(57)【要約】  本発明は、成体ドナー由来の骨髄細胞を使用して、マウスにおいて多数の多様な機能性ナイーブＴ細胞を生成する、動物モデルおよび方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物であって、（ａ）亜致死全身照射で処置されたレシピエント免疫不全動物と、（ｂ）前記レシピエント動物の腎臓被膜下に移植される、Ｔ細胞が枯渇している胎児胸腺組織と、（ｃ）成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞とを含み、前記胎児胸腺組織および前記ＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、非ヒト動物。
【請求項２】
胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物であって、
（ａ）ステップ（ｂ）もしくはステップ（ｃ）の前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、
（ｂ）前記レシピエント動物に、Ｔ細胞が枯渇している胎児胸腺組織を移植することと、
（ｃ）前記レシピエント動物に、ある量の成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を投与することと、を含む方法によって作製され、前記胎児胸腺組織および前記ＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、
非ヒト動物。
【請求項３】
前記胎児胸腺組織は、採取後に凍結保存し、埋め込み前に解凍することによって、Ｔ細胞を枯渇させられる、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
レシピエント動物は、マウス、ラット、またはブタである、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記胎児胸腺組織は、ヒト胎児胸腺組織であり、前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、ヒトのものである、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記レシピエント動物は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、またはＮＳＧマウスである、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記モデルは、ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋細胞の存在によって特徴付けられる、回復したＴ細胞表現型を呈する、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
前記レシピエント動物は、末梢多系統細胞の再構成を呈する、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、Ｉ型糖尿病を患うヒトドナーに由来する、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
前記動物レシピエントは、任意で、抗ＣＤ２  ｍＡｂで処置される、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、静脈内注射によって投与される、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
同種移植片ドナーのＣＤ３４＋細胞または造血細胞移植（ＨＣＴ）レシピエントのＣＤ３４＋細胞をさらに含み、前記同種移植片ドナーのＣＤ３４＋細胞およびＨＣＴレシピエントのＣＤ３４＋細胞は、前記レシピエント動物において、前記成体骨髄ドナーならびに前記同種移植片ドナーまたはＨＣＴレシピエントの両方に寛容性であるＴ細胞を生成するために、互いに相互に寛容性であるＴ細胞を前記レシピエント動物において生成するように、前記胎児胸腺組織および前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞と、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）ステップ（ｂ）もしくはステップ（ｃ）の前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、
（ｂ）前記レシピエント動物に胎児胸腺組織を移植することであって、前記ヒト胎児胸腺組織はＴ細胞が枯渇していることと、
（ｃ）１〜５×１０^５の成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を投与することと、を含み、前記胎児胸腺組織および前記ＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、
方法。
【請求項１４】
前記胎児胸腺は、採取後に凍結保存し、埋め込み前に解凍することによって、Ｔ細胞を枯渇させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
レシピエント動物は、マウス、ラット、またはブタである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記胎児胸腺組織は、ヒト胎児胸腺組織であり、前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、ヒトのものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記レシピエント動物は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、またはＮＳＧマウスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記マウスモデルは、ヒト胸腺リンパ球形成を支持するか、主にナイーブなＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋細胞の存在によって特徴付けられる回復したＴ細胞表現型を呈するか、末梢多系統細胞の再構成を呈するか、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、Ｉ型糖尿病を患うヒトドナーに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物レシピエントは、任意で、抗ＣＤ２  ｍＡｂで処置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
１〜５×１０^５の同種移植片ドナーのＣＤ３４＋細胞または１〜５×１０^５のＨＣＴレシピエントのＣＤ３４＋細胞を投与することであって、前記同種移植片ドナーのＣＤ３４＋細胞およびＨＣＴレシピエントのＣＤ３４＋細胞は、前記レシピエント動物において、前記成体骨髄ドナーならびに前記同種移植片ドナーまたはＨＣＴレシピエントの両方に寛容性であるＴ細胞を生成するために、互いに相互に寛容性であるＴ細胞を、前記レシピエント動物において生成するように、前記胎児胸腺組織および前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞と、ＨＬＡ対立遺伝子を共有することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
投与は、静脈内注射によって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、遺伝子修飾を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒト成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、遺伝子修飾を有し、それによって、前記ヒト成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋に由来する前記Ｔ細胞が、前記成体ドナーに留まるウイルスに耐性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子修飾は、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ４、またはこれらの組み合わせのノックダウンまたは突然変異体を含み、それによって、前記成体ドナーのＣＤ３４＋細胞に由来する前記Ｔ細胞は、ＨＩＶに対する感受性が低くなるか、またはそれに対して耐性となる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
対象とされる抗原に対して特異性を有するＴ細胞を増殖させるための方法であって、請求項１３に記載のステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、およびステップ（ｃ）を含み、（ｄ）対象とされる抗原を前記動物モデルに投与し、それによって前記Ｔ細胞に前記抗原を認識させること、をさらに含み、ステップ（ｄ）は、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、もしくはステップ（ｃ）の前に、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、もしくはステップ（ｃ）と同時に、またはステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、およびステップ（ｃ）の後に行われる、方法。
【請求項２７】
対象とされる抗原をさらに含み、それによって、前記対象とされる抗原に対して特異性を有するＴ細胞を増殖させる、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項２８】
請求項１１に記載のステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、およびステップ（ｃ）を含み、（ｄ）制御性Ｔ細胞を分化させるために、前記動物モデルを抗原に暴露すること、をさらに含む、Ｔ細胞を分化させるための方法。
【請求項２９】
暴露は、ＡＰＣ、またはサイトカイン、またはこれらの組み合わせを、前記非ヒト動物に投与することを介して行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象において、胸腺欠乏、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、自己免疫疾患、またはこれらの組み合わせを治療または予防するための方法であって、請求項１または請求項２に記載の動物モデルにおいて生成したヒトＴ細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物において生成される、単離したＣＤ４、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、または樹状細胞、またはこれらの組み合わせ。
【請求項３２】
請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物において生成される、次の細胞のうちのいずれか１つ以上を含む、薬学的組成物：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、または樹状細胞。
【請求項３３】
前記生成される細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、または樹状細胞である、請求項３１に記載の単離細胞。
【請求項３４】
前記生成さるた細胞は、ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
対象における免疫関連または免疫媒介性障害または疾患を治療するための方法であって、請求項１または請求項２に記載の動物モデルにおいて生成されるＴ細胞を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
前記抗原は、腫瘍特異性抗原もしくは腫瘍に由来するもの、またはウイルス抗原、または自己抗原である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
自己腫瘍に対する癌患者の免疫応答を増加させるための方法であって、請求項２６に記載の方法によって生成された、ある量のヒトＴ細胞を、癌患者に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
ＥＢＶ、または日和見感染症によって引き起こされるリンパ増殖性疾患を患う免疫抑制された個体を治療するための方法であって、請求項２６に記載の方法によって生成された、ある量のＴ細胞を、前記免疫抑制された個体に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
免疫抑制された個体においてＥＢＶによって引き起こされるリンパ増殖性疾患を治療するための方法であって、請求項２６に記載の方法によって生成されたＴ細胞を、前記免疫抑制された個体に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記個体は、ＨＩＶ感染または免疫抑制処置のために免疫抑制されている、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＥＢＶによって引き起こされる前記リンパ増殖性疾患は、移植後のリンパ増殖性疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記日和見感染症は、ＣＭＶ疾患、アスペルギルス症、またはこれらの組み合わせである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記レシピエント動物は、２．５Ｇｙでγ線照射される、請求項１３に記載の方法。
【請求項４４】
対象への薬物または治療の効果を判定するための方法であって、（ａ）請求項１に記載の動物モデルに薬物または治療を施すことと、（ｂ）前記再構成された対象の免疫系に対する前記薬物または治療の前記効果を判定し、前記再構成された免疫系に対する前記薬物または治療の前記効果は、前記対象の前記免疫系に対する前記薬物または治療の前記効果を示すことと、を含む、方法。
【請求項４５】
皮膚同種移植片拒絶を調節する免疫抑制剤を特定するためのインビボ方法であって、（ａ）請求項１に記載の動物に、皮膚同種移植片を移植することと、（ｂ）前記動物に候補薬剤を投与することと、（ｃ）前記皮膚同種移植片が、前記候補薬剤の存在下および非存在下において、前記動物によって拒絶されたかどうかを判定し、それによって、前記薬剤の存在下での拒絶の抑制の判定により、免疫抑制剤を特定することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、２０１０年１２月３１日に出願された米国出願第６１／４２８，９４９号、２０１１年３月１８日に出願された米国出願第６１／４５４，２６６号、および２０１１年９月９日に出願された米国出願第６１／５３２，９５０号の優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの参考文献の開示は、本明細書に記載される本発明の日付において、当業者に知られる最先端技術をより完全に説明するために、参照によって、それらの全体が本出願に組み込まれる。
【０００３】
本特許開示は、著作権保護の対象である資料を含む。著作権保有者は、米国特許商標局の包袋または記録に見られるように、特許文献または特許開示が誰によって複製されることにも異議は無いが、他の点ではあらゆる著作権を保有する。
【０００４】
ヒト免疫系は、依然として完全に理解されておらず、自己免疫疾患等、免疫系における欠陥が関係する非常に多数の疾患が存在する。多数の自己免疫疾患は、自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。このような疾患および障害の治療的処置に有用であり得る、ナイーブＴ細胞の多様なプールを提供する方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
ある特定の態様において、本発明は、胸腺リンパ球形成を含むがこれに限定されない、免疫系の再構成を支持する動物モデルを提供し、この非ヒト動物モデルは、（ａ）任意で、例えば、限定されないが、少量または亜致死量、例えば、限定されないが、１〜１．５Ｇｙの範囲、１．５〜４Ｇｙの範囲、１〜４Ｇｙの範囲、２．５Ｇｙの照射での処置、またはブスルファンの使用によって、例えば、移植の同日、移植の１日前、１．５日前、２日前に、前処置される、レシピエント免疫不全非ヒト動物と、（ｂ）レシピエントマウスの腎臓被膜下に移植される、生存Ｔ細胞が枯渇させられている胎児胸腺組織と、（ｃ）成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞と、を含み、胎児胸腺組織およびＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する。
【０００６】
ある特定の態様において、本発明は、ヒト胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物であって、（ａ）任意で、例えば、限定されないが、少量または亜致死量、例えば、限定されないが、１〜１．５Ｇｙの範囲、１．５〜４Ｇｙの範囲、１〜４Ｇｙの範囲、２．５Ｇｙの照射での処置、またはブスルファンの使用によって、例えば、移植の同日、移植の１日前、１．５日前、２日前に、前処置される、レシピエント免疫不全動物と、（ｂ）レシピエント動物の腎臓被膜下に移植される、Ｔ細胞が枯渇しているヒト胎児胸腺組織と、（ｃ）ヒト成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞と、を含み、ヒト胎児胸腺組織およびヒトＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、非ヒト動物を提供する。
【０００７】
他の態様において、本発明は、（ａ）ステップ（ｂ）もしくはステップ（ｃ）の前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、（ｂ）レシピエント動物に、Ｔ細胞が枯渇している胎児胸腺組織を移植することと、（ｃ）例えば、限定されないが、１〜５×１０5の成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を投与することと、を含む方法によって作製され、胎児胸腺組織およびＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、動物モデルを提供する。
【０００８】
ある特定の実施形態において、本動物モデルは、抗原をさらに含み、それによって、所望される特異性を有するＴ細胞が増殖する。
【０００９】
ある特定の実施形態において、動物は、少量または亜致死量、例えば、限定されないが、１〜１．５Ｇｙの範囲、１．５〜４Ｇｙの範囲、１〜４Ｇｙの範囲、２．５Ｇｙの照射での処置、またはブスルファンを使用して、例えば、移植の同日、１日前、１．５日前、２日前に、前処置される。ある特定の実施形態において、レシピエント動物は、任意の好適な動物、例えば、限定されないが、マウス、ラット、またはブタである。
【００１０】
ある特定の実施形態において、胎児胸腺組織は、ヒト胎児胸腺組織であり、成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、ヒトのものである。ある特定の実施形態において、胎児胸腺組織は、任意の好適な動物、例えば、限定されないが、イヌ、ウマ、ネコ、ブタの胎児胸腺組織に由来する。他の実施形態において、成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、任意の好適な動物、例えば、限定されないが、イヌ、ウマ、ネコ、ブタの胎児胸腺組織に由来する。ある特定の実施形態において、レシピエント動物は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、またはＮＳＧマウスである。
【００１１】
ある特定の実施形態において、マウスモデルは、ヒト胸腺リンパ球形成を支持するか、主にナイーブなＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋細胞の存在によって特徴付けられる、回復したＴ細胞表現型を呈するか、末梢多系統細胞の再構成を呈するか、またはこれらの任意の組み合わせであり、マウスモデルの特徴は、本明細書において、特に実施例２で説明される。
【００１２】
ある特定の実施形態において、成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞は、Ｉ型糖尿病を患うドナーに由来する。ある特定の実施形態において、投与は、静脈内注射によって行われる。
【００１３】
ある特定の実施形態において、動物モデルは、１〜５×１０5の同種移植片ドナーのＣＤ３４＋細胞、または１〜５×１０5の造血細胞移植（ＨＣＴ）レシピエントのＣＤ３４＋細胞をさらに含み、同種移植片ドナーのＣＤ３４＋細胞およびＨＣＴレシピエントのＣＤ３４＋細胞は、レシピエント動物において、成体骨髄ドナーならびに同種移植片ドナーまたはＨＣＴレシピエントの両方に寛容性であるＴ細胞を生成するために、互いに相互に寛容性であるＴ細胞を再構成するように、胎児胸腺組織および成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞と、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する。
【００１４】
ある特定の態様において、本発明は、（ａ）ステップ（ｂ）もしくはステップ（ｃ）の前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、（ｂ）レシピエント動物に、Ｔ細胞が枯渇しているヒト胎児胸腺組織を移植することと、（ｃ）例えば、限定されないが、１〜５×１０5の成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を、投与することと、を含み、胎児胸腺組織およびＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、胸腺リンパ球形成の動物モデルを作製するための方法を提供する。
【００１５】
ある特定の実施形態において、成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を含むがこれに限定されないＣＤ３４＋細胞は、遺伝子修飾を有する。ある特定の実施形態において、遺伝子修飾は、成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞が、成体ドナーに留まるウイルスに耐性になるようなものである。
【００１６】
ある特定の態様において、本発明は、（ａ）ステップ（ｂ）もしくはステップ（ｃ）の前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、（ｂ）レシピエント動物に、Ｔ細胞が枯渇しているヒト胎児胸腺組織を移植することと、（ｃ）動物モデルに、例えば、限定されないが、１〜５×１０5の成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を投与することと、を含み、胎児胸腺組織およびＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有し、さらに、（ｄ）動物モデルに抗原を投与し、それによって、Ｔ細胞に抗原を認識させることを含み、ステップ（ｄ）は、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、もしくはステップ（ｃ）の前に、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、もしくはステップ（ｃ）と同時に、またはステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、およびステップ（ｃ）の後に行われる、所望の特異性を有するＴ細胞を増殖させるための方法を提供する。
【００１７】
ある特定の態様において、本発明は、（ａ）ステップ（ｂ）もしくはステップ（ｃ）の前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、（ｂ）レシピエント動物に、Ｔ細胞が枯渇しているヒト胎児胸腺組織を移植することと、（ｃ）例えば、限定されないが、１〜５×１０5の成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞を投与することと、を含み、胎児胸腺組織およびＣＤ３４＋細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を共有し、さらに、（ｄ）制御性Ｔ細胞の分化を促す方法で、動物モデルを抗原に暴露させることを含み、ステップ（ｄ）は、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、もしくはステップ（ｃ）の前に、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、もしくはステップ（ｃ）と同時に、またはステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、およびステップ（ｃ）の後に行われる、Ｔ細胞を分化させるための方法を提供する。ある特定の実施形態において、暴露は、ＡＰＣ、サイトカイン、またはこれらの組み合わせを介して行われる。
【００１８】
他の態様において、本発明は、胸腺不足、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、自己免疫疾患、またはこれらの組み合わせの治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の動物モデルにおいて生成されたヒトＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【００１９】
動物モデルにおいて生成された、単離したＣＤ４、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、または樹状細胞、またはこれらの組み合わせを、本明細書に記載する。本発明は、（例えば、ナイーブもしくはメモリーの表現型によって、または特定の特異性を有するＴ細胞を特定する四量体を使用して特異性によって選択される）ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞のサブセットの生成を提供する。
【００２０】
本発明は、同種ヒト胎児胸腺移植片において、成体骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞から、ヒト胸腺リンパ球形成のヒト化マウスモデルを提供し、本マウスモデルは、例えば、移植の同日、１日前、１．５日前、２日前に、少量または亜致死量、例えば、限定されないが、１〜１．５Ｇｙの範囲、１．５〜４Ｇｙの範囲、１〜４Ｇｙの範囲、２．５Ｇｙの照射で照射するか、またはブスルファンで処置した、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧマウス、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯと、レシピエントマウスの腎臓被膜下に移植される、胎児成熟Ｔ成熟Ｔ細胞が枯渇しているＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織と、を含むか、本質的にそれらから構成されるか、またはそれらから構成され、非限定的な実施形態において、移植される胸腺は、移植の前に凍結保存して解凍し、成体骨髄ドナーに由来するＨＬＡ型判定済みＣＤ３４＋細胞を静脈内投与し、非限定的な実施形態において、本マウスモデルは、ヒト胸腺リンパ球形成を支持するか、主にナイーブなＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋細胞によって特徴付けられる回復したＴ細胞表現型を呈するか、末梢多系統細胞の再構成を呈するか、胸腺発達が表現型的に正常であるか、末梢Ｔ細胞が機能性であるか、Ｔ細胞がＴ細胞欠損マウスに移入されると正常な恒常性の変化を受けるか、マウスモデルが正常な機能性制御性Ｔ細胞を生成するか、Ｔ細胞のレパートリーが多クローン性であるか、またはこれらの組み合わせである。本動物モデルの特徴は、本明細書に、とりわけ、実施例２において記載される。
【００２１】
別の態様において、本発明は、例えば、ＶＢの使用および個別のＶＢファミリーのＣＤＲ３長さ分布から明らかなように、同種ヒト胎児胸腺移植片内の骨髄ドナーのＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋である、多様な機能性ナイーブＴ細胞を生成するためのヒト化マウスモデルを提供し、このマウスモデルは、（ａ）ステップ（ｂ）の前またはそれと同時に、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧマウス、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯに、γ線照射を行うことと、（ｂ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧ、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯマウスに、ＨＬＡ型判定済みヒト胸腺組織を移植することであって、ある特定の実施形態では胎児胸腺組織を移植し、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織は、ある特定の実施形態ではｄＧｕｏでの処置または凍結保存および解凍によって、成熟Ｔ細胞が枯渇していることと、（ｃ）成体骨髄ドナーに由来する、１〜５×１０5、１〜４×１０5、１〜３×１０5、１〜２×１０5、１．５〜２×１０5のＨＬＡ型判定済みＣＤ３４＋細胞を静脈注射によって投与することであって、ある特定の実施形態では、再構成は１．８×１０5の細胞を投与することによって達成されることと、を含むか、本質的にこれらから構成されるか、またはこれらから構成される、方法によって作製される。当業者は、これらの数は、例えば、細胞数の判定に使用される方法の誤差限界内で、変化し得ることを理解している。共有されるＨＬＡ対立遺伝子を判定するために、ＨＬＡ型の判定を行う。
【００２２】
本発明の一態様において、治療される疾患に応じて、種々の数のＨＬＡ対立遺伝子が共有される。例えば、全体的なＴ細胞の再構成が所望される場合、少なくとも１つのクラスＩ（ＡまたはＢ）および１つのクラスＩＩ（ＤＱまたはＤＲ）の対立遺伝子の共有が必要であり、より多く（少なくとも１つのＡ、Ｂ、ＤＱ、およびＤＲ対立遺伝子）の共有が望ましい。別の例において、ある特定の腫瘍またはウイルス抗原特異的応答については、特異的なペプチドに対するＣＴＬに存在することが既知の特定のクラスＩ対立遺伝子の共有が所望される。別の例において、Ｔ１ＤＭの病因の研究については、特異的疾患に関連するクラスＩＩ（Ｔ１ＤＭについてはＨＬＡ  ＤＲ３／４、ＤＱ８）の対立遺伝子の共有が所望される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、ヒト化マウスモデルは、多数の、マウス当たり最大２．５×１０7を生成し、１５ｍｌの吸引液当たり最大１５匹のマウスであり、単純な臨床骨髄吸引液から合計３．７５×１０8のＴ細胞が、生成される。患者の鎮静により、さらに多くの骨髄を吸引し、それによって、同じ対象から、さらなるマウスの生成のための骨髄を得ることができる。
【００２４】
ある特定の実施形態において、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織の動物レシピエントは、任意で、抗ＣＤ２  ｍＡｂで処置される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、ヒト胸腺リンパ球形成を行う本発明の非ヒト動物レシピエントは、成体骨髄ドナーに由来する肝臓組織を含まない。ある特定の実施形態において、ヒト胸腺リンパ球形成を行う本発明の非ヒト動物レシピエントは、胎児組織ドナーに由来する肝臓組織を含まない。
【００２６】
別の一態様において、本発明は、以下を含むか、本質的にこれらから構成されるか、またはこれらから構成される、方法によって作製される、ヒト胸腺リンパ球形成のヒト化マウスモデルを提供する：
（ａ）ステップ（ｂ）の前またはそれと同時に、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧマウス、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯに、γ線照射を行うことと、
（ｂ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧ、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯマウスに、ＨＬＡ型判定済みヒト胸腺組織を移植することであって、ある特定の実施形態では、１ｍｍ3の胎児胸腺組織を移植し、２０匹未満、または２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２０〜２５、２１〜２６、２２〜２７匹のマウスに、同じ胸腺に由来する組織を移植することができ、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織は、ある特定の実施形態では、記載のようにｄＧｕｏでの処置または凍結保存および解凍によって、成熟Ｔ細胞が枯渇していることと、
（ｃ）成体骨髄ドナーに由来する、１〜５×１０5、１〜４×１０5、１〜３×１０5、１〜２×１０5、１．５〜２×１０5のＨＬＡ型判定済みＣＤ３４＋細胞を、静脈注射によって投与することであって、ある特定の実施形態では、再構成は、１．８×１０5の細胞の投与によって達成されること。当業者は、これらの数は、例えば、細胞数の判定に使用される方法の誤差限界内で、変化し得ることを理解している。
【００２７】
ある特定の態様において、本発明は、それによって対象の免疫系を再構成する、ヒト胸腺リンパ球形成のヒト化マウスモデルを作製するための方法、またはヒト化マウスモデルにおいてナイーブＴ細胞を作製するための方法、またはヒト化マウスモデルにおいてヒト胸腺リンパ球形成を誘発および再現するための方法であって、（ａ）ステップ（ｂ）の前またはそれと同時に、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧマウス、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯに、γ線照射を行うことと、（ｂ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＮＯＧ、もしくはＮＳＧ、またはＲＡＧ  ＫＯ共通γ鎖ＫＯマウスに、ＨＬＡ型判定済みヒト胸腺組織を移植することであって、ある特定の実施形態では、１ｍｍ3の胎児胸腺組織を移植し、ある特定の実施形態では、記載のようにｄＧｕｏでの処置または凍結保存および解凍によって、ＨＬＡ型判定済み胎児ヒト胸腺組織は、成熟Ｔ細胞が枯渇していることと、（ｃ）成体骨髄ドナーに由来する１〜５×１０5、１〜４×１０5、１〜３×１０5、１〜２×１０5、１．５〜２×１０5のＨＬＡ型判定済みＣＤ３４＋細胞を静脈注射によって投与することであって、ある特定の実施形態では、再構成は、１．８×１０5の細胞を投与することによって達成されることと、を含むか、本質的にこれらから構成されるか、またはこれらから構成される、方法を提供する。当業者は、これらの数は、例えば、細胞数の判定に使用される方法の誤差限界内で、変化し得ることを理解している。
【００２８】
特許請求される方法のある特定の態様において、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織の動物レシピエントは、任意で、抗ＣＤ２  ｍＡｂで処置される。
【００２９】
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載されるヒト化マウスモデルを作製するための方法であって、同種移植片ドナーまたはＨＣＴレシピエントに由来する１〜５×１０5、１〜４×１０5、１〜３×１０5、１〜２×１０5、１．５〜２×１０5のＨＬＡ型判定済みＣＤ３４＋細胞を、類似の数の患者由来のものに加えて、静脈注射によって投与することをさらに含み、ある特定の実施形態では、互いに相互に寛容性のＴ細胞を再構成するように、再構成は、１．８×１０5の細胞を投与することにより達成され、それによって、混合キメラによって特徴付けられる再構成された免疫系を提供する、方法を提供する。他の態様において、本発明は、記載のようなヒト化マウスモデルを提供し、マウスは、混合キメラを示す。混合キメラを示すマウスモデルから単離した細胞を、骨髄移植および臓器移植の治療的方法に使用することができる。
【００３０】
ある特定の実施形態において、成体骨髄ドナー、または同種移植片ドナー、またはＨＣＴレシピエントに由来するＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞から生成される細胞に所望される特徴を与える、遺伝子修飾を有する。ある特定の実施形態において、本発明の方法に使用されるＣＤ３４＋細胞の遺伝子修飾は、これらのＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞が、成体ドナーに残存するウイルスに耐性となるようなものである。非限定的な例において、遺伝子修飾は、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４、またはこれらの組み合わせのノックダウンまたは突然変異を含み、それによって、ドナーＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞が、例えばＨＩＶのウイルスに対する感受性が低くなるか、またはそれに対して耐性となる。
【００３１】
ある特定の態様において、本発明は、Ｔ細胞が特異性抗原（複数を含む）を認識する、所望される特異性を有するヒトＴ細胞をインビボで増殖させるための方法であって、本明細書に記載のヒト化マウスモデルを作製するステップを含むか、本質的にそれから構成されるか、またはそれから構成され、さらに、ヒト化マウスを抗原（複数を含む）で免疫付与し、それによってＴ細胞に抗原（複数を含む）を認識させるステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、抗原は、腫瘍特異的抗原、または腫瘍に由来する抗原、またはウイルス抗原である。このような抗原は、当該技術分野で既知であり得るか、または当該技術分野で既知の方法によって特定することができる。このような抗原の非限定的な例には、ＭＡＲＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１等、またはウイルス抗原（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］もしくはエプスタインバーウイルス［ＥＢＶ］ペプチド）が含まれる。
【００３２】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトＴ細胞を分化させるための方法であって、本明細書に記載のヒト化マウスモデルを作製するステップを含むか、本質的にそれから構成されるか、またはそれから構成され、さらに、制御性Ｔ細胞の分化を導く方法で、抗原または自己抗原をヒト化マウスに投与するか、または暴露させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、暴露は、アジュバント、ＡＰＣ、もしくはサイトカイン、またはこれらの組み合わせを介して行われる。
【００３３】
ある特定の態様において、本発明は、特許請求される方法によって分化したヒトＴ細胞を投与することを含む、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、自己免疫疾患、またはこれらの組み合わせを治療または予防するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇである。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ヒト化マウスから単離される。
【００３４】
ある特定の態様において、本発明は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞を含む、ヒトの再構成細胞を提供し、これらの細胞は、本ヒト化モデルにおいて生成される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、発達中に、静脈内投与されたＣＤ３４＋細胞に由来する細胞へ暴露されるため、ドナーに対して寛容性である。ある特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋である、ナイーブＴ細胞である。ある特定の実施形態において、ヒトの再構成細胞は、マウスから単離される。ある特定の実施形態において、特定の細胞集団、例えば、限定されないが、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、または任意の組み合わせ、または亜集団が、再構成された細胞の総集団から精製される。Ｔ細胞または特定の細胞集団を単離および精製するための方法は、当該技術分野で既知である。ある特定の実施形態において、本ヒト化モデルによって生成されたこれらの細胞を、本発明の治療的方法で使用する。ある特定の実施形態において、本発明のヒト再構成細胞は、養子移入方法での使用に好適な薬学的剤形で構成される。
【００３５】
ある特定の態様において、本発明は、本マウスモデルによって生成された免疫細胞を、養子移入方法に使用して、疾患または障害の治療を、それを必要とする対象において行うための治療的方法を提供する。ある特定の実施形態において、成体骨髄ドナーは、非ヒト動物において生成された細胞のレシピエントである。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、Ｔ細胞異常によって引き起こされる。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、癌である。ある特定の実施形態において、本治療的方法を使用して、器官、組織、または細胞移植のレシピエントである、対象を治療する。
【００３６】
治療方法は、対象のＣＤ３４＋細胞から再構成された免疫系を有するヒト化マウスから単離されたＴ細胞を、対象に投与することを含むか、本質的にそれから構成されるか、またはそれから構成される。治療的方法のある特定の実施形態において、再構成された免疫系は、混合キメラによって特徴付けられる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、亜集団、例えば、限定されないが、制御性Ｔ細胞への分化を導く方法で、抗原または自己抗原に暴露されている、ヒト化マウスモデルから単離する。ある特定の実施形態において、暴露は、ＡＰＣ、サイトカイン、またはこれらの組み合わせを介して行われる。
【００３７】
ある特定の実施形態において、この治療的方法により、対象の免疫系から逃れた自己腫瘍に対する、癌患者の免疫応答を改善する。非限定的な例には、悪性黒色腫、腎細胞癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、前立腺癌が挙げられる。
【００３８】
ある特定の実施形態において、治療的方法により、例えば、限定されないが、ＥＢＶによって引き起こされるリンパ増殖性疾患を発症しているか、または日和見感染症を有する、免疫抑制された個体を治療する。これらの方法では、免疫抑制された個体を、本ヒト化マウスモデルから単離した自己Ｔ細胞で処置する。ある特定の実施形態において、マウスは、免疫抑制された個体に由来するＣＤ３４＋細胞を静脈内注射されている。ある特定の実施形態において、マウスモデルは、器官または組織ドナーに由来するＣＤ３４＋細胞とともに、免疫抑制された個体に由来するＣＤ３４＋細胞を静脈内注射されているため、混合キメラを呈する。他の実施形態において、マウスは、特異性抗原を認識するＴ細胞をインビボで増殖させるように、抗原で免疫付与されている。
【００３９】
ある特定の実施形態において、個体は、ＨＩＶ感染のため、または他の免疫抑制治療のため、例えば、限定されないが、器官、組織、または細胞の移植後に、免疫抑制されている。ある特定の実施形態において、ＥＢＶによって引き起こされるリンパ増殖性疾患は、移植後のリンパ球増殖性疾患である。ある特定の実施形態において、日和見感染症は、ＣＭＶ疾患、アスペルギルス症、または他のウイルス性、細菌性、および親近性感染、またはこれらの組み合わせである。
【００４０】
ある特定の態様において、本発明は、ヒト化マウスモデルまたはその再構成細胞を、対象における薬物または治療の効果をスクリーニングおよび判定するための手段として使用する方法であって、（ａ）任意で、再構成された対象の免疫系を有する本明細書に記載のヒト化モデルを提供することと、（ｂ）ステップ（ａ）のマウスモデルに薬物または治療を施すことと、（ｃ）再構成された免疫系に対する薬物または治療の効果を判定し、再構成された免疫系に対する薬物または治療の効果は、対象の免疫系に対する薬物または治療の効果を示すことと、を含むか、本質的にそれらから構成されるか、またはそれらから構成される、方法を提供する。ある特定の実施形態において、スクリーニング方法を使用して、候補免疫抑制剤を、ヒト化マウスにおける皮膚同種移植片拒絶を抑制するそれらの能力について評価することができる。
【００４１】
ある特定の態様において、本発明は、ヒト胎児胸腺移植片および静脈注射で胎児ＣＤ３４＋細胞を受容した免疫不全マウスが、強力なヒト免疫系を生成することを提供する。ヒト胸腺は、ヒト胸腺リンパ球形成を効率的に支持し、末梢ヒト抗原提示細胞は、移出したＴ細胞の最適な機能を促進する。ヒト免疫媒介性障害を研究するために、成体造血細胞は、成熟した移植片の胸腺細胞による拒絶を回避しながらも、共有のＨＬＡ対立遺伝子を有する同種胎児胸腺移植片に定植しなければならない。本発明は、成体１型糖尿病および対照の志願者の骨髄から吸引した造血幹細胞で再構成されたマウスを提供する。胎児胸腺の凍結保存は、成体同種ＣＤ３４＋細胞の拒絶を防止すると同時に、ＨＬＡ型を判定することを可能にする。新たに生成されたＴ細胞は、機能性および自己寛容性であり、多様なレパートリーを有し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が含まれる。成体ＣＤ３４＋細胞ドナーの免疫表現型は、回復している。ある特定の実施形態において、この「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスは、免疫病因および免疫療法剤に対する応答性の分析を可能にし、胸腺不足を有する成体における免疫再構成のためのアプローチを提示する。
【００４２】
本発明のある特定の実施形態において、処置は、少量または亜致死量の照射、例えば、限定されないが、１００ｃＧｙ、１〜１．５Ｇｙの範囲、１．５〜４Ｇｙの範囲、１〜４Ｇｙの範囲、２．５Ｇｙ、もしくは任意の好適な照射量、または薬剤を用いて行われる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込まれた長期ヒト胸腺移植片での正常なヒト胸腺リンパ球形成。典型的な結果を、埋め込み２０週間後のＴＨＹ／ＬＩＶ移植片に対して示す。（Ａ）肉眼での概観。もともとは小さかった（１ｍｍ３）胎児胸腺断片は、腎臓の露出面全体を覆うまでに成長した。（Ｂ）正常な皮質および髄質の構造を示す、組織学的外観。（Ｃ）抗ＣＤ４および抗ＣＤ８での染色プロファイル、正常な胸腺細胞の染色パターンを示す。（Ｄ）未熟な胸腺細胞の大半が低いレベルのクラスＩのみを発現している、正常なプロファイルを示す、ＨＬＡクラスＩの染色。クラスＩが高い集団は、主に成熟した胸腺細胞を示す。
【図２】腎臓被膜下へのＴＨＹ／ＬＩＶ移植片に加えて、静脈注射で同じドナーに由来するヒトＦＬ  ＣＤ３４細胞を受容した、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＰＢＭＣ中のヒトキメラの増加。ヒトＰＢＭＣ再構成の時間経過を、ＴＨＹ／ＬＩＶ移植片を単独（Ｔｈｙ／Ｌｉｖ、緑色線）で、またはＣＤ３４細胞の静脈内注射とともに（Ｔｈｙ／Ｌｉｖ／ＨＳＣ、赤色線）受容した群に対して示す。
【図３】ＴＨＹ／ＬＩＶ移植片に加えて、静脈注射でのＣＤ３４細胞のレシピエントにおける、ヒトＴ、Ｂ、および樹状細胞（ＤＣ）を有する、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのリンパ節の再増殖の増加。胎児ヒトＴＨＹ／ＬＩＶ移植片を、同じ胎児肝臓に由来するＣＤ３４細胞の静脈内注射あり（ＨｕＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＨＳＣ）またはなし（ＨｕＴｈｙ／Ｌｉｖ）で埋め込んだ２５週間後に、リンパ節を分析した。写真は、リンパ節の肉眼的な外観を示し、ＣＤ３４細胞を静脈注射で受容させた動物においては寸法が著しく増加した。右端のパネルは、ゲートしたＨＬＡ−ＤＲ＋、Ｌｉｎ−リンパ節細胞、でのＣＤ１１ｃの発現を示し、ＣＤ３４細胞を静脈注射で受容させた動物におけるＤＣの存在を示す。
【図４】ヒト組織／細胞の移植後、示される時点でのＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＨＳＣ  （□）またはＴｈｙ／Ｌｉｖ単独（■）を受容したマウスにおけるヒトＩｇＧ（図４Ａ）およびＩｇＭ（図４Ｂ）の血清レベル。図４Ｃ。ヒト組織なし（●、ｎ＝５）、ＴＨＹ／ＬＩＶ単独（Ｏ、ｎ＝５）、ＴＨＹ／ＬＩＶ／ＣＤ３４＋ＦＬＣ（■、ｎ＝６）を受容させたＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｔｇマウスにおけるブタ皮膚移植片の生存。図４Ｄ。ＴＨＹ／ＬＩＶ単独の群（上）の生存している移植片、およびＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＣＤ３４＋ＦＬＣ（下）を受容した群の拒絶された移植片の肉眼（左パネル）および顕微鏡（Ｈ＆Ｅは中央パネル、ヒトＣＤ３染色は右パネル）での外観。図４Ｅ〜Ｆ。ヒトＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＣＤ３４＋ＦＬＣを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける成体ブタ膵島異種移植片の拒絶。対照ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（図４Ｅ）およびヒトＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＣＤ３４＋ＦＬＣを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（図４Ｆ）に由来するブタ膵島異種移植片を、薄片にし、それぞれ、ブタインスリン、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ２０、およびヒトＣＤ６８に特異的な抗体で染色した。対照ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに由来する移植片は、インタクトなままであり、ブタインスリンに対して陽性に染色された。対照的に、ヒト化ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに由来する移植片は、検出可能なブタインスリンを生成する細胞を有さなかったが、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージの強い浸潤を示した。ブタ膵島をマウス腎臓被膜下に埋め込み、移植片を移植４〜１０週間後に除去した。５週間の移植片からの代表的な結果を示す。
【図５】図５Ａ、ＤＮＰ−ＫＬＨ免疫付与（■）およびＰＢＳ対照（□）のｈｕ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（１群当たりｎ＝３）に由来するヒトＴ細胞のシミュレーション指標（ＳＩ）。左および右の図は、それぞれ、ＤＮＰ−ＫＬＨおよびＣｏｎ  Ａで刺激した細胞を示す。図５Ｂ、免疫付与したｈｕマウスに由来する二次リンパ器官における胚中心の形成。図５Ｃ、追加免疫付与後１週目（左）および４週目（右）に、ＤＮＰ−ＫＬＨ免疫付与（●）およびＰＢＳ対照（○）Ｈｕマウスから収集した血清中の抗ＤＮＰヒトＩｇＧの血清レベル。
【図６】図６Ａ、ヒト胸腺／ヒト肝臓（ＨＵ／ＨＵ）（左）、ブタ胸腺／ブタ肝臓（ＳＷ／ＳＷ）（中央）、およびＳＷ／ＨＵ（右）胎児胸腺／肝臓の埋め込み片の肉眼での外観。ＨＵ／ＨＵ  ＳＣＩＤ、ＳＷ／ＳＷ  ＳＣＩＤ、およびＳＷ／ＨＵ  ＳＣＩＤマウスレシピエントを、移植片の埋め込み後、１３週で致死させた。図６Ｂ、ヒト胎児肝臓ＳＣＩＤマウスに埋め込んだヒト（左）およびブタ（右）胸腺移植片におけるヒト胸腺細胞の表現型。図６Ｃ。移植片中のヒト（ＨＬＡ／ＤＲ＋）ＡＰＣの存在を示す、代表的なＳＷ／ＨＵ移植片の免疫蛍光染色。
【図７】ブタ胸腺（ＳＷＩ／ＨＵ）移植片で発達するヒト単一陽性（ＳＰ）胸腺細胞は多クローン性であり、ヒト（ＨＵ／ＨＵ）胸腺移植片で発達するものに類似して、各Ｖβに対して、正常なＣＤＲ３の長さ分布を示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてＨＵ／ＨＵ（左）およびＳＷ／ＨＵ（右）ＴＨＹ／ＬＩＶ移植片で発達する、ヒトＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞の代表的なＣＤＲ３のスペクトル型解析プロファイルを示す／分析は、ＴＨＹ／ＬＩＶの埋め込み後２１週目に行った。
【図８】同種ヒト、異種ブタ胸腺のドナーＭＨＣ適合（ＳＬＡｄｄ）、またはドナーＭＨＣ不適合（ＳＬＡｃｃ）ＰＢＭＣで刺激したＨＵ／ＨＵ（左）およびＳＷ／ＨＵ（右）胸腺細胞のＭＬＲ。示されるデータは、３回の独立した実験（４ＳＷ／ＨＵおよび３ＨＵ／ＨＵ）で得られた応答を代表するものである。３回の標準偏差値は、２０％未満である。
【図９】ＳＷ／ＨＵ対ＨＵ／ＨＵのＴＨＹ／ＬＩＶ移植片に加えて、静脈注射でＣＤ３４細胞を受容したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＰＭＢＣにおける類似したヒトＴ細胞の再構成。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、１．５ＧｙでＷＢＩを受容させ、続いてＨＵ／ＨＵ  ＴＨＹ／ＬＩＶに加えてヒトＣＤ３４＋細胞、またはＳＷ／ＨＵ  ＴＨＹ／ＬＩＶに加えてヒトＣＤ３４＋細胞の移植を行った。移植の８週間後に血液を採取し、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のレベルを、ＦＡＣＳによって判定した。
【図１０】ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵ移植片の胸腺細胞サブセットの比較。静脈注射でＨＵ  ＦＬ  ＣＤ２４細胞もまた受容させたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、１８週間前にＨＵ  ＦＬを埋め込んだブタとヒトの胎児胸腺移植片において、類似の細胞充実度（図１０Ａ）および正常なサブセット分布（図１０Ｂ）、ならびにＣＤ４細胞のＴｒｅｇ率（図１０Ｃ）が検出された。
【図１１】ＨＵ／ＨＵおよびＳＷ／ＨＵマウスの移植片における、類似するヒトＣＤ４  ＳＰ  ＣＤ４５hi胸腺細胞の表現型。ゲートしたＣＤ４＋ＣＤ８胸腺細胞を、埋め込み１８週間後に、ＨＵ／ＨＵおよびＳＷ／ＨＵ移植片から分析した。
【図１２】ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵマウスのＣＤ４＋ＰＢＭＣ中の正常なＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７−ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの割合。（図１２Ａ）ゲートしたＣＤ４＋ＰＢＭＣの典型的な表現型の様子、（図１２Ｂ）ＴＨＹ／ＬＩＶ移植片の埋め込みおよびＣＤ２４細胞の静脈注射の１８週間後に、正常なヒトＰＢＭＣ、およびＳＷ／ＨＵのＰＢＭＣ、およびＨＵ／ＨＵマウスに由来する、ゲートしたＣＤ４＋細胞から得られたデータの要約。
【図１３】ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５hiＴ細胞は、「メモリー」表現型を得、ＨＵ／ＨＵマウスの末梢で、ＳＷ／ＨＵマウスよりも大きな規模でＨＬＡ−ＤＲを発現した。ゲートした末梢血ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、移植の１８週間後に分析した。
【図１４】ＨＵ／ＨＵマウスと比較して、ＳＷ／ＨＵの末梢における、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞中のＣＤ４５ＲＯ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋表現型への変換の減少。各記号は、埋め込みの１８週後に分析した、個々のヒトまたはゲートしたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを表す。
【図１５】ＨＵ／ＨＵおよびＳＷ／ＨＵマウスの脾細胞からのヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の分離、ならびに抑制についてのＭＬＲアッセイの設計。
【図１６】ＨＵ／ＨＵマウスの末梢中のヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＳＷ／ＨＵマウスにおけるＴｒｅｇよりも優れた抑制機能を有する。（図１６Ａ）典型的なＨＵ／ＨＵマウスの脾臓に由来するＣＤ２５＋ＣＤ４細胞による同種応答の抑制の滴定。（図１６Ｂ）各記号は、正常ヒトのＰＢＭＣ、またはＨＵ／ＨＵもしくはＳＷ／ＨＵレシピエントの脾臓に由来する、ＣＤ２５＋ＣＤ＄細胞の抑制活性をあらわす。示される源に由来するＣＤ２５＋細胞の存在下におけるＣＤ２５−細胞の増殖率（ＣＤ２５−細胞単独と比較して）を、３つの異なる刺激因子とともに示す。
【図１７】ＳＷ／ＨＵマウスにおけるＴｒｅｇの抑制機能の損失は、ナイーブ表現型の保持と関連する。図１６で試験した２つの個別のＳＷ／ＨＵマウスのＰＢＭＣ  ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞に対するＣＤ４５ＲＯおよびＨＬＡ−ＤＲの発現を示す。高レベルのＣＤ４５ＲＯおよびＨＬＡ−ＤＲの発現を有する動物に由来する細胞は、Ｔｒｅｇがナイーブ表現型を保持した動物、例えばここで示される＃５３３／３４よりも、非常に優れた抑制活性（図１６で赤色の円で囲まれた（＃５３９／４０））を示した。
【図１８】ＣＦＳＥで標識したヒトＴ細胞の、ＨＵ／ＨＵまたはＳＷ／ＨＵマウスからＨＵ−ＡＰＣマウスへの移入方法。
【図１９】図１９Ａ。養子移入実験のための「ＨＵ−ＡＰＣ」マウスの作製。図１９Ｂ。ヒトＡＰＣマウス（Ｔｈｙなし）は、いずれのヒトＴ細胞も有さないが、ヒトＢ細胞および他のヒト骨髄由来細胞を有する。
【図２０】移入されたナイーブＴ細胞の増殖および表現型の変化。ＳＷ／ＨＵまたはＨＵ／ＨＵマウスに由来する、ＣＦＳＥで標識したＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を受容したＨＵ  ＡＰＣマウスを、１５日後に致死させ、それらの脾臓Ｔ細胞の表現型を分析した。ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵの両方のドナーに由来するＴ細胞の広範囲の分裂が観察されたが、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−「メモリー」表現型への変換の程度は、自己胸腺（ＨＵ／ＨＵマウスに由来する細胞）において発達したＴ細胞で、より大きかった。
【図２１】ＨＵ−ＡＰＣレシピエントにおけるＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵマウス由来の養子移入されたＴ細胞の回復は、ＨＵ−ＡＰＣレシピエントにおけるヒトＡＰＣ再構成のレベルと相関する。養子移入されたナイーブＴ細胞を同様に受容させた、再構成されていないＮＯＤ―ＳＣＩＤマウスからは、Ｔ細胞は観察されなかった（０％ヒトキメラ点なし）。データは、ヒトまたはブタ胸腺でヒトＴ細胞の発達を維持するためには、自己（ヒト）ＡＰＣが必要であることを示す。しかしながら、ヒトＡＰＣによる、ＳＷ／ＨＵマウスに由来するＣＤ４およびＣＤ８の両方のＴ細胞の維持が、準最適である。
【図２２】胸腺を摘出し、Ｔ細胞を枯渇させたマウスにおける、レシピエント胸腺の異種胸腺による置き換え。
【図２３】マウス胸腺上皮細胞は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、ブタ胸腺移植片での制御性細胞の生成を促進する。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（前処置なし）に、ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを腎臓被膜下に埋め込んだ。富化させたマウス胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）を、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスから調製し、０日目および５週目にブタ胸腺移植片中に注射する。ブタＴＨＹ／ＬＩＶ移植の１３週間後に、脾細胞を調製し、３Ｇｙで照射した二次ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに養子移入した。ｍＴＥＣなしのＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶ（ＴＨＹ／ＬＩＶ／ｎｏ−ｍＴＥＣ）（◆、ｎ＝５）、０日目および５週目にｍＴＥＣを注射したＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶ（ＴＨＹ／ＬＩＶ／ｄ０＋ｗ５−ｍＴＥＣ）（●、ｎ＝５）、またはＴＨＹ／ＬＩＶ／ｎｏ−ｍＴＥＣおよびＴＨＹ／ＬＩＶ／ｄ０＋ｗ５−ｍＴＥＣの混合脾細胞（○、ｎ＝５）の一次ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスレシピエントに由来する、２×１０７の脾細胞（ＳＰＬ）を受容させた二次レシピエントマウスの体重変化の割合（平均±標準誤差）を示す。正常ＢＡＬＢ／ｃマウス（◇、ｎ＝５）に由来する２×１０７の脾細胞を受容させたか、または細胞移入なし（Ｘ、ｎ＝４）のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、対照として使用した。
【図２４】移植１２週間後に採取した、移植したＦＰ  ＴＨＹにおける注射したマウス胸腺上皮細胞の検出。赤色の染色：抗サイトケラチンｍＡｂ（マウスおよびブタのサイトケラチンを認識する）、緑色の染色：抗マウスクラスＩＩ  ＭＨＣ  ｍＡｂ。マウスＴＥＣを注射しなかった移植片（左）は、ブタサイトケラチンのみを示し、マウスクラスＩＩ＋細胞は、造血ＡＰＣであると思われる。示される時点でマウスＴＥＣを注射した移植片において、黄色の染色は、サイトケラチンとマウスクラスＩＩの共染色を表し、マウスＴＥＣの存在を示す。
【図２５】ｄＧｕｏで処置した胸腺組織の移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、末梢ヒト細胞の再構成。胎児胸腺組織を、５×１０5の同種成体ＣＤ３４＋または４×１０5の自己胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞（白丸、ｎ＝５）を静脈注射で受容させた、亜致死照射を行ったＮＯＤ／ＳＣＩＤへの移植の前に、７日間（黒四角、ｎ＝４）または２１日間（黒三角、ｎ＝５）ｄＧｕｏで処置した。年齢適合対照動物には、５×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を単独で受容させた（白四角、ｎ＝５）。マウスを出血させて、示される時点での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のヒト（ｈｕ）細胞の再構成を測定した。
【図２６】凍結保存／解凍した胸腺移植片および同種成体ＣＤ３４＋細胞を受容したＮＳＧマウスにおける多系統ヒト細胞の再構成。（ａ）凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を、３×１０5（黒四角、ｎ＝６）または５×１０5（黒三角、ｎ＝６）の成体ＣＤ３４＋細胞および２用量の抗ＣＤ２  ｍＡｂの静脈注射と組み合わせて受容させた、亜致死照射したＮＳＧマウスを出血させて、表示される時点での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のヒト細胞の再構成を測定した。年齢適合対照動物には、３×１０5の成体ＨＳＣを単独で受容させた（白四角、ｎ＝６）。ＰＢＭＣの単細胞懸濁液に、ヒト造血細胞（ＣＤ４５）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、および単球（ＣＤ１４）のマーカー染色を行った。死細胞およびマウスの赤血球は、前方散乱および高ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）保持および抗マウスＴｅｒ１１９陽性細胞をゲート排除することによって、分析から除外した。（ｂ）移植の２０週間後の代表的な移植片の外観。凍結保存／解凍した胎児胸腺組織を受容させたＮＳＧマウスは、腎臓被膜の下に豊富な生存胸腺組織を有し、多数の二重陽性なヒト胸腺細胞によって提示される、同種成体ＣＤ３４＋細胞からの胸腺リンパ球形成を支持していた。（ｃ）。写真およびＦＣＭ分析は、１２の移植片の代表である。
【図２７】凍結保存／解凍した胸腺移植片、および臨床骨髄吸引液から単離した同種成体ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスにおける、多系統ヒト細胞の再構成。凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を、健常志願者（黒四角、ｎ＝２）およびＴ１ＤＭ患者（黒三角、ｎ＝４）の骨髄吸引液から単離した１．８×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて受容させた、亜致死照射したＮＳＧマウスを出血させて、表示される時点での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のヒト細胞の再構成を測定した。年齢適合対照動物には、Ｔ１ＤＭ患者の骨髄吸引液から単離した１．８×１０5の成体ＨＳＣを単独で受容させた（白丸、ｎ＝５）。
【図２８】胎児胸腺移植片および同種成体ＣＤ３４＋細胞の移植後の、ＮＳＧマウスにおける機能性免疫系の再構成および正常Ｔｒｅｇの発達。３×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞に加えて、７Ｇｙで照射した胸腺移植片を受容させたＮＳＧマウス（ｎ＝３）は、高いＴ細胞レベルを移植後３０週超で再構成し、照射が胸腺の成長および機能を遅らせることを示す。移植の３９週間後、ヒト化マウスに、同種ヒトおよび異種ブタの皮膚移植片を受容させた（ａ）。（ｂ）移植２０週間後の機能性を分析するために、ヒトＴ細胞を、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片および健常志願者（黒色バー）またはＴ１ＤＭ患者（点描バー）の骨髄吸引液から単離した同種ＣＤ３４＋を受容させたＮＳＧマウスの脾臓および末梢リンパ節から富化させた。純度９０％超を、ＦＡＣＳによって確認した。健常骨髄ドナーのＰＢＬから単離したＴ細胞は、対照として機能した（白色バー）。健常志願者からの同種ヒトＰＢＭＣは、刺激因子として機能した。自己刺激した対照培養物において、レスポンダー細胞を、マウスＣＤ４５＋およびＴｅｒ１１９細胞を枯渇させた自己ＰＢＭＣとともにインキュベートした。（ｃ）移植の２０週間後に、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片および健常対照（丸）またはＴ１ＤＭ患者（黒四角）の骨髄吸引液から単離した同種ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスの胸腺移植片の半分から、単細胞懸濁液を調製した。細胞を、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３を染色し、自然発生型Ｔｒｅｇの数を計算した。（ｄ）２人の健常志願者（黒丸）と比較した、健常対照（黒四角）またはＴ１ＤＭ患者（黒三角）に由来する成体ＣＤ３４＋と組み合わせて凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を移植した２０週後のＰＢＬ中のＴｒｅｇの割合。
【図２９】凍結保存／解凍した胸腺移植片および臨床骨髄吸引液に由来する同種成体ＣＤ３４＋細胞の移植後のＮＳＧマウスにおける多様かつ回復した免疫系の再構成。（ａ）ヒト胎児胸腺組織および同種骨髄由来の成体ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスにおいて発達する、ヒトＣＤ４およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞のスペクトル型解析（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）。ヒトＣＤ４またはＣＤ８  ＳＰ胸腺細胞を、移植の２０週間後に胸腺移植片から採取した。ヒトＢＶファミリー特異的プライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｃβ特異的ＦＡＭで標識したプライマーでの流出反応後にスペクトル型解析を行った。８匹のうち１匹の代表動物からのスペクトル型を示す。縦軸は、相対蛍光単位である（全体＝６，０００単位）。横軸は、ヌクレオチドの大きさであり、３つのヌクレオチド分離のピークを示す。基準の大きさマーカーは、低くわずかなピークとして見られる。代表的なＢＶは、１試料につき合計１１の分析から示される。Ｔ細胞（ｂ）およびＴｒｅｇ（ｃ）のナイーブ／メモリーマーカーを、凍結保存／解凍したＴＨＹに加えて、Ｔ１ＤＭ患者（黒三角）または健常対照（黒三角）に由来するＣＤ３４＋細胞の静脈内注入を受容した２０週間後に、健常志願者ならびにＮＳＧマウスのＰＢＭＣの単細胞懸濁液中で染色した（ＣＤ３４細胞ドナー（白丸）を含み、対照マウスについては白三角で示される）。
【図３０】従来のヒト化マウスモデルを示す。
【図３１】成体ＣＤ３４＋細胞から末梢多系統細胞の再構成を達成する試みを示す。
【図３２】ＮＳＧマウスにおいて、成体のＨＬＡ決定済みＣＤ３４＋細胞から、末梢多系統細胞の再構成を達成することを成功させるヒト化マウスモデルを作製するための方法を示す。
【図３３】７日間のｄＧｕｏによる枯渇を逃れた同種胸腺Ｔ細胞による、ＣＤ３４＋細胞の拒絶を示す。５×１０5の同種成体ＣＤ３４＋細胞の注入後の、２．５Ｇｙで照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、ヒト末梢白血球の再構成。成体ＣＤ３４＋細胞を単独で受容したマウスにおいて（白色バー）、ＣＤ１９＋細胞が観察されたが、Ｔ細胞の再構成は観察されなかった。移植前の７日間のデオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）での胸腺組織処置（青色バー）は、ＴＸ６週後までの早期のＣＤ３＋細胞の検出につながった。しかしながら、いずれの時点においてもＣＤ１９＋細胞は現れず、これらのＴ細胞はｄＧｕｏによる枯渇を逃れ、胸腺移植片から末梢に移出し、そこで、注入された同種ＣＤ３４＋細胞を拒絶したことを示す。ヒト胸腺リンパ球形成およびＣＤ１９＋細胞での末梢再構成の成功は、２１日間のｄＧｕｏ処置後に発生した（赤色バー）。しかしながら、成体同種ＣＤ３４＋細胞の注入後のＴ細胞の再構成は、２１日間ｄＧｕｏで処置した移植片を４×１０5の自己胎児ＨＳＣとともに受容したマウス（黒色バー）と比較して、効率が悪かった。
【図３４】７Ｇｙでの照射が、胸腺の成長および／または機能を損なうことを示す。７Ｇｙで照射した胎児胸腺移植片を、抗ＣＤ２  ｍＡｂの静脈注射による処置あり（白色バー）またはなし（黒色バー）の３×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて移植した、亜致死照射したＮＳＧマウスは、非常にわずかな数のＴ細胞を生成した（図３４Ａ）。ＴＸの２０週間後の移植片の外観は、照射した胸腺移植片が、成長も機能もしなかったことを示す（図３４Ｂ）。
【図３５】凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片と同種成体ＣＤ３４＋細胞との組み合わせが、多系統造血細胞の末梢再構成を可能にすることを示す。凍結保存／解凍したヒト胎児胸腺組織を、抗ＣＤ２  ｍＡｂおよび３×１０5（黒色バー）または５×１０5（赤色バー）の成体同種ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて移植した、亜致死照射したＮＳＧマウスは、強力な多系統ヒト白血球再構成を示した（図３５Ａ）。ＨＳＣ単独（白色バー）のレシピエントは、いずれの時点においても末梢ＣＤ３＋細胞を示さなかった。移植後２０週で、胸腺組織移植片は、著しく増大した（図３５Ｂ）。凍結保存したヒト胎児胸腺組織を、ＣＤ３４＋細胞の静脈注射なしで受容させた対照動物は、末梢に有意なヒト細胞を生成しなかった。
【図３６】ＴＸの２０週間後の胸腺移植片の外観を示す。
【図３７】成体ヒトＣＤ３４＋細胞の注射後のＮＳＧマウスにおけるヒト細胞の再構成を示す。
【図３８】ヒトＣＤ３+細胞の再構成を可能にするレジメンの実験計画の実施形態を示す。
【図３９】臨床骨髄吸引液に由来するＨＳＣでのＮＳＧマウスにおけるヒト細胞の再構成を示す。
【図４０】再構成されたヒト化マウスにおけるＴ細胞は、増殖アッセイで、自己寛容性および機能性を呈することを示す。
【図４１】図４１Ａ。対照ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ヒトＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｈｕ／Ｈｕマウス、２段目および３段目）、ならびに膵島移植前にＢＴＩ３２２によってヒトＴ細胞を枯渇させたヒトＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（下段）に由来する、膵島移植片内のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの染色。ブタ膵島をマウス腎臓被膜下に埋め込み、移植片を移植後４〜１０週で除去した。５週の移植片からの代表的な結果を示す。図４１Ｂ。対照ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（１段目）、Ｈｕ／Ｈｕマウス（中）、および膵島移植の前にＢＴＩ３２２によってヒトＴ細胞を枯渇させたＨｕ／Ｈｕマウス（下）に由来する膵島異種移植片に、Ｈ＆Ｅ、ブタインスリン、ｈｕＣＤ３、ｈｕＣＤ２０、およびでｈｕＣＤ６８染色を行った。
【図４２】ＩＦＡ＋ＴＴでの追加免疫の１週間後のＡｇ刺激による増殖アッセイを示す。ＣＦＡ＋ＴＴ（１３０μｇ／マウス）で免疫付与したＨＵ／ＨＵマウスに、最初の免疫付与の３週間後にＩＦＡ＋ＴＴ（１３０μｇ／マウス）で追加免疫を行い、１週間後、ＣＤ３４＋ＦＬＣまたは（ヒトＰＢＭＣについては）単球に由来するＡｇでパルス刺激した同系ＤＣとの共培養後に増殖応答について評価した。レスポンダー：ヒト化マウスおよびヒトについては、脾臓およびリンパ節の樹状細胞に由来するヒトＴ細胞を枯渇させたｍＣＤ４５およびＴｅｒ１１９が、それぞれ、ヒトドナーＣＤ３４＋ＦＬＣおよびＰＢＭＣ単球に生成された。
【図４３】ブタＢＭＴを受容したヒト化ブタサイトカイントランスジェニックマウスにおける、ブタおよびヒト細胞の共存を示す。プロトコルを上部に示し、ドットプロットは、ブタＢＭＴ２５週間後のＰＢＭＣ、脾臓、肝臓、および骨髄中のヒト（ｙ軸）およびブタ（ｘ軸）の両方の細胞の存在を示す。
【図４４】ヒトＴＨＹ／ＬＩＶ／ＣＤ３４細胞に加えて、ブタＢＭＴを受容させた（「Ｈｕ胸腺移植片」、右パネル）ブタサイトカイントランスジェニックＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスにおける長期ヒト胸腺移植片の髄質中のブタクラスＩＩhigh細胞の存在を示す。対照は、ヒト胎児胸腺組織（左）および正常ブタ胸腺（中央）を含む。
【図４５】ブタ胸腺移植片で生成されたＴ細胞間のヒトおよびブタドナーならびにマウスレシピエントに対する特異的寛容性を示す。ヒト胸腺移植片において生成されたヒトＴ細胞は、ブタに対する寛容性を示さない。ＭＬＲアッセイを、プールしたＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵマウスの脾細胞およびリンパ節に由来するレスポンダー細胞（マウスＣＤ４５およびＴｅｒ１１９＋細胞を枯渇させたヒトのもの）とともに示す。「ヒト」は、レスポンダー細胞がＰＢＭＣ由来のＴ細胞から精製される、正常ヒトドナーを意味する。別のヒトに由来するＰＢＭＣは、「同種ヒト」刺激因子である。ヒトドナーに由来するＤｃは、ＦＬＣから生成した。
【図４６】ヒト化マウスにおける混合キメラの誘発を示す。照射（２．５Ｇｙ）したＮＳＧマウスに、ＣＤ３４細胞なし、ＨＬＡ−Ａ２＋、またはＨＬＡ−Ａ２＋およびＨＬＡ−Ａ２−のＣＤ３４＋細胞で、移植を行った。混合キメラを、ＢＭＴの６週間後にアッセイした。ヒト細胞は、ＣＤ３４細胞を移植しなかったマウスには見られなかった。ＨＬＡ−Ａ２＋およびＨＬＡ−Ａ２のＣＤ３４細胞に由来するＣＤ３４細胞を受容したマウスは、混合キメラを発生させた。
【図４７】図４７Ａ。左：抗ｈｕＶα２４Ｊα１８（６Ｂ１１）および抗ｈｕＣＤ３で染色したＨｕ−マウスの脾臓および肝臓細胞；右、ゲートしたｈｕＣＤ３＋Ｖα２４Ｊα１８＋ｉＮＫＴ細胞上でのＣＤ４およびＣＤ８の発現。図４７Ｂ．：α−ＧａｌＣｅｒで免疫付与したｈｕマウスに由来する脾臓細胞のＩＬ−４ヒト細胞内染色。ゲートしたｈｕＣＤ３＋Ｖα２４Ｊα１８＋ｉＮＫＴ（左）およびｈｕＣＤ３＋Ｖα２４Ｊα１８−Ｔ細胞（右）中のＩＬ−４＋細胞を示す。
【図４８】ヒト化マウスにおける自己ヒトＥＢＶリンパ腫を示す。血球を、ヒトＴＨＹ／ＣＤ３４＋細胞の共移植によって生成されたヒト化マウスから採取した。ヒト化マウスのＰＢＭＣを、細胞の９０％超が、ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋Ｂリンパ腫細胞になるまで、ＥＢＶで培養した。自己ＥＢＶで形質転換させた細胞を、ヒト化マウスに注射し、それを腫瘍の発達について経過観察した。Ｂリンパ腫（すなわち、ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋）細胞は、注射後おおよそ１０日で血中に検出可能となり、全てのマウスが、２〜４週までに瀕死となった。自己ＥＢＶで形質転換させたヒト細胞の注射１７日後の代表的なヒト化マウスのフローサイトメトリー分析（図４８Ａ）および腫瘍を有する器官（図４８Ｂ）を示す。
【図４９】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌマウスに同種胎児胸腺組織とともに移植した成体ＣＤ３４＋ＨＳＣから、多系統ヒト免疫細胞の再構成を達成するヒト化マウスモデルの発達を示す。
【図５０】胎児胸腺移植片および成体ＨＳＣでの再構成による「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスの作製を示す。
【図５１】成体ＣＤ３４＋ＨＳＣからのヒト免疫細胞の再構成を示す。
【図５２】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける回復したＴ細胞表現型を示す。
【図５３】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける自己寛容性Ｔ細胞、および自己ＰＢＭＣではなく同種ＰＢＭＣでの刺激に応答した増殖を示す。
【図５４】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスが、同種ヒトおよび異種皮膚移植片を拒絶することを示す。
【図５５】対照およびＴ１ＤＭのＨＳＣから生成された「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスの胸腺移植片および末梢血における類似数の制御性Ｔ細胞を示す。
【図５６】多系統ヒトリンパ造血細胞の発達の実施形態を示す。
【図５７】再構成されたＮＳＧマウスにおける多様なＴＣＲレパートリーを示す。
【図５８】従来のヒト化マウスモデルを示す。
【図５９】Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスの作製を示す。
【図６０】成体ＣＤ３４＋ＨＳＣからの多系統ヒト免疫細胞の再構成を示す。凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を、健常志願者およびＴ１ＤＭ患者の骨髄吸引液から単離した１．８×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて受容させた、亜致死照射したＮＳＧマウスを出血させて、表示時点での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるヒト細胞の再構成を測定した。年齢適合対照動物には、Ｔ１ＤＭ患者の骨髄吸引液から単離した１．８×１０5の成体ＨＳＣを単独で受容させた。
【図６１】機能性および自己寛容性のＴ細胞を示す。移植の２０週後、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片および健常志願者またはＴ１ＤＭ患者の骨髄吸引液から単離した同種ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスの脾臓および末梢リンパ節からヒトＴ細胞を富化させた。純度９０％超を、ＦＡＣＳによって確認した。健常骨髄ドナーのＰＢＬから単離したＴ細胞は、対照として機能した。健常志願者に由来する同種ヒトＰＢＭＣは、刺激因子として機能した。自己刺激した対照培養物において、レスポンダー細胞を、マウスＣＤ４５＋およびＴｅｒ１１９細胞を枯渇させた自己ＰＢＭＣとともにインキュベートした。
【図６２】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスが、同種ヒトおよび異種皮膚移植片を拒絶することを示す。ヒト胎児胸腺および３×１０5のＣＤ３４＋ＨＳＣを移植したＮＳＧマウスは、３０週間、ヒト免疫細胞を再構成することが可能であった。胸腺移植の３９週間後、各ヒト化マウスに同種ヒトおよび異種ブタ皮膚移植片を受容させた。（ｎ＝３）。
【図６３】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける制御性Ｔ細胞の発達を示す。上のグラフ  移植の２０週間後、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片、および健常志願者（丸）またはＴ１ＤＭ患者（黒四角）の骨髄吸引液から単離した同種ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスの胸腺移植片の半分から、単細胞懸濁液を調製した。細胞に、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３染色を行い、自然発生型Ｔｒｅｇの数を計算した。下のグラフ  ２人の健常志願者と比較した、凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を、健常対照またはＴ１ＤＭ患者に由来する成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて移植した２０週間後のＰＢＬ中のＴｒｅｇの割合。
【図６４】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける多様なＴＣＲレパートリーを示す。ヒト胎児胸腺組織および同種骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスにおいて発達する、ヒトＣＤ４およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞のスペクトル型解析。ヒトＣＤ４またはＣＤ８  ＳＰ胸腺細胞を、移植の２０週間後に胸腺移植片から採取した。ヒトＶβファミリー特異的プライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｃβ特異的ＦＡＭで標識したプライマーでの流出反応後にスペクトル型解析を行った。８匹のうち１匹の代表動物からのスペクトル型を示す。縦軸は、相対蛍光単位である（全体＝６，０００単位）。横軸は、ヌクレオチド寸法であり、３つのヌクレオチド分離のピークを示す。基準寸法マーカーは、低くより弱いピークとして見られる。
【図６５】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける回復したＴ細胞表現型を示す。Ｔ細胞のナイーブ／メモリーマーカーを、凍結保存／解凍したＴＨＹに加えて、Ｔ１ＤＭ患者または健常対照に由来するＣＤ３４＋細胞の静脈内注入を受容した２０週間後に、健常志願者ならびにＮＳＧマウスのＰＢＭＣの単細胞懸濁液中で染色した（ＣＤ３４細胞のドナー（白丸）を含み、対照マウスについては白三角で示される）。
【図６６】「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける制御性Ｔ細胞のナイーブ表現型を示す。凍結保存／解凍したＴＨＹに加えて、Ｔ１ＤＭ患者または健常対照に由来するＣＤ３４＋細胞の静脈内注入を受容させた２０週後に、健常志願者およびＮＳＧマウスに由来するＰＢＭＣの単細胞懸濁液中で、制御性Ｔ細胞を染色した。サブゲートした制御性Ｔ細胞は、さらに、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現に基づいて、ナイーブ型およびメモリー型の細胞に分化した。
【図６７】凍結保存／解凍した胸腺移植片、および臨床骨髄吸引液から単離した同種成体ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスにおける多系統ヒト細胞の再構成。ａ）亜致死照射したＮＳＧマウスに、凍結保存／解凍した胎児胸腺組織を、健常志願者（黒四角、ｎ＝ドナー３、レシピエント６）およびＴ１Ｄ対象（白四角、ｎ＝ドナー４、レシピエント２９）に由来する骨髄吸引液から単離した１．８〜３．０×１０５の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて受容させた。ＰＢＭＣ（マウスとヒトの合計）におけるヒト細胞の再構成の平均レベルを、時間とともに示す。対照動物には、Ｔ１Ｄ対象（白丸、ｎ＝ドナー２、レシピエント７）に由来する成体ＨＳＣを単独で受容させた。胸腺移植片および骨髄ドナーに、ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイを使用して、Ｔ１Ｄ関連のＤＲＢおよびＤＱＢ対立遺伝子、ならびにＨＬＡ  Ａ＊２０１について、ＨＬＡ型の判定を行った。胸腺組織および骨髄ドナーは、少なくともＨＬＡ＊Ａ２０１およびＤＲＢ＊０３０２および／またはＤＱＢ＊０３０１を共有していた。
【図６８】ヒト胸腺移植片で発達する胸腺細胞の絶対数および表面表現型。亜致死照射したＮＳＧマウスに、凍結保存／解凍した胎児胸腺組織を、健常志願者（白色バー、レシピエント３）およびＴ１Ｄ対象（黒色バー）に由来する骨髄吸引液から単離した２×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて受容させた。移植片の胸腺細胞を、移植の２２〜２５週後に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯについて、ＦＣＭによって分析した。平均＋標準誤差を示す。Ｔ１Ｄおよび対照の動物間に、有意差は認められなかった。
【図６９】成体ＣＤ３４＋細胞および胎児胸腺を移植したＮＳＧマウスにおける、Ｔ細胞の多様なレパートリー。移植２０週間後に、１人のＴ１Ｄドナーまたは２人のうち１人の健常対照に由来するＣＤ３４＋細胞で再構成されたＴＨＹ移植片中のヒトＣＤ４およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞のスペクトル型解析（β鎖ＣＤＲ３の長さ分布）。６匹（マウス）のうち１匹の代表動物（＃５７００）からのスペクトル型解析を示す。縦軸は、相対蛍光単位である（全体＝６，０００単位）。横軸は、ヌクレオチドの寸法である。基準寸法マーカーは、低くより弱いピークとして見られる。代表的なＢＶは、１試料につき合計１２の分析から示される。
【図７０】凍結保存により、ヒト胎児移植片中の胸腺細胞を枯渇させる。同じドナーに由来する新鮮な胸腺および凍結保存した胸腺（約０．００２ｇの組織）を、解離し、生存細胞ならびに胸腺細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ８の染色を行った。１×１０5の全イベントを収集し、生存（ＤＡＰＩ−）胸腺細胞でサブゲートした。ＦＣＭプロットを左に示し、ＣＤ４ＣＤ８二重陰性、単一陽性、二重陽性集団の合計細胞数を、右のグラフに示す。
【図７１】ヒト化マウスでのキメラ化に対する抗ＣＤ２  ｍＡＢ  ＢＴＩ３２２の影響。凍結保存した胎児胸腺組織と、抗ＣＤ２  ｍＡｂ  ＢＴＩ３２２での処置ありまたはなしで、同種ＣＤ３４＋細胞とを受容したＮＳＧマウスの血中でのヒト細胞の再構成の比較。表示時点での末梢血単核細胞中のヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示す。２つの群の間で、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、または単球の割合に差は検出されなかった。
【図７２】成体ＣＤ３４＋細胞および同種ヒト胎児胸腺を移植したＮＳＧにおけるナイーブ／メモリー表現型。ＴＨＹの埋め込みに加えて、１人のＴ１Ｄ対象（黒四角）または２人のうち１人の健常対照（黒三角）に由来するＣＤ３４＋細胞の静脈内注入の２０週間後の、健常志願者およびＮＳＧマウスマウスのＰＢＭＣ中の、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４（上段）およびＣＤ８（下段）Ｔ細胞の割合（ＣＤ３４細胞のドナー（白丸）を含み、対照マウスについては白三角で示される）（＊ｐ＜０．０５、対照のＣＤ８集団における異常値は統計分析から除外）。
【図７３】同種ヒト皮膚移植の拒絶および破傷風毒素免疫付与に対する応答。図７３Ａ。７Ｇｙで照射した胎児胸腺移植片に加えて、３×１０5の成体ＣＤ３４＋骨髄細胞を受容させたＮＳＧマウス（ｎ＝３）は、移植後３０週超で、末梢Ｔ細胞を再構成した。移植の３９週間後、それらに、同種ヒト皮膚および異種ブタ皮膚を移植した。「ナイーブＮＳＧ」と表示される、未処置対照ＮＳＧマウスでのヒトおよびブタの皮膚移植片（ｎ＝３）の生存もまた、示す。図７３Ｂ。同じドナーに由来する免疫付与されていないマウス、および免疫付与した正常成体ヒトドナーと比較した、インビボ免疫付与後のＴ１Ｄ  ＨＳＣドナーに由来するＮＳＧマウスに由来する末梢Ｔ細胞の破傷風トキソイドに対する応答性。
【図７４】胎児胸腺および成体ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスにおける自然発生型制御性Ｔ細胞の発達。図７４Ａ。移植２０〜２２週後に、凍結保存したＴＨＹ移植片および２人のうち１人の健常志願者（丸）または１人のＴ１Ｄ対象（四角）に由来する同種ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスの胸腺移植片から単細胞懸濁液を調製し、ＦＣＭによって分析した。図７４Ｂ。自然発生型Ｔｒｅｇのマーカーとして、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２５＋ＣＤ１２７loＦｏｘＰ３＋胸腺細胞中のｈｅｌｉｏｓの発現が、下段の第２のヒトドナー組に由来するＮＳＧマウスに示される。図７４Ｃ。凍結保存した胎児胸腺移植片を、２人のうち１人の健常対照（四角）または１人のＴ１Ｄ対象（三角）に由来するＣＤ３４＋細胞とともに移植した２０週後の、２人の健常ヒト（丸）と比較して類似する割合のＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ。左のプロットは、対照およびＴ１Ｄドナーから生成、再構成されたＮＳＧマウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の染色を示す。
【図７５】Ｔ１Ｄまたは健常対照に由来するＣＤ３４＋細胞で再構成されたＮＳＧマウスに由来するＴ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化。マウスの赤血球および白血球の枯渇によって富化させたヒト細胞を、Ｔ１Ｄまたは健常対照のいずれかのＣＤ３４＋細胞で再構成したＮＳＧマウスに由来するＰＢＭＣおよび脾細胞から単離した。別の健常対照から単離したヒトＰＢＭＣを、対照として示す。ヒト細胞を、示される時点で、ＰＢＳ中において１０００Ｕ／ｍｌで刺激した。細胞を固定し、ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗシステムを使用して、ヒトおよびマウスＣＤ４５、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、および抗リン酸化ＳＴＡＴ５の染色を行った。Ｃｙｔｏｂａｎｋ．ｏｒｇでの分析プログラムを使用して、データを分析した。ＩＬ−２での刺激による活性化が、ＣＤ４＋細胞（図７５Ａ）およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（図７５Ｂ）に示される。各試料について、時間に伴うシグナル強度における倍率中央値の変化を、右側にプロットする。
【図７６】ｄＧｕｏで処置した胸腺組織の移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける末梢ヒト細胞の再構成。胎児胸腺組織を、５×１０5の同種成体ＣＤ３４＋細胞または４×１０5の自己胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞（白丸、ｎ＝５）を静脈注射で受容させた亜致死照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤへの移植の前に、７日間（黒四角、ｎ＝４）または２１日間（黒三角、ｎ＝５）、ｄＧｕｏで処置した。年齢適合対照動物には、５×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を単独で受容させた（白四角、ｎ＝５）。マウスを出血させて、示される時点において、（マウスとヒトの合計）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のヒト（ｈｕ）細胞の再構成を測定した。
【図７７】凍結保存／解凍した胸腺移植片および同種成体ＣＤ３４＋細胞を受容したＮＳＧマウスにおける多系統ヒト細胞の再構成。図７７Ａ。凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を、３×１０5（黒四角、ｎ＝６）または５×１０5（黒三角、ｎ＝６）の成体ＣＤ３４＋細胞および２用量の抗ＣＤ２  ｍＡｂの静脈注射と組み合わせて受容させた、亜致死照射したＮＳＧマウスを出血させて、表示される時点での（マウスとヒトの合計）ＰＢＭＣ中のヒト細胞の再構成を測定した。年齢適合対照動物には、３×１０5の成体ＨＳＣを単独で受容させた（白四角、ｎ＝６）。ＰＢＭＣの単細胞懸濁液に、ヒト造血細胞（ＣＤ４５）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、および単球（ＣＤ１４）のマーカー染色を行った。死細胞およびマウスの赤血球は、分析から除外した。図７７Ｂ。移植２０週間後の代表的なＴＨＹ移植片の外観。凍結保存／解凍した胎児胸腺組織を移植したＮＳＧマウスは、腎臓被膜の下に豊富な生存胸腺組織を有した。図７７Ｃ。胸腺細胞のＦＣＭ分析（単一の実験における１２の移植片の代表）。
【図７８】凍結保存／解凍した胸腺移植片および臨床骨髄吸引液から単離した同種成体ＣＤ３４＋細胞を受容したＮＳＧマウスにおける多系統ヒト細胞の再構成。図７８Ａ。亜致死照射したＮＳＧマウスに、凍結保存／解凍した胎児胸腺組織を、健常志願者（黒四角、ｎ＝ドナー３、レシピエント６）およびＴ１Ｄ対象（黒三角、ｎ＝ドナー４、レシピエント２９）に由来する骨髄吸引液から単離した１．８〜３．０×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて受容させた。ＰＢＭＣ（マウスとヒトの合計）におけるヒト細胞の再構成の平均レベルを、時間とともに示す。対照動物には、Ｔ１Ｄ対象（白丸、ｎ＝ドナー２、レシピエント７）に由来する成体ＨＳＣを単独で受容させた。胸腺移植片および骨髄ドナーに、ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイを使用して、Ｔ１Ｄ関連ＤＲＢおよびＤＱＢ対立遺伝子ならびにＨＬＡ  Ａ＊２０１についてＨＬＡ型の判定を行った。胸腺組織および骨髄ドナーは、少なくともＨＬＡ＊Ａ２０１ならびにＤＲＢ＊０３０２および／またはＤＱＢ＊０３０１を共有していた。図７８Ｂ。移植片の胸腺細胞を、Ｔ１Ｄ（ｎ＝５）および対照（ｎ＝３）のＨＳＣで再構成した動物において、移植の２２〜２５週後に分析した。平均＋標準誤差を示す。Ｔ１Ｄおよび対照の動物間に有意差は認められなかった。
【図７９】胎児胸腺移植片および成体ＣＤ３４＋細胞を受容したＮＳＧマウスにおける機能性および自己寛容性の免疫系。図７９Ａ。７Ｇｙで照射した胸腺移植片に加えて、３×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウス（ｎ＝３）は、移植後３０週超で、末梢Ｔ細胞を再構成した。移植の３９週間後に、同種ヒトおよび異種ブタ皮膚を移植した。未処置対照ＮＳＧマウス「ナイーブＮＳＧ」でのブタおよびヒトの皮膚移植片（それぞれ、ｎ＝３および４）の生存もまた示される。図７９Ｂ。凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片および健常対照（黒色バー）またはＴ１Ｄ対象（点を付したバー）に由来する同種骨髄ＣＤ３４＋細胞を移植した２０週後に、ヒトＴ細胞（＞９０％純粋）を、ＮＳＧマウスの脾臓および末梢リンパ節から富化させた。対照Ｔ細胞を、同じ健常対照志願者（白色バー）のＰＢＭＣから単離した。表１１は、Ｔ１ＤのＣＤ３４＋細胞から再構成された、３匹のマウスにおけるＣＤ４細胞のナイーブ／メモリー細胞の分布を示す。
【図８０】胸腺移植片およびＩＩＲマウスの末梢中のＴｒｅｇ。図８０Ａ。移植２０〜２２週後、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片、および２人の健常志願者（丸）のうちの１人または１人のＴ１Ｄ対象（四角）に由来する同種ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスの胸腺移植片から、単細胞懸濁液を調製し、ＦＣＭによって分析した。自然発生型Ｔｒｅｇのマーカーとして、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＦｏｘＰ３＋胸腺細胞中のＨｅｌｉｏｓの発現を、第２のヒトドナー組に由来するＮＳＧマウスにおいて下段に示す。図８０Ｂ。凍結保存／解凍した胎児胸腺移植片を、２人の健常対照のうちの１人（黒四角）または１人のＴ１Ｄ対象（黒三角）に由来するＣＤ３４＋細胞とともに移植した２０週後のＰＢＭＣにおける、２人の健常ヒト（黒丸）と比較して類似する割合のＴｒｅｇ。左のプロットは、対照およびＴ１Ｄドナーから生成されたＩＩＲマウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の染色を示す。
【図８１】ＩＩＲマウスにおけるＴ細胞の多様なレパートリー。移植２０週後の、１人のＴ１Ｄドナーまたは２人のうち１人の健常対照に由来するＣＤ３４＋細胞で再構成したＴＨＹ移植片におけるヒトＣＤ４およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞のスペクトル型解析（β鎖ＣＤＲ３の長さ分布）。６匹の（マウスの）うちの１匹の代表動物（＃５７００）からのスペクトル型を示す。縦軸は、相対蛍光単位である（全体＝６，０００単位）。横軸は、ヌクレオチドの寸法である。基準寸法マーカーは、低くより弱いピークとして見られる。代表的なＢＶは、１試料につき合計１２の分析から示される。観測されたＴＣＲ  β鎖の長さ分布の、健常成体ＣＤ４  Ｔ細胞の基準分布からの相対距離の尺度である、全６つの試料のハミング距離を表１１に示し、それぞれ、多クローン性レパートリーの再構成を示す。
【図８２】ＩＩＲマウスにおけるＴ細胞のナイーブ／メモリー表現型。図８０Ａおよび図８０Ｂ。ＴＨＹの埋め込みに加えて、１人のＴ１Ｄ対象（黒四角）または２人のうち１人の健常対照（黒三角）に由来するＣＤ３４＋細胞の静脈内注入の２０週後の、健常志願者およびＩＩＲマウスのＰＢＭＣ中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞（図８０Ｂ）ならびにＴｒｅｇ（図８０Ｃ）の割合（ＣＤ３４＋細胞のドナー（白丸）を含み、対照マウスについては白三角で示される）（＊ｐ＜０．０５、対照のＣＤ８集団における異常値は統計分析から除外）。図８０Ｃ。Ｔ細胞集団を、同種胸腺ありまたはなしで、ＣＤ３４＋胎児肝臓細胞を注射したＮＳＧマウスにおいて、移植７週間後にＦＣＭによってアッセイした。各群ｎ＝４で、平均±標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図８３】ＴＨＹ移植片の照射は成長を阻害する。成体ＣＤ３４＋細胞に加えて、移植前に照射を行ったか（図８３Ａの矢印）または移植前に凍結保存した（図８３Ｂ）胸腺移植片を受容させたマウスにおける、移植２０週後の胸腺移植片の外観。
【図８４】凍結保存は、ヒト胎児移植片内の胸腺細胞を枯渇させる。同じドナーに由来する、新鮮および凍結保存した胸腺（約０．００２ｇの組織）を解離し、生存細胞および胸腺細胞のマーカーＣＤ４およびＣＤ８の染色を行った。１×１０5の全イベントを収集し、生存（ＤＡＰＩ-）胸腺細胞でサブゲートした。ＦＣＭプロットを左側に示し、ＣＤ４ＣＤ８二重陰性、単一陽性、二重陽性集団の合計細胞数を、右側のグラフに示す。
【図８５】ＩＩＲマウスのヒト胸腺移植片における、レシピエントマウスに由来する抗原提示細胞。成体ＣＤ３４＋細胞および正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する胸腺で再構成されたＩＩＲマウスに由来する胸腺移植片を分割し、抗マウスｐａｎ−ＭＨＣクラスＩＩ  ｍＡｂで染色し、マウスに由来するＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞の存在を示した。正常なマウス胸腺中、ｍは髄質を表し、ｃは皮質領域を表す。交差反応について試験した際、抗マウスＭＨＣＩＩ抗体は、ヒト胸腺組織に結合しなかった。
【図８６】ヒト化マウスでのキメラ化に対する抗ＣＤ２  ｍＡＢ  ＢＴＩ３２２の影響。凍結保存した胎児胸腺組織、および抗ＣＤ２  ｍＡｂ  ＢＴＩ３２２ありまたはなしで同種ＣＤ３４＋細胞を受容したＮＳＧマウスの血中のヒト細胞の再構成の比較。末梢血単核細胞中のヒトＣＤ４５＋細胞の割合を、表示される時間で示す。２つの群の間で、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、または単球の割合に差は検出されなかった。
【図８７】ヒト同種移植片は、未操作ＮＳＧマウスによって許容される。ＮＳＧマウスに、ヒト皮膚を移植し（中央パネル）、１０６日間、拒絶に関して監視した。全てのＮＳＧマウス（ｎ＝３）は、ヒト皮膚移植片を許容した。ヘマトキシリンおよびエオシン（上段）は、一般的組織形態を示し、抗ヒトサイトケラチン染色（下段）は、ＮＳＧマウス上のヒト皮膚およびヒト同種移植片における特異的染色を示す。ＮＳＧ皮膚単独では、抗ヒトサイトケラチンに染色しない（右下）。ヒト同種移植片は、ｎ＝３の代表である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、多重遺伝子の遺伝性および不明瞭な環境要因の相互作用からもたらされる。ＨＬＡ遺伝子型が、最も強く疾患と関連するが1-5、非ＨＬＡ関連の座位は、明らかにＴ１ＤＭの危険性と関連している6-9。これらの座位の多くは、Ｔ１ＤＭにおける免疫学的障害を最も厳密に複製したモデルである10-12 13 3,14-18、ＮＯＤマウスにおける自己免疫に寄与する非ＭＨＣ座位に対してシンテニーである7。これらは、サイトカイン、副刺激分子、および阻害分子等の免疫調節遺伝子を含む7,6,19,20。制御性ＣＤ４Ｔ細胞21-24およびＮＫ／Ｔ細胞25,26における欠陥は、マウスおよびヒトの両方の疾患と関連している。遺伝子研究により、これらの遺伝子のうちのいくつかがＮＯＤマウスモデルにおいて自己免疫を促進する、機構の分析が可能となった6,7,19,27。Ｔ１ＤＭを有するヒトにおいては、しかしながら、非ＨＬＡ関連の遺伝子から生じる根本的な欠陥は、大部分が定義されていない。これらの座位の多くが、免疫制御性遺伝子を含むことを考慮すると、造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源とする、免疫系の細胞における内在性異常が、自己免疫の発達に寄与することが推定できる。実際に、Ｔ、Ｂ、ＮＫ、ＮＫＴ、および樹状細胞における異常は、ＮＯＤマウスおよび／またはＴ１ＤＭ患者に関係している25,27-35。しかしながら、これらの研究のほとんどが、疾患発症後のＴ１ＤＭ患者の分析に関与したものであり、原因と、疾患または疾患を引き起こす他の（例えば、環境的）要因の影響とを区別するものではない。したがって、制御された前向きな方法で、このような欠陥の分析を可能にするモデルに対する必要性が存在する。ある特定の態様において、本発明は、Ｔ１ＤＭを促進する、ＨＳＣ内在性の遺伝的に決定される免疫系の異常の特定を可能にすることができる、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣから強力な免疫再構成を可能にするヒト化マウスモデルの作製を提供する。この研究の目標は、このようなモデルを作製し、Ｔ１ＤＭと関連するＴ細胞においてＨＳＣ内在性異常の探求を開始することである。
【００４５】
ある特定の態様において、本発明は、対象のＨＳＣから強力な免疫再構成を可能にする、ヒト化マウスモデルの作製を提供する。ある特定の実施形態において、対象は、疾患または障害を患っており、疾患または障害を促進する、ＨＳＣ内在性の遺伝的に決定される免疫系の異常を特定することを可能にし得る。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、免疫障害である。ある特定の実施形態において、疾患は、ＨＩＶまたはＡＩＤＳである。他の実施形態において、疾患または障害は、自己免疫のものである。他の実施形態において、疾患または障害は、癌である。
【００４６】
「ヒト化マウス」モデルを作製した。ヒトＰＢＭＣは、免疫不全マウスに定植させることができ36、ヒトＴ細胞は、免疫不全マウスの腎臓被膜下にＨＳＣ源（胎児肝臓（ＬＩＶ））を埋め込んだヒト（ＨＵ）胎児胸腺（ＴＨＹ）移植片において、正常に発達し得る37。しかしながら、これらのモデルで行うことができる免疫分析には、ヒトＰＢＭＣのレシピエントにおけるＥＢＶ関連のリンパ増殖性疾患の発症36,38、ならびに高レベルで末梢免疫系に定植させるか、または正常に機能させるために、ＨＵ  ＴＨＹ／ＬＩＶ移植片において生成されたＴ細胞不全37,39,40を含む、制限がある。ＮＫ細胞が欠損した、クラスＩ欠損もしくは共通γ鎖（γｃ）ノックアウトＮＯＤ−ＳＣＩＤまたはＲＡＧノックアウトのいずれかのマウスをヒトＨＳＣのレシピエントとして使用することで41-45、免疫機能の改善が報告されているが41,42、それらは、ＨＳＣの周産期の注射を必要とし、マウス胸腺に定植するヒト胸腺細胞はわずかである。
【００４７】
ヒトＨＳＣの注射と腎臓被膜下へのヒト胎児ＴＨＹ／ＬＩＶの埋め込みとの組み合わせは、移植片内に多数（約１０8）の正常ヒト胸腺細胞、ならびにヒトＴ細胞、Ｂ細胞、免疫グロブリン、および骨髄と形質細胞様の両方の樹状細胞46,47の高レベルの末梢再構成を有する、高レベルのヒト免疫再構成を可能にしている。異種移植片の自発的拒絶が、ヒト化マウスモデルに達成されており46,47、Ｔ細胞および抗体の両方の応答が、タンパク質の免疫付与によって誘発される。このモデルは、最近、ＥＢＶでの免疫付与を示す応答を伴って再生成された48。このモデルにヒト胎児ＴＨＹを埋め込むことにより、ヒト胸腺細胞前駆体の最適なホーミング、増殖、および発達を可能にし、いったんＴ細胞が発達して末梢に移動すると、末梢内の再構成されたリンパ組織およびヒト（同系）ＡＰＣ集団は、これらのＴ細胞の増殖、生存、および機能を促進する。機能性および表現型的に正常な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）もまた、これらの移植片において生成される。これらのＴｒｅｇが、胸腺での正の選択の際に存在するものと同じＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用によって、機能性となることが、証拠によって示される。胸腺上皮細胞ＭＨＣ／ペプチド複合体は、Ｔｒｅｇの正の選択を行い49-51、マウスのデータは、末梢でのＭＨＣ52および同種抗原53との接触は、制御性Ｔ細胞が完全な機能を取得し、それを維持することを可能にすることを示す。
【００４８】
胸腺からの移出に続いて、末梢Ｔ細胞は、Ｔ細胞の損失が、ナイーブおよびメモリーＴ細胞の「恒常性」増殖によって均衡される、動的状態に入り54、非常に安定した寸法のＴ細胞のプール寸法を維持する55,56。この種類の増殖を受けるナイーブＴ細胞は、特異性抗原の接触なしに、それらの表現型をメモリーＴ細胞のものに恒久的に変換し57-63、サイトカイン生成等、ある特定のエフェクター機能を得ることができる64,65。年齢に伴う胸腺機能の減少、感染によるクローン性増殖、およびウイルス感染または治療的介入によるリンパ球減少等の生存中のイベントは、これらの恒常性プロセスによって均衡される54。Ｔ細胞の恒常性増殖は、正の選択の際に胸腺中に存在するものと同じ自己ＭＨＣ／ペプチド複合体54,58,66-71 63,67,72-74、ならびにＩＬ−７およびＩＬ−１５等のサイトカイン54,72,75-79を必要とすることが示されている。さらに、末梢内のＭＨＣ／ペプチド複合体は、それらの自己免疫能力52を制限するために、通常のＴ細胞を「調整する」ことに重要な役割を果たす。
【００４９】
リンパ球減少によってもたらされる増殖における異常は、ＮＯＤマウスおよびヒトにおけるＴ１ＤＭの病因と関係している。ＮＯＤマウスにおける免疫欠陥を説明する１つのモデルは、Ｔ細胞による抗アポトーシス分子の発現の減少と関連して、末梢Ｔ細胞のアポトーシスの増加を伴い、リンパ球減少、ＩＬ−２１生成、およびＩＬ−２１によってもたらされるＴ細胞の活性化および増殖につながる80。自己寛容性の低下は、部分的に、自己反応性Ｔ細胞クローンが、自己抗原に対するそれらの親和性のために、この環境で競合および生存する能力を反映する54,80-82。実際に、Ｔ１ＤＭ90,91を含む、いくつかのヒト自己免疫疾患83-89は、リンパ球減少と関連しており、Ｔ１ＤＭの発症は、リンパ球減少を誘発するウイルス感染に続いて起こる場合がある54。
【００５０】
Ｔｒｅｇの数および機能における欠陥が、Ｔ１ＤＭ患者およびＮＯＤマウスに報告されている22-24,92-97。さらに、Ｔｒｅｇの移入98,99は、ＮＯＤマウスにおいて自己免疫を逆転させ得る。しかしながら、Ｔｒｅｇの欠陥は、全ての研究に見られたわけではない。いくつかの場合では、ＮＯＤマウスは、加齢および疾患の発症を伴ってさえも99、Ｔｒｅｇの数および機能を保存したことが判明しており100,101、いくつかのヒト研究は、Ｔ１ＤＭ患者におけるＴｒｅｇの保存を示している102。これらの矛盾するデータのうちのいくつかは、以前の研究ではＣＤ４+Ｔｒｅｇの識別にＣＤ２５マーカーのみを使用し、このマーカーが活性化されたＴ細胞も特定するため、これによって説明することができる99,101,102。より最近の研究は、リンパ系組織ではなく膵臓内の炎症部位でのＴｒｅｇの不足、および制御に対するエフェクター細胞の相対的耐性により、ＮＯＤモデルにおける疾患進行の最終段階を特徴付けることができることを示す101。しかしながら、Ｔ１ＤＭを有するヒトにおける研究は、末梢血試料の分析に限定されており、ヒトＴｒｅｇに一次欠陥が存在するかどうか、およびそれがＴ１ＤＭ患者では遺伝子にプログラムされているかどうかについては、多くが不明なままである。
【００５１】
さらに、ＮＯＤマウスの末梢25,30,31,103,104および胸腺105,106、ならびにＴ１ＤＭ患者の血液において、ＮＫＴ細胞の欠陥が説明されている26,92,101。ＮＫＴ細胞数の減少は、全てのＴ１ＤＭ患者の研究に見られているわけではないが107,108、これらの細胞による活性化の欠損、ならびにＩＦＮ−γ32,92,103およびＩＬ−４92,106,109の両方を含むサイトカインの生成が、疾患病因に関係している。ＮＫＴ細胞の数を増加させること110,111、ならびに既存のＮＫＴ細胞のインビボでの活性化112-114により、ＮＯＤマウスにおける自己免疫を逆転させることができる。これらの動物におけるＮＫＴ細胞機能の異常についての遺伝的根拠は、ＮＯＤバックグラウンドでの、Ｉｄｄ６座位を有するＮＫ複合体への繁殖によるその逆転によって示される115。
【００５２】
ある特定の態様において、本発明は、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣから発達するＴｒｅｇの発達、末梢生存、または末梢「調整」52における欠陥の可能性を試験するためのヒト化マウスモデルおよび方法を提供する。本モデルは、ＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞の発達における、遺伝子にプログラムされた胸腺内および末梢の両方の欠陥の役割を試験する機会を提供する。
【００５３】
ある特定の態様において、本発明は、成体ドナーに由来する骨髄細胞を使用して、マウスにおいて多数の多様な機能性ナイーブＴ細胞を生成する方法を提供する。本方法は、ＨＬＡ対立遺伝子を成人患者の骨髄ドナーに由来するＣＤ３４＋細胞と共有する、凍結保存して解凍したヒト胎児胸腺組織を使用することを伴う。胎児胸腺を腎臓被膜下に埋め込み、ＣＤ３４＋細胞を、限定されないが、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−共通γ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）免疫不全マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス、または好適な遺伝子型を有する任意の他のマウス等の任意の好適なマウスに静脈内注射する。胸腺と成人患者ドナーから生成された抗原提示細胞との間でＨＬＡを共有するため、生成されるＴ細胞は、同じ成体ドナーの抗原提示細胞と最適に機能することができる。ある特定の実施形態において、移植片内に既に存在するＴ細胞が、成体骨髄ドナー細胞またはレシピエントマウスを攻撃することがないように、胸腺移植片の凍結保存および解凍と併せて、抗ＣＤ２抗体をマウスに与える。注入された成体骨髄ＣＤ３４＋細胞に由来する胎児胸腺移植片で発達するＴ細胞は、ＣＤ３４＋細胞ドナーおよびマウスに対して、おそらく、これらがいずれも胸腺内で寛容性の誘発に寄与する抗原提示細胞を生成するため、寛容性である。胸腺および成体ＣＤ３４＋細胞移植片を受容するマウスの末梢に定植するＴ細胞は、機能性および寛容性であることが示されている。さらに、成体骨髄ドナーと比較して、再構成されたマウスにおけるＴ細胞の免疫系は、回復している、すなわち、抗原と接触経験のない「ナイーブ型」のＴ細胞の割合が、大幅に増加する。
【００５４】
元の骨髄ドナーに注入するために多数のナイーブＴ細胞が利用可能であることは、高齢、広範な化学／放射線療法治療、Ｔ細胞を枯渇させた造血細胞の移植、免疫抑制剤治療、移植片対宿主病、またはＨＩＶ感染のために、胸腺が不足した患者において、非常に多くの治療用途を有する。
【００５５】
ある特定の態様において、本発明は、患者のＴ細胞の再構成／免疫療法のために、Ｔ細胞を含むがこれに限定されない細胞を、治療的に使用する方法を提供する。
【００５６】
ある特定の態様において、本発明は、本発明のヒト化マウスモデルによって生成された免疫細胞の養子移入の治療的方法を提供する。種々の疾患または障害を治療するための養子移入方法を記載する参考文献を本明細書に提供し、これらの参考文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。P. J. Amrolia, G. Muccioli-Casadei, H. Huls, S. Adams, A. Durett, A. Gee, E. Yvon, H. Weiss, M. Cobbold, H. B. Gaspar, C. Rooney, I. Kuehnle, V. Ghetie, J. Schindler, R. Krance, H. E. Heslop, P. Veys, E. Vitetta, and M. K. Brenner. Adoptive immunotherapy with allodepleted donor T-cells improves immune reconstitution after haploidentical stem cell transplantation. Blood 108 (6):1797-1808, 2006、 H. E. Heslop, K. S. Slobod, M. A. Pule, G. A. Hale, A. Rousseau, C. A. Smith, C. M. Bollard, H. Liu, M. F. Wu, R. J. Rochester, P. J. Amrolia, J. L. Hurwitz, M. K. Brenner, and C. M. Rooney. Long-term outcome of EBV-specific T-cell infusions to prevent or treat EBV-related lymphoproliferative disease in transplant recipients. Blood 115 (5):925-935, 2010、 P. J. Hanley, C. R. Cruz, B. Savoldo, A. M. Leen, M. Stanojevic, M. Khalil, W. Decker, J. J. Molldrem, H. Liu, A. P. Gee, C. M. Rooney, H. E. Heslop, G. Dotti, M. K. Brenner, E. J. Shpall, and C. M. Bollard. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood 114 (9):1958-1967, 2009、 A. M. Leen, A. Christin, G. D. Myers, H. Liu, C. R. Cruz, P. J. Hanley, A. A. Kennedy-Nasser, K. S. Leung, A. P. Gee, R. A. Krance, M. K. Brenner, H. E. Heslop, C. M. Rooney, and C. M. Bollard. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood 114 (19):4283-4292, 2009、 C. M. Bollard, S. Gottschalk, A. M. Leen, H. Weiss, K. C. Straathof, G. Carrum, M. Khalil, M. F. Wu, M. H. Huls, C. C. Chang, M. V. Gresik, A. P. Gee, M. K. Brenner, C. M. Rooney, and H. E. Heslop. Complete responses of relapsed lymphoma following genetic modification of tumor-antigen presenting cells and T-lymphocyte transfer. Blood 110 (8):2838-2845, 2007、 C. Quintarelli, J. F. Vera, B. Savoldo, G. M. Giordano Attianese, M. Pule, A. E. Foster, H. E. Heslop, C. M. Rooney, M. K. Brenner, and G. Dotti. Co-expression of cytokine and suicide genes to enhance the activity and safety of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Blood 110 (8):2793-2802, 2007、 B. Savoldo, J. A. Goss, M. M. Hammer, L. Zhang, T. Lopez, A. P. Gee, Y. F. Lin, R. E. Quiros-Tejeira, P. Reinke, S. Schubert, S. Gottschalk, M. J. Finegold, M. K. Brenner, C. M. Rooney, and H. E. Heslop. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood 108 (9):2942-2949, 2006、 A. M. Leen, G. D. Myers, U. Sili, M. H. Huls, H. Weiss, K. S. Leung, G. Carrum, R. A. Krance, C. C. Chang, J. J. Molldrem, A. P. Gee, M. K. Brenner, H. E. Heslop, C. M. Rooney, and C. M. Bollard. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat Med 12 (10):1160-1166, 2006、 Y. Cui, H. Zhang, J. Meadors, R. Poon, M. Guimond, and C. L. Mackall. Harnessing the physiology of lymphopenia to support adoptive immunotherapy in lymphoreplete hosts. Blood 114 (18):3831-3840, 2009、 G. Brestrich, S. Zwinger, A. Fischer, M. Schmuck, A. Rohmhild, M. H. Hammer, A. Kurtz, L. Uharek, C. Knosalla, H. Lehmkuhl, H. D. Volk, and P. Reinke. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. Am J Transplant 9 (7):1679-1684, 2009、K. P. Micklethwaite, L. Clancy, U. Sandher, A. M. Hansen, E. Blyth, V. Antonenas, M. M. Sartor, K. F. Bradstock, and D. J. Gottlieb. Prophylactic infusion of cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes stimulated with Ad5f35pp65 gene-modified dendritic cells after allogeneic hemopoietic stem cell transplantation. Blood 112 (10):3974-3981, 200、 B. G. Till, M. C. Jensen, J. Wang, E. Y. Chen, B. L. Wood, H. A. Greisman, X. Qian, S. E. James, A. Raubitschek, S. J. Forman, A. K. Gopal, J. M. Pagel, C. G. Lindgren, P. D. Greenberg, S. R. Riddell, and O. W. Press. Adoptive immunotherapy for indolent non-Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma using genetically modified autologous CD20-specific T cells. Blood 112 (6):2261-2271, 2008、G. Parmiani, A. De Filippo, L. Novellino, and C. Castelli. Unique human tumor antigens: immunobiology and use in clinical trials. J Immunol 178 (4):1975-1979, 2007、J. J. Sussman, R. Parihar, K. Winstead, and F. D. Finkelman. Prolonged culture of vaccine-primed lymphocytes results in decreased antitumor killing and change in cytokine secretion. Cancer Res. 64 (24):9124-9130, 2004。
【００５７】
本発明は、対象において、例えば癌であるがこれに限定されない疾患、または免疫不全を治療または予防する方法を提供する。本方法の実施形態は、ヒト化マウスモデルから単離した自己Ｔ細胞を含む組成物を、疾患または免疫不全を治療するのに効果的な量で対象に投与することを含み、自己Ｔ細胞は、体外で増殖、培養、または活性化されない。ある特定実施形態において、本発明は、任意でリンパ球枯渇化学療法を受けている患者における癌を治療する方法を提供し、本方法は、ＮＫＴを含むがこれに限定されない、本マウスモデルから単離した自己Ｔ細胞を含む組成物を、癌を治療するのに効果的な量で対象に投与することを含む。当業者は、治療効果を達成するために、本ヒト化マウスモデルから単離した細胞を投与するための用量およびレジメンを容易に決定することができる。
【００５８】
本発明の一態様によると、抗原特異的養子Ｔ細胞免疫療法を、マウスモデルからＴ細胞を得ることによって提供し、ここで、Ｔ細胞を、この療法が対象とする特異的な抗原の存在下でマウスモデルにおいて体外ではなくインビボで増殖させて、増殖したＴ細胞を患者内に戻す。
【００５９】
別の態様によると、本発明は、少なくとも１つの標的抗原に特異的なＴ細胞の調製物を生成するための方法を提供する。このような調製物は、特に、感染性疾患、癌、および抗原特異的Ｔ細胞が対象に有効である他の疾患の治療における、医療目的での養子移入に使用することができる。本発明による方法は、上述のようなヒト化マウスモデルを作製するステップ、マウスモデルを対象となる抗原に暴露するステップ、抗原特異的Ｔ細胞の集団を生成するステップ、マウスからＴ細胞集団を単離するステップ、および単離したＴ細胞を治療効果をもたらすのに十分な量で骨髄ドナーに投与するステップを含む。
【００６０】
単離ステップは、任意の好適な方法によって行うことができ、例として、例えば、注射による細胞調製物の患者への適用を促進するように、遠心分離または他の手段で細胞調製物を濃縮することによる、細胞の沈降を含んでもよい。
【００６１】
本発明の別の態様により方法を提供し、それによって、１つ以上の標的抗原またはそのペプチド断片をマウスに投与する。例えば、ペプチドもしくはタンパク質断片として可溶性形態で、または担体構造に複合化されたこのような標的抗原の存在が、ヒト化マウスモデルの免疫系を刺激して、標的抗原に対抗する免疫細胞を生成することになる。
【００６２】
ある特定の態様において、本発明は、例えば、特定の感染症または癌を含むがこれらに限定されない、疾患または障害の治療のための方法であって、ヒトＴ細胞を投与することを含み、非限定的な例において、これらは、特許請求されるマウスモデルの胸腺周辺から単離した細胞である、方法を提供する。具体的な用途に応じて、治療方法に使用する細胞は、特定の細胞集団または全レパートリーのＴ細胞の移植を含み得る。ある特定の態様において、本発明は、免疫系の再構成を、それを必要とする対象、例えば、限定されないが、胸腺が正常に機能していない対象に行うための方法であって、非限定的な例においては、マウスモデルの末梢から単離したヒトＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、養子移入方法で使用する細胞は、マウスモデルに由来するＴ細胞である。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞を単離し、精製する。ある特定の実施形態において、養子移入によって注入されるＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、養子移入によって注入される細胞は、ナイーブＴ細胞を含む、Ｔ細胞の全レパートリーを含むか、本質的にそれから構成されるか、またはそれから構成される。ある特定の実施形態において、養子移入方法に使用する細胞は、ヒト対象への投与に好適な治療的組成物に含まれる。
【００６３】
元の骨髄ドナーに注入するために多数のナイーブＴ細胞が利用可能であることは、高齢、広範な化学／放射線療法治療、Ｔ細胞を枯渇させた造血細胞の移植、免疫抑制剤治療、移植片対宿主病、またはＨＩＶ感染のために胸腺が不足した患者において、非常に多くの治療用途を有する。
【００６４】
ある特定の態様において、本方法は、特異的抗原での免疫付与を含み、それによって、マウスが、骨髄ドナー／患者では有効な免疫応答に達することができない、特異的抗原を認識するＴ細胞を提供することもまた可能となる。非限定的な例において、腫瘍特異的Ｔ細胞が腫瘍自体によって寛容性となっている癌患者に、本マウスモデルから得たＴ細胞を注入することができ、マウスは、癌患者由来のＣＤ３４＋細胞で再構成され、マウスは、患者の癌に由来する抗原に暴露されている。
【００６５】
別の実施形態において、ＥＢＶによって引き起こされるリンパ増殖性疾患、例えば、限定されないが、例として、移植後のリンパ増殖性疾患を発症した免疫抑制患者に、本マウスモデルから得られたＴ細胞を注入することができる。ある特定の実施形態において、マウスモデルは、ＥＢＶ抗原で免疫付与される。
【００６６】
別の実施形態において、免疫抑制された患者、および／または日和見感染症、例えば、限定されないが、ＣＭＶ疾患、アスペルギルス症、または任意の他のウイルス性、細菌性、もしくは真菌性の感染が発症するＨＩＶ感染を有する患者に、本マウスモデルから得られたＴ細胞を注入することができる。ある特定の実施形態において、マウスモデルは、ＣＭＶ抗原で免疫付与される。
【００６７】
ある特定の実施形態において、成体ドナーのＣＤ３４＋細胞は、マウスにおいて生成されたＴ細胞を受容することになる成人患者内に残存するウイルスに耐性となるように、遺伝子修飾することができる。このような修飾の非限定的な例には、ＨＩＶ感染患者に由来するＣＤ３４＋細胞におけるＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４のノックダウンまたは突然変異が含まれ、患者に戻されたときに、マウスモデルで生成された新しいＴ細胞を、ＨＩＶ感染に耐性にすることになる。
【００６８】
マウスの免疫付与による、所望の特異性を有するＴ細胞の増殖に加えて、特定の所望される機能のためのＴ細胞の分化もまた、マウスモデルにおいて行うことができる。非限定的な例において、それぞれ、移植片拒絶／ＧＶＨＤまたは自己免疫疾患を治療／予防するために、マウスを、例えば、特定のＡＰＣ、サイトカインを介して、制御性Ｔ細胞の分化を促す方法で、ドナーの抗原または患者の自己抗原に暴露することができる。
【００６９】
他の実施形態において、マウスはまた、器官または造血細胞の移植が、レシピエント、またはドナーのＨＣＴ移植片、Ｔ細胞枯渇の使用を伴う状況において、同種移植片ドナーまたはＨＣＴレシピエントに先験的寛容性の免疫系を生成するために使用することができる。例えば、患者は、同じドナーに由来する器官に対する混合キメラ／寛容性誘発の目的で、同種ＨＣＴのための骨髄非破壊的レジメンの一部として、徹底的なインビボＴ細胞枯渇を受ける場合がある。混合キメラが患者において生成されている間、またはその前でさえも、ドナーおよび患者両方に由来するＣＤ３４＋細胞は、マウスにおいて互いに対して相互に寛容性であるＴ細胞を再構成することができる。これらは、年齢および／または前処置療法のためにその胸腺がうまく機能していない、成体レシピエントの迅速な免疫の再構成を達成するために、注入することができる。
【００７０】
ある特定の態様において、本発明は、マウスモデルを提供し、このマウスは、ドナーおよびレシピエントに由来するＣＤ３４＋細胞の静脈内注入を受容しており、それによって、再構成された免疫系は、混合キメラを示し、再構成されたＴ細胞は、レシピエントおよびドナーの両方の組織および／または細胞に寛容性である。
【００７１】
一態様において、本発明は、非ヒト動物が、大型プールの自己多クローン性の多様なナイーブＴ細胞のインビボ発達を効果的にもたらすように、ドナーに由来するＣＤ３４＋細胞、および例えば凍結保存および解凍によって事前にＣＤ３４＋細胞を枯渇させた胸腺由来組織のレシピエントである、非ヒト動物を提供する。
【００７２】
上述の混合キメラは、骨髄移植、器官または組織の移植に利点を提供する。
実施例１
【００７３】
Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の遺伝的要因は、制御性細胞の機能および恒常性増殖におけるＴ細胞内在性の異常と関連する可能性がある。制御性Ｔ細胞機能における異常は、ＮＯＤマウスモデルおよびＴ１ＤＭ患者に関連づけられている。リンパ球減少および増加した「恒常性」増殖もまた、ＮＯＤマウスにおける自己免疫の発展と関連づけられている。しかしながら、これらの現象の分析が可能であるモデルは、これまで、ヒトＴ細胞に利用可能ではなかった。本発明は、ヒト胸腺異種移植片と組み合わせたヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）での強力な末梢再構成が、Ｔｒｅｇを含む、ヒトＴ細胞の最適な発達、末梢生存、および機能を可能にする、ヒト化マウスモデルを提供する。さらに、胸腺異種移植片と一緒に埋め込まれた胸腺上皮細胞は、胸腺細胞の選択および寛容性に影響を及ぼし得る。
【００７４】
ある特定の態様において、本発明は、ＨＬＡ決定済みヒト胸腺異種移植片でのヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、ヒト胸腺移植モデルを再凝集させるための方法を提供する。これらの研究は、ヒト化マウスモデルを拡張し、インタクトな胎児胸腺組織を埋め込む代わりに、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織から凍結保存されたＣＤ４５陰性胸腺間質細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込む。共通の糖尿病感受性ＨＬＡ対立遺伝子を保有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照および１型糖尿病対象に由来する、静脈内注射されたＣＤ３４＋細胞からのＴ細胞の胸腺リンパ球形成を支持するであろう。代替的なアプローチには、ＨＬＡトランスジェニックＮＯＤマウスに由来する胸腺上皮細胞をインタクトなヒト胸腺組織に注射すること、または糖尿病感受性対立遺伝子をコードする遺伝子を胸腺異種移植片にアデノウイルス形質導入することが含まれる。
【００７５】
ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する通常のＴ細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型の変換、および自己寛容性を比較するための方法を提供する。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定する。恒常性における内在性の異常が、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞を特徴付けるかどうかを判定する。
【００７６】
ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する制御性Ｔ細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較するための方法を提供する。Ｔ１ＤＭ患者の幹細胞に由来するＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞は、欠陥を示す場合がある。これらの研究は、Ｔ１ＤＭ患者由来、およびそれらの胸腺対胸腺後の起源に由来する制御性細胞における内在性異常を特定するであろう。
【００７７】
ある特定の実施形態において、骨髄は、ＨＬＡ型判定済みのＴ１ＤＭ患者および健常志願者から採取する。５〜６ｍｌのＢＭ吸引液は、１０〜１２匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植するために十分なＣＤ３４細胞（約１．２５×１０6）を提供するであろう。ＨＬＡトランスジェニックＮＯＤマウスが利用可能であり、当該技術分野で既知の方法によって作製することができる。
【００７８】
Ｔ１ＤＭ患者および対照のＨＳＣからの胸腺リンパ球形成を支持するために同種ヒト胸腺を使用するアプローチを支持するデータを、本明細書に提供する。ある特定の実施形態において、以下が提供される：１）ヒト通常および制御性Ｔ細胞の発達、機能、および恒常性の詳細な分析を可能にするヒト化マウスモデルの作製、２）異種胸腺でのヒトＴ細胞の発達を伴うこのモデルにおける変形。これらの研究を通じて得られたデータは、ある特定の実施形態において、ＭＨＣ分子をＨＳＣドナーと共有するヒト胸腺移植片を伴うモデルが、最適なヒトＴｒｅｇの発達および機能ならびにＴ細胞の恒常性に不可欠であることを示す、３）胸腺移植片への胸腺上皮細胞の埋め込みが、正常なＴｒｅｇおよび通常Ｔ細胞の発達および機能を促進し得ることを示す、さらなる異種胸腺の移植モデルを提供する。
【００７９】
ヒト免疫応答を評価するためのヒト化マウスモデル。ヒト胎児胸腺（ＴＨＹ）を、胎児肝臓（ＬＩＶ）組織片とともにマウスの腎臓被膜下に埋め込むことにより、免疫不全マウスでの正常なヒト胸腺リンパ球形成およびＴ細胞の発達を達成する116（図１）。これらのマウスにおけるヒトＴ細胞の発達は、強力な同種および異種の混合リンパ球応答（ＭＬＲ）を示したが、ブタ皮膚の異種移植片を拒絶する能力はなかった46,117。胸腺後のＴ細胞の自己ペプチドＭＨＣリガンドとの接触が成熟Ｔ細胞の抗原反応性を維持するため118、およびＨＳＣ由来のＡＰＣが抗原特異的なＴ細胞の応答を促進するため119、理論に束縛されることなく、末梢ヒトＡＰＣの不足は、ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したマウスにおいてヒト胸腺移植片で発達するヒトＴ細胞のインビボ免疫応答を制限し得る。免疫不全マウスへのヒトＨＳＣの静脈内投与が、高レベルの非Ｔ細胞ヒト免疫の再構成を可能にするため120-129、Ｔ細胞の再構成および機能の改善は、ヒトＴＨＹ／ＬＩＶ移植片のＮＯＤ−ＳＣＩＤレシピエントにＣＤ３４細胞の静脈内移植を追加することによって達成することができる。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、１．５〜３ＧｙのＴＢＩを受けさせ、続いて腎臓被膜下にヒト胎児ＴＨＹ／ＬＩＶ組織を、単独またはＣＤ３４＋胎児肝臓細胞（ＦＬＣ、１×１０5）とともに、静脈内移植した。ＣＤ３４+ＨＳＣの静脈内添加は、ヒト造血再増殖およびリンパ球形成を有意に改善した（図２）。機能性のヒト胸腺リンパ球形成（すなわち、ＣＤ３+Ｔ細胞の発達）は、両方の群に検出されたが、ＣＤ１９+Ｂ細胞および骨髄細胞系統の著しい再増殖は、ＴＨＹ／ＬＩＶ／ＣＤ３４+ＦＬＣを移植したマウスにのみ見られた（図２）。さらに、ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したものではなく、ＴＨＹ／ＬＩＶ／ＣＤ３４+ＦＬＣを移植したマウスに由来するレシピエントのリンパ節は、対照であるＮＯＤ−ＳＣＩＤの未発達な節と比較して、著しく増大した（免疫応答性マウスのリンパ節に類似する寸法まで）。前者は、ヒトＣＤ３+Ｔ、ＣＤ１９+Ｂ、ならびにＬｉｎ-クラスＩＩ+骨髄および形質細胞様の樹状細胞である（図３および47）。ＴＨＹ／ＬＩＶ／ＣＤ３４+  ＦＬＣを移植したマウスはまた、ヒトＩｇの血清レベルを有意に増加させた（図４Ａ、Ｂ）。これらのマウスは、ブタ皮膚（図４Ｃ、Ｄ）および膵島（図４Ｅ、Ｆ）異種移植片を拒絶する能力によって示されるように、著しく改善されたインビボでのヒト免疫応答を示した。この研究は、最初に、事前に活性化したヒトＴ細胞を注射することなく、ヒト化免疫不全マウスにおける異種移植片の拒絶を実証するものであった。
【００８０】
抗原特異的ヒトＴ細胞および抗体応答を、ヒトＴｈｙ／Ｌｉｖ／ＣＤ３４+ＦＬＣを移植した（すなわち「ヒト化」）ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて評価した。図５Ａに示されるように、対照ではなく、ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫付与したヒト化マウスに由来するＴ細胞が、インビトロでＫＬＨに応答して増殖した。胚中心が、免疫付与したヒト化マウスの二次リンパ組織に検出された（図５Ｂ）。ＤＮＰ特異的ＩｇＧ（主にＩｇＧ１およびＩｇＧ２）が、免疫付与したヒト化マウスに検出されたが、対照には検出されなかった（図５Ｃ）。したがって、これらのマウスにおけるヒト免疫系の発達は、インビボで特異的なＴおよびＢ細胞の応答を媒介することができる。ヒトＣＤ３４細胞をヒトＴＨＹ／ＬＩＶ移植片のレシピエントに静脈内投与することによって達成されたＴ細胞機能の改善は、末梢におけるヒトＡＰＣとの相互作用が、ヒト胸腺移植片から発生するヒトＴ細胞の免疫機能を促進することを示唆する。機能におけるこの改善は、接着受容体、サイトカイン等が、異種（すなわち、マウスのもの）ではなく同種である場合に、Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用の改善を反映し得る。
【００８１】
ヒトＴｒｅｇの機能およびＴ細胞の恒常性増殖は、異種胸腺移植片と比較して、ヒト胸腺移植片での発達によって改善される。多様なレパートリー（図７）を有する高レベルの正常ヒト胸腺リンパ球形成（図６）はまた、ＨＵ  ＦＬを埋め込んだブタ（ＳＷ）胸腺異種移植片でも起こり得、異種寛容性につながっている117（図８）。ＳＷ／ＨＵ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＳＷ／ＨＵマウスと称される）に、ヒトＣＤ３４+ＦＬＣを静脈内注射することにより、ヒト造血およびＴ細胞の再増殖を、ＨＵ／ＨＵ  ＴＨＹ／ＬＩＶに加えてヒトＣＤ３４＋ＦＬＣを受容させたマウス（以降、ＨＵ／ＨＵマウスと称される）に匹敵するレベルまで増加させる（図９）。ＨＵ／ＨＵマウスの場合、末梢および胸腺上皮中のヒトＡＰＣは、同じドナーに由来するものであり、一方で、ＳＷ／ＨＵマウスの場合は、胸腺上皮は、ヒトＴ細胞および末梢のヒトＡＰＣに対して異種である（表１）。ブタからの免疫応答性マウス（異種胸腺生着を可能にするため、胸腺摘出、Ｔ細胞枯渇）モデルにおける以前の実験は、異種胸腺上皮が、異種Ｔ細胞の正の選択に全面的に関与し、レシピエントＭＨＣからの寄与は存在しないことを示した130-132。胸腺異種移植片に定植するレシピエントのＡＰＣは、負の選択に寄与し、ドナーおよびレシピエント抗原に対する寛容性の欠失をもたらした132-135。理論に束縛されることなく、類似の状況が、ＳＷ／ＨＵモデルにも適用可能である。ヒトＡＰＣは、これらのブタ胸腺移植片に存在し（図６Ｃ）117、理論に束縛されるものではなく、（ヒト）自己反応性胸腺細胞の負の選択に重要な役割を果たし得る。
【００８２】
類似の胸腺細胞数および正常なサブセットの分布が、ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵ移植片に検出された（図１０）。ヒトＴｒｅｇは、ＨＵ／ＨＵおよびＳＷ／ＨＵ移植片の両方において、類似の数のＣＤ４ＳＰ胸腺細胞中のＦｏｘＰ３+細胞で（図１１）、主にＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ+ＨＬＡ−ＤＲloである類似の表現型で生成される。ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵマウスの末梢で、類似する割合のヒトＦｏｘＰ３+ＣＤ１２７-/low、ＣＤ２５+細胞が検出されたが（図１２）、それらの表現型間で、いくつかの重大な表現型の違いが観察された。図１３に示されるように、正常ヒトＰＢＭＣ中のほとんどのＣＤ４+ＣＤ２５hi細胞は、ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ-「メモリー型」ＴｒｅｇであるＦｏｘＰ３+Ｔｒｅｇであり136,137、大部分がＨＬＡ−ＤＲを発現する。胸腺移植の１８週間後に分析したＨＵ／ＨＵマウスのＰＢＭＣの中では、ほとんどのＣＤ４+ＣＤ２５hi細胞もまた、ＦｏｘＰ３を発現したが（図１３、中央パネル）、これらのうちの大部分はＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの両方を発現し、多くはＨＬＡ−ＤＲもまた発現した。ＣＤ４５ＲＡ+／ＣＤ４５ＲＯ+表現型は、正常成体ヒトドナーよりもはるかに若齢であるこれらの動物における、「メモリー」表現型へ移行中の細胞を示し得る。対照的に、ＳＷ／ＨＵマウス由来のほとんどのＣＤ４+ＣＤ２５hiＰＢＭＣもまた、ＦｏｘＰ３を発現したが、依然としてＣＤ４５ＲＡ+／ＣＤ４５ＲＯ-「ナイーブ」表現型を発現し、ＨＬＡ−ＤＲを発現したものはほとんどなかった（図１３、下パネルおよび図１４）。ＨＬＡ−ＤＲ+Ｔｒｅｇは、それらのＨＬＡ−ＤＲ-対応物よりも優れた抑制機能を有することが報告されている138。これらのデータは、ＳＷ／ＨＵ移植片において発達するＴｒｅｇが、ＨＵ／ＨＵ移植片に由来するものよりも胸腺後に受ける刺激が少ない可能性があり、胸腺および末梢の両方において、同じＭＨＣに接触することを示す。
【００８３】
ＳＷ／ＨＵマウスから単離した末梢Ｔｒｅｇ（図１５）は、ＨＵ／ＨＵマウスからのものと比較して、減少した抑制活性を示し、正常ヒトＰＢＭＣに由来するＣＤ２５+ＣＤ４+細胞と同程度に効果的にＭＬＲ応答を抑制した（図１６）。Ｔｒｅｇ  ＣＤ４５ＲＯおよびＨＬＡ−ＤＲの発現は、個々のＳＷ／ＨＵマウスに由来する細胞の抑制活性のレベルに比例して変化した（図１６および１７）。これらを合わせると、データは、ＨＬＡ−ＤＲの発現およびメモリー表現型への変換が、末梢活性化、または胸腺の正の選択に関与するものと同じＭＨＣ抗原との末梢接触によって最適化されるＴｒｅｇの「調整」のマーカーであることを示す。一貫して、マウスのＴｒｅｇの末梢増殖は、ＭＨＣ／ペプチド複合体の正の選択を行うことによって促進されることが示されている139。
【００８４】
ＳＷにおいて生成されたヒトＴ細胞と自己ＨＵ  ＴＨＹ移植片のものとの間のリンパ球減少によってもたらされる増殖を比較するために、ナイーブＣＦＳＥで標識したナイーブＴ細胞（図１８）を、ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵマウスから、ヒトＡＰＣで再構成したがＴ細胞を欠くマウスへ、養子移入した（「ＨＵ−ＡＰＣマウス」、すなわち、ヒトＦＬ  ＣＤ３４+細胞をＴＨＹ移植片なしで静脈内に受容させたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、図１９）。図２０に示されるように、これらのＴ細胞の多くの割合が、Ｔ細胞欠損宿主への養子移入後に増殖し、ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+表現型に変換された。分裂の量は、ＳＷ／ＨＵおよびＨＵ／ＨＵマウス由来のＴ細胞で類似であったが、「メモリー」表現型への変換は、ＳＷ／ＨＵマウスと比較して、ＨＵ／ＨＵに由来するＴ細胞では、より広範であった。さらに、養子レシピエントにおいて回復したＴ細胞の数は、移入前の養子ＨＵ−ＡＰＣレシピエントにおけるヒト造血再構成のレベルと相関し（図２１）、ヒトＡＰＣが、ヒトＴ細胞の増殖および／または生存を支持したことを示す。この解釈と一貫して、ヒトＴ細胞は、再構成されていないＮＯＤ−ＳＣＩＤ養子レシピエントへの養子移入後に回復することができなかった（図２１）。重要なことに、類似するレベルのヒト造血再構成を有する養子レシピエントについては、移植したＴ細胞の回復は、Ｔ細胞がＳＷで生成された場合、ＨＵ  ＴＨＹ移植片と比較して減少した（図２１）。これらのデータは、リンパ球減少によってもたらされるヒトＴ細胞の増殖の分析のための養子移入モデルの利用性を確立する。データは、ヒトのナイーブＴ細胞が、マウスのように、リンパ球減少によってもたらされる増殖を受け、その際に、メモリー表現型に変換することを初めて示した。データは、正の選択を行う胸腺環境に存在するものと同じＭＨＣの発現が、マウスに対して示されているように、リンパ球減少環境におけるヒトＴ細胞の生存および／または増殖を促進し得ることを示す54,58,66-71。
【００８５】
自己胸腺上皮細胞の埋め込みは、胸腺移植片におけるＴ細胞の選択に影響を及ぼす。胸腺摘出（ＡＴＸ）を行い、次にＴ細胞を枯渇させたｍＡｂで処置した正常な免疫応答性マウスは、レシピエントの腎臓被膜下に移植したブタ胎児（ＦＰ）ＴＨＹ組織の生着、成長、および機能を可能にする133（図２２）。ブタのＴＨＹが宿主のＴＨＹと置き換わり、末梢Ｔ細胞の再構成を可能にし132,133,140、ドナー特異的異種移植片寛容性を達成する133,134。末梢に入るマウスのＴ細胞は、機能性であり、日和見感染を除去する141。ＦＰ  ＴＨＹ移植片に存在するブタおよびマウスの両方のＡＰＣは、胸腺内での負の選択を媒介し132-135、一方で、正の選択は、ブタドナーＭＨＣによって排他的に媒介される130-132。
【００８６】
ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したＡＴＸマウスは、概して、良好な健康状態を示すが、ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したヌードマウスの大部分（６０％超）は、多臓器自己免疫疾患を発症する135。ＡＴＸ  ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したマウスは、宿主の胸腺に由来する残留Ｔ細胞を末梢に有するが、ヌードマウスは、Ｔｒｅｇを含む、既存のＣＤ４のプールを欠いている。ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したヌードマウスから二次ＢＡＬＢ／ｃヌードレシピエントへの養子移入は、自己免疫疾患が、ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したヌードマウスに由来するＣＤ２５-脾細胞によって誘発されたことを明らかにした。さらに、ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したヌードマウスに由来するＣＤ２５+ＣＤ４+細胞は、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する細胞と比較して、二次レシピエントでの疾患抑制能力が損なわれたことを示した。したがって、ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植した後のＴ細胞欠損ヌードマウスにおける自己免疫は、Ｔｒｅｇによる抗宿主免疫の抑制の損失、およびＣＤ２５-ＣＤ４+細胞間の自己反応性の増加を反映し得る。
【００８７】
レシピエント胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）をブタ胸腺異種移植片に付加することで、末梢で同じ抗原と接触することにより自己免疫を抑制することができる、Ｔｒｅｇの正の選択をマウス胸腺上皮で行うことを可能にする49,51,142。さらに、マウス胸腺上皮による器官特異的タンパク質の「異所」生成51,143-146は、異種胸腺内の組織特異的ＣＤ２５-Ｔ細胞を欠失させることができる。したがって、ＢＡＬＢ／ｃレシピエント型ＴＥＣ［コラゲナーゼ／ディスパーゼ／ＤＮａｓｅ消化および（抗ＣＤ４５‐ＭＡＣＳビーズを用いた）負の選択により得た］をＦＰ  ＴＨＹ移植片に注射することの効果を評価した。図２３に示されるように、ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＥＣが埋め込まれている、ＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したヌードマウスに由来する脾臓細胞は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの養子レシピエントにおいて、あまり消耗症候群を誘発せず、これらの動物に由来する脾臓細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＥＣなしでＦＰ  ＴＨＹ／ＬＩＶを移植したマウスに由来する脾細胞によって誘発される消耗症候群を部分的に抑制した。ＴＨＹ移植片のマウスＴＥＣを注入した２色蛍光染色は、これらの動物のＦＰ  ＴＨＹ移植片におけるマウスＴＥＣの長期にわたる持続を明確に示した（図２４）。これらの研究は、単離した胸腺上皮細胞の注射が、通常のＴ細胞およびＴｒｅｇの選択に影響を及ぼし得ることを立証する。
【００８８】
実験計画および方法
【００８９】
ある特定の態様において、本発明は、ＨＬＡ決定済みヒト胸腺移植片でのヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、再凝集ヒト胸腺移植モデルを作製する方法を提供する。これらの研究は、ヒト化マウスモデルを拡張するものであり、インタクトな胎児ＴＨＹ組織を埋め込む代わりに、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織から凍結保存したＣＤ４５陰性の胸腺間質細胞が、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込まれる。共通の糖尿病感受性ＨＬＡ対立遺伝子を有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照およびＴ１ＤＭ対象に由来する静脈内注射したＣＤ３４＋細胞から、Ｔ細胞の胸腺リンパ球形成を支持することになる。
【００９０】
ＨＵ  ＴＨＹ／ＬＩＶ移植片および静脈注射で同じドナーに由来するＣＤ３４細胞を受容したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、正常ヒト胸腺細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＡＰＣ集団を再構成し、二次リンパ器官を発達させ、Ｔ細胞および免疫付与に対する抗体応答を示す。さらに、正常な割合のＴｒｅｇを生成する。このモデルは、Ｔ１ＤＭのＨＳＣに由来する造血幹細胞（ＨＳＣ）依存性Ｔ細胞を試験するために使用可能でありながら、胎児ＴＨＹドナーがＴ１ＤＭのＨＳＣドナーに対して同種である。末梢生存、リンパ球減少にによってもたらされる増殖、Ｔｒｅｇの機能は、胸腺での選択時に接触する末梢ＭＨＣ−ペプチド複合体との相互作用によって最適化され、ＴＨＹ移植片が、ＨＬＡ対立遺伝子をＴ１ＤＭおよび正常な骨髄ドナーと共有する場合、有利であろう。これは、既にＨＬＡ型判定済みの凍結ＴＨＹ組織が、ＨＬＡ型判定済みの志願ドナーのＨＳＣとともに選択的に利用することが可能であれば、達成することができる。ある特定の一般的なクラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子が、Ｔ１ＤＭと強く関連し、これらの患者に存在することが予測される。これらには、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３−ＤＱＢ１＊０２０１（ＤＲ３）、ＤＲＢ１＊０４−ＤＱＢ１＊０３０２（ＤＲ４）、およびＤＱＡ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２（ＤＱ８）が挙げられる1-5。幸運なことに、これらに対立遺伝子はまた、一般集団においても一般的であり、その３０〜５０％が、ＨＬＡ−ＤＲ４および／またはＤＲ３を有する1,147,148。したがって、ほとんどのＴ１ＤＭ患者にも発現するであろう、これらの対立遺伝子のうちの１つまたは両方を発現する、胎児組織および正常対照のＣＤ３４細胞を入手することは困難ではないであろう。さらに、ある特定のクラスＩのＨＬＡ対立遺伝子は、非常に一般的であり（例えば、ＨＬＡ−Ａ２は、約３０％の白色人種に存在する）、単一のクラスＩ対立遺伝子を共有する、Ｔ１ＤＭ患者、正常対照、および胎児ＴＨＹドナーの選択を可能なものにしている。
【００９１】
ある特定の態様において、本発明は、胸腺間質細胞を培養し、ＡＰＣを枯渇させ、次いで腎臓被膜下に埋め込む、胸腺器官培養物を再凝集させるための方法を提供し、これは、胸腺上皮細胞の胸腺リンパ球形成における影響を研究するための確立した手段である51,149。この技術を凍結保存したヒト胸腺間質細胞に適応させることにより、胸腺およびＣＤ３４細胞のドナー間で、ＨＬＡ対立遺伝子を確実に適合させることが可能となる。在胎１７〜２０週のヒト胎児組織を、記載のように46,47、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＩｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡから入手する。ＦＬの小片を、ＨＬＡの遺伝子型判定に使用する。ＣＤ３４+細胞を、記載のように46、ＭＡＣＳを使用してＦＬから精製し、凍結保存する。胸腺組織の半分を、２Ｇｙで照射したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込み、２×１０5の凍結保存して解凍した同じドナーのＦＬに由来するＣＤ３４細胞を、翌日に静脈注射で受容させる。胸腺の残り半分を、小片に切断し、０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、０．２ｍｇ／ｍｌディスパーゼＩ、２％ＦＣＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および２５μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ  Ｉを含有するＩＭＤＭ中で３７℃で消化させ、続いて５ｍＭ  ＥＤＴＡ中でインキュベートする。洗浄後、胸腺間質細胞を、記載のように51,149不連続のＰｅｒｃｏｌｌ勾配上で単離し、次いで、ＭＡＣＳを使用してさらにＣＤ４５+細胞を枯渇させ、洗浄し、凍結保存のために１０6細胞／μｌまで再懸濁するか、またはスラリーとして再懸濁させ、４８時間、０．５〜１×１０6の間質細胞を含有する０．２〜０．４μｌの液滴で、３ｍｌ  ＩＭＤＭおよび１０％ＦＣＳを含有する６ウェルプレート中のＧｅｌｆｏａｍスポンジによって支持される０．４５μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅナイロン膜上に設置する。各フィルターから取り出した１つの固化した再凝集を、記載のように51,149腎臓被膜下に移植する。同じドナーのＦＬに由来する２００，０００のＣＤ３４+細胞を、解凍し、間質細胞を埋め込むときに、静脈内注射する。２Ｇｙで照射したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの群に、新鮮な胸腺間質細胞から形成された再凝集または凍結保存して翌日に解凍した間質細胞からのもののいずれかを、解凍したＣＤ３４細胞とともに、静脈注射で受容させる。ヒトＴ細胞およびＡＰＣの再構成について、埋め込みの４週間後に動物の追跡調査を開始し、その後は２週間毎に行う。埋め込みの１８週間後にそれらを安楽死させ、それらの移植片を全体的な細胞充実度について比較し、胸腺細胞サブセットおよび末梢リンパの再構成を比較する。このようにして、インタクトな胸腺、新鮮な胸腺間質細胞、および凍結保存して解凍した胸腺間質細胞で達成されたＴ細胞の再構成を比較する。理論に束縛されるものではないが、新鮮または凍結保存した胸腺間質細胞からの再凝集培養物を使用して、高レベルのヒト胸腺リンパ球形成を達成することができる。
【００９２】
凍結保存した胸腺間質細胞を使用することの利点は、それが、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＤＲ４、およびＤＱ８を含む、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する、Ｔ１ＤＭ患者および対照に由来するＣＤ３４細胞と併せて使用するための、ＨＬＡ型判定済み細胞の「バンク」の蓄積を可能にすることである。Ｔ細胞は、次いで、末梢での正の選択に関与する、Ｔ細胞の生存、機能、恒常性増殖、および制御を最適化し得る、同じＨＬＡ−ペプチド複合体のうち少なくともいくつかと接触することになる。再凝集胸腺培養物および／または移植片を、マウス51,149およびヒトＴＨＹ組織150から生成することに成功している。しかしながら、理論に束縛されるものではないが、凍結保存は、胸腺間質細胞が再凝集した器官を生成する能力を低下させ得る。この場合、凍結保存および解凍の手順を最適化するように試みることになる。胸腺構築の発達を促進し、インビボで再凝集移植片へ胸腺細胞前駆体を輸送するための要件を克服するために、ＣＤ３４細胞を、インビトロでの「立位型液滴」または腎臓被膜下への埋め込みの際に一緒に埋め込むことの効果を評価することもできる。必要に応じて変化する他のパラメータには、各フィルター上に設置される「立位型液滴」の寸法または埋め込まれた再凝集体の数、およびしたがって胸腺移植片の寸法、ならびに在胎期間が含まれる。代替的なアプローチは、ＣＤ３４細胞のドナーによって共有される関連の糖尿病感受性対立遺伝子を発現するＨＬＡトランスジェニックＮＯＤマウスに由来するＴＥＣを一緒に埋め込むこととともに、インタクトなＨＬＡ型判定済みヒト胸腺組織の埋め込みを伴う。埋め込まれたＴＥＣは、胸腺異種移植片での長期の生存を示し、胸腺選択に影響を与える（図２２〜２４）。マウスのＴＥＣは、ヒト胸腺細胞を選択することができるため41,42、理論に束縛されるものではなく、一緒に埋め込んだＨＬＡトランスジェニックＴＥＣは、関連するＨＬＡ分子上で、ヒト胸腺細胞の正の選択を行うことができる。別の代替方法は、関連ＨＬＡ対立遺伝子を有する凍結保存したヒトＴＥＣを、インタクトなヒト胸腺移植片に注射することである。最終的に、ＨＬＡ遺伝子を有するヒト胸腺移植片は、Ｍａｔｈｉｓらによる151-154ナイーブ胸腺での実行が成功したように、これらのＨＬＡ分子をコードするＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターを注射することによって、形質導入することができる。したがって、これらのアプローチのうちの１つを通じて、理論に束縛されないが、ＨＬＡ型判定済みの正常およびＴ１ＤＭドナー由来のＣＤ３４の胸腺リンパ球形成が、共有のＨＬＡ対立遺伝子との関連において生じる、モデルの生成を成功させることができる。
【００９３】
以前の研究（例えば、図１〜３を参照されたく、典型的に、１つのＨＵ／ＨＵマウスの脾臓およびリンパ節から、１５〜３０×１０6の生成されたヒトＴ細胞を得ることができる）において観察された胎児胸腺の著しい成長および多数の胸腺細胞（典型的に、移植片当たり２〜３×１０8）ならびに高レベルの末梢再構成に基づいて、理論に束縛されることなく、本明細書に記載の研究に十分な数の胸腺および末梢のＴ細胞を得ることができる。しかしながら、再凝集したＴＨＹ移植片で達成されるＴ細胞再構成のレベルが低い場合は、通常のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの代わりに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γｃノックアウトマウスを利用することになる。ＮＫ細胞が欠損したＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γｃマウスは、比較的低いレベルの胸腺リンパ球形成の存在下で、より高いレベルのヒト免疫再構成を可能にすることができる。高レベルのヒトＴ細胞再構成が、本モデルにおいてＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスで達成されているが、γｃノックアウトマウスは、より低いレベルのヒト胸腺リンパ球形成を伴うモデルにおいて有利であり得る41,42。
【００９４】
ある特定の態様において、本発明は、正常細胞に対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する通常のＴ細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型変換、および自己寛容性を比較するための、記載されるマウスモデルおよび方法を提供する。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定する。恒常性における内在性異常が、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞を特徴付けるかどうかを判定する。
【００９５】
図１〜３に示されるように、ＮＯＤ−ＳＣＩＤにおけるヒトＴＨＹおよびＨＳＣの複合移植は、高レベルのヒト多系統造血をもたらす。このモデルは、クラスＩおよびＩＩのＨＬＡ対立遺伝子が、Ｔ１ＤＭ患者および対照に由来する胸腺間質細胞とＣＤ３４細胞との間で共有されることを確実にするように、修飾される。ＮＯＤマウスにおける自己免疫病因は、末梢Ｔ細胞のアポトーシスの増加に関与し、リンパ球減少をもたらし得る54,80。Ｔ１ＤＭ90を含むヒト自己免疫疾患83-89はまた、リンパ球減少と関連している。理論に束縛されるものではないが、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに由来するＴ細胞は、正常対照のＨＳＣに由来するものと比較して、生存の減少、ならびにリンパ球減少によってもたらされる増殖および活性化の増加を示す。開発された最良のレジメンを使用して、胸腺および末梢でクラスＩおよびＩＩ対立遺伝子を共有するヒト化マウスを調製する。ＦＬ  ＣＤ３４細胞の代わりに、同じＨＬＡ対立遺伝子を胎児ＴＨＹドナーと共有する、ＨＬＡ型判定済みのＴ１ＤＭ患者または正常対照（Ｔ１ＤＭの家族歴が陰性）に由来する、ＭＡＣＳで精製した１０5の骨髄ＣＤ３４細胞を動物に受容させる（図２）。１回の５〜６ｍｌの吸引で約１．２５×１０6のＣＤ３４細胞が得られるとして、１つの骨髄吸引液に由来するＣＤ３４細胞を用いて、１０〜１２匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを再構成することができる。記載のように46,47、ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ１４+細胞について、移植の４週間後に動物の末梢血の監視を開始し、２週間毎に行う。５％以上のヒトＣＤ３+Ｔ細胞が末梢血中に存在する場合、マウスは、本明細書に記載のようにさらなる研究に利用することになる。
【００９６】
ヒト胸腺細胞サブセット、ならびに脾臓およびリンパ節（ＬＮ）のＴ細胞を計数する。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＣＤ３４細胞のレシピエントのリンパ系組織は、ＮＯＤマウスモデルに報告されたように80、メモリーＴ細胞における抗アポトーシスタンパク質発現の減少と関連して、対照と比較して細胞数が少ない場合がある。逆に、ＮＯＤマウスにおけるこれらの異常は、疾患の原因ではなく、疾患の影響であり得る。本モデルは、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに由来するＴ細胞の恒常性に主な異常があるかどうかを特定する機会を提供する。メモリー型およびナイーブ型のＣＤ４およびＣＤ８細胞の絶対数は、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌに対するｍＡｂを含む、多色ＦＣＭによって計数する。可能な結果には、Ｔ１ＤＭ患者に報告されたように91,155,156、Ｔ１ＤＭのＨＳＣにより再構成された動物における二重陽性（ＲＯ+ＲＡ+）Ｔ細胞数の増加、またはＴ１ＤＭのＨＳＣから「クローン的に偏差した」ＣＤ４−ＣＤ８αα＋胸腺細胞およびＴ細胞の数の減少が挙げられる。クローン的に偏差した細胞の生成における欠陥は、ＮＯＤバックグラウンドに遺伝的にコードされる157。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、およびＣＤ２５を含む、活性化マーカーの試験もまた行う。Ｔ細胞ＨＬＡ−ＤＲの発現は、新しく発症したＴ１ＤＭ158と関連して上昇する。これらのデータの全てを、Ｂ細胞ならびにリンパおよび骨髄ＤＣサブセットを含む、ヒトＡＰＣ再構成のレベルに関連して分析する。
【００９７】
メモリー型Ｔ細胞における抗アポトーシス分子であるＢｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２の発現の減少は、ＮＯＤマウスにおけるＴ細胞の代謝回転の増加および恒常性増殖と関連付られている80。したがって、多色ＦＣＭを使用して、ナイーブおよびメモリーマーカーによって定義される末梢Ｔ細胞サブセット中の、アポトーシス（アネキシンおよびＡＡＤを使用して）ならびに抗アポトーシスタンパク質の発現（透過性細胞を使用して）を測定する。複写履歴を評価するために、Ｔ細胞受容体切除範囲（ＴＲＥＣ）およびテロメア長の分析を、記載のように159,160ｑＰＣＲを使用して、分類されたナイーブ型およびメモリー型ＣＤ４およびＣＤ８細胞に行う。
【００９８】
Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞における恒常性の異常が、非常に重度であるため、上述の研究の全てを実行することを可能にするのに十分な数のＴ細胞を、再構成されたマウスから得ることができない場合がある。個々の再構成されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスからデータを取得することが好ましいが、必要であれば、同じＣＤ３４細胞で再構成した複数の動物に由来するリンパ球をプールする。さらに、必要であれば、γｃノックアウトＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使用して、ヒト免疫再構成を強化する。
【００９９】
Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞と対比して、正常なものに由来するヒトＴ細胞の末梢生存を、前述のように161ＴＨＹ移植片を除去し、ナイーブ型およびメモリー型のＴ細胞の減衰を監視することによって、比較する。さらに、ＢｒＤＵ標識化研究を、末梢Ｔ細胞のインビボ増殖を評価するために、上述のように80、胸腺正常および移植片摘除の両方の動物に行う。
【０１００】
Ｔ１ＤＭおよび対照ＨＳＣに由来するＴ細胞の機能を、Ｂ型肝炎ワクチンおよび破傷風トキソイドでのインビボ免疫付与後に比較する。Ｔ細胞増殖および抗体応答のインビトロアッセイを評価する。（抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３  Ｄｙｎａｌビーズでの）全体的なＴ細胞刺激に対する増殖性応答、ならびに第三者ならびに胸腺ドナーおよび自己（ＣＤ３４細胞ドナー）の両方のＡＰＣに対する同種応答を、ＦＬまたは骨髄ＣＤ３４細胞に由来するＤＣを使用して比較する。効果的な機能性ＤＣ生成は、０日目にＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦを用いて、３日目にＴＮＦ−αを追加し、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−αを６日目から用いて、解凍された凍結保存ヒトＦＬ  ＣＤ３４細胞から構築されている。後続のＤＣ生成のための凍結保存に十分な、Ｔ１ＤＭおよび正常な対照骨髄ドナーからのＣＤ３４細胞を有することが期待できないため（それらは、概して、全てがマウスの再構成に使用される）、これらのドナーに由来するＤＣは、前述のように162、末梢血単球から生成されることになる。ＴおよびＢ細胞の応答は、１型糖尿病患者および正常の両方で同程度であるが、ＨＳＣおよび／またはＴＨＹドナーのＭＨＣに対する寛容性は、Ｔ１ＤＭのＨＳＣ由来のＴ細胞で、低下する。
【０１０１】
養子移入を用いて、Ｔ１ＤＭ患者および対照に由来するＴ細胞の恒常性増殖および生存を比較する。リンパ球減少によってもたらされる増殖およびアポトーシスは、対照ＨＳＣ由来のＴ細胞よりも、Ｔ１ＤＭのＨＳＣ由来のものの方が大きくなる。ＨＵ  ＴＨＹ移植片で生成されたＴ細胞を、その末梢ＡＰＣ集団が胎児ＴＨＹ移植片なしでＴＨＹと同じＣＤ３４ドナーに由来するＦＬＣで再構成されている、二次ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスレシピエントに養子移入する（ＨＵ−ＡＰＣマウス）。これらの動物は、ヒトＡＰＣを再構成するが、Ｔ細胞は再構成しない（図１９）。それらは、Ｔ細胞を「有さず」、それらのＡＰＣは、もともとのＴＨＹ移植片で正の選択を媒介したものと同じＨＬＡ抗原を発現する。このモデルを、養子移入後のリンパ球減少によってもたらされるＴ細胞の増殖の測定に使用した（図１８〜２１）。ナイーブＣＤ４およびＣＤ８単一陽性（ＳＰ）胸腺細胞を、移植片から二次ＨＵ−ＡＰＣレシピエントに養子移入する。別個のアリコートは、ＣＤ２５+細胞を枯渇させずに、または枯渇させ（ＭＡＣＳでの分類によって）、Ｔｒｅｇの存在下または非存在下でのリンパ球減少に対する応答の比較が可能となる。リンパ球減少によってもたらされるＴｒｅｇの増殖を、特に比較する。これらの成熟した単一陽性胸腺細胞は、胸腺内選択を受けているが、胸腺後選択は受けていないことになる。それらを、ＣＦＳＥで標識し、ＨＵ−ＡＰＣマウスに養子移入する（レシピエント当たり１０6の細胞）。その後、決められた間隔で、ＨＵ−ＡＰＣレシピエントを安楽死させる。Ｔ細胞を計数し、Ｔ細胞ＣＦＳＥの希釈レベル、ならびにＣＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現、ＣＤ２５（ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを区別するため、ＦｏｘＰ３に対比して）、ＣＤ６９、ならびにアポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＡＡＤを使用して）を、ヒトＣＤ４およびＣＤ８細胞に対して試験する。リンパ球減少によってもたらされる増殖は、通常、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９60の上方制御とは関連しないが、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞異常は、リンパ球減少によってもたらされる増殖と関連して、これらのマーカーの上方制御を伴う自己抗原によってもたらされる活性化に関与し得る。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色により、エフェクター機能の増加が、Ｔ１ＤＭのＨＳＣに由来するＴ細胞の恒常性増殖からもたらされるかどうかを示すことができる。何らかのこのような異常が観察される場合、ヒトＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびそれらの受容体の分析を養子レシピエントにおいて行い、これらの異常の病因を特定する。
【０１０２】
恒常性増殖を受けたＴ細胞におけるインビトロ寛容性を、本明細書に記載の方策を使用して検査する。理論に束縛されるものではなく、糖尿病患者由来のＴ細胞におけるリンパ球減少によってもたらされる増殖は、最も高い親和性を有する自己反応性Ｔ細胞の富化、およびしたがって自己寛容性の損失をもたらし得る。この場合の「自己」には、ＴＥＣおよびＦＬ  ＣＤ３４細胞のドナー、ならびにもともとのＴＥＣを移植した動物のＨＳＣドナーが含まれる。
【０１０３】
正常とＴ１ＤＭのＣＤ３４細胞のＨＬＡ型は常に異なり、そのため、ＨＬＡ共有の度合い、ならびに各ＨＳＣおよびＴＨＹドナー間の交差反応の度合いが、異なる。これは、例えば、末梢に発現するＨＬＡがＴ細胞の恒常性増殖を支持することができる度合いにおける差異をもたらし得る。この理由のため、養子移入研究は、胸腺後の選択を受けていないＳＰ胸腺細胞を利用する。さらに、両方のＨＳＣドナー（Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの正常対照）と同じＨＬＡ対立遺伝子のみを共有するＴＨＹドナーを利用する。さらに、これらの研究は、個体間変動の均衡を助けるために、少なくとも５人のＴ１ＤＭおよび５人の対照に由来するＨＳＣで行うものとする。
【０１０４】
ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する制御性Ｔ細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較するためのマウスモデルおよび方法を提供する。Ｔ１ＤＭ患者の幹細胞に由来するＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞は、欠陥を示す。これらの研究は、胸腺後が起源のものと対比して、Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。
【０１０５】
議論の余地はあるが100-102、Ｔｒｅｇの数92および機能22-24における欠陥が、Ｔ１ＤＭ患者およびＮＯＤマウスに報告されている93-97。さらに、ＮＫＴ細胞における欠陥が、ＮＯＤマウスの末梢30,31,103,104および胸腺105、ならびにＴ１ＤＭを有するヒトの末梢血101において説明されている。ＮＫＴ細胞の養子移入もしくは過剰発現110、またはＴｒｅｇの移入98は、ＮＯＤマウスにおける自己免疫を逆転させ得る。膵臓内の炎症部位におけるＴｒｅｇの不足および制御に対するエフェクター細胞の相対的耐性の両方が、ＮＯＤモデルの疾患進行の最終段階を特徴付けると見られる101。しかしながら、Ｔ１ＤＭを有するヒトにおける研究は、末梢血試料の分析に限定されており、ヒトＴｒｅｇにおけるこれらの欠陥が、疾病の結果として生じるのか、または疾患の病因であり、Ｔ１ＤＭ患者の遺伝子にプログラムされているかどうかはわかっていない。理論に束縛されるものではなく、Ｔ１ＤＭ患者は、Ｔｒｅｇの発達、末梢生存、またはそれらを完全に機能させるための末梢「調整」52における欠陥を示す。本モデルは、ＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞の発達における胸腺内および末梢の両方の欠陥の役割を試験する機会を提供する。
【０１０６】
これらの研究は全て、選択する胸腺とＣＤ３４+ＨＳＣ細胞との間で糖尿病誘発性ＨＬＡ分子の共有を確実に行うために作製された本モデルを利用する。このような共有は、ＴＨＹ移植片においてこれらの複合体で選択されたＴｒｅｇによる、末梢ＡＰＣの同じＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用を可能にする。Ｔｒｅｇは、胸腺でそれらを選択するＭＨＣ／ペプチド複合体に特異性を示し51、ＭＨＣ／ペプチド複合体との末梢相互作用がＴｒｅｇの機能性を促進するため52,53、胸腺と末梢ヒトＡＰＣとの間のＨＬＡ共有は、かなりの重要性を有する可能性がある。
【０１０７】
Ｔｒｅｇの分析：ヒトＨＬＡ−ＤＲ３、ＤＲ４、またはＤＱ８＋胸腺組織、ならびに正常個体またはＴ１ＤＭ患者に由来するＣＤ３４＋細胞を移植したＮＤＯ−ＳＣＩＤマウスの胸腺内のＣＤ１２７-/loＦｏｘＰ３+ＣＤ４+ＣＤ８-Ｔｒｅｇの数を、比較する。多色ＦＣＭを使用して、これらの細胞の表現型を比較する。理論に束縛されるものではなく、図１１に提示される胸腺のＴｒｅｇに類似して、これらの細胞は、主にＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ+ＨＬＡ−ＤＲ-/loであり得る。ＮＯＤモデルでの研究に基づいて、胸腺内のＴｒｅｇの割合は、Ｔ１ＤＭ患者由来のＨＳＣのレシピエントにおいて、対照と比較して減少し得る。
【０１０８】
ＣＤ１２７-/loＦｏｘＰ３+ＣＤ４+ＣＤ８-Ｔｒｅｇの数を、上述の動物の末梢リンパ組織（ＬＮおよび脾臓）で比較する。多色ＦＣＭを使用して、これらの細胞のナイーブ／メモリー表現型およびＨＬＡ−ＤＲ発現を比較する。図１３にあるように、正常ドナーのＨＳＣに由来するＴｒｅｇは、ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ-およびＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+のサブセットを、ＨＬＡ−ＤＲ+のサブセットとともに含むことが予測される。ＤＲ+細胞は、高レベルのＦｏｘＰ３を発現し138、本明細書の研究（図１３）は、それらが、胸腺内で接触したものと同じＭＨＣ−ペプチド複合体と末梢内で相互作用し、最適な抑制活性を促進することを示す52。Ｔ１ＤＭのＨＳＣ由来のＴｒｅｇが、機能に内在性欠陥を有する場合、それらは、完全な抑制活性と関連するＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+およびＨＬＡ−ＤＲ+表現型を得ることができない可能性がある。
【０１０９】
Ｔ１ＤＭ患者および正常対照由来のＣＤ３４細胞で再構成されたＨＵ／ＨＵ  マウスの胸腺および末梢リンパ組織に由来する、流動選別したＣＤ１２７-/loＣＤ２５+ＣＤ４+ＣＤ８-Ｔｒｅｇの抑制機能を比較する。段階的な数のＴｒｅｇを、次の組み合わせのレスポンダー細胞および刺激細胞を含有するＭＬＲに追加する。１）ヒト化マウスの末梢リンパ組織から選別し、同種ＰＢＭＣで刺激したＣＤ２５-ＣＤ４+Ｔ細胞、２）ヒト化マウスの末梢リンパ組織から選別し、上述のように162自己ＰＢＭＣ（ＣＤ３４細胞ドナー由来）に由来するＤＣで刺激したＣＤ２５-ＣＤ４+Ｔ細胞、３）ヒト化マウスの末梢リンパ組織から選別し、ＴＨＹドナーの凍結ＦＬ由来のＣＤ３４細胞に由来するＣＤ２５-ＣＤ４+Ｔ細胞。ＦＬ  ＣＤ３４細胞由来の機能性ＤＣを、確実に生成することができる。Ｔ１ＤＭ患者および正常対照に由来する胸腺および末梢のＴｒｅｇが、同種応答ならびに胸腺およびＨＳＣのドナーによって発現される「自己抗原」に対する応答を抑制する能力を、比較する。Ｔ１ＤＭ患者および正常対照に由来するＴ細胞は、胸腺および末梢で、同じ共有ＨＬＡ−ＤＲ抗原に接触するため、制御機能において観察されるいずれの差異も、このような接触の失敗に起因し得ない。ＴＩＤＭのＨＳＣ由来のＴｒｅｇに観察されるいずれの制御機能の低下も、前の段落で説明された研究からの表現型データと関連して解釈されるものとする。胸腺と末梢のＴｒｅｇを比較することで、Ｔ１ＤＭ患者におけるＴｒｅｇ機能の欠陥が表れるのが、胸腺での発達時か胸腺後の発達時かを判定することを可能にする。
【０１１０】
ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのいずれも、Ｔｒｅｇ機能に重要なエフェクターサイトカインに関係するとされている163-165。ＴＧＦ−βはまた、少なくとも部分的にＦｏｘＰ３の発現の誘発によって、Ｔｒｅｇの増殖および末梢生成に重要な役割を果たす36,163,166-170。ＮＯＤマウスにおける研究は、より高齢の動物に由来するＴｒｅｇがＩＬ−１０を生成する能力の低下を示しており97、糖尿病の進行は、Ｔｒｅｇによる膜結合型ＴＧＦ−β発現の急激な低下と関連する94。抑制機能における欠陥がＴ１ＤＭ患者由来のＴｒｅｇに特定された場合、ヒト化マウスの胸腺および末梢から選別したＣＤ１２７-/loＣＤ２５+ＣＤ４+ＣＤ８-Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２を有する抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３  Ｄｙｎａｌビーズで刺激し171、サイトカインｍＲＮＡおよびタンパク質を測定する。
【０１１１】
養子移入研究：正常対照と対比して、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに由来するナイーブなＣＤ１２７-/loＣＤ２５+ＣＤ４+ＣＤ８-Ｔｒｅｇのリンパ球減少によってもたらされる増殖を比較するために、ＣＦＳＥで標識した「ナイーブな」胸腺Ｔｒｅｇを、本明細書に記載のように、各群から二次ＨＵ−ＡＰＣマウスに養子移入する。本明細書に記載の研究が、ＣＤ２５+細胞が枯渇したＳＰ胸腺細胞を養子移入する際に自己反応性および／またはリンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示す場合、共移入研究において、正の選択が行われた胸腺Ｔｒｅｇが自己免疫および／またはリンパ球減少によってもたらされる活性化を抑制する能力に取り組むこととなる。
【０１１２】
ＮＫＴ細胞の分析：不変ＮＫＴ細胞の数の減少および機能の欠陥が、Ｔ１ＤＭ患者に報告されている92。本モデルは、この欠陥が、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに内在性であるかどうか、およびそれがこの細胞サブセットの胸腺の発達における欠陥を反映するものであるかどうかを判定する機会を提供する。多色ＦＣＭを使用して、胸腺および末梢における、不変鎖を発現するＶα２４+Ｖβ１１+およびＶα２４ＪαＱ  ＣＤ４-ＣＤ８-およびＣＤ４+ＣＤ８-細胞を定量化する。Ｔ１ＤＭ患者由来の不変ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ生成に欠陥が報告されているため92、これらの細胞を、上述のように92ＰＭＡ／イオノフォアで刺激し、Ｔ１ＤＭ患者および正常なものに由来するＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の細胞内レベルを、多色ＦＣＭを使用して比較する。これらの研究により、Ｔ１ＤＭ患者におけるＨＳＣおよび胸腺起源のＮＫＴ細胞の欠陥を解明することができる。
【０１１３】
本明細書に記載の研究により、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに由来するＴ細胞が、Ｔ細胞の制御および恒常性に関する内在性欠陥を遺伝子にプログラムされているかどうかを判定し、Ｔ１ＤＭの病因におけるこのような欠陥の役割に関する議論を解決する。結果に応じて、その後の研究は、Ｔ１ＤＭおよび正常のＨＳＣに由来するＴ細胞の遺伝子発現プロファイリング、養子Ｔｒｅｇ発達の研究、ならびに自己免疫におけるＡＰＣおよびＨＳＣに由来する細胞の役割の調査を伴ってもよい。本モデルは、遺伝子操作を含む、疾患病因の遮断への新規なアプローチの評価を可能にする。
【０１１４】
凝固もしくは出血障害または免疫欠損を有さない１８歳以上の１型糖尿病患者の志願者および正常対照の志願者を、本研究に含める。全ての志願者は、ＨＬＡ型の判定によってスクリーニングし、共通の糖尿病関連のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子および共通のクラスＩ対立遺伝子を有するものを、本研究対象に選択する。
【表１】
2014503217.tif 000003
【表２】
2014503217.tif 000004
【０１１５】
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実施例２：「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウス：成体ヒトにおける免疫回復および免疫病因の個別化した分析のためのモデル
【０１１６】
多数の自己免疫疾患は、自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。遺伝的要因は、実質的に、自己免疫に対する感受性に寄与する。ＨＬＡ遺伝子型が、最も強く自己免疫疾患と関連しているが1-4、最近定義された非ＨＬＡ関連遺伝子は、集合的に、実質的な危険性を与える3-10。類似の座位が、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス8およびそのヒト対応物である１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）11において自己免疫に寄与する。これらの座位には、サイトカイン等の免疫調節遺伝子、共刺激分子、および阻害分子が含まれる8,12,13。制御性ＣＤ４Ｔ細胞14-16、ＮＫ／Ｔ細胞17-19、ＡＰＣ20,21ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌｏｓｏｎｅ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｉｎｆｏ：ｄｏｉ％２Ｆ１０．１３７１％２Ｆｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３７３９−添付文書１、およびＴエフェクター細胞22における欠陥は、マウスおよびヒトの両方のＴ１ＤＭおよび他の自己免疫疾患2,23,24と関連する。遺伝子研究により、これらの遺伝子のうちのいくつかがＮＯＤマウスにおける自己免疫を促進する、機構の分析が可能となった8,12。しかしながら、自己免疫疾患を有するヒトにおいては、非ＨＬＡ関連遺伝子から生じる根本的な欠陥は、ほとんどが定義されていない。これらの座位の多くが、免疫制御性遺伝子を含有することを考慮して、疾患感受性はＮＯＤマウス25およびヒト26の両方において、造血幹細胞を介して移行されるため、造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源とする免疫系の細胞における内在性異常が、自己免疫の発達に寄与することが推定される。ほとんどの臨床研究は、疾患発症後の患者の分析を伴い、疾患感受性を与える、遺伝的に決定されたＨＳＣ内在性免疫制御性異常の定義を除き、原因と、疾患、その治療、またはそれを引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。
【０１１７】
「ヒト化マウス」モデルを作製した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、免疫不全マウスに定植させることが可能であり27、ヒトＴ細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺（ＴＨＹ）移植片で発達させる28。最近、腎臓被膜下のヒト胎児胸腺および肝臓（ＴＨＹ／ＬＩＶ）移植片と、ヒトＨＳＣの静脈内注入の組み合わせが、高レベルの末梢ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、免疫グロブリン、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞を伴う、ヒト免疫再構成を可能にすることが示された29。クラススイッチ型抗体応答を含む、強力な抗原特異的免疫応答を、インビボで観察する29-31。抑制機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の正常な胸腺発達が見られた。さらに、このモデルはまた、ヒトＴ細胞の恒常性末梢増殖の提示を可能にした32。
【０１１８】
ヒト自己免疫疾患病因における遺伝的に定義されたＨＳＣ内在性異常の役割を研究するためには、自己免疫を有する患者から得られた成体ＨＳＣを用いて、ヒト末梢Ｔ細胞の再構成および免疫機能を達成することが必要となる。しかしながら、これらの細胞は、大量に入手可能ではなく、成体ヒトＨＳＣは、胎児ＣＤ３４＋細胞のように免疫不全マウスに生着しない33。さらに、同種ＨＳＣは、胎児胸腺移植片内に既存の同種胸腺細胞によって拒絶される可能性がある。
【０１１９】
本発明は、少数の成体同種骨髄ＣＤ３４＋細胞からのＴ細胞およびＡＰＣの生成および末梢再構成を支持することができる、凍結保存／解凍したヒト胎児胸腺組織を使用する、新しいヒト化マウスモデルの作製を提供する。成体骨髄吸引液に由来するＨＳＣから、回復した免疫系を生成する。この「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスは、自己免疫の素因となるＨＳＣ内在性免疫異常の特定、免疫治療方針の個別の評価を可能にし、胸腺不足を有する成体での免疫再構成を達成することができる。
【０１２０】
胎児胸腺移植片において成熟Ｔ細胞によってもたらされる免疫バリアの克服：同種ヒト胎児胸腺組織を移植した免疫不全マウスにおいて、成体ＨＳＣからのヒト免疫再構成を評価するために、ＣＤ３４＋細胞を廃棄されたヒト骨髄注入フィルターから単離し、胎児ＴＨＹ移植を受けた亜致死照射した非肥満性糖尿病の重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに静脈内で与えた。未処置ヒト胎児ＴＨＹ移植片のレシピエントは、移植後最初の数週間は低い割合（％）の末梢Ｔ細胞を見せ、これは最終的には消失し、これらの細胞が移植片から移出したこと、および非Ｔ細胞が、注入された同種ＣＤ３４＋細胞から再構成されなかったことを示す。さらに、いくつかの長期（２０週間超）動物は、ＧＶＨＤ様の消耗症候群を発症した。ＴＨＹ移植片に既に存在していた胸腺細胞は、同種ＣＤ３４＋細胞を拒絶し、増殖してレシピエント組織を攻撃し、それによって、それぞれ、免疫再構成を妨げ、ＧＶＨＤをもたらす可能性がある。移植片内に既存の胸腺細胞を枯渇させるための方法を、これらの現象を防止するために試験した。
【０１２１】
２'−デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）での胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）は、再定着して胸腺リンパ球形成を支持し得る35基質成分を保護しながらも、胸腺細胞を枯渇させることを示した34。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ｄＧｕｏの存在下で７または２１日間培養した胎児ＴＨＹ組織に加えて同種成体ＣＤ３４＋細胞を受容させた。対照動物に、ｄＧｕｏで処置した胸腺組織のドナーに由来する胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞を受容させた。ＴＨＹ移植片なしで５×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を受容したマウスは、１０週目までに平均で２０％のヒトＰＢＭＣを再構成したが（図２５Ａ）、ＣＤ３＋細胞は検出不可能であった（図２５Ｃ）。７日間ｄＧｕｏで培養したＴＨＹ組織に加えて、同種ＣＤ３４＋細胞を受容したマウスにおいて、平均でＰＢＭＣ中約７％のＣＤ３＋レベルが、移植の６週間後までに検出されたが（図２５Ｃ）、ＣＤ１９＋細胞は現れず（図２５Ｂ）、ｄＧｕｏによる枯渇を回避した成熟Ｔ細胞が、注入した同種ＣＤ３４＋細胞を拒絶したことを示し、ＴＨＹ移植片内の常在細胞が、多系統再構成を達成せず、最大限に末梢Ｔ細胞プールを再構成することもないことを示す（図２５Ｃ）。
【０１２２】
５×１０5の同種成体ＣＤ３４＋細胞を２１日間ｄＧｕｏで培養したＴＨＹ移植片と組み合わせて静脈内注入した後に、２０週でＰＢＭＣ中に平均約２５％のヒトＣＤ３＋細胞を有して、ヒト胸腺リンパ球形成ならびに末梢ＣＤ１９＋細胞の再構成を伴う胸腺生着が成功した（図２５Ｃ）。したがって、末梢に注入された同種成体ＣＤ３４＋細胞に由来する前駆体は、ｄＧｕｏで処置した胸腺に定植可能であり、そこで、胸腺リンパ球形成が行われ、末梢に移出する。同種成体骨髄ＣＤ３４＋細胞の代わりに４×１０5の自己胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞とともに、ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織の対照レシピエントは、１４週までにＰＢＭＣ中約３５％のヒト末梢血ＣＤ３＋を有し（図２５Ｃ）、Ｔ細胞の再構成が、同種成体ＣＤ３４＋細胞と対比して、自己胎児ＣＤ３４＋細胞の注射後に、より効果的であったことを示す。
【０１２３】
２１日間のＦＴＯＣ移植片を受容したマウスのいずれの群も、高レベルの長期末梢Ｂ細胞の再構成を示したが（図２５Ｂ）、５×１０5よりも少ない成体ＣＤ３４＋細胞の注入は、生着およびＢ細胞再構成を成功させることが不可能であった。志願者の骨髄吸引液からは限定された数のＨＳＣしか利用可能でないため、ＮＫ細胞を欠いており、ヒトＨＳＣ36の生着に対してより許容性のあるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ鎖null（ＮＳＧ）マウスを、次の実験に使用した。
【０１２４】
既存の胸腺細胞を枯渇させるためのＴＨＹ移植片の照射を、次に評価した。ＮＳＧマウスに、３×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞と組み合わせて、７Ｇｙで照射した胸腺組織を、抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂありまたはなしで腹腔内に受容させた。両方の群のマウスが、同種成体ＣＤ３４＋細胞からの優れたＢ細胞および単球の再構成を示し、移植片のＴ細胞による拒絶が防止されたことを示す。しかしながら、これらのマウスは、２０週までに生成される末梢Ｔ細胞が非常にわずかであり、移植片は開腹時にはほとんど確認できず、胸腺の照射が、胸腺の成長および／または機能を損なうことを示す。
【０１２５】
凍結保存／解凍した胎児ＴＨＹ移植片は、ＮＳＧマウスにおいて、Ｔ細胞の末梢再構成および同種の成体ヒト造血幹細胞から多数の造血系統を可能にする。
【０１２６】
凍結保存／解凍した胸腺組織の移植は、マウスにおける免疫機能を回復させることができる37,38。ヒト胎児ＴＨＹ組織の凍結保存は、成長能力を損なうことなく、胸腺細胞を枯渇させることができる。亜致死照射したＮＳＧマウスの群に、凍結保存／解凍したヒト胎児ＴＨＹ移植片に加えて、静脈注射で３〜５×１０5の同種の成体ＨＳＣおよび２用量の抗ＣＤ２  ｍＡｂを受容させた。図２６に示されるように、全てのマウスは、６週までにヒトＢ細胞および単球のキメラ化を達成した。ＨＳＣ単独のレシピエントとは対照的に、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片を受容したマウスは、末梢Ｔ細胞を生成し、これは、６週までに現れ、移植後１６週で、３×１０5または５×１０5のＣＤ３４＋細胞を注入したマウスにおいて、それぞれ、ＰＢＭＣ中約１０％および約３０％でピークに達した。ＣＤ３４＋細胞のレシピエント由来のＴＨＹ移植片は、移植後２０週で著しく増大し、以前に胎児ＣＤ３４＋細胞で観察されたように31、大半がＣＤ４／ＣＤ８二重陽性ヒト胸腺細胞である（図２６Ｂ〜Ｃ）、強力なヒト胸腺リンパ球形成を示した。
【０１２７】
抗ＣＤ２  ｍＡｂありまたはなしだが、ＣＤ３４＋細胞の静脈注射なしで、凍結保存したＴＨＹを受容した対照動物は、末梢で多数のヒトＴ細胞を再増殖させなかった。したがって、既存の移植片胸腺細胞を凍結保存によって枯渇させ、ＣＤ３４＋細胞の静脈内注射が、ヒトＴ細胞の再構成に必要であった。
【０１２８】
凍結保存／解凍したＴＨＹに加えて抗ＣＤ２  ｍＡｂを受容した本研究の長期動物はいずれも、消耗症候群を発症せず、この症候群が、胸腺移植片から移出する既存の成熟Ｔ細胞の移植片対宿主反応に起因するという仮説と一致する。
【０１２９】
対照およびＴ１ＤＭの志願者に由来する臨床骨髄吸引液からのヒト免疫の再構成。次に、臨床骨髄吸引液から単離した成体ＣＤ３４＋細胞の再構成能力を評価した。１５ｍｌの骨髄吸引により、健常対照およびＴ１ＤＭ患者の志願者から、それぞれ、３．６×１０5および２．７×１０6のＣＤ３４＋細胞を得た。亜致死照射したＮＳＧマウスに、それぞれ、凍結保存／解凍したヒト胎児胸腺移植片および抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂに加えて、１．８×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を受容させた。対照の照射したＮＳＧマウスには、胸腺組織なしでＣＤ３４＋細胞を受容させた。ヒトキメラは、６週目から検出可能であり、２０週までに約２５％〜８０％でピークに達した（図２７）。対照およびＴ１ＤＭ志願者に由来するＣＤ３４＋細胞の静脈注射に加えて、ＴＨＹ移植片を受容したマウスは、ピークのＣＤ３＋細胞レベルが、約５０％〜約９０％に達し、一方で、対照ＮＳＧマウスは、最小限のＴ細胞再構成を有した。ＣＤ１９＋細胞およびＣＤ１４＋細胞もまた、Ｔ１ＤＭおよび対照志願者の両方に由来するＨＳＣから回復した（図２７）。反復実験で類似の結果が得られ、単一のＴ１ＤＭ志願者の吸引液に由来する２×１０5のＣＤ３４＋細胞で、６匹のＮＳＧマウスが再構成された。
【０１３０】
Ｔ１ＤＭおよび対照の成体ＣＤ３４細胞からのＴ細胞機能、自己寛容性、およびＴｒｅｇの発達。成体ＣＤ３４＋細胞を受容した同種および異種（ブタ）の皮膚を、ＴＨＹ移植済みのマウスに移植することによって、Ｔ細胞機能を評価した。図２８Ａに示されるように、これらのマウスは、同種ヒトおよび異種ブタ皮膚移植片を、すぐに拒絶した。Ｔ１ＤＭおよび正常志願者の成体ＣＤ３４＋細胞から生成されたＴ細胞の同種反応性およびＴ細胞の自己寛容性を評価するために、脾臓およびリンパ節から単離した精製されたＴ細胞を使用して、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行った。図２８Ｂに示されるように、Ｔ１ＤＭおよび対照対象から再構成されたマウスに由来するＴ細胞は、ＭＬＲにおいて、強い同種応答とともに、自己寛容性を示した。注目すべきことに、新しい成体ドナーＴ細胞および同じ健常対照骨髄ドナーに由来するＣＤ３４＋細胞を受容したマウスに由来するＴ細胞は、類似の強力な同種刺激因子に対する応答および類似の自己寛容性を示した。したがって、成体志願者の免疫応答性および自己寛容性が、「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスに再現された。
【０１３１】
研究は、Ｔｒｅｇの数が、Ｔ１ＤＭ患者の血液では、非糖尿病対照と比較して減少すること示した39。自然発生型Ｔｒｅｇを、胸腺移植片および再構成したマウスの末梢において定量化した。図２８Ｃに示されるように、ＣＤ４＋ＣＤ８−胸腺細胞中のＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘＰ３＋自然発生型Ｔｒｅｇは、類似の数および割合で、対照およびＴ１ＤＭ志願者から再構成したヒト胸腺移植片に存在した。さらに、類似の割合のＴｒｅｇが、再構成されたマウスの両方の群で、末梢免疫系に検出された（図２８Ｄ）。
【０１３２】
「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおける回復したＴ細胞の表現型。移植後２０週で、Ｔ１ＤＭ  ＣＤ３４細胞および正常志願者から再構成したマウスのＣＤ４およびＣＤ８  ＳＰ胸腺細胞に、スペクトル型解析の分析を行った（図２９Ａ）。Ｔ１ＤＭまたは対照志願者によって再構成された胸腺移植片からの両方の集団において、ヒトＴ細胞は、分析した全１１ＢＶファミリーの利用、およびそれらの全てに対して正常に近いＣＤＲ３の長さ分布を有する、多様なレパートリーを示した。全ての分析したＢＶファミリーの平均ハミング距離は、２１．２であり、２０の正常対照末梢血のＣＤ４サブセットのものに類似のＴ細胞多クローン性を示す。成体対照志願者ＣＤ３４細胞ドナーの血液中のＴ細胞の比較は、同じドナーから再構成された「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおけるナイーブ型ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ４、ＣＤ８、およびＴｒｅｇサブセットの割合の著しい増加を示した（図２９Ｂ、Ｃ）。したがって、成体ドナーの免疫系の回復形態は、「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスにおいて生成される。
【０１３３】
成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞が、凍結保存／解凍した同種胸腺組織を移植した、亜致死照射されたＮＳＧマウスを再構成することができることを、本明細書に提示する。この再構成は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞を含む、複数の造血系統に関与する。照射または７日間のｄＧｕｏ処置とは対照的に、凍結保存／解凍した胎児胸腺組織に加えて、抗ＣＤ２  ｍＡｂを投与することで、胸腺移植片から成熟Ｔ細胞を枯渇させることに成功し、同種ＣＤ３４＋細胞の拒絶を防止し、消耗症候群の後期発症を防止し、胸腺機能を保存する。このような条件下において、成体ドナーの自己寛容性を再現する、胸腺リンパ球形成、胸腺移植片の成長、および機能性の多様な回復した免疫系の再構成を達成する。胎児肝臓断片が、この研究の基礎となるヒト化マウスモデルに含まれたが29,31、注入したＣＤ３４＋細胞に由来する前駆体はヒト胸腺移植片に定植可能であるため、これらの断片は必要ではなかったことが見出された。
【０１３４】
ｄＧｕｏで処置したヒト胸腺からのインビボ胸腺リンパ球形成および末梢再構成が示されるが、注入した成体ＣＤ３４＋細胞からの末梢Ｔ細胞再構成は、同種ＣＤ３４＋細胞の拒絶を防止するために十分な期間（２１日間）胸腺をｄＧｕｏで処置した場合、低速であった。数週間ｄＧｕｏで培養したヒト胸腺組織を使用して、完全型ディジョージ症候群を有する患者において、Ｔ細胞の再構成を達成した40。これらの小児において40Ｔ細胞の回復が低速であったことを考慮して、結果は、ＧＶＨＤを予防しながら、より迅速なＴ細胞を回復させるためのアプローチとして、胸腺組織の凍結保存を示す。
【０１３５】
胎児胸腺組織の凍結保存は、自己免疫疾患と関連するクラスＩＩ対立遺伝子を共有する患者および対照に由来する成体ＣＤ３４＋細胞とともに使用するためのＨＬＡ型判定済みの組織の「バンク」の蓄積を可能にする。これらの対立遺伝子は、一般集団に比較的共通している41。ＮＳＧマウスの使用は、比較的少数の同種成体ＨＳＣの生着を可能にし、そのため複数のマウス（最大１５匹）が、成体志願者の１５ｍｌの骨髄吸引液から単離したＣＤ３４＋細胞から再構成可能である。
【０１３６】
ＮＳＧマウスにおける成体骨髄ＣＤ３４＋細胞からの免疫再構成は、自己免疫疾患の発症と関連するＨＳＣ内在性免疫欠陥のインビボ分析を可能にする。これは、疾患によって変化しない免疫系を提供し、制御された有望な方法で、正常対照と患者との比較を可能にする。ヒト研究は、これまで、末梢血試料の分析に限定されており、疾患の原因と結果を区別することが困難であった。Ｔｒｅｇの数および機能における欠陥が、Ｔ１ＤＭ15,16,39,42、全身性紅斑性狼瘡43、およびリウマチ性関節炎44に報告されている。しかしながら、Ｔｒｅｇの欠陥は、全ての研究に見られるものではなく、ＮＯＤマウスは、Ｔｒｅｇの数および機能を保存したことがわかっている45,46。いくつかのヒト研究は、Ｔ１ＤＭ患者におけるＴｒｅｇの保存を示している47。したがって、これまでのところ、Ｔ１ＤＭ患者のＣＤ３４細胞から生成されたＴ細胞集団に全体的な異常は観察されておらず、健常対照ＣＤ３４細胞ドナーと類似の割合でＴｒｅｇを生成する。したがって、本研究は、Ｔ１ＤＭの造血幹細胞からＴｒｅｇを生成するに能力における遺伝子にプログラムされた低下を除外する。本モデルでのさらなる研究は、Ｔ１ＤＭに関係している無数の免疫制御性異常の徹底的な評価を、それらをもたらし得る遺伝子多型の理解とともに可能にするであろう。
【０１３７】
Ｔ１ＤＭについては、ある程度ヒト疾患に類似の症状を呈する48ＮＯＤマウス等の動物モデルにおける免疫病理学的な発見は、しかしながら、誤解および間違った推測にもつながっている48,49。同種膵島の拒絶を、免疫病因の根底にある根本的な細胞内在性免疫制御性欠陥の分析を除いて、糖尿病ヒト化マウスモデルにおいてモデル化し50、感作し、疾患関連のＰＢＭＣを、既にＴ１ＤＭを発症した個体から移入した。ＨＬＡトランスジェニック免疫応答性マウスは、自己免疫疾患の病因の見識を提供し、リウマチ性関節炎51、多発性硬化症52、セリアック病53、Ｔ１ＤＭ54-56、および自然発症性糖尿病等が説明されている57。しかしながら、これらのモデルは、自己免疫病因を引き起こす、ヒトＨＳＣ内在性の遺伝的に決定される免疫異常の分析を可能にするものではない。対照的に、免疫不全マウスへの静脈注射でのＣＤ３４＋細胞および胎児ＴＨＹ組織の組み合わせ投与は、正常な構造特性ならびに形質細胞様および骨髄の両方の樹状細胞を有する二次リンパ器官の発達とともに、正常なＴ細胞機能の回復、Ｔ−Ｂ相互作用、クラススイッチ抗体応答を可能にする29-31。Ｔｒｅｇが正常に発達し、Ｔ細胞の恒常性をこのモデルにおいて研究することができるため32、それは、自己免疫疾患を有する患者のＨＳＣに由来する細胞における根本的な制御性異常の評価を可能にするであろう。さらに、この「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」モデルはまた、免疫療法に対する成体骨髄ドナーの個別の応答性の分析を可能にするであろう。さらに、成体ＨＳＣに由来する多様なレパートリーを有するナイーブＴ細胞を用いた複数のマウスの再構成は、癌患者、造血細胞移植のレシピエント、またはＨＩＶ患者等の胸腺が不足した患者に、養子移入のための機能性の自己寛容性Ｔ細胞源を提供することができる。タンパク質抗原に対する応答が、ヒトＴＨＹおよびＣＤ３４細胞移植片を受容するマウスにおいて生じるため30、腫瘍抗原またはウイルスタンパク質でマウスに免疫付与し、所望される特異的な免疫応答を生成することができる。さらに、マウスは、自己免疫疾患、ＧＶＨＤ、または同種移植片を有する患者の治療に所望される特異性を有する多数の自己Ｔｒｅｇを生成することができる。本研究におけるＣＤ３４細胞ドナーの「自己」抗原に対する特異的寛容性およびＧＶＨＤの不在は、ヒトドナーおよびマウスレシピエントの両方のクラスＩＩhighＡＰＣの存在が、免疫不全マウスにおける胸腺異種移植片内に、既に提示されているため58、それぞれ、ヒト胸腺移植片内のヒトＨＳＣドナーおよびマウスレシピエントに由来するＡＰＣの存在に起因する、胸腺内の枯渇を反映する可能性が高い。
【０１３８】
本発明は、成体ＨＳＣから多系統末梢ヒト造血細胞への発達を可能にするモデルを提供する。「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスは、自己免疫障害に関連する免疫制御における内在性欠陥、および遺伝的に制御される免疫療法に対する応答の分析のための、疾患またはその治療によって変化しない、「白紙の状態の（ｃｌｅａｎ  ｓｌａｔｅ）」免疫系を提供する。これらのマウスはまた、患者での使用に所望される特異性および特性を有する多クローン性のナイーブまたは活性化Ｔ細胞源としての治療的可能性を有する。
【０１３９】
材料および方法
【０１４０】
動物およびヒトの組織および細胞。非肥満性糖尿病の重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ鎖null（ＮＳＧ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、特定の病原体を含まないマイクロアイソレーター環境で収容した。在胎１７〜２０週のヒト胎児胸腺および肝臓の組織を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から入手した。胎児胸腺組織の断片を、１０％ＤＭＳＯおよび９０％ヒトＡＢ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）中で凍結保存し、実験計画に応じて、照射または培養した。ＣＤ３４＋細胞を、１５ｍｌの骨髄吸引液から、または廃棄されたヒト骨髄フィルターから、または抗ヒトＣＤ３４＋マイクロビーズを用いた磁気活性化細胞分類装置（ＭＡＣＳ）分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、ヒト胎児肝臓組織から、単離した。
【０１４１】
胎児胸腺器官培養。ヒト胎児胸腺の培養を既に公開されているように実行した34。簡単に述べると、胸腺の断片を、１ｃｍ2のＧｅｌｆｏａｍスポンジ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ，ＮＹ）上の０．８μｍのアイソポアメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に設置した。内因性胸腺細胞を排除するために、器官培養物は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）において、１．３５ｍＭ  ２'−デオキシグアノシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、７または２１日間、３７℃で成長させた。
【０１４２】
ヒト組織移植。ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびＮＳＧマウスを、亜致死（２．５Ｇｙ）全身照射で前処置した。解凍済みの照射または培養したヒト胎児胸腺の約１ｍｍ3に測定した断片を、レシピエントの腎臓被膜の下に埋め込んだ。胎児胸腺器官移植の２４時間以内に、１〜５×１０5のヒトＣＤ３４＋細胞を、マウスに静脈内注射した。いくつかのレシピエントは、０日目および７日目に抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂ（ＢＴＩ３２２、１００μｇ／マウス）で処置した。
【０１４３】
皮膚の移植。ＭＨＣミニブタおよび同種ヒトドナー由来の分層（２．３ｍｍ）皮膚試料を、ヒト組織移植の３９週後に、外側胸壁に移植した。皮膚移植片を、７日目以降４週まで毎日評価し、続いて、その後３日毎に少なくとも１回の調査を行った。移植片は、生存している移植片が１０％未満の場合、拒絶されたと定義した。
【０１４４】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）。移植を受けたマウスにおけるヒト造血細胞のレベルを、４色フローサイトメトリーによって評価した。マウスに、移植後に一定の間隔で尾からの採血を行い、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、それをｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で調製した。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した蛍光色素で標識化したｍＡｂを、異なる組み合わせで使用した。抗マウスＣＤ４５、抗マウスＴｅｒ１１９、抗ヒトＣＤ４、抗ヒトＣＤ８、抗ヒトＣＤ１４、抗ヒトＣＤ１９、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ、抗ヒトＣＤ１２７、抗ヒトＦｏｘＰ３、抗ヒトＣＤ２５、およびアイソタイプ対照ｍＡｂ。ＦＣＭ分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、ＦＡＣＳｃａｎｔｏ、またはＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して行い、分析は、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）によって行った。死細胞は、低い前方散乱および高いヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をゲートアウトし、細胞を保持することによって分析から除外した。マウスの赤血球系細胞は、マウスＴｅｒ１１９＋細胞をゲートアウトすることによりヒトキメラの分析から除外した。
【０１４５】
混合リンパ球反応。脾細胞およびリンパ節を、ヒト化マウスから採取し、単核細胞の懸濁液を、フィコール分離によって単離した。ヒトＴ細胞を、製造業者の説明に従って、抗マウスＣＤ４５およびＴｅｒ−１１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してマウスの細胞を枯渇させることにより富化し、続いて、ＰａｎＴ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してＴ細胞を精製した。純度は９０％超であった。レスポンダーＴ細胞（ウェルあたり１０5）を、照射したヒト同種ＰＢＭＣ（３０００ｒａｄ、ウェルあたり１０5の細胞）を刺激因子として用いて５日間培養し、増殖を、上述のように59［3Ｈ］チミジンの取り込みを介して測定した。データは、３通りの培養物中の平均の［3Ｈ］チミジン取り込みとして示される。
【０１４６】
スペクトル型解析。全ＲＮＡを、１〜２×１０4のＣＤ４またはＣＤ８単一陽性胸腺細胞（純度８０％超）から直接抽出し、逆転写し、単鎖ｃＤＮＡの合成を記載の通りに行った60。記載のように60、ＴＣＲ  β鎖定常領域プライマーおよび個別の可変領域を使用して増幅反応を行った。生成物を、次いで、記載のように60、Ｃβ特異的ＦＡＭ標識化プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）での流出反応に使用した。標識化した生成物を、次いで、ＴＣＲ  β−鎖長の長さ分布の判定に使用した。ＤＮＡ生成物に対応するピークの寸法および範囲を、ＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して判定し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ  ３．７  ＮＴを使用して分析した。正常なヒトにおける末梢血ＣＤ４Ｔ細胞の実験および基準のβ−鎖長分布の間の定量的差異を評価するために、ハミング距離を、記載のように計算した60。
【０１４７】
統計分析。統計分析および比較を、ＰＲＩＳＭソフトウェアのバージョン４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。棒グラフのデータは、平均±標準誤差を表す。パラメータデータセットのスチューデントｔ検定、または非パラメータデータセットのマンホイットニー検定を、群の比較に使用した。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意であると見なした。
【０１４８】
ヒト化マウスのためのヒトＣＤ３４＋細胞の単離および胎児胸腺の調製。
【０１４９】
ヒト組織：ヒト胎児胸腺組織を、商業的供給源、例えば、Ｓｔｅｍ−ｅｘまたはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから注文した。
【０１５０】
培地：骨髄培地（５００ｍｌ  Ｍｅｄｉａ１９９、５ｍｌ  ＨＥＰＥＳ、５ｍｌ  ＤＮＡｓｅ、４０μｌゲンタマイシン）、ＭＡＣＳ緩衝液（５００ｍｌ  ＰＢＳ、５ｇＢＳＡ、２ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０分間脱気）
【０１５１】
材料：滅菌の鋏および鉗子、滅菌６ｍｌ注射器、滅菌１０ｃｍペトリ皿、５０ｍｌファルコンチューブ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、４０μｍ細胞染料、ヒトＡＢ血清、および凍結保存の場合はＤＭＳＯ、ＣＤ３４＋ＭＡＣＳ単離キット。全ての手順は、滅菌条件下で行うものとする。
【０１５２】
胎児胸腺組織の調製：１．胎児胸腺組織を、滅菌の鋏で約１〜２ｍｍ３の大きな断片に切断する。２．胎児胸腺組織を、即時の被膜下移植のために氷上の培養培地に保持するか、または９０％ヒトＡＢ血清および１０％ＤＭＳＯを使用して、１．５ｍｌの滅菌凍結保存チューブに凍結保存する。チューブを迅速に細胞凍結装置に移動させ、凍結プロセスを開始する。３．凍結させた後、胎児胸腺組織を有するチューブを−８０℃の凍結装置に移動させる。１週間以内に移植しない場合、組織片は液体窒素中で保存する。４．解凍するためには、チューブを液体窒素から取り出し、３７℃の水浴に入れる。氷が溶け出すとすぐに、チューブを取り出し、骨髄培地を含有する５０ｍｌの円錐容器に内容物を移す。５分後、ＤＭＳＯを希釈するために、新しい骨髄培地を含有する新しい５０ｍｌの円錐容器に、胸腺片を移す。５分後に希釈ステップを繰り返す。５．胸腺片を、即時の被膜下への移植のために、氷上の培地に入れる。
【０１５３】
胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞の調製：１．胎児肝臓を１０ｃｍの滅菌ペトリ皿に入れ、３または６ｍｌの注射器の滅菌プランジャーで骨髄培地に穏やかに砕いて入れる。細胞懸濁液を、４０μｍの細胞濾過器を通して５０ｍｌの円錐容器に移す。２．細胞懸濁液を、新しい５０ｍｌチューブの２０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １．０７７にゆっくりと穏やかに入れる。勾配層を破壊しないように注意する。３．チューブを遠心分離容器に移し、容器のバランスを取り、ブレーキをオフにして、室温で３０分間１４００〜１５００ｒｐｍで遠心分離する。４．遠心分離の後、軟膜を収集し、細胞濾過器を通して再度濾過する。新しい骨髄培地と十分に混合して、勾配の再形成を防止する。５．ブレーキをオンにして、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離する。６．上清を傾瀉し、ペレットを収集する。７．ＭＡＣＳヒトＣＤ３４＋単離キット（１３０−０４６−７０２）の説明書を使用して、ＣＤ３４＋の富化を進める。ＦＡＣＳによって純度を確認し、ＢＭ培地中で洗浄する。８．９０％ヒトＡＢ血清および１０％ＤＭＳＯ中に凍結保存するか、またはＢＭ培地中でマウスあたり１００〜４００，０００のＣＤ３４＋細胞を静脈内に注射する。マウスは、少なくとも８時間前までに、２〜２．５ＧｙのＴＢＩを受容していなければならない。
【０１５４】
実施例２の参考文献
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実施例３
【０１５５】
Ｔ、Ｂ、ＮＫ、ＮＫＴ、および樹状細胞（ＤＣ）を含む、免疫系の細胞における内在性異常が、ＮＯＤマウスおよび／または１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）における自己免疫病因に関連づけられている。しかしながら、ほとんどのヒト研究は、疾患発症後のＴ１ＤＭ患者の分析を伴うため、疾患の原因と結果を区別することができない。制御された有望な方法で、このような欠陥の分析を可能にするであろう新しいヒト化マウスモデルを、本明細書に記載のように作製した。
【０１５６】
ヒトＣＤ３４＋胎児肝臓細胞の静脈内注入に加えて、ヒト胎児胸腺および肝臓組織を移植することによって、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが機能性ヒト免疫系を伴って再構成される、ヒト化マウスモデルについて記載した。これらのマウスは、Ｂ、Ｔ、およびＤＣを含む、多系統ヒト造血細胞の末梢再構成を示し、正常な寸法のリンパ組織を発達させ、インビボで強い抗原特異的免疫応答を示す。正常な胸腺の発達は、制御性Ｔ細胞を示すものであり、Ｔｒｅｇの機能および末梢での「活性化した」表現型への変換を示した。このモデルはまた、これまでのところ適切なインビボモデルに欠けている、ヒトＴ細胞の恒常性末梢増殖の試験を可能にする。ヒト化マウスからＴ細胞欠損ヒト化マウスへの自己Ｔ細胞の養子移入は、リンパ球減少状況において、インビボでの２つの目立った増殖性応答を示した。急速な増殖を受けるヒトナイーブＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、メモリー様の表現型およびＩＦＮ−γを急速に生成する能力を取得し、一方で、低速な増殖を受けているものは、ナイーブ表現型の機能的特徴を維持する。両方の集団の回復は、レシピエントのヒト化マウスの末梢における、ヒトの非Ｔ細胞キメラのレベルに依存する。
【０１５７】
本発明は、少数の成体同種骨髄ＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞およびＡＰＣを有する、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ共通γ鎖ノックアウトマウスの末梢の生成および定植を支持することが可能な凍結保存／解凍したヒト胎児胸腺組織を使用して、ヒト化マウスモデルの構築を提供する。Ｔ１ＤＭ患者および健常対照に由来する骨髄ＣＤ３４＋細胞を、Ｔ１ＤＭ関連ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２０１を発現するヒト胎児胸腺移植片を受容したマウスに注射する。このモデルは、正常対照に対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４＋細胞に由来する、通常および制御性Ｔ細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型変換、ならびに自己寛容性の比較を可能にするであろう。Ｔ１ＤＭ患者に由来する造血幹細胞が自己免疫に寄与する内在性異常を示すことが、可能である。
【０１５８】
１型真性糖尿病は、インスリンを生成するβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。自己免疫の発達に重要な役割を果たす環境要因は明確に定義されていないが、遺伝的要因は、実質的に疾患の感受性に寄与する。
【０１５９】
ＨＬＡの遺伝子型が、最も強くＴ１ＤＭに関連する。しかしながら、非ＨＬＡ関連の座位もまた、明らかに自己免疫に寄与する。これらの座位の多くは、免疫制御性遺伝子を含有する。したがって、理論に束縛されるものではなく、造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源とする、免疫系の細胞における内在性異常は、自己免疫の発達に寄与し得る。ＮＯＤマウスモデルは、これらの遺伝子のうちのいくつかが自己免疫を促進する、機構を分析するための遺伝学的研究を可能にしたが、臨床研究は、疾患発症後の患者の分析を伴い、原因と、疾患、その治療、またはそれを引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。したがって、制御された有望な方法で、ヒトの免疫学的欠陥の分析を可能にするモデルに対する必要性が存在する。
【０１６０】
亜致死照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ鎖欠損（ＮＳＧ）マウスにおいて、少数で投与された成体同種骨髄ＣＤ３４＋細胞から、多系統末梢ヒト造血細胞の発達を可能にする、ヒト化マウスモデルを本明細書に提示する。このモデルは、制御された有望な方法で、自己免疫疾患を有する患者と対比して、正常対照のＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞および他の免疫細胞の比較を可能にする。
【０１６１】
多数の「ヒト化マウス」モデルを作製した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、免疫不全マウスに定植させることが可能であり、ヒトＴ細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺（ＴＨＹ）移植片で発達させる。胎児ＣＤ３４＋細胞の静脈内注入と、腎臓被膜下のヒト胎児胸腺および肝臓（ＴＨＹ／ＬＩＶ）移植片との組み合わせが、末梢ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、免疫グロブリン、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞を伴うヒト免疫の再構成を可能にすることが示された。これらのマウスは、正常な寸法のリンパ組織を発達させ、タンパク質免疫付与後に強力なクラススイッチ型抗体応答を含む、強い抗原特異的免疫応答をインビボで示す。さらに、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の正常な胸腺発達は、Ｔｒｅｇの機能および末梢での「活性化した」表現型への変換を提示した。このモデルはまた、これまでのところ適切なインビボモデルに欠けている、ヒトＴ細胞の末梢の恒常性増殖の試験を可能にする。
【０１６２】
成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞は、亜致死照射した、凍結保存／解凍した同種胸腺組織を移植したＮＳＧマウスを再構成し、Ｔ細胞を含む、複数の末梢造血細胞系統を再構成することができる。照射または７日間のｄＧｕｏ処置とは対照的に、凍結保存／解凍した胎児胸腺組織に加えて、抗ＣＤ２  ｍＡｂの投与は、胸腺内Ｔ細胞の枯渇を成功させ、同種ＣＤ３４＋細胞の拒絶を防止し、胸腺機能を保存する。したがって、自己免疫疾患を有する患者および健常対照に由来する骨髄ＣＤ３４＋細胞を、疾患関連のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を発現するヒト胎児胸腺移植片を受容するマウスに注射することができる。少数の吸引した骨髄細胞を使用して、このモデルは、自己免疫疾患を有する患者におけるＨＳＣ内在性の免疫異常の特定を可能にするであろう。
実施例４
【０１６３】
ある特定の態様において、本発明は、ＨＬＡ決定済みヒト胸腺移植片でヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、再凝集ヒト胸腺移植モデルを作製する方法を提供する。この実施例において、インタクトな胎児胸腺組織を埋め込む代わりに、ＨＬＡ型判定済みのヒト胎児胸腺組織から凍結保存したＣＤ４５陰性胸腺間質細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込むことができる。共通の糖尿病感受性ＨＬＡ対立遺伝子を保有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照および１型糖尿病対象に由来する静脈内注射したＣＤ３４＋細胞から、Ｔ細胞の胸腺リンパ球形成を支持するであろう。代替的なアプローチには、インタクトなヒト胸腺組織に、ＨＬＡトランスジェニックＮＯＤマウス由来の胸腺上皮細胞を注射すること、または糖尿病感受性対立遺伝子をコードする遺伝子を胸腺異種移植片にアデノウイルス形質導入を行うことが含まれる。
【０１６４】
ある特定の態様において、本発明は、正常細胞に対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する通常のＴ細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型変換、および自己寛容性を比較するためのマウスモデルおよび方法を提供する。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定することができる。恒常性における内在性異常が、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞を特徴付けるかどうかを判定することができる。
【０１６５】
ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する制御性Ｔ細胞の数、機能、および末梢表現型変換を比較するための方法を提供する。Ｔ１ＤＭ患者の幹細胞に由来するＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞は、欠陥を示す。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。
【０１６６】
種々のレジメンを、同種ＣＤ３４＋細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にするであろうＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスのヒト胎児胸腺移植片の生着について評価した。
【０１６７】
ヒト骨髄フィルターからのＣＤ３４細胞の単離：研究のために正常および１型糖尿病ドナーに骨髄の採取を行う前に、成体ＣＤ３４+細胞および同種胎児胸腺組織を受容するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて、ヒト胸腺リンパ球形成のためのモデルを構築することが必要であった。これらの研究のための成体ＣＤ３４＋細胞源として、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｕｎｉｔから廃棄された骨髄フィルターを使用した。各フィルターから、フィルター当たり５〜２５×１０6の正常ドナーのＣＤ３４+細胞を、ＭＡＣＳビーズを使用して単離した。フローサイトメトリー分析により、純度約９０％であることがわかった。これらの細胞を、これらの研究で使用するために凍結保存した。
【０１６８】
胎児胸腺器官培養物：ヒト胎児胸腺組織を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手した。胎児胸腺移植片内に存在する成熟Ｔ細胞による同種ＣＤ３４細胞に由来する胸腺細胞の拒絶を防止するために、１．３５Ｍ  ｄＧｕｏの存在下で培養物を評価した。胸腺内のＣＤ４およびＣＤ８単一陽性細胞の割合は、１０日間の培養後、それぞれ、４３％および１４％から、３．４％および２．１％に減少した。比較として、ｄＧｕｏなしで類似の期間培養した後のＣＤ４およびＣＤ８単一陽性細胞の割合は、それぞれ、２０．１％および１３．３％であった。しかしながら、ｄＧｕｏありでの胎児胸腺器官培養物は、２０日間でさえ、全ての成熟胸腺細胞を完全に枯渇させることはなかった。
【０１６９】
ｄＧｕｏで処置したヒト胎児胸腺移植片からのヒトＴ細胞の再構成：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ｄＧｕｏの存在下で２０日間培養したヒト胎児胸腺を移植する１日前に、２．５ＧｙのＴＢＩを受容させた。ヒト胸腺リンパ球形成を伴う胸腺生着の成功は、同種成体ＣＤ３４+細胞の静脈内注入後に生じた：ヒトＣＤ３＋細胞は、移植の２０週後、全てのマウスの末梢血において検出可能であり、平均でＰＢＭＣ中約２５％に相当する。新鮮またはｄＧｕｏで処置したかのいずれかであるが、ＣＤ３４＋細胞を含まないヒト胎児胸腺組織を受容させた年齢適合対照マウスは、移植後のどの時点においても、血中に検出可能なヒトＣＤ３+細胞を有さなかった。これらの結果は、胸腺移植片内に存在する幹細胞および成熟Ｔ細胞が、末梢ヒトＴ細胞を生成するのに十分な胸腺リンパ球形成を維持することができず、追加のＣＤ３４+の注入が必須であることを示す。研究は、ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織中の胸腺細胞が、同種ＣＤ３４細胞に由来する胸腺細胞前駆体を拒絶しないことを示す。さらに、末梢に注入されたＣＤ３４＋細胞に由来する前駆体は、ｄＧｕｏで処置した胸腺に定植することができ、そこで胸腺リンパ球形成が行われることが示された。
【０１７０】
ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織を受容させた別の年齢適合対照群にもまた、同種成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞の代わりに、同じ胎児ドナーの肝臓から単離したＣＤ３４＋細胞を静脈内注入で受容させた。これらの同系胎児ＣＤ３４＋細胞の注入後、ＣＤ３＋細胞の移植の１４週間後までに、平均でＰＢＭＣ中約３５％までの末梢血ＣＤ３＋の再構成が検出可能であった。したがって、ヒト末梢ＣＤ３＋細胞の再構成は、成体から得られた同種ＣＤ３４＋細胞で達成されたものと比較して、自己胎児ＣＤ３４＋細胞の注射後では、より急速であると考えられる。
【０１７１】
データは、ＣＤ３４＋細胞の静脈内投与とともに、ｄＧｕｏで２０日間培養した移植片で達成されたＴ細胞の再構成が、胎児肝臓断片を一緒に埋め込み、同じドナーの胎児肝臓に由来するＣＤ３４＋細胞を静脈注射した、新鮮な胎児胸腺移植片で達成されたものよりも低速であり得ることを示す。このような研究において、高レベルのＣＤ３＋細胞は、移植の９週間以内に末梢血中に検出可能であった。
【０１７２】
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の再構成を加速させる試みの中で、ｄＧｕｏの存在下で７日間だけ培養したヒト胎児胸腺移植片を用いて、別の群を構築した。平均でＰＢＭＣ中約７％のＣＤ３＋レベルが、移植後６週間以内に検出可能であったが、これらのレベルは、その後数週間にわたって低下した。移植２０週間後までに、血中のＣＤ３＋Ｔ細胞レベルは、平均で５％未満となった。さらに、注射したＣＤ３４細胞から多系統ヒト白血球再構成が観察された、２０日間ｄＧｕｏで培養した胸腺およびＣＤ３４細胞の静脈注射で達成された結果とは対照的に、いずれの時点においても、検出可能なＣＤ１９+細胞は存在しなかった。これらの結果は、注射した同種ＣＤ３４+細胞が、７日間ｄＧｕｏで処置した胸腺移植片中の、ｄＧｕｏ処置によって枯渇されなかった成熟Ｔ細胞によって拒絶された可能性があることを示す。したがって、胎児胸腺移植片から成熟胸腺細胞を排除し、それによって、同種ＣＤ３４＋細胞およびそれらの子孫の生存および機能を可能にするためには、より長いｄＧｕｏ培養期間が必要であるという結論に達する。
【０１７３】
他のレジメンでのヒトＴ細胞の再構成：実験により、ヒト胎児胸腺移植片における同種ＣＤ３４細胞の生着を達成するさらなる方法を調査する。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの群に、移植前に凍結保存したヒト胎児胸腺移植片を受容させた。胎児胸腺組織の凍結保存は、研究の他の部分でブタ胸腺移植片において胸腺細胞の数を減少させることが示されており、ヒトＣＤ３４細胞に由来する前駆体による、さらに急速な再増殖をもたらす。代替的なアプローチとして、１つの群のマウスに、移植前に７Ｇｙで照射したヒト胎児胸腺組織を受容させた。別の群において、インビボで胸腺細胞前駆体を移植片へ輸送するための要件を克服するために、ｄＧｕｏで培養した胎児胸腺組織とＣＤ３４+細胞とを埋め込み前に「懸滴」培養で共培養することの有効性を試験した。
【０１７４】
ＯＰ９−ＤＬ１共培養：ヒト胸腺リンパ球形成を促進するための別のアプローチは、ＣＤ３４細胞とＯＰ９−ＤＬ１細胞とを、同種「懸滴」または再凝集胸腺培養物に添加する前に、共培養することによってＴ細胞前駆体を増殖させることであり得る。ＯＰ９−ＤＬ１細胞系を使用することにより、プロトコルは、ヒト成体ＣＤ３４+細胞から前駆Ｔ細胞へのインビトロでの分化を可能にするようになった。単分子層のＯＰ９−ＤＬ１細胞上での１ウェル当たり５×１０5のＣＤ３４+細胞の２８日間の共培養後、合計４×１０5の細胞を得、そのうちの６７％は、前駆Ｔ細胞マーカーのＣＤ１ａおよびＣＤ７に二重陽性であった。しかしながら、１ウェル当たりに必要なＣＤ３４+細胞の数が多いために骨髄吸引を介して糖尿病患者および健常対照から得られるＣＤ３４+細胞の数が限られていることから、このアプローチは、これらの目的には実用的ではない可能性がある。
【０１７５】
さらに、ＭＡＣＳビーズを使用して、ＣＤ４５+細胞の枯渇ありおよびなしの再凝集胸腺培養物の評価を行う。ＣＤ３４+細胞での培養後、これらの再凝集組織を、照射済みＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに移植する。
【０１７６】
最も高く、最も高速なヒトＣＤ３+細胞の再構成を可能にするレジメンを選択する。糖尿病患者ならびに健常志願者の骨髄吸引液に由来するＣＤ３４細胞を、約１０のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移入する。共通の糖尿病感受性ＨＬＡ対立遺伝子を有する胎児胸腺組織を、これらのマウスの腎臓被膜の下に移植する。ヒトＴ細胞の再構成後に、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、およびＮＫＴ細胞の分析が可能となる。
実施例５
【０１７７】
ｄＧｕｏで処置したヒト胎児胸腺移植片からのヒトＴ細胞の再構成：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ｄＧｕｏの存在下で２０日間培養したヒト胎児胸腺の移植の１日前に、２．５ＧｙのＴＢＩを受けさせた（表３）。ヒト胸腺リンパ球形成を伴う胸腺生着の成功は、５×１０5の同種成体ＣＤ３４+細胞の静脈内注入後に生じた：ヒトＣＤ３＋細胞は、移植の２０週間後に、全てのマウスの末梢血に検出可能であり、平均でＰＢＭＣ中約２５％に相当する。新鮮またはｄＧｕｏで処置かのいずれかであるが、ＣＤ３４＋細胞を含まないヒト胎児胸腺組織を受容させた年齢適合対照マウスは、移植後のどの時点においても、血中に検出可能なヒトＣＤ３+細胞を有さなかった。これらの結果は、胸腺移植片内に存在する幹細胞および成熟Ｔ細胞が、末梢ヒトＴ細胞を生成するのに十分な胸腺リンパ球形成を維持することができず、追加のＣＤ３４+の注入が必須であることを示す。研究はまた、２０日間ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織中に既存の胸腺細胞が、同種ＣＤ３４細胞に由来する胸腺細胞前駆体を拒絶しなかったことを示した。さらに、データは、末梢に注入されたＣＤ３４＋細胞に由来する前駆体は、ｄＧｕｏで処置した胸腺に定植することができ、そこで胸腺リンパ球形成が行われることを示した。
【０１７８】
ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織を受容させた別の年齢適合対照群に、同種成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞の代わりに、同じ胎児ドナーの肝臓から単離した４×１０5のＣＤ３４＋細胞を静脈内注入で受容させた。これらの同系胎児ＣＤ３４＋細胞を注入した後、ＣＤ３＋細胞の移植１４週間後までに、末梢血ＣＤ３＋の再構成が、平均でＰＢＭＣ中約３５％まで検出可能であった。したがって、ヒト末梢ＣＤ３＋細胞の再構成は、成体から得た同種ＣＤ３４＋細胞で達成されたものと比較して、自己胎児ＣＤ３４＋細胞の注射後では、より効率的であると考えられる。
【０１７９】
データは、既に公開されているように、ＣＤ３４＋細胞の静脈内投与とともに、ｄＧｕｏで２０日間培養した移植片で達成されたＴ細胞の再構成が、胎児肝臓断片を一緒に埋め込み、同じドナーの胎児肝臓に由来するＣＤ３４＋細胞を静脈注射した、新鮮な胎児胸腺移植片で達成されたものよりも低速であり得ることを示す。これらの研究において、高レベルのＣＤ３＋細胞が、移植の９週間以内に末梢血中に検出可能であった。
【０１８０】
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の再構成を加速させる目的で、ｄＧｕｏの存在下で７日間だけ培養したヒト胎児胸腺移植片を用いて、別の群を構築した。平均でＰＢＭＣ中約７％のＣＤ３＋レベルが、移植後６週間以内に検出可能であったが、これらのレベルは、その後数週間にわたって低下した。移植の２０週後までに、血中のＣＤ３＋Ｔ細胞レベルは、平均で５％未満となった。さらに、注射したＣＤ３４細胞から多系統ヒト白血球再構成が観察された、２０日間ｄＧｕｏで培養した胸腺およびＣＤ３４細胞の静脈注射で達成された結果とは対照的に、いずれの時点においても、検出可能なＣＤ１９+細胞は存在しなかった。これらの結果は、注射した同種ＣＤ３４+細胞が、７日間ｄＧｕｏで処置した胸腺移植片中の、ｄＧｕｏ処置によって枯渇されなかった成熟Ｔ細胞によって拒絶された可能性があることを示す。したがって、胎児胸腺移植片から成熟胸腺細胞を排除し、それによって、同種ＣＤ３４＋細胞およびそれらの子孫の生存および機能を可能にするためには、より長いｄＧｕｏ培養期間が必要であるという結論に達した。
【表３】
2014503217.tif 000005
【０１８１】
ヒト胎児胸腺組織の凍結保存および照射：胎児胸腺組織の凍結保存は、研究の他の部分でブタ胸腺移植片において胸腺細胞の数を減少させることが示されており、ヒトＣＤ３４細胞に由来する前駆体による、より急速な再増殖をもたらす。したがって、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの群に、移植前に凍結保存したヒト胎児胸腺移植片を受容させた（表４）。代替的なアプローチとして、１つの群のマウスに、移植前に７Ｇｙで照射を行ったヒト胎児胸腺組織を受容させ、対照群には未処置の新鮮なヒト胎児胸腺組織を受容させた。全ての動物に、２．５ＧｙのＴＢＩおよび２．５×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を静脈注射で受容させた。この数の細胞が、ヒト胎児肝臓に由来するＣＤ３４＋細胞を使用した場合、高レベルの多系統ヒト再構成を達成するのに十分であることが見出された。この研究の対照群には、２×１０5の自己胎児肝臓に由来するＣＤ３４＋細胞を受容させた。この対照群は、このモデルに典型的に見られるように、強力な多系統ヒトＴ、Ｂ、および骨髄の再構成を達成した。
【０１８２】
１６週間の移植後経過観察の間、成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞の全てのレシピエントにおけるヒト造血の再構成は、非常にわずかであった。未処置のヒト胸腺組織を受容したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいては、ＰＢＭＣ中のヒト細胞の割合（％）は、６週目までに平均で約１０％となり、移植後１６週目までごくわずかな変動を有しただけである。注目すべきことには、移植の６週間後までに、これらのマウスにおけるＴ細胞のレベルは、既に平均でＰＢＭＣ中約７％となり、１０週間で平均レベル約１２．５％のピークに達し、移植後１６週間で平均約２．３％まで低下した。対照的に、これらの動物におけるＢ細胞のレベルは、経過観察期間中、ＰＢＭＣ中約２％を上回るレベルに達することはなかった。これらの結果は、移植後早期に末梢に現れたＴ細胞が、移植の時点で胎児胸腺移植片内に存在しており、後で末梢に移出した、胸腺細胞に由来することを示す。ＣＤ３４細胞のドナーは、これらの胸腺細胞に対して同種であったため、多系統キメラを提示できなかったことは、ＣＤ３４細胞移植片がこれらのＴ細胞によって拒絶されたことを示す。さらに、移植片中に存在する成熟Ｔ細胞および／または前駆細胞は、移植１６週間後の末梢ＣＤ３＋細胞の割合が低いことによって示されるように、長期の胸腺リンパ球形成を維持することができなかった。
【０１８３】
未処置胸腺移植片のレシピエントにおけるこれらの結果とは対照的に、ヒトＢ細胞およびＴ細胞のレベルは、照射を行った胸腺移植片を受容したマウスでは、移植後に約１％を上回ることはなく、７Ｇｙでの照射が、移植片に担持される胸腺細胞の枯渇を成功させたことを示した。しかしながら、これらのマウスにおいて非Ｔ細胞の再構成を達成できなかったことは、与えられた成体ＣＤ３４＋細胞の数（２．５×１０5）があまりにも少なく、強力な多系統ヒト造血再構成を達成できなかったことを示唆した。
【０１８４】
同じ実験において、凍結保存した胎児胸腺組織を受容した群は、移植８週間後まで、末梢に検出可能なＴ細胞を有さなかったが、１０および１２週間で、それぞれ、ＰＢＭＣ中に約３．５および５％のヒトＴ細胞を提示した。これらのデータは、凍結保存により、既存の成熟胸腺細胞を枯渇させることに成功したことを示す。移植後１０週間で開始する、低いが徐々に増加するＴ細胞の再構成は、胸腺内の前駆体が、凍結保存にもかかわらず保存された可能性があることを示す。移植後の観察期間のいずれの時点においても、著しいＢ細胞のキメラ化は検出されなかったため、後期のＴ細胞再構成が、与えられた成体ＣＤ３４細胞に由来する可能性はより低い。
【０１８５】
上述の３つの群のマウスのヒト胸腺移植片の外観の比較は、情報価値が高いことが判明した（図３６）。未処置ヒト胸腺移植片および凍結保存した胸腺レシピエントは、いずれも、移植の２０週間後の致死時点で、腎臓被膜下に豊富な生存胸腺組織を有した（図３６Ａ）。対照的に、照射した胸腺組織のレシピエントは、この時点で、腎臓被膜下に確認できる胸腺をほとんど有さなかった（図３６Ｂ）。これらのデータは、照射が、胸腺上皮細胞の分裂能力を排除し、したがって移植片が成長する能力を排除した、および／または胸腺細胞前駆体を移植片から排除した、のいずれかであることを示す。前者の説明が正しい場合、未処置または凍結保存の胸腺移植片のレシピエントにおいては、ヒトＡＰＣが存在しないため、これらのＴ細胞は末梢に移動すると生存できないことにより、末梢Ｔ細胞再構成なしでの強力な胸腺リンパ球形成の存在は、開始成体ＣＤ３４細胞移植片に由来する前駆体による、これらの移植片の早期再増殖を反映し得る。行われた研究は、末梢におけるヒトＡＰＣが、ヒト胸腺移植片で発達するヒトＴ細胞の生存に不可欠であることを示唆する。
【表４】
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【０１８６】
ＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスにおけるヒト細胞の再構成：成体骨髄ＣＤ３４細胞は、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスにおいて多系統ヒト造血再構成を達成する際に、胎児肝臓ＣＤ３４細胞よりも効果的ではないと考えられるため、成体ＣＤ３４細胞の効率を改善する方法が、この結果を達成するために必要である。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−共通γ鎖ノックアウトマウス（ＮＳＧマウス）は、これらのマウスが、ＮＫ細胞を欠いており、最適なヒト細胞の生着が他のモデルに報告されているため、より許容性である可能性が高い成体ＣＤ３４細胞のレシピエントとして評価した。記載の実験において、胸腺の凍結保存ならびに照射の両方が、胸腺内の同種反応性Ｔ細胞の枯渇を成功させたため、これらのレジメンを、ＮＳＧマウスにおいて試験した。さらに、０日目および７日目に、単クローン性抗ヒトＣＤ２抗体（ＢＴＩ３２２、１００μｇ）の２つの用量をプロトコルに加え、胸腺移植片に由来するＴ細胞の枯渇を強化した（表５）。
【０１８７】
２．５Ｇｙで照射したＮＳＧマウスの群に、３×１０5の成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞を単独で、または凍結保存もしくは７Ｇｙで照射したヒト胎児胸腺組織に加えて、受容させた。１つの群の動物に、凍結保存した胎児胸腺組織に加えて、５×１０5の成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞を受容させ、一方で対照には、凍結保存した胸腺組織を、単独で、またはＢＴＩ３２２と併せてのいずれかで、受容させた。
【０１８８】
注目すべきことに、おおよそ２５％のヒト細胞が、３または５×１０5の成体骨髄ＣＤ３４＋細胞を、単独または凍結保存したヒト胎児胸腺組織と併せてのいずれかで受容したＮＳＧマウスへの移植後６週間で、既にＰＢＭＣ中に検出可能であった（図３７）。ヒト細胞レベルのピーク（ＰＢＭＣ中約６０〜７５％）は、８週間で検出可能であり、その後、平均で約３０〜６０％であった。ヒトＣＤ１９＋細胞は、移植６週間後に、ＰＢＭＣ中約３０％で開始する高いレベルで検出可能であり、８週間で約５５％のピークに達した。凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させたＮＳＧマウスにおいて、Ｔ細胞は、移植後６週間目までに末梢に検出可能であり（ＰＢＭＣ中約３％）、それぞれ、３×１０5または５×１０5の成体ヒトＣＤ３４＋細胞を受容させたマウスにおいて、約１０％および約３０％のピークまで増加した（図３７）。対照的に、ヒト胎児胸腺移植片を受容しなかったＮＳＧマウス、または７Ｇｙで照射した胸腺移植片を受容したマウスにおいては、ヒトＴ細胞は検出不可能であった（ＰＢＭＣ中１％未満）。これらの結果は、７Ｇｙの胸腺照射は、胸腺の成長および／または機能を損ない、本発明のモデルへの移植後の胸腺リンパ球形成を可能にするものではなかった。ＢＴＩ３２２ありまたはなしだが、ＣＤ３４細胞の静脈注入なしで、凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させた対照は、末梢で多くのヒトＴ細胞を生成しなかった。この結果は、胸腺内の前駆体および成熟胸腺細胞が、凍結保存によって十分に枯渇していること、および／または、ヒトＡＰＣの再増殖が付随する、ＣＤ３４＋細胞の静脈内注射が、高レベルの末梢ヒトＴ細胞の再構成を支持するために必要であることを示す。
【表５】
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【０１８９】
抗ＣＤ２  ｍＡＢ（ＢＴＩ３２２）での処置が本モデルに必要であるかどうかを判定する研究が、現在進行中である。重要なことに、移植の前に凍結保存した同種ヒト胎児胸腺移植片で少数の成体骨髄ＣＤ３４＋細胞からヒト胸腺リンパ球形成を成功させる、ヒト化マウスモデルを構築し、本明細書に提供した。
【０１９０】
最も高く、最も高速なヒトＣＤ３+細胞の再構成を可能にするレジメンを選択する。実験計画を図３８に示す。糖尿病患者、ならびに健常志願者からの骨髄吸引液に由来するＣＤ３４細胞を、約１０匹のＮＳＧマウスに輸注する。ＨＬＡ型判定済みであるヒト胎児胸腺組織のバンクを蓄積させた。共通の糖尿病感受性ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を有する胎児胸腺組織を、これらのマウスの腎臓被膜の下に移植する。ＨＬＡクラスＩＩに加えて、共通のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子Ａ２０１のための、ＰＣＲに基づくアッセイが存在する。これは、胸腺移植片とＣＤ３４＋細胞ドナーとの間、さらに白人種の約３０％に存在するＨＬＡ−Ａ２０１を共有する骨髄ドナーと胸腺移植片との間の、糖尿病感受性クラスＩＩ対立遺伝子の適合を可能にする。ヒトＴ細胞の再構成の後、ナイーブ型およびメモリー型Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＮＫＴ細胞の再構成のレベルを比較することができる。養子移入を行って、Ｔ１ＤＭ患者のＣＤ３４細胞に由来するＴ細胞と、健常志願者との間で、Ｔ細胞の恒常性増殖および生存を比較することができる。Ｔｒｅｇの機能およびインビトロでのＴｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の感受性の比較を行うことができる。
【０１９１】
末梢生存を、正常対照と対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する通常Ｔ細胞の恒常性増殖、表現型の変換、および自己寛容性と比較することができる。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかの判定を行うことが可能である。Ｔ１ＤＭ患者において、恒常性における内在性異常が、Ｔ細胞を特徴付けるかどうかの判定を行うことができる。
【０１９２】
ＮＯＤマウスにおける自己免疫病因は、リンパ球減少をもたらす末梢Ｔ細胞のアポトーシスの増加に関与し得る。Ｔ１ＤＭを含むヒト自己免疫疾患はまた、リンパ球減少と関連している。Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに由来するＴ細胞は、正常対照のＨＳＣに由来するものと比較して、生存率が低下し、リンパ球減少によってもたらされる増殖および活性化の増加を示す。
【０１９３】
ヒト胸腺細胞サブセット、ならびに脾臓およびリンパ節（ＬＮ）のＴ細胞を、計数する。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＣＤ３４細胞のレシピエントのリンパ組織は、ＮＯＤマウスモデルに報告されたように、メモリーＴ細胞における抗アポトーシスタンパク質発現の減少と関連して、対照と比較して細胞数が低い場合がある。逆に、ＮＯＤにおけるこれらの異常は、疾患の原因ではなく疾患の影響であり得る。本モデルは、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに由来するＴ細胞の恒常性に主な異常があるかどうかを特定する機会を提供する。メモリー型およびナイーブ型のＣＤ４およびＣＤ８細胞の絶対数は、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌに対するｍＡｂを含む、多色ＦＣＭによって計数する。結果には、Ｔ１ＤＭ患者に報告されたように、Ｔ１ＤＭのＨＳＣで再構成された動物における二重陽性の（ＲＯ+ＲＡ+）Ｔ細胞数の増加、Ｔ１ＤＭのＨＳＣから「クローン的に偏差した」ＣＤ４−ＣＤ８αα＋胸腺細胞およびＴ細胞の数の減少が挙げられる。クローン的に偏差した細胞の生成における欠陥は、ＮＯＤのバックグラウンドに遺伝的にコードされる。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、およびＣＤ２５を含む、活性化マーカーの試験を行ってもよい。Ｔ細胞ＨＬＡ−ＤＲ発現は、Ｔ１ＤＭの新たな発症と関連して上昇する。これらのデータの全ては、Ｂ細胞ならびにリンパおよび骨髄のＤＣサブセットを含む、ヒトＡＰＣ再構成のレベルに関連して分析することができる。
【０１９４】
養子移入を使用して、Ｔ１ＤＭ患者および対照に由来するＴ細胞の恒常性増殖および生存を比較することができる。リンパ球減少によりもたらされる増殖およびアポトーシスは、対照ＨＳＣ由来のＴ細胞よりもＴ１ＤＭのＨＳＣ由来のものに対して、増加し得る。ＨＵ  ＴＨＹ移植片で生成されたＴ細胞を、その末梢ＡＰＣ集団が胎児ＴＨＹ移植片なしでＴＨＹと同じＣＤ３４ドナーに由来するＦＬＣで再構成されている、二次ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスレシピエントに養子移入する（ＨＵ−ＡＰＣマウス）。これらの動物は、ヒトＡＰＣを再構成するが、Ｔ細胞は再構成しない。それらは、Ｔ細胞を「有さず」、それらのＡＰＣは、もともとのＴＨＹ移植片で正の選択を媒介したものと同じＨＬＡ抗原を発現する。このモデルを使用して、養子移入後にリンパ球減少によって生じるＴ細胞の増殖を測定した。移植片から二次ＨＵ−ＡＰＣレシピエントへのナイーブＣＤ４およびＣＤ８単一陽性（ＳＰ）胸腺細胞の養子移入を、達成することができる。別個のアリコートは、ＣＤ２５+細胞を枯渇させずに、または枯渇させ（ＭＡＣＳでの分類によって）、Ｔｒｅｇの存在下または非存在下でのリンパ球減少に対する応答の比較が可能となる。リンパ球減少によってもたらされるＴｒｅｇの増殖を、特に比較する。これらの成熟した単一陽性胸腺細胞は、胸腺内選択を受けているが、胸腺後選択は受けていないことになる。それらを、ＣＦＳＥで標識し、ＨＵ−ＡＰＣマウスに養子移入する（レシピエント当たり１０6の細胞）。その後、決められた間隔で、ＨＵ−ＡＰＣレシピエントを安楽死させる。Ｔ細胞を計数し、Ｔ細胞ＣＦＳＥの希釈レベル、ならびにＣＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現、ＣＤ２５（ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを区別するため、ＦｏｘＰ３に対比して）、ＣＤ６９、ならびにアポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＡＡＤを使用して）を、ヒトＣＤ４およびＣＤ８細胞で試験する。リンパ球減少によってもたらされる増殖は、通常、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御とは関連しないが、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞異常は、リンパ球減少によってもたらされる増殖と関連して、これらのマーカーの上方制御を伴う自己抗原によってもたらされる活性化に関与し得る。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色により、エフェクター機能の増加が、Ｔ１ＤＭのＨＳＣに由来するＴ細胞の恒常的増殖からもたらされる可能性を特定する。何らかのこのような異常が観察される場合、ヒトＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびそれらの受容体の分析を養子レシピエントにおいて行い、これらの異常の病因を特定する。
【０１９５】
対照と対比した、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する制御性Ｔ細胞の数、機能、および末梢表現型の変換の比較。Ｔ１ＤＭ患者の幹細胞に由来するＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞は、欠陥を示す。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。
【０１９６】
Ｔ１ＤＭ患者は、Ｔｒｅｇの発達、末梢生存、制御に対するエフェクター細胞の感受性、またはそれらを完全に機能させるためのＴｒｅｇの末梢「調整」に欠陥を示す。本モデルは、Ｔｒｅｇの発達における胸腺内および末梢の両方の欠陥の役割を試験する機会を提供する。
【０１９７】
ヒトＨＬＡ−ＤＲ３、ＤＲ４、またはＤＱ８＋胸腺組織ならびに正常個体またはＴ１ＤＭ患者に由来するＣＤ３４＋細胞を移植した、ＮＳＧマウスの胸腺ならびに末梢リンパ組織（ＬＮおよび脾臓）における、ＣＤ１２７-/loＦｏｘＰ３+ＣＤ４+ＣＤ８-Ｔｒｅｇの数の比較。Ｔ１ＤＭのＨＳＣに由来するＴｒｅｇが、機能に内在性の欠陥を有する場合、それらは、完全な抑制活性と関連するＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+およびＨＬＡ−ＤＲ+表現型を得ることができない可能性がある。
【０１９８】
制御機能を、自己および同種ＣＤ２５−ＣＤ４Ｔ細胞に加えて、正常とＴ１ＤＭのＣＤ３４＋ＨＳＣのレシピエントの胸腺および末梢に由来するＴｒｅｇの滴定数で比較することができる。
【０１９９】
Ｔ１ＤＭと対比して、正常ＣＤ３４＋ＨＳＣに由来するエフェクター細胞（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＣＤ２５−ＣＤ４細胞）のＴｒｅｇによる抑制に対する感受性を比較することができる。同じ第三者および両方のＣＤ３４細胞ドナーに由来するＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４細胞を、正常とＴ１ＤＭの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＣＤ３４細胞に由来するＣＤ２５−ＣＤ４Ｔ細胞を含有する培養物中に滴定する。
【０２００】
ＮＫＴ細胞の分析：不変ＮＫＴ細胞の数の減少および機能の欠陥が、Ｔ１ＤＭ患者に報告されている。本モデルは、この欠陥が、Ｔ１ＤＭ患者のＨＳＣに内在性であるかどうか、およびそれがこの細胞サブセットの胸腺の発達における欠陥を反映するものであるかどうかを判定する機会を提供する。多色ＦＣＭを使用して、胸腺および末梢における、不変鎖を発現するＶα２４+Ｖβ１１+およびＶα２４ＪαＱ  ＣＤ４-ＣＤ８-およびＣＤ４+ＣＤ８-細胞を定量化することができる。
実施例６
【０２０１】
種々のレジメンを、同種ＣＤ３４＋細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にするであろうＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおける胎児ヒト胸腺移植片の生着について評価した。
【０２０２】
ヒト骨髄フィルターからのＣＤ３４細胞の単離：これらの研究のために正常および１型糖尿病ドナーに骨髄の採取を行う前に、成体ＣＤ３４+細胞および同種胎児胸腺組織を受容するＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおいて、ヒト胸腺リンパ球形成のためのモデルを構築することが必要であった。これらの研究のための成体ＣＤ３４＋細胞源として、廃棄された骨髄フィルターを使用した。ＭＡＣＳビーズを使用して、各フィルターから５〜２５×１０6の正常ドナーＣＤ３４+細胞を単離することができた。フローサイトメトリー分析により、純度約９０％であることがわかった。これらの細胞を凍結保存した。
【０２０３】
胎児胸腺器官培養物：ヒト胎児胸腺組織を入手した。胎児胸腺移植片内に存在する成熟Ｔ細胞による同種ＣＤ３４細胞に由来する胸腺細胞の拒絶を防止するために、１．３５Ｍ  ｄＧｕｏの存在下で培養物を評価した。胸腺内のＣＤ４およびＣＤ８単一陽性細胞の割合は、１０日間の培養後、それぞれ、４３％および１４％か、ら３．４％および２．１％に減少した。比較すると、ｄＧｕｏなしで、類似の期間培養した後、ＣＤ４およびＣＤ８単一陽性細胞の割合は、それぞれ、２０．１％および１３．３％であった。しかしながら、ｄＧｕｏありでの胎児胸腺器官培養物は、２０日間でさえ、全ての成熟胸腺細胞を完全に枯渇させることはなかった。
【０２０４】
ｄＧｕｏで処置したヒト胎児胸腺移植片からのヒトＴ細胞の再構成：ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに、ｄＧｕｏの存在下で２０日間培養したヒト胎児胸腺の移植の１日前に、２．５ＧｙのＴＢＩを受けさせた（表６）。ヒト胸腺リンパ球形成を伴う胸腺生着の成功は、５×１０5の同種成体ＣＤ３４+細胞の静脈内注入後に生じた：ヒトＣＤ３＋細胞は、移植の２０週間後に、全てのマウスの末梢血に検出可能であり、平均でＰＢＭＣの約２５％に相当する。新鮮またはｄＧｕｏで処置したかのいずれかであるが、ＣＤ３４＋細胞はなしで、ヒト胎児胸腺組織を受容させた、年齢適合対照マウスは、移植後のどの時点においても、血中に検出可能なヒトＣＤ３+細胞を有さなかった。これらの結果は、胸腺移植片内に存在する幹細胞および成熟Ｔ細胞が、末梢ヒトＴ細胞を生成するのに十分な胸腺リンパ球形成を維持することができず、追加のＣＤ３４+の注入が必須であることを示す。研究はまた、２０日間ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織中に既存の胸腺細胞が、同種ＣＤ３４細胞に由来する胸腺細胞前駆体を拒絶しなかったことを示した。さらに、データは、末梢に注入されたＣＤ３４＋細胞に由来する前駆体は、胸腺リンパ球形成が行われるｄＧｕｏで処置した胸腺に定植することができることを示した。
【０２０５】
ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織を受容させた別の年齢適合対照群に、同種成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞の代わりに、同じ胎児ドナーの肝臓から単離した４×１０5のＣＤ３４＋細胞を静脈内注入で受容させた。これらの同系胎児ＣＤ３４＋細胞を注入した後、ＣＤ３＋細胞の移植１４週間後までに、末梢血ＣＤ３＋の再構成が、平均でＰＢＭＣ中約３５％まで検出可能であった。したがって、ヒト末梢ＣＤ３＋細胞の再構成は、成体から得た同種ＣＤ３４＋細胞で達成されたものと比較して、自己胎児ＣＤ３４＋細胞の注射後では、より効率的であると考えられる。
【０２０６】
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の再構成を加速させる目的で、ｄＧｕｏの存在下で７日間だけ培養したヒト胎児胸腺移植片を用いて、別の群を構築した。平均でＰＢＭＣ中約７％のＣＤ３＋レベルが、移植後６週間以内に検出可能であったが、これらのレベルは、その後数週間にわたって低下した。移植２０週間後までに、血中のＣＤ３＋Ｔ細胞レベルは、平均で５％未満となった。さらに、注射したＣＤ３４細胞から多系統ヒト白血球の再構成が観察された、２０日間ｄＧｕｏで培養した胸腺およびＣＤ３４細胞の静脈注射で達成された結果とは対照的に、いずれの時点においても、検出可能なＣＤ１９+細胞は存在しなかった。これらの結果は、注射した同種ＣＤ３４+細胞が、７日間ｄＧｕｏで処置した胸腺移植片中の、ｄＧｕｏ処置によって枯渇されなかった成熟Ｔ細胞によって拒絶された可能性があることを示す。したがって、胎児胸腺移植片から成熟胸腺細胞を排除し、それによって、同種ＣＤ３４＋細胞およびそれらの子孫の生存および機能を可能にするためには、より長いｄＧｕｏ培養期間が必要であるという結論に達した。
【０２０７】
胎児ヒト胸腺組織の凍結保存および照射：胎児胸腺組織の凍結保存は、研究でブタ胸腺移植片において胸腺細胞の数を減少させることが示されており、ヒトＣＤ３４細胞に由来する前駆体による、より急速な再増殖をもたらす。したがって、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスの群に、移植前に凍結保存したヒト胎児胸腺移植片を受容させた（表７）。代替的なアプローチとして、１つの群のマウスに、移植前に７Ｇｙで照射を行ったヒト胎児胸腺組織を受容させ、対照群には未処置の新鮮な胎児ヒト胸腺組織を受容させた。全ての動物に、２．５ＧｙのＴＢＩおよび静脈注射で２．５×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を受容させた。この実験の対照群には、２×１０5の自己胎児肝臓に由来するＣＤ３４＋細胞を受容させた。
【０２０８】
この対照群は、このモデルに典型的に見られるように、強力な多系統ヒトＴ、Ｂ、および骨髄の再構成を達成した。
【表６】
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【０２０９】
１６週間の移植後経過観察中の間、成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞の全てのレシピエントにおけるヒト造血の再構成は、非常にわずかであった。未処置のヒト胸腺組織を受容したＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおいては、ＰＢＭＣ中のヒト細胞の割合は、６週目までに平均で約１０％となり、移植後１６週目までごくわずかな変動を有しただけである。注目すべきことには、移植の６週間後までに、これらのマウスにおけるＴ細胞のレベルは、既に平均でＰＢＭＣ中約７％となり、１０週間で平均レベル約１２．５％のピークに達し、移植後１６週間で平均約２．３％まで低下した。対照的に、これらの動物におけるＢ細胞のレベルは、経過観察期間中、ＰＢＭＣ中約２％を上回るレベルに達することはなかった。これらの結果は、移植後早期に末梢に現れたＴ細胞は、移植の時点で胎児胸腺移植片内に存在しており、その後で末梢に移出した、胸腺細胞に由来することを示す。ＣＤ３４細胞のドナーは、これらの胸腺細胞に対して同種であったため、多系統キメラを提示できなかったことは、ＣＤ３４細胞移植片がこれらのＴ細胞によって拒絶されたことを示唆する。さらに、移植片に存在する成熟Ｔ細胞および／または前駆細胞は、移植１６週間後の末梢ＣＤ３＋細胞の割合が低いことによって示されるように、長期の胸腺リンパ球形成を維持することができなかった。
【０２１０】
未処置胸腺移植片のレシピエントにおけるこれらの結果とは対照的に、ヒトＢ細胞およびＴ細胞のレベルは、照射を行った胸腺移植片を受容したマウスでは、移植後に約１％を上回ることはなく、７Ｇｙでの照射が、移植片に担持される胸腺細胞の枯渇を成功させたことを示した。しかしながら、これらのマウスにおいて非Ｔ細胞の再構成を達成できなかったことは、与えられた成体ＣＤ３４＋細胞の数（２．５×１０5）があまりにも少なく、強力な多系統ヒト造血の再構成を達成できなかったことを示した。
【０２１１】
同じ実験において、凍結保存した胎児胸腺組織を受容した群は、移植８週間後まで、末梢に検出可能なＴ細胞を有さなかったが、１０および１２週間で、それぞれ、ＰＢＭＣ中約３．５および５％のヒトＴ細胞を提示した。これらのデータは、凍結保存により、既存の成熟胸腺細胞を枯渇させることに成功したことを示す。移植後１０週間で開始する、低いが徐々に増加するＴ細胞の再構成は、胸腺内の前駆体が、凍結保存にもかかわらず保存された可能性があることを示す。移植後の観察期間のいずれの時点においても、著しいＢ細胞のキメラ化は検出されなかったため、後期のＴ細胞再構成が、与えられた成体ＣＤ３４細胞に由来する可能性は低い。上述の３つの群のマウスのヒト胸腺移植片の外観の比較は、情報価値が高いことが判明した）。未処置ヒト胸腺移植片および凍結保存した胸腺レシピエントは、いずれも、移植の２０週間後の致死時点で、腎臓被膜下に豊富な生存胸腺組織を有した。対照的に、照射した胸腺組織のレシピエントは、この時点で、腎臓被膜下に確認できる胸腺をほとんど有さなかった。これらのデータは、照射が、胸腺上皮細胞の分裂能力を排除し、したがって移植片が成長する能力を排除した、および／または胸腺細胞前駆体を移植片から排除した、のいずれかであることを示す。前者の説明が正しい場合、未処置または凍結保存の胸腺移植片のレシピエントにおいて、ヒトＡＰＣが存在しないため、これらのＴ細胞は末梢に移動すると生存できないことにより、末梢Ｔ細胞再構成なしでの強力な胸腺リンパ球形成の存在は、開始成体ＣＤ３４細胞移植片に由来する前駆体による、これらの移植片の早期再増殖を反映し得る。他の研究は、末梢におけるヒトＡＰＣは、ヒト胸腺移植片で発達するヒトＴ細胞の生存に不可欠であることを示す。
【表７】
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【０２１２】
ＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスにおけるヒト細胞の再構成：成体骨髄ＣＤ３４細胞は、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおいて多系統ヒト造血再構成を達成することにおいて、胎児肝臓ＣＤ３４細胞よりも効果的ではないと考えられるため、成体ＣＤ３４細胞の効率を改善するための方法を、この結果を達成するために模索した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−共通γ鎖ノックアウトマウス（ＮＳＧマウス）は、これらのマウスが、ＮＫ細胞を欠いており、最適なヒト細胞の生着が他のモデルに報告されているため、より許容性である可能性が高い成体ＣＤ３４細胞のレシピエントとして評価した。上述の実験において、胸腺の凍結保存ならびに照射の両方が、胸腺内の同種反応性Ｔ細胞の枯渇を成功させたため、これらのレジメンを、ＮＳＧマウスにおいて試験した。さらに、０日目および７日目に、単クローン性抗ヒトＣＤ２抗体（ＢＴＩ３２２、１００μｇ）の２つの用量をプロトコルに加え、胸腺移植片に由来するＴ細胞の枯渇を強化した（表８）。
【０２１３】
２．５Ｇｙで照射したＮＳＧマウスの群に、３×１０5の成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞を単独で、または凍結保存もしくは７Ｇｙで照射した胎児ヒト胸腺組織に加えて、受容させた。１つの動物群に、凍結保存したヒト胎児胸腺組織に加えて、５×１０5の成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞を受容させ、一方で対照には、凍結保存した胸腺組織を単独で、またはＢＴＩ３２２と併せてのいずれかで受容させた。顕著なことに、３または５×１０5の成体ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞を、単独または凍結保存したヒト胎児胸腺組織と併せてのいずれかで受容したＮＳＧマウスにおいて、おおよそ２５％のヒト細胞が、移植６週後に既にＰＢＭＣ中に検出可能であった。ヒト細胞レベルのピーク（ＰＢＭＣ中約６０〜７５％）は、８週で検出可能であり、その後、平均で約３０〜６０％であった。ヒトＣＤ１９＋細胞は、移植６週間後に、ＰＢＭＣ中約３０％で開始する高いレベルで検出可能であり、８週間で約５５％のピークに達した。凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させたＮＳＧマウスにおいて、Ｔ細胞は、移植後６週間目までに末梢に検出可能であり（ＰＢＭＣ中約３％）、それぞれ、３×１０5または５×１０5の成体ヒトＣＤ３４＋細胞を受容させたマウスにおいて、約１０％および約３０％のピークまで増加した。対照的に、ヒト胎児胸腺移植片を受容しなかったＮＳＧマウス、または７Ｇｙで照射した胸腺移植片を受容したマウスにおいては、ヒトＴ細胞は検出不可能であった（ＰＢＭＣ中１％未満）。これらの結果は、７Ｇｙの胸腺照射は、胸腺の成長および／または機能を損ない、本モデルへの移植後の胸腺リンパ球形成を可能にするものではなかった。ＢＴＩ３２２ありまたはなしだが、ＣＤ３４細胞の静脈注入はなしで、凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させた対照は、末梢で多くのヒトＴ細胞を生成しなかった。
【０２１４】
この結果は、胸腺内の前駆体および成熟胸腺細胞が、凍結保存によって十分に枯渇していること、および／または、ヒトＡＰＣの再増殖が付随する、ＣＤ３４＋細胞の静脈内注射が、高レベルの末梢ヒトＴ細胞の再構成を支持するために必要であることを示す。
【表８】
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【０２１５】
臨床吸引液からのヒト細胞の再構成：この研究のために志願者を募集し、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子Ａ２０１のためのＰＣＲに基づくアッセイに加えて、ＨＬＡクラスＩＩの型の判定を行った。これは、胸腺移植片とＣＤ３４＋細胞のドナーとの間で、糖尿病感受性クラスＩＩ対立遺伝子の適合を可能にするだけでなく、白人種の約３０％に存在するＨＬＡ−Ａ２０１を共有する、骨髄ドナーと胸腺移植片との間の適合を可能にする。ＨＬＡ型判定済みの胎児ヒト胸腺組織のバンクを蓄積させた。上述のように、ＮＳＧマウスにおける多系統再構成が成功した後、臨床骨髄吸引液から単離した成体ＣＤ３４＋細胞で、レジメンを試験した。１５ｍｌの骨髄吸引液は、健常対照および糖尿病患者から、それぞれ、３．６×１０^５および２．７×１０^６のＣＤ３４＋細胞の単離を可能にした。２．５Ｇｙで照射を行ったＮＳＧマウスに、凍結保存／解凍したヒト胎児胸腺移植片および抗ＣＤ２  ｍＡｂに加えて、１．８×１０^５の成体ＣＤ３４＋細胞をそれぞれ受容させた。照射を行ったＮＳＧマウスの対照群に、胸腺の移植なしで、ＣＤ３４＋細胞を受容させた。ヒト細胞は、６週目から検出可能であり、移植後２０週で、約２５％〜約８０％の範囲のレベルでピークに達した（図３９）。ＣＤ１９＋細胞は再構成したが、おそらくはマウス１匹につき注射した成体ＣＤ３４＋細胞の数が少なかった（１．８×１０^５）ために、比較的低いレベルであった（２０％未満）。その後の実験では、２×１０^５超のＣＤ３４＋細胞を注射することを目標とし、これは、強力なＢ細胞および単球の再構成を示した反復実験において行われた。いずれにせよ、成体ＣＤ３４＋細胞の静脈内注入に加えて、胎児胸腺を受容させた動物は、約５０〜９０％のピークＣＤ３＋細胞レベルを有し、一方で対照ＮＳＧマウスは、移植後に最低限のＣＤ３＋レベルで再構成した（図３９）。移植後２０週で、これらのマウスの脾臓およびリンパ節から単離した精製Ｔ細胞を用いてＭＬＲアッセイを行った。全てのマウスが自己寛容性を示しながらも、強い同種応答が観察された（図４０）。健常対照に由来するＣＤ３４＋細胞を受容させたマウスから単離したＴ細胞は、ヒト対照ドナーの血液から富化したＴ細胞に対して、類似の同種応答を示した。さらに、これらのマウスのＴｒｅｇの正常な発達が示された。正常対照ドナーの血液からの試料と、そのドナーに由来するＣＤ３４細胞で再構成したヒト化マウスに由来する細胞との同時比較により、再構成したマウスにおいて、主にナイーブなＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋陽性細胞を有する、回復したＴ細胞（Ｔｒｅｇを含む）表現型が示された。ＣＤ４＋細胞中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７−ＦｏｘＰ３＋細胞の割合、ならびにメモリー対ナイーブのＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の比較は、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４＋細胞で再構成したマウスと健常対照に由来するＨＳＣとの間に差がないことを明らかにした。
【０２１６】
移植の前に凍結保存した同種ヒト胎児胸腺移植片において、少数の成体骨髄ＣＤ３４＋細胞からヒト胸腺リンパ球形成を成功させるヒト化マウスモデルを構築した。新しく生成されたＴ細胞は、成体ＣＤ３４＋細胞ドナーのものに類似する機能性および自己寛容性を示すが、免疫表現型は回復している。この新しい世代のヒト化マウスモデルは、Ｔ１ＤＭまたは他の自己免疫疾患の素因となる造血幹細胞内在性の免疫制御性欠陥の、安全で制御された有望な分析を可能にする。臨床吸引液に由来する２×１０^５の成体ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスの別の群が、再構成された。
【０２１７】
ヒトＴ細胞の再構成の後、ナイーブ型およびメモリー型のＴ細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＮＫＴ細胞の再構成のレベルを比較する。本明細書に記載のように、養子移入を行って、Ｔ１ＤＭ患者のＣＤ３４細胞に由来するＴ細胞と、健常志願者との間で、Ｔ細胞の恒常性増殖および生存を比較する。Ｔｒｅｇの機能およびインビトロでのＴｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の感受性の比較を行う。
【０２１８】
正常対照と対比した、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する通常Ｔ細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型の変換、および自己寛容性の比較。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかの判定を行うことが可能である。Ｔ１ＤＭ患者において、恒常性における内在性異常が、Ｔ細胞を特徴付けるかどうかの判定を行うことができる。
【０２１９】
対照と対比して、Ｔ１ＤＭのＣＤ３４細胞に由来する制御性Ｔ細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較する。Ｔ１ＤＭ患者の幹細胞に由来するＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞は、欠陥を示す。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。
【０２２０】
自己免疫疾患の素因となる造血幹細胞内在性の免疫制御性欠陥、および免疫療法剤に対する個体の応答性の、安全で制御された有望な分析を可能にする、新しい世代のヒト化マウスモデルを作製した。
【０２２１】
ヒトＴ細胞を伴うヒト化マウスの再構成後に、ナイーブ型およびメモリー型のＴ細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＮＫＴ細胞の再構成のレベルを比較する。養子移入を行って、Ｔ１ＤＭ患者のＣＤ３４細胞に由来するＴ細胞と、健常志願者との間で、Ｔ細胞の恒常性増殖および生存を比較する。Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかについての研究を行う。これにより、恒常性における内在性異常が、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞を特徴付けるかどうかを判定する。さらに、Ｔｒｅｇの機能およびインビトロでのＴｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の感受性を比較し、本研究は、Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの胸腺起源と胸腺後起源に由来する制御性細胞における内在性異常を特定することを助けるはずである。
実施例７
【０２２２】
混合キメラにおけるＴ細胞の免疫能力：：同種移植片寛容性を達成するための混合キメラに関する初期の研究41は、部分的に、混合した同種のキメラが、ＭＨＣバリア全体が遮断された場合に完全に同種のキメラよりも免疫応答性であったという調査に基づくものであった42,43。この免疫応答性は、胸腺上皮のＭＨＣのＴ細胞の正の選択における役割を反映し、宿主ＭＨＣとの関連で、ペプチド抗原を選択的に認識するレパートリーにつながる42。レシピエントのＡＰＣは、混合キメラの末梢に存在するが、完全に同種のキメラには存在せず、混合キメラにおける優れた免疫応答につながっている42~44。それにもかかわらず、異種胸腺移植を含む他のモデルが、ある胸腺（この場合においてはブタ）のＭＨＣで選択されたＴ細胞は、完全に異なる（レシピエントの）ＭＨＣに関して活発なＭＨＣによって制限免疫応答を増加させ得ることを示すため、これらの研究は、研究される抗原系の選択肢によって影響を受けた可能性がある45,46。このような動物は、末梢で胸腺ＭＨＣを発現する細胞が存在しないにもかかわらず、日和見感染症を有さなかった45。同様に、それらのＴ細胞プールを再構成する、広範囲のＨＬＡ不適合同種胸腺移植片を受容した先天性胸腺形成不全を有するヒトは、強力な宿主によって制限されされるＴ細胞応答を示す47。異種系において、レシピエントのＭＨＣは胸腺での正の選択に関与しないことが、非常に明確に示された45,46,48。これらの調査およびブタ胸腺移植片で発達するヒトＴ細胞のスペクトル型解析に基づいて49、異種胸腺で選択された多様なＴ細胞のレパートリーが、ＡＰＣ上に存在するレシピエント（異種）のＭＨＣによって制限される、強力な免疫応答を可能にするという結論に達した。資金援助プログラムの付与を受けて行われた研究は、末梢においてヒトＡＰＣが、ヒト胸腺移植片で正の選択が行われたヒトＴ細胞の生存を促進するよりは効果的ではないが、ブタ胸腺移植片で正の選択が行われたヒトＴ細胞の生存を促進する能力を示した。したがって、混合異種キメラは、ドナーのＡＰＣが末梢に存在するため、レシピエントに加えてドナーのＭＨＣに関して免疫応答を生成することができる可能性がある。
【０２２３】
混合異種キメラにおけるＴ細胞の免疫応答性を予測する上述の理由にもかかわらず、混合同種キメラにおける研究は、完全にＭＨＣが不適合のドナーを使用することに関する懸念を提起した。完全にＭＨＣが不適合の同種ドナーで混合キメラを達成したマウスにおいて、ＬＣＭＶによるウイルス感染は、感染したレシピエント動物細胞のクリアランスをもたらしたが、感染したドナー細胞は、動物に疾患をもたらすウイルスレザーバーとして留まった50。この現象は、抗ウイルスＣＴＬ活性の非常に強い宿主ＭＨＣ制限のため、ドナーの造血細胞にレシピエントのＭＨＣ抗原を共有させることによって回避した44 50。このようなＭＨＣの共有は、ブタが、ＨＬＡ対立遺伝子を発現するように改変されていない限り、混合異種キメラにおいては不可能である。ＨＬＡトランスジェニックブタは、既に生成されており27,51-53、研究により、本発明のアプローチに対するそれらの必要性を判定する。
【０２２４】
複数のレベルで免疫寛容性を評価することを可能にするヒト化マウスは、有力な前臨床手段を提供する。ヒト化マウスモデルにおける優れた免疫機能は、先天性および適応性の両方の免疫系に関する重要な課題に取り組み、ブタ起源の動物のどのようなさらなる遺伝子修飾が、この治療的アプローチを向上させ得るかを判定することを可能にする。多数の病原体、特にウイルスは、それらの感染範囲に種特異性を示す。したがって、異種細胞が、慢性感染症を引き起こし得るヒト病原体の感染のレザーバーとして機能し得るかどうかを事前に予測することができず、関連する病原体、および特にブタからヒトへの組み合わせのものについて、検査する必要がある。
【０２２５】
ブタ混合異種キメラの存在下において、ヒト免疫系の機能の分析を可能にするモデルを本明細書に提供する。本研究は、このような問題に取り組むために、ブタサイトカイン導入遺伝子とともに、新しいヒト化マウスモデルを利用する。マウスにおける同種混合キメラモデルに由来する免疫機能に調査を拡大したが、ある特定の細胞と細胞の分子間相互作用は、異種の組み合わせにおいては無効であった54~58。したがって、同種モデルにおいて寛容化されたものと同じ免疫系の要素の中で、寛容性を誘発する混合キメラの能力を、目的の種の組み合わせにおいて試験する必要がある。混合キメラの誘発は、ラットからマウスへの異種の組み合わせにおいて、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を寛容化することが観察された。ブタからヒトへの組み合わせにおけるＮＫ細胞の寛容性およびＢ細胞の寛容性の問題に取り組むために、本明細書に提供されるヒト化マウスモデルおよびブタサイトカインＴｇマウスを、ヒトサイトカインベクターと併せて使用することは、革新的である。これらの細胞を異種移植片に寛容性にするための方法を本明細書に提供する。
【０２２６】
ヒト化マウスにおけるヒトＴ細胞の異種移植片拒絶。ヒト胎児胸腺（ＴＨＹ）および肝臓（ＬＩＶ）移植片をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込むことを伴い、同じ胎児肝臓に由来するＣＤ３４+胎児肝臓細胞（ＦＬＣ）の静脈内注射を併せて行う、ヒト化マウスモデルを本明細書に提供する。このような動物は、Ｔ、Ｂ、樹状細胞（ＤＣ）、および単球を含む、多系統のヒトリンパ球再構成を示し、構造化したリンパ組織を発達させる2。図４１に示されるように、自発的な膵島異種移植片拒絶がこれらの「ＨＵ」マウスに生じた4。ブタ膵島異種移植片は、対照ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで長期間生存したが、ＨＵマウスでは完全に拒絶された（図４１Ａ）。ヒト化ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに由来する移植片は、全てのインスリン生成細胞を失い、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージが激しく浸潤し（図４１Ａ）、ヒト抗体が沈着した（図４１Ｂ）。ヒトＢ細胞およびマクロファージによる浸潤を含む移植片拒絶は、抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂ（ＢＴＩ３２２）でのヒトＴ細胞の枯渇によって、完全に防止され（図４１）、ヒトＴ細胞が、ブタ膵島異種移植片拒絶に非常に重要な役割を果たし、ヒトＢ細胞およびマクロファージによる移植片浸潤に必要であることを提示する。したがって、Ｔ細胞寛容性の誘発が、ブタ膵島異種移植片の拒絶を克服するために重要である。
【０２２７】
ブタ胸腺移植は、Ｔ細胞を枯渇させた胸腺摘出マウスにおいて、強力な異種移植片寛容性を誘発することが示されている62,63。このアプローチはまた、ＮＨＰにおけるブタαＧａｌ  ＫＯ腎臓異種移植片の許容を促進する11。さらに、ＳＷ  ＴＨＹ異種移植は、ＳＷ  ＴＨＹ移植片において発達するヒトＴ細胞の特異的寛容性を導く64。ブタ胸腺移植片が、事前に構築したヒト免疫系を有するヒト化マウスにおいてヒトＴ細胞寛容性を誘発する能力を評価した。ブタ胎児ＴＨＹ移植片を、ヒトＴ細胞再構成が達成された後、おおよそ１０〜１４週間までに、ＨＵマウスの反対側の腎臓被膜下に移植した。既存のＴ細胞によるＳＷ  ＴＨＹ移植片の拒絶を防ぐために、ＨＵマウスに抗ＣＤ２  ｍＡｂ  ＢＴＩ３２２を注射した。ＢＴＩ３２２は、末梢リンパ組織でのみ効率的なＴ細胞の枯渇を媒介し、胸腺ではそれを行わないため、ＨＵ  ＴＨＹ移植片は、ＳＷ  ＴＨＹの埋め込みのときに除去した（腎摘出術により）。全てのＢＴＩ３２２で処置したＨＵ／ＨＵマウスに、ＳＷ  ＴＨＹ移植片の長期生存が見られたが、未処置の対照ＨＵマウスには見られなかった。さらに、ヒトＴ細胞の再構成が、ＳＷ  ＴＨＹ移植の９〜１２週間後にＢＴＩ３２２で処置した移植片摘除ＨＵマウスに生じ、ＳＷ移植片での正常なヒト胸腺リンパ球形成を反映する5。したがって、胸腺移植片摘除および抗ＣＤ２処置により、ヒト化マウスにおけるヒト抗ブタＴ細胞バリアが克服される。このレジメンを、ＳＷ混合キメラを達成するためのＡｉｍ２で使用し、既存の異種反応性Ｎａｂ生成細胞の寛容性を評価する。
【表９】
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表９：ブタ−ヒト混合キメラにおけるドナー特異的皮膚移植片の寛容性を、上述のようにブタサイトカイントランスジェニックＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに調製した。対照動物（ブタＢＭＴを単独で受容した再構成されていない動物）およびブタＢＭＴを受容させたかまたはさせなかった、長期ヒト化マウス（ヒトＴＨＹ／ＬＩＶ／ＣＤ３４細胞を移植したヒト免疫系を有するマウス）に、ドナーＳＬＡ適合およびそれ以外のブタ皮膚を移植した。再構成されていない対象は、いずれの種類の移植片も拒絶できなかった。ブタＢＭＴなしのヒト化マウスは、いずれの種類のブタ移植片も拒絶した。混合ブタ−ヒトキメラは、ドナー種のブタからの皮膚を許容し、それ以外のＳＬＡ不適合の皮膚を拒絶した。
【０２２８】
ＨＵ  マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞および抗体応答の誘発。抗原特異的ヒト応答を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の２，４−ジニトロフェニルヘプタン−キーホールリンペットヘモシアニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ）で免疫付与した、ＨＵマウスにおいて移植の１４週後に評価し、３週間後にＩＦＡ中のＤＮＰ−ＫＬＨで追加免疫した。ＣＦＳＥ増殖アッセイは、両方の群でマイトジェンと同程度の増殖を有し、ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫付与したＨＵマウスにおいてヒトＴ細胞応答を見せたが、ＰＢＳ（アジュバント中）を注射した対照には見られなかった3。胚中心が、二次リンパ組織において観察され、ＤＮＰ特異的ＩｇＧ（主にヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２、いくつかはＩｇＧ３）が、ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫付与したＨＵマウスにおいて検出された65。したがって、効果的なＴ−Ｂ細胞の共同作用を示唆するクラススイッチを含む、Ｔ細胞依存性の抗原特異的免疫応答が、ＨＵマウスに示された。
【０２２９】
タンパク質抗原および病原体での免疫付与に対する応答を評価するために、ＨＵ／ＨＵマウスを、破傷風トキソイド（ＴＴ）で免疫付与し、ＴＴおよび新抗原（トリＩｇＧ）に対する増殖性応答を、４週間後、追加免疫の３週間後に測定した。このような応答のＭＨＣ制限を評価するための、遮断ＨＬＡ特異的ｍＡｂを特定した。マウスＷＢＣおよび赤血球を枯渇させ、抗原を付加した脾細胞の応答、ならびに抗原パルス刺激した自己ヒトＦＬＣ由来のＤＣとともに、精製したヒトＴ細胞の応答を比較した。いずれの事例においても、ＨＵ／ＨＵマウスに由来するヒトＴ細胞は、リコール抗原に対する強い応答を示し（図４２は、ＦＬＣ由来のＤＣでの刺激の結果を示す）、これは抗ヒトクラスＩＩ  ｍＡｂによって遮断され、それらが、ＨＬＡによって制限されたことを示す。新抗原に対するインビトロ応答は検出されなかった（図４２）。
【０２３０】
抗ブタ自然抗体をＨＵマウスにおいて発達させる：ＨＵ  ＴＨＹ−ＣＤ３４細胞の移植の７〜１３週間後に収集した４匹中３匹のマウスからの血清は、ブタ標的に対する細胞毒性のＮＡｂを含有していた。この観測結果を使用して、ブタ混合キメラが、ＨＵマウスにおいてヒト抗ブタＮＡｂを生成する細胞を寛容化させる能力を評価する。
【０２３１】
混合異種キメラが、ブタ−ヒト種の組み合わせにおいて、自然抗体を生成するＢ細胞の寛容性を誘発する能力を探索する。現在資金提供を受けている最中である研究によって、ヒト化マウスが、ブタに対して細胞毒性の自然抗体（ＮＡｂ）を生成することが示された。既存および新しく開発中のヒト抗−ブタＮａｂに対する、混合キメラ誘発の影響を評価することができる。ヒト抗ブタ非Ｇａｌ  Ｎａｂを生成する細胞を特定することができる。
【０２３２】
ヒト胸腺移植／ＣＤ３４細胞の投与の時点で誘発される混合キメラのＮＡｂ形成への影響を調査する。ブタＢＭＴをＨＵ  ＴＨＹ／ＣＤ３４移植と同時に行うときに、抗ブタＮＡｂのレベルを、ＨＵおよびＨＵ−ＳＷ混合キメラのヒト化マウスにおいて比較する。これらの研究により、非Ｇａｌ抗ブタＮａｂのデノボ開発における、混合キメラの影響を検証することを可能にする。細胞毒性アッセイおよび間接的なフローサイトメトリー（ＦＣＭ）の両方を、記載のように70,71,103行う。ＦＣＭは、Ｎａｂアイソタイプの特定を可能にする。ＩｇＭおよびＩｇＧの両方のクラスのヒト抗ブタＮａｂが、正常ヒト血清に検出されている104-109。ＨＵマウスの場合には、マウスがＧａｌ＋であり、したがって、Ｇａｌに対する寛容性または任意の抗Ｇａｌ  Ｎａｂの吸収のいずれかが予測されるため、異種抗体は非Ｇａｌ特異性を有し得る。ＨＵ−ＳＷに観察された場合、ヒト抗ブタＮＡｂ寛容性がドナーのブタに特異的であるかまたは広範であるかを判定するために、ＳＬＡddドナーおよびそれ以外のＹＵＣブタ細胞に対する反応性の比較を行ってもよい。
【０２３３】
ブタ混合異種キメラありおよびなしでのヒト化マウスにおける免疫応答を比較する。ヒト化マウスは、タンパク質免疫付与後に優れたＴ細胞の増殖および抗体応答を伴って、強い免疫応答を示す2-4（図４２）。
【０２３４】
ＨＵマウスおよびＨＵ−ＳＷ混合キメラにおいて生成されたヒトＴ細胞中の免疫原に対する免疫応答の比較（群当たり１０）。上述のように、ブタ造血サイトカインＴｇ  ＮＲＧレシピエントにおいてヒト化マウスを作製し、ブタＢＭＣを、ヒトＴＨＹ／ＣＤ３４の埋め込み／投与と同日に投与する1。対照ＨＵマウスには、ブタＢＭＣを受容させない。ヒトＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の再構成、ならびにヒトＢ細胞および単球の動態を、埋め込みの３週間後に末梢血において監視を開始する。種々の系統のブタ細胞の再構成もまた、監視してもよい。全ヒトおよびブタＩｇＧおよびＩｇＭのレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定する。平均で５％超のヒトＴ細胞が、全ての群のＷＢＣに検出されたときに、１つの群当たり５匹の動物を、図４２のようにＣＦＡおよび破傷風トキソイド（ＴＴ）を使用して免疫付与し、続いて不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）およびＴＴで３週間後に追加免疫する。対照動物（群あたり５）には、アジュバントを単独で受容させる。動物を、免疫追加の１週間後に安楽死させ、もともとのＦＬＣドナーから調製されたＤＣによって提示されたＴＴ、およびにブタドナーのＳＬＡ適合ｄｄ動物に由来するＤＣに対する、精製されたＴ細胞の増殖性応答を評価する。ＦＬ  ＣＤ３４細胞からヒトＤＣを調製するため（図４２を参照されたい）、およびＰＢＭＣからブタＤＣを調製するための技術が確立されている118,119。遮断抗ブタおよびヒトクラスＩＩ  ｍＡｂを追加して、全ての観察された応答のヒトまたはブタＭＨＣの制限を確実にする。記載のように3、ＤＮＰ−ＫＬＨでの免疫付与を使用して、類似の研究を行う。Ｔ細胞増殖性応答を測定することに加えて、血清を、クラススイッチしたＫＬＨに対する抗体応答について、ヒトおよびブタの両方に特異的なＥＬＩＳＡによって試験する。
【０２３５】
同種および異種反応性および寛容性を評価するために、全てのインビトロ分析にはまた、ブタドナーＳＬＡ、それ以外のブタ、ＮＯＤマウス、ヒトドナー、およびそれ以外のヒトに対する反応性の評価が含まれる。
【０２３６】
ＨＵ−ＳＷキメラは、非ドナーのブタおよびヒトに対する強い反応とともに、ドナーのブタおよびヒト1、ならびにレシピエントマウス（図４５のブタ胸腺を移植したＳＷ／ＨＵマウスに類似）に対する寛容性を示し得るが、一方でＨＵマウスは、ブタにではなく、ヒトドナーおよびマウスレシピエントのみに寛容性であり得る（図４５のＨＵ／ＨＵマウスにあるように）。
【０２３７】
実施例７の参考文献
1.  Xu Y, Yang YG, Ohdan H, Ryan D, Harper D, Wu C, Kruger-Grey HS, Thall AD, Awwad M, and Sykes M. Characterization of anti-Gal antibody-producing cells of baboons and humans. Transplantation 81 (6):940-948, 2006. PMID: 16570021, PMCID not available
2.  Lan P, Tonomura N, Shimizu A, Wang S and Yang YG. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood 108(2): 487-492, 2006. PMID: 16410443, PMCID not available.
3.  Ide K, Wang H, Liu J, Wang X, Asahara T, Sykes M, Yang YG, Ohdan H. Role for CD47-SIRPα signaling in xenograft rejection by macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(12):5062-6. PMCID: PMC1829264
4.  Wang H, Madariaga ML, Wang S, Oldenborg P-A, Yang YG. Lack of CD47 on Non-hematopoietic Cells Induces Split Macrophage Tolerance to CD47null Cells. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:13744-13749. PMID: 17699632, PMCID not available
5.  Yang YG and Sykes M. Xenotransplantation - Current Status and a Perspective on the Future. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7(7):519-531. PMID: 17571072, PMCID not available
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11.  Haspot F, Bardwell PD, Zhao G, and Sykes M. High antigen levels do not preclude B cell tolerance induction with alpha1,3Gal via mixed chimerism. Xenotransplantation 2008:15:313-320. PMCID: PMC2633101
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16.  Yang YG. CD47 in xenograft rejection and tolerance induction. Xenotransplantation 2010 (In press).
実施例８
【０２３８】
白血病モデルを作製する方法、および混合キメラｈｕマウスにおいてＲＬＩの抗腫瘍効果を評価するための方法を、本明細書に提供する。３つの群のｈｕマウスを調製した（表１０）：群Ａ、白血病を有さない混合同種ｈｕマウスキメラ（非白血病ＲＬＩおよび非ＲＬＩレシピエント。これらの群により、キメラ排除におけるＲＬＩの有効性を確認する）；群Ｂ、白血病を有する混合同種ｈｕマウス（白血病のＲＬＩレシピエントおよび非ＲＬＩ対照）；および群Ｃ、機能性のヒト免疫系を有するｈｕマウス（ＲＬＩドナー）。各レシピエント群は、少なくとも１０匹の動物を含む。混合ｈｕマウスキメラを作製するために（群Ａ、表１０）、ＮＳＧマウスに、ＨＬＡ−Ａ＊２０１（ＨＬＡ−Ａ２＋およびＨＬＡ−Ａ２−）の差次的発現を有する、２人の異なる同種ドナーに由来する、磁気単離した胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞を、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーに由来する胸腺組織とともに、移植する。これらのドナーにおけるＨＬＡ−Ａ２の発現（Ａ２特異的ｍＡｂ［Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．］を用いて胎児肝臓細胞懸濁液のフローサイトメトリーによって試験）は、フローサイトメトリーによる混合キメラの判定を可能にする。このモデルを使用する他の研究において、胎児胸腺移植片から既存のＴ細胞を枯渇させるための抗ＣＤ２  ｍＡｂ  ＢＴＩ−３２２の注射とともに、凍結保存／解凍した胎児胸腺組織は、静脈注射で与えた同種ＣＤ３４細胞から、強力なヒト多系統造血の再増殖を可能にし、現在では、凍結保存した胸腺、抗ＣＤ２、および凍結させた同種ＣＤ３４細胞の常用が、これらの研究において行われている。したがって、このような組織のＨＬＡ型の判定を行い、特定のＨＬＡ対立遺伝子を必要とする研究に使用するための小規模なバンクの構築がなされた。図４７に示されるように、混合キメラを、ｈｕマウスモデルに誘発することができる。キメラは、移植に続いて、記載のように59、末梢血中のヒトＣＤ１４＋単球、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびＣＤ３＋Ｔ細胞でのＨＬＡ−Ａ２の発現を測定することによって監視する。これらのマウスは、両方のドナーに由来する相互に寛容性のＴ細胞集団を有する多系統の混合キメラを生成することが予測される。実際に、ドナー特異的な寛容性が、このモデルでの混合異種キメラ誘発の初期の研究において示された54。
【表１０】
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【０２３９】
安定な混合キメラを有するマウスを、ＲＬＩのレシピエントとして使用する。白血病が、上述のＷＢＣ分析によって判定されるように、群Ｂのマウスの少なくとも半分に発症した後、ＲＬＩドナーｈｕマウス（群Ｃ）から、群Ａおよび群Ｂの混合キメラｈｕマウス（レシピエント）へ、ヒト脾細胞およびリンパ節細胞（抗マウスＣＤ４５およびＴｅｒ１１９ｍＡｂでコーティングしたＭＡＣＳビーズで負の選択を行い、ヒト細胞のみを残す）を注射することによって、ＲＬＩを行う。初期研究では、ＲＬＩドナーからプールしたヒトリンパ球の半分をレシピエントとして使用するが、この数は、初期実験の結果に応じて、加減することができる。このように、明らかな再発および微小残存病変の両方の症状を呈する段階の白血病を有する動物において、ＲＬＩの効果を評価することができる。ＲＬＩを受ける群または受けない群の比較によって、ＲＬＩが、どの程度顕性および潜在性の確立した白血病を予防するかを判定する。ＲＬＩの予防効果が検出された場合、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーのみから再構成され、したがってキメラではなく、ＲＬＩを受けた対照群、およびＲＬＩに加えて同種ヒトリンパ球を受容した非キメラ群の追加を行ってもよい。マウスモデルにあるように、これらの群は、非ＲＬＩ処置レシピエントのものに類似の腫瘍死亡率を示し得、したがって、構築された移植片の拒絶がＲＬＩの抗腫瘍効果に必須であることを示し得る。
【０２４０】
ＲＬＩの抗腫瘍効果を増強するためにαＧａｌ−Ｃｅｒ処置によりｉＮＫＴ細胞反応性を強化する能力の評価。比較には、ＲＬＩなし、ＲＬＩ単独、αＧａｌ−Ｃｅｒ単独、およびＲＬＩとαＧａｌ−Ｃｅｒの組み合わせを受容する群が含まれる。マウスモデルにおける研究は、αＧａｌ−ＣｅｒがＲＬＩの抗腫瘍効果を強化することを示しており31、マウスモデルに採用したものに類似の投与レジメンを利用する。Ｈｕマウスが、ｉＮＫＴ細胞を生成し、これらは、αＧａｌ−Ｃｅｒを投与するとＩＬ−４を生成することが、既に示されている（図４６）。
実施例９：ウイルス特異的Ｔ細胞およびＥＢＶ誘発リンパ腫のモデルを生成するための方法
【０２４１】
マウスにおいて個々のヒト患者の免疫系を再構成する方法を本明細書に提供する。これらの方法により、広範なレパートリーの特異性を有する多数のナイーブＴ細胞を生成することができる。ある特定の実施形態において、これらの方法により、これらのヒト化マウスにおいてウイルス特異的Ｔ細胞応答を生成し、この技術が、日和見感染ウイルスの再活性化を除去することができない、および／またはＥＢＶ関連のリンパ腫を発症する患者に、保護Ｔ細胞を提供する可能性を示すことができる。
【０２４２】
骨髄もしくは実質臓器の移植を受けるか、またはＨＩＶ−１に感染した多数の患者は、ほとんどの個体に存在する共通のウイルスおよび細菌による日和見感染症を患う。Ｔ細胞免疫系はこれらの患者では正常に機能せず、それら自身の胸腺は新しいＴ細胞を生成することができないため、これらの患者は、しばしば、これらの感染の合併症により死亡するか、または、それらの感染に対する免疫を促進するために免疫抑制が減少してしまうために、それらの移植片を拒絶する。胸腺は、感染性微生物による攻撃からヒトを保護するために必要な、Ｔリンパ球の作製に関与する器官である。本明細書に記載のように、マウスにおいて、個々のヒト患者から新しい機能性免疫系を生成する方法を開発した。骨髄ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を、腎臓被膜下にヒト胎児胸腺の断片もまた受容させた免疫不全マウスに注射することによって、これを達成する。胸腺組織を、患者のＨＳＣが拒絶されないように、その既存のＴ細胞を破壊する方法で処置する。これらの患者のＨＳＣは、免疫不全マウスにおいて、胸腺移植片で発達する多数のＴ細胞を含む、ヒト免疫系を生成する。これらのＴ細胞は、機能性であり、非常に多様なレパートリーの再配置されたＴ細胞受容体を有し、あらゆる種類の外来抗原を認識することを可能にする。中年期までによりメモリー表現型に偏る、すなわち、それらのＴ細胞部分が限定されたレパートリーのＴ細胞で満たされ、しばしば感染を除去する能力が欠けている、成体ヒトドナーとは非常に対照的に、これらのマウスの免疫系を再増殖させるＴ細胞は、「ナイーブ」表現型を有する。
【０２４３】
多数の移植患者、例えば、限定されないが、骨髄または臓器移植患者およびＨＩＶ患者は、胸腺機能が非常に乏しく、ナイーブＴ細胞をほとんど有さない。結果として、それらのＴ細胞レパートリーは、狭い範囲の認識能力で構成され、それらは、日和見感染症を除去する能力がない。これらの患者群に共通の日和見感染症の中でも特に、再活性したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染である。これらのＣＭＶ感染は、生死に関わる可能性があり、ＥＢＶの再活性化は、移植後のリンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）に至る場合があり、治療が成功しない場合は致命的である。ＣＭＶまたはＥＢＶ反応性のＴ細胞の注入が、このような患者に有益であることが示されているが、しばしば、これらのＴ細胞は、数が限定されており、同種（非自己）ドナーに由来するため、大量に存在することができず、部分的な保護のみを提供し得る。
【０２４４】
免疫不全マウスにおいて、ナイーブＴ細胞のレパートリーをデノボ生成する本明細書に記載の方法は、免疫付与後に多数の自己（自己に由来するため、患者の免疫系によって拒絶されない）病原体特異的Ｔ細胞を提供することができる。ある特定の実施形態において、これらの「個人免疫応答」（ＩＩＲ）マウスに、これらの特異性を有する多数のＴ細胞を生成し、それらが、ヒト化マウスモデルにおいてウイルス感染およびＥＢＶ関連ＰＴＬＤを除去することができることを示すために、ＣＭＶおよびＥＢＶ抗原で免疫付与を行ってもよい。これらのデータは、ＩＩＲマウスにおいて生成されたＴ細胞を使用して、免疫障害を有するヒトにおける日和見感染症の治療を改善する可能性を示すことになる。
【０２４５】
本明細書に記載の実験は、成体ヒト志願者に由来する成体骨髄の臨床吸引液を使用して、免疫不全マウスにおいて強力なヒト免疫系を生成することができることを示した（図２７、２８）。これは、「個別化免疫応答」（ＩＩＲ）マウスモデルと称される。新しく生成されたＴ細胞は、機能性かつ自己寛容性であり（図２７、２８）、多様なレパートリーを有し（図２９）、正常な割合で制御性Ｔ細胞を含む。成体ＣＤ３４＋細胞ドナーの免疫表現型は、成体ドナーのものと比較して、回復している（図２９）。これらのマウスを、治療目的で広範なレパートリーを有する自己ナイーブＴ細胞源として使用して、胸腺不足状態（例えば、ＨＩＶ−１感染、造血細胞移植後等）にある免疫能力を改善することができ、ヒト化マウスは、限定されないが、微生物抗原を含む任意の対象の抗原で免疫付与することができるため、これらの患者における難治性感染症を治療するための抗原特異的Ｔ細胞源を提供することができる。本質的にこれらのマウスの数は限定されず、したがって、多様なナイーブ自己Ｔ細胞を、患者の骨髄または動員した末梢血ＨＳＣから生成することができる。
【０２４６】
これらのマウスを使用して、日和見感染ウイルス再活性化疾患に応答するヒトＴ細胞を生成し、このような疾患、例えば、限定されないが、生命に関わるＣＭＶ疾患およびＥＢＶ関連リンパ腫から保護することができる。成体ヒト骨髄に由来するナイーブＴ細胞を有するヒト化マウスを生成し、好適な抗原、例えば、ＣＭＶまたはＥＢＶ抗原で、免疫付与する。このような抗原は、当該技術分野で既知であり、当業者によって容易に決定することができる。これらの免疫応答は、これらの抗原を認識し、防御応答を開始するＴ細胞を定量化することによって、測定する。これらのＴ細胞を、同じドナーに由来する免疫系を有するが、ヒト胸腺移植片を与えられていないためにＴ細胞を欠いている追加のマウスに養子移入し、それらが、Ｔ細胞欠損マウスにおいてＣＭＶおよびＥＢＶの感染を制御することができるかどうかを観察する。
【０２４７】
ＥＢＶに誘発される移植後リンパ増殖性疾患と類似のＥＢＶ誘発リンパ腫のモデルを、ヒト化マウスモデルにおいて生成した（図４８）。このＥＢＶ誘発リンパ腫のモデルを使用して、ＥＢＶの免疫付与によりＩＩＲマウスにおいて生成したＴ細胞の養子移入が、これらの腫瘍を排除または縮小する能力を評価する。非限定的な実施形態において、成体ヒト骨髄に由来するナイーブＴ細胞（第１のヒトドナーに由来するＣＤ３４＋細胞）を有するヒト化マウスを生成し、ＥＢＶ抗原で免疫付与する。このような抗原は、当該技術分野で既知であり、当業者によって容易に決定することができる。これらの免疫応答は、これらの抗原を認識し、防御応答を開始するＴ細胞を定量化することによって、測定する。これらのＴ細胞を、ＥＢＶ誘発リンパ腫、例えば、自己ＥＢＶ誘発リンパ腫を有するマウスに養子移入して、ＥＢＶ免疫付与によりＩＩＲにおいて生成した自己Ｔ細胞が、ＥＢＶ誘発リンパ腫／腫瘍を排除または縮小するかどうかを判定する。
実施例１０：Ｍｉｎｉ−Ｍｅマウス：１型糖尿病の細胞内在性免疫病因を研究するためのヒト化マウスモデル
【０２４８】
１型糖尿病（ＴＩＤＭ）において、ＨＬＡをコードする複数の遺伝的決定基および免疫調節分子が、膵臓β細胞で、自己免疫攻撃を受けやすい免疫系を作製する。ＴＩＤＭ感受性は、マウスおよびおそらくは人間において、造血幹細胞（ＨＳＣ）により移行され、遺伝子にプログラムされたＨＳＣに内在性の欠陥が、異常な免疫制御または自己寛容性をもたらすことを示す。ヒトの場合、なんらかの特定の免疫制御性異常が、疾患を引き起こすか、糖尿病の進行または治療の二次免疫作用の結果であるかを区別することは困難である。Ｔ１ＤＭと関連する、ＨＳＣによって決定される免疫制御性異常を評価するために、多系統ヒト免疫細胞再構成を達成するヒト化マウスモデルを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ＲｔＵｌｉ（ＮＳＧ）マウスに同種凍結保存した胎児胸腺組織を移植した、少数の成体ＣＤ３４＋ＨＳＣから作製した。ＮＳＧマウスを、成体ＴＩＤＭおよび対照志願者の骨髄から吸引したＨＳＣで、再構成した。新しく生成されたＴ細胞は機能性および自己寛容性であり、多様なレパートリーを有し、制御性Ｔ細胞を含む。これらの「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウスの免疫表現型は、成体骨髄ドナーと比較して、よりナイーブであるか、または回復している。Ｔ細胞集団の表現型または数、ならびに成体ＴＩＤＭまたは対照ＨＳＣドナーのＨＳＣに由来する制御性Ｔ細胞の表現型に、全体的な差は検出されなかった。Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスは、糖尿病非存在下で、対照およびＴＩＤＭ傾向の免疫系における免疫表現型および免疫制御性機能の比較を可能にする。このモデルを使用して、免疫制御性細胞集団が、ＴＩＤＭ免疫系において本質的に機能不全であるかどうかを判定する。
【０２４９】
１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、多遺伝子性遺伝とはっきりと定義されていない環境要因との相互作用からもたらされる自己免疫疾患であり、インスリンを生成する膵臓β細胞の破壊によって引き起こされる。それは、全ての糖尿病症例の５〜１５％を占める。
【０２５０】
遺伝的特徴：ＨＬＡによってコードされるＴ１ＤＭ感受性は、遺伝性疾患の危険性の約５０％を占める可能性がある。免疫調節遺伝子（例えば、サイトカイン（ＩＬ２／ＩＬ２１）、共刺激分子（ＩＬ２Ｒα）、および阻害分子（ＣＴＬＡ−４））を含む、多数の非ＨＬＡ  ＩＤＤＭ感受性遺伝子もまた、遺伝的にＴ１ＤＭに関連する。
【０２５１】
Ｔ１ＤＭの現在の動物モデルには、自発的に糖尿病を発症するＮＯＤマウスおよびＢＢラットが含まれる。モデルは、疾患に関する非常に貴重な見識を与え、ＮＯＤマウスとヒトは、いくつかの感受性関連遺伝子を共有する。マウスにおいて展開された２３０を超える免疫介入療法のうち、ヒトにおいて臨床的有意性を有するものはほとんどない。
【０２５２】
ヒト化マウスモデル
【０２５３】
ヒト化マウスモデルとは、「機能性ヒト細胞、組織を生着させた、またはヒト導入遺伝子を発現するマウス」である。それらは、ヒト細胞および組織の機能のインビボ研究を可能にし、基礎研究と臨床解釈との間の橋渡し的な役割を果たす。
【０２５４】
Ｔ１Ｄを研究するためのヒト化マウスモデルの原理：Ｔ１Ｄ患者は、疾患発症後に研究される。したがって、これらの研究は、原因と、疾患または他の（環境）要因の影響とを区別することができない。マウスの場合、Ｔ１Ｄに対する感受性は、造血幹細胞（ＨＳＣ）によって移行され得る。ＨＳＣによって決定される、Ｔ１ＤＭ関連の免疫制御性異常を評価するために、多系統ヒト免疫細胞の再構成を達成するヒト化マウスモデルを、同種胎児胸腺組織をＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｇ  ｎｕｌｌマウスに移植した、成体ＣＤ３４＋ＨＳＣから作製した。理論に束縛されるものではなく、１型糖尿病の遺伝的要因は、制御性Ｔ細胞の機能、制御に対するエフェクターＴ細胞の応答、およびＴ細胞の恒常性におけるＴ細胞内在性の異常と関連付けられる。
【０２５５】
結論およびＭｉｎｉ  Ｍｅモデルの今後の方向性：少数の成体ＣＤ３４＋ＨＳＣからの多系統再構成の達成；Ｂ細胞の再構成および成体に由来するヒトＴ細胞の正常な胸腺リンパ球形成；ＣＤ３４＋ＨＳＣは、マウスにおける持続したＴおよびＢ細胞の再構成をもたらす；ヒト胸腺で発達したＴ細胞は、ヒトドナーと比較して、よりナイーブな、または回復した表現型を有する；Ｔ細胞は、機能性かつ自己寛容性である；Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスにおいて再構成された対照ＨＳＣと比較して、類似の数の「自然発生型」Ｔ制御性細胞が、胸腺移植片によって生成され、Ｔ１ＤＭのＨＳＣの末梢血に存在する。
【０２５６】
ＮＳＧマウスにおける成体骨髄ＣＤ３４＋細胞からの免疫再構成は、安全で制御された有望な方法で、ＨＳＣ内在性の免疫欠陥のインビボ分析を可能にする。
【０２５７】
Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスは、１型糖尿病に関連する免疫制御におけるＨＳＣ内在性の欠陥を分析するための、疾患またはその治療によって変化していない「白紙の状態の」免疫系を提供する。
【０２５８】
多系統ヒトリンパ造血細胞を有する新しいヒト化マウスモデルの作製は、ヒト胸腺組織の移植およびＣＤ３４＋細胞の末梢注射の組み合わせを伴う。このマウスモデルは、高い、持続した再増殖、ならびにインビボおよびインビトロでの強い免疫応答等、複数の利点を有する。
【０２５９】
図〜４９〜５７は、Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスの作製について説明し、Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスモデルを使用して得られた結果のうちいくつかを提示する。
【０２６０】
次のことを行い、観察した：１．８×１０^５の成体ヒトＣＤ３４＋および凍結保存した同種ヒト胎児胸腺組織に加えて、１００μｇ×２の抗ＣＤ２  ｍＡｂの静脈注射による、ＮＳＧマウスにおける多系統ヒトリンパ造血細胞の再構成の成功。大部分がＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞であるヒト胸腺細胞の正常な表現型の分布を有する胸腺移植片の肉眼的に著しい増加。成体ドナーの免疫系の回復形態の生成。ＴＨＹ移植片および同種成体ＣＤ３４＋細胞で再構成したＮＳＧマウスにおける、インビトロおよびインビボでの正常なＴ細胞機能に加えて、自己寛容性。ヒト化マウスにおける、主にナイーブ表現型を有する正常なＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の発達。ＴＨＹ移植片および同種成体ＣＤ３４＋細胞で再構成したＮＳＧマウスにおける、正常なＴ細胞の多クローン性。Ｔ１ＤＭおよび健常対照から再構成したＮＳＧマウスにおける、ＴＨＹ移植片およびＰＢＬ中の類似の数および割合のＴｒｅｇ。
【０２６１】
実施例１１：「Ｍｉｎｉ  Ｍｅ」マウス：１型糖尿病の細胞内在性病因を研究するためのヒト化マウスモデル
【０２６２】
１型真性糖尿病は、インスリンを生成するβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。はっきりと定義されていない環境要因が、自己免疫の発達に重要な役割を果たす一方で、遺伝的要因は、実質的に、自己免疫疾患に対する感受性を決定する。
【０２６３】
ＨＬＡ遺伝子型が、最も強くＴ１ＤＭと関連するが、しかしながら、非ＨＬＡ関連の座位もまた、明らかに自己免疫の危険性に寄与する。これらの多くは免疫制御性遺伝子を含有し、したがって、理論に束縛されるものではなく、造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源とする、免疫系の細胞における内在性異常は、自己免疫の発達に寄与し得る。ＮＯＤマウスモデルは、これらの遺伝子のうちのいくつかが自己免疫を促進する、機構を分析するための遺伝学的研究を可能にしたが、臨床研究は、疾患発症後の患者の分析を伴い、原因と、疾患、その治療、または疾患を引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。ＢＢラットおよびＮＯＤマウスは、Ｔ１ＤＭに関する非常に貴重な洞察を与えたが、それらはまた、誤解および間違った推測にもつながった。したがって、制御された有望な方法で、ヒトの免疫学的欠陥の分析を可能にするモデルに対する必要性が存在する。
【０２６４】
亜致死照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ鎖欠損（ＮＳＧ）マウスにおいて、少数で投与された成体同種骨髄ＣＤ３４＋細胞から、多系統ヒト造血細胞の発達を可能にする、新しいヒト化マウスモデルを本明細書に提示する。このモデルは、制御された有望な方法で、自己免疫疾患を有する患者と対比して、正常対照のＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞と他の免疫細胞の比較を可能にする。
【０２６５】
ヒト化マウス
【０２６６】
多数の「ヒト化マウス」モデルを作製した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、免疫不全マウスに定植させることが可能であり、ヒトＴ細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺（ＴＨＹ）移植片で発達させる。最近、胎児ＣＤ３４＋細胞の静脈内注入と、腎臓被膜下のヒト胎児胸腺および肝臓（ＴＨＹ／ＬＩＶ）移植片との組み合わせが、末梢ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、免疫グロブリン、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞を伴うヒト免疫再構成を可能にすることが示された。これらのマウスは、正常な寸法のリンパ組織を発達させ、タンパク質免疫付与後に強力なクラススイッチ型抗体応答を含む、強い抗原特異的な免疫応答をインビボで示す。さらに、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の正常な胸腺発達は、Ｔｒｅｇの機能および末梢での「活性化した」表現型への変換を提示した。このモデルはまた、これまでのところ適切なインビボモデルに欠けている、ヒトＴ細胞の末梢の恒常性増殖の試験を可能にする。
【０２６７】
図〜５８〜６６は、Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスの作製について説明し、Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスモデルを使用して得られた結果のうちいくつかを提示する。
【０２６８】
結論は、次の事柄を含む：持続した多系統再構成が、腎臓被膜下に同種胎児胸腺を移植した亜致死照射を行ったＮＳＧマウスにおける、少数の成体ヒトＣＤ３４＋細胞の生着によって達成された。多様なレパートリーのＶβ  ＴＣＲの生成および「自然発生型」制御性Ｔ細胞の生成を含む、成体ＣＤ３４＋ＨＳＣに由来するヒトＴ細胞の正常な胸腺リンパ球形成が、胎児胸腺移植片で生じる。Ｔ細胞およびＴ制御性細胞は、ヒトドナーと比較して、よりナイーブまたは回復した表現型を有する。Ｔ細胞は、機能性および自己寛容性である。
【０２６９】
Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスは、１型糖尿病に関連する免疫制御におけるＨＳＣ内在性の欠陥を分析するための、疾患またはその治療によって変化していない「白紙の状態の」免疫系を提供する。
【０２７０】
実施例１２
【０２７１】
ヒト胸腺移植モデルＨＬＡ決定済みのヒト胸腺移植片において、成体ＣＤ３４+からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、再凝集ヒト胸腺移植モデルを作製するための方法を、本明細書に提供する。
【０２７２】
これらの研究は、ヒト化マウスモデルを拡張することになり、インタクトな胎児胸腺組織を埋め込む代わりに、ＨＬＡ型判定済みヒト胎児胸腺組織から凍結保存したＣＤ４５陰性胸腺間質細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に埋め込む。共通の糖尿病感受性ＨＬＡ対立遺伝子を保有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照および１型糖尿病対象に由来する静脈内注射したＣＤ３４＋細胞から、Ｔ細胞の胸腺リンパ球形成を支持するであろう。代替的なアプローチには、インタクトなヒト胸腺組織に、ＨＬＡトランスジェニックＮＯＤマウス由来の胸腺上皮細胞を注射すること、または糖尿病感受性対立遺伝子をコードする遺伝子を胸腺異種移植片にアデノウイルス形質導入を行うことが含まれる。
【０２７３】
これまでに、同種ＣＤ３４+細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にし得る、ＮＯＤ．ｓｃｉｄおよびＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスでのヒト胎児胸腺の生着のための種々のレジメンの評価が報告されている。これらの実験において、７もしくは２１日間いずれかのヒト胎児胸腺組織のデオキシグアノシン処置、または移植前の胎児胸腺の凍結保存が、成体同種ヒトＣＤ３４+造血幹細胞の多系統再構築を可能にするために十分に常在胸腺細胞を枯渇させ得るかどうかを試験した。これらのパイロット実験からの結果は、胎児胸腺の凍結保存が、常在胸腺細胞を十分に枯渇させ、組織のＨＬＡ型の判定およびＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスにおける成体ＣＤ３４+ドナーからのヒト免疫細胞の多系統再構成の両方の時間を確保したことを示した。健常対照およびＴ１Ｄを有する対象からの臨床骨髄吸引液を使用した、複数の実験の編集からの観察結果を本明細書に簡単に要約する。
【０２７４】
臨床吸引液からのヒト細胞の再構成
【０２７５】
以前の報告で、凍結保存した同種ヒト胸腺および第１の組の健常対照およびＴ１Ｄ  ＢＭドナーの臨床骨髄吸引液から単離したＣＤ３４+細胞を移植したＮＳＧマウスの多系統再構成の成功データが記載された。過去１年間で、２０の個体を採用し、そのうちの１９の対象が、ＤＮＡ単離およびＳＮＰ遺伝子型判定のために血液を提供した。これらの研究について、各組のＢＭドナー群および胎児胸腺移植片は、共通の糖尿病感受性座位ＨＬＡ*Ａ２０１、ＤＲＢ*０３０２、および／またはＤＱＢ*０３０１が適合している。ＨＬＡ*Ａ２０１、ＤＲＢ*０３０２、および／またはＤＱＢ*０３０１が適合する健常対照およびＴ１Ｄ臨床骨髄吸引液の追加４組の実行が成功した。ＨＬＡ型判定済みの凍結保存した胎児胸腺組織もまた構築し、蓄積させる。研究に登録されたＴ１Ｄ対象と適合しない、ＢＭ吸引のために採用された健常対照を、実験に引き出す。これらの個体から、３つの骨髄吸引液を引き出した。
【０２７６】
１０〜１５ｍｌの骨髄吸引液は、健常対照またはＴ１Ｄ対象（各群に対してｎ＝５）から、それぞれ、１．５×１０6および２．７×１０6のＣＤ３４+細胞を、約８５〜９０％の純度で提供する。プロトコルを、移植の１日前に２ＧｙのＴＢＩ、移植後０日目および７日目に２回の抗ＣＤ２モノクローナル抗体の注射、ならびに２×１０5の成体ＢＭに由来するＣＤ３４+細胞の注射を含むように標準化した。ヒトキメラの発達の監視は、移植の４週間後に開始し、以降２週間毎に移植２０週間後まで継続する。全ＰＢＭＣ中の全体的なヒトキメラおよび系統特異的キメラを、４つの独立した実験からまとめた（図６７）。対照として、照射したＮＳＧマウスには、胸腺移植なしにＣＤ３４+細胞を単独で受容させた。ヒト細胞は、移植の４週間後ほどの早期に検出可能であり、移植１２週間後に、健常対照およびＴ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来するマウスにおいて、それぞれ、３７％および４３％でピークに達した。対照レシピエントではなく胸腺移植片のレシピエントにおいては、ヒトＣＤ３+細胞は、移植の８週間後までに、健常およびＴ１Ｄの両方のＣＤ３４+細胞に由来するマウスにおいて存在し（ＰＢＭＣの約８％）、移植の２０週間後までに、健常対照およびＴ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来するマウスにおいて、３８％および２４％まで増加した。ヒトＢ細胞キメラは、移植の８週間後までに、健常対照およびＴ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来するマウスにおいて、それぞれ、ＰＢＭＣ中１０％および１７％のＣＤ１９+細胞でピークに達した。単球集団もまた、移植の８週間後に、健常対照およびＴ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来するマウスにおいて、ＰＢＭＣ中１１％および６．５％でピークに達した。ＣＤ３４+細胞のみを受容した動物（胸腺移植片なしの「ＣＤ３４のみのマウス」）は、ヒトキメラを、移植６週間後の最初の観測時点で、ＰＢＭＣ中５７％でピークに達し、移植２０週間後まで着実に低下するレベルで発達した。これらのマウスにおけるヒト細胞集団は、主に、Ｂ細胞から構成され、ＣＤ３+細胞のわずかな増加が、移植１４週間後に見られた。ＣＤ３４+のみのマウスで観察されたＴ細胞は、マウスの胸腺で発達した可能性が高い。胸腺移植片を受容した動物の本来の胸腺は、移植９週間後に致死させた動物におけるヒト胸腺移植片中の胸腺細胞の数と比較すると（０．３〜４３．１×１０6の範囲）、全胸腺細胞をほとんど含まなかった（ｎ＝６の動物全体で、０．９〜２．７×１０6の範囲）。ＣＤ３４+／Ｔｈｙ  Ｔｘ動物と比較した、ＣＤ３４+のみを注射したＮＳＧに由来するＰＢＭＣ集団の分析は、ＣＤ３４+のみの群におけるＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+ナイーブ細胞の割合の減少を示した（ＣＤ３４／Ｔｈｙ  ＴＸ群の５５％と比較して、平均８．５％）。この観測は、少数のヒトＴ細胞は、遅い時点で、ＣＤ３４+のみの動物のマウス胸腺で発達し、末梢で増殖することを示す。
【０２７７】
長期（２２〜２５週間）ＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスにおけるヒト胸腺移植片の分析は、成体ＣＤ３４+細胞の強力な胸腺リンパ球形成を呈した（図６８）。正常な割合のＣＤ４／ＣＤ８二重陽性および単一陽性細胞が存在した。さらに、単一陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞のサブゲートは、自己胎児胸腺および胎児肝臓に由来するＣＤ３４+細胞の移植によって作製されたヒト化マウスの胸腺移植片のものに類似するＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現プロファイルを示した。Ｔ１Ｄ対象に由来する細胞を用いて再構成したマウスは、胸腺細胞数の減少傾向にあるが、Ｔ１Ｄまたは健常対照のＣＤ３４+細胞ドナーで再構成した動物の間に有意な差はなかった。複数の組のＴ１Ｄおよび健常対照のＣＤ３４+細胞ドナーに由来するさらに多くの動物を、これらの分析に加えて、Ｔ１Ｄに由来するＣＤ３４+細胞からの胸腺リンパ球形成が、効率性が低いかどうかを判定する。
【０２７８】
胸腺移植片によって生成されたＴ細胞が、多様なＴＣＲ細胞レパートリーを有するかどうかを判定するために、対照およびＴ１Ｄ対象に由来するＣＤ３４+細胞で再構成したＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスにおいて、単一陽性のＣＤ４およびＣＤ８胸腺細胞を、移植の２０週間後にＴＣＲのβ鎖のスペクトル型解析を行うことにより分析した（図６９）。これらのヒトＴ細胞は、多様なレパートリーを示し、類似するＢＶファミリーの利用および各ＢＶに対する多クローン性ＣＤＲ３の長さ分布を有した。再構成されたレパートリーは、１２人の健常成人の平均のＣＤ４Ｔ細胞レパートリーに類似しており、各試料中において分析した全てのＢＶファミリーの平均のハミング距離は、１４．２〜２６．２の範囲であり、平均は２０．６であった。ハミング距離は、各ＢＶファミリーに対して観測されたＴＣＲ  β鎖の長さ分布の、多クローン性基準分布からの距離の平均である。再構成された胸腺細胞集団に見られるハミング距離は、健常対照の末梢血リンパ球に見られるような、典型的なＴ細胞の多クローン性の指標である。
【０２７９】
胸腺移植片の凍結保存は、移植片胸腺細胞の著しい枯渇をもたらし（図７０）、静脈内注射される同種志願ドナーのＣＤ３４細胞の拒絶の回避に貢献し得る。上述の図６７に示される、ヒト細胞の多系統再構成に加えて、凍結保存／解凍したＴＨＹに加えて、抗ＣＤ２  ｍＡｂを受容させた、消耗症候群または他のＧＶＨＤの兆候を発症した長期動物はいなかったことが観察された。しかしながら、抗ＣＤ２  ｍＡｂを注射しなかった１匹の動物は、移植２２週間後に始まる重度の脱毛症、皮膚の炎症、猫背姿勢、および体重減少によって特徴付けられる、ＧＶＨＤ様症候群を発症した。理論に束縛されるものではなく、抗ＣＤ２  ｍＡｂの注射は、凍結保存後に胎児胸腺に残る残存生胸腺細胞を枯渇させるために重要であり得る。抗ＣＤ２  ｍＡｂでの処置が、多系統再構成およびＧＶＨＤ症状の予防に必要であるかどうかを直接試験するために、ＮＯＤ．ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒ−γnullマウスに、抗ＣＤ２  ｍＡｂの注射ありおよびなしで、凍結保存した胎児胸腺および同種胎児肝臓に由来するＣＤ３４＋細胞を移植した（図７１）。移植後最大１５週間まで、ヒト再構成のレベルに差が見られなかったことから、抗ＣＤ２  ｍＡｂは、同種ドナーの幹細胞の拒絶を予防するために必要ではなかった。さらに、ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ１４細胞による末梢再構成に、差は認められなかった。全ての動物はこの時点まで健康にそうに見え、マウスは、ＧＶＨＤの兆候についての監視を継続する。
【０２８０】
したがって、同種ヒト胎児胸腺移植片において少数の成体骨髄ＣＤ３４+細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にすることに成功するヒト化マウスモデルを構築した。
【０２８１】
作製したモデルを使用して、正常対照と対比して、Ｔ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来する通常のＴ細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型の変換、自己寛容性を比較するための方法を、本明細書に提供する。
【０２８２】
Ｔ１ＤＭ患者に由来するＴ細胞が、胸腺ドナーの「自己」抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定する。恒常性における内在性異常が、Ｔ１ＤＭ患者のＴ細胞を特徴付けるかどうかもまた、判定する。
【０２８３】
Ｔ１Ｄおよび健常対照対象のＨＳＣに由来するＴ細胞の表現型。理論に束縛されるものではないが、Ｔ１Ｄ対象のＨＳＣに由来するＴ細胞は、正常対照のＨＳＣに由来するものと比較して、生存の減少、およびリンパ球減少によって生じる増殖および活性化の増加を示し得る。これに取り組むために、ＣＤ４およびＣＤ８細胞を、末梢血において分析し、ナイーブおよびメモリーＴ細胞のマーカーとして、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現を比較した（図７２）。成体ＣＤ３４+細胞で再構成し、胎児胸腺を移植したＮＳＧマウスにおける免疫系は、ＨＳＣドナーの末梢血と比較して、より高い割合のＣＤ４５ＲＡ+ナイーブ細胞が検出されたため、回復していることがわかった。さらに、Ｔ１Ｄ対照のＨＳＣから生成された免疫系におけるナイーブ細胞の割合に、健常対照のものと比較して有意な減少があった。理論に束縛されるものではなく、この観察は、Ｔ１Ｄ個体のＨＳＣにおける１つまたは多数の遺伝的異常が、Ｔエフェクター細胞の増殖および活性化を促進することを示す。これは、これらの動物が、膵臓の免疫組織学によって評価される、明らかな自己免疫症状を有さないため、Ｔ１Ｄ患者およびＮＯＤマウスにおいて観察されたこの表現型は、疾患の発症または進行によって生じたものではないことを示す。
【０２８４】
成体ＣＤ３４+細胞および胎児胸腺を用いて再構成したＮＳＧマウスにおける、自己寛容性および免疫応答の評価。これまでの報告において、健常対照またはＴ１Ｄ対象に由来するヒトＣＤ３４+細胞を、同種胎児胸腺とともに移植したマウスに由来するＴ細胞は、自己寛容性であるが、混合リンパ球反応において、強い同種応答を呈したことが示された。Ｔ細胞の再構成は、胎児胸腺を移植前の遅い時点で照射した別の実験では、遅い時点（移植後＞３０週）で明白であった。これらの動物におけるヒト免疫系は、同種ヒト組織および異種ブタ組織を認識し、それを拒絶する能力がある。同種ドナー（すなわち、胎児ドナーでなく、成体ＣＤ３４+細胞ドナーでない）に由来するブタ皮膚およびヒト皮膚を、移植の３０週間後に、健常対照対象に由来するＨＳＣ（ＣＤ３４+細胞を骨髄フィルターから回収）で再構成したＮＳＧマウスに移植した（図７３Ａ）。ヒト免疫細胞を有する動物は、５週間以内に皮膚移植片を拒絶したが、ナイーブＮＳＧ動物は、１４週間を上回って、拒絶の兆候なく、ヒト皮膚移植片を許容した。
【０２８５】
成体ＣＤ３４+細胞によって再構成されたＮＳＧマウスにおけるヒト免疫系が、抗原特異的リコールの能力を有するかどうかを判定するために、Ｔ１Ｄ対象のＣＤ３４+細胞に由来する動物に、破傷風免疫付与またはＰＢＳでの疑似免疫付与を行った。それらに、２回目の免疫付与により追加免疫を行い、ヒト細胞を、脾臓および末梢血から精製した。これらの細胞を、インビトロで破傷風トキソイドタンパク質により刺激し、滴定したチミジンの取り込みによって、増殖応答を測定した（図７３Ｂ）。陽性対象として、破傷風に対して免疫付与した成体ドナーに由来するヒトＰＢＭＣの増殖応答を示す。これらのデータは、これらのＮＳＧマウスの免疫系が、特異抗原に対するリコール応答を監視する能力があることを示す。
【０２８６】
作製したマウスモデルにおいて、健常対象と比較して、Ｔ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来する制御性Ｔ細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較するための方法を、本明細書に提供する。
【０２８７】
理論に束縛されるものではなく、Ｔ１ＤＭ患者の幹細胞に由来するＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞は、欠陥を示し得る。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、Ｔ１ＤＭ患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。
【０２８８】
Ｔｒｅｇの数および機能における欠陥が、Ｔ１Ｄ患者およびＮＯＤマウスに報告されている。ＮＯＤマウスにおいては、膵臓の炎症部位におけるＴｒｅｇの欠損および関連するエフェクター細胞の制御に対する耐性が、疾患進行の最終段階に寄与すると見られている。作製したモデルは、Ｔ１Ｄの傾向がある免疫系から生じる、Ｔｒｅｇ表現型における遺伝的に決定される欠陥の予測分析を可能にする。
【０２８９】
健常対照またはＴ１ＤのＣＤ３４+細胞および胎児胸腺を移植したＮＳＧ動物の胸腺移植片を分析し、Ｔｒｅｇが胸腺移植片で発達しているかどうかを判定した。ＣＤ４+ＣＤ８-ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+細胞の割合（％）は、Ｔ１Ｄおよび健常対照対象に由来するＣＤ３４+細胞で再構成した動物において、類似していた。しかしながら、ＦｏｘＰ３+細胞の全細胞数は、Ｔ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来するマウスでは、健常対照に由来する移植片と比較して減少する傾向にあった（図７４Ａ）。この傾向は、Ｔ１Ｄ対象に由来するＣＤ３４+細胞で再構成されたマウスの移植片から回収された全胸腺細胞数が、全体的に低くなる傾向を反映する。胸腺細胞の絶対数における減少は、有意性に達したわけではないが、これらのデータは、Ｔ１Ｄに由来する前駆体からの胸腺リンパ球形成に欠陥が存在する可能性があることを示す。別個の実験において、Ｈｅｌｉｏｓを自然発生型Ｔｒｅｇに対するマーカーとして、ＦＣＭパネルに追加した。対照およびＴ１Ｄの骨髄で再構成した動物は、類似の割合のＣＤ４+ＣＤ８-ＣＤ２５+ＣＤ１２７loＦｏｘＰ３+Ｈｅｌｉｏｓ+細胞を有した（図７４Ｂ）。胸腺での染色に加えて、末梢においてもまた、Ｔｒｅｇの存在をアッセイした。健常対照およびＴ１ＤのＣＤ３４+細胞で再構成したマウスの末梢血中に循環するＴｒｅｇの割合が、健常な成体志願者に見られるものと類似であったことがわかった（図７４Ｃ）。
【０２９０】
ＩＬ−２は、Ｉｄｄ３座位の感受性遺伝子である。ＩＬ−２でのＴｒｅｇの刺激は、転写因子ＳＴＡＴ５の活性化、および続いてＦｏｘＰ３遺伝子転写の上方制御を媒介する。この刺激経路は、Ｔｒｅｇの機能および生存に影響を及ぼす。Ｔ１ＤのＨＳＣで再構成されたＮＳＧ動物に由来するＴｒｅｇにおいて、ＩＬ−２により刺激されるＳＴＡＴ５の活性化に欠陥があるかどうかを判定するために、ＦＣＭプロトコルを設計し、ＩＬ−２で刺激した細胞中のＳＴＡＴ５のリン酸化を測定した。結果（ｎ＝１つのＨＣとＴ１Ｄドナーの組）は、Ｔ１Ｄに由来するＨＳＣから発達したＴ細胞における、ＩＬ−２シグナル伝達における欠陥の可能性を示す。Ｔ１ＤのＣＤ３４+細胞に由来するマウスの細胞は、ＣＤ４+およびＴｒｅｇゲートの両方のサブセットにおいて、成体ヒトＰＢＭＣ対照と比較して、ｐＳＴＡＴ５平均強度の早期偏移およびベースラインへの急速な戻りを示した（図７５）。これは、このＴ１Ｄドナーについて、Ｔｒｅｇシグナル伝達における遺伝的に定義される機能の欠陥を明らかにし得る。
【０２９１】
要約すると、移植前に凍結保存されている同種ヒト胎児胸腺移植片において、少数の成体骨髄ＣＤ３４+細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にすることを成功させる、ヒト化マウスモデルを構築した。この報告において、このモデルにおいて新たに生成されたＴ細胞は、成体ＣＤ３４+細胞ドナーのものに類似する機能性および自己寛容性を有するが、免疫表現型が回復している。プロトコルは、この新しいヒト化マウスモデルのために標準化されており、単球、Ｂ、およびＴ細胞が存在している（移植後８〜１２週間）早い時点で、これらの動物の免疫機能の調査を開始する。Ｔ１Ｄ対象における自己免疫攻撃の進化を説明し得る、Ｔ細胞における遺伝的に決定される欠陥を調査する。
【０２９２】
全ての１型糖尿病患者は、これらの研究から得られるであろうＴ細胞機能における幹細胞内在性の異常の理解から、利益を享受することができる。
【０２９３】
Ｔ１Ｄおよび健常対照のＣＤ３４+細胞に由来する免疫系からの、ナイーブ型およびメモリー型Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ならびにＮＫＴ細胞の再構成のレベルを、動物モデルにおいて比較する。このモデルにおいて、Ｔ細胞の養子移入を通じて、Ｔ細胞の恒常性増殖および生存を、Ｔ１Ｄおよび健常志願者のＣＤ３４+細胞に由来するＴ細胞間で比較する。リコール応答における、Ｔ１Ｄおよび健常対照に由来する免疫系の応答を、破傷風トキソイドでの免疫付与後に比較する。Ｔｒｅｇの抑制機能およびＴｒｅｇに対するエフェクター細胞の感受性を、分析する。フローサイトメトリーに基づくアッセイを継続して、Ｔｒｅｇ内の細胞シグナル伝達を監視する。Ｔｒｅｇシグナル伝達の分析を、ＩＬ−２１（感受性座位Ｉｄｄ３内の別の遺伝子）の刺激の下流のＳＴＡＴ３の活性化を含むように拡大する。さらに、Ｔ１ＤドナーのＨＳＣに由来する制御性Ｔ細胞において、欠陥のあるＩＬ−２に刺激される、ＦｏｘＰ３、ＴＧＦβ、およびＩＬ−１０の遺伝子転写の上方制御が存在するかどうかを、本モデルにおいて特定する。これらの研究は、内在性の遺伝子欠陥のために生じるエフェクターおよび制御性Ｔ細胞集団の機能の欠陥を特定することを助け、Ｔ１Ｄがどのように発達するかに関する洞察に役立つであろう。
【０２９４】
自己免疫疾患の素因となる造血幹細胞内在性の免疫制御性欠陥、および免疫治療剤に対する個々の応答性の、安全な制御された予測分析を可能にする新しい世代のヒト化マウスモデルを作製した。Ｔ１Ｄおよび健常対照志願者に由来する免疫幹細胞を起源とするＴ細胞集団を、このヒト化マウスモデルにおいて調査する。
実施例１２の参考文献
Danzl N, Kalscheuer H, Sykes M. The mini me mouse: a humanized mouse model to study cell intrinsic immune pathogenesis of type 1 diabetes. Presented at the 11th Annual Rachmiel Levine Symposium, Pasadena, CA, March 2011.
Kalscheuer H, Danzl N, Onoe T, Faust T, Winchester R, Goland R, Greenberg E, Spitzer TR, Savage DG, Chio G, Tahara H, Yang YG, and Sykes M. A model for immune rejuvenation and individualized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine, Submitted November 2011.
Oneo, T., Kalscheuer H., Danzl N., Chittenden M., Zhao G., Yang Y.G., Sykes M. Human natural regulatory T cell development, suppressive function and post thymic maturation in a humanized mouse model. Journal of Immunology, 2011 Oct 1; 187(7): 3895-903.
【０２９５】
実施例１３：免疫回復およびヒト免疫応答性の個別化したインビボ分析のためのモデル
【０２９６】
ヒト胎児胸腺移植片および静脈注射で胎児ＣＤ３４＋細胞を受容させた免疫不全マウスは、強力なヒト免疫系を生成する。末梢ヒト抗原提示細胞は、胸腺移植片から移出されるＴ細胞の最適な機能を促進する。しかしながら、ヒト化マウスを使用してヒト免疫媒介性障害を研究または治療するためには、成熟胸腺細胞移植による拒絶を回避しながらも、成体造血細胞が同種胎児胸腺移植片に定植する必要がある。これらの障害は克服されており、マウスにおいて、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有する成体および健常対照志願者の骨髄から吸引した造血幹細胞（ＨＳＣ）での強力な免疫再構成が示された。胎児胸腺の凍結保存により、ＨＬＡ型の判定を可能にし、したがって、同種成体ＨＳＣの拒絶を予防しながら、共有される対立遺伝子の選択を可能にする。新しく生成されたＴ細胞は、機能性および自己寛容性であり、多様なレパートリーを有し、Ｔｒｅｇを含む。成体ＣＤ３４＋細胞ドナーの免疫表現型は、回復している。Ｔ１Ｄおよび対照のＨＳＣは、類似する数の自然発生型Ｔｒｅｇを、胸腺内で生成した。しかしながら、Ｔ１Ｄ対象に由来する末梢Ｔ細胞は、対照と比較して、活性化した／メモリー細胞の割合の増加を示し、Ｔ細胞の恒常性にＨＳＣ内在性の違いを示した。この「個別化免疫応答（ＩＩＲ）」マウスは、遺伝的に制御された免疫制御異常および免疫療法に対する応答性の個別化した分析を可能にし、種々の免疫障害の治療のための自己Ｔ細胞源としての潜在的な治療的有用性を有する。
【０２９７】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、免疫不全マウスに定植することが可能であり（１）、ヒトＴ細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺（ＴＨＹ）移植片で発達させる（２）。静脈内へのヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の注入と、腎臓被膜下へのヒト胎児胸腺および肝臓（ＴＨＹ／ＬＩＶ）移植片との組み合わせは、インビボでの抗原特異的免疫応答（３〜５）とともに、高いレベルの末梢ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞（３）を伴うヒト免疫再構成を可能にする。抑制機能（６）およびヒトＴ細胞の恒常性末梢増殖（７）を伴う制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の正常な胸腺での発達が起こる。
【０２９８】
ヒト化マウスは、胸腺不足状態の治療のためのナイーブＴ細胞源として、免疫付与後の抗原特異的Ｔ細胞源として、または移植または自己免疫疾患における制御性細胞源として、治療目的で使用することができる。ヒト化マウスはまた、自己免疫に関連する遺伝子多型の、免疫制御に対する影響の分析の可能性を有する。最近定義された非ＨＬＡ関連遺伝子は、集合的に、実質的な自己免疫疾患の危険性を与える（８〜１１）。自己免疫疾患を有するヒトにおいては、しかしながら、非ＨＬＡ関連遺伝子から生じる根本的な欠陥は、大部分が定義されていない。これらの座位の多くが、サイトカイン、共刺激分子、および阻害分子等の免疫制御性遺伝子を含むことを考慮すると（８〜１１）、造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源とする、免疫系の細胞における内在性異常は、自己免疫の発達に寄与する可能性が高い。一貫して、糖尿病の疾患感受性は、ＮＤＯマウスにおいて（１２）、さらに理論に束縛されるものではなく、ヒト（１３）において、造血細胞を介して移行される。しかしながら、疾患を有する患者の研究は、根本的な原因と、疾患の発生、疾患の治療、またはそれを引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。
【０２９９】
上述の治療的およびヒト化マウスの基礎研究目標の達成には、患者から得られた成体ＨＳＣでのヒト免疫の再構成および機能の達成が必要となる。しかしながら、これらの細胞は、研究の志願者から大量に入手することができず、成体ＨＳＣは、免疫不全マウスにおける生着効率が胎児ＣＤ３４＋細胞よりも低い（１４）。さらに、治療用途に大量に入手したとしても、成体ＨＳＣは、胎児胸腺移植片内に既に存在する同種胸腺細胞によって拒絶される可能性がある。
【０３００】
少数の成体同種骨髄ＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞およびＡＰＣの強力な末梢再構成を支持する、新しいヒト化マウスモデルの作製を提示する。この「個別化免疫応答（ＩＩＲ）」マウスは、自己免疫の素因となるＨＳＣ内在性の免疫異常を特定するために使用することができ、ヒトの免疫再構成および免疫療法を提供する可能性を有し得る。
【０３０１】
結果
【０３０２】
胎児胸腺移植片において成熟Ｔ細胞によってもたらされる免疫バリアを克服すること。免疫不全マウスにおける成体ＨＳＣからのヒト免疫再構成を評価するために、ＣＤ３４＋細胞を、廃棄されたヒト骨髄注入フィルターから単離し、胎児ＴＨＹ移植を受けた亜致死照射した非肥満型糖尿病との重度複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに静脈注射で与えた。未処置ヒト胎児ＴＨＹ移植片のレシピエントは、移植後最初の数週間の間、低い末梢Ｔ細胞再構成を示し、それは長期間で著しく低下し、これらの細胞が、移植片から移出したことを示す（ｎ＝５で、平均のＣＤ３＋細胞の再構成は移植６週間後でＰＢＭＣ中７．０％±８．２２％、対する移植１６週間後では２．３４％±２．２６％）。非Ｔ細胞は、注射された同種ＣＤ３４＋細胞から再構成されず、これらが拒絶されたことを示す。さらに、ヒト胎児ＴＨＹ移植片およびＣＤ３４＋細胞で再構成したいくつかの長期（２０週間超）動物は、後期発症型の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）様の消耗症候群を発症した。理論に束縛されるものではなく、ＴＨＹ移植片に既に存在していた胸腺細胞は、それぞれ、同種ＣＤ３４＋細胞を拒絶し、増殖してレシピエント組織を攻撃し、免疫再構成を妨害し、異種ＧＶＨＤをもたらす可能性がある。したがって、これらの現象を予防するために、移植片の胸腺細胞を枯渇させるための方法を試験した。
【０３０３】
２'−デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）での胎児胸腺器官培養（ＦＴＯＣ）は、胸腺リンパ球形成（１６）を支持することができる間質成分（１５）を保存しながらも、胸腺細胞を枯渇させる。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、同種成体ＣＤ３４＋細胞に加えて、ｄＧｕｏの存在下で７または２１日間培養した胎児ＴＨＹ組織を受容させた。対照動物には、胸腺組織ドナーに由来する胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞を受容させた。ＴＨＹ移植片なしで５×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を受容させたマウスは、１０週目までに平均で２０％のヒトＰＢＭＣを再構成したが（図７６Ａ）、ＣＤ３＋細胞は、検出不可能であった（図７６Ｃ）。７日間ｄＧｕｏで培養したＴＨＹ組織に加えて、同種ＣＤ３４＋細胞を受容させたマウスにおいては、平均してＰＢＭＣ中約７％のレベルのＣＤ３＋が、６週までに検出可能であり、その後低下したが（図７６Ｃ）、ＣＤ１９＋細胞は、見られなかった（図７６Ｂ）。ｄＧｕｏによる枯渇を逃れた成熟Ｔ細胞は、注入された同種ＣＤ３４＋細胞を拒絶したと見られる。ＴＨＹ移植片内の細胞は、ヒト非Ｔ細胞の再構成も高レベルのＴ細胞再構成も達成しなかった（図７６Ｃ）。
【０３０４】
対照的に、ヒト胸腺リンパ球形成ならびに末梢ＣＤ１９＋細胞再構成を伴う胸腺生着の成功は、５×１０5の同種成体ＣＤ３４＋細胞を２１日間ｄＧｕｏで培養したＴＨＹ移植片とともに静脈内注入した後に生じた（２０週で、平均でＰＢＭＣ中約２５％のヒトＣＤ３＋細胞、図７６Ｂ、Ｃ）。したがって、末梢に注入された同種成体ＣＤ３４＋細胞に由来する前駆体は、ｄＧｕｏで処置した胸腺に定植し、胸腺リンパ球形成を受け、末梢に移出した。同種成体骨髄ＣＤ３４＋細胞ではなく４×１０5の自己胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞とともに、ｄＧｕｏで処置した胎児胸腺組織の対照レシピエントは、同種成体ＣＤ３４＋細胞で達成されたものよりも迅速なＴ細胞の再構成を示した（図７６Ｃ）。
【０３０５】
上述の２１日間のＦＴＯＣ移植片のレシピエントは、高レベルの長期ヒトキメラ化を示したが（図７６）、より少量の成体ＣＤ３４＋細胞では、強力な免疫再構成を達成しなかった（２×１０5のＣＤ３４＋細胞のレシピエントにおいて、２０週で、平均でＰＢＭＣ中３．８９％±９．８９％のヒト細胞、ｎ＝９）。志願者の骨髄吸引を通じて利用可能なＨＳＣは、限られている。したがって、ＮＫ細胞を欠いており、ヒトＨＳＣ（１７）の生着に対してより許容性である、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ鎖null（ＮＳＧ）マウスを、次の実験に使用した。
【０３０６】
既存の胸腺細胞を枯渇させるためのＴＨＹ移植片の照射もまた、評価した。７Ｇｙで照射したＴＨＹに加えて、３×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞を受容させたＮＳＧマウスは、２０週までに、優れたＢ細胞および単球の再構成を示したが、末梢Ｔ細胞数は少なかった。ＴＨＹ移植片は、開腹時にはほとんど見られず（図８３）、胸腺照射が、胸腺の成長および／または機能を損なうことを示した。最終的に末梢および胸腺移植片で再構成されたＴ細胞は、増大し、埋め込みの４５週間超後の致死時点において細胞質であった。
【０３０７】
凍結保存／解凍した胎児ＴＨＹ移植片は、同種成体ヒト造血幹細胞から、Ｔ細胞および複数の造血系統の末梢再構成を可能にする。凍結保存／解凍したマウス胸腺組織の移植は、免疫機能を回復させる（１８、１９）。上述の研究により、ヒト胎児ＴＨＹ組織が、生存能力のある同種反応性および異種反応性の胸腺細胞を含有することを示したため、インタクトな胎児胸腺組織断片の凍結保存により、これらの胸腺細胞を枯渇させる能力を評価した。図８４に示されるように、胸腺組織の凍結保存は、実際に、胎児胸腺組織から、全胸腺細胞サブセットの著しい枯渇（＞２〜＞３ｌｏｇ）をもたらした。
【０３０８】
凍結保存した胎児胸腺組織の有用性を試験するために、亜致死照射したＮＳＧマウスに、凍結保存／解凍したヒト胎児ＴＨＹ移植片に加えて、３〜５×１０5の同種成体ＣＤ３４＋細胞を静脈注射で受容させた。既存の移植片の胸腺細胞に由来するＴ細胞の枯渇をさらに確実なものにするために、枯渇させる抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂをマウスに受容させた。図７７に示されるように、全てのマウスは、６週までにヒトＢ細胞および単球のキメラ化を達成した。最小限のＴ細胞再構成を示したＣＤ３４＋単独のレシピエントとは異なり、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片のレシピエントは、末梢Ｔ細胞を生成し、これは、６週までに現れ、３×１０5または５×１０5のＣＤ３４＋細胞の注入後、１６週で、それぞれ、約１０％および約３０％でピークに達した（図７７Ａ、右下パネル）。２１日間ｄＧｕｏで処置した移植片ではＴ細胞再の構成を達成するのに２０週間を要したが、凍結保存／解凍したＴＨＹ移植片では１０週間までに類似のＴ細胞レベルが再構成された。動物の致死時点で、これらの凍結保存した移植片は、著しく増大しており、主にＣＤ４／ＣＤ８二重陽性胸腺細胞を有する強力なヒト胸腺リンパ球形成の根拠を示す（図７７Ｂ、Ｃ）。
【０３０９】
ＣＤ３４＋細胞の静脈注射なしで凍結保存したＴＨＹ移植片を受容した対照動物（抗ＣＤ２  ｍＡｂあり［ｎ＝５］またはなし［ｎ＝４］）は、末梢に、多数のヒトＴ細胞も非Ｔ細胞も再増殖させなかった（移植２０週間後に０．４６％±０．３４％のヒト細胞再構成、ｎ＝９）。したがって、既存の移植片の胸腺細胞の大半を、凍結保存によって枯渇させ、ＣＤ３４＋細胞を投与することが、ヒトＴ細胞および非Ｔ細胞の再構成に必要であった。新鮮な胸腺組織を同種ＣＤ３４＋細胞とともに受容した追加の対照ＮＳＧ動物は、５週までに、ヒトＴ細胞を示したが（平均でＰＢＭＣ中２．４％）、いずれの他の系統にもヒトキメラを示さず（＜０．００６％）、一方で、自己ＣＤ３４＋細胞のレシピエントは、この時点までに、有意なヒトＴ細胞（平均３．４％）、Ｂ細胞（平均２．１％）、および単球（平均０．２％）の再構成を示した。したがって、ＮＳＧマウスに埋め込まれた新鮮な胸腺組織に由来するＴ細胞は、同種ＣＤ３４＋細胞を拒絶した。
【０３１０】
凍結保存／解凍したＴＨＹに加えて、抗ＣＤ２  ｍＡｂを受容させた長期動物はいずれも、消耗症候群または他のＧＶＨＤの兆候を発症しなかった。マウスのクラスＩＩ＋細胞が、長期ヒトＴＨＹ移植片に存在し（図８５）、静脈内注射したＣＤ３４＋細胞に由来する移植片で発達するヒト胸腺細胞が、負の選択によって、マウスレシピエントに対して寛容化されることを示した。理論に束縛されるものではなく、抗ＣＤ２  ｍＡｂを含むことは、胎児ヒト胸腺移植片から移出する残留異種ＧＶＨ反応性成熟Ｔ細胞によって誘発される消耗症候群を防ぐために重要であった。これは、凍結保存したＴＨＹ移植片（加えて、同種ＣＤ３４＋細胞の静脈注射）を受容したＮＳＧマウスの群のうち、抗ＣＤ２  ｍＡｂを受容しなかったマウスにのみ、後期発症型（２２週で）ＧＶＨＤ様症候群（重度の脱毛症、皮膚の炎症、猫背姿勢、および体重の減少）が発症したことによって示された。しかしながら、凍結保存した胸腺移植片および同種ＣＤ３４＋細胞を、抗ＣＤ２  ｍＡｂ処置ありまたはなしで受容させたマウスの群を比較した場合に、１５週までにヒト再構成のレベルに差が見られなかったため（図８６）、抗ＣＤ２  ｍＡｂは、同種ドナーの幹細胞の拒絶を防ぐためには必要なかった。
【０３１１】
対照およびＴ１Ｄ志願者に由来する臨床骨髄吸引液からのヒト免疫の再構成。臨床骨髄吸引液から単離した成体ＣＤ３４＋細胞の再構成能力を、次に評価した。１５ｍｌの骨髄吸引液から、３．６×１０5および２．７×１０6のＣＤ３４＋細胞を、それぞれ、第１の健常対照およびＴ１Ｄ志願対象から得た。亜致死照射したＮＳＧマウスに、それぞれ１．８×１０5の成体ＣＤ３４＋細胞に加えて、凍結保存／解凍したヒト胎児ＴＨＹ移植片および抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂを受容させた。対照の照射済みマウスには、ＴＨＹ組織なしでＣＤ３４＋細胞を受容させた。ヒトキメラは、６週目までに検出可能であり、約２５％〜８０％でピークに達した。ＴＨＹ移植片に加えて静脈注射での対照およびＴ１Ｄ志願者に由来するＣＤ３４＋細胞のレシピエントは、８週までに、実質的なＣＤ３＋細胞レベルを発達させたが、対照マウス（ＴＨＹ移植片なし）は、Ｔ細胞の再構成が著しく遅かった（図７８）。ＣＤ１９＋細胞およびＣＤ１４＋細胞もまた、Ｔ１Ｄおよび対照志願者のＨＳＣから発達した。３回の追加の実験で類似の結果が得られ、それぞれにおいて、４〜１４匹のＮＳＧマウスが、それぞれ、単一の志願者の吸引液に由来する２〜３×１０5のＣＤ３４＋細胞で再構成された。これらの実験からの複合データを、図７８Ａに示す。脾臓Ｔ細胞の再構成もまた、急速かつ強力であり、９週で致死させた３匹のＴ１Ｄ細胞で再構成したマウスの群では、１つの脾臓当たり平均２．４７×１０6（標準誤差０．６×１０6）のヒトＣＤ３細胞を有し、健常対照で再構成したマウスの脾臓では、１０6のＣＤ３細胞を有した。図７８Ｂは、胎児胸腺および胎児ＣＤ３４＋細胞で見られたような（６）、正常な割合のＣＤ４／ＣＤ８二重陽性および単一陽性細胞、ならびに単一陽性な胸腺細胞間で類似する割合のＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋細胞を含む、成体ＣＤ３４＋細胞からの強力な胸腺リンパ球形成を示す。胸腺細胞の数は、健常対照のＣＤ３４細胞で再構成した動物と比較して、Ｔ１Ｄでは低下する傾向にあるが、２つの群の間に、統計的に有意な差は見られなかった。
【０３１２】
志願ドナーの骨髄ＣＤ３４＋細胞で再構成したマウスにおけるＴ細胞の機能性および自己寛容性。成体ＣＤ３４＋細胞を受容した同種ヒトおよび異種（ブタ）の皮膚を、ＴＨＹを移植したマウスに移植することによって、Ｔ細胞機能を評価した。これらのマウスは、同種ヒトおよび異種ブタの皮膚移植片を急速に拒絶し（図７９Ａ）、一方でナイーブな未処置ＮＳＧマウスは、浸潤または異種移植片もしくは同種移植片の組織構造上に拒絶の形跡を全く有することなく（図８７）、同種ヒトおよび異種の皮膚移植片を、経過観察期間の間（それぞれ、１０６および５０日間）許容した（図７９Ａ）。
【０３１３】
Ｔ１Ｄおよび健常志願者の成体ＣＤ３４＋細胞から生成された、Ｔ細胞の自己寛容性を評価するために、脾臓およびリンパ節から単離した精製されたＴ細胞を使用して、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行った。Ｔ１Ｄおよび対照の対象から再構成されたマウスに由来するＴ細胞は、ＭＬＲにおいて同種ヒト刺激因子に対する強い応答とともに、自己寛容性を示した（図７９Ｂ、表１１）。特に、新しい成体ドナーのＴ細胞および同じ健常対照骨髄ドナーから再構成したマウスに由来するＴ細胞は、同種刺激因子に対する類似の強い応答および類似の自己寛容性を示した。したがって、成体志願者に対する免疫応答性および自己寛容性が、これらのマウスで再現された。それらは、個別の成体骨髄ドナーから免疫機能を生成するため、これらの動物は、これ以降「個別化免疫応答［ＩＩＲ］」マウスと称される。
【表１１】
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表１１：図７９ＢのＭＬＲアッセイに使用したＴ細胞表現型
【０３１４】
Ｔ１Ｄおよび対照の骨髄ＣＤ３４＋細胞からの類似したＴｒｅｇの発達。Ｔｒｅｇの存在を、胸腺移植片および再構成したマウスの末梢において評価した。図８０Ａに示されるように、ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇが、ＩＩＲマウスのＣＤ４＋ＣＤ８−胸腺細胞に存在していた。ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ胸腺細胞の分析は、ＦｏｘＰ３＋細胞の大半がまた、胸腺由来の「自然発生型」Ｔｒｅｇを示すＨｅｌｉｏｓ＋であったことを示した。類似する数および割合のＴｒｅｇが、対照およびＴ１Ｄ志願者から再構成されたＴＨＹ移植片において検出された。さらに、いくつかの研究は、Ｔｒｅｇの数が、Ｔ１Ｄ対象の血液では健常対照（２０）と比較して減少することを示したが、一方で類似の割合のＴｒｅｇが、再構成したマウスの両方の群の末梢血に検出された（図８０Ｂ）。
【０３１５】
成体ドナーＣＤ３４＋細胞に由来する単一陽性（ＳＰ）胸腺細胞における多様なＴＣＲ細胞のレパートリー。移植後２０週間で、Ｔ１ＤのＣＤ３４＋細胞および正常志願者から再構成されたマウスのＣＤ４およびＣＤ８  ＳＰ胸腺細胞にスペクトル型解析分析を行った（図８１）。これらのヒトＴ細胞は、多様なレパートリーを示し、類似するＢＶファミリーの利用および各ＢＶに対する多クローン性ＣＤＲ３の長さ分布を有した。再構成されたレパートリーは、１２人の健康な成体の平均のＣＤ４Ｔ細胞レパートリーに類似しており、各試料中において分析した全てのＢＶファミリーの平均のハミング距離は、１４．２〜２６．２の範囲であり、平均は２０．６であった（表１２）。これは、健常対照のＰＢＬに見られるような、典型的なＴ細胞の多クローン性を示す。
【表１２】
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表１２：選択されたＢＶファミリーに対するハミング距離によって測定される、実験的に再構成したＴ細胞レパートリーと、１２人の健常な成体のプールしたＣＤ４Ｔ細胞の基準レパートリーとのｂ鎖長分布の類似性。
【０３１６】
ＩＩＲマウスにおけるナイーブ対メモリーＴ細胞の表現型。健常対照およびＴ１Ｄ志願者のＣＤ３４＋骨髄細胞から再構成されたマウスの末梢組織に定植するＴ細胞には、「ナイーブ」型ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−細胞および「メモリー」型ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋細胞の両方が含まれた（図８２Ａ）。対照ＣＤ３４＋細胞ドナーの血液中のＴ細胞の比較により、同じドナーから再構成されたＩＩＲマウスにおける、ナイーブ型ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ４、ＣＤ８、およびＴｒｅｇのサブセットの著しい増加が明らかになった（図８２Ａ、Ｂ）。したがって、成体ドナーの免疫系の回復した形態が、ＩＩＲマウスに生成される。図８２Ｃに示されるように、ＣＤ３４＋細胞単独のレシピエントのＰＢＭＣ中のナイーブ型Ｔ細胞の割合が、胸腺移植片もまた受容したマウスのものよりも、著しく低かったため、この回復にはヒト胸腺が必要であった。
【０３１７】
ナイーブ型およびメモリー型ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の割合を、Ｔ１Ｄまたは健常対照のドナーから同時に生成されたＩＩＲマウスの血液において比較した際、Ｔ１ＤのＣＤ３４＋細胞に由来するＴ細胞は、健常対照に由来するものと比較して、有意に減少した割合のナイーブ型細胞を示した（図８２Ａ）。Ｔ１ＤドナーのＣＤ３４＋細胞に由来するＴｒｅｇは、健常対照に由来するものよりも「メモリー」表現型となる傾向にあったが、この傾向は、統計的有意性に達しなかった（図８２Ｂ、ｐ＝０．０７）。
【０３１８】
考察
【０３１９】
成体の骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞は、凍結保存／解凍した同種胸腺組織を移植したＮＳＧマウスを再構成し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞を含む、複数の造血系統を生成することができることを、本明細書に提示する。胎児胸腺を凍結保存／解凍し、さらに抗ＣＤ２  ｍＡｂを投与することによって、移植片から成熟Ｔ細胞を枯渇させ、同種ＣＤ３４＋細胞の拒絶およびＧＶＨＤを予防し、同時に胸腺機能を保存する。胸腺リンパ球形成、胸腺移植片の成長、および機能性で多様な回復した免疫系の再構成を達成する。成体ドナーの自己寛容性を再現する。本研究の基礎であるヒト化マウスモデルには胎児肝臓断片が含まれたが（３、５）、注入したＣＤ３４＋細胞に由来する胸腺細胞前駆体は、ヒト胸腺移植片に定植したため、これらの断片は現在の研究では必要ない。
【０３２０】
インビボ胸腺リンパ球形成および末梢再構成は、ｄＧｕｏで処置したヒト胸腺からも達成されたが、同種ＣＤ３４＋細胞の拒絶を防ぐのに十分に長く（２１日間）胸腺をｄＧｕｏで処置した場合、注入した成体ＣＤ３４＋細胞からのＴ細胞再構成は時間がかかった。Ｔ細胞の回復の遅れは、数週間ｄＧｕｏで培養した胸腺組織を受容させた完全型ディジョージ症候群を有する患者にも観察された（２１）。結果は、胸腺組織の凍結保存が、ＧＶＨＤを予防しながら、より迅速なＴ細胞の回復を支持することができることを示す。
【０３２１】
胎児胸腺組織の凍結保存は、最適な免疫機能に重要である、ＨＬＡ対立遺伝子を共有する成体ＣＤ３４＋細胞とともに使用するための、組織のＨＬＡ型の判定を行うことを可能にする。ＮＳＧマウスの使用は、比較的少数の同種成体ＨＳＣの生着を可能にし、臨床骨髄吸引液から、複数のマウスの再構成を可能にする。
【０３２２】
ＮＳＧマウスにおける、患者の成体骨髄ＣＤ３４＋細胞からの免疫再構成は、疾患によって変化ない免疫系を提供し、制御された有望な方法で、個体の比較を可能にする。ヒト免疫分析は、典型的に、末梢血試料に限定され、根本的な免疫制御異常を、続いて起こる疾患に至る炎症事象と区別することができない。Ｔｒｅｇの数および機能における欠陥が、Ｔ１Ｄ（２０、２２〜２４）、全身性紅斑性狼瘡（２５）、およびリウマチ性関節炎（２６）に対して報告されているが、これは、Ｔ１Ｄ（２７〜２９）においては議論の余地がある。健常対照のＣＤ３４＋細胞と類似の割合でＴｒｅｇを胸腺内生成する、Ｔ１Ｄ対象のＣＤ３４＋細胞から生成されたＴ細胞集団には、全体的な異常は観察されなかった。しかしながら、Ｔ１Ｄから生成されたＩＩＲマウスの血液中に、健常対照ドナーと比較して、著しく減少した割合のナイーブ型Ｔ細胞が観察され、ＮＯＤマウス（３０）において記載されるように、Ｔ細胞恒常性の異常が、Ｔ１Ｄに由来するＨＳＣの特徴であり得ることを示した。本モデルは、素因となる遺伝子の対立遺伝子に関して、Ｔ１Ｄにおいて遺伝子にプログラムされたＨＳＣ内在性の免疫制御性異常の評価を可能にするであろう。
【０３２３】
ＨＬＡトランスジェニック免疫応答性マウスは、リウマチ性関節炎（３１）、多発性硬化症（３２）、セリアック病（３３）、およびＴ１Ｄ（３４〜３７）等の自己免疫疾患の病因に関する見識を提供した。しかしながら、これらのモデルは、自己免疫病因に寄与し得る、ヒトＨＳＣ内在性の遺伝的に決定される免疫異常の分析を可能にするものではない。対照的に、免疫不全マウスに静脈注射でのＣＤ３４＋細胞と胎児ＴＨＹ組織を組み合わせて投与することにより、二次リンパ器官が形質細胞様および骨髄の両方の樹状細胞（３〜５）を含む状態で、機能性のヒトＴ細胞、Ｔ−Ｂ相互作用、クラススイッチ抗体応答を生成した。Ｔｒｅｇは、正常に発達し（６）、Ｔ細胞の恒常性をこのモデルにおいて研究することができるため（７）、ＨＳＣドナーにおける自己免疫疾患と関連するＨＳＣ内在性の免疫制御性異常の評価を可能にするであろう。移植前に胸腺のＨＬＡ型を判定する能力は、疾患関連のＨＬＡ対立遺伝子を有する胸腺の選択を可能にする。理論に束縛されるものではなく、Ｔ１ＤのＨＳＣの移植は、ＮＳＧマウスで自己免疫疾患を引き起こさないため、ＨＬＡトランスジェニックＮＳＧマウスを使用した、このモデルのさらなる進化は、自己免疫疾患病因の研究を可能にすることができる。
【０３２４】
「個別化免疫応答」モデルは、免疫療法剤に対する成体骨髄ドナーの個別の応答性の分析を可能にするであろう。さらに、成体ＨＳＣに由来する多様なレパートリーを有するナイーブＴ細胞を伴う複数のマウスの再構成は、免疫抑制剤、化学療法、照射、またはＨＩＶのために胸腺が不足した患者に、養子移入のための機能性の自己寛容性Ｔ細胞を提供することができる。ヒト胎児ＴＨＹおよびＣＤ３４＋移植片を受容するマウスは、抗ＨＩＶまたは他の抗原特異的免疫応答（４、３８）を生成し、このアプローチの免疫治療的な可能性を示す。マウスはまた、自己免疫疾患、ＧＶＨＤ、または臓器同種移植片を有する患者の治療に所望される特異性を有する、多数の自己Ｔｒｅｇを生成するために使用することができる。本研究におけるＣＤ３４＋細胞ドナーの「自己」抗原に対する特異的寛容性およびＧＶＨＤの非存在は、別の胸腺異種移植片モデルにおいて既に示されたように（３９）、それぞれ、ヒト胸腺移植片におけるヒトＨＳＣドナーおよびマウスレシピエントに由来するＡＰＣの存在に起因する胸腺内の枯渇を反映する可能性が高い。
【０３２５】
要約すると、成体ＨＳＣから多系統末梢ヒト造血細胞の発達を可能にするモデルを構築した。「個別化免疫応答」マウスは、自己免疫障害に関連する免疫制御における内在性欠陥、および遺伝的に制御される免疫療法に対する応答の分析を可能にし得る、疾患またはその治療によって変化しない免疫系を提供する。これらのマウスはまた、患者での使用に所望される特異性および特性を有する多クローン性のナイーブまたは活性化Ｔ細胞源としての、治療的可能性を有する。
【０３２６】
材料および方法
【０３２７】
動物およびヒトの組織および細胞。非肥満性糖尿病の重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ鎖null（ＮＳＧ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、特定の病原体を含まないマイクロアイソレーター環境で収容した。ヒト胎児胸腺および肝臓組織（在胎１７〜２０週）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から入手した。胎児胸腺の断片を、１０％ＤＭＳＯおよび９０％ヒトＡＢ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）中で凍結保存し、実験計画に応じて、照射または培養した。ＣＤ３４＋細胞を、１５ｍｌの骨髄吸引液、またはＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した廃棄されたヒト骨髄フィルターから、または抗ヒトＣＤ３４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いた磁気活性化細胞分類装置（ＭＡＣＳ）分離システムを使用して、単離した。
【０３２８】
胎児胸腺器官培養物。ヒト胎児胸腺の培養を、既に公開されているように行った（１５）。簡単に言うと、胸腺の断片を、１ｃｍ2のＧｅｌｆｏａｍスポンジ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ，ＮＹ）上の０．８μｍのアイソポアメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に設置した。内因性胸腺細胞を排除するために、器官培養物は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）において、１．３５ｍＭ  ２'−デオキシグアノシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、７または２１日間、３７℃で成長させた。
【０３２９】
ヒト組織の移植。マウスを、亜致死（２．５Ｇｙ）全身照射で前処置した。約１ｍｍ3に測定したヒト胎児胸腺の断片を、レシピエントの腎臓被膜の下に埋め込んだ。２４時間以内に、１〜５×１０5のヒトＣＤ３４＋細胞を、静脈内に注射した。いくつかのレシピエントは、０日目および７日目に、抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂ（ＢＴＩ３２２（４０）、１００μｇ）で処置した。
【０３３０】
皮膚の移植。ＭＨＣミニブタおよび同種ヒトドナー由来の分層（２．３ｍｍ）皮膚試料を、ヒト組織移植の３９週後に、外側胸壁に移植した。皮膚移植片を、７日目以降４週まで毎日評価し、続いて、その後３日毎に少なくとも１回の調査を行った。移植片は、生存している移植片が１０％未満の場合、拒絶されたと定義した。
【０３３１】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）。移植を受けたマウスにおけるヒト造血細胞のレベルを、４色フローサイトメトリーによって評価した。マウスを、移植後に一定の間隔で尾から採血し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、それをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で調製した。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した蛍光色素で標識化したｍＡｂを、別の組み合わせで使用した。抗マウスＣＤ４５、抗マウスＴｅｒ１１９、抗ヒトＣＤ４、抗ヒトＣＤ８、抗ヒトＣＤ１４、抗ヒトＣＤ１９、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ、抗ヒトＣＤ１２７、抗ヒトＦｏｘＰ３、抗ヒトＣＤ２５、およびアイソタイプ対照ｍＡｂ。ＦＣＭ分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ、またはＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して行い、分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）によって行った。死細胞は、低い前方散乱および高いヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をゲートアウトし、細胞を保持することによって分析から除外した。マウスの赤血球細胞は、マウスのＴｅｒ１１９＋細胞をゲートアウトすることによって排除した。
【０３３２】
混合リンパ球反応。脾細胞およびリンパ節を、ヒト化マウスから採取し、単核細胞の懸濁液を、フィコール分離によって単離した。ヒトＴ細胞を、製造業者の説明に従って、抗マウスＣＤ４５および抗Ｔｅｒ−１１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してマウスの細胞を枯渇させることにより富化し、続いて、ＰａｎＴ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してＴ細胞を精製した。純度は９０％超であった。レスポンダーＴ細胞（ウェルあたり１０5）を、照射したヒト同種ＰＢＭＣ（３０００ｒａｄ、ウェルあたり１０5の細胞）を刺激因子として用いて５日間培養し、増殖を、記載のように（４１）［3Ｈ］チミジンの取り込みを介して測定した。自己刺激した対照培養物において、レスポンダー細胞を、マウスＣＤ４５＋およびＴｅｒ１１９＋細胞を枯渇させた、同じヒト化マウスに由来する自己ＰＢＭＣとともにインキュベートした。データは、３通りの培養物中の平均の［3Ｈ］チミジン取り込みとして示す。
【０３３３】
スペクトル型解析。全ＲＮＡを、１〜２×１０4のＣＤ４またはＣＤ８単一陽性胸腺細胞（純度８０％超）から直接抽出し、逆転写し、単鎖ｃＤＮＡの合成を記載の通りに行った（４２）。記載のように（４２）、ＴＣＲ  β鎖定常領域プライマーおよび個別の可変領域を使用して増幅反応を行った。生成物を、次いで、記載のように（４２）、Ｃβ特異的ＦＡＭ標識化プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）での流出反応に使用した。標識化した生成物を、次いで、ＴＣＲ  β−鎖長の長さ分布の判定に使用した。ＤＮＡ生成物に対応するピークの寸法および範囲を、ＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して判定し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ  ３．７  ＮＴを使用して分析した。正常なヒトにおける末梢血ＣＤ４  Ｔ細胞の実験および参照のβ鎖長間の定量的差異を評価するために、ハミング距離を、記載のように計算した（４２）。
【０３３４】
統計分析。統計分析および比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。棒グラフのデータは、平均±標準誤差を表す。パラメータデータセットのためのスチューデントｔ検定または非パラメータデータセットのためのマンホイットニー検定を、群の比較に使用した。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると見なした。
【０３３５】
免疫組織化学。ホルマリンで固定した組織を、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色のために、５μｍで切断した。サイトケラチン染色のために、凍結させた皮膚片を、２０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに固定し、次いで、１５分間０．０５％サポニン／１０ｍＭグリシン／５％ロバ血清／ＲＰＭＩ中で透過化を行い、ＰＢＳ中の５％粉乳でブロッキングし、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、抗ヒトサイトケラチン（ＭＦＮ  １１６、Ｄａｋｏ）とともに、一晩インキュベートした。断片を洗浄し、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８およびＤＡＰＩとともに、インキュベートした。マウスＭＨＣＩＩ染色については、凍結片を、１０分間４Ｃでアセトン中に固定し、続いて１５分間０．０５％サポニン／１０ｍＭグリシン／５％ロバ血清／ＲＰＭＩ中で透過化し、ＰＢＳ中の１０％卵白／０．０５％ＢＳＡのビオチンブロッキング液でブロッキングした。断片を抗マウスＭＨＣＩＩ−ビオチン（Ｍ５／１１４．１５．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１時間染色し、洗浄して、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて画像を取得した。
【０３３６】
実施例１３の参考文献
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実施例１４：
【０３３７】
マウスゲノムは、ヒト細胞に感染し得る内因性レトロウイルスを含有する。これらは、ジェノトロピックマウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭＬＶ）およびポリトロピックマウス白血病ウイルス（Ｐ−ＭＬＶ）含む。
【０３３８】
一態様において、本発明は、これらのマウス白血病ウイルスがヒト細胞に感染することができないように作製された、本発明で使用するための遺伝子修飾したマウスの作製を提供する。これは、ヒト細胞に感染するために必要である重要なエンベロープタンパク質を標的とする、小型の阻害性ＲＮＡをコードする導入遺伝子を導入すること、ヒト細胞に感染するために必要である重要なエンベロープタンパク質を標的とする、中和抗体をコードする導入遺伝子を導入することを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の方法によって達成することができる。他の非限定的な実施形態において、Ｍｉｎｉ  Ｍｅマウスを生成するために使用されるヒトＣＤ３４細胞に、小型の制御性ＲＮＡを（形質導入された細胞の物理的な選択を可能にするマーカー遺伝子とともに）形質導入して、Ｘ−ＭＬＶおよびＰ−ＭＬＶの受容体の発現をノックダウンすることができる。
【０３３９】
他の実施形態において、これらのマウス白血病ウイルスは、例えば、限定されないが、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３ＤＥ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ等のヒトアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素の形質導入マウスを使用することによって、ヒト細胞に感染することができないように作製される。Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，２００８，Ｔｈｅ  ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｎｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｕｔａｔｏｒｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，９：２２９．１−２２９．１０を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３４０】
理論に束縛されるものではなく、マウスゲノムへのＡＰＯＢＥＣ３遺伝子の挿入は、Ｘ−ＭＬＶおよびＰ−ＭＬＶ等の内因性レトロウイルスがヒト細胞に感染する能力を妨げることになる。ＡＰＯＢＥＣ３遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野で周知である。トランスジェニックマウスを作製する方法は、当業者に周知である。
【図９】
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【図１０】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３３】
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【図３９】
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【図４２】
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【図４５】
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【図５１】
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【図５３】
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【図５４】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図７１】
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【図７６】
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【図７８】
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【図７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７７】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【国際調査報告】
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