(57)【要約】細胞溶解のためのプロセスを提供する。該プロセスは、細胞の懸濁物および溶解試薬を含む混合物を流水式（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）反応装置に通過させる工程を含み、混合物がパルス流または重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ）振動流とともに反応装置を通過する。該プロセスは、好ましくは、ｐＤＮＡまたは封入体などの生物学的産物の調製のために使用される。【選択図】図１
2014507157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の懸濁物および溶解試薬を含む混合物を流水式反応装置に通過させる工程を含み、混合物がパルス流または重ね合わせ振動流とともに反応装置を通過する、細胞溶解のためのプロセス。
【請求項２】
混合物が重ね合わせ振動流とともに反応装置を通過する、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
振動流が最大２０Ｈｚ、そして好ましくは０．１〜３Ｈｚの振動数である、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
１ｘ１０５ｓ−１未満の流体歪み速度で操作される、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項５】
２またはそれより多い流水式反応装置を連続して使用する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項６】
混合物が第一の流水式反応装置を通過した後に、反応停止試薬を混合物に添加する、請求項５記載のプロセス。
【請求項７】
生物学的産物を産生するためのプロセスであって：
ａ）生物学的産物を産生する宿主細胞を培養し；
ｂ）請求項１〜６のいずれか記載のプロセスによって細胞を溶解し；そして
ｃ）生物学的産物を回収する
工程を含む、請求項５記載のプロセス。
【請求項８】
生物学的産物がｐＤＮＡまたは封入体である、請求項７記載のプロセス。
【請求項９】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である、請求項６または７のいずれか記載のプロセス。
【請求項１０】
少なくとも１０であり、そして５００を超えない、特に１００〜２５０の範囲内の振動レイノルズ数を達成するように反応装置を設定し、そして操作する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項１１】
５〜５０、例えば１０〜２０の純流動レイノルズ数を達成するように反応装置を設定し、そして操作する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項１２】
２〜２０、特に２〜１２の範囲内の速度比を達成するように反応装置を設定し、そして操作する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を溶解するためのプロセス、そして特に、細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の抽出に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞溶解は、細胞内から生物学的産物を回収するために一般的に実施される方法である。多くの場合、細胞を溶解試薬、一般的には界面活性剤を含むアルカリ溶液、または溶解酵素溶液と接触させる。次いで、生物学的産物を溶解溶液から回収することも可能である。
【０００３】
ＥＰ０８１１０５５は、細胞溶解を達成するための静的ミキサーの使用を開示する。
ＥＰ０９６７２６９は、細胞溶解のための流体ボルテックスミキサーの使用を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＥＰ０８１１０５５
【特許文献２】ＥＰ０９６７２６９
【発明の概要】
【０００５】
本発明にしたがって、細胞の懸濁物および溶解試薬を含む混合物を流水式（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）反応装置に通過させる工程を含み、混合物がパルス流または重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ）振動流とともに反応装置を通過する、細胞溶解のためのプロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は本発明のプロセスの１構成を示す図面である。
【図２】図２はアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す写真である。
【図３】図３は本発明のプロセスの１構成を示す図面である。
【図４】図４は本発明のプロセスの１構成を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
当該技術分野に知られる、流水式反応装置中でパルス流または重ね合わせ振動流を生成する、いかなる方法を、本発明のプロセスにおいて使用してもよい。パルス流または重ね合わせ振動流を生成する方法には、例えば、反応装置のいくつかの内在性の要素の交互運動の使用、例えば往復プレートカラムの操作が含まれ、この場合、振動は純流動（ｎｅｔ  ｆｌｏｗ）方向と一致した運動およびそれと反対の運動をプレートが交互に行うことによって生じる。
【０００８】
他の例において、振動流は、反応装置中に含有される液体に対する摂動の流水伝達（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）によって生じる。この摂動は、典型的には、例えば容積型ポンプ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｕｍｐｓ）（例えばプラグポンプまたは膜ポンプ）を用いて反応装置内にフィードを導入する系によって、または空気式振動系を用いることによって生じる。空気式振動系において、振動は、並列分岐中に含有される液体をカラムに向けて推進する加圧気体によって生じる。
【０００９】
さらなる例において、パルス流は、液体をパルセイション・チャンバーに導入して、これがチャンバー内部の圧を増加させることによって生じる。チャンバー中の圧が十分に高くなったら、バルブ手段は、チャンバーから反応装置内に液体が放出されることを可能にする。パルセイション・チャンバー中の対応する圧低下が、バルブ閉鎖を引き起こす。
【００１０】
特定の態様において、振動流を生成する好ましい方法は、振動ピストンポンプの使用を含む。
本発明のプロセスを使用して、細胞から、ポリヌクレオチド、例えばｐＤＮＡ、またはタンパク質、例えば周辺質タンパク質、あるいは封入体などの生物学的産物を回収することも可能である。
【００１１】
本発明のプロセスによって回収可能な生物学的産物は、一般的に、宿主細胞の増殖および採取、そして好ましくは組換え微生物の微生物発酵によって産生される。最も好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）であるが、多くの他の細胞タイプが使用可能である。これには、他の細菌、例えばシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、酵母およびより高次の細胞が含まれる。例には、酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびクロイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種および藻類、クラミドモナス属（Ｃｈａｍｙｄｏｍｏｍａｓ）が含まれる。
【００１２】
本発明のプロセスによって回収可能な封入体は、大腸菌などの細菌細胞の細胞質において形成される、最も一般的にはタンパク質、そして特に組換えタンパク質を含む、不溶性凝集体である。
【００１３】
本発明のプロセスは、好ましくは、ｐＤＮＡの抽出のために使用される。本発明のプロセスによって抽出可能なｐＤＮＡは、複数の型、例えばスーパーコイル型、直鎖および開環（すなわちニックが入ったかまたは弛緩した）アイソフォームの１またはそれより多くで産生されてもよい。スーパーコイル型ｐＤＮＡアイソフォームは、共有結合閉環型を有し、そしてｐＤＮＡは宿主酵素系の作用によって、宿主細胞において負のスーパーコイル状である。開環アイソフォームにおいて、ｐＤＮＡ二重鎖の一方の鎖は、１またはそれより多い箇所で破壊される。多くのプラスミド適用のため、スーパーコイル型アイソフォームが最も好ましく、そして直鎖および開環アイソフォームから好適に分離される。遺伝子移入、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ形質転換またはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のためのプラスミドは、スーパーコイル型プラスミド・アイソフォームが高い割合であり、そして開環アイソフォームが低い割合であることを必要とする可能性もある。したがって、非常に精製されたスーパーコイル型プラスミドＤＮＡを得ることに関する商業的必要性は非常に高い。開環プラスミド・アイソフォームをスーパーコイル型アイソフォームに変換する方法が当該技術分野に知られる。例えば、ＵＳ２００６００５７６８３は、これが酵素的に達成されるプロセスを開示する。したがって、特定の態様において、本発明を用いた抽出後、当該技術分野で確立された方法を用いて、開環アイソフォーム中のｐＤＮＡをスーパーコイル型アイソフォームに変換する。
【００１４】
ｐＤＮＡの産生法は当該技術分野に周知である。ｐＤＮＡは天然または人工、例えば外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡ挿入物を所持するクローニングベクターであってもよい。多くの態様において、ｐＤＮＡは、１キロ塩基〜５０キロ塩基のサイズ範囲である。例えば、発現される干渉ＲＮＡをコードするｐＤＮＡは、典型的には、３キロ塩基〜４キロ塩基のサイズ範囲である。
【００１５】
本発明のプロセスで使用可能な細胞を含む液体には、細胞が増殖されてきた培養ブロスが含まれる。中間処理を伴わずに培養ブロスを使用してもよいし、あるいは培養ブロスを少なくとも部分的に精製するか、または例えば遠心分離によって細胞の濃度を増加させるように培養ブロスを処理してもよい。多くの好ましい態様において、液体は、細胞を培養ブロスから採取し、そして次いで、細胞を好ましくは水性緩衝溶液中に再懸濁することによって調製される、細胞の懸濁物である。細胞は、当該技術分野に周知の方法、例えば遠心分離または精密ろ過によって採取される。
【００１６】
細胞の再懸濁物を使用する場合、細胞は、好ましくは、一般的に４〜１０の範囲のｐＨ、そして好ましくはほぼ中性のｐＨ、例えば７〜９のｐＨを持つ、水性緩衝液中に再懸濁される。緩衝塩濃度は、一般的に１０〜１００ｍＭの範囲、例えば２０〜８０ｍＭの範囲である。特定の態様において、特に適切な緩衝液は、ｐＨ８の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌである。緩衝液は、溶液中の金属イオンを維持し、そして細胞壁陽イオン、例えばカルシウムを可溶化するため、ＥＤＴＡなどのキレート剤を含有してもよい。再懸濁緩衝液はまた、一般的に２〜１５％ｗ／ｗ、好ましくは５〜１０％ｗ／ｗの範囲のポリオール、例えばスクロース；一般的に１〜５％ｗ／ｗ、好ましくは１〜３％ｗ／ｗの範囲の界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００；および／または一般的に０．５〜８Ｍ、好ましくは１〜３Ｍの範囲の濃度のカオトロープ、例えば尿素などの、ｐＤＮＡ遊離を補助する他の化合物も含有してもよい。
【００１７】
細胞を含む液体が培養ブロスである場合、ｐＨを４〜１０の範囲のｐＨに、そして好ましくはほぼ中性のｐＨに、例えば７〜９に調整してもよい。望ましい場合、細胞懸濁のため、上述のような細胞内容物の遊離を補助するため、キレート剤および他の化合物を使用してもよい。
【００１８】
使用可能な溶解試薬は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、水性アルカリ界面活性剤溶液および細胞壁溶解酵素、例えばリゾチームが含まれる。好ましい溶解試薬は、アルカリ界面活性剤溶液、例えば０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．１Ｍ水性水酸化ナトリウムを含む。溶解試薬は、水性糖溶液、例えばスクロース溶液、およびキレート剤、例えばＥＤＴＡを含むことも可能であり、例えば周知のＳＴＥＴ緩衝剤である。特定の態様において、溶解試薬は、細胞懸濁物を、所望の濃度の二倍を有する等体積の溶解溶液（例えば０．２Ｍ水酸化ナトリウム、１．０％ドデシル硫酸ナトリウム）と混合することによって調製される。
【００１９】
所望の度合いの溶解が達成された後、一般的に、溶解された細胞を含む混合物を、中和試薬または反応停止試薬と接触させて、溶解試薬が所望の産物に不都合に影響を与えないように条件を調整する。多くの場合、ｐＨを５〜９、そして好ましくは６〜８、最も好ましくは６．５〜７．５のｐＨに調整して、細胞内容物の分解を最小限にするかまたは防止する。溶解試薬がアルカリ溶液を含む場合、中和試薬は、好ましくは酸性緩衝液、例えばアルカリ金属酢酸塩／酢酸緩衝液を含む。多くの態様において、溶解が実質的に完了する一方、所望の産物の分解が最小限になるように、溶解条件、例えば温度および溶解試薬組成を選択する。多くの態様において、最長１０〜２０分間、一般的には約５分間の溶解時間を使用する。
【００２０】
細胞および溶解試薬の混合物は、パルス流または重ね合わせ振動流とともに流水式反応装置を通過し、好ましくはパルスまたは振動は、実質的に純流動軸に沿っている。多くの態様において、パルス流または振動流は、最大２０Ｈｚ、例えば最大１５Ｈｚ、好ましくは最大１０Ｈｚ、そして最も好ましくは最大５Ｈｚの振動数である。特定の態様において、０．１〜３Ｈｚ、特に０．５〜２Ｈｚの振動数を使用する。
【００２１】
細胞の所望の度合いの溶解、そして典型的には実質的に完全な溶解を達成するように、反応装置中の所望の滞留時間を達成するため、反応装置の体積とともに、流速を選択することが認識されるであろう。
【００２２】
振動の振幅および振動数、整流装置スペーシング、整流装置および壁の間のスペーシング、ならびに整流装置設計は、所望の度合いの混合を達成し、そして剪断力を調節するように選択される。剪断力は、所望の産物に対する損傷を最小限にするかまたは回避するように調節される。好ましくは、１ｘ１０５ｓ−１未満の流体歪み速度を達成するように条件を調節する。本発明記載のプロセスは、滞留時間および混合効率の両方を単純に調節して、産物回収を最適化し、そして産物に対する損傷を回避することを可能にする。
【００２３】
多くの態様において、流水式反応装置は、垂直、水平または傾斜であってもよいカラムを含む。好ましくは垂直または傾斜カラムを使用し、液体は、カラム基部に向かって、またはカラム基部で反応装置に進入し、そして最上部でまたは最上部に向かって反応装置から出て行く。最も一般的には、カラムは円柱状であり、そして１またはそれより多い整流装置、好ましくは環状整流装置を含むことも可能である。望ましい場合、２またはそれより多い流水式反応装置を連続して連結させてもよい。反応装置はまた、反応装置温度調節を可能にする熱交換体、例えばジャケット、試料ポート、流量計、ｐＨ計、伝導率計および類似のプロセス監視装置を含んでもよい。
【００２４】
多くの態様において、少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、そして典型的には５００を超えない、特に１００〜２５０の範囲の振動レイノルズ数（Ｒ振動）を達成するように、反応装置を設計し、そして操作する。特定の態様において、少なくとも５、そして典型的には５０を超えない、例えば１０〜２０の純流動レイノルズ数（Ｒ純流動）を達成するように、反応装置を設計し、そして操作する。特定の好ましい態様において、２〜２０、特に２〜１２の範囲の速度比（Ｒ振動：Ｒ純流動）を達成するように、反応装置を設計し、そして操作する。
【００２５】
特定の態様において、流水式反応装置から出る溶解細胞を、中和試薬または反応停止試薬を含有する容器、好ましくは攪拌容器中に収集する。他の態様において、溶解細胞を、さらなる流水式反応装置中で、最も好ましくは振動流を用いてこの反応装置を通過させながら、中和溶液または反応停止溶液と合わせる。多くの好ましい態様において、中和反応装置または反応停止反応装置は、整流カラムを含む。重ね合わせ振動流またはパルス流と組み合わせたこうしたカラムの使用によって、中和または反応停止が低剪断で迅速に達成可能であり、そしてしたがって所望の産物の分解が最小限になるような、十分な混合が可能になる。
【００２６】
本発明のプロセスは、小規模、中規模または大規模で産生される産物のプロセシングに適している。小規模は、典型的には、一般的に、振盪フラスコを使用する、最大２リットルまでの規模と見なされる。中規模は、典型的には、２リットルから５００リットルの規模と見なされる。大規模は、典型的には、５００リットルより大きい、例えば最大１００，０００リットル、例えば１０００リットル〜１０，０００リットルの規模と見なされる。
【００２７】
本発明のプロセスによって抽出されているｐＤＮＡは、一般的に、当該技術分野に知られる方法によって精製され、そして単離される。こうした方法の例には、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、ディアフィルトレーション、ＣＴＡＢの添加などのまたはＬａｎｄｅｒら  ＵＳ６７９７４７６に記載されるような沈殿、およびＨｕｂｂｕｎｃｈら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００５）４２  ｐｐ５７−６６に記載されるような二相水性抽出が含まれる。
【００２８】
巨大な細胞破片、タンパク質および大部分のゲノムＤＮＡは、一般的に、遠心分離によって除去される。ＲＮアーゼを用いた場合による処理を使用してもよく、そしてｐＤＮＡをろ過して、例えば０．４５ミクロン・フィルターを通じたろ過で、小さい破片をさらに取り除いてもよい。
【００２９】
ｐＤＮＡのサイズにしたがって選択される分子量カットオフを有する限外ろ過膜を一般的に用いて、さらなる不純物をディアフィルトレーションによって除去してもよい。
使用可能なクロマトグラフィー法には、荷電膜クロマトグラフィー（例えばＥｎｄｒｅｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）３７  ｐｐ２５９−６６に記載されるようなもの）、モノリス・クロマトグラフィー（例えばＳｔａｎｃａｒら，  Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）７６：  ｐｐ４９−８５に記載されるようなもの）、陰イオン交換クロマトグラフィーＨＩＣおよび逆相クロマトグラフィーが含まれる。多くの態様において、陰イオン交換法またはＨＩＣおよび逆相法が使用される。遠心分離、ろ過およびディアフィルトレーション工程の少なくとも１つ、そして好ましくは各々が、クロマトグラフィー前に使用されることが好ましい。適切な陰イオン交換マトリックスの例には、ＰＯＲＯＳ陰イオン交換樹脂、Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ、Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ、およびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより入手可能なものが含まれる。適切な逆相マトリックスの例には、ＰＯＲＯＳ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＰＱ  Ｃｏｒｐ．、Ｚｏｒｂａｘ、ＢｉｏＳｅｐｒａ樹脂、ＢｉｏＳｅｐｒａ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ樹脂、ＢｉｏＳｅｐｒａ  Ｑ−Ｈｙｐｅｒ  Ｄ樹脂およびＡｍｉｃｏｎより入手可能なものが含まれる。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーに先行する。適切なＨＩＣ樹脂の例には、セファロース、例えばフェニル、ブチルおよびオクチルセファロース、ならびにＴｏｙｏｐｅａｒｌ、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌヘキシル、ブチルおよびフェニルが含まれる。
【００３０】
精製ｐＤＮＡを濃縮し、そして／またはディアフィルトレーションして、体積を減少させるかまたは緩衝液を交換してもよく、例えばｐＤＮＡを薬学的に許容されうるキャリアーまたは緩衝溶液内に移して、場合によってその後、滅菌してもよい。薬学的に許容されうるキャリアーまたは緩衝溶液の例が、当該技術分野に知られる。ｐＤＮＡの濃縮に適した方法が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ディアフィルトレーション、アルコール沈殿および凍結乾燥が含まれ、ディアフィルトレーションが好ましい。ｐＤＮＡの有用性に影響を及ぼさない滅菌法が当該技術分野に周知であり、例えば小さい孔サイズ、例えば０．２ミクロンおよびそれより小さい孔サイズを有する膜の通過による滅菌がある。
【００３１】
一般的に、本発明のプロセスによって抽出する封入体を、当該技術分野に知られる方法によって精製する。一般的に、タンパク質製封入体を可溶化し、そして次いで、再フォールディングして、機能性天然タンパク質を産生し、これを次いで、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、固定金属アフィニティクロマトグラフィー、ｒｐ−ｈｐｌｃ、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの直交性クロマトグラフィー化学反応によって精製する。多くの場合、次いで、例えば０．２ミクロンフィルターを通じてタンパク質を滅菌ろ過する。
【００３２】
本発明のプロセスを図１、３および４に例示する。図１では、フィードポンプ２および３は、それぞれ、緩衝細胞懸濁物およびＮａＯＨ／ＳＤＳ溶液を流水式反応装置４に供給し、該反応装置には、反応装置を通じて長軸方向に走り、そして整流装置が等間隔に装着されたストリンガーが装着される。振動ポンプ１は、反応装置を通じた、反応媒体の振動流を提供する。反応装置４を出る際に、ポンプ６が供給する酢酸カリウム溶液と反応媒体を接触させる。酢酸カリウム溶液を加えた反応混合物は、次いで、やはり等間隔の整流装置を有する長軸方向のストリンガーが装着された反応装置７を通じて、第二の流れを通じて流れ、そして次いで、出口８で出る。
【００３３】
図３に示す構成では、細胞懸濁物を、１で整流反応装置に投入する。振動流を振動装置２によって提供する。細胞懸濁物が反応装置を流れるにつれて、１またはそれより多い試薬入口３を通じて所望の試薬を添加してもよく、そして細胞懸濁物は、出口４で反応装置から出る。
【００３４】
図４に示す構成では、細胞懸濁物および溶解試薬を、２で整流反応装置内に投入する。振動装置１によって振動流を提供する。細胞懸濁物および試薬は、各々、等間隔の整流装置を有する長軸方向のストリンガーが装着された、複数の流水式反応装置３および５を通じて流れ、そして次いで出口６で反応装置から出る。
【００３５】
本発明は、以下の実施例によって、限定されることなく例示される。
株調製：
抗ニワトリ卵白リゾチームＦａｂ  Ｄ１．３をコードするプラスミドを含有する組換え大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ株を、実験研究に用いた。Ｄ１．３遺伝子を含有するプラスミドのサイズは〜７．５ｋｂであった。
【実施例】
【００３６】
大腸菌株のグリセロールストック４０μｌを、１０ｍｇ／ｍＬテトラサイクリンを補充した５ｍＬのＬＢ（ルリアブロス）培地内に接種し、そして次いで、これを２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩（〜１６時間）、インキュベーションした。次いで、この一晩培養物５０ｍＬを、０．５ＬのＬＢ培地（１０ｍｇ／ｍＬテトラサイクリンを補充したもの）を含有する２Ｌ整流振盪フラスコ内に接種し、そして２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩（〜１６時間）、増殖させた。次いで、１６，０００ｇ、５分間の遠心分離によって、０．５Ｌ振盪フラスコ培養物を採取した。上清分画をデカントして廃棄し、そして細胞ペレットを、所望のターゲットの５％（ｗ／ｖ）濃度で、細胞再懸濁緩衝液Ｐ１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）内に再懸濁した。１７０ｍＬの緩衝液Ｐ１の存在下で、細胞ペレット混合物をボルテックスすることによって、７．７ｇ湿細胞ペレットの再懸濁を達成し、４．５％ｗ／ｖ均質細胞懸濁物を提供した。この生じた１８０ｍＬ細胞懸濁物が、図１に例示するように構成した連続振動整流反応装置（「ＣＯＢＲ」）系の出発フィード物質であった。
【００３７】
ＣＯＢＲ系は、連続して配置される２つのガラス壁試験管からなり、したがって、重ね合わせ振動流を伴う２つの流水式反応装置を生成する。各試験管は直径７ｍｍ、高さ４６．５ｃｍであり、そして各々１ｃｍ離れた３２の内部整流装置を含有し、したがって、０．４５ｍＬの整流チャンバー体積を生じる（流水式反応装置あたり１８．５ｍＬ）。３つのポンプ（三方向バルブ系によって連結される）が、第一の流水式反応装置内にフィードした。第一のポンプは、細胞懸濁物を反応装置内にフィードし、そして第二のポンプは溶解溶液、緩衝液Ｐ２（０．２Ｍ水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム）をフィードした。第三のポンプ（５ｍｌシリンジが装着された、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＰＶＭ計測ポンプ）は、振動流を提供した。第四のポンプは、中和緩衝液Ｐ３（３Ｍ酢酸ナトリウム、２Ｍ酢酸、ｐＨ５．５）を第二の反応チャンバー内にフィードした。三方向バルブセットアップ、２つの反応チャンバーおよび連結チュービングを含む、ＣＯＢＲ系の総体積は３７ｍＬであった。
【００３８】
等体積の細胞懸濁物および緩衝液Ｐ２を、同じフィード速度で第一の振動反応装置内にフィードした。溶解反応時間を５分間に調節するため、第一の反応装置内への流速を、各フィードに関して１．８５ｍＬ／分に設定し、これは３．７ｍＬ／分の合わせたフィード速度に相当し、したがって、５分間の滞留時間を生じた。５分間の溶解時間後、細胞溶解物が第二の流水式チャンバー内を通過するにつれて、緩衝液Ｐ３（３Ｍ酢酸ナトリウム）の連続添加によって、細胞溶解物を中和した。緩衝液Ｐ３のフィード速度もまた１．８５ｍＬ／分であったため、第二の反応装置中の中和溶解物の滞留時間は３．４分であった。第二の流水式チャンバー出口から、単一のバルクとして溶解物を収集した。反応中、ポンプ３は、振動流構成要素を提供し、３ヘルツの振動数で０．１ｃｍ移動を生じた。出口流からのスポット試料を９０ｍＬ間隔で採取し、そしてプラスミドＤＮＡ含量に関して分析した。ＣＯＢＲ実験の経過中、１８０ｍＬの細胞懸濁物を、全部で１８０ｍＬの緩衝液Ｐ２および１８０ｍＬの緩衝液Ｐ３と混合し、９０分間の期間に渡って、５４０ｍＬ細胞溶解物を生成した。
【００３９】
最終バルクの０．６ｍＬ試料を採取することによって、ＣＯＢＲ溶解物のプラスミドＤＮＡ分析を行い、そして０．４５μｍフィルターを通じて９０ｍＬスポット試料を浄化した。ＣＯＢＲ実験からのプラスミドＤＮＡの回収効率を評価するため、この場合は、ＣＯＢＲ実験用の細胞を生成するのに用いたものと同じ培養物１．５ｍＬからの標準実験室ミニプレップである陽性対照からの回収に対して、比較を行った。ミニプレップに関しては、細胞を再懸濁して、ＣＯＢＲ細胞懸濁物のものと同等の４．４％細胞懸濁物にした。ＣＯＢＲ実験に用いた緩衝液Ｐ１、Ｐ２およびＰ３を、ミニプレップにもまた用いた。ＣＯＢＲおよびミニプレップ抽出物を、０．８体積の１００％イソプロパノールの添加を用いて、ＤＮＡ沈殿によって濃縮した。続いて浄化したＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した後、５０μＬの精製水内に再懸濁した。
【００４０】
ＣＯＢＲ試料１〜５（それぞれ、反応体積ポイント、９０ｍＬ、１８０ｍＬ、２７０ｍＬ、３６０ｍＬおよび最終）、および最終バルク抽出物の２つの複製試料と一緒に２つの複製ミニプレップ試料をアガロースゲル電気泳動すると（図２）、ＣＯＢＲ反応中のプラスミドＤＮＡ抽出レベルが、定性的にミニプレップ由来のものと同等であることが示された。さらに、ＣＯＢＲ実験経過に渡って生成されるｐＤＮＡのレベルは、最終バルク試料におけるものと同等であった。
【００４１】
定量的ＡＩＥＸ  ＨＰＬＣ（陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー）によって、この実験由来の平均ミニプレップ収量は、ＣＯＢＲバルクの５３．６±０．２μｇ／ｍＬと比較して、５４．５±７．３μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡであった（表１）。等量の細胞懸濁物が各反応に投入されているため、これらの結果は、各プロセスによって抽出されるプラスミドＤＮＡのレベルが同等であったことを示す。さらに、ＣＯＢＲの異なる時点での試料に関するプラスミドＤＮＡ回収の平均レベルは４６．８±５．５μｇ／ｍＬであり、ＣＯＢＲ反応経過に渡る抽出レベルは一定であり、そしてバルクＣＯＢＲ試料のものに匹敵することが確認された。
【００４２】
表１．  ＣＯＢＲ反応由来の試料のＡＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析。２つの複製ミニプレップ試料、ならびにＣＯＢＲスポット試料および２つの複製ＣＯＢＲバルク試料を分析し、そしてプラスミドＤＮＡ標準曲線に対して定量化した。
【００４３】
【表１】
2014507157.tif 000003
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【国際調査報告】
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