(57)【要約】哺乳動物タウプロテアーゼ、ならびにタンパク質分解活性を有するその断片、バリアント、および変異体が開示される。これらのポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドおよび組換え発現ベクター、ならびに選択される組換え宿主細胞中でこのようなタンパク質を産生する方法、種々の診断および分析アッセイにおいて組成物を使用する方法も開示される。【選択図】図１
2014522237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６からの少なくとも５０アミノ酸の連続配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、約５０〜約３００アミノ酸長の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２】
配列番号６からの少なくとも６０アミノ酸の連続配列と少なくとも約９６％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３】
配列番号６からの少なくとも７０アミノ酸の連続配列と少なくとも約９７％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６からの少なくとも８０アミノ酸の連続配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項５】
配列番号６からの少なくとも９０アミノ酸の連続配列と少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項６】
約７０〜約２５０アミノ酸長の請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項７】
約８０〜約２２０アミノ酸長の請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項８】
約１００〜約２１０アミノ酸長の請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドがセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性の少なくとも８５％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性の少なくとも９５％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号６のアミノ酸残基５、２５７、２６０、２６６、２７２、２７３、２７９、２８０、２８５、２９６、３０１、３０３、３０４、３０５、３１５、３１７、３２０、３３２、３３５、３３６、３３７、３４２、３５２、３５６、３６３、３６９、３８９、４０６、または４２７に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸において置換されている開始哺乳動物タウプロテアーゼのアミノ酸配列を含む、タウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチドであって、前記置換が、元の非置換タウプロテアーゼペプチドまたはポリペプチドのセリンプロテアーゼ活性と比較して、前記プロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチドに増強されたセリンプロテアーゼ活性を与える、タウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１５】
１つまたは複数のアミノ酸置換が、アルギニンからヒスチジン置換、アルギニンからロイシン置換、アルギニンからトリプトファン置換、アスパラギンからアラニン置換、アスパラギンからヒスチジン置換、アスパラギンからリシン置換、グルタミン酸からバリン置換、グルタミンからアルギニン置換、グリシンからアルギニン置換、グリシンからセリン置換、グリシンからバリン置換、イソロイシンからバリン置換、ロイシンからアルギニン置換、ロイシンからバリン置換、リシンからイソロイシン置換、リシンからメチオニン置換、リシンからトレオニン置換、プロリンからロイシン置換、プロリンからセリン置換、プロリンからトレオニン置換、セリンからアスパラギン置換、セリンからイソロイシン置換、セリンからロイシン置換、セリンからフェニルアラニン置換、トレオニンからメチオニン置換、バリンからイソロイシン置換、バリンからメチオニン置換、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１４に記載のタウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１６】
１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｒ５Ｈ置換、Ｒ５Ｌ置換、Ｋ２５７Ｔ置換、Ｉ２６０Ｖ置換、Ｌ２６６Ｖ置換、Ｇ２７２Ｖ置換、Ｇ２７３Ｒ置換、Ｎ２７９Ｋ置換、Ｌ２８４Ｖ置換、Ｎ２９６Ａ置換、Ｎ２９６Ｈ置換、Ｐ３０１Ｌ置換、Ｐ３０１Ｓ置換、Ｐ３０１Ｔ置換、Ｇ３０３Ｖ置換、Ｇ３０４Ｓ置換、Ｓ３０５Ｉ置換、Ｓ３０５Ｎ置換、Ｌ３１５Ｒ置換、Ｋ３１７Ｍ置換、Ｓ３２０Ｆ置換、Ｐ３３２Ｓ置換、Ｇ３３５Ｓ置換、Ｇ３３５Ｖ置換、Ｑ３３６Ｒ置換、Ｖ３３７Ｍ置換、Ｅ３４２Ｖ置換、Ｓ３５２Ｌ置換、Ｓ３５６Ｔ置換、Ｖ３６３Ｉ置換、Ｋ３６９Ｉ置換、Ｇ３８９Ｒ置換、Ｒ４０６Ｗ置換、Ｔ４２７Ｍ置換、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１４または請求項１５に記載のタウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１７】
前記バリアントがセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のタウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１８】
前記バリアントが、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性の少なくとも８５％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のタウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１９】
前記バリアントが、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性の少なくとも９５％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のタウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号６からの少なくとも４０の連続アミノ酸配列を含み、配列番号６のアミノ酸残基５、２５７、２６０、２６６、２７２、２７３、２７９、２８０、２８５、２９６、３０１、３０３、３０４、３０５、３１５、３１７、３２０、３３２、３３５、３３６、３３７、３４２、３５２、３５６、３６３、３６９、３８９、４０６、または４２７に対応する１つまたは複数のアミノ酸において変異されている、約５０〜約３００アミノ酸長の単離されたペプチドまたはポリペプチドであって、前記ペプチドまたはポリペプチドは、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性の少なくとも８５％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のいずれか１つからの少なくとも５０の連続アミノ酸配列を含み、配列番号６のアミノ酸残基５、２５７、２６０、２６６、２７２、２７３、２７９、２８０、２８５、２９６、３０１、３０３、３０４、３０５、３１５、３１７、３２０、３３２、３３５、３３６、３３７、３４２、３５２、３５６、３６３、３６９、３８９、４０６、または４２７の１つまたは複数に対応する１つまたは複数のアミノ酸において変異されている、約７０〜約２２０アミノ酸長の請求項２０に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチドであって、前記ペプチドまたはポリペプチドは、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性の少なくとも７０％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２２】
哺乳動物に対する薬学的投与のために製剤化される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記抗体または抗原結合断片が、実質的に完全長のタウ４Ｒ２Ｎ三量体ポリペプチドと実質的に結合しない、請求項２３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２５】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のポリペプチドに結合しない、請求項２３または請求項２４に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２６】
前記抗体が、モノクローナル、ポリクローナルまたは単一特異的抗体である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２７】
前記抗体が、哺乳動物における発現のためにヒト化されるかまたはコドン最適化される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２８】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドもしくはポリペプチドまたは請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドもしくはポリペプチド、または請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドもしくはポリペプチド、または請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドで形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項３１】
哺乳動物宿主細胞として定義される、請求項３０に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３２】
ヒト宿主細胞として定義される、請求項３０または請求項３１に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３３】
薬学的に許容可能な担体およびａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドまたはポリペプチド、ｂ）請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、ｃ）請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチド、ｄ）請求項２９に記載の発現ベクター、または請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の単離された宿主細胞を含む、組成物。
【請求項３４】
症状の治療、診断、改善、または創薬に使用するための請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ヒトにおけるタウオパチー、神経損失、認知症、老衰、加齢に伴う記憶障害、外傷性脳損傷、またはアルツハイマー病についての症状の治療、診断、改善、または創薬に使用するための請求項３３または請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
（ａ）切断タウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼバリアントの発現をもたらす条件下で、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞の集団を培養する工程、および（ｂ）前記宿主細胞の集団または培地から、発現した切断タウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼバリアントを回収する工程を含む、切断タウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼバリアントを産生する方法。
【請求項３７】
セリンプロテアーゼ阻害剤を識別する方法であって、前記方法は、機能的タウプロテアーゼを発現するのに有効な条件下で、セリンプロテアーゼ活性を阻害する疑いのある化合物を、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のペプチドまたはポリペプチドと接触させる工程を含み、前記化合物によるタウプロテアーゼ活性の阻害が、前記化合物のセリンプロテアーゼ阻害活性の指標である、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法により調製される組換えセリンプロテアーゼ。
【請求項３９】
配列番号１〜配列番号５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む組換えタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼ融合タンパク質。
【請求項４０】
配列番号１〜配列番号５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはポリペプチドであって、前記ペプチドまたはポリペプチドは、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体のセリンプロテアーゼ活性の少なくとも７０％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号１〜配列番号５のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、前記ペプチドまたはポリペプチドが、完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体のセリンプロテアーゼ活性の少なくとも８０％であるセリンプロテアーゼ活性を有する、請求項４０に記載の単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２０日、２０１１年１０月６日、および２０１１年１２月１２日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６１／４８８，４９３号、同第６１／５４４，０９０号および同第６１／５６９，５５８号に対する優先権を主張し、それらの各々の内容はそれらに対する参照を明確にするためにその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、分子生物学の分野、より具体的にはタウタンパク質（ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ならびにそのプロテアーゼ活性断片およびバリアントに関する。特定の実施形態において、十分なセリンプロテアーゼを保持する切断型タウ断片およびタウプロテアーゼバリアントが提供される。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病
アルツハイマー病のための疾患修飾薬についての満たされていない多く、急速に増えている必要性が存在する。現在、世界中で３０００万人より多い人々がＡＤを患っており、この数は約２０年毎に２倍になる。米国において、５４０万人のＡＤ患者が存在すると推定されている。ＡＤは７５歳以上の４人に１人、８０歳以上の３人に１人が罹患している。２０１２年における医療費は２０００億ドルを超えると推定されている（２０１２  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）。現在、５つの軽度に有効なＡＤ症状治療薬物のみが存在するが、どれも内在する神経変性過程を治療していない。ＦＤＡにより承認された医薬は限定された症状軽減を提供するが、疾患の進行を停止、遅延または反転させるわけではない。抗アルツハイマー病薬物についての２００９年の市場は約４３億ドルであったと推定されており、疾患修飾薬（ＤＭＤ）の導入に基づいて１０年間の終わりまでに１４０億ドル以上に増加すると考えられ、５０％を超える市場拡大に入ると考えられる。
【０００４】
ＡＤの症状はゆっくり現れ、最初の症状は軽度の健忘症のみであり得る。この段階において、人は最近の出来事、活動、家族の名前またはものごとを忘れる場合があり、簡単な数学の問題を解くことができない場合がある。疾患進行がＡＤの中度の段階になると、症状はより顕著になり易く、ＡＤを患っている人々または彼らの家族が医療機関に助けを求めるほど深刻になる。ＡＤの中度の段階の症状は、身支度などの簡単な作業をする方法を忘れ、話し、理解し、読み、または書くことに関して問題が起こる。重篤な段階のＡＤ患者は不安または攻撃的になり得、家から離れて徘徊し、最終的に全ての介護を必要とする。
【０００５】
ＡＤの古典的な特徴は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の沈殿または凝集からなるニューロン間プラーク、およびタウタンパク質の沈殿または凝集からなるニューロン間神経原線維変化（ＮＦＴ）である。アミロイドカスケードの仮説は、ＡβがＡＤ発症を駆動し、異常なタウタンパク質の形成を二次的に誘導するＡＤの病的経路として広範に受け入れられている。遺伝学的証拠により、Ａβ凝集の蓄積を増加させる変異が家族性ＡＤを導くと示唆される。しかしながら、Ａβカスケード仮説において、神経変性を引き起こし得る他の経路の重要性を扱っていないという多くの不十分な点が存在する（Ｓｅａｂｒｏｏｋら，２００７）。ＡＤ患者の脳におけるＮＦＴの蓄積および分布は疾患進行と非常に相関し、死後の脳の組織病理によりＡＤを段階分けするために使用され得る。１〜１００歳の人由来の２３３２人の選択されていない脳を、異常なタウおよびＡβの検出について検査するという研究が最近実施された。この研究により、ＡＤ関連タウオパチーが、脳幹下部において人生の最初の１０年間で、プラークの発生前に開始することが示され、アミロイドカスケードの仮説と矛盾している（Ｂｒａａｋら，２０１１）。さらに、ＡＤ経路の分子機構の理解についての疑問を投げかける多くの後期臨床特徴が存在する（例えば、表１を参照のこと）。
【０００６】
【表１】
2014522237.tif 000003
【０００７】
神経変性疾患におけるタウについての因果的役割
そのタウ機能障害は、タウＭＡＰＴについての遺伝子における変異が、第１７染色体（ＦＴＤＰ−１７）に関連するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ）を有する前頭側頭認知症を引き起こすという直接的証拠に起因する他の疾患過程の非存在下でさえ、神経変性および認知症に十分である。１００家族にわたるこの研究において見出された３２個の異なる変異は、一次転写産物のスプライシングに影響を与え、タウのアミノ酸配列の変化を引き起こすカテゴリーに分類され得る。多くのミスセンス変異は集合領域に配置され、通常、ＭＴに対するタウの能力を減少させる。これらの変異のうちのいくつかは、Ｐ３０１ＬおよびＰ３０１Ａなどのインビトロおよびインビボにおけるタウの凝集を促進する。エクソン１０の境界におけるステムループ構造の変異およびその後のイントロンは、４Ｒ対３Ｒアイソフォームの比の異常を引き起こすスプライシングを変化させ、タウアイソフォームの適切な比の維持が神経変性および認知症を予防するのに必要であることを実証している（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ａｎｄ  Ｊａｋｅｓ，２００５）。最近の研究により、タウは、Ａβ−依存性病因およびアポＥ４−依存性病因の両方の重要なメディエータまたはイネイブラーであることが示されている（Ｍｏｒｒｉｓら，２０１１；Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｃｋｅ，２０１２に概説されている）。
【０００８】
疾患進行における細胞外タウ
神経毒性における細胞外タウの役割は比較的新しいが、この分野において重要な概念である。ＡＤにおける細胞外タウに関与する原因となる見識が複数存在する。タウ病理は初期段階の疾患から後期段階の疾患まで脳に隣接して広がり、疾患進行の「感染性」モデルと示唆されている（Ｓｃｈｏｎｈｅｉｔら，２００４）。この考えは、細胞外タウ凝集が細胞の外部から内部までタウミスフォールディングを伝播し得るという最近の報告（Ｆｒｏｓｔら，２００９）により支持される。この考えについてのさらなる裏付けは、正常なヒトタウを有するトランスジェニックマウスの脳内への凝集した変異ヒトタウを有するトランスジェニックマウス由来の脳抽出物の注入はタウ病理を伝播させ、脳にわたってその拡散を誘導するとことが示されている最近の報告によりもたらされている（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａら，２００９）。最近、２匹のトランスジェニックモデルを独立して成長させ、マウス内嗅皮質において病理タウＰ３０１Ｌを発現させた（Ｌｉｕら，２０１２；Ｃａｌｉｇｎｏｎら，２０１２）。公開された結果は、タウ病理が疾患ニューロンから健康なニューロンまで拡散し得るモデルと一致した海馬の隣接領域に病理が拡散することを実証している。トランスジェニックマウスにおける凝集促進ヒトタウの低レベルの誘導は、ヒトおよび正常なマウスタウの両方（同時凝集）からなるタウ凝集体および濃縮体の形成を生じ、正常な宿主タウへの病理タウ特性の伝染による「感染」モデルについての証拠を与えている（Ｍｏｃａｎｕら，２００８）。細胞外タウによりタウ病理を拡散するための受容体により媒介される機構は培養ニューロンでの作用に基づいて記載されている（Ｇｏｍｅｚ−Ｒａｍｏｓら，２００６；２００８；２００９）。タウのレベルはＡＤにおいてＣＳＦを上昇させるが、Ａβレベルは減少させる（Ｓｈａｗら，２００９）。
【０００９】
タウオリゴマー：治療法の開発のための標的
ＮＦＴは認知障害およびニューロン損失とよく関連するため、ＡＤおよびタウオパチーにおける神経変性の媒介に関与している（Ａｒｒｉａｇａｄａら，１９９２；Ｂａｎｃｈｅｒ，１９９３；Ｇｕｉｌｌｏｚｅｔら，２００３；Ｉｑｂａｌら，２００９）。しかしながら、タウオパチーの動物モデルの研究により、記憶障害およびニューロン損失がＮＦＴの蓄積から解離していることが示されている（Ｂｒｕｎｄｅｎら，２００８）。この主張についての強い支持は、テトラサイクリン調節プロモーターの制御下で前脳においてタウＰ３０１Ｌを発現するトランスジェニックマウスｒＴｇ４５１０の分析によりもたらされる。これらのマウスは、構築物が発現された場合、記憶障害、ニューロン損失およびＮＦＴを発症した。しかしながら、発現の抑制により、ＮＦＴが蓄積し続けた場合でさえも、記憶の改善およびニューロン損失の減少が引き起こされ、プレタングル（ｐｒｅｔａｎｇｌｅ）タウ種が、神経変性表現型の原因となることが明確に実証された（Ｓａｎｔａｃｒｕｚら，２００５）。さらに、ニューロン損失およびＮＦＴ病理の局所解離が存在した（Ｓｐｉｒｅｓら，２００６）。このマウスモデルもまた、タングルではなく、可溶性タウが海馬機能の機能障害の原因であることを示すために使用した（Ｆｏｘら，２０１１）。ヒト突然変異体タウＰ３０１Ｓ構築物を発現するトランスジェニックマウスは、線維状タウ封入の蓄積前に、凝集が発生した海馬シナプス損失および機能障害、ならびにミクログリア活性化齢の傾向がある（Ｙｏｓｈｉｙａｍａら，２００７）。同様に、ＦＴＤＰ−１７（Ｐ３０１ＳおよびＧ２７２Ｖ）に見出された２つの突然変異体を有するヒトタウタンパク質を発現するトランスジェニックマウスモデルはタングル形成前に軸索変性症を示した（Ｌｅｒｏｙら，２００７）。タウおよびＡβ病理の両方を蓄積するトリプルトランスジェニックＡＤマウスモデルを、タウおよびＡβの免疫軽減の効果を研究するために使用した。両方のタンパク質に対する抗体が、これらのマウスにおいて学習および記憶挙動を改善するために必要とされた。ＮＦＴではなく、可溶性タウは治療により減少した（Ｏｄｄｏら，２００６）。
【００１０】
タウオリゴマー特異的抗体を使用した正常およびＡＤ  ＣＳＦ検体の研究により、疾患の初期においてタウオリゴマーのＡＤ特異的蓄積が示された（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓら，２０１２）。さらに、タウオリゴマーにより、記憶の機能障害が引き起こされ、マウスにおいてシナプスおよびミトコンドリア機能障害が誘導された（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓら，２０１１）。しかしながら、タウオリゴマーがこれらの神経変性作用を引き起こす機構は確立されていない。
【００１１】
タウを切断するプロテアーゼ
タウ開裂はタウ凝集および神経変性において重要な役割を果たすことが示されている（Ｗａｎｇら，２０１０；ＨａｎｇｅｒおよびＷｒａｙ，２０１０において最近概説されている）。タウ切断により、毒性凝集体の形成を生じる凝集傾向の断片の形成が導かれ、凝集しない毒性断片の形成が導かれる。したがって、タウのタンパク質分解を標的化することは、ＡＤおよび関連するタウオパチーのための治療の開発に有益である。タウは複数のプロテアーゼのための基質であり、その天然に折り畳まれない構造のために、タンパク質分解に非常に感受性がある。タウは、カスパーゼおよびカルパインなどの内因性プロテアーゼならびにピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼに加えてトリプシンおよびキモトリプシンにより切断され得る。ミスフォールドしたタンパク質を分解するプロテアソームもまた、タウを分解するが、タウの線維に結合される場合、阻害される。ＡＤの初期においてタウの断片を生成する未知のプロテアーゼもまた、存在する。
【００１２】
アルツハイマー病におけるタウの役割
ＡＤの古典的な特質は、アミロイドベータタンパク質（Ａβ）の沈殿物または凝集体からなるニューロン間プラーク、およびタウタンパク質のニューロン内神経原線維タングル（ＮＦＴ）である。タウタンパク質は微小管集合および安定性を促進し、軸策の機能に重要であるが、Ａβの正常な機能は完全に理解されていない。アミロイドカスケードの仮設はＡＤの病理経路として広範に認められている。脳におけるＡβの生成およびＡβ凝集体の蓄積は疾患プロセスを開始すると考えられている。Ａβ凝集体の増加した蓄積を生じる突然変異は家族性ＡＤを導くことが遺伝学的証拠により支持されている。しかしながら、神経変性を引き起こし得る他の経路の重要性を扱っていないという点でＡβカスケード仮説において多くの脆弱性が存在する（Ｓｅａｂｒｏｏｋら，２００７）。ＡＤ患者の脳におけるＮＦＴの蓄積および分布は疾患進行と非常に相関しており、死後の脳組織病理によりＡＤを段階分けするために使用され得るが、ＡＤとβアミロイドからなる老人斑の蓄積との間に不十分な相関関係が存在する。このことはアミロイド仮説に疑問を投げかけるために使用されている（Ｊｏｓｅｐｈｓら，２００８）。後期臨床試験におけるＡβに向けられた治療についての精彩を欠いた結果は、タウなどの創薬についての代替の標的を調査する興味を増加させている（Ｉｑｂａｌら，２００９）。
【００１３】
従来技術における欠如
不幸にも、ＡＤについて利用可能な治療法はまだ存在しない。今日、薬物療法はＡＤの症状およびその種々の段階を抑制することに焦点を当てている。例えば、軽度から中度のＡＤは多くの場合、ドネペジル（ＡＲＩＣＥＰＴ（登録商標）、Ｅｉｓａｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ／Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、リバスティグミン（ＥＸＥＬＯＮ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ／Ｓａｎｄｏｚ  ＡＧ）、ガランタミン（ＲＡＺＡＤＹＮＥ（登録商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、［およびより少ない程度でタクリン（ＣＯＧＮＥＸ（登録商標）、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏ．）］などのコリネステラーゼ阻害剤を用いて治療され、一方、中度から重度のＡＤは多くの場合、ドネペジル（ＡＲＩＣＥＰＴ（登録商標））またはメマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ（登録商標）、Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などのＮ−メチルＤ−アスパラギン酸アンタゴニスト、またはそれらの組み合わせを用いて治療される。これらの医薬は、ＡＤの症状を制限された期間、悪化するのを遅延または防止するのに役立ち得るが、これらの医薬が疾患自体の根本的な進行に対する効果を有するという明確な証拠は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
過去十年における広範囲の研究により、ＡＤについての可能なバイオマーカーが識別されているが、危険のあるまたは罹患している個体のＡＤの進行を診断、治療、予防、およびモニタリングするのに特に有用である組成物および方法についての緊急の必要性が依然として存在している。ＡＤおよびその症状の治療に使用するための既存の化学化合物の識別、合成、および／または適応のための薬物標的として役立つ新規組成物および方法もまた必要とされる。さらに、例えば免疫療法薬および次世代療法を含む、疾患を治療するための新規クラスの薬物を開発するための必要性もまた存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の簡単な要旨
本発明は、新規および非自明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質ならびに１種以上の哺乳動物タウプロテアーゼ、その切断型またはバリアントをコードするポリヌクレオチド、同様に１種以上の哺乳動物タウプロテアーゼ、その切断型またはバリアントを発現する構築物、ベクターおよび組換え宿主細胞を含む、関連する生物学的組成物を提供することによって従来技術に特有のこれらおよび他の制限を克服する。タウタンパク質部分の自己タンパク質分解特性に基づいて、本発明の組成物は特に有益である。なぜなら、それらはまた、セリンプロテアーゼとして機能し、脳、神経欠損、および早期発症の老衰、認知症、加齢に伴う記憶喪失、アルツハイマー病などの神経学的病態の種々の疾患の１種以上の症状の診断、治療、予防、および／または改善のための新規薬物候補の開発において重要な役割を果たし得るからである。
【００１６】
本発明は、部分的に、最初に、タウタンパク質が自己タンパク質分解特性を保有し、セリンプロテアーゼとしてインビトロおよび／またはインビボで機能し得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。本発明者らはさらに、切断型ポリペプチドが完全長のタウプロテアーゼのアミノ酸配列の３分の１未満を含んでいる場合でさえ、ヒトタウタンパク質の特定の切断型が顕著なプロテアーゼ活性を保持していることを発見した。本発明者らはまた、野生型タウプロテアーゼ配列における特定の突然変異体もまた、特に有用なタウプロテアーゼバリアントを生じることを発見し、これにより、タウプロテアーゼの機能ドメインをさらに識別し、新規創薬を含む、診断および／または治療適用に有用なタンパク質バリアントの特性を導いた。
【００１７】
本発明はまた、少なくとも１つの単離した遺伝子に特有な、またはそれらを含む、新規および非自明の核酸セグメント、発現ベクター、組換え宿主細胞、オリゴヌクレオチド増幅プライマー、およびオリゴヌクレオチド検出プローブなど、あるいは哺乳動物タウプロテアーゼの全てもしくは一部、またはプロテアーゼ活性タウ断片、タウプロテアーゼバリアント、タウプロテアーゼ変異体、タウタンパク質融合産物、または哺乳動物タウプロテアーゼの１つ以上のエピトープ、活性部位、結合ドメイン、触媒ドメイン、または調節領域の全てもしくは一部をコードする核酸セグメントを提供する。さらに、哺乳動物、好ましくはヒトタウプロテアーゼ、またはそのプロテアーゼ活性断片、バリアント、変異体、エピトープもしくは融合タンパク質をコードする単離された遺伝子、核酸セグメントおよび発現構築物が提供される。
【００１８】
本発明はまた、本発明のタウプロテアーゼを作製するため、タンパク質分解活性であるタウタンパク質の活性断片を作製するため、ならびに選択される組換え発現系においてタウプロテアーゼポリペプチドを産生するためにタウプロテアーゼポリヌクレオチドを発現する発現構築物、組換えベクター、および形質転換宿主細胞ならびにそれらの活性断片またはエピトープを作製するための方法を提供する。本発明はまた、様々な診断、治療、試験研究、および創薬方法における開示されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、約５０〜約３００アミノ酸長、あるいは約７０〜約２５０アミノ酸、または約８０〜約２２０アミノ酸長の単離したペプチドまたはポリペプチドを提供し、そのペプチドまたはポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれかに記載されている少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、または少なくとも８０またはそれ以上の連続アミノ酸配列と少なくとも９０％同一、または少なくとも９２％同一、９４％同一、９６％同一、または９８％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むか、それらから実質的になるか、あるいはそれらからなる。好ましくは、単離したペプチドまたはポリペプチドは、インビトロおよび／またはインビボにおいてタウプロテアーゼ活性、好ましくはセリンプロテアーゼ型の生物活性を有する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸残基５、２５７、２６０、２６６、２７２、２７３、２７９、２８０、２８５、２９６、３０１、３０３、３０４、３０５、３１５、３１７、３２０、３３２、３３５、３３６、３３７、３４２、３５２、３５６、３６３、３６９、３８９、４０６、または４２７に対応する１つまたは複数の位置にて、少なくとも１つ、あるいは少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つもしくはそれ以上のアミノ酸において置換されている開始哺乳動物タウプロテアーゼのアミノ酸配列を含むタウプロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチドを提供し、ここで、置換は、元の非置換のタウプロテアーゼペプチドまたはポリペプチドと比較して、プロテアーゼバリアントペプチドまたはポリペプチドに向上したセリンプロテアーゼ活性を与える。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換はアルギニンからヒスチジン置換、アルギニンからロイシン置換、アルギニンからトリプトファン置換、アスパラギンからアラニン置換、アスパラギンからヒスチジン置換、アスパラギンからリシン置換、グルタミン酸からバリン置換、グルタミンからアルギニン置換、グリシンからアルギニン置換、グリシンからセリン置換、グリシンからバリン置換、イソロイシンからバリン置換、ロイシンからアルギニン置換、ロイシンからバリン置換、リシンからイソロイシン置換、リシンからメチオニン置換、リシンからトレオニン置換、プロリンからロイシン置換、プロリンからセリン置換、プロリンからトレオニン置換、セリンからアスパラギン置換、セリンからイソロイシン置換、セリンからロイシン置換、セリンからフェニルアラニン置換、トレオニンからメチオニン置換、バリンからイソロイシン置換、バリンからメチオニン置換、またはそれらの任意の組み合わせである。例示した実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換としては、Ｒ５Ｈ置換、Ｒ５Ｌ置換、Ｋ２５７Ｔ置換、Ｉ２６０Ｖ置換、Ｌ２６６Ｖ置換、Ｇ２７２Ｖ置換、Ｇ２７３Ｒ置換、Ｎ２７９Ｋ置換、Ｌ２８４Ｖ置換、Ｎ２９６Ａ置換、Ｎ２９６Ｈ置換、Ｐ３０１Ｌ置換、Ｐ３０１Ｓ置換、Ｐ３０１Ｔ置換、Ｇ３０３Ｖ置換、Ｇ３０４Ｓ置換、Ｓ３０５Ｉ置換、Ｓ３０５Ｎ置換、Ｌ３１５Ｒ置換、Ｋ３１７Ｍ置換、Ｓ３２０Ｆ置換、Ｐ３３２Ｓ置換、Ｇ３３５Ｓ置換、Ｇ３３５Ｖ置換、Ｑ３３６Ｒ置換、Ｖ３３７Ｍ置換、Ｅ３４２Ｖ置換、Ｓ３５２Ｌ置換、Ｓ３５６Ｔ置換、Ｖ３６３Ｉ置換、Ｋ３６９Ｉ置換、Ｇ３８９Ｒ置換、Ｒ４０６Ｗ置換、またはＴ４２７Ｍ置換、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２１】
本発明はさらに、タウタンパク質またはプロテアーゼに特異的に結合する、特定の実施形態において、本明細書に開示される切断型タウプロテアーゼまたは置換タウバリアントのうちの１つに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、本明細書に開示される切断型または置換タウプロテアーゼのうちの１つ以上に特異的に結合するが、４Ｒ２Ｎ完全長配列である、配列番号６に記載されるアミノ酸配列などの全野生型タウタンパク質配列を含むポリペプチドに実質的に結合しない。このような抗体としては、モノクローナル、ポリクローナルおよび／または単一特異的抗体および抗原結合断片が挙げられ得る。
【００２２】
別の態様において、本発明は、１つ以上のタウプロテアーゼペプチド、ポリペプチド、タンパク質をコードするか、またはこのようなタウプロテアーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に特異的な抗体もしくは抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドおよび核酸セグメントを提供する。
【００２３】
同様に、本発明は、発現構築物、組換えベクター、および１つ以上のこのようなベクター、構築物で形質転換された単離された宿主細胞、あるいは開示されたタウプロテアーゼペプチドもしくは本明細書のポリペプチドのうちの１つ以上、または本明細書に記載されるタウ特異的抗体もしくは抗原結合断片のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを提供する。例示した実施形態において、このような構築物は、１種以上の哺乳動物（特にヒト）宿主細胞においてタウプロテアーゼまたはタウ特異的抗体もしくは抗原結合断片を発現するように適応され、構成される。関連した実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、例えば、本明細書のいずれかに詳細に記載したように、適切な細菌、真菌、酵母、または他の非哺乳動物細胞中のタンパク質の組換え産物を含む（試験的および大規模調製物を含む）、１種以上の非哺乳動物細胞または宿主系において発現に最適化されたコドンであってもよい。
【００２４】
さらなる実施形態において、本明細書に提供されるタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、発現構築物、ベクター、および／または組換え宿主細胞は、１種以上の緩衝液、希釈剤、ビヒクル、または薬学的に許容可能な賦形剤中で製剤化される。好ましくは、本発明の１種以上のタウプロテアーゼ関連化合物はヒトなどの哺乳動物への医薬投与のために製剤化されてもよいか、または１つ以上の診断、治療、調査、研究もしくは創薬方法、アッセイ、プロトコルまたは投薬計画における使用のために製剤化されてもよい。
【００２５】
特定の実施形態において、このような組成物は、症状の治療、診断、改善、または１つ以上の研究アッセイ、プロトコル、および／もしくは創薬計画に使用するために調製されてもよい。特定の実施形態において、開示される組成物は、症状の治療、診断、改善、または哺乳動物における１種以上の疾患、機能障害、異常状態、損失、欠陥、外傷、または損傷のための創薬に使用するために製剤化される。好ましくは、このような組成物は、限定されないが、タウオパチー、神経欠損、認知症、老衰、加齢に伴う記憶喪失、外傷性脳損傷、もしくはアルツハイマー病、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ヒトにおける神経学的状態の１種以上の症状の治療、予防、診断、または改善に使用するために製剤化される場合、有用であり得る。
【００２６】
本発明はまた、１つ以上の切断型タウプロテアーゼまたは１つ以上のタウプロテアーゼバリアントを産生するための方法を提供する。このような方法は、通常、切断型タウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼバリアントの発現を誘導する条件下で選択されたタウペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞の集団を培養する工程、（ｂ）発現された切断型タウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼバリアントを、宿主細胞の集団または宿主細胞が増殖もしくは培養された培地から回収する工程を含む。
【００２７】
本発明はさらに、大規模、および自動化化合物ライブラリスクリーニングなどを含む、少なくとも１つのセリンプロテアーゼ阻害剤を含有する疑いのある化合物の集団からセリンプロテアーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。その方法は、全般的および一般的な意味において、セリンプロテアーゼ活性を阻害する疑いのある化合物または化合物の集団を、機能的なタウプロテアーゼタンパク質分解活性を観測するのに有効な条件下で、本明細書に開示されるタウプロテアーゼペプチドまたはポリペプチドの１つ以上と接触させる工程、ならびに接触した化合物の１つ以上がタウタンパク質分解活性を阻害または減少させるか否かを決定する工程であって、化合物によるタウプロテアーゼ活性の阻害はセリンプロテアーゼ活性を有する化合物の指標である、工程を少なくとも含む。本発明の前述の態様の各々を以下の実施例、および図面においてさらに詳細に記載する。
【００２８】
タウプロテアーゼポリペプチド
上記のように、本発明は、本発明の以前に得ることができなかったレベルで調製される、好ましくはヒト起源の組換えタウプロテアーゼ活性ペプチド、タンパク質、または融合タンパク質を提供する。その方法は、組換え宿主細胞中でタウプロテアーゼポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子を発現する工程と、発現したポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質を全組換え宿主細胞成分から精製して、約１００μｇ〜約１０００ｍｇの組換えタウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼ活性ポリペプチド、タンパク質、バリアント、変異体、もしくはそれらの融合タンパク質を調製する工程とを含む。スケールアップにより、本発明者らは、最大約１０ｇの組換えタウプロテアーゼポリペプチドを産生する１０倍増加が達成され得ることを意図する。
【００２９】
タウプロテアーゼ融合タンパク質またはタウタンパク質もしくは明確な選択されるアミノ酸配列、例えば選択される抗原性アミノ酸配列、特定の結合親和性を有する選択されるアミノ酸配列、およびＤＮＡ結合またはトランス活性化アミノ酸配列に作動可能に連結されるポリペプチド配列の断片を含む構築物もまた、本発明の範囲内に包含される。特に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアミノ酸配列に作動可能に結合されるタウプロテアーゼ活性アミノ酸配列が、選択的に開裂可能な結合などを有する融合タンパク質として提供され、様々な診断、治療および創薬プロトコルに有用である。
【００３０】
タウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド
上記のように、本発明はまた、本明細書に開示される１つ以上のタウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドおよび核酸セグメントを提供する。
【００３１】
好ましくは、これらのポリヌクレオチドおよび核酸セグメントは、哺乳動物、および好ましくはヒトタウプロテアーゼ、またはプロテアーゼ活性断片、そのバリアント、変異体、エピトープ、もしくは融合タンパク質をコードし、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６のうちのいずれか１つ以上に由来する少なくとも５０の連続アミノ酸配列、またはそれらの生物学的機能等価物；あるいはプロテアーゼ活性断片、そのバリアント、変異体、エピトープ、もしくは融合タンパク質、または遺伝子、ポリヌクレオチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれらにハイブリダイズする核酸セグメントと少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。これらの単離された遺伝子およびコード領域はしたがって、好ましくは、配列番号６に記載される実質的に完全長のタウプロテアーゼコード領域をコードする連続核酸配列またはその生物学的機能等価物；あるいは遺伝子またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれらにハイブリダイズするＤＮＡセグメントを含む。
【００３２】
特定の実施形態において、ＤＮＡセグメントおよびコード領域は、１つ以上の哺乳動物またはヒトタウプロテアーゼ、またはプロテアーゼ活性断片、そのバリアント、変異体、エピトープ、もしくは融合タンパク質をコードし得る。示した例において、約２１０アミノ酸長の哺乳動物タウプロテアーゼ活性断片；または約１１８アミノ酸長の哺乳動物タウプロテアーゼ活性断片、または約９９アミノ酸長の哺乳動物タウプロテアーゼ活性断片、または約８３アミノ酸長の哺乳動物タウプロテアーゼ活性断片；または約８１アミノ酸長の哺乳動物タウプロテアーゼ活性断片をコードするＤＮＡセグメントおよびコード配列が提供され、好ましくは、断片によりコードされる組換えポリペプチドは、インビトロおよび／またはインビボにおいてタウプロテアーゼ活性を有する。例示的なこのような切断型タウプロテアーゼとしては、限定されないが、本明細書の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５において識別される配列、ならびに配列番号６に開示されるタウタンパク質４Ｒ２Ｎ配列の配列内から得られる切断型タウプロテアーゼ
が挙げられる。
【００３３】
特定の遺伝子およびＤＮＡセグメントは好ましくは、実質的に完全長のタウプロテアーゼ、または切断型プロテアーゼ活性タウタンパク質、もしくはそのペプチドもしくはペプチド断片、変異体もしくはバリアントをコードし、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号５、またはその生物学的機能等価物由来の少なくとも約２０、約２５、または約３０アミノ酸またはそれ以上の連続アミノ酸配列を含むか、遺伝子およびＤＮＡセグメントはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのようなコード配列とハイブリダイズする。より好ましくは、遺伝子は、タウプロテアーゼまたはそれから得られるプロテアーゼ活性切断型ポリペプチドをコードし、配列番号６、またはその生物学的機能等価物由来の少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、またはさらに少なくとも約２００またはそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み、遺伝子およびＤＮＡセグメントはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそのようなコード配列とハイブリダイズする。最も好ましくは、これらの遺伝子およびＤＮＡセグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、またはその生物学的機能等価物のうちのいずれか１つ以上において開示されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、またはさらに少なくとも約９９％以上同一であるアミノ酸配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなるタウプロテアーゼをコードし、あるいは遺伝子およびＤＮＡセグメントはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそのようなコード配列とハイブリダイズする。
【００３４】
例示的な遺伝子およびＤＮＡセグメントはまた、実質的に完全長のタウプロテアーゼ、またはその切断型もしくはプロテアーゼ活性サブ断片をコードすると特徴付けられ得、そのアミノ酸配列内に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、またはその生物学的機能等価物のうちのいずれか１つ以上に由来する少なくとも約１０アミノ酸、またはより好ましくは少なくとも２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約６０アミノ酸、少なくとも約７０アミノ酸、少なくとも約８０アミノ酸、少なくとも約９０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１１０アミノ酸、少なくとも約１２０アミノ酸、少なくとも約１３０アミノ酸、少なくとも約１４０アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸またはそれ以上の連続アミノ酸配列を含み、かつ、適度にストリンジェントからストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６において開示されるタンパク質配列のうちの１つ以上とコードする核酸配列とハイブリダイズすると特徴付けられ得る。
【００３５】
ＤＮＡセグメントおよび単離された遺伝子はまた、切断型、変異体またはバリアントタウプロテアーゼ、またはタウプロテアーゼ融合タンパク質またはポリペプチド構築物をコードするように操作され得、少なくとも１つのタウプロテアーゼ活性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、選択されるペプチドまたはタンパク質配列をコードする第２のコード領域に作動可能に結合（すなわち作動可能に連結）される。ヒトタウプロテアーゼ特異的タンパク質またはペプチドを含む、タウプロテアーゼ特異的配列と、１つ以上のさらなる選択される抗原性アミノ酸配列；免疫付与に使用するための選択される抗原性キャリアアミノ酸配列；選択されるアジュバント配列；選択される分子に対する特異的結合親和性を有するアミノ酸配列；活性ＤＮＡ結合またはトランス活性化ドメインを形成するアミノ酸配列との組み合わせが特に意図される。特定の融合タンパク質は、後での容易な分離を可能にする、プロテアーゼ感受性ペプチドリンカーを介して一緒に連結されてもよい。
【００３６】
発現における使用を目的とするＤＮＡセグメントは、所望の宿主細胞中にタウプロテアーゼペプチドまたはポリペプチドの発現を指示する第１のプロモーターの（すなわち「下流」の）制御下で作動可能に配置される。プロモーターは、組換えプロモーター、またはタウプロテアーゼに天然に会合するプロモーターであってもよい。このようなタウプロテアーゼをコードする１つ以上の核酸を発現する組換えベクターはしたがって、本発明の別の重要な態様を形成する。
【００３７】
プロテアーゼ活性ポリペプチドをコードする配列が特に好ましいが、本発明はさらに、配列番号１２の任意の領域から選択される約２０、４０、６０などの連続ヌクレオチドと同じ配列を有するか、または相補的である、少なくとも約２０、４０、６０などの連続ヌクレオチドからなる配列領域を含むか、それらから実質的になるか、それらからなる、またはそれらを含有するもしくは含むと特徴付けられるものを含む、オリゴヌクレオチド増幅プライマー、オリゴヌクレオチド検出プローブ、および他の核酸セグメント；標準的なハイブリダイゼーション条件下、特にハイブリダイゼーション条件下で、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２のうちのいずれか１つ由来の少なくとも１５の核酸連続配列、またはその相補体とハイブリダイズする約４０、８０、１６０などから約５，０００、１０，０００、もしくはさらに２０，０００ヌクレオチド長もしくはそれ以上の核酸セグメントなどのタウが誘導されるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の核酸はまた、ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメントであってもよい。
【００３８】
タウプロテアーゼを発現する組換えベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、少なくとも１つのＤＮＡセグメントまたは哺乳動物（および好ましくはヒト）タウプロテアーゼ、切断型、変異体、もしくはバリアントタンパク質、ポリペプチド、それらのドメインまたは任意の融合タンパク質をコードする単離された遺伝子もしくはコード領域を含むベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。細菌宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、真菌宿主細胞、酵母宿主細胞、および哺乳動物（および好ましくはヒト）宿主細胞を含む、真核性および原核性宿主細胞が特に好ましい。
【００３９】
本発明の組換え宿主細胞は好ましくは、組換えベクターによりそれらに組み込まれる１つ以上のＤＮＡセグメントを有し、好ましくはコードされたタウプロテアーゼを産生するようにＤＮＡセグメントを発現する。組換え宿主細胞は、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に記載されているアミノ酸配列のうちの１つ以上と同一である、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以上の一次アミノ酸配列を共有するアミノ酸配列を含むそれらのポリペプチドを含む、実質的に完全長のタウプロテアーゼ、または１つ以上の切断型タウプロテアーゼ、またはタウプロテアーゼ由来の１つ以上の変異体もしくはバリアント、またはタウプロテアーゼ融合タンパク質を発現でき、好ましくは適切な宿主細胞中でインビトロおよび／またはインビボでのセリンプロテアーゼ活性を発現する。
【００４０】
細胞、組織、または他の生物学的試料中でタウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを検出するための方法もまた提供され、通常、タウプロテアーゼ特異的核酸配列を含有する疑いのある試料から試料核酸を得る工程と、実質的に相補的核酸のハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で試料核酸を、タウプロテアーゼをコードする核酸セグメントと接触させる工程と、このように形成されたハイブリダイズした相補的核酸を検出する工程とを含む。
【００４１】
タウプロテアーゼ免疫検出試薬
これまで記載してきた実施形態に加えて、本発明はまた、タウプロテアーゼ特異的抗体、抗原結合断片、免疫検出試薬、ならびに試料からタウプロテアーゼ組成物を識別、単離、定量、および精製するための方法を提供する。免疫検出試薬は、哺乳動物タウプロテアーゼ、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のうちのいずれか１つに由来する少なくとも約１０の連続アミノ酸のタンパク質に対する免疫特異性を有する抗体またはその抗原結合断片と特徴付けられ得る。
【００４２】
本発明の免疫検出試薬は、さらに必要に応じて１つ以上の検出可能な標識を含んでもよい。本発明に使用するための検出可能な標識としては、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン標識、もしくはアビジンまたは適切な基質との接触時に検出可能な産物を生成する酵素が挙げられ得る。本発明の免疫検出試薬に使用される抗体またはそれから単離される抗原結合断片は、従来の方法、好ましくは１つ以上のハイブリドーマ細胞株に由来するモノクローナル抗体使用して作製されてもよい。
【００４３】
本発明のキットは様々な免疫検出手段を提供する。免疫検出手段は、タウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼの酵素作用により開裂される分子に作動可能に結合される検出可能な標識であってもよい。他のキットにおいて、免疫検出手段はタウタンパク質に結合する第１の抗タウ抗体であってもよく、好ましくは第１の抗タウ抗体検出可能な標識に作動可能に結合される。さらに、免疫検出手段はヒトタウプロテアーゼに作動可能に結合される検出可能な標識であってもよい。
【００４４】
あるいは、免疫検出手段はヒトタウプロテアーゼに結合する第１の抗タウプロテアーゼ抗体であってもよい。本発明はさらにキットを提供し、第１の抗タウプロテアーゼ抗体はヒトタウプロテアーゼサブユニット、ヒトタウプロテアーゼ、またはインタクトなヒトタウプロテアーゼ酵素複合体に結合する。さらに、第１の抗タウプロテアーゼ抗体は検出可能な標識に作動可能に結合され得る。
【００４５】
特定の他のキットは第１の抗タウ抗体または第２の抗−抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含んでもよく、免疫検出標識は第１の抗タウプロテアーゼ抗体に対して結合親和性を有する第２の抗体に作動可能に結合される。そのようなキットにおいて、タウプロテアーゼ、またはその基質のうちの１つ以上は、フィルタ、膜、カラム、マトリクスなどの固体支持体に結合されてもよい。精製されたタウプロテアーゼまたはタウプロテアーゼ誘導体を調製するために使用される同様の抗体が固体支持体に固定されてもよく、固体支持体に抽出物を適用することによって抽出物は断片化される。
【００４６】
タウタンパク質を検出および定量するための診断キット
診断キットは本発明の別の態様を表す。そのようなキットはまた、プローブ、プライマー、蛍光標識、または反応緩衝液、ポリメラーゼなどのためにキット内に１つ以上の別の容器手段を含んでもよい。キットはまた、リアルタイムＰＣＲアッセイ、特にリアルタイムＰＣＲ  ＦＲＥＴベースのアッセイにおいてキット内に含まれる組成物を使用するための指示書をさらに含んでもよい。指示書はまた、インビトロおよび／またはインビボにおいてタウプロテアーゼ活性を保持および／または発現するタウタンパク質または１つ以上のタウ由来のペプチドもしくはタンパク質断片をコードするポリヌクレオチドを検出するためにキット内に含まれる試薬を使用するために提供されてもよい。
【００４７】
このようなキットのための容器手段は典型的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含んでもよく、その容器手段の中に、開示されるタウまたはタウプロテアーゼ断片に特異的なオリゴヌクレオチド組成物（複数も含む）が入れられてもよく、好ましくは適切にアリコートされてもよい。第２のタウまたはタウプロテアーゼ特異的プライマー組成もまた提供される場合、キットはまた、第２の別の容器手段を含有してもよく、その中に、この第２の別のプライマー手段が入れられてもよい。あるいは、複数のタウまたはタウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチド組成物が単一の製剤中に調製されてもよく、バイアル、フラスコ、シリンジ、試験管、アンプル、または他の適切な容器手段などの単一の容器手段内に充填されてもよい。
【００４８】
本発明の様々なキットはまた典型的に、例えば、注射またはブロー成形プラスチック容器、箱、または他の適切な市販のパッケージなどの市販用の閉鎖した封入物の中に含まれるバイアル（複数も含む）を含有するための手段を含み、それらの中に、所望のバイアル（複数も含む）および／または試薬もしくはキット成分が保持される。同様に、本発明のキットはまた、好ましくは、例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）プラットフォームなどの機器により容易にされるリアルタイムＰＣＲ／マイクロ体積蛍光ＦＲＥＴ分析を含む、本明細書に記載されるリアルタイムＰＣＲに基づいたアッセイにおいてそのようなキット内に含まれる物品を使用するための指示書を含む。
【００４９】
タウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー
本発明の実施において、タウタンパク質（ならびに特にタウプロテアーゼ活性を保有するタウペプチドおよびタンパク質断片）をコードするポリヌクレオチドの増幅において使用するためのフォワードおよびリバース増幅プライマーは、好ましくは、配列番号２０に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２１に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか１つに由来する、あるいは配列番号２０に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２１に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列と少なくとも約９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列に由来する、あるいはさらに、配列番号２０に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２１に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列と少なくとも約９５％同一であるオリゴヌクレオチド配列に由来する、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、または少なくとも約２０個以上の連続核酸を含む。
【００５０】
同様に、本発明の増幅方法を実施するのに好ましいプライマー組成は、配列番号２０および配列番号２１に開示される約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、または約２０個またはそれ以上のヌクレオチドの連続核酸配列と約９０％同一である核酸配列からなってもよい。
【００５１】
他の実施形態において、本発明を実施するのに好ましいプライマー組成は、配列番号２０または配列番号２１に開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、または少なくとも約２０個またはそれ以上の連続核酸である核酸配列から実質的になってもよい。
【００５２】
タウおよびタウプロテアーゼ特異的ポリヌクレオチド増幅キット
本発明はまた、哺乳動物ＤＮＡ、特に１つ以上のタウまたはタウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡを増幅するためのキットを提供する。このようなキットは典型的に哺乳動物ＤＮＡを増幅するのに必要な２つ以上の構成要素を含み、このような構成要素は、化合物、試薬、容器および／または機器であってもよい。例えば、キット内の第１の容器は第１のプライマーを含んでもよく、キット内の第２の容器は第２のプライマーを含んでもよい。キット内の第３のプライマーは、ハイブリダイゼーションプローブのセット、またはプローブを標識するための１つ以上の蛍光プローブを含んでもよい。さらに、本発明のキットはまた、使用するための指示書、例えば本明細書に記載される増幅および／または検出反応においてプライマー、ならびに１つ以上の蛍光分子、または必要な場合、例えば、限定されないが、緩衝酵素、ポリメラーゼ、ＲＮａｓｅｓなどを含む、他の試薬を使用するための指示書を含んでもよい。
【００５３】
本発明は、１つ以上の賦形剤、緩衝液担体、希釈剤、助剤、および／または特定のタウまたはタウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチドアッセイ試薬の製剤化、診断ツールの調製に利用され得る他の構成要素と一緒に１つ以上のタウまたはタウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチド構成要素を提供する。特定の実施形態において、本発明は、インビトロおよび／またはインビボにおいてセリンプロテアーゼ活性を保有するタウタンパク質のペプチドまたはタンパク質断片をコードするポリヌクレオチドを増幅するための増幅キットを提供する。
【００５４】
タウプロテアーゼ活性断片をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法
本発明は、試料中の１つ以上のタウプロテアーゼ活性断片をコードする哺乳動物ポリヌクレオチド配列を識別する方法を提供する。本発明はまた、試料中で、および特にヒトから得た臨床または生物学的検体中で、タウタンパク質（およびより特には、１つ以上のタウプロテアーゼ活性断片をコードするポリヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチドを特異的に検出するための方法および組成物を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、試料中で、切断型タウタンパク質、変異型タウタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、またはインビトロおよび／もしくはインビボにおいてセリンプロテアーゼ活性を保有するタウタンパク質のペプチドもしくはポリペプチド断片を特異的に検出するための方法を提供する。これらの方法は好ましくは、タウ特異的標的配列を使用してＰＣＲ増幅産物を検出するため、特にＦＲＥＴ、および後での融解曲線分析を使用してそのような増幅産物を検出および定量するための本明細書に開示されるプライマーおよびプローブ構成要素ならびにキットを利用する。
【００５６】
一実施形態において、本発明は、タウもしくはタウプロテアーゼ活性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはタウプロテアーゼの全てもしくは一部をコードする核酸セグメント、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つに記載されるタウタンパク質アミノ酸配列のうちの１つ以上に由来する、少なくとも３０個、４０個、５０個、もしくは６０個の連続アミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるペプチドを含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなるタンパク質をコードする核酸セグメントの存在または不存在を検出するための方法を提供する。特定の態様において、１つ以上の生物学的試料は、個体から得られてもよく、上記の配列の存在についてスクリーニングされてもよい。特定の実施形態において、試料は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に開示される切断型タウペプチドを含む、セリンプロテアーゼ活性を保有する１つ以上のペプチド断片、または配列番号６に開示される完全長タウ４Ｒ２Ｎ三量体配列の存在についてスクリーニングされてもよい。
【００５７】
本発明の１つの態様において、タウプロテアーゼ特異的ポリヌクレオチド、特に試料内に含まれる複数のポリヌクレオチド内に由来するタウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの存在または不存在を検出するための方法が提供される。特定の実施形態において、試料は哺乳動物から得た生物学的試料である。好ましくは、試料はヒトから得られる。
【００５８】
特定の用途において、これらの方法はリアルタイムＰＣＲベースの増幅工程を含み、それらは通常、少なくとも１つのサイクル工程（少なくとも１つの第１の「増幅する」工程および少なくとも１つの第１の「ハイブリダイズする」工程を含む）を実施することを含む。この増幅する工程は、試料を、一対のタウまたはタウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、タウまたはタウプロテアーゼ標的ポリヌクレオチドが最初に試料中に存在する場合、増幅産物を産生することを含む（標的ポリヌクレオチドが最初に試料中に存在しない場合、ＰＣＲプロセスの間に標的産物増幅は起こらない）。
【００５９】
ハイブリダイズする工程は典型的に、増幅する工程から得られた試料を、一対のタウ特異的オリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。通常、タウ特異的オリゴヌクレオチドプローブの対の第１および第２のメンバーは、互いの約４または５個のヌクレオチド以下内の増幅産物とハイブリダイズする。検出プローブの対の第１のプローブは典型的にドナー蛍光部分で標識され、検出プローブの対の第２のプローブは典型的に対応するアクセプター蛍光部分で標識される。ハイブリダイズする工程に使用するために作動可能に連結され得るこれらの検出プローブおよび部分は本明細書上記により詳細に記載されている。
【００６０】
本発明はまた、１つ以上のタウまたはタウプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーまたは哺乳動物タウポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドを含む疑いのあるポリヌクレオチドの集団中の突然変異体の検出における、特に、インビトロおよび／またはインビボにおいてタウプロテアーゼ活性を保有する哺乳動物ペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドを含む疑いのあるポリヌクレオチドの集団中の突然変異体の検出における本明細書に記載される検出プローブの使用に関する。
【００６１】
ＦＲＥＴベースのプロテアーゼ検出アッセイ
本発明の別の態様は、本発明に従って１つ以上のタウポリヌクレオチドまたはタウポリペプチドを検出するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの検出アッセイの使用である。
【００６２】
ＦＲＥＴベースの検出アッセイにおいて、第１のプローブのドナー蛍光部分および第２のプローブのアクセプター蛍光部分が利用され、ここで、ＦＲＥＴ信号の存在は、アッセイされる試料中の標的化合物の存在の指標である。反対に、ＦＲＥＴ信号の不在は通常、アッセイされる試料中の標的化合物の不在の指標である。
【００６３】
ＦＲＥＴアッセイペプチド基質は、アミノ末端において蛍光分子メチルクマリン（ＭＣＡ）およびペプチド：ＭＣＡ−ＧＧＱＶＥＶＫＳＥ−｛Ｌｙｓ（ＤＮＰ｝（配列番号１８）をコンジュゲートさせるためにＣ末端にさらなるＬｙｓを使用してＣ末端において蛍光消光分子ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を有するタウ４Ｒ２ＮにおけるＬｙｓ３４０後の自己タンパク質分解切断部位周囲の９個のアミノ酸からなる。タウプロテアーゼがペプチドを切断する場合、クエンチは蛍光から解離されるのでアッセイにおいて蛍光信号の検出可能な増加が存在することが考えられる。このアッセイは、タウプロテアーゼ活性を調節する小分子化合物、ペプチドまたは抗体をスクリーニングするためにタウプロテアーゼ活性をモニターするために使用され得る。このアッセイはまた、酵素反応速度を特徴付けるため、タウプロテアーゼについての緩衝条件を最適化するために使用されてもよい。このアッセイはまた、タウプロテアーゼの異なる構築物およびオリゴマー調製物の活性をモニターするために使用されてもよい。ＦＲＥＴペプチドは、クエンチから蛍光を分離するペプチド基質の長さを調節することにより最適化されてもよい。さらなるＦＲＥＴペプチドがタウプロテアーゼの他の切断部位に基づいてタウプロテアーゼ活性をモニターするために作製されてもよい。
【００６４】
ここで、参照が、図面に示された実施形態、または実施例に対してなされ、特定の用語は同じものを説明するために使用される。それにも関わらず、本発明の範囲の限定をそれらにより意図するものではないことは理解されるであろう。記載した実施形態における変更およびさらなる修飾、ならびに本明細書に記載される本発明の原理の任意のさらなる適用は、通常、本発明に関する当業者により想定されると意図される。
【００６５】
以下の図面は本発明の一部を形成し、本発明の特定の態様を実証するために含まれる。本発明は添付の図面と併せて以下の説明に対する参照により、より良く理解され得る。ここで、同様の参照番号は同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１はＡＤにおけるタウプロテアーゼ疾患機構を示す。神経細胞ストレスは、細胞体樹状突起区画におけるタウの蓄積を伴う場合、ジスルフィドにより媒介されるタウオリゴマーの細胞内生成を支持する酸化状態を導き得る。ミトコンドリア機能障害および炎症はタウの過剰リン酸化を潜在的に刺激し得る。これらの状態はアルツハイマー病などの病態においてタウプロテアーゼの形成を導くと考えられる。一旦形成されると、これらの種は機能損失を導く自己切断を受ける。タウ断片化は疾患における原線維の重要な要素と識別されている。疾患において観測される大部分の断片化は、タウプロテアーゼ自己タンパク質分解の結果であり得、それらの神経毒性種を中和しようとする細胞を表し得る。重要なことは、タウプロテアーゼ生成はまた、他のタンパク質標的および神経ペプチドに対するそのタンパク質分解活性に起因し得るタウの毒性機能の獲得と関連し得ることである。例えば、微小管分解、β−セクレターゼ切断部位に隣接するＡＰＰの開裂を導き得るチューブリンの開裂は、ＢＡＣＥ上方制御および発現を導く炎症を刺激できるＡβ（１−４２）を生成できる。ペプチド神経伝達物質の開裂は特に疾患の初期の疾患症状において重要な役割を果たし得る。
【図２】図２は、切断および高次の凝集体形成に先行したジスルフィド媒介性タウオリゴマーの形成を示す。タウ４Ｒ２Ｎオリゴマーを連続溶出電気泳動により精製し、単量体を、プールし、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中に７０００Ｄａの分画分子量を有する回転カラムを使用して緩衝液を交換することによりさらに精製した。少量の単量体を周囲温度にて２時間、１ｍＭの最終濃度で新たに調製したＮＥＭで処理した。インキュベーションのために、ＮＥＭで処理した単量体および未処理の単量体を、週末にわたって（約５０時間）３７℃にてインキュベートし、続いて、還元剤を含まない４〜２０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号３４５−００３３  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分離した。切断の前にタウ４Ｒ２Ｎ−ジスルフィド媒介性オリゴマーが形成し、高次凝集前に切断した。凝集体形成は時間に依存した。タウ４Ｒ２Ｎ＋Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ  Ｓｉｇｍａカタログ番号０４−２６０，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）はジスルフィド媒介性オリゴマー形成を不可逆的に阻害し、自己タンパク質分解活性の損失、および高次凝集体形成の阻害を導いた。レーン１：単量体、二量体、および三量体、四量体を含有するオリゴマーラダーが自然発生的に形成されるタウ４Ｒ２Ｎ；レーン２：３７℃で一晩のインキュベーション時に、４Ｒ２Ｎは分解の証拠を示したが、単量体と比べて二量体、三量体、および四量体の減少を優先的に示す；レーン３：ＮＥＭで処理したタウ４Ｒ２Ｎはオリゴマーラダーをすぐに形成しない；ならびにレーン４：ＮＥＭで処理した４Ｒ２Ｎは、３７℃で一晩のインキュベーション時に分解の証拠を示さず、酵素活性についてのジスルフィドの形成に必要であることを示す。
【図３】図３は、質量分析およびＮ末端シークエンシングについてのタウ断片の調製を示す。５０マイクロリットルの２．４５ｍｇ／ｍＬの精製したタウ４Ｒ２Ｎ二量体を自己タンパク質分解できるように３７℃にて３８．５時間インキュベートした。試料を等体積の２×試料緩衝液（１２６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０５％のブロモフェノールブルー）と合わせ、プレキャストした１５％のポリアクリルアミドＴｒｉｓ−グリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）の５個のウェルで実施した。ゲルを、ＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて１時間染色し、高精製水を用いて一晩脱染した。矢印で表したＦ３により示したバンドを切り取り、新しいカミソリの刃（水およびエタノールで洗浄した）で細かく分割し、一晩撹拌しながら４℃にて５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０中でインキュベートした。溶出したタンパク質を含有する緩衝液を分析のためにＡｌｐｈａｌｙｓｅに送った。高分子量断片１〜４をＰＶＤＦ膜に移すことによってＮ末端シークエンシングのために調製した。その断片をＰｏｎｃｅａｕ染色により可視化し、洗浄した新しいカミソリの刃を用いて切り取った。膜結合断片をＮ末端シークエンシング分析のためにＡｌｐｈａｌｙｓｅに送った。４つの断片についてのＮ末端配列は同じであった：ＳＫＤＧＴＧ（配列番号１８）。このことは、アミノ酸Ｋ１３０とＳ１３１との間の切断部位がタウプロテアーゼの主要な自己タンパク質分解部位であることを示す。
【図４】図４は、断片の分子量（ＭＷ）を決定するために使用した断片Ｆ３のマトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量スペクトル（ＭＳ）を示す。ＭＡＬＤＩ  ＭＳにおいて、溶解した試料を金属標的物に堆積させ、ペプチドおよびタンパク質を光吸収マトリクスを用いて共結晶化した。レーザービームを乾燥マトリクス試料に方向付け、試料分子を脱離し、イオン化し、質量を飛行時間（ＴＯＦ）質量分析器において測定した。より大きなタンパク質は、多くの場合、単一（ＭＨ＋）−、２倍（ＭＨ２  ２＋）−および３倍にプロトン化した（ＭＨ３  ３＋）イオンとして質量スペクトル（ｍ／ｚ）において観測された。タンパク質の質量はインタクトな非プロトン化タンパク質の平均質量として計算した。ＭＡＬＤＩプロセスは、タンパク質調製物が、緩衝する塩および洗浄剤から比較的純粋であることを必要とし、通常、最大約６０ｋＤａまでのインタクトなタンパク質の５〜１０Ｄａ内で質量決定が得られる。この分析において、製造業者のプロトコルに従ってピペットチップ（Ｚｉｐ  Ｔｉｐｓ（登録商標），Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，ＭＡ，ＵＳＡ）（Ｃ１８物質）を使用してタンパク質をマイクロ精製した。５０％メタノールを用いてタンパク質を溶出した。マトリクスとしてＨＣＣＡを使用して線形モードにおいてＭＡＬＤＩ質量分析法によりタンパク質を分析した。外部校正を使用して質量スペクトルを校正した。Ｎ末端ＥｄｍａｎシークエンシングをＡＢＩ  ＰＲＯＣＩＳＥ（登録商標）４９４シーケンサーで実施した。この方法は、Ｅｄｍａｎ分解化学によりタンパク質およびペプチドのＮ末端アミノ酸配列を決定する。シークエンシングは、酸でエッチングしたガラス繊維ディスクまたはＰＶＤＦ膜上で行う。Ｅｄｍａｎ分解は、アミノ酸残基が一度切断され、クロマトグラフィーにより識別される周期的手順である。工程１において、フェニルイソチオシアネート（ｐｈｅｎｕｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＰＩＴＣ）Ｅｄｍａｎ試薬をアルカリ性条件下でＮ末端アミノ基に結合する。工程２において、Ｎ末端残基を酸性媒体中で切断する。工程３において、ＰＩＴＣ結合残基をフラスコに移し、ＰＴＨ残渣に変換し、ＨＰＬＣにより識別する。次いで次のサイクルを次のＮ末端残基の識別のために開始する。断片Ｆ３についてのＮ末端配列はタウ４Ｒ２Ｎのアミノ酸３４１〜３４６に対応するＳＥＫＬＤＦ（配列番号１８）であると決定し、タウプロテアーゼがＬｙｓ３４０とＳｅｒ３４１との間でそれ自身を切断することを示す。
【図５】図５は、タウタンパク質４Ｒ２Ｎ（アミノ酸３３５〜３５３）のペプチド断片がタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼにより切断されたことを示す。質量分析を使用した断片のＮ末端シークエンシングにより自己タンパク質分解部位を識別した。特に、Ｌｙｓ３４０−Ｓｅｒ３４１（３４０ＫＳ３４１）切断部位における切断は容易に起こった。したがって、ＫＳ切断部位（３４０ＫＳ３４１）を含有するタウタンパク質のアミノ酸３３５Ｇ〜３５３Ｌに対応する１９アミノ酸ペプチドを合成した。逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により反応をモニターした。下側のトレースはペプチド単独を示し、上側のトレースはタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼとインキュベートしたペプチドを示し、その両方を３７℃で一晩インキュベートした。下側のトレースにおいて、未切断ペプチドは約２１．２５分の保持時間を示す。アスタリスクはマーカーとして使用した非特異的不純物を示す。上側トレースは、２つの生成物断片が約１７．５（Ｆ１）および２０．５（Ｆ２）分の保持時間を有したことを示す。試験した反応条件下で反応は９０％より多く完了し、その結果は、その自己タンパク質分解反応に加えてペプチドを切断するタウプロテアーゼの能力を決定的に実証した。１０μｇのタウペプチド３３５−３５３（ＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫ）（配列番号１９）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ，ＵＳＡ）によりカスタム合成し、１ｍｇを１ｍＬの緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中に溶解した。２９μｇのペプチドを、３７℃にて２０時間、３０μＬの緩衝液中の１１μｇのタウ三量体プロテアーゼとインキュベートし、分析的Ｃ１８カラム（１２．５ｃｍ×２．１ｃｍ、５μｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ））上で０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％のアセトニトリルにおけるアセトニトリルの線形勾配を使用してＨＰＬＣ［ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ（登録商標）３２Ｋａｒａｔ（商標）ＬＣ−ＣＥシステム，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，（インディアナポリス、ＩＮ）］により分析した。３０μｇのペプチドを陰性対照としてタウプロテアーゼを含まずにインキュベートし、同じ方法を用いて分析した。
【図６Ａ】図６Ａは部分的消化から識別した断片−対を示す。Ｃ末端およびＮ末端に特異的な抗体を使用してタウ４Ｒ２Ｎタンパク質の部分的消化から観測した断片を識別するためにウェスタンブロットを実施した。図６Ａ：精製したタウ４Ｒ２Ｎ単量体、二量体および三量体調製物を、緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で３７℃にて０、２および１６時間インキュベートし、還元剤を有する試料緩衝液を用いて４〜２０％のポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル上で実施した。左から右に、レーン１〜３：単量体、０、２、１６時間インキュベーション；レーン４〜６：二量体、０、２、１６時間インキュベーション；レーン７〜９：三量体、０、２、１６時間インキュベーション。ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。Ｃ末端に特異的な抗体、アミノ酸４０４〜４４１タウ４Ｒ２Ｎにおけるエピトープ（モノクローナルＴ４６，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用してタウ４Ｒ２Ｎタンパク質の部分的消化から観測した断片を識別するために使用する免疫ブロットを実施した。ブロットを剥がし、Ｎ末端、アミノ酸８３〜１２０タウ４Ｒ２Ｎにおけるエピトープに対する抗体（モノクローナル抗体Ｔ１４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて再プローブした。
【図６Ｂ】図６Ｂは部分的消化から識別した断片−対を示す。Ｃ末端およびＮ末端に特異的な抗体を使用してタウ４Ｒ２Ｎタンパク質の部分的消化から観測した断片を識別するためにウェスタンブロットを実施した。図６Ｂ：標準物としてタウオリゴマーラダーを使用し、転移をｌｏｇＭｗに適合して各断片の分子量を決定した。４５．８ＫＤａのタウ４Ｒ２Ｎ  ＭＷの分子量と合計した断片対をマッチングすることにより、部分的消化の間に切断したＫＳ部位の識別が可能となった。さらに、ＫＴ部位における切断と一致した断片もまた、この方法を使用して識別した。このように、質量スペクトルおよびウェスタンブロットから識別したタウ切断部位モチーフはＰ１−Ｋ−（Ｓ，ＴまたはＩ）−Ｐ１’であった。
【図７】図７は、タウタンパク質の２１０−ａａ断片（ＴＰ−２１０；タウ４Ｒ２Ｎ１３１−３４０）がタンパク質分解活性を保持し、それ故、タウのタンパク質分解領域を画定したことを示す。アミノ酸１３１〜３４０、２１０−ａａ断片（プラスその発現に必要なさらなる開始メチオニン）はタウプロテアーゼ活性を保有したことを示す。タウ４Ｒ２Ｎ  １３１〜３４０（ＴＰ−２１０）のアミノ酸配列を示す：ＭＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫ（配列番号１）。タウプロテアーゼ、タウ４Ｒ２Ｎ（アミノ酸３３５〜３５３）ＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫ（配列番号１９）についてのペプチド基質の開裂を使用して、逆相ＨＰＬＣを使用して活性をモニターした。下側のトレースはＴＰ−２１０の不存在下で反応緩衝液中でインキュベートしたペプチドを示し、上側のトレースはＴＰ−２１０とインキュベートしたペプチドを示す。下側のトレースにおける大きなピークは、インタクトなペプチドが上側のトレースにおいて非常に減少し、ＴＰ−２１０により生成される断片を表す２つの小さなピークＦ１およびＦ２と置き換わっていることを示した。アスタリスクはマーカーとして使用した非特異的不純物に由来する人工ピークを示す。１２マイクログラムのタウ４Ｒ２Ｎペプチド（アミノ酸３３５〜３５３）を、３７℃にて一晩、オリゴマー化したＴＰ−２１０と共にまたはオリゴマー化したＴＰ−２１０を有さずにインキュベートし、分析的Ｃ１８カラム（１２．５ｃｍ×２．１ｍｍ、５μｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ））上で０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％のアセトニトリルにおけるアセトニトリルの線形勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ（ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ（登録商標）３２Ｋａｒａｔ（商標）ＬＣ−ＣＥシステム、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，（インディアナポリス，ＩＮ））により分析した。
【図８】図８は、切断型タウタンパク質ＴＰ−９９がペプチド消化ＨＰＬＣアッセイにおいてプロテアーゼ活性を示したことを実証する。アミノ酸２４１〜３４０、９９−アミノ酸断片（プラスその発現に必要なさらなる開始メチオニン）はタウプロテアーゼ活性を保有し、それにより、野生型タウタンパク質のタンパク質分解領域をさらに画定することを決定した。タウ４Ｒ２Ｎ  ２４１−３４０（ＴＰ−９９）のアミノ酸配列を示す：ＭＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫ（配列番号３）。図７のように、タウプロテアーゼタウ４Ｒ２Ｎ（アミノ酸３３５〜３５３）についてのペプチド基質の開裂を、逆相ＨＰＬＣを使用して活性をモニターするために使用した。下側のトレースはＴＰ−９９の不存在下で反応緩衝液中でインキュベートしたペプチドを示し、真ん中のトレースはＴＰ−９９とインキュベートしたペプチドを示す。下側のトレースにおける大きなピークは、上側のトレースにおいて大きく減少し、ＴＰ−９９により生成される断片を表わす２つの小さなピークＦ１およびＦ２と置き換わっているインタクトなペプチドを示す。１００μＭの塩化亜鉛の添加により、タウ４Ｒ２ｎ  ２４１〜３４０（ＴＰ−９９）の活性が増加した（上側のトレース）。アスタリスクはインキュベーション管に由来する人工ピークを示す。１０マイクログラムのタウペプチド３３５〜３５３（ＯＰ−００１）を、３７℃にて４４時間、３０μＬの緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中でＴＰ−９９を含まず、２５μＬのＴＰ−９９オリゴマーラダーと共に、またはさらなる１００μＭの塩化亜鉛と共にインキュベートした。分析的Ｃ１８カラム（１２．５ｃｍ×２．１ｍｍ、５μｍ、（Ｓｕｐｅｌｃｏ））上で０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％のアセトニトリルにおけるアセトニトリルの線形勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ（ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ（登録商標）３２Ｋａｒａｔ（商標）ＬＣ−ＣＥシステム、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，（インディアナポリス，ＩＮ））により試料を分析した。
【図９Ａ】図９Ａは、タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼがα−エンドルフィンペプチドを切断することを示す。ヒトα−エンドルフィンペプチド［ＴｙｒＧｌｙＧｌｙＰｈｅＭｅｔＴｈｒＳｅｒＧｌｕＬｙｓＳｅｒＧｌｎＴｈｒＰｒｏＬｅｕＶａｌＴｈｒ（配列番号１３）（Ａｂｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＬＣ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）］を、１．２ｐｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼと共にまたは１．２ｐｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼを含まずに３７℃にて２０時間インキュベートし、分析的Ｃ１８カラム（１２．５ｃｍ×２．１ｍｍ、５μｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）上で０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％のアセトニトリルにおけるアセトニトリルの線形勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ（ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ（登録商標）３２Ｋａｒａｔ（商標）ＬＣ−ＣＥシステム，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，インディアナポリス，ＩＮ，ＵＳＡ）により分析した。ペプチドはタウにおける自己触媒開裂部位で見出されるその配列中にＬｙｓ−Ｓｅｒを含有しているので、タウプロテアーゼにより切断されると仮定される。タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼにより予測されるように２つの断片ピークが生成された。これらの結果は、タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼが神経伝達物質または神経活性ペプチドを開裂できることを示した。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼがＡＰＰ６６７〜６７６ペプチドを切断することを示す。ヒトＡＰＰ６６７〜６７６ペプチド［Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（配列番号１４）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）］を、１．２ｐｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼと共にまたは１．２ｐｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼを含まずに３７℃にて２０時間インキュベートし、分析的Ｃ１８カラム（１２．５ｃｍ×２．１ｍｍ、５ｐｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）上で０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％のアセトニトリルの線形勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ（ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ（登録商標）３２Ｋａｒａｔ（商標）ＬＣ−ＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）により分析した。２つの主要な断片ピークがＡＰＰ６６７〜６７６ペプチド由来のタウプロテアーゼにより生成され、配列中のＬｙｓ残基の後にタウプロテアーゼが切断することが示唆される。アスタリスクはペプチドに関係のない人工ピークを示す。タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼは、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）切断部位に隣接する最後から２番目のアミノ酸においてＡＰＰを切断し、それによりＡβ（１−４２）を生成する。タウプロテアーゼ活性はＣＳＦにおいて細胞外に観察されている。Ａβ（１−４２）の生成はＢＡＣＥ上方制御を導くニューロン内の炎症を刺激できる。さらに、Ａβ（１−４２）は血小板中で観察されており、Ｎ末端メチオニンのＢＡＣＥ開裂によりＡβ（１−４２）に変換され得る。タウプロテアーゼがアミロイドカスケードについての初期の活性化工程であり得ることが示唆される。
【図１０】図１０は、タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼが、タウ（４Ｒ１Ｎ）単量体およびタウ二量体を切断することを示す。タウオリゴマー形成は、毒性機能の増加およびタウ４Ｒ２Ｎ三量体活性により分解されるタウ単量体の機能の損失を導く。レーン１：タウ４Ｒ２Ｎ単量体（０．１μｇ）；レーン２：還元剤を含まない１×試料緩衝液；レーン３：４Ｒ２Ｎ三量体、４Ｒ１Ｎなし；レーン４：タウ４Ｒ１Ｎ、タウ４Ｒ２Ｎ三量体なし；レーン５：タウ４Ｒ２Ｎ三量体：タウ４Ｒ１Ｎ、１：１０；レーン６：タウ４Ｒ２Ｎ三量体：タウ４Ｒ１Ｎ三量体、１：１００；レーン７：タウ４Ｒ２Ｎ三量体：タウ４Ｒ１Ｎ１：１０。タウ三量体プロテアーゼ（４Ｒ２Ｎ）を、タウ４Ｒ１Ｎオリゴマー混合物と共におよびタウ４Ｒ１Ｎオリゴマー混合物を含まずに３７℃にて一晩インキュベートし、続いて、還元剤（最終β−メルカプトエタノール５％）の存在下で４〜２０％勾配Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、単量体および二量体の両方について特定の切断を観察した。矢印は、タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼ活性から生成されるタウ４Ｒ１Ｎの断片を示す。上側の矢印については、２つのアイソフォームの間で断片は同じ見かけのＭＷを有し、下側の矢印の断片はタウ４Ｒ２Ｎ由来の断片より速く移動するタウ４Ｒ１Ｎ由来の断片と異なる。
【図１１】図１１はタウ４Ｒ２Ｎプロテアーゼについてのセリンプロテアーゼ阻害剤パネルを示す。タウ４Ｒ２Ｎ三量体を、セリン特異的プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共にまたはセリン特異的プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含まずに３７℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション体積は０．１４５ｍｇ／ｍＬタウ４Ｒ２Ｎ三量体の最終濃度で３．４５マイクロリットルであった。レーン１−タンパク質標準物；レーン２−インキュベーションをしていないタウ４Ｒ２Ｎ単量体；レーン３−インキュベーションをしていない（プロテアーゼ阻害剤を含まない）タウ４Ｒ２Ｎ三量体；インキュベーションをした（プロテアーゼ阻害剤を含まない）レーン４−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン５−１ｍＭのフッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）とインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；８００ｎＭのアプロチニンとインキュベートしたレーン６−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン７−１００μＭのアンチパインとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン８−１００μＭのキモスタチンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン９−１００マイクロモルのエラスタチナールとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；３８．１ｍＭのε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）とインキュベートしたレーン１０−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；５００μＭのメシル酸ガベキサートとインキュベートしたレーン１１−タウ４Ｒ２Ｎ酸量体；１００μＭのロイペプチンとインキュベートしたレーン１２−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；５００μＭのメシル酸ナファモスタットとインキュベートしたレーン１３−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；１００μＭのトシルリシンクロモメチルケトン塩酸塩（ＴＬＣＫ−ＨＣＬ）とインキュベートしたレーン１４−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；１００μＭのＮ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロモメチルケトン（ＴＰＣＫ）とインキュベートしたレーン１５−タウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１６−４μＭのトリプシン阻害剤とインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１７−１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）とインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１８−２０％のジメチルスルホキシドとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体。
【図１２】図１２はセリンプロテアーゼ阻害剤パネルとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体を示す。タウ４Ｒ２Ｎ三量体を、低濃度および高濃度にてセリン特異的プロテアーゼ阻害剤と共におよびセリン特異的プロテアーゼ阻害剤を含まずに３７℃にて一晩インキュベートした。レーン１：インキュベーションを用いない（プロテアーゼ阻害剤を含まない）タウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン２：プロテアーゼ阻害剤を含まずにインキュベートした４Ｒ２Ｎ三量体；レーン３：１μＭのトリプシン阻害剤とインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン４：４μＭのトリプシン阻害剤とインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン５：０．１ｍＭのＡＥＢＳＦとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン６：１ｍＭのＡＥＢＳＦとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン７：１ｍｇ／ｍＬのＥＡＣＡとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン８：５ｍｇ／ｍＬのＥＡＣＡとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン９：１μＭのアンチパインとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１０：１００μＭのアンチパインとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１１：１０ｎＭのアプロチニンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１２：８００ｎＭのアプロチニンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１３：１０μＭのキモスタチンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１４：１００μＭのキモスタチンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１５：１０μＭのロイペプチンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体；レーン１６：１００μＭのロイペプチンとインキュベートしたタウ４Ｒ２Ｎ三量体。試験した阻害剤の中で、キモスタチンは試験したセリンプロテアーゼ阻害剤の最大の阻害剤効果を示した。さらに、タウプロテアーゼ活性は用量依存的にセリンプロテアーゼ阻害剤パネルにより阻害された。活性は、プロテアーゼ阻害剤の特異性に基づいて、および質量スペクトルデータに基づいてセリンプロテアーゼファミリーと一致し、トリプシンなどの一部のセリンプロテアーゼの特徴を示す塩基性アミノ酸リシン（Ｋ）の後に開裂を示す。
【図１３】図１３はセリンヒドロラーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦにより遮断されたオリゴマー化タウ４Ｒ２Ｎを標識するＦＰ−ＴＡＭＲＡを示す。この方法は独立して、タウがセリンヒドロラーゼであることを示した。タウ４Ｒ２Ｎオリゴマーラダーを、セリンプロテアーゼにおける活性部位セリンに特異的なプローブである、蛍光性タグ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合したフルオロホスホネート（ＦＰ）で標識した。ＦＰプローブは酵素活性セリンヒドロラーゼのセリンを特異的に標識する。セリンプロテアーゼ特異的阻害剤であるＡＥＢＳＦを、タウがＦＰに特異的に標識したかどうかを決定するために用量反応研究に使用した。標識した試料の４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００（商標）スキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で画像化し、続いてクマシー製品ＧｅｌＣｏｄｅＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色して全タンパク質を可視化し、レーン中のタンパク質の等しい負荷を実証した。その結果により、ＡＥＢＳＦ濃度が増加するにつれてタウ標識が用量依存的に阻害したことが示された。試料を還元剤を含まずまたは示した還元剤と共に泳動した。標識化のために、１０μｇのタウ４Ｒ２Ｎを、１０μＬの緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＮＰ−４０、５％のグリセロール）中の５マイクロモル濃度のＦＰ−ＴＡＭＲＡで室温にて４時間暗所で標識した。試料を、室温にて１時間、０、０．１、１．０、または１０．０ｍＭのＡＥＢＳＦで前処理して、ＦＰ−ＴＡＭＲＡプローブを加える前に活性部位セリンを遮断した。試料を半分に分け、示した還元剤を含むかまたは含まない試料緩衝液で実施した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＡＥＢＳＦがタウ４Ｒ２ｎ三量体プロテアーゼ活性を阻害したことを示す。図５に記載したタウ４Ｒ２Ｎ三量体活性についてのペプチドアッセイを使用して一連のセリンプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。１ｍＭのＡＥＢＳＦを、ペプチド基質を添加する前に室温にて１時間、タウ４Ｒ２Ｎ三量体とインキュベートした。この結果により、タウ４Ｒ２Ｎ三量体がセリンプロテアーゼのクラスであり、タウプロテアーゼの阻害剤を識別するためにこのアッセイを使用して分子がスクリーニングされ得ることが示された。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、アンチパインがタウ４Ｒ２Ｎ三量体活性を阻害したことを示す。１００ｐＭのアンチパイン、セリン／システインプロテアーゼおよび一部のトリプシン様セリンプロテアーゼの可逆的阻害剤はペプチドの開裂を強力に阻害した。図５に記載したタウプロテアーゼ活性についてのペプチドアッセイを使用して一連のセリンプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。１００ｐＭのアンチパインを、ペプチド基質を加える前に室温にて１時間、タウ４Ｒ２Ｎ三量体とインキュベートした。この結果により、タウプロテアーゼがセリンプロテアーゼのクラスであり、分子が、タウプロテアーゼの阻害剤を識別するためにこのアッセイを使用してスクリーニングされ得ることが示される。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、アプロチニンがタウプロテアーゼ活性を強力に阻害したことを示す。図５に記載したタウペプチド活性についてのペプチドアッセイを使用して一連のセリンプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。８００ｎＭのアプロチニンを、ペプチド基質を加える前に室温にて１時間、タウプロテアーゼとインキュベートした。この結果により、タウプロテアーゼがセリンプロテアーゼのクラスであり、分子が、タウプロテアーゼの阻害剤を識別するためにこのアッセイを使用してスクリーニングされ得ることが示された。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、キモスタチンがタウプロテアーゼ活性を阻害したことを示す。キモスタチンは、いくつかの成分（キモスタチンＡ、キモスタチンＢ、キモスタチンＣ）の混合物であり、キモトリプシン、キモトリプシン様セリンプロテイナーゼ、キマーゼを含む多くのプロテアーゼの強力な阻害剤である。９９ｐＭのキモスタチンはペプチドの開裂を強力に阻害した。図５に記載したタウプロテアーゼ活性についてのペプチドアッセイを使用して一連のセリンプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。９９ｐＭのキモスタチンを、ペプチド基質を加える前に室温にて１時間、タウプロテアーゼとインキュベートした。この結果により、タウプロテアーゼがセリンプロテアーゼのクラスであり、分子が、タウプロテアーゼの阻害剤を識別するためにこのアッセイを使用してスクリーニングされ得ることが示された。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、ＰＭＳＦがタウ４Ｒ２Ｎ三量体活性を阻害したことを示す。１ｍＭのＰＭＳＦ、セリンプロテアーゼの不可逆阻害剤はペプチドの開裂を強力に阻害した。図５に記載したタウプロテアーゼ活性についてのペプチドアッセイを使用して一連のセリンプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。１μＭのＰＭＳＦを、ペプチド基質を加える前に室温にて１時間、タウ４Ｒ２Ｎ三量体とインキュベートした。この結果により、タウプロテアーゼがセリンプロテアーゼのクラスであり、分子が、タウプロテアーゼの阻害剤を識別するためにこのアッセイを使用してスクリーニングされ得ることが示される。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。また、パパイン（ＤＴＴ処理により可逆性）およびアセチルコリンエステラーゼを阻害するが、メタロ−、アスパラギン酸およびほとんどのシステインプロテアーゼを阻害しない。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、メシル酸ガベキサート、セリンプロテアーゼ特異的阻害剤は試験した濃度においてペプチドの開裂を有意に阻害しないことを示す。図５に記載したタウプロテアーゼ活性についてのペプチドアッセイを使用して一連のセリンプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。１５０ｐＭのメシル酸ガベキサートを、ペプチド基質を加える前に室温にて１時間、タウプロテアーゼとインキュベートした。この結果により、タウプロテアーゼがセリンプロテアーゼ特異的阻害剤に対する選択性を示すことが示される。アスタリスクはペプチドに関連していない人工ピークを示す。メシル酸ガベキサートは膵炎の処置に治療的に使用される合成セリンプロテアーゼ阻害剤である。
【図１５】図１５はタウプロテアーゼによるタウＦＲＥＴペプチド切断の断片を示す。タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼおよび逆相ＨＰＬＣ分析を使用してタウプロテアーゼＦＲＥＴアッセイのために設計されたプチドＯＰ−００２を切断する試験が示される。タウプロテアーゼ活性のＦＲＥＴ分析のためのペプチドＯＰ−００２は配列：ＭＣＡ−ＧＧＱＶＥＶＫＳＥ｛Ｌｙｓ（ＤＮＰ）｝（配列番号１５）を有し、ここで、ＭＣＡは蛍光メトキシクマリンであり、ＤＮＰは消光ジニトロフェノールである。ペプチドのＣ末端におけるＬｙｓ残基の付加はＤＮＰをペプチドにコンジュゲートするのに必要であった。ペプチドＯＰ−００２は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）によりカスタム合成した。５μｇのペプチドＯＰ−００２を、２０マイクロリットルの緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中の０、１２０ｎｇ、６００ｎｇまたは１２００ｎｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体とインキュベートし、３７℃にて２０時間インキュベートした。分析のために十分な体積を得るために１０μＬのＨ２ＯをＨＰＬＣの前に加えた。分析的Ｃ１８カラム（１２．５ｃｍ×２．１ｍｍ、５μｍ、（Ｓｕｐｅｌｃｏ）上で０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％のアセトニトリルにおけるアセトニトリルの線形勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ（ＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ（登録商標）３２Ｋａｒａｔ（商標）ＬＣ−ＣＥシステム，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，（インディアナポリス，ＩＮ，ＵＳＡ））により分析を実施した。
【図１６】図１６は、タウプロテアーゼによるタウＦＲＥＴペプチド切断の蛍光を示す。５μｇのペプチドＯＰ−００２を、２０μＬの緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中の０、１２０ｎｇ、６００ｎｇまたは１２００ｎｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体とインキュベートし、３７℃にて２３時間インキュベートした。１０μＬの各試料を、ブラック９６ウェルプレートにおいて４０μＬの２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４を含有するウェルに移し、試料体積がウェルの底部を覆うことができるように混合した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してウェルにおける蛍光を測定した。
【図１７】図１７はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）におけるタウプロテアーゼ切断部位を示す。
【図１８】図１８は、Ａβ（１−４２）産生の活性化を生じるアルツハイマー病におけるタウプロテアーゼ作用様式についての疾患モデルを示す。細胞内ドメインを含むＡＰＰにおけるさらなる部位での切断は正常なＡＰＰおよびＡＰＰ断片機能を妨げ得る。
【図１９】図１９は、２１０アミノ酸切断型タウタンパク質、タウ４Ｒ２Ｎ１３１〜３４０（ＴＰ−２１０）（配列番号１）をコードする構築物の核酸配列（配列番号７）を示す。
【図２０】図２０は、９９アミノ酸切断型タウタンパク質、タウ４Ｒ２Ｎ２４１〜２４０（ＴＰ−９９）（配列番号３）をコードする構築物の核酸配列（配列番号９）を示す。
【図２１】図２１は、本発明の一態様に係る切断型タウタンパク質の大規模精製についてのフローチャートを示す。タウタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で発現させた。５００ｍＬの培養物を、０．６ＯＤに到達した６００ｎｍの波長における光学密度まで２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて増殖させた。タンパク質発現は、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて３時間、１ｍＭの最終濃度におけるイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加により可能となった。遠心分離により細胞を採取し、将来の使用まで凍結した。細胞ペレットを、ＣｅｌＬｙｔｉｃＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、全１７５０単位におけるベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭのキモスタチン、４μＭのダイズトリプシン阻害剤、および０．８μＭにおけるアプロチニンを含む細胞溶解緩衝液ｐＨ７．０中で再懸濁した。細胞を４℃にて３０〜６０分間溶解し、続いて溶解物が透明になるまで１５，３１７×ｇにて遠心分離した。溶解物を、穏やかに回転させながら４℃にて１時間、予め平衡化した陽イオン交換樹脂ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とインキュベートした。樹脂を４℃にて低速で遠心分離し、低塩緩衝液で３回洗浄し、２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で結合タンパク質を溶出した。分取電気泳動システム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を約２２０Ｖにて実施し、蠕動ポンプ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して画分を１ｍＬ／分の流速で回収する。４〜２０％の勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ）を使用して還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分を分析した。タンパク質画分をプールし、３０，０００Ｄａの分画分子量を有するＡｍｉｃｏｎ限外濾過装置（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中で交換した。
【図２２】図２２は、矢印により各々について示した切断部位を有するタウＯＰ−００１（ａａ３３５−３５３）（配列番号１６）、ヒトＡＰＰのａａ６６７−６７６（配列番号１４）、およびヒトα−エンドルフィンペプチド（配列番号１３）配列を示すＨＰＬＣ研究のために使用される例示的なペプチド配列を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、アルツハイマーの脳の試料由来のタウタンパク質に対して抗体で免疫精製した活性セリンヒドロラーゼについてのプローブによるタンパク質の特異的標識を示し、タウタンパク質がセリンヒドロラーゼ活性を有することを示唆している。セリンヒドロラーゼはセリンプロテアーゼを含む酵素のクラスを含む。セリンヒドロラーゼスーパーファミリーは、セリン求核試薬を含む触媒機構を共有する最大の公知の酵素ファミリーのうちの１つである。フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）は、それらの酵素活性を不活性化し、プローブがそれらを標識することを防ぐためにセリンヒドロラーゼの活性部位セリンに不可逆的に結合する。ＰＭＳＦで処理した後の標識が減少したバンド内のタンパク質を、活性セリンヒドロラーゼ（矢印により示した）についてのプローブにより特異的に標識した。１ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ、２０ｍＭのホスホラミドン、ホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＴＰＥＲ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＤｏｕｎｃｅ均質化によりＡＤ脳からタンパク質を抽出した。１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離により溶解物を清浄した。上清を、ストレプトアビジン−アガロース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチンについて枯渇させた。活性セリンヒドロラーゼに特異的であるプローブ、蛍光カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）タグ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識したフルオロホスネート（ＦＰ）を、２μＭの最終濃度にて溶解物とインキュベートした。非特異的標識についての対照として、溶解物の一部を、ＦＰ−ＴＡＭＲＡプローブを使用する前に、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、タウプロテアーゼを含むセリンヒドロラーゼの不可逆阻害剤で処理した。ビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ストレプトアビジン−アガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有する溶解物由来の全てのタウを捕捉した。タンパク質を抗体に結合させ、ジスルフィド還元剤β−メルカプトエタノールを有するまたは有さないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解したビーズにより捕捉した。蛍光画像をＴｙｐｈｏｏｎ（登録商標）スキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて捕捉した。レーン１：タウ免疫枯渇後の溶解物、ＰＭＳＦ処理なし；レーン２：タウ免疫枯渇後の溶解物、ＰＭＳＦを用いたＰＭＳＦ処理による；レーン３：免疫捕捉タンパク質、ＰＭＳＦ処理なし；レーン４：免疫捕捉タンパク質、ＰＭＳＦ処理した。ジスルフィド媒介性タウオリゴマーが標識されているかどうかを決定するために還元剤を用いず（図２３Ａ）試料を流した。白色のバンドは画像捕捉のために使用した電圧における過剰露出に起因する。タウ免疫沈降からバンドを可視化するのに高電圧を必要とした。これらの結果により、ＡＤ脳がセリンプロテアーゼ活性を有するタウを含有することが示され、疾患プロセスにおけるその役割が支持される。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび図２３Ｂは、アルツハイマーの脳の試料由来のタウタンパク質に対して抗体で免疫精製した活性セリンヒドロラーゼについてのプローブによるタンパク質の特異的標識を示し、タウタンパク質がセリンヒドロラーゼ活性を有することを示唆している。セリンヒドロラーゼはセリンプロテアーゼを含む酵素のクラスを含む。セリンヒドロラーゼスーパーファミリーは、セリン求核試薬を含む触媒機構を共有する最大の公知の酵素ファミリーのうちの１つである。フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）は、それらの酵素活性を不活性化し、プローブがそれらを標識することを防ぐためにセリンヒドロラーゼの活性部位セリンに不可逆的に結合する。ＰＭＳＦで処理した後の標識が減少したバンド内のタンパク質を、活性セリンヒドロラーゼ（矢印により示した）についてのプローブにより特異的に標識した。１ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ、２０ｍＭのホスホラミドン、ホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＴＰＥＲ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＤｏｕｎｃｅ均質化によりＡＤ脳からタンパク質を抽出した。１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離により溶解物を清浄した。上清を、ストレプトアビジン−アガロース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチンについて枯渇させた。活性セリンヒドロラーゼに特異的であるプローブ、蛍光カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）タグ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識したフルオロホスネート（ＦＰ）を、２μＭの最終濃度にて溶解物とインキュベートした。非特異的標識についての対照として、溶解物の一部を、ＦＰ−ＴＡＭＲＡプローブを使用する前に、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、タウプロテアーゼを含むセリンヒドロラーゼの不可逆阻害剤で処理した。ビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ストレプトアビジン−アガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有する溶解物由来の全てのタウを捕捉した。タンパク質を抗体に結合させ、ジスルフィド還元剤β−メルカプトエタノールを有するまたは有さないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解したビーズにより捕捉した。蛍光画像をＴｙｐｈｏｏｎ（登録商標）スキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて捕捉した。レーン１：タウ免疫枯渇後の溶解物、ＰＭＳＦ処理なし；レーン２：タウ免疫枯渇後の溶解物、ＰＭＳＦを用いたＰＭＳＦ処理による；レーン３：免疫捕捉タンパク質、ＰＭＳＦ処理なし；レーン４：免疫捕捉タンパク質、ＰＭＳＦ処理した。ジスルフィド媒介性タウオリゴマーが標識されているかどうかを決定するために還元剤を用いて（図２３Ｂ）試料を流した。白色のバンドは画像捕捉のために使用した電圧における過剰露出に起因する。タウ免疫沈降からバンドを可視化するのに高電圧を必要とした。これらの結果により、ＡＤ脳がセリンプロテアーゼ活性を有するタウを含有することが示され、疾患プロセスにおけるその役割が支持される。
【図２４】図２４は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（配列番号１７）のアミノ酸配列を示す。
【図２５】図２５は、タウ４Ｒ２Ｎ２６０〜３４０がタウＦＲＥＴペプチドを切断することを示す。タウ４Ｒ２Ｎ２６０〜３４０構築物が、図２２および図２３に記載したタウＦＲＥＴペプチドを使用してプロテアーゼ活性を有するかどうかを決定するためにＦＲＥＴアッセイを実施した。２．５μｇのタウＦＲＥＴペプチドを、単独で、または３０μＬの緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２）中の１０、２５もしくは５０μｇのオリゴマー化タウ４Ｒ２Ｎ２６０〜３４０と３７℃にて１７時間インキュベートした。９６ウェルプレートのウェルについてのバックグラウンド値を決定するために、９５マイクロリットルの緩衝液を、ブラック９６ウェルＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ  Ｉプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに加え、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して（図２３に記載したような）信号を決定した。５μＬの各試料をウェル中の緩衝液と混合し、信号を決定した。試料とバックグラウンドとの間の相違を棒グラフに示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の例示的な実施形態を以下に示す。明確さの目的において、実際の実施の全ての特徴が本明細書に記載されているわけではない。もちろん、任意のこのような実際の実施形態の開発において、多くの実施に特有な決定が、実施ごとに変化する、システムに関連し、ビジネスに関連した制限との適合性などの開発者の特定の目標を達成するためになされなければならないことは理解されるであろう。さらに、このような開発の試みは、複雑であり、時間を消費するが、本開示の利益を有する当業者にとって慣用の実施であることが理解されるであろう。
【００６８】
タウプロテアーゼはジスルフィド結合により安定されるオリゴマータウ種の形成により活性化される。タウプロテアーゼは、タウ単量体および高次の凝集体、チューブリン、ＡＰＰ、およびまた、アルファ−エンドルフィンなどの重要な神経ペプチドを含む、アルツハイマー病に重要である多くのタンパク質を切断することが実証されている。
【００６９】
脳内のタウプロテアーゼの蓄積はアルツハイマー病の進行の主要な原因と考えられる。アルツハイマー病の治療のための有効な薬物は存在しないので、タウプロテアーゼの阻害を研究すること、およびアルツハイマー患者における治療的介入に有用な阻害剤を同定することに興味が集中している。活性タウオリゴマー調製物の野生型マウスへの注入により、記憶形成の阻害ならびにＣＲＥＢリン酸化の減少およびヒストン４アセチル化（両方、記憶形成の分子マーカーである）の阻害が示される。さらに、マウス海馬スライスを使用した注入研究により、長期増強（ＬＴＰ）における用量依存性の機能障害、メモリ形成の電気生理学的尺度が示される。さらに、タウは、ＣＳＦ中に存在し、疾患重篤度と共に増加し、その独自の病理の広がりの原因となり得ることが示される。さらに、ＡＰＰを開裂するその能力は、増加したＢＡＣＥ産生および疾患細胞がアポトーシスに入る減少した能力の両方を生じるアミロイドカスケードモデルを活性化し得る。細胞外タウプロテアーゼは既知の機能を有さない病理と考えられる。したがって、ＣＳＦにおける細胞外または細胞内のいずれかのこの活性を遮断する阻害剤の開発は、有害な副作用を有さず、したがって主要な毒性を有さずに疾患の全ての段階におけるＡＤ患者についての顕著な臨床的有益性を示し得る。
【００７０】
タウタンパク質のアイソフォーム
タウ構造アイソフォームは、チューブリン結合ドメインの数（タンパク質のＣ末端半分に位置する３または４個の反復）において互いに異なり得、それぞれ３Ｒまたは４Ｒタウアイソフォームと称される。それらはまた、１つまたは２つの２９アミノ酸長、タンパク質のＮ末端部分（突出ドメイン）における強い酸性の挿入物のいずれかの存在または非存在において異なり得る。突出ドメインと微小管結合ドメインとの間に、塩基性のプロリンリッチ領域が存在する。タウ４Ｒ２Ｎは、それが緩衝液（ＳＤＳの除去後、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で３７℃にてインキュベートされて、ジスルフィド媒介性オリゴマーを形成する場合、自己タンパク質分解開裂を受ける。タウ４Ｒ１Ｎは同様の特性を示した。活性プロテアーゼを形成する不活性単量体の自己相互作用をカスパーゼにより例示する。活性部位は両方の単量体由来のループから構成されるので、二量化はプロカスパーゼ活性化に重要である。三量体の活性はプロテアーゼおよび神経毒性アッセイの両方において二量体より大きかった。インキュベーションの間、タウ単量体およびタウ二量体は、ゲル上の明確な上側のバンドで観測される限り、高次の凝集体を形成するのに対して、三量体はさらなる高次の凝集体を形成しない。高次オリゴマーを形成する反応性の欠如は、構造が遊離チオールを１つも含まないことを示唆する。タウ三量体ジスルフィドの形成に基づいたモデルは、潜在的な提案される触媒三残基アミノ酸を同定する。
【００７１】
精製したタウ三量体により、長時間のインキュベーションの間に最も完全な自己タンパク質分解活性により３つの主要な断片が与えられることが実証された。単量体調製物は、精製の間にオリゴマーを形成し、同時に断片を形成した。二量体および三量体調製物は、緩衝液交換の間、および精製プロセスの終わりの濃度にて自己タンパク質分解断片化を開始した。ジスルフィド媒介性タウオリゴマーの形成はタウプロテアーゼ活性を活性化した。ザイモグラム分析により、タウ種（インキュベーションの間にジスルフィド媒介性凝集体を形成する単量体バンドについて観測した活性に加えて高次の凝集体およびタウ断片）と相関したプロテアーゼ活性により、汚染により引き起こされる可能性が除外されると実証された。タウバンドと自己タンパク質分解活性との間の特別な相関関係により、タウ自体が活性を有し、汚染プロテアーゼではないことが示された。
【００７２】
タウプロテアーゼ開裂チューブリン
タウプロテアーゼはその自己触媒的開裂反応に加えてチューブリンを切断する。単量体タウの通常の活性はチューブリンと相互作用して、軸索中で微小管を形成し、安定化する。疾患において、チューブリンを分解する活性と共にタウオリゴマー形態は、微小管および神経機能の破壊についての直接的な病理学的機構であると示唆される。タウ三量体プロテアーゼを、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）カクテル（セリンプロテアーゼ、アミノ−ペプチド、システインプロテアーゼおよびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤を含有する）と共にまたはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）カクテルを有さずに一晩インキュベートした場合、ＰＩカクテルは酵素機能と一致した様式でさらなる断片化を阻害した。現在のデータにより、タウ三量体は最も高いプロテアーゼ活性を有するが、タウ二量体は中間の活性を有し、タウ単量体は低いプロテアーゼ活性を有することが示唆される。データはまた、活性三量体プロテアーゼ中に遊離チオールが存在せず、タウプロテアーゼはシステインプロテアーゼではないことが示唆される。
【００７３】
タウのＣ末端およびＮ末端部分に特異的である抗体を使用したウェスタンブロット分析は、タウのカルボキシ末端に対する６．２ＫＤａ断片（断片１）を正確に示し、１．７ＫＤａ断片（断片３）は微小管結合ドメインを含有し、１９．５ＫＤａ断片（断片２）はタウのＣ末端を含有することを示唆する。結合微小管に加えて、タウはまた、細胞膜の成分と相互作用する。タウのＮ末端突出ドメインは細胞膜と会合する。オリゴデンドロサイトにおいて、タウはｆｙｎとの相互作用によりプロセス形成（膜伸長）を調節する。セリン／トレオニン残基におけるタウのＮ末端半分内のリン酸化は、ニューロン膜とのその会合を調節する。Ｆｙｎ、チロシンキナーゼは、そのプロリンリッチ領域を介してタウと相互作用し、Ｎ末端においてタウをリン酸化し、それを細胞膜に移行する。セリン／トレオニン残基におけるリン酸化は、タウ−Ｆｙｎ相互作用を阻害し、膜に移行する。タウのこの樹枝状の役割は、ＡＤの病理および治療について直接関係がある後シナプスにおいてＡβ毒性を与えることである。配列分析により、タウプロテアーゼはＡβを生じる３−セクレターゼ部位に隣接するＡＰＰを切断できることが示唆される。このことは、Ａβおよびタウ病理の両方を直接結び付けるのでアルツハイマー病において重要であり得る。したがって、タウプロテアーゼの阻害は、タウおよびＡβ病理の両方を改善する効果的な治療的介入である。
【００７４】
切断型タウポリペプチドはプロテアーゼ活性を保持する
例示的な切断型タウペプチド（本明細書中でＴＰ−２１０、ＴＰ−９９、ＴＰ−１１８、ＴＰ−８３、およびＴＰ−８１とそれぞれ指定した）を同定し、調製し、それらはタウプロテアーゼ酵素活性を保持する。アミノ酸位置を野生型、４Ｒ２Ｎ形態のものの番号付けに対応して示した：
【００７５】
【表２】
2014522237.tif 000004
【００７６】
【表３】
2014522237.tif 000005
【００７７】
【表４】
2014522237.tif 000006
【００７８】
【表５】
2014522237.tif 000007
【００７９】
【表６】
2014522237.tif 000008
【００８０】
タウプロテアーゼポリヌクレオチドおよび発現
本発明の重要な態様は、１つ以上のタウプロテアーゼ活性ポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ部分および組換えベクター、ならびに１つ以上のタウプロテアーゼ活性ポリペプチドを発現するＤＮＡ技術の適用による組換え宿主細胞の作製および使用に関する。ＤＮＡ部分、組換えベクター、組換え宿主細胞およびこのようなポリペプチドを生成する発現方法もまた、本発明により提供される。本明細書で使用される場合、「核酸部分」という用語は、特定の種の全ゲノム核酸を含まない単離されているポリヌクレオチドを指す。したがって、タウプロテアーゼをコードするＤＮＡ部分とは、タウプロテアーゼコード配列を含有するＤＮＡ部分を指し、さらに全哺乳動物またはヒトゲノムＤＮＡから離れて単離されるか、あるいは全哺乳動物またはヒトゲノムＤＮＡを含まずに精製される。「ＤＮＡ部分」という用語に含まれるのは、ＤＮＡ部分およびそのような部分の小さな断片であり、また例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターである。
【００８１】
同様に、単離されたまたは精製されたタウプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ部分とは、タウプロテアーゼコード配列を含むＤＮＡ部分、ならびに特定の態様において、天然に存在する遺伝子またはタンパク質をコードする配列から離れて実質的に単離された調節配列を指す。これに関して、「遺伝子」という用語は、簡潔さのために、機能タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード単位を指すために使用される。当業者により理解されるように、この機能的用語は、タウプロテアーゼ、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および突然変異体を発現する、または発現するように適合され得るゲノム配列、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列および小さな遺伝子操作した遺伝子断片を含む。
【００８２】
「他のコード配列から離れて実質的に単離した」とは、目的の遺伝子、この場合タウプロテアーゼまたは遺伝子が、ＤＮＡセグメントのコード領域の有意な部分を形成し、ＤＮＡセグメントは大きな部分の天然に存在するコードＤＮＡ、例えば大きな染色体断片または他の機能的遺伝子もしくはｃＤＡＮコード領域を含有しないことを意味する。もちろん、これは、最初に単離されるＤＮＡセグメントを指し、ヒトの手により断片に後で加えられる遺伝子またはコード領域を排除しない。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはそれらの生物学的機能等価物のいずれか１つに由来する少なくとも約１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは７０またはそれ以上の連続アミノ酸配列を含む、実質的に完全長のタウプロテアーゼをコードする単離ＤＮＡセグメントおよび組換えベクター、または１つ以上の切断型タウプロテアーゼ、バリアント、変異体、融合物、もしくはそれらのエピトープをコードする断片および組換えベクターに関する。
【００８４】
本発明のタウプロテアーゼをコードする核酸断片は通常、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、またはその生物学的機能等価物のいずれか１つ由来の少なくとも約１２アミノ酸など、より好ましくは少なくとも約１６アミノ酸などの連続アミノ酸配列、さらにより好ましくは少なくとも約２０連続アミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチド；あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのようなコード配列にハイブリダイズするこのような配列コードする遺伝子および／またはＤＮＡ断片をコードする。
【００８５】
「実質的に配列番号ＸＸに記載される配列」という用語は、その配列が、配列番号ＸＸに列挙されている配列の一部に十分に対応し、配列番号ＸＸに列挙されているアミノ酸配列と同一でない、または生物学的機能等価物でない比較的少数のアミノ酸を有することを意味する。「生物学的機能等価物」という用語は、当該技術分野において十分に理解されており、さらに本明細書に詳細に定義される。したがって、タンパク質の生物活性（すなわちプロテアーゼ活性）が維持されている限り、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６のアミノ酸と同一または機能等価物であるアミノ酸の約８５％〜約９０％；またはより好ましくは約９１％〜約９５％；またはさらにより好ましくは約９６％〜約９９％を有する配列は、「実質的に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に記載される」配列である。
【００８６】
「機能的に等価なコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンについての６個のコドンなどの同じアミノ酸をコードするコドンを指すため、また、生物学的等価アミノ酸をコードするコドンを指すために本明細書に使用される。
【００８７】
また、配列が、タンパク質発現に関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む、上記の基準を満たす限り、アミノ酸および核酸配列は、追加のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸または５’もしくは３’配列などの追加の残基を含んでもよく、さらに実質的に本明細書に開示される配列の１つに記載されていることも理解されるであろう。末端配列の付加は特に、例えば、コード領域の５’もしくは３’タンパク質のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、または種々の内部配列、すなわち遺伝子内で発生することが知られているイントロンを含み得る核酸配列に適用する。
【００８８】
イントロンまたは隣接領域を除いて、および遺伝子コードの縮重を考慮して、配列は本明細書に開示されるヌクレオチド配列の１つ以上と同一であるヌクレオチドの約７５％〜約７９％；またはより好ましくは約８０％〜約８９％；またはさらにより好ましくは約９０％〜約９９％を有する。
【００８９】
本明細書に記載されるものと実質的に同じ配列もまた、比較的ストリンジェントな条件下でこのような配列の相補体を含有する核酸断片にハイブリダイズできる配列として機能的に定義され得る。適切な比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であろう。
【００９０】
本発明についての適切な標準的なハイブリダイゼーション条件としては、例えば、４２℃にて１６時間、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡにおけるハイブリダイゼーション、続いて所望の量のバックグラウンド信号を除去するために６０℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ溶液を用いた１時間の連続洗浄が挙げられる。本発明についてのより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件としては、例えば、４２℃にて１６時間、３５％のホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡもしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡにおけるハイブリダイゼーション、続いて５５℃にて０．８×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを用いた連続洗浄が挙げられる。分子生物学的分野における当業者は、所望のレベルのストリンジェンシーを得るために条件は容易に調節され得ることを認識するであろう。
【００９１】
当然に、本発明はまた、本明細書に記載される配列の１つ以上に相補的、または実質的に相補的である核酸セグメントを包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対合できるものである。本明細書に使用される場合、「相補配列」という用語は、上記の同じヌクレオチド比較によりアッセイされ得る場合、またはすぐ上に記載したものなどの比較的ストリンジェントな条件下で本明細書に開示される核酸セグメントの１つ以上にハイブリダイズできると定義される場合、十分に相補的である核酸配列を意味する。
【００９２】
コード配列自体の長さに関わらず、本発明の核酸セグメントは、プロモーター、ポリアデニル化信号、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコード断片など（それらの全長はかなり変化し得る）の他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよい。したがって、全長が好ましくは意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さにより制限される、ほとんど任意の長さの核酸断片が利用されてもよいことが考慮される。
【００９３】
本発明の開示されるタウプロテアーゼをコードする核酸配列について設計される種々のオリゴヌクレオチド検出プローブおよび増幅プライマーは任意の適切な長さであり得る。数値を配列に割り当てる（例えば第１の残基が１であり、第２の残基が２であるなど）ことによって、全てのプライマーを定義するアルゴリズムが提案され得る：
ｎ〜ｎ＋ｙ
式中、ｎは１から配列の末尾までの整数であり、ｙはプライマー−１の長さであり、ｎ＋ｙは配列の末尾を越えない。したがって、１２５−ｍｅｒについて、プローブは塩基１〜１２５、２〜１２６、３〜１２７などに対応する。３１５−ｍｅｒについて、プローブは塩基１〜３１５、２〜３１６、３〜３１７などに対応する。３６０−ｍｅｒについて、プローブは１〜３６０、２〜３６１、３〜３６２などに対応する。
【００９４】
本発明は、本明細書に開示される特定の核酸およびアミノ酸配列に限定されないこともまた理解されるであろう。したがって、組換えベクターおよび単離されたＤＮＡセグメントは、これらのコード領域自体、塩基コード領域において選択される変更または修飾を保有するコード領域を様々に含むか、あるいはそれらは、それでもなおこのようなコード領域を含む、より大きなポリペプチドをコードできるか、または変異アミノ酸配列を有する生物学的機能等価タンパク質もしくはペプチドをコードできる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチド断片は、１つ以上の生物学的機能等価タウプロテアーゼ、または１つ以上のタウプロテアーゼ由来切断型タンパク質、または１つ以上のタウプロテアーゼ関連ペプチド、それらのエピトープ、断片、バリアント、および／もしくは変異体をコードできる。このような配列は、核酸配列およびそれによりコードされるタンパク質内に天然に発生することが知られているコドン冗長性および機能的等価の結果として生じ得る。あるいは、機能的等価タンパク質またはポリペプチドは組換えＤＮＡ技術の適用により作製されてもよく、その組換えＤＮＡ技術において、タンパク質構造の変化は、交換されるアミノ酸の特性の考慮に基づいて操作されてもよい。人により設計される変化が、例えば、タンパク質の抗原性の改善を組み込むため、またはインビボおよび／もしくはインビボにおいてタウタンパク質もしくは１つ以上のそのタンパク質分解基質の機能を検査するために突然変異体を試験するために部位特異的突然変異誘発法の適用により組み込まれてもよい。
【００９６】
例えば、タウプロテアーゼコード領域が、精製または免疫検出目的などの所望の機能を有する他のタンパク質またはペプチド（例えば、それぞれアフィニティクロマトグラフィーにより精製され得るタンパク質および酵素標識コード領域）を有する同じ発現単位内に整列される融合タンパク質およびペプチドを調製してもよい。
【００９７】
また、例えば、約７〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約１０〜約３０アミノ酸長のペプチドなどの比較的小さなペプチド、ならびにまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に記載される１つ以上の連続アミノ酸配列に対応するタンパク質までのより大きなポリペプチドおよびそれらを含むより大きなポリペプチドをコードする核酸断片も本発明に包含される。
【００９８】
それらを含むポリヌクレオチドおよび核酸セグメントもまた、種々の適用のために利用されてもよい。例えば、特に有用な適用は、タウプロテアーゼまたはそのペプチド、バリアント、切断体、融合体、もしくはエピトープの組換え産生に関する。さらに、本発明のタウプロテアーゼをコードする核酸セグメントはまた、例えば、タウプロテアーゼ遺伝子または関連するゲノム配列の識別およびクローニングに使用され得る、あるいは遺伝子発現の研究などに使用され得る、タウ特異的核酸検出プローブまたは増幅プライマーの調製に使用されてもよい。
【００９９】
核酸検出およびハイブリダイゼーション
タウタンパク質またはセリンプロテアーゼ酵素活性を有するそのペプチド、ポリペプチド変異体または誘導体の発現を行う際のそれらの使用に加えて、本明細書に開示される核酸配列はまた、種々の他の用途も有する。例えば、それらはまた、タウタンパク質もしくはタウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを識別するための核酸ハイブリダイゼーションの実施形態におけるプローブまたはプライマーとしての有用性を有する。
【０１００】
例えば、約１４〜２０、２５〜３０、５０、７５、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００などのヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用により、安定かつ選択的の両方である二本鎖分子の形成が可能となる。ハイブリッドの安定性かつ選択性を増加させるために、約２０塩基長より長いストレッチにわたる相補配列を有する分子が一般に好ましく、それにより、得られる特定のハイブリッド分子の質および程度が改善する。本明細書に開示されるものの任意の領域由来の配列を使用する際に、約７５〜約３００ヌクレオチドまたは所望の場合それらより長いストレッチを有する核酸分子を設計することが一般に好ましい。本明細書に既に開示されているように、より特異領域から選択することによって、当業者は、より小さな配列が好ましい適用において、例えば、約１４〜２０、約２５、約３０、または約３５などのヌクレオチド長のより小さなオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーが設計され、利用され得ることを理解するであろう。
【０１０１】
全てのこのような断片は、例えば、化学的方法により、または組換え体産生のために選択される配列を組換えベクター内に導入することにより、断片を直接合成することを含む、当業者に公知の方法により容易に調製され得る。これらの化学的方法としては、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，６０３，１０２号（これらの各々はそれらの参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（商標））技術、または組換え体産生のために選択される配列を組換えベクター内に導入することが挙げられ得る。
【０１０２】
したがって、本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子またはＲＮＡの相補的ストレッチと二本鎖分子を選択的に形成するか、あるいは組織由来のＤＮＡまたはＲＮＡの増幅のためのプライマーを提供するそれらの能力のために使用され得る。想定される適用に応じて、標的配列に対するプローブの種々の程度の選択性を達成するためにハイブリダイゼーションの種々の条件を利用することが望まれる。特定の適用に関して、例えば、部位特異的突然変異誘発法によるヌクレオチドの置換に関して、より低いストリンジェントな条件が必要とされることが理解される。これらの条件下で、たとえプローブおよび標的鎖の配列が完全に相補的でなくても、ハイブリダイゼーションが起こり得るが、１つ以上の位置においてミスマッチが存在する。条件は、塩濃度を増加させ、温度を減少させることによって低いストリンジェントにすることができる。例えば、本発明についての低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃にて１６時間、３５％のホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡにおけるハイブリダイゼーション、続いて５５℃における０．８×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳでの連続洗浄を提供し、発生する相同タンパク質との異種間のハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１０３】
他の実施形態において、所望の量のバックグラウンド信号を除去するために、例えば、４２℃にて１６時間、５０％のホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、続いて６０℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での１時間の連続洗浄の条件下で、よりストリンジェントなハイブリダイゼーションが達成され得る。
【０１０４】
特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションを決定するために、標識などの適切な手段と共に本発明の核酸配列を利用することが有益である。検出され得る、蛍光、放射線、酵素または他のリガンド例えばアビジン／ビオチンを含む、多種多様の適切な指標手段が当業者に公知である。好ましい実施形態において、放射線または他の環境に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ、例えばアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを利用することが望まれ得る。酵素タグの場合、相補核酸を含有する試料との特異的ハイブリダイゼーションを識別するために、ヒトの眼で見えるまたは分光光度法による検出手段を提供するために利用され得る比色指標物質が公知である。
【０１０５】
一般に、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、対応する遺伝子の発現を検出するためのＰＣＲ（商標）におけるような溶液ハイブリダイゼーションにおける試薬として、ならびに固相を利用する実施形態において有用であると想定される。固相を含む実施形態において、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）は吸着されるかまたはそうでなければ選択されるマトリクスもしくは表面に付着される。この固定された一本鎖核酸は次いで、所望の条件下で選択されるプローブとのハイブリダイゼーションに供される。選択される条件は、必要とされる特定の基準（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸の種類、核酸源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに応じる）に基づいた特定の状況に依存するであろう。非特異的結合プローブ分子を除去するためにハイブリダイズした表面の洗浄後、ハイブリダイゼーションが検出されるか、またはさらに検出可能な標識により定量される。
【０１０６】
増幅およびＰＣＲ（商標）
増幅のための鋳型として使用される核酸は、分子生物学分野における当業者に公知である標準的な方法に従って、生物学的試料中に含有する細胞から単離される。このような核酸は、ゲノムＤＮＡと含有されてもよいか、または断片化もしくは全細胞核酸単離および／もしくは抽出から得られるポリヌクレオチドの集団中に含有されてもよい。タウタンパク質または切断型タウプロテアーゼ、またはそれらのタウプロテアーゼバリアントもしくは変異体に対応する核酸と選択的にハイブリダイズするプライマーの対は、選択的ハイブリダイゼーションを許容する条件下で単離核酸と接触される。本明細書に定義される場合、「プライマー」という用語は、鋳型依存プロセスにおいて初期核酸の合成を準備できる任意の核酸を包含することを意味する。典型的に、プライマーは、長さが１０〜１２塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が利用されてもよい。プライマーは二本鎖または一本鎖形態で提供されてもよいが、一本鎖形態が好ましい。
【０１０７】
一旦ハイブリダイズすると、核酸：プライマー複合体は、鋳型依存性核酸合成を促進する１つ以上の酵素と接触される。増幅の複数のラウンドはまた、「サイクル」と称され、十分な量の増幅産物が産生されるまで実施される。次に増幅産物が検出される。特定の適用において、検出は視覚手段により実施されてもよい。あるいは、検出は、化学発光、組み込まれる放射性標識もしくは蛍光標識の放射性シンチグラフィーによる、またはさらに、電気もしくは熱インパルス信号を使用したシステムによる産物の間接同定を含んでもよい。多くの鋳型依存性プロセスが所与の鋳型試料中に存在するマーカー配列を増幅させるのに利用可能である。最も知られている増幅法の１つは上記のＰＣＲ（商標）である。
【０１０８】
増幅産物はマーカー配列の増幅を確認するために視覚化されなければならない。１つの典型的な視覚化方法は、エチジウムブロマイドでのゲルの染色およびＵＶ光下での視覚化を含む。あるいは、増幅産物が放射性または蛍光定量的に標識されたヌクレオチドで完全に標識される場合、増幅産物は分離後、ｘ線フィルムに曝露され得るかまたは適切な刺激スペクトル下で視覚化され得る。一実施形態において、視覚化は間接的に達成される。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブが、増幅されたマーカー配列と接触される。プローブは好ましくは、検出可能な標識（例えば、発色団、蛍光部分、または１つ以上の磁石、スピン共鳴、または放射性標識）にコンジュゲートされる。別の実施形態において、プローブは、抗体またはビオチンなどの結合パートナーにコンジュゲートされ、結合対の他のメンバーは検出可能な部分を保有する。
【０１０９】
別の実施形態において、検出は、検出可能な標識プローブとのハイブリダイゼーションによるサザンハイブリダイゼーション分析（すなわち「サザンブロット」）などの方法を使用して達成されてもよい。サザンハイブリダイゼーションに含まれる技術は当業者に周知であり、分子プロトコルに関する多くの標準的な本に見出され得る。簡潔に、増幅産物はゲル電気泳動により分離される。次いでゲルは、ＰＶＤＦまたはニトロセルロースなどの膜と接触され、核酸の移動および非共有結合を可能にする。続いて、膜は、標的増幅産物とハイブリダイズできる標識プローブ（発色団とコンジュゲートしたまたは放射性標識プローブなど）とインキュベートされる。検出は、ｘ線フィルムに対する膜の曝露または標準的な検出機器による。
【０１１０】
上述の一例は、参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれている米国特許第５，２７９，７２１号に記載されており、それは自動化電気泳動および核酸の移動のための装置および方法を開示している。その装置は、ゲルを外部操作せずに電気泳動およびブロッティングを可能にし、理想的には、本発明の実施においてこのような方法を実施するように合わせられる。
【０１１１】
試料中にタウプロテアーゼを検出するのに必要とされる全ての必須材料および試薬は、簡便な「キット」形態で一緒に集められてもよい。そのようなキットは診断および研究方法において広範に使用され、一般に、１つ以上の予め選択された増幅プライマーおよび必要に応じて、または１つ以上の予め標識された検出プローブ、分子量基準物、および／または１つ以上の陽性もしくは陰性対照試料を含む。また、種々のポリメラーゼ（逆転写酵素Ｔａｑなど）を含む核酸を増幅するのに適した酵素、デオキシヌクレオチドの混合物、および１つ以上の緩衝液または所与の増幅および／もしくは利用される検出プロトコルに適切な反応混合物を調製するのに必要な他の試薬も含んでもよい。
【０１１２】
このようなキットは一般に、適切なパッケージングにおいて、各々の個々の試薬または酵素の別個の容器ならびにプライマーおよび／またはプローブの各セットのための別個の容器を含む。
【０１１３】
別の実施形態において、このようなキットは、タウプロテアーゼをコードする配列に特異的なハイブリダイゼーションプローブを含む。このようなキットは一般に、適切な容器中に、１つ以上の個々の反応成分、緩衝液、酵素（複数も含む）、デオキシヌクレオチド混合物ならびに選択されたハイブリダイゼーションプローブ（複数も含む）のセットおよび／または試験を実施するのに必要な検出試薬を含む。このようなキットはまたさらに必要に応じて、特定の種類の反応を実施するための指示書、ならびに個別化されたプロトコル、標準曲線、陽性および陰性対照試料などのうちのの１つ以上のセットを含む。
【０１１４】
切断、変異、または置換タウプロテアーゼ
部位特異的突然変異は、内在するＤＮＡの特異的突然変異による、個々のペプチド、または生物学的機能等価タンパク質もしくはペプチドの調製に有用な技術である。その技術はさらに、１つ以上のヌクレオチド配列の変化をＤＮＡに導入することにより、上述の考慮の１つ以上を組み込んだ、配列変異体を調製し、試験する準備能力を提供する。部位特異的突然変異は、十分なサイズのプライマー配列および横断する欠失連結部の両側において安定な二本鎖を形成する配列複雑性を提供するために、所望の突然変異体のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、および十分な数の連続ヌクレオチドの使用による変異体の産生を可能とする。典型的に、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の連結部の両側において約５〜１０残基が変化される。
【０１１５】
一般に、部位特異的突然変異の技術は分子生物学の分野の当業者に周知である。理解されるように、その技術は典型的に単鎖および二本鎖形態の両方に存在するバクテリオファージベクターを利用する。部位特異的突然変異に有用な典型的なベクターとしては、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。これらのファージベクターは商業的に利用可能であり、それらの使用は一般に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、部位特異的突然変異に慣用的に利用され、それはファージ由来の対象の遺伝子をプラスミドに移送する工程を除外する。
【０１１６】
部位特異的突然変異誘発は、多くの場合、一本鎖ベクターを最初に得ること、あるいはその配列内に、所望のタウプロテアーゼ、またはそのプロテアーゼ活性断片、変異体、エピトープ、もしくは突然変異体をコードする核酸断片を含む二本鎖ベクターの二本鎖を融解することにより実施される。所望の突然変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは合成的に調製される。次いでこのプライマーは、一本鎖ＤＮＡ調製物とアニールされ、突然変異を有する鎖の合成を完了するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗ断片などのＤＮＡ重合酵素に供される。したがって、第１の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第２の鎖が所望の突然変異体を保有する、ヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖ベクターは次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの適切な細胞を形質転換するために使用され、突然変異配列アレンジメントを保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。部位特異的突然変異を使用するタウプロテアーゼをコードする核酸配列の配列変化の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段として提供され、遺伝子の配列変化が得られ得る他の方法が存在する場合、限定することを意味するわけではない。例えば、所望のタウをコードするポリヌクレオチドをコードする組換えベクターが、タウプロテアーゼの配列変異を得るために、ヒドロキシルアミンなどの１つ以上の突然変異誘発物質を用いて処理されてもよい。
【０１１７】
組換えベクター、宿主細胞および発現
組換えベクターは本発明の重要なさらなる態様を形成する。「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写され得る遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝構築物を意味する。転写産物はタンパク質に翻訳され得るが、それは必要とされない。したがって、特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写および遺伝子産物へのＲＮＡの翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、例えばアンチセンス構築物を生成するために核酸の転写のみを含む。
【０１１８】
特に有用なベクターは、ＤＮＡ断片のコードタンパク質が、適切な宿主細胞中で配列を発現できる少なくとも第１のプロモーターの転写制御下で作動可能に配置される、それらのベクターであることを意図する。「作動可能に配置される」、「制御下」または「作動可能に連結される」、および「転写制御下」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始を制御し、連結されたプロモーターにより核酸断片の発現を駆動するために、核酸に対して正確な位置および方向にあることを意味する。プロモーターは、例えば、本明細書に開示される組成物と関連して、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）技術を使用してコード断片またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られる場合、タウタンパク質またはタウプロテアーゼをコードする遺伝子と天然に会合するプロモーターの形態であってもよい。
【０１１９】
他の実施形態において、特定の利点が、１つ以上の組換え体、または異種プロモーター（複数も含む）の制御下でコード核酸部分を配置することにより得られることが意図される。本明細書で使用される場合、組換え体または異種プロモーターは、その天然環境においてタウタンパク質またはタウプロテアーゼをコードする遺伝子と天然に会合しないプロモーターを指すことを意図する。そのようなプロモーターは、他の遺伝子と天然に会合するプロモーター、および／または任意の他の細菌、ウイルス、真核細胞、または哺乳動物細胞から単離されるプロモーターを含んでもよい。
【０１２０】
当然に、発現のために選択される、細胞種類、生物、またはさらに動物においてＤＮＡ断片の発現を効果的に駆動するプロモーターを利用することが重要である。タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞種類の組み合わせの使用は一般に分子生物学の分野における当業者に周知である。利用されるプロモーターは、構成的、または誘導的であってもよく、導入される核酸断片の高レベルの発現を駆動する適切な条件下で使用されてもよく、それにより組換えタンパク質またはペプチドの大規模産生において有益である。
【０１２１】
プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールはＲＮＡ合成のための開始部位を位置付ける機能をする。この最適な公知の例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーターなどのＴＡＴＡボックスを欠く一部のプロモーターにおいて、開始部位自体を重複する個別の要素が開始の場所を固定するのに役立つ。
【０１２２】
さらなるプロモーター要素が転写開始の頻度を調節する。典型的に、それらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流における領域に位置するが、多くのプロモーターは同様に開始部位の下流に機能要素を含有することが示されている。プロモーター要素間の間隔は高い頻度でフレキシブルであるので、要素が互いに対して反転または移動される場合、プロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始める前に約５０ｂｐ間隔まで増加し得る。プロモーターに応じて、個々の要素が転写を活性化するために同時に作動可能にまたは独立して機能し得るようである。
【０１２３】
核酸の発現を制御するために利用される特定のプロモーターは、標的細胞中で核酸を発現できる限り、重要でないと考えられる。したがって、ヒト細胞が標的とされる場合、選択されるヒト宿主細胞中で発現できるプロモーターに隣接する核酸コード領域を、選択されるヒト宿主細胞中で発現できるプロモーターの制御下で配置することが好ましい。
【０１２４】
種々の他の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス長い末端反復が、選択される導入遺伝子の高レベルの発現を得るために使用されてもよい。発現のレベルが所与の目的のために十分であるならば、導入遺伝子の発現を達成するために当該技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモーターが同様に意図される。多くの発現要素、エンハンサー、および／またはプロモーターが、タウタンパク質の発現を調節するため、またはタウプロテアーゼ活性断片もしくはその変異体をコードする１つ以上の核酸断片の発現を促進するために本発明に関連して利用されてもよい。そのようなエンハンサー、プロモーター、および発現要素は当業者に周知である。
【０１２５】
エンハンサーは最初は、ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置に位置するプロモーターから転写を増加させる遺伝要素として検出された。遠い距離にわたって作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的研究においてほとんど前例が見られなかった。その後の研究により、エンハンサー活性を有するＤＮＡの領域がプロモーターとそっくりに構造化されることが示された。すなわち、それらは多くの個々の要素から構成され、その各々は１つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な相違は操作可能である。全体としてエンハンサー領域は、ある距離を置いて転写を刺激できなければならず、これをプロモーター領域またはその構成要素に当てはめることは必要とされない。他方で、プロモーターは、特定の部位および特定の方向においてＲＮＡ合成の開始を駆動する１つ以上の要素を有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは多くの場合、重複し、隣接し、多くの場合、非常に類似したモジュール構造を有するように見える。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核生物プロモーターデータベース、ＥＰＤＢによる）もまた、導入遺伝子の発現を駆動するために使用されてもよい。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用が別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、送達複合物の一部としてまたはさらなる遺伝子発現構築物として、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持できる。
【０１２６】
タウプロテアーゼもしくはタウプロテアーゼ活性断片またはその変異体の発現に関して、適切なクローンが得られると（それらがｃＤＮＡベースであるかまたはゲノムであるかに関わらず）、適切な発現系を調製することが開始し得る。原核生物または真核生物系において発現するためのＤＮＡ断片（複数も含む）の操作は一般に当業者に公知の技術により実施され得、本発明者らは、当該技術分野における実質的に任意の従来の発現系が、本発明のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素および／またはエピトープ配列の発現において利用され得ることを意図する。
【０１２７】
タンパク質への翻訳のために機能的ｍＲＮＡを得るために、宿主細胞が一般にゲノム転写産物を進行する場合、ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方が真核生物発現に適している。一般に、組換え遺伝子として遺伝子のｃＤＮＡ型を利用することがより都合が良い。ｃＤＮＡ型の使用は、遺伝子のサイズが一般に、典型的にｃＤＮＡ遺伝子より最大一桁大きいゲノム遺伝子より、標的細胞を形質転換するために、非常に小さく、より容易に利用されるという利点を与えると考えられる。しかしながら、本発明者は、所望の場合、特定の遺伝子のゲノム型を利用する可能性を排除しない。本明細書で使用される場合、「操作された」および「組換え」細胞という用語は、タウタンパク質、またはそのタウプロテアーゼ活性切断体、バリアント、または変異体をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子などの外因性核酸断片または遺伝子が導入される、細胞を指すことを意図する。したがって、操作される細胞は、組換え的に導入される外因性ＤＮＡ断片または遺伝子を含有しない天然に存在する細胞と区別できる。したがって、操作される細胞は、人の手により導入される遺伝子（複数も含む）を有する細胞である。組換え細胞は、導入されるｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子を有するものを含み、また、特定の導入される遺伝子と天然に会合しないプロモーターに隣接して配置される遺伝子も含む。
【０１２８】
本発明によれば、変異体、切断型、野生型に関わらず、組換えタウプロテアーゼを発現するために、１つ以上の適切なプロモーターの制御下でタウプロテアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを調製する。プロモーターの「制御下」にコード配列をもたらすために、通常、選択されるプロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち３’）に転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされる組換えタンパク質の発現を促進する。このことは、この状況における「組換え発現」を意味する。
【０１２９】
多くの標準的な技術が、種々の宿主発現系においてタンパク質またはペプチド発現を達成するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを構築するのに利用可能である。発現に利用可能な細胞種類としては、限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。
【０１３０】
一般に、宿主細胞と適合する種由来のレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主と関連して使用される。ベクターは通常、形質転換細胞において表現型選択を提供できる複製部位、およびマーキング配列を保持する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は多くの場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種由来のｐＢＲ３２２、プラスミドを使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を識別するための容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージはまた、その独自のタンパク質を発現するための微生物により使用され得るプロモーターを含有しなければならないか、または含有するように修飾されなければならない。
【０１３１】
さらに、宿主微生物と適合するレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主と関連した形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージラムダＧＥＭ（商標）−１１が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するために使用され得る組換えファージベクターを生成するのに利用されてもよい。
【０１３２】
さらに有用なベクターとしては、後での精製および分離または開裂のためにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）溶解性融合タンパク質を生成するのに使用するためのＰＩＮベクターおよびｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な融合タンパク質はβ−ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを有するものである。
【０１３３】
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物もまた、宿主として使用されてもよい。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養物であるかどうかに関わらず、任意のこのような細胞培養物が機能できる。哺乳動物細胞に加えて、それらとしては、組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されたまたは１つ以上のタウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系が挙げられる。
【０１３４】
異なる宿主細胞は翻訳後プロセシングおよびタンパク質の修飾のための特徴および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される異種タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確保するように選択され得る。
【０１３５】
哺乳動物においてこのような細胞を使用するための発現ベクターは、複製起点（必要な場合）、任意の必要なリボソーム結合部位と共に発現される遺伝子の前部に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終了配列を含む。複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源由来であり得るものなどの外因性起点を含むベクターの構築物により提供されてもよいか、または宿主細胞染色体複製機構により提供されてもよい。ベクターが宿主細胞染色体内に組み込まれる場合、多くの場合、後者が十分である。
【０１３６】
プロモーターは、哺乳動物細胞（例えばメタロチオネインプロモーター）のゲノム由来または哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来であってもよい。さらに、所望のタウタンパク質またはタウプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列と天然に会合するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、好適であり得るが、但し、このような制御配列は利用される選択される宿主細胞系（複数も含む）と適合する。多くのウイルスベースの発現系が利用されてもよく、例えば一般に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、および高い頻度でシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターが特に有用である。なぜなら、その両方は、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるからである。ウイルス複製起点に位置するＢｇｌＩ部位に対してＨｉｎｄＩＩＩ部位から伸長する約２５０ｂｐの配列を含む場合、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた、使用されてもよい。
【０１３７】
発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部リーダー配列に連結され得る。このキメラ遺伝子は次いで、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノム（例えば領域Ｅ１〜Ｅ３）の非必須領域における挿入の結果、感染宿主中で生存し、タウプロテアーゼを発現できる組換えウイルスが生じる。
【０１３８】
特異的開始信号もまた、特定のタウプロテアーゼをコードする配列の効果的な翻訳に必要とされ得る。これらの信号はＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳制御信号が提供されることをさらに必要としてもよい。このことは特に、開始メチオニンコドンを欠くタウプロテアーゼ断片の場合に当てはまる（例えば、以下の実施例で説明されるＴＰ−８１、ＴＰ−９９、ＴＰ−２１０などの構築物を参照のこと）。当業者は、このことを容易に決定でき、必要な信号を与えることができる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確保するために所望のコード配列のリーディングフレームを有するフレーム内（または相内）になければならないことは周知である。これらの外因性転写制御信号および開始コドンは天然および合成の両方の様々な起点であってもよい。発現の効果は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターを含めることにより増強され得る。
【０１３９】
真核細胞発現において、また、元のクローニングされた断片内に含まれない場合、転写単位内に適切なポリアデニル化部位（例えば５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を組み込むことが典型的に望まれる。典型的に、ポリ−Ａ付加部位は転写終結の前の位置におけるタンパク質の終結部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流」に配置される。
【０１４０】
組換えタウプロテアーゼの長期の高収率の産生に関して、安定な発現が好ましい。例えば、タウプロテアーゼをコードする構築物を安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用すること以外に、宿主細胞が、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位）により制御されるベクター、および選択可能なマーカーで形質転換されてもよい。外来ＤＮＡの導入後、操作される細胞は富栄養培地中で１〜２日間増殖でき、次いで選択培地に換えられる。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーが選択のための耐性を与え、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、後で細胞株内でクローニングされ、増殖され得る病巣を形成するために増殖することが可能となる。
【０１４１】
限定されないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＫ）ｔｋ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｒｔ）（それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において）を含む、多くの選択系が使用されてもよい。また、メトトレキサートに耐性を与えるｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に耐性を与えるｇｐｔ；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を与えるｎｅｏ；およびハイグロマイシンに耐性を与えるｈｙｇｒｏについての選択の基礎として代謝拮抗物質耐性が使用されてもよい。
【０１４２】
動物細胞は２つの様式でインビトロにおいて増殖できる：培養物のバルクを通して懸濁液中で増殖する足場非依存性細胞としてまたはそれらの増殖のために固体基質への結合を必要とする足場依存性細胞（すなわち、単分子層型の細胞増殖）。連続樹立細胞株からの足場非依存性または浮遊培養は、細胞および細胞産物の大規模産生の最も広範に使用される手段である。しかしながら、浮遊培養細胞は、腫瘍形成能などの限定および付着細胞より低いタンパク質産生を有する。撹拌槽中の哺乳動物細胞の大規模浮遊培養は組換えタンパク質を産生するための一般的な方法である。２つの浮遊培養リアクタ、撹拌リアクタおよびエアリフトリアクタの設計は広範に使用されている。撹拌設計はインターフェロンを産生するために８０００リットル容量で首尾良く使用される。１：１〜３：１の高さ対直径比を有するステンレス鋼タンク中で細胞を増殖させる。培養物は通常、ブレードの付いたディスクまたは船用プロペラパターンに基づいた１つ以上の撹拌器を用いて混合する。ブレードより低い剪断力を与える撹拌器システムが記載されている。撹拌は、磁気的に結合されたドライブなどの装置により直接または間接のいずれかで駆動され得る。間接的なドライブは撹拌器シャフトに対する封止により微生物汚染の危険性を減少させる。エアリフトリアクタ（微生物発酵のために最初に特徴付けられ、哺乳動物培養のために後で適合される）は培養物を混合し、酸素を送り込むためにガス流に依存する。ガス流は、リアクタのライザー部に進入し、循環を駆動する。ガスは培養表面で解放し、リアクタの降水管部分において下方に移動するように気泡を含まない高密度液体を生じる。この設計の主な利点は単純であり、機械的混合についての必要性を欠くことである。典型的に、高さ対直径比は約１０：１である。エアリフトリアクタは比較的容易にスケールアップし、ガスの良好な物質移動を有し、比較的低い剪断力を生じる。
【０１４３】
本発明のタウプロテアーゼまたはタンパク質は、「過剰発現」、すなわち細胞内のその天然発現に対して高いレベルで発現され得ることが意図される。このような過剰発現は、放射性標識および／またはタンパク質精製を含む、種々の方法により評価され得る。しかしながら、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質染色またはウェスタンブロッティング、その後の得られるゲルまたはブロットのデンシメトリー走査などの定量分析を含む、簡単かつ直接的な方法が好ましい。天然細胞のレベルと比較して組換えタンパク質またはペプチドのレベルの特異的増加は過剰発現の指標であり、同様に、宿主細胞により産生される他のタンパク質に対する特異的タンパク質の相対存在量の指標であり、例えばゲル上で見える。
【０１４４】
タウタンパク質、ペプチド、およびポリペプチド
したがって、本発明は、精製した、好ましい実施形態において、実質的に精製したタウプロテアーゼ、およびその切断断片、変異体またはバリアントを提供する。本明細書で使用される場合、「精製したタウプロテアーゼ」という用語は、適切な組換え宿主細胞から単離可能なタウタンパク性組成物を指すことを意図し、タウプロテアーゼは、１つ以上のタウプロテアーゼコードする核酸セグメントの識別および特徴付けの前に、以前には得ることができないレベルで調製される。したがって、精製したタウプロテアーゼはまた、天然に存在する環境に含まれないタウプロテアーゼを指す。
【０１４５】
「実質的に精製した」という用語が使用される場合、これは、タウプロテアーゼ、サブユニットまたはペプチドが、組成物中に約５０％のタンパク質またはそれ以上を構成するなどの組成物の主成分を形成する組成物を指す。好ましい実施形態において、実質的に精製したタウプロテアーゼは、組成物中に存在する６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９９％超、またはそれより多いタンパク質から構成される。
【０１４６】
本発明に適用される場合、「均一に精製した」ポリペプチドまたはタンパク質とは、ポリペプチドまたはタンパク質が他のタンパク質および生物学的成分に実質的に含まれない純度のレベルを有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、精製したポリペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、他のタンパク質成分を実質的に含まず、分解シークエンシングが首尾良く実施され得る。
【０１４７】
タウプロテアーゼの精製の程度を定量するための種々の方法が本開示を鑑みて当業者に公知である。タウプロテアーゼを精製するために、少なくとも一部のタウプロテアーゼを含む天然または組換え組成物は、種々の非タウプロテアーゼ成分を組成物から除去するために分画に供される。タンパク質精製の使用に適切な種々の技術は当業者に周知である。それらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体を用いた沈殿、または熱変性、その後の遠心分離による沈殿；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、レクチン親和性などのクロマトグラフィーステップおよび他の親和性クロマトグラフィーステップ；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動；ならびにそれらの組み合わせおよび他の技術が含まれる。
【０１４８】
タウプロテアーゼ特異的抗体、免疫学的試薬、およびエピトープコア配列
タウタンパク質またはそのタウプロテアーゼバリアント、変異体もしくは断片の１つ以上の抗原決定基に対応するペプチド、あるいは「エピトープコア領域」もまた調製され得る。そのようなペプチドは通常、長さが少なくとも７または８アミノ酸残基であるべきであり、好ましくは長さが約１０、１５、２０、２５または約３０アミノ酸残基であり、最大約３５〜５０残基を含み得るなどである。自動化ペプチド合成機器を使用して、または１つ以上の組換え方法により合成ペプチドが製造され得る。
【０１４９】
米国特許第４，５５４，１０１号（その全体は参照により本明細書に具体的に組み込まれる）は、親水性に基づいて第一級アミノ酸配列からのエピトープの識別および調製を教示している。抗体分野の当業者に公知である方法を使用して、本明細書に開示されるタウプロテアーゼ配列のうちの１つのアミノ酸配列内からエピトープを識別できる。
【０１５０】
さらに、タンパク質の抗原部分およびエピトープコア領域の予測を支援するコンピュータプログラムが現在利用可能である。例としては、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に基づいたプログラムおよびタンパク質三次構造予測のための種々のコンピュータプログラムが挙げられ、それらはタンパク質生物学の分野の当業者に公知である。
【０１５１】
さらなる実施形態において、ポリペプチドの主要な抗原決定基が、ポリペプチドをコードする遺伝子の部分が組換え宿主内で発現され、得られたタンパク質が免疫反応を誘発する能力について試験される、実証的アプローチにより識別され得る。例えば、ＰＣＲ（商標）が、タンパク質のＣ末端の連続的に長い断片を欠く様々なペプチドを調製するために使用されてもよい。これらのペプチドの各々の免疫活性が、免疫優勢であるポリペプチドのそれらの断片またはドメインを識別するために決定される。少数のみのアミノ酸が各反復において除去されるさらなる研究により、ポリペプチドの抗原決定基の位置のより正確な決定が可能となる。
【０１５２】
１つ以上のこのような分析が完了すると、１つ以上の抗原決定基の少なくとも必須の特徴を含有するポリペプチドが調製される。次いでペプチドはポリペプチドに対する血清の生成に利用される。これらの決定基をコードするミニ遺伝子または遺伝子融合物もまた、例えばＰＣＲ（商標）クローニング方法を使用して標準的な方法により発現ベクター内で構築され、挿入され得る。
【０１５３】
ワクチン接種のためのこのような小さなペプチドの使用は典型的に、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンなどの免疫原性キャリアタンパク質のペプチドのコンジュゲーションを必要とする。このコンジュゲーションを実施するための方法は当業者に周知である。
【０１５４】
タウ特異的抗体の調製
特定の実施形態において、本発明は、タウタンパク質に高い特異性で結合する抗体および本明細書に開示されるタウタンパク質の１つ以上の切断型または変異バリアントに結合する他の抗体を提供する。野生型タウタンパク質に特異的な抗体および複数の特定のタウバリアントまたは変異体のいずれか１つに特異的な抗体は、当該技術分野において公知の従来の方法を使用して調製され得る。上記の説明のように、実質的に完全長のタンパク質に対して生成した抗体に加えて、抗体はまた、タウまたは他のセリンプロテアーゼ由来の野生型および変異型エピトープを含む１つ以上のエピトープコア領域を含む、より小さな構築物に応答して生成されてもよい。本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどの免疫結合因子のいずれかを広範に指すことを意図する。一般に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが、生理学的状況において最も一般的な抗体であるので、かつ、それらは実験室環境において最も容易に作製されるので、好ましい。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、特定の利点、例えば再現性および大規模産生を有すると認識されており、それらの使用が一般に好ましい。したがって本発明は、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにニワトリ起源のＭａｂを提供する。調製の容易さおよび試薬の入手し易さに起因して、マウスＭａｂが多くの場合、好ましい。
【０１５５】
しかしながら、キメラ抗体として、ヒト定常および／または可変領域ドメイン、二重特異性抗体、組換えおよび操作された抗体およびそれらの断片を保有する、マウス、ラット、または他の種由来の「ヒト化」抗体もまた、意図される。患者の腫瘍に「合わせて作製される（オーダーメードの）」抗体を開発するための方法は同様に当業者に公知であり、そのようなオーダーメード抗体もまた、タウエピトープ特異的抗体などの作製に有用であると意図される。「抗体」という用語は、抗原結合領域を有し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦＶ（一本鎖Ｆｖ）などの抗体断片を含む、任意の抗体様分子を指すために使用される。種々の抗体ベースの構築物および断片を調製し、使用するための技術は当該技術分野において周知である。抗体を調製し、特徴付けるための手段は当業者に周知である。Ｍａｂを生成するための方法は一般に、ポリクローナル抗体を調製するためのものと同じ株と共に開始する。つまり、ポリクローナル抗体は、本発明に従って免疫原性タウ組成物で動物を免疫化し、その免疫化動物から血清を回収することにより調製される。
【０１５６】
様々な動物種が血清を産生するために使用されてもよい。典型的に、抗血清の産生に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。ウサギの比較的多い血液量のために、ウサギがポリクローナル抗体を産生するための好ましい選択である。当業者に周知のように、所与の組成物がその免疫原性を変化させ得る。したがって、多くの場合、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合することにより達成され得るように、宿主免疫系を追加免疫することが必要である。例示的および好ましい担体はキーホールリンペットヘモシアニ（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンもまた、担体として使用されてもよい。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートするための手段は当該技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾチ化（ｂｉｓ−ｂｉａｚｏｔｉｚｅｄ）ベンゾジンを含む。また、当該技術分野において周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫反応の非特異的刺激因子の使用により増強され得る。適切なアジュバントとしては、サイトカイン、毒素または合成組成物などの全ての許容可能な免疫活性化合物が挙げられる。
【０１５７】
使用され得るアジュバントとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、細菌から抽出された３つの成分を含有するＲＩＢＩ；ＭＰＬ；トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）；および２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）が挙げられる。ＭＨＣ抗原がさらに使用されてもよい。例として、多くの場合、好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅した結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫反応の非特異的刺激因子）、不完全フロントアジュバントおよび水酸化アルミニウムが挙げられる。アジュバントに加えて、Ｔ細胞性免疫を上方制御するかまたは抑制遺伝子細胞活性を下方制御することが示されている、生物反応修飾物質（ＢＲＭ）を同時投与することが好適であり得る。そのようなＢＲＭとしては、限定されないが、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ，ＰＡ）；または低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ，ＮＪ）およびγ−インターフェロン、ＩＬ−２、もしくはＩＬ−１２などのサイトカイン、またはＢ−７などの免疫ヘルパー機能に関連するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１５８】
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質および免疫化に使用される動物に応じて変化する。様々な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）が免疫原を投与するために使用され得る。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の種々の時点で免疫化動物の血液をサンプリングすることによりモニターされ得る。次に、追加免疫注射もまた、与えられてもよい。追加免疫および滴定のプロセスは、適切な滴定が達成されるまで反復される。所望のレベルの免疫原性が得られる場合、免疫化動物から血液を抜き出すことができ、血清を単離し、保存し、および／またはＭＡｂを生成するために動物を使用できる。
【０１５９】
ウサギポリクローナル抗体を産生するために、耳静脈を介してまたは代替として心穿刺により血液を抜き取ることができる。取り除いた血液を凝固させ、次いで全細胞および血栓から血清成分を分離するために遠心分離する。種々の用途のために、または所望の抗体画分を、別の抗体、固体マトリクスに結合したペプチドを使用した親和性クロマトグラフィーなどの周知の方法により、または例えばプロテインＡもしくはプロテインＧクロマトグラフィーを使用すすることにより精製できるように、血清は使用され得る。
【０１６０】
Ｍａｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（その全体は参照を示すことにより本明細書に具体的に組み込まれる）に例示されているものなどの周知の技術の使用により容易に調製され得る。典型的に、この技術は、適切な動物を選択される免疫原組成物、例えば精製もしくは部分的に精製したタウプロテーゼ、またはプロテアーゼ活性タウペプチド断片、変異体、バリアント、もしくはエピトープドメイン、野生型またはその１つ以上のバリアント、切断型、もしくは変異体で免疫化することに関する。免疫化組成物は抗体産生細胞を刺激するのに有効な様式で投与される。ＭＡｂを生成するための方法は一般に、ポリクローナル抗体を調製するものと同じ株と共に開始する。マウスおよびラットなどのげっ歯動物が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、または他の細胞種の使用もまた、可能である。ラットの使用は特定の利点を与え得るが、マウスが多くの場合、より高い割合の安定な融合物を一般に与えるので、好ましい。通常、上記のように、抗原を動物に注射する。抗原は必要な場合、キーホールリンペットヘモシアニンなどの担体分子に結合され得る。抗原は典型的に、フロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと混合される。同じ抗原を用いた追加免疫注射はほぼ２週間の間隔で発生する。免疫化後、抗体を産生する可能性のある体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）がＭＡｂ生成プロトコルに使用するために選択される。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃腺またはリンパ節から、あるいは末梢血試料から得られ得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。なぜなら、前者は、形質芽球段階を駆動する抗体産生細胞の豊富な源であるからであり、後者は、末梢血は容易に得られるからである。
【０１６１】
多くの場合、動物のパネルは免疫化され、最も高い抗体力価を有する動物の脾臓は取り除かれ、脾臓リンパ球がシリンジを用いて脾臓を均質化することにより得られる。典型的に、免疫化したマウス由来の脾臓は約５×１０７〜２×１０８のリンパ球を含有する。免疫化動物由来の抗体を産生するＢリンパ球は次いで、不死化骨髄腫細胞の細胞、通常、免疫化される動物と同じ種の１つと融合される。ハイブリドーマを産生する融合手順に使用するのに適した骨髄腫細胞株は好ましくは、非抗体産生であり、高い融合効果、および後で、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖できないようにする酵素欠損を有する。多くの骨髄腫細胞のうちのいずれか１つが使用されてもよく、それらは当業者に公知である。例えば、免疫化動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０Ｂｕｌを使用してもよく；ラットに関して、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用してもよく；Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６はヒト細胞融合物と関連して全てに有用である。１つの好ましいマウス骨髄腫細胞は、ＮＳ−１骨髄腫細胞株（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも称される）であり、細胞株保存番号ＧＭ３５７３を要求することによってＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから容易に入手可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫ＳＰ２／０非産生細胞株である。抗体を産生する脾臓またはリンパ球細胞および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は通常、２：１の割合で体細胞を骨髄腫細胞と混合することを含むが、その割合は細胞膜の融合を促進する薬剤（複数も含む）（化学または電気）の存在下でそれぞれ約２０：１〜約１：１に変更されてもよい。融合手順は、通常、低い頻度、約１×１０−６〜１×１０−８で生存可能なハイブリッドを産生する。しかしながら、このことは、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって親の非融合細胞（特に通常無限に分裂し続ける非融合骨髄腫細胞）と区別されるので、問題ではない。選択培地は通常、組織培地中でヌクレオチドのデノボ合成を遮断する薬剤を含有するものである。例示的および好ましい薬剤はアミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地にヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンが捕捉される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地にはヒポキサンチンなどの化合物が捕捉されてもよい。
【０１６２】
所望の場合、濾過、遠心分離およびＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフ法を使用して、いずれかの手段で産生されたＭＡｂはさらに精製されてもよい。本発明のＭａｂの断片は、ペプシンもしくはパパインなどの酵素を用いた消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の開裂を含む方法により産生されるＭａｂから得られ得る。あるいは、本発明による含まれるモノクローナル抗体断片は、自動化ペプチドシンセサイザーを使用して合成されてもよい。分子クローニングアプローチが、本明細書に開示されるタウプロテアーゼ組成物の１つ以上に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するために使用されてもよいこともまた、意図される。このために、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーが、免疫化動物の脾臓から単離されるＲＮＡから調製され、適切な抗体を発現するファージミドは、抗原および対照細胞を発現する細胞を使用したパニングにより選択される。従来のハイブリドーマ技術に対するこのアプローチの利点は、１回のラウンドで産生され、スクリーニングされ得る抗体が約１０４倍になることであり、ＨおよびＬ鎖の組み合わせにより新規特異性が生じ、適切な抗体を見つける機会をさらに増加させる。あるいは、本発明に含まれるモノクローナル抗体断片は、自動化ペプチドシンセサイザーを使用して、または限定されないが、細菌、酵母もしくは真菌宿主細胞を含む、１つ以上の宿主細胞中の完全長遺伝子もしくは遺伝子断片の発現により合成され得る。
【０１６３】
抗体コンジュゲート
本発明はさらに、通常、抗体コンジュゲートを形成するために１つ以上の他の因子に連結されるモノクローナルタイプの抗タウタンパク質抗体を提供する。十分な選択性、特異性および親和性のいずれかの抗体が抗体コンジュゲートに基づいて利用されてもよい。このような特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング方法を使用して評価され得る。抗体コンジュゲートの特定の例は、抗体が検出可能な標識に連結されるもののコンジュゲートである。「検出可能な標識」は、それらの特異的機能特性、または化学特性に起因して検出され得る化合物または要素であり、その使用により、それらが結合した抗体は検出およびさらに所望の場合、定量され得る。別のこのような例は、細胞毒性薬または「抗毒素」と称され得る抗細胞剤に連結される抗体を含むコンジュゲートの形成である。本発明に関して、抗毒素は通常、あまり好ましくない。したがって診断剤としての使用のために抗体コンジュゲートが好ましい。抗体診断は通常、２つのクラス、すなわち、様々な免疫アッセイなどのインビトロ診断に使用するもの、および一般に、「抗体介在性画像化」として知られているインビボ診断プロトコルに使用するものの範囲内である。再び、抗体介在性画像化は本発明における使用にあまり好ましくない。
【０１６４】
多くの適切な造影剤が、抗体に結合させるための方法として、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号および同第４，４７２，５０９号（それらの各々はその全体が参照を示すことにより具体的に組み込まれる）を参照のこと）。特定の結合方法は、例えば、抗体に結合したＤＴＰＡなどの有機キレート剤を利用する、金属キレート錯体の使用に関する。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨード酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応できる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。常磁性体イオンの場合、例として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）などのイオンが挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線画像化などの他の状況に有用なイオンとしては、限定されないが、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩＩ）、および特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられる。治療および／または診断用途のための放射性同位体の場合、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクニシウム９９ｍおよびイットリウム９０が挙げられる。１２５ヨウ素が多くの場合、特定の実施形態における使用に好ましく、テクニシウム９９ｍおよびインジウム１１１もまた多くの場合、長期検出のためのそれらの低エネルギーおよび適合性に起因して好ましい。
【０１６５】
本発明の放射性標識したタウプロテアーゼ特異的Ｍａｂは当該技術分野において周知の方法に従って産生され得る。例えば、Ｍａｂは、ヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウムおよび次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤との接触によりヨウ化され得る。本発明に係るモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスにより、例えば、スズ溶液で過テクネチウム酸塩を還元すること、還元したテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラム上でキレート化すること、および抗体をこのカラムに適用することによって、または直接標識技術によって、例えば、過テクネチウム酸塩、ＳＮＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液などの緩衝溶液、および抗体をインキュベートすることにより、テクネチウム９９ｍで標識され得る。多くの場合、金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合するために使用される中間官能基はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。蛍光標識としては、ローダミン、フルオレセインイソチアシアネートおよびレノグラフィンが挙げられる。
【０１６６】
本発明の最も好ましい抗体コンジュゲートは主にインビトロでの使用を目的とするものであり、抗体は二次結合リガンドまたは発色基質との接触時に着色産物を生成する酵素（酵素タグ）に連結される。適切な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（セイヨウワサビ）水素ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（それらの各々はその全体が参照を示すことにより本明細書に参照により具体的に組み込まれる）に記載されている。
【０１６７】
免疫検出法およびキット
免疫検出法は、タウプロテアーゼと結合、反応、阻害またはタウプロテアーゼにより開裂する新規化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質またはそのペプチドもしくはエピトープを識別するため、および／あるいは既知のタンパク質の新規特性を識別するために利用され得、そのタンパク質をタウ結合タンパク質、もしくはタウプロテアーゼ標的タンパク質と定義できる。いずれかの事象において、タウプロテアーゼに結合するさらなるウイルスタンパク質の識別は、識別したタンパク質が新規抗Ａβストラテジーの標的とすることができる。このようなアプローチの最初のステップは再び、多くの場合、潜在的化合物が、タウプロテアーゼまたはこのように識別された新たに開発されたタンパク質（複数も含む）もしくは化合物（複数も含む）の結合を阻害する、自己タンパク質分解を防止する、開裂を防止する、またはプロテアーゼ活性を阻害する、それらの能力について試験される、結合アッセイに基づく。
【０１６８】
本発明のタウプロテアーゼ、ペプチド、またはエピトープに対する抗体および標識抗体はさらに、組換え宿主細胞および臨床試料を含む、試料中のタウタンパク質またはタウプロテアーゼ基質を検出するために利用されてもよい。このような抗体は最終的に、ヒト組織などの生物学的試料および／または流体試料中の高いまたは低いレベルのタウプロテアーゼを検出するため、あるいは変異タウタンパク質、切断プロテアーゼもしくはタウ由来ペプチドを検出するために診断的実施形態に利用され得る。
【０１６９】
したがって、タウプロテアーゼ単独の検出は本発明別の重要な態様である。一般に、簡単なタウプロテアーゼ免疫結合法は、タウプロテアーゼ、そのバリアント、ペプチド、または変異体を含有する疑いのある試料を得ること、および免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、本発明に係る第１の抗タウプロテアーゼ抗体または抗変異タウプロテアーゼ抗体と試料とを接触させること、次いでそのように形成された免疫複合体を検出することを含む。
【０１７０】
ＡＤなどの疾患を患っている患者の臨床診断またはモニタリングにおいて、タウプロテアーゼ変異体または正常な被験体由来の対応する生物学的試料中のレベルと比較したタウプロテアーゼのレベルの変化の検出はＡＤを患っている患者の指標である。しかしながら、当業者に知られているように、このような臨床診断は、必ずしも、単離におけるこの方法に基づいてなされているわけではない。当業者は、バイオマーカーの陽性識別、および低レベルまたはバックグラウンド変化を表わす、バイオマーカーの種類または量の有意な差を識別することに関してよく知っている。実際に、バックグラウンド発現レベルは多くの場合、高い検出が有意または陽性としてスコア付けされる「カットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）」以上を形成するために使用される。
【０１７１】
生物学的機能等価物
当業者により理解されるように、修飾および変化が、開示されるタウプロテアーゼの１つ以上、およびセリンプロテアーゼ活性を有する本明細書に開示されるタウプロテアーゼ由来ポリペプチドの１つ以上の構造になされてもよく、さらに、同様または他の所望の特性を有する分子を得る。それはタンパク質の生物学的機能活性を定義するタンパク質の相互作用能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列（またはもちろん、その内在するＤＮＡコード配列）になされてもよいが、それにも関らず、同様の（アゴニスト）特性を有するタンパク質を得る。したがって、種々の変化が、それらの生物学的有用性または活性の検知できる損失を有さずにタウタンパク質またはタウプロテアーゼ活性オリゴマーまたはその断片（またはそのようなタンパク質をコードする内在するＤＮＡ配列）の配列になされてもよいことが本発明者により意図される。
【０１７２】
機能的等価物に関して、生物学的機能等価タンパク質またはペプチドの定義に固有のものは、分子の規定部分内になされ得る変化の数に対する制限が存在し、さらにその結果として検知できるレベルの機能的等価活性を生じる概念であることもまた当業者に理解されるであろう。したがって生物学的機能等価ペプチドは、特定のほとんどまたは全てのアミノ酸が置換されているそれらのペプチドと本明細書に定義される。特に、小さなペプチドに関する場合、ほとんどのアミノ酸は変化されない。もちろん、異なる置換を有する複数の異なるタンパク質／ペプチドが本発明に従って容易に作製され、使用されてもよい。
【０１７３】
特定の残基が、タンパク質またはペプチドの生物学的または構造的特性に特に重要であると示され（例えば、タウプロテアーゼの活性部位における残基）、そのような残基は通常、生じる変異タンパク質の酵素活性に影響を与えずに変化され得ないこともまた理解されるであろう。これは、タンパク質分解機能を維持することを目的とする、プロテアーゼの活性部位における残基が通常、変化されるべきではない、本発明における場合である。
【０１７４】
アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖置換のサイズ、形状および種類の分析は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが全て正電荷残基であり、アラニン、グリシンおよびセリンが全て類似のサイズであり、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが全て全体が類似の形状を有することを表す。したがって、これらの考慮に基づいて、アルギニン、リシンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが本明細書において生物学的機能等価物と定義される。より定量的な変化をもたらすために、アミノ酸のハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスを割り当てられ、それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。タンパク質に相互作用する生物学的機能を与えるハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は一般に当該技術分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，本明細書に参照により組み込まれる）。特定のアミノ酸が、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、さらに類似の生物学的活性を保持することは知られている。ハイドロパシーインデックスに基づいた変化を生成する際に、ハイドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより特に好ましい。
【０１７５】
同様のアミノ酸の置換がハイドロパシーに基づいて効果的になされ得、特にこのように作製される生物学的機能等価タンパク質またはペプチドが、本発明の場合のような免疫学的実施形態における使用のために意図されることもまた、当該技術分野において理解される。参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれている米国特許第４，５５４，１０１号は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と関連して、その連続アミノ酸の親水性によって制御されている、タンパク質の最大の局所平均親水性を記載している。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されているように、アミノ酸残基に以下の親水性値が割り当てられる：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【０１７６】
類似の親水性値に基づいて変化を生成する際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより特に好ましい。説明はアミノ酸変化から生じる機能的等価ポリペプチドに焦点を当てているが、それらの変化は、コードＤＮＡの変化により行われ得ることは理解されるであろう。また、遺伝子コードが縮重され、２つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードし得ることも考慮される。
【０１７７】
医薬組成物
本発明の水性組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、緩衝剤、または水性媒体中に溶解または分散される開示されるプロテアーゼの１つ以上の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容可能」という用語は、動物、または適切な場合、ヒトに投与される場合、有害、アレルギー性または他の厄介な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の培地または剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補足的活性成分もまた、組成物に組み込まれてもよい。ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓにより必要とされる滅菌性、発熱性、および全体的な安全性ならびに純度規格を満たすべきである。
【０１７８】
生物学的物質は、望ましくない低分子量分子を除去するために広範に透析され、適切な場合、所望のビヒクルにより容易に製剤化するために凍結乾燥されるべきである。次いで活性化合物が一般に、非経口投与のために製剤化、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、またはさらに腹腔内経路による注射のために製剤化される。活性成分または組成としてタウプロテアーゼを含有する水性組成物の調製は本発明を考慮して当業者に周知である。典型的に、このような組成物は、注射物質として、液剤または懸濁剤のいずれかとして調製されてもよく；注射前の液体の添加により液剤または懸濁剤を調製するための使用に適した固体形態もまた調製されてもよく；調製物はまた、乳化されてもよい。注射用の使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性ポリエチレングリコールを含む製剤；ならびに滅菌注射溶液または分散剤の即時調製物のための滅菌粉末剤が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌されなければならず、容易に注射できる程度に流動的でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０１７９】
本発明の化合物（遊離塩基としてまたはその薬理学的に許容可能な塩のいずれかとして）の１つ以上を含有する溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合される水中で調製され得る。また、分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。本発明に係るプロテアーゼ組成物はまた、天然または塩形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）、および例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合に必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンなどの組成物の使用によりもたらされ得る。
【０１８０】
滅菌注射剤は、上記に列挙したいくつかの他の成分と共に適切な溶媒中に必要とされる量で開示される化合物の１つ以上を導入し、必要な場合、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散剤は、塩基性分散媒体および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に種々の滅菌活性成分を導入することにより調製される。滅菌注射剤を調製するための滅菌粉末剤の場合、調製の好ましい方法は、活性成分プラス以前に滅菌濾過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１８１】
例示的な定義
本発明によれば、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列などとしては、限定されないが、ＤＮＡ（限定されないが、ゲノムまたはゲノム外（ｅｘｔｒａｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを含む）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ＲＮＡ（限定されないが、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含む）、ヌクレオシド、および天然源、化学的に合成され、修飾されるかのいずれかから得られるか、または人の手により全体もしくは部分的に調製され、もしくは合成される、適切な核酸セグメントが挙げられる。
【０１８２】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および化学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価の任意の方法および組成物が本発明を実施または試験するのに使用され得るが、好ましい方法および組成物が本明細書に記載される。本発明の目的のために以下の用語は以下のように定義される。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ」または「タンパク質分解酵素（複数も含む）」とは、１つ以上のポリペプチド基質を分解する作用をする加水分解酵素を意味する。例示的なプロテアーゼは哺乳動物、特にヒト起源であり得る。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、生物学的配列間の同一の要素の程度の指標、例えば、２つの整列されたタンパク質配列間の同一のアミノ酸の割合である。ギャップが最適アラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に導入されてもよく、相同配列は比較目的のために無視されてもよい。本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、生物学的配列間の類似性の程度、例えば、２つの整列されたタンパク質配列間の類似位置において類似機能および／または構造を有する類似アミノ酸の割合の指標である。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「例えば」または「ｅ．ｇ．」という用語は、限定されないが、意図する例を意味し、明細書中に明確に列挙されたそれらの項目のみを指すと解釈されるべきではない。
【０１８６】
長年の特許法の慣例に従って、「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」という用語は、特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、「一つまたは複数」を示す。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「基質」という用語は、本明細書に開示されるプロテアーゼの１つ以上により触媒され得る化学化合物を意味する。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、成分の量に関して「実質的に含まない」または「本質的に含まない」という用語は、約１０重量パーセント未満、約５重量パーセント未満、および約１重量パーセント未満の化合物を含有する組成物を意味する。一実施形態において、これらの用語は、約０．５重量パーセント未満、約０．１重量パーセント未満、または約０．００１重量パーセント未満を指す。
【０１８９】
「タンパク質」という用語は、「ペプチド」および「ポリペプチド」と交換可能に本明細書で使用され、合成的、組換え的、またはインビトロで産生されるペプチドおよびポリペプチドならびに核酸配列が宿主動物またはヒト被験体内に投与された後にインビボで発現されるペプチドおよびポリペプチドの両方を含む。「ポリペプチド」という用語は、約２〜約２０アミノ酸残基の長さ、約１０〜約１００アミノ酸残基の長さを含む短いペプチド、および約１００アミノ酸残基以上を含む長いポリペプチドを含む、任意のアミノ酸の鎖の長さを指すことを目的とする。さらに、この用語はまた、酵素、すなわち少なくとも１つのアミノ酸ポリマーを含む、機能的生体分子を含むことを意図する。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、翻訳後修飾されている、または翻訳後修飾を有するポリペプチドおよびタンパク質を含み、骨格アミノ酸鎖に付加される任意の糖もしくは他の誘導体（複数も含む）またはコンジュゲート（複数も含む）を含む。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を意味し、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数も含む）を含む。したがって、本明細書で使用される場合、限定されないが、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」および「連続アミノ酸配列」を含む用語は全て、「ポリペプチド」の定義内に包含され、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用され得る。この用語はさらに、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解開裂、翻訳後プロセシング、または１つ以上の非天然に生じるアミノ酸の包含による修飾を含む、１つ以上の翻訳後修飾を受けているポリペプチドを含む。本開示全体を通して、一般的な一文字および三文字のアミノ酸の省略形が当該技術分野における従来の命名に従って利用される：アラニン（Ａ；Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）、およびリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）。本明細書に記載されるアミノ酸残基は「Ｌ」異性体であることが好ましい。しかしながら、「Ｄ」異性体形態の残基は、ポリペプチドの所望の特性が保持されるならば、Ｌ−アミノ酸残基に置換されてもよい。本明細書に表される全てのアミノ酸残基配列は、左から右のアミノ酸末端からカルボキシ末端配向と一致する。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、機能的関係における２つ以上のポリヌクレオチドまたは２つ以上の核酸配列の連結を意味する。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。「作動可能に連結された」とは、連結される核酸配列が、典型的に隣接しているか、または実質的に隣接しており、必要な場合、リーディングフレームに隣接し、かつリーディングフレーム内の２つのタンパク質コード領域に結合することを意味する。なぜなら、エンハンサーは一般に、プロモーターから数キロベース（Ｋｂ）離れている場合に機能し、イントロン配列は可変長であり得るからであるが、一部のポリヌクレオチド要素は隣接していないが作動可能に連結され得る。
【０１９２】
「単離された」または「生物学的に純粋な」という用語は、実質的に、または本質的に、天然状態で見られる物質を通常伴う成分を含まないことを意味する。したがって、一実施形態は、それらのインサイチュ環境においてペプチドと通常関連する物質を含有しない単離されたペプチドを提供する。
【０１９３】
「連結」または「結合」とは、限定されないが、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、静電結合などを含む、２つ以上の分子を機能的に接続するための当業者に周知の任意の方法を意味する。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「活性な」、「生物学的に活性」および「活性」とは、特定のタンパク質またはアミノ酸配列に関連している生物学的活性を意味し、本明細書で交換可能に使用される。例えば、リパーゼに関連する酵素活性は、トランス−脂肪酸またはカルボン酸部分の少なくとも一部を加水分解またはエステル化するように、加水分解および／またはアルコール分解、すなわちエタノール分解である。リパーゼ活性は、トランス−脂肪酸またはカルボン酸部分の少なくとも一部を加水分解および／またはエステル化する能力として測定される。
【０１９５】
特定の実施形態はまた、本明細書に記載される特定の配列の１つ以上と相補的または実質的に相補的なＤＮＡ配列を包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対合できるものである。本明細書で使用される場合、「相補的配列」とは、上記の同じヌクレオチド比較により評価され得る場合、実質的に相補的である核酸配列を意味するか、またはすぐ上に記載した比較的ストリンジェントな条件下で本明細書に開示される特定の核酸断片の１つ以上に加水分解できると定義される。
【０１９６】
「配列番号Ｘに実質的に記載される配列」とは、その配列が、配列番号Ｘの少なくとも第１の部分に実質的に対応し、配列番号Ｘのヌクレオチドと同一ではない、または生物学的に機能等価でない、比較的少ないヌクレオチドを有することを意味する。したがって、本明細書に提供されるヌクレオチド配列の１つ以上と同一または機能的に等価であるヌクレオチドの約８５％〜約９０％；約９１％〜約９５％；または約９６％〜約９９％を有する配列が本発明を実施するのに有用であると特に意図される。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関して、「配列番号Ｘに実質的に記載される配列」とは、配列番号Ｘの少なくとも第１の部分に実質的に対応し、配列番号Ｘのアミノ酸残基と同一でない、または生物学的に機能等価でない、比較的少ないアミノ酸残基を有する配列を意味する。「生物学的に機能等価」という用語は、当業者により十分に理解されており、本明細書に詳細にさらに定義される。したがって、本明細書に提供されるアミノ酸配列の１つ以上と同一または機能的に等価であるアミノ酸の約８５％〜約９０％；約９１％〜約９５％；または約９６％〜約９９％を有するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列は、本発明を実施するのに有用であると特に意図される。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、限定されないが、本明細書に記載されているものを含む、周知の方法（例えばＰＣＲ）を使用した鋳型特異的（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さはその特定の用途に依存するが、典型的に約１５〜約３０ヌクレオチドなどの範囲である。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、コード配列によりコードされる産物の生物学的産生を意味する。多くの場合、コード配列を含む、ポリヌクレオチド（すなわちＤＮＡ）配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成するように転写される。次いでメッセンジャーＲＮＡは、関連する生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成するように翻訳される。発現プロセスは、イントロンを除去するためのスプライシング、および／またはポリヌクレオチド産物の翻訳後プロセシングなどの、ＲＮＡ転写産物に対するさらなるプロセシング工程を含み得る。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、所定の参照遺伝子配列に関連して使用される。例えば、構造的遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、参照構造遺伝子に隣接するが、実験的操作により配置される、天然に存在しないプロモーターとして定義される。同様に、異種遺伝子または核酸断片もしくは配列は、参照プロモーターおよび／またはエンハンサー要素に隣接する天然に存在しない遺伝子または断片と定義される。同様に、「異種」という用語はまた、所定のアミノ酸配列に関連して使用される。例えば、アミノ酸配列に関して、ポリ−ヒスチジンタグなどの異種タンパク質タグは、参照アミノ酸配列に隣接する天然に存在しないペプチド配列として定義される。同様に、異種アミノ酸断片または配列は、参照タグに隣接する天然に存在しない断片または配列として定義される。さらに、異種タンパク質は、特定の生物により天然に産生しない、または特定の生物内に見られないタンパク質を指す。これは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主生物中の非天然リパーゼ遺伝子のクローニングおよび発現により発生できる。
【０２００】
本明細書に使用される場合、「プロテアーゼバリアント」という用語は、「親」プロテアーゼのポリペプチド配列内の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失により誘導される、天然または野生型プロテアーゼとは異なるプロテアーゼを意味し、アミノ酸置換の場合、バリアントは典型的に、通常、対応する、非置換、または「野生型」プロテアーゼに見られない、１つ以上の他のアミノ酸残基により１つ以上のアミノ酸残基において置換される。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、「プライマー」または「プライマー配列」という用語は、相補的鋳型核酸鎖（「標的配列」）と選択的にハイブリダイズし、鋳型鎖を複製するためにヌクレオチドを付加するための開始点として機能する任意の核酸配列または断片を指す。本発明のプライマー配列は、標識されてもよいか、または他の修飾を含有してもよく、それにより増幅産物の検出および／または分析を可能にする。標的ＤＮＡ配列のポリメラーゼ媒介性重複の開始因子として役立つことに加えて、プライマー配列はまた、対応するＤＮＡへの鋳型ＲＮＡの逆転写のために使用されてもよい。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「構造遺伝子」という用語は、コードされるペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボザイム、触媒ＲＮＡ分子、またはアンチセンス分子を産生するために発現されるポリヌクレオチドを意味する。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「標的配列」または「標的ヌクレオチド配列」は、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー配列を伸長でき、それにより相補鎖を複製できる条件下でプライマー配列の１つがハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列を含む。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、外因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ウイルスベクター、プラスミド、または組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）を宿主細胞またはプロトプラスト内に導入するプロセスを意味し、その外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも第１染色体内に導入されるか、または形質転換宿主細胞内で自己複製できる。トランスフェクション、エレクトロポレーション、および「ネイキッド」核酸取り込みは全て、１つ以上のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するために使用される技術の例を表す。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」という用語は、核酸相補体が、１つ以上の外因性オリゴ−またはポリヌクレオチドのその細胞内への導入により変化される、宿主細胞を意味する。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は典型的に、宿主細胞中で複製できる核酸分子（典型的にＤＮＡからなる）および／または別の核酸断片が、結合断片の複製をもたらす作動可能に連結され得る核酸分子を指す。プラスミド、コスミド、またはウイルスが例示的なベクターである。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「実質的に対応する」、「実質的に相同」または「実質的に同一」という用語は、核酸またはアミノ酸配列の特徴を示し、選択される核酸またはアミノ酸配列は、選択される参照核酸またはアミノ酸配列と比較して少なくとも約７０または約７５パーセントの配列同一性を有する。より典型的に、選択される配列および参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４またはさらに８５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５パーセントの配列同一性を有する。さらにより好ましくは、高い相同配列は多くの場合、選択される配列と、比較される参照配列との間で少なくとも約９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を共有する。配列同一性のパーセンテージは、比較される配列の全長にわたって計算され得るか、または選択される参照配列の全体で約２５パーセント未満などの少しの欠失もしくは付加を除外することによって計算され得る。参照配列は、遺伝子もしくは連続配列の一部、または染色体の反復部分などのより大きな配列のサブセットであってもよい。しかしながら、２つ以上のオリゴ−またはポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は典型的には、少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約１６〜２５ヌクレオチド、さらにより典型的には少なくとも約２６〜３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、または少なくとも約６０、７０、８０、９０、もしくはさらに少なくとも約１００などのヌクレオチドを含む。
【０２０８】
好ましくは、高い相同断片が望まれる場合、２つの配列（多くの場合、「標的」および「プローブ」配列と称される）間の同一性パーセントは、少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約８５％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、またはさらに少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％もしくはそれ以上である。２つ以上のオリゴ−またはポリヌクレオチド配列の間の相同性のパーセンテージまたは同一性のパーセンテージは、標準的な配列比較アルゴリズム、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）により記載されているＦＡＳＴＡプログラム分析のうちの１つ以上を使用して、当業者により容易に決定され得る。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、対象物に適用する場合、「天然に存在する（発生する）」という用語は、対象物が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然源から単離され得、実験室で人の手により意図的に修飾されていない、生物に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。
【０２１０】
アミノ酸または核酸配列のいずれかを定義するために使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、特定の対象配列、例えばオリゴヌクレオチド配列が、選択される配列の全てまたは一部と実質的に相補的であるので、選択される配列をコードするｍＲＮＡの一部と特異的に結合することを意味する。したがって、典型的に、配列はｍＲＮＡ「標的」配列と高い相同性を有し、配列の相同性部分にわたって約１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、または１０以下の塩基ミスマッチを有する。多くの場合、配列がマッチすることを必要とする、すなわち、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列と完全に相同し、したがって相補鎖に沿ってミスマッチがゼロであることが好適であり得る。したがって、高い相同プライマーまたはプローブ配列は典型的に、複数のポリヌクレオチドの標的配列領域とかなり特異的に結合するので、リアルタイムＰＣＲにより標的配列の増幅を駆動するのに高い効果を有する。
【０２１１】
実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応する標的核酸配列と約８０パーセントより高い相同性、約８５パーセントより高い相同性、約９０パーセントより高い相同性、またはさらに約９５パーセントより高い相同性（または「正確なマッチ％」）であり、より好ましくは、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応する核酸配列と約９６％またはそれより高い相同性である。特定の態様において、上記のように、本発明の実施に使用するために、さらにより実質的に相同的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ましく、そのような場合、オリゴヌクレオチド配列は、設計されたオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが特異的に結合する標的核酸配列の全てまたは一部と約９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、またはさらに１００％相同である。
【０２１２】
開示される配列のいずれかの類似性パーセントまたは相同性パーセントは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定され得る。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）のアラインメント法を利用する。手短に述べると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列の短い方のシンボルの総数で割った、類似する整列されたシンボル（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムについての好ましいデフォルトパラメータは、（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリクス（識別子について１の値および非識別子について０の値を含有する）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖらの重み付け比較マトリクス、（２）各ギャップ（ｇａｐ）について３．０のペナルティおよび各ギャップにおける各シンボルについてさらに０．１０のペナルティ；ならびに（３）エンドギャップについてペナルティなし。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「蛍光共鳴エネルギー移動対」または「ＦＲＥＴ対」とは、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアを含むフルオロフォアの対を指し、ドナーフルオロフォアは共鳴エネルギーをアクセプターフルオロフォアに移動できる。好ましい蛍光共鳴エネルギー移動対において、ドナーフルオロフォアの吸収スペクトルは、アクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと実質的に重ならない。本明細書で使用される場合、「ドナー」プローブとは、蛍光共鳴エネルギー移動対のドナーフルオロフォアで標識されるプローブを指す。本明細書で使用される場合、「アクセプター」プローブとは、蛍光共鳴エネルギー移動対のアクセプターフルオロフォアで標識されるプローブを指す。一部の場合、ドナーおよびアクセプターの両方は、単一プローブに作動可能に連結され得るか、またはしばしばオリゴヌクレオチドベースのＦＲＥＴ分析における場合、各々は異なるプローブに作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド対」は典型的に、「アンカー」または「ドナー」オリゴヌクレオチドプローブおよび「アクセプター」または「センサー」オリゴヌクレオチドプローブを含み、このような対は、ドナーオリゴヌクレオチドプローブおよびアクセプターオリゴヌクレオチドプローブがそれらの相補的標的核酸配列とハイブリダイズする場合、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）関係を形成する。蛍光共鳴エネルギー移動対として使用するための許容可能なフルオロフォア対は当業者に周知であり、限定されないが、フルオレセイン／ローダミン、フィコエリトリン／Ｃｙ７、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ６４０、フルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ７０５、およびそれらの組み合わせを含む。
【実施例】
【０２１４】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。実施例に開示される技術は、本発明を実施するのに十分に役立つ本発明者らにより発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式とみなされると考慮されるべきであることは当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は本開示を鑑みて、多くの変更が、開示される特定の実施形態においてなされ得、さらに本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果を得ることを認識するであろう。
【０２１５】
実施例１−タウオリゴマーの自己タンパク質分解活性
この実施例はタウオリゴマーの自己タンパク質分解活性の識別を記載する。この研究により、タウ４Ｒ２Ｎが、反応緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中での３７℃におけるインキュベーション時にジスルフィド媒介性オリゴマーを形成する場合、
自己タンパク質分解開裂（すなわち自己開裂）を受けることが実証される。タウ４Ｒ１Ｎは類似特性を示した。
【０２１６】
精製した組換えヒトタウ４Ｒ２Ｎをフローチャートに記載したように調製した。単量体、二量体および三量体種は形成したオリゴマーを有するタウ４Ｒ２Ｎ調製物由来の精製した分取電気泳動であった。電気泳動緩衝液はタンパク質分解活性を阻害する０．１％ＳＤＳを含有した。タウ種を含有する画分は、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過装置（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４に交換した緩衝液であり、タウ自己タンパク質分解活性の回復を導いた。調製物のタンパク質濃度を、ＢＣＡキット（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。試料は、ジスルフィド媒介性オリゴマーを可視化するために、還元剤を使用せずにプレキャスト４〜２０％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で泳動した。ＧｅｌＣｏｄｅＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でゲルを染色した。レーン１：５．２μｇのタウ４Ｒ２Ｎオリゴマー鎖；レーン２：緩衝液交換前の２マイクロリットルの単量体画分；レーン３：緩衝液交換後の０．５μｇの単量体；レーン４：緩衝液交換前の５μＬの二量体画分；レーン５：緩衝液交換後の０．５μｇの二量体；レーン６：緩衝液交換前の２０μＬの三量体画分；レーン７：緩衝液交換後の０．５μｇの三量体。
【０２１７】
タウ４Ｒ２Ｎは、インキュベーション時にジスルフィド媒介性オリゴマーを形成する場合、自己タンパク質分解開裂（自己開裂）を受ける。タウ自己タンパク質分解活性を二量体および三量体種で同時精製した。自己タンパク質分解活性の量は、完全なサイズの三量体がインキュベーション後に残らなかった程度に断片化した三量体で最大であった。二量体はまた、自己タンパク質分解活性を示したが、単量体のみは、インキュベーション時にオリゴマー形成の後で少しの活性を示した。このことは、タウタンパク質が、自己断片化により示される、タンパク質分解活性を有し、そのオリゴマー形成が観測可能なタンパク質分解活性に必要であったことを示す。このことはまた、三量体形態が、二量体形態より活性であり、同様に単量体から形成されるオリゴマーラダーより活性であることを示す。タウ自己タンパク質分解活性が二量体および三量体種で同時精製したこともまた示された。この自己タンパク質分解活性は、三量体活性＞＞二量体活性＞＞単量体活性であると観測された。完全長の三量体は小さな断片中で完全に消化し、インキュベーション時に、単量体は低レベルの自己タンパク質分解活性を生成するオリゴマーラダーを形成した。
【０２１８】
実施例２−プロテアーゼ活性または精製した単量体、二量体、および三量体
この実施例は、精製したタウ単量体、二量体、および三量体のプロテアーゼ活性を実証する研究の結果を記載する。タウ４４１の単量体、二量体、および三量体は、連続溶出電気泳動を使用して非還元条件下で精製した。各オリゴマー試料の画分をプールし、３０，０００ダルトンの分子量カットオフを用いてＡｍｉｃｏｎスピン濃縮器を使用して緩衝液を安定緩衝液に交換した。インキュベートしていない対照を４℃にて氷上に維持しながら、０．３５μｇの各試料を３７℃にて一晩インキュベートした。翌朝、還元剤を有さない２×ＳＤＳの試料緩衝液を各試料に加え、４〜２０％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上にロードした。
【０２１９】
タウ４Ｒ２Ｎプロテアーゼの複数のロットをこれまでに作製し、三量体について最大活性を有するジスルフィド媒介性凝集体の形成後のみプロテアーゼ活性の類似の特性を示す。レーン１−オリゴマーラダー；レーン２−インキュベーションしていない単量体；レーン３−インキュベーションした単量体；レーン４−インキュベーションしていない二量体；レーン５−インキュベーションした二量体；レーン６−インキュベーションしていない三量体；レーン７−インキュベーションした三量体；および４°＝四量体；３°＝三量体；２°＝二量体；１°＝単量体。
【０２２０】
タウ三量体活性＞＞タウ二量体活性＞＞タウ単量体活性
インキュベーションの間、タウ単量体およびタウ二量体は、明確な上側バンド（ボックス１に示す）で観測される限り高次凝集体を形成するのに対して、三量体はさらなる高次凝集体を形成しない（ボックス２に示す）。高次オリゴマーを形成する反応性の欠如により、三量体構造が少しの遊離チオールを含有することが示唆された。なぜなら、それらは既にジスルフィド結合しているか、または立体的に遮蔽されているからである。この実験は、実施例１からの結果が、三量体、続いて二量体について最も高い活性を示しているので再現性がある。この調製物から精製したタウ４Ｒ２Ｎ三量体はまた、インキュベーションの間にさらなる高次種を形成しないように見え、遊離チオールを有さない、または存在する遊離チオールが立体的に遮蔽されているので、反応しないことを示し得る。
【０２２１】
タウ４Ｒ２Ｎプロテアーゼの複数のロットが作製され、各々は、三量体について最大活性を有するジスルフィド媒介性凝集体の形成後にのみプロテアーゼ活性の類似特性を示した。インキュベーションの間、タウ単量体およびタウ二量体は、明確な上側バンドで観測される限り高次凝集体を形成したのに対して、三量体はさらなる高次凝集体を形成しなかった。高次オリゴマーを形成する反応性の欠如により、三量体構造が少しの遊離チオールを含有したことが確認された。なぜなら、それらは既にジスルフィド結合しているかまたは立体的に遮蔽されているからである。
【０２２２】
実施例３−汚染抑制研究
この実施例はタウプロテアーゼの汚染抑制研究からの結果を示す。タウ４４１の単量体、二量体、および三量体を、連続溶出電気泳動を使用して非還元条件下で精製した。各オリゴマー試料の画分をプールし、３０，０００ダルトンの分子量カットオフを用いてＡｍｉｃｏｎスピン濃縮器を使用して緩衝液を安定緩衝液に交換した。インキュベーションしていない対照を４℃にて氷上に維持しながら、０．３５μｇの各試料を３７℃にて一晩インキュベートした。翌朝、還元剤を有さない２×ドデシル硫酸ナトリウム試料緩衝液を各試料に加え、４〜２０％の勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上にロードした。
【０２２３】
タウ三量体は優先的に分解されるのに対して、活性の原因となる場合、等量の汚染プロテアーゼを含有する精製からの等しい試料体積を使用した単量体および二量体の最小の開裂が示された。レーン１−タウオリゴマーラダー標準物；レーン２−空；レーン３−インキュベーションしていない精製した単量体（精製プレートからの画分）；レーン４−インキュベーションしていない精製した単量体；レーン５−インキュベーションした精製した単量体；レーン６−インキュベーションしていない精製した二量体；レーン７−インキュベーションした精製した二量体；レーン８−インキュベーションしていない精製した三量体；３７℃にて一晩インキュベーションした精製した三量体。レーン３〜９はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有する試料緩衝液で処理した。この研究の結果により、タウ三量体は優先的に分解されるのに対して、精製から等しい試料体積を使用した場合、単量体および二量体の最小開裂が観測されたことが実証された。
【０２２４】
調製の間、同じ体積の単量体、二量体および三量体をプールし、緩衝液を交換し、各試料が同じ量の緩衝液に曝露されるように濃縮した。これは、この精製の工程の間に使用される緩衝液内に含まれる汚染プロテアーゼを抑制する。
【０２２５】
実施例４−タウプロテアーゼについての安定緩衝液の開発
この実施例はタウプロテアーゼの活性を保存するための安定緩衝液の開発および特徴付けを記載する。酵素活性についての最小阻害濃度である０．００２％ＳＤＳを含有する酵素安定緩衝液を開発した。安定緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４および０．００２％のドデシル硫酸ナトリウムを含有した。反応緩衝液中で１０倍以上であるタウプロテアーゼ酵素の希釈は活性を戻した。
【０２２６】
各試料に関して、０．３μｇの精製したタウ４Ｒ２Ｎ三量体を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４中の種々の量のドデシル硫酸ナトリウムの存在下で３７℃にて一晩インキュベートした。５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４中のＳＤＳの連続希釈を氷上で調製し、一定量のタウ４Ｒ２Ｎ三量体を各希釈に加えた。インキュベートしていない対照を４℃にて氷上で維持しながら、試料を３７℃にて一晩インキュベートした。翌朝、還元剤を有する２×ＳＤＳを各試料に加え、４〜２０％の勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上にロードした。
【０２２７】
試験したＳＤＳの濃度は、レーン１＝０％；レーン２＝０．００００５０％；レーン３＝０．０００１００％；レーン４＝０．０００２００％；レーン５＝０．０００３９０％；レーン６＝０．０００７８０％；レーン７＝０．００１５６０％；レーン８＝０．００３１３０％；レーン９＝０．００６２５０％；レーン１０＝０．０１２５００％；レーン１１＝０．０２５０００％；レーン１２＝０．０５００００％；レーン１３＝０．１０００００％；レーン１４＝空；レーン１５＝βメルカプトエタノールを有するタウ４Ｒ２Ｎ単量体。
【０２２８】
この研究は、反応緩衝液（すなわち２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４）中で１０倍の希釈により活性化され得る、タウプロテアーゼが安定である緩衝液の形成を可能にした。酵素活性についての最小阻害濃度である、０．００２％ＳＤＳを含有する酵素安定緩衝液を開発した。反応緩衝液中で１０倍以上であるタウプロテアーゼ酵素の希釈は活性を戻す。
【０２２９】
実施例５−安定緩衝液は自己切断を防ぐ
この実施例は、実施例４に記載した安定緩衝液が、そのタンパク質分解ドメインによりタウタンパク質の自己切断を防ぎ、完全長単量体、二量体および三量体タウプロテアーゼの産生を可能にすることを実証する。
【０２３０】
精製したタウ４Ｒ２Ｎ単量体、二量体、および三量体の個々の画分は、３０，０００ダルトンの分子量カットオフを用いてＡｍｉｃｏｎスピン濃縮器を使用して安定緩衝液に緩衝液交換した。同じ日に、各オリゴマー試料のアリコートを、還元剤を有さない２×ＳＤＳを付加することによりゲル分析のために調製し、続いて４〜２０％の勾配のＴｒｉｓＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上にロードした。
【０２３１】
安定緩衝液は、タウプロテアーゼについての完全長単量体、二量体および三量体の産生を可能にする。レーン１−未精製タウ４Ｒ２Ｎオリゴマーラダー；レーン２−空；レーン３−空；レーン４−安定緩衝液中のタウ４Ｒ２Ｎ精製単量体；レーン５−安定緩衝液中のタウ４Ｒ２Ｎ精製二量体；レーン６−安定緩衝液中のタウ４Ｒ２Ｎ三量体。
【０２３２】
その結果により、インタクトの単量体、二量体および三量体が、精製され得、実施例３に記載した安定緩衝液中で安定なままであることが示された。
【０２３３】
実施例６−タウ単量体、二量体、および三量体分解
この実施例に示した研究は５個のタウ断片の質量決定を実証する。タウ三量体、二量体および単量体分解物由来の断片を精製し、質量分析に供した。断片３は、Ｎ末端シークエンシングに基づいて３４０ＫＳ３４１にて切断し、質量決定に基づいて３５３ＫＩ３５４および３７０ＫＩ３７１にて切断した。断片１〜４は同じＮ末端を有することを示し、それらが全て、Ｃ末端上で異なるが、１３０ＫＳ１３１にて切断したことを示す。表３は標準曲線を生成するために分子量マーカーサイズ標準物を使用した断片の見かけの分子量を報告する。
【０２３４】
【表７】
2014522237.tif 000009
【０２３５】
【表８】
2014522237.tif 000010
【０２３６】
質量決定およびＮ末端シークエンシングのための低分子量のタウ断片の調製。５０μＬの２．４５ｍｇ／ｍＬの精製したタウ４Ｒ２Ｎ二量体を、自己タンパク質分解を可能にするために３７℃にて３８．５時間インキュベートした。試料を等量の２×試料緩衝液（１２６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合し、５ウェルのプレキャストの１５％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−グリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）中に泳動した。ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でゲルを１時間染色し、高度に精製された水で一晩脱染した。矢印の標識されたＦ３により示されたバンドを切除し、新たなカミソリの刃（水およびエタノールで洗浄した）で細かく細分化し、一晩撹拌しながら４℃にて５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０中でインキュベートした。溶出部分を含有する緩衝液を分析のためにＡｌｐｈａｌｙｓｅに送った。高分子量の断片１〜４を、ＰＶＤＦ膜に移すことによりＮ末端シークエンシングのために調製した。断片をＰｏｎｃｅａｕ染色で可視化し、洗浄した新たなカミソリで切断した。膜結合断片をＮ末端シークエンス分析のためにＡｌｐｈａｌｙｓｅに送った。４個の断片のＮ末端シークエンスは同じであった：ＳＫＤＧＴＧ（配列番号１８）。このことは、アミノ酸Ｋ１３０とＳ１３１との間の切断部位がタウプロテアーゼの主な自己タンパク質分解部位であることを示す。
【０２３７】
ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ）による分子量決定。ＭＡＬＤＩ  ＭＳにおいて、溶解した試料を金属標的物上に堆積させ、ペプチドおよびタンパク質をリガンド吸収マトリクスで共結晶化する。レーザービームを乾燥マトリクス試料に方向付け、試料分子を脱着させ、イオン化し、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器において質量を測定する。より大きなタンパク質が多くの場合、単一（ＭＨ＋）、二重（ＭＨ２  ２＋）および三重プロトン化（ＭＨ３  ３＋）イオンとして質量スペクトル（ｍ／ｚ）において観測される。タンパク質の質量はインタクトな非プロトン化タンパク質の平均質量として計算する。ＭＡＬＤＩプロセスは、タンパク質調製物が、塩および洗浄剤を干渉することから比較的純粋であることを必要とし、通常、最大約６０ｋＤａまでのインタクトなタンパク質の５〜１０Ｄａ内の質量決定が得られる。この分析において、ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）ユーザガイドに従ってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）（Ｃ１８物質）を使用してタンパク質をマイクロ精製した。タンパク質を５０％メタノールで溶出した。マトリクスとしてＨＣＣＡを使用して線形モードにおいてＭＡＬＤＩ質量スペクトルによりタンパク質を分析した。外部校正を使用して質量スペクトルを校正した。
【０２３８】
ＡＢＩ  Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）４９４シークエンサーに基づいてＮ末端エドマンシークエンシングを実施した。この手順は、エドマン分解化学によりタンパク質およびペプチドのＮ末端アミノ酸配列を決定する。シークエンシングは酸でエッチングしたガラスファイバーディスクまたはＰＶＤＦ膜上で行う。
【０２３９】
エドマン分解は、アミノ酸残基が一つずつ切断され、クロマトグラフィーにより識別される循環手順である。循環手順において３つの工程が存在する。工程１において、ＰＩＴＣ試薬はアルカリ性条件下でＮ末端アミノ基に結合される。工程２において、Ｎ末端残基は酸性培地中で開裂される。工程３において、ＰＩＴＣが結合した残基はフラスコに移され、ＰＴＨ残基に変換され、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより識別される。次いで次のサイクルを次のＮ末端残基の識別のために開始する。断片Ｆ３についてのＮ末端配列は、タウ４Ｒ２Ｎのアミノ酸３４１〜３４６に対応するＳＥＫＬＤＦであると決定し、タウプロテアーゼがリシン３４０とセリン３４１との間でそれ自体を切断することを示す。
【０２４０】
断片の単離およびシークエンシングにより、４つの断片が同じｎ末端（１３０Ｋ−Ｓ１３１にて切断）を有し、反応の間に容易に開裂される１つの断片（３４０Ｋ−Ｓ３４１）がウェスタンブロット（図６Ａ）において見られる信号の損失を生じるので、我々が主要な切断部位と指定したタウにおいて２つの切断部位を識別できた。
【０２４１】
【表９】
2014522237.tif 000011
【０２４２】
表４は、Ｃ末端およびＮ末端に特異的な標識抗体を有するウェスタンブロットを使用して観測したタウ４Ｒ２Ｎ部分消化からの計算したＭＷを示す。切断部位モチーフＰ１−Ｐ１’をこの分析において識別した。精製したタウ４Ｒ２Ｎ単量体、二量体および三量体調製物を、緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で３７℃にて０、２および１６時間インキュベートし、還元剤を有する試料緩衝液を含む４〜２０％のポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル上で泳動した。左から、レーン１〜３−単量体、０、２、１６時間のインキュベーション；レーン４〜６−二量体、０、２、１６時間のインキュベーション；レーン７〜９−三量体、０、２、１６時間のインキュベーション。ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でゲルを染色し、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に移した。Ｃ末端に特異的な抗体、アミノ酸４０４〜４４１タウ４Ｒ２Ｎにおけるエピトープ（モノクローナルＴ４６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用してタウ４Ｒ２Ｎタンパク質の部分消化から観測された断片を識別するために使用した免疫ブロット法を実施した。ブロットを剥がし、Ｎ末端に対する抗体、アミノ酸８３〜１２０タウ４Ｒ２Ｎにおけるエピトープ（モノクローナル抗体Ｔ１４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で再プローブした。
【０２４３】
移動断片の分子量（ＭＷ）を、標準物としてオリゴマーラダーを使用し、移動（Ｒｆ）対ｌｏｇ（ＭＷ）をプロットすることにより決定した。この計算のために、以下のＭＷを使用した：単量体について４５，９００Ｄａ；二量体について９１，８００Ｄａ；三量体について１３７，７００Ｄａ；四量体について１８３，６００Ｄａ、それらから標準曲線を計算し、ｌｏｇ（Ｍｗ）＝−０．５８９３Ｒｆ＋５．５１０７；Ｒ２＝０．９８３２に線形的に適合した。標準曲線から、単量体タウのＭＷが４４，６７４Ｄａであると計算し、実際のＭＷと約１，２２５Ｄａ異なる。このように計算したＭＷは実際のＭＷの近似値である（見かけのＭＷではない）。
【０２４４】
断片対の一致により、４５．９ｋＤａのタウ４Ｒ２Ｎの分子量ＭＷが、部分消化の間に切断したＫＳ部位の識別を可能にすることがまとめられる。さらに、ＫＴ部位における切断と一致する断片もまた、この方法を使用して識別された。したがって、質量スペクトルおよびウェスタンブロットから識別したタウ切断部位モチーフはＰ１−Ｋ−（Ｓ，ＴまたはＩ）−Ｐ１’であった。ＮおよびＣ末端特異的抗体についてのウェスタンブロットで観測した各断片のＭＷを、この標準曲線を使用して計算した。開裂反応が完了していなかったので、Ｎ末端を含有する各々の可能な断片およびＣ末端を含有する各々の可能な断片が表される。このように、断片は、Ｎ末端のＭＷ＋Ｃ末端のＭＷがタウ４Ｒ２ＮのＭＷ（４５，９００）と近似するように組み換えられてもよいか、または一致されてもよい。この分析から、１６個の断片は、４６，０８７Ｄａの計算した平均ＭＷおよび２，２６７Ｄａの標準偏差と一致した。この分析から、代替部位において断片切断を表すことができる４個の一致していない断片が存在した。この結果はＫ−ＳおよびＫ−Ｉ部位を含む質量スペクトルにより識別した切断部位と一致する。Ｋ−ＳおよびＫＩについて全部で１２の切断部位はタウ４Ｒ２Ｎの配列から予想されるが、２つのセットの断片は断片の予測されるＭＷに基づいてＰＡＧＥにより区別可能である。したがって、２２個の予測される断片のうちの２０個が観測され、１６個の断片は一致した対を形成した。４個の断片はＫ−ＳおよびＫ−Ｉにおける切断と関連していないようであるが、タウプロテアーゼについて二次切断部位を表し得るＫ−Ｔにおける切断と一致する。この分析から識別した断片により、我々は、自己タンパク質分解反応の間、最も容易に切断するタウにおける切断部位を識別できる。これにより、我々はまた、Ｋ−Ｓ部位における切断に加えて、タウにおけるＫ−ＩおよびＫ−Ｔ部位における切断が存在することも見ることができる。Ｋ−Ｉ部位における切断は図４における質量決定により支持される。
【０２４５】
実施例７−タウ４Ｒ２Ｎタンパク質分解断片
表４に示した結果ならびにまた、実施例６におけるｎ末端シークエンシングの結果および完全長タウのｎ末端およびｃ末端領域においてプローブするウェスタンブロットの結果（図６Ａ、図６Ｂ）に基づいて、我々は生成される可能性のある断片を識別できる。これらの断片はバイオマーカーとして潜在的有用性を有し、また、固有のプロテアーゼ活性を有し得るかまたは神経毒である可能性もある（仮説）。全部で１６個の切断部位について切断部位Ｐ１−Ｋ−（Ｓ，Ｔ，またはＩ）−Ｐ１’の識別を可能にする不完全な消化物でウェスタンブロットを実施した：
【表１０】
2014522237.tif 000012
【０２４６】
観測した切断のうちの３つは、タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼ自己タンパク質分解反応において見られる主要な切断部位（すなわち、１３０ＫＳ１３１、３４０ＫＳ３４１、３５３ＫＩ３５４、および３９５ＫＳ３９６）であり、反応混合物の一晩のインキュベーション後に３個の断片を生じた。観測した他の１３の切断は二次切断部位であり、単量体または二量体タウ上のＴＰＲの部位（すなわち、６７ＫＳ６８、１３０ＫＳ１３１、１４８ＫＴ１４９、１５０ＫＩ１５１、１７４ＫＴ１７５、１８０ＫＴ１８１、１９０ＫＳ１９１、２３４ＫＳ２３５、２４０ＫＳ２４１、２５７ＫＳ２５８、２５９ＫＩ２６０、３５３ＫＩ３５４、３７０ＫＩ３７１、３８５ＫＴ３８６、および３９５ＫＳ３９６）を表し得る。
【０２４７】
２つの主要な切断部位１３０ＫＳ１３１および３４０ＫＳ３４１により、我々はＴＰ−２１０（１３１〜３４０）から活性断片を識別できた。クローニング後、この断片により、我々は、それがプロテアーゼ活性を有することを実証できたので（図７）、この断片はタウの活性部位領域に及ぶ。
【０２４８】
識別した切断部位に基づいて、タウにおいて１６個の潜在的切断部位が存在した。完全な消化により、表５に記載した１７個の断片が生じた。部分消化により２５７個の断片が生じたようであった。これらの断片は疾患におけるタウタンパク質分解活性についての可能なバイオマーカーを表す。さらに、タウはアニオン性Ｎ末端およびカチオン性Ｃ末端を有するので、これらの断片は大いに異なる特性を示し得ると予想される。断片１５におけるヒト芽球により、それがタウ、およびタウ誘導体、およびＭＡＰ４においてのみ存在することが示された。この断片はＡＤに対する高度に特異的なバイオマーカーを表し得る。また、そのサイズ、変化、および組成に起因して、簡単な血液検査を用いてＡＤの検出を可能にする血漿に容易に侵入すると予想される。
【０２４９】
【表１１】
2014522237.tif 000013
【０２５０】
実施例８−タウプロテアーゼ活性のザイモグラム分析
ブルーカゼイン（１０−ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して４〜１６％のＰＡトリス−グリシンゲルシステムにおいてザイモグラフ分析を実施した。非還元試料緩衝液を使用して試料を泳動し、精製水で２回、２００ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０で１×３０分、ゲルを洗浄した。３７℃にて２００ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０中でゲルをインキュベートし、２時間のインキュベーション後に走査した。
【０２５１】
４〜１６％のＰＡトリス−グリシンブルーカゼインゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）上でザイモグラフ分析を実施した。ゲル内のブルーカゼインの除去はゲル内のその位置におけるタンパク質分解活性を示す。ジスルフィド媒介性オリゴマーを維持するために非還元試料緩衝ゲルを使用して試料を泳動した。精製水でゲルを洗浄して、プロテアーゼ活性に対して阻害性であるＳＤＳを除去し、反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０）中で平衡化した。３７℃にて２時間、反応緩衝液中でゲルをインキュベートし、画像化し、さらに１８時間インキュベートした。ゲルを画像化した後、それを、ＧｅｌＣｏｄｅＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染色して、ゲル内に泳動したタンパク質試料を可視化し、それらをゲル内の観察されるプロテアーゼ活性と関連付けた。レーン１−タンパク質標準物、ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）；レーン２−２５μｇのタウ４Ｒ２Ｎオリゴマーラダー；レーン３−２５μｇのタウ４Ｒ２Ｎ二量体；レーン４−５μｇのタウ４Ｒ２Ｎ二量体；レーン５−１μｇのタウ４Ｒ２Ｎ二量体。
【０２５２】
タウタンパク質バンドとタンパク質分解活性との間の空間相関により、活性がタウに内在しており、汚染プロテアーゼでないことが示された。高次の凝集体およびタウ断片はブルーカゼインの除去により活性を実証した。ブルーカゼインの除去はまた、タウオリゴマーラダーからの単量体バンドの領域において見出された。続いて、このバンドから別のゲル上にタンパク質を泳動することにより、タウが単量体バンドの位置においてゲル内でオリゴマー化され、それが自己タンパク質分解活性を有することが実証された。別の観測により、タウはザイモグラムにおいてカゼインタンパク質基質を切断する能力を有した。
【０２５３】
実施例９−タウ４Ｒ２Ｎ三量体プロテアーゼはチューブリンを切断する
タウプロテアーゼは、その自己タンパク質分解反応に加えて、また、チューブリンを開裂する。タウの主要な正常機能のうちの１つは、微小管内のチューブリンの重合を促進し、ニューロンの軸索内でそれらの構造を維持することである。この作用は、タウがオリゴマーを形成する場合、それがチューブリンを分解できることを示し、微小管および神経機能の破壊のための直接的な病理機構を実証する。
【０２５４】
示していない結果において、タウ４Ｒ２Ｎ三量体はチューブリンを切断する。その研究において、レーン１−チューブリン、インキュベーションなし；レーン２−タウを含まずにインキュベートしたチューブリン；レーン３−タウ４Ｒ／２Ｎ三量体とチューブリン、インキュベーションなし；レーン４−タウ４Ｒ２Ｎ三量体とインキュベートしたチューブリン。チューブリンのみのインキュベーションは一部のチューブリン二量体の形成を導いたが、チューブリンを断片化しなかった。タウ４Ｒ２Ｎ三量体とのチューブリンのインキュベーションは、チューブリン断片の形成およびチューブリン二量体の分解を導いた。
【０２５５】
凍結乾燥したチューブリン（カタログ番号ＴＬ２３８、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  Ｉｎｃ．）を、６ｍｇ／ｍＬの溶液のために２００μＬの緩衝液中で懸濁した。試料を３７℃にて１９．２５時間インキュベートした。１０μＬの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＢＭＥ）を各試料に加えた。試料を、ロードする５分前に加熱した蓋を用いてサーマルサイクラー内で９５℃にて５分間加熱した。
【０２５６】
α−エンドルフィンは内因性オピオイドペプチドであり、そのアミノ酸配列はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号１３）である。それは、β−エンドルフィンのＮ末端の１６アミノ酸配列であり、１つのアミノ酸がガンマ−エンドルフィンと異なる（β−エンドルフィン１〜１７）。したがって、タウプロテアーゼはこれらのタンパク質の全てを切断するはずである。なぜならアルファエンドルフィンがそれらのサブ断片であるからである。
【０２５７】
アルツハイマー疾患におけるタウプロテアーゼによるオピオイドペプチドの分解は、疾患と関連した情緒変化についての機構を提供でき、タウプロテアーゼ活性の阻害は疾患における気分障害を改善する有用性を有し得る。
【０２５８】
１２μｇのα−エンドルフィンペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を、３７℃にて２０時間、反応緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で１．２μｇのタウ４Ｒ／２Ｎ三量体とインキュベートした。逆相ＨＰＬＣを使用してペプチドの開裂をモニターした。下側のトレースはタウプロテアーゼを有さずにインキュベートしたインタクトなペプチドについてのピークを示し、上側のトレースは、アルファエンドルフィンの開裂を示すピークＦ１およびＦ２の形成を示す。アスタリスクは、インキュベーションチューブから誘導される人工ピークを示す。
【０２５９】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を開裂して、アルツハイマー病の病理における重要な因子であると考えられる、Ａβを形成する。ＡＰＰのアミノ酸６６７〜６７６（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ）（配列番号１４）由来のペプチドもまた、ＡβのＮ末端を生成するためにＡＰＰを切断するベータセクレターゼについての開裂部位を含有する。ベータセクレターゼはＭとＤとの間を切断するのに対して、タウプロテアーゼは恐らく、ＫとＭとの間を切断する（ペプチド配列において下線を引いている）。
【０２６０】
実施例１０−タウ三量体活性はプロテアーゼ阻害剤カクテルにより阻害される
タウ三量体プロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、アミノ−ペプチド、システインプロテアーゼおよびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤を含有するプロテアーゼ阻害剤カクテルと、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを有さずに、一晩インキュベートした。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、酵素機能と一致するさらなる断片化を阻害した。
【０２６１】
【表１２】
2014522237.tif 000014
【０２６２】
各試料に関して、０．４５μｇのタウ４Ｒ２Ｎ三量体を、種々の新たに調製したプロテアーゼ阻害剤の存在下で３７℃で０．２ｍｇ／ｍＬにて一晩インキュベートした。インキュベートしていない対照を氷上に一晩４℃にて維持した。翌朝、還元剤を有する２×ドデシル硫酸ナトリウム試料緩衝液を各試料に加え、４〜２０％の勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードした。
【０２６３】
標的とするプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ、アミノ−ペプチダーゼ、システインプロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼを含む。Ｓ＝セリンプロテアーゼ阻害剤；Ｎ＝非特異的セリンプロテアーゼ阻害剤。レーン１＝インキュベートしていない対照；レーン２＝インキュベートした対照；レーン３＝ＡＥＢＳＦ；レーン４＝ＥＡＣＡ；レーン５＝アンチパイン；レーン６＝アプロチニン；レーン７＝ベンズアミジンＨＣｌ；レーン８＝キモスタチン；レーン９＝ＥＤＴＡ；レーン１０＝ＮＥＭ；レーン１１＝ロイペプチン；レーン１２＝ホスホラミドン；レーン１３＝トリプシン阻害剤；レーン１４＝ペプスタチン；レーン１５＝ベスタチン；およびレーン１６＝Ｅ−６４。これらの結果により、タウプロテアーゼが、表６に示したような活性である阻害剤のクラスに基づいたセリンプロテアーゼであることが実証された。
【０２６４】
実施例１１−タウラダーのＴＡＭＲＡ−ＦＰ標識
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）を無水ＤＭＳＯ中で新たに調製した。（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）Ａ８４５６−≧９７％、分子量：２３９．６９；９ｍｇ  ＡＥＢＳＦ／１８７．２μＬ  ＤＭＳＯ＝２００ｍＭ。セリンヒドロラーゼＦＰプローブを、乾燥剤を有する小袋中で室温まで平衡化した。セリンヒドロラーゼＦＰプローブを１００μＬのＤＭＳＯ中に溶解して０．１ｍＭのストック溶液を作製した。試料を５μＬチューブ中にアリコートし、−８０℃の冷凍庫中に保存した。このアッセイに関して、試料を、室温にてＡＥＢＳＦと１時間インキュベートし、次いで０．５μＬのＴＡＭＲＡ−ＦＰを加え（４．５５μＭ最終）、混合し、室温にて４時間インキュベートした。２０μＬの２×試料緩衝液（ＢＭＥなし）を試料に加え、混合し、−８０℃の冷凍庫中で一晩保存した。１０μＬの各試料を、１０μＬの２×試料緩衝液（＋ＢＭＥ）を含有する別のセットのチューブに移し、混合し、サーマルリアクター上で「煮沸」プログラムで加熱した。残りの３０μＬの試料をそのままロードした（この試料は複数のバンドを有するので、２／３の試料を非還元レーンに注いだ）。試料を、Ｔｒｉｓ−グリシンを有する４〜２０％のＰＡゲル、１８−ウェルゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で泳動した。
【０２６５】
実施例１２−ＡＤ脳からのタウのＦＰ−ＴＡＭＲＡ標識
この研究は、アルツハイマーの脳の検体由来のタウタンパク質に対する抗体を用いて免疫精製した活性セリンヒドロラーゼについてのプローブを用いたタンパク質の特異的標識を示し、タウタンパク質がセリンヒドロラーゼ活性を有することが示唆された。セリンヒドロラーゼは、セリンプロテアーゼを含む酵素のクラスを含む。セリンヒドロラーゼスーパーファミリーは、セリン求核試薬を含む触媒機構を共有する最大の公知の酵素ファミリーの１つである。フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）はセリンヒドロラーゼの活性部位セリンに不可逆的に結合して、それらの酵素活性を不活性化させ、プローブがそれらを標識することを防ぐ。ＰＭＳＦでの処置後に減少した標識を有するバンドにおけるタンパク質は、活性セリンヒドロラーゼについてのプローブにより特異的に標識した（矢印により示した）。
【０２６６】
ＴＰＥＲ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ、２０ｍＭのホスホラミドン、またはホスファターゼ阻害剤１×（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＤｏｕｎｃｅ均質化によりＡＤ脳からタンパク質を抽出した。２０分間、１０，０００×ｇの遠心分離により溶解物を清浄した。ストレプトアビジン−アガロース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して上清をビオチンについて枯渇させた。活性セリンヒドロラーゼに特異的なプローブ、蛍光カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）タグ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識したフルオロホスホネート（ＦＰ）を、２μＭの最終濃度にて溶解物とインキュベートした。非特異的標識についての対照として、溶解物の一部をＰＭＳＦ、ＦＰ−ＴＡＭＲＡプローブを使用する前にタウプロテアーゼを含むセリンヒドロラーゼの不可逆的阻害剤で処理した。ビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ストレプトアビジンアガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有する溶解物から全てのタウを捕捉した。抗体に結合し、ビーズにより捕捉されるタンパク質を、ジスルフィド還元剤β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を有するまたは有さないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて蛍光画像を捕捉した。レーン１：タウ免疫枯渇後の溶解物、ＰＭＳＦ処理なし；レーン２：タウ免疫枯渇後の溶解物、ＰＭＳＦでＰＭＳＦ処理した；レーン３：免疫捕捉したタンパク質、ＰＭＳＦ処理なし；レーン４：免疫捕捉したタンパク質、ＰＭＳＦ処理有り、でアッセイした。左のパネル−還元剤なし；右のパネル−ゲルをロードする前に還元剤を試料に加えた。
【０２６７】
ＡＥＢＳＦはセリンプロテアーゼ阻害剤である。阻害定数はＰＭＳＦおよびＤＦＰのものと同様であった。ＡＥＢＳＦは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、カリクレイン、およびトロンビンを阻害する。図１５Ａにおけるデータは、ＡＥＢＳＦもまた、タウプロテアーゼ活性を阻害することを示した。１０μＬの水を各試料に加え、ＨＰＬＣ分析のためのロードの前に混合した。試料の分析の前に２つのブランクをＨＰＬＣ上で泳動した。ＦＲＥＴアッセイについての切断ペプチドの試験は、タウ４４１三量体（２）およびＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー使用してＯＰ−００２をアッセイする。
【０２６８】
試料を３７℃にて２３時間インキュベートした。１０μＬの各試料を、ブラック９６ウェルプレート中に４０μＬの２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４を含有するウェルに移し、混合したので、試料はウェルの底部を覆った。５０μＬの緩衝液を有する対照もまた利用した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）上のゲインを１０〜１００に低下させてカウントを減少させたので、緩衝液のみのウェルは１単位のみであった。
【０２６９】
続いて得られたゲルを使用して、タウに対するモノクローナル抗体ＢＴ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて免疫ブロットを調製した。ゲルの免疫ブロットは、タウ特異的抗体により認識されるタウタンパク質の位置を示した。セリンヒドロラーゼプローブおよび同じ位置における免疫ブロットからの信号により、タウがセリンヒドロラーゼプローブにより標識されたという結論が支持された。しかしながら、免疫ブロットのために使用されるモノクローナル抗体がタウのみの単一のエピトープ（小さな領域）を認識したので、このエピトープを含有するタウの断片がこの抗体により認識される。
【０２７０】
実施例１３−Ｃ末端抗体を用いたウェスタンブロット
結果により、Ｃ末端を切断した場合、信号が、タウのＣ末端の３０アミノ酸領域におけるエピトープを有する抗体について損失したことが示された。タウのこの領域は最も容易に切断するように見え、インビボおよびＡＤにおけるタウプロテアーゼ活性についての重要なバイオマーカーを表し得る。全タウの検出／Ｃ末端抗体を有する検出の比はＡＤについての可能性のあるバイオマーカーである。
【０２７１】
図６Ａから、精製したタウ４Ｒ２Ｎ単量体、二量体および三量体調製物を、緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で３７℃にて０、２および１６時間インキュベートし、還元剤を有する試料緩衝液を有する４〜２０％のポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル上で泳動した。左から、レーン１〜３−単量体、０、２、１６時間のインキュベーション；レーン４〜６−二量体、０、２、１６時間のインキュベーション；レーン７〜９−三量体、０、２、１６時間のインキュベーション。ＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でゲルを染色し、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，ＭＡ）に移した。Ｃ末端に特異的な抗体、アミノ酸４０４〜４４１タウ４Ｒ２Ｎにおけるエピトープ（モノクローナルＴ４６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用してタウ４Ｒ２Ｎタンパク質の部分消化から観測した断片を識別するために使用した免疫ブロットを実施した。ブロットを剥がし、Ｎ末端に対する抗体、アミノ酸８３〜１２０タウ４Ｒ２Ｎにおけるエピトープ（モノクローナル抗体Ｔ１４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて再プローブした。
【０２７２】
実施例１４−タウプロテアーゼ活性検出キット
この実施例は、タウプロテアーゼ阻害剤スクリーニングについて設計されるタウプロテアーゼ活性アッセイキットを記載する。それは、タウプロテアーゼ活性の効果的な検出のために必要とされる全ての試薬（陽性対照として使用するためのタウプロテアーゼの試料を含む）を提供する。このアッセイは、基質がタウプロテアーゼにより開裂された後に蛍光信号の増強が観測される蛍光エネルギー共鳴（ＦＲＥＴ）の簡便な方法に基づく。
【０２７３】
試薬：
キットの例示的な市販の製剤は、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおいて２５０の反応についての十分な試薬を提供する。
蛍光アッセイ緩衝液５０ｍＬ
停止溶液１５ｍＬ
アッセイ標準タウプロテアーゼ、１バイアル
７−メトキシクマリン−４−アセチル  ０．５ｍｇ
タウペプチド断片３３４−３４２（ＯＰ−００２）ＧＧＱＶＥＶＫＳＥ（配列番号１５）は、例えば、タウプロテアーゼスクリーニングアッセイについての基質であり、フルオロフォアおよびクエンチを含有するＦＲＥＴベースの化合物スクリーニングアッセイのために使用され得るＫＳ、ＫＩ、またはＫＭにより規定されるタウ切断部位のいずれかを例示し、ＫＳ部位におけるタウプロテアーゼにより開裂されると、蛍光信号が観測される。
【０２７４】
キットの市販の形態に含まれないが必要とされる機器および試薬：
蛍光光度計
蛍光アッセイについての９６ウェルマイクロタイタープレート
ジメチルスルホキシド
保存／安定性：キットは乾燥氷上で輸送し、−２０℃で保存する。最初の解凍後、蛍光アッセイ緩衝液および停止溶液は２〜８℃に保存するべきである。基質、酵素、および標準物の複数の冷凍−解凍サイクルは、キットの最適な実施に回避されるべきである。
【０２７５】
試薬調製：
以下に説明する試薬の体積は９６ウェルプレート中で実施するアッセイについてである。異なるサイズのプレートまたはウェルについて、必要とされる試薬の量はそれに応じて調整され得る。
【０２７６】
タウプロテアーゼ基質溶液：０．５ｍＬのＤＭＳＯをタウプロテアーゼ基質に加えることにより１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製する。タウプロテアーゼ基質溶液をアリコートし、−２０℃に保存する。
【０２７７】
アッセイを開始する直前に、タウプロテアーゼ基質溶液のアリコートを蛍光アッセイ緩衝液で１０倍希釈する。ウェルを混合する。
【０２７８】
タウプロテアーゼ溶液：アッセイを開始する直前に、タウプロテアーゼを蛍光アッセイ緩衝液で１０倍希釈する。ウェルを混合する。
【０２７９】
アッセイ標準溶液：アッセイを開始する直前に、アッセイ標準物を蛍光アッセイ緩衝液で１０倍希釈する。ウェルを混合する。
【０２８０】
アッセイプロトコル：
３２０ｎｍにおける励起、および４０５ｎｍにおける発光を用いてウェルプレートリーダーモードで蛍光光度計を設定する。全ての成分（タウプロテアーゼ酵素溶液を除く）を室温にする。記載しように成分を蛍光光度計９６ウェルプレートに加える。穏やかなピペット操作によりウェルを混合する。読み取りの直前にタウプロテアーゼ酵素溶液を加える。
反応１：陰性対照（酵素なし）反応および標準曲線ブランク。「ブランク」反応チューブは標準物のみに起因して蛍光を反映する。
反応２：アッセイキットに供給される陽性対照。
反応３：酵素阻害試験。
反応４：試料酵素活性試験。
【０２８１】
酵素を加えた直後に蛍光を読み取る。これは「時間ゼロ」の読み取りである。ウェルにおける信号は酵素の付加とこの最初の読み取りとの間で増加し得る。プレートをパラフィルムで覆い、３７℃にて２時間インキュベートする。「時間ゼロ」＋２時間で信号を読み取る。読み取り前にプレートを室温にすべきである。任意選択：読み取りを行った後、４０μＬの停止溶液を加える。停止溶液の付加は少なくとも２４時間、信号を安定化する。
【０２８２】
データ分析：
このアッセイは、３７℃にて１〜２時間の間、酵素が５〜２０％の基質を蛍光産物に変換するように設計する。標準曲線を決定するために、２時間で全ての信号読み取り（反応５〜８）からブランク値の蛍光単位（ＦＵ）（反応１）を引く。蛍光単位を各標準物に存在するｐｍｏｌに対してプロットする。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ分光計ＩＳＳＯＢ、励起３２０ｎｍ（スリット１２ｎｍ）および発光４０５ｎｍ（スリット１２ｎｍ）を使用して典型的な標準曲線ｙ＝１．３７３６×＋８．７９７３を得た。
【０２８３】
基質開裂のパーセンテージの計算
基質開裂のパーセンテージはチューブ８の蛍光信号読み取りに基づく。この読み取りは５００ｐｍｏｌ標準物からの蛍光を反映し、これは、反応中の基質の量が１，０００ｐｍｏｌであるので、５０％の開裂した産物を示す。試験試料中の基質開裂のパーセンテージを計算するために、ブランクのＦＵ値（反応１）を引き、以下の式に従う。Ｓ＝標準曲線から得られる試験試料（反応４）中の蛍光産物の量（ｐｍｏｌ）。
開裂％＝Ｓ（ｐｍｏｌ）
５００（ｐｍｏｌ）
タウプロテアーゼ阻害剤のアッセイ
酵素活性阻害反応は反応１〜３（すなわち、ブランク、酵素活性反応、および阻害反応チューブ）を使用して設定した。反応３は異なる濃度の阻害剤を有する少しのウェルを含むように拡大し、反応を３７℃にて２時間実施した。
【０２８４】
実施例１５−タウプロテアーゼＵｍｕＤのプロテアーゼ相同性
タウ２６８Ｈｉｓ−タウ３８５Ｌｙｓは、ＵｍｕＤに対して９０％より多いコンセンサスにおいて３５％相同性を示し、セリンリシンプロテアーゼは細菌ＳＯＳ反応に含まれた。ＵｍｕＤをＲｅｃＡ結合およびＮ末端テイルから２４−ａａ断片を開裂する自己タンパク質分解反応により活性化させた。１００％マッチを有するアミノ酸を、タウ（上側配列）とＵｍｕＤとの間にアミノ酸省略形として与える。
【０２８５】
実施例１６−プロテアーゼ活性タウバリアント
タウタンパク質４Ｒ２Ｎ完全長
【表１３】
2014522237.tif 000015
【０２８６】
タウプロテアーゼバリアント：
Ｌｙｓ２７４、Ｌｙｓ２８０、Ｌｙｓ２８１、Ｌｙｓ３１１、Ｌｙｓ３４０およびＬｙｓ３４３（太字、下線タイプで上記の完全長配列に示す）を、触媒部位における活性部位残基について評価した。Ｌｙｓ２７４はβ−ターンとβ−シート構造との間であり、Ｃｙｓ２９１とＣｙｓ３２２との間にジスルフィド結合および／またはヘキサペプチドモチーフＰＨＦ６＊とＰＨＦ６との間に相互作用が存在する場合、推定活性部位Ｓｅｒ３０５に近接し得る。隣接するＧｌｙ２７３はまた、タウオパチー前頭側頭認知症における変異部位である。
【０２８７】
Ｌｙｓ２８０は前頭側頭認知症における変異部位であり、それは欠失され得、Ｌｙｓ２８１はこの状況においてＬｙｓ２８０に置換し得る。この位置におけるリシンの冗長により、この位置におけるこの残基についての有意性が示唆される。これらのリシンはまた、ＰＨＦ６＊ヘキサペプチドモチーフを形成するβ−シートのカルボキシル末端に位置する。Ｌｙｓ３１１はＰＨＦ６ヘキサペプチドモチーフを形成するβ−シートのカルボキシル末端に位置する。Ｌｙｓ３４０は、自己触媒タンパク質分解により形成されるタウ断片のカルボキシル末端に見出される。Ｌｙｓ３４３は相同セリンプロテアーゼＵｍｕＤにおける活性部位リシンに対応する。
【０２８８】
この実施例はまた、タウタンパク質の野生型４Ｒ２Ｎアイソフォームにおいて単一のアミノ酸置換を含有するタウプロテアーゼバリアントを記載する。番号付けは、配列番号６に示すタウの野生型４Ｒ２Ｎアイソフォームに基づく。
【０２８９】
タウタンパク質におけるＦＴＤ変異体
Ｒ５Ｈ、Ｒ５Ｌ、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｇ２７３Ｒ、Ｎ２７９Ｋ、ΔＫ２８０、Ｌ２８４Ｖ、Ｎ２９６Ａ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｇ３０３Ｖ、Ｇ３０４Ｓ、Ｓ３０５Ｉ、Ｓ３０５Ｎ、Ｌ３１５Ｒ、Ｋ３１７Ｍ、Ｓ３２０Ｆ、Ｐ３３２Ｓ、Ｇ３３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖ、Ｑ３３６Ｒ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｓ３５２Ｌ、Ｓ３５６Ｔ、Ｖ３６３Ｉ、Ｋ３６９Ｉ、Ｇ３８９Ｒ、Ｒ４０６Ｗ、Ｔ４２７Ｍ
【０２９０】
３７個のコード領域変異体を有するＦＴＤにおける２９個の変異部位のうちの２０個は、リシン、セリン、またはイソロイシンの除去または挿入に関する。１９個は、２６個のコード領域変異体を有するタウ切断タンパク質ＴＰ−２１０およびＴＰ−９９に存在する。２３個のコード変異体はタウプロテアーゼ切断部位または活性部位セリンに対して直接または潜在的な影響を有する：
【０２９１】
２つは推定タウプロテアーゼ開裂部位を除去している：Ｋ２５７Ｔは２５７ＫＳ２５８を除去しており；Ｉ２６０Ｖは２５９ＫＩ２６０を除去している。１つは推定タウプロテアーゼ開裂部位：Ｐ３３２Ｓを作製している。２つはセリンを置換し、そのうちの１つは触媒三残基、Ｓ３０５ＩおよびＳ３０５Ｎの一部であり得る。６個はタウプロテアーゼ開裂部位に隣接する（Ｋ２５７Ｔは２５９ＫＩ２６０に隣接し；Ｉ２６０Ｖは２５７ＫＳ２５８に隣接し；Ｋ３６９Ｉは３７０ＫＩ３７１に隣接し；Ｅ３４２Ｖは３４０ＫＳ３４１に隣接し；Ｓ３５２Ｌは３５３ＫＩ３５４に隣接し；Ｋ３６９Ｉは３７０ＫＩ３７１に隣接する）。１７個は１つ以上のアミノ酸により潜在的開裂部位を作製または除去または隣接している（Ｒ５Ｈ＆Ｒ５Ｌ；Ｌ２６６Ｖ；Ｇ２７２Ｖ  Ｇ２７３Ｒ；Ｎ２７９Ｋ、ΔＫ２８０、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｌ３１５Ｒ、Ｋ３１７Ｍ、Ｓ３２０Ｆ、Ｑ３３６Ｒ、Ｅ３４２Ｖ、Ｓ３５２Ｌ、Ｇ３８９Ｒ、およびＲ４０６Ｗ）。
【０２９２】
対の螺旋状線維領域：
ＰＨＦ６＊における２つの変異：Ｎ２７９ＫおよびΔＫ２８０
【０２９３】
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ反復領域：
グリシン反復と共にプロリンは、β鎖（β屈曲）を接続する鋭いターンにおいて一般的に見出される。タウ８１は３つのこのような領域２７０ＰＧＧＧ２７３、３０１ＰＧＧＧ３０４、３３２ＰＧＧＧ３３５を含有する。これらの３つの領域において、ＦＴＤにおいて７個のコード変異部位および全部で１０個のコード変異が存在する。変異はＧ２７２Ｖ、Ｇ２７３Ｒ、Ｎ２７９Ｋ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｇ３０４Ｓ、Ｐ３３２Ｓ、Ｇ３３５Ｓ、およびＧ３３５Ｖである。さらに、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ反復領域の２つのＣ末端側における第１のアミノ酸位置において全部で４つの変異（Ｓ３０５Ｉ、Ｓ３０５Ｎ、Ｓ３０５Ｓ、およびＱ３３６Ｒ）が存在する。さらに、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ反復領域の１つのＣ末端側の第２のアミノ酸位置においてさらなる変異（Ｖ３３７Ｍ）が存在する。
【０２９４】
４個はタウプロテアーゼとの見かけの会合を有さない：
Ｌ２８４Ｌ、ΔＮ２９６、Ｎ２９６Ａ、およびＮ２９６Ｈ
【０２９５】
Ｓｅｒ２８５からＡｌａ２８５のアミノ酸置換を有するタウ４Ｒ２Ｎ：
タウ４Ｒ２Ｎ  Ｓ２８５Ａ
【表１４】
2014522237.tif 000016
【０２９６】
Ｓｅｒ２８５（太字、下線）を推定活性部位セリンとして選択した。なぜなら、それは、タウオパチー前頭側頭認知症における変異についての部位である残基Ｌｅｕ２８４の後であるからである。Ｌｅｕ２８４はまた、セリンプロテアーゼｕｍｕＤの活性部位領域に対してこの領域のアラインメントにおいて保存される。
【０２９７】
Ｓｅｒ３０５からＡｌａ３０５のアミノ酸置換を有するタウ４Ｒ２Ｎ：
タウ４Ｒ２Ｎ  Ｓ３０５Ａ
【表１５】
2014522237.tif 000017
Ｓｅｒ３０５（太字、下線）を推定活性部位セリンとして選択した。なぜなら、それは、β−ターンとβ−シート構造の間にも配置されるｕｍｕｄにおける相同活性部位領域と同じ領域内であるからである。Ｓｅｒ３０５はまた、タウオパチー前頭側頭認知症における変異のための頻繁な部位である。Ｓｅｒ３０５直前のβ−ターン領域（Ｐｒｏ３０１−Ｇｌｙ３０４）は前頭側頭認知症における変異のための「ホットスポット」である。Ｓｅｒ３０５はまた、タウ３Ｒアイソフォームにおいてリシンと置換される。タウ４Ｒアイソフォームの過剰発現はタウオパチーと頻繁に会合する。Ｓｅｒ３０５のリン酸化はまた、アルツハイマー病において調節される。
【０２９８】
Ｓｅｒ３１６からＡｌａ３１６のアミノ酸置換を有するタウ４Ｒ２Ｎ
タウ４Ｒ２Ｎ  Ｓ３１６Ａ
【表１６】
2014522237.tif 000018
Ｓｅｒ３１６（太字、下線）を推定活性部位セリンとして選択した。なぜならそれは、残基Ｌｅｕ３１５とＬｙｓ３１７との間に位置するからであり、その両方はタウオパチー前頭側頭認知症における変異のための部位である。
【０２９９】
開示されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の要約
配列番号１  ＴＰ−２０１のポリペプチド配列
配列番号２  ＴＰ−１１８のポリペプチド配列
配列番号３  ＴＰ−９９のポリペプチド配列
配列番号４  ＴＰ−８３のポリペプチド配列
配列番号５  ＴＰ−８１のポリペプチド配列
配列番号６  完全長タウタンパク質のポリペプチド配列
配列番号７  ＴＰ−２１０をコードするＤＮＡ配列
配列番号８  ＴＰ−１１８をコードするＤＮＡ配列
配列番号９  ＴＰ−９９をコードするＤＮＡ配列
配列番号１０  ＴＰ−８３をコードするＤＮＡ配列
配列番号１１  ＴＰ−８１をコードするＤＮＡ配列
配列番号１２  完全長タウタンパク質をコードするＤＮＡ配列
配列番号１３  ヒトα−エンドルフィンペプチド
配列番号１４  ヒトＡＰＰペプチドａａ６６７−６７６
配列番号１５  タウペプチドＯＰ−２
配列番号１６  タウペプチドＯＰ−１
配列番号１７  ヒトＡＰＰタンパク質
配列番号１８  断片Ｆ３のＮ末端配列
配列番号１９  タウプロテアーゼのａａ３３５−３５３
配列番号２０  ヒトＡＰＰペプチド断片ａａ１５５−１６９
配列番号２１  ヒトＡＰＰペプチド断片ａａ６６３−６７８
配列番号２２  ヒトＡＰＰペプチド断片ａａ７４６−７５９
配列番号２３  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号２４  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号２５  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号２６  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号２７  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号２８  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号２９  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３０  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３１  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３２  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３３  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３４  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３５  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３６  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３７  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３８  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号３９  ＫＳ、ＫＴおよびＫＩにおける切断からのタウ４Ｒ２Ｎ断片
配列番号４０  タウ４Ｒ２Ｎ由来プロテアーゼバリアントＳ２８５Ａ置換
配列番号４１  タウ４Ｒ２Ｎ由来プロテアーゼバリアントＳ３０５Ａ置換
配列番号４２  タウ４Ｒ２Ｎ由来プロテアーゼバリアントＳ３１６Ａ置換
【０３００】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものに対する例示的な手順または他の詳細な補足を与える限り、本明細書に参照により具体的に組み込まれる。
【表１７】
2014522237.tif 000019
【表１８】
2014522237.tif 000020
【表１９】
2014522237.tif 000021
【表２０】
2014522237.tif 000022
【表２１】
2014522237.tif 000023
【表２２】
2014522237.tif 000024
【表２３】
2014522237.tif 000025
【０３０１】
本明細書に開示され、特許請求される組成物および方法の全ては、本開示を考慮して過度の実験を行わずに作製され、実施され得る。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、その変更が、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、組成物および方法ならびに本明細書に記載される方法の工程または工程の順序に適用されてもよいことは当業者に明らかであろう。より具体的には、同じまたは類似の結果が達成される限り、化学的および生理学的の両方に関連する特定の因子が本明細書に記載される因子と置き換えられてもよいことは理解されるであろう。当業者に自明である全てのこのような類似の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【図１】
2014522237.tif 000026
【図２】
2014522237.tif 000027
【図３】
2014522237.tif 000028
【図４】
2014522237.tif 000029
【図５】
2014522237.tif 000030
【図６Ａ】
2014522237.tif 000031
【図６Ｂ】
2014522237.tif 000032
【図７】
2014522237.tif 000033
【図８】
2014522237.tif 000034
【図９Ａ】
2014522237.tif 000035
【図９Ｂ】
2014522237.tif 000036
【図１０】
2014522237.tif 000037
【図１１】
2014522237.tif 000038
【図１２】
2014522237.tif 000039
【図１３】
2014522237.tif 000040
【図１４Ａ】
2014522237.tif 000041
【図１４Ｂ】
2014522237.tif 000042
【図１４Ｃ】
2014522237.tif 000043
【図１４Ｄ】
2014522237.tif 000044
【図１４Ｅ】
2014522237.tif 000045
【図１４Ｆ】
2014522237.tif 000046
【図１５】
2014522237.tif 000047
【図１６】
2014522237.tif 000048
【図１７】
2014522237.tif 000049
【図１８】
2014522237.tif 000050
【図１９】
2014522237.tif 000051
【図２０】
2014522237.tif 000052
【図２１】
2014522237.tif 000053
【図２２】
2014522237.tif 000054
【図２４】
2014522237.tif 000055
【図２５】
2014522237.tif 000056
【図２３Ａ】
2014522237.tif 000057
【図２３Ｂ】
2014522237.tif 000058
【配列表】
2014522237000001.app
【国際調査報告】
2014522237.tif 000059
2014522237.tif 000060