(57)【要約】  本発明は、神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための薬剤としての、一般式(I)を有するフッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールならびにその塩酸塩および臭化水素酸塩、それに基づく薬物およびそれを使用する方法に関する。本発明は、医薬の分野に関し、中枢神経系および末梢神経系における破壊的プロセスの発生に対処するための薬剤の範囲を拡大するという課題を解決する。式(I)中、R1=R2=R4=H、Meであり；またはR4+R2=-CH2-CH2-であり；R3=H、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(Cз〜C6)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリールオキシ(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、[F、Cl、Вr、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリール、ヘテリル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アシル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アロイル、ヘテロイル、N,N-ジアルキルカルバモイル、N,N-ジアルキルアミノスルホニルであり；R5、R6、R7、R8=H、F、Cl、Br、CN、OH、CF3、CF3O、CHF2O、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、(C1〜C6)アルコキシ、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリール、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリールオキシ、(Me、Cl、Br置換)ピリジル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アシル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アロイル、N,N-ジアルキルカルバモイル、N,N-ジアルキルアミノスルホニルであり；R9=F、2F、CHF2、CC1F2、CF3.；X=存在しないかまたはCl.Brである。2014533266.tif 000019
2014533266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための有効な薬剤としての、一般式(I)のフッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール、その塩酸塩および臭化水素酸塩
【化１】
2014533266.tif 000018
[式中、
R1=R2=R4は、HもしくはMeであり；またはR1+R2は、-CH2-CH2-であり；
R3は、H、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C3〜C6)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル-置換]アリールオキシ(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル-置換]アリール、ヘテロアリール、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アシル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル-置換]アロイル、ヘテロイル、N,N-ジアルキルカルバモイル、N,N-ジアルキルアミノスルホニルであり；
R5、R6、R7、R8=H、F、Cl、Br、CN、OH、CF3、CF3O、CHF2O、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、(C1〜C6)アルコキシ、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル-置換]アリール、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル-置換]アリールオキシ、(Me、Cl、Br-置換)ピリジル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アシル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル-置換]アロイル、N,N-ジアルキルカルバモイル、N,N-ジアルキルアミノスルホニルであり；
R9=F、2F、CHF2、CClF2、CF3であり；
Xは、存在しないかまたはClもしくはBrである]。
【請求項２】
神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための薬物であって、活性薬剤および薬学的に許容される担体を含み、前記活性薬剤として、有効量の式(I)の化合物有効量を含むことを特徴とする薬物。
【請求項３】
有効量の式(I)の化合物を含む薬物を、治療効果のために要する期間にわたって体重1kg当たり0.01〜1.5mgの用量で1日1回患者に投与するステップを含む、神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野における化合物の使用に関し、制御不能なタンパク質凝集に関連する疾患の予防および治療のための薬理学的な製剤の製造において有効な薬剤として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ある種のタンパク質の制御不能な凝集は、多発性神経変性疾患の病因の基礎にある神経変性のプロセスを発生することにおいて最も重要な因子である。神経系における様々な中間産物(オリゴマー、神経原線維)および最終産物(原線維および非晶質の沈着物)は、その多くが細胞毒性を有し、これらが蓄積すると機能障害を生じ、最終的にはニューロン死を生じる。このようなタイプの病態は、タンパク質症として知られており、本質的に異なる臨床病理学的な徴候を伴う一群の神経障害にまとめられている。こうした疾患のグループには、神経変性障害が含まれ、これらはアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型変性症 (FTD)、ハンチントン舞踏病およびプリオン病など、広範に分布し、現在のところ不治である。疾患の基礎にある病理プロセスに直接作用する有効な薬剤が依然として開発されてないため、今日までのタンパク質症の治療は、好ましくは対症療法である。
【０００３】
現在、制御不能なタンパク質凝集は、神経変性の発生の基礎にあるプロセスを修正することを可能にし、それによって疾患の発症を遅らせ、さらに病理プロセスを抑止する新世代の治療薬を開発するための重要な標的の1つと考えられている[Jacobsen J.S.、Reinhart P.、Pangalos M.N. Neuro R.X.、2005年、2巻(4号)、612〜626頁；Walker L.C.、Ibegbu C.C.、Todd C.W.、Robinsona H.L.、Juckere M.、Illf H.L.、Gandyg S.、Biochemical Pharmacology、2005年、69巻、1001〜1008頁；Christensen D.D、CNS Spectrums、2007年、12巻、113〜123頁]。
【０００４】
水素化ピリド[4,3-b]インドールの誘導体、特に、γ-カルボリン(Dimebon)は、モデル動物の神経系の組織において凝集傾向のあるγ-シヌクレインタンパク質によって形成されたアミロイド様封入体の病的なタンパク質沈着の形成および/または除去の分子細胞プロセスをモジュレートすることが知られている(S.O.Bachurin、A.A.Ustyugov、O.Peters、T.A.Shelkovnikova、V.L.Buchman、N.N.Ninkina、Doklady of the Russian Academy of Sciences、2009年、428巻、262〜265頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2009/038764、A1、C07D471/04(2006/01)、26.03.2009
【特許文献２】WO2009/055828、A1、C07D471/04(2006/01)、30.04.2009
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jacobsen J.S.、Reinhart P.、Pangalos M.N. Neuro R.X.、2005年、2巻(4号)、612〜626頁
【非特許文献２】Walker L.C.、Ibegbu C.C.、Todd C.W.、Robinsona H.L.、Juckere M.、Illf H.L.、Gandyg S.、Biochemical Pharmacology、2005年、69巻、1001〜1008頁
【非特許文献３】Christensen D.D、CNS Spectrums、2007年、12巻、113〜123頁
【非特許文献４】S.O.Bachurin、A.A.Ustyugov、O.Peters、T.A.Shelkovnikova、V.L.Buchman、N.N.Ninkina、Doklady of the Russian Academy of Sciences、2009年、428巻、262〜265頁
【非特許文献５】Jackson Laboratory catalogue (http：//iaxmice.iax.org/strain/Q08843.html)
【非特許文献６】http：//rsbweb.nih.gov/ij/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Dimebonの薬物動態特性は、その誘導体の十分に広範囲な作用に結び付くものではない。
【０００８】
特許請求された発明は、神経系における制御不能なタンパク質凝集であって、その後の中枢神経系および末梢神経系における変性の進行をもたらすもののモジュレーションに関与する薬剤の範囲を広げるという課題に取り組んでいる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための有効な薬剤としての、一般式(I)を有するフッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール、ならびにそれぞれの塩酸塩および臭化水素酸塩の使用。
【００１０】
【化１】
2014533266.tif 000003
【００１１】
[式中、
R1=R2=R4は、HもしくはMeであり；またはR1+R2は、-CH2-CH2-であり；
R3は、H、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C3〜C6)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリールオキシ(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリール、ヘテロアリール、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アシル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アロイル、ヘテロイル、N,N-ジアルキルカルバモイル、N,N-ジアルキルアミノスルホニルであり；
R5、R6、R7、R8=H、F、Cl、Br、CN、OH、CF3、CF3O、CHF2O、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、(C1〜C6)アルコキシ、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリール、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アリールオキシ、(Me、Cl、Br置換)ピリジル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アシル、[F、Cl、Br、NO2、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、アシル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル置換]アロイル、N,N-ジアルキルカルバモイル、N,N-ジアルキルアミノスルホニルであり；
R9=F、2F、CHF2、CClF2、CF3であり；
Xは、存在しないかまたはClもしくはBrである。]
【００１２】
本発明の他の態様は、神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための薬物であり、この薬物は、活性薬剤および薬学的に許容される担体を含み、薬物が活性薬剤として有効量の式(I)の化合物を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の態様は、治療効果に要する期間にわたって体重1kg当たり0.05〜1.5mgの用量で有効量の式(I)の化合物を含む薬物を1日1回患者に投与するステップを含む、神経系における制御不能なタンパク質凝集を低下させるための方法である。
【００１４】
ピリド[4,3-b]インドールのフッ素化された誘導体は、ヒスタミン、アドレナリン作動薬、ドーパミン、セロトニン、イミダゾリンAMPA-およびアミン作動性タンパク質共役受容体に結合するこれらの誘導体の能力、ならびにラット脳シナプトソームにおいてCa2+の再取り込みに対する効果、加えてスコポラミンで処置したラットにおいて記憶を改善するこれらの化合物の効力により、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、統合失調症、多発性硬化症およびいくつかの他の疾患などの神経変性障害を治療するための潜在的な薬剤として用いられることが知られている(明細書：WO2009/038764、A1、C07D471/04(2006/01)、26.03.2009；明細書WO2009/055828、A1、C07D471/04(2006/01)、30.04.2009)。
【００１５】
本発明者らは、研究の課程で、遺伝子修飾によって引き起こされる凝集傾向のあるタンパク質、特に、γ-シヌクレインタンパク質およびタウタンパク質を過剰発現した動物において、式(I)のフッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールを長期的に使用することにより、これらのタンパク質の凝集を顕著に低下させ、アストログリオーシスを抑制し、さらに生存しているニューロンの量をも増加させることを予想外に見出した。
【００１６】
本発明を具体化するときに得ることができる技術上の効果は、これらに基づいて、医薬品の範囲を広げることにある。
【００１７】
したがって、式(I)で示した既知の化合物の新たな特性の発見により、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型変性症(FTD)、ハンチントン病のより有効な治療のためのみならず、より広範囲の神経変性疾患、特に、神経系における制御不能なタンパク質凝集に直接関連する、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック症候群、およびプリオン病の予防および治療のためにも、これらを使用することが可能になる。
【００１８】
Table 1(表3)およびTable 2(表4)は、特許請求する化合物のクラスの収率、融点ならびに1Hおよび19F NMRスペクトルをまとめて示している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】化合物で処置しなかった動物(対照)および3月齢から化合物で処置した動物についての、γ-シヌクレインに対する抗体による、12月齢のホモ接合Thy1mγSNトランスジェニックマウスの脊髄切片の免疫組織化学染色を示す図である。倍率100×。
【図２】対照群の12月齢のホモ接合トランスジェニックマウスおよび式9のFC-203化合物(フッ素含有カルボリン)で処置した動物の脊髄切片中のγ-シヌクレイン陽性凝集体の定量の結果を示す図である。凝集体の密度は、単位面積当たりで算出した。
【図３】化合物で処置しなかった動物(対照)および5週齢からFC-203で処置した動物についての、タウタンパク質に対する抗体による、4月齢および5月齢のホモ接合P301Sトランスジェニックマウスの脊髄切片の免疫組織化学染色を示す図である。倍率400×。
【図４】対照群および実験群における4月齢および5月齢のホモ接合トランスジェニックマウスの脊髄切片中のタウ陽性凝集体の定量の結果を示す図である(n=3、平均値±SEM)。
【図５】対照群および実験群における12月齢のホモ接合Thy1mγSNトランスジェニックマウスの脊髄の切片中のグリア線維酸性タンパク質(glial fibrillar acid protein)(GFAP)の免疫組織化学染色を示す図である。倍率400×。
【図６】対照群および実験群における4月齢および5月齢のホモ接合P301Sトランスジェニックマウスの脊髄の切片中のGFAPの免疫組織化学染色を示す図である。
【図７】対照群(丸)と比較した、1月齢から投与されたFC-203処置群(四角)のThy1mγSNマウスの場合のロータロッドから落下する平均反応時間(latency)を示す図である。
【図８】対照群(丸)と比較した、1月齢から投与されたFC-203処置群(四角)のP301Sマウスの場合のロータロッドから落下する平均反応時間を示す図である。
【図９】対照群(丸)と比較した、1月齢から投与されたFC-203処置群(四角)のThy1mγSNマウスが、逆さのグリッドから落下する平均反応時間を示す図である。
【図１０】対照群(丸)と比較した、1月齢から投与されたFC-203処置群(四角)のP301Sマウスの場合の逆さのグリッドから落下する平均反応時間を示す図である。
【図１１】ヒトFUSタンパク質のC末端エピトープに対する抗体による、SH-SY5Y神経芽細胞腫細胞中のヒトFUSタンパク質の凝集傾向の免疫組織化学的な検出を示す図である。
【図１２】C末端エピトープに対する抗体による、SH-SY5Y神経芽細胞腫細胞中の凝集の増加を特徴とするヒトの異常なTDP-43タンパク質の免疫組織化学的な検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
化合物の合成
本発明による、式(I)の化合物、フッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール、ならびにそれぞれの塩酸塩および臭化水素酸塩は、置換2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールおよびフッ素含有3-ビニルピリジン化合物から、類似の化合物を調製するための従来技術において既知の方法によって得られる。2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールと、フッ素含有3-ビニルピリジン化合物の混合物との反応を、触媒量のフッ化セシウムの存在下、135〜140℃にて8〜10時間ジメチルスルホキシド(DMSO)中で試薬の等モル混合物を加熱することによって行うと、フッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール(I)が形成され、これを塩酸または臭化水素酸で処理することによって、対応する塩酸塩および臭化水素酸塩がもたらされる(スキーム1)。
【００２１】
【化２】
2014533266.tif 000004
【００２２】
特許請求する所期の目的を達成する本発明の実施可能性は、以下の実施例によって裏付けられるが、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
［フッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールの合成(一般的な方法) ］
DMSO1.5ml中の2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール1mmol、フッ素含有3-ビニルピリジン1mmol、CsF200mg、およびヒドロキノン(hydrochinone)5mgを、135〜140℃で8時間撹拌しながら加熱した。DMSOおよびビニルピリジンを、減圧(3mmHg)下で除去し、塩化メチレンを用いて生成物を残留物から抽出した。塩化メチレンを蒸発させ、残留物を、シリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した(60メッシュ、溶離液：メタノール/クロロホルム=1/5)。
【００２４】
化合物1〜7および23〜29の収率、融点、ならびに1Hおよび19F NMRスペクトルのデータを、Table 1(表3)およびTable 2(表4)に示す。
【実施例２】
【００２５】
［フッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールの塩酸塩の合成(一般的な方法) ］
濃塩酸0.1mlを、水5ml中の塩基の懸濁液に加え、塩基が完全に溶解するまで加熱した。水および塩酸を減圧下で蒸発させ、得られた残留物を50%エタノールから再結晶化した。
【００２６】
化合物8〜21および30〜36の収率、融点、ならびに1Hおよび19F NMRスペクトルのデータを、Table 1(表3)およびTable 2(表4)に示す。
【実施例３】
【００２７】
［フッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールの臭化水素酸塩の合成(一般的な方法)］
濃臭化水素酸0.1mlを、水5ml中の塩基の懸濁液に加え、塩基が完全に溶解するまで加熱した。水および臭化水素酸を減圧下で蒸発させ、得られた残留物を50%エタノールから再結晶化した。化合物22の収率、融点、ならびに1Hおよび19F NMRスペクトルのデータを、Table 1(表3)およびTable 2(表4)に示す。
【００２８】
［得られた化合物の生物活性］
特許請求する所期の目的を達成する本発明の実施可能性を、下記試験化合物FC-203を用いて例示する。
【００２９】
【化３】
2014533266.tif 000005
【００３０】
in vitroおよびin vivoの両方のタンパク質症モデルにおいて、この化合物の生物学的特性を試験した。アミロイド形成TDP-43タンパク質およびFUSタンパク質が異所性発現したヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞を、これらのタンパク質の代謝障害に関連する分子病理の最も重要な機序を再現することを可能にするin vitroモデルとして用いた。
【００３１】
このアプローチは、分子機構の発見および神経変性の変化の発生に焦点を絞っており、トランスジェニック動物における試験を補完するものである。さらに、制御不能なタンパク質凝集の機序に対して直接の効果がある治療薬を選択するためのそれらの動物モデルを使用することも可能である。神経組織中で病的な封入体を形成する傾向がある突然変異型のTDP-43タンパク質およびFUSタンパク質を、アミロイド形成タンパク質として選択した。TDP-43タンパク質およびFUSタンパク質が、RNAのプロセシング、輸送および代謝の調節に関与することは以前に示されている。これらのタンパク質の機能障害は、タンパク質症の発生を引き起こす恐れがある。最近、TDP-43およびFUS遺伝子中の点変異が、これらの遺伝子のコード領域においてアミノ酸配列が置換される、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびユビキチン封入体を含む前頭側頭型変性症(FTD-U)のいくつかの変異体の遺伝性および特発性の形態をもつ患者において発見された。かかるタイプの分子病理は、細胞モデル系において再現することができる。
【００３２】
ヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞中でのこれらのモデルタンパク質の過剰発現は、これらのタンパク質の異常型の制御不能な凝集を導き、不溶性の病的な封入体の形成および蓄積も伴うことが示された。同一の分子病理を、TDP-43遺伝子またはFUS遺伝子のそれぞれの突然変異に特異的な細胞系で再現することができ、コードされるタンパク質の構造にダメージをもたらす。
【００３３】
FC-203(式9)の生物学的な作用を、異なる2つのタイプのタンパク質症において研究した。マウスのThy1mgSNおよびP301Sトランスジェニック系統を、in vivoモデルとして用いた。Thy1mgSNトランスジェニックマウスは、C57B16Jバックグラウンドにおいて作製され、中枢神経系の組織中のヒトγ-シヌクレインの高レベルの異所性発現を特徴とする。導入遺伝子発現は、ニューロン特異的プロモーターThy-1の制御下にある。この系統は、Jackson Laboratory catalogue(http：//iaxmice.iax.org/strain/Q08843.html)から市販品として入手可能であり、凝集傾向のあるγ-シヌクレインタンパク質の進行性の蓄積、細胞内の病的なアミロイド様沈着物の形成、および中枢神経系の異なる部分の組織中のその蓄積を特徴としており、これらによってタンパク質症の最も重要な病原性の機序の再現を促進する。
【００３４】
トランスジェニックマウスのもう一つの系統は、P301S(Jacksons Laboratory databaseによる系統のフルネーム-B6；C3-Tg(Prnp-MAPT*P301S)PS19Vle/J)であり、異常なヒトタウタンパク質の過剰発現を特徴とする。導入遺伝子発現は、モデル動物の中枢神経系の組織中のプリオンタンパク質プロモーターPrnpの制御下にあり、神経原線維濃縮体を形成する高リン酸化(hyperphosphorilated)タウタンパク質の蓄積をもたらすが、これらは、タウオパシー、例えば、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症およびピック病などにおいて観察される特徴的な組織学的構造である。したがって、P301Sは、制御不能なタンパク質凝集を伴うタンパク質症の最も重要な機序を再現する。
【００３５】
動物の実験群および対照群は、ヘテロ接合の親を野生型マウスと交雑することによって生産された子孫から構成されていた。トランスジェニックアレルがホモ接合であった雄のコホートを用いた。ハウジング条件は、対照群および実験群で同一であり、12時間の光サイクル、22℃、食餌および水を自由に摂取させる実験プログラムを全期間中変えないまま維持した。試験化合物FC-203を飲料水(70μg/ml)に溶解し、この溶液をマウスの実験群において飲料水の唯一の供給源として用い、化合物FC-203を含む飲用溶液の摂取は制限しなかった。飲用溶液を1週間当たり3回変えた。動物の1日の水分摂取量を記録し、液体摂取の生理学的な標準に対応させたところ、この摂取量は体重30グラムのマウス当たり平均して5mlであった。
【００３６】
FC-203を含有する飲用溶液の1日摂取量は、飲料水の1日摂取量と異なるものではなく、この摂取量は、体重30グラムのマウス当たりおよそ5mlであった。したがって、動物の体重に基づいた化合物の1日摂取量は：
【００３７】
【数１】
2014533266.tif 000006
【００３８】
11.7mg/kgであった。
【実施例４】
【００３９】
［Thy1mγSNマウスにおける神経系の患部中のγ-シヌクレインタンパク質によって形成される病的なアミロイド様封入体の組成に対するFC-203効果の決定］
12-週齢から開始するマウスの実験群に、9カ月間化合物を投与した。対照群には化合物を投与しなかった。致死量のペントバルビタールナトリウム(Euthatal)を腹腔内投与することによって薬物誘発性の安楽死をさせた後、対照群および実験群の両群から脊髄組織を分析用に採取した。脊髄を取り出し、別々の3領域、すなわち、別々に固定された頸部、背部および腰部に分けた。アミロイド沈着物に特定の薬剤でさらに染色するため、冷カルノア溶液(60%エタノール、30%クロロホルムおよび10%氷酢酸)中で終夜4℃で脊髄を固定した。免疫組織化学分析用に使用する組織を、リン酸緩衝液(PBS)中の4%パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、試料を、蒸留水で洗浄し(2回、1時間)、組織を、75%エタノール(15分)、96%エタノール(2回、5および10分)、100%エタノール(2回、10分)、エタノール/クロロホルム(1：1、30分)、およびクロロホルム(1時間)で順次室温で脱水し、次いで、試料をパラフィンに包埋した後、クロロホルム中で終夜4℃でインキュベートした。脊髄の断面を、凝集体の数および分布に関して分析した。
【００４０】
［組織学的切片の調製］
8μm厚の切片をLeica RM2265ロータリーミクロトームで切断し、コンゴーレッドでさらに染色するためにSuperFrostスライド(BDH、Poole、UK)またはさらに免疫染色するためにGold Sealスライド(Gold Seal Products、UK)にマウントした。キシレン中で切片を脱パラフィンし(2回、5分)、アルコールの濃度を段階的に下げることにより再水和させた(エタノール、室温)。
【００４１】
［コンゴーレッド染色およびアミロイド沈着物の計数］
アルコール(エタノール)の濃度(100%、90%、70%)を段階的に下げることによって脱パラフィンおよび再水和(rehydratation)した後、切片を蒸留水で2回洗浄した(5分)。切片を、7分間室温で50%アルコール中の0.5%コンゴーレッド溶液(Sigma、USA)で染色した。染色を、80%アルコール中の0.2%KOHで1分間固定した。次いで、切片を水で洗浄し、風乾した。切片を、1滴のImmu-Mount(Thermo Electron Corporation、USA)でマウントし、カバースライド(50×24mm)で覆い、熱空気滅菌器(dry air sterilizer)で37℃または室温で乾燥した。これらの結果を分析し、蛍光顕微鏡Leica DMI 4000Bで記録した。顕微鏡写真をLeica DFS 490カメラでおよびLeica Application Suite version 2.8.1ソフトウェア(Leica Microsystems、Germany)を用いて作製した。ImageJソフトウェア(http：//rsbweb.nih.gov/ij/)を用いて、0.1mm2の範囲の灰白質試料における染色されたアミロイド沈着物の数をカウントした。Microsoft Office 2003 Excelソフトウェアパッケージ(Microsoft Corp.、USA)を用いて統計解析を行った。
【００４２】
図1および図2中の実験の結果では、化合物FC-203を計画的に投与すると、Thy1mγSNトランスジェニックマウスの脊髄組織中のアミロイド沈着物の数が有意に低下することが示された。このことは起こり得る2つの機序に起因する可能性がある。すなわち、FC-203は、例えば、異常なタンパク質および原線維構造から内部の機能的空間を除去することを目的とした細胞自体の防御機構を活性化することによって、新たな凝集体の形成を防止することも、すでに予形成された封入体の安定性に対して影響を与えることもできる。
【実施例５】
【００４３】
［P301Sマウスの脊髄の組織中の病理組織学的なアミロイド様封入体の数に対するFC-203効果の決定］
タウタンパク質のリン酸化された模倣体を過剰発現するマウス系統においてヒトタウタンパク質凝集体数に対するFC-203の効果を試験した。この系統はニューロン中のタウタンパク質沈着物を伴う早期の神経病変により特徴付けられる。P301Sトランスジェニックマウスの実験群を、FC-203で処置した（神経原線維濃縮体の形成が組織学的に検出されない5週齢から開始）。この実験群中のマウスは、15週間または20週間(それぞれ4月齢もしくは5月齢まで)処置した。P301Sトランスジェニックマウスの脊髄のタウタンパク質の病的な凝集体の数の分析の結果(図3および図4)から、タンパク質症の前体細胞段階(pre-somatic stage)から開始したFC-203の長期投与によって、トランスジェニック動物の脊髄ニューロン中のタウ陽性沈着物の数が統計的に有意に低下することが示された。
【００４４】
したがって、FC-203は、in vivoでFC-203の抗凝集特性と直接関連づけられているヒトタウタンパク質の沈着物の形成を、効果的に低下させる。
【実施例６】
【００４５】
［γ-シヌクレインの合成が増強された動物ニューロンにおけるアストログリオーシスのプロセスに対するFC-203効果の決定］
制御不能なタンパク質凝集を伴う疾患に固有の炎症反応のマーカーとしての反応性アストログリオーシスに関連するプロセスに対する試験化合物の効果を、神経組織における神経炎症反応(neuroinflammatory response)用にしばしば用いられるマーカーであるグリア線維酸性タンパク質(GFAP)の発現レベルに基づいて試験した。本発明者らは、トランスジェニックマウスThy1mγSNおよびP301Sの2系統を用いた。化合物の効果を評価するために、本発明者らは、(特定の色を有する活性化したアストロサイトによって測定した)組織中の炎症反応がより小さいほど、炎症を抑制するための薬剤がより有効であったというルールに依拠した。本実験を、実施例5に記載の方法によって調製された脊髄の切片を用いて行った。次いで、ブロッキング緩衝液(1：1000希釈)中で4℃で終夜GFAP(DAKO、USA)に対するウサギポリクローナル1次抗体と共に切片をインキュベートした。
【００４６】
図5中のデータは、γ-シヌクレインの発現が増強された動物ニューロンにおけるアストログリオーシスに対するFC-203の効果を示している。結果的に、化合物を長期投与すると、γ-シヌクレイン病の動物において、活性化したアストロサイトのレベルが有意に低下する。
【００４７】
したがって、FC-203は、動物における神経系の組織中の制御不能なタンパク質凝集を通常伴う神経特異的な炎症を効果的に抑制する。
【実施例７】
【００４８】
［高リン酸化タウタンパク質の合成が増強された動物ニューロンにおけるアストログリオーシスの発生に対するFC-203効果の決定］
実験条件は、実施例6に開示したものと同様である。
【００４９】
高リン酸化ヒトタウタンパク質の凝集によって引き起こされる病態を伴うP301Sマウスにおける活性化したアストロサイトの検出数は、神経変性のプロセスの進行と共に増加し、タンパク質症の発生の段階に対応する。すなわち、Thy1mγSNマウスでは、γ-シヌクレイン病の発症段階は6カ月から検出可能になるが、他方でP301Sマウスにおけるタウパシー(taupathy)によって引き起こされるニューロン症状ははるかに早く発生する。これに相応して、P301Sマウスにおけるアストログリオーシスも、Thy1mγSN動物よりもかなり早期に開始される。FC-203の使用によって、2つの動物モデルにおけるタンパク質症の発症段階のアストログリオーシスの強度が有意に低下する。
【００５０】
結果に基づくと(図6)、試験化合物は、タウタンパク質の制御不能な凝集によって引き起こされるアストログリオーシスのレベルを有意に低下させる。これは、FC-203が、動物における神経系の組織中の制御不能なタンパク質凝集のプロセスに関連する炎症を効果的に抑制することの直接的な証拠である。
【実施例８】
【００５１】
［トランスジェニック動物の神経系中のγ-シヌクレインの制御不能な凝集に関連する症状の進行に対するFC-203効果の決定：回転ロッド上での平衡および協調性の分析］
Thy1mγSNトランスジェニックマウスの運動機能を、連続的に加速している回転ロッド上で平衡を保つ能力について試験した。回転ロッド上での各試験を5分間行い、この期間、回転の速度を4〜40rpmまで増加させた。動物が回転ロッド上でこれ以上とどまることができないときの落下するまでの反応時間を各マウスについて記録した。試験を、各動物につき30分間隔で休憩させながら3回くり返して、落下するまでの平均反応時間を算出した。
【００５２】
動物を、連続的に加速している回転ロッド上で試験した。回転ロッドから落下するまでの平均反応時間を、未処置対照群(丸)と比較した1月齢(四角)からFC-203で処置した実験群の動物について得た。
【００５３】
図7には、試験化合物で処置したトランスジェニックマウスの平衡および協調性が、対照の未処置マウスにおけるものよりも統計的に優れていたため、試験化合物FC-203は、γ-シヌクレイン病によって引き起こされる神経変性のプロセスの臨床症状の発生を有意に抑制することが示されている。
【実施例９】
【００５４】
［トランスジェニック動物の神経系中の高リン酸化タウタンパク質の制御不能な凝集に関連する症状の進行に対するFC-203効果の決定：回転ロッド上での平衡および協調性の分析］
P301Sトランスジェニックマウスの運動機能を、連続的に加速している回転ロッド上で平衡を保つ能力に従って試験した。回転ロッド上での各試験を5分間行い、この期間、回転の速度を4〜40rpmまで増加させた。動物が回転ロッド上でこれ以上とどまることができないときの落下するまでの反応時間を各マウスについて記録した。試験を、各動物につき30分間隔で休憩させながら3回くり返して、落下するまでの平均反応時間を算出した。
【００５５】
動物を、連続的に加速している回転ロッド上で試験した。図8には、対照群(丸)および実験FC-203群(四角)の落下するまでの平均反応時間が示されており、実験動物は、1月齢から試験化合物で処置した。得られたデータでは、試験化合物がタウパシーの臨床症状の発生を有意に抑制することが示されている。
【００５６】
したがって、FC-203は、タウタンパク質凝集によって引き起こされるP301Sトランスジェニックマウスにおいて平衡および協調性の障害を効果的に低下させる。
【実施例１０】
【００５７】
［トランスジェニックマウスの神経系中のγ-シヌクレインの制御不能な凝集に関連する症状の進行に対するFC-203効果の決定：逆さのグリッド上で保持する動物の能力の評価］
Thy1mγSNトランスジェニックマウスにおいてγ-シヌクレイン病(syncleinopathy)によって引き起こされる神経変性のプロセスが進行することにより、神経変性に関連する検出可能な運動機能障害および筋力低下の発生をもたらす(動物は、逆さのグリッド上で身体を保持する能力を失う)。逆さのグリッド上で身体を保持する動物の能力を、両群の動物について3月齢から開始し、連続して毎月評価した。結果として、落下するまでの平均反応時間(分単位)を各群について記録した。
【００５８】
図9には、対照群(丸)および実験FC-203群(四角)の平均反応時間が示されており、実験群のマウスは、3月齢から試験化合物を投与された。
【００５９】
得られたデータでは、試験化合物が、試験される動物における異常な肢の神経支配によって引き起こされる臨床症状の発生を有意に抑制することが示されている。したがって、FC-203は、トランスジェニックマウスにおけるγ-シヌクレイン病の進行に対して顕著な効果を有する。
【実施例１１】
【００６０】
トランスジェニック動物の神経系中の高リン酸化タウタンパク質の制御不能な凝集に関連する症状の進行に対するFC-203効果の決定：逆さのグリッド上で身体を保持する動物の能力の分析
逆さのグリッド上で身体を保持する動物の能力を、処置群および未処置対照群の両群について2月齢から、毎月評価した。
【００６１】
対照群(丸)および実験群(四角)におけるマウスの各群について得られた平均反応時間を算出し、実験動物を1月齢からFC-203を用いて処置した。
【００６２】
図10には、試験化合物が、タウパシーによって引き起こされるマウスにおける異常な肢の神経支配によって引き起こされる臨床症状の発生を有意に抑制することが示されている。したがって、化合物FC-203は、動物の神経系の組織中の制御不能なタンパク質凝集に関連する症状の強度を効果的に低下させる。
【実施例１２】
【００６３】
［細胞培養中のFUSタンパク質の凝集体の形成に対するFC-203効果の決定］
病原性タンパク質の凝集体の形成および/または安定性に影響を与える試験化合物の能力を、凝集傾向のあるヒトFUSタンパク質の異常型を発現する細胞培養物において評価した。ヒト神経芽細胞腫細胞系統SH-SY5Yの細胞培養物を、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のいくつかの遺伝性の形態に関連する、突然変異ヒトFUSタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。これらの突然変異のアイソフォームは、凝集傾向の増加を示し、病原性タンパク質封入体を形成する。このようなモデル系は、これらのタンパク質の代謝の中断に関連するタンパク質症の分子病理の決定的な段階を再現する。培養培地中で細胞培養物に形質移入した直後にFC-203を加え、その後、FUSタンパク質-形成封入体の数を評価した。対照群においてFUSタンパク質の凝集体は、徐々に蓄積し、細胞死に至らせた。しかしながら、化合物FC-203を加えることによって、タンパク質凝集体の形成のプロセスが有意に抑制された。
【００６４】
図11には、FUS-陽性凝集体は対照の細胞培養物の細胞質に局在するが、他方で処理された細胞中のFUS染色は拡散することが示されている。この事実から、試験化合物が、FUS-タンパク質凝集体の形成を抑制するという仮説が裏付けられる。
【実施例１３】
【００６５】
［細胞培養物におけるTDP-43タンパク質の凝集体の形成に対するFC-203効果の決定］
細胞質のタンパク質凝集体の形成を抑制するFC-203の予想外に見出された特性を試験するために用いられた他のタンパク質は、TDP-43タンパク質であった。FUSタンパク質と同様に、TDP-43タンパク質は、DNA/RNA結合タンパク質であり、構造が類似しており、RNA代謝の調節において機能する。さらに、TDP-43タンパク質は、明らかになった遺伝子突然変異によってコードされるタンパク質の一次配列に変化がもたらされるALSおよび前頭側頭型変性症のいくつかの型においてある役割を担っていることが見出されている。このタンパク質の高い凝集特性を特徴とする異常型をコードする切断されたヒトTDP-43遺伝子のプラスミドを、発現ベクターにクローン化し、前の例に記載した通りヒト神経芽細胞腫細胞SH-SY5Yに形質移入した。封入体の形成を18時間後に細胞質において評価した。試験化合物による処置の結果として、凝集体の数は有意に低下したが、この結果も、異常なTDP-43タンパク質の凝集体形成の低下によるものである。
【００６６】
図12には、TDP-43-陽性凝集体が、対照群の細胞質中に局在することが示されているが、他方で処理された細胞は染色されたTDP-43-陽性凝集体の数が低下することを示している。したがって、使用されたTDF-43タンパク質の異常型の特異的で活動的な特性を考慮すると、FC-203は、TDP-43の凝集を防止する。
【００６７】
本発明の以下の態様は、有効量の式(I)の化合物および薬学的に許容される担体を含む、認知機能および記憶を改善する医薬品である。
【００６８】
本発明による医薬品は、周知の方法によって調製され、式(I)の化合物である活性薬剤(本明細書では「活性薬剤」とさらに呼ばれる)の薬学的有効量を含み、有効量は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、吸収剤、アロマタイザー、および矯味剤などの1種もしくは複数の薬学的に許容される添加物と組み合わせた剤形中に、一般に1〜20wt.%、または1〜20mgである。既知の方法によれば、医薬組成物は、様々な液体または固体の形態で提示され得る。固形剤形の例には、例えば、錠剤、丸剤、ゼラチン化カプセルなどが含まれる。
【００６９】
組成物は、活性薬剤を液体の担体または微細粉末化した固形の担体と混合するステップを行う標準的な手順によって通常調製される。
【００７０】
本発明による錠剤にされる組成物は、1〜20wt.%の活性薬剤と、a)賦形剤：テンサイ糖、ラクトース、グルコース、塩化ナトリウム、ソルビトール、マンニトール、グリコール、リン酸カルシウム；b)結合剤：ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンc)崩壊剤：デキストロース、カンテン、アルギン酸またはその塩、デンプン、およびtweenなどの担体または添加剤を含む。
【００７１】
例1
100mg錠剤は、配合物5mgを含む。
【００７２】
【表１】
2014533266.tif 000007
【００７３】
錠剤は、活性薬剤を1種もしくは複数の添加物と共に加圧するまたは成形することにより生産することができる。
【００７４】
加圧された錠剤を特別な装置で生産した。50mgの量(10000錠を生産するために要する化合物の量)の粉末または顆粒などの遊離型の活性薬剤を、結合剤(トラガント、200g)と混合し、希釈剤(ラクトース、500g)と共に撹拌し、続いて、崩壊剤(アルギン酸、200g)およびクエン酸(50g)を混合物に加えた。
【００７５】
ゼラチン化カプセルは、着色剤および安定剤をさらに含む。適切な着色剤は、テトラジンおよびインジゴであり、安定剤は、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび安息香酸ナトリウムから選択することができる。特許請求されたゼラチン化カプセルは、1〜20%の活性薬剤を含む。
【００７６】
例2
配合物20mgを含む500mgカプセル。
【００７７】
【表２】
2014533266.tif 000008
【００７８】
活性薬剤200g(10000錠を生産するために要する化合物の量)を微細粉末化し、撹拌機でグリセリン(1000g)および液糖(3190g)と混合する。混合した後、ミント油(400g)、安息香酸ナトリウム(100g)、アスコルビン酸(50g)およびテトラジン(50g)を混合物に加える。ゼラチン化カプセルを液滴法によって生産する。本方法は、流動パラフィンに薬液およびゼラチン化した熱塊(ゼラチン、900g)を同時に液滴注入し(drop-wise dosing)、それによって、活性薬剤20mgを含む既成の医薬混合物を満たしたシームレスな球状ゼラチン化カプセルを形成することを可能にする。
【００７９】
本発明によれば、認知機能および記憶を向上させるための方法は、式(I)のフッ素含有置換5-[2-(ピリド-3-イル)-エチル]-2,3,4-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドールの有効量を含む薬物を、治療効果のために要する期間にわたって少なくとも1日1回1〜150mgの用量で患者に投与するステップを含む。
【００８０】
活性薬剤、すなわち、式(I)の化合物の所定の投与用量は、年齢、性別、体重、投与しようとする特定の化合物、投与モード、活性薬剤の所定の調製形態などの複数の因子に応じて変わる。
【００８１】
提供された例から認識できる通り、特許請求された発明は、神経系中で、中枢神経系および末梢神経系において破壊的プロセスの発生をもたらす制御不能なタンパク質凝集を低下させる薬剤の範囲を広げるという課題に対処している。
【００８２】
【表３Ａ】
2014533266.tif 000009
【００８３】
【表３Ｂ】
2014533266.tif 000010
【００８４】
【表４Ａ】
2014533266.tif 000011
【００８５】
【表４Ｂ】
2014533266.tif 000012
【００８６】
【表４Ｃ】
2014533266.tif 000013
【００８７】
【表４Ｄ】
2014533266.tif 000014
【００８８】
【表４Ｅ】
2014533266.tif 000015
【００８９】
【表４Ｆ】
2014533266.tif 000016
【００９０】
【表４Ｇ】
2014533266.tif 000017
【図１】
2014533266.tif 000020
【図２】
2014533266.tif 000021
【図３】
2014533266.tif 000022
【図４】
2014533266.tif 000023
【図５】
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【図６】
2014533266.tif 000025
【図７】
2014533266.tif 000026
【図８】
2014533266.tif 000027
【図９】
2014533266.tif 000028
【図１０】
2014533266.tif 000029
【図１１】
2014533266.tif 000030
【図１２】
2014533266.tif 000031
【国際調査報告】
2014533266.tif 000032
2014533266.tif 000033
2014533266.tif 000034
2014533266.tif 000035