(57)【要約】  本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）リパーゼの活性の調節を用いて生物、特に微細藻類における脂質含量を増大させる方法に関する。本発明は、上記方法によって得られ、脂質含量が増大した生物又は微細藻類、並びに産業及び医学における、特にオメガ３不飽和脂肪酸を得るためのそれらの使用に更に関する。本発明は、新たなＴＡＧリパーゼをコードするフェオダクチラムに由来する核酸、及びバイオマスにおける脂肪酸の割合、特に多価不飽和脂肪酸の含量に影響を与える際の該核酸の使用に更に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物における脂質含量を増大させる方法であって、
ａ．脂質含量を増大すべき生物を準備する工程と、
ｂ．前記生物におけるリパーゼの発現及び／又は機能を調節する工程と、
を含み、
該リパーゼが、
ｉ．配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は、
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は、
ｉｉｉ．標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列、
を含む核酸配列によってコードされる、方法。
【請求項２】
前記生物が、藻類培養物の形態のクロムアルベオラータ、又は珪藻綱（珪藻）、又はナビキュラ目、又はフェオダクチラム科、又はフェオダクチラムから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現及び／又は機能の調節が低減、又は発現の低減である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物における前記脂質含量が、非処理対照と比較して１１０％〜２５０％まで増大し、又は該脂質含量が１２０％〜２００％、１５０％〜２００％、又は１８０％〜２００％、又は約１９０％まで増大する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質含量の増大が前記生物の一定の成長速度で起こる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物におけるリパーゼの発現及び／又は機能の調節が、該リパーゼの発現及び／又は機能の阻害、又は該リパーゼの配列に対して指向性を有するＲＮＡ干渉構築物の前記生物への導入及び発現によって達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ干渉構築物が、配列番号１〜配列番号１０の１つと少なくとも５０％同一な配列を含み、又は該ＲＮＡ干渉構築物が配列番号１０を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を行うことを含む、脂質含量が増大した生物を産生する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって産生される生物。
【請求項１０】
生物の培養特性を改善する方法であって、該生物におけるリパーゼの発現及び／又は機能を修飾することを含み、
該リパーゼが、
ｉ．配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は、
ｉｉ．配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は、
ｉｉｉ．標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列、
を含む核酸配列によってコードされる、方法。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は（ｉｉｉ）標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列を含む核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸又は請求項１２に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１１に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するリパーゼ。
【請求項１５】
脂質を抽出する方法であって、
ａ．請求項９に記載の生物の培養物を準備することと、
ｂ．前記培養物を所望の培養密度が達成されるまで拡大することと、
ｃ．前記脂質を前記培養物から抽出することと、
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって得られる脂質混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）リパーゼの活性を調節することによって生物、特に微細藻類における脂質含量を増大させる方法に関する。本発明は、脂質含量が増大した、本方法によって産生される生物又は微細藻類、並びに産業及び医学における、特にオメガ３不飽和脂肪酸を得るためのそれらの使用にも関する。本発明は、新たなＴＡＧリパーゼをコードするフェオダクチラム（Phaeodactylum tricornutum）に由来する核酸、及びバイオマスにおける脂肪酸の比率、特に多価不飽和脂肪酸の含量に影響を与える際のその使用に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、ヒトの栄養及び健康に必須である顕著な比率の高多価不飽和オメガ３脂肪酸を含む脂質を大量に産生する。この理由のために、微細藻類は２つの点でバイオテクノロジー及び産業にとって高い関心を集めている。１つには、微細藻類はオメガ３脂肪酸の生産源としての魚油の代替品をもたらし、将来的にはバイオディーゼルの生産用の代替原料となる可能性がある。
【０００３】
現在、藻類バイオマスの生産は、他の原料源と比較して利益の上がるものではなく、従来の供給源と競合するにはあまりにも高コストである。高品質オメガ３脂肪酸は現在、魚油から生産され、バイオディーゼルはとりわけヤシ油から得られる。これまでの微細藻類に由来するオメガ３脂肪酸の唯一の市販品は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の製品である。したがって、競合能を改善するには藻類中の脂質の量を増大させることが不可欠である。
【０００４】
微細藻類は、多くの他の生物と同様に脂質の形態で化学エネルギーを貯蔵する。脂肪酸は主にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態で貯留され、これはいわばエネルギー貯蔵である。必要に応じて、例えば藻類が光合成又は他のエネルギー貯蔵形態（例えばデンプン）の分解によってはエネルギー需要を満たすことができない場合、貯蔵脂質が活性化され、代謝に導入されることにより分解されて、そのエネルギーが取り出される。この活性化の開始反応は全ての生物で同じである。この反応は特定の種類の酵素、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）リパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．３）によって触媒される。
【０００５】
リパーゼは、ＴＡＧ等の脂質から水の消費下で脂肪酸が切断される反応（脂肪分解）を触媒する。分解中に、ジアシルグリセリド及びモノアシルグリセリドが中間体として産生され、最終的に遊離脂肪酸及びグリセロールが産生される。リパーゼは概して工業的に非常に重要であり、様々なプロセスに適用される。このため、リパーゼは石鹸の生産のために油脂化学に使用されるか、又は食品の処理、例えばバターの塗布性のために使用される。
【０００６】
珪藻のフェオダクチラムは、多くの他の脂質に加えて、オメガ３脂肪酸のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５  ｎ−３）を高度に産生する。ヒトの代謝にとってのＥＰＡの重要性が多数の研究において示されており（とりわけ非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、既に栄養剤として、また医学において炎症性リウマチ障害の治療に使用されている（例えばMerckによるＥＰＡＭＡＸ）。これらのＥＰＡ製品は現在、もっぱら魚油から得られている。
【０００７】
リパーゼは現行の技術水準で既知である。特許文献１は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）からのＴＡＧリパーゼをコードする核酸の単離を記載している。シロイヌナズナＴＡＧリパーゼを脂質含量が変更された植物の産生に使用することが提唱されている。それにより、特許文献１は、遺伝的構築物によるトランスジェニック植物におけるＴＡＧリパーゼ発現の増大を提案している。しかしながら、これはＴＡＧ、ひいては貯蔵脂質の含量の低下をもたらす可能性がある。
【０００８】
微生物、特に植物の種子又は海洋生物からのＥＰＡ又はＤＨＡを含有する脂質画分のバイオテクノロジー生産が、特許文献２に記載されている。単離された脂質画分は特に栄養補助食品として使用される。微細藻類等の海洋微生物からの脂質画分の抽出も同様に提唱されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】独国特許出願公開第１００２６８４５号
【特許文献２】欧州特許出願公開第１３９２６２３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Braden and Carol 1986
【非特許文献２】Simopoulus 1991
【非特許文献３】Ramjor et al. 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、従来技術に基づくと、本発明の課題は、バイオマスから脂質及び脂質画分を産生する新たな可能性をもたらすことである。特に、本発明は、藻類バイオマスからの脂質産生のエネルギーバランスの不均衡という問題を克服し、ひいては産業上の利用可能性をもたらそうとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題は、第１の態様において、生物における脂質含量を増大させる方法であって、（ａ）脂質含量を増大すべき生物を準備する工程と、（ｂ）生物におけるリパーゼの発現及び／又は機能を調節する工程とを含み、該リパーゼが、（ｉ）配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は（ｉｉｉ）標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列を含む核酸配列によってコードされる、方法によって解決される。
【００１３】
本発明の全ての実施の形態について、「リパーゼ」という用語は、配列番号１に含まれる全てのリパーゼのアイソフォームも示すものとする。コード配列が配列番号１の３４４９位の終止コドンによって規定されるアイソフォームが特に好ましい。特に、配列番号１の３４４９位の終止コドンと、配列番号１の６６３位（配列番号２）、９６９位（配列番号３）、９７７位（配列番号４）、１０２８位（配列番号５）、１０５５位（配列番号６）、１０５８位（配列番号７）、１１７８位（配列番号８）又は１２１８位（配列番号９）から選択される開始コドンとの間に位置するコード配列を有するリパーゼのアイソフォームが好ましい。配列番号１の３４４９位の終止コドンと、６６３位の開始コドン（配列番号２）との間に位置するコード配列を有するリパーゼのアイソフォームが特に好ましい。
【００１４】
本明細書に記載の本発明において、驚くべきことに、脂質蓄積の増大をもたらすには脂肪代謝の鍵酵素であるＴＡＧリパーゼの発現の阻害が有利であることが見出された。本発明は例示的には、フェオダクチラムの遺伝子組換え突然変異体が野生型と比較して、はるかに多くの脂質を蓄積する一方で、同等の成長速度を示したという事実によって確認される。
【００１５】
脂肪酸異化の中心的な酵素の抑制は、本明細書に示されるように、そのような脂質含量の増大をもたらす。さらに、ＴＡＧリパーゼの発現の抑制により脂質含量が増大する原理は、それぞれの標的遺伝子の同定が可能である限り、藻類の他の種にも適用可能であるものとする。
【００１６】
したがって、本発明は、別の実施の形態において、生物が好ましくは、クロムアルベオラータ、好ましくは珪藻綱（珪藻）、好ましくはナビキュラ目、好ましくはフェオダクチラム科、特に好ましくはフェオダクチラムから選択される上記の方法に関する。例えば、生物は藻類培養物の形態で準備される。
【００１７】
さらに、リパーゼが配列番号１〜配列番号１０の配列と少なくとも５０％同一な配列を含む核酸配列によってコードされることが好ましい。この場合、リパーゼは、一実施の形態においてＴＡＧリパーゼとしての活性を特徴とする。その上、リパーゼが配列番号１〜配列番号１０の配列の１つと５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の程度まで同一な配列を含む核酸によってコードされることが好ましい。
【００１８】
加えて、リパーゼが標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の核酸とハイブリダイズする核酸配列によってコードされることが好ましい。「標準条件」という用語は、特に核酸ハイブリダイゼーションの文脈で、条件が十分にストリンジェントであることを意味する。ストリンジェントな条件とは、特に高温で低塩濃度を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は分子生物学の当業者に既知である。Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, USAを参照されたい。
【００１９】
上述の核酸配列は、リパーゼ、特にＴＡＧリパーゼの生物活性を有するタンパク質をコードする上述のＤＮＡ配列のフラグメント、誘導体及び対立遺伝子多型も包含する。「フラグメント」とは、核酸配列の一部が記載のタンパク質の１つをコードするのに十分に長いことを意味する。したがって、本発明の核酸はＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であるのが好ましい。この文脈での「誘導体」という用語は、配列が１つ又は幾つかの位置で上述のＤＮＡ配列とは異なるが、依然としてこれらの配列と高度の相同性、すなわち配列同一性を示すことを意味する。上述の核酸配列からの逸脱は、例えば欠失、置換、挿入又は組換えによってもたらされ得る。
【００２０】
上述のリパーゼの変異体又は誘導体は、配列が変更された酵素である。しかしながら、新規の酵素変異体は元の生物活性及び触媒活性を保持する。配列変化は、例えば遺伝子コードの縮重のために生じる自然発生的な配列変異であってもよく、又は例えばそれぞれの配列の標的突然変異誘発によって人工的に導入されてもよい。かかる技法は当業者に既知である。
【００２１】
本方法は、生物における脂質含量の増大を可能にすることを意図する。リパーゼが脂質異化の中心点として作用するため、本発明においては、リパーゼの発現及び／又は機能の調節が発現及び／又は機能の低減であることが好ましい。特に、リパーゼの発現が低減されることが好ましい。
【００２２】
本発明の更なる実施の形態では、生物における脂質含量が、非処理対照と比較して１１０％〜２５０％まで増大し、好ましくは脂質含量が１２０％〜２００％、１５０％〜２００％、より好ましくは１８０％〜２００％、最も好ましくは約１９０％まで増大する方法が記載される。言い換えると、本方法は、野生型と比較して少なくとも１．１倍、より好ましくは１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９若しくは２倍又はそれ以上の突然変異体の絶対脂質含量の増大をもたらす。
【００２３】
この関連で、一実施の形態では、生物において個々の脂肪酸も増大し得る。ここで、本方法は１４個、１６個、１８個、２０個、２２個又はそれ以上の炭素原子を有し、１個、２個、３個、４個、５個又はそれ以上の二重結合を有する脂肪酸の含量の増大を可能にする。特に、１４：０、１６：４、１６：３、１６：１、１８：４、１８：２、１８：１、１８：０、２０：４、２０：５及び２２：６脂肪酸（炭素原子：二重結合）の含量が増大する。
【００２４】
本発明の方法は生物における脂質含量の増大をもたらし、脂質含量の増大は驚くべきことに生物の一定の成長速度で起こる。
【００２５】
本発明の一実施の形態では、生物におけるリパーゼの発現及び／又は機能の変化が、リパーゼの発現及び／又は機能を阻害することによって達成される方法がより好ましい。この点で、リパーゼの阻害がＲＮＡ干渉構築物を生物に導入し、発現させることによって達成されることが好ましい。ＲＮＡ干渉構築物はリパーゼの配列に対して指向性を有する。
【００２６】
いわゆるアンチセンスＲＮＡ（標的ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ）の発現を用いて、対応する標的遺伝子の発現を微細藻類において抑制することができる（Riso De et al. 2009）。フェオダクチラムにおけるＴＡＧリパーゼのｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現は、ＴＡＧリパーゼの発現を阻害し、それにより突然変異体は貯留脂質を活性化するか、又はその分解の程度をより少なくすることができる。実際に、本明細書に記載の本発明の一環として、それぞれの遺伝的に修飾されたフェオダクチラム突然変異体が、第１の結果によると、同等の成長速度で顕著に高い脂質含量及びトリアシルグリセロールの顕著な蓄積を有することが示された。
【００２７】
したがって、方法は更なる実施の形態において、リパーゼ活性の調節のためのＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）の使用に関し、ＲＮＡ干渉構築物はセンス構築物、アンチセンス構築物又は逆方向反復構築物から選択される。「逆方向反復」とは反対の、ひいては逆行した方向に配置される繰り返し核酸配列である。このため、逆方向反復はそれ自身とハイブリダイズすることができ、これにより分子はいわゆるヘアピン構造として折り畳まれる。したがって、逆方向反復の発現はヘアピンＲＮＡをもたらし、それにより細胞においてＲＮＡｉプロセスを誘起する二本鎖ＲＮＡを生じる。かかる構築物の設計及び発現は既知であり、技術者にとっていかなる特別な課題ももたらさない。
【００２８】
ＲＮＡｉ構築物は、阻害すべきｍＲＮＡに対して少なくとも高度の相同性を示す配列を有することを特徴とする。これは、細胞ＲＮＡｉ機構が標的ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ構築物の配列類似性に従って配向するためである。ＲＮＡｉにおいて発現は転写後に阻害される。これは例えば、ヌクレアーゼによる標的ｍＲＮＡの分解、又は標的ｍＲＮＡの翻訳の阻害によって起こる。このため、更に好ましい実施の形態では、方法は、配列番号１〜配列番号１０から選択される配列と少なくとも５０％同一であるか、又はかかる配列と標準条件下でハイブリダイズすることができる配列を含むアンチセンス構築物に関する。
【００２９】
この場合、リパーゼを阻害する能力を有するアンチセンス構築物が特に好ましく、該リパーゼは、（ｉ）配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は（ｉｉｉ）標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列を含む核酸配列によってコードされる。配列番号１０を含むか、又は配列番号１０と少なくとも５０％同一な核酸配列によってコードされるリパーゼが特に好ましい。
【００３０】
さらに、ＲＮＡｉ構築物が遺伝子のコード領域のみならず、特に標的遺伝子のｍＲＮＡの５’領域及び３’領域中の非翻訳領域にも指向性を有することが当業者に既知である。したがって、一実施の形態において、ＲＮＡｉ構築物が配列番号１の６６３位、９６９位、９７７位、１０２８位、１０５５位、１０５８位、１１７８位若しくは１２１８位から選択される開始コドンの１つの５’領域に位置するか、又は３４４９位の終止コドンの３’領域に位置する配列を含むことが好ましい。
【００３１】
アンチセンス構築物が配列番号１０を含むことが特に好ましい。
【００３２】
アンチセンス構築物、センス構築物又は逆方向反復構築物を導入し、生物の細胞を形質転換することが好ましい。したがって、生物は微細藻類等の微生物であることが好ましい。ここで、形質転換プロセスを行う当該技術分野で既知の全ての可能性を用いて方法を行うことができる。微細藻類の形質転換の場合、実施例に例示的に記載されるように遺伝子銃形質転換が好ましい。
【００３３】
生物における阻害構築物の発現を確実にするために、好ましい実施の形態では、構築物は発現プロモーターを含有する。プロモーターは阻害配列、例えばアンチセンス構築物、センス構築物又は逆方向反復の構成的発現又は誘導性発現を可能にする。この目的で、発現プロモーターは阻害構築物と操作可能に連結する。培養条件に応じて構築物の誘導又は構成的発現を可能にする硝酸還元酵素プロモーター「ＰｒｏＮｒ」の使用が、微細藻類におけるアンチセンス構築物の発現に特に好ましい。
【００３４】
本方法はＲＮＡｉの適用のみに限定されない。むしろ、本明細書に開示のリパーゼの活性の低減をもたらす全てのプロセスが可能であり、包含される。これは生物のゲノム配列への突然変異の導入によっても達成することができる。かかる突然変異は酵素の活性若しくは安定性に影響を与えるか、又はリパーゼの発現の低減をもたらすことができる。リパーゼの発現を低減させるために、それぞれの遺伝子の調節配列に突然変異を導入するのが好ましい。この目的で、遺伝子の特定のプロモーター配列又はエンハンサー配列が望ましい。突然変異誘発技法としては、例えば相同的組換えによる点突然変異若しくは欠失の導入、又はリパーゼのオープンリーディングフレームの破壊をもたらす任意の他の技法が挙げられる。さらに、いわゆる「小分子」又はリパーゼに対する抗体等の阻害分子によって、リパーゼの触媒活性の特異的阻害を引き起こす方法が考えられる。
【００３５】
この文脈では、本発明は別の態様において、リパーゼのモジュレーターを同定する方法であって、該リパーゼが、（ｉ）配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は（ｉｉｉ）標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列を含む核酸配列によってコードされる、方法を含む。この方法はリパーゼを準備する工程と、リパーゼを潜在的モジュレーターと接触させる工程と、候補モジュレーターの存在下でリパーゼの触媒活性を決定する工程とを含む。
【００３６】
好ましいモジュレーターは、特にいわゆる「小分子」又は核酸及びタンパク質、具体的には阻害抗体の既知のコレクションから選択することができる。この場合、リパーゼの活性のアンタゴニストが本発明におけるモジュレーターとして特に好ましい。
【００３７】
上記のプロセスでは、ＴＡＧからジアシルグリセリド及び遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド及び遊離脂肪酸及び／又はグリセロール及び遊離脂肪酸への変換を決定することによってリパーゼの活性を試験することができる。
【００３８】
本発明の別の態様は、上述の方法を行うことを含む、脂質含量が増大した生物を産生する方法に関する。
【００３９】
本発明の一態様は、上述のプロセスによって作製された生物に関する。この文脈では、「産生」とは、上述のような脂質含量の増大をもたらす生物の遺伝的修飾を意味する。これは特に、アンチセンス構築物の導入による遺伝的修飾によって増大した脂質含量を示す微細藻類に関する。
【００４０】
更なる態様では、本発明は、生物の培養特性を改善する方法であって、該生物におけるリパーゼの発現及び／又は機能を修飾することを含み、該リパーゼが、（ｉ）配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は（ｉｉｉ）標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列を含む核酸配列によってコードされる、方法に関する。
【００４１】
本明細書に記載のリパーゼの発現の調節の過程で、驚くべきことに、本明細書に開示の配列番号１の配列によるリパーゼの発現が損なわれた微細藻類が、特に有利な培養特性を示すことが見出された。修飾された微細藻類は、野生型変異体と比較して藻類培養物のフラスコ壁面への藻類残留物（algae-remains）の沈着が低減する。とりわけ大型リアクターでの培養については、バイオマスの一部が不活性となり、リアクターを短い間隔で洗浄する必要もあるため、かかる沈着物には問題がある。
【００４２】
したがって、方法の好ましい実施の形態では、生物がクロムアルベオラータ、好ましくは珪藻綱（珪藻）、好ましくはナビキュラ目、好ましくはフェオダクチラム科、特に好ましくはフェオダクチラムから選択される。
【００４３】
方法の更なる実施の形態では、培養特性の改善は培養容器における藻類沈着物の低減を特徴とする。
【００４４】
本明細書に記載の本発明の更なる態様では、（ｉ）配列番号１〜配列番号１０から選択される配列、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１０の１つとの配列同一性が少なくとも５０％の配列、又は（ｉｉｉ）標準条件下で配列番号１〜配列番号１０の配列とハイブリダイズする配列を含む核酸が提供される。上述のそれぞれの好ましい実施の形態が特許請求される配列に適用可能である。特に、本発明は新たなリパーゼの配列変異体に関する。
【００４５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の核酸の１つを含むベクターに属する。この文脈では、核酸の発現を可能にする当該技術分野で既知の全ての必要な配列を含有する発現ベクターが特に好ましい。したがって、本発明は本発明の核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞に更に関する。
【００４６】
本発明の別の態様は、本発明の核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するリパーゼである。
【００４７】
本発明の別の態様は、脂質を抽出する方法であって、（ａ）本発明による脂質含量が増大した生物の培養物を準備することと、（ｂ）培養物を所望の培養密度が達成されるまで拡大することと、（ｃ）脂質を培養物から抽出することとを含む、脂質を抽出する方法に関する。
【００４８】
このため、更なる態様では、上述のような脂質を産生する方法によって作製された藻類抽出物又は脂質混合物も含まれる。
【００４９】
本明細書に記載の方法及び材料は、補助食品の製造、並びに化粧品及び医薬品の分野において用いることができる。
【００５０】
以下に添付の図面を参照し、実施例を用いて本発明をより詳細に記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＮＣＢＩの他のデータベースの他のアミノ酸配列との自動ＢＬＡＳＴの結果を示す図である。活性部位「活性部位」の特徴的なアミノ酸に（＃）の印を付ける。（Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi）クエリー／ｇｉ  ２１７４０３９６７＝フェオダクチラムのＴＡＧリパーゼの一部（配列番号ｌ）；ｇｉ  １５２３７６０３＝ＳＤＰ１（糖依存型１）、トリアシルグリセロールリパーゼ（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））；ｇｉ  １６８０１５６９８＝予測タンパク質（ヒメツリガネゴケ（Physcomitrellapatens subsp. patens））；ｇｉ  １５９４６７１９８＝予測タンパク質（コナミドリムシ（Chlamydomonasreinhardtii））；ｇｉ  １１６０５５８７３＝α−βヒドロラーゼスーパーファミリーの予測エステラーゼ（ＩＳＳ）（オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri））；ｇｉ  １２５５８８３５３＝仮想的タンパク質ＯｓＪ＿１３０６５（ジャポニカイネ（Oryza sativa Japonica Group））；ｇｉ  １６８０６８１５３＝予測タンパク質（ヒメツリガネゴケ）
【図２】ＮＣＢＩの他のデータベースの他のアミノ酸配列との自動ＢＬＡＳＴの結果を示す図である。特徴「求核性屈曲（nucleophilic elbow）」の特徴的なアミノ酸に（＃）の印を付ける。（Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi）クエリー／ｇｉ  ２１７４０３９６７＝フェオダクチラムのＴＡＧリパーゼの一部（配列番号ｌ）；ｇｉ  １５２３７６０３＝ＳＤＰ１（糖依存型１）、トリアシルグリセロールリパーゼ（シロイヌナズナ）；ｇｉ  １６８０１５６９８＝予測タンパク質（ヒメツリガネゴケ）；ｇｉ  １５９４６７１９８＝予測タンパク質（コナミドリムシ）；ｇｉ  １１６０５５８７３＝α−βヒドロラーゼスーパーファミリーの予測エステラーゼ（ＩＳＳ）（オストレオコッカス・タウリ）；ｇｉ  １２５５８８３５３＝仮想的タンパク質ＯｓＪ＿１３０６５（ジャポニカイネ）；ｇｉ  １６８０６８１５３＝最後の予測タンパク質）（ヒメツリガネゴケ）
【図３】配列番号Ｃｈｒ＿２４：２８１２５９〜２８４７５２（配列番号１）のリパーゼの遺伝子配列を示す図である。
【図４】アンチセンス構築物ｌｏＡＳ（配列番号１１）及びｓｈＡＳ（配列番号１０）のトリガー配列を示す図である。プライマー結合部位には下線を引いている。
【図５】リパーゼ遺伝子（ｐｕｔ＿ｌｉｐ）並びにアンチセンス構築物ｓｈＡＳ及びｌｏＡＳの注釈付き遺伝子配列の概略図である。
【図６】アンチセンスフラグメントのベクターｐＰｈａＮＲへのクローニングの概要を示す図である。
【図７】フェオダクチラム野生型ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ＳｈＡＳｌの光学顕微鏡写真を示す図である。
【図８】フェオダクチラム野生型ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ＳｈＡＳｌの蛍光顕微鏡写真を示す図である。細胞を蛍光色素ナイルレッドで予め処理して、細胞内の脂質滴を可視化した。
【図９】ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ＳｈＡＳｌの脂質抽出物の薄層クロマトグラフィーを示す図である（固定相：シリカゲル６０  Ｆ２５４、Merck）。移動相はＮＬ：ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（８０：２０：１）及びＰＬ：クロロホルム−メタノール−水（９５：３５：５）である。Ａ：可視光でのクロマトグラフィー。Ｂ：ｐｒｉｍｏｌｉｎ色素。標準においては、以下の意味がある：ＰＧ：ホスファチジルグリセロール、ＰＣ：ホスファチジルコリン、ＰＩ：ホスファチジルイノシトール、ＴＡＧ：トリアシルグリセロール、ＤＡＧ：ジアシルグリセロール、ＭＡＧ：モノアシルグリセロール。
【図１０】野生型（Ｗｔ  ＵＴＥＸ  ６４６）及びアンチセンス突然変異体（ＳｈＡＳｌ）の成長曲線を示す図である。
【図１１】野生型ＵＴＥＸ  ６４６及びアンチセンス突然変異体Ｓｈａｓ１の培養フラスコを示す図である。
【図１２】左側：ｑＲＴ−ＰＣＲの相対量の図。３回の異なるＲＮＡ単離を用いて、野生型（Ｗｔ、黒色バー）又は突然変異体（ＳｈＡＳｌ、白色バー）における新たなリパーゼ（配列番号２）の相対発現レベルを決定し、参照のヒストンＨ４と比較した。ｍＲＮＡレベルの定量化を三連で行った。野生型の平均値を較正基準（calibrator）として使用し、１に設定した。右側：フェオダクチラム野生型（黒色バー）及びリパーゼノックダウン突然変異体（ＳｈＡＳｌ、白色バー）の４つの独立した培養物の乾燥重量（ＴＧ）当たりの脂質収量。色素含量は水玉模様で表し、ＴＡＧ（灰色）を表示する。
【図１３】ＳＩＧＭＡリパーゼアッセイによるリパーゼ活性アッセイを示す図である。問題のリパーゼは本発明による新たなリパーゼであり（配列番号２によってコードされる）、これを大腸菌（E. coli）において組換えにより過剰発現させた。
【図１４】フェオダクチラム（P. tricornutum）野生型に由来する脂質抽出物（暗色バー）及びリパーゼノックダウン突然変異体（明色バー）におけるメチルエステル（ＦＡＭＥ）として測定された脂肪酸の相対比率を示す図である。データは３回の独立実験の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５２】
１．  リパーゼの説明
１．１  新たなＴＡＧリパーゼの現在注釈付けられている遺伝子配列
推定ＴＡＧリパーゼを、他のＴＡＧリパーゼとの類似性に基づき完全にシークエンシングされたフェオダクチラムのゲノムにおいて探索した。ＴＡＧリパーゼ配列の特徴を有するフェオダクチラムに由来する潜在的ＴＡＧリパーゼの遺伝子配列の一部（ｐｕｔ＿ｌｉｐ）が、とりわけＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）のデータベースに見られる。この部分配列はＮＣＢＩ「アクセッション番号」ＸＰ  ００２１８４５１７．１を有し、「仮想的タンパク質「ＰＨＡＴＲＤＲＡＦＴ＿１９７１」として注釈付けられている。１９７１は、ＪＧＩ（Joint Genome Institute、http://genome.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html）の遺伝子データのタンパク質／遺伝子ＩＤである。「ＣＣＡＰ  １０５５／１」は、ゲノムシークエンシングに用いたフェオダクチラム株を表す。
【００５３】
個々の塩基の配位を含むリパーゼの遺伝子配列を図３に示す。
【００５４】
１．２  他の生物のリパーゼに対する相同性
本明細書に記載の核酸配列に対する対応するタンパク質のアミノ酸配列における配列相同性に基づき、潜在的リパーゼを「パタチン−ＳＤＰ１様」リパーゼの群に割り当てる。特に、他のリパーゼと一致する触媒中心（「活性部位」）、第２の保存領域として「求核性屈曲」という２つの保存領域を配列中に見ることができる。図１に触媒中心の触媒アミノ酸を示し、図２では対応する配列中の「求核性屈曲」の特徴的アミノ酸を＃で示す。
【００５５】
同様に「パタチン−ＳＤＰ１様」リパーゼの群に割り当てられた、他の生物に由来する選択された（潜在的）ＴＡＧリパーゼのアミノ酸配列の自己配列比較から、この群内の配列相同性の品質が示される（表１）。
【００５６】
【表１】
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表１：他の生物の様々な「パタチンＳＤＰ１様」リパーゼのアミノ酸配列のアラインメントの結果；Ｐｈａｅｏ＝フェオダクチラムの配列番号１に由来するＴＡＧリパーゼの一部（ＰＨＡＴＲＤＲＡＦＴ＿１９７１）；Ｔａｐｓ＝タラシオシラ・シュードナナ（T. pseudonana）に由来するｐｏｔ  ＴＡＧリパーゼ；Ｓａｃｃｈａ＝サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）に由来するＴＡＧリパーゼ（Ｔｇｌ３）；Ａｒａｂ＝シロイヌナズナ（A. thaliana）に由来するＳＤＰ１、Ｃｈｌａｍｙ＝コナミドリムシ（C.reinhardtii）に由来するｐｏｔ  ＴＡＧリパーゼ；ｈｏｍｏ＝ヒト脂肪ＴＡＧリパーゼ
【００５７】
２．  リパーゼの阻害の説明
例えば相同的組換えによる標的遺伝子「ノックアウト」は現在、フェオダクチラム及び他の珪藻においては可能ではない。しかしながら、アンチセンス構築物の組換え発現による「ノックダウン」としての遺伝子発現の阻害は、確立された方法とみなされる（De Riso et al. 2009）。これを本明細書に記載の突然変異体に用いた。代替的には、逆方向反復構築物を使用することもできる（De Riso et al. 2009）。
【００５８】
２．１  構築物の産生
潜在的ＴＡＧリパーゼの阻害のために、リパーゼ遺伝子ｐｕｔ＿ｌｉｐ（配列番号１）に対する、
１．  ２９０ｂｐのアンチセンスＲＮＡ（短いアンチセンス；ｓｈＡｓ−配列番号１０）、及び、
２．  ３１９ｂｐのアンチセンスＲＮＡ（長いアンチセンス；ｌｏＡｓ−配列番号１１）、
を発現する２つの構築物をクローニングした。フェオダクチラム（Phaeodactylum）のゲノムＤＮＡに由来するアンチセンス構築物の増幅のために、以下のプライマーを使用した：
ＳａｌＩ＿ＡＳ＿ｆｗ：５’−CTTC GTC GACGGC GTT AGC GGG TAC CAA AG−３’（配列番号１２）
ＸｂａＩ＿ｓｈＡＳ＿ｒｖ：５’−CTT TCT AGATGG CAC ACA CGA GCG AAC−３’（配列番号１３）
ＸｂａＩ＿ｌｏＡＳ＿ｒｖ：５’−CTT TCT AGAGCA TTC TTC GTC TGT CCG TG−３’（配列番号１４）
【００５９】
プライマーは各々、リパーゼ特異的配列に加えて５’末端に、その後の発現ベクターｐＰｈａ−ＮＲへのクローニングのための制限部位を含有する（プライマー配列中に下線で示される）。５’末端の付加的な塩基はＰＣＲ産物の効率的な制限に必要とされる。
【００６０】
アンチセンス構築物ｌｏＡＳ（配列番号１１）及びｓｈＡＳ（配列番号１０）のトリガー配列を図４に示す。配列中のプライマー結合部位には下線を引いている。リパーゼ配列中のアンチセンス構築物の位置を図５に示す。
【００６１】
アンチセンスフラグメントをＳａｌＩ／ＸｂａＩ認識部位によってベクターｐＰｈａ−ＮＲにクローニングし（図６）、大腸菌をベクターで形質転換した。プラスミドを大腸菌から抽出した後、そのようにして得られたＤＮＡをフェオダクチラムの形質転換に使用した（下記を参照されたい）。
【００６２】
したがって、突然変異体におけるアンチセンス構築物の組換え発現はプロモーター「ＰｒｏＮＲ」の制御下にある。これはフェオダクチラムに由来する硝酸還元酵素のプロモーターである。このプロモーターは通常誘導可能である、すなわちアンチセンス構築物の発現がそれぞれオン又はオフされる可能性がある。しかしながら、本発明者らにより選ばれたフェオダクチラムの成長条件下では、硝酸還元酵素プロモーターは構成的に活性である。
【００６３】
２．２  フェオダクチラムの形質転換
野生型の形質転換のために、初めに培養物を採取し、初期指数増殖期で濃縮した（およそ４日〜５日及びおよそ３×１０６細胞／ｍｌ〜５×１０６細胞／ｍｌ）。続いて、細胞を遺伝子銃形質転換した。このために、およそｌμｇのＤＮＡを３ｍｇの洗浄済みタングステン粒子でスペルミジン及びＣａＣｌ２を用いて沈殿させ、エタノールで洗浄し、そのように作製された粒子を寒天プレート上、成長培地（プレート１枚当たり１０８個の細胞）中での細胞の衝撃に使用した。翌日、ゼオシンを含有する寒天プレートに細胞を移し、更に３週間後に液体培養を行った。
【００６４】
３．  結果
３．１  リパーゼ突然変異体ＳｈＡＳｌの特性化
日常的な顕微鏡による細胞計数で細胞内の脂質滴の数が著しく多いために注目された突然変異体ＳｈＡＳｌを、その後広範に研究した（図７及び図８）。ｑＲＴ−ＰＣＲを行い、細胞培養物において野生型（ＷＴ）リパーゼ及びＲＮＡｉノックダウン突然変異体（ＳｈＡＳｌ）の相対ｍＲＮＡレベルを決定した。どちらの場合も、リパーゼ転写産物の量を構成的に発現されたヒストンＨ４  ｍＲＮＡによって正規化した。野生型リパーゼｍＲＮＡの平均値を１に設定した。突然変異体におけるリパーゼの相対発現は、ＲＮＡｉ構築物によって４４％（±６％）まで低減した。これらのデータは３回の独立したＲＮＡ単離の平均に基づく（図１２、左側）。
【００６５】
３．２  野生型ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ＳｈＡＳ１の脂質抽出
脂質の抽出及び分析のために、フェオダクチラム野生型ＵＴＥＸ  ６４６及びリパーゼ「ノックダウン」突然変異体ｓｈＡＳｌの各々のエアリフト培養物５Ｌを培養した。フラスコにおよそ５０００００細胞／ｍｌで播種し、ＡＳＰ培地中、以下の条件下で４日間培養した：１８℃、明暗サイクル：１６時間／８時間；およそ４０μＥｍ−２ｓ−１；採取時の細胞数：３×１０６細胞／ｍｌ〜４×１０６細胞／ｍｌ（指数増殖期）。
【００６６】
脂質分析
脂質抽出（採取後の細胞計数及び並行した乾燥重量決定）の出発物質（いずれの場合にも、３ｍｌを脂質抽出に使用した）：
ＵＴＥＸ６４６：２．８×１０９細胞／ｍｌ
ＳｈＡＳ１：２．５×１０９細胞／ｍｌ
【００６７】
これにより以下の量の抽出物が得られた：
ＵＴＥＸ６４６：５６．２ｍｇ（およそ６．７ｐｇ／細胞、０．２２±０．０３ｍｇ（脂質抽出物）／ｍｇ（乾燥重量）に相当）
ＳｈＡＳ１：９６．５ｍｇ（およそ１２．９ｐｇ／細胞、０．２８±０．０１ｍｇ（脂質抽出物）／ｍｇ（乾燥重量）の突然変異体に相当（図１２、右側））
【００６８】
抽出物の量を重量測定により決定したが、脂質だけでなく、様々な色素も含有されていた。しかしながら、野生型と突然変異体とで色素含量が同様であると仮定すると（図１２、右側）、以下の野生型と突然変異体との脂質レベル比を算出することができる：
６．７ｐｇ／細胞（野生型）と比較して１２．９ｐｇ／細胞（突然変異体）＝１．９３
【００６９】
これにより、突然変異体では野生型と比較して１細胞当たりおよそ９０％多い抽出物が得られる。突然変異体では、０．０４±０．０１ｍｇ（ＴＡＧ）／ｍｇ（乾燥重量）であったが、この培養条件下でＷＴにはＴＡＧは存在しなかった。
【００７０】
３．３  脂質抽出物の薄層クロマトグラフィー
抽出物を薄層プレート上で標準に対して分析すると（図９）、突然変異体において野生型（ＷＴ）と比較して強いトリアシルグリセリドの濃縮が観察された。加えて、エステル化後の質量分光分析による野生型ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ｓｈＡＳｌの全脂肪酸組成の調査（ＧＣ−ＭＳによる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析）（酢酸メチル＝ＭＥ）を行った（表２及び表３、並びに図１４）。
【００７１】
表２：ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＭＳ分析による脂肪酸の組成
【表２】
2014527803.tif 000003
脂質抽出物の総量及びＦＡＭＥ−ＧＣ−ＭＳ分析に基づく（ＵＴＥＸ  ６４６については６．７ｐｇ／細胞、ＳｈＡＳｌについては１２．９ｐｇ／細胞）
【００７２】
表３：脂肪酸のアシル鎖長に応じて分類された脂肪酸の組成
【表３】
2014527803.tif 000004
【００７３】
３．４  成長比較
成長の比較のために、３００ｍｌのＡＳＰ培地の３つの独立した培養フラスコに５×１０６細胞／ｍｌで野生型及び突然変異体を播種した。培養物を１８℃の温度、明暗サイクル：１６時間／８時間；およそ４０μＥｍ−２ｓ−１でインキュベートし、バッチ培養として培養した。トーマ型血球計算板（Thoma counting chamber）を用いて細胞数を決定した。野生型ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ＳｈＡＳｌの成長速度は、有意な差を示さなかった（図１０）。
【００７４】
３．５  リパーゼ活性
本発明の単離リパーゼの酵素活性を、ＳＩＧＭＡリパーゼアッセイによって更に検査した。このために、リパーゼを大腸菌中で組換えにより過剰発現させた。本発明の新たなリパーゼはバッファー又はＢＳＡタンパク質を含む対照と比較して、数分後には既に酵素活性を示していた（図１３）。
【００７５】
４．  付加的結果
野生型ＵＴＥＸ  ６４６及び突然変異体ＳｈＡＳｌの成長曲線の記録時に、突然変異体は更に注目に値する特性を示した。通常、フェオダクチラム細胞は培養フラスコの縁に沈殿する傾向がある（「壁面成長（Wall Growth）」）。この現象は、使用した光バイオリアクターから残屑を入念に取り除く必要があるために、とりわけ微細藻類の大量培養において大きな問題となる。野生型と比較して、突然変異体ＳｈＡＳｌは培養フラスコの壁面への沈着の顕著な低減を示した（図１１）。
【図１】
2014527803.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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