(57)【要約】本発明は、細胞培養物、精製方法および精製された組成物を包含する、キメラサイトカインタンパク質の調製と送達のための方法と組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むキメラサイトカインタンパク質調製物の精製方法であって、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、またはハイドロキシアパタイトカラムのうちの少なくとも２つを使用してタンパク質調製物を精製することを含む方法。
【請求項２】
陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、およびハイドロキシアパタイトカラムの３つ全てを使用してタンパク質調製物を精製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キメラサイトカインタンパク質調製物が、少なくとも１リットルの培地中で培養された大腸菌細胞（E. coli）から回収され、ここで、大腸菌細胞は、誘導性プロモーター下でキメラサイトカインタンパク質を発現する核酸配列を含むプラスミドを含有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭのＥＤＴＡの存在下で培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
細胞が少なくとも２．５ｍＭのＥＤＴＡの存在下で溶解される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ａ）キメラサイトカインタンパク質調製物を陽イオン交換カラム（ＣＥＸ）に供し、
（ｂ）陽イオン交換カラムを、キメラサイトカインタンパク質を溶出しない洗浄緩衝液で洗浄し、そして、キメラサイトカインタンパク質を含有するＣＥＸ溶出液を供給するために溶出緩衝液を使用して結合タンパク質を陽イオン交換カラムから溶出し、
（ｃ）ＣＥＸ溶出液を陰イオン交換表面に供し、
（ｄ）陰イオン交換カラムからの通過画分（ＡＥＸ通過画分）を収集し、そして、セラミックハイドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡ）に負荷し、
（ｆ）結合タンパク質をＣＨＡカラムから溶出し、
それにより、キメラサイトカインタンパク質調製物を精製する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
脱アラニンタンパク質アイソフォーム、メチオニル化タンパク質アイソフォームおよびアセチル化タンパク質アイソフォームに対する未変化のタンパク質の比率が精製後に上昇する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
精製調製物が、タンパク質の脱アラニン型を１０％未満、タンパク質のアセチル化型を１０％未満、およびタンパク質のメチオニル化型を１０％未満含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
精製調製物が５０百万分率未満の宿主細胞タンパク質を含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
精製タンパク質調製物が
未変化のタンパク質を７０％〜１００％、
脱アラニンタンパク質アイソフォームを０％〜１５％、
メチオニル化タンパク質アイソフォームを０％〜１０％、および
アセチル化タンパク質アイソフォームを０％〜１５％、
含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
精製タンパク質調製物が
未変化のタンパク質を８０％〜９９％、
脱アラニンタンパク質アイソフォームを２％〜７％、
メチオニル化タンパク質アイソフォームを０．１％〜４％、および
アセチル化タンパク質アイソフォームを０％〜５％、
含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むキメラサイトカインタンパク質の精製方法であって、
（ａ）未変化型および場合により脱アラニン型のキメラサイトカインタンパク質を含有する負荷調製物を陽イオン交換表面に供し、
（ｂ）陽イオン交換表面を、キメラサイトカインタンパク質を溶出しない洗浄緩衝液で洗浄し、そして、未変化型のキメラサイトカインタンパク質を含有するＣＥＸ溶出液を供給するために溶出緩衝液で陽イオン交換表面を溶出処理し、
（ｃ）ＣＥＸ溶出液を陰イオン交換表面に供し、
（ｄ）陰イオン交換表面からの通過画分（ＡＥＸ通過画分）を収集し、
（ｅ）ＡＥＸ通過画分をセラミックハイドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡ）に負荷し、
（ｆ）ＣＨＡカラムを溶出処理し、
（ｇ）精製キメラサイトカインタンパク質を含有する溶出液を収集し、
（ｈ）場合により溶出液を限外濾過ステップおよび／または透析濾過ステップに供し、そして、精製キメラサイトカインタンパク質を含有する残余分を収集する、
ことを含む方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法を用いて作製される、配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むキメラサイトカインタンパク質の精製調製物。
【請求項１４】
タンパク質の純度が９０％よりも高く、調製物が１０％未満の脱アラニン型、１０％未満のアセチル化型、および１０％未満のメチオニル化型を含む、請求項１３に記載の精製調製物。
【請求項１５】
調製物が５０百万分率未満の宿主細胞タンパク質を含有する、請求項１３または請求項１４に記載の精製調製物。
【請求項１６】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む未変化型のおよび場合により脱アラニン型、アセチル化型またはメチオニル化型のキメラサイトカインタンパク質を含有する負荷調製物を陽イオン交換表面に供し、
キメラサイトカインタンパク質を溶出しない洗浄緩衝液で陽イオン交換表面を洗浄し、および、未変化型のキメラサイトカインタンパク質を含有するＣＥＸ溶出液を供給するために溶出緩衝液で陽イオン交換表面を溶出処理する、ことを含む方法。
【請求項１７】
負荷調製物が５、４、３．５、３．３ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
負荷調製物が界面活性剤を含まない、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
負荷調製物が、以前にクロマトグラフィー処理をされていない溶菌液から調製される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
負荷調製物が遠心分離および／または濾過により清澄化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
負荷調製物が６．０、５．８、５．６、または５．４、または５．３未満のｐＨを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
負荷調製物が３０％、２５％または２０％未満の脱アラニン型のキメラサイトカインタンパク質を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
負荷調製物が３０％、２５％または２０％未満のアセチル化型のキメラサイトカインタンパク質を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
負荷調製物が３０％、２５％または２０％未満のメチオニル化型のキメラサイトカインタンパク質を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
溶菌液を６．０未満のｐＨに調節して負荷調製物を調製することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
陽イオン交換表面が強陽イオン交換（ＣＥＸ）表面である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
表面がカラムに充填することができるＣＥＸマトリックスを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＥＸマトリックスが架橋ポリ（スチレン‐ジビニルベンゼン）ビーズを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
表面がスルホプロピル官能基を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＥＸマトリックスがＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ、ＣＭＣ‐セルロース、ＳＰ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳＰ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＥＸマトリックスが２０ｍｌより大きい体積のカラム中に存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
カラムを１、５または１０カラム体積よりも多い量で洗浄する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
カラムを５、４、３．５または３．３ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する緩衝液で洗浄する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
洗浄緩衝液が４０、３０または２５ｍＭ未満のＮａＣｌを有し、洗浄緩衝液が少なくとも５、１０または１５ｍＭのＮａＣｌを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
陽イオン交換表面を２つの異なる緩衝液で洗浄する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
１つの洗浄緩衝液がｐＨ５．３を有し、他方の洗浄緩衝液がｐＨ６．２を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
溶出が段階的溶出を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
段階的溶出がより高いｐＨを有する溶出緩衝液を適用することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
段階的溶出が５．５未満のｐＨから５．９より高いｐＨのものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
段階的溶出が、塩濃度を増加させた、および／または電気伝導度を増加させた溶出緩衝液を適用することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
塩濃度を３０ｍＭのＮａＣｌよりも低い濃度から４０ｍＭのＮａＣｌよりも高い濃度に上昇させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
溶出緩衝液中の主要な塩がＮａＣｌである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
溶出緩衝液が４より高い電気伝導度を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
溶出緩衝液が少なくともｐＨ５．９〜６．１の範囲で緩衝能を有する緩衝液を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
未変化型のキメラサイトカインタンパク質および脱アラニン型が異なるキネティクスで溶出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
脱アラニン型が未変化型の後に溶出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
前記の方法が、負荷調製物に比べてＣＥＸ溶出液中の脱アラニン型のパーセンテージを少なくとも１、３、５、７または８％減少させることにより、脱アラニン型に対して未変化型を濃縮する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＥＸ溶出液中の脱アラニン型が、総キメラサイトカインタンパク質の２０、１５、１２または１０％未満である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４９】
アセチル化型およびメチオニル化型が未変化型の前に溶出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
前記の方法が、負荷調製物に比べてＣＥＸ溶出液中の前記のアセチル化型およびメチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１、３、５、７または８％減少させることにより、アセチル化型およびメチオニル化型に対して未変化型を濃縮する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５１】
ＣＥＸ溶出液中のアセチル化型およびメチオニル化型が、それぞれ総キメラサイトカインタンパク質の２０、１５、１２または１０％未満である、請求項２７に記載の方法。
【請求項５２】
キメラサイトカインタンパク質の純度が、ＣＥＸ溶出液中で少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０または９５％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項５３】
ＣＥＸ溶出液が負荷調製物よりも低いＨＣＰレベルを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５４】
ＣＥＸ溶出液を、キメラサイトカインタンパク質が陰イオン交換表面に実質的に結合しない条件下で陰イオン交換表面に供する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５５】
配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むキメラサイトカインタンパク質の調製物であって、請求項１６に記載の方法により得られたＣＥＸ溶出液を含む調製物。
【請求項５６】
配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むキメラサイトカインタンパク質を含有する調製物を陰イオン交換（ＡＥＸ）表面に供し、そして、
陰イオン交換表面からのＡＥＸ通過画分を収集する、
ことを含む方法。
【請求項５７】
ＡＥＸ通過画分が、陰イオン交換表面に供される調製物よりも少ない宿主細胞タンパク質を含有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
陰イオン交換表面が１００〜３００マイクロモルＣｌ−／ｍｌのイオン容量を有する、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
陰イオン交換表面が第四級アンモニウム型強陰イオン交換体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
陰イオン交換表面がＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱまたはＣａｐｔｏ（商標）Ｑ陰イオン交換樹脂を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
陰イオン交換表面が膜を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
ＡＥＸ通過画分中のエンドトキシンが、陰イオン交換表面に供された調製物に比べて減少する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質のバッチ調製物の作製方法であって、
ハイドロキシアパタイトカラムから精製されたタンパク質のバッチ調製物に由来する画分を供給するステップ、
脱アラニン型、アセチル化型、およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上の存在を決定するためにｗＣＥＸクロマトグラフィーにより画分を評価するステップ、および
前記の決定に基づき、バッチの分類、選択、受領、廃棄、公開、保留、医薬製品への処理、出荷、異なる場所への輸送、製剤、ラベル付け、包装、商品公開、販売および売り出しからなる群より選択される１つ以上のステップを含む方法により前記バッチタンパク質調製物をさらに処理するステップ、
を含む方法。
【請求項６４】
脱アラニン型、アセチル化型、およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上が１０％未満のレベルでバッチに存在すると判断される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
さらに処理するステップが、タンパク質調製物の作製のためバッチを受領することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
評価が、バッチが脱アラニン型、アセチル化型、およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上のレベルに基づき、所定の基準値に合致するかを決定することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
評価が、前記の決定を記憶することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
記憶が、コンピュータ読み取り可能記録での記憶を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
基準値が市販のタンパク質試料からまたは以前のバッチから決定された値である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
基準値が規制当局により課された製造基準であるまたはその製造基準を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
基準値が公開基準であるまたは公開基準を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記の決定に基づき、タンパク質調製物の作製におけるステップを変更することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
決定のステップが、タンパク質調製物の所望の特性と関連している存在または量を決定することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
特性がタンパク質製品の添付文書に記載される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
特性がタンパク質についての米国薬局方に出ている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
キメラサイトカインタンパク質を供給する方法であって、
配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含有する大腸菌細胞を培養してキメラサイトカインタンパク質を提供することを含む方法。
【請求項７７】
前記核酸配列がプラスミドに含まれる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸配列が誘導性プロモーターシステムの制御下にある、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞を少なくとも１リットル、１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌまたは５０００Ｌの培地中で培養する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
核酸配列が配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
細胞を、ＬＢ培地よりも富んだ栄養素量を有する培地で培養する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
細胞を、少なくとも０．５％もしくは１％もしくは１．２％のトリプトン、少なくとも１％、２％、２．２％もしくは２．４％の酵母エキス、および／または少なくとも０．１％、０．２％、もしくは０．４％のグリセロールを含有する培地で培養する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
核酸配列の転写がＩＰＴＧによって誘導可能である請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
細胞が５、１０、２０、３０、３５、または４０よりも高いＯＤのときに誘導される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８５】
タンパク質を含有する調製物を供給するために金属キレート剤の存在下で大腸菌細胞を溶解することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８６】
金属キレート剤がＥＤＴＡであり、２．５ｍＭより高い濃度で存在する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
溶菌緩衝液のｐＨが７．５未満である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
溶菌緩衝液が界面活性剤を含まない、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
溶菌緩衝液が２００ｍＭ未満のＮａＣｌを有する、またはそのような濃度のＮａＣｌを有する塩溶液よりも低い電気伝導度を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
３つまたは２つを超えないカラムクロマトグラフィーステップにより溶菌液からタンパク質を精製することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
キメラサイトカインタンパク質の純度が最初のカラムクロマトグラフィーステップの後で少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
キメラサイトカインタンパク質を含む組成物であって、該組成物は、請求項８５に記載の溶菌方法により得られ、ここで、該タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項９３】
配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むキメラサイトカインタンパク質精製調製物であって、キメラサイトカインタンパク質は、純度が９０％よりも高く、ここで、該調製物は、脱アラニン型を１０％未満、アセチル化型を１０％未満およびメチオニル化型を１０％未満含む、調製物。
【請求項９４】
ＨＣＰレベルが１０００ｐｐｍ未満である、請求項９３に記載の調製物。
【請求項９５】
核酸およびエンドトキシンが実質的に含まれない、請求項９３に記載の調製物。
【請求項９６】
凍結乾燥されている請求項９３に記載の調製物。
【請求項９７】
水性である請求項９３に記載の調製物。
【請求項９８】
タンパク質が１〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項９３に記載の調製物。
【請求項９９】
配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む調製物の評価方法であって、
（ａ）前記タンパク質の脱アラニン型のレベル、
（ｂ）前記タンパク質のアセチル化型のレベル、または
（ｃ）前記タンパク質のメチオニル化型のレベル、
のうちの１つ以上または全ての決定値を得て、
それにより調製物を評価する、
ことを含む方法。
【請求項１００】
前記の方法が、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの１つ以上または全ての決定されたレベルを基準値と比較することをさらに含み、ここで、それぞれがそれ自体の基準値を有することができる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
基準値が、前記タンパク質の市販の試料、前記タンパク質の別のバッチ、規制当局により推奨されている、公表されている、または要求されている値のセット、公開仕様または公開基準、薬局方機関により推奨されている、公表されている、または要求されている値のセットから決定する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記の決定がクロマトグラフィーによる分析を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記の調製物が基準値に対して事前に選択した関係を有するかを決定することをさらに含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記の決定に応答して、調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装、または販売のうちの１つ以上を含むプロセスを調製物に行う、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記の決定に応答して、タンパク質を作製するためのプロセスのパラメータを変更する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の型のうちの１つ以上のレベルが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０％（重量／重量）未満である場合、調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装、または販売のうちの１つ以上を含むプロセスを調製物に行う、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０７】
前記調製物が、前駆調製物を精製ステップに供することにより作製された、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０８】
前記調製物が、クロマトグラフィー基材のうちの１つ以上または全てに前駆調製物を接触させて作製された、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０９】
前記調製物が、陽イオン交換基材、陰イオン交換基材、およびハイドロキシアパタイト基材の順序でこれらと前駆調製物を接触させて作製された、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１０】
前記調製物が精製工程における中間産物である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記調製物が精製工程からの溶出液を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記調製物が陽イオン交換カラムからの溶出液を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記調製物が陰イオン交換カラムからの溶出液を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１４】
前駆調製物を精製ステップに供することをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１５】
前駆調製物をクロマトグラフィー基材に接触させることをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１６】
前駆調製物をクロマトグラフィー基材のうちの１つ以上または全てと接触させることをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１７】
前駆調製物を、陽イオン交換基材基材、陰イオン交換基材、およびハイドロキシアパタイト基材の順序で接触させることをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１８】
プロセスが、眼への投与のための調製物を製剤化することを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１９】
評価を記憶することをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１２０】
記憶がコンピュータ読み取り可能記録での記憶を含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
タンパク質調製物の評価方法であって、
ハイドロキシアパタイトカラムから精製された、配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質の調製物から単離画分を供給し、
脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上のレベルを決定するために、弱陽イオン交換（ｗＣＥＸ）クロマトグラフィーを用いて画分を分析する、ことを含み、
ここで、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上が１０％未満のレベルで存在する場合、調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装、または販売のうちの１つ以上を含むプロセスを調製物に行い、
それにより、タンパク質調製物を分析する、ことを含む方法。
【請求項１２２】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質の調製物を作製するプロセスを分析する方法であって、
タンパク質の調製物の単離画分を供給し、
請求項９７に記載の方法を用いて画分を分析し、そして
脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上が１０％未満のレベルで存在する場合、分析に基づき少なくとも部分的にプロセスを維持する、ことを含む方法。
【請求項１２３】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質の調製物の処理方法であって、
調製物中の脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上のレベルについてのｗＣＥＸ決定値を提供し、そして
脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のタンパク質のうちの１つ以上が１０％未満のレベルで存在する場合、調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装、または販売のうちの１つ以上を含むプロセスを調製物に行う、ことを含む方法。
【請求項１２４】
プロセスが眼への投与のための調製物の製剤化を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
タンパク質の活性を決定することをさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質、塩、等張化剤、および界面活性剤を含む組成物。
【請求項１２７】
塩が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化ナトリウム、またはトリス酢酸である、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
界面活性剤が、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはポリエトキシレートである、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２９】
等張化剤が、ソルビトール、マンニトール、ショ糖、トレハロース、またはグリセロールである、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１３０】
ｐＨ５．５、ｐＨ５．６、ｐＨ５．８、ｐＨ５．９、ｐＨ６、ｐＨ６．１、ｐＨ６．３、ｐＨ６．５またはｐＨ６．６である請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１３１】
配列番号２１のアミノ酸配列を含む１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、５％ソルビトール、０．１％ポロキサマー１８８を含み、ｐＨ６を有する、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１３２】
眼への投与に適切な請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１３３】
配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む調製物であって、
（ａ）前記タンパク質の脱アラニン型を０％と１５％の間
（ｂ）前記タンパク質のアセチル化型を０％と１５％の間、および
（ｃ）前記タンパク質のメチオニル化型を０％と１５％の間、
含む調製物。
【請求項１３４】
前記調製物中のタンパク質の少なくとも８０、９０、９５、９９％が、前記タンパク質ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の型である、請求項１３３に記載の調製物。
【請求項１３５】
少なくとも６グラム、６０グラム、６００グラム、６０００グラム、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇまたは１５０ｋｇの前記タンパク質を含む、請求項１３３に記載の調製物。
【請求項１３６】
ポリペプチドを含む調製物であって、
ポリペプチドを７０％〜１００％、
脱アラニンポリペプチドを０％〜１５％、
メチオニル化ポリペプチドを０％〜１０％、および
アセチル化ポリペプチドを０％〜１５％含み、ここで、ポリペプチドが配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、調製物。
【請求項１３７】
調製物が、
ポリペプチドを８０％〜９９％、
脱アラニンポリペプチドを２％〜７％、
メチオニル化ポリペプチドを０．１％〜４％、および
アセチル化ポリペプチドを０％〜５％、
含む、請求項１３６に記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年７月２９日に提出された米国特許仮出願番号第６１／５１３，４５３号、および２０１２年１月２７日に提出された米国特許仮出願番号第６１／５９１，７２７号の優先権を主張する。これらの特許仮出願の内容全体が本願における参照によりここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン‐１α（ＩＬ‐１α）およびβ（ＩＬ‐１β）は免疫調節性サイトカインファミリーの原型メンバーであり、免疫系の調節において大きな役割をいくつか有している。ＩＬ‐１αとＩＬ‐１βはインターロイキン‐１受容体Ｉ（ＩＬ‐１ＲＩ）に結合して補助的受容体であるインターロイキン‐１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ‐１ＲＡｃＰ）の会合を引き起こす。ＩＬ‐１αとＩＬ‐１βによって刺激されたシグナル伝達が、ナイーブＴ細胞の増殖と生存およびＴＨ１７細胞の発生を含むＴ細胞応答を属服することになる。
【発明の概要】
【０００３】
とりわけインターロイキン‐１受容体Ｉ（ＩＬ‐１ＲＩ）に対して応答性の細胞シグナル伝達を調節するために、障害を治療するために、および、細胞性受容体を検出したり、細胞性受容体に結合したりするために使用され得る非天然サイトカインドメインならびに他の薬剤が本明細書に取り上げられる。
【０００４】
インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）キメラインヒビターの精製調製物およびそのようなタンパク質の精製方法も本明細書に取り上げられる。そのキメラインヒビターは、少なくとも２つの異なるインターロイキンの表面形体、例えば、ＩＬ‐１ＲＩと相互作用する表面形体を含み得る。その表面形体は、ＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａ、ＩＬ‐１αとＩＬ‐１ＲＡ、または３種のそのようなサイトカインの全てに由来し得る。ＩＬ‐１キメラインヒビターの合成は未知の作用を有する生成物関連種を生成し得る。本明細書に取り上げられる発明は、そのような生成物関連種の量が大いに減少したタンパク質調製物の作製方法を提供する。驚くことに、本処理に使用された陽イオンカラムと陰イオンカラムの両方がかなりの量の生成物関連種の除去に有効であった。
【０００５】
１つの態様では、本開示は、キメラサイトカインタンパク質の提供方法を特色とする。その方法は、誘導性プロモーターシステムの制御下にキメラサイトカインタンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドを含有する大腸菌（E. coli）細胞を、例えば、少なくとも１リットルの培地に培養することを含む。培養体積は、例えば、１Ｌ〜１５，０００Ｌ、例えば、５Ｌ〜１０，０００Ｌであり得る。例えば、培養体積は、２Ｌ、１０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、８００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、８０００Ｌ、１０，０００Ｌまたは１２，０００Ｌよりも多くあり得る。例えば、前記キメラサイトカインタンパク質には、実施例１のアミノ酸配列、例えば、Ｐ０３、Ｐ０４、またはＰ０５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる。例えば、そのタンパク質はＰ０５である。核酸配列には、実施例１に記載される核酸配列、例えば、Ｐ０５をコードする配列が含まれ得る。
【０００６】
細胞は、ＬＢ培地よりも富んだ栄養素量を有する培地で培養され得る。例えば、細胞は、少なくとも０．５％もしくは１％もしくは１．２％のトリプトン、少なくとも１％、２％、２．２％もしくは２．４％の酵母エキス、少なくとも０．５ｍＭのＥＤＴＡ（例えば、０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭのＥＤＴＡ）、および／または少なくとも０．１％、０．２％、もしくは０．４％のグリセロールを含有する培地で培養される。その培地に微量元素を補充することができる。細胞に、培養中にグルコースを例えば少なくとも３、５、６、７、８、または９ｇ／Ｌ／時間の割合で与えることができる。細胞に、例えば、培地のｐＨ、ＯＤ、および／または細胞培養条件に従って１つよりも多くの割合、例えば、少なくとも２つの異なる割合で栄養を与えることができる。
【０００７】
例えば、細胞に、培養中に例えば５〜６０％の間、３０〜６０％の間、４０〜６０％の間、または２０〜４０％の間の溶存酸素の割合で酸素を補給することができる。培地はｐＨ６〜７．５またはｐＨ６．７〜７．２またはｐＨ６．９〜７．１で維持され得る。
【０００８】
例えば、細胞は、ＯＤが５、１０、２０、３０、３５、または４０よりも高い時点で、例えば、ＩＰＴＧの添加により誘導処理を受ける。例えば、誘導性プロモーターシステムは、Ｔ７プロモーターおよび１つ以上のｌａｃオペレーターの制御下にあるＴ７ポリメラーゼをコードする遺伝子を含む。コード核酸配列は、Ｔ７プロモーターに機能するように結合され得る。
【０００９】
前記の方法は、キメラサイトカインタンパク質を含有する溶菌液を供給するために、例えば、金属キレート剤の存在下で大腸菌細胞を溶解することをさらに含み得る。その金属キレート剤は、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡであり得る。例えば、金属キレート剤はＥＤＴＡであり、２．５ｍＭより高い濃度、例えば、２．６ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭまたは８ｍＭよりも高い濃度、例えば、４〜１１ｍＭの間の濃度で存在する。細胞は、前記の金属キレート剤を含有する溶菌緩衝液を使用して溶解され得る。
【００１０】
溶菌緩衝液は８．０未満、７．９未満、７．５未満、７．１未満、７．０未満、６．９未満のｐＨ、例えば、５．０と７．０の間、または５．９と７．５の間、または５．９と７．１の間のｐＨを有し得る。溶菌緩衝液は０．１％のトリトンＸ‐１００よりも低い界面活性剤濃度／ミセル濃度を有し得る。例えば、溶菌緩衝液は界面活性剤を含まない。溶菌緩衝液は、５００ｍＭ未満、４００ｍＭ未満、３００ｍＭ未満、２００ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、もしくは１０ｍＭ未満のＮａＣｌ、またはそのような濃度のＮａＣｌを有する塩溶液よりも低い電気伝導度を有し得る。
【００１１】
前記の方法は、例えば、３つまたは２つを超えないカラムクロマトグラフィーステップにより溶菌液からキメラサイトカインタンパク質を精製することをさらに含み得る。したがって、本明細書に記載されるとおりに使用するために、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー用に負荷調製物を調製するために溶菌液を使用することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記の方法は次のクロマトグラフィーステップ、すなわち、（ｉ）陽イオン交換ステップ、（ｉｉ）陰イオン交換ステップ、および（ｉｉｉ）ハイドロキシアパタイトカラムステップのうちの少なくとも１つ、２つ、または３つを含み得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質は１つ以下のカラムクロマトグラフィーステップを用いて精製される。例えば、キメラサイトカインタンパク質の純度は最初のカラムクロマトグラフィーステップの後で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラム用の負荷物調製は、例えば、０．８／０．４５μｍ濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２）、および／または０．４５／０．２μｍ濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２）を使用する１つ以上の濾過ステップを含む。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、陽イオン交換カラム、および陰イオン交換カラム、およびハイドロキシアパタイトカラムを使用してキメラサイトカインタンパク質調製物を精製する方法を特色とする。キメラサイトカインタンパク質調製物を、少なくとも５００ｍＬ、１リットル、２リットルまたは５リットルまたはそれより多い培地で培養された細菌細胞、例えば、誘導性プロモーター下でキメラサイトカインタンパク質を発現する核酸配列を有するプラスミドを含有する大腸菌細胞、などの細胞から回収することができた。
【００１６】
１つの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質調製物を陽イオン交換カラム（ＣＥＸ）に供し、その陽イオン交換カラムを、キメラサイトカインタンパク質を溶出しない洗浄緩衝液で洗浄し、そして、キメラサイトカインタンパク質を含有するＣＥＸ溶出液を供給するために溶出緩衝液を使用して結合タンパク質を前記陽イオン交換カラムから溶出する。そのＣＥＸ溶出液を次に、例えば、キメラサイトカインタンパク質が陰イオン交換表面に実質的に結合しない条件下でその陰イオン交換表面に供し、そして、その陰イオン交換カラムからの通過画分（ＡＥＸ通過画分）を収集し、そして、セラミックハイドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡ）に負荷する。緩衝条件は、キメラサイトカインタンパク質がＣＨＡカラムに結合するような条件である。次に精製タンパク質をそのカラムから溶出する。未変化のタンパク質の混入タンパク質アイソフォーム、例えば脱アラニンタンパク質アイソフォーム、メチオニル化タンパク質アイソフォームおよびアセチル化タンパク質アイソフォームに対する割合が精製後に上昇する。例えば、１つの実施形態では、精製調製物は１０％未満の脱アラニン型の前記タンパク質、１０％未満のアセチル化型の前記タンパク質、および１０％未満のメチオニル化型の前記タンパク質を含む。別の実施形態では、精製調製物が５０百万分率未満の宿主細胞タンパク質を含有する。
【００１７】
精製タンパク質調製物は、例えば、７０％〜１００％、例えば、８０％〜９９％の未変化のタンパク質、０％〜１５％、例えば、２％〜７％の脱アラニンタンパク質アイソフォーム、０％〜１０％、例えば、０．１％〜４％のメチオニル化タンパク質アイソフォーム、および０％〜１５％、例えば、０％〜５％のアセチル化タンパク質アイソフォームを含有し得る。
【００１８】
別の態様では、本開示は、未変化のキメラサイトカインタンパク質および随意で無アラニン型（例えば、脱アラニン型）、メチオニル化型およびアセチル化型のキメラサイトカインタンパク質のうちの１つ以上を含有する負荷調製物を陽イオン交換表面に供すること、キメラサイトカインタンパク質を溶出しない洗浄緩衝液で前記陽イオン交換表面を洗浄すること、および、未変化型のキメラサイトカインタンパク質を含有するＣＥＸ溶出液を供給するために前記陽イオン交換表面に溶出緩衝液を流すことを含む方法を特色とする。例えば、未変化型のキメラサイトカインタンパク質には、実施例１のアミノ酸配列、例えば、Ｐ０３、Ｐ０４、またはＰ０５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる。例えば、そのタンパク質はＰ０５である。核酸配列には、実施例１に記載される核酸配列、例えば、Ｐ０５をコードする配列が含まれ得る。未変化のタンパク質、例えば、Ｐ０５タンパク質の脱アラニン型、メチオニル化型およびアセチル化型はタンパク質調製物、例えば、Ｐ０５タンパク質調製物中の、本発明において取り上げられる精製方法により除去される不純物である。未変化のタンパク質の脱アラニン型は、Ｎ末端アラニンがタンパク質分解により除去された未変化型の前記タンパク質であり、未変化のタンパク質のメチオニル化型は、Ｎ末端にメチオニンが結合した前記の未変化のタンパク質であり、キメラサイトカインタンパク質のアセチル化型は、アセチル化された未変化のタンパク質、またはアセチル化された未変化のタンパク質のメチオニル化型である。
【００１９】
例えば、負荷調製物は５ｍＳ／ｃｍ未満、４ｍＳ／ｃｍ未満、３．５ｍＳ／ｃｍ未満、または３．３ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有し得る。負荷調製物は界面活性剤を含まなくてもよい。負荷調製物は６．０未満、５．８未満、５．６未満、または５．４未満のｐＨ、例えば、約５．３のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、負荷調製物は以前にクロマトグラフィーにかけられていない溶菌液から調製される。前記の方法は、負荷調製物を調製するために、例えば、中程度の酸、例えば酢酸を使用して、例えば、８００ｍＭ未満、６００ｍＭ未満、４００ｍＭ未満、３００ｍＭ未満、または好ましくは約２００ｍＭ未満の酢酸の溶液を添加することにより、例えば６．０未満のｐＨに溶菌液を調節することを含み得る。負荷調製物は、例えば、遠心分離および／または濾過により清澄化され得る。負荷調製物は、５ｇ／Ｌ未満、４ｇ／Ｌ未満、３ｇ／Ｌ未満、または２ｇ／Ｌ未満のタンパク質濃度を有し得る。いくつかの実施形態では、負荷調製物は、総キメラサイトカインタンパク質のパーセンテージとして、３０％未満、２５％未満または２０％未満の脱アラニン型、３０％未満、２５％未満または２０％未満のアセチル化型、および３０％未満、２５％未満または２０％未満のメチオニル化型のキメラサイトカインタンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、負荷調製物は、総キメラサイトカインタンパク質のパーセンテージとして、５％〜２０％または７％〜１７％の脱アラニン型、１％〜１０％または２％〜７％のメチオニル化型、および５％〜２０％または８％〜１５％を含有する。陽イオン交換表面は、例えば強陽イオン交換（ＣＥＸ）表面であり得る。いくつかの実施形態では、前記表面はスルホプロピル官能基を含む。前記表面は、カラムに充填され得るマトリックス（ＣＥＸマトリックス）であり得る。例えば、ＣＥＸマトリックスには架橋ポリ（スチレン‐ジビニルベンゼン）ビーズが含まれる。例となるＣＥＸマトリックスにはＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ、ＣＭ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭＣ-セルロース、ＳＰ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳＰ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗが含まれる。
【００２０】
キメラサイトカインタンパク質は、例えば、１ｍｌのＣＥＸマトリックス当たり４０ｍｇ未満の濃度で負荷され得る。例えば、マトリックスは、５０〜２００マイクロモルＮａ＋／ｍｌの間、８０〜１４０マイクロモルＮａ＋／ｍｌの間、または８８〜１２０マイクロモルＮａ＋／ｍｌの間のイオン容量を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸマトリックスは、０．５〜２０ｍｌの間のカラム、または１０ｍＬと１０００Ｌの間のカラム、例えば、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、６Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２５０Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌまたは８００Ｌよりも大きいカラムの中に存在する。例えば、カラムは１カラム体積、５カラム体積または１０カラム体積よりも大きい体積で洗浄される。カラムは、５ｍＳ／ｃｍ未満、４ｍＳ／ｃｍ未満、３．５ｍＳ／ｃｍ未満、３．３ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する緩衝液を使用して洗浄され得る。例えば、洗浄緩衝液は４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、または２５ｍＭ未満のＮａＣｌを有し、および／または洗浄緩衝液は少なくとも５ｍＭ、１０ｍＭ、もしくは１５ｍＭのＮａＣｌまたは同等の濃度の他の塩を有する。洗浄緩衝液は酢酸を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は６．５未満、６．０未満、５．９未満、５．６未満、または５．５未満のｐＨ、例えば、５〜５．５のｐＨ、例えば、約５．３のｐＨ、または５〜５．５のｐＨ、例えば、約５．９のｐＨを有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、溶出は濃度勾配を含まない。例えば、溶出は段階的溶出を含む。その段階的溶出は、結合緩衝液とそれぞれ前の段階の溶出緩衝液よりも高いｐＨを有する溶出緩衝液を供することを含み得る。段階的溶出は、例えば、５．７未満のｐＨから５．７より高いｐＨへ、例えば、５．６未満のｐＨから５．８５より高いｐＨへ、例えば、５．５未満のｐＨから５．９より高いｐＨへ、例えば、約５．３のｐＨから少なくとも６．０のｐＨへ、または約５．３のｐＨから少なくとも６．８のｐＨへの段階的溶出である。段階的溶出は、塩濃度を増加させた、および／または電気伝導度を増加させた溶出緩衝液を供する適用ことを含み得る。例えば、塩濃度は、３０ｍＭ以下のＮａＣｌの濃度から４０ｍＭ以上のＮａＣｌの濃度に、または他の塩の同等の濃度に上昇する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中の主要な塩はＮａＣｌである。
【００２３】
溶出緩衝液は３．５ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍよりも高い電気伝導度、例えば、５．５〜７ｍＳ／ｃｍの間の、例えば、６〜７ｍＳ／ｃｍの間の、例えば、約６．６ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有し得る。溶出緩衝液には、少なくともｐＨ５．９〜６．１の範囲で緩衝能を有する緩衝液が含まれ得る。例えば、溶出緩衝液はＭＯＰＳ、例えば、少なくとも５０ｍＭのＭＯＰＳ、例えば、１００〜２５０ｍＭの間のＭＯＰＳを含む。溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＭのＭＯＰＳを最大で約８．０までのｐＨで含むこともできる。
【００２４】
未変化型のキメラサイトカインタンパク質および脱アラニン型、アセチル化型、およびメチオニル化型はそれぞれと異なる様に、例えば、異なるキネティクスおよび／または異なる塩濃度もしくはｐＨで陽イオン交換表面から溶出し得る。例えば段階的溶出または濃度勾配溶出の間に、例えば、脱アラニン型は未変化型の後に溶出し、アセチル化型はメチオニル化型と未変化型の前に溶出し、そして、メチオニル化型は未変化型の前に溶出する。
【００２５】
前記の方法は、例えば、１つ以上の脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％または８％減少させることにより、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のうちの１つ以上に比べて未変化型を濃縮するために用いられ得る。例えば、溶出液中の脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のうちの１つ以上が総キメラサイトカインタンパク質の２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満または８％未満である。
【００２６】
前記の方法は、脱アラニン型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも１０％、２０％、４０％６０％もしくは７０％以上減少させることにより、脱アラニン型に比べて未変化型を濃縮するために用いられ得る。例えば、溶出液中の脱アラニン型は、総キメラサイトカインタンパク質の２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、または８％未満である。例えば、溶出液中の脱アラニン型は総キメラサイトカインタンパク質の２％〜２０％、３％〜１０％、または４％〜７％である。
【００２７】
前記の方法は、アセチル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９９％減少させることにより、アセチル化型に比べて未変化型を濃縮するために用いられ得る。例えば、溶出液中のアセチル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満、または０．５％未満である。例えば、溶出液中のアセチル化型は総キメラサイトカインタンパク質の０．０１％〜５％、１％〜３％、または２％〜２．５％である。
【００２８】
前記の方法はまた、メチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも１０％、２０％、４０％、７０％もしくは８０％減少させることにより、メチオニル化型に比べて未変化型を濃縮するためにも用いられる得る。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１０％未満、８％未満、５％未満、３％未満、または２％未満である。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１％〜１０％、２％〜８％、または３％〜５％である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質の回収率は２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％よりも高く、例えば、６０％と８０％の間である。いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質の純度はＣＥＸ溶出液中で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。例えば、いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質の純度はＣＥＸ溶出液中で少なくとも７０％〜９９％、８０％〜９８％、９０％〜９５％である。概して、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度は負荷調製物に比べて減少する。宿主細胞タンパク質は、受容体結合因子と異なる調製物中のタンパク質を指し、例えば、調製した受容体結合因子が由来する宿主細胞の内在性タンパク質、典型的には大腸菌タンパク質である。
【００３０】
例えば、ＣＥＸ溶出液は１０００ｐｐｍ未満、８００ｐｐｍ未満、６００ｐｐｍ未満、または５００ｐｐｍ未満のＨＣＰを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＰ濃度は少なくとも７０％、８０％、９０％または９９％減少する。例えば、ＨＣＰ濃度は８０％〜９９．９９％、または９０％〜９９．５％減少する。
【００３１】
１つの態様では、本発明は、例えば、未変化のキメラサイトカインタンパク質、ならびに随意で脱アラニン型、メチオニル化型およびアセチル化型の前記タンパク質を含むＣＥＸ溶出液を特色とする。その溶出液は未変化のタンパク質を８０％〜９９％（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％以上の未変化のタンパク質）、３％〜２０％の脱アラニン種（例えば、脱アラニン種を５％、１０％、１５％または２０％）、０．１％〜１５％のメチオニル化種（メチオニル化種を０．２％、０．５％、１％、５％または１０％）、および０％〜５％のアセチル化種（アセチル化種を０．００１％、０．０１％、０．１％、１％または３％）含み得る。
【００３２】
いくつかの態様では、ＣＥＸ溶出液を、例えば、キメラサイトカインタンパク質が前記陰イオン交換表面に実質的に結合しない条件下で陰イオン交換表面に供する。他の実施形態では、ＣＥＸ溶出液を、陰イオン交換クロマトグラフィーでの吸着と溶出を用いて処理する。
【００３３】
前記の方法は、例えば、総じて３つ以下または２つ以下の追加のカラムクロマトグラフィーステップを含む精製工程において用いられ得る。いくつかの実施形態では、単一のカラムクロマトグラフィーステップが用いられる。例えば、クロマトグラフィーステップの際に濃度勾配溶出を行わない。
【００３４】
別の方法は、キメラサイトカインタンパク質を含有する調製物を陰イオン交換表面に供すること、および、その陰イオン交換表面からの通過画分（ＡＥＸ通過画分）を収集することを含む。前記の方法は、例えば、上で、および本明細書において記載されるように、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーと併用され得る。例えば、ＡＥＸ通過画分は陰イオン交換表面に供された調製物よりも少ないＨＣＰ、例えば、少なくとも２倍、１０倍、または５０倍少ないＨＣＰを含有する。エンドトキシンと核酸、例えばＤＮＡは陰イオン交換表面に供された調製物に比べて減少し得る。いくつかの実施形態では、供される調製物は５０００ｐｐｍよりも少ないＨＣＰを含有し、ＡＥＸ通過画分は１０００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、または３００ｐｐｍよりも少ないＨＣＰを含有する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ通過画分中のＨＣＰはさらに５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ通過画分中のＨＣＰは５０％〜９０％、６０％〜８０％、または６５％〜７５％減少する。
【００３５】
例えば、陰イオン交換表面は第四級アンモニウム型強陰イオン交換体である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換表面にはＣａｐｔｏ（商標）Ｑ陰イオン交換樹脂が含まれる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換表面にはＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ陰イオン交換樹脂が含まれる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換表面は５０〜４００マイクロモルＣｌ−／ｍｌまたは１００〜３００マイクロモルＣｌ−／ｍｌのイオン容量を有する。陰イオン交換カラムの体積は４０ｍＬから２０Ｌまでの範囲にあり得る。例えば、陰イオン交換カラムは約５０ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、８０Ｌ、１００Ｌ、１２０Ｌ、１５０Ｌ、３００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌまたは７００Ｌの体積を有し得る。
【００３６】
陰イオン交換表面は膜であり得る。
【００３７】
１つの態様では、本発明は、未変化のキメラサイトカインタンパク質、ならびに随意で脱アラニン型、メチオニル化型およびアセチル化型の前記タンパク質を含むＡＥＸ通過画分を特色とする。その通過画分は、例えば、未変化のタンパク質を８０％〜９９％（例えば、未変化のタンパク質の８０％、８５％、９０％または９５％以上）、３％〜２０％の脱アラニン種（例えば、脱アラニン種を５％、１０％、１５％または２０％）、０．１％〜１５％のメチオニル化種（メチオニル化種を０．２％、０．５％、１％、５％または１０％）、および０％〜５％のアセチル化種（アセチル化種を０．００１％、０．０１％、０．１％、１％または３％）含み得る。
【００３８】
別の方法は、キメラサイトカインタンパク質を含有する調製物を、例えば、キメラサイトカインタンパク質がＣＨＡカラムに結合する条件下でセラミックハイドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡ）に供すること、および、例えば、キメラサイトカインタンパク質ＣＨＡカラムから遊離する条件下でＣＨＡカラムを溶出処理すること、および、精製キメラサイトカインタンパク質を含有する溶出液を収集することを含む。例えば、ＣＨＡカラムの溶出液から収集された精製キメラサイトカインタンパク質は、より少ない宿主細胞タンパク質、および／または減少した量の脱アラニン、アセチル化およびメチオニル化型などの型のキメラサイトカインタンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＨＡカラムの溶出液から収集される調製物は５００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、１００ｐｐｍよりも少ない、または５０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＨＡカラムの溶出液中のＨＣＰはさらに５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９６％または９８％減少する。いくつかの実施形態では、ＣＨＡカラムの溶出液中のＨＣＰは５０％〜９９％、６０％〜９８％、または８０％〜９５％減少する。
【００３９】
未変化型のキメラサイトカインタンパク質および脱アラニン型、アセチル化型、およびメチオニル化型は他と異なる様に、例えば、異なるキネティクスおよび／または異なる塩濃度もしくはｐＨでＣＨＡ交換表面から溶出し得る。例えば段階的溶出または濃度勾配溶出の間に、例えば、脱アラニン型は未変化型の前に溶出し、そして、メチオニル化型は脱アラニン型の前に溶出する。
【００４０】
前記の方法は、例えば、１つ以上の脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％または８％減少させることにより、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のうちの１つ以上に比べて未変化型を濃縮するために用いられ得る。例えば、溶出液中の脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型のうちの１つ以上は総キメラサイトカインタンパク質の２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満または８％未満である。
【００４１】
前記の方法は、脱アラニン型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも１０％、２０％、４０％６０％もしくは７０％以上減少させることにより、脱アラニン型に比べて未変化型を濃縮するために用いられ得る。例えば、溶出液中の脱アラニン型は総キメラサイトカインタンパク質の１％〜１０％、２％〜８％、または３％〜６％である。溶出液中の脱アラニン型は総キメラサイトカインタンパク質の２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、または８％未満であり得る。
【００４２】
前記の方法は、アセチル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９９％減少させることにより、アセチル化型に比べて未変化型を濃縮するために用いられ得る。例えば、ＣＨＡ溶出液のアセチル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満、または０．５％未満である。例えば、溶出液中のアセチル化型は総キメラサイトカインタンパク質の０．０１％〜５％、１％〜３％、または２％〜２．５％である。
【００４３】
前記の方法また、メチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも１０％、２０％、４０％、７０％、８０％もしくは９０％減少させることにより、メチオニル化型に比べて未変化型を濃縮するためにも用いられる得る。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満または０．０５％未満である。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の０．０５％〜１０％、１％〜８％、または３％〜５％である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質の回収率は５０％、６０％、８０％または９０％よりも高く、例えば、８０％と９９％の間である。いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質の純度はＣＨＡ溶出液中で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。例えば、いくつかの実施形態では、キメラサイトカインタンパク質の純度はＣＨＡ溶出液中で少なくとも７０％〜９９％、８０％〜９８％、９０％〜９５％である。概して、ＨＣＰ濃度は負荷調製物に比べて減少する。
【００４５】
例えば、ＣＨＡ溶出液は１０００ｐｐｍ未満、８００ｐｐｍ未満、６００ｐｐｍ未満、または５００ｐｐｍ未満のＨＣＰを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＰ濃度は少なくとも７０％、８０％、９０％または９９％減少する。例えば、ＨＣＰ濃度は８０％〜９９．９９％、または９０％〜９９．５％減少する。
【００４６】
ＣＨＡカラムの体積は例えば１５０ｍＬから５００Ｌまでの範囲にあり得る。例えば、陰イオン交換カラムは約２００ｍＬ、２２０ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、３０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌまたは８００Ｌの体積を有し得る。
【００４７】
１つの態様では、本発明は、例えば、未変化のキメラサイトカインタンパク質、ならびに随意で脱アラニン型、メチオニル化型およびアセチル化型の前記タンパク質を含むＣＨＡ溶出液を特色とする。その溶出液は、例えば、未変化のタンパク質を８０％〜９９％（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％以上の未変化のタンパク質を）、脱アラニン種を０．１％〜１５％（例えば、２％、５％、または１０％の脱アラニン種を）、メチオニル化種を０．１％〜１０％（０．０１％、０．５％、１％、または５％のメチオニル化種を）、およびアセチル化種を０％〜５％（０．００１％、０．０１％、０．１％、１％または３％のアセチル化種を）含み得る。
【００４８】
本明細書に記載される精製工程は、脱アラニン型、アセチル化型および／またはメチオニル化型を検出する物質の評価をさらに含み得る。例えば、その評価は弱陽イオン交換分析クロマトグラフィーを含む。
【００４９】
前記の精製工程は追加のクロマトグラフィーステップ、セラミックハイドロキシアパタイトステップおよび／または限外濾過／透析濾過の実施をさらに含み得る。
【００５０】
キメラサイトカインタンパク質の総回収率は出発タンパク質調製物の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％であり得る。キメラサイトカインタンパク質の回収率は総出発タンパク質の３０％〜９０％、４０％〜８０％、または５０％〜７０％であり得る。
【００５１】
別の態様では、本開示は、キメラサイトカインタンパク質を含有する精製調製物を特色とする。例えば、キメラサイトカインタンパク質は実施例１に記載されるタンパク質、例えば、Ｐ０３、Ｐ０４、またはＰ０５、またはそのようなタンパク質に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質である。例えば、そのタンパク質はＰ０５である。未変化型の脱アラニン型に対する比率は少なくとも１：１、２：１、３：１、５：１、８：１または１０：１であり、未変化型のアセチル化型に対する比率は少なくとも１：１、２：１、３：１、５：１、８：１または１０：１であり、そして、未変化型のメチオニル化型に対する比率は少なくとも１：１、２：１、３：１、５：１、８：１または１０：１である。
【００５２】
キメラサイトカインタンパク質の純度は９０％、９２％、９４％または９５％よりも高いことがあり得る。例えば、精製調製物は総タンパク質のパーセンテージとして少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の未変化型を含有する。例えば、脱アラニン型は調製物中のタンパク質の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満もしくは１０％未満、および／または総キメラサイトカインタンパク質の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満もしくは１０％未満である。未変化型、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型の相対量は弱陽イオン交換分析クロマトグラフィーなどの分析方法により決定され得る。前記調製物はキメラサイトカインタンパク質の他のアイソフォーム（すなわち、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型以外）の１０％未満の量を含み得る。
【００５３】
精製調製物中のキメラサイトカインタンパク質の濃度は少なくとも０．００１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍｌであり得る。例えば、前記タンパク質の濃度は１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの間、１〜５０ｍｇ／ｍｌの間、１０〜５０ｍｇ／ｍｌの間、または２５〜７５ｍｇ／ｍｌの間、または４０〜１０５ｍｇ／ｍｌの間である。
【００５４】
前記調製物は水性調製物であり得、そして、緩衝剤および薬理学的に許容可能な塩をさらに含み得る。前記調製物は（例えば、注射用水を含む）無菌水性調製物であり得る。調製物は、その体積が様々であり得、そして、少なくとも１ｍｇ、１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、または１ｋｇの未変化のタンパク質を含み得る。
【００５５】
前記調製物は凍結乾燥され得る。前記調製物は、例えば水性である場合、凍結され得るか、４℃〜８℃または室温であり得る。いくつかの実施形態では、前記調製物（例えば、液体調製物または凍結乾燥調製物）は室温（例えば、２１℃〜２５℃、例えば、２３℃）で少なくとも２週間、少なくとも１か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、またはより長い期間安定である。１つの実施形態では、前記調製物は凍結されて（例えば、−２０℃または−７０℃または−８０℃で）少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、またはより長い期間安定である。いくつかの実施形態では、前記調製物は２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の脱アラニン型、アセチル化型、およびメチオニル化型を含む。
【００５６】
前記調製物は核酸とエンドトキシンを実質的に含まないことがあり得る。例えば、前記調製物は１０００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、４００ｐｐｍ未満、３００ｐｐｍ未満、２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満または５０ｐｐｍ未満のＨＣＰレベルを有する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、前記調製物は本明細書に記載される緩衝条件を含む。いくつかの実施形態では、前記調製物は５〜６の間、６〜７の間、または７〜８の間のｐＨ、例えば、５．５〜７．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、前記調製物は１０ｍＳ／ｃｍ未満、８ｍＳ／ｃｍ未満、７ｍＳ／ｃｍ未満、６ｍＳ／ｃｍ未満、５ｍＳ／ｃｍ未満、または４ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する。前記調製物はＭＯＰＳまたは他の緩衝剤、例えばトリスまたは酢酸塩を含み得る。前記調製物は界面活性剤を含まなくてもよい。前記調製物はリン酸塩を含み得る、またはリン酸塩を含まなくてもよい。前記調製物はキレート剤を含み得る。
【００５８】
前記調製物は塩、等張化剤および界面活性剤のうちの１つ以上を含み得る。その塩は、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどであり得る。例となる等張化剤にはソルビトール、マンニトール、ショ糖、トレハロース、およびグリセロールが含まれる。例となる界面活性剤には、例えば、ポロキサマー１８８、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンの他の脂肪酸エステル、およびポリエトキシレートが含まれる。
【００５９】
１つの実施形態では、前記調製物は１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬのキメラサイトカインタンパク質、５ｍＭ〜１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２％〜８％のソルビトール、０．０５％〜０．１５％のポロキサマー１８８、をｐＨ５．５〜６．５で含む。別の実施形態では、前記調製物は１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬのキメラサイトカインタンパク質、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５％のソルビトール、０．１％のポロキサマー１８８をｐＨ６．０で含む。
【００６０】
１つの実施形態では、前記調製物はステロイドをさらに含む。そのステロイドは、例えば、デキサメタゾン、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、またはそれらの塩もしくは混合物であり得る。
【００６１】
１つの態様では、前記調製物は眼への投与、例えば、眼への局所的投与に適切である。
【００６２】
１つの態様では、本発明は、本明細書に記載されるキメラサイトカインタンパク質、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む調製物の評価方法であって、（ａ）脱アラニン型の前記タンパク質のレベル、（ｂ）アセチル化型の前記タンパク質のレベル（その場合、アセチル化型は、全長配列、例えば、キメラサイトカインタンパク質の全長配列、または脱アラニン型の全長のアセチル化型であり得る）、または（ｃ）メチオニル化型の前記タンパク質のレベル（その場合、メチオニル化型は、全長配列、例えば、キメラサイトカインタンパク質の全長配列のメチオニル化型であり得る）のうちの１つ以上または全ての決定値を取得すること、例えば、直接取得することを含む方法を特色とする。前記の方法は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの１つ以上または全ての決定レベルを基準値と比較することをさらに含み得、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のそれぞれはそれ自体の基準値を有することができる。例えば、前記の方法は次のうちの１つ以上または全てを含み得る：（ａ）の決定レベルは脱アラニン型のレベルについての基準値と比較され得る、（ｂ）の決定レベルはアセチル化型のレベルについての基準値と比較され得る、（ｃ）の決定レベルはメチオニル化型のレベルについての基準値と比較され得る。
【００６３】
１つの実施形態では、前記基準値は、例えば、前記タンパク質の市販の試料、別のバッチ、例えば前記タンパク質の以前のバッチ、規制当局により推奨されている、公表されている、または要求されている値のセット、公開仕様または公開基準、米国薬局方などの薬局方機関により推奨されている、公表されている、または要求されている値のセットから決定される。
【００６４】
前記の決定は、例えば、クロマトグラフィーによる分析、例えば、弱陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を含み得る。
【００６５】
１つの実施形態では、前記の方法は前記調製物が基準値に対する事前に選択した関係を有するか決定すること、例えば、それが基準値よりも高いか、基準値と等しいか、または基準値よりも低いか決定することを含む。
【００６６】
１つの実施形態では、その決定に応答して、前記調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装または販売のうちの１つ以上を含む処理を前記調製物に行う。
【００６７】
１つの実施形態では、その決定に応答して、タンパク質を作製するための処理のパラメータが変更される。ある実施形態では、その決定は所与の変更が実施された後に繰り返される。
【００６８】
アセチル化型、メチオニル化型または未変化型のうちの１つ以上のレベルが、例えば、重量／重量で１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１５％未満、または２０％未満である場合、前記調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装または販売のうちの１つ以上を含む処理を前記調製物に行う。
【００６９】
前記調製物は、例えば、前駆調製物を精製ステップに供することにより作製され得る。前記調製物は、前駆調製物を陽イオン交換基材、陰イオン交換基材またはハイドロキシアパタイト基材などのクロマトグラフィー基材と接触させることによっても作製され得る。前記調製物は、前駆調製物を陽イオン交換基材、陰イオン交換基材またはハイドロキシアパタイト基材などのクロマトグラフィー基材のうちの１つ以上または全てと接触させることによっても作製され得る。１つの実施形態では、前記調製物は、前駆調製物を陽イオン交換、陰イオン交換、およびハイドロキシアパタイト基材の順序でこれらと接触させることによって作製された。
【００７０】
いくつかの実施形態では、前記調製物は精製工程における中間産物であり、そしてこの場合、前記調製物は、例えば、クロマトグラフィー工程からの濃縮された、または希釈された溶出液であり得る。
【００７１】
前記調製物には、例えば、陽イオン交換カラムからの濃縮された、または希釈された溶出液など、陽イオン交換カラムからの溶出液を含まれる場合があり、または、前記調製物には陰イオン交換カラムからの溶出液が含まれる場合がある。
【００７２】
１つの実施形態では、前記の方法には、前駆調製物を精製ステップに供することをさらに含む。例えば、前駆調製物を陽イオン交換基材、陰イオン交換基材またはハイドロキシアパタイト基材などのクロマトグラフィー基材のうちの１つ以上または全てと接触させることができる。前駆調製物を陽イオン交換基材と、次に陰イオン交換基材と、そして次にハイドロキシアパタイト基材と接触させることができる。
【００７３】
処理には、例えば、眼への投与用に前記調製物を製剤することが含まれ得る。
【００７４】
１つの実施形態では、例えば、コンピュータ読み取り可能記録の様式で評価が記憶される。
【００７５】
本発明の１つの態様は、タンパク質調製物を評価する方法であって、例えば、ハイドロキシアパタイトカラムから精製された、配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質の調製物に由来する単離画分を供給し、そして、その画分を弱陽イオン交換（ｗＣＥＸ）クロマトグラフィーで分析して脱アラニン型、アセチル化型またはメチオニル化型の前記タンパク質のうちの１つ以上のレベルを決定することによる方法を特色とする。脱アラニン型、アセチル化型またはメチオニル化型の前記タンパク質のうちの１つ以上が１０％未満で存在する場合、例えば、前記調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装または販売により前記調製物が処理される。
【００７６】
１つの態様では、本発明は、配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質の調製物を作製する処理を分析する方法であって、例えば、前記タンパク質の調製物の単離画分を供給し、請求項９３に記載の方法を用いてその画分を分析し、そして、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型の前記タンパク質のうちの１つ以上が１０％未満で存在する場合、少なくとも部分的にその分析に基づきその処理を維持することによる方法を特色とする。
【００７７】
別の態様では、本発明は、配列番号２１の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質の調製物を処理する方法であって、例えば、調製物中の脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型の前記タンパク質のうちの１つ以上のレベルについてのｗＣＥＸ決定値を提供し、そして、脱アラニン型、アセチル化型およびメチオニル化型の前記タンパク質のうちの１つ以上が１０％未満のレベルで存在する場合、前記調製物の選択、受領、医薬製品への処理、出荷、製剤、ラベル付け、包装または販売のうちの１つ以上を含む処理を前記調製物に行うことによる方法を特色とする。
【００７８】
前記の処理には、例えば、眼への投与用に前記調製物を製剤することが含まれ得る。
【００７９】
１つの実施形態では、前記の処理には、前記タンパク質の活性を決定することが含まれる。
【００８０】
別の態様では、本開示は、少なくとも２つの親サイトカインドメインに由来するアミノ酸残基、例えば、少なくとも２つの親サイトカインドメインに由来する受容体結合形体、表面形体、βストランド、およびループを含有するサイトカインドメインを含む単離タンパク質を特色とする。
【００８１】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインはＩＬ‐１ＲＩに結合し、そして、異なる親サイトカインドメインに由来する、例えば、受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａ、またはＩＬ‐１αとＩＬ‐１Ｒａ）に由来する、ＩＬ‐１βとＩＬ‐１αに由来する、またはＩＬ‐１Ｒａ、ＩＬ‐１αとＩＬ‐１Ｒａの３つ全てに由来する受容体結合形体を含む。受容体結合形体は部位ＡおよびＢ内の残基、セグメントまたは領域に対応し得る。部位ＡおよびＢに対応するそのような残基、セグメントおよび領域に関して、ＩＬ‐１（ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１α、およびＩＬ‐１Ｒａ）との関連で、さらに以下の定義を参照されたい。
【００８２】
部位Ａに関して、前記サイトカインドメインは、（ａ）（ｉ）第１親サイトカインドメイン内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ａ残基、（ａ）（ｉｉ）第１親サイトカインドメイン内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である拡張型部位Ａ残基、（ａ）（ｉｉｉ）第１親サイトカインドメインの対応する領域に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である部位ＡセグメントＡ１およびＡ２、ならびに／または（ａ）（ｉｖ）第１親サイトカインドメインの対応する領域に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である部位Ａ領域を有し得る。
【００８３】
部位Ｂに関して、前記サイトカインドメインは、（ｂ）（ｉ）第２親サイトカインドメイン内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ｂ残基、（ｂ）（ｉｉ）第２親サイトカインドメイン内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である拡張型部位Ｂ残基、（ｂ）（ｉｉｉ）第２親サイトカインドメインの対応する領域に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である部位ＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３、ならびに／または（ｂ）（ｉｖ）第２親サイトカインドメインの対応する領域に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である部位Ｂ領域を有し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、（ａ）（ｉ）およびｂ（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）およびｂ（ｉｉ）、（ａ）（ｉｉｉ）および（ｂ）（ｉｉｉ）、または（ａ）（ｉｖ）および（ｂ）（ｉｖ）の形体を含み、例えば、その場合、各形体は８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％の同一性によりさらに定義される。例えば、第１親サイトカインドメインがＩＬ‐１βであり得、第２親サイトカインドメインがＩＬ‐１Ｒａであり得る。例えば、第１親サイトカインドメインがＩＬ‐１αであり得、第２親サイトカインドメインがＩＬ‐１Ｒａであり得る。
【００８５】
前記サイトカインドメインは、サイトカイン補助的受容体（例えば、ＩＬ‐１ＲＡｃＰ）との相互作用を損なう前記ドメイン内の１つ以上の位置に第２親サイトカインドメイン由来のアミノ酸を含むこともできる。例えば、その第２親サイトカインドメインはＩＬ‐１Ｒａである。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１Ｒａに由来する１つ以上の部位Ｃおよび／もしくはＤセグメント（例えば、Ｃ１、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、および／またはＤ５）、またはそのようなセグメントに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、もしくは１００％同一である配列を含む。例えば、前記サイトカインドメインは、（ｉ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ｃ残基、（ｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ｄ残基、（ｉｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であるＣ１セグメント、または（ｉｖ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも３残基、４残基、または５残基で同一であるＤ２セグメントを含む。前記サイトカインドメインは、（ｉ）および（ｉｉ）、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）（例えば、その場合、各形体は８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％の同一性によりさらに定義される）、または（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の形体を含むことができる。
【００８６】
前記ドメインは、少なくとも２つの異なるヒトＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインに由来する、Ａ領域（Ａ１およびＡ２セグメントを有する）、Ｂ領域（Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３セグメントを有する）、Ｃ領域、およびＤ領域（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５セグメントを有する）からなる群より選択される領域を含み得る。
【００８７】
前記サイトカインドメインは、異なるサイトカインドメインに由来する部位Ａ領域および部位Ｂ領域を含み得る。部位Ａ領域は天然受容体アゴニストまたはアンタゴニストに由来し得る。部位Ｂ領域は天然受容体アゴニストに由来し得る。前記サイトカインドメインは、天然受容体アンタゴニストに由来する部位Ｃ領域および／または天然受容体アンタゴニストに由来する部位Ｄ領域を含み得る。
【００８８】
例えば、前記ドメインは、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、または２５アミノ酸長であり、少なくとも２つの異なる親サイトカインドメイン、例えば、第１および第２親サイトカインドメインに由来する対応するセグメントに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一であるセグメントを有するキメラドメインであり得る。その親サイトカインドメインはＩＬ‐１β、ＩＬ‐１αおよびＩＬ‐１ＲａなどのＩＬ‐１ＲＩ結合サイトカインであり得る。いくつかの実施形態では、その第１親サイトカインドメインに由来するセグメントに存在しないアミノ酸は２つ以上の他の親サイトカインドメインに由来する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、第１親サイトカインドメインの対応するセグメントに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一であり、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、または２５アミノ酸長の少なくとも２つのセグメントを含み、そして、そのようなセグメントに存在しないアミノ酸は第２親サイトカインドメイン内の対応する残基に対してほとんど（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％）同一である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、（ｉ）第１親サイトカインドメインの対応するセグメントに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一であり、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、または２５アミノ酸長の少なくとも２つのセグメント、および（ｉｉ）第２親サイトカインドメインに対して同一であり、例えば、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、１０アミノ酸長、または１５アミノ酸長の少なくとも、１つ、２つ、または３つのセグメントを含む。
【００９１】
例えば、前記サイトカインドメインは、それぞれ第１親サイトカインドメイン（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）に対して同一である（または少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、もしくは９８％同一である）、２０〜５０アミノ酸、２５〜５０アミノ酸、３０〜４５アミノ酸、または３０〜４０アミノ酸（例えば、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸、または４０アミノ酸）の第１セグメント、および２０〜４５アミノ酸、２０〜４０アミノ酸、２５〜４０アミノ酸、または２５〜３５アミノ酸（例えば、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、または３５アミノ酸）の第２セグメント、および第２親サイトカインドメイン（例えば、ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１α）に対して同一である（または少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、もしくは９８％同一である）第３セグメントを含み得る。例えば、その第３セグメントは５５〜９０アミノ酸長の間、６０〜９０アミノ酸長の間、６０〜８５アミノ酸長の間、または７０〜８５アミノ酸長の間、例えば、７５アミノ酸長、７６アミノ酸長、７７アミノ酸長、７８アミノ酸長、７９アミノ酸長、８０アミノ酸長、８１アミノ酸長、８２アミノ酸長、８３アミノ酸長、８４アミノ酸長、または８５アミノ酸長であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、第１セグメントはＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶ（配列番号９、本明細書においてＡ１セグメントともいう、そして、配列番号３の残基１６〜４０およびＩＬ‐１βの番号付に従って残基１１〜３６に対応する）に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％のセグメントであり得る。第２セグメントは、（ＩＬ‐１βの番号付に従って）残基１２１〜１３９または１２１〜１４０に対応する配列番号３（ＩＬ‐１Ｒａ）の残基１２０〜１４０または１２０〜１４１に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％のセグメントであり得る。第３セグメントは、ＩＬ-１β（配列番号１）の残基４５〜１００または４２〜１２０に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％であり得る。
【００９３】
いくつかの場合では、第１セグメントは配列番号３の残基１４〜４５（ＩＬ‐１βの番号付に従って残基９〜４１に対応する）に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％のセグメントであり得る。第２セグメントは配列番号３の残基１２０〜１４５（ＩＬ‐１βの番号付に従って残基１２１〜１４５に対応する）または配列番号３の残基１２０〜１４７（ＩＬ‐１βの番号付に従って残基１２１‐１４７に対応する）に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％のセグメントであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも（ＩＬ‐１βの番号付に従う）残基１１〜４１および１２０〜１４７がＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して全体として少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインのセグメントのうちの１つの末端は、配列番号１のアミノ酸４１から５アミノ酸内、４アミノ酸内、３アミノ酸内、２アミノ酸内、または１アミノ酸内に位置し、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインのセグメントのうちの１つの末端は、配列番号１のアミノ酸１２１から５アミノ酸内、４アミノ酸内、３アミノ酸内、２アミノ酸内、または１アミノ酸内に位置する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、前記ドメインは、配列番号１のアミノ酸４２から５アミノ酸内、４アミノ酸内、３アミノ酸内、２アミノ酸内、または１アミノ酸内の位置にＮ末端を有し、配列番号１のアミノ酸１２０から５アミノ酸内、４アミノ酸内、３アミノ酸内、２アミノ酸内、または１アミノ酸内にＣ末端を有するセグメント、および／または配列番号１のアミノ酸１２１から５アミノ酸内、４アミノ酸内、３アミノ酸内、２アミノ酸内、または１アミノ酸内の位置にＮ末端を有し、配列番号１のアミノ酸１４５から５アミノ酸内、４アミノ酸内、３アミノ酸内、２アミノ酸内、または１アミノ酸内にＣ末端を有するセグメントを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、（ＩＬ‐１βの番号付に従う）１１〜４１番および１２０〜１４７番に対応する位置にある前記ドメインの残基はＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して全体として少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である。前記ドメインはまた、例えば、前述のものと類似の位置においてＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーに由来する配列にも基づき得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、次の配列、ＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶ（配列番号９）、ＮＬＥＥＫ（配列番号１０）、ＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫ（配列番号１１）、ＡＭＥＡＤＱＰ（配列番号１２）、ＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹ（配列番号１３）のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの配列、および／または前述の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、もしくは１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、次の配列、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩ（配列番号１４）、ＫＫＫＭＥＫＲＦ（配列番号１５）、およびＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳ（配列番号１６）のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの配列、および／または前述の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、β１β２ループ、β２β３ループ、β８β９ループおよびβ１０β１１ループのうちの１つ以上または全ては、ＩＬ‐１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ‐１Ｒａに由来する対応するループに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、β４β５ループ、β５β６ループ、β６β７ループおよびβ７β８ループのうちの１つ以上または全ては、β１β２ループ、β２β３ループ、β８β９ループおよびβ１０β１１ループに最も類似しているヒト親サイトカインとは異なるＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインに由来する対応するループに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である。例えば、β４β５ループ、β５β６ループ、β６β７ループおよびβ７β８ループのうちの１つ以上または全ては、ＩＬ‐１βなどのＩＬ‐１アゴニストに由来するそのようなループに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、β１１β１２ループは、ＩＬ‐１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ‐１Ｒａに由来する対応するループに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１Ｒａのβストランドであるβ２、β３、β１０およびβ１１のうちの１つ、２つ、３つ、または全てに対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１βのβ４、β６、β７、およびβ８のうちの１つ、２つ、３つ、または全てに対して、またはＩＬ‐１βのβ４、β５、β６、β７、およびβ８に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号３のアミノ酸Ｉ４６〜Ｇ５９、Ａ５５〜Ｇ５９、Ａ５５〜Ｖ８３、Ｉ６０〜Ｖ８３、Ｎ８４〜Ｄ９５、Ｉ４６〜Ｓ１１０、Ｖ４９〜Ｓ１１０、またはＩ４６〜Ｇ１１８に対して８０％、８５％、９０％、９５％よりも高い同一性を有する、または１００％同一であるセグメントを含有しない。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１のアミノ酸Ｎ７〜Ｖ４１、Ｒ１１〜Ｍ３６、Ｎ１０２〜Ｄ１４５、またはＹ１２１〜Ｄ１４５に対して８０％、８５％、９０％、９５％よりも高い同一性を有する、または１００％同一であるセグメントを含有しない。
【０１０１】
概して、前記サイトカインドメインは天然物ではない。それはヒトＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインと異なる。例えば、それは、ＩＬ‐１Ｒａ（配列番号３）、ＩＬ‐１β（配列番号１）、および／またはＩＬ‐１α（配列番号２）と９８％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、または５５％未満同一である。前記サイトカインドメインはそのようなサイトカインに対して少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％同一であり得る。例えば、キメラドメインはＩＬ‐１Ｒａ、ＩＬ‐１β、およびＩＬ‐１αと３０〜９５％、４０〜９０％、または４５〜８５％同一であり得る。例えば、キメラドメインは、ＩＬ‐１βと４０〜９０％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと３５〜８５％同一であり得、ＩＬ‐１βと４０〜８０％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと４５〜８０％同一であり得、ＩＬ‐１βと４５〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと４５〜８０％同一であり得、ＩＬ‐１βと４５〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５３〜８０％同一であり得、ＩＬ‐１βと５０〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５３〜７０％同一であり得、ＩＬ‐１βと６０〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５３〜６８％同一であり得、ＩＬ‐１βと６５〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５４〜６０％同一であり得、またはＩＬ‐１βと６８〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５４〜５７％同一であり得る。例えば、キメラドメインは、ＩＬ‐１αと４０〜９０％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと３５〜８５％同一であり得、ＩＬ‐１αと４０〜８０％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと４５〜８０％同一であり得、ＩＬ‐１αと４５〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと４５〜８０％同一であり得、ＩＬ‐１αと４５〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５３〜８０％同一であり得、ＩＬ‐１αと５０〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５３〜７０％同一であり得、ＩＬ‐１αと６０〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５３〜６８％同一であり得、ＩＬ-１αと６５〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５４〜６０％同一であり得、またはＩＬ‐１αと６８〜７２％同一、そして、ＩＬ‐１Ｒａと５４〜５７％同一であり得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインはＩＬ‐１Ｒａと異なり、そして、一方で天然受容体アンタゴニスト（ＩＬ‐１Ｒａなど）の部位Ｃおよび／または部位Ｄの特性を含みつつ、受容体に結合する。例えば、前記ドメインは、ヒトＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１Ｒａと９８％未満、９５％未満、９２％未満、９０％未満、８５％未満、および８０％未満同一である。例えば、前記ドメインはＩＬ‐１Ｒａと４０〜９５％、４０〜９０％、または４５〜８５%同一である。前記ドメインは、ＩＬ‐１αまたはＩＬ‐１βなどのＩＬ‐１ファミリーサイトカインアゴニストと４０〜９５％、４０〜９０％、または４５〜８５%同一である場合もある。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、サイトカインシグナル伝達のアゴニストである第１親サイトカインドメインの少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％のアミノ酸を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（ＩＬ‐１Ｒａ）よりも受容体アゴニスト（ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１αなど）に対して高いアミノ酸同一性（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％または２０％高い）を有するが、ＩＬ‐１ＲＩのアンタゴニストとして機能する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは完全にキメラであり、例えば、前記ドメイン中の各アミノ酸は複数の親サイトカインドメインのうちの１つ、例えば、２つの親サイトカインドメインのうちの１つ、または３つ以上の親サイトカインドメインのうちの１つに由来する。例えば、親サイトカインドメインはヒトサイトカインドメインまたは非ヒト霊長類サイトカインドメインである。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは部分的にキメラであり、例えば、前記ドメイン中の全てのアミノ酸が複数の親サイトカインドメインのうちの１つに由来するわけではない。
【０１０５】
例えば、前記単離タンパク質はＩＬ‐１ＲＩに結合し、その受容体によるシグナル伝達を調節し、例えば、ＩＬ‐１ＲＩ受容体シグナル伝達活性を刺激または抑制する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ＩＬ‐１β応答性ヒト細胞と接触したときにＩＬ‐６産生を実質的に誘導せず、および／または、例えば、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度でＩＬ‐１β応答性レポーター遺伝子の産生を実質的に誘導しない。概して、前記タンパク質は１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または５ｎＭ未満のＩＣ５０で（例えば、本明細書に記載される細胞性アッセイなどにおいて、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で）ＩＬ‐１βによるシグナル伝達を抑制する。前記タンパク質は、ＩＬ‐１Ｒａのものよりも低い、例えば、少なくとも１０％、２０％または５０％低いＩＣ５０でＩＬ‐１βによるシグナル伝達を阻害することができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、例えば、親サイトカインドメインのうちの１つと同一またはそれよりも高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、または１ｎＭ未満、または５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、または５０ｐＭ未満のＫＤでＩＬ‐１ＲＩに結合する。例えば、結合定数は１×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、または１×１０６Ｍ−１ｓ−１よりも高くあり得、解離定数は１×１０−３ｓ−１、１×１０−４ｓ−１、６×１０−４ｓ−１、または６×１０−５ｓ−１よりも低くあり得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１Ｒａより高い親和性（例えば、低いＫＤ）および／または遅い解離速度でＩＬ‐１ＲＩに結合する。例えば、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１Ｒａのものよりも低い、もしくは同等の解離定数で、および／またはＩＬ‐１βのものよりも高い、もしくは同等の結合定数でＩＬ‐１ＲＩに結合することができる。
【０１０８】
前記サイトカインドメインの長さは、およそ１２０〜１８０アミノ酸の間、１４０〜１７０アミノ酸の間、１４８〜１６０アミノ酸の間、または１５０〜１５６アミノ酸の間である。いくつかの実施形態では、前記ドメインは１５２アミノ酸長、１５３アミノ酸長、または１５４アミノ酸長である。通常、前記ドメインは少なくとも１０個、１１個、または１２個のβストランドを含み、そして、安定的に折り畳まれている。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、本明細書に記載されるように、少なくとも３８℃、４０℃、４２℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、または６４℃の融点（Ｔｍ）を有する。サイトカインドメインは５１〜６１℃の間、５１〜６６℃の間、５６〜６１℃の間、または５６〜６６℃の間のＴｍを有し得る。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、少なくとも４８℃、５０℃、５１℃、５５℃、５７℃、５８℃、または５９℃まで折畳み構造の変性を開始しない。例えば、それは、生理的緩衝液中でのＩＬ‐１Ｒａおよび／またはＩＬ‐１βのＴｍの祝なくとも１０℃以内または５℃以内にあるＴｍを有する。いくつかの実施形態では、生理的緩衝液中でＩＬ‐１Ｒａおよび／またはＩＬ‐１βよりも熱安定性を有する。例えば、前記ドメインは、生理的緩衝液中でのＩＬ‐１Ｒａおよび／またはＩＬ‐１βのＴｍよりも少なくとも２℃、４℃６℃、７℃、または８℃高い、例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でのＩＬ‐１Ｒａおよび／またはＩＬ‐１βのＴｍよりも約５〜１２℃、５〜１０℃、または７〜１０℃だけ高いＴｍを有し得る。
【０１０９】
前記タンパク質は本明細書に記載される他の形体を含み得る。
【０１１０】
別の態様では、本開示は、キメラＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインを含む単離タンパク質を特色とする。ＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーの例にはＩＬ‐１α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１Ｒａ、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐１Ｆ５、ＩＬ‐１Ｆ６、ＩＬ‐１Ｆ７、ＩＬ‐１Ｆ８、ＩＬ‐１Ｆ９、ＩＬ‐１Ｆ１０、およびＩＬ‐３３が含まれる。前記サイトカインドメインには、前述のサイトカインのうちの１つの受容体結合領域、または１つ以上のそのようなサイトカインの要素を含むタンパク質配列が含まれ得る。例えば、前記サイトカインドメインには、２つ以上のＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーからなるキメラが含まれ得る。
【０１１１】
１つの実施形態では、キメラドメインは、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長、４０アミノ酸長、４５アミノ酸長、５０アミノ酸長、５５アミノ酸長、６０アミノ酸長、６５アミノ酸長、または７０アミノ酸長であり、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインに対するアミノ酸同一性を有する（または少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である）少なくとも１つのセグメント、および少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長、または４０アミノ酸長であり、第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインに対するアミノ酸同一性を有する（または少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である）別のセグメントを含む。キメラドメインは、第１および第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインのうちの一方または両方と９０％未満、８５％未満、８０％未満または７５％未満が同一であり得る。
【０１１２】
１つの実施形態では、第１および第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインは、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１αおよびＩＬ‐１Ｒａからなる群より選択される。別の実施形態では、第１および第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインは、ＩＬ‐１Ｆ５、ＩＬ‐１Ｆ６、ＩＬ‐１Ｆ７およびＩＬ‐１Ｆ８からなる群より選択される。別の実施形態では、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインはアゴニストからなる群より選択され、第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインはアンタゴニストからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、キメラドメインは、同じ親サイトカインドメインに由来する１２０個、１１０個、１００個、９０個、または８０個よりも少ない連続するアミノ酸を含む。
【０１１３】
１つの実施形態では、キメラドメインは、少なくとも５０か所、６０か所、７０か所、８０か所、９０か所、１００か所、１１０か所、または１２０か所の位置で第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインと同一であり、少なくとも５０か所、６０か所、７０か所、８０か所、９０か所、１００か所、１１０か所、または１２０か所の位置で第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインと同一である（両方のそのようなサイトカインとそれぞれに同一であり得る位置を含む）。
【０１１４】
１つの実施形態では、キメラドメインは、それぞれ少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、または２０アミノ酸長であり、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインの対応するセグメントに対するアミノ酸同一性を有し（または少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり）、そして、残りの位置ではほとんど第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインに由来するアミノ酸を含む、少なくとも２つ、３つ、または４つの非連続的なセグメントを含む。１つの実施形態では、キメラドメインは、隣接するセグメントが異なる親ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインに由来する、４つ、５つ、６つ、または７つのセグメントを含む。例えば、前記ドメイン内の各アミノ酸は、天然ヒトＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインに由来する少なくとも５アミノ酸長または６アミノ酸長のペプチド内に位置する。１つの実施形態では、キメラドメインは、（ｉ）ＩＬ‐１βに由来する少なくとも５０アミノ酸長、６０アミノ酸長、６５アミノ酸長、７０アミノ酸長、または７５アミノ酸長のセグメント、（ｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａに由来する少なくとも１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長のセグメント、および（ｉｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａに由来する少なくとも１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長の別のセグメントのうちの少なくとも１つ、２つ、または３つを含む。
【０１１５】
１つの実施形態では、非連続的なセグメントは、ＩＬ‐１β内のそのような位置の番号付に従って、残基（ｉ）１〜６および４５〜６１、（ｉｉ）１〜６および８６〜９５、（ｉｉｉ）４５〜６１および８６〜９５、（ｉｖ）１〜６および１４８〜１５３、（ｖ）４５〜６１および１４８〜１５３、または（ｖｉ）８６〜９５および１４８〜１５３を含む。第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインに由来する３つの非連続的なセグメントは、ＩＬ‐１β内のそのような位置の番号付に従って、例えば、残基１〜８、４２〜１２０および１４１〜１５３、残基１〜１０、３７〜１２５および１３１〜１５３、または残基１〜６、４５〜６１、８６〜９５および１４８〜１５３を含み得る。キメラドメインは、残りの位置で第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインに対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。１つの実施形態では、非連続的なセグメントの境界部のうちの１つ以上が、第１および第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインが同一または保存されている位置に位置する。前記タンパク質は本明細書に記載される他の形体を有し得る。
【０１１６】
別の態様では、本開示は、ＩＬ‐１ＲＩに結合するＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインを含む単離ＩＬ‐１インヒビターを特色とする。例えば、ＩＬ‐１インヒビターは、上または本明細書の別の部分に記載の１つ以上の形体を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、（ａ）次の（ＩＬ‐１βの番号付に従って）ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＮ３８、ＧＬＮ３９、ＡＬＡ１２７、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、ＭＥＴ１３０、およびＧＬＮ１４１の位置でＩＬ‐１Ｒａと同一であるアミノ酸、および（ｂ）次のＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ６、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、ＰＲＯ５７、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、ＡＳＮ１０８、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２の位置でＩＬ‐１βと同一であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、部位ＡセグメントＡ１およびＡ２はＩＬ‐１Ｒａの対応するセグメントに対して（全体として）少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、部位ＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３はＩＬ‐１βの対応するセグメントに対して（全体として）少なくとも８０％同一である。例えば、部位ＡセグメントＡ１およびＡ２はＩＬ‐１Ｒａの対応するセグメントに対して（全体として）少なくとも９０％同一であり、そして、部位ＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３はＩＬ‐１βの対応するセグメントに対して（全体として）少なくとも９０％同一である。例えば、部位ＡセグメントＡ１およびＡ２はＩＬ‐１Ｒａの対応するセグメントと同一であり、そして、部位ＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３はＩＬ‐１βの対応するセグメントと同一である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１Ｒａのβストランドであるβ２、β３、β１０およびβ１１に対して（全体として）少なくとも８０％同一である配列、およびＩＬ‐１βのβストランドであるβ４、β６、β７、およびβ８に対して（全体として）少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１Ｒａのβストランドであるβ２、β３、β１０およびβ１１と同一である配列、およびＩＬ‐１βのβストランドであるβ４、β６、β７、およびβ８と同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、上でＩＬ‐１βから特定されたセグメントおよび形体はＩＬ‐１α、またはＩＬ‐１βもしくはＩＬ‐１αの組合せから得られる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ‐１インヒビターは、次の特性のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ）を含む：（ｉ）ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１α、またはＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ａ残基または部位Ｂ残基（および／または拡張型部位Ａ残基および拡張型部位Ｂ残基）、（ｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して全体として少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であるＡ１セグメントおよびＡ２セグメント、（ｉｉｉ）ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１α内の対応する残基に対して全体として少なくとも８０％同一であるＢ１セグメント、Ｂ２セグメント、およびＢ３セグメント、（ｉｖ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ａ領域、（ｖ）ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１α内の対応する残基に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％である部位Ｂ領域、（ｖｉ）ＩＬ‐１ＲａまたはＩＬ３６Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも５０、６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である部位Ｃ残基および／または部位Ｄ残基、（ｖｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であるＣ１セグメント、（ｖｉｉｉ）ＩＬ‐１Ｒａ内の対応する残基に対して少なくとも３残基、４残基、または５残基で同一であるＤ２セグメント。前記サイトカインドメインはＩＬ‐１Ｒａと異なり、例えば、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１Ｒａと９９％未満、９８％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満同一であり、および／またはＩＬ‐１Ｒａと少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％同一である、例えば、ＩＬ‐１Ｒａと４０〜９５％、４０〜９０％、または４５〜８５％同一である。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号３のアミノ酸Ｉ４６〜Ｇ５９、Ａ５５〜Ｇ５９、Ａ５５〜Ｖ８３、Ｉ６０〜Ｖ８３、Ｎ８４〜Ｄ９５、Ｉ４６〜Ｓ１１０、Ｖ４９〜Ｓ１１０、またはＩ４６〜Ｇ１１８に対して８０％、８５％、９０％、９５％よりも高い同一性を有する、または１００％同一であるセグメントを含有しない。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１のアミノ酸Ｎ７〜Ｖ４１、Ｒ１１〜Ｍ３７、Ｎ１０２〜Ｄ１４４、またはＹ１２１〜Ｄ１４４に対して８０％、８５％、９０％、９５％よりも高い同一性を有する、または１００％同一であるセグメントを含有しない。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、前記インヒビターは、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＫＤでＩＬ‐１ＲＩに結合する。いくつかの実施形態では、前記インヒビターは、ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１Ｒａよりも高い親和性（例えば、低いＫＤ）および／または遅い解離速度でＩＬ‐１ＲＩに結合する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、前記インヒビターは、ＩＬ‐１β応答性ヒト細胞に接触したときにＩＬ‐６発現を実質的に誘導しない。概して、前記インヒビターは、例えば、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または５ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ‐１βによるシグナル伝達を阻害する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、次の配列、ＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶ（配列番号９）、ＮＬＥＥＫ（配列番号１０）、ＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫ（配列番号１１）、ＡＭＥＡＤＱＰ（配列番号１２）、ＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹ（配列番号１３）のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの配列、および／または前述の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、次の配列、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩ（配列番号１４）、ＫＫＫＭＥＫＲＦ（配列番号１５）、およびＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳ（配列番号１６）のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの配列、および／または前述の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一である配列を含む。前記インヒビターは本明細書に記載される他の形体を含み得る。
【０１２２】
別の態様では、本開示は、本明細書において開示される配列、例えば、表４または実施例１に記載される配列、例えば、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、もしくはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、もしくは本明細書中の別のか所の配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、少なくとも１つの置換、挿入または欠失を含む。そのアミノ酸配列は１５個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個よりも少ない非保存的置換、または１５個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個より少ない全置換を含み得る。そのアミノ酸配列は少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個の置換、例えば、保存的置換を含み得る。
【０１２３】
Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、もしくはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、もしくは本明細書中の別のか所の配列に対してメチオニンＮ末端を含む単離タンパク質、およびＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、もしくはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、もしくは本明細書中の別のか所の配列であってＮ末端のアラニンが存在しない単離タンパク質も提供される。これらの型はそれぞれ未変化のタンパク質のメチオニル化アイソフォームおよび脱アラニンアイソフォームを表す。アセチル化されている単離タンパク質も提供される。アセチル化型にはアセチル化未変化タンパク質、アセチル化メチオニル化タンパク質、およびアセチル化脱アラニンアイソフォームが含まれる。前述の配列は本明細書において開示される他の形体を含み得る。例えば、その配列は、例えば、ＩＬ‐１ＲＩ結合配列のＮ末端側またはＣ末端側にヘキサヒスチジン配列などのタグをさらに含み得る。前記配列は、ＩＬ‐１ＲＩ結合配列の安定性または薬物動態を修飾する部分をさらに含み得る。というのも、前記配列は、血清アルブミンおよび／またはＦｃドメイン、またはそれらの１つ以上のドメイン、例えば、１つ以上の免疫グロブリン定常ドメインまたは１つ以上のアルブミンドメインをさらに含み得るからである。前記タンパク質は本明細書に記載される他の形体を有し得る。いくつかの実施形態では、前記単離タンパク質は、本明細書において開示される配列またはキメラドメインからなる、またはそれらから基本的になる。
【０１２４】
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載される循環置換した型のサイトカインドメイン、例えば表４に記載されるサイトカインドメインを有するドメイン、および／または配列番号３を包含するドメインを含む単離タンパク質を提供する。そのタンパク質は、リンカーで空間をあけてもよい、前記の循環置換型のＮ末端またはＣ末端に異種性配列（例えば、Ｆｃドメインまたはアルブミン）をさらに含み得る。前記タンパク質は本明細書に記載される他の形体を有し得る。
【０１２５】
本開示はまた、本明細書に記載される１つ以上の受容体結合剤（例えば、キメラサイトカインドメインを含むタンパク質）を含む医薬組成物も取り上げる。その組成物は点眼用医薬組成物、局所投与用組成物、または非経口投与用組成物であり得る。
【０１２６】
別の態様では、本開示は、対象において免疫応答または炎症応答を調節する方法を特色とする。前記の方法は、本明細書に記載される受容体結合剤を含む組成物を、対象における免疫応答または炎症応答を調節するのに有効な量でその対象に投与することを含み得る。
【０１２７】
別の態様では、本開示は、対象においてＩＬ‐１介在性障害を治療する方法を特色とする。前記の方法は、ＩＬ‐１ＲＩに結合することができるタンパク質、例えば、本明細書に記載される受容体結合剤を含む組成物をその対象に投与することを含む。例えば、その障害は自己免疫障害、例えば、リウマチ性関節炎または若年性慢性関節炎、強皮病、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、炎症性腸疾患、喘息、血管炎、または乾癬であり得る。前記の障害は凝集体形成を伴う障害、例えば、高尿酸血症、痛風、糖尿病（非インスリン依存性糖尿病を含む。）、アルツハイマー病、二次反応性アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、またはパーキンソン病であり得る。前記の障害はＣＡＰＳ（ＣＩＡＳ１関連周期性症候群）障害または本明細書に記載される他の障害でもあり得る。
【０１２８】
別の態様では、本開示は、対象においてＩＬ‐１介在性眼疾患を治療する方法を特色とする。前記の方法は、ＩＬ‐１ＲＩに結合することができるタンパク質、例えば、本明細書に記載される受容体結合剤を含む組成物をその対象に投与することを含み得る。例えば、その組成物は、対象の眼または周辺領域に局所的に投与される点眼用組成物である。１つの実施形態では、その障害はドライアイ障害である。いくつかの実施形態では、対象は全身性自己免疫疾患の症状を示さない。いくつかの実施形態では、対象はシェーグレン症候群を有する。いくつかの実施形態では、対象は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する。さらに他の実施形態では、その障害はぶどう膜炎である。
【０１２９】
さらに別の態様では、本開示は、ＩＬ‐１活性を阻害する方法を特色とする。前記の方法は、ＩＬ‐１ＲＩに結合することができる受容体結合剤をＩＬ‐１応答性細胞または対象に接触させることを含む。概して、そのタンパク質は、その細胞または対象に付随するＩＬ‐１活性を阻害するのに有効な量で投与される。前記タンパク質を対象から取り出した細胞に生体外で接触させることができる。
【０１３０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるタンパク質をコードする１つ以上の配列、または本明細書（例えば、表５）において開示される核酸、そのような核酸にハイブリダイズする配列、またはそのような核酸に対して８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を包含する単離核酸を特色とする。例となるハイブリダイズする配列は少なくとも２００ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４２０ヌクレオチド長、または４５０ヌクレオチド長、例えば、４２０〜４８０ヌクレオチド長の間であり得る。その核酸は本明細書において開示される他の形体を含むこともできる。
【０１３１】
本明細書に記載されるタンパク質およびそれらのポリペプチド鎖をコードする１つ以上の配列を包含する核酸を含む組換え宿主細胞も取り上げられる。受容体結合剤は、その受容体結合剤の発現を可能にする条件下でその宿主細胞を培養すること、および随意で、その受容体結合剤を、例えば、その宿主細胞に関連する細胞または培地から回収することを含む方法により作製され得る。例えば、受容体結合剤は、前記の細胞の溶菌液から精製され得る。精製した受容体結合剤は、例えば、賦形剤、安定化剤、および緩衝液のうちの１つ以上と製剤化され得る。
【０１３２】
キメラタンパク質ドメインを提供する方法も取り上げられる。前記の方法は、共通の折畳み構造を有する少なくとも２つの親タンパク質（例えば、第１親タンパク質と第２親タンパク質）を特定し、第１親タンパク質内の少なくとも２つのセグメントの位置を特定し、そして、第１親タンパク質のその２つのセグメント、および残りの位置に主に第２親タンパク質に由来する残基を含むキメラアミノ酸配列をコードする配列を有する核酸を構築することを含む。前記ドメインは、主にβ‐シートから構成されるドメイン、または主にα‐ヘリックスから構成されるドメイン、またはそのような要素の組合せを有するドメインであり得る。例えば、前記ドメインは、サイトカインの折畳み構造を有し得る。第１および第２親タンパク質は、相同性、例えば、１０〜４０％の間のアミノ酸同一性で関連し得る。いくつかの実施形態では、第１タンパク質由来のセグメントは単一の折畳み構造を有するタンパク質ドメイン内に位置し、そして、キメラアミノ酸配列は第１および第２親タンパク質の対応するドメインと同一ではないある形状の折畳まれたタンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、その２つの親タンパク質は異なる機能特性を有し、そして、そのキメラドメインはその親タンパク質うちの一方または両方の特質を有し得る。いくつかの実施形態では、キメラドメインは、第１親タンパク質に由来する１つの結合面を有し、第２親タンパク質に由来する別の結合面を有する。
【０１３３】
本明細書は、部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに関して、ＩＬ‐１ファミリーサイトカイン内の様々な領域、セグメントおよび残基を参照する。ヒトＩＬ‐１βの配列（配列番号１）内のそのような残基、セグメントおよび領域の場所、および対応する位置が下および図１に提供されている。
【０１３４】
部位Ａ．ＩＬ‐１β内の部位Ａ残基は次を含む：ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＳＥＲ２１、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９およびＭＥＴ１３０、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書において「部位Ａ残基」と呼称される）。ある特定の状況では、特にＩＬ‐１βと関連して、部位Ａ残基ならびにＧＬＮ１４９、およびＰＨＥ１５０、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基を含む「拡張型部位Ａ残基」を参照する。さらに、例えばＡ１セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の１１〜３６に対応する）およびＡ２セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の１２５〜１３１に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応するセグメントを含む、図４に示される「部位Ａ領域」を定義することができる。
【０１３５】
部位Ｂ．ＩＬ‐１β内の部位Ｂ残基は次を含む：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＡＲＧ４、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＡＳＮ５３、ＩＬＥ５６、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５およびＡＳＮ１０８、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書において「部位Ｂ残基」と呼称される）。ある特定の状況では、特にＩＬ‐１βと関連して、部位Ｂ残基ならびに図４の部位Ｂ領域の外側にあるＰＨＥ４６およびＳＥＲ１５２を含む「拡張型部位Ｂ残基」を参照する。さらに、例えばＢ１セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の１〜５に対応する）、Ｂ２セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の４８〜５６に対応する）、およびＢ３セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の９２〜９８に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応するセグメントを含む、図４に示される「部位Ｂ領域」を定義することができる。
【０１３６】
部位Ｃ．ＩＬ‐１β内の部位Ｃ残基は次を含む：ＩＬＥ１０４、ＩＬＥ１０６、ＡＳＮ１０７、ＬＹＳ１０９、ＧＬＵ１１１、ＴＨＲ１３７、ＬＹＳ１３８、ＧＬＹ１３９、ＧＬＹ１４０、ＧＬＮ１４１、ＴＨＲ１４４およびＡＳＰ１４５、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書において「部位Ｃ残基」と呼称される）。さらに、例えばＣ１セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の１３６〜１４５に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応するセグメントを含む、図４に示される「部位Ｃ領域」を定義することができる。
【０１３７】
部位Ｄ．ＩＬ‐１β内の部位Ｄ残基は次を含む：ＬＥＵ６、ＴＨＲ９、ＬＹＳ６３、ＧＬＵ６４、ＬＹＳ６５およびＡＳＮ６６、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書において「部位Ｄ残基」と呼称される）。さらに、例えば、Ｄ１セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の６〜９に対応する）、Ｄ２セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の３７〜４１に対応する）、およびＤ３セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の６３〜６６に対応する）、Ｄ４セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の８６〜９１に対応する）、およびＤ５セグメント（ＩＬ‐１βにおいて配列番号１の１５０〜１５３に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応するセグメントを含む、図４に示される「部位Ｄ領域」を定義することができる。
【０１３８】
図４に示されている配列に対して件のサイトカインのアラインメントを行うことにより、部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの残基および領域の場所をさらに特定することができる。
【０１３９】
本明細書において参照されるＩＬ‐１β（ヒト）のアミノ酸配列は次のものである：ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳ（配列番号１）。
【０１４０】
本明細書において参照されるＩＬ‐１α（ヒト）のアミノ酸配列は次のものである：ＳＡＰＦＳＦＬＳＮＶＫＹＮＦＭＲＩＩＫＹＥＦＩＬＮＤＡＬＮＱＳＩＩＲＡＮＤＱＹＬＴＡＡＡＬＨＮＬＤＥＡＶＫＦＤＭＧＡＹＫＳＳＫＤＤＡＫＩＴＶＩＬＲＩＳＫＴＱＬＹＶＴＡＱＤＥＤＱＰＶＬＬＫＥＭＰＥＩＰＫＴＩＴＧＳＥＴＮＬＬＦＦＷＥＴＨＧＴＫＮＹＦＴＳＶＡＨＰＮＬＦＩＡＴＫＱＤＹＷＶＣＬＡＧＧＰＰＳＩＴＤＦＱＩＬＥＮＱＡ（配列番号２）。
【０１４１】
本明細書において参照されるＩＬ‐１Ｒａ（ヒト）のアミノ酸配列は次のものである：ＲＰＳＧＲＫＳＳＫＭＱＡＦＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＩＤＶＶＰＩＥＰＨＡＬＦＬＧＩＨＧＧＫＭＣＬＳＣＶＫＳＧＤＥＴＲＬＱＬＥＡＶＮＩＴＤＬＳＥＮＲＫＱＤＫＲＦＡＦＩＲＳＤＳＧＰＴＴＳＦＥＳＡＡＣＰＧＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＦＱＥＤ（配列番号３）。ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１α、およびＩＬ‐１Ｒａという用語は、本明細書において使用される場合、それぞれの成熟タンパク質を指す。
【０１４２】
本明細書において参照され、図４において示されるβシートは次の表の配列を指す。
【表１】
2014522868.tif 000003
【０１４３】
２つの配列の間の「相同性」または「配列同一性」（それらの用語は本明細書において互換的に使用される）の計算は次のように行われる。本明細書において提供されるアラインメントに従ってそれらの配列のアラインメントを行う、または適切なアラインメントが存在しないとき、最適なアラインメントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２スコアリング・マトリックスと１０のギャップ・ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを用いるＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅのアルゴリズムで実施されるように、NeedlemanとWunschのアルゴリズムを使用して最良のスコアとして決定される。Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453、Addison Wesley社出版の D. Sankoff および J. B. Kruskal, (編), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, 1〜44頁のKruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison、およびヨーロッパ・バイオインフォマティクス研究所(英国、ケンブリッジ)のEMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P. et al., A., Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-277より入手可能なツール、ならびにebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.htmlおよびemboss.open-bio.org/wiki/Appdoc:Needleにおいてオンラインで入手可能なツールを参照のこと。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列内の位置が第２配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているとき、それらの分子はその位置で同一である（本明細書において使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸の「相同性」と同じである）。２つの配列の間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である。一群の参照配列に対する目的の１つの配列の全体的な同一性を決定するため、目的の配列が、参照配列からなる群のうちのいずれか１つ以上において対応する位置にある少なくとも１つのアミノ酸と同一である場合、その位置を同一であると見なす。セグメント、形体または領域のリストに関して、そのようなリストの全てのメンバーについて同一性を全体として計算して全体の同一性パーセンテージを得ることができる。
【０１４４】
本明細書は、本明細書において開示される配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を提供する。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、「獲得する（acquire）」または「獲得すること（acquiring）」という用語は、物体または値、例えば数値を、その物体または値を「直接的に獲得すること」または「間接的に獲得すること」により所有することを指す。「直接的に獲得すること」は、物体または値を得るためにある過程を実行すること（例えば、合成方法または分析方法を実行すること）を意味する。「間接的に獲得すること」は、別の機関または出所（例えば、物体または値を直接的に獲得する第三者機関）から物体または値を受け取ることを指す。物体の直接的な獲得には、物質、例えば出発物質の物理的変化を含む過程を実行することが含まれる。例となる変化には、２つ以上の出発物質からの物体の作製、物質の剪断または断片化、物質の分離または精製、２つ以上の別々の実体の混合物への混合、共有結合または非共有結合の分断と形成を含む化学反応の実行が含まれる。値の直接的獲得には、試料または別の物質の物理的変化を含む過程を実行すること、例えば、試料、分析物、または試薬などの物質の物理的変化を含む分析過程（時には、本明細書において「物理的分析」と呼称される）の実行、分析方法、例えば、次のうちの１つ以上を含む方法の実行が含まれる：物質、例えば、分析物、またはその断片もしくは他の派生物の別の物質からの分離または精製；分析物、またはその断片もしくは他の派生物と別の物質、例えば、緩衝液、溶媒または反応物質との混合；または、分析物、またはその断片もしくは他の派生物の、例えばその分析物の第１原子および第２原子の間の共有結合または非共有結合の分断または形成による構造変化；または、試薬、またはその断片もしくは他の派生物の、例えばその試薬の第１原子および第２原子の間の共有結合または非共有結合の分断または形成による構造変化。
【０１４６】
本明細書において使用される場合、「〜に対応する」という用語は、参照ポリペプチドに関する、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基の位置を指定するために用いられる。概して、その位置は本明細書において提供されるアラインメント（例えば、図４）によって特定される位置である。
【０１４７】
本明細書において使用される場合、「高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応実行の手引きは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1〜6.3.6中に見出すことができ、それは参照により組み込まれる。水性の方法および非水性の方法がその参照文献中に記載されており、どちらも使うことができる。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６５℃での１回以上の洗浄、または実質的に同じ条件が含まれる。本明細書は、本明細書において開示されるアミノ酸配列をコードする核酸、および本明細書、例えば実施例１において開示される核酸に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含有する単離核酸を提供する。
【０１４８】
本明細書において参照される天然タンパク質は、そのようなタンパク質のヒト型、および他の哺乳類種の型もまた特定的に包含する。
【０１４９】
本明細書において引用される全ての特許文書、特許出願公開文書、および公開参照文献は、あらゆる目的について参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】Ｘ線結晶解析のデータから決定されたＰ０４の構造の図。ＩＬ‐１Ｒａに由来する残基の骨格は黒色で示されており、ＩＬ‐βに由来する残基の骨格は灰色で示されている。
【図２】ヒトＩＬ‐１ＲＩの細胞外ドメインに結合したＰ０５タンパク質のモデルの３つの視像を示す図。Ｐ０５では、ＩＬ‐１Ｒａ残基は黒色で示されており、ＩＬ‐１β残基は白色で示されている。
【図３】ＩＬ‐１Ｒａ残基が黒色で示されており、ＩＬ‐１β残基が白色で示されている、キメラタンパク質のモデルを示す図。モデルは次のタンパク質を示す：Ｐ０１（図３Ａ）、Ｐ０３（図３Ｂ）、Ｐ０４（図３Ｃ）、Ｐ０５（図３Ｄ）、Ｐ０７（図３Ｅ）、およびＰ０６（図３Ｆ）。
【図４】いくつかのヒトＩＬ‐１ファミリーサイトカインのアラインメントを提供する図：ＩＬ‐１β（配列番号１）、ＩＬ‐１α（配列番号２）、ＩＬ‐１Ｒａ（配列番号３）、ＩＬ-３３（配列番号４）、ＩＬ‐３６Ｒａ（配列番号５）、ＩＬ‐３６α（配列番号６）、ＩＬ‐３６β（配列番号７）、およびＩＬ‐３６γ（配列番号８）。本明細書の本文において参照されているセグメントがアラインメントの下に特定されている。さらに、ｂ‐シートおよびそのようなシート間のループが特定されている。
【図５Ａ】Ｐ０１のアミノ酸配列（配列番号１７）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｂ】Ｐ０２のアミノ酸配列（配列番号１８）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｃ】Ｐ０３のアミノ酸配列（配列番号１９）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｄ】Ｐ０４のアミノ酸配列（配列番号２０）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｅ】Ｐ０５のアミノ酸配列（配列番号２１）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図６】受容体結合剤を発現する大腸菌細胞から精製されたタンパク質からなる例となる試料を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの画像。１５ｋＤａと２０ｋＤａの分子量マーカーが左に示されている。レーンは次のとおりである：分子量マーカー（レーン１および６）、抽出物（レーン２および７）、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製された物質（レーン３および８）、陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製された物質（レーン４および９）、およびそのような物質の還元試料（レーン５および１０）。レーン２〜５はＰ０５精製のもの、およびレーン６〜１０はＰ０４精製のものである。実施例２も参照されたい。
【図７Ａ】ＩＬ‐１βと陰性対照であるβ‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパク質と比べたＰ０６、Ｐ０７、およびＰ０１タンパク質のシグナル伝達を刺激する能力を示す表および付随の棒グラフ。
【図７Ｂ】様々なＩＬ‐１β濃度におけるＰ０１によるＩＬ‐１βの拮抗作用を示すグラフ。
【図８Ａ】０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１β（ヒト）の存在下におけるＰ０３（ヘキサヒスチジンタグ化）、Ｐ０４（ヘキサヒスチジンタグ化）、Ｐ０５（ヘキサヒスチジンタグ化）、およびＩＬ‐１ＲａによるＩＬ‐１βの拮抗作用を示すグラフ。
【図８Ｂ】０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１β（ヒト）の存在下における非タグ化型のＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５、およびＩＬ‐１Ｒａを含有する溶菌液によるＩＬ‐１βの拮抗作用を示すグラフであって、各溶菌液中のタンパク質濃度の推定値を使用しているグラフ。
【図９】固定化された可溶性ＩＬ‐１ＲＩに対する次のタンパク質、すなわち、ＩＬ‐１β（図９Ａ）、ＩＬ‐１Ｒａ（図９Ｂ）、Ｐ０４（図９Ｃ）、およびＰ０５（図９Ｄ）の結合キネティクスを示すＳＰＲデータのグラフを含む図。
【図１０Ａ】実施例７に記載される、ＩＬ‐１Ｒａ、ＩＬ‐１β、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５の熱変性を示すグラフ。
【図１０Ｂ】図１０Ａ内のグラフの負の一次導関数を示す図。
【図１１Ａ】ドライアイモデルのマウスについて第０日、第３日、第７日、第９日、および第１１日に、２つの独立した試験の中の眼毎の、角膜のフルオレセイン染色により試験した、平均角膜染色スコア±標準誤差（ＳＥＭ）を示す棒グラフ。処置を受けなかった（ｎ＝１８）、１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５の処置を受けた（ｎ＝１９）、またはベヒクルである１．２５×ＰＢＳの処置を受けた（ｎ＝２０）マウスがいた。星印は次のような、ベヒクルと比べたＰ０５の統計的有意性を示す：＊（Ｐ＜０．０５）および＊＊（Ｐ＜０．００５）。
【図１１Ｂ】ドライアイモデルのマウスについて第０日、第３日、第７日、第９日、および第１１日での、眼毎の平均角膜染色スコア±標準誤差（ＳＥＭ）を示す、別個の実験に由来するデータを表す棒グラフ。処置を受けなかった（ｎ＝８）、ベヒクルである１．２５×ＰＢＳの処置を受けた（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）の処置を受けた（ｎ＝８）、または１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５の処置を受けた（ｎ＝９）マウスがいた。星印は次のようなマウス血清アルブミンと比べたＰ０５の統計的有意性を示す：＊（Ｐ＜０．０５）および＊＊＊（Ｐ＜０．０００５）。
【図１１Ｃ】図１１Ｂと同じ実験において、レスタシス（Restasis）（登録商標）（０．０５％サイクロスポリン乳剤）（ｎ＝８）で処置されたマウスのデータを含む棒グラフ。星印は次のようなレスタシス（登録商標）と比べたＰ０５の統計的有意性を示す：＊＊（Ｐ＜０．００５）および＊＊＊（Ｐ＜０．０００５）。
【図１２Ａ】Ｐ０４のＸ線結晶解析構造（黒色）をＰ０４の構造のコンピュータモデル（灰色）に重ね合わせた構造を示す図。
【図１２Ｂ】Ｐ０４のＫ６４とＥ３９の間の相互作用を例示する図。
【図１２Ｃ】Ｐ０４のＣ末端残基Ｑ１４９およびＳ１５２のＫ４０およびＲ９との間の相互作用を例示する図。
【図１３】ｐＨ６．０および３５％Ｂでの溶出について、洗浄および溶出プロファイルを示す拡大されたクロマトグラムを含むグラフ。
【図１４】ｐＨ６．０および３０％Ｂでの溶出について、洗浄および溶出プロファイルを示す拡大されたクロマトグラムを含むグラフ。
【図１５】ｐＨ６．０および３５％Ｂでの溶出を利用する実験から精製されたタンパク質からなる例となる試料を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの画像。
【図１６】ｐＨ６．０および３０％Ｂでの溶出を利用する実験から精製されたタンパク質からなる例となる試料を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの画像。
【図１７Ａ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【図１７Ｂ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【図１７Ｃ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【図１７Ｄ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０１５１】
ＩＬ‐１ファミリーのサイトカインにはいくつかのメンバーが含まれ、全てが、β‐バレルを形成する６つのβストランドとそれに取り付けられた別の６つのβストランドから構成される共通のｂ‐トレフォイル折畳み構造を有する。ヒト型および他の哺乳類型のこれらのサイトカインの一次構造は公知である。いくつかのヒトＩＬ‐１ファミリーメンバーからなる例となる構造アラインメントが図１に示されている。
【０１５２】
我々は、とりわけ、ＩＬ‐１の折畳み構造が可塑性に富むことを発見した。特に、異なるメンバーに由来する要素を組み合わせてサイトカインシグナル伝達を刺激する、またはそれを抑制するタンパク質を提供することができる。これらのタンパク質の例には、例えば、１つのサイトカインに由来する２つ以上のセグメントまたは表面残基を、別のサイトカインまたはサイトカインコンセンサス配列を背景として含み、そうして異なるＩＬ‐１ファミリーサイトカインに由来する受容体相互作用部位からなる非天然型の組合せを作り出すキメラサイトカインドメインが含まれる。
【０１５３】
ＩＬ‐１ファミリーサイトカインは、部位Ａおよび部位Ｂと呼ばれる少なくとも２つの主要な受容体相互作用部位を含み得る。部位ＡおよびＢは主要なサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ‐１ＲＩ）との接触に関与する。ＩＬ‐１ＲａとＩＬ‐１βの場合では、例えば、その２つのタンパク質は、ＩＬ‐１Ｒａによる受容体の接触が部位Ａよりも部位Ｂにおいて少なくなるほど、部位ＡおよびＢについて実質的に異なる。
【０１５４】
我々は、１つのサイトカインに由来する部位Ａと別のサイトカインに由来する部位Ｂを含む機能性キメラサイトカインドメインの構築が可能であることを発見した。ＩＬ‐１の折畳み構造の可塑性により、ＩＬ‐１シグナル伝達を抑制する様々なキメラサイトカインドメインの構築が可能になる。
【０１５５】
さらに、ＩＬ‐１ファミリーサイトカインは、部位Ｃおよび部位Ｄと呼ばれる２つの補助的受容体との相互作用部位であって、活性化作用および／または拮抗作用に関わり、そして、サイトカインの、その補助的サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ‐１ＲＡｃＰ）と相互作用する能力にとって決定的であり得る相互作用部位を含み得る。天然の受容体アンタゴニスト（ＩＬ‐１Ｒａなど）に由来する部位Ｃ残基および／または部位Ｄ残基を含むことにより、拮抗特性が付与され得る。１つ以上のＩＬ‐１アゴニスト（例えば、ＩＬ‐１βとＩＬ‐１α）および／または１つのＩＬ‐１受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）に由来する部位ＡおよびＢの一方または両方、および１つのＩＬ‐１受容体アンタゴニスト（ＩＬ‐１Ｒａなど）に由来する部位ＣおよびＤの一方または両方を含むキメラサイトカインドメインを構築することができる。したがって、シグナル伝達を抑制し、ＩＬ‐１アゴニストに由来する部位Ｂ残基を含むキメラサイトカインドメインを作製することができる。
【０１５６】
例となる組合せは下の表２でも提供される。
【表２】
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【０１５７】
起源配列は、特定されたサイトカインドメインについてヒト配列と同一であり得る、または、それらの起源配列は、別々の領域についてそれぞれヒト配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多い割合で同一であるように、例えば、それぞれの領域に由来する１つ以上のセグメントを含み得るように、そのヒト配列に対して変異を含有し得る。
【０１５８】
部位Ａ残基と部位Ｂ残基の供給源は、主要受容体への親和性を最大にするように選択され得る。例えば、ＩＬ‐１ＲＩに結合するため、部位Ａ残基はＩＬ‐１Ｒａに由来し得、部位Ｂ残基はＩＬ‐１βに由来し得る。
【０１５９】
キメラサイトカインドメインは、１０−８未満、１０−９未満、または１０−１０未満のＫＤ、例えば、同じ条件下で天然受容体リガンド（例えば、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１α、またはＩＬ‐１Ｒａ）の１０倍以内または１００倍以内のＫＤで、または同じ条件下で天然リガンド（例えば、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１α、またはＩＬ‐１Ｒａ）のＫＤ未満のＫＤでＩＬ‐１ファミリー受容体、例えば、ヒトＩＬ‐１ＲＩに結合する能力を有し得る。さらに、ある特定の実施形態では、そのキメラサイトカインドメインは、その親サイトカインドメインのうちの少なくとも１つよりも低いＫＤで、それより速いＫｏｎで、またはそれより遅いＫｏｆｆで結合する。
【０１６０】
ＩＬ‐１ファミリー受容体に結合し、そして、受容体シグナル伝達を阻害するキメラサイトカインドメインは、下で説明するように、ＩＬ‐１ファミリーサイトカインシグナル伝達が介在する障害を治療するための受容体結合剤として使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、そのキメラサイトカインドメインはＩＬ‐１ＲＩに結合し、そして、ＩＬ‐１シグナル伝達を抑制する。例えば、それは１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、または０．３ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインに対して少なくとも４０％、４５％、または５０％同一であり得るが、完全に同一ではなく、例えば、９５％未満、９０％未満、８５％未満、または８０％未満同一である。同時に、前記サイトカインドメインは、第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインに対して少なくとも４０％、４５％、または５０％同一でもあり得るが、完全に同一ではなく、例えば、９５％未満、９０％未満、８５％未満、または８０％未満同一である。第１および第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインは互いに対して５０％未満同一であり得る。例えば、第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインはアゴニスト（例えば、ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１α）であり得、一方、第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインは受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）であり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメイン内の位置の少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、それぞれのそのような位置で、そこに存在するアミノ酸が第１ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインと同一であるか、第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインと同一である（または、特定の位置で第１および第２ＩＬ‐１ファミリーサイトカインが同一である場合、両方と同一である）という性質を有する。前記サイトカインドメイン内のアミノ酸位置の１００％がこの性質を有する場合、前記ドメインは２つのサイトカインからなる完全なキメラである。キメラサイトカインドメインはまた、２つより多くのサイトカインから作製され得、その親サイトカインに対して変異を有することもできる（例えば、１つ以上の特定の位置で、そこに存在するアミノ酸が、その親サイトカインのそれぞれにある対応するアミノ酸と異なる）。
【０１６３】
サイトカインドメインは、様々なＩＬ‐１サイトカインドメインに由来する部位Ａ残基、部位Ｂ残基、部位Ｃ残基、および部位Ｄ残基を有することができ、そして同様に、様々なＩＬ‐１サイトカインドメインに由来する部位Ａ領域、部位Ｂ領域、部位Ｃ領域、および部位Ｄ領域を有することができる。
【０１６４】
部位Ａ．例えば、ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、上で特定された部位Ａ残基のうちの少なくとも５個、１０個、１２個、１５個、１６個、１７個、もしくは１８個で、または上で特定された拡張型部位Ａ残基のうちの少なくとも５個、１０個、１２個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、もしくは２０個で、またはそのような残基の保存的置換で、またはそのような残基の少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％で、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）またはアゴニストに由来する残基を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）またはアゴニスト（例えば、ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１α）内のセグメントＡ１、Ａ２、またはＡ１＋Ａ２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である残基を含む。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書において特定される部位Ａ残基のうちの少なくとも５個、１０個、１２個、１５個、１６個、１７個、もしくは１８個で、または上で特定された拡張型部位Ａ残基のうちの少なくとも５個、１０個、１２個、１５個、１６個、１７個、もしくは１８個で、またはそのような残基の保存的置換で、またはそのような残基の少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％でＩＬ‐１アゴニスト（例えば、ＩＬ‐１β残基）に対して同一である残基を含む。
【０１６６】
部位Ｂ．ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書において特定される部位Ｂ残基のうちの少なくとも２個、３個、５個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、もしくは１５個で、またはそのような残基の保存的置換で、またはそのような残基の少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％でＩＬ‐１アゴニスト（例えば、ＩＬ‐１β残基またはＩＬ‐１α残基）に対して同一である残基を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１サイトカインアゴニスト（例えば、ＩＬ‐１βまたはＩＬ‐１α）内のセグメントＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１＋Ｂ２、Ｂ１＋Ｂ３、Ｂ２＋Ｂ３、またはＢ１＋Ｂ２＋Ｂ３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、または１００％同一である残基を含む。
【０１６７】
部位Ｃ．ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書において特定される部位Ｃ残基のうちの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、もしくは１２個で、そのような残基の保存的置換で、またはそのような残基の少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、もしくは１００％で受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ残基）に対して同一である残基を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）内のセグメントＣ１に対して少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、または１００％同一である残基を含む。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、例えば、配列番号１のＴＨＲ１３７に対応する位置に疎水性アミノ酸（例えば、メチオニンまたはイソロイシン）、または配列番号１のＧＬＮ１４１に対応する位置に疎水性アミノ酸、例えば、脂肪族アミノ酸（例えば、バリンまたはイソロイシン）、および配列番号１のＡＳＰ１４５に対応する位置に非酸性アミノ酸、例えば塩基性アミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）、および他のＩＬ‐１サイトカインにおいてそれらに対応する位置にあるそのような残基のうちの１つ以上を含み得る。Ａｓｐ１４５は、ＩＬ‐１ＲＡｃＰの動員に重要であることが証拠により示されており、したがって、非酸性残基への変異がアゴニスト活性を妨害し、そして、拮抗特性を付与するためにその変異を用いることができる。したがって、ある特定の実施形態では、塩基性アミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）または疎水性アミノ酸などの非酸性アミノ酸は、配列番号１のＡＳＰ１４５に対応する場所に位置する。
【０１６９】
部位Ｄ．ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書において特定される部位Ｄ残基のうちの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個で、またはそのような残基の保存的置換で、またはそのような残基の少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％で受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ残基）に対して同一である残基を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ‐１Ｒａ）内のセグメントＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ１＋Ｄ２、Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３、およびそれらの組合せに対して少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一である残基を含む。
【０１７０】
ＩＬ‐１β内のいくつかの残基、例えば、ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ６、ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＮ３８、ＧＬＮ３９、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、ＰＲＯ５７、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、ＡＳＮ１０８、ＡＬＡ１２７、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、ＭＥＴ１３０、ＧＬＮ１４１、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２はＩＬ‐１ＲＩの近くでそれと接触する、またはＩＬ‐１ＲＩの近くに位置する。上で記述した部位の指定に加えて、これらの残基は２つの集合、すなわち、集合１および集合２に分類され得る。
【０１７１】
ＩＬ‐１β内の例となる集合１残基は次を含む：ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＮ３８、ＧＬＮ３９、ＡＬＡ１２７、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、ＭＥＴ１３０およびＧＬＮ１４１、および他のＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバー内の対応する残基。拡張型集合１残基には相互作用集合１残基および１ＩＴＢ構造内で前述の残基と４オングストローム以内にある残基が含まれる。ＩＬ‐１β内の例となる集合２残基は次を含む：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ６、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、ＰＲＯ５７、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、ＡＳＮ１０８、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０およびＳＥＲ１５２、および他のＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバー内の対応する残基。拡張型集合２残基には、相互作用集合２残基および１ＩＴＢ構造内で前述の残基と４オングストローム以内にある残基が含まれる。ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、上で特定された集合１残基のうちの少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２１個でＩＬ‐１β残基を含む。ある特定の実施形態では、サイトカインドメインは、上で特定された集合２残基のうちの少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、または２２個でＩＬ‐１β残基を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、拡張型集合１残基のうちの少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２１個でＩＬ‐１β残基を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、拡張型集合２残基のうちの少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２１個でＩＬ‐１β残基を含む。
【０１７２】
受容体結合剤として使用され得る他の変異体には、２つ以上のＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーに由来する配列を有するタンパク質が含まれる。そのような変異体の例には、ＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａに基づくキメラドメインが含まれる。例えば、その変異体は、ＩＬ‐１Ｒａの集合１に由来する（例えば、ＩＬ‐１Ｒａに由来する全ての集合１残基）１つ以上のアミノ酸残基、およびＩＬ‐１βの集合２に由来する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、ＩＬ‐１βに由来する全ての集合２残基）を含み得る。
【０１７３】
例となるキメラタンパク質は、次のアミノ酸位置でＩＬ‐１βと、すなわち、ＩＬ‐１β内のこれらの位置との一致に基づき、ほとんど（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である：配列番号１の残基１〜８、４２〜１２０、および１４１〜１５３；配列番号１の残基１〜６、４５〜６１、８６〜９５、および１４８〜１５３；ならびに配列番号１の残基１〜１０、３７〜１２５、および１３１〜１５３。
【０１７４】
残りの残基はＩＬ‐１Ｒａとほとんど（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る。例えば、次のアミノ酸位置がＩＬ‐１Ｒａとほとんど同一であり得る：配列番号１の残基９〜４１および１２１〜１４０；配列番号１の残基７〜４４、６２〜８５、および９６〜１４７；ならびに配列番号１の残基１１〜３６および１２６〜１３０。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインはＩＬ‐１βのアミノ酸位置Ｇｌｎ４８〜Ａｓｎ５３に加えて少なくとも２か所、４か所、５か所、１０か所、または２０か所の位置でＩＬ‐１βと同一であり、そして、例えば、前記サイトカインドメインはＩＬ‐１β以外のサイトカインとほとんど、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１の１〜８番に対応する位置でＩＬ‐１βと同一である少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、または８個の残基を含む。例えば、それは、ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、およびＬＥＵ６のうちの３つ、４つ、または５つ全てに対応する位置でＩＬ‐１βと同一である残基を含む。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１の４５〜６１番に対応する位置でＩＬ‐１βと同一である少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、または１７個の残基を含む。例えば、それは、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、およびＰＲＯ５７のうちの３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つに対応する位置でＩＬ‐１βと同一である残基を含む。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１の８６〜９５番に対応する位置でＩＬ‐１βと同一である少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の残基を含む。例えば、それは、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、およびＬＹＳ９４のうちの１つ、２つ、または３つ全てに対応する位置でＩＬ‐１βと同一である残基を含む。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１の１４８〜１５３番に対応する位置でＩＬ‐１βと同一である少なくとも３個、４個、５個、または６個の残基を含む。例えば、それは、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２のうちの１つ、２つ、または３つ全てに対応する位置でＩＬ‐１βと同一である残基を含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、ＩＬ‐１β内のＴＨＲ１４７に対応する位置でトレオニンを含まない。例えば、この位置は、チロシンなどの芳香族アミノ酸であり得る。ＩＬ‐１β内のＴＨＲ１４７に対応する位置にあるその芳香族アミノ酸は、いくつかの実施形態において（ＩＬ‐１βの番号付に従って）位置１１に存在する別の芳香族アミノ酸（例えば、トリプトファン）の近位に位置し得る。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインはＩＬ‐１β内のＣＹＳ８に対応する位置で芳香族アミノ酸を含まない。例えば、この位置は、フェニルアラニン以外のアミノ酸、または芳香族アミノ酸以外のアミノ酸であり得る。例えば、それは、システイン、バリン、セリン、トレオニンまたはアラニンであり得る。この位置は、他の大残基、特に（ＩＬ‐１βの番号付に従って）ＭＥＴ４４およびＭＥＴ１４８の近位に位置する。位置８、４３、および１４８のうちの３つ全てが大残基ではないことが好ましい。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１の３０〜３６番に対応する位置でＩＬ‐１Ｒａと同一である少なくとも５個、６個、または７個の残基、例えば、ＹＬＱＧＰＮＶ（配列番号４３）と同一である少なくとも５個、６個、または７個の残基を含む。例えば、前記サイトカインドメインは、配列番号１の１１〜３６番に対応する位置でＩＬ‐１Ｒａと同一である少なくとも１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、または２６個の残基を含む。前記サイトカインドメインはまた、配列番号１の１４５番に対応する位置で塩基性残基を含むこともできる。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、（ａ）ＩＬ‐１βのＶａｌ４０に対応する位置でグルタミン酸、およびＩＬ‐１βのＬｙｓ６５に対応する位置でリシン；（ｂ）ＩＬ‐１βのＴｈｒ９に対応する位置でアルギニン、およびＩＬ‐１βのＧｌｎ１４９に対応する位置でグルタミン；ならびに／または（ｃ）ＩＬ‐１βのＶ４１に対応する位置でリシン、およびＩＬ‐１βのＳｅｒ１５２に対応する位置でセリンを含む。
【０１８４】
前記サイトカインドメインはまた、１２６〜１３２番に対応する位置でＩＬ‐１Ｒａと同一である少なくとも４個、５個、６個、または７個の残基、例えば、ＭＥＡＤＱＰＶＳ（配列番号４４）と同一である少なくとも４個、５個、６個、または７個の残基も含み得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、前記サイトカインドメインは、配列番号１の６２〜８５番に対応する位置でＩＬ‐１βと同一である少なくとも１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個の残基を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、前記サイトカインドメインは次のアミノ酸配列のうちの１つ以上（例えば、４つ全て）を含む：ＲＳＬＡＦＲ（配列番号４５）、ＩＤＶＳＦＶ（配列番号４６）、ＫＫＭＤＫＲ（配列番号４７）、およびＫＦＹＭＱＦ（配列番号４８）；次のうちの１つ以上（例えば、４つ全て）：ＲＳＬＡＦＲ（配列番号４５）、ＩＤＶＳＦＶ（配列番号４６）、ＮＫＬＳＦＥ（配列番号４９）、およびＫＦＹＭＱＦ（配列番号４８）；次のうちの１つ以上（例えば、４つ全て）：ＲＳＬＡＦＲ（配列番号４５）、ＥＥＫＦＳＭ（配列番号５０）、ＲＦＶＦＩＲ（配列番号５１）、およびＶＴＫＦＴＭ（配列番号５２）；次のうちの１つ以上（例えば、４つ全て）：ＲＳＬＡＦＲ（配列番号４５）、ＥＥＫＦＳＭ（配列番号５０）、ＦＥＳＡＡＣ（配列番号５３）、およびＶＴＫＦＴＭ（配列番号５４）；または次のうちの１つ以上（例えば、４つ全て）：ＬＮＣＲＩＷ（配列番号５５）、ＥＥＫＦＳＭ（配列番号５０）、ＰＮＷＦＬＣ（配列番号５６）、およびＫＦＹＭＱＦ（配列番号４８）。
【０１８７】
キメラタンパク質は様々な目的のために使用され得る。例えば、受容体シグナル伝達活性を上昇または低下させるために、受容体を発現している細胞を検出するために、または、キメラタンパク質が結合する細胞またはタンパク質を精製するために、それらのキメラタンパク質を使用することができる。
【０１８８】
ＩＬ‐１βとＩＬ-Ｒａに基づくキメラサイトカインドメインの具体的な例は、下の実施例１において提供され、そして、ＩＬ‐１シグナル伝達を抑制する、次の例となるサイトカインドメインを包含する。
【０１８９】
Ｐ０１．Ｐ０１ドメインは、配列番号３のアミノ酸Ａｌａ１２〜Ｖａｌ４８、Ｉｌｅ６０〜Ｖａｌ８３、およびＡｓｐ９５〜Ｔｙｒ１４７に対応するＩＬ‐１Ｒａに由来する３つのセグメント、およびＩＬ‐１βに由来する残りの４つのセグメントを含む。全体として、Ｐ０１ドメインは、ＩＬ‐１βに由来する１５３アミノ酸のうちの７４アミノ酸（約４８％同一性）およびＩＬ‐１Ｒａに由来する１１９アミノ酸（約７７％同一性）を有する。これらのパーセンテージは総計で１００％よりも大きくなる。なぜなら、Ｐ０１および本明細書において開示される他の例となるタンパク質の多数のアミノ酸がＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａの間で保存されているアミノ酸であり、したがって、それらがＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａの両方の同一性パーセンテージに寄与するからである。
【０１９０】
Ｐ０２．Ｐ０２ドメインは、配列番号３のアミノ酸Ａｌａ１２〜Ｖａｌ４８、Ｉｌｅ６０〜Ｖａｌ８３、およびＳｅｒ１１０〜Ｔｙｒ１４７に対応するＩＬ‐１Ｒａに由来する３つのセグメント、およびＩＬ‐１βに由来する残りの４つのセグメントを含む。全体として、Ｐ０２ドメインは、ＩＬ‐１βに由来する１５３アミノ酸のうちの８５アミノ酸（約５５％同一性）およびＩＬ‐１Ｒａに由来する１０８アミノ酸（約７０％同一性）を有する。
【０１９１】
Ｐ０３．Ｐ０３ドメインは、配列番号３のアミノ酸Ａｌａ１２〜Ｌｙｓ４５およびＰｈｅ１００〜Ｌｙｓ１４５に対応するＩＬ‐１Ｒａに由来する２つのセグメント、およびＩＬ‐１βに由来する残りの３つのセグメントを含む。全体として、Ｐ０３ドメインは、ＩＬ‐１βに由来する１５３アミノ酸のうちの９４アミノ酸（約６１％同一性）およびＩＬ‐１Ｒａに由来する９１アミノ酸（約６４％同一性）を有する。
【０１９２】
Ｐ０４．Ｐ０４ドメインは、配列番号３のアミノ酸Ａｌａ１２〜Ｌｙｓ４５およびＡｌａ１１４〜Ｌｙｓ１４５に対応するＩＬ‐１Ｒａに由来する２つのセグメント、およびＩＬ‐１βに由来する残りの３つのセグメントを含む。全体として、Ｐ０４ドメインは、ＩＬ‐１βに由来する１５３アミノ酸のうちの１０４アミノ酸（約６８％同一性）およびＩＬ‐１Ｒａに由来する８９アミノ酸（約５８％同一性）を有する。
【０１９３】
Ｐ０５．Ｐ０５ドメインは、配列番号３のアミノ酸Ａｒｇ１４〜Ｌｙｓ４５およびＰｈｅ１２０〜Ｔｙｒ１４７に対応するＩＬ‐１Ｒａに由来する２つのセグメント、およびＩＬ‐１βに由来する残りの３つのセグメントを含む。全体として、Ｐ０５ドメインは、ＩＬ‐１βに由来する１５３アミノ酸のうちの１０８アミノ酸（約７０％同一性）およびＩＬ‐１Ｒａに由来する８５アミノ酸（約５５％同一性）を有する。
【０１９４】
他のキメラタンパク質を同様に構築することができる。例えば、ＩＬ‐１αとＩＬ‐１Ｒａの間でキメラタンパク質をすることができ、例えば、具体的には、ドメインは、上の例のそれぞれについてＩＬ‐１Ｒａの前記の特定されたセグメントとＩＬ‐１βよりもむしろＩＬ‐１αに由来する対応する残基を組合せて含む。
【０１９５】
タンパク質の修飾と置換
タンパク質配列、例えば本明細書に記載される配列は、例えば、１つ以上の保存的置換を行うことにより変更され得る。保存的置換を行って機能を保持する、または機能に適度の変化を与えることができる。例となる保存的置換が次の表に記載される。
【表３】
2014522868.tif 000005
2014522868.tif 000006
【０１９６】
置換は、（ａ）置換の近傍の骨格構造、例えば、シートまたはらせん構造、（ｂ）目的の部位にある分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の体積および分岐に与えるそれらの置換の効果の可能性に基づいて選択され得る。アミノ酸残基は側鎖の特性に基づいて分類され得る：（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；（２）中性親水性：システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン；（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（４）塩基性：ヒスチジン、リシン、アルギニン；（５）骨格構造に影響する残基：グリシン、プロリン；および（６）芳香族アミノ酸：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０１９７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーで異なるクラスのメンバーを置換することを含み得る。保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーで同じクラスの別のメンバーを置換することを含み得る。
【０１９８】
特定の残基の重要性は、アミノ酸の疎水性（hydropathic）指標との関係で評価される場合もある。それぞれのアミノ酸には、その疎水性と電荷特性に基づく疎水性指標が割り当てられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。疎水性アミノ酸指標とその重要性に関する考察について、例えば、Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131を参照されたい。
【０１９９】
タンパク質の配列は、オリゴヌクレオチド介在性（部位特異的）変異形成（Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487, 1987）、カセット式変異形成(Wells et al., Gene, 34:315, 1985)、制限選択式変異形成（Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London, 317:415, 1986）、およびＰＣＲ式変異形成を含むあらゆる方法によって変更され得る。In Vitro Mutagenesis Protocols: 第３版、Braman (編), Humana Press, (2010) ISBN: 1607616513 およびPCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering, Chen and Janes (編), Humana Press, (2002) ISBN: 0896039730も参照のこと。
【０２００】
スキャニング・アミノ酸分析を、連続する配列に沿って１つ以上のアミノ酸を評価するために用いることができる。その方法は、領域内の各々のアミノ酸またはほぼ各々のアミノ酸を特定のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはバリンなどの比較的小型で中性のアミノ酸に変異させることを含み得る。アラニンはβ炭素を越える側鎖を排除しており、変異体の主鎖の立体構造を変える可能性が低いので、アラニンが選択されるのが通常である(Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989)。アラニンは最も一般的なアミノ酸でもあり、そして、タンパク質内部に埋まった位置およびタンパク質表面に露出した位置の両方で頻繁に見いだされる（Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.）、Chothia, J. Mol. Biol., 150:1, 1976）。より顕著な変更をおこなうためにスキャニング過程を適用することができ、例えば、荷電残基を反対の電荷を有する残基に変更することができ、短い側鎖を有する残基を大きい側鎖を有する残基で置換することができる。例えば、アルギニン・スキャニングは、アラニン・スキャニングの代わりに、またはアラニン・スキャニングに加えて用いることができるアプローチである。そのスキャニングを、領域内の各残基に、または特定の特性を有する残基、例えば、タンパク質の表面もしくはその近くの残基、またはそのタンパク質の表面もしくはその近くにありそうな残基に適用することができる。
【０２０１】
タンパク質の構造、そのドメインのうちの１つの構造、またはそのタンパク質を含む複合体の構造を、例えば、相同性ベース・モデル化法、エネルギー最小化法、および／または公知の解明済みの構造を使用する他のモデル化法を実行することによりモデル化することができる。そのような方法には、サンディエゴにあるＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社が２０１０年に公開したＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（登録商標）、リリース３．０、ＡＭＢＥＲ（商標）モデリング・ソフトウェア（Case et al. (2005) J. Computat. Chem. 26, 1668-1688 およびCase et al. (2010), AMBER 11, カリフォルニア州立大学サンフランシスコ校、米国カリフォルニア州）およびＣＨＡＲＭＭ（商標）モデリング・ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）が含まれる。Baker and Sali, Science 294(5540):93-6, 2001も広く参照されたい。構造を直接的に、例えば、Ｘ線結晶構造解析および／またはＮＭＲスペクトル分析を用いて決定することもできる。
【０２０２】
ＩＬ‐１ファミリーサイトカインの構造について説明する例となるＰＤＢ構造には１Ｉ１Ｂ、１ＩＬＲ、１ＩＲＡ、１ＩＴＢ、２Ｉ１Ｂ、２ＩＬＡ、２ＫＬＬ、４Ｉ１Ｂ、５Ｉ１Ｂ、６Ｉ１Ｂ、７Ｉ１Ｂ、８Ｉ１Ｂ、９ＩＬＢ、および１ＭＤ６が含まれる（米国ニュージャージー州ピスカタウェイにあるＲＣＳＢ‐ラトガース共同研究機構から、および米国国立医学図書館（米国、メリーランド州、ベセスダ）からオンラインによりpdb.orgで入手可能である）。例えば、ＩＬ‐１βのみの構造および受容体ＩＬ‐１ＲＩとの複合体での構造が解明されている。例えば、 Finzel et al. (1989) J. Mol. Biol. 209: 779-791、ＰＤＢ  １ＩＴＢ、および Vigers et al. (1997) Nature 386: 190-194を参照のこと。ＩＬ‐１ＲＩが付いたＩＬ‐１Ｒａの構造も解明されている。例えば、ＰＤＢ  １ＩＲＡおよびSchreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200を参照のこと。
【０２０３】
相同性モデル化法を（複数の）配列のアラインメントにより、例えば、基本的局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）、ＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ‐ＢＬＡＳＴ、ＷＵ‐ＢＬＡＳＴ‐２、および／またはＭＥＧＡＢＬＡＳＴなどのコンピュータソフトウェアを用いて支援することができる。Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410、 Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266, 460-480、およびKarlin et al., 1993, PNAS USA 90, 5873-5787を参照のこと。巨大分子（アミノ酸配列および核酸配列）のアラインメントを行うためのさらなるアルゴリズムには、ＦＡＳＴＡ（Pearson, 1995, Protein Science 4, 1145-1160）、 ＣｌｕｓｔａｌＷ（Higgin et al., 1996, Methods Enzymol. 266, 383-402）、ＤｂＣｌｕｓｔａｌ（Thompson et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28, 2910-2926）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（Chemical Computing Group, Montreal, Quebec Canada H3A 2R7）が含まれる。さらに、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージのＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Myers & Miller, CABIOS 4, 11-17, 1988）を用いることができる。
【０２０４】
ＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａのコンセンサス配列を、その２つの配列を比較し、そして、同一である残基または高度に保存されている残基を特定することにより得ることができる。本明細書に記載されるキメラサイトカインドメインは、そのような同一である残基または高度に保存されている残基のうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を有し得る。例となるコンセンサス配列は、ＤＸＸＱＫＸ｛８〜９｝Ｌ−ＡＸＸＬＱＧＸ｛１８〜２８｝ＬＧＸ｛７｝ＬＳＣＶＸＸＸＤＸＸＸＬＱＬＥＸＶＸ｛８〜９｝ＫＸＸＫＲＦＸＦＸ｛１０｝ＦＥＳＡＸＸＰＸＷＸＸＸＴＸＸＸＸＸＸＰＶＸＬＸ｛５〜６｝ＧＸＸＸＴＸＦＸＸＱ（配列番号５７）であり、その配列でＸは独立して任意のアミノ酸であり、そして、下付きの数または範囲はそのアミノ酸の出現数である。本明細書に記載されるキメラサイトカインドメインは、そのコンセンサス配列（その配列の中でＸ残基は同一性の対象として計数しない）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有し得る。他のコンセンサス配列は、同様にして特定され得る。
【０２０５】
ＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーのさらなる変異体は、ディスプレイ・ベースの系または他のライブラリー・ベースのスクリーニングを用いて作製および評価され得る。例えば、前記タンパク質変異体は、呈示または発現させられ、そして、ＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーの受容体に結合する能力について評価され得る。例えば、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１Ｒａ、または本明細書に記載されるサイトカインドメインの変異体はＩＬ‐１ＲＩの可溶性細胞外ドメインに結合する能力について評価され得る。ディスプレイ・ベースの系についての一般的な説明には次のものが含まれる：細胞ディスプレイについては、Chao et al. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68、Colby et al. Methods Enzymol. 2004;388:348-58、Boder et al., Methods Enzymol. 2000;328:430-44)、ファージディスプレイについては、（例えば、Viti et al., Methods Enzymol. 2000;326:480-505およびSmith (1985) Science 228:1315-1317）、およびリボソームディスプレイについては（例えば、 Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 および Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92、Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30、および Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-3。
【０２０６】
多くの実施形態が本明細書においてヒトＩＬ‐１サイトカイン配列を親ドメインとして用いて例示されているが、他の配列を使用することができる。例えば、他の種に由来する多数の他のＩＬ‐１サイトカインが知られており、利用可能であり、そして、Ｅｎｔｒｅｚ（メリーランド州、ベセスダの米国国立医学図書館）およびＥＢＩ‐ＥＭＢＬ（英国、ケンブリッジシャー、ヒンクストン）などの公立のデータベースにおいて見つけ出すことができる。ＵＮＩＰＲＯＴデータベースからのそのような配列の例（UniProt.orgで利用可能であり、そして、The UniProt Consortium, Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)を参照のこと）には次のものが含まれる：
【表４】
2014522868.tif 000007
【０２０７】
本明細書に記載されるサイトカインドメインは、ＩＬ‐１ＲＩに結合することができる変異体サイトカインドメインに存在する置換を含むこともできる。例えば、配列番号１の位置１５（配列番号３の位置２０に対応する）はメチオニンまたはアスパラギンでありうる。配列番号１の位置３０（配列番号３の位置３４に対応する）はグリシン、ヒスチジン、トリプトファン、またはメチオニンであり得る。
【０２０８】
ＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａのさらなる例となる変異体には、Boraschi et al. (1996) Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library 1, d270-308、 Evans et al., J. Biol. Chem., 270:11477 (1995）およびGreenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995)に記載される変異体が含まれる。例えば、ＩＬ‐１βの変異体にはＲ１１Ｇ、Ｒ１１Ａ、Ｑ１５Ｈ、Ｅ１０５Ｇ、およびＴ１４７Ｇが含まれる。例えば、Evans et al.を参照のこと。ＩＬ‐１Ｒａの変異体にはＷ１６Ｙ、Ｑ２０Ｍ、Ｑ２０Ｎ、Ｙ３４Ｇ、Ｙ３４Ｈ、Ｙ３４Ｗ、Ｙ３４Ｍ、Ｙ１４７Ｇ、Ｙ１４７Ｈ、Ｙ１４７Ｍ、Ｋ１４５Ｄ、Ｈ５４Ｐ、Ｖ１８Ｓ、Ｔ１０８Ｋ、Ｃ１１６Ｆ、Ｃ１２２Ｓ、Ｃ１２２Ａ、Ｙ１４７Ｇ、Ｈ５４Ｐ、Ｈ５４Ｉ、ならびにEvans et al. および Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995)中の他の変異体が含まれる。サイトカインドメインは、前述の位置のうちの１つでＩＬ‐１Ｒａと同一である残基を含み得る。サイトカインドメインはまた、前述の変異のうちの１つと異なる残基を対応する位置で含むこともできる。
【０２０９】
さらに、ＩＬ‐１ファミリーサイトカインは、１つ以上の不対システイン残基を含み得る。１つ以上、例えば、２つ、３つ、または全てのそのような不対システイン残基は変異形成されて別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンなどの非荷電アミノ酸になり得る。例えば、Ｐ０１は配列番号１７の位置６７、７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１つ、２つ、３つ、または４つ全てのそのようなシステインは別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンなどの非荷電アミノ酸で置換され得る。Ｐ０２は配列番号１８の位置６７、７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１つ、２つ、３つ、または４つ全てのそのようなシステインは別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンなどの非荷電アミノ酸で置換され得る。Ｐ０３は配列番号１９の位置７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１つ、２つ、または３つ全てのそのようなシステインは別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンなどの非荷電アミノ酸で置換され得る。Ｐ０４は配列番号２０の位置７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１つ、２つ、または３つ全てのそのようなシステインは別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンなどの非荷電アミノ酸で置換され得る。Ｐ０５は配列番号２１の位置８、７０、および１２２にシステインを含む。１つ、２つ、または３つ全てのそのようなシステインは別のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンなどの非荷電アミノ酸で置換され得る。
【０２１０】
本明細書に記載されるキメラサイトカインドメインを包含するＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインを循環置換することもできる。例えば、前記ドメインのＣ末端セグメントを再配置して、それがもとのＮ末端とＮ末端セグメント（一般に、Ｃ末端セグメントの切除後にもとのタンパク質の残りの部分を含む）のＮ末端側にあるようにすることができる。その２つの再配置されたセグメントは（例えば、約３アミノ酸〜１０アミノ酸の間の）リンカーによって分断され得る。概して、置換前の前記ドメイン内の全てのアミノ酸が、順序の他は保持される。いくつかの実施形態では、その置換のための切断点は可動領域内、例えば、ｂ６〜ｂ７ループ（例えば、配列番号３の７１〜８０番に対応するアミノ酸）またはｂ７〜ｂ８ループ（例えば、配列番号３の８４〜９９番に対応するアミノ酸）などの可動性ループ内に存在し得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される受容体結合剤、例えば、ＩＬ‐１ファミリーサイトカインドメインを含む受容体結合剤は、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２２ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、１９ｋＤａ未満、１８ｋＤａ未満、または約１７ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、その受容体結合剤は１８ｋＤａ超、１９ｋＤａ超、２０ｋＤａ超、２２ｋＤａ超、２５ｋＤａ超、３０ｋＤａ超、４０ｋＤａ超、４５ｋＤａ超、または５０ｋＤａ超の分子量を有する。例えば、その受容体結合剤は、他のポリペプチド、重合性成分または非重合性成分、例えば、薬剤の薬物動態、安定性、免疫原性、および／または分子量を修飾する成分を含み得る。そのタンパク質は他の修飾、例えば、翻訳後修飾または合成による修飾を含み得る。ある特定の実施形態では、前記受容体結合剤は糖鎖修飾を受けていない。他の実施形態では、前記受容体結合剤は少なくとも１つの糖鎖修飾を含む。
【０２１２】
例えば、本明細書に記載される受容体結合剤は、追加のドメインと形体を含み得る。例えば、受容体結合剤は抗体タンパク質のドメインに、例えば、Ｆｃドメインまたは１つ以上の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）に直接的または間接的に融合され得る。例えば、前記ドメインはヒトのドメインまたはヒトのドメインの変異体であり得る。Ｆｃドメインまたは１つ以上の定常ドメインは受容体結合剤のＮ末端側またはＣ末端側に位置し得る。
【０２１３】
Ｆｃドメインを、あらゆる適切な免疫グロブリンから、例えば、ヒト抗体、例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭの抗体などから得ることができる。一例では、そのＦｃドメインにはおよそ位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはおよそ位置Ｐｒｏ２３０からＦｃドメインのカルボキシル末端までの配列が含まれる。Ｆｃドメインは一般に２つの定常ドメインでありＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含み、および随意でＣＨ４ドメインを含む。抗体のＦｃ領域に置換を有し、そして増加した血清半減期を有する抗体は国際公開第００／４２０７２号、国際公開第０２／０６０９１９号、Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)、Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)にも記載されている。ＩｇＧ重鎖内の残基の番号付は、メリーランド州にある米国公衆衛生局国立衛生研究所（１９９１年）出版の Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版中のＥＵ指標の番号付であって、その中のヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付を参照した番号付である。
【０２１４】
１つの実施形態では、受容体結合剤は、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号およびGhetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000)に記載されるように、インビボ血清半減期を増加させるサルベージ受容体結合エピトープを含む。いくつかの実施形態では、そのエピトープはその受容体結合剤に融合されているＦｃ領域内に含まれる。
【０２１５】
１つの実施形態では、受容体結合剤は血清アルブミン配列、またはＦｃＲｎ受容体に結合するような配列の一部分、または血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンに結合する配列を含む。例えば、血清アルブミンに結合するある特定のペプチドは前記の受容体結合剤、例えば、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号２２）という配列と結合し得る。Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)も参照されたい。
【０２１６】
受容体結合剤は修飾されて、その薬剤のサイズおよび安定性を増加させる配列、例えば、国際公開第２００８／１５５１３４号または国際公開第２００９／０２３２７０号に記載されている配列を含むことができる。そのような配列は概して生物学的に不活性であり得、例えば、それはＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーが介在するシグナル伝達を調節することがない。様々な安定化ポリペプチド配列、例えば、グリシンやセリンに富む配列、ならびにグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンまたはプロリンなどの他のアミノ酸に富む配列を使用することができる。例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％グリシンおよび／またはセリン残基を含むように配列を設計することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質に付加される安定化ポリペプチド配列の合計の長さは少なくとも２０アミノ酸、２５アミノ酸、３５アミノ酸、５０アミノ酸、６０アミノ酸、７０アミノ酸、８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸、６００アミノ酸、７００アミノ酸、８００アミノ酸、９００アミノ酸、または１０００アミノ酸もしくは２０００アミノ酸よりも長くあり得る。安定化配列は、例えば、生物学的活性が有るポリペプチドに、例えば受容体結合剤のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。安定化配列の融合により、非修飾型タンパク質と比べてその融合タンパク質の流体力学半径を著しく増加させることができ、その増加は、例えば、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィーまたは光分散によって検出され得る。いくつかの実施形態では、安定化配列は次のアミノ酸をほとんど、または全く含有しない：システイン（ジスルフィド形成と酸化を防ぐため）、メチオニン（酸化を防ぐため）、アスパラギンおよびグルタミン（脱アミド化を防ぐため）およびアスパラギン酸。安定化配列を、タンパク質分解性の変質に対する感受性を低下させる傾向があるプロリン残基を含むように設計することができる。
【０２１７】
結合アッセイ
受容体結合剤とその標的の相互作用を、例えば放射免疫アッセイ、細胞結合アッセイ、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含むあらゆる適切なアプローチを用いて分析することができる。放射性ヨウ素化タンパク質競合を用いる例となる細胞結合アッセイがBoraschi et al., J. Immunol., 155(10):4719-25 (1995)に記載されている。
【０２１８】
ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）はリアルタイムで、および、相互作用物のいずれも標識することなく生体分子特異的相互作用を検出することができる。ＢＩＡチップの結合面での質量の変化（結合事象を示す）によりその表面近傍での光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）が起こる。その屈折率の変化が検出可能なシグナルを生じ、そのシグナルが生体分子間のリアルタイムの反応の指標として測定される。ＳＰＲを用いる方法は、例えば、Raether, 1988, Surface Plasmons, Springer Verlag、Sjolander and Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345、Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 、およびBIAcore International AB社（スウェーデン、ウプサラ）により提供されるオンライン情報源に記載されている。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムまたはＲｅｉｃｈｅｒｔ  ＳＲ７０００ＤＣ  Ｄｕａｌ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＳＰＲを使用して、キネティクス、親和性または特異性について、標識を使用することなくリアルタイムで相互作用を比較およびランク付けすることができる。サイトカイン受容体細胞外ドメイン（例えば、ＩＬ‐１ＲＩの細胞外ドメイン）の受容体結合剤の結合親和性はおよそ生理的な条件、例えば、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のツイーン２０の下でＳＰＲを用いて測定され得る。ＳＰＲに依らない他の方法も、例えば、結合および親和性を測定するために用いられ得る。
【０２１９】
結合アッセイから得られた情報を使用して正確で定量的な平衡解離定数（ＫＤ）の測定値、および受容体結合剤の標的への結合についての反応速度論的パラメータ（例えば、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）を提供することができる。そのようなデータを使用して異なるタンパク質、標的および条件を比較することができる。この情報を使用して構造活性相関（ＳＡＲ）を展開することもできる。例えば、変異体タンパク質の反応速度論的パラメータおよび平衡結合パラメータを参照物質または親タンパク質のパラメータと比較することができる。特定の結合パラメータ、例えば、高親和性および低速Ｋｏｆｆと相関する所与の位置での変異体アミノ酸を特定することができる。この情報を（例えば、相同性モデル化法、エネルギー最小化法、またはＸ線結晶構造解析もしくはＮＭＲによる構造決定を用いる）構造モデル化と組み合わせることができる。
【０２２０】
親和性の評価に使用するタンパク質は、組換え型として作製され得、そして、精製または固定化に適切なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニンタグ、ヒスチジンタグ、またはＦｃドメイン融合を含み得る。受容体タンパク質（例えば、ＩＬ‐１ＲＩ、およびＩＬ‐１ＲＡｃＰ）の細胞外ドメインを、例えば、細菌細胞または昆虫細胞での発現により、例えば、Ｓｆ９細胞でのバキュロウイルス発現を用いて組み換え型として作製することができる。可溶性受容体タンパク質を、例えば、それらのタグに結合する試薬を含むチップ、例えば、Ｆｃドメインまたは他のタグに特異的なＩｇＧで被覆されたチップを使用してＢＩＡｃｏｒｅシステムに固定化することができる。
【０２２１】
細胞活性アッセイ
受容体結合剤の受容体アンタゴニストとして機能する能力を、例えば、細胞ベースの測定法で評価することができる。例えば、受容体結合剤によるＩＬ‐１ＲＩ阻害を評価することができる。ＩＬ‐１活性のいくつかの例となる測定法がBoraschi et al.（上掲）に記載されており、そして、その測定法にはＴ細胞増殖アッセイ、ＩＬ‐６産生アッセイおよびＩＬ‐８産生アッセイ、およびカルシウム流入阻害が含まれる。
【０２２２】
一例となる測定法では、受容体結合剤のその能力は、ヒト線維芽細胞からのＩＬ‐６のＩＬ‐１β誘導化放出を阻害するその能力について評価される。ＭＲＣ５細胞におけるＩＬ‐１β誘導化サイトカイン放出の阻害はＩＬ‐１介在性活性をインビボで阻害するその薬剤の能力と相関する。その測定法の詳細はDinarello et al., Current Protocols in Immunology, Ch. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., 2000に記載されている。簡単に説明すると、ヒトＭＲＣ５ヒト線維芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ‐１７１、米国、バージニア州、マナサス）をマルチウェルプレート内で集密になるまで培養する。細胞を設定した用量の受容体結合剤および対照で処理する。その後、細胞をその用量設定した薬剤および／または対照の存在下で１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ‐１βと接触させる。陰性対照細胞にはＩＬ‐１βで刺激を与えない。各群の処理細胞で放出されたＩＬ‐６の量を、ＩＬ‐６  ＥＬＩＳＡキット（例えば、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、米国、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス）を使用して測定する。使用することができる対照には緩衝液のみ、ＩＬ‐１Ｒａ、およびＩＬ‐１βに対する抗体が含まれる。
【０２２３】
受容体結合剤の効力をインビボで評価することもできる。例となる測定法はEconomides et al., Nature Med., 9:47-52 (2003)に記載されている。簡単に説明すると、マウスに設定した用量の受容体結合剤および対照を腹腔内注射する。注射から２４時間後に、マウスに１ｍｇ／ｋｇの用量で組換えヒトＩＬ‐１βを皮下注射する。ＩＬ‐１βの注射から２時間後（ＩＬ‐６応答のピーク時間）にマウスを殺処理し、そして、血液を採取し、処理して血清を得る。血清ＩＬ‐６レベルをＥＬＩＳＡにより測定する。阻害の割合（％）を実験動物の血清で検出されたＩＬ‐６の対照で検出されたＩＬ‐６に対する比率に基づいて計算することができる。
【０２２４】
インビボでのＩＬ‐１活性についての他の例となる測定法がBoraschi et al.（上掲）に記載されており、そして、その測定法には食欲低下アッセイ、低血糖血アッセイ、および好中球増加血アッセイが含まれる。
【０２２５】
作製
受容体結合剤は組換え宿主細胞における発現によって作製され得るが、インビトロ転写と翻訳、および化学合成などの他の方法によっても作製され得る。
【０２２６】
細胞による発現では、受容体結合剤をコードする１つ以上の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）をクローニングまたは発現のための複製可能なベクターに挿入することができる。様々なベクターが公開されており、利用可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、ファージミド、ファージゲノム、または他の自律複製性配列であり得る。適切なコード核酸配列を様々な技法によりベクターに挿入することができる。例えば、適切な制限酵素部位を（例えば、ＰＣＲを用いて）設計することができる。次いで、制限酵素消化とライゲーションを用いてコード核酸配列を適切な場所に挿入することができる。ベクターの要素は通常、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上を含む。
【０２２７】
受容体結合剤は単独で組換え技術により作製され得るが、シグナル配列、エピトープまたは精製部分、および標識などの１つ以上の他の成分への融合によっても組換え技術により作製され得る。受容体結合剤はインターロイキン‐１ファミリーメンバーのプロドメインを含むことができ、例えば、そのプロドメインはタンパク質分解処理により除去され得る。
【０２２８】
細菌による発現では、受容体結合剤を、シグナル配列を付けて、またはシグナル配列を付けずに作製することができる。例えば、その受容体結合剤を細胞内で産生することができ、それでその受容体結合剤は封入体に、または可溶性画分に蓄積する。その受容体結合剤を、例えば、原核生物性シグナル配列、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩなどに由来する適切なリーダー配列を付加することにより、分泌させることもできる。発現用の例となる細菌性宿主細胞にはあらゆる形質転換可能な大腸菌Ｋ‐１２株（例えば、大腸菌ＢＬ２１、Ｃ６００、ＡＴＣＣ２３７２４；大腸菌ＨＢ１０１  ＮＲＲＬＢ‐１１３７１、ＡＴＣＣ‐３３６９４；大腸菌ＭＭ２９４  ＡＴＣＣ‐３３６２５；大腸菌Ｗ３１１０  ＡＴＣＣ‐２７３２５、および大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３））、枯草菌（B. subtilis）、シュードモナス属、および他の桿菌の株が含まれる。細菌系で産生されたタンパク質は通常糖鎖修飾されていない。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される受容体結合剤は実質的に糖鎖修飾を含まず、例えば、哺乳類または他の真核細胞の糖鎖修飾を含まない。
【０２２９】
受容体結合剤を酵母宿主細胞、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（ Schizosaccharomyces pombe）、ハンゼヌラ属（Hanseula）、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現させることができる。酵母発現では、受容体結合剤を細胞内で産生することもでき、または、例えば、酵母インベルターゼリーダーまたはα因子リーダー（サッカロマイセス型およびクルイベロマイセス型を含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、またはカンジダ・アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開された欧州特許第３６２，１７９号）を使用して分泌により産生することもできる。哺乳類細胞発現では、同じ種または近縁の種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列ならびにウイルス性分泌リーダーなど、哺乳類シグナル配列を使用して前記タンパク質が分泌するようにすることができる。あるいは、受容体結合剤を、インターロイキン‐１ファミリーメンバーのプロドメイン、例えば、ＩＬ‐１αプロドメインまたはＩＬ‐１βプロドメインを使用して産生することができる。
【０２３０】
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、そのベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含有する。そのような配列は様々な細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大半のグラム陰性細菌にとって適切であり、２ｍプラスミド起点は酵母にとって適切であり、そして、様々なウイルス性起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳類細胞でのクローニングベクターにとって有用である。
【０２３１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常選択遺伝子または選択マーカーを含有する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンへの抵抗性を付与するタンパク質をコードし、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するタンパク質（例えば、サッカロマイセス属におけるＵＲＡ３マーカー）をコードし、または（ｃ）複合培地からは入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、その遺伝子は桿菌のためのＤ‐アラニンラセマーゼをコードする。様々なマーカー、例えばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼが哺乳類細胞にも利用可能である。ＤＨＦＲを、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)によって説明されるように、ＤＨＦＲ活性に欠損を有する細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）と併せて使用することができ、調製し、そして増殖させることができる。
【０２３２】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、受容体結合剤をコードする核酸配列に機能するように結合された、ｍＲＮＡを合成させるためのプロモーターを含有する。原核生物性宿主との使用に適切な例となるプロモーターにはｂ‐ラクタマーゼプロモーターシステムおよびラクトースプロモーターシステム(Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776)、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)）が含まれる。細菌系で使用するためのプロモーターは適切に位置するシャイン・ダルガノ配列を含有することもできる。また、Ｔ７ポリメラーゼシステムを使用して、Ｔ７プロモーターの制御下に置かれている核酸コード配列を発現させることもできる。例えば、ｐＥＴベクター（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、米国、ニュージャージー州、ギブスタウン）および、例えば、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手可能なＮｏｖａｇｅｎ使用者プロトコルＴＢ０５３および米国特許代５，６９３，４８９号に記載されているような宿主細胞を参照のこと。例えば、そのようなベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞と併用してタンパク質を、例えば、細胞培養物１ｍｌ当たり少なくとも０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、または０．３ｍｇ作製することができる。使用することができる他の細胞株にはＢ８３４のＤＥ３ライソジェン型、ＢＬＲのＤＥ３ライソジェン型、ＨＭＳ１７４のＤＥ３ライソジェン型、ＮｏｖａＢｌｕｅのＤＥ３ライソジェン型が含まれ、それらの細胞株にはｐＬｙｓＳプラスミドを担持する細胞が含まれる。
【０２３３】
酵母細胞と使用するための例となるプロモーターには３‐ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)）または他の解糖系の酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース‐６‐リン酸イソメラーゼ、およびピルビン酸キナーゼのためのプロモーターが含まれる。他の例となる酵母プロモーターは誘導可能であり、培養条件により転写が制御されるというさらなる利点を有する。誘導性プロモーターの例にはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、およびマルトースとガラクトースの利用に重要な酵素のためのプロモーター領域が含まれる。
【０２３４】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの受容体結合剤をコードするｍＲＮＡの発現は、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種性哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御され得る。異種性プロモーターシステム、例えばテトラサイクリン応答性プロモーターを使用することもできる。Urlinger, S., et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963−7968を参照のこと。転写をｃｉｓまたはｔｒａｎｓに位置するエンハンサー配列によって引き起こすこともできる。例となる哺乳類エンハンサー配列にはグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α‐フェトプロテイン、およびインスリンのためのエンハンサーが含まれる。さらなる例には複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーを受容体結合剤のコード配列の５’側の位置または３’側の位置でベクターに挿入することができるが、プロモーターの５’側の部位に設置することが好ましい。
【０２３５】
真核生物性宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞）において使用される発現ベクターは転写の終結とｍＲＮＡの安定化に必須の配列を含有することもできる。そのような配列は通常真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域および時には３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、受容体結合剤をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。発現ベクターは１つ以上のイントロン配列を含んでもよい。
【０２３６】
受容体結合剤を昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞またはＳＦ２１細胞内で、例えば、ｐＦＡＳＴ‐ＢＡＣ（商標）システムを使用して発現させることもできる。さらなる例となるバキュロウイルス発現ベクターは米国、カリフォルニア州、カールスバードのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能である。受容体結合剤を哺乳類細胞内で発現させることもできる。例えば、哺乳類起源の細胞株を使用することもできる。哺乳類宿主細胞株の例にはサル腎臓細胞のＣＯＳ‐７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）（Gluzman et al., Cell 23:175, 1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞株、およびMcMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)によって記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。ＤＮＡを哺乳類細胞に導入するために確立された方法が記述されている（Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 1569)。
【０２３７】
組換え細胞における受容体結合剤の合成への適応に適切なさらに他の方法、ベクター、および宿主細胞はMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Sambrook et al. (編)、Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773)に記述されている。
【０２３８】
受容体結合剤は、一度細胞内で発現すると、培地、封入体、または細胞溶解液から回収され得る。細胞を、凍結融解循環処理、超音波処理、機械的破砕、または細胞誘拐罪（例えば、界面活性剤）などの物理的手段または化学的手段により破砕することができる。
【０２３９】
受容体結合剤を細胞溶解液または細胞培地の中で見出すことができる他の細胞タンパク質またはポリペプチドから精製することができる。様々なタンパク質精製の方法を用いることができ、そして、そのような方法は当技術分野において公知であり、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)、およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (2010) (ISBN: 1441928332)に記載されている。例となる精製法には、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ‐７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧなどの混入汚染物質を除去するためのプロテインＡ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム；および親和性カラム（例えば、前記タンパク質のエピトープタグ化型に結合する金属キレーティングカラム、および受容体結合剤と関係が有るどのような精製部分をも結合する様々なリガンドを有するカラム）による精製法が含まれる。精製方法には、２つの異なるイオン交換クロマトグラフィーステップの組合せ、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーとその後の陰イオン交換クロマトグラフィー、またはその逆が含まれ得る。受容体結合剤を、塩および／またはｐＨの勾配溶出または段階的溶出を含む様々な方法によりイオン交換樹脂から溶出することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合剤は精製部分（例えば、エピトープタグおよび親和性ハンドル）を含む。そのような部分を親和性クロマトグラフィーのために使用することができ、そして随意で、タンパク質分解性の切断により除去することができる。
【０２４０】
イオン交換クロマトグラフィーをイオン交換分離技術として使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーは（複数の）分子の全体の電荷の間の差異に基づいて分子を分離する。イオン交換クロマトグラフィーを用いて未変化型の受容体結合剤を他の型のそのようなタンパク質から分離することができる。
【０２４１】
陰イオン性置換基または陽イオン性置換基を、クロマトグラフィー用の陰イオン性担体または陽イオン性担体を形成するためにマトリックスに取り付けることができる。陰イオン交換置換基にはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基、および第４級アミン（Ｑ）基が含まれる。陽イオン性置換基にはカルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が含まれる。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ‐２３、ＣＭ‐３２およびＣＭ‐５２などのセルロースイオン交換樹脂がＷｈａｔｍａｎ社から入手可能である（英国、ケント州、メードストン）。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）と他の架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ‐、ＱＡＥ‐、ＣＭ‐およびＳＰ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ‐、Ｑ‐、ＣＭ‐およびＳ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗがＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ社から入手可能である。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ‐６５０ＳまたはＭ、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＣＭ‐６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール‐メタクリレート共重合体がＴｏｓｏ  Ｈａａｓ社（米国、ペンシルバニア州、フィラデルフィア）から入手可能である。
【０２４２】
陽イオン交換表面は、共有結合した負に帯電したリガンドを有するイオン交換表面であり、そのイオン交換表面は、したがって、表面と接触している溶液の中の陽イオンと交換される遊離陽イオンを有する。例となる表面には、陽イオン交換樹脂、例えば、共有結合した基がカルボキシレートまたはスルホネートである陽イオン交換樹脂が含まれる。市販の陽イオン交換樹脂にはＣＭＣ‐セルロース、ＳＰ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳＰ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が含まれる。
【０２４３】
陰イオン交換表面は、共有結合した正に帯電した基、例えば第４級アミノ基を有するイオン交換表面である。例となる陰イオン交換表面は陰イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥセルロース、ＴＭＡＥ、ＱＡＥ‐Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、ＦａｓｔＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）およびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである。
【０２４４】
受容体結合剤のための例となる精製計画には、溶菌緩衝液の中での大腸菌細胞の溶解とそれに続く深層濾過が含まれる。次に、その材料を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）に供する。次にＣＥＸ溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）ステップで陰イオン交換媒体に流す。ＡＥＸの通過画分（ＦＴ）を最終精製ステップに供することができる。次に材料を限外濾過／透析濾過により処理して、例えば、その材料を濃縮または脱塩することができる。限外濾過／透析濾過膜は、塩などの低分子量物質を濾液へと通過させつつ、残余分中にタンパク質を保持するように、名目分子量カットオフ（「ＮＭＷＣＯ」）に基づいて選択され得る。どのような緩衝性溶液も、または滅菌水を、例えば生成物の所望の最終ｐＨおよび電気伝導度に応じて、最終緩衝液交換ステップの間に使用することができる。
【０２４５】
受容体結合剤を、水、ＰＢＳ、および緩衝溶液を含む様々な溶液の中で貯蔵することができる。例となる緩衝溶液には酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、コハク酸（ｐＨ５．２）、コハク酸（ｐＨ５．４）、コハク酸（ｐＨ５．６）、コハク酸（ｐＨ５．８）、ヒスチジン（ｐＨ５．７）、ヒスチジン（ｐＨ６．０）、ヒスチジン（ｐＨ６．３）、ヒスチジン６．６）、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）、リン酸ナトリウム７．０）、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、イミダゾール（ｐＨ６．５）、イミダゾール（ｐＨ６．８）、イミダゾール（ｐＨ７．２）、トリス（ｐＨ７．０）、トリス（ｐＨ７．５）、トリス（ｐＨ７．７）が含まれる。緩衝性薬剤は、例えば、約１〜１００ｍＭ、５〜５０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、または５〜２５ｍＭの濃度で存在し得る。その溶液はＮａＣｌなどの塩（例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、または２５０ｍＭ、およびそれらの間の範囲）、アルギニン（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、およびそれらの間の範囲で）、ショ糖（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、８．５％、１０％、１５％、およびそれらの間の範囲で）、グリセロール（例えば、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、８．５％、１０％、１５％、およびそれらの間の範囲で）、および／または界面活性剤、例えばＴＸ‐１００、およびツイーン８０（ポリソルベート）（例えば、約０．００１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１．０％およびそれらの間の範囲で）をさらに含み得る。
【０２４６】
受容体結合剤は少なくとも５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、またはそれより多くの量で前記組成物中に存在し得る。
【０２４７】
分析方法
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は受容体結合因子と異なる調製物中のタンパク質を指し、例えば、調製した受容体結合因子が由来する宿主細胞の内在性タンパク質、典型的には大腸菌タンパク質である。宿主細胞タンパク質は１００００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、９００ｐｐｍ、８００ｐｐｍ、または７００ｐｐｍ（百万分率）よりも少なく存在することが好ましい。ＨＣＰは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の検出方法により検出され得る。例えば、ＥＬＩＳＡはＨＣＰに対するポリクローナル抗体を使用することができる。例となるキットがＣｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能である（カタログ番号Ｆ４１０；米国、ノースカロライナ州、サウスポート）。別の例となるキットはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術を使用する（ＡｌｐｈａＬｉｓａ（登録商標）大腸菌ＨＣＰキット、製品番号ＡＬ２６１Ｃ／Ｆ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、米国、マサチューセッツ州、ウォーザン）。
【０２４８】
受容体結合剤を含有する材料、または受容体結合剤を含有している可能性がある材料を、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いて評価することができる。例となる分析技術には弱陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ｗＣＥＸ‐ＨＰＬＣ）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ‐ＨＰＬＣ）、逆相液体クロマトグラフィー、ＥＳＩ‐ＭＳ、ターボスプレー・イオン化マススペクトロメトリー、ナノスプレー・イオン化マススペクトロメトリー、サーモスプレー・イオン化マススペクトロメトリー、ソニックスプレー・イオン化マススペクトロメトリー、ＳＥＬＤＩ‐ＭＳおよびＭＡＬＤＩ‐ＭＳが含まれる。他の分析技術には光散乱スペクトル測定が含まれる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、受容体結合剤のＮ末端領域にはＩＬ‐１βのＮ末端領域に由来するペプチドと同一である配列、例えば、ペプチドＡＰＶＲＳ（配列番号５８）が含まれる。そのようなタンパク質を発現する組換え細胞（特に大腸菌細胞）は未変化のタンパク質ならびに脱アラニンアイソフォーム、アセチル化アイソフォーム、および（例えば、Ａｌａ１のＮ末端側に）追加のメチオニンを有するアイソフォームを含む他のアイソフォームを産生し得る。アミノ酸位置２（Ｎ末端残基が位置１にある場合）にプロリンを含む受容体結合剤は、大腸菌のプロテアーゼ、例えば、Ｘ‐ＰＲＯに対する切断特異性を有するアミノペプチダーゼＰによる切断を受けやすいことがあり得る。この切断によりＮ末端アミノ酸が除去され得る。例えば、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５は位置２にプロリンを有する。未変化型のＰ０３、Ｐ０４、およびＰ０５は１５３アミノ酸長であり、そして、アラニンで始まり、一方、脱アラニン種は１５２アミノ酸長であり、そして、プロリンで始まる。メチオニン化（methonated）アイソフォームは１５４アミノ酸長であり、そして、メチオニンで始まり、そのメチオニンはＡｌａ１のＮ末端側にある。
【０２５０】
上で挙げたものなどの分析技術を用いて、未変化型と他の型、例えば、脱アラニン種、アセチル化脱アラニン種またはメチオニル化種との間で区別を付けることができる。例となる分析技術はｗＣＥＸ‐ＨＰＬＣである。例えば、Ｐ０５を、下の実施例９に記載されるようにＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ‐１０  ４×２５０ｍｍカラム（製品番号０５４９９３）を使用して評価することができる。ＷＣＸ‐ＨＰＬＣのピークをＣ４逆相（ＲＰ）‐ＨＰＬＣ接続質量分析により評価することができる。未変性のＰ０５は１７７００．４Ｄａの理論上の質量を有し、そして、１７７００．４Ｄａとして検出される。脱アラニン種は１７６２９．４Ｄａとして検出され、それは未変性のＰ０５の質量よりも７１Ｄａ少ない。その７１Ｄａの質量の減少は１つのアラニン残基の除去に対応する。メチオニル化未変性Ｐ０５種は１７８３０．８０Ｄａとして検出され、そして、メチル化メチオニル化Ｐ０５種１７８４５．５９Ｄａで検出可能である。アセチル化型は、例えば、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ／ＨＰＬＣ）を介したトリプシン分解性ペプチドマッピングにより検出され得る。
【０２５１】
医薬組成物
受容体結合剤を医薬組成物として製剤することができる。典型的には、その組成物は無菌であり、そして、緩衝剤、薬学的に許容可能な塩、および賦形剤または安定化剤のうちの１つ以上を含む。例えば、その組成物は水性組成物であり得る。本明細書に記載される受容体結合剤を生物学的製剤の標準的な方法に従って製剤することができる。例えば、Gennaro (編), Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、 Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472)、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第７版、Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727)、Kibbe (編), Handbook of Pharmaceutical Excipients、第３版、(2000) (ISBN: 091733096X)、Protein formulation and delivery, McNally and Hastedt (編), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007)を参照のこと。
【０２５２】
医薬組成物用の受容体結合剤の純度は通常少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９９％であり、そして、その受容体結合剤は通常ヒトタンパク質を含まない。その受容体結合剤は前記組成物中の唯一のタンパク質、または前記組成物中の唯一の活性タンパク質であり得る。その受容体結合剤を１つ以上の他の活性タンパク質、例えば、１つ以上の他の精製活性タンパク質、例えば、関連または非関連のタンパク質と組み合わせることもできる。いくつかの実施形態では、前記組成物は約０．００１〜１０％、例えば、０．００１〜０．１％、０．０１〜１％、または０．１％〜１０％の間の濃度で受容体結合剤を含有し得る。
【０２５３】
したがって、本明細書は精製型または単離型の本明細書に記載される前記薬剤も取り上げる。「単離された（isolated）」という用語は、物質のもともとの環境（例えば、細胞または材料であって、そこから受容体結合剤が作製される細胞または材料）から取り出されたその物質を指す。医薬組成物は、実質的に発熱性物質を含まず、実質的に核酸を含まず、および／または実質的に細胞性酵素および成分、例えば、ポリメラーゼ、リボソームタンパク質、およびシャペロンタンパク質を含まないことがあり得る。
【０２５４】
医薬組成物は薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、生理的に適合性があるどのような、および全ての溶媒、分散媒体、被覆材、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。「薬学的に許容可能な塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、そして、どのような望まれない毒性効果も付与することがない塩（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）、例えば、酸付加塩および塩基付加塩を指す。
【０２５５】
１つの実施形態では、受容体結合剤を１つ以上の賦形剤、例えば、塩化ナトリウム、およびリン酸緩衝剤（例えば、リン酸水素ナトリウム７水和物、リン酸二水素ナトリウム）、およびポリソルベートと共に製剤する。受容体結合剤を、例えば、緩衝溶液中に、例えば、約５〜１００ｍｇ／ｍｌ、５〜３０ｍｇ／ｍｌ、３０〜５０ｍｇ／ｍｌ、または５０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供することができ、および、受容体結合剤を２〜８℃で貯蔵することができる。医薬組成物は様々な他の形状であることもできる。これらには、例えば、液体剤形、半固体剤形および固体剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および点滴可能溶液）、分散体または懸濁液、およびリポソームが含まれる。好ましい形状は目的とする投与法および治療適応に左右され得る。本明細書に記載される薬剤のための組成物は通常注射可能溶液または点滴可能溶液の形状であり、または局所送達または眼内送達（以下を参照のこと）用である。
【０２５６】
医薬組成物は通常無菌であり、そして、製造条件および貯蔵条件下で安定である。医薬組成物を、それが投与用の規制基準および工業基準に合っていることを確認するために試験することもできる。その組成物を溶液、マイクロエマルジョン、分散体、リポソーム、または高薬品濃度に適切な他の規則構造として製剤することができる。無菌注射可能溶液を、必要とされる量の本明細書に記載される薬剤を適切な溶媒に、必要に応じて上で列挙した要素のうちの１つ、または組合せと共に混合し、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散体は、基礎分散媒体および上で列挙したもののうちの必要とされる他の要素を含有する無菌ベヒクルに本明細書に記載される薬剤を投入して混合することにより調製される。無菌注射可能溶液の調製用の無菌粉剤の場合では、好ましい調製方法は、以前に濾過滅菌されたその溶液に由来する本明細書に記載される薬剤およびあらゆる追加の所望の成分からなる粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。適切な溶液の流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材を使用することにより、分散体の場合は必要とされる粒径を維持することにより、および、界面活性剤を使用することにより維持され得る。注射可能組成物の長期化した吸収を、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを含むことにより図ることができる。
【０２５７】
例えば、受容体結合剤を重合体、例えば、実質的に非抗原性の重合体、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドと結合させることができる。いくつかの実施形態では、その重合体は受容体結合剤と、例えば、直接的または間接的に共有結合で結合している。適切な重合体は、実質的に重量によって異なる。約２００ダルトンから約３５，０００ダルトンまで（または約１，０００〜約１５，０００ダルトン、および２，０００〜約１２，５００ダルトン）の範囲にある数平均分子量を有する重合体を使用することができる。例えば、受容体結合剤を水溶性重合体、例えば、親水性ポリビニル重合体、例えば、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンと複合体化することができる。そのような重合体の非限定的なリストにはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモ重合体、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらの共重合体および、ブロック共重合体の水溶性が維持されることを条件として、それらのブロック共重合体が含まれる。さらなる有用な重合体には、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニック）などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリレート；カルボマー；ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖類、例えば、ヒアルロン酸からなる多糖サブユニットなどのホモ多糖類およびヘテロ多糖類を包含する、単糖であるＤ‐マンノース、Ｄ‐およびＬ‐ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ‐キシロース、Ｌ‐アラビノース、Ｄ‐グルクロン酸、シアル酸、Ｄ‐ガラクツロン酸、Ｄ‐マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ‐グルコサミン、Ｄ‐ガラクトサミン、Ｄ‐グルコースおよびノイラミン酸を含む分岐または非分岐多糖類；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールの重合体；ヘパリンまたはヘパランが挙げられる。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、受容体結合剤は、化合物を急速な放出から守る担体と共に調製され得る。その受容体結合剤は制御放出性製剤として送達され得、インプラントにより送達され得、またはマイクロカプセル化送達系により送達され得る。例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生物分解性、生体適合性重合体を使用することができる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を広く参照のこと。
【０２５９】
投与
受容体結合剤を対象、例えば、ヒト対象に様々な方法、例えば、ボーラス投与としての静脈内投与により、またはある期間に渡る連続点滴により、筋肉内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、滑膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外の注射、胸骨内注射および点滴により投与することができる。さらに他の投与方法には局所（例えば、皮膚または粘膜性）または吸入（例えば、鼻腔内または肺内）経路が含まれる。多数の適用で、投与経路は静脈内注射または点滴、皮下注射、または筋肉内注射のうちの１つである。
【０２６０】
受容体結合剤を一定の用量で、またはｍｇ／ｋｇ用量で投与することができる。受容体結合剤を静脈内投与（ＩＶ）または皮下投与（ＳＣ）することができる。受容体結合剤を、例えば、毎日、隔日、２日おきに、３日おきに、または４日おきに、毎週、３週〜５週間ごとに、例えば、３週間おきに、または毎月投与することができる。
【０２６１】
医薬組成物は「治療的有効量」の本明細書に記載される薬剤を含み得る。薬剤の治療的有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別および体重、および個体において所望の応答、例えば、少なくとも１つの障害パラメータの改善、またはその障害の少なくとも１つの症状の改善を誘起するその化合物の能力、（および随意で、投与されている任意のその他の薬剤の効果）などの要因に応じて変化し得る。治療的有効量はまた、前記組成物のどのような有毒効果または有害効果よりも治療上有益な効果の方が上回る量でもある。受容体結合剤は通常治療的有効量で投与される。
【０２６２】
医薬組成物を、医療装置、例えば、インプラント、点滴ポンプ、皮下注射針、および無針皮下注入装置を使用して投与することができる。その装置は、例えば、医薬組成物を貯蔵するための１つ以上の筐体を含むことができ、そして、単位用量の受容体結合剤および随意で第二剤を送達するように構成され得る。その用量は一定の用量、すなわち、治療される対象にとって単位投与量として適切な物理的に別個の単位であり得、各単位は、所望の治療効果をもたらすために計算された所定の量の受容体結合剤を医薬担体および随意で別の薬剤と併せて含有し得る。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される障害を治療するため、受容体結合剤を、その障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標で持続的改善を誘導するのに充分である量および時間でその障害を有する対象に投与することができる。その対象が１〜４週間を隔てた少なくとも２つの機会に改善を示す場合、その改善は「持続的」と見なされる。改善の程度を徴候または症状に基づいて決定することができ、そして、改善の程度は、クオリティ・オブ・ライフについての質問書など、その対象に対して与えられる質問書を用い得ることもできる。
【０２６４】
疾患の程度を反映する様々な指標が、治療の量と時間が充分であるか決定するために評価され得る。選択した指標または（複数の）指標のベースライン値は、受容体結合剤の最初の用量の投与前の対象を検査することにより確定される。最初の用量の投与の約６０日以内にベースライン検査を行うことが好ましい。
【０２６５】
改善は、対象が、選択した指標または（複数の）指標についてのベースラインよりも上の改善を表すまで受容体結合剤の用量を繰り返し投与することにより引き起こされ得る。慢性の病気の治療では、改善の程度は、少なくとも一か月、またはそれより長い期間、例えば、１か月間、２か月間、または３か月間、またはそれより長い期間、または無期限で投与を繰り返すことにより得られ得る。急性の病気の治療では、前記薬剤を１〜６週間の期間、またはたったの一用量投与することができる。
【０２６６】
１つ以上の指標によって、治療後の疾患の程度が改善されたように見えることがあるが、同じレベルまたは低減した用量もしくは頻度で治療を無期限に続けてもよい。治療を、例えば、改善または症状が消えた時点で中断することもできる。治療をいったん低減または中断して、症状が再び現れた場合、治療を再開することができる。
【０２６７】
治療
受容体結合剤、例えば、ＩＬ‐１ＲＩに結合し、そして、ＩＬ‐１シグナル伝達を抑制する受容体結合剤を使用して「ＩＬ‐１介在性障害」を治療することができる。ＩＬ‐１介在性障害には、（ｉ）少なくとも部分的にはＩＬ‐１の受容体活性化作用により引き起こされ、（ｉｉ）ＩＬ‐１シグナル伝達成分（例えば、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐１β、またはＩＬ‐１ＲＩ）のレベルもしくは活性の上昇、またはＩＬ‐１シグナル伝達の上昇を伴い、および／または（ｉｉｉ）ＩＬ‐１活性を低下させることにより改善されるあらゆる疾患または医学的状態が含まれる。ＩＬ‐１介在性障害には、自己免疫障害および炎症性障害を含む、急性および慢性障害が含まれる。ＩＬ‐１介在性障害には全身性および非全身性障害が含まれる。ＩＬ‐１αとＩＬ‐１βは、感染応答ならびにリウマチ性関節炎を含む炎症性疾患に関連がある強力な炎症促進性サイトカインであるということはよく確証されている。ＩＬ‐１産生の増加がいくつかの自己免疫障害、虚血、および様々な癌を有する患者で観察されており、したがって、ＩＬ‐１をこれらの疾患および関連の疾患と関連づける。
【０２６８】
Sims and Smith, The IL-1 family: regulators of immunity, Nature Reviews Immunology, doi:10.1038/nri2691 (2010)も広く参照されたい。
【０２６９】
「治療する（treat）」という用語は、対象、例えば、患者への本明細書に記載される薬剤の投与であって、統計学的に有意な程度にまで、または当業者が検出可能な程度にまで、障害、例えば、本明細書に記載される障害に伴う健康状態、症状またはパラメータを改善するために有効な、または、障害の進行を防ぐために有効な量、方式、および／または方法での投与を指す。その治療は、障害、障害の症状、または障害になりやすい傾向を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変える、修正する、改良する、一時的にやわらげる、改善する、または影響を及ぼすことを意図したものであり得る。有効な量、方式または方法は対象に応じて異なることがあり得、そして、対象に合わせてそれらを適合させることができる。例となる対象にはヒト、霊長類、および他の非ヒト哺乳類動物が含まれる。受容体結合剤を、障害またはその症状の発生のリスクを減少させるために予防的に投与することもできる。
【０２７０】
ＩＬ‐１介在性障害は自己免疫障害でありうる。ＩＬ‐１介在性自己免疫障害の例にはリウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、喘息、乾癬、Ｉ型糖尿病、および本明細書において特定される他の障害が含まれる。本明細書に記載される受容体結合剤を、そのようなＩＬ‐１介在性自己免疫障害を有する、またはそのリスクがある対象に投与することができる。ＩＬ‐１介在性障害は、下で説明されるものなどの炎症性障害であり得る。本明細書に記載される受容体結合剤を、そのようなＩＬ‐１介在性炎症性障害を有する、またはそのリスクがある対象に投与することができる。
【０２７１】
例となるＩＬ‐１介在性障害は次の物を含む。
【０２７２】
リウマチ性関節炎および関連の関節炎疹
受容体結合剤を、リウマチ性関節炎を有する、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、関節部の滑膜を冒し、そして、関節軟骨を損傷する慢性全身性自己免疫炎症性疾患である。ＲＡの発病はＴリンパ球依存性であり、そして、リュウマチ因子として知られる自己抗体の産生を含み得る。リュウマチ因子と抗原の複合体が関節滑液および血液中で形成し、蓄積することができ、それは、リンパ球、好中球、および単球の滑膜への浸潤を含む。対称的なパターンで関節が冒されることが典型的であるが、例えば、肺性線維症、血管炎、および皮膚の潰瘍、または好中球減少症、血小板減少症および巨脾症を現すフェルティ症候群を引き起こす関節外での疾患も生じ得る。患者は冒された関節の領域内のリウマチ結節、心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、および肺性線維症を伴う間質性肺炎を示す場合もある。１つの型のＩＬ‐１Ｒａが中程度から重症の活動性ＲＡの治療に適応される。例えば、Cohen, S. et al. Arthritis & Rheumatism 46, 614-24 (2002)、Fleischmann, R.M. et al. Arthritis & Rheumatism 48, 927-34 (2003)、Nuki, G., et al. Arthritis & Rheumatism 46, 2838-46 (2002)、Schiff, M.H. et al. Arthritis & Rheumatism 50, 1752-60 (2004)を参照のこと。
【０２７３】
活動性ＲＡの症状には疲労感、食欲の欠如、微熱、筋肉痛および関節痛、および凝りが含まれる。筋肉および関節の凝りは通常午前中、および一定時間何もしなかった後に最も目立つ。病的再燃（フレア）の間、関節は、一般に滑膜炎の結果として、しばしば赤くなり、むくみ、痛くなり、そして固くなる。ＲＡとＲＡの症状の評価に有用な尺度には、リウマチ性関節炎重症度スケール（ＲＡＳＳ；Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41(1):38-45）、ＳＦ‐３６関節炎特異的健常度指数（ＡＳＨＩ； Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Suppl):MS40-50）、関節炎インパクト測定スケールまたは関節炎インパクト測定スケール２（ＡＩＭＳまたはＡＩＭＳ２； Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1):1-10）；スタンフォード健常度評価質問書（ＨＡＱ）、ＨＡＱＩＩ、または改変ＨＡＱ（例えば、Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53を参照のこと）が含まれる。
【０２７４】
本明細書に記載される受容体結合剤を、ＲＡを有する、またはそのリスクがある対象に、前述の徴候および症状のうちの１つ以上の発症を遅らせる、および／またはそれを改善するために投与することができる。その対象は中程度から重症の活動性ＲＡを有する場合がある。その対象はＴＮＦ阻害剤療法（例えば、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）、またはＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）を用いる治療法）に対して応答しない者であり得、その対象は以前にＴＮＦ阻害剤を投与されたことがあり得；またはその対象はＴＮＦ阻害剤を受け続けている（およびそれに応答している、または応答していない）こともあり得る。
【０２７５】
前記対象にメトトレキサートを投与することもできる。その対象に１つ以上の他のＤＭＡＲＤＳ（疾患修飾性抗リュウマチ薬）、コルチコステロイド、および／または非ステロイド性抗炎症剤を投与することができる。受容体結合剤と共投与することができるさらに他の薬品には、ＣＤ２８の阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４‐Ｉｇ）、ＲＡＮＫＬの阻害剤、ＩＦＮｇの阻害剤、ＩＬ‐６の阻害剤、ＩＬ‐８の阻害剤、およびＩＬ‐１７の阻害剤が含まれる。阻害剤にはそのようなメディエーターに対する抗体、そのようなメディエーターに特異的な可溶性受容体に対する抗体、および／またはそのようなメディエーターの受容体に対する抗体が含まれる。
【０２７６】
若年性慢性関節炎
受容体結合剤を、例えば、２１歳未満、１８歳未満、１７歳未満、１６歳未満、１５歳未満、または１４歳未満の対象における若年性慢性関節炎を治療するために使用することができる。若年性慢性関節炎はいくつかの点でＲＡに類似している。対象はリュウマチ因子陽性であり得る。対象は少間接性型、多関節性型、または全身性型のこの疾患を有し得る。その関節炎は関節の強直および関連の成長の原因となることがあり、そして、慢性前部ぶどう膜炎および全身性アミロイドーシスを引き起こすこともあり得る。受容体結合剤を、１つ以上のそのような症状の発症を遅らせ、またはそれを改善するために使用することができる。
【０２７７】
受容体結合剤を、全身発症若年性特発性関節炎（ＳＯ‐ＪＩＡ）を含む若年性特発性関節炎を治療するために使用することができる。対象は、以前のコルチコステロイド治療がうまくいかなかったことがあり得、または０．３ｍｇ／ｋｇに等しいか、それより多くの一日量でのコルチコステロイド治療を必要としたことがあり得る。例えば、Quartier et al. (2011) Ann Rheum Dis. 70(5):747-54を参照のこと。
【０２７８】
他のリュウマチ性障害
本明細書に記載される受容体結合剤を、強皮病、全身性エリテマトーデス、痛風、骨関節炎、リウマチ性筋痛、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎を包含する他のリュウマチ性障害、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、およびリンパ脈管筋腫症（lymphangioleimyomatosis）を包含する随意筋および他の筋肉の炎症、発熱性関節炎症候群、小児肉芽腫性関節炎（ＰＧＡ）／ブラウ症候群、および本明細書において考察される他のリュウマチ性障害を治療するために使用することもできる。
【０２７９】
受容体結合剤を、代謝性リュウマチ性障害、例えば、高尿酸血症に伴う障害、例えば慢性急性痛風を含む痛風、および他の結晶介在性関節症を治療するために使用することができる。その薬剤を、例えば、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、尿酸オキシダーゼ、または尿酸排泄薬により誘発される病的再燃（フレア）を含む痛風に伴う薬物誘発性の病的再燃（フレア）を治療するために使用することができる。痛風では、尿酸の結晶がインフラマソームを活性化し、ＩＬ‐１βの放出を引き起こし得る。
【０２８０】
脊椎関節症
受容体結合剤を、脊椎関節症を治療するために使用することができ、その脊椎関節症には、強直性脊椎炎、ライター症候群、炎症性腸疾患に伴う関節炎、乾癬に伴う脊椎炎、若年発症脊椎関節症および未分化脊椎関節症などの障害が含まれる。脊椎関節症は、しばしば、ＨＬＡ‐Ｂ２７遺伝子と関係がある。対象がリュウマチ因子を持たない場合が有り、脊椎炎を伴う、または伴わない仙腸骨炎および炎症性非対称性関節炎を示す場合がある。対象が眼炎を有している場合もある（以下を参照のこと）。
【０２８１】
強皮病
受容体結合剤を、強皮病または全身性硬化症を治療するために使用することができる。強皮病は、局所的または全身性であり得る皮膚の硬化を特徴とする。微小血管系での血管病変および内皮細胞傷害が存在することもあり得る。対象は、皮膚病変部に単核球の浸潤を示し、抗核抗体を有する場合がある。発病を示す他の器官には、異常な蠕動／運動性という結果になる平滑筋の萎縮および線維症を有する場合がある胃腸管、小弓状動脈および小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎臓皮質の血流を減少させる同心円状の内皮細胞下内膜増殖を有する場合が有り、そして、タンパク尿症、高窒素血症、および高血圧の原因となる場合がある腎臓、萎縮、間質性線維症、炎症、肺、間質性肺炎および間質性線維症を含む場合がある骨格筋、ならびに例えば、収縮帯の壊死と瘢痕形成／線維症を示す場合がある心臓が含まれ得る。本明細書に記載される受容体結合剤を、強皮病を有する、またはそのリスクがある対象に、前述の徴候および症状のうちの１つ以上を改善するために投与することができる。
【０２８２】
シェーグレン症候群
受容体結合剤を、シェーグレン症候群を治療するために使用することができる。シェーグレン症候群は、免疫介在性炎症とその後の涙腺と唾液腺の機能破壊を特徴とする。その疾患は炎症性結合組織病と関連が有り得る、またはそれらを伴い得る。その疾患はＲｏ抗原およびＬａ抗原に対する自己抗体産生と関連があり、それらの抗原の両方は低分子ＲＮＡ‐タンパク質複合体である。病変により、胆汁性肝硬変、末梢神経障害または感覚神経障害を含む他の徴候または関連を有する乾性角結膜炎および口腔乾燥症、および触知可能な紫斑が生じ得る。シェーグレン症候群に関連する眼疾患の治療も下で考察する。
【０２８３】
甲状腺障害
受容体結合剤を、甲状腺障害を治療するために使用することができる。例となる甲状腺障害はグレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、および萎縮性甲状腺炎を包含し、そして、それは、甲状腺内に存在し、多くの場合、甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生と甲状腺抗原に対する自己免疫応答の結果である。自然発症モデル、すなわち、ラット（ＢＵＦラットおよびＢＢラット）およびニワトリ（肥満ニワトリ）、およびサイログロブリンか甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）を使用する動物の免疫により作製された誘発性モデルを含む実験動物モデルが利用可能である。
【０２８４】
糖尿病性障害および代謝性障害
受容体結合剤を、若年発症性糖尿病（自己免疫真性糖尿病およびインスリン依存型の糖尿病を含む）および成人発症性糖尿病（インスリン非依存性糖尿病および肥満介在性糖尿病を含む）、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病などの糖尿病性障害を治療するために使用することができる。例えば、Ｉ型真性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病は、自己抗体および自己反応性Ｔ細胞によって引き起こされる膵島細胞の自己免疫性破壊を伴う。さらに、ＩＬ‐１β活性を低下させることによりグルコース制御とβ細胞機能を改善することができ、そして、ＩＩ型糖尿病を治療するためにＩＬ‐１β活性の低下を用いることができる。例えば、Owyang et al. Endocrinology. 2010;151(6):2515-27を参照のこと。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される受容体結合剤を、インスリンを投与されていない対象、例えばインスリン依存性ではない対象に投与することができる。例えば、その対象は前糖尿病性であり得る。その対象は耐糖能障害か空腹時血糖障害のどちらかを有し得る。その対象は肥満であるか、２３ｋｇ／ｍ２、２５ｋｇ／ｍ２、３０ｋｇ／ｍ２、３５ｋｇ／ｍ２、または４０ｋｇ／ｍ２を越える肥満度指数を有する場合がある。その対象はインスリン耐性であるか、および／または高血糖症または高インスリン血症を特徴とする場合がある。その対象はＩＩ型糖尿病に伸展するリスクを有する場合がある。Larsen, et al. (2007) NEJM 356:1517-26およびLarsen, et al. (2009) Diabetes Care 32:1663-8も参照されたい。いくつかの実施形態では、前記対象は６．１ｍｍｏｌ／Ｌ、６．５ｍｍｏｌ／Ｌ、７ｍｍｏｌ／Ｌ、または８ｍｍｏｌ／Ｌよりも高い空腹時血漿グルコース値を有する。いくつかの実施形態では、前記対象は５．５％、５．７％、６％、６．４％、７％、７．５％または８％よりも高いＡ１Ｃレベルを有する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、前記対象に、例えば、インスリンの分泌を刺激するスルホニルウレア（例えば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）および／またはメグリチニド類（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）などのインスリン分泌促進物質も投与する。前記対象にビグアニド（例えば、メトホルミン）を投与することもできる。受容体結合剤を、膵臓β細胞の欠損および／または膵臓β細胞への傷害を減少させるために投与することができる。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、前記対象は遺伝子ＩＬ１ＲＮの５’部近位に位置するｒｓ４２５１９６１というＣアレルについてヘテロ接合性またはホモ接合性である。
【０２８７】
受容体結合剤を用いる治療には、糖尿病に伴う二次的健康状態、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性患者における腎臓移植拒絶、肥満介在性インスリン耐性、および自体タンパク尿症および高血圧を伴い得る腎不全の改善またはそれらの悪化の予防が含まれる。
【０２８８】
胃腸障害
本明細書に記載される受容体結合剤を、例えばセリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、特発性胃不全麻痺、慢性膵臓炎および急性膵臓炎を含む膵臓炎、炎症性腸疾患、ならびに胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む潰瘍を包含する炎症性胃腸障害を治療するために使用することができる。
【０２８９】
肺疾患
受容体結合剤を、ＩＬ‐１が介在する肺疾患を治療するために使用することができる。治療することができる例となる肺疾患には慢性閉塞性肺疾患（例えば、肺気腫および慢性気管支炎）、肺胞タンパク症、ブレオマイシン誘発性ニューモパチーおよび線維症、特発性肺線維症および放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、肺性サルコイドーシス、嚢胞性線維症、肺コラーゲン蓄積症、ＡＲＤＳ、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患、および早生児の慢性線維化肺疾患が含まれる。さらに、本明細書に記載される受容体結合剤を、石綿症、炭鉱労働者の塵肺症、ケイ肺症、または微細粒子への長期の曝露に伴う類似の健康状態を含む職業性肺疾患を治療するために使用することができる。好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺臓炎を含む炎症性肺疾患および線維化肺疾患は、受容体結合剤を使用して治療することができる誤調節された免疫炎症応答を含む場合がある。
【０２９０】
サルコイドーシスは、身体のほぼ全ての組織における類上皮肉腫の存在を特徴とする、病因が未知である健康状態である。肺の病変が最も一般的である。発病は、疾患部位での活性型マクロファージおよびリンパ系細胞の存続とこれらの細胞種により放出された活性産物の局所的および全身的な放出の結果としてのその後の慢性続発症を伴う。
【０２９１】
心血管障害
本明細書に記載される受容体結合剤を、心血管障害または傷害、例えば、大動脈瘤、急性冠動脈症候群、動脈炎、大脳動脈閉塞を含む血管閉塞、冠状動脈バイパス手術の合併症、虚血／再灌流傷害、アテローム硬化性心臓病を含む心臓病、慢性自己免疫心筋炎およびウイルス性心筋炎を含む心筋炎、慢性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞を含む心不全、心臓手術後または頸動脈バルーン血管形成術後の再狭窄および／またはアテローム性硬化症、無症候性心筋虚血、左心室ポンプ機能不全、左心室補助装置の移植後合併症、レーノー現象、血栓性静脈炎、川崎血管炎を含む血管炎、静脈閉塞性疾患、巨細胞性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、およびシェーンライン・ヘノッホ紫斑病を治療するために使用することができる。受容体結合剤を、例えば、そのような心血管障害のリスクを低下させるために予防的に投与することもできる。いくつかの実施形態では、受容体結合剤を患者に、アテローム性硬化症を治療するために、またはそのリスクを低下させるために投与する。
【０２９２】
ＩＬ‐１介在性シグナル伝達は急性心筋梗塞により活性化され、そして、そのシグナル伝達が梗塞巣周縁の心筋細胞においてアポトーシス性細胞死を開始させることができ、それが梗塞巣のサイズに拡大する。本明細書に記載される受容体結合剤を、心筋梗塞により引き起こされる損傷を減少させるために投与することができる。例えば、受容体結合剤を、心筋梗塞のリスクが有る対象、または心筋梗塞、特に急性心筋梗塞を、例えば、ここ２時間以内、４時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、または４８時間以内に経験したことが有る対象に投与することができる。前記薬剤を、例えば、ヘパリンおよびアスピリンを含む他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０２９３】
受容体結合剤を、脳卒中、くも膜下出血、頭部外傷または脳傷害、および／または心血管障害に伴う炎症を治療するために使用することもできる。例えば、ＩＬ‐１βレベルの上昇は、脳卒中および脳傷害と関連が有る神経炎症との関係が示されている（Rothwell, N. J., et al., TINS 23(12): 618-625, 2000）。受容体結合剤を、そのような炎症ならびに虚血および／または低酸素症と関連が有る他の炎症を軽減させるために投与することができる。さらに、受容体結合剤を、例えば、そのような障害および／またはそのような障害に関連する炎症のリスクを低下させるために予防的に投与することもできる。例えば、受容体結合剤を、脳卒中、虚血イベント、他の心血管系イベント、または出血性イベント（例えば、くも膜下出血）のリスクが有る対象、または脳卒中、虚血イベント、他の心血管系イベント、または出血性イベント（例えば、くも膜下出血）を、例えば、ここ２時間以内、４時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、または４８時間以内に経験したことが有る対象に投与することができる。
【０２９４】
泌尿生殖器系障害および腎臓障害
泌尿生殖器系の障害を、本明細書に記載される受容体結合剤を使用して治療することもできる。そのような障害には、自己免疫糸球体腎炎、毒物への曝露に起因する糸球体腎炎、または溶血連鎖球菌（Haemolytic streptococci）または他の感染性因子との感染に続いて発生する糸球体腎炎を包含する糸球体腎炎が含まれる。糸球体腎炎および尿細管間質性腎炎を含む免疫介在性腎疾患は、腎臓抗原に対する自己反応性抗体またはＴ細胞の産生の結果として直接的な、または他の非腎臓抗原に対して反応する抗体および／または免疫複合体の腎臓内での沈着の結果として間接的な腎臓組織への抗体またはＴリンパ球う介在性傷害の結果である。したがって、免疫複合体を形成することとなる他の免疫介在性疾患は間接的な続発症として免疫介在性腎疾患を誘発することもあり得る。直接的な免疫機構と間接的な免疫機構の両方により、結果として器官の機能障害を生じ、いくつかの場合では、腎不全へと進行する腎臓組織における傷害の発生をもたらす／誘発することになる。液性免疫機構と細胞性免疫機構の両方が傷害の発生に関与し得る。
【０２９５】
受容体結合剤を、環境毒素、薬品または他の原因への曝露に伴う尿毒症症候群を含む尿毒症症候群およびその臨床的合併症（例えば、腎不全、貧血および肥大型心筋症）を治療するために使用することもできる。吸収機能の変化を引き起こすことになる胆嚢璧の炎症から生ずる合併症を治療することもできる。そのような合併症には胆石症（胆石）および胆管結石症（胆管石）および胆石症と胆管結石症の再発が含まれる。治療することができるさらなる病気は血液透析の合併症、良性前立腺肥大、非細菌性前立腺炎、および慢性前立腺炎を含む前立腺の病気、および血液透析の合併症である。受容体結合剤を、慢性前立腺炎／骨盤痛症候群を含む慢性骨盤痛、およびヘルペス感染後の疼痛などの慢性疼痛を治療するために使用することもできる。
【０２９６】
血液疾患および腫瘍疾患
本明細書に記載される受容体結合剤を、癌関連カヘキシー、疲労感、無力症、カヘキシー腫瘍随伴症候群および高カルシウム血症を包含する、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、エプスタイン・バール・ウイルス陽性鼻咽頭癌、グリオーマ、大腸癌、胃癌、前立腺癌、腎臓細胞癌、子宮頚部癌および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）を含む様々な型の癌を治療するために使用することができる。例えば、Voronov et al. (2003) PNAS 100:2645-2650を参照のこと。肉腫、骨肉腫および癌腫を含む固形腫瘍、例えば、腺癌（例えば、乳癌）および扁平上皮癌は治療可能でもある。ある特定の腫瘍におけるにおけるＩＬ‐１βの役割に関して、例えば、Krelin et al. (2007) Cancer Res. 67:1062-1071を参照のこと。その他の癌には食道（esophogeal）癌、胃癌、胆嚢癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄球性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病および有毛細胞性白血病を含む白血病が含まれる。多発性骨髄腫を含む、転移浸潤能力を有する他の悪性腫瘍を、受容体結合剤を使用して治療することができる。例えば、Lust et al. (2009) Mayo Clin Proc 84(2):114-122を参照のこと。
【０２９７】
受容体結合剤を、慢性特発性好中球減少症、慢性疾患性貧血、ファンコーニ再生不良性貧血を含む再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病、骨髄異形成症候群（不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球増加を伴う不応性貧血、移行期芽球の増加を伴う不応性貧血を含む）、骨髄線維症／骨髄様異形成、および鎌状赤血球血管閉塞性（vasocclusive）クリーゼを含む貧血および血液疾患を治療するために使用することもできる。
【０２９８】
自己免疫溶血性貧血、免疫汎血球減少症、および発作性夜間ヘモグロビン尿症は、赤血球細胞の表面（および、いくつかの場合では、同様に血小板を含む他の血液細胞の表面）に発現された抗原と反応する抗体の産生の結果生じる場合が有り、そして、それは、それらの抗体が被覆した細胞の補体介在性溶解および／またはＡＤＣＣ／Ｆｃ受容体介在性機構を介した除去の結果である。血小板減少性紫斑病を含む自己免疫血小板減少症、および他の臨床背景における免疫介在性血小板減少症では、血小板の破壊／除去は抗体または補体のどちらかの血小板への結合とその後の補体性溶解、ＡＤＣＣまたはＦＣ受容体介在性機構による除去の結果として起こる。
【０２９９】
受容体結合剤を、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球性白血病、有毛細胞性白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタイン・バール・ウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、ホジキン病、びまん性侵攻性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔガンマリンパ増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉腫）およびセザリー症候群を含む様々なリンパ増殖性障害を有する、またはそのリスクが有る対象に投与することもできる。
【０３００】
肝疾患
本明細書において開示される受容体結合剤は、急性アルコール性肝炎、急性薬物誘発性肝炎またはウイルス性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型、硬化性胆管炎、肝類洞上皮、未知の原因による肝臓の炎症を含む、肝炎などの肝臓の病気を治療するのにも有用である。
【０３０１】
聴覚障害
受容体結合剤を、聴力損失を伴い、そして、異常なＩＬ‐１発現と関連する障害を治療するために使用することもできる。そのような障害には自己免疫過程から生じると考えられている蝸牛神経関連聴力損失、例えば、自己免疫聴力損失、メニエール症候群およびコレステリン腫、聴力損失を多くの場合伴う中耳障害が含まれる。
【０３０２】
骨障害
骨と関節の非関節炎性障害も本明細書に記載される受容体結合剤を使用して治療することが可能である。この非関節炎性障害は骨または関節の炎症性障害、骨損失につながる破骨細胞障害、例えば、限定されないが、閉経後の骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、骨関節炎、歯の弛緩または損失を引き起こす歯根膜炎、および人工関節置換術後の義肢の弛緩（一般に、装着具の破片に対する炎症応答と関連がある）、例えば、整形外科インプラント性の骨溶解を包含する。
【０３０３】
アミロイド疾患
また、本明細書に記載される受容体結合剤を、原発性アミロイドーシスおよびアルツハイマー病を含む様々な病気の特色をなしている続発性アミロイドーシス、二次反応性アミロイドーシス、ダウン症候群、および透析関連アミロイドーシスを治療するために使用することができる。さらに、受容体結合剤を、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、およびパーキンソン病を治療するために使用することができる。これらの疾患は炎症応答を引き起こすことができる凝集体とアミロイドの形成を伴うこともあり得る。
【０３０４】
神経障害
受容体結合剤を、多発性硬化症；特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーを含む中枢神経系および末梢神経系の神経炎症を治療するために使用することもできる。これらの障害は自己免疫基盤を有し、オリゴデンドロサイトまたはミエリンに対して直接的に引き起こされた損傷の結果として神経の脱髄化を生じると考えられている。多発性硬化症では、疾患の誘発にＴリンパ球が関与する。多発性硬化症は再発寛解の経過または慢性進行性経過のどちらかを有する。病変部には主にＴリンパ球介在性のミクログリア細胞からなる浸潤物および浸潤性マクロファージが含まれ、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が病変部での主な細胞種である。オリゴデンドロサイト細胞死とその後の脱髄化の機序は分かっていないが、Ｔリンパ球駆動性である可能性がある。
【０３０５】
ミオパチー
受容体結合剤を、炎症と自己免疫に関連するミオパチーを治療するために使用することができる。皮膚筋炎、多発性筋炎および他のものを含む特発性炎症性ミオパチーは、筋力低下を引き起こす、病因が未知である慢性筋肉炎症の障害である。筋肉傷害／炎症は多くの場合対称的であり、進行性である。自己抗体が大半の型と関連する。これらの筋炎特異的自己抗体はタンパク質合成に関与する要素、タンパク質およびＲＮＡの機能に向けられたものであり、それらの機能を阻害する。
【０３０６】
脈管炎障害
本明細書に記載される受容体結合剤を、血管炎障害、例えば、全身性血管炎を治療するために使用することができる。全身性血管炎には、初期病変が炎症であり、その後の血管への損傷が、冒された血管によって栄養供給されている組織の虚血／壊死／変性、およびいくつかの場合では最終的に末端器官機能不全を引き起こす疾患を含まれる。脈管炎はリウマチ性関節炎、全身性硬化症などのような他の免疫性炎症介在性疾患の二次病変または続発症として、特に免疫複合体の形成も伴う疾患において生じる場合もある。
【０３０７】
原発性全身性血管炎群内の疾患には全身性壊死性血管炎、結節性多発動脈炎、アレルギー性血管炎と肉芽腫症、多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、リンパ腫様肉芽腫症、および巨細胞性動脈炎が含まれる。混合型脈管炎には皮膚粘膜リンパ節症候群（ＭＬＮＳまたは川崎病）、ＣＮＳ単独血管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）および皮膚壊死性細静脈炎が含まれる。これらの血管炎障害の発病機構は主に血管壁における免疫グロブリン複合体の沈着とその後のＡＤＣＣ、補体活性化、またはそれらの両方を介した炎症応答の誘発に起因すると考えられている。
【０３０８】
ＣＡＰＳ
受容体結合剤を、ＣＡＰＳ障害、すなわち、ＣＩＡＳ１関連周期性症候群を治療するために使用することができる。ＣＡＰＳには３つの遺伝的症候群、すなわち、新生児期発症多臓器炎症性障害（ＮＯＭＩＤ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、および家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）（Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305、Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203、Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348）が含まれる。ＣＡＰＳは散発的または家族的パターンを有する常染色体優性遺伝形式で遺伝される。ＣＩＡＳ１は、カスパーゼ１の活性を調節する細胞内酵素複合体である「インフラマソーム」のタンパク質成分であるＮＡＬＰ３をコードする。ＣＩＡＳ１の変異によりＩＬ‐１産生の増加と多数の病理的帰結が引き起こされる（Aksentijevich et al. 2002、上掲）。ＩＬ‐１は肝臓における急性期反応物質、例えば、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の産生を強力に誘導する。
【０３０９】
ＣＡＰＳ障害は共通の臨床的特徴を有し、そして、様々な臨床的重症度を有する疾患として存在する。ＮＯＭＩＤは最も重症であり、ＭＷＳはやや軽度であり、そして、ＦＣＡＳは最も軽度である。ＣＡＰＳ障害はいくつかの重なり合う特徴を有し、そして、個体は徴候および症状からなる特有の型を有し得る。これらの病気全てに共通の特徴には、発熱、じん麻疹様の発疹、関節炎または関節痛、筋肉痛、倦怠感、および結膜炎が含まれる。
【０３１０】
ＮＯＭＩＤでは、慢性無菌性髄膜炎が知的傷害を引き起こす場合が有り、そして、これらの患者は骨端と膝蓋骨において外観を損ない、且つ、障害を引き起こす骨の過形成を患う場合もある。これらの患者は、頭蓋内の圧力上昇により生じる視神経の萎縮に起因する盲目症を患う場合もある。ＭＷＳおよびＮＯＭＩＤは通常、聴覚系、髄膜および関節を含み得る重い炎症を伴う。これらの患者は毎日の高熱のスパイク熱、および分布と程度が頻繁に変化する慢性の発疹を患う場合がある。患者は聴力損失または難聴を患う場合がある。結膜炎と乳頭浮腫が頻繁に観察される。アミロイドーシスは慢性炎症に起因する腎不全と急性期反応物質（特にＳＭ）の過剰産生を発生および誘発し得る。受容体結合剤を、ＮＯＭＩＤ、ＭＷＳ、またはＦＣＡＳを有する、またはＮＯＭＩＤ、ＭＷＳ、もしくはＦＣＡＳに関連する遺伝子型を有すると診断された対象に投与することができる。さらに、受容体結合剤を、ＴＲＡＰＳ（ＴＮＦ受容体関連周期性症候群）を有する対象に投与することができる。
【０３１１】
皮膚疾患
受容体結合剤を、皮膚疾患、例えば、炎症性皮膚疾患または自己免疫性もしくは免疫介在性皮膚疾患を治療するために使用することができる。例となる障害は乾癬である。水疱性皮膚症、多形性紅斑、および接触皮膚炎を含むその他の自己免疫性または免疫介在性皮膚疾患には自己抗体が介在しており、その自己抗体の発生はＴリンパ球依存的である。乾癬はＴリンパ球介在性炎症性疾患である。病変部にはＴリンパ球、マクロファージおよび抗原加工細胞、およびいくつかの好中球からなる浸潤物が含まれる。
【０３１２】
治療することができる皮膚または粘膜のその他の傷害には、ダリエー病、毛包性角化症および尋常性天疱瘡を包含する棘融解性疾患が含まれる。さらにその他の障害には、にきび、酒さ、円形脱毛症、アフタ性口内炎、水泡性類天疱瘡、火傷、湿疹、多形性紅斑および多形水泡性紅斑（スティーブンス・ジョンソン症候群）を含む紅斑、炎症性皮膚疾患、扁平苔癬、線状ＩｇＡ水泡性士官（小児期慢性水泡性皮膚病）、皮膚弾力喪失、胃潰瘍を含む粘膜性表面潰瘍、好中球性皮膚炎（スィート症候群）、皮膚筋炎、毛孔性紅色粃糠疹、乾癬、壊疽性膿皮症、多中心性細網組織球症、および中毒性表皮剥離症が含まれる。受容体結合剤により治療可能な他の皮膚関連健康状態には疱疹状皮膚炎（デューリング病）、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、およびじん麻疹（慢性特発性じん麻疹を含む）が含まれる。
【０３１３】
アレルギー性疾患
受容体結合剤を、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、アレルギー性結膜炎（以下も参照のこと）およびじん麻疹を治療するために使用することができる。これらの疾患には、しばしばＴリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ介在性炎症、またはそれらの両方が介在する。
【０３１４】
喘息は、多くの場合１つ以上の誘引に応答して、気道が時に収縮し、炎症を起こし、そして、過剰量の粘液で埋め尽くされる呼吸器系に関係する慢性健康状態である。寒気、暖気、湿った空気、運動または労作、感情的なストレス、およびウイルス性の病気などの環境中の刺激（またはアレルゲン）への曝露のような事によって、エピソードが誘発され得る。気道の狭窄は喘鳴、息切れ、胸部圧迫、および咳などの症状を引き起こす。受容体結合剤を、喘息を治療するために使用することができ、そして、そのような治療のための局所的送達または肺送達用に製剤することができ、または、非経口的に送達することができる。
【０３１５】
移植
受容体結合剤を、移植を受けるところである、移植を受けている、または移植から回復しているところである対象に投与することができる。移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む移植に関連する疾患はＴリンパ球依存性であり、Ｔリンパ球機能の阻害は改善につながる。角膜移植は、受容体結合剤を使用する治療により改善され得る新血管形成を伴い得る。受容体結合剤を、固形器官の移植、例えば心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺（肺移植気道閉塞）の移植または骨髄移植を含む他の移植により生じる合併症を治療するために使用することもできる。
【０３１６】
感染症
本明細書に記載される受容体結合剤はマラリアおよび住血吸虫症を含む原虫症の治療、および、らい性結節性紅斑、細菌性またはウイルス性髄膜炎、肺性結核を含む結核、ならびにインフルエンザの感染および伝染性単核球症を含む細菌またはウイルスの感染に続いて発生する肺炎の治療に有用である。
【０３１７】
家族性地中海熱、高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群、およびＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、および成人発症性スティル病、シュニッツラー症候群、および線維化肺胞炎を含む遺伝性周期性発熱症候群も受容体結合剤を使用して治療可能である。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、受容体結合剤を、対象においてＩＬ‐６の活性または発現を低下させるためにその対象に投与する。例えば、その対象は、少なくとも部分的にＩＬ‐６に関係する、またはＩＬ‐６が介在する障害を有し得る。
【０３１９】
眼疾患および眼内送達
本明細書に記載される受容体結合剤を、眼の表面を冒す眼疾患、炎症性眼疾患、および自己免疫反応が少なくとも部分的に介在する眼疾患を含む眼疾患を治療するために使用することができる。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、眼疾患は眼の表面を冒すドライアイ障害である。その障害には、乾性角結膜炎、乾性角膜炎、眼球乾燥症候群、眼球乾燥症、涙液膜障害、涙産生の減少、涙液欠損、およびマイボーム腺機能不全と呼ばれる健康状態が含まれる。ドライアイはシェーグレン症候群（ＳＳ）に関連する型、例えば、シェーグレン症候群関連乾性角結膜炎を含み得るが、シェーグレン症候群に関連しない型、例えば、非シェーグレン症候群関連乾性角結膜炎も含み得る。患者は全身性自己免疫障害の他の徴候を有する場合も有しない場合もある。ＩＬ‐１はドライアイ障害の発病と関連があるとされている。例えば、Enriquez de Salamanca et al. (2010), Mol. Vis. 16:862-873を参照のこと。
【０３２１】
ドライアイ症候群を有する対象は眼の炎症による乾燥を示す場合が有り、そして、ざらざらする、チクチクする、むずむずする、燃えるような、または圧力をかけられた感覚、刺激、疼痛、および充血を経験する場合がある。ドライアイは過剰な目の加水および逆に不十分な涙の産生の両方を伴う場合がある。受容体結合剤をそのような対象に、１つ以上のそのような症状の発症または悪化を改善または予防するために投与することができる。受容体結合剤を、例えば、神経炎症に起因する痛み、例えば眼の痛みをそのような痛みを経験している対象においてやわらげるために使用することもできる。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、前記眼疾患は、全身性自己免疫障害（例えば、シェーグレン症候群およびリウマチ性関節炎）に、またはＩＬ‐１または別のＩＬ‐１サイトカインファミリーメンバーに関連する障害に伴う眼疾患である。患者は全身性自己免疫障害または全身性自己免疫障害の他の徴候を有する場合も有しない場合もある。
【０３２３】
受容体結合剤を、眼の表面、例えば角膜を冒す他の障害を治療するために使用することもできる。そのような障害には角膜眼表面炎症状態、角膜新血管形成、末梢潰瘍性角膜炎および細菌性角膜炎を含む角膜炎が含まれる。受容体結合剤を、角膜の創傷を治癒している対象（例えば、角膜の創傷を有する対象）を治療するために使用することができる。受容体結合剤を、眼に関係する手技、例えば、角膜移植／角膜形成術、人工角膜移植手術、眼表層移植、選択的内皮移植を受けるところである、受けている、またはそれから回復しているところである対象に投与することができる。例えば、Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43、Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9、およびDana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7を参照のこと。受容体結合剤を、結膜瘢痕化障害および結膜炎を含む結膜を冒す障害を治療するために使用することができる。受容体結合剤を、類天疱瘡症候群およびスティーブンス・ジョンソン症候群などのさらに他の障害を治療するために使用することができる。本明細書に記載される受容体結合剤を対象に、眼の中、または眼の周囲での新血管形成を調節するために投与することができる。例えば、Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43を参照のこと。
【０３２４】
受容体結合剤を、眼を冒すアレルギー性反応を有する対象、例えば、重症のアレルギー性結膜炎などのアレルギー性（アトピー性）眼疾患を経験している対象に投与することができる。例えば、受容体結合剤を局所的に投与することができる。例えば、Keane-Myers AM et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12): 3041-6も参照されたい。
【０３２５】
受容体結合剤を、眼を冒す自己免疫障害を有する対象に投与することができる。例となる自己免疫眼疾患には交換性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、バードショット網脈絡膜症（birdshot retinochoriodopathy）、眼瘢痕性類天疱瘡、フックス異時性虹彩毛様体炎、および様々な型のぶどう膜炎が含まれる。受容体結合剤を対象に、前述の障害のうちのいずれかを治療するために投与することができる。
【０３２６】
受容体結合剤を、糖尿病性網膜症を有する、またはそのリスクが有る対象に投与することができる。例えば、Demircan et al. (2006) Eye 20:1366-1369 and Doganay et al. (2006) Eye, 16:163-170を参照のこと。
【０３２７】
ぶどう膜炎には急性型と慢性型が含まれ、そして、虹彩、毛様体および脈絡膜のうちの１つ以上の炎症が含まれる。慢性型は全身性自己免疫疾患、例えば、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、若年性リウマチ性関節炎、ライター症候群および炎症性腸疾患と関連が有る場合がある。前部ぶどう膜炎では、炎症は主に虹彩中に存在する（虹彩炎とも）。前部ぶどう膜炎は、全身性自己免疫疾患を有する対象を冒す場合があるが、全身性自己免疫疾患を有しない対象を冒す場合もある。中間部ぶどう膜炎は前部硝子体、周辺網膜および毛様体の炎症を伴い、多くの場合、前部ぶどう膜炎または脈絡網膜炎症をほとんど有しない。周辺部ぶどう膜炎（pan planitis）は虹彩と脈絡膜の間にある毛様体扁平部の炎症により生じる。後部ぶどう膜炎はぶどう膜と主に脈絡膜に関係し、そして、脈絡膜炎とも呼称される。後部ぶどう膜炎は全身性感染症または自己免疫疾患に伴う場合がある。それは数か月および数年持続することがある。受容体結合剤を対象に、前述の型のぶどう膜炎のうちのいずれかを治療するために投与することができる。例えば、Tsai et al. (2009) Mol Vis 15:1542-1552およびTrittibach P et al. (2008) Gene Ther. 15(22): 1478-88も参照されたい。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、受容体結合剤を、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する、またはそのリスクがある対象を治療するために使用する。受容体結合剤を眼に局所的に投与、（例えば、硝子体中に）注入、または全身的に投与することができる。例えば、Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3):195-200を参照のこと。
【０３２９】
本明細書に記載される受容体結合剤を、眼疾患を治療するためにあらゆる方法により投与することができる。その薬剤を非経口的な方法で送達することができる。あるいは、または加えて、その薬剤を眼に直接的に、または眼の近傍に送達することができる。例えば、前記タンパク質を局所的または眼内に、例えば、下で説明するように投与することができる。
【０３３０】
眼内送達用の製剤と方法
受容体結合剤を含有する点眼用製剤を局所投与のために、例えば、液滴剤もしくは軟膏としての投与のために、または、例えば、前眼房もしくは結膜嚢への移植のために送達することができる。液滴剤を、点眼器を使用して送達することができる。眼内送達用に製剤されているとき、受容体結合剤は０．０００１〜０．１％、０．００１〜５％、例えば、０．００５〜０．５％、０．０５〜０．５％、０．０１〜５％、０．１〜２％または１％〜５％の濃度で存在し得る。しばしば、点眼用製剤は眼に直接に適用され、それは、まぶたへの局所的適用または眼球とまぶたの間の空間（結膜嚢）への滴下を含む。点眼用製剤は、涙液と容易に混合し、角膜と結膜の表面に拡がるように設計され得る。通常の投与技術を用いて、その薬品の大部分を下結膜円蓋に置く。毛管現象、拡散力、およびまばたき反射により、その薬品が角膜前涙液膜に入り込み、そこからその薬品が角膜へと浸透する。
【０３３１】
点眼用製剤は１つ以上の他の薬剤、例えば、リメキソロン、ロテプレドノール、メドリゾンおよびヒドロコルチゾンなどの抗炎症性ステロイド、または非ステロイド性抗炎症剤を含むこともできる。例えば、そのステロイドは０．００１〜１％の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、ステロイドが存在しない。例えば、受容体結合剤は製剤中の唯一の活性薬剤である。
【０３３２】
前記製剤は次の成分のうちの１つ以上を含むこともできる：界面活性剤、等張化剤、緩衝液、保存剤、共溶媒および粘度上昇剤。等張化剤を、前記組成物の浸透圧を、例えば、天然の涙の浸透圧に調節するために使用することができる。例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ブドウ糖および／またはマンニトールを、適切な等張性、例えば、生理的等張性を得るために添加することができる。等張化剤を、約１５０〜４５０ｍＯｓｍまたは２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を生じさせるのに充分な量で添加することができる。
【０３３３】
前記製剤は点眼用送達に適切な緩衝化物を含むこともできる。その緩衝剤は、特に貯蔵条件下でｐＨの変化に対する１つ以上の緩衝成分（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）を含み得る。例えば、緩衝液を、ｐＨ５．５〜７．５、６．０〜７．５、または、例えば６．５〜７．５の範囲内にある目標のｐＨをもたらすために選択することができる。
【０３３４】
前記製剤は水性担体またはリン脂質担体を含み得る。特にドライアイ障害の治療のために、前記製剤は短期の症状の軽減をもたらす薬剤、例えば、眼を潤滑し、そして、涙の形成を補助する化合物を含み得る。例えば、（１つ以上のリン脂質を含む）リン脂質担体を使用して短期の症状の軽減をもたらすことができる。人工涙様担体として有用な例または人工涙様組成物にはＴｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ（商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｓ社、米国、テキサス州）が含まれる。例えば、前記製剤は、ｍｌ当たり、１ｍｇのデキストラン、７０および３ｍｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース、および随意でＰＯＬＹＱＵＡＤ（登録商標）（ポリクオタニウム‐１）０．００１％（質量／体積）のような保存剤を含み得る。リン脂質担体製剤の例には、米国特許第４，８０４，５３９号、米国特許第４，８８３，６５８号、米国特許第５，０７５，１０４号、米国特許第５，２７８，１５１号、および米国特許第５，５７８，５８６号において開示されるものが含まれる。
【０３３５】
前記製剤は、滑沢剤または湿潤剤として作用する他の化合物を含むこともできる。これらには、単量体ポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール；重合体ポリオール、例えばポリエチレングリコール、様々なセルロースファミリーの重合体、すなわち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（「ＨＰＭＣ」）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（「ＨＰＣ」）、デキストラン、例えばデキストラン７０；水溶性タンパク質、例えばゼラチン；およびビニル重合体、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン；およびカルボマー、例えばカルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１；カルボマー９４０、カルボマー９７４Ｐなどの粘性剤が含まれる。さらにその他の例には多糖類、例えばヒアルロン酸およびその塩ならびにコンドロイチン硫酸およびその塩、ならびにアクリル酸重合体が含まれる。ある特定の実施形態では、前記製剤は１〜４００ｃＰの間の粘性を有する。
【０３３６】
前記製剤は、例えば、付属の点眼器が付いた瓶に、または単回使用用の点眼器として、単回使用用または多用量使用用に包装され得る。前記製剤は、例えば使用中の細菌または真菌の汚染混入を防ぐために１つ以上の保存剤を、および／または、例えばタンパク質を可溶化するために１つ以上の界面活性剤を含むこともできる。例となる保存剤には塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、臭化ベンゾドデシニウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、およびポリクオタニウム‐１が含まれ、そして、それらは０．００１から１．０％（重量／体積）までの濃度で含まれ得る。無菌だが保存剤を含まない、受容体結合剤を含有する製剤を提供することも可能である。例となる界面活性剤にはトリトンＸ‐１００、エリュージェント（Elugent）、ツイーン２０およびツイーン８０が含まれ、そして、それらは０．００１から１．０％（重量／体積）までの濃度で含まれ得る。界面活性剤を含まない製剤を提供することも可能である。前記製剤は単回使用による適用のために調製され得る。
【０３３７】
眼科医療用パックを、点眼用製剤の眼との接触を長くするために使用することができる。綿球を前記製剤で浸し、次に、それを上結膜円蓋または下結膜円蓋に挿入する。受容体結合剤を、イオントフォレーシスにより投与することもできる。この方法は、電極を担持する洗眼器内で溶液の角膜との接触を維持する。その薬品の拡散が電位差によりもたらされる。
【０３３８】
受容体結合剤を注射、例えば、結膜下注射により送達することもできる。前記製剤を結膜の下に注射することができ、それが強膜を通って眼への単純な拡散による移動を容易にする。前記製剤を結膜の下、およびより眼の後方の部分内の基底をなすテノン嚢の下に注射して前記薬剤を毛様体、脈絡膜および網膜に送達することもできる。前記製剤を球後注射により投与することもできる。
【０３３９】
ドライアイと他の表面障害に関して、対象を、例えば、次のアプローチのうちの１つ以上を用いて評価することができる：眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）、角膜および結膜の染色、およびシルマー試験。当技術分野において公知の他の方法を使用することができる。
【０３４０】
眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）は、ＤＥＳを含む眼表面炎症性障害、および視覚関連機能へのそれらの影響と一致する眼の刺激の症状を迅速に評価する１２項目からなる質問集である。例えば、Ocul Immunol Inflamm. 2007 Sep-Oct;15(5):389-93を参照のこと。そのＯＳＤＩ質問書の１２項目は０〜４の段階で採点される。スコアが回答に基づいて得られ、ＯＳＤＩスコアが０〜１００の段階で生じる。スコアが高いほど大きな障害を表す。ベースラインからの負の変化は視覚関連機能および眼炎症性障害の改善を示す。
【０３４１】
角膜と結膜の染色
角膜染色は表皮の疾患、または通常ドライアイなどの眼表面炎症性障害に関して見られる眼の表面の表皮バリアにおける破損の尺度である。角膜染色は、臨床的に明らかなドライアイがなくても、重いまぶたの疾患、例えば後部眼瞼炎がある場合は、存在し得る。角膜染色と目の不快感との相関は、全てではないが多くの患者で高く、全般的に、角膜染色は上で説明されたＯＳＤＩの高いスコアと関連がある。角膜フルオレセイン染色には、生理食塩水で湿らせたフルオレセイン試験紙または１％ナトリウムフルオレセイン溶液を使用して涙液膜を染色する。角膜全体を次に、黄色のバリアフィルター（ラッテン１２番）とコバルトブルーの照明を使用する細隙灯評価を用いて試験する。染色をオックスフォード・スキーマに従って格付けする。結膜染色は、同様に、表皮の疾患または眼の表面の表皮バリアにおける破損の尺度である。結膜染色は、リサミン・グリーンを使用して、細隙灯下で行われる。生理食塩水で湿らせた試験紙または１％リサミン・グリーン溶液を使用して涙液膜を染色し、そして、眼瞼間結膜の染色が３０秒から後、２分未満の後に評価される。中程度の強度の白色光を用いて、眼瞼間領域の鼻側の、および一時的な結膜の染色だけがオックスフォード・スキーマを用いて格付けされる。
【０３４２】
シルマー試験
シルマー試験は、下結膜円蓋に濾紙の紙片（５×３５ｍｍのワットマン４１番濾紙の紙片）を設置して、麻酔して、および麻酔せずに行われる。この試験は薄暗い部屋で行われる。患者は、５分が経過し、紙片が取り除かれるまでその眼をゆるく閉じる。涙の線は、紙片が眼から取り除かれた後に数ミリメーター進み続けるので、正確に５分の時点で涙の線にボールペンで印をつける。涙液の産生は、紙片が５分の間に湿ったミリメーター単位の長さにより測定される。麻酔無しでの１０ｍｍ以下のシルマー試験の結果および麻酔有りでの５ｍｍ以下のシルマー試験の結果は異常と見なされる。ベースラインからの正の変化は本明細書に記載される眼炎症性障害の１つ以上の症状の改善を示す。
【０３４３】
肺送達用の製剤と方法
受容体結合剤を、例えば、その薬剤を気道、例えば上気道および下気道の組織に投与するために肺送達の吸入法または他の方法用に製剤することができる。肺の通気道へ薬剤を局所的に送達するために使用することができる３つの共通するシステムには、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、定量吸入器（ＭＤＩ）およびネブライザが含まれる。ＭＤＩを使用して受容体結合剤を可溶化型で、または分散体として送達することができる。ＭＤＩには、装置を起動するとエアロゾル化した医薬を気道へと押し出すフレオンまたは他の比較的高い蒸気圧の噴射剤が含まれているのが典型的である。対照的にＤＰＩは一般に、乾燥粉末の医薬を肺に導入するためには患者の息を吸い込む労力に依存する。ネブライザは液体溶液にエネルギーを加え、吸入することができる医薬品のエアロゾルを形成する。前記薬剤を凍結乾燥形状で（例えば、室温で）貯蔵し、吸入前に溶液に再構成することができる。液体換気または肺洗浄の際の薬品のフルオロケミカル媒体を使用する直接的肺送達も有望な送達方法である。これらの方法および他の方法を、受容体結合剤を送達するために使用することができる。例えば、前記薬剤は、１吹き（ｐｕｆｆ）当たり少なくとも約０．０２ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇまたは５０ｍｇ、またはそれより多くの投与単位形態で送達される。
【０３４４】
受容体結合剤は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジエリロロテトラフルオロクトリアン（dielilorotetrafluoroctliane）、二酸化炭素または他の適切な気体を使用して、加圧パックまたはネブライザからエアロゾルスプレー物の形態で好都合にも送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを付けることにより決定され得る。吸入器または吹入器で使用するためのカプセルおよびカートリッジは、粒子が製剤化された粒子である場合、受容体結合剤とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基材の粉末混合物を含有して製剤されてもよい。製剤化受容体結合剤または製剤化されていない受容体結合剤に加えて、１００％のＤＰＰＣまたは他の界面活性剤などの他の材料を一緒に混合して製剤化受容体結合剤または製剤化されていない受容体結合剤の送達および分散を促進することができる。粒径を、上気道への送達であるか下気道への送達であるか制御するために変更することもできる。例えば、１〜５ミクロンまたは１０〜５０ミクロンの範囲のサイズの粒子をそれぞれ下気道および上気道用に使用することができる。
【０３４５】
界面活性剤などの送達増強剤を使用して肺送達をさらに増強することができる。界面活性剤は一般に、親水性部分および親油性部分を有する化合物であって、２つの非混和相の間の接触面と相互作用することにより薬品の吸収を促進する化合物である。界面活性剤は乾燥粒子ではいくつかの理由のため、例えば、粒子の凝集の低下およびマクロファージによる貪食の低下のため有用である。界面活性剤は当技術分野においてよく知られており、そして、それにはホスフォグリセリド、例えばホスファチジルコリン、Ｌ‐α‐ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ヘキサデカノール、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレン‐９‐、アウリルエーテル（auryl ether）、パルミチン酸、オレイン酸、ソルビタントリオレエート（スパン８５）、グリココール酸塩、サーファクチン、ポロクソマー（poloxomer）、ソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタントリオレエート、チロキサポール、およびリン脂質が含まれる。
【０３４６】
また、本明細書に記載されるキメラサイトカインドメインを特異的に認識する抗体も本明細書に取り上げられる。例えば、そのような抗体はあらゆる親サイトカインドメインと比べてキメラドメインに優先的に結合する。例えば、特異的抗体は、第１親サイトカイン由来のセグメントと第２親サイトカインの間の連結部を包含するエピトープに結合することができる。
【０３４７】
核酸送達
受容体結合剤は、その受容体結合剤をコードし、そして、発現することができる核酸を送達することによって対象に提供され得る。例えば、受容体結合剤をコードする核酸配列を転写制御配列の制御下に置き、遺伝子送達用の核酸ベクター、例えば、ウイルス性ベクターに配置することができる。例となるウイルス性ベクターにはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターが含まれる。ベクターはプラスミドまたは線状分子、例えば、線状二本鎖ＤＮＡの形状であり得る。その送達される核酸は標的細胞のゲノムに組み込まれる、例えば、標的細胞のゲノムに組み込まれるように設計され得る。あるいは、その送達される核酸は、送達後にそれが細胞内で自律的に存在するように設計され得る。
【０３４８】
転写制御配列を操作して一過性発現または構成的発現をもたらすことができる。一過性制御は、外部からの薬剤によって、例えば、外部からの薬剤（例えば、ステロイドホルモンまたはＦＫ５０６）または環境シグナルに応答する転写因子の転写応答エレメントを使用することによって調節される制御を包含し得る。
【０３４９】
送達される核酸上に提供されている遺伝子の発現を、例えば、その遺伝子がコードするタンパク質の（例えば、抗体を使用する）検出により、または、例えばＰＣＲもしくはノーザンハイブリダイゼーションを用いるｍＲＮＡの検出により評価することができる。送達される核酸が一般に操作されて、転写が開始され、それにより生じるメッセージからタンパク質が翻訳されるように転写調節ＤＮＡと翻訳調節ＤＮＡが受容体結合剤のコード配列に対して適切な位置に配置される。その核酸は哺乳類細胞、特にヒトに由来する転写調節性核酸配列および翻訳調節性核酸配列を含み得る。そのような配列には、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および終結配列、翻訳開始配列および終結配列、およびエンハンサー配列または活性化配列が含まれる。
【０３５０】
さらに、発現ベクターは追加のエレメントを含んでもよい。例えば、組み込み型発現ベクターでは、その発現ベクターは宿主細胞のゲノムに相同な少なくとも１つ、または２つの配列を、例えば、発現コンストラクトを挟み込んで含有することができる。その組み込み型ベクターを、適切な相同配列をそのベクター内への包含に選択することにより、宿主細胞内の特定の座位に導くことができる。組み込み型ベクターのコンストラクトは当技術分野においてよく知られている。
【０３５１】
例となるアデノウイルスベクターにはＡｄ２またはＡｄ５などの改変型のヒトアデノウイルスが含まれ、それらのウイルスではウイルスがインビボで複製するのに必要な遺伝配列が除去されている。例えば、Ｅ１領域を除去することができ、そして、そのゲノムを、受容体結合剤をコードする発現カセットを受け入れるようにさらに改変することができる。
【０３５２】
例となるレトロウイルスベクターにはＬＮＬ６、ＬＸＳＮ、ＬＮＣＸおよびレンチウイルスベクターが含まれる。特定のレンチウイルスベクターがPawliuk et al. (2001) Science 294:2368およびImren et al. (2002) PNAS 99:14380によって説明されており、そして、それらには、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が含まれる。これらのベクターが安全であるように、例えば、必須遺伝子（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）を別々のベクターに分割することにより、および、レトロウイルスを複製欠損にすることにより、構築および操作することができる。次に複製欠損レトロウイルスを、標準的な技法により、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株の使用を介してビリオンにパッケージする。組換えレトロウイルスの作製およびそのようなウイルスを使用するインビトロまたはインビボでの細胞の感染のためのプロトコルはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (編) Greene Publishing Associates, (1989)、第９．１０〜９．１４節、および他の標準的な実験マニュアルに見出され得る。レトロウイルスベクターは、受容体結合剤を発現するための配列に加えて、左側（５’）レトロウイルスＬＴＲ、レトロウイルス搬出配列、随意でリバース応答配列（ＲＲＥ）、プロモーター、および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）または他の転写インシュレーター配列および右側（３’）レトロウイルスＬＴＲを含み得る。レトロウイルスベクターは中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）またはＤＮＡフラップをさらに含有してウイルスタイターおよび形質導入効率を増加させることができる。
【０３５３】
受容体結合剤をコードする配列を含有する核酸を任意の適切な標的細胞に、例えば、エクスビボまたはインビボで送達することができる。例となる標的細胞には滑膜細胞、造血細胞、皮膚細胞などが含まれる。その核酸を眼に関連する標的細胞、例えば角膜上皮細胞に送達することができる。送達にはデブリードマン、または上皮基底層を露出するための角膜上皮の擦過が含まれ得る。その後、送達用の核酸を添加する。別の実施形態では、前記核酸は角膜内皮細胞、角膜の周縁部の下にある小柱網の細胞、眼の脈絡膜層の細胞、網膜、強膜または毛様体の細胞、網膜血管系または眼血管系の細胞、または硝子体の細胞または水晶体、例えば水晶体上皮の細胞に送達される。
【０３５４】
送達方法には、例えば、レトロウイルスの感染、アデノウイルスの感染、プラスミドを使用する形質転換、外来性核酸を含有するリポソームを使用する形質転換、遺伝子銃による核酸送達（例えば、金粒子または他の金属粒子への核酸の負荷と細胞への射出または注入）、アデノ随伴ウイルスの感染、およびエプスタイン・バール・ウイルスの感染が含まれる。送達は、注射針による注入、皮下噴射、電気穿孔または遺伝子銃を含むあらゆる方法による細胞または組織への送達であり得る。
【０３５５】
遺伝子送達のための他の方法は、例えば、Kay, M. A. (1997) Chest 111(増刊第6 号):138S-142S、Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81、Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74、Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86、Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52、Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56、Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101、Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172、Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49、およびLee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8に見出され得る。
【０３５６】
例となる第二剤
本明細書に記載される受容体結合剤を第二剤と共に投与することができる。その２つの薬剤は共投与され得る、または例えば異なる投与計画を用いて別個に投与され得る。例となる第二剤には抗炎症性薬剤が含まれる。
【０３５７】
１つの実施形態では、第二剤はＩＬ‐１７アンタゴニスト（全てのＩＬ‐１７ファミリーメンバーのアンタゴニスト、例えば、ＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７Ｂ、ＩＬ‐１７Ｃ、ＩＬ‐１７Ｄ、およびＩＬ‐１７Ｅのアンタゴニストを包含する）である。例となるＩＬ‐１７アンタゴニストには、ＩＬ‐１７（ＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７Ｂ、ＩＬ‐１７Ｃ、ＩＬ‐１７Ｄ、およびＩＬ‐１７Ｅを含む）に結合し、ＩＬ‐１７介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ＩＬ‐１７の１つ以上の受容体、例えばＩＬ‐１７ＲＡおよびＩＬ‐１７ＲＣに結合し、ＩＬ‐１７介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ＩＬ‐１７と少なくとも１つの受容体サブユニット、例えば、ＩＬ‐１７とＩｌ‐１７ＲＡ、またはＩＬ‐１７、ＩＬ‐１７ＲＡとＩＬ‐１７ＲＣを含有する複合体に結合し、ＩＬ‐１７介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ならびにＩＬ‐１７ＲＡおよびＩＬ‐１７ＲＣの可溶性細胞外ドメインのうちの１つ以上を含み、ＩＬ‐１７介在性シグナル伝達を抑制する可溶性受容体などの薬剤が含まれる。
【０３５８】
別の実施形態では、第二剤はＩＬ‐１２アンタゴニストである。例となるＩＬ‐１２アンタゴニストには、ＩＬ‐１２（ｐ３５およびｐ４０を含む）に結合し、ＩＬ‐１２介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ＩＬ‐１２の１つ以上の受容体、例えばＩＬ‐１２Ｒβ１またはＩＬ‐１２Ｒβ２に結合し、ＩＬ‐１２介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ｐ３５、ｐ４０および少なくとも１つの受容体サブユニット、例えばＩＬ‐１２Ｒβ１またはＩＬ‐１２Ｒβ２を含有する複合体に結合し、ＩＬ‐１２介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、およびＩＬ‐１２Ｒβ１またはＩＬ‐１２Ｒβ２の可溶性細胞外ドメインのうちの１つ以上を含み、ＩＬ‐１２介在性シグナル伝達を抑制する可溶性受容体などの薬剤が含まれる。
【０３５９】
別の実施形態では、第二剤はＩＬ‐２３アンタゴニストである。例となるＩＬ‐２３アンタゴニストには、ＩＬ‐２３（ｐ１９およびｐ４０を含む）に結合し、ＩＬ‐２３介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ＩＬ‐２３の１つ以上の受容体、例えばＩＬ‐１２Ｒｂ１またはＩＬ‐２３Ｒに結合し、ＩＬ‐２３介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、ｐ１９、ｐ４０および少なくとも１つの受容体サブユニット、例えば、ＩＬ‐１２Ｒｂ１またはＩＬ‐２３Ｒを含有する複合体に結合し、ＩＬ‐２３介在性シグナル伝達を抑制する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）、およびＩＬ‐１２Ｒｂ１またはＩＬ‐２３Ｒの可溶性細胞外ドメインうちの１つ以上を含み、ＩＬ‐２３介在性シグナル伝達を抑制する可溶性受容体などの薬剤が含まれる。
【０３６０】
ＩＬ‐２３に対する例となる抗体が説明されている。例えば、Beyer et al., J. Mol. Biol. (2008), doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001を参照のこと。
【０３６１】
動物モデル
受容体結合剤を、ヒトの疾患、例えばヒト自己免疫疾患および／またはヒト炎症性疾患の動物モデルにおいて評価することができる。その薬剤はその動物における対応する標的タンパク質への特異性を有し得る。
【０３６２】
リウマチ性関節炎モデル
受容体結合剤をリウマチ性関節炎の動物モデル、例えば、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて評価することができる。例えば、McIndoe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214、Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569、およびCurrent Protocols in Immunology, Unit 15.5, Coligan et al. (編), John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。そのモデルは、天然ＩＩ型コラーゲンに関して感受性のラット／マウスの系統を免疫することにより作製される。コラーゲンを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化し、そして、尾の付け根に皮内注射する（１００ｍｇコラーゲン：１００ｍｇＣＦＡ／マウス）。対照マウスに０．０５ｍｌの上流水／ＣＦＡ乳液を皮内注射する。不完全アジュバント中のコラーゲンかなる追加免疫用の注射を最初の免疫の２１日後に投与する。疾患はコラーゲンで免疫されて誘導された自己免疫応答に起因する。
【０３６３】
関節を関節炎、炎症、パンヌス、軟骨損傷および骨吸収について、確定された尺度を用いて採点することができる。例えば、関節炎の重症度を次のように採点することができる：０＝目に見える関節炎の影響無し；１＝１つの指または関節の浮腫および紅斑；２＝２つの関節の浮腫および紅斑；３＝２つより多くの関節の浮腫および紅斑；４＝足関節の強直と手足の変形を伴う、足および指全体の重症の関節炎。各肢の採点を合計し、それぞれ個々の動物の関節炎指標（ＡＩ）として記録する。他の採点スキームをこれらおよび他の基準について使用することもできる。
【０３６４】
多発性硬化症
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は多発性硬化症についての有用なマウスモデルである。受容体結合剤をＥＡＥモデルにおいて評価することができる。ＥＡＥは、中枢神経系におけるＴ細胞および単核球細胞炎症およびその後の軸索の脱ミエリン化を特徴とするＴ細胞介在性自己免疫障害である（例えば、Bolton, C., 1995, Multiple Sclerosis, 143を参照のこと）。例となるプロトコルはCurrent Protocols in Immunology, Unit 15.1 and 15.2; Coligan et al. (編), John Wiley & Sons, Inc.に見出され得る。オリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞が、例えば、Duncan et al., 1997, Molec. Med. Today, 554-561に記載されるように中枢神経系に移植されているモデルがミエリン疾患に利用可能でもある。
【０３６５】
同種移植片
受容体結合剤を、例えば、マウス尾皮膚移植片を使用する皮膚同種移植片拒絶反応の動物モデルにおいて評価することができる。皮膚同種移植片拒絶反応にはＴ細胞、ヘルパーＴ細胞およびキラー・エフェクターＴ細胞が介在する。例えば、Current Protocols in Immunology, Unit 4.4; Coligan et al. (編), 1995, John Wiley & Sons, Inc. を参照のこと。他の移植拒絶モデルを使用することもできる。例えば、Tinubu et al., 1994, J. Immunol., 4330-4338を参照のこと。
【０３６６】
ＩＢＤおよび大腸炎モデル
炎症性腸疾患の例となるモデルは、ＳＣＩＤマウスに移植されたＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ‐高発現細胞を使用するものである。例えば、Hirano et al., J Pharmacol Sci. 2009 Jun;110(2):169-81遺伝子導入ＩＬ‐１０欠損マウスの使用法を参照のこと。例えば、Inaba et al., Inflamm Bowel Dis., DOI: 10.1002/ibd.21253 (2010)を参照のこと。さらに別の例となる大腸炎モデルは急性大腸炎を誘発させるためにデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を使用する。例えば、大腸炎は自由に飲める飲料水中の５％（重量／体積）ＤＳＳ（３０〜４０ｋＤａの分子質量；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、オハイオ州、オーロラ）を投与することによりマウスにおいて誘導され得る。この処置により生じる症状は、出血性の下痢、体重減少、大腸の短縮化、および好中球浸潤に伴う粘膜の潰瘍形成である。ＤＳＳ誘発性大腸炎は、リンパ過形成、限局性陰窩損傷、および上皮の潰瘍形成と共に炎症性細胞の固有層への浸潤を組織学的な特徴とする。これらの変化はＤＳＳの上皮への毒性効果のため、および固有層細胞の貪食およびＴＮＦ‐αとＩＦＮ‐γの産生により生じると考えられている。例えば、Hassan et al. PLoS One. 2010 Jan 25;5(1):e8868を参照のこと。
【０３６７】
ドライアイ疾患モデル
受容体結合剤を当技術分野において公知の方法を用いてドライアイ疾患のマウスモデルにおいて評価することができる。例えば、ドライアイは、マウスにスコポラミンを皮下注射し、次にそのマウスを環境制御室で飼育することにより誘発され得る。具体的な例として、正常で健康な６〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、環境制御室内で乾燥環境に連続的に曝露することによりドライアイを持つように誘導することができる。その部屋は３０％未満の低相対湿度（全般的に約１９％）、高い空気の循環（１５リットル／分）および一定の温度（約２２℃）を有する。その部屋で飼育されたマウスは涙の分泌を阻害するためにスコポラミンで処理もされる。持続放出性経皮スコポラミンパッチをＮｏｖａｒｔｉｓ社（ニュージャージー州、サミット）から入手することができる。パッチの４分の１を４８時間ごとにマウスの脱毛した尾の中部に適用する。環境制御室およびスコポラミンの組合せにより、比較的短期間（約２〜４日）に重症のドライアイが生じる。環境制御室をBarbino et al., Invest. Ophthal. Vis. Sci., 46: 2766-2711 (2005)に記載されるように準備することができ、そして、環境制御室が空気の循環、湿度および温度の制御を可能とする。
【０３６８】
マウスをドライアイの徴候について、例えば、ａ）ドライアイの患者では一般的に減少する涙液の産生を測定する綿糸試験、ｂ）角膜表面の損傷のマーカーである角膜フルオレセイン染色、および一般的な眼科検査を実行することによって、モニターすることができる。
【０３６９】
綿糸試験
涙の産生を、フェノールレッド（Ｚｏｎｅ‐Ｑｕｉｃｋ、Ｌａｃｒｉｍｅｄｉｃｓ社、ワシントン州、イーストサウンド）を染み込ませる綿糸試験を用いて測定することができる。蛍光灯付き拡大鏡の下で糸をジュエラーピンセットで持ち上げ、右目の結膜円蓋の外眼角に３０秒または６０秒配置する。涙が染み込んだ長さ（ｍｍ）を顕微鏡下で血球計算版の目盛りを用いて読み取る。
【０３７０】
角膜フルオレセイン染色
角膜フルオレセイン染色を、マイクロピペットにより眼の下結膜嚢に１．０μｌの５％フルオレセインを適用することにより評価することができる。角膜をフルオレセインの滴下から３分後にコバルトブルーの光を用いる細隙灯付き生物顕微鏡で検査する。点状の染色を、角膜の表面が分割されている５つの領域のそれぞれについて０〜３段階の標準化国立眼研究所（ＮＥＩ）格付けシステムを用いて盲検的に記録する。
【０３７１】
他の適切な方法を使用してもよい。例えば、実施例８（下掲）を参照のこと。
【０３７２】
診断上の使用および他の使用
本明細書に記載される受容体結合剤を使用して、ＩＬ‐１Ｒ１を試料、すなわちそのような受容体を発現する細胞において検出することができる。例えば、その薬剤を、標識である部分、すなわちシグナルを生じる部分、例えば酵素、放射性標識、エピトープ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）で直接的または間接的に標識することができる。前記薬剤を試料または細胞と接触させて、前記受容体が試料中に、または細胞上に存在するか、例えば、標準的な免疫ブロッティング、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光エネルギー移動、ウエスタンブロット、および他の診断技術および検出技術を用いて決定することができる。
【０３７３】
また、受容体結合剤をインビボ検出用に標識し、対象に投与することもできる。その対象は、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段により画像化され得る。例えば、前記結合剤を、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈなどの放射性標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーが検出可能であるポジトロン放出性同位体、ルシフェリンなどの化学発光体、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素マーカーを使用して標識することができる。前記薬剤を、常磁性の薬剤および強磁性体または超常磁性体（主にＴ２応答を変える）などの造影剤を使用して標識することができる。
【０３７４】
受容体結合剤を、それが結合する受容体を発現する細胞を精製するために使用することもできる。例えば、受容体結合剤を固定化担体（例えば、磁性ビーズまたはカラムマトリックス）に結合し、そして、その受容体を発現する細胞に接触させることができる。その担体を、例えば、生理的緩衝液を使用して洗浄することができ、そして、その細胞をその担体から回収することができる。
【０３７５】
受容体結合剤を使用して、それが結合する可溶性型の受容体を精製することができる。例えば、その可溶性受容体を含有する試料を固定化受容体結合剤に結合させることができ、次に、例えば、洗浄後にその固定化薬剤から回収することができる。
【０３７６】
次の非限定的な実施例が本明細書に記載される本発明の実施形態をさらに例示する。
実施例
【実施例１】
【０３７７】
（下の）表４に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を、Ｔ７プロモーターとアンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＥＴベクター（ｐＥＴ３１シリーズ）またはＴ７プロモーターとカナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＥＴベクター（ｐＥＴ２８シリーズ）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、米国、ニュージャージー州、ギブスタウン）内に構築し、そして、発現させた。発現に使用することができるコード配列の例が表５において提供される。
【表５】
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2014522868.tif 000009
【０３７８】
上のタンパク質をコードする例となる核酸配列が表５に記載される。いくつかの実施形態では、その核酸配列は下に記載されている最初のヌクレオチドの前にＡＴＧをさらに含む。いくつかの実施形態では、その核酸配列は下に記載されている最後のヌクレオチドの後に終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）をさらに含む。
【表６】
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【０３７９】
前記タンパク質は、下に例示されるように、ＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａに由来する多種多様な残基を含み得る。Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５という例の中で、サイトカインドメインはＩＬ‐１βに由来する４８〜７０％の残基とＩＬ‐１Ｒａに由来する５５〜７８％の残基を有し得る。（多数のアミノ酸残基がその２つのタンパク質の間で保存されているので、ＩＬ‐１βとＩＬ‐１Ｒａに対する同一性パーセンテージの合計は１００％よりも高くなる場合がある。）
【表７】
2014522868.tif 000014
【実施例２】
【０３８０】
ヘキサヒスチジンタグを含有するタンパク質を大腸菌細胞ＢＬ２１（ＤＥＳ）株またはＢＬＲ（ＤＥ３）内で、ＬＢブロス培地中で１ｍＭのＩＰＴＧを使用して３７℃で３時間誘導することにより発現させた。細胞を２０〜５０ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ‐１００、ｐＨ８．０中で溶菌した。溶菌液を、０．１％のポリソルベート８０を含有する１．２５×ＰＢＳに対して透析し、次に、Ｈｉｓ  ＴｒａｐＨＰ（登録商標）充填済みカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を使用するＩＭＡＣクロマトグラフィーにかける前に０．８／０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過した。そのカラムを５０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１に平衡化し、そのカラムに試料を負荷し、そして、そのカラムを同じ緩衝液で洗浄した。そのカラムに対し、同じ緩衝液中の２５ｍＭイミダゾールを使用して前溶出操作を行い、そして、同じ緩衝液中の１２５ｍＭイミダゾールを使用して溶出操作を行った。溶出されたタンパク質を１．２５×ＰＢＳ、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析した。
【０３８１】
タンパク質を、それが２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液中にある状態で負荷した。そのタンパク質を、２００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の緩衝液を使用して溶出した。溶出されたタンパク質をＰＢＳ、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）（１０Ｋ）フィルターを使用して濃縮し、そして、４℃または−８０℃で貯蔵した。
【０３８２】
ヘキサヒスチジンタグを欠くタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Ｐ０５タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。発現細胞の溶菌液を、塩が無く（約１ｍＳ／ｃｍの電気伝導度）、低ｐＨ（約ｐＨ５．５）の状態でＧｉｇａＣａｐＳ（商標）カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ社、米国、ペンシルバニア州、キング・オブ・プロシア）に供した。その後、そのカラムに対し、ｐＨ勾配（緩衝液Ａ＝１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．５；緩衝液Ｂ＝２０ｍＭトリス、ｐＨ８）による溶出操作をおこなった。次に、溶出されたタンパク質を含有する５ｍｌの画分を５ｍｌのＨ２Ｏと５ｍｌの２０ｍＭトリス（ｐＨ８）で希釈し、その後、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）に供し、そして、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中の０ｍＭ〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配を使用して溶出した。溶出されたタンパク質を１．２５×ＰＢＳ、０．１％ツイーン（登録商標）８０またはツイーン（登録商標）を欠く１．２５×ＰＢＳに対して徹底的に透析し、そして、貯蔵した。図６を参照のこと。Ｐ０３タンパク質およびＰ０４タンパク質を、同様の方法を用いて精製した。
【０３８３】
Ｐ０５を発現する細胞を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ２Ｌ  Ｂｉｏｓｔａｔ（商標）Ａ＋内の、１０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、微量元素（１ｍｇ／ｍｌのＴｅｋｎｏｖａ（商標）１０００Ｘ微量元素、Ｔ１００１番）および抗生物質で補充された無動物成分ソイトン（Ｔ７６６０番）を含むＴｅｋｎｏｖａ（商標）テリフィック・ブロスでも培養し、そして、その細胞に対し、ＯＤ３５〜４０の時点で１ｍＭのＩＰＴＧを使用して約６時間の誘導操作を行った。細胞を３７℃、３０％の溶存酸素、ｐＨ７．０、および２００〜８００ｒｐｍの撹拌、２Ｌ／分の酸素注入の条件で培養した。ｐＨの上昇によって検出されるグルコースの欠乏が起きたときに、細胞に９ｇのグルコース／Ｌ／時間の割合でグルコースを供給した。ｐＨが減少する（誘導から約２．５時間後）ときは、供給を６ｇグルコース／Ｌ／時間に低下させた。
【０３８４】
細胞を収集し、溶菌緩衝液（２０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトン、ｐＨ８．０；２０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトン、ｐＨ７．０；５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトン、ｐＨ６．５；または５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトン、ｐＨ６．０）中で溶菌した。溶菌液をｐＨ５．３および３ｍＳ／ｃｍ（１ｍｌカラム樹脂当たり３５ｍｇの生成物）でＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ陽イオンイオン交換媒体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、カリフォルニア州、カールスバード）に負荷した。
【０３８５】
例となる手法では、Ｐ０５タンパク質を、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含有する緩衝液を使用するｐＨ７．０へのステップにより溶出した。第１溶出ピークを廃棄し、第２溶出ピークをプールして収集し、そして、その第２溶出ピークがＰ０５タンパク質を含んでいた。初期のプールは脱アラニン種と比べて未変性のＰ０５タンパク質に富んでいた。この溶出された物質を次にＣａｐｔｏＱ（商標）陰イオン交換樹脂に流した。通過画分に未変性のＰ０５タンパク質が含まれており、その通過画分を収集した。
【０３８６】
別の例となる手法では、媒体を１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で洗浄した。Ｐ０５タンパク質を、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０〜５８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を含有する緩衝液を使用するｐＨ６．０へのステップにより溶出した。第１溶出ピークをその後のピークと分離し、そして、その第１溶出ピークが未変性のＰ０５タンパク質を含んでいた。この溶出された物質を次にＣａｐｔｏＱ（商標）陰イオン交換樹脂に流した。通過画分に未変性のＰ０５タンパク質が含まれており、その通過画分を収集した。
【実施例３】
【０３８７】
タンパク質またはタンパク質を含有する上清をＩＬ‐１活性について細胞ベースの測定法において評価した。ＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ‐１β応答性細胞を使用してＩＬ‐１β活性をモニターした（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴより入手可能）。これらの細胞は５つのＮＦ‐κＢ結合部位と５つのＡＰ‐１結合部位に融合したＩＦＮ‐β最小プロモーターの制御下にあるＳＥＡＰレポーター遺伝子を含む。細胞表面上のＩＬ‐１受容体のＩＬ‐１βとの結合によりＮＦ‐κＢ活性化とＳＥＡＰ産生が引き起こされる。ＳＥＡＰレポートは、例えば、ＱＵＡＮＴＩ‐Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）と分光光度分析を用いて検出され得る。ＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ  ＩＬ‐１β細胞懸濁液を７０〜８０％の集密まで培養された細胞から調製した。その再懸濁細胞を新しい培養培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１０％（体積／体積）加熱不活化胎児ウシ血清（５６℃で３０分）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍｌノルモシン（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）Ｔ）中に約３３０，０００細胞／ｍｌに調節した。
【０３８８】
試薬を平底９６ウェル細胞培養プレートのウェルに添加した：５０ｍｌの最終体積へ１０ｍｌの２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ‐１β、ｕｍｌの目的の薬剤および３０ｍｌの細胞培地。陽性対照試料と陰性対照試料を並行して調製した。次に１５０ｍｌのＨＥＫ‐ＢｌｕｅＩＬ‐１β細胞懸濁液（約５０，０００細胞）を各ウェルに添加し、そして、そのプレートを組織培養恒温器内、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。概して、（２００ｍｌの最終体積中の）最終ＩＬ‐１β濃度は０．１ｎｇ／ｍｌであった。ＩＬ‐１β活性を翌日（１２〜１５時間後）に評価した。定量前に製造業者の指示に従ってＱＵＡＮＴＩ‐Ｂｌｕｅ（商標）試薬を調製した。平底９６ウェル測定用プレートを、１５０ｍｌのＱＵＡＮＴＩ‐Ｂｌｕｅ（商標）溶液を各ウェルに添加して準備した。９６ウェル組織培養プレートのウェルから５０ｍｌの調整済み培地を測定用プレートの各ウェルに添加した。そのプレートを３７℃で約１５〜２０分間保温した。その後、ＳＥＡＰレベルを、分光光度計を使用して６２０〜６５５ｎｍで測定した。
【０３８９】
結果．図７Ａに示されているように、このアッセイでは、Ｐ０６タンパク質はＩＬ‐１ＲＩアゴニストとして挙動し、Ｐ０７タンパク質は部分的アゴニストとして挙動し、そして、Ｐ０１タンパク質は受容体を活性化することができなかった。実際には、Ｐ０１タンパク質は、ＩＬ‐１βの存在下でアッセイされたとき、アンタゴニストとして挙動した。図７Ｂは、上のＨＥＫＢｌｕｅ（商標）細胞アッセイを使用した、様々なＩＬ‐１βタンパク質濃度におけるＰ０１によるＩＬ‐１β活性の拮抗作用を示す。拮抗作用はＰ０１の量の増加と共に上昇した（ｘ軸はＰ０１を含有する上清のマイクロリッター数を反映する）。
【０３９０】
タンパク質Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５はそれぞれＩＬ‐１β活性を抑制した。例えば図８Ａおよび８Ｂを参照のこと。Ｐ０５のＩＣ５０は約５ｎｇ／ｍｌ未満であった。Ｐ０５を、このアッセイにおいてＩＬ‐１ＲＩを刺激する能力について試験し、そして、Ｐ０５は、試験した最も高い濃度である１ｍｇ／ｍｌでもどのような検出可能な受容体活性化作用も有していないことが観察された。Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５も、ＩＬ‐１βに対して応答性であるヒト骨肉腫細胞株であるＭＧ‐６３細胞におけるＩＬ‐１β誘導性ＩＬ‐６発現を阻害した。ドライアイ疾患のマウスモデルでは、ヘキサヒスチジンタグ化Ｐ０５が生物活性を有することが観察された。非タグ化Ｐ０５については下の実施例８も参照されたい。
【実施例４】
【０３９１】
可溶性組換えヒトＩＬ‐１ＲＩ（ＩＬ‐１ＲＩの細胞外ドメインに対応する）へのタンパク質の結合特性を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＳＲ７０００ＤＣ  Ｄｕａｌ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＳＰＲシステムを使用する表面プラズモン共鳴を用いて評価した。結合は、０．００５％ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水中で評価された。ＩＬ‐１βは８〜９ｎＭの間のＫＤおよび２〜３×１０−３ｓ−１の間の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察され、別の実験では、約２ｎＭのＫＤ、１．３〜１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１の結合定数および約２．９〜３．０×１０−３ｓ−１の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察された。図９Ａを参照のこと。Ｐ０１タンパク質はＩＬ‐１βと同様の結合キネティクスで結合したが、結合実験（約１８０秒）の解離期の間に解離しなかった。このように、Ｐ０１タンパク質は、同様の条件下でＩＬ‐１βよりも高い親和性でＩＬ‐１ＲＩに結合した。
【０３９２】
ＩＬ‐１Ｒａの結合は約０．３３ｎＭのＫＤ、約２×１０５Ｍ−１ｓ−１の結合定数（Ｋａ）、および約６．６×１０−５ｓ−１の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察された。図９Ｂを参照のこと。キメラサイトカインドメインＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５は約１２ｐＭから１７００ｐＭまでの範囲のＫＤ、約３×１０４Ｍ−１ｓ−１から３×１０６Ｍ−１ｓ−１までの範囲の結合定数（Ｋａ）、および約２×１０−５から１×１０−３ｓ−１までの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察された。例えば、図９Ｃおよび９Ｄならびに下の表７を参照のこと。
【表８】
2014522868.tif 000015
【実施例５】
【０３９３】
その他の例となるキメラＩＬ‐１ファミリータンパク質には次のものも含まれる。
【表９】
2014522868.tif 000016
【０３９４】
下のポリペプチドは、ＩＬ‐１αに由来する少なくとも２つのセグメントとＩＬ‐１Ｒａに由来する少なくとも２つのセグメントを含むキメラドメインである。
【表１０】
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【実施例６】
【０３９５】
循環置換したＩＬ‐１キメラドメインが、その分子のＮ末端を、リンカー配列を使用してＣ末端に結合し、それらの末端のそれぞれについて新しい場所を選択することにより構築され得る。ＩＬ‐１βに由来する末端を有するタンパク質にとって、リンカーの長さは５アミノ酸から１０アミノ酸までの間、例えば約７アミノ酸であり得る。新しい末端にとって好ましい場所は、受容体から見て外側に向くループ、例えばβ６〜β７ループ（例えば、配列番号１の７１〜８０に対応するアミノ酸）またはβ７〜β８ループ（例えば、配列番号１の８４〜９９に対応するアミノ酸）内にある。
【０３９６】
そのような循環置換したＩＬ‐１キメラドメインの例には、
ＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＭＱＦＶＳＳＧＧＳＧＧＧＳＡＰＶＲＳＬＮＣＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤ（配列番号４０）；および
ＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＭＱＦＶＳＳＧＧＳＧＧＧＳＡＰＶＲＳＬＮＣＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫ（配列番号４１）
が含まれる。
【実施例７】
【０３９７】
タンパク質Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、ｍＩＬ‐１Ｒａ（メチオニルＩＬ‐１Ｒａ）およびＩＬ‐１βをリン酸‐緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。それらのタンパク質をＳＹＰＲＯオレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州）と、ストック濃度について１：５００で希釈して混合し、示差走査型蛍光定量にかけた。例えば、He et al. (2010) J. Pharm. Sciences, 99 1707-1720を参照のこと。蛍光の測定を、１分あたり１℃の率で温度を２５℃から９５℃まで上昇させているときに、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５  ＱＰＣＲ機械を使用してモニターした。融点（Ｔｍ）の値は、蛍光遷移の一次導関数の最大値から得た。タンパク質Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５は５０℃よりも高い５９℃という折畳み構造の変性の開始温度、ならびに５９℃、６０℃、６２℃および６４℃よりも高いＴｍを有することが観察された。結果が下の表８ならびに図１０Ａおよび１０Ｂに示されている。
【表１１】
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【０３９８】
Ｐ０４はｍＩＬ‐１ＲａとＩＬ‐１βよりも約４℃高いＴｍを有し、そして、ｍＩＬ‐１Ｒａよりも約３℃高く、ＩＬ‐１βよりも約１０℃高い折畳み構造の変性の開始温度を示す。Ｐ０３とＰ０５はｍＩＬ‐１ＲａとＩＬ‐１βよりも約９℃高いＴｍを有し、そして、ｍＩＬ‐１Ｒａよりも約１１℃高く、ＩＬ‐１βよりも約１８℃高い折畳み構造の変性の開始温度を示す。
【実施例８】
【０３９９】
精製されたＰ０５（ヘキサヒスチジンタグを欠く）を１．２５×ＰＢＳ中に調製し、ドライアイ疾患のマウスモデルにおいて試験した。このモデルでは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した（３０％以上の相対湿度、ヒドロゲル補助食品、およびｅｎｖｉｒｏｄｒｙ環境強化を有する動物飼育室で１〜２週間順応させられた）６〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを第０日にフルオレセイン染色について事前に選別した。フルオレセイン染色について、新しく注射用水に１０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して作製したフルオレセインをそれぞれの各眼に対して０．４μＬずつ投与した。投与から約８〜１３分後、Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光解剖顕微鏡を使用して眼を採点した。点状の染色を、角膜の表面が分割されている５つの領域のそれぞれについて０〜３段階の標準化国立眼研究所（ＮＥＩ）格付けシステムを用いて記録した（スコアの範囲は０〜１５／眼である）。教育用ブリッジを使用して、各眼について１つの全体的なスコアを与えるために、２つの盲検によるスコアにより（複数の）マウスが同時に評価された。
【０４００】
各眼について（１５という最大のスコアのうち）７以下のスコアを有するマウスを第１日にドライアイチャンバー（２０％±２％の湿度と約２１Ｌ／分／ケージという一定の空気の循環）内に配置し、そして、実験の最中は（検査を除いて）このチャンバー内で飼育した。第３日に、マウスを再度採点し、そして、１群当たり８〜１０匹のマウスを有する処置群に無作為化した。４〜５匹のマウスからなる各ケージがほぼ同じ平均疾患スコアを有するようにマウスを無作為化した。第３日に開始し、無作為化の後に、マウスに１日につき２回の頻度で３μＬ／眼で目薬中のＰ０５またはベヒクル（１．２５×ＰＢＳ）を局所投与した。マウスを角膜フルオレセイン染色について第７日、第９日、および第１１日に上で説明したように検査し、採点した。実験の最中は、採点者は処置群について盲検状態にされた。
【０４０１】
図１１Ａは、次の１日につき２回の処置、すなわち、処置無し、ベヒクル（１．２５×ＰＢＳ）による処置、および１０ｍｇ／ｍｌ（１％）Ｐ０５による処置の下にある、２つの同一の実験のマウスについての第０日、第３日、第７日、第９日、および第１１日での平均角膜染色スコア±標準誤差の棒グラフである。１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５は実験の第７日、第９日、および第１１日に角膜染色を著しく低下させた。角膜染色の低下によって評価される効力は０．１ｍｇ／ｍｌのＰ０５という低い用量を用いても観察された。組換えＩＬ‐１Ｒａも中程度にその動物モデルにおける角膜染色を低下させた。
【０４０２】
図１１Ｂに示されているように、１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５の効果は、同じベヒクル中の１０ｍｇ／ｍｌのマウス血清アルブミンとの比較に基づいて特異的であった。ベヒクルと比べて、１０ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）では効果は見られず、そして、１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５の効果は１０ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミンと比べて統計的に有意であった。図１１Ｃに示されているように、１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５を点眼用乳剤中の０．０５％サイクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））とも比較した。Ｐ０５は角膜染色を低下させたが、０．０５％サイクロスポリン点眼用乳剤については１日つき２回の投薬から約１週間後に効果が観察されなかった。
【実施例９】
【０４０３】
補足ステップが、ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌細胞における発酵により産生されたＰ０５の精製のために開発されている。溶出条件は、１ｍＬのカラムについての実験アプローチの統計的設計（ＤＯＥ）により確定された。その最適化された条件は中間規模（１０ｍＬカラム）で実行された。
【０４０４】
生成物を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したｐＨ７．０の２０ｍＭトリスからなる溶菌緩衝液中でマイクロフルイダイゼーションにより抽出する。清澄化した溶菌液を５．３のｐＨおよび３ｍＳ／ｃｍの電気伝導度に調節する。その調整済み溶菌液を、１ｍＬのカラム当たり２５〜３０ｍｇのＰ０５という容量に対して２分間の滞留時間を有するＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ（強陽イオン交換樹脂）に負荷する。そのカラムを平衡化緩衝液で洗浄して結合しなかった種を除去する。ｐＨ６．０および３ｍＳ／ｃｍでの２回目の洗浄を実施して夾雑物の集団を除去する。生成物をｐＨ６．０および６．６ｍＳ／ｃｍで溶出する。生成物関連種をｐＨ６．０および１２．４ｍＳ／ｃｍで溶出する。カラムを高塩緩衝液およびＮａＯＨで清浄化する。
【０４０５】
Ｐ０５は６．５８という理論上のｐＩを有する１７ｋＤａのタンパク質である。脱アラニン種の理論上のｐＩは６．８である。メチオニル化種の理論上のｐＩは６．３であり、アセチル化種の理論上のｐＩ値は６．３より下である。これらの３つのアイソフォームとＰ０５タンパク質は弱陽イオン交換分析クロマトグラフィーによって容易に分離される。脱アラニン種は、大腸菌内に見出されるアミノペプチダーゼＰ活性の産物である可能性がある。それらのアイソフォームは質量分析法、ペプチドマッピング法、およびＨＰＬＣ法によって特定され得る。
【０４０６】
クロマトグラフィーの材料
Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳは５０uｍの公称粒径を有する架橋ポリ（スチレン‐ジビニルベンゼン）ビーズに基づく。そのクロマトグラフィー用マトリックスはスルホプロピル表面化学を有する。それは結合の最中の塩レベルの上昇に耐えるように設計された。Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ（カタログ番号４４０４３３９、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）材は大量の泥状物として調達され、そして、１ｍＬという最終カラム体積（５ｃｍのベッド高）を有する５×５０ｍｍ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（カタログ番号２８‐４０６４‐０９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に充填され、または１０×１５０ｍｍ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（カタログ番号２８‐４０６４‐１６、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に１０．５ｍＬという最終体積（１３．４ｃｍのベッド高）まで充填された。
【０４０７】
緩衝液
全ての緩衝液はＭｉｌｌｉＱ水を使用して体積に基づいて調製された。所望のｐＨに達するために、１０ＮのＨＣｌまたは（１０ＭのＮａＯＨのストック溶液から作製された）１ＭのＮａＯＨのどちらかを添加して緩衝液を滴定した。調製後、全ての緩衝液を０．２ｍｍのＰＥＳボトルトップフィルターに通して濾過した。全てのｐＨと電気伝導度の測定を室温（約２０〜２５℃）で実行した。
【０４０８】
Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ緩衝液
ＣＥＸ平衡化緩衝液−１Ｌの緩衝液当たり０．５７ｍＬの氷酢酸と２．４４ｇのＮａＣｌを添加することにより作製された２１ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸（ＨｏＡＣ）。最終ｐＨは５．３であり、最終電気伝導度は３ｍＳ／ｃｍであった。
【０４０９】
ＣＥＸ洗浄緩衝液−１Ｌの緩衝液当たり１９．５ｇのＭＯＰＳ遊離酸、１．５ｇのＭＯＰＳナトリウム塩、および１．２８ｇのＮａＣｌを添加することにより作製された２２ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭ  ＭＯＰＳ。最終ｐＨは（所望により）５．７〜６．６であり、最終電気伝導度は３ｍＳ／ｃｍであった。
【０４１０】
ＣＥＸ溶出緩衝液−１Ｌの緩衝液当たり１９．５ｇのＭＯＰＳ遊離酸、１．５ｇのＭＯＰＳナトリウム塩、および６．９３ｇのＮａＣｌを添加することにより作製された１１８ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭ  ＭＯＰＳ。最終ｐＨは（所望により）５．７〜６．６であり、最終電気伝導度は１２．４ｍＳ／ｃｍであった。
【０４１１】
ＣＥＸ溶離緩衝液−１Ｌの緩衝液当たり０．５７ｍＬの氷酢酸と１７５ｇのＮａＣｌを添加することにより作製された３ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸。最終ｐＨは５．３であり、最終電気伝導度は１８８ｍＳ／ｃｍであった。
【０４１２】
溶菌液調製物
溶菌液のｐＨを、１Ｌの緩衝液当たり１１．５ｍＬの氷酢酸を混合することにより作製された２００ｍＭでｐＨ４．５の酢酸を使用して調節した。その溶液を、１ＭのＮａＯＨを使用して４．５の最終ｐＨまで滴定した。濃縮された酸または強酸の低いｐＨに起因する局所的な沈殿を防ぐためにこの溶液を使用した。
【０４１３】
これらの実験の負荷材料は２Ｌフェドバッチバイオリアクターの運転に由来する抽出物であった。細胞沈殿物からの生成物の抽出は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したｐＨ７．０の２０ｍＭトリスを使用して行われた。その新しい抽出物を、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して３ｍＳ／ｃｍの電気伝導度にまで希釈した（通常１：１〜１．５の希釈）。その希釈された抽出物を４１ｍＬのアリコットにして−２０℃で凍結した。負荷物を調製するために、アリコットを室温で融かし、そして、ｐＨ４．５の２００ｍＭ酢酸を使用してｐＨ５．３に滴定した。電気伝導度のわずかな調整は、滴定後に必要とされるとき、ＭｉｌｌｉＱ水の添加により行った。最後に、負荷物を、ＣＥＸ平衡化緩衝液を使用して２．５倍に希釈して約１．７ｇ／Ｌの濃度にした。その負荷物を０．８／０．２uｍフィルターに通して滅菌濾過した。その調整済み負荷物を調製した当日に使用した。
【０４１４】
宿主細胞タンパク質の測定
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを大腸菌発現システムに特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（カタログ番号Ｆ４１０、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により決定した。そのキットと共に提供されたプロトコルに正確に従った。ＨＣＰレベルについてアッセイされる試料を、試料希釈剤（カタログ番号Ｉ０２８、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、１０倍という最小希釈率で希釈した。試料は通常２つの希釈率で希釈して、それぞれの希釈について２つ組でプレートに添加した。ＨＣＰのレベルは百万分率（ｐｐｍ）またはｎｇ‐ＨＣＰ／ｍｇ‐生成物を単位として表される。
【０４１５】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）による純度分析では、１ｍｍ×１０ウェル、１ｍｍ×１２ウェル、または１ｍｍ×１５ウェルのいずれかのＮｕＰＡＧＥ４‐１２％ビストリスゲル（それぞれカタログ番号ＮＰ０３２２ＢｏｘおよびＮＰ０３２３Ｂｏｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する。泳動緩衝液は２０×濃度（カタログ番号ＮＰ０００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から調製した１×ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液である。Ｎｏｖｅｘシャープ染色済みタンパク質標準物質（カタログ番号５７３１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を分子量の指標として使用する。分析用の試料はＭｉｌｌｉＱ水を使用する希釈により３０ｍＬの最終体積に調製され、そして、１０ｍＬの４×ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）（カタログ番号ＮＰ０００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１×の終濃度まで添加した。その試料をボルテックスにより５秒間混合した。Ａ２８０／Ａ３２０測定により計算したタンパク質濃度に基づき、ウェル当たり３μｇの目的物を負荷した。
【０４１６】
ｗＣＥＸ
Ｐ０５を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）と１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の移動相溶液を使用する、１．２ｍＬ／分の流速でＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ‐１０  ４×２５０ｍｍカラム（製品番号０５４９９３）を使用する弱陽イオン交換クロマトグラフィー（ｗＣＥＸ）により評価した。濃度勾配は２０分に渡って１０％Ｂから２５％Ｂまで実行される。アセチル化種が、実行から約１０分後に最初に溶出する。メチオニル化種が２番目に溶出し、次に未変性のＰ０５が、その濃度勾配の後の部分にある脱アラニン種の約１．５〜２．５分前に溶出する。
【０４１７】
陽イオン交換捕捉クロマトグラフィー
クロマトグラフィーをＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００クロマトグラフィーシステムで実行した。１０ｍＬのＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳカラムを充填した。材料を４０ｍｇのＰ０５／ｍｌの割合で負荷した。または、材料を２５〜３０ｍｇのＰ０５／ｍｌの割合で負荷することができる。クロマトグラフィーの方法が表９にまとめられている。滞留時間は負荷ステップおよび溶出ステップの間、２分で一定に保たれた。擬似溶出プールを作成し、そして、精製物の回収率、ＨＣＰれべる、および未変性のタンパク質の割合（％）について測定した。全部で２回の実行を、１０ｍＬカラムについて、ｐＨ６．０で３０％と３５％の％Ｂを用いて完了した。
【表１２】
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【０４１８】
２回目の洗浄により、主に夾雑物から構成されるピークが生じる。３０％のＢと３５％のＢによる１回目の溶出によって、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析で純度が９５％よりも高い生成物が生じる。２回目の洗浄の塩濃度を少しずつ上昇させて溶出ピークの肩部を取り除くことができる。図１３〜１６も参照されたい。最終生成物プールの回収率は５０％よりも高く、脱アラニン種は１０％未満、溶出液中のＨＣＰは６００ｐｐｍ未満である。
【０４１９】
２Ｌの培養調製物では、２５０ｍＬのＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳカラムを捕捉クロマトグラフィーのために使用し、５０ｍＬのＰｏｒｏｓＨＱ陰イオンカラムを使用し、そして、２２０ｍＬのＣＨＡ（ハイドロキシアパタイトカラム）を使用して夾雑物をさらに除去した。
【０４２０】
１００Ｌの培養調製物では、６．２５ＬのＰｏｒｏｓＸＳカラムを捕捉クロマトグラフィーのために使用し、１ＬのＰｏｒｏｓＨＱカラムを陰イオンクロマトグラフィーのために使用し、そして、３０ＬのＣＨＡハイドロキシアパタイトカラムを使用して夾雑物をさらに除去した。３回のサイクルが１００Ｌの発酵槽全体を処理するために必要とされた。
【０４２１】
１０００Ｌの培養調製物では、約５０Ｌから約８０Ｌまで、例えば約６０Ｌ、または約７０Ｌの体積を有するＰｏｒｏｓＸＳカラムを捕捉クロマトグラフィーのために使用することができ、約５Ｌから約２０Ｌまで、例えば約１０Ｌまたは約１５Ｌの体積を有するＰｏｒｏｓＨＱカラムを陰イオン交換クロマトグラフィーのために使用することができ、そして、約２５０Ｌから約５００Ｌまで、例えば約３００Ｌまたは約４００Ｌの体積を有するＣＨＡハイドロキシアパタイトカラムを使用して夾雑物をさらに除去することができる。所望により、いくつかのバッチにおける大きい発酵槽を処理するためにより小さいカラムが使用されるだろう。
【実施例１０】
【０４２２】
Ｐ０４が精製され、そして、２５％ＰＥＧ１５００、０．１Ｍ  ＰＣＢ（ｐＨ４．０）中２０℃で回折品質の結晶を成長させた。そのタンパク質は空間群Ｐ２１２１２１の状態に結晶化し、ａ＝４４．５、ｂ＝４６．４、ｃ＝６４．８という典型的な単位格子ディメンションを有する。その結晶は高分解まで回折され、そして、１．４７Åまで拡大したデータセットが先端放射光施設ビームラインＬＳ‐ＣＡＴ２１ＩＤ‐Ｆ（米国、イリノイ州、シカゴ）で収集された。Ｐ０４のＸ線構造は、ＰＤＢ構造の１ＩＴＢと１ＩＲＡ（Vigers et al., (1997) Nature 386: 190-194および Schreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200）に由来する既知のＩＬ‐１β構造とＩＬ‐１Ｒａ構造の適切な部分を組み込んでいるモデルを使用する分子置換により解明された。最終モデルは１７．６％／２０．４％というＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅまで精緻化された。その最終モデルは１つのＰ０４分子（１４０残基）と９８分子の水を含有する（表１０）。Ｐ０４残基１〜２、４８〜４９および８５〜９３は、その電子密度では見えなかった。それらの残基は最終モデルでは失われている。
【表１３】
2014522868.tif 000020
【０４２３】
Ｐ０４結晶構造はモデル化により予想された構造と同様の折畳み構造を有する。この構造の視像が図１に示されている。その２つの構造を重ね合わせたものが図１２Ａに示されている。骨格炭素の根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）は、ＩＬ‐１βセグメントとＩＬ‐１Ｒａセグメントとそれぞれの親分子上の同じ残基に対して、１．４１Åと１．０９Åであった。Ｐ０４は少なくとも１つの特有の塩橋を有し、そして、ＩＬ‐１βに由来する残基とＩＬ‐１Ｒａに由来する対応する残基、すなわち、（ｉ）図１２Ｂに示されるＧｌｕ３９−Ｌｙｓ６４（ＩＬ‐１ＲＡに由来するＧｌｕ３９、ＩＬ‐１βに由来するＬｙｓ６４）、（ｉｉ）図１２Ｃに示されるＡｒｇ９−Ｇｌｎ１４９（ＩＬ‐１ＲＡに由来するＡｒｇ９、ＩＬ‐１βに由来するＧｌｎ１４９）、および（ｉｉｉ）図１２Ｃに示されるＳｅｒ１５２−Ｌｙｓ４０（ＩＬ‐１ＲＡに由来するＳｅｒ１５２、ＩＬ‐１βに由来するＬｙｓ５０）との間の相互作用に関わる２つの特有の水素を有する。これらの相互作用はＩＬ‐１β構造とＩＬ‐１Ｒａ構造には存在しないので、これらの特有の相互作用がＰ０４の上昇した熱安定性を説明することができる。これらの相互作用に関与する残基は、同様に上昇した熱安定性を有するタンパク質であるＰ０３とＰ０５にも存在する。
【実施例１１】
【０４２４】
追加の精製ステップを、細胞培養物から作製されたタンパク質をさらに精製するために用いて、例えば、生成物関連種、例えば脱アラニン種、アセチル化種およびメチオニル化種、例えばメチオニル化された未変化のタンパク質を分離して除くことを補助することができる。そのような精製ステップは、例えば、セラミックハイドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡ）を使用し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを５０ｐｐｍ未満にまで低下させることができる。ＣＨＡタイプＩは、電荷および／またはカルシウムイオンの配位に基づいて生体分子の分離を提供するマルチモーダルクロマトグラフィー媒体である。５ｍＬのカラム体積と４０uｍの粒径を有する充填済みカラムをＢｉｏ‐Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カタログ番号７３２‐４３２２）から入手した。
【０４２５】
緩衝液調製物
全ての緩衝液はＭｉｌｌｉＱ水を使用して体積に基づいて調製された。全ての緩衝液成分は、供給業者とカタログ情報と共に表１１にまとめられている。所望のｐＨに達するために、１０ＮのＨＣｌまたは（１０ＭのＮａＯＨのストック溶液から作製された）１ＮのＮａＯＨのどちらかを使用して緩衝液を滴定した。調製後、全ての緩衝液を０．２uｍのＰＥＳボトルトップフィルターユニットに通して濾過した。全てのｐＨと電気伝導度の測定を室温（約２０〜２５℃）で実行した。
【表１４】
2014522868.tif 000021
【０４２６】
ＣＨＡ緩衝液調製物
ＣＨＡの平衡化および洗浄用緩衝液−１３．５ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウムが１Ｌの緩衝液当たり１．１８ｇのリン酸二水素カリウム、０．２１ｇのリン酸水素二カリウム、および０．７９ｇのＮａＣｌを添加することにより作製された。最終ｐＨは６．５であり、最終電気伝導度は２．５ｍＳ／ｃｍであった。
【０４２７】
ＣＨＡ溶出緩衝液−１６０ｍＭリン酸カリウムが１Ｌの緩衝液当たり１４．１ｇのリン酸二水素カリウムおよび９．８ｇのリン酸水素二カリウムを添加することにより作製された。最終ｐＨは６．５であり、最終電気伝導度は約１８ｍＳ／ｃｍであった。
【０４２８】
ＣＨＡ溶離／調整緩衝液−４００ｍＭリン酸カリウムが１Ｌの緩衝液当たり１９．２ｇのリン酸二水素カリウムおよび４５．１ｇのリン酸水素二カリウムを添加することにより作製された。最終ｐＨは６．８であり、最終電気伝導度は約５２ｍＳ／ｃｍであった。
【０４２９】
注入流（feed stream）調製物
ＡＥＸ通過画分を、限外濾過（１０，０００ｋＤａ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ‐Ｓｔｅｄｉｍ社）を用いて５倍に濃縮した。透析濾過はこれらの実験には実行しなかった。濃縮後、ｐＨを、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して氷酢酸を１０倍に希釈して作製した１０％酢酸を使用して調節した。電気伝導度を、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して調節した。
【０４３０】
注入流（feed stream）調製物
これらの実験の負荷物を２Ｌフェドバッチバイオリアクター実験で発酵させられた大腸菌細胞から抽出した。抽出は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡが添加された０．１％トリトンＸを含むｐＨ７．０の２０ｍＭトリスを使用して実行された。作りたての抽出物を、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して３ｍＳ／ｃｍの電気伝導度にまで希釈し（通常１〜１．５倍の希釈）、そして、ＣＥＸによる精製のためにｐＨ５．３にまで滴定した。希釈された抽出物を０．８／０．２uｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ＸＬＧフィルター（カタログ番号５４４１３０７Ｇ４−−ＯＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ‐Ｓｔｅｄｉｍ社）に通して滅菌濾過した。溶菌液をＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳカラムに負荷し、そして、約１２ＣＶの溶出液を収集した。その溶出液を、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ７．５まで滴定し、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して５ｍＳ／ｃｍまで希釈し、そして、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱカラムに負荷した。５０ｍＭトリス、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の緩衝液をＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱカラムクロマトグラフィー（chromoatogrpahy）に使用した。Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ通過画分のプールを上で説明したように５倍に濃縮し、その後、ｐＨ６．５および２．５ｍＳ／ｃｍに調節した。
【０４３１】
Ａ２８０／Ａ３２０によるタンパク質濃度
2８０ｎｍでの吸光度を、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して測定し、３２０ｎｍでのベースラインの減算を行った。濃度は次の式により計算された：
【数１】
2014522868.tif 000022
この式で、Ｃはｍｇ／ｍＬを単位とする濃度であり、Ａ２８０とＡ３２０はそれぞれ２８０ｎｍおよび３２０ｎｍでの吸光度であり、ｅはタンパク質の吸光係数（１ＡＵ×ｍＬ×ｍｇ−１×ｃｍ−１）であり、そして、
【数２】
2014522868.tif 000023
は光路長である。２ｍＬのアリコットをそのまま希釈せずに測定した。
【０４３２】
宿主細胞タンパク質の測定
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを大腸菌発現システムに特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（カタログ番号Ｆ４１０、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により決定した。そのキットと共に提供されたプロトコルに正確に従った。ＨＣＰレベルについてアッセイされる試料を、試料希釈剤（カタログ番号Ｉ０２８、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して希釈した。精製された試料中のＨＣＰレベルは低いため、ＣＨＡ溶出液試料をそのまま希釈せずに測定した。試料は通常１つの希釈率で希釈して、それぞれの希釈について２つ組でプレートに添加した。特定の試料に対する典型的な希釈が表１２に概説されている。ＨＣＰのレベルは百万分率（ｐｐｍ）またはｎｇ‐ＨＣＰ／ｍｇ‐Ｐ０５を単位として表される。
【表１５】
2014522868.tif 000024
【０４３３】
弱陽イオン交換クロマトグラフィー（ｗＣＥＸ）
分析的ｗＣＥＸ分析をＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステムまたはＢｉｏＩｎｅｒｔシステムで実行し、そして、５℃に設定した温度制御自己注入チャンバーおよび２８０ｎｍでデータを収集するＰＤＡ検出器を利用した。移動相ＡはｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウムであった。移動相Ｂは２５０ｍＭ  ＮａＣｌが添加されたｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウムであった。約１０〜５０μｇの生成物をＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ‐１０カラム（カタログ番号０５４９９３、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）に注入した。カラムを１．２ｍＬ／分で操作した。未変性のＰ０５は約１６分に溶出する。脱アラニン種は約１８分に溶出し、メチオニル化種は約１４分、そして、ａｃＰ０５は約９分に溶出する。
【０４３４】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析的ＳＥＣ分析をＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｂｉｏ‐ｉｎｅｒｔ  ＨＰＬＣシステムで実行し、そして、５℃に設定した温度制御自己注入チャンバーおよび２１４ｎｍと２８０ｎｍでデータを収集するＰＤＡ検出器を利用した。移動相は１０×ＰＢＳストック溶液（カタログ番号ＢＰ３９９４、Ｆｉｓｈｅｒ社）の希釈液から調製した１×ＰＢＳであった。約１０〜５０μｇの生成物をＺｅｎｉｘ  ＳＥＣ‐１５０（カタログ番号２１３１５０‐７８２０、Ｓｅｐａｘ社）に注入した。カラムを１ｍＬ／分で操作した。Ｐ０５の単量体は約５．２分で溶出した。高次構造分子量種は３．７〜４．９分で溶出した。
【０４３５】
現行のＣＨＡカラムの操作条件
注記：開発に使用した小さいカラム体積（５ｍＬ）と比較的大きいクロマトグラフィー系の体積のため、スケールアップ時に体積を調節する必要があり得る。現行のＣＨＡカラムの操作条件が表１３にまとめられている。全てのステップが２分の滞留時間（２．５ｍＬ／分）および室温で実行された。１ｍＬのカラム当たり１５ｍｇのＰ０５という負荷が目標とされた。溶出ピークが２ＣＶ分の画分に収集され、そして、Ａ２８０／Ａ３２０、ｗＣＥＸ、ＳＥＣ、およびＨＣＰのＥＬＩＳＡにより検定された後に最終的な溶出プールを作製した。
【表１６】
2014522868.tif 000025
【０４３６】
セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡ）クロマトグラフィーのまとめ
ＣＨＡクロマトグラフィーのまとめが表１４に提供されている。生成物を、耐塩性強陽イオン交換樹脂であるＰｏｒｏｓＸＳを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーにより捕捉する。ＰｏｒｏｓＸＳ溶出液を調整し、そして、通過モードでＰｏｒｏｓＨＱに負荷する。生成物はカラムを通過した画分に収集される。通過画分を限外濾過／透析濾過か希釈／滴定のどちらかによりｐＨ６．５と２．５ｍＳ／ｃｍに調節することができる。次に、その生成物流（product stream）をＣＨＡカラムに負荷し、そして、１０％Ｂから９０％Ｂまでの２０ＣＶに渡る濃度勾配を用いて溶出する。濃度勾配溶出の間、画分を取集し、そして、夾雑物と生成物関連種のレベルを決定するためにｗＣＥＸにより検定した後に最終プールを作成する。将来の開発には、結合能とその分離能への影響、ならびに負荷物中の生成物関連種レベルの上昇の分離能への影響の調査が含まれる。より規模が大きいＣＨＡカラム（約１５０ｍＬ）も拡張性を確保するために評価される。
【表１７】
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【実施例１２】
【０４３７】
１００Ｌでの実施が、次のようにＰ０５を発現させ、精製して行われた。
（Ａ）実施例９に従う１００Ｌのバイオリアクターでの発酵により、４．４５ｇ／Ｌ×１０３．２Ｌ＝４５９．２ｇのＰ０５タンパク質が産生された。
（Ｂ）３回のＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ陽イオン交換カラム［ＰｏｒｏｓＸＳ  １９．９ｃｍのベッド高×２０ｃｍの内径（６．２５Ｌ）］への注入とその後の溶出により次のようにＰ０５が捕捉された。
１回目：９７．８Ｌ×１．４１ｇ／Ｌ＝１３７．９ｇ
２回目：１０５Ｌ×１．２８ｇ／Ｌ＝１３４．４ｇ
３回目：１０２Ｌ×１．４２ｇ／Ｌ＝１４４．８ｇ
総計のＰ０５負荷物＝４１７．１ｇ（９０．８％）
３回のＰｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳおよび溶出プール：１８７．５Ｌ×１．８２ｇ／Ｌ＝３４１．２ｇのＰ０５
Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳによるＰ０５の回収率（％）＝（３４１．２／４１７．１）×１００＝８１．８％
（Ｃ）２回のＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ陰イオン交換カラム［ＰｏｒｏｓＨＱ  １３．０ｃｍのベッド高×１０ｃｍの内径（１．０２Ｌ）］への注入とその後のＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱによる通過とさらに２回のＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱへの注入により次のようにＰ０５が捕捉された。
１回目：２１０Ｌ×０．７２５ｇ／Ｌ＝１５２．５ｇ
２回目：２００Ｌ×０．７２５ｇ／Ｌ＝１４５．０ｇ；総計のＰ０５負荷物＝２９７．５ｇ
Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱからの通過画分
１回目：２１０Ｌ×０．７１３ｇ／Ｌ＝１４９．７ｇ
２回目：２００Ｌ×０．７１ｇ／Ｌ＝１４２．０ｇ；総計のＰ０５負荷物＝２９１．７ｇ
Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱによるＰ０５の回収率（％）＝（２９１．７／２９７．５）×１００＝９８．１％
（Ｄ）ハイドロキシアパタイト（ＣＨＡ）カラム［ハイドロキシアパタイトタイプ１  ４０μｍ  １９．２ｃｍのベッド高×４４．６ｃｍの内径（３０．０Ｌ）］への負荷と溶出により次のようにＰ０５が捕捉された。
負荷調製物１：４６０Ｌ×０．３３ｇ／Ｌ＝１５１．８ｇ
負荷調製物２：４２０Ｌ×０．３２ｇ／Ｌ＝１３４．４ｇ；総計のＰ０５負荷物＝２８６．２ｇ
溶出プール：２８５Ｌ×０．９５ｇ／Ｌ＝２７０．７５ｇ
ハイドロキシアパタイトによるＰ０５の回収率（％）＝（２７０．７５／２８６．２）×１００＝９４．６％
（Ｅ）溶出されたＰ０５の限外濾過／透析濾過により次のようにＰ０５が捕捉された。
負荷２８５Ｌ×０．９５ｇ／Ｌ＝２７０．７５ｇ
残余分：３．９６Ｌ×６５．３ｇ／Ｌ＝２５８．６ｇ、回収率（％）＝（２５８．６／２７０．７５）×１００＝９５．５％
限外濾過／透析濾過緩衝液はｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５％ソルビトールであった。
（Ｆ）パック・オフを、１０％ルトロール（Lutrol）からなる緩衝液、ならびにｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％ソルビトールおよび０．１％ルトロールからなる緩衝液を使用して実行した。
最終生成物プールの回収率は７０％超であり、溶出液中の脱アラニン種は１０％未満であり、そして、ＨＣＰは５０ｐｐｍ未満である。
【実施例１３】
【０４３８】
Ｐ０５のためのフェドバッチ発酵工程
フェドバッチ培養を、１．６Ｌの作業体積を用いるＢｉｏｓｔａｔＡ＋制御器付きのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ２Ｌ  Ｕｎｉｖｅｓｓｅｌバイオリアクターで行った。バイオリアクターを１２１℃で６０分間オートクレーブにかけ、そして、無菌の瓶と配管溶接器を使用してオートクレーブ後にバッチ培地を添加した。
【０４３９】
バッチ培地は、１０ｇ／Ｌのグルコースと２ｍＭの硫酸マグネシウムを添加した、無動物成分ソイトン（Ｔｅｋｎｏｖａ社）を使用するテリフィック・ブロスからなった。この溶液を、０．２μｍのＰＥＳ膜フィルターを使用して濾過した。バイオセーフティー・キャビネット内で無菌濃縮ストック溶液のアリコットを濾過したテリフィック・ブロスに添加することにより、補助栄養素の濃度が次の終濃度に達した：０．０８ｇ／Ｌアンチフォーム２０４（Ｓｉｇｍａ社）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｃａｌｉｂｅｒ社）、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ社）および１ｍＬ／Ｌ微量元素溶液（１０００Ｘ微量元素、Ｔｅｋｎｏｖａ社）。微量元素溶液は５０ｍＭ塩化第二鉄、２０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化マンガン、１０ｍＭ塩化亜鉛、２ｍＭ塩化コバルト、２ｍＭ塩化銅、２ｍＭ塩化ニッケル、２ｍＭモリブデン酸ナトリウム、２ｍＭ亜セレン酸ナトリウム、および２ｍＭホウ酸を含有した。
【０４４０】
フェドバッチ培養を３７℃とｐＨ７．０±０．０５の条件で実行した。ｐＨは、上限については８５％のリン酸（Ａｍｒｅｓｃｏ社）を使用して、そして、下限については２８％水酸化アンモニウム（Ｒｉｃｃａ社）を使用して調節された。泡はアンチフォーム２０４溶液（Ｓｉｇｍａ社）により制御された。空気の循環と初期撹拌速度をそれぞれ１．２５（体積／体積／ｍ）と２００ｒｐｍに設定した。溶存酸素分圧は、８００ｒｐｍへの撹拌カスケードと酸素濃縮を用いて飽和圧力の３０％に制御された。
【０４４１】
最初のグルコースレベル（１０ｇ／Ｌ）が消尽され、ｐＨと溶存酸素の急速な増加が観察されたらすぐに、栄養素の供給を開始した。供給培地は、４００ｇ／Ｌのグルコース（Ｓｉｇｍａ社）と３０ｍＭの硫酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社）を添加した、無動物成分ソイトン（Ｔｅｋｎｏｖａ社）を使用するテリフィック・ブロスからなった。初期供給速度は約０．６ｍＬ／分（９ｇグルコース／Ｌ／時間）であった。培養の導入から４時間に、供給速度を、グルコースの蓄積を避けるために約０．４ｍＬ／分（６ｇグルコース／Ｌ／時間）に低下させた。
【０４４２】
培養物のＯＤ６００が３５〜４０に達したらすぐに１ｍＭのイソプロピルＢ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して誘導を行った。誘導から６時間後に培養物を回収した。
【０４４３】
次のパラメータのために培養物を１時間毎に試料抽出した：オフラインでのｐＨ（Ｏｒｉｏｎ  ４  Ｓｔａｒ  ｐＨメーター、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＯＤ６００（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２１００  Ｐｒｏ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、グルコース濃度と乳酸濃度（ＹＳＩ７１００、ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルからなる濃度測定を用いる生成物の濃度、分析ｗＣＥＸのために１０ｍＬの試料、および湿潤細胞重量と乾燥細胞重量のために１ｍＬの試料。湿潤細胞重量試料と乾燥細胞重量試料について、前もって重量測定した微量遠心管内の１ｍＬの培養物を１４，０００ｇで２分間遠心沈殿した（Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌｕｓ遠心分離機、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）。上清を廃棄し、ペレットを１ｍＬの１．２５×リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）で２回洗浄した。その後、そのペレットとチューブの重量を測定し、湿潤細胞重量を決定した。その後、そのペレットをチューブ内において６５℃で少なくとも４８時間乾燥させた。そのペレットとチューブの重量を再度測定し、乾燥細胞重量を決定した。
【０４４４】
様々なＩＬ‐１β／ＩＬ‐１Ｒａハイブリッドを発現する細胞株を振盪フラスコ実験において培養し、そして、発現誘導した。５つの株全てが最適化された培養条件を用いて同様の生産性を示した。細胞ベースの活性アッセイでは、Ｐ０５はＩＬ‐１Ｒ１受容体に対して、次に最も近いハイブリッド分子よりも一桁高い、１２ｐＭというＫｄを有する最も高い活性を示した（表１５を参照のこと）。Ｐ０１分子とＰ０２分子も高い活性を示したが、それらは不溶性であり、抽出時に封入体中に存在することが明らかになった。Ｐ０３生成物からＰ０５生成物までは可溶性画分に存在した。Ｐ０３からＰ０５までの製造はより容易であることから、これらの３つのハイブリッドに集中して初期の安定性の試験を行った。
【表１８】
2014522868.tif 000027
【０４４５】
それらの３つの可溶性ハイブリッド分子の融点を、定量的ＰＣＲ機械（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用する示差走査型蛍光定量により決定した。それらの融点は表１５に示されている。３つのハイブリッド分子全てがＩＬ‐１Ｒａよりも高い融点を有したが、Ｐ０３とＰ０４は６５℃という最も高い融点を有した。
【０４４６】
発酵工程の開発による生成物関連種の低減
Ｐ０５タンパク質の品質に対する炭素源の効果を測定するために、２つ組の２Ｌフェドバッチ実験を行った。それぞれの実験では、１つのリアクターは、上で説明したように基本培地に１０ｇ／Ｌのグルコースを含有し、供給培地に４００ｇ／Ｌのグルコースを含有し、そして、１つのリアクターは基本培地に１０ｇ／Ｌのグリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有し、供給培地に４００ｇ／Ｌのグリセロールを含有した。その２つのリアクターでの細胞増殖の差は顕著ではないにもかかわらず（表１６を参照のこと）、グリセロール含有発酵は、グルコース含有発酵よりも少ないＰ０５を産生した（５．４ｇ／Ｌに対して７．０ｇ／Ｌ）。グリセロールを使用して産生された原料はより高いパーセンテージのアセチル化種（対照リアクターにおける総タンパク質の８．９％に対して、総タンパク質の１４．７％）、ならびにより高いパーセンテージの脱アラニン種（対照リアクターにおける総タンパク質の１３．４％に対して、総タンパク質の１７．３％）を含有した。グリセロール含有発酵による酸素利用の増加も観察されたという事実から、これらの培養物における生成物のアセチル化の上昇は低酸素状態または何らかの他のストレス状態により生じ得たのだろうという仮説が立てられた。したがって、グルコースがＰ０５の発酵にとって優れた炭素源であることが確認された。
【０４４７】
高温、わずかに塩基性の環境（ｐＨ７．５〜９）、および触媒としてのＭｎ２＋の存在の全てがアミノペプチダーゼＰの酵素活性を上昇させる。アミノペプチダーゼＰ活性にとってあまり好ましくない培養条件を利用することの利点を調査するためにいくつかの実験を行った。振盪フラスコ実験を３２℃で行ったが、対照フラスコと比べた生産性の顕著な低下が観察された。この特性が、工程所要時間が増加すること、および技術移転とスケールアップが複雑になることに加えて、Ｐ０５タンパク質の品質を改善するこの方法を望ましくないものとした。
【０４４８】
発酵工程の開発による生成物関連種の低減
Ｐ０５タンパク質の品質に対する培養ｐＨの効果を測定するために、２Ｌフェドバッチ発酵をｐＨ６．８±０．０５で行った。脱アラニン種のパーセンテージはｐＨ６．８に制御された発酵においてより低かったが（対照リアクターにおける総タンパク質の１３．４％にたいして、総タンパク質の６．９％）、比較的低いｐＨにおける細胞増殖と生産性は対照発酵におけるものよりも著しく低かった（表１６を参照のこと）。生産性の４０％よりも大きい損失が、Ｐ０５タンパク質の品質を改善するこの方法を望ましくないものとした。
【０４４９】
回収、抽出、および清澄化
回収時に培養物を３００〜３２０ｍＬの等量の体積で５つに分け、そして、４℃、６０００ｇ（ＧＳ‐３ローターを用いるＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ５Ｃ  Ｐｌｕｓ遠心分離機、Ｄｕｐｏｎｔ社）で２０分間遠心沈殿させた。凍結したペレットを直ぐに抽出操作にかけない場合は−８０℃で凍結した。生成物を抽出するために、ペレットを、ｐＨ７．０で２０ｍＭトリス・ベース（Ｆｉｓｈｅｒ社）、０．１％トリトンＸ‐１００（Ｆｉｓｈｅｒ社）、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｃａｌｉｂｅｒ社）からなる溶菌緩衝液に再懸濁した。次に細胞のペーストを１８，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザー（Ｍ‐１１０Ｐマイクロフルイダイザー、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）に３回通した。次に溶液を６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。抽出液を直ぐに清澄化しない場合は−２０℃で凍結した。
【表１９】
2014522868.tif 000028
【０４５０】
塩化マンガンを含有しない微量元素溶液を特別に処方した（１０００Ｘ微量元素−ＭｎＣｌ２、Ｔｅｋｎｏｖａ社）。この溶液の使用を２Ｌフェドバッチ発酵において評価した。より低いｐＨを利用する実験から理解できるように、細胞増殖と生産性は塩化マンガンを取り除くことによって負の影響を受けた（表１６を参照のこと）。脱アラニン種のパーセンテージは減少したが（対照リアクターにおける総タンパク質の１３．４％に対し、総タンパク質の４．８％）、アセチル化種とメチオニル化種のパーセンテージはそれぞれ１％超と５％超上昇した。全ての金属ベースの酵素活性を低下させる試みにおいて、基本培地におけるＥＤＴＡの使用を研究した。基本培地における０〜０．８ｍＭのＥＤＴＡの使用を研究する振盪フラスコ実験を行った。ＥＤＴＡの基底濃度の上昇は増殖に何の負の効果も引き起こさなかった。最終ＯＤ６００値は上昇した。生産性のわずかな減少が観察されたが、未変性の生成物種の相対的なパーセンテージは顕著に増加した（表１７を参照のこと）。例えば、０．４ｍＭのＥＤＴＡの基本培地への付加により、脱アラニン種の相対的パーセンテージが６．３％から２．５％まで減少した。
【表２０】
2014522868.tif 000029
【０４５１】
これらの小規模の実験に基づき、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、および０．４ｍＭのＥＤＴＡ濃度を２Ｌフェドバッチ発酵において試験した。振盪フラスコ試験から理解できるように、ＥＤＴＡを含有する発酵はわずかにより高い最終ＯＤ６００値まで増殖した（表１６を参照のこと）。生産性は維持されるかわずかに向上した。例えば、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する培養物は、１５０の最終ＯＤ６００、２９ｇ／Ｌの乾燥細胞重量まで増殖し、そして、Ｐ０５の８ｇ／Ｌを産生した（それぞれ対照培養物の１４０のＯＤ６００、２８ｇ／Ｌ、および７ｇ／Ｌと比較して）。産生された脱アラニン種のパーセンテージはＥＤＴＡの濃度の上昇と共に減少したが、アセチル化種のパーセンテージは増加した。メチオニル化種のパーセンテージもＥＤＴＡを含有する発酵の全てでより高かった（対照培養物の２．６％と比較して６．０〜６．１％）。０．１ｍＭのＥＤＴＡという条件が望ましくない生成物関連種を減少させる最も効果的な発酵戦略であると判断された。アセチル化種とメチオニル化種のパーセンテージは対照培養物におけるものよりも高いが、０．１ｍＭのＥＤＴＡの基本培地への付加により、全体の生産性を上昇させつつ、増殖とスケールアップという考慮すべき事柄に対する影響を最小にしながら脱アラニン種を効果的に減少させた。
【０４５２】
発酵工程のスケールアップ
自家開発したフェドバッチ発酵工程をＣＭＯ（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ  Ｄｉｏｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国、ビリンガム）に技術移転した。技術移転によるフェドバッチ発酵を、３Ｌの作業体積を用いるＤＣＵ２制御器付きの５Ｌ  Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  ＥＤバイオリアクターで行った。次に自家のＧＭＰ遵守テリフィック・ブロスと微量元素溶液をさらなる発酵のために利用し、そして、それらが成績において研究用培地の処方と同等であることが明らかになった。最終的な１００Ｌ規模の工程を、１００Ｌの作業体積を用いるＤＣＵ‐３制御器付きの１００Ｌ  Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｄバイオリアクターで行った。
【０４５３】
２Ｌと１００Ｌの反応からのタンパク質の回収とそれに続くカラムクロマトグラフィーがそれぞれ実施例１４および１５において説明される。クロマトグラフィーステップには、Ｐ０５タンパク質を捕捉するためのＰｏｒｏｓＸＳ陽イオン交換カラムの使用、Ｐ０５調製物から夾雑物をさらに精製するための陰イオン交換カラムおよびセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡ）カラムの使用が含まれる。
【０４５４】
ＰｏｒｏｓＸＳ捕捉ステップでは、負荷物の調製は、１００Ｌの発酵から得られた負荷大腸菌溶菌液のｐＨ／電気伝導度をｐＨ５．３に調節し、次に１５，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより行われた。遠心分離後、工程流（process stream）を３０インチの０．８／０．４５μｍフィルターに、続いて３０インチの０．４５／０．２μｍフィルターに流してバッチ濾過した。さらなる工程開発の試みにより、負荷物の調製中にｐＨ範囲を５．３〜５．９の範囲内に調節することが研究されている。捕捉カラムの生成物結合能は、１ｍＬの樹脂あたり４０ｍｇのタンパク質まで負荷するときは影響されなかった。アセチル化型およびメチオニル化型のＰ０５の減少度は、負荷物のｐＨが上昇するにつれ大きかった。脱アラニン型の分離はｐＨが上昇するにつれ低下したが、なお許容レベルであった。
【０４５５】
セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡ）カラムの溶出条件を次のように開発した。溶出条件には２０ＣＶの濃度勾配が含まれ、それがその後の下流の工程において大容積を処理する、すなわち、限外濾過と透析濾過の必要性の原因となる。様々なパラメータを調査して、ＣＨＡカラムの溶出を生成物の回収率、小さい溶出体積、および生成物種の分離に関して最適化した。改変型の濃度勾配溶出／段階的溶出の組合せがＣＨＡタイプＩカラムの溶出体積を減少させるために開発された。簡単に説明すると、１０ｍＭリン酸から３２〜６４ｍＭリン酸までの５ＣＶに渡る濃度勾配溶出とその次の１６０ｍＭリン酸への段階溶出が実施された。５ＣＶの濃度勾配溶出の間、メチオニル化型と脱アラニン型のＰ０５が溶出画分に濃縮された。１６０ｍＭリン酸への段階的溶出の間に溶離する溶出プールに所望の生成物プロファイルを有するＰ０５が濃縮した（すなわち、１％未満のメチオニル化型、４％未満の脱アラニン型）。この工程の作業ウィンドウを説明するために完全要因実験を完了した。６．２と６．８の間のｐＨ値および上で言及した５ＣＶの濃度勾配溶出中のリン酸濃度の範囲を調査した。生成物関連種の減少、工程関連不純物（ＨＣＰ）の減少、および生成物の回収率に関して、堅牢な作業がこのウィンドウ内で観察された。このウィンドウ内の最適な条件を、約２倍のスケールアップを実証するために１２ｍＬのカラムに合わせて調整した。さらに、脱アラニン型とメチオニル化型のＰ０５のレベルが上昇した難しい負荷物をその最適な条件で調査した。溶出プロファイルは同様であった。
【実施例１４】
【０４５６】
２回の２Ｌ培養反応が、実施例１３において上で説明されたようにＰ０５を発現および精製して行われた。
【０４５７】
結果は次の通りである。
（Ａ）実施例１３に従う２Ｌのバイオリアクターでの発酵により次のパーセンテージでタンパク質が回収された。
【表２１】
2014522868.tif 000030
【０４５８】
（Ｂ）Ｐ０５は、回収されたタンパク質から、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ陽イオン交換カラム［２３５ｍＬの体積］を通して捕捉され、続いて溶出され、それにより次のパーセンテージでタンパク質の収集が行われた。
【表２２】
2014522868.tif 000031
【０４５９】
（Ｃ）ＰｏｒｏｓＸＳの収集物に由来するタンパク質をＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ陰イオン交換カラム［５０ｍＬの体積］に通して処理し、それにより次のパーセンテージでタンパク質が生じた。
【表２３】
2014522868.tif 000032
【０４６０】
陰イオン交換カラムの主な目的はＤＮＡ、エンドトキシン、およびＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）を除去することであることに留意すること。
【０４６１】
（Ｄ）ＰｏｒｏｓＨＱ収集物に由来するタンパク質をハイドロキシアパタイト（ＣＨＡ）カラム［ハイドロキシアパタイトタイプ１、２２０ｍＬの体積］に通して処理し、それにより次の濃度でタンパク質が生じた。
【表２４】
2014522868.tif 000033
【０４６２】
（Ｅ）ＣＨＡカラムからのタンパク質を限外濾過／透析濾過にかけ、それにより次の濃度でタンパク質が生じた。
【表２５】
2014522868.tif 000034
【０４６３】
限外濾過／透析濾過ステップの主な目的は、緩衝液を交換すること、およびタンパク質を濃縮することであることを留意すること。
【表２６】
2014522868.tif 000035
【実施例１５】
【０４６４】
２回の１００Ｌの系の実施が、実施例１３において上で説明されたようにＰ０５を発現および精製して行われた。１回目の実施はＲ＆Ｄ（研究開発）条件の下で行われ、２回目の実施はＧＭＰ（医薬品製造基準）条件の下で行われた。
【０４６５】
結果は次の通りである。
（Ａ）実施例１３に従う１００Ｌのバイオリアクターでの発酵により次のパーセンテージでタンパク質が回収された。
【表２７】
2014522868.tif 000036
【０４６６】
（Ｂ）Ｐ０５は、回収されたタンパク質から、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ陽イオン交換カラム［６．２５Ｌの体積］を通して捕捉され、続いて溶出され、それにより次のパーセンテージでタンパク質の収集が行われた。
【表２８】
2014522868.tif 000037
【０４６７】
（Ｃ）ＰｏｒｏｓＸＳの収集物に由来するタンパク質をＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ陰イオン交換カラム［１Ｌの体積］に通して処理し、それにより次のパーセンテージでタンパク質が生じた。
【表２９】
2014522868.tif 000038
【０４６８】
（Ｄ）ＰｏｒｏｓＨＱ収集物に由来するタンパク質をハイドロキシアパタイト（ＣＨＡ）カラム［ハイドロキシアパタイトタイプ１、３０Ｌの体積］に通して処理し、それに次のパーセンテージを有するタンパク質プールが生じた。
【表３０】
2014522868.tif 000039
【０４６９】
（Ｅ）ＣＨＡカラムからのタンパク質を限外濾過／透析濾過にかけ、それにより次の濃度でタンパク質が生じた。
【表３１】
2014522868.tif 000040
【０４７０】
限外濾過／透析濾過ステップの主な目的は、緩衝液を交換すること、およびタンパク質を濃縮することであることを留意すること。
【表３２】
2014522868.tif 000041
【０４７１】
他の実施形態は次の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2014522868.tif 000042
【図２】
2014522868.tif 000043
【図３】
2014522868.tif 000044
【図４】
2014522868.tif 000045
【図５Ａ】
2014522868.tif 000046
【図５Ｂ】
2014522868.tif 000047
【図５Ｃ】
2014522868.tif 000048
【図５Ｄ】
2014522868.tif 000049
【図５Ｅ】
2014522868.tif 000050
【図６】
2014522868.tif 000051
【図７Ａ】
2014522868.tif 000052
【図７Ｂ】
2014522868.tif 000053
【図８Ａ】
2014522868.tif 000054
【図８Ｂ】
2014522868.tif 000055
【図９】
2014522868.tif 000056
【図１０Ａ】
2014522868.tif 000057
【図１０Ｂ】
2014522868.tif 000058
【図１１Ａ】
2014522868.tif 000059
【図１１Ｂ】
2014522868.tif 000060
【図１１Ｃ】
2014522868.tif 000061
【図１２Ａ】
2014522868.tif 000062
【図１２Ｂ】
2014522868.tif 000063
【図１２Ｃ】
2014522868.tif 000064
【図１３】
2014522868.tif 000065
【図１４】
2014522868.tif 000066
【図１５】
2014522868.tif 000067
【図１６】
2014522868.tif 000068
【図１７Ａ】
2014522868.tif 000069
【図１７Ｂ】
2014522868.tif 000070
【図１７Ｃ】
2014522868.tif 000071
【図１７Ｄ】
2014522868.tif 000072
【配列表】
2014522868000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月10日(2014.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
前記の方法はまた、メチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも１０％、２０％、４０％、７０％もしくは８０％減少させることにより、メチオニル化型に比べて未変化型を濃縮するためにも用いられ得る。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１０％未満、８％未満、５％未満、３％未満、または２％未満である。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１％〜１０％、２％〜８％、または３％〜５％である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
前記の方法また、メチオニル化型のパーセンテージを少なくとも１％、３％、５％、７％、もしくは８％、または少なくとも１０％、２０％、４０％、７０％、８０％もしくは９０％減少させることにより、メチオニル化型に比べて未変化型を濃縮するためにも用いられ得る。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満または０．０５％未満である。例えば、溶出液中のメチオニル化型は総キメラサイトカインタンパク質の０．０５％〜１０％、１％〜８％、または３％〜５％である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、もしくはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、もしくは本明細書中の別のか所の配列に対してメチオニンＮ末端を含む単離タンパク質、およびＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、もしくはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、もしくは本明細書中の別のか所の配列であってＮ末端のアラニンが存在しない単離タンパク質も提供される。これらの型はそれぞれ未変化のタンパク質のメチオニル化アイソフォームおよび脱アラニンアイソフォームを表す。アセチル化されている単離タンパク質も提供される。アセチル化型にはアセチル化未変化タンパク質、アセチル化メチオニル化タンパク質、およびアセチル化脱アラニンアイソフォームが含まれる。前述の配列は本明細書において開示される他の形体を含み得る。例えば、その配列は、例えば、ＩＬ‐１ＲＩ結合配列のＮ末端側またはＣ末端側にヘキサヒスチジン配列などのタグ（配列番号：４２）をさらに含み得る。前記配列は、ＩＬ‐１ＲＩ結合配列の安定性または薬物動態を修飾する部分をさらに含み得る。というのも、前記配列は、血清アルブミンおよび／またはＦｃドメイン、またはそれらの１つ以上のドメイン、例えば、１つ以上の免疫グロブリン定常ドメインまたは１つ以上のアルブミンドメインをさらに含み得るからである。前記タンパク質は本明細書に記載される他の形体を有し得る。いくつかの実施形態では、前記単離タンパク質は、本明細書において開示される配列またはキメラドメインからなる、またはそれらから基本的になる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
【図１】Ｘ線結晶解析のデータから決定されたＰ０４の構造の図。ＩＬ‐１Ｒａに由来する残基の骨格は黒色で示されており、ＩＬ‐βに由来する残基の骨格は灰色で示されている。
【図２】ヒトＩＬ‐１ＲＩの細胞外ドメインに結合したＰ０５タンパク質のモデルの３つの視像を示す図。Ｐ０５では、ＩＬ‐１Ｒａ残基は黒色で示されており、ＩＬ‐１β残基は白色で示されている。
【図３】ＩＬ‐１Ｒａ残基が黒色で示されており、ＩＬ‐１β残基が白色で示されている、キメラタンパク質のモデルを示す図。モデルは次のタンパク質を示す：Ｐ０１（図３Ａ）、Ｐ０３（図３Ｂ）、Ｐ０４（図３Ｃ）、Ｐ０５（図３Ｄ）、Ｐ０７（図３Ｅ）、およびＰ０６（図３Ｆ）。
【図４】いくつかのヒトＩＬ‐１ファミリーサイトカインのアラインメントを提供する図：ＩＬ‐１β（配列番号１）、ＩＬ‐１α（配列番号２）、ＩＬ‐１Ｒａ（配列番号３）、ＩＬ-３３（配列番号４）、ＩＬ‐３６Ｒａ（配列番号５）、ＩＬ‐３６α（配列番号６）、ＩＬ‐３６β（配列番号７）、およびＩＬ‐３６γ（配列番号８）。本明細書の本文において参照されているセグメントがアラインメントの下に特定されている。さらに、ｂ‐シートおよびそのようなシート間のループが特定されている。
【図５Ａ】Ｐ０１のアミノ酸配列（配列番号１７）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｂ】Ｐ０２のアミノ酸配列（配列番号１８）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｃ】Ｐ０３のアミノ酸配列（配列番号１９）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｄ】Ｐ０４のアミノ酸配列（配列番号２０）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図５Ｅ】Ｐ０５のアミノ酸配列（配列番号２１）の表。ＩＬ‐１βに由来するセグメントは太字の斜体で示されている。下の実施例１も参照されたい。
【図６】受容体結合剤を発現する大腸菌細胞から精製されたタンパク質からなる例となる試料を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの画像。１５ｋＤａと２０ｋＤａの分子量マーカーが左に示されている。レーンは次のとおりである：分子量マーカー（レーン１および６）、抽出物（レーン２および７）、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製された物質（レーン３および８）、陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製された物質（レーン４および９）、およびそのような物質の還元試料（レーン５および１０）。レーン２〜５はＰ０５精製のもの、およびレーン６〜１０はＰ０４精製のものである。実施例２も参照されたい。
【図７Ａ】ＩＬ‐１βと陰性対照であるβ‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパク質と比べたＰ０６、Ｐ０７、およびＰ０１タンパク質のシグナル伝達を刺激する能力を示す表および付随の棒グラフ。
【図７Ｂ】様々なＩＬ‐１β濃度におけるＰ０１によるＩＬ‐１βの拮抗作用を示すグラフ。
【図８Ａ】０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１β（ヒト）の存在下におけるＰ０３（ヘキサヒスチジンタグ化（配列番号４２に開示されたヘキサヒスチジン））、Ｐ０４（ヘキサヒスチジンタグ化（配列番号４２に開示されたヘキサヒスチジン））、Ｐ０５（ヘキサヒスチジンタグ化（配列番号４２に開示されたヘキサヒスチジン））、およびＩＬ‐１ＲａによるＩＬ‐１βの拮抗作用を示すグラフ。
【図８Ｂ】０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１β（ヒト）の存在下における非タグ化型のＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５、およびＩＬ‐１Ｒａを含有する溶菌液によるＩＬ‐１βの拮抗作用を示すグラフであって、各溶菌液中のタンパク質濃度の推定値を使用しているグラフ。
【図９】固定化された可溶性ＩＬ‐１ＲＩに対する次のタンパク質、すなわち、ＩＬ‐１β（図９Ａ）、ＩＬ‐１Ｒａ（図９Ｂ）、Ｐ０４（図９Ｃ）、およびＰ０５（図９Ｄ）の結合キネティクスを示すＳＰＲデータのグラフを含む図。
【図１０Ａ】実施例７に記載される、ＩＬ‐１Ｒａ、ＩＬ‐１β、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５の熱変性を示すグラフ。
【図１０Ｂ】図１０Ａ内のグラフの負の一次導関数を示す図。
【図１１Ａ】ドライアイモデルのマウスについて第０日、第３日、第７日、第９日、および第１１日に、２つの独立した試験の中の眼毎の、角膜のフルオレセイン染色により試験した、平均角膜染色スコア±標準誤差（ＳＥＭ）を示す棒グラフ。処置を受けなかった（ｎ＝１８）、１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５の処置を受けた（ｎ＝１９）、またはベヒクルである１．２５×ＰＢＳの処置を受けた（ｎ＝２０）マウスがいた。星印は次のような、ベヒクルと比べたＰ０５の統計的有意性を示す：＊（Ｐ＜０．０５）および＊＊（Ｐ＜０．００５）。
【図１１Ｂ】ドライアイモデルのマウスについて第０日、第３日、第７日、第９日、および第１１日での、眼毎の平均角膜染色スコア±標準誤差（ＳＥＭ）を示す、別個の実験に由来するデータを表す棒グラフ。処置を受けなかった（ｎ＝８）、ベヒクルである１．２５×ＰＢＳの処置を受けた（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）の処置を受けた（ｎ＝８）、または１０ｍｇ／ｍｌのＰ０５の処置を受けた（ｎ＝９）マウスがいた。星印は次のようなマウス血清アルブミンと比べたＰ０５の統計的有意性を示す：＊（Ｐ＜０．０５）および＊＊＊（Ｐ＜０．０００５）。
【図１１Ｃ】図１１Ｂと同じ実験において、レスタシス（Restasis）（登録商標）（０．０５％サイクロスポリン乳剤）（ｎ＝８）で処置されたマウスのデータを含む棒グラフ。星印は次のようなレスタシス（登録商標）と比べたＰ０５の統計的有意性を示す：＊＊（Ｐ＜０．００５）および＊＊＊（Ｐ＜０．０００５）。
【図１２Ａ】Ｐ０４のＸ線結晶解析構造（黒色）をＰ０４の構造のコンピュータモデル（灰色）に重ね合わせた構造を示す図。
【図１２Ｂ】Ｐ０４のＫ６４とＥ３９の間の相互作用を例示する図。
【図１２Ｃ】Ｐ０４のＣ末端残基Ｑ１４９およびＳ１５２のＫ４０およびＲ９との間の相互作用を例示する図。
【図１３】ｐＨ６．０および３５％Ｂでの溶出について、洗浄および溶出プロファイルを示す拡大されたクロマトグラムを含むグラフ。
【図１４】ｐＨ６．０および３０％Ｂでの溶出について、洗浄および溶出プロファイルを示す拡大されたクロマトグラムを含むグラフ。
【図１５】ｐＨ６．０および３５％Ｂでの溶出を利用する実験から精製されたタンパク質からなる例となる試料を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの画像。
【図１６】ｐＨ６．０および３０％Ｂでの溶出を利用する実験から精製されたタンパク質からなる例となる試料を示すＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの画像。
【図１７Ａ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【図１７Ｂ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【図１７Ｃ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【図１７Ｄ】２Ｌと１００Ｌのタンパク質産生シリーズで行われた最終フェドバッチ発酵プロセスを比較するグラフ。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８０】
ヘキサヒスチジンタグ（配列番号４２）を含有するタンパク質を大腸菌細胞ＢＬ２１（ＤＥＳ）株またはＢＬＲ（ＤＥ３）内で、ＬＢブロス培地中で１ｍＭのＩＰＴＧを使用して３７℃で３時間誘導することにより発現させた。細胞を２０〜５０ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ‐１００、ｐＨ８．０中で溶菌した。溶菌液を、０．１％のポリソルベート８０を含有する１．２５×ＰＢＳに対して透析し、次に、Ｈｉｓ  ＴｒａｐＨＰ（登録商標）充填済みカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を使用するＩＭＡＣクロマトグラフィーにかける前に０．８／０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過した。そのカラムを５０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１に平衡化し、そのカラムに試料を負荷し、そして、そのカラムを同じ緩衝液で洗浄した。そのカラムに対し、同じ緩衝液中の２５ｍＭイミダゾールを使用して前溶出操作を行い、そして、同じ緩衝液中の１２５ｍＭイミダゾールを使用して溶出操作を行った。溶出されたタンパク質を１．２５×ＰＢＳ、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
ヘキサヒスチジンタグ（配列番号４２）を欠くタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Ｐ０５タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。発現細胞の溶菌液を、塩が無く（約１ｍＳ／ｃｍの電気伝導度）、低ｐＨ（約ｐＨ５．５）の状態でＧｉｇａＣａｐＳ（商標）カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ社、米国、ペンシルバニア州、キング・オブ・プロシア）に供した。その後、そのカラムに対し、ｐＨ勾配（緩衝液Ａ＝１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．５；緩衝液Ｂ＝２０ｍＭトリス、ｐＨ８）による溶出操作をおこなった。次に、溶出されたタンパク質を含有する５ｍｌの画分を５ｍｌのＨ２Ｏと５ｍｌの２０ｍＭトリス（ｐＨ８）で希釈し、その後、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）に供し、そして、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中の０ｍＭ〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配を使用して溶出した。溶出されたタンパク質を１．２５×ＰＢＳ、０．１％ツイーン（登録商標）８０またはツイーン（登録商標）を欠く１．２５×ＰＢＳに対して徹底的に透析し、そして、貯蔵した。図６を参照のこと。Ｐ０３タンパク質およびＰ０４タンパク質を、同様の方法を用いて精製した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９０】
タンパク質Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５はそれぞれＩＬ‐１β活性を抑制した。例えば図８Ａおよび８Ｂを参照のこと。Ｐ０５のＩＣ５０は約５ｎｇ／ｍｌ未満であった。Ｐ０５を、このアッセイにおいてＩＬ‐１ＲＩを刺激する能力について試験し、そして、Ｐ０５は、試験した最も高い濃度である１ｍｇ／ｍｌでもどのような検出可能な受容体活性化作用も有していないことが観察された。Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４およびＰ０５も、ＩＬ‐１βに対して応答性であるヒト骨肉腫細胞株であるＭＧ‐６３細胞におけるＩＬ‐１β誘導性ＩＬ‐６発現を阻害した。ドライアイ疾患のマウスモデルでは、ヘキサヒスチジンタグ化Ｐ０５（配列番号４２に開示されたヘキサヒスチジン）が生物活性を有することが観察された。非タグ化Ｐ０５については下の実施例８も参照されたい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９９】
精製されたＰ０５（ヘキサヒスチジンタグ（配列番号４２）を欠く）を１．２５×ＰＢＳ中に調製し、ドライアイ疾患のマウスモデルにおいて試験した。このモデルでは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した（３０％以上の相対湿度、ヒドロゲル補助食品、およびｅｎｖｉｒｏｄｒｙ環境強化を有する動物飼育室で１〜２週間順応させられた）６〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを第０日にフルオレセイン染色について事前に選別した。フルオレセイン染色について、新しく注射用水に１０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して作製したフルオレセインをそれぞれの各眼に対して０．４μＬずつ投与した。投与から約８〜１３分後、Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光解剖顕微鏡を使用して眼を採点した。点状の染色を、角膜の表面が分割されている５つの領域のそれぞれについて０〜３段階の標準化国立眼研究所（ＮＥＩ）格付けシステムを用いて記録した（スコアの範囲は０〜１５／眼である）。教育用ブリッジを使用して、各眼について１つの全体的なスコアを与えるために、２つの盲検によるスコアにより（複数の）マウスが同時に評価された。
【国際調査報告】
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