(57)【要約】本発明は、少なくとも一つの遺伝子Ａの遺伝子モザイクを使用する代謝経路の体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの構築及び組換えによる、前記代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントの代謝的進化のための方法であって、ａ）一段階法で、（ｉ）細胞を、細胞ゲノムの不可欠な部分であるか又は遺伝子構築物のフレームワーク中に存在する組換えられるもう一つの遺伝子と、９９．５％より少ない配列相同性を有する、少なくとも一つの遺伝子Ａで形質転換し、（ｉｉ）前記遺伝子を組換え、（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位において当該遺伝子の遺伝子モザイクを生成させ、ここで前記少なくとも一つの遺伝子Ａは、５’末端又は３’末端の何れかに前記組込み部位の５’又は３’末端に固着する単一の隣接標的配列を有する、（ｉｖ）前記代謝経路の最終的な更なる遺伝子を組換え、そしてｂ）前記遺伝子モザイクと前記バリアントを発現することが可能な前記最終的な更なる遺伝子とを含んでなるクローンを選択することを含んでなる、前記方法、代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントを産生する細胞のライブラリーを調製する方法、このように産生され、そして前記バリアントを調製するために使用されるライブラリー、に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの遺伝子Ａの遺伝子モザイクを使用する、代謝経路の体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの構築及び組換えによる、前記代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントの代謝的進化のための方法であって、
ａ）一段階法で、
（ｉ）細胞を、細胞ゲノムの不可欠な部分であるか又は遺伝子構築物のフレームワーク中に存在する組換えられるもう一つの遺伝子と、９９．５％より少ない配列相同性を有する、少なくとも一つの遺伝子Ａで形質転換し、
（ｉｉ）前記遺伝子を組換え、
（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位において当該遺伝子の遺伝子モザイクを生成させ、ここで前記少なくとも一つの遺伝子Ａは、５’末端又は３’末端の何れかに前記組込み部位の５’又は３’末端に固着する単一の隣接標的配列を有する、
（ｉｖ）前記代謝経路の最終的な更なる遺伝子を組換え、そして
ｂ）前記遺伝子モザイクと前記バリアントを発現することが可能な前記最終的な更なる遺伝子とを含んでなるクローンを選択すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記もう一つの遺伝子が、前記細胞のゲノムの一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、少なくとも一つの遺伝子Ａ及び少なくとも一つの遺伝子Ｂで同時形質転換され、ここで、遺伝子Ａの前記単一の隣接標的配列は、前記標的ゲノムの組込み部位の５’末端に固着し、そしてここで、遺伝子Ｂは、前記組込み部位の３’末端に固着する単一の隣接標的配列に連結されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、少なくとも二つの異なった遺伝子Ａ１及びＡ２で同時形質転換され、そして少なくとも二つの異なった遺伝子Ｂ１及びＢ２で同時形質転換されてもよい、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの更なる遺伝子Ｃが同時形質転換され、前記更なる遺伝子Ｃは、遺伝子Ａ及び／又は前記もう一つの遺伝子への前記更なる遺伝子Ｃの構築を得るための、遺伝子Ａ及び／又は前記もう一つの遺伝子の配列とハイブリダイズする配列を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子Ａ及び／又は前記もう一つの遺伝子が、非コード配列、又はポリペプチドもしくは活性を有するポリペプチドの一部をコードする配列である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記代謝経路の少なくとも二つの遺伝子が、組換えられ、そして構築される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子が、好ましくは３００ないし２０，０００ｂｐの直線状ポリヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
好ましくは７００ｂｐ当たり少なくとも３回のクロスオーバー現象を伴う、少なくとも３から２０，０００塩基対までの遺伝子モザイクが得られる、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＤＮＡ修復欠損細胞である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、真核細胞、好ましくは真菌、哺乳動物又は植物細胞、或いは原核細胞である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記天然の芳香族小分子が、フェニルプロパノイド、フラボノイド、フラバノール、アントシアニン、リグニン、シアニジン、カルコン、バニリン、及び天然に存在するこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バリアントが、組換え酵素バリアントによって合成される、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントを産生する細胞のライブラリーを調製する方法であって、少なくとも一つの遺伝子Ａの遺伝子モザイクを使用する前記代謝経路の体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの構築及び組換えによって組換え細胞を操作することを含んでなり、
ａ）一段階法で、
（ｉ）細胞を、細胞ゲノムの不可欠な部分であるか又は遺伝子構築物のフレームワーク中に存在する組換えられるもう一つの遺伝子と、９９．５％より少ない配列相同性を有する、少なくとも一つの遺伝子Ａで形質転換し、
（ｉｉ）前記遺伝子を組換え、
（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位において当該遺伝子の遺伝子モザイクを生成させ、ここで前記少なくとも一つの遺伝子Ａは、５’末端又は３’末端の何れかに前記組込み部位の５’又は３’末端に固着する単一の隣接標的配列を有する、
（ｉｖ）前記代謝経路の最終的な更なる遺伝子を組換え、そして
ｂ）前記遺伝子モザイクと前記最終的な更なる遺伝子とを含んでなるクローンを収集し、前記バリアントを産生することが可能なライブラリーを得ること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
前記バリアントを産生する少なくとも１０Ｅ３個の異なったクローンを含んでなる、請求項１４に記載の方法によって得られるライブラリー。
【請求項１６】
代謝経路のレパートリーをコードする組換え遺伝子を含んでなる細胞のライブラリーである、請求項１５に記載のライブラリー。
【請求項１７】
合成酵素のレパートリーをコードする組換え遺伝子を含んでなる細胞のライブラリーである、請求項１５又は１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載のライブラリーから得ることが可能な合成組換え酵素のライブラリー。
【請求項１９】
請求項１５ないし１８のいずれか１項に記載のライブラリーからの遺伝子のバリアントを含んでなる、生物体。
【請求項２０】
請求項１５ないし１８のいずれか１項に記載のライブラリーからの天然の芳香族小分子のバリアントを選択する方法。
【請求項２１】
前記バリアントの構造及び機能を決定することを更に含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バリアントを組換え宿主中に産生することを更に含んでなる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記バリアントを合成的に産生することを更に含んでなる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記バリアントが、抗細菌性、抗酸化活性又は芳香剤及び風味剤としての群から選択される生物学的活性を持つフェニルプロパノイドである、請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子モザイクを使用する、代謝経路の体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの構築及び組換えによる、前記代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントの代謝的進化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質設計の主要な目的の一つは、新しい又は改善された特質を持つタンパク質を作り出すことである。タンパク質又は酵素に所望の活性を与えるための能力は、化学及び製薬工業においてかなりの実用性がある。定方向タンパク質進化は、タンパク質工学における強力な技術プラットフォームとして浮上しており、ここで、バリアントのライブラリーは、所望の特質を保有するクローンについて実験的に探索される。
【０００３】
定方向タンパク質進化は、天然には見いだされない所望の特質を持つタンパク質又は核酸を進化させるための自然選択の力を利用する。タンパク質変異体及びバリアントを作り出し、そして所望の機能を選択するために、各種の技術が使用される。組換えＤＮＡ技術は、単一の構造遺伝子又は経路全体の遺伝子の、急速な増殖及び／又は高レベルのタンパク質産生のために適した代替宿主への移入を可能にした。活性又は他の特質の蓄積された改善は、通常、変異及びスクリーニングの反復によって得られる。定方向進化の適用は、タンパク質の安定性を改善し、そして酵素及び生物体の活性又は全体的性能を向上させるために、又は酵素基質の特異性を変更し、そして新しい活性を設計するために、学術的及び工業的研究所において主として見いだされる。殆どの定方向進化のプロジェクトは、農業、医学又は工業的状況においてヒトのために有用である特質を進化させようと努めている（生体触媒作用）。
【０００４】
殆どの天然及び新規な化合物が、単一の酵素によるよりもむしろ経路によって産生されるため、代謝経路全体の進化は、特に魅力的な概念である。代謝経路工学は、通常、経路中の全ての酵素の協調的操作を必要とする。新しい代謝経路の進化及びバイオプロセスの向上は、通常、組換え及びスクリーニング又は選択の反復サイクルの過程によって行なわれ、個々の遺伝子、全プラスミド、多重遺伝子クラスター、又は全ゲノムをさえ進化させる。
【０００５】
Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ（１）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の隣接する断片の５’又は３’末端の配列を含有する５’及び３’末端における二つの隣接（固着（anchoring））領域のｉｎ  ｖｉｖｏの相同組換えによる単一工程での、全生化学経路又はゲノムをコードする大きい組換えＤＮＡの構築を記載している。
【０００６】
Ｅｌｅｆａｎｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２）は、ｌａｃＺレポーター遺伝子がＳＣＬ遺伝子座にノックインされた変異マウスを作り出すための、遺伝子ターゲティング実験を記載している。二つの、即ち、５’及び３’末端のそれぞれに一つの、固着配列を使用するＳＣＬ−ｌａｃＺ遺伝子ターゲティング戦略を示す図１を参照されたい。
【０００７】
米国特許第７８０７４２２号Ｂ２（３）は、組換え微生物によるフラボノイドの産生を開示している。一組の遺伝子が、当該遺伝子の発現が酵素の産生をもたらすように、異種宿主細胞に導入される。
【０００８】
Ｎａｅｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（４）は、酵母における生合成経路のランダムな構築及び多様な天然の産物又は中間体の産生を記載している。７工程のフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子を、酵母発現カセットに個々にクローン化し、次いでこれを人工酵母染色体上でランダムに組合せた。同様に、Ｔｒａｎｔａｓ  ｅｔ  ａｌ（５）は、酵母プラスミド中のフラボノイド及びスチルベン経路の酵素をコードする異種遺伝子を発現させることが可能であった。
【０００９】
定方向進化は、生きた細胞中で行うことができ、これはｉｎ  ｖｉｖｏ進化とも呼ばれ、又は全く細胞に関係しないことができる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化）。Ｉｎ  ｖｉｖｏ進化は、細胞環境における特質について選択されるという利点を有し、これは、進化されたタンパク質又は核酸が生きた生物体中で使用される場合に有用である。酵母中のｉｎ  ｖｉｖｏの相同組換えは、遺伝子クローニング、プラスミド構築及びライブラリー作成のために広く使用されている。
【００１０】
ライブラリーの多様性は、変異誘発又は組換えによって得られる。ＤＮＡシャッフリングは、多数の遺伝子からの有益な変異の直接組換えを可能にする。ＤＮＡシャッフリングにおいて、ＤＮＡ配列の集団は、無作為に断片化され、そして次いで全長のハイブリッド配列に再編成される。
【００１１】
相同組換えの目的のために、天然に存在する相同遺伝子は、始めの多様性の供給源として使用される。単一遺伝子シャッフリングライブラリーのメンバーは、典型的には、９５％より高い同一性を有する。然しながら、ファミリーシャッフリングは、典型的には、６０％より高い同一性を有する配列のブロック交換を可能にする。機能的配列の多様性は、自然選択を生き残った関連する親配列に由来する；従って、さらに多くの変異が、構造又は機能に不都合な効果を導入することなく、与えられた配列中に許容される。
【００１２】
３０％までの多様性を伴う異なった起源のＤＮＡ断片の組換えは、ＷＯ１９９０００７５７６Ａ１（６）中に記載されている。ハイブリッド遺伝子は、ミスマッチ修復欠損細菌中又はミスマッチ修復（ＭＭＲ）系が一時的に不活化された細菌中の、属間及び／又は種間組換えよってｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。これによって、損傷したＤＮＡを修復するこれらの過程が回避され、当該過程は、多様な配列間の組換え、即ち、同祖的（homeologous）組換え、の頻度に対する阻害効果を有する。
【００１３】
ライブラリーの多様性は、一倍体細胞の、二倍体生物体の形成に導く効率よく交配する能力の利点を取り込むことによって向上させることができる。その無性生活環において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、一倍体ゲノムを有し、即ち、あらゆる染色体は、単一コピーとして存在する。ある種の条件下で、一倍体細胞は交配することができる。この方法によって、二倍体細胞が形成される。二倍体細胞は、特にある種の栄養素が欠損した場合、再び一倍体細胞を形成することができる。次いで、これらは、減数分裂と呼ばれる過程を経て、続いて胞子形成し、四つの一倍体胞子を形成する。減数分裂中に、二つの親ゲノムの異なった染色体が組換わる。減数分裂組換え中にＤＮＡ断片が交換され、組換えＤＮＡ物質がもたらされる。
【００１４】
ＷＯ２００５／０７５６５４Ａ１（７）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で組換えＤＮＡ配列を作り出すための系を開示しており、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの有性生殖サイクルに基づいている。ヘテロ接合性二倍体細胞は、減数分裂及び胞子形成の過程を誘導する条件下で培養される。減数分裂は、一般的に、遺伝子組換えの頻度の上昇によって特徴づけられる。従って、一倍体細胞又は胞子である減数分裂の産物は、二つの互いに異なるＤＮＡ配列間の組換えに起因する組換えＤＮＡ配列を含有することができる。反復的方法によって、組換え二倍体の子孫は、選択され、そして互いに交配され、得られた二倍体は、再び胞子形成し、そしてその子孫の胞子は、適当な選択条件にかけられて、新しい組換え現象が確認される。この過程は、野生型又はミスマッチ修復欠損Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において記載されている。従って、それぞれ二つの選択マーカーによって隣接された興味のある遺伝子は、ミスマッチ修復欠損二倍体株の二つの娘染色体のそれぞれの同一遺伝子座に組込まれる。ＤＮＡ配列は、ＤＮＡが組込まれるべき遺伝子座の隣接するＤＮＡ配列に、１００％同一である新しいＤＮＡ断片の５’又は３’末端に加えられる。これらの隣接標的配列は、約４００−４５０個のヌクレオチドの長さである。次いで細胞は、胞子形成を開始するよう強いられる。胞子形成中に、組換え過程が起こる。得られた胞子及び組換え配列は、適当な隣接マーカーについての選択によって識別することができる。
【００１５】
相同ＤＮＡ配列を効率よく組換える酵母の能力は、ライブラリーの多様性を増加させるために活用することもできる。８９．９％の相同性を共有する二つの遺伝子が、ＰＣＲによって変異され、そして野生型酵母に形質転換された場合、１０ｅ７個のキメラライブラリーが、ｉｎ  ｖｉｖｏの相同組換えによって作成され、二つの遺伝子全体にわたって幾つかのクロスオーバーの点が示される（８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７８０７４２２号Ｂ２（３）：Ｋｏｆｆａｓ  Ｍ．，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｅ．，Ｙａｎ  Ｙ．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ０５−Ｏｃｔ−２０１０．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
【特許文献２】ＷＯ１９９０００７５７６Ａ１（６）：Ｒａｄｍａｎ  Ｍ．ａｎｄ  Ｒａｙｓｓｉｇｕｉｅｒ  Ｃ．ＷＯ  ｐａｔｅｎｔ  １９９０．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
【特許文献３】ＷＯ２００５／０７５６５４Ａ１（７）：Ｓｍｉｔｈ  Ｋ．ａｎｄ  Ｂｏｒｔｓ  Ｒ．ＷＯ  ｐａｔｅｎｔ  ２００５．Ｇeｎeｒａｔｉｏｎ  ｄｅ  ｇeｎｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｄａｎｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ（１）：Ｓｈａｏ  Ｚ．，Ｚｈａｏ  Ｈ．ａｎｄ  Ｚｈａｏ  Ｈ．２００９．ＤＮＡ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ，ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７（２）：ｅ１６  Ｅｐｕ
【非特許文献２】Ｅｌｅｆａｎｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２）：Ｅｌｅｆａｎｔｉ  Ａ．，Ｂｅｇｌｅｙ  Ｃ．，Ｍｅｔｃａｌｆ  Ｄ．，Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｌ．，Ｋｏｎｔｇｅｎ  Ｆ．ａｎｄ  Ｒｏｂｂ  Ｌ．１９９８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＳＣＬ，ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌａｃＺ  “ｋｎｏｃｋ−ｉｎ”  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５，１１８９７−１１９０２
【非特許文献３】Ｎａｅｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（４）：Ｎａｅｓｂｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．８：４５
【非特許文献４】Ｔｒａｎｔａｓ  ｅｔ  ａｌ（５）：Ｔｒａｎｔａｓ  Ｅ．，Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ．ａｎｄ  Ｖｅｒｖｅｒｉｄｉｓ  Ｆ．２００９．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｔｉｌｂｅｎｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１１：３３５−３６６
【非特許文献５】（８）：Ｓｗｅｒｓ  Ｊ．，Ｋｅｌｌｏｇｇ  Ｂ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．２００４．Ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（３）ｅ３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
組換え宿主を操作することによって代謝経路を改善し、工業的規模で小分子を産生するために、努力がなされたが、このような代謝産物のバリアントは、例えば中間体の蓄積をもたらす不完全な経路によって、散発的に見いだされるのみであった。
【００１９】
代謝経路の産物としての天然の芳香族小分子のバリアントを産生するための改善された方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この目的は、本発明の実施態様の提供によって達成される。
【００２１】
発明の概要
本発明によれば、少なくとも一つの遺伝子Ａの遺伝子モザイクを使用する、代謝経路の体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの構築及び組換えによる、前記代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントの代謝的進化のための方法が提供され、これは、
ａ）一段階法で、
（ｉ）細胞を、細胞ゲノムの不可欠な部分であるか又は遺伝子構築物のフレームワーク中に存在する組換えられるもう一つの遺伝子と、９９．５％より少ない配列相同性を有する、少なくとも一つの遺伝子Ａで形質転換し、
（ｉｉ）前記遺伝子を組換え、
（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位において当該遺伝子の遺伝子モザイクを生成させ、ここで前記少なくとも一つの遺伝子Ａは、５’末端又は３’末端の何れかに前記組込み部位の５’又は３’末端に固着する単一の隣接標的配列を有する、
（ｉｖ）前記代謝経路の最終的な更なる遺伝子を組換え、そして
ｂ）前記遺伝子モザイクと前記バリアントを発現することが可能な前記最終的な更なる遺伝子とを含んでなるクローンを選択すること、
を含んでなる。
【００２２】
選択マーカーが遺伝子モザイクで使用され、そしてクローンが選択マーカーの存在によって選択されることが特に好ましい。例えば、遺伝子モザイクは、選択マーカーを含んでなり、例えば、前記遺伝子Ａは選択マーカーに連結される。或いは、選択は、組換え体に由来するいずれもの産物の存在によって、例えば収率又は機能的特徴を決定することによって、行うこともできる。具体的には、１つまたはそれより多くの異なる選択マーカーを使用して、遺伝子モザイクのタイプを区別することができる。
【００２３】
本発明の方法のために有用である選択マーカーは、既知の栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、ノックインマーカー、活性化因子／結合ドメインマーカー及び優性劣性マーカー並びに比色マーカーの何れかからなる群から選択することができる。好ましいマーカーは、一時的に不活化又は機能的にノックアウトすることができ、そしてそのマーキング特質を回復するように再建することができる。更なる好ましいマーカーは、追跡可能な遺伝子であり、ここで当該マーカーは、遺伝子配列Ａの何れかの機能、及び／又はマーカー機能を持つ別個の配列を伴わない、遺伝子Ｂのような他の遺伝子（１つまたは複数）であり、そのため遺伝子モザイクの発現は、モザイク自体の検出によって直接決定することができる。この場合、遺伝子モザイクは、直接追跡可能である。
【００２４】
具体的な態様によれば、前記遺伝子は、直線状ポリヌクレオチド、ベクター又は人工酵母染色体に含まれる。具体的には、遺伝子Ａ及び／又は組換えられる他の遺伝子は、好ましくは３００ないし２０，０００ｂｐの直線状ポリヌクレオチドの形態である。具体的には、プラスミド又はメガプラスミドを構築或いは使用する必要はない。従って遺伝子（１つ又は複数）は、そのままで、即ち、担体を伴わずに使用することができる。
【００２５】
組換え及び組込みのために使用される遺伝子は、いずれもの遺伝子構築物中に含まれることもでき、例えば、前記遺伝子（１つ又は複数）を運ぶためのベクターとして使用することができる。従って、前記遺伝子は、遺伝子構築物、例えば直線状ポリヌクレオチド、ベクター又は人工酵母染色体中に含まれることができる。これらは、好ましくは、直線状ポリヌクレオチド、プラスミド、ＰＣＲ構築物、人工酵母染色体のような人工染色体、ウイルスベクター又は転位因子を含む。
【００２６】
本発明の具体的な態様によれば、標的ゲノムの組込み部位は、遺伝子の何れか上に、例えば直線状ポリヌクレオチド、プラスミド又は人工染色体を含む染色体内に位置する。
【００２７】
具体的には、前記もう一つの遺伝子は、標的ゲノムの一部、例えば細胞のゲノムである。好ましい態様において、前記もう一つの遺伝子は、細胞のゲノムの一部である遺伝子Ｂである。
【００２８】
別の好ましい態様によれば、前記もう一つの遺伝子は、直線状ポリヌクレオチドのような標的ゲノムから分離された遺伝子構築物であり、そして組換えの過程で標的ゲノムに所望により組込まれる。
【００２９】
本発明による方法の具体的な側面によれば、細胞は、少なくとも一つの遺伝子Ａ及び少なくとも一つの遺伝子Ｂで同時形質転換され、ここで、前記遺伝子Ａの単一の隣接標的配列は、前記標的ゲノム上の組込み部位の５’末端に固着し、そしてここで、遺伝子Ｂは、組込み部位の３’末端に固着する単一の隣接標的配列に連結されている。
【００３０】
具体的には、細胞は、選択マーカーを持つ少なくとも一つの遺伝子Ａ及び少なくとも一つの遺伝子Ｂで同時形質転換されることができ、ここで、前記遺伝子Ａの単一の隣接標的配列は、前記標的ゲノム上の組込み部位の５’末端に固着し、そしてここで、遺伝子Ｂは、異なった選択マーカー及び当該組込み部位の３’末端に固着する単一の隣接標的配列に連結されており、そしてここで、少なくとも二つの選択マーカーについてクローンが選択される。
【００３１】
具体的には、細胞は、少なくとも二つの異なる遺伝子Ａ１及びＡ２で、そして所望により少なくとも二つの異なる遺伝子Ｂ１及びＢ２で、同時形質転換される。
【００３２】
本発明による方法の更なる側面によれば、少なくとも一つの更なる遺伝子Ｃが同時形質転換され、これは、遺伝子Ａ及び／又は前記もう一つの遺伝子、例えば遺伝子Ｂ、の配列とハイブリダイズする配列を有し、前記更なる遺伝子Ｃの遺伝子Ａ及び／又は前記もう一つの遺伝子への構築並びに最終的な組換えを得る。
【００３３】
具体的には、前記遺伝子Ｃのハイブリダイズする配列は、前記配列に対する９９．５％より少ない配列相同性を、そして好ましくは少なくとも３０％の配列相同性を有する。
【００３４】
具体的には、少なくとも一つのヌクレオチド交換、又は遺伝子内のクロスオーバーを有する遺伝子モザイク、即ち、遺伝子Ａの一部、並びに結合された前記もう一つの遺伝子（１つ又は複数）の一部を含んでなるもののような遺伝子内クロスオーバーを持つモザイク、が選択され、これは、例えば改善された特質又は改善された収率を有する、異なった方法での産物の発現のために適した遺伝子のような、組換え遺伝子内遺伝子モザイクを得るための、部分的遺伝子の混合物として理解される。このような遺伝子内遺伝子モザイクは、組換え、そして好ましくは、更に一連の遺伝子の構築によって、産生することができ、ここで、一つ又はそれより多い構築された遺伝子は、このような遺伝子内遺伝子モザイクを有する。
【００３５】
好ましい態様によれば、少なくとも三つの異なった遺伝子、Ａ及び／又はＢ及び／又はＣのモザイクを得ることができる。
【００３６】
好ましくは、前記遺伝子Ａ及び／又は前記もう一つの遺伝子は、非翻訳配列、又はポリペプチドもしくは活性を有するポリペプチドの一部をコードする配列である。
【００３７】
具体的には、本発明の方法は、活性を有するポリペプチドの一部をコードする遺伝子Ａ、Ｂ及び／又はＣを使用する。従って、遺伝子Ａ及び／又はＢ及び／又はＣのような遺伝子、好ましくはこれらの全ては、生物学的に活性なポリペプチドをそのまま個々にはコードしないが、しかしその一部のみをコードするものであり、そして遺伝子構築によってのみ、それぞれの活性又は修飾された活性をもたらすことができる。
【００３８】
本発明の方法を使用すれば、生化学的経路のポリペプチドをコードする多数の遺伝子を、構築し及び組換えることができる。好ましい態様によれば、前記代謝経路の少なくとも二つの遺伝子を組換え及び構築することができ、例えば、前記代謝経路のポリペプチドをコードする少なくとも二つの遺伝子を組換え及び構築することができる。
【００３９】
具体的には、前記遺伝子は、好ましくは３００ないし２０，０００ｂｐの直線状ポリヌクレオチドである。
【００４０】
具体的な態様によれば、少なくとも３個、好ましくは少なくとも９個、２０，０００個までの塩基対の、好ましくは、７００ｂｐ当たり少なくとも３個のクロスオーバー現象を伴う遺伝子モザイクが得られる。少なくとも一つの遺伝子内モザイクを、好ましくは７００個の塩基対当たり、より好ましくは６００ｂｐ当たり、５００ｂｐ又はなお少ない塩基対当たり、少なくとも３回のクロスオーバー現象、好ましくは少なくとも４、５、又は１０個のクロスオーバー現象を伴って、含んでなる、遺伝子モザイクが好ましい。典型的には、高い程度のクロスオーバー現象は、組換えられた遺伝子の大きい多様性を提供し、これは、適したライブラリーのメンバーを選択するためのライブラリーを作成するために使用することができる。モザイク又はクロスオーバー現象の程度は、このようなライブラリーの品質のパラメーターとして理解することができる。
【００４１】
本発明による方法は、具体的には、遺伝子内遺伝子モザイクを有する少なくとも一つのクローンの選択を提供する。具体的には、遺伝子構築物及び少なくとも一つの遺伝子内遺伝子モザイクを有する少なくとも一つのクローンが選択される。
【００４２】
本発明の方法によって修飾される遺伝子は、例えば科学的又は工業的目的のための、有機小分子を産生するための原料物質の酵素的加工のために有用ないずれもの遺伝子であることができる。これらの遺伝子は、例えば、ポリペプチドのバリアントを、全て又は部分的にコードすることができ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードしない部分配列を含み、このポリペプチドは、具体的には、酵素、転写因子、運搬タンパク質、シグナルペプチド、受容体、ホルモン、成長因子からなる群から選択され、しかしプロモーター、ターミネーター及び産物の発現を改善することができる他の制御因子のような非ポリペプチド遺伝子をコードすることもできる。
【００４３】
従って、本明細書中で理解されるような“酵素的進化”又は“酵素的合成”を含む“代謝的進化”のための配列の組換え及び／又は構築は、酵素バリアントによるか、又は、補助因子を含む酵素の発現もしくは活性を改善する化合物によるような、代謝経路の酵素的加工を支持する配列モザイクを指すが、しかし非コード配列も含む。
【００４４】
生物学的活性を有するポリペプチドの一部としてのアミノ酸配列をコードする、“部分的遺伝子”とも呼ばれる遺伝子が修飾される場合、このような部分的遺伝子の構築物が機能的特徴を有すること、例えば生物学的活性を有するポリペプチドをコードすること、が好ましいことでありうる。好ましくは、多くの異なった遺伝子、例えば３ｂｐないし２０，０００ｂｐの範囲の、具体的には少なくとも１００ｂｐ、好ましくは３００ｂｐないし２０，０００ｂｐ、具体的には１０，０００ｂｐまでのサイズの、異なった部分的遺伝子が組換えられ、この異なった遺伝子の数は、少なくとも２個、より具体的には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個であり、例えば生物学的活性を有する組換えポリペプチドをコードする組換え遺伝子配列を産生し、当該組換えポリペプチドは、有利に調節されており、例えば増加した生物学的活性を有する。用語“生物学的活性”は、これに関して使用される場合、具体的には特定の基質を特定の産物に転換する活性のような酵素活性を指す。本発明によって多様化されるような好ましい遺伝子は、多鎖ポリペプチドをコードする。
【００４５】
本発明による方法は、具体的には、常に中間体を含む、フェニルプロパノイド、フラボノイド、フラバノール、アントシアニン、リグニン、シアニジン、カルコン、バニリン、及び天然に存在するこれらの誘導体からなる群から選択される天然の芳香族小分子に関連している。
【００４６】
特に、前記バリアントは、組換え酵素バリアントによって合成される。
【００４７】
具体的態様において、酵素バリアントは、そのような遺伝子モザイクによって、例えば、遺伝子モザイクの組換え及び最終的な構築によって直接的に、又はそのような遺伝子モザイクの結果として、例えば酵素的過程の連続によって、得られる。例示的な方法は、桂皮酸−４−ヒドロラーゼ（Ｃ４Ｈ）及び改善された又は新しい酵素学的特質を有する酵素をコードするＣ４Ｈから作り出された遺伝子に関連している。
【００４８】
４−クマロイルＣｏＡは、ポリプロパノイド代謝における中心的分子であり、そしてこれは、フラボノイド及びスチルベンの合成を定義するための重要な分岐点であるリガーゼ４ＣＬの基質でもある。鍵となる酵素ＣＨＳは、フラボノイド及びイソフラボンの両方の合成のための中間体として使用されるカルコンを合成する。
【００４９】
好ましい態様によれば、前記バリアントは、抗細菌剤、抗酸化剤、芳香剤及び例えば機能アッセイによって決定される風味活性からなる群から選択される生物学的活性を持つフェニルプロパノイドである。
【００５０】
具体的には、好ましい方法は、生物学的活性を有する少なくとも二つの酵素を含んでなる、酵素及び酵素経路の組換え及び構築を使用し、生物学的原料物質又は配列を加工するための、それぞれの遺伝子モザイクを有する酵素バリアント又は経路バリアントを得て、新しい構造及び機能を持つ天然の芳香族小分子のこのようなバリアントを産生する。これによって、酵素的進化により新しい小分子を合成することが可能になった初めてのことであった。
【００５１】
いずれもの組換え適格性の真核又は原核宿主細胞は、本発明による体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの組換えによって、遺伝子モザイクを生成するために使用することができる。本発明の好ましい態様によれば、細胞は、修復欠損細胞、例えばＤＮＡ修復欠失を伴うような核酸修復欠損細胞、即ち、ＤＮＡ修復欠損細胞、又はＭＭＲ欠損細胞である。
【００５２】
具体的には、細胞は、真核細胞、好ましくは真菌、哺乳動物又は植物細胞、或いは原核細胞である。
【００５３】
好ましくは、細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ又は真菌細胞であり、好ましくは、これは、サッカロミセス、カンジダ、クルイベロミセス、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、ピキア及びアスペルギルス属からなる群から選択することができる。
【００５４】
好ましくは、一倍体酵母株のような一倍体株が使用される。
【００５５】
或いは、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルス、ストレプトマイセスのような原核細胞、或いはＨｅＬａ細胞又はジャーカット細胞のような哺乳動物細胞、或いはシロイヌナズナのような植物細胞を使用することができる。
【００５６】
具体的な態様によれば、隣接標的配列は、少なくとも５ｂｐ、好ましくは少なくとも１０ｂｐ、より好ましくは少なくとも２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５，０００ｂｐまでの長さである。具体的には、隣接標的配列は、前記遺伝子に連結されているか、又は前記遺伝子の不可欠の末端部分である。前記隣接標的配列が、３０％ないし９９．５％の範囲の、好ましくは９５％より少ない、９０％より少ない、８０％より少ない相同性を有し、前記組込み部位の固着配列とハイブリダイズすることが好ましい。
【００５７】
ゲノムの標的組込み部位に固着する少なくとも二つの異なった隣接標的配列が、本発明によって使用される場合、これらが互いと組換わらないことが好ましく、好ましくは、これらは、３０％より少ない相同性を共有する。
【００５８】
本発明の特別の態様によれば、本発明による方法を使用して、細胞中の遺伝子モザイクの変種を作り出し、そしてモザイクのライブラリーを得るために前記細胞の表面上に前記変種を提示することを含んでなる、遺伝子バリアントの細胞ディスプレイの方法が提供される。
【００５９】
本発明の具体的な側面によれば、代謝経路の天然の芳香族小分子産物のバリアントを産生する細胞のライブラリーであって、少なくとも一つの遺伝子Ａの遺伝子モザイクを使用する、前記代謝経路の体細胞性のｉｎ  ｖｉｖｏの構築及び組換えによって組換え細胞を操作することを含んでなる、前記ライブラリーが提供され、これは、
ａ）一段階法で、
（ｉ）細胞を、細胞ゲノムの不可欠な部分であるか又は遺伝子構築物のフレームワーク中に存在する組換えられるもう一つの遺伝子と、９９．５％より少ない配列相同性を有する、少なくとも一つの遺伝子Ａで形質転換し、
（ｉｉ）前記遺伝子を組換え、
（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位において当該遺伝子の遺伝子モザイクを生成させ、ここで前記少なくとも一つの遺伝子Ａは、５’末端又は３’末端の何れかに前記組込み部位の５’又は３’末端に固着する単一の隣接標的配列を有する、
（ｉｖ）前記代謝経路の最終的な更なる遺伝子を組換え、そして
ｂ）前記遺伝子モザイクと、前記バリアントを産生することが可能なライブラリーを得るための前記最終的な更なる遺伝子とを含んでなるクローンを収集すること、
を含んでなる。
【００６０】
本発明のもう一つの側面によれば、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％機能的ＯＲＦを含有する、前記バリアントを産生する少なくとも１０Ｅ３個の異なったクローンを含んでなるような方法によって得ることが可能なライブラリーが提供される。
【００６１】
用語“得ることが可能”は、方法によって得られる産物にも関連していることは十分に理解される。
【００６２】
具体的な態様によれば、代謝経路のレパートリーをコードする組換え遺伝子を含んでなる細胞のライブラリーが、提供され、これは、本発明による方法によって得ることが可能である。
【００６３】
具体的には、ライブラリーは、合成酵素のレパートリーをコードする組換え遺伝子を含んでなる細胞のライブラリーである。
【００６４】
具体的には、合成組換え酵素のライブラリーが提供され、これは、本発明による方法によって得ることが可能なこのようなライブラリーから得ることが可能である。
【００６５】
このような好ましいディスプレイによって得ることができるライブラリーは、具体的には、機能的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の高いパーセントの、好ましくは少なくとも８０％の、遺伝子モザイクを含んでなる。
【００６６】
本発明によるライブラリーは、具体的には、いずれもの適した形態、具体的には、遺伝子バリアントを含有する各種の生物体を含んでなる生物学的ライブラリーであることができる。本発明による生物学的ライブラリーは、生物体の集団に含有されるか、及び／又は当該集団によって特異的に発現され、生物体のレパートリーを作り出すことができ、ここで、個々の生物体は、少なくとも一つのライブラリーのメンバーを含む。
【００６７】
本発明の具体的な側面によれば、このようなライブラリーからの遺伝子バリアントを含んでなる生物体、例えば、生物体のレパートリーから選択される生物体が、更に提供される。本発明によって提供されるような生物体は、適した発現系中での遺伝子発現産物を発現させるために、例えば産生宿主細胞として、使用することができる。
【００６８】
本発明による方法は、好ましくは、本発明によるライブラリーから天然の芳香族小分子のバリアントを、例えば機能的アッセイによって、選択することを更に提供する。
【００６９】
バリアントを、例えば前記バリアントの構造及び機能を決定することによって、更に特徴付けすることが好ましい。
【００７０】
具体的な態様において、この方法は、組換え宿主中で前記バリアントを産生することを更に含んでなる。
【００７１】
もう一つの具体的な態様において、この方法は、更に、前記バリアントを合成的に製造することを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ｉｎ  ｖｉｖｏの非減数分裂組換えを示す。同祖的（ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子Ａ及びＢ（９９．５％より少ない相同性）を組換えた。マーカー配列及び隣接標的配列は相同ではないため、組換え／構築は、遺伝子Ａ及びＢ間でのみ起こった。結果として、ハイブリッド／モザイクＤＮＡは、組換えられた遺伝子Ａ及びＢ、二つのマーカー並びに両方の隣接標的配列を含有していた。遺伝子モザイクは、標的染色体の標的遺伝子座に組込まれる。全構築物を組込まれたクローンは、両方のマーカーに対して選択的である適当な培地上で増殖させた。Ｔ５’及びＴ３’は、染色体部位への相同的組込みを行う酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上の標的配列（９９．５％より少ない相同性）に対応する。Ｍ１及びＭ２は、二重選択のための隣接マーカーである。遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは、所定の程度の相同性（９９．５％より少ない）を持つ関連する同祖バージョンである。重複配列は、両方の遺伝子の全ＯＲＦに対応する。ＭＭＲ欠損酵母形質転換体中の同祖的組換えによる構築後、二重選択は組換え体の単離を可能にする。
【図２】図２は、同祖的組換えによるＤＮＡの組換え及び構築を示す。この図は、具体的な態様の概略図を示し、ここで、細胞は、少なくとも二つの遺伝子、ここではＤＮＡ断片Ａ及びＢ、で同時形質転換され、これは、８０ｂｐのその重複部分について９９．５％より少ない相同性を有する。それぞれのＤＮＡ断片は、一つの選択マーカーによって隣接されていた。断片Ａは、染色体上の５’末端の正確な組込み部位に対応する隣接標的配列及び断片Ｂと重複するハイブリダイズする領域を含有し、断片Ｂは、３’組込み部位に対応する隣接標的配列及び断片Ａと重複するハイブリダイズする領域を含有していた。ミスマッチ欠損酵母細胞を、得られた断片で形質転換した。得られた形質転換体を、両方のマーカーに対して選択的である培地上に播種した。両方のマーカーに対して選択することができるクローンを、単離し、そして構築された／組込まれたクラスターの完全性、並びに遺伝子Ａ及びＢのＯＲＦの再構成を、選択された組換え体のゲノムＤＮＡの分子分析によって検証した。Ｔ５’及びＴ３’は、染色体部位への相同的組込みを行う酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上の標的配列（９９．５％より少ない相同性）に対応する。Ｍ１及びＭ２は、二重選択のための隣接マーカーである。ＤＮＡ断片Ａ及びＢは、ＧＦＰのように追跡可能であることができる一つの遺伝子に構築されることができるか、この方法によって構築される二つの遺伝子を表すことができるかの何れかである。全ての遺伝子の重複配列は、９９．５％より少ない相同性を有し（１２０ｂｐ）、同祖的組換えによる構築後のＯＲＦの再構成を可能にする。二重選択は、組換え体の単離を可能にし、そして構築の一次検証として役立つ。
【図３】図３は、遺伝子Ａ、Ｂ及びＣの組換え及び構築を示す。この図は、更なる遺伝子Ｃの同時形質転換を示し、これは、前記遺伝子Ｃの遺伝子Ａ及びＢへの構築を得るための、遺伝子Ａ及び／又はＢの隣接配列とハイブリダイズする配列を有する。Ｔ５’及びＴ３’は、染色体部位への相同的組込みを行う酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上の標的配列（９９．５％より少ない相同性）に対応する。Ｍ１及びＭ２は、二重選択のための隣接マーカーである。遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ及び遺伝子Ｃは、所定の程度の相同性（９９．５％より少ない）を持つ関連する同祖性バージョンである。重複配列は、遺伝子の５’部分及び３’部分に対応する。遺伝子Ｂは、隣接断片と接続し、そして新しいＯＲＦのＡＢＣが配列の類似性によって再構成される。ＭＭＲ欠損酵母形質転換体中の同祖的組換えによって構築された後、二重選択は、組換え体の単離を可能にする。
【図４】図４は、同祖的遺伝子配列を含有する断片によるフラボノイド経路の構築を示す。この図は、フェニルアラニンから出発するフラボノイド産生のための８個の遺伝子を含んでなる８個の断片の同時形質転換を示す。それぞれの断片は、それぞれの親遺伝子（同祖又は相同配列）の全ＯＲＦの領域中のみでハイブリダイズし、そして組換わる。この方法により、全経路がＤＮＡ修復欠損酵母細胞中に構築され、そして次いで、染色体に組込まれる。Ｔｇ５’及びＴｇ３’は、所望の染色体部位への相同的組込みをもたらす酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上の標的配列（９９．５％より少ない相同性）に対応する。ＵＲＡ３及びＨＰＨ（ハイグロマイシン耐性）は、組換え経路の二重選択を可能にする隣接マーカーである。遺伝子ＣＨＩ、Ｆ３Ｈ、ＰＡＬ、ＣＨＳ、Ｃ４Ｈ、ＦＬＳ、及び４ＣＬは、所定の程度の相同性（９９．５％より少ない）を持つ関連する同祖バージョンである。それぞれの遺伝子は、酵母細胞中のこれらの発現を可能にする一つのプロモーター及び一つのターミネーター配列を保有する。重複配列は、遺伝子の全ＯＲＦに対応する。ＭＭＲ欠損酵母形質転換体中の同祖的組換えによる断片の構築後、機能的に組換えられた完全な経路が再構成され、そして二重選択は、組換え体の単離を可能にする。それぞれの遺伝子の植物供給源は、３文字で、これもまた３文字で示される遺伝子名に続いて、示される。対応する植物種は、左側に示される。遺伝子の同祖性バージョン間の配列の同一性は、パーセントで示される。幾つかの断片の傍の記号＊は、これらが相同的組込みのためにも使用されたことを示し、重複断片の遺伝子配列が、１００％同一（野生型対照、クローンＨ３）であることを意味する。
【図５】図５は、新しい組換えフラボノイド経路の構造及び構築のためのそれぞれの断片を増幅するために使用されたプライマーを示す。この図は、図４に記載したような合成ＤＮＡ断片との形質転換後のＤＮＡ修復欠損酵母細胞中に組込まれたフラボノイド経路の最終的なｉｎ  ｖｉｖｏの組換えられた構造を示す。灰色の矢印（一番目及び最後の矢印）は、選択マーカーに対応し、黒の矢印は、フラボノイド経路のために特異的な遺伝子を示し、そして白の長方形はそれぞれの遺伝子に対するプロモーター及びターミネーター配列を表す（詳細は、図４を参照されたい）。更に、この図は、図４に出てくるそれぞれの断片を増幅するために使用されるプライマーを記載する。プライマーの詳細及び機能については、表６を参照されたい。
【図６】図６は、経路の構築を検証するために、そして配列決定のための組換え遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを示す。図５のように、この図は、酵母中の組込み後の断片の構築を検証するために、そして配列決定分析のための組換え遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを示す。プライマーの詳細及び機能については、表７を参照されたい。
【図７−１】図７は、クローンＭ１から得られた組換え経路のモザイク配列を示す。７Ａ：この絵は、フラボノイド経路の発現カセットを含有する断片の酵母中の構築及び組込みから得られる７個の組換え遺伝子のモザイク構造を示す。ゲノムのＤＮＡは、選択されたクローンから抽出し、そして特異的プライマーを使用して組換えフラボノイド遺伝子を増幅させた。白の長方形は、親遺伝子Ａ由来の配列に対応する（即ち、ＰＡ＝Ｇｌｙｓｉｎｅ  ｍａｘ．からのＣＨＩ遺伝子であり、Ｈ３［野生型対照］クローン中にも存在する）。黒の長方形は、親遺伝子Ｂ由来の配列に対応する（即ち、ＰＢ＝Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｓｐ．からのＣＨＩ遺伝子である）。Ｍ１クローンの遺伝子配列中の一つより多いヌクレオチド交換の存在は、構築の結果としての親遺伝子間のクロスオーバー現象を証明する（詳細については図１４の配列を参照されたい）。
【図７−２】７Ｂ：使用されたそれぞれの親遺伝子に対する遺伝子名及び植物供給源への言及である。
【図８】図８は、フラボノイド経路を含有する組換えクローン由来の酵母上清の静菌効果を示す。この図は、フラボノイド遺伝子を発現する酵母培養上清の、Ｅ．ｃｏｌｉ培養細胞に対する阻害効果を示す。１／１０体積の、組換えフラボノイド経路を含有するクローンの誘導された上清を、９／１０の体積の、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞を０．０５のＯＤ６００で播種したＬＢに加えた。幾つかの時点で、ＯＤを測定し、そして得られた値を、フラボノイド遺伝子を発現していない対応する対照と比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ増殖に対する強力な阻害効果が、クローンＨ３、Ｍ１、Ｍ７及びＭ８の上清を加えた場合に観察された。クローンＭ３及びＭ４について、並びに陰性対照クローンＹ２６について、又は酵母培地のみの使用では、顕著な効果は観察されなかった。
【図９】図９は、酵母培養上清中のフラボノイドの存在下でのＤＰＨのクエンチングを示す。この図は、組換えフラボノイド経路を発現するクローンによって産生された化合物が、フラボノイドの事例において知られるように、ＤＰＨをクエンチすることが可能であることを示す。組換えフラボノイド経路を含有するクローンの酵母培養の誘導上清を、酢酸エチルで抽出し、そして凍結乾燥した。ペレットを、初期体積の１／１０の７０％エタノール中に回収した。それぞれの試料に対して、９μｌを、１μｌの０．１ｍＭのＤＰＨ（ＤＭＳＯ中の）に加え、そして混合した。次いで、５μｌを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ膜にのせ、そして試料のクエンチングをＵＶトランスイルミネーター上で観察した（挿入図Ａ）。Ｉｍａｇｅ−Ｊプログラムを、スポットのシグナル強度を測定するために使用した。値を、培地のみ（クエンチングなし）から調製した抽出物で得たシグナルに対して正規化した。ナリンゲニン（１μＭ）を、最大クエンチングの対照として使用した。Ｈ３、Ｍ１、Ｍ４及びＭ７クローンは、より高い値のクエンチングを示し、そしてクローンＭ２、Ｍ３及びＹ２６（陰性対照）では不良な効果が観察されたか、又は効果が観察されなかった。
【図１０−１】図１０は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ７の配列（配列番号１−１４）を示す。ＯＸＡ７起源のヌクレオチド配列は、太字で、そして下線が引かれ、変異ヌクレオチド配列は、太字で、そしてイタリックである。クローンを二重選択によって単離し、そしてＤＮＡを増幅及び配列決定のために使用した。両方の鎖の明確に読取り可能な配列のみを使用した。得られたクロマトグラムをＣｌｕｓｔａｌ様プログラムで整列させた。
【図１０−２】図１０は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ７の配列（配列番号１−１４）を示す。
【図１０−３】図１０は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ７の配列（配列番号１−１４）を示す。
【図１１−１】図１１は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ５の配列（配列番号１５−３８）を示す。ＯＸＡ５起源のヌクレオチド配列は、太字で、そして下線が引かれ、変異ヌクレオチド配列は、太字で、そしてイタリックである。クローンを二重選択によって単離し、そしてＤＮＡを増幅及び配列決定のために使用した。両方の鎖の明確に読取り可能な配列のみを使用した。得られたクロマトグラムをＣｌｕｓｔａｌ様プログラムで整列させた。
【図１１−２】図１１は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ５の配列（配列番号１５−３８）を示す。
【図１１−３】図１１は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ５の配列（配列番号１５−３８）を示す。
【図１１−４】図１１は、遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ５の配列（配列番号１５−３８）を示す。
【図１２】図１２は、親遺伝子ＯＸＡ１１（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＧＩ：２９６５４９、配列番号３９）、ＯＸＡ７（Ｅ．ｃｏｌｉ、ＧＩ：５１６１８８、配列番号４０）及びＯＸＡ５（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＧＩ：４８８５６、配列番号４１）の配列を示す。
【図１３−１】図１３は、同祖的構築ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応する複合モザイク遺伝子を含んでなるクローンの配列を示す。配列のクローン及びそれぞれのタンパク質アニーリングの結果：ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７の、図１３ａ）ＯＵＬ３−０５−ＩＩ（配列番号４２及び４３）、図１３ｂ）ＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ（配列番号４４及び４５）、図１３ｃ）ＯＵＬ３−０５−ＩＶ（配列番号４６及び４７）、図１３ｄ）ＯＵＬ３−０５−ＩＸ（配列番号４８及び４９）及び図１３ｅ）ＯＵＬ３−０５−Ｘ（配列番号５０及び５１）。ＯＸＡ５のヌクレオチド配列は、太字であり、ＯＸＡ７に対応するものは下線を引いてある。太字でなく、下線のない配列は、ＯＸＡ１１に対応する。
【図１３−２】図１３は、同祖的構築ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応する複合モザイク遺伝子を含んでなるクローンの配列を示す。
【図１３−３】図１３は、同祖的構築ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応する複合モザイク遺伝子を含んでなるクローンの配列を示す。
【図１３−４】図１３は、同祖的構築ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応する複合モザイク遺伝子を含んでなるクローンの配列を示す。
【図１３−５】図１３は、同祖的構築ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応する複合モザイク遺伝子を含んでなるクローンの配列を示す。
【図１４−１】図１４は、実施例３の組換えクローンの配列を示す。配列番号：５２−５８として提供される配列のクローン及び結果。
【図１４−２】図１４は、実施例３の組換えクローンの配列を示す。
【図１４−３】図１４は、実施例３の組換えクローンの配列を示す。
【図１５】図１５は、組換えクローンＭ１の誘導されたモザイクＣ４Ｈ酵素が、対照のクローンＨ３と比較してより高い量のｐ−クマル酸を蓄積することが可能であることを示す。この図は、部分的誘導条件下で、そして培養物に桂皮酸を加えることによって、クローンＭ１（モザイクフラボノイド経路）の上清が、対照（モザイクなし）のＨ３クローンより２倍多いｐ−クマル酸を含有していたことを示す。培養物を、ＰＡＬ活性を抑制するためにグルコースの存在下で、Ｃ４Ｈ発現を誘導するために外因性フェニルアラニン及びメチオニンを用いずに増殖させた。桂皮酸の供給を、１５０μＭの前駆体を培地に加えることによって行った。培養物のアリコートを異なった時点で採取し、そして細胞をペレット化することによって上清を得た。上清をＳＰＥカラム上で抽出し、そしてメタノール抽出物を、（４）に記載されるような、アセトニトリル／水の勾配のＣ１８ＨＰＬＣカラムを使用する標準的なプロトコルによって分離した。上清中のｐ−クマル酸及び桂皮酸のモル濃度を、標準分子による補正に先立つピーク下面積を使用して計算した。値を、培養物中の細胞の数に対して正規化した。ｐ−クマル酸の産生を、連続した黒線で示す。Ｈ３対照クローンは、黒の四角に、そしてモザイクＭ１クローンは、黒の菱形に対応する。明るい灰色の線は、供給前駆体桂皮酸の枯渇を示す。
【図１６】図１６は、ナリンゲニン−カルコンの供給中の対照（モザイクではない）及びＭ１（モザイク）クローンの上清中の中間体及び最終フラボノイド産物の異なった収率を示す。この図は、完全に誘導された培養物に１５０μＭのナリンゲニン−カルコン（ＮＡＲ）を供給する場合、Ｈ３（黒い菱形、挿入図Ａ）より５倍高い、Ｍ１（黒い四角）上清中のｐ−クマル酸の量を示す。陰性対照の値は、灰色の三角で描かれる。上清をＳＰＥカラム上で抽出し、そしてメタノール抽出物を、（４）に記載されたようなＣ１８ＨＰＬＣカラム及びアセトニトリル／水の勾配を使用する標準的なプロトコルによって分離した。１２時間目における桂皮酸の産生及び消費（挿入図Ｂ）は、１２時間目のジヒドロケンフェロールの産生（挿入図Ｃ）と相関し、この最後のものは、確かに供給分子ナリンゲニン由来である。最後のフラボノイド産物のケンフェロールは、（１８時間、挿入図Ｄ）の直後に出現する。Ｍ１クローンは、対照のＨ３より３倍少ない量のケンフェロールを得るが、然しながらモザイククローンは、Ｈ３と比較してより多い前駆体を消費する。これらの差は、組換え誘導モザイク現象が、最終及び中間体産物の改善された産生をもたらすことを示唆し、そして組換え経路が、同一の培養及び供給で、前駆体及び／又は中間体の利用において、異なった挙動をとることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
従って、本発明は、同祖的なＤＮＡ配列、即ち、類似であるが同一ではない配列、のｉｎ  ｖｉｖｏの組換えのための新規かつ高効率の方法によって初めて可能になった、天然の芳香族小分子のバリアントの酵素的進化に関する。本明細書中で以下、用語相同的組換えは、同祖的配列が組換えられる場合には同祖的組換えと呼ばれることもあるが、同一であってもそうでなくてもよい、ある一定の相同性を有する配列の組換えを指す。部位特異的消化及びライゲーションに依存する慣用的なクローン化法と異なり、相同的組換えは、相補的配列を整列させ、そして断片間の交換を可能にする。組換えモザイク遺伝子は、ハイブリッド遺伝子とも呼ばれるが、ミスマッチ塩基を有する配列のハイブリダイゼーションによって細胞中に作り出される。このような本発明の変異誘発法によって、時間的に効率の良い様式で興味あるポリペプチドの適切な選択及び再設計のための多様性を容易に作り出すことが可能である。
【００７４】
具体的には、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏの組換えの機能的な系による、一段階法での、効果的な組換え並びに多様な遺伝子のモザイク形成、多様化及び構築を使用する。
【００７５】
用語“一段階法”は、遺伝子による細胞の形質転換、遺伝子の組換え、モザイク遺伝子の生成及び標的ゲノムへの遺伝子の組込みのような、組換え体を操作する幾つかの方法の工程が、一つの方法の工程で技術的に行われることを意味する。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏの組換えに先立つＤＮＡ担体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換え、又は減数分裂を使用するものを含む方法の工程のいずれもの繰返しサイクルの必要はない。好都合には、減数分裂酵母細胞の使用を回避することができる。
【００７６】
本発明による一段階法は、宿主によるこのような操作された組換え体の発現を、更に同時に含むことができる。これにより、発現産物を得るために、更なる操作は、必要ない。
【００７７】
本発明による用語“遺伝子モザイク”は、少なくとも一回のクロスオーバー現象を伴う少なくとも二つの異なった遺伝子の組合せを意味する。具体的には、このようなクロスオーバーは、ＤＮＡ配列の組合せ又は混合を提供する。遺伝子モザイクは、遺伝子（１つ又は複数）の遺伝子内混合、遺伝子内遺伝子モザイク、及び／又は遺伝子構築によって作成することができ、遺伝子構築は、例えば重複部分における遺伝子間クロスオーバーを伴う遺伝子構築物、及び重複を伴ってもよい一緒に並べられた複合遺伝子、更に所望により遺伝子内及び遺伝子間クロスオーバー（１回又は複数回）の両方又は遺伝子モザイク（１つ又は複数）を伴う遺伝子の構築物を得るために、遺伝子を連結すること、例えば少なくとも二つの直線状遺伝子又はその一部のヘッドトゥートウ（head-to-toe）接続、として理解される。
【００７８】
用語“クロスオーバー”は、二つのＤＮＡ鎖が、遺伝子情報、即ち、少なくとも一つのヌクレオチド、を交換することができる部位における遺伝子間の組換えを指す。クロスオーバー過程は、親遺伝子に由来する遺伝子又は配列の様々な組合せを有する子孫モザイク遺伝子をもたらす。
【００７９】
或いは、クロスオーバーに基づかない他の修復機構、例えば、鎖の接合後の不正確なヌクレオチドの認識、切除及び／又は置換を含んでなる、ヌクレオチド切除修復又は非相同性末端連結機構、を提供することができる。
【００８０】
用語“隣接標的配列”は、組換えられる遺伝子（１つ又は複数）Ａ及び／又は他の遺伝子（１つ又は複数）の部位を含むゲノム標的組込み部位、直線状ポリヌクレオチド、直線状又は環状プラスミドＹＡＣ等のような、興味のある標的に対して相補的であるヌクレオチド配列の領域を指す。相補性又は相同性の具体的な程度により、隣接標的配列は、標的組込み部位とハイブリダイズすることができ、そしてそこに遺伝子（１つ又は複数）を組込むことができる。
【００８１】
細胞の用語“ゲノム”は、遺伝子及びＤＮＡの非コード配列によって表される、生物の遺伝情報の全体を指し、例えば遺伝子Ａ及び／又は組換えられる他の遺伝子（１つ又は複数）を含む直線状ポリヌクレオチド、ウイルス、自己複製担体及びベクター、プラスミド、並びに転移因子のような、染色体性又は非染色体性のいずれかの遺伝因子であり、人工染色体等を含む。人工染色体は、直線状又は環状のＤＮＡ分子であり、これは、細胞中への導入において安定な維持のために必要な全ての配列を含有し、ここで、これらは、天然の染色体と同様に挙動し、そして従って、ゲノムの一部と考えられる。
【００８２】
用語“相同性”は、二つ又はそれより多いヌクレオチド配列が、対応する位置において同一又は保存された塩基対を有する（１００％までのある程度まで）ことを示す。本発明によって使用される場合、相同的配列は、相補的、対応する又はマッチング配列とも呼ばれるが、好ましくは、本明細書中に開示される全長の天然のＤＮＡ配列又はＤＮＡ配列の断片に関して、それぞれの相補的配列と、例えば少なくとも３０％の配列同一性、しかし９９．５％より少ない、あるいは９５％より少ない、９０％より少ない、８５％より少ない又は８０％より少ない配列同一性を有する、相同な対応物配列とハイブリダイズする。好ましくは、相同的配列は、少なくとも約３０％のヌクレオチド配列の同一性、好ましくは少なくとも約４０％の同一性、より好ましくは少なくとも約５０％の同一性、より好ましくは少なくとも約６０％の同一性、より好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する。上記に引用したような上限及び下限を持つ好ましい範囲は、３０％ないし９９．５％の対応する配列の同一性の範囲にある。本明細書中で使用する場合、同一性の程度は、常に相補的配列に同様に当てはまる。
【００８３】
遺伝子のヌクレオチド配列に関する“同一性のパーセント（％）”は、配列を整列し、そして最大のパーセントの配列同一性を達成するために必要な場合にはギャップを導入した後の、そして配列同一性の一部としていずれもの保存的置換を考慮しない、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドと同一である候補ＤＮＡ配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。ヌクレオチド配列同一性のパーセントを決定する目的のための整列は、当該分野における技術の範囲内の各種の方法で、例えば、公的に使用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大の整列を達成するために必要ないずれものアルゴリズムを含む、整列を測定するための適当なパラメーターを決定することができる。
【００８４】
用語“固着”は、遺伝子又は遺伝子モザイクの、ゲノムの組込み部位へのこのような遺伝子又は遺伝子モザイクの組込みを可能にする、部分的又は完全な配列相同性を持つ“固着配列”と呼ばれるセグメントによる組込み配列への結合を意味する。具体的には、固着配列は、ゲノム配列の組込み部位に対して相同な又は部分的に相同な隣接標的領域であることができる。好ましい固着配列は、好ましくは、標的組込み部位に対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９９．５％までの配列相同性を有するか、又はゲノムのハイブリダイズする部分と完全な対応を有する。
【００８５】
組込み部位は、適当には、高い頻度の組換え現象が起こる宿主ゲノム上の規定された遺伝子座であることができる。好ましい遺伝子座は、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの第ＩＩＩ染色体上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座である。一般的に、高い頻度での組換えを示すが、しかし細胞の生存能に変化を示さない、酵母染色体上のいずれもの更なる遺伝子座が好ましい。
【００８６】
用語“発現”又は“発現系”或いは“発現カセット”は、作動可能に連結された所望のコード配列及び制御配列を、これらの配列で形質転換又は形質移入された宿主がコードされたタンパク質を産生することが可能であるように、含有する、核酸分子を指す。形質転換を行うために、発現系は、ベクター上に含まれてもよい；然しながら、関連するＤＮＡは、次いで更に宿主の染色体に組込まれてもよい。
【００８７】
用語“遺伝子”は、更に遺伝子のＤＮＡ断片を、特に部分的遺伝子であるものを、含む。断片は、同一のＯＲＦ又は異なったＯＲＦの何れかの繰返しの、幾つかのオープンリーディングフレームも含有することができる。この用語は、具体的には、非コード配列、例えば非転写又は非翻訳配列であるか、或いは全体又は一部のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
本発明によって使用される用語“遺伝子Ａ”は、非コード配列或いは興味あるポリペプチド又は複数のポリペプチドをコードする、いずれものヌクレオチド配列を意味する。遺伝子Ａは、発現カセット、直線状ポリヌクレオチド、プラスミド又はベクター、のような遺伝子構築物のフレームワーク中に存在することによって特徴づけられ、これらは、好ましくは、少なくとも一つのマーカー配列を組込んでおり、そして遺伝子Ａ又は遺伝子構築物の５’末端或いは３’末端の何れかに単一の隣接標的配列を有する。本発明による方法において、遺伝子Ａは、典型的には、遺伝子モザイク形成のために組換えられる一連の遺伝子中の一番目の遺伝子である。遺伝子Ａは、組換えられるもう一つの遺伝子に相同であり、これは、最終的に、場合によって、遺伝子Ａのバリアント、又は遺伝子Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、等の何れかのどちらかである。これによって、遺伝子Ａ当たり一つのみの隣接標的配列が、典型的には最大の忠実度の目的のために提供される。遺伝子Ａのバリアントは、遺伝子Ａ１、Ａ２、Ａ３、等と呼ばれ、これは、ある程度までの配列相同性、及び所望により類似の機能的特徴を有する。用語“少なくとも一つの遺伝子Ａ”は、少なくとも一つの遺伝子Ａ及び所望により遺伝子Ａのバリアントを意味する。
【００８９】
用語“遺伝子Ｂ”は、本発明によって使用する場合、非コード配列或いは興味あるポリペプチド又は複数のポリペプチドをコードするいずれものヌクレオチド配列を意味し、これは、組換えられるもう一つの遺伝子との遺伝子モザイク形成のために選択され、これは、最終的に、場合によって、遺伝子Ａ、遺伝子Ｂのバリアントの何れか、又は遺伝子Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、等の何れかである。遺伝子Ｂは、遺伝子Ａ又は組換えられる他の遺伝子とのモザイク形成を可能にするためにある程度まで遺伝子Ａ又は他の遺伝子と相同である。本発明による方法において、遺伝子Ｂは、典型的には、遺伝子モザイク形成のために組換えられる一連の遺伝子中の最後の遺伝子である。遺伝子Ｂは、細胞のゲノムの不可欠な部分であることができるか、或いは発現カセット、直線状ポリヌクレオチド、プラスミド又はベクターのような遺伝子構築物のフレームワーク中に存在することができ、これらは、好ましくは、少なくともマーカー配列を組込んでおり、そして遺伝子Ｂ又は遺伝子構築物の５’末端又は３’末端の何れかに、遺伝子Ａの隣接標的配列の対応物、これは遺伝子の逆の末端を意味する、としての単一の隣接標的配列を有する。遺伝子Ａの隣接標的配列が遺伝子Ａの５’末端にある場合、遺伝子Ｂは、典型的には、その隣接標的配列を３’末端に有し、そして逆も又同じである。これにより、遺伝子Ｂ当たり一つのみの隣接標的配列が、典型的には最大の忠実度の目的のために提供される。遺伝子Ｂは、遺伝子Ａのバリアントであることができる。遺伝子Ｂのバリアントは、遺伝子Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、等と呼ばれ、これは、ある程度までの配列相同性、及び所望により類似の機能的特徴を有する。用語“少なくとも一つの遺伝子Ｂ”は、少なくとも遺伝子Ｂ及び所望により遺伝子Ｂのバリアントを意味する。
【００９０】
用語“遺伝子Ｃ”は、本発明によって使用される場合、非コード配列又は興味あるポリペプチドをコードするいずれものヌクレオチド配列を意味する。遺伝子Ｃは、発現カセット、直線状ポリヌクレオチド、プラスミド又はベクターのような遺伝子構築物のフレームワーク中に存在することによって特徴づけられ、これらは、所望によりマーカー配列を組込んでおり、そして、場合により、遺伝子Ａ及び／又は遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃのバリアント、或いは最終的に他の遺伝子Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、等の配列と相同である、そのヌクレオチド配列のセグメントによって更に特徴付けられる。遺伝子Ｃは、好ましくは、遺伝子Ｃの５’末端又は３’末端の何れかに単一の隣接標的配列を有するか、或いは両側に隣接標的配列を有する。これにより、遺伝子Ｃは、遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子と部分的に又は完全にハイブリダイズし、当該遺伝子を組換え、連結し及び構築することができる。本発明による方法において、遺伝子Ｃは、典型的には、遺伝子モザイク形成のために組換えられる一連の遺伝子中の遺伝子Ａに続く二番目の遺伝子である。遺伝子Ｃのバリアントは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３等と呼ばれ、これらは、ある程度までの配列相同性、及び所望により類似の機能的特徴を有する。
【００９１】
更なる遺伝子Ｄは、場合によって、それぞれの組換え及び連結を提供するために、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄのバリアント、又は最終的に他の遺伝子Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、等の配列に相同であるそのヌクレオチド配列又はそのヌクレオチド配列のセグメントのハイブリダイゼーションによって、更に組換え及び構築することができる。遺伝子Ｄは、好ましくは、遺伝子Ｄの５’末端又は３’末端の何れかに単一の隣接標的配列を有するか、或いは両側の隣接標的配列を有する。本発明による方法において、遺伝子Ｄは、典型的には、遺伝子モザイク形成のために組換えられる一連の遺伝子中の遺伝子Ｃに続く次の遺伝子である。遺伝子Ｄのバリアントは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、等と呼ばれ、これらは、ある程度までの配列相同性、及び所望により類似の機能的特徴を有する。
【００９２】
更なる遺伝子Ｅは、場合によって、それぞれの組換え及び連結を提供するために、遺伝子Ｄ、遺伝子Ｅのバリアント、又は最終的に他の遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、等の配列に相同であるそのヌクレオチド配列のセグメントによって、更に組換え及び構築することができる。遺伝子Ｅは、好ましくは、遺伝子Ｅの５’末端又は３’末端の何れかに単一の隣接標的配列を有するか、或いは両側に隣接標的配列を有する。本発明による方法において、遺伝子Ｅは、典型的には、遺伝子モザイク形成のために組換えられる一連の遺伝子中の遺伝子Ｄに続く次の遺伝子である。遺伝子Ｅのバリアントは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、等と呼ばれ、これらは、ある程度までの配列相同性、及び所望により類似の機能的特徴を有する。
【００９３】
更なる遺伝子Ｆ、Ｇ、Ｈ、等は、それに応じて使用することができる。一連の更なる遺伝子は、アルファベットの文字の数によって制約されないと理解される。興味ある遺伝子の最終的な鎖は、ゲノムの組込み部位における遺伝子構築を得るための遺伝子Ａ及びＢへの連結によって得られる。このように構築された興味ある遺伝子は、対応する興味あるポリペプチド及び代謝産物のそれぞれの発現を支持するために作動可能なように連結することができる。構築の具体的な方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏの組換えによるカセットの組合せを使用し、多数のＤＮＡ断片でさえも構築して、かなりのサイズの所望のＤＮＡ分子を得る。重複配列を表現するカセットは、所望の配列全体を包含するように適当に設計される。一つの態様において、好ましい重複は、少なくとも約５ｂｐ、好ましくは少なくとも約１０ｂｐである。他の態様において、重複は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０から１，０００ｂｐまでであることができる。
【００９４】
一つの好ましい態様において、幾つかのカセットは、確認を可能にするマーカー配列を含有するように設計される。典型的には、マーカー配列は、最終の所望の核酸配列に対する生物学的影響を最小にするように、トランスポゾン挿入を許容する部位に位置される。
【００９５】
具体的な態様において、宿主細胞は、当該宿主細胞中で、重複配列を有する多くの遺伝子又は核酸のＤＮＡ断片、例えば少なくとも２個、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９個、より好ましくは少なくとも１０個の遺伝子又は核酸断片、でさえも、前記遺伝子又は断片の混合物を用いる同時形質転換、及び組換えられたか又は構築された配列が移入される前記宿主の培養により、組換え又は構築することが可能である。
【００９６】
本発明により使用される遺伝子又はＤＮＡ断片は、全遺伝子又は一部の何れかとして、二本鎖又は一本鎖の何れかであることができる。二本鎖核酸配列は、一般的に３００−２０，０００個の塩基対であり、そして一本鎖断片は、一般的により短く、そして４０ないし１０，０００個のヌクレオチドの範囲であることができる。例えば、２Ｍｂ程度から５００Ｍｂまでの構築物を酵母中に構築することができる。
【００９７】
多くの生物体からのゲノム配列は、公的に入手可能であり、そして本発明による方法と共に使用することができる。これらのゲノム配列は、好ましくは、具体的な多様性を有する相同的配列を得るために、宿主細胞の異なった株又は異なった種から得た情報を含む。
【００９８】
組換えのための基質として使用される最初の遺伝子は、通常、遺伝子のバリアントの形態を含んでなるポリヌクレオチドの収集物である。バリアントの形態は、基質間の相同的組換えを可能にするために十分な、実質的な配列同一性を相互に示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、天然のもの、例えば対立遺伝子又は種のバリアント、誘導されたもの、例えばエラープローンＰＣＲ又はエラープローン反復配列組換え、或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えの結果、であることができる。多様性は、代替コドン使用を伴う天然のタンパク質をコードする再合成遺伝子からの結果であることもできる。組換えが、出発物質に存在するよりも多様な産物を作り出すことができる、基質間の十分な多様性が少なくとも存在すべきである。少なくとも一つ又はそれより多い位置で異なる、少なくとも二つの基質が存在しなければならない。多様性の程度は、組換えられる基質の長さ及び進化させる機能的変化の程度に依存する。６９％までの位置の多様性が典型的である。
【００９９】
本発明の方法によれば、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ及び更なる遺伝子は、少なくともハイブリダイゼーションのために設計された特異的セグメントにおいて、例えば重複部分において、当該重複及び所望により全長の遺伝子を含む遺伝子構築物において少なくとも一回のクロスオーバーを得るように、少なくとも３０％の相同性を共有することが好ましい。好ましい相同性のパーセントは、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％であり、９９．５％未満までである。
【０１００】
より大きい遺伝子、例えば個々の代謝経路のメンバー、を多様化するために、単純に構築する、例えば一緒に並べ、そして所望によりこのような遺伝子を遺伝子バリアントと混合するか、又は本発明の方法により多数の代謝経路を構築することも好ましいことがありうる。天然に存在しない代謝経路を、この様式で構築することができる。従って、このような下流の酵素を欠く異なった生物体によって産生される所望の基質に作用するある生物体中に存在する酵素は、組換え酵素を得るための遺伝子又は部分遺伝子の構築物を構築することによって同じ生物体中にコードさせることができる。従って、多数の酵素を、複合代謝経路を構築するために含むことができる。これは、ポリペプチド又は部分ポリペプチドのクラスターが、経路内のその生化学的機能にしたがって配置される場合に好都合である。興味ある例示的な遺伝子経路は、フラボノール、マクロライド、ポリケタイド、等のような工業的に興味深い二次的代謝産物の合成のための酵素をコードしている。
【０１０１】
更に、コンビナトリアルライブラリーを、断片を混合することによって調製することができ、ここで、同じハイブリダイズする配列を伴うが、酵素又は他のタンパク質をコードする異なった介在配列を伴う、一つ又はそれより多い断片が供給される。
【０１０２】
遺伝子経路は、コンビナトリアルライブラリー中のそれぞれのメンバーが、遺伝子のバリアントの異なった組合せを有するようにコンビナトリアル様式で構築することができる。例えば、バリアントのコンビナトリアルライブラリーは、個々のＤＮＡ要素から構築することができ、ここで、異なった断片が組換え及び構築され、そしてここで、それぞれの異なった断片は、幾つかのバリアントを有する。代謝経路の組換え及び構築は、好結果な操作を証明するためのマーカー配列の存在を必要としないことができる。所望の方法における代謝産物の発現は、既に実施例を示している。代謝経路の好結果な組換え及び構築は、例えば、細胞培養培地中の二次代謝産物の検出によって決定することができる。
【０１０３】
Ｅ．ｃｏｌｉ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐのような細菌性宿主細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母宿主細胞、Ｓｐｏｄｏｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫宿主細胞、又はＨｅＬａ及びジャーカットのようなヒト宿主細胞を含む、原核及び真核宿主細胞は、両方とも開示される方法と共に使用するために意図されている。
【０１０４】
好ましい宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐからのような一倍体細胞である。
【０１０５】
本発明の方法は、有性生殖周期又は減数分裂組換えを使用しない。ＤＮＡ断片を一倍体細胞に形質転換することができる。形質転換体は、選択性プレート上に直ちに画線（streak）することができる。次いで組換え体は、ＰＣＲ又はギャップ修復のような他の手段によって単離される。
【０１０６】
本発明の方法は、いずれもの野生型又は修復欠損の原核又は真核細胞中で行うことができ、当該修復欠損の原核又は真核細胞は、ＤＮＡ又はＲＮＡ修復のような核酸修復の欠損を伴うものを含む。野生型細胞において、同祖的組換えを可能にする適した組込み部位が選択される。野生型細胞において行われるような本発明による方法は、好ましくは、遺伝子Ａ及びＢのような遺伝子の組換えを提供し、当該遺伝子は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。損傷及びミスマッチしたＤＮＡは、通常、修復され、そして組換えは阻害されるが、組込み部位における同祖的組換えが、このような野生型細胞において同様に可能であることが驚くべきことに分かった。
【０１０７】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）系の変異又は修飾は、細胞中の組換えの頻度を向上させる。或いは、組換えを向上させることができるＤＮＡ修復遺伝子ｒａｄ１、ｒｅｃＱの完全な又は一時的なノックアウトのような、他の修復欠損系を使用することができる。
【０１０８】
ＤＮＡ修復欠損細胞は、好ましくは、本発明による方法において使用される。例として、ミスマッチ修復は、完全に又は一時的にノックアウトすることができるか、或いは条件的であるか又は細胞培養培地への特異的基質の添加によって誘導することができ、ここで、細胞は、標的組換え中又はその後に培養される。具体的には、細胞のＭＭＲ欠損は、ミスマッチ修復に関係する遺伝子の変異、ＵＶ光による処理、２−アミノプリンのような化学薬品による処理、ミスマッチ修復に関係する遺伝子の誘導発現又は抑圧を含む、ミスマッチ修復を一過的に又は永久的に損なういずれもの戦略によって、例えば、一過的不活化及び活性化を可能にする制御可能なプロモーターによって、達成することができる。
【０１０９】
細菌のミスマッチ修復系は、広範に研究されている。酵母のような他の系において、その産物が、細菌のミスマッチ修復タンパク質、例えば、ＭｕｔＳタンパク質の類似体、即ち、Ｍｓｈ１、Ｍｓｈ２ｐ、Ｍｓｈ３ｐ、Ｍｓｈ４、Ｍｓｈ５、Ｍｓｈ６ｐ、及びＭｕｔＬタンパク質の類似体、即ち、Ｍｌｈ１ｐ、Ｍｌｈ２ｐ、Ｍｌｈ３ｐ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＰｍｓ１と、相同性を共有する幾つかの遺伝子が確認されている。
【０１１０】
好ましいミスマッチ修復欠損細胞の例は、欠損又は（一時的に）不活化されたＭＳＨ２を伴うＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、例えば、ＭＸＹ４７（破壊されたＭＳＨ２を伴うＷ３０３）株のような、操作されたＷ３０３、ＢＹ、ＳＫ１株のような、特異的酵母細胞である。
【０１１１】
ＭＭＲの更に好ましい系は、酵素的ＭｕｔＨＬＳミスマッチ修復系を欠損した株、例えばミスマッチの認識に関与する、タンパク質ＭｕｔＳ及びＭｕｔＬを欠損したｍｕｔＳ又はｍｕｔＬ型のような、ＵＳ５９１２１１９中に記載されたもののような、周知の細菌株の選択である。好ましい株は、例えば、Ｆ−  ｍｕｔＬ又は組換えＥ．Ｃｏｌｉ  Ｈｆｒ／Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｆ−  ｍｕｔＬを使用するＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株である。
【０１１２】
一方、ＨｅＬａ及びジャーカット細胞のような他の真核ミスマッチ修復欠損細胞が、好ましくは本発明によって使用される。
【０１１３】
本発明による方法は、好結果な組換え産物の、マーカー補助による選択を、主として使用する。分子マーカー又はＤＮＡフィンガープリント法のような道具の使用は、興味のある遺伝子をマッピングすることができる。これは、興味ある特性を保有する細胞の選択を得るための、細胞の大きいレパートリーのスクリーニングを可能にする。スクリーニングは、ある種の遺伝子の存在又は非存在に基づく。
【０１１４】
用語“選択マーカー”は、本発明によって使用される場合、好結果な組込みにおいてマークを提供する、タンパク質をコードするか又は非コードＤＮＡ配列を指す。具体的には、タンパク質をコードするマーカー配列は、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、蛍光マーカー、ノックインマーカー、活性化因子／結合ドメインマーカー及び優性劣性マーカー、比色マーカー、並びに二つ又はそれより多いサブユニットが同じ細胞中に発現する場合にのみ機能する、酵素の異なったサブユニットをコードする配列、の群から選択される。当該用語は、別個のマーカー配列を使用する必要がなく、遺伝子モザイクの直接的決定を提供する、組換えられる追跡可能な遺伝子をも指す。
【０１１５】
“栄養マーカー”は、細胞の栄養要求性を補償し、そして従ってその栄養要求性細胞に原栄養性を与えることができる遺伝子産物をコードするマーカー配列である。本発明によれば、用語“栄養要求性”は、細胞を、栄養要求性細胞自体によって産生されえない必須栄養素を含有する培地中で増殖させなければならないことを意味する。栄養マーカー遺伝子の遺伝子産物は、栄養要求性細胞中にないこの必須栄養素の合成を促進する。栄養マーカー遺伝子を好結果に発現させることによって、細胞が増殖する培養培地にこの必須栄養素を加える必要がなくなる。
【０１１６】
好ましいマーカー配列は、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＴＲＰ１、ＡＤＥ１及びＭＥＴ５である。
【０１１７】
“色素マーカー”をコードする遺伝子は、発現すると細胞を染色することができる色素の合成に関係する遺伝子産物をコードする。これによって、色素マーカーを好結果で発現する細胞の迅速な表現型による検出が提供される。
【０１１８】
“抗生物質耐性マーカー”は、遺伝子産物を発現しない細胞が増殖することができない濃度の抗生物質の存在下で細胞が増殖することを可能にする、前記産物をコードする遺伝子である。
【０１１９】
“抗生物質感受性マーカー”は、遺伝子産物が、抗生物質の存在下で前記マーカーを発現する細胞の増殖を阻害する、マーカー遺伝子である。
【０１２０】
“ノックイン”マーカーは、ノックアウト細胞にとってのミッシングリンクを表し、従って好結果な組換え及び操作によって細胞の増殖を起こす、ヌクレオチド配列として理解される。ノックアウト細胞は、一つ又はそれより多い遺伝子が、標的変異によって遮断されている、遺伝子的に操作された細胞である。このような欠失した遺伝子は、ノックインマーカーとして適当に使用することができる。
【０１２１】
“蛍光マーカー”は、それぞれの蛍光シグナルを発光することによって検出可能であるフルオロフォアをコードするヌクレオチド配列を意味する。細胞は、示差蛍光標識に基づくフローサイトメトリーの周知の技術によって容易に選別することができる。
【０１２２】
多様化又は組換えのために使用される遺伝子は、非コード配列、或いはポリペプチドをコードする配列又はタンパク質をコードする配列、或いは好結果な組換え現象のために十分な配列の長さを有するこれらの一部又は断片であることができる。より具体的には、前記遺伝子は、３ｂｐの最小の長さを有し、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐである。
【０１２３】
本発明によって得られる好ましい遺伝子モザイクは、少なくとも３個、好ましくは２０，０００個までの塩基対のものであり、好ましい範囲は、３００−１０，０００ｂｐである；特に好ましいものは、少なくとも５００ｂｐ、又は少なくとも１，０００ｂｐの大きいＤＮＡ配列である。
【０１２４】
具体的に好ましいものは、７００個の塩基対当たり少なくとも３回のクロスオーバー現象、好ましくは７００個の塩基対当たり少なくとも４回のクロスオーバー、より好ましくは７００個の塩基対当たり又は５００個の塩基対当たり、少なくとも５、６又は７回のクロスオーバーによって特徴づけられる遺伝子モザイクであり、これは、単一のヌクレオチド、又は少なくとも１個のセグメント、好ましくは少なくとも２、３、４、５、１０、２０個、それより大きいヌクレオチド配列までの交差を含む。
【０１２５】
本発明の方法によれば、奇数回だけでなく偶数回の組換え現象を、一つの単一組換え遺伝子で得ることができる。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏの減数分裂組換えに対する具体的な利点である。
【０１２６】
複雑なパターンの組換えモザイク現象を、本発明の方法によって得ることができ、一つの単一分子内の異なった長さの多くの組換え配列ブロックに達する。更に、ストランドテンプレートの一つに対応するヌクレオチドの点様置換は、オープンリーディングフレームのフレームに関する多様性の重要な供給源として得ることができる。モザイク現象及び点様交換は、必ずしもタンパク質レベルで保存的ではない。実際、異なった極性を持った新しいアミノ酸を、組換え後に作り出すことができ、この方法によって誘導された組換えタンパク質に新規な潜在能力及び酵素的タンパク質特質を与える。
【０１２７】
好ましくは、遺伝子は、非コード配列、或いは治療的又は工業的適用の酵素又はタンパク質をコードする、タンパク質をコードする配列又はその断片の一部である。以下において、用語“ポリペプチド”は、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３個のポリペプチド及びタンパク質を有する興味あるペプチドを含む。興味あるポリペプチドは、制約されるものではないが、酵素、転写因子、輸送タンパク質、シグナルペプチド、受容体、ホルモン及び成長因子から選択される。遺伝子モザイクから得られたそれぞれの組換えバリアントは、新しい代謝産物の合成を誘発し、そして触媒することができる。従って、これは、酵素的合成過程を支持する代謝的進化によって多くの天然の芳香族小分子のバリアントを効率良く産生することが可能となった最初である。
【０１２８】
具体的には、酵素活性によって植物又は酵母によって産生されるもののようなフェニルアラニン、チロシン又は及びトリプトファンのような芳香族アミノ酸の代謝産物、或いはいずれもの中間体又は誘導体は、新規な方法で産生することができる。従って、酵素バリアントのレパートリーは、多様な代謝産物形成につながり、次いで、これは所望の構造及び機能に対してスクリーニングされる。天然の芳香族小分子のこれらのバリアントは、それらが機能的又は生物学的活性を保有する可能性の増大のため、純粋に合成された有機物質より利点を有する。
【０１２９】
Ｐｈｅ及びＴｙｒは、密接に関連している。これらはベンゼン環を含有し、これは、チロシンにおいては更に水酸化されている。チロシンは、必須アミノ酸のフェニルアラニンから直接合成される。トリプトファンは、共役したインドール環を含有する。これらの代謝的関係は、複雑な栄養素依存性を生じる。
【０１３０】
植物において、シキミ酸経路は、フェニルプロパノイドの生合成のための化合物フェニルアラニンを産生する。レダクターゼ、オキシゲナーゼ、及びトランスフェラーゼの組合せによって産生されるヒドロキシ桂皮酸及びエステルは、器官中の代謝産物の特異的パターンを規定し、そしてその発生に応じて、このプロファイルは、それぞれの植物種について特徴的である。ＰＰ経路の最初の三つの工程は、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及び４ＣＬ酵素によって触媒され、そして全てのその後の分岐及び得られる代謝産物、例えば：フラボノイド、リグニン、フェニルプロパノイドエステル、オーロン、イソフラボン、スチルベン、プロアントシアニン、等に対する基礎を提供する。
【０１３１】
例えば、ＰＡＬは、桂皮酸を得るためのＰｈｅの脱アミノ化を触媒することが知られており、これは、フェニルプロパノイド経路の最初の工程であり、そして一次代謝と二次代謝との間の制御点である。フェニルプロパノイド化合物は、リグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、クマリン及びスチルベンを含む、天然において多くの機能を持つ一定の範囲のフェノール化合物に対する前駆体である。
【０１３２】
代謝経路の産物は、典型的には、天然の小分子又は、例えばグリコシル化、アシル化、アミノ化、ヒドロキシル化又はメチル化において異なっており、改善されたか又は新しい機能を持つそのバリアントである。これらの代謝産物は、芳香剤又は風味剤として、或いは治療的分子（例えば、抗感染又は癌の治療のため）として適している。
【０１３３】
用語“芳香族小分子”は、本明細書中で使用する場合、芳香族構造を有するある範囲の有機小分子を指し、ここで、一つ又はそれより多いＣＨ基は、Ｎ、Ｏ及びＳのようなヘテロ原子によって置換されることができ、異なった種類及び数の芳香族環、並びに各種の置換基を持つ複合構造を含む。
【０１３４】
代謝産物として得ることができる天然の芳香族小分子の好ましい例は、バリン、クマル酸、フェルラ酸、リグニン、３−フェニルプロパノイド、フラボノイド、アントシアニンである。
【０１３５】
新しい機能的特質を有する好ましい例は、例えばエチルバニリン（風味剤）、オクチルメトキシ桂皮酸及びそのエステル（日焼け止め）、増加した抗細菌効果を持つカルコン誘導体である。
【０１３６】
このような代謝産物産生の中間体は、風味剤又は芳香剤或いは食品成分として時に有用である。
【０１３７】
遺伝子モザイクを含んでなる選択されたクローンによる代謝産物又はこのような代謝産物の中間体として合成されると、これらは、典型的には、適した発現系によって、例えば微生物産生によって、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの合成法によって大規模に産生される。
【０１３８】
本発明の好ましい態様において、モザイク遺伝子の構築、宿主ゲノムとのその組換え、そして更に興味ある組換えポリペプチド又は前記宿主細胞の代謝産物を産生するためのモザイク遺伝子の発現は、一段階法によって行われる。
【０１３９】
本発明によれば、当該分野の技術の範囲内である、慣用的な分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が使用されてよい。このような技術は、文献（９）中で完全に説明されている。
【０１４０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏの組換えのために、ゲノム又は他の遺伝子と組換えられる遺伝子は、標準的な形質移入技術を使用して宿主に形質移入するために使用される。適した態様において、複製開始点を提供するＤＮＡが、構築物中に含まれる。複製開始点は、当業者によって適当に選択されることができる。遺伝子の性質に応じて、追加の複製開始点は、配列が、それ自体複製開始点として作動可能である遺伝子又はゲノムと共に既に存在する場合、必要ないことがある。
【０１４１】
合成核酸配列又はカセット及びサブセットは、直線状ポリヌクレオチド、プラスミド、メガプラスミド、植物、細菌、哺乳動物又は酵母の人工染色体のような合成又は人工の染色体の形態で産生されることができる。
【０１４２】
細胞は、外因性又は異種ＤＮＡが細胞内部に導入されている場合、そのようなＤＮＡによって形質転換されうる。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムに組込まれても、即ち、共有結合的に連結されても、されなくてもよい。例えば原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞において、形質転換するＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム要素上に維持することができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換するＤＮＡが、これが染色体複製により娘細胞に受け継がれるように、染色体に組込まれたものである。この安定性は、形質転換するＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成される細胞系又はクローンを確立するための真核細胞の能力によって証明される。
【０１４３】
多様な遺伝子基質を、プラスミドに組込むことができる。プラスミドは、しばしば標準的なクローニングベクター、例えば細菌性マルチコピープラスミドである。基質は、同じか又は異なったプラスミドに組込むことができる。しばしば、異なった種類の選択可能なマーカーを有する少なくとも二つの異なった種類のプラスミドが、少なくとも二つの種類のベクターを含有する細胞の選択を可能にするために使用される。
【０１４４】
多様な遺伝子基質を含有するプラスミドは、最初、いずれもの方法（例えば、化学的形質転換、天然の形質転換受容性、電気穿孔、遺伝子銃、ファージ又はウイルス系へのパッケージング）によって細胞に導入される。しばしば、プラスミドは、同じ細胞に一つより多いプラスミドが進入する可能性を増加させるために、（最大の形質移入容量に関して）飽和濃度で又はその近くで存在する。各種の基質を含有するプラスミドは、同時に又は多数回で形質移入することができる。例えば、後者の方法において、細胞をプラスミドの第一のアリコートで形質移入し、形質移入体を選択し、そして増殖させ、そして次いで、プラスミドの第２のアリコートで感染させることができる。好ましいプラスミドは、例えば、ｐＵＣ及びｐＭＸＹ９、ｐＭＸＹ１２及びｐＭＩＸ−ＬＡＭのようなｐＢｌｕｓｃｒｉｂｅ誘導体又はＹＣｐ５０のようなＹＡＣ誘導体である。
【０１４５】
進化の速度は、全ての遺伝子基質が組換えに関与することを可能にすることによって増加させることができる。このようなことは、形質移入された細胞を電気穿孔に供することによって達成することができる。電気穿孔の条件は、外因性ＤＮＡを細胞に導入するために慣用的に使用されるものと同じである。進化の速度は、プラスミド又は染色体の交換を誘導するために細胞を融合させることによって増加させることもできる。融合は、ＰＥＧのような化学的薬剤、又はインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ＨＳＶ−１  ｇＢ及びｇＤのようなウイルスタンパク質によって誘導することができる。進化の速度は、変異誘発（mutator）宿主細胞（例えば、細菌におけるＭｕｔＬ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｈ、酵母における類似の変異体、及びＡｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａヒト細胞株）の使用によって増加させることもできる。
【０１４６】
組換え遺伝子を保有する細胞は、所望の機能のためにスクリーニング又は選択に供される。例えば、関係する基質が薬物耐性遺伝子を含有する場合、薬物耐性について選択する。
【０１４７】
典型的には、本発明の組換えの方法において、所望の表現型を獲得した組換えの最終産物は、０．１％−５０％の位置で出発基質と異なり、そして天然に獲得する変異の速度の数桁過剰（例えば、少なくとも１０倍、１００倍、１，０００倍、又は１０，０００倍）の速度で進化している。最終の遺伝子モザイク産物は、産生目的のためにシャッフルされたＤＮＡの使用のためにより望ましいもう一つの宿主に移されてもよい。
【０１４８】
本発明による好ましい方法において、宿主細胞は、周知の細胞ディスプレイ系を使用して細胞表面に遺伝子モザイクをディスプレイする。このようなハイブリダイゼーションによる多様化によって、遺伝子のバリアントのレパートリーが産生され、これは、このようなバリアントのライブラリーを作成するために適当にディスプレイすることができる。
【０１４９】
適したディスプレイ法は、酵母ディスプレイ及び細菌細胞ディスプレイを含む。特に好ましいライブラリーは、タンパク質工学及びライブラリースクリーニングにおける多くの適用で使用されるような酵母表面ディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーは、野生型ポリペプチドのものに対して向上された表現型特質を有するポリペプチドバリアントの適切な選択を提供する。好ましくは、細胞ベースの選択法が、例えば表面固定化リガンドに対して、使用される。普通に使用される選択技術は、このようなライブラリーから得た変異ポリペプチドの特質を分析し、そして野生型ポリペプチドの特質と比較することを含んでなる。改善された所望の特質は、リガンドポリペプチドの結合特性の特異性又は親和性の変化を含み、これは、受容体に結合することが可能である。ポリペプチド親和性成熟は、本発明の特に好ましい態様である。バリアントの更に好ましい特質は、安定性、例えば熱安定性、ｐＨ安定性、プロテアーゼ安定性、溶解性、収率又は興味ある組換えポリペプチドの分泌のレベルを指す。
【０１５０】
本発明による方法によって得られるライブラリーは、高いパーセントの機能的モザイク遺伝子の潜在的なリード候補を含有し、当該機能的モザイク遺伝子は、機能的ＯＲＦ中で発現することができる。好ましいライブラリーは、機能的ＯＲＦ内に含有される遺伝子モザイクの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、更に少なくとも９５％を有する。本発明によって提供されるライブラリーは、具体的には、高いパーセントの好結果なハイブリダイゼーションを示すマーカー配列の存在によって更に特徴づけられる。本発明によれば、奇数回だけではなく偶数回のモザイクパッチも得ることができ、これは、前記方法によって産生される組換えライブラリー中のバリアント又はライブラリーのメンバーの数を増加させる。
【０１５１】
通常、本発明によるライブラリーは、遺伝子モザイクの、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１，０００個、より好ましくは少なくとも１０４個、より好ましくは少なくとも１０５個、より好ましくは少なくとも１０６個、より好ましくは少なくとも１０７個、より好ましくは少なくとも１０８個、より好ましくは少なくとも１０９個、より好ましくは少なくとも１０１０個、より好ましくは少なくとも１０１１個、１０１２個までのバリアントを含んでなり、なお多い数が可能である。
【０１５２】
本発明による方法は、遺伝子モザイクの機能的バリアントを発現する少なくとも１０２個の独立のクローンを含有するライブラリーを提供することができる。本発明によれば、例えば親和性成熟された事前に選択された独立のクローンのプールも提供され、このプールは、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１，０００個、より好ましくは少なくとも１０，０００個、１００，０００個よりなお多い独立のクローンを含んでなる。事前に選択されたプールを含有するこれらのライブラリーは、本発明による高い親和性のバリアントを選択するための好ましい供給源である。
【０１５３】
本発明によって使用されるようなライブラリーは、好ましくは、少なくとも１０２個のライブラリーメンバー、より好ましくは少なくとも１０３個、より好ましくは少なくとも１０４個、より好ましくは少なくとも１０５個、より好ましくは少なくとも１０６個のライブラリーメンバー、より好ましくは少なくとも１０７個、より好ましくは少なくとも１０８個、より好ましくは少なくとも１０９個、より好ましくは少なくとも１０１０個、より好ましくは少なくとも１０１１個、１０１２個のライブラリーのメンバーを含んでなり、好ましくは、当該ライブラリーのメンバーは、対応する興味あるポリペプチドに新しい特質を操作するための親遺伝子から誘導される。
【０１５４】
好ましくは、ライブラリーは、酵母ライブラリーであり、そして酵母宿主細胞は、好ましくは生物学的活性を有する興味あるペプチドを細胞の表面に示す。或いは、産物は、細胞内にとどまるか、又は細胞から分泌される。酵母宿主細胞は、好ましくは、サッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、クリベロミセス、ヤロウイア及びカンジダ属から選択される。最も好ましくは、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【０１５５】
本明細書中に記載される実施例は、本発明の例示であり、そしてそれに制約されることは意図されていない。本発明の異なった態様は、本発明によって記載されている。多くの改変及び変化は、本明細書中に記載され、そして例示される技術に対して、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく行うことができる。従って、実施例が、例示のみであり、そして本発明の範囲に対して制約するものではないことは理解されるべきである。
【実施例】
【０１５６】
実施例１
説明
第１の実験の設定において、本発明者等は、組換えられる基質としてＯＸＡクラスのベータラクタマーゼ遺伝子を使用した。ＯＸＡ遺伝子の利点は、使用可能な異なった多様性（５−５０％まで）の同祖的遺伝子が存在するという事実にある。従って、これらの遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏの組換えにおける多様性の限度を試験するための良好な候補である。この遺伝子は、取扱いが容易でもある（約８００ｂｐの長さ）。
【０１５７】
【表１】
2014519831.tif 000003
【０１５８】
第１の実験において、Ｏｘａ１１を、Ｏｘａ７（９５％同一性）、Ｏｘａ５（７７％同一性）及びＯｘａ１（４９％同一性）それぞれと組換えた。
【０１５９】
本発明者等は、株コレクション（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）に由来するＢＹ４７酵母株を使用し、これは、栄養要求性（−ｕｒａ３、−ｌｅｕ２）マーカー遺伝子及びｍｓｈ２のノックアウトを含有している。ウラシル及びロイシンの生合成経路の遺伝子欠損は、栄養要求性をもたらし、即ち、ウラシル及びロイシンを、増殖培地に加えなければならない。
【０１６０】
第１の工程において、一方にマーカーＵＲＡ３及びＯＸＡ１１を、又は他方に他のマーカーＬＥＵ２と共にＯＸＡ５／７／１それぞれを、含有する遺伝子断片を設計した。ＵＲＡ−ＯＸＡ１１断片の５’末端に隣接して、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を挿入したが（５’隣接標的配列）、これは、酵母染色体のＢＵＤ３１領域の５’挿入部位に対応する。ＯＸＡ５／７／１の３’末端における、染色体（ｓ．図３）上の隣接する３’部位に対応する約４００ｂｐのＤＮＡ断片（３’隣接標的配列）。全ての断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）において標準的なプロトコルによって合成した。
【０１６１】
合成された断片を、ＰＣＲによって増幅し、そして形質転換に使用した。
【０１６２】
ＵＲＡ３−ＯＸＡ１１断片及び他のＯＸＡ−ＬＥＵ２断片の一つを、野生型（二倍体ＢＹ２６２４０、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）及びミスマッチ欠損株（一倍体ａ接合型（mater）ＢＹ０６２４０、ｍｓｈ２−、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に形質転換した。形質転換のプロトコルは、Ｇｉｅｔｚ（１０）によった。形質転換物を、適当なマーカーに対する選択のための選択的培地（ウラシル、ロイシン無し）を含有するプレートに播種した。７２時間後、コロニーを観察することができた。
【０１６３】
【表２】
2014519831.tif 000004
【０１６４】
ＢＹ０６２４０形質転換から生じた合計４８個のコロニーを単離し、そしてコロニーＰＣＲを行った（Ｃｈａ及びＴｈｉｌｌｙのプロトコル（１１）に基づく溶菌及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲ）。異なったＰＣＲ反応を行い、標的領域への断片の正しい挿入を確認する。４８個のうちの３７個のクローンは、正しい挿入プロファイルを示した。これらの３７個のうち、３１個は、配列決定のための明確なそして利用可能な増幅産物を与えた。ＯｘａのＯＲＦに隣接する二つの特異的プライマーを使用する反応は、ＯＸＡ配列が実際に構築された場合のみ、真の組換え体の増幅を許す。更に、得られた産物は、直接配列決定のための正しい基質である。従って、陽性増幅産物が配列決定された（ＧＡＴＣ）。
【０１６５】
配列決定の結果
３１個のうち２４個のクローン（より明確な陽性増幅シグナルを持つもの）を配列決定した。これらは、以下に対応した：相同的な対照Ｏｘａ１１／Ｏｘａ１１（配列番号３９）、相同的な対照Ｏｘａ０７／Ｏｘａ０７（配列番号４０）、相同的な対照Ｏｘａ０５／Ｏｘａ０５（配列番号４１）ｆｅ０２ないしｆｅ０６、ｆｅ０９及びｆｅ１１：Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０７（配列番号１ないし配列番号１４）ｆｅ０９及びｆｅ１３、ｆｅ１４、ｆｅ１６ないしｆｅ２４：Ｏｘａ１１／Ｏｘａ５（配列番号１５ないし配列番号３８）。
【０１６６】
全てのクローンの配列決定の結果については、図１０及び１１並びに配列番号１ないし３８を参照されたい。
【０１６７】
Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０７クローンのＤＮＡアニーリングについては、図１０、配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３を参照されたい。
【０１６８】
Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０５クローンのＤＮＡアニーリングについては、図１１、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、及び３７）を参照されたい。
【０１６９】
ＯＸＡ１１／Ｏｘａ０７のタンパク質アニーリングについては、図１０、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４を参照されたい。
【０１７０】
Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０５のタンパク質アニーリングについては、図１１、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８を参照されたい。
【０１７１】
実施例２
説明
複合モザイク遺伝子のライブラリーを作り出すための第２の別の方法として、三つの異なるが関連する遺伝子配列を構築し、そして組換えた。実施例１のように、ＯＸＡ遺伝子配列を、ＭＭＲ欠損酵母中でのこれらの構築のために使用した。図３に示すように、モザイク生成の原理は、ＯＸＡ５（遺伝子Ｃ）の全ＯＲＦとハイブリダイズするＯＸＡ１１（遺伝子Ａ）及びＯＸＡ７（遺伝子Ｂ）のそれぞれの切断された配列の使用に基づいている。従って、栄養要求性マーカーを共有する、構築され、そして統合されたカセットＡ−Ｂ−Ｃのみが、形質転換後に選択される。
【０１７２】
実施例１のように、本発明者等は、栄養要求性（−ｕｒａ３、−ｌｅｕ２）マーカー遺伝子のノックアウト及びｍｓｈ２の欠失を含有する株コレクション（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）由来のＢＹ４７酵母株を使用した。ウラシル及びロイシンの生合成経路における遺伝子欠損は、栄養要求性をもたらす：即ち、ウラシル及びロイシンを、増殖培地に加えなければならない。
【０１７３】
切断された遺伝子Ａ及びＢを含有する新しい遺伝子断片は、実施例１中に既に記載した断片からの特異的ＰＣＲによって得た：ＵＲＡ−Ｏｘａ１１（ＯＸＡ１１のＯＲＦのヌクレオチド３８６−４０６上にアニーリングする逆方向プライマー）及びＯＸＡ７−Ｌｅｕ（ＯＸＡ７のＯＲＦのヌクレオチド４２１−４４１上にアニーリングする順方向プライマー）。ＯＸＡ５遺伝子の全ＯＲＦは、断片ＯＸＡ５−ＬｅｕからのＰＣＲによって得た。断片ＥＮＤ−Ｌｅｕは、実施例１のように使用した。精製されたＰＣＲ断片を、形質転換のために使用した。
【０１７４】
形質転換のプロトコルは、Ｇｉｅｔｚ（１０）によった。形質転換体を、適当なマーカーに対する選択のための選択的培地（ウラシル、ロイシン無し）を含有するプレート上に播種した。７２時間後、コロニーを観察することができた。
【０１７５】
【表３】
2014519831.tif 000005
【０１７６】
ＢＹ０６２４０形質転換から生じた合計８個のコロニーを、無作為に単離し、そしてコロニーＰＣＲを行った（Ｃｈａ及びＴｈｉｌｌｙのプロトコル（１１）に基づく溶菌及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲ）。標的領域への断片の正しい挿入を確認するために、異なったＰＣＲ反応を行った。８個のうち７個のクローンは、正しい挿入プロファイルを示した。これらの７個から、配列決定のために明確な、そして利用可能な増幅産物を得た。ＯｘａのＯＲＦに隣接する二つの特異的プライマーを使用する反応は、ＯＸＡ配列が実際に構築された場合のみ、真の組換え体の増幅を許す。更に、得られた産物は、直接配列決定のための正しい基質である。従って、陽性増幅産物が、配列決定された（ＧＡＴＣ）。
【０１７７】
配列決定の結果
８個のうち７個のクローン（より明確な陽性増幅シグナルを持つもの）を配列決定し、５個の利用可能な配列を得た。これらは全て、同祖構築ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応しており、クローンＯＵＬ３−０５−ＩＩ、ＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ、ＯＵＬ３−０５−ＩＶ、ＯＵＬ３−０５−ＩＸ及びＯＵＬ３−０５−Ｘ由来であった。
【０１７８】
全てのクローンの配列決定の結果及びタンパク質アニーリングについては、選択されたクローンの配列を参照されたい（図１３）：ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７のＯＵＬ３−０５−ＩＩ（配列番号４２及び４３）、ＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ（配列番号４４及び４５）、ＯＵＬ３−０５−ＩＶ（配列番号４６及び４７）、ＯＵＬ３−０５−ＩＸ（配列番号４８及び４９）及びＯＵＬ３−０５−Ｘ（配列番号５０及び５１）。
【０１７９】
考察
細胞による構築及びｉｎ  ｖｉｖｏの組換えによる多様性の生成のためのテンプレートとして多岐にわたる配列を用いる有糸分裂ＭＭＲ欠損細胞の簡単な形質転換の方法が証明されている。
【０１８０】
組換えモザイク現象の複雑なパターンは、実施例１に記載された方法によって得られており、８００ｂｐの一つの単一分子への異なった長さの少なくとも１７個のパッチに達している（即ち、クローンｆｅ１９（配列番号２７）及びｆｅ２０（配列番号２８））。組換え現象は全ての長さの配列で起こるように見受けられる。
【０１８１】
更に、ストランドテンプレートの一つに対応するヌクレオチドの点様置換は、ＯＲＦのフレームについての多様性の重要な供給源として観察された（即ち、クローンｆｅ１９（配列番号２７）及びｆｅ２０（配列番号２９））。
【０１８２】
更に、この組換え法は、三つの関連する遺伝子（ＯＸＡ１１、ＯＸＡ７及びＯＸＡ５）からの配列を同時に使用することによって、実施例２に示すように二つより多い関連する遺伝子からモザイクを産生した（即ち、クローンＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ及びＯＵＬ３−０５−ＩＸ）。これは、幾つかの遺伝子からの興味ある領域を組換えるための非常に効率の良い方法であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでのモザイク遺伝子ライブラリーの生成に基づく分岐（divergence）の新しい供給源を表す。
【０１８３】
いずれの組換えクローンも、翻訳されたＤＮＡのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析によって証明されたように、切断されたタンパク質産物を産生しなかった。
【０１８４】
２１個のうち１個のクローン（ｆｅ１５）のみが、親のプロファイルを示した（データは示さない）。
【０１８５】
モザイク現象及び点様交換は、タンパク質レベルにおいては必ずしも保存的ではない。実際、異なった極性を持つ新しいアミノ酸が、組換え後に作り出され、組換えムテインに、新規な潜在能力、及び酵素的タンパク質の特質を与えた（即ち、クローンｆｅ１９（配列番号２７）及びｆｅ２０（配列番号２９））。
【０１８６】
組換え体ライブラリーを富化するこのアプローチによる組換え体生成の一つの非常に魅力ある特色は、それによって奇数回の現象のみをライブラリーに提示することができる減数分裂組換えのアプローチと比較して、奇数回だけでなく、偶数回の組換え現象も得ることができる（即ち、ｆｅ０６（配列番号７）、ｆｅ１１（配列番号１３）、ｆｅ１３（配列番号１７）、ｆｅ１９（配列番号２７））という事実である。
【０１８７】
親のテンプレートに関連しない幾つかの点変異が、幾つかの配列において観察された（即ち、ｆｅ１６（配列番号２１）及びｆｅ１７（配列番号２３））。全てのこれらの場合、変異は、得られたＯＲＦのリーディングフレームを変化させなかった。
【０１８８】
実施例３
説明
フラボノイド合成は、全てのフェニルプロパノイドと同様にフェニルアラニンで開始する。七つの酵素がＬ−フェニルアラニンのフラボノールへの転換のために必要である。フェニルアラニンは、酵素フェニルアラニンリアーゼ（ＰＡＬ）、桂皮酸−４−ヒドロラーゼ（Ｃ４Ｈ）及び４−クマロイル−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）の連続した作用によって、クマル酸−ＣｏＡに転換される。クマル酸−ＣｏＡは、様々なポリフェノールの生合成について重要な分岐点である。例として、クマル酸−ＣｏＡは、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）及びフラバノールシンターゼ（ＦＬＳ）が関係する反応カスケードの前駆体である。ＮＡＤＰ−シトクロムＰ４５０オキシレダクターゼ（ＣＰＲ）は、Ｃ４Ｈ及びＦ３’Ｈ酵素の触媒作用のために存在すべきである。経路の中間体代謝産物は、広い範囲のフラボノイドの新しい基質として役立つ。この代謝経路の多くの植物遺伝子が、特徴づけられている（１２、１３、及びこれらの中の参考文献）。
【０１８９】
殆どのこれらの遺伝子は、酵母中で機能的に発現することができる、然しながら、発現レベルも、活性又は安定性も、説明されていない。従って、本発明者等は、生物学的活性を決定し、並びに代謝フラックスを分析するために、誘導性発現系を選択した。これにより、形質転換細胞（即ち、構築及び組換え後）の上清を使用する、一次の及び／又はハイスループットのスクリーニング法を開発した。殆どのフラボノイド遺伝子は、９５から７０％までのＤＮＡ配列類似性の範囲の同祖対応物を有する。
【０１９０】
コンピューターによる解析は、フラボノイド経路の８個の遺伝子を含有する８個の断片、並びにこれらの同祖的組換えパートナーを設計することを可能にした。断片、ＯＲＦ、並びに上流及び下流の配列を図４に示す（配列の供給源の詳細については、表４及び５を参照されたく、それぞれの断片の増幅については図５Ｂ及び表６を参照されたい）。前述の参考文献とは対照的に、本発明者等は、２０ｋｂのＤＮＡ範囲中の経路の七つの遺伝子を構築し、そして組換えることに決定した。最初及び最後の断片は、実施例２に示したように、ゲノムへの経路の組込みのための標的配列を更に含有した。この最初の実験において、それぞれの酵素の二つの遺伝子を構築した／組換えた。機能的試験及び比較の参考値を得るために、それぞれの酵素の同じ親バージョンの遺伝子（ＰＡ）のみを含有する野生型経路を構築した。
【０１９１】
【表４】
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【０１９２】
【表５】
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【０１９３】
【表６】
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【０１９４】
【表７】
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【０１９５】
酵母の形質転換：酵母の形質転換のためのプロトコルは、Ｇｅｉｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｅｓ（１０）から僅かに改変した。細胞を、ＹＰＤ培地中で前培養し、そして次いで新しい富栄養培地に播種するために使用した。これらを、ＯＤ６００が０．６に達した時点で回収し、ペレットを二回洗浄し、そして１／５０の体積に濃縮した。コンピテント細胞を、５００ｎｇのそれぞれの断片と共にＰＥＧ／ＬｉＡＣ／ｓｓＤＮＡ形質転換混合物に加えた。直ちに、断片（相同及び同祖）を、等モル混合物中に調製し、そしてコンピテント細胞ＢＹ０６（ｍｓｈ２欠損）を形質転換した。更に、コンピテント細胞を、ＤＮＡを伴わずに形質転換した（陰性対照）。組換えクローンの選択は、Ｕｒａを含まず、そしてハイグロマイシンを含有する培地上で行った。
【０１９６】
組換えの分析：
５日後、異なった断片で形質転換したクローンを、選択培地上で観察した。予測したように、ＤＮＡのない対照の場合にはクローンは観察されなかった。配列分析のために、７個のクローンを無作為に選択した：構築された野生型遺伝子を含有する１つのクローンを形質転換から選択し、Ｈ３と命名した。このクローンは、野生型対照として役立った。同祖遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏの組換えから得られた６個の他のクローンも単離し、そしてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して調製した。先ず、クラスターの正しい組込みを、ｇＤＮＡからの標的ＰＣＲによって分析した。選択したクローンの９０％より多くにおいて、増幅された断片は、予測された長さに対応し、正しい組込みが証明された。次いで、これらのクローンのそれぞれの７個のフラボノイド遺伝子を、特異的プライマーで増幅し、これも断片の正しい構築を証明した。増幅産物を配列決定した。（詳細については、図１４の組換えクローンＭ１の構築された配列を参照されたい）。配列決定の結果は、本発明者等が、経路に関係する８個の遺伝子の構築、組換え及び染色体中の安定した組込みによって、酵母中の完全なフラボノイド経路を再構成することに成功したことを証明した。Ｈ３と命名された野生型クローンは、１００％相同の遺伝子の構築から生じ、そして６個の組換えクローンの分析は、同祖遺伝子が組換え及び構築され、正しいＯＲＦをもたらしたことを明らかにした。本発明者等は、いずれものフレームシフト、欠失又は挿入を観察することができなかった。無作為に単離された同祖クローンの配列分析は、フラボノイド経路の殆どの遺伝子が、これらの二つの親バージョン間のモザイクであることを証明した。
【０１９７】
組換えフラボノイド経路を含有する酵母クローンの分析
ａ）組換えクローンの培養上清の静菌効果
フラボノール又はカルコンのようなポリフェノール代謝産物は、静菌性又は抗菌効果を有する化合物として記載されている（１４、１５、１６）。この特徴は、フラボノイド誘導体及びその前駆体を、薬物開発の興味ある候補にする。静菌効果は、簡単な方法、例えば、細菌増殖阻害のための測光試験、によってスクリーニングすることができる。
【０１９８】
前述のクローンの幾つかの上清を、Ｅ．ｃｏｌｉ増殖培養物に加えた場合のその静菌能力を確認するために使用した（図８）。酵母培養物を誘導条件（単一炭素源としてのガラクトース、フェニルアラニンを伴い、そしてメチオニンを伴わない）下で、少なくとも７２時間増殖させた。これらを遠心によって回収し、そして上清を回収した。対照として、本発明者等は、クローンと同じ条件下で培養したＹ０６株（フラボノール遺伝子なし）及び酵母を含まない培地を使用した。１／１０体積のこれらの上清を、Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁物（ＯＤ６００＝０．０５）を伴うＬＢ培地に加えた。細菌培養物を３０℃で増殖させ、そしてこれらの細胞密度を２時間ごとに測定した。図８に示すように、細菌増殖に対する強力な阻害効果が、対照と比較した場合、クローンＨＩＩＩ、Ｍ１、Ｍ７及びＭ８の上清中で観察された。他のクローンは、低い効果を生じたか、又は全く効果を生じなかった。最後に、これらの阻害因子は、フラボノイド遺伝子を伴うクローン中にのみ存在し、そして対照培養物Ｙ０６（フラボノイド遺伝子なし）ではこの誘導条件では存在しない。
【０１９９】
幾つかのフラボノイド遺伝子は、ＰＡＬ及びＦ３Ｈに対するＧＡＬ１／１０並びにＣＨＩ及びＣ４Ｈに対するＭＥＴ２／２５のような誘導可能なプロモーターによって制御される。上記の阻害の結果を確認するために、本発明者等は、経路の誘導可能な遺伝子を発現停止させ、そしてフラボノイド代謝産物の産生を抑制するために、酵母のクローンを、グルコース及びメチオニンを伴う培地中で培養した。非誘導酵母培養物を先のように処理し、そして上清を、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物に対するこれらの阻害効果を分析するために使用した（データは示さない）。阻害効果は、組換えフラボノイドクローンのいずれに対しても観察されなかった。実際、全てのこれらの上清は、本質的に対照Ｙ０６のように挙動する。興味あることに、クローンを誘導条件（ガラクトース、メチオニン及びフェニルアラニンを伴う）で培養する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物に対する阻害効果は、回復した（データは示さない）。これらの阻害効果は、同じ培養条件における対照Ｙ０６と比較して、クローンＨＩＩＩ、Ｍ１及びＭ８の場合、５倍高く、他のクローンについては２倍以下である。
【０２００】
ｂ）組換えフラボノイド経路を含有する酵母培養上清中のフラボノイド及び前駆体の存在によるＤＰＨのクエンチング
この試験は、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン（ＤＰＨ）の蛍光をクエンチする、フラボノイドのような三環分子の能力に基づく。この特徴は、フラボノイドを分解する微生物を分析するために効率よく使用されている（１７）。このプロトコルを採用して、ナイロン膜上のフラボノイドを含有する抽出物のクエンチングを可視化した。組換えフラボノイド経路を含有する誘導条件で増殖させた酵母培養の上清を、酢酸エチルで抽出し、そして凍結乾燥した。次いで、ペレットを初期体積の１／１０の７０％エタノール中に回収した。それぞれの試料に対して、９μｌを、１μｌのＤＰＨ（ＤＭＳＯ中の０．１ｍＭ）に加え、そして混合した。次いで、５μｌを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ膜上にのせ、そして試料のクエンチングをＵＶ−トランスイルミネーターで観察した（図８、挿入図Ａ）。ｉｍａｇｅ−Ｊプログラムを、スポットのシグナル強度を測定するために使用し、そして値を培地のみ（クエンチングなし）からの抽出物から得たシグナルに対して正規化した。ナリンゲニン（１μＭ）を、最大クエンチングの対照として使用した。値のヒストグラムを示す（図８、挿入図Ｂ）。明らかなことに、Ｈ３、Ｍ１、Ｍ４及びＭ７クローンは、より高い値のクエンチングを示し、そしてクローンＭ２、Ｍ３及びＹ２６（陰性対照）では不良な効果が観察されたか又は効果が観察されなかった。これらの結果は、組換えフラボノイド経路を含有する本発明者等の酵母細胞が、フラボノイド及びその中間体を合成していることの更なる証拠である。
【０２０１】
ｃ）誘導された培養からの酵母組換えフラボノイド上清のＨＰＬＣ分析
細菌阻害活性を調査することを記載した幾つかのクローンの上清を、ＳＰＥカラム上で抽出し、そしてメタノール抽出物を、（４）に記載されているようにＣ１８ＨＰＬＣカラム及びアセトニトリル／水の勾配を使用する標準的なプロトコルによって分離した。更に、興味あるピークを、標準的な方法（４、５）によるＨＰＬＣ−ＭＳによる質量分光に供して、誘導培養上清中のフラボノイド化合物の存在を確認した。
【０２０２】
既に記述したように、部分的誘導条件で増殖した培養からの野生型及び陰性対照の上清を、ＨＰＬＣによって分析した。図８に示したクローンの上清を、ＳＰＥのＣ１８  Ｈｙｄｒａカラムで、製造業者（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）の指示に従って更に精製し、そして高性能液体クロマトグラフィー及び質量分析を、記載されたように（４、５）行った。表８に得られた最も重要な結果の概要を示す。
【０２０３】
選択されたピークの質量を決定するために、試料の上清をＳＰＥ（Ｃ１８）カラム上で抽出し、そしてＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。最初に１００μｌの抽出物を、ＨＰＬＣによって分析した。フラボノイド経路遺伝子を発現する細胞からの抽出物が、フラボノイド遺伝子を含有しない対照と比較した場合、新しいピークを含有することを証明することができた（表８を参照されたい）。選択されたピークを、質量分光によって更に分析した。従って、新しいピークに対応する質量（masses）を断片化し、そして得られた断片を既知のフラボノイド標準の断片化から得られた断片と比較した。このようにして、一例として、コーヒー酸、ｔｒａｎｓ−桂皮酸、ｐ−クマル酸、ナリンゲニン、ジヒドロケンフェロール、ケンフェロール、及びケルセチンが確認され、酵母クローンＨ３及びモザイククローンＭ１中のフラボノイドの産生を確認した。
【０２０４】
記述したように、より詳細な分析は、Ｈ３及び幾つかの組換えクローンも、ｐ−クマル酸及び桂皮酸のようなフラボノイドの初期の前駆体を蓄積することを示した。驚くべきことに、フラボノイド経路に直接関係しない三つの化合物、コーヒー酸、フロレト酸及びスチレンも検出された。ある種の条件下で、フラボノイド遺伝子で形質転換された酵母細胞が、新しい中間体を産生するために前駆体を使用することが可能であるか、又は異なった酵素遺伝子の組換えが、変更された活性及び基質特異性を持つ酵素をもたらしたと考えることは妥当である。次いで、これは、代謝化合物ライブラリー中に見出される分子の多様性を反映することができた。最後に、なお未知の幾つかのピークを、上清中に検出し、これらは、フラボノイド組換え経路を含有するクローンに特異的である。（表８）。
【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
ｄ）相同フラボノイド組換え体とモザイククローンとの間の異なった化合物プロファイル
ＣＨ４モザイク酵素及びｐ−クマル酸産生
完全誘導条件下で、そして同じ細胞量に関連して、ＨＰＬＣによる分離後、Ｍ１クローンが、相同対照のＨ３より３倍多いクマル酸を蓄積することが可能であることが観察されている。この挙動は、外因性フェニルアラニンが培養物から除去されても同じままである（細胞は内因性アミノ酸を使用する）。両方の場合とも、桂皮酸の量は検出されないままであり、これが産生されると同時にこれが消費されることを示唆する。細胞培養物に、外因性フェニルアラニンの非存在下で、そしてメチオニンを培養物に加えることなく、１５０μＭの桂皮酸を供給する場合、Ｈ３より二倍多いクマル酸がモザイクＭ１クローン中に存在する（図１５）。両方のクローン中のＣ４Ｈ酵素の発現がメチオニンの非存在下で誘導されるため、この培養物中のＭ１モザイクＣ４Ｈ酵素は、Ｈ３クローンのものにおけるその親バージョンよりも活性が高い。
【０２０７】
Ｆ３Ｈモザイク酵素は、親のＨ３より多い前駆体をケンフェロールに転換する
誘導されたＨ３及びＭ１細胞培養物に、１５０μＭのナリンゲニン−カルコンを供給した場合、桂皮酸の明白により良好な転換（図１６Ｂ）を伴う、モザイククローンＭ１に対する同じ挙動（より高いｐ−クマル酸産生）（図１６Ａ）が観察された。同時に、親のクローンＨ３は、前駆体ジヒドロケンフェロールが完全には使用されていなくても、より高い量のフラボノイドケンフェロールを産生することが可能であった（図１６Ｃ及びＤ）。他方、モザイクＭ１クローンは、ジヒドロケンフェロールを蓄積せず、これは、ケンフェロールに完全に転換されたように見受けられた（図１６Ｃ及びＤ）。ＦＬＳ酵素の発現は、両方の場合とも構成的であり、そしてフラボノイド産生にとってボトルネックであるように見受けられる。Ｆ３Ｈ酵素の発現は、ガラクトースの存在下で調節することができる。ジヒドロケンフェロールの蓄積がモザイククローンＭ１で観察されず、しかし同じ培養培地でのＨ３においてはそうではないという事実は、モザイク酵素が、ジヒドロケンフェロール転換及び得られたケンフェロール収率におけるこの異なった挙動の原因である改変を受けたことを示唆している。
【０２０８】
考察
組換え経路の複合ライブラリーを構築し、組換え、そして発現させるための新しい一段階法は、著しい有効性を示した。１４個の関連する遺伝子バージョンを使用して、ＤＮＡ修復欠損細胞に構築し、そして組込んだ場合に、その発現を調節することができるモザイク経路を作り出した。この過程は、酵素の組換え形態が機能的に発現することができることを可能にするＯＲＦの構造的完全性を重んじる。この特異的な場合、本発明者等は、経路の最終産物としてのフラボノイド、及びその中間体を、対応する遺伝子を改変及び誘導することによって確認することが可能であった。組換え経路の誘導性発現が機能的であるため、これは、本発明者等に、簡単な培地の改変によって中間体及び誘導体、並びに最終のフラボノイド産物を作り出す可能性を与える。誘導された組換え細胞培養物（モザイク経路）のＨＰＬＣによる上清の分析は、ある種の分子の産生が、対照（非モザイク経路）と比較してより高いことを示し、触媒性酵素の改良を示唆している。更に、スチレン、コーヒー酸及びフロレト酸のような異なった分子は、組換えクローンの上清中でのみ見いだされた。最後に、フラボノイド断片のシグネチャを含有する幾つかの確認されていない分子が検出され、複合フェニルプロパノイド化合物ライブラリーが、この方法によって作り出されたという概念を強化した。これらの結果は、バニリン、スチレン、アミノ酸、等のような芳香族化合物の代謝に関係する他の経路におけるライブラリーのクローンを開発する可能性も開く。従って、この方法は、他の経路に適用することもでき、そして同祖的組換え及び遺伝子クラスター構築を促進して新規な多様性を作り出すためにＤＮＡ修復機構を調節することができる他の生物体において使用することができる。
【０２０９】
参考文献
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１５−  Ｋａｒａｍａｎ  Ｉ，Ｇｅｚｅｇｅｎ  Ｈ，Ｇｕｒｄｅｒｅ  Ｍ，Ｄｉｎｇｉｌ  Ａ，Ｃｅｙｌａｎ  Ｍ．２０１０．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．７（２）：４００−８
１６−  Ｂａｔｏｖｓｋａ  Ｄ．ａｎｄ  Ｔｏｄｏｒｏｖａ  Ｉ．２０１０．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈａｌｃｏｎｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５（１）：１−２９，Ｒｅｖｉｅｗ
１７−  Ｓｃｈｏｅｆｅｒ  Ｌ．，Ｂｒａｕｎｅ  Ａ．，Ｂｌａｕｔ  Ｍ．２００１．Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０４：２７７−２８０
１８−  Ｖｏｇｔ  Ｔ．２０１０．Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｓ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．Ｖｏｌ  ３，１：２−２０
１９−  Ｗａｌｔｏｎ  Ｎ．，Ｍａｙｅｒ  Ｍ．，Ｎａｒｂａｄ  Ａ．２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：Ｖａｎｉｌｌｉｎ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６３ ：５０５−５１５
２０−  Ｓｉｎｈａ  Ａ．，Ｓｈａｒｍａ  Ｕ．，Ｓｈａｒｍａ  Ｎ．２００８．Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｖａｎｉｌｌａ  ｆｌａｖｏｒ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｎｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｎｕｔｒ．５９：２９９−３２６。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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