(57)【要約】癌を処置する方法が記載され、その方法は、必要とする被験者に有効な量のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を投与するステップを有する。ＤＲ遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンのようなフェノチアジン誘導体であってよい。選択肢として癌は急性骨髄性白血病である。また、癌被験者を識別する方法、癌被験者の予後を提供する方法、およびＤＲ遮断薬による治療に応答性のありそうな被験者を識別する方法が記載される。癌幹細胞および、ＤＲ遮断薬である化学療法剤を識別する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置する方法であって、前記被験者にドーパミン受容体遮断薬を投与するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ドーパミン受容体遮断薬がＤ２ファミリードーパミン受容体の遮断薬である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ドーパミン受容体遮断薬がフェノチアジン誘導体または表１に記載される化合物である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フェノチアジン誘導体がチオリダジンである、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記急性骨髄性白血病はＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）を発現する細胞を有する、ことを特徴とする請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）を発現する細胞は、ＣＤ１４も発現する、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ドーパミン受容体遮断薬が、造血性または正常な幹細胞に比較して優先的に、癌幹細胞の分化を誘発する、ことを特徴とする請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者は寛解にある、ことを特徴とする請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
癌細胞の増殖を減少させる方法であって、前記癌細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させるステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記癌細胞は癌幹細胞であり、そして前記癌幹細胞に前記ドーパミン受容体遮断薬を接触させるステップは前記癌幹細胞の分化を誘発する、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にある、ことを特徴とする請求項９−１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ドーパミン受容体遮断薬がＤ２ファミリードーパミン受容体の遮断薬である、ことを特徴とする請求項９−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ドーパミン受容体遮断薬がフェノチアジン誘導体または表１に記載される化合物である、ことを特徴とする請求項９−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記フェノチアジン誘導体がチオリダジンである、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ドーパミン受容体遮断薬での処置に適した癌被験者を識別する方法であって、
前記方法は、前記被験者からの癌細胞試料内で１種類以上のドーパミン受容体の発現を測定するステップを有し、それにより１種類以上のドーパミン受容体を発現する癌細胞を有する被験者が、ドーパミン受容体遮断薬での処置に適していると識別される、
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記試料内で１種類以上のドーパミン受容体の発現を測定する前記ステップは、１種類以上のドーパミン受容体をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルについて前記試料を試験するステップを有する、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１種類以上のドーパミン受容体はＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される、ことを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種類以上のドーパミン受容体はＤ２ファミリードーパミン受容体を含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌は白血病または乳癌である、ことを特徴とする請求項１６−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または単球性白血病である、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌被験者の予後を判定する方法であって、
前記被験者からの試料において、ドーパミン受容体（ＤＲ）１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーの出現レベルを測定するステップと、そして
前記１種類以上のバイオマーカーの前記出現レベルを対照と比較するステップと、
を有し、
ここにおいて前記１種類以上のバイオマーカーの出現レベルが前記対照と比較して増大していることは、前記被験者が前記対照と比較してより重篤な癌の形態を有することを示唆する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記試料内で１種類以上のバイオマーカーの発現を測定する前記ステップは、１種類以上のドーパミン受容体をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルについて前記試料を試験するステップを有する、ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカーがＤＲ３および／またはＤＲ５である、ことを特徴とする請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は白血病であり、そして前記１種類以上のバイオマーカーの出現レベルが前記対照と比較して増大していることは、前記対照と比較してより重篤な白血病の形態を示唆する、ことを特徴とする請求項２２−２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または単球性白血病である、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
白血病被験者を識別する方法であって、
前記被験者からの白血球細胞の試料において、ドーパミン受容体（ＤＲ）１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーの出現レベルを測定するステップと、そして
前記１種類以上のバイオマーカーの出現レベルを対照と比較するステップと、
を有する、ことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記１種類以上のドーパミン受容体の出現レベルが前記対照と比較して増大していることは、前記被験者が白血病であることを示唆する、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または単球性白血病である、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗癌活性について化合物をスクリーニングする方法であって、
１種類以上のドーパミン受容体を遮断する化合物を識別するステップを有し、
ここにおいてドーパミン受容体を遮断する化合物は抗癌活性を有するとして識別される、ことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記抗癌活性は、乳癌細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞または単球細胞の増殖の減少を含む、ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
癌幹細胞を細胞集団から識別する方法であって、
細胞がドーパミン受容体（ＤＲ）１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを出現するか否かを判定するステップを有し、
ここにおいて前記１種類以上のバイオマーカーの出現は前記細胞が癌幹細胞であることを示唆する、
ことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記細胞集団は哺乳類から単離された細胞か、または組織培養内の細胞である、ことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞集団は多能性幹細胞を有する、ことを特徴とする請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞集団は白血病細胞または乳癌細胞のような癌細胞または前癌細胞を有する、ことを特徴とする請求項３２−３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞集団は血液系癌細胞を有する、ことを特徴とする請求項３２−３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
細胞が１種類以上のバイオマーカーを出現するか否かを判定するステップは、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４またはＤＲ５をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現について前記細胞を試験するステップを有する、ことを特徴とする請求項３２−３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５を発現する細胞は、癌幹細胞と識別される、ことを特徴とする請求項３２−３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌幹細胞を前記細胞集団から単離するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項３２−３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌幹細胞を前記細胞集団から単離するステップは、フローサイトメトリ、蛍光標識細胞分取、パニング、親和性カラム分離、または磁気選別を有する、ことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予後または処置の方法に関し、特にドーパミン受容体を対象とする癌の予後または処置の方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願は２０１１年２月２８出願の米国暫定特許出願６１／４４７，３６２（特許文献１）に対し優先権を主張し、その全ての内容はここに参照され採り入れられる。
【０００３】
多くの証拠が癌／腫瘍の発現が癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれ（Ｄｉｃｋ，２００９；Ｊｏｒｄａｎ，２００９；Ｒｅｙａ他、２００１）独自に疾病を開始し維持することができる稀な細胞集団に起因することを示唆した。さらに実験の結果が、癌細胞系の増殖を抑制し（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６）またはマウスモデルにおいて腫瘍量を減少させる（Ｆｒｅｓｅ及びＴｕｖｅｓｏｎ，２００７）能力を特徴とする従来型の化学療法薬剤がヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対して有効でないことを示した（Ｇｕａｎ他，２００３；Ｌｉ他，２００８）。この化学療法剤に対する抵抗性は、しばしば健康な幹細胞および前駆細胞に影響を与える無差別な細胞毒性と組合わされて、投与量制限につながり、そして保護処置を必要とさせる（Ｓｍｉｔｈ他、２００６）。この方向に沿った最近の事例には、細胞死の選択的誘導（Ｇｕｐｔａ他，２００９；Ｒａｊ他，２０１１）があるが、それはまだ正常幹細胞及びヒトシステムでのテストが残されている。したがって前臨床検査用の真に選択的な抗ガン剤を提供するために、癌幹細胞のみを標的とする薬剤の識別が喫緊の課題である。
【０００４】
正常幹細胞及び腫瘍性幹細胞は自己再生と分化ポテンシャルとの間のしっかりと制御された平衡状態により機能的に定義される。癌幹細胞の場合この平衡状態は増大した自己再生とサバイバルの側にかたより、その結果限定された分化能力をもたらし、それは最終的に腫瘍の成長を可能にする。正常な幹細胞にも等しく影響する直接的毒性効果とは対照的に、癌幹細胞を根絶する他の手段は、癌幹細胞集団を消耗させる努力の中で、この平衡状態を分化の側に変更することによる。したがって、選択的に体細胞性癌幹細胞を標的にし、一方で健常な幹細胞能力を助命する分子を識別することは、革新的な診断及び処置の開発にとって選択的にヒト癌幹細胞を標的にするために有用である。
【０００５】
血液系腫瘍は血液、骨髄およびリンパ節に影響を及ぼす癌のタイプである。血液系腫瘍は２つの主要血液細胞分化系列のいずれかに由来する：骨髄性またはリンパ性細胞系。血液系腫瘍の例は、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む。
【０００６】
血液系腫瘍は全て一般的に骨髄内の骨髄性分化系列の前駆体から発生すると考えられているが、それらは症状、病理および処置において高度に多岐にわたっている。例えば２００８年ＷＨＯ骨髄増殖性腫瘍分類（Ｔｅｆｆｅｒｉ他、Ｃａｎｃｅｒ９月１日号、３８４２−３８４７頁（２００９年）および；Ｖａｎｎｕｃｃｈｉ他  骨髄増殖性腫瘍の理解と管理の進展  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．２００９年；５９：１７１−１９１参照。両文献はここに参照され採り入れられる。）は骨髄性腫瘍の５つの異なる分類スキームを提示し、そして急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び他の骨髄増殖性腫瘍とは異なるカテゴリーに分類している。さらに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はしばしばＢＣＲ−Ａｂｌ転座を含むことが特徴としてあげられるが、これは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）には存在しない。骨髄腫瘍のような白血病の好適な処置は、造血性幹細胞集団に不当に影響を与えることなく白血病細胞を標的とするであろう。
【０００７】
チオリダジンはフェノチアジン薬グループに属するドーパミン受容体遮断薬であり、そして抗精神病薬として使用されている。それは１９５９以来、病院で使用されてきたが、高投与量での心毒性および網膜症にたいする懸念から、この薬は一般的には処方されず、より普遍的に使用される抗精神病薬に対し、応答に失敗した又は禁忌である患者に対しとっておかれている。統合失調症に有効であると見做される量の投与量でドーパミン受容体遮断薬による処置を受けている統合失調症患者は、一般集団に比べて直腸、結腸及び前立腺癌の発現率が低いことが報告されている。
癌の処置と予後のための新規の方法、とくに急性骨髄性白血病の処置と予後のための新規の方法に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国暫定特許出願６１／４４７，３６２
【発明の概要】
【０００９】
驚くべきことに、チオリダジンまたはクロルプロマジンのようなドーパミン受容体遮断薬は、癌細胞特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の癌細胞に対し細胞毒性を有することが特定された。さらに癌細胞に対し毒性を有する濃度のドーパミン受容体遮断薬は、造血性幹細胞のような正常幹細胞に対し比較的限定された影響しか及ぼさないことが判った。またさらに、ドーパミン受容体はＡＭＬ細胞系および原発性ＡＭＬ細胞には発現するが、正常造血性幹細胞が多い細胞系には比較的少ない発現が見られた。さらに、ＡＭＬ細胞内のドーパミン受容体の発現は単芽球マーカーＣＤ１４の発現と相関していることが示された。チオリダジンのようなドーパミン受容体遮断薬はＣＤ１４を発現するＡＭＬ細胞に対し細胞毒性を有する。
【００１０】
したがって、ある側面では、ドーパミン受容体遮断薬を必要とする被験者に投与するステップを有する、被験者の癌または前癌性の疾病を処置する方法が提供される。類似の側面において、本発明の開示は、癌または前癌性の疾病の処置に対しドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を使用する方法を記載する。ある実施形態では、癌または前癌性の疾病は骨髄増殖性疾病または白血病である。ある実施形態では癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は、造血性幹細胞または正常幹細胞と比べて優先的に癌幹細胞の分化を誘発する。
【００１１】
ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は、チオリダジンまたはクロルプロマジンのようなフェノチアジン誘導体である。選択肢として、ドーパミン受容体遮断薬は１種類以上のドーパミン受容体を遮断する多重受容体遮断薬である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はＤ２ファミリーのードーパミン受容体遮断薬である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１に記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００１２】
他の側面では、癌細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させるステップを有する、癌細胞の増殖を減少させる方法が提供される。類似の側面では、癌細胞の増殖を減少させるためにドーパミン受容体遮断薬を使用する方法が提供される。ある実施形態では、細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させることが、癌細胞または前癌性細胞の細胞死または分化を誘発する。ある実施形態では、癌細胞は癌幹細胞であり、癌幹細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させることが癌幹細胞の分化を誘発する。細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でもよい。ある実施形態では、前癌性細胞は骨髄増殖性細胞である。選択肢として、癌細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞または単球性白血病細胞のような白血病細胞である。ある実施形態では、細胞はＣＤ１４ポジティブである。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はチオリダジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１の記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００１３】
他の１つの局面では、ドーパミン受容体遮断薬による処置に適した癌を有する被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、被験者からの癌細胞試料中において１種類以上のドーパミン受容体の発現を測定するステップを含む。ある実施形態では、１種類以上のドーパミン受容体を発現する癌細胞を有する被験者がドーパミン受容体遮断薬による処置に適しているとして識別される。ある実施形態では、癌は白血病であり、癌細胞は白血病細胞である。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。ある実施形態では、癌は乳癌である。ある実施形態では、癌を有する被験者を識別する方法は試料をＣＤ１４の発現について試験するステップを有する。
【００１４】
ある側面では、癌被験者の予後を決定する方法が提供される。それは被験者からの試料において１種類以上のドーパミン受容体バイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、そして１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを対照と比較するステップを有する。選択肢として、ここに提供される方法は、被験者からの癌細胞の試料を提供または獲得するステップを有する。ある実施形態では、対照に比べて増加した１種類以上のバイオマーカーの発現レベルは、癌が対照に比べてより重症な形態である示す。ある実施形態では、ドーパミン受容体バイオマーカーはＤＲ３および／またはＤＲ５である。ある実施形態では、癌は白血病または乳癌であり、そして試料は白血病細胞または乳癌細胞からなる。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。
【００１５】
また白血病の被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、被験者からの試料において１種類以上のドーパミン受容体の発現レベルを測定するステップと、そして１種類以上のドーパミン受容体の発現レベルを対照と比較するステップを有する。選択肢として、試料は白血球細胞からなり、および／または方法は、被験者からの白血球細胞からなる試料を提供するステップをさらに含む。ある実施形態では、対照に比べて増加した１種類以上のドーパミン受容体の発現レベルは被験者が急性骨髄性白血病または単球性白血病などの白血病であることを示す。ある実施形態では、方法はＣＤ１４について試験するステップをさらに含む。
【００１６】
さらに抗ガン活性の化合物をスクリーニングする方法が提供される。それは、ドーパミン受容体遮断薬である化合物を識別するステップを含む。ある実施形態では、抗ガン活性は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞または単球細胞の増殖の減少である。選択肢として、方法は、造血性または正常幹細胞に比べて優先的に癌幹細胞の分化を誘発する化合物を識別するステップを含む。
【００１７】
ある側面では、癌幹細胞を細胞集団から識別する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は細胞がドーパミン受容体（ＤＲ）１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを発現するかを測定するステップを含む。ある実施形態では、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４および／またはＤＲ５の発現はその細胞が癌幹細胞であることを示唆する。
【００１８】
ある実施形態では、細胞集団は哺乳類から単離された細胞、または細胞培養液のような培養内の細胞である。ある実施形態では、細胞の集団は多能性幹細胞である。ある実施形態では、細胞の集団は血液系癌細胞または前癌性細胞のような癌細胞を含む。選択肢として、方法は、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４またはＤＲ５をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現について細胞を試験するステップを含む。ある実施形態では、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５を発現する細胞は癌幹細胞であると識別される。いくつかの実施形態では、ここに記載される方法はまた、癌幹細胞を細胞集団から単離するステップを含む。例えば、癌幹細胞と識別された細胞は、フローサイトメトリ、蛍光標識細胞分取、パニング、親和性コラム分離、または磁気選別などの既存技術を使用して細胞集団または他の材料から単離可能である。ある実施形態では、癌幹細胞は１種類以上のＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５に対する抗体を使用して単離される。
【００１９】
本開示の他の特徴および優位性は以下の詳細説明から明らかになるであろう。しかし詳細説明および特定の事例は、本開示の好適な実施形態を示すが、説明のためにだけ与えられ、開示の精神と範囲内で多くの変更と修飾がこの記述を読んだ当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の１つ以上の実施形態が図に関連して記載される；
【図１】１０μＭのチオリダジンはＨＬ−６０、ＭＶ４−１１およびＯＣＩ３の白血病細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。
【図２】１０μＭのチオリダジンは正常造血幹細胞（ＨＳＣ）のコロニー形成ポテンシャルには限られた影響しか及ぼさないが（図２Ａ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の芽細胞形成ポテンシャルを有意に減少させることを示す図である。
【図３−４】（図３）は、チオリダジンで処置された正常造血幹細胞（ＨＳＣ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から形成されたＣＦＵコロニーの細胞ペレットを示す図である。（図４）は、１０μＭのクロルプロマジンと１０μＭのチオリダジンは共にＨＬ−６０、ＭＶ４−１１およびＯＣＩ３の白血病細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。
【図５】ドーパミン受容体ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５の発現を示す図である。ドーパミン受容体（ＤＲ）発現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系、幾つかの原発性ＡＭＬおよび単核細胞（ＭＮＣ）には見られるが、造血幹細胞（ＨＳＣ）を豊富に含んだ細胞（系統枯渇へその緒臍帯血ＣＢｌｉｎ（−））では見られなかった。
【図６】多重ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。ＳＫＦ＝（Ｒ）−（＋）−ＳＫＦ−３８３９３塩酸塩；７ＯＨ＝Ｒ（＋）−７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩；ＧＲ＝ＧＲ  １０３６９１；ＳＣＨ＝Ｒ（＋）−ＳＣＨ−２３３９０塩酸塩；ＣＬＯＺ＝クロザピン；ＣＨＬ＝クロルプロマジン塩酸塩；ＴＨＩＯ＝チオリダジン。
【図７−８】（図７）は、原発性ＡＭＬにおいてドーパミン受容体がＣＤ１４＋細胞集団の中に発現することを示す蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）データの図である。（図８）は、原発性ＡＭＬにおいてチオリダジンがＣＤ１４＋細胞を選択的に標的とし、そしてその正規化出現度数を減少させることを示す図である。
【図９Ａ−Ｃ】腫瘍性のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を分化する化合物のための化学スクリーニングを使用した、メフロキンとチオリダジンの識別を示す図である。（図９Ａ）はスクリーニング手順の概略を示す。（図９Ｂ）は５９０種類の化合物スクリーンの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヘキスト信号の％残存活性（％ＲＡ）のＸＹ分散プロットである。囲まれた領域は減少したＧＦＰと減少したヘキストで定義される多能性の喪失（ＬＯＰ）を示す。各点はｎ＝３、平均＋／−標準偏差。（図９Ｃ）は５９０種類の化合物の反応の要約を示す。
【図９Ｄ−Ｇ】（図９Ｄ）は候補化合物；チオリダジン、アザチオプリンおよびメフロキンの化学構造式を示す。（図９Ｅ）は候補化合物１０μＭで処置したｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ、ヘキストおよびそれらを合体させた代表的顕微鏡画像である。（図９Ｆ）はこれら画像のＧＦＰ強度のヒストグラムである。（図９Ｇ）はｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰの投与量反応曲線と５０％有効濃度（ＥＣ５０）の計算値である。各点はｎ＝３、平均＋／−標準偏差。
【図１０Ａ−Ｃ】サリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンの正常および腫瘍性集団に対する影響を示す図である。（図１０Ａ−Ｂ）１０−７−１０−６Ｍのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）で処置されたＨ９（図１０Ａ）およびｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（図１０Ｂ）内のＯｃｔ４＋細胞の出現頻度のフローサイトメトリ分析である。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準偏差。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準偏差、（−）ＢＭＰ４処置試料における％Ｏｃｔ４＋レベル。（図１０Ｃ）同一化合物の同一濃度での、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ内のＯｃｔ４＋細胞の正規化出現頻度％に対するＨ９内のＯｃｔ４＋細胞の正規化出現頻度％の比率である。
【図１０Ｄ−Ｈ】（図１０Ｄ、Ｅ）は１０μＭのエトポシド、チオリダジン（ＴＨＩＯ）、ＢＭＰ４で２４時間処置後、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処置（対照、ＣＴＲＬ）において、ｐ５３（図１０Ｄ）およびｐ２１（図１０Ｅ）に対しポジティブに染色する腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のパーセントを示す。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準偏差。エトポシド、チオリダジン処置後の代表的画像が含まれる。矢印はエトポシド処置細胞とチオリダジン処置細胞におけるｐ５３＋とｐ２１＋を示す。（図１０Ｆ）は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のチオリダジン処置後、２倍超増加した分化に伴う遺伝子を示す図である。遺伝子はそれぞれの行に分けられている、内胚葉（ＥＮＤＯ）、中胚葉（ＭＥＳＯ）、胚細胞（ＧＥＲＭ）、神経細胞（ＮＥＵＲＯ）および栄養芽細胞（ＴＲＯＰＨ）。各バーは２つの別個の実験の平均値である。（図１０Ｇ−Ｋ）はメチルセルロース検定法を使用して検知された、化合物処置に反応した造血性多重分化系列及びクローン原性ポテンシャルを示す。（図１０Ｇ）は化合物処置後の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）からの代表的コロニー形成単位（ＣＦＵ）ペレットを示す。（図１０Ｈ）は化合物処置後のＡＭＬからの代表的芽細胞ＣＦＵペレットを示す。
【図１０Ｉ−Ｌ】（図１０Ｉ−Ｊ）は、化合物処置後のＨＳＰＣ（図１０Ｉ）およびＡＭＬ芽細胞（図１０Ｊ）から生成されたそれぞれＣＦＵと芽細胞ＣＦＵの定量化結果を示す。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準偏差。各ＨＳＰＣバーはｎ＝７個別サンプル、平均＋／−標準偏差。各ＡＭＬバーは少なくともｎ＝５個別患者サンプル、平均＋／−標準偏差。（図１０Ｋ）は同一化合物の同一濃度における正規化されたＡＭＬ芽細胞のＣＦＵに対するＨＳＰＣのＣＦＵの比率。（図１０Ｌ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはＤＭＳＯ溶媒（ＣＴＲＬ）で９６時間まで処置後の培養された患者ＡＭＬ細胞内のＣＤ１１ｂ顆粒球細胞の正規化出現頻度を示す。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準偏差。（＊）ｐ＜０．０５（＊＊）ｐ＜０．０１（＊＊＊）ｐ＜０．００１（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。
【図１１Ａ−Ｂ】サリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンの線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対する効果を示す図である。（図１１Ａ）１０−７−１０−６Ｍのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）で処置した線維芽細胞由来ｉＰＳＣ（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）におけるＯｃｔ４＋細胞の出現頻度のフローサイトメトリ分析である。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準偏差。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準偏差、（−）ＢＭＰ４処置試料の％Ｏｃｔ４＋レベル。（図１１Ｂ）化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する拡大投与量応答である。各点は平均＋／−標準偏差。
【図１１Ｃ−Ｄ】（図１１Ｃ）はチオリダジンで処置された系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）の造血性分化系列ポテンシャルを示す。メチルセルロース検定法において生成された赤芽球（ＣＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ）および顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）コロニーのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。（図１１Ｄ）はサリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンで処置された系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）から生成されたＣＦＵの構成を示す図である。０．１μＭ、１μＭ、１０μＭのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）処置で生成されたＣＦＵの％構成を示す。（＊）ｐ＜０．０５（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図１２Ａ−Ｂ】造血性幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）生着に対するチオリダジンの影響を示す図である。（図１２Ａ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはメフロキン１０μＭ（ＭＱ  １０μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の出現頻度である。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＨＳＰＣ試料が評価された。平均＋／−標準偏差。（図１２Ｂ）ｈＣＤ４５＋集団内の側方散乱（ＳＳＣ）に対する骨髄性マーカー（ＣＤ３３）またはリンパ系マーカー（ＣＤ１９）の代表的フローサイトメトリプロットである。
【図１２Ｃ−Ｅ】（図１２Ｃ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはメフロキン１０μＭ（ＭＱ  １０μＭ）で急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）処置後の骨髄（ＢＭ）内のＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＡＭＬ芽細胞の発現頻度である。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＡＭＬ試料が評価された。（図１２Ｄ）ＤＭＳＯ処置された対照（ＣＴＲＬ）集団とチオリダジン処置（ＴＨＩＯ  １０μＭ）におけるＣＤ３３に対するＣＤ４５の代表的フロープロットである。（図１２Ｅ）ｈＣＤ４５造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）生着の正規化％に対するｈＣＤ４５  ＣＤ３３ＡＭＬ芽細胞生着の正規化％の比率である。（＊）ｐ＜０．０５。
【図１３Ａ−Ｃ】薬剤処置に対する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）応答を示す図である。（図１３Ａ）は１μＭのサリノマイシン（ＳＡＬ  １μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の骨髄内のヒトＣＤ４５＋細胞の正規化出現頻度をＤＭＳＯ処置された対照（ＣＴＲＬ）との比較で示す。計２つのＨＳＰＣ試料が評価された。平均＋／−標準偏差。（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。（図１３Ｂ）は造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の脾臓生着に対するチオリダジンの効果を示す図である。（図１３Ｂ上段）はチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の脾臓内のヒトＣＤ４５＋細胞の出現頻度を示す。数値はＤＭＳＯで処置されたＨＳＰＣ対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＨＳＰＣ試料が評価された。平均＋／−標準偏差。（図１３Ｂ下段）はチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）でＡＭＬを処置後の脾臓内のＣＤ４５＋ＣＤ３３＋芽細胞の出現頻度を示す。数値はＤＭＳＯで処置されたＡＭＬ対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＡＭＬ患者試料が評価された。（図１３Ｃ）チオリダジンの赤血球および巨核球の再生に対する効果を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）ＨＳＰＣを注入された異種移植骨髄内で検知されるヒト血液細胞の構成。赤血球（ＲＢＣ）はグリコホリンＡポジティブ性により、そして血小板はＣＤ４１ａにより規定される。
【図１３Ｄ−Ｆ】（図１３Ｄ）はＡＭＬとの異種移植の骨髄性白血病生着の確認を示す。側方散乱対リンパ系細胞のマーカーであるＣＤ１９のフローサイトメトリ。囲み内の数値は平均＋／−標準偏差。（図１３Ｅ−Ｆ）は造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）自己再生に関するチオリダジンの効果を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）原発性系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）  （図１３Ｅ）または原発性ＡＭＬ（図１３Ｆ）生着片から外植された同数のｈＣＤ４５細胞を受け取る、２次異種移植の骨髄における、ｈＣＤ４５＋細胞（図１３Ｅ）またはｈＣＤ４５＋ＣＤ３３＋（図１３Ｆ）の生着レベルを示す。各バーはｎ＝３マウス、平均＋／−標準偏差。
【図１４Ａ−Ｃ】腫瘍性幹細胞に発現したドーパミン受容体を示す図である。（図１４Ａ−Ｂ）はＳＳＥＡ３および全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された正常Ｈ９（図１４Ａ）および腫瘍性ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞（図１４Ｂ）のフローサイトメトリである。ＳＳＥＡ３＋断片内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現が示される。（図１４Ｃ）はＣＤ３４，ＣＤ３８および全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された分化系列が枯渇した臍帯血（造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ））のフローサイトメトリ。ドーパミン受容体（ＤＲ）発現はゲートで囲まれた集団で示される。
【図１４Ｄ−Ｆ】（図１４Ｄ）は全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された、ＦＡＢ分類を持つ１３人のＡＭＬ患者試料のフローサイトメトリ。（図１４Ｅ）はＣＤ４４とＣＤ２４で染色された３重ネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−，およびＨＥＲ２−）の原発性ヒト乳癌におけるＤＲＤ５の共局在性をしめす。（図１４Ｆ）はＤＲＤ３およびＤＲＤ５集団内の３重ネガティブ乳癌幹細胞（ＣＳＣ）（ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ）の発現頻度。各バーは３つの原発性３重ネガティブ乳癌からなり、平均＋／−標準偏差。
【図１４Ｇ−Ｈ】ＤＲＤ３（図１４Ｇ）およびＤＲＤ５（図１４Ｈ）にポジティブである、患者試料からのＡＭＬ芽細胞（ＣＤ３３＋ＣＤ４５＋）の出現頻度。計８人の患者試料が異種移植のレシピエントにおける白血病発症ポテンシャルについて評価された。白血病発症はマウス骨髄においてヒト生着＞ＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋の０．１％で定義された。２２匹のマウスの内４匹の白血病発症ＡＭＬ試料が検定され、一方１７匹のマウスの内４匹の白血病非発症ＡＭＬ試料が検定された。計ｎ＝８ＡＭＬ試料、平均＋／−標準偏差。
【図１５Ａ−Ｃ】（図１５Ａ−Ｂ）は全ての５種類のドーパミン受容体で染色された線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）（図１５Ａ）およびへその緒臍帯血由来ｈｉＰＳＣ（図１５Ｂ）内のＳＳＥＡ３＋断片のフローサイトメトリ。（図１５Ｃ）はヒト血液集団のドーパミン受容体発現を示す。へその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリであり、赤血球系（グリコホリンＡ）、巨核球（ＣＤ４１ａ）で染色されている。
【図１５Ｄ−Ｆ】（図１５Ｄ）はへその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリでありＴ−細胞（ＣＤ３）、Ｂ−細胞（ＣＤ１９）で染色されている。（図１５Ｅ）はへその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリであり単球（ＣＤ１４）、顆粒球（ＣＤ１５）で染色されている。ゲートで囲まれた集団内の全ての５つのドーパミン受容体による染色はヒストグラムで示される。（図１５Ｆ）血液集団内でのドーパミン受容体の局在性の要約。
【図１５Ｇ−Ｈ】（図１５Ｇ）はＡＭＬ患者のフローサイトメトリであり、ゲートで囲まれた集団にドーパミン受容体を示す。（図１５Ｈ）３重ネガティブヒト乳癌におけるドーパミン受容体発現。乳癌幹細胞はＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏで規定される（Ａｌ−Ｈａｊｊ他、２００３）。それぞれのドーパミン受容体（ＤＲ）のＣＤ４４およびＣＤ２４集団内での共局在が３つの３重ネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−およびＨＥＲ２−）乳癌に対して示される。
【図１６Ａ−Ｂ】ＡＭＬにおいてチオリダジンがドーパミン受容体シグナル伝達を抑制することを示す図である。（図１６Ａ）はＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞系のドーパミン受容体発現を示す。（図１６Ｂ）は３種類のドーパミン受容体遮断薬で処置されたＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞の細胞数。数値はＤＭＳＯで処置された対照試料に対し正規化されている。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準偏差。
【図１６Ｃ−Ｄ】無血清条件下でドーパミン受容体Ｄ２ファミリー刺激薬の７０Ｈ−ＤＰＡＴ（図１６Ｃ）またはドーパミン受容体Ｄ１ファミリー刺激薬のＳＫＦ３８３９３（図１６Ｄ）で処置された、同一の細胞系の生存可能細胞数（７ＡＡＤ−、ヘキスト＋）。数値はＤＭＳＯで処置された対照試料に対し正規化されている。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準偏差。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（Ｉ．定義）
ここでは「癌」は、隣接組織または体の他の部位に拡大する制御されない異常な細胞増殖により引き起こされる一群の疾病の１つを言う。癌細胞は癌細胞が一塊になる固形腫瘍を形成可能であり、または白血病のように分散した細胞として存在する。
【００２２】
「癌細胞」とは、制御されない異常な増殖と他の組織に侵入する能力を特徴とする細胞、あるいはそのような細胞から由来する細胞を言う。癌細胞は例えば、癌患者から獲得された原発性癌細胞、またはそのような細胞から由来する細胞系を含む。同様に「血液系癌細胞」とは、血液細胞または骨髄細胞由来の癌細胞をいう。癌細胞の事例としては、限定されないが、癌幹細胞、乳癌細胞、直腸癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、および骨髄腫，白血病細胞またはリンパ腫細胞などの血液系癌細胞を含む。
【００２３】
「癌幹細胞」とは、自己再生能力および、腫瘍または血液系腫瘍からなる癌細胞の分化系列に分化する能力のある細胞を言う。癌幹細胞はその疾病を独自に開始しそして維持することができる。
【００２４】
「前癌障害」とは癌に発展する可能性のある一群の高増殖性障害の１つであり、例えば骨髄増殖性疾病のような前癌血液障害または骨髄異形成症候群を含み、それは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関連し、および／またはそれに発展する可能性のある前悪性の症状である。
【００２５】
「前癌細胞」とは、制御されない異常な増殖を特徴とする細胞またはそのような細胞に由来する細胞を言う。「前癌細胞」には、例えば前癌障害の患者から獲得された原発性前癌細胞、またはそのような細胞または癌幹細胞由来の細胞系を含む。同様に、「血液系前癌細胞」とは、血液細胞または骨髄細胞由来の前癌細胞を言う。ある実施形態では、血液系前癌細胞は骨髄増殖性細胞である。
【００２６】
「白血病」とは、造血性組織、他の器官および通常血液内において、増加した数で発見される異常白血球の進行的増殖を含む任意の疾病を言う。「白血病細胞」とは、増大する細胞異常増殖を特徴とする白血球細胞を言う。白血病細胞は白血病と診断された被験者から獲得されてもよい。
【００２７】
「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」とは、血液細胞の骨髄系の癌を言い、骨髄に蓄積しそして正常な血液細胞の生成を妨害する異常白血球の速い成長を特徴とする。骨髄異形成性または骨髄増殖性症候群のような前白血病症状もまたＡＭＬに進展する可能性が有る。
【００２８】
「単球性白血病」とは、ＣＤ１４を発現することを特徴とする白血病のサブタイプを言い、そして急性骨髄性白血病のサブタイプである急性単球性白血病を含む。ある実施形態では、被験者は、骨髄に２０％超の芽細胞を持ち、かつその内８０％超が単球系である場合、急性単球性白血病であると識別される。
【００２９】
「ドーパミン受容体遮断薬」とは、１つ以上のドーパミン受容体の機能または活性において任意の検知可能なまたは測定可能な減少を生成する化合物を言う。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）はＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される。ドーパミン受容体遮断薬は１つのドーパミン受容体に選択的または多重のドーパミン受容体に選択的（即ち「多重受容体遮断薬」）であってよい。多重受容体遮断薬の事例には、チオリダジンおよびクロルプロマジンを含む。ドーパミン受容体は一般的にＤ１ファミリードーパミン受容体（ＤＲ１およびＤＲ５）とＤ２ファミリードーパミン受容体（ＤＲ２、ＤＲ３およびＤＲ４）にグループ分けされる。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１に記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００３０】
【表１】
2014509323.tif 000002
2014509323.tif 000003
【００３１】
「フェノチアジン」または「フェノチアジン誘導体」とは、フェノチアジン分子または骨格に由来し、または含む化合物を言う。フェノチアジンの一般式はＳ（Ｃ６Ｎ４）２ＮＨであり、フェノチアジン誘導体はフェノチアジンに対し１つ以上の置換または追加を有する。例えば、幾つかのフェノチアジン誘導体は３環構造を持ち、そこでは２つのベンゼン環が窒素および硫黄により連結されている。フェノチアジン誘導体の事例には、チオリダジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、メソリダジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、およびトリフルオペラジンを含む。本発明の方法で使用されるフェノチアジン誘導体の追加の事例は、表１に示される。ある実施形態では、チオリダジンはＩＵＰＡＣ名１０−｛２−［（ＲＳ）−１−メチルピペリジンー２−イル］エチル｝−２−メチルサルファニルフェノチアジンを持つ。
選択肢として、チオリダジンのような１種類以上のフェノチアジン誘導体のラセミ体がここに記載される方法で使用される。
【００３２】
「癌細胞の増殖を減少させる」とは、細胞成長または細胞分裂の結果として癌細胞から発生する細胞数の減少を意味し、細胞死または癌幹細胞の分化を含む。「細胞死」とは、ネクローシスおよびアポトーシスを含む全ての形態の細胞死を含む。「癌幹細胞の分化」とは、それにより癌幹細胞が自己再生の能力を失い、腫瘍または血液系腫瘍を含む癌細胞の系列分化を引き起こすプロセスを言う。
【００３３】
「予後を判定する」とは、疾病のありそうな進行及び／または転帰の予測を意味し、選択肢として、規定された転帰（回復、徴候、特性、期間、再発、合併症、死および／または生存率など）を含む。
【００３４】
「対照」とは、比較試料または事前設定数値を意味する。ある実施形態では、「対照」はここに記載されるように、バイオマーカーの発現レベルを言う。ある実施形態では、対照は正常な病気の無い細胞、組織または血液を意味する。ある実施形態では、対照は臨床転帰または疾病の重症度が既知の癌被験者を意味する。例えば、ある実施形態では、対照はＡＭＬと診断後少なくとも５年生存した被験者を意味する。ある実施形態では、対照は疾病の特定のグレードの段階にある癌被験者を意味する。ある実施形態では、対照は癌幹細胞ではない幹細胞を意味する。
【００３５】
「効果的な数量」または「治療的に効果的な数量」とは、投与において、そして所望の結果を得るために必要な期間において効果的な数量を言う。例えば、ＡＭＬのような癌のコンテキストまたは治療において効果的な数量とは、たとえば寛解を誘発し、腫瘍量を減少させ、および／またはその化合物の投与無く得られた応答に比べて腫瘍の拡散または白血病細胞の成長を防止する数量をいう。効果的な数量は病期、動物の年齢、性別、および体重のような因子により変化する。このような数値に対応する所定の化合物の数量は所定の薬剤または化合物、製剤処方、投与経路、疾病または障害のタイプ、治療される被験者またはホストの独自性、など多くの因子により変化するが、それでも当業者により日常的に決定可能である。
【００３６】
「医薬的に許容可能」とは、動物、特にヒトの治療に適合するという意味である。
【００３７】
「被験者」とは、哺乳類を含む動物界の全ての構成要員を含み、好適にはヒトを示す。選択肢として、「被験者」は癌であると診断され、または寛解にある哺乳類を含む。
【００３８】
「処置する」または「処置」とは、当業者に周知のとおり、臨床転帰を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の結果には、限定されないが、検知可能であれ不可能であれ、１つ以上の徴候または症状の軽減または回復、疾病の程度の減弱、安定した（即ち、悪化しない）病状（例えば患者を寛解に保つ）、疾病の拡散の防止、疾病の進行の遅延または進行速度の低下、病状の回復または緩和、疾病の再発の減弱、そして寛解（部分寛解または完全寛解）を含んでよい。「処置する」または「処置」は処置を受けなかった場合の期待生存に対し延長された生存を意味してもよい。「処置する」または「処置」とは、また、予防的処置を含む。ある実施形態では、処置用法は、ここに記載されるような被験者に処置的に有効な量のドーパミン受容体遮断薬を投与するステップと、そして選択肢として、単一の投与、あるいは連続的な投与のステップを含む。
【００３９】
（ＩＩ。方法と使用）
驚くべきことに、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬がＡＭＬ系および原発性ＡＭＬに対して細胞毒性を有し、一方正常造血性幹細胞に対しては細胞毒性がそれより少ないことが発見された。事例２及び１０に示されるように、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬チオリダジンは有意に白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を減少させ、一方で正常造血性幹細胞の能力を維持した。
【００４０】
従って、ある実施形態では、それを必要とする被験者にドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を投与するステップを有する、被験者の癌または前癌障害を処置する方法が提供される。
また、癌または前癌障害を処置するためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬の使用法が提供される。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は骨髄増殖性疾病などの前癌障害を処置するのに有用である。ある実施形態では、癌はＡＭＬ、または単球性白血病などの白血病である。ここに記載される方法または使用法は特にドーパミン受容体を発現する癌細胞に有用である。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は単球マーカーＣＤ１４を発現する癌細胞の処置に有用である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は造血性幹細胞または正常幹細胞に比べて、優先的に被験者の癌幹細胞の分化を誘発する。ある実施形態では、癌幹細胞は白血病癌幹細胞である。ある実施形態では、被験者はＡＭＬを罹患し、癌幹細胞はＡＭＬ癌幹細胞である。
【００４１】
ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５などの１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）に対する遮断薬である。選択肢としてドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は多重受容体遮断薬であり、または単一のドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプに特異である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は表１に記載される化合物から選択される。当業者は容易にここに記載されるような癌の処置に有用な、追加のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を識別できるであろう。
【００４２】
ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は、チオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体を含む。当業者は容易にここに記載されるような癌の処置に有用な、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬である追加のフェノチアジン誘導体を識別できるであろう。ある実施形態では、フェノチアジン誘導体は、正常幹細胞または造血性幹細胞に比べて白血病細胞のような癌細胞に対し差別的に毒性を有する。
【００４３】
ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および／またはフェノチアジン誘導体は、それを必要とする被験者への投与のため、既存技術に既知のように調製される。適合する調剤の選択と調製のための従来技術の手順および原材料は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３年、２０版）および１９９９年発行のＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）に記載されている。
【００４４】
ある実施形態では、その細胞にドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を接触させるステップを有する、癌細胞の増殖を減少させる方法もまた提供される。同様の実施形態では、癌細胞の増殖を減少させるためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬の使用法が提供される。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は癌幹細胞の分化または細胞死を誘発する。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は癌細胞の細胞死を誘発する。選択肢として癌細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）である。癌細胞は骨髄異形成性細胞または骨髄増殖性細胞などの前癌細胞であってもよい。ある実施形態では、癌細胞はＡＭＬ患者からの細胞などの白血病細胞である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は表１に記載される化合物から選択される。
【００４５】
事例４と図５に示すように、出願人は驚くべきことに、幾つかのＡＭＬ細胞系および原発性ＡＭＬ細胞は正常造血性幹細胞と比べてドーパミン受容体（ＤＲ）発現の相対的増加を示した。したがって、癌被験者を癌細胞内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現によってスクリーニングすることは、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬による処置により利益を得られる被験者を識別することに資するであろう。
従って、本発明の１側面では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬による処置に適した被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は被験者からの癌細胞試料中に１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現を測定するステップを有する。１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）を発現する癌細胞を有する被験者は、それによりドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬による処置に適した被験者と識別される。例えば、癌細胞試料中の１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現は、ドーパミン受容体（ＤＲ）に対しエンコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して癌細胞を試験することにより測定可能である。ある実施形態では、方法は、被験者から癌細胞の試料を獲得または提供するステップと、および／または１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現について試料を試験するステップを有する。ある実施形態では、癌は白血病であり、癌細胞は白血病細胞である。ある実施形態では、癌はＡＭＬである。選択肢として、方法は癌、血液系腫瘍、白血病、またはＡＭＬに付随することが既知の追加のマーカー、または特定の処置レジームに付随するマーカーを測定するステップを有する。ある実施形態では、癌細胞は単球マーカーＣＤ１４に対しても試験される。
【００４６】
ドーパミン受容体（ＤＲ）の発現は乳癌およびＡＭＬの試料において観察されており、それは疾病の重症度のバイオマーカーとして役立つ。事例１１および図１４Ｇ，Ｈで示されるように、高レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）発現は予後不良と関連し、一方低レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）発現はより良好な予後を意味する。したがって、本発明の１側面では、癌被験者の予後を決定する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は被験者からの癌細胞試料において、ドーパミン受容体（ＤＲ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４、ＤＲ５およびＣＤ１４から選択される１種類以上のバイオマーカーの発現を測定するステップと、そして１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを対照と比較するステップを有する。ある実施形態では、１種類以上のバイオマーカーの発現レベルの対照と比較した増加は、その被験者が対照より重度の癌の形態を有することを示唆する。選択肢として、ここに記載される方法は、白血病細胞を含む血液試料または腫瘍試料などの、被験者からの癌細胞試料を提供または獲得するステップを有する。ある実施形態では、癌細胞は白血病細胞または乳癌細胞であり、そして１種類以上のバイオマーカーの発現レベルの対照と比較した増加は、白血病または乳癌が対照より重度の形態であることを示唆する。選択肢として、癌または疾病の重症度に付随することが既知の追加のバイオマーカーも試験され、そして対照試料と比較される。当業者は、癌被験者の特定の予後を代表する対照を選択し、１種類以上のバイオマーカーのレベルの試験試料と対象との間の差異または類似性を観察することが、被験者の対応する予後を提供することを理解するであろう。例えばある実施形態では、対照は特定の転帰または予後をもつことが既知のＡＭＬと診断された被験者を代表し、１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現レベルが対照と比べて増加していることを観察することは、被験者の対照より不良な予後を示唆する。
【００４７】
ここに記載される方法は、また癌被験者を識別するのに有用である。ある実施形態では、ここに記載される方法は、ＡＭＬまたは単球性白血病などの白血病被験者を識別するのに有用である。従って、ある実施形態では、被験者からの試料を提供するステップと、そしてそのサンプルをＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーの発現について試験するステップを有する、白血病被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、その試料は白血病細胞などの癌細胞および／または白血球細胞からなる。ある実施形態では、その方法は、１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを対照と比較するステップを有する。ある実施形態では、対照と比較して増加した、試料内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現は癌を示唆する。ある実施形態では、対照と比較した被験者におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の増加発現は、白血病を示唆する。ある実施形態では、対照と比較した被験者におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の増加発現は、ＡＭＬまたは単球性白血病を示唆する。選択肢として、ここに記載される方法は、当業者に既知の癌または白血病の識別のための他の診断的方法と組み合わせて使用されてもよい。
【００４８】
事例１１に示すように、ドーパミン受容体（ＤＲ）発現は、多能性マーカーステージ特異的胎児抗原３（ＳＳＥＡ３）を発現する正常ｈＰＳＣなどの他の細胞からヒト癌幹細胞を分離する。したがって、ある実施形態では、細胞がドーパミン受容体（ＤＲ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを発現するかを特定するステップを有する、癌幹細胞を細胞集団から識別する方法が提供される。ある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５の発現は、その細胞が癌幹細胞であることを示唆する。選択肢として、２種類以上、３種類以上、４種類以上、または５種類全てのドーパミン受容体（ＤＲ）の発現は、その細胞が癌幹細胞であることを示唆する。ある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５を発現する細胞は癌幹細胞であると識別される。
【００４９】
ある実施形態では、癌幹細胞が細胞の集団から識別される。ある実施形態では、細胞集団は体細胞系細胞、多能性幹細胞、癌細胞および／または癌幹細胞などの１つ以上の細胞タイプを有する。ある実施形態では、細胞集団は組織培養のような細胞培養内の複数の細胞である。ある実施形態では、細胞集団は原発性組織試料または血液試料のような哺乳類からの細胞の集団である。ある実施形態では、細胞集団は哺乳類からの、癌細胞または癌の疑いのある細胞の集団である。ある実施形態では、細胞集団は１種類以上の癌幹細胞のみならず幹細胞、体細胞系幹細胞および／または多能性幹細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は血液系癌細胞のような癌細胞または前癌細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は単球細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は乳癌細胞を含む。選択肢として、細胞集団は腫瘍試料などの組織試料からの細胞の集団であり、単一細胞に解離されている。
【００５０】
方法の１側面では、細胞が１種類以上のバイオマーカーを発現するか否かを測定するステップは、その細胞をＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現について試験するステップを有する。例えば、既存技術の方法で、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）またはポリヌクレオチドの発現を検知するレポーター遺伝子、またはポリペプチドの発現を検知する免疫組織化学的方法が、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５などのバイオマーカーの発現を測定するのに使用可能である。ある実施形態では、バイオマーカーは細胞表面バイオマーカーであり、そして方法は細胞の表面上に発現したＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５を検知するステップを含む。
【００５１】
ある実施形態では、ここに記載される癌幹細胞を識別する方法は、ドーパミン受容体（ＤＲ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、そしてその後発現レベルを対照レベルと比較するステップを有する。例えば、ある実施形態では、対照は体細胞系幹細胞、血液系幹細胞または多能性マーカーＳＳＥＡ３を発現する細胞のような、癌幹細胞ではない細胞を意味し、そしてＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４および／またはＤＲ５のバイオマーカーが対照に比較して増加した発現レベルを有する細胞は、癌幹細胞と識別される。選択肢として、対照に比較して増加した発現量（例えば、少なくとも２倍、５倍または１０倍など）を有する細胞は、癌幹細胞と識別される。
【００５２】
ある実施形態では、方法はまた、（ａ）細胞集団を提供するステップと；（ｂ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーに特異的に結合する薬剤を細胞集団に接触させるステップと；（ｃ）（ｂ）の薬剤に特異的に結合する細胞を選択し、それにより癌幹細胞を細胞集団から識別および／または単離するステップを有する。ある実施形態では、その薬剤は選択的にバイオマーカーに結合する抗体である。ある実施形態では、ここに記載される方法は、選択肢として２つ以上の選択または単離ステップを有してもよい。ここに記載される方法は、また消去法による選択、例えば、癌幹細胞でない細胞で発現した１種類以上のバイオマーカーを発現する細胞を除外し、または特定のマーカーの発現レベルが低い細胞を除外するステップ、を含んでもよい。
【００５３】
ある実施形態では、本発明は細胞集団から癌幹細胞を単離するステップを含む。例えばある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを発現する細胞を選択または単離することにより、癌幹細胞と識別された細胞が、癌幹細胞でない細胞から、または、試料内の他の材料から、単離される。選択肢として、癌幹細胞は、既存技術で知られる１種類以上のマーカーの発現に基づいて分類する方法により、単離または選択される。例えば、ある実施形態では、癌幹細胞を細胞集団から単離するステップは、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞分類、パニング、親和性カラム分離、または磁気選択を有する。ある実施形態では、１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）を発現する細胞は、ドーパミン受容体（ＤＲ）に選択的に結合する結合剤を使用して単離され、その結合剤は分離コラムまたは磁気ビーズ内のマトリックのような支持体に接合する。
【００５４】
本発明の１側面では、ここに記載される方法は、被験者からの試料内の１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）のレベルのような、１種類以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップを含む。ある実施形態では、試料は癌細胞を有し、または、癌細胞または前癌細胞を有すると疑われている。例えば、試料は血液試料、例えば末梢血試料、分画された血液試料、骨髄試料、生検、冷凍組織試料、新鮮組織試料、細胞試料、および／またはパラフィン埋め込み切片を含んでよい。ある実施形態では、被験者はＡＭＬを罹患しまたは罹患の疑いが有り、そして試料は、単核細胞からなる。ある実施形態では、試料はバイオマーカーレベルを検知する前に処理される。例えば、試料は、使用されるバイオマーカーのレベル測定方法に依存して、分画され（例えば遠心分離により、または寸法排除のためのコラムを使用して、または単球用バイオマーカーを使用したＦＡＣＳにより、）、濃縮または処理される。
【００５５】
ここに記載されるバイオマーカーの発現レベルは当業者に周知の方法で測定される。例えば、ある実施形態では、１種類以上のバイオマーカーのレベルが、ｍＲＮＡなどの核酸のレベル、またはタンパク質またはポリペプチドのレベルを測定または検知することにより決定される。ある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４および／またはＤＲ５の細胞表面発現を検知することにより１種類以上のバイオマーカーの発現が測定される。ある実施形態では、ここに記載される方法は、例えば、そのバイオマーカーに特異な抗体またはバイオマーカーに特異な他の検出試薬を使用するような、免疫組織化学を使用して、バイオマーカーを検知するステップを含む。ここに記載される方法での使用に適したドーパミン受容体（ＤＲ）抗体の事例は、本発明の事例７にリストアップされている。
【００５６】
ある実施形態では、バイオマーカーに対しエンコードするｍＲＮＡのレベルは、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲのような定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ法、マイクロアレイの使用、デジタル分子バーコード化技術、またはノーザンブロットを使用して測定される。当業者は、多くの方法がバイオマーカーのレベルを測定するのに使用可能であることを理解しよう。それらは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）およびプロダクトイオンモニタリング（ＰＩＭ）などの質量分析アプローチ、そしてウェスタンブロットのような免疫検定法そして酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの抗体ベースの方法を含む。ある実施形態では、ここに記載される１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）などのバイオマーカーの発現を測定するステップは、免疫組織化学および／または免疫検定法を使用するステップを含む。ある実施形態では、免疫検定法はＥＬＩＳＡである。さらなる実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡである。
【００５７】
「レベル」とは、試料内で計測可能または検知可能なバイオマーカーのある数量（相対的数量または濃度）を言う。例えば、レベルはμｇ／Ｌのような濃度または相対数値、例えば、対照レベル、標準または参照レベルの１．２，１．３，１．４，１．５，１．６，１．７，１．８，１．９，２．０，２．２，２．４，２．６，２．８，３．０，３．２，３．４，３．６，３．８，４．０，４．２，４．４，４．６，４．８，５．０，１０，１５，２０，２５，３０，４０，６０，８０，および／または１００倍以上大きい。選択肢として、対照は対照試料内の平均または中心値レベルのような１つのレベルである。バイオマーカーのレベルは、例えば、タンパク質のレベル、またはドーパミン受容体（ＤＲ）などのバイオマーカーに対しエンコードするｍＲＮＡのレベルである。
【００５８】
ある実施形態では、２種類以上のバイオマーカーのレベルが測定されると、２種類以上のバイオマーカーのレベルは被験者の発現プロファイルを生成するのに使用可能である。例えば、ある実施形態では、ここに記載される方法は、試料内の２種類以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップと、２種類以上のバイオマーカーのレベルに基づいて発現プロファイルを生成するステップと、そしてその発現プロファイルを対照発現プロファイルと比較するステップを有する。試験試料発現プロファイルと対照発現プロファイルとの相違または類似性はその後、試験被験者の予後を提供し、癌被験者であると識別し、または被験者がドーパミン受容体遮断薬での処置に適合しているか否かを示唆するのに使用される。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、癌または前癌障害の処置に対するドーパミン受容体遮断薬の使用法を含む。類似の側面では、癌または前癌障害の処置に使用されるドーパミン受容体遮断薬が提供される。ある実施形態では、癌は白血病である。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１にリストアップされる化合物から選択される。
【００６０】
ここではさらに癌および／または前癌障害の処置用の医薬品の製造のためのドーパミン受容体遮断薬の使用法が開示される。
【００６１】
本発明のさらなる側面は、１種類以上のドーパミン受容体を遮断する化合物を識別するステップを有する、抗ガン活性用の化合物をスクリーニングする方法を含む。ある実施形態では、ドーパミン受容体を遮断する化合物は抗ガン活性を有するとして識別される。ある実施形態では、方法は、造血性幹細胞のような正常な幹細胞と比較して癌幹細胞の増殖を減少させる化合物を識別するために、化合物をスクリーニングする、事例７と８に記載されるような、ステップを含む。
【００６２】
以下の、非限定的事例は本発明の開示を示す。
【００６３】
（事例）
（事例１：チオリダジンは白血病細胞系に対し細胞毒性を有する）
正規化された細胞数に対するチオリダジンの効果が３つの白血病細胞系：ＨＬ−６０、ＭＶ４−１１及びＯＣＩ−ＡＭＬ３で評価された。３つの細胞系は全て白血病細胞系である。ＨＬ−６０は前骨髄球性ＡＭＬ由来であり、一方ＭＶ４−１１及びＯＣＩ−ＡＭＬ３はＡＭＬの代表である。それぞれの化合物は細胞と共に７２時間インキュベートされる。対照はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（即ち化合物に使用される溶媒）に７２時間。それぞれの条件は３度繰り返された。
【００６４】
図１にしめすように、０．１μＭと１μＭのチオリダジン投与は正規化細胞数にほとんど影響を与えなかったが、一方１０μＭでは正規化細胞数は殆どゼロに減少した。
【００６５】
（事例２：  ＡＭＬの芽細胞形成ポテンシャルと正常幹細胞のコロニー形成ポテンシャルに対するチオリダジンの異なる活性）
ＡＭＬ細胞系における芽細胞形成に対するチオリダジンの効果が正常ヒト幹細胞におけるコロニー形成に対するチオリダジンの効果と比較された。
【００６６】
正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞は健常な患者の前駆細胞が増大させられた末梢血またはへその緒臍帯血のいずれかに由来した。原発性ＡＭＬ細胞はＡＭＬと診断された患者から採取された。正常ＨＳＣおよび原発性ＡＭＬ細胞は共に標準生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）メトセルロース検定条件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ−Ｈ４４３４−Ｃｌａｓｓｉｃ．ａｓｐｘおよびＣｌｉｎｔｏｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ他「ヒト幹細胞序列は自己再生ポテンシャルに関するＭｃｌ−１ｈへの機能的依存性により定義される」Ｂｌｏｏｄ  １１６（９）１４３３−１４４２（２０１０年６月４日）参照、これらはここに参照され採り入れられる）のもとで少なくとも１４日間培養され、その後コロニーの数が記録された。図２に示すように、１０μＭチオリダジンは正常ＨＳＣとＡＭＬ細胞とでは異なる効果を見せた。１０μＭチオリダジンは正常ＨＳＣのコロニー形成ポテンシャルを約１００（対照、ＤＭＳＯ処置）から総コロニー数６６まで減少させた。（図２Ａ）。しかしＡＭＬ細胞に対してはＣＦＵコロニーの数を約２２芽細胞コロニーから１．６芽細胞コロニーに大幅に減少させた（図２Ｂ）。
【００６７】
図３はチオリダジンで処置された正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）とＡＭＬから形成されたＣＦＵコロニーの細胞ペレットを示す。１０μＭの投与量では、ペレット化した細胞はＨＳＣでは視認できるが、ＡＭＬ細胞では見えない。したがってチオリダジンはＡＭＬ細胞の芽細胞―ＣＦＵポテンシャルを選択的に標的とする。
【００６８】
（事例３：クロルプロマジンはＡＭＬ細胞系に対して毒性を有する）
ドーパミン受容体遮断薬でありそしてフェノチアジン関連化合物であるクロルプロマジンもＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０，ＭＶ４−１１およびＯＣＩ−ＡＭＬ３に対する効果について調査された。試験は事例１に示されるように実施された。図４に示すように、１０μＭクロルプロマジンはＡＭＬ細胞系に対して毒性を有する。
【００６９】
（事例４：正常血液ｖｓ白血病におけるドーパミン受容体の発現）
ドーパミン受容体ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５の発現が、ＡＭＬ細胞系（ＨＬ−６０，ＭＶ４−１１，ＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３）、ＡＭＬ患者から単離された原発性ＡＭＬ細胞（ＡＭＬ２２１０１、ＡＭＬ２９４２８、ＡＭＬ２２１７４、ＡＭＬ２９５６０）、正常血液単核細胞（ＭＮＣ）（ＭＰＢ２１４７１およびＭＰＢ２８１３７；健常患者血液）およびＳｔｅｍＳｅｐ（登録商標）ヒト造血性前駆体細胞エンリッチメントキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＳｔｅｍＳｅｐ−Ｈｕｍａｎ−Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ−Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｃｅｌｌ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ−Ｋｉｔ．ａｓｐｘ）を使用し、ＨＳＣ／ヒト前駆体細胞のエンリッチメントレベルがフローサイトメトリで確認された、正常ヒト幹細胞または前駆体を豊富に含んだへその緒臍帯血原発性細胞（ＣＢ１０７、ＣＢ１０８およびＣＢ１０９）に対して分析された。アイソタイプ発現が背景として計測された。アイソタイプピークの右側のピークはドーパミン受容体（ＤＲ）マーカーのポジティブ発現を意味する。
【００７０】
図５に示されるように、ドーパミン受容体は原発性ＡＭＬ、ＡＭＬ細胞系および正常単核血液細胞（ＭＮＣ）において発現するが、正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）（系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−））を豊富に含んだ血液では発現しない。データは試料がドーパミン受容体（ＤＲ）発現にポジティブな場合、全ての５つのＤＲサブタイプが通常存在することを示す。
【００７１】
全ての原発性ＡＭＬがドーパミン受容体を発現するとは限らなかった。従って、ドーパミン受容体遮断薬によるＡＭＬ処置に適した被験者を識別するため、被験者はドーパミン受容体発現について事前にスクリーニングされてよい。選択肢として、被験者の事前スクリーニングは全ての５つのＤＲサブタイプ、または特定のサブタイプ、またはサブタイプの組合せに及んでもよい。
【００７２】
（事例５：多重ＤＲ遮断薬はＡＭＬ細胞系に対し細胞毒性を有する）
一連のドーパミン受容体刺激薬、Ｄ３−遮断薬、ＤＲ１＆５−遮断薬および多重受容体遮断薬が３つのＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３に対する細胞毒性に関して試験された。試験は事例１の設定に従って実行された。
【００７３】
図６に示すように、高い濃度のクロザピン（ＣＬＯＺ）、およびクロルプロマジン塩酸塩（ＣＨＬ）、チオリダジン（ＴＨＩＯ）はＡＭＬ細胞系に対し有意の細胞毒性を有する。理論に制限されることなく、細胞毒性効果は多重ドーパミン受容体の阻害を必要とするかもしれない。多重受容体遮断薬であるＣＬＯＺ、ＣＨＬ、ＴＨＩＯはＡＭＬ細胞系を根絶するように作用するが、一方特異遮断薬であるＤ３−、ＤＲ１＆５−は細胞数を６０％にまで減少させるだけである。
【００７４】
（事例６：ドーパミン受容体は原発性ＡＭＬのＣＤ１４＋細胞集団において発現する）
原発性ＡＭＬ細胞においてドーパミン受容体サブタイプの発現が分析された。ＡＭＬ患者から得られた原発性ＡＭＬ細胞はＤＲサブタイプおよびＣＤ１４に特異な抗体を、フローサイトメトリを使用した分析の前に含んだ。大多数のＤＲ＋細胞はＣＤ１４ポジティブであることが判った。
【００７５】
図７に示すように、ＣＤ１４単球マーカーの発現はそれぞれのＤＲサブタイプの発現と相関関係が有る。
【００７６】
チオリダジンの効果も原発性ＡＭＬ内のＣＤ１４＋細胞サブ集団で試験された。原発性ＡＭＬ細胞は対照（ＤＭＳＯ溶媒）または１０μＭチオリダジンのもとで７２時間培養され、そしてＣＤ１４に特異な抗体により染色された。対照とチオリダジン処置試料の両方のＣＤ１４＋細胞の数はフローサイトメトリを使用して測定され、そしてＣＤ１４＋細胞の出現頻度はチオリダジン処置試料の方が低く、このことはこの化合物が選択的にＡＭＬ細胞の中のＣＤ１４＋サブ集団を標的とすることを示唆した。
【００７７】
図８に示すように、１０μＭチオリダジンも原発性ＡＭＬ細胞内のＣＤ１４＋細胞の正規化出現頻度を減少させ、このことはチオリダジンが選択的にＣＤ１４＋細胞を標的とすることを示した。ＡＭＬ対照グループはＣＤ１４＋細胞を一部分含んだ。この一部分はチオリダジン処置により減少し、そして対照（１００％）対処置済（２０％）の正規化出現頻度の減少として示されている。
【００７８】
（事例７：ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発する薬剤の識別と特徴付け）
正常な幹細胞（ＳＣ）に影響することなく癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的にする薬剤の識別は、将来の癌治療にとって理想的であるが、しかし膨大な生物学的スクリーンを受容できるヒトの癌幹細胞（ＣＳＣ）及び正常な幹細胞の両方の検定法がないため、制限されている。以下の事例で述べるように、腫瘍性ｖｓ正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）分化プラットフォームを使用して、非毒性であり、癌幹細胞（ＣＳＣ）の腫瘍性自己再生に打ち勝つための分化を誘発する、化合物が識別される。識別された抗癌幹細胞（ＣＳＣ）薬剤の幾つかの候補の内、承認された抗精神病薬であるチオリダジンは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で白血病を開始する能力のあるヒト体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とすることができ、一方で正常血液幹細胞（ＳＣ）の能力には影響を与えなかった。チオリダジンによるドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングの遮断は癌幹細胞（ＣＳＣ）の選択的標的化の基礎をなし、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）が造血性腫瘍および乳癌由来の癌幹細胞（ＣＳＣ）のバイオマーカーであることを明らかにした。
【００７９】
（実験手順）
（腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）ＥＯＳ−ＧＦＰ系の生成）
腫瘍性ｖ１Ｈ９またはｖ２Ｈ９ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）がＤｒ  Ｊａｍｅｓ  Ｅｌｌｉｓにより提供されたＥＯＳ−Ｃ３＋ＥＯＳ−Ｓ４＋ベクタ−を運ぶレンチウィルスを形質導入された（Ｈｏｔｔａ他、２００９）。レンチウィルス形質導入の後、細胞はピューロマイシンを使用して選択され、そしてその後ＦＡＳＣＡｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現に基づき、単一細胞として９６ウェルプレートにソートされた。単一細胞クローンから形成されたコロニーは、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｃ３＋），ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｃ３＋）およびｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｓ４＋）系を確立するのに使用された。
【００８０】
（細胞培養液）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ），ｖ１Ｈ９，ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は前述のように培養された。（Ｃｈａｄｗｉｃｋ他２００３；Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）
【００８１】
（原発性ヒト試料）
ＡＭＬ標本のため、末梢血および／または骨髄が臨床的プレゼンテーション時に収集された。健康な造血性細胞がへその緒の臍帯血試料から得られた。全ての試料は研究倫理委員会（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ）承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびロンドン健康科学センターで採取された。ヒト乳癌試料は、乳房縮小手術から、研究倫理委員会承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学で採取された。
【００８２】
（正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）用、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養プラットフォーム）
化学スクリーンは，ウェル当り５，０００細胞で８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地（ＭＥＦＣＭ）内に植えつけられたｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞を含んだ。２４時間後、培地は化合物１０μＭおよび０．１％ＤＭＳＯ，０．１％ＤＭＳＯ（−ＢＭＰ４）またはＢＭＰ４１００ｎｇ／ｍｌおよび０．１％ＤＭＳＯ（＋ＢＭＰ４）を含むＭＥＦＣＭと４８時間に亘って交換され、その後化合物を含む新鮮な培地に２４時間に亘って交換された（合計化合物処置７２時間）。その後固定され自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。コンフルエントなＨ９及び線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が１０，０００細胞／ウェルで８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を追加されたＭＥＦＣＭ内に植えつけられた。２４時間後細胞は化合物１０μＭおよび０．１％ＤＭＳＯ，０．１％ＤＭＳＯ（−ＢＭＰ４）またはＢＭＰ４１００ｎｇ／ｍｌおよび０．１％ＤＭＳＯ（＋ＢＭＰ４）で処置された。化合物を加えられた新鮮なＭＥＦＣＭが毎日５日間にわたって交換された。５日目にヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は固定され、自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。更なる詳細は補足的実験手順参照。
【００８３】
（奇形腫検定法）
４００，０００のＨ９ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）またはｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰがオス非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの精巣内に注入され、そして奇形腫がＯｃｔ４について前述のように（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）分析された。
【００８４】
（異種移植検定法）      
ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃＳｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ｗｊｌ／ＳｚＪ成体マウス（ＮＳＧマウス）が移植２４時間前に３１５ラドで亜致死性に放射線照射された。化合物またはＤＭＳＯ溶媒で２４時間処置された０．８−１．０ｘ１０７ＡＭＬ単球細胞（ＭＮＣ）または１．５−１．８ｘ１０５系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢ  ｌｉｎ−）造血性細胞が尾静脈経由で注入された（静脈内注射（ＩＶ））。６−１０週間後、動物は殺傷され、そして骨髄と脾臓がヒト細胞の存在についてフローサイトメトリで分析され（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ）そしてデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ）  を使用して分析された。２次的ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）移植に対しては、系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢ  ｌｉｎ−）生着からの同一数の移植ヒト細胞が、前述のように成体放射線照射ＮＳＧマウスに静脈内注射（ＩＶ）で注入された。
【００８５】
（統計的分析）
データは平均値±平均値の標準誤差または平均値±標準偏差で表わされる。グループ間の有意の差異は独立２方向または１方向ｔ検定を使用して決定された。
【００８６】
（多能性幹細胞培養）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ），ｖ１Ｈ９，ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＧＩＢＣＯ  １３２５６−０２）を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地（ＭＥＦＣＭ）を有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートされた（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３２３４）プレート上で培養された。ＭＥＦＣＭはＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ１０８２９−０１８），２０％ＫＯ−血清代替（ＧＩＢＣＯ１０８２８−０２８），１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ１１１４０−０５０）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１１ｍＭ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ７５２２）から構成される。細胞系は１００ユニット／ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（ＧＩＢＣＯ１７１０４−０１９）を２−３分間使用して７日ごとに継代された。細胞蒔き密度、検定法継続期間、および９６ウェル内のＤＭＳＯ溶媒濃度は、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞および正常Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対して最適化された。ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰに対しては、最適初期細胞蒔き密度は７２時間処置に対し５，０００細胞／ウェルがＧＦＰ最大レベルと±ＢＭＰ４対照間のｚ’識別に基づいて選択された。正常ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対しては、最適細胞蒔き密度１０，０００細胞／ウェルが最大ｚ’―プライム識別に基づいて選択された。
【００８７】
（原発性ヒト試料）
単核細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅプレミアム（ＧＥヘルスケア）を使用して調製された。造血性細胞に対しては、ＥａｓｙＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  テクノロジーズ）を使用して系統枯渇化がメーカーの推奨に従って実施された。  
【００８８】
（ＡＭＬ／ＨＰＳＣ細胞培養）
ＡＭＬ細胞系、即ち、ＯＣＩ−ＡＭＬ２（Ｍ４），ＯＣＩ−ＡＭＬ３（Ｍ４），ＨＬ−６０（Ｍ２）およびＭＶ−４−１１（Ｍ５）は５％過熱―非活性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）を加えたロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ）内で培養された。Ｒ（＋）−７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴハイドロブロマイド（Ｓｉｇｍａ）でのドーパミン受容体（ＤＲ）刺激薬研究に対しては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内のドーパミンの蔓延のため（Ｌｉｔｔｌｅ他，２００２）、無血清条件が適用された。ＡＭＬ患者芽細胞が５％過熱非活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ），５ｘ１０−５Ｍ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）およびＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  タクノロジーズ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）内で培養された。ヒト幹細胞（ＨＳＣ）培地は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍＬ  Ｆｌｔ−３Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）  ２０ｎｇ／ｍＬ  トロンボポエチン（ＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含んだ。患者のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料は化合物またはＤＭＳＯ溶媒（０．１％）で２４時間処置され、その後コロニー形成単位（ＣＦＵ）プレーティングや異種移植研究が実施された。
【００８９】
（抗体）
免疫細胞化学に使用された抗体は以下の通り：Ｏｃｔ３／４（ＢＤ  Ｔｒｕｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ＃６１１２０３），Ｓｏｘ２（Ｒ＆Ｄ，  ｃａｔ＃ＡＦ２０１８）。ヒト造血性細胞を検知するため、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−，フィコエリトリン（ＰＥ）−，アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル付きの抗ヒトＣＤ４５が使用された（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＦＩＴＣ抗ＣＤ３３、ＰＥ抗ＣＤ１３、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４１ａ，ＦＩＴＣ抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ドーパミン受容体（ＤＲ），ＰＥ抗ＣＤ１９抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手した。ＰＥ抗ＣＤ１４，ＰＥ抗ＣＤ１５およびＰＥ抗ＧｌｙＡはＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒより入手した。多能性を測定するため、ＰＥ抗ＳＳＥＡ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＥ−またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗Ｏｃｔ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が使用された。ウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体ＤＲＤ１（Ｃａｔ＃３２４３９０），ＤＲＤ２（Ｃａｔ＃３２４３９３），ＤＲＤ３（Ｃａｔ＃３２４４０２），ＤＲＤ４（Ｃａｔ＃３２４４０５），ＤＲＤ５（Ｃａｔ＃３２４４０８），はＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手した。抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は２次抗体として使用された。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手した原発性抗ｐ５３（Ｃａｔ＃２５２７）および抗ｐ２１（Ｃａｔ＃２９４７）ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は固定され透過処理された細胞を染色するのに使用された。抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は２次抗体として使用された。乳癌染色のため、ＡＰＣ抗ＣＤ４４およびＰＥ−ＣＤ２４がＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手された。
【００９０】
（自動画像化および分析）
（腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の画像化）
細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定され、そして１０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）でＣｏｍｂｉ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して染色された。Ｏｃｔ４免疫細胞学に関する実験のためには、Ｏｃｔ４用モノクローナル抗体（ＢＤ）がＡｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７２次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）と共に使用された。免疫細胞学的染色はＪａｎｕｓ自動液体ハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。画像は１０ｘＮ．ＡでＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣＳ  ＶＴＩリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
【００９１】
（正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の画像化）
細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定され、そして１０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。標準的蛍光発光免疫細胞化学技術が、細胞をＯｃｔ４用モノクローナル抗体（ＢＤ）およびＡｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７  ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）で染色するのに使用された。全ての工程はＪａｎｕｓ  自動液体ハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して実施された。画像は５ｘでＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣＳ  ＶＴＩリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
【００９２】
（画像分析）
画像分析はＡｃａｐｅｌｌａソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のカスタムスクリプトを使用して実施された。細胞核物質はヘキスト信号から区分された。腫瘍性細胞系に関しては物体輝度分析が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ポジティブ細胞に対してのみ実施された。正常細胞系に関しては、Ａｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７ポジティブ細胞が定量された。画像およびウェルレベルのデータはＣｏｌｕｍｂｕｓデータベース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で保存されそして分析され、さらにＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）でデータ分析、化合物登録、およびヒット識別が実施された。
【００９３】
（遺伝子発現分析）
特定の条件下の細胞が集められそしてＲＮＡがＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され，相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成され、事前増幅およびＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がメーカー指示通りに実施された。それぞれの処置済み細胞集団の遺伝子発現プロファイルはＴａｑＭａｎ（登録商標）幹細胞多能性アレイカードを使用して、ＶｉｉＡ  ７  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析された。各反応試料はアレイカード上のウェルに搭載され、そして３３６Ｘｇで各１分間２度遠心分離され、密封され、サーマルサイクラーに置かれた。以下のサイクル条件が全てのアレイカードの使用に適用された：４５℃で１０分間、８４℃で１０分間、そして（９４℃で３０秒その後６０℃で１分間）のサイクルを４０回。アレイデータは１８Ｓ  ＲＮＡ及びグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化され、そしてデータ分析２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して比較された。
【００９４】
（メチルセルロースコロニ−形成検定法）
ＡＭＬ患者および系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）細胞が化合物存在下またはＤＭＳＯ溶媒（０．１％）対照で２４時間培養された。ＡＭＬ細胞は５０，０００細胞／ｍＬでＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にプレートされた。系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）細胞は１，０００細胞／ｍＬでＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にプレートされた。コロニーは１４日間の培養後、標準形態基準を使用してスコア付けされた。
【００９５】
（体積測定的細胞カウント）
ドーパミン受容体遮断薬（図１６Ｂ）とドーパミン受容体刺激薬（図１６Ｃ，Ｄ）による７２時間処置後のＡＭＬ−ＯＣＩ２とＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞の存在数は、前方散乱および側方散乱クラスタリングにより定義される格子ストラタジーに従って固定容積内のイベントの数を測定することによりカウントされる、７ＡＡＤ−およびヘキスト＋。
【００９６】
（ヒト乳癌試料処理）
ヒト乳癌試料は、乳房縮小手術から、研究倫理委員会承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学で採取された。乳癌肉片はハサミおよびメスで小さな断片（１ミリ以下）に切断された。その後、３ｍＬのバーゼン液（０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１ｍＬを１Ｌの１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させたもの）および７ｍＬのトリプシン−コラーゲン分解酵素溶液が腫瘍組織１ｇに対して添加され、そして３７℃で３０分間恒温放置された。トリプシン−コラーゲン分解酵素溶液はＲＰＭＩ  １６４０培地（ｇｉｂｃｏ  ＃１１８７５０９３），２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０１６３），１％ファンギゾン抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５２９００１８），２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），３ｍｇ／ｍＬコラーゲン分解酵素Ａ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＃１１０８８７９３００１）および０．１％の２．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５０９０）から構成される。その後２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有する同じ容積のＲＰＭＩ  １６４０が組織懸諾液に添加された。組織懸諾液は４０ミクロンナイロンストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３４０）でフィルターされた。上澄みが廃棄されそして細胞ペレットが２％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％ファンギゾン抗真菌薬を加えた１０ｍＬ  Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｈａｍ  １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３１７６５）に再懸濁された。生存可能細胞が血球計数器およびトリパン（Ｔｒｙｐａｎ）ブルー溶液を使用してカウントされ、そしてフローサイトメトリ用に調製された。抗体染色はウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体を含んだ；ＤＲＤ１（Ｃａｔ＃３２４３９０），ＤＲＤ２（Ｃａｔ＃３２４３９３），ＤＲＤ３（Ｃａｔ＃３２４４０２），ＤＲＤ４（Ｃａｔ＃３２４４０５）およびＤＲＤ５（Ｃａｔ＃３２４４０８）はＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手した。そして抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は、２次抗体として、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手したアロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗ＣＤ４４およびフィコエリトリン（ＰＥ）−ＣＤ２４と共に使用された。
【００９７】
（事例８：腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発する化合物の高生産性スクリーニング識別）  
発明者らは以前に、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、末端分化能力の迷走的遮断と共に自己再生および生存の増大を含む腫瘍性の特徴を示す、変異形ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系について述べた（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）。体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）との機能的特徴の類似性に基づき、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で高含有量高生産性のスクリーニングを許容する、体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）の代理物として試験された。スクリーニングプラットフォームは選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を標的とし、一方正常ｈＰＳＣには殆ど影響しない小分子を識別するように開発された。この分化スクリーニングプラットフォームは、体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とし、一方正常幹細胞（ＳＣ）の能力を残す、強力な候補医薬を識別することができる。
【００９８】
Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の自己再生性多能性状態の喪失と分化の誘発に対する信頼度の高い指標を提供する。腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の誘発された分化の間のＯｃｔ４およびＳｏｘ２の喪失を検知する、より直接的な方法を提供するため、ＧＦＰレポーター系が、ＥＯＳ−ＧＦＰレポーター（それぞれｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰおよびｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）を腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に形質導入することにより形成された（Ｈｏｔｔａ他、２００９）。ＧＦＰ輝度は自己再生の安定性に有利に働く処置およびＢＭＰ４の追加による分化を誘発する条件において、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２発現と相関しているように観察された。この応答は、Ｓｏｘ２レポーター系（ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）のみならず、同じＥＯＳレンチウィルスＧＦＰレポーター（ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）を形質導入された追加の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系、ｖ２Ｈ９（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）を使用して一貫して見られた。
【００９９】
生成された全てのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系における分化に対する均一な応答と多能性の維持はまた、ＥＯＳレポーター形成挿入によるウィルス統合またはクローンの選択は応答性に無関係であることを明らかにした。この結果は、分化を誘発する化合物は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系におけるＧＦＰ輝度の減少に基づいて識別可能であり、そして化学スクリーニングに利用可能であることを示唆した。そのため、自動高含有量顕微鏡法および蛍光定量ベースの高生産性スクリーニングのための条件が、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の多能性マーカー発現の減少を検知するのに使用された。正常ｈＰＳＣの顕微鏡分析では、ＢＭＰ４処置の後、明確なＯｃｔ４＋細胞が消失したことを示した。同様に、腫瘍性Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ｈＰＳＣのＢＭＰ４処置によるＯｃｔ４とＧＦＰの両方の減少は、高含有量顕微鏡法およびプレート読み取り機ベースの蛍光定量法により計量された。癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的とする理想的な候補を識別するため、化合物処置に応答した正常および腫瘍性ｈＰＳＣの両方の分化が並行して評価された。
【０１００】
スクリーニングプラットフォームの有効性を前提として、ＮＩＨクリニカルコレクションおよびカナダ化合物コレクションからの５９０の確立された注釈つきの化合物からなる化学ライブラリーがスクリーニングされた。これらのコレクションは以前に他の多くの哺乳類細胞系において綿密に調査された（Ｄｉａｌｌｏ他，２０１０；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６）。蛍光定量的な高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）および高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォームは、５１の定義された化合物の多能性の喪失（それぞれＧＦＰ  ＲＦＵおよび細胞当り平均ＧＦＰ輝度）および細胞カウント（それぞれヘキストＲＦＵおよび細胞カウント）に対し等価の測定値を与えるという証明に従って、高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）がより高速に化合物ライブラリーをスクリーニングするための好適なプラットフォームとして選択された（図９Ａ）。スクリーニングされた５９０の化合物の中で（従前の研究に基づき１０μＭで（Ｉｎｇｌｅｓｅ他、２００７））、１１の化合物が、ＧＦＰ％残存活性（％ＲＡ）とヘキスト％ＲＡの両方での減少により示されるように、分化を誘発するとして識別された（図９Ｂ−Ｃ）。計４つのこれら化合物、インダトラリン、チオリダジン、アザチオプリン、およびメフロキンが、クラスタリングおよびヘキスト％ＲＡが３０％超であることに基づいて（図９Ｂ）候補化合物として識別された。
【０１０１】
２次的高含有量分析はインダトラリンが疑問のある候補であることを明らかにし、それは除外された。しかし高含有量分析および高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）は共にチオリダジン、アザチオプリン、およびメフロキンが候補化合物であることを確認し（図９Ｄ）、そしてそれら化合物は更なる試験向けに選択された（図９Ｅ−Ｇ）。対照処置ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に比較して、それぞれの化合物は明確な形態的変化を腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に誘発した（図９Ｅ）。ＧＦＰ輝度の減少は、画像分析（図９Ｆ）を使用して確認され、そしてさらにそれぞれの化合物の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を計算するため、広範囲の投与量に亘って評価された（図９Ｇ）。チオリダジンとメフロキンのみが１０μＭの目標閾値より低いＥＣ５０値を有し（図９Ｇ）、それにより、それら化合物は患者からの腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を使用する更なる詳細な評価向けの候補として定義された。
【０１０２】
（事例９：チオリダジンは選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発し、そして正常造血性幹／前駆細胞に影響を与えずにヒトＡＭＬ芽細胞を減少させる）
Ｏｃｔ４の喪失を検知しそして分化の程度を明らかにするため、チオリダジンとメフロキンに対する応答が、正常（図１０Ａ）および腫瘍性（図１０Ｂ）のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の両方で、３つの濃度で定量的フローサイトメトリを使用して評価された。乳癌幹細胞の既報告の選択的抑制薬（Ｇｕｐｔａ他，２００９）のサリノマイシンが比較のため含まれた。１０μＭでは、全ての化合物が細胞数を減少させた。しかし、残存正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内のＯｃｔ４レベルはＢＭＰ４処置で観察されたレベルを下回らなかった（図１０Ａ）。これと同一の応答が、明確な成体由来の追加の正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系を代表する線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）で再現され（図１１Ａ）、このことは、効果が胚性起源に特異ではないことを示唆した。同じ化合物が腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の処置に使用された場合、チオリダジンとメフロキン処置は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内の細胞数とＯｃｔ１４のレベルの減少をもたらした。チオリダジンだけがＯｃｔ４のレベルをＢＭＰ４分化対照以下に減少させることができ（図１０Ｂ）、これはチオリダジンが腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化阻害に打ち勝つ能力が有ることを示唆した。この応答を確認するため、全ての化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する網羅的な投与量応答が実施された（図１１Ｂ）。
【０１０３】
選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を分化させる化合物を定量的に識別するために、これらの化合物に応答したＯｃｔ４＋細胞の正規化％の正常ｈＰＳＣと腫瘍性ｈＰＳＣの間の比率が測定された。例えば、比率１は分化が同等であることを意味し、一方比率＞１は、正常ｈＰＳＣに対して腫瘍性ｈＰＳＣの方が、分化が相対的に多いことを意味する。チオリダジンだけが、１μＭと１０μＭの両方で正常ｈＰＳＣに対する腫瘍性ｈＰＳＣの分化に有意のインパクトを与えた（図１０Ｃ）。細胞ストレスマーカーｐ５３（図１０Ｄ）およびその転写ターゲットｐ２１（図１０Ｅ）の速い蓄積が、さらに分化誘発を細胞毒性から区別するのに使用された。腫瘍性ｈＰＳＣの毒性化学治療薬エトポシドによる処置は、２４時間後に高レベルのｐ５３とｐ２１をもたらした。しかし１０μＭのチオリダジンまたはＢＭＰ４の処置は、毒性だけを誘発する薬剤と異なり、ｐ５３またはｐ２１の蓄積を生じなかった。このことはストレス応答プログラムよりはむしろ誘発された分化と一貫性があった。さらにチオリダジン処置は腫瘍性ｈＰＳＣ内に分化遺伝子の発現をもたらし、それはＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ−ｑＰＣＲにより定量化された。処置された腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内で、分化に伴う遺伝子５０種類の内２１種類において増加が観察され（図１０Ｆ）、それはチオリダジンの分化誘発効果と一貫性があった。
【０１０４】
化学的応答における腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する潜在的類似性を検証するため、ヒト造血性システムの正常および腫瘍性集団が評価された。実験的に、ヒト造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の両方の自己再生および分化は、造血性システムにユニークに使用可能な、強力で確立された生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）検定法により調査可能である。それにより、それを、正常および腫瘍性ｈＰＳＣを抗癌幹細胞（ＣＳＣ）化合物の１次スクリーニングツールとして使用するという潜在的代理性を評価するための理想的な組織にしている。系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）は造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）を高度に豊富に含み、そして、自己再生と全ての血液系統への多系統分化ができる正常体細胞性幹細胞（ＳＣ）の信頼度の高い供給源である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、自己再生する白血病幹細胞（ＬＳＣ）により維持される成熟骨髄の分化阻害を特徴とする血液性腫瘍である（ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋ，１９９７；Ｌａｐｉｄｏｔ他，１９９４）。
【０１０５】
このように、メチルセルロース内の前駆体検定法が造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）と５つの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者試料で実施された；各試料は各化合物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のクローン原性および多重系統造血性分化に対するインパクトを評価するため、チオリダジン、メフロキンまたはサリノマイシンで処置された。全コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＨＳＰＣ（図１０Ｇ）およびＡＭＬ（図１０Ｈ）から生成され、それぞれの化合物で処置された代表的細胞ペレットが示される。チオリダジン処置はＡＭＬの増殖／クローン原性能力を低減させ、一方でＨＳＰＣの多重系統分化を維持した（図１１Ｃ）。多重系統分化における変化は、これら化合物でＨＳＰＣ試料（図１０Ｉ）およびＡＭＬ患者試料（図１０Ｊ）を処置した後に形成されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の列挙に基づいて定量化された。１μＭと１０μＭの両方でサリノマイシンはＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを減少させたが（図１０Ｊ）、しかし同時に、全ての試験投与濃度でＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャルを減少させ（図１０Ｉ）、このことは、造血性システムにおける非特異的毒性を示唆した。対照的に、チオリダジンおよびメフロキンはＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵ形成を減少させたが（図１０Ｊ）、一方でＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャル（図１０Ｉ）および多重系統構成（図１１Ｄ）に殆ど影響せず、このことは、チオリダジンおよびメフロキンは正常な造血を変化させないことを示唆した。
【０１０６】
識別された化合物の臨床用に最も望まれる結果は、ＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵ形成の優先的消滅と、一方で正常造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）の前駆体能力を維持することである。ＡＭＬを標的とするための最高の選択性を明らかにするため、ＨＳＰＣから生成された全ＣＦＵに対するＡＭＬ−芽細胞の比率が計算された（図１０Ｋ）。比率１は正常前駆体と腫瘍性前駆体のポテンシャルが等しいことを意味する。比率＞１は選択的にＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを減少させる化合物を定義する。サリノマイシン（１μＭ）、メフロキン（１０μＭ）およびチオリダジン（１０μＭ）投与はそれぞれの化合物に対する最高の比率値を示し（図１０Ｋ）、そして生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）評価向けに選択された。チオリダジン１０μＭは、特に、全ての化合物のなかで最高比率を示したが、しかし最も重要なのは、正常ＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャルに比較して有意に低いＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを示した唯一の化合物である点である（図１０Ｋ）。
【０１０７】
ＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵのクローン原性ポテンシャルを減少させるチオリダジンの特殊性が分化の誘発に起因するものかを議論するため、チオリダジン処置に応答した、患者ＡＭＬ細胞内の顆粒球性成熟マーカーＣＤ１１ｂの出現頻度が検定された（図１０Ｌ）。顆粒球性ＡＭＬ−芽細胞の発現頻度の顕著な増加は、処置の期間観察され（図１０Ｌ）、それはチオリダジンがそのＡＭＬ細胞の特異的標的化を分化の誘発を介して表わすことを示唆している。この発見は、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においてみられた分化誘発に類似しており、そしてこのスクリーニングプラットフォームの、腫瘍性細胞を分化させることができる薬剤を識別することに対する強力な読み出しを確認する。この結果はまた、チオリダジンがＡＭＬ癌幹細胞（ＣＳＣ）の特異的標的化に対する最良の候補であり、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ヒトーマウス異種移植検定法を使用した試験が必要であることを示唆する。
【０１０８】
（事例１０：チオリダジンは白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を減少させ、一方で正常造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）を残す）
生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検知されたＡＭＬ−芽細胞の抑制が、腫瘍性幹細胞区画に影響する化合物に起因するかを描写するため、機能的に白血病幹細胞（ＬＳＣ）および造血性幹細胞（ＨＳＣ）を定義する異種移植研究（Ｄｉｃｋ，２００８）が実施された（図１２）。造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）のサリノマイシン（１μＭ）による処置は造血性生着をほぼ検知不能レベルにまで減少させ（図１３Ａ）、そのことはこの化合物がＨＳＰＣからの正常造血に干渉することを明示し、そしてこの化合物は所望の抗癌幹細胞（ＣＳＣ）の選択的標的化を提供する可能性が低いため、さらなる評価から除外された。対照的に、メフロキン（１０μＭ）処置は、僅かな、しかし有意とは言えない、造血性幹細胞（ＨＳＣ）能力の減少を対照に比較して示した（図１２Ａ）。しかしメフロキンはＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）能力の減少には効果が無いことが判り、従って選択的効果が欠如しているため、さらなる評価を中断された（図１２Ｃ）。
【０１０９】
サリノマイシンとメフロキンの両方と対照的に、ＨＳＰＣのチオリダジン（１０μＭ）での処置は対照溶媒処置細胞と同じ骨髄生着（図１２Ａ）と脾臓生着（図１３Ｂ）のレベルを示した。多重系統再構成能力は対照とチオリダジン処置ヒト造血性幹細胞（ＨＳＣ）で同一であり、骨髄性（図１２Ｂ）、リンパ系（図１２Ｂ）、赤血球系（図１３Ｄ）、および巨核球性発現（図１３Ｄ）は全く影響されなかった。一連の２次的生着で測定されたように、チオリダジン処置は対照処置試料にくらべて造血性幹細胞（ＨＳＣ）自己再生に影響を与えなかった（図１３Ｆ）。しかしサリノマイシンとメフロキンと全く対照的に、チオリダジン処置は白血病疾病開始ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有意に減少させた（図１２Ｃ−Ｄ；図１３Ｃ；図１３Ｅ）。
【０１１０】
ＨＳＰＣ正常造血性再生（％ｈＣＤ４５＋）対ＡＭＬ白血病誘発（％ＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋芽細胞）比率の計算は、チオリダジンが白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を有意に減少させ、一方で正常造血性幹細胞（ＨＳＣ）能力を保持することを明らかにした（図１２Ｅ）。チオリダジンが無い場合、２次移植レシピエントの白血病生着レベルに差が無いことが観察された。このことは、２次レシピエントにとってこの化合物への連続的暴露が白血病誘発を抑制するのに必要であることを示唆した。これらのデータは，生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でチオリダジンが体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とし、一方で正常幹細胞機能には影響を与えないことを示した。チオリダジンが正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用する新規の分化スクリーニングプラットフォームの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用を介して識別されたため、チオリダジンの機能的効果は、体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）を理解するのにヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用することの予測的価値の事例を提供する。
【０１１１】
（事例１１：ドーパミン受容体はヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）を明確に分離する）
チオリダジンはドーパミン受容体（ＤＲ１−５）を介して作用することが知られている（ＢｅａｕｌｉｅｕおよびＧａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ，２０１１；ＳｅｅｍａｎおよびＬｅｅ，１９７５）。正常幹細胞に比較してヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に選択的に干渉するチオリダジン作用のメカニズムがドーパミン受容体遮断性を介したものなのかを評価するため、ドーパミン受容体（ＤＲ）の細胞表面発現が分析された。現在までに、５つのドーパミン受容体（ＤＲ）が識別され、そしてＤ１ファミリー受容体（Ｄ１とＤ５）とＤ２ファミリー受容体（Ｄ２，Ｄ３およびＤ４）に分けられた（ＳｉｂｌｅｙおよびＭｏｎｓｍａ，１９９２）。多能性マーカーＳＳＥＡ３を発現する正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）はドーパミン受容体（ＤＲ）発現を欠く（図１４Ａおよび図１５Ａ−Ｂ）。対照的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は５種類全てのドーパミン受容体（ＤＲ）を発現した（図１４Ｂ）。観察された腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対するドーパミン受容体（ＤＲ）の差別的な発現とチオリダジンの選択的抑制は、ドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングの抑制が、正常幹細胞（ＳＣ）と比較したヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する選択的標的化に役割を果たしている可能性を示唆する。
【０１１２】
チオリダジン処置の機能的役割に基づいた、癌幹細胞（ＣＳＣ）におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の潜在的役割を拡大するため、我々はドーパミン受容体（ＤＲ）遮断がチオリダジン処置後の白血病幹細胞（ＬＳＣ）の機能喪失を説明できるかを検討した。造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）そして正常臍帯血（ＣＢ）からのヒト造血性単核細胞（図１５Ｃ−Ｆ）及びＡＭＬ患者試料（図１４Ｄおよび図１５Ｇ）におけるＤＲ１−５の発現が分析され（図１４Ｃ）た。ドーパミン受容体（ＤＲ）は、臍帯血の原始造血性幹細胞（ＨＳＣ）または前駆体集団（それぞれＣＤ３４＋３８−またはＣＤ３４＋３８＋として識別される（Ｂｈａｔｉａ他，１９９７））では観察されなかった（図１４Ｃ）。これは造血性幹細胞（ＨＳＣ）および前駆体はチオリダジンの標的を発現しないことを示唆した。
【０１１３】
同様に、ドーパミン受容体（ＤＲ）は、赤血球系（図１５Ｃ）、巨核球性（図１５Ｃ）およびリンパ系細胞（図１５Ｄ）では検知不能であった。ＣＤ１４＋として定義される単球およびＣＤ１５＋として定義される顆粒球集団の半分のみがドーパミン受容体（ＤＲ）を発現した（図１５Ｅ−Ｆ）。分析された全ての１３のＡＭＬ患者試料が５種類全ての受容体の異なるレベルを有するＤＲ＋芽細胞の集団を含み、そしてそれらはＣＤ３４＋／ＣＤ１４＋細胞において優勢に検知された（図１５Ｇ）。しかし、正常造血性幹細胞（ＨＳＣ）と異なり、ＣＤ３４＋細胞はヒトＡＭＬにおける白血病幹細胞（ＬＳＣ）能力と相関せず（Ｔａｕｓｓｉｇ他，２００８）、そして近年ＣＤ３４またはＣＤ３８を欠く多くの細画分で識別された（Ｅｐｐｅｒｔ他、２０１１）。正常およびＡＭＬヒト造血性試料におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の差別的発現は、ヒトＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）が不均一であり、薬剤標的化は代替表現型の叙述ではなく分子経路に基づくべきであることを強く示唆した。
【０１１４】
造血性組織は別として、ヒト乳癌において体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）が最近識別され検証され、そしてＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ表現型を持つ（Ａｌ−Ｈａｊ他，２００３）。エストロゲン受容体にネガティブ（ＥＲ−），プロゲステロン受容体にネガティブ（ＰＲ−）およびヒト上皮成長因子受容体２遺伝子（ＨＥＲ２−）にネガティブの結果の、最悪の予後不良を伴うヒト原発性乳癌を使用して（Ｄｅｎｔ他，２００７）、我々はドーパミン受容体（ＤＲ）がＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ乳癌幹細胞と共局在することを明らかにする（ｎ＝３患者）（図１４Ｅ−Ｆおよび図１５Ｈ）。この発見は正常乳腺組織で発見された低レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）と矛盾せず、一方良性乳房腫瘍はこれら受容体の中間レベルを示し、乳癌はこれら受容体の高いレベルを示す（Ｃａｒｌｏ，１９８６）。
【０１１５】
ＡＭＬ芽細胞におけるドーパミン受容体（ＤＲ）発現がＡＭＬ患者における白血病幹細胞（ＬＳＣ）出現率に相関するか否かが調査された。ＤＲＤ３＋芽細胞およびＤＲＤ５＋芽細胞の大きな断片を持つＡＭＬ試料は、白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有しない、有意に低いレベルのドーパミン受容体（ＤＲ）を有するＡＭＬ患者試料と異なり、それらが異種移植レシピエントにおいて白血病を開始することができるため、白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有した。白血病幹細胞（ＬＳＣ）を含むＡＭＬ患者試料は予後不良と相関し、一方ＬＳＣを含まない試料は良好な予後を示した（Ｅｐｐｅｒｔ他，２０１１）。高レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）出現は予後不良と相関し、一方低レベルのＤＲ出現は良好な予後を示した（図１４Ｇ−Ｈ）。これはドーパミン受容体（ＤＲ）評価が予後バイオマーカーとしての用途を持ち、そしてそれぞれのＡＭＬ患者に対する分子署名または白血病幹細胞（ＬＳＣ）カウントより単純であることを示唆する。当初の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）での識別にもとづき、これら全体の結果は、ヒト体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）におけるドーパミン受容体（ＤＲ）出現に対し、予期したものに比べ潜在的により一般化した役割の存在を示唆し、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）を他のヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するバイオマーカー候補として認定する。
【０１１６】
（事例１２：チオリダジンのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断はヒトＡＭＬを抑制する）
ヒトＡＭＬ内のドーパミン受容体（ＤＲ）の機能的役割をよりよく理解するため、患者由来の２種類のＡＭＬ細胞系；ＡＭＬ−ＯＣＩ２とＡＭＬ−ＯＣＩ３が使用された（Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ他，２００１）。
【０１１７】
原発性試料のように、これら２種類の細胞系は各ＤＲ１−５（図１６Ａ）に対し患者試料よりはるかに高いレベルの発現を示した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内のドーパミンの生物学的利用能に起因して（Ｌｉｔｔｌｅ他，２００２）、ＡＭＬ内のドーパミン受容体（ＤＲ）の役割を評価するのに無血清条件が採用された。両方のＡＭＬ系はチオリダジン処置され、そして他の既知のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬クロザピンおよびクロルプロマジンと比較された（ＳｅｅｍａｎおよびＬｅｅ，１９７５）。３つの全てのＤＲ遮断薬は処置後ＡＭＬ細胞数を減少させた（図１６Ｂ）。ドーパミン受容体（ＤＲ）のヒトＡＭＬ細胞を標的化する特異性を評価するため、患者ＡＭＬ試料はＤＲ＋とＤＲ−細画分に蛍光活性化細胞振り分けにより分割され、その後ＤＭＳＯ溶媒またはチオリダジンで２４時間処置され、その後、芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）の内容について検定された。
【０１１８】
芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）形成の減少はチオリダジン処置ＤＲ＋細画分にのみ見られた（図１７Ａ）、一方チオリダジン処置ＤＲ−細画分では見られなかった（図１７Ｂ）。逆に、ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ２ファミリー刺激薬７ＯＨ−ＤＰＡＴの追加は、ＡＭＬ細胞を増加させた（図１６Ｃ）。ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ２ファミリーおよびＤ１ファミリーは、反対の作用を細胞間シグナリングに加え、その結果異なる生物学的効果をもたらす（Ｓｅｌｆ他，１９９６）。ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ１ファミリー刺激薬ＳＫＦ３８３９３による処置はＡＭＬ細胞を有意に減少させ、それはＤ２ファミリーシグナリングがＡＭＬ細胞の生存に必要であることを確認した（図１６Ｄ）。これらの結果を組み合わせて、チオリダジンの作用のメカニズムはＤ２ファミリードーパミン受容体（ＤＲ）の遮断によるものであり、標的を外したためではないことを示唆し、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングを介した癌幹細胞（ＣＳＣ）標的化の新規の道を識別したことを示唆する。
【０１１９】
本発明は現在好適であると見做される事例を参照して記述されてきたが、本発明は開示された事例に制限されないことを理解するべきである。逆に、本発明は請求項の精神と範囲に含まれる種々の変化形および等価のアレンジメントに及ぶことを意図している。
【０１２０】
全ての刊行物、特許および特許申請は、あたかもそれぞれの刊行物、特許および特許申請が特異的にかつ個別にその全体が参照により採り入れられるように、その全てがここに参照により採り入れられる。
【０１２１】
（参照）
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【図１】
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【図２】
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【図３−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−８】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｇ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｈ】
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【図１０Ｉ−Ｌ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ−Ｅ】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３Ｄ−Ｆ】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１４Ｄ−Ｆ】
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【図１４Ｇ−Ｈ】
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【図１５Ａ−Ｃ】
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【図１５Ｄ−Ｆ】
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【図１５Ｇ−Ｈ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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