(57)【要約】  本発明は、突然変異組織プラスミノーゲン活性化因子、及び血栓性疾患を処置するためのそれらの使用に関する。
2014527805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ｉ）配列番号２又は配列番号２５の配列を含み、好ましくは配列番号２からなるか、又は配列番号２５と配列番号２６との結合物からなるタンパク質であって、前記配列が、
配列番号２又は配列番号２５のリシン結合部位の任意のアミノ酸の、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換からなる突然変異Ａ’、又は
配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換からなる突然変異Ｂ、又は
配列番号２又は配列番号２５のリシン結合部位の任意のアミノ酸の、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質、
ｉｉ）配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質、及び
ｉｉｉ）クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２のフラグメントからなるタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質
からなる群より選択されるタンパク質。
【請求項２】
突然変異Ａ’のリシン結合部位の前記アミノ酸が、リシン結合部位の荷電アミノ酸及び疎水性アミノ酸、好ましくは配列番号２又は配列番号２５の２３６位及び２３８位のアスパラギン酸並びに２５３位のトリプトファンから選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記突然変異Ａ’が、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換からなる突然変異Ａである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記二重突然変異Ａ’及びＢが、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ及びＢである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項５】
突然変異Ａ’、又は突然変異Ａ’及びＢ、好ましくは突然変異Ａ、又は突然変異Ａ及びＢを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記突然変異Ａが、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンのアルギニンによる置換からなるか、又は前記突然変異Ａ及びＢが、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンのアルギニンによる置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
タンパク質ｉｉ）が、配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有し、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
タンパク質ｉｉ）が、以下の改変：
−  配列番号２又は配列番号２５の１２５位のプロリンのアルギニンによる置換、
−  配列番号２若しくは配列番号２５におけるＮ末端におけるフィンガードメインの欠失及び／若しくはＥＧＦ様ドメインの欠失、並びに／又は配列番号２若しくは配列番号２５の１１７位のアスパラギンのグルタミンによる置換、
−  配列番号２若しくは配列番号２５の１０３位のトレオニンのアスパラギンによる置換、及び／又は配列番号２若しくは配列番号２５の１１７位のアスパラギンのグルタミンによる置換、及び／又は配列番号２の２９６位〜２９９位のリシン−ヒスチジン−アルギニン−アルギニン（ＫＨＲＲ）のアラニン−アラニン−アラニン−アラニン（ＡＡＡＡ）による置換、
−  配列番号２又は配列番号２５の８４位のシステインのセリンによる置換、
−  配列番号２若しくは配列番号２５の２７５位のアルギニンのグルタミン酸若しくはグリシンによる置換
の少なくとも１つを含み、突然変異Ａのみ、及び／又は配列番号２若しくは配列番号２５におけるクリングル１ドメインの欠失を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
タンパク質ｉｉ）又はｉｉｉ）が、ラット、マウス、ブタ又はウシ起源であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３〜配列番号１４の配列の少なくとも１つを含むタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列番号３〜配列番号１４の配列からなる群で選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１５及び配列番号１６の配列に由来する、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクター、又は請求項１２若しくは１３に記載のポリヌクレオチドを含む、ホスト細胞。
【請求項１６】
薬品として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
血栓性疾患を処置するのに使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
虚血、動脈閉塞又は静脈閉塞、脳内出血及び眼出血、好ましくは網膜中心動脈閉塞、脳卒中、実質内出血、脳室内出血、くも膜下出血、加齢性黄斑変性症及び硝子体出血から選択される疾患を処置するのに使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
脳卒中又は網膜中心動脈閉塞を処置するのに使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、突然変異組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、並びに血栓性疾患及び出血性疾患、好ましくは脳内出血及び眼出血、より好ましくは血栓性神経障害及び網膜中心動脈閉塞、最も好ましくは脳卒中を処置するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、内皮細胞（Angles-Cano et al., 1985）、ニューロン（Pecorino et al., 1991）及びグリア細胞（(Siao and Tsirka, 2002); (Buisson et al., 1998)）によって神経血管単位（ＮＶＵ）で分泌されるセリンプロテアーゼである。その他のセリンプロテアーゼとは異なり、ｔＰＡは、通常、完全な固有活性及び低チモーゲン性を有する活性チモーゲンである（Loscalzo, 1988）。脈管構造では、ｔＰＡは、大量の不活性フィブリン結合チモーゲンであるプラスミノーゲンをプラスミンに変換することにより、フィブリン溶解を促進する。脳実質では、ｔＰＡは、特に、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）シグナル伝達のコントロールを介して重要な機能（例えば、神経細胞移動、学習及び記憶プロセスのコントロール）を示すことが報告された（(Calabresi et al., 2000); (Nicole et al., 2001); (Su et al., 2008); (Seeds et al., 1999)）。
【０００３】
Federal Food and Drug AdministrationによってｔＰＡ（臨床的にはActilyse（登録商標）又はAlteplase（登録商標）として送達される）が虚血性脳卒中の急性処置に承認された際、実験データは、ｔＰＡが、その有益な血管効果に加えて、脳実質における損傷特性（出血性トランスフォーメーション及び神経毒性を含む）を有し得るという考えを支持している（(Fugate et al., 2010); (Yepes et al., 2009)）。実際、凝固溶解を促進する能力に加えて、実験モデル及び臨床データの両方から、ｔＰＡは、成長因子であるメタロプロテイナーゼを活性化でき、好中球の活性化を媒介し、従って、出血性トランスフォーメーションを促進することが現在では十分に立証されている（(Suzuki et al., 2009); (Fredriksson et al., 2004); (Rosell et al., 2008)）。興味深いことに、静脈内ｔＰＡは、インタクトな血液脳関門及び損傷した血液脳関門の両方を通過するので（(Harada et al., 2005); (Benchenane et al., 2005); (Benchenane et al., 2005)）、神経毒性などの脳機能障害に影響を及ぼすこともできる（(Samson and Medcalf, 2006); (Benchenane et al., 2007)；総説については、(Yepes et al., 2009)）。従って、ＮＶＵでは、内因性の実質ｔＰＡとともに、血液由来ｔＰＡが、in vitro及びin vivoでいくつかの基質と相互作用する。その作用機序の中で、ニューロンにおけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）と相互作用することによって、ｔＰＡは、ＮＭＤＡＲ依存性シグナル伝達過程を活性化して、酸素及びグルコース枯渇条件における神経細胞死の悪化、興奮毒性又は虚血をもたらすことが公知である(Nicole et al., 2001)(Baron et al., 2010)。
【０００４】
従って、既存のｔＰＡの脳実質損傷特性（神経細胞死の悪化を含む）を有することなく、良好な又は改善されたフィブリン溶解活性を示し得るｔＰＡ誘導体を同定することは主な関心事である。
【０００５】
前記ｔＰＡ誘導体は、血管の有害効果が最小化されるように適度な固有活性（これは、それらのアミド分解活性によって測定され得る）を有することも主な関心事である。
【０００６】
本発明者らは、効果的な血栓溶解性を有し、適度な固有活性を有し、ＮＭＤＡＲ媒介性神経毒性を促進しない特定の突然変異ｔＰＡを同定した。
【０００７】
発明の概要
本発明は、血栓溶解活性及びフィブリン溶解活性を有し、従って血栓性神経障害及び網膜中心動脈閉塞、最も好ましくは脳卒中を処置するのに効果的であるが、神経毒性有害事象を示さない特定の突然変異ｔＰＡに関する。
【０００８】
その結果として、本発明の一目的は、以下：
ｉ）配列番号２又は配列番号２５の配列を含み、好ましくは配列番号２からなるか、又は配列番号２５と配列番号２６との結合物からなるタンパク質であって、前記配列が、
配列番号２又は配列番号２５のリシン結合部位の任意のアミノ酸の、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換からなる突然変異Ａ’、又は
配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換からなる突然変異Ｂ、又は
配列番号２又は配列番号２５のリシン結合部位の任意のアミノ酸の、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質、
ｉｉ）配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質、及び
ｉｉｉ）クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２のフラグメントからなるタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質
からなる群より選択されるタンパク質である。
【０００９】
好ましくは、本発明のタンパク質は、以下：
ｉ）配列番号２又は配列番号２５の配列を含み、好ましくは配列番号２からなるか、又は配列番号２５と配列番号２６との結合物からなるタンパク質であって、前記配列が、
配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換からなる突然変異Ａ、又は
配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換からなる突然変異Ｂ、又は
配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質、
ｉｉ）配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むタンパク質であって、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質、及び
ｉｉｉ）クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２のフラグメントからなるタンパク質であって、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質
からなる群より選択される。
【００１０】
本発明の別の目的は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００１２】
本発明の別の目的は、前記発現ベクター又は前記ポリヌクレオチドを含むホスト細胞である。
【００１３】
本発明の別の目的は、薬品としての前記タンパク質の使用である。特に、前記タンパク質は、血栓性疾患を処置するために、好ましくは脳内出血又は眼出血を処置するために、より好ましくは脳卒中又は網膜中心動脈閉塞を処置するために使用され得る。
【００１４】
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体における血栓性疾患、特に脳卒中又は網膜中心動脈閉塞を処置するための方法であって、治療有効量の本発明のタンパク質を前記被験体に投与することを含む方法である。
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は本明細書では同義的に使用され、５００個よりも多くのアミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、５００〜１０００アミノ酸、好ましくは５１０〜９００アミノ酸、好ましくは５２０〜８００アミノ酸、好ましくは５２５〜７００アミノ酸を有するアミノ酸配列を包含する。
【００１６】
本明細書において使用される「相同性」（又は「相同」）という用語は「同一性」という用語と同義であり、２つのポリペプチド分子間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。両比較配列中のある位置が、同じ塩基又は同じアミノ酸残基によって占められる場合、各分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同性のパーセンテージは、２つの配列が共有するマッチング又は相同位置の数を比較位置の数で割って１００を乗じたものに対応する。一般に、比較は、２つの配列をアライメントした場合に最大の相同性が得られるように行なわれる。相同アミノ酸配列は、同一又は類似のアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、参照配列中の対応するアミノ酸残基についての保存的置換又は「許容される点突然変異」である。参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基と物理的又は機能的に類似する（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合又は水素結合の形成能を含む）などを有する）置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoff et al. ("Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington,  DC, Suppl. 3, 22: 354-352)による「容認される点突然変異」について定義されている基準を満たすものである。
【００１７】
相同配列は、例えば、GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズム、例えばBLAST、FASTA、CLUSTALWなどのいずれかを使用して、アライメントによって同定される。従って、本発明によれば、配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有する配列は、前記配列及び配列番号２が共有するマッチング又は相同位置の数を配列番号２の長さで割って１００を乗じたものが少なくとも８０に等しい配列である。
【００１８】
本明細書において使用される「血栓性疾患」という用語は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び急性冠症候群（ＡＣＳ）、網膜中心動脈閉塞（ＣＲＡＯ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び血栓性神経障害、例えば脳卒中を包含する。
【００１９】
本明細書において使用される「血栓性神経障害」という用語は、被験体の神経系の正常な機能又は解剖学的形態に直接的又は間接的に影響を与える疾患、障害又は症状と定義され、限定されないが、脳血管不全、脳虚血又は脳梗塞、例えば脳卒中、網膜虚血（糖尿病性又はその他のもの）、緑内障、網膜変性、多発性硬化症、虚血性視神経障害、急性脳虚血後の再灌流、周産期低酸素虚血性損傷、又は任意の種類の頭蓋内出血（限定されないが、硬膜外出血、硬膜下出血、くも膜下出血又は大脳内出血を含む）が挙げられる。
【００２０】
「フィブリン溶解活性」又は「血栓溶解活性」という用語は、フィブリン塊を分解する能力を指す。
【００２１】
障害又は症状の「処置」という用語は、このような障害又は症状の１つ以上の症候の過程を逆行させ、緩和し、又は阻害することを指す。
【００２２】
本明細書において使用される「被験体」という用語は、齧歯類、ネコ科、イヌ科、ブタ、ウシ及び霊長類などの哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明の被験体は、ヒトである。
【００２３】
本明細書において使用される「治療有効量」は、治療効果を被験体に与えるのに必要な活性剤の最小量を意図する。例えば、被験体に対する「治療有効量の活性剤」は、被験体の罹患疾患に関連する病的症候、疾患進行又は身体症状の改善を誘導し、向上させ、又は引き起こす活性剤の量である。
【００２４】
本発明
本発明は、以下：
ｉ）配列番号２又は配列番号２５の配列を含み、好ましくは配列番号２からなるか、又は配列番号２５と配列番号２６との結合物からなるタンパク質であって、前記配列が、
配列番号２又は配列番号２５のリシン結合部位の任意のアミノ酸の、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換からなる突然変異Ａ’、又は
配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換からなる突然変異Ｂ、又は
配列番号２又は配列番号２５のリシン結合部位の任意のアミノ酸の、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質、
ｉｉ）配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質、及び
ｉｉｉ）クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２のフラグメントからなるタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むタンパク質
からなる群より選択されるタンパク質に関する。
【００２５】
突然変異Ａ’が関係するリシン結合部位のアミノ酸は、同定するのが容易である：以下の実施例１で説明されているように（「興奮毒性神経細胞死」のプロトコールを参照のこと）、前記リシン結合部位の１個のアミノ酸が突然変異される場合、対応する突然変異体は、ＮＭＤＡ神経毒性に有意な影響を及さない。
【００２６】
突然変異Ａ’に従って突然変異され得るリシン結合部位のアミノ酸は、好ましくは、リシン結合部位の（正又は負に）荷電したアミノ酸及び疎水性アミノ酸である。好ましくは、前記アミノ酸は、配列番号２又は配列番号２５の２３６位及び２３８位のアスパラギン酸並びに２５３位のトリプトファンである。
【００２７】
好ましくは、突然変異Ａ’は、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換からなる突然変異Ａである。
【００２８】
好ましくは、二重突然変異Ａ’及びＢは、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる突然変異Ａ及びＢである。
【００２９】
好ましくは、本発明のタンパク質は、以下：
ｉ）配列番号２又は配列番号２５の配列を含み、好ましくは配列番号２からなるか、又は配列番号２５と配列番号２６との結合物からなるタンパク質であって、前記配列が、
配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換からなる突然変異Ａ、又は
配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換からなる突然変異Ｂ、又は
配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸による置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質、
ｉｉ）配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むタンパク質であって、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質、及び
ｉｉｉ）クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２のフラグメントからなるタンパク質であって、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質
からなる群より選択される。
【００３０】
好ましくは、前記突然変異Ａは、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンのアルギニンによる置換からなる。好ましくは、前記突然変異Ａ及びＢは、配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンのアルギニンによる置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる。
【００３１】
好ましくは、本発明のタンパク質は、突然変異Ａ’、又は突然変異Ａ’及びＢ、好ましくは突然変異Ａ、又は突然変異Ａ及びＢを含む。
【００３２】
本発明の前記タンパク質は、良好なフィブリン溶解活性を有し、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）媒介性神経毒性を促進しない突然変異ｔＰＡである。このことは、以下の実施例に特に示されている。
【００３３】
ｔＰＡはＰＬＡＴ遺伝子によってコードされ、セリンプロテアーゼＥＣ３．４．２１．６８という。ヒトｔＰＡは、Alteplase（Activase（登録商標）又はActilyse（登録商標））として市販されている。ｔＰＡは、５個のドメイン：Ｎ末端フィンガードメイン、次いでＥＧＦ様ドメイン、クリングル１及びクリングル２ドメイン、そして最後にＣ末端触媒ドメインから構成されている。クリングル２ドメインは、リシン結合部位（ＬＢＳ）を含む。ｔＰＡタンパク質は、哺乳動物間でよく保存されている：ヒト、ブタ、ウシ、マウス及びラットｔＰＡは、少なくとも８０％の相同性を共有する。特に、ヒト及びラットｔＰＡは、８１％の相同性を共有する。
【００３４】
ヒトｔＰＡは、UniProtKBにおいてアクセッションナンバーＰ００７５０で見つけることができ、ラットｔＰＡは、UniProtKBにおいてアクセッションナンバーＰ１９６３７で見つけることができる。ヒトｔＰＡは、４個のアイソフォームで存在する：アイソフォーム１は標準的な配列であるのに対して、アイソフォーム２〜４は欠失及び置換によりこの標準的な配列と異なる。
【００３５】
このタンパク質は、プロセシング中に改変される：哺乳動物のｔＰＡはプレプロペプチド形態で翻訳され、次いで成熟タンパク質にプロセシングされる。成熟タンパク質は、最終的には、二本鎖型になるように２本の鎖に切断され、この場合の両鎖は、ジスルフィド結合により互いに連結している。
【００３６】
例えば、ヒトｔＰＡは、最初に、５６２アミノ酸を含むプレプロペプチド形態で翻訳され、次いで、５２７アミノ酸を含む成熟タンパク質にプロセシングされる（最初の３５アミノ酸は、プロセシング中に切断される）。最終的には、成熟タンパク質の切断後、ヒト二本鎖型は、２７５アミノ酸の第１の鎖及び２５２アミノ酸の第２の鎖を含む。
【００３７】
ヒトｔＰＡのプレプロペプチドは、本発明では配列番号１に対応するのに対して、その成熟タンパク質は配列番号２に対応する。最後に、ヒト二本鎖型の第１の鎖は配列番号２５に対応し、ヒト二本鎖型の第２の鎖は配列番号２６に対応する。配列番号２５は、配列番号２の最初の２７５アミノ酸と同一である。配列番号２６は、配列番号２の最後の２５２アミノ酸と同一である。別の例として、ラットｔＰＡは、最初に、５５９アミノ酸を含むプレプロペプチド形態で翻訳され、次いで、５２７アミノ酸を含む成熟タンパク質にプロセシングされる（最初の３２アミノ酸は、プロセシング中に切断される）。
【００３８】
いかなる理論にも縛られないが、本発明者らは、クリングル２ドメインに存在するリシン結合部位、特にＬＢＳの構成的トリプトファンを特異的に突然変異させたｔＰＡ（すなわち、配列番号４又は配列番号３のようなもの）が神経毒性を誘導しないことを実施例で示した。それにもかかわらず、前記突然変異は、前記突然変異ｔＰＡの血栓溶解能を低下させない（クリングル２ドメインは、わずかなフィブリン溶解活性機能を有する（Bakker et al, 1995; Bennett et al, 1991））。
【００３９】
また、少なくとも突然変異Ｂを含む本発明のｔＰＡ突然変異体は、それらの野生型種よりも安定である。
【００４０】
本発明のタンパク質は、それら本来の成熟型又は切断型の突然変異ｔＰＡタンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢで突然変異された一本鎖ｔＰＡ（ｓｃ−ｔＰＡ）を含む。ｓｃ−ｔＰＡは、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ｔＰＡの成熟タンパク質を指す。
【００４１】
本発明のタンパク質はまた、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢで突然変異された二本鎖ｔＰＡ（ｔｃ−ｔＰＡ）を含む。ｔｃ−ｔＰＡは、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ａｒｇ−Ｉｌｅ、例えばヒトではＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６におけるタンパク質分解切断によってｓｃ−ｔＰＡ成熟タンパク質が切断された後に得られる切断型のｔＰＡを指す。ｔｃ−ｔＰＡの両鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結している。
【００４２】
本発明の突然変異Ｂにより、ｓｃ＊突然変異体は、その通常の活性化因子（例えば、プラスミン又はカリクレイン）によってｔｃ−ｔＰＡ型に変換されることができず、ｓｃ−ｔＰＡ型のみであることに留意しなければならない。
【００４３】
本発明のタンパク質は、群ｉ）、すなわち、配列番号２又は配列番号２５の配列を含み、好ましくは配列番号２からなるか、又は配列番号２５と配列番号２６との結合物からなるタンパク質であって、前記配列が、
配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換からなる突然変異Ａ、又は
配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換からなる突然変異Ｂ、又は
配列番号２又は配列番号２５の２５３位のトリプトファンの、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによる置換と、配列番号２又は配列番号２５の２７５位のアルギニンのセリンによる置換とからなる二重突然変異Ａ及びＢを含むタンパク質から選択され得る。
【００４４】
前記群ｉ）は、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）で特異的に突然変異されている配列番号２を含む配列に対応し、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）で特異的に突然変異されている配列番号２５を含む配列にも対応する。
【００４５】
本発明の突然変異Ａは、以下の置換である：２５３位のトリプトファンが、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニンによって置換される。従って、突然変異Ａは、以下の置換である：Ｗ２５３Ｒ（本出願では、この術語は、置換されるアミノ酸、配列番号２又は配列番号２５におけるその位置、及び導入されるアミノ酸を連続的に示す）。本発明の突然変異Ｂは、以下の置換である：Ｒ２７５Ｓ。
【００４６】
本発明の突然変異Ａ及びＢは、二重突然変異Ｗ２５３（アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン及びヒスチジンから選択される親水性アミノ酸、好ましくはアルギニン）及びＲ２７５Ｓである。
【００４７】
好ましくは、本発明の突然変異Ａ及びＢは、二重突然変異Ｗ２５３Ｒ及びＲ２７５Ｓである。
【００４８】
好ましくは、群ｉ）は、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢで特異的に突然変異されている配列番号２からなる配列に対応し、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢで特異的に突然変異されている配列番号２５と配列番号２６との結合物からなる配列にも対応する。
【００４９】
配列番号２５と配列番号２６と「の結合物」という表現は、両配列がジスルフィド結合により互いに連結していることを意味する。それは、ｔｃ−ｔＰＡ型に対応する。
【００５０】
好ましくは、群ｉ）のタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１４である。
【００５１】
本発明のタンパク質はまた、群ｉｉ）、すなわち、配列番号２又は配列番号２５（の配列全体）と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むタンパク質であって、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）を含むタンパク質から選択され得る。群ｉｉ）のタンパク質は、配列番号２とその全長にわたって少なくとも８０％の相同性を有する配列を含み、前記タンパク質は、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）を含む。群ｉｉ）のタンパク質はまた、配列番号２５とその全長にわたって少なくとも８０％の相同性を有する配列を含み、前記タンパク質は、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）を含む；この場合、前記相同タンパク質は、ジスルフィド結合により、配列番号２６からなるタンパク質に連結してもよい。
【００５２】
前記群ｉｉ）は、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）で特異的に突然変異されている配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列に対応する。好ましくは、群ｉｉ）のタンパク質は、配列番号２又は配列番号２５と少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有し、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）を含む。
【００５３】
群ｉｉ）のタンパク質は、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むという条件で、以下の改変：
−  配列番号２又は配列番号２５の１２５位のプロリンのアルギニンによる置換、
−  配列番号２若しくは配列番号２５におけるＮ末端フィンガードメインの欠失及び／若しくはＥＧＦ様ドメインの欠失、並びに／又は配列番号２若しくは配列番号２５の１１７位のアスパラギンのグルタミンによる置換、
−  配列番号２若しくは配列番号２５の１０３位のトレオニンのアスパラギンによる置換、及び／又は配列番号２若しくは配列番号２５の１１７位のアスパラギンのグルタミンによる置換、及び／又は配列番号２の２９６位〜２９９位のリシン−ヒスチジン−アルギニン−アルギニン（ＫＨＲＲ）のアラニン−アラニン−アラニン−アラニン（ＡＡＡＡ）による置換、
−  配列番号２又は配列番号２５の８４位のシステインのセリンによる置換、
−  配列番号２若しくは配列番号２５の２７５位のアルギニンのグルタミン酸若しくはグリシンによる置換
の少なくとも１つを含み得、突然変異Ａのみ及び／又は配列番号２若しくは配列番号２５におけるクリングル１ドメインの欠失を含む。
【００５４】
本発明のタンパク質は、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢを含むという条件で、群ｉｉｉ）、すなわち、クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２のフラグメントからなるタンパク質から選択され得る。従って、クリングル２ドメイン及び触媒ドメインからなる配列番号２の前記フラグメントは、フィンガードメイン、ＥＧＦ様ドメイン及びクリングル１ドメインを持たない。好ましくは、配列番号２の前記フラグメントは、配列番号２の１８０位〜５２６位のアミノ酸からなる。従って、前記群ｉｉｉ）は、好ましくは、突然変異Ａ’、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ’及びＢ（好ましくは、突然変異Ａ、突然変異Ｂ、又は突然変異Ａ及びＢ）を含む配列番号２の１８０位〜５２６位のアミノ酸配列に対応する。
【００５５】
好ましくは、群ｉｉ）又はｉｉｉ）のタンパク質は、ヒト、ラット、マウス、ブタ又はウシ起源である。
【００５６】
好ましくは、群ｉｉ）のタンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１及び配列番号１２である。
【００５７】
好ましくは、本発明のタンパク質は、配列番号３〜配列番号１４の配列の少なくとも１つを含むタンパク質からなる群より選択される。より好ましくは、本発明のタンパク質は、配列番号３〜配列番号１４の配列からなる群で選択される；換言すれば、前記タンパク質は、配列番号３〜配列番号１４の配列のうちの１つからなる。
【００５８】
本発明の別の目的は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記タンパク質のアミノ酸配列を考慮して、対応するポリヌクレオチドを合成できる。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１５又は配列番号１６の配列に由来する。
【００５９】
本特許出願において記載される配列は、以下のように要約できる：
【表１】
2014527805.tif 000003
【００６０】
本発明の別の目的は、前記タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。本発明によれば、本発明において使用するのに適切な発現ベクターは、核酸配列に機能的に連結された少なくとも１つの発現コントロール要素を含み得る。発現コントロール要素は、核酸配列の発現をコントロール及びレギュレーションするためにベクターに挿入される。発現コントロール要素の例としては、限定されないが、ｌａｃシステム、ラムダファージのオペレーター及びプロモーター領域、酵母のプロモーター、並びにポリオーマ、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス又はＳＶ４０に由来するプロモーターが挙げられる。さらなる好ましい又は必要な機能的要素としては、限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び核酸配列がホストの系で適切に転写され続いて翻訳されるのに必要な又は好ましい任意のその他の配列が挙げられる。当業者であれば、必要な又は好ましい発現コントロール要素の正しい組み合わせは、選択されるホストの系に依存することを理解するであろう。発現ベクターは、核酸配列を含有する発現ベクターがホストの系で輸送され続いて複製されるのに必要なさらなる要素を含有するべきであることがさらに理解されるであろう。このような要素の例としては、限定されないが、複製起点及び選択可能なマーカーが挙げられる。当業者であれば、このようなベクターは、通常の方法又は市販されているものを使用して容易に構築されることをさらに理解するであろう。
【００６１】
本発明の別の目的は、上記発現ベクター又は上記ポリヌクレオチドを含むホスト細胞である。本発明によれば、使用され得るホスト細胞の例は、動物、植物、昆虫及び酵母細胞などの真核細胞、並びにE. coliなどの原核細胞である。遺伝子を有するベクターを細胞に導入し得る手段としては、限定されないが、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウム又は当業者に公知のその他の手法を使用したマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション又はトランスフェクションが挙げられる。
【００６２】
好ましい実施態様では、真核細胞で機能する真核細胞発現ベクターが使用される。このようなベクターの例としては、限定されないが、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス；レンチウイルス、細菌発現ベクター、プラスミド、例えばｐｃＤＮＡ５又はバキュロウイルス移入ベクターが挙げられる。好ましい真核細胞株としては、限定されないが、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状細胞又は単核細胞が挙げられる。
【００６３】
本発明のタンパク質は、薬品として使用され得る。従って、本発明のタンパク質を医薬組成物に組み込まれ得る。
【００６４】
特に、本発明のタンパク質は、血栓性疾患を処置するのに使用され得る。前記血栓性疾患としては、虚血、動脈閉塞又は静脈閉塞（網膜中心動脈閉塞のようなもの）、脳内出血及び眼出血が挙げられる。脳内出血としては、脳卒中、実質内出血、脳室内出血及びくも膜下出血が挙げられる。脳内血腫（又は実質内）は脳卒中の一種であり、血液が脳実質内に自然発生することを特徴とし、その原因は外傷ではない。
【００６５】
眼出血としては、眼疾患、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）に関連する黄斑出血及び硝子体出血が挙げられる。
【００６６】
特に、本発明のタンパク質は、好ましくは、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、網膜閉塞（中心性でも非中心性でもよいし、動脈性でも静脈性でもよい）、好ましくは網膜中心動脈閉塞（ＣＲＡＯ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脳血管不全、脳虚血、脳梗塞、例えば脳卒中、網膜虚血、緑内障、網膜変性、多発性硬化症、虚血性視神経障害、急性脳虚血後の再灌流、周産期低酸素虚血性損傷、及び任意の種類の頭蓋内出血から選択される血栓性疾患を処置するのに使用され得る。好ましくは、本発明のタンパク質は、脳内出血又は眼出血を処置するために、より好ましくは脳卒中又は網膜中心動脈閉塞を処置するために使用される。
【００６７】
本発明の医薬組成物を薬学的に許容しうる賦形剤、そして場合により持続放出マトリックス、例えば生体分解性ポリマーと組み合わせて、治療組成物を形成してもよい。
【００６８】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、眼内、脳内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、活性成分を単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形態で、通常の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与できる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、眼内又は脳内経路により投与される。
【００６９】
眼内経路としては、硝子体内投与（注射のようなもの）及び眼窩底経路の投与が挙げられる。
【００７０】
適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤及び経口懸濁液又は溶液、舌下及び口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下（subcutaneous）、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下（subdermal）、経皮、くも膜下腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。
【００７１】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容しうるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌食塩溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を追加すると、注射液の構成を可能とする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。前記溶液は、少なくともポリウレタンを含み得る。
【００７２】
注射用途に適切な剤形としては、滅菌水性液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、この形態は滅菌されているものでなければならず、易注射性が存在する程度に流動的でなければならない。それは製造及び保存の条件下において安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【００７３】
遊離塩基又は薬理学的に許容しうる塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製できる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物並びに油中で調製できる。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、中性又は塩の形態の組成物に製剤化できる。薬学的に許容しうる塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられるが、これは、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【００７５】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合では、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【００７６】
滅菌注入可能溶液は、適切な溶媒中で、必要量の活性物質を上に列挙されているその他の成分のいくつかと組み合わせ、必要であれば続いて滅菌ろ過することによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒体及び上に列挙されている成分からの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、種々の滅菌有効成分を取り込むことによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、先に滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
【００７７】
製剤化されると、溶液は、投与製剤に合った方法で、及び治療有効量で投与される。製剤は、様々な剤形、例えば上記種類の注入可能溶液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要な場合には適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にするべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、用いられ得る菌水媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解させ、１０００mlの皮下注入液に追加することもできるし、提案された注入部位に注入することもできる。投与量のいくらかの変動が、処置されている被験体の状態に応じて必ず生じるであろう。投与責任者は、任意の事象において、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０又はさらには約１０ミリグラムかそこらを含むように治療用混合物の範囲内で製剤化され得る。複数用量を投与することもできる。
【００７９】
非経口投与、例えば静脈内又は筋肉内注射用に製剤化された本発明の化合物に加えて、その他の薬学的に許容しうる形態としては、例えば、経口投与用の錠剤又はその他の固体；リポソーム製剤；徐放カプセル；及び現在使用されている任意のその他の形態が挙げられる。
【００８０】
本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されるであろう。任意の特定の患者についての特定の治療有効用量レベルは、処置されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般健康、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び医学分野において周知の要因含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なものよりも低レベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることは、十分に、当技術分野の技能の範囲内である。しかしながら、製品の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲にわたって変化しうる。好ましくは、組成物は、処置されるべき患者への投与量の対症調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。薬品は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの有効成分、好ましくは１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００８１】
本発明の種々の実施態様を説明する目的で、以下の実施例を示す。
【００８２】
重要な注意点：
実施例に関連する以下の図面では、アミノ酸は、成熟Rattus norvegicus  ｔＰＡ配列（UniProtKB：Ｐ１９６３７）のＮ末端のセリンからナンバリングされている。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】３個のプラスミノーゲン活性化因子の比較表。Ａ）ヒトｔＰＡ、ラットｔＰＡ及びDesmodus rotundusプラスミノーゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）は、アミノ末端のフィンガードメインからカルボキシル末端のプロテアーゼドメインに及ぶドメインについて、ほとんど同様の配列を示す。ＤＳＰＡには、ｔＰＡのクリングル２ドメインが存在しない。また、ヒト及びラットｔＰＡ並びにＤＳＰＡは、強い相同性を共有する（ラット及びヒトｔＰＡの間では＞８０％；ヒトｔＰＡ及びＤＳＰＡの間では＞６５％）。Ｂ）ラットｗｔ  ｔＰＡの発現実験で使用したプラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのマップ。
【図１Ｂ】３個のプラスミノーゲン活性化因子の比較表。Ａ）ヒトｔＰＡ、ラットｔＰＡ及びDesmodus rotundusプラスミノーゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）は、アミノ末端のフィンガードメインからカルボキシル末端のプロテアーゼドメインに及ぶドメインについて、ほとんど同様の配列を示す。ＤＳＰＡには、ｔＰＡのクリングル２ドメインが存在しない。また、ヒト及びラットｔＰＡ並びにＤＳＰＡは、強い相同性を共有する（ラット及びヒトｔＰＡの間では＞８０％；ヒトｔＰＡ及びＤＳＰＡの間では＞６５％）。Ｂ）ラットｗｔ  ｔＰＡの発現実験で使用したプラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのマップ。
【図２Ａ】ヒト及びラットｔＰＡ並びにＤＳＰＡの一次構造の比較。Ａ）ＤＳＰＡのクリングルドメインの配列分析は、非機能的なリシン結合部位をもたらす天然に存在するアミノ酸置換を表している：Ｄ２３７位及びＤ２３９位のアニオン電荷（黒枠１）並びに疎水性アミノ酸Ｗ２５４（黒枠２）がない。Ｂ）ＤＳＰＡは、一本鎖型でのみ存在する特定のプロテアーゼであるのに対して、ヒト又はラットｔＰＡなどのプロテアーゼは二本鎖型にプロセシングされ得る。
【図２Ｂ】ヒト及びラットｔＰＡ並びにＤＳＰＡの一次構造の比較。Ａ）ＤＳＰＡのクリングルドメインの配列分析は、非機能的なリシン結合部位をもたらす天然に存在するアミノ酸置換を表している：Ｄ２３７位及びＤ２３９位のアニオン電荷（黒枠１）並びに疎水性アミノ酸Ｗ２５４（黒枠２）がない。Ｂ）ＤＳＰＡは、一本鎖型でのみ存在する特定のプロテアーゼであるのに対して、ヒト又はラットｔＰＡなどのプロテアーゼは二本鎖型にプロセシングされ得る。
【図３Ａ】ｔＰＡ関連突然変異タンパク質の生化学的特性決定。Ａ）等量（１００ng）のｗｔ  ｔＰＡ、ΔＫ２−ｔＰＡ、Ｋ２＊−ｔＰＡ及びｓｃ＊−ｔＰＡ突然変異タンパク質を免疫ブロッティングに供した。（Ｂ〜Ｃ）蛍光発生基質（Ｂ）又はプラスミノーゲン−カゼインザイモグラフィー分析（Ｃ）のいずれかで測定したｔＰＡ関連突然変異タンパク質の活性。
【図３Ｂ】ｔＰＡ関連突然変異タンパク質の生化学的特性決定。Ａ）等量（１００ng）のｗｔ  ｔＰＡ、ΔＫ２−ｔＰＡ、Ｋ２＊−ｔＰＡ及びｓｃ＊−ｔＰＡ突然変異タンパク質を免疫ブロッティングに供した。（Ｂ〜Ｃ）蛍光発生基質（Ｂ）又はプラスミノーゲン−カゼインザイモグラフィー分析（Ｃ）のいずれかで測定したｔＰＡ関連突然変異タンパク質の活性。
【図３Ｃ】ｔＰＡ関連突然変異タンパク質の生化学的特性決定。Ａ）等量（１００ng）のｗｔ  ｔＰＡ、ΔＫ２−ｔＰＡ、Ｋ２＊−ｔＰＡ及びｓｃ＊−ｔＰＡ突然変異タンパク質を免疫ブロッティングに供した。（Ｂ〜Ｃ）蛍光発生基質（Ｂ）又はプラスミノーゲン−カゼインザイモグラフィー分析（Ｃ）のいずれかで測定したｔＰＡ関連突然変異タンパク質の活性。
【図４Ａ】Ｋ２関連突然変異タンパク質は、フィブリン溶解特性を改善した。Ａ）ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡは、非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動後にフィブリンアガロースザイモグラフィーに供すると、ｗｔ−ｔＰＡのようなフィブリン溶解活性を示す。Ｂ）乏血小板凝固血漿（ＰＰＰ−ｃｌｏｔ）を使用したフィブリン溶解活性のin vitro評価。Ｋ２＊−ｔＰＡ及びΔＫ２−ｔＰＡ突然変異タンパク質は、ｗｔ−ｔＰＡと比較して改善した全体的なフィブリン溶解効率を示す（それぞれ２６％及び５１％）。半凝固溶解時間を使用して、ラットｗｔ−ｔＰＡに対してフィブリン溶解活性を標準化した（＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４Ｂ】Ｋ２関連突然変異タンパク質は、フィブリン溶解特性を改善した。Ａ）ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡは、非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動後にフィブリンアガロースザイモグラフィーに供すると、ｗｔ−ｔＰＡのようなフィブリン溶解活性を示す。Ｂ）乏血小板凝固血漿（ＰＰＰ−ｃｌｏｔ）を使用したフィブリン溶解活性のin vitro評価。Ｋ２＊−ｔＰＡ及びΔＫ２−ｔＰＡ突然変異タンパク質は、ｗｔ−ｔＰＡと比較して改善した全体的なフィブリン溶解効率を示す（それぞれ２６％及び５１％）。半凝固溶解時間を使用して、ラットｗｔ−ｔＰＡに対してフィブリン溶解活性を標準化した（＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【図５Ａ】ｔＰＡクリングル２ドメインの構成的リシン結合部位の無効化は、ｔＰＡ媒介性神経毒性を消滅させる。（Ａ〜Ｃ）一次培養皮質ニューロン（in vitro培養１４日目−ＤＩＶ）を５０μMのＮＭＤＡに単独で、又は（Ａ）ヒトｔＰＡ若しくはラットｗｔ−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、３回の独立した実験）（Ｂ）ｗｔ−ｔＰＡ、ΔＫ２−ｔＰＡ若しくはＫ２＊−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、４回の独立した実験）若しくは（Ｃ）０，１mMのリシン類似物ε−ＡＣＡ（ε−アミノカプロン酸）の有無の下でヒトｔＰＡ（ｎ＝１９、５回の独立した実験）のいずれかを補充して１時間曝露した２４時間後のバス培地（bathing media）におけるＬＤＨの放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。データは、コントロールに対する神経細胞死の平均値±ＳＤ（パーセント単位）として示す。（＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意）。
【図５Ｂ】ｔＰＡクリングル２ドメインの構成的リシン結合部位の無効化は、ｔＰＡ媒介性神経毒性を消滅させる。（Ａ〜Ｃ）一次培養皮質ニューロン（in vitro培養１４日目−ＤＩＶ）を５０μMのＮＭＤＡに単独で、又は（Ａ）ヒトｔＰＡ若しくはラットｗｔ−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、３回の独立した実験）（Ｂ）ｗｔ−ｔＰＡ、ΔＫ２−ｔＰＡ若しくはＫ２＊−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、４回の独立した実験）若しくは（Ｃ）０，１mMのリシン類似物ε−ＡＣＡ（ε−アミノカプロン酸）の有無の下でヒトｔＰＡ（ｎ＝１９、５回の独立した実験）のいずれかを補充して１時間曝露した２４時間後のバス培地（bathing media）におけるＬＤＨの放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。データは、コントロールに対する神経細胞死の平均値±ＳＤ（パーセント単位）として示す。（＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意）。
【図５Ｃ】ｔＰＡクリングル２ドメインの構成的リシン結合部位の無効化は、ｔＰＡ媒介性神経毒性を消滅させる。（Ａ〜Ｃ）一次培養皮質ニューロン（in vitro培養１４日目−ＤＩＶ）を５０μMのＮＭＤＡに単独で、又は（Ａ）ヒトｔＰＡ若しくはラットｗｔ−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、３回の独立した実験）（Ｂ）ｗｔ−ｔＰＡ、ΔＫ２−ｔＰＡ若しくはＫ２＊−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、４回の独立した実験）若しくは（Ｃ）０，１mMのリシン類似物ε−ＡＣＡ（ε−アミノカプロン酸）の有無の下でヒトｔＰＡ（ｎ＝１９、５回の独立した実験）のいずれかを補充して１時間曝露した２４時間後のバス培地（bathing media）におけるＬＤＨの放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。データは、コントロールに対する神経細胞死の平均値±ＳＤ（パーセント単位）として示す。（＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意）。
【図６Ａ】フィブリンは、不活性ｓｃ＊−ｔＰＡのプラスミノーゲン活性化機能を部分的に回復させる。（Ａ）非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動後にフィブリンアガロースザイモグラフィーによって、及び（Ｂ）乏血小板凝固血漿（ＰＰＰ−ｃｌｏｔ）溶解アッセイで検出したところ、ｓｃ＊−ｔＰＡは、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を単独では促進できないのに対して、そのフィブリン補因子は、そのプラスミノーゲン活性化機能を部分的に元に戻す。フィブリンの凝固は、ｓｃ＊−ｔＰＡの活性を、ｗｔ−ｔＰＡのフィブリン溶解活性の半分よりも高いレベルにまで回復させる（ｎ＝３）。半凝固溶解時間を使用して、ラットｗｔ−ｔＰＡに対してフィブリン溶解活性を標準化した。（＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【図６Ｂ】フィブリンは、不活性ｓｃ＊−ｔＰＡのプラスミノーゲン活性化機能を部分的に回復させる。（Ａ）非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動後にフィブリンアガロースザイモグラフィーによって、及び（Ｂ）乏血小板凝固血漿（ＰＰＰ−ｃｌｏｔ）溶解アッセイで検出したところ、ｓｃ＊−ｔＰＡは、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を単独では促進できないのに対して、そのフィブリン補因子は、そのプラスミノーゲン活性化機能を部分的に元に戻す。フィブリンの凝固は、ｓｃ＊−ｔＰＡの活性を、ｗｔ−ｔＰＡのフィブリン溶解活性の半分よりも高いレベルにまで回復させる（ｎ＝３）。半凝固溶解時間を使用して、ラットｗｔ−ｔＰＡに対してフィブリン溶解活性を標準化した。（＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【図７】ｓｃ−ｔＰＡのチモーゲン性の回復は、ＮＭＤＡ媒介性神経毒性のｔＰＡ増強からニューロンを救う。一次培養皮質ニューロン（in vitro培養１４日目−ＤＩＶ）を５０μMのＮＭＤＡに単独で、又はラットｗｔ−ｔＰＡ若しくはラットｓｃ＊−ｔＰＡ（０．３μM；ｎ＝１２、４回の独立した実験）のいずれかを補充して１時間曝露した２４時間後のバス培地におけるＬＤＨの放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。データは、コントロールに対する神経細胞死の平均値±ＳＤ（パーセント単位）として示す。（＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意）。
【図８】ヒトｔＰＡ変異体の特性決定。等量（２００ng）のヒトｔＰＡ変異体を免疫ブロッティングに供し、市販型のｔＰＡ（actilyse）及びレテプラーゼ（rapilysin）と比較した。
【図９】ｔＰＡ変異体の生化学的特性決定。左、生成した遊離発色団（ＡＭＣ）の吸光度の増加を測定することによって決定したｔＰＡ変異体の固有活性であって、λ４４０nmにおける単位時間あたりの固有活性を、独自の基質と比較したもの。使用した蛍光発生基質は、Spectrofluor  ｔＰＡ（式：ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．ＡｃＯＨ、American Diagnostica）である。測定は、３回の独立した実験で５個の異なる用量を使用して、デュプリケイトで実施した。中央、オイグロブリン由来凝固物に対する半凝固溶解時間を使用して、二重又は三重ｔＰＡ突然変異体のフィブリン溶解活性を市販のｔＰＡ（actilyse）に対して標準化したもの。右、全血漿由来凝固物に対する半凝固溶解時間を使用して、二重又は三重ｔＰＡ突然変異体のフィブリン溶解活性を市販のｔＰＡ（actilyse）に対して標準化したもの。
【図１０】ヒトｔＰＡ変異体の非神経毒性効果概念のin vitroでの証明。方法のセクションに記載されているように、バス培地における乳酸脱水素酵素の放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。ヒトｔＰＡ（actilyse）、ｈｕｔＰＡｓｃ＊又はＯｐｔ−ＰＡ２（０．３μM；４回の独立した実験）（ｈｕｔＰＡｓｃ＊及びＯｐｔ−ＰＡ２の定義については、上記配列表を参照のこと）データは、コントロールに対する神経細胞死の平均値±ＳＤ（パーセント単位）として示す；ｎｓ：非有意。
【図１１】ヒトｔＰＡ変異体の非神経毒性効果概念のin vitroでの証明。方法のセクションに記載されているように、バス培地における乳酸脱水素酵素の放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。ヒトｔＰＡ（actilyse）、ｈｕｔＰＡＫ２＊又はＯｐｔ−ＰＡ（０．３μM；４回の独立した実験）（ｈｕｔＰＡＫ２＊及びＯｐｔ−ＰＡの定義については、上記配列表を参照のこと）データは、コントロールに対する神経細胞死の平均値±ＳＤ（パーセント単位）として示す；ｎｓ：非有意。
【図１２】Ｏｐｔ−ＰＡは、in vivoでＮＭＤＡ誘導性神経毒性を促進しない。ＮＭＤＡ（１２，５mM）を単独で、又はactilyse（５μM）、Ｏｐｔ−ＰＡ（５μM）若しくはｈｕｔＰＡＫ２＊（５μM）（ｈｕｔＰＡＫ２＊及びＯｐｔ−ＰＡの定義については、上記配列表を参照のこと）のいずれかと組み合わせて線条体注射した２４時間後に、方法のセクションに記載されているように磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって、ＮＭＤＡ誘導性興奮毒性脳損傷を測定した。データは、損傷容積の平均値±ＳＤ（mm3単位）として示す。
【図１３】表１．本研究で生産したｔＰＡ関連突然変異タンパク質の概要。
【図１４】表２．ｔＰＡ変異体の生化学的特徴。（１）：UniProtデータベースで利用可能な配列、アクセッションナンバーＰ１９６３７；（２）：International Reference Preparation (IRP 98/714)を参照し、５０％の凝固溶解が得られる時間を使用して、オイグロブリン凝固溶解時間アッセイから得られたフィブリン溶解活性；（３〜４）：３回の独立した実験（１２個の試験用量）から得られたフィブリンのＫｄ（３）並びにフィブリンの存在下におけるプラスミノーゲンのＫｍ及びｋｃａｔ（４）。
【００８４】
実施例１：ラットｔＰＡ突然変異体
重要な注意点：
以下の研究では、アミノ酸は、成熟Rattus norvegicus  ｔＰＡ配列（UniProtKB：Ｐ１９６３７）のＮ末端のセリンからナンバリングされている。
【００８５】
材料及び方法
化学物質。
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）は、Tocris (Bristol, United Kingdom)から購入した。Spectrofluor 444FLは、American Diagnostica (Stamford, USA)から購入した。６−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）、Dulbecco改変Eagle培地（ＤＭＥＭ）、ポリ−Ｄ−リシン、シトシンβ−Ｄ−アラビノシド及びハイグロマイシンＢは、Sigma-Aldrich (L’Isle d’Abeau, France)製であった。QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キットは、Stratagene (La Jolla, California, USA)製であった。プラスミノーゲンは、Calbiochem (Nottingham, United Kingdom)から購入した。Lipofectamine 2000、Opti-MEM RSM、ウシ胎仔血清及びウマ血清、ラミニンは、Invitrogen (Cergy Pontoise, France)製であった。ｔＰＡ（Actilyse（登録商標））は、Boehringer-Ingleheim (Germany)製であった。
【００８６】
野生型ｔＰＡ及びΔＫ２−ｔＰＡ突然変異タンパク質を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターの構築。
【化１】
2014527805.tif 000004
を使用してＰＣＲによって、完全サイズのラット野生型ｔＰＡをコードする配列を増幅した。成熟タンパク質のＮ末端部に６ｘＨｉｓタグを配置した。次いで、設計したＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)に挿入した。以下の融合プライマー：
【化２】
2014527805.tif 000005
を用いて同じプロトコールを使用して融合ＰＣＲを実施し、ｗｔ−ｔＰＡコード配列からΔＫ２−ｔＰＡを得た。自動配列分析を使用して、最終構築物をチェックした。
【００８７】
部位特異的突然変異誘発。
Stratagene (Agilent Technologies, Massy, France)から購入したQuikChange（登録商標）XL部位特異的突然変異誘発キット並びに以下のプライマー
【化３】
2014527805.tif 000006
を使用することによって、全長ｔＰＡｗｔの突然変異誘発（ｔＰＡ  Ｗ２５４Ｒ）を実施した。
【化４】
2014527805.tif 000007
を使用して、非切断ｔＰＡ（ｔＰＡ  Ｒ２７６Ｓ）を得た。自動配列分析を使用して、突然変異を確認した。
【００８８】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）−２９３細胞の培養及び安定トランスフェクション。
ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏベクター(HEK-FlpIn, Invitrogen)で既に安定トランスフェクションしたヒト胎児腎臓２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び２mMグルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で成長させた。製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従ってlipofectamine 2000試薬を使用して、ｔＰＡ関連プラスミド及びプラスミドヘルパーｐＯＧ４４を含有する混合物を用いて、高いコンフルエンスの細胞をトランスフェクションした。２４時間後に、細胞を洗浄した。トランスフェクションの４８時間後に、ハイグロマイシンＢ選択によって陽性クローンを単離した。ＲＴ−ＰＣＲｑによって、トランスフェクションの質を評価した。
【００８９】
ｔＰＡ関連突然変異タンパク質を含有する馴化培地。
異なるｔＰＡ関連プラスミドで安定トランスフェクションした高いコンフルエンスの細胞を最小培地（Opti-MEM RSM (Invitrogen)に２mMグルタミンを追加し、１０IU/mlアプロチニン及び２００μg/mlハイグロマイシンＢを含有するものから構成される）中で２４時間インキュベーションした。上清を０．０１％アジド、２mM  ＥＤＴＡ、０．０１％ｔｗｅｅｎ２０中に回収し、１０．０００ｇで１５分間遠心分離し、最終的には−２０℃で保存した。
【００９０】
ｔＰＡ関連突然変異タンパク質のバイオリアクター生産。
高レベルの突然変異タンパク質を生産するために、安定トランスフェクションしたＨＥＫ細胞を実験室規模のバイオリアクターCELLine AD 1000中で成長させた。生細胞１ｘ１０６個／mlで接種した２週間後から、細胞区画を４カ月間にわたって週２回回収する。回収した各上清をｐＨ、濁度についてコントロールし、１０．０００ｇで１５分間遠心分離し、６ｘｈｉｓ精製前に−２０℃で保存する。
【００９１】
６ｘｈｉｓ突然変異タンパク質の精製。
製造業者のプロトコールに従ってニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）金属−アフィニティークロマトグラフィーマトリックス(Qiagen, Courtaboeuf, France)を使用して、精製を進めた。次いで、突然変異タンパク質をＮＨ４ＨＣＯ３０．５Ｍ緩衝液中で整え、定量し、保存した。
【００９２】
ｔＰＡ免疫ブロッティング。
ペンタヒスチジン配列（１／１０００ｅｍｅ）に対して作製したモノクローナルマウス抗体を使用して、免疫ブロッティングを実施し、続いて、適切なビオチン化標識二次抗体と一緒にインキュベーションした。Extravidine(Sigma)ビオチン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１／５０００）を使用して、シグナルを増幅した。強化化学発光ECL Plus免疫ブロッティング検出システム(Perkin Elmer-NEN, Paris, France)を用いて、免疫ブロットを可視化した。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥプラスミノーゲン−カゼインザイモグラフィー。
プラスミノーゲン（４．５μg/ml）及びカゼイン（１％）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中に追加することによって、ザイモグラフィーアッセイを実施した。電気泳動を４℃で実施した。ゲルをＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２．５％）で洗浄し、３７℃で２時間インキュベーションした。クマシー染色後に、カゼイン分解バンドを可視化した。
【００９４】
アミド分解活性アッセイ。
蛍光発生基質（５μM）（Spectrofluor（登録商標）FL444）の存在下で、ｔＰＡ関連突然変異タンパク質をインキュベーションした。１５０mM  ＮａＣｌを含有する５０mMトリス（ｐＨ８．０）（総容量１００μL）中、３７℃で、反応を行った。アミド分解活性は、４４０nmの蛍光発光（３６０nmで励起）の変化として測定した。Spectrozyme（登録商標）（アミド分解基質（Spectrozyme tPA，SptPA））を使用して、SptPAの濃度を増加させながら（０〜１mM）、マイクロプレート（１ウェルあたり２００μL）中で、ｗｔ−ｔＰＡ及びｓｃ＊−ｔＰＡ（０．３nM）をインキュベーションし、マイクロプレート分光光度計（ELx 808, Biotek, USA）を使用して、ＯＤ４０５nmを毎分記録した。次いで、以下のように反応の最大速度（Ｖｍａｘ）を計算し、データをプロットした：
【数１】
2014527805.tif 000008
【００９５】
フィブリンアガロースザイモグラフィー。
非還元条件下の８％ポリアクリルアミドゲル中で、タンパク質（１０μg）及び参照タンパク質（１０μLのｔＰＡ０．０６iu/mL、ｕＰＡ０．２５iu/mL及びプラスミン２００nM）を電気泳動した。次いで、ＳＤＳを２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と交換した。過剰なＴｒｉｔｏｎＸ−１００を蒸留水で洗い流した後、１mg/mLのウシフィブリノーゲン、１００nM  プラスミノーゲン及び０．２ＮＩＨ単位／mLのウシトロンビンを含有する１％アガロースゲル上に、このゲルを慎重にオーバーレイした。３７℃で１２時間かけてザイモグラムを現像し、暗視野照明を使用して一定の間隔で撮影した。公知の泳動マーカー（ｕＰＡ、ｔＰＡ、プラスミン）を参照することによって、細胞溶解物中の活性タンパク質を同定した。活性化因子のアイデンティティを確認するために、ｔＰＡ又は非免疫ＩｇＧに対するポリクローナル抗体を含有するフィブリン−アガロースゲル上に、ザイモグラムを作成した。
【００９６】
凝固溶解時間。
ヒト血漿を採取し、２０容量の冷酢酸２．９mMで１容量の冷血漿を希釈することによって、β−及びγ−グロブリンを含有するオイグロブリン画分を分離した。４℃で１５分間インキュベーションし、３０００ｇで１０分間遠心分離した後、オイグロブリン画分を沈殿させ、上清を廃棄し、沈殿物をＨＥＰＥＳ緩衝液（１０mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０mM  ＮａＣｌ）中に溶解させた。オイグロブリン溶液（１００μL）に、１５mM塩化カルシウム及び５、１０、１５、２０、２５又は３０I.U.のｔＰＡ突然変異タンパク質を補充した。３７℃における光学密度（４０５nmの吸光度）によって、凝固溶解時間を記録した。試験は、デュプリケイトで実施した。結果は、５０％凝固溶解時間として表す。
【００９７】
神経細胞の培養。
以前に記載されているように(Nicole et al., 2001)、胎仔マウス（胎生１５〜１６日目）から神経培養物を調製した。簡潔に言えば、皮質を解体し、ＤＭＥＭ中に分離し、ポリ−Ｄ−リシン（０．１mg/mL）及びラミニン（０．０２mg/mL）で予めコーティングした２４ウェルプレートにプレートした。５％ウシ胎仔血清、５％ウマ血清及び２mMグルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、細胞を培養した。加湿５％ＣＯ２雰囲気中で、培養物を３７℃に維持した。グリア増殖を阻害するために、in vitro培養３日（ＤＩＶ）後にシトシンβ−Ｄ−アラビノシド（１０μM）を追加した。in vitro培養１４日（１４ＤＩＶ）後に、種々の処置を実施した。
【００９８】
興奮毒性神経細胞死。
１０μMのグリシンを補充した無血清ＤＭＥＭ中で、皮質ニューロンをＮＭＤＡ（５０μM）に１時間曝露することによって、興奮毒性を誘導した。適応があれば、リコンビナントヒトｔＰＡ及びラットｔＰＡ関連突然変異タンパク質をＮＭＤＡと一緒にアプライした。細胞毒性検出キット(Roche Diagnostics; Mannheim, Germany)を使用して、損傷細胞からバス培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定することによって、２４時間後に神経細胞死を定量した。２００μMのＮＭＤＡに曝露した姉妹培養物で、最大神経細胞死に対応するＬＤＨレベルを決定した（ＬＤＨｍａｘ）。コントロール洗浄に供した姉妹培養物で、バックグラウンドのＬＤＨレベルを決定した（ＬＤＨｍｉｎ）。コントロールに対する神経細胞死の割合で結果を表すために、ＬＤＨｍｉｎを引いた後に実験値を測定し、次いでＬＤＨｍａｘ−ＬＤＨｍｉｎに対して標準化した。
【００９９】
フィブリンの存在下におけるプラスミノーゲンの活性化動態。
Angles-canoらが以前に記載しているように、各ｔＰＡ突然変異体について、フィブリン表面上におけるプラスミノーゲンの活性化動態を決定した。簡潔に言えば、グルタルアルデヒドによって予め活性化したＰＶＣプレート上に、フィブリノーゲン（０．３μM）を固定化した。次いで、トロンビン（１０ＮＩＨU/mL）を３７℃で２時間にわたって追加して、フィブリノーゲンをフィブリンに変換した。次いで、９nM  ＰＰＡＣＫを含有する結合緩衝液（５０mM  ＰＯ４（ｐＨ６．８）、８０mM  ＮａＣｌ、０．４％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド及び２mM  ＥＤＴＡ）で、プレートを洗浄する。次いで、フィブリン表面上で、５０μLの結合緩衝液と一緒に、ｔＰＡ変異体を３７℃で１時間インキュベーションした。緩衝液（５０mM  ＰＯ４（ｐＨ７．４）、８０mM  ＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド）で洗浄することによって非結合タンパク質を除去し、漸増量のプラスミノーゲン（０〜５００nM）及び一定濃度（０．７５mM）のプラスミン選択発色基質(CBS0065, Diagnostica STAGO, Asnieres, France)を含有する５０μLのアッセイ緩衝液（５０mM  ＰＯ４（ｐＨ７．４）、８０mM  ＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ）を追加することによって、反応を開始した。分光光度計（ELx 808, Biotek, USA）を使用して４０５nmの吸光度を１８時間にわたって記録し、以下のようにデータをプロットした：（［Ｐｎ］＝ｆ（ｔ））。各活性化因子の濃度について最大速度（ＭＰｎ．ｓ−１）を測定し、活性化因子の濃度に対してプロットした（Ｖｉ＝ｆ（［Ｐｇ］）。Lineweaver-Burk式：
【数２】
2014527805.tif 000009
に対してデータを合わせることによって、動態パラメータを決定した。
以下の式：
【数３】
2014527805.tif 000010
を使用することによって、ｋｃａｔを計算した。
【０１００】
統計分析。
両側Kruskall-Wallis検定を行い、続いて両側Mann-Whitney検定で事後比較することによって、すべての統計分析を実施した。結果は、コントロールに対する平均±ＳＤとして表す。ｐ＜０．０５の場合に、統計的に有意であるとみなす。
【０１０１】
結果
ｔＰＡに由来する新たな血栓溶解薬の作製。マルチプルアラインメントを使用して、ヒトｔＰＡ（UniProtKB：Ｐ００７５０）、ラットｔＰＡ（UniProtKB：Ｐ１９６３７）及びＤＳＰＡα１（ＤＳＰＡと命名）（UniProtKB：Ｐ９８１１９）の間の構造的差異を研究した。ラットｔＰＡは、８１％のアミノ酸同一性及び８９％の保存的置換をヒトｔＰＡと共有する（図１Ａ）。ＤＳＰＡは、６７％のアミノ酸同一性及び７９％の保存的置換をラットｔＰＡと共有する。ＤＳＰＡは、ｔＰＡのクリングル１ドメイン（図２Ａ）と高度なアミノ酸配列相同性を有する１個のクリングルドメインを含有し、構成的リシン結合部位（図２Ａ−黒枠）がない。一方、ｔＰＡのクリングル２ドメインは、２３７位及び２３９位のアスパラギン酸と２５４位のトリプトファンとのペアによって形成された構成的リシン結合部位を含有する。第２の関心点は、ｔＰＡとは対照的に、ＤＳＰＡが常に一本鎖のセリンプロテアーゼであることである（Schleuning et al., 1992）。実際、ＤＳＰＡの一次配列の分析により、ｔＰＡに存在する切断部位（Ａｒｇ２７６−Ｉｓｏ２７７）が欠如していることが明らかになっている（図２Ｂ）。興味深いことに、ｔＰＡと比較したＤＳＰＡのこれらの特徴はすべて、フィブリンに対する親和性の増加（Schleuning et al., 1992）及び神経毒性の欠如（Liberatore et al., 2003）に関連している。
【０１０２】
従って、これらの観察結果に基づいて、本発明者らは、ラットｔＰＡ（Rattus norvegicus）（ラット野生型ｔＰＡ、ｗｔ−ｔＰＡと命名）に由来する３個の突然変異タンパク質を設計及び作製した：（ｉ）そのＫ２ドメインが完全に欠失している遺伝子操作したラットｔＰＡ（１８１位〜２６２位のアミノ酸の欠失）、ΔＫ２−ｔＰＡと命名；（ｉｉ）２５４位におけるトリプトファンからアルギニンへの点突然変異（Ｗ２５４Ｒ）を含有するラットｔＰＡ、Ｋ２＊−ｔＰＡと命名；（ｉｉｉ）２７６位におけるアルギニンからセリンへの点突然変異（Ｒ２７６Ｓ）によって得られた常に一本鎖のラットｔＰＡ、ｓｃ＊−ｔＰＡと命名（表１）。上記のように、ＰＣＲによって適切な欠失／突然変異を誘発した後、方法のセクションに記載されているように、対応する６ｘヒスチジンタグ化ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（ＦＲＴ：Flp Recombination Target）に挿入し（図１Ｂ）、対応するリコンビナントタンパク質を安定生産するために、Flp-In system (Invitrogen)を発現するＨＥＫ−２９３細胞に安定トランスフェクションした。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製したら、突然変異タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び免疫ブロッティングに供した。ｗｔ−ｔＰＡ、ｓｃ＊−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡは同様の分子量を示したのに対して、Ｋ２が欠失したｔＰＡ（ΔＫ２−ｔＰＡ）は、１５kDa小さい分子量を示した（図３Ａ）。興味深いことに、ｓｃ＊−ｔＰＡは常に一本鎖型で存在するのに対して、ｗｔ−ｔＰＡ、Ｋ２＊−ｔＰＡ及びΔＫ２−ｔＰＡは二本鎖型で存在する（ΔＫ２−ｔＰＡの場合は３５kDa及び２５kDa）。従って、Ｒ２７６Ｓ点突然変異（ｓｃ＊−ｔＰＡ）は、非切断型ｔＰＡの生成につながる。ｔＰＡは、同定されていないアロステリックレギュレーターとともに、プラスミノーゲン以外のいくつかの基質、例えばＰＤＧＦ−Ｃ又はＮＭＤＡＲのＮＲ１サブユニットに結合して切断するので、本発明者らは、最初に、これらの各突然変異タンパク質の固有のタンパク質分解活性を評価した。従って、上記の異なるｔＰＡ関連突然変異タンパク質について、プラスミノーゲン含有ザイモグラフィーアッセイ（図３Ｂ）及び蛍光発生基質（Spectrofluor）に対するアミド分解活性アッセイ（図３Ｃ）を実施した。本発明者らのデータは、ｗｔ−ｔＰＡ及びクリングル２関連突然変異体（ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡ）は、ｗｔ−ｔＰＡで観察されたものと同等のアミド分解活性を示すが、ｓｃ＊−ｔＰＡは示さないことを表している。これ以降は、突然変異タンパク質の濃度は、それらの固有のタンパク質分解活性に対して標準化したものである。
【０１０３】
本発明者らは、ｗｔ−ｔＰＡ、ｓｃ＊−ｔＰＡ、Ｋ２＊−ｔＰＡ及びΔＫ２−ｔＰＡそれぞれについて、０．２６nM、１．２nM、０．５nM及び０．８２nMのＫｄを用いて、各ｔＰＡ突然変異体のフィブリン結合能を測定した（表２）。
【０１０４】
ｔＰＡは、同定されていないアロステリックレギュレーターとともに、プラスミノーゲン以外のいくつかの基質（例えば、ＧｌｕＮ１サブユニット）に結合して切断することが公知である。従って、本発明者らは、各ｔＰＡ変異体の固有のタンパク質分解活性を評価した。このようなものとして、上記の異なるｔＰＡ関連突然変異体について、蛍光発生基質（Spectrofluor）に対するアミド分解活性アッセイ、及びプラスミノーゲン含有ザイモグラフィーアッセイを実施した。このデータは、ｗｔ−ｔＰＡ及びクリングル２関連突然変異体（ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡ）は、ｗｔ−ｔＰＡで観察されたものと同等のアミド分解活性を示すが、ｓｃ＊−ｔＰＡは示さないことを表している。ｗｔ−ｔＰＡと比較したｓｃ＊−ｔＰＡ変異体の性質をさらに調査するために、本発明者らは、基質としてアミド分解Spectrozyme（登録商標）を使用することによって、両プラスミノーゲン活性化因子のＫｍを決定した。このデータにより、ｔＰＡの切断部位内の点突然変異は、ｗｔ−ｔＰＡと比較してＫｍ値を３倍増加させることが示された（それぞれ２．８３Ｅ−０４及び９．１２Ｅ−０５Ｍ）。これ以降は、特に記載しない限り、ｔＰＡ突然変異体の濃度は、それらの固有のアミド分解活性に対して標準化したものである。
【０１０５】
クリングル２関連突然変異タンパク質（ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡ）は、より高いフィブリン溶解活性を示し、ＮＭＤＡレセプター媒介性神経毒性を促進することができなかった。
方法のセクションに記載されているように、フィブリン−寒天プレート上でフィブリン溶解を開始する能力について、Ｋ２関連突然変異タンパク質を特性決定した。ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡは、ｗｔ−ｔＰＡのように、フィブリンの存在下において、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化をトリガーする（図４Ａ）。乏血小板ヒト凝固血漿（ＰＰＰ−ｃｌｏｔ）を基質として実施したin vitro凝固溶解アッセイにより、Ｋ２＊−ｔＰＡ及びΔＫ２−ｔＰＡは、ｗｔ−ｔＰＡと比較して増強したフィブリン溶解活性を示した（それぞれ＋２６％及び＋５１％）ことが明らかになった（図４Ｂ）。それらがＮＭＤＡレセプター媒介性神経毒性に及ぼす効果を評価するために、皮質ニューロンの純粋な培養物（in vitro培養１４日目）を５０μMのＮＭＤＡに単独で、又は精製ΔＫ２−ｔＰＡ若しくはＫ２＊−ｔＰＡ（０．３μMの各アミド分解活性に相当するもの）のいずれかと組み合わせて１時間曝露してから、２４時間後に神経細胞死を測定した。ラットｗｔ−ｔＰＡはＮＭＤＡＲ媒介性興奮毒性の３９％の増強をもたらし（神経細胞死は、ＮＭＤＡ単独では５１％であるのと比較して７１％である）、これは、actilyse（登録商標）を含有するヒトｔＰＡ（図５Ａ；ｎ＝３、ｐ＜０．０１）について観察されるものと同様の効果であるが、ΔＫ２−ｔＰＡ及びＫ２＊−ｔＰＡ（図５Ｂ；ｎ＝４、ｐ＜０．０１）は、神経毒性促進プロファイルを有しない。従って、ｔＰＡのクリングル２ＬＢＳの構成的アミノ酸である２５４位のトリプトファンは、ｔＰＡの神経毒性促進性を媒介するのに重要なものである。従って、ｔＰＡのＬＢＳと競合することが公知のリシン類似物であるε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）の存在下で実施した同じ実験は、ＬＢＳ機能の妨害が、野生型ｔＰＡによって誘導されるＮＭＤＡＲ媒介性神経毒性の増強を抑制したことを示している（図５Ｃ；ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。
【０１０６】
チモーゲン性ｔＰＡ（ｓｃ＊−ｔＰＡ）は、非神経毒性促進プロファイルを示す。本発明者らは、上記のように作製及び精製した非切断型のラットｔＰＡ（ｓｃ＊−ｔＰＡ）のフィブリン溶解活性及び神経毒性促進性の両方を試験した。固有のアミド分解活性が欠如しているのとは対照的に（図３Ｂ〜図３Ｃ）、ｓｃ＊−ｔＰＡは、ｗｔ−ｔＰＡの活性よりも低い活性ではあるが（−３９％）（図６Ｂ）、フィブリンの存在下で依然としてフィブリン溶解性である（図６Ａ）。次いで、皮質ニューロンの一次培養物におけるＮＭＤＡＲ媒介性神経毒性に影響を及ぼす能力について、この突然変異タンパク質を試験した。興味深いことに、ｓｃ＊−ｔＰＡは、ｗｔ−ｔＰＡと比較して、ＮＭＤＡレセプター依存性興奮毒性を増強できない（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）（図７）。
【０１０７】
まとめると、本発明者らは、ｔＰＡに由来する独自のフィブリン溶解薬のセットを作製及び特性決定した：Ｋ２＊−ｔＰＡ（配列番号４）は、フィブリン溶解活性がより高く、神経毒性促進性が欠如していることを特徴とし、ｓｃ＊−ｔＰＡ（配列番号８）は、フィブリン溶解活性が保存されているにもかかわらずアミド分解活性及び神経毒性促進性の両方が欠如していることを特徴とする。これらのin vitroデータは、可能性のある臨床応用移行前に、この新世代のフィブリン溶解薬の有効性を血栓症の実験モデルで評価するためのさらなる研究の基盤を提供する。
【０１０８】
実施例２：ヒトｔＰＡ突然変異体
材料及び方法
化学物質
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）は、Tocris (Bristol, United Kingdom)から購入した；Spectrofluor 444FLは、American Diagnostica (ADF Biomedical, Neuville-sur-oise, France)製であった；６−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）、Dulbecco改変Eagle培地（ＤＭＥＭ）、ポリ−Ｄ−リシン、シトシンβ−Ｄ−アラビノシド及びハイグロマイシンＢは、Sigma-Aldrich (L’Isle d’Abeau, France)製であった。Lipofectamine 2000、ウシ胎仔血清及びウマ血清、ラミニン並びにGeneArt（登録商標）部位特異的突然変異誘発システムは、Invitrogen (Cergy Pontoise, France)製であった。ｔＰＡ（Alteplase（登録商標））は、Boehringer-Ingleheim (Paris, France)製であった。レテプラーゼ（Rapilysin）は、Actavis (Paris, France)製であった。
【０１０９】
野生型ｔＰＡを含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターの構築。
【化５】
2014527805.tif 000011
を使用してＰＣＲによって、ヒトｔＰＡを増幅した（成熟タンパク質のＮ末端部に６ｘＨｉｓタグを有する）。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)に挿入した。最終構築物を自動で配列決定した。
【０１１０】
部位特異的突然変異誘発
GeneArt（登録商標）部位特異的突然変異誘発システム並びに以下のプライマー：
【化６】
2014527805.tif 000012
を使用して、ｈｕｔＰＡｗｔの突然変異誘発を実施した。
配列分析によって、突然変異を確認した。
【０１１１】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）−２９３細胞の培養及び安定トランスフェクション
ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏベクター(HEK-FlpIn, Invitrogen)でトランスフェクションした安定ヒト胎児腎臓２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び２mMグルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で成長させた。lipofectamine 2000を使用して、細胞をトランスフェクションした。ハイグロマイシンＢ選択によって、陽性クローンを単離した。ＲＴ−ＰＣＲｑによって、トランスフェクションの質を評価した。
【０１１２】
ｔＰＡ関連突然変異体のバイオリアクター生産
高収量の突然変異体遺伝子を生産するために、安定トランスフェクションしたＨＥＫ細胞を実験室規模のバイオリアクターCELLine AD 1000(Dominique Dutscher SAS, Brumath, France)中で成長させた。
【０１１３】
６ｘｈｉｓ突然変異体の精製
ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）金属−アフィニティークロマトグラフィーマトリックス(Qiagen, Courtaboeuf, France)を使用して、精製を進めた。次いで、ｔＰＡ突然変異体をＮＨ４ＨＣＯ３０．５Ｍ緩衝液中で整え、保存した。
【０１１４】
ｔＰＡ免疫ブロッティング
National institute for agronomic research (INRA, Clermont-Theix, France)で調製されたヒトｔＰＡ（１：５０００）に対して作製したポリクローナルヒツジ抗血清、及びマウスｔＰＡ（１２５ng/μl）に対して作製したポリクローナルウサギ抗血清を使用して、免疫ブロッティングを実施し、続いて、適切なペルオキシダーゼ標識二次抗体と一緒にインキュベーションした。強化化学発光ECL Plus免疫ブロッティング検出システム(Perkin Elmer-NEN, Paris, France)を用いて、免疫ブロットを可視化した。
【０１１５】
アミド分解活性アッセイ
蛍光発生基質（５μM）（Spectrofluor（登録商標）FL444）の存在下で、ｔＰＡ変異体をインキュベーションした。１５０mM  ＮａＣｌを含有する５０mMトリス（ｐＨ８．０）（総容量１００μL）中、３７℃で、反応を行った。アミド分解活性は、４４０nmの蛍光発光（３６０nmで励起）の変化として測定した。
【０１１６】
凝固溶解時間
クエン酸血からヒト血漿を得た。１５mMの塩化カルシウム並びに４００、４２０、４４０、４６０、４８０及び５００I.Uの各ｔＰＡ突然変異体を血漿に補充した。上記のようにオイグロブリン画分を回収し、１５mMの塩化カルシウム並びに１５、２０、２５、３０、３５又は４０I.U.のｔＰＡ突然変異タンパク質を補充した。市販型のｔＰＡ（actilyse）を参照し、３７℃における光学密度測定（Ａ４０５nm）によって、凝固溶解時間を記録した。試験は、デュプリケイトで実施した（３回の独立した実験による）。結果は、５０％の凝固溶解が得られる時間として表す。
【０１１７】
神経細胞の培養
胎仔マウス（胎生１５〜１６日目）から神経培養物を調製した。皮質を解剖し、ＤＭＥＭ中に分離し、ポリ−Ｄ−リシン（０．１mg/mL）及びラミニン（０．０２mg/mL）で予めコーティングした２４ウェルプレートにプレートした。５％ウシ胎仔血清、５％ウマ血清及び２mMグルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、細胞を培養した。加湿５％ＣＯ２雰囲気中で、培養物を３７℃に維持した。グリア増殖を阻害するために、in vitro培養３日（ＤＩＶ）後にシトシンβ−Ｄ−アラビノシド（１０μM）を追加した。in vitro培養１４日（１４ＤＩＶ）後に、種々の処置を実施した。
【０１１８】
興奮毒性神経細胞死
１０μMのグリシンを補充した無血清ＤＭＥＭ中で、皮質ニューロンをＮＭＤＡ（５０μM）に１時間曝露することによって、興奮毒性を誘導した。適応があれば、異なるｔＰＡ変異体をＮＭＤＡと一緒にアプライした。細胞毒性検出キット(Roche Diagnostics; Mannheim, Germany)を使用して、損傷細胞からバス培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定することによって、２４時間後に神経細胞死を定量した。２００μMのＮＭＤＡに曝露した姉妹培養物で、最大神経細胞死に対応するＬＤＨレベルを決定した（ＬＤＨｍａｘ）。コントロール洗浄に供した姉妹培養物で、バックグラウンドのＬＤＨレベルを決定した（ＬＤＨｍｉｎ）。コントロールに対する神経細胞死の割合で結果を表すために、ＬＤＨｍｉｎを引いた後に実験値を測定し、次いでＬＤＨｍａｘ−ＬＤＨｍｉｎに対して標準化した。
【０１１９】
興奮毒性損傷
イソフルラン誘導麻酔下の雄性スイスマウス（２５〜３０ｇ；CURB, Caen, France）で、興奮毒性損傷を実施した。動物を定位固定フレーム下に配置した後、１２，５nmolのＮＭＤＡの線条体注射（座標：ブレグマに対して０．５mm後側、＋２．０mm外側、−３．０mm腹側；Paxinos & Watson, 1995）をＮＭＤＡ／actilyse、ＮＭＤＡ／Ｏｐｔ−ＰＡ又はＮＭＤＡ／ｈｕｔＰＡＫ２＊（１２，５mMのＮＭＤＡ及び５μMのアミド分解活性に相当するｔＰＡ；総容量１μl）と対比して実施した。適合注射針（１５mm/μLでキャリブレーション；アシスタントｒｅｆ５５５／５；Hoecht, Sodheim-Rhoen, Germany）を使用して注射を行い、５分後に取り出した。２４時間後に、脳をＭＲＩ分析した。
【０１２０】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
興奮毒性損傷を行った２４時間後に、Pharmascan 7T (Bruker, Germany)で実験を行った。マルチスライスマルチエコー（ＭＳＭＥ）シーケンス：ＴＥ／ＴＲ５１．３ms／１７００ms（空間分解能７０×７０×３５０μm3）を使用して、Ｔ２強調画像を得た。ImageJ software (v1.45r)を使用してこれらの画像上で、損傷サイズを定量した。
【０１２１】
結果
ｔＰＡに由来する新たな血栓溶解薬の作製。本発明者らは、ヒトｔＰＡに由来する６個のｔＰＡ突然変異体を設計及び作製した：（ｉ）ヒト野生型ｔＰＡ、ｈｕｔＰＡｗｔ（配列番号２７）と命名；（ｉｉ）そのＫ２ドメインが完全に欠失している遺伝子操作したヒトｔＰＡ（１８０位〜２６１位のアミノ酸の欠失）、ｈｕｔＰＡΔＫ２と命名；（ｉｉｉ）２５３位におけるトリプトファンからアルギニンへの点突然変異（Ｗ２５３Ｒ、配列番号２８）を含有するヒトｔＰＡ、ｈｕｔＰＡＫ２＊と命名；（ｉｖ）２７５位におけるアルギニンからセリンへの点突然変異（Ｒ２７５Ｓ、配列番号２９）によって得られた常に一本鎖のヒトｔＰＡ、ｈｕｔＰＡｓｃ＊と命名；（ｖ）二重突然変異Ｗ２５３Ｒ  Ｒ２７５Ｓを含有するヒトｔＰＡ、Ｏｐｔ−ＰＡと命名（配列番号３０）；（ｖｉ）三重突然変異Ｐ１２５Ｒ  Ｗ２５３Ｒ  Ｒ２７５Ｓを含有するヒトｔＰＡ（配列番号３１）、Ｏｐｔ−ＰＡ２と命名。上記のように、ＰＣＲによって適切な欠失／突然変異を誘発した後、方法のセクションに記載されているように、対応する６ｘヒスチジンタグ化ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴに挿入し、対応するリコンビナントタンパク質を安定生産するために、Flp-In system (Invitrogen)を発現するＨＥＫ−２９３細胞に安定トランスフェクションした。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製したら、ｔＰＡ突然変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び免疫ブロッティングに供した。標準としてレテプラーゼ及びアクチバーゼを使用した（図８）。興味深いことに、Ｒ２７５Ｓ点突然変異を有するｔＰＡ突然変異体は、常に一本鎖型で存在する。
【０１２２】
ヒト由来ｔＰＡ突然変異体の生化学的特性決定。本発明者らは、最初に、これらの各突然変異体の固有のタンパク質分解活性を評価した。従って、蛍光発生基質（Spectrofluor）（図９−左）に対するアミド分解活性アッセイを実施した。本発明者らのデータは、ｓｃ＊−ｔＰＡ、Ｏｐｔ−ＰＡ及びＯｐｔ−ＰＡ２が、それぞれ１０倍、２，５倍及び２倍減少したアミド分解活性を示すことを表している。乏血小板ヒト凝固血漿（ＰＰＰ−ｃｌｏｔ）を基質として実施したin vitro凝固アッセイのモデルでフィブリン溶解を開始する能力について、突然変異体を特性決定した。これらのアッセイは、Ｏｐｔ−ＰＡ及びＯｐｔ−ＰＡが両方とも、ｔＰＡ阻害剤の存在下でも（違いは１桁分しかない、図９−右）フィブリン溶解をトリガーする同様の潜在能力を示す（図９−中央）ことを表している。
【０１２３】
Ｒ２７５Ｓ点突然変異は、ｔＰＡ関連ＮＭＤＡレセプター媒介性神経毒性を無効化するのに十分ではない。ｔＰＡ突然変異体であるｈｕｔＰＡｓｃ＊及びＯｐｔ−ＰＡ２がＮＭＤＡレセプター媒介性神経毒性に及ぼす効果を評価するために、皮質ニューロンの純粋な培養物（in vitro培養１４日目）を５０μMのＮＭＤＡに単独で、又は精製突然変異体（０．３μM）と組み合わせて１時間曝露してから、２４時間後に神経細胞死を測定した。actilyseはＮＭＤＡＲ媒介性興奮毒性の６１％の増強をもたらすが（神経細胞死は、ＮＭＤＡ単独では３７％であるのと比較して５９％である）、ｈｕｔＰＡｓｃ＊についても同様の効果が観察されている（神経細胞死は６２％である、図１０；ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。従って、Ｒ２７５Ｓ点突然変異はそれ自体では、ｔＰＡ関連ＮＭＤＡレセプター媒介性神経毒性を無効化するのに十分ではない。本発明者らはまた、上記の実験設定で三重突然変異体Ｏｐｔ−ＰＡを試験した。本発明者らは、ｔＰＡ関連ＮＭＤＡレセプター媒介性神経毒性を無効化する強い傾向（しかし有意ではない）を観察した（神経細胞死は５１％である、ｎ＝４、ｐ＝０．０８）。
【０１２４】
クリングル２関連ヒトｔＰＡ突然変異体は、非神経毒性プロファイルを示す。興奮毒性神経細胞死アッセイにおいて、ｈｕｔＰＡｓｃ＊及びＯｐｔ−ＰＡ２の代わりにｈｕｔＰＡＫ２＊及びＯｐｔ−ＰＡを使用した（図１１）。ここでは、actilyseはＮＭＤＡＲ媒介性興奮毒性の４１％の増強をもたらすが（神経細胞死は、ＮＭＤＡ単独では５３％であるのと比較して７５％である）、ｈｕｔＰＡＫ２＊及びＯｐｔ−ＰＡはＮＭＤＡＲ媒介性神経毒性を促進しない（神経細胞死はそれぞれ６４％及び６２％である、図１１；ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。従って、ｔＰＡのクリングル２ＬＢＳの構成的アミノ酸である２５３位のトリプトファンは、ｔＰＡの神経毒性促進性を媒介するのに重要なものである。２個のｔＰＡ突然変異体（ｈｕｔＰＡＫ２＊及びＯｐｔ−ＰＡ）は、興味深い非神経毒性プロファイルを有する。
【０１２５】
Ｏｐｔ−ＰＡは、線条体損傷のin vivoモデルで神経毒性を増加させない。次いで、本発明者らは、線条体損傷のin vivoモデルで、ｈｕｔＰＡＫ２＊及びＯｐｔ−ＰＡの両方の神経毒性を試験した。方法のセクションに記載されているように、１２．５mMのＮＭＤＡ及び５μMのｔＰＡ変異体をスイスマウスの線条体に注射する。注射の２４時間後に、非侵襲ＭＲＩイメージングを使用して、損傷容積を測定する（図１２）。actilyseはＮＭＤＡ媒介性興奮毒性の４８％の増強をもたらすのに対して（損傷容積は、ＮＭＤＡ単独では３．６２mm3であるのと比較して５．３６mm3である）、ｈｕｔＰＡＫ２＊は不均一な神経毒性効果を有し（損傷容積は５．１５mm3である）、Ｏｐｔ−ＰＡはＮＭＤＡ媒介性神経毒性を促進しない（損傷容積は４．００mm3である、図１２；ｎ＝１１、ｐ＜０．０５）。
【０１２６】
まとめると、本発明者らは、ヒトｔＰＡに由来する独自のフィブリン溶解薬のセットを作製及び特性決定した。この突然変異体のセットから、Ｏｐｔ−ＰＡ（配列番号３０）は、in vitro及びin vivoでactilyseと同様のフィブリン溶解活性があり、神経毒性促進性が欠如していることを特徴とする。これらのデータは、可能性のある臨床応用移行前に、この新世代のフィブリン溶解薬の有効性を血栓症の実験モデルで評価するためのさらなる研究の基盤を提供する。
【０１２７】
【表２】
2014527805.tif 000013
2014527805.tif 000014
2014527805.tif 000015
2014527805.tif 000016
2014527805.tif 000017
【図３Ａ】
2014527805.tif 000018
【図１Ａ】
2014527805.tif 000019
【図１Ｂ】
2014527805.tif 000020
【図２Ａ】
2014527805.tif 000021
【図２Ｂ】
2014527805.tif 000022
【図３Ｂ】
2014527805.tif 000023
【図３Ｃ】
2014527805.tif 000024
【図４Ａ】
2014527805.tif 000025
【図４Ｂ】
2014527805.tif 000026
【図５Ａ】
2014527805.tif 000027
【図５Ｂ】
2014527805.tif 000028
【図５Ｃ】
2014527805.tif 000029
【図６Ａ】
2014527805.tif 000030
【図６Ｂ】
2014527805.tif 000031
【図７】
2014527805.tif 000032
【図８】
2014527805.tif 000033
【図９】
2014527805.tif 000034
【図１０】
2014527805.tif 000035
【図１１】
2014527805.tif 000036
【図１２】
2014527805.tif 000037
【図１３】
2014527805.tif 000038
【図１４】
2014527805.tif 000039
【配列表】
2014527805000001.app
【国際調査報告】
2014527805.tif 000040
2014527805.tif 000041
2014527805.tif 000042
2014527805.tif 000043
2014527805.tif 000044