(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルス抗原および炭水化物を提示する脂質二重層小胞の組成物または組成物、およびニコチアナタバカム植物におけるその生成に関する。ウイルス感染の治療または予防において使用するための前記脂質小胞を含む医薬組成物も、本明細書において開示する。
2014533253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径４０ｎｍ〜２５０ｎｍの平均サイズ分布を有する組成物。
【請求項２】
ＶＬＰが直径５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均サイズ分布を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＶＬＰが脂肪酸とステロールの組合せを含む脂質二重層で構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＶＬＰの脂質二重層が
ａ．０．５μｇ／ｍＬ未満のオレイン酸、ならびに／または
ｂ．３．０μｇ／ｍＬ〜５．０μｇ／ｍＬの濃度のリノール酸および／もしくはリノレン酸、ならびに／または
ｃ．０．７５μｇ／ｍＬを超えるアラキドン酸
の含量を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ＶＬＰの脂質二重層が、ＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳにより決定したときに１より大きいコレステロール：シトステロール比を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ＶＬＰが０．３０〜０．４５である脂質（脂肪酸およびステロール）のタンパク質に対する質量比を示す、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ＶＬＰ上で提示される抗原が血球凝集素である、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
血球凝集素がＡ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ血球凝集素である、請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
インフルエンザ亜型Ａ血球凝集素が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
インフルエンザ亜型Ａ血球凝集素がＨ５亜型の血球凝集素である、請求項１から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ウイルス様粒子により提示される血球凝集素が
ａ．Ｓ−アシル化状態
ｂ．Ｎ−グリコシル化状態
ｃ．Ｓ−アシル化状態かつＮ−グリコシル化状態である、
請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
血球凝集素が配列番号１４中に示すインフルエンザ血球凝集素５ポリペプチド（Ｈ５）である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
わずか２個の細胞質システインがパルミチン酸でのアシル化により翻訳後修飾される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体と一緒に、治療上または免疫学上有効な量の請求項１から１３のいずれか１項に記載の１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含む組成物。
【請求項１５】
アジュバントを含む請求項１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物の投与後に対象において免疫応答を誘導するための、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
治療の必要がある対象におけるインフルエンザウイルス感染、特にＨ５亜型のインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染に対する治療または予防において使用するための、請求項１から１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１４までのいずれか１項に記載のＶＬＰを生成する方法であって、
ｉ．ニコチアナタバカム植物の選択品種、育種系統、または栽培変種とアグロバクテリウム種の選択株の組合せを用意するステップであって、品種、育種系統、または栽培変種が、０．３２のＯＤ６００の細胞密度で選択アグロバクテリウム株を前記品種、育種系統、または栽培変種の葉にシリンジで注射した５日後に、１０％未満の壊死、５％未満の壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示すステップ、
ｉｉ．０．１〜４．０のＯＤ６００でニコチアナタバカム植物において機能的な制御エレメントの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザ抗原のコード配列を含むバイナリーベクターを含む、アグロバクテリウム種の選択株の懸濁液を、ニコチアナタバカムの品種、育種系統、または栽培変種の完全植物に浸潤させるステップ、
ｉｉｉ．浸潤状態の植物中で発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、浸潤状態の植物を５日間〜２０日間の間インキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１９】
ＶＬＰの（ｉ）精製／清浄化および（ｉｉ）捕捉ステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイナリーベクターが、大腸菌およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製に必要不可欠である、タバコ植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移動のための配列エレメント、ならびにさらなるＴ−ＤＮＡ領域を含む、最小サイズのバイナリーベクターであり、必要不可欠な配列エレメントが最小サイズのバイナリーベクター全体の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％を占める、請求項１８および１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
インフルエンザ抗原がインフルエンザ血球凝集素またはその免疫原性断片である、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイナリーベクターが植物選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
浸潤状態の植物を７日間〜１５日間の間インキュベートする、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
浸潤状態の植物を８日間〜１０日間の間インキュベートする、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質抗原および炭水化物を提示する脂質小胞の組成物または調製物、および植物細胞におけるその生成に関する。前記組成物中の脂質小胞は、二重層構造、約４０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のサイズ分布、ならびに抗原に対する免疫応答を効果的に刺激する抗原および炭水化物の量を有する。
特に本発明は、ニコチアナタバカム植物におけるウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の生成、ならびに有利な免疫原性をＶＬＰに与えるサイズ分布、抗原／炭水化物比および脂質組成のＶＬＰの単離に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス構造タンパク質は、有機的マクロ分子構造に自己組織化して、ウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）として知られる空洞構造殻を生成することができる。ウイルス様粒子は非感染性である。それらはウイルス核酸を欠き、抗原提示の担体として使用することができるからである。それはおそらく、それ自体は免疫系を刺激する際に有効でないペプチド抗原の免疫原性を増大して、前記抗原に対する防御抗体の生成を高めることができる。例えば、細菌、酵母、および哺乳動物ベース系などの、異なる原核生物および真核生物異種発現系において、ＶＬＰが生成され組織化され得ることが以前に報告されている。近年、数種の植物、ジャガイモ、ルピナス、レタス、トマト、ダイズ、およびニコチアナベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔａｍｉｎｉａｎａ）においても、ＶＬＰの生成が報告されている。弱毒生ウイルスまたは不活化死菌ウイルスをベースとするワクチンの安全な代替として、ＶＬＰはおそらく有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ここで本発明は、ニコチアナタバカム植物において生成される、有利な免疫原性を有するＶＬＰを提供する。
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径４０ｎｍ〜２５０ｎｍ、４０ｎｍ〜２００ｎｍ、５０ｎｍ〜２５０ｎｍ、特に５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均サイズ分布を有する組成物に関する。本発明の一実施形態では、前に定義した組成物中のＶＬＰは脂肪酸とステロールを含む脂質二重層で構成され、一実施形態では、脂肪酸：ステロール比は１より大きい。
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１３０ｎｍ、特に８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲で最大量集団を表すピーク最大値を有する組成物に関する。一実施形態では、ニコチアナタバカムにおいて生成されるウイルス様粒子は、低濃度のモノ不飽和脂肪酸、特にＣ１８モノ不飽和脂肪酸、例えばオレイン酸などを含有し、それはＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに、０．４μｇ／ｍＬ未満、０．５μｇ／ｍＬ未満、１．０μｇ／ｍＬ未満、または１．５μｇ／ｍＬ未満の濃度で脂質二重層中に存在する。
【０００４】
さらに、様々な実施形態で本明細書において開示する、本発明によるニコチアナタバカムにおいて生成されるウイルス様粒子は、高濃度のポリ不飽和脂肪酸、特にＣ１８ポリ不飽和脂肪酸、例えばリノール酸および／またはリノレン酸などを含有し、それはＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに、３．０μｇ／ｍＬ〜５．０μｇ／ｍＬの濃度で脂質二重層中に存在する。
【０００５】
別の実施形態では、様々な実施形態で本明細書において開示する、本発明によるニコチアナタバカムにおいて生成されるウイルス様粒子は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに、高濃度の飽和脂肪酸、特にＣ２０飽和脂肪酸、０．５μｇ／ｍＬを超える、０．７５μｇ／ｍＬを超える、０．９μｇ／ｍＬを超える、または１．０μｇ／ｍＬを超えるアラキドン酸などを含有する。
一実施形態では、様々な実施形態で本明細書において開示する、本発明によるニコチアナタバカムにおいて生成されるウイルス様粒子は、前のパラグラフにおいて本明細書で前に開示した濃度で、モノ不飽和脂肪酸、特にＣ１８モノ不飽和脂肪酸、例えばオレイン酸などと、ポリ不飽和脂肪酸、特にＣ１８−Ｃ２０ポリ不飽和脂肪酸、例えばリノール酸および／またはリノレン酸など、および／またはアラキドン酸などのＣ２０飽和脂肪酸の組合せを含有する。
【０００６】
本発明の別の実施形態では、前の実施形態のいずれかのＶＬＰの脂質二重層が、ＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳにより決定したときに、１を超える、０．７５を超える、０．５を超える、および０．４を超える、コレステロールとシトステロールの比（コレステロール：シトステロール）を有する。
本発明は、前の実施形態のＶＬＰが０．３０〜０．４５、０．３５を超える、０．４を超える、特に０．３４〜０．４２である脂質（脂肪酸およびステロール）のタンパク質に対する質量比を示す、さらなる実施形態を企図する。
具体的な実施形態では、本発明は、１つまたは複数の抗原、特に１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径４０ｎｍ〜２５０ｎｍ、特に直径５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均サイズ分布を有し、脂肪酸とステロールの組合せを含む脂質二重層で構成される組成物に関する。
【０００７】
具体的な実施形態では、本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１３０ｎｍ、特に８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲で最大量集団を表すピーク最大値を有する組成物に関する。
本発明の別の具体的な実施形態では、１つまたは複数の抗原、特に１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径４０ｎｍ〜２５０ｎｍ、特に直径５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均サイズ分布を有し、ＶＬＰの脂質二重層がＧＣ−ＭＳもしくはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに０．５μｇ／ｍＬ未満のオレイン酸含量、および／またはＧＣ−ＭＳもしくはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに０．７５μｇ／ｍＬを超えるアラキドン酸含量、および／またはＧＣ−ＭＳもしくはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに３．０μｇ／ｍＬと５．０μｇ／ｍＬの間のリノール酸および／もしくはリノレン酸含量を有する組成物を提供する。
【０００８】
本発明の別の具体的な実施形態では、１つまたは複数の抗原、特に１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが直径８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１３０ｎｍ、特に８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲で最大量集団を表すピーク最大値を有する組成物を提供する。
別の具体的な実施形態では、様々な実施形態で本明細書において記載する、本発明によるニコチアナタバカムから得るウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物は１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含み、前記ＶＬＰは直径４０ｎｍ〜２５０ｎｍ、特に直径５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均サイズ分布を有し、ＶＬＰの脂質二重層はＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳにより決定したときに１より大きいコレステロール：シトステロール比を有する。
【０００９】
別の具体的な実施形態では、様々な実施形態で本明細書において記載する、本発明によるニコチアナタバカムから得るウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物は１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含み、前記ＶＬＰは直径８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１３０ｎｍ、特に８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲で最大量集団を表すピーク最大値を有する。
さらに別の具体的な実施形態では、本発明は、１つまたは複数の抗原、特に１つまたは複数のインフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを含むニコチアナタバカム植物から得たウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）の組成物であって、前記ＶＬＰが（ｉ）直径４０ｎｍ〜２５０ｎｍ、特に直径５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均サイズ分布を有し、（ｉｉ）一実施形態では脂肪酸：ステロール比が１より大きい、脂肪酸とステロールの組合せを含む脂質二重層で構成され、（ｉｉｉ）ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときにオレイン酸含量が０．５μｇ／ｍＬ未満であり、および／またはＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときにアラキドン酸含量が０．７５μｇ／ｍＬ超であり、および／またはＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳにより決定したときにリノール酸および／またはリノレン酸含量が３．０μｇ／ｍＬ〜５．０μｇ／ｍＬであり、かつ（ｉｖ）ＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳに従って決定したときにコレステロール：シトステロール比が１より大きい、組成物に関する。
【００１０】
一実施形態では、前記ＶＬＰは直径８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１３０ｎｍ、特に８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、特に９０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲で最大量集団を表すピーク最大値を有する。
本発明の一実施形態では、前の実施形態で定義したいずれか１つの組成物のＶＬＰ上で提示される抗原は、血球凝集素、特に組換え血球凝集素である。血球凝集素は、本発明の一実施形態では、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ血球凝集素、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるインフルエンザ亜型Ａ血球凝集素である。
【００１１】
本発明の具体的な実施形態では、血球凝集素はＨ５亜型の血球凝集素である。
本発明の具体的な実施形態では、ＶＬＰは１つのインフルエンザ抗原のみを提示する。
本発明の具体的な実施形態では、ＶＬＰは１つのインフルエンザ抗原のみを提示し、抗原は血球凝集素である。
本発明の具体的な実施形態では、ＶＬＰは１つのインフルエンザ抗原のみを提示し、抗原はＨ５亜型の血球凝集素である。
【００１２】
本発明の別の具体的な実施形態では、前の実施形態のいずれか１つによるウイルス様粒子により提示される血球凝集素は、Ｓ−アシル化状態またはＮ−グリコシル化状態、または両方の状態、Ｓ−アシル化状態かつＮ−グリコシル化状態である。
本発明のさらに別の具体的な実施形態では、前の実施形態のいずれか１つによるウイルス様粒子により提示される血球凝集素は、パルミチン酸でのアシル化により翻訳後修飾された、わずか２個の細胞質システインを有する。
本発明の一実施形態では、前の実施形態のＶＬＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでニコチアナタバカム植物または植物細胞において生成される。
本発明の具体的な実施形態では、前の実施形態のＶＬＰを単離する。
一実施形態では、本発明は、本明細書で記載する技法の使用によるＶＬＰの（ｉ）精製／清浄化（ｉｉ）捕捉ステップを含む、本明細書で前に記載したＶＬＰを生成するための方法を提供する。
【００１３】
具体的な実施形態では、本発明は、様々な実施形態で本明細書において開示する本発明によるＶＬＰを有する、高バイオマス量加工植物を含む組成物を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に、特に治療有効量で、本明細書で定義する本発明によるＶＬＰを含む医薬組成物を企図する。
具体的な実施形態では、様々な実施形態で本明細書において記載する、本発明による前記医薬組成物は、１つまたは複数のインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質、特にＨ５亜型の血球凝集素タンパク質を提示するＶＬＰを含む。
別の実施形態では、本発明は、前記組成物の投与後に対象において免疫応答を誘導するための、薬学的に許容される担体と一緒に、特に免疫学上有効な量で、様々な実施形態で本明細書において定義する本発明によるＶＬＰまたはＶＬＰ組成物を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、治療の必要がある対象におけるインフルエンザウイルス感染、特にＨ５亜型のインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染に対する治療または予防において使用するための、薬学的に許容される担体と一緒に、特に治療有効量で、本明細書において定義する本発明によるＶＬＰまたはＶＬＰ組成物を含む医薬組成物に関する。
本発明の具体的な実施形態では、前で定義した医薬組成物のいずれか１つがアジュバントをさらに含む。
本発明はさらに、前記ＶＬＰ組成物の投与後に対象において免疫応答を誘導するための、様々な実施形態で本明細書において定義する本発明のＶＬＰ組成物または医薬組成物のいずれか１つの使用に関する。
本発明はさらに、治療の必要がある対象におけるインフルエンザウイルス感染、特にＨ５亜型のインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染に対する治療または予防のための、様々な実施形態で本明細書において定義するＶＬＰ組成物または医薬組成物のいずれか１つの使用に関する。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、ウイルス、特にインフルエンザウイルスに対する免疫応答を対象において誘導するための方法であって、様々な実施形態で本明細書において開示する本発明のＶＬＰ組成物または医薬組成物のいずれか１つを、免疫学上有効な量、前記対象に投与するステップを含む方法を企図する。
さらなる実施形態では、本発明は、治療の必要がある対象におけるウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染の治療、特に予防治療または弱毒化のための方法であって、様々な実施形態で本明細書において開示する本発明のＶＬＰ組成物または医薬組成物のいずれか１つを、治療上有効な量で、前記対象に投与するステップを含む方法を企図する。
本発明の一実施形態では、本発明のＶＬＰ組成物または医薬組成物の投与は、任意の適切な経路、特に経口、非経口、皮下、腹腔内、局所、経粘膜、経真皮、気管支内、肺内および鼻腔内、心室内、関節内、鞘内、膣内、または気管内投与による投与であってよい。
【００１６】
配列の簡単な説明
記載および例中で、配列表中に表す以下の配列に言及する。
配列番号１は、最小植物選択バイナリーベクターｐＰＭＰ１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、５’ＵＴＲＨＴ−ＣＰＭＶのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３は、３’ＵＴＲＨＴ−ＣＰＭＶのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、Ｐ１−ＨｃＰｒｏ−Ｐ３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５は、二重ＭＭＶプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号６および７は、Ｃ末端血球凝集素Ｈ５ペプチド断片を示す。
配列番号８〜１３は、Ｈ５成熟タンパク質骨格から得た異なるペプチド断片を示す。
配列番号１４は、インフルエンザ血球凝集素５（Ｈ５）のヌクレオチド配列を示す。
記載および例中で、以下の図に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗原を提示する脂質小胞と炭水化物の図である。６０／４５％スクロースクッションでの超遠心分離により精製した、タバコ属由来ウイルス様粒子のＡＦ４−ＭＡＬＳ分析の図である。  Ａ．ニコチアナタバカムＰＭ１３２（−ｘ−ｘ−ｘ−）、ニコチアナタバカムＰＭ２０４（−ｏ−ｏ−ｏ−）、ニコチアナタバカムバーレイ２１（−）および  Ｂ．ニコチアナベンタミアナ（−□−□−□−）の図である。
【図２】１３．００〜２０．００分のズームでの、ニコチアナベンタミアナ由来ウイルス様粒子の脂肪酸のＧＣプロファイルの図である。ピーク最大値における割り当てを示す。２つの未確認脂肪酸は、ステアリン酸およびアラキドン酸のＣ１８−０およびＣ２０−０異性体として仮に割り当てる。それらの質量スペクトルは、ステアリン酸およびアラキドン酸のそれと非常に類似しているからである。
【図３】様々なウイルス様粒子で提示された血球凝集素Ｈ５のＡｓｎ−１１糖ペプチドの、デコンボリューションＮ−グリコシル化パターンの図である。Ｈ５−ＰＭ０１５、ニコチアナタバカムバーレイ２１、Ｈ５−ＰＭ１３２、ニコチアナタバカムＰＭ１３２、Ｈ５−ＰＭ２０４、ニコチアナタバカムＰＭ２０４およびＨ５−ＰＭ１８２、ニコチアナベンタミアナ。例２３も参照。
【００１８】
【図４】様々なウイルス様粒子で提示された血球凝集素Ｈ５のＡｓｎ−２３糖ペプチドの、デコンボリューションＮ−グリコシル化パターンの図である。Ｈ５−ＰＭ０１５、ニコチアナタバカムバーレイ２１、Ｈ５−ＰＭ１３２、ニコチアナタバカムＰＭ１３２、Ｈ５−ＰＭ２０４、ニコチアナタバカムＰＭ２０４およびＨ５−ＰＭ１８２、ニコチアナベンタミアナ。例２３も参照。
【図５】様々なウイルス様粒子で提示された血球凝集素Ｈ５のＡｓｎ−１５４糖ペプチドの、デコンボリューションＮ−グリコシル化パターンの図である。Ｈ５−ＰＭ０１５、ニコチアナタバカムバーレイ２１、Ｈ５−ＰＭ１３２、ニコチアナタバカムＰＭ１３２、Ｈ５−ＰＭ２０４、ニコチアナタバカムＰＭ２０４およびＨ５−ＰＭ１８２、ニコチアナベンタミアナ。例２３も参照。
【図６】様々なウイルス様粒子で提示された血球凝集素Ｈ５のＡｓｎ−１６５糖ペプチドの、デコンボリューションＮ−グリコシル化パターンの図である。Ｈ５−ＰＭ０１５、ニコチアナタバカムバーレイ２１、Ｈ５−ＰＭ１３２、ニコチアナタバカムＰＭ１３２、Ｈ５−ＰＭ２０４、ニコチアナタバカムＰＭ２０４およびＨ５−ＰＭ１８２、ニコチアナベンタミアナ。例２３も参照。
【００１９】
【図７】様々なウイルス様粒子で提示された血球凝集素Ｈ５のＡｓｎ−２８６糖ペプチドの、デコンボリューションＮ−グリコシル化パターンの図である。Ｈ５−ＰＭ０１５、ニコチアナタバカムバーレイ２１、Ｈ５−ＰＭ１３２、ニコチアナタバカムＰＭ１３２、Ｈ５−ＰＭ２０４、ニコチアナタバカムＰＭ２０４およびＨ５−ＰＭ１８２、ニコチアナベンタミアナ。例２３も参照。
【図８】様々なウイルス様粒子で提示された血球凝集素Ｈ５のＡｓｎ−４８４糖ペプチドの、デコンボリューションＮ−グリコシル化パターンの図である。Ｈ５−ＰＭ０１５、ニコチアナタバカムバーレイ２１、Ｈ５−ＰＭ１３２、ニコチアナタバカムＰＭ１３２、Ｈ５−ＰＭ２０４、ニコチアナタバカムＰＭ２０４およびＨ５−ＰＭ１８２、ニコチアナベンタミアナ。例２３も参照。
【図９】Ｓ−アシル化ペプチド断片に対応するシグナルを有する血球凝集素Ｈ５の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本出願の範囲内で使用する技術および科学用語および表現は、植物生物学の関連分野でそれらに通常適用される意味を一般に与えられる。当業者に知られる様々な方法を本明細書で言及する。言及するこれらの既知の方法を述べる刊行物および他の資料は、完全に言及するわけではないがそれらの全容を本明細書に組み込む。本発明の実践では、他に示さない限り、当技術分野の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、遺伝子操作および植物生物学の従来技法を利用する。
当業者に知られる任意の適切な材料および／または方法を、本発明を実施する際に利用することができるが、しかしながら、好ましい材料および／または方法を記載する。以下の記載および例中で言及する材料、試薬などは、他に示さない限り市販の供給源から入手可能である。
【００２１】
全ての以下の用語の定義は、本出願の全内容に適用する。語句「含む」は他の要素またはステップを除外するわけではなく、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は複数を除外するわけではない。１ステップが、特許請求の範囲中に列挙する数個の要件の機能を果たすことができる。特に属性または値に関する用語「ほぼ」、「約」、「およそ」などは、それぞれ正確にその属性、または正確にその値も定義する。所与の数値または範囲の文脈での用語「約」は、その所与の値または範囲の２０％以内、１０％以内、または５％以内にある値または範囲を指す。
本発明中で使用する「植物」は、任意の生活環または成長段階の、任意の植物およびその子孫を指す。
本明細書で使用する「植物部分」または「植物の一部分」は、植物の任意の部分、すなわち植物体または培養物における植物器官、植物組織、植物細胞、胚、葉などを言及することを意味する。高圧または低圧またはこれらの組合せの下での植物接種に関する、本発明の特定の実施形態では、この用語は植物体における植物部分を指す。
【００２２】
本発明内で使用する「タバコ植物」は、それだけに限られないが、ニコチアナタバカム（またはＮ．ｔａｂａｃｕｍ）を含めた、タバコ属に属する種の植物を指す。ニコチアナタバカムを指定せずに用語「タバコ植物」を使用して、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載し、このような記載はニコチアナタバカムを具体的に含むものとして解釈される。
本発明内で使用する「植物細胞」または「タバコ植物細胞」は、植物、特にタバコ植物の構造および物理単位を指す。植物細胞は、細胞壁がないプロトプラスト、単離単細胞もしくは培養細胞の形で存在してよく、またはそれだけに限られないが植物組織、植物器官、もしくは完全植物などを含めた高度に編成された単位の一部として存在してよい。
本発明内で使用する「植物材料」は、葉、茎、根、花もしくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、断片、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養物を含めた植物、または植物の任意の他の部分もしくは生成物から入手可能な、任意の固体、液体または気体組成物、またはこれらの組合せを指す。
本明細書で使用する「植物組織」は、構造または機能単位に編成された植物細胞の一群を意味する。植物体または培養物における任意の植物組織が含まれる。この用語には、それだけに限られないが、完全植物、植物器官、および種子が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する「植物器官」は、根、茎、葉、花芽または胚などの、植物の特有部分または分化部分に関する。
用語「光学濃度」または「ＯＤ」は、分光光度計で測定した所与の波長（例えば、６００ｎｍ＝ＯＤ６００）での、光学エレメントの吸光度の光学決定値に関する。
用語「ポリヌクレオチド」を本明細書で使用して、非修飾または修飾デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であってよいヌクレオチドのポリマーを指す。したがって、ポリヌクレオチドは、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡであってよい。さらにポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物とのハイブリッド分子であってよい。さらにポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む三本鎖領域で構成されていてよい。ポリヌクレオチドは、ホスホチオエートなどの１つまたは複数の修飾塩基を含有することができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってよい。一般に、本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、もしくは個々のヌクレオチド、もしくは前述の組合せの単離またはクローニング断片から組織化され得る。
【００２４】
本明細書で使用する用語「遺伝子配列」は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドまたは生物活性ＲＮＡをコードする核酸分子またはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指し、異種タンパク質の断片のみをコードする部分的コード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列は、コード配列に対して上流または下流に位置する遺伝子の発現に対する制御機能を有する配列、および遺伝子のイントロン配列も含むことができる。
用語「転写制御ヌクレオチド配列」または「制御配列」は、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または転写される関係（もしくは機能上関連がある）ヌクレオチド配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列をそれぞれ指す。転写制御ヌクレオチド配列は、転写されるヌクレオチド配列に対して様々な局在化があり得る。転写制御ヌクレオチド配列は、転写される配列（例えば、コード配列）の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に局在化し得る。転写制御ヌクレオチド配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む群から選択することができる。それらは天然配列および合成配列、ならびに合成配列と天然配列の組合せであってよい配列を含む。
【００２５】
用語「プロモーター」は、遺伝子の転写の開始を指示する、遺伝子の５’末端におけるヌクレオチド配列を指す。一般に、プロモーター配列は必要不可欠であるが、作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導するのに常に十分であるわけではない。発現可能な遺伝子構築物の設計において、遺伝子の発現がプロモーター配列によって調節されるように、プロモーターに対して十分近く適切な方向に遺伝子を配置する。プロモーターは、プロモーターとその本来の状態でそれが調節する遺伝子の間の距離と近似した転写開始部位からの距離で、遺伝子の上流に優先的に位置する。当技術分野で知られているように、プロモーター機能の消失なしで、この距離のある程度の変動は許容され得る。
【００２６】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、コード領域の転写がプロモーターにより調節および制御されるような形式で、そのコード領域とそのプロモーターが結びついたことを意味する。プロモーターとコード領域を作動可能に連結するための手段は、当技術分野ではよく知られている。
本発明の文脈において使用する用語「遺伝子サイレンシングのサプレッサー」は、サイレンシングＲＮＡとの結合により特定ウイルスに転写後遺伝子サイレンシングを回避させる、ウイルスコードタンパク質を指す。導入遺伝子も、植物細胞中に導入されると転写後遺伝子サイレンシングを誘導する可能性があり、その結果としてこのような遺伝子の低発現または無発現が確定する。
【００２７】
本明細書で使用する用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」または「ペプチド断片」は交換可能であり、ペプチド結合により連結した２つ以上のアミノ酸で構成される生体分子を意味すると定義し、二次、三次または四次構造にフォールディングして個々の形態を得ることができる。
本明細書で使用する用語「異種」は、細胞または生物における特異的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈で、本来存在しない生物学的配列を指す。本明細書で交互に使用する用語「組換えタンパク質」または「異種タンパク質」または「異種ポリペプチド」は、その細胞中には本来存在しないが細胞によって生成される、タンパク質またはポリペプチドを指す。例えば、植物細胞または完全植物において生成される組換えまたは異種タンパク質は、哺乳動物またはヒトタンパク質であってよい。
【００２８】
修飾型植物細胞において発現され得る異種タンパク質は、それだけに限られないが、病原体のタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、原生動物タンパク質、線虫タンパク質を含めた（限定されないが、ワクチンで使用することができる）抗原、それだけに限られないが（限定されないが、ヒト疾患の治療または産業用途において使用することができる）酵素を含めた酵素、サイトカイン、サイトカイン受容体の断片、血液中タンパク質、ホルモン、ホルモン受容体の断片、リポタンパク質、抗体または抗体の断片であってよい。
用語「抗体」および「抗体（複数可）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単鎖ドメイン抗体、ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬＡ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、および任意の前述のエピトープ結合断片を指す。特に抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。
【００２９】
本発明の文脈における「発現可能」は、葉内に含まれる植物細胞中の遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドの発現を指示する、制御エレメントと遺伝子の作動可能な連結を指す。
本明細書で互換的に使用する「壊死」と「壊死反応」は、植物組織への例えばアグロバクテリウム株の接種によって例えば誘導される、植物、特にタバコ植物の組織における過敏反応に関する。注射した葉の組織が崩壊し細胞が死んだとき、壊死が観察される（Klement & Goodman, Annual Review of Phytopathology 5(1967) 17-44参照）。葉組織の崩壊がなく広範囲の細胞死がないとき、当業者により、壊死は黄化状態と識別可能である。
【００３０】
本明細書で使用する「Ｔ−ＤＮＡボーダー」は、アグロバクテリウム株、例えばアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株、またはその修飾もしくは突然変異型などの毒性遺伝子産物によって認識され得る、かつ真核生物細胞、好ましくは植物細胞への結合したＤＮＡ配列の移動に十分である、約２５ヌクレオチド長配列を含むＤＮＡ断片を指す。この定義には、それだけに限られないが、野生型Ｔｉプラスミド、およびその任意の機能的誘導体由来の全ての天然Ｔ−ＤＮＡボーダーが含まれ、化学合成Ｔ−ＤＮＡボーダーが含まれる。一態様では、本発明によるコード配列と発現構築物の発現調節配列は、２つのＴ−ＤＮＡボーダー間に位置する。
本明細書で使用する用語「減圧浸潤法」は、細胞内または間質空間への病原菌、例えばアグロバクテリウムの侵入を可能にする方法に関する。物理的には減圧は、植物組織中の細胞間の空間を減少させる負圧をもたらす。時間が長くなり圧力が低下するほど、植物組織内の空間は減少する。後の圧力の増大によって、浸潤中で使用する細菌懸濁液を植物組織に再移動させ、植物組織内の植物細胞とアグロバクテリウム細胞の接触を引き起こす。
【００３１】
本明細書で使用する「一過性発現のレベル」は、植物組織質量１ｋｇ当たり、少なくとも約２５０マイクログラム、少なくとも約５００マイクログラム、少なくとも約７５０マイクログラム、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１５０ｍｇ、少なくとも約２００ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約１０００ｍｇ、少なくとも約１．５ｇ、少なくとも約２ｇ、少なくとも約２．５ｇ、少なくとも約５ｇ、少なくとも約７．５ｇ、少なくとも約１０ｇ、少なくとも約１５ｇ、または少なくとも約２０ｇを発現する能力を指す。
【００３２】
本明細書で使用する「一過性」は、適切な植物組織からのタンパク質の単離を可能にするほど十分長い時間を指す。タンパク質の発現は、適切に高いレベルでは、植物組織への発現構築物の導入後、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日以内であることが好ましい。一態様では、植物組織への発現構築物の導入後、３〜７または５〜１０日以内、およびより好ましくは３〜５または５〜７日以内に適切に高いレベルを得る。
【００３３】
用語「治療」、「治療する」などを本明細書で使用して、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味する。効果は疾患またはその症状を完全もしくは部分的に予防する点において予防的であってよく、および／または疾患および／または疾患が原因の悪影響を部分的もしくは完全に治癒する点において治療的であってよい。本明細書で使用する用語「治療」は対象における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因を有し得る対象における望ましくない免疫応答関連疾患の発生の予防、（ｂ）疾患の阻害、すなわちその進行の抑制、または（ｃ）疾患の軽減、すなわち疾患の退行を引き起こす治療を含む。
【００３４】
本発明の目的での「患者」または「対象」は互換的に使用し、ヒトと他の動物の両方、特に哺乳動物、および他の生物を含むことを意味する。したがって本発明の方法は、ヒト療法と獣医用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態では、患者または対象は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態では、患者または対象はヒトである。
本明細書で使用する用語「弱毒化」は、対象または対象の組織におけるウイルス感染の低下、すなわち、ウイルス量もしくはウイルス負荷の低下またはクリアランスを指す。低下またはクリアランスの特定の程度もしくはレベルは少なくとも１５％、２５％、３５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上である。
本明細書で使用する用語「アジュバント」は、免疫原に曝された対象において免疫原に対しての免疫応答を刺激する免疫原（すなわち抗原）の能力を、増大または助長する物質を指す。特定の実施形態では、アジュバントは少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、５００、１０００倍以上免疫原に対しての免疫応答を増大する。他の実施形態では、アジュバントは、特定レベルの免疫応答（細胞および／または体液性および／または粘膜）、例えば、少なくとも１５％、２５％、３５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上の低下を得るのに必要な免疫原の量を低下させる。さらにアジュバントは、（例えば、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、またはそれ以上長い時間）免疫応答、場合によっては防御免疫応答が持続する時間を延長する物質であってよい。
【００３５】
表現「医薬組成物」と「治療用組成物」は、広義で本明細書において互換的に使用する。それらは、本発明の目的では、場合によっては薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と一緒に、治療上有効な量の活性成分、すなわち式（Ｉ）のＶＬＰまたはその薬学的に許容される塩を指すことを意味する。
その表現は、人間または非ヒト動物における、状態の治癒的治療、調節、回復、改善、または疾患もしくは障害の予防に適した組成物を包含する。したがってその表現は、ヒトまたは獣医学医療の分野で使用するための医薬組成物を包含する。このような「治療用組成物」は、本発明の少なくとも１つのＶＬＰ、および場合によっては担体または賦形剤を包含することを特徴とし、それによって塩および担体および賦形剤は治療する標的生物によって許容される。
「治療有効量」は、所与の状態および投与レジメンに関して治療効果をもたらす量を指す。特に「治療有効量」は、疾患の症状を予防、緩和または回復するのに、またはヒトもしくは非ヒト動物であってよい治療対象の生存期間を延長するのに有効な量を意味する。治療有効量の決定は当業者の技術の範囲内にある。
【００３６】
本発明による化合物の治療有効量または用量は、広範囲内で変わる可能性があり、関連技術分野で知られている形式で決定することができる。用量は広範囲内で変わる可能性があり、当然ながら、各々個々の場合で個々の要件に対して調節しなければならない。
「免疫学上有効な量」は、対象において活性免疫応答（細胞および／または体液性）をもたらす免疫原の量を指す。本発明の幾つかの実施形態では、前記免疫応答は、完全的または持続的である必要がない防御効果をもたらすのに十分である。免疫学上有効な量の決定は当業者の技術の範囲内にある。
「アジュバント有効量」は、免疫原に曝されたとき対象において免疫原によってもたらされる、活性免疫応答（細胞および／または体液性、または場合によっては活性粘膜免疫応答）を高めるまたは刺激するアジュバントの量を指す。
【００３７】
防御免疫応答の文脈において、用語「アジュバント有効量」は、宿主中の免疫応答の誘導を加速するのに必要な、および／または防御を得るための追加免疫処置の必要性を減らすのに十分であり得るアジュバントの量を指す。
免疫応答の延長の文脈において、用語「アジュバント有効量」は、免疫応答、場合によっては防御免疫応答が持続する時間を延長するアジュバントの量を指す。
前に示した文脈におけるアジュバント有効量の決定は、当業者の技術の範囲内にある。
ＨＢｓＡｇ、ＮＶＣＰ、ＨＰＶ１１−Ｌ１またはＨＰＶ１６−Ｌ１などの様々なウイルス抗原が、タバコ、ジャガイモ、ルピナス、レタス、トマト、ダイズ、ニコチアナベンタミアナを含めた異なる植物系において、ナノ粒子を組織化する能力を有することは以前に報告されている。これらのいわゆるウイルス様粒子は、様々な脂肪酸（すなわち、リン脂質）とステロールを含む脂質二重層で構成される。
【００３８】
ニコチアナベンタミアナにおける完全長組換え血球凝集素タンパク質の発現は、二重層膜を有する人工ウイルス様粒子の形成につながり、前記ＶＬＰは１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のサイズ分布を有することがさらに示された。ニコチアナベンタミアナにおいて生成されるウイルス様粒子の脂質二重層は、等量の脂肪酸とステロールを有する。
本発明の範囲内で、驚くことに、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでニコチアナタバカム植物において生成される血球凝集素などの組換えインフルエンザウイルス抗原はＶＬＰを組織化できること、およびこれらのニコチアナタバカム植物において生成されるＶＬＰは、改善された性質を有することが現在分かっている。
本発明の一実施形態では、血球凝集素は、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ血球凝集素、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるインフルエンザ亜型Ａ血球凝集素である。
【００３９】
本発明の具体的な実施形態では、血球凝集素はＨ５亜型の血球凝集素である。
血球凝集素を提示するニコチアナタバカム植物または植物細胞において生成されるＶＬＰは、約５０ｎｍ〜２００ｎｍの好ましいサイズ分布を有する。２０〜２００ｎｍの小粒子は排出リンパ節樹状細胞およびマクロファージと結合し、一方で大粒子は、典型的には注射部位からの樹状細胞のみと結合することが分かっており（Manolova et al.(2008)Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size.Eur.J.Immunol.38: 1404-1413）、ニコチアナタバカム植物において生成される小粒子はより免疫原性が高くなる。
さらに、ニコチアナタバカム植物細胞において生成されるＶＬＰは、ニコチアナベンタミアナ細胞において生成されるＶＬＰと比較して、脂質二重層の組成が異なる。ニコチアナタバカム植物細胞において生成されるウイルス様粒子の脂質二重層は、ステロールより多量の脂肪酸を有する。
【００４０】
一実施形態では、ニコチアナタバカムにおいて生成されるウイルス様粒子は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに、０．４μｇ／ｍＬ未満、０．５μｇ／ｍＬ未満、１．０μｇ／ｍＬ未満、または１．５μｇ／ｍＬ未満の濃度で脂質二重層中に存在する、低濃度のモノ不飽和脂肪酸、特にＣ１８モノ不飽和脂肪酸、例えばオレイン酸などを含有することが示された。
本発明の別の実施形態では、前のいずれかの実施形態のＶＬＰの脂質二重層は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに、０．５μｇ／ｍＬを超える、０．７５μｇ／ｍＬを超える、０．９μｇ／ｍＬを超える、または１．０μｇ／ｍＬを超える含量のＣ２０飽和脂肪酸、特にアラキドン酸を有する。
さらに、ニコチアナタバカムにおいて生成されるウイルス様粒子は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳに従って決定したときに、３．０μｇ／ｍＬ〜５．０μｇ／ｍＬの濃度で脂質二重層中に存在する、高濃度のポリ不飽和脂肪酸、特にＣ１８ポリ不飽和脂肪酸、例えばリノール酸および／またはリノレン酸などを含有することが示された。
リノール酸などのポリ不飽和脂肪酸は免疫系の正常な機能に必要不可欠であり、サイトカイン応答の制御に関与している（Fritsche,K (2006)「Fatty acids as modulators of the immune response」Annu. Rev.Nutr.26:45-73）。
【００４１】
さらに、ニコチアナタバカム植物または植物細胞において生成されるウイルス様粒子の脂質二重層は、ＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳにより決定したときに１より大きいことが分かった、改善されたコレステロール：シトステロール比を有する。したがって、ニコチアナベンタミアナにおいて生成されるＶＬＰと比較したとき、ニコチアナタバカム植物ＶＬＰの脂質二重層は、約５０％を超えるコレステロール、ただしわずか半分の濃度のシトステロールを含有する。
コレステロールは二重層膜の流動性と浸透性を低下させ、膜流体を保ちながら機械的剛性の増大をもたらす（Raffy and Teissie (1999)「Control of lipid membrane stability by cholesterol content」 Biophys.J.76:2072-2080;Crane and Tamm (2004) 「Role of cholesterol in the formation and nature of lipid rafts in planar and spherical model membranes」 Biophys.J.86:2965-2979）。ニコチアナタバカム植物由来粒子の高いコレステロール含量は低い浸透性、したがって粒子腔内に含有される少ない植物細胞タンパク質を有するより安定した粒子をもたらす。この理論によって縛られずに、ニコチアナベンタミアナと比較したニコチアナタバカム植物由来粒子におけるより高い割合のコレステロールは、哺乳動物原形質膜に一層類似した異なるオルガネラ起源を示唆する。
【００４２】
本発明の一実施形態では、ウイルス様粒子により、特にニコチアナタバカム細胞におけるヌクレオチド配列をコードする組換え血球凝集素の発現により生成する粒子により提示される血球凝集素は、Ｓ−アシル化状態である。
本発明の一実施形態では、ウイルス様粒子により、特にニコチアナタバカム細胞におけるヌクレオチド配列をコードする組換え血球凝集素の発現により生成する粒子により提示される血球凝集素は、Ｎ−アシル化状態である。
本発明の一実施形態では、ニコチアナタバカム細胞におけるヌクレオチド配列をコードする組換え血球凝集素の発現により生成するウイルス様粒子により提示される血球凝集素は、Ｓ−アシル化状態かつＮ−グリコシル化状態である。
【００４３】
本発明の一実施形態では、血球凝集素は、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ血球凝集素、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるインフルエンザ亜型Ａ血球凝集素である。
本発明の具体的な実施形態では、血球凝集素はＨ５亜型の血球凝集素である。
さらに別の具体的な実施形態では、本発明は、インフルエンザ血球凝集素５ポリペプチド（Ｈ５）、特に選択ニコチアナタバカム品種、育種系統、または栽培変種において生成される、配列番号８中に示すインフルエンザ血球凝集素５ポリペプチド（Ｈ５）を提示するＶＬＰを含むＶＬＰ組成物を提供する。
【００４４】
ニコチアナタバカム細胞において生成されるＨ５血球凝集素では、わずか２個の細胞質システインがパルミチン酸でのアシル化により翻訳後修飾される。したがって、本発明によるニコチアナタバカム細胞において生成されたＨ５血球凝集素は、わずか２本のパルミトイル（パルミテート）鎖を有する。これは、パルミテートとステアレートの混合物でＳ−アシル化された２個の細胞質および１個の膜貫通型システインを有する、哺乳動物で生成される血球凝集素Ｈ５とは対照的である。
したがって、本発明のタバコ属において生成されるＨ５血球凝集素は、膜貫通型システインが非アシル化状態であり、ステアレート（Ｃ１８）がアシル化タンパク質において検出されない点で、哺乳動物系において生成される血球凝集素とは著しく異なる。
【００４５】
Ｓ−アシル化は膜のアフィニティーを大幅に増大し、膜の内外または脂質ミクロドメインの入出を繰り返すタンパク質に典型的である（概要に関しては、Hemsley & Grierson (2008) 「Multiple roles for protein palmitoylation in plants」Trends in Plant Sci.13:295-302を参照）。パルミテートの独占的存在は、ニコチアナタバカムの血球凝集素が短鎖脂質で構成されるミクロドメインに移動することを示す。本発明では、ニコチアナタバカムにおいて生成された全ての血球凝集素Ｃ末端ペプチドに関してパルミトイル化を観察し、Ｓ−アシル化／パルミトイル化がないペプチドは検出されない。Ｓ−アシル化はプロテインＳ−アシルトランスフェラーゼによって触媒される。ニコチアナタバカムは５個の推定Ｓ−アシルトランスフェラーゼを有し、一方ニコチアナベンタミアナはわずか２個を有し、Ｓ−アシル化はニコチアナタバカム中でより起こりやすく、ニコチアナベンタミアナと比較してニコチアナタバカムにおいて、血球凝集素のより安定した膜複合体形成の可能性が増すことを示唆する（Hemsley (2009)「Protein S-acylation in plants」(Review). Molecular Membrane Biology26:114-125）。
【００４６】
インフルエンザウイルスの血球凝集素は、異なる血球凝集素型と亜型間で広範囲において数および構造が変化する、Ｎ−グリコシド炭水化物側鎖を有する。血球凝集素分子上の特異的部位に結合する、これらのオリゴ糖は、抗体結合、受容体結合、タンパク質分解活性化、およびトリマー組織化に干渉することができ、したがって異なる血球凝集素の生物学的性質の調節に対して有意な影響を有する。
ニコチアナタバカム細胞において、ヌクレオチド配列をコードする組換え血球凝集素の発現によって生成するウイルス様粒子により提示される血球凝集素も、Ｎ−グリコシル化状態である。ニコチアナタバカムにおいて生成するウイルス様粒子上で提示される血球凝集素のＮ−グリコシド炭水化物側鎖は一般に、例えばニコチアナベンタミアナにおいて生成するＶＬＰにおける側鎖と比較してより単純である。
したがって、単純Ｎ−グリコシル化血球凝集素の完全グリコシル化かつルイス型血球凝集素に対する比は、ニコチアナベンタミアナにおいて生成する血球凝集素と比較して、ニコチアナタバカムにおいて生成する血球凝集素に関して高い。ニコチアナタバカムにおいて生成する血球凝集素の単純なＮ−グリコシル化パターンの結果として、ニコチアナタバカムにおける血球凝集素は、保存型エピトープを含む多量のタンパク質骨格配列を露出する。
【００４７】
要約すると、ニコチアナタバカムにおいて生成する血球凝集素は、位置Ａｓｎ１１、Ａｓｎ２３、Ａｓｎ１５４、Ａｓｎ１６５、Ａｓｎ２８６およびＡｓｎ４８４でグリコシル化されており、平均的に、還元性末端において、位置Ａｓｎ１５４での主要Ｎ−グリカンは１個のＧｌｃＮＡｃを有し、位置Ａｓｎ２８６では２個のＧｌｃＮＡｃを有し、位置４８４ではＧｌｃＮＡｃを有さない。
【００４８】
位置Ａｓｎ１１、Ａｓｎ２３、Ａｓｎ１５４、Ａｓｎ１６５、およびＡｓｎ２８６でのＮ−グリコシル化は、それぞれ位置１１と２８６に数個〜多数のルイス型Ｎ−グリカンを有するニコチアナベンタミアナの血球凝集素と比較して、ニコチアナタバカムにおいて生成する血球凝集素において単純構造を示す。
特に位置Ａｓｎ１５４および１６５において、ニコチアナタバカムにおいて生成する血球凝集素はニコチアナベンタミアナ由来血球凝集素と比較してより単純な構造を示し、マンノース残基を露出する。マンノース残基は、インフルエンザＡウイルスを含めた多くの病原体の表面上に提示される炭水化物において見ることができ、そこでそれらは、マクロファージの動員および活性化により前炎症性応答を誘導する先天的免疫系の、内生マンノース結合レクチン（‘ＭＢＬ）受容体のリガンドとして機能する（総説に関しては、Marth & Grewal (2008) 「Mammalian glycosylation in immunity」 Nat. Rev. Immunol.8:874-887を参照）。多くの天然インフルエンザＡウイルスは位置Ａｓｎ１６５に高マンノース構造を示し（Ward et al.(1980) 「Carbohydrate composition of the oligosaccharide units of the hemagglutinin from the Hong Kong influenza virus A/Memphis/102/72」Biochem.J.189:649-652を参照）、ニコチアナベンタミアナ由来血球凝集素はインフルエンザウイルス自体の「天然」血球凝集素形状により類似していることを示唆し、（ニコチアナベンタミアナと比較して）それはワクチン目的でより優れた免疫原となる。
【００４９】
本発明の一実施形態では、前の実施形態のＶＬＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでニコチアナタバカム植物または植物細胞において生成される。
前の実施形態のＶＬＰは、ニコチアナタバカム植物または植物細胞において、バイナリーベクター、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製、ならびにタバコ植物細胞、およびニコチアナタバカム植物において機能的な制御エレメントの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザ抗原のコード配列、特にインフルエンザ血球凝集素もしくはその免疫原性断片を含むさらなるＴ−ＤＮＡ領域への、Ｔ−ＤＮＡの移動に必要不可欠な配列エレメント、および場合によっては植物選択マーカー遺伝子を含む、最小サイズのバイナリーベクターであって、必要不可欠な配列エレメントが最小サイズのバイナリーベクター全体の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％を占めるバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム細胞と、前記ニコチアナタバカム植物または植物細胞をインキュベートすることによって生成することができる。
【００５０】
以下の核酸エレメントを含む、これらからなる、または本質的にこれらからなる、最小バイナリーベクターを使用することができる。
ａ）  大腸菌およびアグロバクテリウム種において機能的な選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸エレメント、
ｂ）  大腸菌において機能的な第１の複製起点のヌクレオチド配列を含む第２の核酸エレメント、
ｃ）  複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸エレメント、
ｄ）  第１の複製起点と異なりアグロバクテリウムにおいて機能的な第２の複製起点のヌクレオチド配列を含む第４の核酸エレメント、および
ｅ）  腫瘍誘導型アグロバクテリウムツメファシエンスプラスミドもしくは根部誘導型アグロバクテリウムリゾゲネスプラスミドのＴ−ＤＮＡ右ボーダー配列およびＴ−ＤＮＡ左ボーダー配列を含むＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を含む第５の核酸エレメント。
前述の核酸エレメントは環状ポリヌクレオチド分子で提供し、複製、維持または核酸移動の機能がないギャップヌクレオチド配列により隔てられ、前記ギャップヌクレオチド配列はベクターサイズ全体の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％未満を占める。ギャップヌクレオチド配列は、ベクターサイズ全体の２０％未満を占めることが好ましい。
【００５１】
インフルエンザ抗原、特にインフルエンザ血球凝集素もしくはその免疫原性断片をコードする発現可能なヌクレオチド配列は、大腸菌およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製、ならびにタバコ植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移動に必要不可欠な配列エレメント、および場合によっては植物選択マーカー遺伝子を含む最小サイズのバイナリーベクターでクローニングすることができ、必要不可欠な配列エレメントの割合は、インフルエンザ抗原をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含まない最小サイズのバイナリーベクター全体のヌクレオチドの少なくとも７０％を占める。
本発明によるＶＬＰの組成物において使用するためのベクター分子は、６’０００ｂｐ未満、特に５’５００ｂｐ未満、特に５’２００ｂｐ未満、特に５’１００ｂｐ未満、ただし特に５１３９ｂｐの全体サイズを有し得る。
前記最小バイナリーベクターは広域宿主プラスミドｐＲＫ２をベースとする。
最小サイズのバイナリーベクターは、配列番号１中に示す配列を有し得る。
【００５２】
本発明の別の態様では、インフルエンザ抗原、特にインフルエンザ血球凝集素もしくはその免疫原性断片の発現を調節する、植物において作動可能な制御配列は、プロモーター、特に本明細書で以下に開示するプロモーターの１つ、ただし特にＨＴ−ＣＰＭＶプロモーター、特に配列番号２中に示す最小３５ＳＣａＭＶプロモーターと組合せたＨＴ−ＣＰＭＶプロモーターなどを含む。
場合によっては、制御配列は、５’非翻訳リーダー配列、ポリアデニル化シグナル、または１つまたは複数のエンハンサー、または前述の組合せを含む。さらに本発明は、当業者に知られており本明細書で以下に開示する、遺伝子サイレンシングのサプレッサーを含めた他の制御配列を企図する。
したがってバイナリーベクターは、インフルエンザ抗原、特にインフルエンザ血球凝集素もしくはその免疫原性断片をコードする発現可能なヌクレオチド配列、およびさらにタバコ植物において作動可能な制御エレメントと作動可能に連結した遺伝子サイレンシングのサプレッサーのコード配列を含むことができる。
【００５３】
遺伝子サイレンシングのサプレッサーはウイルス由来、および特にキュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）のｐ１９タンパク質、イネ黄斑ウイルス（ＲＹＭＶ）のｐ１タンパク質、ポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）のｐ２５タンパク質、アフリカンキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）のＡＣ２タンパク質、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の２ｂタンパク質およびポチウイルスのヘルパー成分プロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）からなる群から選択される遺伝子サイレンシングのサプレッサーであってよい。
【００５４】
本発明の一態様では、ニコチアナタバカム植物において、
ｉ）ニコチアナタバカム植物の選択品種、育種系統、または栽培変種とアグロバクテリウム種の選択株の組合せを用意するステップであって、品種、育種系統、または栽培変種が、０．３２のＯＤ６００の細胞密度で選択アグロバクテリウム株を前記品種、育種系統、または栽培変種の葉にシリンジで注射した５日後に、１０％未満の壊死、５％未満の壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示すステップ、
ｉｉ）０．１〜４．０のＯＤ６００で、ニコチアナタバカム植物において機能的な制御エレメントの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザ抗原のコード配列、特にインフルエンザ血球凝集素もしくはその免疫原性断片、および場合によっては植物選択マーカー遺伝子を含むバイナリーベクター、特に大腸菌およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製に必要不可欠である、タバコ植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移動のための配列エレメント、ならびにさらなるＴ−ＤＮＡ領域を含む最小サイズのバイナリーベクターであって、必要不可欠な配列エレメントが最小サイズのバイナリーベクター全体の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％を占める最小サイズのバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム種の選択株の懸濁液を、ニコチアナタバカムの品種、育種系統、または栽培変種の完全植物に浸潤させるステップであって、前記株がポリペプチドをコードし植物において作動可能な制御配列の調節下にある発現可能なヌクレオチド配列を含むステップ、
ｉｉｉ）浸潤状態の植物中で発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、浸潤状態の植物を５日間〜２０日間、詳細には７日間〜１５日間、ただし特に８日間〜１０日間インキュベートするステップ
を含む前の実施形態のＶＬＰを生成する。
【００５５】
本発明は、ニコチアナタバカム植物の前記選択品種、育種系統、または栽培変種に浸潤させるための、遺伝子サイレンシングのサプレッサーのコード配列を含むバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム細胞の第２の懸濁液の使用をさらに企図する。場合によっては、アグロバクテリウム細胞の第２の懸濁液は、選択したアグロバクテリウム株と同じ株のものであってよい。アグロバクテリウム細胞の第１の懸濁液と第２の懸濁液は、任意の順序または同時に浸潤させることが可能である。アグロバクテリウム細胞の第１の懸濁液と第２の懸濁液を使用前に混合して、タバコ植物に浸潤させることが可能である。場合によっては、アグロバクテリウム細胞の第１の懸濁液と第２の懸濁液を、各懸濁液から決められた数の細胞比で混合する。
【００５６】
ニコチアナタバカム品種、育種系統、または栽培変種の浸潤に関するステップ（ｉｉ）で使用することができるアグロバクテリウム細胞の懸濁液は、０．１５〜０．３５の範囲の細胞密度（ＯＤ６００）を有する。
【００５７】
前の実施形態のＶＬＰは、ＮＣＩＭＢ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、もしくはＤＡＣ  Ｍａｔａ  Ｆｉｎａに寄託されたニコチアナタバカム受託番号ＰＭ０１６、ＰＭ０２１、ＰＭ９２、ＰＭ１０２、ＰＭ１３２、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、ＰＭ２１５、ＰＭ２１６もしくはＰＭ２１７、ＰＯ２、ＢＹ−６４、ＡＳ４４、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ９４４（ＭＮ９４４）、バーレイ２１、Ｋ１４９、Ｙａｋａ  ＪＢ１２５／３、Ｋａｓｔｕｒｉ  Ｍａｗａｒ、ＮＣ２９７、Ｃｏｋｅｒ３７１  Ｇｏｌｄ、ＰＯ２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｕｎ、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、交雑ＢＵ２１×Ｈｏｊａ  Ｐａｒａｄｏ系統９７由来のＦ４、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ、Ｉｚｍｉｒ、Ｘａｎｔｈｉ  ＮＮ、Ｋａｒａｂａｌｇａｒ、ＤｅｎｉｚｌｉおよびＰＯ１からなる群から選択される、ニコチアナタバカム品種、育種系統、または栽培変種において生成することができる。
【００５８】
本発明の一実施形態では、前の実施形態のＶＬＰは、受託番号ＮＣＩＭＢ４１７９８の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ（ブダペスト条約の下、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１  ９ＹＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ所在の国際寄託機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ））にその種子が寄託されたニコチアナタバカム系統ＰＭ０１６、受託番号ＮＣＩＭＢ４１７９９の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ０２１、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８００の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ０９２、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０１の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ１０２、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０２の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ１３２、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０３の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２０４、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０４の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２０５、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０５の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２１５、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０６の下寄託されたＰＭ２１６、および受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０７の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２１７からなる群から選択される、ニコチアナタバカム品種、育種系統、または栽培変種において生成される。
【００５９】
前の実施形態のＶＬＰの生成において使用するアグロバクテリウム株は、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ２２６０、ＧＶ３１０１およびＣｈｒｙ５からなる群から選択されるアグロバクテリウムツメファシエンスの株、特にアグロバクテリウム株ＡＧＬ１またはＥＨＡ１０５であってよい。
【００６０】
ニコチアナタバカム植物において、本明細書に記載する本発明によるＶＬＰを生成するため、植物葉および／または植物花および／または植物茎および／または植物根、および特に植物全体を含めた前記植物の主要部分を、大気圧または減圧より低い圧力にｉｎ  ｓｉｔｕで曝すことができる。
代替として、植物葉および／または植物花および／または植物茎および／または植物根、および特に植物全体を含めたニコチアナタバカム植物の主要部分を、大気圧より高い圧力にｉｎ  ｓｉｔｕで曝すことができる。
浸潤後、ニコチアナタバカム植物を１日当たり７〜９時間、好ましくは１日当たり８時間の日光条件下でインキュベートして、異種タンパク質の一過的発現のレベルを改善することができる。
【００６１】
本発明の別の態様では、ニコチアナタバカム植物は直立位置で、または代替的に転位位置でインキュベートすることができる。
本発明の具体的な実施形態では、ニコチアナタバカム植物を、転位位置、または１日当たり７〜９時間の日光条件下、またはその両方でインキュベートする。
本発明のさらに別の態様では、ニコチアナタバカム植物は、（ａ）浸潤前１平方メートル当たり少なくとも１００植物の密度で、または（ｂ）浸潤後１平方メートル当たり少なくとも１００植物の密度で、または（ｃ）浸潤前１平方メートル当たり少なくとも１００植物の密度、かつ浸潤後１平方メートル当たり少なくとも１００植物の密度で成長することができる。
【００６２】
発現構築物が複数の植物細胞中でペプチド抗原を発現するのに適した条件下において、植物または植物組織をインキュベートした後、ペプチドはＶＬＰに自己組織化することができ、植物器官もしくは植物組織もしくはその細胞などの植物または植物部分において、ＶＬＰを検出し定量化することができる。採取後、当技術分野で一般的な方法を使用して、ＶＬＰの単離を実施することができる。例えば、バイオマスの少なくとも一部分を均質化し、組換えペプチド抗原を提示するＶＬＰを抽出し、さらに精製することができる。抽出は、適切な溶媒におけるホモジェネートの浸漬または埋没を含むことができる。精製法には、イムノアフィニティー精製、およびペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体の具体的サイズ、単離するペプチドもしくはタンパク質の電気泳動移動度、生物活性、および／または実質電荷に基づく、またはタンパク質中のタグ分子の存在に基づく精製手順があるが、これらだけに限られない。単離したペプチドまたはタンパク質の特徴付けは、イムノアッセイにより、または当技術分野で知られている他の方法により実施することができる。例えばペプチドまたはタンパク質は、ウエスタンブロッティングによりＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、またはペプチドまたはタンパク質が実質的に精製されたときはクーマシーブルー染色によって分析することができる。
【００６３】
本発明の方法によって生成されるＶＬＰは医薬品として使用することができ、滋養剤および化粧剤としてその有用性を示すことができる。これらの製品は、ヒトへの直接摂取、注射もしくは施用（例えば、局所投与）に使用されるからである。本発明のＶＬＰは、同様に規制されている獣医学的製品の製造においても有用である。
本明細書で開示する本発明のＶＬＰは、そのように、または組成物、特に医薬組成物の形で提供することができる。前記組成物は、意図する用途および施用に応じて、他の医療物質、医薬物質、担体、バッファー、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含むことができる。
本明細書で開示する本発明によるＶＬＰを含有する適切な（医薬）組成物の投与は、当業者に周知の異なる方法によって、例えば非経口、皮下、腹腔内、局所、経粘膜、経真皮、気管支内、肺内および鼻腔内、心室内、関節内、鞘内、膣内、気管内投与、および局所治療を望む場合は病変内投与によって実施することができる。非経口投与には、腹腔内、筋肉内、真皮内、皮下、静脈内または動脈内投与がある。本発明の組成物は、例えばバイオリスティック送達によって、標的部位、特異的影響がある器官もしくは腫瘍のような、外部もしくは内部標的部位に直接投与することもできる。
【００６４】
本発明のＶＬＰおよび前記ＶＬＰを含む医薬組成物は経口投与することができ、したがって経口投与に適した形に、すなわち固体もしくは液体調製物として製剤化することができる。適切な固体経口製剤には、錠剤、カプセル、ピル、顆粒、ペレットなどがある。適切な液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油などがある。カプセルの形で製剤化する場合、本発明の組成物は、活性化合物および不活性担体もしくは希釈剤以外に、硬質ゼラチンカプセルを含む。
本発明のＶＬＰは、例えばヒトもしくは獣医学において使用するための従来型座薬基剤を含有する座薬として、または例えば従来型ペッサリー基剤を含有するペッサリーとして、製剤化することもできる。
【００６５】
適切な医薬担体、賦形剤および／または希釈剤の例は当技術分野でよく知られており、それだけには限られないが、ガム、スターチ（例えば、コーンスターチ、プレゼラチンスターチ）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース物質（例えば、微晶質セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が含まれる。
【００６６】
液体製剤用の薬学的に許容される担体は、水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、エマルジョンまたは油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。油の例は、動物、野菜、または合成源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚類肝油、別の鉱油、または乳もしくは卵由来の脂質である。
水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水溶液などの緩衝培地含む、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な型の湿潤剤、滅菌溶液などがある。このような担体を含む組成物は、よく知られている従来法により製剤化することができる。適切な担体は、本発明の生物活性化合物と組合せたとき生物活性を保持する、任意の物質を含むことができる。
【００６７】
非経口投与用の調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水および緩衝培地を含めたエマルジョンまたは懸濁液がある。非経口賦形薬は、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または固定油を含むことができる。静脈内賦形薬は、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えばリンガーデキストロースベースの補充剤）などを含むことができる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどを含めた、防腐剤および他の添加剤も存在してよい。さらに、本発明の医薬組成物は、例えば好ましくはヒト起源の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質担体を含むことができる。
別の実施形態では、本明細書に記載する本発明のＶＬＰおよび前記ＶＬＰを含有する医薬組成物は、体表面に局所投与することができ、したがって局所投与に適した形に製剤化することができる。適切な局所製剤には、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、滴剤などがある。局所投与用に、医薬担体有りまたは無しで生理的に許容される希釈剤を含む溶液、懸濁液、またはエマルジョンとして式（Ｉ）の化合物を調製し施用する。
【００６８】
本明細書で提供する医薬組成物は、放出制御組成物、すなわち投与後一定時間にわたり活性ＶＬＰが放出される組成物として投与することもできる。放出制御組成物または徐放性組成物は、親油性デポ剤の製剤（例えば脂肪酸、ワックス、油）を含む。別の実施形態では、組成物は、即時放出性組成物、すなわち全ＶＬＰまたは任意の他の活性成分が投与直後に放出される組成物である。
さらに、本明細書に記載する本発明によるＶＬＰまたは前記ＶＬＰを含む組成物は、食品、機能性食品、飲料、医療用食品と混合して投与することができる。
適切な製剤に関するさらなる例は、その全容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０８５９８３中に提供される。
【００６９】
これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投薬レジメンは、担当医および臨床的要因によって決定される。医療分野でよく知られているように、任意の一患者に関する投薬は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する個々の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的健康状態、および同時に投与される他の薬剤を含めた多くの要因に依存する。
【００７０】
本明細書に記載する本発明によるＶＬＰは、鳥類、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、マウス、ラットおよびウサギを含めたヒトおよび動物を治療するために、ヒトおよび獣医学において使用することができる。
本明細書に記載する本発明によるＶＬＰの適切な用量は、対象の状態、年齢および種類に応じて変わり、当業者によって容易に決定することができる。獣医学とヒト医療の両方で利用する式（Ｉ）の化合物の１日当たりの合計用量は、体重１ｋｇ当たり０，０１〜２０００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０，１〜１０００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇの範囲であることが適切であり、これらは一回用量または分割用量として投与することができ、さらに加えて、指示が見られるときは上限を拡大することもできる。これらの用量は、各々個々の症例において、投与する具体的化合物（複数可）、投与の経路、治療する状態、および治療する患者を含めた個々の要件に対して調節する。しかしながら、化合物はデポ剤調製物（インプラント、徐放性製剤など）として毎週、毎月またはさらに長い間隔で投与することもできる。このような症例では、用量は１日当たりの用量よりはるかに多く、投与形、体重および具体的指示に適合させなければならない。適切な用量は、従来型モデル、好ましくは動物モデルでの試験の実施によって決定することができる。一般に、体重約７０Ｋｇのヒト成人への経口または非経口投与の場合、約１０ｍｇ〜約１０．０００ｍｇ、好ましくは約２００ｍｇ〜約１．０００ｍｇの１日当たりの用量が適しているはずであるが、指示があるときは上限を拡大することができる。１日当たりの用量は一回用量または分割用量として投与することができ、または非経口投与用に、連続注入としてそれを与えることができる。
【００７１】
ＶＬＰの有効用量は、治療する状態の性質、毒性、予防的に（低用量で）または活発な感染もしくは状態に対して化合物（複数可）を使用するかどうか、送達の方法、および医薬製剤に少なくとも依存し、従来型用量漸増試験を使用し臨床医により決定される。それは１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０５〜約３０ｍｇであると予想することができる。例えば局所送達用の、体重約７０Ｋｇのヒト成人に対する１日当たりの考えられる用量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、一般に約５ｍｇと約４０ｍｇの間の範囲であり、投与部位に一回または多数回用量の形をとり得る。
免疫原およびアジュバントとしてのＶＬＰは、同じまたは異なる組成物で（例えば、互いに数時間以内に）併用して同時投与することができ、後者の場合、同じまたは異なる経路により投与することができる。あるいはアジュバントは、免疫原の投与の前後に（例えば、免疫原投与前後の約６、１２、２４、３６、４８、７２、９６または１２０時間以上で）投与することができる。
さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の目的とする用途に応じて、さらなる生物学的活性物質を含む可能性があることが想定される。これらのさらなる生物学的活性物質は、例えば、抗体、抗体断片、ホルモン、増殖因子、酵素、結合分子、サイトカイン、ケモカイン、核酸分子および薬剤であってよい。
【実施例】
【００７２】
以下の例は、限定としてではなく例示として提供する。他に示さない限り、本発明は、当業者に知られる、分子生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡ技術、植物生物学、植物育種およびタンパク質生成の従来技法および方法を利用する。
【００７３】
（例１）
タバコ植物のアグロバクテリウム浸潤法、浸潤状態の植物の栽培、および植物材料の採取
１．１  アグロバクテリウム浸潤法
この例は、アグロバクテリウム細胞をニコチアナタバカムに浸潤させる様々な方法を記載する。完全植物または植物組織に、減圧、高圧支援により、またはニードルのないシリンジにより、アグロバクテリウムを浸潤させることが可能である。浸潤前に、２０時間明期と４時間暗期、２６℃／２０℃日中／夜間および７０％／５０％相対湿度（日中／夜間）において、ロックウールブロック内、温室内でタバコ植物を成長させる。植物には地下灌漑により化学肥料を与える。
【００７４】
１．１．１  接種物の組成
植物制御エレメントの調節下にあるＴ−ＤＮＡおよび対象の遺伝子を含有するバイナリーベクターを含む、アグロバクテリウムツメファシエンスまたはアグロバクテリウムリゾゲネス菌を、ロータリーシェーカー上のエルレンマイヤーフラスコにおいて２８℃および２５０ｒｐｍで、２ｇ／Ｌのビーフ抽出物、０．４ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＢａｃｔｏ−ペプトン、２ｇ／Ｌのスクロース、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、およびそれぞれのアグロバクテリウム株とバイナリーベクターの選択に適した抗生物質を含むＹＥＢ培地中でＯＤ６００＞１．６まで増殖させる。次いで培養物を、１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および適切な抗生物質を含有する新たなＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｍｉｌｌｅｒ培地中に１：１００で希釈し、ロータリーシェーカー上において２８℃および２５０ｒｐｍでＯＤ６００＞２までさらに増殖させる。８’０００ｇおよび４℃で１５分間の遠心分離により細菌を回収する。ペレット状細菌は、５．６の最終ｐＨ、およびＯＤ６００＞２で、（本明細書で浸潤溶液と呼ぶ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＭＥＳを含有する浸潤溶液中に再懸濁させる。場合によっては、細菌を浸潤溶液中にさらに希釈することができ、アセトシリンゴンを加えて毒性を誘導することができる。場合によっては、前に記載したように調製した第１のアグロバクテリウム菌懸濁液を、第２のバイナリーベクターおよび第２の発現遺伝子を含む第２のアグロバクテリウム菌懸濁液と混合する。このような第２の遺伝子の非制限的な例は、遺伝子サイレンシングのサプレッサーをコードするコード配列である。場合によっては、接種物は使用まで４〜６℃で、最大１週間保存することができる。
【００７５】
１．１．２  シリンジ浸潤法
標準２ｍｌシリンジの寸法を有するシリンジに細菌浸潤溶液を満たし、ニードルなしで葉の背軸側に対して押し出す。ピストンを押して葉組織に細菌懸濁液を進入させる。葉表面の大部分が浸潤するまで、これを繰り返す。浸潤後、植物は少なくとも８時間少量の光で保ち、第１日中は完全日光から保護する。翌日、採取するまで植物を通常光条件下に置く。
【００７６】
１．１．３  減圧浸潤法
細菌接種物を満たした１０Ｌビーカー中での空気性部分の浸漬、および感染植物（単数または複数）の全体を（本明細書で一般に減圧と呼ぶ）大幅に低下した大気圧（本明細書で一般に減圧と呼ぶ）に曝すことによって、植物を浸潤させる。減圧浸潤法は、Ｖ−８５５レギュレーターと接続したＶ−７１０  Ｂｕｃｈｉポンプを使用して、ガラス製ベルジャー（Ｓｃｈｏｔｔ−Ｄｕｒａｎ  Ｍｏｂｉｌｅｘ  ３００ｍｍ）で実施し、圧力は３〜４分で大気圧（１バール）から５０ミリバールに低下させる。到達後、ベルジャー中の減圧を１分間保ち、次に約２秒で大気圧に戻す。人工光（８０〜１００μｍｏｌフォトン／ｃｍ２）を浸潤プロセス全体中で保ち、一貫した光条件を確実にする。浸潤後、採取するまで、温室中に非浸潤対照植物と共に植物を置く。受精、光周期および温度などの成長条件は、浸潤前に使用したものと同じである。細流灌漑システムを使用して、水と化学肥料を植物に施す。
【００７７】
１．２  転位位置での浸潤タバコ植物のインキュベーション
転位位置での浸潤タバコ植物のインキュベーションが、組換えタンパク質の発現の増加をもたらすことを、驚くことに発見した。特に温室内において高密度でインキュベートすると、浸潤タバコ植物は倒れる傾向がある。植物および植物の茎は、浸潤葉の重量を支えることができないからである。通常の直立位置でインキュベートしたタバコ植物と比較して組換えタンパク質生成の有意な増加をもたらす、転倒状態での浸潤状態の植物のインキュベーションによって、溶液を与える。受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０２の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託された、ロックウール内で成長させいずれも約２８ｃｍ高である、５〜６週齢のニコチアナタバカム植物ＰＭ１３２に、ｔＧＦＰ発現カセットを含むプラスミドｐＣ９１またはＨ５発現カセットを含むｐＣ７１の一方を有するアグロバクテリウム株Ａｇｌ１の細胞を用いて、前に記載したように減圧浸潤法を施す。
【００７８】
遺伝子構築物ｐＣ９１は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの調節下にあるクローニングＥｖｒｏｇｅｎのＴｕｒｂｏＧＦＰ（ｔＧＦＰ）緑色蛍光タンパク質遺伝子およびＨＴ−ＣＰＭＶ配列およびＮＯＳターミネーター配列を含む、ｐＢＩＮＰＬＵＳ（Van Engelen et al.(1995)Transgenic Research4:288-290）誘導体バイナリーベクターである。ｐＣ７１は前に記載したのと同様である。前に記載したように、タバコ植物を成長させ、プラスミドｐＣ９１またはｐＣ７１の一方を有するアグロバクテリウム株Ａｇｌ１の細胞を用いて減圧浸潤法を施す。全てのタバコ植物に、前に記載した遺伝子サイレンシングの発現ＨｃＰｒｏサプレッサーを含むｐＣ１２０を同時浸潤させる。
【００７９】
全てのタバコ植物に、前に記載した遺伝子サイレンシングの発現ＨｃＰｒｏサプレッサーを含むｐＣ１２０も同時浸潤させる。
浸潤直後、温室内で植物上の位置から照明を与えながら、浸潤状態の植物を転倒状態でインキュベートする。浸潤後第４日と第６日で、各処理群から４植物を採取し、植物当たり３リーフディスクを使用してｔＧＦＰ発現を測定する。リーフディスクは液体窒素下で凍結させ、２ｍｌエッペンドルフチューブ中で微細粉末に砕き、ｔＧＦＰの抽出は前に記載したように行う。ｔＧＦＰ発現の定量化のため、５μＬの各抽出物を２００μＬに希釈し、記載したように蛍光を測定する。３回の反復を行う。
植物は水によるストレスの症状を示さなかった。植物を転倒状態にした数日後、植物の茎は前より高い位置から照らした光の方に曲がり、フック様構造を形成する。ｔＧＦＰの発現と蛍光は、直立位置でインキュベートした正常処理植物と比較して、転位位置（すなわち転倒状態）でインキュベートした植物では平均２倍高い。
【００８０】
１．３  高密度の成長
この実施例は、ｔＧＦＰおよび組換えＨ５の発現に対する、浸潤前に高密度で成長したタバコ植物の驚くべき影響を記載する。この実験は、ＮＣＩＭＢにその種子が寄託された２タバコ品種ＰＭ１３２とＰＭ２１７は、浸潤前に高密度で成長すると、通常直立状態下でインキュベートし低密度で成長した植物と比較して、浸潤バイオマス重量ベースで約４０％超のｔＧＦＰおよび７０％％超の組換えＨ５を顕著に生成したことを示す。
【００８１】
１．３．１  植物および浸潤
異なる植物密度で成長したタバコの影響を試験するため、２植物、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０２の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたニコチアナタバカムＰＭ１３２、および受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０７の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２１７を、２つの密度：１平方メートル当たり２５植物と１００植物で成長させる。種まき後４６日で、前に記載したようなｔＧＦＰ発現カセットを含有するｐＣ９１またはＨ５発現カセットを含有するｐＣ７１の一方を含むアグロバクテリウムツメファシエンス株Ａｇｌ１、および前に記載したような遺伝子サイレンシングのＨｃＰｒｏサプレッサーを含有するｐＣ１２０を含むアグロバクテリウムツメファシエンス株Ａｇｌ１を各々用いて、植物に減圧浸潤法を施す。浸潤中使用した最終ＯＤ６００は０．３２である。両密度で成長した植物に関して、平均植物高、気孔の直径、クロロフィル含量、葉の厚さおよび水分量を浸潤前に測定する。高密度で成長した植物は大きく、クロロフィルが少なく葉は薄いが、気孔の直径は同じである。ＰＭ１３２に関しては、低密度または高密度で成長した植物の水分量は同じであるが、ＰＭ２１７に関しては、低密度で成長すると水分量は一層少なかった。浸潤後、植物の半分を直立位置または転位位置（転倒状態）でインキュベートする。測定は、各３植物の３反復にわたり処理当たり合計９（９）植物で実施する。
【００８２】
浸潤後５日で葉を採取し、前に記載したように、抽出物を調製しｔＧＦＰ発現の分析を実施する。抽出物はＧＦＰバッファーに１：１に希釈し、５μＬを蛍光定量化用に２００μＬのＧＦＰバッファーと混合する。通常直立位置でインキュベートしたときの両品種に関するｔＧＦＰ１ｍｇ／新鮮葉バイオマス１ｋｇ重量の発現は、低密度で成長した植物と比較したとき、浸潤前に高密度で成長した植物に関して平均４１％高い。低密度で成長し浸潤後通常直立位置でインキュベートした植物と比較したとき、高密度で成長したとき２１〜４０％の平均発現増加を示したＨ５に関して同様の結果を得る。ｔＧＦＰおよびＨ５の発現に対する転位インキュベーションの影響を試験するため、浸潤状態の植物の半分を浸潤後転位位置でインキュベートする。低密度で成長し転位位置でインキュベートした植物に関してｔＧＦＰとＨ５の両方の有意な発現の増加があるが、浸潤前に高密度で成長した植物に関して発現の増加はそれほどない。低密度で成長し転位位置でインキュベートしたＰＭ１３２植物に関しては、ｔＧＦＰの４０％の増加とＨ５の７１％の増加をもたらす。浸潤前に高密度で成長した植物に関しては、通常直立位置でインキュベートした植物と比較して、増加はｔＧＦＰに関してわずか３％およびＨ５に関して７％である。全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を確定し、ｔＧＦＰとＨ５の発現をＴＳＰに対して推定する。ｔＧＦＰとＨ５の発現は、高密度で成長し転位位置でインキュベートした植物に関して常に高い。直立位置では、低密度で成長した植物には約１０．５％のｔＧＦＰ発現の増加があった。高密度で成長した植物に関しては、増加は約１３．６％である。Ｈ５に関しては、浸潤前に低密度で成長し転位位置でインキュベートした植物に関する収率の増加は０．２５％であり、一方高密度で成長した植物に関する収率の増加は０．３７％である。ｔＧＦＰとＨ５の両方に関して、転位位置でのインキュベーションは、（ＴＳＰの割合で測定して）発現の増加をもたらした。低密度で成長した植物に関しては、転位位置でのインキュベーションは、４０〜６０％のバイオマスの増加をもたらした。高密度で成長した植物に関しては、転位位置でのインキュベーションは２０％の増加をもたらした。ｔＧＦＰに関しては、最高タンパク質収率は１６．２％であり、植物を浸潤前に高密度で成長させ転位位置でインキュベートしたとき、それを得る。低密度で成長し通常の直立位置でインキュベートした植物（１０．５％のＴＳＰ）と比較して、これは％ＴＳＰの点でタンパク質収率の５４％の増加を表した。
【００８３】
１．４  採取および材料サンプリング
サンプリングは１６時間後に開始することができるが、典型的には、浸潤葉または葉の浸潤領域は温室内でのインキュベーション後第６日で採取する。場合によっては、浸潤葉または葉の浸潤領域はインキュベーションの１０日後に採取する。葉材料はヒートシールパウチ中に置き、密閉しドライアイスの層間に少なくとも１０分間置く。採取後、全ての葉サンプルはさらに処理するまで−８０℃で保存する。採取した葉は、ドライアイス上でコーヒー豆挽き器を使用して微細粉末に均質化し、（ｉ）５０ｍＭのトリス塩基、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のトリトンＸ−１００を含有する３ｖｏｌ／ｗｔ抽出バッファー、最終ｐＨ７．５中でのそれぞれ２０秒間の２ステップの攪拌、および（ｉｉ）２０，０００ｇで１５分間の遠心分離によって抽出する。可溶性抽出物は分析するまで氷上で保存する。
【００８４】
（例２）
一過性発現用のバイナリーベクター
この例は、本出願において使用するバイナリーベクターｐＣ１００の設計および開発を記載する。本出願のバイナリーベクターは、ウイルス様粒子の形成をもたらす植物細胞における血球凝集素の発現に使用する。このような血球凝集素の非制限的な例は、インフルエンザ株Ａ／インドネシア／０５／２００５の血球凝集素Ｈ５（Ｈ５Ｎ１）またはインフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／０４／２００９のＨ１（Ｈ１Ｎ１）であってよい。
【００８５】
２．１  ｐＣ１００のＴ−ＤＮＡ領域および骨格断片の構築
約１３，５００塩基対長のマルチコピーバイナリーベクターｐＢＩＮ６１（Bendahmane et al.,2000.Plant Journal 21:73-81）のヌクレオチド配列を、トランスジェニック細胞の複製、維持、選択、およびＴ−ＤＮＡの移動において機能を有する核酸に関して分析する。前に記載した機能を有する核酸のみを含む、新たなヌクレオチド配列を開発する。生成するヌクレオチド配列は二部分で化学合成される。Ｔ−ＤＮＡ右（ＲＢ）ボーダー配列とＴ−ＤＮＡ左（ＬＢ）ボーダー配列により隔てられたＴ−ＤＮＡ領域、ノパリンシンターゼ（ｐＮＯＳ）プロモーターとｔＮＯＳターミネーターの調節下にあるｐＢＩＮ６１の植物選択可能カナマイシン耐性（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ならびに特有ＳｔｕＩ、ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有する第１の断片を隣接ＰｖｕＩＩ制限部位で化学合成し、ＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）および細菌カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）をさらに含有するｐＵＣ由来ｐＭＫベクター（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰｖｕＩＩ部位でクローニングし、ｐＧＡ１３を生成する。ＣｏｌＥ１ｏｒｉと最小ＲＫ２ｏｒｉＶ複製起点を有する骨格領域、およびｐＢＩＮ６１のＲＫ２由来ＴｒｆＡ複製開始タンパク質をコードする遺伝子を含有する第２の断片は、特有ＡｓｃＩ、ＳｔｕＩおよびＰｖｕＩＩ制限部位で化学合成し、アンピシリン（ＡｐＲ）耐性遺伝子をさらに含有するｐＵＣ由来ｐＭＡベクター（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でクローニングし、ｐＧＡ１４を生成する。
【００８６】
２．２  バイナリーベクターｐＣ１００の設計および開発
最小植物選択可能バイナリーベクターｐＣ１００（配列番号１）を、２つの断片、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成された第１の断片と第２の断片を組合せることにより作製する。第１の断片は、１、大腸菌およびアグロバクテリウムにおいて機能的なカナマイシン薬剤耐性遺伝子、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩＩ遺伝子、２、ＣｏｌＥ１複製起点、３、最小ｏｒｉＶ複製起点（Kowalczyk L.et al., Molecular Microbiology,2005,57(5):1439-1449）、４、ｏｒｉＶを活性化するＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子（Kongsuwan K. et al.,J.Bacteriology,2006,188(15):5501-5509）、および５、前記断片１と断片２を組合せて最小バイナリーベクターｐＣ１００を作製するため、断片の両末端に特有ＡｓｃＩおよびＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する。第２の断片は、６、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ左ボーダー配列、７、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ右ボーダー配列を含有するＴ−ＤＮＡ領域、８、場合によっては、トランスジェニック植物細胞の選択用の選択可能マーカー遺伝子、およびアグロバクテリウムツメファシエンスノパリンプラスミドのノパリンシンターゼプロモーターとノパリンシンターゼターミネーター配列の調節下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子、９、外来遺伝子のクローニング用で７、Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーと８、選択可能マーカー遺伝子の間に位置する、特有ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および１０、最小バイナリーベクターｐＣ１００（配列番号１）を作製するため、断片の両末端に特有ＡｓｃＩおよびＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する。
【００８７】
（例３）
インフルエンザウイルス様粒子の一過性発現
この例は、ウイルス様粒子の形成をもたらす、タバコ属植物細胞における血球凝集素の一過性発現を記載する。このような血球凝集素は血球凝集素Ｈ５であってよい。
【００８８】
３．１  遺伝子構築物
タバコエッチングウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ  Ｐ１−ＨｃＰｒｏ−Ｐ３；配列番号４）分離株ＴＥＶ７ＤＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ９８６２８８．１）の遺伝子サイレンシングのＨｃＰｒｏサプレッサーをコードする遺伝子をｐＣ１００の特有ＥｃｏＲＩ部位でクローニングして、ｐＣ１２０を作製する。ＨｃＰｒｏのコード配列は、ダブルカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＴＥＶ７ＤＡの５’非翻訳領域、およびノパリンシンターゼターミネーター配列の調節下にある。インフルエンザＨ５Ｎ１株Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＥＦ５４１３９４）の血球凝集素５（Ｈ５）のセグメント４をコードする配列を、５’末端で最小カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＨＴ−ＣＰＭＶの５’ＵＴＲ（配列番号２）、および３’末端でノパリンシンターゼターミネーターとＨＴ−ＣＰＭＶの３’ＵＴＲ（配列番号３）の調節下に置き、ｐＣ１００の植物選択カナマイシン耐性遺伝子を最初に削除した後、ｐＣ１００の特有ＥｃｏＲＩ部位でクローニングして、配列番号１中に示すようなｐＰＭＰ１最小バイナリーベクターを得る。
【００８９】
場合によっては、血球凝集素のコード配列を、米国特許第５，９９４，５２１Ａ号中に開示されたようにゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）完全長転写産物（ＦＬｔ）プロモーターもしくはＦＭＶ−ＦＬｔプロモーターおよびダブルエンハンサー、米国特許第５，８５０，０１９Ａ号中に開示されたようにピーナッツ萎黄病縞ウイルス（ｐｅａｎｕｔ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＣＩＳＶ）ＦＬｔプロモーターもしくはＰＣＩＳＶ−ＦＬｔプロモーターおよびダブルエンハンサー、米国特許第６，４２０，５４７Ｂ１号中に開示されたようにミラビリスモザイクウイルス（ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＶ）ＦＬｔプロモーターもしくはＭＭＶ−ＦＬｔプロモーターおよびダブルエンハンサー（ＭＭＶ；配列番号５）、または米国特許第６，９３０，１８２Ｂ１号中に開示されたようにＭＭＶサブゲノム転写産物（Ｓｇｔ）プロモーターの調節下に置く。植物は例１中に記載したように成長させる。
【００９０】
３．２  植物材料およびアグロバクテリウム接種物
受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０２の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたニコチアナタバカムバーレイ２１、ＰＭ１３２、および受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０３の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２０４、およびニコチアナベンタミアナ植物を、２０時間明期と４時間暗期、２６℃／２０℃日中／夜間温度および７０％／５０％日中／夜間相対湿度において、ロックウールブロック内温室内で成長させる。遺伝子構築物はアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇｌ１に導入する。
【００９１】
例１．１で報告した条件下において、３．５の最終ＯＤ６００まで細菌を増殖させる。ｐＣ２２９遺伝子構築物と遺伝子サイレンシング構築物のｐＣ１２０サプレッサーを含有するアグロバクテリウム培養物を３：１の比で混合し、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＭＥＳを含有する浸潤溶液、最終ｐＨ５．６においてＯＤ６００＝０．８に希釈する。あるいは、浸潤用にこのような培養物をさらに希釈することができる。
【００９２】
３．３  タバコ属植物の浸潤および浸潤状態の植物の抽出
３．３．１  ニコチアナタバカム：
１５秒以内に空気圧を大気圧未満の９００ミリバールに低下させ、６０秒の保持時間、次に約２秒で大気圧に戻すことによって、植物を浸潤状態にする。浸潤状態のニコチアナベンタミアナ植物は、採取するまで温室内で５日間インキュベートする。
浸潤状態の植物の葉を１０植物から回収し、暗所において４℃で一晩保存する。コーンで少なくとも４５ｐｓｉ圧を使用し、１５〜２０Ｋｇ／時間でスクリュープレス（Ｇｒｅｅｎ  Ｓｔａｒ  Ｃｏｒｒｕｐａｄ、ＧＳ１０００、Ｋｏｒｅａ  Ｃｏ．ｏｒ  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＣＰ−４）を使用して葉を均質化する。青汁抽出物を回収し、メタ重亜硫酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで青汁に加えて、サンプルの酸化を低減する。抽出物のｐＨはｐＨ５．３に調節し、その後攪拌せずに２０〜３０分室温でインキュベートする。次いでＣｅｌｐｕｒｅＰ３００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０％）を抽出物に加え、１分間混合する。溶液は、ＣｅｌｐｕｒｅＰ３００（１０ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムを含む１０％ＣｅｌｐｕｒｅＰ３００スラリー）をプレコーティングしたＷｈａｔｍａｎ濾過紙を介して濾過する。
【００９３】
３．３．２  ニコチアナベンタミアナ：
前述の遺伝子構築物と培養物を使用して、または代替的に、１５秒以内に空気圧を大気圧未満の９００ミリバールに低下させ、６０秒の保持時間、次に約２秒で大気圧に戻すことによって、D’Aoust et al.（D’Aoust et al.(2008) Influenza virus-like particles produced by transient expression in Nicotiana benthamiana induce a protective immune response against a lethal viral challenge.Plant Biotechnology Journal 6(2008) 930-940）中に記載されたように、インフルエンザウイルス様粒子をニコチアナベンタミアナ植物において生成させる。浸潤状態のニコチアナベンタミアナ植物は、採取するまで温室内で６日間インキュベートする。
【００９４】
浸潤状態の植物からの葉の回収および葉の抽出は、例３．３．１中で前に記載したように実施する。
【００９５】
３．４  ウイルス様粒子の精製
超遠心分離用に、３個のスクロースクッションを以下のように超遠心分離チューブにおいて調製する。１）３ｍｌの８０％スクロース、２）各１．５ｍｌの６０および４５％スクロース、および３）各１ｍｌの６０、４５および３５％スクロース。清澄化および濾過抽出物サンプル（最大１３ｍｌ）をスクロース勾配の上部に静かに置き、４℃において１時間２４，０００ｒｐｍで（１３５，０００ＲＣＦｍａｘ）、攪拌バケット型ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｕｒｅｓｐｉｎ  ６３０；Ｋｅｎｄｒｏ）において超遠心分離を施す。スクロース濃縮サンプルは０．４５μｍフィルターを使用して予め濾過し、自動ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムでアイソクラティック条件下において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に施す。ランニングバッファーはＴＢＳ、ｐＨ７．５であり、サンプルサイズはＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１０６９−０１）において１ｍｌ／分の流速下で４ｍｌである。精製Ｈ５を含有する分画をプールし、３０ｋＤａカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎ限外濾過膜デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約０．３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、さらに分析する。
【００９６】
３．５  ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによるＨ５の検出
プールした分画のサンプルに、標準的な技法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングおよびＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを直接施す。あるいは、浸潤状態の植物の葉を、ドライアイス上でコーヒー豆挽き器を使用して最初に微細粉末に均質化し、（ｉ）５０ｍＭのトリス塩基、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のトリトンＸ−１００を含有する３ｖｏｌ／ｗｔ抽出バッファー、最終ｐＨ７．５中でのそれぞれ２０秒間の２ステップの攪拌、および（ｉｉ）２０，０００ｇで１５分間の遠心分離により抽出して、前述の浸潤状態の葉におけるＨ５の存在を決定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上である。Ｈ５の陽性対照として、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｃａｔ．＃ＩＴ−００３−００５２ｐ）の市販の組換えＨ５を使用する。分離後、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｍタンパク質染色液（Ｐｉｅｒｃｅ＃２４６１５）でタンパク質を染色する。ウエスタンブロッティング用の、一次抗体はウサギ抗ＨＡ抗体（Ｈ５Ｎ１ＶＮ１２０３／０４＃ＩＴ００３−００５Ｖ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）である。検出用に、ＨＲＰ標識ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧＦＣ断片を使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃１１１−０３５−０４６）。Ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔａｒ  ＨＲＰ化学発光キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１７０−５０４０）を使用して、化学発光により検出を行う。結果はＣｈｉｍｉｏ−Ｃａｐｔ３０００を使用して捕捉し、ｐＣ２２９遺伝子構築物を浸潤させた植物抽出物およびサイズ排除クロマトグラフィー後の分画中の、Ｈ５の存在を示す。その分子量は、市販の組換えＨ５の分子量と同等である。４〜１６％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で原型ＰＡＧＥを実施する。充填用に、サンプルは原型ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）サンプルバッファーにおいてジギトニンで処理し、４℃で１時間インキュベートする。その後、原型ＰＡＧＥＧ−２５０サンプル添加剤（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を０．５％の最終濃度まで加え、サンプルを充填し４〜１６％のＢｉｓ−ＴｒｉｓＰＡＧＥゲル上に施す。ゲルには４℃において最初の６０分１５０Ｖの一定電圧を施す。その後、さらに３０分で電圧を２５０Ｖに上昇させ、ゲルはＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｍタンパク質染色液で染色する。それぞれタバコ属植物とニコチアナベンタミアナにおける一過性発現後、原型ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングの結果はＨ５の首尾よい発現を示す。
【００９７】
３．６  血球凝集
血球凝集素は、赤血球細胞の赤血球表面上に存在する単糖シアル酸と結合する能力を有する。血球凝集を使用して血球凝集素タンパク質の相対活性を決定することができ、血球凝集を使用して、前に記載したようにＨ５を一過的に発現するニコチアナタバカムの粗製抽出物中の、ウイルス様粒子中に存在する組換えＨ５の生物活性を決定する。ウイルス様粒子中に存在するタバコ生成Ｈ５の血球凝集活性は、９６ウエルプレート中で、１．５倍連続希釈の植物抽出物およびサイズ排除クロマトグラフィーによる精製後に得た分画と、特定量の赤血球細胞をインキュベートすることにより測定する。Ｈ５と結合しなかった赤血球細胞は、ウエルの底部に沈み沈殿を形成し、適切にフォールディングしたトリマーＨ５は赤血球と結合する。それぞれｐＣ２２９遺伝子構築物を浸潤させたタバコ属植物とニコチアナベンタミアナ植物の抽出物、およびサイズ排除クロマトグラフィー後に得た抽出物の分画において、血球凝集活性を観察する。
【００９８】
（例４）
スクロースクッションでの超遠心分離によるウイルス様粒子の精製
この例は、スクロース勾配遠心分離法によるウイルス様粒子の精製を記載する。このようなウイルス様粒子は、例えば植物細胞中でのインフルエンザ血球凝集素Ｈ５もしくはＨ１の発現によって得ることができる。このような植物細胞は、ニコチアナタバカムまたはニコチアナベンタミアナの細胞であってよい。
４．１  ウイルス様粒子の単離
本発明により、血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子をニコチアナベンタミアナまたはニコチアナタバカムにおいて生成する。本発明中に記載する例および手順により精製を実施し、ウイルス様粒子の質は、例６と７中に概説する分析ツールパネルを使用して調べる。３つの異なるニコチアナタバカム変種、受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０２の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたニコチアナタバカムバーレイ２１、ＰＭ１３２、および受託番号ＮＣＩＭＢ４１８０３の下２０１１年１月６日付けでＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにその種子が寄託されたＰＭ２０４においてウイルス様粒子を作製し、試験する。
【００９９】
４．２  均質化および抽出
血球凝集素ウイルス様粒子を発現するニコチアナベンタミアナおよびニコチアナタバカム植物の葉を、アグロバクテリウム浸潤法後第６日で採取し、暗所において４℃で一晩保存する。葉と茎を含めた植物バイオマスは、スクリュープレス（Ｇｒｅｅｎ  Ｓｔａｒ  Ｃｏｒｒｕｐａｄ、ＧＳ１０００、Ｋｏｒｅａ  Ｃｏ）を使用して均質化し、メタ重亜硫酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで加えサンプルの酸化を回避する。
４．３  清澄化および濾過
スクリュープレスから得た粗製汁は、２０％希釈酢酸を使用して即座にｐＨ５．３に調節する。部分的清澄化のため、抽出物は攪拌せずに２０〜３０分室温で放置する。２ｍｍ厚ＣｅｌｐｕｒｅＰ３００（１０ｍＭのＭＢＳを含む１０％ＣｅｌｐｕｒｅＰ３００スラリー）をプレコーティングしたＷｈａｔｍａｎ濾過紙を介して、濾過を実施する。減圧は５０８ミリバールで保つ。ＣｅｌｐｕｒｅＰ３００（１０％）を抽出物に加え５分間混合する。最後に、（濾過ケークにおいて２ｃｍ以下の液相で）抽出物−ｃｅｌｐｕｒｅスラリーを部分的に加えることにより、抽出物を軽く濾過する。
【０１００】
４．４  スクロースクッションによる精製
３ｍｌのスクロースクッションを超遠心分離チューブにおいて調製する（１．５ｍｌの４５％および１．５ｍｌの６０％スクロース）。清澄化および濾過抽出物サンプル（最大１３ｍｌ）をスクロースクッションの上部に加え、攪拌バケット型ローターにおいて超遠心分離を施す（２４，０００ｒｐｍ＝１３５，０００ＲＣＦｍａｘ、１時間、４℃、および９、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｕｒｅｓｐｉｎ  ６３０ローター、Ｋｅｎｄｒｏの加速および減速プロファイル）。チューブはローターから除去し、スクロースは残りの抽出物から単離する。スクロース濃縮サンプルは０．４５μｍフィルターを使用して予め濾過し、自動ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムでアイソクラティック条件下において、ゲル濾過クロマトグラフィーを施して（ランニングバッファーＴＢＳ、ｐＨ７．５、サンプルサイズ４ｍＬ、流速１ｍｌ／分、ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１０６９−０１）、スクロースを除去する。精製Ｈ５−ＶＬＰを含有する分画をプールし、３０ｋＤａカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎ限外濾過膜デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約０．３ｍｇ／ｍｌに濃縮する。精製Ｈ５−ＶＬＰサンプルはすぐに等分し、必要となるまで４℃で保存する。
【０１０１】
（例５）
別のウイルス様粒子精製プロトコール
この例は、本発明中に記載する方法に従い、浸潤状態の植物葉の抽出物からウイルス様粒子を精製するための別のプロトコールを記載する。このプロトコールは、スクリュープレスを使用する代わりに、冷却均質化バッファー中での葉の均質化による精製を記載する。
【０１０２】
５．１  ＶＬＰ精製プロトコール
１．  ２〜１０ｄｐｉで浸潤葉を採取し、酢酸を用いてｐＨ６で緩衝処理した、５０ｍＭのトリスｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウム、１ｍＭＰＭＳＦ、メタノール中を含有する冷却均質化バッファー中で均質化する。場合によっては、プロテアーゼ阻害剤を均質化バッファーに加えることができる。
２．  乳鉢および乳棒を使用して、均質化バッファー１．５ｍＬと葉組織１ｇの比で採取した葉組織を粉砕する。ガラス製ピペットでバッファーを粉砕した混合物に加えて、植物細胞の溶解を助長する。２層のチーズクロスを介してホモジェネートを圧搾する。
３．  溶解物を４２℃で５分間加熱する。
４．  珪藻土を加熱処理した抽出物に加え汚染物質を吸収する。
５．  ＃１Ｗｈａｔｍａｎ濾紙を介して精製したスラリーを濾過する。
６．  室温において１０分間１０，０００×ｇでホモジェネートを遠心分離する。
７．  ０．８μｍ次に０．２μｍＣｏｒｎｉｎｇシリンジフィルターを介して上清を濾過する。
８．  濾過物に、上清１ｍＬ当たり６０ｕＬのＦｅｔｕｉｎアガロースを加える。上清に加える前に、最初にＦｅｔｕｉｎアガロースを均質化バッファー中で３回洗浄する。室温で３０分間混合する。
９．  ｐＨ６．０で緩衝処理した４００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリスを含有する洗浄バッファーを使用して、１０×カラム体積で３回カラムを洗浄して、非結合タンパク質を除去し、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収する。
１０．  ０．０００５％（最終濃度）Ｔｗｅｅｎ−８０を加え、ｐＨ６．０で緩衝処理した１．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＥＳを含有する等体積の溶出バッファーを用いて、カラムからタンパク質を溶出させる。少なくとも３回溶出させる。
【０１０３】
１１．  １０ｋＤａＭＷＣＯ遠心分離チューブで溶出物を濃縮し、氷上において４℃で保存する、または
１２．  ６０％スクロース２．５ｍｌで層状の溶出バッファー中４５％スクロース５．５ｍｌを得る。サンプルは４５％スクロースで層状である。場合によっては、ステップ１１と１２は省略することができる。
１３．  ４℃において１４時間６０，０００×ｇで遠心分離する。
１４．  チューブに穴を開け、シリンジとニードルを使用してウイルスバンドを回収する。
１５．  次のステップまで氷上において４℃または−８０℃で保存する。
【０１０４】
（例６）
植物由来のウイルス様粒子を清浄化および捕捉するための２ステップの捕捉プロセス
この例は、本出願中に記載する方法に従い得た植物抽出物から、ウイルス様粒子を捕捉するための、２ステップの清浄化および捕捉プロセスを記載する。第１のステップでは、ウイルス様粒子を含有する抽出物から緑色植物物質を除去する。このような緑色植物物質は、ウイルス様粒子を精製するためのクロマトグラフィー中に使用するカラムを、閉塞および封鎖する可能性がある。
【０１０５】
６．１  ２ステップの捕捉プロセス
緑色植物汁抽出物を、前に記載したように浸潤およびインキュベートした葉の均質化によって、およびスクリュープレスの使用によって得る。緑色植物汁は事前捕捉ステップで最初に処理する。緑色植物汁抽出物、および特に緑色植物色素をもたらすこのような抽出物中の任意の物質は、クロマトグラフィー中に使用するリガンドの大部分と好んで結合し、したがってクロマトグラフィー精製中に使用するカラムの閉塞および封鎖を引き起こすからである。植物由来のウイルス様粒子に関する２ステップの捕捉プロセスを設定して、最初に抽出物を清浄化し、このプロセスは以下のステップを含む：
ステップ１、ｐＨ７で、１５０μｍの平均粒子サイズを有する粒子と結合したポリエチレンイミン（ＰＥＩ）イオン交換体を使用した、静的結合モード／バッチインキュベーションモードでの、緑色植物汁抽出物の緑色色素を決定する物質と不純物の結合。
ステップ２、ｐＨ７で、５０μｍの平均粒子サイズを有する粒子と結合したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換体を使用した、膨張層吸着モードでの、ステップ１の上清由来のウイルス様粒子の結合。
【０１０６】
６．２  実験設定
本発明中に記載し例示するように、ウイルス様粒子を発現するニコチアナタバカム植物の抽出物を調製し、濾過し、使用前に脱イオン水で５倍希釈する。最終ｐＨはｐＨ７に設定し、およびステップ１中のインキュベーションに関する合計体積は１５０ｍＬである。伝導率は５．３ｍＳ／ｃｍである。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）吸着の平衡化は、５層体積の０．５Ｍトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７、次に１０層体積の１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７．０で実施する。静的モードでの緑色植物汁抽出物とＰＥＩ吸着の比は１：１５である。合計９．５ｍＬのＰＥＩ吸着を使用する。室温で３０分インキュベーションし、ステップ２用にインキュベーション後１４０ｍＬの上清を回収する。
ステップ２では、ステップ１の１２０ｍＬ上清はｐＨ７．０に調節し、膨張層吸着モードに施す。伝導率は５．４ｍＳ／ｃｍであり、膨張層モードで使用するジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換体の平衡化は、５層体積の０．５Ｍトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７、次に１０層体積の１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７．０で行う。合計１２ｍＬのＤＥＡＥ吸着を使用する。膨張層カラムは１ｃｍ径、およびカラム高７０ｃｍおよび層高１５ｃｍである。サンプルとＤＥＡＥ吸着の比は１：１０である。ステップ１の上清は３．８ｃｍ／分の流速でカラムに充填し、充填後、カラムは１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファーを含有する洗浄バッファー、ｐＨ７．０で洗浄する。結合物質は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌおよび１ＭのＮａＣｌを含有する溶出バッファー、ｐＨ９．０を使用して溶出させる。ランスルー（Ｒｕｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ）および洗浄分画は２５ｍＬ体積で回収する。溶出物は一分画で回収し、溶出物の回収前にチューブに１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．５溶液を加えることにより、溶出中にｐＨをｐＨ７に調節する。
【０１０７】
６．３  血球凝集素の検出
ステップ１に入る前に濾過したニコチアナタバカム緑色植物汁抽出物に関する血球凝集素タンパク質の量、前に記載したように、静的モードでのインキュベーション後の上清、フロースルー、洗浄、および膨張層モード吸着および溶出後の溶出物を推定する。抽出物および分画中の全タンパク質含量を、標準プロトコールを使用して推定する。濾過した緑色植物汁抽出物において血球凝集アッセイを使用して測定した血球凝集素の量、ＰＥＩイオン交換体との静的モードでのインキュベーション用の出発物質、ＰＥＩイオン交換体と抽出物のインキュベーション由来の上清、ＰＥＩイオン交換体を使用する膨張層吸着用の出発物質、ランスルー、および膨張層カラムの溶出後の溶出物を、前記分画およびサンプルの全タンパク質含量と一緒に表１中に与える。この実験中、緑色をもたらしカラムを閉塞させる物質の大部分は、血球凝集素タンパク質を消失させずにＰＥＩ吸着を使用してステップ１において除去し、血球凝集素タンパク質を含むウイルス様粒子は、ＤＥＡＥイオン交換体を使用して膨張層吸着モード中に捕捉する。
【０１０８】
【表１】
2014533253.tif 000003
【０１０９】
（例７）
膨張層クロマトグラフィーを使用したウイルス様粒子の大規模捕捉
この例は、産業規模で膨張層クロマトグラフィーを使用した、植物抽出物から生じ抽出した血球凝集素を含むウイルス様粒子の大規模捕捉を記載する。
【０１１０】
７．１  抽出
記載したようにタバコ植物を浸潤状態にし、浸潤後、採取まで６日間温室内でインキュベートする。浸潤状態の植物の葉を採取し、バイオマスは暗所において４℃で一晩保ち、コーンで少なくとも４５ｐｓｉ圧を使用し１５〜２０Ｋｇ／時間で、スクリュープレス（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＣＰ−４）を使用して均質化する。血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子を含有する２５０ｋｇの粗製葉バイオマスは、さらなる処理用に得る。緑色植物汁を回収し、メタ重亜硫酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで青汁に加える。伝導率を測定し、使用前に約１０の最終伝導率まで、水で抽出物を希釈する。抽出物は室温で保つ。希釈後の全体体積は約１，２５０Ｌ抽出物である。
【０１１１】
７．２  カラムの性質
ビーズ組成：エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）。コア：タングステンカーバイド（ビーズ体積の約１０〜１５％を占める）。リガンド：ＤＥＡＥイオン交換体。平均粒子径：５０μｍ。吸着粒子の平均密度：１６ｋｇ／Ｌ。カラム径：４５ｃｍ。沈殿状態の気孔率：充填体積の約４０％。全体体積：６３Ｌの吸着物質を４５ｃｍ径カラムに加える。カラムは、５カラム体積の０．５ＭトリスＣｌバッファーｐＨ７、次に１０カラム体積の１０ｍＭトリスＣｌバッファーｐＨ７で平衡化する。
【０１１２】
７．３  充填
充填は、６５３Ｌ／時間に等しい４５０ｃｍ／時間の流速で、多量の１，２５０Ｌ抽出物をポンプで処理することによって実施する。膨張係数は２．０〜２．５に保ち、非結合物質は、同じ膨張率で１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７を用いて洗浄除去する。
７．４  溶出
インフルエンザウイルス様粒子を、１．２の膨張率で５０ｍＭトリス／ＨＣｌおよび１ＭＮａＣｌ、ｐＨ９を用いた溶出によって回収する。溶出ピーク回収前に１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．５を容器に加えることにより、溶出した分画を中和する。本発明の方法により測定した、血球凝集素を含むウイルス様粒子を含有する分画を、さらなる捕捉および精製用にプールする。
７．５  性能モニタリング
クロマトグラフィーの性能を、２８０ｎｍと６００ｎｍでのＵＶ吸収、伝導率およびｐＨの測定によってモニタリングする。血球凝集素Ｈ５を含有するウイルス様粒子の捕捉をＥＬＩＳＡにより、血球凝集を例２中に記載したようにまたはＤ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８、上記）に従い定量的に測定する。ブラッドフォードアッセイを使用して分画の全タンパク質含量を決定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して精度を確定し、例２中に記載しＤ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８、上記）によるように血球凝集素Ｈ５特異的抗体を使用して、同定および特徴付けのためウエスタンブロッティングを使用する。
【０１１３】
（例８）
定量的な顕微鏡による粒子形態の測定
この例は、本発明の方法に従い、血球凝集素を含有するウイルス様粒子の構造特性を決定するための方法を記載する。ウイルス様粒子における血球凝集素スパイクの長さおよび潜伏期は、透過型電子顕微鏡検査により測定する。ウイルス様粒子のサイズは、走査型電子顕微鏡検査により測定する。
【０１１４】
８．１  葉サンプルの透過型電子顕微鏡検査
本発明に従い浸潤およびインキュベートした新たな非凍結葉を、エッペンドルフチューブにおいて１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーで粉砕する（１×１ｃｍリーフディスク、５０ｕＬバッファー中）。生成した混合物は１５分間１０Ｋｇで遠心分離し、上清は透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）用グリッド上に１０分間置き、濾過紙で乾燥させ、陰性染色用に３％ホスホタングステン酸の滴剤、ｐＨ６．５に置く。透過型電子顕微鏡検査のイメージを、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ１０１０透過型電子顕微鏡において８０ｋＶの加速電圧で得て、ＩｍａｇｅＪ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌｋｉｔで分析する。
８．２  精製ウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡検査
ウイルス様粒子の１００マイクロリットルサンプルを、エッペンドルフチューブ中に置く。グリッドはチューブの底部に置き、次いで２５分間１０Ｋでそれを遠心分離する。グリッドを除去し、濾過紙で乾燥させ、陰性染色用に３％ホスホタングステン酸の滴剤、ｐＨ６．５に置く。顕微鏡検査のイメージを、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ１０１０透過型電子顕微鏡において８０ｋＶの加速電圧で得て、ＩｍａｇｅＪ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌｋｉｔで分析する。
【０１１５】
８．３  走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）
走査型電子顕微鏡検査を使用して懸濁液中のウイルス様粒子をイメージ化する。透過型電子顕微鏡検査は、固体支持体を必要とするからである。走査型電子顕微鏡検査は、それらの本来の環境でのウイルス様粒子の分析を可能にする。以下の手順、方法および材料を使用する。黄色粒子４０〜８０ｎｍ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ  Ｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＦＰ−００５５２−２）；黄色粒子９０〜３００ｎｍ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ  Ｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＦＰ−０２５２−２）；シリカおよび金粒子（ｑｕａｎｔｏｍｉｘ）、５００ｎｍと４０ｎｍの較正用ビーズ。ＱＸ−１０２カプセル（ｑｕａｎｔｏｍｉｘ）をポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８９２０）でコーティングして、懸濁液中粒子のイメージ結果を改善する。１５μｌの０．１％ポリ−Ｌ−リシン溶液を液体用皿に加え、室温で１時間インキュベートする。溶液は除去し、液体用皿は蒸留水で二回すすぐ。最後に、ウイルス様粒子の施用前に、水を除去し液体用皿を乾燥させる。５分間５００ｇでの適度な遠心分離を使用して、ポリ−Ｌ−リシンマトリックス上にウイルス様粒子を固定する。
【０１１６】
（例９）
分画化によるウイルス様粒子のサイズ分布の決定
この例は、分画化により、本出願中に記載する方法に従い得たウイルス様粒子のサイズを測定するための方法を記載する。
【０１１７】
９．１  ＡＦ４−ＭＡＬＬＳ
マルチアングル光散乱検出器（ＡＦ４−ＭＡＬＬＳ）と組合せた非対称−フローフィールド−フロー分画化（ＡＦ４）を使用して、それらの流体力学的性質に基づいてウイルス様粒子を分離する。それは固定相との相互作用に関与しないからである。ウイルス様粒子を含有するサンプルは、非対称フローＦＦＦシステム（Ｅｃｌｉｐｓｅ３＋、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）、次にＭＡＬＬＳ分析（ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ  ＩＩ検出器、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）によって分離する。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してサンプルを注入し、移動相をＦＦＦシステムに送達する。台形フローチャンネルを形成する３５０μｍ厚テフロン（登録商標）スペーサーを用いて、ＦＦＦ装置を組み立てる。膜は３０ｋＤａ分子量カットオフでＰＥＳで構成される。サンプルは通常溶出モードで分離し、この場合粒子は大きい順に溶出する。サンプルは最初に、０．２ｍｌ／分の２反対側面フローフィールドおよび０．６ｍｌ／分の垂直方向クロス−フローフィールドで、チャンネルの上部に集束させる。集束時間は２分である。サンプルは５０ｍＭのＮａＮＯ３、ｐＨ７．５で溶出させる。全てのサンプルは、３５分間１．５ｍｌ／分の側面流速および０．６ｍｌ／分のクロス−フロー勾配で溶出させる。精製ウイルス様粒子サンプルに関する注入体積は５０μｌである。ＦＦＦ分離後、１８−アングルＭＡＬＳ検出器を用いてウイルス様粒子を検出する。入射ビーム波長は６８０ｎｍであり、３０ｍＷガリウムヒ素レーザーによって生じる。Ａｓｔｒａソフトウエア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）を使用してベースライン散乱とピークの境界を決定する。旋回状態の粒子の平均二乗（ｒｍｓ）半径（Ｒｇ）は、アングル依存性の光散乱レイリー比を二次指数に適合させることによって計算する。適合値はゼロアングルに補外し、Ａｓｔｒａソフトウエアを使用してＢｅｒｒｙの数式に従い、ゼロアングルでのスロープから半径を計算する。
【０１１８】
９．２  粒子サイズ
図１Ａから、ニコチアナタバカムバーレイ２１、ニコチアナタバカムＰＭ１３２およびＰＭ２０４由来のウイルス様粒子は、約４０〜２２０ｎｍ径のサイズ分布を有することを見ることができる。このようなウイルス様粒子間のサイズ分布の差は、ニコチアナタバカムＰＭ１３２に関しては４５ｎｍ、ニコチアナタバカムＰＭ２０４に関しては６０ｎｍ、およびニコチアナタバカムバーレイ２１に関しては５０ｎｍ周辺のピークで見られる（図１Ａ＊）。ニコチアナタバカム由来のウイルス様粒子は、約１００〜３００ｎｍ径のサイズ分布を有するニコチアナベンタミアナから単離した粒子と比較して有意に小さい（図１Ｂ＊）。ここで最も多量の集団を表すピーク上部は、１５０ｎｍ粒子径に等しい７５ｎｍ（±０．４％）である。（＊全てのピーク値は半径として示す）
【０１１９】
（例１０）
脂肪酸分析のための方法
この例は、本発明によるウイルス様粒子の、脂質含量および脂質組成を分析するための方法を記載する。脂質は脂肪酸からなる。数クラスの脂質が存在し、その中でリン脂質は生体脂質二重層膜の主成分となる。
【０１２０】
１０．１  サンプル組成物およびＧＣ−ＭＳによる脂肪酸分析
本発明に従い得た１００μｌのウイルス様粒子溶液を、６５℃で適度な窒素流を使用し乾燥状態まで溶媒を除去することによって、オートサンプラーバイアル中に濃縮する。次いで、２ｍｌのヘキサンおよび０．２ｍｌの水酸化カリウムメタノール溶液（２Ｍ）を、加水分解およびエステル化用に加える。１０分間の超音波処理後、１Ｍ塩酸を用いて生成溶液を中和する。ヘキサン相を分離し、乾燥状態まで濃縮する。生成した脂肪酸メチルエステルは０．５ｍｌイソオクタンに溶かし分析する。バイアルからの２μｌアリコートを、ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｓｅｒｉｅｓ  ＧＣ、および５９７３質量選択検出器、ＭＳＤ）で、キャピラリーカラム（ＢＰＸ９０、３０ｍ×０．２５ｍｍ、すなわち０．２５μｍフィルム厚）にパルススプリットレス注入する。インジェクター温度は２６０℃であり、オーブンは８０℃を１分間維持し、その後５℃／分で１８０℃まで上昇し、さらに１０℃／分で２２０℃まで上昇し、それを３分間保つようにプログラムする。ヘリウムは１．２ｍｌ／分の流速で担体ガスとして使用する。ＧＣ−ＭＳスクリーニング分析は主に、５０〜３５０ａｍｕのスキャン範囲でスキャンモードを使用して実施する。さらに、幾つかの検体および分析用に、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）モードを使用する。ＳＩＭモードで使用したイオン質量は表２中に列挙する。
【０１２１】
【表２】
2014533253.tif 000004
脂肪酸メチルエステルの同定を、実験質量スペクトルとＮＩＳＴ質量スペクトルライブラリーの比較により最初に実施する。最後に、その保持時間および質量スペクトルと、参照脂肪酸メチルエステル化合物のそれらの比較により、脂肪酸を同定する。
【０１２２】
（例１１）
脂質クラスのスクリーニング
この例は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる脂質クラスのスクリーニングに関する方法を記載する。様々なリン脂質およびフィトステロールが、この方法により標的化される。
【０１２３】
１１．１  脂肪酸分析用のサンプル組成物
液体−液体抽出用に、３７５μＬの２：１（ｖ／ｖ）メタノール−塩化メチレン混合物を１００μＬのウイルス様粒子溶液に加え、溶液を攪拌する。次に、１２５μＬの塩化メチレンを加え溶液を攪拌し、１２５μＬの水を加え溶液を再度攪拌する。次に、室温において５分間１０００ｒｐｍで溶液を遠心分離して、２相に分離させる。上部水性相層は除去し、下部有機性相層はオートサンプラーバイアルに移し、２００μＬの酢酸アンモニウムメタノール溶液（１ｍＭ）を加える。ウイルス様粒子溶液の代わりに１００μＬの水を平行して使用し、対照サンプルを同じ手順に従い調製する。
１１．２  標的脂質構造
この方法により標的化されるリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトールである。標的化されるフィトステロールは、コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロールおよびシトステロールである。
【０１２４】
１１．３  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる脂質クラスのスクリーニング
リン脂質分析用に、オートサンプラーバイアルから高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｓｙｎｅｒｇｉ  ４μ極性ＲＰ、１５０ｍｍ×２．０ｍｍ）に２μｌを注入する。液体クロマトグラフィーによる分離は、３ポンプ、脱気装置、冷却オートサンプラーおよびカラムオーブンを備えるＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ２０Ａで実施する。ＬＣ分離に関する流速および勾配プログラムは表３中に与える。カラム温度は３０℃であり、検体の検出用に、タンデム質量分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４０００  Ｑｔｒａｐ）を使用する。検体のイオン化は、ポジティブモードおよびネガティブモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用して実施する。分析はニュートラルロス、または４００Ｄａ〜１２００Ｄａのスキャン範囲でのプレカーサーイオンスキャンモードで実施する。イオンソースに関する機器のパラメータ、および異なる化合物クラスに関する質量分析器の設定は、表５および６中に与える。データ取得およびデータ処理は、有効なクロマトグラフィーデータシステム（Ａｎａｌｙｓｔ１．４．１）で実施する。
【０１２５】
【表３】
2014533253.tif 000005
【０１２６】
【表４】
2014533253.tif 000006
【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
１１．４  フィトステロールのスクリーニング
フィトステロールの分析用に、オートサンプラーバイアルから、ガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８、３ｍｍ×４ｍｍ、５μｍ）と結びつけた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム（Ｍｅｒｃｋ、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＳｐｅｅｄＲＯＤ  ＲＰ−１８ｅ、５０ｍｍ×４．６ｍｍ）に２０μｌを注入する。液体クロマトグラフィーによる分離は、バイナリーポンプ、脱気装置、冷却ウエルプレートオートサンプラーおよびカラムオーブンを備えるＡｇｉｌｅｎｔ１１００で実施する。カラムオーブンは４０℃の温度に、ウエルプレートオートサンプラーは６℃に設定する。ＬＣ分離に関する流速および勾配プログラムは表６中に与える。シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロールおよびコレステロールを検出するため、タンデム質量分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４０００  Ｑｔｒａｐ）を使用する。検体のイオン化は、正イオンモード大気圧化学イオン化（ＡＰＰＣＩ）を使用して実施する。分析はマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）モードで実施する。イオンソースに関する機器のパラメータ、および異なる化合物に関する質量分析器の設定は、表８および９中に与える。データ取得およびデータ処理は、有効なクロマトグラフィーデータシステム（Ａｎａｌｙｓｔ１．４．１）で実施する。本明細書ではこの技法をＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳと呼ぶ。
【０１２９】
【表６】
2014533253.tif 000008
【０１３０】
【表７】
2014533253.tif 000009
【０１３１】
【表８】
2014533253.tif 000010
【０１３２】
（例１２）
ニコチアナベンタミアナ由来ウイルス様粒子の脂肪酸組成物
この例は、本発明による血球凝集素を含むウイルス様粒子を含む、３種のニコチアナベンタミアナサンプルの脂肪酸組成物を記載する。
【０１３３】
１２．１  結果
図２中のクロマトグラムは、ニコチアナベンタミアナウイルス様粒子サンプルＶＬＰ１の脂肪酸スクリーニングの結果を示す。６種の脂肪酸、パルミチン酸（Ｃ１６−０）、ステアリン酸（Ｃ１８−０）、アラキドン酸（Ｃ２０−０）、オレイン酸（Ｃ１８−１）、リノール酸（Ｃ１８−２）およびリノレン酸（Ｃ１８−３）を見ることができる。図２中に見られる２種の別の脂肪酸は、おそらくステアリン酸とアラキドン酸の異性体である。その質量スペクトルは、ステアリン酸とアラキドン酸のそれに非常に類似しているからである。このウイルス様粒子サンプル中の脂肪酸濃度に関する定量的情報を得るため、パルミチン酸メチルエステルおよびオレイン酸メチルエステルに関して較正を実施する。前記サンプル中に存在する検体は、この２つの較正を使用して定量化する（表９）。したがって、パルミチン酸とオレイン酸は定量的に決定し、一方ステアリン酸、アラキドン酸、リノール酸およびリノレン酸は半定量的にのみ決定する。前記ウイルス様粒子サンプルの脂肪酸含量は、未確認の脂肪酸を考慮して約１．９ｐｍｏｌ／サンプル溶液１ｍＬであると計算する。
【０１３４】
【表９】
2014533253.tif 000011
【０１３５】
ニコチアナベンタミアナの２つの他のウイルス様粒子サンプル、ＶＬＰ２とＶＬＰ３の脂肪酸分析をスキャンモードで行い、さらにパルミチン酸とオレイン酸に関してもＳＩＭモードで行う。パルミチン酸とオレイン酸に関してのみ較正を再度実施し、サンプル１に関して前に記載したように全脂肪酸の定量化に使用する。３回の技法反復を実施し、３回の技法反復から計算した平均値は表１０中に与える。
【０１３６】
【表１０】
2014533253.tif 000012
【０１３７】
（例１３）
ニコチアナベンタミアナ由来ウイルス様粒子のリン脂質組成物
この例は、本発明に従いニコチアナベンタミアナから作製し単離した、ウイルス様粒子のリン脂質組成物を記載する。
【０１３８】
１３．１  ＬＣ−ＭＳによる脂質プロファイリングおよび定量化
ＬＣ−ＭＳによる標的化手法は、それらの特徴的な極性頭部基に関して特異的イオンをモニタリングすることによって、リン脂質の検出および同定を可能にする。異なる保持時間で溶出し一定分子量を有する種は、特異的頭部基の存在によって分類することができ、それと結合した脂肪酸の特徴付けを可能にするＭＳ−ＭＳ断片化によって、さらに特徴付けすることができる。この方法を使用して、リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトール、およびステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロールおよびシトステロールを標的化する。サンプル組成物はBligh & Dyer(A rapid method for total lipid extraction and purification.Can J Biochem Physiol 37(1959)911-917)に従う。
【０１３９】
１３．２  結果
ＬＣ−ＭＳは５個のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と３個のホスファチジルコリン（ＰＣ；表１１）を明らかにする。（それぞれ分子量７３９、７４１および７４３の）３個のＰＥと（分子量７８３の）１個のホスファチジルコリンに関して、２個の可能な構造を正確な分子量から示すことができる。２個のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）も同定する（表１１）。
【０１４０】
【表１１】
2014533253.tif 000013
【０１４１】
（例１４）
ニコチアナ由来ウイルス様粒子の全体脂質組成
この例は、どのようにして、例１５〜１９に記載する様々な方法、および脂質の誘導体化後の脂肪酸のＧＣ−ＭＳ測定を使用して、本発明に従いニコチアナ植物細胞で作製したウイルス様粒子の、全体脂質含量および組成を決定することができるかを記載する。このようなウイルス様粒子における全体脂肪酸の定量化のため、遊離脂肪酸、ならびにリン脂質、ステロール脂質およびエステルを構成する脂肪酸を測定する。
【０１４２】
１４．１  ウイルス様粒子の脂質含量プロファイリングのための手法。
脂質は脂肪酸からなり、数クラスの脂質が存在し、その中でリン脂質は生体脂質二重層膜の主成分となる。リン脂質、ステロール脂質およびエステルおよびスフィンゴ脂質は、脂質二重層膜の構成単位である。３つの方法を使用して、本発明の方法に従い得た植物由来ウイルス様粒子の脂質組成を決定する。第１の方法１）はＧＣ−ＭＳによるものであり、ウイルス様粒子における脂肪酸のスクリーニングおよび半定量化に使用する。脂肪酸はメチルエステルとして分析する。この目的のため、プロファイリングを可能にするため、リン脂質の加水分解およびそれらの構成脂肪酸のエステル化を最適化する。第２の方法２）は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（Ｐｌ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含めたリン脂質の脂質クラススクリーニングに使用するＬＣ−ＭＳに基づく方法である。これらのリン脂質の定性および比較決定を行う。化合物として純コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロールおよびシトステロールを使用してフィトステロールを測定する。親イオンの正確な質量およびタンデム質量分析断片イオンの決定用の高分解能質量分析計を使用して、脂質の同定を実施する。高次断片化実験を単位分解能で実施して、追加的な構造情報を得る。ウイルス様粒子の様々な脂質のより包括的な分析は、ＬＣ−ＭＳに基づく非標的化スクリーニング法により行う。リン脂質、スフィンゴ脂質およびステロール脂質はＢｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ（１９５９、上記）に従いウイルス様粒子から選択的に抽出して、脂質クラススクリーニングを可能にするＬＣ−ＭＳにより、生成混合物の分析を可能にし、混合物内に存在する異なる全脂質をプロファイルおよび特徴付けする。第３の方法３）は、方法１および２により検出されなかった分子の同定を直接可能にし、任意の未確認種を定量化し同定するための、ウイルス様粒子中に存在する脂質混合物の分析による方法である。
【０１４３】
１４．２  誘導体化の方法
１００μＬのウイルス様粒子サンプルを得て、５０μｌのＩＳＴＤ（Ｃ１７−０、１，２−ジヘプタデカノイル−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）を加え、攪拌し、２ｍＬヘキサンを加え、２ＭＫＯＨ（メタノール）０．４ｍＬを加え、攪拌し、超音波処理によって１０分間処理し、１ＭＨＣｌ（３と７の間のｐＨ）で中和し、ヘキサンを除去し、窒素ガス下で乾燥させ、０．５ｍＬイソオクタンに再溶解させる。
【０１４４】
１４．３  ＧＣ−ＭＳＤの方法
ＧＣカラムＢＰＸ９０、３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ。２６０℃で３μｌサンプルをパルススプリットレスで注入する。オーブンプログラム：１分間、８０℃；１８０℃まで５℃／分の上昇、０分；２２０℃まで１０℃／分の上昇、３分間。ＭＳＤ：ＳＩＭ．Ｃ１６−０、ｍ／ｚ：７４（８７、１４３、２７０）；Ｃ１７−０、ｍ／ｚ：７４（８７、１４３、２８４）；Ｃ１８−０、ｍ／ｚ：７４（８７、１４３、２９８）；Ｃ１８−１、ｍ／ｚ：２６４（５５、６７、７４）；Ｃ１８−２、ｍ／ｚ：８１（６７、９５、２９４）；Ｃ１８−３、ｍ／ｚ：７９（６７、９５、２９２）；Ｃ２０−０、ｍ／ｚ：７４（８７、１４３、３２６）。品質管理に使用した化合物：１，２−ジパルミトイル−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン；Ｃ１８−０：１，２−ジステアロイル−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン；Ｃ１８−１：１，２−ジオレイル−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン；Ｃ１８−２：１，２−ジリノレオイル−グリセロ−３−ホスファチジルコリン；Ｃ１８−３：１，２−ジリノレノイル−グリセロ−３−ホスファチジルコリン；Ｃ２０−０：１，２−ジアラキドイル−グリセロ−３−ホスファチジルコリン．Ｃ１７−０：１，２−ジヘプタデカノイル−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＩＳＴＤ）。サンプル組成物なしで脂肪酸のメチルエステルにより較正を行う。Ｒ＾２：０．９９７〜０．９９９。品質管理に使用した化合物はＴＲＩＳバッファー中で調製する。
【０１４５】
【表１２】
2014533253.tif 000014
【０１４６】
分析技法を使用すると、比較は、ニコチアナタバカムを使用して作製したＶＬＰの脂質二重層は０．５μｇ／ｍＬ未満のオレイン酸含量を有し、一方ニコチアナベンタミアナにおけるオレイン酸含量は約２であることを示す。したがって、ニコチアナベンタミアナ由来ＶＬＰにおけるオレイン酸の量は、ニコチアナタバカムＶＬＰの量の少なくとも４〜５倍である。
【０１４７】
さらに比較は、ニコチアナタバカムを使用して作製したＶＬＰの脂質二重層は０．８μｇ／ｍＬを超えるアラキドン酸含量を有し、一方ニコチアナベンタミアナにおけるアラキドン酸含量は約０．４であることを示す。したがって、ニコチアナベンタミアナ由来ＶＬＰにおけるアラキドン酸の量は、ニコチアナタバカムＶＬＰの量の少なくとも２倍である。
【０１４８】
１４．４  全フィトステロール。
表１３は、ＬＣ−ＡＰＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定し本発明に従い様々なニコチアナタバカム品種およびニコチアナベンタミアナから得た、ウイルス様粒子におけるフィトステロールの濃度を要約する。
【０１４９】
【表１３】
2014533253.tif 000015
【０１５０】
この分析は、コレステロールとシテルステロールの比が異なることを示す。ニコチアナタバカム由来ＶＬＰでは、コレステロールとシテルステロールの比はほぼ同じであり（すなわち約１．０）、一方ニコチアナベンタミアナ由来ＶＬＰにおける比は、その比は約０．３で一層低い。
【０１５１】
ニコチアナベンタミアナ由来ウイルス様粒子の全脂肪酸。
表１４は、本発明の様々なウイルス様粒子に関する、様々な技術を使用して測定し表１４と１５中に一部分を示すリン脂質とフィトステロールの結果、および前記粒子の脂質：タンパク質の比を要約する。タンパク質含量は、標準的な技法を使用して測定する。
【０１５２】
【表１４】
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【０１５３】
（例１５）
タンパク質特徴付けのための方法
この例は、本発明のウイルス様粒子上で提示される血球凝集素タンパク質の、構造特徴付けのための幾つかの方法を記載する。ワクチン組成物における抗原としての血球凝集素の機能は、幾つかの構造的特徴に依存する。最も重要なのは、ホモトリマーへの血球凝集素Ｈタンパク質のフォールディングおよび組織化である。別の重要な機能の特徴は、様々な糖型を含めたタンパク質のＮ−グリコシル化パターンである。高分解能エレクトロスプレー質量分析またはマトリックス支援脱離イオン化質量分析と結びつけた、ナノスケール液体クロマトグラフィーを使用して、前記血球凝集素タンパク質のアミノ酸配列およびＮ−グリカン組成および糖型を解明する。
【０１５４】
１５．１  Ｈ５分析用のサンプル組成物
溶液中での酵素による消化のため、トリクロロ酢酸、アセトンと０．１Ｍメタノール塩酸の混合物（５０：５０、ｖ／ｖ）またはメタノールジクロロメタンのいずれかを、タンパク質沈殿用に本発明のウイルス様粒子から入手または抽出した血球凝集素Ｈ５を含有する５０〜１００μＬ溶液に加える。タンパク質沈殿後、サンプルを２分間遠心分離し、ペレットは５０μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー中に溶かす。タンパク質沈殿がないサンプル組成物に関しては、ＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＫ）を５０〜１００μＬのＨ５溶液に加える。ＲａｐｉＧｅｓｔを加えた後、溶液は５分間で１００℃まで加熱し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーに溶かした５０μＬの５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液、および５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーに溶かした２５μＬの１００ｍＭヨードアセトアミド溶液を、還元およびアルキル化のため加える。５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーに溶かした５μＬの５０ｍＭＤＴＴ溶液、および別の８０μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーを加えることにより、アルキル化を停止させる。後に、２．３μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー／アセトニトリル８０：２０中２０μｇ／ｍｌ）を加え、混合物は３７℃で一晩インキュベートする。トリプシンによる消化は、１μＬのギ酸を加えることにより停止させる。
【０１５５】
１５．２  ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるペプチドマスフィンガープリンティング。
オートサンプラーバイアルから、ＨＰＬＣカラム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｌｏ０１８、１００ｍｍ×２．１ｍｍ、２．７μｍ）に５μＬを注入する。液体クロマトグラフィーによる分離は、バイナリーポンプ、脱気装置、冷却ウエルプレートオートサンプラーおよびカラムオーブンを備えるＡｇｉｌｅｎｔ１１００で実施する。カラムオーブンは６０℃の温度に設定する。ＬＣ分離に関する流速および勾配プログラムは表１５中に与える。検体の検出用に、高分解能質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ−ＦＴ  Ｕｌｔｒａを使用する。検体のイオン化は、正イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用して実施する。分析はスキャンモードで実施し、スキャン範囲は３００Ｄａ〜２０００Ｄａである。質量分析器に関する機器のパラメータは表１６中に与える。
【０１５６】
【表１５】
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【０１５７】
【表１６】
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【０１５８】
１５．３  ナノ−ＬＣによるＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるペプチドマスフィンガープリンティング。
前述のように調製した５μＬサンプルを、プレカラム（Ｎａｎｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ＮＳ−ＭＰ−１０  ＢｉｏＳｐｈｅｒｅ  ０１８、５μｍ、１２０Ａ、３６０／１００ｐｍ、Ｌ＝２ｃｍ）を備えるナノ−ＨＰＬＣカラム（Ｎａｎｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ＮＳ−ＡＣ−１０  ＢｉｏＳｐｈｅｒｅ  ０１８、５μｍ、１２０Ａ、３６０／７５μｍ、Ｌ＝１０ｃｍ）に注入する。液体クロマトグラフィーによる分離は、室温においてＢｒｕｋｅｒ  ＥＡＳＹ−ｎＬＣＩＩで実施する。ナノ−ＬＣ分離に関する流速および勾配プログラムは表１７中に与える。１０ｓ、すなわち５０ｎｌの分画はシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液とオンライン混合し、Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＡＬＤＩ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｅｅｒ（登録商標）ｆｃＩＩを使用して、アンカーチップステンレス鋼製ＭＡＬＤＩターゲット（３８４ＭＴＰ、８００ｐｍアンカー）にスポットする。
【０１５９】
【表１７】
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【０１６０】
１５．４  マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析。
検体を検出するため、ＭＡＬＤＩ質量分析計、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ（登録商標）を使用する。脱離およびイオン化は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｓｍａｒｔｂｅａｍ（登録商標）ＩＩＩレーザー、改変型Ｎｄ／ＹＡＧレーザー、および１ｋＨｚ捕捉率を使用して実施する。７００Ｄａ〜４０００Ｄａのスキャン範囲においてポジティブモードで分析を実施する。質量分析計はリフレクターモードで作動させる。スペクトルはＭＳおよびＭＳ／ＭＳモードで捕捉する。ＭＳモードでは１レーザーショットから２５００単一スペクトル、ＭＳ／ＭＳモードでは２０００を加える。
【０１６１】
（例１６）
タンパク質配列完全性の確認
この例は、本発明により生成したウイルス様粒子の表面に提示される組換え血球凝集素タンパク質の、配列完全性を確認するための実験を記載する。配列の確認は、タンパク質サンプルを最初に還元およびアルキル化し、後にエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃおよびトリプシンでの消化後、ＵＰＬＣ−Ｑｔｏｆ−ＭＳＥおよびペプチドマッピングによって行う。
【０１６２】
１６．１  サンプル組成物
ニコチアナベンタミアナおよびニコチアナタバカムから精製した、ウイルス様粒子の血球凝集素Ｈ５を含むタンパク質サンプルを２０ｍＭＤＴＴ（３０分；５６℃）で還元し、ＮａｎｏＳｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ濃縮器により限外濾過する。トリプシンでの消化用に、限外濾過後、アリコートを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ消化バッファー（ｐＨ８．５）に再溶解させ、そのさらなるアリコートは１００ｍＭトリス−ＨＣｌおよび２μｇのトリプシンで処理する（３７℃、１８時間）。Ｇｌｕ−Ｃでの消化用に、限外濾過後、アリコートを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムバッファー（ｐＨ８．０）に再溶解させ、さらなるアリコートは５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムバッファーおよび２μｇのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃで処理する（３７℃、１８時間）。
【０１６３】
１６．２  ニコチアナベンタミアナの血球凝集素
トリプシンでの消化後にニコチアナベンタミアナから単離したウイルス様粒子由来の血球凝集素の配列率は９９．１％である。全体で５５２個のアミノ酸の中で５４７個のアミノ酸を同定し、予想シグナルペプチドアミノ酸配列に対応するペプチドは同定されない。トリプシンでの消化に関して、残りの０．９％はこの手法により検出できないトリプシンの切断特異性に従うと、未検出１アミノ酸トリプシンペプチドである。その一次構造はインドネシア２００５株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＰ５１９６９．１）由来のＨ５タンパク質のアミノ酸配列と正確に一致する。さらにペプチド配列決定は、非マッピング配列ＭＥＫＩＶＬＬＬＡＩＶＳＬＶＫＳ（図中には示さない）からなるシグナルペプチドの効率よいプロセシングを示す。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化ならびにメチオニン残基の酸化のような、幾つかの生成物関連不純物も報告された。アスパラギンに関して位置１１、２３、８４、１５４、１６５および２８６でＮ−グリコシル化が示される。
【０１６４】
１６．３  ニコチアナタバカムの血球凝集素
ニコチアナタバカムバーレイ２１から得た血球凝集素Ｈ５の配列率は９７．５％であり、ニコチアナタバカムＰＭ１３２に関しては９５．７％、およびニコチアナタバカムＰＭ２０４に関しては９７．５％である。３種全てに関してシグナルペプチドは適切に切断され、Ｎ末端とＣ末端の両方が予想通り正確である。アスパラギン残基に関して位置１１、２３、８４、１５４、１６５、２８６でＮ−グリコシル化が観察される。
【０１６５】
（例１７）
ウイルス様粒子に関する血球凝集素のＮ−グリコシル化パターン
この例は、本発明のウイルス様粒子内に含まれる血球凝集素タンパク質のＮ−グリコシル化パターンを記載する。
【０１６６】
１７．１  サンプル組成物
その各々の分子量から決定しウエスタン分析により確認した、血球凝集素タンパク質を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルバンドをゲルから切断し、３０％アセトニトリル２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣ０３中で洗浄し、３０分間５６℃において１０ｍＭＤＴＴ２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣ０３中を用いた処理で還元し、２０分間室温において４０ｍＭヨードアセトアミド２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣ０３中でアルキル化する。サンプルはトリプシンで一晩消化し、生成したペプチドは５０％アセトニトリル５％ギ酸水中で抽出する。
【０１６７】
１７．２  逆相高性能液体クロマトグラフィーの条件
カラム：ＵＰＬＣ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＢＥＨ  Ｃ１８；１．７μｍ；１．０×１００ｍｍ；カラムオーブン４０℃。系Ａ：０．１％ギ酸水中。系Ｂ：０．１％０．１％ギ酸アセトニトリル中。流速：７０μＬ／分。注入：５μＬ。勾配：０〜２５分、２〜４０％系Ｂ；２５〜２７分、４０〜８０％系Ｂ；２７〜２８分、８０〜９８％系Ｂ。
【０１６８】
１７．３  データ組成および処理。
糖ペプチドの保持時間は、高エネルギー断片化によって生じる特徴的グリカン断片Ｂ−ＨｅｘＮＡｃ（ｍ／ｚ＝２０４．０９）の抽出イオン電流クロマトグラムによって確認する。グリカン断片の保持時間に従い、低エネルギーモード捕捉のスキャンを合計し、１つに集め、最大エントロピーＩＩＩアルゴリズムによりデコンボリューション化する。生成する質量は、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋＢｅｎｃｈ  １．１ソフトウエア（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）を使用したグリカンデータベースと一致する。
【０１６９】
１７．４  ニコチアナ由来血球凝集素Ｈ５タンパク質のＮ−グリコシル化部位。
Ｎグリカン含有ペプチド種を同定し特徴付けするためのイオン抽出の方法を使用したＵＰＬＣ−ＱＴｏｆ−ＭＳＥによる、ニコチアナベンタミアナおよびニコチアナタバカム由来ウイルス様粒子から単離および抽出した血球凝集素Ｈ５の分析は、６個のＮ−グリコシル化部位の存在を明らかにする（表１８）。
【０１７０】
【表１８】
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【０１７１】
Ｎ−グリカンオリゴ糖構造の典型的構成単位であるＮ−アセチルグルコースアミン残基のオキソニウムイオンに相当するｍ／ｚ＝２０４．０９でのイオン（Ｂ−ＨｅｘＮＡｃ）を参照として選択する。ニコチアナタバカムバーレイ２１（Ｈ５−ＰＭ０１５）、ニコチアナタバカムＰＭ１３２（Ｈ５−ＰＭ１３２）、ニコチアナタバカムＰＭ２０４（Ｈ５−ＰＭ２０４）およびニコチアナベンタミアナ（Ｈ５−ＰＭ１８２）由来血球凝集素Ｈ５タンパク質の６個のＮ−グリコシル化部位各々に関するデコンボリューションＮ−グリコシル化パターンは図３（Ａｓｎ−１１）、４（Ａｓｎ−２３）、５（Ａｓｎ−１５４）、６（Ａｓｎ−１６５）、７（Ａｓｎ−２８６）および８（Ａｓｎ−４８４）中に示す。
【０１７２】
（例１８）
血球凝集素のＳ−アシル化
この例は、本発明によるウイルス様粒子上に提示される血球凝集素の、Ｓ−アシル化を評価するための実験を記載する。アミノ酸５２４〜５６８の血球凝集素Ｈ５のＣ末端断片の分析は、２パルミトイル鎖の存在を示す。
【０１７３】
１８．１  化学物質および消耗品
水はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）から、クロロホルム、ＴＦＡおよびメタノールはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）から、Ｔｒｉｓ  Ｕｌｔｒａ  ＱｕａｌｉｔｙおよびＨＣｌはＲｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）から、アセトニトリルはＶＷＲ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から、ブロメラインはパイナップルの茎（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）から、ｏ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）はＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ（Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）から、Ｎａｎｏｓｅｐ遠心分離デバイスはＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）からである。
【０１７４】
１８．２  サンプル処理
血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子を本発明に従いニコチアナタバカムＰＭ１３２において生成させ、スクロース勾配によって単離し、１％ＣＨＡＰＳで処理して粒子を破壊する。リン酸緩衝生理食塩水において１％ＣＨＡＰＳの存在下で、サイズ排除クロマトグラフィーにより脂質を除去する。２５０μｇ量のサンプルをトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に溶かし、約３．８ｍｇのブロメラインを用いて３７℃で１時間消化する。Ｓ−アシル化ペプチド断片はメタノール／クロロホルム（４：１）で抽出する。ペプチド断片を含有する有機相はＨＣＣＡと共に標的プレート上にスポットし、サンプルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。
【０１７５】
１８．３  結果
ブロメラインによる消化によって、アミノ酸５２４〜５６８を含み３個の潜在的システインアシル化部位を有する、Ｃ末端血球凝集素Ｈ５断片が生成する（表１９参照）。ｍ／ｚ５２８９．４５での主要シグナルは、２パルミトイル鎖を有するＣ末端ペプチドである（図９；表１９）。パルミトイル基（予想質量４８１３．７９１）がないＣ末端ペプチドに相当するシグナルは存在せず、１もしくは３パルミトイルまたはステアロイルとパルミトイル鎖を有する任意の組合せが存在する（図９）。しかしながら、ブロメラインの他の切断部位を示唆する、さらなる小シグナルが検出される（図９；表１９）。
【０１７６】
【表１９】
2014533253.tif 000021
【０１７７】
（例１９）
粒子サイズの縮小
この例は、より均質で小さな粒子を得るための方法を記載する。これらの方法は、本発明の血球凝集素を提示するウイルス様粒子、および例２９中で例示する様々な脂質組成物と共に使用することができる。
【０１７８】
１９．１  粒子サイズを縮小するための超音波処理
超音波処理を使用して、より均質で小さな粒子を以下のように得る：
１．本発明による血球凝集素を提示するウイルス様粒子、および／または例２９中で例示する脂質および／または別の化合物を有するその混合物のサンプルに０．００１Ｍフルオレセインを加えて、リポソームの形成を目に見える状態にする。
２．ＦＳ２０Ｄ超音波計および１分間当たり６０超音波バーストの設定を使用して、４２℃で３０分間超音波処理する。
３．４５−６０−７０−８０％スクロースを含むスクロース勾配で超音波処理した物質を層状にする。勾配の体積はサンプルサイズに応じて選択する。
４．４℃で１４時間６５，０００ｇにおいて遠心分離する。
５．ＵＶにより目に見える状態にした蛍光バンドを回収する。
６．１．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０および０．０００５％のＴｗｅｅｎ−８０を含む１体積の透析バッファーをサンプルに加え、サンプルは透析チューブ中に置いて、過剰な透析バッファーを透析することによりスクロースを除去する。
７．２８０ｎｍで吸光度を調べる。
【０１７９】
場合によっては、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度を有するサンプルを電子顕微鏡によって分析し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＭＷＣＯ１０，０００膜を使用して、回収したスピン体積の約半分までサンプルを濃縮する。
【０１８０】
１９．２  迅速な押し出し
均質にサイズ分けされたウイルス様粒子は、３０〜２００ｎｍの範囲の孔径を有するポリカーボネートフィルターを介した、連続押し出しによって得ることもできる。フィルターの孔径は３０、５０、１００または２００ｎｍであってよい。
【０１８１】
（例２０）
マウスにおける免疫応答および有効性の測定
この例は、マウスにおける本発明に従い生成したインフルエンザ血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子に対する免疫応答を測定するための方法、およびこのような免疫処置でのインフルエンザウイルスによる致命的感染に対する防御を記載する。
【０１８２】
２０．１  エンドトキシンおよび残留ＤＮＡの測定
内部対照大腸菌０１１１：Ｂ４を使用してリムルスアメボサイトライセート（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）試験キット（ＱＣＬ−１０００、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）によりエンドトキシンを決定する。残留ＤＮＡはＰｉｃｏＧｒｅｅｎＨ蛍光色素アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により決定し、標準としてラムダＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して蛍光測定法により測定する。
【０１８３】
２０．２  免疫処置および力価の測定
免疫処置および予防接種試験を、６〜８週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で実施する。このような免疫処置試験の非制限的な例は、５匹の動物６グループにランダムに分けた３０匹のマウスを用いた実験である。場合によっては、グループ数およびグループ内の動物数は増大または減少させることが可能である。免疫処置実験の非制限的な例は２投与レジメンでのマウスの免疫処置を含み、２回目の免疫処置は１回目の３週間後である。場合によっては、免疫処置は３投与レジメンを使用して行うことができ、２回目と３回目の免疫処置は、それぞれ初回免疫処置と１回目追加免疫処置の３週間後である。場合によっては、免疫処置は１回投与免疫処置として行うことができる。非制限的な例では、無麻酔状態のマウスを、１：１の比においてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ２％（ミョウバン、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）で製剤化した０．１μｇ、１μｇ、５μｇ、１２μｇまたは２０μｇの用量を使用して、血球凝集素Ｈ５を含む精製ウイルス様粒子を後足に筋肉内投与することにより免疫処置する。場合によっては、無麻酔状態のマウスを、アジュバント有りまたは無しで０．１μｇ、１μｇ、５μｇ、１２μｇまたは２０μｇの用量を使用して、血球凝集素Ｈ５を含む精製ウイルス様粒子を鼻腔内、皮下または経皮投与することにより免疫処置する。対照として、マウスの１グループを、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入しミョウバンで製剤化した５μｇの組換え血球凝集素Ｈ５で免疫処置し、マウスの１グループは、ミョウバンで製剤化したリン酸緩衝生理食塩水で免疫処置する。副伏在静脈血を、無麻酔状態のマウスの１回目および２回目免疫処置後１４日で回収する。血清は１０分間８０００ｇでの遠心分離により回収し、記載されたように（Kendal et al.,1982;WHO,2002）血清の血球凝集素力価を測定する。不活性化Ａ／インドネシア／５／０５ウイルス（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、血球凝集素活性に関してマウス血清サンプルを試験することができる。ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）から調製した受容体破壊酵素ＩＩ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＲＤＥＩＩ）で、血清を前処理する。血球凝集アッセイは０．５％七面鳥赤血球細胞を用いて実施する。血球凝集素抗体力価は、血球凝集の完全阻害を引き起こす最高希釈の逆数として定義することができる。
【０１８４】
２０．３  マウスにおける致命的攻撃
非制限的な例では、８匹のマウス５グループにランダムに分けた４０匹のマウスを使用し、６〜８週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実験を実施する。場合によっては、異なるグループ数およびグループ当たりのマウス数を使用することができる。マウスは０．５μｇ、２．５μｇまたは７．５μｇ用量の血球凝集素に相当するインフルエンザウイルス様粒子で免疫処置し、リン酸緩衝生理食塩水はマウスの第４の対照グループに使用する。抗原は１％（ｖ／ｖ）の最終濃度においてミョウバンで製剤化することができる。場合によっては、アジュバントもミョウバンも使用しない。非制限的な例では、マウスは第０日と１４日に筋肉内に免疫処置し、２回目の免疫処置後７５日に一ＬＤ５０用量の生インフルエンザウイルス（Ａ／ベトナム／１１９４／０４；Ｈ５Ｎ１）で鼻腔内を攻撃する。マウスは挙動変化に関して攻撃後毎日モニタリングし、体重は２日毎に、または動物が疾患の兆候を示す場合は毎日測定する。２５％の体重減少があるマウスは標準手順に従い安楽死させ、生存率を１４日の期間にわたり測定する。
【０１８５】
（例２１）
フェレットにおけるワクチンの有効性の測定
この例は、フェレットにおける、本発明による血球凝集素を提示するウイルス様粒子を含むインフルエンザワクチンの、有効性を試験するための実験を記載する。フェレットはヒトインフルエンザウイルスによる感染の影響を非常に受けやすく、インフルエンザの研究に広く使用されている。さらにフェレットは、ヒトにおいて見られるインフルエンザの幾つかの症状を発症する。
【０１８６】
２１．１  フェレットの試験
オスのフィッチフェレットを去勢し、香腺を除去し、代表的な循環ヒトインフルエンザＡ株に血清反応陰性であることを分析する。実験の開始時には、フェレットは６〜８ヶ月であり０．８〜１．６ｋｇである。フェレットには、本発明によるインフルエンザウイルス様粒子を含む組成物、およびミョウバンで製剤化した０．７ｍｇ、１．８ｍｇ、３．７ｍｇもしくは１１．０ｍｇの対応する用量の血球凝集素Ｈ５タンパク質（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＨ；１ｍｇ／１ｍＬ用量）を、第０日と２１日に筋肉内に二回予防接種する。対照として、フェレットをリン酸緩衝生理食塩水とミョウバンの溶液で免疫処置する。非制限的な例では、１．８ｍｇまたは３．７ｍｇ予防接種用量のグループ、および対照グループ当たり８匹の動物を、第２１日、１回目の追加免疫処置後４５日に、致命的用量のインフルエンザウイルスＡ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１クレード１ウイルス）で鼻腔内攻撃する。致命的用量はフェレットＬＤ５０の１０倍に等しい。フェレットは、予防接種と攻撃の間の期間中は毎週、および攻撃期間中は毎日、体重減少、体温変化および活性の消失に関してモニタリングする。生存したフェレットは攻撃後１４日で安楽死させる。各グループの攻撃した３匹の動物を攻撃後３日で屠殺し、肺および鼻甲介組織を回収し、体重を量り、ウイルス力価の決定に後に使用するため液体窒素中に急速凍結する。均質化したサンプルは１０倍に連続希釈し、生存１０〜１１日齢胚メンドリ卵に接種し、インフルエンザウイルス力価は卵感染用量５０（ＥＩＤ５０）アッセイにより測定する。データはＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を使用しｌｏｇ１０（ＥＩＤ５０／ｍＬ）として表す（Reed and Muench (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. The Amer J of Hygeine 27: 493-497）。１回目および２回目免疫処置の前、および２回目免疫処置後１４日に、前腹側大静脈を介して麻酔状態フェレットの血液を回収する。血清は使用するまで−２０℃においてアリコートで保存する。
【０１８７】
２１．２  免疫応答の評価
血球凝集阻害アッセイは、世界保健機関（動物インフルエンザの診断および監視に関するＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＳＲ／ＮＣＳ／２００２．５ＷＨＯのマニュアル）により推奨されたのと同様である。不活性化ウイルスはＨ５Ｎ１株Ａ／インドネシア／５／０５、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４、Ａ／アンホイ／０１／２００５、またはＡ／七面鳥／トルコ／１／０５である。血清は３７℃で一晩受容体破壊酵素ＩＩ（Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ  Ｃｏ．，東京、日本のＲＤＥＩＩ）で前処理し、リン酸緩衝生理食塩水を加えて１：８および１：１０希釈を得る。血清はＶ底マイクロタイタープレートにおいて２倍連続希釈する。２５μＬの試験ウイルス（２〜８ＨＡＵ／５０μＬ）を各ウエルに加え、０．５％ウマ赤血球（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を加える前に、プレートを室温で３０分インキュベートする。プレートは室温で６０〜９０分さらにインキュベートし、血球凝集素力価は、血球凝集の完全阻害を引き起こす最高希釈の逆数として定義する。ベースライン（８以下）から血球凝集素力価ε３２への、血球凝集素力価の４倍の増加として血清変換を定義する。血球凝集素力価４０以上を有する対象の割合として血清防御を定義する。
【０１８８】
（例２２）
ウイルス様粒子の脂質とタンパク質の比を決定するための方法
この例は、ウイルス様粒子サンプル全体の脂質とタンパク質の比を決定するための、スルホ−ホスホ−バニリン法を記載する。
【０１８９】
２２．１  スルホ−ホスホ−バニリン法
１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５はＢｉｏｒａｄからのものである（Ｂｉｏｒａｄ１６１−０７８０）。０．６ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ６３１１８）は、精製水で１００ｍＬに作製する前に１０ｍＬ無水エタノールに溶かす。生成した溶液は、次いで一定攪拌の下で４００ｍＬの濃縮Ｈ２Ｐ０４と混合し、ホスホ−バニリンを作製する。ホスホ−バニリン溶液は、室温において暗所で容器内に保存する。オレイン酸（Ｓｉｇｍａ０１００８）は１０ｇ／Ｌで無水エタノールに溶かし、必要な場合さらに希釈する。
【０１９０】
２２．２  脂質：タンパク質の比の決定
濃縮精製ウイルス様粒子を、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を加えることにより破壊し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２５℃で３０秒間均質化し、脂質から血球凝集素タンパク質を解離させる。試験する０．２ｍＬのタンパク質−脂質サンプルを含有する試験管に、０．４ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４を加える。試験管は沸騰水浴中で１０分間加熱し、その後冷却し、クリーンドライチューブ中に０．４ｍＬアリコートを置く。１ｍＬのホスホ−バニリン試薬を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して決定した５０μｇサンプルに加える。次いで混合物を暗所で４５分間インキュベートし、最終吸光度値は５２５ｎｍ波長で測定する。サンプル分析は常に三連で行い、最終値は平均値として報告する。標準曲線を２００、１００、５０、１０および０μｇのオレイン酸で作製し、吸光度値はプレートリーダーを使用して決定する。脂質含量は、ウイルス様粒子の精製後直接決定する。
【０１９１】
２２．３  ニコチアナベンタミアナ由来ウイルス様粒子の脂質：タンパク質の比。
スルホ−ホスホ−バニリン試験を使用して検出した脂質の量は、ニコチアナベンタミアナ由来ウイルス様粒子の３つの異なるバッチに関して、血球凝集素タンパク質５０μｇ当たり１３０〜１３４μｇの脂質の範囲であった。生成したタンパク質と脂質の比は、０．０５の標準偏差で０．３７である（表２０）。
【０１９２】
【表２０】
2014533253.tif 000022
【０１９３】
次表（表２１）中に示されるように、バッチ１および３からのＨ５−ＶＬＰは類似した結果を示し、一方バッチ２からのＨ５−ＶＬＰは非常に少量の全体脂質とタンパク質を示したが、それらの比は依然許容可能であった。
【０１９４】
【表２１】
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【０１９５】
（例２３）
ウイルス様粒子の脂質組成を改変するための方法
リポソーム、エトソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅｓ）、トランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）、ビロソーム（ｂｉｌｏｓｏｍｅｓ）および免疫刺激複合体などの脂質ベースの粒子は非常に免疫原性があり、皮下、鼻腔内、経口、粘膜または経皮投与に使用することができる。この例は、ウイルス様粒子の脂質組成を変更または改変するための方法を記載する。このような方法を利用して、血球凝集素を提示する本発明のウイルス様粒子の内膜の、脂質組成を改変することができる。そうすることによって、このような粒子および関連抗原の物理的および／または免疫学的性質を変更することができる。
【０１９６】
２３．１  リポソーム
非制限的な例では、脂質フィルム水和作用または脱水作用−再水和作用によって、リン脂質とコレステロールを含むリポソームを作製することができる。
【０１９７】
２３．２  カチオン性リポソーム
脂質フィルム水和作用または脱水作用−再水和作用によって、リン脂質とカチオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール、ＤＣ／コレステロールもしくはジメチルジオクタデシルアンモニウムなどを含むカチオン性リポソームを作製することができる。
【０１９８】
２３．３  ＩＳＣＯＭ
透析、遠心分離、脂質フィルム水和作用、エタノール注入またはエーテル注入によって、Ｑｕｉｌｌａｊａサポニン、ＤＣ−コレステロールおよびリン脂質を含む免疫刺激複合体を作製することができる。
【０１９９】
２３．４  ＰＬＵＳＣＯＭ
脂質フィルム水和作用によって、Ｑｕｉｌｌａｊａサポニン、ＤＣ−コレステロールおよび／またはリン脂質を含むカチオン性ケージ様粒子を作製することができる。
【０２００】
２３．５  トランスフェロソーム
脂質フィルム水和作用によって、リン脂質、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレートおよび／またはポリオイルエチレンソルビタンモノラウレートのトランスフェロソームを作製することができる。
【０２０１】
２３．６  エトソーム
脂質フィルム水和作用によって、リン脂質と多量のエタノール（２０から４５％）を含むエトソームを作製することができる。
【０２０２】
２３．７  ビロソーム
脂質フィルム水和作用を使用して、非イオン性界面小胞および／または胆汁酸塩を含むビロソームを作製することができる。
【０２０３】
２３．８  脂質インプラント
脂質フィルム水和作用および凍結−乾燥および圧縮を使用して、Ｑｕｉｌｌａｊａサポニンまたはイミキモドまたはα−ガラクトシルセラミド、コレステロールまたはＤＣ−コレステロールまたはリン脂質を含む脂質インプラントを作製することができる。
【０２０４】
（例２４）
ウイルス様粒子の重合
この例は、ウイルス様粒子脂質二重層の面上の成分を重合させることによって、本発明のウイルス様粒子の安定性を高めるための方法を記載する。
【０２０５】
２４．１  重合による安定化
それだけに限られないが、アクリル、スチレン、アセチレンおよびジエノイル基などを含めた重合性官能基を、本発明のウイルス様粒子の脂質の頭部、鎖または尾部領域に組み込む。このようにして、ウイルス様粒子脂質二重層の表面における頭部反応基の重合、またはリン脂質尾部における反応基の重合のいずれかによって、本発明のウイルス様粒子を安定化することができる。
【０２０６】
（例２５）
粒子の低温電子顕微鏡および原子間力顕微鏡検査
この例は、低温電子顕微鏡および原子間力顕微鏡を使用して、ウイルス様粒子の形状、構造および均質性を測定するための方法を開示する。高分解能原子間力顕微鏡によって、ウイルス様粒子を１つに保持する相互作用、ならびに例えば機械的ストレスもしくはｐＨ変化が原因の安定性および構造変換を測定することができる。
【０２０７】
２５．１  低温電子顕微鏡
高分解能低温電子顕微鏡（ＪＥＭ−３２００）を使用してウイルス様粒子の構造を試験する。ウイルス様粒子は、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ低温浸漬−固定装置を使用し試料用グリッドにおいて薄いフィルム状ガラス中に包埋する。試料の観察は、電子顕微鏡への最小の露出で放射線感受性試料の高分解能イメージを記録するよう設計した、低用量プロトコールを使用することにより行う。
【０２０８】
２５．２  原子間力顕微鏡検査
原子間力顕微鏡検査用に、ウイルス様粒子を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーに縣濁させる（ｐＨ７．５）。基質として、新たに切断した高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ）を使用する。原子間力顕微鏡は、ＡＡ２０００原子間力顕微鏡またはＡＡ５０００多機能走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）システム装置（Ａｎｇｓｔｒｏｍ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｃ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＵＳＡ）であってよい。
【０２０９】
寄託：
以下の種子サンプルは、ブダペスト条約の規定の下２０１１年１月６日に、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｓ．Ａの名称で、ＮＣＩＭＢ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２１  ９ＹＡ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫに寄託された。
【０２１０】
【表２２】
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【図１Ａ】
2014533253.tif 000025
【図１Ｂ】
2014533253.tif 000026
【図２】
2014533253.tif 000027
【図３Ａ】
2014533253.tif 000028
【図３Ｂ】
2014533253.tif 000029
【図３Ｃ】
2014533253.tif 000030
【図３Ｄ】
2014533253.tif 000031
【図４Ａ】
2014533253.tif 000032
【図４Ｂ】
2014533253.tif 000033
【図４Ｃ】
2014533253.tif 000034
【図４Ｄ】
2014533253.tif 000035
【図５Ａ】
2014533253.tif 000036
【図５Ｂ】
2014533253.tif 000037
【図５Ｃ】
2014533253.tif 000038
【図５Ｄ】
2014533253.tif 000039
【図６Ａ】
2014533253.tif 000040
【図６Ｂ】
2014533253.tif 000041
【図６Ｃ】
2014533253.tif 000042
【図６Ｄ】
2014533253.tif 000043
【図７Ａ】
2014533253.tif 000044
【図７Ｂ】
2014533253.tif 000045
【図７Ｃ】
2014533253.tif 000046
【図７Ｄ】
2014533253.tif 000047
【図８Ａ】
2014533253.tif 000048
【図８Ｂ】
2014533253.tif 000049
【図８Ｃ】
2014533253.tif 000050
【図８Ｄ】
2014533253.tif 000051
【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014533253.tif 000054
2014533253.tif 000055
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