(57)【要約】本発明は、川崎病を診断および治療するための組成物および方法を提供する。より具体的には、ＫＤを有する患者のプロテオームでは、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣが増大しており、これらは、ＫＤのためのバイオマーカー（および潜在的治療標的）となる。したがって、本明細書において提供する組成物および方法を用いる、これらのバイオマーカーの検出は、対象に実施される治療法を教示することができる。2014512014.tif 000013
2014512014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において川崎病（ＫＤ）を診断するためのアッセイ法であって、
メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣから選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルについて、対象から得られた生体試料を分析するステップ
を含み、
正規化タンパク質の参照レベルと比較して、該バイオマーカーのレベルの２倍以上の増加が、ＫＤを該対象が有していることを示す、アッセイ法。
【請求項２】
前記正規化タンパク質の参照レベルが、（ａ）ＫＤを有していない個体におけるバイオマーカーのレベル、（ｂ）前記対象試料中のハウスキーピングタンパク質のレベル、または（ｃ）前記生体試料中の総タンパク質のレベルである、請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項３】
ＫＤを有する対象の治療効果をモニタリングするための方法であって、
（ａ）第１の時点において対象から得られた生体試料から、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣから成る群からの少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するステップ、
（ｂ）該対象に対して治療を施すステップ、
（ｃ）第２の時点において該対象から得られた試料中の、該バイオマーカーのレベルを決定するステップ、ならびに
（ｄ）該第２の時点における該バイオマーカーのレベルを、該第１の時点における該バイオマーカーのレベルと比較するステップ
を含み、該第２の時点における該バイオマーカーのレベルの減少が、該対象に対して該治療が有効であることを示し、かつ、該第２の時点における該バイオマーカーのレベルの増加が、該対象に対して該治療が有効ではないことを示す、方法。
【請求項４】
前記生体試料が尿または血清である、請求項１もしくは２に記載のアッセイ法、または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマーカーのレベルが、抗体に基づいた結合物質を使用して検出され、該結合物質が該バイオマーカーに特異的に結合する、請求項１もしくは２に記載のアッセイ法、または請求項３もしくは４に記載の方法。
【請求項６】
ＫＤバイオマーカーのレベルが増加した前記対象に対して、追加の治療を施すステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
生体試料中のＫＤバイオマーカーを検出するための試薬を含む、ＫＤの検出のためのキットであって、該ＫＤバイオマーカーが、フィラミンＣ、フィラミンＢ、またはメプリンＡである、キット。
【請求項８】
前記生体試料が尿または血清である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記試薬が、フィラミンＣに結合する作用物質、またはメプリンＡに結合する作用物質、またはフィラミンＢに結合する作用物質を含む、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
前記作用物質が抗体またはその一部である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記試薬が、フィラミンＢ、フィラミンＣ、またはメプリンＡの標準量を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記試薬が正規化のためのタンパク質標準物質を含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
請求項８に記載の作用物質に結合する第２の作用物質をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
請求項９に記載の抗体に結合する第２の作用物質をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
前記第２の作用物質が検出可能に標識される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記検出が、検出されたバイオマーカーのレベルを測定することをさらに含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
ＥＬＩＳＡキットである、請求項７〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
少なくとも一個体のＫＤを診断するための方法をコンピュータ上で実施するためのソフトウェアモジュールを定義するためのコンピュータ可読の命令が記録された、固定されたコンピュータ可読記憶媒体であって、
（ａ）少なくとも一個体から得られた生体試料に関して決定される、フィラミンＢ、フィラミンＣ、およびメプリンＡから選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルならびに正規化タンパク質のレベルを表すデータを記憶しかつ該データにアクセスするための命令と、（ｂ）正規化モジュールによって該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを該正規化タンパク質のレベルに正規化し、それにより、該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルを生成するための命令と、（ｃ）比較モジュールを使用して、該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルを、記憶装置上に記憶された参照データと比較するための命令であって、比較するステップが、読み出された内容を生成する、命令と、（ｄ）該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルに変化があるかどうかを表示する該読み出された内容のページを、ユーザに表示し、それにより、ＫＤを該少なくとも一個体が有するかどうかを判定するための命令と
を備える、固定されたコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１９】
川崎病（ＫＤ）を治療する方法であって、
正規化タンパク質の参照レベルと比較して、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣから選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが治療前に２倍超増加した対象に対して、ガンマグロブリンの有効量を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
川崎病（ＫＤ）を診断するための方法であって、
メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣから選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルについて、対象から得られた生体試料を分析するステップ
を含み、
正規化タンパク質の参照レベルと比較して、該バイオマーカーのレベルの２倍以上の増加が、ＫＤを該対象が有していることを示す、方法。
【請求項２１】
前記生体試料が尿または血清である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金援助
本発明は、一部、国立衛生研究所によって承認された助成金番号Ｕ０１  ＨＬ０６８２８５、ＲＲ  ０２１７２、Ｕ０１  ＨＬ０６８２７０、Ｕ０１  ＨＬ０６８２６９、Ｕ０１  ＨＬ０６８２９２、Ｕ０１  ＨＬ０６８２９０、Ｕ０１  ＨＬ０６８２８８、Ｕ０１  ＨＬ０６８２８１、およびＵ０１  ＨＬ０６８２７９を受けて、連邦政府資金を用いて行われた。本発明において、米国連邦政府は、一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本発明は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１１年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，９３６号、および２０１１年１２月２２日に出願された米国仮特許出願６１／５７９，００７号の利益を主張し、そのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
分野
本発明は、川崎病（ＫＤ）に関連付けられる診断マーカーおよび治療標的を提供する。より具体的には、ＫＤを有する患者のプロテオームでは、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣが増大しており、これらは、ＫＤのためのバイオマーカーとなる。したがって、本明細書に提供される組成物および方法を用いるこれらのバイオマーカーの検出は、対象に実施される治療法を教示することができる。
【背景技術】
【０００４】
背景
川崎病（ＫＤ）は、原因不明の全身性血管炎である。また川崎病は、先進国において後天性小児心疾患の最も一般的な原因であるが、その兆候および症状が、多くの他の小児期発熱性疾患を模倣した症状を呈するため、依然として主要な医療問題となっている。確定的な診断マーカーの欠如は、疑わしいＫＤの臨床評価の精度を制限し、罹患率の著しい増加をもたらす。ひいては、その分子病態の不十分な理解が、治療法の改善に必要な合理的標的の同定を遅らせる。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本実施形態は、ＫＤの診断および治療に有用なマーカーを提供する。ＫＤを有する患者の尿プロテオームでは、模倣する状態の患者においてはそうではないが、フィラミンおよびタリン等の細胞障害タンパク質、補体調節因子ＣＳＭＤ３等の免疫調節因子、免疫パターン認識受容体のムクリン(ｍｕｃｌｉｎ)、ならびに免疫サイトカインプロテアーゼのメプリンＡが増大していた。フィラミンＣ、フィラミンＢ、およびメプリンＡの著しい増加が、ＫＤを有する患者の血清および尿の両方で検出された。現在使用される盲検症例対照研究における疾病のマーカーと比較すると、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣは、優れた診断機能を示した。特に、メプリンＡは、ＫＤのマウスモデルの冠動脈病変において増大していた。すべてにおいて、尿プロテオームプロファイルは、フィラミンＣ、フィラミンＢ、およびメプリンＡを含む、ＫＤの新規分子マーカーを明らかにした。
【０００６】
したがって、本発明の一態様は、それを必要とする対象におけるＫＤの診断およびモニタリングに対して特異的な少なくとも１つのバイオマーカーを提供する。
【０００７】
本態様の一実施形態は、ＫＤを有する患者において著しく増加している、尿中および血清バイオマーカーであるフィラミンＣを提供する。
【０００８】
本態様の別の実施形態は、ＫＤを有する患者において著しく増加している、尿中および血清バイオマーカーであるメプリンＡを提供する。
【０００９】
本態様の別の実施形態は、ＫＤを有する患者内において著しく増加している、尿中および血清バイオマーカーであるフィラミンＢを提供する。
【００１０】
本態様の別の実施形態は、それぞれＫＤ患者内において増加しているバイオマーカーのパネルを提供し、ＫＤの診断および予後における比較値を提供する。本態様の一実施形態において、ＫＤバイオマーカーパネルは、フィラミンＢ、フィラミンＣ、またはメプリンＡを含む。かかる実施形態はまた、総タンパク質または正規化タンパク質に対して特異的な作用物質を含んでもよいか、あるいは、例えば対象試料間の、または異なる時点において一対象から単離された一連の試料間の多様な比較を可能するために、量もしくは濃度に対してバイオマーカーのパネルが正規化され得る、該量もしくは該濃度を提供するように、総タンパク質もしくは正規化タンパク質の量または濃度を測定するアッセイ法が実行されてもよい。
【００１１】
本発明の一実施形態において、尿または血清等の生体試料中に存在するＫＤバイオマーカーレベル（例えば、フィラミンＣまたはメプリンＡの量または濃度）は、試験試料またはその調整物を、抗体に基づいた作用物質等の作用物質と接触させることによって測定され、該作用物質は、少なくとも１つのＫＤバイオマーカーにまたはその一部に特異的に結合し、該作用物質は、バイオマーカーレベル（例えば、量または濃度）を決定するアッセイ法において使用され得るバイオマーカーと複合体を形成する。当業者に既知の任意の手段を使用して、バイオマーカーレベルを評価することができる。例えば、ＫＤバイオマーカーレベルは、ＥＬＩＳＡ、多重ビート分析、または質量分析によって、評価されてもよい。
【００１２】
一実施形態は、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣから選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルについて、対象から得られた生体試料を分析するステップを含む、対象においてＫＤを診断するためのアッセイ法を提供し、正規化タンパク質の参照レベルと比較して、バイオマーカーのレベルの２倍超の増加は、該対象がＫＤであることを示す。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＫＤの治療に関する治療効果を最適化する方法を提供する。したがって、本態様の一実施形態において、本方法は、（ａ）メプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣを含むバイオマーカーのパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベル（例えば、量または濃度）を測定するステップ、および（ｂ）該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを、該少なくとも１つのバイオマーカーの参照レベルと比較することを含み、該少なくとも１つのバイオマーカーの参照レベルに対する、試料中のメプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣを含むバイオマーカーのパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの増加は、対象に対して、ＫＤのための治療的処置を施す必要性を示す。一部の実施形態において、生体試料は尿試料である。一部の実施形態において、生体試料は血清である。
【００１４】
本態様の別の実施形態において、本方法は、（対象から得た）生体試料を、少なくともフィラミンＣ、フィラミンＢ、またはメプリンＡを含むバイオマーカーのパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーに対して特異的な少なくとも１つの作用物質に接触させるステップ、（ｂ）該少なくとも１つの作用物質に対して特異的なアッセイ法を使用して、該少なくとも１つのバイオマーカーの量または濃度を測定するステップ、および（ｃ）該少なくとも１つのバイオマーカーの量または濃度を、該少なくとも１つのバイオマーカーの参照レベルと比較するステップを含み、該少なくとも１つのバイオマーカーの参照量または参照濃度に対する、該試料中のフィラミンＣ、フィラミンＢ、またはメプリンＡを含むバイオマーカーのパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーの量または濃度の増加は、該対象に対して、ＫＤのための治療的処置を施す必要性を示す。一部の実施形態において、生体試料は尿試料である。一部の実施形態において、生体試料は血清である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、生体試料中の少なくとも１つのＫＤバイオマーカー、例えば、フィラミンＣ、フィラミンＢ、メプリンＡを同定、または測定する手段を含むキットを提供する。キットは、生体試料（例えば、尿試料または血清試料）を保持する容器と、尿試料または血清試料等の生体試料中の少なくとも１つのＫＤバイオマーカーの量の決定、濃度の決定、または存在の判定に使用するための、少なくとも１つのＫＤバイオマーカーと特異的に結合する抗体またはその一部等の少なくとも１つの作用物質とを含む。
【００１６】
本態様の一実施形態において、キットは、少なくとも１つのＫＤバイオマーカーおよび固定化のための抗体またはその一部に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその一部を含む。かかる一実施形態において、一抗体は固相に固定化され、少なくとも１つのバイオマーカーに対して特異的な少なくとも１つの抗体が検出可能に標識される。キットは、抗メプリンＡ、抗フィラミンＢ、もしくは抗フィラミンＣ抗体、またはそれらの一部を含んでもよい。
【００１７】
別の態様は、少なくとも一個体のＫＤを診断するための方法をコンピュータ上で実施するためのソフトウェアモジュールを定義するためのコンピュータ可読の命令が記録された、コンピュータ可読記憶媒体に関連し、コンピュータ可読記憶媒体は、（ａ）少なくとも一個体から得られた生体試料に関して決定される、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルおよび正規化タンパク質のレベルを表すデータを記憶しかつ該データにアクセスするための命令と、（ｂ）少なくとも１つの該バイオマーカーのレベルを正規化モジュールによって正規化タンパク質の量に正規化し、それにより、該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルを生成するための命令と、（ｃ）比較モジュールを使用して、該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルを、記憶装置上に記憶された参照データと比較するための命令であって、比較するステップが、読み出された内容を生成する、命令と、（ｄ）該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルに変化があるかどうかを表示する該読み出された内容のページを、ユーザに表示し、それにより、ＫＤを該少なくとも一個体が有するかどうかを判定するための命令とを備える。正規化タンパク質は、総タンパク質または特定のタンパク質であってもよい。一実施形態において、生体試料は尿試料である。一実施形態において、生体試料は血清である。
【００１８】
また本明細書では、少なくとも一個体から得られた生体試料からデータを得るためのコンピュータシステムが記述され、該システムは、（ａ）生体試料を保持するための検体容器と、（ｂ）レポーター分子情報が、（１）正規化タンパク質への作用物質の結合を表す情報、および（２）少なくとも１つのバイオマーカーへの作用物質の結合を表す情報を含む、該レポーター分子情報を判定するように構成された判定モジュールと、（ｃ）該判定モジュールからのデータ出力を記憶するように構成された記憶装置と、（ｄ）少なくとも１つのバイオマーカーへの作用物質の結合を表すレポーター分子情報を、正規化タンパク質への作用物質の結合を表すレポーター分子情報に正規化するように構成された、正規化モジュールと、（ｅ）該正規化モジュールから得られたデータを該記憶装置上の参照データと比較するよう適合化され、読み出された内容を生成する、比較モジュールと、（ｆ）該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルに変化があるかどうかを表示する該読み出された内容のページをユーザに表示し、それにより、ＫＤを該少なくとも一個体が有するかどうかを判定するための表示モジュールとを備える。一実施形態において、正規化タンパク質は特定のタンパク質である。一実施形態において、正規化タンパク質は総タンパク質である。一実施形態において、生体試料は尿試料である。別の実施形態において、生体試料は血清である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＫＤ患者が、ＫＤを有していない患者、または一般に存在する尿タンパク質を有する患者とは異なる、独特の尿プロテオームを示すことを示す。ＫＤを有さない患者と比較した、ＫＤを有する患者において検出された上位１０種のタンパク質（行）のベイズ解析の結果を示す、１５個体の尿プロテオーム（列）のヒートマップ。シェーディンググラデーション（Ｓｈａｄｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）は、尿タンパク質存在度に対応する、ＭＳ／ＭＳスペクトルの数（スペクトルカウント）を表す。
【図２Ａ−Ｃ】川崎病を有する患者は、模倣する状態の患者においてはそうではないが、著しく増加したメプリンＡおよびフィラミンＣの血清および尿レベルを有することを例示し、それはＫＤの疑いのある患者の盲検研究において、優れた診断機能を示す。図２Ａ〜２Ｃは、ＫＤの疑いのある患者の盲検症例対照研究において、メプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣの特異的なＥＬＩＳＡを使用して測定された、尿濃度のボックスプロットであり、ＫＤ状態ではない患者（左）、および静脈内ガンマグロブリン治療を受けているＫＤを有する患者（ＩＶＩｇ、右）と比較して、ＫＤを有する患者の著しく増加したメプリンＡおよびフィラミンＣの濃度（中央）を示す。Ｐ＜０．０５。水平バーは、各比較群の平均を表す。
【図２Ｄ】川崎病を有する患者は、模倣する状態の患者においてはそうではないが、著しく増加したメプリンＡおよびフィラミンＣの血清および尿レベルを有することを例示し、それはＫＤの疑いのある患者の盲検研究において、優れた診断機能を示す。図２Ｄは、共通マーカーである赤血球沈降速度（ＥＳＲ、左から３番目の線）、ならびに血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ、右の線）と比較した、尿メプリンＡ（一番左の線）、フィラミンＢ（左から２番目の線）、およびフィラミンＣ（左から４番目の線）の受信者動作特性。受信者動作特性の曲線下面積（ＡＵＣ）値、および、測定された診断マーカーに対する、その９５％信頼区間（ＣＩ）。
【図２Ｅ−Ｆ】川崎病を有する患者は、模倣する状態の患者においてはそうではないが、著しく増加したメプリンＡおよびフィラミンＣの血清および尿レベルを有することを例示し、それはＫＤの疑いのある患者の盲検研究において、優れた診断機能を示す。図２Ｅ〜２Ｆは、ＫＤを模倣する状態ではない患者（左）と比較した、ＫＤを有する患者（右）におけるメプリンＡ（図２Ｅ）およびフィラミンＣ（図２Ｆ）の特異的なＥＬＩＳＡを使用して測定された、血清濃度のボックスプロット。ｐ＜０．０５。
【図３】ＫＤを有する患者の疾病活動性と関連付けられる、尿フィラミンＣおよびメプリンＡを示す。図３Ａ〜３Ｂは、診断時、治療後２４〜４８時間後、および臨床反応の完了の１カ月後に採取された一致する検体で測定された、５人のＫＤを有する患者における尿メプリンＡ（図３Ａ）およびフィラミンＣ（図３Ｂ）レベル。図３Ｃは、最初の症状の５．５か月後にＫＤ再発を経験した一患者における、尿メプリンＡレベル。図３Ｄは、初期治療法に反応した患者（左、応答者）対反復治療を必要とした患者（右、非応答者）の尿フィラミンＣレベルを示す散布図。
【図４】メプリンＡが、川崎病のマウスモデルの冠動脈病変において増大していることを示す。図４Ａ〜４Ｂは、対照動物（図４Ａ）にはないが、瀕死のＫＤ罹患動物（図４Ｂ）にある単核細胞の浸潤物（矢じり）を示す、冠状動脈のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の顕微鏡写真。図４Ｃ〜４Ｄは、対照動物（図４Ｃ）にはないが、瀕死の動物（図４Ｄ）にある、冠状動脈の単核細胞湿潤物におけるメプリンＡの増大を示す、冠状動脈のメプリンＡ免疫組織化学染色切片の顕微鏡写真。図４Ｅは、対照マウス（左）と比較して、瀕死のマウス（右）におけるメプリンＡの血清レベルは増加している。
【図５】受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して、併合したメプリンＡおよびフィラミンＣの診断機能を反映したデータを提示する。これら二重のＫＤバイオマーカーの使用は、ＫＤ診断において、高いレベルの感度および特異性を提供する。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＫＤのマウスモデルにおけるメプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣの血清レベルを比較するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本発明は、本明細書に記述される特定の方法、手順、および試薬等に制限されず、したがって変化し得ることを理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、本発明の範囲を制限するものではなく、それは請求項によってのみ定義される。
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される際、文脈が明確に指示しない限り、単数形は複数の参照を含み、逆もまた同様である。用語「または」は、例えば、「いずれかの」によって修飾されない限り、包括的である。操作実施例内、または別に示される場所場合以外は、本明細書で使用される構成要素もしくは反応条件の量を示す全ての数字は、用語「約」によって、すべての事例において修飾されることを理解されたい。
【００２２】
全ての特許および他の特定された出版物は、例えば、本発明と関連して使用され得るかかる出版物において記述される方法を記述および開示する目的で、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日以前のそれらの開示に関してのみ提供される。この点のいかなる内容も、先行発明、または任意の他の理由によって、発明者らがかかる開示に先行する権利がないことを承認すると、解釈するべきではない。日付に関する記載、または、これらの文書の内容の描写のすべては、出願人が利用可能な情報に基づき、日付または、これらの文書の内容の正確性のいかなる承認も構成しない。
【００２３】
別に定義されない限り、本明細書で使用される、すべての技術的および科学的な用語は、本発明が関連する当業者に一般的に理解される意味と同様の意味を有する。任意の既知の方法、装置、および材料が、本発明の実行、または試験において使用されてもよいが、この点における方法、装置、および材料は本明細書において記述される。本実施形態は、ＫＤの診断および治療に有用な新規バイオマーカーを提供する。端的に言えば、高精度質量分析プロテオミクスを使用して、ＫＤを有する患者の臨床尿検体中の、２，０００個を超える独特なタンパク質を分析した。分析は、ＫＤを有する患者の尿プロテオームでは、模倣する状態の患者においてはそうではないが、フィラミンおよびタリン等の細胞障害のマーカー、補体調節因子ＣＳＭＤ３等の免疫調節因子、免疫パターン認識受容体のムクリン、ならびに免疫サイトカインプロテアーゼのメプリンＡが増大していることを明らかにした。合計１９２名の患者から成る、ＫＤを有する患者の２つの独立コホートにおいて、フィラミンＣおよびメプリンＡの著しい増加が、血清および尿の両方で検出された。メプリンＡおよびフィラミンＣは、それぞれ０．９９（０．９６〜１の９５％信頼区間）および０．９４（０．８９〜０．９９の９５％信頼区間）の受信者動作特性曲線下面積を有する、ＫＤの疑いのある６９名の患者の盲検症例対照研究において、現在使用されている疾病のマーカーと比較して優れた診断機能を示した。特に、メプリンＡは、ＫＤのマウスモデルの冠動脈病変内において増大していた。すべてにおいて、尿プロテオームプロファイルは、フィラミンＣおよびメプリンＡを含む、ＫＤの新規分子マーカーを明らかにした。これらおよび他のタンパク質は、ＫＤの疑いのある小児の臨床評価の診断精度を改善し、新規治療標的の同定をもたらし、ＫＤの生物学的分類の発展を可能にすることができる。
【００２４】
ＫＤは、長期発熱、ならびに、口腔粘膜の炎症、非滲出性結膜炎、発疹、四肢の変化、および通常片側の頸部リンパ節腫脹を含む皮膚粘膜の炎症を示す、原因不明の全身性血管炎である。Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１１８  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．６８０（１９９１）。川崎病は、アメリカおよびヨーロッパの人口において、約１０，０００人に１人という発症率をもつが、先進国における後天性小児心疾患の最も一般的な原因であり、その兆候および症状が、多くの他の小児期発熱性疾患を模倣した症状を呈するため、依然として主要な医療問題となっている。Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１５４  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．５９２（２００９）、Ｔａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１１９  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ  ２７９（１９９１）。加えて、ＫＤの有病率はアジアで非常に高く、５歳未満の日本人の子供１，０００人の内２人が、川崎病を発症している。Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０  Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．３０２（２０１０）。
【００２５】
正確な診断の遅れが、ＫＤの合併症による死亡率および罹患率の増加を引き起こす。Ｗｉｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２６  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．２５６（２００７）、Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１２３  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １８３６（２０１１）。特に、適時な治療を欠くと、２５％もの患者が死亡の危険性、および長期の罹患率を伴う冠動脈拡張または動脈瘤を発症する可能性がある。ＭｃＣｒｉｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１１６  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １７４（２００７）。重要なことに、本発明以前、ＫＤの早期特定および診断のための、特徴的試験は存在しなかった。Ｇｅｄａｌｉａ，９  Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．３３６（２００７）、Ｄｅｄｅｏｇｌｕ ａｎｄ Ｓｕｎｄｅｌ，３３  Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．５５５（２００７）。臨床アルゴリズムの使用は、ＫＤの診断を改善したが、その精度は限定的なままである。Ｙｅｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１２５  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ｅ２３４（２０１０）。ＫＤの臨床評価の信頼性の改善の試みは、臨床的および一般的な炎症の実験用マーカーに集中していた。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１２１  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．９２４（１９９２）、Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，３４  Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｍｉｎ  Ｇｕｏ  Ｘｉａｏ  Ｅｒ  Ｋｅ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｈｕｉ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ７７（１９９３）、Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１６４  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．４２７（２００５）、Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，８  Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｄａｎｇ  Ｄａｉ  Ｅｒ  Ｋｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２０８（２００６）、Ｓｕｇａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，５０  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｔ．２６４（２００８）。しかしながら、伝染性のトリガーと過剰な炎症反応との間の相互作用によって引き起こされると考えられるＫＤの病態生理学において特異的な関連性がおそらくないため、機能は不十分であった。Ｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，６  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９４（２００８）。
【００２６】
本実施形態は、発見に基づいた手法を用い、この手法はプロテオームスケール上のＫＤ病態生理学的変化を特定した。尿は、血清と比較して、豊富であることおよび相対分析が簡潔であったため、研究された。これまでに、高精度質量分析は、局所および全身性のバイオマーカーを同定するため、ならびに、改善された疾病の診断マーカーを発見するために、十分詳細に尿プロテオームを測定した。Ｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，５  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３４６７（２００５）、Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，５  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １７６０（２００６）、Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．Ｒ８０（２００６）、Ｗｏｒｏｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２６  Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２５８（２００６）、Ｏｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，４７  Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．８９８（２００６）、Ｚｉｍｍｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２９０（２００８）、Ｋｅｎｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，５５  Ａｎｎ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．６２（２０１０）。 
【００２７】
本実施形態は、有望な小児コホート内で同定された、ＫＤの検証された診断マーカーを提供する。ＫＤの疑いのある小児から採取された尿検体の、高精度質量分析プロテオームのプロファイリングは、個々の尿プロテオームの違いを同定した。候補診断マーカーは、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＫＤを有する患者の２つの独立コホートの尿および血清において、検証された。次いで、これらの診断機能は、ＫＤの疑いのある小児の、盲検プロスペクティブ研究において評価された。
【００２８】
最初の対象研究には、発熱しており、ＫＤの可能性が懸念される６９名の対象が登録された。疫学およびＫＤの症状のこれまでの研究に一致して、調査母集団は主に、表１に記述する兆候および症状を呈する平均年齢３歳の男児であった。
【００２９】
（表１）ＫＤの疑いのある患者の呈する兆候、症状、診断
2014512014.tif 000003
【００３０】
４５名の患者（６５％）が、最終的にＫＤと診断された。すべてのＫＤを有する患者は、高用量アスピリンおよび静脈内ガンマグロブリンを用いた治療を受け、１３名の患者（２８％）は、初期の臨床反応欠如のため、反復治療を必要とした。１名の患者（２％）は、当初は治療法に反応したが、最初の症状の６カ月後に疾病が再発した。ＫＤを伴わない２４名の患者（５０％）のうち１２名は、表２に示すように、非特異性のウイルス症候群を有することがわかり、残りの患者は、ＫＤを模倣した状態を呈示し得る様々な疾患を有することがわかった。
【００３１】
（表２）６９名の調査患者の最終診断
2014512014.tif 000004
【００３２】
ＫＤの候補診断マーカーは、研究開始時に採取され、有効性に基づいて選択された次の１５個の検体の分析に基づいて同定された。６つのＫＤ検体（３つは冠動脈拡張を有さず、３つは有する）、６つの非ＫＤ検体（２つは非特異性ウイルス症候群を有し、３つはアデノウイルスを有し、および１つは腎盂腎炎を有する）、ならびに治療に対する反応完了の１カ月後（ＫＤの回復期）にＫＤを有する患者から採取された、３つの一致する検体。この分析は、これまでの研究と類似した凝集体尿プロテオームの組織および物理的原因（Ｋｅｎｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，３  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．１０５２（２００９））、ならびに同定された２，１３１個の独特のタンパク質を示す。３つの比較群の分析は、ＫＤを有する患者の尿中における１９０個超のタンパク質の同定をもたらしたが、ＫＤを有していない患者、またはＫＤが完治した患者のいずれにおいてもそうではなかった。候補ＫＤマーカーの存在量は、ＫＤを有する患者において最も増大しているそれらを同定するために、分析され、相対存在度および有病率順に並べられた（図１）。同定されたマーカーは、フィラミンおよびタイチン等の、内皮細胞傷害および心筋細胞傷害に関連付けられる様々なタンパク質、ならびにＤＭＢＴ１およびメプリンＡ等の免疫調節因子を含む。
【００３３】
市販のＥＬＩＳＡを使用して選択された候補ＫＤマーカーは、尿中のフィラミンＣおよびメプリンＡレベルを分析して検証された。フィラミンＣおよびメプリンＡのＫＤの診断機能は、患者の最終診断を知らない研究者によって、患者の尿中におけるその濃度を測定することによって評価された。メプリンＡおよびフィラミンＣ両方の尿濃度は、ＫＤを有していない患者と比較して、ＫＤを有する患者において著しく増加していた（それぞれ、３．８ｎｇ／ｍｌに対して２１．７の平均フィラミンＣ、および１２．４ｎｇ／ｍｌに対して５７．１の平均メプリンＡ、ｐ＜０．０５、図２Ａ〜２Ｂ）、表Ｓ２。
【００３４】
（表Ｓ２）メプリンＡおよびフィラミンＣはＫＤを有する患者の尿中において著しく増加している
2014512014.tif 000005
【００３５】
年齢、性別、人種および発熱継続期間の対照は、メプリンＡおよびフィラミンＣの増加の統計的有意性に影響がなかった。重要なことに、尿メプリンＡおよびフィラミンＣはまた、４つの従来の主要診断基準のうち、３つしか合致しないＫＤの不完全症状を有する患者において、ＫＤを有していない場合と比較して著しく増加していた（それぞれ、３．８ｎｇ／ｍｌに対して２８．５ｎｇ／ｍｌの平均フィラミンＣ、および１２．４ｎｇ／ｍｌに対して３８．２ｎｇ／ｍｌの平均メプリンＡ、ともにｐ＜０．０５）。
【００３６】
メプリンＡおよびフィラミンＣの診断機能は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して、６９名の患者すべてに対して分析された。これらのマーカーのＲＯＣ曲線は、現在使用されている赤血球沈降速度（ＥＳＲ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）等の実験用マーカーと比較して優れた診断機能を示し、メプリンＡおよびフィラミンＣは、それぞれ、０．９９の曲線下面積値（０．９６〜１．０の９５％信頼区間）および０．９４（０．８９〜０．９９の９５％信頼区間）を有した（図２Ｃ〜２Ｄ、５）。
【００３７】
メプリンＡおよびフィラミンＣと、治療法に対する反応との間における関係性は、一連の検体と一致するそれらの尿濃度の測定によって評価された。これらは、一致する検体を採取し得る５名の患者において、治療法の開始前の診断時、高用量アスピリンおよび静脈内ガンマグロブリンを用いた治療の２４〜４８時間後、および治療に対する臨床反応の完了から１カ月後に採取された。すべての対象患者において、治療に対する反応と関連付けられる尿メプリンＡおよびフィラミンＣレベルを研究した（一元配置分散分析ｐ＜０．０５、図３Ａ〜３Ｂ）。
【００３８】
特に、尿メプリンＡは、治療に対して当初は反応したが、最初の症状から５．５カ月後に疾病が再発した１名のＫＤ患者において測定不能であった。尿メプリンＡの増加の再発は、ＫＤの再発に関連付けられた（図３Ｃ）。同様に、初期の臨床反応欠如のため、静脈内ガンマグロブリンを用いた治療の反復を必要とした患者は、発症時において、初期の治療法に反応した患者に比べて著しく高い量のフィラミンＣを有した（２０ｎｇ／ｍｌに対して平均６４、ｐ＜０．０５、図３Ｄ）。
【００３９】
これらの発見により促され、メプリンＡおよびフィラミンＣの検証は、患者の独立コホートまで拡大した。したがって、ＫＤを有する患者の１１２の血清検体を、分析し（近年の小児心臓ネットワーク（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）研究の一部として採取された）、当初ＫＤを有する疑いがあったが、最終的にＫＤでない発熱性疾患と診断された１１名の患者と比較した（図２Ｅ〜２Ｆ）。ＥＬＩＳＡを使用して、メプリンＡおよびフィラミンＣの両方は、ＫＤを有する患者の血清中において非ＫＤ対照と比較して著しく増加していた（それぞれ、６．６ｎｇ／ｍｌに対して２１７の平均フィラミンＣ、および１４．８ｎｇ／ｍｌに対して１，３６３のメプリンＡ、ともにｐ＜０．０５）、表Ｓ３。
【００４０】
（表Ｓ３）メプリンＡおよびフィラミンＣはＫＤを有する患者の血清中において著しく増加している
2014512014.tif 000006
【００４１】
メプリンＡは、様々な免疫サイトカインを制御するプロテアーゼであるため、ＫＤのいくつかの特徴を再現する冠動脈炎のマウスモデルを使用して、ＫＤの発症機序においてメプリンＡが関係する可能性が研究された。Ｌｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，４８  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１０８（１９８８）。このモデルにおいて、瀕死のマウスは、冠動脈瘤を引き起こす全身性単核細胞血管炎を発症する。特異的メプリンＡ抗体を使用した免疫組織化学的分析は、メプリンＡが、冠動脈炎を有するマウスの血管病変において増大していたが、対照マウスではそうではなかったことを示した（図４Ａ〜４Ｄ）。同様に、循環するメプリンＡのレベルは、冠動脈炎を有するマウスの血清中において、対照と比較して著しく増加していた（０．３ｎｇ／ｍｌに対して平均４．７、ｐ＜０．０５、図４Ｅ）。図６も参照。
【００４２】
小児の急性特発性血管炎であるＫＤは、迅速に診断、および治療がされなかった場合、著しい罹患率および死亡率を引き起こす。心エコー検査を併用した臨床アルゴリズムの使用は、ＫＤの診断的評価の精度を改善した。迅速な治療とともに、これは、死亡率および冠状動脈瘤による合併症の著しい減少をもたらす。しかしながら、本発明以前、ＫＤの診断に使用されていた臨床基準はこの状態に対して特異的ではなく、ＫＤを有する小児の大部分が、疾病の主要な兆候のうちいくつかが欠如していたため（不完全なＫＤ）、深刻な診断上の課題が残っていた。
【００４３】
以前のいくつかの研究は、ＫＤの可能性評価の診断精度の改善を目標に、ＫＤのバイオマーカーを同定しようと試みた。末梢白血球数、ＥＳＲおよびＣＲＰレベル等の急性反応物質は、臨床的に最も有用である。本明細書で確認されたとおり（図２Ｃ〜２Ｄ）、これらのマーカーは、その特異性および感度に関して、不十分なままである。（Ｘｉｕ−Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２４  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．３８５（２０１０）、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，３１  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１２０９（２０１０））。オステオプロテゲリン、ナトリウム利尿ペプチド、および血管内皮成長因子等の改善した診断マーカーを同定しようとする近年の試みはまた、限られた改善をもたらし、これはＫＤを特徴付ける独特な免疫機構に対する特異性が不十分であった結果であろう。Ｓｉｍｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，３２  Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２２３３（２００５）、Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｃａｒｄｉｏｌ，（２０１１）、Ｅｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，７５  Ｃｉｒｃ．Ｊ．１４５５（２０１１）。
【００４４】
近年発達した質量分析手法の高い精度および感度は、本明細書に記述する新規で、より正確でかつ高感度な診断マーカーの発見を促進した。当初ＫＤを有する疑いがあったが他の発熱性疾患を有すると証明された他の尿プロテオームと比較した場合のＫＤを有する患者の尿プロテオームは、１９０個を超える独特の候補ＫＤマーカーから成るＫＤの分子病態生理学的プロファイルの構築を可能にした（図１）。これらの分子は、内皮および心筋傷害のマーカー（タリン、フィラミン、デスモグレイン、オブスクリン、タイチン）、白血球活性化のマーカー（ＡＭＩＣＡ１、ＣＡＥＣＡＭ、ＣＸＣＬ１２、ＧＤＦ１５、ＬＡＩＲ１）、病原体免疫認識のマーカー（ＤＭＢＴ１、ＡＢＣＢ９）、およびサイトカイン調節のマーカー（ＣＳＭＤ３、メプリンＡ）を含む。
【００４５】
本明細書に提供されるとおり、いくつかの免疫調節因子分子は、ＫＤを有する患者の尿中における固有に存在する。これらの中には、ＩＬ−１およびＩＬ−６を含むＫＤの発症機序に関わっている炎症性サイトカインの活性化ならびに分解に機能する金属プロテアーゼであるメプリンＡがあった。Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，３１  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ３９４（２００５）。同様に、ムクリンまたはｇｐ３４０としても既知であるＤＭＢＴ１は、様々な細菌およびウイルスの抗原を認識する先天性免疫スカベンジャー受容体である。Ｍａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１６  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（２０１０）。最後に、ＴＡＰＬとしても既知であるＡＢＣＢ９は、免疫抗原提示に機能する輸送体である。Ｂａｎｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，３９２  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６１（２０１１）。同定されたＫＤマーカーの多くは、本発明者が本明細書で行ったとおりに適切に検証される場合、診断マーカーだけではなく、新規治療標的になることができる。すべてにおいて、表Ｓ１に記載された１９０個の新規候補ＫＤマーカーを含む、プロテオーム・コモンズ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｃｏｍｍｏｎｓ）（ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇにてオンライン）にて入手可能な同定されたプロテオームは、ＫＤの分子生理学的プロファイルを提供する。この分子プロファイルによる、患者の先天性および適応免疫応答の構成要素の相互作用は、ＫＤを媒介する発症機序をさらに解明し得る。
【００４６】
重要なことに、ＫＤの疑いを有する患者に関するこのプロスペクティブ盲検研究は、フィラミンＣおよびメプリンＡが、ＫＤを有する患者の血清中および尿中における著しく増加したが、様々な模倣する状態の患者においてはそうではなかったことを確認した（図２）。両方のマーカーは、現在臨床試験で使用されているものと比較して、優れた診断機能を示した（図２）。筋細胞中のフィラミンＣの優勢発現は、フィラミンＣが、ＫＤと同時に発症する潜在的な心筋炎の高感度のおよび特異的なマーカーになることを示唆する。実際に、トロポニン等のはっきりとした心筋細胞傷害のマーカーは、臨床治療、または心エコーの心筋炎の証拠と関連付けられていない。Ｃｈｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２２  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０２（２００１）、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（Ｊｕｌｙ  １９，２０１１）。加えて、完全な反応を有する患者と比較して、初期の治療法に対して反応しなかったＫＤを有する患者におけるフィラミンＣの増加したレベルは、フィラミンＣがＫＤ活性のマーカーであることを示唆する（図３Ｄ）。
【００４７】
同様に、メプリンＡは、生物活性ＩＬ−１β、前炎症性キーサイトカイン（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）、多形性がＫＤの治療に対する耐性に関連付けられている（Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，７４  Ｃｉｒｃ．Ｊ．５４４（２０１０））を含む、様々な炎症性サイトカインを制御するプロテアーゼである。このため、メプリンＡは、ＫＤの免疫機構の開始、増殖または代償の一因となり得る。メプリンＡのＫＤの病態生理学への潜在的寄与は、ＫＤのマウスモデルにおける冠動脈病変中のその増大（図４）およびＫＤを有する患者における疾病活動性との相互関係（図３）によって、強調される。
【００４８】
これらの発見されたＫＤマーカーを患者の尿中において蓄積する機序、およびＫＤの病態生理学とのそれらの関連性は、本実施形態のための即時有用性を示す。加えて、最近発見された尿タンパク質マーカーは、腎性のもしくは泌尿器の疾病、または極度の脱水症を有する患者との臨床的関連を有する可能性がある。さらに広く見れば、本明細書で提示された手法は、広範囲の様々な一般的および稀なヒトの状態への応用を伴って、臨床診療への直接的な転換に特異的に設計されたプロテオームのプロファイリングの枠組みを促進する。例えば、Ｋｅｎｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，３  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．１０５２（２００９）、Ｋｅｎｔｓｉｓ，５５  Ａｎｎａｌｓ  Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．６２（２０１０）を参照。
【００４９】
つまり、本明細書で提示する研究は、ＫＤの診断を改善し、その病態生理学を解明し、かつ治療法を方向付けるための、多くの潜在的手法を開放する。特に、本明細書で提供されるとおり、特異的なかつ高感度のＫＤのマーカーとしてのメプリンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣの検証は、例えば、一般に入手可能なＥＬＩＳＡといった、それらの臨床用途を可能にし、ＫＤの診断の精度および適時性を改善する。加えて、本発明の記述された分子生理学的プロファイル、および検証された診断マーカーは、いまや患者の層化を改善し、治療を個別化するであろうＫＤの生物学的分類を可能にする。
【００５０】
したがって、本発明の一態様は、それを必要とする対象におけるＫＤの診断およびモニタリングに対して特異的な少なくとも１つのバイオマーカーを提供する。本態様の一実施形態は、ＫＤを有する患者において著しく増加している、尿中および血清バイオマーカーであるフィラミンＣを提供する。本態様の他の実施形態は、ＫＤを有する患者において著しく増加している、尿中および血清バイオマーカーであるメプリンＡを提供する。本態様の他の実施形態は、ＫＤを有する患者において著しく増加している、尿中および血清バイオマーカーであるフィラミンＢを提供する。
【００５１】
用語「個体」、「対象」、および「患者」は、区別せずに用いられ、動物、例えば、ヒト等の哺乳類を指す。用語「哺乳類」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、猿）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ラット、ハムスター、モルモット、およびマウスを含む。
【００５２】
用語「試料」または「生体試料」は、対象から得られた健常または病理的な状態の生体液、組織、または細胞の試料を指す。かかる試料は、尿、全血、血清、血漿、痰、唾液、羊水、リンパ液、組織、または細針生検試料、腹水、脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されず、細胞溶解物、溶解細胞、細胞抽出物、および核抽出物の上清を含む。一部の実施形態において、全血試料は、血清または血漿試料へとさらに処理される。一部の実施形態において試料は、ヒト対象から採取され、代替的な実施形態では、哺乳類から採取される。試料は、必要に応じて、適切な緩衝液、または所望に応じて濃縮された緩衝液で希釈することによって、保管または保存のために前処理されてもよい。生理的ｐＨのホスフェート、トリス等の、様々な緩衝剤のうちの１つを採用する標準緩衝水溶液の種類のいずれかが、使用されてもよい。試料は、本明細書で開示されるように、アッセイ法で使用する前に使用するために、保管されてもよい。保管庫は、＋４℃または、例えば、−２０℃もしくは−８０℃の凍結状態であってもよい。
【００５３】
「バイオマーカー」、「尿中バイオマーカー」または「血清バイオマーカー」は、個体中で内因的に発現された、または個体由来の生体試料中で発見もしくは隔離された、タンパク質またはポリペプチドを指す。「ＫＤバイオマーカー」という用語は、本明細書に記述される方法と共に用いて有用なバイオマーカーの種類の例として、本明細書を通して使用される。ＫＤバイオマーカーは、メプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣのうちの少なくとも１つを指す。例えば、メプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣといった、ＫＤの診断に有用なバイオマーカーのそれぞれについて、バイオマーカータンパク質の参照はまた、それらのタンパク質のドメインまたは断片、ならびにそれらの種、変異形、相同物、対立型、突然変異型および同等物を包含する。
【００５４】
「作用物質」は、生体試料中の総タンパク質、正規化タンパク質（例えば、アクチン）、もしくは生体試料等の試料中のＫＤバイオマーカーのレベル、濃度、発現レベル、または活性の検出または定量化を可能にするタンパク質結合物質を指してもよい。かかる物質には、抗体（「抗体」は、エピトープ結合ペプチドまたは抗原結合ペプチド、パラトープ、機能的ＣＤＲ等の抗体の一部；組み換え抗体；キメラ抗体；トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）；ミディボディ（ｍｉｄｉｂｏｄｙ）；またはそれらの誘導体、類似体、変異形、一部、もしくは断片を含む）、タンパク質結合物質、小分子、組み換えタンパク質、ペプチド、アプタマー、アビマーおよびタンパク質結合誘導体、それらの一部もしくは断片が挙げられるが、これらに限定されない。「少なくとも１つのバイオマーカーに対して特異的な作用物質」という語句は、直接的あるいは間接的に、バイオマーカーのレベル、量、濃度もしくは、発現レベルの検出または定量化を可能にするバイオマーカー結合物質を指す。かかる物質には、抗体もしくはそれらの一部、タンパク質結合物質、小分子、組み換えタンパク質、ペプチド、アプタマー、アビマーおよびタンパク質結合誘導体またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。作用物質は、特異的なバイオマーカー、正規化タンパク質、もしくは総タンパク質と結合すると、「作用物質-バイオマーカー複合体」、「作用物質-正規化タンパク質複合体」、または「作用物質-総タンパク質複合体」を形成する。
【００５５】
「レポーター分子情報」は、作用物質の試料中のＫＤバイオマーカーへの結合、または、試料中のＫＤバイオマーカーとの複合体形成、すなわち、「作用物質-バイオマーカー複合体」、「作用物質-正規化タンパク質複合体」もしくは「作用物質-総タンパク質複合体」の形成を示す信号から導出されたデータを指す。信号は、ＫＤバイオマーカー、正規化タンパク質、または総タンパク質に結合した作用物質を示す、光信号、蛍光信号、比色信号、または他の検出可能な信号などを含むことができる。
【００５６】
「正規化タンパク質のレベルを超える、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの増加」という語句は、生体試料中に存在する正規化タンパク質のレベル、または参照レベルよりも大きい少なくとも１つのバイオマーカーのレベル（例えば、濃度または量）を指す。バイオマーカーの「増加した濃度」、「レベルの増加」、「より高いレベル」または「より高い濃度」という用語は、異なる時点での同一対象由来の試料中において、正規化タンパク質のレベルに対してもしくは参照レベルに対して統計的に有意であるバイオマーカーのレベル、または、対照もしくは参照試料中で発見されるバイオマーカーのレベルを著しく超えるバイオマーカーのレベルを指す。「正規化タンパク質の濃度を超える、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの増加」という語句は、生体試料中に存在する正規化タンパク質の濃度または量よりも大きい、少なくとも１つのバイオマーカーの濃度または量を指す。「より高いレベル」または「レベルの増加」は、例えば、１．２倍もしくはそれより高い、例えば、少なくとも１．８倍高い、少なくとも１．９倍高い、少なくとも２倍高い（すなわち、２倍以上の）、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い等であってもよい（境界値も含む）。同様に、約０．７８のＡＵＣ値は、統計的に有意であると見なされてもよい。比較の目的で、試験試料および対照試料は、同じ試料型由来であり、つまり、それらは同じ生物源（例えば、尿または血清）から得られる。対照または参照試料はまた、通常、健常な個体から得られた生体試料中で発見されるＫＤバイオマーカーの、同じ濃度を含有した標準試料であってもよい。代替として、対照は、ＫＤバイオマーカーを正規化するために使用される、患者の生体試料中で発見された正規化タンパク質であってもよい。
【００５７】
一実施形態において、バイオマーカーの「より高いレベル」または「レベルの増加」という用語は、参照値または正規化タンパク価と比較して、対象由来の試料における少なくとも５％の、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの増加を指す。バイオマーカーのレベルの増加は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％（境界値も含む）であってもよく、参照レベル（例えば、ＫＤを有していない個体由来の試料中の同じバイオマーカーのレベル）よりも、少なくとも１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍（すなわち、２倍以上）、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍以上（境界値も含む）、高い。
【００５８】
別の実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの減少は、参照レベルと比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％であることも、または１００％（すなわち、欠如）にもなることもある（境界値も含む）。一代替的実施形態では、「正規化されたレベルにおける違い」は、参照レベルと比較して、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルにおける統計的に有意な変化（増加または減少のどちらでもよい）を指す。
【００５９】
「バイオマーカーのレベルの正規化」および同様のものは、試料中のバイオマーカー（例えば、フィラミンＢ、フィラミンＣ、またはメプリンＡ）のレベルを表すデータ値を、試料中の総タンパク質または正規化タンパク質のレベルを表す発現データ値によって除算することによる変換を指し、それにより、正規化されたバイオマーカー値を複数の試料間で、または１つ以上の参照試料もしくは参照値と比較することを可能にする。
【００６０】
「正規化タンパク質」または「正規化因子」は、異なる生体試料中の対象とするタンパク質の量の比較を可能にするために、対象とするバイオマーカーのレベルが正規化されるタンパク質を指す。一部の実施形態において、異なる生体試料は、異なる対象由来である。他の実施形態において、異なる生体試料は、同じ対象由来であるが、異なる時点の後である。概して、正規化タンパク質は、構成的に発現され、かつ、例えば、所与の疾病および非疾病状態といった、少なくとも２つの生理的状況または状態の間において別個に制御されず、該生理的状況または状態由来の試料が分析されるであろう。このため、例えば、正規化タンパク質は、例えばＫＤの存在および欠如において、実質的に変化しない（すなわち、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、またはそれより少ない（境界値も含む））。一実施形態において、正規化タンパク質は、希釈系列の予測関連性（例えば、線形回帰による予測）と比較された、試料希釈の系列上で測定されたタンパク質の相関度（例えば、分散の最低量または反復中の最低標準偏差）に基づいて選択される。例えば、希釈系列に関して評価された測定されたタンパク質レベルに対して、最高相関度を有する（例えば、同じ測定に供されたタンパク質試料中の別のタンパク質と比較した場合）正規化タンパク質が選択されてもよい。「最高相関度」は、希釈系列上の予測関連性と比較して、２未満の希釈系列上のタンパク質測定（例えば反復測定）に対する標準偏差を指す。好ましくは、標準偏差は、１．５未満、１未満、０．５未満、０．１未満、０．０１未満、０．００１未満またはそれより少なく（境界値も含む）、０の標準偏差（例えば、測定および予測された値が同じである）を含む。一部の実施形態において、正規化タンパク質は、「ハウスキーピング遺伝子」の生成物であり、この遺伝子は、構成的に発現されかつ基本的な維持および不可欠な細胞機能に必要なタンパク質をコードする、遺伝子である「ハウスキーピング遺伝子」の生成物である。ハウスキーピング遺伝子は、概して、細胞依存的または組織依存的に発現されず、ほとんどの場合、所与の生物における全ての細胞によって発現される。ハウスキーピング遺伝子によってコードされる正規化タンパク質の一部の例は、例えば、特にアクチン、チューブリン、ＧＡＰＤＨを含む。一実施形態において、ハウスキーピング遺伝子生成物は、正規化タンパク質として使用される。
【００６１】
様々なアッセイフォーマットは、バイオマーカーまたは正規化タンパク質のレベルを判定するために使用され得る。アッセイフォーマットの例は、ウエスタンブロット分析、放射免疫測定（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定（ＩＲＭＡ）、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の化学発光免疫測定、多重ビート分析、蛍光抗体法、受身血球凝集反応、質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ等）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析、核磁気共鳴分光学、およびＨＰＬＣタンデム質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等の既知の技術を含む。免疫測定のいくつかは、化学発光免疫測定法のためのＳｉｅｍｅｎｓ  Ｂａｙｅｒ  ＡＣＳ  １８０（商標）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（例えば、Ｂｌｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．，Ｉｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹから広く入手可能である）等の適切な機器の使用によって、容易に自動化されてもよい。
【００６２】
ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡは、バイオマーカーの濃度またはレベルの判定に対して、検出感度、速度、精度、および手順の自動化の可能性等の利益を提供する。概して、Ｋａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１３  Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｓｕｒｇ．Ｐａｋ  ２２（２００３）、Ｏｈｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１２８９  Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇ．Ｓｅｒ．７１（２００６）、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，５  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８８３（１９９１）、Ｋａｓｈｙａｐ  ｅｔ  ａｌ．，６０  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７１（１９７７）を参照。抗体配列またはタンパク質チップもまた、採用されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／００１３２０８号、同第２００２／０１５５４９３号、同第２００３／００１７５１５号、米国特許第６，３２９，２０９号、同第６，３６５，４１８号を参照。他の技術を使用して、実行者の選好に従い、本開示に基づいて、本明細書に記述される方法の実行に必要とされるように、本明細書に記述されるＫＤバイオマーカーを検出してもよい。
【００６３】
本発明の予後の方法はまた、ＫＤを有する患者に対する治療の適切な過程を判定するために有用である。治療の過程は、ＫＤに対する診断後または治療後に患者に対して取られる治療手段を指す。例えば、ＫＤの診断後、対象は、高用量アスピリンの投与、または免疫グロブリンの投与によって、治療されてもよい。
【００６４】
本発明はまた、ＫＤの検出および予後評価のための市販キットも対象とする。キットは、当業者に既知である任意の構成であってもよく、少なくとも１つのＫＤバイオマーカー（例えば、フィラミンＢ、フィラミンＣ、またはメプリンＡ）の検出または定量のための、本明細書に記述される方法のうち１つ以上の実行に対して有用である。キットは、本明細書に記述されるもの等の試験生体試料（例えば、尿試料または血清試料）中の少なくとも１つのＫＤバイオマーカーを検出するためのアッセイ法の実施に対して不可欠な試薬の、すべてではないが多くを供給する点で利便性がよい。加えて、アッセイ法は、試験の結果が定量化または検証され得るように、少なくとも１つのＫＤバイオマーカーの所定の量等のキットに含まれる標準または複数の標準と同時に実行されてもよい。
【００６５】
特定の実施形態において、キットは、尿の試料中の少なくとも１つのＫＤバイオマーカーのレベルを検出する手段を含む。キットは、少なくとも１つのＫＤバイオマーカー結合物質が固定化された「ディップスティック」を含んでもよく、該ＫＤバイオマーカー結合物質はＫＤバイオマーカータンパク質と特異的に結合する。次に、特異的に結合されたＫＤバイオマーカーは、例えば、比色薬剤または放射性同位体で検出可能に標識される第２抗体を使用して、検出され得る。
【００６６】
他の実施形態において、アッセイキットは、競合および非競合アッセイ法、放射免疫測定（ＲＩＡ）、多重ビート分析、生物発光および化学発光分析、蛍光分析、サンドイッチ分析、免疫放射定量測定、ドットブロット、ＥＬＩＳＡを含む酵素免疫測定、マイクロタイタープレート、または、免疫細胞化学の構成要素を含有してもよい。各キットに対する、アッセイ法の範囲、感度、正確さ、信頼性、特異性、および再現性は、当業者に既知の手段によって確立されている。
【００６７】
本発明の他の態様は、少なくとも１つのＫＤバイオマーカー（例えば、フィラミンＢ、フィラミンＣ、またはメプリンＡ）のレベルを判定することによって、ＫＤに対する治療の効果をモニタリングまたは改善するための方法を提供する。
【００６８】
したがって、本態様の一実施形態において、本方法は、（ａ）メプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣを含む、バイオマーカーのパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベル（例えば、量または濃度）を測定するステップ、および（ｂ）該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを少なくとも１つのバイオマーカーの参照レベルと比較するステップを含み、該参照レベルに対する、試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの増加は、対象に対してＫＤのための治療的処置を施す必要性を示す。一部の実施形態において、生体試料は尿試料である。一部の実施形態において、生体試料は血清試料である。
【００６９】
本態様の別の実施形態において、本方法は、対象から得られた生体試料を、メプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣを含むバイオマーカーのパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーに対して特異的な少なくとも１つの作用物質に接触させるステップ、（ｂ）該少なくとも１つの作用物質に対して特異的なアッセイ法を使用して、該バイオマーカーのレベルを測定するステップ、および（ｃ）該バイオマーカーのレベルを該バイオマーカーの参照レベルと比較するステップを含み、該バイオマーカーの参照レベルに対する該試料中の該バイオマーカーのレベルの増加は、該対象に対してＫＤのための治療的処置を施す必要性を示す。一部の実施形態において、生体試料は尿試料である。一部の実施形態において、生体試料は血清試料である。
【００７０】
本態様の別の実施形態において、ＫＤを有する対象の治療効果をモニタリングするための方法が提供され、該方法は、（ａ）第１の時点において対象から得られた生体試料から、メプリンＡ、フィラミンＢ、またはフィラミンＣを含むバイオマーカーのパネル中の、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル（例えば、量または濃度）を決定するステップ、（ｂ）第２の時点において該対象から得られた試料から、該バイオマーカーのレベルを決定するステップ、および（ｃ）該第２の時点における該バイオマーカーのレベルを、該第１の時点における該バイオマーカーのレベルと比較するステップを含み、該第２の時点における該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルまたは濃度の減少は、該対象に対して治療が有効であることを示し、かつ、該第２の時点における該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルまたは濃度の増加は、該対象に対して治療が有効ではないことを示す。一部の実施形態において、生体試料は尿試料である。一部の実施形態において、生体試料は血清試料である。
【００７１】
所与のＫＤに対する治療の効果は、例えば、本明細書で考察された基準を使用して、熟練した臨床医によって判定され得る。治療は、例えば、高用量アスピリンの投与、または静脈内への免疫グロブリンの投与を含んでもよい。ＫＤ治療の「有効量」とは、少なくとも一部の期間において、すなわち永久的ではない場合は一時的に、ＫＤまたはＫＤ症状を軽減、緩和、または消散するための治療に十分な量である。
【００７２】
したがって、本発明は、ＫＤを個体が有するかどうかを評価するための方法を実行するためのシステム（例えば、コンピュータシステムに与えるためのコンピュータ可読媒体を備える）を提供する。したがって、別の態様は、少なくとも一個体のＫＤを診断するための方法をコンピュータ上で実施するためのソフトウェアモジュールを定義するためのコンピュータ可読の命令が記録された、コンピュータ可読記憶媒体に関連し、該コンピュータ可読記憶媒体は、（ａ）少なくとも一個体から得られた生体試料に関して決定される、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルおよび正規化タンパク質のレベルを表すデータを記憶しかつ該データにアクセスするための命令と、（ｂ）正規化モジュールによって、該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを正規化タンパク質のレベルに正規化し、それにより、該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルを生成するための命令と、（ｃ）比較モジュールを使用して、該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルを、記憶装置上に記憶された参照データと比較するための命令であって、比較するステップが、読み出された内容を生成する、命令と、（ｄ）該少なくとも１つのバイオマーカーの正規化されたレベルに変化があるかどうかを表示する該読み出された内容のページを、ユーザに表示し、それにより、ＫＤを該少なくとも一個体が有するかどうかを判定するための命令とを備える。一実施形態において、正規化タンパク質は総タンパク質である。一実施形態において、生体試料は尿試料である。一実施形態において、生体試料は血清である。
【００７３】
代替の実施形態は、少なくとも一個体から得られた生体試料からデータを得るためのコンピュータシステムを含み、該システムは、（ａ）生体試料を保持するための検体容器と、（ｂ）レポーター分子情報が、（１）正規化タンパク質への作用物質の結合を表す情報、および（２）少なくとも１つのバイオマーカーへの作用物質の結合を表す情報を含む、該レポーター分子情報を判定するように構成された判定モジュールと、（ｃ）該判定モジュールからのデータ出力を記憶するように構成された記憶装置と、（ｄ）少なくとも１つのバイオマーカーへの作用物質の結合を表すレポーター分子情報を正規化タンパク質への作用物質の結合を表すレポーター分子情報に正規化するように構成された、正規化モジュールと、（ｅ）正規化モジュールから得られたデータを、該記憶装置上の参照データと比較するよう適合化され、読み出された内容を生成する、比較モジュールと、（ｆ）該バイオマーカーの正規化されたレベルに変化があるかどうかを表示する該読み出された内容のページを、ユーザに表示し、それにより、ＫＤを該個体が有するかどうかを判定するための表示モジュールとを備える。一実施形態において、正規化タンパク質は特定のタンパク質である。一実施形態において、正規化タンパク質は総タンパク質である。一実施形態において、生体試料は尿試料である。別の実施形態において、生体試料は血清である。
【００７４】
本明細書に記述されるシステムおよびコンピュータ可読媒体は、慢性腎障害を個体が有するかどうかを評価する方法を実行する本発明の実施形態の実例に過ぎず、本発明の範囲を制限すると意図されない。機械のモジュール、またはコンピュータ可読媒体内で使用されるそれらは、多数の構成を想定してもよい。例えば、機能は、単一の機械上に提供されることができる、または複数の機械にわたり分散されることができる。本明細書に記述されるシステムおよびコンピュータ可読媒体の変更は可能であり、本発明の範囲内に含まれると意図される。
【００７５】
本発明の態様および実施形態は、第１の検証されたＫＤに対する診断バイオマーカー、正確で迅速、および低／非侵襲性試験のための組成物、キットおよび方法、ならびに救急医療科、病院内医師、および診療所開業医のための分析的およびポイント・オブ・ケア試験を提供する。本発明の態様および実施形態は、評価の精度および適時性において好都合であり、低費用で臨床診療に広く組み込まれることから、不必要な入院、治療または処置を削減し得る。
【実施例】
【００７６】
実施例１．研究設計、参加者、および成果
研究は、２段階で実施された。発見段階では、冠動脈拡張を有する患者および有していない患者の両方を含むＫＤを有する６名の患者由来の尿試料が、当初ＫＤの疑いがあったが、最終的にＫＤを模倣する発熱性疾患と診断された６名の患者由来の尿試料と比較された。発見の分析ではまた、治療の完了後および症状の消散後に、ＫＤを有する患者から採取された３つの個体内制御検体を含んだ。検証段階では、ＫＤの可能性があると評価されたが、最終診断の判定前の患者が登録された。血清検体は、川崎病の小児心臓ネットワーク研究の一部として採取された独立検証コホートから採取された。Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，３５６  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．６６３（２００７）を参照。
【００７７】
すべての研究患者において、尿は中間採取試料として採取された。検体は、すべての分析が盲検であるように、研究番号で標識された。検体は、採取から６時間以内に−８０℃で保管された。血清採取のための血液検体は、採取から３０分以内に−８０℃で保管された血清を用いた標準方法に従って、凝固させ、遠心分離された。
【００７８】
研究は、３次医療の小児科病院で実施され、臨床研究のボストン小児病院委員会によって認められた。ＫＤの可能性について評価された１８歳未満の患者が、病歴および身体検査に従って、登録された。適格な患者は、少なくとも４日間の発熱を有し、かつ、４つ以上の主要なＫＤに対する臨床基準（Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１１０  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２７４７（２００４））、または、二次元心エコーによって測定された場合に近位右冠動脈もしくは左冠動脈前下行枝に対して冠動脈Ｚ値２．５以上のいずれかを有した。加えて、３つの診断臨床基準にしか合致しないＫＤの不完全な症状を有する患者は、専門家の意見に基づいて登録された。患者は、既存の腫瘍性、腎性もしくは泌尿器の疾病を有するかまたは妊娠している場合、排除された。小児科救急医療師またはリウマチ医師は、７歳より上の小児に対して、介護人からの承諾書および同意を得た。
【００７９】
最終診断は、公表されたＫＤに対する診断基準に従って、単独の３次医療療機関の小児科のリウマチ医師によって判定された。Ｎｅｗｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４。小児心臓ネットワーク研究の一部として登録された患者に対して、最終診断は、同一の基準を使用して判定された。Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，３５６  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．６６３（２００７）。入院していなかった患者に対して、成果は、評価の６〜８週間後の用意された質問を使用した電話によって、または、患者が任意にその後の医療を受けたかどうかを確かめるカルテの検査から、確認された。ＫＤを有していないことがわかった患者に対して、特異的な病原体が同定されない場合、臨床評価に基づいて非特異性のウイルス症候群の診断が与えられた。すべての研究された患者は、最終的な成果を受けとった。臨床および実験データは、標準化された症例報告書を使用して記録された。
【００８０】
実施例２．尿プロテオーム分析および免疫測定
ＫＤの候補マーカーの発見に対して、融解された５ｍｌの尿アリコートは、詳細に公表されているように、超遠心分離、タンパク質沈殿、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および逆相液体クロマトグラフィーを使用して、分割された。Ｋｅｎｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，３  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．１０５２（２００９）。個々の尿タンパク質画分を、ハイブリッド線形イオントラップ−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＬＴＱ  ＦＴ  Ｕｌｔｒａ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と接続されるナノフローＨＰＬＣシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）を使用して、液体クロマトグラフィータンデム質量分析に供する。各ＭＳ／ＭＳスペクトルに対して、２００個の最も強いピークが抽出され、ＭＡＳＣＯＴの使用によって（バージョン２．１．０４、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒト国際タンパク質指数データベース（ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ  ｄａｔａｂａｓｅ）  （バージョン３．６９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＩＰＩ）に照らして精査された。同定精度の評価は、標的ＩＰＩデータベースの逆タンパク質配列から成る、デコイデータベースの精査によって実行された。Ｅｌｉａｓ ａｎｄ Ｇｙｇｉ，４  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０７（２００７）。２つ以上の独特のペプチドに基づいて同定されたタンパク質のみが、ペプチドレベルで１％未満の偽発見率で分析に含まれる。分析された個々の尿プロテオームは、プロテオーム・コモンズにおいて、広く利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ）。フィラミンＢ、フィラミンＣ、およびメプリンＡに加えて、表Ｓ１に示される追加のマーカーがＫＤの診断において使用されてもよい。
【００８１】
フィラミンＣおよびメプリンＡの濃度は、酵素免疫吸着法を使用して測定された（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ、Ｃｈｉｎａ）。アッセイ法の最低検出限度は、それぞれ０．１ｎｇ／ｍｌおよび０．０６ｎｇ／ｍｌであり、両方のアッセイ法に対して、１０％未満の品質制御検体に対する変動係数を有する。
【００８２】
統計分析：尿プロテオームの発見は、記述されるように（Ｋｅｎｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、タンパク質スペクトルカウントを計算するために合計された個々のペプチドカウントを用いて、質素にタンパク質をグループ化することによって、整理された。ＱＳｐｅｃ（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２３７３（２００８））において実施されたとおり、ベイズ統計を使用して、川崎病を有する患者由来の試料中において統計的に有意に増大していたが、非川崎病患者由来の試料、または治療完了後の川崎病を有する患者の個体内制御試料においてはそうではなかった、タンパク質を同定するために、正規化タンパク質スペクトルカウントを分析した。受信者動作特性および多変量線形回帰モデルは、標準方法（ＳＴＡＴＡ、バージョン  １０．１、ＳｔａｔａＣｏｒｐ）を使用して計算された。すべての統計的試験は、対数変換測定値の比較を使用して両側検定した。
【００８３】
（表Ｓ１）川崎病を有する患者の尿中において独特に同定されたタンパク質
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【００８４】
実施例３．冠動脈炎のマウスモデルおよびメプリンＡ免疫組織化学
グループＢカセイ菌(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ)（ＬＣＷＥ）の細胞壁抽出物の腹腔内注射に基づいた冠動脈炎の確立されたマウスモデルが使用された。Ｌｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，４８  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１０８（１９８８）。グループＢカセイ菌(Ｌ．  ｃａｓｅｉ)は、成長し、細胞壁抽出物（ＬＣＷＥ）は、記述されるように調整された。Ｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１８３  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５３１１（２００９）。端的に言えば、６週齢Ｃ５７／ＢＬ６マウスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２５０μｇのＬＣＷＥまたは生理的食塩水単体を、注入された。１４日後には、マウスは犠牲となり、冠状動脈は、ホルマリンで安定され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された連続切片（７μｍ）で、同定された。免疫組織化学的分析のために、切片は０．３％過酸化水素を用いてＰＢＳで３０分間事前処理された。メプリンＡ（クローンＦ−２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）またはアイソタイプ対照抗体（ヤギ血清、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）は、ＰＢＳ中の０．５％ウシ血清アルブミンに１：１００で１時間適用された。次いで、スライドを洗浄し、ビオチン抗ヤギセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）は、１：５００で３０分間適用され、洗浄され、ストレプトアビジン共益セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、１：１，０００で３０分間染色された。免疫組織化学的染色は、ＳＫ４１００  ＤＡＢキットを製造者の指示（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）通りに使用して検出された。
【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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