(57)【要約】  本発明は、割合に基づく妊娠成功の見込みを決定するための方法を含み、前記割合は、被験者のサンプル、好ましくは尿サンプル中の細菌の総量に関する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の存在を使用する式として示される。また、本発明に含まれるものは、本発明の方法を実行し、結果を出力する、キット、好ましくはｑＰＣＲキットである。係る方法及びキットは、ＩＶＦ又はＩＣＳＩ等の人工授精の方法を経ている又は対象である被験者における、妊娠成功の見込みを予測することに関して、特に有意である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．尿サンプルを取得するステップ；
ｂ．前記のサンプル中に存在する細菌の総量のパーセンテージとして、細菌種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を決定するステップ；及び
ｃ．前記の細菌間の割合に基づき、妊娠成功の見込みを予測するステップ；
を含む、被験者における妊娠成功の見込みを予測する方法。
【請求項２】
前記被験者は、ＩＶＦ又はＩＣＳＩ等の人工授精方法を経ている又はその対象である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓである、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである、
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌の量の測定は、ＰＣＲ、より好ましくはｑＰＣＲによって実行される、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、プライマー５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’及び５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３’を使用して決定される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、プライマー５’−  ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ−３’及び５’−  ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’を使用して決定される、
請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌の量の測定は、質量分析法、より好ましくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって実行される、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
妊娠成功の前記見込みは、式：
Y  =  a*  (%Lactobacillus)−  b*(%Staphylococcus)−  c
によって決定される、
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
（但し、前記式中、
ａは、０．０２５から０．０５１までの値を有し；
ｂは、０．０４から０．０７までの値を有し；
ｃは、−１．１０から−０．６６までの値を有し；
％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量であり；
％Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量であり；かつ、
Ｙは、成功の見込みを表す。）
【請求項１０】
ａは、０．０２５から０．０４までの値を有する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ｂは、０．０４から０．０６までの値を有する、
請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
ｃは、−１．０６から−０．９までの値、より好ましくは−１．０６から−１．０１までの値を有する、
請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌は、中流の尿サンプル中で検出される、
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記のａのステップは、膣スミア等の膣に関するサンプルを取得するステップである、
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
妊娠成功の見込みを予測するキットであって、
ａ．被験者からのサンプル中の細菌の総量を測定する手段；
ｂ．細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量を測定する手段；
ｃ．細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を測定する手段；
ｄ．請求項８乃至１１のいずれか一項に記載された前記式に従い前記見込みを計算する手段；
を含む、キット。
【請求項１６】
前記細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量を測定する手段は、プライマー５’−  ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ−３’及び５’−  ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’を含む、
請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を測定する手段は、プライマー５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’及び５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３’を含む、
請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記被験者からのサンプル中の細菌の総量を測定する手段は、細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡに特異的な一般的なプライマーセットを含む、
請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記一般的なプライマーセットは、少なくとも１つの順方向及び少なくとも１つの逆方向ＥＵＢプライマーを含む、
請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記見込みを計算する手段は、前記の測定された細菌値を入力として受け取ることができ、請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の前記式に従い前記見込みを計算するプロセッサを含む、
請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記プロセッサは、前記キットを使用する人が読み取ることができるシグナル伝達手段に前記見込みを出力することができる、
請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの繁殖の分野に、より具体的には、ヒトの繁殖が失敗している状況に関する。係る状況において、女性が妊娠するのを補助するために、人工的な方法が整っているが、これらの処置の成功は低く、より重要なことに、予測不可能である。本発明は、これより、体外受精における成功の可能性を予測するための、より信頼できる方法を供する。
【背景技術】
【０００２】
低受胎は、西洋の世界において、１０から１５％までのカップルに影響を及ぼす。この低受胎は、状況の半分において、女性を原因に帰することができ、２０から２６％において男性を原因に帰し、２５から３０％において、原因が知られていない（ＥＶＥＲＳ，  Ｊ．Ｌ．，  ２００２，  ＬＡＮＣＥＴ  ３６０：１５１−１５９）。多くのカップルは、彼らの子供への望みを満たすために、体外受精（ＩＶＦ）又は顕微授精（ＩＣＳＩ）を始める。これらの技術の成功率は、開始されたサイクルあたり約２５％である（ＡＮＤＥＲＳＥＮ，  Ａ．  ＥＴ  ＡＬ．  ２００７，  ＨＵＭ．  ＲＥＰＲＯＤ．  ２２：  １５１３−１５２５）。もしこの成功率が改善され得るなら、非常に感情的かつ経済的な恩恵があろう。補助された妊娠治療の個人的及び社会的責任の観点において、自然妊娠に関する、非常に低い成功の見込みを有するカップルと、高い見込みを有するカップルとを特定することが望ましい。特に、不妊の原因が知られていないカップルは、高い比率の自然妊娠を示し、彼らのために、妊娠管理が望ましくあり得る（ＢＲＡＮＤＥＳ，  Ｍ．  ＥＴ  ＡＬ．，  ２０１１，  ＨＵＭ．  ＲＥＰＲＯＤ．  ２６：  ３６０−３６８）。したがって、処置を改善することのため、及び、個々の場合において、続けるかどうかを決定するための両方のために、ＩＶＦ／ＩＣＳＩの後に、女性が妊娠するであろうか、及び、生児出生を与えるであろうかどうかを正確に予測することができるモデルに関する必要性がある。１０年を超える間、年齢、以前に失敗したＩＶＦの試みの数及び不妊に関する確からしい理由を含む臨床データに基づいて、生児出生の見込みを予測するモデルが利用できた。大きいグループに関して、観察された生児出生に対する予測率は、４０から６０％であった（ＮＥＬＳＯＮ，  Ｓ．Ｍ．  ＡＮＤ  ＬＡＷＬＯＲ  Ｄ．Ａ．  ２０１１，  ＰＬＯＳ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ  ８：  １−１０）。これらの著者は、年齢、不妊の原因、使用され（得る）手順、卵子のソース及び不妊治療（ＣＨＩＬＤ  ＷＩＳＨ）の期間に関するより多くの階層を使用して、１４０，０００を超える女性からのデータに基づいて改善されたモデルを開発した。新しいモデルのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）が、この新しいモデルがどれくらい良好に機能するかのために使用されるとき、僅かに、しかしながら重大な増大が報告された（０．６１８４から０．６３３５へと）。このモデルは、より大きいグループの女性（１０，０００より多い）に関して良好な予測を与えるようである。しかしながら、このモデルが個人ベースにおいてどのくらい良好に予測するかは、未だ知られていない。
【０００３】
生児出生へのルートは、３つの決定的なステップに分類され得、卵子の受精、女性環境による受精した卵子の受容、及び実際の生児出生への更なる成長である。第１のステップが（ＩＶＦ及びＩＣＳＩ等で）人工的に対処されるなら、生児出生に至る見込みは、第２のステップに関するマーカーによって説明され得る。しかしながら、受精した卵子の受容の責任を負う要因は、実質的には知られていない。したがって、この第２のステップで成功を予測するであろう基準を確立することは、現在不可能である。
【０００４】
したがって、個人ベースで成功したＩＶＦ／ＩＣＳＩ処置の見込みをより信頼性良く予測することができるモデルに関して、依然必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
現在、発明者らは、個人ベースでのＩＶＦ／ＩＣＳＩ処置成功の（又は不成功の）見込みにおける予測を７５−１００％まで増大させるモデルを開発できることがわかった。
【０００６】
本発明は、被験者における妊娠成功の見込みを予測する方法を含み、当該方法は：
ａ．尿サンプルを取得するステップ；
ｂ．前記のサンプル中に存在する細菌の総量のパーセンテージとして、細菌種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を決定するステップ；及び
ｃ．前記の細菌間の割合に基づき、妊娠成功の見込みを予測するステップ；
のステップを含む。
【０００７】
好ましくは、前記方法において、被験者は、ＩＶＦ又はＩＣＳＩ等の人工授精に関して、経験している又はその対象である。別の好ましい実施形態において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓであり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである。
【０００８】
更に好ましいものは、細菌の量の測定は、ＰＣＲで、より好ましくはｑＰＣＲで実行され、この方法において、その後Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、好ましくは、プライマー５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’及び５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３’を使用して決定され、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、好ましくは、プライマー５’−  ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ−３’及び５’−  ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’を使用して決定される。
【０００９】
あるいは、細菌の量の測定は、質量分析法、より好ましくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって実行される。
【００１０】
本発明に係る方法でより具体的には、妊娠成功の見込みは、式によって決定される：
Y  =  a*  (%Lactobacillus)−  b*(%Staphylococcus)−  c
ここで、
ａは、０．０２５から０．０５１までの値を有し；
ｂは、０．０４から０．０７までの値を有し；
ｃは、−１．１０から−０．６６までの値を有し；
％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量であり；
％Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量であり；かつ、
Ｙは、成功の見込みを表す。
【００１１】
好ましくはこの式において、ａは、０．０２５から０．０４までの値を有し、また好ましくは、ｂは、０．０４から０．０６までの値を有し、更に好ましくはｃは、−１．０６から−０．９までの、より好ましくは−１．０６から−１．０１までの値を有する。
【００１２】
細菌が検出されるサンプルは、尿サンプルであり得、好ましくは、細菌は、中流の尿サンプルで検出されるが、サンプルは、また、膣スミア等の膣サンプルであっても良い。
【００１３】
本発明はまた、妊娠成功の見込みを予測するためのキットを含み：
ａ．被験者からのサンプル中の細菌の総量を測定する手段；
ｂ．細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量を測定する手段；
ｃ．細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を測定する手段；
ｄ．上記定義された式に従い前記見込みを計算する手段；
を含む。
【００１４】
好ましくは係るキットにおいて、細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量を測定する手段は、プライマー５’−ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ−３’及び５’−ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’を含み、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を測定する手段は、プライマー５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’及び５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３’を含む。また好ましくは係るキットにおいて、被験者からのサンプル中の細菌の総量を測定する手段は、細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡに対して特異的な一般的なプライマーセットを含み、より好ましくは、前記一般的なプライマーセットは、少なくとも１つの順方向及び少なくとも１つの逆方向ＥＵＢプライマーを含む。
【００１５】
更に好ましくは前記キットにおいて、前記見込みを計算する手段は、入力として測定された細菌値を受信することができ、上記定義された式に従い前記見込みを計算するプロセッサを含み、好ましくは前記プロセッサは、当業者が読み取ることができるシグナル伝達手段へと前記見込みを出力することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の説明及び実施例では、多くの専門用語が使用される。係る専門用語に与えられ得る範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を供するために、以下の定義が供される。本明細書で他の定義がない限り、使用される全ての技術的及び科学的専門用語は、本発明が属する当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
【００１７】
“ＩＶＦ”又は体外受精は、女性の卵巣からの卵子（複数の卵子）が除去される治療である。それらは、実験室的手順で精子と受精され、その後、受精した卵子（胚）が、女性の子宮に戻される。
【００１８】
“ＩＣＳＩ”は、卵細胞質内精子注入法、受精を達成するために精子が直接卵子へと注入される試験管受精手順を表す。ＩＣＳＩは、主に男性不妊のためになされ、ＩＶＦ治療の一部を形成し得る。
【００１９】
“中流の尿”は、本明細書で、尿の出だしが丁寧に取り除かれた後の、尿のフローの中間の間に採集される尿試料として定義される。中流の尿サンプルはまた、“クリーンキャッチ試料（ｃｌｅａｎ  ｃａｔｃｈ  ｓｐｅｃｉｍｅｎ）”とも呼ばれる。
【００２０】
“尿路感染症”は、尿路の如何なる部分に影響を及ぼす細菌感染である。症状は、排尿に対する頻繁な感覚及び／必要性、排尿の間の痛み及び混濁尿を含む。
【００２１】
“１６Ｓ  ｒＤＮＡ”は、メッセンジャーＲＮＡのタンパク質鎖への翻訳が達成される、リボソームの成分をその後形成する、ＲＮＡのタイプをコードする細胞核の核小体におけるＤＮＡである。種々の器官のリボソームＲＮＡの遺伝子配列の比較が、器官間の進化論の関係を決定するために使用される。
【００２２】
現在、本発明者らは、子宮内の受精した卵子の安定の成功を予測する要因の１つが、女性の尿生殖器領域における細菌個体群の構成によって形成されることを発見している。細菌個体群の組成（腸内又は膣内のように）が、それらの直接の環境の表れであり、この組成が、その環境内で変わる時に変わり得るということが、知られている。このことは、例えば、全てのヒトの母集団群に亘り、胃腸内の常在細菌が、我々が遭遇する種々の細菌種の無作為の収集ではないという発見において明らかである。それらは、それらの宿主によって供される環境と動的平衡にある区別できる母集団である（Ｂｌａｓｅｒ，  Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ，  Ｓ．，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７：８８７−８９４）。ヒトの腸は、受け入れられる細菌の住処となる。それらは、ヒトの腸細胞が不足し、それらの宿主の食生活に対して応答するキャパシティを参照するので（Ｄｅ  Ｆｉｌｉｐｐｏ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  ＰＮＡＳ  １０７：  １４６９１−１４６９６）。食生活における変化は、実際に、細菌が生息している環境の化学的組成における変化である。腸内微生物叢の組成に影響を及ぼすであろう他の環境的要因は、（免疫）防御システム、細胞表面特性及びそれらが住処としている生態的地位の物理的特性等の宿主因子を含む（Ｂａｃｋｈｅｄ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：  １９１５−１９２０）。
【００２３】
尿生殖路からの例は、膣条件が変わる時に起こる膣内細菌個体群における変化である。通常、膣は、１から６までの細菌種を含み、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓによって影響が及ぼされる個体群を好む低ｐＨ環境を供する（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ，  Ｄ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３５３：  １８９９−１９１１）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉは更に、低ｐＨを維持し、さらに、他の細菌に対してそれらの生態的地位を活発に防御する。細菌性膣炎を有する女性において、ｐＨはより高く、膣内細菌個体群は、１７種にまで拡張され、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの存在は大いに低減され、病原性バクテリアに有利になる。細菌個体群構成におけるこのシフトの開始は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属における減少又は他の細菌の湿潤のいずれかであり得る。しかしながら、継続によって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属における減少、ｐＨにおける増大、及び新しい状況で成長するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ等の種における増大の間の変化するバランスであろう。もしこれらのシフトが、膣症の症状に先行するかどうかは、未だ確立されていない。
【００２４】
細菌個体群が特定の状況を予測するために使用され得るという指摘は、バクテリアの個体群が、広範囲の１６ｓ  ｒＤＮＡ解析で調査された、尿道炎を有する又は有さない男性における小さい研究で発見された（Ｒｉｅｍｅｒｓｍａ，  Ｗ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１：１９７７−１９８６）。３つのこれまでは知られていない細菌の存在が、尿道炎の欠如と関連付けられた。
【００２５】
本発明で行った調査において、発明者らは、基本的に２つの質問を尋ねており：女性の内部環境が妊娠を達成するためにＩＶＦ又はＩＣＳＩに適しているかどうかの情報を、女性における尿細菌個体群が保存するか？及び細菌の個体群が、尿路感染症に関する変更されたリスクに関連しているか？である。第１の目標の裏の考えは、ＩＶＦ又はＩＣＳＩの成功に対する第１のステップが、卵子が巣を作らなければならない期間の間の、女性の内部環境による、異物、受精卵の受け入れであるということである。この内部環境は、ホルモン制御下にあろう。この制御の性質は、完全には知られていないが、子宮内の状況だけでなく、尿路等の体内の他の状況にも影響を及ぼすであろうと思われる。その結果、それは、その尿路における、異物の受け入れ、常在細菌個体群に影響を及ぼすである。この考えに基づき、調査を推進する２つの仮設が明確に述べられ：第１は、女性内の細菌個体群は、受精した卵子がどれくらい良好に受け入れられるであろうかを示すということであり、第２は、女性が妊娠するときに、彼女の中で起こる環境的変化に、尿中の細菌個体群が反応するであろうということである。妊娠の間、尿路は、腎盂及び尿道の膨張、膀胱の移動及び膀胱平滑筋の緩和及び化学的変化に関連する尿停滞等の解剖学的変化を経る（尿ｐＨ、尿オスモル濃度、糖尿及びアミノ酸尿）。これらの変更された条件は、常在細菌とは別の細菌種に、より快適であると期待され得る。常在細菌は、研究において、尿路それ自身（の感染）に内在する問題の源であり得るので、また、尿中の細菌個体群組成と尿路感染との間の関係が調査された。
【００２６】
この研究において、５つの細菌種／菌種のコアグループが、調査された全ての環境下（妊娠した、妊娠していない、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ後で妊娠していない）で発見されたようであった。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、全てのサンプルの大部分で存在しており、一方、Ｅ．  ｃｏｌｉ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．及びｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅ  ＣＨ９６Ｆｃ＿Ｈ１０は、より少ない数のサンプルで発見された。全ての女性において、全個体群の７０％以上が、全個体群の１０％以上として個々に存在していた最大４つのタイプから成った。これは、５つの述べれられた細菌種プラス他のタイプのショートリストを含んでいた（表５参照）。多くの細菌タイプが、１又は少数のサンプルにおける、小さいパーセンテージで発見された（表３参照）。
【００２７】
我々の全ての検査条件下において、女性内に発見された５つの細菌種のコアグループが、高い見込みで外のプール（outside  pool）から尿路へと侵入し、尿路内の条件によりよく適合し、又は宿主によってよりよく受け入れられる、種を意味し得る。第２のグループは、まれに発見されるが、時間とともに個々の女性に残り、更に優占種になり得る種から成る。なぜこれらの種がそうそう発見されないかの理由は、これらの細菌に関して、尿路が外のプールに晒されることが、全ての女性に関して同じでない又は特定の宿主因子が、小サブセットの女性にだけそれらの存在を許す、ということであり得る。１つの単一のサンプルでのみ発見された多くの種は、尿路内で良好に生存しない通りすがり（passers-by）を意味し得る。
【００２８】
本研究から判断され得ることは、女性が妊娠するとき、尿路内の細菌個体群の組成が劇的に変わるということである。妊娠前において、細菌個体群は、種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株（主にＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）によって支配される。妊娠の間、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、しばしば優占種になる、他の細菌、主にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによって置き換えられる。それは、ＩＶＦ／ＩＣＳＩを経たが、妊娠していない女性において起こらなかったので、このシフトは、女性が経験した治療に依らなかった。
【００２９】
勿論、妊娠を決定するより容易な方法があるので、尿路個体群が、女性が妊娠したかどうかを反映するという発見は、臨床的に無関係である。明らかに、女性の受胎状態が、尿路内の細菌個体群に影響を与えるという観察によって、関連性が与えられる。このことは、尿路内の細菌個体群が、宿主の内部的条件のマーカーであるという仮説を支持します。
【００３０】
本研究は、このマーカー機能が、妊娠したい女性の受胎を診断するために、十分に特異的であるということを示す。実験に関するセクションから明らかであるように、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ治療前の尿中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の相対的な存在で作られたモデルが成功するかどうかであろう。
【００３１】
したがって、本発明は、被験者の妊娠成功の見込みを予測するための方法であって：
ａ．尿サンプルを取得するステップ；
ｂ．前記のサンプル中に存在する細菌の総量のパーセンテージとして、細菌種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を、決定するステップ；及び
ｃ．前記の細菌間の割合に基づき、妊娠成功の見込みを予測するステップ；
のステップを含む方法を供する。
【００３２】
ＩＶＦ又はＩＣＳＩ等の人口受精方法を経ている又は適している被験者に関して好ましいが、係る方法は、そのような範囲に限られない。係る方法は、彼女らが自然な方法で妊娠する見込みがどうであろうかについて興味がある被験者に関しても、役に立ち得る。この観点において、サンプルが男性被験者から、若い女性から又はすでに妊娠した女性、即ち妊娠することができない被験者から取得されるとき、係る方法はまた、正しい予測を与えることができる：これらのサンプルから、テストの結果が否定的であるように思われる、ということは、注目に値します。勿論、人工授精が使用されない場合において、上記で計算された妊娠成功における見込みは、妊娠した見込みが、パートナーの不妊性によって又は女性被験者の著しい生理不全によって影響されないそれらの状況に関係があるだけである（例えば、子宮の不在、ホルモンの不均衡、等）。
【００３３】
好ましくは、検出されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓである。しかしながら、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｉｎｅｒｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ等のまた別のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属を検出することも有用であり得る。これらの属は、複数の女性で直面され、これらの属をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｅの群への包含は、上記の方法の予測力を増大させます。同じことが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓだけでなく、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、
Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＳ．ｃｏｈｎｉｉも、予測力に加えるために直面され、発見されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓにも当てはまります。好ましくは、本発明の方法における細菌種の検出は、ＰＣＲ及び好ましくはｑＰＣＲ等の分子生物学的アッセイを通じて行われる。係るアッセイにおいて、細菌は、検出される細菌に関して特異的であるプライマーを用いた増幅によって、検出され、定量化される。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの場合において、このことは、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓに関して特異的であるプライマーが使用され得るが、好ましくは、係るプライマーはまた、上述されたような他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属を認識するであろうということを意味する。現在、最適な検出方法は、例２で使用されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに特異的なプライマーを含む。
【００３４】
操作の同様の方法はまた、主にＳ．ａｕｒｅｕｓが検出され得るが、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＳ．ｃｏｈｎｉｉも包含され得る、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の検出に適用する。またこの場合において、例２で示されるプライマーセットが最適な結果を与える。
【００３５】
しかしながら、理解されるべきことは、使用され得るのが、検出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの絶対比率ではないということである。むしろ、細菌の総量に関するこれらの細菌のパーセンテージの比率が使用される。サンプル中における細菌の総量を決定するために、細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡを認識するプライマーを使用することが好ましく、これは、全ての細菌中に存在する１６Ｓ  ｒＤＮＡの保存部分を認識するプライマーを使用する機会をもたらす。細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡに特異的であり、したがって、他の器官からの生物由来物質が存在するサンプル中における、細菌だけを認識することができるプライマーセットが、文献で記載されている。Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ（http://en.Wikipedia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA）では、次のプライマーが述べれている：
プライマー名       配列（５’−３’）
B27F        AGA  GTT  TGA  TCC  TGG  CTC  AG
U1492R GGT  TAC  CTT  GTT  ACG  ACT  T
928F          TAA  AAC  TYA  AAK  GAA  TTG  ACG  GG
336R          ACT  GCT  GCS  YCC  CGT  AGG  AGT  CT
1100F         YAA  CGA  GCG  CAA  CCC
1100R         GGG  TTG  CGC  TCG  TTG
337F          GAC  TCC  TAC  GGG  AGG  CWG  CAG
907R          CCG  TCA  ATT  CCT  TTR  AGT  TT
785F          GGA  TTA  GAT  ACC  CTG  GTA
805R          GAC  TAC  CAG  GGT  ATC  TAA  TC
533F          GTG  CCA  GCM  GCC  GCG  GTA  A
518R          GTA  TTA  CCG  CGG  CTG  CTG  G
非常に良好に適しているプライマーセットは、いくつかが利用可能である、所謂ＥＵＢプライマーを使用する（例えば、ＥＵＢ  ｆ９３３及びＥＵＢ  ｒ１３８７；ＥＵＢ  ８ｆ及びＥＵＢ５３６ｒ、ＥＵＢ３４１及びＥＵＢ５３４等）。また、ＥＵＲプライマーに基づく、細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡを検出するためのキットが商業的に利用可能である（Iris  technologies  Int.,  Cursdorf,  GermanyからのOnar（登録商標）EUB  kit等）。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、サンプル中の細菌の量が、質量分析、ラマン分光法及び同様の分光手段によって決定される。好ましくは量の係る測定において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが分析ツールとして使用される。
【００３７】
全細菌の量及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量が決定されるとき、本発明の好ましい実施形態において、細菌の割合及び従って妊娠成功の見込みが、式に従い計算され得る：
Y  =  a*  (%Lactobacillus)−  b*(%Staphylococcus)−  c
ここで、
ａは、０．０２５から０．０５１までの値を有し；
ｂは、０．０４から０．０７までの値を有し；
ｃは、−１．１０から−０．６６までの値を有し；
％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量であり；
％Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量であり；かつ、
Ｙは、成功の見込みを表す。
【００３８】
Ｙの値は、式によって、０（成功の見込みがない）と１（確実な成功）との間の範囲にある見込みへと変換され得る：
見込み＝eY/(1+eY)
使用される定数に依存して、Ｙの値は、４．４４（１００％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ａ＝０．０５１及びｃ＝−０．６６）から−８．１（１００％Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ｂ＝０．０７及びｃ＝−１．１）までの間で変わるであろう。実際の妊娠に対する予測された妊娠の比較に関して、最善のカットオフ値は、見込み＝０．５であると分かった。０．５に等しい又は０．５より高いＹ値は、そのとき成功を予測し、０．５より低い値は、失敗を予測する。このカットオフ値を用いて、式は、ＩＶＦ／ＩＣＳＩの第１の試みの後、８６％の女性において、妊娠を正しく予測し、１年の間、多数の試みの後、９２．３％の女性において、妊娠を正しく予測した。したがって、７．７％の場合において、女性はＩＶＦ／ＩＣＳＩの後、妊娠したが、式は、失敗を予測した（偽陰性）。３．８％において、妊娠が、流産により達成されなかった。３．８％において、式は、実際の生児出生を外した。式が妊娠を予測した２５％の場合において、進行中の妊娠が達成されなかった（偽陽性）。
【００３９】
妊娠したい及びＩＶＦ／ＩＣＳＩを続けるかどうかを決定するために予測検査を使用する女性は、特に、偽陰性予測を受け入れないであろうから、偽陰性予測を３．８％からゼロへと低減することが望ましい。その場合、カットオフ値は０．０４へと下げられなければならない。しかしながら、このカットオフ値では、式は、全ての女性に関して妊娠を予測し、勿論これも望まれない。
【００４０】
完了された妊娠の最善の予測に関して、式は、ａが０．０３から０．０５１までの値を有して、一方更に好ましくはｂが０．０５６から０．０６４までの値を有して使用される。更に好ましくは、ｃは−１．０６から−１．０３までの値を有する。その後、妊娠を得るための見込みに関するカットオフは、好ましくは０．５である。
【００４１】
対象者からのサンプルは、好ましくは尿サンプルであり、より好ましくは中流の尿サンプルである。係る中流の尿サンプルは、これが尿中の細菌個体群を最善に表すため、好ましい。これは、最初の尿は、尿道を洗い落としており、尿道にいる細菌を持って来るであろう。
【００４２】
本発明の方法を膣のサンプルで実行することも可能である。同じタイプの細菌が膣中で直面されるので、妊娠成功におけるチャンスを予測するための、同様の割合及び好ましくは同様の式が、尿サンプルに関して使用され得るということは、もっともらしい。ａ、ｂ及びｃの値が最適化される必要があるが、係る最適化は、当業者の技術の良好な範囲内である。
【００４３】
また、本発明の一部は、妊娠成功の見込みを決定するためのキットである。係るキットは、サンプル中の細菌の総量を決定する手段と、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの細菌の両方を検出する手段を含む。さらに、係るキットは、上述された式に基づいて見込みを計算するための手段を含むであろう。係る見込みを計算するための手段は、好ましくは、細菌及び特定の上述された細菌の種／属の総量の検出の値を受けることができるプロセッサを含むであろう。プロセッサはその後、本発明の式に係るＹを計算し、妊娠成功の見込みを出力するであろう。この出力は、数値の形式であっても良いが（式から得られるＹの実際の値）、それは、例えば、赤（陰性）又は緑（陽性の見込み）のいずれかであろう、合図している光源を通じた、又は、負の値が、暗い赤色（強い陰性）から、明るい赤色（中程度の陰性）を経て、黄色（大よそゼロ）への階調度を示し、正の値が、黄色（大よそゼロ）から明るい緑色（中程度の陽性）を経て暗い緑色（強い陽性）への階調度を示す、Ｙの数値を表すカラーコード化されたバーを通じた、見込みを示すものであっても良い。係る方法において、被験者は、予測の信頼性の視覚的な示唆を受け取ることができる。全ての応用において、見込みに関するカットオフ値（０．５で標準設定である）が、偽陽性予測の数を増大させることを犠牲にして、偽陰性の予測の数を減らすために、低くされるというオプションを含んでも良い。勿論、Ｙの値を表す別の示唆が使用可能であり、当業者は、本発明の主旨から逸脱することなく、上記実施形態における変更を設計することができるであろう。
【００４４】
（実施例）
（患者包含とグループ割当て）
２００５年及び２００６年において、ロッテルダムにあるＥｒａｎｓｍｕｓＭＣのＩＶＦ病棟を訪れた９８名の女性が、研究に登録された。これら９８名の女性のうち４０名（４１％）が、３年の研究の間、場合によっては複数の試みの後、妊娠した。告知に基づく同意と、中流の尿採取をどのように実行するかについての指導を与えた後、女性は、１回目の訪問の間、中流の尿サンプルを送り、抗生物質の以前の使用及び以前のＵＴＩについての質問に答えた。彼女らは、尿容器及び中流の尿の採取の手順を述べている折り畳み印刷物を受け取った。女性らは、彼女らが、妊娠の１６週目で又は妊娠にならなかったそれらの女性に関する胚の配置後に相当する時間でのいずれかであるときに、２回目のサンプルを採取するようにリマインドされた。尿サンプルは、同じ日に病院に戻された又は凍結され、後日に戻された。２回目のサンプルの採取の後、妊娠の結果に関する、及び後の妊娠に関する、データを集めるために、最大３年の間、女性らの後を追った。
【００４５】
９８名の女性のうち１６名は、質問書における全ての質問には答えなかった又はインタクトな（intact）第２の尿サンプルを返さなかった。これらは、２つの時間点でのサンプルを必要とする我々の発見研究からは除外された。残っている８２名の女性から、１回目の尿サンプルに続いた、最初のＩＶＦ／ＩＣＳＩサイクルによって妊娠した最初の２１名が、発見研究のために含まれた。２回目のサンプルを採取したとき（胚の配置後１６週）に妊娠していなかった２１名の女性が、妊娠していない女性のグループに含まれた。包含期間の後、２１名の妊娠していない女性のうちの１人が、彼女が自分の２回目のサンプルを採取したときに妊娠していたということがわかった。彼女は、妊娠したグループに再び割り当てられた。これにより、ｎ＝２２の妊娠したグループ及びｎ＝２０の妊娠していないグループをもたらした。これらの４２名の女性において、我々は、広域スペクトル１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析によって、両方の尿サンプル中の細菌個体群を決定した。さらに、女性らについて、妊娠とその結果に関して、３年の間、臨床的に後を追った。全ての４２名の女性の１度目の尿サンプル中に同定された細菌種が、ＩＶＦ／ＩＣＳＩの結果（妊娠した／妊娠していない）を予測するモデルを作るために使用された。女性が妊娠したときに起こった細菌個体群における変化が、ＵＴＩの主な原因における変化と比較された。後者は、別のグループから得られた（下記参照）。
【００４６】
残っている４０名の２つの尿サンプル及び完全な質問書の両方を戻した女性と、インタクトな１回目のサンプル及び完全な質問書の両方を戻した女性とから、我々は、ｎ＝４２の、独立した検証グループを編成した。このグループにおいて、我々は、予測モデルに含まれる細菌に特異的なプライマーに基づいたｑＰＣＲ検査を使用して、上述で得られる予測モデルを確認した。
【００４７】
留意すべきことは、我々の選択プロトコルにより、我々の発見フェーズにおける、妊娠成功の割合は、２２／４２＝５２％であり、これは全グループの９８名の女性に関する４１％に比較されるということである。
【００４８】
（除外基準）
１６週の研究期間の間、抗生物質を使用した又はＵＴＩを有した女性が除外された。
【００４９】
（追跡調査（３年間））
妊娠したグループの４名の女性において、妊娠は、流産（３）又は子宮内死（ＩＵＤ）に終わった。更なる治療の後、全ての４名が、２回目のサンプルが採取された後６ヶ月以内に妊娠成功した。
【００５０】
失敗したＩＶＦグループのうち１２名の女性は、決して妊娠せず、７名は２回目のサンプルの採取の間妊娠していないが、別の時間点で妊娠した。これは：
患者６、１回目のサンプル後１年を超え、２回目のサンプル後１年内に妊娠
患者１０、１回目のサンプル後１年以内に妊娠（双子）
患者１４、１回目のサンプルの後１年以内に妊娠
患者１９、一回目のサンプルの後１年以内、流産
患者５８、は、１回目のサンプルの採取の前後に、自然妊娠であるとわかった。この方は、ＩＵＤに終わった。ＩＶＦが後に続き、胚の配置後１６週に、２回目のサンプルが採取された。ＩＶＦは失敗した。この患者は、第１のＩＶＦ／ＩＣＳＩの結果の結果及び妊娠による見込みの検査に関して、妊娠していないグループに割り当てられた。完全性のために、モデル作成は、また、妊娠したグループに割り当てられている患者５８で実行された。彼女は、女性が１年以内に妊娠し得るかどうかの検査に関して、妊娠したグループに割り当てられた。
【００５１】
患者７８、１回目及び２回目のサンプルの後１年を超え、自然妊娠、流産。
【００５２】
患者９２、１回目及び２回目のサンプルの後１年を超え、妊娠（ＩＶＦ）、流産、その後１回目のサンプルの後２年で自然妊娠成功。
【００５３】
（ＩＶＦ／ＩＣＳＩの成功に関する予測モデル）
１回目の尿サンプルの細菌個体群のデータが、２つのモデルを作成するために、二項回帰分析へと入力された。モデル１は、１回目のＩＶＦ／ＩＣＳＩ試みによって妊娠が達成されるかどうかを予測する。モデル２は、１年間のＩＶＦ／ＩＣＳＩの試み（１から３までの試み）によって、女性が妊娠するかどうかを予測する。このモデルに関して、モデルに基づく、１回目の尿サンプルの採取の後１年内に妊娠した／妊娠した患者１０、１４、１９及び５８は、妊娠したグループに再び割り当てられ、ｎ＝２６の妊娠したグループ及びｎ＝１５の妊娠していないグループをもたらした。患者６、７８及び９２は、１年以内に妊娠していないグループにいた、これは、彼女らの妊娠が、２回目のサンプルの採取の後１年を超えて開始したからである。予測モデルは、１６週で採取された尿サンプルに適用された。広域解析に基づくモデルは、独立の検査グループに認証された種特異的ｑＰＣＲ検査に変換された。
【００５４】
（妊娠していない及び妊娠した女性における、ＵＴＩの細菌個体群及び原因）
ＤＮＡ解析で発見された細菌個体群は、ＵＴＩ無しでの妊娠した／妊娠していない女性の尿道において、少ない数で存在している細菌を意味する。このデータは、エルビルにあるＭａｔｅｒｎｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに通っている女性からの、尿及び膣スミア培養物によって得られた妊娠した／妊娠していない女性におけるＵＴＩ及び膣感染症の原因におけるデータと比較された。トータルで２００９年の間、５９９の尿培養成果（２１０の妊娠していない及び３８９の妊娠した）及び２１６の膣スミア培養成果（９４の妊娠していない及び１２２の妊娠した）が得られた。
【００５５】
表１．２つの患者グループの特徴
【００５６】
【表１】
2014522669.tif 000002
（方法）
（ＤＮＡ精製）
バクテリア個体群組成が、広域スペクトル細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析によって評価された（Ｒｉｅｍｅｒｓｍａ，  Ｗ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１：１９７７−１９８６）。尿サンプルが、８００ｇで１０分間遠心分離された。その後、１５０μｌのペレットが、ＤＮＡ抽出及び精製のために使用された。１５０μｌ未満の体積を有するサンプルに対して、補償量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ−５０ｍＭ  グルコース緩衝溶液が添加された。先ず、７５μｌのリソスタフィン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．）を添加し、混合物を３７℃で３０分間加熱した。その後、１ｍｌのグアニジン溶解緩衝溶液（４ｍＭ  グアニジンイソチオシアネート、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加し、５０μｌのセライト懸濁液を添加した後、混合物を室温で１時間保持した。サンプルを室温で１０分間一定間隔で混合した。ボルテックス及び遠心分離後（エッペンドルフ型遠心分離機で１４，０００ｒｐｍで１０分）、上澄みを廃棄し、ペレットをもう一つの溶解緩衝溶液（４Ｍ  グアニジンイソチオシアネート、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ６．４）で２度、エタノール（７０％）で２度、最後にアセトンで１度洗浄した。ペレットを真空乾燥し、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で乳化した。サンプルを５６℃に１０分間加熱し、遠心分離した（エッペンドルフ型遠心分離機で１４，０００ｒｐｍで１０分）。上澄みは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５０ｍＭグルコースを含む緩衝溶液（ｐＨ７．５）中でのＰＣＲに関するテンプレートとして使用した。
【００５７】
（ＰＣＲ）
精製ＤＮＡからの細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの単離は、遺伝子の保存された部分に方向付けられたプライマーを使用したＰＣＲ反応で実行した（ＥＵＢ−Ｌ  （５’−ＣＴＴＴＡＣＧＣＣＣＡＴＴＴＡＡＴＣＣＧ−３’）及びＥＵＢ−Ｒ  （５’−ＡＧＡ−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧ−３’））。ＰＣＲによって、小サブユニット（ｓｓｕ）ｒＲＮＡ遺伝子の３’−端末側終端から得られた〜５００−ｂｐ断片を作り出した（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｋ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２８：  １９４２−１９４６）。５μｌの精製ＤＮＡ溶液に対して、４５μｌのＰＣＲ混合物を添加した（１０μｌ  ２０ｍＭ  デソキシヌクレオチド三リン酸塩貯蔵液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  Ｏｈｉｏ）、５μｌ  １０倍濃縮ＳｕｐｅｒＴａｑ  ＰＣＲ緩衝溶液（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、０．５μｌの両プライマー、２８．９２μｌ蒸留水及び０．０８μｌ  ＳｕｐｅｒＴａｑ  ポリメラーゼ（１５Ｕ／μｌ；ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ））。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間プリサイクル変性ステップ、続いて９４℃（４５ｓ）での３０サイクルの変性、５５℃（４５ｓ）でのアニール及び７２℃（４５ｓ）での伸長を含んだ。コントロールサンプルとして、追加のＤＮＡサンプル無しでの５０μｌのＰＣＲ混合物を平行して行った。その後、ＰＣＲ生成物の１０μｌ部を、エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル上で解析した。電気泳動を０．５Ｘ  ＴＢＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭホウ酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で実行し；ゲルを含水エチジウムブロマイド中で染色し、ＵＶ照射下で撮影した。
【００５８】
（増幅生成物のクローニング）
ＰＣＲ増幅生成物は、尿中に存在していた種々の細菌から生じる１６Ｓ  ｒＤＮＡ断片の混合物を含む。これらの断片を分離するために、クローニング−形質転換ステップを実行した。各々のＰＣＲ生成物の３μｌを、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒでのライゲーションのために使用し、コンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９細胞への熱ショックによって形質転換した。クローンをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ  ａｇａｒプレート上で、３７℃で一晩培養した。形質転換は、ブルーホワイトコロニースクリーニングで確認した。
【００５９】
（シークエンシング）
挿入でプラスミドを含む全てのクローンの、プラスミドを、ＱＩＡｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ，  Ｖｅｎｌｏ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して単離した。サンプルあたり、最大１００クローンを使用した。各々のプラスミド単離に関してシークエンシングＰＣＲを、１６Ｓ  ｒＤＮＡの可変部分に方向付けられたＴ７プライマーで実行した（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）。結果の配列をＢＬＡＳＴデータベースにおけるオリジナルの細菌タイプを同定するために使用した。全ての結果を、解析されたクローンの総数に関連付け、特定の細菌タイプによってあらわされる個体群のパーセンテージを得た。したがって、１００のクローンを解析し、２０がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓに関する配列を得たとき、個体群の２０％がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓである。
【００６０】
我々のＰＣＲ方法は、本人の尿サンプル中におけるバクテリアの個体群の定量分析を得る。定量的データを得る培養物は、感染症の症状がない、これらの女性においては実行されなかった。
【００６１】
（統計）
全ての統計学的検査を、ＰＡＳＷ１７．０プログラム（ＳＰＳＳ）で実行した。グループ内における１回目のサンプルと２回目のサンプルとの間の違いを、ペアスチューデントのｔ検定で、重要性を見つけるために検査した。グループ間の違いを、２つのグループの等分散性での、独立スチューデントのｔ検定で検査した。
【００６２】
予測モデルを、二項回帰分析で得た。
【００６３】
（結果）
（細菌個体群の組成及び安定性）
全ての尿サンプルを、１から１０までの細菌タイプからなる細菌個体群を有していた。表２に、妊娠した１人と、妊娠していない１人との２人の女性に関する結果を示す。発見された細菌の種々のタイプは別として、これらの細菌個体群が、妊娠した又はしていない女性において時間に亘ってどれくらい安定であるかを決定することも、興味深い。安定性の第１の測定は、１回目のサンプルからの、２回目のサンプルで見直される細菌種の数を定性的に見ることです。表２において、これらは、ボールド体の数字で示されている。したがって、妊娠した女性に関して、４つの細菌種類の中から３つ（７５％）が、１６週を超える時間期間に亘って存在したままである(Lactobacillus  crispatus  strain  ZDY35b,  Staphylococcus  aureus  strain  LA14及びPseudomonas  acephalitica、75%重複)。妊娠していない女性において、重複は６０％であった。
【００６４】
安定性に関する第２の測定は、２つのサンプル間のパーセンテージにおける絶対不変重複部分である。妊娠した女性に関して、３７％の個体群が、両方の時間地点に関して確認された（12%  Lactobacillus  crispatus,  15%  Staphylococcus  aureus,  10%  Pseudomonas  acephalitica）。Lactobacillus  crispatusからStaphylococcus  aureusへの大きいシフトが起こった。妊娠していない女性において、７９％の個体群が、ＩＶＦ前後で同一であった。
【００６５】
【表２】
2014522669.tif 000003
この分析を全グループに適用するは、下記のことを示す：
妊娠したグループに関して、細菌種の平均数は、両方のサンプルにおいて４であった。妊娠していないグループに関して、この数は、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ治療前が３であり、後が４であった。妊娠したグループにおいて、平均で、１．９±１．２のバクテリアのタイプが、両方のサンプルで存在していた。妊娠していないグループに関して、その数は、２．１±０．９であった。種々の種は、両方のグループ間で大きくは異ならなかった。
【００６６】
１回目のサンプルと２回目のサンプルとの間の正確な重複は、妊娠したグループにおいてはかなり低く（ｐ＜０．００１）、３７±２３％であり、これは妊娠していないグループの、６８±２４％と比較される。
【００６７】
全体の細菌個体群は、妊娠していない女性において、定性的及び定量的の両方において、安定していた。妊娠した女性において、多くの個々の細菌タイプにおいて、大きいシフトが、既存の個体群内で起こった。このシフトの本質が下記に与えられる。
【００６８】
【表３】
2014522669.tif 000004
2014522669.tif 000005
2014522669.tif 000006
2014522669.tif 000007
2014522669.tif 000008
（細菌のタイプ及び優占種）
全７９において、種々の細菌種が発見され、表３に概観が与えられる。大部分の解析に関して、ＢＬＡＳＴデータバンクにおける、得られたＤＮＡ配列と種特異的配列との間の整合は、９７％を超えた。より低い整合割合が、表に示される。大抵の種は、数サンプルだけに発見された。表４は、細菌種が発見された頻度を示す。
【００６９】
表４  １つ以上のサンプル中に存在する種の数
【００７０】
【表４】
2014522669.tif 000009
Ｎ  ｓａｍｐｌｅｓ＝ある特定の種が存在したサンプルの番号
Ｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｎ  ｓａｍｐｌｅｓが適合する種の番号（したがって、４９の種は、１のサンプルだけに発生し、一方、１の種は、７５のサンプルに発生した）
（少数種）
大抵の種は、ただ１人の女性の、しばしばただ１つのサンプル中で、個体群の１０％より少なく存在した。妊娠したグループにおいて、１９の種が両方の時間地点で発見され（同じ女性でそうとは限らない）、１６が１回目のサンプルに関して固有で、１８が２回目のサンプルに関して固有であった。妊娠していないグループにおいて、１６の細菌種が両方のサンプル中で発生し、１４が１回目のサンプルに関して固有で、２５が２回目のサンプルに関して固有であった。４つの別々のサンプルグループ（妊娠していない、妊娠した、ＩＶＦ／ＩＣＳＩが失敗する前、ＩＶＦ／ＩＣＳＩが失敗した後）に関して、固有の細菌種はなかった。
【００７１】
（多数種）
５つの種が、全ての４つのサンプルグループ内で発生した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、全てのサンプルの大部分で存在していた。Ｅ  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ及びｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅ  ＣＨ９６Ｆｃ＿Ｈ１０は、より少ないサンプルであるが、４つの全てのグループにおいて同様に存在していた。
【００７２】
（優占種（前個体群の最大画分））
４サンプルのグループに関する優占種が示す平均割合は、各々、６７±１６％（妊娠したグループの１回目のサンプル、範囲４８％から１００％まで）、５９±１８％（妊娠したグループの２回目のサンプル、範囲２２％から８８％まで）、５６±１５％（妊娠していないグループの１回目のサンプル、範囲２０％から１００％まで）及び５７±１７％（妊娠していないグループの２回目のサンプル、範囲１８％から１００％まで）。優占種の概観は、表５で与えられる。
【００７３】
【表５】
2014522669.tif 000010
Lc=Lactobacillus  crispatus,  Lcu=Lactobacillus  curvatus  clone  B225,  Li=Lactobacillus  iners,  Lj=Lactobacillus  jensenii  isolate  C72,  Sa=Staphylococcus  aureus,  B  RG4=Bacillus  sp.  RG4,  Bcpb=    Bacillus  sp.  CPB  8,  Msb=  Marine  sediment  bacterium  ISA-3195  ,  S=Sphingomonas  sp.  FL13-1-1,  Cc=  Clostridium  crispatus  cTPY-17  ,  Bc=  Bacillus  clausii  strain  za-w-3,  UbB=  Uncultured  bacterium  clone  Bermudas8-E3,  UbE=    Uncultured  bacterium  clone  E67BE-207  
妊娠したグループにおいて、種々の株のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが、１回目の時間地点で採取された２２のサンプルのうちの２１での及び妊娠中に採取された４つのサンプルでの、優占種であった。妊娠中、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、高頻度の優占種であった。２２人の女性のうち５人において、優占種は、両方のサンプルに関して同じであった。
【００７４】
妊娠していないグループにおいて、１回目のサンプル中の優占種は、２０人の女性のうち１１人に関して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属であった。６つのサンプルにおいて、それはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＡａｕｒｅｕｓであった。優占種は、２０人の女性のうち１６人に関して、両方のサンプルにおいて同じであった。
【００７５】
優占種のタイプに基づくと、細菌個体群は、失敗のＩＶＦ治療（ＩＶＦ治療の効果がない）において安定であり、妊娠中に強い変化を受けるようである。
【００７６】
（妊娠中及びＩＶＦ後の細菌個体群における特性変化）
妊娠中に発生する多数の細菌種のシフトは、主に、６２±２１％から１８±１６％までのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の減少であり（ｐ＜０．０００１）、７±１１％から４１±２９％までのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の増大である（ｐ＜０．０００１）。
【００７７】
妊娠していないグループにおける、２回目のサンプルに対する１回目のサンプルの存在度は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、４０±２７に対する４６±２４、及び、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、３２±２５に対する２７±２２、の両方に関して、変わらなかった。
【００７８】
上記比較に関して、２回目のサンプルの採取の間妊娠していなかったが、１回目のサンプルの採取の後のある別の時間地点で妊娠した７人の女性は、妊娠していないグループに割り当てられた。７人のうち４人は、彼女らの１回目のサンプルにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを有していなかった。２人は、高存在でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを有し、続く第２年又は第３年で妊娠した（１人は流産し、１人は流産し、続いて２年後に自然妊娠に成功した）。７番目の女性は、高存在でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを有し、失敗したＩＣＳＩ、続いて失敗した１回目のＩＶＦ治療、その後、１年以内に自然妊娠した（流産）。
【００７９】
（以前のＵＴＩ又は抗生物質の使用に対する、細菌個体群の関係）
妊娠したグループのうち、５人の女性（２３％）が、過去にＵＴＩを有していたと報告し、２人の女性（９％）が最近抗生物質を使用したと報告した。妊娠していないグループのうち、９人の女性（４５％）が以前にＵＴＩを有し、５人（２５％）が最近抗生物質を使用した。違いは、統計学的には、有意ではなかった。以前のＵＴＩ又は抗生物質の使用を報告した女性における、細菌個体群の組成は、彼女らの各々のグループの別の女性におけるものとは有意に違わなかった。
【００８０】
（ＩＶＦ／ＩＣＳＩの結果に対するＩＶＦ／ＩＣＳＩ前の細菌個体群）
ＩＶＦ／ＩＣＳＩ治療前に得られた尿は、妊娠したグループと比較した妊娠していないグループに関して、より多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属（７±１１％に対する２７±２２％、ｐ＜０．００１）及びより少ないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（６２±２１％に対する４６±２４％、ｐ＜０．００１）を含んだ。
【００８１】
（妊娠した及び妊娠していない女性における、ＵＴＩ及び膣感染症の主原因）
２００９年に、エルビル（クルディスタン地域  イラク）にあるＭａｔｅｒｎｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌに通っている女性に関して、総数５９９の尿培養及び２０６の膣スミア培養が実行された。表６に、妊娠した又は妊娠していない各々である女性に関して、結果を示す。妊娠していない女性において、Ｅ  ｃｏｌｉが、全ての陽性の尿培養物の４４％（７０／１５８）で見受けられ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが２２％（３５／１５８）で見受けられた。妊娠した女性において、Ｅ  ｃｏｌｉが２１％（７５／３５０）で見受けられ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが５０％で見受けられた（１７５／３５０）。
【００８２】
膣スミアに関して、全ての陽性のスミアのうち、Ｅ  ｃｏｌｉが、２９％（２４／８４）で見受けられた病原菌で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが２９％（２５／８４）で見受けられた病原菌であった。妊娠した情勢に関して、前記の数は、Ｅ  ｃｏｌｉに関して３８％（２８／７４）であり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに関して４９％（３６／７４）であった。尿に関して及びより少ない程度で膣スミアに関して、妊娠中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの存在が増大し（ｐ＜０．００１）、Ｅ  ｃｏｌｉの存在が減少する（ｐ＜０．００１）向きへのシフトがあった。
【００８３】
表６
【００８４】
【表６】
2014522669.tif 000011
Ｐｓｅｕｄｏ．＝ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｋｌｅｂ．＝Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ｅｎｔｅｒｏｂ．＝ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ．＝ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓである。
【００８５】
（ＩＶＦ／ＩＣＳＩの成功の見込みに関する予測モデル）
モデルは、１回目の尿サンプルで同定された細菌種の入力で、二項回帰分析によって作られた（ＩＶＦ／ＩＣＳＩ前、ｎ＝４２）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属が、モデルに有意に寄与された。１回眼のＩＶＦ／ＩＣＳＩ後の妊娠の最善予測は、モデルY=  0.030*%Lactobacillus−0.057*%Staphylococcus−1.031で得られた。患者５８が妊娠したグループに割り当てられたとき（彼女は、１回目のサンプルが採取されたころに妊娠した）、方程式はY=0.034*%Lactobacillus−0.064*%Staphylococcus−0.668になり、前記の％は、８６％から９６％まで増大して、妊娠を正しく予測した。１年の予測の間、方程式は、Y=0.051*%Lactobacillus−0.056*%Staphylococcus−1.053になった。表７は、１回目のＩＶＦ／ＩＣＳＩ試みのモデル及び１年期間のモデルに関するクロス集計値を示す。１年期間のモデルにおいて、複数のＩＶＦ／ＩＣＳＩ試みがなされた。
【００８６】
表７
【００８７】
【表７】
2014522669.tif 000012
２つのモデルに関するＲＯＣ曲線は、曲線の下の領域から（０．８１９、１回目の試み及び０．９０１、１年）、１年以内の妊娠が最も良好に予測され得るように見えるということを示す。この１年の予測において、不妊症の原因が、４つの偽陽性予測のうち３つ及び２つの偽陰性予測のうち１つに関して男性であった。４つの偽陽性予測のうち１つ及び２つの偽陰性予測のうち１つに関して、原因は不明であった。
【００８８】
不妊性の下人と我々のモデルの予測力との間に関係性が存在するかどうかのテストのために、我々は、既知の原因の不妊症（ｎ＝３０）及び未知の原因の不妊症（ｎ＝１２）に、女性を細分化した（表８）。
【００８９】
表８
【００９０】
【表８】
2014522669.tif 000013
２回目のサンプルの採取の間、妊娠しなかった女性、ｎ＝２０に関して、新しいＩＶＦ／ＩＣＳＩ試みが開始された。２回目のサンプルに基づいて、これらの女性が、次の１２ヶ月内でのこれらの新しい試みによって妊娠するかどうかを予測するために、１年のモデルを使用した。４人の女性は、その期間に妊娠した（患者１０、１４、１９及び５８）。表９は、モデルによって予測された結果に対する実際の結果を示す。新しい試みによって妊娠がもたらされる予測は、１４／１５（９３％）のケースで正しかった。
【００９１】
表９
【００９２】
【表９】
2014522669.tif 000014
モデルが妊娠の１６番目の週で得られた尿に適用されたとき、モデルは、これらの女性がの誰も、続くＩＶＦ／ＩＣＳＩ治療から妊娠しないであろうと予測した。
【００９３】
（Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔモデル）
予測モデルを検証するために、我々は、Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ手順を適用した。この手順において、モデルは、４１の患者のデータから作られ、このモデルを、無視された患者からの尿データに適用し、この患者がＩＶＦ／ＩＣＳＩの開始の１年内に妊娠するか否かを予測した。結果（表１０）は、全グループの４２で得られた結果と完全に整合する（表７）。
【００９４】
表１０
【００９５】
【表１０】
2014522669.tif 000015
検証グループにおいて、モデルは、２８のうちの２４の妊娠及び１６のうちの１２の失敗を正しく予測した（表１０）。
【００９６】
（既存のモデル（５）に対する比較）
Ｎｅｌｓｏｎからのモデルにおいて、生児出生に関する個々の見込みは、年齢、不妊治療の期間及びいくつかの別の臨床的パラメータに基づいて予測される。我々は、我々の研究グループに関するこれらのデータをモデルに入力し、生児出生が無い女性に対する、１年内での観察された生児出生を有する女性に関するその結果を比較した。予測見込みは、両方のグループに関して違わなかった（ｐ＝０．１８、独立ｔ−検定）。
【００９７】
表１１
【００９８】
【表１１】
2014522669.tif 000016
（例２）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に関するｑＰＣＲ）
例１で示された予測モデルは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ及び存在する細菌の総数の存在に関するデータを使用するので、それら３つの値を測定するために特異的に方向付けられたｑＰＣＲ法を展開することを決定した。
【００９９】
尿サンプルにおいて、ＰＣＲは、一般的なプライマーセット（ＥＵＢ−Ｒ、ＥＵＢ−Ｌ）で実行される。このＰＣＲの生成物は、尿中の全ての細菌から得られる１６Ｓ  ｒＤＮＡの混合物であり、したがって、細菌の総数に関して表現する。
【０１００】
続いて、この全混合物において、ｑＰＣＲが、３つのプライマーセット、一般的なプライマーセット、（複数のタイプの）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関して特異的なプライマーセット及び（複数のタイプの）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに関して特異的なプライマーセットで実行される。
【０１０１】
最初のＰＣＲ生成物の全ＤＮＡ含有量は、ｎａｎｏｄｒｏｐアッセイを介して測定される。この分析におけるＤＮＡは、ほとんど全て、１６Ｓ  ｒＤＮＡを含む。このｎａｎｏｄｒｏｐ分析に基づいて、各々のアッセイにおけるＤＮＡの全量は同じに保たれ得る。
【０１０２】
一般的なプライマーは、全ての１６Ｓ  ｒＤＮＡ断片と反応し、したがって、細菌個体群の１００％を定義するＣＴ値を提示する。一般的なプライマーセットは、また、最初のＰＣＲ生成物の希釈系列に関して検査されるであろう（１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１）。この希釈系列は、各々、全体の約８０％、６０％、４０％、２０％及び１０％のＤＮＡの量と整合するＣＴ値をもたらすであろう。
【０１０３】
特異的なプライマーセットでのｑＰＣＲアッセイは、一般的なプライマーセットで得られたＣＴ値と等しい（もし個体群が１つの種だけを含むなら）又はそれより高い（もし検査された種が、全個体群の一部だけであるなら）ＣＴ値をもたらすであろう。希釈系列に基づいて、パーセンテージが、この特異的なＣＴ値に整合するかが決定され得る。
【０１０４】
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプライマーセット（下記中で公開されるように））：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｌｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｉｌｋ．  Ｒａｓｏｌｏｆｏ  ＥＡ，  Ｓｔ−Ｇｅｌａｉｓ  Ｄ，  ＬａＰｏｉｎｔｅ  Ｇ，  Ｒｏｙ  Ｄ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｍａｒ  ３１；１３８（１−２）：１０８−１８．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊａｎ  ２０）：
順方向（ｎｔ  ６１）プライマー  ５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’
逆方向（ｎｔ  ２４１）プライマー  ５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３
断片サイズ  ２０１ｂｐ
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓプライマーセット（下記中で公開されるように））：
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖａｇｉｎｏｓｉｓ．  Ｍａｒｃｅｌａ  Ｚｏｚａｙａ−Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆｅ，  Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｌｉｌｌｉｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｔｉｎ，  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．  Ｆｅｒｒｉｓ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｍａｙ；  ４８（５）：  １８１２−１８１９；  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０１０  Ｍａｒｃｈ  １９．  ｄｏｉ：  １０．１１２８／ＪＣＭ．００８５１−０９．  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２８６３８７０）
順方向プライマー  ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ
逆方向プライマー  ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月14日(2014.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．尿サンプルを取得するステップ；
ｂ．前記のサンプル中に存在する細菌の総量のパーセンテージとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのグループ、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌の量を決定するステップ；及び
ｃ．前記の細菌間の割合に基づき、妊娠成功の見込みを予測するステップ；
を含む、被験者における妊娠成功又は不成功の見込みを予測する方法。
【請求項２】
前記被験者は、ＩＶＦ又はＩＣＳＩ等の人工授精方法を経ている又はその対象である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓである、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである、
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌の量の測定は、ＰＣＲ、より好ましくはｑＰＣＲによって実行される、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、プライマー５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’及び５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３’を使用して決定される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、プライマー５’−  ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ−３’及び５’−  ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’を使用して決定される、
請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌の量の測定は、質量分析法、より好ましくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって実行される、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
妊娠成功の前記見込みは、式：
Y = a* (%Lactobacillus)−b*(%Staphylococcus)−c
によって決定される、
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
（但し、前記式中、
ａは、０．０２５から０．０５１までの値を有し；
ｂは、０．０４から０．０７までの値を有し；
ｃは、−１．１０から−０．６６までの値を有し；
％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量であり；
％Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、細菌の総量のパーセンテージとして表現される細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量であり；かつ、
Ｙは、成功の見込みを表す。）
【請求項１０】
ａは、０．０２５から０．０４までの値を有する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ｂは、０．０４から０．０６までの値を有する、
請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
ｃは、−１．０６から−０．９までの値、より好ましくは−１．０６から−１．０１までの値を有する、
請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌は、中流の尿サンプル中で検出される、
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記のａのステップは、膣スミア等の膣に関するサンプルを取得するステップである、
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記妊娠成功又は不成功の見込みを予測することは、子宮内の受精卵の安定成功又は不成功の見込みを予測することである、
請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
妊娠成功の見込みを予測するキットであって、
ａ．被験者からのサンプル中の細菌の総量を測定する手段；
ｂ．細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量を測定する手段；
ｃ．細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を測定する手段；
ｄ．請求項８乃至１１のいずれか一項に記載された前記式に従い前記見込みを計算する手段；
を含む、キット。
【請求項１７】
前記細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの量を測定する手段は、プライマー５’−  ＧＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡ−３’及び５’−  ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’を含む、
請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量を測定する手段は、プライマー５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣ−３’及び５’−ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣ−３’を含む、
請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記被験者からのサンプル中の細菌の総量を測定する手段は、細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡに特異的な一般的なプライマーセットを含む、
請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記一般的なプライマーセットは、少なくとも１つの順方向及び少なくとも１つの逆方向ＥＵＢプライマーを含む、
請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記見込みを計算する手段は、前記の測定された細菌値を入力として受け取ることができ、請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の前記式に従い前記見込みを計算するプロセッサを含む、
請求項１６乃至２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記プロセッサは、前記キットを使用する人が読み取ることができるシグナル伝達手段に前記見込みを出力することができる、
請求項２１に記載のキット。
【国際調査報告】
2014522669.tif 000017
2014522669.tif 000018
2014522669.tif 000019