(57)【要約】【課題】本発明は、心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターする方法を提供する。【解決手段】そのような方法は、治療的介入を受けている患者からの生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定または検出することと、このレベルをコントロールサンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルと比較することと、を含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルは、治療的介入の治療有効性の指標となる。患者からの生物学的サンプル中の１種以上のｍｉＲＮＡを測定することにより、患者における心不全の重症度または進行を予測または評価する方法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターする方法であって、
前記治療的介入を受けた患者からの生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することを含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが前記治療的介入の治療有効性の指標となる、方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルが血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが心臓組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、表２〜４のいずれか１つに列挙されたｍｉＲＮＡから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルに対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの減少が、前記治療的介入の治療有効性の指標となる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９９から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルに対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの増加が、前記治療的介入の治療有効性の指標となる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１４から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療的介入がｍｉＲＮＡベースの治療剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡベースの治療剤が、心臓組織で発現されるｍｉＲＮＡを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１９ｂまたはｍｉＲ−２２３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の１〜６週間後に測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
参照レベルまたは前記コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルに対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの変化が、心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現の減少の指標となる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療的介入がアンギオテンシン変換酵素阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−１５０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記心臓障害が、心筋梗塞、病的心肥大、心不全、または高血圧である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的サンプルが、前記治療的介入開始の少なくとも１週間後に患者から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが、コントロールサンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルと比較され、前記比較が、前記治療的介入の治療有効性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが、あらかじめ決められた参照値と比較され、前記比較が、前記治療的介入の治療有効性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルに基づいて前記治療的介入を変更することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするのに有用な情報を提供する方法であって、患者の生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少に基づいて前記有効性の決定を提供するエンティティーに前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを提供することと、を含む、方法。
【請求項２５】
生物学的サンプル中の表２〜４のいずれか１つから選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、患者において心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするために前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための説明書と、を含むキット。
【請求項２６】
前記試薬が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１４から選択されるｍｉＲＮＡを逆転写または増幅するためのｍｉＲＮＡ特異的プライマーを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
１種以上の標準化コントロールをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記１種以上の標準化コントロールが、サンプルまたは反応にスパイクするための１種以上の個別の試薬として提供される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
少なくとも１種の標準化コントロールが、非内因性のＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたは前記サンプル中で発現されないｍｉＲＮＡである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
少なくとも１種の標準化コントロールがＣ．エレガンスｍｉＲＮＡである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
少なくとも１種の標準化コントロールが、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２、ｃｅｌ−ｌｉｎ−４、またはａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記キットの各ｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎプローブをさらに含む、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記生物学的サンプルが、心臓障害の治療を受けている患者から取得した血漿または血清である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３４】
前記心臓障害が、心筋梗塞、病的心肥大、心不全、または高血圧である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価する方法であって、
前記患者からの生物学的サンプル中の表１から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することを含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが、前記患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる、方法。
【請求項３６】
前記コントロールサンプルが、心不全に罹患していないかまたは心不全と診断されていない健常対象から取得される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが、コントロールサンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルと比較され、前記比較が、前記患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが、あらかじめ決められた参照値と比較され、前記比較が、前記患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記コントロールサンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルまたは前記あらかじめ決められた参照値に対する前記ｍｉＲＮＡの測定されたレベルの減少が、前記患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１９５から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記コントロールサンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルまたは前記あらかじめ決められた参照値に対する前記ｍｉＲＮＡの測定されたレベルの増加が、前記患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９３から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物学的サンプルが血漿または血清である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
生物学的サンプル中の表１から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価するために前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための説明書と、を含むキット。
【請求項４５】
前記試薬が、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９３から選択されるｍｉＲＮＡを逆転写または増幅するためのｍｉＲＮＡ特異的プライマーを含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
心不全の患者を治療する方法であって、前記患者が、高レベルまたは低レベルの表１に列挙された１種以上のｍｉＲＮＡを有し、前記方法が、ｍｉＲ−２０８（ａ）阻害剤またはｍｉＲ−２０８（ｂ）阻害剤を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記患者が、高レベルのｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６（ｂ）、および／またはｍｉＲ−４２３−５ｐを有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６（ｂ）、および／またはｍｉＲ−４２３−５ｐのレベルが、心不全の治療前に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ｍｉＲ−１９（ｂ）のレベルが、治療の過程で少なくとも１回モニターされる、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１１年９月２３日に出願された米国仮出願第６１／５３８，５８５号、２０１１年６月９日に出願された米国仮出願第６１／４９５，２２０号、および２０１０年１２月１５日に出願された米国仮出願第６１／４２３，４５６号（それぞれその全体について参照により本明細書に援用する）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、心臓障害に対する治療的介入の有効性を評価もしくはモニターするためのまたは患者における心不全の重症度もしくは疾患進行のレベルを評価するためのｍｉｃｒｏＲＮＡの検出に関する。本発明はさらに、心臓障害の患者の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
心不全を含めて心臓障害の現在の治療は、薬理学的方法、心室補助装置（ＶＡＤ）などの装置、心臓再同期療法（ＣＲＴ）、および心臓移植を含む。薬理学的方法は、変力剤（すなわち、心収縮力を増大させる化合物）、神経液性ブロッカー（たとえば、βブロッカー、アンギオテンシン変換酵素阻害剤）、アルドステロンアンタゴニスト、利尿剤、および血管拡張剤の使用を含み得る。しかしながら、これらの作用剤はいずれも、単独でも組合せでも完全には有効でない。移植組織の入手可能性は、きわめて限られており、しかも心不全に罹患している多くの者は、健康状態が悪いので、良好な手術候補者でないことが多い。これらの理由から、特に先進世界において、心不全は、依然として罹患および死亡の主な原因である。それに加えて、心不全の正確な病因を決定することが困難なこともあり、より特異な療法の開発を妨げる要因となっている。さらに、分子レベルの診断技術が一般に欠如している。したがって、心不全の重症度の評価を支援するさらなる診断マーカーの発見ならびに現在の治療およびまだ記載されていない治療の両方に対するその応答の必要性が、当業界に存在する。本発明は、とりわけ以上の必要性に対処する。
【０００４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはｍｉＲ）は、遺伝子発現を転写後制御する一群の制御ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、約１８〜２５ヌクレオチド長の進化的に保存された小さい非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、特異的「標的」ｍＲＮＡと塩基対合し、その際、翻訳の阻害またはｍＲＮＡの分解を促進する（Battel, Cell, 116, 281-297 (2004)）。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして機能し、それらの配列が完全に相補的である場合、その分解を促進することにより、またはそれらの配列がミスマッチを含有する場合、翻訳を阻害することにより機能する。
【０００５】
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、心臓機能の制御および維持を含む多くの生物学的プロセスに関与している（Eva Van Rooij and Eric Olson, MicroRNAs: Powerful new regulators of heart disease and proactive therapeutic targets, J. Clin. Invest. 117(9):2369-2376 (2007)、およびChien KR, Molecular Medicine: MicroRNAs and the tell-tale heart, Nature 447, 389-390 (2007)を参照されたい）。ｍｉＲＮＡはまた、生物の発生に関与すると報告されており（Ambros, Cell 113: 673-676）、多くの組織で（Xu et al., 2003 Curr. Biol. 13:790-795; Landgraf et al., 2007 Cell 129: 1401-14）、ウイルス感染過程で（Pfeffer et al., 2004 Science 304: 734-736）、差次的に発現され、そして腫瘍形成に関連付けられている（Calin, et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 2999-3004; Calin et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(24): 15524-15529）。したがって、ｍｉＲは、とりわけ、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症（pathologic cardiac fibrosis）などの病状についての比較的新しいクラスの治療標的を代表する。本発明は、部分的には、ｍｉＲＮＡの検出が、心臓障害の治療に対する治療有効性を評価およびモニターするのにかつ治療法決定の手引きとするのに有用であるという驚くべき発見に基づく。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターする方法を提供する。そのような方法は、治療的介入を受けた患者からの生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定もしくは検出すること（または一群のｍｉＲＮＡを検出すること）を含む。いくつかの実施態様において、生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルは、参照レベルまたはコントロールサンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定レベルと比較される。前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定レベルは、治療的介入の治療有効性の指標となる。いくつかの場合には、ｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少は、治療的介入の有効性の指標となる。いくつかの実施態様において、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、表２〜４のいずれかに列挙されたｍｉＲＮＡから選択される。いくつかの実施態様において、表２〜４からの複数のｍｉＲＮＡは、治療を評価またはモニターするために、測定されて参照レベルまたはコントロールサンプル中のレベルと比較される。患者サンプル中の一群のｍｉＲＮＡを決定する場合、患者サンプルは、分類アルゴリズムに基いて有効介入または非有効介入の指標として分類され得る。いくつかの実施態様において、治療的介入は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／もしくはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは標準治療剤、たとえば、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤である。測定ｍｉＲＮＡレベルに基づいて、治療は、継続してもよく、あるいはたとえば、用量もしくは投与頻度の変化により、または他の活性剤の追加により、または治療レジメン全体の変化により、変更してもよい。
【０００７】
いくつかの実施態様において、治療前または治療レジメン初期に患者から採取したサンプルを基準にした少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定レベルの変化は、治療的介入の治療有効性の指標となる。
【０００８】
いくつかの実施態様において、心臓障害は、心筋梗塞、病的心肥大、心不全、または高血圧である。
【０００９】
本発明はまた、治療的介入を受けた患者からの生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、前記生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少に基づいて治療レジメンを変更することと、を含む治療物質の治療レジメンを変更する方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、患者の生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少に基づいて有効性の決定を提供するエンティティーに少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを提供することと、を含む、心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするのに有用な情報を提供する方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価する方法を包含する。一実施態様において、本方法は、患者からの生物学的サンプル中の表１から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することと、測定されたレベルを参照レベルまたはコントロールサンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルと比較することと、を含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルは、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少は、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる。
【００１２】
さらに他の態様において、本発明は、心不全の患者を治療する方法を提供する。ただし、この患者は、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６（ｂ）、および／またはｍｉＲ−４２３−５ｐあるいは表１に列挙されたアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるマーカーの他の組合せ（たとえば、少なくとも２種の組合せ）の１つ以上がレベル（たとえば、血清中または血漿中のレベル）の上昇を有する。この態様によれば、患者は、従来の治療剤（たとえばＡＣＥ阻害剤）を用いて、または本明細書に記載のａｎｔｉ−ｍｉＲ治療戦略（たとえばａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８（ｂ））を用いて、心不全の治療を受ける。ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６（ｂ）、および／またはｍｉＲ−４２３−５ｐのレベルは、治療前および／またはレジメンの有効性をモニターするために治療中に決定し得る。いくつかの実施態様において、治療剤はａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８（ｂ）であり、ｍｉＲ−１９（ｂ）または表２〜４の１つ以上に列挙されたマーカーの組合せのレベルが治療中にモニターされる。
【００１３】
本発明の他の態様は、生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための説明書と、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルに基づいて患者における心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするための説明書と、を含むキットである。いくつかの実施態様において、キットは、表２〜４からの少なくとも１、２、３種、またはそれ以上を含めて２〜約２０種のヒトｍｉＲＮＡを測定するための試薬を含有する。対象の心不全の重症度または進行を評価または予測するためのキットは、生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルに基づいて心不全の重症度または進行を評価するための説明書と、を含み得る。これもまた、本発明に含まれる。いくつかの実施態様において、キット試薬は、本明細書に記載の１種以上のｍｉＲＮＡを逆転写、増幅、および／またはハイブリダイズするためのｍｉＲＮＡ特異的プライマーおよび／またはプローブを含む。そのようなキットは、１種以上の標準化コントロールおよび／またはキットの各ｍｉＲＮＡに特異的なTaqManプローブをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｍｉＲ−２０８ａの治療的サイレンシングは、心不全に有益である。Ａ．ダール高血圧ラットモデルのカプラン・マイヤー生存曲線は、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロール群の両方で８％高食塩（ＨＳ）食に応答して生存率の顕著な減少を示すが、これは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して有意に改善される。ラットは、ＨＳ食の１週間後に開始して２週間ごとに２５ｍｇ／ｋｇで投与された。Ｂ．体重分析から、８％ＨＳ食のダール高血圧ラットは、低食塩（ＬＳ）食の動物と比較して低減された体重増加を呈するが、ＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、体重増加の有意により良好な維持を示すことが示唆される。ＡおよびＢでは、ＬＳ／生理食塩水に対してｎ＝６、ＨＳ／生理食塩水およびＨＳ／コントロールに対してｎ＝１５、およびＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに対してｎ＝１４。グラフ上の「ｎ」は、摂食後８週目で生き残っている全生存動物数を表す。Ｃ．４％ＨＳ食のダールラットの体重分析では、ＬＳ食コントロールと比較して体重増加が有意に低減するが、２週間ごとの５および２５ｍｇ／ｋｇ注入の両方は、普通食の動物に匹敵する体重増加を維持するのに十分であることが示される。Ｄ．心エコー測定から、４％ＨＳ食に応答する等容弛綬時間（ＩＶＲＴ）の増加および僧帽弁早期対能動期充満速度比（mitral valve early to active filling velocity ratio）（ＭＶ  Ｅ／Ａ）の減少は、摂食開始８週間後にａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して有意に改善されることが示唆される。ＣおよびＤでは、すべての群に対してｎ＝１０。Ｅ．ヘマトキシリンとエオシンＨ＆Ｅおよびピクロシリウスレッドで染色された左室組織切片の代表的な画像は、８週間の４％ＨＳ食に応答して心筋細胞肥大の増加および血管周囲線維症を示すが、両方のパラメーターが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して低減される。Ｆ．ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの存在下で有意により少ない肥大および線維症を示す組織学的定量化の棒グラフ図。ＤおよびＦでは、エラーバーは、ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水、＃ｐ＜０．０５対ＬＳ生理食塩水を示す。
【図２】ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、ダール食塩感受性ラットにおいてｍｉＲ−４９９およびＭｙｈ７を低減する。分析はすべて、４％高食塩（ＨＳ）食開始８週間後およびａｎｔｉｍｉＲ治療開始７週間後に行われた（ＡおよびＣのすべての群に対してｎ＝１０）。ＢおよびＤでは、各レーンは、ｎ＝１０群からの代表的な動物である。ラットは、２週間ごとに２５ｍｇ／ｋｇ（コントロール）またはＨＳ食１週間後に開始してａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａの指定用量で投与された。グラフ上の赤線は、群を分離する。Ａ．リアルタイムＰＣＲ分析は、左室（ＬＶ）および右室（ＲＶ）の両方でｍｉＲ−２０８ａの用量依存的減少を示しており、これは、ｍｉＲ−４９９の用量依存的減少に対応する。ｍｉＲ−２０８ｂは、ＨＳ食に応答して増大するが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、この応答を有意に減弱させる。スクランブルコントロール化学物質(chemistry)の投与は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−４９９、またはｍｉＲ−２０８ｂの発現に影響を及ぼさなかった。Ｂ．ノーザンブロット分析により示されたａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答するｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂの制御。Ｃ．リアルタイムＰＣＲ分析から、ＨＳ食は、Ｍｙｈ６を低減し、Ｍｙｈ７を増大させることが示される。ａｎｉｔｍｉＲ−２０８ａ治療は、用量依存的にＭｙｈ６発現を増大させ、Ｍｙｈ７ｂ発現を低減する。Ｍｙｈ７のＨＳ食起因性増加は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａにより用量依存的に低減される。Ｄ．心室組織のＭｙｈ７のウェスタンブロット分析により、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して用量依存的減少が確認される。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。Ｅ．ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａの存在下でｍｉＲ−２０８ａ標的脱抑制を示すＨＰ１βウェスタンブロットの定量化。ＡおよびＣでは、エラーバーは、ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水、＃ｐ＜０．０５対ＬＳ生理食塩水を示す。
【図３】血漿中のｍｉＲ−４９９は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性のバイオマーカーとして機能する。Ａ．血漿サンプルのリアルタイムＰＣＲ分析から、高食塩（ＨＳ）食に応答してｍｉＲ−４９９が増加するが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、４％ＨＳ食開始８週間後およびａｎｔｉｍｉＲ治療開始７週間後、血漿中のｍｉＲ−４９９の検出を有意に低下させることが示唆される。Ｂ．さらなるｍｉＲＮＡ分析は、そのほかに、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答して血漿中の検出可能なｍｉＲ−４２３−５ｐの減少を示す。グリコーゲン支援ＲＮＡ沈殿法（Invitrogen）を用いてTrizol-LSによりＲＮＡを血漿サンプルから単離し、Applied Biosystem製の市販のｍｉＲＮＡ Taqmanアッセイを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡ精製前、５ｆｍｏｌの合成Ｃ．エレガンス（C. elegans）ｌｉｎ−４およびｍｉＲ−２をサンプルに添加し、血漿中ｍｉＲＮＡ値を合成インプット配列の平均回収率に標準化した。＊Ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水（各群につきｎ＝１０）。
【図４】ダール食塩感受性ラットの食物摂取。ダール高血圧ラットにおいて体重増加および健康の差がＨＳ食の摂取の差に起因することを除いて、食餌の摂取量に基づいて、治療群間に有意差は存在しない。４週目（Ａ）、５週目（Ｂ）、６週目（Ｃ）、および７週目（Ｄ）が示されている。
【図５】筋特異的ｍｉＲＮＡの血漿中検出。ｍｉＲ−２０８ａ（Ａ）およびｍｉＲ−１（Ｂ）の２種の筋特異的ｍｉＲＮＡの血漿中検出から、これらのｍｉＲＮＡのレベルは、ダール高血圧ラットにおいてａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に対する応答を示さないことが明らかにされる。
【図６】ａｎｔｉｍｉＲ治療後の分子有効性を実証する心臓組織マーカー。分析はすべて、４％高食塩（ＨＳ）食開始８週間後およびａｎｔｉｍｉＲ治療開始７週間後に行った。Ａ．指定群における心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａのリアルタイムＰＣＲ分析。Ｂ．リアルタイムＰＣＲ分析から、ＨＳ食は、Ｍｙｈ６発現を低減し、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、この低減を予防することが示される。コントロールオリゴヌクレオチドによる治療は、Ｍｙｈ６発現のＨＳ食起因性減少に影響を及ぼさない。Ｃ．リアルタイムＰＣＲ分析から、ＨＳ食は、Ｍｙｈ７発現を増加させ、ａｎｉｔｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドによる治療は、この増加を低減することが示される。
【図７】ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド（１０１０１）、コントロールオリゴヌクレオチド（１０５９１）、または生理食塩水で治療された高血圧症起因性心不全のラットにおいて、疾患進行と共にｍｉＲ−１６（Ａ）、ｍｉＲ−１９ｂ（Ｂ）、ｍｉＲ−４２３−５ｐ（Ｃ）、およびｍｉＲ−４９９（Ｄ）についてリアルタイムＰＣＲにより測定された血漿中ｍｉＲＮＡレベルを示す経時変化データ。
【図８】治療群のそれぞれについて高食塩食での体重対指定週数を示す折れ線グラフ。パネルＡは、すべての治療群について経時的に体重を示しており、パネルＢは、治療群の一部を示している。＃は、ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５の有意性であることを示す。体重グラフは、試験終了前に死亡したラットの最終体重のキャリーオーバーにより作成した。
【図９】ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、高食塩食のダール食塩感受性ラットの生存率を改善する。指定の治療を受けたダール高血圧ラットモデルにおけるカプラン・マイヤー生存曲線。ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／１．５ｍｇ／ｋｇカプトプリル群の両方で６％高食塩（ＨＳ）食に応答して生存率の顕著な減少が観測されるが、これは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１Ｇ１）治療に応答して有意に改善される。低食塩（ＬＳ）コントロールでもＨＳ／Ｍ−１０１０１治療ラットでも、死亡は観測されなかった。＊ｐ＜０．０５対Ｍ−１０１０１単独。
【図１０】指定の治療群のラットの心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａ（Ａ）、ｍｉＲ−４９９（Ｂ）、およびｍｉＲ−２０８ｂ（Ｃ）のリアルタイムＰＣＲ分析。＃ｐ＜０．０５対ＬＳ／生理食塩水、＊ｐ＜０．０５対ＨＳ／生理食塩水。
【図１１】指定の治療群のラットの心臓組織中のαＭＨＣ（Ｍｙｈ６、Ａ）、Ｍｙｈ７ｂ（Ｂ）、βＭＨＣ（Ｍｙｈ７、Ｃ）のリアルタイムＰＣＲ分析。＃ｐ＜０．０５対ＬＳ／生理食塩水、＊ｐ＜０．０５対ＨＳ／生理食塩水。
【図１２】指定の治療群のラットの心臓組織中のｍｉＲ−２０８の直接標的遺伝子Ｄｙｎｌｔ１（Ａ）、Ｖｃｐｉｐ（Ｂ）、およびＴｅｇｔ（Ｃ）のリアルタイムＰＣＲ分析。＃ｐ＜０．０５対ＬＳ／生理食塩水、＊ｐ＜０．０５対ＨＳ／生理食塩水。
【図１３】指定の治療群のラットのｍｉＲ−４２３−５ｐ（Ａ）、ｍｉＲ−１０６ｂ（Ｂ）、ｍｉＲ−１６（Ｃ）、ｍｉＲ−９２ａ（Ｄ）、ｍｉＲ−３７８（Ｅ）、ｍｉＲ−２１０（Ｆ）、ｍｉＲ−３７８＊（Ｇ）、ｍｉＲ−２０ｂ（Ｈ）、およびｍｉＲ−９３（Ｉ）の血漿中レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。これらのｍｉＲＮＡの血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療およびカプトプリル治療の両方の有効性と相関した。
【図１４】指定の治療群のラットのｍｉＲ−１９ｂ（Ａ）、ｍｉＲ−２２３（Ｂ）、ｍｉＲ−２１（Ｃ）、およびｍｉＲ−１５０（Ｄ）の血漿中レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−２２３の血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド療法の有効性と相関するように思われ、一方、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１５０の血漿中レベルは、カプトプリル療法の有効性と相関するように思われた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、部分的には、１種以上のｍｉＲＮＡのレベルが、心臓障害に対する治療的介入の治療有効性の指標としてまたは心不全などの心臓障害の重症度もしくは疾患進行を評価する指標として使用可能であるという驚くべき発見に基づく。いくつかの実施態様において、本発明は、心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価および／またはモニターする方法を提供する。この方法は、治療的介入を受けた患者からの生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定する工程と、測定されたレベルを参照レベルまたはコントロールサンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルと比較する工程と、を含み得る。少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルは、治療的介入の治療有効性の指標となる。ある種の実施態様において、本方法は、生物学的サンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルに基づいて治療的介入を変更することをさらに含む。
【００１６】
したがって、本発明の方法の一態様は、生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの測定または検出を提供する。いくつかの実施態様において、レベルの測定または検出が行われるｍｉｃｒｏＲＮＡは、イントロンに埋め込まれたｍｉＲＮＡである。いくつかの実施態様において、レベルの測定または検出が行われるｍｉｃｒｏＲＮＡは、心臓組織中で発現される。特定の実施態様において、レベルの測定が行われるｍｉｃｒｏＲＮＡは、表１〜４のいずれか１つに列挙されたｍｉｃｒｏＲＮＡから選択される。ある種の実施態様において、表２〜４のいずれか１つから選択される一群のｍｉｃｒｏＲＮＡ中の各ｍｉｃｒｏＲＮＡのレベルが測定される。たとえば、本方法のいくつかの実施態様において、表１〜４の１つ以上から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、１０種以上、１５種以上、２０種以上、２５種以上、３０種以上、３５種以上、４０種以上、５０種以上、６０種以上、７０種以上、８０種以上、または９０種以上のｍｉｃｒｏＲＮＡが測定される。特定の実施態様において、表４から選択される１種以上のｍｉｃｒｏＲＮＡまたは一群のｍｉｃｒｏＲＮＡのレベルが測定される。
【００１７】
いくつかの実施態様において、２０種未満、１５種未満、１０種未満、または５種未満の一群のｍｉＲＮＡが試験され、この一群は、表１〜４のいずれか１つからの１種、２種、３種、４種、または５種のｍｉＲＮＡを含む。患者が心不全であると推測される場合および／または治療を必要とすると推測される場合、この一群は、表１に列挙されたｍｉＲＮＡを含み得る。患者が心不全の治療を受けている場合、この一群は、表２、３、または４から選択されるｍｉＲＮＡを含み得る。
【００１８】
サンプル中のマイクロＲＮＡ量の測定または検出は、当業者に公知の任意の方法で実施可能であり、ｍｉＲＮＡのレベルを測定または検出する技術は、周知であり、容易に利用可能である。ｍｉＲＮＡを検出するための種々の方法は、記載されており、ノーザンブロッティング法、マイクロアレイ法、電気化学的方法（ｍｉＲＮＡにライゲートされたナノ粒子の酸化）、生物発光法、生物発光タンパク質再集合法、ＢＲＥＴに基づく方法（ＢＲＥＴ：生物発光共鳴エネルギー移動）、ＲＴ−ＰＣＲ法、蛍光相関分光法、および表面増強ラマン分光法を含む（たとえば、Cissell, . A. and Deo, S. K., Trends in microRNA detection, Anal. Bioanal. Chenx, 394: 1109-1116 (2009)を参照されたい。その全体について参照により本明細書に援用する）。
【００１９】
また、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いてｍｉｃｒｏＲＮＡの検出および定量に使用し得るAmbion, U.S.A.から入手可能なqRT-PCR miRNA Detection Kitなどの市販のキットが存在する。成熟ｍｉＲＮＡの短い長さを補償するために標的特異的ステムループ逆転写プライマーを利用するTaqMan MicroRNA Assaysもまた、Applied Biosystems（Life Technologies, Inc., USA）から入手可能である。OriGene, Inc. (USA)から市販されているqSTAR MicroRNA Detection Assaysを使用することも可能である。
【００２０】
１８ヌクレオチド以上のｍｉＲＮＡを単離するために、Qiagen, USAから入手可能なPAXgene Blood miRNA Kit（これはシリカベースのＲＮＡ精製技術を使用する）などの他の市販のキットを利用することが可能である。ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、SYBR GreenベースのリアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲＮＡの検出を可能にする三成分系のmiScript PCR Systemは、単一のサンプルから成熟ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ、およびｍＲＮＡのすべてを定量すべく利用可能である（同様にQiagen, USAから入手可能）。GeneCopoeiaは、ｍｉＲＮＡの定量のためにSYBR Greenと組み合わされたＲＴ−ＰＣＲの使用に基づく市販のキット（GeneCopoeia, Inc., USAから入手可能なAll-in-One (商標） miRNA qRT-PCR Detection Kit）を利用可能にしている。Life Technologies, Inc. (USA)から入手可能なmirVANAは、低分子ＲＮＡを単離すべくガラス繊維フィルター（ＧＦＦ）ベースの方法を利用する。
【００２１】
また、ｍｉＲＮＡを検出する方法は、ハイブリダイゼーションに基づく技術プラットフォームおよび複数のｍｉｃｒｏＲＮＡの同時検出を可能にする大規模並列次世代低分子ＲＮＡ配列決定法を含み得る。ハイブリダイゼーションに基づく市販の技術の１つは、標識分岐ＤＮＡにより提供されるシグナル増幅を用いたサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを利用する（Panomics）。ハイブリダイゼーションに基づく他の技術は、Nanostring Technology（nCounter miRNA Expression Assay）から入手可能であり、この場合、蛍光標識配列タグを用いて複数のｍｉＲＮＡ配列が検出および識別される。次世代配列決定法の例は、Life Technologies（SOLiDプラットフォーム）およびIllumina, Inc.から入手可能である。
【００２２】
また、ｍｉＲＮＡは、低分子ＲＮＡ分子を単離するための当技術分野で記載される方法により単離可能である（たとえば、米国特許出願公開第２０１００２９１５８０号、米国特許出願公開第２０１００２２２５６４号、米国特許出願公開第２００６００１９２５８号、米国特許出願公開第２０１１００５４００９号、および米国特許出願公開第２００９００２３１４９号を参照されたい。これらはすべて、その全体について参照により本明細書に援用する。）。
【００２３】
サンプルからｍｉＲＮＡを単離する他の方法は、次の工程、すなわち、ａ）ｍｉＲＮＡを有するサンプルを取得する工程、ｂ）抽出溶液をサンプルに添加する工程、ｃ）抽出されたサンプルにアルコール溶液を添加する工程、ｄ）サンプルを無機またはポリマーの担体に適用する工程、およびｅ）イオン溶液を用いてｍｉＲＮＡを含むＲＮＡを無機担体またはポリマー担体から溶出させる工程を含む方法を利用することを含む。サンプルからｍｉＲＮＡ分子を単離する他の手順は、ａ）アルコール溶液をサンプルに添加すること、ｂ）サンプルを無機またはポリマーの固体担体に適用すること、ｃ）イオン溶液を用いてｍｉＲＮＡ分子を担体から溶出させること、およびｄ）ｍｉＲＮＡ分子を使用または特性解析することを含み得る。（米国特許出願公開第２０１００２２２５６４号を参照されたい。その全体について参照により本明細書に援用する。）
【００２４】
ｍｉＲＮＡはまた、ｍＲＮＡからｍｉＲＮＡを分離することを含む方法、たとえば、米国特許出願公開第２００６００１９２５８号（その全体について参照により本明細書に援用する）に記載の方法により単離することが可能である。この方法は、ａ）５’キャップ構造を有するｍＲＮＡと５’リン酸を有する低分子ＲＮＡとを含む生物学的単離物を提供する工程、ｂ）標識部分が５’キャップ構造よりも５’リン酸に優先的に付加されて標識された低分子ＲＮＡを生成する条件下で、標識部分を有するリン酸反応性試薬に単離物を接触させる工程、およびｃ）標識の存在により低分子ＲＮＡをｍＲＮＡと識別する工程を含む。
【００２５】
ｍｉｃｒｏＲＮＡを単離および／または定量する方法の例は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの少なくとも一部を蛍光核酸（蛍光プローブ）とハイブリダイズさせること、ハイブリダイズされたｍｉｃｒｏＲＮＡを蛍光試薬と反応させて、ハイブリダイズされたｍｉｃｒｏＲＮＡが蛍光を発するようにすること、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの少なくとも一部を放射性標識された相補的核酸にハイブリダイズさせること、を含み得るが、これらに限定されるものではない。ｍｉＲＮＡの蛍光標識および検出のための市販の製品が存在する。NCode miRNA Rapid Labeling SystemおよびNCode Rapid Alexa Fluor 3 miRNA Labeling Systemは両方とも、Life Technologies, Inc. (USA)から市販されている。さらに、蛍光標識は、市販されており、Alexa Fluor 3、Alexa Fluor 5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、およびAlexa Fluor 750を含む、Life Technologies, Inc. (USA)から入手可能なMolecular Probes Alexa Flour染料を含み得る。Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7を含むLumiprobes Cy染料。DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 750、およびDyLight 800を含む、ThermoScientific(USA)から入手可能なDyLightフルオロフォア。FluoProbesは、FluoProbes 390、FluoProbes 488、FluoProbes 532、FluoProbes 547H、FluoProbes 594、FluoProbes 647H、FluoProbes 682、FluoProbes 752、およびFluoProbes 782を含む。
【００２６】
また、ロックド核酸プローブを利用することも可能である。たとえば、miRCURY LNA microRNA ISH Optimization Kits (FFPE)は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出を提供する。このキットは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用可能なdouble DIG*-labeled miRCURY LNA(商標） microRNA Detectionを利用し、Exiqon (USA and Denmark)から市販されている。
【００２７】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡを検出するためのプローブは、一本鎖デオキシリボ核酸分子、一本鎖リボ核酸分子、一本鎖ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または一本鎖ロックド核酸（ＬＮＡ）を含めて、一本鎖分子を含み得る。いくつかの実施態様において、プローブは、プローブがｍｉＲＮＡを検出し得るように、実質的に相補的であり、たとえば、検出されるｍｉＲＮＡの相補体に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％、または１００％の同一性である。いくつかの実施態様において、プローブは、プローブがｍｉＲＮＡの相補体を検出し得るように、ｍｉＲＮＡに実質的に同一、すなわち、ｍｉＲＮＡに対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性である。いくつかの場合には、プローブは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチドである。いくつかの場合には、プローブは、２５ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、または１２５ヌクレオチド以下の長さであり得る。いくつかの実施態様において、プローブは、ｍｉＲＮＡの少なくとも５連続ヌクレオチド、たとえば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、および２２、またはそれ以上の連続ヌクレオチドに実質的に相補的または実質的に同一である。いくつかの実施態様において、プローブは、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５０〜１００、または１００超の連続ヌクレオチド長であり得る。
【００２８】
いくつかの好ましい実施態様において、ｍｉＲＮＡを検出する方法は、リアルタイムＰＣＲ法、ｍｉＲＮＡ  Ｔａｑｍａｎアレイカード法、およびノーザンブロット分析法を含む。いくつかの実施態様において、検出されるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ  −３４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ（ｍｉＲ−１２６＊）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−��ｉＲ−１３９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、またはそれらの組合せを含む。他の実施態様において、検出されるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、またはそれらの任意の組合せを含む。さらに他の実施態様において、検出されるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５０、またはそれらの組合せを含む。
【００２９】
心臓障害に対する治療的介入の治療有効性の指標として使用するために、ｍｉＲＮＡのレベルを決定しなければならない。患者サンプル中のｍｉｃｒｏＲＮＡの量は、心臓障害（たとえば心不全）の患者または健常集団（たとえば、そのそれぞれは参照レベルとして参照され得る）に存在するｍｉｃｒｏＲＮＡの標準量と比較することが可能である。他の実施態様において、レベルは、コントロールサンプル（心臓障害対象からでないサンプル）中のｍｉｃｒｏＲＮＡの量と比較され、または治療的介入による治療前の患者から採取されたサンプル中もしくは未治療患者から採取されたサンプル中のｍｉｃｒｏＲＮＡの量と比較される。ｍｉｃｒｏＲＮＡの標準レベルは、あらかじめ決められた参照値または閾値を得るために、正常な健常コントロール対象から取得した十分に多数のサンプル中のｍｉｃｒｏＲＮＡのレベルを決定することにより、決定可能である。本明細書で用いられる場合、「参照値」とは、既知のサンプルから確認されたｍｉＲＮＡのレベルまたは濃度のあらかじめ決められた値を意味する。
【００３０】
標準レベルはまた、治療的介入による治療前の患者からのサンプル中のｍｉｃｒｏＲＮＡのレベルを決定することにより、決定することも可能である。さらに、標準レベルの情報および標準レベルの決定方法は、公用データベースさらには他の供給源から取得可能である。（たとえば、Bunk, D.M., “Reference Materials and Reference Measurement Procedures: An Overview from a National Metrology Institute,“” Clin. Biochem. Rev., 28(4): 131-137 (2007)、およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Twenty First Edition (2005)を参照されたい。）。いくつかの実施態様において、サンプル中に通常は存在しない既知量の他のｍｉＲＮＡをサンプルに添加し（すなわち、サンプルを既知量の外因性ｍｉＲＮＡでスパイクし）、スパイクされたｍｉＲＮＡの既知量に基づいて、目標の１種以上のｍｉＲＮＡのレベルを計算する。１種以上のｍｉＲＮＡの測定されたレベルと、参照量またはコントロールサンプル中の１種以上のｍｉＲＮＡのレベルと、の比較は、当業者に公知の任意の方法により実施可能である。たとえば、サンプル中のｍｉｃｒｏＲＮＡの量と標準量との比較は、５Ｓ  ｒＲＮＡ（またはスパイクされたｍｉＲＮＡ）とサンプル中のｍｉＲＮＡとの比を、５Ｓ  ｒＲＮＡ（またはスパイクされたｍｉＲＮＡ）とコントロールサンプル中のｍｉＲＮＡとの発表されたまたは既知の比と比較することを含む。ｍｉｃｒｏＲＮＡの量をコントロールと比較する場合、コントロールサンプルは、心臓障害に罹患していないことがわかっている任意の供給源から取得可能である。治療的介入が施された後の患者から採取されたサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルはまた、治療的介入の施行前の患者から採取されたサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルと比較することも可能である。
【００３１】
本発明によれば、いくつかの実施態様において、コントロールサンプル（たとえば、治療前の患者もしくは未治療の患者のサンプル）中のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの差（増加または減少）は、治療的介入の治療有効性の指標となる。いくつかの実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの増加は、治療的介入の治療有効性の指標となる。たとえば、そのような実施態様において、表３または４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルが、治療的介入に応答してコントロールサンプル中のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較して増加した場合、増加は、治療的介入の治療有効性の指標となる。ある種の実施態様において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１４から選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルが、治療的介入に応答してコントロールサンプル中のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較して増加した場合、増加は、治療的介入の治療有効性の指標となる。
【００３２】
本発明によれば、いくつかの実施態様において、コントロールサンプル（たとえば、治療前の患者もしくは未治療の患者のサンプル）中のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの低下または減少は、治療的介入の治療有効性の指標となる。たとえば、そのような実施態様において、表２または４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルが、治療的介入に応答してコントロールサンプル中のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較して減少した場合、減少は、治療的介入の治療有効性の指標となる。ある種の実施態様において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａｍｉＲ−  １５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９９から選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルが、治療的介入に応答してコントロールサンプル中のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較して減少した場合、減少は、治療的介入の治療有効性の指標となる。
【００３３】
サンプリング法は、当業者に周知であり、いかなるタイプの生物学的サンプルを取得するためのいかなる適合技術も、可能と考えられ、本発明の方法で利用可能である。（たとえば、Clinical Proteolytics: Methods and Protocols, Vol. 428 in Methods in Molecular Biology, Ed. Antonia Vlahou (2008)を参照されたい。）サンプルは、ｍｉＲＮＡが単離され得る任意の生物学的サンプルを含み得る。そのようなサンプルは、血清、血液、血漿、全血、およびそれらの派生物、心臓組織、皮膚、毛髪、毛嚢、唾液、口腔粘液、膣粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精漿、前立腺液、射精前液（カウパー液）、排泄物、生検試料、腹水、脳脊髄液、リンパ液、心臓組織、さらには他の組織抽出物サンプルまたは生検試料を含み得る。いくつかの実施態様において、生物学的サンプルは、血漿または血清である。他の実施態様において、生物学的サンプルは、心臓組織である。
【００３４】
開示された方法で使用するための生物学的サンプルは、治療的介入開始後の任意の時点で患者から取得可能である。いくつかの実施態様において、サンプルは、治療的介入開始の少なくとも１、２、３、または６ヶ月後に取得される。いくつかの実施態様において、サンプルは、治療的介入開始の少なくとも１、２、３、４、６、または８週間後に取得される。いくつかの実施態様において、サンプルは、治療的介入開始の少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日後に取得される。いくつかの実施態様において、サンプルは、治療的介入開始の少なくとも１時間、６時間、１２時間、１８時間、または２４時間後に取得される。他の実施態様において、サンプルは、治療的介入開始の少なくとも１週間後に取得される。いくつかの実施態様において、表２〜４のいずれか１つから選択される１種以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのｍｉＲＮＡベースの治療剤（たとえば、ａｎｔｉ−ｍｉＲ治療剤）の投与の１〜８週間後に測定される。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡの１種以上は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ治療の２〜７週間後に血漿サンプルで測定される。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡの１種以上は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ治療の１、２、３、４、５、６、７、または８週間後に血漿サンプルで測定される。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡの１種以上は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ治療の７週間後に血漿サンプルで測定される。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡの１種以上は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ治療の２週間後に血漿サンプルで測定される。
【００３５】
本発明の方法により可能と考えられるｍｉｃｒｏＲＮＡを検出するために、分析用サンプルは、いくつかの実施態様において、約１ｎｇ〜約１００ｎｇのＲＮＡを含有し得る。いくつかの実施態様において、サンプルは、約１０ｎｇ〜約９０ｎｇのＲＮＡを含有する。いくつかの実施態様において、サンプルは、約２０ｎｇ〜約８０ｎｇを含有する。本発明の方法により可能と考えられるｍｉｃｒｏＲＮＡを検出するために、分析用サンプルはまた、０．１〜１０μｌの血漿中ＲＮＡ等価物（多量の血漿から精製されたＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの場合には、分析用サンプルは、０．５μｌ〜５μｌの血漿中ＲＮＡ等価物（多量の血漿から精製されたＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの場合には、分析用サンプルは、約０．１μｌ、０．５μｌ、１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、または１０μｌの血漿中ＲＮＡ等価物（多量の血漿から精製されたＲＮＡ）を含有し得る。
【００３６】
本発明の方法はまた、治療的介入の治療レジメンを変更する方法を含み得る。そのような方法は、治療的介入を受けた患者からの生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、たとえば、表２〜４のいずれか１つに列挙された１種以上のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、前記生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少に基づいて治療レジメンを変更することと、を含む。いくつかの実施態様において、本方法は、表２〜４の１つ以上に列挙された２、３、４、５、１０種、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ（たとえば、すべてのｍｉＲＮＡを含む）を検出することを含む。いくつかのそのような実施態様において、ｍｉＲＮＡは、カスタマイズされた検出プラットフォームを用いて検出され、その際、表２〜４のｍｉＲＮＡを含めて、１００種未満、５０種未満、または２５種未満のｍｉＲＮＡが検出される。治療レジメンの変更は、治療的介入のタイプ、治療的介入の施行時の投与量、治療的介入の施行頻度、治療的介入の施行経路、さらには変化および／または改変することが医師に周知と思われる任意の他のパラメーターを変化および／または改変することを含み得るが、これらに限定されるものではない。たとえば、表２のｍｉＲＮＡが治療中に減少するもしくは参照レベルに一致する場合およびまたは表３のｍｉＲＮＡが治療中に増加するもしくは参照レベルに一致する場合、治療的介入は継続される。いくつかの実施態様において、表２のｍｉＲＮＡが治療中に減少もせず参照レベルにも一致しない場合および／または表のｍｉＲＮＡが治療中に増加もせず参照レベルにも一致しない場合、治療的介入は変更される。
【００３７】
ある種の実施態様において、一群のｍｉＲＮＡは、表１〜４の１つから決定され、この一群は、分類アルゴリズムに基づいて分類される。たとえば、サンプルは、記載の閾値に基づいて、または１つの集団でもしくは１つの集団対他の集団で平均値および／もしくは中央値のｍｉＲＮＡレベルに基づいて、分類可能である（たとえば、健常コントロール集団および心不全患者集団、または有効治療対無効治療に基づくレベル）。
【００３８】
２つ以上のクラス間または群間でサンプルを分類するための種々の分類方式が知られており、限定されるものではないが、これらには、主成分分析法、ナイーブベイズ法、サポートベクターマシン法、最近傍法、決定木法、ロジスティック法、人工ニューラルネットワーク法、ペナルティー付きロジスティック回帰法、およびルールベース方式が含まれる。それに加えて、複数のモデルからの予測を組み合わせて全体の予測を生成することが可能である。したがって、分類アルゴリズムまたは「クラス予測」は、サンプルが分類されるように組立て可能である。好適なクラス予測の作製プロセスは、R. Simon, Diagnostic and prognostic prediction using gene expression profiles in high-dimensional microarray data, British Journal of Cancer (2003) 89, 1599-1604に概説されており、その概説はその全体について参照により本明細書に援用する。
【００３９】
いくつかの実施態様において、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少に関する情報は、治療的介入による治療の治療有効性を決定したり、さらには治療的介入の治療レジメンを調整したりするために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、治療的介入を継続するかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、治療的介入を中断するかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、治療的介入を改変するかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、治療的介入の投与量を増加または減少させるかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、治療的介入の投与頻度を変化させるかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、治療的介入の施行の回数または頻度を変化させるかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、１日あたり、１週間あたりの投与回数、１日間あたりの回数を変化させるかを決定するために使用可能である。いくつかの実施態様において、治療有効性は、投与量を変化させるかを決定するために使用可能である。
【００４０】
本発明の方法はまた、心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするのに有用な情報を提供する方法を提供する。この方法は、患者の生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、たとえば、表２〜４のいずれか１つに列挙された１種以上のｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少に基づいて有効性の決定を提供するエンティティーに少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを提供することと、を含み得る。
【００４１】
「治療有効性の指標となる」という表現およびその変形表現は、治療的介入が患者に利点を提供することを決定する任意の方法を含み得る。「治療有効性」という用語およびその変形語は、一般的には、心臓障害に関連付けられる１つ以上の徴候または症状の軽減により表され、治療される心臓障害の１つ以上の徴候または症状の軽減は、当業者であれば容易に決定可能である。また、「治療有効性」とは、心臓障害に対する標準的な治療的介入に典型的に関連付けられる毒性の徴候および症状の予防または改善をも意味し得る。治療有効性を決定する方法は、治療される心臓障害に特異的であってもよく、治療が心臓障害患者に有益な効果を提供することを決定する当技術分野で周知の任意の方法を含み得る。たとえば、治療有効性の証拠は、対象の心臓肥大、心不全、もしくは心筋梗塞の１つ以上の症状の改善もしくは軽減、または心臓肥大から心不全への移行の遅延を含み得るが、これらに限定されるものではない。１つ以上の改善または軽減される症状は、たとえば、運動能力増加、心駆出量増加、左室拡張末期圧低下、肺毛細血管楔入圧低下、心拍出量増加、心係数増加、肺動脈圧低下、左室の収縮末期および拡張末期の大きさの減少、心臓線維化減少、心筋中のコラーゲン堆積減少、左・右室壁ストレス減少、壁張力低下、生活の質の向上、および疾患関連の罹患率または死亡率の低下を含み得る。さらに、治療有効性はまた、患者の全身の健康状態の全体的改善、たとえば、患者の生活の質の向上、予測生存率の増加、抑鬱症の減少、または適応症の再発率の減少を含み得るが、これらに限定されるものではない。（たとえば、Physicians' Desk Reference (2010)を参照されたい。）
【００４２】
治療的介入の有効性はまた、対照の心臓肥大、心不全、もしくは心筋梗塞の１つ以上の症状の改善、または心臓肥大から心不全への移行の遅延のために、評価またはモニターすることを含み得る。１つ以上の改善される症状は、たとえば、運動能力増加、心駆出量増加、左室拡張末期圧低下、肺毛細血管楔入圧低下、心拍出量増加、心係数増加、肺動脈圧低下、左室の収縮末期および拡張末期の大きさの減少、心臓線維化減少、心筋中のコラーゲン堆積減少、左・右室壁ストレス減少、壁張力低下、生活の質の向上、および疾患関連の罹患率または死亡率の低下を含み得る。いくつかの実施態様において、血漿中ｍｉＲＮＡ（たとえば、表２〜４に列挙されたｍｉＲＮＡのいずれか）の測定されたレベルは、治療的介入の有効性のサロゲートマーカーとして機能する。
【００４３】
本明細書に記載の組成物のいずれかは、キットに含まれ得る。一実施態様において、キットは、生物学的サンプル中の表２〜４のいずれか１つから選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための説明書と、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルに基づいて患者における心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするための説明書と、を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、表２もしくは３の１つまたは表２および３から合計で、少なくとも２、３、４、５、１０、または２０種のｍｉＲＮＡ（またはそれ以上）のレベルを測定するための試薬を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、心不全に対する治療の有効性を決定するようにカスタマイズされ、その際、表２および３のｍｉＲＮＡを含めて、５０種以下、４０種以下、３０種以下、または２５種以下のｍｉＲＮＡを決定するための試薬を提供する。
【００４４】
いくつかの実施態様において、キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１４から選択される１種以上のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上を測定するための説明書と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上のレベルに基づいて患者における心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするための説明書と、を含有する。特定の実施態様において、キットは、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５０から選択される１種以上のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上を測定するための説明書と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上のレベルに基づいて患者における心臓障害を治療するための治療的介入の有効性を評価またはモニターするための説明書と、を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、およびそれらの組合せから選択されるｍｉＲＮＡの逆転写または増幅のためのｍｉＲＮＡ特異的プライマーを含有する。
【００４５】
いくつかの実施態様において、キットは、ｍｉＲＮＡベースの治療剤の治療有効性の指標となる生物学的サンプル中の１種以上のｍｉＲＮＡを測定するための試薬を含有する。たとえば、一実施態様において、キットは、生物学的サンプル中のｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂおよびｍｉＲ−９３から選択される１種以上のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上を測定するための説明書と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上のレベルに基づいて患者における心臓障害を治療するためのｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を評価またはモニターするための説明書と、を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、表２もしくは３の１つまたはまとめて表２および３から少なくとも２、３、４、５、１０、または２０種のｍｉＲＮＡ（またはそれ以上）のレベルを測定するための試薬を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、心不全に対する治療の有効性を決定するようにカスタマイズされ、その際、表２および３のｍｉＲＮＡを含めて、５０種以下、４０種以下、３０種以下、または２５種以下のｍｉＲＮＡを決定するための試薬を提供する。
【００４６】
他の実施態様において、キットは、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤などの標準治療剤の治療有効性の指標となる生物学的サンプル中の１種以上のｍｉＲＮＡを測定するための試薬を含有する。たとえば、一実施態様において、キットは、生物学的サンプル中のｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３から選択される１種以上のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上を測定するための説明書と、これらのｍｉＲＮＡの１つ以上のレベルに基づいて患者における心臓障害を治療するためのＡＣＥ阻害剤の有効性を評価またはモニターするための説明書と、を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、表２もしくは３の１つまたは表２および３から合計で、少なくとも２、３、４、５、１０、または２０種のｍｉＲＮＡ（またはそれ以上）のレベルを測定するための試薬を含有する。いくつかの実施態様において、キットは、心不全に対する治療の有効性を決定するようにカスタマイズされ、その際、表２および３のｍｉＲＮＡを含めて、５０種以下、４０種以下、３０種以下、または２５種以下のｍｉＲＮＡを決定するための試薬を提供する。
【００４７】
いくつかの実施態様において、キットは、１種以上の標準化コントロールをさらに含有し得る。いくつかの他の実施態様において、１種以上の標準化コントロールは、サンプルまたは反応にスパイクするための１種以上の個別の試薬として提供される。標準化コントロールは、約０．１ｆｍｏｌ〜約５ｍｏｌの範囲内で添加可能である。いくつかの実施態様において、標準化コントロールは、約０．１ｆｍｏｌ、０．５ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、２ｆｍｏｌ、３ｆｍｏｌ、４ｆｍｏｌ、または５ｆｍｏｌで添加される。いくつかの実施態様において、少なくとも１種の標準化コントロールは、非内因性のＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたはサンプル中で発現されないｍｉＲＮＡである。いくつかの実施態様において、少なくとも１種の標準化コントロールは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施態様において、少なくとも１種の標準化コントロールは、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２、ｃｅｌ−ｌｉｎ−４、またはａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａである。いくつかの実施態様において、使用したＣ．エレガンス配列は、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２（ＵＡＵＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＧＡＵＧＵＧＣ、配列番号５）、およびｃｅｌ−ｌｉｎ−４（ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＡ、配列番号６）であった。使用したａｔｈ−ｍｉＲ１５９ａの配列は、（ＵＵＵＧＧＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＧＣＵＣＵＡ、配列番号７）であった。
【００４８】
いくつかの実施態様において、キットは、キットの各ｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎプローブをさらに含有し得る。いくつかの実施態様において、ＴａｑＭａｎプローブは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１４よりなる群から選択されるｍｉＲＮＡに特異的である。
【００４９】
いくつかの実施態様において、キットは、心臓障害の治療を受けた患者からの生物学的サンプルで使用可能と考えられる。さらなる実施態様において、生物学的サンプルは、心臓障害の治療を受けた患者から取得した血漿または血清である。そのほかのさらなる実施態様において、心臓障害は、心筋梗塞、病的心肥大、心不全、または高血圧である。
【００５０】
キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化し得る。キットの容器手段は、一般的には、成分を配置し得る、好ましくは好適に分注し得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器手段を含むであろう。キット中に１つ以上の成分が存在する場合、キットはまた、一般的には、追加成分を個別に配置し得る第２、第３、または他の追加容器を含有するであろう（たとえば、無菌の薬学的に許容可能な緩衝液および／または他の希釈剤）。しかしながら、成分の種々の組合せは、１つのバイアル中に含まれ得る。本発明のキットはまた、典型的には、核酸を収容するための手段および商業販売のために厳重に密閉された任意の他の試薬容器を含むであろう。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
【００５１】
キットの成分が１つおよび／または複数の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水性溶液であり、無菌水性溶液は特に好ましい。
【００５２】
しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加により再構成可能である。溶媒はまた、他の容器手段中に提供し得ると考えられる。
【００５３】
そのようなキットはまた、試薬を保存もしくは維持するまたは分解から保護する成分を含み得る。そのような成分は、ＤＮＡｓｅフリー、ＲＮＡｓｅフリーであってもよく、またはヌクレアーゼ（たとえば、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅ）から保護されていてもよい。そのようなキットは、一般的には、好適な手段で、それぞれ個々の試薬または溶液に対して個別の容器を含むであろう。
【００５４】
キットはまた、キット成分の利用さらにはキットに含まれない他のいずれかの試薬の使用のための説明書を含むであろう。説明書は、実施可能な変形態様を含み得る。
【００５５】
そのような試薬は、本発明のキットの実施態様であると考えられる。しかしながら、そのようなキットは、以上に規定された特定の項目に限定されるものではなく、ｍｉＲＮＡの操作または特性解析に使用される任意の試薬を含み得る。
【００５６】
本発明の治療的介入は、心臓障害を治療するために使用される治療剤の任意の組合せを含み得る。例としては、ｍｉＲＮＡベースの治療剤（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）、抗高リポタンパク血症剤、抗動脈硬化剤、抗血栓剤／フィブリン溶解剤、血液凝固剤、抗不整脈剤、抗高血圧剤、昇圧剤、鬱血性心不全治療剤、抗狭心症剤、抗細菌剤、またはそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されるものではない。（たとえば、米国特許出願公開第２０１０／０３１７７１３号を参照されたい。その全体について参照により本明細書に援用する。）
【００５７】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、ｍｉＲＮＡベースの治療剤(therapeutic)である。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡベースの治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡベースの治療剤は、心臓組織で発現されるｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、治療的介入は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある種のそのような実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの変化は、心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現の減少の指標となる。そのような実施態様において、コントロールサンプル中の前記１種以上のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較される、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３から選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効性の指標となる。特定の一実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲ−１９ｂおよび／またはｍｉＲ−２２３のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較されるｍｉＲ−１９ｂおよび／またはｍｉＲ−２２３のレベルは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効性の指標となる。ある種の実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲ−１９ｂのレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較されるｍｉＲ−１９ｂのレベルの増加は、心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現の減少の指標となる。他の実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲ−２２３のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較されるｍｉＲ−２２３のレベルの減少は、心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現の減少の指標となる。
【００５８】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療剤は、少なくとも１つの化学修飾を有する（すなわち、オリゴヌクレオチドは化学修飾される）。たとえば、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の「配座拘束型」または二環式の糖ヌクレオシド修飾、たとえば「ロックド核酸」で構成され得る。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡベースの治療剤は、化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡベースの治療剤は、心臓組織で発現されるｍｉＲＮＡを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする。
【００５９】
ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂ  ｍｉｃｒｏＲＮＡは、国際公開第２００８／０１６９２４号パンフレット、国際公開第２００９／０１８４９２号パンフレット、および国際公開第２０１０／０９１２０４号パンフレットに記載されている。ヒトｍｉＲ−２０８ａの配列をコードするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、以下に配列番号８として示され、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列は、配列番号９において提供される（たとえば、米国特許出願公開２０１０／０２３２３４号（その全体について参照により本明細書に援用する）を参照されたい。）。ヒトｍｉＲ−２０８ｂの配列をコードするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、以下に配列番号１０として示され、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列は、配列番号１１に提供される。
【００６０】
ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号８）
ＡＣＧＧＧＣＧＡＧＣ  ＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧ  ＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴ  ＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧ  ＴＡＴＡＡＧＡＣＧＡ  ＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴ  ＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧ  Ａ
【００６１】
成熟ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号９）
ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＵＧＵ
【００６２】
ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ（配列番号１０）
ＣＣＵＣＵＣＡＧＧＧＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＣＵＣＧＡＡＵＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＡＵＣＣＧＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵＣＵＧＡＧＧＧＣＡＧ
【００６３】
成熟ｍｉＲ−２０８ｂ（配列番号１１）
ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ
【００６４】
ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡまたは他の修飾ヌクレオチドと、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドと、の組合せを含有し得る。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸骨格ではなくペプチド系骨格を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドが含有し得る他の化学修飾としては、糖修飾、たとえば、２’−Ｏ−アルキル（たとえば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾、ならびに骨格修飾、たとえば、１つ以上のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレートリンケージ（たとえば、米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号（それらの全体について参照により本明細書に援用する）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特定的には、より短い長さ（たとえば１５ヌクレオチド未満）のものは、１つ以上の親和性促進修飾、たとえば、ＬＮＡ、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’Ｏアルキル修飾などを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
いくつかの実施態様において、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含有し、その中心に少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドを有する２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。この「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ依存的分解機序を開始可能である。安定性を向上させかつ有効性を改善するアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、たとえば、米国特許第６，８３８，２８３号（その全体について参照により本明細書に援用する）に記載のものは、当技術分野で公知であり、本発明の方法で使用するのに好適である。ｍｉＲＮＡの活性の抑制に有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約５０ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長である。ある種の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜約１８ヌクレオチド長であり、他の実施態様において、約１２〜約１６ヌクレオチド長である。特定的には、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂに相補的な、すなわち、ｍｉＲの５’末端から出発して成熟配列の３’末端まで、ｍｉＲ−２０８ａ中またはｍｉＲ−２０８ｂ中の任意の連続配列に相補的な任意のａｎｔｉｍｉｒ配列の、任意の８ｍｅｒまたはそれよりも長いものを使用し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの場合、成熟ｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み得、たとえば、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有する。いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に実質的に相補的であり得る。すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有する。一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する配列を含む。
【００６６】
「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドに高い熱安定性を付与する「ロックされた（locked）」コンフォメーションをもたらすリボース糖部分の２’および４’炭素間に追加の架橋を含有する修飾リボヌクレオチドである。ＬＮＡは、たとえば、米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，３１６，１９８号、米国特許第６，４０３，５６６号、米国特許第６，７７０，７４８号、米国特許第６，９９８，４８４号、米国特許第６，６７０，４６１号および米国特許第７，０３４，１３３号（それらはすべて、その全体について参照により本明細書に援用する）に記載されている。ＬＮＡは、「ロックされた」コンフォメーションをもたらすリボース糖部分の２’および４’炭素間の追加の架橋を含む修飾ヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドに導入可能な他の好適なロックドヌクレオチドは、米国特許第６，８３３，３６１号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載のものを含む。
【００６７】
他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒである。「アンタゴｍｉｒ」とは、ｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖化学修飾リボヌクレオチドのことである。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル糖修飾などの１つ以上修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施態様において、アンタゴｍｉｒは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴｍｉｒはまた、部分的または完全なホスホロチオエート骨格を生じる１つ以上のホスホロチオエートリンケージを含み得る。たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を向上させるために、アンタゴｍｉｒは、コレステロールなどのステロイド、脂肪酸、ビタミン、炭水化物、ペプチド、または他の小分子リガンドに、その３’末端で連結することが可能である。ｍｉＲＮＡの阻害に好適なアンタゴｍｉｒは、約１５〜約５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１８〜約３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０〜約２５ヌクレオチド長である。「部分的に相補的」とは、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有する配列を意味する。アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有する。いくつかの実施態様において、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に実質的に相補的である。すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有する。他の実施態様において、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。
【００６８】
治療的介入はまた、以上に記載のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的化治療剤に加えて、他の標準的心臓治療剤を含む。これらの実施態様において、本発明の治療的介入は、抗高リポタンパク血症剤、抗動脈硬化剤、抗血栓剤／フィブリン溶解剤、血液凝固剤、抗不整脈剤、抗高血圧剤、昇圧剤、鬱血性心不全治療剤、抗狭心症剤、抗細菌剤、またはそれらの組合せを含み得る。たとえば、米国特許出願公開第２０１０／０３１７７１３号（その全体について参照により本明細書に援用する）を参照されたい。
【００６９】
一実施態様において、本発明は、生物学的サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することにより、ＡＣＥ阻害剤などの標準心臓治療剤の有効性を評価またはモニターする方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、ＡＣＥ阻害剤の投与を受けた患者からの生物学的サンプル中のｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することと、測定されたレベルをコントロールサンプル中の前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較することと、を含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルは、ＡＣＥ阻害剤の治療有効性の指標となる。他の実施態様において、本方法は、ＡＣＥ阻害剤の投与を受けた患者からの生物学的サンプル中のｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−１５０のレベルを測定することと、測定されたレベルをコントロールサンプル中のｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−１５０のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較することと、を含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルは、ＡＣＥ阻害剤の治療有効性の指標となる。
【００７０】
ある種の実施態様において、コントロールサンプル中の前記１種以上のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対する１種以上のｍｉＲＮＡの測定されたレベルは、併用療法の治療有効性の指標となる。併用療法は、２種以上のｍｉＲＮＡベースの治療剤、２種以上の標準治療剤、またはｍｉＲＮＡベースの治療剤と標準治療剤との組合せであり得る。たとえば、併用療法は、心臓で発現されるｍｉＲＮＡを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＡＣＥ阻害剤などの標準治療剤であり得る。特定の一実施態様において、併用療法は、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂを標的とする化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびカプトプリルなどのＡＣＥ阻害剤である。そのような実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡの１つ以上のレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、およびｍｉＲ−９３から選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドおよびＡＣＥ阻害剤（たとえば、カプトプリル）の併用療法の治療有効性の指標となる。いくつかの実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のレベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドおよびＡＣＥ阻害剤（たとえば、カプトプリル）の併用療法の治療有効性の指標となる。
【００７１】
さらに他の態様において、本発明は、心不全の患者を治療する方法を提供する。ただし、この患者は、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６（ｂ）、および／もしくはｍｉＲ−４２３−５ｐまたは表１に列挙されたアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされるマーカーの他の組合せ（たとえば、少なくとも２種の組合せ）の１つ以上がレベル（たとえば、血清中または血漿中のレベル）の上昇を有する。この態様によれば、患者は、従来療法（たとえばＡＣＥ阻害剤）を用いてまたは本明細書に記載のａｎｔｉ−ｍｉＲ治療戦略を用いて心不全の治療を受ける。いくつかの実施態様において、治療は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８（ａ）アンチセンス阻害剤またはａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８（ｂ）アンチセンス阻害剤を用いて行われる。ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６（ｂ）、および／またはｍｉＲ−４２３−５ｐのレベルは、治療前および／またはレジメンの有効性をモニターするために治療中に決定し得る。いくつかの実施態様において、治療剤はアンチセンスのａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８（ｂ）であり、ｍｉＲ−１９（ｂ）または表２〜４の１つ以上に列挙されたマーカーの組合せのレベルが治療中にモニターされる。いくつかの実施態様において、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８（ｂ）治療は、本明細書または米国仮出願第６１／４９５，２２４号（その全体について参照により本明細書に援用する）に記載のとおりである。たとえば、阻害剤は、１０〜１８ヌクレオチド（たとえば１６ヌクレオチド）のおよび／または他の化学モチーフに加えて９つのロックド核酸を含有するアンチセンス阻害剤であり得る。阻害剤は、米国仮出願第６１／４９５，２２４号に記載のＭ−１０１０１であってもよく、皮下に投与され得る。
【００７２】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、「抗高リポタンパク血症剤」として本明細書中において既知の、１種以上の血中の脂質および／またはリポタンパク質の濃度を低下させる作用剤の投与を含み、本発明の治療的介入の一部であり得る。
【００７３】
抗高リポタンパク血症剤の例としては、アシフラン、アザコステロール、ベンフルオレックス、ｐ−ベンザルブチルアミド、カルニチン、コンドロイチン硫酸、クロメストロン、デタキストラン、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、エリタデニン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、ペンタエリトリトールテトラアセテート、α−フェニルブチルアミド、ピロザジル、プロブコール（ロレルコ）、ｐ−シトステロール、スルトシル酸ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノール、およびキセンブシンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
いくつかの実施態様において、抗高リポタンパク血症剤は、アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体、樹脂／胆汁酸捕捉剤、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモンもしくは甲状腺ホルモン類似体、その他の作用剤、またはそれらの組合せをさらに含み得る。
【００７５】
アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体の例としては、ベクロブラート、ベンザフィブラート、ビニフィブラート、シプロフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブラート（アトロミドＳ）、クロフィブリン酸、エトフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル（ロビド）、ニコフィブラート、ピリフィブラート、ロニフィブラート、シンフィブラート、およびテオフィブラートが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
樹脂／胆汁酸捕捉剤の例としては、コレスチラミン（コリバー、クエストラン）、コレスチポール（コレスチド）、およびポリデキシドが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の例としては、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラボコール）、およびシンバスタチン（ゾコール）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
ニコチン酸誘導体の例としては、ニコチネート、アセプルモックス（aceplmox）、ニセリトロール、ニコクロナート、ニコモール、およびオキシニアシン酸が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
甲状腺ホルモンおよびその類似体の例としては、エトロキサート、チロプロープ酸、およびチロキシンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
抗動脈硬化剤の例としては、ピリジノールカルバメートが含まれ得るが、これに限定されるものではない。
【００８１】
いくつかの実施態様において、血餅の除去または予防を支援する作用剤の投与は、特にアテローム硬化症および血管（たとえば動脈）閉塞の治療で、モジュレーターと併用され得る。抗血栓剤および／またはフィブリン溶解剤の例としては、抗凝固剤、抗凝固剤アンタゴニスト、抗血小板剤、血栓溶解剤、血栓溶解剤アンタゴニスト、またはそれらの組合せが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
いくつかの実施態様において、抗血栓剤は、経口投与されるもの、たとえば、アスピリンおよびワルファリン（クマジン）などを含み得る。
【００８３】
抗凝固剤は、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロミンジオン、クロリンジオン、クメタロール、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクムアセテート、エチリデンジクマロール、フルインジオン、ヘパリン、ヒルジン、リアポレートナトリウム、オキサジジオン、ペントサンポリ硫酸、フェニンジオン、フェンプロクモン、ホスビチン、ピコタミド、チオクロマロール、およびワルファリンを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
抗血小板剤は、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（ペルサンチン）、ヘパリン、スルフィンピラノン（アンツラン）、およびチクロピジン（チクリド）を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
血栓溶解剤は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ）、およびアニストレプラーゼＡＰＳＡＣ（エミナーゼ）を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
他の実施態様において、対象が出血を生じているまたは出血の可能性が高い場合、血液凝固を増強し得る作用剤を利用することも可能である。血液凝固促進剤の例としては、血栓溶解剤アンタゴニストおよび抗凝固剤アンタゴニストが含まれる。
【００８７】
血栓溶解剤アンタゴニストは、アミノカプロン酸（アミカール）およびトラネキサム酸（アムスタット）を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
抗凝固剤アンタゴニストは、プロタミンおよびビタミンＫを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、抗血栓剤／フィブリン溶解剤である。抗血栓フィブリン溶解剤は、アナグレリド、アルガトロバン、シルスタゾール、ダルトロバン、デフィブロチド、エノキサパリン、フラキシパリン、インドブフェン、ラモパラン、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド、テデルパリン、チクロピジン、およびトリフルサルを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、抗不整脈剤である。抗不整脈剤は、クラスＩ抗不整脈剤（ナトリウムチャネルブロッカー）、クラスＩＩ抗不整脈剤（βアドレナリンブロッカー）、クラスＩＩＩ抗不整脈剤（再分極延長剤）、クラスＩＶ抗不整脈剤（カルシウムチャネルブロッカー）、およびその他の抗不整脈剤を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
ナトリウムチャネルブロッカーの例としては、クラスＩＡ、クラスＩＢ、およびクラスＩＣ抗不整脈剤が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。クラスＩＡ抗不整脈剤の例としては、ジソピラミド（ノルペース）、プロカインアミド（プロネスチル）、およびキニジン（キニデックス）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。クラスＩＢ抗不整脈剤の例としては、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカード）、およびメキシレチン（メキシチル）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。クラスＩＣ抗不整脈剤の例としては、エンカイニド（エンカイド）およびフレカイニド（タンボコール）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
ｐアドレナリンブロッカー、ｐアドレナリンアンタゴニスト、またはクラスＩＩ抗不整脈剤としても知られるβブロッカーの例としては、アセブトロール（セクトラール）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、塩酸ブチドリン、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベタペース）、スルフィナロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロール、およびキシビノロールが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
いくつかの実施態様において、βブロッカーは、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含み得る。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の例としては、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、およびトリプロロールが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
クラスＩＩＩ抗不整脈剤としても知られる再分極を延長する作用剤の例としては、アミオダロン（コルダロン）およびソタロール（ベタペース）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
クラスＩＶ抗不整脈剤としても知られるカルシウムチャネルブロッカーの例としては、アリールアルキルアミン（たとえば、ベプリジル、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニラミン、テロジリン、ベラパミル）ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）ピペラジン誘導体（たとえば、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン）、またはその他のカルシウムチャネルブロッカー、たとえば、ベンシクラン、エタフェノン、マグネシウム、ミベフラジル、またはペルヘキシリンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、カルシウムチャネルブロッカーは、長時間作用性ジヒドロピリジン（ニフェジピンタイプ）カルシウムアンタゴニストを含む。
【００９６】
その他の抗不整脈剤の例としては、アデノシン（アデノカード）、ジゴキシン（ラノキシン）、アセカイニド、アジマリン、アモプロキサン、アプリンジン、ブレチリウムトシレート、ブナフチン、ブトベンジン、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラミド、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イパトロピウム、リドカイン、ロラジミン、ロルカイニド、メオベンチン、モリシジン、ピルメノール、プラジマリン、プロパフェノン、ピリノリン、ポリガラクツロン酸キニジン、硫酸キニジン、およびビキジルが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、抗高血圧剤である。抗高血圧剤の例としては、交感神経遮断剤、α／βブロッカー、αブロッカー、抗アンギオテンシンＩＩ剤、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、血管拡張剤、およびその他の抗高血圧剤が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
αアドレナリンブロッカーまたはαアドレナリンアンタゴニストとしても知られるαブロッカーの例としては、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、メシル酸エルゴロイド、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシン、およびヨヒンビンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ある種の実施態様において、αブロッカーは、キナゾリン誘導体を含み得る。キナゾリン誘導体は、アルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、およびトリマゾシンを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
ある種の実施態様において、抗高血圧剤は、αおよびβアドレナリンアンタゴニストの両方である。α／βブロッカーの例としては、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
抗アンギオテンシンＩＩ剤の例としては、アンギオテンシン変換酵素阻害剤およびアンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニストが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）は、アラセプリル、エナラプリル（バソテック）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、キナプリル、およびラミプリルを含み得るが、これらに限定されるものではない。アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、ＡＮＧレセプターブロッカー、またはＡＮＧ−ＩＩタイプ１レセプターブロッカー（ＡＲＢＳ）としても知られるアンギオテンシンＩＩレセプターブロッカーの例としては、アンギオカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、およびバルサルタンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
交感神経遮断剤の例としては、中枢性交感神経遮断剤または末梢性交感神経遮断剤が含まれる。中枢神経系（ＣＮＳ）交感神経遮断としても知られる中枢性交感神経遮断剤の例としては、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ウィテンシン）グアンファシン（テネックス）、およびメチルドパ（アルドメット）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
末梢性交感神経遮断剤の例としては、神経節遮断剤、アドレナリン作動性ニューロン遮断剤、βアドレナリン遮断剤、またはα１アドレナリン遮断剤が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。神経節遮断剤の例としては、メカミラミン（インベルシン）およびトリメタファン（アルフォナード）が含まれる。アドレナリン作動性ニューロン遮断剤の例としては、グアネチジン（イスメリン）およびレセルピン（セルパシル）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
βアドレナリンブロッカーの例としては、アセニトロール（セクトラール）、アテノロール（テノーミン）、ベタキソロール（ケルロン）、カルテオロール（カルトロール）、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）、メトプロロール（ロプレッサー）、ナダノール（コルガード）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（ビスケン）、プロプラノロール（インデラル）、およびチモロール（ブロカドレン）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
α１アドレナリンブロッカーの例としては、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（カルジュラ）、およびテラゾシン（ヒトリン）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、血管拡張剤（たとえば、脳血管拡張剤、冠血管拡張剤、または末梢血管拡張剤）を含み得る。他の実施態様において、血管拡張剤は、冠血管拡張剤を含む。冠血管拡張剤の例としては、アモトリフェン、ベンダゾール、ヘミコハク酸ベンフロジル、ベンズヨーダロン、クロラシジン、クロモナール、クロベンフロール、クロニトレート、ジラゼプ、ジピリダモール、ドロプレニラミン、エフロキサート、エリトリチルテトラニトラート、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル、ガングレフェン、ヘレストロール（herestrol）ビス（ｐ−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、イトラミントシレート、ケリン、リドフラニン、マンニトールヘキサニトレート、メジバジン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリトリトール、ペントリニトロール、ペルヘキシリン、ピメフィリン、トラピジル、トリクロミル、トリメタジジン、リン酸トロルニトレート、およびビスナジンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、血管拡張剤は、長期治療血管拡張剤または高血圧緊急症血管拡張剤を含み得る。長期治療血管拡張剤の例としては、ヒドララジン（アプレソリン）、およびミノキシジル（ロニテン）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。高血圧緊急症血管拡張剤の例としては、ニトロプルシド（ニプリド）、ジアゾキシド（ヒペルスタットＩＶ）、ヒドララジン（アプレソリン）、ミノキシジル（ロニテン）、およびベラパミルが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、治療的介入は、抗高血圧剤を含み得る。その他の抗高血圧剤の例としては、アジマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェニオド、シクレタイニン、シクロシドミン、タンニン酸クリプテナミン、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミラミン、メチルドパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペンピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン、プロトベラトリン、ラウバシン、レスシメトール、リルメニデン、サララシン、ニトロプルシドナトリウム、チクリナフェン、カンシル酸トリメタファン、チロシナーゼ、およびウラピジルが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０８】
ある種の実施態様において、抗高血圧剤は、アリールエタノールアミン誘導体（ベンゾチアジアジン誘導体）、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、第四級アンモニウム化合物、レセルピン誘導体、またはスルホンアミド誘導体を含み得る。
【０１０９】
アリールエタノールアミン誘導体の例としては、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ソタロール、およびスルフィナロールが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
ベンゾチアジアジン誘導体の例としては、アルチジド、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチアジド、テトラクロルメチアジド、およびトリクロルメチアジドが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の例としては、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、およびラミプリルが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
ジヒドロピリジン誘導体の例としては、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、およびニトレンジピンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
グアニジン誘導体の例としては、ベタニジン、デブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン、グアネチジン、グアンファシン、グアノクロル、グアノキサベンズ、およびグアノキサンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１４】
ヒドラジン／フタラジンの例としては、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジン、およびトドララジンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１５】
イミダゾール誘導体の例としては、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チアメニジン、およびトロニジンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
第四級アンモニウム化合物の例としては、臭化アザメトニウム、塩化クロルイソンダミン、ヘキサメトニウム、ビス（メチル硫酸）ペンタシニウム、臭化ペンタメトニウム、酒石酸ペントリニウム、塩化フェナクトロピニウム、およびメト硫酸トリメチジニウムが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
レセルピン誘導体の例としては、ビエタセルピン、デセルピジン、レシナミン、レセルピン、およびシロシンゴピンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
スルホンアミド誘導体の例としては、アンブシド、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネタゾン、トリパミド、およびキシパミドが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
鬱血性心不全の治療のための作用剤の例としては、抗アンギオテンシンＩＩ剤、後負荷前負荷軽減治療、利尿剤、および変力剤が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
利尿剤の例としては、チアジド誘導体またはベンゾチアジアジン誘導体（たとえば、アルチアジド、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチアジド、テトラクロロメチアジド、トリクロルメチアジド）、有機水銀剤（たとえば、クロルメロドリン、メラルリド、メルカンファミド、メルカプトメリンナトリウム、メルクマリル酸、マーキュマチリンナトリウム、塩化第一水銀、メルサリル）、プテリジン（たとえば、フルテレン、トリアムテレン）、プリン（たとえば、アセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パマブロム、プロテオブロミン、テオブロミン）、アルドステロンアンタゴニストを含むステロイド（たとえば、カンレノン、オレアンドリン、スピロノラクトン）、スルホンアミド誘導体（たとえば、アセタゾラミド、アンブシド、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾラミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン４，４’ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキシゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、キネタゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（たとえば、アミノメトラジン、アミソメトラジン）、カリウム保持性アンタゴニスト（たとえば、アミロリド、トリアムテレン）、またはその他の利尿剤、たとえば、アミノジン（aminozine）、アルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクマフェン（ticmafen）、およびウレアが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
強心剤としても知られる陽性変力剤の例としては、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ヘミコハク酸ベンフロジル、ブクラデシン、セルベロシン（cerberosine）、カンフォタミド、コンバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドーパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリトロフレイン、フェナルコミン、ギタリン、ギトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム、ミルリノン、ネリフォリン、オレアンドリン、ウアバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロシラリジン、レシブホゲニン、シラレン、シラレニン、ストロファンチン、スルマゾール、テオブロミン、およびキサモテロールが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、変力剤は、強心配糖体、ベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、またはホスホジエステラーゼ阻害剤である。強心配糖体の例としては、ジゴキシン（ラノキシン）およびジギトキシン（クリストジギン）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。βアドレナリン作動性アゴニストの例としては、アルブテロール、バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン、ドブタミン（ドブトレックス）、ドーパミン（イントロピン）、ドペキサミン、エフェドリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール、およびキサモテロールが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ホスホジエステラーゼ阻害剤の例としては、アムリノン（イノコール）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
抗狭心症剤は、有機ニトレート、カルシウムチャネルブロッカー、βブロッカーおよびそれらの組合せを含み得る。ニトロ血管拡張剤としても知られる有機ニトレートの例としては、ニトログリセリン（ニトロ−ビド、ニトロスタット）、二硝酸イソソルビド（イソルジル、ソルビトラート）、および硝酸アミル（アスピロール、バポロール）が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
エンドセリン（ＥＴ）は、心不全の進行に関与すると思われる強力な生理学的および病態生理学的な作用を有する２１アミノ酸ペプチドである。ＥＴの作用は、２つのクラスの細胞表面レセプターとの相互作用により媒介される。細胞を刺激するＥＴの能力の阻害は、ＥＴとそのレセプターとの相互作用を遮断する作用剤の使用を含む。エンドセリンレセプターアンタゴニスト（ＥＲＡ）の例としては、Bosentan、Enrasentan、Ambrisentan、Darusentan、Tezosentan、Atrasentan、Avosentan、Clazosentan、Edonentan、シタクスセンタン、TBC3711、BQ123、およびBQ788が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
ある種の実施態様において、治療的介入は、二次療法面、たとえば、予防的、診断的、または病期分類的手術、治癒的手術、および待期的手術を含む、たとえば、いくつかのタイプの手術を含み得る。手術、特定的には、治癒的手術は、本明細書に記載の１つ以上の他の手段を含む、他の治療と組み合わせて使用してもよい。血管および心血管の疾患および障害に対するそのような手術療法手段は、当業者に周知であり、生体に手術を行うこと、心血管機械的プロテーゼ、血管形成、冠動脈再灌流、カテーテルアブレーションを提供すること、対象に植込み型除細動器、機械的循環補助を提供すること、またはそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されるものではない。本発明で使用可能な機械的循環補助の例としては、大動脈内バルーンカウンターパルセイション、左心補助装置、またはそれらの組合せが含まれる。
【０１２６】
本発明はまた、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価するための方法およびキットを包含する。一実施態様において、本発明は、患者からの生物学的サンプル中の表１から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することと、測定されたレベルをコントロールサンプル（たとえば、健常な年齢の一致する対象から取得したサンプルまたは心不全を患っていないもしくは心不全と診断されていない対象から取得したサンプル）中の前記少なくとも１種ｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較することと、を含み、前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡの測定されたレベルが、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測するまたは評価する方法を提供する。生物学的サンプルは、本明細書に記載の任意のサンプルであり得る。ある種の実施態様において、血漿または血清のサンプルが好ましい。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、コントロールサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの増加は、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる。たとえば、そのような実施態様において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９３から選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルは、コントロールサンプル中のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較して増加し、増加は、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる。
【０１２８】
他の実施態様において、コントロールサンプル（たとえば、健常な年齢の一致する対象から取得したサンプルまたは心不全を患っていないもしくは心不全と診断されていない対象から取得したサンプル）中のｍｉＲＮＡのレベルまたはあらかじめ決められた参照値に対するｍｉＲＮＡの測定されたレベルの低下または減少は、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる。たとえば、そのような実施態様において、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１９５から選択される１種以上のｍｉＲＮＡのレベルが、コントロールサンプル中のレベルまたはあらかじめ決められた参照値と比較して減少した場合、減少は、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルの指標となる。
【０１２９】
本発明はまた、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価するためのキットを包含する。一実施態様において、キットは、生物学的サンプル中の表１から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための試薬と、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価するために前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための説明書と、を含む。たとえば、ある種の実施態様において、キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９３から選択されるｍｉＲＮＡを逆転写または増幅するためのｍｉＲＮＡ特異的プライマーと、患者における心不全の重症度または心不全の進行のレベルを予測または評価するための前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡを測定するための説明書と、を含む。キットは、心臓治療の治療有効性を評価またはモニターするためのキット用の本明細書に記載の追加の試薬、たとえば、標準化コントロールおよびキット中のｍｉＲＮＡのそれぞれに特異的なＴａｑｍａｎプローブをさらに含み得る。
【０１３０】
心臓障害は、心臓および／または血管、たとえば、動脈および静脈を含む、心血管系に影響を及ぼす任意の障害を含み得る。本発明の方法により可能と考えられる心臓障害は、心疾患さらには心不全を含み得る。心臓障害はまた、腎臓に影響を及ぼす障害を含み得る。心臓障害は、心不全、心臓肥大、冠心疾患、心血管疾患、心筋症、虚血性心疾患、高血圧性心疾患、炎症性心疾患、弁膜性心疾患、アテローム硬化症、心腎疾患、腎疾患および他の腎障害を含み得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、心臓障害は、心筋梗塞、病的心肥大、心不全、または高血圧である。
【０１３１】
心血管疾患は、糖尿病、高血圧、高ホモシステイン血症、および高コレステロール血症を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
心筋症は、アルコール性心筋症、冠動脈疾患、先天性心疾患、虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜性心筋症、炎症性心筋症、および心筋ジストロフィーを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
高血圧性心疾患は、左心室肥大、冠心疾患、心不全（鬱血性のものを含む）、高血圧性心筋症、心不整脈、および腎障害を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１３４】
炎症性心疾患は、心内膜炎、炎症性心肥大、および心筋炎を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１３５】
以下の実施例は、単に本発明の種々の態様を例示するために含まれる。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明が任意のヒトまたは他の動物に同等に適用可能であることはわかるはずである。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：心臓病状に対する薬効のサロゲートマーカーとしての血中ｍｉＲＮＡ
心臓の機能および機能不全に対するｍｉＲＮＡの重要性から、心疾患の場合にｍｉＲＮＡの生物学を治療的に活用する可能性が示唆される。一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的塩基対合を介してｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉＲＮＡを不活性化するのに有効であることが示されており（Elmen, J. et al. (2008) Nature 452, 896-899、Elmen, J. et al (2008) Nucleic Acids Res 36, 1153-1162、Krutzfeldt, J. et al. (2007) Nucleic Acids Res 35, 2885-2892、Krutzfeldt, J. et al. (2005) Nature 438, 685-689、Lanford, R.E. et al. (2010) Science 327, 198-201）、病的ｍｉＲＮＡを不活性化する潜在的に有効な手段となる。
【０１３７】
この実施例では、ｍｉＲ−２０８ａを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの心不全モデルでの治療有効性について説明する。特定的には、我々は、ｍｉＲ−２０８ａに対するロックド核酸（ＬＮＡ）修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身送達が、心臓でのｍｉＲ−２０８ａの特異的、強力、かつ持続的なサイレンシングを誘導するのに十分であることを示す。さらに、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａは、ストレス起因性リモデリング、機能悪化、および心臓ミオシンスイッチングを用量依存的に減弱すると同時に、拡張期心不全のラットモデル（ダール食塩感受性ラット）で全般的健康状態および生存率を改善する。興味深いことに、我々は、高血圧ラットのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの生理学的作用が、循環ｍｉＲＮＡの血漿中レベルの有意な変化に反映されることから、この循環ｍｉＲＮＡは、薬効のサロゲートマーカーであることが示唆される。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉＲ−２０８ａ阻害の治療可能性を決定するために、我々は、成熟ｍｉＲ−２０８ａの５’領域の塩基２〜１７を標的とするかつホスホロチオエート結合により連結されたＬＮＡとＤＮＡとの組合せを含有するａｎｔｉｍｉＲを設計した。Ｍ−１０１０１として参照されるａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの配列は、５’−ＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１２）であった。ｍｉＲ−２０８ａ阻害の治療適合性を試験するために、我々は、８週齢から始めて、低食塩（ＬＳ）食（０．２５％ＮａＣｌ）または高食塩（ＨＳ）食（８．０％ＮａＣｌ）のいずれかが給餌されたダール食塩感受性ラットを使用した。ダール食塩感受性ラットでＨＳ食を開始すると、慢性高血圧になり、これは、進行して主に拡張機能不全に関連付けられる鬱血性心不全のモデルになる（Rodenbaugh et al. (2007) Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293, H1705-H1713）。１週間のＨＳ食の後、生理食塩水、２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ、または２５ｍｇ／ｋｇのスクランブルコントロールオリゴを２週間ごとにラットに皮下投与した。３〜４週間のＨＳ食の後、生理食塩水およびコントロールの治療動物は、不快感の徴候を示し始め、そして死亡したが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの皮下送達では、この症状が有意に緩和された（図１Ａ）。健康の指標として、我々は、試験期間中、体重をモニターした。生理食塩水またはコントロールオリゴのいずれかが注入されたＨＳ食のダールラットは、ＬＳ食のコントロールと比較して、有意な体重増加の低減を呈した。しかしながら、ＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、同程度の体重増加を示した（図１Ｂ）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療動物が８％ＨＳ食のより少ない摂取により体重を維持していた可能性を排除するために、食物摂取をモニターしたところ、すべてのＨＳ給餌群間で同等の摂取を示した（図４）。
【０１３９】
ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答して観測される保護作用の基礎的なさらなる知見を得るために、４．０％ＮａＣｌ食を用いて、後続試験を行い、その間、ラットは、生理食塩水、５もしくは２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ、または２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲコントロールのいずれかを２週間ごとに摂取した。体重分析から、ＨＳ食のダールラットは、ＬＳ食のコントロールと比較して、体重増加の有意な低減を呈するが、ＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、体重増加の増大を維持することが示唆された（図１Ｃ）。心エコー検査を用いた機能評価から、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、ＨＳ食８週間後、ＨＳ／生理食塩水コントロールと比較して、等容弛綬時間（ＩＶＲＴ）の有意な用量依存的減少を呈し、さらにはＨＳ／生理食塩水コントロールと比較して、僧帽弁早期対能動期充満速度比（ｍｉｔｒａｌ  ｖａｌｖｅ  ｅａｒｌｙ  ｔｏ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）（ＭＶ  Ｅ／Ａ）の標準化を呈することが示唆された（図１Ｄ）。ＨＳ食の後、２週間ごとに時間依存的心エコー検査を行ったところ、ＨＳ／生理食塩水コントロールと比較して、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療ラットで等容弛綬時間の有意な減少を示した（データは示していない）。心筋細胞サイズの定量化では、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａによる治療の後、心筋細胞肥大の有意な減少を示した（図１Ｅ〜Ｆ）。そのほかに、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、ピクロシリウスレッド染色の定量化により評価したとき、ＨＳ食により誘導される細動脈周囲線維症を低減した（（図１Ｅ〜Ｆ））。
【０１４０】
ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａは、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａの最終注入２週間後に左室および右室の両方でｍｉＲ−２０８ａの用量依存的阻害を引き起こしたが、コントロールオリゴは、生理食塩水と比較して差を示さなかった（図２Ａ）。ｍｉＲ−４９９はまた、ｍｉＲ−２０８ａの持続的阻害後に発現の用量依存的減少を示した（図２Ａ）。ｍｉＲ−２０８ｂは、βミオシン重鎖のアップレギュレーションと併行して、ＨＳ／生理食塩水およびＨＳ／コントロールの治療動物の両方で誘導されたが、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療では、ｍｉＲ−２０８ｂレベルの用量依存的減少を生じた（図２Ａ）。ノーザンブロット分析から、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂのこの制御が確認された（図２Ｂ）。
【０１４１】
ミオシン宿主遺伝子の制御を評価するために、我々は、Ｍｙｈ６、Ｍｙｈ７、およびＭｙｈ７ｂのｍＲＮＡレベルを調べた。Ｍｙｈ７は、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロール群の両方でＨＳに応答して有意に増大された。この増大は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａに応答して用量依存的に減弱された。そのほかに、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療は、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロール群の両方で観測されるＭｙｈ６  ｍＲＮＡの発現の減少を標準化した（図２Ｃ）。Ｍｙｈ７の発現は、ｍｉＲ−４９９レベルを反映し、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療により用量依存的減少を呈した。さらに、Ｍｙｈ７の用量依存的制御は、ウェスタンブロットにより確認された（図２Ｄ）。それに加えて、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療は、これまで特性解析されたｍｉＲ−２０８ａ標的Ｈｐ１βの脱抑制を引き起こしたことから、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ作用がｍｉＲ−２０８ａ阻害を介して起こることがさらに示唆される（図２Ｅ）。
【０１４２】
種々の疾患状況での血漿中のｍｉＲＮＡの検出は、増大する診断の有望性を示していている（Cortez MA and Calin GA (2009) Expert Opin Biol Ther. 9, 703-711）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性と相関する特異的ｍｉＲＮＡが存在することを確認するために、我々は、ＨＳ治療時、一群の筋肉関連ｍｉＲＮＡを調べた。注目すべき点として、ｍｉＲ−４９９は、高食塩下では血漿中検出の中程度の増加を示すにすぎなかったが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療動物では有意に低減されたことから、ｍｉＲ−４９９は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性の血漿ベースのマーカーとして作用し得ることが示唆される（図３）。そのほかに、これまでヒト心不全に相関付けられてきた血漿中ｍｉＲ−４２３−５ｐレベル（Tijsen, A.J., et al. (2010) Circ Res 106, 1035-1039）は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａで治療された動物において低減されることが判明した（図３）。他の筋特異的ｍｉＲＮＡは、試験群間で有意差を示さなかった（図５）。
【０１４３】
この試験の結果から、ｍｉＲ−２０８の治療的阻害は、心臓リモデリングの低減をもたらすかことが示唆され、これは、心疾患時の生存率および心臓機能の有意な改善と一致する。心臓でのｍｉＲ−２０８ａ阻害の有効性は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−４２３−５ｐの血漿中レベルを測定することによりモニターすることが可能である。なぜなら、これらのｍｉＲＮＡの血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドによる心臓組織でのｍｉＲ−２０８ａノックダウンと相関付けられたからである。特に、血漿中ｍｉＲＮＡ分析から、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療は、血清中のｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−４２３−５ｐの減少をもたらし、これは、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａ治療に応答してＭｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の心臓発現の低下と併行して起こることが示唆される。血漿ベースのｍｉＲ−４９９／ｍｉＲ−４２３−５ｐレベルとａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａの有効性との相関を仮定すれば、これらのデータから、血漿中のｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−４２３−５ｐレベルは、患者に移行した場合、心臓へのａｎｔｉ−ｍｉＲ−２０８ａの効果的送達のバイオマーカーをとして機能することが示唆される。
【０１４４】
特異的方法
動物およびＬＮＡ修飾ａｎｔｉｍｉＲの送達。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列の５’領域に完全に相補的な非接合および完全にホスホロチオレート化されたオリゴヌクレオチドとしてmiRagen Therapeutics, Inc.で合成した。ＬＮＡコントロールオリゴヌクレオチドは、Ｃ．エレガンス特異的ｍｉＲＮＡに対する配列からなるものであった。特に指定がないかぎり、オリゴヌクレオチド化学物質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、成体雄Ｃ５６Ｂ１６マウスまたは成体雄ダール食塩感受性ラット（Harlan, Indianapolis）のいずれかに、尾静脈または皮下注入を介して低圧静脈内（ｉ．ｖ．）注入により達成した。すべての化学物質を同等の最終体積の生理食塩水に溶解させて注入し、その後、化学物質の明確な副作用に関して動物を調べた。指定の時点で組織サンプルを採取し、分子的または組織学的検査に供した。８週齢でダールラットを０．２５ＮａＣｌで維持し、または４％もしくは８％ＮａＣｌ食で給餌した（Harlan, Indianapolis）。
【０１４５】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ｉｎ  ｖｉｖｏリアルタイムＰＣＲ分析のために、Trizol（Invitrogen）を用いて心臓組織からＲＮＡを取り出し、その後、各組織サンプルからの２μｇのＲＮＡを用いて、製造業者の仕様（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってSuper Script II逆転写酵素によりｃＤＮＡを産生した。ｍｉＲ−２０８のレベルを検出するために、１０〜１００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、製造業者の推奨基準に従ってTaqman MicroRNAアッセイ（Ａpplied Biosystems, ABI）によりＲＴ−ＰＣＲを行った。ABIから購入したTaqmanプローブを用いて定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝子の一部の発現を分析した。
【０１４６】
ノーザンブロット分析。Trizol試薬（Gibco/BRL）を用いて心臓組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。以上に記載したように、ｍｉｃｒｏＲＮＡを検出するノーザンブロットを行った。Ｕ６プローブは、ローディングコントロールとして機能した（IDT）。心筋細胞または心臓組織からの１０μｇの全ＲＮＡを２０％アクリルアミド変性ゲル上に充填し、電気泳動によりZeta-probe GTゲノムブロット膜（Bio-Rad）に移した。転写後、ブロットを架橋して、８０℃で１時間焼成した。ｍｉＲＮＡ検出感度を最大化するために、Starfire Oligos Kit（IDT, Coralville, IA）およびα−３２Ｐ  ｄＡＴＰ（AmershamまたはPerkin Elmer）を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを標識した。Rapid-hyb緩衝液（Amersham）中３９℃でプローブを膜に一晩ハイブリダイズさせ、その後、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣを用いて３９℃で１０分間２回洗浄した。ブロットを露出させて、PhosphorImager分析（GE HealthCare Life Sciences）により定量化し、Ｕ６プローブをローディングコントロールとして機能させた（ABI）。phosphorimagerおよびImageQuant（Bio-Rad）を用いて、放射性シグナルの強度により発現の変化倍率を定量化した。
【０１４７】
ウェスタンブロット分析。ウェスタンブロット分析のために、記載されるとおり心臓細胞または心臓組織からミオシンを抽出した（Hamalainen, N. & Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech 30, 381-389 (1995)）。４〜１５％グラジエントゲル上に０．１μｇのタンパク質溶解物を充填することによりＭＨＣアイソフォームを検出し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、Ｍｙｈ７にきわめて特異的なマウスモノクローナル抗ミオシン（遅筋型、骨格Ｍ８４２１）（Sigma, MO）を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【０１４８】
血漿からの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。製造業者のプロトコルにより、Ｔrizol LS Reagent（Invitrogen）を用いて、血漿サンプルからのＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離前、２５０ｐｍｏｌの２つの異なる合成Ｃ．エレガンスｍｉＲＮＡ配列を添加して、標的ｍｉＲＮＡの標準化内部コントロールとして機能させた。使用したＣ．エレガンス配列は、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２（ＵＡＵＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＧＡＵＧＵＧＣ、配列番号５）およびｃｅｌ−ｌｉｎ−４（ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＡ、配列番号６）（Dharmacon）であった。以上に記載したように、初期血漿体積に等しい最終体積で最終ＲＮＡペレットを再懸濁させ、５μｌを後続のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。
【０１４９】
統計解析。一元配置ＡＮＯＶＡおよびニューマン・クールズ多重比較事後検定を用いて有意性を決定した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなした。
【０１５０】
実施例２：血漿中ｍｉＲＮＡは、心不全の疾患進行およびａｎｔｉｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドの治療有効性のバイオマーカーである。
血漿中バイオマーカーを経時的に評価するために、実施例１に記載の鬱血性心不全のダール食塩感受性ラットモデルで非侵襲的隔週採血を行うべく外科的埋め込みカテーテルを使用した。疾患の進行およびｍｉＲ−２０８ａを標的とするＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１０１、配列番号１２）による治療処置と共に血漿中ｍｉＲＮＡバイオマーカーの変化を評価した。次の実験群を試験した。
【０１５１】
【表１】
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【０１５２】
Ｍ−１０５９１オリゴヌクレオチド（配列番号１３）は、哺乳動物組織で発現されないＣ．エレガンス由来のｍｉＲ−６７を標的とするので、対照として使用した。０週目にダール食塩感受性ラットにカテーテルを埋め込み、ベースライン血液を採取した。カテーテル移植手術後、高食塩食を開始した。４．０％ＮａＣｌ食の開始１週間後、生理食塩水または２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲをラットに２週間に１回皮下（ｓ．ｃ．）投与した。隔週（注入を行わない週）で、血漿単離のために１．５ｍｌの血液をカテーテルから採取した。初期注入の８週間後、動物を屠殺した。
【０１５３】
Taqman RT-PCRアッセイを用いて血漿および組織の分子評価項目を評価した。特定的には、Trizol LS（Invitrogen）を用いて血漿サンプルからＲＮＡを単離した。ｌｉｎ−４およびｍｉＲ−２に対する合成Ｃ．エレガンスｍｉＲＮＡ配列を一定濃度で各サンプルに添加し、精製効率をモニターして標準化に供した。標準的Trizol RNA単離法を用いて、組織ＲＮＡを単離した。標準的ABI Taqman miRNAアッセイプロトコルを用いて、相対ｍｉＲＮＡレベルを決定した。
【０１５４】
ａｎｔｉｍｉＲ−２０８治療の有効性を評価するために、心臓組織マーカーを測定した。高食塩食（ＨＳ）は、ｍｉＲ−２０８ａレベルの有意な減少をもたらした。Ｍ−１０１０１  ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドによる治療は、ＨＳ／生理食塩水群と比較して心臓組織中のｍｉＲ−２０８ａのより大きい阻害をもたらした（図６Ａ）。Ｍｙｈ６発現（ｍｉＲ−２０８ａに対する宿主遺伝子）を調べたところ、低食塩（ＬＳ）／生理食塩水群の動物と比較して、生理食塩水またはＭ−１０５９１コントロールオリゴヌクレオチドのいずれの投与を受けたＨＳ食の動物でも、有意な減少が明らかにされた（図６Ｂ）。これとは対照的に、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａによる治療では、Ｍｙｈ６発現の高食塩食起因性減少が予防された（図６Ｂ）。Ｍｙｈ７遺伝子の発現は、ＬＳ／生理食塩水群と比較して、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロールオリゴヌクレオチド群の動物で有意に増大された（図６Ｃ）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、Ｍｙｈ７発現の高血圧症起因性増加を減弱させた（図６Ｃ）。これらの結果から、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチド治療は、高血圧病状により誘導される遺伝子発現変化を低減するうえで分子レベルで有効であることが示される。
【０１５５】
ｍｉＲＮＡ  Ｔａｑｍａｎアレイカード分析により、ダール食塩感受性ラットの高血圧進行時の血漿中の種々のｍｉＲＮＡのレベルの変化を測定し（低食塩食／生理食塩水群対高食塩／生理食塩水群）、低食塩食または高食塩食のいずれでも、８週間後にリアルタイムＰＣＲ分析により確認した（表１）。これらの血漿中ｍｉＲＮＡは、疾患重症度および心不全進行を経時的に評価するためのバイオマーカーとして機能し得る。
【０１５６】
【表２】
2014507123.tif 000003
【０１５７】
miRNA Taqmanアレイカード分析（表２および３）およびリアルタイムＰＣＲ分析（表４）の両方により、高血圧症起因性心不全に罹患しているラット（ＨＳ／生理食塩水群）とａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド（ＨＳ／Ｍ−１０１０１）で治療されたラットとの間の血漿中ｍｉＲＮＡレベルの変化を８週間で評価した。
【０１５８】
【表３】
2014507123.tif 000004
【０１５９】
【表４】
2014507123.tif 000005
【０１６０】
【表５】
2014507123.tif 000006
【０１６１】
【表６】
2014507123.tif 000007
【０１６２】
【表７】
2014507123.tif 000008
【０１６３】
【表８】
2014507123.tif 000009
【０１６４】
【表９】
2014507123.tif 000010
【０１６５】
【表１０】
2014507123.tif 000011
【０１６６】
【表１１】
2014507123.tif 000012
【０１６７】
興味深いことに、この試験の結果から、心不全の進行および重症度、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療の治療有効性、ならびにその両方の血漿中ｍｉＲＮＡバイオマーカーが存在することが示される。また、疾患進行マーカーはすべて、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８治療の治療有効性のマーカーであった。しかしながら、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドの治療有効性のみのバイオマーカーであるいくつかの血漿中ｍｉＲＮＡ、たとえば、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１２２、およびｍｉＲ−１２６が存在した。実験全体を通して、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−４９９、およびｍｉＲ−１６の血漿中レベルの経時変化を図７に示す。
【０１６８】
これらの実験の結果から、特異的ｍｉＲＮＡの血漿中レベル（たとえば、存在量）は、心臓治療剤、特にａｎｔｉｍｉＲ−２０８治療剤の有効性のサロゲートマーカーとして、さらには心不全の進行および重症度のマーカーとして機能し得ることが示される。
【０１６９】
実施例３：ａｎｔｉｍｉＲ治療およびカプトプリル治療は両方とも、循環ｍｉＲに影響を及ぼす。
鬱血性心不全のダール食塩感受性ラットモデル（実施例１参照）を用いて、血漿中ｍｉＲＮＡレベルに及ぼすさまざまな治療剤の効果を評価した。特定的には、ＬＮＡ含有ａｎｔｉｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１０１）、カプトプリル（アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤）、または両者の組合せ（Ｍ−１０１０１＋カプトプリル）でラットを治療した。
【０１７０】
次の実験群を評価した。
【０１７１】
【表１２】
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【０１７２】
６．０％ＮａＣｌ食の開始１週間後、生理食塩水または２５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１０１、５’−ＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１２）、またはＭ−Ｉ０５９１、５’−ＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＧＡ−３’（配列番号１３））を２週間ごとにラットに皮下（ｓｃ）投与した。カプトプリルまたは水は、経口胃管注入により毎日投与した。静脈内投与１週間後に開始して、２週間ごとに心エコー検査を行った。ラットに対するカプトプリル用量は、人間における標準的ヒト用量に一致するように選択した。Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて血漿および組織の分子評価項目を評価した。
【０１７３】
ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１０１）による治療は、高食塩食により誘導される体重低下を部分的に予防した（図８Ａ）。これとは対照的に、コントロールオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０５９１）による治療は、体重増加に対して明確な効果を及さなかった。１５ｍｇ／ｋｇのカプトプリルで治療されたラットは、レギュラー低食塩（ＬＳ）食の動物と比較して、より低い体重を呈したが、高食塩食の動物と比較して、より高い体重を呈した（図８Ｂ）。したがって、カプトプリルは、体重の高食塩（ＨＳ）食起因性減少をわずかに低減したが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療剤と同定度に効果的ではなかった。体重グラフは、試験終了前に死亡したラットの最終体重のキャリーオーバーにより作成した。図９に示されるように、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）単独による治療のみで、動物に高食塩食を給餌した後、生存率が有意に改善された（＊ｐ＜０．０５；Ｍ−１０１０１、水で治療されたラット対高食塩食、生理食塩水で治療されたラット）。ＬＳ、生理食塩水コントロール治療ラットでもＨＳ、Ｍ−１０１０１治療ラットでも、死亡は観測されなかった。
【０１７４】
ｍｙｏｍｉＲ（ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−４９９、およびｍｉＲ−２０８ｂ）のリアルタイムＰＣＲ分析から、６％ＨＳ食は、ｍｉＲ−２０８ａの心臓中レベルを低減するが、ｍｉＲ−２０８ａレベルは、Ｍ−１０１０１によるｍｉＲ−２０８ａ阻害によりさらに低減されることが示された（図１０Ａ）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドによる治療はまた、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂの心臓中レベルの減少をもたらした（図１０ＢおよびＣ）。ミオシン遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析から、６％ＨＳ食は、心臓中のαＭＨＣ（Ｍｙｈ６）を低減するが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１０１）治療、カプトプリル治療、またはａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａとカプトプリル治療との両者の組合せにより標準化されることが示された（図１１Ａ）。Ｍｙｈ７ｂレベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドの投与を受けた動物では特異的に低減された（図１１Ｂ）。しかしながら、カプトプリル治療単独では、Ｍｙｈ７ｂ発現に対して明確な効果を及さなかった。カプトプリル治療およびａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド治療は両方とも、ＨＳ食（たとえば心臓ストレス要因）により誘導されるβＭＨＣ（Ｍｙｈ７）発現の増加を低減したが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドはより有効であった（図１１Ｃ）。実際に、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療動物のβＭＨＣレベルは、ＬＳ食の動物との有意差がなかった。図１２に示されるように、ｍｉＲ−２０８ａの直接標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析から、ａｎｉｔｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドＭ−１０１０１による動物の治療は、これらの遺伝子の発現の増加を引き起こすことが判明したことから、Ｍ−１０１０１は、ｍｉＲ−２０８ａ機能を効果的に阻害したことが示唆される。
【０１７５】
以上に記載された結果から、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａおよび標準治療剤（カプトプリル）は両方とも、高血圧により引き起こされる生理学的および分子的な変化の両方を低減するのに有効であることが実証される。しかしながら、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、ダール食塩感受性ラットモデルで高血圧症起因性心不全の治療にカプトプリルよりも有効であると思われる。
【０１７６】
種々のｍｉＲＮＡの血漿中レベルがａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド治療の有効性と相関したので（実施例２参照）、異なる治療群のそれぞれのラットからの血漿中ｍｉＲＮＡレベルを測定して、血漿中ｍｉＲＮＡレベルがカプトプリルなどの他の心臓治療剤の影響を受けるかを決定した。いくつかのｍｉＲＮＡの血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド治療およびカプトプリル治療の両方の有効性と相関すると思われた（図１３Ａ−Ｉ）。たとえば、リアルタイムＰＣＲ分析から、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療およびカプトプリル治療の両方に応答して低減されることが示された。興味深いことに、ｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−３７８＊の血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲとＡＣＥ阻害剤との両者の併用療法と特異的に相関すると思われた（図１３ＥおよびＧ）。他のｍｉＲＮＡの血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチド治療またはカプトプリル治療のいずれかと相関した。たとえば、ｍｉＲ−１９Ｂの血漿中レベルは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドの投与を受けた動物で有意に増大された（図１４Ａ）。ｍｉＲ−２２３の血漿中レベルは、両方のタイプの治療に応答して有意に低減されたが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドの投与を受けて動物では、より有意な減少が観測された（図１４Ｂ）。これとは対照的に、血漿中のｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１５０のレベルは、カプトプリル治療（図１４Ｃ  Ｄ）で特異的に低減された。
【０１７７】
これらの結果から、異なる心臓治療剤に応答して血漿中レベルの変化が観測され得る一群のｍｉＲＮＡが存在することが示される。興味深いことに、特定のタイプの心臓治療剤（たとえば、ｍｉＲ−２０８ａ治療剤またはＡＣＥ阻害剤）とレベルが相関する特異的な血漿中ｍｉＲＮＡが存在すると思われるが、他の血漿中ｍｉＲＮＡのレベルは、両方のタイプの治療と相関すると思われる。血漿中ｍｉＲＮＡのさらに他のサブセットは、併用療法のみの有効性のマーカーであると思われる。したがって、血漿中ｍｉＲＮＡレベルは、心臓治療剤全般の有効性をモニターするだけでなく、特異的な治療的介入または併用治療の有効性をモニターするためにも、使用可能である。
【０１７８】
特異的方法
動物およびＬＮＡ修飾ａｎｔｉｍｉＲの送達。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列の５’領域に完全に相補的な非接合および完全にホスホロチオレート化されたオリゴヌクレオチドとしてmiRagen Therapeutics, Inc.で合成した。ＬＮＡコントロールオリゴヌクレオチドは、Ｃ．エレガンス特異的ｍｉＲＮＡに対する配列からなるものであった。別段の指定がないかぎり、オリゴヌクレオチド化学物質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、成体雄ダール食塩感受性ラット（Harlan, Indianapolis）の尾静脈または皮下注入を介して低圧静脈内（ｉ．ｖ．）注入により達成した。すべての化学物質を同等の最終体積の生理食塩水に溶解させて注入し、その後、化学物質の明確な副作用に関して動物を調べた。指定の時点で組織サンプルを採取し、分子的または組織学的検査に供した。８週齢でダールラットを０．２５ＮａＣｌで維持し、または４％、６％、もしくは８％ＮａＣｌ食で給餌した（Harlan, Indianapolis）。
【０１７９】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析。ｉｎ  ｖｉｖｏリアルタイムＰＣＲ分析のために、Trizol（Invitrogen）を用いて心臓組織からＲＮＡを取り出し、その後、各組織サンプルからの２μｇのＲＮＡを用いて、製造業者の仕様（Invitrogen）に従ってSuper Script II逆転写酵素によりｃＤＮＡを産生した。ｍｉＲ−２０８のレベルを検出するために、１０〜１００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、製造業者の推奨基準に従ってTaqman MicroRNAアッセイ（Applied Biosystems, ABI）によりＲＴ−ＰＣＲを行った。ABIから購入したTaqmanプローブを用いて定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝子の一部の発現を分析した。
【０１８０】
血漿からの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。製造業者のプロトコルにより、Trizol LS Reagent（Invitrogen）を用いて、血漿サンプルからのＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離前、２５０ｐｍｏｌの２つの異なる合成Ｃ．エレガンスｍｉＲＮＡ配列を添加して、標的ｍｉＲＮＡの標準化内部コントロールとして機能させた。使用したＣ．エレガンス配列は、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２（ＵＡＵＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＧＡＵＧＵＧＣ、配列番号５）およびｃｅｌ−ｌｉｎ−４（ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＡ、配列番号６）（Dharmacon）であった。以上に記載したように、初期血漿体積に等しい最終体積で最終ＲＮＡペレットを再懸濁させ、５μｌを後続のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。
【０１８１】
統計解析。一元配置ＡＮＯＶＡおよびニューマン・クールズ多重比較事後検定を用いて有意性を決定した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなした。
【０１８２】
本明細書で考察および引用された出版物はすべて、それらの全体について参照により本明細書に援用する。開示された本発明は、記載の特定の方法、プロトコル、および材料に限定されるものではない。なぜなら、これらは、変更可能であるからである。同様に、本明細書中で用いられる用語は、特定の実施態様を説明することだけを目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１８３】
当業者であれば、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価態様がわかるであろう。またはそれらを確認することができるであろう。そのような等価態様は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
2014507123.tif 000015
【図１Ｅ−Ｆ】
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【図２Ａ−Ｂ】
2014507123.tif 000017
【図２Ｃ−Ｅ】
2014507123.tif 000018
【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｄ】
2014507123.tif 000020
【図５Ａ−Ｂ】
2014507123.tif 000021
【図６Ａ−Ｃ】
2014507123.tif 000022
【図７Ａ−Ｄ】
2014507123.tif 000023
【図８Ａ−Ｂ】
2014507123.tif 000024
【図９】
2014507123.tif 000025
【図１０Ａ−Ｃ】
2014507123.tif 000026
【図１１Ａ−Ｃ】
2014507123.tif 000027
【図１２Ａ−Ｃ】
2014507123.tif 000028
【図１３Ａ−Ｄ】
2014507123.tif 000029
【図１３Ｅ−Ｈ】
2014507123.tif 000030
【図１３Ｉ】
2014507123.tif 000031
【図１４Ａ−Ｄ】
2014507123.tif 000032
【配列表】
2014507123000001.app
【国際調査報告】
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