(57)【要約】  本発明は、アゾ化合物と、診断方法におけるメディエーターとしてのそれらの使用とに関する。さらには、本発明は、そのようなアゾ化合物を含む、検出試薬、キットおよび試験エレメントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2014530208.tif 000019
式中、
Ｒ1は、ＯＲ7およびＮＲ7Ｒ8を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3-を含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2が、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示し；
Ｒ6は、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＯＨおよびＣ（＝Ｘ）Ｒ9を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ7は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含む残基を示し、
Ｒ8は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ7およびＲ8が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、ならびに、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく；
Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ9およびＲ10が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく；
Ｘは、ＯおよびＳを含む群より選択されるヘテロ原子を示し；ならびに
ｎは１〜６の整数である；
ただし、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5を含む群より選択される少なくとも２つの残基が残基Ｈであり、そして、前記一般式（Ｉ）のアゾ化合物が、２−（エチル−｛３−メチル−４−［（ピペリジン−１−イルカルボニル）ジアゼニル］フェニル｝−アミノ）エタノールではない
であるアゾ化合物。
【請求項２】
Ｒ1が、残基ＮＲ7Ｒ8であることを特徴とする請求項１記載のアゾ化合物。
【請求項３】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5を含む群より選択される少なくとも３つの残基が残基Ｈであることを特徴とする請求項１または２記載のアゾ化合物。
【請求項４】
Ｒ2が、ＨおよびＯ（アルキル）を含む群より選択される残基であり、そして、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5のそれぞれが残基Ｈであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のアゾ化合物。
【請求項５】
Ｒ6が、残基Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、特には残基Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ9Ｒ10であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のアゾ化合物。
【請求項６】
Ｒ8が、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のアゾ化合物。
【請求項７】
Ｒ7または／およびＲ8が、ヒドロキシエチル残基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のアゾ化合物。
【請求項８】
Ｒ9または／およびＲ10が、アルキルおよびアリールを含む群より選択される残基を示しており、前記アルキルまたはアリールは、ＯＨ、Ｏ（アルキル）およびＯ（アリール）を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよいか、または
Ｒ9およびＲ10が、それらが結合しているＮ原子とともに５員環または６員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のアゾ化合物。
【請求項９】
Ｒ9または／およびＲ10が、メチル、エチル、フェニル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシフェニルおよびメトキシフェニルを含む群より選択される残基であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のアゾ化合物。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）のアゾ化合物
【化２】
2014530208.tif 000020
式中、
Ｒ1は、ＯＨ、ＯＲ7、ＳＲ7、ＮＨＲ7およびＮＲ7Ｒ8を含む群より選択される残基を示し、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3-を含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2が、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示し；
Ｒ6は、ＣＮ、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨ2、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＲ9、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＯＨおよびＣ（＝Ｘ）Ｒ9を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ7およびＲ8が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく；
Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ9およびＲ10が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環が、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく；
Ｘは、ＯおよびＳを含む群より選択されるヘテロ原子を示し；ならびに
ｎは１〜６の整数である
の、診断方法におけるメディエーターとしての使用。
【請求項１１】
（ａ）フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素、
（ｂ）還元性のフラビン、ニコチンアミド、またはピロロキノリンキノン補酵素、
（ｃ）一般式（Ｉ）
【化３】
2014530208.tif 000021
式中、
Ｒ1は、ＯＨ、ＯＲ7、ＳＲ7、ＮＨＲ7およびＮＲ7Ｒ8を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3-を含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2が、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示し；
Ｒ6は、ＣＮ、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨ2、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＲ9、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＯＨおよびＣ（＝Ｘ）Ｒ9を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ7およびＲ8が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ9およびＲ10が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環が、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｘは、ＯおよびＳを含む群より選択されるヘテロ原子を示し；および
ｎは１〜６の整数である
であるアゾ化合物、ならびに
（ｄ）任意には、還元性光学的インジケーター
を含む、分析物を測定するための検出試薬。
【請求項１２】
前記フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素が、フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性脱水素酵素、特には、フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性グルコース脱水素酵素またはグルコース−６−リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項１１記載の検出試薬。
【請求項１３】
前記還元性のフラビン、ニコチンアミドまたはピロロキノリンキノン補酵素が、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、ＰＱＱまたはそれらの誘導体、および特には、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、カルバＮＡＤ+またはカルバＮＡＤＰ+であることを特徴とする請求項１１または１２記載の検出試薬。
【請求項１４】
（ａ）請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の検出試薬、および
（ｂ）試験エレメント、特には、光学的または電気化学的センサーとしてデザインされている試験エレメント
を含む、分析物を測定するためのキット。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の検出試薬を含む、分析物を測定するための試験エレメント。
【請求項１６】
光学的または電気化学的センサーとしてデザインされていることを特徴とする請求項１５記載の試験エレメント。
【請求項１７】
（ａ）分析物を含むサンプルを、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の検出試薬、請求項１４記載のキットまたは請求項１５もしくは１６記載の試験エレメントに接触させる工程、および
（ｂ）分析物の存在または／および量を測定する工程
を含む、分析物を測定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アゾ化合物と、診断方法におけるメディエーターとしてのそれらの使用とに関する。さらに、本発明は、そのようなアゾ化合物を含む、検出試薬、キットおよび試験エレメントに関する。
【０００２】
診断用エレメントは、分析物を測定するための臨床的に意義のある方法の重要な構成要素である。この場合、主要な焦点は、酵素に基づいたシステムを使用して測定される分析物の迅速かつ正確な測定に特におかれている。このプロセスにおいて、測定される分析物は、通常触媒量で使用される適切な酵素、補酵素および任意にはメディエーターと接触され、ここで補酵素は、例えば酸化または還元など物理化学的に変化し、そして、続いて適切な方法を用いて検出され得る。
【０００３】
メディエーターが追加で使用される場合、それは、分析物の酵素的変換のあいだに物理化学的に変化した補酵素から遊離される酸化還元等価物を、通常、光学インジケーターまたは電極の伝導性の要素上に伝達し、これによりこのプロセスが例えば光度計測的または電気化学的に検出され得る。測定された値の較正により、測定される分析物の濃度との間の直接的な関係が提供される。
【０００４】
分析物を測定するための試験エレメント中で使用されるメディエーターは、先行技術において既知であり、特には、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、フェロセン誘導体、キノン、オキサジン、フェナジンおよびチアジンなどが挙げられる。適切な検出システム上への酸化還元等価物の直接的な伝達を確実にもたらし、かつ、特に、血糖の電気化学的測定のために使用され得るメディエーターに関する総説は、例えば非特許文献１および非特許文献２などに見ることができる。
【０００５】
公知の別のクラスのメディエーターとしては、特許文献１および特許文献２に開示されるニトロソアニリンが挙げられる。酸化還元等価物の直接的な伝達を可能にする上記のメディエーターと比較して、ニトロソアニリンは、始めに実際のメディエーターの前駆化合物が調製され、それが続く工程において、有効なメディエーターへと還元され、それにより、ブランク反応を避けられるという優位性を有することによって特徴付けられる。
【０００６】
しかしながら、ニトロソアニリンを使用する際の問題は、それらが一般的にアゾキシ二量体を形成する傾向を有しており、かつ、アミノ基およびメルカプト基を有する物質に対して高い反応性を有する（非特許文献３）ことであり、これは最終的に望ましくない副反応を導き、そして、分析物測定の特異性および感度に悪影響を及ぼし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２０６，１４７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２８６，３６２号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Takaminami，Materials Integration (2008), 21, 317-323
【非特許文献２】Hellerら，Chemical Reviews (2008), 108, 2482-2505
【非特許文献３】J.A. Hinson，Advances in Experimental Medicine and Biology (1986), 197, 691-696
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これゆえ、本発明の根底にある目的は、先行技術における不利な点が少なくとも部分的に解消される、分析物の定性的または／および定量的測定のためのメディエーターを提供することであった。具体的には、メディエーターは、例えばアスコルビン酸によるメディエーターの還元などのブランク反応の発生が回避されるように、かつ同時に、例えばメディエーター二量体などの副生成物、または、メディエーターとアミノ基または／およびメルカプト基を含む物質との非制御的な反応の生成物の形成が最小となるように、デザインされるべきである。さらに、メディエーターは、許容できる反応速度を有しつつ、ニトロソアニリンと比較して加水分解に対してより抵抗性であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、一般式（Ｉ）のアゾ化合物
【化１】
2014530208.tif 000002
式中、
Ｒ1は、ＯＲ7およびＮＲ7Ｒ8を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3-を含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2が、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示し；
Ｒ6は、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＯＨおよびＣ（＝Ｘ）Ｒ9を含む群より選択される残基であり；
Ｒ7は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含む残基を示し、
Ｒ8は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ7およびＲ8が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、そして、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、ならびに、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ9およびＲ10が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、そして、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく、
または、
Ｘは、ＯおよびＳを含む群より選択されるヘテロ原子を示し；ならびに
ｎは１〜６の整数である；
ただし、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5を含む群より選択される少なくとも２つの残基が残基Ｈである
により、本発明にしたがって達成される。
【００１１】
本願の範囲内において使用される場合、用語「アルキル（alkyl）」は、１〜１２個の炭素原子のうちの任意の一つ上に結合原子価を有する、１〜１２個の炭素原子を含む飽和の、直鎖または分岐の炭化水素残基を意味する。アルキルは、好ましくは、１〜８個の炭素原子を含む、より好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む炭化水素残基を示す。特に好ましいアルキルとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００１２】
本願の範囲内において使用される場合、用語「シクロアルキル（cycloalkyl）」は、３〜１２個の炭素原子のうちの任意の一つ上に結合原子価を有する、３〜１２個の炭素原子を含む飽和または不飽和の、環状炭化水素残基を意味する。シクロアルキルは、好ましくは、３〜１０個の炭素原子を含む、より好ましくは、３〜８個の炭素原子を含む環状炭化水素残基を示す。特に好ましいシクロアルキルとしては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
【００１３】
本願の範囲内において使用される場合、用語「アルケニル（alkenyl）」は、２〜１２個の炭素原子のうちの任意の一つ上の結合原子価および少なくとも１つの二重結合を有する、２〜１２個の炭素原子を含む不飽和の、直鎖または分岐の炭化水素残基を意味する。アルケニルは、好ましくは、２〜８個の炭素原子を含む、より好ましくは、２〜６個の炭素原子を含む炭化水素残基を示す。特に好ましいアルケニルとしては、例えばエテニル、プロペニルおよびブテニルが挙げられる。
【００１４】
本願の範囲内において使用される場合、用語「アルキニル（alkinyl）」は、２〜１２個の炭素原子のうちの任意の一つ上の結合原子価および少なくとも１つの三重結合を有する、２〜１２個の炭素原子を含む不飽和の、直鎖または分岐の炭化水素残基を意味する。アルキニルは、好ましくは、２〜８個の炭素原子を含む、より好ましくは、２〜６個の炭素原子を含む炭化水素残基を示す。特に好ましいアルキニルとしては、例えばエチニル、プロピニルおよびブチニルが挙げられる。
【００１５】
本願の範囲内において使用される場合、用語「アリール（aryl）」は、３〜１４個の環原子、より好ましくは、６〜１０個の環原子を含む芳香族環系であって、環原子として炭素原子のみを含み、かつ、３〜１４個の環形成原子のうちの任意の一つ上に結合原子価を有する芳香族環系を示す。好ましいアリールとしては、例えばフェニル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナントレニルが挙げられる。
【００１６】
本願の範囲内において使用される場合、用語「アラルキル（aralkyl）」は、少なくとも一つの水素原子が上で定義されるようなアリール残基によって置換されている、上で定義されるようなアルキル残基を意味する。好ましいアラルキルとしては、例えばベンジルおよびフェネチルなどが挙げられる。
【００１７】
本願の範囲内において使用される場合、用語「ヘテロシクロアルキル（heterocycloalkkyl）」は、３〜１４個の環原子を含む、より好ましくは、５〜７個の環原子を含む飽和または部分的に不飽和の環系であって、炭素原子に加えて、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択される少なくとも一つのヘテロ原子を環原子として含み、かつ、３〜１４個の環形成原子のうちの任意の炭素原子または窒素原子上に結合原子価を有する環系を示す。好ましいヘテロシクロアルキルとしては、例えばアゼピニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、チアジアゾリジニル、チアゾリジニルおよびチオモルホリニルが挙げられる。
【００１８】
本願の範囲内において使用される場合、用語「ヘテロアリール（heteroaryl）」は、３〜１４個の環原子を含む、より好ましくは、５〜６個の環原子を含む芳香族環系であって、炭素原子に加えて、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択される少なくとも一つのヘテロ原子を環原子として含み、かつ、３〜１４個の環形成原子のうちの任意の炭素原子または窒素原子上に結合原子価を有する芳香族環系を示す。好ましいヘテロアリールとしては、例えばフラニル、イミダゾイル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、ピロリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニルおよびトリアジニルが挙げられる。
【００１９】
本願の範囲内において使用される場合、用語「ハロゲン（halogen）」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。
【００２０】
本発明による一般式（Ｉ）のアゾ化合物において、好ましい実施態様において、Ｒ1は、残基ＮＲ7Ｒ8である。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施態様において、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5を含む群より選択される少なくとも３つの残基は、残基Ｈであり、一方、４つ目の残基は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3を含む群より選択される任意の残基であり得、ここで、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2は上記で定義されるように置換されていてもよい。
【００２２】
本発明による一般式（Ｉ）のアゾ化合物において、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5を含む群より選択される少なくとも３つの残基が、残基Ｈである場合、Ｒ2がＨおよびＯ（アルキル）を含む群より選択される残基であり、そして、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5のそれぞれが残基Ｈであることが特に好ましいと考えられる。全ての残基Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、最も好ましくはそれぞれＨである。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様において、Ｒ6は、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10およびＣ（＝Ｘ）ＮＨＯＨを含む群より選択される残基であり、ここで、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10が最も好ましいと考えられる。Ｒ6は、最も好ましくは残基Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ9Ｒ10である。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施態様において、Ｒ7はアルキル残基であり、ここでアルキル残基は、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の親水性置換基を含み、その結果、アゾ化合物の水に対する溶解度が向上し得る。アルキル基は、より好ましくは、親水性置換基（複数の置換基）として、一またはそれ以上のＯＨ基、そして特には、単一のＯＨ基を含む。
【００２５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、Ｒ8は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の親水性置換基を含む残基である。
【００２６】
Ｒ8は、より好ましくは、アルキル残基であり、ここでアルキル基は、ＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の親水性置換基を含む。アルキル基は、より好ましくは、親水性置換基（複数の置換基）として、一またはそれ以上のＯＨ基、そして特には、単一のＯＨ基を含む。
【００２７】
最も好ましい実施態様において、Ｒ7または／およびＲ8、そして特には、Ｒ7およびＲ8は、ヒドロキシエチル残基である。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施態様において、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、アルキルおよびアリールを含む群より選択される残基を示しており、ここで、アルキルまたはアリールは、ＯＨ、Ｏ（アルキル）およびＯ（アリール）を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい。より好ましくは、Ｒ9およびＲ10は、それぞれ独立して、メチル、エチル、フェニル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシフェニルおよびメトキシフェニルを含む群より選択される残基を示しており、ここで、メチル、エチルおよびヒドロキシエチルが好ましいと考えられる。
【００２９】
本発明の代替的な実施態様において、Ｒ9およびＲ10は、それらが結合しているＮ原子とともに５員環または６員環のヘテロ環を形成し、ここで、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい。
【００３０】
５または６員環であるヘテロ環が置換されている場合、前記ヘテロ環がＣＯＯ-、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の親水性置換基を含んでいることが好ましい。
【００３１】
さらに好ましい本発明の実施態様において、Ｘは、酸素原子である。
【００３２】
好ましくは２−（エチル−｛３−メチル−４−［（ピペリジン−１−イルカルボニル）ジアゼニル］フェニル｝−アミノ）エタノールではない、本発明による一般式（Ｉ）のアゾ化合物は、ニトロソアニリンメディエーターとは異なり、自然にはアゾキシ二量体を形成し得ない。さらに、本発明によるアゾ化合物は、それによってアミノ基または／およびメルカプト基を含む物質、例えば酵素などとの反応が起こり得るかもしれない、いかなる反応性のニトロソ基も有さない。
【００３３】
一方、ニトロソアニリンと類似して、一般式（Ｉ）のアゾ化合物は、実際のメディエーターがその化合物からのその後の還元によってのみ形成されるという前駆化合物にすぎない。したがって、本発明のアゾ化合物は、一方では、ブランク反応を避けるというニトロソアニリンの公知の利点を有しながら、同時に、ニトロソアニリンを使用して分析物を測定する際に見られるような好ましくない副反応は避けられ得る。
【００３４】
この点において、本発明は、さらなる態様において、一般式（Ｉ）のアゾ化合物
【化２】
2014530208.tif 000003
式中、
Ｒ1は、ＯＨ、ＯＲ7、ＳＲ7、ＮＨＲ7およびＮＲ7Ｒ8を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3-を含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2が、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示し；
Ｒ6は、ＣＮ、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨ2、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＲ9、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＯＨおよびＣ（＝Ｘ）Ｒ9を含む群より選択される残基であり；
Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ7およびＲ8が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ9およびＲ10が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環が、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく；
Ｘは、ＯおよびＳを含む群より選択されるヘテロ原子を示し；ならびに
ｎは１〜６の整数である
の、診断方法におけるメディエーターとしての使用に関する。
【００３５】
メディエーターとして使用されるアゾ化合物の好ましい実施態様に関し、本発明によるアゾ化合物の記載に関連してなされる説明が参照される。
【００３６】
メディエーターとしてのそれらの機能において、上記のアゾ化合物は、原則的に、例えば光学的または電気化学的診断方法などにおけるサンプル中の分析物の定性的または／および定量的測定を可能にする全ての診断方法において使用され得る。これに関連して、アゾ化合物は単量体としてまたはポリマーとして存在し得、そして、遊離型で、および結合型で使用され得る。したがって、具体的には、例えば電極上などの担体上にアゾ化合物を固定化すること、または／および、それらを適切な検出試薬の他の成分に、例えば酵素または補酵素などに連結することが可能である。
【００３７】
上記のアゾ化合物は、メディエーターとして作用するアゾ化合物に加えて、例えば酵素、補酵素および光学的インジケーターなどのさらなる成分を含み得る検出試薬の形で好ましくは使用される。
【００３８】
したがって、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素、
（ｂ）還元性のフラビン、ニコチンアミド、またはピロロキノリンキノン補酵素、
（ｃ）一般式（Ｉ）
【化３】
2014530208.tif 000004
式中、
Ｒ1は、ＯＨ、ＯＲ7、ＳＲ7、ＮＨＲ7およびＮＲ7Ｒ8を含む群より選択される残基を示し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＯ2およびＳＯ3-を含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アリール）、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）またはＮ（アリール）2が、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示し；
Ｒ6は、ＣＮ、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨ2、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＲ9、Ｃ（＝Ｘ）ＮＲ9Ｒ10、Ｃ（＝Ｘ）ＮＨＯＨおよびＣ（＝Ｘ）Ｒ9を含む群より選択される残基であり；
Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ7およびＲ8が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく；
Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む群より選択される残基であって、前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールが、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよい残基を示すか、
または、
それらが結合しているＮ原子とともにＲ9およびＲ10が、５〜７員環のヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環が、Ｎ、ＯおよびＳを含む群より選択されるさらなるヘテロ原子、または／および、ＣＮ、ＣＯＯ-、ハロゲン、ＮＨ2、ＮＨ（アルキル）、Ｎ（アルキル）2、Ｎ（アルキル）3+、ＮＨ（アリール）、Ｎ（アリール）2、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2）−ＮＨ2+、ＮＯ2、ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ、Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ（アルキル）、Ｏ（アルキル）、Ｏ（アラルキル）、Ｏ（アリール）、ＯＰＯ32-、ＰＯ32-およびＳＯ3-を含む群より選択される一またはそれ以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｘは、ＯおよびＳを含む群より選択されるヘテロ原子を示し；および
ｎは１〜６の整数である
であるアゾ化合物、ならびに
（ｄ）任意には、還元性光学的インジケーター
を含む、分析物を測定するための検出試薬に関する。
【００３９】
本発明による検出試薬中に含まれるアゾ化合物の好ましい実施態様に関し、本発明によるアゾ化合物の記載に関連してなされる説明が参照される。
【００４０】
本発明の検出試薬中で使用される酵素は、原則的には、各々の適用の目的のために当業者にとって適切であると思われる、任意の所望のフラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素であり得る。フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素は、好ましくは、フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性脱水素酵素、例えば、アルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素などである。
【００４１】
本発明のよりさらに好ましい実施態様において、フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性グルコース脱水素酵素またはグルコース−６−リン酸脱水素酵素が、フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素として使用される。最も好ましくは検出試薬は、ニコチンアミド依存性グルコース脱水素酵素またはグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含む。
【００４２】
酵素に加えて、本発明の検出試薬はさらに、それぞれの場合において使用される酵素を考慮して適切な方法で当業者によって選択され得る還元性のフラビン、ニコチンアミドまたはピロロキノリンキノン補酵素を含む。還元性のフラビン、ニコチンアミドまたはピロロキノリンキノン補酵素は、好ましくは、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、ＰＱＱまたはそれらの誘導体であり、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+およびそれらの誘導体が好ましいと考えられる。
【００４３】
ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+の誘導体が使用される場合、それらは好ましくは、安定化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）化合物、すなわち天然のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）の化学的誘導体である。例えばカルバＮＡＤ+およびカルバＮＡＤＰ+などのカルバ環状類似体を具体的には含む、本発明の意味における安定化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）化合物は、特に、Ｓｌａｍａ（Biochemistry (1988), 27, 183-193）、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら（Chemical Communications (1996), 2765-2766)、米国特許第５，８０１，００６号明細書、国際公開第９８／３３９３６号、国際公開第０１／４９２４７号および国際公開第２００７／０１２４９４に記載されており、その開示は、本明細書に参照として明確に組み込まれる。
【００４４】
本発明の最も極めて好ましい実施態様において、還元性のフラビン、ニコチンアミドまたはピロロキノリンキノン補酵素は、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、カルバＮＡＤ+またはカルバＮＡＤＰ+である。
【００４５】
酵素、補酵素およびアゾ化合物に加えて、本発明の検出試薬は、必要に応じて、追加で、検出試薬における必要性にしたがって当業者によって選択され得る還元性光学的インジケーターを含んでいてもよい。還元性であり、かつ、例えば色、蛍光、反射、透過、偏光または／および屈折率などのその光学特性における視覚的または／および機械的に検出可能な変化をともなう任意の物質が、光学的インジケーターとして使用され得る。本発明の意味において好ましい光学的インジケーターの例としては、還元性のヘテロポリ酸、特には２，１８−リンモリブデン酸などが挙げられる。
【００４６】
本発明の検出試薬は、光学的または電気化学的に検出され得る任意の生物学的または化学的物質の定性的または／および定量的測定のために使用され得る。分析物は、好ましくは、マレイン酸、アルコール、アスコルビン酸、コレステロール、グルコース、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシ酪酸塩、乳酸、ピルビン酸塩およびトリグリセリドを含む群より選択され、ここで、グルコースが好ましい。
【００４７】
測定される分析物は、任意の供給源由来のものであり得るが、好ましくは、これらに限定されるわけではないが、全血、血漿、血清、リンパ液、胆液、脳脊髄液、細胞外組織液、尿、および、例えば唾液または汗などの腺分泌物などを含む体液中に存在する。しかしながら、本発明の検出試薬は、好ましくは、全血、血漿および血清を含む群より選択されるサンプル中の分析物の存在または／および量を測定するために使用される。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の検出試薬と試験エレメントとを含む、分析物を測定するためのキットに関する。本発明の好ましい実施態様において、試験エレメントは、例えば、サンプルを適用するための適用領域と、分析物を検出試薬と反応させるための反応領域と、サンプル中の分析物の存在または／および量を測定するための検出領域と、任意には廃棄物領域とを含み得る光学的または電気化学的センサーとしてデザインされる。
【００４９】
本発明の範囲内で使用され得る試験エレメントとしては、具体的には、その上に分析物を含むサンプルが水性または非水性溶液の形で適用され得る試験エレメントが挙げられる。本発明の意味における好ましい試験エレメントとしては、テストテープ、テストディスク、テストパッドおよびテストストリップが挙げられ、ここでテストストリップが特に好ましいと考えられる。本発明にしたがって使用される試験エレメントの具体的な例は、特に、米国特許第５，２７１，８９５号明細書、米国特許第６，２０７，０００号明細書、米国特許第６，５４０，８９０号明細書、米国特許第６，７５５，９４９号明細書、米国特許第７，００８，７９９号明細書、米国特許第７，０２５，８３６号明細書、米国特許第７，０６７，３２０号明細書、米国特許出願公開第２００３／００３１５９２号明細書および米国特許出願公開第２００６／０００３３９７号明細書に記載されており、その開示は、本明細書に参照として明確に組み込まれる。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、本発明による検出試薬を含む、分析物を測定するための試験エレメントに関する。本発明の好ましい実施態様において、試験エレメントは、例えば、サンプルを適用するための適用領域と、分析物を検出試薬と反応させるための、本発明の検出試薬を含む反応領域と、サンプル中の分析物の存在または／および量を測定するための検出領域と、任意には廃棄物領域とを含み得る、光学的または電気化学的センサーとしてデザインされる。本発明による試験エレメントのさらに好ましい実施態様に関連して、本発明のキットの記載に関連してなされた説明が参照される。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）分析物を含むサンプルを、本発明の検出試薬、本発明のキットまたは本発明の試験エレメントに接触させる工程、および
（ｂ）分析物の存在または／および量を測定する工程
を含む、分析物を測定するための方法に関する。
【００５２】
本発明の方法の範囲内において、分析物を含むサンプルは、初めに、本発明の検出試薬、キットまたは試験エレメントに接触させられ、これによって、分析物が、フラビン−、ニコチンアミド−、またはピロロキノリンキノン−依存性酸化還元酵素によって酸化され、還元性のフラビン、ニコチンアミドまたはピロロキノリンキノン補酵素が還元され、そして、還元されたフラビン、ニコチンアミドまたはピロロキノリンキノン補酵素の電子がメディエーターとして使用されるアゾ化合物によって、電極の伝導性の要素上へ、または、任意的に存在する光学的インジケータ上へと移動される。
【００５３】
分析物の定性的または／および定量的測定のために、当業者によって手動で、または／および、適切な検出装置を用いて、評価され得るまたは／および読み取られ得る測定可能なシグナルを作製する酵素反応を検出するための当該技術分野において公知の全ての方法が使用可能である。本発明の範囲内において、分析物は、好ましくは、光学的または電気化学的に測定され、ここで光学的手法としては、具体的には、測光法および蛍光法が挙げられる。
【００５４】
本発明は以下の図面および実施例にしたがい、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬおよび５００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度での、ＦＡＤ−依存性グルコース脱水素酵素の存在下におけるメディエーター、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）のサイクリックボルタモグラムを示す図である。時間単位あたりの電位の変化：１００ｍＶ／ｓｅｃ。
【図２】０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬおよび５００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度で、ＮＡＤ−依存性グルコース脱水素酵素およびカルバＮＡＤの存在下、メディエーター、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）を用いた、グルコース溶液の変換速度を示す図である。５秒、１０秒、１５秒および２０秒の時間後の電流フローが、それぞれ、２００ｍＶの印加電圧下で測定された。
【図３Ａ】様々な還元剤を用いた、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の還元の速度を示す図である。アスコルビン酸を用いた還元（測定された曲線は、特定を容易にするために、矢印で示されている）。
【図３Ｂ】様々な還元剤を用いた、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の還元の速度を示す図である。カルバＮＡＤＨを用いた還元。
【図３Ｃ】様々な還元剤を用いた、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の還元の速度を示す図である。ＮＡＤＨを用いた還元。
【実施例】
【００５６】
実施例１：本発明のアゾ化合物の合成
他に明記しない限り、使用された化学薬品は、市販されており、そして、可能な限り最も高い業務用品質のものである。
【００５７】
２−［（２−ヒドロキシエチル）−（４−ニトロフェニル）−アミノ］−エタノール（３）の合成
【化４】
2014530208.tif 000005
１−フルオロニトロベンゼン（１）（１．００ｍＬ、９．３８ｍｍｏｌ）およびジエタノールアミン（２）（２．７３ｍＬ、２８．５ｍｍｏｌ）を２０．０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、そして、１４０℃で４時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧下（３ｍｂａｒ、８０℃）留去し、そして、オレンジ色の残渣オイルを酢酸エチルおよび水の混合物中に溶解した。有機層を分離し、水で数回洗浄し、そしてＭｇＳＯ4上で乾燥した。減圧下で溶媒を留去した後、表題の化合物１．３５ｇ（６３％）を得た。
【００５８】
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−アミノアニリンジヒドロクロライド（４）の合成
【化５】
2014530208.tif 000006
２−［（２−ヒドロキシエチル）−（４−ニトロフェニル）−アミノ］−エタノール（３）（１．３５ｇ、５．９７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの濃ＨＣｌ（３７％）に溶解し、塩化スズ(II)２水和物（８．０７ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）を添加し、そして、１０５℃で１．５時間加熱還流した。その後、氷冷しながら、混合物のｐＨをアンモニア水（２５％）の添加によって８．５に調整したところ、そのあいだに無色の固体が沈殿した。酢酸エチルを用いて水性懸濁液を数回抽出した後、合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、初期量の１／４をエバポレートして、３．００ｍＬの濃ＨＣｌ（３７％）を加えた。減圧下溶媒を留去し、そして、残渣を高真空下で乾燥した後、表題の化合物５９０．０ｍｇ（３７％）を得た。
【００５９】
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾシアニド（６）の合成
【化６】
2014530208.tif 000007
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−アミノアニリンジヒドロクロライド（４）（５０．０ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）を、１．８０ｍＬの水に溶解し、そして、０℃まで冷却した。その後、水（１．９０ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（３８．５ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）をこの溶液に３０分の滴下時間をかけて滴下したところ、混合物の色が赤色から緑茶色へと変化した。続いて、水（０．６０ｍＬ）中のＫＣＮ（３６．３ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）を反応混合物に冷却しながら３０分の滴下時間をかけて滴下したところ、そのあいだに反応混合物の色が赤茶色に変化した。この温度で４５分間攪拌した後、反応混合物を酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、そして、溶媒を減圧下留去した。シリカゲル上での残渣のクロマトグラフィー精製（溶出液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝９２：８）により、表題の化合物３１．４ｍｇ（７２％）を暗赤色結晶として得た。
【００６０】
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の合成
【化７】
2014530208.tif 000008
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾシアニド（６）（４３．９ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を、１５．０ｍＬのアンモニア水（３０〜３３％）に溶解し、そして室温で３時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を分取用ＨＰＬＣ（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ；０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液／アセトニトチルのグラジエント）によって精製し、表題の化合物２４．４ｍｇ（３８％）を、暗赤色、吸湿性結晶として、対応する酢酸塩の形で得た。
【００６１】
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾジメチルカルバミド（８）の合成
【化８】
2014530208.tif 000009
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾシアニド（６）（１０．２ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を、２．００ｍＬの水に溶解した。その後、ジメチルアミン（２ＭのＴＨＦ溶液、２．００ｍＬ、５２．２ｍｍｏｌ）を添加し、そして、反応混合物を室温で４時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を分取用ＨＰＬＣ（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ；０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液／アセトニトチルのグラジエント）によって精製し、表題の化合物７．１ｍｇ（４７％）を、暗赤色、吸湿性結晶として、対応するモノ酢酸塩の形で得た。
【００６２】
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−カルバミド（９）の合成
【化９】
2014530208.tif 000010
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾシアニド（６）（６．５０ｇ、２７．７５ｍｍｏｌ）を、５２０ｍＬの水に懸濁した。その後、ジエタノールアミン（２）（１３．２６ｍＬ、１３８．７ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、そして、反応混合物を室温で７２時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝８５：１５＋２％  ＮＥｔ3）によって二回精製し、その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０上でのカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した（溶出液：Ｈ2Ｏ）。凍結乾燥後、表題の化合物４．１０ｇ（４３％）を赤色の非結晶質固体として得た。
【００６３】
４−（２−（４−（ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ）−フェニル）−ジアゾカルボニル）−モルホリン（１１）の合成
【化１０】
2014530208.tif 000011
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾシアニド（６）（１００．０ｍｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）を、４．００ｍＬのＨ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１：１）に懸濁させた。その後、モルホリン（７４４μＬ、８．５４ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、そして、反応混合物を室温で１６時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝７０：３０＋２％  ＮＥｔ3）によって二回精製し、表題の化合物１２．５ｍｇ（９％）を暗赤色の結晶として得た。
【００６４】
２−（４−（ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ）−フェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−ジアゼン−カルボキシアミド（１３）の合成
【化１１】
2014530208.tif 000012
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾシアニド（６）（１００．０ｍｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）を、４．００ｍＬのＨ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１：１）に懸濁した。その後、ヒドロキシルアミン（１２）（１３１μＬ、２．１４ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、そして、反応混合物を室温で３時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝８５：１５＋２％  ＮＥｔ3）によって二回精製し、表題の化合物５３．１ｍｇ（４６％）を橙色固体として得た。
【００６５】
４−メトキシ−ベンゼンジアゾシアニド（１６）の合成
【化１２】
2014530208.tif 000013
ｐ−アニシジン（１４）（２．５０ｇ、２０．３０ｍｍｏｌ）をＨＣｌ水溶液（１Ｍ、４０ｍＬ）に溶解し、そして、０℃まで冷却した。その後、１２０ｍＬの水中の亜硝酸ナトリウム（４．２０ｇ、６０．９０ｍｍｏｌ）の溶液をこの溶液に３０分の滴下時間をかけて滴下したところ、反応混合物は赤茶色に変化した。続いて、反応混合物に、６０．０ｍＬの水中のＫＣＮ（３．９７ｇ、６０．９０ｍｍｏｌ）溶液を継続的に冷却しながら３０分かけて添加したところ、そのあいだに、黄橙色固体が沈殿し、この沈殿をろ過して、１ＭのＨＣｌで一回、Ｈ2Ｏで二回洗浄した。固体を酢酸エチルに溶解し、そして、有機層を水で、および飽和ＮａＣｌ溶液で、ともに一回ずつ洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、そして溶媒を減圧下留去した後、残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶出液：ｎ−ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡｃ＝８０：１０：１０）により精製し、表題の化合物８５０．０ｍｇ（２６％）を橙茶色結晶として得た。
【００６６】
４−メトキシ−ベンゼンジアゾ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−カルバミド（１７）の合成
【化１３】
2014530208.tif 000014
４−メトキシ−ベンゼンジアゾシアニド（１６）（１００．０ｍｇ、０．６２１ｍｍｏｌ）を、２．００ｍＬのＨ2Ｏおよび４．００ｍＬのＭｅＯＨの混合物中に懸濁した。その後、ジエタノールアミン（２）（２９７μＬ、３．１０３ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、そして、反応混合物を室温で７２時間攪拌した。減圧下で溶媒を留去した後、残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝９２：８）によって精製し、表題の化合物８２．３ｍｇ（４９％）を橙色固体として得た。
【００６７】
２−［（２−ヒドロキシエチル）−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−アミノ］−エタノール（１９）の合成
【化１４】
2014530208.tif 000015
２−フルオロ−５−ニトロアニソール（１８）（２．００ｇ、８．６２ｍｍｏｌ）およびジエタノールアミン（２）（２．４８ｍＬ、２８．４８ｍｍｏｌ）を、２０．０ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、そして、１４０℃で２時間、そして１６０℃で４時間加熱還流した。減圧下（３ｍｂａｒ、８０℃）で溶媒を留去して得られた、赤茶色のオイルである残渣をＣＨ2Ｃｌ2およびＨ2Ｏの混合物に溶解した。水層を２ＭのＨＣｌを用いてｐＨ１まで酸性にし、そして、ＣＨ2Ｃｌ2を用いて数回抽出した。ろ過後、水層を２ＭのＮａＯＨでｐＨ１２に調整し、そして再びＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、そして溶媒を減圧下留去して橙色をおびたオイルを得た。残渣のシリカゲル上でのクロマトグラフィー精製（溶出液：ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝９５：５）により、表題の化合物１３６．５ｍｇ（６％）を得た。
【００６８】
２−［（４−アミノ−２−メトキシフェニル）−２−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−エタノールジヒドロクロライド（２０）の合成
【化１５】
2014530208.tif 000016
２−［（２−ヒドロキシエチル）−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−アミノ］−エタノール（１９）（１３６．９ｍｇ、０．５３４ｍｍｏｌ）を１０．０ｍＬの濃ＨＣｌ（３７％）に溶解し、塩化スズ(II)２水和物（７２３．２ｍｇ、３．２０５ｍｍｏｌ）を添加し、そして、１１０℃で２時間加熱還流した。その後、氷冷しながら、混合物のｐＨをアンモニア水（２５％）の添加によって８．６に調整したところ、無色の固体が沈殿した。酢酸エチルを用いて水性懸濁液を数回抽出した後、合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、初期量の１／４をエバポレートして、１．００ｍＬの濃ＨＣｌ（３７％）を加えた。減圧下溶媒を留去し、そして、残渣を高真空下で乾燥した後、表題の化合物（２０）１１４．６ｍｇ（７１％）を得た。
【００６９】
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−２−メトキシ−ベンゼンジアゾシアニド（２２）の合成
【化１６】
2014530208.tif 000017
２−［（４−アミノ−２−メトキシフェニル）−２−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−エタノールジヒドロクロライド（２０）（５５．６ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）を、１．８０ｍＬの水に溶解し、そして、０℃まで冷却した。１．９０ｍＬの水中の亜硝酸ナトリウム（３８．５ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）をこの溶液に３０分の滴下時間をかけて滴下したところ、反応混合物が茶色に変化した。続いて、０．６０ｍＬの水中のＫＣＮ（３６．３ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）溶液をこれに冷却しながら３０分かけて添加したところ、反応混合物の色が深赤色に変化した。この温度で４５分間攪拌した後、反応混合物を酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、そして、溶媒を減圧下留去した。シリカゲル上での残渣のクロマトグラフィー精製（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝９０：１０）により、表題の化合物２９．７ｍｇ（６０％）を暗赤紫色結晶として得た。
【００７０】
実施例２：本発明のアゾ化合物の酸化還元挙動の測定
本発明における典型的、代表的なアゾ化合物の酸化還元挙動が、一般式（Ｉ）のアゾ化合物が診断方法におけるメディエーターとしてどれだけ使用可能であるかの評価の一部として調べられた。
【００７１】
この目的のため、始めに、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）（ｐＨ７．０である０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．９％ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中、５ｍＭ）を調製した。ＦＡＤ−依存性グルコース脱水素酵素（２０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのグルコース溶液（濃度：０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬおよび５００ｍｇ／ｄＬ）をこの溶液４０μＬに加え、そして５分間プレインキュベートした。
【００７２】
続いて、Ａｇ／ＡｇＣｌに対するサイクリックボルタモグラムが測定された。このためには、始め電位を０ｍＶ〜−８００ｍＶまで継続的に変化させ、そして続いて反転して＋８００ｍＶまで変化させ、そして最終的に−１００ｍＶとし、そして流れた電流を記録した。時間単位あたりの電位の変化は、１００ｍＶ／ｓｅｃであった。これらの測定の結果は、図１に示されている。
【００７３】
図１に示されているように、サイクリックボルタモグラムは、それぞれのグルコース濃度に依存して、１００〜２００ｍＶのあいだの範囲の酸化ピーク（還元されたメディエーターの再酸化）の大きさの明確な段階的変化を示している。これらの結果は、このような物質が電流測定または双電流測定によるグルコース定量におけるメディエーターとして使用可能であることを示している。
【００７４】
実施例３：本発明のアゾ化合物を使用したグルコースの変換速度
さらなる実験において、一般式（Ｉ）のアゾ化合物の酸化還元挙動を評価するために、種々の濃度であるグルコース溶液の変換速度が、例として、ＮＡＤ−依存性グルコース脱水素酵素、カルバＮＡＤおよび４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の存在下で試験された。
【００７５】
この目的のため、始めに４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）およびカルバＮＡＤ（それぞれ、ｐＨ７．０である０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．９％ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中、２５ｍＭ）を調製した。ＮＡＤ−依存性グルコース脱水素酵素（２０ｍｇ／ｍＬ）を加えた後、この溶液４０μＬに、グルコース溶液（濃度：０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬおよび５００ｍｇ／ｄＬ）１０μＬをそれぞれ加えたところ、酵素／グルコース反応によって、その後メディエーターの還元をもたらすカルバＮＡＤＨが形成された。
【００７６】
変換の速度は、グルコースの添加後直ちに（すなわち、プレインキュベーションなしに）電流測定により測定された。この目的のため、２００ｍＶの電圧が印加され、そして、メディエーターの再酸化に起因して流れる電流が、５、１０、１５および２０秒の時間後に記録された。測定の結果は図２に示されている。
【００７７】
グルコース濃度とそれぞれの場合において測定された電流とのあいだのおおよその線形相関が、例えば５秒の反応時間などの短い反応時間において既に明らかに見られている。したがって、記録された曲線は、実施例２で得られる結果によって明確に示されている電流測定によるグルコース定量に関する較正線として使用することができる。
【００７８】
実施例４：本発明のアゾ化合物の還元速度
さらなる実験において、一般式（Ｉ）のアゾ化合物の酸化還元挙動を評価するために、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の還元速度が、３つの異なる還元剤を用いて試験された。
【００７９】
この目的のため、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の酢酸塩の溶液（ｐＨ７である０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中、０．０５Ｍ）１．００ｍＬを、１５当量の還元剤［アスコルビン酸、カルバＮＡＤＨ（二ナトリウム塩として）またはＮＡＤＨ（二ナトリウム塩として）；それぞれ、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート中の溶液として］と、それぞれ石英キュベット中で反応させた。個々の反応条件は表１に要約されている。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の予想される還元の速度が、還元剤の添加後直ちに、５００ｎｍにおける吸収（使用されたメディエーターの酸化型の最大吸収）の減少に基づいてＵＶ分光法によって記録された（ＵＶ分光計：ＳＰＥＣＯＲＤ  ２１０、ソフトウェア：ＷｉｎＡＳＰＥＣＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２．０、Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ）。これらの測定の結果は図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示されている。
【００８２】
図３Ａは、アスコルビン酸の存在下における反応の継時変化を表すものであり、４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）のこの還元剤に対する不感受性を示している。実際、１８００秒後においてでさえも、時間経過によるメディエーター（酸化型）の量の有意な減少は全く見られなかった。測定時間後のより大過剰な量のアスコルビン酸の添加でさえも、同じ結果を導いた。
【００８３】
図３ＢおよびＣは、カルバＮＡＤＨおよびＮＡＤＨによる４−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−ベンゼンジアゾカルバミド（７）の還元の反応の時間経過を示している。図に示されているように、カルバＮＡＤＨおよびＮＡＤＨは、メディエーターの還元を導き、そして、２つの曲線の比較により、人工の補酵素カルバＮＡＤＨにおける実質的により高い還元速度が推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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