(57)【要約】  本発明は、ナノ粒子およびこのようなナノ粒子を含む組成物、ならびにペプチドの細胞内送達のための方法、ならびにナノ粒子および関連生成物を生成するための方法を提供する。ナノ粒子は、金属および/または半導体原子を含むコアと;コアに共有結合的に連結された複数のリガンドを含むコロナとを含み、前記複数のリガンドのうち少なくとも第1のリガンドは、第1のリンカーを介してコアに共有結合的に連結される炭水化物部分を含み、前記複数のリガンドのうち少なくとも第2のリガンドは、第2のリンカーを介してコアに共有結合的に連結される選択ペプチドを含む。第2のリンカーは、ペプチド部分および非ペプチド部分を含み、前記第2のリンカーの前記ペプチド部分は、配列X1X2Z1を[式中、X1はAおよびGから選択されるアミノ酸であり;X2はAおよびGから選択されるアミノ酸であり;Z1はYおよびFから選択されるアミノ酸である]を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)金属および/または半導体原子を含むコアと、
(ii)コアに共有結合的に連結された複数のリガンドを含むコロナであって、前記複数のリガンドのうちの少なくとも第1のリガンドが、第1のリンカーを介してコアに共有結合的に連結されている炭水化物部分を含むまたはグルタチオンを含み、前記複数のリガンドのうちの少なくとも第2のリガンドが、第2のリンカーを介してコアに共有結合的に連結されている選択ペプチドを含み、前記第2のリンカーが、ペプチド部分および非ペプチド部分を含み、前記第2のリンカーの前記ペプチド部分が配列X1X2Z1[式中、X1は、AおよびGから選択されるアミノ酸であり;X2は、AおよびGから選択されるアミノ酸であり;Z1は、YおよびFから選択されるアミノ酸である]を含む、コロナと
を含むナノ粒子。
【請求項２】
第2のリンカーの前記非ペプチド部分が、C2〜C15アルキルおよび/またはC2〜C15グリコールを含む、請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記第1のリガンドおよび/または前記第2のリガンドが、硫黄含有基、アミノ含有基、ホスフェート含有基または酸素含有基を介してコアに共有結合的に連結されている、請求項1または2に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記第2のリンカーの前記ペプチド部分が、
(i)AAY;および
(ii)FLAAY(配列番号1)
から選択されるアミノ酸配列を含むまたはこのようなアミノ酸配列からなる、請求項1から3のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記第2のリンカーが
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAY;
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAY;
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY;
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAY;
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY;および
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY
からなる群から選択され、前記第2のリンカーが、リンカーの非ペプチド部分のチオール基を介して前記コアに共有結合的に連結されている、請求項1から4のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記選択ペプチドがそのN末端を介して、前記第2のリンカーの前記ペプチド部分に連結されている、請求項1から5のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記第2のリガンドが
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2;
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2;
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2;
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2;
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2;および
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2
からなる群から選択され、Z2が前記選択ペプチドを表す、請求項6に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記選択ペプチドが、クラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合し、またはクラスI MHC分子に結合するように処理され得るエピトープペプチドである、請求項1から7のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記選択ペプチドが、8〜40個のアミノ酸残基の配列からなる、請求項1から8のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記選択ペプチドが、8〜12個のアミノ酸残基の配列からなる、請求項9に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
選択ペプチドが、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を刺激するように、クラスI MHC分子によって提示され得るエピトープペプチドである、請求項1から10のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
選択ペプチドが、腫瘍関連抗原(TAA)またはウイルス関連抗原、細菌関連抗原もしくは寄生虫関連抗原の少なくとも一部を形成するまたはこれらに由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
TAAが肺癌抗原である、請求項12に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記肺癌が小細胞肺癌および任意の非小細胞肺癌から選択され、場合により、前記非小細胞肺癌が腺癌を含む、請求項13に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記病原体関連抗原が、ウイルス、細菌または寄生虫抗原である、請求項12に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記選択ペプチドがオボアルブミン(OVA)に由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
選択ペプチドが、アミノ酸配列SIINFEKL(配列番号2)を含むまたはそれからなる、請求項16に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
(i)前記第1のリガンドの炭水化物部分が単糖および/または二糖を含み、ならびに/または
(ii)前記複数のリガンドが、グルタチオン硫黄原子を介してナノ粒子のコアに共有結合的に連結された少なくとも1つのグルタチオンリガンドを含む、ならびに/または
(iii)前記複数のリガンドが
(a)グルコース;
(b)N-アセチルグルコサミン;
(c)グルタチオン;
(d)グルコースおよびN-アセチルグルコサミン;
(e)グルコースおよびグルタチオン;
(f)N-アセチルグルコサミンおよびグルタチオン;または
(g)グルコース, N-アセチルグルコサミンおよびグルタチオン
を含む
請求項1から17のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記(i)において、前記炭水化物部分が、グルコース、マンノース、フコースおよび/またはN-アセチルグルコサミンを含む、請求項18に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記第1のリンカーが、C2〜C15アルキルおよび/またはC2〜C15グリコールを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記第1のリガンドが、チオール硫黄原子を介してコアに共有結合的に結合された2'-チオエチル-β-D-グルコピラノシドまたは2'-チオエチル-α-D-グルコピラノシドを含む、請求項1から20のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個もしくは少なくとも50個の炭水化物含有リガンドおよび/またはグルタチオンリガンドを含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個または少なくとも5個の選択ペプチド含有リガンドを含む、請求項1から22のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
選択ペプチド含有リガンドに対する炭水化物含有リガンドおよび/またはグルタチオンリガンドのモル比が、5:1〜100:1の範囲にある、請求項1から23のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
選択ペプチド含有リガンドに対する炭水化物含有リガンドおよび/またはグルタチオンリガンドのモル比が、10:1〜30:1の範囲にある、請求項24に記載のナノ粒子。
【請求項２６】
ナノ粒子のコアの直径が1nm〜5nmの範囲にある、請求項1から25のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
そのリガンドを含むナノ粒子の直径が、5nm〜20nmの範囲、場合により5nm〜15nmまたは8nm〜10nmの範囲にある、請求項1から26のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
コアが、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、GdおよびZnまたはこれらの任意の組合せからなる群から選択される金属を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
コアが、Au、Ag、Pt、PdおよびCu、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される不動態金属を含む、請求項28に記載のナノ粒子。
【請求項３０】
コアが、Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/GdおよびAu/Fe/Cu/Gdからなる群から選択される金属の組合せを含む、請求項29に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
コアが磁性である、請求項1から30のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
コアが、Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+およびランタニド3+からなる群から選択されるNMR活性原子をさらに含む、請求項1から31のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３３】
コアが半導体を含む、請求項1から32のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３４】
半導体が、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムおよび硫化亜鉛からなる群から選択される、請求項33に記載のナノ粒子。
【請求項３５】
コアが、量子ドットとして作用することができる、請求項33または34に記載のナノ粒子。
【請求項３６】
ナノ粒子が少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドを含み、少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドのそれぞれの選択ペプチドが異なる、請求項1から35のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３７】
前記少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドの選択ペプチドが、1種または複数のTAAの少なくとも一部をそれぞれ形成し、または1種または複数のTAAにそれぞれ由来する、請求項36に記載のナノ粒子。
【請求項３８】
前記少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドの選択ペプチドが、異なる肺癌のTAAの少なくとも一部をそれぞれ形成し、または異なる肺癌のTAAにそれぞれ由来する、請求項37に記載のナノ粒子。
【請求項３９】
請求項1から38のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む組成物。
【請求項４０】
少なくとも1種の医薬として許容される担体、塩および/または希釈剤をさらに含む、請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
第1の選択ペプチド含有リガンドを有する第1の種のナノ粒子、および第2の選択ペプチド含有リガンドを有する第2の種のナノ粒子を含み、前記第1の種および第2の種の選択ペプチドが異なる、請求項39または40に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第1の種および第2の種のナノ粒子のそれぞれの選択ペプチドが、1種または複数のTAAの少なくとも一部をそれぞれ形成し、または1種または複数のTAAにそれぞれ由来する、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第1の種および第2の種のナノ粒子のそれぞれの選択ペプチドが、異なる肺癌のTAAの少なくとも一部をそれぞれ形成し、または異なる肺癌のTAAにそれぞれ由来する、請求項42に記載の組成物。
【請求項４４】
少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも10個の異なる種のナノ粒子のプールを含み、それぞれの種が異なる選択ペプチドを有する、請求項41から43のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
少なくとも1種のアジュバントをさらに含む、請求項39から44のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
アジュバントが、少なくとも1種のナノ粒子のコアに共有結合的に結合される、請求項45に記載の組成物。
【請求項４７】
アジュバントが、(S)-(2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2RS)-プロピル)-N-パルミトイル-(R)-Cys-(S)-Ser(S)-Lys4-OH(「Pam3Cys」)を含む、請求項45または46に記載の組成物。
【請求項４８】
アジュバントを実質的に含まない、またはアジュバントの唯一の効果がナノ粒子によって提供される、請求項39から44のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物を含むワクチン。
【請求項５０】
癌の治療的または予防的処置のための、請求項49に記載のワクチン。
【請求項５１】
前記癌が肺癌である、請求項50に記載のワクチン。
【請求項５２】
前記肺癌が小細胞肺癌および任意の非小細胞肺癌から選択され、場合により、前記非小細胞肺癌が腺癌を含む、請求項51に記載のワクチン。
【請求項５３】
医薬において使用するための、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物、または請求項49から52のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５４】
哺乳動物対象における癌または病原体感染を治療する方法に使用するための、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物、または請求項49から52のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５５】
哺乳動物対象における肺癌を治療する方法に使用するための、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物、または請求項49から52のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５６】
前記肺癌が小細胞肺癌および任意の非小細胞肺癌から選択され、場合により、前記非小細胞肺癌が腺癌を含む、請求項55に記載の方法において使用するためのナノ粒子、組成物またはワクチン。
【請求項５７】
哺乳動物対象における癌または病原体感染を治療するための薬剤の調製における、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物、または請求項49から52のいずれか一項に記載のワクチンの使用。
【請求項５８】
哺乳動物対象における肺癌を治療するための薬剤の調製における、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物、または請求項49から52のいずれか一項に記載のワクチンの使用。
【請求項５９】
前記肺癌が小細胞肺癌および任意の非小細胞肺癌から選択され、場合により、前記非小細胞肺癌が腺癌を含む、請求項58に記載の使用。
【請求項６０】
前記ナノ粒子、組成物、ワクチンまたは薬剤がリンパ管取り込みを介した投与のためのものである、請求項53から56のいずれか一項に記載のナノ粒子、組成物もしくはワクチン粒子または請求項57から59のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６１】
癌または病原体感染を予防的または治療的に処置する方法であって、予防的にまたは治療的に十分な量の、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物または請求項49から52のいずれか一項に記載のワクチンを、それを必要とする哺乳動物対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項６２】
前記癌が肺癌である、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記肺癌が小細胞肺癌および任意の非小細胞肺癌から選択され、場合により、前記非小細胞肺癌が腺癌を含む、請求項61または62に記載の方法。
【請求項６４】
前記ナノ粒子、組成物またはワクチンが、リンパ管取り込みの部位で投与される、請求項61から63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
CTL応答を生じさせるためのインビトロまたはインビボの方法であって、
(i)少なくとも1種の抗原提示細胞(APC)と請求項1から38のいずれか一項に記載の少なくとも1種のナノ粒子を接触させて、前記選択ペプチドが前記APCのクラスI MHC分子上に提示されるようにする工程と、
(ii)前記(i)の少なくとも1種のAPCと少なくとも1種の細胞障害性Tリンパ球(CTL)細胞を接触させて、前記CTL細胞が前記APCによって活性化され、前記選択ペプチドに特異的であるCTL応答を生じさせるようにする工程であり、前記選択ペプチドがエピトープペプチドである、工程と
を含む、方法。
【請求項６６】
APCが、前記ナノ粒子の存在下で培養され、同時にまたは連続的に前記CTL細胞と共培養される、請求項65に記載のインビトロの方法。
【請求項６７】
APCが、前記CTL細胞と共培養される前であって、ナノ粒子と接触させた後に洗浄工程に供される、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
哺乳動物対象にCTL細胞を投与する工程をさらに含む、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
前記ナノ粒子が、
リンパ管取り込みの部位でまたはその周辺における、哺乳動物対象の臓器または組織への注入、
噴霧またはゲルを介した鼻腔送達、
噴霧もしくはゲルまたは経口溶解性フィルムを介した口腔送達、
溶解性フィルムを介した経口送達、
ナノ粒子を組み込んだパッチを介した経皮送達、および
ナノ粒子を含む組成物の吸入送達
からなる群から選択される投与経路によって送達される、請求項65に記載のインビボの方法。
【請求項７０】
前記少なくとも1種のナノ粒子が、異なる選択ペプチドを有するナノ粒子のプールを含む、請求項65から69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記CTL応答が1種または複数のサイトカインの産生を含む、請求項65または66に記載の方法。
【請求項７２】
前記1種または複数のサイトカインがインターフェロンガンマ(IFN-γ)を含む、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子を生成する方法であって、
炭水化物を第1のリンカーで誘導化する工程と、
選択ペプチドを第2のリンカーで誘導化する工程と、
第1のリンカーで誘導化された炭水化物および第2のリンカーで誘導化された選択ペプチドを反応体と反応させ、ナノ粒子のコアを生じさせ、それによって、ナノ粒子の自己集合中に、ナノ粒子コアが、炭水化物および選択ペプチドにそれらのそれぞれのリンカーを介して結合する工程と
を含む、方法。
【請求項７４】
反応混合物が、ナノ粒子を生成するために、誘導化された炭水化物、誘導化された選択ペプチド、金属および/もしくは半導体原子の塩ならびに還元剤を含む、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
反応生成物が、ナノ粒子を含み、未反応の遊離ペプチドを除去するために精製工程に供され、任意選択で、精製工程が、反応生成物をG-50 Sephadex(商標)カラムに通過させることを含む、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも1種の医薬として許容される担体、塩または希釈剤とともに、組成物中にナノ粒子を製剤化する工程をさらに含む、請求項73から75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第2のリンカーを介して前記選択ペプチドを前記ナノ粒子に結合させて、結合した選択ペプチドを有するナノ粒子が、細胞によって内在化され得るようにする、請求項73から76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第2のリンカーを介して前記選択ペプチドを前記ナノ粒子に結合させて、選択ペプチドが結合したナノ粒子が、抗原提示細胞(APC)によって内在化され得るようにする、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
選択ペプチドを細胞内送達させるための方法であって、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子または請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物と細胞を接触させる工程を含む、方法。
【請求項８０】
選択ペプチドの細胞内送達のための、請求項1から38のいずれか一項に記載のナノ粒子または請求項39から48のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内ペプチド送達、特にナノ粒子を媒介としたペプチドの送達に有用な物質および組成物に関する。特定の場合において、本発明は、例えば、T細胞応答を誘導するための、エピトープペプチドの細胞内送達に関する。細胞内ペプチド送達は、特に、腫瘍、および/または細菌、ウイルスまたは寄生虫感染などの病原体を媒介とした疾患の治療的および/または予防的処置に用い得る。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法などのペプチドをベースとする治療法の設計および開発のための重要な課題は、ペプチドの細胞内コンパートメントへの細胞内送達である。これの一例は、抗原プロセッシング機構に抗原ペプチドを送達して、クラスI MHC分子に結合したペプチドが提示されることによって、それがCTL応答を刺激するようにすることが必要なことである。他の例としては、細胞内の薬物標的へのペプチド系薬物の送達が含まれる。特に、細胞による遊離ペプチドの取り込みは不良であることが多い。
【０００３】
今日まで用いられてきたアプローチの1つは、細胞にベクターをトランスフェクトでき且つペプチドが細胞翻訳機構によって生成されるように、選択ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、例えばウイルスベクターを投与することによって、細胞内局所にペプチドを送達することである。細胞内局所にペプチドを送達させるための戦略のさらなる例は、Mudersら、2009、Clin Cancer Res、Vol. 15(12)、4095〜4103頁に記載され、この例においては、GIPC-PDZ標的ペプチドが特定の膵臓腫瘍細胞に送達される。ペプチドは、N末端のミリストイル化によって修飾された。
【０００４】
しかしながら、例えば、免疫応答を誘導するために、または特定のペプチド系薬物の投与のために、ペプチドの細胞内送達のためのさらなる方法および組成物の必要性は残されている。本発明は、これらの必要性および他の必要性に対処する。
【０００５】
WO2006/037979は、抗原とアジュバントを含むナノ粒子、および該ナノ粒子を含む免疫原性構造体を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2006/037979
【特許文献２】WO2002/032404
【特許文献３】WO2004/108165
【特許文献４】WO2005/116226
【特許文献５】WO2007/015105
【特許文献６】WO2007/122388
【特許文献７】WO2005/091704
【特許文献８】EP2305310
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mudersら、2009、Clin Cancer Res、Vol. 15(12)、4095〜4103頁
【非特許文献２】Biotechnol. Prog.、19: 1095〜100頁(2003)、J. Am. Chem. Soc.、125:9828〜33頁(2003)
【非特許文献３】J. Colloid Interface Sci. 255:293〜8頁(2002)
【非特許文献４】Y.C. Cao、R. Jin、C. A. Mirkin、Science 2002、297: 1536〜1539頁
【非特許文献５】Handbook of Pharmaceutical Additives、第2版(M. AshおよびI. Ash編集)、2001(Synapse Information Resources、Inc.、Endicott、New York、USA)
【非特許文献６】Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、pub. Lippincott、Williams & Wilkins
【非特許文献７】Handbook of Pharmaceutical Excipients、第2版、1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
広義には、本発明は、ペプチドのナノ粒子ベースの細胞内送達に関する。本発明者らは、本明細書に記載される本発明のナノ粒子が、特定のリンカーを介してナノ粒子のコアに共有結合的に結合される選択ペプチドを含むコロナを有し、ナノ粒子が細胞によって取り込まれ、それにより選択ペプチドを細胞内標的に送達することができることを見出した。本明細書に記載されるように、次に、選択ペプチドは、例えば、特定の開裂プロセスによってナノ粒子から放出され、細胞内標的との相互作用のために選択ペプチドが遊離される。この一例は、CTL応答が生成され得るように、クラスI MHC分子を介したプロセッシングと提示のためにAPCにエピトープペプチドを送達することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第一の態様において、本発明は、
(i)金属および/または半導体原子を含むコアと、
(ii)コアに共有結合的に連結された複数のリガンドを含むコロナであって、前記複数のリガンドのうちの少なくとも第1のリガンドが、第1のリンカーを介してコアに共有結合的に連結されている炭水化物部分を含むまたはグルタチオンを含み、前記複数のリガンドのうちの少なくとも第2のリガンドが、第2のリンカーを介してコアに共有結合的に連結されている選択ペプチドを含み、前記第2のリンカーが、ペプチド部分および非ペプチド部分を含み前記第2のリンカーのペプチド部分が配列X1X2Z1[式中、X1は、AおよびGから選択されるアミノ酸であり;X2は、AおよびGから選択されるアミノ酸であり;Z1は、YおよびFから選択されるアミノ酸である]を含む、コロナと
を含むナノ粒子を提供する。
【００１０】
本発明によるいくつかの場合において、第2のリンカーの非ペプチド部分は、C2〜C15アルキルおよび/またはC2〜C15グリコール、例えば、チオエチル基またはチオプロピル基を含む。
【００１１】
本発明によるいくつかの場合において、第1のリガンドおよび/または前記第2のリガンドは、硫黄含有基、アミノ含有基、ホスフェート含有基または酸素含有基を介してコアに共有結合的に連結されている。
【００１２】
本発明によるいくつかの場合において、前記第2のリンカーの前記ペプチド部分は、
(i)AAY;および
(ii)FLAAY(配列番号1)
から選択されるアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる。
【００１３】
特定の好ましい場合において、前記第2のリンカーは、
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAY;
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAY;
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY;
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAY;
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY;および
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY
からなる群から選択され、前記第2のリンカーは、該リンカーの非ペプチド部分のチオール基を介して前記コアに共有結合的に連結されている。
【００１４】
好ましくは、選択ペプチドは、前記第2のリンカーの前記ペプチド部分にそのN末端を介して連結されている。
【００１５】
本発明によるいくつかの場合において、前記第2のリガンドは、
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2;
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2;
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2;
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2;
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2;および
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2
からなる群から選択され、Z2は前記選択ペプチドを表す。
【００１６】
本発明によるいくつかの場合において、前記選択ペプチドは、クラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合し、またはクラスI MHC分子に結合するように処理され得るエピトープペプチドである。
【００１７】
本発明によるいくつかの場合において、前記選択ペプチドは、8〜40個のアミノ酸残基の配列からなる。特定すると、選択ペプチドは、8〜12個のアミノ酸残基の配列からなっていてもよい。
【００１８】
本発明によるいくつかの場合において、選択ペプチドは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を刺激するように、クラスI MHC分子によって提示され得るエピトープペプチドである。
【００１９】
本発明によるいくつかの場合において、選択ペプチドは、腫瘍関連抗原(TAA)またはウイルス関連抗原、細菌関連抗原もしくは寄生虫関連抗原の少なくとも一部を形成するまたはこれらに由来する。特定すると、TAAは肺癌抗原であってもよい。肺癌は、場合によっては、小細胞肺癌および任意の非小細胞肺癌から選択されてもよく、場合により、前記非小細胞肺癌は腺癌を含む。病原体関連抗原が、場合によっては、ウイルス、細菌または寄生虫抗原であってもよい。
【００２０】
本発明によるいくつかの場合において、前記第1のリガンドの炭水化物部分は、単糖および/または二糖を含む。特定すると、前記炭水化物部分は、グルコース、マンノース、フコースおよび/またはN-アセチルグルコサミンを含んでもよい。
【００２１】
本発明によるいくつかの場合において、前記複数のリガンドは、前記選択ペプチドを含む1つまたは複数のリガンドに加えて、グルコース、N-アセチルグルコサミンおよびグルタチオンからなる群から選択される1つまたは複数のリガンドを含む。
【００２２】
本発明によるいくつかの場合において、前記複数のリガンドは、前記選択ペプチドを含む前記リガンドに加えて、
(a)グルコース;
(b)N-アセチルグルコサミン;
(c)グルタチオン;
(d)グルコースおよびN-アセチルグルコサミン;
(e)グルコースおよびグルタチオン;
(f)N-アセチルグルコサミンおよびグルタチオン;または
(g)グルコース、N-アセチルグルコサミンおよびグルタチオン
を含む。
【００２３】
本発明によるいくつかの場合において、前記第1のリンカーは、C2〜C15アルキルおよび/またはC2〜C15グリコールを含む。
【００２４】
本発明によるいくつかの場合において、前記第1のリガンドは、チオール硫黄原子を介してコアに共有結合的に結合された2'-チオエチル-β-D-グルコピラノシドまたは2'-チオエチル-α-D-グルコピラノシドを含む。
【００２５】
本発明によるいくつかの場合において、ナノ粒子は、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個もしくは少なくとも50個の炭水化物含有リガンドおよび/またはグルタチオンリガンドを含む。
【００２６】
本発明によるいくつかの場合において、ナノ粒子は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個または少なくとも5個のペプチド含有リガンドを含む。
【００２７】
本発明によるいくつかの場合において、ペプチド含有リガンドに対する炭水化物含有リガンドおよび/またはグルタチオンリガンドのモル比は、5:1〜100:1の範囲、例えば、10:1〜30:1の範囲にある。
【００２８】
本発明によるいくつかの場合において、ナノ粒子のコアの直径は1nm〜5nmの範囲にある。
【００２９】
本発明によるいくつかの場合において、そのリガンドを含むナノ粒子の直径は、5nm〜20nmの範囲、場合により5nm〜15nmまたは8nm〜10nmの範囲にある。
【００３０】
本発明によるいくつかの場合において、コアは、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、GdおよびZn、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される金属を含む。
【００３１】
本発明によるいくつかの場合において、コアは磁性である。
【００３２】
本発明によるいくつかの場合において、コアは半導体を含む。特定すると、半導体は、場合によっては、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムおよび硫化亜鉛からなる群から選択されてもよい。
【００３３】
本発明によるいくつかの場合において、コアは、量子ドットとして作用することができる。
【００３４】
本発明によるいくつかの場合において、ナノ粒子は、少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドを含み、少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドのそれぞれの選択ペプチドは異なる。
【００３５】
本発明によるいくつかの場合において、前記少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドの選択ペプチドは、1種または複数のTAAなどの抗原の少なくとも一部をそれぞれ形成し、または1種または複数のTAAなどの抗原にそれぞれ由来する。本発明によるいくつかの場合において、前記少なくとも2つの選択ペプチド含有リガンドの選択ペプチドは、異なる肺癌のTAAの少なくとも一部をそれぞれ形成し、または異なる肺癌のTAAにそれぞれ由来する。
【００３６】
さらなる一態様において、本発明は、本発明の第一の態様による複数のナノ粒子を含む組成物を提供する。組成物は、少なくとも1種の医薬として許容される担体、塩および/または希釈剤をさらに含んでもよい。
【００３７】
本発明によるいくつかの場合において、組成物は、第1の選択ペプチド含有リガンドを有する第1の種のナノ粒子、および第2の選択ペプチド含有リガンドを有する第2の種のナノ粒子を含み、前記第1の種および第2の種の選択ペプチドが異なる。前記第1の種および第2の種のナノ粒子のそれぞれの選択ペプチドは、場合によっては、TAAなどの1種または複数の抗原の少なくとも一部をそれぞれ形成し、またはTAAなどの1種または複数の抗原にそれぞれ由来してもよい。
【００３８】
本発明によるいくつかの場合において、本発明の組成物は、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも10個の異なる種のナノ粒子のプールを含んでもよく、それぞれの種が異なる選択ペプチドを有する。
【００３９】
組成物は、少なくとも1種のアジュバントをさらに含んでもよく、アジュバントは、場合により、少なくとも1種のナノ粒子のコアに共有結合的に結合されてもよい。あるいは、本発明の組成物は、アジュバントを実質的に含んでなくてもよく、または唯一のアジュバントの効果がナノ粒子によって提供されてもよい。
【００４０】
さらなる一態様において、本発明は、本発明の組成物を含むワクチンを提供する。ワクチンは、肺癌を含む癌の治療的または予防的処置に使用し得る。
【００４１】
さらなる一態様において、本発明は、医薬において使用するための、本発明のナノ粒子、組成物、またはワクチンを提供する。
【００４２】
ナノ粒子、組成物、またはワクチンは、哺乳動物対象における癌または病原体感染を治療するための方法に使用し得る。
【００４３】
さらなる一態様において、本発明は、哺乳動物対象における癌または病原体感染の治療に使用するための薬剤を調製するための、発明のナノ粒子、組成物、またはワクチンの使用を提供する。
【００４４】
本発明のナノ粒子、組成物、またはワクチンは、リンパ管取り込みを介した投与に使用し得る。
【００４５】
さらなる一態様において、本発明は、癌または病原体感染を予防的または治療的に処置する方法であって、予防的にまたは治療的に十分な量のナノ粒子、組成物、またはワクチンを、それを必要とする哺乳動物対象に投与する工程を含む、方法を提供する。本発明の前記方法の態様によるいくつかの場合において、前記ナノ粒子、組成物、またはワクチンは、
リンパ管取り込みの部位でまたはその周辺における、哺乳動物対象の臓器または組織への注入、
噴霧またはゲルを介した鼻腔送達、
噴霧もしくはゲルまたは経口溶解性フィルムを介した口腔送達、
溶解性フィルムを介した経口送達、
ナノ粒子を組み込んだパッチを介した経皮送達、および
ナノ粒子を含む組成物の吸入送達
からなる群から選択される経路によって投与される。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、CTL応答を生じさせるためのインビトロまたはインビボの方法であって、
(i)少なくとも1種の抗原提示細胞(APC)と本発明の少なくとも1種のナノ粒子を接触させて、前記選択ペプチドが前記APCのクラスI MHC分子上に提示されるようにする工程と、
(ii)前記(i)の少なくとも1種のAPCと少なくとも1種の細胞障害性Tリンパ球(CTL)細胞を接触させて、前記CTL細胞が前記APCによって活性化され、前記選択ペプチドに特異的であるCTL応答を生じさせるようにする工程であり、前記選択ペプチドがエピトープペプチドである、工程と
を含む、方法を提供する。
【００４７】
本発明によるいくつかの場合において、APCは、前記ナノ粒子の存在下で培養され、同時にまたは連続的に前記CTL細胞と共培養される。場合により、APCは、前記CTL細胞と共培養される前であって、ナノ粒子と接触させた後に洗浄工程に供されてもよい。いくつかの場合において、方法は、哺乳動物対象にCTL細胞を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００４８】
本発明によるいくつかの場合において、ナノ粒子は、
リンパ管取り込みの部位でまたはその周辺における、哺乳動物対象の臓器または組織への注入、
噴霧またはゲルを介した鼻腔送達、
噴霧もしくはゲルまたは経口溶解性フィルムを介した口腔送達、
溶解性フィルムを介した経口送達、
ナノ粒子を組み込んだパッチを介した経皮送達、および
ナノ粒子を含む組成物の吸入送達
からなる群から選択される投与経路によって送達されてもよい。
【００４９】
いくつかの場合において、前記少なくとも1種のナノ粒子は、異なる選択ペプチドを有するナノ粒子のプールを含む。
【００５０】
さらなる一態様において、本発明は、本発明によるナノ粒子を生成する方法であって、
炭水化物を第1のリンカーで誘導化する工程と、
選択ペプチドを第2のリンカーで誘導化する工程と、
第1のリンカーで誘導化された炭水化物および第2のリンカーで誘導化された選択ペプチドを反応体と反応させ、ナノ粒子のコアを生じさせ、それによって、ナノ粒子の自己集合中に、ナノ粒子コアが、炭水化物および選択ペプチドにそれらのそれぞれのリンカーを介して結合する工程と
を含む、方法を提供する。いくつかの場合において、反応混合物は、ナノ粒子を生成するために、誘導化された炭水化物、誘導化された選択ペプチド、金属および/もしくは半導体原子の塩、ならびに還元剤を含む。それに加えてまたはそれに代えて、前記炭水化物は、グルタチオンによって置換され、またはグルタチオンによって補足されてもよい。
【００５１】
本発明の本態様および他の態様による特定の場合において、ナノ粒子を含む反応生成物は、未反応の遊離ペプチドを除くために精製工程に供され、場合により、精製工程が、反応生成物をG-50 Sephadex(商標)カラムに通過させることを含む。
【００５２】
本発明の本態様および他の態様による特定の場合において、方法は、少なくとも1種の医薬として許容される担体、塩または希釈剤とともに、組成物中にナノ粒子を製剤化する工程をさらに含んでもよい。
【００５３】
本発明の本態様および他の態様による特定の場合において、方法は、前記第2のリンカーを介して前記選択ペプチドを前記ナノ粒子に結合させ、選択ペプチドが結合したナノ粒子が、細胞によって内在化され得るようにするためのものである。
【００５４】
本発明の本態様および他の態様による特定の場合において、方法は、前記第2のリンカーを介して前記選択ペプチドを前記ナノ粒子に結合させ、選択ペプチドが結合したナノ粒子が、抗原提示細胞(APC)によって内在化され得るようにするためのものである。
【００５５】
さらなる一態様において、本発明は、選択ペプチドを細胞内送達させるための方法であって、本発明のナノ粒子または組成物と細胞を接触させる工程を含む、方法を提供する。
【００５６】
さらなる一態様において、本発明は、選択ペプチドの細胞内送達のための、本発明のナノ粒子または組成物の使用を提供する。
【００５７】
本発明は、説明された態様および好ましい特徴の組合せが明らかに許容されない場合、または避けられることが明示的に述べられている場合を除き、そのような組合せを含む。本発明のこれらの態様および実施形態、ならびにさらなる態様および実施形態を、添付の実施例および図面を参照しながら、以下でさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】GNP由来のSIINFEKL(配列番号2)提示を示すグラフである。LKb細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次に、GNPは、1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色)の同等物に対してパルスされた。2時間後、細胞を洗浄し、25.D1.16(Angel)抗体によるフローサイトメトリー標識に供された。翌日、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【図１Ｂ】GNP由来のSIINFEKL(配列番号2)提示を示すグラフである。LKb細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次に、GNPは、1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色)の同等物に対してパルスされた。2時間後、細胞を洗浄し、25.D1.16(Angel)抗体によるフローサイトメトリー標識に供された。翌日、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【図１Ｃ】GNP由来のSIINFEKL(配列番号2)提示を示すグラフである。LKb細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次に、GNPは、1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色)の同等物に対してパルスされた。2時間後、細胞を洗浄し、25.D1.16(Angel)抗体によるフローサイトメトリー標識に供された。翌日、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【図１Ｄ】GNP由来のSIINFEKL(配列番号2)提示を示すグラフである。LKb細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次に、GNPは、1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色)の同等物に対してパルスされた。2時間後、細胞を洗浄し、25.D1.16(Angel)抗体によるフローサイトメトリー標識に供された。翌日、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【図１Ｅ】GNP由来のSIINFEKL(配列番号2)提示を示すグラフである。LKb細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次に、GNPは、1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色)の同等物に対してパルスされた。2時間後、細胞を洗浄し、一晩、共培養のためにB3Z CTLと組み合わせられた。翌日、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【図２Ａ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。GNP8および9は、Sephadexカラムによって15個の画分に分離され、次に、タンパク質レベルについてUV吸収で分析された。図2A中の赤線(丸で示す)は遊離ペプチドのみを表す。
【図２Ｂ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。GNP8および9は、Sephadexカラムによって15個の画分に分離され、次に、タンパク質レベルについてUV吸収で分析された。
【図２Ｃ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色))で、記載されたGNPまたは対応する遊離ペプチドとともに2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図２Ｄ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色))で、記載されたGNPまたは対応する遊離ペプチドとともに2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図２Ｅ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色))で、記載されたGNPまたは対応する遊離ペプチドとともに2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図２Ｆ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色))で、記載されたGNPまたは対応する遊離ペプチドとともに2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図２Ｇ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色))で、記載されたGNPまたは対応する遊離ペプチドとともに2時間パルスされた。読み取りは、B3Zアッセイによるものである。
【図２Ｈ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、0.1μg/mL(青色)、または0.01μg/mL(赤色))で、記載されたGNPまたは対応する遊離ペプチドとともに2時間パルスされた。読み取りは、B3Zアッセイによるものである。
【図２Ｉ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKbは、氷上にて2時間、記載された遊離ペプチドでパルスされた。次に、細胞は、SIINFEKL(配列番号2)提示についてフローサイトメトリーによって分析された。ヒストグラムの赤色部分は、非パルス細胞と比較した陽性染色を表す。
【図２Ｊ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKbは、氷上にて2時間、記載された遊離ペプチドでパルスされた。次に、細胞は、SIINFEKL(配列番号2)提示についてフローサイトメトリーによって分析された。ヒストグラムの赤色部分は、非パルス細胞と比較した陽性染色を表す。
【図２Ｋ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKbは、氷上にて2時間、記載された遊離ペプチドでパルスされた。次に、細胞は、SIINFEKL(配列番号2)提示についてフローサイトメトリーによって分析された。ヒストグラムの赤色部分は、非パルス細胞と比較した陽性染色を表す。
【図２Ｌ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKbは、37℃にて2時間、記載された遊離ペプチドでパルスされた。次に、細胞は、SIINFEKL(配列番号2)提示についてフローサイトメトリーによって分析された。ヒストグラムの赤色部分は、非パルス細胞と比較した陽性染色を表す。
【図２Ｍ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKbは、37℃にて2時間、記載された遊離ペプチドでパルスされた。次に、細胞は、SIINFEKL(配列番号2)提示についてフローサイトメトリーによって分析された。ヒストグラムの赤色部分は、非パルス細胞と比較した陽性染色を表す。
【図２Ｎ】遊離ペプチド提示と比較したGNP提示を示すグラフである。LKbは、37℃にて2時間、記載された遊離ペプチドでパルスされた。次に、細胞は、SIINFEKL(配列番号2)提示についてフローサイトメトリーによって分析された。ヒストグラムの赤色部分は、非パルス細胞と比較した陽性染色を表す。
【図３Ａ】遊離ペプチドを欠いた調製物からのGNP提示を示すグラフである。GNP8および9の新規な調製物は、Sephadex G-50カラムによって、15個の画分に分離され、次に、タンパク質レベルについてUV吸収によって分析された。矢印は、画分をさらなる使用のためにプールしたことを示す。
【図３Ｂ】遊離ペプチドを欠いた調製物のからGNP提示を示すグラフである。GNP8および9の新規な調製物は、Sephadex G-50カラムによって、15個の画分に分離され、次に、タンパク質レベルについてUV吸収によって分析された。矢印は、画分をさらなる使用のためにプールしたことを示す。
【図３Ｃ】遊離ペプチドを欠いた調製物のからGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、または0.1μg/mL(赤色))にて、GNP(旧GNP)の記載された従来の調製物、または(AおよびB)からの新しい調製物(新GNP)を用いて2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図３Ｄ】遊離ペプチドを欠いた調製物のからGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、または0.1μg/mL(赤色))にて、GNP(旧GNP)の記載された従来の調製物、または(AおよびB)からの新しい調製物(新GNP)を用いて2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図３Ｅ】遊離ペプチドを欠いた調製物からのGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、または0.1μg/mL(赤色))にて、GNP(旧GNP)の記載された従来の調製物、または(AおよびB)からの新しい調製物(新GNP)を用いて2時間パルスされた。読み取りは、フローサイトメトリーによるものである。
【図３Ｆ】遊離ペプチドを欠いた調製物からのGNP提示を示すグラフである。LKb細胞は、記載された濃度(1μg/mLペプチド(緑色)、または0.1μg/mL(赤色))にて、GNP(旧GNP)の記載された従来の調製物、または(AおよびB)からの新しい調製物(新GNP)を用いて2時間パルスされた。読み取りは、B3Zアッセイによるものである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明を説明するにあたり、以下の用語を使用するが、これは、以下に示すように定義するものとする。
【００６０】
本明細書において使用するとき、「ナノ粒子」は、ナノメートルスケールの粒子を指し、いかなる具体的な形状制限も示唆することを意図しない。特に、「ナノ粒子」は、ナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスター、ナノロッドなどを包含する。特定の実施形態において、本明細書において企図されるナノ粒子および/またはナノ粒子コアは、概ね多面体または球状の構造を有する。
【００６１】
複数の炭水化物含有リガンドを含むナノ粒子は、例えば、WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704(そのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる)に記載されており、このようなナノ粒子は、本発明による使用を見出すことができる。さらに、有機化合物で官能化された(例えばチオール-金結合を介して)酸化鉄フェライト(式XFe2O4(式中、X=Fe、MnまたはCoである)を有する)の磁性コアを含む金被覆ナノ粒子は、EP2305310(その全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる)に記載されており、本発明によるナノ粒子/ナノ粒子コアとしての使用に特に企図される。
【００６２】
本明細書において使用するとき、「コロナ」は、ナノ粒子コアの露出表面を部分的または完全に被覆し得る層またはコーティングを指す。コロナは、少なくとも1つの炭水化物部分、1つの界面活性剤部分および/または1つのグルタチオン部分を含む複数のリガンドを含む。したがって、コロナは、金属コアを囲むまたは金属コアを部分的に囲む有機層であると考えることができる。特定の実施形態において、コロナは、ナノ粒子のコアの不動態化をもたらすおよび/またはそれに関与する。したがって、特定の場合において、コロナは、金属含有コアを実質的に安定化させるのに十分完全な被覆層を含み得る。しかしながら、例えば貴金属で被覆された金属酸化物含有内部コアを含むコアを有する特定のナノ粒子は、コア表面を部分的にのみ被覆するコロナを含んでもよいことが、本明細書において特に企図される。特定の場合において、コロナは、本発明のナノ粒子の溶解度、例えば、水溶解度を促進する。
【００６３】
ナノ粒子
ナノ粒子は、リガンドを固定するための基質として用いることができる小さな粒子、例えば、金属または半導体原子のクラスターである。
【００６４】
好ましくは、ナノ粒子は、平均径が0.5〜50nmの間、より好ましくは0.5〜10nmの間、より好ましくは0.5〜5nmの間、より好ましくは0.5〜3nmの間、さらにより好ましくは0.5〜2.5nmの間であるコアを有する。コアに加えてリガンドが考慮される場合、好ましくは、粒子の全平均径は5.0〜100nmの間、より好ましくは5〜50nmの間、最も好ましくは5〜10nmの間である。平均径は、透過型電子顕微鏡などの当該技術分野において公知の技術を用いて測定することができる。
【００６５】
コア材料は、金属または半導体であってもよく、2種以上の原子で形成されていてもよい。好ましくは、コア材料は、Au、FeまたはCuから選択される金属である。また、ナノ粒子のコアは、Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd、およびAu/Fe/Cu/Gdを含む合金から形成されてもよく、本発明において使用することができる。好ましいコア材料は、AuおよびFeであり、最も好ましい材料はAuである。好ましくは、ナノ粒子のコアは、ナノメートル範囲内のコア径を提供するために、約100〜500個の間の原子(例えば、金原子)を含む。他の特に有用なコア材料は、NMR活性である1つまたは複数の原子がドープ塗布され、インビトロとインビボの両方で、ナノ粒子がNMRを用いて検出され得る。NMR活性な原子の例には、Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3およびランタニド+3、または本出願において他の箇所で記載されている量子ドットが挙げられる。
【００６６】
ナノメートルスケールの半導体結晶が量子ドットとして作用することができるため、半導体原子を含むナノ粒子コアを検出することができる。すなわち、それらは、より高いエネルギーレベルに材料中の電子を励起し、続いて、材料に特徴的な周波数で光の光子を放出することによって、光を吸収することができる。半導体コア材料の例には、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムがある。また、硫化亜鉛などの亜鉛化合物も含まれる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子のコアは磁性であってもよく、場合により不動態金属原子と組み合わせて、磁性金属原子を含んでもよい。例として、不動態金属は、金、白金、銀または銅であってもよく、磁性金属は、鉄またはガドリニウムであってもよい。好ましい実施形態において、不動態金属が金であり、磁性金属が鉄である。この場合において、好都合には、コアの磁性金属原子に対する不動態金属原子の比は、約5:0.1〜約2:5の間である。より好ましくは、この比は約5:0.1〜約5:1の間である。本明細書で使用するとき、用語「不動態金属」は、磁性を示さず、酸化に対して化学的に安定である金属を指す。不動態金属は、反磁性または超常磁性であってもよい。好ましくは、このようなナノ粒子は超常磁性である。
【００６８】
常磁性金属を含むコアを有するナノ粒子の例としては、Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3およびランタニド+3を含むものが挙げられる。
【００６９】
他の磁性ナノ粒子は、MnFe(スピネルフェライト)またはCoFe(コバルトフェライト)などの材料から形成されてもよく、上記で定義されているさらなるコア材料の添加の有無に関わらず、ナノ粒子(磁性流体)に形成され得る。このようなナノ粒子を生成する自己集合の結合化学の例が、Biotechnol. Prog.、19: 1095〜100頁(2003)、J. Am. Chem. Soc.、125:9828〜33頁(2003)、J. Colloid Interface Sci. 255:293〜8頁(2002)に示されている。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子またはそのリガンドは検出可能な標識を含む。標識は、ナノ粒子またはリガンドのコアの要素であってもよい。標識は、ナノ粒子のその要素の固有の特性に起因して、または、検出可能なさらなる部分に連結され、コンジュゲートされ、または結合されることによって検出可能であり得る。標識の好ましい例としては、蛍光基、放射性核種、磁気標識または色素である標識が挙げられる。蛍光基は、フルオレセイン、ローダミンまたはテトラメチルローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5などを含み、ラマン散乱分光法(Y.C. Cao、R. Jin、C. A. Mirkin、Science 2002、297: 1536〜1539頁)を用いた蛍光標識の励起、および放射光の検出によって検出されてもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、例えば、PET、SPECTを用いて、放射性核種によって放出される放射活性を用いてナノ粒子の検出における使用のために、または治療のために、すなわち、標的細胞を死滅させるために放射性核種を含んでもよい。本発明における使用に容易に適合し得る、当該技術分野において通常使用される放射性核種の例には、様々な酸化状態で存在する99mTcが挙げられるが、最も安定なものは、TcO4-;32Pまたは33P; 57Co; 59Fe;多くの場合Cu2+塩として使用される67Cu; Ga3+塩として通常用いられる67Ga、例えばクエン酸ガリウム; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; In3+塩として一般に使用される111In;ヨウ化ナトリウムとして一般に使用される125Iまたは131I; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re;塩化タリウムなどのTl+塩として一般に使用される201Tl; 39Y3+; 71LU3+および24Cr2+である。標識およびトレーサーとしての放射性核種の一般的な使用は、当該技術分野において周知であり、本発明の態様において使用について当業者によって容易に適合させることができる。放射性核種は、ナノ粒子のコアをドープ塗布することによって、またはナノ粒子上に固定化されたリガンドの一部として存在する標識としてこれらを含むことによって、最も容易に使用することができる。
【００７２】
それに加えたまたはそれに代えて、本発明のナノ粒子、または他の種とのこれらの相互作用の結果は、上記で指示されているナノ粒子と関連付けられた標識を用いて、またはそれらの特性を用いることによって、当該技術分野において周知である多数の技術を用いて検出することができる。ナノ粒子を検出するこれらの方法は、例えば、単純な目視検査によって、または光散乱(ナノ粒子を含有する溶液の透過率)を用いることによって、ナノ粒子が別の種に結合した際に生じる凝集を検出することから、ナノ粒子を視覚化するための透過型電子顕微鏡(TEM)または原子間力顕微鏡(AFM)などの高機能な技術を用いることまでを範囲とすることができる。金属粒子を検出するためのさらなる方法は、通常、光照射によって引き起こされる、金属表面での電子の励起であるプラズモン共鳴を用いることである。表面プラズモン共鳴(SPR)の現象は、金属(例えば、AgまたはAuなど)の界面、および空気または水などの誘電体材料に存在する。分析物がナノ粒子の表面上に固定化されたリガンドに結合すると、界面の屈折率が変化するため、SPRの変化が生じる。SPRのさらなる利点は、リアルタイムの相互作用をモニターするために使用することができることである。上述したように、ナノ粒子がNMR活性である原子を含む、またはNMR活性である原子でトープ塗布される場合、この技術は、当該技術分野において周知である技術を用いて、インビトロとインビボの両方において粒子を検出するために使用することができる。また、ナノ粒子は、銀(I)による還元が促進されたナノ粒子を用いることにより、定量的なシグナル増幅に基づくシステムを用いて検出することができる。ナノ粒子が蛍光プローブのようなリガンドを含む場合、蛍光分光法を用いることができる。また、炭水化物の同位体標識は、これらの検出を促進にするために使用することができる。
【００７３】
選択ペプチド
本発明のナノ粒子は、リンカー(「前記第2のリンカー」)を介してナノ粒子のコアに共有結合的に連結されているペプチド含有リガンド(「前記第2のリガンド」)を含む。第2のリガンドは、細胞内送達のために意図され得るペプチドを含む。この「選択ペプチド」は、任意の適切なペプチドであってもよい。特に、ペプチドは、細胞内部位に送達された際に効果を発揮することができるより大きなポリペプチドの断片であってもよい。特定の場合において、選択ペプチドは、ペプチド系薬物であってもよい。特定の場合において、選択ペプチドは、例えば、APCの細胞内コンパートメントに送達された際に免疫応答を生じさせるエピトープ(「エピトープペプチド」)を含んでもよい。特定の好ましい場合において、選択ペプチドは、クラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合する、またはクラスI MHC分子に結合するように処理され得るペプチドであってもよい。本発明によるいくつかの場合において、選択ペプチドは、8〜40個のアミノ酸残基の配列、例えば、8〜12個のアミノ酸残基の配列からなってもよい。特定の場合において、選択ペプチドは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を刺激するように、クラスI MHC分子によって提示されることが可能であってもよい。このようなエピトープペプチドは、腫瘍関連抗原(TAA)または病原体関連抗原(例えばウイルス、細菌もしくは寄生虫抗原)の少なくとも一部を形成する、またはそれらに由来してもよい。場合によっては、選択ペプチドは、細胞内標的を標的とするペプチドなどのペプチド薬物であってもよい。このような細胞内標的ペプチドの一例は、Mudersら、2009、Clin Cancer Res、Vol. 15(12)、4095〜4103頁(その全内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているGIPC-PDZドメイン阻害剤である。
【００７４】
投与および治療
本発明のナノ粒子および組成物は、経腸または非経口経路を含む、かなり多数の異なる経路により患者に投与し得る。非経口投与には、以下の経路による投与が含まれる:静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋内、眼内、経上皮、腹腔内、および局所(皮膚、眼、直腸、鼻、吸入およびエアロゾルを含む)、ならびに直腸の全身経路。
【００７５】
投与は、例えば、注入により、または表皮の外層の経皮的通過を促進するための送達銃を用いて弾道的に実施する。次に、ナノ粒子は、例えば、樹状細胞などにより取り込まれ得、それらがリンパ系を介して移動する間に成熟し、結果として、エピトープペプチドおよび/またはエピトープペプチドが由来するか、一部を形成する抗原に対する免疫応答およびワクチン接種の調節がもたらされる。ナノ粒子はまた、エアロゾルで送達されてもよい。これは、小さなサイズのナノ粒子により可能になる。
【００７６】
本発明のナノ粒子の非常に小さなサイズは、それらが標的または治療分子と連結している場合でさえも細胞により取り込まれ得るので、細胞および組織への送達にとって非常に有益である。このようにして、ナノ粒子は、APCなどの細胞によって内在化され、例えば、クラスI MHCを介した提示のために、または細胞内成分との相互作用のために、ペプチドは処理され、放出される。
【００７７】
本発明のナノ粒子は、固体または液体組成物の形態であってよい医薬組成物として製剤化されてよい。このような組成物には、一般に、ある種の担体、例えば、ゼラチンもしくはアジュバントもしくは不活性希釈剤などの固体担体、または水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油もしくは合成油などの液体担体などが含まれる。生理食塩水、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールも含めてよい。このような組成物および調製物は、一般に、少なくとも0.1重量%の化合物を含有する。
【００７８】
静脈内、皮膚もしくは皮下注入、または苦痛部位での注入のために、有効成分は、非経口として許容可能な水溶液の形態であって、発熱物質を含まず、適したpHを有し、等張性および安定性の水溶液の形態である。関連する当業者は、例えば、生理食塩水、グリセロールを用いて調製された分散液、液体ポリエチレングリコール、または油中、例えば、化合物またはその誘導体の溶液などを用いて、適した溶液を十分に調製することができる。
【００７９】
組成物は、1種または複数の化合物に加えて、場合により他の活性成分と組み合わせて、1種または複数の医薬として許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、等張化剤(isotonicising agent)、保存剤、もしくは抗酸化剤、または当業者に周知の他の材料を含めることができる。このような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口または非経口などに依存してもよい。
【００８０】
液体医薬組成物は、典型的には、約3.0〜9.0のpH、より好ましくは約4.5〜8.5のpH、さらにより好ましくは約5.0〜8.0のpHを有するように製剤化される。組成物のpHは、典型的には、約1mM〜50mMの範囲で用いられる緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、トリス、またはヒスチジンなどの使用により維持できる。組成物のpHは、別の方法では、生理学的に許容可能な酸または塩基を用いることにより調整することができる。
【００８１】
保存剤は、一般に、微生物の増殖を遅らせるために医薬組成物中に含まれ、これにより、組成物の貯蔵期間を延長でき、多重使用パッケージングが可能になる保存剤の例には、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸およびそのエステル、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。保存剤は、典型的には、約0.1〜1.0%(w/v)の範囲で用いられる。
【００８２】
好ましくは、医薬組成物は、予防的に有効な量または治療的に有効な量(場合によっては、予防が治療と考えられるかもしれないが)で個体に与えられ、これは、個体にとっての利益を示すのに十分なものである。典型的には、これは、個体にとっての利益を提供する、治療的に有用な活性を生じさせる。投与される化合物の実際の量、ならびに投与割合およびタイムコースは、治療されるべき病態の性質および重篤度によって決まる。治療処方、例えば、用量に関する決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に知られている他の因子を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Handbook of Pharmaceutical Additives、第2版(M. AshおよびI. Ash編集)、2001(Synapse Information Resources、Inc.、Endicott、New York、USA);Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、pub. Lippincott、Williams & Wilkins;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients、第2版、1994に見出すことができる。例として、組成物は、好ましくは、体重1kg当たり約0.01〜100mgの活性化合物の用量で、より好ましくは体重1kg当たり約0.5〜10mgの活性化合物の用量で、患者に投与される。
【００８３】
腫瘍の治療が考えられる場合には、治療には、腫瘍の患者に対する影響を軽減するために、医師による任意の措置が含まれることが理解される。このようにして、腫瘍の完全寛解が望ましい目標であるが、効果的な治療にはまた、腫瘍の部分寛解、および転移を含む腫瘍の増殖速度の減速を達成できる任意の措置が含まれる。このような措置は、生活の質を延長および/または高め、および疾患の症状を軽減するのに有効であり得る。
【００８４】
免疫療法
特許請求の範囲に定義されるワクチンなどの本発明の組成物は、いくつかの場合において、癌などの疾患の予防および治療のため、より具体的には免疫療法のために使用され得る。
【００８５】
本発明において、用語「ワクチン接種」とは、能動免疫を意味し、これは、ワクチン接種された個体により外来物として認識される少量の抗原を、例えば、皮下、皮内、筋内、経口、または経鼻経路を介して投与することによる、特異的免疫応答の導入であり、したがって、適した製剤において免疫原性である。このようにして、抗原は、抗原に対する特異的免疫応答を構築するために、免疫系に対して「引き金」として用いられる。
【００８６】
本発明によれば、ワクチン接種は、治療的でも予防的でもよい。例として、癌に罹患していない個体のワクチン接種によって、癌疾患の突発的発生に対する予防的保護を達成することが可能となり得る。このような予防的ワクチン接種が適用されてよい個体の例は、癌疾患にかかるリスクの高い個体であるが、この適用は、このような個体に限定されるわけではない。癌のリスクを有する患者は、原発腫瘍または転移のいずれかとして、腫瘍を既に患っているか、またはガンに対する素因を示す。
【００８７】
本発明による癌患者の能動免疫のために、ナノ粒子は、典型的には、ワクチンとして製剤化される。好ましくは、このような医薬調製物には、医薬として許容される担体が含有され、この担体には、例として、補助物質、緩衝剤、塩、および/または保存料がさらに含まれてよい。医薬調製物は、例えば、癌患者における癌関連病態、例えば、転移形成などの予防および治療のために用いられてよい。その際に、抗原提示細胞が、TAAに対する免疫応答を生じさせるように、インビボにおいてまたはエクスビボにおいても、特異的に調節される。
【００８８】
特異抗原または抗原の組合せを用いた能動免疫のために、通常、免疫原を含むワクチン製剤が用いられる。ここで、免疫原は、天然TAAもしくはそのエピトープ、模倣体またはネオエピトープ模倣体であり、主に低濃度で、例えば、0.01μg〜10mgの範囲の免疫原性量で用いられるが、用量範囲を100〜500mgの範囲に増加させることもできる。例えば、外来種の配列または誘導体化などによって決定されるワクチン接種抗原の免疫原性に応じて、またはさらにそれぞれ用いられる補助物質もしくはアジュバンドに応じて、適した免疫原性用量を選択でき、例えば、0.01μg〜1mgの範囲で、好ましくは100μg〜500μgの範囲で選択することができる。しかしながら、長期間にわたって生物に送達されるべき持続性ワクチンはまた、さらに多量のワクチン接種抗原を含有してもよく、例えば、少なくとも1mg〜100mg超のワクチン接種抗原が含有されていてよい。
【００８９】
濃度は、投与される液体または懸濁ワクチンの量に依存する。ワクチンは、通常、0.01〜1ml、好ましくは0.1〜0.75mlの範囲の体積を有する、即時使用可能なシリンジまたはアンプルで提供される。
【００９０】
ワクチンの成分であるワクチン接種抗原は、好ましくは、医薬として許容可能な担体に存在し、ここで、担体は、皮下、筋内、およびさらに皮内、または経皮投与に適したものである。投与のさらなる形態は粘膜経路を介して機能し、例えば、経鼻または経口投与によるワクチン接種などである。固体物質が、ワクチン製剤の補助剤として用いられる場合、補助剤とワクチン抗原との例えば、それぞれ、吸着物、または懸濁混合物が投与される。具体的な実施態様において、ワクチンは、水性溶媒中の溶液または液体ワクチンとして与えられる。
【００９１】
好ましくは、腫瘍ワクチンのワクチン接種ユニットは、適切な即時使用可能なシリンジまたはアンプルで既に提供される。ワクチンの安定な製剤は、有利には、即時使用可能な形態で市場に出されてよい。チメロサールまたは改善された耐性を有する他の保存料などの、保存料の含有量は、必ずしも必要ではないが、冷蔵温度から最大で室温までの貯蔵温度での、より長い安定性のために、製剤中に提供されてよい。しかしながら、本発明に係るワクチンはまた、凍結または凍結乾燥形態で提供されてもよく、それぞれ、所要時に、解凍されるまたは再構成されてよい。
【００９２】
本発明による特定の場合において、本発明のワクチンの免疫原性はアジュバントを用いることによって高めることができる。この目的のために、固体物質または液体ワクチンアジュバントが用いられ、例えば、水酸化アルミニウム(Alu-Gel)もしくはリン酸アルミニウム、増殖因子、リンホカイン、サイトカイン、例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF、ガンマインターフェロン、または補体因子、例えば、C3d、さらなるリポソーム調製物、またはさらには、免疫系が、強い免疫応答を既に産生しているものに対するさらなる抗原を有する製剤、例えば破傷風トキソイド、細菌毒素、例えば、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、ならびにリピドAおよびリポ多糖類の誘導体などが用いられる。
【００９３】
特定の場合において、付加的なアジュバントは用いられない。具体的には、本明細書に記載されている実施例は、CTL応答の効率的な生成は、いずれも添加されるアジュバントを含まずに、本発明のナノ粒子を用いて達成されることを示す(一般的には、1種または複数のアジュバントとともに投与される遊離ペプチドを参照されたい)。多くのアジュバントが毒性であり、またはその他としてヒトでの使用に不適切であると考えられるので、これは特定の状況において非常に有益である。
【００９４】
以下は、例として示され、特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきものではない。
【００９５】
(実施例)
(実施例1)
ナノ粒子の合成および特徴付け
試験リガンドおよびこれらの識別番号を以下に示す(分子量wt);
SIINFEKL   (963)   (配列番号2)
SIINFEKL-N-(CH2)2-SH   (1021)
FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH   (1280)   (配列番号3)
FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH   (1587)   (配列番号4)
AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH   (1325)   (配列番号5)
HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL   (1051)
HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL   (1309)
HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL   (1616)
HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL   (1356)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL   (1471)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL   (1732)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL   (2034)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL   (1774)
【００９６】
試験NPは、10μmolの塩化金(Aldrich 484385)、30μmolのチオエチルリンカーを有するグルコース(GlcC2)、および1.5μmolのペプチドリガンド(可変1.5〜3mg)を用いて合成された。
【００９７】
以下の方法を用いた。1.5μmolのペプチドを2mlのメタノールに溶解し、次に、200μlのメタノール中30μmolのGlcC2、10μmolのAuを含有する116μlの水性塩化金を添加した。試料を30秒間ボルテックスし、約5分間振とうし、その後、全30秒間、急速のボルテックスしながら、1MのNaBH4を200μl添加した。試験管を密封し、次に、1.5時間、穏やかに振とうした。
【００９８】
試料をベンチスピンし、上清を除去し、黒みがかったペレットを2mlの水に溶解した。次に、10kDaのビバスピンに移し、各回5Krpmで8分間、2mlの水で全4回洗浄する。ナノ粒子(NP)をビバスピンから取り出し、水で500μlとし、次に、15Krpmのベンチスピンに供して、任意の大きな凝集体を除去した。
【００９９】
実験室アッセイによるスピン/生成後の金含有量を以下に示し、100%の収率は1.97mgである。
【０１００】
【表１】
2014527960.tif 000002
【０１０１】
NP3、4、および5は、大きなほぼ完全に近い凝集を示したが、これらの凝集体へのDMSOの添加によってはこれらの粒子を可溶化しなかった。
【０１０２】
残りのNP試料を再スピンし、さらなる凝集体を除去した。後の分析、特に金およびペプチド含有量の分析を可能にするために、アリコートを採取した。1つのアリコートを水で500μlとし、日付を入れ、標識した。続いて、HLA提示試験のためにこれらを使用した。
【０１０３】
HLA提示についてのこれらの500μl試料の最終分析は以下の通りであった;
【０１０４】
【表２】
2014527960.tif 000003
【０１０５】
使用されたリガンド比は、2ペプチドが、約100Au原子の各NPに理論的に結合されるべきようなものであり、上記のデータは約6〜8個のペプチド/100Au原子を示唆する。これは、単に、NP結合したペプチドまたはおそらくは結合されたペプチドリガンドのペプチド測定のために使用されたBCA法(およびBSA標準)のアーティファクトであり得た。
【０１０６】
ペプチド含有量の分析は、重要であり、この場合においては複雑であり、BCA法を用いた。あいにく金NPは大きなuv/vis吸光度を示し、そのため、試験試料の実施に加えて、NPのアリコートもまた水中で測定された。BCAアッセイにおいて使用された波長565nmでのこれらの吸光度を決定するために水に対してブランクとした。この吸光度は、試験試料のBCAアッセイ値の約20%に達し、個別に補正した。しかしながら、この補正は、BCA分析に供されたペプチドNPが、BCAの特定成分に加えて、遊離NPについて観察された同じ吸光度をなおも維持することを想定する;これは、まさに純粋な金NPで観察される高い吸光係数と一致している。
【０１０７】
上記の表において、*は、最初は重量に基づき、次に、ペプチドのモル数に変換されるBSA標準に関する定量を指す。**カラムにおいて、個々のペプチドリガンドを標準として用いた。
【０１０８】
遊離型NP結合したペプチドの分離を試みるためのPBS溶出液によるSephadex G-50を用いた最初の分析は、主にNP6を用いて行われ、これは、遊離リガンドがNP調製物をほとんど/全く汚染していないことを示唆する。ヨウ素を用いて全てのNP結合したリガンドを放出させ、ヨウ素は、図1について、画分16+において出現し始めた。
【０１０９】
次に、ヨウ素処理前後でNPのより大きな画分サイズと同量を用いた。画分10におけるピークでは、ヨウ素はペプチド溶出物を放出し、この材料は、標準ペプチドよりも小さいようであり、これは、おそらく、後者は酸化/二量化されているためである。また、個々の補正は、NP6からの非ペプチド性の吸光度について適用され、曲線下のほぼ同等の領域が、補正されたNP6とNP6+ヨウ素について得られた。
【０１１０】
NP8および12の生成
NP8および12は上記方法によって首尾よく生成された。以下に与えられる定量は、続いて用いられた500μlの試料を表し、順に、(全調製物の60%)である;
【０１１１】
【表３】
2014527960.tif 000004
【０１１２】
NP2-5の繰り返し生成
NPの2-5は、合成段階において95%ではなく75%のメタノールを用いる変更によって生成された。NP2は従前のように「通常の」NPを生成し、以前のようにNP3、4、および5は凝集体を形成した。これらの凝集体は、水、10%酢酸、PBS、DMSO、DMFにおいて可溶性でなかった。しかしながら、300mMのNaOHは全NP可溶化をもたらした。
【０１１３】
追加の合成は、あらゆる遊離ペプチドを除去するためにSephadex G-50を用いて行われた。これらのNPは、以下の変更以外は上記と同様に行われた。
【０１１４】
遊離ペプチドは、MeOHに十分に可溶性ではなかった。そこで、2mlのMeOHに加えて、100μlの水を添加し、P8についてはさらに70μlの1MNaOH、およびP9についてはほんの20μlのNaOHをプラスし、これは、完全なペプチドの可溶化を行うために必要とされた。NaOHは、NP合成に適合し、水とアルカリは、ホウ化水素還元後の最終MeOH%を減少させ、NP8およびNP9のそれぞれについて82および83.5%であった。
【０１１５】
過剰の洗浄工程は、還元後であるがビバスピン前の初期スピンダウン後に含まれた。これは、2ml MeOHと100μlの1MNaClを用いて行われた。
【０１１６】
ビバスピン後、各調製物の半分をSephadex G-50カラムに供し、PBSで溶出し、画分を回収し、アリコートをBCAによってタンパク質について測定した。主要なタンパク質性ピークの狭いプールをプールして、次に、再度、水洗浄を伴うビバスピンに供し、溶媒変化を行った。
【０１１７】
NP調製物を半分だけG-50に通過させ、得られたプロファイルとプールは、遊離ペプチドが本質的にないことが見出された。NPの茶色の着色は、画分12まで視覚的に見ることができ、別のランにおいて、50μlの保存調製物を同じ条件下で再実施し、515nmの吸光度を測定した(遊離ペプチドではなくAu NPを検出する)。これは、NPがG-50カラムから排出されていくかどうかの指標となる。
【０１１８】
最終のプールされた材料は以下の仕様を有する。
【０１１９】
【表４】
2014527960.tif 000005
【０１２０】
理論値は、44個のリガンド/100個のAu、NPの形成とAu回収時点での2つのリガンド間のランダムな競合を想定することによって決定される。
【０１２１】
ヨウ素を用いたNPリガンドの放出
NP9のアリコートを4倍体積過剰な1M KIと混合し、4℃にて4日間放置し、完全なリガンド放出をもたらした。4日後、材料を遠心分離し、透明な上清をG-50に通過させ、画分を回収し、BCAによってアッセイした。KIアッセイした後のNP9の量は、NP単独について用いられたものの正確に2倍であり(1.1の補正はアッセイ間の吸光度の違いのために適用した)、領域はほぼ正確に2:1であることが見出され、これは、リガンドを完全に除去したことを示唆する。放出されたリガンドの量は、2つのアッセイ;クーマシーおよびBCAを用いて定量化され、2つの標準ペプチド9とBSAを共に使用し、以下の表にした。
【０１２２】
【表５】
2014527960.tif 000006
【０１２３】
表中のデータは、全調製物について期待された全収率まで補正された。
【０１２４】
結論として、ペプチド含有NPが合成された。ペプチドNPは、Sephadex G-50ゲルろ過クロマトグラフィーの単純使用によって、汚染している遊離ペプチドが本質的にない。ヨウ素を用いてNP結合したペプチドを首尾よく放出させ、定量的な収率データを与えた。
【０１２５】
(実施例2)
提示アッセイの評価
T細胞受容体(TCR)は、Tリンパ球の表面上にあり、主要組織適合性複合体(MHC)との関連でペプチドを認識する(1)。一般的に、抗原提示細胞(APC)は、タンパク質を処理し、空のMHCにそれらを積載する機構を含有する。CD4+ T細胞はMHCクラスII(MHCII)を認識するが、一方、CD8+ T細胞はMHCクラスI(MHCI)に反応する。通常、MHCIIペプチドは、細胞外環境のエンドサイトーシスされた成分に由来する。対照的に、MHCIは、細胞内の供給源から処理されたペプチドを積載する(1,2)。
【０１２６】
SIINFEKL(配列番号2)は、オボアルブミン(OVA)に由来するペプチドエピトープであり、H-2Kbと呼ばれるマウスMHCI対立遺伝子と関連して提示される(3)。OVAがH-2Kbを発現するマウス細胞において発現される場合、SIINFEKLは、通常提示される。しかしながら、OVAが外因的に供給される場合、SIINFEKLは、MHCI交差提示として知られている代替プロセスによって提示され得る(4,5)。実際に、OVAで免疫されたハプロタイプが一致したマウスは、SIINFEKL(配列番号2)に対する免疫優性応答を生じる。
【０１２７】
したがって、多くの試薬は、従来と代替のMHCI提示をさらに理解する目的で、このペプチドの提示をアッセイするために開発されている。これらの試薬は、ナノ粒子におけるペプチドの潜在的な化学結合を用いて実験するために利用することができる。このようにして、どの結合がマウス細胞株において最も容易に処理されるかを見出すができる。
【０１２８】
結果および検討
提示の指標としてのフローサイトメトリー
ナノ粒子へのエピトープ結合を分析するために、本発明者らは、最初に、ナノ粒子から放出されるエピトープの提示について読み取りアッセイを最適化した。この目的のために、LKb細胞におけるSIINFEKL提示を評価した。前述したように、2つ以上の試薬が存在する。試験した2つの方法のうち、1つはフローサイトメトリーベースであり、他方は、細胞ベースである。フローサイトメトリーベースの方法は、様々な量のSIINFEKLペプチドでLKb細胞をパルスすることから開始する。表面Kb分子へのペプチド結合について十分な時間を与えた後、細胞を洗浄し、SIINFEKL:Kb複合体に特異的である25.D1.16抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を二次的に標識し、フローサイトメトリー解析に供し、バックグラウンド読み取りとしてパルスしていない細胞を用いた。細胞はわずか5ng/mLでパルスしたとき、この方法は、表面複合体を検出したことが見出された。
【０１２９】
抗原提示の指標としてのT細胞活性化
エピトープ特異的抗原提示の別の形態は、MHCIペプチド複合体によるT細胞活性化の測定である。ここでは、本発明者らは、Kbとの関連でSIINFEKLを認識するB3Z(OVAペプチド特異的T細胞株)を用いた。便利な指標として、このT細胞株は、NFATプロモーターでクローン化されたβ-ガラクトシダーゼを含有する。ペプチド認識およびT細胞の活性化により、β-ガラクトシダーゼが発現され、検出可能な基質の変換は、T細胞への抗原提示の優れた指標として役立つ。
【０１３０】
この方法を評価するために、本発明者らは上記と同様の実験を行った。LKb細胞をSIINFEKLペプチドでパルスし、洗浄し、次に、B3Z T細胞株とともに一晩、共インキュベートした。翌日、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼを発光基質を用いて測定した。期待されたように、この方法の分解能は従来の方法に類似し、検出限界は約5ng/mLであった。
【０１３１】
したがって、両方の方法は、ほぼ同じ分解能を示し、ナノ粒子-ペプチド構築物の評価における使用のために選択された。
【０１３２】
材料と方法
細胞株
LKb細胞はマウス線維芽細胞であり、初代株を使用した。具体的には、これらは、マウスH-2Kbの分子を安定して発現するL929細胞である。
【０１３３】
合成ペプチド
合成SIINFEKL(OVA257-264)(配列番号2)ペプチドをGenscript USA(Piscataway、NJ)から購入した。ペプチドはDMSO中で5mg/mLとなるように再懸濁され、図に示された濃度で細胞にパルスされた。
【０１３４】
T細胞ハイブリドーマ
SIINFEKL:Kb特異的Tハイブリドーマ(B3Z)は、ペプチド-MHCクラスI複合体の認識によりβ-ガラクトシダーゼを発現し、以前に記載されている(3,6)。T細胞ハイブリドーマは、完全RPMI+10%FCSおよび0.05mMの2-ME中で維持された。活性化は、製造業者の使用説明書に従って、発光基質Galactolight Plus(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して測定された。光強度は、TopCount NXTプレートリーダー(Perkin Elmer、Waltham、MA)を用いて測定された。
【０１３５】
フローサイトメトリー
LKb細胞を、様々な量のSIINFEKL(配列番号2)ペプチドで処理し、2時間インキュベーション後、細胞を回収し、PBSで1回洗浄し、次に、氷上で25.D1.16培養上清(H-2Kbに複合化したSIINFEKLに特異的なモノクローナル抗体)(7)とともに1時間インキュベートした。その後、細胞をPBS中で2回洗浄し、FITC標識したヤギ抗マウスIgG二次抗体(Caltag Laboratories、Burlingham、CA)とともに氷上で30分間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、Guava EasyCyte Plus Flow Cytometer (Millipore、Billerica、MA)でのフローサイトメトリーのためにPBS+.1%BSA中に再懸濁し、添付のソフトウェアを用いて分析した。
【０１３６】
抗原提示アッセイ
フローサイトメトリーまたは細胞ベースの方法を用いてSIINFEKL(配列番号2)提示をアッセイするために、本発明者らは、15mLの円錐内で37℃にて2時間、LKb細胞をパルスした。このインキュベーション後、細胞をPBSで1回洗浄し、次に、フローサイトメトリーを用いた検出に供し、または1:1のエフェクター対標的比でB3Z細胞に添加した。
【０１３７】
(参考文献)
2014527960.tif 000007
【０１３８】
(実施例3)
ナノ粒子-ペプチド提示アッセイ
下記に列挙された試験リガンドは、上記のリンカー化学によって、構成され、金ナノ粒子(GNP)に結合された。
1.SIINFEKL(配列番号2)
2.SIINFEKL-N-(CH2)2-SH
3.FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH(配列番号3)
4.FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH(配列番号4)
5.AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH(配列番号5)
6.HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL
7.HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL
8.HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL
9.HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL
10.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL
11.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL
12.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL
13.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL
【０１３９】
SIINFEKL(配列番号2)は、マウスMHCI分子H-2Kbとの関連で提示されているオボアルブミンに由来するエピトープであり、2つの方法を用いて測定された。1つの方法は、SIINFEKL/MHCI複合体を認識する、「Angel」とも呼ばれる25.D1.16と称されるTCR様抗体を利用した。加えて、本発明者らは、NFAT(CTLシグナル伝達分子)プロモーター下でβ-ガラクトシダーゼ(活性化時に、発光基質によって測定されるβ-galを発現する)を発現するB3Z、SIINFEKLペプチド特異的CTLハイブリドーマを用いて提示を評価した。
【０１４０】
A.GNPの分析
GNPと関連付けられたSIINFEKLを処理し、提示する細胞の能力評価するために、本発明者らは、L-Kbマウス線維芽細胞を使用した。図1に示されるように、GNP8、9、12、および13は、良好なプロセッシングおよび提示を示した。これは、フローサイトメトリー(図1A〜図D-プロセッシング)とCTLベースの方法(図1E-提示)の両方についての場合であることを見出した。このようにして、FLAAYSIINFEKL(配列番号4)およびAAYSIINFEKL(配列番号5)は、優れたインビトロでのSIINFEKL(配列番号2)プロセッシングを示した(下線部はリンカーのペプチド部分を示す)。また、図1Eに説明されるように、HS-(CH2)10-(CH20CH2)7-CONH化学は、HS(CH2)2-CONHよりも良好に処理されることが見出された。しかしながら、HS(CH2)2-CONHは、非常に効率的に処理されることもさらに見出された。加えて、本発明者らは、0.01μg/mLでは検出されない提示の用量依存的減少に留意する。
【０１４１】
B.遊離ペプチドの分析
ナノ粒子の試料に存在する任意の遊離ペプチドの可能な効果を考慮することは重要であった(図2A〜図B)。したがって、本発明者らは、各調製物からの対応する遊離ペプチドが、どのようにして効率的に提示されるかを評価した。先の実験と同様に、LKb細胞は、GNPまたは遊離ペプチドの3つの濃度で2時間パルスされた。提示は、フローサイトメトリー(図2C〜図F)またはB3Zアッセイ(図2G〜図H)によって評価された。これらの結果から、本発明者らは、遊離ペプチドが十分に提示されていると推定した。最後に、本発明者らは、プロセッシングがこれらの遊離ペプチドの提示に必要であるかどうかを試験しようと試みた。試験は、37℃と比較して、氷上でペプチドのパルスを必要とする。37℃にて、細胞はペプチドを取り込み、エンドソーム内でこれを処理することができる。しかしながら、氷上では、ペプチドは、プロセッシングなしの表面に積載され得るだけである。実際に、本発明者らは、リンカーを有する遊離ペプチドは概してプロセッシングを必要とし、一方、リンカーを持たないペプチドはいずれのプロセッシングもなしに提示され得る(図2I〜図N)ことを観察した。
【０１４２】
C.遊離ペプチドを欠いた調製物の分析
遊離ペプチドを汚染する可能性のある影響を実証する結果を考慮すると、精製された調製物を作製した。精製は、全ての遊離ペプチドを除去するSephadex G-50カラムを用いたGNP(8および9)で行った(図3A〜図B)。最後に、上記の実験は、同じアッセイにおいて従来および新しい調製物を用いて繰り返された。本発明者らは、2時間のインキュベーションを一晩に延長し、これは、SIINFEKL提示には十分であることが示されている(データを示さず)。フローサイトメトリー分析により、本発明者らは、ペプチドを含有する試料とまさに同程度に、遊離ペプチドを欠いた試料が作用することを観察した(図3C〜図E)。次に、これらの結果は、B3Zアッセイを用いて確認された(図3F)。したがって、GNP8および9は、MHCIの提示のために抗原提示細胞へのペプチド送達に実施可能なオプションとして役立つことは明らかである。
【０１４３】
D.結論
・GNP8、9、12、および13は処理され、他と比較して非常に良好に提示される。
・これは、インビトロでのSIINFEKL(配列番号2)提示にとって最善である配列FLAAYSIINFEKL(配列番号4)およびAAYSIINFEKL(配列番号5)に対応する(リンカーのペプチド部分を下線で示す) 。
・HS-(CH2)10-(CH20CH2)7-CONH化学は、HS(CH2)2-CONHよりも良好に処理される。しかしながら、HS(CH2)2-CONHはまた十分に処理され、費用効率がより高い。
・汚染している遊離ペプチドが提示を生じさせ得る。
・遊離ペプチドを欠いている新しい調製物はまた、処理され、十分に提示される。
・これは、GNP8および9が、SIINFEKL(配列番号2)の提示のために効率的に処理されることを示唆する。
【０１４４】
本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、あらゆる目的において、個々の出版物または特許もしくは特許出願のそれぞれが、具体的および個別に、参照によりその全体が組み込まれるものとして示されるのと同等に組み込まれる。
【０１４５】
本明細書に記載の特定の実施形態は、限定を目的とせず、例示を目的として示される。本明細書におけるいずれの副題も、利便性のみを目的として含まれ、いかなる様式でも、本開示を制限するものとして解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2014527960.tif 000008
【図１Ｂ】
2014527960.tif 000009
【図１Ｃ】
2014527960.tif 000010
【図１Ｄ】
2014527960.tif 000011
【図１Ｅ】
2014527960.tif 000012
【図２Ａ】
2014527960.tif 000013
【図２Ｂ】
2014527960.tif 000014
【図２Ｃ】
2014527960.tif 000015
【図２Ｄ】
2014527960.tif 000016
【図２Ｅ】
2014527960.tif 000017
【図２Ｆ】
2014527960.tif 000018
【図２Ｇ】
2014527960.tif 000019
【図２Ｈ】
2014527960.tif 000020
【図２Ｉ】
2014527960.tif 000021
【図２Ｊ】
2014527960.tif 000022
【図２Ｋ】
2014527960.tif 000023
【図２Ｌ】
2014527960.tif 000024
【図２Ｍ】
2014527960.tif 000025
【図２Ｎ】
2014527960.tif 000026
【図３Ａ】
2014527960.tif 000027
【図３Ｂ】
2014527960.tif 000028
【図３Ｃ】
2014527960.tif 000029
【図３Ｄ】
2014527960.tif 000030
【図３Ｅ】
2014527960.tif 000031
【図３Ｆ】
2014527960.tif 000032
【配列表】
2014527960000001.app
【国際調査報告】
2014527960.tif 000033
2014527960.tif 000034
2014527960.tif 000035
2014527960.tif 000036