(57)【要約】  角膜上皮細胞の集団を作製する方法が開示される。この方法は、ヒト多能性幹細胞を、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養し、それにより、角膜上皮細胞の集団を得ることを含む。単離された細胞集団及び角膜細胞、並びにその使用が開示される。【選択図】図１Ａ−１Ｅ【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞を、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養し、それにより、角膜上皮細胞の集団を作製することを含む、角膜上皮細胞の集団を作製する方法。
【請求項２】
前記角膜線維芽細胞馴化培地は骨形態形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記角膜線維芽細胞馴化培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび表皮増殖因子（ＥＧＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記角膜線維芽細胞馴化培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび表皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲンＩＶ、ラミニン、フィブロネクチンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
角膜上皮細胞の集団を、ケラチン３（Ｋ３）、ケラチン１２（Ｋ１２）、ペアードボックス遺伝子６（ｐａｘ６）、ケラチン１８（Ｋ１８）およびコネキシン４３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーについて分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記角膜線維芽細胞馴化培地は縁線維芽細胞を含んでいない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法に従って作製されるヒト角膜上皮細胞の単離された集団。
【請求項１０】
皮膚細胞を含まない、請求項９に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
【請求項１１】
集団の細胞の少なくとも７０％がＫ３およびＰａｘ６を共発現する、請求項９に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
【請求項１２】
集団の細胞の１０％未満がｎａｎｏｇおよびＯｃｔ４を発現する、請求項９に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
【請求項１３】
眼障害の処置において使用するためのものである、請求項９に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
【請求項１４】
眼障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に、請求項１に記載の方法に従って作製される角膜上皮細胞の治療効果的な量を移植し、それにより、前記対象における前記眼障害を処置することを含む方法。
【請求項１５】
請求項９に記載の角膜上皮細胞の単離された集団と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１６】
角膜組織を作製する方法であって、
（ａ）請求項９に記載のヒト角膜上皮細胞の単離された集団を解離させて、解離させたヒト角膜上皮細胞の集団を作製すること；および
（ｂ）前記解離させたヒト角膜上皮細胞を、角膜組織を生じさせる条件下、足場において培養すること
を含む方法。
【請求項１７】
前記足場はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびコラーゲンＩを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記足場はヒト羊膜を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法に従って作製される単離されたヒト角膜組織。
【請求項２０】
眼障害の処置において使用するための、請求項１９に記載のヒト角膜組織。
【請求項２１】
眼障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に、請求項１６に記載の方法に従って作製される角膜組織の治療効果的な量を移植し、それにより、前記対象における前記眼障害を処置することを含む方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の単離された角膜組織と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項２３】
角膜上皮系譜への分化を高める作用因についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、前記作用因の存在下、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養すること；および
（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞の分化状態を分析すること
を含み、
前記作用因の非存在下における分化と比較した場合の分化における増大により、角膜上皮系譜への分化を高める作用因が示される、方法。
【請求項２４】
前記多能性幹細胞はｉＰＳ細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｉＰＳ細胞は、健康な患者に由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｉＰＳ細胞は、疾患患者に由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地はさらに、ＢＭＰ−４を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患患者は欠指・外胚葉異形成・裂隙（ＥＥＣ）症候群の患者である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記分析が、前記多能性幹細胞の形態を分析することによって行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記分析が、前記多能性幹細胞における角膜細胞マーカーの発現を分析することによって行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記角膜細胞マーカーはＰａｘ６またはＫ３／Ｋ１２である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その一部の実施形態において、角膜細胞を多能性幹細胞から作製する方法、および該角膜細胞を含む細胞集団に関連する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は、虹彩、瞳孔および前眼房を覆う特異な透明な構造体であり、眼の光学的能力のほとんどを提供する。水晶体と一緒に、角膜は光を屈折させ、結果として、焦点を合わせることを助ける。角膜は、水晶体が寄与するよりも多く、全体的な屈折に寄与しているが、水晶体の曲率が焦点を「合わせる」ように調節され得る一方で、角膜の曲率は固定されている。角膜には血管がなく、その栄養分が、涙液、房水、および、角膜を神経支配する神経線維によって供給される様々な神経栄養因子からの拡散を介して得られる。したがって、例えば、これらの流体の循環における乱れ、または、炎症プロセスが、角膜異常の病理発生において大きな役割を果たしている。
【０００３】
角膜は、密な結合組織からほとんどが構成される。しかしながら、コラーゲン線維が平行様式で配置されており、このことは、光波が干渉して強め合うことを可能にし、したがって、光を比較的阻害されずに通過させる。
【０００４】
角膜の組織は、それぞれが別個の機能を有する５つの基本的な層、すなわち、上皮、ボーマン層、角膜実質、デスメ膜および内皮で配置される。上皮は角膜の最外層であり、組織の厚さの約１０％を占める。上皮は主として、（１）異物（例えば、ほこり、水および細菌など）が眼の中および角膜の他の層の中に入ることを阻止するために、また、（２）酸素と、涙からの細胞養分とを吸収し、その後、これらの養分を角膜の残部部分に分配する平滑な表面を提供するために機能する。角膜の上皮は、角膜の周辺部、すなわち、縁として公知の領域に位置する幹細胞（ＳＣ）によって維持される。角膜の上皮自体は自身の幹細胞を有していない。縁の線維芽細胞が、ＬＳＣが存在する縁支質の主要な細胞成分を形成しており、また、ＬＳＣによる角膜上皮の創傷治癒を促進させる特異的なサイトカインを産生する。
【０００５】
角膜の加齢に伴う変化には、増大した混濁、増大した前面曲率、および、場合によっては屈折率分布における変化が含まれる。様々な屈折率矯正の眼の手術技術は、矯正用レンズの必要性を軽減するために、あるいは眼の屈折状態を改善するために角膜の形状を変化させる。多くの技術において、角膜の再形成が、エキシマーレーザーを使用するフォトアブレーションによって行われる。
【０００６】
角膜実質に、視覚的に著しい混濁、不規則性または水腫が生じるならば、死体ドナーの角膜を移植することが可能である。
【０００７】
縁の自家移植片が、比較的高い成功度を伴って患者に適用されている。重篤な場合、例えば、総縁部幹細胞欠乏症（ｔｏｔａｌ  ｌｉｍｂａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）などでは、同種移植片が、患者の親族から、または死後のドナーから得られる場合がある。しかしながら、縁組織は非常に免疫原性であり、移植片拒絶率が移植後５年で３５％を超える。この方法はさらに、ドナーの不足のために制限される。さらに、生体ドナーが縁部幹細胞欠乏症を発症する危険性がある。この危険性を減らすために、より小さい縁組織がドナーから移植され、また、移植前にエクスビボで拡大される場合がある。この技術では、細胞を移植前に数週間にわたって培養することが必要であるので、患者を傷害直後に処置することができない。そのうえ、患者への同種の縁幹細胞移植は最終的には拒絶される。
【０００８】
合成角膜もまた存在し（人工角膜移植）、しかしながら、これらは典型的には可塑性の挿入物であるか、または、合成角膜内への組織内成長を促し、それにより、生物学的一体化（ｂｉｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を促進させる生体適合性の合成材料から構成される場合がある。あるいは、角膜矯正術では、眼の屈折状態を改善するために、または、メガネおよびコンタクトレンズの必要性を軽減するために、特殊化された硬質または剛直なガス透過性コンタクトレンズの使用が、角膜を一時的に再形成するために試みられる。
【０００９】
Ｈｏｍｍａ他［Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２００４（Ｄｅｃ）、４５（１２）：４３２０〜６］は、コラーゲンＩＶ被覆ディッシュにおけるマウス胚様体の角膜上皮分化を教示する。
【００１０】
Ｓａｊｊａｄ他［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００７（Ｍａｙ）、２５（５）：１１４５〜５５］は、ヒト胚性幹細胞を、縁線維芽細胞によって馴化された培地の存在下、コラーゲンＩＶ被覆ディッシュに播種することによる角膜上皮様細胞の生成を教示する。生じた角膜上皮細胞には、皮膚細胞が混入していた。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ヒト多能性幹細胞を、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養し、それにより、角膜上皮細胞の集団を作製することを含む、角膜上皮細胞の集団を作製する方法が提供される。
【００１２】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜線維芽細胞馴化培地は骨形態形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）を含む。
【００１３】
本発明の一部の実施形態によれば、ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）を含む。
【００１４】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜線維芽細胞馴化培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび表皮増殖因子（ＥＧＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む。
【００１５】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜線維芽細胞馴化培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび表皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む。
【００１６】
本発明の一部の実施形態によれば、細胞外マトリックス成分は、コラーゲンＩＶ、ラミニン、フィブロネクチンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）からなる群から選択される。
【００１７】
本発明の一部の実施形態によれば、上記方法はさらに、角膜上皮細胞の上記集団を、ケラチン３（Ｋ３）、ケラチン１２（Ｋ１２）、ペアードボックス遺伝子６（ｐａｘ６）、ケラチン１８（Ｋ１８）およびコネキシン４３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーについて分析することを含む。
【００１８】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜線維芽細胞馴化培地は縁線維芽細胞を含んでいない。
【００１９】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の方法に従って作製されるヒト角膜上皮細胞の単離された集団が提供される。
【００２０】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜上皮細胞の単離された集団は皮膚細胞を含まない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態によれば、上記集団の細胞の少なくとも７０％がＫ３およびＰａｘ６を共発現する。
【００２２】
本発明の一部の実施形態によれば、上記集団の細胞の１０％未満がｎａｎｏｇおよびＯｃｔ４を発現する。
【００２３】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜上皮細胞の単離された集団は、眼障害の処置において使用するためのものである。
【００２４】
本発明の一部の実施形態によれば、眼障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に、本発明の方法に従って作製される角膜上皮細胞の治療効果的な量を移植し、それにより、前記対象における前記眼障害を処置することを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の角膜上皮細胞の単離された集団と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００２６】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜組織を作製する方法であって、
（ａ）本発明のヒト角膜上皮細胞の単離された集団を解離させて、解離させたヒト角膜上皮細胞の集団を作製すること；および
（ｂ）解離させたヒト角膜上皮細胞を、角膜組織を生じさせる条件下、足場において培養すること
を含む方法が提供される。
【００２７】
本発明の一部の実施形態によれば、足場はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびコラーゲンＩを含む。
【００２８】
本発明の一部の実施形態によれば、足場はヒト羊膜を含む。
【００２９】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の方法に従って作製される単離されたヒト角膜組織が提供される。
【００３０】
本発明の一部の実施形態によれば、眼障害の処置において使用するためのヒト角膜組織が提供される。
【００３１】
本発明の一部の実施形態によれば、眼障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に、本発明の方法に従って作製される角膜組織の治療効果的な量を移植し、それにより、前記対象における前記眼障害を処置することを含む方法が提供される。
【００３２】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の単離された角膜組織と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００３３】
本発明の一部の実施形態の一態様によれば、角膜上皮系譜への分化を高める作用因についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、前記作用因の存在下、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養すること；および
（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞の分化状態を分析すること
を含み、前記作用因の非存在下における分化と比較した場合の分化における増大により、角膜上皮系譜への分化を高める作用因が示される、方法が提供される。
【００３４】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞はｉＰＳ細胞を含む。
【００３５】
本発明の一部の実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、健康な患者に由来する。
【００３６】
本発明の一部の実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、疾患患者に由来する。
【００３７】
本発明の一部の実施形態によれば、培地はさらに、ＢＭＰ−４を含む。
【００３８】
本発明の一部の実施形態によれば、疾患患者は欠指・外胚葉異形成・裂隙（ＥＥＣ）症候群の患者である。
【００３９】
本発明の一部の実施形態によれば、分析が、前記多能性幹細胞の形態を分析することによって行われる。
【００４０】
本発明の一部の実施形態によれば、分析が、前記多能性幹細胞における角膜細胞マーカーの発現を分析することによって行われる。
【００４１】
本発明の一部の実施形態によれば、角膜細胞マーカーはＰａｘ６またはＫ３／Ｋ１２である。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ−１Ｅ】図１Ａ−１Ｅは、ヒト胚性幹（ｈｕＥＳ）細胞の角膜分化拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）を例示する。図１Ａは、１０日間の角膜分化後におけるコンフルエントなヒトＥＳ細胞集団の形態を表わす。図１Ｂ−図１Ｅは、ｈｕＥＳ細胞の角膜分化の異なる日における角膜マーカーおよび多能性マーカーの速度論的分析を表わす。細胞、ＲＮＡ抽出物およびタンパク質抽出物を、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析図（図１Ｂ）、ウエスタンブロット分析（図１Ｃ）、免疫蛍光分析（図１Ｄ）およびＦＡＣＳ分析（図１Ｅ）のために分化拘束の異なる時間で集めた。これらは、角膜特異的マーカー（ｐａｘ−６、Ｋ１２、Ｋ３、コネキシン４３）の効率的な産生、および、多能性特異的マーカー（ｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇ）の消失を示す。
【図１Ｆ−１Ｇ】図１Ｆ−１Ｇは、ヒト胚性幹（ｈｕＥＳ）細胞の角膜分化拘束を例示する。図１Ｆ−１Ｇは、ｈｕＥＳ細胞の角膜分化の特異性を表わす。図１Ｆは、蛍光ＧＦＰ遺伝子をＫ１２プロモーターのもとで有する角膜特異的ＤＮＡ構築物を、角膜分化拘束の期間中にいくつかの細胞株およびヒトＥＳ細胞にトランスフェクションし、定量化をＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳ分析によって行った。角膜のＫ１２プロモーターが、ヒト角膜上皮対照細胞（ＨＣＥ）において、また、Ｄ６およびＤ１２におけるｈｕＥＳ分化拘束細胞において活性であり、未分化ＥＳ細胞または非角膜上皮細胞株（Ｈｅｌａ、ＨａＣａＴ）では活性でなかった。図１Ｇは、分化した表皮に特異的なマーカーのＫ１、Ｋ１０およびインボルクリンは、陽性対照として使用された正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）と比較した場合、未分化のｈｕＥＳ細胞（Ｄ０）、または、角膜分化に拘束されたｈｕＥＳ細胞（Ｄ６、Ｄ１２およびＤ１７）によって発現されなかった。
【００４４】
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ−２ＣはヒトＥＳ細胞からの角膜上皮の製作を例示する。角膜線維芽細胞を、角膜実質同等物を生じさせるために１型コラーゲンゲルに埋め込んだ（図２Ａ）。１週間後、ｈｕＥＳ由来の角膜細胞を、増殖を可能にするために１週間、ゲルの頂部に播種した。その後、培養物を、層形成を誘導するために気液境界に持ち上げた（図２Ｂ）。免疫蛍光分析により、生じた角膜上皮がＫ３（赤色）およびｐａｘ−６（緑色；ｄａｐｉでは青色）について陽性であることが明らかにされた（図２Ｃ）。
【００４５】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、羊膜を足場として使用する角膜上皮組織の製作を例示する写真である。
【００４６】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、角膜上皮系譜へのｉＰＳＣ細胞の分化を例示するグラフを表わす。ｉＰＳＣコロニーを、角膜線維芽細胞によって馴化された上皮培地の存在下、コラーゲンＩＶ被覆ディッシュに播種した。角膜分化の示された日に得られたＲＮＡ調製物を示された遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析に供した。ｍＲＮＡ発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。データは、未分化ｈＥＳ細胞で記録されるレベルと比較した場合のそれぞれの転写物の相対的な倍数変化を表わす（図４Ａ）。ＢＭＰ−４の試験を表わす（図４Ｂ）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、角膜上皮系譜への図４Ａ−４Ｂの説明よりｉＰＳＣ細胞の分化を例示するグラフを表わす。ｉＰＳＣコロニーを、角膜線維芽細胞によって馴化された上皮培地の存在下、コラーゲンＩＶ被覆ディッシュに播種した。データは、Ｋ１８、ｐａｘ６、ＤＮｐ６３、Ｋ１４およびＫ３の各遺伝子についてリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって定量化される、毛包由来ｉＰＳＣ細胞（ＨＦ２−ｉＰＳ）、線維芽細胞由来ｉＰＳＣ（ＤＦ１およびＤＦ２−ｉＰＳ）およびヒトＥＳ細胞の角膜分化拘束を表わす（図４Ｃ）。
【００４７】
【図５Ａ】図５Ａは、ｉＰＳ細胞株の角膜分化拘束を例示する写真である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｉＰＳ細胞株の角膜分化拘束を例示する写真である。
【００４８】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、ＥＥＣ−ｉＰＳ細胞の損なわれた角膜分化を例示する写真およびグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、その一部の実施形態において、角膜細胞を多能性幹細胞から作製する方法、および該角膜細胞を含む細胞集団に関連する。
【００５０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００５１】
角膜が疾患または傷害のために濁るとき、光は眼の中を突き抜けて、光感受性の網膜に達すことができない。視覚低下または失明が生じる場合がある。角膜移植手術は、濁った角膜の中心部分の除去、および、その部分を、通常アイバンクを通して供与される透明な角膜により置き換えることを要する。この技術は、ドナーの不足および移植片の拒絶によって妨げられる。
【００５２】
縁の自家移植片が、比較的高い成功度を伴って、角膜の障害を有する患者に適用されている。重篤な場合、例えば、総縁部幹細胞欠乏症などでは、同種移植片が、患者の親族から、または、死後のドナーから得られる場合がある。しかしながら、縁組織は非常に免疫原性であり、移植片拒絶率が移植後５年で３５％を超える。この方法はさらに、ドナーの不足のために制限される。さらに、生体ドナーが、縁部幹細胞欠乏症を発症する危険性がある。この危険性を減らすために、より小さい縁組織がドナーから移植され、また、移植前にエクスビボで拡大される場合がある。この技術では、細胞を移植前に数週間にわたって培養することが必要であるので、患者を傷害直後に処置することができない。そのうえ、患者への同種の縁幹細胞移植は最終的には拒絶される。
【００５３】
これらの問題を克服するために、本発明者らは、角膜上皮細胞集団を多能性幹細胞から作製する技術を考案した。その分化プロトコルは角膜線維芽細胞馴化培地の使用に依拠する。
【００５４】
図１Ａ〜図１Ｇに例示されるように、作製された角膜上皮細胞集団は均一であり、細胞は、Ｋ３、Ｋ１２、ｐａｘ６およびコネキシン４３を発現した。さらに、本発明者らは、この細胞集団が、表皮マーカー（例えば、Ｋ１、Ｋ１０およびインボルクリンなど）を発現する細胞を含んでいなかったことを認めた（図１Ｇを参照のこと）。
【００５５】
本発明者らはさらに、そのような細胞の３Ｄ培養が角膜組織同等物の生成をもたらしたことを示した（図２）。この手法は、角膜移植のための組織をすぐに使用できる角膜組織同等物の製作を可能にし、それにより、ドナーの必要性を解消する。
【００５６】
したがって、本発明の一態様によれば、ヒト多能性幹細胞を、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養し、それにより、角膜上皮細胞の集団を作製することを含む、角膜上皮細胞の集団を作製する方法が提供される。
【００５７】
本発明の方法は最初に多能性幹細胞を得て、その多能性幹細胞を培養することによって行われる。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、表現「幹細胞」は、特定の特殊化された機能を有する他の細胞タイプ（例えば、完全に分化した細胞）に誘導されて分化するまでは、培養において長期間未分化状態に留まる能力を有する細胞（例えば、多能性幹細胞または多分化能幹細胞）を示す。表現「多能性幹細胞」は胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を包含する。幹細胞は典型的には哺乳動物の多能性細胞であり、例えば、ヒト多能性幹細胞などである。
【００５９】
表現「胚性幹細胞」は、胚の３つすべての胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞に分化する能力を有するか、または、未分化状態に留まる能力を有する胚細胞を示す。表現「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成され（例えば、胚盤胞）、胚が着床する前に形成される胚組織（すなわち、着床前胚盤胞）から得られる細胞、着床後で、原腸形成前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開ＷＯ２００６／０４０７６３を参照のこと）、および、妊娠期間中の任意の時期の胎児（好ましくは、妊娠１０週前の胎児）の生殖組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を含む場合がある。
【００６０】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ；胚様幹細胞）は、多能性が賦与される（すなわち、胚の３つの胚細胞層（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）に分化する能力を有する）、成体の体細胞の脱分化によって得られる細胞である。本発明の一部の実施形態によれば、そのような細胞は、分化した組織（例えば、体性組織、例えば、皮膚または毛など）から得られ、胚性幹細胞の特徴を獲得するために細胞を初期化する遺伝子操作による脱分化を受ける。本発明の一部の実施形態によれば、誘導多能性幹細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４およびｃ−Ｍｙｃの発現を体性幹細胞において誘導することによって形成される。
【００６１】
本発明の胚性幹細胞は、広く知られている細胞培養方法を使用して得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞をヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は典型的には、ヒトの体内の着床前の胚から、または、体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞のヒト胚を胚盤胞段階に拡張することができる。ヒトＥＳ細胞の単離のために、透明帯が胚盤胞から除かれ、内部細胞塊（ＩＣＭ）が免疫手術によって単離される。この場合、栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかな分注によって無傷のＩＣＭから除かれる。その後、ＩＣＭが、その成長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコに置床される。９日〜１５日の後、ＩＣＭ由来の成長物が機械的解離または酵素的分解のどちらかによって塊に解離させられ、その後、これらの細胞が、新鮮な組織培養培地で再置床される。未分化の形態を明らかにするコロニーがマイクロピペットによって個々に選択され、塊に機械的に解離させられ、再置床される。その後、生じたＥＳ細胞が４日〜７日ごとに常法により分割される。ヒトＥＳ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎ他［米国特許第５８４３７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、３８：１３３、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８４４、１９９５］、Ｂｏｎｇｓｏ他［Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ、４：７０６、１９８９］、および、Ｇａｒｄｎｅｒ他［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．、６９：８４、１９９８］を参照のこと。
【００６２】
市販の幹細胞もまた、本発明のこの態様とともに使用され得ることが理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞をＮＩＨヒト胚性幹細胞登録機関（ｗｗｗ．ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販されている胚性幹細胞株の限定されない例として、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３およびＴＥ３２が挙げられる。
【００６３】
加えて、ＥＳ細胞を他の生物種から同様に得ることができ、そのような生物種には、マウス（ＭｉｌｌｓおよびＢｒａｄｌｅｙ、２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ他、１９８８、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１２７：２２４〜７］、ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ他、１９９４、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１６３：２８８〜９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓ他、１９９３、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ、３６：１３０〜８；Ｇｒａｖｅｓ＆Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ、１９９３、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ、１９９３、３６：４２４〜３３］、一部の家畜種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ他、１９９１、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｕｐｐｌ、４３：２５５〜６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ、１９９４、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ、６：５６３〜８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ他、２００１、Ｃｌｏｎｉｎｇ、３：５９〜６７］、およびヒト以外の霊長類種（アカゲザルおよびマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎ他、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：７８４４〜８；Ｔｈｏｍｓｏｎ他、１９９６、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ、５５：２５４〜９］が含まれる。
【００６４】
伸長胚盤胞細胞（ＥＢＣ）を、原腸形成前の段階の、受精後少なくとも９日の胚盤胞から得ることができる。この胚盤胞を培養する前に、透明帯が、内部細胞塊を露出するように、［例えば、タイロード酸性溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）によって］消化される。その後、胚盤胞は、標準的な胚性幹細胞培養方法を使用してインビトロにおいて受精後少なくとも９日、最大１４日間（すなわち、原腸形成事象前の期間）、完全な胚として培養される。
【００６５】
ＥＧ細胞が、当業者に公知の実験室技術を使用して妊娠約８週〜１１週の胎児（ヒト胎児の場合）から得られる原始生殖細胞から調製される。生殖隆起が解離させられ、小さい塊にぶつ切りされ、この塊がその後、機械的解離によって細胞に解体される。その後、ＥＧ細胞は、適切な培地を含む組織培養フラスコで成長させられる。細胞は、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が認められるまで、典型的には７日〜３０日後または１回〜４回の継代後まで、培地の取り替えを毎日行いながら培養される。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１３７２６、１９９８］および米国特許第６０９０６２２号を参照のこと。
【００６６】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）（胚様幹細胞）を体細胞の遺伝子操作によって体細胞から作製することができ、例えば、転写因子（例えば、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４など）による体細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞など）のレトロウイルス形質導入によって作製することができる［Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２００７、１（１）：３９〜４９；Ａｏｉ  Ｔ他、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｏｍａｃｈ  Ｃｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８（Ｆｅｂ  １４）（印刷に先立つＥｐｕｂ）；ＩＨ  Ｐａｒｋ、Ｚｈａｏ  Ｒ、Ｗｅｓｔ  ＪＡ他、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２００８、４５１：１４１〜１４６；Ｋ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｔａｎａｂｅ  Ｋ、Ｏｈｎｕｋｉ  Ｍ他、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃｅｌｌ、２００７、１３１：８６１〜８７２］。他の胚様幹細胞を、卵母細胞への核移入、胚性幹細胞との融合、または、受容細胞が有糸分裂において停止しているならば、接合体への核移入によって作製することができる。
【００６７】
未分化幹細胞は、当業者によって、胚起源または成体起源の分化細胞から明瞭に識別可能である独特の形態を有する細胞であることが理解されるであろう。典型的には、未分化幹細胞は、大きい核／細胞質比、目立つ核小体、および、細胞間結合が良好に認識されない緻密なコロニーの形成を有する。未分化幹細胞のさらなる特徴がさらに本明細書中下記で記載される。
【００６８】
現在実施されているＥＳ培養方法は主に、幹細胞の増殖のために必要とされる因子を分泌し、一方で、同時にそれらの分化を阻害するフィーダー細胞層の使用に基づく。フィーダー細胞を用いないシステムもまた、ＥＳ細胞の培養において使用されており、そのようなシステムでは、血清、サイトカインおよび増殖因子が補充されるマトリックスがフィーダー細胞層の代用として利用される。
【００６９】
多能性幹細胞の角膜上皮系譜への分化を誘導するために、多能性幹細胞が角膜線維芽細胞馴化培地で培養される。
【００７０】
角膜線維芽細胞を死体ドナーまたは生体ドナーから得ることができる。一実施形態によれば、角膜線維芽細胞がヒトから得られる。典型的には、角膜線維芽細胞が、角膜を分散化剤（例えば、ディスパーゼＩＩ、トリプシンまたはコラゲナーゼなど）と３７℃で約１時間〜１８時間インキュベーションすることによって単離される。その後、上皮シートを鉗子により除くことができる。縁組織が角膜サンプルに混入することを避け、その結果、馴化培地を作製するために使用される細胞に縁の線維芽細胞が混入しないように注意しなければならない。
【００７１】
馴化培地は、ある特定の培養期間の後で存在する単層細胞培養物（すなわち、フィーダー細胞）の成長培地である。馴化培地は、培養物中の単層細胞によって分泌される増殖因子およびサイトカインを含む。
【００７２】
角膜線維芽細胞馴化培地を製造するために、単離された線維芽細胞を最初に好適な培地（例えば、１０％の新生児ウシ血清が補充されるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））における培養によって拡大することができる。線維芽細胞の細胞集団が約８０％〜１００％の密度に達するとき（図２Ａを参照のこと）、細胞増殖が、例えば、マイトマイシンＣ（８μｇ／ｍｌ）中での約３時間のインキュベーションによって停止させられる。その後、マイトマイシン処理された細胞が、好適な成長培地でインキュベーションされる。
【００７３】
馴化培地が、単層物を培養中に形成する角膜線維芽細胞から回収される。
【００７４】
成長培地は、角膜線維芽細胞を培養するために好適ないかなる培地であることもできる。成長培地には、角膜線維芽細胞の細胞成長に役立つ栄養因子（例えば、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、抗酸化剤（例えば、ベータ−メルカプトエタノール）および増殖因子など）を補うことができる。
【００７５】
一実施形態によれば、骨形態形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）を培養期間中に添加することができる。ＢＭＰ−４を培養期間の全期間にわたって、または、培養期間の特定の段階で（例えば、培養期間の最初の３日間にわたって）添加することができる。
【００７６】
ＢＭＰ−４の例示的な濃度は約０．１ｎＭ〜１０ｎＭの間であり、より好ましくは０．１ｎＭ〜５ｎＭの間であり、より好ましくは０．１ｎＭ〜１ｎＭの間（例えば、０．５ｎＭ）である。
【００７７】
一実施形態によれば、成長培地は下記薬剤の少なくとも１つを含む：インスリン（例えば、５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（例えば、０．５μｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）。
【００７８】
別の実施形態によれば、成長培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよびＥＧＦを含む。
【００７９】
一例示的な培地が、上皮培地（ＤＭＥＭ（６０％）、ＨａｍＦ１２（３０％）、ＦＣＩＩ（１０％）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、０．２ｍＭのアデニン、１０ｎＭのコレラトキシン）である。
【００８０】
上皮線維芽細胞が、角膜上皮細胞系譜への幹細胞分化を支援するために、分泌された因子の十分な蓄積を可能にするための十分な時間にわたって成長培地で培養される。典型的には、培地は、３７℃での４時間から２４時間まで培養することによって馴化される。
【００８１】
しかしながら、培養期間は、幹細胞分化に対する馴化培地の影響を評価することによって決めることができる。
【００８２】
培地を馴化するための培養装置の選択は、馴化培地の規模および目的に基づく。大規模製造では専用デバイスの使用が好ましい。連続細胞培養システムが、Ｆｕｒｅｙ（２０００）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ、２０：１０において総説される。
【００８３】
培養物における十分な因子の蓄積の後、成長培地（すなわち、馴化培地）が角膜線維芽細胞から分離され、回収される。角膜線維芽細胞は、細胞がその培地馴化能を保持するならば、培地のさらなるバッチをさらなる培養期間にわたって馴化するために繰り返し使用され得ることが理解されるであろう。
【００８４】
一実施形態によれば、培地が、１０日までの期間、毎日回収され、新鮮な培地によって取り換えられる。
【００８５】
好ましくは、馴化培地は使用前に滅菌される（例えば、２０μｍのフィルターを使用するろ過）。本発明の一部の実施形態の馴化培地は幹細胞にそのまま加えられる場合があり、または、例えば、塩ろ過などによって抽出して効果的な因子を濃縮する場合がある。将来の使用のために、馴化培地は好ましくは、−８０℃で凍結保存される。
【００８６】
角膜線維芽細胞馴化培地における培養は典型的には、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で行われる。細胞外マトリックス成分の例には、コラーゲンＩＶ、ラミニン、フィブロネクチンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
培養ディッシュを細胞外マトリックス成分により被覆する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、本明細書中下記の実施例の節においてさらに詳しく記載される。
【００８８】
多能性幹細胞は、分化を可能にするための好適な条件下で培養される。一実施形態によれば、細胞は、約５日間、７日間または約１０日間にわたって培養される。
【００８９】
細胞の分化状態を、そのマーカー発現を分析することによって求めることができる。したがって、例えば、下記マーカーを分析することができる：サイトケラチン３（Ｋ３）、サイトケラチン１２（Ｋ１２）、ペアードボックス遺伝子６（ｐａｘ６）、サイトケラチン１８（Ｋ１８）およびコネキシン４３。上記マーカーの、作製された細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％における発現をもって、この細胞集団が角膜上皮系譜に向かって分化していることを示すものとして使用することができる。
【００９０】
特定の実施形態によれば、集団の細胞の少なくとも７０％、８０％または９０％がＫ３およびＰａｘ６を共発現する細胞の集団が選択される。
【００９１】
あるいは、または加えて、細胞の分化状態を、未分化幹細胞のマーカー（例えば、Ｏｃｔおよびｎａｎｏｇなど）を分析することによって求めることができる。上記マーカーの、作製された細胞集団の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満における発現をもって、この細胞集団が分化した細胞を含むことを示すものとして使用することができる。
【００９２】
好ましくは、作製された細胞集団は皮膚細胞を含まない。したがって、細胞集団を皮膚細胞マーカー（例えば、Ｋ１、Ｋ１０およびインボルクリンなど）について分析することができ、そのようなマーカーを発現しない細胞集団（例えば、１０％未満の細胞が発現、または、５％未満の細胞が発現）のみが選択される。
【００９３】
細胞を特定のマーカーについて分析するための様々な方法がこの技術分野では広く知られており、これらには、例えば、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリーおよび逆転写酵素ＰＣＲ分析（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれる。免疫組織化学技術を、特定の細胞が２つ以上のマーカーを共発現しているかどうかを確認するために使用することができる。
【００９４】
Ｋ３、Ｋ１２、Ｐａｘ６、Ｋ１８、Ｋ１、Ｋ１０、インボルクリンおよびコネキシン４３に対する各抗体が、様々な会社から、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＣｈｅｍｉｃｏｎなどから市販されている。
【００９５】
細胞の分化状態を分析するために使用することができる例示的なプライマー配列が本明細書中下記に提供される。
2014503200.tif 000002
【００９６】
細胞の分化状態はまた、分化した細胞において発現されることが公知の特定の遺伝子についてプロモーター活性を分析することによって求めることができる。本明細書中下記の実施例の節の実施例１は、ｋ１２プロモーター（角膜特異的プロモーター）の活性が分化細胞の集団においてどのように分析され得るかを詳述する。
【００９７】
上記の分化プロトコルは、角膜上皮系譜への分化を高める作用因についてスクリーニングするために使用される場合がある。
【００９８】
したがって、本発明の別の態様によれば、角膜上皮系譜への分化を高める作用因についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、当該作用因の存在下、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養すること；および
（ｂ）ヒト多能性幹細胞の分化状態を分析すること
を含み、当該作用因の非存在下における分化と比較した場合の分化における増大により、角膜上皮系譜への分化を高める作用因が示される、方法が提供される。
【００９９】
細胞の分化状態の分析が本明細書中上記に記載されている。
【０１００】
多能性幹細胞は胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であり得る。ｉＰＳ細胞は、健康な対象に由来してもよく、または、角膜上皮細胞を冒す疾患を有する患者に由来してもよく、例えば、欠指・外胚葉異形成・裂隙（ＥＥＣ）症候群の患者に由来してもよい。本発明者らは、そのような患者に由来するｉＰＳ細胞が、角膜上皮細胞に至る分化を、健康な対象に由来するｉＰＳ細胞と同程度に受けないことを示している。したがって、本発明のプロトコルは、特定の疾患を処置するために角膜上皮細胞分化を高める薬物についてスクリーニングするために使用することができる。
【０１０１】
スクリーニングされ得る作用因の例には、ポリペプチド作用因、ポリヌクレオチド作用因、小分子作用因および他の化学物質が含まれる。
【０１０２】
本発明のこの態様の方法に従って作製される単離された細胞集団は、本明細書中下記でさらに記載する角膜の疾患または障害を処置するための、その移植を含む様々な適用のために使用することができる。加えて、単離された細胞集団は、薬物発見および細胞毒性試験のための細胞モデルとして使用することができる。同じ供給源からの同一細胞の再現性により、比較が可能となるであろうし、また、研究が標準化され、このことは、化粧品学および薬理学の企業には非常に重要である。
【０１０３】
あるいは、単離された細胞集団（例えば、角膜線維芽細胞馴化培地で１週間〜２週間、最初に分化させられた細胞集団）はさらに、角膜組織を作製するために３Ｄ足場で分化させることができる。
【０１０４】
一実施形態によれば、角膜組織は層形成している。
【０１０５】
別の実施形態によれば、角膜組織は角膜上皮組織の少なくとも３つの層を含む。
【０１０６】
別の実施形態によれば、角膜組織は扁平上皮細胞を含んでいない。
【０１０７】
角膜組織を足場において作製する方法が下記の実施例の節の実施例２に記載され、図３Ａ〜図３Ｉに例示される。
【０１０８】
一実施形態によれば、３Ｄ足場は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびコラーゲンＩから構成されるゲルを含む。
【０１０９】
別の実施形態によれば、足場はヒト羊膜を含む。
【０１１０】
そのような技術が、Ｋｏｉｚｕｍｉ他、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００（Ａｕｇｕｓｔ）、第４１巻、第９号；Ｇａｇｇｉｏｌｉ他、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、第９巻、第１２号、２００７；および、Ｌａｒｏｕｃｈ他、第１５章、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第４８２巻、２００９に記載されている（それぞれの内容が参照によって組み込まれる）。
【０１１１】
典型的には、細胞集団は、角膜組織の分化を誘導するために約１週間〜２週間、足場において分化させられる。
【０１１２】
述べられたように、単離された角膜上皮細胞集団（および、そこから分化する角膜組織）は、角膜の疾患および障害を処置するために使用することができる。
【０１１３】
角膜を冒す障害には、様々なアレルギー、結膜炎、角膜感染症、ドライアイ、フックスジストロフィー、帯状疱疹、虹彩角膜内皮症候群、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、地図状斑点状指紋萎縮症、眼ヘルペス、スティーブンス・ジョンソン症候群、翼状片、角膜炎、角膜潰瘍、角膜剥離、雪盲、アーク眼、タイゲソン点状表層角膜炎および乾性角結膜炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
角膜移植手術において、外科医は典型的には、患部角膜または傷害角膜の中心部分を取り除き、その部分を透明な角膜により置き換える。この新しい角膜または角膜細胞が開口部に置かれ、眼に縫合される（例えば、Ｒａｐｕａｎｏ他、Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｓｅｇｍｅｎｔ，Ｔｈｅ  Ｒｅｑｕｉｓｉｔｅｓ（Ｒｅｑｕｉｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）（１９９９、Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）を参照のこと）。典型的には、約１〜２×１０６個／眼の細胞が、損傷を受けた角膜に移植される。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の合成角膜を使用して眼の角膜を置き換えるための方法は、角膜を眼から外科的に切除すること、除かれた角膜の領域に合成角膜を挿入すること、および、合成角膜を切除部の下にある組織と整合させて、合成角膜を眼に固定することを含む。
【０１１６】
関連した態様において、本方法は、角膜の外側表面の一部分を分離し、それにより、角膜皮弁および角膜床を形成すること（ただし、角膜皮弁は前面および後面を有し、角膜床は、形状化された前面を有する）、合成角膜を角膜床に移植すること（ただし、合成角膜は前面および後面を有する）、および、分離された角膜の一部分を置き換えることを含む。
【０１１７】
慎重な組織学的分析および免疫組織化学的分析を、特異的マーカーを使用することによって移植後の種々の時点で行わなければならない。角膜表面における杯細胞の数を、縁欠乏症の存在を評価するために印象（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）細胞学により評価しなければならない。拒絶指数（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）、平均生存時間および拒絶率をそれぞれの群について計算することができる。
【０１１８】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の角膜細胞または角膜組織は、自己由来の供給源に由来するもの（誘導多能性幹細胞）、または、同種の供給源に由来するもの（例えば、胚性幹細胞など）のどちらもが可能である。非自己細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導する可能性があるので、一部の取り組みが、非自己細胞の拒絶の可能性を減らすために開発されている。例えば、移植に先立って、対象の組織適合性を調べ、組織適合性の角膜移植片のみが移植され得るようにすることができる。
【０１１９】
他の取り組みには、移植者の免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を移植前に免疫隔離性の半透過性膜でカプセル化することのいずれかが含まれる。
【０１２０】
カプセル化技術は一般には、小さい球状ビヒクルを伴うマイクロカプセル化として、また、より大きい平坦シート膜および中空繊維膜を伴うマクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．他、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
【０１２１】
マイクロカプセルを調製する様々な方法がこの技術分野では公知であり、これらには、例えば、Ｌｕ  ＭＺ他、Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３；Ｃｈａｎｇ  ＴＭおよびＰｒａｋａｓｈ  Ｓ、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０；および、Ｌｕ  ＭＺ他、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１によって開示される方法が含まれる。
【０１２２】
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー殻と複合体化することによって、２μｍ〜５μｍのカプセル厚に調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負に帯電した平滑な表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらなる２μｍ〜５μｍのターポリマー殻によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
【０１２３】
他のマイクロカプセルが、アルギン酸塩、すなわち、海洋多糖類（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００３、５：６６５〜８）、または、その誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との間における塩化カルシウム存在下での多電解質複合体化によって調製することができる。
【０１２４】
より小さいカプセルが使用されるとき、細胞カプセル化が改善されることが理解されるであろう。したがって、カプセルサイズが１ｍｍから４００μｍに縮小されたとき、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が改善された（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．他、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ、２００２、１３：７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、目的に適合した表面化学、および、精密な微細構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾よく免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ、Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１０：６〜９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．、Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、２：６３３〜４６）。
【０１２５】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、エタネルセプト、ＴＮＦ−アルファ遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的作用因、および、非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナム酸塩、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
適切であるならば、患者はさらに、移植された細胞の生存および機能を容易にする医薬用薬剤または生物活性剤により処置することができる。これらの薬剤には、とりわけ、例えば、インスリン、ＴＧＦ−ベータファミリーのメンバー（これには、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３が含まれる）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３）、線維芽細胞増殖因子−１および線維芽細胞増殖因子−２、血小板由来増殖因子−ＡＡおよび血小板由来増殖因子−ＢＢ、血小板富化血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンが含まれる場合がある。他の医薬用化合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）およびグルカゴン様ペプチド−ＩＩ、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２のミメチボディー、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、ＭＡＰＫ阻害剤（例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物など）が含まれ得る。
【０１２７】
本発明の細胞または組織は、それ自体で、あるいは好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物でヒト対象に移植することができる。
【０１２８】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される細胞集団の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１２９】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容されるキャリア」および表現「医薬的に許容されるキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０１３０】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１３２】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１３３】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１３４】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療効果的な量」は、疾患の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的である、有効成分（角膜細胞）の量を意味する。
【０１３５】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に与えられた詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３６】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療効果的な量は、希望の濃度または力価を達成するために動物モデルから推定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１３７】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１３８】
投薬量および投薬間隔を、視力の治療または改善を誘導するために十分である細胞数（最小有効濃度（ＭＥＣ））を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出分析を使用して、血漿中濃度を求めることができる。
【０１３９】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１４０】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１４１】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１４２】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１４３】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１４４】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１４５】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１４６】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１４８】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１４９】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１５０】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１５１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３編；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ���およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１５２】
実施例１
ヒト胚性幹細胞の角膜細胞への分化
Ｉ．角膜線維芽細胞馴化上皮培地の調製：馴化培地を調製するために、初代角膜線維芽細胞を、移植に適していないヒト角膜から、角膜をディスパーゼＩＩ（２ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で一晩インキュベーションすることによって取り出した。上皮シートを除き、線維芽細胞を、１０％の新生児ウシ血清が補充されるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養ディッシュで培養した。線維芽細胞の細胞集団が８０％〜１００％の密度に達したとき（図２Ａを参照のこと）、細胞増殖をマイトマイシンＣ（８μｇ／ｍｌ）中での約３時間のインキュベーションによって停止させた。馴化培地を得るために、マイトマイシン処理された細胞を上皮培地（ＤＭＥＭ（６０％）、ＨａｍＦ１２（３０％）、ＦＣＩＩ（１０％）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、０．２ｍＭのアデニン、１０ｎＭのコレラトキシン）とインキュベーションした。培地を、１０日までの期間、毎日回収し、新鮮な培地によって取り換えた。培地をろ過し、使用まで−２０℃で貯蔵した。
【０１５３】
ＩＩ．培養ディッシュの被覆：培養ディッシュをコラーゲンＩＶ（０．５ｍｇ／ｍｌ）またはマトリゲル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で４時間インキュベーションし、その後、リン酸塩緩衝化生理的食塩水により徹底的に洗浄した。
【０１５４】
ＩＩＩ．多能性幹細胞の角膜上皮系譜への分化：多能性幹細胞をコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）と１時間インキュベーションし、その後、コロニーをコラーゲンＩＶ被覆ディッシュまたはマトリゲル被覆ディッシュに置床した。培地を約２週間にわたって１日おきに新鮮な角膜線維芽細胞馴化上皮培地によって取り換えた。
【０１５５】
リアルタイムＰＣＲ分析：角膜分化の異なる時点における細胞のＲＮＡ抽出物を、Ｋ１８、Ｋ１２、ｐａｘ６、ＧＡＰＤＨのリアルタイムＰＣＲ分析によって分析した。
【０１５６】
ウエスタンブロット分析：本発明者らは、抗Ｋ３／Ｋ１２  Ａｂ、抗ｐａｘ６  Ａｂ、抗Ｋ１８  Ａｂ、抗コネキシン４３  Ａｂ、抗Ｎａｎｏｇ  Ａｂ、抗Ｏｃｔ４  Ａｂを使用した。
【０１５７】
ＦＡＣＳ分析：ＦＡＣＳ分析を、抗Ｋ１８  Ａｂ、抗Ｋ３／Ｋ１２  Ａｂおよび抗ｐａｘ６  Ａｂを使用して行った。
【０１５８】
Ｋ１２プロモーター下のＧＦＰによる細胞のトランスフェクション：胚性幹細胞由来の角膜細胞（分化の１０日目）、および陽性対照として使用された細胞（ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）不死化細胞株）、または、陰性対照として使用された細胞（ＨａＣａＴ、Ｈｅｌａ、未分化ＥＳ細胞）を、Ｆｕｇｅｎｅ試薬を製造者の説明書に従って使用して、Ｋ１２角膜特異的プロモーターの支配を受けるＧＦＰコードのプラスミドによりトランスフェクションした。４８時間後、ＧＦＰ蛍光を有する細胞の百分率をＦＡＣＳ分析によって調べた。
【０１５９】
結果
分化した細胞の形態は、図１Ａに示されるように、９日目において比較的均一のようであった。角膜分化を角膜上皮マーカーの定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって評価した（図１Ｂ）。上昇したレベルの外胚葉マーカーＫ１８（およびＫ８、これは示されず）およびｐａｘ６（眼および角膜の発達における重要な因子）が初期の培養日において記録された。角膜特異的なサイトケラチン、すなわち、Ｋ１２およびＫ３のｍＲＮＡレベルが後期の培養日において増大した（図１Ｂ）。
【０１６０】
ウエスタンブロット分析では、公知の角膜上皮マーカー（すなわち、ｐａｘ６、Ｋ３、Ｋ１２およびコネキシン４３）のタンパク質レベルが後期の分化段階において徐々に増大し、一方で、胚性幹細胞マーカー（ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４）が６日〜８日のうちに検出不能になったことが明らかにされた（図１Ｃ）。このことから、このプロトコルはＥＳ細胞の効率的な角膜分化を誘導することが示唆される。
【０１６１】
Ｋ１８およびｐａｘ６の共発現は、角膜上皮が由来する「水晶体板」（マウス胚形成の９．５日目（Ｅ９．５）に現れる構造体）の顕著な特徴である。後半の胚段階では、角膜上皮はｐａｘ６の発現を維持しており、Ｋ１２およびＫ３を発現し始める。注目すべきことに、ＥＳ分化の４日目における細胞の大部分がＫ１８を発現し、または、Ｋ１８およびｐａｘ６を共発現し（図１Ｄ、左パネル）、一方で、ＥＳ分化の１０日目では、大部分の細胞がＫ３およびｐａｘ６を共発現した（図１Ｄ）。このことから、ＥＳ細胞が、角膜の胚形成を連想させる様式で角膜前駆体に分化することが示唆される。
【０１６２】
角膜上皮の運命をさらに評価するために、分化した細胞を、Ｋ１８、ｐａｘ６およびＫ３のＦＡＣＳ分析に供した。図１Ｅに示されるように、細胞のほとんどがＫ１８およびｐａｘ６を６日目に発現し、一方で、細胞の圧倒的多数がＫ３およびｐａｘ６を１２日目に発現した（＞９０％）。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコード配列が、角膜マーカーの中では最も特異的であるＫ１２遺伝子の角膜特異的プロモーターのもとにクローン化された。角膜上皮細胞に対するこの構築物の特異性が、陰性対照としての様々な非角膜細胞株（Ｈｅｌａ、ＨａＣａＴ、ＥＳ）のトランスフェクションによって、または、陽性対照としてのヒト角膜上皮細胞株（ＨＣＥ）のトランスフェクションによって確認された（図１Ｆ）。非角膜細胞は何ら著量のＧＦＰを発現しなかった一方で、ＨＣＥの７８％およびＥＳ由来角膜上皮様（ＥＳ−ＥＣ）細胞の７１％が強いＫ１２プロモーター活性を示した（図１Ｆ）。最後に、表皮分化マーカー（すなわち、Ｋ１、Ｋ１０およびインボルクリン、図１Ｇを参照のこと）が全く検出されなかった。このことは、表皮様細胞が混入していないＥＳ−ＥＣ細胞の高富化集団が得られたことを示唆する。
【０１６３】
実施例２
角膜組織の胚性幹細胞からの作製
材料および方法
馴化培地の存在下におけるコラーゲンＩＶまたはマトリゲルでの多能性幹細胞の分化を１週間〜２週間行った後、細胞をディスパーゼまたはトリプシンによって集め、３Ｄ器官型再構成アッセイにおいて角膜実質同等ゲルに再播種した：初代ヒト角膜線維芽細胞を、マトリゲルおよびコラーゲンＩから構成されたゲルに埋め込み、ｈＥＳ由来角膜細胞を上皮培地におけるこれらのゲルの頂部に播種した。角膜の層形成を、図２Ａ〜図２Ｃに例示されるように、また、Ｇａｇｇｉｏｌｉ他、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、第９巻、第１２号（２００７）においてさらに例示されるように気液相間によって誘導した。その後、気液境界を、挿入物内部の培地を減らすことによって誘導し、細胞に、１週間〜２週間の層形成を行わせ、その間、培地を毎日取り換えた。あるいは、分化した細胞を、（例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉ他、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００（Ａｕｇｕｓｔ）、第４１巻、第９号に記載されるように）ヒト羊膜に播種し、培養液から引き上げた。
【０１６４】
実施例３
ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の角膜細胞への分化
Ｉ．角膜線維芽細胞馴化上皮培地の調製：実施例１に記載される通りである。
【０１６５】
ＩＩ．培養ディッシュの被覆：実施例１に記載される通りである。
【０１６６】
ＩＩＩ．ｉＰＳ細胞の角膜上皮系譜への分化：ヒトの毛包細胞または皮膚線維芽細胞に由来するｉＰＳをコラーゲンＩＶ被覆ディッシュまたはマトリゲル被覆ディッシュに播種した。培地を、約２週間にわたって１日おきに、新鮮な角膜線維芽細胞馴化上皮培地によって取り換えた。３日目、８日目および１４日目に、ＢＭＰ−４を培地に加えた。
【０１６７】
リアルタイムＰＣＲ分析：角膜分化の異なる時点における細胞のＲＮＡ抽出物を、Ｋ３、Ｋ１４、Ｋ１２、Ｋ１８、ｐａｘ６およびＤＮｐ６３のリアルタイムＰＣＲ分析によって分析した。
【０１６８】
ＦＡＣＳ分析：ＦＡＣＳ分析を、抗Ｋ１４  Ａｂ、抗Ｋ３／Ｋ１２  Ａｂおよび抗ｐａｘ６  Ａｂを使用して行った。
【０１６９】
結果
最初の３日間におけるＢＭＰ−４の添加は、ＤＮｐ６３、Ｋ１４およびＫ１２の増大した発現によって提示されるように（図４Ａ）、角膜分化を著しく高めた。この影響がＬＤＮ（ＢＭＰ−４の特異的アンタゴニスト）によって阻害された。角膜分化拘束を追跡するために、角膜上皮系譜遺伝子のメッセンジャーＲＮＡレベルをｑＰＣＲによってｉＰＳＣ分化の経過における異なる時点で記録した（図４Ｂ）。外胚葉マーカーＫ１８（およびＫ８、これは示されず）における上昇が、ｐａｘ６（神経外胚葉細胞の運命の初期マーカーで、眼の発達の重要な調節因子）の発現と一緒に、２日〜４日の培養日のうちに既に現れた（図４Ｂ）。初期の上皮分化拘束が、縁マーカーのｐ６３およびＫ１４の発現によって６日目〜８日目に検出され、一方で、成熟した角膜上皮のマーカー（Ｋ３、Ｋ１２）、およびコネキシン４３（示されず）が、１０日〜１４日のうちに現れた（図４Ｂ）。初期段階におけるＫ１８およびｐａｘ６の同時発現は、Ｅ９．５での水晶体板におけるインビボ共発現を繰り返し、その後には、成熟した角膜細胞の顕著な特徴であるｐａｘ６およびＫ３の共発現が続いた。角膜上皮様細胞集団の頑健性をＦＡＣＳ分析によって１２日目に評価した。細胞の圧倒的部分がＫ３を発現し（＞９０％）、一方で、２０％の細胞がＫ１４陽性細胞のままであった。最後に、表皮マーカーのＫ１０がｍＲＮＡレベルで増大したが、Ｋ１０タンパク質を検出することができなかった（示されず）。類似した結果が、ヒト線維芽細胞に由来するｉＰＳＣ、または、ｈｕＥＳＣに関して得られた（図４Ｃ）。
【０１７０】
実施例４
疾患ｉＰＳ細胞の角膜運命への分化
ＥＥＣ患者は、縁部幹細胞欠乏症に伴う損なわれた角膜のために視覚の病的状態に悩まされている。様々なｉＰＳＣ株を、実施例３に記載されるように角膜運命に誘導した。リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって例示されるように、ヒトｉＰＳＣ株が、４日目には外胚葉前駆体（Ｋ８／Ｋ１８＋／Ｐａｘ６＋）に、８日目には縁細胞（Ｋ１４／Ｋ５／Ｐａｘ６＋／ｐ６３＋）に、そして、１４日目には角膜上皮細胞（Ｐａｘ−６＋／Ｋ３／Ｋ１２＋）に順次、分化した（図５Ａ）。注目すべきことに、１４日目に、細胞のほとんどが、免疫蛍光染色（図５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（データは示されず）によって検出されるように、角膜上皮細胞になった。ＥＥＣ患者は縁部幹細胞欠乏症に悩まされているので、ｉＰＳＥＥＣ細胞は、ｉＰＳＣｃｔｌと比較した場合、適正な角膜上皮分化拘束を受けるその能力について障害があった。免疫蛍光染色分析を、Ｋ１８、Ｅ−カドヘリンおよびＫ１４に対して惹起された抗体を用いて１０日目に行った（図６Ａ）。外胚葉始原体（Ｋ１８＋／Ｅ−カドヘリン＋）の類似した生成が、ｉＰＳＣｃｔｌ、ｉＰＳＣ２０４ＷおよびｉＰＳＣ３０４Ｗについて１０日目に認められた。しかしながら、Ｋ１４染色およびＫ３染色の非存在により、ｉＰＳＥＥＣは、ｉＰＳＣｃｔｌと比較した場合、縁細胞および角膜細胞を生じさせるためのさらなる分化拘束を受けることができないことがそれぞれ明らかにされた。同時に、公知のｐ６３標的遺伝子の遺伝子発現をリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって分化拘束の１０日目に評価した（図６Ｂ）。これらの遺伝子のほとんどが、対照細胞と比較した場合、変異細胞ではそれほど発現していなかった。
【０１７１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１７２】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ−１Ｅ】
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【図１Ｆ−１Ｇ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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