(57)【要約】  癌、例えば、肺癌に対する診断アッセイが記載されている。アッセイはまた、処置中の患者を追跡するため、および処置後の疾患再発の評価のために使用することができる。アッセイは、トランスジェニックマウスモデルにおいて同定される腫瘍形成に対するバイオマーカーを利用する。アッセイは、患者のバイオマーカー発現に基づく患者に対する治療的指標を同定するために使用される。バイオマーカーおよびそのフラグメントはまた、癌、例えば、肺または大腸癌を処置するために有用である。
2014512515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から生物学的サンプルを提供すること；
１つ以上の高分子を含む一団を提供すること、ここで、それぞれの高分子は、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカーであるか、またはバイオマーカーに特異的に結合する；
該バイオマーカーの発現のレベルを決定するために、哺乳動物の生物学的サンプルを一団と接触させること；
該哺乳動物サンプルにおいて発現される該バイオマーカーのレベルを、参照サンプルにおける該バイオマーカーのレベルと比較すること；
を含む、哺乳動物において肺癌を診断するための方法であって、該参照サンプルと比較して、該哺乳動物の生物学的サンプルにおける該バイオマーカーの発現の定量的に異なるレベルの存在が、癌を示す、方法。
【請求項２】
該参照サンプルが、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；および、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つ以上の高分子が、抗体、核酸、タンパク質およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該バイオマーカーが、タンパク質、ｍＲＮＡおよび抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該バイオマーカーが、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２からなる群から選択されるタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該バイオマーカーが、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２からなる群から選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該バイオマーカーが、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する自己抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
該バイオマーカーの少なくとも１つがＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該一団が、１つ以上の抗体またはそれらのフラグメントを含み、該抗体が、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカータンパク質に特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該一団が、１つ以上のｃＤＮＡ分子またはそれらのフラグメントを含み、該ｃＤＮＡ分子が、バイオマーカーｍＲＮＡまたはその相補的配列に特異的に結合し、該バイオマーカーｍＲＮＡまたはその相補的配列が、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該方法が、該哺乳動物の生物学的サンプルおよび該参照サンプルからｍＲＮＡを単離すること、および該ｍＲＮＡを定量的に増幅すること、およびｃＤＮＡを生産することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該一団が、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカーである１つ以上のタンパク質またはそれらのフラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該哺乳動物の生物学的サンプルが液体サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該液体サンプルが、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該哺乳動物の生物学的サンプルおよび該参照サンプルが検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
候補患者から生物学的サンプルを提供すること；
患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現の存在を検出すること；
患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルを、参照サンプルにおける該ＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較すること；および
候補患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカー発現が、該参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルよりも高いとき、ＨＤＡＣインヒビター化学療法に対する応答候補として候補患者を同定すること
の工程を含む、インヒビター化学療法に対して応答する候補患者を同定するための方法。
【請求項１７】
該参照サンプルが、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカー；既知の非応答患者由来の生物学的サンプル；および、既知の非応答患者由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌患者が肺癌を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該ＴＬＥバイオマーカーの発現が、ＴＬＥタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該患者の生物学的サンプルが液体サンプルまたは組織サンプルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
該液体サンプルが、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該組織サンプルが肺組織である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
処置プロトコールを行う前に、患者から生物学的サンプルを提供すること；
該処置前の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現の存在を検出すること、
該処置前の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルを、該処置中または該処置後の、該患者由来の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルと、もしくは参照サンプルにおける該ＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較すること
の工程を含む、癌患者処置プロトコールの有効性をモニタリングするための方法であって、該処置前の患者サンプルと比較して該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルの変化、または、該参照サンプルにおける該ＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較して該処置後の患者サンプルのＴＬＥ発現のレベルの違いが、該処置の有効性を示す、方法。
【請求項２４】
該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥの減少したレベルが有効な処置を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該参照サンプルが、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；および、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該処置が、治療有効量のＨＤＡＣインヒビターを投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
癌患者が肺癌を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該ＴＬＥバイオマーカーの発現が、ＴＬＥタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
該生物学的サンプルが液体サンプルまたは組織サンプルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
該液体サンプルが、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該組織サンプルが肺組織である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
患者から処置後の生物学的サンプルを提供すること；
該患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現の存在を検出すること；
該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルを、参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルと比較すること
の工程を含む、癌患者処置プロトコールの有効性をモニタリングするための方法であって、該参照サンプルにおける該ＴＬＥ発現のレベルと比較して該処置後の患者サンプルのＴＬＥ発現のレベルの違いが、該処置の有効性を示す、方法
【請求項３３】
該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥの減少したレベルが、有効な処置を示す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該参照サンプルが、治療に対して応答しない処置後の癌患者から得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
癌患者が肺癌を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
該ＴＬＥバイオマーカーの発現が、ＴＬＥタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
該生物学的サンプルが液体サンプルまたは組織サンプルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
該液体サンプルが、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該組織サンプルが肺組織である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
患者から生物学的サンプルを提供すること；
参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較して、該患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのより高いレベルの存在を検出すること；および
治療有効量のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のフラグメントの投与で該癌を処置するための候補として、癌患者を同定すること
の工程を含む、癌患者処置候補を同定するための方法。
【請求項４１】
該参照サンプルが、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカー；既知の非応答患者由来の生物学的サンプル；および、既知の非応答患者由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該癌患者が肺癌を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
該フラグメントがＱドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
患者から生物学的サンプルを提供すること；
該患者の生物学的サンプルにおける不活性化ＡＰＣまたはベータ−カテニン突然変異の存在を検出すること；および、
該癌患者への治療有効量のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のフラグメントの投与で該癌を処置するための候補として、該不活性化ＡＰＣまたはベータ−カテニン突然変異を有する癌患者を同定すること
の工程を含む、癌患者処置候補を同定するための方法。
【請求項４５】
癌患者が大腸癌を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該フラグメントが少なくともＷＤ４０ドメインを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
治療有効量のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のフラグメントを該哺乳動物に投与すること
の工程を含む、哺乳動物における癌を処置するための方法。
【請求項４８】
該癌が肺癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該フラグメントがＱドメインを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該癌が大腸癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
該フラグメントが少なくともＷＤ４０ドメインを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
治療有効量のベータ−カテニンを癌に投与すること
の工程を含む、哺乳動物における癌を処置するための方法。
【請求項５３】
該癌が肺癌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ゲノムが、Ａｐｃ遺伝子が少なくともコドン１６３８で切断されているＡＰＣタンパク質をコードする遺伝子のヘテロ接合のヌル対立遺伝子、およびＧｒｏｕｃｈｏ関連遺伝子の半接合の導入遺伝子の対立遺伝子を含み、腫瘍の形成を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項５５】
ゲノムが、Ａｐｃ遺伝子が少なくともコドン１６３８で切断されているＡＰＣタンパク質をコードする遺伝子のヘテロ接合のヌル対立遺伝子、およびＧｒｏｕｃｈｏ関連遺伝子の半接合の導入遺伝子の対立遺伝子を含み、腫瘍の形成を示すトランスジェニックマウスを作製すること；
作製されたトランスジェニックマウスを候補化合物で処置すること；
腫瘍細胞の数、腫瘍の体積または腫瘍細胞生存能力を測定することにより、候補化合物で処置されたトランスジェニックマウスにおける腫瘍のレベルを決定すること；および
腫瘍細胞の数または腫瘍の体積が、候補化合物での処置前のトランスジェニックマウスにおける腫瘍細胞の数または腫瘍の体積と比較して減少されているとき、または、腫瘍細胞のアポトーシスが、候補化合物での処置後に誘導されているとき、抗腫瘍活性を有する化合物として候補化合物を同定すること
の工程を含む、抗腫瘍活性に対して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項５６】
非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルである１つ以上のバイオマーカーを含む、診断キット。
【請求項５７】
該１つ以上のバイオマーカーが、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２からなる群から選択される、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
少なくとも１つのバイオマーカーがＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
該１つ以上のバイオマーカーが、固体支持体に結合されているバイオマーカーの一団として提供される、請求項５６に記載のキット。
【請求項６０】
Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウス由来の生物学的サンプルおよびＧｒｇ１を発現しないマウス由来の生物学的サンプルを提供すること；
該Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスおよび該Ｇｒｇ１を発現しないマウスにおけるバイオマーカーの発現を測定すること；および、
該サンプルにおいて異なるレベルで発現されるバイオマーカーを同定すること
を含む、非小細胞性肺癌に対するマーカーを同定するための方法。
【請求項６１】
該バイオマーカーが、タンパク質およびｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
該生物学的サンプルが液体サンプルまたは組織サンプルである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
該液体サンプルが、血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
該組織サンプルが肺組織である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
測定工程前に、該生物学的サンプルを結合パートナーと接触させることをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
該結合パートナーが、抗体、核酸、リガンド、アプタマーおよびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
該同定する工程が、結合パートナーへの結合を検出することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
該生物学的サンプルが検出可能に標識されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
該検出する工程が、該マーカー−結合パートナー複合体を第２の結合パートナーと接触させることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
該第２の結合パートナーが検出可能に標識されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
該方法が、液体クロマトグラフィー分析およびタンデム質量分析を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
バイオマーカー発現のレベルが、Ｇｒｇ１を発現しないマウスにおけるバイオマーカー発現のレベルと比較したとき、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて増加されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項７３】
バイオマーカー発現のレベルが、Ｇｒｇ１を発現しないマウスにおけるバイオマーカー発現のレベルと比較したとき、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて減少されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項７４】
該方法が、ｍＲＮＡレベルを比較する工程前に、該サンプルをＤＮＡと接触させることをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
該方法が、該サンプルからｍＲＮＡを単離すること、および該ｍＲＮＡを定量的に増幅すること、およびｃＤＮＡを生産することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、出典明示によりその全体が本明細書に包含させる２０１１年２月２３日に出願された米国６１／４４５，９７２の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、生物学的マーカーを使用する癌の診断および癌の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
肺癌は、数十年にわたって最も一般的な癌であり、世界中で最も多くの癌による死を引き起こしている。２００８年は、世界中でおよそ１６１万人の新規症例（全１２．７％）があり、１３８万人の死（全１８．２％）が肺癌により引き起こされた。これは、乳房、前立腺および結腸直腸癌を合わせた死亡率を超える。肺癌は、喫煙者、喫煙経験者および非喫煙者に影響を及ぼし、後者のグループは症例の約１５％を構成する。この疾患の腫瘍進行性および侵襲性生物学的挙動の根拠は、依然としてほとんど分かっていない。まとめると、問題は、利用できる動物モデルの不足であり、そのことが疾患の生物学的および分子的起源ならびに最適な処置戦略を決定することを困難にしている。
【０００４】
他の癌と同様に、肺癌は早期に検出されると、生存率は非常に高い。該疾患が早期の局所段階に検出され、外科的に除去することができる場合、５年生存率が８５％に達することができる。しかしながら、一旦癌が他の臓器、とりわけ遠位部位に広がると、患者の５年生存率がわずか２％となる。残念ながら、肺癌は進行した段階に達するまで、通常、無症候性である。したがって、肺癌のほんの５％が早期の局所段階に見出される。したがって、最も早期の最も治療可能な段階における肺癌の検出を導く、無症候性個体のスクリーニングに役立つツールに対して切迫した必要性が存在する。
【０００５】
早期肺癌を検出するための可能性のあるスクリーニングツールは、胸部Ｘ線およびコンピュータートモグラフィー（ＣＴ）スキャンである。しかしながら、高コストおよび高い偽陽性率が、これらの放射線ツールを日常的な広範な使用に実用的でないものとする。例えば、米国の国立癌研究所の最近の試験は、胸部Ｘ線での肺癌に対するスクリーニングは、早期肺癌を検出することができるが、多数の偽陽性試験結果を生じ、不必要な追跡調査を引き起こすと結論づけた、Okenら Journal of the National Cancer Institute, 97(24)1832-1839, 2005。偽陽性の同様の問題は、ＣＴスキャンを含む継続中の試験で見られる。ＣＴスクリーニングの特異性は、不確定な放射線所見の数に基づいて約６５％で計算される。普及しているＣＴスキャンにおいて見られる多数の不確定な肺結節は、侵襲的手段によるさらなる研究を必要とし、ＣＴスキャンにより同定される肺結節の多くは、良性であり、このことは、１生命あたりに発生する医療費の大部分の削減について大きな関心を引き起こす。
【０００６】
ＰＥＴスキャンは別の診断選択肢であるが、ＰＥＴスキャンは、スクリーニングプログラムにおける使用のために、コスト的に、および一般的に受け入れられない。
【０００７】
現在、年齢および喫煙歴が、大規模スクリーニング研究による選択基準として使用されているたった２つの危険因子である。放射線画像で明らかな癌（＞０．５ｃｍ）ならびに潜伏および前悪性癌（放射線検出の限界未満）を検出することができる血液試験は、放射線学的スクリーニングを最も正当化する個体を同定し、事実上、さらなる精密検査を必要とする良性肺所見の数を減少させる。
【０００８】
したがって、放射線技術の前記制限を克服する改善された肺癌スクリーニングおよびより良い検出ツールに対する緊急の必要性が存在することが明らかである。
【０００９】
肺癌に対する診断スクリーンに加えて、検出ツールが最適な治療処置の指標を提供することができると、大きな価値がある。癌、例えば、乳癌および大腸癌において、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）において突然変異を有する患者に対する標的治療は、臨床試験において成功を示している。処置を患者に特異的に調整することができるため、標的または「オーダーメイド医療」のこのアプローチは、患者応答を改善し、また、医療費を抑えることができる。
【００１０】
生物学的マーカーを使用する癌の診断のための２、３の方法および治療的指標のための生物学的マーカーの使用が、記載されている。しかしながら、これらは、早期の最も治療可能な段階における肺癌の検出を導く無症候性個体のスクリーニングに役立つコスト的に有効な、低侵襲性の、高度予測分析手段のために有用でない。癌のマーカーの同定と関連する技術的問題は、前向き研究においてヒト血清サンプルを使用することにより、先行技術において満足に取り組まれていない。前向き研究において、肺癌を発症する高い危険性のある患者は、ＣＴスキャンによりスクリーニングされ、サンプルが採取され、試験のために保存され、該患者を数年間追跡し、どの患者が肺癌を発症するかを決定した。どの患者が肺癌を発症するか分かったとき、これらの患者由来の保存されたサンプルを、ＤＮＡまたはタンパク質バイオマーカーにおける顕著な違いについて試験することができる。癌を有すると疑われる患者において癌を検出するための、または危険性のある患者をスクリーニングするためのこれらの先行技術研究の結果を使用する主な問題は、このアプローチは中期から後期の肺癌に対するバイオマーカーを同定するが、一方、低侵襲性でありコスト的に有効な方法を使用して肺癌の早期検出を提供し、治療的に標的とされ、かつ治療に対する患者の応答の予後指標および指標として使用されるバイオマーカーが必要とされることである。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本明細書に記載されている本発明の開発に役立つために克服された１つの技術的問題は、肺癌の存在と関連のない遺伝子およびタンパク質発現における可変性のために、肺癌に対するバイオマーカーはヒト患者において同定することが難しいことである。したがって、適当な肺癌動物モデルは、再現性のある予測可能な疾患の発症および適当なネガティブコントロールを提供することができる。
【００１２】
本発明の開発に役立つために克服された別の技術的問題は、癌を有する患者と癌を有さない患者とで定量的に異なっている特定のバイオマーカーを同定することであった。このようなバイオマーカーは、試験結果の統計分析を必要とするよりも、医師へのイエスかノーの答えを提供することにおける臨床状況において非常に有用であり、単純な臨床診断試験に適していない。さらに、本発明において、タンパク質の（選択されたバイオマーカーに依存して）高い、または低い患者の発現レベルを示すアッセイ結果が、さらなるスクリーニング、例えば、ＣＴスキャンの必要性に関してイエスかノーの決定を提供することができるように、それぞれのバイオマーカーに対して閾値発現レベルを同定することができる。これは、患者が癌を有する可能性を計算するために、多数のタンパク質／ｍＲＮＡの発現パターンの複合統計分析を使用する他の方法を超える利点がある。
【００１３】
本発明の開発に役立つために克服された別の技術的問題は、動物モデルにおいて試験することができる癌処置において標的化することができる既知の機能を有するバイオマーカーを同定することであった。さらなる技術的問題は、１つの組織における癌遺伝子が必ず、異なる組織における癌遺伝子であるか否かを決定することであった。
【００１４】
出願人は、これらの技術的問題が、肺癌マウスモデルを使用して癌バイオマーカーを同定すること、肺癌を有する可能性のある患者を同定するためにバイオマーカーを使用すること、および患者が応答する可能性のある処置を予測するために治療的指標としてバイオマーカーを使用することを含む方法を手段として解決されることを見出した。本明細書に記載されている本発明のバイオマーカーまたはバイオマーカーの誘導体は、癌に対する処置として使用され得る。また、バイオマーカーが肺組織以外の組織臓器の腫瘍に対する抗癌剤として使用されるとき、重要な、予期し得ない結果がなし遂げられ得ることを見出した。
【００１５】
１つの局面において、本発明は、癌のバイオマーカーおよび癌を処置するために有用な治療を同定するための、肺癌に対するトランスジェニックマウスモデル（Ｇｒｇ１マウス）の使用に関する。本発明の局面の１つの態様において、Ｇｒｇ１マウスは、患者血液サンプルにおいて定量的に測定することができるバイオマーカーを同定する、ならびに、肺癌患者および正常コントロールサンプル間の違いを検出するために使用され得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、癌の存在または非存在が決定される患者の組織または体液サンプルを使用する肺癌の早期検出のためのアッセイ、方法およびキットに関する。１つの態様において、本発明は、一団のバイオマーカーとして存在することができる１つ以上のバイオマーカーの存在を評価することによる肺癌の検出に関する。１つの態様において、本発明は、とりわけ、癌に対する危険性について患者集団、例えば、患者の放射線イメージングおよび他のスクリーニングモダリティと共に使用されるとき、肺癌スクリーニング戦略において使用され得る。本発明は、肺癌の存在を排除するように、これらの患者のさらなる放射線分析のために癌を有する可能性が非常に高い集団を高めるために使用することができる。要するに、この局面において、本発明は、患者における肺癌の存在を検出する方法に関する。
【００１７】
１つの態様において、患者由来の血液サンプルは、本発明における肺癌と関連するタンパク質バイオマーカーの１つまたは一団の存在について分析される。特定の態様において、本発明は、許容される試験およびプロトコールを使用して肺癌と診断されていない無症候性患者または高危険性グループの患者、すなわち、例えば、これらの患者は放射線画像で検出可能な肺癌を欠いている、に対して以下に記載されるバイオマーカーを使用するスクリーニング試験に関する。本明細書に記載されている本発明の方法は、癌に対する高い特異性で比較的安価で低侵襲性であり、現在の肺癌スクリーニング方法、例えば、胸部Ｘ線またはＬｏｗ  Ｄｏｓｅ  ＣＴの高いコストおよび低い特異性の代替品を提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、１つ以上の薬物処置に対する患者応答を予測するために以下に記載される１つ以上のバイオマーカーの状態を使用することにより、治療的介入を決定することに関する。本発明の別の態様において、バイオマーカー、またはバイオマーカーのアナログ、ホモログもしくはフラグメントは、癌を処置するために使用され得る。
【００１９】
したがって、本発明のこの局面において、生物学的サンプルにおける１つ以上の肺腫瘍タンパク質バイオマーカーの同定のための方法が提供される。このような生物学的サンプルは、体液または組織、例えば、限定はしないが、血液、血清または血漿または細胞（例えば、生検から得られるもの）を含む。方法は、肺癌を有さないと同定される個体の肺腫瘍組織間で、例えば、ウェスタンブロット、プロテオーム分析、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、以下に記載されており、Ｇｒｇ１マウスモデルにおいて同定されている免疫測定法を使用して、同定された肺腫瘍タンパク質バイオマーカー発現を測定すること；および、肺癌患者と疑われるもの由来の生物学的サンプル、例えば、ヒト血液サンプルにおける同じ肺腫瘍タンパク質バイオマーカーの測定、それにより肺癌を有さない患者（正常またはネガティブコントロール）と比較して肺癌患者において測定できる程度に異なるタンパク質バイオマーカーを同定することの工程を含む。
【００２０】
本発明の別の局面において、本発明は、癌、例えば、限定はしないが肺癌の検出のための１つ以上のバイオマーカーを含むキットに関する。本発明の１つの態様において、１つ以上のバイオマーカーは、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、例えば、限定はしないがＴＬＥ１に関する。キットは、患者の体液、例えば、血液、血清または血漿における、限定はしないがＧｒｏｕｃｈ関連タンパク質を含むバイオマーカーの発現レベルを測定するための固体支持体に固定された抗体を含むことができる。固体支持体、例えば、抗体アレイは、患者サンプルにおける癌の存在の可能性を決定することにおける使用のための、癌を示さないサンプル由来の参照、コントロールまたはベースライン量の同じ１つ以上のバイオマーカーをさらに含むことができる。
【００２１】
種々の態様において、バイオマーカーは、１つ以上のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２またはＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２を含む。患者において癌の可能性を決定するために、本発明の方法の別の態様において、方法は、１つ以上のＭｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２またはＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２および／またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、例えば、限定はしないがＴＬＥの量の定量測定を測定することを含む。別の局面において、本発明は、癌患者における処置の方法としてヒストン−デアセチラーゼインヒビター（ＨＤＡＣインヒビター）の使用を示すための方法に関する。この方法の１つの態様において、血液サンプルは癌患者から得られ、癌患者におけるＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質の発現が測定され、癌を有さない患者からの該タンパク質の発現の参照値と比較される。このデータから、ヒストン−デアセチラーゼインヒビターで患者を処置する有用性が決定される。さらに別の局面において、本発明は、１つ以上の候補化学療法薬をＧｒｇ１肺癌マウスモデルに適用し、処置および未処置Ｇｒｇ１マウスにおける肺腫瘍のサイズ、数および組織学的外観を定量的に比較することにより、癌処置に対する薬物を評価するための方法に関する。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、癌を処置するための方法に関する。１つの態様において、方法は、タンパク質バイオマーカーの誘導体、例えば、アナログ、ホモログまたはフラグメントを使用する。例えば、１つの態様において、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のＱ−ドメインは、肺癌を処置するために使用することができる。別の態様において、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質またはそのアナログ、ホモログもしくはフラグメントは、大腸癌を処置するために使用することができる。
【００２３】
本発明の別の局面において、本発明は、哺乳動物から生物学的サンプルを提供すること；１つ以上の高分子を含む一団を提供すること、ここで、それぞれの高分子は、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカーであるか、またはバイオマーカーに特異的に結合する；バイオマーカーの発現のレベルを決定するために、哺乳動物の生物学的サンプルを一団と接触させること；哺乳動物サンプルにおいて発現されるバイオマーカーのレベルを、参照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較することにより哺乳動物において肺癌を診断するための方法であって；参照サンプルと比較して、哺乳動物の生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの発現の定量的に異なるレベルの存在が、癌を示す、方法に関する。
【００２４】
種々の態様において、参照サンプルは、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；または、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーである。
【００２５】
種々の態様において、高分子は、抗体、核酸、タンパク質またはそれらのフラグメントである。
【００２６】
種々の態様において、バイオマーカーは、タンパク質、ｍＲＮＡまたは抗体である。
【００２７】
種々の態様において、バイオマーカーは、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２であるタンパク質；または、１つのこのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡ；または、１つのこのようなタンパク質に特異的に結合する自己抗体である。好ましい態様において、少なくとも１つのバイオマーカーはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質を含む。バイオマーカータンパク質は、通常、非分泌タンパク質であるタンパク質として特徴付けられる。
【００２８】
種々の態様において、一団は、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカータンパク質に特異的に結合する１つ以上の抗体を含むか；または、一団は、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカーｍＲＮＡまたはその相補的配列に特異的に結合する１つ以上のｃＤＮＡ分子を含むか；または、一団は、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルで測定可能であるバイオマーカーである１つ以上のタンパク質を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、方法は、哺乳動物の生物学的サンプルおよび参照サンプルからｍＲＮＡを単離すること、およびｍＲＮＡを定量的に増幅すること、およびｃＤＮＡを生産することをさらに含む。
【００３０】
種々の態様において、哺乳動物の生物学的サンプルは液体サンプルである。液体サンプルは、血液、血漿または血清であり得る。種々の他の態様において、哺乳動物の生物学的サンプルおよび参照サンプルは、検出可能に標識されている。
【００３１】
本発明の別の局面において、本発明は、候補患者から生物学的サンプルを提供すること；患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現の存在を検出すること；患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルを、参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較すること；および、候補患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカー発現が、参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルよりも高いとき、ＨＤＡＣインヒビター化学療法に対する応答候補として候補患者を同定することによりインヒビター化学療法に対して応答する候補患者を同定するための方法に関する。１つの態様において、癌患者は肺癌を有する。種々の態様において、ＴＬＥバイオマーカーの発現は、ＴＬＥタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される。ＴＬＥバイオマーカータンパク質は、通常、非分泌タンパク質であるタンパク質として特徴付けられる。
【００３２】
種々の態様において、参照サンプルは、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカー；既知の非応答患者由来の生物学的サンプル；または、既知の非応答患者由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーである。
【００３３】
種々の態様において、患者の生物学的サンプルは液体サンプルまたは組織サンプルである。液体サンプルは、血液、血漿または血清であり得る。組織サンプルは肺組織であり得る。
【００３４】
本発明の別の局面において、本発明は、処置プロトコール前に、患者から生物学的サンプルを提供すること；処置前の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現の存在を検出すること；処置中に、または処置後に、処置前の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルを、患者由来の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルと、もしくは参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較することにより癌患者処置プロトコールの有効性をモニタリングするための方法であって、処置後の患者サンプルと比較して処置前の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルの変化、または、参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較して処置後の患者サンプルのＴＬＥ発現のレベルの違いは、処置の有効性を示す、方法に関する。１つの態様において、該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥの減少したレベルは、有効な処置を示す。種々の態様において、ＴＬＥバイオマーカーの発現は、ＴＬＥタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される。
【００３５】
種々の態様において、参照サンプルは、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；または、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーである。
【００３６】
１つの態様において、処置は、治療有効量のＨＤＡＣインヒビターを投与することを含む。１つの態様において、癌患者は肺癌を有する。
【００３７】
種々の態様において、サンプルは液体サンプルまたは組織サンプルである。液体サンプルは血液、血漿または血清であり得る。組織サンプルは肺組織であり得る。
【００３８】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、該患者から処置後の生物学的サンプルを提供すること；該患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現の存在を検出すること；該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルを、参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーの発現のレベルと比較することにより癌患者処置プロトコールの有効性をモニタリングするための方法であって、該参照サンプルにおける該ＴＬＥ発現のレベルと比較して該処置後の患者サンプルのＴＬＥ発現のレベルの違いが、該処置の有効性を示す、方法に関する。１つの態様において、該処置後の患者サンプルにおけるＴＬＥの減少したレベルが、有効な処置を示す。ＴＬＥバイオマーカータンパク質は、通常、非分泌タンパク質であるタンパク質として特徴付けられる。
【００３９】
１つの態様において、参照サンプルは、治療に対して応答しない処置後の癌患者から得られる。種々の他の態様において、参照サンプルは、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；または、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーである。
【００４０】
本発明の別の局面において、本発明は、患者から生物学的サンプルを提供すること；参照サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのレベルと比較して、患者の生物学的サンプルにおけるＴＬＥバイオマーカーのより高いレベルの存在を検出すること；および、治療有効量のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のフラグメントの投与で癌を処置するための候補として、癌患者を同定することにより、癌患者処置候補を同定するための方法に関する。１つの態様において、癌患者は肺癌を有する。ＴＬＥバイオマーカータンパク質は、通常、非分泌タンパク質であるタンパク質として特徴付けられる。１つの態様において、フラグメントはＱドメインを含む。
【００４１】
種々の態様において、参照サンプルは、癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプル；癌と診断されておらず、癌に対する増加した危険因子を有さない健常哺乳動物由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカー；既知の非応答患者由来の生物学的サンプル；または、既知の非応答患者由来の生物学的サンプルにおいて測定されるレベルに対応する濃度レベルで提供される精製されたバイオマーカーである。
【００４２】
本発明の別の局面において、本発明は、患者から生物学的サンプルを提供すること；患者の生物学的サンプルにおける不活性化ＡＰＣまたはベータ−カテニン突然変異の存在を検出すること；および、癌患者への治療有効量のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のフラグメントの投与で癌を処置するための候補として、不活性化ＡＰＣまたはベータ−カテニン突然変異を有する癌患者を同定することにより、癌患者処置候補を同定するための方法に関する。１つの態様において、癌患者は大腸癌を有する。１つの態様において、フラグメントは少なくともＷＤ４０ドメインを含む。
【００４３】
本発明の別の局面において、本発明は、治療有効量のＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のフラグメントを哺乳動物に投与することにより哺乳動物における癌を処置するための方法に関する。１つの態様において、癌は肺癌である。１つの態様において、フラグメントはＱドメインを含む。さらに別の態様において、癌は大腸癌である。１つの態様において、フラグメントは、少なくともＷＤ４０ドメインを含む。
【００４４】
本発明の別の局面において、本発明は、治療有効量のベータ−カテニンを癌に投与することにより、哺乳動物における癌を処置するための方法に関する。１つの態様において、癌は肺癌である。
【００４５】
本発明の別の局面において、本発明は、ゲノムが、Ａｐｃ遺伝子が少なくともコドン１６３８で切断されているＡＰＣタンパク質をコードする遺伝子のヘテロ接合のヌル対立遺伝子、およびＧｒｏｕｃｈｏ関連遺伝子の半接合の導入遺伝子の対立遺伝子を含み、腫瘍の形成を示す、トランスジェニックマウスに関する。
【００４６】
本発明の別の局面において、本発明は、ゲノムが、Ａｐｃ遺伝子が少なくともコドン１６３８で切断されているＡＰＣタンパク質をコードする遺伝子のヘテロ接合のヌル対立遺伝子、およびＧｒｏｕｃｈｏ関連遺伝子の半接合の導入遺伝子の対立遺伝子を含み、腫瘍の形成を示すトランスジェニックマウスを作製すること；作製されたトランスジェニックマウスを候補化合物で処置すること；腫瘍細胞の数、腫瘍の体積または腫瘍細胞生存能力を測定することにより、候補化合物で処置されたトランスジェニックマウスにおける腫瘍のレベルを決定すること；および、腫瘍細胞の数または腫瘍の体積が、候補化合物での処置前にトランスジェニックマウスにおける腫瘍細胞の数または腫瘍の体積と比較して減少されているとき、または、腫瘍細胞のアポトーシスが、候補化合物での処置後に誘導されているとき、抗腫瘍活性を有する化合物として候補化合物を同定することの工程を含む、抗腫瘍活性に対して化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００４７】
本発明の別の局面において、本発明は、非トランスジェニックマウスよりも、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて定量的に異なるレベルである１つ以上のバイオマーカーを含む診断キットに関する。
【００４８】
１つの態様において、キットの１つ以上のバイオマーカーは、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２またはＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２である。好ましい態様において、少なくとも１つのバイオマーカーはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質を含む。１つの態様において、キットは、固体支持体に結合されているバイオマーカーの一団として提供される１つ以上のバイオマーカーを含む。バイオマーカータンパク質は、通常、非分泌タンパク質であるタンパク質として特徴付けられる。
【００４９】
本発明の別の局面において、本発明は、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウス由来の生物学的サンプルおよびＧｒｇ１を発現しないマウス由来の生物学的サンプルを提供すること；Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスおよびＧｒｇ１を発現しないマウスにおけるバイオマーカーの発現を測定すること；および、サンプルにおいて異なるレベルで発現されるバイオマーカーを同定することによる、非小細胞性肺癌に対するマーカーを同定するための方法に関する。バイオマーカータンパク質は、通常、非分泌タンパク質であるタンパク質として特徴付けられる。
【００５０】
１つの態様において、バイオマーカーは、タンパク質またはｍＲＮＡである。種々の態様において、サンプルは液体サンプルまたは組織サンプルである。液体サンプルは、血液、血清または血漿であり得る。組織サンプルは肺組織であり得る。
【００５１】
１つの態様において、方法は、測定する工程前に、生物学的サンプルを結合パートナーと接触させることをさらに含む。結合パートナーは、抗体、核酸、リガンドまたはアプタマーであり得る。種々の態様において、同定する工程は、結合パートナーへの結合を検出することを含む。したがって、生物学的サンプルは検出可能に標識されていてもよい。他の態様において、検出する工程は、マーカー−結合パートナー複合体を第２の結合パートナーと接触させることを含む。このような態様において、第２の結合パートナーは、検出可能に標識されていてもよい。いくつかの態様は、液体クロマトグラフィー分析およびタンデム質量分析を含む。
【００５２】
１つの態様において、バイオマーカー発現のレベルは、Ｇｒｇ１を発現しないマウスにおけるバイオマーカー発現のレベルと比較したとき、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて増加されている。別の態様において、バイオマーカー発現のレベルは、Ｇｒｇ１を発現しないマウスにおけるバイオマーカー発現のレベルと比較したとき、Ｇｒｇ１を発現するトランスジェニックマウスにおいて減少されている。
【００５３】
いくつかの態様において、方法は、ｍＲＮＡレベルを比較する工程前に、サンプルをＤＮＡと接触させることをさらに含む。さらに他の態様において、方法は、サンプルからｍＲＮＡを単離すること、およびｍＲＮＡを定量的に増幅すること、およびｃＤＮＡを生産することをさらに含む。
【００５４】
本発明のこれらの、および他の特徴、局面および利点は、以下の記載および請求の範囲によってより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、Ｇｒｇ１およびＧｒｇ５トランスジェニックマウスに対するタンパク質発現における変化の要約の図表示である；
【図２】図２は、抗体マイクロアレイのために使用される抗体希釈の表である；
【図３】図３は、抗体アレイマップを描写する表である；
【図４】図４は、抗体マイクロアレイに対する検出およびスポット分析を示す表である；
【図５】図５は、抗体マイクロアレイに対するイメージ例である（ネガティブイメージ、１４５１４５Ａ５とインキュベートされるアレイ）；
【図６】図６は、スライドインキュベーション中のサンプル再分配を示す表である（１４アレイ／スライド）；
【００５６】
【図７】図７は、それぞれのアレイまたはサンプルに対する標識化ＢＳＡポジティブコントロールの平均値、ＳＤおよびＣＶの表である；
【図８】図８は、それぞれのサンプルでのコントロール：抗アルブミンおよび抗−Ｈ１抗体の平均値（正味のシグナル、除去されたバックグラウンドシグナル）、ＳＤおよびＣＶの表である；
【図９】図９は、それぞれのサンプルに対するネガティブコントロール（ＰＢＳ）およびバックグラウンド（Ｂ６３５）の平均値、ＳＤおよびＣＶの表である；
【図１０】図１０は、血清およびインキュベーションコントロールに対する平均正味のシグナルの表である；
【図１１】図１１は、強調された値の例を示す表である；
【図１２】図１２は、１０個の抗体に対して得られた結果の表である；
【００５７】
【図１３】図１３は、ＭＤＭ２抗体のボックスプロットである（ｐ＝０．０３、Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙ）；
【図１４】図１４は、ＴＬＥ１抗体のボックスプロットである（ｐ＝０．０３、Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙ）；
【図１５】図１５は、トリコスタチンＡでの処置後のＧｒｇ１トランスジェニックマウスにおける腫瘍発生を示す表である；
【図１６】図１６は、トリコスタチンＡ処置を有さない、または該処置を有するＧｒｇ１ｈＰＬＡＰトランスジェニックマウス由来の腫瘍切片の写真である；
【図１７】図１７は、ＡＰＣｍｉｎ／Ｇｒｇ１ｈＰＬＡＰマウスにおける腸ポリープおよび肺腺腫の定量を示す表である；および、
【図１８】図１８ＡおよびＢは、脊椎動物Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質の構造的および配列的保存を示す概略である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
サンプルの不均一性のために、ヒトサンプルを使用してバイオマーカーを同定することが難しい。多数の違いが、疾患と関連しないヒトサンプル中で起こる。この困難性を克服するために、予測可能な疾患進行および適当なネガティブコントロールの利用可能性を提供する動物モデルを、本明細書に記載されている本発明を開発することにおいて使用した。
【００５９】
Ｇｒｇ１トランスジェニックマウス系を、肺癌に対する生物学的タンパク質マーカーを同定するために使用した。Ｇｒｇ１マウスは、ヒト非小細胞肺腺癌に似ている肺腫瘍を発生する。Ｇｒｇ１マウスを、肺腫瘍発生中の遺伝子およびタンパク質の違いの測定のためのサンプルを提供するために、組織の供給源として使用した。Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスの生産は、Allen, Tら “Grg1 Acts as a Lung-Specific Oncogene in a Transgenic Mouse Model”, Cancer Res, 66:3, 1294-1301(2006)（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。本発明において、Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスを、肺癌に対する生物学的タンパク質マーカーを同定するために使用した。肺癌を有する患者を同定するために関連する同定された生物学的タンパク質マーカーは、ヒトにおける癌を診断する慣用の手段により分析される場合に、癌を有さないヒトコントロール患者において同定されるタンパク質と定量的または定性的に異なるヒト癌患者由来の血清において測定可能なタンパク質であった。本発明は、肺癌を検出するためのアッセイおよび方法を提供する。要するに、癌を有する疑いのある、または診断として癌を排除する必要性のある患者または対象由来のサンプル、例えば、血液サンプルを得て、肺癌に対するバイオマーカーの存在または非存在について分析する。肺癌とある程度関連している１つのバイオマーカーまたはバイオマーカーの一団を使用する。本発明のバイオマーカーは、ヒトにおいてトランスデューシン様エンハンサーオブスプリット(enhancer-of-split)（ＴＬＥ）と呼ばれるＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質に対する自己抗体、またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。本発明のバイオマーカーは、Ｍｄｍ２タンパク質、Ｍｄｍ２タンパク質に対する自己抗体、またはＭｄｍ２タンパク質をコードする核酸をさらに含むが、これらに限定されない。
【００６０】
Ｇｒｏｕｃｈｏタンパク質は、多くの転写因子およびヒストンデアセチラーゼ−１（ＨＤＡＣ−１）と相互作用し、標的遺伝子の転写を抑制する転写共抑制因子である。Ｇｒｏｕｃｈｏタンパク質ファミリーは、マウスにおけるＧｒｇ１−５およびヒトにおけるＴＬＥ１−５によってコードされる。大多数のＧｒｏｕｃｈｏタンパク質は、ショウジョウバエＧｒｏｕｃｈｏタンパク質のプロトタイプの全てのドメインを有するが、Ｇｒｇ５／ＴＬＥ５、あるいはＧｒｇ３のスプライス変異体は、アミノ末端ＱおよびＧ／Ｐドメインのみを有するＧｒｏｕｃｈｏアイソフォームをコードする。Ｑドメインを、Ｇｒｏｕｃｈｏタンパク質のオリゴマー形成のために使用する。したがって、短いＧｒｏｕｃｈｏタンパク質は、非機能性複合体を形成することにより、長いタンパク質の活性を阻害し得る。
【００６１】
図１８Ａは、上部でショウジョウバエＧｒｏｕｃｈｏタンパク質の構造機構を示し、Ｇｒｏｕｃｈｏドメインの全てが保存されているか、またはＱおよびＢ／Ｐドメインのみを含む関連脊椎動物タンパク質を下部に示す。Ｇｒｏｕｃｈｏホモログの命名法は、左欄に示されている。数は、ショウジョウバエＧｒｏｕｃｈｏタンパク質（斜線の左）またはヒトＴＬＥタンパク質（斜線の右）とのアミノ酸同一性パーセントを示す。
【００６２】
図１８Ｂは、マウスＧｒｏｕｃｈｏホモログのＱおよびＷＤ４０ドメインのアラインメントを示す。ダッシュ記号は、アミノ酸同一を示す。右側のパーセントは、Ｇｒｇ３との相同性を示す。Ｇｒｇ３において、ヒトＴＬＥ３に対する保存が、丸括弧内に挙げられている。
【００６３】
表１は、ＴＬＥタンパク質のそれぞれに対するアミノ酸番号によりＱドメインおよびＷＤ４０ドメインを同定している。Ｇｒｇ１−５およびＴＬＥ１−５のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、添付物Ａにおいて提供される。
表１
【表１】
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【００６４】
Ｍｄｍ２（マウス二重微小染色体２（ｍｄｍ２）遺伝子）のヒトホモログは、ｐ５３腫瘍サプレッサーのネガティブレギュレーターであるＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼをコードする。この遺伝子の過剰発現は、腫瘍タンパク質ｐ５３の過剰不活性化をもたらし、腫瘍抑制機能を減少させることができる。ヒトＭＤＭ２のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、添付物Ａにおいて提供される。
【００６５】
本発明のバイオマーカー、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質（マウスにおけるタンパク質のＧｒｇファミリー；ヒトにおけるタンパク質のＴＬＥファミリー）、Ｍｄｍ２、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＣｙｃｌｉｎＤ１／Ｄ２は、細胞中に存在し、機能するタンパク質である。したがって、本発明のタンパク質バイオマーカーは、通常、非分泌タンパク質である。液体生物学的サンプル、例えば、血液、血清または血漿においてバイオマーカーを検出することができるアッセイは、分泌タンパク質の検出に限定されるであろうことが予期される。したがって、本発明の局面が、液体生物学的サンプル、例えば、血液、血漿または血清における測定可能なレベルの本発明のバイオマーカーを検出するための診断アッセイおよびキットであるということは、驚くべき予測し得ないことである。
【００６６】
本発明の全ての局面および態様において、本発明のバイオマーカーは、一団として示すことができ、一団は、本発明のアッセイまたは方法において選択または提供される特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーのグループ；または、本発明のキットにおいて提供される特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーのグループを示す。
【００６７】
本発明の全ての局面および態様において、バイオマーカーは、高分子として提供される。高分子は、そのタンパク質、核酸、抗体またはフラグメントであり得る。高分子がタンパク質であるとき、フラグメントは、限定はしないが、抗原フラグメント、種々の長さのＮ−末端ドメイン、種々の長さのＣ−末端ドメイン、当分野で同定されている指定されたドメイン（例えば、Ｇｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のＱドメインまたはＷＤ４０ドメイン）を含むことができる。高分子が核酸であるとき、核酸は、限定はしないが、そのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびフラグメントを含むことができる。核酸のフラグメントは、限定はしないが、コード配列および上記種々のタンパク質フラグメントに対応する配列を含むことができる。高分子が抗体であるとき、抗体は、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体およびそれらのフラグメントを含むことができる。抗体のフラグメントは、あらゆる抗原結合フラグメント、例えば、限定はしないがＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含むことができる。
【００６８】
以下により詳細に記載されているとおり、本発明のアッセイおよび方法は、ステージＩまたはステージＩＩ肺癌を有することが知られている患者を同定することができる。現行のアッセイおよびスクリーニングモダリティは、強固かつ費用効率の良い方法で早期肺癌患者の同定を行う能力をほとんど有さないため、早期肺癌を有する患者の同定は特に価値がある。アッセイはまた、多くのサンプルを同時に試験することを可能にするアッセイフォーマットを使用することにより、例えば、マイクロアレイを使用することにより（任意の集団に対してコントロールサンプルを並行して実施して、信頼度の高い識別データを得ることができ、ここに、複数のコントロールは、できるだけ多くのパラメーターについて、該試験集団に合致させる）、汎用的である。
【００６９】
本発明はまた、変化するバイオマーカーに基づいて、有効であり得る処置治療を決定するための方法を提供する。バイオマーカーまたはバイオマーカーと相互作用する他のタンパク質を標的化する処置を選択することができる。
【００７０】
本発明はまた、ＡＰＣ経路タンパク質が変化する他の癌、例えば、限定はしないが大腸癌の処置のために提供する。処置は、治療有効量においてＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質またはＧｒｏｕｃｈｏ関連タンパク質のホモログもしくはフラグメントを癌患者に導入することにより、もたらされ得る。
【００７１】
バイオマーカー選択
肺癌関連マーカー、例えば、タンパク質バイオマーカーまたはタンパク質に対する自己抗体の選択および同定は、Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスを使用して行われた。Ｇｒｇ１マウス由来の組織サンプルを回収し、差異的(differential)ＲＮＡアレイ、ウェスタンブロットまたはプロテオミクス方法、例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む方法により分析した。Ｇｒｇ１マウスにおけるタンパク質または遺伝子発現レベルを、非腫瘍コントロールマウスと比較した。隣接正常肺組織と比較してＧｒｇ１マウスまたは腫瘍において異なるレベルで発現されたタンパク質または遺伝子は、肺癌の早期検出における使用のための可能性のある肺癌バイオマーカーを示す。これらのタンパク質を、ヒト肺癌患者サンプルにおける存在について試験した。
【００７２】
バイオマーカーに対する抗体は、「診断チップ」上にまとめられ、例えば、一団の抗体は、マイクロアレイとしての固相基質上に存在し、肺癌患者のサンプルと非肺癌集団のサンプルとの区別における独立した予測値についてさらに評価した。診断マーカーを、対象における放射線学的に検出可能な肺癌の存在または将来的存在を同定する能力について選択した。
【００７３】
患者サンプルにおけるバイオマーカー測定
以下により詳細に議論されているとおり、本発明は、異なるアッセイフォーマットの使用を意図する。マイクロアレイは、複数のマーカーおよびサンプルの同時試験を可能にする。したがって、多くのポジティブおよびネガティブコントロールを、マイクロアレイに含ませることができる。次に、アッセイは、複数のサンプル、例えば、既知の癌を有する患者由来の１つ以上のサンプル（ポジティブコントロール）、および癌を有さない患者由来の１つ以上のサンプル（ネガティブコントロール）の同時処置を、試験され、比較されるべき１つ以上のサンプル、例えば患者サンプルと共に行うことができる。アッセイにおいて内部ポジティブおよびネガティブコントロールを含むことは、アッセイ内でのシグナル強度の正常化、校正および標準化を可能にする。例えば、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールおよび患者サンプルのそれぞれを複数で行うことができ、複数のサンプルは連続希釈物であり得る。コントロール部位および患者サンプル部位は、また、試験デバイス上のサンプル部位位置によって変化を最小限にするように、マイクロアレイデバイス上にランダムに配置することができる。
【００７４】
したがって、このような内部コントロールを有するマイクロアレイまたはチップは、マイクロアレイまたはチップ上で同時に試験される患者の診断を可能にする。このような制御手段における試験およびデータ獲得の多重方法は、適当なコントロールが説明されるので、アッセイデバイス内で患者の診断を可能にし、マーカーの一団が個々に合理的に高い予測力を有するものである場合、ケア診断結果のポイントを得ることができる。
【００７５】
サンプルおよび試験の例示
試験、特にスクリーニングアッセイに適しているサンプルは、一般的に、好ましくは、非侵襲性または低侵襲性手段において、患者から容易に得ることができるものである。血液サンプル、血漿または血清は、かかる適当なサンプルであり、非常に免疫測定法フォーマットに容易に適している。血液サンプルの文脈において、多数の既知の血液回収チューブが存在し、多くは５または１０ｍｌの液体を回収する。最も一般的に秩序化された診断血液試験と同様に、５ｍｌの血液を回収することができるが、マイクロアレイとして操作するアッセイは、１ｍｌ未満の血液を必要とし得る。血液回収容器は、抗凝固剤、例えば、ヘパリン、クエン酸塩またはＥＤＴＡを含むことができる。細胞成分を、一般的に、４℃で１０分間、例えば、１０００＊ｇ（ＲＣＦ）で遠心分離により分離し（分析のための〜４０％血漿を生じ）、一般的に、使用するまで冷蔵庫温度で、または４℃で保存することができる。好ましくは、血漿サンプルは、回収から３日以内にアッセイされるか、または、例えば、−２０℃で冷凍保存される。過剰なサンプルは、必要とされる繰り返し分析のために最大２週間、（サンプルの凍結融解を回避するために、霜なし冷蔵庫において）−２０℃で貯蔵される。２週間よりも長い期間の保存は、−８０℃でされるべきである。血清サンプルは、抗凝固剤を提供せず、サンプルを凝固させないことにより得ることができる。当分野で知られているタンパク質構造および機能を保存する標準処理および保存方法が実行される。
【００７６】
本発明において、次に、癌を有する疑いのある、または診断として癌を排除する必要性のあるヒト患者由来の液体サンプルは、例えば、本明細書において議論されているバイオマーカーに対する抗体を負荷された部位を含む試験組成物、例えば、マイクロアレイに、１つの態様において、好ましくは適当なポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールサンプルと共に適用される。患者、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールサンプルは、定量化を可能にするために、段階的な量、例えば連続希釈において提供することができる。サンプルは、マイクロアレイのあらゆる位置効果に取り組むために、マイクロアレイ上にランダムに配置することができる。インキュベーション後、マイクロアレイを洗浄し、次に、検出器に暴露する。再び、マイクロアレイを洗浄し、次に、１つの態様において、レポーターの検出を可能にするために試薬に暴露する。したがって、レポーターが着色粒子、例えば金属ゾルを含むとき、特定の検出手段を必要としない。本発明の別の態様において、蛍光分子を使用し、適当な入射光で検出する。あるいは、本発明の別の態様において、酵素を使用し、マイクロアレイを視覚化のための適当な基質に暴露する。マイクロアレイは、部位に結合された反応産物について評価する。視覚的評価することができるが、他のデバイスが検出し、必要なとき、シグナル強度を定量する。次に、データは、例えば、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプルを観察することにより、反応の有効性の情報を提供するために解釈され、有効であるとき、患者サンプルを評価する。アッセイから得られたデータを、患者サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーが、ネガティブコントロールサンプルと定量的に異なるか否かを決定するために分析する。患者サンプルが、選択されたバイオマーカーに依存して、ネガティブコントロールサンプルよりも、より多いまたはより少ない量のバイオマーカーを有するとき、該患者は肺癌に対してポジティブとして診断される。
【００７７】
キットおよびアッセイの使用
本発明の血液アッセイ（試験）は、複数の使用および応用を有するが、後の経過観察のための早期診断または早期警告が、疾患の結果に対する潜在的な影響のために非常に説得力がある。本発明は、肺癌に対する放射線スクリーニングを補足するために、診断ツールとして使用され得る。連続ＣＴスクリーニングは、一般的に肺癌に対して感受性であるが、非常に高価であり、非特異的（報告された特異性６４％）である傾向にある。したがって、ＣＴは、約１０分の４という多数の偽陽性を生じる。放射線イメージング中の不確定な肺結節の日常的な同定は、頻繁に、高価な後処理および潜在的に有害な介入、例えば侵襲性生検に至る。現在、年齢および喫煙歴が、肺癌に対して大規模スクリーニング試験により選択基準として使用されているたった２つの危険因子である。
【００７８】
放射線画像で明らかな癌（＞０．５ｃｍ）および／または潜伏および前悪性癌（放射線検出の限界未満）を検出するための本発明の方法は、さらなるスクリーニングが最も正当化される個体を定義する。したがって、本明細書に記載されている本発明のアッセイは、癌の存在を示すポジティブ結果が、当分野で慣用かつ知られているさらなる試験、例えば、放射線分析によるさらなる試験、例えば、ＣＴ、ＰＥＴ、Ｘ線などの適応を示す一次スクリーニング試験として役立たせることができる。加えて、定期的再試験は、新たな非小細胞性肺癌ＮＳＣＬＣを同定し得る。
【００７９】
本明細書に記載されている本発明のアッセイの臨床的適用の例は、医療行為における使用であり、高い危険性の喫煙者（例えば、２０年以上、１日に１パック相当の喫煙者）由来の体液サンプル、例えば血液が、毎年の身体試験の一環として本明細書に記載されている１つ以上の肺癌バイオマーカーについてアッセイされ得る。何らさらなる明らかな症状のないネガティブなアッセイ結果は、少なくとも毎年、さらなる試験を指示することができる。試験結果がポジティブであるとき、患者は、診断イメージングにより可能性のある腫瘍を同定するために、さらなる試験、例えば、アッセイの繰り返しおよび／またはＣＴスキャンもしくはＸ線を受けるであろう。腫瘍がＣＴスキャンまたはＸ線において明らかでないとき、腫瘍が直径で少なくとも０．５ｍｍであり、検出され、外科的に除去することができるまで、アッセイは、１年以内に１または２回および翌年以降に複数回繰り返されるであろう。臨床的スクリーニングプロトコールにおけるその使用に加えて、本発明のアッセイおよび方法はまた、ＣＴスクリーニングにおいて同定される悪性結節から良性結節を区別することにおいて有用であり得る。孤立性肺結節（ＳＰＮ）は、正常肺組織により完全に取り囲まれる、イメージングにより直径で３ｃｍ未満の単一の球状病変として定義される。ＳＰＮにおける悪性腫瘍の報告された有病率が、約１０％から約７０％の範囲であるが、ＳＰＮの現代の定義を使用する非常に最近の試験は、約４０％から約６０％である悪性腫瘍の有病率を示す。大多数の良性病変は肉芽腫の結果であるが、大多数の悪性病変は原発性肺癌である。ＳＰＮの最初の診断評価は、悪性腫瘍に対する危険因子、例えば、年齢、喫煙歴、悪性腫瘍の前歴、および結節の胸部放射線特性、例えば、サイズ、石灰化、境界（針骨状(spiculated)、または平滑(smooth)）および古い胸部Ｘ線の評価に基づく成長パターンの評価に基づく。次に、これらの因子は、悪性腫瘍の可能性を決定するために、およびさらなる患者管理を導くために使用される。
【００８０】
最初の評価後、多数の結節は、悪性腫瘍の中間確率（２５−７５％）を有するとして分類される。該グループにおける患者は、生検または手術前のアッセイでのさらなる試験から利益を得るであろう。成長を評価する連続スキャンまたは代謝イメージング（例えば、ＰＥＴスキャン）は、現在利用できる唯一の非侵襲性選択肢であり、理想から程遠い。連続放射線分析は、成長の測定に依存しており、病変が２年の時間枠にわたって成長を示さないことを必要とする；スキャン間の理想的な間隔は決定されていないが、２年間３月毎のＣＴスキャンが慣用の経時的評価である。ＰＥＴスキャンは、肺癌に対して９０−９５％特異性および８０−８５％感受性を有する。これらの予測値は、良性肉芽腫性疾患（例えばヒストプラスマ症）の局所有病率に基づいて変化し得る。
【００８１】
ＰＥＴスキャンは、現在、試験あたり＄２０００から＄４０００かかる。非外科手術、例えば、気管支鏡検査または経胸腔針生検（ＴＴＮＢ）からの診断率は、４０％から９５％の範囲である。非診断手段の設定における後の管理は、問題になり得る。外科的介入は、しばしば、他の診断後処理と共に、または該処理なしで、非常に実行可能な選択肢として続行される。該選択肢は、悪性腫瘍の試験前危険性が高いか、低いか、特定の施設での試験の利用可能性、結節の特性（例えば、サイズおよび位置）、患者の外科的危険性、および患者の選択に依存する。他の胸腔外悪性腫瘍の以前の病歴は、即座に肺への転移性癌の可能性を示唆し、非侵襲性試験の関連は、無視できるようになる。肺癌に対する不確定な臨床的疑いを有するＳＰＮの混乱する臨床的シナリオにおいて、循環腫瘍マーカーは、有害な侵襲性診断後処理の可能性を回避し、逆に侵襲性外科的介入の理論的根拠を支持する手助けをすることができる。
【００８２】
したがって、記載されている発明は、侵襲性診断の代わりに結節を連続的にイメージングするために選択する臨床的快適性を増強する。本発明はまた、連続Ｘ線またはＣＴスクリーニングに関する間隔における影響を有し、それにより臨床的医療費を低くする。記載されている発明は、肺癌が存在または非存在である確率をさらに増加させるための費用効率の良い方法として、ＰＥＴスキャンを補足するか、または置き換えられる。
【００８３】
本発明は、治療的介入後の疾患再発を評価することにおいて有用である。大腸および前立腺癌に対する血液試験は、一般的に、マーカーレベルが処置成功または失敗の指標として追跡される場合、および、上昇するマーカーレベルが治療的介入に至る再発に対するさらなる診断評価の必要性を示す場合に、該能力において使用される。
【００８４】
したがって、本明細書に記載されている本発明のアッセイは、処置の経過、処置の成功、再発、ケアなどをモニタリングするために、スクリーニング、処置の選択および処置中の継続使用のための重要な診断ツールである。アッセイの試薬、特定の一団のマーカーは、特定の目的に適合するように操作することができる。例えば、スクリーニングアッセイにおいて、マーカーのより大きい一団または非常に一般的なマーカーの一団は、より多くの個体に対する予測力を最大化するために使用され得る。しかしながら、処置を受けている個体の文脈において、例えば、患者の特定の腫瘍型の特定のバイオマーカーフィンガープリントを得ることができ、スクリーニングのために使用されるバイオマーカーの全ておよび恐らくサブセットのみを必要としてもよく、または必要としなくてもよい。バイオマーカーの特定化されたサブセットは、患者における腫瘍の存在、および後の治療的介入をモニタリングするために使用することができる。
【００８５】
本発明のアッセイおよびキットの成分は、配分および使用のための多くの異なるフォーマットにおいて構成することができる。例えば、１つ以上の抗体は、アリコートし、１つ以上の容器、例えば、ガラスバイアル、遠心チューブなどに保存することができる。抗体溶液は、当分野で知られている防腐剤、抗菌剤、安定剤などを含む適当なバッファーなどを含むことができる。抗体は、保存された形態、例えば、乾燥させた形態、フリーズドライ形態などであり得る。抗体は、特定のアッセイにおける使用のための適当な固相上に置くことができる。したがって、抗体は、培養プレートのウェルに置かれ、乾燥され、層状アッセイまたは側方フロー免疫測定法デバイスにおける膜上にスポットされ、マイクロアレイのためのスライドまたは他の支持体上にスポットされるなどされ得る。物(item)は、最大保存期間を保証するために当分野で知られているとおり、例えば、プラスチックフィルムラップまたは不透明なラップでパッケージし、箱に詰めることができる。アッセイコンテナは、容器(vessel)中に、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプルをそれぞれ含むことができ、これは、サンプルが液体であるとき、ドロッパーを有する容器か、またはこれは、滴(drops)を分注することを可能にするキャップを有する容器、サンプル回収デバイス、他の液体輸送デバイス、検出試薬、現像試薬、例えば、銀染色試薬および酵素基質、酸／塩基溶液、水などを含む。使用のために適切な指示書を含んでもよい。
【００８６】
例えば、ビーズベースのアッセイまたはキットを使用する他のフォーマットにおいて、複数の抗体を、患者サンプルに暴露されるように準備されたビーズの種々の集団（これは、次に単一の試薬中に混合することができる）に添付することができる。
【００８７】
今回、本発明は、以下の非限定的な実施例において例示される。
【００８８】
実施例
実施例１
抗体マイクロアレイ
非小細胞性肺癌に対する候補バイオマーカーは、非腫瘍を有するマウスと比較して、肺腫瘍を発生するＧｒｇ１を発現するマウスにおけるタンパク質レベルを測定するためにウェスタンブロットを使用して、Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスにおいて同定した。Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスにおいて変化されると同定されるタンパク質は、図１に示される。
【００８９】
抗体マイクロアレイ実験の目的は、３０個のヒト血清に対するカスタム抗体アレイを使用して、肺癌  対  コントロールサンプルにおける１０個のヒトタンパク質の相対存在量を評価することである。
【００９０】
スライドのスポッティングプロトコールおよびインキュベーション
１．スライドのスポッティング
スポッティングは、Ｑｕｉｌｌ  Ｐｉｎｓ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔ  ２５００を備えたＭｉｃｒｏｇｒｉｄ  ＩＩスポッターにより行った。スポット直径は１５０μｍである。スポッターは、４℃にセットされた温度制御Ｂｉｏｂａｎｋによって、備えられている。
【００９１】
使用されるスライドは、ニトロセルローススライド（Gentel PATH PLUS Protein Microarray slides）であった。
【００９２】
抗体を、市販の保存バッファー中、１４パッドにスポットするか、またはリン酸緩衝生理食塩水（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で希釈した。それぞれの抗体に対して使用される希釈を最適化した（図２参照）。それぞれの抗体の３つの複製物を、１アレイあたりにスポットした。
【００９３】
それぞれのパッドにおいてトリプリケートにてスポットされた４つの異なるコントロールが存在した（図３参照）。第１のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）はネガティブコントロールである。第２の標識化ＢＳＡ（０．０５ｍｇ／ｍｌにおいてスポットされている）は、グリッド位置／ポジティブコントロールである。第３は、血清インキュベーションのポジティブコントロールである抗アルブミン抗体（０．１ｍｇ／ｍｌにおいてスポットされている）である。最後のコントロールは、ネガティブコントロールである抗Ｈ１抗体（０．５ｍｇ／ｍｌでスポットされている抗ヒストンＨ１）である。
【００９４】
２．サンプルの標識化およびインキュベーション
血清サンプルは、肺癌患者ドナー由来のＡｓｔｅｒａｎｄ：Ａｓｔｅｒａｎｄ  ＸＰｒｅｓｓＢＡＮＫＴＭヒト血清およびヒト正常コントロール血清から得た。ヒト正常コントロール血清は、本明細書に記載されている参照サンプルに対応する。それぞれの患者の癌のステージは、腫瘍組織学にしたがって決定した。
【００９５】
５００μｌのそれぞれの血清（１／１０で希釈された）を、５０μｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン  ４０ｍＭで標識化した。混合物を、１０分毎に短いボルテックスで室温で１時間インキュベートした。プロトコールは、最も良いシグナル／ノイズ比率を得るように最適化される。
【００９６】
スライドを、震盪（５０ｒｐｍ）しながら２回２分洗浄し、室温で１時間、穏やかに震盪（１５ｒｐｍ）しながら５ｍｌのＰＢＳ（０．０１Ｍ；ｐＨ＝７，４）  Ｔｗｅｅｎ  ０．１％  カゼイン  １％でブロックした。
【００９７】
７０μｌのそれぞれのサンプルを、穏やかに震盪しながら室温で１時間、１／３００（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％＋カゼイン  ０．１％）とインキュベートした。次に、それぞれのウェルを、３５ｒｐｍで８０μｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％  カゼイン  ０．１％で５回５分洗浄した。
【００９８】
７０μｌのストレプトアビジン  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７溶液を、穏やかに震盪（１５ｒｐｍ）しながら暗所において室温で１時間、それぞれのウェルにて１μｇ／ｍｌでインキュベートした。それぞれのウェルを、暗所において３５ｒｐｍで８０μｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％  カゼイン  ０．１％で５回５分洗浄し、スライドを、暗所において３５ｒｐｍで５分間５ｍｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％  カゼイン  ０．１％で２回洗浄した。最後に、スライドを蒸留水で濯ぎ、暗い無菌の場所で乾燥させ、スキャンする。
【００９９】
イメージ分析
スライドを、Ｉｎｎｏｓｃａｎ７００  蛍光  マイクロアレイスキャナー（Ｉｎｎｏｓｃａｎ  ７００−ＩｎｎｏｐｓｙｓＴＭ）でスキャンした。スキャンパラメーターを最適化した。
【０１００】
イメージを、ソフトウェアＭａｐｉｘ（登録商標）（Ｖｅｒｓ．  ２．８．２）で処理した。検出グリッドおよびスポット同定を、対応するイメージに重ね合わせた。
【０１０１】
分析パラメーター
イメージ分析を支援するソフトウェアは、スポット検出パラメーター（スポット検出閾値、可変または不変スポット直径、異常検出）を構成することができる。Ｍａｐｉｘで該分析のために構成されたパラメーターは、図４に示される。例示的イメージを図５に示す。インキュベーションマップを図６に示す。
【０１０２】
検出グリッド位置をチェックし、異常の存在または謝ったスポット検出（ダスト検出、高いバックグラウンド）を検出するために、イメージをまた、視覚化した。いくつかのサンプルは２回インキュベートされている。最も良いイメージは、これらのサンプルのそれぞれに対して選択されている。
【０１０３】
品質管理
１．スポッティングコントロール
第１の品質管理は、視覚的に行った。分析に影響し得る異常は示されなかった。
【０１０４】
それぞれのグリッドは、位置決めポジティブコントロールスポット：標識化ＢＳＡ（パッドあたり３スポット）および抗アルブミン抗体（パッドあたり３スポット）を含んだ。最後のスポットされた標識化ＢＳＡスポットを、グリッド位置決めおよび全てのスポットがスポットされたコントロールのために使用した（図７）。抗アルブミン抗体は、マイクロアレイ上の血清インキュベーションコントロールである。予期されるとおり、該ポジティブコントロールは高い反応性を示した（図８）。
【０１０５】
ネガティブコントロールスポット：ＰＢＳおよび抗−Ｈ１抗体もあった。ＰＢＳ（グリッドあたり５１）は、非特異的シグナルのチェックのために使用した。対応するシグナルは、およそバックグラウンドレベルであると予期された（図９）。抗−Ｈ１抗体は、血清のインキュベーションのためのネガティブコントロールである。予期されるとおり、ネガティブコントロールは低い反応性を示した（図８）。
【０１０６】
２  インキュベーションコントロール
２つのアレイを、ストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ溶液のインキュベーションのみで得られた非特異的シグナルをチェックするために、患者サンプルの代わりにインキュベーションバッファーとインキュベートした。
【０１０７】
該コントロールで測定された全てのシグナルは、「Ｒｂ  ｈｙｐｏ」抗体を除けば、ほぼバックグラウンド（バックグラウンド近接カットオフの下）であった。該抗体において、得られたシグナルは、カットオフより高いが、サンプルをインキュベートしたとき、測定されたシグナルと比較して非常に低い（図１０）。
【０１０８】
生のデータ処置
それぞれのスポットの強度を、スポットに含まれるピクセルの中央値から計算した。
【０１０９】
スポットに対して測定されるシグナルは、シグナルを増加させるローカルバックグラウンド（スポット周囲のエリアにおいて測定される）により影響される。したがって、ローカルバックグラウンドは、系統的に、シグナルから引き、正味のシグナルを得る。正味のシグナルは、スポットシグナル（弱いスポットシグナル）よりも少し高いバックグラウンドレベルによって、ネガティブであり得る。この場合、ネガティブ正味値（中央スポットシグナル−中央ローカルバックグラウンドシグナル）を、値「１０」：修正値に置き換える。
【０１１０】
それぞれの抗体は、それぞれのアレイ上にトリプリケートにてスポットした。これは、再現間の値一致を立証するシグナル有効性をチェックすることができる。トリプリケートがＣＶ＞５０％を示すとき、計算された中央値は、表および対応する標準値においてアステリスク（＊）で強調されている。
【０１１１】
バックグラウンド付近のシグナルレベルを示すスポットは、バックグラウンド変化に対する重要な感受性を有する。したがって、バックグラウンド付近のデータの対の比較は、低いシグナルにもかかわらず良い比率をもたらし得る。これらの値を明白に同定するために、本発明者らは、以下のとおりに計算されるそれぞれのスポットに対してバックグラウンド近接カットオフを設定する：
ローカルバックグラウンドの（ピクセルの）平均＋３ＳＤ
【０１１２】
１つの再現がカットオフ下でシグナルを示すとき、その正味のシグナル値を表においてカラット（＾）で強調する。スポットの３つの再現のうち少なくとも２つがカットオフ下でシグナルを示すとき、タンパク質シグナルはバックグラウンド付近として考える。この場合、トリプリケートから計算された中央値は、スポットトリプリケート間のＣＶの値と関係なく、表においてハッチ記号（＃）で強調される。ハイライトは、対応する標準値において報告される（実施例、図１１）。
【０１１３】
分析および標準化
異なるサンプルおよびスライドで得られるシグナルの集団を比較するために、それぞれの集団の標準化が必要である。確かに、実験パラメーターは変化し得、タンパク質濃度は正確に同じではない。
【０１１４】
次に、強度の平均における標準化を選択した。標準化のための参照は、コントロールスポットを除けば、それぞれのサンプルに対する全てのスポット（正味のシグナル）の強度の平均を計算することにより計算した。
【０１１５】
次に、それぞれのタンパク質に対するシグナルを、以下のとおりに標準化した：
標準化値（ＶＮ）＝（シグナル−Ｂｋｇ）抗体／平均（シグナル−Ｂｋｇ））アレイ×Ｋ
Ｋ：定常値（データ読み取り快適(comfort)に関する）＝１００００
以下に記載される種々の分析は、これらの標準値で行う。
【０１１６】
比較コントロールグループ  ｖｓ  肺癌グループ
２グループのサンプル：コントロールおよび肺癌が存在した。以下の比較をした：肺癌／コントロール（図１２）。それぞれのグループは１５サンプル含み、それぞれのグループの中央を計算した。比率（中央肺癌グループ）／（中央コントロールグループ）およびＬｏｇ２（比率）を標準値から計算した。
【０１１７】
グループにおける値の少なくとも半分が強調されるとき、グループの得られる中央値はまた、図１２においてカラット（＾）で強調される。
【０１１８】
サンプルのグループを比較するために、Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙ試験も使用した。Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙは、独立したサンプルに対して使用されるノンパラメトリック試験である。試験のためのヌル仮説はＨ０であり：集団中央は等しい。試験に対して選択された有意性のレベルは５％（α＜０．０５）であった。
【０１１９】
全ての抗体に対して得られた比率の値は、比較的弱いが、Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙの統計的試験は、２つの抗体：ＭＤＭ２（図１３）およびＴＬＥ１（図１４）の単離を可能にした（仮説Ｈ０が拒絶される）。これらの２つの抗体について、タンパク質は、コントロールグループと比較して、肺癌グループにおいて過剰に発現される。
【０１２０】
結論
データ分析は、Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を使用して、２つの可能性のある特異的に発現されたタンパク質を明らかにした：ＭＤＭ２およびＴＬＥ１。これらの２つのタンパク質は、コントロールグループと比較して、肺癌グループにおいて過剰に発現される。
【０１２１】
実施例２
薬物処置
バイオマーカーを、薬物処置の有効性を予測するために使用することができる。Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスは、ＨＤＡＣ複合体と相互作用し、その機能を引き起こすＧｒｇ１（ヒトＴＬＥ１）タンパク質を過剰発現する。したがって、Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスにおける肺腫瘍は、ＨＤＡＣインヒビターでの処置により阻害され得る。ＨＤＡＣインヒビター薬物は、多数の癌の処置において使用されるが、どの患者が応答するか明確でない。さらに、ＨＤＡＣインヒビターは深刻な副作用を有し、したがって、より特異的な活性を有するＨＤＡＣインヒビターが開発されている。Ｇｒｇ１マウスモデルは、非小細胞性肺癌に対する有効性について新規ＨＤＡＣインヒビターを試験するための理想的な状況を提供する。
【０１２２】
トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、肺癌腫細胞系の増殖を阻害するヒストンデアセチラーゼインヒビターである。しかしながら、動物モデルにおいて肺癌の発症に対するＴＳＡの効果は試験しなかった。本実施例において、ＴＳＡを、Ｇｒｇ１の過剰発現によって気管支肺胞上皮肺癌腫を発生するトランスジェニックマウスを処置するために使用した。ＴＳＡ処置時に、肺腫瘍増殖がＧｒｇ１トランスジェニックマウスにおいて阻害されたことを発見した。ＴＳＡ処置Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスのグループにおいて、６つのうち１つのみが腫瘍を発症した。加えて、腫瘍血管形成もまた、ＴＳＡにより阻害された。これらの発見は、ＴＳＡが肺腫瘍増殖をインビボで有効に阻害することができ、ヒストンデアセチラーゼ活性の阻害が気管支肺胞上皮腺癌に関して治療的可能性を有することを示す。
【０１２３】
材料および方法
トランスジェニックマウスは、Ｇｒｇ１（マウスＴＬＥ１）のＣｒｅ条件発現で作製した。導入遺伝子は、最初に、ｌａｃＺレポーター遺伝子を発現する。Ｃｒｅリコンビナーゼが導入されたとき、ｌｏｘＰ−側面  ｌａｃＺ遺伝子は切除され、導入遺伝子はＧｒｇ１および別のレポーター遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ｈＰＬＡＰ）を発現する。Ｃｒｅ切除前および後の両方の導入遺伝子の広範な発現が証明され、Ｇｒｇ１過剰発現が肺腺癌の発症を引き起こすことを見出した。
【０１２４】
Ｃｒｅ切除前にｌａｃＺレポーターを発現するマウスは、Ｇｒｇ１ｌａｃＺマウスと称し、Ｃｒｅ切除後にＧｒｇ１およびｈＰＬＡＰを発現するマウスは、Ｇｒｇ１ｈＰＬＡＰマウスと称する。該記載はＧｒｇ１を発現する（Ｇｒｇ１ｈＰＬＡＰ）マウスのみに関し、したがって、それらは、代替的に、Ｇｒｇ１ｈＰＬＡＰマウスまたは単にＧｒｇ１トランスジェニックマウスと称する。
【０１２５】
１２９個のバックグラウンドにおけるＧｒｇ１トランスジェニックマウスを作製し、Allen, Tら “Grg1 Acts as a Lung-Specific Oncogene in a Transgenic Mouse Model”, Cancer Res, 66:3, 1294-1301(2006)に記載されているとおりに、アルカリホスファターゼ染色により遺伝子型を決定した。ＴＳＡ(BIOMOL Research Laboratories, Plymouth Meeting, Pennsylvania)を、０．５ｍｇ／ｋｇで４０μｌの１０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ（Ｍｉｓｈｒａら、２００３）にて１月齢Ｇｒｇ１ｈＰＬＡＰマウスおよびコントロール同腹子に腹腔内に注射した。４０μｌの１０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳのコントロール溶液を、Ｇｒｇ１マウスおよびコントロール同腹子の他のグループに注射した。それぞれのグループは６匹のオスマウスからなり、注射を３０日間続けた。３月後、マウスを殺し、肺を組織学的試験のために解剖した。左肺の下葉を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次に、葉全体を１００μｍ距離間隔で、５μｍの連続切片化のためにパラフィンに埋め込んだ。切片をＨ＆Ｅで染色し、１０Ｘ倍率で腺腫／癌腫増殖についてスクリーニングした。病変の数を記録し、統計的有意性をＡＮＯＶＡにより測定した。
【０１２６】
結果
５月齢時、Ｇｒｇ１を過剰発現するマウスは、連続切片上に見える腫瘍を発生した。ＴＳＡ処置Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスのグループは健常であり、組織学的切片は、腫瘍増殖において有意な減少を示した（図１５）。６匹のＧｒｇ１マウスのうち５匹が腫瘍を発生した未処置グループと比較して、６匹のＴＳＡ処置Ｇｒｇ１マウスのうち１匹のみが腫瘍を発生した。非トランスジェニック動物は、ＴＳＡ処置有り、または無しで、腫瘍を発生しなかったか、または何ら明らかな表現型を示さなかった。
【０１２７】
Ｈ＆Ｅ染色連続切片の試験は、Ｇｒｇ１を過剰発現するマウスにおいて発生した腫瘍が広範囲の増殖を示したことを示し、血管が腫瘍に成長していることが観察された。図１６は、ＴＳＡ処置後に腫瘍を発症した単一のマウス由来の病変を示す。病変は、同様の細胞形態を有したが、ずっと小さいサイズであった。血管は、病変周囲に観察されなかった。他の異常は、ＴＳＡ処置Ｇｒｇ１トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウス由来の肺組織において観察されなかった。
【０１２８】
実施例３
腫瘍を処置するために使用することができるＧＲＯＵＣＨＯタンパク質
ベータ−カテニン／Ｔｃｆ機能に関してＧｒｇタンパク質に対する提案されたアンタゴニスト役割を考慮すると、Ｇｒｇタンパク質は、異常Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達により引き起こされる悪性腫瘍に対して腫瘍サプレッサー役割を果たし得る。しかしながら、Ｇｒｇ１の肺腫瘍表現型は、該仮説に矛盾する。さらに、該問題に取り組むために、Ｇｒｇ１およびＧｒｇ５を過剰発現するマウスをＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子を有するマウスと交配させた。ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスは、マウスＡＰＣ遺伝子の１コピーのコドン８５０における短縮型突然変異を有する。野生型ＡＰＣ対立遺伝子の喪失は、これらのマウスにおいて上昇したレベルのベータ−カテニンおよび腸腺腫の形成を引き起こす。本発明者らは、Ｇｒｇ１過剰発現が、ＡＰＣｍｉｎ／＋モデルにおける腸ポリープの発生に対する有意な効果を有することを見出した。逆に、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子の存在はまた、Ｇｒｇ１により誘導される肺腺腫の結果を有する。
【０１２９】
Ｇｒｇ１は、ＡＰＣｍｉｎ／−マウスにおける巨大腺腫の数を減少させる
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドにおいて、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスは４から６月の生存期間を有し、複数の腸腺腫を発生する。腺腫多様性および致死性は、修飾因子部座位の存在によって、非近交系バックグラウンドにおいて減少される。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスをＧｒｇ１およびＧｒｇ５マウスと交配し、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子を有し、Ｇｒｇ１またはＧｒｇ５を過剰発現もするマウスを生産した。導入遺伝子挿入と関連する効果を排除するために、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスも、Ｇｒｇ１ｌａｃＺおよびＧｒｇ５ｌａｃＺマウスと交配し、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子および非切除導入遺伝子を有するマウスを生産した。これらの交配により生産されたマウスの非近交系バックグラウンドは、６月時点でのマウスの評価ならびにＧｒｇ１関連肺腫瘍およびＡＰＣｍｉｎ／＋関連腸ポリープの同時試験を可能にした。本発明者らは、この時点は、Ｇｒｇ１を過剰発現するマウスにおける肺腺腫の定量に理想的であったことを見出した。
【０１３０】
マウスの小腸および大腸の全体を取り出し、腸ポリープの数およびサイズを測定した。図１７は、試験されたそれぞれの遺伝子型を有するマウスにおける腸ポリープの平均数を示す。ポリープは、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子を有さないＧｒｇ１（ｎ＝６）またはＧｒｇ５（ｎ＝５）マウスにおいて見出されなかった。ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて、平均４９．９のポリープを発生し、同様に、コントロールＧｒｇｌａｃＺ／ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて、平均４７．６のポリープであった。ポリープの総数は、Ｇｒｇ１またはＧｒｇ５過剰発現を有するＧｒｇ１／ＡＰＣｍｉｎ／＋またはＧｒｇ５／ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて有意に変化しなかったが、ＡＰＣｍｉｎマウスよりも少数のポリープである傾向があった。
【０１３１】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおける致死性は、通常、１つ以上の腺腫の進行によって腸閉塞と関連する。したがって、腺腫のサイズは、疾患重症度の重要な決定因子である。本発明者らは、Ｇｒｇ１およびＧｒｇ５過剰発現の非存在または存在下でＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて発生した腸ポリープのサイズを測定した。Ｇｒｇ１を過剰発現するＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて見られた巨大腺腫（＞２ｍｍ）の数は、有意に減少した。Ｇｒｇ５／ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスは、大型腸腺腫の数における同様に強い減少を示さなかった。したがって、全長Ｇｒｏｕｃｈｏタンパク質であるＧｒｇ１の過剰発現は、巨大腺腫の数を減少させた。Ｇｒｇ１／ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスの体重、小腸の長さおよび大腸の長さは、試験された他のグループと比較して有意に異ならなかった。
【０１３２】
肺腫瘍組織量は、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子を有するＧｒｇ１マウスにおいて低下する
Ｇｒｇ１マウスは、１８０日で胸膜表面上に見える８．３＋／−６．０（ｎ＝２８）肺病変を発生する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドへの１世代の交配は、肺腺腫数における有意な変化を生じず、Ｇｒｇ１誘導表現型に対する株特異的効果がなかったことを示す（図１７、列５；７．４＋／−３．１  表面に見える腺腫）。しかしながら、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子の存在は、胸膜表面上および肺連続切片中に見ることができる病変の数を劇的に減少させた（図１７、列５、７）。一般的に、Ｇｒｇ１マウスにおける腺腫は、Ｇｒｇ１／ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて見られるものよりも大きい。高い倍率での腺腫の試験は、２つの遺伝子型間で細胞形態において見える違いは示さなかった。したがって、ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子は、Ｇｒｇ１による肺腺腫の誘導を完全に破壊しないが、肺腫瘍組織量を有意に減少させた。
【０１３３】
材料および方法
マウス系および遺伝子型決定
ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスを生産し、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得られたストックからのＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上に維持した。ｉＺ／ＡＰ−Ｇｒｇ１（２Ｆ１２系）およびｉＺ／ＡＰ−Ｇｒｇ５（Ｈ２系）マウスは、Allen, Tら “Grg1 Acts as a Lung-Specific Oncogene in a Transgenic Mouse Model”, Cancer Res, 66:3, 1294-1301(2006)に記載されている。非切除導入遺伝子を有するマウスは、Ｇｒｇ１ｌａｃＺおよびＧｒｇ５ｌａｃＺと称する。全体的に切除されたｉＺ／ＡＰ−Ｇｒｇ導入遺伝子を有するマウスは、Ｇｒｇ１またはＧｒｇ５と称する。ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子およびｉＺ／ＡＰ−Ｇｒｇ導入遺伝子を有するマウスを作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスを、非切除（ＧｒｇｌａｃＺ）または切除（Ｇｒｇ）導入遺伝子のいずれかを有するＦ２およびＦ３世代ｉＺ／ＡＰ−Ｇｒｇトランスジェニックマウスと交配した。ＡＰＣｍｉｎ対立遺伝子に対する遺伝子型決定は、ietrich, W.Fら “Genetic identification of Mom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse”, Cell, 75:4, 631-639 (1993)に記載されているプライマーおよび条件を使用する競合ＰＣＲにより行った。Ｇｒｇ１およびＧｒｇ５導入遺伝子の存在について、マウスを、耳パンチ組織のｌａｃＺまたはｈＰＬＡＰ染色のいずれかにより遺伝子型同定した。
【０１３４】
腸ポリープおよび肺腺腫の定量
動物を約６月齢で殺した。小腸および大腸を、それぞれのマウスから全体にて取り出し、ＰＢＳでそれらの内容物を流した。腸を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで一晩で固定した。次の日、腸をＰＢＳで洗浄し、７０％エタノール（ｖ／ｖ）に保存した。試験において、固定された腸を、縦方向に開き、ペトリ皿中の硬化３％アガロースの層以下に内腔側をピンで留めた。解剖顕微鏡（２０−４０Ｘ）およびキャリパーの使用で、ポリープ数およびサイズの両方を、小腸および大腸全体に対してスコア化した。ポリープサイズを、それぞれのポリープの最大直径を測定することにより決定した。わずか０．３ｍｍの直径の腸ポリープを、この様式においてスコア化することができた。同じマウス由来の肺を、解剖顕微鏡（１０Ｘ）を使用して、胸膜表面上の腫瘍について試験した。パラフィンに埋め込まれた肺の連続切片を、胸膜表面上に見えない腫瘍について検査を行った。５μｍ切片を、左葉中１００μｍ間隔で切った。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、１００Ｘ倍率で微小腺腫について視覚的にスキャンした。隣接切片上に存在するほど十分な大きさの腺腫は、２回カウントしなかった。１０個の連続切片を、マウスあたりでスコア化した。
【０１３５】
統計分析
分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、ポリープ多様性、小腸の長さ、大腸の長さおよび重さにおける有意な変化について試験するために行った。Ｄｕｎｎ’ｓ試験の後にノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定を、ポリープサイズにおける有意な差異について評価するために使用した。胸膜表面または肺連続切片における腫瘍数の変化の統計的有意性を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を使用して分析した。
【０１３６】
ウェスタンブロッティング
全組織タンパク質抽出物を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５％グリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．８、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、０．５ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、０．７ｍｇ／ｍｌのペプスタチン、２ｍｇ／ｍｌのアプロチニンの冷溶解バッファーを使用して、新たに解剖された組織から作製した。組織を音波処理し、破片を簡単な遠心分離により除去した。上清を新たなチューブに移し、−８０℃で即座に冷凍した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して測定した。ウェスタンブロット分析において、１００μｇの溶解物を１０％ポリアクリルアミドゲル上に流し、ＰＶＤＦ膜に移した。ブロッキングを、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）中の１０％スキムミルク粉末にて一晩で行った。一次および二次抗体の結合は、５％スキムミルク粉末ＴＢＳＴ中であった。Ｇｒｇ５に対するウサギポリクローナル血清を、Ｃ−末端１８アミノ酸ペプチドを使用して作製した。主な市販の抗体は、α−ＴＬＥ１ウサギポリクローナル血清Ｍ−１０１（Santa Cruz Biotechnology)(Husainら 1996）、マウスモノクローナルα−ベータ−ガラクトシダーゼ（Promega）、マウスモノクローナルα−ベータ−アクチンＡＣ−１５（Sigma）、α−ベータ−カテニンＨ−１０２ウサギポリクローナル血清（Santa Cruz Biotechnology）、マウスモノクローナルα−アクティブベータ−カテニン（α−ＡＢＣ）８Ｅ７（Upstate）、およびα−ホスホ−ベータ−カテニン（Ｓｅｒ−３３、３７、Ｔｈｒ−４１）ウサギ抗血清（Cell Signaling）であった。ＨＲＰ結合二次抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。
【０１３７】
免疫染色
脱パラフィン化、再水和および抗原回復後、切片を、α−Ｇｒｇ３／ＴＬＥ２ウサギポリクローナル血清（Santa Cruz Biotechnology）、α−Ｇｒｇ１／ＴＬＥ１ウサギポリクローナル血清、α−ベータ−カテニンウサギポリクローナル血清、α−ＡＢＣマウスモノクローナル抗体またはα−ホスホ−ベータ−カテニン（Ｓｅｒ−３３、３７、Ｔｈｒ−４１）ウサギ抗血清とインキュベートした。次に、切片を、ビオチン化二次抗体、アビジン−ビオチン複合体およびＤＡＢ（Vector Laboratories Inc.）とインキュベートした。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。免疫蛍光において、ヤギα−マウステトラメチルローダミン結合二次抗体（Molecular Probes）を使用した。
【０１３８】
組織化学的染色
固定、ならびに組織および凍結切片の染色は、対比染色はｌａｃＺまたはｈＰＬＡＰ染色凍結切片において使用しなかったことを除いて、Lobe Cら “Z/AP, a double reporter for Cre-mediated Recombination”, Dev. Biol. 208:2 281-292に本質的に記載されていた。
【０１３９】
配列表
配列番号：１
ヒトＴＬＥ１タンパク質
【表２】
2014512515.tif 000004
【０１４０】
配列番号：２
ヒトＴＬＥ２タンパク質
【表３】
2014512515.tif 000005
【０１４１】
配列番号：３
ヒトＴＬＥ３タンパク質
【表４】
2014512515.tif 000006
【０１４２】
配列番号：４
ヒトＴＬＥ４タンパク質
【表５】
2014512515.tif 000007
【０１４３】
配列番号：５
ヒトＴＬＥ５タンパク質
【表６】
2014512515.tif 000008
【０１４４】
配列番号：６
ヒトＴＬＥ１コード配列
【表７】
2014512515.tif 000009
【０１４５】
配列番号：７
ヒトＴＬＥ２コード配列
【表８】
2014512515.tif 000010
【０１４６】
配列番号：８
ヒトＴＬＥ３コード配列
【表９】
2014512515.tif 000011
【０１４７】
配列番号：９
ヒトＴＬＥ４コード配列
【表１０】
2014512515.tif 000012
【０１４８】
配列番号：１０
ヒトＴＬＥ５コード配列
【表１１】
2014512515.tif 000013
【０１４９】
配列番号：１１
マウスＧｒｇ１タンパク質
【表１２】
2014512515.tif 000014
【０１５０】
配列番号：１２
マウスＧｒｇ２タンパク質
【表１３】
2014512515.tif 000015
【０１５１】
配列番号：１３
マウスＧｒｇ３タンパク質
【表１４】
2014512515.tif 000016
【０１５２】
配列番号：１４
マウスＧｒｇ４タンパク質
【表１５】
2014512515.tif 000017
【０１５３】
配列番号：１５
マウスＧｒｇ５タンパク質
【表１６】
2014512515.tif 000018
【０１５４】
配列番号：１６
ヒトＭＤＭ２タンパク質
【表１７】
2014512515.tif 000019
【０１５５】
配列番号：１７
ヒトＭＤＭ２コード配列
【表１８】
2014512515.tif 000020
【０１５６】
配列番号：１８
マウスＧｒｇ１コード配列
【表１９】
2014512515.tif 000021
【０１５７】
配列番号：１９
マウスＧｒｇ２コード配列
【表２０】
2014512515.tif 000022
【０１５８】
配列番号：２０
マウスＧｒｇ３コード配列
【表２１】
2014512515.tif 000023
【０１５９】
配列番号：２１
マウスＧｒｇ４コード配列
【表２２】
2014512515.tif 000024
【０１６０】
配列番号：２２
マウスＧｒｇ５コード配列
【表２３】
2014512515.tif 000025
【図１】
2014512515.tif 000026
【図２】
2014512515.tif 000027
【図３】
2014512515.tif 000028
【図４】
2014512515.tif 000029
【図５】
2014512515.tif 000030
【図６】
2014512515.tif 000031
【図７】
2014512515.tif 000032
【図８】
2014512515.tif 000033
【図９】
2014512515.tif 000034
【図１０】
2014512515.tif 000035
【図１１】
2014512515.tif 000036
【図１２】
2014512515.tif 000037
【図１３】
2014512515.tif 000038
【図１４】
2014512515.tif 000039
【図１５】
2014512515.tif 000040
【図１６】
2014512515.tif 000041
【図１７】
2014512515.tif 000042
【図１８Ａ】
2014512515.tif 000043
【図１８Ｂ】
2014512515.tif 000044
【配列表】
2014512515000001.app
【国際調査報告】
2014512515.tif 000045
2014512515.tif 000046
2014512515.tif 000047
2014512515.tif 000048
2014512515.tif 000049
2014512515.tif 000050
2014512515.tif 000051