(57)【要約】  スクロースからのポリ（α１，３グルカン）の酵素による調製のための方法が、開示される。唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ酵素（ｇｔｆＪ）は、スクロースをフルクトースおよびポリ（α１，３グルカン）に変換するために使用される。ｇｔｆ酵素の副産物であるフルクトースを絶え間なく除去し、したがって、ポリ（α１，３グルカン）リットルを増加させる半透膜の適用が、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
半透膜によって分離される２つのチャンバーを含む反応系において、ポリ（α１，３グルカン）を産生するための方法であって、
ａ）第１のチャンバーが、
ｉ）スクロースと、
ｉｉ）少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素と
を含む酵素反応溶液を含み、
ｂ）第２のチャンバーが、前記酵素反応溶液に接する半透膜によって、前記第１のチャンバーから分離され、前記半透膜が、フルクトースに対して透過性であるが、ポリ（α１，３グルカン）に対して不透過性であり、前記第１のチャンバー内部に、ポリ（α１，３グルカン）および前記少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素を保持しながら、フルクトースおよび他の低分子量成分の絶え間ない除去を促進する、方法。
【請求項２】
前記酵素反応溶液が、２０℃〜２５℃の温度で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのプライマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記半透膜が、１リットル当たり３０グラム〜１リットル当たり２００グラムの範囲にわたる濃度まで、ポリ（α１，３グルカン）の蓄積を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記半透膜が、１２，０００〜１００，０００ダルトンの分画分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記半透膜が、透析チューブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、連鎖球菌に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、ｇｔｆＪ、ｇｔｆＢ、ｇｔｆＣ、およびｇｔｆＩからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来のものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、ｇｔｆＪである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのプライマーが、デキストランである、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、プライマー非依存性の酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、プライマー依存性の酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
１つを超えるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、前記酵素反応溶液中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つを超えるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも１つのプライマー依存性の酵素および少なくとも１つのプライマー非依存性の酵素の混合物を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造多糖の産生の分野に関する。詳細には、本発明は、酵素反応を介しての、ポリ（α１，３グルカン）の産生に関する。より詳細には、本発明は、酵素反応の間に形成されるポリ（α１，３グルカン）の力価を増加させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
自然のプロセスによってβ（１，４）グリコシド連結を介してグルコースから形成される多糖であるセルロース（非特許文献１）は、それに由来する有用な産物が多くあることの結果として、繊維として商業的に有名になった。特に、天然に存在するセルロースの高純度形態である綿は、繊維素材への応用におけるその有益な特質についてよく知られている。
【０００３】
セルロースは、溶液中で十分な鎖伸長および骨格剛性を示し、液状の結晶性の溶液を形成する（特許文献１）。しかしながら、十分な多糖鎖伸長は、主として、β（１，４）連結多糖においてこれまで実現されてきた。グルカン多糖ファミリーにおけるその骨格幾何学的配置からのあらゆる著しいずれは、規則正しいリオトロピック（ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ）相の形成に必要とされる比未満に、分子のアスペクト比を低下させる。そのうえ、綿およびレーヨンなどのような重要な市販のセルロース系繊維は、土地利用および環境上の痕跡に関して、持続性についての問題をますます提起していることがよく知られている。
【０００４】
そのため、再生可能な資源から低コストの構造材料を産生することが現在、主として重要視されているという理由で、フィルム、繊維、および樹脂において実用性を有する、他のグルコースベースの多糖を発見することは、非常に望ましいことである。そのうえ、そのようなポリマーは、それらの全ライフサイクルを通じて、環境上やさしい材料を提供する。
【０００５】
α（１，３）グリコシド連結を有することによって特徴付けられるグルカンポリマーであるポリ（α１，３グルカン）は、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆＪ）酵素とスクロースの水溶液を接触させることによって単離された（非特許文献２）。グルカンは、グリコシド結合によって連結されたＤ−グルコース単量体から構成される多糖を指す。ポリ（α１，３グルカン）から調製されるフィルムは、１５０℃までの温度に耐え、β（１，４）連結多糖から得られるポリマーにまさる利点をもたらした（非特許文献３）。
【０００６】
特許文献２は、ヘキソース単位を含む多糖繊維の調製を開示し、ポリマー内のヘキソース単位の少なくとも５０％は、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のグルコシルトランスフェラーゼ酵素ｇｔｆＪを使用して、α（１，３）グリコシド連結を介して連結された。開示されるポリマーは、それが、溶媒または溶媒を含む混合物中で臨界濃度超で溶解された場合、液状の結晶性の溶液を形成した。この溶液から、繊維素材において使用するに非常に適した、切れ目がなく、強く、綿様の繊維が、紡糸され、誘導体化形態でまたは非誘導体化（再生）形態のいずれかとして使用された。特許文献２におけるポリ（α１，３グルカン）は、バッチプロセスにおいて作製され、ポリ（α１，３グルカン）力価は、典型的に、１リットルの反応器容積当たり、２５グラム未満のポリ（α１，３グルカン）であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，５０１，８８６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０００，０００号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆ．Ｈａｐｐｅｙ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｅ．Ａｔｋｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９
【非特許文献２】Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４１：１４５１−１４６０，１９９５
【非特許文献３】Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｂｅｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４７：３５３−３６２，１９８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
酵素反応によって形成されるポリ（α１，３グルカン）の力価を増加させるための方法を開発することは、望ましいものとなり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、繊維、フィルム、およびパルプにおいて応用するための、再生可能な原材料からのポリ（α１，３グルカン）の産生のための方法である。ポリマーは、触媒としての組換えグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆＪ）酵素および基質としてのスクロースを使用して、ワンステップ酵素反応において直接作製される。
【００１１】
一態様において、開示される本発明が、半透膜によって分離される２つのチャンバーを含む反応系において、ポリ（α１，３グルカン）を産生するための方法であって、
ａ）第１のチャンバーが、
ｉ）スクロースと、
ｉｉ）少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素と
を含む酵素反応溶液を含み、
ｂ）第２のチャンバーが、酵素反応溶液に接する半透膜によって、第１のチャンバーから分離され、半透膜が、フルクトースおよび他の低分子量成分に対して透過性であるが、ポリ（α１，３グルカン）に対して不透過性であり、第１のチャンバー内部に、ポリ（α１，３グルカン）および少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素を保持しながら、フルクトースおよび他の低分子量成分の絶え間ない除去を容易にする、方法である。
【００１２】
他の態様において、開示される本発明は、１リットル当たり３０〜２００グラムの力価のポリ（α１，３グルカン）が、少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素によってスクロースから産生される方法である。
【００１３】
ＤＮＡ配列の説明
配列番号１は、大腸菌における発現のためにコドン最適化された、成熟グルコシルトランスフェラーゼの合成遺伝子の配列である。
【００１４】
配列番号２は、プラスミドｐＭＰ５２についてのＤＮＡ配列である。
【００１５】
配列番号３は、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２５９７５）由来の成熟グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆＪ酵素；ＥＣ  ２．４．１．５；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＡ２６８９６．１）のＤＮＡ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ポリ（α１，３グルカン）は、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のｇｔｆＪ酵素を使用して、スクロースなどのような再生可能な資源から酵素により産生することができる、低コストになり得るポリマーである。α（１，３）グリコシド連結を有するヘキソース単位を含む、選択されたポリマーは、ポリマーがある条件下で溶媒中に溶解された場合に、規則正しい液状の結晶性の溶液を形成することができることが示された。（米国特許第７，０００，０００号明細書）。さらに、そのような溶液は、紡糸され、切れ目がなく高強度の綿様の繊維にすることができる。米国特許第７，０００，０００号明細書において、バッチ酵素反応は、ｇｔｆＪによる、スクロースの、ポリ（α１，３グルカン）への変換のために用いられ、副産物であるフルクトースおよびロイクロースが、反応器中に蓄積した。蓄積されたフルクトースは、酵素反応の間にグルコシル成分と競合することが知られているので、ポリ（α１，３グルカン）への利用可能なグルコースの変換は、その結果として妨げられ、したがって、単位反応器容積（ｕｎｉｔ  ｒｅａｃｔｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）当たりの所望の産物の最終力価を制限してしまう。
【００１７】
本明細書において使用される用語「ロイクロース」は、α（１，５）結合によって連結された、グルコースおよびフルクトースからなる二糖を指す。
【００１８】
本明細書において使用される用語「グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素」は、ポリ（α１，３グルカン）を合成するためにスクロースのグリコシド結合の高自由エネルギーを利用する、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）などのような口腔ストレプトコッカスによって分泌される酵素を指す。グリコシド結合は、２つの単糖をつないで、二糖を形成することができる。グリコシド結合は、αまたはβ立体配置をとることができ、たとえば、α（１，２）、α（１，３）、α（１，４）、α（１，６）、β（１，２）、β（１，３）、β（１，４）、またはβ（１，６）連結を生成することができる。本明細書において使用される用語「α（１，３）グリコシド連結」は、隣接するグルコース環どうしの環炭素１および３を通してグルコース分子を互いにつなぐ一種の共有結合を指す。
【００１９】
本明細書において使用される用語「ポリ（α１，３グルカン）」は、α（１，３）グリコシド連結を介してグルコース単位を連結することから結果として生じる多糖分子から得られる高分子量線状高分子を指す。
【００２０】
本発明は、１つまたは複数のｇｔｆ酵素を使用する酵素反応においてスクロースから産生される多糖、ポリ（α１，３グルカン）の力価を増加させるための方法に関する。用語「酵素反応」は、ｇｔｆ酵素によって実行される反応を指す。本発明の「酵素反応溶液」は、一般に、スクロースをポリ（α１，３グルカン）に変換するために、スクロースおよび場合により１つまたは複数のプライマーを含むバッファー溶液中に少なくとも１つのｇｔｆ酵素を含む反応混合物を指す。
【００２１】
本発明において使用されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、任意のｇｔｆ酵素とすることができる。使用されるｇｔｆ酵素は、任意の連鎖球菌由来ものとすることができる。適したｇｔｆ酵素は、たとえば、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のｇｔｆＪ、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来のｇｔｆＢおよびｇｔｆＣ、ならびにストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ）由来のｇｔｆＩとすることができる。特に、ストレプトコッカスは、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）とすることができる。より詳細には、ｇｔｆ酵素は、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のｇｔｆＪ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．５）酵素とすることができる。
【００２２】
一実施形態において、酵素反応溶液が、本明細書において記載される１つのｇｔｆ酵素のみを含むことができる。他の実施形態において、酵素反応溶液が、１種類を超えるｇｔｆ酵素の組み合わせを含むことができる。
【００２３】
本発明の目的のために、十分な量のｇｔｆＪ酵素は、実施例において記載されるように、ｇｔｆＪの産生のために組換え大腸菌株を使用して産生することができる。コドン最適化遺伝子の設計および大腸菌における発現のための方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００２４】
組換え微生物の増殖のための方法は、当技術分野においてよく知られている。本発明の反応を実行するための、所望のｇｔｆ酵素を発現する組換え微生物は、たとえば、くぼみ（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）ありおよびなしの様々な種類のフラスコ、密閉し、かつ温度をコントロールすることができる任意のオートクレーブ可能な容器、または任意の種類の発酵槽などのような、任意の容器中で増殖させることができる。一実施形態において、本発明におけるポリ（α１，３グルカン）産生のためのｇｔｆＪ酵素の産生が、発酵槽において、ｇｔｆＪ酵素を発現する組換え大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＭＰ５２を増殖させることによって実現することができる。
【００２５】
本発明において、スクロースの、ポリ（α１，３グルカン）への変換のために触媒として使用される唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のｇｔｆＪ酵素は、プライマー依存性のｇｔｆ酵素である。本出願において言及されるプライマー依存性のｇｔｆ酵素は、ポリ（α１，３グルカン）合成の間に酵素のためのプライマーとして作用するための、酵素反応溶液中の開始分子の存在を必要とするｇｔｆ酵素を指す。したがって、「プライマー」は、用語が本明細書において使用されるように、プライマー依存性のグルコシルトランスフェラーゼのためのイニシエータとして作用することができる任意の分子を指す。他の多くのグルコシルトランスフェラーゼは、プライマー非依存性の酵素である。プライマー非依存性の酵素は、反応を実行するためにプライマーの存在を必要としない。本発明の目的のために、プライマー非依存性の酵素および／またはプライマー依存性のｇｔｆ酵素のいずれかまたは両方は、ポリ（α１，３グルカン）合成の間に同じ酵素反応系において使用することができる。
【００２６】
ｇｔｆＪは、プライマー依存性の酵素である。本発明において、複雑な分岐グルカンであるデキストランを、ｇｔｆＪ酵素のためのプライマーとして使用した。ｇｔｆは、プライマー依存性の酵素であるが、この酵素による、スクロースの、ポリ（α１，３グルカン）への変換はまた、プライマーの非存在下においても行うことができる。
【００２７】
唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のｇｔｆＪ酵素による、ポリ（α１，３グルカン）の産生は、その副産物であるフルクトースによって阻害される。フルクトースが、酵素反応溶液中に蓄積すると、フルクトースは、おそらく、利用可能なグルコシル成分と競合することによって、酵素によるポリ（α１，３グルカン）の産生を阻害し得、これは、二糖であるロイクロースの形成をもたらす。本発明において、フルクトースのｇｔｆＪに対する影響を低下させるために、酵素反応溶液中のフルクトースは、絶え間なく除去し、酵素反応溶液において阻害性のレベルまでそれが蓄積するのを予防することができる。本発明の目的のために、反応系は、１つまたは複数のｇｔｆ酵素、１つまたは複数のプライマー、およびスクロースを含む、第１のチャンバー中に含有される酵素反応溶液を、第２のチャンバー中に含有される、包囲バッファーから分離する半透膜を含むことができる。本明細書において使用される用語「チャンバー」は、酵素反応溶液または酵素反応溶液の産物を保持することができる任意の容器を指す。チャンバーは、ガラス、プラスチック、金属、フィルム、膜、または酵素反応溶液を保持することができる任意の他の種類の不活性材料から作製することができる。本明細書において使用される用語「半透膜」は、いくつかの他の分子を保持しながら、拡散によって、ある分子またはイオンの通過を可能にするであろう膜を指す。本質的に、酵素およびポリ（α１，３グルカン）を保持しながら、フルクトースおよび他の低分子量成分が通過するのを可能にするであろう、１２，０００〜１００，０００ダルトンの分子カットオフを有する任意の半透膜は、本発明における使用に適し得る。本明細書において使用される用語「他の低分子量成分」は、酵素反応溶液中に存在し得る、１０００ダルトン未満の分子量を有する様々な化合物を指す。第１のチャンバー中に含有される酵素反応溶液からの副産物フルクトースの除去により、ロイクロース形成を低下させることができる。本発明の一実施形態において、透析チューブが、酵素反応溶液から副産物フルクトースを除去するために半透膜として使用することができる。
【００２８】
本発明については、酵素反応溶液は、２０℃〜２５℃に維持することができる。
【００２９】
本発明は、繊維、フィルム、およびパルプを含む、様々な応用のために、容易に再生可能なスクロース原材料から経済的に得ることができる低コスト材料としてのポリ（α１，３グルカン）の産生を提供する。特に、ポリ（α１，３グルカン）繊維は、たとえば、綿および再生セルロース繊維の実用的な代わりになり、前述の在任者（ｉｎｃｕｍｂｅｎｔ）と比較して、最小限の環境に対する打撃しか有さず、かつ優れた持続性を有する、新しい織物用繊維がもたらされるであろうということが期待される。
【実施例】
【００３０】
本明細書において開示される組成物および方法の有利な特質および効果は、下記に記載される実施例から、より十分に評価することができる。実施例が基礎を置く方法の実施形態は、代表的なものに過ぎず、本発明を例証するためのそれらの実施形態の選択は、これらの実施例において記載されない材料、構成成分、反応物、条件、仕様、ステップ、もしくは技術が、これらの方法の実施に適さないということまたはこれらの実施例において記載されない主題が、添付される請求項およびその均等物の範囲から除外されるということを示すものではない。
【００３１】
材料
透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ  ２５２２５−２２６、１２０００分子量カットオフ）は、ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から購入した。
【００３２】
デキストランおよびエタノールは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。スクロースは、ＶＷＲから購入した。
【００３３】
Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ７１５３消泡剤は、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から購入した。
【００３４】
他のすべての化学物質は、そのような化学物質について、一般に利用されている供給者から購入した。
【００３５】
シード培地
発酵槽のためのスターター培養物を増殖させるために使用するシード培地は、酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｘ  ６９５、１リットル当たり５．０グラム（ｇ／Ｌ））、Ｋ２ＨＰＯ４（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）、およびクエン酸鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含有した。培地のｐＨは、５Ｎ  ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４を使用して、６．８に調節し、培地は、フラスコ中で滅菌した。滅菌後、添加物として、グルコース（５０％ｗ／ｗ溶液の２０ｍＬ／Ｌ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ原液の４ｍＬ／Ｌ）を含んだ。
【００３６】
発酵槽培地
発酵槽において使用する増殖培地は、ＫＨ２ＰＯ４（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ａｍｂｒｅｘ  ６９５，５．０ｇ／Ｌ）、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ７１５３消泡剤（１リットル当たり０．２５ミリリットル（ｍＬ／Ｌ））、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（１０ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有した。ＮＩＴ微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）、およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。滅菌後、添加物として、グルコース（５０％ｗ／ｗ溶液の１２．５ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ原液の４ｍＬ／Ｌ）を含んだ。
【００３７】
実施例１
グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆＪ）酵素発現株の構築
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受入Ｍ６４１１１．１）において報告される唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２５９７５）由来の成熟グルコシルトランスフェラーゼ酵素（ｇｔｆＪ；ＥＣ  ２．４．１．５）をコードする遺伝子は、大腸菌における発現のために最適化したコドンを使用して合成した（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）。その核酸産物（配列番号：１）は、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）の中にサブクローニングし、ｐＭＰ５２（配列番号：２）として同定されるプラスミドが生成された。プラスミドｐＭＰ５２は、大腸菌ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６ＴＭ）を形質転換するために使用し、ＭＧ１６５５／ｐＭＰ５２として同定される株が生成された。グルコシルトランスフェラーゼ酵素発現株の構築に使用される手順はすべて、当技術分野においてよく知られており、過度の実験作業を伴わないで当業者らによって実行することができる。
【００３８】
実施例２
発酵における組換えｇｔｆＪの産生
発酵槽における組換えｇｔｆＪ酵素の産生は、実施例１において記載されるように構築した、ｇｔｆＪ酵素を発現する大腸菌株ＭＧ１６５５／ｐＭＰ５２のプレシード培養物を調製することによって開始した。１０ｍＬ一定分量のシード培地は、１２５ｍＬ使い捨てバッフル付きフラスコの中に追加し、２０％グリセロール中、大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＭＰ５２の１．０ｍＬ培養物を接種した。この培養物は、３時間、３００毎分回転数（ｒｐｍ）で振盪しながら、３７℃で増殖させた。
【００３９】
発酵槽を始動させるためのシード培養物は、２Ｌ振盪フラスコに０．５Ｌのシード培地を装填することによって調製した。１．０ｍＬのプレシード培養物は、フラスコ中０．５Ｌシード培地の中に無菌的に移し、５時間、３７℃および３００ｒｐｍで培養した。シード培養物は、光学濃度５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）＞２で、３７℃の、上記に記載される８Ｌの発酵槽培地を含有する１４Ｌ発酵槽（Ｂｒａｕｎ，Ｐｅｒｔｈ  Ａｍｂｏｙ，ＮＪ）に移した。
【００４０】
大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＭＰ５２の細胞を発酵槽において増殖させ、培地中のグルコース濃度が０．５ｇ／Ｌまで減少したら、グルコース供給（１％ｗ／ｗ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有する５０％ｗ／ｗグルコース溶液）を開始した。供給は、毎分０．３６グラムの供給量（ｇ供給量／分）で始め、毎時、それぞれ、０．４２、０．４９、０．５７、０．６６、０．７７、０．９０、１．０４、１．２１、１．４１  １．６３、１．９２、２．２ｇ供給量／分まで次第に増加させた。速度は、その後一定のままとした。培地中のグルコース濃度は、ＹＳＩグルコース分析装置（ＹＳＩ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ）を使用してモニターした。グルコース濃度が０．１ｇ／Ｌを超過した場合、供給速度を一時的に減少させたまたは供給を止めた。細胞が７０のＯＤ５５０に達したとき、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性の誘発を、９ｍＬの０．５Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクト−ピラノシド）の追加により開始した。溶存酸素（ＤＯ）濃度は、２５％の空気飽和度にコントロールした。ＤＯは、最初、羽根による撹拌速度（４００〜１２００ｒｐｍ）によって、また、その後、エアレーション速度（標準状態での１分あたりの流量２〜１０リットル（ｓｌｐｍ））によってコントロールした。ｐＨは、６．８にコントロールした。ＮＨ４ＯＨ（１４．５％重量／容積（ｗ／ｖ））およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）を、ｐＨのコントロールに使用した。背圧は、０．５バールで維持した。様々な間隔（２０、２５、および３０時間）で、５ｍＬのＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ７１５３消泡剤を、泡立を抑制するために発酵槽の中に追加した。細胞は、ＩＰＴＧ追加の８時間後に、遠心分離によって収集し、細胞のペーストとして−８０℃で保存した。
【００４１】
実施例３
細胞のペーストからのＧＴＦＪ粗酵素抽出物の調製
上記得られた細胞ペーストは、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．２中に１５０ｇ／Ｌで懸濁し、スラリーを調製した。スラリーは、１２，０００ｐｓｉでホモジナイズし（Ｒａｎｎｉｅ型のマシン、ＡＰＶ−１０００またはＡＰＶ  １６．５６）、ホモジネートは、４℃まで冷却した。ほどよく力強くかき混ぜながら、細胞ホモジネート１リットル当たりに、５０ｇのフロック（ｆｌｏｃ）溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｎｏ．４０９１３８、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０中５％）を追加した。撹拌は、弱めて、１５分間、軽くかき混ぜた。次いで、細胞ホモジネートは、５〜１０℃で、３時間、４５００ｒｐｍでの遠心分離によって浄化した。粗ｇｔｆＪ酵素抽出物を含有する上清は、３０キロダルトン（ｋＤａ）カットオフ膜により濃縮した（およそ５倍）。ｇｆｔＪ酵素溶液中のタンパク質の濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、４〜８ｇ／Ｌであることが決定された。
【００４２】
実施例４
半透膜を使用することによる、ポリ（α１，３グルカン）の力価の改善
本実施例は、スクロースの、ポリ（α１，３グルカン）への変換の間に形成される副産物フルクトースの除去および／または希釈が、ポリ（α１，３グルカン）力価を増加させることを実証する。透析チューブは、それが、チューブの内部から透析チューブの外部までの、酵素反応の間に形成される副産物フルクトースの通過を可能にするので、本実施例における半透膜として使用した。
【００４３】
本実施例における酵素反応溶液は、８Ｌのスクロース原液（表１）、プライマーとして２４ｇのデキストランＴ−１０、および１．０容積％のｇｔｆ酵素を含有した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
４つの個々の透析チューブ（５０ｍＬ容量）を、試験サンプルとして使用し、５０ｍＬの酵素反応溶液を装填し、密閉した。次いで、個々の透析チューブは、包囲バッファーとして様々な容積のスクロース原液（表１）を保持するポリエチレンバケット中につるした。次いで、これらのポリエチレンバケットは、磁性かき混ぜプレート上に置き、７２時間、２０〜２５℃でかき混ぜた。コントロールサンプルは、試験サンプルと同じ割合の、５０ｍＬの酵素反応溶液からなる、蓋の付いた遠心分離管中で調製し、かき混ぜなしで、７２時間、２０〜２５℃の温度で置いておいた。コントロールサンプルは、透析チューブ中にも包囲バッファー中にも置かなかった。
【００４６】
７２時間後、透析チューブ中の試験サンプルを、包囲バッファーから取り出し、チューブを切り開き、ポリ（α１，３グルカン）の固体を、４０マイクロメートルのろ紙にわたる３２５メッシュスクリーンを使用してブフナー漏斗上で収集した。ろ過ケークは、脱イオン水中に再懸濁し、上記のようにさらに２回以上ろ過し、残存しているスクロース、フルクトース、および他の低分子量で可溶性の副産物を除去した。最後に、メタノールによるさらなる２回の洗浄を実行した。ろ過ケークは、漏斗上で徹底的に押し固め、室温で真空下で乾燥させた。コントロールサンプルにおいて形成されたポリ（α１，３グルカン）もまた、単離し、重さを量った。試験およびコントロールサンプル中のポリ（α１，３グルカン）の形成は、公的に入手可能な情報を使用して確認した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８：８６８−８７２，２００４）。試験およびコントロールサンプルから、ｇｔｆＪ酵素による、スクロースの、ポリ（α１，３グルカン）への変換後に得られるポリ（α１，３グルカン）の結果として生じる乾燥重量を、表２に示す。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
上記の結果は、酵素反応溶液を透析チューブ中に置き、かつ透析チューブの内部から外部への、副産物フルクトースの絶え間ない通過を可能にし、したがって、チューブの内部で、酵素によって形成されるフルクトースの濃度を希釈する包囲バッファー中に置いた場合に、ポリ（α１，３グルカン）の力価が、有意に増強されたことを明確に示す。最高のポリマー力価は、副産物フルクトースのより高度な希釈をもたらすことができる、より大きな容積の包囲バッファーで得られた。
【００４９】
実施例５
定期間隔で形成されるポリ（α１，３グルカン）の量の決定
３Ｌのスクロース原液（表１）に、プライマーとして９ｇのデキストランＴ−１０および２．０％容積％のｇｔｆを追加し、酵素反応溶液を調製した。
【００５０】
７つの個々の透析チューブを試験サンプルとして使用し、５０ｍＬの酵素反応溶液を装填し、密閉した。次いで、個々の透析チューブは、包囲バッファーとして３Ｌのスクロース原液を含有するポリエチレンバケット中につるした。バケットは、磁性かき混ぜプレート上に置き、７２時間、２０〜２５℃でかき混ぜた。個々の透析チューブは、表３に示す定期間隔で取り出した。実施例４において記載されるように、コントロールサンプルにおいて形成されるポリ（α１，３グルカン）の力価が、７２時間後に変わらずに約０．６ｇであったので、コントロールサンプルは、本実験において使用しなかった。
【００５１】
各定期間隔で、透析チューブ中に形成されたポリ（α１，３グルカン）の固体は、実施例４において記載されるように単離した。様々な時間間隔で酵素反応溶液から得られたポリ（α１，３グルカン）の結果として生じる乾燥重量を、表３に示す。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
上記の結果は、酵素反応がより長い期間（たとえば７２時間）、進行するのを可能にしたので、ポリ（α１，３グルカン）の産生が、有意に増強されたことを明確に示した。
【国際調査報告】
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