(57)【要約】【課題】ウイルス担体は標的性遺伝子工学薬物として各種の実体腫瘍を治療でき、腫瘍内の注射に運用でき、腹腔と胸腔内の注射にも適用でき、明らかな副作用を引き起こさず、良い治療効果と安全性を有する。【解決手段】  Ad-TD-hIL12は標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスで中国典型培養物保存センターで保存され保存番号はCCTCC NO：V201031である。ウイルス担体はサブクラスCの5型アデノウイルスで、E1A-CR2、E1B19KとE3gp-19Kの三つの遺伝子を削除し、E3gp-19Kプロモーター遺伝子を利用し、人IL12を表現するp35とp40サブユニット遺伝子配列を制御する。ウイルスは腫瘍細胞の感染を通じて腫瘍細胞で複製し腫瘍細胞を溶解すると同時に、腫瘍組織でハイレベルの多種抗腫瘍作用があるhIL12を生成できる。hIL12は抗腫瘍血管形成作用を有し人体免疫力を調節し人体に抗腫瘍特異免疫能力を形成させ、遠端転移腫瘍細胞を殺し、腫瘍の再発を防止できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中国典型培養物保存センターで保存され、その保存番号がCCTCC NO：V201031であることを特徴とする一種の標的性治療人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルス（oncolytic adenovirus）Ad-TD-hIL12。
【請求項２】
当該ウイルス担体がサブクラスCの5型アデノウイルスAd5で、E1A-CR2、E1B19KとE3gp-19Kの三つの遺伝子を削除し、それにE3gp-19Kプロモーター遺伝子で人IL12を表現するp35とp40サブユニット遺伝子配列を制御することを特徴とする請求項1に記載の標的性治療人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12。
【請求項３】
前記の2p35とp40サブユニット遺伝子に対応するアミノ酸配列がそれぞれSEQ NO：1とSEQ NO：2で、相応なヌクレオチド配列がそれぞれSEQ NO：3とSEQ NO：4であることを特徴とする請求項2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12。
【請求項４】
前記の2p35とp40サブユニット配列が人IL12 DNA配列の増加、削除又は点突然変異で得られる配列及び5’及び/又は3’端欠陥による配列だけでなく、配列SEQ NO：5を含むが、これに限らないことを特徴とする請求項2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12。
【請求項５】
前記の2p35とp40サブユニット配列が前記の人IL12 DNA配列と異なり、抗腫瘍効果を表し、又は腫瘍の減退を引き起こす相同配列又は番号のポリペプチドだけでなく、SEQ NO：6を含むが、これに限らないことを特徴とする請求項2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12。
【請求項６】
前記の人腫瘍が各種の実体腫瘍を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12。
【請求項７】
請求項1又は請求項2に記載の標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12の腫瘍治療薬物製作での応用。
【請求項８】
（1）健康人の末梢血を取り、リンパ球を分離し、植物性凝集素の刺激の下で培養し、RNAを抽出し、cDNAになるよう逆転写反応を行い、制限酵素切断部位を含むプライマーで人インターロイキンhIL12のp35とp40サブユニット遺伝子をクローンし、p35とp40サブユニット遺伝子区切りをhIL12の完全な遺伝子区切りに接続して、クローン担体T担体に接続し、pORF-hIL-12に命名し、これからNco IとNhe Iダブル制限酵素切断pORF-hIL-12プラスミドを使用してから、T4 DNAポリメラーゼで切断されたhIL12遺伝子の区切りを平らにして、使用に備えること、
（2）平ら端末切断酵素で単一にアデノウイルス担体pAd-TDのE3gp-19K欠陥区を切断し、前記のhIL12遺伝子をゲノム一致性順序によってウイルス担体pAd-TDの制限酵素切断部位に挿入し、PCR方法で插入方向の正しい再構成担体を鑑定・選別すること、及び、
（3）前記の再構成担体を293細胞にトランスフェクションを行い、前記の担体Ad-TD-hIL12を構築すること、
上記手順を含む標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスの担体Ad-TD-hIL12の構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学生物技術分野にかかり、特に一種の標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルス及びその応用に係る。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学アデノウイルス担体Ad-TDは、一種の腫瘍標的性担体で、E1A-CR2、E1B19KとE3gp-19Kという三つの遺伝子を削除し、それにE3gp-19Kプロモーター遺伝子配列の5型アデノウイルスを保留し、良い抗腫瘍効果を持っている。インターロイキン12（IL12）は、自然殺傷細胞刺激因子又は細胞毒性リンパ球成熟因子と称され、ジスルフィド結合により接続されるヘテロ二量体細胞因子で、二つのサブユニットは、p35及びp40と称される。p35は、T細胞  B細胞、NK細胞及び単球等により生まれ、p40は主に活性化された単球及びB細胞により生まれる。人とマウスのp35とp40遺伝子は、配列がすでに測定され、それに体内外でNK細胞とT細胞の成長因子の機能を表す。更なる研究は、IL12が有効にマウスの腫瘍に減退させ、それに完全に失わせることを表明した。但し、IL12は、体内で短い半減期があり、持続に注射してからこそ、治療効果を達成することができ、IL12の需要量が相対に大きく（1-10μg/日）、それに、再構成されたIL12蛋白はしばしば重度な毒性を致す。現在、逆転写ウイルス担体を利用するIL12遺伝子治療は、一部分の実験室で実行していて、その抗腫瘍効果はすでに証明されたが、直接IL12を運用する遺伝子治療は、まだ確立された腫瘍病巣と腫瘍自発転移病巣の減退を引き起こさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一種の人腫瘍標的性治療アデノウイルス腺病毒Ad-TD-hIL12を提供し、当該ウイルスは、腫瘍治療の遺伝子工学薬物としてもよく、当該ウイルス担体は、標的性、安全と高効率の特徴を持っている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
5型アデノウイルス担体は、コード人IL12のp35とp40サブユニット遺伝子を含むする複製選択型アデノウイルスであり、当該ウイルスは、腫瘍細胞で選択的に複製し、それに、腫瘍に入った後、機能のある人IL12を表現する。これらの腫瘍は、裸眼で見える又は顕微鏡で見える実体腫瘍、転移腫瘍と拡散腫瘍を含む。当該ウイルス担体は、人体に入った後、選択的に腫瘍細胞で複製し、それに腫瘍細胞を溶解し、大量な腫瘍関連抗原を釈放し、表現する細胞因子人IL12と協同に作用することによって、人体に高効率的且つ特異な抗腫瘍反応を発生させ、ウイルスにより感染されていない遠端腫瘍細胞を殺傷し、その中で、転移した微小腫瘍細胞病巣も含まれる。腫瘍細胞で高い表現があるIL12は抗腫瘍血管形成等の多種の作用も有する。
【０００５】
前記問題を解決する為に、本発明は一種の腫瘍標的性アデノウイルス担体Ad-TD-hIL12を構築した。当該ウイルス担体は、サブクラスCの5型アデノウイルスAd5で、当該アデノウイルスのE1A-CR2、E1B19KとE3gp-19Kの三つの内在遺伝子（Triple DeletionとTD）を削除し、それにウイルス遺伝子の表現に役立ち、ウイルスの体内持続時間を強化するE3B遺伝子を保留し、これと同時に、E3gp-19Kプロモーター遺伝子表現外部治療遺伝子、即ち、人インターロイキン12を保留する。
【０００６】
インターロイキン12はヘテロ二量体で、p35とp40サブユニットを含み、各サブユニットが自分の遺伝子コードを有し、IL12のp35とp40サブユニットのコードDNA配列が人を含む組織から得られる。本発明での人IL12配列は、人組織源、体外合成又は再構成の完全な及び変更された抗腫瘍効果があるコード配列を含む。これらの配列は、人IL12 DNA配列の増加、削除と点突然変異及び5’及び/又は3’端の欠陥を含むが、これには限らない。本発明の人IL12配列と異なる相同DNA配列又は番号のポリペプチドが抗腫瘍の効果を表す場合、それに腫瘍減退を引き起こす配列である場合もこれに含まれる。
【０００７】
前記p35とp40サブユニット遺伝子に対応するアミノ酸配列はそれぞれSEQ NO：1とSEQ NO：2で、相応なヌクレオチド配列はそれぞれSEQ NO：3とSEQ NO：4である。
【０００８】
前記の人腫瘍は、人の各種の実体腫瘍である。
【０００９】
前記の標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12の腫瘍治療薬物製作での応用である。
【００１０】
標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスの担体Ad-TD-hIL12の構築方法は、下記手順を含む。
【００１１】
（1）健康人の末梢血を取り、リンパ球を分離し、植物性凝集素の刺激の下で培養し、RNAを抽出し、cDNAになるよう逆転写反応を行い、制限酵血切断部位を含むプライマーで人インターロイキン12のp35とp40サブユニット遺伝子をクローンし、p35とp40サブユニット遺伝子区切りをhIL12完全な遺伝子区切りに連続して、クローン担体T担体に接続し、pORF-hIL12に命名する。これからNco IとNhe Iダブル制限酵素切断pORF-hIL-12プラスミドを使用してから、T4 DNAポリメラーゼで切断されたhIL12遺伝子の区切りを平らにして、使用に備える。
【００１２】
（2）平ら端末切断酵素で単一にアデノウイルス担体pAd-TDのE3gp-19K欠陥区を切断し、前記のhIL12遺伝子をゲノム一致性順序によってウイルス担体pAd-TDの制限酵素切断部位に挿入し、PCR方法で插入方向の正しい再構成担体を鑑定・選別する。
【００１３】
（3）前記の再構成担体を293細胞にトランスフェクションを行い、前記のウイルス担体Ad-TD-hIL12を構築する。
【００１４】
本発明の腫瘍標的性アデノウイルスAd-TD-hIL12は、中国典型培養物培養センターで保存されていて、保存コード：CCTCC NO：V201031、保存日付：2010年12月1日となっている。
【発明の効果】
【００１５】
（1）本発明の腫瘍標的性アデノウイルスAd-TD-hIL12は、ウイルスの内在遺伝子のプロモーター遺伝子を利用して、E1A-CR2、E1B19KとE3gp-19Kの三つのアデノウイルスの内在遺伝子を削除し、E3区の一部分の遺伝子を保留し、E3gp-19K遺伝子のプロモーター遺伝子を利用して、人のIL12遺伝子を治療遺伝子とすることを表現する。当該ウイルスは、特定標的人腫瘍細胞で良く見えるRb遺伝子と抗アポトーシス遺伝子の異常によって、選択的に腫瘍細胞で複製することができ、正常細胞で複製するのではなくて、特異性と安全性を増加し、複製するウイルスは腫瘍細胞を溶解できると同時に、腫瘍組織にハイレベルの多種の抗腫瘍作用があるIL12を生成できる。
【００１６】
（2）本発明のAd-TD- hIL12が表現するhIL12は、抗腫瘍血管形成の作用を有し、一層重要なこととしては、人体免疫力を調節でき、それに、腫瘍細胞で複製するAd-TD-hIL12と協同作用を生成し、人体に抗腫瘍特異免疫力を持たせ、これによって、遠端転移した腫瘍細胞を殺し、それに腫瘍の再発を防止できる。細胞学実験と動物試験によって、当該ウイルスは、選択的に腫瘍細胞を殺し、一部分の免疫欠陥と免疫無し欠陥マウス類の移植腫瘍を除去でき、良い治療効果と安全性を有する。
【００１７】
（3）本発明の腫瘍標的性アデノウイルスAd-TD-hIL12は、腫瘍標的性と抗腫瘍効果を有し、一種の標的性遺伝子工学薬物としても良く、治療できる腫瘍は、裸眼で見える又は顕微鏡で見える実体腫瘍、転移腫瘍と拡散腫瘍を含み、それに晩期のびまん性拡散腫瘍も治療される。
【００１８】
（4）本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-hIL12は、腫瘍内注射だけでなく、腹腔、胸腔内注射にも運用でき、それに、明らかな副作用を引き起こさない。
【００１９】
（5）本発明の標的性人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルスAd-TD-IL12は、安全で且つ高効率を持ち、一種の腫瘍標的性遺伝子工学薬物として、臨床応用への推進に基礎を造り、腫瘍患者に一種の有効的な治療方法を提供し、良い社会と経済効果・利益を出す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の腫瘍標的性アデノウイルスAd-TD-hIL12、Ad-TD-gene、dl1520と対照ウイルスAd-TD-RFPの構造図。
【図２】本発明のウイルスAd-TD-hIL12と対照ウイルスの大負荷腫瘍に対する治療効果。
【図３】異なる投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520で腫瘍移植ハムスターを処理する際の腫瘍成長曲線。
【図４】異なる投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520で腫瘍移植ハムスターを処理する際の腫瘍進展停止率。
【図５】異なる投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520で腫瘍移植ハムスターを処理する際の腫瘍清掃率。
【図６】低投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520で瘤腫移植ハムスターを処理する際の腫瘍成長曲線。
【図７】低投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520で瘤腫移植ハムスターを処理する際の腫瘍進展停止率。
【図８】低投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520で瘤腫移植ハムスターを処理する際の腫瘍清掃率。
【図９】Ad-TD-m/hIL12で、免疫力を有する腫瘍移植動物を治療した後、発生した腫瘍特異免疫能力。
【図１０】異なる投薬量Ad-TD-hIL12の膵臓癌腹腔拡散に対する治療作用(その中で、1：PBS、2： Ad-TD-hIL12 1×109 pt/回、3：Ad-TD-hIL12 2.5×109 pt/回、4：Ad-TD-hIL12 5×109 pt/回となる)。
【００２１】
その中で、図3、図4、図6と図7での記号表示は下記の通りである。
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【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下は、実例を通じて本発明を更に説明し、本発明の保護範囲を限定することでなく、本分野の技術者は、説明書に基づいて、これらの実施案を修正でき、本発明の精神と範囲から外れない限り、類似する又は同じ結果を得られ、皆本発明の保護範囲に属する。
【００２３】
実例1：腫瘍標的性アデノウイルス担体Ad-TD- hIL12の相応なマウスIL12遺伝子ウイルス担体Ad-TD-mIL12の構築方法について、図1を参照して下さい。手順は下記の通りである。
【００２４】
（1）まずPCR方法で改造する配列E1A-CR2遺伝子の両側のDNA区切りを取得し、上流配列は、左アームと称され、下流は右アームと称され、遺伝子工学の方法で左アームと右アームをウイルス遺伝子一致性配列によって、プラスミド担体pSuperShuttleに接続し、E1A-CR2シャトル担体を構築する。
【００２５】
アデノウイルス担体Ad5とE1A-CR2シャトル担体を1:2〜10の比例でBJ5183細菌に転換し、相同再構成を行う。これからPCR方法陽性再構成細菌を鑑定し、再構成プラスミドを抽出し、293細胞にトランスフェクションして、E1A-CR2欠陥のAd5R-CR2ウイルス担体を得る。
【００２６】
（2）E1A-CR2シャトル担体の構築と同じ方法でE1B19Kシャトル担体を構築してから、Ad5R-CR2ウイルス担体と相同再構成を行い、CR2とE1B19K両方欠陥のAd5R-CR2-E1B19Kウイルス担体を得る。
【００２７】
（3）PCR方法でE3gp-19K遺伝子蛋白コード区両側配列を拡張し、左アームの範囲が−1087bp〜0bpで、その中でE3gp-19K遺伝子のプロモーター遺伝子を含み、右アームがE3gp-19K遺伝子の終止パスワードから後1146bpとなり、両アームは制限酵素切断部位で接続され、シャトル担体を構築していから、Ad5ΔR-CR2-E1B19Kウイルス担体と相同再構成を行い、E1A-CR2、E1B19KとE3gp-19Kの三つのコード遺伝子が皆欠陥となるアデノウイルス担体pAd-TDを取得し、この上、pAd-TDを293細胞にトランスフェクションして、腫瘍標的性アデノウイルス担体Ad-TD-gene（Ad-TD）を生産する。
【００２８】
（4）健康マウスの末梢血を取り、リンパ球を分離し、植物性凝集素（PHA）の刺激の下で培養し、RNAを抽出し、cDNAになるよう逆転写反応を行い、制限酵素切断部位を用むプライマーでマウスのインターロイキン12のp35とp40サブユニット遺伝子をPCRクローンし、p35とp40サブユニット遺伝子区切りをhIL-12完全な遺伝子区切りにして、クローン担体T担体に接続し、pORF-mIL-12に命名する。これからNco IとNhe Iダブル制限酵素切断pORF-hIL-12プラスミドを使用してから、T4 DNAポリメラーゼで切断されたmIL12遺伝子の区切りを平らにして、使用に備える。
【００２９】
（5）平ら端末切断酵素で単一にアデノウイルス担体pAd-TDのE3gp-19K欠陥区を切断し、これから、前記mIL12遺伝子をゲノム一致性順致によってウイルス担体の制限酵素切断部位に挿入し、PCR方法で挿入方向の正しい再構成担体を鑑定・選別する。
【００３０】
（6）挿入方向の正しい再構成担体を293細胞にトランスフェクションし、ウイルス担体Ad-TD-mIL12を生産する。
【００３１】
実例2：腫瘍標的性アデノウイルスAd-TD- hIL12の抗腫瘍応用である。
【００３２】
5-6週間年齢のハムスターの背部右上側に1×106的HPD1-nr細胞（金黄地鼠膵臓腺癌細胞）を接種し、腫瘍体積が160mm3である時、それぞれPBS、dl1520、Ad-TD-RFP、Ad-TD-mIL12とAd-TD-hIL12で腫瘍内注射5×109pt/回を行い、三回に分けて治療した後、治療効果を観察する。
【００３３】
結果として、図2は、単独にAd-TD-hIL12を使用すると、大負荷腫瘍動物に対する全快率が85.71%で、dl1520組の動物の全快率が0%であることを示す。
【００３４】
実例3：異なる投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520の体内抗腫瘍効果の比較である。
【００３５】
5-6週間年齢のハムスターの背部右上側で1×106のHPD1-nr細胞を接種し、腫瘍が大きな接種腫瘍（160mm3）になる時、腫瘍内にそれぞれPBS、dl1520、Ad-TD-RFP、Ad-TD-mIL12とAd-TD-hIL12を注射し、5×109pt/回、毎日一回、合計五回(発売したアデノウイルス薬物H101の臨床応用案と一致するが、投薬量が20倍低いである)となり、これから、腫瘍の大きさと腫瘍の清掃率を観察する。
【００３６】
結果は、図3、図4と図5を参照して下さい。図3は、Ad-TD-hIL12がdl1520と対照ウイルスAd-TD-RFPと比べると、より強い抗腫瘍効果を示すことを表す。図4は、Ad-TD-hIL12治療組動物の腫瘍成長プロセスが一番遅いのを説明する。図5は、Ad-TD-hIL12治療組動物の腫瘍清掃率が一番高く、100%に達し、但し、dl1520組、Ad-TD-RFP組の動物の腫瘍清掃率が、皆33.33%であることを説明する。
【００３７】
実例4：低投薬量Ad-TD-hIL12、対照ウイルスとdl1520の体内抗腫瘍効果の比較である。
【００３８】
ハムスターの腎臓癌モデルを使用し、5-6週間年齢のハムスターの背部右上側で5×106のHAK細胞を接種し、腫瘍が大きな体積（230 mm3）に成長する時、より低い投薬量の異なるウイルス（1×10E9pt/回、五回治療）で腫瘍内にそれぞれPBS、dl1520とAd-TD-hIL12を注射してから、腫瘍の大きさと腫瘍の清掃率を観察した結果は図6、図7と図8である。図6は、低投薬量dl1520、対照ウイルスAd-TD-RFPとPBSが皆明らかな抗腫瘍能力を持っていないが、Ad-TD-hIL12が強い抗腫瘍能力を示すことを説明する。図7は、Ad-TD-hIL12治療組で動物の腫瘍成長プロセスが一番遅いのを説明する。図8は、Ad-TD-hIL12治療組動物の腫瘍清掃率が一番高く、71.43%に達し、但し、dl1520組とAd-TD-RFP組動物の腫瘍清掃率が皆0であることを説明する。
【００３９】
実例5：Ad-TD-m/hIL12で、免疫力を有する腫瘍移植動物を治療した後、発生した腫瘍特異免疫能力である。
【００４０】
実例3でm/hIL12治療組で、腫瘍が失ったハムスターは、腫瘍失ってから60日後、もともと腫瘍接種の反対側皮下でその他の腫瘍腎臓癌細胞を（ハムスター癌細胞HAK、5×106個）又は細胞数が元の2倍であるHPD1-nr細胞（2×106）を接種し、7日後、皆腫瘍組織は成長した。第13日、7個の再度HPD1-nr接種動物の中で、5個の腫瘍は失った。第103日で、依然として7個の中で5個の腫瘍は失った。発生した腫瘍の特異免疫能力比率が71.43%であり、但し、HAK接種の5個のハムスターは、ずっと皆接種腫瘍があり、腫瘍特異免疫能力比率が0である（図9参照）。
【００４１】
実例6：異なる投薬量Ad-TD-hIL12の膵臓癌腹腔拡散に対する治療作用である。
【００４２】
5-6週間年齢のハムスターに腹腔に5×106 HPD1-nr細胞を注射し、7日後、治療を始め、毎日腹腔に異なる製剤を一回注射し、合わせて5日持続し、これから動物の生存状態と生存率を観察する。製剤注射は、PBS組の下で、それぞれAd-TD-hIL12 1×109 pt/回治療、Ad-TD-hIL12  2.5×109 pt/回治療とAd-TD-hIL12 5×109 pt/回治療である。PBS組とAd-TD-hIL12低投薬量（1×109 pt/回と2.5×109 pt/回）の下で、動物は、腫瘍注射37日後全部悪質病、大量腹水と腹腔多発癌転移病巣に罹るが、Ad-TD-hIL12 5×109 pt/回治療組の動物は、生存が良好で、肝臓機能衰弱のような如何なる副作用がない。図10を参照して下さい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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