(57)【要約】本発明は、免疫障害および／または自己免疫障害の処置のための、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の療法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、1型糖尿病、エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ、卵巣炎、および造血幹細胞移植後の移植片対宿主病（GvHD）と関連する自己免疫病状を含むがこれらに限定されない、自己免疫疾患の予防および／または処置において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性材料で作製されたナノ粒子、および該ナノ粒子と表面結合している自己由来または同種異系の制御性T細胞（Treg）を、対象に投与する段階を含む、対象において免疫寛容を誘導するための方法であって、該ナノ粒子が、その内部にTreg選択的増殖因子および自己抗原を封入しており、かつ該ナノ粒子の表面がTreg細胞表面に結合している、方法。
【請求項２】
生分解性材料が、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ナノ粒子が、IL-2、ラパマイシン、およびシロスタミドから選択されるTreg選択的増殖因子を封入している、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ナノ粒子が、IL-2およびシロスタミドを封入している、請求項3記載の方法。
【請求項５】
自己抗原が、インスリンペプチド、膵島細胞自己抗原、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）、インスリノーマ関連-2-タンパク質（IA-2）、およびプレプロインスリンからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
自己免疫疾患を処置するために使用される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
対象が、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患を発病する素因を有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
対象が1型糖尿病を有する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ナノ粒子が、直径が約300〜500ナノメートルのサイズを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
生分解性材料で作製されたナノ粒子、および該ナノ粒子と表面結合している自己由来または同種異系の制御性T細胞（Treg）を、対象に投与する段階を含む、自己免疫疾患を処置するかまたはその発症を遅延させる方法であって、該ナノ粒子が、その内部にTreg選択的増殖因子および自己抗原を封入しており、かつ該ナノ粒子の表面がTreg細胞表面に結合している、方法。
【請求項１１】
生分解性材料が、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ナノ粒子が、IL-2、ラパマイシン、およびシロスタミドから選択されるTreg選択的増殖因子を封入している、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
ナノ粒子が、IL-2およびシロスタミドを封入している、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患が1型糖尿病であり、自己抗原が、インスリンペプチド、膵島細胞自己抗原、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）、インスリノーマ関連-2-タンパク質（IA-2）、およびプレプロインスリンからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
対象が、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患の家族歴を有する、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患が、1型糖尿病、エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ、卵巣炎、および造血幹細胞移植後の移植片対宿主病（GvHD）と関連する自己免疫病状から選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
（a）生分解性材料で作製され、内部にTreg選択的増殖因子および自己抗原を封入しているナノ粒子、ならびに
（b）自己由来または同種異系のTreg細胞の集団
を含む、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物であって、Treg細胞が該ナノ粒子と表面結合している、組成物。
【請求項１８】
生分解性材料が、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）を含む、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
Treg選択的増殖因子が、IL-2、ラパマイシン、またはシロスタミドである、請求項17記載の組成物。
【請求項２０】
自己抗原が、インスリンペプチド、膵島細胞自己抗原、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）、インスリノーマ関連-2-タンパク質（IA-2）、およびプレプロインスリンからなる群より選択される、請求項17記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2011年9月8日に出願された米国特許仮出願第61/532,209号の優先権の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
1型糖尿病（T1D）は、免疫寛容の破綻から生じ、慢性的な自己免疫攻撃により、膵臓β細胞の損失がもたらされる。T1Dが、過剰反応性の免疫応答よりもむしろ、免疫欠損と関連することが、次第に明らかになってきている。このことは、ゲノムワイド関連解析（GWAS）により支持されている。例えば、T1D患者は、T細胞受容体（TCR）の欠陥に起因する自己反応性T細胞応答を制御する能力の低下、ならびに、CD25、IL2、PTPN2、およびPTPN22の遺伝的欠陥に起因する異常なサイトカインシグナル伝達と関連する遺伝的変異体を有する可能性がより高い（Lowe et al. (2007)、Long et al. (2010)、Rieck et al. (2007)、Smyth et al. (2008)）。
【０００３】
T1Dは、世界的に罹患率および死亡率の主な原因であるが、T1Dに対する現在の処置レジメンは、限定された成功しか達成していない。一過性にT細胞を枯渇させる免疫調節剤（抗CD3、リツキシマブ）は、一時的な有効性しか実証していない。自己抗原（例えば、インスリン）単独の投与を含む伝統的なワクチン戦略もまた、進行中のβ細胞自己免疫を十分に阻止することはできていない。従って、強力かつ長期的な処置効果を提供する改善された処置戦略が必要とされる。
【０００４】
制御性T細胞（Treg）は、末梢免疫寛容の主要な媒介物質として機能する。Tregは、抗原提示細胞（APC）により誘導される炎症性応答の減衰、および抗炎症性生化学経路の活性化を含む様々な経路を介して、自己反応性T細胞応答を抑制する（Brusko et al. (2008)）。Tregは、免疫学的寛容の確立を促進する抗炎症性環境をもたらし、かつ維持する。重要なことに、この防御効果は、感染寛容（infectious tolerance）の過程を通して新規の抗原を認識するT細胞に移すことができる（Jonuleit et al. (2002)）。
【０００５】
免疫寛容の維持におけるTregの重要性の発見により、治療的介入の新たな手段、すなわち養子Treg療法が開発された（Riley et al. (2009)）。治療法としての移入されたTregの有効性は、全身性エリテマトーデス（SLE）（Scalapino et al. (2006)）、多発性硬化症（MS）（Kohm et al. (2002)）、炎症性腸疾患（IBD）（Nottet et al. (2003)）、卵巣炎（Setiady et al. (2006)）、およびT1D（Bluestone et al. (2004)、Masteller et al. (2005)、Tang et al. (2004)）の動物モデルにおいて実証されている。しかしながら、養子Treg療法の主な限界は、移入されたTreg集団の減少である。本発明の1つの目的は、T1Dおよび他の免疫障害を処置するための改善された養子Treg療法を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明は、対象における免疫寛容の誘導を介する、免疫障害および／または自己免疫障害の予防および／または処置のための改善された養子Treg細胞療法を提供する。1つの態様において、本発明は、
（a）生分解性材料で作製され、内部に制御性T細胞（Treg）選択的増殖因子ならびに抗原および／または自己抗原を封入しているナノ粒子；
（b）自己由来または同種異系のTreg細胞の集団；ならびに任意で、
（c）1つまたは複数の追加的な関心対象の治療剤
を含む、ナノ粒子が連結した寛容原性Tregの治療用組成物であって、Treg細胞が該ナノ粒子と表面結合している、組成物を提供する。
【０００７】
1つの態様において、本発明のナノ粒子は、その内部にIL-2、ラパマイシン、およびシロスタミドから選択されるTreg選択的増殖因子を封入している。
【０００８】
ある特定の態様において、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物は、1型糖尿病、エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、および卵巣炎を含むがこれらに限定されない、自己免疫疾患の予防（疾患の発症を遅延させることなど）、処置、および／または寛解において使用することができる。別の態様において、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物は、造血幹細胞移植後の移植片対宿主病（GvHD）と関連する自己免疫病状の予防および／または処置において使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の寛容原性Treg療法の態様を示す。簡潔に言うと、インビトロで増殖させた自己由来のTregを、ワクチンを装填したナノ粒子と結合させる。NPは、溶解性縫合材料において一般的に使用されるFDAに認可されている材料であるポリ(ラクチド-コ-グリコール酸)（PLGA）で作製され、直径が約300〜500ナノメートルのサイズを有する。NPは、Treg選択的増殖因子（IL-2およびラパマイシン）ならびにプレプロインスリンに由来する自己抗原性ペプチド（例えば、インスリンB(9-23)）などの治療剤を、その内部に封入している。Tregは、流入領域リンパ節の方に向かい、そこで寛容原性微小環境をもたらす。ワクチンを装填したNPは、封入された治療剤をゆっくり放出し、自己分泌および傍分泌の様式で作用して、免疫寛容を誘導する。
【図２】インビトロで増殖させたヒト臍帯血Tregが、CD4+レスポンダーT細胞の増殖を抑制することを示す。簡潔に言うと、新鮮に単離された臍帯血CD4+CD45RA+CD25+CD127-/loT細胞をFACS選別して、14日間増殖させる。増殖後、細胞を、FACSによりFOXP3について解析し、様々な比のTreg対Trespで、CD4+レスポンダーT細胞の増殖を抑制する能力について解析する。1つの代表的な増殖を示す。Tregは、14日間にわたって平均で744倍（n＝3）増殖する。選別前のパネルは、通常存在するTregのパーセンテージを示す。選別後のパネルは、細胞の単離および濃縮後のパーセンテージを示す。
【図３Ａ】ナノ粒子（NP）のリンパ球細胞株（BW1100）への結合を示す。簡潔に言うと、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)ナノ粒子（PLGA NP）を、水-油-水二重エマルション溶媒蒸発技術を用いて製造し、377 nmの平均NP直径が得られる（ヒストグラム）。NPの直径を、容積分布アルゴリズムを用いて動的光散乱により推定する。PLGA NPの表面上の活性化されたカルボキシル基を、カルボジイミド化学反応によりBW1100細胞の表面上に存在する第一級アミンに結合させる。
【図３Ｂ】ナノ粒子（NP）のリンパ球細胞株（BW1100）への結合を示す。簡潔に言うと、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)ナノ粒子（PLGA NP）を、水-油-水二重エマルション溶媒蒸発技術を用いて製造し、377 nmの平均NP直径が得られる（ヒストグラム）。カルセインをロードしたBW1100細胞を、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）で活性化されたか（左のパネル）または活性化されていない（右のパネル）AMCA装填NPと、45分間37℃で穏やかに撹拌しながらインキュベーションする。細胞を、穏やかな洗浄段階により、結合していないNPから分離する。蛍光顕微鏡検査により、EDCで活性化されたNPが細胞の表面に選択的に結合したことが明らかになる。
【図４Ａ】PLGAで作製されたナノ粒子（NP）の特徴決定を示す。動的光散乱（DLS）法を用いたNP直径の代表的なヒストグラムを示す。比較プロットは、3回のラン（ヒストグラムオーバーレイ；赤色、緑色、黄色）および平均直径（青色）を示す。NPを、プロピレンカーボネート（PC）（上）および塩化メチレン（MC）（下）を有機溶媒として用いて、二重エマルション法により調製する。両方の製剤において、10％ポリビニルアルコール（PVA）を、両方の水相のために使用する。
【図４Ｂ】PLGAで作製されたナノ粒子（NP）の特徴決定を示す。Qdotを装填したNP（ex/em 705/750）の蛍光顕微鏡による20×倍率の画像を示す。
【図４Ｃ】PLGAで作製されたナノ粒子（NP）の特徴決定を示す。H2O中のNPの走査電子顕微鏡画像（1.0 kV、×4.0K倍率）を示す。
【図５Ａ】NPが培養中のJurkat T細胞に共有結合していることを示す。AmCyan色素（Ex-Max 457 nm/Em-Max 491 nm）を装填したNPを、PEG-マレイミドリンカーまたはPEG-メチル（陰性対照）を用いて、SIGMA-PKH26で膜染色したJurkat細胞に架橋し、共焦点顕微鏡により撮像する。
【図５Ｂ】NPが培養中のJurkat T細胞に共有結合していることを示す。架橋したNPの蛍光を、結合後0日目から5日目まで測定する。
【図５Ｃ】NPが培養中のJurkat T細胞に共有結合していることを示す。クマリン-6を装填したNP（ex/em 450/520）を用いて、NPが連結した細胞をAMNIS（登録商標）イメージングフローサイトメトリー（60×）により可視化する。
【図６】IL-2を装填したNPが、CTLL-2細胞の増殖を誘導することを示す。IL-2を装填した粒子を、CTLL-2細胞に結合させ、Cell Trace Violet色素で染色する。細胞増殖を、結合の7日後に色素希釈に基づいて評価する。ヒストグラムオーバーレイは、以下を示す：青色＝IL-2 NPが結合したCTLL-2細胞；赤色＝ブランクNP＋CTLL-2細胞；橙色＝無染色の対照；緑色＝可溶性IL-2を補給した対照（200 IU/ml）。
【図７】アデノシン代謝によって媒介される、TregによるAPC/Teffの抑制の1つの機構を示す。炎症誘発性細胞外ATPは、Tregにより発現される細胞外酵素によってアデノシンに代謝され、次いでアデノシンは、GPCR（Gタンパク質共役受容体）アデノシン受容体に結合する。アデノシンのその受容体への結合により、アデニリルシクラーゼ（AC）が活性化し、これは細胞内ATPをcAMPに変換する。ギャップ結合を介してTeffおよび／またはAPCに移入されたcAMPが、細胞増殖、サイトカイン産生、および抑制性分子の発現を調節する。cAMPはホスホジエステラーゼ（PDE）により分解され、PDEによるcAMPの分解はFOXP3により制御される。FOXP3はまた、miR142-3pによるAC mRNAの分解も阻害し、従ってcAMPのレベルを増大させる。
【図８】PDEの阻害が、ナイーブヒトCD4+ T細胞においてFOXP3発現を誘導することを示す。新鮮に単離されたナイーブ（CD4+ CD25- CD127hi CD45RO-）T細胞を培養して、PDE3bおよびPDE4の阻害剤（中央のパネル）もしくはラパマイシン（陽性対照）（右のパネル）で処置するか、または無処置のままにする（左のパネル）。CD25およびFOXP3の発現を、増殖の14日後にフローサイトメトリーにより測定する。
【図９】シロスタミド注射が、NODマウスにおいて糖尿病の発症を遅延させることを示す。簡潔に言うと、8週齢のNODマウスに、様々な用量のシロスタミド（低：0.65 mg/kg、中程度：6.5 mg/kg、高：65 mg/kg）、またはビヒクルのみを注射（i.p.）する。シロスタミドを、1週間に3回、5週間投与する。処置したマウスにおける糖尿病の発症を、血糖測定によりモニタリングする。血糖の読み取り値が2日間、240 mg/dlよりも大きい場合に、糖尿病と診断される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な開示
本発明は、対象における免疫寛容の誘導を介する、免疫障害および／または自己免疫障害の予防および／または処置のための改善された養子制御性T細胞（Treg）療法を提供する。1つの態様において、本発明は、
（a）生分解性材料で作製され、内部にTreg選択的増殖因子ならびに抗原および／または自己抗原を封入しているナノ粒子；
（b）自己由来または同種異系のTreg細胞の集団；ならびに任意で、
（c）1つまたは複数の追加的な関心対象の治療剤
を含む、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物であって、Treg細胞が該ナノ粒子と表面結合している、組成物を提供する。
【００１１】
1つの態様において、ナノ粒子は、その内部に寛容原性ワクチン組成物を封入している。生分解性NPは、封入された成分を時限式で放出するため、リンパ節に常在するT細胞は、抗原特異的かつ寛容原性の様式でプライミングされる。1つの態様において、NPは、IL-2（Treg選択的増殖因子）およびラパマイシン（mTOR阻害剤）を時限式で放出し、それによりT細胞を制御性表現型へ偏向させる。別の態様において、NPは、IL-2およびシロスタミドを時限式で放出し、それによりT細胞を制御性表現型へ偏向させる。さらに、本発明は、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物を使用した養子Treg療法を提供する。有利なことに、本発明は、抗原特異性を達成し、かつ、自己由来Tregの表面上に自己抗原を送達することによりバイスタンダーおよび感染寛容を誘発することができる。さらに、本発明の養子Treg療法は、感染寛容の過程を通して、自己抗原に対する、耐久性があり長期的な寛容を誘導することができる。
【００１２】
図1は、本発明の寛容原性Treg療法の1つの態様を図示する。図2は、インビトロで増殖させたヒト臍帯血Tregが、CD4+レスポンダーT細胞の増殖を抑制することを示す。図3は、本発明のナノ粒子（NP）のTregへの結合を示す。
【００１３】
ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物
1つの局面において、本発明は、1型糖尿病（T1D）などの自己免疫障害の処置のための、ナノ粒子が連結した寛容原性Treg細胞の治療用組成物を提供する。1つの態様において、T細胞治療用組成物は、
（a）生分解性材料で作製され、内部にTreg選択的増殖因子ならびに抗原および／または自己抗原を封入しているナノ粒子；
（b）自己由来または同種異系のTreg細胞の集団；ならびに任意で、
（c）1つまたは複数の追加的な関心対象の治療剤
を含み、Treg細胞は該ナノ粒子と表面結合している。
【００１４】
好ましくは、ナノ粒子マトリクスは主として、実質的に生物学的に不活性の材料または生物学的に適合性の材料で作製される。本明細書において使用される「不活性の」、「生物学的に不活性の」、または「生物学的に適合性の」という用語は、生きている組織中に投与された場合に通常の治癒期間後に、実質的に有害な生化学的応答、アレルギー応答、または望ましくない免疫応答を誘発しない物質または材料を指す。
【００１５】
ナノ粒子を作製するために有用である生体適合性材料は、ヒドロゲル、コラーゲン、アルギナート、ポリ(グリコリド)（PGA）、ポリ(L-ラクチド)（PLA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリアミドを含むがこれらに限定されない生分解性ポリマー材料；リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムを含むがこれらに限定されない非ポリマー生分解性セラミック材料；またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
好ましい態様において、ナノ粒子は、治療薬の送達についてFDAに認可されているポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）から製造される。
【００１７】
1つの態様において、ナノ粒子の外側表面は、Treg細胞に結合する1つまたは複数の表面リガンドまたは表面抗体を含む。
【００１８】
1つの態様において、ナノ粒子の外側表面は、Treg細胞の表面に共有結合している。特定の態様において、ナノ粒子の外側表面は、Treg細胞の表面上に存在する第一級アミンに結合することができる活性化されたカルボキシル基を含む。1つの態様において、ナノ粒子のTregへの結合は、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）および／もしくはN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）により促進され、または代替的な態様においては、マレイミドチオールリンカーを用いて促進される。
【００１９】
特定の態様において、Treg選択的増殖因子は、IL-2、ラパマイシン、または、シクロスタミド、テオフィリン、ペントキシフィリン、ザプリナスト、シルデナフィル、アルニノン（arninone）、ミルリノン、ロリプラム、およびシロミラストを含むがこれらに限定されないホスホジエステラーゼ（PDE）阻害剤である。1つの態様において、Treg選択的増殖因子は、シロスタミドなどのホスホジエステラーゼ3B（PDE3b）阻害剤である。IL-2は、Tregの選択的な増殖因子かつ生存因子である。
【００２０】
本発明に従って有用である（自己免疫疾患と関連する）抗原および／または自己抗原は、自己反応性応答および制御性応答を誘導できる内因性の抗原性ペプチドまたは抗原性ペプチド断片に由来させ得る。
【００２１】
糖尿病の場合は、本発明に従って有用である自己抗原は、例えば、インスリン、膵島細胞自己抗原、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）、およびインスリノーマ関連-2-タンパク質（IA-2）であり得る。具体的な態様において、T1Dの処置のための自己抗原は、プレプロインスリンに由来する（例えば、インスリンB(9-23)ペプチド）。
【００２２】
ある態様において、治療剤は、例えば、免疫調節剤、トランスフォーミング成長因子β1、ビタミンD、およびレチノイン酸；ヘモグロビン：ハプトグロビン、ヘミン、ヘム：ヘモペキシン、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、例えばアスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセン、トリテルペノイド、例えばベツリン酸、バルドキソロンメチル、およびトリテルペノイドサポニン、ピルビン酸エチル（EP）、ヘム酸素添加酵素（HO-1）経路活性化剤、アラキドン酸経路阻害剤、ならびにCOX経路阻害剤を含むが、これらに限定されない抗炎症剤；IL-10およびTGF-βを含むが、これらに限定されない免疫制御サイトカインを含む。
【００２３】
ある態様において、ナノ粒子は、10〜1000 nm、またはその間の任意の値、例えば、50〜900 nm、100〜800 nm、200〜500 nm、300〜400 nmなどの範囲の直径を有する。好ましい態様において、ナノ粒子は、300 nm〜500 nm、またはその間の任意の値、例えば、300〜450 nm、300〜400 nm、330〜480 nm、350〜450 nm、350〜400 nmなどの直径を有する。
【００２４】
1つの態様において、Treg細胞を、臍帯血細胞または末梢血細胞から単離する。別の態様において、ヒト末梢血由来のインビトロで増殖させたTreg細胞を使用する。ある態様において、Treg細胞は、CD45RA+CD25+CD127-/lo細胞である。
【００２５】
本発明に従って有用であるTreg細胞は、ヒト、類人猿、チンパンジー、オランウータン、サルなどの霊長類；イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの動物を含むがこれらに限定されない、様々な種のTreg細胞であり得る。好ましい態様において、ヒトTreg細胞を使用する。
【００２６】
1つの態様において、T細胞治療用組成物は、
（a）生分解性材料で作製され、内部にTreg選択的増殖因子ならびに抗原および／または自己抗原を封入しているナノ粒子；ならびに任意で、
（b）自己由来または同種異系のTreg細胞の集団；ならびに
（c）1つまたは複数の追加的な関心対象の治療剤
を含み、該ナノ粒子はTreg細胞の表面に結合することができる。
【００２７】
免疫障害および／または自己免疫疾患の処置
本発明は、対象において免疫寛容を誘導するための改善された養子Treg細胞療法を提供する。前記方法は、ナノ粒子と表面結合している自己由来のTreg細胞を、対象に投与する段階を含む。1つの態様において、ナノ粒子は、生分解性ポリマー材料で作製され、該ナノ粒子は、その内部にTreg選択的増殖因子および自己抗原を封入しており、該ナノ粒子の表面はTreg細胞表面に結合している。
【００２８】
別の態様において、本発明は、対象において免疫寛容を誘導するための方法であって、
（a）生分解性材料で作製され、内部にTreg選択的増殖因子ならびに抗原および／または自己抗原を封入しているナノ粒子；ならびに任意で、
（b）自己由来または同種異系のTreg細胞の集団；ならびに
（c）1つまたは複数の追加的な関心対象の治療剤
を含み、該ナノ粒子がTreg細胞の表面に結合することができるT細胞治療用組成物を、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。本発明の養子Treg細胞療法は、免疫障害および／または自己免疫疾患を予防するため、処置するため、または寛解させるために使用することができる。
【００２９】
本明細書において使用される、「処置」という用語または任意のその文法的変化形（例えば、処置する、処置すること、および処置など）は、疾患の症候または状態を寛解させることまたは緩和すること、状態の進行、重症度、および／または範囲を、低減させること、抑制すること、阻害すること、少なくすること、またはそれらに影響を及ぼすことを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において使用される、「予防」という用語または任意のその文法的変化形（例えば、予防する、予防すること、および予防など）は、症候の発症を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの回数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の潜伏期を増大させること、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される「予防」または「処置」という用語は、疾患または障害の症候の完全な除去が起きなければならないことは意味しない。
【００３１】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、疾患もしくは状態を処置することもしくは寛解させることができるか、または意図された治療効果を別の方法で生じることができる量を指す。
【００３２】
本明細書において使用される「対象」という用語は、それに対して本発明に従う組成物による処置を提供することができる、霊長類などの哺乳動物を含む生物を表す。開示される処置の方法から恩恵を受けることができる哺乳動物種は、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル；ならびに、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
1つの態様において、本発明のT細胞治療用組成物を、自己免疫疾患または免疫障害の家族歴か、またはそれらを発病する素因を示す他の要素を有する対象に投与する。1型糖尿病を含む多くの自己免疫疾患は、遺伝要因と環境要因との組み合わせにより引き起こされると考えられている。自己免疫疾患が家族内に存在する場合、他の親族は、同じ自己免疫疾患または異なる自己免疫疾患を発病する危険性があり得る。ある特定の環境要因もまた、自己免疫過程を引き起こす役割を果たす。例えば、プロカインアミドおよびヒドロリジン（hydrolyzine）などの薬物は、遺伝的に感受性の個体においてループス様症候を誘導し得、これは薬物を中断した時に低減する。溶血性貧血、血小板減少症、および白血球減少症のいくつかを含む、薬物により誘導される他の自己免疫疾患が記載されている。1つの態様において、本発明は、免疫障害および／または自己免疫疾患、特に1型糖尿病の予防、処置、または寛解において使用することができる。ある態様において、本発明は、抗原特異的免疫寛容の誘導および／または過剰反応性免疫もしくは自己免疫の抑制が有益である、1型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、尋常性天疱瘡、ならびに、自己免疫疾患の原型である全身性エリテマトーデス（SLE）および関連障害を含むがこれらに限定されない、免疫障害および自己免疫疾患を処置するかまたは寛解させるために有用である。別の態様において、本発明は、造血幹細胞移植後の移植片対宿主病（GvHD）と関連する自己免疫病状の予防、処置、または寛解において使用することができる。
【００３４】
ある特定の態様において、本発明は、1型糖尿病、エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、および卵巣炎を含むがこれらに限定されない、自己免疫疾患の予防、処置、または寛解において使用することができる。
【００３５】
さらに、本発明は、感染症、炎症、アレルギー誘発反応、細胞増殖、血管新生、および悪性腫瘍と関連する疾患の予防、処置、または寛解において使用することができる。
【００３６】
製剤
本発明は、治療用組成物または薬学的組成物を提供する。作用物質と一緒に使用するのに適した非毒性の薬学的に許容される担体は、薬学的製剤の分野の当業者にとって明らかであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, seventeenth edition, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)を参照されたい。
【００３７】
1つの態様において、本発明のナノ粒子を、炎症性障害および／または自己免疫関連障害を発病する危険性がある対象への投与のためのワクチン組成物へと製剤化する。ワクチン組成物は、疾患に対する能動免疫を生じるために使用される1つまたは複数の免疫原性抗原を含む、抗原性調製物である。さらに、本発明の組成物は、1つまたは複数の炎症性障害および自己免疫関連障害の既存の症候を有する対象に投与することができ、疾患の悪化を予防するかまたは最小限にするようにカスタマイズされた投与スケジュールおよび組成物を提供する。
【００３８】
治療用量範囲は、本開示の恩恵にあずかる当業者が決定することができる。当然、そのような治療用量範囲は、患者のサイズ、種、および身体状態、患者の医学的状態の重症度、使用される特定の剤形、投与の経路などによって変化するであろう。
【００３９】
組成物は、単回投与で、または望ましい効果を与えるためのある期間にわたって2回以上の投与で、投与することができる。
【００４０】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、これらの適当な混合物、ならびに植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、妥当な流動性を維持することができる。
【実施例】
【００４１】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は、限定するように解釈されるべきではない。別に記述のない限り、すべてのパーセンテージは重量によるものであり、すべての溶媒混合比率は容積によるものである。
【００４２】
実施例1‐自己抗原および制御性T細胞増殖因子を装填したナノ粒子の生成
FDAに認可されている縫合生体材料であり、50：50の比の乳酸とグリコール酸の共重合体であるPLGAから、ナノ粒子を製造する。制御性T細胞（Treg）増殖因子IL-2の封入のために、二重エマルション溶媒蒸発法を用いる。二重エマルション溶媒調製法は、親水性分子を封入するのに適している。Treg表現型を増強かつ安定化し、水に難溶性であるラパマイシンの封入のためには、単一エマルション法を用いる。
【００４３】
およそ300〜500 nmの直径を有するナノ粒子（NP）を製造する。粒子サイズおよび品質は、投入エネルギー、エマルションを形成する際に存在する界面活性剤の量、湿度、有機相中に水相を注入する際の液滴のサイズ、および外側の水相に対する有機相の比を含む、様々な要因により調整することができる。粒子サイズおよび品質を調整する主要な要因は、粒子の表面をコーティングする反応における投入エネルギーおよび界面活性剤の量である。
【００４４】
ナノ粒子を製造する過程において、2つの主要な変数である、投入エネルギーおよび界面活性剤の量を調節する。1つの態様において、エネルギーの主な供給源は均質化であり、また、投入エネルギーは、より少ない程度ではあるが、乳化中の撹拌速度により影響を受ける。従って、均質化の速度および期間は、粒子サイズに対して重大な影響を及ぼす。
【００４５】
表1に示すように、製剤2は、動的光散乱（DLS）により測定した際に、最も小さいNP直径および最も狭いサイズ範囲を生じる（図4A）。高濃度のPVAの存在下では、粒子の収率および品質は、粒子凝集のために著しく損なわれる。別の実験においては、製剤3が使用され、最も少ない量の粒子凝集をもたらす。
【００４６】
【表１】
2014526472.tif 000002
【００４７】
表1は、NPの製造に用いた様々な製剤の概要を示す。均質化速度は、すべての製剤について15,000 rpmである。PC＝プロピレンカーボネート、MC＝塩化メチレン、PVA＝ポリビニルアルコール。
【００４８】
実施例2‐インビトロで増殖させた制御性T細胞へのナノ粒子の結合の開発および最適化、ならびにナノ粒子が結合した細胞のインビトロ活性
T細胞にナノ粒子（NP）を結合させるために、様々なアプローチを用いることができる。1つの態様において、アミン反応性エステル中間体の形成および安定化を促進する、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）を利用して、アミド結合を、PLGAのカルボキシル基と任意の細胞表面タンパク質の第一級アミンとの間に形成させることができる。簡潔に言うと、NPを、安定な共有結合の形成により、T細胞リンパ腫細胞株であるJurkat細胞に安定に結合させる（図5A）。NPが結合したJurkat細胞粒子は、結合後の6日間検出可能である（図5B）。別の態様において、細胞表面上のフリーのスルフヒドリル基と反応する、架橋剤のポリエチレングリコール（PEG）-マレイミドを使用することができる。この反応は、1細胞あたりにより少ない数の架橋された粒子をもたらす（図5C）。
【００４９】
本実施例においては、細胞を、穏やかに揺らしてEDCおよびNHSにより事前に活性化させたナノ粒子とインキュベーションすると、安定なアミド結合が形成される。結合効率は、インキュベーション時間および容積を含むいくつかの要因により、ならびにNP対細胞の比により影響を受ける。従って、細胞生存度を損なうことなく最大効率を達成するために、直接結合過程を最適化することができる。
【００５０】
図6に示すように、IL-2を装填したNPは、T細胞の増殖および残存を促進する。T細胞上のサイトカイン装填NPの生物活性および増殖特性を評価するために、IL-2を装填した粒子（IL-2 NP）を、IL-2依存性マウスT細胞株由来のCTLL-2細胞に結合させる。IL-2を装填したNPが細胞表面上に結合した細胞は、空のナノ粒子と結合した細胞またはナノ粒子と結合していない細胞よりも、大きなレベルの増殖を呈する。さらに、IL-2を装填したNPと結合した細胞は、CD25のより高い発現レベルを示す。CD25は、IL-2Rのα-サブユニットであり、IL-2シグナル伝達に応答して上方制御される（図6）。
【００５１】
実施例3‐NPが連結した制御性T細胞の投与による、非肥満性糖尿病（NOD）マウスにおける糖尿病の予防および処置
本実施例は、制御性T細胞（Treg）の安定性を保つため、および通常のT細胞において制御性表現型を誘発するために使用することができる選択的免疫抑制剤を特定する。さらに、本実施例は、制御性表現型を維持および誘導するためにNPにおいて低分子を共投与することにより、Tregの養子移入を改善する。
【００５２】
mTOR阻害剤であるラパマイシンは、Treg集団を誘導および増殖させることが示されている。ラパマイシンは、mTOR-Akt経路を阻害し、従って、Aktにより媒介されるFoxoタンパク質阻害をもたらす。Foxoタンパク質は、Tregの抑制機能の最も重要な媒介物質であるFOXP3の誘導に必要とされる。mTOR-akt経路はまた、細胞の生存および増殖にも必要とされ、従って、mTOR-akt経路の下方制御は、FOXP3を誘導するが、Tregの増殖を低下させる。
【００５３】
シロスタミドは、細胞移入時にTregの増殖を停止させることなく制御性表現型を増強する。従って、シロスタミドは、移植環境における制御性表現型の誘導のために有用であり得る。
【００５４】
Tregは、高いレベルのcAMPを有し、cAMPは、接触依存性の様式でギャップ結合を介してエフェクターT細胞（Teff）に移入される。cAMPは、移入されると、標的細胞において細胞増殖およびサイトカイン産生を制御し、この過程が、Tregの抑制機能の1つの機構を構成する。cAMPレベルは、アデニリルシクラーゼ（AC）によるATPのcAMPへの変換と、ホスホジエステラーゼ（PDE）によりAMPに戻るその加水分解との間のバランスによって調整される。Tregは、細胞外炎症性ATPを異化する2種の細胞外酵素、CD39およびCD73を発現する。CD39は、ATPをADPに変換し、次いでAMPに変換し、これが続いてCD73によりアデノシンに変換される。アデノシンは、いくつかのアイソフォームで存在する細胞表面アデノシン受容体に結合する。A2AアイソフォームとA2Bアイソフォームとの連結が、免疫抑制効果を有する。アデノシンのアデノシン受容体への結合時に、アデニリルシクラーゼ（AC）が活性化され、それによりcAMP産生がもたらされる。同時に、cAMPの分解は、ホスホジエステラーゼのPDE3bアイソフォームを直接阻害する主なTreg特異的転写因子であるFOXP3により阻害される。FOXP3はまた、AC RNAを分解の標的とするmiR-142-3pマイクロRNAを下方制御する。従って、cAMPのレベルは、Tregにおいて上昇したままである。上昇したcAMPレベルは、その抑制活性において重要な役割を果たす。cAMPは、標的細胞に移入されると、誘導性cAMP初期リプレッサー（ICER）転写因子を上方制御する。ICER転写因子および活性化T細胞核内因子（NFAT）の存在により、IL-2産生が抑制される。また、cAMPは、感染寛容に関与し得る、制御性表面分子である細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）の発現を上方制御する（図7）。
【００５５】
T細胞において高いcAMPレベルを維持する低分子によるTregの処置を、制御性表現型を誘導するために使用することができる。T細胞において高いcAMPレベルを維持する低分子は、PDEを阻害する作用物質およびACを活性化する作用物質を含む。図8に示すように、新鮮に単離されたナイーブCD4+（CD4+ CD25- CD45RO-）T細胞の、PDE3b阻害剤であるシロスタミドによる処置は、無処置対照と比較した場合、増加したFOXP3誘導をもたらす。シロスタミドで処置した群におけるFOXP3+細胞の比は、ラパマイシンで処置した群の比に匹敵する（図8）。
【００５６】
自己免疫攻撃の初期におけるFoxP3+細胞レベルの増加を、自己免疫疾患の発症を予防するためまたは遅延させるために使用することができる。簡潔に言うと、8週齢のNODマウスを、腹腔内（i.p.）注射により様々な用量（低：0.65 mg/kg；中程度：6.5 mg/kg；高：65 mg/kg）のシロスタミドで処置する。シロスタミドを、1週間に3回、5週間マウスに投与する。65 mg/kgの用量でのシロスタミドの投与は、単独療法として利用した場合に、NODマウスにおいて糖尿病の発症を遅延させた（図9）。
【００５７】
実施例4‐NODマウスモデルにおいて病原性自己反応性T細胞応答を抑制するための、ナノ粒子が連結した制御性T細胞の生成
本実施例は、非肥満性糖尿病（NOD）マウスにおいて病原性自己反応性T細胞応答を抑制することができるナノ粒子（NP）連結Tregを記載する。ナノ粒子は、生分解性ポリマー材料であるポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）で作製され、IL-2（Treg選択的増殖因子）、インスリンB鎖（9-23）ペプチド（自己抗原）、およびラパマイシン（mTOR阻害剤）を含むワクチン組成物をその内部に封入している。
【００５８】
異なる濃度のIL-2およびラパマイシンを有するPLGA-NPを生成する。NPを、活性化されたマウスまたはヒトCD4+T細胞とインキュベーションする。FoxP3を上方制御するためおよび／またはTeff細胞増殖を制限するためのIL-2およびラパマイシンの最適濃度を、決定する。
【００５９】
Tregの表面へのNPの結合を、蛍光標識したPLGA-NPをインビトロで増殖させたTregの表面に連結することにより最適化する。NPが結合したTreg細胞のインビトロでの機能性を、heliosおよびFoxP3などの表現型マーカーの発現、ならびにTreg細胞の増殖、細胞シグナル伝達、および生存度に基づいてモニタリングする。
【００６０】
糖尿病を予防および処置するためのワクチンを装填したNPの治療効果を、評価する。簡潔に言うと、8週齢のメスのNODマウスを、以下の群（n＝15／群）に無作為に分ける：処置を受けないマウス、NP単独を受けるマウス、IL-2、インスリンB鎖（9-23）ペプチド、およびラパマイシンを含有するワクチン組成物を装填したNPを受けるマウス、Treg単独を受けるマウス、空のNPと結合したTregを受けるマウス、ならびにワクチンを装填したNPと結合したTregを受けるマウス。各群において、10匹のマウスをカプラン・マイヤー解析用のコホートに含め、一方、残りの5匹のマウスを横断的機構研究のために使用する。
【００６１】
処置効果を、蛍光活性化細胞選別（FACS）による免疫表現型検査、遺伝子発現、膵臓組織学的検査、膵島炎スコアリング、血液学、およびインビトロ機能アッセイから作成されるデータを用いて決定する。ELISpotアッセイを使用して、細胞内サイトカイン（例えば、IFN-γ、IL-17、IL-10）の抗原特異的細胞応答を評価する。
【００６２】
異なる処置群の間で、糖尿病を処置する最も大きい有効性は、抗原、IL-2、およびラパマイシンを含有するワクチン組成物を装填したNPと結合したTregを移入したNODマウスにおいて観察される。具体的には、ワクチンを装填したNPが結合したTregの移入により、免疫防御のための抗原特異的Tregの堅牢な増殖がもたらされる。短期の治療有効性は、移入したTreg集団により達成されるが、長期の寛容は、内在性Tregの発生に起因する。
【００６３】
自己免疫を逆転させる際のワクチン装填NPが結合したT細胞の正確な機構を決定するために、マウスの1群を抗Thy1.1抗体で処置し、それにより、養子Treg療法を介してマウスに移植されたTreg細胞のみを枯渇させる。マウスの別の群を、PC62 mAbを用いた抗CD25処置で処置し、それにより、Treg集団全体を枯渇させる。Treg集団全体の枯渇後のみで免疫寛容が失われることが想定され、これは、ワクチン装填NPが結合したTreg細胞の移入が、内在性Treg集団を増殖させることを示す。
【００６４】
実施例5‐ヒトのナノ粒子結合制御性T細胞の開発
本実施例において、末梢血または臍帯血から得たCD4+CD45RA+CD127-/loCD25+T細胞を、FACSにより選別し、インビトロで増殖させる。インビトロで増殖させたTregを、以下の群に分ける：（1）結合させないTreg、（2）空のNPと結合したTreg、（3）IL-2を装填したNPと結合したTreg、（4）ラパマイシンを装填したNPと結合したTreg、ならびに（5）IL-2およびラパマイシンを装填したNPと結合したTreg。
【００６５】
各群において、Tregを、新鮮なIL-2欠損培地中で培養し、経時的実験のために、細胞培養において増殖させる。Treg細胞を、培養の24、48、72、および96時間後に収集し、細胞生存度、表現型マーカー（例えば、CD25、CD127、FOXP3、およびhelios）ならびに細胞内サイトカイン（例えば、IL-2、IL-10、IFN-γ）の発現について評価する。
【００６６】
Treg機能と相関することが示されている（Polansky et al. (2008)、Wieczorek et al. (2009)）FOXP3のTreg特異的な脱メチル化領域でのエピジェネティック修飾を評価する（Epiontis, Germany）。Tregを、応答するT細胞の増殖を抑制する能力についてモニタリングする。
【００６７】
NPが結合したTregを、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識し、新鮮なCD4+CD45RA+CD127+CD25-Tconv細胞（紫色色素で標識）と様々な比（1：0、1：1、1/2：1、0：1）で混合する。Treg培養物を、インビトロで再刺激し、増殖、ならびに、CD25、CD127、FOXP3、およびheliosなどの様々な表現型マーカーの発現について評価する。Treg細胞およびTconv細胞に対する、NP結合ワクチンの自己分泌効果および傍分泌効果を決定する。
【００６８】
本明細書において言及されるかまたは引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度まで、すべての図面および表を含み、全体として参照により組み入れられる。
【００６９】
本明細書において記載される実施例および態様は、例示のみを目的としていること、ならびにそれらを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、かつ本出願の精神および範囲内に含まれるべきであることが、理解されなければならない。
【００７０】
参照文献
2014526472.tif 000003
【図１】
2014526472.tif 000004
【図２】
2014526472.tif 000005
【図３Ａ】
2014526472.tif 000006
【図３Ｂ】
2014526472.tif 000007
【図４Ａ】
2014526472.tif 000008
【図４Ｂ】
2014526472.tif 000009
【図４Ｃ】
2014526472.tif 000010
【図５Ａ】
2014526472.tif 000011
【図５Ｂ】
2014526472.tif 000012
【図５Ｃ】
2014526472.tif 000013
【図６】
2014526472.tif 000014
【図７】
2014526472.tif 000015
【図８】
2014526472.tif 000016
【図９】
2014526472.tif 000017
【国際調査報告】
2014526472.tif 000018
2014526472.tif 000019
2014526472.tif 000020