(57)【要約】本発明は、抱合を可能にする条件下で治療用タンパク質と活性化水溶性脂肪酸誘導体とを接触させることを含む、水溶性脂肪酸誘導体と治療用タンパク質とを抱合する材料および方法に関する。一局面において、水溶性リンカーに結合した脂肪酸または脂肪酸エステルを含み、治療用タンパク質と安定に結合した、水溶性脂肪酸誘導体が提供される。別の局面において、この水溶性脂肪酸誘導体は、インビトロまたはインビボでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性リンカーに結合した脂肪酸または脂肪酸エステルを含み、治療用タンパク質と安定に結合した、水溶性脂肪酸誘導体。
【請求項２】
インビトロまたはインビボでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する、請求項１に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項３】
天然の治療用タンパク質と比較して増加した半減期を有する、請求項１〜２のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項４】
前記脂肪酸が飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項５】
前記脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項４に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項６】
前記脂肪酸が分岐鎖脂肪酸である、請求項４に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項７】
前記脂肪酸がＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、およびＣ２４からなる群から選択される鎖長を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項８】
前記脂肪酸がＣ１４、Ｃ１６、およびＣ１８からなる群から選択される鎖長を有する、請求項７に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項９】
前記脂肪酸が、末端カルボキシル基およびω基からなる群から選択される前記脂肪酸上の基で前記水溶性リンカーに結合している、請求項１〜８のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１０】
前記脂肪酸が前記ω基で前記水溶性リンカーと結合している、請求項９に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１１】
前記ω基が、ヒドロキシル、アミノ、チオ、およびカルボキシルからなる群から選択される、請求項１０に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１２】
前記脂肪酸が１６−ヒドロキシヘキサデカン酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１３】
前記脂肪酸エステルが、メチルエステルおよびエチルエステルからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１４】
前記脂肪酸エステルが１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルである、請求項１３に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１５】
前記水溶性リンカーが、水溶性ポリマーと、前記治療用タンパク質に結合した少なくとも１つの官能基とを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１６】
前記官能基が、スルホ基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アミド基、マレイミド基、アミノオキシ基、およびヒドラジド基からなる群から選択される、請求項１５に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１７】
前記官能基がアミノオキシ基である、請求項１６に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１８】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項１９】
前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、請求項１８に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２０】
前記水溶性ポリマーが、Ｏ３、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１３、およびＯ１５からなる群から選択される鎖長を含む、請求項１５〜１７および１９のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２１】
前記水溶性リンカーが、
ａ）式：
【化４０】
2014501262.tif 000078
の３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミン、
ｂ）式：
【化４１】
2014501262.tif 000079
の３，６，９−トリアオキサウンデカン（ｔｒｉａｏｘａｕｎｄｅｃａｎｅ）−１，１１−ジオキシアミン、
ｃ）式：
【化４２】
2014501262.tif 000080
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン、および
ｄ）式：
【化４３】
2014501262.tif 000081
の３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサン−１，２３−ジオキシアミンからなる群から選択される、請求項１７に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２２】
前記水溶性リンカーが、式：
【化４４】
2014501262.tif 000082
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミンである、請求項２１に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２３】
前記水溶性リンカーが、式：
【化４５】
2014501262.tif 000083
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンである、請求項２１に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２４】
前記脂肪酸誘導体が、オキシム連結により前記治療用タンパク質と安定に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２５】
前記オキシム連結が、前記水溶性リンカー上のオキシム基と前記治療用タンパク質上の酸化炭水化物のアルデヒド基との間に形成される、請求項２４に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２６】
前記水溶性リンカー上のマレイミド基が前記治療用タンパク質上の遊離スルフヒドリル基に結合することにより、前記脂肪酸誘導体が前記治療用タンパク質と安定に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２７】
前記水溶性リンカー上のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが前記治療用タンパク質上の遊離アミノ基に結合することにより、前記脂肪酸誘導体が前記治療用タンパク質と安定に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２８】
前記脂肪酸誘導体が、
ａ）式：
【化４６】
2014501262.tif 000084
の１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシイミノ）−ヘキサデカン酸ナトリウム塩、および
ｂ）１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサデカン酸メチルエステル
【化４７】
2014501262.tif 000085
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項２９】
前記治療用タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−オメガ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２アルファ、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮成長因子、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）、エピレギュリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子１１、線維芽細胞成長因子１２、線維芽細胞成長因子１３、線維芽細胞成長因子１６、線維芽細胞成長因子１７、線維芽細胞成長因子１９、線維芽細胞成長因子２０、線維芽細胞成長因子２１、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、肝細胞癌由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在型形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮアーゼ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、胎児性タンパク質、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、表１のタンパク質、またはそれらの生物活性断片、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項３０】
前記治療用タンパク質がＦＶＩＩａである、請求項２９に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項３１】
前記治療用タンパク質がＦＶＩＩＩである、請求項２９に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項３２】
前記治療用タンパク質がＦＩＸである、請求項２９に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項３３】
ａ）脂肪酸上のω−ヒドロキシ基を酸化させて、前記脂肪酸上にアルデヒド基を生成することと、
ｂ）活性アミノオキシ基を含む水溶性リンカーを前記アルデヒド基とカップリングさせて、安定なオキシム連結を形成することと、
を含み、前記脂肪酸誘導体が水溶性である、請求項１に記載の脂肪酸誘導体を調製する方法。
【請求項３４】
前記ω−ヒドロキシ基が、デス・マーチン・ペルヨージナン試薬、Ｔｅｍｐｏ試薬、塩化オキサリル／ＤＭＳＯ、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（ＴＰＡＰ）、および６価クロム試薬（コリンズ試薬、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）、および重クロム酸ピリジニウム）からなる群から選択される酸化試薬により酸化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記酸化試薬がデス・マーチン・ペルヨージナンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記脂肪酸が飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記脂肪酸が分岐鎖脂肪酸である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記脂肪酸がＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、およびＣ２４からなる群から選択される鎖長を含む、請求項３３〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記脂肪酸がＣ１４、Ｃ１６、およびＣ１８からなる群から選択される鎖長を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記脂肪酸が１６−ヒドロキシヘキサデカン酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記水溶性リンカーが水溶性ポリマーおよび少なくとも１つのアミノオキシ基を含む、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記水溶性ポリマーが、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１３、およびＯ１５からなる群から選択される鎖長を含む、請求項４２または４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記水溶性リンカーが、
ａ）式：
【化４８】
2014501262.tif 000086
の３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミン、
ｂ）式：
【化４９】
2014501262.tif 000087
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン、
ｃ）式：
【化５０】
2014501262.tif 000088
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン、および
ｄ）式：
【化５１】
2014501262.tif 000089
の３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサン−１，２３−ジオキシアミンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記水溶性リンカーが、式：
【化５２】
2014501262.tif 000090
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミンである、請求項４６に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項４８】
前記水溶性リンカーが、式：
【化５３】
2014501262.tif 000091
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンである、請求項４６に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項４９】
ａ）脂肪酸上のカルボキシル基をエステル化して、前記脂肪酸上にエステルを生成することと、
ｂ）脂肪酸上のω−ヒドロキシ基を活性化して、ステップａ）の脂肪酸上にメシル基を生成することと、
ｃ）ステップｂ）のメシル基を置換することによって、活性アミノオキシ基を含む水溶性リンカーをカップリングさせ、それにより安定なオキシイミン−メチレン結合を形成することと、
を含み、前記脂肪酸誘導体が水溶性である、請求項１に記載の脂肪酸誘導体を調製する方法。
【請求項５０】
前記カルボキシル基が、塩化アセチル、酸存在下でのメタノール、酸存在下でのエタノール、ジアゾメタン、およびヨウ化メチルからなる群から選択されるエステル化剤によりエステル化される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記エステル化剤が塩化アセチルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ω−ヒドロキシ基が、塩化メシル、塩化トシル、および塩化ノシルからなる群から選択される活性化剤により活性化される、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記活性化剤が塩化メシルである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記脂肪酸が飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記脂肪酸が分岐鎖脂肪酸である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記脂肪酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、およびＣ２４からなる群から選択される鎖長を含む、請求項４９〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記脂肪酸が、Ｃ１４、Ｃ１６、およびＣ１８からなる群から選択される鎖長を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記脂肪酸が１６−ヒドロキシヘキサデカン酸である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記水溶性リンカーが水溶性ポリマーおよび少なくとも１つのアミノオキシ基を含む、請求項４９〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記水溶性ポリマーが、Ｏ３、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１３、およびＯ１５からなる群から選択される鎖長を含む、請求項６０または６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記水溶性リンカーが、
ａ）式：
【化５４】
2014501262.tif 000092
の３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミン、
ｂ）式：
【化５５】
2014501262.tif 000093
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン、
ｃ）式：
【化５６】
2014501262.tif 000094
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン、および
ｄ）式：
【化５７】
2014501262.tif 000095
の３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサン−１，２３−ジオキシアミンからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記水溶性リンカー、式：
【化５８】
2014501262.tif 000096
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミンである、請求項６４に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項６６】
前記水溶性リンカーが、式：
【化５９】
2014501262.tif 000097
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンである、請求項６４に記載の脂肪酸誘導体。
【請求項６７】
抱合を可能にする条件下で、前記治療用タンパク質上の酸化炭水化物部分と請求項１に記載の脂肪酸誘導体とを接触させることを含む、治療用複合タンパク質を調製する方法であって、
前記炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝剤とのインキュベーションによって酸化され、
前記酸化炭水化物部分と前記脂肪酸誘導体上の活性アミノオキシ基との間にオキシム連結が形成され、
前記オキシム連結形成が、アニリン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンザミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒により触媒される、方法。
【請求項６８】
前記治療用タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−オメガ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２アルファ、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮成長因子、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）、エピレギュリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子１１、線維芽細胞成長因子１２、線維芽細胞成長因子１３、線維芽細胞成長因子１６、線維芽細胞成長因子１７、線維芽細胞成長因子１９、線維芽細胞成長因子２０、線維芽細胞成長因子２１、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、肝細胞癌由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在型形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮアーゼ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、胎児性タンパク質、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、表１のタンパク質、またはそれらの生物活性断片、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項６７〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記治療用タンパク質がＦＶＩＩａである、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記治療用タンパク質がＦＶＩＩＩである、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記治療用タンパク質がＦＩＸである、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、請求項６７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記求核触媒がｍ−トルイジンである、請求項６７〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記治療用複合タンパク質を精製することをさらに含む、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記脂肪酸誘導体が請求項３３〜４７のいずれか１項に記載の方法により調製される、請求項６７〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記脂肪酸誘導体が請求項４９〜６６のいずれか１項に記載の方法により調製される、請求項６７〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
ａ）脂肪酸上のカルボキシル基をエステル化して、前記脂肪酸上にエステルを生成することと、
ｂ）活性マレイミド基を含む水溶性リンカーを遊離スルフヒドリル（ＳＨ）基とカップリングさせることによって、安定なチオエーテル結合を形成することと、
を含み、前記脂肪酸誘導体が水溶性である、請求項１に記載の脂肪酸誘導体を調製する方法。
【請求項７９】
ａ）脂肪酸上のカルボキシル基をエステル化して、脂肪酸エステルを生成することと、
ｂ）ステップａ）によって生じた前記脂肪酸をアジド試薬と反応させることによって、対応する脂肪酸アジドを生成することと、
ｃ）ステップｂ）の脂肪酸アジドを水素化して、対応する脂肪酸アミンを生成することと、
ｄ）活性ＮＨＳ基を含む水溶性リンカーを遊離アミン基とカップリングさせることによって、安定な結合を形成することと、
を含み、前記脂肪酸誘導体が水溶性である、請求項１に記載の脂肪酸誘導体を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性脂肪酸誘導体をタンパク質に抱合させるための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質に抱合させて患者への投与後の治療用複合タンパク質の半減期を増加させるための様々な分子および／または化合物が記載されている（非特許文献１、非特許文献２、および非特許文献３）。
【０００３】
脂肪酸（ＦＡ）を治療用タンパク質に抱合させて、長時間作用型誘導体を形成することが可能である。このタンパク質またはペプチドの半減期延長の原理は、ＦＡがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；アルブミン結合プローブとも称される）に結合することができるという事実に基づいている。ＦＡが血流中のヒト血清アルブミンと結合すると、新生児Ｆｃ受容体を介してアルブミンと一緒に再循環するため、治療用タンパク質の半減期が著しく延長され得る。ＦＡおよびその誘導体（例えば、対応するメチルエステル）は、同様のアルブミン結合特性を示している（Ｓｐｅｃｔｏｒ  ＡＡ，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  １９７５；１６：１６５−７９）。
【０００４】
この長時間作用原理の１つの顕著な例は、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社製のインスリンデテミル（Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標））である。インスリンデテミルでは、ＦＡのカルボキシル基がインスリンタンパク質のリジン残基のε−アミノ基と共有結合している（例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３を参照）。他の研究グループが類似の手法を記載している（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ２００５；１６：９１３−２０、およびＳａｓｓｏｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０；１４２：２１４−２０）。例えば、これらのグループは、タンパク質のアミノ酸にカップリングさせるための活性ＮＨＳエステルを含む放出可能なＦＭＯＣ系を記載している。しかしながら、この概念では、ＦＡがω位の官能基を介してタンパク質に連結することよりカルボキシル基を未変化にする点が異なる。したがって、ヒト血清アルブミンと結合するが、生理学的条件下でＦＭＯＣ系がゆっくりと加水分解するにつれ時間とともに解離する、長期作用型プロドラッグを調製することができる（Ｓａｓｓｏｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０；１４２：２１４−２０）。
【０００５】
脂肪酸の他に、水溶性ポリマーと治療用タンパク質との間に共有結合を形成することによる複合体の調製は、種々の化学的方法によって実施することができる。ポリペプチド薬のＰＥＧ化は、循環血中のポリペプチド薬を保護し、それらの薬力学的および薬物動態的プロファイルを改善する（Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００３；２：２１４−２１）。このＰＥＧ化プロセスは、エチレングリコール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の繰り返し単位をポリペプチド薬に結合させる。ＰＥＧ分子の流体力学的容積は大きく（球状タンパク質のサイズの５〜１０倍）、高水溶性であり、水和されており、非毒性であって、非免疫原性であり、身体から迅速に除去される。分子のＰＥＧ化は、薬物の酵素分解耐性の向上、インビボでの半減期の増加、投与頻度の減少、免疫原性の減少、物理的安定性および熱安定性の向上、溶解度の向上、液体安定性の向上、および凝集の低減をもたらし得る。１９９０年代初期に最初のＰＥＧ化薬物がＦＤＡに承認された。それ以来、ＦＤＡは、経口用、注射用、および局所投与のためのいくつかのＰＥＧ化薬物を承認している。
【０００６】
コロミン酸（ＣＡ）とも称されるポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然由来の多糖である。これはα（２→８）ケトシド連結を有するＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端に隣接ジオール基を含有する。これは負電荷を持つ、ヒトの身体の天然の構成成分である。これは大量の細菌から、規定の物理的特徴を有するように、容易に産生することができる（特許文献４）。細菌によって産生されたＰＳＡは、ヒトの体内で産生されたＰＳＡと化学的および免疫学的に同一であるため、細菌性ＰＳＡは、タンパク質とカップリングしたときでさえ非免疫原性である。一部のポリマーとは異なり、ＰＳＡ酸は生物分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼへのコロミン酸の共有結合は、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を増大することが明らかになっている。ポリシアル化アスパラギナーゼと非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル化が酵素の半減期を増加させたことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２００１；２１７：２１５−２４）。
【０００７】
ＰＥＧ−誘導体とペプチドまたはタンパク質とのカップリングは、Ｒｏｂｅｒｔｓらにより検討されている（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００２；５４：４５９−７６）。水溶性ポリマーを治療的タンパク質とカップリングするための１つの手法は、タンパク質の炭水化物部分を介したポリマーの抱合である。タンパク質中の炭水化物の隣接ヒドロキシル（ＯＨ）基は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で容易に酸化され、活性アルデヒド基を形成することができる（Ｒｏｔｈｆｕｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９６３；２３８：１４０２−１０、ｖａｎ  Ｌｅｎｔｅｎ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９７１；２４６：１８８９−９４）。その後、ポリマーは、例えば活性ヒドラジド基を含有する試薬の使用によって、炭水化物のアルデヒド基とカップリングすることができる（Ｗｉｌｃｈｅｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂａｙｅｒ  ＥＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８７；１３８：４２９−４２）。より最近の技術は、アルデヒドと反応してオキシム連結を形成するアミノオキシ基を含有する試薬の使用である（特許文献５、特許文献６）。
【０００８】
治療用タンパク質への水溶性ポリマーの抱合を説明するさらなる例は、フォンヴィレブランド因子中の炭水化物部分の酸化、およびヒドラジド化学を使用するＰＥＧへのその後のカップリングを教示する特許文献７、ｒＦＶＩＩＩの酸化、ならびにヒドラジド化学を使用するＰＥＧおよび他の水溶性ポリマー（例えば、ＰＳＡ、ＨＥＳ、デキストラン）へのその後のカップリングを教示する特許文献８、異なる凝固因子（例えば、ｒＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩａ）の酸化、ならびにオキシム連結を形成することによってアミノオキシ化学を使用する、例えばＰＥＧへのその後のカップリングを教示する特許文献６、およびＦＩＸの酸化、ならびにヒドラジド化学を使用するＰＥＧへのその後のカップリングを教示する特許文献９に説明されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，８６６，５３８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０１１，００７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８６９，９３０号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８４６，９５１号明細書
【特許文献５】国際公開第９６／４０６６２号
【特許文献６】国際公開第２００８／０２５８５６号
【特許文献７】国際公開第０６／０７１８０１号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００９／００７６２３７号明細書
【特許文献９】米国特許第５，６２１，０３９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ＦＭ  ａｎｄ  Ｍｅｒｏ  Ａ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２００８；２２：３１５〜２９
【非特許文献２】Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２００５；３００：１２５〜３０
【非特許文献３】Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２００７；Ｖｏｌ  １３：１０５〜１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のタンパク質抱合のための材料および方法にかかわらず、例えば安定なタンパク質複合体の操作および調製を可能にする、新しい材料および方法が望まれている。脂肪酸はＨＳＡに結合するという利点を提供し得るが、脂肪酸は、水溶液環境で操作がしばしば困難であり、時間とともにそのタンパク質結合パートナーから放出または除去され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ポリマーおよび水溶性脂肪酸誘導体をタンパク質に抱合させるための材料および方法を提供するが、これは、この抱合反応が求核触媒に触媒されたとき、タンパク質の薬力学的および／または薬物動態的特性を改善し、同時に種々の試薬に付随するコストおよび受容患者への健康リスクを最小限に抑える。本発明は、水溶液中で水溶性脂肪酸誘導体をタンパク質に抱合させ、それによって脂肪酸誘導体が時間とともに放出されない安定なタンパク質複合体を生成するための材料および方法を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、水溶性リンカーと結合した脂肪酸または脂肪酸エステルを含み、治療用タンパク質と安定に結合した、水溶性脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、脂肪酸誘導体は、インビトロまたはインビボでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する。また別の実施形態において、脂肪酸誘導体−治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比較して、増加した半減期を有する。さらに別の実施形態において、前述の脂肪酸誘導体は飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸を含む。関連実施形態において、脂肪酸は飽和脂肪酸である。さらに別の実施形態において、脂肪酸は分岐鎖脂肪酸である。
【００１４】
脂肪酸誘導体中の様々な長さの脂肪酸が想定されている。一実施形態において、脂肪酸が、奇数炭素数を有する合成脂肪酸を含む、鎖長Ｃ１０〜Ｃ２４を含む前述の脂肪酸誘導体が提供される。一実施形態において、脂肪酸がＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２０、Ｃ２２、およびＣ２４からなる群から選択される鎖長を含む、前述の脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１４、Ｃ１６、およびＣ１８からなる群から選択される鎖長を有する。また別の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１３、Ｃ１５、およびＣ１７からなる群から選択される鎖長を有する。
【００１５】
また別の実施形態において、脂肪酸が、末端カルボキシル基およびω基からなる群から選択される脂肪酸上の基で水溶性リンカーに結合している、前述の脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、脂肪酸は、ω基で水溶性リンカーに結合している。また別の実施形態において、ω基は、ヒドロキシル、アミノ、チオ、およびカルボキシルからなる群から選択される。
【００１６】
本発明の一実施形態において、脂肪酸が１６−ヒドロキシヘキサデカン酸である、前述の脂肪酸誘導体が提供される。
【００１７】
別の実施形態において、脂肪酸エステルがメチルエステルおよびエチルエステルからなる群から選択される、脂肪酸誘導体が提供される。一実施形態において、脂肪酸エステルは１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルである。
【００１８】
様々な水溶性リンカーが本発明において想定されている。一実施形態において、水溶性リンカーが、水溶性ポリマーと、治療用タンパク質に結合した少なくとも１つの官能基とを含む、前述の脂肪酸誘導体が提供される。一実施形態において、治療用タンパク質に結合した官能基は、負電荷または正電荷を付与する能力を有し、それによってリンカーを水溶性にする。また別の実施形態において、官能基は、スルホ基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アミド基、マレイミド基、アミノオキシ基、およびヒドラジド基からなる群から選択される。一実施形態において、官能基はアミノオキシ基である。
【００１９】
多数の水溶性ポリマーが本発明において想定されている。一実施形態において、リンカーの必須部分である水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、前述の脂肪酸誘導体が提供される。また別の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧである。また、様々な長さの水溶性ポリマーも本明細書において想定されている。一実施形態において、水溶性ポリマーが、Ｏ３、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１３、およびＯ１５からなる群から選択される鎖長を含む、脂肪酸誘導体が提供される。
【００２０】
一実施形態において、水溶性リンカーが、
３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミン
【化１】
2014501262.tif 000002
３，６，９−トリアオキサウンデカン（ｔｒｉａｏｘａｕｎｄｅｃａｎｅ）−１，１１−ジオキシアミン
【化２】
2014501262.tif 000003
３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン；
【化３】
2014501262.tif 000004
３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサン−１，２３−ジオキシアミン
【化４】
2014501262.tif 000005
からなる群から選択される、脂肪酸誘導体が提供される。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、脂肪酸誘導体が、オキシム連結により治療用タンパク質と安定に結合している、脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、オキシム連結は、水溶性リンカー上のオキシム基と治療用タンパク質上の酸化炭水化物のアルデヒド基との間に形成される。
【００２２】
本発明のまた別の実施形態において、水溶性リンカー上のマレイミド基が治療用タンパク質上の遊離スルフヒドリル基に結合することにより、脂肪酸誘導体が治療用タンパク質と安定に結合している、脂肪酸誘導体が提供される。また別の実施形態において、水溶性リンカー上のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが治療用タンパク質上の遊離アミノ基に結合することにより、脂肪酸誘導体が治療用タンパク質と安定に結合している。
【００２３】
本発明の一実施形態において、
ａ）式：
【化５】
2014501262.tif 000006
の１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシイミノ）−ヘキサデカン酸ナトリウム塩、および
ｂ）１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサデカン酸メチルエステル
【化６】
2014501262.tif 000007
からなる群から選択される、脂肪酸誘導体が提供される。
【００２４】
様々な治療用タンパク質が本発明において想定されている。一実施形態において、治療用タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−オメガ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２アルファ、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮成長因子、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）、エピレギュリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子１１、線維芽細胞成長因子１２、線維芽細胞成長因子１３、線維芽細胞成長因子１６、線維芽細胞成長因子１７、線維芽細胞成長因子１９、線維芽細胞成長因子２０、線維芽細胞成長因子２１、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、肝細胞癌由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在型形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮアーゼ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、胎児性タンパク質、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、表１のタンパク質、またはそれらの生物活性断片、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、前述の脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質はＦＶＩＩａである。さらに別の実施形態において、治療用タンパク質はＦＶＩＩＩである。また別の実施形態において、治療用タンパク質はＦＩＸである。
【００２５】
また、脂肪酸誘導体を調製する方法も本明細書において想定されている。一実施形態において、ａ）脂肪酸上のω−ヒドロキシ基を酸化させて、この脂肪酸上にアルデヒド基を生成することと、ｂ）活性アミノオキシ基を含む水溶性リンカーをこのアルデヒド基とカップリングさせて、安定なオキシム連結を形成することと、を含み、脂肪酸誘導体が水溶性である、本明細書に記載されている脂肪酸誘導体を調製する方法が提供される。一実施形態において、ω−ヒドロキシ基が、デス・マーチン・ペルヨージナン試薬、Ｔｅｍｐｏ試薬、塩化オキサリル／ＤＭＳＯによるスワーン酸化、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（ＴＰＡＰ）、６価クロム試薬、例えばコリンズ試薬、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）、および重クロム酸ピリジニウムからなる群から選択される酸化試薬により酸化される、前述の方法が提供される。また別の実施形態において、酸化試薬はデス・マーチン・ペルヨージナンである。
【００２６】
別の実施形態において、脂肪酸が飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、前述の方法が提供される。また別の実施形態において、脂肪酸は飽和脂肪酸である。
【００２７】
本発明のまた別の実施形態において、脂肪酸が分岐鎖脂肪酸である、前述の方法が提供される。
【００２８】
別の実施形態によると、脂肪酸が、奇数炭素数を有する合成脂肪酸を含む、鎖長Ｃ１０〜Ｃ２４を含む、前述の方法も提供される。一実施形態において、脂肪酸がＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２０、Ｃ２２、およびＣ２４からなる群から選択される鎖長を有する、前述の脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１４、Ｃ１６、およびＣ１８からなる群から選択される鎖長を有する。また別の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１３、Ｃ１５、およびＣ１７からなる群から選択される鎖長を有する。
【００２９】
また別の実施形態において、水溶性リンカーが、水溶性ポリマーおよび少なくとも１つのアミノオキシ基を含む、前述の方法が提供される。
【００３０】
前述の方法で使用するための多数の水溶性ポリマーが、本明細書において想定されている。一実施形態において、水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、前述の方法が提供される。一実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧである。
【００３１】
また、様々な長さの水溶性ポリマーも想定されている。一実施形態において、水溶性ポリマーが、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１３、およびＯ１５からなる群から選択される鎖長を含む、前述の方法が提供される。
【００３２】
また別の実施形態において、水溶性リンカーが、
ａ）式：
【化７】
2014501262.tif 000008
の３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミン、
ｂ）式：
【化８】
2014501262.tif 000009
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン、
ｃ）式：
【化９】
2014501262.tif 000010
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン、および
ｄ）式：
【化１０】
2014501262.tif 000011
の３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサン−１，２３−ジオキシアミンからなる群から選択される、前述の方法が提供される。
【００３３】
さらに別の実施形態において、水溶性リンカーが、式：
【化１１】
2014501262.tif 000012
の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミンである、前述の方法が提供される。
【００３４】
また別の実施形態において、水溶性リンカーが、式：
【化１２】
2014501262.tif 000013
の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンである、前述の方法が提供される。
【００３５】
脂肪酸誘導体を作成するためのまた他の方法も本明細書において想定されている。一実施形態において、ａ）脂肪酸上のカルボキシル基をエステル化して、この脂肪酸上にエステルを生成することと、ｂ）ステップａ）の脂肪酸上のメシル基の導入によって、脂肪酸上のω−ヒドロキシ基を活性化することと、ｃ）ステップｂ）のメシル基を置換することによって、活性アミノオキシ基を含む水溶性リンカーをカップリングさせ、それにより安定なオキシアミン−メチレン結合を形成することと、を含み、この脂肪酸誘導体が水溶性である、前述の脂肪酸誘導体を調製するための方法が提供される。
【００３６】
一実施形態において、カルボキシル基が、塩化アセチル、酸存在下でのメタノール、酸存在下でのエタノール、ジアゾメタン、およびヨウ化メチルからなる群から選択されるエステル化剤によりエステル化される、前述の方法が提供される。別の実施形態において、エステル化剤は塩化アセチルである。
【００３７】
また別の実施形態において、ω−ヒドロキシ基が、塩化メシル、塩化トシル、および塩化ノシルからなる群から選択される活性化剤により活性化される、前述の方法が提供される。一実施形態において、活性化剤は塩化メシルである。
【００３８】
様々な脂肪酸が前述の方法における使用に想定されている。一実施形態において、脂肪酸が飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、前述の方法が提供される。別の実施形態において、脂肪酸は飽和脂肪酸である。さらに別の実施形態において、脂肪酸は分岐鎖脂肪酸である。
【００３９】
また別の実施形態において、脂肪酸が、奇数炭素数を有する合成脂肪酸を含む、鎖長Ｃ１０〜Ｃ２４を含む、前述の方法が提供される。一実施形態において、脂肪酸がＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２０、Ｃ２２、およびＣ２４からなる群から選択される鎖長を有する、前述の脂肪酸誘導体が提供される。別の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１４、Ｃ１６、およびＣ１８からなる群から選択される鎖長を有する。また別の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１３、Ｃ１５、およびＣ１７からなる群から選択される鎖長を有する。
【００４０】
また、様々な水溶性ポリマーが、前述の方法における使用に想定されている。一実施形態において、水溶性リンカーが水溶性ポリマーおよび少なくとも１つのアミノオキシ基を含む、前述の方法が提供される。別の実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される。別の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧである。
【００４１】
本発明のまた別の実施形態において、水溶性ポリマーがＯ３、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１３、およびＯ１５からなる群から選択される鎖長を含む、前述の方法が提供される。別の実施形態において、水溶性リンカーは、［００５０］からなる群から選択される。
【００４２】
複合タンパク質を調製する方法も本発明において想定されている。一実施形態において、抱合を可能にする条件下で、治療用タンパク質上の酸化炭水化物部分と前述の脂肪酸誘導体（または本明細書に記載の水溶性ポリマー）とを接触させることを含む、治療用複合タンパク質を調製するための方法であって、前記炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝剤とのインキュベーションによって酸化され、前記酸化炭水化物部分と前記脂肪酸誘導体上の活性アミノオキシ基との間にオキシム連結が形成され、前記オキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンザミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒により触媒される、方法が提供される。
【００４３】
別の実施形態において、治療用タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−オメガ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２アルファ、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮成長因子、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）、エピレギュリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子１１、線維芽細胞成長因子１２、線維芽細胞成長因子１３、線維芽細胞成長因子１６、線維芽細胞成長因子１７、線維芽細胞成長因子１９、線維芽細胞成長因子２０、線維芽細胞成長因子２１、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、肝細胞癌由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在型形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮアーゼ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、胎児性タンパク質、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、表１のタンパク質、またはそれらの生物活性断片、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、前述の方法が提供される。
【００４４】
別の実施形態において、治療用タンパク質がＦＶＩＩａである、前述の方法が提供される。またさらに別の実施形態において、治療用タンパク質がＦＶＩＩＩである、前述の方法が提供される。さらに別の実施形態において、治療用タンパク質がＦＩＸである、前述の方法が提供される。
【００４５】
また別の実施形態において、酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、前述の方法が提供される。別の実施形態において、求核触媒がｍ−トルイジンである、前述の方法が提供される。
【００４６】
さらに別の実施形態において、治療用複合タンパク質を精製することをさらに含む、前述の方法が提供される。
【００４７】
また別の実施形態において、脂肪酸誘導体が本明細書に記載の方法で調製される、前述の方法が提供される。
【００４８】
脂肪酸誘導体を調製するまた他の方法も本発明において想定されている。一実施形態において、ａ）脂肪酸上のカルボキシル基をエステル化して、脂肪酸上にエステルを生成することと、ｂ）活性マレイミド基を含む水溶性リンカーを遊離スルフヒドリル（ＳＨ）基とカップリングさせることによって、安定なチオエーテル結合を形成することと、を含み、脂肪酸誘導体が水溶性である、前述の脂肪酸誘導体を調製する方法が提供される。
【００４９】
また別の実施形態において、ａ）脂肪酸上のカルボキシル基をエステル化して、脂肪酸エステルを生成することと、ｂ）ステップａ）によって生じた脂肪酸をアジド試薬と反応させることによって、対応する脂肪酸アジドを生成することと、ｃ）ステップｂ）の脂肪酸アジドを水素化して、対応する脂肪酸アミンを生成することと、ｄ）活性ＮＨＳ基を含む水溶性リンカーを遊離アミン基とカップリングさせることによって、安定な結合を形成することと、を含み、脂肪酸誘導体が水溶性である、前述の脂肪酸誘導体を調製する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】水溶性リンカーである３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミンの合成を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
治療用タンパク質の薬理学的および免疫学的特性は、化学修飾、ならびに高分子化合物、例えば本発明による脂肪酸および脂肪酸誘導体との抱合によって改善可能である。
【００５２】
本明細書に記載の水溶性脂肪酸誘導体の添加は、治療用タンパク質、例えば、血液凝固タンパク質である第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、またはＡＤＡＭＴＳ  １３プロテアーゼ、ならびに他の既知のタンパク質または生物学的活性／治療活性を有するそれらの断片の特性を改善するための１つの手法である。
治療用タンパク質
【００５３】
本発明の特定の実施形態において、前述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、以下の治療用タンパク質により例示される：酵素、抗原、抗体、受容体、血液凝固タンパク質、成長因子、ホルモン、およびリガンド。特定の実施形態において、治療用タンパク質は、血液凝固タンパク質、例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、またはＡＤＡＭＴＳ  １３プロテアーゼである。
【００５４】
特定の実施形態において、治療用タンパク質は、免疫グロブリン、サイトカイン、例えばＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−オメガ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２アルファ、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン、例えばＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチドＡＮＧＰＴＬ１〜７、ビトロネクチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮成長因子、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）、エピレギュリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子１１、線維芽細胞成長因子１２、線維芽細胞成長因子１３、線維芽細胞成長因子１６、線維芽細胞成長因子１７、線維芽細胞成長因子１９、線維芽細胞成長因子２０、線維芽細胞成長因子２１、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、肝細胞癌由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２を含むＴＮＦ、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在型形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮成長因子、およびキメラタンパク質、ならびに生物学的活性または免疫学的活性を有するそれらの断片である。
【００５５】
特定の実施形態において、治療用タンパク質は、アルファ−、ベータ−、およびガンマ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチンおよびリシン、腫瘍壊死因子および関連対立遺伝子、可溶型の腫瘍壊死因子受容体、インターロイキン受容体および可溶型のインターロイキン受容体、成長因子、例えば組織成長因子、例えばＴＧＦαまたはＴＧＦβおよび上皮成長因子、ホルモン、ソマトメジン、色素ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ならびに免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮアーゼ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、副腎皮質ステロイド、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、胎児性タンパク質、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ＤＮアーゼ、インテグリン、トロンビン、造血成長因子、レプチン、グリコシダーゼ、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、およびそれらの断片、または上述のタンパク質もしくはそれらの断片を含む任意の融合タンパク質である。前述のタンパク質に加え、以下の表１は、本発明により想定される治療用タンパク質を提示する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【００５６】
本明細書において提供される治療用タンパク質は、排他的なものとみなすべきではない。むしろ、本明細書において提供する開示から明らかなように、本発明の方法は、本発明により水溶性脂肪酸誘導体の結合が望まれるいかなるタンパク質にも適用可能である。例えば、治療用タンパク質は、参照により全体が本明細書に援用される、米国特許第２００７／００２６４８５号に記載されている。
血液凝固タンパク質
【００５７】
一態様において、本発明の出発物質は、ヒト血漿に由来してもよく、または米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，７３３，８７３号、米国特許第５，１９８，３４９号、米国特許第５，２５０，４２１号、米国特許第５，９１９，７６６号、および欧州特許第３０６  ９６８号の特許に記載のように、組換え操作技術によって作製してもよい、血液凝固タンパク質である。
【００５８】
治療用ポリペプチド、例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ  １３プロテアーゼを含む血液凝固タンパク質は、タンパク質分解酵素により迅速に分解され、抗体により中和される。これによりそれらの半減期および循環時間が減少し、それによってそれらの治療有効性を制限する。これらの凝固タンパク質の所望の治療効果または予防効果を達成または維持するためには、比較的高用量および頻回投与が必要とされる。その結果、適切な用量調節の実現が困難であり、頻回静脈内投与が必要なことで、患者の生活様式が制限される。
【００５９】
本明細書に記載のように、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ  １３プロテアーゼを含むがこれらに限定されない血液凝固タンパク質が、本発明により想定されている。本明細書で使用する「血液凝固タンパク質」という用語は、その特定の天然血液凝固タンパク質と関連する生物学的活性を示す、任意の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ  １３プロテアーゼを指す。
【００６０】
血液凝固カスケードは、内因系、外因系、および共通経路の３つの異なる部分に分けられる（Ｓｃｈｅｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；１１：２７２−７）。このカスケードは、一連のセリンプロテアーゼ酵素およびタンパク質補因子を含む。必要な場合には、不活性酵素原前駆体が活性型に変換され、その結果カスケード中の次の酵素が変換される。
【００６１】
内因系経路は、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、および第ＸＩＩ凝固因子を必要とする。内因系経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、および第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が負電荷を持つ表面に暴露されたときに生じる。また、血小板から分泌されるカルシウムイオンおよびリン脂質も必要とされる。
【００６２】
外因系経路は、血管の血管内腔が損傷を受けたときに開始される。膜糖タンパク質組織因子が露出して、循環している第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）および既存の少量のその活性型ＦＶＩＩａと結合する。この結合は、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの完全な変換を促進し、続いて、カルシウムおよびリン脂質の存在下、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）から第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）および第Ｘ因子（ＦＸ）から第Ｘａ因子（ＦＸａ）への変換を促進する。ＦＶＩＩａの組織因子との結合は、ＦＶＩＩの基質（ＦＩＸおよびＦＸ）結合部位をより接近させ、また立体構造変化を誘導することによって、タンパク質分解活性を強化し、これはＦＶＩＩａの酵素活性を強化する。
【００６３】
このＦＸの活性化は、２つの経路の共通点である。リン脂質およびカルシウムとともに、第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換し（プロトロンビナーゼ複合体）、これは次いでフィブリノゲンを切断してフィブリンモノマーを形成する。このモノマーは重合してフィブリン鎖を形成する。第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）は、これらの鎖を互いに共有結合させて強固な網目を形成する。
【００６４】
また、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの変換は、トロンビン、ＦＩＸａ、ＦＸａ、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、および第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）を含む複数のプロテアーゼによっても触媒される。このカスケードの初期段階を阻害するために、組織因子経路インヒビターは、ＦＶＩＩａ／組織因子／ＦＸａ複合生成物を標的とする。
第ＶＩＩａ因子
【００６５】
ＦＶＩＩ（安定因子またはプロコンベルチンとも称される）は、止血および凝固における中枢的役割を有する、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００２；３：２８７−９９）。
【００６６】
ＦＶＩＩは肝臓で合成され、４８ｋＤの一本鎖糖タンパク質として分泌される。ＦＶＩＩは、全てのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質と類似するタンパク質ドメイン構造を共有し、これは、タンパク質と脂質膜の相互作用に関与する、９〜１２残基を有するアミノ末端γカルボキシシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン、カルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイン）、および組織因子との相互作用を媒介する、カルシウムイオン結合部位を含有する２つの上皮成長因子様ドメインからなる。γグルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端部分内のＧｌａ残基のカルボキシル化を触媒する。このカルボキシラーゼは、その作用について還元型のビタミンＫに依存し、それはエポキシド型に酸化される。エポキシド型のビタミンＫを還元型に変換し戻すためには、ビタミンＫエポキシド還元酵素が必要とされる。
【００６７】
ＦＶＩＩの大部分は、酵素原の形態で血漿中を循環し、この形態の活性化は、アルギニン１５２とイソロイシン１５３との間のペプチド結合の切断をもたらす。その結果生じた活性ＦＶＩＩａは、単一ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１３５〜Ｃｙｓ２６２）を介して連結した、ＮＨ２由来の軽鎖（２０ｋＤ）およびＣＯＯＨ末端由来の重鎖（３０ｋＤ）からなる。軽鎖は膜結合Ｇｌａドメインを含有し、重鎖は触媒ドメインを含有する。
【００６８】
遺伝因子および環境因子によって決定されるＦＶＩＩの血漿濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである（Ｐｉｎｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：３４２３−８）。ＦＶＩＩ遺伝子型が異なると、平均ＦＶＩＩレベルに数倍の差が生じる可能性がある。血漿ＦＶＩＩレベルは、健康女性の妊娠中に上昇し、また年齢とともに増加し、女性および高トリグリセリド血症患者ではより高い。ＦＶＩＩは、全ての凝固促進因子の中で最短の半減期（３〜６時間）を有する。健康な個人のＦＶＩＩａの平均血漿濃度は３．６ｎｇ／ｍＬであり、ＦＶＩＩａの循環半減期は、他の凝固因子と比較して比較的長い（２．５時間）。
【００６９】
遺伝性ＦＶＩＩ欠損症は稀な常染色体劣性出血性疾患であり、有病率は一般集団において５００，０００人当たり１例と推定される（Ａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４；２２４８−５６）。阻害物質による後天的ＦＶＩＩ欠損症もまた、非常に稀である。セファロスポリン、ペニシリン、および経口抗凝固剤などの薬物に関連して発症する欠損症の例も報告されている。さらに、後天的ＦＶＩＩ欠損症は、自然に、または骨髄腫、敗血症、再生不良性貧血などの他の症状に付随して、インターロイキン−２および抗胸腺細胞グロブリン療法によって発症することが報告されている。
【００７０】
参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列には、例えば、ゲノム配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２９３３、ｃＤＮＡについてはＭ１３２３２（Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １９８６；８３：２４１２−６）、ポリペプチド配列についてはＰ０８７０９が含まれる（参考文献は全体が本明細書に援用される）。ＦＶＩＩの種々の多型が記載されているが、例えば、Ｓａｂａｔｅｒ−Ｌｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；１１８：７４１−５１）を参照されたい（参考文献は全体が本明細書に援用される）。
第ＩＸ因子
【００７１】
ＦＩＸは、カルシウムイオン、リン脂質、およびＦＶＩＩＩａの存在下でＦＸをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因系経路に関与するビタミンＫ依存性血漿タンパク質である。ＦＩＸの主要な触媒能力は、セリンプロテアーゼとしての触媒能力であり、ＦＸ内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特異性を有する。ＦＸＩａによってＦＩＸの活性化が生じ、これはＦＩＸから活性化ペプチドを切除し、１つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される２つの鎖を含む活性ＦＩＸ分子を生成する。ＦＩＸの欠損は、Ｘ連鎖血友病Ｂの原因である。
【００７２】
血友病ＡおよびＢは、それぞれＦＶＩＩＩおよびＦＩＸポリペプチドの欠損を特徴とする遺伝性疾患である。この欠損の根本的な原因は、しばしばＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ遺伝子の突然変異の結果であり、これら双方はＸ染色体上に位置する。血友病に対する従来の療法は、しばしば、健常者からのプール血漿または半精製された凝固タンパク質の静脈内投与を伴う。これらの製剤は、感染性プリオン、ＨＩＶ、パルボウイルス、Ａ型肝炎、およびＣ型肝炎などの病原体またはウイルスが混入する可能性がある。したがって、ヒト血清の使用を必要としない治療薬に対する緊急の必要性が存在する。
【００７３】
ＦＩＸ活性の減少レベルは、血友病Ｂの重症度に正比例する。血友病Ｂの現在の治療は、血漿由来または組換えＦＩＸ（ＦＩＸ置換または補充治療もしくは療法と称される）による、不足したタンパク質の補充からなる。
【００７４】
ＦＩＸのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０、および米国特許第６，５３１，２９８号において見出すことができる。
第ＶＩＩＩ因子
【００７５】
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に非共有結合する。止血中、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離し、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で活性化の速度を高めることによって、活性第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）媒介のＦＸ活性化のための補因子として機能する。
【００７６】
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する、約２７０〜３３０ｋＤの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製した場合（例えば、「血漿由来」または「血漿性」）、ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成される。軽鎖の分子質量は、８０ｋＤであり、Ｂドメイン内のタンパク質分解により、重鎖は９０〜２２０ｋＤの範囲内である。
【００７７】
ＦＶＩＩＩはまた、出血性障害における治療用途のための組換えタンパク質として合成される。治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を判断するために、種々のインビトロアッセイが考案されている。これらのアッセイは、内在性ＦＶＩＩＩのインビボ効果を模倣する。ＦＶＩＩＩのインビトロトロンビン処理は、インビトロアッセイによって測定されるその凝固促進活性の迅速な増加およびその後の減少をもたらす。この活性化および不活性化は、重鎖および軽鎖の両方における特定の制限タンパク質分解と同時に起こり、これはＦＶＩＩＩ中の様々な結合エピトープの有用性を変更して、例えば、ＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させて、リン脂質表面に結合させるか、または特定のモノクローナル抗体に対する結合能力を変更する。
【００７８】
ＦＶＩＩＩの欠如および機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友病Ａと関連する。血友病Ａの管理に最適な治療は、血漿由来またはｒＦＶＩＩＩ濃縮物による補充療法である。ＦＶＩＩＩレベル１％未満の重度の血友病Ａ患者は、一般に、次の服用までのＦＶＩＩＩを１％超に維持することを目標とする予防療法を受ける。循環血中の種々のＦＶＩＩＩ製剤の平均半減期を考慮すると、通常はＦＶＩＩＩを週２〜３回投与することによって、この結果を達成することができる。
【００７９】
参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列には、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００４５１（ＦＡ８＿ＨＵＭＡＮ）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３２６−３０（１９８４）、Ｖｅｈａｒ  ＧＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３３７−４２（１９８４）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＡＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２００３：２９；１１−２９（２００２）がある。
フォンヴィレブランド因子
【００８０】
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、サイズが約５００〜２０，０００ｋＤの範囲の一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって連結した２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットからなる。ＶＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への初期の血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を示す。内皮細胞は大きいポリマー形態のＶＷＦを分泌し、低分子重量を有するＶＷＦの形態（低分子重量ＶＷＦ）はタンパク質分解的切断から生じると考えられている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体中に貯蔵され、刺激時に遊離する。
【００８１】
ＶＷＦは、大部分が繰り返しドメインからなるプレプロＶＷＦとして、内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの切断時に、プロＶＷＦは、そのＣ末端領域のジスルフィド結合によって二量体化する。この二量体は、多量体化のためのプロトマーとして機能し、これは遊離末端間のジスルフィド結合によって制御される。多量体へのアセンブリ後、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続く（Ｌｅｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４（１９９１），２５７−２６１）。
【００８２】
ＶＷＦのクローン化ｃＤＮＡから予測される一次翻訳産物は、２８１３残基の前駆体ポリペプチド（プレプロＶＷＦ）である。プレプロＶＷＦは、２２個のアミノ酸シグナルペプチドおよび７４１個のアミノ酸プロペプチドからなり、成熟ＶＷＦは２０５０個のアミノ酸を含む（Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｚ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｒｅ，Ｊ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，３０８−３１６（１９９３））。
【００８３】
ＶＷＦの欠損は、事実上顕著な出血表現型を特徴とするフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の病因である。３型ＶＷＤは、ＶＷＦが完全に欠損した最も重度な形態であり、１型ＶＷＤは、ＶＷＦの量的減少に関連し、その表現型は非常に軽度なこともある。２型ＶＷＤは、ＶＷＦの質的欠損に関連し、３型ＶＷＤと同じくらい重度のこともある。２型ＶＷＤには多くのサブ形態があり、高分子量多量体の損失または減少に関連するものもある。２ａ型フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ−２Ａ）は、中間体および大きい多量体の両方の損失を特徴とする。ＶＷＤ−２Ｂは、最も高分子重量の多量体の損失を特徴とする。ＶＷＦに関連する他の疾患および障害は、当分野において既知である。
【００８４】
プレプロＶＷＦのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５５２およびＮＰ＿０００５４３で入手可能である。
【００８５】
本発明による他の血液凝固タンパク質は、当分野において、例えば、Ｍａｎｎ  ＫＧ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９９；８２：１６５−７４に記載されている。
Ａ．ポリペプチド
【００８６】
一態様において、本発明の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書で使用する治療用タンパク質という用語は、その治療用タンパク質に関連する生物学的活性を示すあらゆる治療用タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は全長タンパク質である。
【００８７】
想定される治療用タンパク質分子は、全長タンパク質、全長タンパク質の前駆体、全長タンパク質の生物学的に活性なサブユニットまたは断片、ならびに治療用タンパク質のこれらの形態のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体および変異体を含む。したがって、治療用タンパク質は、（１）参照核酸によってコードされたポリペプチドまたは本明細書に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたり、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％を上回る、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、および／または（２）本明細書に記載の参照アミノ酸配列、その免疫原性断片、および／またはその保存的に改変された変異体を含む免疫原に対して生じた抗体、例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に特異的に結合するものを含む。
【００８８】
本発明によると、「治療用組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって得られたあらゆる治療用タンパク質を含む。特定の実施形態において、この用語は、本明細書に記載のタンパク質を包含する。
【００８９】
本明細書で使用する「治療用内因性タンパク質」という用語は、治療を受けることが意図される哺乳動物に由来する治療用タンパク質を含む。この用語は、前記哺乳動物中に存在する導入遺伝子または他の任意の外来ＤＮＡから転写された治療用タンパク質も含む。本明細書で使用する「治療用外因性タンパク質］という用語は、治療を受けることが意図される哺乳動物に由来しない血液凝固タンパク質を含む。
【００９０】
本明細書で使用する「血漿由来の血液凝固タンパク質」または「血漿性」とは、凝固経路に関与する特性を有する、哺乳動物から採取した血液中に認められる全ての形態のタンパク質を含む。
【００９１】
本明細書で使用する「生物学的に活性な誘導体」または「生物学的に活性な変異体」とは、前記分子の実質的に同じ機能的および／または生物学的特性、例えば結合特性、および／または同じ構造基盤、例えばペプチド骨格もしくは基本ポリマー単位を有する分子のあらゆる誘導体または変異体を含む。
【００９２】
「類似体」、「変異体」または「誘導体」とは、場合によって程度は異なるが、天然に存在する分子と構造が実質的に類似し、同じ生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド変異体とは、参照ポリペプチドと実質的に類似する構造を共有し、同じ生物学的活性を有するポリペプチドを指す。変異体または類似体は、その類似体が由来する天然に存在するポリペプチドと比較して、（ｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（例えば、断片）における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端（典型的には「付加」または「融合」）および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（典型的には「挿入」）における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加、あるいは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列中の１つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、を含む１つまたは複数の突然変異に基づき、アミノ酸配列の組成が異なる。例として、「誘導体」は、（例えば化学的に）改変された参照ポリペプチドと同じまたは実質的に類似する構造を共有するポリペプチドを指す。
【００９３】
種々の実施形態において、類似体、変異体、または誘導体は、例えば、タンパク質類似体、変異体、または誘導体に別の分子を抱合することによって、本発明による複合タンパク質を形成できるように設計される。
【００９４】
変異体または類似体ポリペプチドには、本発明の治療用タンパク質アミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸残基が付加された挿入変異体が含まれる。挿入は、タンパク質のいずれかまたは両方の末端に位置してもよく、および／または治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けてもよい。いずれかまたは両方の末端に付加残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質がある。一態様において、血液凝固タンパク質分子は、特にその分子が大腸菌などの細菌細胞で組換え発現される場合に、Ｎ−末端Ｍｅｔを場合により含有する。
【００９５】
欠失変異体では、本明細書に記載される治療用タンパク質ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。欠失は、治療用タンパク質ポリペプチドの一方または両方の末端において、および／または治療用タンパク質アミノ酸配列内の１つまたは複数の残基の除去によって実施することができる。したがって、欠失変異体は、治療用タンパク質ポリペプチド配列の断片を含む。
【００９６】
置換変異体では、治療用タンパク質ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換される。一態様において、置換は本質的に保存的であり、この種の保存的置換は当分野で周知である。あるいは、本発明は非保存的である置換も包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、下記に示す。
【表２】
2014501262.tif 000049
【００９７】
代替として、例示的な保存的置換を下記に示す。
【表３】
2014501262.tif 000050
Ｂ．ポリヌクレオチド
【００９８】
本発明の治療用タンパク質をコードする核酸には、例えば、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、多型変異体、対立遺伝子、合成変異体および天然に存在する変異体があるが、これらに限定されない。
【００９９】
また、本発明の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される参照アミノ酸配列、およびその保存的に改変された変異体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするもの、（２）本明細書に記載される参照核酸配列に対して、少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約５００個、約１０００個、またはそれ以上のヌクレオチド（最大で、成熟タンパク質の全長配列である１２１８個のヌクレオチド）の領域にわたり、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を上回る、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するものも含まれるが、これらに限定されない。例示的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件には、４２℃、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（２０ｍＭ  Ｎａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８）でのハイブリダイゼーション、および５５℃の１×ＳＳＣで３０分間の洗浄が含まれる。ハイブリダイズする配列の長さおよびＧＣヌクレオチド含量に基づいて、これらの例示的な条件を変化させてもよいことは理解される。当分野で標準的な方法は、適切なハイブリダイゼーション条件の決定に適している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）§§９．４７−９．５１を参照されたい。
【０１００】
「天然に存在する」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類、例えばヒト；齧歯類、例えばラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば、異種であり、野生型配列もしくはその変異体をコードするもの、または非天然のもの）であってもよい。
Ｃ．治療用タンパク質の作製
【０１０１】
治療用タンパク質の作製には、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの作製、（ｉｉ）例えば、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる、原核細胞および真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）前記形質転換細胞の培養、（ｉｖ）治療用タンパク質の例えば構成的な、または誘導時の発現、および（ｖ）例えば培養培地からの、または形質転換細胞の採取による、精製された治療用タンパク質を得るための血液凝固タンパク質の単離、のための当分野で既知のあらゆる方法を含む。
【０１０２】
別の態様では、治療用タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を生成することを特徴とする好適な原核または真核宿主系での発現によって作製される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２などの哺乳動物細胞である。
【０１０３】
多種多様なベクターが治療用タンパク質の調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現用のベクターの例には、限定するものではないが、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＢＡＤなどのプラスミドがあり、原核発現ベクターに使用されるプロモーターには、限定するものではないが、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤのうちの１つまたは複数がある。真核発現用のベクターの例には、（ｉ）酵母での発現の場合、限定するものではないがＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用した、限定するものではないがｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞での発現の場合、限定するものではないがＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用した、限定するものではないがｐＭＴ、ＰＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現の場合、限定するものではないがＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチンなどのプロモーターを使用した、限定するものではないがｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および一態様では、限定するものではないがワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクター、が含まれる。
【０１０４】
本発明の種々の実施形態において、治療用タンパク質は、水溶性脂肪酸誘導体または水溶性リンカーを治療用タンパク質上の１つまたは複数の炭水化物に抱合させることによって改変される。したがって、一実施形態において、治療用タンパク質は、糖タンパク質であり、グリコシル化が可能な宿主細胞から精製される（すなわち、このタンパク質は、インビボでグリコシル化されたあと、糖タンパク質として精製される）。種々の実施形態において、治療用タンパク質は糖タンパク質であるか、または糖タンパク質でなく、宿主細胞からの精製後にインビトロでグリコシル化される。インビトログリコシル化方法は、当分野で周知である（例えば、Ｍｅｙｎｉａｌ−Ｓａｌｌｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｅｓ  Ｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６，４６：１−１４；／Ｓｏｌa  ＲＪ  ａｎｄ  Ｇｒｉｅｂｅｎｏｗ  Ｋ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０１０，２４：９−２１を参照されたい）。当然ながら、当業者は、当分野で既知の手法によって、（１）治療用タンパク質を精製し、（２）インビトロでの場合により部位特異的なグリコシル化を可能にするために、治療用タンパク質を改変し（例えば、アミノ酸欠失／挿入／置換）、（３）インビトロで改変タンパク質をグリコシル化することができるであろう。
Ｄ．投与
【０１０５】
一実施形態において、本発明の治療用複合タンパク質は、静脈注射、筋肉注射、または腹腔内注射などの注射によって投与してもよい。
【０１０６】
本発明の治療用複合タンパク質を含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様において、この組成物は１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に許容可能な」という用語は、下記に記載のように当分野で周知の経路を用いて投与したときに、安定であり、凝集および切断産物などのタンパク質分解を抑制し、さらにアレルギー性または他の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容可能な担体」には、上記で開示した物質を含む、あらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。
【０１０７】
本明細書で使用する「有効量」とは、疾患もしくは障害を治療する、または疾患もしくは障害の症状を改善するのに好適な用量を含む。一実施形態において、「有効量」は、本明細書に記載される出血性障害を有する哺乳動物を治療するのに好適な用量を含む。
【０１０８】
組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧によって、経膣的に、直腸に、または頭蓋内注射によって投与してもよい。本明細書において使用する非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射または注入手法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射による投与、および／または特定の部位における外科的移植も想定されている。一般に、組成物は、発熱因子、およびレシピエントに害を与え得る他の不純物を本質的に含まない。
【０１０９】
組成物の単回または複数回投与は、治療する医師によって選択された用量レベルおよびパターンで実施することができる。疾患の予防または治療のための適切な投薬量は、上述のような治療する疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物の投与が予防目的なのか治療目的なのか、治療歴、患者の病歴および薬物に対する反応、ならびに担当医の裁量により異なることになる。
【０１１０】
また、本発明は、有効量の本明細書に記載される治療用複合タンパク質を含む薬学的組成物にも関する。この薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝剤、または賦形剤をさらに含んでもよい。この薬学的組成物は、上記で定義した出血性障害の治療に使用することができる。本発明の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥剤であってもよい。薬学的組成物の溶液に任意の好適な凍結乾燥プロセスを行ってもよい。さらなる態様として、本発明は、対象への投与のためのその使用を容易にするような形でパッケージ化された本発明の組成物を含むキットを含む。一実施形態において、かかるキットは、密封ボトルまたは容器などの包装容器に詰められた、本明細書に記載の化合物または組成物（例えば、治療用複合タンパク質を含む組成物）を含み、本方法を実施する際のその化合物または組成物の使用について説明したラベルが包装容器に貼られるか、またはパッケージ内に含まれる。一実施形態において、キットは、治療用複合タンパク質を含む組成物を有する第１の包装容器と、第１の包装容器中の組成物用の生理学的に許容可能な再構成液を有する第２の包装容器とを含む。一態様において、化合物または組成物は、単位剤形でパッケージ化される。キットは、特定の投与経路による組成物の投与に好適な装置をさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の使用を説明したラベルを含む。
脂肪酸、脂肪酸誘導体、およびタンパク質−脂肪酸誘導体複合体
【０１１１】
一態様において、本明細書において提供される治療用タンパク質誘導体（すなわち、治療用複合タンパク質）分子は、水溶性脂肪酸誘導体と結合している。本明細書で使用する「水溶性脂肪酸誘導体」は、本明細書に記載の水溶性リンカー（例えば、アミノオキシリンカー）に結合した脂肪酸（すなわち、カルボン酸）を含む。かかる脂肪酸誘導体は、本発明によると、安定であり（すなわち、タンパク質から放出されない）、水溶性であり、ヒト血清アルブミンに結合可能である。
Ａ．脂肪酸
【０１１２】
脂肪酸（すなわち、１つまたは複数のＦＡ）は、本発明によりヒト血清アルブミンに結合可能な、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、分岐鎖脂肪酸（Ｍｕｋｈｅｒｉｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２００３；４２：３５９−７６）、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
例として、脂肪酸は以下の一般構造を有する：
飽和ＦＡ：一般構造
【化１３】
2014501262.tif 000051
飽和ＦＡメチルエステル：一般構造
【化１４】
2014501262.tif 000052
飽和ＦＡエチルエステル：一般構造
【化１５】
2014501262.tif 000053
【０１１４】
また、脂肪酸は、本発明の種々の実施形態によると、種々の代替的構造（例えば、メチルエステルまたはエチルエステル）、または他の構造、例えばω位に末端基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、およびカルボキシル基）を含むものなどを含む。
【０１１５】
一実施形態において、脂肪酸は天然に存在する脂肪酸である。種々の実施形態において、脂肪酸は、短鎖脂肪酸（例えば、炭素６個未満）、中鎖脂肪酸（例えば、炭素６〜１２個）、長鎖脂肪酸（例えば、炭素１２を上回る）、または超長鎖脂肪酸（例えば、炭素２２を上回る）である。別の実施形態において、脂肪酸は４〜２８個の炭素を有する。一実施形態において、脂肪酸はシス配置である。また別の実施形態において、脂肪酸はトランス配置である。
【０１１６】
一実施形態において、脂肪酸は、炭素１２〜２０個の長さの飽和脂肪酸である。かかる脂肪酸は、当分野で既知であり、例えば、Ｃ１２（ドデカン酸、ラウリン酸）、Ｃ１４（テトラデカン酸、ミリスチン酸）、Ｃ１６（ヘキサデカン酸、パルミチン酸）、Ｃ１８（オクタデカン酸、ステアリン酸）、およびＣ２０（エイコサン酸、アラキジン酸）がある。不飽和脂肪酸の例は、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノレン酸（Ｃ１８：２）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４）である。これらの脂肪酸のほとんどは、市販されており、また様々な化学的方法で調製することができる（Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｋｎｏｔｈｅ  Ｇ  ａｎｄ  Ｄｅｒｋｓｅｎ  ＪＴＢ，ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９，ＩＳＢＮ  １−８９３９９７−００−６）。
【０１１７】
本発明の種々の実施形態において、脂肪酸は、４個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個、３２個、３４個、３６個、３８個、４０個、４２個、４４個、４６個、４８個、または５０個の炭素を含む。
Ｂ．脂肪酸誘導体
【０１１８】
本発明は、ヒト血清アルブミンに結合可能な新規の活性化脂肪酸誘導体（ＦＡ誘導体）群の調製を提供する。このＦＡ誘導体は水溶性スペーサーまたはリンカーを含み、これは水溶液としてのＦＡ誘導体の取扱いおよび操作を可能にする（すなわち、本発明による脂肪酸誘導体は、それが由来する対応する脂肪酸とは異なり、水溶性である）。一実施形態において、ＦＡ誘導体は活性アミノオキシ基を含み、これは安定なオキシム連結を形成する、ＦＡ誘導体と治療用タンパク質上の酸化炭水化物部分（主にＮ−グリカン）とのカップリングを可能にする。本明細書で使用する「安定な」連結とは、「非解離性」または「非加水分解性」である共有結合が形成されることを意味する。
【０１１９】
炭水化物を介する化学修飾は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、およびＦＶＩＩａなどの凝固タンパク質が高い残効性を有する複合体を形成するための好ましい選択肢であろう。
【０１２０】
例えば、限定するものではないが、以下の方策は、活性アミノオキシ基を含む水溶性ＦＡ誘導体を調製するための本発明による一実施形態を表す。
【０１２１】
方策１：
【０１２２】
ＦＡ誘導体（例えば、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸）のω−ヒドロキシ基をデス・マーチン・ペルヨージナンで酸化させて、アルデヒド基を生成する。次のステップでは、水溶性ＰＥＧ鎖を含むジアミノオキシリンカー（例えば、３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）をこのアルデヒド基とカップリングさせて、安定なオキシム連結を形成する。以下の概略図は、方策１による一例を表す。
【０１２３】
ステップ１：１６−ヒドロキシステアリン酸をデス・マーチン試薬で選択的に酸化して、１６−オキソステアリン酸を得た。分離剤としてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーでこの粗生成物精製した。
【化１６】
2014501262.tif 000054
【０１２４】
ステップ２：１６−オキソステアリン酸ナトリウム塩の１６−オキソ部分を３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミンと反応させた。分離剤としてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーでこの粗生成物精製した。
【化１７】
2014501262.tif 000055
【０１２５】
代替的に、別の実施形態では、活性アミノオキシ基を含む水溶性ＦＡ誘導体を調製するために以下の方策が採用される。
【０１２６】
方策２：
【０１２７】
ω−ヒドロキシ脂肪酸（例えば、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸）のカルボキシル基は、塩化アセチルによりエステル化される。このメチルエステル誘導体のω−ヒドロキシ基は、塩化メシルによって活性化されて、より優れた脱離基が導入される。次に、このメシル基が水溶性ＰＥＧ鎖を含むジアミノオキシリンカー（例えば、３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）と反応して、安定なアミノオキシ−メチレン結合を形成する。場合により、このメチルエステルをアルカリ溶液中で加水分解して、遊離カルボキシル基を生成する。以下の概略図は、方策２による一例を表す。
【０１２８】
ステップ１：メチル化試薬として塩化アセチルを使用してメチルエステルを形成することによって、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸のカルボン酸部分を保護した。
【化１８】
2014501262.tif 000056
【０１２９】
ステップ２：水酸基をより優れた脱離基であるメシルで置換することにより、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルの１６−ヒドロキシ部分を活性化した。
【化１９】
2014501262.tif 000057
ステップ３：１６−メチルスルホニルヘキサデカン酸メチルエステルの１６−メシル部分を二官能性３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミンの１つのアミノオキシ部分で置換した。分離剤としてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーでこの粗生成物精製する。
【化２０】
2014501262.tif 000058
【０１３０】
さらなる方策も本発明により想定されている。本発明は、例えば、酸化炭水化物残基のアルデヒド基とのカップリングのためのアミノオキシ化学に制限されない。本明細書に記載のように、治療用タンパク質のアルデヒド基とのカップリングのためのヒドラジド、アミノ基とのカップリングのためのＮＨＳエステル、遊離ＳＨ基とのカップリングのためのマレイミドを含むがこれらに限定されない他の化学の使用も想定されている。
【０１３１】
例として、上述のように調製した脂肪酸メチルエステルを市販のＭＡＬ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ｍａｌ−ＰＥＧ（１２）−ＣＯＯＨ／ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と本明細書に記載のように反応させる。また別の例として、反応性アミノ基を有する脂肪酸エステルを市販のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＨＳ−ｄＰＥＧ（４）−ＮＨＳ／ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と本明細書に記載のように反応させる。
【０１３２】
水溶性リンカーには、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）が含まれるが、これに限定されない。このリンカーは、その水溶性を増加させる１つまたは複数の官能基を含む、いかなる化学構造からなってもよい。これらの官能基は、負電荷または正電荷を生成し、それによりリンカーを水溶性にする能力を有してもよい。一実施形態において、この官能基は、スルホ基またはカルボキシル基を含むが、これらに限定されない。さらに、リンカーをより水溶性にする、いかなる極性官能基を使用してもよい。この例には、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、マレイミド基、アミノオキシ基、およびヒドラジド基、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよびスルホＮＨＳエステルがある。
【０１３３】
種々の実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
一実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧである、本発明の種々の実施形態において、水溶性ポリマーは、およそ３〜２５個の酸素の鎖長を含む。例えば、本発明による種々の実施形態において、水溶性ポリマーは、３個、５個、７個、９個、１１個、１３個、１５個、１７個、１９個、２１個、２３個、または２５個の酸素を含む。
Ｃ．タンパク質−脂肪酸誘導体複合体
【０１３５】
アミノオキシリンカー系（すなわち、水溶性脂肪酸誘導体がアミノオキシリンカーを含む系）は、本発明により想定されている。例えば、本発明の一実施形態において、オキシム基を形成する、ヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体のアルデヒド（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上のもの）との反応が、タンパク質複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質（例えば、本発明による治療用タンパク質）をまず過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）などの酸化剤で酸化する（Ｒｏｔｈｆｕｓ  ＪＡ  ｅｔ  Ｓｍｉｔｈ  ＥＬ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９６３，２３８，１４０２−１０、およびＶａｎ  Ｌｅｎｔｅｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ  Ｇ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９７１，２４６，１８８９−９４）。糖タンパク質の過ヨウ素酸塩酸化は、隣接ジオールを過ヨウ素酸で酸化して活性アルデヒド基を形成する、１９２８年に記載された古典的なマラプラード反応に基づく（Ｍａｌａｐｒａｄｅ  Ｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ  Ｓｏｃ  Ｃｈｉｍ  Ｆｒａｎｃｅ，１９２８，４３，６８３−９６）。かかる酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、酢酸マンガン（ＭｎＯ（Ａｃ）３）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＯＡｃ）２）、酢酸タリウム（ＴｌＯＡｃ）、硫酸セリウム（Ｃｅ（ＳＯ４）２）（米国特許第４，３６７，３０９号）、または過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）（Ｍａｒｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９７，１１９，１２６６１−２）である。「酸化剤」とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な弱い酸化化合物を意味する。
【０１３６】
第２のステップは、オキシム連結を形成するための、アミノオキシ基を含有するポリマー（例えば、脂肪酸誘導体）の酸化炭水化物部分とのカップリングである。本発明の一実施形態において、このステップは、触媒量の求核触媒アニリンまたはアニリン誘導体の存在下で実施してもよい（Ｄｉｒｋｓｅｎ  Ａ  ｅｔ  Ｄａｗｓｏｎ  ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８；Ｚｅｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシム結合を劇的に加速し、非常に低濃度の試薬の使用を可能にする。本発明の別の実施形態において、オキシム連結は、ＮａＣＮＢＨ３による還元によって安定化され、アルコキシアミン結合を形成する。さらなる触媒を下記に記載する。別の実施形態では、このステップをｍ−トルイジンの存在下で実施する。
【０１３７】
本発明の一実施形態において、水溶性リンカー（例えば、脂肪酸誘導体）をタンパク質に抱合させる反応ステップは別個に順次実施する（すなわち、出発物質（例えば、治療用タンパク質、水溶性リンカーなど）、試薬（例えば、酸化剤、アニリンなど）、および反応生成物（例えば、治療用タンパク質上の酸化炭水化物、活性化アミノオキシ水溶性リンカーなど）が、個々の反応ステップ間で別々である）。別の実施形態において、本発明による抱合反応を完了するために必要な出発物質および試薬は、単一の容器中で実施される。一実施形態では、天然タンパク質をアミノオキシ−ポリマー試薬と混合する。その後、酸化試薬を添加し、抱合反応を実施する。
【０１３８】
アミノオキシ技術に関するさらなる情報は、以下の参考文献に記載され、これらはそれぞれ全体が本明細書に援用される：欧州特許第１６８１３０３Ａ１号（ヒドロキシアルキルデンプン化エリスロポエチン）、国際公開第２００５／０１４０２４号（オキシム結合基により連結したポリマーとタンパク質の複合体）、国際公開第９６／４０６６２号（アミノオキシ含有リンカー化合物および複合体におけるそれらの用途）、国際公開第２００８／０２５８５６号（改変タンパク質）、Ｐｅｒｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８，５４，１２２６９−７８、Ｋｕｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂ  Ｊ  ａｎｄ  Ｐｏｚｓｇａｙ  Ｖ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０，６８８７−９０、Ｌｅｅｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６，２４（６），７１６−２９、およびＨｅｒｅｄｉａ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００７，４０（１４），４７７２−９。
【０１３９】
水溶性リンカーのカップリングは、タンパク質との直接カップリングによって（例えば、タンパク質上の遊離スルフヒドリル基または遊離アミノ基を介して）、または本明細書に記載のリンカー分子を介して行うことができる。抱合は、一態様では、安定な結合の形成下で、水溶性リンカーの治療用タンパク質との直接カップリング（または、リンカー系を介するカップリング）によって実施される。
【０１４０】
したがって、本発明の種々の実施形態において、本明細書に記載の脂肪酸誘導体は、治療用タンパク質への抱合を可能にするよう設計される。例えば、脂肪酸誘導体は、本明細書に記載のように、種々の末端反応性基を含むように設計される。
【０１４１】
特定の態様では、様々な化学的方法のいずれかを用いて、治療用タンパク質を水溶性脂肪酸誘導体に抱合させる（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ  ２００２；５４：４５９−７６）。例えば、一実施形態において、治療用タンパク質は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを用いて、脂肪酸誘導体をタンパク質の遊離アミノ基に抱合させることによって改質される。別の実施形態において、マレイミド化学を用いて、水溶性脂肪酸誘導体を遊離ＳＨ基とカップリングさせる。別の実施形態では、ヒドラジド化学またはアミノオキシ化学を用いて、水溶性脂肪酸誘導体を前酸化後の治療用タンパク質の炭水化物部分とカップリングさせる。
【０１４２】
本発明の一実施形態では、活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む水溶性脂肪酸誘導体の使用により、リジン残基を介して治療用タンパク質を改変する。この誘導体は、安定なアミド結合を形成することにより、温和な条件下で治療用タンパク質のリジン残基と反応する。
【０１４３】
本発明の別の実施形態において、タンパク質または脂肪酸誘導体の一方または両方上のカルボキシル基とタンパク質または脂肪酸誘導体のアミン基との間のペプチド結合、あるいはタンパク質または脂肪酸誘導体のカルボキシル基と治療用タンパク質または脂肪酸誘導体の水酸基と間のエステル連結による連結が想定されている。治療用タンパク質が脂肪酸誘導体と共有結合する別の連結は、脂肪酸の末端に形成されたアルデヒド基と反応するタンパク質の遊離アミノ基との間のシッフ塩基を介するものである。生成されたシッフ塩基は、一態様において、ＮａＣＮＢＨ３による特異的還元によって安定化されて、第２級アミンを形成する。代替的な手法は、前酸化後にＮＨ４Ｃｌを用いた、還元的アミノ化によって脂肪酸誘導体中に末端遊離アミノ基を生成することである。二官能性試薬を用いて、２つのアミノ基または２つの水酸基を連結してもよい。例えば、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）などの試薬を用いて、アミノ基を含有する脂肪酸誘導体をタンパク質のアミノ基とカップリングさせる。さらに、例えばアミン基およびチオール基に連結するために、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）などのヘテロ二官能性架橋試薬が用いられる。
【０１４４】
別の手法では、活性ヒドラジド基を有する脂肪酸誘導体を調製し、前酸化およびアルデヒド官能基の生成後に、タンパク質の炭水化物部分とカップリングさせる。
【０１４５】
上述のように、治療用タンパク質の遊離アミン基は、脂肪酸誘導体の１−カルボキシル基と反応してペプチジル結合を形成するか、または１−カルボン酸基とタンパク質上のヒドロキシルもしくは他の好適な活性基との間にエステル連結が形成される。
【０１４６】
種々の実施形態において、治療用タンパク質は、化学量論量（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：７、１：８、１：９、または１：１０など）で脂肪酸誘導体に連結するか、または結合する。種々の実施形態において、１〜６個、７〜１２個、または１３〜２０個の脂肪酸誘導体がタンパク質に連結している。また別の実施形態において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上の脂肪酸誘導体がタンパク質に連結している。
【０１４７】
種々の実施形態において、治療用タンパク質を改変して、グリコシル化部位（すなわち、天然グリコシル化部位以外の部位）を導入する。かかる改変は、当分野で既知の標準的分子生物学的手法を用いて達成することができる。さらに、治療用タンパク質は、１つまたは複数の炭水化物部分を介する水溶性リンカーへの抱合前に、インビボまたはインビトロでグリコシル化してもよい。これらのグリコシル化部位は、タンパク質の水溶性リンカーとの抱合の標的としての機能を果たし得る（米国特許出願第２００９００２８８２２号、米国特許出願第２００９／００９３３９９号、米国特許出願第２００９／００８１１８８号、米国特許出願第２００７／０２５４８３６号、米国特許出願第２００６／０１１１２７９号、およびＤｅＦｒｅｅｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１６，９，８３３−４３）。
【０１４８】
一実施形態において、複合タンパク質は、天然治療用タンパク質生成物の完全な機能的活性を保持し、天然治療用タンパク質生成物比較して延長されたインビボ半減期を提供する。別の実施形態において、複合タンパク質は、天然タンパク質に対して少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６，５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、または１５０％（パーセント）の生物学的活性を保持する。
【０１４９】
関連態様において、合タンパク質および天然血液凝固タンパク質の生物学的活性は、血液凝固因子抗原値に対する発色活性の比率（血液凝固因子：Ｃｈｒ：血液凝固因子：Ａｇ）によって決定される。
【０１５０】
本発明のまた別の実施形態において、複合タンパク質の半減期は、天然治療用タンパク質のインビボ半減期に対して０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１．０倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍減少または増加する。
求核触媒
【０１５１】
本明細書に記載のように、水溶性脂肪酸誘導体の治療用タンパク質への抱合は、アニリンによって触媒することができる。アニリンは、アルデヒドおよびケトンのアミンとの水性反応を強く触媒して、安定なイミン、例えばヒドラゾンおよびオキシムを形成する。下図は、無触媒とアニリン触媒のオキシム結合反応を比較している（出典：Ｋｏｈｌｅｒ  ＪＪ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９；１０：２１４７−５０）。
【化２１】
2014501262.tif 000059
【０１５２】
しかしながら、アニリンに付随する多数の健康リスクを考慮すると、代替的触媒が望ましい。本発明は、代替的オキシム結合触媒としてのアニリン誘導体を提供する。かかるアニリン誘導体には、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンザミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンが含まれるが、これらに限定されない。下図は、無触媒とｍ−トルイジン触媒のオキシム結合反応を比較している（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４５８７３号）。
【化２２】
2014501262.tif 000060
【０１５３】
本発明の一実施形態において、ｍ−トルイジン（別名メタ−トルイジン、ｍ−メチルアニリン、３−メチルアニリン、または３−アミノ−１−メチルベンゼン）を使用して、本明細書に記載の抱合反応を触媒する。Ｍ−トルイジンおよびアニリンは、類似する物理的特性および本質的に同じｐＫａ値（ｍ−トルイジン：ｐＫａ４．７３、アニリン：ｐＫａ４．６３）を有する。
【０１５４】
本発明の求核触媒は、オキシム結合（例えば、アミノオキシを使用）またはヒドラゾン形成（例えば、ヒドラジド化学を使用）に有用である。本発明の種々の実施形態において、抱合反応に求核触媒が０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、６．５ｍＭ、７．０ｍＭ、７．５ｍＭ、８．０ｍＭ、８．５ｍＭ、９．０ｍＭ、９．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で提供される。一実施形態において、求核触媒１〜１０ｍＭが提供される。本発明の種々の実施形態において、抱合反応のｐＨは、４．０〜７．０、４．５〜７．０、５．０〜６．５、５．０〜６．５である。種々の実施形態において、抱合反応のｐＨは、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、および７．５である。一実施形態において、このｐＨは５．５〜６．５である。
複合タンパク質の精製
【０１５５】
種々の実施形態において、酸化剤とともにインキュベートされたタンパク質および／または本発明による水溶性脂肪酸誘導体と抱合された治療用タンパク質の精製が望ましい。多数の精製法が当分野で既知であり、限定するものではないが、クロマトグラフ法、濾過法、および沈殿法が挙げられる（例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ４６３（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＲＲ  ａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  ＭＰ），２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９を参照されたい）。
【０１５６】
以下の実施例は、制限を意図するものではなく、本発明の特定の実施形態の例示に過ぎない。
【実施例】
【０１５７】
実施例１
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２の調製
【０１５８】
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２
【化２３】
2014501262.tif 000061
【０１５９】
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って、第１級アミンの修正ガブリエル合成を利用した２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含む３オキサペンタン−１，５−ジオキシアミンを合成した（図１）。第１のステップでは、２，２−ジクロロジエチルエーテルの１つの分子をエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子とＤＭＦ中で反応させた。得られた中間体から、エタノール中でのヒドラジン分解によって、所望のホモ二官能性生成物を調製した。
実施例２
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２の調製
【０１６０】
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２
【化２４】
2014501262.tif 000062
【０１６１】
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って、第１級アミンの修正ガブリエル合成を利用した２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含む３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンを合成した。第１のステップでは、ヘキサエチレングリコールジクロリドの１つの分子をエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子とＤＭＦ中で反応させた。得られた中間体から、エタノール中でのヒドラジン分解によって、所望のホモ二官能性生成物を調製した。
実施例３
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２の調製
【化２５】
2014501262.tif 000063
【０１６２】
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って、第１級アミンの修正ガブリエル合成を利用した２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含むホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２（３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）を合成した。第１のステップでは、ビス−（２−（２−クロロエトキシ）−エチル）−エーテルの１つの分子を、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子とＤＭＦ中で反応させた。得られた中間体から、エタノール中でのヒドラジン分解によって、最終的ホモ二官能性生成物を調製した。
実施例４
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシイミノ）−ヘキサデカン酸ナトリウム塩の調製
【０１６３】
Ｈａｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｎａｉｒ（Ａｒｋｉｖｏｃ  ２００６（ｉｉ）１０１−１０６）およびＨｕｂｂｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｔｈｃｏｃｋ（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，２００３；１２５：１２８３６−４３）に従って、２ステップ有機反応で、脂肪酸-アミノオキシリンカー１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシイミノ）−ヘキサデカン酸ナトリウム塩を合成した。
【０１６４】
中間体１：１６−オキソヘキサデカン酸ナトリウム塩
【化２６】
2014501262.tif 000064
【０１６５】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の１６−ヒドロキシヘキサデカン酸（８００ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、デス・マーチン・ペルヨージナン（１６３６ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この混合物をＡｒ雰囲気下、０℃で３．５時間、室温で２．５時間撹拌した。次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液中のチオ硫酸ナトリウムの１５％溶液を添加し、この混合物を室温で１．５時間撹拌した。中間体１をジエチルエーテルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥後、有機層を蒸発乾固し、分離剤としてのシリカゲルおよびトルエン／酢酸エチル溶媒混合物を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。収率：３４％（白色固体）。
【０１６６】
生成物：１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシイミノ）−ヘキサデカン酸ナトリウム塩
【化２７】
2014501262.tif 000065
【０１６７】
無水テトラヒドロフラン（３ｍＬ）中の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン（１４６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液に、中間体１（１９．１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をＡｒ雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。次いで、この混合物を蒸発乾固し、分離剤としてのシリカゲルおよびジクロロメタン／メタノール／ヒューニッヒ塩基溶媒混合物を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。収率：７１％（白色固体）。
【０１６８】
質量分析（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４７７，３５２９、［Ｍ＋２Ｈ］＋
実施例５
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサデカン酸メチルエステルの調製
【０１６９】
Ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００７；１２９：２７４４−５）に従って、３ステップ有機反応で、脂肪酸メチルエステル-アミノオキシリンカー１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサデカン酸メチルエステルを合成した。
【０１７０】
中間体１：１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステル
【化２８】
2014501262.tif 000066
【０１７１】
無水メタノール（２７ｍＬ）中の１６−ヒドロキシヘキサデカン酸（３０００ｍｇ、１０．７９ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に、塩化アセチル（３．８３７ｍＬ、５３．９６ｍｍｏｌ）を℃で２分以内に滴下添加し、次いでこの混合物をＡｒ雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。その後、この混合物を蒸発乾固し、残留物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン溶液（１×５０ｍＬ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥後、回収した有機層を蒸発乾固し、室温で真空乾燥した。収率：９２％（白色固体）。
【０１７２】
中間体２：１６−メチルスルホニルヘキサデカン酸メチルエステル
【化２９】
2014501262.tif 000067
【０１７３】
ジクロロメタン（４０ｍＬ）中の中間体１（２８０７ｍｇ、９．８０ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、トリエチルアミン（１．５０２ｍＬ、１０．７８ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジクロロメタン（５ｍＬ）中の塩化メシル（０．８３４ｍＬ、１０．７８ｍｍｏｌ）の予冷却溶液（０℃）を０℃で１０分以内に滴下添加した。この混合物を０℃で３０分間、室温で２．７５時間撹拌した。次いで、この混合物をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で希釈し、水（１×１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）、およびブライン溶液（１×１００ｍＬ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥後、回収した有機層を蒸発乾固し、室温で真空乾燥した。収率：９５％（淡黄白色固体）。
【０１７４】
生成物：１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル
【化３０】
2014501262.tif 000068
【０１７５】
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２２ｍＬ）中の３，６，９−トリアオキサウンデカン−１，１１−ジオキシアミン（５１７ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７ｍＬ）中の中間体２（７０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液をＡｒ雰囲気下、室温で１時間滴下添加した。この混合物を異なる温度（室温、５０℃、８０℃）で２日間撹拌して反応を完了させた。次いで、この混合物を蒸発乾固し、分離剤としてのシリカゲルおよびジクロロメタン／メタノール溶媒混合物を用いたカラムクロマトグラフィーによって、この粗生成物を精製した。収率：３１％（無色の部分的に凝固した白油）。
【０１７６】
質量分析（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４９３，３８２４、［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例６
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステルの凝固第ＶＩＩＩ因子の炭水化物部分とのカップリング
【０１７７】
２ステップ手順を用いてＦＡ−ｒＦＶＩＩＩを調製する。第１ステップにおいて、ｒＦＶＩＩＩをＮａＩＯ４で酸化し、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）によって精製する。続いて、この酸化ｒＦＶＩＩＩをＦＡ−アミノキシ試薬で改変する。
【０１７８】
ｒＦＶＩＩＩ（４５ｍｇ出発物質）をＮａＩＯ４（最終濃度２００μＭ）で酸化する。３０分間のインキュベーション時間後（２２℃）、１ＭのＬ−システイン水溶液（最終濃度：１０ｍＭ）を添加して、酸化反応を停止させる。この酸化ｒＦＶＩＩＩをＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）上のアニオン交換クロマトグラフィーによって精製する。次いで、２５μＬの１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル（実施例３に従って調製したもの）のＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液をこの溶出液（タンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、カップリング反応を４℃で１８時間実施する。次いでこのＦＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体をＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ上のＨＩＣによってさらに精製する。最後に、３０ｋＤ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いたＵＦ／ＤＦによって、この溶出液を濃縮する。
実施例７
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステルの凝固第ＩＸ因子の炭水化物部分とのカップリング
【０１７９】
１０ｍｇのｒＦＩＸを反応緩衝液（２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に溶解して、最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬとする。この溶液に５ｍＭのＮａＩＯ４水溶液を添加して、最終濃度１００μＭとした。この反応混合物を暗所での穏やかな撹拌下、４℃で１時間インキュベートした。次いで、過剰ＮａＩＯ４を除去するために、この混合物を予め平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムに充填する。この混合物に８μＬの１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル（実施例３に従って調製したもの）のＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液を添加し、カップリング反応を４℃、ｐＨ６．０で１８時間実施する。次いで、この複合体を  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上のＩＥＸによってさらに精製する。最後に、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置を用いたＵＦ／ＤＦによって、この溶出液を濃縮する。
実施例８
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステルの凝固第ＶＩＩａ因子の炭水化物部分とのカップリング
【０１８０】
１０ｍｇのｒＦＶＩＩａを反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、５ｍＭ  塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に溶解して、最終濃度２．０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液に、５ｍＭのＮａＩＯ４水溶液を添加して、最終濃度５０μＭとする。この反応混合物を暗所での穏やかな撹拌下、４℃で１時間インキュベートする。次いで、過剰ＮａＩＯ４を除去するために、この混合物を予め平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムに装填する。この混合物に８μＬの１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル（実施例３に従って調製したもの）のＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液を添加し、カップリング反応を４℃、ｐＨ６．０で１８時間実施する。次いで、この複合体を  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上のＩＥＸによってさらに精製する。最後に、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置を用いたＵＦ／ＤＦによって、この溶出液を濃縮する。
実施例９
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステルの凝固第ＶＩＩＩ因子の炭水化物部分とのカップリング
【０１８１】
１０ｍｇのｒＦＶＩＩＩをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に溶解して、タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍＬとする。次いで、１０μＬの１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル（実施例３に従って調製したもの）のＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液をこのＦＶＩＩＩ溶液に添加する。続いて求核触媒ｍ−トルイジンの水溶液（５０ｍＭ）を調製し、この混合物に１５以内に添加して最終濃度１０ｍＭとする。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加して濃度４００μＭとする。この反応混合物を暗所での穏やかな撹拌下、温度２２℃で１２０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）を添加して反応混合物中の最終濃度１０ｍＭにし、６０分間インキュベートすることにより反応を停止させる。続いて、この反応混合物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを充填したＩＥＸカラム（１．６×８ｃｍ）に装填する。このカラムを２０カラム体積の平衡化緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で洗浄し、このＦＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出させる。最後に、この生成物に、ダイアフィルトレーション緩衝液としてＨｅｐｅｓ緩衝液７．４（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を用いた、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置によるＵＦ／ＤＦを実施する。
実施例１０
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステルの凝固第ＩＸ因子の炭水化物部分とのカップリング
【０１８２】
７ｍｇのｒＦＩＸをＨｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）に溶解して、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬとする。次いで、７μＬの１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル（実施例３に従って調製したもの）のＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液をこのＦＩＸ溶液に添加する。次いで、求核触媒ｍ−トルイジンの水溶液（５０ｍＭ）を調製し、この混合物に１５以内に添加して最終濃度１０ｍＭとする。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加して濃度２５０μＭとする。この反応混合物を暗所での穏やかな撹拌下、温度２２℃で１２０分間インキュベートする。続いて、Ｌ−システイン（最終濃度：５ｍＭ）を室温で３０分間添加して、反応を停止させる。
【０１８３】
このＦＡ−ｒＦＩＸ複合体をアニオン交換クロマトグラフィーによって精製する。この反応混合物を１０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）に装填する。同じ緩衝液を用いて、５ＣＶでカラムを洗浄する。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出する。この複合体を含む画分を再生セルロースで作られた１０ｋＤ膜を用いたＵＦ／ＤＦによって濃縮する。１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に対する最終ダイアフィルトレーションステップを実施する。
実施例１１
１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステルの凝固第ＶＩＩａ因子の炭水化物部分とのカップリング
【０１８４】
１０ｍｇのｒＦＶＩＩａをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、５ｍＭ  塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に溶解する。次いで、１０μＬの１６−（２−（２−（２−（２−アミノオキシエトキシ）−エトキシ）−エトキシ）−エトキシアミノ）−ヘキサ−デカン酸メチルエステル（実施例３に従って調製したもの）のＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液をこのＦＶＩＩａ溶液に添加する。続いて求核触媒ｍ−トルイジンの水溶液（５０ｍＭ）を調製し、この混合物に１５以内に添加して最終濃度１０ｍＭとする。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加して濃度２５０μＭとする。この反応混合物を暗所での穏やかな撹拌下、温度２２℃で１２０分間インキュベートする。続いて、Ｌ−システイン（最終濃度：５ｍＭ）を室温で３０分間添加して、反応を停止させる。このＦＡ−ｒＦＶＩＩａ複合体をアニオン交換クロマトグラフィーによって精製する。この反応混合物１０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で希釈し、緩衝液Ａで平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）に装填する。同じ緩衝液を用いて、５ＣＶでカラムを洗浄する。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出する。この複合体を含む画分を再生セルロースで作られた１０ｋＤ膜を用いたＵＦ／ＤＦによって濃縮する。１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に対する最終ダイアフィルトレーションステップを実施する。
実施例１２
求核触媒存在下での活性アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体の酸化炭水化物部分とのカップリング
【０１８５】
活性アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体の治療用酸化タンパク質（本明細書の表１に記載のタンパク質など）とのカップリングも提供される。
【０１８６】
アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体のカップリングのために、治療用タンパク質（例えば、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、またはインスリン；表１参照；濃度：０．５〜３ｍｇ／ｍＬ）の炭水化物部分（主にＮ−グリカン）をまずＮａＩＯ４（濃度：２００μＭ）で酸化する。次いで、Ｌ−システイン（最終濃度：５ｍＭ）の添加により反応を停止させ、この試薬をＵＦ／ＤＦによって分離する。ダイアフィルトレーション後、２５Ｍ過剰量を用いてＦＡアミノオキシ試薬（すなわち、ＦＡ誘導体）を添加し、求核触媒ｍ−トルイジン（濃度：１０ｍＭ）の存在下で、穏やかな撹拌下、ｐＨ６．０、室温で１時間のカップリング反応を実施する。続いて、反応混合物をイオン交換（ＩＥＸ）カラムに装填する。このカラムを５ＣＶを上回る洗浄用緩衝液で洗浄し、この複合体をＮａＣｌリニアグラジエントで溶出する。最後にこの複合体を含む画分にＵＦ／ＤＦを実施する。
実施例１３
求核触媒存在下での活性アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体の酸化炭水化物部分とのカップリング
【０１８７】
アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体の治療用タンパク質の炭水化物部分とのカップリングのために、求核触媒ｍ−トルイジン（濃度：１０ｍＭ）の存在下、タンパク質（例えば、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、またはインスリン；表１参照；濃度：０．５〜３ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ６．０でＮａＩＯ４（濃度：３００μＭ）とともに室温で１時間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン（最終濃度：５ｍＭ）の添加により反応を停止させ、この反応混合物をイオン交換（ＩＥＸ）カラムに装填する。このカラムを５ＣＶを上回る洗浄用緩衝液で洗浄し、この複合体をＮａＣｌリニアグラジエントで溶出する。最後にこの複合体を含む画分にＵＦ／ＤＦを実施する。
実施例１４
求核触媒存在下での活性アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体の酸化血液凝固タンパク質とのカップリング
【０１８８】
活性アミノオキシ基を含むＦＡ誘導体の酸化血液凝固タンパク質（上記の実施例に記載のようなＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩａなど）とのカップリングは、濃度範囲２〜２０ｍＭの求核触媒、例えばｍ−トルイジンの存在下で実施してもよい。
実施例１５
水溶性ＭＡＬ脂肪酸リンカーの調製
【０１８９】
ω位の水溶性ＰＥＧ鎖および活性ＭＡＬ基を含む脂肪酸リンカーを２ステップ合成で調製する。
【０１９０】
ステップ１：１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルの調製：
【化３１】
2014501262.tif 000069
【０１９１】
実施例３に従って、メタノール中、室温で５時間、市販の１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を塩化アセチルでエステル化して対応するメチルエステルを得る（Ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ＪＡＣＳ  ２００７；１２９：２７４４−５）。
【０１９２】
ステップ２：ＭＡＬ脂肪酸リンカーの調製：
【化３２】
2014501262.tif 000070
【０１９３】
光延反応を利用して、ＴＨＦ中、室温で、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルを市販のＭＡＬ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ｍａｌ−Ｐｅｇ（１２）−ＣＯＯＨ／ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と一晩反応させる（Ｔｏｙｏｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｎｋｅｒ，Ｎ−［４−（Ａｍｉｎｏｏｘｙ）ｂｕｔｙｌ］−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ，ｆｏｒ  Ｆａｃｉｌｅ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  ａ  Ｔｈｉｏｌ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  １８Ｆ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２００３；１４：１２５３−９）。
実施例１６
水溶性ＮＨＳ脂肪酸リンカーの調製
【０１９４】
ω位の水溶性ＰＥＧ鎖および末端活性ＮＨＳエステルを含む脂肪酸リンカーを４ステップ合成を使用して調製する。
【０１９５】
ステップ１：１６−ブロモヘキサデカン酸メチルエステルの調製
【化３３】
2014501262.tif 000071
【０１９６】
還流温度で一晩、市販の１６−ブロモヘキサデカン酸をメタノールおよび触媒量の濃硫酸でエステル化して、対応するメチルエステルを得る（Ｚｉｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｉｓｏｍｅｒｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｇｅｌａｔｏｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｇｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ，Ｒａｃｅｍｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｇｅｌａｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ  ２０１０；１６：３０６６−８２）。
【０１９７】
ステップ２：１６−アジドヘキサデカン酸メチルエステルの調製
【化３４】
2014501262.tif 000072
【０１９８】
アセトニトリル中、還流温度で４日間、１６−ブロモヘキサデカン酸メチルエステルをアジ化ナトリウムと反応させて対応するアジドを得る（Ｚｉｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｉｓｏｍｅｒｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｇｅｌａｔｏｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｇｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ，Ｒａｃｅｍｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｇｅｌａｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０；１６：３０６６−８２）。
【０１９９】
ステップ３：１６−アミノヘキサデカン酸メチルエステルの調製
【化３５】
2014501262.tif 000073
【０２００】
メタノール中、３バールで３時間、１６−アジドヘキサデカン酸メチルエステルをパラジウム／活性炭で触媒を用いて水素化し、対応するアミンを得る（Ｚｉｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｉｓｏｍｅｒｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｇｅｌａｔｏｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｇｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ，Ｒａｃｅｍｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｇｅｌａｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０；１６：３０６６−８２）。
【０２０１】
ステップ４：ＮＨＳ脂肪酸リンカーの調製
【化３６】
2014501262.tif 000074
【０２０２】
１，４−ジオキサン中、室温で３日間、１６−アミノヘキサデカン酸メチルエステルを市販のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＨＳ−ｄＰＥＧ（４）−ＮＨＳ／ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と反応させてＮＨＳ脂肪酸リンカーを得る（Ｃｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  Ｅｓｔｅｒｓ．Ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｕｄｙ，ＪＡＣＳ  １９８７；１０９：３０８７−９１）。
実施例１７
タンパク質ＦＡ複合体の分析による特徴付け
【０２０３】
本明細書の実施例に従って調製したＦＡ−ｒＦＶＩＩＩ、ｒＦＩＸ、もしくはＦＶＩＩａ試料のアルブミン結合特性を酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）系を使用してインビトロで検証する。９６ウェルプレートをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するポリクローナル抗体でコーティングする。次のステップは、ＰＢＳ−ゼラチン緩衝液によるＥＬＩＳＡプレートのブロッキングである。次いで、ＨＡＳをその抗体に結合させ、その後異なる濃度で希釈したＦＡ−タンパク質試料を結合させる。最後に、このＨＳＡ−タンパク質試料をペルオキシダーゼで標識した抗ＶＩＩＩ、抗ＦＩＸ、もしくは抗ＦＶＩＩａ抗体により検出する。基質としてテトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）を用いて、ペルオキシダーゼ活性を検出する。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ｎｍの発色強度を測定する。ＦＡ−タンパク質試料のＨＡＳとの結合は、異なる試料濃度をｘ軸に示し、それらが対応する吸光度値をｙ軸に示すことによって評価する。
実施例１８
アミノオキシ基を含む水溶性ＰＥＧ化脂肪酸リンカーの調製
【０２０４】
実施例１に記載の３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミンを用いて、ω位のアミノオキシ部分が脂肪酸カルボキシル基と連結した水溶性ＰＥＧ鎖を含む脂肪酸リンカーを３ステップ合成で調製する。
【０２０５】
ステップ１：Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミンの調製
【化３７】
2014501262.tif 000075
【０２０６】
１，４−ジオキサン中、周囲温度で１時間、３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミンを９−フルオレニルメチルクロロホルメートと反応させた。この溶液を減圧下で蒸発させ、溶媒混合物としてジクロロメタン／メタノール２０／１（ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーを使用してこの粗生成物を精製し、純粋なモノＦＭＯＣ保護ジオキシアミンを得た（Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂａｓｉｃ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１５，５４８５−９２）。
【０２０７】
ステップ２：ヘキサデカン酸（２−（２−（Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノオキシ）エトキシ）エトキシ）アミドの調製
【化３８】
2014501262.tif 000076
【０２０８】
ＴＨＦ中、周囲温度で一晩、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−オキサペンタン−１，５−ジオキシアミンを市販のパルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、モノＦＭＯＣ保護アミノオキシ−脂肪酸複合体を得る（Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｒａｍｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９７２；Ｖｏｌ．１３，８１９−２２）。
【０２０９】
ステップ３：ヘキサデカン酸（２−（２−アミノオキシエトキシ）エトキシ）アミドの調製
【化３９】
2014501262.tif 000077
【０２１０】
ジクロロメタン中、周囲温度で、モノＦＭＯＣ保護アミノオキシ−脂肪酸複合体をピペリジンと反応させて、最終生成物として脱保護アミノオキシ−脂肪酸リンカーを得る（Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂａｓｉｃ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１５，５４８５−９２）。
実施例１９
ＭＡＬ脂肪酸リンカーのＡ１ＰＩとのカップリング
【０２１１】
光延反応を利用した１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルと市販のＭＡＬ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ｍａｌ−Ｐｅｇ（１２）−ＣＯＯＨ／ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）との反応によって、実施例１５に記載のように、ＭＡＬ基を含む脂肪酸リンカーを調製する。このリンカーをＡ１ＰＩの遊離ＳＨ基とカップリングさせる。
【０２１２】
１０ｍｇの精製Ａ１ＰＩ（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を反応緩衝液（２０ｍＭ  リン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に溶解し、１０μＬのＭＡＬ脂肪酸リンカーのＤＭＳＯ中５％（ｗ／ｖ）溶液をこのＡ１ＰＩ溶液に添加する。改変反応を室温で２時間実施したあと、Ｌ−システイン（最終濃度：１０ｍＭ）による反応停止ステップを行う。Ｌ−システインの添加後、穏やかな撹拌下、反応混合物を同じ温度でさらに１時間インキュベートする。改変されたＡ１ＰＩを平衡化緩衝液（２５ｍＭ  リン酸塩、ｐＨ６．５）で希釈してこの溶液を伝導率４．５ｍＳ／ｃｍ未満に補正し、カラム体積（ＣＶ）５ｍＬの予備充填したＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に装填する。次いで、このカラムを１０ＣＶの平衡化緩衝液（流量：２ｍＬ／分）で平衡化する。最後に、ＰＥＧ−Ａ１ＰＩを溶出緩衝液（２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を用いてリニアグラジエントで溶出する。
実施例２０
ＮＨＳ脂肪酸リンカーの凝固第ＶＩＩＩ因子とのカップリング
【０２１３】
１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルと市販のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＨＳ−ｄＰＥＧ（４）−ＮＨＳ（ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）との反応によって、実施例１６に記載のように、ＮＨＳ基を含む脂肪酸リンカーを調製する。このリンカーを凝固第ＶＩＩＩ因子のリジン残基の遊離アミノ基とカップリングさせる。
【０２１４】
１０ｍｇのｒＦＶＩＩＩをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に溶解して、タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍＬとする。次いで、１０μＬのＮＨＳ脂肪酸リンカーのＤＭＳＯ中１０％（ｗ／ｖ）溶液をこのＦＶＩＩＩ溶液に添加する。この反応混合物を暗所での穏やかな撹拌下、温度２２℃で１２０分間インキュベートする。次いで、グリシン水溶液（１Ｍ）を添加して反応混合物中の最終濃度２０ｍＭとし、反応を停止させる。この混合物を穏やかな撹拌下、室温で１５分間インキュベートし、続いてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（１．６×８ｃｍ）を充填したＩＥＸカラムに装填する。このカラムを２０カラム体積の平衡化緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で洗浄し、このＦＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出させる。最後に、この生成物に、ダイアフィルトレーション緩衝液としてＨｅｐｅｓ緩衝液７．４（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を用いた、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置によるＵＦ／ＤＦを実施する。
【図１】
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【国際調査報告】
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