(57)【要約】本開示は、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に変異が存在するかしないかを決定することによってＣＬＬを有する被験体の予後を判定する方法、ならびに、フルダラビンを用いた処置に対する該被験体の応答を決定する方法を提供する。本開示は、ＳＦ３Ｂ１（スプライシング因子３ｂ、サブユニット１、１５５ｋＤａ）遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、該遺伝子のミスセンス変異および欠失変異を提供する。該タンパク質におけるこれらの変化には機能的帰結がある。
2014530013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を判定する方法であって、
（ａ）該被験体から生体試料を得る工程と、
（ｂ）該試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインをコードする配列を含むＳＦ３Ｂ１遺伝子の一部の配列を決定する工程と、
（ｃ）該ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列を変異について分析する工程とを含み、
ここで、該ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列に該変異が存在することにより該被験体の生存の減少を予測し、
それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する該被験体の予後を判定する方法。
【請求項２】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法であって、
（ａ）該被験体から生体試料を得る工程と、
（ｂ）該試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインをコードする配列を含むＳＦ３Ｂ１遺伝子の一部の配列を決定する工程と、
（ｃ）該ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列を変異について分析する工程とを含み、
ここで、該ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列に該変異が存在することにより該被験体がフルダラビンに対して抵抗性または不応性であることを示し、
それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する該被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法。
【請求項３】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を判定する方法であって、
（ａ）該被験体から生体試料を得る工程と、
（ｂ）該試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含むＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの一部の配列を決定する工程と、
（ｃ）該ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列を変異について分析する工程とを含み、
該ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列に該変異が存在することにより該被験体の生存の減少を予測し、
それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する該被験体の予後を判定する方法。
【請求項４】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法であって、
（ａ）該被験体から生体試料を得る工程と、
（ｂ）該試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含むＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの一部の配列を決定する工程と、
（ｃ）該ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列を変異について分析する工程とを含み、
ここで、該ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列に該変異が存在することによって該被験体がフルダラビンに対して抵抗性または不応性であることを示し、
それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する該被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法。
【請求項５】
前記生存の減少が、無処置生存または全生存を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
フルダラビンを用いた処置を中止する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
フルダラビンを用いた処置を、クロラムブシル、シクロホスファミド、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベンダムスチン、またはそれらの組合せを用いた処置に置き換える、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
フルダラビンを用いた処置を、アレムツズマブを用いた処置に置き換える、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体を、クロラムブシル、シクロホスファミド、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベンダムスチン、またはそれらの組合せを用いて処置する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有すると診断されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料が、単離され、精製されたゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、単離され、精製されたポリペプチド分子を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含む前記ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの前記一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１９からなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含む前記ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの前記一部が配列番号１または配列番号１９である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異がミスセンス変異またはインフレーム欠失である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２０４４位または２１４６位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２０４６位におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２２６７位におけるグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａｌｄｅｎｉｎｅ）（Ａ）への置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基１９３８位におけるアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換である、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２０３４位におけるシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への置換である、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２０３２位におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換である、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２０４４位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２１４６位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２１４３位〜２１４８位に対応するヌクレオチド配列ＣＡＧＡＡＡの欠失である、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異が配列番号１７のヌクレオチド塩基２０５６位におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換である、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記変異により、配列番号１９のコドン６６６または７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる、請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
前記変異により、配列番号１９のコドン６６６におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）残基への置換が起こる、請求項３に記載の方法。
【請求項２９】
前記変異により、配列番号１９のコドン７４０におけるグリシン（ＧｌｙまたはＧ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる、請求項３に記載の方法。
【請求項３０】
前記変異により、配列番号１９のコドン６３０におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）残基からセリン（ＳｅｒまたはＳ）残基への置換が起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項３１】
前記変異により、配列番号１９のコドン６６２におけるヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）残基からグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基への置換が起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項３２】
前記変異により、配列番号１９のコドン６６２におけるヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）残基からアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）残基への置換が起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
前記変異により、配列番号１９のコドン６６６または７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項３４】
前記変異により、配列番号１９のコドン６９９におけるグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基およびコドン７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基の欠失が起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項３５】
前記変異により、配列番号１９のコドン６７０におけるグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５４０，６１８号からの優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、あたかも全体が示されるようにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
開示の分野
本開示は、一般に、分子生物学、遺伝学、およびがんの分野に関する。具体的には、ＳＦ３Ｂ１遺伝子における変異を使用して、慢性リンパ性白血病の被験体に対し診断し、予後判定し、最適な処置レジメンについて決定する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、リンパ球と称される白血球のがんである。ＣＬＬが進行するにつれ、骨髄に存在するＢリンパ球またはＢ細胞の数が増加する。これらのがん性Ｂ細胞は骨髄から血液中に移動または拡散する。これらのがん性細胞は血液を介して体内の全ての器官に到達する。最も一般的には、がん性Ｂ細胞は、リンパ節、肝臓、および脾臓に影響を及ぼす。最終的に、骨髄は適正に機能できなくなり、死に至る。
【０００４】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の臨床経過は、正常な寿命を伴う非常に不活性な障害から、最終的に化学療法不応性（ｃｈｅｍｏｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）になり死に至る、急速に進行する疾患までにわたる。時々、ＣＬＬは組織学的な形質転換を受けてリヒター症候群（ＲＳ）になる。
【０００５】
ＣＬＬの変動し得る臨床経過は、少なくとも部分的に、その疾患の分子不均一性によって駆動される。最近の進歩にもかかわらず、現在までに同定されている遺伝子病変では、ＣＬＬ分子病理発生が十分に再現されておらず、化学療法不応性およびＲＳ転換などの重度の合併症の発生が完全には説明されておらず、これにより、まだ満たされていない臨床的必要性がなお示されている。
【０００６】
化学療法不応性（ｃｈｅｍｏｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ）に関連づけられる遺伝子病変を同定することは、高リスクのＣＬＬ患者を早期同定するため、および分子的に調整された薬物を開発するための重要な工程を意味する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
開示の要旨
本開示の組成物および方法は、長年解決されていなかった疾患の進行および処置への応答性の生物学的指標の必要性への解決法を提供する。本開示は、ＳＦ３Ｂ１（スプライシング因子３ｂ、サブユニット１、１５５ｋＤａ）遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、該遺伝子のミスセンス変異および欠失変異を提供する。該タンパク質におけるこれらの変化には機能的帰結がある。ＳＦ３Ｂ１は、スプライシング因子３ｂタンパク質複合体のサブユニット１をコードする。正常状態または野生型状態の下では、スプライシング因子３ｂは、スプライシング因子３ａおよび１２Ｓ  ＲＮＡユニットと共にＵ２核内低分子リボヌクレオタンパク質複合体（Ｕ２  ｓｎＲＮＰ）を形成する。スプライシング因子３ｂ／３ａ複合体はプレｍＲＮＡに結合する。スプライシング因子３ｂはマイナーＵ１２型スプライソソームの構成成分でもある。したがって、スプライシング因子３ｂタンパク質複合体のサブユニット１は、細胞のスプライシング機構においていくつもの重要な役割を果たす。ＳＦ３Ｂ１における変異は、細胞の、イントロン配列を含有するプレｍＲＮＡを成熟ｍＲＮＡへと変換する能力に影響を及ぼす。ＣＬＬに関して、これらの変異により、患者の生存の減少およびフルダラビンを用いた処置に対する抵抗性の増加が予測される。
【０００８】
本開示は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を判定する方法であって、（ａ）被験体から生体試料を得る工程と、（ｂ）試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインをコードする配列を含むＳＦ３Ｂ１遺伝子の一部の配列を決定する工程と、（ｃ）ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列を変異について分析する工程とを含み、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列に変異が存在することにより被験体の生存の減少を予測し、それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を判定する方法を提供する。多くの実施形態では、変異はＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメイン内に存在する。さらなる実施形態では、上記方法は、被験体から核酸分子を調製し、その後、本明細書に開示されている通りに分析して、確かな（ｐｒｏｂａｂｌｅ）ＣＬＬの経過および／または転帰が予測または予想される核酸の変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を検出することを含む。
【０００９】
あるいは、またはそれに加えて、本開示は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を判定する方法であって、（ａ）被験体から生体試料を得る工程と、（ｂ）試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含むＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの一部の配列を決定する工程と、（ｃ）ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列を変異について分析する工程とを含み、ここで、ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列に変異が存在することにより被験体の生存の減少を予測し、それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を判定する方法を提供する。多くの実施形態では、変異はＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメイン内に存在する。さらなる実施形態では、上記方法は、被験体からポリペプチド分子を調製し、その後、本明細書に開示されている通りに分析して、確かなＣＬＬの経過および／または転帰が予測または予想されるアミノ酸の変化を検出することを含む。
【００１０】
被験体の予後を判定する方法に関して、生存の減少という用語は、無処置生存（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）または全生存を包含する。本発明の実施形態は、ＣＬＬに対する処置の非存在下で核酸またはアミノ酸の変化を有する被験体において確かなＣＬＬの経過および／または転帰を予測または予想することを含む。他の実施形態では、確かな経過および／または転帰は、開示されているＣＬＬに対する処置を用いて処置した場合に核酸またはアミノ酸の変化を有する被験体に対するものである。
【００１１】
本開示は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法であって、（ａ）被験体から生体試料を得る工程と、（ｂ）試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインをコードする配列を含むＳＦ３Ｂ１遺伝子の一部の配列を決定する工程と、（ｃ）ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列を変異について分析する工程とを含み、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の配列に変異が存在することにより被験体がフルダラビンに対して抵抗性または不応性であることを示し、それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法も提供する。多くの実施形態では、変異はＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメイン内に存在する。さらなる実施形態では、上記方法は、被験体から核酸分子を調製し、その後、本明細書に開示されている通りに分析して、被験体におけるＣＬＬのフルダラビンを用いた処置に対する確かな非応答性が予測または予想される核酸の変化を検出することを含む。
【００１２】
あるいは、またはそれに加えて、本開示は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法であって、（ａ）被験体から生体試料を得る工程と、（ｂ）試料中の、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含むＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの一部の配列を決定する工程と、（ｃ）ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列を変異について分析する工程とを含み、ここで、ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの配列に変異が存在することによって被験体がフルダラビンに対して抵抗性または不応性であることを示し、それにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法を提供する。多くの実施形態では、変異はＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメイン内に存在する。さらなる実施形態では、上記方法は、被験体からポリペプチド分子を調製し、その後、本明細書に開示されている通りに分析して、被験体におけるＣＬＬの、フルダラビンを用いた処置に対する確かな非応答性が予測または予想されるアミノ酸の変化を検出することを含む。
【００１３】
この方法のある特定の態様では、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含むＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの一部は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメインまたはＨＥＡＴ５ドメインの配列を含むＳＦ３Ｂ１ポリペプチドの一部は配列番号１または配列番号１９である。
【００１４】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の、フルダラビンを用いた処置に対する応答を決定する方法に関して、ＳＦ２Ｂ１遺伝子またはＳＦ２Ｂ１ポリペプチドのいずれかに１つまたは複数の変異を有する被験体では、フルダラビンを用いた処置を中止する、またはクロラムブシル、シクロホスファミド、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベンダムスチン、またはそれらの組合せを用いた処置に置き換える。多くの実施形態では、フルダラビンを用いた処置を、アレムツズマブを用いた処置で置き換える。他の実施形態では、フルダラビンを用いた処置を開始せず、その代わりに、被験体をクロラムブシル、シクロホスファミド、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベンダムスチン、またはそれらの組合せを用いて処置する。したがって、本開示は、本明細書に開示されている通りにフルダラビン処置に対する応答性を決定する工程、および上記の通り処置を中止または変更する工程を含む、ＣＬＬを有する被験体を処置する方法をさらに含む。さらなる実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている通りにフルダラビン処置に対する応答性を決定する工程、および上記の通りフルダラビン以外の療法を用いたＣＬＬに対する処置を開始する工程を含む、ＣＬＬを有する被験体を処置する方法を含む。
【００１５】
本開示の任意の方法に関して、分析する工程は、当業者に公知の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング、またはそれらの組合せを含んでよい。いくつかの実施形態では、分析には、鋳型として、またはハイブリダイゼーション用に使用される調製または単離されたＤＮＡ分子を使用することができる。いくつかの場合には、ＤＮＡ分子を鋳型として、増幅された分子の検出を補助するためにそれらを必要に応じて検出可能に標識して、例えば、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲにより増幅する。他の場合では、増幅された分子は、ポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づいて検出することができる。別の場合では、調製または単離されたＤＮＡ分子をコピーまたは増幅しないが、その代わりに、シークエンシングする前に固体支持体または固相媒体に任意選択の直接固定化または間接固定化を行い、直接シークエンシングする。固体支持体または固相媒体の非限定的な例としては、ビーズ、ミクロビーズ、または他の不溶性材料が挙げられる。さらなる場合では、ＤＮＡ分子は、エマルションまたは区画、例えば、液滴または微小滴、または他の溶液中懸濁物に組み込むことによって、または該エマルションまたは区画（例えば、液滴または微小滴、または他の溶液中懸濁物）の一部として調製または単離することができる。
【００１６】
本開示の実施において、被験体は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有すると診断されていてもよく、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有すると診断されていなくてもよい。これらの方法は、被験体の診断または処置の任意の点で適用することができる。ＣＬＬを有する被験体は、以下の症状の非限定的な一覧の１つまたは複数を示していてよい：リンパ節、肝臓、または脾臓の肥大；過剰な発汗または寝汗；疲労；発熱；繰り返し発生する感染症；および故意でない体重減少。ＣＬＬを有する被験体は、正常よりも多い白血球数、貧血および／または血小板減少症を示し得る。被験体は、以下の非限定的な例示的処置の１つまたは複数を用いて処置することができる：フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）、クロラムブシル、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベンダムスチン、またはそれらの組合せ。本明細書に記載の変異の１つまたは複数を有するためにフルダラビンを用いた処置に対して抵抗性または不応性である被験体は、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）を用いて処置することができる。本明細書に記載の変異の１つまたは複数を有する被験体は、特に最初の処置後にＣＬＬが再発する（ｒｅｔｕｒｎ）場合、または被験体または患者に再発（ｒｅｌａｐｓｅ）が起こる場合、ベンダムスチンを用いて処置することもできる。
【００１７】
本開示の実施において、生体試料は、単離され、精製されたゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子を含む。あるいは、生体試料は、単離され、精製されたポリペプチド分子を含む。生体試料は、１つまたは複数の組織または体液から得ることができる。変異を検出するための例示的な組織としては、これだけに限定されないが、骨髄、血液細胞、末梢血液細胞、リンパ節、脾臓、筋肉組織（筋肉細胞または筋肉線維で構成される平滑筋、内臓筋、横紋筋、骨格筋、または心筋を含む）、神経系組織（これだけに限定されないが、ニューロンおよびグリアまたは中枢神経系および末梢神経系が挙げられる）、または上皮組織（これだけに限定されないが、皮膚、気道、生殖器官（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｃｔ）、および消化管を含む上皮細胞が挙げられる）が挙げられる。体細胞起源の変異を確認するための例示的な検体としては、皮膚の非侵襲的な掻爬または頬の内側のスワブによって得られる唾液、表皮細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、組織試料は、全血から単離した赤血球または白血球を含む。例示的な体液としては、これだけに限定されないが、眼房水、硝子体液、胆汁、全血、血清、母乳、脳脊髄液（ＣＳＦ）、内リンパ、外リンパ、胃液、粘液（鼻漏（ｎａｓａｌ  ｄｒａｉｎａｇｅ）および痰（ｐｈｌｅｇｍ）を含む）、腹腔液、胸膜液（ｐｌｅｕｒａｌ  ｆｌｕｉｄ）、唾液、皮脂（皮脂（ｓｋｉｎ  ｏｉｌ））、汗、涙、および尿が挙げられる。いくつかの実施形態では、体液は全血、血清、内リンパ、外リンパ、唾液、または尿である。
【００１８】
本開示の実施において、ＳＦ３Ｂ１変異は、ＳＦ３Ｂ１遺伝子または結果として生じるＳＦ３Ｂ１遺伝子によりコードされるポリペプチドにおける、それぞれポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列におけるミスセンス変異またはインフレーム欠失であり得る。多くの実施形態では、ミスセンス変異またはインフレーム欠失はＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメイン、またはＨＥＡＴ５ドメインにおけるものである。
【００１９】
被験体の予後を判定するいくつかの開示されている方法では、変異は、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４３３．２）のヌクレオチド塩基２０４４位または２１４６位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換；ヌクレオチド塩基２０４６位におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換；またはヌクレオチド塩基２２６７位におけるグアニン（Ｇ）からアラニン（Ａ）への置換であってよい。
【００２０】
被験体の予後を判定する他の開示されている方法では、変異は、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６５６５．２）のコドン６６６または７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換；コドン６６６におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）残基への置換がもたらされる；またはコドン７４０におけるグリシン（ＧｌｙまたはＧ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換であってよい。
【００２１】
フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定するいくつかの開示されている方法では、変異は、配列番号１７のヌクレオチド塩基１９３８位におけるアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換；ヌクレオチド塩基２０３４位におけるシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への置換；ヌクレオチド塩基２０３２位におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換；ヌクレオチド塩基２０４４位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換；ヌクレオチド塩基２１４６位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換；ヌクレオチド塩基２１４３位〜２１４８位に対応するヌクレオチド配列ＣＡＧＡＡＡの欠失；またはヌクレオチド塩基２０５６位におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換であってよい。
【００２２】
フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定するいくつかの開示されている方法では、変異は、配列番号１９のコドン６３０におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）残基からセリン（ＳｅｒまたはＳ）残基への置換；コドン６６２におけるヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）残基からグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基への置換；コドン６６２におけるヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）残基からアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）残基への置換；コドン６６６または７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換；コドン６９９におけるグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基の欠失およびコドン７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基の欠失；コドン６７０におけるグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換であってよい。
【００２３】
被験体の予後を判定する多くの開示されている方法では、変異により、コドン６６６または７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる。Ｋ６６６Ｅ置換またはＫ７００Ｅ置換のいずれかが存在する場合、変異は、それぞれヌクレオチド塩基２０４４位または２１４６位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である。被験体の予後を判定するいくつかの開示されている方法に関して、変異により、コドン６６６におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）残基への置換が起こる。Ｋ６６６Ｎ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２０４６位におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換である。被験体の予後を判定する他の開示されている方法に関して、変異により、コドン７４０におけるグリシン（ＧｌｙまたはＧ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる。Ｇ７４０Ｅ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２２６７位におけるグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への置換である。
【００２４】
フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定する他の開示されている方法では、変異により、コドン６３０におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）残基からセリン（ＳｅｒまたはＳ）残基への置換が起こる。Ｒ６３０Ｓ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基１９３８位におけるアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換である。フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定するいくつかの開示されている方法では、変異により、コドン６６２におけるヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）残基からグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基への置換が起こる。Ｈ６６２Ｑ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２０３４位におけるシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への置換である。フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定するさらなる開示されている方法では、変異により、コドン６６２におけるヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）残基からアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）残基への置換が起こる。Ｈ６６２Ｄ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２０３２位におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換である。フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定する追加的な開示されている方法では、変異により、コドン６６６または７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる。Ｋ６６６Ｅ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２０４４位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である。Ｋ７００Ｅ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２１４６位におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である。フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定する開示されている方法の例では、変異により、コドン６９９におけるグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基の欠失およびコドン７００におけるリシン（ＬｙｓまたはＫ）残基の欠失が起こる。Ｑ６９９−Ｋ７００欠失が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２１４３位〜２１４８位に対応するヌクレオチド配列ＣＡＧＡＡＡの欠失である。フルダラビンを用いた処置に対する被験体の応答を決定する開示されている方法の別の例では、変異により、コドン６７０におけるグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）残基からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）残基への置換が起こる。Ｑ６７０Ｅ置換が存在する場合、変異は、ヌクレオチド塩基２０５６位におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換である。
【００２５】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓスプライシング因子３ｂ、サブユニット１、１５５ｋＤａ、ＳＦ３Ｂ１、転写物変種１は、以下のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１２４３３．２、配列番号１７）（ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメイン、およびＨＥＡＴ５ドメインをコードする部分に下線が引かれている）によりコードされる：
【００２６】
【化１】
2014530013.tif 000003
【００２７】
【化２】
2014530013.tif 000004
【００２８】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓスプライシング因子３ｂ、サブユニット１、１５５ｋＤａ、ＳＦ３Ｂ１、転写物変種２は、以下のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００１００５５２６、配列番号１８）によりコードされる：
【００２９】
【化３】
2014530013.tif 000005
【００３０】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓスプライシング因子３ｂ、サブユニット１、１５５ｋＤａ、ＳＦ３Ｂ１、転写物変種１は、以下のアミノ酸配列（ＮＰ＿０３６５６５．２、配列番号１９）（ＨＥＡＴ３ドメイン、ＨＥＡＴ４ドメイン、およびＨＥＡＴ５ドメインを含有する部分に下線が引かれている）によりコードされる：
【００３１】
【化４】
2014530013.tif 000006
【００３２】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓスプライシング因子３ｂ、サブユニット１、１５５ｋＤａ、ＳＦ３Ｂ１、転写物変種２は、以下のアミノ酸配列（ＮＰ＿００１００５５２６、配列番号２０）によりコードされる：
【００３３】
【化５】
2014530013.tif 000007
【００３４】
本開示のいくつかの非限定的な複数の実施形態では、開示されている方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いて、本明細書に開示されている通り、診断または医学的処置行為を含めることなくＳＦ３Ｂ１配列および配列の変化を分析することができる。
【００３５】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであり、以下の詳細な記載および特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、機能的ドメイン（ＰＰＰ１Ｒ８結合ドメインおよびＨＥＡＴリピート）を有するヒトＳＦ３Ｂ１遺伝子（上）およびタンパク質（下）の概略図である。オルソロガスＳＦ３Ｂ１タンパク質（ｎ＝１５）を用いての、ヒトＳＦ３Ｂ１タンパク質のＨＥＡＴ３アミノ酸配列、ＨＥＡＴ４アミノ酸配列およびＨＥＡＴ５アミノ酸配列の対応する複数のアラインメントが提供される。種間で保存されているアミノ酸が強調表示されている（灰色）。色分けされた形は、診断時にＣＬＬに見いだされる変異の位置（緑色、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ７００Ｅ、およびＧ７４０Ｅに対応するミスセンス変異；表４も参照されたい）、フルダラビン不応性ＣＬＬに見いだされる変異の位置（赤色、Ｒ６３０Ｓ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｄ、Ｋ６６６Ｅ、およびＫ７００Ｅに対応するミスセンス変異；ｄｅｌＱ６９９＿Ｋ７００に対応するインフレーム欠失；表４も参照されたい）、およびリヒター症候群（ＲＳ）に見いだされる変異の位置（オレンジ色、Ｑ６７０ＥおよびＫ７００Ｅに対応するミスセンス変異；表４も参照されたい）を示す。下の配列が提供される：
【００３７】
【化６】
2014530013.tif 000008
【００３８】
【化７】
2014530013.tif 000009
【図２】図２Ａ〜Ｄは、ＣＬＬにおけるＳＦ３Ｂ１変異の存在率、他の遺伝子病変との相互関係、および臨床的な影響を示す一連のグラフである。パネルＡ：診断時ＣＬＬにおける、フルダラビン不応性ＣＬＬにおける、およびリヒター症候群におけるＳＦ３Ｂ１変異の存在率であり、上の数字は、分析した総数に対する変異した試料の実際の数を示す。パネルＢ：診断時ＣＬＬにおける、およびフルダラビン不応性ＣＬＬにおけるＳＦ３Ｂ１変異と他の遺伝子病変の相互関係である。ヒートマップにおいて、行は同一の遺伝子に対応し、列は遺伝子の状態に基づいて色分けされた個々の患者を表す（白色：野生型；赤色：ＳＦ３Ｂ１の変異、ＮＯＴＣＨ１の変異、ＴＰ５３の変異および／または欠失、ＡＴＭの欠失）。パネルＣ：連続した一連の新しく診断され、以前に処置されていないＣＬＬ（ｎ＝３０１）における、診断からの無処置生存（ＴＦＳ）および全生存（ＯＳ）のカプラン−マイヤー推定値である。ＳＦ３Ｂ１野生型（ＳＦ３Ｂ１ｗｔ）が青色の線で表されている。ＳＦ３Ｂ１が変異した症例（ＳＦ３Ｂ１Ｍ）は赤色の線で表されている。パネルＤ：正常なＢ細胞亜集団（ナイーブ；中心芽細胞、ＣＢ；中心細胞、ＣＣ；記憶）およびＣＬＬ試料におけるＢＣＬ６、ＡＩＣＤＡ、ＢＣＬ２、ＩＲＦ４およびＳＦ３Ｂ１の遺伝子発現レベルである。遺伝子発現の相対的なレベルがカラースケールで示されている：赤色は最高レベルの発現を表し、青色は最低レベルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
開示を実施する態様の詳細な説明
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）において同定される遺伝子病変では、疾患の病理発生および化学療法不応性などの重篤な合併症の発生は完全には再現されない。フルダラビン不応性ＣＬＬをコードするゲノムを調査している間に、スプライシング因子をコードし、細胞スプライソソームの重要な構成成分を表すＳＦ３Ｂ１の変異がフルダラビン不応性の症例の１０／５９（１７％）で再発し、診断時に試料採取した連続したＣＬＬコホートにおいて観察されたものよりも発生頻度が有意に高いことが発見された（１７／３０１、５％；ｐ＝０．００２）。変異は体細胞性に獲得され、一般に、ミスセンスのヌクレオチド変化で表され、ＳＦ３Ｂ１タンパク質の選択されたＨＥＡＴリピートにおいて密集し、３つのホットスポット（コドン６６２、６６６および７００）を反復的に標的とし、予後不良が予測された。フルダラビン不応性ＣＬＬでは、ＳＦ３Ｂ１変異およびＴＰ５３の破壊は相互排他的に分布していた（ｐ＝０．０４６）。ＳＦ３Ｂ１変異が同定されることにより、スプライシング調節がＣＬＬにおける臨床的関連性の新規の発病機構であることが示される。
【００４０】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の臨床経過は、正常な寿命を伴う非常に不活性の障害から、死に至る急速に進行する疾患までにわたる。時々、ＣＬＬは組織学的な形質転換を受けてリヒター症候群（ＲＳ）になる（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ  ＨＫら：Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ＳＨら編  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ：ＩＡＲＣ；２００８年：１８０〜１８２頁中；Ｈａｌｌｅｋ  Ｍら  Ｂｌｏｏｄ．  ２００８年；１１１巻（１２号）：５４４６〜５４５６頁；Ｒｏｓｓｉ  Ｄら  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１１年；１１７巻（１２号）：３３９１〜３４０１頁）。ＣＬＬの変動し得る臨床経過は、少なくとも部分的に、疾患の免疫遺伝学的不均一性および分子不均一性によって駆動される（Ｃｈｉｏｒａｚｚｉ  Ｎら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００５年；３５２巻（８号）：８０４〜８１５頁）。
【００４１】
最近の進歩にもかかわらず、現在までに同定されている遺伝子病変では、ＣＬＬ分子病理発生が十分に再現されておらず、化学療法不応性などの重度の合併症の発生が完全には説明されておらず、これにより、まだ満たされていない臨床的必要性がなお示されている（Ｋａｙ  ＮＥら  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００７年；２１巻（９号）：１８８５〜１８９１頁）。フルダラビン不応性は、不応性の症例の約４０％においてＴＰ５３の破壊に起因するが、患者の大部分ではこの急速進行性の臨床的表現型の分子基盤は不明のままである（Ｓｔｉｌｇｅｎｂａｕｅｒ  ＳおよびＺｅｎｚ  Ｔ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．  ２０１０；２０１０：４８１〜４８８）。
【００４２】
最近、疾患の発症のときに調査したＣＬＬをコードするゲノムに関する２つの独立した試験により、ＮＯＴＣＨ１を含めた限られた数の変異した遺伝子が明らかになった（Ｆａｂｂｒｉ  Ｇら  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０１１年；２０８巻（７号）：１３８９〜１４０１頁；Ｐｕｅｎｔｅ  ＸＳら  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１１年；４７５巻（７３５４号）：１０１〜１０５頁）。これらの試験により、他の悪性腫瘍と同様に、ゲノムワイドな変異性分析によりＣＬＬにおける潜在的な生物学的および臨床的関連性のある新規の病変を同定することができるという概念の証拠がもたらされた。フルダラビン不応性ＣＬＬをコードするゲノムの全エキソームシークエンシングからの最初の所見に続いて、細胞スプライソソームの重要な構成成分であるＳＦ３Ｂ１の反復的な変異の出現が本明細書に開示されている。
【００４３】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外配列（ｅｘｔｒａ−ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびプラスミド配列、ならびに、ポリペプチドを発現する、またはポリペプチドを発現させるために適合させることができる工学的に作製されたより小さな遺伝子セグメントを含んでよい。
【００４４】
「単離された核酸」とは、他のゲノムＤＮＡ配列ならびに天然ではネイティブな配列に付随するリボソームおよびポリメラーゼなどのタンパク質または複合体から実質的に分離された核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、また、組換え型のまたはクローニングされたＤＮＡ単離体および化学的に合成された類似体または異種の系によって生物学的に合成された類似体を包含する。実質的に純粋な核酸とは、核酸の単離された形態を包含する。これは、最初に単離された核酸を指し、また、単離された核酸に人間の手によって後で加えられた遺伝子または配列を排除しない。上記の核酸分子の調製に加えて、本開示は、固体支持体または固相媒体への直接固定または間接固定を行うことによる核酸分子の調製を含む。直接固定化は、非限定的な例として、例えば、ハイブリダイゼーションの場合、水素結合によって媒介されてもよく、１つまたは複数の共有結合によって媒介されてもよい。非限定的な例としては、核酸分子の、対象の核酸分子を検出するためのマイクロアレイまたはビーズまたは別の固体支持体上のポリヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションが挙げられる。必要に応じて、ハイブリダイズした核酸分子はＰＣＲによって増幅されたものであってよい。核酸分子の間接的固定化は、固定化したポリメラーゼ、例えばＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼなどへの結合によって媒介されてよい。さらなる実施形態では、核酸分子は、塩基対の相補性により、公知の核酸配列にライゲーションすることによって、またはプライマーポリヌクレオチドに結合させることによって、シークエンシングするために調製することができる。いくつかの実施形態では、増幅または複製を必要とせずに固定化した核酸分子をシークエンシングすることができる。さらなる実施形態では、調製された核酸分子は、その分析を補助するために検出可能に標識されたＲＮＡ分子であっても、または本明細書に記載の通り使用するためのｃＤＮＡ分子へと変換されたＲＮＡ分子であってもよい。
【００４５】
「ポリペプチド」という用語は、その従来の意味で、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さの産物に限定されない。ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義の範囲内に含まれ、このような用語は、特に他の指示がなければ本明細書において互換的に使用することができる。また、この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など、ならびに、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方の当技術分野で公知の他の修飾を指さない、またはそれを排除する。ポリペプチドは、タンパク質全体、またはその部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）であってよい。
【００４６】
「単離されたポリペプチド」とは、その天然の環境の構成成分から同定され、分離され、かつ／または回収されたものである。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドを、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合にポリペプチドの９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することによってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を使用して還元条件または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製する。単離されたポリペプチドは組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕのポリペプチドを包含する。なぜなら、上記ポリペプチドの天然の環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかし、普通は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４７】
「ネイティブな配列」のポリヌクレオチドとは、天然由来のポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するものである。「ネイティブな配列」のポリペプチドとは、天然由来の（例えば、任意の種由来の）ポリペプチド（例えば、タンパク質サブユニット）と同じアミノ酸配列を有するものである。そのようなネイティブな配列のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然から単離することもでき、組換え手段または合成手段によって作製することもできる。
【００４８】
「変異体または変異した」ポリヌクレオチドとは、この用語が本明細書使用される場合、一般には、本明細書に具体的に開示されているポリヌクレオチドとは１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入で異なるポリヌクレオチドである。そのような変種は、天然に存在するものであってもよく、例えば、本明細書に記載の通りおよび／または当技術分野で周知のいくつもの技法のいずれかを用いて本開示のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数を改変すること、およびコードされるポリペプチドの１つまたは複数の生物活性を評価することによって合成で生成することもできる。本開示の「変異体」ポリヌクレオチドは、それにコードされる結果として生じるポリペプチドの機能を変える１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入を含有する。あるいは、またはそれに加えて、本開示の「改変された」ポリヌクレオチドは、それにコードされる結果として生じるポリペプチドの機能を変えない１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入を含有する。いくつかの実施形態では、「変異体または変異した」ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている野生型配列を参照することによって定義される。さらに、「変異体または変異した」ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている他のポリヌクレオチドと同じ様式で調製すること、および必要に応じて検出することができる。
【００４９】
「変異体または変異した」ポリペプチドとは、この用語が本明細書使用される場合、一般には、本明細書に具体的に開示されているポリペプチドとは、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入で異なるポリペプチドである。そのような変種は、天然に存在するものであってもよく、または、例えば、本明細書に記載の通りおよび／または当技術分野で周知のいくつもの技法のいずれかを用いて本開示の上記ポリペプチド配列のうちの１つまたは複数を改変すること、該ポリペプチドの１つまたは複数の生物活性を評価することによって合成で生成することもできる。本開示の「変異体」ポリペプチドは、結果として生じるポリペプチドの機能を変える１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入を含有する。あるいは、またはそれに加えて、本開示の「改変された」ポリペプチドは、結果として生じるポリペプチドの機能を変えない１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入を含有する。いくつかの実施形態では、「変異体または変異した」ポリペプチドは、本明細書に開示されている野生型配列を参照することによって定義される。さらに、「変異体または変異した」ポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法によって分析または検出することができる。非限定的な例としては、ペプチドシークエンシング、質量分析による分析、および抗体または受容体による結合が挙げられる。
【００５０】
改変は、本開示の野生型または変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に行うことができ、それでも所望の特性を有する変種または誘導体ポリペプチドをコードする機能分子が得られる。等価の、または改善までされた本開示のポリペプチドの変種または部分を創製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変えることが望まれる場合、当業者は、一般には、コードしているＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変化させる。
【００５１】
例えば、タンパク質の構造内で、他のポリペプチドまたは細胞と結合するその能力を感知できるほど失うことなく、他のアミノ酸を特定のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の結合能力および性質によりタンパク質の生物学的機能活性が定義されるので、タンパク質配列、および当然、タンパク質の基礎をなすＤＮＡコード配列において特定のアミノ酸配列置換を行うことができ、他の方法では同様の性質を有するタンパク質が得られる。したがって、開示された組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物学的な有用性または活性を感知できるほど失うことなく、種々の変化を行うことができることが意図されている。
【００５２】
多くの場合、改変されたポリペプチドは、１つまたは複数の保存された置換を含有する。「保存された置換」とは、あるアミノ酸で、同様の性質を有する別のアミノ酸を置換するものであり、したがって、ペプチド化学の当業者には、ポリペプチドの二次構造およびハイドロパシーの性質が実質的に変化しないことが予想される。
【００５３】
そのような変化を行うことにおいて、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することができる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、当技術分野において一般に理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー的特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、今度はそれにより、該タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、および抗原などとの相互作用が定義されることが一般に認められる。各アミノ酸に、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００５４】
ある特定のアミノ酸を、同様のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有し、なお同様の生物活性を有するタンパク質がもたらされる、すなわち、なお生物学的機能的に等価のタンパク質が得られる他のアミノ酸で置換することができることが当技術分野で公知である。そのような変化を行うことにおいて、そのハイドロパシーインデックスが±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、ハイドロパシーインデックスが±１の範囲内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、ハイドロパシーインデックスが±０．５の範囲内であるアミノ酸の置換がなおさらに特別好ましい。当技術分野では、同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に行うことができることも理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号では、タンパク質の最大の局所的な平均親水性は、それに近接するアミノ酸の親水性に支配されるので、該タンパク質の生物学的性質と相関することが述べられている。
【００５５】
米国特許第４，５５４，１０１号において詳細に記載されている通り、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸で、同様の親水性の値を有し、なお生物学的に等価である、具体的には、免疫学的に等価であるタンパク質が得られる別のアミノ酸を置換することができることが理解される。そのような変化では、その親水性の値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性の値が±１の範囲内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、親水性の値が±０．５の範囲内であるアミノ酸の置換がなおさらに特別好ましい。
【００５６】
したがって、上に概説されている通り、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、およびサイズなどに基づく。種々の前記の特性を考慮した例示的な置換は当業者には周知であり、それらとして、アルギニンおよびリシン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００５７】
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ、親水性の値が同様である非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存された変化を示し得るアミノ酸の他の群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変されたポリペプチドは、また、またはあるいは、非保存的な変化を含有し得る。好ましい実施形態では、変種ポリペプチドは、ネイティブな配列とは５つ以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって異なる。改変されたポリペプチドは、また、（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびハイドロパシーの性質に対する影響が最小であるアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。
【００５８】
ポリペプチドは、共翻訳で、または翻訳後にタンパク質の転移を導くシグナル（またはリーダー）配列をタンパク質のＮ末端に含み得る。ポリペプチドは、該ポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするため（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）、または該ポリペプチドと固体支持体の結合を増強するためにリンカーまたは他の配列にコンジュゲートすることもできる。例えば、ポリペプチドは、ビオチン、ストレプトアビジン、またはＦｃ免疫グロブリンとコンジュゲートすることができる。
【００５９】
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を比較する場合、下記の通り対応が最大になるようにアラインメントした場合に２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、２つの配列は「同一」であると言える。２つの配列間の比較は、一般には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定し、比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」とは、本明細書で使用される場合、配列を、同じ数の連続した位置の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、少なくとも約２０の連続した位置、通常３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指す。
【００６０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用い、デフォルトパラメータを使用して行うことができる。このプログラムにより、以下の参考文献に記載のいくつかのアラインメントスキームが組み入れられる：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（１９７８年）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  ５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０年）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．（１９８９年）ＣＡＢＩＯＳ  ５巻：１５１〜１５３頁；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８年）ＣＡＢＩＯＳ  ４巻：１１〜１７頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．（１９７１年）Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ  １１巻：１０５頁；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．  Ｎｅｓ，  Ｍ．（１９８７年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４巻：４０６〜４２５頁；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．（１９７３年）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．（１９８３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０巻：７２６〜７３０頁。
【００６１】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ  ２巻：４８２頁の局所的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁の同一性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、または検査によって行うことができる。
【００６２】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの１つの非限定的な例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータとともに使用することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。
【００６３】
例示的な一例では、累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびパラメータＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出することができる。各方向におけるワードヒットの伸長を、累積アラインメントスコアがその最大の実現値から数量Ｘだけ減少するとき、１つまたは複数のネガティブスコアリング残基アラインメントが蓄積することに起因して累積スコアがゼロ以下になるとき、またはいずれかの配列の末端に到達するときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸによりアラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、初期値としてワード長（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０９１５頁を参照）アラインメントでは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
【００６４】
アミノ酸配列については、スコアリング行列を用いて累積スコアを算出することができる。各方向におけるワードヒットの伸長を、累積アラインメントスコアがその最大の実現値から数量Ｘだけ減少するとき、１つまたは複数のネガティブスコアリング残基アラインメントが蓄積することに起因して累積スコアがゼロ以下になるとき、またはいずれかの配列の末端に到達するときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸによりアラインメントの感度およびスピードが決定される。
【００６５】
１つの手法では、「配列同一性の百分率」は、２つの最適にアラインメントされた配列を少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定し、ここで、２つの配列を最適にアラインメントするために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。百分率は、両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が見いだされる位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出する。
【００６６】
「相同性」とは、配列をアラインメントし、最大のパーセント相同性を実現するために必要であればギャップを導入した後に、ポリヌクレオチド配列変種またはポリペプチド配列変種における、非変種配列と同一の残基の百分率を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド変種およびポリペプチド変種は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％  ポリヌクレオチド相同性またはポリペプチド相同性を有する。
【００６７】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなるネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。それにもかかわらず、本開示のポリペプチドをコードするが、コドン使用の違いに起因して異なるポリヌクレオチドは本開示により具体的に意図されている。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本開示の範囲内である。対立遺伝子は、１つまたは複数の変異、例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換の結果として変えられた内在性遺伝子である。しかし、その結果として生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、構造または機能が変えられている必要はない。対立遺伝子は、標準の技法（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて同定することができる。
【００６８】
本開示のある特定の実施形態では、コードされるポリペプチドの１つまたは複数の性質、例えば、その結合特異性または結合強度を変えるために、本開示のポリヌクレオチド配列の変異誘発を実施する。変異誘発のための技法は当技術分野で周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の変種を創製するためにも広く用いられている。本明細書に記載のポリペプチドの変種および／または誘導体を調製するために、部位特異的変異誘発などの変異誘発手法を用いる。この手法により、ポリペプチド配列における特定の改変を、それらをコードする基礎をなすポリヌクレオチドの変異誘発を通じて行う。これらの技法により、配列変種を調製し、試験するための簡単な手法、例えば、ポリヌクレオチドに１つまたは複数のヌクレオチド配列変化を導入することにより前記の考察のうちの１つまたは複数を組み入れることがもたらされる。
【００６９】
部位特異的変異誘発により、所望の変異のヌクレオチド配列ならびに十分な数の近接するヌクレオチドを含む特定のオリゴヌクレオチド配列を使用し、欠失接合部の両側に横断して安定な二重鎖が形成されるのに十分なサイズおよび配列の複雑性を有するプライマー配列を提供することによって変異体を作製することが可能になる。選択されたポリヌクレオチド配列において変異を使用して、ポリヌクレオチド自体の性質を改善する、変える、減少させる、改変する、または他のやり方で変化させる、および／またはコードされるポリペプチドの性質、活性、組成、安定性、または一次配列を変える。
【００７０】
本開示の他の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、例えば、ＰＣＲプライマーとして使用する。そのような核酸プローブが対象の配列と特異的にハイブリダイズすることができることにより、所与の試料における相補配列の存在を検出することが可能になる。しかし、他の使用、例えば、変異体種プライマーを調製するための配列情報、または他の遺伝子構築物の調製において使用するためのプライマーの使用も本開示に包含される。そのように、本明細書に開示されている１５ヌクレオチド長の連続した配列と同じ配列を有する、またはそれと相補的である少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続した配列の配列領域を含む本開示の核酸セグメントが特に有用である。全長の配列を含めた、より長い、例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（中間の長さを全て含む）の連続した同一または相補配列、およびその間の全ての長さもある特定の実施形態で使用される。したがって、本開示は、非限定的な例として、核酸の増幅および検出において使用するためのものなどの核酸プライマーおよびプローブの設計および調製における開示されている配列の使用を包含する。いくつかの実施形態では、プライマーを、変異体配列などの開示されている配列を検出するための核酸シークエンシングのために使用することができる。
【００７１】
本明細書に開示されているポリヌクレオチド配列と同一または相補的である１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、またはさらには１００〜２００ヌクレオチド程度（中間の長さも同様に含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有するポリヌクレオチド分子が、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法において使用するためのハイブリダイゼーションプローブとして、および／または、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲにおいて使用するためのプライマーとして特に意図されている。断片の総サイズ、ならびに相補性ストレッチ（複数可）のサイズは、最終的には特定の核酸セグメントの意図された使用または適用に依存する。ハイブリダイゼーションの実施形態ではより小さな断片が一般に使用され、ここで、連続した相補性領域の長さは、約１５〜約１００ヌクレオチドなど変動してよいが、検出したい相補配列の長さに応じてそれよりも大きな連続した相補性ストレッチを使用することができる。
【００７２】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成が可能になる。しかし、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それにより、得られる特定のハイブリッド分子の質および程度を改善するためには、１２塩基長を超えるストレッチにわたって連続した相補配列を有する分子が一般に好ましい。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または所望であればさらに長い遺伝子と相補的なストレッチを有する核酸分子が一般に好ましい。
【００７３】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に開示されている配列のいずれかの任意の一部から選択される。本明細書に記載の配列、またはプローブもしくはプライマーとして利用したい約１５〜２５ヌクレオチド長から全長の配列まで、および全長の配列を含めた配列の任意の連続した部分を精査することだけが必要である。プローブ配列およびプライマー配列の選択は、さまざまな因子に支配される。例えば、全配列の末端からの、末端に向けてのプライマーを使用することを望んでもよい。
【００７４】
本開示のポリヌクレオチド、またはその断片もしくは改変された配列は、例えば、一般に、自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して実施されるように化学的手段によって断片を直接合成することによって容易に調製することができる。また、断片は、米国特許第４，６８３，２０２号のＰＣＲ（商標）技術などの核酸再生技術を適用することによって、選択された配列を組換え作製のための組換えベクターに導入することによって、および分子生物学の当業者に一般に公知の他の組換えＤＮＡ技法によって得られる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドを、当業者に公知の任意の方法によって配列を決定または検出するために調製することができる。非限定的な例としては、１）４種類の可逆的ターミネーター塩基を使用して増幅して、一度にＤＮＡの１つのヌクレオチドのみを伸長させ、その後色素を末端３’ブロッカーと一緒に除去して、次の伸長のサイクルを可能にすることを伴う可逆的色素−ターミネーターおよびスライド上のプライマーへのＤＮＡ分子の結合、２）配列が公知である固定化されたオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲ（必要に応じてエマルションＰＣＲ）およびシークエンシング、３）半導体による検出を伴うヌクレオチドの伸長に起因した水素イオン放出、４）ナノボールシークエンシング、５）ポリＡ尾部アダプターの付加、その後のシークエンシングとしてのヌクレオチドの伸長、６）固定化したポリメラーゼを使用することによる単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、７）大量平行サインシークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）；８）Ｐｏｌｏｎｙシークエンシング、９）単一のプライマーをコーティングしたビーズとハイブリダイズする単一のＤＮＡ鋳型を介したパイロシークエンシング、および１０）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）媒介性シークエンシングに基づくシークエンシングが挙げられる。
【００７６】
本開示の分析には種々の関連する行為が先行してもよく、それが後に続いてもよい。いくつかの実施形態では、分析には、分析を必要とするヒト被験体の決定または診断が先行してよい。分析には、例えば、医師、看護師または他の医療提供者もしくは専門家、またはその指示の下で働く者、または、実行に対する払い戻しまたは支払いを要求するための基礎として測定の実施を承認する健康保険もしくは健康維持組合の人員による分析の必要性の決定が先行してよい。いくつかの実施形態では、分析の後に開示されている方法の実行に対する支払いが続いてよい。
【００７７】
本開示の分析には、実際の分析に必要な予備的行為が先行してもよい。非限定的な例としては、ヒト被験体から細胞を含有する試料もしくは核酸を含有する試料もしくはポリペプチドを含有する試料を実際に得ること、またはそのような試料を受け取ること、または細胞を含有する試料の切片作製を行うこと、または細胞を含有する試料から細胞を単離すること、または細胞を含有する試料の細胞から核酸分子を調製すること；または細胞を含有する試料の細胞からＲＮＡを逆転写することが挙げられる。
【００７８】
本開示は、さらに、本明細書に記載の開示されている任意の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、一般には、本開示を実施するための本明細書に記載の核酸配列またはポリペプチド配列を検出するための１つまたは複数の試薬を含む。非限定的な例としては、発現レベルを検出するためのポリヌクレオチドプローブまたはプライマー、本開示の方法において使用する１種または複数種の酵素、および本開示の実施において使用するための１つまたは複数の容器または固体支持体または固形媒体が挙げられる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の配列を検出するための、非限定的な例としてビーズを含めたアレイまたは他の固形媒体を含む。他の実施形態では、キットは、本明細書に開示されている遺伝子配列の変化の存在を示すポリペプチド上に存在するエピトープに対して免疫反応性の１つまたは複数の抗体を含んでよい。いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片である。
【００７９】
本開示のキットは、本明細書において提供される本開示の方法における本開示のキットまたはプライマーまたはプローブの使用について開示または記載されている指示材料も含んでよい。キットは、キットがそのために設計される特定の適用を容易にするための追加の構成成分も含んでよい。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段をさらに含有してよい（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、またはヒツジ抗マウス−ＨＲＰなどの適切な二次標識など）。キットは、本開示の方法において使用するために認められているバッファーおよび他の試薬をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、キットを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断薬として使用するために設計することができる。
【００８０】
ここで本開示が一般に提供され、本開示は、例証のために提供され、指定がなければ本開示を限定するものではない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
患者および方法
患者
試験集団は、異なる疾患相を示す３つの臨床的コホートを含んだ：ｉ）フルダラビン不応性ＣＬＬ（ｎ＝５９）、全エキソームシークエンシングに供した症例（ｎ＝１１）を含む（表１）；ｉｉ）連続した一連の新しく診断され、以前に処置されていないＣＬＬ（ｎ＝３０１）（表２）；およびｉｉｉ）クローン的に関連するＲＳ（ｎ＝３３；全てびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）（表３）。ＣＬＬの診断はＩＷＣＬＬ−ＮＣＩ基準（Ｈａｌｌｅｋ  Ｍら  Ｂｌｏｏｄ．  ２００８年；１１１巻（１２号）：５４４６〜５４５６頁）に基づき、フルダラビン不応性の診断はガイドライン（Ｈａｌｌｅｋ  Ｍら  Ｂｌｏｏｄ．  ２００８年；１１１巻（１２号）：５４４６〜５４５６頁）に従い、ＲＳは、組織学的基準（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ  ＨＫら  Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ＳＨら編  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ：ＩＡＲＣ；２００８年：１８０〜１８２頁；Ｓｔｅｉｎ  Ｈら  Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ＳＨら編  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ：ＩＡＲＣ；２００８年：２３３〜２３７頁）に基づいた。末梢血腫瘍試料を以下の通り得た：ｉ）フルダラビン不応性ＣＬＬについては、患者が最終的に応答できなくなったその処置を開始する直前、ｉｉ）新しく診断され、以前に処置されていないＣＬＬについては、疾患の発症のとき。ＲＳ試験は全てＲＳ診断用生検に対して実施した。同じ患者由来の正常なＤＮＡを唾液からまたは精製した顆粒球から得、腫瘍に特異的なＩＧＨＶ−Ｄ−Ｊ再配列のＰＣＲによって腫瘍がないことを確認した。患者に現地のＩＲＢ要件およびヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを提供した。試験はｔｈｅ  Ａｍｅｄｅｏ  Ａｖｏｇａｄｒｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｉｅｄｍｏｎｔ付属のＥｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｓｐｅｄａｌｅ  Ｍａｇｇｉｏｒｅ  ｄｅｌｌａ  Ｃａｒｉｔａ  ｄｉ  Ｎｏｖａｒａ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｃｏｄｅ  ５９／ＣＥ；Ｓｔｕｄｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＥ  ８／１１）によって承認された。
【００８２】
表１．フルダラビン不応性ＣＬＬコホートａの臨床的特性および生物学的特性
【００８３】
【表１】
2014530013.tif 000010
【００８４】
ａｗｔ、野生型；ＦＣＲ、フルダラビン、シクロホスファミド、リツキシマブ；ＦＲ、フルダラビン、リツキシマブ；ＦＣ、フルダラビン、シクロホスファミド；Ｆ、フルダラビン；ＩＧＨＶ、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子；ＦＩＳＨ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
表２．連続した一連の新しく診断され、以前に処置されていないＣＬＬａの臨床的特性および生物学的特性
【００８５】
【表２】
2014530013.tif 000011
【００８６】
ａｗｔ、野生型；ＩＧＨＶ、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子；ＦＩＳＨ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
表３．ＲＳコホートａの臨床的特性および生物学的特性
【００８７】
【表３】
2014530013.tif 000012
【００８８】
ａＵＬＮ、正常値上限；ＧＣ、胚中心；ＩＧＨＶ、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子
ＳＦ３Ｂ１の変異分析
ＳＦ３Ｂ１（エクソン１〜２５、スプライシング部位を含む；ＲｅｆＳｅｑまたはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４３３．２）の変異性分析をサンガーシークエンシング（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓで実施）と標的化次世代シークエンシング（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｊｕｎｉｏｒ、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ；平均適用範囲（ｍｅａｎ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）約２００Ｘで実施）の組合せによってゲノムＤＮＡから得たＰＣＲアンプライマーで実施した。自動キュレーションおよび手動キュレーションの両方を行った後、Ｍｕｔａｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  バージョン２．４１（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）を使用してサンガー配列を対応する生殖細胞系ＲｅｆＳｅｑと比較した。次世代シークエンシングによって得られたシークエンシング読み取りをＡｍｐｌｉｃｏｎ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ソフトウェアパッケージ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＲｅｆＳｅｑにマッピングした。その後、サンガーシークエンシングまたは次世代シークエンシングによって同定された配列変種を全て、独立したアンプリマーで両方の鎖からサンガーシークエンシングによって確認した。データベース（ｄｂＳＮＰ１３２、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）から公知の同義の変異、生殖細胞系多形、およびマッチする正常なＤＮＡに存在する変化を分析から除いた。分子試験を臨床データに関して盲検で実施した。ＰｏｌｙＰｈｅｎ−２アルゴリズム（ソフトウェア  バージョン２．１、ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｂｗｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｐｈ２）（Ａｄｚｈｕｂｅｉ  ＩＡら  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１０年；７巻（４号）２４８〜２４９頁）を使用することによってアミノ酸置換の機能的影響の予測を実施した。
【００８９】
ＦＩＳＨ核型ならびにＩＧＨＶ変異、ＴＰ５３変異およびＮＯＴＣＨ１変異の分析
ＦＩＳＨ分析を、プローブＬＳＩ１３およびＬＳＩＤ１３Ｓ３１９、ＣＥＰ１２、ＬＳＩｐ５３、ならびにＬＳＩＡＴＭ（Ａｂｂｏｔｔ、Ｒｏｍｅ、Ｉｔａｌｙ）（Ｒｏｓｓｉ  Ｄら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９年；１５巻（３号）：９９５〜１００４頁）を使用し、報告されている通りに実施した。ＩＧＨＶの変異性の状態を以前に報告されている通り調査した（Ｒｏｓｓｉ  Ｄら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９年；１５巻（１３号）：４４１５〜４４２２頁）。配列をＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ配列要覧（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ）にアラインメントし、対応する生殖細胞系遺伝子に対する同一性が＜９８％であれば変異しているとみなした（Ｈａｍｂｌｉｎ  ＴＪら  Ｂｌｏｏｄ．  １９９９年；９４巻（６号）：１８４８〜１８５４頁；Ｄａｍｌｅ  ＲＮら  Ｂｌｏｏｄ．  １９９９年；９４巻（６号）：１８４０〜１８４７頁）。ＴＰ５３変異およびＮＯＴＣＨ１変異を報告されている通りに分析した（Ｒｏｓｓｉ  Ｄら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９年；１５巻（３号）：９９５〜１００４頁；Ｆａｂｂｒｉ  Ｇ、ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０１１年；２０８巻（７号）：１３８９〜１４０１頁）。
【００９０】
コピー数解析
ゲノムワイドなＤＮＡプロファイルをＣＬＬ患者の高分子量ゲノムＤＮＡから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ６．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して得た。コピー数変化を同定するために使用したバイオインフォマティクスパイプラインは以前に記載された（Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉ  Ｌら  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１１年；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．８９２；Ｒｉｎａｌｄｉ  Ａら  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ２０１１年；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１４１．２０１１．０８７８９．ｘ）。
【００９１】
遺伝子発現プロファイル分析
精製した正常Ｂ細胞亜集団およびＣＬＬ試料の遺伝子発現プロファイル分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３＿ｐｌｕｓ２アレイを使用して独立した試験の一部として実施した（ＧＥＯデータベースＧＳＥ１２１９５）。図２Ｄで使用したプローブは以下である：２２８７５８＿ａｔ、２０３１４０＿ａｔ、および２１５９９０＿ｓ＿ａｔ（ＢＣＬ６に対して）；２１９８４１＿ａｔおよび２２４４９９＿ｓ＿ａｔ（ＡＩＣＤＡに対して）；２０３６８４＿ｓ＿ａｔおよび２０３６８５＿ａｔ（ＢＣＬ２に対して）；２０４５６２＿ａｔおよび２１６９８６＿ｓ＿ａｔ（ＩＲＦ４に対して）；ならびに２０１０７０＿ｘ＿ａｔ、２０１０７１＿ｘ＿ａｔ、２１１１８５＿ｓ＿ａｔ、および２１４３０５＿ｓ＿ａｔ（ＳＦ３Ｂ１に対して）。
【００９２】
統計解析
全生存を、診断日から死亡日（事象）または最後の追跡調査日（打ち切り）まで測定した。無処置生存を、診断日から、ＩＷＣＬＬ−ＮＣＩガイドラインに従って進行性かつ症候性の疾患に処置が必要になった日（事象）、死亡日、または最後の追跡調査日（打ち切り）まで測定した（Ｈａｌｌｅｋ  Ｍら  Ｂｌｏｏｄ．  ２００８年；１１１巻（１２号）：５４４６〜５４５６頁）。生存をカプラン−マイヤー法（Ｋａｐｌａｎ  ＥＬおよびＭｅｉｅｒ  Ｐ．  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ．  １９５８年；５３巻：４５７〜４８１頁）によって推定した。ＳＦ３Ｂ１変異と生存との間の生の関連性（ｃｒｕｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）をログランク解析によって推定した（Ｋａｐｌａｎ  ＥＬおよびＭｅｉｅｒ  Ｐ．  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ．  １９５８年；５３巻：４５７〜４８１頁）。
【００９３】
カテゴリー変数をカイ二乗検定および適切な場合には正確確率検定（ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）によって比較した。統計的検定は全て両側性であった。統計的有意性をｐ値＜０．０５と定義した。解析は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＰＳＳ）ソフトウェア  ｖ．１８．０（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて実施した。
【００９４】
（実施例２）
慢性リンパ性白血病の進行およびフルダラビン不応性に影響を及ぼすＳＦ３Ｂ１スプライシング因子の変異
全エキソームシークエンシングによって分析されたフルダラビン不応性ＣＬＬの３／１１において反復的なＳＦ３Ｂ１変異が最初に観察された後、患者が最終的に応答できなくなったその処置を開始する直前の進行の時点に収集した、進行性かつフルダラビン不応性のＣＬＬの追加の４８症例におけるＳＦ３Ｂ１コード配列およびスプライス部位の標的化再シークエンシングを実施した（分析した症例の総数：５９）（表１）。フルダラビン不応性ＣＬＬの１０／５９（１７％）において、ミスセンス変異（ｎ＝９）またはインフレーム欠失（ｎ＝１）によってＳＦ３Ｂ１が変化しており、それはＳＦ３Ｂ１タンパク質のＨＥＡＴ３、ＨＥＡＴ４およびＨＥＡＴ５反復において密集していた（図１および図２Ａ；表４）。種間で高度に保存されている２つの部位（コドン６６２およびコドン７００）はそれぞれ３症例および５症例で反復的に変異していた（図１）。ＳＦ３Ｂ１変異は単一対立遺伝子性であり、ＰｏｌｙＰｈｅｎ−２アルゴリズムによると機能的に有意であることが予測された（表４）（Ａｄｚｈｕｂｅｉ  ＩＡら  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１０年；７巻（４号）：２４８〜２４９頁）。これらのデータにより、スプライソソームの重要な構成成分であるスプライシング因子であるＳＦ３Ｂ１の変異が、フルダラビン不応性ＣＬＬと反復的に関連することが実証される。
【００９５】
ＳＦ３Ｂ１変異を有するフルダラビン不応性ＣＬＬの生物学的特性が表１に要約されている。変異はＩＧＨＶ変異の状態、ＣＤ３８発現およびＺＡＰ７０発現に関係なく起こった。フルダラビン不応性の時点に、ＳＦ３Ｂ１変異は正常なＦＩＳＨ核型を有する症例において富化された（ｐ＝０．００８；表１）。また、ＳＦ３Ｂ１変異は、欠失および／または変異によって試験したＴＰ５３の破壊と比較して相互排他的に分布していた（相互の情報Ｉ＝０．０６０９；ｐ＝０．０４６；図２Ｂ）。ＳＦ３Ｂ１変異と、化学療法不応性の症例において富化された他の遺伝子病変（ＴＰ５３の破壊、ＮＯＴＣＨ１変異、ＡＴＭ欠失）を組み合わせることにより（Ｆａｂｂｒｉ  Ｇら  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０１１年；２０８巻（７号）：１３８９〜１４０１頁；Ｄｏｅｈｎｅｒ  Ｈら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０００年；３４３巻（２６号）：１９１０〜１９１６頁；Ｒｏｓｓｉ  Ｄら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９年；１５巻（３号）：９９５〜１００４頁；Ｚｅｎｚ  Ｔら  Ｂｌｏｏｄ．  ２００９年；１１４巻（１３号）：２５８９〜２５９７頁；Ｓｔｉｌｇｅｎｂａｕｅｒ  Ｓら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００９年；２７巻（２４号）：３９９４〜４００１頁）、フルダラビン不応性ＣＬＬは、いくらかの程度までは相互排他的である複数の分子の変化を特徴とするようであった（図２Ｂ）。
【００９６】
ＳＦ３Ｂ１変異が化学療法不応性の症例に制限されるかどうかを調査するために、次いで、フルダラビン不応性の時点に観察される変異の存在率と他の疾患相において観察される変異の存在率を比較した。ＣＬＬ診断時の連続した一連の評価では、ＳＦ３Ｂ１変異はまれであり（１７／３０１；５％）（図２Ａ；表４）、無処置生存（ｐ＜０．００１）および全生存（ｐ＝０．０１１）が短いこととの生の関連性が示された（図２Ｃ）。驚くべきことに、診断時に変異していたＣＬＬの５／１７（２９％）が原発性フルダラビン不応性患者であった。診断時に野生型ＳＦ３Ｂ１対立遺伝子を有した一人の患者はその後、フルダラビン不応性の発生を伴うＳＦ３Ｂ１変異を獲得した（表４の症例７９１５）。診断時に調査したＣＬＬでは、ＳＦ３Ｂ１変異のホットスポット分布および分子スペクトル、ならびに他の遺伝病変とのその相互関係は、フルダラビン不応性ＣＬＬにおいて観察されたものと同様であった（図１および２Ｂ；表４）。ＳＦ３Ｂ１変異は、クローン的に関連するＲＳの２／３３（６．０％）においてのみ見いだされた（図１および２Ａ；表４）。調査した異なる疾患相にわたって、変異は生殖細胞系ＤＮＡが入手可能な全ての症例（ｎ＝１８）において体細胞性に獲得されることが確認された（表４）。ＣＬＬにおけるＳＦ３Ｂ１の相対的な発現は正常Ｂ細胞サブセットと比較して高いが（図２Ｄ）、ＳＮＰアレイ解析による広範囲にわたる調査により、この白血病におけるＳＦ３Ｂ１の限局性のコピー数の異常は除外された（ｎ＝０／３２３）。これらのデータにより、ＳＦ３Ｂ１変異が、ｉ）ＣＬＬ発症のときには低率で起こるが、フルダラビン不応性の症例において富化されること；ｉｉ）ＲＳ転換において副次的な役割を果たし、これにより、ＣＬＬの組織学的シフトがＲＳ転換を伴わない化学療法不応性の進行とは分子的に別個であるという概念が確証されることが実証される（Ｒｏｓｓｉ  Ｄら  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１１年；１１７巻（１２号）：３３９１〜３４０１頁）。
【００９７】
ＳＦ３Ｂ１変異が同定されることにより、ＣＬＬにおける新規の発病機構としてスプライシング調節の関与が示される。ＳＦ３Ｂ１は、主要な（Ｕ２様）スプライソソームとマイナー（Ｕ１２様）スプライソソームの両方の重要な構成成分であり（Ｌｕｋｅ  ＭＭら  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９６年；１６巻（６号）：２７４４〜２７５５頁；Ｗａｎｇ  Ｃら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １９９８年；１２巻（１０号）：１４０９〜１４１４頁；Ｄａｓ  ＢＫら  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９９年；１９巻（１０号）：６７９６〜６８０２頁）、プレｍＲＮＡからイントロンを正確に削除する（Ｗａｈｌ  ＭＣら  Ｃｅｌｌ．  ２００９年；１３６巻（４号）：７０１〜７１８頁；Ｄａｖｉｄ  ＣＪおよびＭａｎｌｅｙ  ＪＬ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０１０年；２４巻（２１号）：２３４３〜２３６４頁；Ｗａｒｄ  ＡＪおよびＣｏｏｐｅｒ  ＴＡ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０１０年；２２０巻（２号）：１５２〜１６３頁。ＣＬＬにおけるＳＦ３Ｂ１変異の正確な生物学的役割は、現在ははっきりとわかっていない。ＣＬＬにおけるＳＦ３Ｂ１変異の病理発生は、これらの変異がＨＥＡＴドメイン内に局在する進化的に保存されたホットスポットに密集することによって強力に裏付けられれ、該ＨＥＡＴドメインは、他の構成成分が集合することができる柔軟な足場としての機能を果たすタンデムに配置された渦巻き様構造である（Ａｎｄｒａｄｅ  ＭＡおよびＢｏｒｋ  Ｐ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９５年；１１巻（２号）：１１５〜１１６頁；Ａｎｄｒａｄｅ  ＭＡら  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  ２００１年；１３４巻（２〜３号）：１１７〜１３１頁）。また、ＳＦ３Ｂ１により、細胞周期の進行およびアポトーシスを制御する遺伝子のオルタナティブスプライシングプログラムが調節されるという知見により、腫瘍細胞の増殖および生存の調整におけるＳＦ３Ｂ１変異の潜在的な寄与が示される（Ｄａｖｉｄ  ＣＪおよびＭａｎｌｅｙ  ＪＬ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０１０年；２４巻（２１号）：２３４３〜２３６４頁；Ｋａｉｄａ  Ｄら  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２００７年；３巻（９号）：５７６〜５８３頁；Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏ  Ａら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０１１年；２５巻（５号）：４４５〜４５９頁）。
【００９８】
病理発生的な関連に加えて、ＳＦ３Ｂ１変異により、現在、抗がん薬として前臨床開発中のＳＦ３Ｂ１阻害剤の処置標的ももたらされる（Ｋａｉｄａ  Ｄら  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２００７年；３巻（９号）：５７６〜５８３頁；Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏ  Ａら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０１１年；２５巻（５号）：４４５〜４５９頁）。
【００９９】
表４．ＣＬＬおよびＲＳにおけるＳＦ３Ｂ１変異
【０１００】
【表４】
2014530013.tif 000013
【０１０１】
ａこれらの患者について、対をなす正常ＤＮＡが入手可能であり、体細胞起源の変異が確認された
ｂこれらの患者では、フルダラビン不応性の時点は臨床的診断を伴った
ｃＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４３３．２による番号付け
ｄＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６５６５．２による番号付け
ｅＳＦ３Ｂ１オルソログ間で保存されている位置
ｆｎａ、該当なし、ＰｏｌｙＰｈｅｎ−２アルゴリズムではアミノ酸置換の影響のみが予測されるため
ｇＣａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースｖ５４リリース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ／）に列挙されている変異。
【０１０２】
本明細書における文書の引用は、いずれも関連性のある先行技術であるとの容認を反映するものと解釈されるべきではない。さらに、それらの引用は、関連性のある開示の検索を示すものではない。文書の日付（複数可）または内容に関する記載は全て、入手可能な情報に基づき、それらの的確さまたは正確さに関する容認ではない。
【０１０３】
特許、特許出願、および刊行物を含めた本明細書において引用された全ての参考文献は、前に具体的に組み入れられていようがいまいが、これによってそれらの全体が参照により組み込まれる。
【０１０４】
ここで本発明の主題が十分に記載され、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、また過度な実験を伴わずに、広範囲の等価なパラメータ、濃度、および条件で本発明を実施することができることが当業者には理解されよう。
【０１０５】
本開示はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらに改変することができることが理解されよう。本出願は、一般に、本開示の原理に従う本開示のいかなる変形、使用、または適応も包含し、本開示からのそのような逸脱を、本開示が関係する技術分野の範囲内の公知または通例の実施の範囲内に入るものとして、および上文に記載されている本質的な特徴に適用することができるものとして含めるものとする。
【図１】
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【図２】
2014530013.tif 000015
【国際調査報告】
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