(57)【要約】  薬剤の抗微生物活性を判定する方法は、ウェルを提供することを含み得、該ウェルは少なくとも１つの抗微生物剤を含有し、該ウェルは、少なくとも２つの電極を更に含む。微生物の試料がウェルに添加され、電圧が電極の間でパルス変調され得る。電気的特性がサンプリングされ、記録され得る。別の態様において、少なくとも１つの微生物を特定する方法は、少なくとも１つの微生物を含有する試料を採取することと、少なくとも１つの微生物を試料から単離することと、少なくとも１つの微生物を少なくとも１つのウェルへと分割することとを含み、それぞれのウェルが、少なくとも１つの抗微生物剤および少なくとも２つの電極を含む。電圧が少なくとも２つの電極の間でパルス変調され、パルス変調中に電気的特性がサンプリングされ、記録される。別の態様において、少なくとも１つの微生物を検出するための診断装置が提示される。【選択図】なし
2014519022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤の抗微生物活性を判定する方法であって、
ウェルであって、少なくとも１つの抗微生物剤を含有し、少なくとも２つの電極を更に含む、ウェルを提供することと、
少なくとも１つの微生物の試料を前記ウェルへ添加することと、
電圧を前記少なくとも２つの電極の間でパルス変調することと、
前記パルス変調中、電気的特性をサンプリングすることと、
前記電気的特性を記録することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記方法が、
前記パルス変調、前記サンプリング、および前記記録を反復することと、
シグネチャを形成するように、時間に対して前記記録をプロットすることと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの微生物が、細菌、真菌、ウイルス、または線虫から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗微生物剤が、バクテリオファージ、ミコウイルス、ヴィロファージ、線虫ファージ（ｎｅｍａｔｏｐｈａｇｅ）、抗生物質、抗微生物剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または寄生虫駆除剤から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記ウェル内の温度またはｐＨを測定することを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記パルス変調が、オン期間およびオフ期間を含み、前記オン期間および前記オフ期間の合計が、サンプリング期間を構成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記オン期間が、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約２ミリ秒、少なくとも約３ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、または少なくとも約５００ミリ秒である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オフ期間が、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、少なくとも約２秒、少なくとも約３秒、少なくとも約５秒、少なくとも約１０秒、少なくとも約２０秒、少なくとも約４０秒、少なくとも約５０秒、または少なくとも約６０秒である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記オン期間が、約５００ミリ秒以下、約２００ミリ秒以下、約１００ミリ秒以下、約５０ミリ秒以下、約２０ミリ秒以下、約１０ミリ秒以下、約５ミリ秒以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記オフ期間が、約６０秒以下、約３０秒以下、約１０秒以下、約５秒以下、約２秒以下、約１秒以下、約５００ミリ秒以下、約２００ミリ秒以下、約１００ミリ秒以下、約５０ミリ秒以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプリング期間が、約１秒、約５秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約６０秒である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記電圧が、少なくとも約０．０００５Ｖ、少なくとも約０．００１Ｖ、少なくとも約０．００２Ｖ、少なくとも約０．００５Ｖ、少なくとも約０．０１Ｖ、少なくとも約０．０２Ｖ、少なくとも約０．０５Ｖ、少なくとも約０．１Ｖ、少なくとも約０．２Ｖ、少なくとも約０．５Ｖ、少なくとも約１．０Ｖ、少なくとも約２．００Ｖ、少なくとも約５．０Ｖ、または少なくとも約１０．０Ｖである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電圧が、約２．０Ｖ以下、約１．０Ｖ以下、約０．５Ｖ以下、約０．２Ｖ以下、または約０．１Ｖ以下である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記電圧が、約０．０００５Ｖ〜約２．０Ｖ、約０．０００５Ｖ〜約１．０Ｖ、約０．００１Ｖ〜約１．０Ｖ、約０．０５Ｖ〜約１．０Ｖ、約０．０５Ｖ〜約０．５Ｖ、または約０．０５Ｖ〜約０．１Ｖの範囲である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記電気的特性の前記サンプリングが、前記サンプリング期間中に行われる、請求項６〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気的特性の前記サンプリングが、少なくとも約０．５ミリ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約２ミリ秒、少なくとも約３ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、または少なくとも約５００ミリ秒である、請求項６〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
生存性の監視が、約３６０分より長くなく、約１８０分より長くなく、約１２０分より長くなく、約９０分より長くなく、約６０分より長くなく、約４５分より長くなく、約３０分より長くなく、約２０分より長くなく、約１０分より長くなく、約５分より長くなく、または約２分より長くない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記生存性の監視が、約１５秒〜約６０分、約１５秒〜約４５分、約１５秒〜約２０分、約１５秒〜約１０分、約１分〜約２０分、約２分〜約２０分、約５分〜約２０分、約５分〜約１０分、または約１０分〜約２０分である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの微生物を特定する方法であって、
前記少なくとも１つの微生物を含有する試料を採取することと、
前記少なくとも１つの微生物を前記試料から単離することと、
前記少なくとも１つの細菌を少なくとも１つのウェルに分割することであって、それぞれのウェルが少なくとも１つの抗微生物剤を含有し、それぞれのウェルが少なくとも２つの電極を含むことと、
電圧を前記少なくとも２つの電極の間でパルス変調することと、
前記パルス変調中、電気的特性をサンプリングすることと、
サンプリング持続期間中の前記電気的特性を時間の関数として記録することと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記単離が、
前記試料を濾過し、前記少なくとも１つの微生物を前記試料から単離することと、
前記少なくとも１つの微生物を被検体中に浸漬することと、を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの微生物が、細菌、真菌、ウイルス、または線虫から選択される、請求項１９および２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの抗微生物剤が、バクテリオファージ、ミコウイルス、ヴィロファージ、線虫ファージ、抗生物質、抗微生物剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または寄生虫駆除剤から選択される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体が、水、緩衝液、生理食塩水、ブイヨン、寒天、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の微生物の計数を判定する方法であって、
前記試料を濾過し、前記少なくとも１つの微生物を前記試料から単離することと、
前記少なくとも１つの微生物を被検体中に浸漬し、浸液を形成することと、
前記浸液を特定の時間の間、インキュベートすることと、
前記浸液を少なくとも１つのウェルへと分割することと、
サンプリングの持続期間中、前記ウェル内の電気的特性を測定することと、
前記電気的特性を時間の関数として計数と相関させることと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記電気的特性を測定する前に、少なくとも１つのバクテリオファージを前記ウェルのうちの少なくとも１つに添加することを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプリングの持続期間が、約１秒、約５秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約６０秒である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記インキュベートための前記特定の時間が、少なくとも約０．１秒、少なくとも約０．５秒、少なくとも約１秒、少なくとも約３０秒、少なくとも約１分、または少なくとも約２分、または少なくとも１０分、少なくとも１時間、または少なくとも約８時間である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記インキュベートための前記特定の時間が、約１ミリ秒より長くなく、約１分より長くなく、約２分より長くなく、約５分より長くなく、１時間より長くなく、８時間より長くない、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記インキュベートための前記特定の時間が、１ミリ秒〜５分、０．５秒〜２分、１秒〜１分、１時間〜８時間である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、第１の微生物のための第１の計数および第２の微生物のための第２の計数を判定する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
微生物の抗微生物耐性を判定する方法であって、
少なくとも１つの微生物の試料を少なくとも１つの抗微生物剤を含有するウェルに添加し、少なくとも１つの微生物の試料を対照ウェルに添加することと、
サンプリングの持続期間中の前記ウェルの電気的特性を時間の関数として測定することと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記サンプリングの持続期間が、少なくとも１時間であって、６時間以下である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの微生物が、アエロバクター、バチルス、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア、クロモバクテリウム、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロバクター、エシェリキア、ヘモフィルス、クレブシエラ、リステリア、ミコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌、プロテウス、シュードモナス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ビブリオ、エルシニア、アシネトバクター、バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、アイケネラコローデンス、ガードネレラバギナリス、モビルンカス、プロテオバクテリア、デスルホバクテラーレス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、デスルホビブリオナーレス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ）、栄養共生バクテラーレス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、サーモデスルホバクテリア（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ニトロスピラ、グラム陽性ペプトコッカス、古細菌、アーケオグロブス、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの薬剤が、アクチノミセスファージ、バチルスファージΦ２９、バクテリオファージＭ１０２、バクテリオファージｅ１０、バクテリオファージｆ１、バクテリオファージλ、バクテリオファージＰＩ、球状ファージＰｈｉＸ１７４、球状ファージＧ４、球状ファージＳ１３、バクテリオファージＴ１、バクテリオファージＴ２、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＴ４、バクテリオファージＴ５、バクテリオファージＴ６、バクテリオファージＴ７、ｓｓＲＮＡバクテリオファージＭＳ２、ｓｓＲＮＡバクテリオファージＲ１７、ｓｓＲＮＡバクテリオファージｆ２、ｓｓＲＮＡバクテリオファージＱベータ、ミュータンスレンサ球菌ファージ、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウェルが、少なくとも約１μＬ、少なくとも約１０μＬ、少なくとも約２０μＬ、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約２００μＬ、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約１ｍＬ、少なくとも約１．５ｍＬ、または少なくとも約２ｍＬの保持容量を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウェルが、約２ｍＬ以下、約１．５ｍＬ以下、約１ｍＬ以下、約５００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、または約２０μＬ以下の保持容量を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウェルが、約１０μＬ〜約２ｍＬ、約２０μＬ〜約２ｍＬ、約１００μＬ〜約２ｍＬ、約１００μＬ〜約１．５ｍＬ、約１００μＬ〜約１ｍＬ、約５００μＬ〜約２ｍＬ、約５００μＬ〜約１．５ｍＬ、または約５００μＬ〜約１ｍＬの保持容量を有する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記電気的特性が、コンダクタンス、抵抗、電圧、アンペア数、キャパシタンス、インピーダンス、インダクタンス、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気的特性が、コンダクタンスまたは抵抗である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記特定または前記判定が、９０分未満、６０分未満、４５分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１８分未満、１５分未満、または１２分未満で実行される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、尿、血液、汗、粘液、唾液、精液、膣分泌物、嘔吐物、涙、皮脂、胸膜液、腹腔液、胃液、耳垢、脳脊髄液、母乳、内リンパ、外リンパ、眼房水、硝子体液、バイオマス、およびそれらのいずれかの組み合わせから採取される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの微生物を検出する診断装置であって、
第１のユニットおよび第２のユニットであって、前記第１のユニットが、前記第２のユニットの中に積み重ね可能であり、
前記第１のユニットが、少なくとも１つのウェルであって、前記少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する、少なくとも１つのウェルを備える、診断ユニットであり、
前記第２のユニットが、前記診断ユニットの前記電極のためのコネクタ部を備える、読取り器ユニットである、第１のユニットおよび第２のユニットと、
流体システムであって、前記流体システムを加圧するための一方向弁およびポートからなる流体システムと、を備え、
前記第２のユニットが、前記加圧のためのコネクタ部を備える、読取り器ユニットである、診断装置。
【請求項４３】
前記第１のユニットが、試料保持器およびフィルタユニットを更に備え、前記試料保持器およびフィルタユニットが、流体連通する、請求項４２に記載の診断装置。
【請求項４４】
試料中の少なくとも１つの細菌を特定する診断装置であって、
第１のユニットおよび第２のユニットを備え、前記第１のユニットが、前記第２のユニットの中に積み重ね可能であり、
前記第１のユニットが、少なくとも１つのウェルであって、前記少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極と、ならびに前記流体システムを加圧するための一方向弁およびポートからなる流体システムとを有する、少なくとも１つのウェルを備える、診断ユニットであり、前記診断ユニットが、少なくとも１つのバクテリオファージを備え、
前記第２のユニットが、前記診断ユニットの前記電極および少なくとも１つのマイクロポンプの接続ための接続部を備える、計算読取り器ユニットである、診断装置。
【請求項４５】
試料中での少なくとも１つの微生物の計数を判定する診断装置であって、
少なくとも１つのウェルであって、前記少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する少なくとも１つのウェルを備える、診断ユニットと、
読取り器ユニットであって、前記診断ユニットおよび前記読取り器ユニットが、積み重ね可能な一体化システムを形成する、読取り器ユニットと、
相関データを格納するメモリチップと、を備える、診断装置。
【請求項４６】
試料中の少なくとも１つの細菌の抗生物質耐性を判定する診断装置であって、
第１ユニットおよび第２のユニットを備え、前記第１のユニットが、前記第２のユニットへの中に積み重ね可能であり、
前記第１のユニットが、少なくとも１つのウェルであって、前記少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する少なくとも１つのウェルを備える、診断ユニットであり、前記診断ユニットが、少なくとも１つの抗生物質を更に備え、
前記第２のユニットが、前記診断ユニットの前記電極のためのコネクタ部を備える、読取り器ユニットである、診断装置。
【請求項４７】
前記電極が、非酸化材料を備える、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の診断装置。
【請求項４８】
前記非酸化材料が、金属、非金属、ポリマー、複合体、レジスト、樹脂、カーボンナノチューブ、プラスチック、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項４７に記載の診断装置。
【請求項４９】
前記電極が、グラフェンで覆われた銅を備える、請求項４７または４８のいずれか一項に記載の診断装置。
【請求項５０】
前記電極が、銅、金、ニッケル、またはそれらの組み合わせを備える、請求項４７に記載の診断装置。
【請求項５１】
前記診断ユニットが、
試料注入口と、
試料レセプタクルと、
前記試料レセプタクルに接続された第１の区画であって、第１の液体を格納する第１の区画と、
廃棄物区画およびファージ区画を格納する濾過チャンバと、
前記濾過チャンバに接続された第２の区画であって、第２の液体を格納する第２の区画と、
マニホルドウェルユニットと、を更に備える、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載の診断ユニット。
【請求項５２】
前記第１または前記第２の液体が、水性緩衝液、生理食塩水、脱イオン水、ブイヨン、寒天、または被検体を含む、請求項５１に記載の診断ユニット。
【請求項５３】
前記濾過チャンバが、フッ化ポリマーからなる少なくとも１つのフィルタを含む、請求項５１に記載の診断ユニット。
【請求項５４】
前記フッ化ポリマーが、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）である、請求項５３に記載の診断ユニット。
【請求項５５】
前記少なくとも１つのフィルタが、セルロース材料からなるプレフィルタ層を含む、請求項５４に記載の診断ユニット。
【請求項５６】
前記セルロース材料が、セルロースエステルである、請求項５５に記載の診断ユニット。
【請求項５７】
前記第２の液体が、脱イオン水、緩衝液、生理食塩水、ブイヨン、寒天、被検体、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項５１に記載の診断ユニット。
【請求項５８】
前記読取り器ユニットが、
少なくとも１つの電極コネクタと、
少なくとも１つのアナログからデジタルへのコンバータと、
少なくとも１つのシステム時計と、
少なくとも１つのメモリチップと、
少なくとも１つの計算ユニット付きマイクロプロセッサと、
ディスプレイプロセッサと、
ディスプレイと、を更に含む、請求項４２〜５７のいずれか一項に記載の診断装置。
【請求項５９】
前記読取り器ユニットが、
前記診断装置を加圧し、前記流体システムを起動する、少なくとも１つの機構を更に含む、請求項５８に記載の診断装置。
【請求項６０】
前記読取り器ユニットが、
無線通信装置および関連付けられた通信ポートを更に含む、請求項５８に記載の診断装置。
【請求項６１】
前記読取り器ユニットが、前記診断装置を加圧し、前記流体システムを起動するための少なくとも１つのマイクロポンプを更に含む、請求項４２〜６０のいずれか一項に記載の診断装置。
【請求項６２】
読取り器ユニットが、別の計算装置に、または別の計算装置からデータを提出するためのポートを更に含む、請求項４２〜６１のいずれか一項に記載の診断装置。
【請求項６３】
前記ポートが無線送信機である、請求項６２に記載の診断装置。
【請求項６４】
前記ポートが、配線された通信装置である、請求項６２に記載の診断装置。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの抗微生物剤が、アミノグリコシド、アンフェニコール、アンサマイシン、ベータ―ラクタム、リンコサミド、マクロライド、ポリペプチド抗生物質、テトラサイクリン、サイクロセリン、ムピロシン、ツベリン、２、４―ジアミノピリミジン、ニトロフラン、キノロン、スルホンアミド、スルホン、クロホクトール、ヘキセジン、メテナミン、ニトロキソリン、タウロリジン、およびキシボルノールから選択される、請求項４２〜６４のいずれか一項に記載の診断装置。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの抗微生物剤が、アミカシン、アズロシリン、カルベニシリン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォタキシム、セフォペラゾン、セホキシチン、セフチゾキシム、セフトリアクソン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネゾリド、メシリナム、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、ネチルマイシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、キヌプリスチン―ダルホプリスチン合剤、スパルフロキサシン、スルバクタム、タゾバクタム、テイコプラニン、テトラサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、およびバンコマイシンから選択される、請求項４２〜６５に記載の診断装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概ね、人間の健康管理、動物用医薬剤、動物飼育、臨床実験室、生体医学的および生物学的調査、食品管理の分野、および微生物によって影響される全ての産業の分野に適用可能な微生物診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９４２年、初めて患者の生命が、ペニシリンによる治療によって救われた。それでもなお、感染症および病原性細菌に対する戦いは継続している。２００６年、米国感染症学会（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、毎年病院で細菌感染を被った２００万人のうち、９０，０００人が死亡すると報告した。それは、４．５％の死亡率であり、病院を訪れただけでもたらされる。多種薬剤への耐性のある細菌種が主要な問題であり、過去数十年間に毎年急速に増加している問題である。新しい抗生物質の必要性以外に、伝染病への感染の蔓延に備えるために細菌感染を迅速に特定および定量化する必要性もある。
【０００３】
食品産業において、低温殺菌は、ウイルス、細菌、糸状菌、および酵母菌等の病原生物を死滅させるために、牛乳、ジュース等の液体食材製品を加熱することを伴う。しかし、いくらかの量の微生物が低温殺菌処理を生き延びる場合があり、または更なる処理中、軽率にも持ち込まれる場合がある。そのような微生物は、典型的に、食材製品を腐敗させ、毎年、１００億ドルを超える経済的損失を引き起こす。更に、残存する微生物が病原性であるとき、食材由来の病気の突発が顧客の間に発生する場合がある。およそ７，６００万の食材由来の病気が米国のみで年毎に発生し、そのうちの５０００件が死をもたらし、それによって経済的損失にまで更に影響すると試算されている。
【０００４】
ゆえに、低温殺菌法等の処理を生き延びる微生物を検出および定量化することは、食材の品質および食材の安全を保障し、更には、政府機関または通商機関によって設定された基準を順守するために重要である。例えば、米国のＰａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ  Ｍｉｌｋ  Ｏｒｄｉｎａｎｃｅは、「Ａ級」の低温殺菌された牛乳が２０，０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ以下の合計微生物計数および１０ＣＦＵ／ｍｌ以下の大腸菌計数を有することを要求する。食材生産者および／または市場の食材販売者は、規制基準を満たすために微生物学的試験を行わなければならない。材料および労力の可能な限り最も少ない費用でそれを行うことが彼らの経済活動にとって重要である。
【０００５】
現在、臨床的試料または食材試料中の微生物を検出するためのいくつかの方法がある。大まかに分類されると、（ｉ）平板インキュベーションおよび生化学的分析法等の従来の方法と、（ｉｉ）多くの場合、ミクロ／ナノ粒子および蛍光体を伴うＤＮＡおよび抗体に基づく方法と、（ｉｉｉ）培地での細菌の新陳代謝の効果を監視することに依存する、他の「自動化された」技術とがある。これらのうち、従来の方法が最も広く使用され、多くの場合、それと他の技術が比較される基準として作用する。しかし、そのような従来の方法は、冗漫で労働集約的であり、微生物を検出するために非常に長い時間を要し、使用される生物および培地の種に応じて、一晩〜数週間の範囲になり得る。
【０００６】
前述は、微生物がいかに人々の日常生活および経済に影響するかの２例に過ぎない。そのような微生物の影響が、健康管理および製薬業界から、食材および家畜業界を超えて、都市および地方の住民、更には石油およびガス産業まで達する、いかに広範囲に及ぶか、またパイプラインまたは貯蔵タンクを用いて供給される産業が、存在する微生物によって腐食されていることは周知である。ゆえに、広範な区域の経済分野において、試料中の生存能力のある微生物を検出、判定、定量化するための改善された方法及び装置を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、微生物の生存性を監視するための方法は、ウェルに微生物の試料を配置することを含み、ウェルは、少なくとも２つの電極で構成される。電圧は、２つの電極の間でパルス変調され、電気的特性は、電圧パルス変調中、サンプリングされる。電気的特性は、時間の関数として記録され、微生物の成長を特定するために分析される。
【０００８】
別の態様において、細菌を判定するための方法は、細菌の試料を採取することと、細菌を試料から単離することと、細菌をいくつかのウェルに分割することを含み、それぞれのウェルは、２つの電極で構成される。本方法は、特定される細菌に特異的なバクテリオファージを、ウェルの少なくとも１つに添加することを更に含む。電圧は、２つの電極の間でパルス変調され、電気的特性は、電圧のパルス変調中、サンプリングされる。電気的特性は、時間の関数として記録され、成功裏のバクテリオファージ攻撃の明瞭なデジタルシグネチャを探して、分析される。
【０００９】
別の態様において、試料中で微生物の計数を判定する方法は、試料を濾過し、微生物を試料から単離することと、微生物を、生命を支持する培地（以下、被検体と呼ばれる）中に浸漬し、浸液を形成することと、を含む。浸液は、ウェルへと分割され、電圧は、２つの電極の間でパルス変調され、電気的特性は、電圧のパルス変調中、サンプリングされる。電気的特性は、時間の関数として記録され、分析される。電気的特性は、計数に相関される。
【００１０】
別の一態様において、微生物の抗微生物耐性を特定するための方法は、微生物の試料を少なくとも１つの抗微生物剤を含有するウェルへと添加することと、微生物の試料をウェルに配置することによって、生存性または微生物の成長率を測定することとを含み、ウェルは、少なくとも２つの電極で構成される。電圧は、２つの電極の間でパルス変調され、電気的特性は、電圧のパルス変調中、サンプリングされる。電気的特性は、時間の関数として記録され、抗微生物剤の微生物反応を判定するために分析される。
【００１１】
なお別の態様において、微生物の生存性を検出するための診断装置は、１組の積み重ね可能なユニットを含む。第１のユニットは、連続するウェルを有する診断ユニットである。ウェルは、ウェルの内側および外側に接触する電極を有する。第１のユニットは、自動化された試料調製の制御を容易にするための接続機構も有する。第２のユニットは、読取り器ユニットである。読取り器ユニットは、電極および自動化された試料調製のためのコネクタ部を含む。
【００１２】
更に別の態様において、試料中の微生物を特定するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、ウェルであって、ウェルの内側および外側に接触する電極を有するウェルを含む診断ユニットである。第１のユニットは、自動化された試料調製の制御を容易にするための接続機構も有する。診断ユニットは、バクテリオファージも含む。第２のユニットは、読取り器ユニットであり、診断ユニットおよび自動化された試料調製の電極のためのコネクタ部を含む。
【００１３】
更なる一態様において、試料中の微生物の計数を判定するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、ウェルであって、ウェルの内側および外側に接触する電極を有するウェルを含む、診断ユニットである。第１のユニットは、自動化された試料調製の制御を容易にするための接続機構も有する。第２のユニットは、読取り器ユニットであり、診断ユニットおよび自動化された試料調製の電極のためのコネクタ部を含み、読取り器ユニットは、相関するデータを格納するメモリチップを含む。
【００１４】
別の態様において、試料中の抗微生物耐性の微生物を判定するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、ウェルであって、それぞれのウェルの内側および外側、ならびに自動化された試料調製システムに接触する電極を有するウェルを含む、診断ユニットである。診断ユニットは、抗微生物剤も含む。第２のユニットは、読取り器ユニットであり、診断ユニットの電極のためのコネクタ部と、第１のユニットの自動化された試料調製システムを駆動するため機構を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本実施形態の特徴および利点が達成され、より詳細に理解され得るように、上に簡潔に要約された本実施形態のより具体的な説明が、添付された図面を参照することによって得られ得る。しかし、図面はいくつかの実施形態のみを例示し、ゆえに、他の等しく有効な実施形態にあてはまることを認め得る本発明の範囲を限定すると見做されるものではない。
【００１６】
【図１】図１は、電圧のパルス変調のプロットを含む。電圧パルス変調選択の更なる支援は、図９に見られる。
【図２】図２は、診断装置の実施形態の例示を含む。
【図３】図３は、診断装置の診断ユニットの実施形態の例示を含む。
【図４】図４は、診断装置の読取り器ユニットの実施形態の例示を含む。
【図５ａ】図５ａは、１ｍＬ毎の単位を形成するコロニーの様々な微生物計数でのシグネチャのプロットを含む。
【図５ｂ】図５ｂは、１ｍＬ毎の単位を形成するコロニーの様々な微生物計数でのシグネチャのプロットを含む。
【図６】図６は、細菌上へのファージ攻撃を示すシグネチャ、対照を示す第２のシグネチャ、ファージの不存在中の細菌のプロットを含む。
【図７ａ】図７ａは、異なる抗微生物剤で処置される微生物のためのシグネチャのプロットを含む。
【図７ｂ】図７ｂは、異なる抗微生物剤で処置される微生物のためのシグネチャのプロットを含む。
【図７ｃ】図７ｃは、異なる抗微生物剤で処置される微生物のためのシグネチャのプロットを含む。
【図７ｄ】図７ｄは、異なる抗微生物剤で処置される微生物のためのシグネチャのプロットを含む。
【図８ａ】図８ａは、読取り器ユニットの技術的設定の例示を含む。
【図８ｂ】図８ｂは、読取り器ユニットの技術的設定の例示を含む。
【図８ｃ】図８ｃは、読取り器ユニットの技術的設定の例示を含む。
【図９ａ】図９ａは、正しい電圧、パルス長、および所与の特定の被検体をサンプリングすることを決定するための方法を含む。
【図９ｂ】図９ｂは、正しい電圧、パルス長、および所与の特定の被検体をサンプリングすることを決定するための方法を含む。
【図１０ａ】図１０ａは、図８ｃの拡張としての４×４センサ構成を有する多重化センサの例示を含む。
【図１０ｂ】図１０ｂは、図８ｃの拡張としての４×４センサ構成を有する多重化センサの例示を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で使用されるように、用語「備える」、「備えている」、「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、またはそれらのいずれかの変形は、非排他的な包含を含むことを意図される。例えば、特徴のリストを含む処理、方法、物品、または装置は、それらの特徴に必ずしも限定されず、そのような処理、方法、物品、または装置に明示的に列挙されていないか、または固有でない他の特徴を含んでもよい。更に、反対に、明示的に記述されない限り、「または」は、包括的な「または」を指すのであって、排他的な「または」ではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在する）、かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）、かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または存在する）。
【００１８】
また、「ａ」または「ａｎ」の使用は、本明細書に記載される複数の要素および構成要素を記載するために利用される。これは、利便、ならびに本発明の範囲の一般的感覚を与えるためになされるのみである。この説明は、１つまたは少なくとも１つを含むように読まれるべきであり、単数は、別に意味されることが明らかである場合を除き、複数も含む。
【００１９】
利益、他の利点、および問題への解決法が、特定の実施形態に関連して説明された。しかし、利益、利点、問題への解決法、ならびにいずれの利益、利点、解決法を生じさせ得るか、またはより顕著にさせ得るいずれの特徴（複数可）も、請求項のいずれかまたは全ての重要な、要求された、または不可欠の特徴として解釈されないものとする。
【００２０】
本明細書の読後、当業者は、明確にするために別個の実施形態の文脈で本明細書に記載された特定の特徴が、単一の実施形態で組み合わされて提供されてもよいことを理解するであろう。反対に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載された様々な特徴が、別個に、またはいずれかの部分的組み合わせで提供されてもよい。更に、範囲で記述される値への参照は、その範囲内の全ての値を含む。
【００２１】
培地中の微生物の新陳代謝は、炭酸塩、有機酸、ならびにナトリウム、カリウム、およびマグネシウムの塩等の電解質のバイオマスへの解放をもたらし、すなわち、微生物のコロニーが成長しているとき、電解質は培地と交換され、特定の生命的事象は、予測可能な様式で電解質を変化させる。例えば、バクテリオファージが細菌を攻撃すると、１０８までのカリウムイオンが解放される。
【００２２】
分子のレベルでは、培地中のコンダクタンスは、分子の可動性直接的結果であり、微生物は、分子の複合体として見られ得、したがってコンダクタンスに影響する。微生物のコロニーが成長すると、コンダクタンスは、オームの法則に従い、かつ等価体とコンダクタンスとの関係（Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈの法則）およびＤｅｂｙｅ―Ｈｕｅｃｋｅｌの理論を利用し、予測可能な様式で増大する。微生物の生命事象の結果として、培地の電気的特性は、導電率滴定と同様に変化する。
【００２３】
イオンを検出するための原理は、イオン含有量の関数として、電気的特性において容易に定量化可能および測定可能な変化に依存する。例えば、導電率滴定は、本方法の利用のよく確立された実施例である。水中でのイオン導電性は、水中でのイオン可動性の関数である。例えば、周期表の第１列の金属から生産されたイオンの実施例は、リチウムが最も小さいイオンであり、ナトリウムが次に大きいサイズであり、カリウムが更に大きい等、を示す。しかし、リチウムイオンは、周期表の第１列で見られる全ての金属イオンのうちで最も低い導電性を有する。これは、リチウムイオンが非常に親水性であり、その周囲に大きな水の水和構造を構築するからである。これらのイオンの導電性反応は、非常に個別であり、結果として、濃度（および濃度における変化）は容易に測定される。カリウムイオンの濃度における変化は、特定の有害な微生物の特異的なファージ攻撃と共に増大するため、カリウムイオンの濃度における変化は、水溶液中の導電性、ならびに、反対に抵抗およびキャパシタンスの変化によって容易に測定され得る。ゆえに、結果として、微生物の成長コロニーの電気特性の変化を、時間を経て監視すると、総インピーダンスの抵抗構成要素の減少を観察するであろう。観察可能な電気的特性のこの変化、ここにおいては抵抗およびキャパシタンスが、時間を経て、微生物の濃度または計数に帰される特徴を個々に、または一緒に有する、シグネチャを形成する。電気的特性のいくつかまたは全てが使用されるとき、細菌の様々な生命の兆候が検出される場合がある。
【００２４】
更に、コロニーがその個体群で最大成長および停滞に達すると、シグネチャは、電気的特性における変化を示さないだろう。この概念を更に考慮すると、コロニーが個体群において衰え始めると、それらの体部が電気的に不活性な断片へと減衰し、培地の導電性に関与しなくなり、培地中の抵抗が増大し、コロニーが死滅しつつあることを結論付け得る。
【００２５】
この概念は、微生物コロニーの生存性を判定する方法の基礎を提供し、インピーダンスの抵抗部が、時間を経ると減少するために、成長コロニーに対する正のシグネチャを提供し、インピーダンスの抵抗部分が定常であるために、停滞する個体群に対する定常シグネチャを提供し、インピーダンスの抵抗部分が増大しているために、劣化するコロニーに対する負のシグネチャを提供する。
【００２６】
本概念は、特異的な微生物種を標的とする薬剤を適用すると、更に一層改良され得る。例えば、抗微生物剤を培地に添加すると、抗微生物剤は、成長コロニーに対して再び活性になり、結果は、負のシグネチャの観察であり、または緩慢に行動する抗微生物剤については、停滞する個体群に対する定常シグネチャであろう。同様に、不活性抗微生物剤の培地への添加は、コロニーの継続した成長を表すシグネチャをもたらすであろう。更に、シグネチャにおけるわずかな変化は、適用された抗微生物剤への微生物の感度に関する情報を与えるであろう。更に、本概念は、バクテリオファージまたはファージ（抗微生物剤とも見做される）を適用することによって、細菌の１つの特定種を特定するように調整までもされ得る。ファージは、細菌に感染し、死滅させるウイルスである。概ね、ファージは溶解性であり、細菌の溶解を引き起こし、特徴的なシグネチャをもたらす。更に、膨大な数の利用可能なファージによって、細菌の単一種、細菌の類、または細菌の混合物までを判定するための方法が可能になる。
【００２７】
ファージが細菌を攻撃すると、１０８のカリウムイオンは、細菌が回復サイクルの間、イオンを再吸収するまで、総インピーダンスの抵抗部を直ちに低下させるように、培地へと解放される。培地の抵抗における変化は即時であり、回復は５分間の期間に渡って生じる。ゆえに、細菌が溶解することを待たずにファージ攻撃が判定される。
【００２８】
培地中の微生物の生存性は、培地中の電気的特性における変化を監視することによって測定され得る。時間を経た電気的特性の変化は、シグネチャとして定義される。電気的特性は、ＬＢブイヨン等の補助培地中に微生物を含有する試料ウェル等のウェルに存在する、少なくとも２つの電極によって測定され得る。
【００２９】
電気的特性を測定することは、水性培地中の微生物が試料ウェルに印加される電圧または電流によって影響されず、または最小限に影響されるように行われるべきである。これを最小限化するための１つの方法は、サンプリングと呼ばれる手順による。
【００３０】
［サンプリング］
図１は、サンプリングの概念を図示する。電圧は、補助培地中に微生物試料を含むウェル内の２つの電極の間でパルス変調される。電圧のパルス変調は、オン期間およびオフ期間を含む。サンプリング期間は、電圧が印加される時間および電圧が除去される時間の合計の長さ、すなわちオン期間＋オフ期間によって定義される。
【００３１】
実施形態において、測定回路は、ＬＢブイヨンの補助成長培地中に微生物を含有する試料電解槽と、電圧を印加し、コンダクタンスを測定するための少なくとも２つの電極とを備える。定常電圧または基準電圧は、１つの電極に印加され、他の電極は、抵抗およびコンダクタンスを含む総インピーダンスを測定することができる電流測定回路を作製するために間隔を置いて印加される、ＤＣ電圧の源に接続される。電流測定回路は、帰還抵抗を有する低ノイズ増幅器を含み、基準電圧は、０．０Ｖまたは低ノイズ増幅器の実装の容易さのために好適であるその他のＤＣ電圧であり得る。次いで、ＤＣ電圧が、低ノイズ増幅器を有する回路を使用して他の電極に印加され、電圧が印加されると、電流は、クロック装置に従って測定される。いくつかの場合において、それぞれの電流測定回路に印加される電圧が１つのサンプリング期間から次のサンプリング期間へと逆の極性を有していることは、有利である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、抵抗、キャパシタンス、およびインダクタンス、または総インピーダンスを測定することは有利であり得、そのために、直流（ＤＣ）ではなく交流（ＡＣ）が、サンプリング期間中、印加され得る。
【００３３】
他の実施形態において、サーミスタまたは類似の装置は、サンプリング期間中、温度を捕捉するために使用される測定回路に付加され得る。なお別の実施形態において、ｐＨ電極またはｐＨプローブが、サンプリング中、ｐＨおよびｐＨの変化を捕捉するために付加され得る。
【００３４】
実施形態において、電圧の印加されるオン期間は、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約２ミリ秒、少なくとも約３ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、または少なくとも約５００ミリ秒である。
【００３５】
他の実施形態において、オン期間は、約５００ミリ秒以下、約２００ミリ秒以下、約１００ミリ秒以下、約５０ミリ秒以下、約２０ミリ秒以下、約１０ミリ秒以下、約５ミリ秒以下である。
【００３６】
別の実施形態において、オフ期間は、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、少なくとも約２秒、少なくとも約３秒、少なくとも約５秒、少なくとも約１０秒、少なくとも約２０秒、少なくとも約４０秒、または少なくとも約５０秒、もしくは少なくとも約１分である。
【００３７】
なお別の実施形態において、オフ期間は、約６０秒以下、約３０秒以下、約１０秒以下、約５秒以下、約２秒以下、約１秒以下、約５００ミリ秒以下、約２００ミリ秒以下、約１００ミリ秒以下、または約５０ミリ秒以下である。
【００３８】
なお別の実施形態において、オン期間の合計は、１秒〜１分である。例えば、オン期間は５０ミリ秒であり得、オフ期間は９５０ミリ秒であり得る。別の実施例において、オン期間は５ミリ秒であり得、オフ期間は９９５ミリ秒であり得る。これらの実施例から、オン期間は、比較的短い端数のサンプリング期間を構成するが、一方でオフ期間は、サンプリング期間の主要部を構成することが見られ得る。したがって、監視中、試料は、短い持続期間中のみ、電圧および電流に曝露される。
【００３９】
実施形態において、試料に印加される電圧はＤＣ電圧であり、少なくとも約０．０００５Ｖ、少なくとも約０．００１Ｖ、少なくとも約０．００２Ｖ、少なくとも約０．００５Ｖ、少なくとも約０．０１Ｖ、少なくとも約０．０２Ｖ、少なくとも約０．０５Ｖ、少なくとも約０．１Ｖ、少なくとも約０．２Ｖ、５Ｖ、少なくとも約１．０Ｖ、少なくとも約２．００Ｖ、少なくとも約５．０Ｖ、または少なくとも約１０．０Ｖであり得る。
【００４０】
なお別の実施形態において、電圧は、約５．０Ｖ以下、約２．０Ｖ以下、約１．０Ｖ以下、約０．５Ｖ以下、約０．２Ｖ以下、または約０．１Ｖ以下である。例えば、電圧は、５０ｍＶ〜１．２４ボルトで印加され、なお水の電解または試料ウェルの他の成分未満であり得る。
【００４１】
実施形態において、サンプリング持続期間は、サンプリング期間の合計数量によって定義される。サンプリング持続期間は、実装される診断機能によって変化する。例えば、細菌特定のサンプリング持続期間は、２分〜１０分であり得る。なお、別の実施形態において、サンプリング持続期間は、２分〜３０分、または更に６０分であり得る。別の実施例において、抗微生物剤感度試験のサンプリング持続期間は、４０分〜４時間であり得る。なお、別の実施形態において、抗微生物剤感度試験のサンプリングは、４時間より長い可能性がある。なお別の実施例において、コロニー計数は、１つのサンプリング期間のサンプリング持続期間を有し得る。したがって、コロニー計数することは、１分のみで達成され得る。
【００４２】
実施形態において、微生物の生存性を試験または監視することは、約３６０分より長くなく、約１８０分より長くなく、約１２０分より長くなく、または約９０分より長くかかり得ない。なお別の実施形態において、微生物の生存性を試験または監視することは、約６０分より長くなく、約４５分より長くなく、または約３０分より長くかかる可能性はない。更なる実施形態においても、微生物の生存性を試験または監視することは、約２０分より長くなく、約１０分より長くなく、約５分より長くなく、または約２分より長くかかる可能性はない。
【００４３】
生存性の監視が、約１５秒〜約６０分、約１５秒〜約４５分、約１５秒〜約２０分、約１５秒〜約１０分、約１分〜約２０分、約２分〜約２０分、約５分〜約２０分、約５分〜約１０分、または約１０分〜約２０分である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【００４４】
［信号忠実度の改善（図９ａ〜９ｂ）および（図１０）］
特定の被検体に対する信号の忠実度を改善するために、複数の電気的特性がサンプリングされてもよく、電圧強度およびパルス変調オンおよびパルス変調オフ期間は、被検体に対して注意深く調整されなければならない。本発明の一実施形態において、抵抗、キャパシタンス、および電気的時定数がサンプリングされ、システムは、ＲＣ回路モデルを特徴とし得る。
【００４５】
本実施形態において、回路は、低インピーダンス電圧緩衝液を提供し、もたらされる電解槽電圧を電圧信号へと変換するためのトランスインピーダンス増幅器で、試験下の電解槽を駆動するように構築された。これは、良好な信号とノイズとの比率および高い再現性を継続するための電解槽反応の特徴を可能にした。信号発生およびサンプリングを改善するためにいくつかのパルス変調振幅で正のパルス変調を出力する、信号発生器が使用された。
【００４６】
ＬＢブイヨンを伴う上記の条件下で試験された４×４試験電解槽、図１０ａは、５５０オームの抵抗および０．０４μＦの電極キャパシタンスの周囲のイオン溶液を示す。５０ｍＶの正のパルス変調で、初期的試験電解槽の電流（ピーク）は、＋９１μＡである。この電流は、−９１ｍＶのピークトランスインピーダンス増幅器の出力電圧を生成する。正の電圧パルス変調中、試験電解槽の電流は、電極キャパシタンスが帯電すると、指数関数的に低下する。この指数関数的電流のトレースは、２２μｓの時定数を有する。
【００４７】
電解槽が低い信号レベルで線形ネットワークとして応答するという検証、およびこの同等の直列ＲＣ回路を備える抵抗およびキャパシタンの測定は、異なる被検体を比較するための基礎を提供した。より高い信号レベルで、非線形効果は、システムがスケーリングおよび時間の不変性を失うと、優勢になり、比較をより困難にする。非線形状態へと十分に作動することは、多くの場合、電極腐食の可視の兆候を伴って、応答における恒常的変化を引き起こし得る。
【００４８】
この作業の重要な部分は、線形および非線形状態を分離する境界を特定することであった。線形モデルからの逸脱の閾値未満に止まるために、最大の試験信号振幅が被検体溶液に対して特徴付けられるべきであり、閾値未満での作動が要求される。
【００４９】
［４×４センサ（図１０）］
センサの一実施形態は、銅のトレースを回路基板上に配置し、次いで、はんだマスクを使用して、それぞれの電解槽内に５ｍｍ離間した中心点を伴う直径１ｍｍの少なくとも２つの電極を提供することによって作製された。次いで、金でトレースをコーティングするために、標準的な無電解のニッケルと金のめっき処理が使用された。ＩＰＣ−４５５２（Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｅｓｓ  Ｎｉｃｋｅｌ／Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  金  （ＥＮＩＧ）  Ｐｌａｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｂｏａｒｄｓ）における金の厚さは、最低で１．９７マイクロインチである。ニッケルの厚さは、１１８．１〜２３６．２マイクロインチの厚さである。はんだマスクは、露出された２つの円形電極パターンを残して、慎重に適用され、それぞれの電解槽内の適当な区域に慎重に離間配置された。はんだマスクの適用の不正確さに適合するために十分大きくなるように、それぞれの電極の末端の正方形のパッドを寸法決めすることが重要である。センサの機能は、はんだマスクにおける開口部の直径、開口部の間の距離、および溶液を保持する電解槽の寸法の関係に依存する。本実施形態において、１６個の直径１ｃｍの孔が、Ｄｅｌｒｉｎブロックに穿孔された。次いで、Ｄｅｌｒｉｎブロックは、エポキシ接着剤を使用して回路基板に取り付けられた。本実施形態において、それぞれの電解槽は、およそ１ｍｌの液体を保持する。本実施形態において、Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｐａｕｗ電解槽が、製造中の工程制御を補助するために追加された。
【００５０】
他の実施形態は、ワイヤハーネスを使用する射出成型技術を使用して行われ得る。
【００５１】
別の実施形態は、金ではなく、グラフェンまたは他の導電性材料で回路基板上の銅のトレースまたはワイヤハーネス中のワイヤをコーティングし得るであろう。
【００５２】
［診断システム］
図２は、組み立てられた構成における診断システム２００の実施形態を表示し、この構成は、尿等の液体試料の試験のために最適化されている。診断システムは、２つの積み重ね可能なユニット、診断ユニット２０２、および読取り器ユニット２０４を備える。診断システム２００は、積み重ねられた構成において、外側の長さｌ、幅ｗ、および高さｈを有する。長さは、約２．５〜約４．５インチ、好ましくは約３．０〜約４．０インチ、より好ましくは約３．５インチであり得る。読取り器ユニット２０４の幅ｗは、約３．５〜約５．５インチ、好ましくは約４．０〜約５．０インチ、より好ましくは約４．４インチの範囲であり得る。高さｈは、診断ユニット２０２の寸法に依存し、約３．５〜約５．０インチ、好ましくは約４．０〜約４．５インチ、より好ましくは約４．２インチの範囲であり得る。他の実施形態において、積み重ね可能なユニットは、側面構成によって側面に積み重ねられ得る。他の実施形態において、積み重ね可能ユニットは、他の試料種を試験するときに要求される、より少ない体積を収納するために小型化され得る。他の実施形態において、積み重ね可能なユニットは、１つの一体化されたユニットへと形成され得る。
【００５３】
図３は、診断ユニット２０２の内部を図示する。診断ユニットの内部は、管、液体区画、フィルタ、およびウェルの集合を有する。試料および他の液体の流れは、チャンバ３１２、３０６、３０８に連続して適用される圧力によって調整され得る。弁３１４は、一方向弁であり得、すなわち、一方向のみへの流れを可能にする。弁は、３２０、３２２、３３０からおよびこれらへの、および３３２への流れ、ならびにマニホルド３１６からおよびこれへの、および更にウェル３１８への流れを制御し得る。他の実施形態において、圧力が読取り器ユニット２０４内に存在し、更に以下で論じられる電子機構によって独立して調整され得る。
【００５４】
試料保持器３０２は、患者から試料を受け取る。試料は、尿、血液、汗、粘液、唾液、精液、膣分泌物、嘔吐物、涙、皮脂、胸膜液、腹腔液、胃液、耳垢、脳脊髄液、母乳、内リンパ、外リンパ、眼房水、硝子体液、バイオマス、またはそれらのいずれかの組み合わせから採取され得る。試料保持器３０２の体積容量は、約０．４ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。試料保持器３０２は、ねじキャップを含む。ねじキャップは、キャップを締めている間に試料保持器内に正圧が生成されるように、構成され得る。
【００５５】
いくつかの実施形態は、ねじキャップ圧力システムではなく、電子加圧システムを使用して、診断ユニットの流体システムに圧力を加えるための読取り器ユニット２０４を有し得る。次いで、読取り器ユニットの加圧システムは、少なくとも１つの圧力ポートを介して診断ユニットに接続するであろう。
【００５６】
一方で試料は試料保持器３０２内に留まるが、圧力が液体をチャンバ３１２からマニホルド３１６へと、次いで、ウェル３１８へと均一に押し出す。抗微生物剤またはバクテリオファージは、いくつかの、または全てのウェルで個別に乾燥して含まれ得る。ウェル３１８へと流れる液体は、これらの抗微生物剤またはバクテリオファージを溶解し、または乳化する。液体は、抗微生物剤またはバクテリオファージを溶解するための治療ガイドラインに依存するであろう。いくつかの実施形態は、チャンバ３１２等の２つ以上のチャンバを有するであろう。例えば、異なる乾燥された材料が抗微生物剤またはバクテリオファージを再構成、溶解、または調製するための異なる液体を必要とするとき、チャンバ３１２等の付加的チャンバは、必要な液体を保持するであろう。いくつかの実施形態は、それぞれのチャンバ３１８を２つの半分へと分割し、溶解または乳化された抗微生物剤は、１つの半分へと、次いで、ミクロンフィルタおよび一方向弁を通って他の半分へと流れる。ウェルのいくつかは、試料が濾過され、調製された後、微生物試料を受け取る。この液体の体積は、提供者の試料種に応じて、４．０ｍｌ〜１２ｍｌの範囲であり得る。
【００５７】
３０４４は、液体区画３０６を試料保持器３０２と連通する管を表示する。液体区画３０６は、水性液体、脱イオン化水、緩衝液、またはブイヨンを含み得る。３０６内の液体は、様々な目的に有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、区画３０６内の液体は、試料を希釈し得る。他の実施形態において、区画３０６内の液体は、試料のｐＨを調節し得る。なお他の実施形態において、区画３０６内の液体は、試料中に存在する微生物の成長を促進する、滅菌されたブイヨンを含有し得る。区画３０６の体積容量は、約１ｍＬ〜約２４ｍＬ、好ましくは約３ｍＬ〜約５ｍＬ、より好ましくは約４ｍＬの範囲であり得る。
【００５８】
圧力がチャンバ３０６に適用される実施形態において、そこでの液体は、試料保持器３０２へと押し出され、試料に３０４４を通り、次いで一方向弁３１４を通って放出させる。試料保持器３０２は、管３０４２を介して、内容物を濾過ユニット３１０へと放出する。濾過ユニット３１０は、フィルタによって分離され、濾過後、液体の逆流を保証しない一方向弁３１４で構成された、いくつかのチャンバから構成される。試料保持器３０２の内容物は、受け取りチャンバ３２０へと放出される。受け取りチャンバ３２０に隣接するのは、微生物チャンバ３２２である。チャンバ３２０および３２２は、フィルタ３２４によって分離される。フィルタ３２４は、微生物はフィルタを通ってチャンバ３２２へと通過し得るが、一方でフィルタ寸法より大きい不溶性材料、粒子、人間または動物の細胞、および生物学的物質は受け取りチャンバ３２０内に留まるように選択された、フィルタ寸法を有する。フィルタ材料は、いずれの好適な材料であり得る。例えば、フィルタ材料は、セルロース、ポリマー、またはガラス繊維であり得る。例えば、実施形態において、フィルタ材料は、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜であり得る。ＰＶＤＦ膜は、セルロースエステル（ＲＷ０６）プレフィルタ層を有し得る。実施形態において、フィルタ３２４は、０．４５ミクロン以下、０．５ミクロン以下、０．６ミクロン以下のフィルタ寸法を有し得る。他の実施形態において、０．８ミクロン、または１．０ミクロン、または更に２．０ミクロン以下のフィルタ３２４のフィルタ寸法が想到される。
【００５９】
微生物チャンバ３２２に隣接するのは、ファージチャンバ３３０であり、フィルタ３２６によって分離されている。フィルタ３２４とは逆に、フィルタ３２６は、微生物がフィルタを通ってチャンバ３３０へと通過しないが、一方でフィルタ寸法より小さい材料がチャンバ３２２からチャンバ３３０へと流れるように選択された、フィルタ寸法を有する。そのような材料は、試料中に存在する野生型のファージを含む。フィルタ３２６のフィルタ材料は、いずれの好適な材料でもあり得る。例えば、フィルタ材料は、セルロース、ポリマー、またはガラス繊維であり得る。例えば、実施形態において、フィルタ材料は、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜であり得る。ＰＶＤＦ膜は、セルロースエステル（ＲＷ０６）プレフィルタ層を有し得る。実施形態において、フィルタ３２６は、０．１ミクロン以下、０．２ミクロン以下、０．４５ミクロン以下のフィルタ寸法を有し得る。他の実施形態において、０．５ミクロン、または０．６ミクロン、もしくは更に０．７ミクロン以下である、フィルタ３２４のフィルタ寸法が想到される。
【００６０】
ファージチャンバ３３０に隣接して、フィルタ３２８によって分離される廃棄物チャンバ３３２が位置する。フィルタ３２４および３２８とは逆に、フィルタ３２８は、野生型ファージがフィルタを通ってチャンバ３３２へと通過しないが、一方でフィルタ寸法より小さい材料がチャンバ３３０からチャンバ３３２へと流れるように選択された、フィルタ寸法を有する。フィルタ３２８のフィルタ材料は、いずれの好適な材料でもあり得る。例えば、フィルタ材料は、セルロース、ポリマー、またはガラス繊維であり得る。例えば、実施形態において、フィルタ材料は、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜であり得る。ＰＶＤＦ膜は、セルロースエステル（ＲＷ０６）プレフィルタ層を有し得る。実施形態において、フィルタ３２８は、０．０５ミクロン以下、０．１ミクロン以下、０．２ミクロン以下のフィルタ寸法を有し得る。他の実施形態において、フィルタ３２８のフィルタ寸法は、０．３ミクロン、または０．４ミクロン以下であり、もしくは更に０．４５ミクロンが想到される。
【００６１】
図３に図示されないが、チャンバ３２０からのフィルタ３２４を通るチャンバ３２２への液体の流れまたはチャンバ３２２からのフィルタ３２６を通るチャンバ３３０への液体の流れ、ならびにチャンバ３３０からのフィルタ３２８を通るチャンバ３３２への液体の流れは、液体の前のチャンバへの逆流を回避するために、一方向弁によって調整され得る。
【００６２】
被検体チャンバ３０８は、被検体溶液を格納し、微生物チャンバ３２２と連通する。被検体溶液は、微生物を補助し、一度混合されると、同一性、計数、または抗微生物耐性について分析される微生物試料を形成する。被検体溶液は、次いで、一方向弁３１４によって導かれてチャンバ３２２へと流れ、それによって提供者試料の濾過から存在する微生物を浸漬する。被検体溶液は、微生物の生存性を支持する成分を含む。例えば、被検体溶液は、ブイヨン、希釈されたブイヨン、緩衝液、またはブイヨンと混合された緩衝液を含有し得る。同様の溶液は、チャンバ３１２内にも格納され得る。
【００６３】
被検体溶液によってチャンバ３２２内で微生物を浸漬し、微生物試料を形成すると、微生物試料はチャンバ３２２からマニホルド３１６へと流れ、いくつかのウェル３１８全体に試料を均一に分布させる。ウェル３１８の数は、２〜２４、好ましくは８〜２０、好ましくは約１８であり得る。ウェルの合計数量に関係なく、少なくとも１つのウェルは、微生物試料を受け取らないが、チャンバ３１２からの被検体溶液を受け取る。このウェルは、対照ウェルとして指定される。それぞれのウェル３１８は、少なくとも２つの電極で装備され、電極は、読取り器ユニット２０４と接続する積み重ね可能なインターフェース３２０と接続される。
【００６４】
ウェル内の電極は、いずれの既知の電極材料によっても作製され得る。実施形態において、電極材料は、電極の感度を増加させる材料でコーティングされ得る。実施形態において、電極材料は、金、プラチナ、またはパラジウム等の貴金属でコーティングされ得る。電極は、非酸化材料から作製されるべきであり、いくつかの金属および非金属材料からなってもよい。他の実施形態において、電極材料は、特別な調合のグラフェンでコーティングされた銅である。銅コーティングおよびグラフェンは、非酸化の高電導性の電極を生成する。
【００６５】
一実施形態において、グラフェンの水性散布は、フミン酸の接触水素化によって調製され得る。フミン酸は、レオナルダイト（Ａｇｒｏ−Ｌｉｇ）から抽出され、次いで触媒的に水素化され得る。接触水素化は、１５０℃でＰａｒｒリアクタ内において様々な触媒を使用して行われ得る。触媒は、パラジウムもしくはプラチナ金属、または木炭上のパラジウムもしくは木炭上のプラチナであり得る。散布は、過剰な陽イオンを除去するために強酸イオン交換カラムを通過させられ得る。グラフェンの水性散布は、銅電極、金電極、または銀電極等の電極に適用され得る。実施形態において、水性散布のグラフェン含有量は、０．５重量％であり得る。別の実施形態において、グラフェン含有量は、１重量％である場合もある。そしてなお別の実施形態において、グラフェン含有量は、２重量％である場合もある。なお別の実施形態において、グラフェン含有量は、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．５重量％、約０．重量８％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．５重量％、約１．８重量％、約２．０重量％、または約２．５重量％であり得る。
【００６６】
本方法によって調製されたグラフェンは、グラフェンに結合された水酸基等の官能基を有する。これらの官能基は、グラフェンを金属に結合させるための親和性を有し、したがって、グラフェンでの電極のコーティングを改善する。グラフェンコーティングされた電極は、酸化に対する電極抵抗を改善し、電極の導電性特性も改善する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、診断装置は、そのユニットまたは区画を加熱するための加熱構成要素を更に含む。例えば、加熱コイル等の加熱構成要素は、微生物チャンバ３２２の周囲に配置され、微生物試料の温度を制御し得る。
【００６８】
実施形態において、試料保持器および濾過ユニットを含む診断ユニットは、いずれの分析読取り器ユニットとも組み合わせて使用され得る。例えば、診断ユニットは、抗微生物剤分析のための試料調製装置として調製され得、分析は、酵素アッセイまたは蛍光体アッセイ等の従来の方法によって実行される。
【００６９】
図４は、読取り器ユニット２０４を表示する。読取り器ユニットは、積み重ね可能インターフェース３２０を受けるためのカードコネクタスロット４０２を有する。内部は、様々な電子構成要素を含む。内部は、アナログからデジタル（Ａ／Ｄ）へのコンバータ４０４、デジタル信号プロセッサ４０６、ディスプレイプロセッサ４０８、およびメモリ構成要素４１０を含む。読取り器は、サンプリング期間およびサンプリングの持続期間を制御するための図には示されない、時計ユニットを有する。読取り器は、メモリ構成要素４１０へと収集されるデータが患者と関連付けられ得るように、４１２によって表される通信ポートを使用して入力を受信し得る。いくつかの実施形態において、入力機構は、読取り器装置に一体化され得る。これらの電子構成要素４０４〜４１０のうちのいくつかまたは全ては、１つの構成要素へと統合され得る。読取り器ユニットは、蓄電池等の電源４１４およびデータを別の計算装置に伝送するためのポート４１２を更に含み、データは、データベースとして格納され、または更に処理され得る。ポート４１２を介する伝送は、計算装置へのワイヤを介して直接的に行われ得、データベースとして格納され、または更に処理され得る。あるいは、ポート４１２を介する伝送は、無線ネットワーク、移動通信体ネットワーク、またはＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂを介して無線で行われ、更に処理し、データベース内に格納し、ユーザに提示されるためのアプリケーションに到達し得る。実施形態において、診断装置によって取得されたデータは、保護されたｅメールまたはＳＭＳとして、医師または看護師等、少なくとも１人のユーザに伝送され得る。他の実施形態において、診断ユニットから取得されたデータは、健康管理設備、疾病管理センター、または保険会社等の他のユーザまたはデータベースに伝送され得る。
【００７０】
ポート４１２は、メモリ構成要素４１０内に格納されるために患者と直接的に関連付けられた入力を受信してもよく、入力は、データを患者に関連付けるために使用される。
【００７１】
読取り器ユニットはディスプレイを更に含み、ディスプレイは、どのウェルが抗微生物剤による攻撃または抑制と関連付けられたシグネチャを有するかを表示する、ウェルインジケータフィールド４１６となり得る。更に、ディスプレイは、陽性または陰性の細菌同一性と関連付けられ得る。ウェルインジケータフィールドは、第１の積み重ね可能なユニットへのラベルとして適用されることを想定されたテンプレートと相関され得る。インジケータフィールドは、ライトであってもよいが、他の実施形態が想到されている。
【００７２】
読取り器ユニットは、測定された計数を表示する計数出力部４１８を更に含み得る。計数は、図またはメータライトとして表示され得、計数が高くなればなる程に、例えば、より多くのバーを示す。更に、自己試験診断が適切に機能し、更に蓄電池が活性であることを示すディスプレイがある。区域４１８に格納されるオン／オフボタンもある。
【００７３】
生物学的試料を診断ユニット２０２の試料保持器３０２へと挿入すると、ユニットは、カード読取り器スロット４０２へと挿入される。実施形態において、読取り器ユニットは、診断ユニット２０２によって液体の流れを制御するマイクロポンプシステムで更に装備され得る。他の実施形態において、読取り器ユニットは、一方向弁３１４を制御し、診断ユニット２０２によって液体の流れを導く。なお他の実施形態において、読取り器ユニットは、マイクロポンプおよび一方向弁３１４に対する個々の制御の補助で、診断装置によって液体の流れを制御する。いくつかの実施形態において、カードスロット４０２は、２０４および２０２の並んだ配列を容易にするように位置し得る。いくつかの実施形態において、２０２および２０４は、１つのユニットに一体化され、試料種に応じて小型化され得る。
【００７４】
微生物試料をチャンバ３２２内で得るために生物学的試料を前処理するとき、微生物試料は、いくつかのウェル３１８に分配されるが、一方で少なくとも１つのウェルは、対照として機能し、被検体溶液形式の区画３１２のみを格納する。この時点で、診断装置は、本明細書に記載されるサンプリング方法に従ってデータをサンプリングする。
【００７５】
計数が判定される実施形態において、読取り器ユニットは、コンダクタンス、抵抗、電圧、アンペア数、キャパシタンス、インピーダンス、インダクタンス、またはそれらのいずれかの組み合わせ等の電気的特性をサンプリングし、デジタルシグネチャを生成する。
【００７６】
微生物試料中の微生物の同一性が判定される実施形態において、診断ユニットのウェル３１８は、バクテリオファージ、ミコウイルス、ヴィロファージ、または線虫ファージ（ｎｅｍａｔｏｐｈａｇｅ）を含有する。これらのファージは、それぞれ、細菌、真菌、ウイルス、または線虫の攻撃に特定化する。ファージは、生物学的試料が診断ユニットに適用される前に、ウェルに存在する。
【００７７】
実施形態において、細菌試料を受けるそれぞれのウェルは、異なるバクテリオファージを含有する。バクテリオファージは、適切な結合部位を有する細菌のみを攻撃する。したがって、バクテリオファージは、特定の細菌に対して選択され得、したがって、その細菌のみを攻撃するであろう。一度バクテリオファージが細菌を攻撃すると、サンプリングにおける信号が観察され得る。ゆえに、１つまたは複数のバクテリオファージの細菌試料へのバクテリオファージ攻撃を測定することによって、試料中に存在する細菌種のパーセンテージに関する最終的データおよびそのような細菌の同一性を取得し得る。
【００７８】
いくつかの実施形態は、他種のファージを使用して、他種の微生物を特定するかもしれない。例えば、微生物が真菌であるとき、微生物を特定するために、ミコウイルスが使用され得る。他の実施形態において、ウイルスまたは線虫を特定するために、ヴィロファージまたは線虫ファージが使用され得る。
【００７９】
実施形態において、細菌特定の特徴は、１つのウェルのみで実装され得るが、確度を上げるためにより多くのウェルからなってもよい。少なくとも１つのウェルは、特定される細菌に特異的なバクテリオファージを伴う試料を含む。バクテリオファージは、たった１つの細菌を攻撃するように選択することができる。なお他の実施形態において、バクテリオファージは、細菌群を特定するために使用され得るファージカクテルを生成するように組み合わされてもよい。
【００８０】
抗生物質の耐性または微生物試料の抗微生物耐性が判定される実施形態において、診断ユニットのウェル３１８は、抗生物質または抗微生物剤を含み、少なくとも１つのウェルは、対照ウェルとしての微生物試料を含有する。これらの抗生物質または抗微生物剤は、生物学的試料が診断ユニットに適用される前に、ウェルに存在する。実施形態において、微生物試料を受けるそれぞれのウェルは、異なる抗生物質または抗微生物剤を含有する。抗生物質または抗微生物剤は、微生物の異なる株または種に対して異なるように機能する。一度微生物コロニーがウェルに存在する抗生物質または抗微生物剤で停滞または死滅すると、サンプリングにおけるこの特定のウェルの信号が観察され得る。ゆえに、１つまたは複数の抗生物質または抗微生物剤の微生物試料への抗生物質または抗微生物活性を測定することによって、試料に存在する微生物種の抗生物質または抗微生物剤の感受率に関する最終データを取得し得る。他方、ウェルに対して、抗生物質または抗微生物活性がなく、対照ウェルが微生物生存性を示す場合、微生物試料の抗生物質耐性または抗微生物耐性を観察する。
【００８１】
実施形態において、抗微生物剤感度試験は、少なくとも２つのセンサウェルを必要とする。少なくとも１つのセンサウェルは、微生物試料、すなわち、被検体溶液中に浸漬された微生物からなる対照試料を含有する。他のセンサは、有効性について試験される抗生物質または抗微生物剤を伴う試料を含む。サンプリングの持続期間の終わりに、対照試料のコロニー計数は、始めのコロニー計数に対して比較され、微生物があれば、計数はサンプリングの持続期間の終わりまでに増加しているであろう。対照試料中の微生物の成長がないとき、抗生物質または抗微生物剤を伴う試料からの結果は、抑制され、微生物が活性でなく、ゆえに抗生物質または抗微生物剤処理を必要としないという観察を支持するであろう。そうでなければ、サンプリングの持続期間中に生成された抗微生物剤試料のデジタルシグネチャを比較することからの結果は、分析され、報告されるであろう。デジタルシグネチャは、本明細書に更に記載される。
【００８２】
抗微生物剤を１つの電解槽内に試料と共に配置し、そして、ある時間周期後にバクテリオファージもその電解槽（電解槽ＡＰ）へと解放し、サンプリングにおける信号を測定し、バクテリオファージのみが解放された別の電解槽内でのサンプリング信号に対して比較することによって、抗微生物剤の有効性を定量化するために比較され得る。（電解槽Ｐ）。第２の電解槽の試料信号の信号で割った電解槽の信号における差は、抗微生物剤によって殺菌された細菌のパーセンテージを示すであろう。（電解槽Ｐ−電解槽ＡＰ）／電解槽Ｐであり、式中、電解槽Ｐは、バクテリオファージを試料に添加した後の電解槽の信号強度であり、電解槽ＡＰは、バクテリオファージが、抗生物質が付加された後の時間周期を待った後に添加されるときに判定された、信号強度である。
【００８３】
なお他の実施形態において、診断システムは、細菌同一性、微生物コロニー計数、または抗微生物剤感度試験の特徴の１つまたはいずれかの組み合わせからなってもよい。例えば、いくつかのウェルは、ファージまたは抗微生物剤等の添加剤を含まなくてもよく、いくつかのウェルは、ファージを含有してもよく、いくつかのウェルは、抗微生物剤または抗生物質を含有してもよい。そのような集合は、微生物試料の抗生物質または抗微生物剤での計数、同一性、および処理に対する分析を容易にする。
【００８４】
［デジタルシグネチャ］
デジタルシグネチャは、サンプリングの持続期間中に捕捉されたデータからなり、特徴的な曲線である。デジタル信号処理パターンは、パターン一致に至る特徴的なデジタルシグネチャと一致する。特徴的なデジタルシグネチャは、以前の特性評価に基づくデータベース内に記録される。実施形態において、デジタルシグネチャは、時間の関数としての試験試料の平均的抵抗等の電気的特性における変化を捕捉することに基づく。いくつかの実施形態において、デジタルシグネチャは、パターン一致せずに、しかし、他の機能的分析を使用して、判定され得る。
【００８５】
概ね、読取り器ユニットは、微生物試料の抵抗における変化に基づく生微生物、すなわち、被検体溶液中に浸漬された微生物の濃度における変化を検知し得る。実施形態において、他の特徴的なデジタルシグネチャがある。例えば、バクテリオファージが細菌を攻撃すると、１０８までのカリウムイオンが、細菌によるイオンの再吸収に続いて、細菌から解放され得、経時的に測定された抵抗における特徴的な変化を生成する。
【００８６】
微生物のそれぞれの生命事象は、特徴的なパターンを有する。例えば、成長する微生物は、増殖し、自然の呼吸作用および代謝過程の一部としてのカリウム、カルシウム、およびナトリウムの陽子およびイオンを放出するため、より少ない抵抗を生成する。例えば、細菌は、２０分毎に増殖し、この生命事象は、抵抗測定値を絶えず低下させることによって、検知され得る。
【００８７】
［微生物計数］
図５ａは、ＬＢブイヨン中で懸濁された、様々な濃度のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌を含む試料について測定された抵抗を図示する。図５ｂは、人工尿中で懸濁された、様々な濃度のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌を含む試料について測定された抵抗を図示する。試料は、１０２ＣＦＵ／ｍＬ、１０４ＣＦＵ／ｍＬ、１０５ＣＦＵ／ｍＬ、１０６ＣＦＵ／ｍＬ、１０７ＣＦＵ／ｍＬ、および１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度を有する。図５は、試料が、時を経て、総インピーダンスの特徴的な抵抗構成要素を有することを明らかに示す。試料は、平均的抵抗値によって区別され得る。実施形態において、この特徴は、微生物試料の濃度を判定し、試料保持器内に配置された生物学的試料の体積の考慮の下に、そのような濃度を生物学的試料中に存在する計数または濃度に相関させるために、利用される。この特徴は、微生物の生存性を判定するためにも利用される。
【００８８】
［５．細菌の同一性］
図６は、０．１ｍＬの濃度１．６２×１０１１Ｔ４のファージによって攻撃された最終体積０．９ｍＬ当たりのＬＢブイヨンの被検体中の試料である１０８ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌のシグネチャおよびファージの存在下の対照試料を図示する。シグネチャ６０２は、ファージを含まない対照試料の推移を表示する。初期には、試料は、いくらかのブイヨンを含有する試料中での速いコロニー成長のために、抵抗において急速に低下する。信号は、細菌が成長をまさに緩慢にするとき、捕捉される。総インピーダンス値の抵抗構成要素は、細菌成長が試料中の栄養素の限定された供給源のために減速し始めると、水平になって線形の推移になる。対照試料は、少なくとも２０分（または１２００秒）超の間、線形の傾斜を維持する。シグネチャの最後の区分は、約１４０１秒で始まり、抵抗におけるわずかな増加を示し、細菌の個体群が数において減少することを示す。
【００８９】
他方、図６のシグネチャ６０４は、ファージ攻撃下での大腸菌の微生物コロニーのシグネチャを示す。ファージ攻撃は、データが収集され、その時点でグラフ上に示される前に、ファージを添加することによって開始される。ファージ攻撃は、即時であり、サンプリングの持続期間が開始され、細菌が、それぞれ、１０８までのカリウムイオンを解放し、被検体の抵抗における急速な低下を引き起こす前に、すでに進行中である。次の２００秒以内に、ファージ攻撃に続いて、総インピーダンスの抵抗構成要素における増加があり、コロニーが、ファージ攻撃が細菌に解放させたカリウムイオンを再吸収することによって、攻撃から回復することを試みていることを示す。約２００秒後、ファージ攻撃は、終了し、シグネチャは水平になる。次の２０〜２５分の推移中、シグネチャの正の傾斜が観察され得、細菌コロニーが成長において阻害されていることを示す。更に、シグネチャの傾斜における増加は、約１４００秒で観察され得る。これは、およそ、ファージが自己複製し、細菌コロニーを溶菌し始める時間である。
【００９０】
図６のシグネチャ６０２および６０４を比較すると、細菌の特定の株または種に特異的な既知のファージを含む試料は、試料がこの特異的な細菌コロニーを含むかを特定するために使用され得る。同様に、試料が株または種において特徴的な２つの種の細菌を含むとき、異なるファージに対してこれらの細菌をサンプリングするアッセイは、それぞれの株または種の存在を独立して特定し得る。
【００９１】
［６．抗微生物耐性］
図７ａ〜７ｄは、０．１ｍＬの抗生物質または抗微生物剤で処理された、濃度１０３ＣＦＵ／ｍＬの２時間大腸菌０．９ｍＬの微生物試料のシグネチャおよびその不存在下での対照試料を図示する。全ての図７に共通することは、抗生物質または抗微生物剤におけるシグネチャに対する傾斜は、抗生物質または抗微生物剤を添加すると、正になる、すなわち、微生物試料の総インピーダンスの抵抗構成要素が増大することである。対照試料の傾斜は負のままである。
更に詳細には、シグネチャに対する傾斜変化の程度における差が観察される。そのような差は、抗生物質または抗微生物剤の種類、ならびに作用のメカニズムによる。例えば、図７ｃのスルファメトキサゾールは、細胞内でＤＮＡ合成の阻害を引き起こし、それによって、不可欠の細胞機能を狙っている。対照的に、図７ｂのアジスロマイシンは、細菌中のタンパク質阻害を阻害し、それによって、潜在的細胞機能に作用する。結果として、スルファメトキサゾールに対するシグネチャの傾斜は、前者で処理された微生物コロニーが速く死滅することが予期されるため、アジスロマイシンに対するより急である。
【００９２】
［７．読取り器ユニットの技術的調製］
図８は、２つのリード線を有する読取り器ユニットの実装形態を表示する。リード線は、試料ウェルの電極に接続される。図８ａおよび８ｂに示される読取り器ユニットは、データのサンプリングおよび記録を制御する。実施形態において、例えば、図８ｃに図示される試料ウェルまたは試料管は、電極（図８ｃで可視でない）および読取り器ユニットが接続され得る管の外側の接点で装備された容器を含む。一実施形態において、電極は、２重量％のグラフェン溶液製のグラフェンでコーティングされた銅ワイヤであり、銅ワイヤに非腐食性であるが、導電性の表面を形成し得る。対照ウェルは、微生物を例外とするが、試料ウェルと同じ成分を含有し、両方のウェルは、センサ＃１および＃２として図８ａに図示されたリード線にそれぞれ接続される。データは、本明細書に記載されるサンプリング法によって収集される。読取り器ユニットは、フィードバック抵抗器および低ノイズ増幅器、ディスプレイ制御器付ディスプレイ及びアナログからデジタル（Ａ／Ｄ）へのコンバータを収容した中央処理装置（ＣＰＵ）を含む。通信ポートは、分析のために、別のコンピュータにデータを伝送し得る。
【００９３】
実施形態において、通信ポートは、ＰＯＴＳ電話接続である。実装された別の実施形態は、ＵＳＢ接続であった。別の実施形態は、他の計算装置によって使用される、他の直接配線されたポートへの接続として想定され、他の計算装置は、ラップトップ、デスクトップ、ノートブック、タブレット、ミニＰＣ、ミニタブレット、ならびに携帯電話または他のそのような装置であってもよい。
【００９４】
別の実施形態は、無線接続であってもよい。なお別の実施形態は、移動体接続であることを想定される。両方の実施形態は、他の計算装置によって使用される、他の無線ポートへの接続として想定され、他の計算装置は、ラップトップ、デスクトップ、ノートブック、タブレット、ミニＰＣ、ミニタブレット、ならびに携帯電話または他のそのような装置であってもよい。
【００９５】
他の実施形態は、最終結果を提供するスマートフォンと通信してもよい。なお他の実施形態は、スマートフォンがデータを分析し、保護されたｅメールまたはＳＭＳメッセージによってユーザに結果データを送り得るように、スマートフォンにデータをストリームしてもよいであろう。
【００９６】
他の実施形態は、診断装置にパラメータ入力を提供するスマートフォンと通信してもよい。加えて、他の実施形態は、診断読取り器ユニットからのデータまたは結果と共に、診断装置によって後の伝送のために結果と共に格納されるべき患者情報をダウンロードしてもよいであろう。
【００９７】
別の実施形態は、サーバ上でのアプリケーションを伴うＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂに接続し、データを分析し、データベース内に格納することを想定される。アプリケーションがサービスアプリケーションとしてのソフトウェアとして、他のアプリケーションに更にインターフェース接続し得ることが想定される。本実施形態において、出来高払い制は、医療従事者および抗生物質製造者に蓄積された診断結果の非人格化された結果を使用して、統計から収集された抗生物質耐性微生物および抗生物質の使用の地域の人口統計を提供し得る。別の実施形態は、診断キットのラベルに抗生物質の広告を配置してもよい。
【００９８】
他の実施形態は、通信ポートを介して計算装置から入力コマンドを受信してもよいであろう。加えて、他の実施形態は、診断読取り器ユニットからのデータまたは結果と共に、診断装置によって後の伝送のために結果と共に格納されるべき患者情報をダウンロードしてもよい。
【００９９】
異なる多くの態様および実施形態が可能である。いくつかの態様および実施形態は、以下に記載される。本明細書の読後、当業者は、それらの態様および実施形態が例示的のみであって、本発明の範囲を限定しないことを理解するであろう。
【０１００】
一態様において、薬剤の抗微生物活性を判定するための方法は、ウェルを提供することを含み、該ウェルは、１つまたは複数の抗微生物剤を含有する。該ウェルは、少なくとも２つの電極を更に含む。本方法は、少なくとも１つの微生物の試料をウェルに添加することと、電極の間で電圧をパルス変調することと、パルス変調中に電気的特性をサンプリングすることと、電気的特性を記録することとを更に含む。
【０１０１】
実施形態において、本方法は、パルス変調を反復することと、サンプリングおよび記録することと、シグネチャを形成するように、時間に対して記録をプロットすることとを更に含む。他の実施形態において、本方法は、微生物が細菌、真菌、ウイルス、または線虫から選択されることを更に含む。他の実施形態において、本方法は、バクテリオファージ、ミコウイルス、ヴィロファージ、線虫ファージ、抗生物質、抗微生物剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または寄生虫駆除剤から選択される、１つまたは複数の抗微生物剤を含んでもよい。バクテリオファージ、ミコウイルス、ヴィロファージ、線虫ファージは、細菌、真菌、ウイルス、および線虫をそれぞれ攻撃するウイルスである。なお他の実施形態において、本方法は、ウェル内の温度を測定することを更に含む。温度は、サーミスタで測定することができる。
【０１０２】
本方法のパルス変調は、オン期間およびオフ期間を含み、オン期間およびオフ期間の合計は、サンプリング期間を構成する。実施形態において、オン期間は、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約２ミリ秒、少なくとも約３ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、または少なくとも約５００ミリ秒である。他の実施形態において、オフ期間は、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、少なくとも約２秒、少なくとも約３秒、少なくとも約５秒、少なくとも約１０秒、少なくとも約２０秒、少なくとも約４０秒、少なくとも約５０秒、または少なくとも約６０秒である。他の実施形態において、オン期間は、約５００ミリ秒以下、約２００ミリ秒以下、約１００ミリ秒以下、約５０ミリ秒以下、約２０ミリ秒以下、約１０ミリ秒以下、約５ミリ秒以下である。なお別の実施形態において、オフ期間は、約６０秒以下、約３０秒以下、約１０秒以下、約５秒以下、約２秒以下、約１秒以下、約５００ミリ秒以下、約２００ミリ秒以下、約１００ミリ秒以下、約５０ミリ秒以下である。なお他の実施形態において、サンプリング期間は、約１秒、約５秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約６０秒である。
【０１０３】
実施形態において、電圧は、少なくとも約０．０００５Ｖ、少なくとも約０．００１Ｖ、少なくとも約０．００２Ｖ、少なくとも約０．００５Ｖ、少なくとも約０．０１Ｖ、少なくとも約０．０２Ｖ、少なくとも約０．０５Ｖ、少なくとも約０．１Ｖ、少なくとも約０．２Ｖ、少なくとも約０．５Ｖ、少なくとも約１．０Ｖ、少なくとも約２．００Ｖ、少なくとも約５．０Ｖ、または少なくとも約１０．０Ｖである。他の実施形態において、電圧は、約２．０Ｖ以下、約１．０Ｖ以下、約０．５Ｖ以下、約０．２Ｖ以下、または約０．１Ｖ以下である。更なる実施形態において、電圧は、約０．０００５Ｖ〜約２．０Ｖ、約０．０００５Ｖ〜約１．０Ｖ、約０．００１Ｖ〜約１．０Ｖ、約０．０５Ｖ〜約１．０Ｖ、約０．０５Ｖ〜約０．５Ｖ、または約０．０５Ｖ〜約０．１Ｖの範囲である。
【０１０４】
実施形態において、電気的特性のサンプリングは、サンプリング期間中、行われる。なお、他の実施形態において、電気的特性のサンプリングは、少なくとも約０．５ミリ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約２ミリ秒、少なくとも約３ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、または少なくとも約５００ミリ秒である。更なる実施形態において、サンプリングは、約３６０分より長くなく、約１８０分より長くなく、約１２０分より長くなく、約９０分より長くなく、約６０分より長くなく、約４５分より長くなく、約３０分より長くなく、約２０分より長くなく、約１０分より長くなく、約５分より長くなく、約２分より長くない。なお他の実施形態において、サンプリングは、約１５秒〜約６０分、約１５秒〜約４５分、約１５秒〜約２０分、約１５秒〜約１０分、約１分〜約２０分、約２分〜約２０分、約５分〜約２０分、約５分〜約１０分、または約１０分〜約２０分である。
【０１０５】
別の態様において、少なくとも１つの微生物を特定するための方法は、少なくとも１つの微生物を含む試料を採取することと、少なくとも１つの微生物を試料から単離することと、少なくとも１つの微生物をいくつかのウェルへと分割することとを含み、それぞれのウェルは、少なくとも１つの抗微生物剤および少なくとも２つの電極を含む。本方法は、少なくとも２つの電極の間で電圧をパルス変調することと、パルス変調中、電気的特性をサンプリングすることと、サンプリングの持続期間中、電気的特性を記録することとを更に含む。
【０１０６】
実施形態において、本方法の単離は、試料を濾過し、少なくとも１つの微生物を試料から単離することと、少なくとも１つの微生物を被検体中に浸漬することとを更に含む。被検体は、水、緩衝液、生理食塩水、ブイヨン、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される。微生物は、細菌、真菌、ウイルス、または線虫から選択される。抗微生物剤は、バクテリオファージ、ミコウイルス、ヴィロファージ、線虫ファージ、抗生物質、抗微生物剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または寄生虫駆除剤から選択される。
【０１０７】
別の態様において、試料中の微生物の計数を判定するための方法は、試料を濾過し、少なくとも１つの微生物を試料から単離することと、少なくとも１つの微生物を被検体中に浸漬し、浸液を形成することと、浸液を特定の時間の間、インキュベートすることと、浸液をいくつかのウェルへと分割することと、サンプリングの持続期間中、ウェル内の電気的特性を測定することと、電気的特性を計数に相関させることとを含む。実施形態において、本方法は、電気的特性を測定する前に、少なくとも１つのバクテリオファージをウェルのうちの少なくとも１つに添加することを更に含む。
【０１０８】
実施形態において、サンプリングの持続期間は、約１秒、約５秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約６０秒である。他の実施形態において、インキュベートのための特定の時間は、少なくとも約０．５秒、少なくとも約１秒、少なくとも約３０秒、少なくとも約１分、または少なくとも約２分である。他の実施形態において、インキュベートのための特定の時間は、約１ミリ秒より長くなく、約１分より長くなく、約２分より長くなく、約５分より長くない。なお他の実施形態において、インキュベートのための特定の時間は、１ミリ秒〜５分、０．５秒〜２分、１秒〜１分である。
【０１０９】
別の実施形態において、本方法は、第１の微生物に対する第１の計数および第２の微生物に対する第２の計数を判定する。
【０１１０】
更なる一態様において、微生物の抗微生物耐性を判定するための方法は、少なくとも１つの微生物の試料を少なくとも１つの抗微生物剤を含むウェルに添加することと、サンプリングの持続期間中、ウェル内の電気的特性を測定することとを含む。サンプリングの持続期間は、少なくとも１時間であり、６時間以下である。
【０１１１】
実施形態において、微生物は、アエロバクター、バチルス、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア、クロモバクテリウム、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロバクター、エシェリキア、ヘモフィルス、クレブシエラ、リステリア、ミコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌、プロテウス、シュードモナス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ビブリオ、エルシニア、アシネトバクター、バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、アイケネラコローデンス、ガードネレラバギナリス、モビルンカス、プロテオバクテリア、デスルホバクテラーレス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、デスルホビブリオナーレス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ）、栄養共生バクテラーレス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、サーモデスルホバクテリア（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ニトロスピラ、グラム陽性ペプトコッカス、古微生物、アーケオグロブス、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される。
【０１１２】
他の実施形態において、抗微生物剤は、アクチノミセスファージ、バチルスファージΦ２９、バクテリオファージＭ１０２、バクテリオファージｅ１０、バクテリオファージｆ１、バクテリオファージλ、バクテリオファージＰＩ、球状ファージＰｈｉＸ１７４、球状ファージＧ４、球状ファージＳ１３、バクテリオファージＴ１、バクテリオファージＴ２、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＴ４、バクテリオファージＴ５、バクテリオファージＴ６、バクテリオファージＴ７、ｓｓＲＮＡバクテリオファージＭＳ２、ｓｓＲＮＡバクテリオファージＲ１７、ｓｓＲＮＡバクテリオファージｆ２、ｓｓＲＮＡバクテリオファージＱベータ、ミュータンスレンサ球菌ファージ、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される。
【０１１３】
他の実施形態において、ファージは、微生物学の分野の従事者に周知の方法を使用して、特定されるべき微生物のみを攻撃するように培養および単離される。そのようなファージは、ライブラリーで容易に入手可能である。
【０１１４】
実施形態において、電気的特性は、コンダクタンス、抵抗、電圧、アンペア数、キャパシタンス、インピーダンス、インダクタンス、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される。実施形態において、いずれの方法も、９０分未満、６０分未満、４５分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１８分未満、１５分未満、または１２分未満で実行される。
【０１１５】
実施形態において、試料は、尿、血液、汗、粘液、唾液、精液、膣分泌物、嘔吐物、涙、皮脂、胸膜液、腹腔液、胃液、耳垢、脳脊髄液、母乳、内リンパ、外リンパ、眼房水、硝子体液、バイオマス、およびそれらのいずれかの組み合わせから採取される。
【０１１６】
［８．積み重ね可能なユニットと試料調製の自動化］
なお別の態様において、少なくとも１つの微生物を検出するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、少なくとも１つのウェルであって、少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する少なくとも１つのウェルを備える、診断ユニットである。第２のユニットは、診断ユニットの電極のためのコネクタ部を備える、読取り器ユニットである。実施形態において、第１のユニットは、試料保持器およびフィルタユニットを更に備え、試料保持器およびフィルタユニットは、流体連通する。
【０１１７】
別の態様において、試料中の少なくとも１つの細菌を特定するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、少なくとも１つのウェルであって、少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する、少なくとも１つのウェルと、流体システムであって、一方向弁および流体システムを加圧するためのポートからなる流体システムとを備える、診断ユニットである。第２のユニットは、診断ユニットの電極のためのコネクタ部および少なくとも１つのマイクロポンプの接続を備える、計算読取り器ユニットである。
【０１１８】
別の態様において、試料中の少なくとも１つの細菌を特定するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、少なくとも１つのウェルであって、少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する少なくとも１つのウェルを備える、診断ユニットである。診断ユニットは、少なくとも１つのバクテリオファージを更に含み得る。第２のユニットは、診断ユニットの電極のためのコネクタ部を備える、計算読取り器ユニットである。
【０１１９】
更なる一態様において、試料中の少なくとも１つの微生物の計数を判定するための診断装置は、少なくとも１つのウェルを含む診断ユニットを備える。少なくとも１つのウェルは、少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する。診断装置は、読取り器ユニットを更に含む。診断ユニットおよび読取り器ユニットは、積み重ね可能な一体化システムを形成する。読取り器ユニットは、相関データを格納するメモリチップを含む。相関データは、読取り器ユニットによってサンプリングされたデータから採取された、微生物に対する計数を提供する。
【０１２０】
なお更なる一態様において、試料中の少なくとも１つの微生物の抗微生物耐性を判定するための診断装置は、第１のユニットおよび第２のユニットを含み、第１のユニットは、第２のユニットの中に積み重ね可能である。第１のユニットは、１つまたは複数のウェルを備える、診断ユニットである。ウェルは、少なくとも１つのウェルの内側および外側に接触する電極を有する。診断ユニットは、少なくとも１つの抗微生物剤も含む。第２のユニットは、診断ユニットの電極のためのコネクタ部を備える、読取り器ユニットである。
【０１２１】
実施形態において、診断装置は、非酸化材料を含む電極を有する。非酸化材料は、金属、非金属、ポリマー、複合体、レジスト、樹脂、カーボンナノチューブ、プラスチック、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され得る。特定の実施形態において、診断装置は、グラフェンで覆われた銅を含む電極を有する。
【０１２２】
［９．自動化された試料調製］
他の実施形態において、診断装置は、試料注入口と、試料レセプタクルと、試料レセプタクルに接続された第１の区画であって、第１の液体を格納する第１の区画とを更に含む。診断装置は、廃棄物区画およびファージ区画を格納する濾過チャンバと、濾過チャンバに接続された第２の区画であって、第２の液体を格納する第２の区画と、マニホルドウェルユニットとを更に含む。第１または第２の液体は、リン酸塩緩衝液、炭酸水素ナトリウム、ジメチルスルホキシド、ＮａＯＨ、メタノール、または氷酢酸、ＨＣＬ、乳酸、もしくは塩酸、水性緩衝液、生理食塩水、脱イオン水、ブイヨン、またはＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  “Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ；Ｔｗｅｎｔｙ−Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ”，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１１，Ｖｏｌ３１  Ｎｏ１に基づく被検体から選択され得る。実施形態において、第１または第２の液体は、薬剤を微生物と混合するために、バクテリオファージまたは抗微生物性配合物、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または寄生虫駆除剤等の薬剤を再構成、溶解、または調製するために使用し得る。
【０１２３】
濾過チャンバは、フッ化ポリマーを含む、少なくとも１つのフィルタを含む。例えば、フッ化ポリマーは、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）である。他の実施形態において、フィルタは、セルロース材料であり得る、プレフィルタ層を含む。例えば、セルロース材料は、セルロースエステルであり得る。第２および第３の液体は、脱イオン水、緩衝液、生理食塩水、ブイヨン、被検体、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され得る。別の実施形態は、乾燥形式からの再構成のために、組み合わされた抗微生物剤の異なる必要性に適合するための付加的液体チャンバを含んでもよいであろう。別の実施形態は、抗微生物剤が再構成されるチャンバと、電極を格納する、チャンバの間に付加的フィルタおよび一方向弁を含んでもよいであろう。
【０１２４】
他の実施形態において、診断装置は、試料注入口と、試料レセプタクルと、試料レセプタクルに接続された第１の区画であって、第１の液体を含む第１の区画とを更に含む。診断装置は、廃棄物区画およびファージ区画を格納する濾過チャンバと、濾過チャンバに接続された第２の区画であって、第２の液体を格納する第２の区画と、マニホルドウェルユニットとを更に含む。第１もしくは第２または第３の液体は、リン酸塩緩衝液、炭酸水素ナトリウム、ジメチルスルホキシド、ＮａＯＨ、ＨＣＬ、乳酸、塩酸、水性緩衝液、生理食塩水、脱イオン水、ブイヨン、もしくは被検体、または他の液体から選択され、バクテリオファージの乾燥形式を再構成し得る。濾過チャンバは、フッ化ポリマーからなる少なくとも１つのフィルタを含む。例えば、フッ化ポリマーは、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）である。他の実施形態において、フィルタは、セルロース材料であるプレフィルタ層を含む。例えば、セルロース材料は、セルロースエステルであり得る。第２または第３の液体は、脱イオン水、緩衝液、生理食塩水、ブイヨン、被検体、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され得る。別の実施形態は、乾燥形式からの再構成のために、組み合わされたバクテリオファージの異なる必要性に適合するための付加的液体チャンバを含んでもよいであろう。別の実施形態は、バクテリオファージが再構成されるチャンバと、電極を格納するチャンバの間に付加的フィルタおよび一方向弁を含んでもよいであろう。
【０１２５】
実施形態において、診断装置は、１つまたは複数のアナログからデジタルへのコンバータと、１つまたは複数のメモリチップと、計算ユニットを伴う１つまたは複数のマイクロプロセッサと、システム時計と、ディスプレイプロセッサと、ディスプレイとを更に含む、読取り器ユニットを有する。読取り器ユニットは、診断装置を加圧し、流体システムを起動するための１つまたは複数のマイクロポンプを更に含み得る。
【０１２６】
なおいくつかの実施形態において、診断装置は、通信装置および関連付けられたポートを含む、読取り器ユニットを有する。他の実施形態において、読取り器ユニットは、データを提出するためのポートを含む。他の実施形態において、読取り器ユニットは、データを受信するためのポートを含む。ポートは、無線送信機または配線された通信装置であり得る。
【０１２７】
実施形態において、診断装置は、アミノグリコシド、アンフェニコール、アンサマイシン、ベータ―ラクタム、リンコサミド、マクロライド、ポリペプチド抗生物質、テトラサイクリン、サイクロセリン、ムピロシン、ツベリン、２，４―ジアミノピリミジン、ニトロフラン、キノロン、スルホンアミド、スルホン、クロホクトール、ヘキセジン、メテナミン、ニトロキソリン、タウロリジン、およびキシボルノールから選択される、少なくとも１つの抗微生物剤を含む。
【０１２８】
更なる実施形態において、少なくとも１つの抗微生物剤は、アミカシン、アズロシリン、カルベニシリン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォタキシム、セフォペラゾン、セホキシチン、セフチゾキシム、セフトリアクソン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネゾリド、メシリナム、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、ネチルマイシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、キヌプリスチン―ダルホプリスチン合剤、スパルフロキサシン、スルバクタム、タゾバクタム、テイコプラニン、テトラサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、およびバンコマイシンから選択される。
【０１２９】
実施形態において、診断ユニットは、少なくとも約１μＬ、少なくとも約１０μＬ、少なくとも約２０μＬ、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約２００μＬ、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約１ｍＬ、または少なくとも約１．５ｍＬ、もしくは少なくとも約２ｍＬの保持容量を伴う１つまたは複数のウェルを有する。
【０１３０】
他の実施形態において、診断ユニットは、約２ｍＬ以下、約１．５ｍＬ以下、約１ｍＬ以下、約５００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、または約２０μＬ以下の保持容量を伴う１つまたは複数のウェルを有する。
【０１３１】
なお他の実施形態において、診断ユニットは、約１μＬ〜約２ｍＬ、約１０μＬ〜約２ｍＬ、約１００μＬ〜約２ｍＬ、約１００μＬ〜約１．５ｍＬ、約１００μＬ〜約１ｍＬ、約５００μＬ〜約２ｍＬ、約５００μＬ〜約１．５ｍＬ、または約５００μＬ〜約１ｍＬの保持容量を伴う１つまたは複数のウェルを有する。
【０１３２】
本明細書に記載される実施形態の仕様および例示は、様々な実施形態の構造の一般的な理解を提供することが意図される。仕様および例示は、本明細書に記載される構造及び方法を使用する装置およびシステムの要素および特徴の全ての網羅的および包括的説明として機能することは意図されない。別個の実施形態は、また、単一の実施形態で組み合わされて提供されてもよく、反対に、簡潔には、単一の実施形態の文脈で記載される様々な特徴が、別個に、またはいずれかの部分的組み合わせで提供されてもよい。更に、範囲で記載された値への参照は、その範囲内の全ての値を含む。他の多くの実施形態が、本明細書の読後にのみ、当業者に明らかになり得る。他の実施形態が、本開示から使用され、または導かれることが可能であり、構造的代用、論理的代用、または別の変更が本開示の範囲を逸脱せずに行われ得る。したがって、本開示は、限定的というよりはむしろ例示的なものとして見做されるものである。
【実施例】
【０１３３】
［実施例］
［実施例１］
［グラフェンでの銅ワイヤのコーティング］
図８ｃの単一の電解槽センサの実施形態において、グラフェンの水性散布は、フミン酸の接触水素化によって調製された。フミン酸は、レオナルダイト（Ａｇｒｏ−Ｌｉｇ）から抽出され、次いで、１５０℃でＰａｒｒリアクタ内において様々な触媒を使用して、触媒的に水素化された。次いで、溶液は、過剰な陽イオンを除去するために強酸イオン交換カラムを通過させられる。グラフェンの水性散布は、点滴器でセンサ内の銅ワイヤ接点に適用され、乾燥することを可能にした。一実施形態において、グラフェン含有量は、水性散布の０．５重量％であってもよいであろう。別の実施形態において、グラフェンは、１重量％であってもよいであろう。そして、なお別の実施形態において、グラフェンは、２重量％であってもよいであろう。
【０１３４】
更なる実施形態において、グラフェンを銅または電極を構成する他の材料に適用する代替の技術が考えられる。
【０１３５】
［実施例２］
［細菌同一性の判定の実施形態］
試験が実施され、室温での実験が、経時的に、実験が摂氏３７度の水槽で行われた場合と同様の機能を生成したことを示し、このデータは示されない。
【０１３６】
例示的な実施形態において、１つのセンサウェルは、室温の試料を含有し、他のセンサウェルは、大腸菌に特異的で、やはり室温のＴ４バクテリオファージを含有した。例示的な実装形態の場合において、使用された細菌は大腸菌であり、使用されたファージはＴ４種であり、被検体はＬＢブイヨンの補助培養物であったが、被検体がＬＢブイヨンに限定される必要はなく、標的とされる細菌種に依存するであろう。ＬＢブイヨンは、Ｍｉｌｌｅｒによって製造され、部品番号はＢＬ７２９Ａである。それは、カゼイン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの酵素消化からなり、ＰＨは、２５℃で７．３＋／−０．２に調節される。被検体の抵抗は、まず、第１部のファージ攻撃中に低下し、次いで、細菌がカリウムイオンを再吸収した約２０１秒で出発点に戻ったことが見られ得た。
【０１３７】
［実施例３］
［抗微生物性判定の実施形態］
室温に達した、およそ１０９の細胞濃度での大腸菌の一晩の細菌培養物は、やはり室温に達したＬＢブイヨンを使用して、１０３の最終細胞濃度に希釈された。次いで、この溶液のうちの０．９ｍｌは、読取り器ユニットのリード線＃１に接続された１つのセンサウェルに配置された。追加の０．９ｍｌの細菌が、読取り器ユニットのリード線＃２に接続された第２のセンサウェルに配置された。抗生物質またはｄｉＨ２Ｏの添加前に、およそ４分間、これらの溶液についてデータが収集された。２６３秒で、室温に達したスルファメトキサゾールの保存溶液０．１ｍＬが第１のセンサウェルに添加され、２８３秒で、室温のｄｉＨ２Ｏが第２のセンサウェルに添加され、データ収集は、継続された。全てのセンサウェルは、以下の試験前に、７０％のエタノールで洗浄され、ｄｉＨ２Ｏで１０回洗浄された。
【０１３８】
室温に達した、およそ１０９の細胞濃度での大腸菌の一晩の細菌培養物は、１０３の最終細胞濃度まで希釈された。次いで、この溶液の０．９ｍｌは、読取り器ユニットのリード線＃１に接続された第１のセンサウェルに配置された。追加の０．９ｍｌの細菌が、読取り器ユニットのリード線＃２に接続された第２のセンサウェルに配置された。抗生物質またはｄｉＨ２Ｏの添加前に、およそ１分間、これらの溶液についてデータが収集された。６３秒で、室温に達した０．１ｍｌのトリメトプリム保存溶液が、第１のセンサウェルに添加され、２７８秒で、室温のｄｉＨ２Ｏが、第２のセンサウェルに添加され、データ収集が暫時、継続された。全てのセンサは、以下の試験前に、７０％のエタノールで洗浄され、ｄｉＨ２Ｏで１０回洗浄された。
【０１３９】
室温に達した、およそ１０７の細胞濃度での２時間の大腸菌の細菌培養物は、ＬＢブイヨンで１０３の最終細胞濃度に希釈された。次いで、この溶液０．９ｍＬは、読取り器ユニットのリード線＃１に接続されたセンサウェルに配置された。追加の０．９ｍＬの細菌が、読取り器ユニットのリード線＃２に接続された第２のセンサウェルに配置された。抗微生物またはｄｉＨ２Ｏの添加前に、およそ１０分間、室温で放置されたこれらの溶液についてデータが収集された。６７９秒で、室温に達した０．１ｍＬのポリミキシン保存溶液が、センサウェルに添加され、７０２秒で、ｄｉＨ２Ｏが別のセンサウェルに添加され、データが暫時、収集された。全てのセンサは、以下の試験前に、７０％のエタノールで洗浄され、ｄｉＨ２Ｏで１０回洗浄された。
【０１４０】
大腸菌の細菌培養物は、およそ２時間３０分の間、室温に達した、およそ１０７の細胞濃度で成長させられ、室温に達した、ＬＢブイヨンで１０３の最終細胞濃度に更に希釈された。次いで、０．９ｍＬのこの溶液が、読取り器ユニットのリード線＃１に接続されたセンサウェルに配置された。追加の０．９ｍｌの細菌が、読取り器ユニットのリード線＃２に接続された別のセンサウェルに配置された。抗生物質またはｄｉＨ２Ｏ添加前に、１０分間、これらの溶液についてデータが収集され、室温で成長するように放置された。６６５秒で、室温で放置された、０．１ｍＬのアジスロマイシンがセンサウェルに添加され、６７６秒で、０．１ｍＬのｄｉＨ２Ｏが他のセンサウェルに添加された。全てのセンサは、以下の試験前に、７０％のエタノールで洗浄され、ｄｉＨ２Ｏで１０回洗浄された。
【０１４１】
［実施例４］
［細菌の生存性判定］
細菌の生存性試験は、室温に達した、様々な濃度のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌を含む試料の抵抗を測定することによって実施され、上記試料は、やはり室温に達した、ＬＢブイヨン中で懸濁された。試料は、１０２ＣＦＵ／ｍＬ、１０４ＣＦＵ／ｍＬ、１０５ＣＦＵ／ｍＬ、１０６ＣＦＵ／ｍＬ、１０７ＣＦＵ／ｍＬ、および１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度を有する。細菌は、１１１秒間、室温で成長するように放置され、抵抗は、時間の関数として低下した。試験は、ＬＢブイヨンおよび細菌も室温に達した後に、室温で実行された。
【０１４２】
細菌の生存性試験は、様々な濃度のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌を含む試料の抵抗を測定することによって、人工尿中でも実施された。試料は、１０２ＣＦＵ／ｍＬ、１０４ＣＦＵ／ｍＬ、１０５ＣＦＵ／ｍＬ、１０６ＣＦＵ／ｍＬ、１０７ＣＦＵ／ｍＬ、および１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度を有する。細菌は、１１１秒間、室温で成長するように放置され、抵抗は、時間の関数として低下した。センサは、被検体の抵抗における低下によって示される細菌の成長を検知する。試験は、人工尿および細菌も室温に達した後に、室温で実行された。人工尿は、表１に開示される成分で調製された。Ａ部およびＢ部は、別個に調製され、成分は、表１の量に応じて各部から組み合わされた。ｐＨは、５．８に調整された。溶液は、濾過によって滅菌された。Ｂ部は、Ａ部に無菌で添加され、２Ｌの人工尿を付与した。人工尿は、摂氏４度で保管され、１〜１．５週間の間、持続し得た。
【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
［実施例５］
［読取り器の実施形態］
図８は、読取り器ユニットシステムの実施形態を開示する。電極を有する試料ウェルは、センサに接続されているリード線に取り付けられる。読取り器ユニットは、シグネチャプロットが生成される時間にわたって、データを収集する。
【０１４５】
一般的な説明または例示において記載された全ての活動が必ずしも必要とされるのではなく、特定の活動の一部が必要とされない場合があり、１つまたは複数の更なる活動が、記載されたそれらに加えて行われてもよいことに注意されたい。なお更に、活動が列挙される順序は、必ずしもそれらが行われる順序ではない。
【０１４６】
利益、他の利点、および問題への解決策が、特定の実施形態に関連して上に記載された。しかし、利益、利点、問題への解決策、ならびにいずれかの利益、利点、または解決策を生じさせ得る、またはより顕著にさせ得るいずれの特徴（複数可）も、いずれかまたは全ての請求項の決定的な、必要とされる、または必須の特徴として解釈されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【国際調査報告】
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