(57)【要約】本発明は、腫瘍抑制因子遺伝子機能を、そのような腫瘍抑制因子遺伝子機能が失われたがん細胞に対して選択的に回復するための、抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質による、Ｂ細胞悪性疾患のような血液悪性疾患を含むがんを処置するための方法および組成物に関する。本発明はまた、がんを診断するための、ならびに処置に対する応答を予測および評価するための方法および組成物に関する。例えば、ＣＤ２０抗原と特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部分を含む融合タンパク質であって、該Ｉｇ重鎖またはその一部分は、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている、融合タンパク質が提供される。
2014512184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０抗原と特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部分を含む融合タンパク質であって、該Ｉｇ重鎖またはその一部分は、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている、融合タンパク質。
【請求項２】
前記腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤは、配列番号２を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
がんの一つ以上の症状を減らすための方法であって、その必要のある被験体に、請求項１に記載の融合タンパク質および請求項３に記載の発現ベクターのうちの少なくとも１つの治療的に有効な量を投与することを含む、方法。
【請求項５】
前記がんがリンパ腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが、がん細胞を含み、該がん細胞が、
ａ）ＣＤ２０タンパク質を発現する、および
ｂ）ｉ）エフリン受容体Ａ７（ＥＰＨＡ７）遺伝子の欠失、
ｉｉ）ＥｐｈＡ７タンパク質の減少した発現、および
ｉｉｉ）ＥｐｈＡ２タンパク質の増加した発現
のうちの一つ以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記がん細胞がＢ細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記がんがリンパ腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法に応答性のがん細胞を同定するための方法であって、前記がん細胞において、エフリン受容体Ａ７（ＥＰＨＡ７）遺伝子の欠失の存在を決定することを含み、ここで、該ＥＰＨＡ７遺伝子の欠失を検出することにより、該がん細胞が請求項４に記載の方法に応答性であることが同定される、方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法に応答性のがん細胞を同定するための方法であって、該がん細胞によるＥｐｈＡ７タンパク質の発現を決定することを含み、ここで、該ＥｐｈＡ７タンパク質の減少した発現を検出することにより、該がん細胞が請求項４に記載の方法に応答性であることが同定される、方法。
【請求項１２】
請求項４に記載の方法に応答性のがん細胞を同定するための方法であって、該がん細胞によるＥｐｈＡ２タンパク質の発現を決定することを含み、ここで、該ＥｐｈＡ２タンパク質の発現を検出することにより、該がん細胞が請求項４に記載の方法に応答性であることが同定される、方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞表面マーカー抗原と特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部分を含む融合タンパク質であって、ここで、該Ｉｇ重鎖またはその一部分は、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている、融合タンパク質。
【請求項１４】
前記腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤが配列番号２を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項１６】
がんの一つ以上の症状を減らすための方法であって、その必要のある被験体に請求項１３に記載の融合タンパク質および請求項１５に記載の発現ベクターのうちの少なくとも１つの治療的に有効な量を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記がんがリンパ腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが、がん細胞を含み、該がん細胞が
ａ）ＣＤ２０タンパク質を発現する、および
ｂ）ｉ）エフリン受容体Ａ７（ＥＰＨＡ７）遺伝子の欠失、
ｉｉ）ＥｐｈＡ７タンパク質の減少した発現、および
ｉｉｉ）ＥｐｈＡ２タンパク質の増加した発現
のうちの一つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記がん細胞がＢ細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんがリンパ腫である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１１年４月７日に出願した同時係属中の米国仮出願第６１／５１６，７３８号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張する。米国仮出願第６１／５１６，７３８号は、その全体が本明細書に参考として援用される。
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与されたＣＡ１４２７９８−０１の下で米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腫瘍抑制因子遺伝子機能を、そのような腫瘍抑制遺伝子機能が失われたがん細胞に選択的に回復させるために、がん、具体的には血液悪性疾患が挙げられる、およびより具体的にはＢ細胞悪性疾患が挙げられるがんを、抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質で処置するための方法および組成物に関する。本発明はまた、がんを診断するための、および処置に対する応答を予測および評価するための、方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
悪性疾患を処置する、および特定の処置レジメンに対するその応答を予測および評価する従来のアプローチは、存在する腫瘍のタイプを適切に分類することに依存している。適切な分類は、今度は、臨床的な特徴、腫瘍細胞の形態、腫瘍細胞の免疫表現型に主に依存しており、そしてより低い程度において、腫瘍細胞の染色体異常に依存している。しかし、所定の腫瘍の型の中でも、特定の処置レジメンに対する応答は、しばしば非常に変動し、そして分子レベルにおける分析は、従来の分類スキームによって定義される腫瘍のタイプは、しばしば非常に不均一であることを明らかにする。
【０００４】
従って、血液悪性疾患を始めとする、腫瘍を分類するための最近の努力は、特定の腫瘍の型の増殖を促進する、特定の遺伝子異常を同定することに集中している。そのような遺伝子異常は次いで、疾患のマーカー、および／または治療の標的となり得る。
【０００５】
濾胞性リンパ腫（ＦＬ）は、なかでも最もよくあるＢ細胞悪性疾患の１つである。ＦＬは、ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）染色体転座によって特徴付けられ、それは抗アポトーシスＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（Ｂｃｌ２）タンパク質の構成的発現を引き起こす。しかし、リンパ腫発生および疾患の進行は、さらなる遺伝子の損傷を必要とする（非特許文献１（Ｂｅｎｄｅ、Ｓｍｉｔおよびｖａｎ  Ｎｏｅｓｅｌ  ２００７））。ｃ−ＭＹＣの増幅、ｐ５３の喪失、および染色体６ｑの欠失は全て、Ｂ細胞リンパ腫の進行および生存期間の短縮と関連していた（非特許文献２（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９））（非特許文献３（Ｎａｎｊａｎｇｕｄら、２００７））。これらの分子的イベントの正確な性質は、不完全にしか理解されていない。Ｂ細胞リンパ腫を有する患者の臨床成績は、従来の化学療法レジメンに抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキシマブ）を加えることによって改善した。しかし、依然として移植がＦＬの唯一の治癒選択肢である（非特許文献４（Ｒｅｌａｎｄｅｒら、２０１０））。
【０００６】
最近の技術的進歩が、がんにおける遺伝的および後成的な変化のゲノム全体での検出を促進した。並行して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術および遺伝子スクリーニングに対するその適用が、哺乳類細胞およびインビボにおける、迅速な、および不偏性の機能喪失研究の実行を可能にした（非特許文献５（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、２００２））。共に、これらの技術はゲノムデータ分析単独によっては同定されなかったかもしれない腫瘍抑制因子遺伝子を明らかにすることを助け得る（非特許文献６（Ｏｒｉｃｃｈｉｏら、２０１０））。
【０００７】
腫瘍抑制因子遺伝子のタンパク質産物は、細胞分裂を直接または間接的に阻止し得る、または細胞死を引き起こし得る。遺伝子の欠失、不活性化変異、または後成的なメカニズムによる、腫瘍抑制因子遺伝子および／またはそのタンパク質産物の機能喪失は、制御されない細胞増殖およびがんの発生を引き起こし得る。多くの腫瘍は、腫瘍抑制因子の機能喪失から主に起こることが公知である。しかし、腫瘍抑制因子機能を、そのような腫瘍抑制因子機能が失われたがん細胞に対して特異的に標的化することが元来困難であることから、腫瘍細胞に対して腫瘍抑制因子機能を回復させることは、今まで、がん処置の実行可能なアプローチとは見られなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bende,  R  J,  L  A  Smit,およびC  J  van  Noesel.  ”Molecular  Pathways  in  Follicular  Lymphoma.”  Leukemia  21,  no.  1  (January  2007):  18-29.
【非特許文献２】Johnson,  Nathalie  A.ら，”Lymphomas  with  Concurrent  BCL2  and  MYC  Translocations:  The  Critical  Factors  Associated  with  Survival.”  Blood  114,  no.  11  (September  2009):  2273-2279.
【非特許文献３】Nanjangud,  G.ら，”Molecular  Cytogenetic  Analysis  of  Follicular  Lymphoma  (FL)  Provides  Detailed  Characterization  of  Chromosomal  Instability  Associated  with  the  t(14;18)(q32;q21)  Positive  and  Negative  Subsets  and  Histologic  Progression.”  Cytogenetics  and  Genome  Research  118,  no.  2-4  (November  2007):  337-344.
【非特許文献４】Relander,  Thomas,  Nathalie  A.  Johnson,  Pedro  Farinha,  Joseph  M.  Connors,  Laurie  H.  Sehn,およびRandy  D.  Gascoyne.  ”Prognostic  Factors  in  Follicular  Lymphoma.”  Journal  of  Clinical  Oncology  28,  no.  17  (June  2010):  2902-2913.
【非特許文献５】McCaffrey,  Anton  P.,  Leonard  Meuse,  Thu-Thao  T.  Pham,  Douglas  S.  Conklin,  Gregory  J.  Hannon,およびMark  A.  Kay.  ”Gene  Expression:  RNA  Interference  in  Adult  Mice.”  Nature  418,  no.  6893  (July  2002):  38-39.
【非特許文献６】Oricchio,  Elisa,  Andrew  L.  Wolfe,  Jonathan  H.  Schatz,  Konstantinos  J.  Mavrakis,およびHans-Guido  Wendel.  ”Mouse  Models  of  Cancer  as  Biological  Filters  for  Complex  Genomic  Data.”  Disease  Models  &  Mechansims  3,  no.  11-12  (November  -  December  2010):  701-704.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、Ｂ細胞悪性疾患を始めとするがんを診断および処置するための、ならびに処置に対する応答を予測および評価するための、方法および組成物に関する。いくつかの実施態様において、エフリン受容体Ａ７遺伝子（ＥＰＨＡ７）の欠失、またはＥｐｈＡ７発現の喪失を、ＥｐｈＡ７の細胞外ドメインを含む、分泌される短縮ＥｐｈＡ７アイソフォーム（ＥｐｈＡ７ＥＣＤ；ＥｐｈＡ７ＴＲと呼ばれることもある）またはそのアナログによる処置に応答するリンパ腫のサブセットを同定するために使用し得る。他の実施態様において、抗ＣＤ２０抗体−ＥｐｈＡ７ＥＣＤ融合タンパク質（抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７）を含む医薬組成物の投与を、そのようなリンパ腫を治療するために使用し得、ここでＥｐｈＡ７ＥＣＤが、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）／ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）定常領域の下流に融合している。いくつかの他の実施態様において、ＥＰＨＡ７の欠失、ＥｐｈＡ７発現の喪失、および／またはＥｐｈＡ２を始めとするＥｐｈＡ受容体の細胞表面発現の増加を、ＥｐｈＡ７ＥＣＤまたはそのアナログによる処置に応答する可能性の高い腫瘍を同定するために使用し得る。さらに他の実施態様において、抗腫瘍抗体−ＥｐｈＡ７ＥＣＤ融合タンパク質を含む医薬組成物の投与を、そのような腫瘍を処置するために使用し得る。
【００１０】
従って、１つの実施態様において、本発明は、以下のものを含む抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質を提供する：（１）腫瘍細胞の細胞表面抗原に特異的なアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部分；および（２）そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって、腫瘍抑制因子タンパク質またはその機能的部分のアミノ末端アミノ酸へと結合している、当該重鎖またはその一部分。１つの実施態様において、抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質のＩｇ重鎖は、リツキシマブのＦｖを含む。別の実施態様において、抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質のＩｇ重鎖Ｆｖは、ＣＤ２０に特異的である。特定の実施態様において、Ｉｇ重鎖Ｆｖは、悪性Ｂ細胞において見出される細胞表面抗原に特異的である。さらなる実施態様において、Ｉｇ重鎖Ｆｖは、血液性腫瘍の細胞において見出される細胞表面抗原に特異的である。別の実施態様において、Ｉｇ重鎖Ｆｖは、固形腫瘍の細胞の細胞表面抗原に特異的である。別の実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤである。またさらなる実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質は、ＥｐｈＡ７またはそのＥｐｈＡ２結合部分である。
【００１１】
本発明はまた、本明細書中で記載された抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質のうちのいずれか１つまたはそれより多くの治療的に有効な量を投与することを含む、がんを処置するための方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、本明細書中で記載された抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質のうちのいずれか１つまたはそれより多くをコードするＤＮＡ構築物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、以下のものを含む腫瘍抑制因子免疫複合体を提供する：（１）そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって、腫瘍抑制因子タンパク質またはその機能的部分のアミノ末端アミノ酸へと結合した、腫瘍細胞の細胞表面抗原に特異的なＦｖを有する組換えＩｇ重鎖またはその一部分；および（２）当該細胞表面抗原に特異的なＦｖを有するＩｇ軽鎖またはその一部分であって、当該Ｉｇ重鎖および軽鎖またはその一部分は、一緒になって機能的な抗原結合部位を形成し、その結果、当該免疫複合体は、抗原結合特異性および腫瘍抑制因子活性の両方を示す。
【００１４】
本発明はさらに、本明細書中で記載された腫瘍抑制因子免疫複合体のうちのいずれか１つまたはそれより多くの治療的に有効な量を投与することを含む、がんを処置するための方法を提供する。１つの実施態様において、その抗原結合部位は、リツキシマブの抗原結合部位である。別の実施態様において、その抗原結合部位は、ＣＤ２０に特異的である。さらなる実施態様において、その抗原結合部位は、悪性Ｂ細胞において見出される細胞表面抗原に特異的である。別の実施態様において、その抗原結合部位は、血液性腫瘍の細胞において見出される細胞表面抗原に特異的である。さらなる別の実施態様において、その抗原結合部位は、固形腫瘍の細胞の細胞表面抗原に特異的である。さらなる実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤである。別の実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質は、ＥｐｈＡ７またはそのＥｐｈＡ２結合部分である。
【００１５】
本発明はさらに、本明細書中で記載される腫瘍抑制因子免疫複合体のうちのいずれか１つまたはそれより多くをコードするＤＮＡ構築物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、腫瘍抑制因子の遺伝子の欠失もしくは不活性化、および／または腫瘍抑制因子タンパク質の発現の喪失を測定することによって、本明細書中で記載される抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質のうちのいずれか１つまたはそれより多くによる処置に応答性の腫瘍を同定する方法を提供する。１つの実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤである。
【００１７】
腫瘍抑制因子の遺伝子の欠失もしくは不活性化、および／または腫瘍抑制因子タンパク質の発現の喪失を測定することによって、本明細書中で記載される腫瘍抑制因子免疫複合体のうちのいずれか１つまたはそれより多くによる処置に応答性の腫瘍を同定する方法も本発明によって提供される。特定の実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤである。
【００１８】
本発明はまた、細胞表面ＥｐｈＡ受容体発現を測定することによって、本明細書中で記載される抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質のうちのいずれか１つまたはそれより多くによる処置に応答性の腫瘍を同定する方法を提供する。
【００１９】
細胞表面ＥｐｈＡ受容体発現を測定することによって、本明細書中で記載される腫瘍抑制因子免疫複合体のうちのいずれか１つまたはそれより多くによる処置に応答性の腫瘍を同定する方法も、本発明によって提供される。
【００２０】
本発明はさらに、腫瘍細胞表面マーカー抗原に特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部分を含む融合タンパク質を提供し、ここでそのＩｇ重鎖またはその一部分は、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている。１つの実施態様において、その腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤは、配列番号２を含む。
【００２１】
本発明はまた、腫瘍細胞表面マーカー抗原に特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部分を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供し、ここでそのＩｇ重鎖またはその一部分は、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている。
【００２２】
本発明はさらに、がんの１つまたはそれより多くの症状を減らすための方法であって、その必要のある被験体に、（ａ）腫瘍細胞表面マーカー抗原に特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部を含む融合タンパク質であって、ここで、そのＩｇ重鎖またはその一部分が、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている、融合タンパク質、および（ｂ）腫瘍細胞表面マーカー抗原に特異的に結合するアミノ末端可変領域（Ｆｖ）を有する、組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖またはその一部を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターであって、ここで、そのＩｇ重鎖またはその一部分が、そのカルボキシ末端において、ペプチド結合によって腫瘍抑制因子タンパク質ＥｐｈＡ７ＥＣＤのアミノ末端アミノ酸へと連結されている、組換え発現ベクター、のうちの少なくとも１つの治療的に有効な量を投与することを含む、方法を提供する。１つの実施態様において、そのがんはリンパ腫である。別の実施態様において、そのがんは、ａ）ＣＤ２０タンパク質を発現する、およびｂ）ｉ）エフリン受容体Ａ７（ＥＰＨＡ７）遺伝子の欠失、ｉｉ）ＥｐｈＡ７タンパク質の減少した発現、およびｉｉｉ）ＥｐｈＡ２タンパク質の増加した発現のうちの１つまたはそれより多くを含む、がん細胞を含む。さらなる実施態様において、そのがん細胞は、Ｂ細胞を含む。特定の実施態様において、そのがんはリンパ腫である。より特定の実施態様において、その被験体はヒトである。
【００２３】
本開示において、本発明を、その特定の実施態様に関して記載する。しかし、本発明のより広い範囲および趣旨から逸脱することなく、様々な修飾および変更をそれに行い得ることが明らかである。よって、概要、説明、材料および方法、ならびに図面は、限定する意味ではなく例証と考えられる。
【００２４】
本文書を通して、特許および印刷された出版物に対して多くの参照がなされた。引用された参考文献および印刷された出版物のそれぞれは、個々にその全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＦＬにおいて腫瘍抑制因子遺伝子を同定するためのがんゲノム研究。ａ．その研究デザインは、ゲノム腫瘍分析を、ＲＮＡｉスクリーニング、ならびにマウスモデルおよび異種移植における検証と組み合わせる；ｂ．ゲノム中のゲノム増加（ｇａｉｎ）（赤）および減少（ｌｏｓｓ）（青）の頻度を示す、６８例のＦＬのａＣＧＨ分析；ｃ．示したＣＲＤを有する染色体６ｑに影響を与える、再発する増加（赤）および減少（青）の高解像度の描写；ｄ．ＣＲＤのマッピング。観察された６ｑの欠失は、典型的には大きく、そしてヘミ接合性であり、そして標的遺伝子を容易に同定することがない。
【図２】ＦＬにおける染色体６ｑ中の増加および減少の症例ごとの分析。ａ．第６染色体のマップと整列させた、コピー数の減少および増加の領域。減少を青で示し、そして増加を赤で示し、色の強度は、シグナルの強さを示す。いくつかの重要な遺伝子ならびにＣＲＤ４およびＣＲＤ９の位置を示す。ｂ．ＥＰＨＡ７は、ＣＲＤ４を含む、１３個の欠失のうち８個において影響を受ける；同様に、ＴＮＦＡＩＰ３は、ＣＲＤ９の欠失を有する１２例のうち９例において影響を受ける。ｃ．ＥＰＨＡ７、ＰＲＤＭ１およびＴＮＦＡＩＰ３は、頻繁に同時に欠失している。６４例のＦＬのうち、欠失は、８例（１２．５％）においてＥＰＨＡ７に影響を与え、６例（９．４％）においてＰＲＤＭ１に影響を与え、および９例（１４％）においてＴＮＦＡＩＰ３に影響を与える。６４例のＦＬのうち５例（７．８％）において、３つの遺伝子全てが影響を受ける。それらの欠失は、ほとんど全体的にヘミ接合性であり、そして両アレルの喪失によって直接影響をうける遺伝子はない。欠失のサイズおよび複雑なパターンは、複数の標的を示唆する；しかし、ゲノムデータ単独は、ＦＬに関連する何らかの特異的な遺伝子の位置を正確に示さない。
【図３】６例のＨＩＶ関連ＢＬのａＣＧＨ分析。ａ．ＣＮＶに関して修正したセグメント分析は、参照と比較して、６例のうち２例において６ｑの欠失を明らかにする。ｂ．ゲノム全体の変化および影響を受けたＢＬの割合。６ｑにおける欠失の最も小さい共通領域は、ヌクレオチド８４，３４１，５５２からヌクレオチド１１７，０８４，５１７まで伸び、それはＦＬにおけるＣＲＤ４〜７と重なっており、そしてＥＰＨＡ７およびＰＲＤＭ１を含む。
【図４】ＲＮＡｉスクリーニングおよび候補腫瘍抑制因子遺伝子のインビボにおける検証。ａ．代理モデル（不死化ＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞）における、プールした欠失特異的ｓｈＲＮＡライブラリースクリーニングのデザイン。ｂ．ＩＬ−３欠乏後にｓｈＲＮＡ（およびＧＦＰレポーター）を発現する細胞の濃縮を示す、プールした６ｑ欠失ライブラリーで形質導入した細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析。ｃ．濃縮された集団から回収されたｓｈＲＮＡ配列の絶対数およびアイデンティティー。ｄ．ＦＬにおける、それぞれＣＲＤ４およびＣＲＤ９に対する、ＥＰＨＡ７およびＴＮＦＡＩＰ３のマッピング；ＰＲＤＭ１は、このスクリーニングにおいて得点しなかった。ｅ．養子移植は、ＦＬのｖａｖＰ−ＢＣＬ２モデルにおける遺伝的研究を可能にする。ｆ．空のベクター（黒、ｎ＝１１）またはＥＰＨＡ７（赤、ｎ＝１８）またはｐ５３（緑、ｎ＝９）に対するｓｈＲＮＡ、または過剰発現ｃ−ＭＹＣ（青、ｎ＝７）で形質導入した、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２トランスジェニックＨＰＣを投与された動物の腫瘍潜伏期間。ｇ．示した構築物を発現する、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２リンパ腫の顕微鏡的病理学および免疫組織化学。赤い矢印は、浸潤する腫瘍細胞を示す。
【図５】スクリーニング結果の個々の検証。示したｓｈＲＮＡ／ＧＦＰまたはコントロール構築物で部分的に形質導入したＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞を、ＩＬ−３欠乏培地に移し、そしてＧＦＰ発現細胞の割合の変化をモニターする。ＧＦＰ発現細胞（赤い輪郭で示す）の割合の増加は、ＩＬ−３欠乏時のＢｃｌ２発現Ｂ細胞の生存および増殖において、同時に形質導入された遺伝子を関係付ける。
【図６】ＥＰＨＡ７  ｓｈＲＮＡの特徴付け。ａ．図５で記載したような、ＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞におけるＥＰＨＡ７を標的とする３つのｓｈＲＮＡ（ｓｈ１〜３）の評価。ｂ．ブロットし、そして示したような抗体でプローブした、ＥＰＨＡ７を標的とする３つのｓｈＲＮＡ（ｓｈ１〜３）のうちの１つまたはベクター（Ｖ）を発現する、ＦＡＣＳ分取したＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞のライセート（ｐ２１は、ｓｈＲＮＡの共通のオフターゲットと報告された）。
【図７】ｖａｖＰ−ＢＣＬ２  ＨＰＣレシピエント動物におけるＴＮＦＡＩＰ３の役割。ａ．空のベクター（黒、ｎ＝１１）、またはＥＰＨＡ７を標的とするｓｈＲＮＡ（赤、ｎ＝１８）、ＴＮＦＡＩＰ３（緑、ｎ＝３）、またはＥＰＨＡ７およびＴＮＦＡＩＰ３（青、ｎ＝５）で形質導入した、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２トランスジェニックＨＰＣを投与された動物の腫瘍潜伏期間。ｂ．ブロットし、そして示したような抗体でプローブした、ベクターまたはＴＮＦＡＩＰ３を標的とするｓｈＲＮＡを発現するＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞のライセート。
【図８】ｖａｖＰ−ＢＣＬ２リンパ腫の顕微鏡的病理学および免疫組織化学。赤い矢印は、浸潤する腫瘍細胞を示す。
【図９】マウスｖａｖＰ−ＢＣＬ２リンパ腫の分子的特徴付け。ａ．クローン性を分析するために使用したプライマーの位置。ｂ．ＤＪ組換えのネステッドＰＣＲ分析は、約１４０ｂｐにおいて単一のバンドを明らかにし、このｖａｖＰ−ＢＣＬ２／ＥＰＨＡ７リンパ腫のクローン性を示す。ｃ．トランスジェニックｖａｖＰ−ＢＣＬ２動物、および示したｓｈＲＮＡ構築物で形質導入したＨＰＣを投与されたマウスにおいて生じるリンパ腫におけるＤＪ組換えのＰＣＲ分析は、そのクローン性を確認する。ｄ．ブロットし、そして示したような抗体でプローブした、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２トランスジェニックＨＰＣ（ＨＳＣ）および脾細胞（脾臓）のライセート。ｅ．ｃ−ＭＹＣ、またはＥＰＨＡ７、ＦＯＸＯ３もしくはｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡを発現し、そして示したような抗体でプローブした、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２腫瘍の腫瘍全体のライセート。
【図１０】Ｅμ−ＭＹＣリンパ腫モデルにおける候補腫瘍抑制因子遺伝子。ａ．ＦＬおよびＢＬで見られる６ｑの欠失を比較するダイアグラム。ｂ．Ｅμ−ＭＹＣモデルおよび我々のＨＰＣ移植アプローチ。ｃ．空のベクター（黒、ｎ＝６０、同時および履歴のコントロールを含む）、ＥＰＨＡ７に対するｓｈＲＮＡ（赤、ｎ＝１１）、またはＡＫＴ（青、ｎ＝８）で形質導入した、Ｅμ−ＭＹＣトランスジェニックＨＰＣを投与された動物の腫瘍潜伏期間；ｐ（ｓｈＥＰＨＡ７またはＡＫＴ対ベクター）＜０．０５。ｄ．ブロットし、そして示したようにプローブした、ベクターまたはｓｈＥＰＨＡ７を発現するＥμ−ＭＹＣリンパ腫からのライセート。ｅ．示した構築物を発現する、Ｅμ−ＭＹＣリンパ腫の顕微鏡的病理学および免疫組織化学。
【図１１】ＥＰＨＡ７は識別的に、ＦＬにおいてサイレンシングされ、そしてＧＣ  Ｂ細胞で発現する。ａ．反応性扁桃腺（Ｔ）、ＧＣ、ＦＬ、およびＢＬからの精製Ｂ細胞におけるＥＰＨＡ７のｑＲＴ−ＰＣＲの結果。結果を、平均±標準偏差で示す；ＦＬおよびＢＬに関してｐ（腫瘍対正常）＜０．０５。ｂ．正常扁桃腺における、ＥｐｈＡ７タンパク質の免疫組織化学的検出。ｃ．ＥｐｈＡ７に関して染色した３２２例のヒトＦＬを示すＴＭＡの代表的な切片。ｄおよびｅ．３２例のＦＬ（ｄ）および１６例のヒトリンパ腫系統（ｅ）ならびにポジティブ／ネガティブコントロール（Ｃｔｒｌ）における、ＥＰＨＡ７プロモーターメチル化のＭａｓｓＡＲＲＡＹ分析；カラースケールはメチル化の程度を示し、赤は０％および黄色は１００％を示す。ｆ．５−アザ−２’−デオキシシチジン（Ａｚａ）によって処置したヒトリンパ腫細胞系統におけるＥＰＨＡ７  ｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ；全ての細胞系統に関してｐ（Ａｚａ対未処置）＜０．０１；Ｒａｊｉ細胞は、ＥＰＨＡ７に関してヘミ接合性である。
【図１２】ヒト組織のより高い解像度のＥｐｈＡ７免疫組織化学。ａ．正常扁桃腺のＥｐｈＡ７染色。ｂおよびｃ．ＴＭＡにおける、ヒトＦＬの代表的なネガティブ染色（ｂ）およびポジティブ染色（ｃ）（そのＴＭＡはまた、コントロールとして、既知のＥｐｈＡ７染色パターンを有する、ヒトの正常な腎臓および肝臓ならびに胃のがんを含む。）
【図１３】正常ＧＣ  Ｂ細胞、ＦＬ、ＤＬＢＣＬ、およびＤＬＢＣＬ由来細胞系統における、識別的なＥＰＨＡ７プロモーターメチル化のＨＥＬＰ分析。ａ．ＥＰＨＡ７プロモーターメチル化を分析するために使用したプローブの位置。ｂおよびｃ．中心芽細胞（ＣＢ；ｎ＝９）を、ＦＬ（ｎ＝８）およびＤＬＢＣＬ（ｎ＝１５５）と比較する（ｂ）、およびＣＢをＤＬＢＣＬ由来細胞系統と比較する（ｃ）プローブ１による結果。ｄおよびｅ．プローブ２に関する同様の結果。サイレンシングは、ＧＣ  Ｂ細胞からＦＬまで進行性であり、そしてＤＬＢＣＬにおいて急速に進行し、そしてＤＬＢＣＬ系統においてほとんど完全である（＊はｐ＜０．０５を示す）。そのデータは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹおよび発現データと一致しており、そしてリンパ腫およびＧＣ  Ｂ細胞の間の識別的なサイレンシングを示す。
【図１４】５−アザ−２’−デオキシシチジン処置ヒトリンパ腫系統から発現したＥｐｈＡ７ＥＣＤの特徴付け。ａ．１μｇおよび５μｇの５−アザ−２’−デオキシシチジン（Ａｚａ）による処置時のＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞におけるＥＰＨＡ７転写物の再発現を示すＲＴ−ＰＣＲ。ｂ．再発現されたＲＮＡのｃＤＮＡ配列（配列番号１）。ｃ．ｃＤＮＡ配列（配列番号１）の翻訳（配列番号２）。ｄ．再発現されたＲＮＡによってコードされるタンパク質のドメイン構造。ｅ．既知のＥｐｈＡ２構造との類似性に基づく、予測される３次元構造。ｆ．ＥｐｈＡ７のＦｃタグ化外部ドメイン（ＥｐｈＡ７Ｆｃ）のゲル精製。
【図１５】Ｒａｊｉリンパ腫細胞におけるＥＰＨＡ７遺伝子座およびその発現の分析。ａ．Ｒａｊｉリンパ腫細胞におけるＥＰＨＡ７遺伝子のコピー数を決定するためのゲノムｑＰＣＲは、これらの細胞におけるＥＰＨＡ７の１つの対立遺伝子の喪失と一致している。ｂ．ＥＰＨＡ７  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲは、正常扁桃腺と比較して、Ｒａｊｉ細胞におけるＥＰＨＡ７発現の欠如を確認する（＊はｐ＜０．０５を意味する）。
【図１６】ＥｐｈＡ７Ｆｃは、発がんシグナルを遮断し得、そして異種移植したヒトリンパ腫の増殖を抑制し得る。ａ．ＥｐｈＡ７に対する抗体でプローブした、空のベクター、ＥＰＨＡ７を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＥｐｈＡ７）、または全長ＥＰＨＡ７（ＥｐｈＡ７ＦＬ）を発現する、ＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞からのライセートおよび馴化培地。ｂ．抗ＥｐｈＡ７抗体で免疫沈降し、そしてＥｐｈＡ７またはＥｐｈＡ２に対する抗体でプローブした、ＥｐｈＡ７Ｆｃ（ＥｐｈＡ７のＦｃタグ化外部ドメイン）またはＦｃコントロールで処置したＲａｊｉ細胞のライセートの免疫沈降。ｃ．Ｅｐｈ７ＦｃまたはＦｃで処置したＲａｊｉ細胞におけるＥｐｈＡ２リン酸化に関するＥＬＩＳＡ。ｄ．Ｆｃコントロール、ＥｐｈＡ７Ｆｃ（５μｇ）またはＥｐｈＡ２に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で処置したＲａｊｉ細胞のライセートのイムノブロット。ｅ．示したように５μｇ／ｍｌのＥｐｈＡ７Ｆｃで処置したＲａｊｉ細胞のライセートのイムノブロット。ｆ．ＥｐｈＡ２の公知の構造およびそのＥｐｈＡ７との相同性に基づく、ＥｐｈＡ２−ＥｐｈＡ７ＥＣＤ相互作用のモデル（ＬＢＤ、リガンド結合ドメイン；ＥＧＦ、ＥＧＦ様ドメイン；ＦＮＩＩＩ、フィブロネクチンドメイン）。ｇ．ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部で増殖させ、そして２０μｇのＥｐｈＡ７Ｆｃ（赤丸）またはビヒクル（Ｆｃ；黒丸）の腫瘍内投与によって、１日おきに３回処置した、異種移植したＲａｊｉリンパ腫。ｈ．示したように染色した、ＥｐｈＡ７Ｆｃ処置および偽処置のＲａｊｉリンパ腫の顕微鏡的病理学。ｉ．インビボでＥｐｈＡ７Ｆｃまたはビヒクル（Ｆｃ）で処置した腫瘍のライセートのイムノブロット。ｊ．８例（Ａ〜Ｈ）のＥｐｈＡ７Ｆｃ処置（赤）およびビヒクル（Ｆｃ）処置（黒）のＲａｊｉリンパ腫の腫瘍体積のマッチドペア分析。ｋ．ＥｐｈＡ７Ｆｃ（２０μｇ／日×３日間；赤）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、ビヒクル（Ｆｃ）の投与と比較して、１×１０６のＲａｊｉリンパ腫細胞の注射後の腫瘍の発達を遅延させる。ｌ．抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体の概略図。ｍ．抗ＣＤ２０抗体（ＣＤ２０）で処置したか、抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体（ＣＤ２０／Ｅ７）で処置したか、または未処置（Ｕｎｔｒ．）のＲａｊｉ細胞のライセートのイムノブロット。ｎ．示したように処置したＲａｊｉ細胞の増殖；＊はｐ（ＣＤ２０／Ｅ７対ＣＤ２０）＜０．０５を意味する。ｏ．２４時間および４８時間における、示したように処置したＲａｊｉ細胞のアポトーシス（＊および＊＊は、ｐ＜０．０５を意味する）。ｐ．未処置のまま（Ｕｎｔｒ．）の、または１μｇ／日×５日間の抗ＣＤ２０抗体（ＣＤ２０）もしくは抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体（ＣＤ２０／Ｅ７）を投与した、Ｒａｊｉ異種移植片（＞１ｃｍ３）を有するマウス由来の腫瘍の重量。腫瘍（マトリゲル中）を、最後の処置の２日後に回収し、エキソビボで計量し、そして完全な応答（ＣＲ；０〜３０ｍｇ）、部分的な応答（ＰＲ；３０〜１００ｍｇ）、または変化なし／疾患の悪化（ＮＣ／ＰＤ；＞１００ｍｇ）に分類した。
【図１７】ヒトリンパ腫細胞系統におけるＥｐｈＡ７シグナル伝達の影響。ａ．抗ＥｐｈＡ７抗体で免疫沈降し、そしてＥｐｈＡ７に対する抗体またはＥｐｈＡ２に対する抗体でプローブした、ＥｐｈＡ７ＦｃまたはＦｃで処置したＤｏＨＨ２細胞のライセートのイムノブロット。ｂ．イムノブロットによる、Ｒａｊｉ細胞におけるＥｐｈＡ２発現の確認。ｃ．示した時間にわたってＥｐｈＡ２に対するｓｉＲＮＡで処置し、そして示したようにプローブしたＲａｊｉ細胞のライセートのイムノブロット。ｄ．示したようにＥＰｐｈ７Ｆｃで処置したＳＵ−ＤＨＬ−６、ＤｏＨＨ２、およびＫａｒｐａｓ  ４２２細胞の細胞ライセートのイムノブロットは、シグナル伝達におけるいくつかの細胞型特異的な差異および類似を明らかにする。
【図１８】ＥｐｈＡ７ＦｃおよびｓｈＲＮＡによるＥＰＨＡ７ノックダウンのシグナル伝達の影響。ａ．示した抗体でプローブした、空のベクターまたはｓｈＥｐｈＡ７を発現するＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞。ｂ．示した時間にわたってＥｐｈＡ７Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）で処置し、そして示したようにプローブした、ｓｈＥｐｈＡ７を発現するＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞（ＦＬ５−１２／ＢＣＬ２／ｓｈＥｐｈＡ７）。
【図１９】ＥｐｈＡ７Ｆｃは、ヒトリンパ腫細胞において、いくつかのシグナル伝達分子に影響を与える。ａ．５μｇ／ｍｌの精製ＥｐｈＡ７Ｆｃまたはビヒクルによって１５分間処置したＲａｊｉ細胞からのライセートでプローブしたリンタンパク質アレイ。ｂ．リンタンパク質アレイ結果の定量；青い線は、未処置の細胞の値を示す。ｃ．ＥｐｈＡ７Ｆｃによって媒介されるＥｒｋ阻害の用量−応答関係。ｄおよびｅ．５μｇ／ｍｌの精製ＥｐｈＡ７Ｆｃまたはビヒクル（ｖ）で１５分間処置し、そして示したシグナル伝達分子に関してプローブした、Ｒａｊｉ（ｄ）およびＳＵ−ＤＨＬ−１０（ｅ）リンパ腫細胞のライセートのイムノブロット。
【図２０】ヒトリンパ腫細胞におけるＥＰＨＡ７ＥＣＤのレトロウイルス発現。ａ．Ｒａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞における、ＥＰＨＡ７ＥＣＤ（ＥＰＨＡ７ＴＲ）ｍＲＮＡのレトロウイルス発現のレベルを示すｑＲＴ−ＰＣＲ。ｂ．ベクターまたはＥＰＨＡ７ＥＣＤ（ＥＰＨＡ７ＴＲ）を発現するＲａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞のＦＡＣＳ分取集団の増殖曲線。ｃ．インビトロ培養における７２時間の間の、混合集団からのＥＰＨＡ７ＥＣＤ（ＥＰＨＡ７ＴＲ）／ＧＦＰを発現するＲａｊｉ細胞の進行性の欠乏。
【図２１】インビトロにおけるＦＬ由来細胞系統のＥｐｈＡ７Ｆｃによるアポトーシスの誘導。ａ．Ｒａｊｉ細胞、Ｋａｒｐａｓ  ４２２細胞およびＤｏＨＨ２細胞における、５μｇのＥｐｈＡ７Ｆｃによる処置によって誘導されたアポトーシスのＦＡＣＳ分析。ｂ．リンパ腫系統のパネルにおけるアポトーシスの定量（Ｖ、ビヒクル／Ｆｃ、ＥｐｈＡ７Ｆｃ；ｐ（Ｅ７対Ｖ）＜０．０５）
【図２２】ＥｐｈＡ７ＦｃまたはＦｃで処置した、異種移植したＳＵ−ＤＨＬ−１０およびＲａｊｉヒトリンパ腫細胞のマッチドペア分析。ａ．２０μｇのＥｐｈＡ７ＦｃまたはＦｃ（ビヒクル）で処置後の、ｅｘ  ｓｉｔｕの腫瘍の写真。ｂ．ＥｐｈＡ７Ｆｃ処置腫瘍とＦｃ処置腫瘍とを比較する腫瘍重量（ＳＵ−ＤＨＬ−１０およびＲａｊｉに関してｐ＜０．０５）。
【図２３】抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７ＥＣＤ融合抗体の精製および機能的特徴付け。ａ．抗ＣＤ２０抗体および抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体の産生のＥＬＩＳＡ測定。ｂ．抗ＣＤ２０抗体または抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＩｇＧ抗体で処置した、ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞のＦＡＣＳ分析。ｃ．Ｆｃ（Ｕｎｔｒ．）、ＥｐｈＡ７Ｆｃまたは抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７で処置したＲａｊｉ細胞におけるＥｐｈＡ２リン酸化のＥＬＩＳＡ（＊は、ｐ（いずれかの処置対ビヒクル）＜０．０５を示す）。
【図２４】抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７は、細胞死を誘発し、そしてＤｏＨＨ２リンパ腫細胞の増幅を阻害する。ａ．２４時間および４８時間における、未処置（Ｕｎｔｒ．）か、抗ＣＤ２０（ＣＤ２０）または抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７（ＣＤ２０／Ｅ７）で処置したＤｏＨＨ２細胞のアポトーシス。ｂ．未処置（Ｕｎｔｒ．）か、抗ＣＤ２０抗体（ＣＤ２０）または抗ＣＤ２−ＥｐｈＡ７抗体（ＣＤ２０／Ｅ７）で処置したＤｏＨＨ２細胞の増殖。
【図２５】Ｒａｊｉ異種移植片の顕微鏡的組織学および免疫組織化学。腫瘍を、抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体（１μｇ／日×５日間）またはビヒクルで処置し、そして最終的な処置の２時間後に回収した。抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７で処置した腫瘍は、ＴＵＮＥＬ陽性のいくらかの増加、増殖の減少、およびＥｒｋリン酸化の減少を明らかにする。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
序文
ＦＬは、最もよくあるタイプの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の１つである。それらは、転座ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）およびＢＣＬ２の発現の増加によって特徴付けられる（Ｂｅｎｄｅ、Ｓｍｉｔおよびｖａｎ  Ｎｏｅｓｅｌ  ２００７）。ｃ−ＭＹＣの増幅、ｐ５３の喪失および染色体６ｑの欠失は全て、ＦＬにおける進行および生存の短縮と関連付けられている（Ｎａｎｊａｎｇｕｄら、２００７）。２０％までのＦＬが、染色体６ｑ１１−２７の大きくかつヘミ接合性の欠失を有し、この領域における１つまたはそれより多くの腫瘍抑制因子遺伝子の存在を示唆する（Ｏｆｆｉｔら、１９９３）（Ｇａｉｄａｎｏら、１９９２）。臨床的に、ＦＬは持続する増殖および最終的な進行を示す。標準的な化学療法レジメンに抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを加えることによって結果は改善したが、依然として移植がＦＬの唯一の治癒選択肢である（Ｒｅｌａｎｄｅｒら、２０１０）。
【００２７】
我々は、腫瘍のゲノム解析を補完するために、不偏性の機能喪失スクリーニングを使用した。ＦＬで見られる６ｑの欠失に合わせて作ったＲＮＡｉライブラリーを用いて、我々は、腫瘍抑制因子として、ＥｐｈＡ７受容体の分泌形態（ＥｐｈＡ７ＥＣＤ）を同定した（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ、ＣｌａｒｋｅおよびＦｒｉｓｅ’ｎ、２０００）。ＥＰＨＡ７のヘミ接合性喪失は、ＦＬの１２％で起こり、そしてその遺伝子は、ＦＬのうちの７２％までにおいて識別的にサイレンシングされている。ＥＰＨＡ７のインビボノックダウンは、ＦＬのマウスモデルにおいてリンパ腫の発達を促進する。逆に、精製ＥｐｈＡ７ＥＣＤタンパク質は、異種移植されたヒトリンパ腫細胞に対して著しい抗腫瘍効果を有する。さらに、ＥｐｈＡ７を抗ＣＤ２０抗体に融合することによって、我々は、インビボで、ＥｐｈＡ７の腫瘍抑制活性を、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞に標的化し得る。従って、我々は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤの、リンパ腫における有意な治療可能性を有する抗腫瘍タンパク質としての驚くべき役割を同定し、そして我々は新規戦略である、抗腫瘍抗体−腫瘍抑制因子融合タンパク質を使用して、腫瘍抑制因子遺伝子機能が失われたがん細胞に対して、そのような機能を選択的に回復させることを記載する。
【００２８】
ＦＬおよびバーキットリンパ腫（ＢＬ）における６ｑ欠失のゲノム解析
我々は、ＦＬの分子的病因に対する、系統的な機能的ゲノム化学研究を行った（図１ａ）。まず、我々は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）によって、病理学的グレードＩ−ＩＩＩを示す６４例のＦＬ（グレードＩ、２１；ＩＩ、２３；ＩＩＩａ、１６；ＩＩＩｂ、８）を解析した。我々は、９２ヶ所の共通（すなわち、試験したＦＬの１０％よりも多くに存在する）欠失領域（ＣＲＤ）を観察した；３８ヶ所は腫瘍特異的であり、そして参照ＤＮＡにおいては見出されず、４ヶ所は生理学的であり、そして５０ヶ所はコピー数バリエーション（ＣＮＶ）であった（図１ｂ）。以前の細胞遺伝学的研究（Ｏｆｆｉｔら、１９９３）（Ｇａｉｄａｎｏら、１９９２）（Ｈａｕｐｔｓｃｈｅｉｎら、１９９８）と一致して、我々は、染色体６ｑ１１−２７に影響を与える欠失は、ＦＬの２３％で起こったことを見出した（１５／６４症例）。個々の症例は、不均一な６ｑ喪失のパターンを示した（図２）。
【００２９】
累積分析は、５キロベース（ｋｂ）（ＣＲＤ１１）から２７メガベース（Ｍｂ）（ＣＲＤ４）までの範囲に及んでいて、そして１から７８の間の遺伝子を含むＣＲＤを明らかにした（図１ｃおよび１ｄ）。ほとんど全ての欠失がヘミ接合性であり、そしてＣＲＤ４およびＣＲＤ１１における明らかなホモ接合性欠失の小さい領域は、いかなる遺伝子にも影響を与えなかった。６例のＨＩＶ関連バーキットリンパ腫（ＢＬ）の解析は、２つの症例において部分的に重なる６ｑの欠失を明らかにした（図１ｄ、図３）。従って、ＦＬにおけるヘミ接合性６ｑ欠失のサイズおよび複雑なパターンは、この領域における複数の腫瘍抑制因子遺伝子の存在を示唆するが、ゲノムデータ単独は、直接に特定の腫瘍抑制因子遺伝子の位置を正確に示さない。
【００３０】
不偏性のＲＮＡｉスクリーニングは、６ｑ１１−２７における腫瘍抑制因子遺伝子としてＥＰＨＡ７を同定する。
ＦＬにおける６ｑ欠失の複雑性を考慮して、我々は、不偏性の欠失特異的機能喪失スクリーニングが、潜在的な腫瘍抑制因子遺伝子の位置を示し得るかどうか考えた。我々は、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に基づく、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクターにおいて、８４個の遺伝子を標的とする、２６０個の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のライブラリーを構築した（遺伝子あたり１〜７個のｓｈＲＮＡ）。我々は、代理のインビトロシステムとして、増大したレベルのＢｃｌ２を発現するように操作した非形質転換マウスプロＢリンパ球（ＦＬ５−１２細胞）を使用し、そしてサイトカイン（インターロイキン−３；ＩＬ−３）欠乏から細胞を保護するｓｈＲＮＡに関してスクリーニングした（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）（図４ａ）。簡単には、我々は、Ｂｃｌ２を過剰発現するＦＬ５−１２細胞を、プールした６ｑ欠失ライブラリーまたは空のベクターで部分的に形質導入し、そしてＩＬ−３欠乏後にＧＦＰ（およびｓｈＲＮＡ）を発現する細胞の濃縮をモニターした（図４ｂ）。配列決定は、濃縮集団に存在するｓｈＲＮＡを同定し（図４ｃ）、そして個々の再テストは、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３；Ａ２０）およびＥＰＨＡ７遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡの保護効果を確認した（図４ｄ、図５および６）。従って、我々のＲＮＡｉスクリーニングは、公知の腫瘍抑制因子（ＴＮＦＡＩＰ３）（Ｃｏｍｐａｇｎｏら、２００９）を同定し、そして新規の候補腫瘍抑制因子遺伝子としてＥＰＨＡ７を示す。
【００３１】
ＥＰＨＡ７のインビボノックダウンは、ＦＬのマウスモデルにおいてリンパ腫の発達を促進する
次に、我々は、ＦＬのマウスモデルにおけるＥＰＨＡ７の影響を試験した。簡単には、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２モデルは、ヒトＦＬの遺伝的性質および形態を再現する（Ｅｇｌｅら、２００４）。我々は、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２トランスジェニック造血前駆細胞（ＨＰＣ）を、レトロウイルスｓｈＲＮＡ構築物で形質導入し、そしてこれらの遺伝子操作した細胞を、照射したレシピエントに移植した（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）（図４ｅ）。コントロール動物の９０パーセントが、１００日よりも長い期間にわたって腫瘍無しのままであった（ベクター；ｎ＝１１）。ｃ−ＭＹＣおよびｐ５３は、ＦＬの形質転換において確立された役割を有し（Ｎａｎｊａｎｇｕｄら、２００７）、そしてｃ−ＭＹＣ発現の強化（ｐ＜０．０１；ｎ＝７）およびｐ５３のノックダウン（生存期間中央値６０日、ｐ＜０．０１；ｎ＝９）は、どちらもインビボでリンパ腫形成を促進した。ＥＰＨＡ７のノックダウンは、腫瘍潜伏期間に対して、ｐ５３ノックダウンと同様の影響を有していた（ｐ＜０．０１；ｎ＝１８）（図４ｆ）。ＴＮＦＡＩＰ３のノックダウンは、単独で、またはＥＰＨＡ７のノックダウンと組み合わせて、ｖａｖＰ−ＢＣＬ２モデルにおいて、リンパ腫潜伏期間に対して中程度の影響を示した［ｐ（ＴＮＦＡＩＰ３対ベクター）＝０．２８；ｎ＝３およびｐ（ＴＮＦＡＩＰ３＋ＥＰＨＡ７対ＥＰＨＡ７）＝０．９３；ｎ＝５］］（図７）。ｖａｖＰ−ＢＣＬ２マウスにおいて誘発された腫瘍の分析は、ＦＬの特徴を明らかにした。これらは、胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞表現型と一致して、濾胞性構造およびピーナツ凝集素（ＰＮＡ）陽性を含んでいた。そのリンパ腫は、全体的に低い、しかし不均一なＫｉ６７を有していたが、アポトーシスは存在しなかった。ｖａｖＰ−ＢＣＬ２／ｃ−ＭＹＣ腫瘍のみがびまん性のパターンで増殖し、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）と似ていた（図４ｇ、図８）。全ての腫瘍はＢ細胞マーカーを発現し（Ｂ２２０、ＣＤ１９）、そして様々な程度のＴ細胞の浸潤を示した（Ｅｇｌｅら、２００４）。免疫グロブリンＪＨ４イントロンの配列決定は、体細胞超変異を確認した（Ｍａｎｄｅｌｂａｕｍら、２０１０）（Ｅｇｌｅら、２００４）（ＭｃＢｒｉｄｅら、２００８）。腫瘍における免疫グロブリン重鎖遺伝子座のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析は、そのクローン性の起源を確認した（図９）（Ｅｇｌｅら、２００４）。イムノブロットは、マウス脾細胞およびＨＰＣにおけるＥｐｈＡ７の発現ならびにリンパ腫における部分的ノックダウンを明らかにした（図９ｄおよび９ｅ、図１０）。従って、ＥＰＨＡ７は、ＦＬの遺伝的特徴および病理の多くの局面を再現するマウスモデルにおいて、腫瘍抑制因子遺伝子としてふるまう。
【００３２】
我々は、プレＢ細胞リンパ腫のＥμ−ＭＹＣモデルにおいて、ＥｐｈＡ７に関して同様の観察を行った（Ａｄａｍｓら、１９８５）。ＥＰＨＡ７のノックダウン（ｎ＝１１）は、ベクター（ｐ＜０．００１；ｎ＝６０）と比較して、腫瘍の発達を促進した（図１０）。
【００３３】
ＥＰＨＡ７は、リンパ腫において欠失および／またはプロモーターのメチル化によって不活性化される
ＥＰＨＡ７は、ＦＬのうちの１２％においてヘミ接合性欠失によって影響を受ける。そして我々は、ＥＰＨＡ７もまた後成的なサイレンシングまたは変異的不活性化を受ける対象であるかどうかを考えた。我々は、ＧＣ  Ｂ細胞と比較して、リンパ腫細胞におけるＥＰＨＡ７発現レベルの識別的減少を認めた（図１１ａおよび１１ｂ）。我々は、ＦＬにおいてＥＰＨＡ７の変異を検出しなかった。しかし、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、精製したリンパ腫細胞におけるＥＰＨＡ７  ｍＲＮＡレベルの低下を明らかにした。具体的には、５０例のＦＬのうち４１例（８２％）および６例のＢＬのうち４例（６７％）が、ＧＣまたは扁桃腺由来のＢ細胞と比較して、ＥＰＨＡ７  ｍＲＮＡレベルの減少を示した（ｐ（リンパ腫対Ｂ細胞）＜０．０２）（図３ａ）。同様に、ＥｐｈＡ７タンパク質は、免疫組織化学によって正常扁桃腺において容易に検出されたが、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）において、３３２例のＦＬサンプルのうち２３１例（７２％）において完全に欠如していた（図１１ｂおよび１１ｃおよび図１２）。
【００３４】
３２例の原発性ＦＬおよび１６例のリンパ腫細胞系統におけるＥＰＨＡ７プロモーターの質量分析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ）は、後成的な遺伝子サイレンシングと一致して、広範囲のＣｐＧアイランドのメチル化を明らかにした（図１１ｄおよび１１ｅ）。メチル化の検出のためのライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小断片濃縮（ＨＥＬＰ）アッセイを用いた２番目のパネルの細胞の分析は、リンパ腫細胞（９例のＦＬ、１５５例のＤＬＢＣＬ、および２４例のリンパ腫細胞系統）において、試験したリンパ腫の正常な対応物であるＧＣＢ細胞（ｎ＝９）と比較して、ＥＰＨＡ７プロモーターの識別的なメチル化を確認した（図１３）。一致して、５−アザ−２’−デオキシシチジンによるヒトリンパ腫細胞のインビトロ処置は、ＥＰＨＡ７の再発現を引き起こした（図１１ｆ、図１４）。その効果は、ＥＰＨＡ７遺伝子のコピーを１つしか有さないＲａｊｉ細胞においては、それほど明白ではなかった（図１５）。従って、リンパ腫におけるＥＰＨＡ７発現の喪失は、ＥＰＨＡ７プロモーターの識別的メチル化による。我々の観察と一致して、ＥＰＨＡ７の識別的なサイレンシングが、マウスリンパ腫およびヒトＢリンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）において報告された（Ｄａｗｓｏｎら、２００７）（Ｋｕａｎｇら、２０１０）。従って、識別的な後成的サイレンシングの証拠が、Ｂ細胞悪性疾患における腫瘍抑制因子遺伝子としてのＥＰＨＡ７の役割を支持する。
【００３５】
Ｂ細胞は、ＥｐｈＡ７の細胞外ドメインを含む、分泌型短縮アイソフォームのみを発現する
エフリン受容体は、ダイマーを形成するチロシンキナーゼであり、そしてエフリン発現細胞との接触時に活性化される（Ｓｅｉｒａｄａｋｅら、２０１０）（Ｈｉｍａｎｅｎら、２０１０）。がんにおけるエフリンシグナル伝達の役割は不明である；発がん機能および腫瘍抑制機能の両方が提案されている（Ｎｏｒｅｎら、２００６）（Ｐａｓｑｕａｌｅ、２０１０）。ＥＰＨＡ７の選択的スプライシングが、短縮タンパク質（ＥｐｈＡ７ＥＣＤまたはＥｐｈＡ７ＴＲと呼ばれる）を産生し、それは細胞内ドメインおよび全長タンパク質のキナーゼ活性を欠く（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ、ＣｌａｒｋｅおよびＦｒｉｓｅ’ｎ、２０００）（Ｄａｗｓｏｎら、２００７）（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９５）。マウスＢリンパ球および５−アザ−２’−デオキシシチジンで処置したＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤのみを発現し（図１６ａ、図１４）、それは培地中に放出される（図１６ａ）。
【００３６】
ＥｐｈＡ７ＥＣＤはＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２およびＳｒｃキナーゼの活性化を阻害する
免疫グロブリンＦｃ断片タグ化ＥｐｈＡ７ＥＣＤ（ＥｐｈＡ７Ｆｃ）の免疫沈降は、Ｒａｊｉ（図１６ｂ）およびＦＬ由来ＤｏＨＨ２細胞（図１７ａ）において、ＥｐｈＡ７のＥｐｈＡ２受容体への結合を実証する。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＥｐｈＡ７ＦｃによるＥｐｈＡ２リン酸化の阻害を明らかにする（図１６ｃ）。ＥｐｈＡ２のノックダウンおよびＥｐｈＡ７Ｆｃタンパク質の投与はどちらも、Ｒａｊｉ細胞（図１６ｄおよび１６ｅ）ならびにＳＵ−ＤＨＬ−６細胞、ＤｏＨＨ２細胞およびＫａｒｐａｓ  ４２２細胞（図１７ｃおよび１７ｄ）において、Ｅｒｋの活性化を阻害する。腫瘍細胞と異なり、非形質転換ＦＬ５−１２リンパ球は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤを発現する。ＦＬ５−１２細胞におけるＥＰＨＡ７のノックダウンは、Ｅｒｋを活性化し、そしてこの活性化は、ＥｐｈＡ７Ｆｃによる細胞の処置により逆転する（図１８）。リンタンパク質アレイは、Ｒａｊｉ細胞においてＥｐｈＡ７Ｆｃのさらなるシグナル伝達の影響を同定する（図１９ａおよび１９ｂ）。我々は、イムノブロットによってＥｒｋ、ＳＴＡＴ３およびＳｒｃリン酸化に対する影響を確認し、そして異なるリンパ腫系統の間にいくらかの差異を認めた（図１６ｅ、図１９ｄおよび１９ｅ）。
【００３７】
我々は、ＥｐｈＡ２の公知の構造（Ｓｅｉｒａｄａｋｅら、２０１０）（Ｈｉｍａｎｅｎら、２０１０）およびＥｐｈＡ７配列とのその相同性（５１％）およびドメイン構造に基づいて、ＥｐｈＡ７とＥｐｈＡ２との間の相互作用のモデルを作った。我々のモデルは、受容体のＳｕｓｈｉおよびリガンド結合ドメインによる相互作用を示唆し（図１６ｆ）、ＥｐｈＡ７ＥＣＤおよびＥｐｈＡ７Ｆｃがデコイ受容体として機能し、細胞表面のＥｐｈＡ２とダイマー化し、そしてＥｐｈＡ２の活性化およびシグナル伝達を阻害することを示唆する。より一般的には、我々のモデルは、ＥｐｈＡ７ＥＣＤおよびＥｐｈＡ７Ｆｃは、細胞表面の他のＥｐｈＡ受容体とダイマー化することができ、そしてそれらの活性およびシグナル伝達も阻害し得ることを示唆する。
【００３８】
ＥｐｈＡ７Ｆｃは、インビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を示す
レトロウイルス形質導入、またはＥｐｈＡ７Ｆｃの適用によるＥＰＨＡ７活性の回復は、インビトロで、Ｒａｊｉ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞、ＤｏＨＨ２細胞およびＫａｒｐａｓ  ４２２細胞に対して抗増殖効果を有する（図２０および２１）。精製したＥｐｈＡ７Ｆｃの静脈内投与（２０μｇ／日を３日間）は、異種移植したＲａｊｉ腫瘍およびＳＵ−ＤＨＬ−１０腫瘍の劇的な退縮を引き起こし、一方、ビヒクル（すなわちＦｃ）で処置した腫瘍は、増殖し続けた（ｎ＝１２；ｐ（ＥｐｈＡ７Ｆｃ対Ｆｃ）＜０．０４）（図１６ｇ、図２２）。残りのＥｐｈ７Ｆｃで処置したＲａｊｉ腫瘍は、広範囲のアポトーシス、破壊された構造、およびＥｒｋリン酸化の減少を示した（図１６ｈ〜ｊ）。予防研究におけるＥｐｈＡ７Ｆｃの全身性投与（静脈内に２０μｇ／日を３日間）は、よく許容され、そしてＲａｊｉリンパ腫の発達を有意に遅らせた（ＥｐｈＡ７Ｆｃ、ｎ＝５；Ｆｃ、ｎ＝５；ｐ＜０．０５）（図１６ｋ）。いくつかの乳がん細胞系統を含む、高レベルの細胞表面ＥｐｈＡ２を発現する他の腫瘍細胞系統のＥｐｈＡ７Ｆｃ処置は、Ｅｒｋリン酸化によって評価したところ、ＥｐｈＡ２シグナル伝達の有意な阻害を引き起こした。
【００３９】
抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７ＥＣＤ融合抗体の抗リンパ腫活性は、抗ＣＤ２０抗体またはＥｐｈＡ７ＥＣＤのものを上回る
次に、我々は、ＥｐｈＡ７ＥＣＤを抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）に融合することが、ＥｐｈＡ７ＥＣＤの治療可能性をさらに増強し得るかどうかを試験した（図１６ｌ、図２３ａ）。その融合抗体（抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７）は、両方のタンパク質の性質を保持している。それはＣＤ２０＋リンパ腫細胞を認識し、そしてＥｐｈＡ２およびＥｒｋリン酸化を阻害する（図１６ｍ、図２３ｂおよび２３ｃ）。その融合抗体はまた、インビトロで、Ｒａｊｉ細胞またはＤｏＨＨ２細胞の増殖の緩徐化、および破壊において、抗ＣＤ２０単独よりも有効であった（図１６ｎおよび１６ｏ、図２４）。抗ＣＤ２０または抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７のいずれかによるインビボ処置（静脈内に１μｇ／日を５日間）は、よく許容された。Ｒａｊｉ異種移植片において（処置時に＞１ｃｍ３）、低用量の抗ＣＤ２０抗体の投与は、部分的な応答を引き起こしたか、またはビヒクル（Ｆｃ）と比較して進行を遅くした。融合抗体のみが、７匹の動物のうち３匹において、完全な応答を引き起こした（エキソビボの腫瘍重量０〜３０ｍｇ）（ｐ＝０．０３９、３つのグループ全てに関するフィッシャーの正確確率検定）（図１６ｐ、図２５）。従って、抗腫瘍抗体を使用して、腫瘍抑制因子機能が失われたがん細胞に、そのような機能を選択的に回復させ得る。
【００４０】
材料および方法
アレイ−比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａ−ＣＧＨ）
新鮮な凍結した、または最適な切断温度の化合物包埋組織由来のＤＮＡを、標準的なフェノール−クロロホルム抽出法によって単離した。ＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｎａｎｏｄｒｏｐ．ｃｏｍ）を用いて定量し、その純度を、２６０ｎｍ対２８０ｎｍにおける吸光度の比によって評価し、そしてその完全性を１％アガロースゲル上でエチジウムブロミドを用いて可視化した。各ＤＮＡサンプルの標識の前、およびそれをＡｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）２４４Ｋオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズする前に、１μｇのＤＮＡを１μｌのＨａｅＩＩＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）と、３７℃で２時間インキュベートし、そして未消化および消化ＤＮＡ（それぞれ１００ｎｇ）を、１ｋｂのＤＮＡラダーと並行して、１％アガロースゲルに流すことによって、消化効率をチェックした。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得たヒト男性ＤＮＡ（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ；カタログ＃Ｇ１４７Ａ）を、参照ＤＮＡとした。標識およびハイブリダイゼーションを、Ａｇｉｌｅｎｔによって提供されたプロトコールによって行った。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ＳｙｓｔｅｍおよびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（ｖ９．１）を用いて、５μｍの解像度でスライドを分析した。
【００４１】
ＤＮＡコピー数の分析
ＵＣＳＣ  Ｍａｒｃｈ  ２００６ヒト参照配列（ｈｇ１８／ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３６）を用いる図１６を除いて、この研究において記載される全てのゲノム位置は、ＵＣＳＣ  Ｍａｙ  ２００４ヒト参照配列（ｈｇ１７／ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３５）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）を指す。修飾Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＢＳ）アルゴリズムを使用して、常染色体に沿って分節型の増加および減少を同定した。変化点はセグメントとして規定され、０．０５未満のｐ値に対応した。ＣＲＤは症例のうちの１０％より多くの例で観察される、２つの近接するプローブの増加および／または減少として定義された。全部で９２のＣＲＤが同定された。これらのうち、４個は生理学的変化であり（Ｂ細胞受容体およびＴ細胞受容体）、５０個はＣＮＶであり、そして残りの３８個が腫瘍特異的であった。Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＴＣＡＧ）によって収集された構造的バリエーションのカタログであるＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ（ＤＧＶ）（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｔｃａｇ．ｃａ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ／）を使用して、ＣＮＶを同定し、除外した。データ分析の時点で、ＤＧＶは３，９３３ヶ所のゲノム遺伝子座にマッピングされた８，０８３のエントリーを含んでいた［ｖａｒｉａｔｉｏｎ．ｈｇ１７．ｖ２．ｔｘｔ；２００７年９月５日（Ｂｕｉｌｄ  ３５／ｈｇ１７）］。ＣＧＨデータをさらに、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて処理して、画像を定量した。標準化のために、我々は、プローブの全強度およびそのプローブの周囲のゲノム領域の局所ＧＣ含有量の両方に「ｌｏｅｓｓ  ｎｏｒｍ」を行う、カスタムＧＣ−標準化アルゴリズムを用いた。標準化したデータを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒから入手可能な、標準的なＣＢＳアルゴリズムである、ＤＮＡｃｏｐｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｈｅｌｐ／ｂｉｏｃ−ｖｉｅｗｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ＤＮＡｃｏｐｙ．ｈｔｍｌ）を用いてセグメント化した。次いで各サンプルを、セグメント平均値を派生ノイズ（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｎｏｉｓｅ）（アレイ上の隣接するプローブの間の差の平均絶対値）で割ることによって、それ自体のサンプルあたりのノイズに対して標準化した。次の工程は、コホート全体のマルチサンプル分析を行うために、ＲＡＥアルゴリズム（Ｔａｙｌｏｒら、２００８）を用いた。ＲＡＥアルゴリズムは、サンプルあたりの較正した閾値を計算し、それを使用してサンプル間のシグナルレベルを比較し得る。閾値関数は、２つのロジスティック関数によるＣＢＳ出力からのｌｏｇ２比シグナルを、減少［−１、０］および増加［０−１］インジケーター出力に変換し、それを次いで平均してゲノム全体の増加／減少再現頻度を得る（図１でプロットする）。染色体６ｑの減少分析に関して、我々は、減少に関して−０．５、およびホモ接合性の欠失に関して４．５のグローバル閾値を用いた。図３は、ＣＢＳによって計算したセグメント境界を示し、横軸��セグメント平均値の大きさを示す。さらなる詳細に関してはＴａｙｌｏｒら（２００８）を参照のこと。
【００４２】
マウス腫瘍の分子解析
ゲノムＤＮＡを、トランスジェニックｖａｖＰ−ＢＣＬ２マウスに生じたリンパ腫から、および移植したｖａｖＰ−ＢＣＬ２  ＨＳＣ由来のリンパ腫から抽出した。ＤＮＡ抽出に関して、凍結した組織を、液体窒素に浸し、次いで粉砕した。できた粉末を回収し、そして氷上の微量遠心管に移した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）を用いてＤＮＡを精製し、そして水で希釈し、そして１％のアガロースゲルにおける電気泳動後、視覚化によってＤＮＡの質を評価した。マウス腫瘍におけるＤＪ組換えを、記載された（ＹｕおよびＴｈｏｍａｓ−Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ、２００２）ようにネステッドＰＣＲによって分析し、そしてサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＤＮＡ１０００Ｋｉｔを用いて分析した。体細胞超変異分析に関して、ＤＮＡサンプルを記載された（ＭｃＢｒｉｄｅら、２００８）ように増幅し、そして報告された（Ｍａｎｄｅｌｂａｕｍら、２０１０）ように正確にＰＣＲ産物を直接配列決定した。
【００４３】
定量的ＤＮＡメチル化分析
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｓｅｑｕｅｎｏｍ．ｃｏｍ）のＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ＥｐｉＴＹＰＥＲを用いて、定量的ＤＮＡメチル化分析を行った。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ＥｐｉＴＹＰＥＲは、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡの塩基特異的切断およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いた、ＤＮＡメチル化の検出および定量分析のためのツールである。亜硫酸水素塩変換ＤＮＡの特異的ＰＣＲプライマーを、ＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒプログラム（ｗｗｗ．ｅｐｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｃｏｍ）を用いてデザインした。Ｔ７プロモータータグを逆向きプライマーに加えて、インビトロで転写され得る産物を得て、そして１０マーのタグを前向きプライマーに加えて、ＰＣＲ条件を釣り合わせた。１μｇの腫瘍ＤＮＡ中の非メチル化シトシンを、製造会社の指示に従って、ＥＺ−９６  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ｗｗｗ．ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）による亜硫酸水素塩処理によってウラシルに変換した。ＰＣＲ反応を、２つの選択したプライマーペアのそれぞれで２組、サンプルあたり全部で４つの複製物について行った。各複製物に関して、０．２ユニットのＫＡＰＡ２Ｇ  Ｆａｓｔ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｗｗｗ．ｋａｐａｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ)、２００ｍＭのｄＮＴＰ、および４００ｎＭの各プライマーを用いて、３８４穴マイクロタイタープレートにおいて、５ｍｌのＰＣＲ反応のために、１ｍｌの亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを、鋳型として使用した。サイクリング条件は、９４℃で１５分間；９４℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を４５サイクル；および７２℃で３分間の最終サイクルを１回であった。組み込まれなかったｄＮＴＰを、２ｍｌ中０．３Ｕのエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いて、３７℃で２０分間不活性化し、続いて８５℃で５分間熱不活性化した。２ｍｌのＳＡＰ処理した反応物を、新しい３８４穴マイクロタイタープレートに移し、そして１×Ｔ７ポリメラーゼ緩衝液、３ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２４ｍｌのＴ  Ｃｌｅａｖａｇｅミックス、２２ＵのＴ７  ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼ、および０．０９ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡを含む、ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥキット（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を用いて、単一の５ｍｌの反応混合物中でインビトロ転写およびＴ切断を行った。その反応物を、３７℃で３時間インキュベートした。残った塩を反応物から除去するために陽イオン交換樹脂を加えた後、１０ｎｌのＥｐｉＴＹＰＥＲ反応産物を、３８４−エレメントＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ  ＩＩアレイ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）に添加した。ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ＳｐｅｃｔｒｏＲＥＡＤＥＲ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を用いて分析した。結果を、ＥｐｉＴＹＰＥＲ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを用いて分析し、そしてスペクトルの質およびピークの定量に関しては手作業で調査した。５−アザ−２’−デオキシシチジンによるインビトロ処理は、��載された（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）通りであった。
【００４４】
ＤＮＡメチル化に関するＨＥＬＰ（ライゲーション介在性ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小型断片濃縮）アッセイ
ＤＬＢＣＬ標本を、ＶａｎｃｏｕｖｅｒのＢＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ＡｇｅｎｃｙまたはＷｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、患者から得た。ヒト組織の使用は、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＣｏｌｕｍｂｉａおよびＷｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの研究倫理審議会が同意した。ＨＥＬＰアッセイを、ＥＰＨＡ７遺伝子の転写開始部位の上流に位置し、かつその転写開始部位と重なる２つのプローブを用いて、以前に公開された（Ｓｈａｋｎｏｖｉｃｈ、ＦｉｇｕｅｒｏａおよびＭｅｌｎｉｃｋ、２０１０）ように行った。ＨＥＬＰの産物を、２５，６２６のＨｐａＩＩ増幅可能断片をカバーする、ヒトＨＧ１７カスタムプロモーターアレイ（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ，Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ．ｃｏｍ）にハイブリダイズした。データの品質管理および分析を、記載された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００８）ように行った。品質管理処理の後、各アレイに対して五分位正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った。ＨＥＬＰによってプロファイルされたＤＮＡサンプルをまた、前に記載されたように、亜硫酸水素塩処理およびＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ＥｐｉＴＹＰＥＲ分析にかけた。全ての可能性のある消化部位をカバーするために、プライマーを、選択されたＨｐａＩＩ増幅可能断片（ＨＡＦ）の最も外側のＨｐａＩＩ部位およびＨＡＦの上流または下流２０００塩基対までのあらゆる他のＨｐａＩＩ部位をカバーするようにデザインした。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ結果とＨＥＬＰアッセイからの正規化データとの相関は、Ｒ＝０．８８のスピアマンの順位相関を明らかにした。変換式を得るために、調整した線形回帰モデルを使用した。
【００４５】
免疫組織化学および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）法
ＥｐｈＡ７発現の分析のための研究コホートは、１９８５年から２０００年の間に、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）で継続的に確認されたＦＬを含んでいた。全てのがんの生検をＭＳＫＣＣで評価し、そして組織学的診断は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に基づいていた。組織サンプルの使用は、ＭＳＫＣＣのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄおよびＨｕｍａｎ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。ＴＭＡを、完全に自動化されたアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＴＡ−２７）を使用したこと以外は、以前に記載された（Ｓｃｏｔｔら、２００７）とおりに構築した。ＴＭＡを、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｖｅｎｔａｎａｍｅｄ．ｃｏｍ）で前処理し、Ａｂｇｅｎｔ（ｗｗｗ．ａｂｇｅｎｔ．ｃｏｍ）のＥｐｈＡ７ウサギポリクローナル抗体とともに１：５０希釈で６０分間インキュベートし、そして次いでＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ）の２次抗ウサギ抗体で、１：２００希釈で６０分間染色した。コア（Ｃｏｒｅｓ）を０、１または２で得点をつけた。ここで０＝染色無し；１＝限局性の弱い染色；および２＝腫瘍細胞のうちの５０％よりも多くにおける中程度から強度の染色。
【００４６】
抗体産生および精製
抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７抗体を構築するために、我々はヒトゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによってＥｐｈＡ７ＥＣＤコード配列を増幅した。そのＰＣＲ産物を、抗ＣＤ２０重鎖可変領域を有するＩｇＧ１定常領域を含むｐＡＨ６７４７にクローニングした（Ｓｈｅｒｉｅ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士、ＵＣＬＡ）。抗体産生のために、ｐＡＨ６７４７由来の抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７重鎖構築物および抗ＣＤ２０軽鎖（ｐＡＧ１０８１８）構築物（Ｓｈｅｒｉｅ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士、ＵＣＬＡ）を、２９３Ｔ細胞へ同時にトランスフェクトし、そして細胞が増殖する培地を１日おきに交換した。抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７を、組換えプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、この馴化培地から精製した。簡単には、抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７を含む回収した培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中で透析し、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）を通し、そして１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液をガラスのフラクションチューブに回収し、そしてすぐに溶出液１ｍｌあたり７５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。抗体を含むピークフラクションをプールし、リン酸緩衝化食塩水中で透析し、そしてろ過滅菌した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって純度を決定し、そして抗体融合物産物の濃度を、１．４３の吸光係数を用いて、分光光度計（２８０ｎｍ）で決定した。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ．ｃｏｍ；＃７０９−００５−１４９）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；＃７０９−０３５−０９８）抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用して、タンパク質の純度および完全性を確認した。
【００４７】
細胞培養、細胞生存率および増殖アッセイ、ベクターおよびプールしたｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング
ＦＬ５−１２マウスリンパ球を、ＢＣＬ２で安定に形質導入した（ＦＬ５−１２／ＢＣＬ２）；ＩＬ−３欠乏研究およびウイルス形質導入は、記載された（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）通りであった。細胞生存率を、Ｇｕａｖａ  Ｖｉａｃｏｕｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）およびＬＤＳ７５１細胞−浸透性核酸染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を用いて、以前に記載された（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）ように評価した。利用するレトロウイルス構築物は、ＭＳＣＶに基づき、そしてＢＣＬ２（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）、および個々のまたはプールしたｓｈＲＮＡ構築物（Ｄｉｃｋｉｎｓら、２００５）を含む。プールしたｓｈＲＮＡのスクリーニング技術が記載された（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）。簡単には、個々にクローニングしたｓｈＲＮＡをプールすることによって、ｓｈＲＮＡライブラリーを構築した。スクリーニングのデザインを、図４ａに示す。ＦＬ５−１２／ＢＣＬ２細胞を、２６２のｓｈＲＮＡを含むライブラリープールで、低い感染多重度で形質導入し、そして７日間のＩＬ−３欠乏を行った。生存率の回復後、ＤＮＡ単離のためにサンプルを回収した。組み込まれたｓｈＲＮＡをＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、そしてｓｈＲＮＡ配列決定によって同定した。スクリーニングからの個々の「ヒット」を、同じインビトロアッセイで再テストし、そして同じ遺伝子に対して複数のｓｈＲＮＡを用いて確認した。ＰＴＥＮおよびｐ５３に対するｓｈＲＮＡが以前に報告された（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２０１０）（Ｗｅｎｄｅｌら、２００６）。
【００４８】
マウスにおける腫瘍の産生、処置、および分析
ＦＬのｖａｖＰ−ＢＣＬ２モデル（Ｅｇｌｅら、２００４）およびレトロウイルスで形質導入したＨＰＣの養子移植（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）が記載された。統計学的有意性について、データを、対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いて、カプラン−マイヤー形式で分析した。Ｈ＆Ｅ染色、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）およびＫｉ６７、切断されたカスパーゼ、Ｂ２２０および他の表面マーカーについての分析は、Ｍａｖｒａｋｉｓら（２００８）によって記載された通りであった。腫瘍異種移植片は、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）と混合した、１×１０６のＲａｊｉヒトリンパ腫細胞またはＳＵ−ＤＨＬ−１０ヒトリンパ腫細胞の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ（ｓｃｉｄ）／Ｊ）マウスの側腹への皮下注射によって確立された。腫瘍が１ｃｍ３のサイズを超えたら、マウスをビヒクルまたは２０μｇのＥｐｈＡ７Ｆｃ（組換えマウスＥｐｈＡ７  Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）の３回の腫瘍内注射によって処置した。記載された（Ｂｅｒｇｅｒｓら、１９９９）とおりに、腫瘍の重量を測定し、そして体積を測定した。ＥｐｈＡ７ＦＣおよび抗ＣＤ２０−ＥｐｈＡ７の全身性投与は、尾静脈注射によった。
【００４９】
ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、およびタンパク質アレイ
イムノブロットを、記載された（Ｗｅｎｄｅｌら、２００４）ように、細胞全体のライセートまたは上清から行った。簡単には、サンプルあたり５０μｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、そしてＥｐｈＡ７に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ；＃ｓｃ−９１７、１：２００希釈）、ＥｐｈＡ２に対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．＃０５−４８０、１：１０００希釈）、Ｂｃｌ２に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃ｓｃ−５０９、１：５００希釈）、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃ｓｃ−４０、１：２００希釈）、リン酸化ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ１に対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ；＃９４５１、１：１０００希釈）、リン酸化Ｅｒｋ１／２に対する抗体（Ｃｅｌl  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃９１０１、１：８００希釈）、Ｅｒｋ１／２に対する抗体（Ｃｅｌl  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃９１０２、１：１０００希釈）、リン酸化Ｓｒｃに対する抗体（Ｃｅｌl  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃２１０１、１：１０００希釈）、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質に対する抗体（Ｃｅｌl  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃２２１５、１：１０００希釈）、リン酸化Ａｋｔに対する抗体（Ｃｅｌl  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．＃４０５８、１：１０００希釈）、およびチューブリンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．；ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ；＃Ｔ５１６８、１：５０００希釈）でプローブした。ブロットを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、化学発光により発色させた。Ｒａｊｉ細胞ライセートにおけるリン酸化ＥｐｈＡ２に関するＥＬＩＳＡを、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥｐｈＡ２  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＤＹＣ４０５６−２）を使用して、製造会社の指示に従って行った。ヒトリンタンパク質検出アレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＲＹ００３）を、製造会社の指示に従って、細胞ライセートでプローブした。
【００５０】
ＥｐｈＡ７Ｆｃタンパク質の産生
市販の供給源（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；上記を参照のこと）から得たＥｐｈＡ７Ｆｃタンパク質に加えて、我々は、バキュロウイルス発現システムを用いて、同じタンパク質を産生した。ＥｐｈＡ７アミノ酸Ｌｙｓ３１からＡｓｎ５２５に対応するＤＮＡ断片を、そのタンパク質コード領域（Ａｎｔｉｐｅｎｋｏら、２００３）（Ｘｕら、２００８）のＣ末端にＩｇＧ  Ｆｃタグを有するバキュロウイルスベクターである、ｐＡｃＧＰ６７Ｂに基づく（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ｐＭＡ１５２のＢａｍＨ１／Ｎｏｔ１部位にクローニングした。組換えバキュロウイルス構築物を、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ線状化バキュロウイルスＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、Ｓｆ９昆虫細胞へ同時にトランスフェクトした。第４継代組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭタンパク質フリーの昆虫細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１．８×１０６細胞／ｍｌの濃度の懸濁液において、Ｈｉ−５細胞を感染させるために使用した。感染した細胞を、２７℃および１００ｒｐｍで増殖させ、そして６４時間後に回収した。分泌されたＥｐｈＡ７Ｆｃを含むＨｉ−５細胞上清を、プロテインＡセファロースカラムにローディングし、そして１００ｍＭのグリシン中、段階的なｐＨ勾配分画によって溶出した。収率は、Ｈｉ−５細胞懸濁液１リットルあたり、１〜２ｍｇのタンパク質であった（Ａｎｔｉｐｅｎｋｏら、２００３）（Ｘｕら、２００８）。
【００５１】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、腫瘍サンプルおよび細胞系統から抽出した。ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲ、およびΔΔＣｔ法による分析を、記載された（Ｍａｖｒａｋｉｓら、２００８）ように行った。ＥｐｈＡ７  ＰＣＲは、前向きプライマーとしてＴＴＴＣＡＡＡＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡ、および逆向きプライマーとしてＣＡＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＣ、およびＳＹＢＲグリーン検出を使用した；標準としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐｄｈ）を使用した（ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ前向きプライマー、ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧ逆向きプライマー、およびＳＹＢＲグリーン検出）；そして内因性コントロールとして、ヒトβグルクロニダーゼ（ｇｕｓｂ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ；＃４３３３７６７Ｆ）を使用した。
【００５２】
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定
ゲノムＤＮＡの配列決定を、記載された（Ｖｅｅｒｉａｈら、２０１０）ように行った。ゲノムＤＮＡを、ＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅した。目的のエキソン領域（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３６．１）を５００ｂｐまたはそれより小さいアンプリコンに分割し、そしてＰｒｉｍｅｒ３プログラムを用いて、エキソン領域プラス隣接するイントロン配列の少なくとも５０塩基対をカバーする、特異的プライマーをデザインした。Ｍ１３尾部を加えてサンガー配列決定を促進した。ＰＣＲ反応を、１０ｎｇの増幅ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるタッチダウンＰＣＲプロトコールを用いて、Ｄｕｎｃａｎ  ＤＴ−２４（ＫＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；ｗｗｗ．ｋｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）水浴サーマルサイクラー中、３８４穴プレートで行った。タッチダウンサイクリング条件は、９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の３サイクル；９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の３サイクル；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の３サイクル；９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の３７サイクル；および７０℃で５分間の最終サイクルを１回であった。できたＤＮＡ配列決定鋳型を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）を用いて精製した。精製したＰＣＲ反応産物を２つに分け、そしてＭ１３前向きプライマーおよびＭ１３逆向きプライマーならびにＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって双方向的に配列決定した。ダイターミネーターを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＣｌｅａｎＳＥＱキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて除去し、そして配列決定反応を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０ｘｌ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。
【００５３】
変異の検出
変異を、ＭＳＫＣＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅにおいて自動化検出パイプラインを用いて検出した。双方向的な配列決定の読み取りおよびマッピングの表（読み取り名（ｒｅａｄ  ｎａｍｅ）をサンプル識別子（ｓａｍｐｌｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）、遺伝子名、読み取りの方向、および増幅産物と結び付ける）を、塩基１００〜２００に関して１０未満の平均Ｐｈｒｅｄスコアを有する読み取りを除外するフィルターにかけた。通過した読み取りを、コマンドラインＣｏｎｓｅｄ  １６．０（Ｇｏｒｄｏｎ、ＡｂａｊｉａｎおよびＧｒｅｅｎ、１９９８）を用いて、遺伝子の５ｋｂ上流および下流を含む全てのコードエキソンおよび非翻訳エキソンを含む、各遺伝子に関して参照配列に対してアセンブルした。アセンブリーを、ＰｏｌｙＰｈｒｅｄ６．０２ｂ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、ＴｏｂｅおよびＴａｙｌｏｒ、１９９７）に伝達して推定候補変異のリストを産生し、そしてアセンブリーをＰｏｌｙＳｃａｎ３．０（Ｃｈｅｎら、２００７）に伝達して推定変異の第２のリストを産生した。それらのリストを合わせて、統合した報告とし、そして推定変異コール（ｃａｌｌ）を、「＋」ゲノム座標に標準化し、そしてＧｅｎｏｍｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いてアノテートした。得られたアノテートした推定変異のリストを、各変異コール（ｃａｌｌ）についての選択アセンブリーの詳細（アセンブリー位置、範囲、および変異コール（ｃａｌｌ）を支持する方法）と共に、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬデータベースに読み込んだ。変異検出ソフトウェアパッケージによって作成される偽陽性の数を減らすために、少なくとも１つの双方向の読み取りペアおよびＰｏｌｙＰｈｒｅｄによってコールされる（ｃａｌｌｅｄ）少なくとも１つのサンプル変異によって支持される点変異のみを考慮し、そして非同義のコーッディング効果を有するとアノテートされる、エキソン内、またはエキソン境界の１１塩基対以内で起こるか、または０．６９９よりも大きな保存スコアを有する推定変異のみを、最終的な候補リストに含めた。いかなる方法でコールされた（ｃａｌｌｅｄ）挿入欠失も、手作業で再調査し、そしてもしエキソンにヒットすることが見出されたなら候補リストに含めた。マッチした正常組織ＤＮＡの増幅および配列決定と並行して、全ての推定変異を、２回目のＰＣＲおよび配列決定反応によって確認した。変異コール（ｃａｌｌ）についての全てのトレースを、手作業で再調査した。
【００５４】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014512184.tif 000010
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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