(57)【要約】  本発明は、スフィンゴ脂質シグナリングのモジュレーターとしての新たな複素環式化合物、並びに増殖性疾患、変性疾患、感染性疾患及び他の疾患の治療に好適な医薬活性物質としてのその使用に関する。    【化１】【選択図】なし
2014509633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014509633.tif 000019
（式中、
Ｒ１はメチレン、Ｏ、ＮＨ及びＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏから選択され、
Ｒ２は、例えばピペリジン等のアミン部分で任意に置換された、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−アルキル（ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される）から選択され、
Ｒ３は欠落しているか、又はＣ１〜Ｃ８アルキルから選択され、
ここで、Ｒ２及びＲ３は任意に、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−基（ｎ＝１又は２）を介して環を形成する）
を有する化合物及び薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２】
Ｒ１がＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
【化２】
2014509633.tif 000020
を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2014509633.tif 000021
（式中、ＸはＣＨ２及びＯから選択される）
を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
式（ＩＶ）：
【化４】
2014509633.tif 000022
（式中、
Ｒ１はＯであり、
Ｒ２はＣ１〜Ｃ８飽和アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８アルキルから選択され、
ここで、Ｒ２及びＲ３は任意に、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−基（ｎ＝１又は２）を介して環を形成する）
を有する、請求項１に記載の化合物及び薬学的に許容可能なその塩。
【請求項６】
式（Ｖ）：
【化５】
2014509633.tif 000023
（式中、
Ｒ２はパラ位にある）
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
式（ＶＩ）：
【化６】
2014509633.tif 000024
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
式（ＶＩＩ）：
【化７】
2014509633.tif 000025
（式中、Ｒ２及びＲ３が、３，４位の−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−及び−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−から選択される基を介して環を形成する）
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
活性成分として請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を含み、任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤を更に含む、医薬組成物。
【請求項１０】
疾患を治療する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
増殖性障害、血管新生関連障害、神経変性障害、代謝関連病態、感染性疾患、免疫関連障害、炎症性疾患及びプロスタグランジン形成の増大を特徴とする他の病的状態からなる群から選択される障害の治療に使用される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記増殖性障害ががんであるか、又は前記血管新生関連障害が糖尿病性網膜症及び黄斑変性から選択されるか、又は前記神経変性障害がアルツハイマー病若しくは多発性硬化症であるか、又は前記代謝関連病態が糖尿病、嚢胞性線維症及び脂質蓄積症から選択されるか、又は前記感染性疾患がウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び原虫感染症からなる群から選択されるか、又は前記免疫関連障害が自己免疫疾患であるか、又は炎症性疾患が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）若しくはアレルギーであるか、又は前記プロスタグランジン形成の増大に関連する病的状態が疼痛である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤感受性及び薬剤耐性のがん細胞の死滅に使用される、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
増殖性障害、血管新生関連障害、神経変性障害、代謝関連病態、感染性疾患、免疫関連障害及び疼痛からなる群から選択される障害を治療する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ脂質シグナリングのモジュレーターとしての新たなオキサゾロ（oxazolo）−オキサゾール化合物、並びに増殖性疾患、変性疾患、感染性疾患及び他の疾患の治療に好適な医薬活性物質としてのその使用に関する。本発明の目的上、本明細書中に引用される全ての参照文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
過去１０年にわたって、スフィンゴ脂質に関する研究が、その群の成員をシグナル伝達プロセスに関連付けた発見のために非常に増加している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５に概説される）。
【０００３】
シグナル伝達におけるスフィンゴ脂質の役割（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献５及び非特許文献８に概説される）は広範に研究されており、「スフィンゴミエリンサイクル」を介して作用することが提唱されている。この仮説によると、炎症性サイトカイン、細胞傷害物質、化学療法薬、分化誘導物質、並びに活性窒素種及び活性酸素種を含む多様なストレス誘導因子が、スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドを生じる細胞膜結合スフィンゴミエリナーゼを活性化することが可能である。スフィンゴ脂質は、細胞内標的を活性化するか又は阻害して、最終的にアポトーシスによる細胞の死滅、細胞増殖の阻害、細胞分化等の細胞応答及び炎症反応を誘発することができる（非特許文献８）。細胞透過性の短鎖（例えばＣ２又はＣ６）セラミドが細胞の死滅をもたらす生物学的応答を引き起こすという報告も特に興味深い。セラミドの分解産物（スフィンゴシン）を用いた他の研究では、細胞の成長及び生存に対するその重大な影響が示されている。概して、スフィンゴ脂質シグナリングモジュールの成員に対して複数の治療指標が提唱されている。スフィンゴシンと何らかの関係がある化合物が、このカスケードで生成される最終段階のメディエーターの１つを形成するため、特に関心が持たれている。
【０００４】
スフィンゴシンのリン酸化型、すなわちスフィンゴシン−１−リン酸は、Ｓ１Ｐ受容体を介して細胞外で、又は依然として不明確な標的を介して細胞内で作用し、標準的な分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケード、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔカスケード及びＴＧＦβ／Ｓｍａｄカスケードを含む多様なシグナリングカスケードを活性化することが示されている。加えて、ＰＬＡ２、ＰＬＣ及びＰＬＤを含む様々なホスホリパーゼが活性化される。このため、スフィンゴシン−１−リン酸は、脂質シグナリング（signaling）において直接的及び間接的なメッセンジャーとして作用する。ジメチル化スフィンゴシン又はトリメチル化スフィンゴシンは、がん細胞の成長を阻害することが示されている（非特許文献９）。
【０００５】
特許文献１は、下記一般式の化合物を記載している：
【化１】
2014509633.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して一般式Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２及び／又はＲ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４（ここで、Ｒ１及びＲ２及び／又はＲ３及びＲ４は全てが同時に水素となることはない）の部分であり得る。Ｒ６はＨ、又は例えばＯＨ基及び／又はアミノ基で置換され得るアルキルであってもよく、及び／又は最大８個の非隣接ＣＨ２基がＯに置き換えられていてもよい。Ｒ５及びＲ７はＨであり得る。この化合物は香料として使用される。
【０００６】
特許文献２は、一般式：
【化２】
2014509633.tif 000004
（式中、Ａ及びＢは硫黄又は酸素であり、Ｒ１及びＲ２は独立してハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキルであり、Ｒ３はアルコールである）の神経保護化合物を記載している。
【０００７】
特許文献３は、スフィンゴシン−１−リン酸受容体作動薬又はスフィンゴシン−１−リン酸を活性成分として含有する抗線維化剤、及び線維症を治療する方法におけるその使用を記載している。
【０００８】
Rosen et al（非特許文献１０）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を調節することが可能であり、免疫応答に対する影響が従来の免疫抑制剤とは全く異なる、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を共通のリガンドとする５つの異なる高親和性Ｇタンパク質共役受容体サブタイプを記載している。Ｓ１Ｐレオスタット（rheostat）の薬理学的破壊は、多発性硬化症において臨床的に効果的であることが判明していると記載されている。
【０００９】
免疫調節剤ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド）は、多発性硬化症の治療に対して治療薬として使用され、免疫調節疾患における使用が評価されている。フィンゴリモドは、主に作動性プロドラッグとしてスフィンゴシン−１−リン酸受容体を刺激するが、それに続いて、ＦＴＹ７２０はＳ１Ｐ１受容体サブタイプを特異的に脱感作することにより機能的拮抗薬として作用する。この後者の効果は、免疫抑制剤としてのその治療効果に関与することも提唱されている。ＦＴＹ７２０の構造は以下のとおりである。
【化３】
2014509633.tif 000005
【００１０】
２−アミノ−２［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール化合物が特許文献４に開示されている。
【００１１】
特許文献５は化合物ＦＴＹ７２０の塩、例えば結晶塩及びその使用に関する。この化合物は免疫抑制剤として有用であることが見出されている。したがって、この化合物は、多発性硬化症を含む様々な自己免疫状態の治療又は予防に有用であり得る。この群の具体的な化合物は、遊離塩基又は塩酸塩の形態で得ることができるＦＴＹ７２０である。
【００１２】
Nagaoka et al.（非特許文献１１）は、５つのうち４つのＳ１Ｐ受容体サブタイプに対する高親和性作動薬である、ＦＴＹ７２０−１−リン酸（ＦＴＹ７２０−Ｐ）へのリン酸化によって生物学的に活性化される免疫抑制剤ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド）を記載している。ＦＴＹ７２０は抗腫瘍活性を有するが、それにも関わらず、ＦＴＹ７２０のリン酸化とがん細胞に対するＦＴＹ７２０の成長阻害との間の関連性は推測であり、解明されていないと述べられている。Nagaoka et al.による研究では、ヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳｋ−Ｂｒ−３）及びヒト結腸がん細胞株（ＨＣＴ−１１６及びＳＷ６２０）の増殖に対するＦＴＹ７２０、スフィンゴシン及びそれらの関連化合物の効果が調査された。非リン酸化ＦＴＹ７２０、スフィンゴシン及びＦＴＹ７２０誘導体であるＩＳＰ−Ｉ−５５は、これらの細胞において顕著な成長阻害を示した。対照的に、リン酸化誘導体であるＦＴＹ７２０−Ｐ及びスフィンゴシン−１−Ｐ、並びにホスフィナンＦＴＹ７２０誘導体であるｃＦＴＹ７２０−Ｐは、試験濃度ではこれらの細胞の成長を阻害せず、一方でＦＴＹ７２０−Ｐ及びスフィンゴシン−１−ＰはＭＣＦ−７細胞の成長を僅かに誘導した。ＦＴＹ７２０とスフィンゴシンキナーゼ阻害剤であるジメチルスフィンゴシンとの組合せは、ＦＴＹ７２０の阻害効果を増強した。これらの結果から、ＦＴＹ７２０の抗増殖活性が、内因的にも又は外因的にもそのリン酸化に起因しないことが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０３０５０６３号
【特許文献２】米国特許第７，５９８，２８２号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６−０２８１７０９号
【特許文献４】欧州特許出願公開第０６２７４０６号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０５５０２７号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Fernandis et al, Curr.Opin. Lipidol. 18: 121-8,(2007)
【非特許文献２】Levade et al, Biochim.Biophys. Acta 1438, 1-17(1999)
【非特許文献３】Mathias et al, Biochem. J. 335, 465-480 (1998)
【非特許文献４】Perry et al, Biochim. Biophys. Acta 1436, 233-243 (1998)
【非特許文献５】Riboni et al, Prog.Lipid Res. 36, 153-195 (1997)
【非特許文献６】Eyster KM AdvPhysiol Educ. 31: 5-16, (2007)
【非特許文献７】L. Zheng et al Biochim Biophys Acta. 1758: 1864-84,(2006)
【非特許文献８】A. Huwiler et al Biochim Biophys Acta. 1485, 63-99 (2000)
【非特許文献９】Endo et al.,Cancer Research 51, 1613-8, (1981)
【非特許文献１０】Rosen H,Gonzalez-Cabrera P, Marsolais D, CahalanS, Don AS, Sanna MG. Modulating tone: the overture ofS1P receptor immunotherapeutics. Immunol.Rev. 2008; 223: 221-35
【非特許文献１１】Nagaoka Y, OtsukiK, Fujita T, Uesato S. Effects of phosphorylation of immunomodulatory agent FTY720 (fingolimod)on antiproliferative activity against breast andcolon cancer cells. Biol. Pharm. Bull. 2008; 31(6): 1177-81
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、がん及び網膜症等の細胞増殖の増大及び／又は血管新生の増大に関連する障害の治療に特に好適な新規の化合物を提供することである。本発明の別の目的は、糸球体腎炎、自己免疫介在疾患、特に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む炎症性疾患、及び疼痛等のプロスタグランジン形成の増大に関連する他の病的状態の治療に好適な新規の化合物及び化合物の組合せを提供することである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、プロドラッグ特性を有さず、そのため薬理学的プロファイルがフィンゴリモド（ＦＴＹ７２０）よりも複雑でない新規のスフィンゴ脂質類似体を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる目的は、神経変性障害、代謝関連病態及び感染性疾患を治療する効力がある新規のスフィンゴ脂質類似体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
2014509633.tif 000006
（式中、
Ｒ１はメチレン、Ｏ、ＮＨ及びＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏから選択され、
Ｒ２は欠落しているか、又は例えばピペリジン等のアミン部分で任意に置換された、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−アルキル（ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される）から選択され、
Ｒ３は欠落しているか、又はＣ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−アルキル−Ｏ−（ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ２アルキルから選択される）から選択され、
ここで、Ｒ２及びＲ３は任意に、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−基（ｎ＝１又は２）を介して環を形成する）
を有する化合物及び薬学的に許容可能なその塩を提供する。
【００１９】
驚くほど強力な治療効果を示す新たなスフィンゴ脂質類似体が今回合成された。このため、本発明は、プロドラッグ特性を有さず、したがって薬理学的プロファイルが例えばフィンゴリモド（ＦＴＹ７２０）等の他のスフィンゴ脂質モジュレーターよりも複雑でないスフィンゴ脂質モジュレーターに関する。本発明による化合物は、ＦＴＹ７２０との類似性が高い親油性構造を含む。したがって、本発明による化合物は、プロドラッグ特性を欠くが、依然としてスフィンゴ脂質シグナリングに効果的に影響を与えることが可能な構造的に関連した化合物群である。プロドラッグ特性の欠如は、プロドラッグを変換する生理学的な、したがって変動する代謝段階が迂回されることにより回避されるため、薬理学的操作、例えば該薬物の投薬及び有効な投与に関する幾つかの利点を有する。したがって、本発明による化合物は、その薬理学的効果（複数の場合もあり）についてより予測可能であるはずである。
【００２０】
Ｒ１がＣＨ２である本発明による化合物が好ましい。さらに、式（ＩＩ）：
【化５】
2014509633.tif 000007
に記載の本発明による化合物（ＳＴ−１５０５）が好ましい。
【００２１】
さらに、式（ＩＩＩ）：
【化６】
2014509633.tif 000008
（式中、ＸはＣＨ２及びＯから選択される）
に記載の本発明による化合物、例えばＳＴ９６８：
【化７】
2014509633.tif 000009
又はＳＴ１０７１：
【化８】
2014509633.tif 000010
が好ましい。
【００２２】
式（ＩＶ）：
【化９】
2014509633.tif 000011
（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＣ１〜Ｃ８飽和アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８アルキルから選択され、
ここで、Ｒ２及びＲ３は任意に、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−基（ｎ＝１又は２）を介して環を形成する）
の本発明による化合物及び薬学的に許容可能なその塩が更に好ましい。
【００２３】
更に、式（Ｖ）：
【化１０】
2014509633.tif 000012
（式中、Ｒ２は上記のようなものであり、パラ位にある）の本発明による化合物が更に好ましい。具体的には上記式（ＩＩＩａ）又は式（ＩＩＩｂ）を参照されたい。
【００２４】
式（ＶＩ）：
【化１１】
2014509633.tif 000013
の本発明による化合物（ＳＴ−１３７５）が特に好ましい。
【００２５】
式（ＶＩＩ）：
【化１２】
2014509633.tif 000014
（式中、Ｒ２及びＲ３が、好ましくは３，４位の−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−及び−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−から選択される基を介して環を形成する）の本発明による化合物が特に好ましい。
【００２６】
本発明者らによって行われた生物学的アッセイにおいて、本発明の化合物、特にＳＴ９６８及びＳＴ１０７１は、１つ又は幾つかのＳ１Ｐ受容体サブタイプに対して作動能を示した。さらに、抗炎症効果が見出された。加えて、本発明による化合物、特に化合物ＳＴ９６８及びＳＴ１０７１（図２参照）は、結腸がん細胞（ＨＣＴ−１１６）においてコロニー形成を阻害及び／又は低減した。このため、本発明による化合物は、単独で又は他の抗がん薬と組み合わせて、薬剤感受性及び薬剤耐性の細胞を含む多様ながん細胞株に対する強力な成長阻害剤であることが期待される。
【００２７】
本発明の別の態様は、スフィンゴ脂質シグナリングの不均衡を特徴とする疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験体に治療的に有効な量の本発明による式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、方法に関する。
【００２８】
本発明において、「治療的に有効な量」とは、その化合物が有効な疾患を患う被験体に投与した場合、疾患の軽減、寛解又は退行をもたらす化合物又は組成物の任意の量である。
【００２９】
「被験体」は脊椎動物、哺乳動物、家畜又はヒトである。
【００３０】
本発明の実施に際して、「薬学的に許容可能なビヒクル」とは、医薬組成物の配合に有用な当業者に既知の任意の生理学的ビヒクルである。
【００３１】
本発明は更に、活性成分として少なくとも１つの本発明による化合物を含み、任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤を更に含む、医薬組成物に関する。本発明の化合物は概して、医薬組成物の形態で提供される。該組成物は注射、皮膚適用及び局所適用、又は経口摂取によって用いられる。持続的な薬物放出及び他の好適な医薬製剤にパッチを用いてもよい。
【００３２】
本発明の医薬組成物は概して、緩衝剤、浸透圧を調整する薬剤、並びに任意に１つ又は複数の担体、賦形剤、及び／又は例えば風味、色、潤滑性等を医薬組成物に加える目的の当該技術分野で既知の添加剤を含む。
【００３３】
各々の担体は、他の成分と相溶性があり、治療対象の被験体にとって傷害性でないという意味で薬学的かつ生理学的に許容可能であるものとする。配合物には直腸投与、経鼻投与に好適なもの含まれるが、好ましい配合物は経口投与、又は例えば筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、具体的には静脈内投与を含む非経口投与が意図される。配合物は単位剤形で都合よく与えることができ、薬学分野で既知の任意の方法によって調製することができる。
【００３４】
本発明は、本化合物の薬学的に許容可能な塩も包含する。かかる塩としては、薬学的に許容可能な付加塩、薬学的に許容可能な金属塩、アンモニウム塩及びアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩には無機酸及び有機酸の塩が含まれる。好適な無機塩の代表例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸等が挙げられる。好適な有機酸の代表例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、グルタミン酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、サリチル酸、コハク（succinic）酸、スルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、酒石酸、アスコルビン酸、ビスメチレンサリチル酸、ethynditamic酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。薬学的に許容可能な無機酸及び有機酸の付加塩の更なる例としては、例えばS. M. Berge, L. D. Bighley, D. C. Monkhouse, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19及びP. H. Stahl, C: G: Wermuth, Handbook of
pharmaceutical salts: Properties, selection and use. 2002, Verlag
Helvetica Chimica Acta, Zuerich;
ISBN: 3-906390-26-8に列挙される薬学的に許容可能な塩が挙げられる。金属塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム（potassium）塩、マグネシウム塩等が挙げられる。アンモニウム塩、アルキル化（alkylated）アンモニウム塩の例としては、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム（hydroxyethylammonium）塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム（tetramethylammonium）塩等が挙げられる。
【００３５】
薬学的に許容可能な酸付加塩として、本化合物が形成することが可能な水和物も意図される。
【００３６】
酸付加塩は化合物合成の直接生成物として得ることができる。代替的には、適切な酸を含有する好適な溶媒に遊離塩基を溶解し、溶媒を蒸発させるか又は別の形で塩と溶媒とを分離することによって塩を単離することができる。
【００３７】
本発明の化合物は、当業者に既知の方法を用いて標準的な低分子量溶媒と溶媒和物を形成することができる。かかる溶媒和物は、本発明の範囲内に含まれることが企図される。
【００３８】
担体としては、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば微結晶性セルロース、キサンタンガム等を挙げることができる。潤滑剤としては、水添ヒマシ油等を挙げることができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に有害でないあらゆる溶媒、分散媒及びコーティングを含む。
【００４０】
次に、新規の本発明の化合物と薬学的に（pharmaceutically）許容可能な担体とを組み合わせることによって形成された医薬組成物は、開示の投与経路に好適な多様な剤形で容易に投与される。配合物は、薬学分野で既知の方法によって単位剤形で都合よく与えることができる。
【００４１】
経口投与に好適な本発明による医薬組成物の配合物は、各々が所定量の活性成分を含有し、好適な賦形剤を含み得るカプセル剤又は錠剤等の個別単位として与えることができる。これらの配合物は、水溶液若しくは非水液体中の溶液若しくは懸濁液、又は水中油型エマルション若しくは油中水型エマルションとして、粉末剤又は顆粒剤又は融液の形態とすることができる。
【００４２】
必要に応じて、本発明の医薬組成物は、本発明による化合物を１つ又は複数の薬理活性物質と組み合わせて含み得る。抗菌剤及び抗真菌剤が含まれていてもよい。かかる媒体及び薬剤の医薬品活性物質への使用は当該技術分野で既知である。
【００４３】
本発明は、本化合物の活性代謝産物も包含する。かかる代謝産物には、化学反応及び（as well as）酵素反応によって体内で形成されるものが含まれる。種々の共役誘導体としての第１相及び第２相の代謝産物の形成が活性代謝産物の定義に含まれる。
【００４４】
本発明の化合物は、異なる又は特殊な多形を含む任意の薬学的に許容可能なその塩を含み得る。
【００４５】
医薬組成物は、経口経路、直腸経路、経鼻経路、経肺（pulmonary）経路、局所経路（口腔経路及び舌下経路を含む）、経皮経路、嚢内（intracisternal）経路、腹腔内経路、硝子体内経路、膣内経路及び非経口経路（皮下経路、筋肉内経路、髄腔内経路、静脈内経路及び皮内経路を含む）等の任意の好適な経路に合わせて個別に配合することができる。経口経路及び経皮経路が好ましく、経口経路が最も好ましい。好ましい経路が治療対象の被験体の全身状態及び年齢、治療する病態の性質並びに選択される活性成分に応じて異なることが理解されよう。
【００４６】
本発明の好ましい実施の形態では、化合物を経口投与用に配合する。
【００４７】
経口投与用の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、丸薬、舐剤、粉末剤及び顆粒剤等の固体剤形であり得る。固体剤形は、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、結合剤又は錠剤崩壊剤としても作用する１つ又は複数の物質を含んでいてもよい。粉末剤では、ビヒクルは、微粉化した本発明による化合物と混合される微粉化した固体である。錠剤では、本発明による化合物は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末剤及び錠剤は、最大で９９％の本発明の化合物を含有するのが好ましい。好適な固体ビヒクルとしては、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。固体担体の量は大きく異なるが、通常約２５ｍｇ〜約１０００ｍｇである。
【００４８】
必要に応じて、固体剤形は腸溶コーティング等のコーティングを用いて調製するか、又は当該技術分野で既知の方法に従って活性成分の徐放若しくは持続放出等の制御放出、若しくはボーラス適用をもたらすように配合することができる。
【００４９】
従来の錠剤化技法（例えば圧縮）によって調製することができる典型的な好ましい錠剤は、以下のものを含有し得る：
コア：
活性化合物（遊離化合物又はその塩として）  ５．０ｍｇ〜１０．０ｍｇ
ヨーロッパ薬局方ラクトース                ６７．８ｍｇ
微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）        ３１．４ｍｇ
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲＰ８８＊    １．０ｍｇ
ヨーロッパ薬局方ステアリン酸マグネシウム  適量
コーティング：
ヒドロキシプロピルメチルセルロース        およそ９ｍｇ
Ｍｙｗａｃｅｔｔ  ９−４０  Ｔ＊＊          およそ０．９ｍｇ
＊ポラクリリンカリウムＮＦ、錠剤崩壊剤、Rohm and Haas
＊＊フィルムコーティングの可塑剤として使用されるアシル化モノグリセリド
【００５０】
経口投与用の医薬組成物は、代替的に液体形態であってもよい。液体担体は、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル及び加圧組成物の形態であり得る。本発明の化合物は、水、有機溶媒、それらの混合物又は薬学的に許容可能な油若しくは脂肪等の薬学的に許容可能な液体ビヒクルに溶解又は懸濁することができる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、バッファー、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤又は浸透圧調節剤等の他の好適な医薬品添加剤を含有していてもよい。経口投与に好適な液体ビヒクルの例としては、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシルメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、並びに油（例えば分留ヤシ油及びラッカセイ油）が挙げられる。
【００５１】
本発明の別の実施の形態では、化合物は非経口投与用に配合される。
【００５２】
液体組成物は非経口的に使用するのが好ましい。この場合、上記で論考される液体形態、特に液体ビヒクルを使用することができる。さらに、非経口投与については、ビヒクルはオレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピル等の油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルが、非経口投与用の滅菌液体形態組成物に有用である。
【００５３】
滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、他の好ましい投与経路に利用することができる。例えば、液体は筋肉内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、腹腔内注射、硝子体内注射又は皮下注射に使用することができる。滅菌溶液は静脈内投与することもできる。化合物は、投与時に滅菌水、生理食塩水又は他の適切な滅菌注射媒体を用いて溶解又は懸濁することができる滅菌固体組成物として調製してもよい。ビヒクルには、必要な不活性の結合剤、懸濁化剤、潤滑剤、着香料（flavorants）、甘味料、防腐剤、着色料及びコーティングが含まれる。
【００５４】
他の好適な投与形態としては、坐剤、噴霧剤、軟膏、クリーム、ジェル、吸入剤（inhalates）、皮膚パッチ、インプラント等が挙げられる。
【００５５】
典型的な経口投与量は、１回又は複数回の投与、例えば１回〜３回の投与で投与される１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは１日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。正確な投与量は、適用の頻度及び様式、治療対象の被験体の性別、年齢、体重及び全身状態、治療する病態の性質及び重症度、並びに治療する任意の合併症及び当業者に明らかな他の要因に応じて異なる。
【００５６】
本発明による医薬組成物は、当業者に既知の方法によって単位剤形で都合よく与えることができる。１日１回又は複数回、例えば１日１回〜３回の経口投与に典型的な単位剤形は、０．０５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好ましくは（preferably）約０．５ｍｇ〜約３０００ｍｇ、より好ましくは約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、最も好ましくは約１０ｍｇ〜約５００ｍｇを含有する。
【００５７】
非経口経路、例えば静脈内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与及び同様の投与については、用量は通常は経口投与に用いられる用量の約半分程度である。
【００５８】
本発明の化合物は概して、遊離物質又は薬学的に許容可能なその塩として利用される。一例は、遊離塩基の有用性を有する化合物の酸付加塩である。本発明の化合物が遊離塩基を含有する場合、かかる塩は、本発明の遊離塩基の溶液又は懸濁液を化学当量の薬学的に許容可能な酸、例えば無機酸又は有機酸で処理することによって従来どおり調製される。代表例は上記に言及される。ヒドロキシル基を有する化合物の生理学的に許容可能な塩としては、ナトリウムイオン又はアンモニウムイオン等の好適な陽イオンと組み合わせた該化合物の陰イオンが挙げられる。
【００５９】
別の好ましい医薬製剤は、注射、例えば静脈内注射による投与に使用するのが好ましい。
【００６０】
非経口投与については、滅菌水溶液又は非水溶液、含水プロピレングリコール又はゴマ油若しくはピーナッツ油中の新規の本発明の化合物の溶液を用いることができる。かかる水溶液を必要に応じて緩衝化し、初めに希釈された液体を十分な生理食塩水又はグルコースで等張とすべきである。水溶液は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に特に好適である。用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技法によって容易に利用可能である。
【００６１】
注射による使用に好適な医薬品形態としては、滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末剤が挙げられる。いずれの場合も、この形態は滅菌状態でなければならず、注射針の通過が容易である範囲で流動性としなければならない。この形態は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護しなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、好適なその混合物及び植物油等を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適当な粘稠度は、例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合に所要の粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【００６２】
滅菌注射溶液は、所要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した幾つかの他の成分とともに適切な溶媒中に混入した後、濾過滅菌することによって調製される。分散液は概して、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒及び上記に列挙した所要の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに混入することによって調製される。
【００６３】
滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥法及び凍結乾燥法であり、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分の粉末剤に加えて任意の付加的な所望の成分が得られる。
【００６４】
医薬組成物の調製は当該技術分野で既知であり、多くの論文及び教科書に記載されている。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro
A.R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990、とりわけその１５２１頁〜１７１２頁を参照されたい。
【００６５】
添加剤は、細胞膜を介した活性薬剤の取込みを向上させるようにも設計される。かかる薬剤は概して、本発明の分子の細胞取込みを向上させる薬剤である。例えば、本発明の化合物はリポソームに封入することができる。例えば特定のトランスフェクション試薬を用いたリポソームの調製及び使用が、当該技術分野で既知である。リポソームを得る他の方法は、センダイウイルス又は他のウイルスの使用を含む。
【００６６】
活性薬剤の用量は、個々の（individual）治療的に有効な量によって異なり得る。用量は概して、疾患、疾患の状態、患者の年齢、体重及び性別に応じて異なり、主治医によって決定される。
【００６７】
多くの分子生物学分野の方法が当業者に既知であるため、本明細書中で詳述しない。かかる方法を記載している教科書は例えば、Sambrook et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN:
0879693096, 1989、Current Protocols in Molecular Biology
by F. M. Ausubel, ISBN: 047150338X, John Wiley &
Sons, Inc. 1988、及びShort Protocols in Molecular Biology
by F. M. Ausubel et al. (eds.) 3rd ed., John Wiley
& Sons, ISBN: 0471137812, 1995である。さらに、多くの免疫学的技法が当業者に既知であるため、各々の場合について本明細書中では詳細に記載しない（例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan
et al. (eds), John Wiley & Sons. Inc., New York,
NYを参照されたい）。
【００６８】
次に、本発明の別の態様は、医薬及び疾患の治療に使用される本発明による化合物又は本発明による医薬組成物に関する。
【００６９】
このため、本発明による化合物を含む医薬組成物は、スフィンゴ脂質シグナリングの不均衡に関連し、及び／又は本発明による化合物を用いたスフィンゴ脂質シグナリングの変調に基づいて治療することができる（すなわち、少なくとも症状を改善することができる）疾患、例えば増殖性障害、血管新生関連障害、神経変性障害、代謝関連病態、感染性疾患、免疫関連病態及び疼痛からなる群から選択される障害の治療が特に意図される。
【００７０】
前記増殖性障害ががんであるか、又は前記血管新生関連障害が加齢に伴う黄斑変性又は糖尿病性網膜症等の網膜症であるか、又は前記神経変性障害がアルツハイマー病若しくは多発性硬化症であるか、又は前記代謝関連病態が糖尿病、嚢胞性線維症及び脂質蓄積症から選択されるか、又は前記感染性疾患がウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び原虫感染症からなる群から選択されるか、又は前記免疫関連病態が自己免疫疾患及び炎症性疾患、ＧＶＨＤ若しくはアレルギーである、本発明による医薬組成物が好ましい。
【００７１】
次に、本発明の別の態様は、薬剤感受性及び薬剤耐性のがん細胞、特にいわゆる「多剤耐性」がん細胞を死滅させる本発明による医薬組成物に関する。
【００７２】
次に、本発明の更に別の態様は、増殖性障害、神経変性障害、代謝関連病態、感染性疾患及び免疫関連病態からなる群から選択される障害を治療する薬剤の調製における本発明による化合物の使用に関する。
【００７３】
また更なる態様では、本発明は、細胞増殖性疾患、特にがん性疾患を治療する、具体的にはかかる治療を必要とする患者において野生型及び薬剤耐性のがん細胞を死滅させる方法であって、該患者に治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。好ましい実施の形態では、少なくとも１つの上記式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を、神経変性障害、代謝関連病態、感染性疾患及び免疫関連病態の治療に対して、かかる治療を必要とする患者において使用し、この治療は上記患者に治療的に有効な量の式（Ｉ）の本発明による化合物又は薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む。
【００７４】
本発明のまた別の態様は、不均衡なスフィンゴ脂質シグナリングに起因又は関連する疾患／障害を治療、予防及び／又は改善する方法であって、かかる疾患／障害を治療、予防及び／又は改善するのに有効な量の本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００７５】
本発明を幾つかの具体的な例を用いて記載したが、多くの変更形態及び変形形態が可能である。したがって、当然ながら本発明が添付の特許請求の範囲以外には決して限定されないことが意図される。本発明の上記及び他の特性及び利点は、添付の図面を参照して以下の実施例からより容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＳＴ−９６８刺激性ＭＡＰＫ／ＥＲＫリン酸化に対する百日咳毒素並びにＳ１Ｐ１／Ｓ１Ｐ３受容体拮抗薬ＶＰＣ２３０１９及びＷ１４６の影響、並びに腎メサンギウム細胞におけるＳＴ−１０７１刺激性ＭＡＰＫ／ＥＲＫリン酸化の影響を示す図である。（Ａ＋Ｂ）：コンフルエントなメサンギウム細胞を百日咳毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）で１６時間、又はビヒクル（−）、ＶＰＣ２３０１９（１０μＭ）及びＷ１４６（１０μＭ）で３０分間前処理した後、ビヒクル（Ｃｏ）又はＳＴ−９６８（１μＭ）で１０分間刺激した。（Ｃ）：細胞をビヒクル（Ｃｏ）又は指定の濃度（μＭ）のＳ１Ｐ及びＳＴ−１０７１で１０分間刺激した。その後、３０μｇのタンパク質を含有する細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し、ホスホ−ｐ４２／４４（１０００倍希釈；Ａ、上パネル）及び全ｐ４２／ＥＲＫ２及びｐ４４／ＥＲＫ１（各々６０００倍希釈；Ｂ、下パネル）に対する抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。ブロットをＥＣＬ法によってメーカーの推奨に従って染色した。ホスホ−ｐ４２／４４及び全ＥＲＫに相当するバンドを比重走査し、評価した（Ｂ）。Ｂの結果はＳＴ−９６８刺激の％として示し、平均±標準偏差である（ｎ＝３）。
【図２】腎メサンギウム細胞におけるサイトカイン誘発性分泌ホスホリパーゼＡ２発現に対するＳＴ−９６８の影響を示す図である。細胞を、指定の濃度のＳＴ−９６８の非存在下（０）又は存在下で、ビヒクル（−、０）又はインターロイキン１β（１ｎＭ）＋ホルスコリン（１０μＭ）（ＩＬ−１／Ｆｋ、＋）で２４時間処理した。その後、上清を採取し、同量をトリクロロ酢酸を用いたタンパク質沈殿に供した。等量（Equal aliquots）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し、ラットｓＰＬＡ２に対するモノクローナル抗体を６０倍希釈で用いたウエスタンブロット分析に供した。ブロットをＥＣＬ法によってメーカーの推奨に従って染色した。データは同様の結果が得られた２回の独立実験の代表である。
【図３】腎メサンギウム細胞からのサイトカイン誘発性一酸化窒素放出に対するＳＴ−９６８の影響を示す図である。細胞を、指定の濃度のＳＴ−９６８（μＭ）又はベタメタゾン（ｎＭ）の非存在下（０）又は存在下で、ビヒクル（−）又はインターロイキン１β（１ｎＭ）＋ホルスコリン（１０μＭ）（ＩＬ−１／Ｆｋ、＋）で２４時間処理した。その後、上清を採取し、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を用いて亜硝酸塩を定量した。
【図４】ヒト内皮細胞株ＥＡ．ｈｙ  ９２６におけるＭＡＰＫ／ＥＲＫリン酸化に対するＳ１Ｐ及びＳＴ−９６８を用いた短期処理及び長期処理の影響を示す図である。コンフルエントなＥＡ．ｈｙ  ９２６細胞を、ビヒクル（Ｃｏ）、Ｓ１Ｐ（１μＭ）又はＳＴ−９６８（１μＭ）で１０分間（左側）又は４時間（右側）処理した。その後、３０μｇのタンパク質を含有する細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し、ホスホ−ＥＲＫ１／２（１０００倍希釈；Ａ、上パネル）並びに全ｐ４２／ＥＲＫ２及び全ｐ４４／ＥＲＫ１（各々６０００倍希釈；Ｂ、下パネル）に対する抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。ブロットをＥＣＬ法によってメーカーの推奨に従って染色した。ホスホ−ＥＲＫに相当するバンドを比重評価した。結果は対照に対する％として示し、平均±標準偏差である（ｎ＝２／３）。
【図５】ヒト内皮細胞の血清刺激性移動に対するＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１の影響を示す図である。８μＭポリカーボネートインサート中の血清飢餓ＥＡ．ｈｙ  ９２６細胞を、指定の濃度のＳＴ−９６８又はＳＴ−１０７１の非存在下又は存在下で、１０％血清で６時間処理した。移動した細胞をＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡（microscope）計数した。結果は１視野当たりの移動した細胞の数を示し、平均±標準偏差である（ｎ＝４）。
【図６】ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ−１１６のコロニー形成に対する新規のＦＴＹ７２０誘導体及びミリオシンの影響を示す図である。細胞を、６０ｍｍ径のディッシュに１枚当たり７００個の細胞という密度で成長培地中に播種した。２４時間後、細胞をビヒクル（Ｃｏ）又は指定の濃度（μＭ）のＦＴＹ７２０、ミリオシン（ｍｙｒｉｏ）、ＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１で処理し、３７℃で更に１０日間培養した。その後、コロニーを染色し、方法セクションに記載のように定量した。データは播種した７００個の細胞当たりのコロニー数を示し、単一値である。この実験は二重反復試験であり、同様の結果を有する２回の独立実験の代表である。
【図７】ＦＴＹ７２０と比較した、マウス血液中のリンパ球数に対するＳＴ−９６８、ＳＴ−１０７１、ＳＴ−１３６２、ＳＴ−１３７３、ＳＴ−１３７４、ＳＴ−１３７５及びＳＴ−１５０５の影響を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１ｍｇ／ｋｇ（体重）のＦＴＹ７２０（Ａ）、ＳＴ−９６８（Ａ）、ＳＴ−１０７１（Ａ）、ＳＴ−１３６２（Ｂ）、ＳＴ−１３７３（Ｂ）、ＳＴ−１３７４（Ｂ）、ＳＴ−１３７５（Ｂ）、ＳＴ−１５０５（Ｂ）をＰＢＳ中１００ｕｌ容量で腹腔内注射した。２４時間後、血液を採取し、リンパ球を血球計で測定した。データは血液１ｍｌ当たりのリンパ球数を示し、平均±標準偏差である（ｎ＝３〜１０）。対照マウスと比較して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は統計的に有意であるとみなした。
【図８】ＦＴＹ７２０と比較した、活動性ＥＡＥに対するＳＴ−９６８を用いたマウスの予防的治療の効果を示す図である。活動性ＥＡＥを、４ｍｇ／ｍｌの生育不能なヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する完全フロイントアジュバント（Freund's adjuvant）中２００μｇのＭＯＧａａ３５〜５５を皮下注射することによって誘導し、免疫化後１日目及び３日目に３００ｎｇの百日咳菌（Bordetellapertussis）を（腹腔内）注射した。（Ａ）臨床疾患スコアを、以下の４点スコアリングシステムを用いて毎日決定した：０、健常；０．５、尾弛緩；１、後肢不全対麻痺；２、後肢対麻痺；３、失禁を伴う後肢対麻痺。（Ｂ）マウスの体重を毎日測定した。予防的治療については、３日目〜１３日目に、マウスに１ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０（丸）又はＳＴ−９６８（三角）を毎日与えた。対照群にはＰＢＳ／ＤＭＳＯ（四角）を与えた。Ａでは、データは平均臨床スコア±標準偏差を示す（ｎ＝８）。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
以下の実施例は、本発明の態様を行う上で本発明者らが用いた技法を代表するものにすぎない。これらの技法は本発明の実施に関する好ましい実施形態の例示であるが、当業者は本開示に鑑みて、本発明の趣旨及び意図される範囲から逸脱することなく多数の変更形態を行うことができると認識するであろうことが理解されよう。
【実施例】
【００７８】
本明細書で提示される化合物は、ヒトの疾患又は障害の治療（並びに予防及び／又は改善）に特に有用である。本明細書で提示される化合物は、特異的な生物物理学的／生化学的試験で精査し、細胞ベースの疾患／障害モデルにおいて更に評価した。特に好ましい本発明の化合物は以下のとおりである。
【化１３】
2014509633.tif 000015
【００７９】
実験手順
出発化合物ＦＴＹ７２０及びオキシ類似体化合物を、以前に文献に報告されているように調製した（Fujita et al., J. Med. Chem. 2000. 43, 2946、Zivkovic and
Stark, Tetrahedr. Lett.
2010, 51, 3769）。実施例１及び実施例３には還元的アミノ化条件下での生成物の合成、実施例２及び実施例３にはディーンスターク装置を用いた化合物ＳＴ９６８及びＳＴ１０７１の合成を記載する（還元的アミノ化：Darabantu et al.,
(2000a) Tetrahedron, 2000, 56(23), 3799-3816、Darabantu et al. (2000b) Tetrahedron, 2000b, 56(23), 3785-3798、Darabantu (2004)
Eur. J. Org. Chem., 2004, 12, 2644-2661）。
【００８０】
実施例１
７ａ−（４−オクチルフェネチル）テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール（ＳＴ−９６８）の調製
１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中のＦＴＹ７２０（４００ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）と、ＺｎＣｌ２（７２０ｍｇ、５．２０ｍｍｏｌ）と、パラホルムアルデヒド（１６０ｍｇ、５．２０ｍｍｏｌ）との混合物を室温で９０分間撹拌した後、ＮａＢＨ４（２００ｍｇ、５．２０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を更に１時間撹拌した。２５％ＮＨ３（１０ｍｌ）の添加によって反応をクエンチし、更に１０分間撹拌し、有機層を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ３／１）に供した。生成物は収率５０％で単離された。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）
７．１５（ｑ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ，ＨＡｒ）、４．４９（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．３５（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、３．８０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．６４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、２．６０（ｍ，４Ｈ，２＊Ａｒ−ＣＨ２，）、１．８５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ２Ｏ−Ｎ−）、１．５８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）５−ＣＨ３）、１．３０（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−（ＣＨ２）５）、０．９２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，Ａｒ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３）；
ＥＳＩ（＋）：３３２．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（ヘキサン（hexane）／ＥｔＯＡｃ：３／１）
元素分析：算出値：Ｃ（７６．０９％）、Ｈ（１０．０３％）、Ｎ（４．５２％）；
実測値：Ｃ（７６．３１％）、Ｈ（９．８４％）、Ｎ（４．２３％）；
【００８１】
実施例２
７ａ−（４−オクチルフェネチル）テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール（ＳＴ−９６８）の調製
フィンゴリモド（５０ｍｇ）とパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ）との混合物をトルエン（４０ｍｌ）に溶解し、触媒量のｐ−ＴＳＡを添加した。反応混合物を、ディーンスターク装置を用いて還流下で２０時間撹拌した。次いで（then）、溶媒を蒸発乾固し、粗生成物をＥｔＯＡｃと水との間で分配した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固した。実施例１に既に挙げた分析データを用いて５０ｍｇの純粋なＳＴ９６８を単離した。化合物を更にジエチルエーテルからＨＣｌ塩（ＳＴ−９６８・ＨＣｌ）として結晶化した（２Ｍ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏを添加）。分析データは実施例１のものに一致する。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）
７．１２（ｑ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ，ＨＡｒ）、４．４５（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．４２（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、３．８０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．６４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、２．６０（ｍ，４Ｈ，２＊Ａｒ−ＣＨ２，）、１．８５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ２Ｏ−Ｎ−）、１．５８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）５−ＣＨ３）、１．３０（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−（ＣＨ２）５）、０．９２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，Ａｒ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３）；
ＥＳＩ（＋）：３３２．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
元素分析：算出値：Ｃ（６８．５５％）、Ｈ（９．３１％）、Ｎ（３．８１％）；
実測値：Ｃ（６８．４２％）、Ｈ（９．４２％）、Ｎ（３．６７％）；
【００８２】
実施例３
７ａ−（４−（ヘプチルオキシ）フェネチル）テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾールの調製
化合物ＳＴ−１０７１を、化合物ＳＴ−９６８（実施例１を参照されたい）と同様にして合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）
７．０６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，ＨＡｒ）、６．７７（ｄ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ，２Ｈ，ＨＡｒ）、４．３８（ｄ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．２４（ｄ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、３．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−）、３．６９（ｄ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．５３（ｄ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、２．４７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２，）、１．８５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ２Ｏ−Ｎ−））、１．５８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ３）、１．３０（ｍ，８Ｈ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）４）、０．８２（ｔ，Ｊ＝６．２５Ｈｚ，３Ｈ，Ａｒ−Ｏ−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）；
ＥＳＩ（＋）：３３３．９（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４８（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ：３／１）
元素分析：算出値：Ｃ（７２．０４％）、Ｈ（９．３７％）、Ｎ（４．２０％）；
実測値：Ｃ（７１．９４％）、Ｈ（９．３８％）、Ｎ（４．１５％）；
【００８３】
実施例４
７ａ−（４−（ヘプチルオキシ）フェネチル）テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾールの調製
化合物ＳＴ−１０７１を、化合物ＳＴ−９６８（実施例２を参照されたい）と同様にして合成した。ＳＴ−１０７１をＨＣｌ塩（ＳＴ−１０７１・ＨＣｌ）としても得た。分析データは実施例３のものに一致する。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（２５０ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ６）
７．１１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，ＨＡｒ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ，２Ｈ，ＨＡｒ）、４．４２（ｄ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．２４（ｄ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、３．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−）、３．７３（ｄ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．５３（ｄ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、２．４７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２，）、１．８５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ２Ｏ−Ｎ−）、１．５８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ３）、１．３０（ｍ，８Ｈ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）４）、０．８１（ｔ，Ｊ＝６．２５Ｈｚ，３Ｈ，Ａｒ−Ｏ−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）；
ＥＳＩ（＋）：３３３．９（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
元素分析：算出値：Ｃ（６４．９４％）、Ｈ（８．７２％）、Ｎ（３．７９％）；
実測値：Ｃ（６４．８２％）、Ｈ（８．９５％）、Ｎ（３．７０％）；
【００８４】
実施例５
７ａ−（４−（３−（ピペリジン−１−イル）プロポキシ）フェネチル）テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール（ＳＴ  １５０５）の調製
【化１４】
2014509633.tif 000016
２０ｍｌのアセトン中の７ａ−（４−（３−ブロモプロポキシ）フェネチル）テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール（２５０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）と、Ｋ２ＣＯ３（５００ｍｇ）と、ピペリジン（０．８５ｍｍｏｌ、１００μｌ）との混合物を一晩還流させた。反応混合物を蒸発乾固し、ＥｔＯＡｃと水との間で分割した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、アセトンからの結晶化後に純粋な生成物を得た（１５０ｍｇ、収率５９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ）、６．８７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝５．７８Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．３２（ｄ，Ｊ＝５．７８Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．０３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ２−）、３．７６（ｄ，Ｊ＝８．７７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．５８（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、２．４６（ｍ，６Ｈ，Ｎ（−ＣＨ２）３−）、１．９２（ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，−Ａｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．６２〜１．３９（ｍ，６Ｈ，Ｐｉｐ−（ＣＨ２）−）；
ＥＳＩ（＋）：３６１．６（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
ＨＲＭＳ：３６１．２４８５６（ｇｅｆ．）、３６１．２４８５７；
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５７（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １：１）
元素分析：算出値：Ｃ（６９．９７％）、Ｈ（８．９５％）、Ｎ（７．７７％）；
実測値：Ｃ（６９．６７％）、Ｈ（９．０１％）、Ｎ（７．４７％）；
【００８５】
実施例６
（テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール−７ａ−イル）メチル２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イルカルバメート（ＳＴ  １３７３）の調製
【化１５】
2014509633.tif 000017
３０ｍｌのベンゼン中の９７％２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イルイソシアネート（６４７ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ）と、（テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール−７ａ−イル）メタノール（５１３ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ）との混合物を一晩還流させた。反応混合物を冷却すると純粋な生成物が結晶化した（７３４ｍｇ、収率６５％）。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．５２（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．０１（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ）、６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ）、６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝５．７８Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．３２（ｄ，Ｊ＝５．７８Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．２１（ｍ，６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｏ−ＣＨ２−）、３．７６（ｄ，Ｊ＝８．７７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．５８（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）；
ＥＳＩ（＋）：３２３．０（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３７（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １：１）
元素分析：算出値：Ｃ（５５．９０％）、Ｈ（５．６３％）、Ｎ（８．６９％）；
実測値：Ｃ（５５．９４％）、Ｈ（５．６７％）、Ｎ（８．３３％）；
【００８６】
実施例７
（テトラヒドロ−１Ｈ−オキサゾロ［３，４−ｃ］オキサゾール−７ａ−イル）メチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルカルバメート（ＳＴ  １３７４）の調製
【化１６】
2014509633.tif 000018
化合物ＳＴ  １３７４を、市販の９８％３，４−（メチレンジオキシ（methylenedioxy））フェニルイソシアネートからＳＴ  １３７３と同様にして合成した。反応混合物を冷却すると純粋な生成物が結晶化した（収率６８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ［ｐｐｍ］（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．６３（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．０９（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ）、６．８３（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ）、５．９４（２，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ）、４．４６（ｄ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．３３（ｄ，Ｊ＝５．７６Ｈｚ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２Ｏ−）、４．０８（ｓ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝８．７３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）、３．６６（ｄ，Ｊ＝８．７６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ）；
ＥＳＩ（＋）：３０９．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）；
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２５（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １：１）
元素分析：算出値：Ｃ（５４．５４％）、Ｈ（５．２３％）、Ｎ（９．０９％）；
実測値：Ｃ（５４．７８％）、Ｈ（５．１９％）、Ｎ（８．８４％）；
【００８７】
実施例８
細胞培養実験の方法
化学薬品及び材料：
ＩＬ−１βはCell
Concept GmbH（Umkirch，Deutschland）から入手し、ＶＰＣ  ２３０１９及びＷ１４６はAvanti
Polar（Alabaster，Alabama，US）から入手し、百日咳毒素はMerck Biosciences（Schwalbach，Germany）から入手し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ及びホースラディッシュ結合二次抗体はGE
Healthcare Systems（Freiburg，Germany）から入手し、ラットＩＩＡ−ｓＰＬＡ２に対するモノクローナル抗体は以前に記載のように生成及び特性化し（Aarsman
et al., 1989）、誘導型ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）抗体はドイツフランクフルト大学付属病院のJ.
Pfeilschifter教授の厚意により提供され、ホスホ−ｐ４２／ｐ４４抗体はCell Signaling（Frankfurt
am Main，Germany）から入手し、全ｐ４２及びｐ４４−ＭＡＰＫ抗体は以前に記載のように生成及び特性化し（Huwiler
and Pfeilschifter, Br. J. Pharmacol. 113, 1455-1463）、ＰＧＥ２酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）はBIOTREND Chemikalien GmbH（Koeln，Germany）のＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓによって行い、全ての細胞培養栄養素はInvitrogen/Life
Technologies（Karlsruhe，Germany）から入手した。
【００８８】
細胞培養：
ラット腎メサンギウム細胞は以前に記載のように単離し、特性化し、培養した（Pfeilschifter et
al., 1984）。本研究で行った実験については、８継代〜３０継代の細胞を使用した。ヒト内皮細胞株ＥＡ．ｈｙ  ９２６は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。ＨＣＴ−１１６結腸癌細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ培地中で培養した。刺激の前に、全ての細胞を０．１ｍｇ／ｍｌの無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で２４時間静止させた。
【００８９】
細胞刺激及びウエスタンブロット分析：
コンフルエントなメサンギウム細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌの無脂肪酸ウシ血清アルブミン及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で図面の説明文に示すように刺激した。刺激の後、上清をＰＧＥ２又はＮＯの定量化及び分泌されたＩＩＡ−ｓＰＬＡ２の検出に供した。細胞単層を溶解バッファー中でホモジナイズし、以前に記載のとおりに処理した（Huwiler et al.,
2006）。細胞溶解物をタンパク質定量に供した。同量のタンパク質を含有する溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、図面の説明文に示す抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。バンドをメーカー推奨の増強化学発光法によって検出した。
【００９０】
分泌されたＩＩＡ−ｓＰＬＡ２の検出：
同数の細胞に由来する同量の上清を、７％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を用いたタンパク質沈殿に供した。沈殿したタンパク質を、ジチオスレイトールを含まないＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉバッファーに再溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲル）に供し、ニトロセルロース膜に転写し、ラットＩＩＡ−ｓＰＬＡ２に対するモノクローナル抗体を０．０１％粉乳中６０倍希釈で用いて免疫染色した。
【００９１】
ＰＧＥ２合成の決定：
２４ウェルプレート内のコンフルエントな細胞を、図面の説明文に示すように刺激した。７０μｌの上清を、メーカーの使用説明書に従ってＰＧＥ２  ＥＬＩＳＡに供した。
【００９２】
ＮＯ形成の定量化：
２４ウェルプレート内の静止メサンギウム細胞を、図面のように刺激し、上清を記載のようにＧｒｉｅｓｓ試薬を用いた亜硝酸塩定量に供した（Green et al., 1982）。
【００９３】
内皮細胞移動：
ＥＡ．ｈｙ  ９２６細胞を、無血清条件下で２４時間培養した。走化性をＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ（ポリカーボネートコーティング膜、孔径８μＭ）内で測定した。下部コンパートメントに無血清ＤＭＥＭを満たし、指定の刺激剤及び阻害剤の非存在下又は存在下で１つのインサート当たり１．７×１０５個の細胞を播種した。指定の期間の後、移動していない細胞を膜から機械的に除去し、膜に移動した細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、１ｕｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。ＤＡＰＩ染色した細胞を、蛍光顕微鏡を用いて計数した。各々のデータ点は５つのランダムな視野の平均細胞数であり、４つの個別ウェルの平均である。
【００９４】
コロニー形成アッセイ：
細胞を、６０ｍｍ径のディッシュに１枚のディッシュ当たり７００個の細胞という密度で継代培養した。２４時間後、細胞を成長培地中の指定濃度の種々の化合物で処理し、更に１０日間インキュベートして、コロニー形成させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、風乾させ、２％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで３０分間染色し、水で洗浄し、再度風乾させた。コロニーの数をＣｏｌＣｏｕｎｔ（商標）（哺乳動物細胞コロニーカウンター、Oxford Optronix（Oxford，U.K.））を用いて定量した。５０個を超える細胞を含有するコロニーのみを評価した。
【００９５】
統計分析：
統計分析は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。同じ対照群を用いた多重比較については、ボンフェローニ法に従って有意限界（limit of significance）を比較回数で除算した。
【００９６】
結果
ＦＴＹ７２０は、標準的なＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードを含む腎メサンギウム細胞の様々なシグナリングカスケードを活性化することが可能であるため（Xin et al., 2006）、初めに新規のオキサゾロ−オキサゾールＳＴ−９６８が同様の効果を有するか否かを明らかにした。ラット腎メサンギウム細胞を用いた場合、ＳＴ−９６８による１０分間の短期刺激が、ｐ４２／４４−ＭＡＰＫ活性を表すと考えられるｐ４２／４４リン酸化を増大させることが実際に見出された（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【００９７】
この効果は百日咳毒素によって部分的にしか遮断されず、Ｇｉ／ｏタンパク質が部分的に関与することが示唆された（図１Ａ及び図１Ｂ）。加えて、近年開発されたＳ１Ｐ１／Ｓ１Ｐ３受容体拮抗薬、すなわちＶＰＣ２３０１９を用いた。この拮抗薬はＳＴ−９６８によって誘導されるｐ４２／４４活性化を完全に無効にし、ＳＴ−９６８の刺激効果がＳ１Ｐ１受容体又はＳ１Ｐ３受容体（又はその両方）によって媒介されることが示唆された（図１Ａ及び図１Ｂ）。対照的に、よりＳ１Ｐ１選択的な拮抗薬として報告されている（Sanna et al., 2006、Gonzales-Cabrera et al., 2008）、別のＳ１Ｐ受容体拮抗薬である（Ｒ）−３−アミノ−（３−ヘキシルフェニルアミノ）−４−オキソブチルホスホン酸（Ｗ１４６）は、ＳＴ−９６８によって誘発されるＭＡＰＫ活性化に対して影響を有しなかった。ＳＴ−１０７１も１０分後に濃度依存的にｐ４２／４４リン酸化を刺激した（図１Ｃ）。しかしながら、これはＳ１Ｐよりも弱いことが見出された（図１Ｃ）。
【００９８】
これらのデータから、ＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１が１つ又は幾つかのＳ１Ｐ受容体に対して作動能を有し、シグナル伝達を活性化することが可能であることが初めて証明される。ＦＴＹ７２０が、サイトカイン誘導性の炎症誘発性分泌ホスホリパーゼＡ２の発現及び続くＰＧＥ２合成を減少させることによって、メサンギウム細胞において抗炎症的に作用することが示されているため（Xin et al., 2007）、ＳＴ−９６８が同様の効果を及ぼすか否かを更に調査した。
【００９９】
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）＋ホルスコリンによって２４時間刺激したメサンギウム細胞は、ｓＰＬＡ２タンパク質の発現及び細胞から上清への分泌の大幅な誘導を示した（図２）。漸増用量のＳＴ−９６８の存在下では、ｓＰＬＡ２発現は減少するため、ＦＴＹ７２０の効果に類似している。
【０１００】
ＰＧＥ２以外に、一酸化窒素（ＮＯ）も、メサンギウム細胞において炎症性条件下で誘導型ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）によって生成される炎症誘発性メディエーターであると考えられる。ＩＬ−１β／ホルスコリンによって誘導されるＮＯ形成がＳＴ−９６８によって用量依存的に減少することが見出された。１μＭ〜１０μＭのＳＴ−９６８では、１ｎＭ〜１００ｎＭの糖質コルチコイドベタメタゾンによって得られるものと同様の減少が見られた（図３）。
【０１０１】
これらのデータから、ＳＴ−９６８が炎症誘発性メディエーター生成を低減可能であることが示され、したがってＳＴ−９６８もｉｎ  ｖｉｖｏで抗炎症効果及び鎮痛効果を示し得ると考えられる。
【０１０２】
次の段階では、別の細胞系、すなわちヒト内皮細胞株ＥＡ．ｈｙ  ９２６を調査した。この系においても、ＳＴ−９６８がｐ４２／４４−ＭＡＰＫカスケードを活性化し得ることが見出された。Ｓ１Ｐと比較すると、１０分間の刺激の後、Ｓ１Ｐがｐ４２／４４リン酸化をＳＴ−９６８よりも強く増大させることが見出された（図４Ａ及び図４Ｂ）。しかしながら、刺激期間を４時間に延長すると、ＳＴ−９６８はｐ４２／４４リン酸化をＳ１Ｐよりも強く増大させた（図４Ａ及び図４Ｂ）。これらのデータから、Ｓ１ＰとＳＴ−９６８とが異なる薬物動態特性を有し得ることが示される。
【０１０３】
内皮細胞では、Ｓ１Ｐがこれらの細胞の増殖及び移動を調節し、それにより病態生理学的状況下で血管新生を誘発し得ることが報告されているため（Lucke and Levkau, Cell Physiol Biochem. 26, 87-96 (2010)）、ＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１が、適合ボイデンチャンバーアッセイにおいてヒト内皮細胞（細胞株ＥＡ．ｈｙ  ９２６）の移動に対して影響を与えるか否かについて更に分析した。図５に示されるように、ＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１の両方が３μＭ及び１０μＭの濃度で血清刺激移動を低減することが可能であった。
【０１０４】
これらの結果から、両方の化合物が、内皮細胞移動の増大に関連する病態生理学的な病態、例えばがん並びに糖尿病性網膜症及び加齢に伴う黄斑変性を含む様々な形態の網膜症を治療するのに有効であり得ることが示される。
【０１０５】
第３のアプローチでは、ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ−１１６を使用した。ＦＴＹ７２０は抗腫瘍効果を示し得ることが以前に示されている（Wang et al., 1999、Azuma et al., 2002、LaMontagne et al.,
2006）。したがって、今回、ＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１（及び他の一連のＦＴＹ７２０誘導体）ががん細胞のコロニー形成能に影響を与えるか否かを試験した。図６に示されるように、ＦＴＹ７２０はこれらのがん細胞においてコロニー形成を完全に無効にしたが、ＦＴＹ７２０前駆体ミリオシンは効果を有しなかった。また、化合物ＳＴ−９６８及びＳＴ−１０７１は活性を有し、コロニー形成を強く減少させた（図６）。
【０１０６】
実施例９
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験方法：
マウスにおける実験的自己免疫誘導性脳脊髄炎：
全ての動物実験は、ベルン州獣医局の動物実験委員会によって認可された。活動性ＥＡＥを、８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、４ｍｇ／ｍｌの生育不能なヒト型結核菌（Ｈ３７Ｒ４、Ｄｉｆｃｏ、BD Biosciences）を含有する完全フロイントアジュバント中のＭＯＧａａ３５〜５５をマウス１匹当たり２００μｇ皮下注射することによって誘導した。免疫化後１日目及び３日目に、合計で３００ｎｇの百日咳菌を腹腔内注射した。以下の４点スコアリングシステムを用いた臨床疾患スコアリングを毎日行った：０、健常；０．５、尾弛緩；１、後肢不全対麻痺；２、後肢対麻痺；３、失禁を伴う後肢対麻痺。ＦＴＹ７２０又はＳＴ−９６８を用いた予防的治療については、３日目〜１３日目に、マウスに１ｍｇ／ｍｌの薬物を毎日与えた。
【０１０７】
マウス血液のリンパ球計数：
全ての化合物を、ＤＭＳＯ中２０ｍＭ又は４０ｍＭのストック溶液に溶解した。注射溶液を、ストック溶液をＰＢＳで希釈することによって調製した。体重１ｋｇ当たり１ｍｇを１００μｌ容量で注射した。２４時間後、血液を採取し、血球を血球計で分析した。
【０１０８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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