(57)【要約】  本発明は、標的抗原によって免疫化されたウシの初乳由来の精製された免疫グロブリン組成物を提供する。この免疫グロブリン組成物は、標的抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含み、非免疫グロブリン因子が除去されている。本発明は、本発明の組成物を製造する方法も含む。本発明は、本発明の精製された免疫グロブリン組成物および任意の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬製剤をさらに含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンから基本的に構成される組成物であって、前記組成物が還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、前記組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡによって測定される場合、前記組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１ｍｇ未満のラクトフェリンを含有し、前記組成物がｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイで標的抗原に結合することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組成物がラクトフェリンを０．３ｍｇ／ｇ未満含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がαラクトアルブミンを２０ｍｇ／ｇ未満含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。.
【請求項４】
前記組成物がβラクトグロブリンを５ｍｇ／ｇ未満含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物がラクトペルオキシダーゼを２ｍｇ／ｇ未満含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物がインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）を１ｍｇ／ｇ未満含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより測定される場合、少なくとも９５％免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンから基本的に構成される組成物であって、前記組成物が還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、前記組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡによって測定される場合、前記組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ未満のラクトフェリンを含有し、前記組成物がｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイで標的抗原に結合し、前記組成物の調製が以下のステップ：
（ａ）標的抗原によって免疫化されたウシの初乳由来の乳清を陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムを通じて濾過すること；
（ｂ）ステップ（ａ）でのカラムのフロースルーを採取すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）のフロースルーを限外濾過により濃縮すること
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンから基本的に構成される組成物であって、前記組成物が還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、前記組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡによって測定される場合、前記組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ未満のラクトフェリンを含有し、前記組成物がｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイで標的抗原に結合し、前記組成物の調製が以下のステップ：
（ａ）標的抗原によって免疫化されたウシの初乳由来の乳清のｐＨをｐＨ６．６〜７．０に調節すること；
（ｂ）塩レベルまたはｐＨを変化させる物質を添加することなく、前記乳清が直列接続した両方のカラムを順に流れる、陽イオン交換カラムに直列接続した陰イオン交換カラムを通じて前記乳清を濾過すること；
（ｃ）採取を行う前に、塩レベルまたはｐＨを変化させる物質を添加することなく、ステップ（ｂ）の両方のカラムを通過した後のフロースルーを採取すること；および
（ｄ）ステップ（ｂ）のフロースルーを限外濾過により濃縮することを含む
から成ることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
任意の薬学的に許容可能な賦形剤およ標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンから基本的に構成される組成物から基本的に構成される医薬製剤であって、組成物が還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、前記組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡによって測定される場合、前記組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ未満のラクトフェリンを含有し、前記組成物がｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイで標的抗原に結合することを特徴とする組成物。
【請求項１１】
口腔への局所送達、経口送達または直腸送達向けに製剤化された、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記組成物が噴霧乾燥された粉末または凍結乾燥粉末の形式であることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
前記組成物が、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９５％免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンから基本的に構成される組成物を製造するプロセスであって、前記組成物が還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、前記組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡによって測定される場合、前記組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ未満のラクトフェリンを含有し、前記組成物が以下のステップ：
（ａ）標的抗原によって免疫化されたウシの初乳由来の乳清のｐＨをｐＨ６．６〜７．０に調節すること；
（ｂ）塩レベルまたはｐＨを変化させる物質を添加することなく、前記乳清が直列接続した両方のカラムを順に流れる、陽イオン交換カラムに直列接続した陰イオン交換カラムを通じて前記乳清を濾過すること；
（ｃ）採取を行う前に、塩レベルまたはｐＨを変化させる物質を添加することなく、ステップ（ｂ）の両方のカラムを通過した後のフロースルーを採取すること；および
（ｄ）ステップ（ｂ）のフロースルーを限外濾過により濃縮すること
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイで標的抗原に結合することを特徴とするプロセス。
【請求項１５】
前記組成物が還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９５％免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）の濃縮した物質を凍結乾燥または噴霧乾燥することをさらに含む、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記組成物中に存在する免疫グロブリンが複数のアイソタイプの免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物中に存在する前記免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡのアイソタイプを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＥＬＩＳＡにより測定される場合、ＩｇＭおよびＩｇＡが合わせて、前記組成物中に存在する免疫グロブリン全部の少なくとも１０％を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の乳清の導電性がステップ（ｃ）のフロースルーの導電性と同じであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｃ）のフロースルーのｐＨがステップ（ａ）の乳清のｐＨと同じであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的抗原がＴＮＦであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物を治療的に有効な量、患者に投与することを含む、炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）、口腔粘膜炎または腸管粘膜炎の治療方法。
【請求項２４】
前記患者がヒトの患者であり、前記組成物がヒトＴＮＦに特異的なポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製されたポリクローナル抗体から基本的に構成され、非免疫グロブリン因子が前記組成物から初乳に含有される通常レベルの１０分の１未満のレベルまで除去され、前記組成物が動的抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイがＥＬＩＳＡであることを特徴とする、請求項１および１０に記載の組成物。
【請求項２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体結合アッセイがＥＬＩＳＡであることを特徴とする、請求項８、９および１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１１年２月２２日出願の米国仮特許申請第６１／４４５，２０１号の利益を主張する。前記出願の全内容が参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究に関する記述
本発明は、全体または一部が、ＮＩＨ助成金番号１Ｒ４３ＤＥ０１９７３５−０１および１Ｒ４３ＤＫ０８３８１０−０１Ａ１、ならびにＨＨＳ契約ＨＨＳＯ１００２０１１０００２７Ｃによる支援を受けた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
抗体は製剤の重要なクラスの１つである。標的抗原に対して特異的な抗体は、癌および自己免疫疾患の治療において有効性の高い治療薬であることが明らかになっており、それらの使用は患者に大きな利益をもたらし続けてきた。抗体は、一般に特定の標的に対して極めて特異的であり、したがって、小分子治療薬に比べて、標的以外に与える毒性が低い傾向がある。
【０００４】
国際特許出願第２００９／０４６１６８号；国際特許出願第２００９／０２０７４８号および米国特許第２００７０１８４０４９号Ａ１は、典型的には、消化管に送達されて、１つまたは複数の疾患の病原を調節する抗原を標的とする治療薬として使用する目的での免疫哺乳類の乳に由来するポリクローナル抗体の使用を記述している。特にウシに由来する初乳および乳は、ヒト患者に経口で送達するための、他に類を見ないほど安全なポリクローナル抗体の供給源である。通常の牛乳は約１．５ｇ／ＬのＩｇＧを含有しているため、ウシ免疫グロブリンに対してヒトはすでに広範に暴露されている。しかしながら、乳および初乳には、それ独自の治療的用途を有するが、乳に由来するポリクローナル抗体を使った特定疾患の治療という文脈では理想的ではない可能性のある他の成分も含有している。ドナー動物の免疫化により誘導される特異的抗体に加えて、乳および初乳は、その他の特異性ならびにタンパク質、ペプチドおよび小分子（Ｋｏｒｈｎｏｎｅｎ｛ＫｏｒｈｏｎｅｎおよびＰｉｈｌａｎｔｏ，２００７，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，１３巻，８２９〜４３頁｝およびＬｉａｎｇ
｛Ｌｉａｎｇら，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｒｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，８巻，３７６４〜７６頁｝で検討された）を含むが、これらに限られない、その他多くの生物学的に活性な非免疫グロブリン因子を有する抗体を含有している。
【０００５】
乳および初乳中の特異的非免疫グロブリン成分（その多くが単独または組合せで生物学的活性を有する）の例としては、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、αラクトアルブミン、βラクトグロブリン、トランスフェリン、リゾチーム、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＣＴＧＦ、成長ホルモン、インスリン、プロテアーゼ、ＰＲＰ、グルタミン、ポリアミン、ヌクレオチド、プロラクチン、ソマトスタチン、オキシトシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ＴＳＨ、チロキシン、カルシトニン、エストロゲン、プロゲステロン、ＩＬ−１ｂ、
ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、Ｉｆｎ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ３、Ｃ４、哺乳類由来の成長因子ＩＩ、人乳成長因子ＩＩＩ；成長ホルモンおよび成長ホルモン放出因子、カゼイン、カゼイン由来のペプチド、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｅ、Ａ、Ｃ、葉酸、パントテン酸、ベータカロチン、グリコーゲン、レチノイン酸、カルシウム、クロム、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、
ナトリウム、亜鉛、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、リジン、トレオニン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、アラニン、チロシン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、β２ミクログロブリン、ヘモペキシン、ハプトグロブリン、オロチン酸、ペルオキシダーゼおよびキサンチンオキシダーゼが挙げられる。
【０００６】
初乳は、栄養補給物として広く用いられており、治療薬として研究されてきた｛Ｋｈａｎら，２００２年，Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，１６，１９１７〜２２頁｝。また、結腸炎の動物モデルにおいて有効であることも示されている｛Ｂｏｄａｍｍｅｒら，２０１１年，Ｊ  Ｎｕｔｒ，１４１巻，１０５６〜６１頁｝。
【０００７】
多くの研究者は、上記の非免疫グロブリン成分の１種または２種以上を濃縮し、免疫グロブリンおよびカゼインなどのその他の成分を除去することにより、初乳および乳のこのような非免疫グロブリン成分の治療的用途の利点を活用してきた。このように濃縮した成長因子の潜在的な治療用途としては、消化管の疾患の治療および消化管の炎症の治療が挙げられる。初乳は、種々多様な腸の不調に有益な治療法として考えられてきた。乳または初乳由来の成長因子は、化学療法により引き起こされる粘膜炎での使用が検討されてきた。乳由来の成長因子およびその他の生理活性成分を強化するための方法は当該技術分野で知られている。当該技術では、疾患、特に、病原菌による感染を原因とする胃腸疾患の治療を目的とした経口投与のためのウシ由来の抗体の組成物が開示されている。しかしながら、当該技術では、特に経口で送達されるとき、乳または初乳に存在する非免疫グロブリン成分から単離して、このような抗体を使用することは検討されていない。実際、初乳の非免疫グロブリン成分は、経口投与では抗体を安定化させると以前は信じられていた。
【０００８】
抗体医薬品中の複数の活性非免疫グロブリン因子の存在が問題になり得ることは以前は理解されていなかった。非免疫グロブリン生理活性物質の存在により生じる問題のいくつかをここに列挙する。第一に、これらの非免疫グロブリン因子のいくつかのレベルは、乳牛の健康状態、農場の管理実務、および搾乳を行った授乳の段階により影響を受ける。例えば、５５頭の乳牛からの初乳の調査の１つ｛Ｋｅｈｏｅら，２００７年，Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，９０巻，４１０８〜１６頁｝では、ラクトフェリンの平均レベルは、０．８ｍｇ／ｍｌだったが、個々の乳牛は０．１ｍｇ／ｍｌ〜２．２ｍｇ／ｍｌの範囲で変動した。これは、認可された生物学的薬剤に要求される製造の一貫性達成を困難にする可変性の源を製品に導入する。
【０００９】
これらの非免疫グロブリン因子の発現における変異性は、初乳の生物学的活性に関与する単一成分または複数成分の混合物を明確に識別することが可能ではなかったため、とりわけ難しい課題である。一方で、これは製品の均一性を達成することを極めて困難にする。他方で、製品に関する仕様を規定することを困難にする。
【００１０】
第二に、これらの非免疫グロブリン因子のいくつかは、治療薬中の特異的抗体が標的としているのと同一の経路または疾患経過に作用する可能性がある。これはその特異的抗体の投与から生じる治療効果を評価するのを困難にする。
【００１１】
第三に、これらの非免疫グロブリン因子のいくつかは、特に胃腸疾患のある患者に与えたときに、安全性の懸念を伴う可能性がある。これは抗体製品が慢性的に投与されることを意図しているときに特に当てはまる。例えば、成長因子に長期に暴露されると、悪性腫瘍のリスクが高まる恐れがある。
【００１２】
したがって、非免疫グロブリン因子の不純物の存在も含め、治療的に潜在的交絡活性のない一貫性のある抗体製品の製造を可能にするための組成物および方法を開発する必要が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、生物源由来の組成物を提供し、その組成物は、標的抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含むものとする。１つの実施形態において、組成物は非免疫グロブリン因子を除去した、精製および単離した免疫グロブリンである。１つの実施形態において、生物源は乳または初乳である。１つの好ましい実施形態において、生物源は標的抗原またはその免疫原性部分により免疫化した動物からの乳または初乳である。１つの実施形態において、組成物はラクトフェリンを除去される。１つの実施形態において、組成物は低分子量成長因子を除去される。１つの実施形態において、組成物は非免疫グロブリン因子を除去され、さらに、標的抗原に対して特異的でない免疫グロブリンを除去される。本発明は、本発明の組成物を製造する方法を含む。本発明は、本発明に従う薬学的組成物および患者の疾患を治療する目的でこのような組成物を使う方法もさらに含み、このような疾患は患者の標的抗原の活性により調節されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例５で論じたものと異なる条件下で、加工された初乳試料の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図２】Ｃａｐｔｏ−Ｓフロースルー材料のＭＥＰ結合およびｐＨ溶出液からの試料の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図３】ＭＥＰ溶出液のサイズ排除クロマトグラフィー分析である。
【図４】ＭＥＰ樹脂上でのパイロットスケール調製物の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図５】ＭＥＰとＣａｐｔｏ−Ｓとを比較する還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図６】異なる中和手法を比較する還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図７】シーケンシャルなフロースルークロマトグラフィーからの試料の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図８】直列のＣａｐｔｏ−Ｓ/Ｃａｐｔｏ−Ｑカラムで精製された試料の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図９】直列のＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑカラムで精製された試料の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の濃度測定分析である。
【図１０】質量分析のために切除された、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥからのゲルフラグメントの同定。
【図１１】異なる条件下で精製されたポリクローナル抗体組成物の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【図１２】異なる条件下で精製されたポリクローナル抗体組成物の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の濃度測定分析である。
【図１３】グリアジン（Ａ）またはペプチド５６〜８９（配列ＩＤ番号：１）（Ｂ）に結合する親和性精製抗グリアジン抗体のＥＬＩＳＡ分析である。
【図１４】Ｃａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑによって精製された後、限外濾過された組成物の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ａ）および濃度測定分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、「（単数または複数の）免疫グロブリン（Ｉｇ）」という用語は、抗原に特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンおよびミュー定常領域の遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリンの可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはエプシロンとして分類され、ガンマはＩｇＧ、ミューはＩｇＭ、アルファはＩｇＡ、デルタはＩｇＤ（ウシ亜科の動物には存在しない）、エプシロンはＩｇＥの免疫グロブリンのクラスをそれぞれ定義する。通常、免疫グロブリンの抗原結合領域は、標的受容体への結合の特異性および親和性に非常に重要である。例示的な免疫グロブリンの構造単位は、四量体を含み、本明細書中では、「抗体」または「複数の抗体」とも呼ばれ、ポリクローナル抗体を含む。四量体の各々は、２対の同一のポリペプチド鎖から成り、各対は「軽」鎖（約２５ｋＤ）１本と「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）１本とを有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸から成る可変領域を定義する。「可変軽鎖（ＶＬ）」という用語はこれらの軽鎖を、「可変重鎖（ＶＨ）」という用語はこれらの重鎖をそれぞれ指す。
【００１６】
免疫グロブリンは、例えば、無傷抗体として、または多種多様なペプチダーゼによる分解によって生成される、よく特徴づけられた数多くの抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｃ）として存在する。
免疫グロブリン（単数または複数）は、また、例えば、乳または初乳などの生物源に存在する可能性のあるフラグメントとしても存在し、これは乳または初乳の天然の分解または加工に伴う分解の結果である。本明細書中で用いられる場合、「免疫グロブリン（単数または複数）」という用語は、ＩｇＡおよびＩｇＭに関連する分泌成分ならびにＪ鎖成分などの免疫グロブリンに関連するポリペプチドを含む。したがって、本明細書中で用いられる場合、「免疫グロブリン（Ｉｇ）組成物」という用語は無傷抗体（ポリクローナル抗体を含む）もしくはそのフラグメント、または全ての免疫グロブリンのアイソタイプに由来する、これらに関連したタンパク質成分の組成物を指す。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、「ポリクローナル抗体（単数または複数）」という用語は、同一または異なる抗原上のいくつもの異なる特異的抗原決定基と結合するか、またはそれらと反応することの可能な、異なる抗体分子から成る組成物を指す。免疫化動物の血液、乳、初乳または卵から単離したポリクローナル抗体の調製物は、通常、標的抗原に対して特異的な抗体に加えて、標的抗原に対して特異的でない抗体も含む。したがって、本明細書中で用いられる場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、標的受容体に対して特異的な抗体が濃縮された抗体調製物とそれほど濃縮されていない調製物との両方を指す。好ましくは、ポリクローナル抗体は、以下で規定するように、標的抗原またはその一部によって動物を免疫化することにより調製される。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、「非免疫グロブリン因子」という用語は、非免疫グロブリンのタンパク質およびペプチド、非免疫グロブリンの高分子および小分子を含む。初乳、乳または血清などの生物源に存在し、標的抗原に対して特異的でない抗体は、本明細書中では、「非特異的抗体」と称される。「標的抗原」という用語は、組成物のポリクローナル抗体が結合先として意図している抗原を指す。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明の組成物のポリクローナル抗体は、内因性標的抗原に対して特異的である。「内因性標的抗原」は、本発明のポリクローナル抗体によって治療されるヒトまたは動物の患者の細胞または組織によって製造される抗原である。非感染性の「友好的な」細菌または感染性病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、寄生虫）を含め、患者の体内に生息する生物により合成される抗原は、本発明によれば、内因性標的抗原とはみなされない。１つの実施形態において、本発明の抗体は、外因性因子に対して特異的であり、ここで「外因性因子」は、内因性標的抗原ではないこれらの因子として定義される。抗体による治療を受けている動物の体内に生息する微生物により合成される因子は外因性因子である。本発明の１つの実施形態において、抗体はウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫を含め、感染因子を標的としない。本発明の１つの実施形態において、標的抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫の細胞毒性成分または免疫原性成分を含まない。
【００２０】
「生物源」はポリクローナル抗体を含む、本発明の組成物の由来源を指し、このような由来源は細胞、細胞成分、組織、血清、乳および初乳を含むが、これらに限定されない、少なくとも１つの生体成分を含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、ポリクローナル抗体を含む本発明の組成物の生物源は、乳または初乳である。１つの好ましい実施形態において、乳または初乳は、標的抗原またはその免疫原性部分によって免疫化されている動物に由来する。抗原の「免疫原性部分」は、その抗原によって免疫化されている宿主動物において免疫反応を誘因することが可能な抗原の任意部分であり、好ましくは、動物に標的抗原に対するポリクローナル抗体を生じさるように誘因する抗原の任意部分である。
【００２２】
当該分野で理解されているとおり、標的抗原は、その標的抗原に対して特異的な、本発明のポリクローナル抗体組成物で最終的に治療を受ける予定の患者の体内に存在している抗原である。したがって、本発明に従うポリクローナル抗体は、患者に投与されたとき、標的抗原に結合する。例えば、ＴＮＦに対して特異的なポリクローナル抗体の場合、患者がヒトの患者であるとき、標的抗原は、好ましくは、ヒトＴＮＦα（ＴＮＦ）である。
【００２３】
好ましい実施形態において、標的抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む組成物は、ウシ、好ましくは免疫化した乳牛の乳または初乳から単離される。１つの好ましい実施形態において、ポリクローナル抗体はウシＩｇＧ抗体である。特に好ましい実施形態において、ポリクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧを含む乳または初乳に存在する混合型Ｉｇアイソタイプのウシの抗体である。
【００２４】
ウシの初乳（初期の乳）は、本発明にとって、好ましいポリクローナル抗体組成物の供給源である。乳牛において、抗体は胎盤を横断しないため、全ての受動免疫は初乳を通じて生まれたての子牛に移される。結果として、乳牛は出産の直後、初乳に大量の抗体を瞬時に分泌するので、初乳中のタンパク質の約５０％は免疫グロブリンである。誕生後、最初の４時間は、通常、初乳中の免疫グロブリンレベルは５０ｍｇ／ｍｌであり、２４時間後には２５〜３０ｍｇ／ｍｌに低下する。本明細書中で用いられる場合、「初乳」は、出産後、最初の３〜４日間以内に乳牛が生成する乳状の分泌物を指す。場合によっては、初乳は出産後の特定の時間フレーム（例えば、初回の搾乳初乳、初日の初乳または出産後、最初の３〜４日目の初乳）から単離することが規定される。
【００２５】
通常の牛乳はＩｇＧを最大１．５ｇ／Ｌ含有するため、ウシの免疫グロブリンにヒトはすでに広範に暴露しているので、初乳および乳は、経口送達のためのポリクローナル抗体の供給源として他に類がないほど安全である。
【００２６】
動物においてポリクローナル抗体を生成する方法は、当業者に知られている。フロイントアジュバントなどの標準的なアジュバントおよび標準的な免疫方法を使って、適切な動物を標的抗原の全部または一部で免疫化する。初乳中の抗体の単離のために、特異的抗体レベルが出産時に望ましいレベルになるように、免疫化はタイミングをはかる。免疫原性調製物に対する動物の免疫反応は、試験血液を採取し、標的受容体に対する反応性の滴定量を求めることにより、モニタリングすることができる。免疫原に対してある程度高い滴定量の抗体が得られたら、初乳、乳または血清を動物から採取し、抗体を含む組成物を得る。標的抗原に対して反応する抗体を濃縮するための抗体組成物のさらなる分別が実施されてもよい。
【００２７】
ドナー動物の免疫化によって誘導される標的抗原に特異的なポリクローナル抗体に加えて、乳および初乳は、他の特異性を有する抗体（ここでは「非特異的免疫グロブリン」と称される）ならびに他の多くのタンパク質、ペプチドおよび小分子
（「非免疫グロブリン因子」と称される）を含む。これらの非免疫グロブリン因子は、種々多様な生物活性を有しており、一般に、良性または有益であると考えられてきた。
【００２８】
本発明の１つの態様において、非免疫グロブリン因子は、製造プロセスの間に本発明のポリクローナル抗体組成物から除去される。この除去は、不純物または免疫グロブリンを親和性カラムに吸収させることにより実施され得る。あるいは、この除去はサイズ除外クロマトグラフィーまたは類似の技法を使って実行されることも可能である。あるいは、この除去は限外濾過／ダイア濾過または類似の技法を使って実行されることも可能である。あるいは、この除去は不純物または免疫グロブリンをイオン交換カラムに吸収させることにより実行されることも可能である。本発明による免疫グロブリンの精製および単離のための上述した方法は複数が併用されてもよい。
【００２９】
本発明の１つの態様において、プロセス内試験の間、および特異的標的抗原に向けられたポリクローナル抗体を含む組成物の放出試験の一環として、特異的非免疫グロブリン因子のレベルがモニタリングされる。１つの実施形態において、全ての非免疫グロブリン成長因子のレベルは、初乳における平均レベルの少なくとも５倍低減される。１つの実施形態において、全ての非免疫グロブリン成長因子のレベルは、平均レベルの少なくとも１０倍低減される。１つの実施形態において、本発明のポリクローナル組成物は、実質的に非免疫グロブリン因子を含有しない。
【００３０】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリクローナル抗体組成物から除去される非免疫グロブリンはラクトフェリンである。１つの好ましい実施形態において、本発明のポリクローナル抗体組成物から除去される非免疫グロブリンは、１つまたは複数の特異的成長因子である。１つの実施形態において、１つまたは複数の特異的成長因子は、初乳におけるそれぞれの天然のレベルの少なくとも１０倍除去され、好ましくは、本発明の組成物は、実質的に成長因子を含有しない。
【００３１】
成長因子としては、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、成長ホルモンおよびインスリンが挙げられるが、これらに限られない。
【００３２】
表１は、乳および初乳の中に天然に存在する種々多様な非免疫グロブリン因子の一般的なレベルを示す（Ｏｎｔｓｏｕｋａら，Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ８６巻：２００５〜２０１１頁）。
【表１】
2014512340.tif 000002
【００３３】
表２は、乳および初乳の中に天然に存在する種々多様な非免疫グロブリン因子の一般的なレベルを示す追加データを提供する。（Ｓｕ，Ｃ．Ｋ．およびＢ．Ｈ．  Ｃｈｉａｎｇ（２００３年）Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，８６巻：１６３９〜１６４５頁）.
【表２】
2014512340.tif 000003
【００３４】
表３は、乳および初乳に存在する種々多様な非免疫グロブリン因子の正常なレベルを示すデータを提供する（Ｐｌａｙｆｏｒｄら，２０００年，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７２巻：５〜１４頁）。
【表３】
2014512340.tif 000004
【００３５】
本発明に従い、乳または初乳由来の本発明のポリクローナル抗体組成物から除去されてよい成長因子を含む非免疫グロブリン因子は、表４に記載されているものを含むが、これらに限られない。
【表４】
2014512340.tif 000005
キー：（−）＝ネガティブ調節、ＴＧＦ＝形質転換成長因子、ＭＣＰ＝マクロファージ化学誘引タンパク質、ＭＩＰ＝マクロファージ炎症性プロテイン、ＧＲＯ＝増殖関連腫瘍遺伝子、ＩＬ＝インターロイキン、ＶＥＧＦ＝血管内皮細胞増殖因子、ＰＬＧＦ＝胎盤成長因子、ＦＧＦ＝線維芽細胞増殖因子、ＨＧＦ＝肝細胞増殖因子、Ｃｙｒ６１＝システインリッチ６１、ＧＭ−ＣＳＦ＝顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＰ=インターフェロン−γ−誘導タンパク質、ＰＴＧＦ＝血小板由来成長因子、ＣＴＧＦ＝結合組織増殖因子、ＩＧＦ＝インスリン様成長因子、ＮＧＦ＝神経成長因子、ＥＧＦ＝上皮成長因子、ＨＢ−ＥＧＦ＝ヘパリン結合上皮成長因子、ＮＤＦ＝Ｎｅｕ分化因子、ＢＭＰ＝骨形成タンパク質、
Ｉｇ＝免疫グロブリン、ＰＲＰ＝プロリンリッチポリペプチド、Ｃ＝補体、ＩＦ＝インターフェロン−γ。
【００３６】
非免疫グロブリン因子を除去した、本発明のポリクローナル抗体組成物は、本明細書中では、時として「非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物」と称される。本発明のこのような非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物は、疾患の病原がポリクローナル抗体が向けられた標的抗原により調節される疾患の治療に使用するのに適している。このような治療は、また、その治療が急性疾患または慢性疾患である疾患の治療において、生物源由来のポリクローナル抗体の使用に伴う、潜在的な副作用の緩和も含む。
【００３７】
本発明の非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物は、非特異的免疫グロブリンがポリクローナル抗体組成物から選択的に除去または取り除かれた、標的抗原に特異的なポリクローナル抗体の存在を強化するためにさらに加工されてもよい。特定の標的抗原に対する抗体のポリクローナル抗体を濃縮するための数多くの技法が当業者に知られている。１つの実施形態において、本発明の組成物中に存在する免疫グロブリンの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％は、標的抗原に対して特異的なポリクローナル抗体である。１つの実施形態において、ポリクローナル抗体組成物が標的抗原に対して濃縮されるため、組成物は実質的に非特異的免疫グロブリンを含有しない。標的抗原に対して濃縮された非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物は、本明細書中では、時として「濃縮非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物」と称される。１つの実施形態において、本発明は、非特異的抗原が除去され、非免疫グロブリン因子が任意で除去されたポリクローナル組成物を含む。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明は、標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンを含む組成物を提供し、その組成物は、当該技術分野で公知のとおり、標準アッセイで標的抗原に結合および／または標的抗原を中和および／または標的抗原の機能を調節することが可能なポリクローナル抗体を含む。このようなアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測、免疫拡散法、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング法、凝集、免疫電気泳動法、表面プラズモン共鳴、標的抗原の機能の中和または調節をベースとするアッセイ、例えば、Ｌ９２９細胞ベースアッセイ法におけるＴＮＦの中和などが挙げられるが、これらに限られない。１つの実施形態において、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、組成物は少なくとも９０％免疫グロブリンである。好ましい実施形態において、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、組成物は少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、および好ましくは少なくとも９９％免疫グロブリンである。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明に従って、ウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリン組成物は、非免疫グロブリン因子が初乳におけるそれらの正常レベルに比べて少なくとも５倍除去される。１つの実施形態において、Ｉｇ組成物は、非免疫グロブリン因子が初乳におけるそれらの正常レベルに比べて少なくとも１０倍除去される。１つの実施形態において、ラクトフェリン（ＬＦ）、αラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）、βラクトグロブリン（ｂ−Ｌａｃ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の少なくとも１つが、初乳におけるその正常レベルに比べて少なくとも１０倍除去される。
【００４０】
１つの好ましい実施形態において、組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０巻，７６〜８５頁，（１９８５年））により測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡにより測定される場合、ラクトフェリンは、ウシの初乳由来の免疫グロブリン組成物中に、その組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ以下のレベルで存在する。より好ましくは、ラクトフェリンのレベルは、総タンパク質の約３ｍｇ／ｇ以下、より好ましくは、総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ以下、最も好ましくは、総タンパク質の１ｍｇ／ｇ、たとえば、０．３ｍｇ／ｇ以下である。
【００４１】
１つの好ましい実施形態において、組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、αラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）のレベルがＥＬＩＳＡにより測定される場合、ａ−Ｌａｃは、ウシの初乳由来のＩｇ組成物中に、その組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約７５ｍｇ以下のレベルで、好ましくは、その組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約２０ｍｇ以下のレベルで存在する。より好ましくは、ａ−Ｌａｃのレベルは総タンパク質の約３ｍｇ／ｇ（ｗ／ｗ）以下であり、より好ましくは、総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ以下であり、最も好ましくは、総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ未満である。
【００４２】
１つの好ましい実施形態において、組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、βラクトアルブミン（ｂ−Ｌａｃ）のレベルがＥＬＩＳＡにより測定される場合、ｂ−Ｌａｃは、組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約２０ｍｇ以下のレベルで、好ましくは、Ｉｇ組成物中に、その組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ以下のレベルで存在する。より好ましくは、ｂ−Ｌａｃのレベルは総タンパク質の約５ｍｇ／ｇ以下であり、より好ましくは、総タンパク質の約３ｍｇ／ｇ以下であり、より好ましくは、総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ以下であり、最も好ましくは総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ未満である。
【００４３】
１つの実施形態において、組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）のレベルがＥＬＩＳＡにより測定される場合、ＬＰＯは、Ｉｇ組成物中に、その組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ以下のレベルで存在する。より好ましくは、ＬＰＯのレベルは、総タンパク質の約２ｍｇ／ｇ（ｗ／ｗ）以下であり、より好ましくは、総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ以下であり、より好ましくは、総タンパク質の約０．２ｍｇ／ｇ以下であり、最も好ましくは総タンパク質の約０．２ｍｇ／ｇ未満である。
【００４４】
１つの実施形態において、組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、インスリン様成長因子１（ＩＦＧ−１）のレベルが、ＥＬＩＳＡにより測定される場合、ＩＧＦ−１は、ウシの初乳由来のＩｇ組成物中に、その組成物中に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ以下のレベルで存在する。より好ましくは、ＩＧＦ−１のレベルは、総タンパク質の約１ｍｇ／ｇ以下であり、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｇ以下であり、最も好ましくは総タンパク質の約０．１ｍｇ／ｇ未満である。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明は、標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンを含む組成物を調製するための方法を提供し、その組成物は、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、ラクトフェリン（ＬＦ）、αラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）、βラクトグロブリン（ｂ−Ｌａｃ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）を含むが、これらに限られない、非免疫グロブリン因子が実質的に除去されており、組成物は標準抗体結合アッセイにおいて、標的抗原に結合し、組成物の調製は以下のステップを含む：当該技術分野で公知の標準的な手順によって、脂肪およびガゼインを除去するために加工した、標的抗原によって免疫化されたウシの初乳由来の乳清を用意する；加工した乳清のｐＨをｐＨ６．６〜７．０に調節する；乳清を陽イオン交換カラムと並列接続した陰イオン交換カラムを通して濾過する（乳清は塩のレベルまたはｐＨを変化させる物質を加えることなく、並列接続した両方のカラムを順に流れる）；採取が行われる前に、塩のレベルまたはｐＨを変化させる物質を加えることなく、フロースルーが並列接続した両方のカラムを順に通過した後、フロースルーを採取する；および限外濾過によりフロースルーを濃縮する。このプロセスはさらに、標準技法を使って、ステップの濃縮したフロースルー生成物を凍結乾燥または噴霧乾燥することを含んでもよい。このプロセスはさらに、実施例に記述したアッセイを含む標準的な手段により、噴霧乾燥または凍結乾燥の前に、不純物が望ましいレベルにあるかを判断するために、濃縮したフロースルー生成物を試験することを含んでもよい。
【００４６】
１つの実施形態において、陰イオン交換カラムは強陰イオン交換体であり、陽イオン交換カラムは強陽イオン交換体カラムである。本発明での使用に適した強陽イオン交換体としては、Ｃａｐｔｏ  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本東京）、Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本東京）、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）が挙げられるが、これらに限られない。本発明での使用に適した強陰イオン交換体としては、Ｃａｐｔｏ−Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本東京）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＱＡＥ−２５ＳＷ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ
（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）が挙げられるが、これらに限られない。
【００４７】
弱陽イオンおよび弱陰イオン交換体も、本発明で使用するのに適しているであろう。本発明での使用に適した弱陽イオン交換体としては、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＣＭ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）が挙げられるが、これらに限られない。本発明で使用するのに適した弱陰イオン交換体としては、ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本東京）、ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ５  ＮＰＲ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本東京）、Ｃａｐｔｏ−ＤＥＡＥ
（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＤＥＡＥ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ−Ｄ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ
（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、ＰＯＲＯＳ  Ｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）が挙げられるが、これらに限られない。
【００４８】
１つの実施形態において、カラムに入る乳清液の導電率は約４＋／−１ミリジーメンス／ｃｍである。１つの実施形態において、両方のカラムのフロースルーの導電率は、約４＋／−１ミリジーメンス／ｃｍである。１つの実施形態において、カラムに入る乳清液のｐＨは、両方のカラムのフロースルーのｐＨと同じである。
【００４９】
本方法は、上述されたように、非Ｉｇ因子を実質的に除去した、本発明の精製され、単離されたＩｇ組成物を大規模量調製する場合に特に有用である。イオン交換クロマトグラフィーを使って、ポリクローナル抗体を含むＩｇ組成物から非免疫グロブリン因子を除去することは、ポリクローナル組成物内の種々多様な抗体クローンのｐＩの範囲が原因で、過去においては難しい課題だった。従来の方法は、ポリクローナル抗体種のｐＩよりも高いまたは低いｐＩを有する非免疫グロブリン因子から免疫グロブリンを分離するための条件および溶出ステップを変えながら、複数のカラムを使うことを必要とした。直列に連結された陰イオンおよび陽イオン交換カラムを順に通過するフローの使用は、ポリクローナル抗体の大規模な精製を可能にし、同時に、最終的な組成物から、非Ｉｇ因子を実質的に除去する。この方法は、複数のカラムからの別々の溶出、ならびにｐＨ、塩および温度などのプロセス条件に複数の変更を必要とすることなく、Ｉｇ組成物の精製および単離を可能にする。本明細書中で用いられる場合、大規模精製は少なくとも３０リットルの出発材料（初乳）を意味する。
【００５０】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中で詳述するように、任意で、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬製剤および標的抗原の全部または一部によって免疫化されたウシの初乳由来の単離され、精製された免疫グロブリンを本質的に含む組成物を提供し、組成物は、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／濃度測定により測定される場合、少なくとも９０％免疫グロブリンであり、組成物の総タンパク質量がビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定され、ラクトフェリンのレベルがＥＬＩＳＡにより測定される場合、ラクトフェリンを組成物に存在する総タンパク質の１グラム当たり約１０ｍｇ未満の量で含有し、組成物はアッセイにおいて標的抗原に結合または調節する。本発明の薬学的組成物からは、αラクトアルブミン（ａ−Ｌａｃ）、βラクトアルブミン（ｂ−Ｌａｃ）、ラクトペルオキシダーゼ
（ＬＰＯ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）を本明細書中に記述したレベルまで除去することを含むが、これらに限られず、上述したように、追加の非免疫グロブリン因子を除去してもよい。
【００５１】
本発明に従う、ウシの初乳に由来する、精製され、単離された免疫グロブリン組成物は、標的抗原、例えば、疾患病状または疾患の治療に関係する抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含み得る。例えば、本発明の非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物は、消化管の管腔表面上または付近上、ならびに上皮の底側上などの粘膜関門に発現する生物学的標的、粘膜下層内で発現する標的、側面の細胞間隙内で発現する標的、および基底膜内に発現する標的などに向けられてもよい。本発明の目的では、「消化管」は口、咽頭、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結腸、直腸）および肛門から成る。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明の組成物中に存在するポリクローナル抗体は、患者の粘膜関門にそれ以前から存在していた損傷の結果、患者の粘膜関門を横断する。１つの実施形態において、消化管の粘膜関門は、歯および口の傷、食道の傷、または腸の部分切除、空腸造瘻、回腸造瘻、結腸造瘻もしくはその他の外科手術による手術による外傷を含むが、これらに限られない機械的外傷を通じて、破壊または傷つけられ得る。消化管の粘膜関門も、また、虚血または再灌流傷害によって破壊され得る。消化管の粘膜関門も、また、癌の化学療法、癌の放射線療法または治療設定を超えた高線量放射線暴露を原因とする損傷により破壊され得る。消化管の粘膜関門は、歯周病、アフタ性口内炎、消化管の細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫感染、消化性潰瘍、ストレスまたはピロリ菌感染に伴う潰瘍、食道逆流によって生じた損傷、炎症性腸疾患、消化管の癌を原因とする損傷、セリアック病を含む食物不耐性、または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）もしくはその他の摂取もしくは全身送達される薬物により誘発された潰瘍に限られないが、これらを含め、肉眼的炎症および／または潰瘍によって破壊または傷つけられ得る。
【００５３】
本発明の１つの実施形態において、ポリクローナル抗体は、ＴＮＦ、ＴＮＦ−カッパ、Ｉｆｎ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ２７、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３およびＩＬ−３５を含むが、これらに限られない、炎症を調節するサイトカインなどの標的抗原に対して特異的である。本発明の１つの実施形態において、ポリクローナル抗体は、消化管で発現するセロトニンの受容体（５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ／Ｂ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ７、５−ＨＴ１Ｐ）も含め、消化管の粘膜関門の下で発現する、消化器官の神経伝達物質またはそれらの受容体または輸送体である標的抗原に対して特異的である。本発明の１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は、食物摂取を抑制するペプチドまたはそのようなペプチドに対する受容体である標的抗原に対して特異的である。このようなペプチドとしては、ＣＣＫ、ＧＬＰ１、ＧＩＰ、オキシントモジュリン、ＰＹＹ３−３６、エンテロスタチン、ＡＰＯＡＩＶ、ＰＰ、アミリン、ＧＲＰおよびＮＭＢ、胃のレプチンおよびグレリンが挙げられるが、これらに限られない。本発明の１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は、結腸直腸癌細胞上の上皮成長因子受容体である標的抗原に対して特異的である。１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は傷の治癒を促進し、オクルジン、クローディン、接合部接着分子、ＺＯ−１、Ｅ−カドヘリン、コクサッキーアデノウイルス受容体およびクローディンの放出に関与するエラスターゼなどのセリンプロテアーゼなどの密着結合の機能を変化させる生物学的標的である標的抗原に対して特異的である。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は、先端腸の受容体である標的抗原に対して特異的である。本明細書中で用いられる場合、「先端腸の受容体」は、腸管の管腔側に面する細胞の細胞膜で発現する内因性膜貫通タンパク質である。本発明で記述される先端腸の受容体のクラスとしては、栄養物の受容体および輸送体（糖受容体および輸送体、味覚受容体、アミノ酸輸送体および遊離脂肪酸受容体）；パターン認識受容体（Ｔｏｌｌ様受容体を含む）；ケモカインおよびサイトカイン受容体；胆汁塩受容体；カルシウム鉄およびその他のイオンおよび鉱物の輸送体；ペプチダーゼ；ジサッカリダーゼ；ＧＩ管内の癌細胞の表面に発現する成長因子受容体（上皮成長因子受容体を含む）およびタンパク質が挙げられるが、これらに限られない。先端腸の受容体は、胃、小腸または結腸に発現することもあり得る。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は、食物抗原である標的抗原に対して特異的である。このようなポリクローナル抗体は、セリアック病も含めて、食物アレルギーまたは食物不耐性の治療および予防に有用である。１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は、グルテンまたはグルテン由来のペプチドである標的抗原に対して特異的であり、セリアック病の治療に有用である。
【００５６】
１つの好ましい実施形態において、本発明の非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体の調製は、炎症性サイトカイン、ＴＮＦ−α「ＴＮＦ」に対して特異的なポリクローナル抗体を含む。このような組成物は、本明細書中では、時として、「非Ｉｇ因子除去抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物」と称される。当該技術分野で炎症性腸疾患と総称される、クローン病および潰瘍結腸炎に罹患した患者は、しばしば、ＴＮＦに対して向けられる全身投与される抗体（例えば、モノクローナル抗体）によって治療される。１つの好ましい実施形態において、本発明は、本発明の非Ｉｇ因子除去抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物、そして好ましくは本発明のウシの乳、またはウシの初乳に由来する薬学的組成物を使った、炎症、そして特に炎症性腸疾患の治療のための薬学的組成物および方法を含む。このような本発明の非Ｉｇ因子除去抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物は、さらに、本発明に従って非特異的抗体を除去されてもよい。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明の非Ｉｇ因子除去抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物は、口腔粘膜炎または腸の粘膜炎の治療での使用に適している。これらの粘膜炎は、例えば、放射線治療、化学療法またはこれらの任意の組合せを原因として生じ得る。１つの実施形態において、粘膜炎は放射線治療の文脈以外での全身照射も含め、高線量の放射線に被曝することにより生じ得る。１つの実施形態において、本発明の非Ｉｇ因子除去抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物は、再発性のアフタ性口内炎の治療に使用するのに適している。本発明の組成物は、口腔粘膜炎およびアフタ性口内炎の治療のために、口腔に局所的に投与されてもよく、または腸の粘膜炎の治療のために、消化管に向けて経口投与または直腸投与されてもよい。このような製剤は当業者にはよく知られている。これらの投与経路および剤形については本明細書中に詳述される。
【００５８】
１つの態様において、本発明は、本発明のポリクローナル抗体組成物およびを製剤を使用して患者を治療する方法を提供する。本明細書中で用いられる場合、「患者」という用語は動物を指す。好ましくは、動物は哺乳類である。より好ましくは、哺乳類はヒトである。「患者」は、また、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、モルモット、魚類、鳥類、爬虫類なども指す。
【００５９】
「治療」「治療する」および「治療すること」という用語は、疾患、病気、病またはその他の病状（本明細書中ではまとめて「病状」と称される）の１つの症状またはその他の側面の緩和、治癒または予防、あるいは病状の重症度の減少などを含有する。本発明の組成物または医薬製剤は、利用可能な治療薬を構成するのに、完全な治療の効果を持つことも１つの疾患のあらゆる症状または兆候を根絶することも必要とされない。関連分野において認識されているように、治療薬として使用される薬物は、所定の疾患の状態の重症度を減少させることができるが、有用な治療薬とみなされるのに、その疾患のあらゆる兆候を消す必要はない。同様に、予防的投与される治療薬も、利用可能な予防薬となるために、病状の兆候を予防する上で完全に有効である必要はない。単に、ある疾患の影響を減らす（例えば、その症状の数もしくは重症度を減少させることにより、または別の治療の有効性を高めることにより、または別の有益な効果を生み出すことなどにより）、またはその疾患が被験体で発生または悪化する可能性を減らすことができれば、十分である。１つの実施形態において、治療的に有効な量の組成物が患者に投与されたというしるしは、特定の疾患の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続的な改善である。
【００６０】
本発明の医薬製剤は、好ましくは、舌下投与および粘膜下層投与を含めた、口腔への局所投与；鼻内への注入；消化管へ向けた経口投与、直腸投与または吸入により、患者に投与される。
【００６１】
最も好ましくは、口腔の疾患の場合、本発明の抗体は、うがい薬、リンス、ペースト、ゲル、またはその他の適切な製剤中で送達させることができる。本発明の組成物は、活性抗体と粘膜表面との間の接触を増加させるように設計された製剤、例えば頬側パッチ、頬側テープ、粘膜付着性フィルム、舌下錠、トローチ剤、ウエハ、咀嚼錠、素早くまたは迅速に溶解する錠剤、発泡錠、または頬側もしくは舌下固体を用いて送達させることができる。
【００６２】
最も好ましくは、消化管への送達が最も有効になる疾患に対して、本発明の組成物および製剤は、薬物を消化管に導入するために設計されたカプセル、錠剤、液体製剤の形態または同様の形態で、経口摂取により送達させることができる。あるいは、本発明の製剤および組成物は、下部消化管に送達させるために、坐薬または浣腸剤により投与されてもよい。このような製剤は当業者にはよく知られている。これらの投与経路およびおよび剤形については本明細書中に詳述される。
【００６３】
本発明の医薬製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と一緒に任意で製剤化される。本発明のポリクローナル抗体組成物の「治療的に有効な量」は、どのような医学的治療にも適用される合理的な利益／リスクの割合で、治療の対象者に対して、治療効果を与える量の組成物を意味する。治療効果は、「治療」という用語が本明細書中で用いられる意味で、患者を「治療」するのに十分である。
【００６４】
本明細書中で用いられる場合、「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」という用語は、無毒で不活性な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または任意の種類の製剤補助物を意味する。薬学的に許容可能な担体としての機能を果たせる材料の例の一部としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびアセチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；ラッカセイ油、綿種油、サフラワー油、胡麻油、オリーブオイル、コーンオイルおよび大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；エチルオレエートおよびエチルラウレートなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに硫酸ラウリルナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの、その他の無毒性適合性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤および芳香剤があり、保存料および抗酸化剤も調合者の判断により、組成物中に存在することができる。薬学的に許容可能な賦形剤としては、タンパク質の凝固を予防および／または耐温性を提供するために使用される、ソルビトール、マニトール、グリセロール、トレハロース、マルロース、グルタミン酸、アルギニンおよびヒスチジンを挙げられるが、これらに限られない、ポリオール、糖およびタンパク質などを含むものが挙げられる。
【００６５】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性化合物の他に、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコー
ル、ジメチルホルムアミド、油（特に綿種油、ラッカセイ油、コーンオイル、胚芽油、オリーブオイル、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など、当技術分野において普通に使用される不活性希釈剤を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤および芳香剤を含むことができる。
【００６６】
直腸投与のための組成物は、好ましくは、室温では固体だが、体温では液体になり、したがって、直腸腔または膣腔内で溶け、活性化合物を放出するカカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの、適切な非刺激性の賦形剤または担体と、本発明の化合物とを混合することにより調製できる坐薬である。１つの実施形態において、直腸投与のための組成物は浣腸の形態を取る。
【００６７】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、小袋および顆粒が挙げられる。このような固体剤形では、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤または担体および／または：ａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マニトールおよびケイ酸などの充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの湿潤剤、ｄ）寒天培地、炭酸カルシウム、馬鈴薯デンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）四級アンモニウム化合物などの吸収加速剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、硫酸ラウリルナトリウムなどの潤滑剤、ならびにこれらの混合物などと混合されてもよい。カプセル、錠剤および丸薬の場合、剤形は、また、緩衝剤を含有してもよい。同様の種類の固体組成物も、また、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを賦形剤として使用して、ソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用され得る。
【００６８】
ある種の条件下では、胃分解に対して追加レベルの保護を提供することが望ましい可能性がある。これが望ましい場合、腸溶コーティングについて多数の選択肢が存在する（例えば、米国特許第４，３３０，３３８および第４，５１８，４３３号を参照されたい）。１つの実施形態において、腸溶コーティングは、フィルムコーティングを溶解し、活性成分を放出するために、胃を通過後のｐＨの変化を利用する。コーティングおよび製剤は、タンパク質治療薬を小腸に送達させる目的で開発されており、これらのアプローチは、本発明の抗体の送達のために適合化させることも可能である。
【００６９】
加えて、糖衣錠、錠剤、カプセル、丸薬および顆粒の固体剤形は、医薬製剤化技術分野ではよく知られた他のコーティングおよびシェルを使って調製されることも可能である。それらは、任意で、乳白剤を含有してもよく、また、腸管の特定の部分でのみまたは腸管の特定の部分に優先的に、任意で遅延した形で活性成分（複数も可）を放出する組成物とすることも可能である。使用することのできる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【００７０】
有効用量は投与経路、ならびに他の薬剤との併用の可能性に応じて変化するであろう。しかしながら、本発明の組成物の１日の総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは理解されるであろう。任意の特定の患者に対して、治療的に有効な用量の具体的な値は、治療の対象とする疾患、その疾患の重症度；使用されている具体的な組成物の活性；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；使用される具体的な組成物の投与時間、投与経路および排泄率；食物摂取に比較した化合物の送達のタイミング；治療期間；使用されている具体的な組成物と併用または同時に用いられる薬物；および医学技術分野においてよく知られた同様の要因も含め、種々多様な要因に依存するであろう。
【００７１】
本発明によれば、投与経路にはカテーテルまたは栄養管を介する経口投与が含まれる。
【００７２】
本発明の特定の実施形態は、本発明のポリクローナル組成物を、ポリクローナル抗体の用量が約１ｍｇ／日〜約１ｇ／日、より好ましくは約１０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、最も好ましくは約２０ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日になるように、患者に投与することを伴う。１つの実施形態において、本発明のポリクローナル抗体組成物を、ポリクローナル抗体の用量が約１００ｍｇ／日〜約５０ｇ／日、より好ましくは約５００ｍｇ／日〜約１０ｇ／日、最も好ましくは約１ｇ／日〜約５ｇ／日になるように、患者に投与される。１つの実施形態において、標的抗原に向けられるポリクローナル抗体が濃縮されている組成物の場合、より用量を減少させて使うこともできる。
【００７３】
治療計画は、本明細書中に開示される医学的疾患を治療するために、本発明の抗体組成物を１日１回、１日２回または１日３回以上投与することを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体組成物は、本明細書中に開示した医学的疾患を治療するために、１日４回、１日６回または１日８回投与される。１つの実施形態において、本発明の抗体組成物は、本明細書中に開示される医学的疾患を治療するために、１週間に１回、１週間に２回または１週間に３回以上投与される。
【００７４】
本発明の方法および組成物は、本発明の非Ｉｇ因子除去ポリクローナル抗体組成物を、患者が患っている症状を治療するのに有用な１種または複数種の治療薬と併用することを含む。このような治療薬の例には、タンパク質薬と非タンパク質薬の両方が含まれる。複数の治療薬が共投与されるときは、当該技術分野で認識されているように、用量は適切に調節されてよい。「共投与」および併用治療は、共投与に限られず、本発明の抗体が、少なくとも１種の他の治療薬を患者に投与することを必要とする治療過程の間に、少なくとも１回投与される治療計画も含む。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態または特徴を説明する目的のために提供されるものであり、その範囲を制限することは意図していない。
【００７６】
実施例
実施例１：ウシ初乳の抗ＴＮＦポリクローナル抗体組成物およびプロセス
【００７７】
監査され、適格とされた動物施設で免疫初乳を生産した。ＦＤＡ  Ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ  Ｍｉｌｋ  Ｏｒｄｉｎａｎｃｅ（ＰＭＯ）の下で規制を受ける、米国内の商用グレードＡ酪農場から、妊娠したホルスタイン乳牛が供給された。ＰＭＯは、収容の要件、建物および装備の標準、許容可能な清掃および殺虫剤の材料、搾乳手順、衛生要件などを規定する。
【００７８】
動物は免疫化の開始に先立って、少なくとも２週間、隔離され、必要であれば、身体を清拭した。適格と判断された乳牛は収容され、他の動物とは別に維持され、毎日観察を受けた。認可されていない動物源タンパク質が導入されるのを防ぐために、飼料源を管理した。初乳の供給源となる乳牛群は、ブルセラ症およびＴＢに罹患していないことを国によって試験または認証された。乳牛は、以下に対して定期的に免疫を受け（殺処分または不活性化され）るか、または以下についてスクリーニングを受けた：
ウシ白血病ウイルス                                    大腸菌
ウシウイルス性下痢症ウイルス                          ロタウイルス
パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）                  ビブリオ症
ウシ伝染性鼻気管炎                                    レプトスピラ症
ウシＲＳウイルス                                      クロストリジウム疾患
ヨーネ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
コクシエラ菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）
【００７９】
乳牛に使用することがＵＳＤＡにより認可されている市販の獣医アジュバントを使って、ｒｈＴＮＦの３回投与量を使って、適格な乳牛を免疫化した。最終的に調製したワクチンを、２〜３週の間隔で、確立されたＳＯＰに従って、獣医の直接の監督のもとで投与した。毎回注射するごとおよび分娩時に血清試料を採取した。
【００８０】
免疫化した乳牛は個別に搾乳した。動物は分娩時に良好な健康状態であることが明らかでなければならず、臨床的な乳腺炎の兆候があってはならなかった。乳牛の乳房を、ＦＤＡ  Ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ  Ｍｉｌｋ  Ｏｒｄｉｎａｎｃｅの下で、使用を認可されている標準の乳牛の清拭方法および材料を使って、搾乳できるように準備した。出産後の３日間、１日に２回、初乳を採取した。各乳牛の初乳の搾乳の各々の試料を分析のために採取し、試料および大量の初乳を直ちに−２０℃で凍結した。入ってくる未加工の初乳は全て使用の前に認可を受けた。
【００８１】
初乳を解凍し、１２００〜３６００ｌｂ／時の流速かつ２４〜４３．５℃の温度での連続的なフロー遠心分離により、脂肪成分を減少させた。薄い膜を１．５容量の逆浸透（ＲＯ）水で希釈し、ｐＨを測定および記録した後、酸を使って４．６±０．１に調節した。酸性化した、薄い膜を除去した初乳を２１〜３５℃の温度で２５〜４５分の間、静止状態になるように放置した。酸性化ステップで沈殿したカゼインを、デキャンティング遠心分離により除去した。浄化した上澄みおよびカゼインスラッジを別々に採取し、測定および記録し、カゼインフラクションを破棄した。
【００８２】
浄化した上澄みからの免疫グロブリンを、閉鎖系でプロテインＧクロマトグラフィーにより単離した。プロテインＧ樹脂（たとえば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｇｅｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）を、製造業者の推奨に従ってカラムに充填し、結合バッファーと平衡化した。最適な結合のために適正なイオン強度およびｐＨが維持されるようにするために、浄化した上澄みを結合バッファーで透析し、続いて総タンパク質対カラム体積比率が２０
ｍｇ／ｍｌの状態にて、カラム体積に加えた。流速は０．８ｍｌ／分であった。カラムを結合バッファーの１０カラム体積で洗浄した。結合したウシＩｇＧを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．７）の１０カラム体積を使って溶出した。溶出フラクションを中和するために、１００μｌ／ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を、溶出の前に、採取管に添加した。精製プロフィールを２８０ｎｍでモニタリングし、標的フラクションを採取し、プールし、４℃にてＰＢＳで透析した。採取した生成物の溶出液を限外濾過により濃縮した。
【００８３】
実施例２  ウシ初乳の抗ＴＮＦ抗体：炎症性腸疾患のマウスモデルにおける免疫初乳乳清との精製抗体の比較
【００８４】
ＵＳＤＡに登録されている、ニューメキシコ州のＬａｓ  Ｃｒｕｃｅｓにある研究施設、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌａｂｓで免疫初乳を製造した。６頭のホルスタイン牛を、それらの妊娠後期に購入し、施設に輸送し、免疫化に先立って１週間、環境に慣れさせた。２つのアジュバンドの１つを使って、動物に抗原の皮下注射を、回と回の間に２〜３週間の間隔を取って３回実施し、最後の注射は計算された出産日の３週間前に与えた。最初の８回の搾乳（出産後最初の４日）の間、全頭から初乳を採取した。１頭は乳房の十分な発達が起きる前に早産したため、初乳中の免疫グロブリンが低レベルとなったので、この１頭の初乳は破棄した。
【００８５】
出産後１〜４日目に採取された初乳からプールを調製し、標準的な方法を使って乳清を調製した（ＳｕおよびＣｈｉａｎｇ，２００３年）。初乳を蒸留水で１：３に希釈し、氷酢酸でｐＨ４．６に酸性化し、カゼインを沈殿させ、遠心分離にかけた。上澄みを除去し、ｐＨを７．４に調節し、免疫乳清を生成した。
【００８６】
チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）吸着剤を使って、免疫グロブリンのフラクションを精製した。チオフィリック吸着剤（Ｔ−ｇｅｌ）はＰｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。クロマトグラフィーカラムに樹脂５０ｍｌを充填し、１５０ｍｌの結合バッファー
（０．５Ｍの硫酸ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）と均衡化した。免疫乳清を水浴で解凍し、固体硫酸ナトリウムを添加し、最終レベルを０．５Ｍにした。溶液を１５分間、３７００ｒｐｍで回転させ、特定の物質を除去し、結合バッファーを使って１：１で希釈し、室温でＴ−ｇｅｌカラムにローディングした。カラムを結合バッファーの５カラム体積（１５０ｍｌ）で洗浄した。低塩（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で免疫グロブリンを溶出させ、タンパク質を含有しているカラムフラクションを溶出させ、プールした。溶出物質をＡｍｉｃｏｎで攪拌した細胞上にＹＭフィルターを使って濃縮し、１００，０００分子量でカットオフし、フィルターを滅菌した。.
【００８７】
対照免疫グロブリンを並行して精製した。抗ＴＮＦ活性（免疫性の免疫グロブリン、ＡＶＸ−４７０ｍ）を含有する免疫グロブリンと対照の初乳免疫グロブリンの両方に対して、それらがマウスのＴＮＦに結合する能力と中和する能力の両方について分析した。免疫性の免疫グロブリンは特異的ＥＬＩＳＡにおいてＴＮＦに結合したが、対照の免疫グロブリンでは結合はまったく見られなかった。
【００８８】
ウシ抗体がＴＮＦを中和する能力を、マウスのＬ９２９細胞を使って、標準的な細胞ベースのＴＮＦアッセイを使って測定した。変化する濃度の抗体をマウスＴＮＦを使って、９６ウェルマイクロタイタープレート内で３７℃にて２時間、プレインキュベートした。この抗体−抗原の混合物をＬ９２９細胞の融合型培地に、１ｕｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤと一緒に加え、２４時間３７℃にてインキュベートした。細胞生存性を、ＷＳＴアッセイを使って評価した。この細胞ベースのアッセイにおいて、抗ＴＮＦ抗体はＴＮＦを中和したが、対照抗体は何の作用も及ぼさなかった。
【００８９】
精製したＡＶＸ−４７０ｍおよび対照免疫グロブリンを、マウスＴＮＦで免疫化した乳牛からの乳清および対照乳清と共に、マウスＴＮＢＳ誘発性結腸炎モデルで評価した。この研究は、Ｂｉｏｍｏｄｅｌｓ社で実施された。開始時の平均体重２１．０ｇの雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）から入手した。研究開始に先立って、マウスを５日間、環境に慣れさせた。０日目に５０％エタノールビヒクル中４ｍｇのＴＮＢＳの直腸内投与により、結腸炎を誘発した。
【００９０】
０日目にイソフルラン麻酔下で、５０％エタノール中１００μＬのＴＮＢＳ（４ｍｇ）の直腸内投与により、結腸炎を誘発した。さらに８匹の動物が未処置の対照として用いられ、１００μＬの５０％エタノールを直腸内投与した。動物には、−１日目から３日目まで、１日につき２回（ｂ．ｉ．ｄ．）、１回当たり０．１ｍｌで、経口（ｐ．ｏ．）で試験物またはビヒクルを投与した。５日目に、全ての動物での結腸炎の重症度を、ビデオ内視鏡検査を使って評価した。内視鏡検査は、小動物内視鏡（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ  Ｅｎｄｏｓｋｏｐｅ、ドイツ）を使って、盲検の形式で実施した。結腸炎の重症度を評価するために、動物をイソフルランで麻酔し、下部結腸のビデオ内視鏡検査にかけた。結腸炎は正常を表す０から重症度の潰瘍形成を表す４までの範囲を取るスケールで視覚的に採点された。説明的な用語では、このスケールは次のように定義されている：
内視鏡検査結腸炎の採点スケール
スコア：説明
０：正常
１：血管増生の喪失 
２：血管増生の喪失および破砕性
３：破砕性およびびらん
４：潰瘍形成および出血
【００９１】
試験群とビヒクル対照との統計差をスチューデントのｔ検定（ＳＩｇＭａＰｌｏｔ  １１．２、Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使って測定した。
内視鏡検査のスコアを以下に示す。
【表５】
2014512340.tif 000006
【００９２】
エタノールで処置された対照群と比較して、ＴＮＢＳで処置された群では、結腸炎スコアが大幅に増加していた。５ｍｇのＡＶＸ−４７０ｍまたはＡＶＸ−４７０ｍの乳清による経口処置を受けていた群は、どちらも５日目に結腸炎の重症度スコアの大幅な減少を示した。結腸炎の重症度に他には顕著な差は観察されなかった。
【００９３】
驚くべきことに、これらのデータは、ＡＶＸ−４７０ｍと精製したＡＶＸ−４７０ｍの両方で活性が見られることを示している。免疫グロブリンを他の乳清成分から精製したときには、活性の減少は見られなかった。
【００９４】
実施例３  免疫初乳の生産
【００９５】
監査され、適格とされた動物施設で免疫初乳を生産した。ＵＳ  ＦＤＡ  Ｇｒａｄｅ  Ａ  Ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ  Ｍｉｌｋ  Ｏｒｄｉｎａｎｃｅ（ＰＭＯ）の下で管理されている商用の酪農場から、妊娠したホルスタイン乳牛が供給された。
【００９６】
動物を隔離し、身体を清拭した。初乳の供給源となる乳牛群は、ブルセラ症およびＴＢに罹患していないことを国によって試験または認証された。乳牛は、以下に対して定期的に免疫を受けるか（殺処分または不活性化され）、または以下についてスクリーニングを受けた：
【表６】
2014512340.tif 000007
【００９７】
Ｑｕｉｌ  Ａアジュバンドを使って、ｒｈＴＮＦを、回と回の間に２〜３週間の間隔を取って、３回投与することで適格な乳牛を免役化し、最後の注射は計算された出産日の３週間前に与えた。最初の８回の搾乳（出産後最初の４日）の間、
全頭から初乳を採取した。各乳牛の初乳の搾乳の各々の試料を分析のために採取し、試料および大量の初乳を直ちに−２０℃で凍結した。乳牛は全頭が、Ｌ９２９細胞アッセイにおいて、ＥＬＩＳＡによるコンビナントヒトＴＮＦへの特異的結合およびリコンビナントヒトＴＮＦの中和により判断される特異的抗体を産出した。
【００９８】
実施例４  硫酸アンモニウム沈殿によるウシ初乳由来の免疫グロブリンの精製
【００９９】
リコンビナントマウスＴＮＦで免疫化された乳牛からの初乳試料を解凍し、合わせて７５０ｍＬの初乳のプールを生成した。脂肪を除去するために、初乳を室温にて、２０分間、２９５４ｘｇで遠心分離にかけた。脂肪を除去した後、初乳を水で希釈し（１パート初乳；２パート水）、酢酸を使ってｐＨを４．６に調整した後、２０分間攪拌した。懸濁液を室温にて、３０分間、３４８８ｘｇで遠心分離にかけ、カゼインの沈殿物を乳清から除去した。乳清のｐＨを、１０Ｎ  ＮａＯＨを使ってｐＨ７．４に調整した。５０％の飽和硫酸アンモニウム液（硫酸アンモニウム３１３ｇ／Ｌ）を乳清にゆっくりと添加し、４℃にて１．５時間攪拌した。懸濁液を４℃にて３０分間、３４８８ｘｇで遠心分離にかけた。上澄みをゆっくりとデカンターに移した。免疫グロブリンの沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）に再懸濁して、沈殿物を溶解させた。試料を３６時間、４℃にて、２Ｌの
ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）を８回交換して透析した。ウシの免疫グロブリンを、４℃にて、管の上にポリビニルピロリドン粉末（ＰＶＰ−４０、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州
Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を加えることで濃縮した。濃縮した免疫グロブリン溶液を透析管から除去した。
【０１００】
実施例５  ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ−Ｓカラム上での初乳からの不純物の除去
【０１０１】
凍結した初乳（１．８９Ｌ）を４５℃にて水浴で解凍した。酢酸を使った酸性化ステップを実行して、カゼインを沈殿させた後、初乳の沈殿物を４℃にて一晩放置した。酸性化した物質を４３℃で温め、２，７３０ＲＣＦで遠心分離にかけた。上澄みを保持し、水酸化ナトリウムでｐＨ６．４に中和した。中和した沈殿物を、等量の逆浸透水を加えることで希釈し、２．８Ｌの脱脂し、カゼインを減らした初乳または初乳の乳清を作った。乳清沈殿物のアリコートを試験し、種々のクロマトグラフィーカラムの有効性を評価した。.
【０１０２】
この例では、乳清のアリコート（３０ｍＬ）を陰イオン交換カラム（５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ−Ｑ  ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージ州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから購入）または陽イオン交換カラム （５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ−Ｓ、これもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）に加えた。各カラムを１ＭのＮａＣｌを使って溶出させ、フロースルーおよび溶出液を還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。マーカーレーンには、Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）をローディングした。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、タンパク質を視覚化した。このゲルは図１に示されている。レーン１〜７は、乳清成分の沈殿物を表し、レーン９〜１２はカラムクロマトグラフィーの結果を示している。
枠で囲まれている５０ｋＤａと２５ｋＤａの２つの帯域は、それぞれ免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を指す。乳清の調製中、この方法により判断された場合、免疫グロブリンの収量に顕著な損失は起こらなかった（レーン１〜７）。免疫グロブリンはＣａｐｔｏ−ＱカラムとＣａｐｔｏ−Ｓカラムの両方のフロースルーで視覚化されている。この初乳乳清の調製に使用された条件下では、Ｃａｐｔｏ−Ｑマトリックスは、乳清調製物中の豊富なタンパク質のどれとも顕著には結合しなかった。ただし、さらなる実施例で見られるように、それほど豊富でないタンパク質の不純物の除去には、重要な役割を有し得る。対照的に、Ｃａｐｔｏ−Ｓは初乳の乳清からのタンパク質に結合することで、初乳の乳清からのタンパク質を濃縮し、分子量を約７５ｋＤａ減少させた（レーン１２）ことが認識された。
【０１０３】
実施例６  メルカプトエチルピリジン（ＭＥＰ）クロマトグラフィーによる非免疫グロブリン因子の除去によるポリクローナル抗体組成物の調製
【０１０４】
免疫グロブリンの精製に有用なＭＥＰマトリックス（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を、乳清からのポリクローナル抗体調製物を精製する能力について試験した。この例では、Ｃａｐｔｏ−Ｓフロースルーからの２５ｍｇ試料を最終濃度が０．１５Ｍ  ＮａＣｌになるように調整し、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を使って濾過した。
続いて、試料を流速２ｍＬ／分にて、ＭＥＰマトリックスの１ｍＬカラムに加えた。２８０ｎｍでの吸光度をモニタリングし、吸光度がベースラインレベルに達するまでカラムを洗浄した。カラムに結合していたタンパク質を、クエン酸のグラジエントを使ってｐＨを減少させることで溶出させた。免疫グロブリンのフラクションは、約ｐＨ５．０で溶出した。図２では、レーン１はＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒマーカーであり、レーン２はＣａｐｔｏ−Ｓフロースルー（ＭＥＰカラムロード）、レーン３〜１２は析出ピークからのフラクションを含めたフラクション３６〜４３。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使った濃度測定スキャンは、重鎖および軽鎖が総タンパク質の約９５％を占めることを明らかにした。
【０１０５】
これらのデータはＭＥＰが不純物の除去に有効な樹脂である可能性を示唆している。しかしながら、この後の実施例によって、ＭＥＰは好ましい方法ではないことが証明される。
【０１０６】
実施例７  ＭＥＰによって精製された乳清タンパク質抗体の組成物の分析的サイズ除外クロマトグラフィーによる調査
【０１０７】
サイズ除外クロマトグラフィーは、精製したタンパク質調製物の組成を評価するのに有用な手法である。タンパク質複合体または本来の分子量が高いタンパク質は、本来の分子量が低いタンパク質よりも早く溶出する。ＡＫＴＡＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）
ＦＰＬＣシステム上で、高解像度ＴＲＩＣＯＲＮ（登録商標）２００  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）上で乳清タンパク質（総容量０．５ｍＬ中０．５ｇ）のクロマトグラフィーからの溶出液を分析的サイズ除外クロマトグラフィー分析にかけた。カラムを同じく析出バッファーであるリン酸緩衝生理食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌ）中で事前に均衡化した。吸光度を２８０ｎｍにてモニタリングした。ピークの下にある面積をＵｎｉｃｏｒｎソフトウェアパッケージを使って測定した。これらの条件下では、免疫グロブリンは天然の立体配座を維持すると予想された。図３に示すように溶出容量１３．５ｍＬの主要ピークは、球状タンパク質に対する保持時間である約１４９ｋＤａを表すと計算され、免疫グロブリンに対する理論上の分子量１５０ｋＤａと極めて近い結果となった。この例でのデータは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致し、ＭＥＰマトリックスがポリクローナル抗体組成物と結合し、精製することを示している。
【０１０８】
実施例８  １５Ｌの初乳および２ＬのＭＥＰカラムを使った、より大規模なプロセスへのスケールアップの調査
【０１０９】
この例では、ＭＥＰカラムプロセスをスケールアップするために、パラメタを調査した。脱脂乳清をパイロットスケールで調製した：すなわち、最初に連続的なフロー遠心分離により脱脂初乳（１５Ｌ）を調製し、続いて、１０％の酢酸を使ってｐＨ４．６に酸性化した。一晩放置した後、カゼインを遠心分離により除去し、上澄みを保持し、０．５Ｍ  ＮａＯＨを使ってｐＨ６．４に中和した。次に、乳清をパイロットスケールのフィルタートレインである、デプスフィルター（ＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）にかけ、続いて０．２μｍフィルターにかけ、２０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ６．８と予め均衡化しておいたＩＮｄＥＸカラムに装填したＭＥＰ樹脂の２Ｌカラムにローディングした。約１０Ｌの同じ緩衝液を使ってカラムを十分に洗浄した後、２０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ２．８）を使って溶出させた。溶出した試料を１Ｍのトリスを使って中和した。次に溶出液を５容量の逆浸透水に対してダイア濾過し、緩衝液を交換した後、Ｐｉｌｏｔ  Ｓｃａｌｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使って、限外濾過により濃縮した。
【０１１０】
図４に示す還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、（一部レーンの過重ローディングにつながる）急速分析のための容量ローディングされたゲルである。レーン１：マーカー、レーン２：空白、レーン３：ＭＥＰロード、レーン４：ＭＥＰフロースルー、レーン５：ＭＥＰ洗浄、レーン６：空白、レーン７〜９：ＭＥＰ溶出液フラクションである。これらの結果は、ベンチスケールで見られた結果を広く再現するものだった。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖以外に、主に２つの不純物が存在することが認識された。
【０１１１】
実施例９  ２０１１年１２月１９日のレポートからの噴霧乾燥実施例
【０１１２】
ウシ免疫グロブリンのＭＥＰクロマトグラフィーによる分離からの溶出液を限外濾過／ダイア濾過により、約８０ｍｇ／ｍｌタンパク質に濃縮し、ベンチスケールの噴霧乾燥実験のための供給流を作成した。全ての噴霧乾燥開発作業は、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０ベンチトップラボ噴霧乾燥機を使って、ニューヨーク州Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＨｉｌｌｓにあるＰｈａｒｍａ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ，  Ｉｎｃ．で行われた。
【０１１３】
これらの初期実験の目的は、サイクロン内で、付着および生成物の詰まりを最小限に抑えながら、採取可能な粉末を形成する噴霧乾燥条件を明らかにすることだった。噴霧乾燥に先立って、濃縮された初乳の免疫グロブリンに賦形剤は添加しなかった。
【表７】
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これらの試験粉末のおのおのは、ゼラチンカプセル（サイズ００のＣａｐｓｕｇｅｌ、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に手で封入し、経口剤形のプロトタイプを作った。
【０１１４】
実施例１０  ＭＥＰ精製プロセスとＣａｐｔｏ−Ｓ精製プロセスの比較
【０１１５】
ＭＥＰ樹脂を使って得た結果を評価する際には、溶出液中の不純物の存在に関する懸念、ならびに結合能に関する懸念が存在する。さらに、薬理学的組成物を調製するためのプロセスでは、スケーラビリティ、速やかなスループット、および容量変化回避が重要な要因となる。薬理学的成分がカラム樹脂に結合しないが、望ましくない混入物は結合するプロセスは、好ましいプロセスを表す可能性がある。したがって、フロースルー方法を再度調査した。
【０１１６】
この例では、初期のステップを記述されたとおり（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ａ．Ｇ．，米国特許第５，７０７，６７８号）に実行した：すなわち、脱脂初乳を逆浸透数で２倍に希釈し、酸性化し、中和した後、連続フロー遠心分離で処理した。一晩の放置ステップの後、珪藻土（ＵＳＰ／ＮＦグレード、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を４ｇ／Ｌに加え、材料を１０分間攪拌し、１０％水酸化ナトリウムで中和し、Ｃｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＢｉｏＣａｐデプスフィルター（６０２Ａ０５Ａ、３Ｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ）および０．２μｍフィルター（ＭｉｌｌｉＰＡＫ  ＭＰＧＬ  ０２ＧＨ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ）を通して濾過した。
【０１１７】
乳清をＭＥＰカラムまたはＣａｐｔｏ−Ｓカラムのいずれかに注入した。クロマトグラフィーに続いて、比較の各群からの適切なフラクション（保持したフラクション、ＭＥＰに対するｐＨ勾配を使って溶出した；Ｃａｐｔｏ−Ｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌに調整）を、Ｐａｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌシリーズ装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）およびＴＭＰ−Ｆｌｕｘ  ５０
ｋＤ公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）膜を使って、概算レベル５０ｇ／Ｌになるように限外濾過した。膜貫通圧（ＴＭＰ）を、１５ｐｓｉに近いレベルを維持するように調整した。材料を３〜５容量の逆浸透水に対してダイア濾過した後、再び限外濾過ステップを実行して、タンパク質レベルを１００ｇ／Ｌにした。供給業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）による記述に従って、ＢＣａ（登録商標）アッセイキットを使って、ビシンコニン酸法を実施し、タンパク質レベルを測定した。ＮＵＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを使って、還元性４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮＯＶＥＸゲル（ＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で試料を実行した。マーカーレーンは、Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐの予め着色されたタンパク質標準（カリフォルニア州ＣａｒｌｓｂａｄのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）だった。ゲルをＥＺブルー着色試薬（ＳＩｇＭａ  Ｃａｔ  Ｇ１０４１）を使って着色した。ゲルをデスクトップスキャナー（ＨＰ  ＳｃａｎＪｅｔモデルＧ３０１０）でスキャンし、イメージングデータをＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）で分析した。
【０１１８】
図５は還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示している。この例で示されている全ての試料は、 レーン７の試料を除き、フィルター補助として珪藻土を利用しているプロセスからのものである。レーン１〜１０は次のようにローディングされた：レーン１：分子量マーカー、レーン２：出発初乳、レーン３：脱カゼインした乳清（ＭＥＰまたはＣａｐｔｏ−Ｓカラムへのロード）、レーン４：Ｃａｐｔｏ−Ｓフロースルー、レーン５：ＭＥＰ溶出液、レーン６：ＴＦＦ濃縮ＭＥＰ溶出液、レーン７：ＭＥＰ溶出液（珪藻土なし）、レーン８：ＴＦＦ濃縮Ｃａｐｔｏ−Ｓフロースルー、レーン９：Ｃａｐｔｏ−Ｓ１Ｍ  ＮａＣｌストリップ、レーン１０：ＣａｐｔｏＳ−ＴＦＦプロセスのＵＦ／ＤＦステップからの透過液。分析したとき、ＭＥＰプロセスおよびＣａｐｔｏ−Ｓ−ＴＦＦプロセスからは異なるプロフィールが生じ、例えば、ＭＥＰは可能性のある混入物として圧倒的に多くのラクトフェリンを有していた（以下の実施例１１を参照）のに対し、Ｃａｐｔｏ−Ｓプロセスは可能性の高い混入物としてラクトグロブリンを有していた。混入物の正体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行した標準と比較し、等電点をおよび質量分析法の結果を考慮して求めた。以降、適切な最適化および研磨ステップを加えることで、ポリクローナル抗体組成物の異なる好ましい実施形態を達成することができる。
【０１１９】
実施例１１  ポリクローナル組成物におけるＩｇＭおよびＩｇＡの定量
【０１２０】
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｅ１１−１０１およびＥ１１−１２１、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、テキサス州Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ）を使って、異なる調製物におけるＩｇＭとＩｇＡのそれぞれのレベルを測定した。抗ウシＩｇＭまたはＩｇＡ抗体を用意されていた９６ウェルストリッププレート上で事前にコーティングした。プレートを洗浄し、ブロックして、試料の階段希釈液を加え、洗浄して、コンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ、親和性精製ヤギ抗ウシＩｇＭまたはヤギ抗ウシＩｇＡおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のいずれかを基質として、結合を検出した。ＭＥＰクロマトグラフィーにより精製した材料を、Ｃａｐｔｏ−Ｓクロマトグラフィーからのフロースルー材料と比較した。データはＢＣＡアッセイを使って、タンパク質レベルに基づいて、生成物１グラム当たりのアイソタイプのｍｇとして表している。
【表８】
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【０１２１】
不純物（とりわけカゼイン）が除去されるにつれて免疫グロブリンが濃厚になったことを反映して、ＩｇＡレベルはどちらの精製調製物でも増加した。ＩｇＭはＣａｐｔｏ−Ｓ調製物ではわずかにレベルが上がったが、ＭＥＰ調製物では顕著に減少した。これは、ＭＥＰに比べてＣａｐｔｏ−Ｓ方法の方が優れていることをさらに実証している。Ｃａｐｔｏ−Ｓ調製物では、タンパク質の１３％がＩｇＡであり、７％はＩｇＭだった。初乳におけるこれらのアイソタイプの典型的なレベルに基づくと、これは全てのＩｇＡが保持され、ＩｇＭの約５０％が消失したことを反映している。
【０１２２】
実施例１２  ラクトフェリンを除去するための選択的沈殿
【０１２３】
選択的沈殿は関心対象のタンパク質を濃縮するまたは混在タンパク質を除去することのできる手法である。この実験では、酸性化、脱脂および脱カゼインした初乳の第二リン酸塩による中和はラクトフェリンを選択的に沈殿させることを明らかにした。脱脂した初乳
を解凍し、４２℃に過熱し、１．５倍容量の水で希釈した。溶液を５％の乳酸で酸性化し、最終ｐＨを４．６に調整した。粗い濾過に続き連続的フロー遠心分離にかけて、カゼインを除去し、酸性化した物質を一晩、２〜８℃で放置した。翌朝、４ｇ／Ｌの珪藻土を加え、材料をＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｃａｐｓｕｌｅフィルターで濾過した。続いて、温度、中和速度、ＮａＯＨまたは
第二リン酸ナトリウムの使用を変化させて、異なる中和条件を比較した。全ての場合において、ある程度の濁りが観察され、沈殿物質は遠心分離によって除去され、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析された。
【０１２４】
図６は以下を示す。レーン１：カゼイン後の出発物質、レーン２：上澄み、高速で第二リン酸ナトリウムで中和、レーン３：ペレットフラクション、高速で第二リン酸ナトリウムで中和、レーン４：上澄みフラクション、高速で水酸化ナトリウムで中和、レーン５：ペレットフラクション、高速で水酸化ナトリウムで中和、レーン６：上澄みフラクション、２０分かけて第二リン酸ナトリウムで中和、レーン７：ペレットフラクション、２０分かけて第二リン酸ナトリウムで中和、レーン８：上澄み、２０分かけて中和されたＮａＯＨフラクション、レーン９：ペレットフラクション、２０分かけて水酸化ナトリウムで中和、レーン１０：分子量マーカー。
【０１２５】
この実験では、カゼイン後の初乳からの乳清の調製で、水酸化ナトリウム（レーン４〜５、８〜９）と比較して、第二リン酸ナトリウムを使ってｐＨを中和したとき（レーン２〜３、６〜７）は、ペレットフラクションにおいて、（市販の標準に比較して）ラクトフェリンの同一相対移動の７５ｋＤａタンパク質が濃縮されることが分かった。推定上のラクトフェリンの相対的な濃縮には、白い沈殿物が付随し、これはリン酸カルシウムの可能性が高かった。
【０１２６】
この結果に基づいて、第二リン酸ナトリウムを中和剤として使い、連続的フロー遠心分離を使って、沈殿物質を除去することで、パイロットスケール運転を実施した。しかしながら、リン酸カルシウムの沈殿物は、処理装置からの洗浄が極めて困難であることが判明した。したがって、この方法はベンチスケールでは有用であるかもしれないが、パイロットスケールまたは生産スケールでは有用な方法ではない。
【０１２７】
実施例１３  順次フロースルー戦略の利点−ベンチスケール研究
【０１２８】
ここで記述する実験は、パイロットスケールおよびプロセススケールに信頼性をもってスケールを合わせる樹脂を使ったベンチスケールクロマトグラフィーを示し、それに続いて還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使ってタンパク質プロフィールを分析する。初乳乳清をパイロットスケールで調製し、試料を下記のように、５ｍｌカラムにローディングした。
【０１２９】
図７は、この実験からの還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。レーンは左から右に番号を付与された。レーン１：分子量マーカー、レーン２：カラム樹脂結合実験用の出発材料、レーン３：Ｃａｐｔｏ−Ｑフロースローフラクション、レーン４：Ｃａｐｔｏ−Ｑ  １Ｍストリップ、レーン５：Ｃａｐｔｏ−Ｓフロースルー、レーン６：Ｃａｐｔｏ−Ｓ
１Ｍストリップ、レーン７：異なるバッチからのＣａｐｔｏ−Ｓフロースループロセス試料、レーン８：ウシラクトフェリン（５μｇ、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、レーン９：ウシラクトフェリン（０．５μｇ）、レーン１０：Ｃａｐｔｏ−Ｑが後に続く、順次カラムフロースルーＣａｐｔｏ−Ｓ、レーン１１：Ｃａｐｔｏ−Ｓが後に続く、直列カラムフロースルーＣａｐｔｏ−Ｑ。
【０１３０】
実施例１０のデータと一緒に、この実験はＣａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑを使ったシーケンシャルなフロースルークロマトグラフィープロセスは、ＭＥＰカラムクロマトグラフィーと比較すると、改善されたプロセスになり得ることを示唆している。とりわけ、フロースルーＣａｐｔｏ−Ｓと直列でのフロースルーＣａｐｔｏ−Ｑの新規戦略による結果は、特に有望であるように見える。
【０１３１】
実施例１４  ３０Ｌ初乳および３Ｌカラムにスケールを合わせた直列Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑクロマトグラフィー
【０１３２】
Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ装置（ＳＡ−１−０２−１７５、ＧＥＡ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＵＳ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｎｏｒｔｈｖａｌｅの）での連続的フロー遠心分離、４２℃での乳酸添加による酸の調製（ＤＬ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ、８５％溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ））および粗い濾過により、初乳３０Ｌから脂肪を除去した。粗い濾過に続いて、材料を２〜８℃にて一晩放置した後、トロメタミン（Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）の添加により中和した。中和した血清を連続的フロー遠心分離によって浄化した。次に、軟凝集ステップでは、珪藻土濾過剤（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を最初のフィルターカプセル（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ａ．Ｇ．，米国特許第５，７０７，６７８号）の前の４ｇ／ｍＬに加え、１０分間攪拌した。浄化フィルタートレインは、２０μｍのＡｌｐｈａ繊維ポリプロピレン（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ）／０．４５
μｍポリプロピレンフィルターＣＬＭＦＯ．４５−２２２（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ）／０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から成る。
【０１３３】
Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂（３Ｌカラム体積）およびＣａｐｔｏ−Ｑ樹脂（３Ｌカラム体積）を直列接続した２つのＩＮｄＥＸ１４０／５００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）に充填した。試料をローディングする前に、カラムを１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの１Ｍ  ａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、次に６０Ｌの１M  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ６．８を順に使って洗浄した。乳清（３０Ｌ）を０．５Ｌ／分の流速でカラムにポンプで汲み上げ、カラムを２．５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。２８０ｎｍでの吸光度をインラインフローセル（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ、ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）を使ってモニタリングした。フロースルーの採取は、Ａ２８０がベースラインに近づいたところで中止した。クロマトグラフィーの後、Ｐａｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓの装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使って、生成物を限外濾過（５０ｋＤＡ  ＮＭＷＣＯフィルター）により濃縮した後、５容量の逆浸透水に対してダイア濾過した。生成物は限外濾過により７５ｍｇ／ｍｌ未満に濃縮された。終端の熱処理は１０時間、６０℃にて実行された。
【０１３４】
図８は、直列接続したＣａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑ上でのこの３０Ｌパイロットスケールのカラムクロマトグラフィーからの還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析結果を示している。Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑのカラムに結合したタンパク質を、１ＭのＮａＣｌでカラムを取り除くことで測定した。レーン１：タンパク質分子量マーカー、レーン２〜４：免疫グロブリン含有量（電気泳動、純度９９％超、ミズーリ州Ｓｔ  ＬｏｕｉｓのＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手したヒト骨髄腫血漿由来）を定量化するための対照として使用されるＩｇＧ軽鎖を増加しながらのローディング材料
、レーン５：連続的クロマトグラフィーの前のロード、レーン６：Ｃａｐｔｏ−Ｓ／３Ｌ  Ｃａｐｔｏ−Ｑ直列カラムからのフロースルー、レーン７：直列カラム（１Ｍ  ＮａＣｌ）の溶出液。ゲルに、クマシーブリリアントブルーで着色し、ＭＦＣ−９１２０ＣＮスキャナー（Ｂｒｏｔｈｅｒ）を使って電子的に撮像した。ＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓソフトウェア（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａの国立衛生研究所、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｈｏｖ／ｉｊ／ｄｏｃｓ）を使って、濃度測定プロットを作成した。ハーフピーク高さ間にベースライン減算面積を統合化することでピーク面積を測定した。
【０１３５】
図９は、レーン５、６および７の濃度測定のトレースである。レーン５と６との比較は、 非Ｉｇタンパク質の減少およびＩｇタンパク質、重鎖および軽鎖の濃縮を示している。レーン６に示した比較では、この生成物の８１％は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖に存在する。高分子量帯域は、凝集したＩｇ重鎖（実施例１４を参照されたい）であり、７０〜８０ｋＤａセクションに存在するおよび物質の大半は、生成物に関連する（ＩｇＭおよび分泌成分。実施例１４を参照されたい）。したがって、生成物の９５％は免疫グロブリンである。
【０１３６】
レーン７のトレースは、多数の非Ｉｇタンパク質が優先的に樹脂に結合したことを示している。レーン５および６からのトレースおよびその他のデータと考え合わせると、連続的フロースルークロマトグラフィーは、初乳からのポリクローナル抗体組成物の調製のための強力な方法となることが結論づけられた。フロースルーおよび溶出液中のタンパク質
の正体を以下の実施例でさらに調査した。このプロセスまたはその変型によって、経口投与に適したポリクローナル抗体組成物が適切な収量得られることが容易に認識されるであろう。
【０１３７】
実施例１５  ８０Ｌの初乳にスケールを合わせた直列的Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑ クロマトグラフィー（机上）
【０１３８】
３０Ｌスケールで抗体組成物を調製するための方法を例示的に示したので、この手順は包括的な実験をしなくても８０Ｌにスケールアップすることが可能であることは当業者によって認識されるであろう。初乳８０Ｌからの抗体組成物の調製は下記の手順によって実施される。
【０１３９】
Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ装置（ＳＡ−１−０２−１７５、ＧＥＡ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＵＳ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｎｏｒｔｈｖａｌｅ）での連続的フロー遠心分離によって、初乳（８０Ｌ）から脂肪を除去する。その結果、得られる脱脂初乳を２容量の逆浸透水で希釈し、カゼインを沈殿させるために、ブロードブレード垂直羽根車または相当する混合装置を使って混合しながら、乳酸（ＤＬ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ、８５％溶液、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）を添加し、４２℃にて最終ｐＨ４．６に調節した。粗い濾過または相当するステップ、例えばチーズプレスなどを実行してカゼインを除去した後、材料を一晩、２〜８℃にて放置した後、トロメタミン（Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）の添加により中和する。珪藻土濾過剤（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を、最初のフィルターカプセルの前の４ｇ／ｍＬに加え、１０分間攪拌する。浄化フィルタートレインは、２０μｍのＡｌｐｈａ繊維ポリプロピレンフィルター（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ）／０．４５
μｍポリプロピレンフィルターＣＬＭＦＯ．４５−２２２（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ）／０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から成る。これらまたは、その他の製造業者からの他のフィルターもクロマトグラフィーのための試料を同様に調製することが認識されるだろう。
【０１４０】
この実施例では、試料を３アリコートに分割し、各々を直列クロマトグラフィーにかけ、試料から試料の間で、設定されているカラムを洗浄することで、スケールアップが達成される。Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂（３Ｌカラム体積）およびＣａｐｔｏ−Ｑ樹脂（３Ｌカラム体積）を、直列接続した２つのＩＮｄＥＸ  １４０／５００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）に充填する。各試料のローディングの前に、直列カラムを１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、１２Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１２Ｌの逆浸透水、次に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８を順に使って洗浄する。乳清のｐＨおよび導電性を測定し、乳性を０．５Ｌ／分の流速でカラムにポンプで汲み上げ、設定されたカラムを２．５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄する。２８０ｎｍでの吸光度およびｐＨをインラインフローセル（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ、ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）を使ってモニタリングした。フロースルーの採取は、Ａ２８０がベースラインに近づいたところで中止した。クロマトグラフィーの後、ｐＨはローディングした材料の１ｃｍ当たり１ミリジーメンス以内であることが判明する。Ｐａｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓの装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使って、生成物を限外濾過（５０ｋＤＡ  ＮＭＷＣＯフィルター）により濃縮した後、５容量の逆浸透水に対してダイア濾過する。生成物は限外濾過により７５ｍｇ／ｍｌ未満に濃縮される。終端の熱処理は１０時間、６０℃にて実行される。
【０１４１】
実施例１６  ポリプロクローナル抗体調製物におけるタンパク質の正体の質量分析による調査
【０１４２】
初乳の乳清５２ｋｇを、実施例１４で記述した要領で、直列になっているＣａｐｔｏ−ＳとＣａｐｔｏ−Ｑの２つの３Ｌカラムにローディングした。フロースルーおよびストリップフラクションを還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析し、図１０に、ゲルから切除した帯域の正体を示してある。試料を質量分析にかけた。分析はマサチューセッツ大学にてＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）で実施した。結果として得られるペプチド配列を使ってＮＣＢＩ  ｎｒデータベースを検索した。
【表９】
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【０１４３】
フロースルー材料の分析は、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（帯域４および５）上の主要帯域は、ＩｇＧ重鎖および軽鎖を表すことを確認した。帯域４（帯域３）の上の着色は、これもＩｇＧ重鎖であり、恐らくは異なる糖型を表す。ウシ免疫グロブリンのすべての分析で見られた高分子量帯域（帯域１）は、ＩｇＧ重鎖の凝集体である。帯域２と標識された資料には、３つの帯域が見られる。この３つは主に分泌成分（７９ｋＤａ）、ＩｇＭ
（７６ｋＤａ）およびトランスフェリン（７３ｋＤａ）から成る。分泌成分およびＩｇＭはどちらも組成物の望ましい成分であるのに対し、トランスフェリンは不純物である。残りの低分子量帯域は、不純物であるαラクトアルブミンとケラチンを含んでいる。これらの不純物は、限外濾過ダイア濾過での下流研磨の間に除去される。
【０１４４】
カラムからストリップした材料の分析は、このプロセスがラクトフェリン、ウシ血清アルブミン、βラクトグロブリンおよびαラクトアルブミン、ならびに多少の免疫グロブリンと多少のわずかな不純物も除去したことを確認した。
【０１４５】
この分析は、薬学的に活性なポリクローナル抗体の調製物の生産を混乱させる異質タンパク質をこの戦略を使って除去することが可能であること、さらに研磨ステップを適用することで、胃腸系が弱っている患者も含めて、患者群に適した組成物を生産するために、研磨ステップを適用することが可能であることを示した。
【０１４６】
実施例１７  異なる方法を使って精製した組成物の直接比較
【０１４７】
４つの異なる方法、すなわち、チオエステルＴ−ｇｅｌクロマトグラフィー（実施例２）、硫酸アンモニウム沈殿（実施例４）、ＭＥＰクロマトグラフィー（実施例８）およびＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑ直列クロマトグラフィー（実施例１４）を使って精製した初乳の組成物について直接比較した。各調製物の試料を還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡにより分析し、ラクトフェリン、αラクトアルブミン、βラクトグロブリンのレベルを定量化した。試料をさらにＥＬＩＳＡで測定し、ラクトペルオキシダーゼおよびＩＧＦ−１のレベルも定量化した。
【０１４８】
図１１は、これらの異なる組成物の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示している。レーン１：分子量マーカー；レーン２：脱脂してプールした初乳；レーン３：脱脂し、カゼインを除去した乳清；レーン４：Ｃａｐｔｏ−Ｓのみのフロー；レーン５：Ｃａｐｔｏ−Ｑのみのフロー；レーン６：Ｃａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑのフロー；レーン７：ＭＥＰクロマトグラフィー；レーン８：硫酸アンモニウムで精製した抗体調製物；レーン９：Ｔ−ｇｅｌで精製した抗体調製物；レーン１０：マウスＴＮＦに対して特異的な親和性精製した抗体。図１２はこのゲルの濃度測定分析を示している。これらのデータは上記の実施例で提示した結果を裏づけ、この方法によって判断される場合、調査の対象となった４つの方法は、ほぼ同等な純度になったことを示している（Ｔ−ｇｅｌおよび硫酸アンモニウム
の生成物はベンチスケールで精製したのに対し、ＭＥＰおよびＣａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑ生成物はパイロットスケールで生産されたことに注意されたい）。
【０１４９】
より顕著な違いは、特定の不純物のレベルを定量化するために測定を実施したときに見られた。
【０１５０】
試料をＢＣＡアッセイで分析し、タンパク質の総量を定量化し、ＥＬＩＳＡによって特定の不純物のレベルを定量化した。市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｅ１０−１２６、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、テキサス州Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）を使って、ラクトフェリンを定量化した。製造業者の推奨に従い、ＥＬＩＳＡプレートを、提供されたヤギ抗ウシラクトフェリンコーティング抗体試薬の１：１００希釈液でコーティングした。プレートを洗浄し、ブロックし、試料の階段希釈を添加して洗浄し、コンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ、親和性精製ヤギ抗ウシラクトフェリンおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
を基質として、結合を検出した。市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｅ１０−１２５およびＥ１０−１２８、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、テキサス州Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ）を使って、それぞれβラクトグロブリンおよびαラクトアルブミンを定量化した。製造業者の推奨に従い、ＥＬＩＳＡプレートを、提供されたヤギ抗ウシβラクトグロブリンまたはαラクトアルブミンのコーティング抗体試薬の１：１００希釈液でコーティングした。プレートを洗浄し、ブロックし、試料の階段希釈を添加して洗浄し、コンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ、それぞれ親和性精製ヤギ抗ウシβラクトグロブリンまたはαラクトグロブリン、および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
を基質として、結合を検出した。市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＴ−２０２８３およびＫＴ−１８２７８、Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．、ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ）を使って、異なる調製物中のそれぞれウシのラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−I）のレベルを測定した。抗ウシＬＰＯまたはＩＧＦ−I 抗体は、提供された９６ウェルストリッププレート上に予めコーティングした。検出試薬Ａの添加の前に、試料の階段希釈およびキャリブレーター標準物質を添加し、インキュベートした。追加のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、検出試薬Ｂを添加し、インキュベートした。最終的に、４ウェルを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液でインキュベートした後、５０ｎｍにて読み取る前に停止液を加えた。
【表１０】
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【０１５１】
実施例１８  親和性クロマトグラフィーによるＡＶＸ−１７６の抗原特異的成分の精製
【０１５２】
６頭のホルスタイン牛を、それらの妊娠後期にグリアジンとアジュバンド３回注射することで免疫化した。出産後の最初の４日間、初乳を採取したグリアジンで免疫化した６頭すべての乳牛からの初乳試料をプールした。脂肪を遠心分離で除去し、カゼインをｐＨ４．６への酸性化により沈殿させた。抗グリアジン抗体（ＡＶＸ−１７６）を実施例２で記述したように、チオフィリック吸着剤クロマトグラフィーを使って精製した。グリアジン中の免疫優勢ペプチドの１つとして知られる３３塩基長のペプチドを合成した。このペプチドは５６−８９と呼ばれ、配列はＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列ＩＤ番号：１）である。親和性カラムを、２０ｍｇの５６〜８９を１２．５ｍｌのＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに連結することで調製した。抗体のグリアジン特異的成分を、Ｔ−ｇｅｌで精製した調製物２１０ｍｇをカラムにローディングし、最初にＰＢＳで、次にＰＢＳ中ＮａＣｌ
２５０ｍＭ を使って洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で特異的抗体を析出することにより、精製した。フラクションをＴｒｉｓ緩衝液に採取し、溶液を即座に中和した。
【０１５３】
ＡＶＸ−１７６および親和性精製された成分（ＡＶＸ−１７６Ａ）の活性をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡプレートを尿素（３ｍｏｌ／Ｌ）と炭酸・重炭酸コーティング緩衝液（１００ｍＭ）に溶解したグリアジンによって、または炭酸・重炭酸コーティング緩衝液（１００ｍＭ）中で２０
ｍｇ／ｍｌでのペプチド５６−８９によってコーティングした。マウスＴＮＦまたはＡＶＸ−６１０対照ウシ免疫グロブリンに対して特異的なＡＶＸ−１７６Ａ、ＡＶＸ−１７６または対照抗体ＡＶＸ−４７０ｍをプレートに添加し、結合を標準技法を使って測定した。結果を図１３に示す。
【０１５４】
この実施例は、ポリクローナル抗体組成物の抗原特異的成分を、抗原親和性カラム上でのクロマトグラフィーにより濃縮できることを示している。この濃縮プロセスを通じて、成分の非特異的抗体を除去した。
【０１５５】
実施例１９  Ｃａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑクロマトグラフィー上で精製した後、限外濾過した組成物の還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析
【０１５６】
免疫グロブリンを実施例１４に記述した要領で初乳の乳清から精製した。直列Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＣａｐｔｏ−Ｑカラムを流れた物質を、３０，０００分子量でカットオフする膜で限外濾過し、被保持物を還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。図１４に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ａ）からのゲルおよびゲルの濃度測定分析（Ｂ）を示す。
【０１５７】
この例のゲルと図１１および１２のゲルとの比較は、限外濾過ステップの追加により、Ｃａｐｔｏ−Ｓ／Ｃａｐｔｏ−Ｑフロースルーに残っているαラクトアルブミンをきれいに除去できることを示している。図１１および１２で分析した物質は、αラクトアルブミンのピーク面積が、濃度測定分析では１％であり、これはＥＬＩＳＡによるαラクトアルブミンのレベル７５ｍｇ／ｇに相当する（実施例１７を参照されたい）。限外濾過に続き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、検出可能なαラクトアルブミンは存在しなかったが、これはαラクトアルブミンのレベルが１５ｍｇ／ｇ未満であることを表している。
【０１５８】
この濃度測定に基づくと、この組成物は９７％免疫グロブリンであり、５５％Ｉｇ重鎖 （ＩｇＧおよびＩｇＡ）、３３％Ｉｇ軽鎖（カッパおよびラムダ）、３％分泌ＩｇＭ重鎖および３％トランスフェリンの不純物である。
【０１５９】
Ｃａｐｔｏ−Ｑは強陰イオン交換体である、Ｃａｐｔｏ−Ｓは強陽イオン交換体である。一般には、タンパク質のｐＩに基づいて一方の樹脂または他方の樹脂を結合するようにｐＨを最適化するであろう。
しかしながら、ポリクローナル抗体は広いｐＩ範囲を有しており、このアプローチを複雑にしている。精製して単離した免疫グロブリンの高い収益を達成できるようにこれらのカラムを使用する新規のアプローチは、ポリクローナル免疫グロブリンの予測されるｐＩの範囲の中央、例えば６．６〜７．０の範囲などののｐＨを選択することである。
【表１１】
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【０１６０】
本明細書に記述した実験は、フロースルーの方がスループットがより高速で、高価な緩衝液の使用が少なく、より高度に精製された調製物を製造するため、結合して溶出させるよりもフロースルーアプローチを使うことが好ましいことを明らかにした。条件が正しくない場合、免疫グロブリンの一部は樹脂に結合し、収量を減少させる。本明細書に記述した新規アプローチは、免疫グロブリン組成物の純度を最高にして、収量を最高にする結果に繋がるように条件を最適化した。
【０１６１】
本明細書中で言及される特許および科学文献は、当業者が使用することができる知識を確立する。本明細書で引用される全ての米国特許および公開された、または公開されていない米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全ての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
本発明について、その好ましい実施形態を参照して示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲により含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細において様々な変更が可能であることを理解するであろう。本明細書中に記載される実施形態は互いに排他的でなく、本発明によれば、様々な実施形態からの特徴は、全体として、または部分的に組み合わされ得ることもまた理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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