、リンカーにおける配置は、ＦＧＦ２１活性をノックダウンするために使用することができる。このような分子は、融合物の効力を調整することにおいて有用であり得る（例えば、より低い効力の有効なレベルでＦＧＦ２１を投与するとき、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４の高い効力が乏しい治療濃度域をもたらすとき）。
【０２７９】
これらのデータに基づいて、ＧＬＰ−１（Ｖ２７３）のＫ３４Ｃまたはエキセンディン−４（Ｖ２７４）のＫ２７Ｃでのペグ化を有する融合物を、ＦＧＦ２１（Ｖ７６−Ｃ１５４Ｒ）で製造した。その配列は以下のとおりである：
【表６１】
2014527986.tif 000062
【０２８０】
ｏｂ／ｏｂマウスにおける２週間試験は、新規融合物（Ｖ２７３およびＶ２７４）が以前の融合物と同様のインビトロでの効力およびラットにおいて同様の薬物動態学を示したが、それらはインビボで有効ではなかったことを証明する。０．２ｍｇ／ｋｇで、ＧＬＰ−１融合変異体は、グルコースまたは体重に対して有意な有効性を示さなかった。エキセンディン−４融合変異体は、ビヒクルと比較して、ＡＬＴおよび体重の有意な低下およびＡＳＴの低下の傾向を示したが、血糖に対して有意な効果は示さなかった。これらの融合物はより高い用量で有効性を示し得るが、ＦＧＦ２１におけるＲ１５４Ｃでのペグ化を有する原型をさらなる試験のために選択した。この予測されない差異が、代替部位でのペグ化によりブロックされる融合物のＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６−１５４Ｒ）−ＰＥＧ型の特別な特性を示すか、または、天然受容体レベルで、インビトロアッセイに対して使用されるトランスフェクト細胞よりも、天然細胞でより良いＰＥＧブロッキングＧＬＰ−１Ｒ相互作用のような別の解釈があるか、不明である。
【０２８１】
実施例４：本発明のＧＬＰ−１／ＦＧＦ２１タンパク質のさらなる特性化
本発明のＧＬＰ−１−ＦＧＦ２１−ＰＥＧデュアル活性タンパク質をさらに最適化およびランク付けするため、および共投与モデルを超えるそれらの改善された有効性の完全な評価を得るために、融合物を有効性のｏｂ／ｏｂモデルにおいて試験する。これらは、血清安定性または活性を改善するために、より長いまたはより短いリンカー、本発明のさらなるタンパク質（これは、変異体７６に基づく突然変異体、または、開発におけるさらなる変異体、例えば、さらなるまたは異なる点突然変異、挿入または欠失、二量体化分子、代替ペグ化戦略、さらなるジスルフィド架橋を有する分子、異なる発現系において生産される分子を含み得るが、これらに限定されない）、およびエキセンディン−４またはＧＬＰ−１の変異体を有する分子を含むが、これらに限定されない。候補物も、コンピューター内での最終産物の免疫原性予測、発現レベルおよび質（溶解度、凝集および安定性に関する）により、フィルターをかける。
【０２８２】
糖尿病および肥満の処置のためにＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１の相乗効果をさらに特徴付けするために、２つの分子の相互作用ダイナミックスをマッピングし、融合タンパク質を個々の親分子の最大に有効な共投与と比較する。これらの実験は、肥満および体重減少（ラットまたはマウスにおける食餌性肥満）に焦点を当てたモデルおよび糖尿病、例えば、高血糖、脂質異常症、およびベータ細胞機能障害のより良いモデル局面（ｏｂ／ｏｂまたはＤｂ／ｄｂマウス）のモデルにおいて行う。本発明のデュアル活性タンパク質によりなし遂げられる相乗効果の程度は、それぞれの個々の分子、異なる比率で２つの組合せおよび融合物の有効性をマッピングすることによりさらに決定することができる。
【０２８３】
初代(primary)または不死化ラット膵島および初代ヒト膵島での細胞ベースのアッセイにおける試験を、細胞増殖、アポトーシスからの保護および機能について融合物の有効性を評価するために、例えば、１型糖尿病の認められたモデルにおいて本発明のデュアル活性タンパク質を確認するために、行う（さらにVan Belle, T.L.ら Drug Discovery today: disease models. 209 pp. 41-45参照）。好ましいインビボモデルは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）による膵臓切除を特徴とするモデル；食餌にドキシサイクリンで補うことによりベータ−細胞が破壊され、ジフテリア毒素の標的化発現を誘導する遺伝的に修飾され誘導されたマウス血統（ＲＩＰ−ＤＴＡ）における標的化ベータ−細胞切除；または、自己免疫メカニズムを有する１型糖尿病の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルである。これらのモデルにおいて、試験は、（特にＮＯＤにおいて）ベータ−細胞保護を評価するために予防投与ならびに（特にＳＴＺおよびＲＩＰ−ＤＴＡにおいて）ベータ−細胞刺激および増殖を評価するために抗原投与後の投与の両方において可能である。
【０２８４】
以下の実験を、共投与レジメンを超える本発明のデュアル活性タンパク質によりなし遂げられる有効性相乗効果のメカニズムをより完全に理解するために行う：両方の受容体（ＧＬＰ−１Ｒ；ＦＧＦＲ１（ＩＩＩｃ）、２（ＩＩＩｃ）、３（ＩＩＩｃ）または４；およびベータ−クロトー）で共トランスフェクトされた細胞を、受容体が細胞表面で反対のシグナルを強化することができるかを決定するために使用することができる。下流シグナル間のクロストーク(crosstalk)を、両方の受容体を天然に発現する細胞（例えば、ベータ細胞）において検出することができる。動物において、食物摂取量の寄与（ペアフィード(pair-fed)コホートで試験された）、代謝速度の増加（クランプ(clamp)および代謝チャンバー実験において試験された）、および他のメカニズムを、さらに徹底的に試験し、２つのシグナルの相乗効果に対する作用機序を解明することができた。重要な組織（肝臓、膵臓、脂肪、腸、心臓、大動脈、脳など）の遺伝子発現プロファイリングもまた、それらの改善された有効性について潜在的に構成する融合タンパク質のユニークなシグナル伝達を解明するために行い得る。
【０２８５】
以下の実験を、間葉性幹細胞（ＭＳＣ）の分化を制御または修飾する本発明のデュアル機能性タンパク質の活性を理解するために行う：ＭＳＣを、本発明のタンパク質単独で、または、骨形成を誘導する既知の化合物もしくは該化合物の混合物または脂質生成を誘導する既知の化合物もしくは該化合物の混合物と共に処置し、骨芽細胞様細胞または脂肪細胞様細胞への得られる分化率を測定することができる。
【０２８６】
実施例５：Ｆｃ−融合ＦＧＦ２１変異体からのＧＬＰ−１およびエキセンディン−４を含む本発明のタンパク質の設計
構築物を、代替リンカー（例えば、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号：１３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号：１７３）、ＧＧ、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１７４））、ＦＧＦ２１変異体、およびＧＬＰ−１−関連ペプチドで作製した。一般的に、Ｆｃドメインを含むデュアル機能性タンパク質をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。これらの融合物のＤＮＡコード配列を、分泌のためにタンパク質を指向するリーダーペプチドをコードする配列を含み、所望の産物のｍＲＮＡ合成およびタンパク質発現を促進するために必要とされる配列をさらに含むベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を、ベクターで一時的にトランスフェクトした。これらの細胞培養物から培地を回収し、濾過し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。溶出液を中性ｐＨに至らせ、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。次に、産物を濃縮し、種々のアッセイのために保管した。変異体を、以下の４つのアッセイにおいてインビトロでの活性について試験した：ＧＬＰ−１Ｒを介する活性を測定するために、ＧＬＰ−１ＲでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３におけるＣＲＥ−ルシフェラーゼ発現誘導（表３）およびＩＮＳ１Ｅ細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌（表６）；ＦＧＦ２１活性を測定するために、ベータ−クロトーでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３におけるＥＲＫリン酸化誘導（表４）および３Ｔ３Ｌ１細胞による２−デオキシグルコース摂取（表５）。ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）および１５個のアミノ酸リンカーを有する変異体は、ＧＬＰ−１およびより短いリンカーを有する変異体よりも、より活性であった。試験された全てのリンカーを有するエキセンディン−４（１−３９）変異体が活性であった。エキセンディン−４（１−３０）を含む変異体は、エキセンディン−４（１−３９）を含む構築物と同様のインビトロ効力を有した。エキセンディン−４（１−３９）のタンデムリピートを有する変異体は、ＧＬＰ−１−関連ペプチドの単一のコピーを有する変異体ほど強力でなかった。
【表６２】
2014527986.tif 000063
【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【０２８７】
８匹のｏｂ／ｏｂマウスに変異体を週に２回０．５ｍｇ／ｋｇで２週間投与した。血糖および体重を試験中に測定し、肝臓脂質を試験の最後に測定した。以下の表（表７）において示されているとおり、処置動物は、ビヒクル処置された同年齢動物と比較したとき、試験中、血糖を減少、体重を低下、および肝臓脂質を低下した。
【表６６】
2014527986.tif 000067
【０２８８】
実施例６：受容体薬理学的アッセイにおける本発明のタンパク質のさらなる特性化
例えば、図９において示されているとおり、本発明のデュアルアゴニストタンパク質を、ベータ−クロトーでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３においてＥＲＫリン酸化を誘導する能力について、ＦＧＦ２１およびエクセナチドの種々の形態と比較した。１０分で、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）で処置された細胞は、ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ  プラス  エクセナチドで処置された細胞と比較したとき、より高い効力および全ＥＲＫに対するホスホ−ＥＲＫのより高い最大比率を示した。より高い最大ホスホ−ＥＲＫシグナルは、恐らく受容体とのより良い相互作用（例えば、Ｎ−末端延長が、デュアル機能性タンパク質を受容体結合または活性化のためにより好ましい構造に達成させる）によって、デュアル機能性タンパク質Ｖ２７２が、ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ分子と比較したとき、ＦＧＦＲ１ｃ／ベータ−クロトーを介するシグナル伝達に対して優れたアゴニストであることを示す。
【０２８９】
選択されたデュアル機能性タンパク質を、ヒト脂肪細胞においてホスホ−ＥＲＫシグナル伝達を誘導する能力について試験した。単一の機能性ＦＧＦ２１分子（Ｖ１０１）と比較したとき、デュアル機能性タンパク質Ｖ２０８、Ｖ２０９、Ｖ２１１、Ｖ１４およびＶ２７２は、ＥＲＫのリン酸化を刺激することについてより強力であった。これらがヒト細胞であるため、今まで齧歯動物において活性について証明されているものと同様の他のＦＧＦ２１模擬物を含む処置と比較したとき、本発明のデュアル機能性タンパク質がヒト疾患の処置において高く活性であるとも示唆され得る。
【０２９０】
例えば、表８および図１０において示されているとおり、本発明のデュアルアゴニストタンパク質を、ＧＬＰ−１ＲでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはＧＬＰ−１Ｒ、ベータ−クロトーおよびＦＧＦＲ１ｃで共トランスフェクトされた細胞においてＧＬＰ−１Ｒを介してシグナリングする能力について、エクセナチド、ＧＬＰ−１ペプチド、エキセンディン−４（１−３９）−Ｌ５−Ｆｃ（Ｖ２０１）およびＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）と比較した。細胞を３０分間、化合物で処置し、ｃＡＭＰレベルを測定した。表８は、ＧＬＰ−１ＲおよびＦＧＦ２１受容体複合体の両方を有する細胞において、デュアルアゴニストタンパク質（Ｖ２７２およびＶ２１１）が、単一のアゴニスト（Ｖ２５３およびＶ１０１）単独またはエキセンディン−４との組合せよりもより高い効力を示したことを示す。ＧＬＰ−１Ｒのみを有する細胞において、単一のアゴニスト単独またはエキセンディン−４と組み合わせた効力は、デュアルアゴニストタンパク質と同等であった。ＦＧＦ２１変異体単独は、アッセイにおいて不活性であった。
【０２９１】
【表６７】
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【０２９２】
２つのさらなるＨＥＫ２９３細胞系を、受容体活性化時のアレスチンの補充を測定するために、ベータ−アレスチンおよびＧＬＰ−１ＲのＣ−末端に対するベータ−ガラクトシダーゼフラグメントの相補性を利用するＤｉｓｃｏｖｅｒｘ’ｓ  ＰａｔｈＨｕｎｄｅｒアッセイフォーマットにおいて産生した。図１０ａ−１０ｄは、細胞とタンパク質またはペプチドとの１時間のインキュベーションで、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）、エキセンディン−４（１−３９）−Ｌ１５−Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｖ１０３）（Ｖ２１１）、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）、およびエキセンディン−４（１−３９）−Ｌ５−Ｆｃ（Ｖ２０１）が、ベータ−アレスチンの補充についてエクセナチドよりもあまり強力でなかったこと、および細胞がＧＬＰ−１Ｒ／ＦＧＦＲ１ｃ／ベータ−クロトーまたはＧＬＰ−１Ｒ単独を含むか否かで作用において差異がなかったことを示す。
【０２９３】
ここで述べられている受容体薬理学的試験は、本発明のデュアル機能性タンパク質が、慣用のＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１／エクセナチド分子の組合せまたは共処置と比較したとき、活性および有効性において優れていることを示唆する。ＰＥＧ化デュアル機能性タンパク質ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）は、ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ分子と比較したとき、予想外に、ホスホ−ＥＲＫ誘導に対してより高い効力および最大シグナルを示した。これらのデータは、デュアル機能性タンパク質が、他のＦＧＦ２１変異体と比較したとき、ＦＧＦ２１シグナル伝達について同等であるか、または優れていることを示す。同様に、デュアル機能性タンパク質は、細胞がＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１受容体の両方を発現するとき、ＧＬＰ−１ＲのｃＡＭＰシグナル伝達下流に対してより高い効力を示す。これらの特性は、受容体間の直接的相互作用、または、間接的な効果、例えば、２つの受容体に対する親和性を介する局所濃度におけるブーストを反映し得る。これらの観察は、本発明の他の実施例に示されているとおり、なぜ個々のＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１変異体の共処置が、デュアル機能性タンパク質のインビボ有効性に匹敵するのに十分でないかを説明し得るデュアル機能性タンパク質の改善された活性についてのメカニズムを示唆する。
【０２９４】
実施例７：１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のモデルにおける本発明のタンパク質の特性化
ＲＩＰ−ＤＴＡトランスジェニックマウス（９−１０週齢）を、３日間ドキシサイクリンで処置し、コントロールされたベータ−細胞切除を誘導した（Thorelら, Nature 2010(464)1149-1154と同様）。次に、マウスを３週間、週に２回、ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ、ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ＋ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）またはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（Ｖ７６）−ＰＥＧ（Ｖ２７２）で処置した。全３つの群における処置動物は、試験中、より低い基礎食餌グルコースレベルを示した。デュアル機能性タンパク質処置は、組合せ処置（ビヒクルから５５％減少）と比較して、有意に低いグルコースＡＵＣ（ビヒクルから６４％減少）をもたらした。絶食後、マウスにグルコースボーラス投与し、グルコース周遊を測定した。全３つの処置は、ビヒクル処置動物と比較して血糖レベルを低下させ、デュアル機能性タンパク質処置は、組合せ処置に対する６６％と比較して７６％減少をもたらした。全ての処置群は、ビヒクルと比較して膵臓インスリン量を増加させ、デュアル機能性タンパク質処置は、組合せ処置よりも７６％良いインスリン量をもたらした。
【０２９５】
ＮＯＤマウスを、３週間、週に２回、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＦＧＦ２１（１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３５）またはＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−ＰＥＧ（Ｖ２５３）＋ＦＧＦ２１（１５４Ｃ）−ＰＥＧ（Ｖ２３８）で処置した。２週間後、マウスを絶食させ、ＯＧＴＴに対してグルコースボーラス投与した。デュアル機能性タンパク質で処置されたマウスは、ビヒクルと比較して、有意に低い絶食時グルコース（ビヒクルの〜６０％）および抗原投与中のグルコース周遊（〜４５％）を示したが、組合せ処置動物は、ビヒクル（〜７０％）と有意に差異がない絶食時グルコースレベルおよびビヒクル処置動物と比較して同等の抗原投与中のグルコース周遊を有した。試験の最後に、デュアル機能性タンパク質処置動物は、ビヒクルよりも有意に低い基礎グルカゴンレベル（〜５０％）を有したが、組合せ処置動物は、ビヒクルと同等のレベルを有した。
【０２９６】
実施例８．予測免疫原性結果−ＭＨＣ−関連ペプチドプロテオミクス（ＭＡＰＰ）およびＴ細胞アッセイ結果
ｍＡｂおよび他の治療タンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成は、潜在的に、重度の免疫毒性学的応答、例えば、ＩｇＥ−介在アナフィラキシー応答（Chungら (2008) N Eng J Med, 358, 1109-17）または免疫複合体病、例えば、脈管炎、糸球体腎炎（Descotes and Gouraud (2008) Expert Opin Drug Metab Toxicol 4, 1537-49）ならびに臨床的暴露(exposure)および有効性の喪失を引き起こし得る。治療タンパク質、ＰＥＧ化巨核球増殖発達因子（ＰＥＧ−ＭＧＤＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ；Ｅｐｒｅｘ）で処置されたいくつかの患者は、それらのそれぞれの内因性対応物と交差反応性である中和するＡＤＡを発生させ、ＰＥＧ−ＭＧＤＦで重度の血小板減少症およびＥｐｒｅｘで赤芽球癆を引き起こした（Liら (2007) Blood 98, 3241-8; Casadevallら (2002) N Engl J Med 346, 469-75）。したがって、ヒト試験の前に免疫原性の危険性を評価することが重要である。臨床開発段階において、免疫原性の危険性を評価することおよび確かな(solid)免疫原性の危険性の緩和計画を適所に置くことは、修飾された非ヒト配列、例えば、本発明の対象であるＦＧＦ２１変異体を含む治療タンパク質に対してとりわけ重要である。
【０２９７】
ＡＤＡの形成は、少なくとも２つの異なる方法において誘導することができる。Ｔ細胞依存性および非依存性経路は、Ｂ細胞活性化に関して記載されている。強い高親和性ＩｇＧ応答は、Ｔ細胞依存性であり、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）の関与を必要とする。免疫応答は、外来抗原に対する応答に類似している：ナイーブ(naive)ＴＨ細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞（ＤＣ）により特異的に活性化され、順に薬物特異的Ｂ細胞の活性化を誘導する。
【０２９８】
ＭＨＣ−関連ペプチドプロテオミクス（ＭＡＰＰ）アッセイは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞により処理されるＨＬＡクラスＩＩ関連ペプチドのインビトロ同定を含む。抗原摂取、処理および提示プロセスを考慮する。このアプローチにおいて、種々の健常血液ドナーの未成熟ヒト単球由来ＤＣを、活性化刺激の存在下で種々の生物学的薬物候補物とインキュベートする。生物学的治療タンパク質から生じる天然に処理されるＨＬＡクラスＩＩ−関連ペプチドは、液体クロマトグラフィー質量分析により同定される（Kropshofer and Spindeldreher (2005) in Antigen Presentaing Cells: From Mechanisms to Drug Development, eds. Kropshofer and Vogt, Wiley-VCH, Weinheim, 159-98）。
【０２９９】
Ｔ細胞アッセイは、全タンパク質治療の免疫原性についての可能性のある危険性を評価することができるフォーマットを提供する。Ｔ細胞アッセイは、治療タンパク質がＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する能力を評価する。広範なＨＬＡクラスＩＩハプロタイプ集団を覆う健常血液ドナーのコホートを使用して、精製された治療タンパク質をインビトロでＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌について試験する。該技術は、インビボで免疫応答を誘導する可能性についてタンパク質変異体と比較するために成功裏に使用されており（Jonesら (2004) J Interferon Cytokine Res. 24, 560-72.; Jonesら (2005) J Thromb Haemost. 3, 991-1000）、現在承認されているモノクローナル抗体のこの評価は、インビトロで観察されるＴ細胞の活性化と臨床における免疫原性との間であまり相関関係を示さない（Perryら (2008) Drugs R D 9, 385-96）。本発明の文脈において、（ＨＬＡアロタイプに基づく）世界集団を代表する５０の健常ドナーのコホートからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦＧＦ２１変異体とインキュベートし、Ｔ細胞応答を増殖アッセイ（［３Ｈ］−チミジン摂取）およびＩＬ−２サイトカイン分泌（ＥＬＩＳｐｏｔ）を使用して測定する。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度および大きさの分析を行い、臨床的免疫原性の危険性を評価する。
【０３００】
Ｔ細胞およびＭＡＰＰアッセイの組合せ使用は、ヒト細胞を使用する臨床的において免疫原性の危険性の評価に対する有効なプロセスを提供する。Ｔ細胞アッセイにおいて樹状細胞により提示されるペプチドの数の減少および応答するドナーの数の減少をもたらす治療タンパク質候補物に対する修飾は、これらのタンパク質が臨床的において免疫原性を発達させる危険性がより低いため、有利である。免疫原性を減少させるために記載されているタンパク質修飾の例はペグ化である。しかしながら、免疫原性の減少は、ペグ化でいつも起こらない（Liら (2007) Blood 98, 3241-8）。
【０３０１】
ＭＡＰＰアッセイにおいて、Ｖ２７２（ＰＥＧ化）およびＶ２７７（ＰＥＧ化）を含む全ての試験されたＰＥＧ化ＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）およびエキセンディン−４  ＦＧＦ２１−融合分子およびＱ５５Ｃ、Ｇ１４８Ｃ突然変異を含む非ＰＥＧ化Ｆｃ−ＦＧＦ２１変異体（Ｖ１０１、Ｖ１０３およびＶ１８８）は、少ない数のクラスター、およびＶ７６（ＰＥＧ化）に匹敵し、野生型ＦＧＦ２１またはＶ７６（非ＰＥＧ化）よりも低いペプチド長変異体を示す。Ｔ細胞アッセイにおいて、Ｔ−細胞応答の頻度は試験コホートの＜１０％であり、応答の大きさは、Ｖ２７２（ＰＥＧ化）およびＶ２７７（ＰＥＧ化）およびＱ５５Ｃ、Ｇ１４８Ｃ突然変異を含む非ＰＥＧ化Ｆｃ−ＦＧＦ２１変異体（Ｖ１０１、Ｖ１０３およびＶ１８８）について低かった（表１０）。ＰＥＧ部分の非存在またはＱ５５Ｃ、Ｇ１４８Ｃでのさらなるジスルフィド結合の非存在は、野生型ＦＧＦ２１およびＶ７６（非ＰＥＧ化）で見られるＭＡＰＰおよびＴ細胞アッセイ応答の増加に寄与し得る（表９および１０）。ＭＡＰＰおよびＴ細胞アッセイからの結果に基づいて、臨床的において免疫原性を発達させる危険性が、Ｖ７６（ＰＥＧ化）、Ｖ２７２（ＰＥＧ化）、Ｖ２７７（ＰＥＧ化）およびＱ５５Ｃ、Ｇ１４８Ｃ突然変異を含む非ＰＥＧ化Ｆｃ−ＦＧＦ２１変異体（Ｖ１０１、Ｖ１０３、Ｖ１８８）について低いと考えることができる。タンパク質へのジスルフィド結合の付加が、それらのタンパク質分解安定性を増強することができ、Ｑ５５Ｃ、Ｇ１４８Ｃ突然変異を含むＦｃ−ＦＧＦ２１変異体の該特徴が、ＭＡＰＰアッセイにおいて抗原負荷された成熟樹状細胞により提示されるペプチドの数の減少に寄与し得ることが知られている。
【０３０２】
加えて、非ＰＥＧ化Ｖ７６に対するアッセイにおけるＭＡＰＰ応答の増加は、分子の二量体化を引き起こし、それにより抗原処理および提示に影響を与えるフリーなシステインにより説明され得る。これは、導入されたフリーなシステインを有する野生型ＦＧＦ２１が、二量体化するのと同じ傾向を示し、ペプチドの提示の増加を生じるという観察に一致する。恐らく、さらなるＰＥＧ化デュアル機能性タンパク質、およびＱ５５Ｃ、Ｇ１４８Ｃ突然変異を含むＧＬＰ−１（Ａ８Ｓ）−Ｆｃ−ＦＧＦ２１変異体（Ｖ２０２、Ｖ２０３、Ｖ２１２、Ｖ２１３、Ｖ２１４、Ｖ２１５、Ｖ２１６、Ｖ２１８など）およびエキセンディン−４−Ｆｃ−ＦＧＦ２１変異体（Ｖ１９６、Ｖ１９７、Ｖ１９８、Ｖ１９９、Ｖ２０６、Ｖ２０７、Ｖ２０８、Ｖ２０９、Ｖ２１０、Ｖ２１１など）もまた、臨床的において免疫原性を発達させる低い危険性と一致するＭＡＰＰおよびＴ細胞アッセイ応答を示す。
【０３０３】
【表６８】
2014527986.tif 000069
【表６９】
2014527986.tif 000070
【図１】
2014527986.tif 000071
【図２】
2014527986.tif 000072
【図３】
2014527986.tif 000073
【図４】
2014527986.tif 000074
【図５−１】
2014527986.tif 000075
【図５−２】
2014527986.tif 000076
【図５−３】
2014527986.tif 000077
【図５−４】
2014527986.tif 000078
【図６−１】
2014527986.tif 000079
【図６−２】
2014527986.tif 000080
【図７】
2014527986.tif 000081
【図８−１】
2014527986.tif 000082
【図８−２】
2014527986.tif 000083
【図９】
2014527986.tif 000084
【図１０−１】
2014527986.tif 000085
【図１０−２】
2014527986.tif 000086
【配列表】
2014527986000001.app
【国際調査報告】
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