(57)【要約】本発明は、敗血症を有する対象者又は敗血症を有すると疑われる対象者の死亡率及び／又は転帰についての診断、予測、又はリスク層別化の方法に関し、以下のステップを含む：（ａ）前記対象者から採取したサンプル中のアンチトリプシン（ＡＴＴ）又はその断片の存在及び／又はレベルを決定するステップ並びに／あるいはトランスサイレチン（ＴＴＲ）又はその断片の存在及び／又はレベルを決定するステップ、（ｂ）その場合、ＡＴＴ及び／又はＴＴＲ又はそれらの断片の存在及び／又はレベルは、死亡リスク増大と相関しており、かつ（ｃ）ＡＴＴの前記レベルがあるカットオフ値未満である場合及び／又はＡＴＴの断片の前記レベルがあるカットオフ値を超えている場合に、死亡リスク増大及び／又は予後不良と決定するステップ、並びに／あるいは（ｄ）ＴＴＲの前記レベルがあるカットオフ値未満である場合及び／又はＴＴＲの断片の前記レベルがあるカットオフ値未満である場合に、死亡リスク増大及び／又は予後不良と決定するステップ。本発明は、一般に、敗血症診断のためのＡＴＴ及び／又はＴＴＲ又はそれらの断片の使用に関し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２ないし１４のヌクレオチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症を有する対象者又は敗血症を有すると疑われる対象者の死亡率又は転帰についての診断、予測、又はリスク層別化の方法であって、下記の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む及び／又は下記の（ｄ）〜（ｆ）のステップを含む方法：
（ａ）前記対象者から採取したサンプル中のアンチトリプシン（ＡＴＴ）又はその断片のレベルを決定するステップ、
（ｂ）但し、ＡＴＴ又はその断片の前記レベルが、死亡リスク増大又は予後不良と相関しており、かつ
（ｃ）ＡＴＴの前記レベルが、あるカットオフ値未満である場合及び／又はＡＴＴの断片の前記レベルが、あるカットオフ値を超えている場合に、死亡リスク増大又は予後不良と決定するステップ；
（ｄ）前記対象者から採取したサンプル中のトランスサイレチン（ＴＴＲ）又はその断片のレベルを決定するステップ、
（ｅ）但し、ＴＴＲ又はその断片の前記レベルが、死亡リスク増大又は予後不良と相関しており、かつ
（ｆ）ＴＴＲ又はその断片の前記レベルが、あるカットオフ値未満である場合に、死亡リスク増大又は予後不良と決定するステップ。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＡＴＴ又はその断片の前記レベル及び／又はＴＴＲ又はその断片の前記レベルが、死亡又は転帰についての予測又はリスク層別化と、以下の選択肢から選択される方法によって好ましくは相関している，方法：
（ａ）所定のサンプルの集合体におけるレベルの中央値に関する相関付け、
（ｂ）所定のサンプルの集合体におけるレベルの変位量に関する相関付け、及び
（ｃ）例えば、Ｃｏｘ回帰モデル等の数学的モデルによる相関付け。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）ＡＴＴの前記レベルの前記カットオフ値が約２ｇ／Ｌであって、分析対象の患者に応じて約２０%だけ偏位可能であり；
（ｂ）ＴＴＲの前記レベルの前記カットオフ値が約１０ｍｇ／ｄＬであって、分析対象の患者に応じて約２０%だけ偏位可能である、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ＡＴＴ又はその断片の前記レベル及び／又はＴＴＲ又はその断片の前記レベルが、
（ａ）ＡＴＴについては、正常集団の中央値より低いため、
（ｂ）ＡＴＴの断片については、正常集団の中央値を超えているため、及び
（ｃ）ＴＴＲ又はその断片については、正常集団の中央値より低いために、
死亡についてのリスク増大と相関している、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、下記の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む及び／又は下記の（ｄ）〜（ｆ）のステップを含む方法：
（ａ）対象者からサンプルを採取するステップ、
（ｂ）ＡＴＴ又はその断片のレベルを決定するステップ、及び
（ｃ）ＡＴＴ又はその断片の前記レベルと、死亡又は生存の変位量毎のリスクを相関させるステップ；
（ｄ）対象者からサンプルを採取するステップ、
（ｅ）ＴＴＲ又はその断片のレベルを決定するステップ、及び
（ｆ）ＴＴＲ又はその断片の前記レベルと、死亡又は生存の変位量毎のリスクを相関させるステップ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、サンプルが下記の時点で１回又は複数回採取される、方法：対象者が医療施設又は救急車に初めて収容される時、対象者が緊急治療室に入る時、対象者が集中治療室に入る時、治療前、治療開始後、治療開始から２４時間後、治療開始から４８時間後及び／又は治療開始から７２時間後。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記対象者が、敗血症様感染症の先行状態、敗血症様感染症の進行状態、重度敗血症、及び敗血症性ショックを含む群から選択される状態の下にある、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記対象者の死亡又は転帰についての予測又はリスク層別化に加え、前記対象者から採取されたサンプル中でのＡＴＴ又はその断片の前記レベル及び／又はＴＴＲ又はその断片の前記レベルの決定が、前記対象者が全身性炎症（ＳＩＲＳ）、初期敗血症、重度敗血症、又は敗血症性ショックを有する可能性があるかについての鑑別診断に用いられる、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルが、血漿サンプル、血清サンプル、全血サンプル、血液サンプル又はその画分、リンパ液サンプル、尿サンプル、並びに前記サンプルのいずれかからの抽出物を含む群から選択される、方法。
【請求項１０】
敗血症又は敗血症様疾患を有する対象者において、ある薬剤に対する反応をモニターリングすることにより、前記疾患の重症度に関する個別の患者の療法に関して、医学的決定をおこなう方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）のステップを含む及び／又は下記の（ｅ）〜（ｈ）のステップを含む方法：
（ａ）以下の群から選択される様々な時点で前記患者から少なくとも二つのサンプルを採取するステップ、
ｉ．    治療開始前、
ｉｉ．  治療開始後、及び／又は
ｉｉｉ．一つ又は複数の他の時点、
（ｂ）前記サンプル中のＡＴＴ又はその断片のレベルを決定するステップ、
（ｃ）前記サンプル中のＡＴＴ又はその断片の前記レベルと、前記ある薬剤への陽性又は陰性反応とを関連付けるステップ、及び
（ｄ）薬剤治療中にＡＴＴの前記レベルが増大する場合及び／又は薬剤治療中にＡＴＴの断片の前記レベルが低減する場合に、陽性反応と認めるステップ；
（ｅ）以下の群から選択される様々な時点で前記患者から少なくとも二つのサンプルを採取するステップ、
ｉ．    治療開始前、
ｉｉ．  治療開始後、及び／又は
ｉｉｉ．一つ又は複数の時点、
（ｆ）前記サンプル中のＴＴＲ又はその断片のレベルを決定するステップ、
（ｇ）前記サンプル中のＴＴＲ又はその断片の前記レベルと、前記ある薬剤への陽性又は陰性反応とを関連付けるステップ、及び
（ｈ）前記薬剤による治療中にＴＴＲ又はその断片の前記レベルが増大する場合に、陽性反応と認めるステップ。
【請求項１１】
対象者における疾患を鑑別診断する方法であって、前記疾患が、（ｉ）全身性炎症（ＳＩＲＳ）、（ｉｉ）初期敗血症、（ｉｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｖ）敗血症性ショックを含む群から選択され、下記の（ａ）〜（ｄ）のステップを含む及び／又は下記の（ｄ）〜（ｆ）のステップを含む方法：
（ａ）前記対象者から採取したサンプル中のＡＴＴ又はその断片のレベルを決定するステップ、
（ｂ）ＡＴＴ又はその断片の前記レベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとを関連付けるステップ、及び
（ｃ）但し、ＡＴＴの前記レベルがあるカットオフ値未満である場合及び／又はＡＴＴのタンパク質分解断片の前記レベルがあるカットオフ値を超えている場合に、ＡＴＴ又はその断片の前記レベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとの関連性を認めるステップ；
（ｄ）前記対象者から採取したサンプル中のＴＴＲ又はその断片のレベルを決定するステップ、
（ｅ）ＴＴＲ又はその断片の前記レベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとを関連付けるステップ、及び
（ｆ）但し、ＴＴＲ又はその断片の前記レベルがあるレベル未満である場合に、ＴＴＲ又はその断片の前記レベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとの関連性を認めるステップ。
【請求項１２】
敗血症患者における敗血症診断用の又はその予後予測用のキットであって、以下を含むキット：
（ａ）ＡＴＴ又はその断片及び／又はＴＴＲ又はその断片に対して特異性の抗体、及び
（ｂ）サンプルに含まれるＡＴＴ又はその断片のレベルと予後との相関関係を示す標準データ及び／又はＴＴＲ又はその断片のレベルと予後との相関関係を示す標準データ、及び任意選択で
（ｃ）マニュアル。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の内のいずれか一つの配列を有する、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
請求項１３に記載の及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドの敗血症診断法における、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野に関し、詳細には診断に関し、より詳細には敗血症の診断及び予後診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、感染性合併症の診断に関する。用語の「敗血症」は、感染に伴う炎症性全身症状に関係する様々な臨床状態を指す。非感染性病因に続発する炎症反応に臨床状態が類似しているため、敗血症の同定は、特に困難な診断上の問題である。これに関して、一般的に感染性病因又は非感染性病因に対する重度の全身性反応を意味する「全身性炎症反応症候群（即ち「ＳＩＲＳ」）」、並びに関連する症候群である、「敗血症」、「重症敗血症」、及び「敗血症性ショック」の定義が、示されている（非特許文献１）。ＳＩＲＳは、感染、並びに、心的外傷を含む、数多くの非感染性病因の双方に、関係している可能性がある。
【０００３】
抗生物質及び支持療法が適用可能ではあるが、敗血症は、著しく高い罹患率及び死亡率を示す。敗血症の診断／予後診断のための、対象者の完全な臨床検査と併用する、いくつかの実験的検査法の使用が検討されている（非特許文献２）。
【０００４】
ヒトにおける敗血症及び数種の動物における敗血症の診断、治療、及びモニターリングを容易にするいくつかの分子マーカーが検討されている。それらの内、最も幅広く用いられているのが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びプロカルシトニン（ＰＣＴ）である。
【０００５】
様々なインターロイキン類も、敗血症のバイオマーカーの可能性があるとして検討されている。しかし、特異性に欠けるため、現状では使用が限定されている。例えば、Ｃａｒｒｉｇａｎらは、ヒトにおけるこれらのマーカーの下記のような感度及び特異度を、報告している（非特許文献３）。
【表１】
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この概要は、欧州特許出願公開第２０６０９２０Ａ１号明細書に記載されている。
【０００６】
これらのデータは、現在公表されているデータの均質性はさておき、敗血症の病型が幅広く検討されてきている、ヒトにおいても、現在のマーカーの感度及び特異度が（平均値としても）それぞれ３３%及び６１%にまで低くなり得ることを示している。
【０００７】
これらのデータは、改善された診断特性を有する新たな診断マーカーが明らかに必要であることを、示している。そのため、敗血症の診断、特に敗血症の早期診断が臨床医療において大いに必要とされている。敗血症を発症するリスクのある者又は敗血症の早期段階にある者を明らかにすることが、最適な診断である。特に、全身性炎症において、即ち、多発性傷害患者においては、集中治療医学で通常測定される「正常な」生理学的値が他の病的過程により干渉されるため、そのような最適な診断は多くの場合非常に困難である。
【０００８】
全身性炎症の患者における、例えば、多発性傷害を併発している患者における敗血症の診断は、集中治療医学において高度に必要とされる、非常に特異的な問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、高感度でおよび／または高特異度で敗血症を診断する好適な方法を提供することである。
【００１０】
定義
用語の「敗血症」又は「感染性合併症」は、本願において、同義語として使用され、全ての症状が感染を伴う炎症の全身症状に関係している、「敗血症」、「感染性合併症」、「重症敗血症」、「敗血症性ショック」、並びにそれらの早期段階を包含すると、理解される。
【００１１】
本明細書において、「全身性炎症反応症候群（即ち「ＳＩＲＳ」）」は、下記条件の内の二つ以上を呈する、様々な重度の臨床的な病因に対する全身性炎症反応と、定義される：１）体温>３８℃又は<３６℃；２）脈拍数>９０回／分；３）呼吸数>２０回／分又はＰａＣＯ２<３２ｍｍＨｇ；及び４）白血球数>１２，０００／ｍｍ3又は<４，０００／ｍｍ3、或いは未熟顆粒球（集団）>１０%。確認された感染過程の結果がＳＩＲＳである場合、敗血症と呼ばれる（非特許文献３）。
【００１２】
本明細書において、「α−１−アンチトリプシン」は、アンチトリプシン及び「ＡＴＴ」とも呼ばれる。アルファ−１−アンチトリプシン又はα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）は、セルピン・スーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。一般に、血清トリプシン阻害剤として知られている。α−１−アンチトリプシンは、幅広いプロテアーゼを阻害するため、α−１−プロテアーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも呼ばれる。α−１−アンチトリプシンは、炎症性細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから、組織を保護し、１．５〜３．５ｇ／Ｌの血中基準範囲を有しているが、その濃度は、急性炎症の際に何倍にも上昇し得る。α−１−アンチトリプシンが存在していない場合、好中球エラスターゼがフリーとなって、肺の弾性に寄与しているエラスチンを分解し、成人における肺気腫又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の呼吸器合併症、並びに成人又は児童における肝硬変を生じる。
【００１３】
本明細書において、「トランスサイレチン」（ＴＴＲ）は、甲状腺ホルモンのチロキシン（Ｔ４）及びレチノールの血清担体及び脳脊髄液担体である。チロキシン及びレチノールを輸送するため、トランスサイレチンという名前になった。ＴＴＲは、電気泳動ゲル上でアルブミンより早く走行するため、当初はプレアルブミンと呼ばれた。ＴＴＲの識別ピークは、１３．８ｋＤａにあって、特許請求される方法及びキットとの関連で請求されている。
【００１４】
本発明の文脈において、用語の「閾」、「閾値」、「カットオフ」、及び「カットオフ値」は、同義的に用いられる。
【００１５】
診断マーカー及び予後診断マーカーの使用に関連して本明細書で用いられる場合、用語の「相互関係を示すこと」は、患者におけるマーカーの存在及び量を、所定の条件にさらされていると知られている、又はさらされるリスクがあると知られている者における、あるいは所定の条件がないと知られている者における、その存在又は量と比較することを、意味する。上記のように、ある患者のサンプルにおけるマーカーのレベルは、特定の診断に関連すると知られているレベルと比較可能である。サンプルのマーカーのレベルは、診断と相互関係を示すと言われており、すなわち、当業者なら、そのマーカーのレベルを用いて、患者が特定の診断を受けるか否か、したがって対応するか否かを、決定することができる。あるいは、サンプルのマーカーのレベルを、良好な転帰（例えば、疾患が存在しない等々）と関連していると知られているマーカーのレベルと比較することができる。好ましい実施形態において、マーカーレベルの分析結果は、広範な可能性又は特定の転帰と相関付けられる。
【００１６】
「予後診断」は、所定の経過又は転帰が生ずる可能性の指定を、意味する。予後診断は、一つ又は複数の「予後指標」の検査によって決定されることが多い。予後指標はマーカーであって、患者における（あるいはその患者から得られたサンプルにおける）その存在又は量は、所定の経過又は転帰が生ずる可能性を示す。例えば、一つ又は複数の予後指標が、患者から得られたサンプルにおいて十分高いレベルに達する場合、そのレベルは、その患者が最終的に末期腎不全（ＥＳＲＤ）まで進行する可能性が高いこと、すなわち、その患者が「疾患進行者」である可能性が高いことを、示すことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、敗血症を有する又は有すると疑われる対象者の死亡率及び／又は転帰についての診断、予測、又はリスク層別化の方法に関し、以下を含む：
・前記対象者から採取したサンプル中のアンチトリプシン（ＡＴＴ）又はその断片の決定並びに／あるいはトランスサイレチン（ＴＴＲ）又はその断片の存在及び／又はレベルの決定、
・ＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片の存在及び／又はレベルが、死亡及び／又は不良転帰の増大したリスクと相関しているとの決定；並びに
・ＡＴＴ（成熟断片；５５ｋＤａ）の存在及び／又はレベルが特定のカットオフ値未満である及び／又はそれらの断片のレベルが特定のカットオフ値を超えている場合に、前記死亡及び／又は不良転帰の増大したリスクがもたらされるかの決定並びに／あるいは
・ＴＴＲの存在及び／又はレベルが特定のカットオフ値未満である及び／又はそれらの断片のレベルが特定のカットオフ値未満である場合に、前記死亡及び／又は不良転帰の増大したリスクがもたらされるかの決定。
【００１８】
前記断片は、図９に示されている断片である。
【００１９】
本発明は、一般に、ＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片の敗血症診断のための使用にも関している。
【００２０】
多くのプロテアーゼは、α−１−アンチトリプシンを活性な中心ループにおいてＣ−末端で消化する。α−１−アンチトリプシンの断片が生成される（各図参照）。表面増強型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）は、本発明の文脈におけるこれらの断片の分析用の及び／又は存在及び／又はレベルの決定用の一つの方法として請求されている。
【００２１】
感染性敗血症又はＳＩＲＳの２４０名の患者を分析した。本発明により主張されるように、４７８９．７Ｄａのα−１−アンチトリプシンの断片が、一般にＳＩＲＳと敗血症を識別するマーカーとして、認められた。
【００２２】
本発明による方法は、診断される個人／患者／対象者についてのマーカーのレベルを事前に設定される値と比較することも含んでいる。この事前設定される値は、様々な形式であることができる。事前設定される値は、単にカットオフ値であることができる。事前設定される値は、例えば、対照集団の中央値又は平均値あるいは７５パーセンタイル、９０パーセンタイル、９５パーセンタイル、又は９９パーセンタイルであることができる。事前設定される値は、例えば、「最適」カットオフ値であることができる。あるマーカーについての最適カットオフ値は、このマーカーについて診断感度及び診断特異度が最高である場合の値である。診断感度は、その疾患に罹患している患者又はその疾患を発症するリスクを有する患者によって異なり（具体的なケースで答えを出すべき診断又は予後診断による）、マーカーによってその疾患があるとして精確に検知され（「真の陽性」）、また診断特異度は、その疾患に罹患している患者又はその疾患を発症するリスクを有する患者によって異なり（具体的なケースで答えを出すべき診断又は予後診断による）、マーカーによってその疾患がないとして精確に検知される（「真の陰性」）。事前設定される値は、臨床的必要性又は経済的必要性に応じて、最適化されたカットオフ値による、最大陰性予測値又は最大陽性予測値であることができる。それにより、感度及び特異度も最適化される。
【００２３】
上記のように、「偽陽性」判定の危険をおかしてもリスクのある対象者をより多く同定するのがより適切であると考えるか、あるいは中等度のリスクの対象者を見逃す危険をおかしても主に高いリスクの対象者を同定するのがより適切であると考えるかによって、採用されるカットオフ値が異なる。事前設定される値は、比較される群、例えば、ある群におけるリスクが他の群の２倍である等、に応じて設定できる。比較される群に幅を持たせることができ、例えば、被試験集団を、低リスク群、中間リスク群、及び高リスク群等の群に分割する、あるいは、最低リスクの者に最低の変位量、最高リスクの者に最高の変位量を割り付けることができる。
【００２４】
事前設定される値は、彼らの習慣、民族性、遺伝的特徴等に基づいて選択される、特定の対照集団の間で、変わり得る。したがって、事前設定される値は、ある個人が該当するカテゴリーを考慮して選択できる。好適な幅及びカテゴリーは、通常の実験の範囲内で当業者が選定できる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、あるパネル内の一つ又は複数のマーカー用の特定の閾値によらず、対象者から得られるマーカーレベルの分析結果が特定の診断／予後診断を示すか否かが決定される。むしろ、本発明は、統一された全体としてのマーカーパネル「特性」の評価を利用できる。そのようなマーカーパネルにおける特定の「明確な」変化パターンは、実際に、固有の診断指標又は予後診断指標として機能できる。上記のように、そのような変化パターンは、単一サンプルから、あるいはパネルの単一又は複数のメンバーにおける（又はパネルに対応する値における）経時的な変化から、得られる。本明細書において、パネルは、マーカーの組合せを意味する。本明細書において、既知のマーカーの内の一つをＡＴＴ及び／又はＴＴＲと組み合わせることができる。
【００２６】
パネルに対応する値は、様々な方法で入手可能である。その一例は、Ｃｏｘ比例ハザード解析法である。もう一つの例は、ＲＯＣ曲線最適化法である。ＲＯＣ曲線最適化は、特定のマーカーパネルの感度対そのパネルの１−（特異度）のＲＯＣ曲線を様々なカットオフ値でプロットすることで達成できる。
【００２７】
これらの方法において、対象者からのマーカー測定値の分析結果は、全体で、診断又は予後診断の広範囲な可能性（数値スコアとして又は危険率としてのいずれかで表される）を提供すると考えられる。そのような実施形態において、マーカーのあるサブセットにおける増大は、ある患者における特定の診断／予後診断を示すのに十分であり得て、一方、マーカーの異なるサブセットにおける増大は、別の患者における同一の又は異なる診断／予後診断を示すのに十分であり得る。重み付け係数も、パネル内の一つ又は複数のマーカーに適用可能であって、例えば、あるマーカーが特定の診断／予後診断の同定に特に高い有用性を示す場合には、そのマーカーは、そのマーカーが所定のレベルにあるだけで陽性の結果を示すのに十分なほどに、重み付けられ得る。同様に、重み付け係数は、特定のマーカーが所定のレベルにないだけで陽性の結果を示すのに十分なほどに、重み付けられ得るが、他のマーカーもその分析に寄与する場合、ある結果のみを示す。
【００２８】
いくつかの実施形態において、マーカー及び／又はマーカーパネルは、少なくとも約７０%の感度、より好ましくは少なくとも約８０%の感度、さらにより好ましくは少なくとも約８５%の感度、その上より好ましくは少なくとも約９０%の感度、最も好ましくは少なくとも約９５%の感度を、少なくとも約７０%の特異度、より好ましくは少なくとも約８０%の特異度、さらにより好ましくは少なくとも約８５%の特異度、その上より好ましくは少なくとも約９０%の特異度、最も好ましくは少なくとも約９５%の特異度との組合せで示すために、選択される。特に好ましい実施形態において、感度及び特異度は双方とも、少なくとも約７５%、より好ましくは少なくとも約８０%、さらにより好ましくは少なくとも約８５%、その上より好ましくは少なくとも約９０%、最も好ましくは少なくとも約９５%である。この文脈において、用語の「約」は、所与の測定値の+／-５%を意味する。
【００２９】
他の実施形態において、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、又はハザード比は、リスクを予測する又はある疾患を診断する、ある試験の能力の指標として使用される。陽性尤度比の場合、１という値は、「疾病」群及び「対照」群双方の被験者間で陽性結果が等しく生じることを示し、１を超える値は、陽性結果が疾病群においてより生じやすいことを示し、１未満の値は、陽性結果が対照群においてより生じやすいことを示す。陰性尤度比の場合、１という値は、「疾病」群及び「対照」群双方の被験者間で陰性結果が等しく生じることを示し、１を超える値は、陰性結果が疾病群においてより生じやすいことを示し、１未満の値は、陰性結果が対照群においてより生じやすいことを示す。いくつかの好ましい実施形態において、マーカー及び／又はマーカーパネルは、少なくとも約１．５以上又は約０．６７以下、より好ましくは少なくとも約２以上又は約０．５以下、さらにより好ましくは少なくとも約５以上又は約０．２以下、その上より好ましくは少なくとも約１０以上又は約０．１以下、最も好ましくは少なくとも約２０以上又は約０．０５以下の陽性尤度比又は陰性尤度比を示すように選択されることが好ましい。この文脈において、用語の「約」は、所与の測定値の+／-５%を意味する。
【００３０】
オッズ比の場合、１という値は、「疾病」群及び「対照」群双方の被験者間で陽性結果が等しく生じることを示し、１を超える値は、陽性結果が疾病群においてより生じやすいことを示し、１未満の値は、陽性結果が対照群においてより生じやすいことを示す。いくつかの好ましい実施形態において、マーカー及び／又はマーカーパネルは、少なくとも約２以上又は約０．５以下、より好ましくは少なくとも約３以上又は約０．３３以下、さらにより好ましくは少なくとも約４以上又は約０．２５下、その上より好ましくは少なくとも約５以上又は約０．２以下、最も好ましくは少なくとも約１０以上又は約０．１以下のオッズ比を示すように選択されることが好ましい。この文脈において、用語の「約」は、所与の測定値の+／-５%を意味する。
【００３１】
ハザード比の場合、１という値は、「疾病」群及び「対照」群双方の被験者間である評価項目（例えば、死亡）の相対リスクが等しく生じることを示し、１を超える値は、リスクが疾病群においてより生じやすいことを示し、１未満の値は、リスクが対照群においてより生じやすいことを示す。いくつかの好ましい実施形態において、マーカー及び／又はマーカーパネルは、少なくとも約１．１以上又は約０．９１以下、より好ましくは少なくとも約１．２５以上又は約０．８以下、さらにより好ましくは少なくとも約１．５以上又は約０．６７下、その上より好ましくは少なくとも約２以上又は約０．５以下、最も好ましくは少なくとも約２．５以上又は約０．４以下のハザード比を示すように選択されることが好ましい。この文脈において、用語の「約」は、所与の測定値の+／-５%を意味する。
【００３２】
当業者なら、診断指標又は予後指標と、診断又は将来の臨床的転帰の予後リスクとの関連付けが統計的解析法によることを、理解するであろう。例えば、あるマーカーのレベルがＸを超えることは、統計的有意性のレベルによって決定されるように、そのレベルがＸ以下の患者よりその患者が不良な転帰を被りやすいことを、示し得る。また、マーカー濃度のベースラインレベルからの変化は、患者の予後を反映する可能性があり、マーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連する可能性がある。統計的有意性は、二つ又はそれ以上の集団の比較により、並びに信頼区間及び／又はｐ値の決定により、決定されることが多い。例えば、非特許文献４を参照されたい。本発明の好ましい信頼区間は、９０%、９５%、９７．５%、９８%、９９%、９９．５%、９９．９%、及び９９．９９%であり、一方、好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。
【００３３】
さらに他の実施形態において、診断マーカー又は予後診断マーカーの多重決定をなし得て、かつマーカーにおける経時変化は、診断又は予後診断の決定に使用可能である。例えば、対象者のサンプル中のマーカー濃度は、最初に決定でき、二度目の対象者のサンプルから二度目に再度決定できる。そのような実施形態において、マーカー濃度における初回から二回目への増大は、特定の診断又は特定の予後を示す可能性がある。同様に、マーカー濃度における初回から二回目への低減は、特定の診断又は特定の予後を示す可能性がある。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語の「サンプル」は、患者等の、対象者の診断、予後診断、又は評価の目的で得られる、体液のサンプルを意味する。好ましい検査サンプルには、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、及び胸水が含まれる。また、当業者なら、分別操作又は精製操作、例えば、全血の血清成分又は血漿成分への分離、の後でいくつかの検査サンプルの分析がより容易になることを、理解するはずである。
【００３５】
このように、本発明の方法の好ましい実施形態において、前記サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、及び尿サンプル、又は前記サンプルのいずれかからの抽出物を含む群から選択される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、ＡＴＴ及び／又はＴＴＲ又はそれらの断片のレベルは、好ましくは、下記の選択肢の群から選択可能な方法により、死亡及び／又は転帰についての予測又はリスク層別化と関連付けられ得る：
・事前に決定されたサンプルの集合体におけるＡＴＴ及び／又はその断片のレベルの中央値に関する関連付け、
・事前に決定されたサンプルの集合体におけるＡＴＴ及び／又はその断片のレベルの変位値に関する関連付け、及び
・例えば、Ｃｏｘ回帰モデル等の数学的モデルによる相関付け。
【００３７】
好ましくは、ＡＴＴのカットオフ値は、約２ｇ／Ｌであって、分析対象の患者に応じて約５%、１０%だけ、あるいは２０%も偏位可能である。
【００３８】
好ましくは、ＡＴＴの断片のカットオフ値は、例えば、断片４７８９．７（表３のＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１０、ＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱＫ）については２０ｎｇ／μＬに相当する、約４．１８ｐｍｏｌ／μＬであり、かつ断片５０ｋＤ（４．１８ｐｍｏｌ／μＬ）は、分析対象の患者に応じて約５%、１０%だけ、あるいは２０%偏位可能である。
【００３９】
ＴＴＲのカットオフ値は、約１０ｍｇ／ｄＬ（表４参照）であって、分析対象の患者に応じて約５%、１０%だけ、あるいは２０%も偏位可能である。
【００４０】
本発明によれば、死亡の増大したリスクと相関している、ＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片のレベルは、下記のいずれかである：
・ＡＴＴについて、正常集団の中央値より低い、及び／又は
・ＡＴＴの断片について、正常集団の中央値より高い、及び／又は
・ＴＴＲについて、正常集団の中央値より低い。
【００４１】
請求される方法は、下記のステップをさらに含むことができる：
・対象者からサンプルを採取するステップ、及び／又は
・ＡＴＴ又はその断片のレベルを決定するステップ、及び／又は
・ＴＴＲ又はその断片のレベルを決定するステップ、及び／又は
・ＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片のレベルと、死亡のリスク又は生存の変位値とを関連付けるステップ。
【００４２】
本発明は、下記の時点の内の一つ又は複数においてサンプルが採取される、方法に関する：対象者が医療施設又は救急車に初めて収容される時、対象者が緊急治療室に入る時、対象者が集中治療室に入る時、治療前、治療開始前、治療開始から２４時間後、治療開始から４８時間後、及び／又は治療開始から７２時間後、並びに／あるいはそれらから１０日後、１４日後等、さらには２０日後。
【００４３】
前記対象者は、抗菌療法を必要とする感染症；敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック等の感染症の進行した状態を含む群から選択される状態にある。
【００４４】
前記対象者の死亡及び／又は転帰についての予測又はリスク層別化に加えて、対象者から採取されたサンプル中のＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片のレベルの決定は、本発明において、対象者が全身性炎症（ＳＩＲＳ）、初期敗血症、重度敗血症、又は敗血症性ショックを有する可能性があるかについての鑑別診断に用いられる。
【００４５】
前記サンプルは、好ましくは、血漿サンプル、血清サンプル、全血サンプル、血液サンプル又はその画分、リンパ液サンプル、尿サンプル、並びに前記サンプルのいずれかからの抽出物を含む群から選択される。
【００４６】
ＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片のレベルは、好ましくは、ＥＬＩＳＡ又は質量分析法又は表面増強型レーザー脱離イオン化・飛行時間型・質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の診断検査により決定される。
【００４７】
本発明は、以下のステップを含む、敗血症を有する対象者又は敗血症様疾患を有する対象者において、ある薬剤に対する反応をモニターリングすることにより、前記疾患の重症度に関する個別の患者の療法に関して、医学的決定をおこなう方法に関する：
・  以下の群から選択される様々な時点で前記患者から少なくとも二つのサンプルを採取するステップ、
ｉ．    治療開始前、及び／又は
ｉｉ．  治療開始後、及び／又は
ｉｉｉ．一つ又は複数の他の時点、
・前記対象者から採取された前記サンプル中のＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片のレベルを決定するステップ、
・前記対象者から採取された前記サンプル中のＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片のレベルと、前記ある薬剤に対する陽性又は陰性反応とを関連付けるステップ。
【００４８】
前記陽性反応は、前記薬剤による治療中にＡＴＴのレベルが増大する場合及び／又は前記薬剤による治療中にＡＴＴの断片のレベルが低減する場合、並びに／あるいは前記薬剤による治療中に、ＴＴＲ又はその断片のレベルが低減する場合に、認められる。
【００４９】
本発明は、好ましくは、以下のステップを含む、ある対象者における疾患の重症度に関する個別の患者の療法についての医学的決定をおこなう方法に関する：
・以下の群から選択される様々な可能な時点で前記患者から少なくとも一つのサンプルを採取するステップ、
ｉ．    治療開始前、及び／又は
ｉｉ．  治療開始後、及び／又は
ｉｉｉ．一つ又は複数の他の時点、
・前記対象者から採取された前記サンプル中のＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片のレベルを決定するステップ、
・前記対象者から採取された前記サンプル中のＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片のレベルと、ある治療の必要性とを関連付けるステップ。
【００５０】
ＡＴＴ又はその断片のレベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとの関連性は、ＡＴＴのレベルがあるカットオフ値より低い場合及び／又はＡＴＴのタンパク質分解断片のレベルがあるカットオフ値より高い場合に認められ、並びに／あるいは、ＴＴＲ又はその断片のレベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとの関連性は、ＴＴＲ又はその断片のレベルがあるカットオフ値より低い場合に認められる。
【００５１】
本発明は、好ましくは、対象者におけるある疾患を鑑別診断する方法であって、前記疾患が、（ｉ）全身性炎症（ＳＩＲＳ）、（ｉｉ）初期敗血症、（ｉｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｖ）敗血症性ショックを含む群から選択され、以下のステップを含む方法に関する：
（１）前記対象者から採取されたサンプル中のＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片のレベルを決定するステップ、及び
（２）ＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片の存在及び／又は前記レベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとを関連付けるステップ、
（３）但し、前記ＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片の存在及び／又はレベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとの関連性は、ＡＴＴの前記レベルがあるカットオフ値より低い場合及び／又はＡＴＴのタンパク質分解断片の前記レベルがあるカットオフ値より高い場合に認められ、並びに／あるいは
（４）前記ＡＴＴ及び／又はＴＴＲあるいはそれらの断片の存在及び／又はレベルと、（ｉ）初期敗血症、（ｉｉ）重度敗血症、又は（ｉｉｉ）敗血症性ショックとの関連性は、ＴＴＲの前記レベルがあるカットオフ値より低い場合に認められる。
【００５２】
また、本発明は、敗血症患者における敗血症診断用及び／又はその予後予測用のキットであって、ＡＴＴ又はその断片並びに／あるいはＴＴＲ又はその断片に対して特異的である抗体、アプタマー、又は他の標的特異的分子；サンプルに含まれるＡＴＴ又はその断片の量と、予後との相関関係を示す標準データ、並びにマニュアルを含むキットに関する。
【００５３】
また、本発明は、敗血症患者における敗血症診断用及び／又はその予後予測用のＬＣ−ＭＳ／ＭＳキットであって、ＡＴＴ、ＴＴＲ、又はそれらの断片が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって再保証されるキットに関する。これらは、標準データセットと比較される。
【００５４】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のタンパク質が検知される。上記及び下記の概略のように、敗血症において、完全長タンパク質のその断片に対する比は、下記の変化を示した。
【００５５】
【表２】
2014533368.tif 000003
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、リーダーを欠く上記のタンパク質であって、下記の配列を有する：
2014533368.tif 000004
【００５６】
【表３】
2014533368.tif 000005
表３は、完全長タンパク質の断片を示す。この表においては、前記断片が、敗血症の診断／予後診断においてのおおよその好ましさ別に分類されている（等級１は、非常に好ましく、等級６は、好ましい）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、上記の方法用に最も好ましく使用される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、非常に好ましく使用可能である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及び／又は７は、好ましく使用可能である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及び／又は８は、使用可能である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１、２、６、９、１１、１２、及び１３も、使用可能である。
【００５７】
上記の方法において、一つ又は複数の前記断片が検知され得る。上記の断片のいずれの組合せも本明細書に開示されており、当業者なら可能なように全てを書き留めることなく、請求されている。
【００５８】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の内のいずれか一つを有するポリペプチドにも関する。
【００５９】
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含される。
【００６０】
本発明が、列挙された前記バイオマーカーの断片の決定を含む方法に関するため、本発明は、これらの断片を特異的に検知し、それらの決定を可能とする、物質にも関する。好ましい実施形態において、前記物質は、抗体である。したがって、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のいずれかの配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体にも関する。
【００６１】
さらに、本発明は、敗血症を診断する方法における、好ましくは上記の方法における、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び／又は１４で示されるポリペプチドの使用にも関する。
【００６２】
本発明は、さらに、切断に好適な条件下でＭＭＰ−７と共にＡＡＴをインキュベートするステップを含む方法により産生されたＡＡＴの断片用の参照基準に関する。この種の参照基準の人工的に合成された参照基準をしのぐ利点は、ｉｎ  ｖｉｖｏで発生するＡＡＴの断片により類似していることである。前記参照基準は、同定されるｉｎ  ｖｉｖｏ分子の分子量の決定、その濃度決定等に、他の参照基準と同様に、使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１Ａ】ＳＩＲＳ患者及び敗血症患者の分類  二つの決定木アルゴリズムによる、非感染病原性のＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）患者及び敗血症（重症敗血症及び敗血症性ショック）患者の分類並びにアプロチニンとしてのマーカーＣＭ＿６．１５の同定及びそのトラジロール療法との関連性。  Ａ及びＢ、分類木（最上部）；ＣＭ＝ＣＭ１０アレイから得られたクラスター；Ｃ１＝Ｑ１０アレイから得られたクラスター。受信者動作特性曲線分析（中段）及びピーククラスターを用いるクラス有意化結果（下段）及び患者群（敗血症；ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）識別用の決定木アルゴリズム；青色＝訓練サンプル、緑色＝盲検化試験サンプル、橙色＝５か月後に再分析された盲検化試験サンプル、赤色＝決定木検証用に前向きに収集されている１９のＩＣＵ試験サンプル。
【図１Ｂ】ＳＩＲＳ患者及び敗血症患者の分類  二つの決定木アルゴリズムによる、非感染病原性のＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）患者及び敗血症（重症敗血症及び敗血症性ショック）患者の分類並びにアプロチニンとしてのマーカーＣＭ＿６．１５の同定及びそのトラジロール療法との関連性。  Ａ及びＢ、分類木（最上部）；ＣＭ＝ＣＭ１０アレイから得られたクラスター；Ｃ１＝Ｑ１０アレイから得られたクラスター。受信者動作特性曲線分析（中段）及びピーククラスターを用いるクラス有意化結果（下段）及び患者群（敗血症；ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）識別用の決定木アルゴリズム；青色＝訓練サンプル、緑色＝盲検化試験サンプル、橙色＝５か月後に再分析された盲検化試験サンプル、赤色＝決定木検証用に前向きに収集されている１９のＩＣＵ試験サンプル。
【図１Ｃ】ＳＩＲＳ患者及び敗血症患者の分類  二つの決定木アルゴリズムによる、非感染病原性のＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）患者及び敗血症（重症敗血症及び敗血症性ショック）患者の分類並びにアプロチニンとしてのマーカーＣＭ＿６．１５の同定及びそのトラジロール療法との関連性。  ＣＭ１０チップ上での、トラジロールのマーカー６．５１に近いｍ／ｚ領域の代表的な分析結果（最上部）、非感染病原性ＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）患者個人からの代表的な分析結果（中段）、及び敗血症患者個人からの代表的な分析結果（下段）。内部校正に用いた内部標準のピークには、矢印を付けた。
【図２】決定木アルゴリズムにより検討された、非感染性病原性のＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）患者及び感染性病原性のＳＩＲＳ（ｓＳＥＰＳＩＳ）（重度敗血症／敗血症性ショック）患者の分類用の、ＣＭ＿６．１５を考慮しない二つ目の代替の決定木  分類木；ＱＣ及びＣ１＝Ｑ１０アレイから得られたクラスター（上段パネル）；患者群（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+；ｓＳＥＰＳＩＳ）識別用のピーククラスター及び決定木アルゴリズムを用いる、ＲＯＣ曲線分析（下段右側のパネル）及び分類結果（下段左側のパネル）。青色＝訓練サンプル、緑色＝盲検化試験サンプル、橙色＝５か月後に再分析された盲検化試験サンプル、赤色＝決定木検証用に前向きに収集されている１９のＩＣＵ試験サンプル。
【図３】ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+のサンプル及びｓＳＥＰＳＩＳのサンプルの正規化ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ分析結果の代表例  ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+のサンプル及びｓＳＥＰＳＩＳのサンプルの正規化ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ分析結果の代表例。ゲル一覧に示すように、異なる研究群の患者からの代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳタンパク質パターン。左側：チップタイプＱ１０；低分子量領域、４．４ｋＤａないし５ｋＤａのチップタイプＱ１０；ピーククラスターＣ１＿４．７。中間：チップタイプＱ１０；中間分子量領域、１２．５ｋＤａないし１５ｋＤａ；ピーククラスターＣ１＿１３．８。右側：チップタイプＱ１０；高分子量領域、３０ｋＤａないし６０ｋＤａ；ピーククラスターＱＣ＿５５．７。ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者及び敗血症患者を識別するピーククラスターは、矢印およびボックスで強調されている。
【図４】トランスサイレチン（ＴＴＲ）として識別発現されたピークＣ１＿１３．８の同定及び検証  （Ａ）ＴＴＲのウェスタンブロット分析；ｓＳＩＲＳ＝ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者からのサンプル；ｓＳＥＰＳＩＳ＝ｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプル；+＝ＴＴＲ陽性の対照；−＝ＴＴＲ陰性の対照。（Ｂ）６９名のｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプル及び５９名のＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者からのサンプルのμｇ／ｍＬでのＴＴＲ濃度の箱ひげ図。（Ｃ）特異的に発現されるマーカーＣ１＿１３．８によるＴＴＲ増大確認のための、ＴＴＲ特異性抗体（下側のパネル）又は対照抗体のいずれかを用いた免疫喪失後のサンプルの代表的な正規化ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ分析結果。
【図５】ＱＣ＿５５．７及びＣ１＿４．７の精製及び同定  （Ａ）ゲル内消化並びにＭＳ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析によって、α−１−アンチトリプシン（ＡＴＴ）及び線維素原（ＦＢＧ）として同定されている、三つのスポットを示す、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者及びｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプルの１０%  Ｍａｘｉ−ＰＡＧＥ  （Ｂ）ＡＴＴが、狭いバンドを有する二つのアイソフォームで主にｓＳＥＰＳＩＳサンプル中に存在していることを示す、抗ＡＴＴウェスタンブロット  （Ｃ）ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者からのサンプルに比べ、ｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプルにおける増大したＡＴＴ断片を示すための等電点電気泳動法  （Ｄ）ｓＳＥＰＳＩＳ患者におけるＡＴＴの切断によって４．７９ｋＤａのピークが生成されることを実証するため、我々が、ｓＳＥＰＳＩＳ患者からの少量の血漿と共にＡＴＴをインキュベートし、ｓＳＥＰＳＩＳ血漿の存在下でＡＴＴが切断され、４．７８ｋＤａの断片が生じた  （Ｅ）還元剤の存在下で、汚染している血清タンパク質を沈殿させた後の代表的なＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイの分析結果。ほとんど存在していないアルブミンのピークに比べ、５５．７ｋＤａのＡＴＴのピーク及び２８ｋＤａの領域における二重に標識されたピーク（５５９８２．１１＋２Ｈ）のピーク強度の増大により、ＡＴＴの増強が示されている。
【図６】アミノ酸配列  アンチトリプシンの活性中心のアミノ酸配列。
【図７】敗血症患者  アンチトリプシンの断片を含む、敗血症患者からのＳＥＬＤＩスペクトル。
【図８】敗血症患者  四つの患者集団内でのＬＣ−ＭＳによる４．８ｋＤａのアンチトリプシン断片の定量化。そのレベルは、非感染性の多傷害患者及びＳＩＲＳ患者と比べる場合、感染病原性の患者集団において著しく高い。媒体の高い濃度が、好中球減少症患者及び軽度感染症患者において測定可能である。
【図９】α−１−アンチトリプシンの完全アミノ酸配列（Ｎ−末端からＣ−末端まで）及びその断片
【図１０】バイオマーカーレベルは、重度敗血症患者においてのみ増大する  重度敗血症患者又は重度ＳＩＲＳ患者から採取したサンプルにおけるバイオマーカーレベルの、乳癌（Ｍａｍｍａ−Ｃａ）患者から採取したサンプルにおけるバイオマーカーレベルとの比較。
【実施例】
【００６４】
表１：患者の臨床特性
データは、平均値±ＳＤ（数値は、小数第１に四捨五入した）及びパーセントで示す。ＳＩＲＳ−ＰＣＴ-は、<０．３ｎｇ／ｍＬの血清ＰＣＴレベルを表わし、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+は、>０．３ｎｇ／ｍＬの血清ＰＣＴレベルを表わす。*ＡＰＡＣＨＥ−ＩＩは、急性生理学及び慢性健康評価ＩＩスコアである。この尺度のスコアは、０から７１までであり、スコアが高いほど疾患の重症度が高いことを示す。**ＳＯＦＡは、逐次臓器不全評価スコアである。ＳＯＦＡの小計スコアは、６の臓器系のそれぞれについて０から４までであり、総計スコアは０から２４までであって、スコアが高いほど臓器不全の重症度が高いことを示す。
【００６５】
材料及び方法
２００２年９月から２００３年９月まで及び２００６年１月から２００６年３月まで麻酔科及び集中治療科の集中治療室（ＩＣＵ）に収容された患者の内、ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ合意会議の敗血症基準又は急性臓器不全を伴い非感染性病原のＳＩＲＳの基準を満たす患者それぞれを本研究に組み入れた（ＩＣＤ−１０−ＧＭコード）。
【００６６】
非感染病原性ＳＩＲＳ患者において、ＩＣＵ収容後に血液サンプルを採取し、内６７名（８３%）ではＩＣＵ収容後２４時間以内に、７名（８．６%）では４８時間以内に、残りの患者では４８時間より後に採取した。重症敗血症患者又は敗血症性ショック患者においては、最初の敗血症誘発性臓器不全発症後２４時間以内に採取した。１８歳未満、妊婦、又はインフォームドコンセントを得られなかった患者は、除外した。非感染病原性ＳＩＲＳ患者については、組み入れ日の血清プロカルシトニン（ＰＣＴ）濃度によりさらに層別化した。<０．３ｎｇ／ｍＬの血清ＰＣＴレベルはＰＣＴ陰性ＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ-）に、上昇した血清ＰＣＴレベルはＰＣＴ陽性ＳＩＲＳ（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）に分類した。倫理委員会は、本研究を承認した。
【００６７】
標準化プロトコルに従い、動脈血１０ｍＬをＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ株式会社、Ｎｅｕｍｂｒｅｃｈｔ市、ドイツ）内に吸入し、直後にプロテアーゼ阻害剤カクテル（商品名、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ市、ドイツ）８００μＬを加えた。チューブの内容物をおだやかに混合し、３７５０ｒｐｍ（チューブの中央で２５１６ｇ）にて４℃で１０分間遠心分離し、血漿アリコートを-８０℃で直ちに冷凍した。１５９名の患者から合計して１６６個のサンプルを採取し、ＳＩＲＳからｓＳＥＰＳＩＳへと分類が変更された７名の患者においては、ＩＣＵ滞在中の異なる時点で二つずつサンプルを採取し、それぞれのサンプル群に割り付けた。
【００６８】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  ＳＥＬＤＩリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ市、カリフォルニア州）で実施し、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００液体操作ステーションをＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐで処理するためのサンプル希釈用に用いた。サンプルは、４℃で１晩解凍し、２回分析した。アリコートは、１回又は２回それぞれ３度目及び４度目の測定のために解凍した。２度目の測定において、既にＵ９緩衝液で変性され-８０℃で分析までに保管されていた、１度目の測定で残ったアリコートを用いた。タンパク質チップ分析のため、サンプル４０μＬを変性緩衝液（９Ｍ尿素、１%Ｃｈａｐｓ）６０μＬで変性し、３０分間インキュベートした。変性したサンプルの内２０μＬは、０．１ｍｏｌ／ＬのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０（Ｑ１０）、又は０．０５ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３（ＣＭ１０）で５倍に希釈し、好適なチップの準備及び洗浄の後に、それぞれＱ１０  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  アレイ（強陰イオン交換アレイ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ市、カリフォルニア州）上及びＣＭ１０  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  アレイ（弱陽イオン交換アレイ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ市、カリフォルニア州）上に載せた。ＤＰＣ  ＭｉｃｒｏＭｉｘ  ５  シェーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ市、ウィスコンシン州）上で室温で３０分間インキュベートした後、各チップを好適な緩衝液で３回洗い、水で２回リンスした。残った液体を除去するため、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐチップを２９５０ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、５分間風乾した。各チップを分析する前に、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）の飽和溶液（アセトニトリル７５μＬ及び１%トリフルオロ酢酸７５μＬの中にシナピン酸５ｍｇが溶解している）１μＬをスポット表面に塗布した。質量分析は、３５０レーザーショットを含む自動化データ収集プロトコルを用いて、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  リーダー（ＰＣＳ  ４０００、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ市、カリフォルニア州）で実施した。二つのスペクトル部：１〜３０ｋＤａ及び３０〜２００ｋＤａ：に分けられた、１〜２００ｋＤａの質量範囲を用いた。レーザーエネルギーは、１〜３０ｋＤａ及び３０〜２００ｋＤａの測定に対して、ＣＭ１０チップ用に３０００ｎｊ及び４９００ｎｊ（予熱ショットは３７００ｎｊ及び５５００ｎｊ）、Ｑ１０チップ用に３２５０ｎｊ及び５２００ｎｊ（予熱ショットは３７５０ｎｊ及び５９００ｎｊ）にそれぞれ設定した。各ポイントについて、データを平均化して、スペクトルとした。質量精度は、既知のタンパクシツ基準を用いて内部的に、かつ一体型ペプチド／タンパク質分子量基準を用いて外部的に、補正した。
【００６９】
スペクトルは、全イオン電流（ＴＩＣ）によって正規化した。ほとんどの場合、最初の決定木用に、二つの異なる領域（１．５〜２００ｋＤａ及び５．５〜２００ｋＤａ）で行い、正規化因子が平均正規化因子の２．５５倍を超えるスペクトル及び０．４２倍を下回るスペクトルを本分析から除外した。異なる測定間でのピーク強度の比較可能性を確保するため、最初の測定の正規化の後で得られた、外部正規化係数を用いた。ピークは、チップタイプ毎に、３つの異なる領域（即ち、ｍ／ｚ：１５００〜１００００、１００００〜３００００及び３００００〜２０００００）でＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ソフトウェア（バージョン３．０；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ市、カリフォルニア州）を用いて検知された。ピークのクラスターは、ベースライン減算後に下記の条件で検知された：ファーストパスについて、最小ピーク閾値が５%でＳ／Ｎ比>５並びにセカンドパスにおいてクラスター完了のため、分析対象のクラスター領域に応じてクラスターマスウィンドウが０．１%〜０．３%でＳ／Ｎ比>２。次いで、各ピークについての強度値が、分析対象の二つのサンプルペアのそれぞれについて平均化された。３つの異なるｍ／ｚ領域についてのピークデータは、ＣＳＶファイルとしてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、Ｒｅｄｍｏｎｄ市、ワシントン州）中にエクスポートされた。ＣＡＲＴ分析は、全質量範囲（１．５〜２００ｋＤａ）のピーク強度を含む一つのファイルを得るために統合された、二つのチップタイプからの三つの異なる質量領域のピークデータを含むＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  バイオマーカーパターンソフトウェア（ＢＰＳ）バージョン５．０  ＣＳＶファイルを用いて実施された。トレーニングセットからのデータは、ＢＰＳ内にインポートされ、上記のように、分類木が樹立された。
【００７０】
統計的解析は、ＳＰＳＳ  １８を用いて実施された。平均ピーク強度の算出並びに第二の決定木（図Ｓ２  Ａ〜Ｃ）の個別マーカーのボックスプロット及びＲＯＣ曲線作成のために、三つのマーカーの全てについて完全なデータセットを有するサンプルのみを含ませた。
【００７１】
タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製された。対応するサイズを有するスポットは、摘出され、ゲル内トリプシン消化され、ＭＳ分析を受けた。詳細については、本論文のオンラインバージョンに添付される補足データ中の補足文を参照されたい。
【００７２】
α−１−アンチトリプシン（ＡＴＴ）は、Ｇｌａｓｅｒら（１５）の修正法に従って濃縮された。トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、比濁法によりＩＭＭＡＧＥ（登録商標）免疫化学システム上で製造業者（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｂｒｅａ市、カリフォルニア州）に指示に従って測定された。
【００７３】
結果
非感染性病原ＳＩＲＳ患者とｓＳＥＰＳＩＳ患者とを識別するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの能力を試験するため、血漿タンパク質プロファイルを、臨床ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ合意基準に従って分類された患者からのサンプルにおいて分析した。患者１５９名からの１６６のサンプル、重度敗血症又は敗血症性ショック（ｓＳＥＰＳＩＳ）の患者からの８１のサンプル、非感染性病原ＳＩＲＳ患者からの８５のサンプルが組み込まれた。例えば、ＳＩＲＳからｓＳＥＰＳＩＳへと分類が変更された７名の患者においては、二つずつサンプルを採取し、それぞれのサンプル群に割り付けた。非感染病原性ＳＩＲＳ患者は、組み入れ日の血清ＰＣＴ濃度により、ＰＣＴ陰性（ＰＣＴ<０．３ｎｇ／ｍＬ）ＳＩＲＳ患者（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ-）及びＰＣＴ陽性（ＰＣＴ>０．３ｎｇ／ｍＬ）ＳＩＲＳ患者（ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+）にさらに分類された。診断質量パターン同定のプロトコルには、以下のステップが含まれていた：（１）決定木を得るための、既知の診断を有するサンプルを含む訓練セットの分析；（２）同一コホートの追加の患者からの試験セットにおいての、所定の決定木の識別能の検証；（３）５か月後に同一の試験セットの分析を繰り返すことによる、この識別能の再現性の試験；及び（４）独立した盲検化試験セットにおけるこの分析の繰返し。訓練群、試験群、及び予後試験群に割り付けられた、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ-患者、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者、及びｓＳＥＰＳＩＳ患者の臨床特性を表１に示す。
【００７４】
精緻化されたアルゴリズムは、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ陽性患者とｓＳＥＰＳＩＳ患者とを識別するが、トラジロール療法に関係するアプロチニンに依存する
ＰＣＴは、ＳＩＲＳ患者とｓＳＥＰＳＩＳ患者とを識別できない
我々は、最初に、我々の研究コホートにおける感染病原性ＳＩＲＳ患者と非感染病原性ＳＩＲＳ患者とを識別するためのＰＣＴの診断値を評価した。ＳＩＲＳサンプルについてのＰＣＴの中央値（ｎ＝７５；ＰＣＴ＝６．７９[中央値]；３．３８〜１１．５０[２５〜７５パーセンタイル]）並びにｓＳＥＰＳＩＳサンプルについての中央値（ｎ＝７２；ＰＣＴ＝４．０２[中央値]；１．８４〜１２．４６[２５〜７５パーセンタイル]）の間で有意な違いは認められなかった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によるｐ＝０．６２）。ＲＯＣ曲線による解析は、ＰＣＴがＳＩＲＳ患者からのサンプルとｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプルとを識別するには不十分であることを、明らかにした（ＡＵＣ＝０．５２５；９５%ＣＩ＝０．４２８〜０．６２１；オンライン補足データの図Ｓ１Ａ）。訓練群、試験群、及び予後試験群において、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+サンプルとｓＳＥＰＳＩＳサンプルとを識別するＰＣＴの識別能に注目する場合にも、同じである（ＡＵＣ＝０．４１１〜０．６９；オンライン補足データの図Ｓ１Ｂ〜Ｄ）。
【００７５】
あるアルゴリズムは、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者とｓＳＥＰＳＩＳ患者とを識別し、盲検化試験セットにおいて検証されている
次に、我々は、質量分析結果がＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者とｓＳＥＰＳＩＳ患者とをさらに識別できるか試みてみた。この目的のために、５４名の患者（ｓＳＥＰＳＩＳ患者、ｎ＝３１、ＰＣＴ＝２５．８４±７５．４；ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者、ｎ＝２３、ＰＣＴ＝２０．０１±３４．３：表１）からのスペクトルによるＣＡＲＴ解析を実施した。得られた分類アルゴリズムは、ｓＳＥＰＳＩＳ患者とＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者との識別に重要なのが６．５ｋＤａのピークであることを、明らかにした。図１に示す、二つのアルゴリズムの例は、それぞれ９６%及び１００%のＳＥＰＳＩＳ患者及びＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者の正確な同定を可能とした。これらの結果の検証には、同様な構成の別の患者７７名（表１：ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者、ｎ＝３６、ＰＣＴ＝１６．９８±２６．１；ｓＳＥＰＳＩＳ患者、ｎ＝４１、ＰＣＴ＝１５．８２±３３．１）を含む盲検化試験セットを用いた。図１Ａ／Ｂに示すこれらの分類アルゴリズムは、再度、患者３７名中３６名のｓＳＥＰＳＩＳ及び患者２５名中２４名のＳＩＲＳ−ＰＣＴ+をそれぞれ正確に予測した（感度＝９０．２%／８７．８%、特異度＝６６．６%／６９．４%：試験セットの予測ＡＵＣ、ｓＳＥＰＳＩＳについて０．７５６／０．７５３）。
【００７６】
繰返しにより、診断タンパク質パターン分析の長時間後での再現性が示され、独立した試験セットにおいて臨床的検証が可能である
盲検化試験セットは、訓練セットと同一の条件を用いて５か月後に再分析された。同一の決定木を用いて、我々は、ｓＳＥＰＳＩＳ患者（７８%；２９／３７；ＡＵＣ＝０．８４１）及びＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者（９２．８%；２６／２８；ＡＵＣ＝０．８７２）の正確な同定についての同様な結果を得た（図１）。更なる検証のため、この分析を、サンプリング時にＰＣＴ陽性であって、後に従来からの臨床基準に従ってｓＳＥＰＳＩＳ群（ｎ＝９）又はＳＩＲＳ−ＰＣＴ+群（ｎ＝１０）のいずれかに後向きに割り付けられた、１９名のＩＣＵ患者の独立した盲検化試験セットにおいて繰り返した。図１に示すように、サンプルは、それぞれｓＳＥＰＳＩＳ患者及びＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者の７７%／６６%及び１００%／１００%において正確に同定された。
【００７７】
ＣＭ＿６．１５は、トラジロール療法に関係するアプロチニンとして同定される
次に、我々は、最初に特異的に発現されるマーカーＣＭ＿６．１５の同定を試みた。この研究用にサンプルが収集された２００２年及び２００３年において、冠動脈バイパス移植手術（ＣＡＢＧ）を受ける患者は、術中失血及び輸血の必要性を低減させるために一般にアプロチニン（商品名、トラジロール（登録商標））を投与されたが、我々のＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者にほとんども心臓手術を受けた（表１）。心臓手術患者９８名中７０名でアプロチニン用量の後向き評価のための記録が利用可能であって、そのほとんど（９４．２９%）は、５億単位から最高８０億単位までの総用量を投与された。アプロチニンは、６．５１２ｋＤａの分子量を有する、天然のタンパク質分解酵素阻害剤である。ＣＭ＿６．１５がアプロチニンであるエビデンスは、ＣＭ１０チップ上に（登録商標）を塗布した後のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルと、トラジロール（登録商標）を投与されたＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者からのスペクトルとの比較によってもたらされた（図１）。６５１２．７４ＤａのマーカーＣＭ＿６．１５は、６５１２．７８Ｄａのアプロチニンのピークに対応し、さらに、ＣＭ＿６．１５は、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者（患者番号１６２；トラジロール（登録商標）５０億単位を投与）に存在するが、トラジロール（登録商標）を投与されていないｓＳＥＰＳＩＳ患者（患者番号１４０）においてはほぼ存在していない。ＣＭ＿６．１５のピーク強度は、トラジロール（登録商標）１５億単位以上を投与されたＳＩＲＳ患者に適用されたトラジロール（登録商標）の総用量と相関している（Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数＝０．８４８；ｐ<０．００１）。したがって、ＣＭ＿６．１５は、心肺バイパス法を受けるそれらの患者における予防的なトラジロール（登録商標）投与を反映するため、異なる患者群を真に識別するが、ＣＭ＿６．１５は、感染性のＳＩＲＳ（重症敗血症／敗血症性ショック）／重度臓器不全を有する非感染性ＳＩＲＳの過程における病態生理学的マーカーではない。
【００７８】
代替の識別決定木は、ＣＭ＿６．１５とは無関係である
代替の識別決定木作成のため、我々は、異なる分析設定、例えば、上記のマーカーＣＭ＿６．１５の除外を評価した。図２には、練習セットにおいてｓＳＥＰＳＩＳ患者とＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者とを識別する（感度、９３%；特異度、９５%）、二つ目の決定木が示されている。興味深いことに、この決定木は、最初の決定木において重要な予測因子であることが既に示されている、二つのクラスター（４．７ｋＤａ、１３．８ｋＤａ）を含んでいた。追加される主な識別要素は、Ｑ１０表面上で検知され、約５５．７ｋＤａの分子量を有していた。得られた正規化ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ分析結果の代表的な例を図３に示す。この決定木の試験セットにおける最初の検証で、８５．３%の感度、８６．１%の特異度が得られた（図２）。この検証は、５か月後に、８６．４%の感度、９２．８%の特異度として再現された（図２）。独立した盲検化繰返し試験セットにおいてこの決定木を用いると、ｓＳＥＰＳＩＳ患者で８８．８%、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者で９０%の正確な同定が再度もたらされた（全分類アルゴリズムのＲＯＣ曲線下面積（ＲＯＣ積分値）、即ち、ＡＵＣ＝０．９１１、図２）。ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+及びｓＳＥＰＳＩＳの予測についての最初の試験サンプル及び独立した盲検化試験サンプルにおける三つの関連するマーカーのＲＯＣ面積は、それぞれ０．８９５〜０．９３３（ＱＣ＿５５．７）、０．６５６〜０．９１０（Ｃ１＿１３．８）、及び０．７１２〜０．９２２（Ｃ１＿４．７）の範囲であった（オンライン補足データの図Ｓ２Ａ〜Ｃ）。
【００７９】
特異的に発現するタンパク質の同定は、従来からの免疫分析法及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる免疫捕捉の検証を可能にする
特異的に発現するタンパク質の同定のため、対象のタンパク質ピークが多量に存在するサンプルを使用した。同定のため、サンプルｐ２１８のアリコートの分別後に陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた、１３．８ｋＤａのタンパク質フラクション４は、１２%  Ｍｉｎｉ−ＰＡＧＥによって精製された。ｍ／ｚ５５．７ｋＤａのピークは、１０%  Ｍａｘｉ−ＰＡＧＥ上で精製され、対応するサイズのスポットは、摘出され、ゲル内でトリプシン消化された。得られた断片のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析及びそれに続くＭＡＳＣＯＴサーチは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）としてマーカーＣ１＿１３．８の同定を可能にした。ＴＴＲの特異的に発現した１３．８ｋＤａのタンパク質への割当は、ＴＴＲが主にＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者において発現される一方、ｓＳＥＰＳＩＳ患者においては検知されないことを示す、ウェスタンブロット分析（図４Ａ）によって最初に確認された。次に、ＴＴＲは、６９名のｓＳＥＰＳＩＳ患者及び５９名のＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者のサンプルで測定され、平均濃度は、それぞれ７．１５ｍｇ／ｄＬ（９５%ＣＩ＝６．３５〜７．９５）及び１０．７ｍｇ／ｄＬ（９５%ＣＩ＝１０．０〜１１，５）であって（図４Ｂ）、Ｃ１＿１３．８のピーク強度が従来からのＴＴＲの免疫分析結果（図Ｓ２Ｂ）と相関していることを示している。最後に、ＴＴＲ特異的抗体を用いる免疫喪失は、対照抗体を用いた後に認められるピーク強度に比べ、１３．８ｋＤａのピーク強度の大幅な低下をもたらした（図４Ｃ）。
【００８０】
ｍ／ｚ  ５５．７ｋＤａのピークの同定のための、１０%  Ｍａｘｉ−ＰＡＧＥ上での精製後に得られた三つのスプットの分析（図５Ａ）は、α−１−アンチトリプシン（ＡＴＴ）及び線維素原（ＦＢＧ）の同定をもたらした。ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者及びｓＳＥＰＳＩＳ患者におけるウェスタンブロット分析は、ＦＢＧの発現に差がないことを示した（データは示さず）。一方、ＡＴＴは、狭いバンドを有する二つのアイソフォームで主にｓＳＥＰＳＩＳサンプル中に存在している（図５Ｂ）。このため、ＡＴＴがｓＳＥＰＳＩＳ患者内で分解されると仮定した。この仮定を確認するため、我々は、ＡＴＴのアイソフォームを等電点電気泳動法で分析した。図５Ｃに示すように、ＳＩＲＳ−ＰＣＴ+患者からのサンプルに比べ、より明白なＡＴＴの断片化をｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプルに認めた。この結果は、炎症部位で好中球から放出されるメタロプロテイナーゼによってＡＴＴが切断されることを示した、Ｖｉｓｓｅｒｓらの結果（１６）と整合している。予想された断片は４７９０Ｄａであり、４．７９ｋＤａでＱ１０チップ上でｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプルに認められる３番目に重要な識別ピークのサイズそのものである。このピークが、ｓＳＥＰＳＩＳ患者におけるＡＴＴの切断から生じることを確認するため、我々は、図５Ｄに示すように、ｓＳＥＰＳＩＳ患者からの少量の血清と共に、ＡＴＴ（商品名、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ  Ｖｉｔａｌ社、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ市、ドイツ）をインキュベートした。ＡＴＴは、ｓＳＥＰＳＩＳ患者からの血清の存在下で切断され、対照サンプル中には存在しない４．７８ｋＤａの断片が生じた。この結果は、ｓＳＥＰＳＩＳ患者からのサンプルで認められた５５．７ｋＤａのピーク発現の低減（オンライン補足データの図Ｓ２Ｃ）が、５０ｋＤａ領域におけるピーク強度増大（データは示さず）に伴われるとの知見に適合する。最後に、５５．７ｋＤａのピークがＡＴＴに対応することをさらに確認するため、我々が、まず、ＡＴＴを免疫捕捉した。５５．７ｋＤａ及び二重に標識化された２８ｋＤａのピークについてのピーク強度低減が小さかったため（データは示さず）、次に、我々は、汚染している血漿タンパク質を還元剤の存在下で沈殿させる、Ｇｌａｓｅｒらの修正法（１５）に基づき、ＡＴＴを強化した。図５Ｅに示すように、ＡＴＴの強化は、他のタンパク質、例えば、アルブミンのピーク強度に比べ、５５．７ｋＤａのピーク及び２８ｋＤａの領域で二重に標識化されたピークのピーク強度の大幅な増大を生じ、５５．７ｋＤａのピークが実際にＡＴＴであることをさらに裏付けた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００８１】
【非特許文献１】Bone et al., Chest 101:1644-53, 1992
【非特許文献２】Giamarellos-Bourboulis et al., Intensive Care Med. 28: 1351-56, 2002
【非特許文献３】Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger RP, Fein AM, Knaus WA, et al. 敗血症及び器官損傷の定義並びに敗血症における革新的治療の利用指針（Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis.） The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest. 1992 Jun.;101(6):1644-1655
【非特許文献４】Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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