(57)【要約】  本発明は、ネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチドに結合する単離された抗体、および組織試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣＡ１ポリペプチドに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、ネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチドに結合する、前記抗体。
【請求項２】
前記ＡＢＣＡ１ポリペプチドがヒトＡＢＣＡ１ポリペプチドである、請求項１の単離された抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１または２の単離された抗体。
【請求項４】
前記抗体は、適切な動物を、ＡＢＣＡ１ポリペプチド、好ましくはヒトＡＢＣＡ１ポリペプチドを発現している全細胞を用いて免疫化することによって産生される、請求項１〜３の単離された抗体。
【請求項５】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインのＣＤＲ３、並びに、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＬドメインのＣＤＲ３を含む、請求項１〜４の単離された抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインから得ることのできる抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１からＣＤＲ３、並びに、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞から得ることのできる抗体のＶＬドメインのＣＤＲ１からＣＤＲ３を含む、請求項１〜５の単離された抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、請求項１〜６の単離された抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、請求項１〜７の単離された抗体。
【請求項９】
ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインをコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１１】
ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１２】
ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株によって産生された抗体をコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１０〜１２の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１６の宿主細胞を培養して、よって抗体を産生することを含む、抗体の産生法。
【請求項１６】
動物の組織試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出のための請求項１〜８の抗体の使用。
【請求項１７】
前記組織試料が全血である、請求項１６の使用。
【請求項１８】
前記動物がヒト被験者である、請求項１６または１７の使用。
【請求項１９】
ｃ）動物の組織試料を準備する工程、
ｄ）請求項１〜８の抗体を使用して工程ａ）の試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドを検出する工程を含む、
動物の組織試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出のための方法。
【請求項２０】
前記組織試料が全血である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記動物がヒト被験者である、請求項１９または２０の方法。
【請求項２２】
工程ｂ）におけるＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出がフローサイトメトリーによって行なわれる、請求項１９〜２１の方法。
【請求項２３】
特に前記の実施例を参照して、本明細書で前記されたような本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＡ１ポリペプチドに結合する抗体、およびＡＢＣＡ１ポリペプチドを検出するための方法におけるその使用に関する。
【０００２】
ＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）は、細胞外にある脂質の乏しいＨＤＬ粒子にコレステロールおよびリン脂質の搬出を媒介するＡＴＰ依存性輸送体である。ヒトＡＢＣＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１に示される。ＡＢＣＡ１は、リン脂質およびアポリポタンパク質による新生ＨＤＬ粒子の構築に必須である。ＡＢＣＡ１は、細胞からアポリポタンパク質への脂質の搬出の非常に重要なレギュレーターとして機能し、従って、アテローム動脈硬化症のリスクを低減することに関与する。ＡＢＣＡ１は、血漿中ＨＤＬレベルに影響を及ぼす点で非常に重要である。肝臓および小腸で活性であり、大半の循環中ＨＤＬを生成する。ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の異常は、家族性低アルファリポタンパク血症（ＦＨＡ）の遺伝的原因の１つであることが示された。
【０００３】
市販の抗ＡＢＣＡ１抗体は、組織試料中のネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出には適していない。
【０００４】
それ故、組織試料中のネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチドを検出することのできる抗ＡＢＣＡ１抗体が必要である。
【０００５】
第１の局面において、本発明は、ネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。
【０００６】
特定の態様において、ＡＢＣＡ１ポリペプチドはヒトＡＢＣＡ１ポリペプチドである。
【０００７】
さらなる特定の態様において、抗ＡＢＣＡ１抗体はモノクローナル抗体である。
【０００８】
さらに特定の態様において、前記抗体は、適切な動物を、ＡＢＣＡ１ポリペプチド、好ましくはヒトＡＢＣＡ１ポリペプチドを発現している全細胞を用いて免疫化することによって産生される。
【０００９】
さらに特定の態様において、前記抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインのＣＤＲ３、並びに、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞から得ることのできる抗体のＶＬドメインのＣＤＲ３を含む。
【００１０】
別の特定の態様において、前記抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインから得ることのできる抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１からＣＤＲ３、並びに、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞から得ることのできる抗体のＶＬドメインのＣＤＲ１からＣＤＲ３を含む。
【００１１】
さらに特定の態様において、前記抗体は、ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。
【００１２】
さらに特定の態様において、前記抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株によって産生される。
【００１３】
別の局面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株に関する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＨドメインをコードする配列を含む単離された核酸に関する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株から得ることのできる抗体のＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／８４（ＤＳＭ ＡＣＣ３１０９）、ハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−３／１２５（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１０）およびハイブリドーマ細胞株ＡＢＣＡ１−４／１８（ＤＳＭ ＡＣＣ３１１１）からなる群より選択されたハイブリドーマ細胞株によって産生された抗体をコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本発明の核酸を含むベクター、および本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本発明の宿主細胞を培養して、よって抗体を産生することを含む、抗体の産生法を提供する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、動物の組織試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出のための本発明の抗体の使用を提供する。
【００２０】
本発明の使用の特定の態様において、前記組織試料は全血である。
【００２１】
本発明の使用の特定の態様において、前記動物はヒト被験者である。
【００２２】
別の局面において、本発明は、
ａ）動物の組織試料を準備する工程、
ｂ）本発明の抗体を使用して工程ａ）の試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドを検出する工程を含む、
動物の組織試料中のＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出のための方法を提供する。
【００２３】
特定の態様において、前記組織試料は全血である。
【００２４】
特定の態様において、前記動物はヒト被験者である。
【００２５】
特定の態様において、工程ｂ）におけるＡＢＣＡ１ポリペプチドの検出はフローサイトメトリーによって行なわれる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、「染色指数」という用語の可視化である。青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。
【図２ａ】ＦＡＣＳアッセイにおいて市販の抗ＡＢＣＡ１抗体Novus DyLight 488を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１．５４である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体希釈率：１：２００。
【図２ｂ】ＦＡＣＳアッセイにおいて市販の抗ＡＢＣＡ１抗体ａｂ８１９５０ビオチンを使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１．２４である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体希釈率：１：２００。
【図２ｃ】ＦＡＣＳアッセイにおいて市販の抗ＡＢＣＡ１抗体Novusビオチンを使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１．２８である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体希釈率：１：２００。
【図２ｄ】ＦＡＣＳアッセイにおいて市販の抗ＡＢＣＡ１抗体ａｂ１８１８０を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１．４１である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体希釈率：１：２００。
【図２ｅ】ＦＡＣＳアッセイにおいて市販の抗ＡＢＣＡ１抗体ａｂ６６２１７を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１．８４である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体希釈率：１：２００。
【図３ａ】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／８４を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は８．９である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体濃度：０．１μg/ml。
【図３ｂ】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／８４を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１０．４である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体濃度：１μg/ml。
【図３ｃ】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／８４を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は１０．５である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体濃度：１０μg/ml。
【図４ａ】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／１２５を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は４９．７である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体濃度：０．１μg/ml。
【図４ｂ】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／１２５を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は４７．０である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体濃度：１μg/ml。
【図４ｃ】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／１２５を使用しての、ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株（ＦＬＰ２９３／ＡＢＣＡ１細胞株）におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出；染色指数は４６．９である（蛍光ＦＬＰ２９３ＡＢＣＡ１細胞株／蛍光ＦＬＰ２９３親細胞株）；青色：ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株；白色：親細胞株２９３。抗体濃度：１０μg/ml。
【図５】２つの異なるＬＸＲアゴニストおよびＬＰＳを用いての、ＣＤ１４＋単球上でのＡＢＣＡ１のアップレギュレーション。全血をＬＸＲアゴニストまたはＬＰＳと共に２４時間かけてインキュベーションした。ＡＢＣＡ１の検出は、抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／１２５を使用してＦＡＣＳによって実施された。
【図６】生成された抗ＡＢＣＡ１モノクローナル抗体ＡＢＣＡ１−３／８４、ＡＢＣＡ１−３／１２５およびＡＢＣＡ１−４／１８のウェスタンブロット分析。以下の細胞溶解液をウェスタンブロットに使用して、生成された抗ＡＢＣＡ１モノクローナル抗体の特異性を試験した：レーン１：刺激されたＴＨＰ１細胞溶解液；レーン２：刺激されていないＴＨＰ１細胞溶解液；レーン３：ＦＬＰ２９３−ｈｕ−ＡＢＣＡ１（ＡＢＣＡ１を発現しているＦＬＰ２９３細胞株）；レーン４：ＦＬＰ２９３（ネガティブコントロール）レーン５：ＭＷＭ（分子量マーカー）；レーン６：ＨＥＫ−２９３−ｈｕ−ＡＢＣＡ１（ＤＢ２７２−ｉｎ ｐＡＮＩＴＡ２）−６Ｈｉｓ（Ｈｉｓタグと共にヒトＡＢＣＡ１タンパク質を発現しているＨＥＫ細胞株）。
【図７】ＡＢＣＡ１タンパク質のウェスタンブロット分析。クローン４は、全長タンパク質（約２４０ｋＤＡ）の検出によって示される大量のＡＢＣＡ１およびいくつかのより小さな種を発現する。比較すると、トランスフェクションされていないＦＬＰ細胞株にはＡＢＣＡ１タンパク質は全く検出されなかった。
【図８】ＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲによる分析。ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのＣｐ値は、ＡＢＣＡ１を過剰に発現するクローン４と親株とでは一定に維持されていた（１８．００±０．２４ｖｓ１８．５６±０．２０）。対照的に、Ｃｐ値は、トランスフェクションされていない株では極めて低いＡＢＣＡ１ｍＲＮＡの発現を示したが（３６．００±０．７３）、クローン４−ＡＢＣＡ１株では高いレベルを示した（２１．６４±０．４８）。差異を計算するためにｄｄＣｐ法を使用することは、クローン４が、親ＦＬＰ細胞株と比較して２１，０００倍のＡＢＣＡ１転写物を発現することを示す。
【図９】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−４／１８を使用しての、ＴＨＰ−１細胞におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出。ＴＨＰ−１細胞をＬＸＲアゴニストを用いて一晩かけて処理して、ＡＢＣＡ１の発現を誘導するか、またはＤＭＳＯコントロールを用いてコントロール処理した。細胞を、１μg/mlのＡＢＣＡ１特異的抗体（クローン４／１８）またはアイソタイプコントロールを用いて染色し、その後、マウスＩｇＧ１に対するＰＥにコンジュゲートさせた二次抗体を用いて染色した。抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−４／１８は、アイソタイプコントロールと基礎ＡＢＣＡ１シグナルとを良好に分離する。
【図１０】ＦＡＣＳアッセイにおいて本発明の抗ＡＢＣＡ１抗体ＡＢＣＡ１−３／１２５を使用しての、ＴＨＰ−１細胞におけるＡＢＣＡ１の表面発現の検出。ＴＨＰ−１細胞をＬＸＲアゴニストを用いて一晩かけて処理して、ＡＢＣＡ１の発現を誘導するか、またはＤＭＳＯコントロールを用いてコントロール処理した。細胞を、１μg/mlのＡＢＣＡ１特異的抗体（クローン３／１２５）またはアイソタイプコントロールを用いて染色し、その後、マウスＩｇＧ１に対するＰＥにコンジュゲートさせた二次抗体を用いて染色した。
【図１１】マウス抗ＡＢＣＡ１ｍＡｂクローン３／８４を使用したウェスタンブロットによって示されるＡＢＣＡ１タンパク質のヒト組織における分布。
【図１２】マウス抗ＡＢＣＡ１ｍＡｂクローン３／８４を用いてのヒト肝臓におけるＡＢＣＡ１の免疫組織化学的染色。緑色：肝細胞の細胞膜に局在したＡＢＣＡ１タンパク質、および青色：ＤＡＰＩにより染色された核。
【００２７】
本発明の態様の詳細な説明
本明細書において使用する「染色指数」という用語は以下のように定義される：
染色指数：ＡＢＣＡ１を発現している細胞株の蛍光強度の中央値
ＡＢＣＡ１陰性の親細胞株の蛍光強度の中央値
【００２８】
「抗体」という用語は、完全抗体および抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない、種々の形態の抗体構造を包含する。本発明による抗体は、本発明による特徴的な特性が保持されている限りにおいて、ヒト化抗体、キメラ抗体またはさらに遺伝子工学された抗体であり得る。
【００２９】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例としては、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。さらに、抗体フラグメントは、ＡＢＣＡ１に結合する（すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位に会合することができる）ＶＨドメインまたはＡＢＣＡ１に結合する（すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位に結合することができる）ＶＬドメインの特徴を有し、これにより特性が付与された、一本鎖ポリペプチドを含む。
【００３０】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００３１】
「キメラ抗体」という用語は、通常組換えＤＮＡ技術によって調製される、１つの起源または種からの可変領域（すなわち結合領域）と、異なる起源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体を指す。マウス可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される他の好ましい形態の「キメラ抗体」は、定常領域が、元来の抗体のそれとは、特にＣ１ｑへの結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合に関して改変または変化されて、本発明による特性を生じているものである。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野において周知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号および第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【００３２】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンと比較して特異性の異なる免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体を指す。好ましい態様において、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植されて、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327：およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上記した抗原を認識する配列を示すものに相当する。本発明によって包含される他の形態の「ヒト化抗体」は、定常領域が、元来の抗体のそれとは、特にＣ１ｑへの結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合に関して改変または変化されて、本発明による特性を生じているものである。
【００３３】
本明細書において使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は当技術分野の最新技術において周知である（van Dijk, M.A.およびvan de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、免疫化により、内因性免疫グロブリンの非産生下で、完全なレパートリーのまたは選抜されたヒト抗体を産生することのできる、トランスジェニック動物（例えばマウス）において産生され得る。このような生殖系列の突然変異マウスへのヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原によるチャレンジ時にヒト抗体が産生される（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生され得る（Hoogenboom, H.R.およびWinter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388；Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。Cole et al.およびBoerner et al.の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体についてすでに記載したように、本明細書において使用する「ヒト抗体」という用語はまた、定常領域において、特にＣ１ｑへの結合および／またはＦｃＲへの結合に関して、例えば「クラススイッチ」、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４へおよび／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって改変されて、本発明による特性を生じる、このような抗体を含む。
【００３４】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することのできる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、そして特定の態様において、特異的な３次元構造特徴およびまたは特異的な荷電特徴を有し得る。エピトープは、抗体の結合する抗原の領域である。
【００３５】
本明細書において使用する「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原と抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの各対を示す。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、同じ一般的な構造を有し、そして各ドメインは、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、これらは３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続されている。フレームワーク領域はβシートコンフォメーションをとり、そしてＣＤＲは、βシート構造を接続しているループを形成し得る。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によってその３次元構造が保たれ、そして他の鎖のＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００３６】
本明細書において使用する場合の「抗体の抗原結合部位」という用語は、抗原との結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義したような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原との結合に最も寄与する領域であり、そして抗体の特性を規定する。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域、並びに／または「超可変ループ」に由来する残基は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
【００３７】
「ＡＢＣＡ１ポリペプチド」という用語は、本明細書において、任意の動物、例えば哺乳動物種（ヒトを含む）に由来するネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチド、およびＡＢＣＡ１変異体を指す。ＡＢＣＡ１ポリペプチドは、ヒト組織型を含む種々の起源から単離され得るか、あるいは組換え法および／または合成法によって調製され得る。ヒトＡＢＣＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に示される。
【００３８】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、９５％または９９％超の純度まで精製され、これは例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される。抗体純度の評価のための方法の論評については、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
【００３９】
「単離された」核酸は、その天然の環境の成分から単離された核酸分子を指す。単離された核酸としては、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子が挙げられるが、核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置にも存在する。
【００４０】
「抗ＡＢＣＡ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖および軽鎖をコードする１つ以上の核酸分子（またはそのフラグメント）（単一のベクターまたは別々のベクター中のこのような核酸分子（群）および宿主細胞中の１つ以上の位置に存在するこのような核酸分子（群）を含む）を指す。
【００４１】
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増幅させることのできる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、並びに、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。このようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と称する。
【００４２】
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載のように、組換え法および組成物を使用して産生され得る。１つの態様において、本明細書に記載された抗ＡＢＣＡ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる態様において、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのこのような態様において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、あるいは（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えばそれを用いて形質転換されている）。１つの態様において、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。１つの態様において、抗ＡＢＣＡ１抗体を作製する方法が提供され、前記方法は、上で提供されたような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養し、そして場合により宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【００４３】
本発明の抗体の組換え産生のために、例えば前記したような抗体をコードする核酸が単離され、そしてさらなるクローニングおよび／または宿主細胞における発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、慣用的な手順を使用して（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離およびシークエンスされ得る。
【００４４】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞としては、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、細菌において産生されてもよい。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号および第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、E.coliにおける抗体フラグメントの発現を記載している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、そしてさらに精製され得る。
【００４５】
モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングするための方法は、当業者には公知である。例えば、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の遺伝子情報は、免疫グロブリン特異的プライマーと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してハイブリドーマ細胞から増幅させることができる（Methods Mol Med. 2004;94:447-58）。その後、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）をコードする核酸を、宿主細胞における発現のために適切なベクターにクローニングすることができる。
【００４６】
生物学的試料中のポリペプチドの検出および／または測定のための方法は、当技術分野において周知であり、そしてこれにはウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ、または種々のプロテオミクス技術が挙げられるがそれらに限定されない。例えば、変性タンパク質に結合することのできる抗体、例えばポリクローナル抗体を使用して、ウェスタンブロットにおいてＡＢＣＡ１ポリペプチドを検出することができる。ポリペプチドを測定するための方法の一例はＥＬＩＳＡである。この種類のタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉することのできる抗体、および捕捉された抗原を検出することのできる二次抗体に基づく。
【００４７】
ネイティブなＡＢＣＡ１ポリペプチドの好ましい検出法は、フローサイトメトリーである。フローサイトメトリー法は、Handbook of Flow Cytometry Method, J. Paul Robinson (Editor);  Flow Cytometry - A Basic Introduction,  Michael G Ormerod (2008) and Current Protocols in Cytometry (2010), Wileyに記載されている。
【００４８】
実施例および方法
本発明のモノクローナル抗ヒトＡＢＣＡ１抗体
ヒトＡＢＣＡ１に対するモノクローナル抗体を産生する以下の３つのマウスハイブリドーマ細胞株は、ＤＳＭＺ−（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に２０１１年１月２０日にF. Hoffmann-La Roche Ltd.の名称で寄託され、そして以下に列挙された寄託番号を受け取った：
ABCA1-3/84＝DSM ACC3109
ABCA1-3/125＝DSM ACC3110
ABCA1-4/18＝DSM ACC3111
【００４９】
モノクローナル抗ヒトＡＢＣＡ１抗体の生成
哺乳動物細胞の細胞表面上におけるＡＢＣＡ１タンパク質の発現
ヒトＡＢＣＡ１細胞外ドメインを、発現プラスミドｐＡＮＩＴＡ２を使用してＨＥＫ細胞の細胞表面上に発現させた。ヒトＡＢＣＡ１の細胞外ドメインを発現しているＨＥＫ由来細胞株を安定なトランスフェクションによって確立した。
【００５０】
高発現している細胞株を得るために、トランスフェクション体を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて表面染色した後、蛍光活性化細胞選別によって高発現している細胞プールへと分類した。高発現している細胞プールへと選別するためにゲート化された細胞の蛍光強度平均は、全てのトランスフェクション体の２．１〜４．３倍高かった。
【００５１】
ヒトＡＢＣＡ１を発現している細胞株を、ウェスタンブロット分析によって発現について試験し、これにより予期された分子量を有する高レベルのタンパク質の発現が示された。
【００５２】
トランスフェクションされたＨＥＫ細胞を用いて免疫化されたマウスにおけるＡＢＣＡ１特異的抗体の発達
本発明者らのアプローチは、その細胞表面上に組換え抗原を発現している安定にトランスフェクションされた哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３）を利用する。トランスフェクションされた細胞はまた、血清転換の測定、ハイブリドーマの選択および抗体の特徴付けのために使用される。免疫化およびハイブリドーマ選択のためにそのネイティブなコンフォメーションで抗原を提示することによって、この手順は、内因性タンパク質と結合することのできる抗体の生成を促進する。
【００５３】
免疫原は、組換えタンパク質を免疫精製することによって得られ、これにより免疫複合体が得られ、そしてこれらの免疫複合体を免疫化抗原として使用する。免疫精製は、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット分析によって確認された。
【００５４】
免疫複合体を用いて免疫化されたマウスの脾臓細胞を、ＰＡＩ骨髄腫細胞と融合して、Ｂ細胞ハイブリドーマを生成した。融合細胞をマイクロタイター培養プレートのウェルに分配した。ＡＢＣＡ１特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために、精製組換えタンパク質の必要性が全くない、２工程のスクリーニング手順を使用した。まず全ての培養ウェルをＥＬＩＳＡによってＩｇＧの産生について試験した。第２工程でＩｇＧ産生について陽性である全てのウェルを、ＩＦＡによって、トランスフェクションされた細胞への抗体の結合についてスクリーニングした。マルチウェルスライドガラス上にスポットされたトランスフェクションされたおよびトランスフェクションされていないＨＥＫ細胞を、個々のハイブリドーマ上清を用いて染色し、そして蛍光顕微鏡によって分析した。トランスフェクションされていないＨＥＫ細胞は、各試料のためのネガティブコントロールとして使用した。
【００５５】
生成されたモノクローナル抗体ＡＢＣＡ１−３／８４、ＡＢＣＡ１−３／１２５およびＡＢＣＡ１−４／１８の特異性をウェスタンブロットによって確認した（図６）。ＴＨＰ１＝ヒト単球細胞株。
【００５６】
細胞培養
ヒト胚腎細胞（Ｆｌｉｐ−Ｉｎ２９３細胞、Invitrogen）を、１０％ウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミンおよび抗生物質の補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。細胞を、製造業者によって記載されたようなＦｕｇｅｎｅ−６（Roche Biochemicals）を使用してトランスフェクションした。
【００５７】
ヒト末梢血単球（ＴＨＰ−１、ＡＴＣＣ＿Ｆ−６４３０）を、０．０５mMの２−メルカプトエタノール（Invitrogen）および１０％の熱失活ＦＢＳ（Invitrogen）の補充されたＲＰＭＩ−１６４０Glutamax (Invitrogen)中で培養した。細胞濃度は１×１０６個の細胞/mlを超えなかった。最大継代数は３０であった。
【００５８】
プラスミド：完全長ヒトＡＢＣＡ１をコードする６．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＸｈｏＩで消化しクレノウで埋めたプラスミドＰＮ７２１へとサブクローニングした。配列を確認した後、６．５ｋｂのフラグメントを回収し、そしてプラスミドｐＣＤＮＡ５−ＦＲＴ（Invitrogen）へとさらにサブクローニングした。
【００５９】
ＡＢＣＡ１安定細胞株の生成
ヒトＡＢＣＡ１を発現しているモノクローナル安定細胞株は、製造業者の推奨に従って、ゼオシンの非存在下で、増殖培地中でＦｕｇｅｎｅ−６（Roche Biochemicals）を使用して、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＡＢＣＡ１およびｐＯＧ４４プラスミドを一緒に（Invitrogen）共トランスフェクションすることによって得られた。トランスフェクションの次の日、ハイグロマイシンＢを５０μg/mlの最終濃度となるまで加え、そしてハイグロマイシンＢ耐性コロニーが出現するまで、培地を３〜４日間毎に交換した。個々のコロニーを選択し、そしてハイグロマイシンＢの存在下でさらに増殖させた。個々のクローンを定量ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析によってＡＢＣＡ１の発現について評価した。これらの結果に基づき、クローン４を、高度にＡＢＣＡ１を発現する細胞株ベースとして選択した。
【００６０】
ＡＢＣＡ１タンパク質発現のウェスタンブロットによる分析：ＦＬＰ細胞またはクローン４細胞を、１２ウェルプレートにおいて１０６個の細胞/ウェルで４８時間かけて培養した。細胞をレムリ緩衝液／ベンゾナーゼ中で溶解し、そして変性した試料を３〜８％酢酸トリスゲルにアプライし、そして１次元ゲル電気泳動によって分離した。分離したタンパク質を、膜へのエレクトロブロットによって転写した。ＡＢＣＡ１が、マウスモノクローナル抗体ＡＢＣＡ１（Neuromics）と、続いて、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Abcam20043番）とのインキュベーションによって検出された（図７）。
【００６１】
ヒト組織のウェスタンブロットによる分析：Biochain Institute, Inc., Hayward, CA 94545, USAのヒト組織溶解液を使用した。ブロットを、前の段落で記載したのと同じように行なった。ＡＢＣＡ１が、マウス抗ＡＢＣＡ１ｍＡｂ（クローン３／８４）、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰとのインキュベーションによって検出された（図１１）。
【００６２】
ＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ発現の定量ＰＣＲによる分析：ＦＬＰ細胞またはクローン４細胞を、９６ウェルプレートにおいて５×１０５個の細胞/ウェルで３７℃で４８時間かけて培養した。全ＲＮＡが、製造業者の指示に従って（Qiagen）自動システムを使用して単離された。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを、one-step reagent mix (Qiagen)およびプローブ／プライマーセット（Applied Biosystems）を使用してLightcycler 480機器(Roche)で実施し、ＡＢＣＡ１およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡの相対的発現を検出した。データは、Ｃｔの平均値（Ｎ＝８ウェル／条件）＋/−ＳＤとして表現される（図８）。
【００６３】
抗体および第２工程の試薬
ＡＢＣＡ１に対する特異性を試験した市販の一次モノクローナル抗体は、Abcam（登録商標）およびNovus（登録商標）（クローンＨＪ１およびクローンＡＢ.Ｈ１０）製であった。試験したウサギポリクローナル抗体はAbcam（登録商標）（ａｂ８１９５０）製であった。第２ステップの試薬であるストレプトアビジンＰＥおよびヤギ−α−マウスＩｇＧ ＰＥはSouthern Biotechnology（登録商標）製であった。
【００６４】
市販の抗体に加えて、社内で生成した３つのマウス抗ＡＢＣＡ１ハイブリドーマ上清を、フローサイトメトリーでＡＢＣＡ１を検出するその能力について評価した。検出は、第２試薬（Southern Biotechnology（登録商標）製のストレプトアビジンＰＥ、ヤギ抗マウスＩｇＧ ｐＥおよびＩｇＧ１ＰＥ）をアプライすることによって行なわれた。２つのクローン（クローンＡＢＣＡ１−３／８４およびＡＢＣＡ１−３／１２５）のハイブリドーマ上清を精製し、再試験し、そして滴定した。後の時点において、クローンＡＢＣＡ１−３／１８に由来する抗体を試験し、そしてＴＨＰ−１細胞を使用してＡＢＣＡ１−３／１２５と比較した。以下の抗体を、特異的ヒト血液サブセットの同定のために使用した：ＣＤ３パシフィックブルー、クローンＵＣＨＴ１、ＣＤ１４ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、クローンＭ５Ｅ２、ＣＤ１５ ＡＰＣ、クローンＨＩ９８、ＣＤ１６ ＡＰＣ−Ｃｙ７、クローン３Ｇ８、ＣＤ１９ ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＳＪ２５ＣＩおよびＣＤ６６ｂ ＦＩＴＣ、クローンＧ１０Ｆ５。全てのＣＤマーカー特異的抗体は、Becton Dickinson（登録商標）から入手した。
【００６５】
ＦＬＰ２９３細胞、ＦＬＰ２９３由来細胞およびＴＨＰ−１細胞のＦＡＣＳによる分析
ＦＡＣＳ分析のために、ＦＬＰ２９３細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤ−ＰＢＳ（Gibco（登録商標））で濯ぎ、そして０．０２％ＥＤＴＡ（Sigma（登録商標））と共にインキュベーションした。収集後、それらを２回、冷Ｄ−ＰＢＳを用いて洗浄し、その後、抗体染色へと進んだ。簡潔に言えば、０．８〜１×１０６個の細胞／試料を、１：２００に希釈された一次抗体を含む１００μlのＢＤ社の染色用緩衝液／２％ＦＣＳ（Becton Dickinson（登録商標））中に再懸濁した。インキュベーション時間は、暗闇中で＋４℃で４５分間であった。細胞を１回、ＢＤ社の冷染色用緩衝液／２％ＦＣＳを用いて洗浄し、そしてＢＤ社の染色用緩衝液／２％ＦＣＳ中で希釈された１００μｌの第２工程の試薬を加えた。＋４℃で暗闇中で４５分間インキュベーションし、ＢＤ社の冷染色用緩衝液／２％ＦＣＳを用いて２回洗浄した後、細胞を分析した。付着していないＴＨＰ−１細胞を、ＦＬＰ２９３細胞について前記したようと同じように処理したが、ＥＤＴＡを含む緩衝液中でのインキュベーションは省いた。
【００６６】
細胞を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Becton Dickinson（登録商標））で分析した。評価をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star（登録商標））で実施した。
【００６７】
ＡＢＣＡ１の全血におけるアッセイおよびＦＡＣＳにおける染色
全血のＦＡＣＳ分析のために、社内で生成した抗ＡＢＣＡ１クローン３／１２５を全ての場合において使用した。Ｎａ−ヘパリン全血を、指定されたアゴニストと共に３７℃で２４時間かけてインキュベーションした。インキュベーション後、一次抗ＡＢＣＡ１特異的抗体を、暗闇中で氷上で３０分間かけて１：８００の最終希釈率で１００μlの全血に加えた。
【００６８】
赤血球を、１×赤血球溶解緩衝液（Becton Dickinson（登録商標））を用いて溶解し、そして洗浄した。続いて、１：２５０に希釈した１００μlの二次ヤギ−α−マウスＩｇＧ１ ＰＥ（Southern Biotechnology（登録商標））を加え、そして＋４℃で２０分間かけてインキュベーションし、続いて２回の洗浄工程を実施した。
【００６９】
細胞サブセット特異的抗体を、＋４℃で暗闇中で２０分間かけて加え、続いて洗浄工程を実施して、その後、分析した。
【００７０】
細胞を、FACS Canto II (Becton Dickinson（登録商標））で分析した。評価は、ＦｌｏｗＪソフトウェア（Tree Star（登録商標））で実施した。
【００７１】
免疫組織化学的染色
ヒト肝臓ＦＦＰＥ切片（５mm、Biochain）を脱水し、クエン酸緩衝液（Thermo Scientific）と共にマイクロウェーブ処理し、そしてマウス抗ＡＢＣＡ１ ｍＡｂ（クローン３／８４、１mg/ml）と共に１時間かけてインキュベーションし、続いて二次抗体による検出（１mg/mlで１時間かけて、Alexa Fluor（登録商標）４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Invitrogen, Basel, Switzerland）およびＤＡＰＩによる染色を実施した。
【００７２】
前記の本発明は、理解し易くするために説明および実施例により幾分詳細に記載されているが、本文および実施例は本発明の範囲を制限するものと捉えるべきではない。本明細書において引用されている全ての特許文献および科学文献の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。
【図１２】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014519337.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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