(57)【要約】ＧＰＲ４９に対する抗体、およびそのような抗体の使用について本明細書にて記載する。種々の態様は、ＧＰＲ４９に対するモノクローナル、ヒト化、もしくは完全ヒト抗体、そのような抗体を発現するハイブリドーマもしくはその他の細胞株、そのような抗体をコードする核酸および核酸を含むベクター、ならびにそのような抗体による癌の治療方法に関する。
2014533247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における癌を治療する方法であって、
１０×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合するモノクローナル抗体の治療量を、前記哺乳類へ投与することを含み、
前記ＧＰＲ４９ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、
前記治療量は前記癌の治療に十分である、方法。
【請求項２】
前記抗体が１×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体の前記治療量が前記哺乳類中にて腫瘍成長を低減するのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍成長の低減が腫瘍体積の減少として測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体の前記治療量が、コントロールと比較して、前記哺乳類の生存率を増加させるのに十分である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がＩｇＧクラス抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＩｇＧ１クラス抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がヒト抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がマウス抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、７８Ｆ０５、５Ｄ６．３、１Ｂ３．５、１４Ａ８．１、７６Ｃ１２、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、５Ｆ２．５、７Ｃ３．４、および８Ｅ９．１から成るリストより選択されるモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体またはその断片が、７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４から成る群より選択されるモノクローナル抗体、または
モノクローナル抗体２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体
を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、１×１０−１２Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９ポリペプチドと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類対象中での治療された癌腫瘍の再成長を阻止する方法であって、
Ｇタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合するモノクローナル抗体の治療量を前記哺乳類対象に投与することを含み、
前記ＧＰＲ４９ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、
前記治療量は治療された癌腫瘍の再成長を阻止するのに十分である、方法。
【請求項１５】
前記抗体が、７８Ｆ０５、５Ｄ６．３、１Ｂ３．５、１４Ａ８．１、７６Ｃ１２、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、５Ｆ２．５、７Ｃ３．４、および８Ｅ９．１から成るリストより選択されるモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類対象中での治療された癌腫瘍の再成長を遅延する方法であって、
Ｇタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合するモノクローナル抗体の治療量を前記哺乳類対象に投与することを含み、
前記ＧＰＲ４９ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、
前記治療量は、治療された癌腫瘍の再成長を阻止するのに十分である、方法。
【請求項１７】
前記抗体が、７８Ｆ０５、５Ｄ６．３、１Ｂ３．５、１４Ａ８．１、７６Ｃ１２、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、５Ｆ２．５、７Ｃ３．４、および８Ｅ９．１から成るリストより選択されるモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１０×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合し、前記ＧＰＲ４９ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体。
【請求項１９】
前記抗体がＩｇＧクラス抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体がＩｇＧ１クラス抗体である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が５×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９と結合する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体が１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９と結合する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が１０−１０Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９と結合する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が１０−１１Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９と結合する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体が１０−１２Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９と結合する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２８】
前記Ｋｄが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光励起細胞分離（ＦＡＣｓ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって特定される、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、モノクローナル抗体７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｃ１０．５、１０Ａ９．２、２Ｈ９−２、６Ｈ５．４、６Ｇ１０．１、８Ｅ９．１、１１Ｆ６．１、１２Ｇ５．１、５Ｂ１０．１、６Ｈ５．１、１４Ａ８．１、９Ｃ７．１、４Ａ１０．２、１４Ｈ９．１、１４Ｅ３．１、１４Ｆ７．１、４Ｆ６．２、６Ｅ１０．１、２Ｐ６９．２、３Ｆ１１．１、７Ｃ３．４、１８Ｇ７．１、１Ｂ３．５、または１７Ｃ９．１である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体またはその断片が、７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４から成る群より選択されるモノクローナル抗体、または
モノクローナル抗体２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体
を阻害する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項３１】
１×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合し、前記ＧＰＲ４９ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む、癌の治療のためのモノクローナル抗体。
【請求項３２】
前記抗体が、７８Ｆ０５、５Ｄ６．３、１Ｂ３．５、１４Ａ８．１、７６Ｃ１２、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、５Ｆ２．５、７Ｃ３．４、および８Ｅ９．１から成るリストより選択されるモノクローナル抗体である、請求項３１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３３】
前記抗体またはその断片が、７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４から成る群より選択されるモノクローナル抗体、または
モノクローナル抗体２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体
を阻害する、請求項３１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３４】
前記モノクローナル抗体が、１×１０−１２Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９ポリペプチドと結合する、請求項３１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３５】
１×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合し、前記ＧＰＲ４９ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む、腫瘍再成長の阻止のためのモノクローナル抗体。
【請求項３６】
前記抗体が、７８Ｆ０５、５Ｄ６．３、１Ｂ３．５、１４Ａ８．１、７６Ｃ１２、１８
Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、５Ｆ２．５、７Ｃ３．４、および８Ｅ９．１から成るリストより選択されるモノクローナル抗体である、請求項３５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３７】
前記抗体またはその断片が、７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４から成る群より選択されるモノクローナル抗体、または
モノクローナル抗体２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体
を阻害する、請求項３５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３８】
前記モノクローナル抗体が、１×１０−１２Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９ポリペプチドと結合する、請求項３５に記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リストの参照
本出願は、電子フォーマットでの配列リストと共に出願される。この配列リストは、２０１２年１０月２６日に作成されたBIONO.002WO_Sequence.txtというファイル名のファイルとして提供され、そのサイズは、およそ３１ｋｂである。この電子フォーマットでの配列リストの情報は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月１日に出願された、発明の名称が、METHODS OF TREATING CANCERである米国特許仮出願第６１／５５４，４３６号の優先権を主張するものであり、本出願はまた、２０１１年１１月１日に出願された、発明の名称が、ANTI-GPR49 ANTIBODIESである米国特許仮出願第６１／５５４，４４０号の優先権も主張するものであり、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、癌生物学の分野全体に関する。より詳細には、実施形態は、ＧＰＲ４９に対する抗体、およびそのような抗体の使用に関する。いくつかの実施形態は、ＧＰＲ４９に対するモノクローナル、ヒト化、もしくは完全ヒト抗体、そのような抗体を発現するハイブリドーマもしくはその他の細胞株、そのような抗体をコードする核酸および核酸を含むベクター、ならびにそのような抗体による癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）は、ＬＧＲ５／ＨＧ３８／ＦＥＸとしても知られ、構造的に糖タンパク質ホルモン受容体に類似するロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）に属する。ＬＧＲは、以下の３つのサブグループに分類される：（１）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体、および黄体ホルモン（ＬＨ）受容体を含む糖タンパク質ホルモン受容体；（２）リラキシン受容体ＬＧＲ７およびＬＧＲ８；ならびに（３）ＧＰＲ４８、ＧＰＲ４９、およびＬＧＲ６。ＧＰＲ４９は、腸、骨格筋、胎盤、脳、および脊髄を含むいくつかの組織中にて発現される。しかし、ＧＰＲ４９の機能に関してはほとんど分かっていない。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態は、哺乳類における癌を治療する方法に関し、その方法は、１×１０−９Ｍ未満のＫｄにてＧタンパク質共役受容体４９（ＧＰＲ４９）ポリペプチドと結合する、治療量のモノクローナル抗体のをその哺乳類へ投与することを含み、ＧＰＲ４９ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、治療量は、その癌の治療に十分な量である。１つの態様では、抗体の治療量は、哺乳類における腫瘍成長を低減するのに十分な量である。別の態様では、腫瘍成長の低減は、腫瘍体積の減少として測定される。さらなる態様では、抗体の治療量は、コントロールに対してその哺乳類の生存率を増加させるのに十分な量である。追加の態様では、抗体は、１×１０−１２Ｍ未満のＫｄにてＧＰＲ４９ポリペプチドと結合する。
【０００６】
他の態様では、抗体は、ＩｇＧクラス抗体、ＩｇＧ１クラス抗体、ヒト抗体、またはマウス抗体である。追加の態様では、ＧＰＲ４９ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から成る。
【０００７】
さらなる態様では、抗体は、モノクローナル抗体７８Ｆ０５、５Ｄ６．３、１Ｂ３．５、１４Ａ８．１、７６Ｃ１２、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、５Ｆ２．５
、または７Ｃ３．４である。
【０００８】
種々の態様では、抗体は、７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４から成る群より選択されるモノクローナル抗体を、またはモノクローナル抗体２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２から成る群より選択される、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、競合的に阻害する。
【０００９】
特定の態様は、ＧＰＲ４９と特異的に結合する抗体またはその断片を作製する方法に関し、その方法は、請求項１に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを有する宿主細胞を培養すること；および前記抗体またはその断片を回収することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡによる、抗ＧＰＲ４９  ＦａｂのヒトＧＰＲ４９−Ｆｃとの結合を示す棒グラフである。
【図２】図２は、ＦＡＣＳによる、抗ＧＰＲ４９  ＦａｂのヒトＧＰＲ４９−ＨＡトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｅ細胞との結合を示す棒グラフである。
【図３Ａ】図３は、ＦＡＣＳ結合による、ＣＨＯ−ＧＰＲ４９細胞（図３Ａ）または親ＣＨＯ細胞（図３Ｂ）に対する３つのＤｙａｘ  Ｆａｂ候補のＥＣ５０値を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３は、ＦＡＣＳ結合による、ＣＨＯ−ＧＰＲ４９細胞（図３Ａ）または親ＣＨＯ細胞（図３Ｂ）に対する３つのＤｙａｘ  Ｆａｂ候補のＥＣ５０値を示すグラフである。
【図４Ａ】図４は、幾何平均（図４Ａ）または陽性細胞パーセント（図４Ｂ）によって測定される、ＧＰＲ４９  ＦａｂのＳＷ６２０結腸腫瘍細胞との結合を示す一式の棒グラフである。
【図４Ｂ】図４は、幾何平均（図４Ａ）または陽性細胞パーセント（図４Ｂ）によって測定される、ＧＰＲ４９  ＦａｂのＳＷ６２０結腸腫瘍細胞との結合を示す一式の棒グラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＦＡＣＳ幾何平均によって測定される、ＧＰＲ４９  ＦａｂのＳＷ４８０結腸腫瘍細胞との結合を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＦＡＣＳ陽性細胞パーセントによって測定される、ＧＰＲ４９  ＦａｂのＳＷ４８０結腸腫瘍細胞との結合を示す棒グラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＳＷ４８０結腸腫瘍細胞との結合に用いられる７６Ｃ１２  Ｆａｂの種々の濃度に対する一連のＦＡＣＳヒストグラムである。
【図６Ａ】図６Ａは、ＦＡＣＳ幾何平均によって測定される、ＧＰＲ４９  ＦａｂのＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞との結合を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＦＡＣＳ陽性細胞パーセントによって測定される、ＧＰＲ４９  ＦａｂのＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞との結合を示す棒グラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞との結合に用いられる７６Ｃ１２  Ｆａｂの種々の濃度に対する一連のＦＡＣＳヒストグラムである。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。図８Ｂおよび８Ｄは、それぞれ、図８Ａおよび８Ｃの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。図８Ｂおよび８Ｄは、それぞれ、図８Ａおよび８Ｃの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図８Ｃ】図８Ａおよび８Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。図８Ｂおよび８Ｄは、それぞれ、図８Ａおよび８Ｃの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図８Ｄ】図８Ａおよび８Ｃは、ＦＡＣｓによる、マウスＧＰＲ４９抗体のＣＨＯ  ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ発現細胞との結合を示すグラフである。図８Ｂおよび８Ｄは、それぞれ、図８Ａおよび８Ｃの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ａ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｂ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｃ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｄ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｅ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｆ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｇ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図９Ｈ】図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇは、ダイレクトＥＬＩＳＡによる、第二世代マウス抗体のＧＰＲ４９との結合を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、および９Ｈは、それぞれ、図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｇの抗体のＥＣ５０を示す表である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、分離ＧＰＲ４９＋、分離ＧＰＲ４９−、または未分離結腸腫瘍細胞からの腫瘍スフェアの平均数を示す棒グラフである。図１０Ｂは、腫瘍スフェアアッセイにおけるＧＰＲ４９＋およびＧＰＲ４９−の顕微鏡像である。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、分離ＧＰＲ４９＋、分離ＧＰＲ４９−、または未分離結腸腫瘍細胞からの腫瘍スフェアの平均数を示す棒グラフである。図１０Ｂは、腫瘍スフェアアッセイにおけるＧＰＲ４９＋およびＧＰＲ４９−の顕微鏡像である。
【図１１Ａ】図１１は、ＧＰＲ４９＋  ＭｏＦｌｏ分離結腸腫瘍細胞を接種したマウスにおける、経時での腫瘍体積（図１１Ａ）および体重（図１１Ｂ）を示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１は、ＧＰＲ４９＋  ＭｏＦｌｏ分離結腸腫瘍細胞を接種したマウスにおける、経時での腫瘍体積（図１１Ａ）および体重（図１１Ｂ）を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、マウスにおけるＧＰＲ４９抗体７６Ｃ１２の経時での血清濃度を示すグラフである。図１２Ｂは、マウスにおける、ＧＰＲ４９抗体７６Ｃ１２の週１回投与した用量のシミュレーションによる経時での血清濃度を示すグラフである。図１２Ｃは、単一の腹腔内投与後のマウスにおける抗ＧＰＲ４９抗体Ｃ１２  ＩｇＧ１の薬物動態パラメータを示す表である。
【図１２Ｂ】図１２Ａは、マウスにおけるＧＰＲ４９抗体７６Ｃ１２の経時での血清濃度を示すグラフである。図１２Ｂは、マウスにおける、ＧＰＲ４９抗体７６Ｃ１２の週１回投与した用量のシミュレーションによる経時での血清濃度を示すグラフである。図１２Ｃは、単一の腹腔内投与後のマウスにおける抗ＧＰＲ４９抗体Ｃ１２  ＩｇＧ１の薬物動態パラメータを示す表である。
【図１２Ｃ】図１２Ａは、マウスにおけるＧＰＲ４９抗体７６Ｃ１２の経時での血清濃度を示すグラフである。図１２Ｂは、マウスにおける、ＧＰＲ４９抗体７６Ｃ１２の週１回投与した用量のシミュレーションによる経時での血清濃度を示すグラフである。図１２Ｃは、単一の腹腔内投与後のマウスにおける抗ＧＰＲ４９抗体Ｃ１２  ＩｇＧ１の薬物動態パラメータを示す表である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＩｇＧ１コントロールｍＡｂ、抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂ  ７６Ｃ１２（Ｃ１２）、またはイリノテカンで処理したマウスにおける、経時での原発性結腸腫瘍体積を示すグラフである。図１３Ｂは、第６２日におけるＴ／Ｃ値を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａは、ＩｇＧ１コントロールｍＡｂ、抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂ  ７６Ｃ１２（Ｃ１２）、またはイリノテカンで処理したマウスにおける、経時での原発性結腸腫瘍体積を示すグラフである。図１３Ｂは、第６２日におけるＴ／Ｃ値を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＩＤＥＣ１５２コントロール抗体、７６Ｃ１２（ＥＴ  ＣＳＣ  ｍＡｂ）、化学賦形剤（chemo vehicle）を有するコントロールｍＡｂ、または化学賦形剤を有するＥＴ  ＣＳＣ  ｍＡｂで処理したマウスにおける、経時での腫瘍体積を示す一式のグラフである。
【図１５】図１５は、未処理マウス、またはイリノテカンおよびＩｇＧ１コントロール、７６Ｃ１２（ＥＴ  ｍＡｂ）、もしくはイリノテカンおよび７６Ｃ１２（ＥＴ  ｍＡｂ）で処理したマウスの、経時での生存パーセントを示すカプラン・マイヤー曲線である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＩＤＥＣ１５２コントロール抗体、イリノテカンおよびＩＤＥＣ１５２コントロール抗体、または７６Ｃ１２（Ｃ１２）抗体で処理したマウスにおける、経時でのＤＬＤ−１結腸異種移植腫瘍成長を示すグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、デキストロースコントロール、イリノテカンおよびコントロールＩｇＧ１、またはイリノテカンおよび７６Ｃ１２（ＥＴ１２）抗体で処理したマウスにおける、経時でのＤＬＤ−１結腸異種移植腫瘍成長を示すグラフである。
【図１７】図１７は、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有する原発性結腸癌モデルにおける腫瘍成長阻害を示すグラフである。
【図１８】図１８は、腫瘍成長阻害パーセントを示す図である。
【図１９】図１９は、ＧＰＲ４９  ｍＡｂ＋イリノテカンの組み合わせで処理したＫ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有するＣＲＣ腫瘍の腫瘍阻害パーセントを示す図である。
【図２０】図２０は、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、ＳＴＫ１１、ＪＡＫ２、およびＲＢ１変異を有する原発性結腸癌モデルにおける腫瘍成長阻害を示すグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、抗ＧＰＲ４９抗体が、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有する結腸癌腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させることを示す図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、抗ＧＰＲ４９抗体による処理により、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有するＣＲＣ腫瘍が第二のレシピエントマウスへ移植された場合に新たな腫瘍を再形成する能力が阻害されることを示すグラフである。
【図２２】図２２は、ＧＰＲ４９  ｍＡｂ  １８Ｇ．７．１による処理によって、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、ＳＴＫ１１、ＪＡＫ２、およびＲＢ１変異を有するＣＲＣ腫瘍からの癌幹細胞の数が減少することを示す図である。ＣＳＣ頻度は、示されるように既に処理された原発性ＣＲＣ腫瘍細胞を用いた、連続再移植、限界希釈アッセイにて測定した。
【図２３】図２３は、抗ＧＰＲ４９抗体＋イリノテカンの処理によって、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、ＳＴＫ１１、ＪＡＫ２、およびＲＢ１変異を有するＣＲＣ腫瘍の、第二のレシピエントマウスへの再移植後に成長する能力が阻害されることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本出願のいくつかの実施形態は、ＧＰＲ４９に対する抗体、およびそのような抗体による癌の治療に関する。種々の実施形態は、ＧＰＲ４９に対するヒト化または完全ヒト抗体、そのような抗体を発現するハイブリドーマまたはその他の細胞株、そのような抗体をコードする核酸および核酸を含むベクター、ならびにそのような抗体による癌の治療方法に関する。
【００１２】
抗ＧＰＲ４９抗体
いくつかの実施形態は、抗ＧＰＲ４９抗体に関する。本明細書で用いられるＧＰＲ４９としては、これらに限定されないが、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号１）のポリペプチドを含むヒトＧＰＲ４９が挙げられ、これは、ＮＭ＿００３６６７．２（配列番号２）またはその断片内のコードヌクレオチド配列によってコードされる。ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００３６５８．１のアミノ酸配列およびＮＭ＿００３６６７．２のヌクレオチド配列は、その全体が参照により完全に組み込まれる。本明細書で考慮されるＧＰＲ４９断片の例としては、ＧＰＲ４９外部ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内ドメイン、およびその一部が挙げられる。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、「抗体」の用語は、これらに限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組換えによって作製された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）（二重特異性ｓｄＦｖを含む）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合性断片を含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれよりも多い多重特異性のものであってよい。多重特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってよく、またはポリペプチドならびに、異種ポリペプチドまたは固体支持物質などの異種エピトープの両方に対して特異的であってもよい。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。
【００１４】
考慮されるその他の抗ＧＰＲ４９抗体としては、「オリゴクローナル」抗体が挙げられる。本明細書で用いられる場合、「オリゴクローナル」抗体の用語は、別々のモノクローナル抗体の既定の混合物を意味する。オリゴクローナル抗体を作製するための方法は、本技術分野にて公知である。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／２０４０１の「実施例セクション」、実施例１；米国特許第５，７８９，２０８号および同第６，３３５，１６３号を参照されたい。特定の実
施形態では、オリゴクローナル抗体は、単一細胞中で作り出される１つ以上のエピトープに対する抗体の既定の混合物から成る。他の実施形態では、オリゴクローナル抗体は、共通の軽鎖とペア形成して多重特異性を有する抗体を作り出すことができる複数の重鎖を含む（例：その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ０４／００９６１８）。オリゴクローナル抗体は、単一の標的分子上（例：ＧＰＲ４９）の複数のエピトープを標的とすることが所望される場合に、特に有用である。意図する目的および所望される必要性に対してどのような種類の抗体または抗体の混合物が適用可能であるかについては、当業者であれば公知であるか、または判断することができる。特に、いくつかの実施形態の抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、ＧＰＲ４９抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子（例：抗ＧＰＲ４９抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。また、いくつかの実施形態の抗体が、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、ＧＰＲ４９抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子（例：抗ＧＰＲ４９抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含むことも特に考慮される。
【００１５】
いくつかの実施形態は、抗体７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４を含む、以下の実施例に記載のようにして作製される抗ＧＰＲ４９ヒトＦａｂに関し、これらは、ヒトＧＰＲ４９−Ｆｃ外部ドメイン（ＧＰＲ４９−ＲＦｃ）（配列番号３）と結合する。いくつかの実施形態は、実施例に記載のように、これらのＦａｂの完全長ヒトＩｇＧに関する。
【００１６】
いくつかの実施形態は、以下の実施例に記載のように、ヒトＧＰＲ４９外部ドメイン（ＧＰＲ４９−Ｈｉｓ）（配列番号４）に対して産生されるマウスモノクローナル抗体に関し、抗体２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、および６Ｇ１０．１を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態は、以下の実施例に記載のように、完全長ヒトＧＰＲ４９に対して産生されるマウスモノクローナル抗体に関し、抗体１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態の抗ＧＰＲ４９抗体は、免疫グロブリン分子のいかなるタイプ（例：ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。様々なＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ重鎖が、カッパまたはラムダ型の軽鎖とペア形成し得る。
【００１９】
いくつかの実施形態は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する
抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つを含む抗ＧＰＲ４９抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマに関する。１つの態様では、このハイブリドーマは、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。
【００２０】
ある実施形態は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つを含む抗ＧＰＲ４９抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子に関する。１つの態様では、核酸分子は、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。
【００２１】
種々の実施形態は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つを含む抗ＧＰＲ４９抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする１もしくは複数の核酸分子を含むベクターに関する。
【００２２】
他の実施形態は、少なくとも１つの宿主細胞を、抗ＧＰＲ４９抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子でトランスフェクトすること、前記宿主細胞中にてこの核酸分子を発現させること、および前記抗体を単離することを含む、抗ＧＰＲ４９抗体を作製する方法に関する。いくつかの態様では、そのような抗ＧＰＲ４９抗体としては、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つが挙げられる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗体は、１０−５Ｍ未満、または１０−６Ｍ未満、または１０−７Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満、または１０−１０Ｍ未満、または１０−１１Ｍ未満、または１０−１２Ｍ未満、または１０−１３Ｍ未満の解離定数またはＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）にてＧＰＲ４９およびその抗原性断片と特異的に結合することができる。
【００２４】
別の実施形態では、抗体は、１×１０−３秒−１未満のＫｏｆｆにてＧＰＲ４９および／またはその抗原性断片と結合することができる。他の実施形態では、抗体は、１０−３秒−１未満、５×１０−３秒−１未満、１０−４秒−１未満、５×１０−４秒−１未満、
１０−５秒−１未満、５×１０−５秒−１未満、１０−６秒−１未満、５×１０−６秒−１未満、１０−７秒−１未満、５×１０−７秒１未満、１０−８秒−１未満、５×１０−８秒−１未満、１０−９秒−１未満、５×１０−９秒−１未満、または１０−１０秒−１未満のＫｏｆｆにてＧＰＲ４９およびその抗原性断片と結合する。
【００２５】
別の実施形態では、抗体は、少なくとも１０−５Ｍ−秒−１、少なくとも５×１０−５Ｍ−１秒−１、少なくとも１０−６Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０−６Ｍ−１秒−１、少なくとも１０−７Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０−７Ｍ−１秒−１、または少なくとも１０−８Ｍ−１秒−１、または少なくとも１０−９Ｍ−１秒−１の会合速度定数またはｋｏｎ速度にてＧＰＲ４９および／またはその抗原性断片と結合する。
【００２６】
追加の実施形態は、特定の等電点（ｐＩ）または溶融温度（Ｔｍ）などの特定の好ましい生化学的特性を有する抗体を含む。
【００２７】
１つの実施形態では、高親和性抗体は、５．５から９．５の範囲のｐＩを有する。１つの実施形態では、いくつかの実施形態の高親和性抗体は、約６５℃から約１２０℃の範囲のＴｍを有する。
【００２８】
いくつかの実施形態の抗体はまた、哺乳類（例：ヒト）中での半減期（例：血清中半減期）が１日超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、１０日超、１５日超、２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヶ月超、３ヶ月超、４ヶ月超、または５ヶ月超である抗体も包含する。哺乳類（例：ヒト）中での抗体の半減期が延長されることにより、哺乳類中での前記抗体または抗体断片の血清力価が高められる結果となり、従って、前記抗体もしくは抗体断片の投与の頻度が減少し、および／または投与されることになる前記抗体もしくは抗体断片の濃度が低下する。生体内半減期が延長された抗体は、当業者に公知の技術によって作製することができる。例えば、生体内半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与していることが識別されているアミノ酸残基の修飾（例：置換、欠失、または付加）によって作製することができる（例えば、国際公開ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；米国特許第６，７３７，０５６号および米国特許出願公開第２００３／０１９０３１１号を参照されたく、以下でより詳細に考察する）；これらの各々について、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるGhetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15:637-40；Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564；Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662；Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59；Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543；Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984；Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117；Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119；Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104；Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969；Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184；Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933；Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26；Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575；Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65；Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490)；米国特許第５，６２４，８２１号；同第５，８８５，５７３号；同第５，６７７，４２５号；同第６，１６５，７４５号；同第６，２７７，３７５号；同第５，８６９，０４６号；同第６，１２１，０２２号；同第５，６２４，８２１号；同第５，６４８，２６０号；同第６，１９４，５５１号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，２７７，３７５；米国特許出願公開第１０／３７０，７４９、およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／２９３５；
ＷＯ９９／５８５７２；ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０２／０６０９１９、ＷＯ０４／０２９２０７に開示されるものなど、そのＦｃドメイン内における修飾／置換および／または新規アミノ酸を含んでよい。Ｆｃドメインのその他の修飾／置換は、当業者にとって容易に明らかである。
【００３０】
抗体は、当業者に公知の数多くの方法によって作製可能であるそのＦｃ領域中の修飾／置換および／または新規アミノ酸残基を含むことができる。限定されない例は、抗体コード領域の単離（例：ハイブリドーマから）、および単離された抗体コード領域のＦｃ領域における１つ以上の所望される置換の作製を含む。別の選択肢として、抗体の可変領域を、１もしくは修飾／置換（one or modifications/substitutions）および／または新規アミノ酸残基を含むＦｃ領域をコードするベクター中へサブクローン化してもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態の抗体はまた、やはり抗体の１つ以上の機能特性を改変する目的で、グリコシル化を改変するために修飾されてもよい。
【００３２】
種々の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾されてよい。例えば、アグリコシル化抗体が作製されてよい（すなわち、グリコシル化のない抗体）。グリコシル化を改変して、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。そのような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位の改変によって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を行い、それによってその部位でのグリコシル化を排除することができる。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得るものである。そのような手法は、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号においてより詳細に記載されている。
【００３３】
加えて、または別の選択肢として、いくつかの実施形態の抗体は、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体またはバイセクティング(bisecting)ＧｌｃＮＡｃ構造が増加された抗体など、改変されたグリコシル化のタイプを有するように作製されてよい。そのような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが実証されている。そのような糖鎖修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本技術分野にて報告されており、遺伝子組換え抗体を発現させることによってグリコシル化が改変された抗体を作製するための宿主細胞として用いることができる。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるShields, R. L.
et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana et al. (1999) Nat. Biotech.
17:176-1、さらには欧州特許ＥＰ１，１７６，１９５；ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０３５８３５；ＷＯ９９／５４３４２を参照されたい。
【００３４】
いくつかの実施形態の抗体は、単独で、またはその他の組成物と組み合わせて用いられてよい。抗体は、さらに、ＮもしくはＣ末端にて異種ポリペプチドへ遺伝子組換えによって融合されてよく、またはポリペプチドもしくはその他の組成物へ化学的に結合されてもよい（共有および非共有結合を含む）。例えば、抗体は、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、またはトキシンなど、検出アッセイにおける標識として有用である分子およびエフェクター分子と、遺伝子組換えによって融合されても、または結合されてもよい。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７を参照されたい。
【００３５】
本明細書にて提供される抗体は、修飾された誘導体、すなわち、抗体によるＧＰＲ４９
ポリペプチドもしくはその断片との結合、および／または所望される応答の発生を共有結合が阻止しないような形で、いずれかのタイプの分子を抗体へ共有結合させることによって修飾された誘導体を含んでよい。例えば、これらに限定されないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／封止基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞リガンドもしくはその他のタンパク質との連結などによって修飾された抗体が挙げられる。数多くの化学修飾のいずれも、公知の技術によって実施されてよく、これらに限定されないが、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられる。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号１）のヒトＧＰＲ４９ポリペプチドまたはその断片に対して少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、または少なくとも少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するＧＰＲ４９ポリペプチドを含むか、またはそれから成るポリペプチドと特異的に結合する。そのような断片は、例えば、配列番号１の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００の隣接または非隣接アミノ酸、または上述の長さのいずれかの間のいずれかの数の隣接または非隣接アミノ酸であってよい。
【００３７】
２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の同一性パーセントは、例えば、最適比較の目的でこれらの配列を整列（align）させることによって決定することができる（例：第一の配列の配列中にギャップが導入されてよい）。次に、対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドを比較し、２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の実際の比較は、数学的アルゴリズムの使用を例とする公知の方法によって達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの具体的な限定されない例は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)に記載されている。そのようなアルゴリズムは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるSchaffer et al., Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)に記載のように、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．２）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、対応するプログラム（例：ＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが用いられてよい。２００２年４月１０日から利用可能であるhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。１つの実施形態では、検索されるデータベースは、非重複（ＮＲ）データベースであり、配列比較のパラメータは：フィルターなし；Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０；Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３；ＭａｔｒｉｘはＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ  ＣｏｓｔはＥｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ  １を有する、として設定されてよい。
【００３８】
いくつかの実施形態はまた、上述の抗体の変異体も包含し、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインおよび／または可変重鎖（ＶＨ）ドメインに１つ以上のアミノ酸残基置換を有する、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１
、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つが挙げられる。いくつかはまた、１つ以上のＶＬＣＤＲおよび／または１つ以上のＶＨＣＤＲに１つ以上の追加のアミノ酸残基置換を有する上述の抗体の変異体も包含する。上述の抗体のＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬドメイン、および／またはＶＬＣＤＲに置換を導入することによって作製される抗体は、例えばＧＰＲ４９と結合するその能力について、生体外および生体内にて試験されてよい（例えば、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅを含むイムノアッセイによる）。
【００３９】
他の実施形態において、抗体は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つを含む上述の抗体のＣＤＲの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを有してよい。
【００４０】
種々の実施形態は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つなど、ＧＰＲ４９と特異的に結合する抗ＧＰＲ４９抗体のＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬＣＤＲの誘導体を含む、ＧＰＲ４９と特異的に結合する抗体を含む。当業者に公知の標準的な技術を用いて、抗体をコードするヌクレオチド配列中に変異（例：付加、欠失、および／または置換）を導入することができ、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が挙げられ、これらは、アミノ酸置換の作製に慣行的に用いられる。１つの実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ誘導体は、元のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲに対して、２５アミノ酸未満の置換、２０アミノ酸未満の置換、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換、または２アミノ酸未満の置換を含む。別の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ誘導体は、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基（すなわち、抗体のＧＰＲ４９との特異的結合に不可欠なものではないアミノ酸残基）にて作製された保存的アミノ酸置換（例：上記）を有する。別の選択肢として、変異は、飽和変異誘発などにより、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲコード配列のすべて、または一部に沿ってランダムに導入されてもよく、得られた変異体は、生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を保持する変異体が識別されてよい。変異誘発に続いて、コードされた抗体が発現されてよく、その抗体の活性が特定されてよい。
【００４１】
いくつかの実施形態はまた、ＧＰＲ４９またはその断片と特異的に結合する抗体も包含し、前記抗体は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２
．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つを含む本明細書で述べる抗体のいずれかの可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対して、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
種々の実施形態はさらに、ＧＰＲ４９またはその断片と特異的に結合する抗体も包含し、前記抗体または抗体断片は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つを含む本明細書で述べる抗体の１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に対して、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含む当業者に公知のいずれの方法によって決定されてもよい。
【００４３】
別の実施形態は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つなど、抗ＧＰＲ４９抗体のいずれかの部分における保存的アミノ酸置換の導入を含む。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に同等であるアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味することは本技術分野にて公知である。保存的アミノ酸変化は、得られるペプチドのアミノ酸配列にサイレントな変化をもたらす。例えば、類似の極性を有する１つ以上のアミノ酸は、機能的に同等に作用し、そのペプチドのアミノ酸配列内にサイレントな改変をもたらす。電気的に中性であり、残基をより小さい残基で置き換える置換も、たとえそれらの残基が異なる群であったとしても（例：フェニルアラニンをより小さいイソロイシンで置換）、「保存的置換」と見なされ得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野にて識別されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを表１に示す。
【００４４】
【表１】
2014533247.tif 000003
【００４５】
「保存的アミノ酸置換」の用語はまた、アミノ酸類似体または変異体の使用も意味する。
【００４６】
抗体を作製する方法
ＧＰＲ４９ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当業者に公知のその他の技術によって識別することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態の抗体は、本技術分野にて公知の適切ないかなる方法で作製されてもよい。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、本技術分野にて公知の様々な手順によって作製することができる。例えば、ＧＰＲ４９ポリペプチドを、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない種々の宿主動物へ投与して、抗原に対して特異的であるポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発することができる。宿主種に応じて、免疫学的応答を高めるために種々のアジュバントが用いられてよく、これらに限定されないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用であるヒトアジュバントが挙げられる。このようなアジュバントも、本技術分野にて公知である。
【００４８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、遺伝子組換え、およびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組み合わせを含む本技術分野にて公知である広範囲の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて作製することができ、本技術分野で公知であり、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)に教示されるものが挙げられる。本明細書で用いられる場合、「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」と略される）の用語は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」の用語は、いずれの真核、原核、またはファージクローンをも含む単一クローンから誘導される抗体を意味し、それが作製される方法を意味するものではない。「モノクローナル抗体」は、２つのタンパク質、すなわち重鎖および軽鎖を
含んでよく、または別の選択肢として、それらから成っていてよい。
【００４９】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製およびスクリーニングするための方法は、慣行的な手順であり、本技術分野にて公知である。限定されない例として、マウスが、ＧＰＲ４９ポリペプチド、またはそのようなペプチドを発現する細胞によって免疫化されてよい。抗原に対して特異的である抗体がマウス血清中にて検出されることを例とする免疫応答の検出が得られた後、マウスの脾臓が取り出され、脾細胞が単離される。次に、脾細胞は、公知の技術によって、ＡＴＣＣから入手可能である細胞株ＳＰ２０からの細胞を例とするいずれかの適切な骨髄腫細胞と融合される。限界希釈法により、ハイブリドーマが選択され、クローン化される。このハイブリドーマクローンは、次に、ＧＰＲ４９ポリペプチドと結合する能力を有する抗体を分泌する細胞について、本技術分野で公知の方法によって分析される。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することにより、一般的に高レベルの抗体を含有するものである腹水を作り出すことができる。
【００５０】
従って、いくつかの実施形態は、モノクローナル抗体を作製する方法、ならびにその方法で作製された抗体を提供し、その方法は、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含み、ハイブリドーマは、ＧＰＲ４９抗原で免疫化されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次にＧＰＲ４９ポリペプチドと結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、その融合から得られたハイブリドーマをスクリーニングすることによって作製される。
【００５１】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作製することができる。例えば、いくつかの実施形態のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片の作製）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片の作製）などの酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解開裂によって作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【００５２】
種々の実施形態の抗体はまた、本技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリペプチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。特定の実施形態では、そのようなファージを用いて、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例：ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示することができる。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識抗原、または固体表面もしくはビーズ上に結合または捕捉された抗原を用いることで、抗原によって選択または識別を行うことができる。これらの方法で用いられるファージは、通常、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインがファージのｇｅｎｅ  ＩＩＩまたはｇｅｎｅ  ＶＩＩＩタンパク質と遺伝子組換えによって融合されてファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。いくつかの実施形態の抗体の作製に用いることができるファージディスプレイ法の例としては、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願公開番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号に開示されるものが挙げられる。
【００５３】
上記参考文献に記載のように、ファージによる選択の後、ファージからの抗体コード領
域を単離し、これを用いてヒト抗体を含む全抗体またはその他のいずれかの所望される抗原結合断片を作製することができ、ならびに、例えば以下で詳細に述べるように、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む所望されるいずれの宿主中にも発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を遺伝子組換えによって作製する技術の利用は、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992)；およびSawai et al., AJRI 34:26-34 (1995)；およびBetter et al., Science 240:1041-1043 (1988)に開示されるものなど、本技術分野にて公知の方法を用いて行うこともできる。
【００５４】
一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を作製するために用いることができる技術の例としては、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88
(1991)；Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993)；およびSkerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)に記載のものが挙げられる。
【００５５】
ヒト抗体および抗体のヒト化
抗体のヒトにおける生体内使用および生体外検出アッセイを含むいくつかの使用のために、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を用いることが望ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を作製するための方法は、本技術分野にて公知である。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるMorrison, Science 229:1202 (1985)；Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、所望される抗原と結合する非ヒト種抗体からの抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基がＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置換されて、抗原結合性が改変、好ましくは改善される。これらのフレームワーク置換は、本技術分野にて公知の方法によって識別され、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデル化による抗原結合に重要であるフレームワーク残基の識別、ならびに配列比較による特定の位置での異常なフレームワーク残基の識別による（例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるQueen et al., 米国特許第５，５８５，０８９号；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照されたい）。
【００５６】
ヒト抗体では、マウスもしくはラットの可変および／または定常領域を持つ抗体に付随する問題のいくつかが回避される。そのようなマウスまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスに繋がる場合があり、または患者による抗体に対する免疫応答の発生に繋がる場合もある。マウスまたはラット由来抗体の利用を回避するために、本技術分野にて公知である種々の技術を用いて抗体がヒト化されてよく、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号；これらの各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)）、脱免疫化（de-immunization）（米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号）、およびチェインシャフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号）が挙げられ、これらの各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的措置に用いることができる。ヒト抗体は、本技術分野にて公知の種々の方法によって作製することができ、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いた上述のファージディスプレイ法が挙げられる。各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照されたい。
【００５８】
ヒト抗体はまた、機能的内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製することもできる。例えば、ヒト重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体が、ランダムに、または相同遺伝子組換えによってマウス胚性幹細胞中へ導入されてよい。別の選択肢として、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域（diversity region）が、ヒト重および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞中へ導入されてもよい。マウス重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同遺伝子組換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入と別個に、または同時に、非機能性とされてよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内在性抗体産生を阻止する。修飾された胚性幹細胞は、増殖され、胚盤胞中へ微量注入され、キメラマウスが作出される。次に、キメラマウスが飼育されて、ヒト抗体を発現するホモ接合体子孫が作出される。トランスジェニックマウスは、ＧＰＲ４９ポリペプチドのすべてまたは一部を例とする選択された抗原により、通常の方法で免疫化される。その抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫化トランスジェニックマウスから得ることができる。このトランスジェニックマウスが持つヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の過程で再構成し、続いて、クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。従って、そのような技術を用いることにより、治療的に有用であるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概要は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるLonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルについての詳細な考察は、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、アブジェニックス社（Abgenix, Inc.）（フリーモント，カリフォルニア州）およびジェンファーム（Genpharm）（サンホゼ，カリフォルニア州）などの企業が、上述のものに類似の技術を用いることによる、選択された抗原に対するヒト抗体の提供に関与し得る。アブジェニックス社（フリーモント，カリフォルニア州）は、１０００ｋｂ未満のサイズであるヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖伝子座の生殖系列構造断片（germline configured fragments）を含有するように遺伝子操作された、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）というマウスの系統を提供する。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) and Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)を参照されたい。
【００５９】
別の選択肢としての手法では、ジェンファームインターナショナル社を含む他の企業が、「ミニ遺伝子座（minilocus）」の手法を用いている。ミニ遺伝子座の手法では、Ｉｇ遺伝子座からの部分（pieces）（個々の遺伝子）を含めることによって外来性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。従って、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー（ｍｕ）定常領域、および通常は第二の定常領域（好ましくは、ガンマ
定常領域）が、動物への挿入のためのコンストラクトとして形成される。この手法は、その開示事項が参照により本明細書に組み込まれるSurani et al．への米国特許第５，５４５，８０７号、各々Lonberg and Kayへの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、および同第６，２５５，４５８号、Krimpenfort and Bernsへの米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３，０１０号、Berns et al.への米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、および同第５，７８９，２１５号、ならびにChoi and Dunnへの米国特許第５，６４３，７６３号、ならびに、ジェンファームインターナショナル社の米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月２９日出願、同第０７／５７５，９６２号、１９９０年８月３１日出願、同第０７／８１０，２７９号、１９９１年１２月１７日出願、同第０７／８５３，４０８号、１９９２年３月１８日出願、同第０７／９０４，０６８号、１９９２年６月２３日出願、同第０７／９９０，８６０号、１９９２年１２月１６日出願、同第０８／０５３，１３１号、１９９３年４月２６日出願、同第０８／０９６，７６２号、１９９３年７月２２日出願、同第０８／１５５，３０１号、１９９３年１１月１８日出願、同第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月３日出願、同第０８／１６５，６９９号、１９９３年１２月１０日出願、同第０８／２０９，７４１号、１９９４年３月９日出願に記載されている。その開示事項がすべてにわたって参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂ１号、国際特許出願番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、およびＷＯ９８／２４８８４、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたい。さらに、その開示事項がすべてにわたって参照により本明細書に組み込まれるTaylor et al., 1992、Chen et al., 1993、Tuaillon et al., 1993、Choi et al., 1993、Lonberg et al., (1994)、Taylor et al., (1994)、およびTuaillon et al., (1995)、Fishwild et al., (1996)も参照されたい。
【００６０】
ヒト抗体は、微小核細胞融合によって染色体の大きな部分または染色体全体が導入されたトランスジェニックマウスから作製することができる。その開示事項が参照により本明細書に組み込まれる欧州特許出願第７７３  ２８８号および同第８４３  ９６１号を参照されたい。加えて、Ｔｃマウスとメダレックス（Medarex）のミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑育種の結果であるＫＭ（商標）−マウスが作出されている。これらのマウスは、キリンのマウスのヒトＩｇＨ導入染色体およびジェンファームのマウスのカッパ鎖導入遺伝子を有している（Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102）。
【００６１】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（guided selection）」と称される技術を用いて作製することができる。この手法では、マウス抗体を例とする選択された非ヒトモノクローナル抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択が誘導される（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるJespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)）。
【００６２】
さらに、今度はＧＰＲ４９ポリペプチドに対する抗体を用いて、ＧＰＲ４９ポリペプチドを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を、当業者に公知の技術を用いることで作製することができる（例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるGreenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444; (1989)およびNissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)を参照されたい）。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、生体内にて治療的に用いることができる。従って、抗体は、個体中でのその免疫原性が低減するように修飾されてよい
。例えば、個体がヒトである場合、抗体は、「ヒト化」されてよく、この場合、抗体の（１もしくは複数の）相補性決定領域が、ヒト抗体へ移植されるものであり（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525, 1986；およびTempest et al., Biotechnology 9:266-273, 1991に記載にように）、これはその全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
ファージディスプレイ技術も、抗ＧＰＲ４９抗体の保持についてスクリーニングされたヒトからのリンパ球のＰＣＲ増幅ｖ遺伝子のレパートリーからの、またはナイーブライブラリーからの、ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子の選択に用いることができる（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるMcCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990；およびMarks, et al., Biotechnology 10:779-783, 1992）。これらの抗体の親和性を、チェインシャフリングによって改善することもできる（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるClackson et al., Nature 352: 624-628, 1991）。
【００６５】
抗体を作製する方法
いくつかの実施形態の抗体は、抗体の合成のための本技術分野にて公知であるいかなる方法によって作製されてもよく、特には、化学合成、または、好ましくは遺伝子組換え発現技術による。
【００６６】
抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体（例：抗体の重もしくは軽鎖、または一本鎖抗体）の遺伝子組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要である。抗体分子、または抗体の重もしくは軽鎖、またはその一部（好ましくは、重または軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られた後、抗体分子を作製するためのベクターは、本技術分野にて公知の技術を用いて、遺伝子組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。従って、抗体コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を作製するための方法が、本明細書にて記載される。当業者に公知である方法を用いて、抗体コード配列、ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。このような方法としては、例えば、生体外遺伝子組換えＤＮＡ技術、合成技術、および生体内遺伝子組換えが挙げられる。従って、種々の実施形態は、抗体分子、またはその重もしくは軽鎖、または重もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、プロモーターと操作可能に連結された形で含む複製型ベクター（replicable vectors）を提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく（例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変ドメインが、重または軽鎖全体の発現のために、そのようなベクター中へクローン化されてよい。
【００６７】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞へ移植され、次に、このトランスフェクトされた細胞が従来の技術によって培養され、抗体が産生される。従って、いくつかの実施形態は、抗体分子、またはその重もしくは軽鎖、または一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを、異種プロモーターと操作可能に連結された形で含有する宿主細胞を含む。以下で詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために、重および軽鎖の両方をコードするベクターが宿主細胞中にて共発現されてよい。
【００６８】
本明細書で述べる抗体分子の発現には、種々の宿主−発現ベクター系を用いることができる。そのような宿主−発現系は、目的のコード配列の産生、および続いての精製が可能である媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、ｉｎ  ｓｉｔｕにて抗体分子を発現することができる細胞も表す。これらとしては、限定されないが、抗体コード配列を含有する、遺伝子組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細
菌（例：大腸菌、枯草菌）；抗体コード配列を含有する遺伝子組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例：サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））；抗体コード配列を含有する遺伝子組換えウイルス発現ベクター（例：バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、遺伝子組換えウイルス発現ベクター（例：カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）による感染、または遺伝子組換えプラスミド発現ベクター（例：Ｔｉプラスミド）による形質転換が行われた植物細胞系；または、哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する遺伝子組換え発現コンストラクトを持つ哺乳類細胞系（例：ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、３Ｔ３、ＰｅｒＣ６細胞）が挙げられる。大腸菌などの細菌細胞および真核細胞を、遺伝子組換え抗体分子の発現に用いることができる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメント（major intermediate early gene promoter element）などのベクターと組み合わされたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞は、抗体用の効果的な発現系である（Foecking et al., Gene 45:101 (1986)；Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)）。また、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８２７，７３９号、同第５，８７９，９３６号、同第５，９８１，２１６号、および同第５，６５８，７５９号も参照されたい。
【００６９】
細菌系では、発現される抗体分子の意図する用途に応じて、数多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のために、そのようなタンパク質が大量に作製されることになる場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高いレベルの発現を指向するベクターが望ましいものであり得る。そのようなベクターとしては、これらに限定されないが、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中に個々に結合され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)）、これはその全内容が参照により本明細書に組み込まれる；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985)；Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)）、これらの各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる；などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現させるために用いることができる。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、ならびに続いての遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計される。
【００７０】
昆虫系では、オートグラファカリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。このウイルスは、スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で成長する。抗体コード配列は、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。
【００７１】
哺乳類宿主細胞では、数多くのウイルス発現系が用いられ得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、目的の抗体コード配列は、後期プロモーターおよび三連リーダー配列を例とするアデノウイルス転写／翻訳制御複合体と結合され得る。このキメラ遺伝子は、次に、生体外または生体内遺伝子組換えにより、アデノウイルスゲノム中へ挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例：領域Ｅ１またはＥ３）への挿入の結果
として、感染宿主中にて生存可能であり、抗体分子を発現することができる遺伝子組換えウイルスが得られる（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるLogan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)を参照されたい）。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレームと同相（in phase）である必要がある。このような外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって向上され得る（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるBittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)を参照）。
【００７２】
加えて、挿入配列の発現を調節する、または所望される特定の方法で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択されてよい。タンパク質産物のそのような修飾（例：グリコシル化）およびプロセッシング（例：開裂）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的で特異的な機構を有している。適切な細胞株または宿主系を選択することで、発現された外来性タンパク質の適正な修飾およびプロセッシングを確実に得ることができる。この目的を達成するために、一次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が用いられ得る。そのような哺乳類宿主細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＮＳ０、Ｐｅｒ．Ｃ６、特には、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄなどの乳癌細胞株、ならびに例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの正常乳腺細胞株が挙げられる。
【００７３】
遺伝子組換えタンパク質の長期的な高収率での作製の場合、安定な発現が用いられてよい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が遺伝子操作されてよい。ウイルス起源の複製を含有する発現ベクターが用いられるのではなく、宿主細胞が、適切な発現制御エレメント（例：プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡおよび選択可能マーカーで形質転換されてよい。外来性ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作された細胞は、集積培地（enriched medium）にて１〜２日間成長させ、次に、選択培地へ変更する。遺伝子組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体内へプラスミドを安定的に一体化させて、続いてクローン化し、細胞株へと増殖することができる増殖巣を形成することを可能とする。この方法を用いて、有利には、抗体分子を発現する細胞株を遺伝子操作することができる。このような遺伝子操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用を起こす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【００７４】
数多くの選択系が用いられてよく、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223 (1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22:817 (1980)）が挙げられ、これらの遺伝子を、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞に用いることができる。また、代謝拮抗剤耐性を、以下の遺伝子の選択の基礎として用いることもできる：ｄｈｆｒ、メトトレキサートに対する耐性を付与（Wigler et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)；O'Hare et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)）；ｇｐｔ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)）；ｎｅｏ、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与  Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu,
Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596
(1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215）；およびｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与（Santerre et al., Gene 30:147 (1984)、これらの各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子組換えＤＮＡ技術の分野で公知の方法を、所望される遺伝子組換えクローンの選択に慣行的に適用することができ、このような方法は、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；ならびに、チャプター１２および１３、Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)に記載されている。
【００７５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（レビューについては、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるBebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピーの数が増加する。増幅された領域は、抗体遺伝子と関連することから、抗体の産生も増加することになる（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるCrouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)）。
【００７６】
宿主細胞は、２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターとによって共トランスフェクトされてよい。２つのベクターは、重および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能とする同一の選択可能マーカーを含有していてよい。別の選択肢として、重および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一のベクターが用いられてもよい。そのような状況では、有害な遊離重鎖が過剰となることを避けるために、軽鎖が重鎖の前に配置されるべきである（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるProudfoot, Nature 322:562 (1986)；Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)）。重および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでよい。
【００７７】
抗体分子は、動物によって産生されるか、化学合成されるか、または遺伝子組換え発現された後、免疫グロブリン分子の精製のための技術分野で公知であるいかなる方法で精製されてもよく、例えば、クロマトグラフィ（例：イオン交換、親和性、特にプロテインＡに対する特異的抗原の親和性による、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のためのその他のいずれかの標準的な技術による。加えて、抗体またはその断片は、精製を容易とするために、本明細書で述べる、またはそれ以外では本技術分野で公知である異種ポリペプチド配列と融合されてもよい。
【００７８】
さらに、抗体またはその断片は、精製を容易とするために、ペプチドなどのマーカー配列と融合されてもよい。特定の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、中でもｐＱＥベクター（キアゲン社（QIAGEN, Inc.），９２５９  イートンアベニュー，キャッツワース，カリフォルニア州，９１３１１）中に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。その全内容が参照により本明細書に組み込まれるGentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)に記載のように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製をもたらす。精製に有用であるその他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来エピトープに対応する「ＨＡ」タグ（その全内容が参照により本明細書に
組み込まれるWilson et al., Cell 37:767 (1984)）および「フラグ（ｆｌａｇ）」タグが挙げられる。
【００７９】
本明細書で述べる抗体は、修飾された誘導体を含む（例：いずれかの種類の分子の抗体への共有結合による）。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／封止基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞リガンドもしくはその他のタンパク質との連結などによって修飾された抗体が挙げられる。数多くの化学修飾のいずれも、公知の技術によって実施されてよく、これらに限定されないが、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられる。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。
【００８０】
生体内半減期が延長された抗体またはその断片は、前記抗体または抗体断片に、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子を結合させることによって作製することができる。ＰＥＧの前記抗体または抗体断片への結合は、前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合により、またはリジン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカー有りまたは無しにて行うことができる。生物学的活性の喪失が最小限の結果となる直鎖または分岐鎖ポリマー誘導体化が用いられる。結合の度合いは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって密接にモニタリングされ、ＰＥＧ分子の抗体への適切な結合が確実に行われる。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィによって、抗体−ＰＥＧ結合体から分離することができる。
【００８１】
さらに、抗体は、抗体もしくは抗体断片を生体内にてより安定とするために、または生体内でのより長い半減期を持たせるために、アルブミンと結合させることができる。この技術は、本技術分野にて公知であり、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、およびＷＯ０１／７７１３７；ならびに欧州特許番号ＥＰ  ４１３，６２２を参照されたい。本明細書で提供される実施形態は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤（mimetic agents）、合成薬物、無機分子、および有機分子が挙げられるがこれらに限定されない１つ以上の部分と結合または融合された抗体またはその断片の使用を包含する。
【００８２】
種々の実施形態は、異種タンパク質もしくはポリペプチド（またはその断片、特には、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）と遺伝子組換えによって融合または化学的に結合（共有および非共有結合を含む）されて融合タンパク質を生成する抗体またはその断片の使用を包含する。ある実施形態では、抗体またはその断片は、異種タンパク質もしくはポリペプチド（またはその断片、特には、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００アミノ酸のポリペプチド）と遺伝子組換えによって融合または化学的に結合（共有および非共有結合を含む）されて融合タンパク質を生成することができる。融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を通して行われてもよい。例えば、抗体は、その抗体を特定の細胞表面受容体に特異的である抗体と融合または結合することにより、生体外または生体内において、異種ポリペプチドを特定の細胞型へ標的化することに用いることができる。異種ポリペプチドと融合または結合された抗体はまた、本技術分野で公知の方法を用いることによる生体外イムノアッセイおよび精製方法に用いることもできる。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ９３／２１２３２；欧州特許番号
ＥＰ４３９，０９５；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99；米国特許第５，４７４，９８１号；Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432；およびFell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452を参照されたい。
【００８３】
いくつかの実施形態は、抗体断片と融合もしくは結合された異種タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを含有する製剤を含む。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬ  ＣＤＲ、またはこれらの断片と融合または結合されてよい。ポリペプチドを抗体部分と融合または結合させるための方法は、本技術分野にて公知である。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号；欧州特許番号ＥＰ３０７，４３４およびＥＰ３６７，１６６；国際公開番号ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
【００８４】
ＧＰＲ４９またはその断片と特異的に結合する抗体のさらなる融合タンパク質は（例：上述）、ジーンシャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技術によって作製することができる。ＤＮＡシャフリングを用いて、抗体またはその断片の活性を改変することができる（例：より高い親和性とより低い解離速度を有する抗体またはその断片）。一般的には、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにPatten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):
76-82；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308-313を参照されたい。抗体もしくはその断片、またはコードされた抗体もしくはその断片は、遺伝子組換えの前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、またはその他の方法によるランダム変異誘発が施されることによって改変されてよい。Ｃ／ＣＬＰと特異的に結合する部分である抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドの１つ以上の部分に、１つ以上の異種分子の１つ以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを用いた遺伝子組換えが施されてよい。
【００８５】
さらに、抗体またはその断片は、精製を容易とするために、ペプチドなどのマーカー配列と融合されてもよい。特定の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、中でも、ｐＱＥベクター（キアゲン社，９２５９  イートンアベニュー，キャッツワース，カリフォルニア州，９１３１１）中に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。その全内容が参照により本明細書に組み込まれるGentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製をもたらす。精製に有用であるその他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来エピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるWilson et al., 1984, Cell 37:767）および「フラグ（ｆｌａｇ）」タグが挙げられる。
【００８６】
種々の実施形態は、さらに、診断または治療剤と結合された抗体またはその断片も包含する。例えば、その抗体は、例えば任意の治療レジメンの効果を判断することを目的として、臨床検査手順の一環として腫瘍の発生または進行のモニタリングのために、診断的に
用いることができる。抗体を、検出可能物質とカップリングすることによって、検出を容易とすることができる。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影に用いられるポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能物質の抗体（もしくはその断片）へのカップリングもしくは結合は、直接行われても、または本技術分野にて公知の技術を用いて、中間体（例えば、本技術分野で公知のリンカーなど）により間接的に行われてもよい。診断剤として用いるために抗体へ結合させることができる金属イオンについては、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、これらに限定されないが、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが挙げられ、加えて種々のポジトロン放出断層撮影に用いられるポジトロン放出金属、非放射性常磁性金属イオン、および放射標識された、または特定の放射性同位体と結合された分子が、本明細書で述べる抗体と結合されてよい。
【００８７】
さらに、抗体またはその断片は、細胞分裂阻害剤もしくは細胞致死剤（cytocidal agent）を例とする細胞毒などの治療部分、治療剤、または例えば２１３Ｂｉなどのアルファ線放射体を例とする放射性金属イオンと結合されてもよい。細胞毒または細胞傷害性剤には、細胞にとって有害であるいかなる剤をも含まれる。例としては、パクリタキソール（paclitaxol）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン（1-dehydrotestosterone）、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。治療剤としては、これらに限定されないが、代謝拮抗剤（例：メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  デカルバジン（decarbazine））、アルキル化剤（例：メクロレタミン、チオエパ（thioepa）  クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）  シスプラチン）、アントラサイクリン（例：ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例：ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに、有糸分裂阻害剤（例：ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。治療部分のより広範囲のリストは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０７５９５７に見出すことができる。
【００８８】
これらの結合体は、任意の生物学的応答の修飾に用いることができ、この治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望される生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えば、アポトーシス剤（apoptotic agent）または血管新生阻害剤が挙げられる。
【００８９】
抗体はまた、固体支持体に結合されてもよく、これは、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。そのような固体支持体としては、これらに限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられる。
【００９０】
そのような治療部分を抗体と結合させるための技術は公知であり、例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれるAmon et al., Monoclonal Antibodies
And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)の"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"；Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)の"Antibodies For Drug Delivery"；Thorpe, Monoclonal Antibodies '84の"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review": Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.
(eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)の"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy"、およびThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)を参照されたい。
【００９１】
抗体は、他のポリペプチドと結合されてよい。抗体をポリペプチド部分と融合または結合させるための方法は、本技術分野にて公知である。例えば、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535；Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590；およびVil et al., 1992, PNAS USA 89:11337を参照されたい。部分への抗体の融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して行われてもよい。そのようなリンカー分子は、本技術分野にて公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483；Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553；Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943；Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171に記載されている。別の選択肢として、各々についてその全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６７６，９８０号にてSegalによって述べられているように、抗体は、第二の抗体と結合されて、抗体ヘテロ結合体（antibody heteroconjugate）が形成されてもよい。
【００９２】
抗ＧＰＲ４９抗体による癌の治療方法
いくつかの実施形態は、抗ＧＰＲ４９抗体によって対象の癌を治療することに関する。種々の実施形態は、抗ＧＰＲ４９抗体によって対象の結腸癌を治療することに関する。ある実施形態では、結腸癌などの癌の治療方法は、その癌の治療に十分である抗ＧＰＲ４９抗体の有効量を対象へ投与することを含む。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、「対象」は、抗ＧＰＲ４９抗体によって治療可能である癌に罹患する可能性のある生物を含み、ヒトおよび非ヒト動物などである。好ましい動物としては、ヒト対象が挙げられる。本発明の「非ヒト動物」の用語は、すべての脊椎動物、哺乳類、げっ歯類（例：マウスおよびラット）、および非ヒト霊長類（例：サルおよびマカク）を含む。「投与」または「投与する」の用語は、その意図する機能を起こすために、対象へ抗ＧＰＲ４９抗体を導入する経路を含む。
【００９４】
癌の治療に関して用いられる場合、「有効量」の用語は、癌を治療するのに十分である抗ＧＰＲ４９抗体の量を意味し、それは、いくつかの様々なパラメータによって測定する
ことができ、これらに限定されないが、癌を有する対象における腫瘍サイズの減少、癌を有する対象における腫瘍の成長速度もしくは増殖速度の低下、転移の阻止もしくは転移の度合いの低減、またはコントロールと比較した場合の癌を有する対象の生存の延長が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＧＰＲ４９抗体の有効量は、約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％、または前述のパーセントの間のいずれかの数値での腫瘍サイズの減少によって測定される、対象における癌の治療に十分なものである。ある態様では、抗ＧＰＲ４９抗体は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、対象における癌の治療に十分である抗ＧＰＲ４９抗体の有効量が、約１μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２７５ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３２５ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、３７５ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４２５ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４２５ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４７５ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、または前述の用量のいずれか２つの間のいずれかの数値での用量（抗体の質量／対の象質量）で投与されてよい。ある態様では、抗ＧＰＲ４９抗体は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。
【００９６】
ある実施形態では、癌の治療に十分である抗ＧＰＲ４９抗体の有効量は、約１ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、または前述の濃度のいずれか２つの間のいずれかの数値での対象中の血中または血清中濃度である。ある態様では、抗
ＧＰＲ４９抗体は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。
【００９７】
別の実施形態では、抗ＧＰＲ４９抗体の有効量は、対象の質量に関係なく、固定された用量で投与されてよい。例えば、対象における癌の治療に十分である抗ＧＰＲ４９抗体の有効量は、約１μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ、１２５０ｍｇ、１５００ｍｇ、１７５０ｍｇ、２０００ｍｇ、２２５０ｍｇ、２５００ｍｇ、２７５０ｍｇ、３０００ｍｇ、３５００ｍｇ、４０００ｍｇ、４５００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇ、２５００ｍｇ、３０００ｍｇ、３５００ｍｇ、４０００ｍｇ、４５００ｍｇ、５０００ｍｇ、５５００ｍｇ、６０００ｍｇ、６５００ｍｇ、７０００ｍｇ、７５００ｍｇ、８０００ｍｇ、８５００ｍｇ、９０００ｍｇ、９５００ｍｇ、１０，０００ｍｇ、または前述の固定用量のいずれか２つの間のいずれかの数値の固定用量であってよい。ある態様では、抗ＧＰＲ４９抗体は、以下の実施例にて作製され、記載される２Ｂ５．５、７Ｆ８．２、１Ｂ３．５、９Ｃ６．４、６Ｈ５．４、１０Ａ６．７、１０Ａ９．２、２Ｇ８．１、６Ｃ１０．５、６Ｇ１０．３、８Ｈ８．１、６Ｂ１０．２、３Ｂ８．１１、２Ｆ１２．５、５Ｇ２．１１、１Ｆ１０．５、１０Ｅ１．１、７Ｃ３．４、２Ｈ９．２、５Ｂ１２．４、３Ｇ８．１、５Ｆ２．５、６Ｇ１０．１、１４Ｈ９．１、１２Ｇ５．１、６Ｅ１０．１、１４Ｆ７．１、４Ａ１０．２、３Ｆ１１．１、１１Ｆ６．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、８Ｅ９．１、９Ｃ７．１、４Ｆ６．２、１Ｂ８．１、１８Ｇ７．１、１２Ｅ３．１、６Ｈ５．１、２Ｐ６９．２、１７Ｃ９．１、２Ｈ５．１、および１０Ａ９．２と称する抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。
【００９８】
投与および医薬形態
抗ＧＰＲ４９抗体は、本明細書で提供される実施形態において、癌の治療のために様々な方法および医薬形態で投与されてよい。従って、いくつかの実施形態は、上記および以下の実施例で記載される抗ＧＰＲ４９抗体のいずれか１つまたは組み合わせ、ならびに投与の経路および形態に応じて、薬理学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００９９】
用いられてよい投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、くも膜下腔内）、または経口経路が挙げられる。医薬製剤は、各投与経路に適する形態で与えられてよい。例えば、これらの製剤は、錠剤もしくはカプセルの形態で、注射により、または経口で投与されてよい。注射は、ボーラスであてよく、または連続注入であってもよい。抗ＧＰＲ４９抗体は、単独で投与されてよく、または本技術分野にて公知である癌治療のための別の１もしくは複数の剤と、または薬理学的に許容されるキャリアと、またはその両方と組み合わせて投与されてもよい。
【０１００】
本明細書で用いられる場合、「キャリア」は、用いられる用量および濃度でそれに暴露
される対象にとって無毒性である薬理学的に許容されるキャリア、賦形剤、または安定化剤を含む。多くの場合、生理学的に許容されるキャリアは、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容されるキャリアの例としては、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、およびその他の糖類；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１０１】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒が挙げられる。そのような固体剤形では、抗体は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの薬理学的に許容される不活性キャリアと混合されてよい。そのような剤形は、通常の慣行として、不活性希釈以外の追加の物質も含んでよく、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤である。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤も含んでよい。錠剤および丸剤は、さらに、本技術分野で公知の腸溶コーティングと共に作製されてよい。
【０１０２】
経口投与のための液体剤形としては、水などの本技術分野にて一般的に用いられる不活性希釈剤を含有するエリキシールを有する、薬理学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップが挙げられる。そのような不活性希釈剤に加えて、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、ならびに甘味剤、香味剤、および香料などの賦形剤も含んでよい。
【０１０３】
抗ＧＰＲ４９抗体はまた、非経口投与されてもよい。「非経口投与」および「非経口投与される」の語句は、本明細書で用いられる場合、例えば、腸内および局所投与以外の、通常は注射による投与のモードを含み、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注射ならびに注入が挙げられる。非経口投与は、滅菌水性もしくは非水性溶液、懸濁液、またはエマルジョンが挙げられ得る。非水性溶媒または媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。そのような剤形はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの賦形剤も含有してよい。それらの滅菌は、例えば、細菌保持フィルター（bacteria retaining filter）を通してのろ過によって、滅菌剤を組成物中に混合することによって、組成物を照射処理することによって、または組成物を加熱することによって行われてよい。それらはまた、使用の直前に、滅菌水、または何らかのその他の滅菌注射用媒体を用いて作製されてもよい。
【０１０４】
非経口投与の場合、抗体は、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、または薬理学的に許容される非経口媒体と合わせての凍結乾燥粉末として製剤されてよい。そのような媒体の例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび固定油などの非水性媒体も用いられてよい。媒体または凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、バッファーおよび保存剤）を維持する添加剤を含有してよい。製剤は、一般的に用いられる技術によって滅菌される。例えば、注射による投与に適する非経口組成物は、１．５重量％の活性成分を０．９％の塩化ナトリウム溶液中に溶解することによって作製される。
【０１０５】
本明細書で述べる医薬組成物は、単一用量または複数用量として投与されてよく；個別の治療剤としてまたはその他の治療剤と組み合わせて投与されてよく；ならびに、従来の治療法と組み合わされて、それらが順次にまたは同時に実施されてよい。
【０１０６】
併用療法
上述の抗ＧＰＲ４９抗体のいずれも、互いに、および／または癌の治療に有用であることが公知であるいずれかの治療剤と組み合わされて投与されてよい。上述の抗ＧＰＲ４９抗体と組み合わされてよい治療剤の限定されないクラスとしては、これらに限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物由来抗腫瘍剤、カンプトテシン誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、抗体、およびインターフェロンが挙げられる。
【０１０７】
アルキル化剤としては、これらに限定されないが、ナイトロジェンマスタード  Ｎ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、ＡＭＤ−４７３、アルトレタミン、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、ホテムスチン、グルホスファミド、イホスファミド、ＫＷ−２１７０、マホスファミド、およびミトラクトールが挙げられ；白金配位アルキル化化合物としては、これらに限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、またはサトルプラチン（satrplatin）が挙げられる。
【０１０８】
代謝拮抗剤としては、これらに限定されないが、メトトレキサート、６−メルカプトプリン  リボシド、メルカプトプリン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）単独またはロイコボリンとの組み合わせ、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスフェート、エノシタビン、Ｓ−１、ゲムシタビン、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロールニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、ＴＳ−１、メルファラン、ネララビン、ノラトレキセド、オクホスフェート、プレメトレキセドジナトリウム、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキセート、ビダラビン、ビンクリスチン、またはビノレルビンが挙げられる。
【０１０９】
抗生物質としては、これらに限定されないが：アクラルビシン、アクチノマイシンＤ、アムルビシン、アナマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エルサミトルシン、エピルビシン、ガラルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、メモルビシン（memorubicin）、ネオカルチノスタチン、ペプロマイシン、ピラルビシン、レベッカマイシン、スチマラマー、スルテプトゾシン（srteptozocin）、バルルビシン、またはジノスタチンが挙げられる。
【０１１０】
ホルモン療法剤としては、エキセメスタン、アナストロゾール、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、ホルメスタン、タモキシフェンクエン酸塩およびフルベストラントなどの抗エストロゲン剤、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、またはビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、および４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−(トリフルオロメチル)プロピオンアニリド）などの抗アンドロゲン剤が挙げられる。。
【０１１１】
植物由来抗腫瘍物質としては、例えば、ニトティック阻害剤（nitotic inhibitor）、例えば、ビンブラスチン、ドセタキセル、およびパクリタキセルから選択されるものが挙げられる。
【０１１２】
細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害剤としては、アクラルビシン、アモナフィド、ベロテカン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ジフロモテカン、イリノテカン、エドテカリン、エピルビシン、エトポシド、エキサテカン、ギマテカン、ルロテカン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピクサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド、およびトポテカン、ならびにこれらの組み合わせから成る群より選択される１つ以上の剤が挙げられる。
【０１１３】
免疫剤（immunologicals）としては、インターフェロンおよびその他の数多くの免疫増強剤が挙げられる。インターフェロンとしては、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロン、アルファ−２ｂ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ−１ａ、またはインターフェロンガンマ−ｎ１が挙げられる。
【０１１４】
その他の抗癌剤としては、ＰＦ３５１２６７６、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン（sizofilan）、ウベニメクス、ＷＦ−１０、アルデスロイキン、アレムフズマブ（alemfuzumab）、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、メルグラモスチヌム（melgramostinm）、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン（tecleukin）、チマラシン（thymalasin）、トシツモマブ、Ｖｉｒｕｌｉｚｉｎ、Ｚ−１００、エピラツズマブ、ミツモマブ（mitumomab）、オレゴボマブ、ペムツモマブ、アリトレチノイン、アンプリゲン、アトラセンタン、ベキサロテン、ボルテゾミブ、カルシトロール（calcitrol）、エクシスリンド、フィナステリド、ホテムスチン、イバンドロン酸、ミルテホシン、ミトキサントロン、ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロツネ（tazarotne）、ＴＬＫ−２８６、またはトレチノインが挙げられる。
【０１１５】
抗血管新生化合物としては、アシトレチン、フェンレチニド、サリドマイド、ゾレドロン酸、アンジオスタチン、アプリジン、シレングチド（cilengtide）、コンブレタスタチン、Ａ−４、エンドスタチン、ハロフジノン、レビマスタット、レモバブ、スクアラミン、およびウクラインが挙げられる。
【０１１６】
抗ＧＰＲ４９抗体と組み合わせて用いることができる治療剤のより広範囲のリストは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０７５９５７に見出すことができる。
【０１１７】
本発明の実施形態を、明確化および理解の目的である程度詳細に記載してきたが、当業者であれば、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細事項に種々の変更を行ってよいことは理解される。
【実施例】
【０１１８】
ＧＰＲ４９に対する抗体、そのような抗体を発現するハイブリドーマもしくはその他の細胞株、そのような抗体をコードする核酸および核酸を含むベクター、ならびにそのような抗体による癌の治療方法に関する実施形態を全般的に述べてきたが、単に例証の目的で提供され、限定することを意図するものではない特定の具体的な実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。
【０１１９】
実施例１
ファージディスプレイライブラリーからのヒトＧＰＲ４９に特異的であるヒトＦａｂの選択
ヒトＧＰＲ４９受容体の細胞外ドメインを特異的に認識するヒト抗体を、ファージディ
スプレイ技術を用いて単離した。
【０１２０】
パートＩ：ファージディスプレイパニング
方法：遺伝子組換えヒトＧＰＲ４９−Ｆｃ外部ドメイン（ＧＰＲ４９−Ｆｃ）（配列番号３）を用いて、３．５×１０１０のユニーククローンを含有するヒトナイーブファージミドＦａｂライブラリーのスクリーニングを行った（Hoet, R. M., et al. NatBiotechnol. 23(3): 344-8 (2005)）。ファージライブラリーによるインキュベーションの前に、ビオチン化抗Ｆｃ抗体を磁気ビーズ上に捕捉し、続いて、ＧＰＲ４９−Ｆｃ融合タンパク質を捕捉した。Hoet et al.の記載に従って選択を実施した。３ラウンドのパニングの後、４７９ｂｐのｇｅｎｅ  ＩＩＩスタンプ部をＭｌｕｌ消化によって除去し、ベクターを、ＴＧＩ細胞中での可溶性Ｆａｂ発現に任せた。
【０１２１】
結果：このパニングにより、６１のユニーククローンを単離した。続いて、ユニーククローンを精製し、結合を再確認した。
【０１２２】
パートＩＩ：ＥＬＩＳＡ
遺伝子組換えヒトＧＰＲ４９−Ｆｃ外部ドメインへのＦａｂの結合を、ＥＬＩＳＡによって実証した。方法：簡潔に述べると、ｐＨ９．６、０．０２５Ｍ  炭酸塩バッファー中の２．５ｕｇ／ｍＬの可溶性ＧＰＲ４９−Ｆｃ融合タンパク質を、９６ウェルプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ、ダイネックステクノロジーズ社（Dynex Technologies, Inc.）、カタログ番号３４５５）に５０ｕＬ／ウェルにてコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、アーバインサイエンティフィック（Irvine Scientific）、カタログ番号９２４０）、ｐＨ７．４、プラス０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０により、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００（スカトロンインスツルメンツ（Skatron Instruments））で洗浄し、１％  脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０をＰＢＳ中に含有するｐＨ７．４のバッファーでブロッキングし、次に、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳに０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で洗浄した。アッセイのために、ＧＰＲ４９コーティングプレートを、次に、コントロール、およびＰＢＳ中の１％  脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０にて５０ｕＬ／ウェルで希釈した種々の濃度の試験抗体と共にインキュベートした。室温での１時間のインキュベーション後、プレートを、ＰＢＳに０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で洗浄した。ＰＢＳ中の１％  脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０にて２０００倍に希釈したヤギ抗ヒトカッパ−ＨＲＰ（サザンバイオテック（Southern Biotech）、カタログ番号２０６０−０５）を、５０ｕＬ／ウェルで添加して、結合したＦａｂを検出した。プレートを、室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳに０．０２５％
Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で洗浄した。ＴＭＢ溶液（キルケガード＆ペリーラブズ社（KIRKEGAARD & PERRY LABS, INC.）、カタログ番号５０−７６−００）を１００ｕＬ／ウェルで添加し、２分後、５０ｕＬ／ウェルの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ラブケム（LabChem）、カタログ番号ＬＣ２５８３０−１）で反応を停止した。ＴＭＢの吸光度を、４５０ｎｍ、バックグラウンド５４０ｎｍにて、モレキュラーデバイス（Molecular Devices）のプレートリーダーを用いて測定した。データの解析は、ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウェアパッケージ  バージョン４．３  ＬＳ (モレキュラーデバイス社)を用いて行った（図１）。
【０１２３】
結果：この結果、以下の６つのＦａｂが滴定可能な結合を有していた：７１Ｃ１０、８６Ｃ１１、６６Ｄ０５、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４。
【０１２４】
パートＩＩＩ：ＦＡＣＳ分析
方法：６つのＧＰＲ４９  Ｆａｂを、１：２０、１：４０、および１：８０に希釈し、
ＨＡ−ＧＰＲ４９でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｅとの結合について、ＦＡＣＳによって試験した。トランスフェクション後２４時間から４８時間にて細胞を懸濁液として回収し、抗ＧＰＲ４９抗体またはコントロールＩｇＧと共に、氷上にてインキュベートする。細胞を洗浄し、蛍光発色団と結合された抗マウス二次抗体により、一次抗体を検出した。次に、標識細胞をＦＡＣＳで分離し、未変性の細胞表面ＧＰＲ４９タンパク質の発現を特異的に認識する抗ＧＰＲ４９抗体を識別した。
【０１２５】
結果：６つの有望なＦＡＣＳ陽性ＧＰＲ４９  Ｆａｂのすべてが、Ｆａｂ希釈率の増加に従ってＨＡ−ＧＰＲ４９−ＨＥＫ２９３Ｅとの結合の減少を示し、いずれもＨＥＫ２９３Ｅとの結合を示さなかった（図２）。幾何平均が低いのは、Ｆａｂエピトープへの接近のし易さがそれほど高くないこと、細胞表面でのＧＰＲ４９の発現が低いこと、またはＦａｂが低親和性であり得ることに起因している可能性がある。ＣＨＯ親株と比較したＣＨＯ−ＧＰＲ４９（５０ｎＭ  ＭＴＸ）に対するＧＰＲ４９  Ｆａｂ（４００ｎＭからゼロまでの２倍希釈）のＦＡＣＳによる追加の試験により、以下の３つのＦａｂが、およそＥＣ５０＜１０ｎＭを有することが明らかとなった：７６Ｃ１２、７６Ｂ０４、および７８Ｆ０５（図３Ａおよび３Ｂ）。腫瘍細胞株（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、およびＨＣＴ１１６）に対するＦａｂの試験からは、７６Ｃ１２のＦａｂのみが結合能力を有することがＦＡＣＳによって明らかとなった（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ〜Ｃ、および６Ａ〜Ｃ）。
【０１２６】
パートＩＶ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析
方法：３つの特定のＦａｂ（７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４）は、ＦＡＣＳにより、１０ｎＭ未満の親和性にてヒトＧＰＲ４９受容体と特異的に結合することが識別された。結合動態学の分析のために、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ上に、２９５０ＲＵのレベルまで固定した。次に、ＧＰＲ４９−Ｆｃを、フローセル２に約４００ＲＵの密度まで捕捉し、フローセル１はレファレンスとして用いた。精製Ｆａｂ（ＨＳＰ−ＥＰ中１００、５０、２５ｎＭ）を、３０μＬ／分にて７分間注入し、解離のために２０分間置いた。データの解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖ４．１）により、１：１モデルを仮定して行った。次に、ＦａｂのＦｃドメインとの交差反応性を試験するために、ＩｇＧ１  Ｆｃを、フローセル２に約２５０ＲＵの密度まで捕捉し、フローセル１はレファレンスとして用いた。次に、すべてのＦａｂを、上記と同じ条件下にて試験した。ｂｉａｃｏｒｅ実験はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ
３０００の装置上、２５℃にて行った。
【０１２７】
結果：７６Ｃ１２および７８Ｆ０５のＦａｂは、それぞれ３．４ｎＭおよび１．７ｎＭのＫＤにて結合した。７６Ｂ０４のＦａｂは、弱い結合を示した。
【０１２８】
実施例２
完全長抗ＧＰＲ４９  ＩｇＧの構築
方法：３つのＦａｂをヒトＩｇＧ１に変換し、ＣＨＯ細胞中にて発現させた。３つの別々の抗ＧＰＲ４９  Ｆａｂである、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および７６Ｂ０４をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子組換えヒトＧＰＲ４９外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質に対するバイオパニングにより、ヒト抗体ファージライブラリー（ダイアックス社（Dyax Corp））から選択した。これらのＦａｂ遺伝子配列を用い、哺乳類細胞中での抗体産生のためのｐＶ９０ＡＳ発現ベクター系を用いることにより、完全長抗体をコードする発現プラスミドを構築した。ｐＶ９０ＡＳは、一次転写物の選択的スプライシングによって単一のプロモーターから２つの転写物が生成されるように設計された修飾ｐＶ９０発現ベクターである（参考文献：米国特許商標庁出願  ＷＯ２００５／０８９２８５）。天然ＣＭＶスプライスドナーをスプライスして、抗体軽鎖コード転写物を生成させるための部分損傷スプライスアクセプター、または抗体重鎖コード転写物を生成させるための天然ＣＭＶスプライスアクセプターとする。部分損傷スプライスアクセプターは、重および軽鎖転写物の
両方が類似量で得られるように操作されたものである。軽鎖可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）領域を、ＰＣＲで増幅した。５’軽鎖ＰＣＲプライマーには、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるNakamura T, et al., Int J Immunopharmacol. 22:131-41 (2000)に記載の方法に従って、Ｓｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、および続いて免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドをコードする配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号５）を、ＶＬ領域のアミノ末端に対応する配列に対してインフレームで含有させた。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動、およびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（キアゲン  カリフォルニア州）を用いた抽出によって精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ  ＩおよびＡｓｃ  Ｉで消化し、Ｓｆｉ
Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ消化ｐＨＬＰ０２５ベクター（ホリープレンティス（Holly Prentice））と連結した。ｐＨＬＰ０２５ベクターは、天然のＣＭＶスプライスドナー部位配列に加えて、Ｓｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ消化ＰＣＲ断片として抗体軽鎖（シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ）を受けるためのＳｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、部分損傷スプライスアクセプター部位配列、およびポリＡシグナル配列を含有している（参考文献：米国特許商標庁出願  ＷＯ２００５／０８９２８５）。
【０１２９】
各抗ＧＰＲ４９  Ｆａｂ（７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、７６Ｂ０４）の重鎖可変（ＶＨ）領域を、ＰＣＲで増幅した。５’重鎖ＶＨ  ＰＣＲには、上述のように、Ｎｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、および続いて合成重鎖シグナルペプチドをコードする配列ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号６）を、ＶＨ領域のアミノ末端に対応する配列に対してインフレームで含有させた。３’重鎖ＶＨ  ＰＣＲプライマーには、ＶＨ領域のカルボキシル末端に対応する配列およびＳｆｉ  Ｉ部位を含有させた。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動、およびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（キアゲン，カリフォルニア州）を用いた抽出によって精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉで消化し、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化ｐＨＬＰ０２９ベクター（ホリープレンティス）と連結した。ｐＨＬＰ０２９ベクターは、上流のポリＡシグナル配列、天然のＣＭＶスプライスアクセプター部位配列、および下流のポリＡシグナル配列に加えて、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化ＰＣＲ断片として抗体シグナルペプチド−ＶＨ配列を受けるためのＮｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ部位を含有している（参考文献：米国特許商標庁出願  ＷＯ２００５／０８９２８５）。
【０１３０】
ｐＨＬＰ０２５中の（Ｓｆｉ  Ｉ部位−軽鎖シグナルペプチド−抗ＧＰＲ４９  ＶＬおよびＣＬ）、およびｐＨＬＰ０２９中の（重鎖シグナルペプチド−抗ＧＰＲ４９  ＶＨ−Ｓｆｉ  Ｉ部位）をコードする遺伝子配列を、上述の５’軽鎖および３’重鎖ＶＨ  ＰＣＲプライマーを用い、両ベクターに共通して存在するオーバーラップ配列を通して、ＰＣＲ増幅により集合させて、単一のＤＮＡ断片を構築した。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動、およびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（キアゲン，カリフォルニア州）を用いた抽出によって精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ  Ｉで消化し、Ｄｒａ  ＩＩＩ消化ＩｇＧ１親ベクターと連結した。
【０１３１】
結果：得られたプラスミドは、選択的スプライシング後に翻訳的に活性である抗体重鎖および軽鎖ｍＲＮＡがおよそ化学量論的量で得られる、バイシストロン性前駆体転写物を生成する。ＤＮＡ配列分析によって正しい配列を確認した。哺乳類細胞中での完全長の発現により、安定なヒトＩｇＧ１抗体の産生が得られた。
【０１３２】
実施例３
哺乳類細胞中での改善された発現のための完全長抗ＧＰＲ４９  ＩｇＧの構築
抗体発現の収率および産物の質を改善するために、抗ＧＰＲ４９  Ｆａｂ、７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、７６Ｂ０４、からの元のＶＨ遺伝子配列の修飾を行った。
【０１３３】
方法：第一に、抗ＧＰＲ４９  ＶＨ配列を、公開配列認識プログラム（www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html（ゲノム科学研究所（The Institute for Genomic Research），９７１２  メディカルセンタードライブ，ロックビル，メリーランド州  ２０８５０）、www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)。（Martin G. Reese and Frank H. Eeckman，ローレンス・バークレー国立研究所（Lawrence Berkeley National Laboratory），ゲノムインフォマティクスグループ（Genome Informatics Group），１  サイクロトロンロード，バークレー，カリフォルニア州  ９４７２０；Reese M G, Eeckman, F H, Kulp, D, Haussler, D, 1997. "Improved Splice Site Detection in Genie". J Comp Biol 4(3), 311-23、も参照されたい。)を用いて、推定スプライス部位を含有する配列について分析した。第二に、抗ＧＰＲ４９  Ｆａｂの重鎖可変領域中のコドンを、元の抗ＧＰＲ４９  ＶＨポリペプチド配列中における変化にまったく遭遇することなくＣＨＯ細胞中で良好に発現された抗体からの同一のＫａｂａｔ位置に対応するコドンで置き換えた。この第二の工程は、推定スプライス部位をほとんど除去するが、追加のスプライス部位分析、およびこれに続く同義コドン交換を実施して、推定スプライス部位が存在する予測される可能性を低減した。
【０１３４】
抗ＧＰＲ４９  Ｆａｂの配列が最適化されたＶＨ配列とインフレームである合成重鎖リーダーをコードするＤＮＡ断片を、化学合成された二本鎖ＤＮＡ配列として市販業者から入手した（ブルーヘロンバイオテクノロジー社（Blue Heron Biotechnology, Inc.），ボセル，ワシントン州）。この合成断片中には、Ｎｃｏ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位が５’および３’に含まれていた。リーダーおよび抗ＧＰＲ４９配列最適化ＶＨ領域断片を、上記実施例２に記載のように、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化ｐＨＬＰ０２９ベクター中にクローン化した。ｐＨＬＰ０２５中の適切な対応する軽鎖による遺伝子組換えおよびそれに続く単一断片のクローン化は、上記実施例２に記載の通りである。ＤＮＡ配列分析によって正しい配列を確認した。
【０１３５】
結果：哺乳類細胞中でのこのプラスミドシリーズからの完全長抗体の発現は、安定なヒトＩｇＧ１抗体の産生を増加させる結果となった。
【０１３６】
実施例４
ＧＰＲ４９抗体の一過性発現および特徴づけ
方法：プラスミドＤＮＡを用いて、抗体タンパク質の一過性産生のために、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を形質転換した。２０ｕｇのプラスミドＤＮＡを、体積０．４ｍＬの１×ＰＢＳ中にて４×１０６細胞と混合した。この混合物を、０．４ｃｍキュベット（バイオラッド（BioRad））に添加し、氷上に１５分間配置した。細胞を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ電気穿孔器（バイオラッド）により、６００ｕＦおよび３５０ボルトにて電気穿孔した。細胞を、ＣＨＯ−ＳＳＦＭ  ＩＩ培地に、１００ｕＭ  ヒポキサンチンを添加したもの、および１６ｕＭ  チミジンを入れたＴ−２５フラスコ中に配置し、３７°にて４日間インキュベートした。さらに、プラスミドＤＮＡを用いて、抗体タンパク質の一過性発現のために、２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。１．２ｕｇの各（重および軽）プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  トランスフェクション  プロトコル（キアゲン，カリフォルニア州）を用いて、２×１０６細胞中へトランスフェクトした。細胞を３７℃にて３日間インキュベートした。
【０１３７】
結果：上清を回収し、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ法の両方によって完全長抗体を確認した。完全ＩｇＧ１のＧＰＲ４９と結合する能力は、ＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１３８】
実施例５
抗ＧＰＲ４９抗体産生ＣＨＯ細胞株の樹立
本実施例は、完全長ＩｇＧ１として、Ｆａｂ  ７６Ｃ１２の結合ドメインを含む抗ＧＰＲ４９抗体の発現についての詳細な記述を与えるものである。本明細書で述べるその他のＦａｂ、すなわち、実施例１に挙げるものについては、類似の方法で発現した。
【０１３９】
方法：７６Ｃ１２の可変および定常領域は、ヒト配列由来である。軽鎖および重鎖可変領域全体は、ＤＹＡＸファージディスプレイ技術によってヒトＧＰＲ４９に対して作製されたＦａｂ由来のものである。可変、ならびに軽鎖定常領域を、選択的スプライシング発現ベクター（alternate splice expression vector）中へサブクローン化した。選択的スプライシングの構成により、単一のスプライスドナーを２つのスプライスアクセプターと共に用いることで、軽および重鎖が連結され、、各スプライスアクセプターは、２つの鎖の一方をコードする転写物を生成する。免疫グロブリン遺伝子をコードする発現ベクターＤＮＡを、インスリン非依存性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４ｉ）へ電気穿孔した。ＣＨＯトランスフェクトーマを産生目的のために選択した。
【０１４０】
７６Ｃ１２の軽鎖遺伝子の対応する可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）ドメインおよび７６Ｃ１２の重鎖遺伝子の可変（ＶＨ）ドメインからの相補ＤＮＡを、発現ベクター中にクローン化した。このベクターは、ヒト重鎖定常領域のすぐ上流側に全軽鎖および可変重鎖ｃＤＮＡを挿入するためのクローン化部位を含有する。Ｉｇ遺伝子に加えて、この発現ベクターは、哺乳類細胞中での選択に用いることができるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有する。次に、得られた発現ベクターをＣＨＯ細胞中へトランスフェクトして、抗ＧＰＲ４９分泌ＣＨＯ細胞株の作製を開始した。
【０１４１】
この発現ベクターを、ＣＨＯ細胞中へ電気穿孔した。免疫グロブリン軽鎖特異的ＰＣＲプライマーを用いて、Ｆａｂ軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。５’特異的オリゴ配列は、バイオジェンアイデック（Biogen Idec）の抗ＣＤ２３分子の軽鎖からの天然シグナルペプチドを含んでいた。５’および３’オリゴ配列は、中間体ベクター中へサブクローン化するために、それぞれ、Ｓｆｉ  ＩおよびＡｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有している。ＶＨ  ｃＤＮＡは、合成重鎖シグナルペプチドを含む５’オリゴ配列を用いてＰＣＲ増幅した。５’および３’オリゴ配列は、中間体ベクター中へサブクローン化するために、それぞれ、Ｎｃｏ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有している。
【０１４２】
軽鎖５’およびＶＨ３’オリゴ配列をテンプレートとして用いたオーバ−ラッピングＰＣＲを利用して、軽鎖およびＶＨ領域を１つのｃＤＮＡセグメントに組み合わせた。得られた産物を、Ｄｒａ  ＩＩＩ部位にサブクローン化し、こうして、最終の選択的スプライシング発現ベクターを作り出した。選択的スプライシングの構成により、一次転写物の選択的スプライシングを通して、単一プロモーターから２つの転写物が作製される。天然ＣＭＶスプライスドナーは、準最適スプライスアクセプターへスプライスされて軽鎖コード転写物が作製されるか、または天然ＣＭＶスプライスアクセプターへスプライスされて重鎖コード転写物が作製される。準最適スプライスアクセプターは、類似量の両転写物を作製するように設計された。
【０１４３】
最終のＤＮＡベクターは、ＨＥＢＳバッファー中、７００ｎｇ／ｕＬの濃度で作製し、その後、ＣＨＯ細胞中へ電気穿孔した。種々の濃度のＤＮＡを用いて（１５、２０、３０、４０、および４５ｕｇ）５回の電気穿孔を行った。各電気穿孔は、０．７ｍＬの滅菌ＨＥＢＳバッファー中の４×１０６の対数期ＣＨＯ細胞および０．１ｍＬのＨＥＢＳ中のＤＮＡ（合計体積０．８ｍＬ）を入れた使い捨て０．４ｃｍキュベット（インビトロジェン（Invitrogen））中にて行った。バイオ−ラッド  ジーンパルサー  Ｘセル（Bio-Rad Gene Pulse Xcell）を用い、２９０ボルト、９５０マイクロファラデーに設定して、細胞にショックを与えた。ショックを与えられた細胞を、次に、室温にて１０分間静置し、続い
て、室温のインスリンフリーＣＨＯＭ１６培地１０ｍＬと混合し、遠心分離にかけ（３’＠１０００ｒｐｍ）、吸引した。次に、細胞を、１２ｍＬのインスリンフリーＣＨＯＭ１６培地（室温）に再懸濁し、Ｔ−７５組織培養フラスコへ移した。
【０１４４】
細胞および培地：電気穿孔の前に、ＣＨＯ細胞を、１×ヌクレオシドを添加した血清フリー培地（ＣＨＯＭ２４）中にて成長させた。ＣＨＯＭ２４は、動物成分をまったく含有しない化学的に明らかである自家培地製剤である。メトトレキサート選択を、ヌクレオシドフリーであるＣＨＯＭ１６およびＣＨＯＭ２４の化学的に明らかである培地中にて行った。
【０１４５】
電気穿孔の後、４×１０６のＣＨＯ細胞をＴ−７５フラスコ中にプールした。細胞をヌクレオシドフリー培地に播種し、すぐにＤＨＦＲ発現についての選択を開始した。細胞は、最終的に、ＣＨＯＭ２４中、１２５ｍＬのシェイクフラスコへ拡張した（約３週間）。クローン細胞株を単離するために、トランスフェクトされた安定なプールを希釈し、４つの９６ウェルプレート上に、２００ｕＬのＣＨＯＭ１６において１細胞／ウェルで播種した。プレートを、抗体力価についてのスクリーニングを行うまで、３７℃に維持した。
【０１４６】
ＣＨＯコロニーを、ヒトカッパ鎖に対して特異的であるＥＬＩＳＡを用いて細胞上清を分析することにより、免疫グロブリン産生についてスクリーニングした（播種後第２１日から２８日）。ＥＬＩＳＡで用いた捕捉抗体は、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（ササンバイオテック）であり、検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したポリクローナルヤギ抗ヒトカッパ（ササンバイオテック）であった。免疫グロブリンの分泌量が最も多いコロニーを増大させた。
【０１４７】
結果： スケールアップおよび製造に適する期待される生化学的および生物物理学的特性を有する抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂが得られる高発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。
【０１４８】
実施例６
完全ヒト抗ＧＰＲ４９  ＩｇＧ１抗体の精製および特徴づけ
ＣＨＯ細胞中で産生された抗体を、以下で述べる方法によって精製および特徴づけした。
【０１４９】
方法：プロテインＡ捕捉：プロテインＡカラムを、１×ＰＢＳ（平衡バッファー）により、１００〜１５０ｃｍ／時間にて、３カラム分の体積で予備平衡化した。上清を、最大で樹脂１ミリリットルあたり１０ｍｇのＧＰＲ４９  ｍＡｂにより、１５０ｃｍ／時間にて充填した。充填後、カラムを５カラム分の体積の平衡バッファーで洗浄した。次に、カラムを、ｐＨ３．０の１００ｍＭ  グリシンにより、上向流方向で段階溶出した。所望される画分を回収し、２Ｍ  トリス塩基にて中性ｐＨまで滴定した。回収した画分を、１×ＰＢＳに対して透析し、濃縮物をサイズ排除工程のために調製した。サイズ排除凝集物除去工程に含まれるのは、ＳＵＰＥＲＤＥＸ２００を、１．５カラム分の体積の１×ＰＢＳにより、３６ｃｍ／時間の流速で平衡化し、続いてタンパク質を充填し、所望される画分を回収することであった。
【０１５０】
同一性試験を以下のようにして行った：
【０１５１】
１）分子質量測定をエレクトロスプレー質量分析器（ＥＳＩ−ＭＳＤ）で行う質量分析によるインタクト質量分析（intact mass analysis）。分析の前に、サンプルを還元してジスルフィド結合を除去した。デコンボリューションされた（deconvoluted）質量スペクトルは、重および軽鎖の質量を表している。
【０１５２】
２）Ｎ末端配列分析を、オンラインＰＴＨアナライザーを搭載したＡＢＩタンパク質シークエンサーを用い、エドマン分解によって行った。軽鎖および重鎖の最初のアミノ酸の配列を識別した。
【０１５３】
３）質量分析によるペプチドマッピング：トリプシンまたは／およびＥｎｄｏＬｙｓＣペプチドマッピングを行って、各ペプチドから得られたＬＣ／ＭＳデータの解析から、完全な配列カバレッジを得た。加えて、酸化および脱アミド化の部位および量を検出して特定した。
【０１５４】
精製試験を以下によって行った；１）ＳＤＳ−ＰａｇｅまたはＣＥ−ＳＤＳ：還元および非還元サンプル、この技術は、抗体の断片化、凝集、および不純物の測定に用いる。２）ＬＳおよびＲＩ技術によるＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、凝集および断片化を測定し、光散乱により、サンプル成分のモル質量が特定される。３）ＳＤＳゲルまたはキャピラリーＩＥＦ法を用いて、ＣおよびＮ末端不均一性および／または脱アミド化に起因し得る荷電アイソフォームの等電点電気泳動パターンおよびｐｉ分布を特定した。最後に、エンドトキシン濃度を、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）カイネティック比濁法によって測定した。
【０１５５】
結果：抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂの精製により、スケールアップおよび製造に適する特性を有する９９％超の単量体エンドトキシンフリーｍＡｂがグラム単位の量で得られた。
【０１５６】
実施例７
ヒトＧＰＲ４９外部ドメインに対するマウス抗体の作製
パートＩ：ハイブリドーマ選択
方法：ＧＰＲ４９の外部ドメインに対する抗体を作製するために、マウスを、精製されたエンドトキシンフリーＧＰＲ４９−Ｈｉｓ（配列番号２）により、標準的な技術を用いて３回免疫化した。個々のマウスからの血液を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を用いて、抗原認識についてスクリーニングした。次に、最も高い抗体力価を有する動物を、最終的な抗原ブーストのために選択し、その後、脾臓細胞をハイブリドーマ産生のために単離した。およそ１０００のクローンを、４×２４ウェル融合プレートから１０×９６ウェル培養プレートに移した。１９９の陽性クローンを、ＧＰＲ４９−Ｆｃ捕捉ＥＬＩＳＡによって選択し、４８ウェルプレートに移した。これらのうち、ＦＡＣＳにより、ＧＰＲ４９−ＣＨＯ陰性を示したか、または親株ＣＨＯとの結合に陽性を示したことから、１００の陽性クローンは選択しなかった。そして、９９陽性クローンのうちの５０を、アイソタイプに応じて選択した。
【０１５７】
結果：３６のクローンをサブクローン化した（単一または混合ＩｇＧバンド、ＩｇＧ１／ｋ、ＩｇＧ２ａ／Ｇ、およびＩｇＧ１／２ｂ／ｋなど）。親からサブクローンまでに、８のクローンが発現を喪失した。２４の選択されたサブクローンからのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、プロテインＡまたはプロテインＧアガロースクロマトグラフィを用いてハイブリドーマ上清から精製し、抗体を、以下で述べるように、ＦＡＣＳによって試験した。
【０１５８】
パートＩＩ：ＦＡＣＳ分析
方法：２４のマウスＧＰＲ４９  ｍＡｂを段階希釈し、ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−ＨｉｓでトランスフェクトされたＣＨＯおよび親株ＣＨＯとの結合について、ＦＡＣＳによって試験した（標準的な方法）。
【０１５９】
結果：結果を表２にまとめる（図７Ａ〜Ｃに示すデータ）。
【０１６０】
【表２−１】
2014533247.tif 000004
【０１６１】
【表２−２】
2014533247.tif 000005
【０１６２】
パートＩＩＩ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析
マウスｍＡｂの結合反応速度論を、Ｂｉａｃｏｒｅによって分析した。
【０１６３】
方法：ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ上に、２９５０ＲＵのレベルまで固定した。次に、ＧＰＲ４９−Ｆｃを、フローセル２に約４００ＲＵの密度まで捕捉し、フローセル１はレファレンスとして用いた。精製マウスｍＡｂ（ＨＳＰ−ＥＰ中１００、５０、２５ｎＭ）を、３０μＬ／分にて７分間注入し、解離のために２０分間置いた。データの解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖ４．１）により、１：１モデルを仮定して行った。ｂｉａｃｏｒｅ実験はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００の装置上、２５℃にて行った。
【０１６４】
結果：マウスｍＡｂは、６４ｎＭから１ｎＭ未満の親和性（ＫＤ）にて、ＧＰＲ４９−Ｆｃと結合した。データを表３に示す。
【０１６５】
【表３−１】
2014533247.tif 000006
【０１６６】
【表３−２】
2014533247.tif 000007
【０１６７】
実施例８
完全長ヒトＧＰＲ４９に対するマウス抗体の作製
パートＩ：ハイブリドーマ選択
方法：完全長受容体に対する抗体を作製するために、マウスを、ＧＰＲ４９遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンをコードするＤＮＡベクターを金粒子と混合したものの１０ｕｇ／マウスにて、３回免疫化した。最初の免疫化のおよそ７５日後に、個々のマウスの血液を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析により、抗原認識についてスクリーニングした。次に、最も高い抗体力価を有する動物を、最終的な抗原ブースト（２５ｕｇ  ＧＰＲ４９−Ｆｃ、１０ｕｇ  ＧＰＲ４９−ＤＮＡ／金粒子、および５×１０６  ＧＰＲ４９−ＣＨＯ細胞）のために選択し、その後、脾臓細胞をハイブリドーマ作製のために単離した。およそ１０，０００のクローンを作製し、およそ２００の陽性クローンを、ＧＰＲ４９−ＣＨＯ捕捉ＥＬＩＳＡによって選択した。
【０１６８】
結果：６７のクローンを、ＥＬＩＳＡおよびＧＰＲ４９−ＣＨＯ  ＦＡＣＳによって確認した。次に、２２の陽性クローンをサブクローン化した（単一または混合ＩｇＧバンド、ＩｇＧ１／ｋ、ＩｇＧ２ａ／Ｇ、およびＩｇＧ１／２ｂ／ｋなど）。１９の選択されたサブクローンからのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、プロテインＡまたはプロテインＧアガロースクロマトグラフィを用いてハイブリドーマ上清から精製し、抗体を、以下で述べるように、ＦＡＣＳによって試験した。
【０１６９】
パートＩＩ：ＦＡＣＳ分析
方法：１９のマウスＧＰＲ４９  ｍＡｂを段階希釈し、ＧＰＲ４９−Ｆｌａｇ−ＨｉｓでトランスフェクトされたＣＨＯおよび親株ＣＨＯとの結合について、ＦＡＣＳによって試験した（標準的な方法）。
【０１７０】
結果：マウスｍＡｂは、１７ｎＭから１ｎＭ未満（ＥＣ５０）にて、ＧＰＲ４９と結合した。結果を表４にまとめる（図８Ａ〜Ｄに示すデータ）。抗体１０Ａ９．１は、コントロールとして用いた。
【０１７１】
【表４−１】
2014533247.tif 000008
【０１７２】
【表４−２】
2014533247.tif 000009
【０１７３】
パートＩＩＩ：ＧＰＲ４９ダイレクト結合ＥＬＩＳＡ
マウス抗体のＧＰＲ４９との結合の特徴づけを行うために、ダイレクト結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０１７４】
方法：ｐＨ９．６の０．０２５Ｍ  炭酸バッファー中２．５ｕｇ／ｍＬの可溶性ＧＰＲ４９−Ｆｃ融合タンパク質を、５０ｕＬ／ウェルにて９６ウェルプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ、ダイネックステクノロジーズ社、カタログ番号３４５５）にコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、アーバインサイエンティフィック、カタログ番号９２４０）、ｐＨ７．４に０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００（スカトロンインスツルメンツ）で洗浄し、１％  脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０をＰＢＳ中に含有するｐＨ７．４のバッファーでブロッキングし、次に、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳに０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で洗浄した。アッセイのために、ＧＰＲ４９コーティングプレートを、次に、コントロール、およびＰＢＳ中の１％  脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０にて５０ｕＬ／ウェルで希釈した種々の濃度の試験抗体と共にインキュベートした。室温での１時間のインキュベーション後、プレートを、ＰＢＳに０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で洗浄した。ＰＢＳ中の１％  脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０にて２０００倍に希釈したヤギ抗マウス−Ｆｃ−ＨＲＰ（サザンバイオテック、カタログ番号２０６０−０５）を、５０ｕＬ／ウェルで添加して、結合したＦａｂを検出した。プレートを、室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳに０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにより、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で洗浄した。ＴＭＢ溶液（キルケガード＆ペリーラブ
ズ社、カタログ：５０−７６−００）を１００ｕＬ／ウェルで添加し、２分後、５０ｕＬ／ウェルの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ラブケム、カタログ番号ＬＣ２５８３０−１）で反応を停止した。ＴＭＢの吸光度を、４５０ｎｍ、バックグラウンド５４０ｎｍにて、モレキュラーデバイスのプレートリーダーを用いて測定した。データの解析は、ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウェアパッケージ  バージョン４．３  ＬＳ (モレキュラーデバイス社)を用いて行った。結果として、ＥＣ５０値を得た。
【０１７５】
結果：マウスｍＡｂは、２２４ｎＭから１ｎＭ未満の範囲のＥＣ５０にて、ＧＰＲ４９−Ｆｃと結合した（表５；図９Ａ〜Ｄ）。
【０１７６】
【表５−１】
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【０１７７】
【表５−２】
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【０１７８】
実施例９
癌腫瘍は抗ＧＰＲ４９抗体で標識可能
方法：結腸およびその他の腫瘍細胞中におけるＧＰＲ４９の発現を、抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、７６Ｃ１２および７８Ｆ０５を用い、フローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）によって測定した。
【０１７９】
結果：ＧＰＲ４９は、複数の結腸腫瘍（ＣＴ１、ＣＴ３、ＬＳ１７４Ｔ、Ｓｗ４８０、ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ）、胃腫瘍Ｎ８７、肺腫瘍Ａ５４９、および陽性コントロールＧＰＲ４９−ＣＨＯ安定化トランスフェクタント中にて発現されることが分かった。加えて、ＧＰＲ４９への抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂの結合の特異性が、ＬＳ１７４Ｔ細胞中のＧＰＲ４９のＲＮＡｉノックダウンによって確認され、それは、ＬＳ１７４Ｔ細胞と結合するＧＰＲ４９  ｍＡｂ、７６Ｃ１２、７６Ｂ０４、および７８Ｆ０５の結合を大きく阻害した。
【０１８０】
実施例１０
結腸癌幹細胞（ＣＳＣ）のマーカーとしてのＧＰＲ４９の検証
パートＩ：
方法：癌幹細胞腫瘍スフェア状態に維持されたＣＴ１原発性結腸腫瘍細胞を、ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、７６Ｃ１２を用いたＦＡＣｓによって分離した。ＧＰＲ４９陽性（ＧＰＲ４
９＋）、ＧＰＲ４９陰性（ＧＰＲ４９−）、および未分離の生ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）陰性細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１細胞で播種し、３週間後に、スフェア形成能（すなわち、癌幹細胞の数）について分析した。
【０１８１】
結果：分離したＧＰＲ４９陽性（ＧＰＲ４９＋）結腸腫瘍細胞は、ＧＰＲ４９陰性および未分離細胞と比較して、癌幹細胞活性が非常に高められていた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ＧＰＲ４９で分離したＬＳ１７４Ｔ結腸腫瘍細胞は、２つの別個に独立した実験において、癌幹細胞が同様に非常に高濃度となっていた。
【０１８２】
パートＩＩ：
方法：これらの結果をさらに確認するために、結腸癌幹細胞腫瘍スフェアをＧＰＲ４９またはコントロールＲＮＡｉ−１で処理し、次にウェルあたり２５０細胞で９６ウェルプレートに播種するという追加の実験を行った。
【０１８３】
結果：コントロールＲＮＡｉ−１ではなく、ＧＰＲ４９  ＲＮＡｉ−１での処理により、処理の１４日後に測定した結腸癌幹細胞の数が大きく減少した。
【０１８４】
実施例１１
ＧＰＲ４９陽性結腸腫瘍細胞は生体内にて癌幹細胞特性を有する
方法：単離したＧＰＲ４９＋細胞が、癌幹細胞特性を有することを示すために、ＧＰＲ４９−細胞に対してＧＰＲ４９＋の生体内での成長を比較する生体内癌幹細胞アッセイを実施した。原発性結腸腫瘍細胞株ＣＴ１からのＧＰＲ４９＋細胞を、ＭｏＦｌｏを用いて７６Ｃ１２によって分離し、マウスあたり１０００細胞にて移植した。マウスを、その後５０日間にわたって、腫瘍形成および体重減少について分析した。
【０１８５】
結果：ＧＰＲ４９＋原発性結腸腫瘍細胞は、原発性腫瘍異種移植実験において、高悪性度の腫瘍成長（図１１Ａ）および急速な体重減少（図１１Ｂ）を引き起こしている。対照的に、ＧＰＲ４９−細胞は、非常にゆっくり成長し、急速な体重減少を引き起こさなかった。これらの知見から、ＧＰＲ４９高発現結腸腫瘍細胞は、癌幹細胞の重要な特徴である高い腫瘍原性を有することが実証される。
【０１８６】
実施例１２
Ｒ−スポンジンは高親和性にてＧＰＲ４９と結合するが、ＧＰＲ４９媒介シグナル伝達を活性化しない
パートＩ：ＧＰＲ４９は、糖タンパク質ホルモン受容体ファミリー（例：ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨに対する受容体）と関連するオーファンＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であり、腸のＷｎｔ標的遺伝子をスクリーニングすることによって識別された腸および胃幹細胞マーカーである（Barker et al., Nature, 2007）。ＧＰＲ４９の天然リガンドを識別するために、結合実験では、公知のＷｎｔ経路修飾因子であるノギン、グレムリン１、ＤＡＮ、コーディン様１（Chordin-like 1）、セルベルス１、ＰＲＤＣ、スタニオカルシン−１、ＣＯＣＯ、コーディン、Ｒ−スポンジン１〜３、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ４に注目した。
【０１８７】
方法：ＧＰＲ４９−Ｆｃに対するリガンド結合活性を、バイオレイヤー干渉法に基づくアッセイ（biolayer interometry-based assay）にて特定した。簡潔に述べると、ＧＰＲ４９−Ｆｃおよび試験リガンド（すべてＲ＆Ｄシステムズ（R&D systems）から購入）を、すべて、ＯＢバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、０．０１％（重量／体積）  ＮａＮ３、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．０２％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（フォルテバイオ社（ForteBio, Inc.），メンロパーク，カリフォルニア州）を用いて、ＧＰＲ４９−Ｆｃを、抗ヒトＩｇＧ  Ｏｃｔｅｔチップ（
フォルテバイオ社，メンロパーク，カリフォルニア州：パーツ番号  １８−５００１）上に捕捉した。チップをＯＢバッファーで洗浄し、ＯＢバッファー中の試験リガンドを含有するウェルへ移した。試験リガンドのＧＰＲ４９−Ｆｃとの結合を、会合フェーズ（１２０秒間）および解離フェーズ（１２０秒間）の間に、バイオ干渉シグナル（biointerferometry signals）として記録した。加えて、リガンドを、マウスＧＰＲ４９−Ｆｃに対して試験した。
【０１８８】
結果：Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーは、ヒトＧＰＲ４９−Ｆｃと相互作用を起こすが、解釈を困難とする非特異的構成要素を示している。具体的には、観察された２フェーズの会合および解離は、複数の結合イベントを示唆している。ＲＳＰＯファミリーメンバーは、マウスＧＰＲ４９−Ｆｃ［８８％同一性（９１％類似）］とは相互作用を起こさない。
【０１８９】
パートＩＩ：用いたＧＰＲ４９−Ｆｃは、溶解したＧＰＲ４９外部ドメインの二量体（Ｆｃ片側部分同士の相互作用による）であるが、ＧＰＲ４９−Ｆｃがチップへの固定化されていること、および試験ＲＳＰＯ分子が単量体状態であることから、２フェーズの結合は、これによって説明することができない。従って、ＧＰＲ４９−ＦｃへのＲＰＯＳの結合の２フェーズ性について、溶液親和性表面プラズモン共鳴アッセイ（solution affinity surface plasmon resonance assay）によってさらに調べた。
【０１９０】
方法：ＲＳＰＯのＧＰＲ４９との結合を、溶液親和性表面プラズモン共鳴を用いて分析した（Day ES, et al. Biochemistry. 2005 Feb 15;44(6):1919-31）。この方法は、いわゆる「質量輸送律速（mass-transport-limited）」結合の条件を用いるものであり、ここでは、リガンド結合の初期速度（タンパク質のセナーチップ（senor chip）への結合）が、溶液中のリガンドの濃度に比例する（BIApplications ハンドブック (1994) 第６章: Concentration measurement, pp 6-1-6-10, Pharmacia Biosensor AB）。このような条件下では、可溶性分析物（チップ表面上を流れるタンパク質）のチップ上に固定化されたタンパク質への結合は、チップ表面のデキストランマトリックス中への分析物の拡散と比較して速い。従って、分析物の拡散特性およびチップ表面上を流れる溶液中の分析物濃度から、分析物がチップへ結合する速度が決定される。この実験において、溶液中の遊離ＲＳＰＯ−１の濃度は、固定化されたＧＰＲ４９−Ｆｃを含有するＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップへの初期結合速度によって決定される。これらのＲＳＰＯ−１溶液を、競合ＧＰＲ４９−Ｆｃで滴定した。
【０１９１】
結果：初期結合速度を、センサーグラムの生データから得た。Ｒ−スポンジン−１は、２フェーズ結合プロファイルを示し、このことは、ＧＰＲ４９上における、ＲＳＰＯに対する複数の協同的結合部位の存在を示唆している。
【０１９２】
パートＩＩＩ．  ＧＰＲ４９シグナル伝達に対するＲＳＰＯの影響を試験するために、複数のアッセイを用いた。
【０１９３】
方法：環状ＡＭＰ、カルシウム流、およびβ−アレスチンアッセイを、標準的な方法で行った。加えて、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路を特徴づける転写に基づくレポーターアッセイであるβ−カテニン／ＴＣＦレポーターアッセイ。このβ−カテニン／ＴＣＦレポーターアッセイでは、ＳＡバイオサイエンスのＴＣＦ／ＬＥＦレポーターまたはネガティブコンストラクトでトランスフェクトした細胞を用いた。２４時間のトランスフェクションの後、細胞をカウントし、９６ウェルプレートへ分注した（２×１０４細胞／ウェル）。次に、細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．５％  ＦＢＳ＋０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ＋１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム＋１×抗生物質培地にて６時間飢餓状態とした。次に、細胞を滴定量のＲＳＰＯおよびｍＷｎｔ３ａ（２００ｎｇ／ｍＬ）により、抗体有り
または無しにて１８時間処理した。プロメガ（Promega）のデュアルルシフェラーゼキットを用いて、デュアルルシフェラーゼ活性を発生させる。加えて、ＧＰＲ４９  ＲＮＡｉを用いて、ＲＳＰＯ依存性β−カテニン／ＴＣＦレポーター活性へのＧＰＲ４９の特異的な寄与について調べた。
【０１９４】
結果：ｃＡＭＰ、カルシウム流、またはβ−アレスチン活性アッセイにおいて、ＲＳＰＯに対する測定可能な活性は観察されなかった。しかし、ＲＳＰＯは、ＧＰＲ４９  ＲＮＡｉでノックダウンされたβ−カテニン／ＴＣＦレポーター活性を、用量依存的様式で作用させた。
【０１９５】
実施例１３
ＧＰＲ４９−３Ｔ３細胞のＲ−スポンジン−１による刺激
方法：ＧＰＲ４９過剰発現細胞に対するＲ−スポンジンの影響を調べるために、ＧＰＲ４９で安定的にトランスフェクトされた２５００のＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞（ＧＰＲ４９−３Ｔ３クローン５０）を、Ｒ−スポンジン−１と共に２日間インキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ＡＴＰアッセイを用いて、細胞増殖を評価した。ＧＰＲ４９−３Ｔ３クローン５０は、これまでに、抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、７６Ｃ１２でのＦＡＣｓにより、細胞表面ＧＰＲ４９を高レベルで発現することが示されていた。
【０１９６】
結果：Ｒ−スポンジン１による刺激は、無血清条件において、スタニオカルシンによるコントロール刺激と比較して、ＧＰＲ４９−３Ｔ３細胞の細胞増殖を２５〜４０％増加させた。この結果は、異なるクローン、ＧＰＲ４９−３Ｔ３クローン２８を用いた第二の独立した実験でも確認され、ここでは、ＧＰＲ４９スタニオカルシンコントロール刺激細胞と比較して、Ｒ−スポンジン１に応答して示した増殖増加は４倍であった。
【０１９７】
実施例１４
ＧＰＲ４９  ｍＡｂによるＲ−スポンジン結合の阻害
本発明にて詳細に述べた抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂがＲＳＰＯの可溶性ＧＰＲ４９−Ｆｃへの結合をブロックする能力の特定を行った。
【０１９８】
方法：抗ＧＰＲ４９抗体のリガンドブロック能を、液相競合表面プラズモン共鳴アッセイ（solution phase competition surface plasmon resonance assay）によって特定した。簡潔に述べると、抗体（１ｕＭ）を、２００ｎＭ  ＲＳＰＯと共に、氷上にて４５分間共インキュベートした。次に、ＲＳＰＯ単独（２００ｎＭ）またはインキュベートした抗体と組み合わせて、ＧＰＲ４９−Ｆｃを固定したＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ上を流動させた（実施例１にて詳述の通り）。６０秒間の会合フェーズの最後の結合シグナル（Ｒｍａｘ）であるＲｍａｘを、定常状態／平衡にて結合した断片の測定値として用いた。
【０１９９】
結果：抗ＧＰＲ４９抗体、３Ｂ８．１１、１０Ａ６．７、２Ｂ５．５、６Ｃ１０．５のすべてが、Ｒｍａｘを２０％を超えて減少させた。３Ｇ８．１、６Ｈ５．４、および７Ｆ８．２はいずれも、Ｒｍａｘを２０％未満減少させた。
【０２００】
実施例１５
関連するファミリーメンバーであるＧＰＲ４８（ＬＧＲ４）およびＬＧＲ６に対するＧＰＲ４９  ｍＡｂの交差反応性および特異性
方法：本発明で詳細に述べた抗ＧＰＲ４９抗体の関連するファミリーメンバー、ＧＰＲ４８（ＬＧＲ４）およびＬＧＲ６に対する特異性を特定するために、遺伝子組み換えＧＰＲ４８、ＧＰＲ４９、およびＬＧＲ６を、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）中にて独立して発現させた。これらの受容体を過剰発現する細胞への抗体の結合を、ＦＡＣＳ（標準的方法）によって評価し、コントロールベクター（ｐＶ１００）でトランスフェクトした細胞
と比較した。
【０２０１】
結果：７６Ｃ１２抗体は、哺乳類細胞にて発現されたＧＰＲ４８とは結合するが、ＬＧＲ６とは結合しない。試験したその他の抗体のいずれも、ＧＰＲ４８またはＬＧＲ６と結合しない（表６）。
【０２０２】
【表６】
2014533247.tif 000012
【０２０３】
実施例１６
完全ヒト抗ＧＰＲ４９抗体によるＧＰＲ４９の内在化
方法；染色手順の４８時間前に、Ｌｏｖｏ結腸腫瘍細胞を、８ウェルチャンバースライド（ベクトンディキンソン（Becton Dickinson）１型コラーゲンコーティング培養スライド、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）番号３５４６３０）へ、ウェルあたり５０，０００細胞にて播種した。細胞を、通常通りに２０継代未満に維持した。染色処置の日に、培地を各ウェルから廃棄し、５００ｕＬの冷インキュベーションバッファー（ＭＥＭイーグル  ＡＴＣＣ番号３０−２００３＋１％  ＢＳＡ）で置換した。細胞を、このバッファーにより、２回、各３分間洗浄した。次に、試験されるべき各ｍＡｂ（７６Ｃ１２、７８Ｆ０５
、およびマウス１０Ａ９．２）の２５０ｕＬを、１０ｕｇ／ｍＬの濃度にて適切なウェルに添加し、インキュベーション培地で希釈し、氷上にて１時間インキュベートした。ヒト抗ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体をポジティブコントロールとして用いて、内在化の度合いを比較した。抗体５Ａ７（抗Ｉｄ  ｍＡｂ）、ＩＤＥＣ１５２（抗ＣＤ２３  ＩｇＧ１  ｍＡｂ）、および抗体無しをネガティブコントロールとして用いた。氷上での４５分間のインキュベーションの後、時間ゼロ（ｔ＝０’）のスライドを、５００ｕＬの冷洗浄バッファー（ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋２％  ヤギ血清）により、３回、各３分間洗浄した（スライドは常に氷上に保持）。次に、ｔ＝０スライドを、５００ｕＬの１４％  パラホルムアルデヒド（１６％ストックからＰＢＳで希釈；ＥＭＳ番号１５７１０）により、室温にて１５分間固定した。次に、ｔ＝０スライドを、再度、冷洗浄バッファーにより、３回、各３分間洗浄し、続いて氷上に静置した。一方、残りのスライドについては、指定の時間点（１５および６０分）にて、３７℃のインキュベーターに入れた。そのインキュベーション時間の終了後、各スライドは、上記と同じ手順、洗浄および固定に従い、氷上に配置した。次に、すべてのスライドを、２００ｕＬの冷透過バッファー（洗浄バッファー＋０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）により、氷上にて１０分間透過処理した。続いて、すべてのスライドを、５００ｍＬの冷洗浄バッファーにより、３回、各３分間洗浄した。ストックバイアルを４℃、１０，０００ｒｐｍにて１０分間最初に回転させた後、二次抗体を、洗浄バッファー中にて１：１０００の希釈率で調製した（ｍＡｂに対しては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、モレキュラープローブ（Molecular Probes）  番号Ａ１１０２９、およびＧ４抗体に対しては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、モレキュラープローブ  番号Ａ１１０１３）。希釈した二次抗体の２５０ｕＬを各ウェルに添加し、室温、暗所（覆うことによる）にて４０分間インキュベートした。スライドを、再度５００ｍＬの冷洗浄バッファーにより、３回洗浄した。最終洗浄時にバッファーを廃棄し、すべてのウェルを空にした。次に、提供された分解ツールを用いてスライドからチャンバーを分解し、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（mounting medium）（ベクター（Vector）  番号Ｈ−１５００、Ｈａｒｄ  Ｓｅｔ（商標））を用いてカバースリップをのせた。スライドを、暗所、４℃にて一晩保存して、封入剤を乾燥させた。ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ２０００プログラム（バイオラッド
ｖ５．２）を用いた共焦点顕微鏡によりスライドの写真を撮影し、それを、Ｋａｌｍａｎ  １０の平均処理からの青色および緑色成分の合成像として表した。
【０２０４】
結果：７６Ｃ１２、７８Ｆ０５、および１０Ａ９．２はすべて、６０分以内という迅速なＧＰＲ４９の内在化を示した。予想された通り、陽性コントロール、ＩＧＦ１Ｒ  Ｃ０６は、ＩＧＦ１Ｒ受容体の内在化を示したが、一方、アイソタイプマッチ陰性コントロール（マウス５Ａ７、ＩＤＥＣ１５２（霊長類化抗ＣＤ２３抗体））は、結合も内在化も起こさなかった。
【０２０５】
実施例１７
ＧＰＲ４９抗体はマウスＧＰＲ４９と結合する
方法：本明細書で述べる抗ＧＰＲ４９抗体の特異性を特定するために、遺伝子組換えマウスＧＰＲ４９を、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）中で発現させた。受容体を過剰発現する細胞への抗体の結合を、ＦＡＣＳ（標準的方法）で評価し、コントロールベクター（ｐＶ１００）でトランスフェクトした細胞と比較した。
【０２０６】
結果：７６Ｃ１２は、哺乳類細胞中で発現されたマウスＧＰＲ４９と、高い親和性で結合する。複数のさらなるＧＰＲ４９  ｍＡｂも、マウスＧＰＲ４９と結合する（表７）。
【０２０７】
【表７】
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【０２０８】
実施例１８
抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂのエピトープ分類
平衡結合アッセイを開発し、これを用いて、本発明で詳細に述べる一連のＧＰＲ４９抗体における共通のエピトープ結合グループを特定した。ＧＰＲ４９への結合の交差ブロッキングを用いて、ＧＰＲ４９の特有の結合エピトープと結合する抗体のグループを明らかにした。
【０２０９】
方法：試験抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂに対するＧＰＲ４９−Ｆｃ結合活性を、バイオレイヤー干渉法に基づくアッセイにて、二次試験ｍＡｂ（それ自体、または異なるｍＡｂ）と共にプレインキュベートしたＧＰＲ４９−Ｆｃのものと比較した。一次抗ＧＰＲ４９試験ｍＡｂ（一次ｍＡｂ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（サーモサイテンティフィック（Thermo Scientific）、番号２１４２５）により、製造元のプロトコルに従ってビオチン化した。ビオチン化一次ｍＡｂ、ＧＰＲ４９−Ｆｃ、およびＧＰＲ４９−Ｆｃに二次試験抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂ（二次ｍＡｂ）を添加したものはすべて、ＯＢバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、０．０１
％（重量／体積）  ＮａＮ３、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．０２％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（フォルテバイオ社，メンロパーク，カリフォルニア州）を用いて、ビオチン化一次ｍＡｂを、ストレプトアビジン  Ｏｃｔｅｔチップ（フォルテバイオ社，メンロパーク，カリフォルニア州：パーツ番号  １８−５００１）上に捕捉した。チップをＯＢバッファーで洗浄し、ＯＢバッファー中のＧＰＲ４９−Ｆｃを含有するウェルへ移した。チップ上でのＧＰＲ４９−Ｆｃの一次ｍＡｂへの結合を、会合フェーズ（１２０秒間）の間に、バイオ干渉シグナルとして飽和まで記録し、会合フェーズの最後の結合シグナル（Ｒｍａｘ）を、定常状態／平衡にて結合した断片の測定値として用いた。解離フェーズ（１２０秒間）の間の結合も記録した。種々のｍＡｂの互いに対する交差ブロッキング能を測定するために、第二の結合実験を実施し、ここでは、上記で概説したＧＰＲ４９−Ｆｃを、５倍モル過剰の二次試験ｍＡｂ（非ビオチン化）と共にプレインキュベートした。次に、ビオチン化一次ｍＡｂでプレロードしたチップへこれを結合させて、Ｒｍａｘ’を特定した。次に、Ｒｍａｘ’プライムをＲｍａｘと比較し、Ｒｍａｘ’／Ｒｍａｘのパーセントを算出して、チップ上に予め結合させた一次ｍＡｂと結合するＧＰＲ４９−Ｆｃの能力に対して二次ｍＡｂが有するブロッキングの量を特定した。一次ｍＡｂに対する二次の交差ブロッキング（Ｒｍａｘ’／Ｒｍａｘ×１００）を、以下のように記録した：０〜２５％  完全交差ブロッキング、２５〜５０％
部分交差ブロッキング、５０〜７５％  低交差ブロッキング、７５〜１００％  交差ブロッキング無し。ｍＡｂはすべてそれ自体に対して試験し（一次および二次ｍＡｂが同じ試験ｍＡｂ）、適正な分析を確保した。
【０２１０】
結果：試験した抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂにおいて、６つの別個のエピトープ結合グループが観察された。そのグループは：グループ１（７６Ｃ１２、１Ｂ３．５、６Ｂ１０．２、４Ｆ６．２）、グループ２（１８Ｇ７．１、１４Ａ８．１、５Ｂ１０．１、１４Ｆ７．１、１１Ｆ６．１、１４Ｅ３．１、１Ｂ８．１）、グループ３（５Ｆ２．５、６Ｂ１０．２）、グループ４（３Ｆ１１．１）、グループ５（１０Ａ．２）、およびグループ６（６Ｅ１０．１）である。ｍＡｂ自体による交差ブロッキングを表８および９に示す。
【０２１１】
【表８】
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【０２１２】
【表９】
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【０２１３】
実施例１９
ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、７６Ｃ１２の薬物動態特性
方法：ＧＰＲ４９抗体、７６Ｃ１２のマウスにおける薬物動態特性、およびＣＴ１モデルでの７６Ｃ１２による次に行う予定である実験のための適切な投与スケジュールを特定するために、１５または３０ｍｇ／ｋｇによる７６Ｃ１２の単一用量を、Ｉ．Ｐ．にてＣＲＬ  ＳＣＩＤベージュマウスに投与した。採血を、１５分、３０分、６０分、２、６、２４、および４８時間、ならびに４、７、９、１１、および１４日後に行った。血清濃度をＥＬＩＳＡで特定した。
【０２１４】
結果：７６Ｃ１２は、およそ４日間の半減期を示す（図１２Ａ〜Ｃ）。
【０２１５】
実施例２０
原発性結腸癌モデルにおける原発性腫瘍成長の生体内阻害
方法：７６Ｃ１２  ＩｇＧ１抗体の単一剤での生体内効力を、ＣＴ１（原発性結腸癌）細胞を用いた原発性結腸腫瘍異種移植モデル系で評価した。ＣＴ１は、結腸腫瘍患者サンプル由来の結腸腫瘍細胞株であり、これを用いて結腸癌幹細胞（腫瘍スフェア）株を樹立した。これは、患者原発性サンプルから最近得られた低継代（＜１０継代）であることから、「原発性」細胞株と見なされる。これは、確立された癌幹細胞条件下（血清フリー培地）、低結合プレート（low-attachment plates）（細胞は懸濁状態で成長）にて成長されることから、癌幹細胞株であると見なされる。雌のＣＲＬ  ＳＣＩＤベージュマウスに
、１０００細胞を接種し、腫瘍成長のモニタリングを行った。治療開始時の平均腫瘍体積は、およそ１３０ｍｍ３であった。７６Ｃ１２  ｍＡｂを、３０および１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。７６Ｃ１２  ｍＡｂはまた、１５および７．５ｍｇ／ｋｇでの４週間にわたる週２回投与でも試験した。ネガティブコントロールとして、アイソタイプマッチ抗体、ＣＥ９．１（ＩｇＧ１）を、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週１回投与し、一方、イリノテカンを、１５ｍｐｋにて、４週間にわたって週１回投与した。接種後の示したインターバルで腫瘍を摘出し、全腫瘍体積を測定した。
【０２１６】
結果：完全ヒト７６Ｃ１２抗体は、用量依存的様式にて腫瘍成長を阻害した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。抗体は、３０ｍｇ／ｋｇでの４週間にわたる週１回の投与にて、統計的に有意である単一剤効力を示した。
【０２１７】
実施例２１
併用療法を用いた原発性腫瘍成長の生体内阻害
方法：７６Ｃ１２  ＩｇＧ１抗体の単一剤での生体内効力を、ＣＴ１（原発性結腸癌）細胞を用いた原発性結腸腫瘍異種移植モデル系で評価した。雌のＣＲＬ  ＳＣＩＤベージュマウスに、１０００細胞を接種し、腫瘍成長のモニタリングを行った。治療開始時の平均腫瘍体積は、およそ１３０ｍｍ３であった。７６Ｃ１２  ｍＡｂを、３０および１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回、単一剤として、および治療の現行標準に従うイリノテカンの投与（すなわち、４週間にわたって７日間ごとに１２５ｍｇ／ｍ２）と組み合わせて、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ネガティブコントロールとして、未処理、アイソタイプマッチ抗体  ＩＤＥＣ１５２（ＩｇＧ１）、化学賦形剤コントロール、およびＩＤＥＣ１５２プラスイリノテカン（組み合わせのコントロール）を、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週１回投与し、一方、イリノテカンを、１５ｍｐｋにて、４週間にわたって週１回投与した。接種後の示したインターバルで腫瘍を摘出し、全腫瘍体積を測定した。
【０２１８】
結果：抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、７６Ｃ１２抗体およびイリノテカンは、単一剤として（すなわち、単独で投与）、類似の効力を示した。イリノテカンと組み合わせると、３０ｍｇ／ｋｇ（図１４）および１５ｍｇ／ｋｇでの週２回スケジュールの７６Ｃ１２抗体は、単一剤処理と比較して、相加効力を示した。加えて、１５ｍｇ／ｋｇでの組み合わせも、相加効力を示した。
【０２１９】
実施例２２
併用療法を用いた原発性腫瘍成長の生体内阻害
方法：実施例２１からの方法。
【０２２０】
結果：ＧＰＲ４９抗体の処理の相加的有益性が、マウスの全生存について観察された（実施例２１で述べる実験から）。ＧＰＲ４９抗体、７６Ｃ１２での処理により、体重減少が著しく低減され、悪液質性ＣＴ１モデルにて、動物生存率が５０％増加した（図１５）。加えて、抗ＧＰＲ４９  ｍＡｂによる処理が無毒性であることも観察されており（実施例１６および１８から、７６Ｃ１２は内在性マウスＧＰＲ４９と交差反応し、結合する）；この知見およびＧＰＲ４９  ｍＡｂ処理マウスの生存率の増加は、癌をＧＰＲ４９抗体で遮断することの高い可能性および安全性の両方を支持するものである。
【０２２１】
実施例２３
併用療法を用いた腫瘍細胞株ＤＬＤ−１の成長の生体内阻害
方法：７６Ｃ１２  ＩｇＧ１抗体の単一剤での生体内効力を、結腸腫瘍異種移植モデルＤＬＤ−１で評価した。雌のＣＲＬ  ＳＣＩＤベージュマウスに、１０００細胞を接種し
、腫瘍成長のモニタリングを行った。治療開始時の平均腫瘍体積は、およそ１３０ｍｍ３であった。７６Ｃ１２  ｍＡｂを、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回、単一剤として、および治療の現行標準に従うイリノテカンの投与と組み合わせて、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ネガティブコントロールとして、化学賦形剤コントロールおよびＩＤＥＣ１５２プラスイリノテカン（組み合わせのコントロール）を、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週１回投与した。接種後の示したインターバルで腫瘍を摘出し、全腫瘍体積を測定した。
【０２２２】
結果：７６Ｃ１２抗体は、腫瘍成長の阻害を示した。イリノテカンとの組み合わせにより、効力の向上が観察された。（図１６Ａおよび１６Ｂ）
【０２２３】
実施例２４
抗ＧＰＲ４９抗体を用いたヒト癌の治療
この例は、ＧＰＲ４９に対する抗体を用いて、ＧＰＲ４９の発現が検出された癌幹細胞または腫瘍開始細胞を例とする悪性細胞を標的とすることにより、癌を治療するための方法について述べる。
【０２２４】
特定の実施形態では、本発明の抗ＧＰＲ４９抗体は、精製され、注射用の適切な医薬媒体と共に製剤される。過剰増殖性障害のヒト患者は、本発明の実施形態の完全ヒトまたはヒト化抗ＧＰＲ４９抗体の複数用量を、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重にて、例えば、２週間ごとに１回、または月１回、少なくとも６か月間にわたって、静脈内注入によって投与される。インターバルは、患者における予後指標を測定することによる指示に従って、不規則であってもよい。
【０２２５】
抗体は、標準的な放射線療法レジメンの前に、それと同時に、またはその後に投与される。患者のモニタリングを行い、治療の結果として、例えば腫瘍縮小、新たな腫瘍の発生率の低減、腫瘍抗原発現の低下、無予後生存率（prognosis free survival）の改善、もしくは全生存期間の延長、または疾患予後を評価するその他の手段に基づく抗腫瘍応答が得られるかどうかを判断する。
【０２２６】
実施例２５
ＧＰＲ４９抗体を用いたＫ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有する原発性結腸癌腫瘍の生体内阻害
発明者らは、ＧＰＲ４９抗体が、公知の癌治療法に対する耐性に繋がり得る特定の変異を有する結腸癌の阻害に生体内にて効果的であるかどうかを判断するための実験を行った。例えば、ＫＲＡＳ変異を有する患者は、結腸直腸癌のパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））およびセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））による治療法に対する応答が不良であり得る。従って、発明者らは、ＧＰＲ４９抗体が、これらの公知の治療耐性マーカーを有する結腸癌に有用な治療を提供することができるかどうかを特定したいと考えた。
【０２２７】
方法：マウス抗体１４Ｆ７．１、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、１Ｂ３．５の単一剤での生体内効力を、ＣＴ１原発性異種移植細胞を用いた原発性結腸腫瘍異種移植モデル系で評価した。ＣＴ１は、新しいＣＲＣ患者腫瘍サンプルから樹立した原発性結腸直腸癌（ＣＲＣ）生体内異種移植腫瘍である。腫瘍細胞の変異状態は、癌遺伝子変異を識別するためのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カールスバッド，カリフォルニア州）ディープシーケンシングによって特定した。ＣＴ１腫瘍のおよそ５〜１５％がＧＰＲ４９を発現する。雌のＳＣＩＤベージュマウスに、ＣＴ１腫瘍細胞を接種し、腫瘍成長のモニタリングを行った。平均腫瘍体積が１７５ｍｍ３に達した時点で、マウスをランダムに１０体のグループに分けた。抗体を
、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ネガティブコントロールとして、アイソタイプマッチ抗体ＩｇＧ１を、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回投与した。腫瘍体積および体重を週２回測定した。
【０２２８】
結果：抗体は、コントロールと比較して、腫瘍成長を最大４０％阻害した（図１７および１８）。抗体１４Ｆ７および１８Ｇ７は、最も高い腫瘍成長阻害を示した（それぞれ、４０％および３４％の腫瘍阻害）。抗体による３４％および４０％の腫瘍成長阻害は、ＧＰＲ４９が腫瘍細胞のおよそ５〜１５％にしか発現されないことから、「特別に大きい」効果である。この特別に大きい効果は、ＧＰＲ４９陽性癌幹細胞の抗体による阻害が、生体内にて、増殖性腫瘍細胞の発生源を標的としていることを示唆している。
【０２２９】
実施例２６
化学療法剤イリノテカンと組み合わせたＧＰＲ４９抗体によるＫ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有する原発性結腸腫瘍の生体内阻害
発明者らはまた、公知の癌治療剤と組み合わせたＧＰＲ４９抗体が、公知の癌治療法に対する耐性に繋がり得る特定の変異を有する結腸癌の阻害に生体内にて効果的であるかどうかを判断するための実験も行った。
【０２３０】
方法：マウス抗体１４Ｆ７．１、１８Ｇ７．１、５Ｂ１０．１、１４Ａ８．１、１Ｂ３．５の単一剤での生体内効力を、ＣＴ１原発性異種移植細胞を用いた原発性結腸腫瘍異種移植モデル系で評価した。ＣＴ１は、新しいＣＲＣ患者腫瘍サンプルから樹立した原発性結腸直腸癌（ＣＲＣ）生体内異種移植腫瘍である。変異状態は、癌遺伝子変異を識別するためのイオントレントディープシーケンシングによって特定した。ＣＴ１腫瘍のおよそ５〜１５％がＧＰＲ４９を発現する。雌のＳＣＩＤベージュマウスに、ＣＴ１腫瘍細胞を接種し、腫瘍成長のモニタリングを行った。平均腫瘍体積が１７５ｍｍ３に達した時点の第０日に、マウスをランダムに１０体のグループに分けた。化学療法剤イリノテカンを、１０ｍｇ／ｋｇにて、最初の５日間に１日１回ＩＰ投与した。抗体は、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。接種後の示したインターバルで、全腫瘍体積について腫瘍を測定した。
【０２３１】
結果：イリノテカンと組み合わせた抗ＧＰＲ４９抗体は、イリノテカン単独による４５％の腫瘍阻害と比較して、５７％から６５％にて腫瘍成長を阻害した（図１７、図１９）。ＧＰＲ４９抗体は、従って、特定の利用可能な治療法に対して耐性を有することが知られている結腸癌において、イリノテカンの抗腫瘍活性を２７％から４４％向上させた。
【０２３２】
実施例２７
Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、ＳＴＫ１１、ＪＡＫ２、およびＲＢ１変異を有する原発性結腸癌腫瘍の生体内阻害
発明者らは、公知の癌治療法に対する耐性に繋がり得る特定の変異を有する結腸癌腫瘍の単一剤阻害剤としてＧＰＲ４９抗体が効果的であるかどうかを判断するための実験を行った。上記にて、発明者らは、公知の癌治療剤と組み合わせたＧＰＲ４９抗体が効果的であることを特定した。本実験では、発明者らは、無治療コントロールと比較した、ＧＰＲ４９抗体による治療時の腫瘍成長の相対的阻害を特定した。
【０２３３】
方法：マウス抗体１８Ｇ７．１および７Ｃ３．４の単一剤での生体内効力を、ＣＴ３（原発性結腸癌）細胞を用いた原発性結腸腫瘍異種移植モデル系で評価した。ＣＴ３は、新しいＣＲＣ患者腫瘍サンプルから得た原発性結腸腫瘍異種移植片であり、生体内にて低継代数（ｐ＜４）で維持される。変異状態は、癌遺伝子変異を識別するためのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔディープシーケンシングによって特定した。ＣＴ３腫瘍のおよそ１５〜２０％
がＧＰＲ４９を発現する。雌のＣＢ１７−Ｓｃｉｄマウスに、ＣＴ３細胞を接種し、腫瘍成長のモニタリングを行った。平均腫瘍体積が１３０ｍｍ３に達した時点にて（第０日）、マウスをランダムに１０体のグループに分けた。次に、抗体を、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ネガティブコントロールとして、アイソタイプマッチ抗体ＩｇＧ１を、１５ｍｇ／ｋｇにて、４週間にわたって週２回投与した。腫瘍体積および体重を、実験完了まで週２回測定した。
【０２３４】
結果：抗体は、コントロール処理と比較して、腫瘍成長を最大４３％阻害した（図２０）。この＞４０％の腫瘍成長阻害は、ＧＰＲ４９抗体がＣＴ３腫瘍細胞の１５〜２０％のサブ集団にしか結合しないことを考えると、「特別に大きい」効果である。この特別に大きい効果は、ＧＰＲ４９陽性癌幹細胞の抗体阻害が、生体内にて、増殖性腫瘍細胞の発生源を標的としていることを示唆している。
【０２３５】
実施例２８
ＧＰＲ４９  ｍＡｂによる処理は、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、およびｐ５３変異を有する原発性結腸腫瘍における生体内での癌幹細胞頻度を低減する
発明者らは、公知の癌治療法に対する耐性に繋がり得る特定の変異を有する結腸癌腫瘍由来の細胞において、ＧＰＲ４９抗体が癌幹細胞頻度に与える影響について分析する実験を行った。発明者らの観察によると、ＧＰＲ４９抗体ＧＰＲ４９抗体は、結合する腫瘍細胞の比率と比較して「特別に大きい」ものである腫瘍成長に対する相対的な影響を示した。この実験は、特にこれらの抗体による癌幹細胞頻度に対する効果を特定するためのものであった。
【０２３６】
方法：実施例１および２で概説した生体内実験からの、コントロール、ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、イリノテカン、およびイリノテカンと組み合わせたＧＰＲ４９  ｍＡｂによる処理、ならびにコントロールのグループから単離したＣＴ１腫瘍細胞を回収し、プールし、分離し、限界希釈二次移植アッセイ（limiting dilution secondary transplant assay）にて再移植し、癌幹細胞頻度を測定した。各処理グループについて、８体のマウスに、３０、１００、および３００細胞を移植した。腫瘍形成（すなわち、腫瘍生着）および成長率を、８週間にわたり週２回のペースでモニタリングした。癌幹細胞の頻度を各処理グループで算出するために、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）を用いた直線回帰解析を行い、各処理グループにおける癌幹細胞の頻度を算出した。このアッセイは、二次宿主中にて新たな腫瘍を誘発し得る任意のいずれの腫瘍中におけるＣＳＣクローンについても、その頻度を測定するものである機能的ＣＳＣアッセイであることから、ＣＳＣを測定するための至適基準であると見なされる。このアッセイでは、測定されるべきＣＳＣを含有する腫瘍を、限界希釈アッセイにて二次レシピエントへ連続的に移植した。従って、このアッセイは、いずれの幹細胞についても重要な構成要素である自己複製能力の機能的生体内測定である。これは、ＣＳＣの生体外測定に多くの場合用いられる依然として理解および特徴づけが不完全である細胞表面マーカー、または酵素アッセイには依存していない。
【０２３７】
結果：ＧＰＲ４９  ｍＡｂおよびイリノテカンと組み合わせたＧＰＲ４９  ｍＡｂで前処理した腫瘍からの腫瘍の再成長は、著しく阻害された（図２１）。ＧＰＲ４９  ｍＡｂまたはＧＰＲ４９  ｍＡｂ＋イリノテカン前処理腫瘍を移植したマウスの６２％超（５／８）は、移植後の８週間にて腫瘍形成を示さなかった（すなわち、無腫瘍であった）。対照的に、コントロール処理腫瘍を移植したマウスのうち、移植後８週間で無腫瘍のままであったのは、僅かに１／８（１３％）であった。直線回帰解析により、ＧＰＲ４９抗体処理後のＣＳＣの数は、コントロールと比較して、３倍の減少が示された（図２１）。
【０２３８】
実施例２９
ＧＰＲ４９  ｍＡｂによる処理は、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰ
Ｃ、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、ＳＴＫ１１、ＪＡＫ２、およびＲＢ１変異を有する原発性結腸腫瘍における生体内での癌幹細胞頻度を低減する
発明者らは、公知の癌治療法に対する耐性に繋がるより多くの様々な変異を持つ癌細胞に対して、ＧＰＲ４９抗体が類似の影響を与えるかどうかを特定する実験を行った。上記の結果をさらに展開して、発明者らは、より数多くの変異を持つ癌細胞株における癌幹細胞頻度に対するこれらの抗体の効果を特定した。
【０２３９】
方法：実施例３で概説した生体内実験における処理およびコントロールグループからの、コントロール、ＧＰＲ４９  ｍＡｂ、イリノテカン、およびＧＰＲ４９  ｍＡｂ＋イリノテカンによる処理腫瘍から単離したＣＴ３原発性腫瘍細胞を回収し、プールし、分離し、限界希釈二次移植アッセイにて再移植し、癌幹細胞頻度を測定した。各処理グループについて、８体のマウスに、１０、３０、および１００細胞を移植した。腫瘍形成および成長率を、１２週間にわたり週２回のペースでモニタリングした。癌幹細胞の頻度を各処理グループで算出するために、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄを用いた直線回帰解析を行い、各処理グループにおける癌幹細胞の頻度を算出した。このアッセイは、二次宿主中にて新たな腫瘍を誘発し得る任意のいずれの腫瘍中におけるＣＳＣクローンについても、その頻度を測定するものである機能的ＣＳＣアッセイであることから、ＣＳＣを測定するための至適基準であると見なされる。このアッセイでは、測定されるべきＣＳＣを含有する腫瘍を、限界希釈アッセイにて二次レシピエントへ段階的に移植した。従って、このアッセイは、いずれの幹細胞についても重要な構成要素である自己複製能力の機能的生体内測定である。これは、ＣＳＣの生体外測定に多くの場合用いられる依然として理解および特徴づけが不完全である細胞表面マーカー、または酵素アッセイには依存していない。
【０２４０】
結果：ＧＰＲ４９  ｍＡｂでの処理により、ＣＳＣの頻度は、コントロールと比較して、５倍減少した（図２２）。
【０２４１】
実施例３０
化学療法剤イリノテカンと組み合わせたＧＰＲ４９  ｍＡｂによる処理は、結腸腫瘍細胞が二次レシピエント中にて新たな腫瘍を形成することを阻止する
発明者らは、イリノテカンと組み合わせたＧＰＲ４９  ｍＡｂによる結腸腫瘍異種移植の生体内処理により、結腸腫瘍細胞が二次レシピエント中にて新たな腫瘍を形成することが阻止されるかどうかを特定するための実験を行った。処理済み腫瘍細胞を移植した対象における新たな二次腫瘍の形成は、癌細胞集団における腫瘍幹細胞の頻度の測定の代わりとなるものである。発明者らは、ＧＰＲ４９抗体およびイリノテカンの組み合わせによる二次腫瘍形成に対する効果を、処理済み結腸腫瘍細胞を受けた対象において特定したいと考えた。
【０２４２】
方法：実施例３で概説した生体内実験からの、コントロールまたはＧＰＲ４９  ｍＡｂ＋イリノテカン処理腫瘍から単離した腫瘍細胞を回収し、プールし、分離し、限界希釈二次移植アッセイにて再移植し、癌幹細胞頻度を分析した。各処理グループについて、８体のマウスに、１０、３０、１００細胞を移植した。腫瘍形成を、１２週間にわたり週２回のペースでモニタリングした。
【０２４３】
結果：１４０日間の追跡の後、ＧＰＲ４９  ｍＡｂ＋イリノテカングループから腫瘍成長は観察されなかった（腫瘍を有するマウス  ０／８）。対照的に、コントロールのイリノテカン処理を移植したマウスでは、５／８の動物が、平均サイズ１７２９ｍｍ３の腫瘍を形成した（図２３）。これは、ＧＰＲ４９抗体による処理が、腫瘍を根絶し（destemmed）、ＧＰＲ４９抗体での処理を停止した後でも、癌幹細胞が増殖を続ける能力を大きく低減したことを示すものであった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１４】
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【図２１Ｂ】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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