(57)【要約】  イメージング法は、蛍光Ｓｉ含有粒子の蛍光寿命を利用して、バックグラウンド蛍光から区別する。粒子は組織に導入する。励起光パルスを印加して、蛍光Ｓｉ含有粒子からの発光を励起する。応答発光信号を時間ゲート測定して、粒子を識別する。好ましい実施形態では、粒子は有機材料で被覆またはカプセル化される。粒子の蛍光寿命は、酸化レベル、消光処理、または時効処理などにより、製造中に制御することができる。これにより、固有の寿命を持つ粒子群をイメージングに導入して使用することが可能となり、粒子が生物化学的刺激に反応する際に、複数の時間ゲートを使用して異なる粒子を識別したり、または単一セットの粒子の寿命変化をモニタリングしたりすることができる。また、粒子は、特定の組織への親和性を持つように機能化することができ、治療分子を担持させることもできる。【選択図】図１
2014519361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光Ｓｉ含有粒子を組織に導入し、
励起光パルスを印加して前記蛍光Ｓｉ含有粒子からの発光を励起し、
応答発光信号を時間ゲート測定して前記粒子を識別する、
ことを含むイメージング法。
【請求項２】
前記時間ゲート測定は、一定時間後、自家蛍光および励起レーザースペクトルの漏れ込みが無視できる蛍光である時に、前記発光信号を検出または分析することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記時間は、前記励起光パルスの終了後、少なくとも約１０ナノ秒である、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記時間は、１０ナノ秒〜１ミリ秒の範囲である、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織へ導入することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記導入は、蛍光Ｓｉ含有粒子の複数の群を、光子放出寿命が異なる別の群とともに導入することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子は、約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長領域に現れる発光極大および約１０ナノ秒〜１ミリ秒の発光寿命を有する生分解性多孔質Ｓｉ含有ナノ構造体を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子は、全体または一部に二酸化ケイ素を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子は、約０．００１μｍ〜１００μｍの粒子サイズを有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子は、有機材料で被覆またはカプセル化される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機材料は、デキストラン、アミノ化デキストラン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、デキストランおよびポリ乳酸のコポリマー、キトサン、タンパク質Ａ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、およびアビジンのうちの１つを含む、
請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
蛍光消光または増強材料は、前記蛍光Ｓｉ含有粒子に共有結合している、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
蛍光消光または増強材料は、前記蛍光Ｓｉ含有粒子内または上に物理的に吸着される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子の発光寿命に影響を与える有機材料は、前記蛍光Ｓｉ含有粒子に共有結合している、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子の発光寿命に影響を与える有機材料は、前記蛍光Ｓｉ含有粒子内または上に物理的に吸着される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子の発光寿命に影響を与える無機材料は、前記蛍光Ｓｉ含有粒子に共有結合している、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子の発光寿命に影響を与える無機材料は、前記蛍光Ｓｉ含有粒子内または上に物理的に吸着される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子は、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、キシレン、ジエチルエーテル、蟻酸、ベンゾフェノン、ナフタレン、ピレン、アントラセン、９，１０-ジメチルアントラセン、エタノール、ポルフィリン、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、フルオレセイン、トリスビピリジンルテニウム、またはフェロセンのうちの一つ、またはその一つの誘導体である有機材料をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光Ｓｉ含有粒子は、金、銀、銅、白金、鉄、コバルト、クロム、マンガン、亜鉛、ルテニウム、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、炭素元素、またはカーボンナノチューブのうちの一つを含む無機材料をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府権益の声明）
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約番号ＣＡ１１９３３５およびＣＡ１２４４２７の下で、米国政府支援により行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（優先権の主張および関連出願の参照）
本出願は、２０１１年４月２８日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる先の米国仮特許出願第６１／４８０，１４９号に対し、米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張する。また、本出願は、係属中の先の米国特許出願第１３／２０２，２７１号の一部継続出願であり、参照により本明細書に組み込まれる同米国特許出願に対し、米国特許法第１２０条に基づく優先権を主張する。
【０００３】
本発明の技術分野は、イメージング／診断のための薬剤および方法である。本発明のもう一つの技術分野は、発光ナノ構造体である。
【背景技術】
【０００４】
蛍光イメージングは、高感度で、高空間分解能を有し、低コストで、非侵襲的であるため、生物医学研究において最も汎用性が高く、広く使用されている可視化法の一つである。この方法では、蛍光プローブ分子またはナノ粒子を用いて、所望の領域で画像のコントラストを強調したり、または、特定の特徴、分子、もしくは組織を識別したりする。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングは、特有の造影剤が不足していること、励起または発光波長の組織透過性が低いこと、およびバックグラウンド組織の自家蛍光が遍在することにより、臨床診療では広く利用されていない。
【０００５】
一般的な蛍光イメージングまたは検出技術では、通常、波長（エネルギーまたは色）に基づいた方法を用いて、蛍光プローブと、バックグラウンドまたはその他のプローブとを区別する。どの蛍光種も、蛍光プローブに利用可能な放射および無放射減衰過程の速度によって決まる固有の寿命（蛍光強度が短パルス励起後に１／ｅまで減衰するのに要する時間）で発光する。有機分子または量子ドットを用いた従来の蛍光プローブは、通常、蛍光寿命が短い（数ナノ秒程度）。これらの寿命は、自家蛍光の原因である、組織および細胞培地中の自然発生種の寿命に匹敵する。このことにより、時間領域においてプローブの蛍光信号とバックグラウンド蛍光とを分離することが困難となっている。また、発光フィルタを通して励起光がいくらか漏洩することは避けられない。そのため、強度画像は、蛍光プローブ、組織の自家蛍光、および励起光の漏洩からの蛍光を含む。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングは、主要な前臨床分子イメージングモダリティとなっている。いくつかの市販の機器により、小動物における蛍光プローブのｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光強度画像を容易に得ることができる。しかし、組織の自家蛍光は、依然として蛍光強度画像の解釈を混乱させ得る難敵である。最近では、スペクトル分離法を利用して、組織の自家蛍光を補正している。
【０００７】
蛍光プローブのみの所望の画像を得るためには、これらの強度源をさらなる情報で区別する必要がある。一つの手法として、強度を発光波長の関数として測定する方法、即ち、蛍光分光法がある。これは、蛍光色素が異なれば、互いにおよび励起光源と区別可能な発光スペクトルも異なることによる。これらのスペクトルは重なるため、測定した混合スペクトル信号は、スペクトル分離法を用いて蛍光プローブが寄与するものに分解しなければならない。別の方法としては、強度の減衰を励起光パルス後の時間（ナノ秒単位の時間スケール）の関数として測定する方法がある。これは、蛍光色素が異なれば、互いにおよび励起光パルスと区別可能な蛍光寿命も異なることによる。ここで、測定した減衰カーブは、寿命分離法を用いて蛍光プローブが寄与するものに分解しなければならない。
【０００８】
１９８０年代以降、蛍光の波長依存性に代わり、時間依存性（「蛍光寿命」）を利用して組織、細胞、および生命体全体をイメージングすることに関心が寄せられてきた。しかし、この目標は、上記の干渉蛍光信号のために到達困難であることが明らかとなった。イメージングには外因性の色素が好ましいが、操作者が、有用な診断測定（例えば、細胞生存性または代謝活性の）を得るために組織に添加した外因性色素を撮像しようとすると、生体系で自然発生する分子から放射される蛍光が干渉を起こす。組織の自家蛍光は、外因性プローブと同じ波長域で現れることが多く、そのため分析感度が制限される。すべての市販の外因性色素に使用される分子、および自然に存在する分子は、どれも励起状態寿命が非常に短い傾向がある。つまり、これらの分子は、励起源を切った後は、非常に短い時間だけ発光を続ける。１０ナノ秒以下の寿命が典型的である。
【０００９】
これまで、時間ゲートバイオイメージングは、外因性色素およびその他のプローブで検討されてきた。例えば、Ｃｕｂｅｄｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｉｍｅ−Ｇａｔｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ，”  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７  ４８０−４８５  （１９９３）を参照。外因性色素の寿命は、組織の自家蛍光の寿命に近く、これらの技術に関する研究は、継続されてこなかったと思われる。むしろ研究者は、時間分解法よりも波長分解法を好んできた。より蛍光寿命の長い分子および材料は、時間ゲートイメージング用に提案されてきたが、その細胞毒性または全身毒性のためにこれらの有用性は限られていた。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｏｏｍ−Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｕｌｔｉｅｘｃｉｔｏｎ  Ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＣｄＳｅ  Ｃｏｒｅ−Ｓｈｅｌｌ  Ｎａｎｏｃｙｓｔａｌｓ，”  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９４  （２００５）；  Ｄａｈａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｉｍｅ−Ｇａｔｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ，”  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６（１１）  ８２５−８２７  （２００１）を参照。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの実施形態は、イメージング法である。この方法では、蛍光Ｓｉ含有粒子を組織に導入する。励起光パルスを印加して蛍光Ｓｉ含有粒子からの発光を励起する。応答発光信号を時間ゲート測定して、粒子を識別する。好ましい実施形態では、粒子を有機材料で被覆またはカプセル化する。粒子の蛍光寿命は、酸化レベル、消光処理、または時効処理などにより、製造中に制御することができる。これにより、固有の寿命を持つ粒子群をイメージングに導入して使用することが可能となり、複数の時間ゲートを使用して異なる粒子を識別することができる。また、粒子は、特定の組織への親和性を持つように機能化することができ、治療分子を担持させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、発光多孔質シリコンナノ粒子の合成の概略図であり、このナノ粒子を用いて、本発明の遅延ゲートイメージング法を実証する実験のための粒子を製造した。
【図２】図２に、実験で作製した多孔質シリコンナノ粒子の寿命減衰カーブを例示する。
【図３Ａ】図３Ａに、マウスの脚パッドに投与した多孔質シリコンナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂに、マウスの脚パッドに投与した多孔質シリコンナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光データを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃに、マウスの脚パッドに投与した多孔質シリコンナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の好ましい実施形態の方法は、対象組織の自家蛍光寿命よりも長い蛍光寿命を有する蛍光シリコン含有粒子を用いた組織のイメージングを提供する。粒子の蛍光寿命は、好ましくは組織の自家蛍光寿命よりも実質的に長い、つまり、粒子は、組織の自家蛍光が無視できるレベルまで減少した後で容易に測定できる蛍光をもたらす。蛍光応答は、光パルスが消滅して組織の自家蛍光を回避した後に、遅延時間ゲート法（ｌａｔｅ  ｔｉｍｅ−ｇａｔｉｎｇ）を用いて測定する、即ち、組織の自家蛍光が無視できるレベルまで減少した後に測定を行う。これは、遅延時間ゲート期間後の信号のみを検出すること、または継続的に信号を検出するが、自家蛍光からの寄与が低いレベルまで減少した後の信号のみを分析することを包含する。
【００１３】
多孔質およびその他のシリコンナノ粒子は、非常に長い寿命の励起状態（数百マイクロ秒から１ミリ秒まで）を有することができる。これにより、励起から数十ナノ秒後には存在しない組織の自家蛍光を完全に排除することが可能となる。自家蛍光は、周囲の組織を基準として、典型的には約１−１０ナノ秒後に無視できるレベルまで減衰し、典型的には約２０−３０ナノ秒後に完全に排除されるため、時間ゲートデータは、多孔質シリコンナノ粒子のみを示し、バックグラウンドは示さない。組織の種類により具体的な自家蛍光の減衰量が決まる。組織の自家蛍光に寄与する内因性の蛍光色素分子は、組織の種類に応じて〜１−１０ナノ秒の減衰寿命を有する。例えば、Ｂｅｒｅｚｉｎ，  Ｍ．Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，”  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１０，  ２６４１−２６８４  （２０１０）を参照。
【００１４】
従って、長寿命の蛍光粒子は、蛍光信号を出す。信号は、バックグラウンドの自家蛍光を排除する後処理を必要としない。また、遅延時間ゲート法（センサー信号のセンサー分析またはソフトウェア分析のいずれかを用いる）は、発光フィルタを通じた励起光の漏洩に関連するバックグラウンド信号も回避する。これは、遅延時間ゲート検出がなされる前に励起光パルスが終了することによる。本発明の方法は、強度画像を使用でき、波長分析を必要としない。これは、得られる遅延ゲート強度信号が、蛍光粒子からの蛍光を含むが、組織の自家蛍光または励起光の漏洩からの無視できない信号は全く含まない強度画像を有することによる。シリコンナノ粒子は非毒性であり、腎臓で除去される成分へと比較的短い期間で分解され、全身または細胞毒性への関与がほとんどまたは全く見られないことが実証されているため、本発明の方法は、明らかに臨床に応用できる可能性がある。
【００１５】
シリコンは天然に存在し、二酸化ケイ素（シリカ）またはケイ酸塩といった様々な形態の化合物として広く分布している。シリコンは、電子工業で使用されており、その場合、実質的に純粋なシリコンおよび高純度のシリコンがウエハーの形成に使用されている。純粋なシリコンは、半導体産業で、電子工学で、および光発電への応用で使用される超純粋シリコンウエハーの製造に使用されている。超純粋シリコンは、他の元素でドーピングして、電流キャリアの数および電荷（正または負）を制御することにより、その電気的応答を調整することができる。このような制御は、トランジスタ、太陽電池、集積回路、マイクロプロセッサ、半導体検出器、並びに電子工学およびその他のハイテク技術への応用で使用される他の半導体デバイスにとって望ましい。シリコンは、骨および結合組織の健康に関連した必須微量元素である。
【００１６】
二酸化ケイ素は、化合物ＳｉＯ２を意味する（シリカと称することもある）。二酸化ケイ素は、シリコンが酸素（または空気もしくは水）に曝されると形成される。周囲条件下でシリコンが空気に曝されると、いわゆる「自然酸化物」の薄層（およそ１ｎｍまたは１０Å）が表面上に形成される。より高い温度および代わりの環境（水相など）を用いて、シリコン上の二酸化ケイ素の層を成長させる。二酸化ケイ素は、不活性であり、無害である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態は、大半の有機分子およびバックグラウンド組織の自家蛍光と比べて寿命が長い蛍光（発光）多孔質シリコン系ナノ粒子を使用して、時間ゲート蛍光イメージングに基づいた高忠実度イメージングを行う方法を提供する。本発明は、発光する、および／または、消光／安定化成分で修飾されている多孔質シリコン含有ナノ構造体を提供する。本発明の一つの好ましい実施形態において、多孔質シリコン含有ナノ構造体は、酸化物の含有量が高く、これは、１ヶ月または最長約３ヶ月までの長期間に渡り水で酸化することにより得られる。本発明は、発光寿命の長いシリコン元素から調製される多孔質ナノ粒子であって、ナノ粒子の発光寿命および発光強度を調整可能な複数の消光／安定化分子を潜在的に含有している多孔質ナノ粒子を提供する。好ましい実施形態の安定化分子として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−シランが挙げられる。また、その他のシリコンナノ粒子も蛍光を発することが知られており、処理を施して蛍光寿命に影響を与えることができる。このようなシリコンナノ粒子も本発明で使用できる。例えば、Ｐｅｎｇ  Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒ−Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｅｐ  Ｐｌａｓｍａ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳｉＢｒ４，”Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０，  １６６９−１６７５  （２０１０）；  Ｍａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１３０：２１８−２３  （２００８）；  Ｎａｙｆｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｘｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓ，”  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  ７３．  ８４１  （１９９８）を参照。
【００１８】
消光成分は、蛍光シリコンナノ粒子において、励起状態からエネルギーまたは電荷を受容できる種であってもよく、例えば、ポルフィリン、多環芳香族炭化水素、酸化還元活性分子、もしくは金属状態またはイオン状態の金属などがある。これらの種は、非放射励起減衰チャンネルを光化学系に導入し、実測発光寿命を縮めることが期待できる。Ｓａｉｌｏｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｆｉｌｍｓ，  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”  Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００９，  １９  （２０），  ３１９５−３２０８を参照。消光成分は、蛍光シリコンナノ粒子を十分近接して配置することにより、エネルギーまたは電荷の輸送過程が行われるようにするために、物理的または化学的に蛍光シリコンナノ粒子に吸着させてもよい。これらの消光成分を可溶化または分解する生物学的または化学的過程は、次に、消光経路を除去してナノ粒子プローブの発光寿命を延ばすことが期待される。この発光寿命の変化は、その後、プローブされた組織の生物学的状態を示すのに用いることができる。これらの消光化学反応は、既に実証されているが、この化学反応を利用して寿命イメージングを実現すること、特にこの寿命イメージングを生物学的状態のプローブとして使用することは、これまでに提案または報告されていないと思われる。また、蛍光ナノ粒子は、材料の生体適合性を改善する分子、例えば、ポリ（エチレングリコール）、デキストラン、アミノ化デキストラン、またはキトサンなどを含有していてもよい。また、蛍光ナノ粒子は、材料が特定の組織を標的とする能力を改善する分子、例えば、ＣＲＥＫＡペンタペプチド、ＲＧＤトリペプチド、ｉＲＧＤ環状ペプチド（Ｓｕｇａｈａｒａ，  Ｋ．  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｕｍｏｒ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１，  ３２８  （５９８１）  １０３１−１０３５）、抗体、またはアプタマーなどを、含有または担持していてもよい。時間ゲート検出（励起光源が終了した後、既定の期間後に検知すること、または強度振動励起源の位相に対して発光の位相シフトをモニタリングすることにより継続的に検知することのいずれかを用いる）を用いたナノ粒子のイメージングにより、組織による自家蛍光からのバックグラウンド信号、その他の短寿命蛍光による干渉、およびあらゆる短寿命励起光のフィルタ漏れ信号を排除することによる、より忠実度の高いイメージングが可能となる。
【００１９】
好ましい実施形態の方法では、多孔質シリコンナノ粒子（ｐＳｉＮＰ）、例えば、光励起下で可視光から近赤外光を放出することができ、発光寿命が、＞１０ナノ秒であるものを使用する。本発明の好ましい実施形態は、約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長領域に現れる発光極大および約１０ナノ秒〜１ミリ秒の発光寿命を有する生分解性多孔質Ｓｉ含有ナノ構造体を用いた、時間ゲート蛍光イメージング法である。好ましい実施形態において、遅延ゲートは、１００ナノ秒後の信号を提供する。大半の組織の自家蛍光は、〜３００−１０００ｎｍの範囲の典型的な励起パルスを有し、通常は約１０ナノ秒後に無視できる程度になり、１５ナノ秒後には全てのケースおよび組織において無視できる程度になるものである。従って、粒子の蛍光寿命は、自家蛍光の範囲を優に超え、遅延ゲート測定を可能にする。シリコン材料は、二酸化ケイ素材料であってもよく、またはシリコン元素および二酸化ケイ素材料の両方であってもよい。その他の実施形態では、固体蛍光シリコンナノ粒子を使用するが、この粒子は、制御可能な蛍光を生じさせ、組織への導入に適していることが当該技術分野において知られている。固体および多孔質粒子の粒子サイズは、１ｎｍ〜１００，０００ｎｍの範囲をとることができる。本発明の生分解性シリコンナノ構造体は、非毒性を特徴とすることができる。
【００２０】
また、本発明のイメージング法で使用されるシリコン粒子は、他にも利点を有する。高忠実度バイオイメージングに使用される多くのナノ材料（例えば、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、金ナノ粒子（ＧＮ）、および量子ドット（ＱＤ）など）とは異なり、本発明の粒子は生分解性であり、即ち、腎臓で除去される成分へと比較的短い期間で分解され、全身または細胞毒性への関与がほとんどまたは全く見られない。また、好ましい多孔質シリコンナノ粒子または多孔質酸化ケイ素ナノ粒子は、ナノ粒子の発光寿命を調整することが可能な、複数の同じまたは異なる分子または複合体を拘束する能力を有する、多孔質ナノ構造体を提供し、この分子または複合体は、特定の刺激に反応して蛍光寿命を調整するように設計することが可能である。本発明の生分解性多孔質ナノ構造体は、多孔質ナノ構造体の蛍光寿命を変化させることが可能な消光種を含む有機または高分子材料で被覆またはカプセル化してもよい。適切な消光種の例としては、ポルフィリン、多環芳香族炭化水素、酸化還元活性分子、もしくは金属状態またはイオン状態の金属などが挙げられる。更なる適切な消光種の例としては、芳香族化合物、複素環化合物、もしくは金属含有配位化合物、またはそれらの化合物の組み合わせが挙げられる。消光は、センサーを使用して生物学的／化学的トリガーの反応を測定する場合に有用である。Ｓａｉｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｘｙｇｅｎ，”ＬＡＮＧＭＵＩＲ  Ｖｏｌ．  １３，  ｉｓｓｕｅ  １７  ｐｐ．  ４６５２−４６５８  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｌａ９６０５３５ｚ  （１９９７）を参照。適切な有機または高分子材料の例としては、酵素開裂リンカーポリペプチド、オリゴヌクレオチド、デキストラン、アミノ化デキストラン、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、並びにデキストランおよびポリ乳酸のコポリマー、またはこれらの材料の組み合わせが挙げられる。有機または高分子材料は、生体反応リンカーと見なすことができ、内因性の生物学的種（例えば、タンパク質分解酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、またはコラゲナーゼなど）が有機または高分子材料に作用することにより、ナノ粒子の有効近傍から消光種が放出され、そのためナノ粒子の発光寿命が延びる。次に、このナノ粒子の発光寿命の延長は、プローブされた組織の生理学的状態（特定の遺伝子の上方制御または下方制御、上記の生物学的種の存在または濃度）を示すものとして、時間ゲートイメージング法で使用することができる。
【００２１】
好ましい有機材料は、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、キシレン、ジエチルエーテル、蟻酸、ベンゾフェノン、ナフタレン、ピレン、アントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、エタノール、ポルフィリン、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、フルオレセイン、トリスビピリジンルテニウム、もしくはフェロセンのうちの一つ、またはその一つの誘導体である。好ましい無機材料は、金、銀、銅、白金、鉄、コバルト、クロム、マンガン、亜鉛、ルテニウム、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、炭素元素、またはカーボンナノチューブのうちの一つを含む。
【００２２】
本発明のイメージング法で使用する好ましい粒子は、以下のように調製することができる。シリコンウエハーをエッチングして多孔質ナノ構造フィルムを作製する。この多孔質ナノ構造フィルムをシリコンウエハー基質から分離した後、破砕して１ｎｍ〜１００，０００ｎｍのサイズのナノ粒子を作製する。好ましい実施形態には、発光に関与し、＜１０ｎｍのサイズの、多孔質ナノ粒子内の結晶シリコン機構を含める。他の好ましい実施形態において、活性発光中心は、＜５００ｎｍのサイズの界面シリコン／酸化ケイ素材料からなる。好ましい多孔質シリコンナノ構造体は、直径１−２００ｎｍの細孔を有する。一つの好ましい実施形態では、有機または高分子被覆により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生分解性多孔質ナノ構造体の循環時間が増加する。
【００２３】
エッチング条件および材料により、孔隙率および細孔径を制御することができる。例えば、ドーピングによる制御を用いることで、電気化学エッチングで作製された多孔質シリコンの孔隙率および細孔サイズを決めることができる。細孔サイズおよび細孔分布を制御する方法は、例えば、本発明者およびその同僚のうちの何人かによる以下の特許文献に開示されている：Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許第５，３３８，４１５号明細書；Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許第７，４３３，８１１号明細書；Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許第７，９０３，２３９号明細書；Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許第７，０４２，５７０号明細書；Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許第７，９４２，９８９号明細書；Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許出願公開第２００７／００５１８１５号明細書；およびＳａｉｌｏｒらによる米国特許出願公開第２００５／００４２７６４号明細書。
【００２４】
ナノ粒子は、水溶液中で活性化される。この水溶液は、例えば、純水、水酸化ナトリウム、過酸化水素、またはホウ酸イオンを含む水溶液などであってもよい。また、粒子は、発光寿命を変化させる分子または薬剤：ポルフィリン、多環芳香族炭化水素、酸化還元活性分子、金属状態もしくはイオン状態の金属、芳香族化合物、複素環化合物、金属含有配位化合物、炭化ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの化合物の組み合わせ、を担持していてもよい。これらの製剤により、寿命の違いを基に粒子を区別することが可能となる。生体適合性薬剤をナノ構造体に吸着させて、循環半減期または循環時間をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させることができる。また、組織特異的標的薬剤を、粒子またはその被膜上に担持させることもできる。治療薬剤を、ナノ粒子の細孔に担持させることもできる。治療薬剤を担持した本発明のナノ粒子は、薬学的に許容されるキャリアを有する、生分解性多孔質ナノ構造体である医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明の好ましい方法は、破砕した多孔質ナノ粒子を、破砕後にろ過すること、およびサイズで分別したナノ多孔質材料を、水溶液中でインキュベートすることにより活性化して蛍光多孔質シリコンナノ粒子を得ることを含む。薬物およびその他の分子を担持するための多孔質シリコンおよび二酸化ケイ素の製造について、詳細は、Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許出願公開第２０１１／１０３００２２２号明細書を参照のこと。
【００２６】
加えて、ナノ粒子は、その多孔性により、薬物、より小さいナノ粒子、蛍光増感剤、または蛍光消光剤などの種をさらに担持することができる。薬物およびその他の分子を担持するための多孔質シリコンおよび二酸化ケイ素の調製について、詳細は、Ｓａｉｌｏｒらによる米国特許出願公開第２０１１／１０３００２２２号明細書を参照のこと。
【００２７】
蛍光信号を検出または分析する既定の遅延時間ゲート、例えば、励起パルスから、少なくとも２０ナノ秒後、好ましくは１００ナノ秒後に、ナノ粒子からの蛍光強度のみが持続し、励起パルスおよび組織の自家蛍光は無視できるレベルまで減衰している。このように、蛍光ナノ粒子のみの所望の画像を遅延時間ゲートデータから直接作成できる。この簡単で簡潔な手法では、所望の信号、並びにバックグラウンドおよび自家蛍光が、一時的にも重なることがないため、どんな分離法をも必要としない。
【００２８】
また、本発明者は、粒子の蛍光寿命は、表面処理または酸化によって変化し、また時効処理（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにて）によっても変化すること、そして、これにより寿命の違いを基に粒子を区別することが可能となることを確認した。好ましいイメージング法では、２種類以上の粒子（例えば、異なる界面化学的性質を持つことで異なる組織を標的とすることが可能な多孔質Ｓｉナノ粒子、または異なる消光分子を有することにより異なる放射寿命を持ち、異なる生体反応リンカーを有する多孔質Ｓｉナノ粒子など）を組織に導入する。速度の異なる蛍光減衰により、異なる種類の粒子を区別することができる。また、ｅｘ  ｖｉｖｏにて異なる時間の間、時効処理された粒子、または異なる時間にｉｎ  ｖｉｖｏ注入された粒子は、同じ効果を得ることができる。そのため、異なる色素の放射スペクトル波長を、その色調を基にスペクトル領域で区別できるのと同様に、本発明により、寿命が異なる多孔質Ｓｉナノ粒子を、時間領域で区別することができる。よって、本発明は、より複雑な処理によりスペクトル領域で達成された課題を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて達成する、多孔質Ｓｉナノ粒子を用いた時間領域イメージングを提供する。
【００２９】
本発明の多孔質シリコンナノ粒子は、時間ゲート蛍光イメージングおよび組織（例えば、腫瘍、脳、心臓、皮膚など）のモニタリングのための、装置および方法を提供する。例えば、ナノ粒子の発光を時間ゲートして、急速に減衰するバックグラウンド信号（組織の自家蛍光、スペクトルの漏れ込み（ｂｌｅｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）など）を排除し、シリコンナノ粒子からの長寿命発光のみを集める方法は、イメージング法の感度および信号対雑音比を顕著に高めることができる。
【００３０】
本発明の一つの好ましい実施形態である、生分解性多孔質シリコン含有粒子は、光励起下で可視光から近赤外光を放出することができ、バックグラウンド（組織）の自家蛍光または励起スペクトルの漏れ込みと比較して発光寿命が長いため、ナノ粒子の発光の時間ゲートを用いる方法により、急速に減衰するバックグラウンド信号を排除し、装置からの長寿命発光のみを集めることができる。ナノ材料は、自己破壊率を制御することができ、構成要素は、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能した後、この自己破壊によって無害で腎臓で除去される生成物へと階層的に分解される。本発明の方法、ナノ構造体、およびシステムは、低侵襲のイメージングおよび診断システム、並びに、蛍光イメージングおよび蛍光分析の感度および信号対雑音比を高めることが可能なシステムを用いた方法に対する、重要でまだ満たされていないと思われる生物医学的ニーズに対処する。
【００３１】
実験および実験に関連したデータについて、本発明の好ましい実施形態を説明する。実験結果の説明とともに提示する図面は、概略図を含むが、当該技術分野の一般知識および以下に続く説明に照らせば、当業者には明らかであるだろう。構成要素は、図面において強調するために誇張されている場合もあり、また、実際の比率ではない場合もある。
【００３２】
図１は、発光多孔質シリコンナノ粒子の合成の概略図であり、このナノ粒子を用いて、本発明の遅延ゲートイメージング法を実証する実験のための粒子を製造した。エタノールＨＦ溶液中で、多孔質シリコン層１０をエッチングして、単結晶シリコン基質１２を得た。細孔形態および細孔サイズは、マクロ、メソ、およびミクロの細孔を形成するように、電流密度、ドーパントの型および濃度、ウエハーの結晶配向、並びに電解質濃度を調整することにより、変えることができる。１ｎｍ〜数μｍの範囲の細孔サイズは、この工程で調製できる。元々のシリコンウエハーのドーパント型は、これにより電気腐食反応における主要な酸化等価物である価電子帯の正孔の有用性が決まるため、重要である。一般に、ドーパントと形態との関係は、ドーパントの型および濃度に基づいて、４つのグループ：ｎ型、ｐ型、高濃度ｎ型、および高濃度ｐ型に分類できる。「高濃度」とは、材料が半導体の基本バンド構造を保ってはいるものの、その伝導挙動は半導体的というよりも金属的であるようなドーパントレベルを意味する。比較的中度のドーピングレベルであるｎ型シリコンウエハーでは、空間電荷領域から価電子帯正孔を除去することで細孔径が決まる。中度のｐドープ材料においては、量子拘束効果により細孔サイズが制限されると考えられる。どちらのドーパント型についても、反応は結晶面選択的であり、細孔は主に単結晶の＜１００＞結晶学的方向に伝搬する。
【００３３】
成長中の多孔質Ｓｉ層の孔隙率は、印加した電流の密度に比例し、典型的には４０〜８０％の範囲である。細孔はＳｉ／多孔質Ｓｉ界面で形成され、一度形成されると、細孔の形態は残りのエッチング工程において有意には変化しない。しかし、成長層の孔隙率は、印加電流を変化させることで変更できる。この膜は、電流が変化するまでこの新たな孔隙率で成長し続ける。
【００３４】
ステインエッチングは、多孔質Ｓｉ粉末の電気化学的な製造方法に代わる方法である。用語「ステインエッチング」は、処理を受ける結晶シリコン材料上に形成される多孔質Ｓｉ膜の褐色または赤みを帯びた色を意味する。ステインエッチング手順において、化学酸化剤（典型的には、硝酸）は、電気化学的に駆動される反応で使用される電源に代わるものである。ＨＦは必須成分であり、その他の種々の添加剤を用いて反応を制御する。ステインエッチングは、近年の進歩により処理の信頼性が実質的に改善されているものの、電気化学的処理に比べて一般的に再現性が低い。ステインエッチングにより調製された多孔質Ｓｉ粉末は、市販されている。
【００３５】
多孔質ナノ構造体１０全体を、Ｓｉ基質１２から除去する。次に、自立水素終端多孔質シリコン膜１０を水溶液中に設置し、超音波処理により破砕して粒子１４を得る。多孔質層は、「電解研磨」または「リフトオフ」によりＳｉ基質から取り除くことができる。エッチング電解質をより低濃度のＨＦを含む電解質に置き換え、電流パルスを数秒間印加する。より低濃度のＨＦにより、細孔の伝播よりも速くシリコンが結晶Ｓｉ／多孔質Ｓｉ界面から剥がれる拡散律速状態となる。その結果、多孔質層はアンダーカットされ、Ｓｉ基質から離れる。その後、自立多孔質Ｓｉ膜は、ピンセットでまたは激しく濯ぐことで剥がすことができる。
【００３６】
次に、粒子を多孔質ろ過膜でろ過するか、または遠心分離して、所望のサイズの多孔質シリコン粒子を得る。最後に、粒子を水溶液中でインキュベートしてその発光を活性化し、発光粒子１６を作製する。消光種は、物理的または化学的にナノ粒子に吸着され、発光寿命が変化する。一つの実施例として、アミノ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−シランを試験したところ、粒子と結合した後にわずかに寿命を縮めることが可能である。これにより、異なる既定の発光寿命を有する異なるナノ粒子群を得ることが可能となる。また、より均一な形状の粒子が望ましい場合は、従来のリソグラフィまたはその他のパターン形成法を使用して、破砕を制御することができる。
【００３７】
酸化水性環境において、十分な時間をかけて多孔質Ｓｉ表面を酸化し、発光材料を得る。このような発光材料は、毒性が問題となっている細胞または環境において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの状態または生物学的変化のモニタリングを行うのに有用である。種々の酸化水性緩衝液が知られている。例えば、一つの実施形態において、ホウ酸塩水性緩衝液が有用である。化学におけるホウ酸塩とは、ホウ素オキソアニオンを含む化合物であり、ホウ素の酸化状態は＋３である。他にも多くが知られているが、最も単純なホウ酸イオンは、平面三角形構造のＢＯ３３−である。
【００３８】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）による多孔質Ｓｉ表面のゆっくりとした酸化は、ＨＦによる新たに形成された酸化物の溶解と組み合わせると、多孔質Ｓｉ膜の細孔を拡大させる穏やかな手段となる。また、ＫＯＨなどの塩基の水溶液も、エッチング後の細孔の拡大に使用することができる。電気化学的酸化では、多孔質Ｓｉ試料がＨ２ＳＯ４などの鉱酸の存在下で陽極酸化され、かなり安定した酸化物を生成する。酸化により多孔質構造体に親水性が付与され、親水性の薬物または生体分子を、細孔内に包含および吸着することが可能となる。Ｃａ２＋を含めた種々のイオンの存在下で水性酸化すると、石灰化型の多孔質Ｓｉが生成され、これは生物活性を有することが分かっており、ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用に特に関心が持たれている。石灰化は、直流電流を印加することにより促進できる。
【００３９】
多孔質Ｓｉの機械的不安定性は、膜を電気化学的エッチング処理で作製する際に膜に生じる歪みに直接関連しており、熱酸化に伴う体積膨張もまた、歪みを引き起し得る。穏やかな化学酸化剤は恐らく、最も歪みが生じ、それ故に最も反応性が高いＳｉ−Ｓｉ結合で優先的に多孔質Ｓｉを攻撃する。これに代わるものとして、硝酸塩はより強い酸化剤であり、硝酸溶液は上記の化学ステインエッチング法によりシリコン粉末から多孔質Ｓｉ粒子を調製する際に広く使用される。
【００４０】
細孔が小さいほど表面積は大きくなり、より多くの部位が水媒体からの攻撃に曝されることになる。膜内の多孔質フィラメントが小さいほど溶解速度は速くなり、多孔質Ｓｉホストの分解速度を制御する便利な手段となる。分類された粒子の混合物をろ過して、所望の平均粒子サイズとすることができる。例えば、フィルタを使用して、２２０ｎｍ未満のナノ構造体を得ることができる。多孔質Ｓｉは、表面積が大きいため、空気または水による酸化の影響を特に受けやすい。一度酸化されると、ナノ相ＳｉＯ２は容易に水媒体に溶解し、界面活性剤または求核試薬により処理が加速される。Ｓｉ−Ｏ結合は、酸化により多孔質Ｓｉ上に容易に作られ、様々な化学または電気化学酸化剤を用いることができる。空気中での熱酸化は、特に反応を＞６００℃で行う場合に比較的安定な酸化物を生成する傾向にある。オゾン酸化は、通常室温で行われ、水媒体に速やかに溶解するより水和した酸化物を形成する。より穏やかな化学酸化剤、例えば、ジメチルスルホキシド、バンゾキノン、ピリジン、ホウ酸塩、水性緩衝液、または過酸化水素などもまた、この反応に使用される。穏やかな酸化剤は、典型的にはとても脆弱な高多孔質Ｓｉ膜の機械的安定性を改善することができるため、好まれることがある。
【００４１】
細孔のサイズおよび体積を電気化学的エッチング中に容易に調整できることは、多孔質Ｓｉに特有の性質であり、これは、薬物、ワクチン、または抗原の送達への応用に非常に有用である。他の多孔質材料は、一般に、細孔サイズを制御するためにより複雑な設計プロトコルを必要とし、それでもなお、使用できる細孔サイズは限られた範囲となりがちである。電気化学的に調製した多孔質Ｓｉでは、孔隙率および細孔サイズは、エッチング中の電流設定を調整することにより制御される。典型的には、電流密度が大きいほど、大きな細孔を生じる。大きな細孔は、かなり大きい分子または薬物を細孔内に包含する際に望ましい。細孔サイズおよび孔隙率は、薬物充填に重要であるばかりでなく、多孔質Ｓｉホストマトリックスの分解速度も決定する。
【００４２】
実験において、電気化学的エッチングは、２００ｍＡ／ｃｍ２の定電流密度を１５０秒間、ＨＦ／エタノール水性電解質中で印加することにより行った。自立膜は、４ｍＡ／ｃｍ２の電流パルスを２５０秒間、ＨＦ／エタノール水性電解質中で印加することにより得た。次に、この自立膜に超音波を当てて破砕し、ナノ粒子とした。粒子は、ナノ多孔質材料の溶液を０．２２−０．４５μｍのろ過膜に通すことにより、さらに分離した。ナノ粒子を、水性ホウ酸塩緩衝液または過酸化水素中でインキュベートすることにより活性化した。サイズで分別したナノ粒子は、脱イオン水中でおよそ２週間、活性化した。
【００４３】
本発明のイメージング法は、上述のようにして製造した粒子で行った。多孔質シリコンナノ粒子の発光の時間ゲートを行い、急速に減衰するバックグラウンド信号（例えば、組織の自家蛍光、スペクトルの漏れ込みなど）を効果的に排除し、本発明のシリコンナノ粒子からの比較的寿命の長い発光を使用することが実証された。実験により、遅延ゲート法を使用して、組織に導入した粒子の簡単な時間領域イメージングができることが実証された。
【００４４】
時間領域イメージングにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの予備結果を得た。具体的には、時間領域蛍光前臨床イメージング装置（エクスプローラー オプティクス（登録商標））を使用して、シリコンナノ粒子を注射したマウスからｉｎ  ｖｉｖｏデータを得た。標準蛍光強度画像を、遅延時間ゲート画像と比較した。遅延時間ゲート画像は、シリコンナノ粒子のみを示し、標準蛍光強度画像は、急速に減衰するバックグラウンド信号（例えば、組織の自家蛍光、スペクトルの漏れ込みなど）に関連する干渉信号もさらに示す。
【００４５】
図２に、実験的に製造された多孔質シリコンナノ粒子の寿命減衰カーブを例示する。寿命はおよそ１２μｓである（発光強度が初期強度の１／ｅまで下がった時に計算）。しかし、１２μｓを過ぎても測定可能な顕著な発光が残り、遅延ゲート測定に使用できる。図２の具体的なデータセットにおいて、約４０−５０μｓまでの間は、無視できない発光となっている。これもまた、異なる処理で変更できる。具体的には、多孔質シリコンナノ粒子の発光寿命は、材料の物理的または化学的変更により調整できる。例えば、粒子サイズ、細孔径、酸化物層、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被膜により、多孔質シリコンナノ粒子の発光寿命を変更することができる。これにより、精選した消光剤を包含させることによる多孔質シリコン系ナノ粒子の寿命制御が可能となり、特有の発光時間スケールを、生化学的処理のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏプローブとして使用することが可能となる。下記の表１は、初期強度の１／ｅに準じて計算した、異なる発光寿命を有する粒子の例である。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
また、粒子の蛍光寿命は、寿命に影響を及ぼす無機および有機材料を吸着または共有結合させることで、効果的に制御することができ、蛍光消光または増強材料は、多孔質Ｓｉ含有粒子に共有結合する。有機材料としては、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、キシレン、ジエチルエーテル、ギ酸、ベンゾフェノン、ナフタレン、ピレン、アントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、エタノール、ポルフィリン、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、フェロセン、および誘導体が挙げられる。無機材料としては、金、銀、銅、白金、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、またはカーボンナノチューブが挙げられる。しかし、カーボンナノチューブは、腎臓で最も除去され難く、どの消光または増強材料を選択する際も、このような検討を考慮するべきである。
【００４８】
図３Ａ−３Ｃは、マウスの脚パッドに投与した多孔質シリコンナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングおよびデータを示している（画像の右下：Ｔ１およびＴ４）。図３Ａは、従来の波長に基づいた蛍光画像を使用している。図３Ａの画像は、多孔質シリコンナノ粒子からの信号に比べて強い、組織の自家蛍光および励起レーザースペクトルの漏れ込み（左上および左下：Ｔ２、Ｔ３、およびＴ５領域）を含む。図３Ｂは、画像上の５つの異なる点の蛍光減衰カーブを示している。多孔質シリコンの注射領域（Ｔ１およびＴ４；上方のデータプロット）では、最初の組織自家蛍光およびレーザーパルスピークの後、１５−２１ｎｓの時間スケールにおいて、蛍光強度の減少がほとんど見られない。自家蛍光および励起レーザースペクトルの漏れ込み（残りのデータプロット）は、５−１０ｎｓの範囲で急激に下降し、約１０μｓ後には無視できるものとなっている。図３Ｃは、図３Ａから発光の最初の約１５ｎｓを除いた後の時間ゲート蛍光信号を表しており、多孔質シリコンからの長寿命発光のみを表している。その他の全ての蛍光は無視できるものであり、簡単な時間領域分析用に綺麗な信号が提供され得ることを示している。複雑な分離またはろ過技術を適用する必要はない。
【００４９】
ホウ酸塩は、水溶液中で様々な形態で存在する。酸性および中性に近い条件では、ホウ酸塩はホウ酸として存在し、通常Ｈ３ＢＯ３と表されるが、より正確にはＢ（ＯＨ）３である。ホウ酸のｐＫａは、２５℃で９．１４である。ホウ酸は、水溶液中で解離しないが、水分子との相互作用によりテトラヒドロキシホウ酸を形成するため、酸性である。
【００５０】
ナノ構造体は、活性化されて発光することができる。発光は、水溶液中で活性化される。酸化ケイ素は、活性化の間に水素終端多孔質シリコンの表面上で成長し、量子拘束効果およびＳｉ／ＳｉＯ２界面に局在する欠陥に起因して顕著に発光する。調整条件を最適化して、治療薬剤またはその他の機能性カーゴ（ｃａｒｇｏｓ）を担持するのに適した細孔容積および表面積、並びに許容可能な分解速度を維持する長いｉｎ  ｖｉｖｏ循環時間を実現した。
【００５１】
炭素グラフト化は、水媒体中での溶解に対して多孔質Ｓｉを安定化するが、それでもその表面は、オプソニン化またはカプセル化を起こし得るタンパク質およびその他の種が非特異的に結合するのを防がなければならない。炭素グラフト化は、好ましい実施形態である。炭素処理をしていない粒子を使用することもできるが、より強固な非特異的結合をする可能性が高い。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを多孔質Ｓｉ表面上に配置する反応は、この目的に使用されている。短鎖ＰＥＧリンカーにより親水性表面が生じ、これにより、生体分子が強固に結合することなく細孔の中へまたは細孔から外へ通過することが可能となる。ＰＥＧリンカーの末端を修飾することにより、その他の種、例えば、薬物、切断し得るリンカー、蛍光消光剤、または標的部分と、この材料とを結合させることもできる。
【００５２】
多孔質Ｓｉの酸化物は、通常のシラノール化学種を用いて容易に官能化することができる。（ｐ型試料の場合のように）小さい細孔が存在する場合、モノアルコキシジメチルシラン（ＲＯ−Ｓｉ（Ｍｅ）２−Ｒ’）は、トリアルコキシシラン（（ＲＯ）３Ｓｉ−Ｒ’）よりも表面リンカーとして効果的である。これは、トリアルコキシシランが、とりわけ高濃度で用いると、オリゴマー化してより小さい細孔開口部を詰まらせるからである。Ｓｉ−Ｃ化学種は、頑強で用途が広いが、Ｓｉ−Ｏ結合を含む化学種は、少なくとも２つの理由からその代わりとなる魅力的な化学種である。第１に、高多孔質ＳｉＯ２が水媒体中で安定している時間スケールは、多くの短期薬物送達適用（典型的には、２０分間〜数時間）と一致している。第２に、さらなる安定化化学種を含有していない多孔質ＳｉＯ２試料は、毒性または抗原性副作用を生じる可能性が少ないと思われる。多孔質Ｓｉ材料がｉｎ  ｖｉｖｏで長期間安定していることが望ましい場合（例えば、徐放製剤またはｉｎ  ｖｉｖｏバイオセンサー）は、Ｓｉ−Ｃ化学種、例えば、末端キャッピングを伴うヒドロシリル化、またはアセチレンによる熱炭化が有用である。長寿命の酸化物マトリックスが望ましい場合、より高い温度（＞７００℃）で形成された酸化ケイ素は、より低い温度でまたはオゾン酸化により形成された酸化ケイ素よりも水媒体中で有意に安定である。
【００５３】
本発明の具体的な実施形態を示し、記載したが、その他の改変、代用、および代替は、当業者に明らかであることを理解されたい。このような改変、代用、および代替は、添付の請求項から定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【００５４】
本発明の様々な特徴は、添付の請求項に記載する。
【図１】
2014519361.tif 000004
【図２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
2014519361.tif 000009
2014519361.tif 000010