(57)【要約】  本発明は、炎症障害の治療において使用されるＩＬ１７Ｃのアンタゴニストを提供する。
2014530836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症障害の治療において使用されるＩＬ１７Ｃに特異的な単離抗体または抗体断片。
【請求項２】
請求項１に記載の単離抗体または抗体断片において、ＩＬ１７Ｃは、配列番号１８１のアミノ酸を含むことを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の単離抗体または抗体断片において、前記治療は、関節炎、喘息、敗血症、自己免疫疾患、肺炎症、乾癬、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、全身性エリテマトーデスおよびサルコイドーシスの治療であることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の単離抗体または抗体断片において、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７ＲＥへの結合を遮断することを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の単離抗体または抗体断片において、表１の抗体の何れかのＫａｂａｔにより定義される６つのＣＤＲを含む抗体または抗体断片と交差競合することを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の単離抗体または抗体断片において、モノクローナル抗体であることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項７】
請求項６に記載の抗体または抗体断片において、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗体断片であることを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項８】
請求項６に記載の抗体または抗体断片において、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含むことを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項９】
請求項６に記載の抗体または抗体断片において、ＩｇＧアイソタイプのものであることを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項１０】
請求項６に記載の抗体または抗体断片において、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’、ｓｃＦＶからなる群から選択されることを特徴とする抗体または抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１１年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５４８，７４４号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、炎症障害、例えば、関節炎の治療において使用されるＩＬ１７Ｃのアンタゴニストに関する。例示的なＩＬ１７Ｃアンタゴニストは、ＩＬ１７Ｃ特異的抗体またはその断片、例えば、ヒト抗ＩＬ１７Ｃ抗体である。
【背景技術】
【０００３】
ＩＬ１７Ｃは、ＩＬ１７タンパク質ファミリーの分泌ジスルフィド結合ホモダイマーである。インビトロで、ＩＬ１７Ｃは、単球系ＴＨＰ−１からのＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの放出を刺激することが示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，７７３−８）。ＩＬ１７Ｃは、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）および３Ｔ３細胞系における炎症サイトカイン、例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現を誘導し得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９，７１２８−３６。インビボで、ＩＬ１７Ｃが形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、マウスにおいてコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）を悪化させ、ＩＬ１７Ｃが形質導入された骨髄細胞により再構成されたマウスは重度のコラーゲン誘導性関節炎を罹患した。ＩＬ１７Ｃは、ＩＬ−１７受容体Ｅ（ＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃ）に結合することが報告され、ＮＦ−κＢを活性化すると考えられた（Ｃａｌｈｏｕｎ（２００７）Ｂａｃｈｅｌｏｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＩＬ１７Ｃ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｎｏｕｒｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ；Ｇａｆｆｅｎ（２００９）Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９，５５６−６７）、ＩＬ１７Ｃ欠損マウスにおけるＴｈ１７細胞活性化において核ＩカッパＢファミリーメンバーＩｋＢζに影響することも報告された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３５，１−１１）。正常組織におけるＩＬ１７Ｃ発現は、成人および胎児腎臓に制限されると考えられる。ＣＩＡマウスの関節炎足におけるＩＬ１７ＣのｍＲＮＡ発現は、高度に上昇する。Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、関節リウマチ患者の滑液および末梢血の単核細胞におけるＩＬ１７Ｃ発現を記載した（Ｈｗａｎｇ  ＆  Ｋｉｍ（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  １９，１８０−１８４）。
【０００４】
国際公開第９９／０６０１２７号パンフレットは、ＩＬ１７Ｃ（ＰＲＯ１１２２）のクローニングを記載している。国際公開第９９／０６０１２７号パンフレットは、ある障害、例として、関節炎（例えば、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎）、敗血症、潰瘍性大腸炎、乾癬、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、巨細胞動脈炎、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン症候群をＩＬ１７Ｃと大まかに関連付けた。種々の病態、例として、本明細書に同定される疾患関連遺伝子の過剰発現および／または活性化を特徴とするものを治療するために国際公開第９９／０６０１２７号パンフレットの化合物を使用することができることも企図される。しかしながら、ＩＬ１７Ｃのこの推測的機能に実験的証明が提供されていない。同じことは国際公開第２００５／０６５７１１号パンフレットについても当てはまる。
【０００５】
本発明は、インビボ実験においてＩＬ１７Ｃのアンタゴニストが炎症障害の治療において高度に有効であることを最初に実証する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、炎症障害の治療において使用されるＩＬ１７Ｃのアンタゴニストを提供する。
【０００７】
本発明のアンタゴニストにより治療される炎症障害は、関節炎、例えば、関節リウマチ、喘息、敗血症、自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびサルコイドーシスから選択される任意の炎症障害であり得る。特定の実施形態において、前記炎症障害は関節炎である。
【０００８】
本発明のＩＬ１７Ｃのアンタゴニストは、任意のアンタゴニストであり得る。好ましくは、前記アンタゴニストは、抗体または抗体断片、例えば、モノクローナル抗体である。前記抗体は、ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体もしくはその断片またはＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体もしくはその断片であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、受容体相互作用アッセイのためのアッセイ設定を示す。ＩＬ１７受容体のＥＣＤ融合タンパク質をＭｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ（登録商標）３８４ウェルプレート上でコートした。ビオチン化マウスＩＬ１７Ｃをアプライし、ストレプトアビジンを介して検出した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示される受容体相互作用アッセイの結果を示す。ＩＬ１７Ｃは、マウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃに結合するが、マウスＩＬ−１７ＲＢにも別の無関連受容体にも結合しないことが明確に見出された。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａに示される受容体相互作用アッセイの結果を示す。３つの先行技術抗体は、マウスＩＬ１７Ｃの、マウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃへの結合を阻害しない。
【図２】図２は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に基づく品質管理結果を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにおけるＥＣ５０測定の結果を示す。全ての精製キメラヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ抗体を、マウスＩＬ１７Ｃに対して１００ｎＭの濃度から出発してタイトレーションした。
【図４】図４は、抗ＩＬ１７Ｃ抗体の一価親和性を示す。親和性は、Ｆａｂ断片を使用する溶液平衡タイトレーション（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（ＳＥＴ）により測定した。
【図５】図５は、実施例１１に記載のＩＬ−１７受容体Ｅ阻害アッセイにおいて測定されたＩＣ５０値を示す。
【図６】図６は、マウス血清安定性アッセイの結果を示す。１１の精製ＩｇＧは、マウス血清との２４時間のインキュベーション後に許容可能な産生収率およびマウスＩＬ１７Ｃへの特異的結合を示した。
【図７】図７は、ビヒクル、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）および対照抗体（ＭＯＲ０３２０７）と比較したマウスＣＩＡモデルの治療プロトコルにおける臨床スコアに基づくＭＯＲ１２７４３およびＭＯＲ１２７６２投与の結果を示す。
【図８】図８は、ビヒクル、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）および対照抗体（ＭＯＲ０３２０７）と比較したマウスＣＩＡモデルの治療プロトコルにおける臨床スコアのＡＵＣに基づくＭＯＲ１２７４３およびＭＯＲ１２７６２投与の結果を示す。
【図９】図９は、対照抗体（ＭＯＲ０３２０７）と比較したマウスＣＩＡモデルの予防プロトコルにおけるラーセンスコアに基づくＭＯＲ１２７６２投与の結果を示す。
【図１０】図１０は、対照抗体（ＭＯＲ０３２０７）と比較した急性肺好中球増加症のマウスモデルにおける炎症細胞のＢＡＬＦ中へのリクルートメントに基づくＭＯＲ１２７６２またはＭＯＲ１２７４３投与の結果を示す。
【図１１】図１１は、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用するＩＬ１７Ｃ発現プロファイリングの結果を示す。対照試料におけるＩＬ１７Ｃ発現レベルと比較して、炎症呼吸疾患と診断されたドナーに由来する肺組織試料においてＩＬ１７Ｃ発現レベルの増加が検出された。５人の個々のドナーからの試料をそれぞれの群について分析した。
【図１２】図１２は、イミキモド（ＩＭＱ）乾癬様マウスモデルにおける表皮厚に対するＭＯＲ１２４３中和抗体の効果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、培地単独、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１７Ａ（２５０ｎｇ／ｍＬ）またはそれらのトリガーの組合せにより２時間、６時間、２４時間または４８時間処理されたヒト表皮角化細胞におけるＩＬ１７Ｃ  ｍＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、培地単独または種々のＴＬＲリガンド：ＴＬＲ４リガンドＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）、ＴＬＲ５リガンドフラジェリン（１μｇ／ｍＬ）、ＴＬＲ７リガンドｇｕａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（４μｇ／ｍＬ）、ＴＬＲ７／８リガンドＣＬ０９７（１０μｇ／ｍＬ）およびＴＬＲ９リガンドＣｐＧ  ＯＤＮ２１１６（１０μＭ）により２時間、６時間、または２４時間処理されたヒト表皮角化細胞におけるＩＬ１７Ｃ  ｍＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ＩＬ１７Ｃが炎症障害の治療のための有効な標的であることを実証する。これに関して、本発明は、一態様において、炎症障害の治療において予防または治療利益をもたらすためにＩＬ１７Ｃアンタゴニストを使用する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、治療が必要とされる対象への治療有効量のＩＬ１７Ｃアンタゴニストの投与を含む治療法を提供する。本明細書において使用される「治療有効量」または「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するために必要なＩＬ１７Ｃアンタゴニストの量を指す。主題発明によれば、治療有効量は、炎症障害を治療および／または予防するために必要なＩＬ１７Ｃアンタゴニストの量である。
【００１２】
「炎症障害」または「炎症疾患」という用語は、同義に使用され、本明細書に使用されるとおり、炎症を伴う任意の異常を指す。炎症を伴う障害の例には、尋常性ざ瘡、関節炎、例えば、関節リウマチ、喘息、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、糸球体腎炎、過敏性、炎症性腸疾患、骨盤炎症疾患、再灌流障害、サルコイドーシス、移植片拒絶、血管炎、間質性膀胱炎および敗血症が含まれる。炎症疾患は、慢性または急性であり得る。自己免疫疾患の例には、強直性脊椎炎、クローン病、Ｉ型糖尿病、胃炎、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、下肢静止不能症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性エリテマトーデスおよび潰瘍性大腸炎が含まれる。
【００１３】
関節炎はそれ自体、疾患の原発性形態として顕在し得る。これは、例えば、骨関節炎、関節リウマチ、敗血症性関節炎、痛風および偽痛風、若年性特発性関節炎、スティル病ならびに強直性脊椎炎についての場合である。関節炎の他の形態は、他の疾患、例えば、エーラス・ダンロス症候群、サルコイドーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、乾癬性関節炎、反応性関節炎、血色素病、肝炎、ウェゲナー肉芽腫症（および他の血管炎症候群）、ライム病、家族性地中海熱、回帰熱を伴う高免疫グロブリン血症Ｄ、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群および炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる）に続発する。
【００１４】
「肺炎症」という用語は、任意の炎症肺疾患、急性慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、グッドパスチャー症候群、および白血球が役割を担い得る任意の肺病態、例として、限定されるものではないが、特発性肺線維症および任意の他の自己免疫肺疾患を包含する。
【００１５】
「ＩＬ１７Ｃ」という用語は、インターロイキン１７Ｃ（ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＨＧＮＣ）においてＩＤ５９８３により、およびマウスゲノムインフォマティクス（Ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）（ＭＧＩ）データベースにおいてＩＤ２４４６４８６により同定）として公知のタンパク質を指す。ＩＬ１７Ｃは、一部の古い刊行物においてはＣＸ２またはＩＬ−２１と称されるが、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞中で特異的に発現されるが、他の組織のほとんどで発現されないＩＬ−２１サイトカインと混同すべきでない（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ（２０００）．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（６８０８）：５７−６３）。ヒトＩＬ−２１は、第４染色体上に局在し、ＨＧＮＣデータベースにおいてＩＤ６００５により同定される。ヒトＩＬ１７Ｃは、第１６染色体上に局在し、以下（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９Ｐ０Ｍ４）のアミノ酸配列を有する：
2014530836.tif 000003
【００１６】
「ＩＬ１７ＲＡ」という用語は、インターロイキン１７受容体Ａとして公知のタンパク質を指す。ヒトＩＬ１７ＲＡは、以下（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９６Ｆ４６）のアミノ酸配列を有する：
2014530836.tif 000004
【００１７】
「ＩＬ１７ＲＥ」という用語は、インターロイキン１７受容体Ｅとして公知のタンパク質を指す。ヒトＩＬ１７ＲＥは、以下（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ８ＮＦＲ９）のアミノ酸配列を有する：
2014530836.tif 000005
【００１８】
本明細書において使用される「ＩＬ１７Ｃのアンタゴニスト」および「ＩＬ１７Ｃアンタゴニスト」は、最も広い意味のＩＬ１７Ｃアンタゴニストを指す。ＩＬ１７Ｃの活性もしくは機能を阻害し、または他の任意の手法によりＩＬ１７Ｃに対する効果を与える任意の分子が含まれる。ＩＬ１７Ｃアンタゴニストという用語には、限定されるものではないが、ＩＬ１７Ｃに特異的に結合する抗体もしくは抗体断片、ＩＬ１７Ｃに特異的な阻害核酸またはＩＬ１７Ｃに特異的な有機小分子が含まれる。ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的に結合する抗体もしくは抗体断片、ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な阻害核酸またはＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な有機小分子も、ＩＬ１７Ｃアンタゴニストという用語の意味の範囲内である。ＩＬ１７Ｃアンタゴニストという用語は、非抗体足場分子、例えば、フィブロネクチン足場、アンキリン、マキシボディー／アビマー（ｍａｘｙｂｏｄｙ／ａｖｉｍｅｒ）、プロテインＡ由来分子、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、ａｆｆｉｌｉｎ、タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）なども指す。
【００１９】
阻害核酸には、限定されるものではないが、アンチセンスＤＮＡ、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、外部ガイド配列、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡが含まれる。有用な阻害核酸には、ＩＬ１７ＣをコードするＲＮＡの発現を、対照と比較して少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５パーセントだけ低減させるものが含まれる。阻害核酸およびそれらを産生する方法は、当分野において周知である。ｓｉＲＮＡ設計ソフトウエアが利用可能である。
【００２０】
ＩＬ１７ＣまたはＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な有機小分子（ＳＭＯＬ）は、天然産物スクリーニングまたは化学ライブラリーのスクリーニングを介して同定することができる。典型的には、ＳＭＯＬの分子量は、５００ダルトン未満、より典型的には、１６０から４８０ダルトンである。ＳＭＯＬの他の典型的な特性は、以下の１つ以上である：
・−０．４から＋５．６の範囲の分配係数ｌｏｇＰ
・４０から１３０のモル屈折率
・２０から７０の原子数
概説については、Ｇｈｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｃｏｍｂｉｎ  Ｃｈｅｍ：１，５５−６８およびＬｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ：２３，３−２５参照。
【００２１】
好ましくは、本発明において使用されるＩＬ１７Ｃアンタゴニストは、ＩＬ１７Ｃに特異的な、またはＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体である。このような抗体は、任意のタイプのもの、例えば、ネズミ、ラット、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であり得る。「ヒト」抗体または機能ヒト抗体断片は、本明細書において、キメラでなく（例えば、「ヒト化」されていない）、非ヒト種由来でない（全体的にも部分的にも）ものと定義される。ヒト抗体または機能抗体断片はヒトに由来し得、または合成ヒト抗体であり得る。「合成ヒト抗体」は、本明細書において、既知ヒト抗体配列の分析に基づく合成配列に全体的または部分的にインシリコで由来する配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体断片配列のデータベースを分析し、それから得られたデータを利用してポリペプチド配列を構築することにより達成することができる。ヒト抗体または機能抗体断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によりコードされるものである（すなわち、このようなライブラリーは、ヒト天然源から採取された抗体に基づく）。
【００２２】
「ヒト化抗体」または機能ヒト化抗体断片は、本明細書において、（ｉ）非ヒト源（例えば、異種免疫系を担持するトランスジェニックマウス）に由来し、ヒト生殖系列配列に基づくもの；または（ｉｉ）可変ドメインが非ヒト起源に由来し、定常ドメインがヒト起源に由来するキメラであるものまたは（ｉｉｉ）可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源からのものである一方、可変ドメインの１つ以上のフレームワークがヒト起源であり、定常ドメイン（存在する場合）がヒト起源であるＣＤＲグラフトであるものと定義される。
【００２３】
「キメラ抗体」または機能キメラ抗体断片という用語は、本明細書において、ある種に見出される配列に由来し、または対応する定常抗体領域および別の種に由来する可変抗体領域を有する抗体分子と定義される。好ましくは、定常抗体領域は、ヒト、例えば、ヒト生殖系列または体細胞に見出される配列に由来し、または対応し、可変抗体領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲまたはＦＲ領域）は、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターに見出される配列に由来する。
【００２４】
一態様において、抗原結合は、インタクト抗体の「断片」により行われ得る。抗体の「抗体断片」という用語の範囲内に包含される結合断片の例には、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００２５】
「単鎖断片（ｓｃＦｖ）」は、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖である（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３参照）。２つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、それらは組換え法を使用して、それらの単一タンパク質鎖としての作製を可能とする人工ペプチドリンカーにより結合させることができる。このような単鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分が含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣用の技術を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００２６】
「単離」という用語は、例えば、異なる抗原特異性を有する他の抗体も抗体断片も実質的に含まない抗体または抗体断片であり得る化合物を指す。さらに、単離抗体または抗体断片は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないことがある。
【００２７】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについてのユニークな結合特異性および親和性を有するユニークな結合部位を提示する。
【００２８】
本明細書において使用される抗体は、そのような抗体がそのような抗原と１つ以上の参照抗原とを区別し得る場合、抗原（本明細書において、ＩＬ１７Ｃ、またはＩＬ１７Ｃの受容体）「に特異的に結合する」、「に特異的に結合する」、「に特異的」または「を特異的に認識する」。それというのも、結合特異性は絶対的ではなく、相対的特性であるためである。参照抗原は、参照点として使用される１つ以上の密接に関連する抗原、例えば、ＩＬ１７ＡまたはＩＬ１７Ｂであり得る。「特異的結合」は、その最も一般的な形態（および定義された参照が挙げられない場合）において、例えば、以下の方法の１つに従って測定されるとおり、抗体の、関心対象の抗原と無関連抗体とを区別する能力を指す。このような方法には、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンを含む。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。スコアリングは、標準的な発色（例えば、サイヨウワサビペルオキシドを有する二次抗体およびテトラメチルベンジジン、過酸化水素を用いる）により実施することができる。あるウェル中の反応は、例えば、４５０ｎｍにおける光学密度によりスコアリングされる。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤであり得；典型的な陽性反応は、１ＯＤであり得る。これは、陽性／陰性の差が１０倍を超え得ることを意味する。典型的には、結合特異性の測定は、単一参照抗原ではなく、約３から５つの無関連抗原、例えば、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの組を使用することにより実施される。さらに、「特異的結合」は、抗体の、その標的抗原の異なる部分、例えば、ＩＬ１７ＣもしくはＩＬ１７Ｃの受容体の異なるドメインもしくは領域、またはＩＬ１７ＣもしくはＩＬ１７Ｃの受容体のアミノ酸残基の１つ以上のキーアミノ酸残基もしくはストレッチを区別する能力に関し得る。
【００２９】
「交差競合する（ｃｒｏｓｓ  ｃｏｍｐｅｔｅ）」は、抗体、抗体断片または他の抗原結合部分の、標準競合結合アッセイにおける特異的抗原への他の抗体、抗体断片または抗原結合部分の結合を干渉する能力を意味する。抗体、抗体断片または他の抗原結合部分が特異的抗原への別の抗体、抗体断片または抗原結合部分の結合を干渉し得る能力または程度、およびしたがって本発明により交差競合すると断定することができるか否かは、標準競合結合アッセイを使用して測定することができる。１つの好適なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を計測し得るＢｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することによる）の使用を含む。交差競合を計測する別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースアプローチを使用する。抗体をそれらの交差競合に基づき「エピトープビニング」する高スループットプロセスは、国際特許出願の国際公開２００３／４８７３１号パンフレットに記載されている。交差競合は、調査中の抗体または抗体断片がＩＬ１７Ｃへの表１記載の抗体の１つの結合を６０％以上だけ、具体的には７０％以上だけ、より具体的には８０％以上だけ低減させる場合および表１記載の抗体の１つがＩＬ１７Ｃへの前記抗体または抗体断片の結合を６０％以上だけ、具体的には７０％以上だけ、より具体的には８０％以上だけ低減させる場合に存在する。
【００３０】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体相互作用により特異的に認識され、またはそうでなければある分子と相互作用する任意のタンパク質性領域が含まれる。一般に、エピトープは、化学的に活性な表面分子群、例えば、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖のものであり、一般に、特異的な三次元構造特徴、および特異的電荷特徴を有し得る。当業者により認識されるとおり、事実上、抗体が特異的に結合し得る全てのものがエピトープであり得る。エピトープは、抗体が結合する残基を含み得、「直鎖」または「立体構造」であり得る。「直鎖エピトープ」という用語は、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間の相互作用点の全てがタンパク質の一次アミノ酸配列（連続）に沿って直鎖に生じるエピトープを指す。「立体構造エピトープ」という用語は、不連続アミノ酸が一緒に三次元立体構造をなすエピトープを指す。立体構造エピトープにおいて、相互作用点は、互いに離れているタンパク質上のアミノ酸残基にわたり生じる。
【００３１】
「と同一のエピトープに結合する」は、抗体、抗体断片または他の抗体結合部分の、例示的抗体と同一のエピトープを有する特異的抗原に結合する能力を意味する。例示的抗体および他の抗体のエピトープは、エピトープマッピング技術を使用して決定することができる。エピトープマッピング技術は、当分野において周知である。例えば、立体構造エピトープは、例えば、水素／重水素交換、ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴などによりアミノ酸の空間立体構造を決定することにより容易に同定される。
【００３２】
また、本明細書において使用される「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ（またはそれらの任意のサブクラス）に属するタンパク質と定義され、それには全ての慣用的に公知の抗体およびその機能断片が含まれる。抗体／免疫グロブリンの「機能断片」は、本明細書において、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンの断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つ以上の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、−２、および／または−３領域中に見出され；しかしながら、可変「フレームワーク」領域も、例えば、ＣＤＲに足場を提供することにより抗原結合において重要な役割を担い得る。好ましくは、「抗原結合領域」は、可変軽（ＶＬ）鎖の少なくともアミノ酸残基４から１０３および可変重（ＶＨ）鎖の５から１０９、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３から１０７およびＶＨの４から１１１を含み、完全ＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１から１０９およびＶＨの１から１１３；国際公開第９７／０８３２０号パンフレットによる番号付与）が特に好ましい。本発明において使用される免疫グロブリンの好ましいクラスは、ＩｇＧである。本発明の「機能断片」には、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖのドメインもしくは単一免疫グロブリン可変ドメインを含む構築物、または単一ドメイン抗体ポリペプチド、例えば、単一重鎖可変ドメインもしくは単一軽鎖可変ドメインが含まれる。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化または完全に除去するように遺伝子操作することができる。
【００３３】
本発明の抗体は、インシリコで設計され、合成により作出された核酸によりコードされるアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーに由来し得る。抗体配列のインシリコ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、それから得られたデータを利用してポリペプチド配列を構築することにより達成される。インシリコ作出配列を設計および取得する方法は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７，Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８）３７６：１１８２；およびＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されている。
【００３４】
ＩＬ１７Ｃに特異的な任意の抗体を本発明に使用することができる。例示的な抗体には、先行技術の抗体、例えば、
Ａ：ラットＩｇＧ２Ａモノクローナル抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；クローン３１１５２２、＃ＭＡＢ２３０６１）、
Ｂ：ラットＩｇＧ２Ａモノクローナル抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；クローン３１１５２３、＃ＭＡＢ２３０６）および
Ｃ：ラット抗マウスＩＬ１７Ｃ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；クローン：８Ｂ２８、＃Ｉ８４３９−２０Ｒ３）が含まれる（実施例４より）。
【００３５】
本発明を実施するために使用することができる他の抗体には、Ａｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ＃Ｈ０００２７１８９−Ｂ０１Ｐ、＃Ｈ０００２７１８９−Ｄ０１および＃Ｈ０００２７１８９−Ｄ０１Ｐ）から入手可能な抗ＩＬ１７Ｃ抗体およびａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ  ＧｍｂＨ（Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ＃ＡＢＩＮ５２５８９２、＃ＡＢＩＮ３２７４１１、＃ＡＢＩＮ５２５８９３、＃ＡＢＩＮ２２１３４０、＃ＡＢＩＮ２２１３４１、＃ＡＢＩＮ２２１３４２および＃ＡＢＩＮ５２５８９１）から入手可能な抗ＩＬ１７Ｃ抗体が含まれる。本発明に使用することができるＩＬ１７Ｃに特異的な他の抗体は、本発明において単離および記載されたもの自体、すなわち、表１に列記されるものである。
【００３６】
本発明の組成物は、治療または予防用途に使用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体（または機能抗体断片）およびそのための薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含有する医薬組成物を含む。関連態様において、本発明は、炎症障害を治療する方法を提供する。このような方法は、投与が必要とされる対象に、本明細書に記載または企図される本発明の抗体を含有する有効量の医薬組成物を投与する工程を含有する。
【００３７】
ある態様において、本発明は、対象において炎症障害を治療する方法において、ＩＬ１７Ｃアンタゴニストを前記対象に投与する工程を含む方法を提供する。これに関して使用される「対象」は、任意の哺乳動物、例として、齧歯類、例えば、マウスまたはラット、および霊長類、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）またはヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を指す。好ましくは、対象は、霊長類、最も好ましくは、ヒトである。
【００３８】
ある態様において、本発明は、炎症障害を治療する方法において、対象にＩＬ１７Ｃアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＩＬ１７Ｃアンタゴニストは、約１００ｎＭ未満、より好ましくは、約６０ｎＭ未満、よりいっそう好ましくは、約３０ｎＭ未満の親和性でＩＬ１７Ｃに結合し得る方法を提供する。約１０ｎＭ未満、より好ましくは、約３ｎＭ未満の親和性でＩＬ１７Ｃに結合する抗体または抗体断片がさらに好ましい。
【００３９】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃアンタゴニストは、ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片であり、前記抗体または抗体断片は、別の種のＩＬ１７Ｃ、例えば、マウス、ラット、アカゲザルおよび／またはカニクイザルからのＩＬ１７Ｃと交差反応性である。ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃ抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃに特異的な単離抗体または抗体断片である。別の実施形態において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な単離抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体または抗体断片である。さらなる実施形態において、前記単離モノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な単離モノクローナル抗体である。さらなる実施形態において、前記単離モノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号１８１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的な単離モノクローナル抗体である。さらなる実施形態において、前記単離モノクローナル抗体または抗体断片は、別の種のＩＬ１７Ｃ、例えば、マウス、ラット、アカゲザルおよび／またはカニクイザルからのＩＬ１７Ｃと交差反応性である。
【００４０】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片は、ヒト合成抗体である。ある態様において、本発明は、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な単離モノクローナル抗体または抗体断片において、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である単離モノクローナル抗体または抗体断片を提供する。ある態様において、本発明は、配列番号１８１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的な単離モノクローナル抗体または抗体断片において、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である単離モノクローナル抗体または抗体断片を提供する。ある態様において、前記配列番号１８１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的な抗体または抗体断片は、ヒト合成抗体または抗体断片である。
【００４１】
ある態様において、本発明は、炎症障害においてＩＬ１７Ｃをアンタゴナイズし得るＩＬ１７Ｃアンタゴニストを含む組成物において、１つ以上の薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤をさらに含む組成物を提供する。ある態様において、ＩＬ１７Ｃのアンタゴニスト、例えば、ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体は、炎症障害におけるＩＬ１７Ｃの役割の何れかをアンタゴナイズし得る。
【００４２】
別の態様において、本発明は、対象において炎症障害を予防する方法において、ＩＬ１７Ｃアンタゴニストを前記対象に投与することを含む方法を提供する。これに関して使用される「予防」は、疾患を発症を予防する目的とし、または疾患の発症を遅延させる方法を指す。
【００４３】
ある態様において、本発明は、炎症障害の治療において有用なＩＬ１７Ｃアンタゴニストを含む組成物において、１つ以上の薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤をさらに含む組成物を提供する。
【００４４】
ある態様において、本発明は、炎症障害の治療において使用されるＩＬ１７Ｃアンタゴニストを提供する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、炎症障害の治療のための医薬品の調製におけるＩＬ１７Ｃアンタゴニストの使用を提供する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、ＩＬ１７Ｃのアンタゴニストを対象に投与することを含む、対象において炎症障害を治療する方法を提供する。
【００４７】
特定の態様において、本発明のＩＬ１７Ｃアンタゴニストは、皮下投与される。他の態様において、本発明のＩＬ１７Ｃアンタゴニストは、静脈内、関節内または髄腔内投与される。
【００４８】
本発明の組成物は、好ましくは、ＩＬ１７Ｃアンタゴニストおよび薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む、炎症障害の治療のための医薬組成物である。このような担体、希釈剤および賦形剤は、当分野において周知であり、当業者は、本発明のＩＬ１７Ｃアンタゴニストにより対象を治療するために最も適した配合物および投与経路を見出す。
【００４９】
ある態様において、本発明は、対象において炎症障害を治療または予防する方法において、対象に有効量のＩＬ１７Ｃのアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。ある態様において、前記対象は、ヒトである。代替的な態様において、前記対象は、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスである。
【００５０】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃのアンタゴニストは、ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片である。ある態様において、前記アンタゴニストは、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体または抗体断片である。代替的な態様において、前記ＩＬ１７Ｃのアンタゴニストは、ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体または抗体断片である。
【００５１】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７Ｃの受容体への結合を遮断する。代替的な態様において、前記ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７Ｃの受容体への結合を遮断する。
【００５２】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７の受容体への結合を遮断し、前記受容体は、ＩＬ１７ＲＥである。代替的な態様において、前記ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７ＲＥへの結合を遮断する。
【００５３】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片は、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭまたは１ｐＭ未満のＩＣ５０濃度でＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７ＲＥへの結合を遮断する。ある態様において、ＩＣ５０濃度は、ＥＬＩＳＡ；ＳＥＴ、ＦＡＣＳまたはＭＳＤ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により測定することができる。
【００５４】
ある態様において、前記ＩＬ１７Ｃに特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７Ｃの１つ以上の受容体への結合を遮断する。代替的な態様において、前記ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７Ｃの受容体への結合を遮断し、ＩＬ１７の受容体には、ＩＬ１７ＲＥおよびＩＬ１７ＲＡが含まれる。代替的な態様において、前記ＩＬ１７Ｃの受容体に特異的な抗体または抗体断片は、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７ＲＥおよびＩＬ１７ＲＡへの結合を遮断する。
【００５５】
ある態様において、本発明は、炎症障害の治療または予防において使用されるＩＬ１７Ｃのアンタゴニストを提供する。ある態様において、前記治療または予防は、対象に有効量のＩＬ１７Ｃのアンタゴニストを投与する工程を含む。ある態様において、前記対象は、ヒトである。代替的な態様において、前記対象は、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスである。
【００５６】
別の態様において、本開示は、表１に記載の抗体と交差競合する単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。ある実施形態において、本開示は、表１に記載の抗体の１つの６つのＣＤＲを含む抗体と交差競合する単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。ある実施形態において、本開示は、表１に記載の抗体と交差競合し、表１に記載の抗体の１つの特異的結合をＥＬＩＳＡベース交差競合において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％だけ低減させる単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。ある実施形態において、本開示は、表１に記載の抗体と交差競合し、表１に記載の抗体の１つの、ＩＬ１７Ｃへの特異的結合をＥＬＩＳＡベース交差競合において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％だけ低減させる単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。
【００５７】
別の態様において、本開示は、表１に記載の抗体と同一のエピトープと相互作用（例えば、結合、安定化、空間分布による）する単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。
【００５８】
一態様において、本開示は、表１の抗体の何れかのＫａｂａｔにより定義される６つのＣＤＲを含む単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。別の態様において、本開示は、表１の抗体のそれぞれのＫａｂａｔにより定義される６つのＣＤＲを含む単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。
【００５９】
一態様において、本開示は、表１の抗体の何れかのＶＨおよびＶＬを含む単離モノクローナル抗体またはその断片に関する。
【００６０】
別の態様において、本開示は、単離モノクローナル抗体またはその断片をコードする核酸において、表１の抗体の何れかのＶＨおよびＶＬを含む核酸に関する。
【００６１】
別の態様において、本開示は、表１に記載の核酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有する、単離モノクローナル抗体またはその断片をコードする核酸に関する。
【００６２】
当業者は、本明細書に記載の本発明が具体的に記載されるもの以外の変更および改変を許容することを認識する。本発明は、全てのそのような変更および改変を含むと理解すべきである。本発明は、本明細書に個別的または集合的に言及され、または示される工程、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに前記工程または特徴の任意の２つ以上の任意のおよび全ての組合せも含む。
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【実施例】
【００６３】
実施例１
マウスＩＬ１７Ｃ
マウスＩＬ１７ＣをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（＃２３０６−ＭＬ／ＣＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。ＥＣＬ（商標）ビオチン化モジュール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；＃１０６１９１８）を使用してビオチン化マウスＩＬ１７Ｃを調製した。ビオチン化後、Ｚｅｂａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ；＃８９８８９）を使用して生成物を精製した。
【００６４】
動的光散乱（ＤＬＳ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してビオチン化ＩＬ１７Ｃの品質管理を実施した。予測されるとおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元条件下で約２２ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの見かけの分子量を明らかにした。さらに、高分子量の種も凝集物も検出することはできなかった。抗原の予測サイズはＳＥＣにおいて確認し、ビオチン化マウスＩＬ１７Ｃは１つのピークとして可視的であり、分子量は約４３ｋＤａであった。ＤＬＳにおいて、凝集物は検出することができなかった。さらに、マウスＩＬ１７Ｃが定量的にビオチン化されることを確認した。
【００６５】
品質管理に合格した材料のみをパニングおよび結合アッセイに使用した。
【００６６】
実施例２
マウスＩＬ１７受容体Ｅ
マウスＩＬ１７受容体Ｅ（ＧｅｎｅＩＤ：５７８９０、アイソフォーム１）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃ」と称する）としてクローニングした。ｖκ−リーダーに続くマウスＩＬ１７ＣのＥＣＤを含有する構築物を、ＨＫＢ１１細胞（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；９（６Ｐｔ２）：６３１−８）中で一過的に発現させた。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを介して生成物を精製した。純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて変性、還元および変性、非還元条件下で、ならびに高速ＳＥＣおよびＤＬＳにより天然状態で分析した。
【００６７】
実施例３
ＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用アッセイ
マウスＩＬ１７の、その推定受容体ＩＬ１７受容体Ｅへの結合を試験するため、相互作用アッセイを設定した。アッセイ設定を図１Ａに示す。簡潔に述べると、ＩＬ１７受容体ＢおよびＥをＭｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ（登録商標）３８４ウェルプレートスタンダードプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；＃Ｌ２１ＸＡ−４）上でコートし、ビオチン化マウスＩＬ１７Ｃを添加した。マウスＩＬ１７Ｃの、その受容体への結合は、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中でのストレプトアビジンの結合を介して計測した。
【００６８】
結果を図１Ｂに示す。ＩＬ１７Ｃは、マウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃに結合するが、マウスＩＬ−１７ＲＢにも別の無関連受容体にも結合しないことが明確に見出された。また、無関連ビオチン化リガンドは、試験された３つの受容体のいずれへの結合も示さなかった。したがって、相互作用アッセイは、高度に特異的であり、ＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用の分析に十分適している。
【００６９】
実施例４
ＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用に対する従来技術抗体の効果
実施例３の相互作用アッセイにおいて、３つの従来技術抗体を、マウスＩＬ１７Ｃの、マウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃへの結合を阻害するそれらの能力について試験した。以下の抗体を試験した：
Ａ：ラットＩｇＧ２Ａモノクローナル抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；クローン３１１５２２、＃ＭＡＢ２３０６１）
Ｂ：ラットＩｇＧ２Ａモノクローナル抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；クローン３１１５２３、＃ＭＡＢ２３０６）
Ｃ：ラット抗マウスＩＬ１７Ｃ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；クローン：８Ｂ２８、＃Ｉ８４３９−２０Ｒ３）
【００７０】
抗体をビオチン化マウスＩＬ１７Ｃとプレインキュベートし、次いで事前形成された複合体をコートされたマウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃに添加した。
【００７１】
結果を図１Ｃに示す。従来技術抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体のいずれも、マウスＩＬ１７Ｃの、その受容体ＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃへの結合に対するいかなる効果も示さなかった。
【００７２】
実施例５
パニング戦略
ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用してマウスＩＬ１７Ｃに対する特異的Ｆａｂ断片を選択した。このファージミドライブラリーは、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）に開示されるＨｕＣＡＬ（登録商標）概念に基づき、Ｆａｂをファージ表面上に提示させるＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術を用いる（Ｌｏｈｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第２００１／０５９５０号パンフレット）。
【００７３】
異なるパニング戦略の溶液パニング、例として、種々の突然変異戦略、および慣用の固相パニングを実施した。固相パニングについては、マウスＩＬ１７ＣをＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）イムノプレート（Ｎｕｎｃ；＃４４２４０４）上で直接コートした。合計３ラウンドのパニングを固相パニングについて実施した。３つの選択ラウンドは、ラウンド毎に洗浄ストリンジェンシーを連続増加させ、抗原濃度を連続低減させて実施した。溶液パニングについては、ビオチン化抗原を溶液中でファージライブラリーに曝露させ、続いてストレプトアビジンビーズ上でファージ−抗原複合体を捕捉した。ここでも、３つの選択ラウンドは、ラウンド毎に洗浄ストリンジェンシーを連続増加させ、抗原濃度を連続低減させて実施した。ファージは、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１２−０５Ｄ）を使用して単離した。高親和性抗体を選択するため、ＨＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ライブラリーを第２の選択ラウンド後に作製し（平均ライブラリーサイズ約１×１０８）、次いでさらに２つの選択ラウンドを、ストリンジェンシーをさらに増加させ、抗原濃度をさらに減少させて行った。
【００７４】
実施例６
ＥＬＩＳＡを介するパニングアウトプットの初回特性決定
粗製細菌溶解物中での可溶性Ｆａｂ断片の急速発現を容易にするため、ペリプラズム抽出物を既に記載されているとおり調製した（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８．４０：３８１９４−２０５）。Ｆａｂ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を初回ヒットのＥＬＩＳＡスクリーニングに使用した。
【００７５】
結合剤の特異性は、直接コートされた抗原またはビオチン化抗原に対してＥＬＩＳＡスクリーニングを介して調査した。直接コートされた抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニングについては、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ；＃４６０５１８）をＰＢＳ中２．５μｇ／ｍＬのマウスＩＬ１７Ｃによりコートした。プレートをＰＢＳ中５％の脱脂粉乳によりブロッキングした後、Ｆａｂ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を添加した。Ｆａｂの結合は、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ：＃１１６８１９８２００１）を使用してアルカリホスファターゼにコンジュゲートしているＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００に希釈）により検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光を４３０ｎｍにおける励起で記録した。ビオチン化抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニングについては、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートをＰＢＳ中で１：１０００に希釈されたＦｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（結合部位、＃ＰＣ０７５）によりコートした。ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳によりブロッキングした後、Ｆａｂ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を添加した。続いて、捕捉されたＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を１μｇ／ｍｌのビオチン化マウスＩＬ１７Ｃに結合させ、それをアルカリホスファターゼにコンジュゲートしているストレプトアビジンとインキュベートし、次いでＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ：＃１１６８１９８２００１）を添加することにより検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光を４３０ｎｍにおける励起で記録した。パニング手順から単離された約９０００のＦａｂ断片をこれらのＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験し、約２９００が全てのＥＬＩＳＡ試験において陽性であった。
【００７６】
実施例７
ＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用アッセイを介する結合剤の特性決定
Ｆａｂ含有粗製細菌溶解物を高スループットスクリーニングモードにおいて中和活性について試験するため、実施例３に概説されるアッセイをわずかに改変して使用した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルＭＳＤプレート（Ｎｕｎｃ；＃４６０５１８）を、ＰＢＳ中０．６μｇ／ｍＬの３０μＬのマウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃにより４℃において一晩コートした。翌日、２０μＬのＦａｂ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を２ｎＭの等容量のビオチン化マウスＩＬ１７Ｃと室温において３０分間プレインキュベートした。プレートをＰＢＳ中５％のＢＳＡにより１時間ブロッキングした後、事前形成された抗体−リガンド複合体をコートされたＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃに１時間添加し、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してストレプトアビジン−ＥＣＬを介して受容体結合を検出した。
【００７７】
ｍＩＬ−１７ＲＥ相互作用アッセイにおいて精製抗ＩＬ１７Ｃヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａの阻害活性を測定するため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルＭＳＤプレートをＰＢＳ中７５ｎｇ／ｍＬの３０μＬのマウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃにより４℃において一晩コートした。翌日、２５μＬの抗体段階希釈物（０．００１から１００ｎＭの濃度）を０．１２５ｎＭの等容量のビオチン化マウスＩＬ１７Ｃと室温において３０分間プレインキュベートした。プレートをＰＢＳＴ中２．５％のＢＳＡにより１時間ブロッキングした後、事前形成された抗体−リガンド複合体をコートされたＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃに１時間添加し、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒを使用してストレプトアビジン−ＥＣＬを介して受容体結合を検出した。
【００７８】
全てのＥＬＩＳＡ陽性結合剤のうち、ＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用アッセイ、次いで陽性クローンの配列決定は、３３の異なるＨＣＤＲ３ファミリーに属する１４１の配列ユニーククローンを明らかにしたにすぎなかった。この数は、ＥＬＩＳＡおよびマウスＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃ阻害アッセイにおける確認スクリーニングによりさらに低減した。最良の阻害活性を有する候補物を選択するため、ＢＥＬ溶解物をＩＬ１７ＲＥ／Ｆｃ阻害アッセイにおける使用のために１：５００まで事前希釈した。最終的に、８つの異なるＨＣＤＲ３ファミリーに属する１８の配列ユニーククローンを同定することができ、それらはＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用アッセイにおいて一貫して繰り返し陽性であった。
【００７９】
実施例８
ポリクローナルＩｇＧ変換
Ｆａｂ断片のＩｇＧフォーマットへの変換を、Ｆａｂ断片の所望のＩｇＧフォーマットへのポリクローナルクローニングにより実施した。ヒト−マウスキメラＩｇＧフォーマットを使用して野生型マウスを用いるインビボ概念実証試験において投与される抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体に対して指向される免疫原性反応を回避した。２つの異なる定常領域ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１アイソタイプを使用した。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；＃０２００５２４）を使用する部位特異的突然変異導入を介して除去した。この手順から回収された全てのＩｇＧの配列多様性を表１に示す。
【００８０】
実施例９
ＩｇＧの試験スケール産生
実施例８に記載の手順から回収された全てのＩｇＧを、キメラヒト／マウスＩｇＧ２ａおよびキメラヒト／マウスＩｇＧ１アイソタイプフォーマットの両方でＨＫＢ１１細胞（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；９（６Ｐｔ２）：６３１−８）中で試験スケールで産生して２つの異なる定常領域を有する抗体の産生収率およびモノマー部分を評価した。最大量は、キメラヒト／マウスＩｇＧ２ａフォーマットの抗体を用いて産生することができた。このフォーマットは、ＳＥＣにおける品質管理にも良好に合格した（＞９０％のモノマー含有率）。したがって、キメラヒト／マウスＩｇＧ２ａフォーマットをさらなる機能試験のために選択した。精製収率およびＳＥＣにおいて測定されたモノマーの部分を図２に示す。
【００８１】
実施例１０
親和性測定
全ての精製キメラヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ抗体を、１００ｎＭの濃度から出発してＥＬＩＳＡにおけるＥＣ５０測定のためにマウスＩＬ１７Ｃに対してタイトレーションした。マウスＩＬ１７Ｃに対するＥＣ５０値は、１から３つの独立実験において測定した。結果を図３に示す。
【００８２】
ＥＣ５０値は、２００から１２００ｐＭの範囲であり、ほとんどのＥＣ５０値は約３００ｐＭであった。４つのＩｇＧ（ＭＯＲ１２７５５、ＭＯＲ１２７５６、１２７５７、１２７５８）の結合活性を精製ＩｇＧ２ａについて確認することができなかったため、これらのＩｇＧはさらなる特性決定から除外した。抗体のいずれも、ヒトＩＬ１７Ｃ（配列同一性７７％）への交差反応性も、マウスＩＬ−１７Ｂ（配列同一性３０％）への交差反応性も、陰性対照抗原リゾチームへの交差反応性も示さなかった。
【００８３】
抗ＩＬ１７Ｃ抗体の一価親和性は、Ｆａｂ断片を使用する溶液平衡タイトレーション（ＳＥＴ）により測定した。溶液中での親和性測定は、基本的には、文献に記載のとおり実施した（Ｆｒｉｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７７：３０５−１９）。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するため、それを古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベース技術（Ｈａｅｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３９．１：１８２−８４）に移行させた。結合剤をＦａｂ＿ＦＨフォーマットで発現させ、精製した。一部のＦａｂは、結合もせず、ＳＥＴにおいてシグモイド結合曲線も示さなかったため、親和性は、１０の候補物についてのみ測定することができた。一価親和性は、４８から４１００ｐＭの範囲であり、ＦａｂのほとんどのＫＤ値は低ｐＭ範囲（≦１００ｐＭエラー！参照元が見つかりません。）であった。結果を図４に示す。
【００８４】
実施例１１
ＩｇＧフォーマットの結合剤を用いるＩＬ１７Ｃ−ＩＬ１７受容体Ｅ相互作用アッセイ
ヒト／マウスＩｇＧ２ａフォーマットの抗体をより詳細に特性決定するため、それぞれの候補物について、ＩＣ５０値を最大４つの独立実験において本明細書に上記のとおりＩＬ−１７受容体Ｅ阻害アッセイにおいて測定した。
【００８５】
結果を図５に示す。１２のＩｇＧのうち１１が阻害活性を示し、平均ＩＣ５０値は、９から８４４２ｐＭの範囲であった。これらの１１の阻害ＩｇＧのうち９つは、低ピコモル濃度範囲のＩＣ５０値も有した。最良の候補物は、異なるＨＣＤＲ３ファミリーに属し、異なるＶＬサブタイプ（カッパまたはラムダ）のものであった。
【００８６】
実施例１２
マウス血清中の安定性
選択された抗マウスＩＬ１７Ｃ抗体がマウスにおけるインビボ投与に好適か否かを分析するため、マウス血清中の安定性を許容可能な産生収率およびマウスＩＬ１７Ｃへの特異的結合を示す１１の精製ＩｇＧのサブセットについて測定した（上記参照）。
【００８７】
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ；＃４４２４０４）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度のアビジンにより４℃において一晩コートした。翌日、抗ＩＬ１７キメラＩｇＧ２ａをマウス血清中で３７℃において１００μｇ／ｍＬの最終濃度において２４時間インキュベートした。インキュベーション工程後、抗体をＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；＃１００５００）中で１：１００に希釈した。参照として、同一セットの抗体をＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液＋１％マウス血清中で新たに希釈し、室温において３０分間インキュベートした。アビジンコートされたプレートを、ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ製Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液、＃３７５１５）とインキュベートし、続いて１００μＬのＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液中０．１μｇ／ｍＬのビオチン−ＩＬ１７Ｃをブロッキングされたウェルに添加した。洗浄工程後、血清インキュベートおよび新たに希釈されたＩｇＧの段階希釈物を添加した。ＩｇＧの結合は、基質としてのＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰを使用して抗マウス−ＩｇＧ２ａ  ＰＯＤコンジュゲート検出抗体（ＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液中で１：５０００に希釈）により検出した。１ＭのＨＣｌを添加することにより反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにおいて計測した。
【００８８】
わずかな血清安定性のみを示した１つのＩｇＧ候補物（ＭＯＲ１２７６０）を除き、全ての他の抗体は、３７℃における２４時間のインキュベーション後に極めて良好なマウス血清中の安定性（変動係数≦２０％）を示した。結果を図６に示す。
【００８９】
実施例１３
インビボ概念実証試験のための結合剤の選択
ＭＯＲ１２７４３およびＭＯＲ１２７６２を、ＩＬ−１７ＲＥ受容体阻害アッセイおよび細胞ベースＮＦｋＢレポーター遺伝子アッセイにおける生産性、安定性、結合および機能活性に関するそれらの好ましい特性に基づき、インビボ概念実証試験のための候補物として選択した。
【００９０】
実施例１４
インビボＣＩＡモデル
１４．１  材料
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）をＤｉｆｃｏ（ＭＩ，ＵＳ）から購入した。ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、およびＥｎｂｒｅｌを、ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓｉｇｍａ（Ｐ４２５２、Ｌ’Ｉｓｌｅ  ｄ’Ａｂｅａｕ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｗｈｙｅｔｔ（２５ｍｇの注射可能なシリンジ、Ｆｒａｎｃｅ）からそれぞれ入手した。使用される全ての他の試薬は、試薬グレードのものであり、全ての溶媒は、分析グレードのものであった。
【００９１】
１４．２  動物
ＤＢＡ１／Ｊマウス（雄、６〜７週齢、約２０グラム）を、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｌｅｖａｇｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌａｖａｌ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。マウスを１２時間の明／暗サイクル（０７００〜１９００）で管理した。温度を２２℃に維持し、食物および水を不断給餌した。
【００９２】
１４．３  コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）
実験前日、ＣＩＩ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を０．０５Ｍの酢酸を用いて調製し、４℃において貯蔵した。免疫化直前、等容量のアジュバント（ＩＦＡ）およびＣＩＩを氷水浴中で事前冷却されたガラス瓶中でホモジナイザーにより混合した。エマルションが形成されない場合、追加アジュバントおよびホモジナイズの延長が要求され得る。１日目に０．１ｍＬのエマルションをそれぞれのマウス尾の付け根において皮内注射し、２１日目に第２のブースター皮内注射（ＣＦＡ中２ｍｇ／ｍＬのＣＩＩ溶液、０．１ｍＬエマルション）を実施した。この免疫化法は、公開されている方法（Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；ｖｏｌ２（５）：１２６９−１２７５；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｎｔｉ−ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ（ＨＤＡＣ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ａｐｒ；１５０（７）：８２９−３１）から改変した。
【００９３】
１４．４  試験設計
１４．４．１  治療プロトコル
抗体の治療効果をマウスＣＩＡモデルにおいて試験した。マウスを均等な群にランダムに分割し、それぞれの群は１０匹のマウスを含有した。１日目に全てのマウスを免疫化し、２１日目にブーストした。治療投与を３１日目から４６日目まで継続した。陰性対照群をビヒクル（ＰＢＳ）により処理し、陽性対照群をＥｎｂｒｅｌ（１０ｍｇ／ｋｇ、週３回、腹腔内）により処理した。関心対象の抗体を１０ｍｇ／ｋｇ、週３回、腹腔内において試験した。
【００９４】
したがって、５つの異なる処理群を使用し、それぞれの群は、１０匹のマウスからなるものであった。
第１群：ビヒクル（ＰＢＳ）
第２群：Ｅｎｂｒｅｌ  １０ｍｇ／ｋｇ／週３回、腹腔内
第３群：ＭＯＲ０３２０７  １０ｍｇ／ｋｇ／週３回、腹腔内
第４群：ＭＯＲ１２７４３  １０ｍｇ／ｋｇ／週３回、腹腔内
第５群：ＭＯＲ１２７６２  １０ｍｇ／ｋｇ／週３回、腹腔内
【００９５】
抗ＩＬ１７Ｃ抗体を１０ｍｇ／ｋｇにおいて週３回腹腔内投与した。薬物動態分析のために血液試料（約２５０μＬ）を３１および４６日目に採取した。
【００９６】
１４．４．２  予防プロトコル
抗体の予防効果をマウスＣＩＡモデルにおいて試験した。マウスを２０匹のマウスを含有する２つの均等な群にランダムに分割した。１日目に全てのマウスを免疫化し、２１日目にブーストした。予防投与を２１日目から４６日目まで継続した。陰性対照群を陰性抗体（ＭＯＲ０３２０７、１０ｍｇ／ｋｇ、週３回、腹腔内）により処理した。関心対象の抗体（ＭＯＲ１２７６２）を１０ｍｇ／ｋｇ、週３回、腹腔内において試験した。
【００９７】
したがって、２つの異なる処理群を使用し、それぞれの群は、２０匹のマウスからなるものであった。
第１群：ＭＯＲ０３２０７  １０ｍｇ／ｋｇ／週３回、腹腔内
第２群：ＭＯＲ１２７６２  １０ｍｇ／ｋｇ／週３回、腹腔内
【００９８】
抗ＩＬ１７Ｃ抗体を１０ｍｇ／ｋｇにおいて週３回腹腔内投与した。薬物動態分析のために血液試料（約２５０μＬ）を２１、３６および４６日目に採取した。
【００９９】
１４．５  関節炎の臨床評価
Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ  ２００６（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，２５１２−６）、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００７（前掲）；Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００４（Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｖｉａ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ１６ＩＮＫ４ａ  ａｎｄ  ｐ２１（ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１０：３３６５−７６）；およびＢｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００７（前掲）の方法に従って、関節炎をスコアリングした。四肢のそれぞれの腫脹を関節炎スコアにより以下のとおり順位付けした：０−無症状；１−１種の関節、例えば、足関節もしくは手関節の軽度であるが、明確な発赤および腫脹、または罹患指の数にかかわらず個々の指に限定された見かけの発赤および腫脹；２−２種以上の関節の中程度の発赤および腫脹；３−指を含む足全体の重度の発赤および腫脹；４−複数の関節を含む最大炎症の手足（動物当たりの最大推定臨床関節炎スコア１６）（Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（前掲））。
【０１００】
要求される場合、複数の治療試験のメタ分析を可能とするため、臨床スコア値を以下のとおり正規化することができる：
【０１０１】
臨床スコアのＡＵＣ（ＡＵＣスコア）：
３１（２１）日目から４６日目までの曲線下面積（ＡＵＣ）をそれぞれの個々の動物について計算した。それぞれの動物のＡＵＣを、その動物に対するデータが得られた試験におけるビヒクルについて得られた平均ＡＵＣにより割り、１００を掛けた（すなわち、ＡＵＣを試験当たりの平均ビヒクルＡＵＣの割合として表現した）。
【０１０２】
２１日目から４６日目までの臨床スコア増加（終点スコア）：
それぞれの動物についての臨床スコア差を、その動物に対するデータが得られた試験におけるビヒクルについて得られた平均臨床スコア差により割り、１００を掛けた（すなわち、差を試験当たりのビヒクルについての平均臨床スコア差の割合として表現した）。
【０１０３】
１４．６  放射線学的分析（ラーセンスコア）
それぞれの個々の動物の後足のＸ線写真を撮影した。ランダムブラインド識別番号を写真のそれぞれに割り当て、骨びらんの重症度を３人の独立のスコアラーにより放射線学的ラーセンスコア系により以下のとおり順位付けした：０−正常、完全な骨輪郭および正常な関節腔；１−わずかな異常、わずかな外側中足骨の任意の１つまたは２つが骨びらんを示す；２−明確な早期異常、外側中足骨の任意の３から５つが骨びらんを示す；３−中程度の破壊性異常、全ての外側中足骨および内側中足骨の任意の１または２つが明確な骨びらんを示す；４−重度の破壊性異常、全ての中足骨が明確な骨びらんを示し、内側中足骨関節の少なくとも１つが完全に侵食され、一部の骨関節輪郭が部分的に保たれたままである；５−ムチランス型異常、骨輪郭を示さない。このスコアリング系は、Ｓａｌｖｅｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  Ｍ４０４０３，ａ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４：２９０９−２１）；Ｂｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｊｏｉｎｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４６：８０２−５）；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｂｏｎｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，５０：２３３８−４６）およびＪｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  １  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５２：３３９−４４）からの改変物である。
【０１０４】
１４．７  結果
治療モデルにおいて、治療を臨床スコアおよびラーセンスコアを介して評価した。結果を図７および図８に示す。注目すべきことに、試験された抗ＩＬ１７Ｃ抗体の両方（ＭＯＲ１２７４３およびＭＯＲ１２７６２）が有意な炎症の阻害を実証した。陰性対照抗体ＭＯＲ０３２０７は炎症を阻害しなかった一方、陽性対照Ｅｎｂｒｅｌは疾患進行を阻害した。
【０１０５】
予防モデルにおいて、治療を臨床スコアおよびラーセンスコアを介して評価した。結果を図９に示す。注目すべきことに、試験された抗ＩＬ１７Ｃ抗体（ＭＯＲ１２７６２）が有意な炎症および骨分解の阻害を実証した。陰性対照抗体ＭＯＲ０３２０７は、炎症も骨びらんも阻害しなかった。
【０１０６】
１４．８  定常状態ＰＫ
投与前、３１および４６日目（治療プロトコル）または２１、３６および４６日目（予防プロトコル）において、血液試料を後眼窩静脈洞において抗凝固剤としてのリチウムヘパリンを用いて回収した。全血試料を遠心分離し、得られた血漿試料を分析まで−２０℃において貯蔵した。
【０１０７】
実施例１５
タバコ煙モデル
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をタバコ煙（ＴＳ）に１１日連続で毎日曝露させることにより肺炎症をもたらし、それは最終曝露から２４時間後、同様に処理された空気曝露群と比較して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）において回収された細胞の総数の増加により示される。応答は、ＢＡＬにおいて回収されたマクロファージ、上皮細胞、好中球およびリンパ球の数の有意な増加からなるものであった。
【０１０８】
曝露１、４、７および１０日目に、ＭＯＲ１２７４３をＴＳ曝露１時間前に腹腔内経路（ｉ．ｐ．）により投与した。これは、ＢＡＬにおいて回収された細胞の総数、具体的には、上皮細胞および好中球の数の有意な阻害をもたらした。
【０１０９】
曝露１、４、７および１０日目に、ＭＯＲ０３２０７をＴＳ曝露１時間前に腹腔内経路（ｉ．ｐ．）により投与した。これは、ＢＡＬにおいて回収された総細胞数または任意の具体的に同定される細胞タイプの数のいかなる有意な阻害ももたらさなかった。
【０１１０】
ロフルミラスト（ＣｈｅｍＰｈａｒｍａＳｅｒｖｅ  Ｌｔｄ．参照番号００１０２０６）をそれぞれのＴＳ曝露１時間前に５ｍｇ／ｋｇ経口（ｐ．ｏ．）投与した。これは、ＢＡＬにおいて回収された細胞の総数および具体的には上皮細胞好中球およびリンパ球の数を有意に阻害した。
【０１１１】
全てのＴＳ曝露群は、１２日目の安楽死においていくらかの体重損失を示したが、空気曝露群と比較して有意でなかった。
【０１１２】
１５．１  材料
腹腔内投与のためのビヒクル：Ｄ−ＰＢＳ  ｐＨ７．４（ＰＡＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔ参照番号Ｈ１５−００２、ロット番号Ｈ００２０８−２３５３）
経口投与のためのビヒクル：注射用ＰＥＧ２００／水（６０％／４０％ｖ／ｖ）
【０１１３】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）のためのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＧｉｂｃｏから入手した。Ｅｕｔｈａｔａｌ（ペントバルビトンナトリウム）をＭｅｒｉａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌｔｄ．から入手した。タバコ煙は、商用供給業者から購入した「Ｍａｒｌｂｏｒｏ１００」シガレットを使用して生成した。
【０１１４】
配合物：
ＭＯＲ１２７４３およびＭＯＲ０３２０７を１ｍｇ／ｍＬにおいて冷凍した。両方の試験物質を投与前に４℃において一晩解凍させた。
【０１１５】
ロフルミラストは、事前に秤量された量を鉢中に装入し、穏やかに粉砕する一方、ビヒクル（ＰＥＧ２００／水、６０％／４０％ｖ／ｖ）を滴加して懸濁液を形成することにより配合した。懸濁液を投与前にボルテックスにより混合した。
【０１１６】
１５．２  方法
予備試験により、ＢＡＬにおいて回収された細胞の総数が１１日間毎日のＴＳ曝露の最後から２４時間後に有意に上昇することを確認した。この試験において、最終空気またはＴＳ曝露２４時間後の時点を分析に使用した。
【０１１７】
試験１、４、７および１０日目に、ビヒクル（ＰＢＳ）、ＭＯＲ１２７４３およびＭＯＲ０３２０７をＴＳ曝露１時間前に腹腔内投与した。ロフルミラストは、それぞれのＴＳ曝露１時間前に経口投与した。
【０１１８】
１５．２．１  １１日間連続の動物のＴＳへの毎日の曝露
この曝露プロトコルにおいて、マウスを透明ポリカーボネートチャンバ（２７ｃｍ×１６ｃｍ×１２ｃｍ）中で５つの群で曝露させた。「Ｍａｒｌｂｏｒｏ１００」シガレットからのＴＳを曝露チャンバに１００ｍＬ／分の流速において流入させた。高レベルのＴＳへの繰り返し曝露により引き起こされるあらゆる潜在的な問題を最小化するため、ＴＳへの曝露期間を最初に試験開始時（１日目）の２５分間から３日目の最大４５分間に増加させた。この試験において使用された曝露スケジュールは以下のとおりであった：
１日目：２５分間の曝露（約５本のシガレット）。
２日目：３５分間の曝露（約７本のシガレット）。
３〜１１日目：４５分間の曝露（約９本のシガレット）。
曝露箱を１０分後に通気させ、以後５分毎に通気させた。
１つのさらなるマウス群を、偽処理対照（ＴＳ曝露なし）として同等の時間の長さで空気に毎日曝露させた。
【０１１９】
１５．２．２  気管支肺胞洗浄およびｃｙｔｏｓｐｉｎ分析
気管支肺胞洗浄を以下のとおり実施した：
１０ｍｍ長のＬｕｅｒフィッティングステンレス鋼カニューレを使用して気管にカニューレ挿入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を洗浄液として使用した。０．４ｍＬの容量を穏やかに滴下し、１ｍＬのシリンジを使用して３回抜き出し、次いでエッペンドルフ管中に装入し、後続の測定前に氷上で保持した。
【０１２０】
総細胞カウントを以下のとおり実施した：
洗浄液を細胞から遠心分離（３４００ｒｐｍにおいて６分間、ＲＣＦ＝３０７０×ｇ−「Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ」）により分離し、上清をデカントし、考えられる後続の分析のために冷凍した。細胞ペレットを既知容量のＰＢＳ中で再懸濁させ、染色（Ｔｕｒｋｓ染色）アリコートを顕微鏡下で血球計を使用してカウントすることにより総細胞数を計算した。
【０１２１】
分別細胞カウントを以下のとおり実施した：
残留細胞ペレットを１ｍＬ当たり約１０５個の細胞に希釈した。５００μｌの容量をｃｙｔｏｓｐｉｎスライドの漏斗中に装入し、８００ｒｐｍ、ＲＣＦ＝７２．２６×ｇ（Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３）において８分間遠心分離した。スライドを風乾させ、製造業者の説明書によりライツ（Ｗｒｉｇｈｔｓ）／ギムザ染色を使用して染色した。乾燥させ、カバースリップ処理したとき、光学顕微鏡を使用して分別細胞カウントを実施した。約４００個の細胞をそれぞれのスライドについてカウントした。標準的な形態学的技術を使用して細胞を識別した。
【０１２２】
１５．３  治療レジーム
この試験において、４つのマウス群を１１日間毎日のＴＳ曝露に供し、最終ＴＳ曝露２４時間後の１２日目に安楽死させた。３つの群は、試験１、４、７および１０日目にＴＳ曝露１時間前にビヒクル（Ｄ−ＰＢＳ）、ＭＯＲ１２７４３またはＭＯＲ０３２０７の何れかを腹腔内で受けた。１つの群は、それぞれのＴＳ曝露１時間前にロフルミラストを経口で受けた。さらなる群を１１日間連続で空気に曝露させ、最終空気曝露２４時間後の１２日目に安楽死させた。この群は、試験１、４、７および１０日目に曝露１時間前にビヒクル（Ｄ−ＰＢＳ）を腹腔内で受けた。全ての群について、ｎ＝１０である。
【０１２３】
１５．４  サンプリング手順
空気またはＴＳへの最終曝露２４時間後の１２日目に全てのマウスを腹腔内バルビツール酸塩麻酔過剰摂取により屠殺した。血液試料を鎖骨下静脈からヘパリンを介して採取し、血漿を遠心分離により分離し、−４０℃において貯蔵した。０．４ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用してＢＡＬを実施した。ＢＡＬから回収された細胞を総細胞および分別細胞カウントに使用した。ＢＡＬ上清および残留細胞ペレットを、考えられる将来の分析のために−４０℃および−８０℃においてそれぞれ貯蔵した。ＢＡＬ後、カニューレを定位置に縛っておいた。胸部を穏やかに切開し、胸骨および肋骨の両側部を切断した後に心臓および肺を摘出した。左葉を結紮し、摘出し、瞬間冷凍し、−８０℃において貯蔵した。右葉を１０％のリン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）によりＰＢＦの１８ｃｍの圧力に２０分間伸展させた。次いで、気管をカニューレ下方で結紮し、カニューレを取り出した。心臓、肺および気管をＰＢＦ中で浸漬させた。
【０１２４】
１５．５  データ計測および統計分析
結果をそれぞれの動物についての個々のデータ点として提示し、平均値をそれぞれの群について計算した。
【０１２５】
したがって、データを最初に一元配置分散分析検定（ＡＮＯＶＡ）に供し、次いで多重比較のためにボンフェローニ補正して処理群間の統計的有意差について検定した。＜０．０５の「ｐ」値を統計的に有意とみなした。
以下の式を使用して阻害割合を計算した：
2014530836.tif 000019
【０１２６】
１５．６  結果
１５．６．１  ＴＳへの毎日の曝露により誘導された、ＢＡＬにおいて回収された細胞数の増加により示される肺炎症
１つの群をＴＳに１１日間毎日曝露させ、その群は試験１、４、７および１０日目にＴＳ曝露１時間前にビヒクル（Ｄ−ＰＢＳ）を腹腔内で受けた。同様に処理された空気曝露群と比較して、マウスは、１２日目（最後のＴＳ曝露から２４時間後）の安楽死時のＢＡＬにおいて回収された細胞の総数の有意増加（ｐ＜０．００１）として提示される肺炎症を示した。この炎症は、空気曝露（偽処理）動物と比較してマクロファージ、上皮細胞、好中球およびリンパ球の数の有意増加（全てについてｐ＜０．００１）からなるものであった（表２）。
2014530836.tif 000020
【０１２７】
１５．６．２  ＴＳへの毎日の曝露により誘導された、ＢＡＬにおいて回収された細胞数の増加により示される、肺炎症に対するＭＯＲ１２７４３の腹腔内投与の効果
１、４、７および１０日目に、ＴＳ曝露１時間前に５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与されたＭＯＲ１２７４３は、ＢＡＬにおいて回収された総細胞数（２６％、ｐ＜０．００１）、具体的には、上皮細胞（５２％、ｐ＜０．００１）および好中球（４８％、ｐ＜０．００１）を有意に阻害した。阻害の程度および有意性を表３にまとめる。
【０１２８】
１５．６．３  ＴＳへの毎日の曝露により誘導された、ＢＡＬにおいて回収された細胞数の増加により示される、肺炎症に対するＭＯＲ０３２０７の腹腔内投与の効果
１、４、７および１０日目に、ＴＳ曝露１時間前に５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与されたＭＯＲ１２７４３は、ＢＡＬにおいて回収された総細胞数もＴＳ曝露後に上昇した任意の具体的に同定される細胞タイプの数も有意に阻害しなかった。データを表３にまとめる。
【０１２９】
１５．６．４  ＴＳへの毎日の曝露により誘導された、ＢＡＬにおいて回収された細胞数の増加により示される、肺炎症に対するロフルミラストの経口投与の効果
１、４、７および１０日目に、それぞれのＴＳ曝露１時間前に５ｍｇ／ｋｇで経口投与されたロフルミラストは、ＢＡＬにおいて回収された総細胞数（３２％  ｐ＜０．００１）、具体的には、上皮細胞（５０％  ｐ＜０．００１）、好中球（５６％  ｐ＜０．００１）およびリンパ球（５４％  ｐ＜０．０１）を有意に阻害した。阻害の程度および有意性を表３にまとめる。
2014530836.tif 000021
【０１３０】
全てのデータを比較のためにＡＮＯＶＡ検定に供して処理群間の有意差について検定した。＜０．０５の「ｐ」値を統計的に有意とみなした。ｎｓ＝統計的に有意でない。
【０１３１】
１５．６．５  １１日間の毎日のＴＳへの曝露全体にわたるマウスの体重に対する治療の効果
曝露プロトコルの継続時間全体にわたりマウスの健康をモニタリングするため、マウスを試験の開始時、６日目および１２日目に安楽死前に秤量した。１２日間の試験にわたり、偽処理曝露マウスは、体重の変化をほとんど示さず、または示さなかった。全てのＴＳ曝露群はこの期間にわたりいくらかの体重損失を示したが、これらの損失は統計的に有意でなかった。
【０１３２】
１５．７  結論
１、４、７および１０日目に腹腔内投与されたＭＯＲ１２７４３（５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＡＬにおいて回収された細胞の総数、具体的には、上皮細胞および好中球を有意に阻害した。同一の手法で投与されたＭＯＲ０３２０７（５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＡＬにおいて回収された総細胞数に対しても、任意の具体的に同定される細胞タイプの数に対しても効果を有さなかった。
【０１３３】
それぞれのＴＳ曝露１時間前に経口投与された参照化合物ロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＡＬにおいて回収された細胞の総数、具体的には、上皮細胞好中球およびリンパ球を有意に阻害した。応答は予備試験において見られたものと同様であった。
【０１３４】
全てのＴＳ曝露群は、１２日間の試験期間にわたりいくらかの体重損失を示したが、処理群のいずれの間にも有意差は存在しなかった。
【０１３５】
実施例１６
ＬＰＳの鼻腔内滴下：急性肺好中球増加症のマウスモデル
ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）の一部の関連態様を模倣する急性肺好中球増加症のマウスモデルへのリポ多糖（ＬＰＳ）鼻腔内滴下において１つの陰性ｍＡｂおよび２つの陽性ｍＡｂを用いて２つの独立試験を実施した。効果を気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）炎症細胞カウントにより計測した。
【０１３６】
１６．１  試験群
いくつかのマウス群を異なる抗体およびデキサメタゾンにより処理し、ＬＰＳのみに供されたマウスと比較した。群のまとめを表４に提供する。
2014530836.tif 000022
【０１３７】
１６．２  材料
・リポ多糖（ＬＰＳ）：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）０５５：Ｂ５由来、参照番号：Ｌ４５２４−２５ＭＧ、親和性クロマトグラフィーにより精製、ロット番号：０１８Ｋ４０７７−Ｓｉｇｍａ。ＬＰＳを鼻腔内滴下により投与される容量基準で調製した：５０μＬ／マウス（１０μｇ／５０μＬ）。
・生理食塩溶液：塩化ナトリウム０．９％、ロット番号９Ｆ０１９１（エンドトキシン不含、Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ）
・ケタミン：Ｉｍａｌｇｅｎｅ  ＭＥＲＩＡＬ１０００、１０ｍＬ
・キシラジン：Ｒｏｍｐｕｎ  ＢＡＹＥＲ  ＰＨＡＲＭＡ  ２％、２５ｍＬ
・イソフルラン：Ａｅｒｒａｎｅ、バッチ番号１０Ｅ２８Ａ３５
・メチルセルロース（ＭＣ）：ＶＷＲ、参照番号ＡＸ０２１２３３バッチ番号Ｍ１３９５
・デキサメタゾン（ＤＥＸ）調製物：３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇ、０．２ｍＬ／マウス、経口
・抗体を１ｍｇ／ｍＬにおいて冷凍した。試験物質を投与前に４℃において一晩解凍させた。全ての抗体は、解凍時に即時使用可能であった（またはそれらを即時希釈した）。
【０１３８】
１６．３  動物
Ｈａｒｌａｎ（Ｆｒａｎｃｅ，）製のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをこの試験において使用した。マウス重量は約２０ｇであった。
【０１３９】
１６．４  実験手順
鼻腔内投与
マウスをイソフルラン吸入により麻酔した。呼吸の間、ＬＰＳを鼻腔内滴下した。２４時間後、マウスを腹腔内（ＩＰ）麻酔し、気管支肺胞洗浄手順を実施した。マウスをマウス重量１０ｇ当たり０．１ｍＬの麻酔溶液の注射により麻酔した。または水溶液は、１８ｍｌの０．９％ＮａＣｌ、０．５ｍＬのキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）および１．５ｍＬのケタミン（７５ｍｇ／Ｋｇ）から構成した。
【０１４０】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）
気管を正中切開を介して曝露させ、それに（マウスカテーテルにより）カニューレ挿入した。１ｍＬの滅菌ＰＢＳ緩衝液を使用してＢＡＬを２回実施した。洗浄液を取り出し、１５００ｒｐｍにおいて４℃において１０分間遠心分離した。細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳ緩衝液中で再懸濁させた。細胞カウンター（Ｖｅｔ  ａｂｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して細胞をカウントした。洗浄液上清を炎症メディエーター投与のために−２０℃において保持した。
【０１４１】
１６．５  試験設計
デキサメタゾン：デキサメタゾンによる処理を、ＬＰＳ滴下２４、１６および１時間前およびＬＰＳ投与６時間後に実施した。
抗体：ＬＰＳ滴下２４時間前に、マウスをｍＡｂ（ＭＯＲ０３２０７、ＭＯＲ１２７６２またはＭＯＲ１２７４３）の１つにより処理した。
【０１４２】
全ての群について、ＢＡＬをＬＰＳ投与２４時間後に実施し、細胞カウントを計測した。
【０１４３】
結果
スチューデントｔ検定を使用して結果を分析した。抗体またはデキサメタゾンの何れかにより処理されたマウスからのＢＡＬからの細胞カウントを、ＬＰＳのみに供されたマウスにおける細胞カウントと比較した。それぞれの群におけるマウスからの細胞カウントの平均＋／−標準誤差を考察した。結果を図１０に提示する。
【０１４４】
結論
５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ０３２０７抗体（陰性対照）による単一処理は、炎症細胞のＢＡＬＦ中へのリクルートメントを有意に阻害しなかった（ｎｓ傾向）。同時に、５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ１２７６２またはＭＯＲ１２７４３による単一処理は、炎症細胞のＢＡＬＦ中へのリクルートメントを有意に阻害した。このことは、ＩＬ１７Ｃが急性好中球増加症を調節し、肺疾患、例えば、ＣＯＰＤのための治療標的であることを示す。
【０１４５】
したがって、ＩＬ１７Ｃアンタゴニスト、例えば、ＩＬ１７Ｃ抗体が炎症障害および疾患の治療において有効であることが最初に実証された。
【０１４６】
実施例１７
ヒト呼吸組織におけるＩＬ１７Ｃ発現プロファイリング
この試験において、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を介して対照および疾患試料の両方からの異なるヒト呼吸組織タイプ（第三次気管支、第四次気管支および肺動脈）においてＩＬ１７Ｃ発現を計測した。対照試料は、非喫煙および喫煙ドナーに由来した一方、疾患試料は、ＣＯＰＤ患者、急性／慢性気管支炎患者および肺気腫を有する患者に由来した。
【０１４７】
１７．１．  ＲＮＡ精製およびＱＣ
標準的方法を供給業者のプロトコルに従って、または社内適合させて使用してトータルＲＮＡを冷凍組織から単離した。
【０１４８】
適合ＱＣ基準（データ示さず）は、以下のとおりであった：
１８ＳリボソームＲＮＡの存在
以下のとおりｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される制御遺伝子ｍＲＮＡ転写物の最少コピー数：
・β−アクチン（アンプリコン長２９５ｂｐ）＞３，８００の転写物コピー／１００ｎｇのトータルＲＮＡ
・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、アンプリコン長７１ｂｐ）＞１０，０００の転写物コピー／１００ｎｇのトータルＲＮＡ
・ＤＮＡ汚染なし
【０１４９】
１７．２  ＤＮアーゼによるＲＮＡ試料の処理
トータルＲＮＡをＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩにより処理してあらゆる残留ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を除去した。ＲＮＡ試料からのＤＮＡの良好な除去について試験するため、ｑＰＣＲを事前の逆転写なしで行った。増幅シグナルの不存在により、ＲＮＡ試料がＤＮＡを含まないことが確認された。
【０１５０】
１７．３  プライマープローブセット
ｑＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマープローブセットを以下に示す：
ＩＬ１７Ｃアンプリコンサイズ：７２ｂｐ
フォワードプライマー：５’−ＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号１８４）
リバースプライマー：５’−ＣＣＣＧＴＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＡ−３’（配列番号１８５）
プローブ：５’−ＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号１８６）
【０１５１】
プローブを５’末端において６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）により、３’末端において６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）により標識した。
【０１５２】
１７．４  ｃＤＮＡ合成
ＤＮアーゼ処理ＲＮＡを、逆転写緩衝液中でベータ１、ベータ２、ベータ３およびＧＡＰＤＨについてのリバースプライマーとインキュベートし、試料を７２℃に加熱し（二次構造を除去するため）、次いで５５℃に冷却した（プライマーをアニールさせるため）。ＭｕＬＶ逆転写酵素およびヌクレオチドを添加し、反応混合物を３７℃において３０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成を生じさせた。次いで、試料を９０℃に５分間加熱して逆転写酵素を変性させた。
【０１５３】
１７．５  ｑＲＴ−ＰＣＲ
関心対象の遺伝子およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルの同時計測に多重化法を使用するｑＲＴ−ＰＣＲを使用した。それぞれのアッセイ管におけるＧＡＰＤＨの同時計測は、良好な逆転写およびｑＲＴ−ＰＣＲについてのＱＣチェックを提供した。５０ｎｇのトータルＲＮＡに由来するｃＤＮＡを用いて反応を実施した。それぞれの標的およびＧＡＰＤＨについてのフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブをヌクレオチド、緩衝液およびＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（商標）Ｔａｑポリメラーゼとともに反応混合物に添加した。ＰＣＲ条件は：９４℃における１２分間（酵素活性化工程）、次いで９４℃における１５秒間の４０サイクル（変性工程）および６０℃における３０秒間（アニールおよび伸長させるため）であった。感度試験後、ベータ３についての初回ＰＣＲ温度を９７℃に増加させた。
【０１５４】
結果
本明細書に提示されるデータは、炎症促進サイトカインのインターロイキン１７ファミリーのメンバーＩＬ１７Ｃが、ヒト肺において構成的に発現されることを示す。さらに、正常試料と比較してＩＬ１７Ｃの発現レベルの増加が炎症呼吸疾患、例えば、ＣＯＰＤ、気管支炎または肺気腫と診断されたドナーに由来する肺組織試料において観察された（図１１）。
【０１５５】
実施例１８
イミキモド（ＩＭＱ）乾癬様マウスモデル
皮膚におけるＩＬ１７Ｃの炎症促進機能を、乾癬の非感染性皮膚炎マウスモデルにおいて試験し、ここで、局所的ＴＬＲ７−ＴＬＲ８アゴニストのイミキモドが、病原性ＴＨ１７サイトカインに依存性である表皮増殖および白血球浸潤を特徴とする乾癬皮膚病変を誘導する（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｍａｙ  １；１８２（９）：５８３６−４５．）。この特定モデルにおけるＩＬ１７Ｃの役割は、近年記録され（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｃａｒｒｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  １２（１２）：１１５９−６６）、疾患モデルにおけるＩＬ１７Ｃの役割の信憑性のある遺伝学的証明がＩＬ１７Ｃ−／−マウスを用いて提供された。同一の乾癬様モデルを使用して皮膚におけるＩＭＱに対するＩＬ１７Ｃ応答をさらに試験し、ＩＬ１７Ｃ産生細胞を同定した。
【０１５６】
１８．１  試薬
ワセリン（Ｖａｓｅｌｉｎｅ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ、Ｃｏｏｐｅｒ）およびイミキモドクリーム（Ａｌｄａｒａ、５％クリーム、ＭＥＤＡ）を使用した。使用される抗体は、抗マウスＩＬ１７Ａ／Ｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、クローン５０１０４、参照番号ＭＡＢ４２１）および抗マウスＩＬ２３ｐ４０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＣ１７．８、参照番号１６−７１２３−８５）であった。
【０１５７】
１８．２  動物
Ｂａｌｂ／ｃＮマウス（雌、１８〜２０グラム、約１０週齢）をＣＥＲＪまたはＨａｌａｎ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。マウスを１２時間の明／暗サイクル（０７００〜１９００）で管理した。温度を２２℃に維持し、食物および水を不断給餌した。
【０１５８】
１８．３  実験手順
乾癬様応答を誘導するため、剃毛した背中および右耳上の５日間連続（０日目〜４日目）での６２．５ｍｇの１日局所用量のイミキモドクリーム、換言すると、活性化合物の３．１３ｍｇの１日用量であった。対照群は、同一量のワセリンクリームを受けたマウスにより構成した。皮膚炎（紅斑、鱗屑および肥厚）の重症度を毎日観察した。体重を毎日記録した。解剖および示される日において耳および背中皮膚厚をマイクロメータ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を使用して計測した。背中および耳皮膚からの試料を組織学分析および遺伝子発現のために回収した。脾臓および胸腺重量を計測した。
【０１５９】
１８．４  試験設計
マウスを均等な群（ｎ＝１０）にランダムに分割した。ＩＭＱ群は、６２．５ｍｇの１日局所用量のイミキモドクリームを剃毛した背中および耳上で５日間連続（０日目〜４日目）で受け、換言すると活性化合物の３．１３ｍｇの１日用量であった。対照群は、同一量のワセリンを受けた対照マウスにより構成した。抗体をＰＢＳ中で配合し、１０ｍｇ／ｋｇ（２００ｕｇ／マウス）において試験し、実験３日前および開始時（０日目）において腹腔内投与し、したがって、６つの異なる処理群を使用した：
・対照（ワセリン）
・ＩＭＱ（Ａｌｄａｒａ  ５％クリーム）
・ＩＭＱ＋ＭＯＲ０３２０７＿ｈ／ｍ  １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（陰性対照Ａｂ）
・ＩＭＱ＋ＭＯＲ１２７４３＿ｈ／ｍ  １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内
・抗マウスＩＬ１７Ａ／Ｆ  １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内
・抗マウスＩＬ２３ｐ４０  １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内
【０１６０】
１８．５  結果
ビオチン化ＭＯＲ１２７４３抗体およびＩＨＣを使用してＩＬ１７Ｃタンパク質発現を検出した。ＩＬ１７Ｃを対照およびＩＭＱ処理群の両方における真皮のマスト細胞中で発現させた（データ示さず）。ＩＭＱに応答して、ＩＬ１７Ｃ発現は表皮の角化細胞において２日目から４日目まで増加し、より高い発現が３日目ならびに真皮および層の一部のより小さい炎症細胞において観察された。ＭＯＲ０３２０７（アイソタイプ対照）は、条件にかかわらず染色を示さなかった。
【０１６１】
この観察は、ＩＬ１７Ｃ遺伝子発現と一致した。基底レベルは、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆについては検出不能であり、ＩＬ１７ＣおよびＩＬ２３ｐ１９については低かった。ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆは、９６時間後に背中皮膚においてＩＭＱにより最大増加した一方、ＩＬ２３ｐ１９およびＩＬ１７Ｃは最大４８時間でより早期に増加した。ＩＬ１７ＲＡおよびＩＬ１７ＲＥは、ＩＭＱに応答して極めて適度な発現変化で十分に発現された。
【０１６２】
ＩＬ１７Ｃの経路に関連し、またはそれに特異的な中和抗体の効果を、ＩＭＱ誘導性乾癬に対して、表皮厚の組織学的尺度により評価した。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２３ｐ４０抗体は、当分野における共通認識と一致する部分的な予防効果を示した。ＭＯＲ１２４３中和抗体の効果は、有意であり、したがって、ＩＬ１７Ｃ中和がマウス耳皮膚においてＩＭＱにより誘導される表皮厚を有意に予防し得ることを実証した（図１２）。
【０１６３】
実施例１９
初代ヒト表皮角化細胞におけるＩＬ１７Ｃ発現および機能
乾癬におけるＩＬ１７Ｃの機能をさらに探索するため、本発明者らは、初代ヒト表皮角化細胞におけるＩＬ１７Ｃ発現および機能にフォーカスした。
【０１６４】
１９．１  成人正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−Ａｄ）培養物
成人からの冷凍保存された初代正常ヒト表皮角化細胞をＬｏｎｚａから入手し、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｇｏｌｄ（ＫＢＭ−Ｇｏｌｄ（商標））に、ウシ下垂体抽出物、ヒドロコルチゾン、ｈＥＧＦ、エピネフリン、トランスフェリン、インスリンおよびＧＡ−１０００を含む成長因子補給物質の種々のＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（商標）を補給することにより作製されたＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｇｏｌｄ（ＫＧＭ−Ｇｏｌｄ（商標））中で培養した（培地および補給物質は全てＬｏｎｚａ製）。さらに２回の継代で増殖させた細胞を９６ウェルプレート（２５０００個の細胞／ウェル）中でＫＧＭ−Ｇｏｌｄ（商標）中で播種した。一晩培養後、培地を除去し、ヒドロコルチゾンを有さないＫＧＭ−Ｇｏｌｄ（商標）に交換してから種々のサイトカイントリガーを添加した。トータルＲＮＡを種々の時点において抽出し、ＩＬ−１７ＲＥ、ＩＬ１７Ｃおよびβ−デフェンシン−２（ＤＥＦ４Ｂ）の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。回収された細胞上清を、ＥＬＩＳＡを使用して分泌β−デフェンシン−２（ｈＢＤ２）レベルについて分析するまで−２０℃において保持した。組換えヒトＩＬ１７Ｃは、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ製であった。組換えヒトＩＬ−１βおよびＴＮＦαは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製であった。組換えヒトＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２２は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製であった。以下のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手した：ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から精製されたフラジェリン（ＦＬＡ）（ＴＬＲ５アゴニスト）、ｇｕａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（ＴＬＲ７アゴニスト）、ＣＬ０９７（ＴＬＲ７／８アゴニスト）およびＣｐＧオリゴヌクレオチドＯＤＮ２６１１（ＴＬＲ９アゴニスト）。ＴＬＲ４アゴニストのリポ多糖（ＬＰＳ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）血清型０２６：Ｂ６由来）をＳｉｇｍａから入手した。
【０１６５】
１９．２  定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを細胞から抽出し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写させた。ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧを有さないＴａｑｍａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび事前設計されたＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ遺伝子発現プライマー／プローブセット（全てＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して２５μｌのＰＣＲ反応物を調製した。ｑＰＣＲをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実施した。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに正規化し、ΔＣｔ値として表現し、ΔＣｔ＝Ｃｔ遺伝子−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）であり、または２−ΔＣｔ法を使用して得られる特異的遺伝子発現の相対ｍＲＮＡレベルとして表現した。
【０１６６】
１９．３  ｈＢＤ２ＥＬＩＳＡ
以下のプロトコルを開発し、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（カタログ番号９００−Ｋ１７２）から入手した捕捉および検出抗体を使用してｈＢＤ２レベルを計測することを実証した。白色Ｌｕｍｉｔｒａｃ６００  ３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、４０μＬの抗ｈＢＤ２捕捉抗体溶液（ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ）によりコートした。プレートを４℃において一晩インキュベートした後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ））により１回、ＰＢＳにより１回洗浄し、１００ｕＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％スクロース＋０．０５％ＮａＮ３）と室温において４時間インキュベートすることによりブロッキングした。プレートを反転させ、それを吸着紙上にタップすることによりブロッキング緩衝液を除去した。プレートを１００μＬのＰＢＳＴおよび１００μＬのＰＢＳにより洗浄し、３５ｕＬのｈＢＤ２スタンダードまたは試料を添加した。プレートを４℃において一晩インキュベートした後、ＰＢＳＴにより２回、ＰＢＳにより１回洗浄した。続いて、３５ｕＬのビオチン化抗ｈＢＤ２検出抗体溶液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中０．１μｇ／ｍＬ）を添加した。プレートを室温において２時間インキュベートした後、上記のとおり洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で１／２０００に希釈された３５μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＳＮＮ２００４）とインキュベートした。４５分後、プレートを上記のとおり洗浄し、５０μＬ／ウェルのＢＭ  Ｃｈｅｍ  ＥＬＩＳＡ基質（Ｒｏｃｈｅ）と室温において５分間インキュベートした。読取は、Ｌｕｍｉｎｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔルミノメータ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）上で１００ｍ秒の積分時間で実施した。
【０１６７】
１９．４  結果
ＩＬ−１７ＲＡがユビキタスに発現される一方、ＩＬ−１７ＲＥの発現はより限定され、その発現は、上皮起源の細胞上で特に高い。本発明者らは、初代ヒト表皮角化細胞上でのＩＬ−１７ＲＥ  ｍＲＮＡの発現を分析し、それらの細胞においてＩＬ−１７ＲＥの高い発現を観察し、ΔＣＴ（ＩＬ−１７ＲＥ、ＧＡＰＤＨ）は約４〜６であった。ＩＬ−１７ＲＥの発現は、試験された炎症トリガーのいずれによってもモジュレートされなかった（データ示さず）。
【０１６８】
本発明者らは、これらの初回知見をさらに拡張し、Ｔｈ１７細胞により産生され、乾癬において重要な役割を担うことが公知のサイトカインＩＬ−１７Ａによる角化細胞におけるＩＬ１７Ｃ発現の調節も分析した。得られたデータにより、ＩＬ−１およびＴＬＲ５アゴニストのフラジェリンによるＩＬ１７Ｃ  ｍＲＮＡの誘導が確認された（図１３Ａおよび１３Ｂ）。他のＴＬＲ（ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９）のリガンドは、ＩＬ１７Ｃ  ｍＲＮＡを有意に誘導しなかった。カイネティック分析は、ＩＬ−１またはフラジェリンによるＩＬ１７Ｃ  ｍＲＮＡの誘導が急速および一過的であることを示した。興味深いことに、ＩＬ−１７ＡはそのままではＩＬ１７Ｃ  ｍＲＮＡを有意に誘導しなかった一方、それは炎症促進サイトカインＴＮＦまたはＩＬ−１と組み合わせた場合、ＩＬ１７Ｃの発現を経時的に相乗的に増強および保持した（図１３Ａ）。
【０１６９】
角化細胞が高レベルのＩＬ−１７ＲＥを発現するため、それらの細胞におけるＩＬ１７Ｃの機能をさらに試験した。ヒト初代角化細胞はＩＬ１７Ｃ単独に応答しなかったが、ＩＬ１７Ｃは、他の試験された炎症促進遺伝子、すなわち、ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ−２２と相乗的にβ−デフェンシン−２の発現を刺激した。β−デフェンシン−２ｍＲＮＡ発現の相乗刺激は、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの両方において観察された。
【０１７０】
１９．５  まとめ
全体として、データは、角化細胞において炎症促進サイトカインにより産生されるＩＬ１７Ｃが角化細胞における炎症遺伝子発現を増幅および保持する正のフィードフォワードループにおける役割を担い、乾癬皮膚炎症に寄与することを示す。
【０１７１】
実施例２０
ＥＬＩＳＡベース交差競合アッセイ
抗ＩＬ１７Ｃ抗体または別のＩＬ１７Ｃ結合剤の交差競合は、以下の標準的手順に従ってＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより検出することができる。同様に、抗ＩＬ１７Ｃ抗体または別のＩＬ１７Ｃ結合剤の交差競合を検出することができる。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡアッセイの一般原理は、抗ＩＬ１７Ｃ抗体をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコートすることを含む。次いで、過剰量の第２の潜在的交差競合抗ＩＬ１７Ｃ抗体を溶液中で添加する（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートに結合していないもの）。続いて、限定量のＩＬ１７Ｃ−Ｆｃをウェルに次いで添加する。
【０１７３】
ウェル上にコートされた抗体および溶液中の抗体は、限定数のＩＬ１７Ｃ分子の結合について競合する。次いで、プレートを洗浄してコートされた抗体に結合しなかったＩＬ１７Ｃ分子を除去し、第２の溶液相抗体および第２の溶液相抗体とＩＬ１７Ｃとの間で形成されたいかなる複合体も除去する。次いで、結合したＩＬ１７Ｃの量を、適切なＩＬ１７Ｃ検出試薬を使用して計測する。したがって、ＩＬ１７Ｃは、適切なタグ特異的抗体を介して検出することができるタグ、例えば、Ｆｃ、Ｆｌａｇなどと融合させることができる。
【０１７４】
コートされた抗体と交差競合する溶液中の抗体は、第２の溶液相抗体の不存在下でコートされた抗体が結合し得るＩＬ１７Ｃ分子の数に対して、コートされた抗体が結合し得るＩＬ１７Ｃ分子の数の減少を引き起こし得る。
【０１７５】
このアッセイを、Ａｂ−ＸおよびＡｂ−Ｙと称される２つの抗体についてより詳細にさらに以下に記載する。Ａｂ−Ｘが固定化抗体であるように選択される場合、それを、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコートし、その後にプレートを好適なブロッキング溶液によりブロッキングして続いて添加される試薬の非特異的結合を最小化させる。次いで、過剰量のＡｂ−Ｙを、ウェル当たりのＡｂ−ＹのＩＬ１７Ｃ結合部位のモル数がＥＬＩＳＡプレートのコートの間にウェル当たりに使用されるＡｂ−ＸのＩＬ１７Ｃ結合部位のモル数よりも少なくとも１０倍多くなるようにＥＬＩＳＡプレートに添加する。次いで、ＩＬ１７Ｃを、ウェル当たりに添加されるＩＬ１７Ｃのモル数がそれぞれのウェルのコートに使用されるＡｂ−ＸのＩＬ１７Ｃ結合部位のモル数よりも少なくとも２５倍少なくなるように添加する。好適なインキュベーション期間後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＩＬ１７Ｃ検出試薬を添加してコートされた抗ＩＬ１７Ｃ抗体（この場合、Ａｂ−Ｘ）により特異的に結合されたＩＬ１７Ｃ分子の量を計測する。アッセイについてのバックグラウンドシグナルは、コートされた抗体（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相抗体（この場合、Ａｂ−Ｙ）、緩衝液のみ（すなわち、ＩＬ１７Ｃなし）およびＩＬ１７Ｃ検出試薬を有するウェルにおいて得られるシグナルと定義する。アッセイについての陽性対照シグナルは、コートされた抗体（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相抗体緩衝液のみ（すなわち、第２の溶液相抗体なし）、ＩＬ１７Ｃ検出試薬を有するウェルにおいて得られるシグナルと定義する。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍であるような様式で実行することが必要とされる。
【０１７６】
どの抗体をコート抗体として使用し、どの抗体を第２の（競合）抗体として使用するかの選択から生じるいかなるアーティファクト（例えば、ＩＬ１７ＣについてのＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙとの間の有意に異なる親和性）も回避するため、交差ブロッキングアッセイは、２つのフォーマットで実行することが必要とされる：１）フォーマット１は、Ａｂ−ＸがＥＬＩＳＡプレート上にコートされる抗体であり、Ａｂ−Ｙが溶液中の競合抗体である場合であり、２）フォーマット２は、Ａｂ−ＹがＥＬＩＳＡプレート上にコートされる抗体であり、Ａｂ−Ｘが溶液中の競合抗体である場合である。
【図１Ａ】
2014530836.tif 000023
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014530836.tif 000031
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014530836.tif 000034
【図１１】
2014530836.tif 000035
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月6日(2013.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症障害の治療において使用されるＩＬ１７Ｃに特異的な単離抗体または抗体断片において、前記炎症障害は、肺炎症、乾癬、関節リウマチおよび／またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）であり、ＩＬ１７Ｃは、配列番号１８１のアミノ酸からなることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項２】
請求項１に記載の単離抗体または抗体断片において、ＩＬ１７Ｃの、ＩＬ１７ＲＥへの結合を遮断することを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の単離抗体または抗体断片において、Ｋａｂａｔにより定義される６つのＣＤＲを含む抗体または抗体断片と交差競合し、
配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７４０）、または
配列番号３１のＨＣＤＲ１、配列番号３２のＨＣＤＲ２、配列番号３３のＨＣＤＲ３、配列番号３４のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２および配列番号３６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７４３）、または
配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、配列番号４３のＨＣＤＲ３、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２および配列番号４６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７４４）、または
配列番号５１のＨＣＤＲ１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、配列番号５３のＨＣＤＲ３、配列番号５４のＬＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣＤＲ２および配列番号５６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７４５）、または
配列番号６１のＨＣＤＲ１、配列番号６２のＨＣＤＲ２、配列番号６３のＨＣＤＲ３、配列番号６４のＬＣＤＲ１、配列番号６５のＬＣＤＲ２および配列番号６６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７４６）、または
配列番号７１のＨＣＤＲ１、配列番号７２のＨＣＤＲ２、配列番号７３のＨＣＤＲ３、配列番号７４のＬＣＤＲ１、配列番号７５のＬＣＤＲ２および配列番号７６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７５１）、または
配列番号９１のＨＣＤＲ１、配列番号９２のＨＣＤＲ２、配列番号９３のＨＣＤＲ３、配列番号９４のＬＣＤＲ１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７５４）、または
配列番号１４１のＨＣＤＲ１、配列番号１４２のＨＣＤＲ２、配列番号１４３のＨＣＤＲ３、配列番号１４４のＬＣＤＲ１、配列番号１４５のＬＣＤＲ２および配列番号１４６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７５９）、または
配列番号１５１のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５３のＨＣＤＲ３、配列番号１５４のＬＣＤＲ１、配列番号１５５のＬＣＤＲ２および配列番号１５６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７６０）、または
配列番号１６１のＨＣＤＲ１、配列番号１６２のＨＣＤＲ２、配列番号１６３のＨＣＤＲ３、配列番号１６４のＬＣＤＲ１、配列番号１６５のＬＣＤＲ２および配列番号１６６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７６１）、または
配列番号１７１のＨＣＤＲ１、配列番号１７２のＨＣＤＲ２、配列番号１７３のＨＣＤＲ３、配列番号１７４のＬＣＤＲ１、配列番号１７５のＬＣＤＲ２および配列番号１７６のＬＣＤＲ３（ＭＯＲ１２７６２）
を含むことを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の単離抗体または抗体断片において、モノクローナル抗体であることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項５】
請求項４に記載の抗体または抗体断片において、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗体断片であることを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体または抗体断片において、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含むことを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項７】
請求項４に記載の抗体または抗体断片において、ＩｇＧアイソタイプのものであることを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項８】
請求項４に記載の抗体または抗体断片において、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’、ｓｃＦＶからなる群から選択されることを特徴とする抗体または抗体断片。
【国際調査報告】
2014530836.tif 000039
2014530836.tif 000040
2014530836.tif 000041
2014530836.tif 000042