(57)【要約】植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法が提供される。この方法は、第１の核酸および第２の核酸を、植物または植物の一部分中に導入するステップを含む。この第１の核酸は、この植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む。この第２の核酸は、この植物において活性でかつ、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む。この植物または植物の一部分は、これらの核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートされ、それによりＶＬＰを生成する。
2014530006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）前記植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を、前記植物または前記植物の一部分中に導入するステップ、
ｂ）前記植物において活性でかつ、チャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップ、
ｃ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記チャネルタンパク質がプロトンチャネルタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロトンチャネルタンパク質が、Ｍ２またはＢＭ２から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロトンチャネルタンパク質が、プロトンチャネルシグネチャー配列ＨＸＸＸＷを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記構造ウイルスタンパク質が、三量体化ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＨＡタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｂ  ＨＡ、Ｃ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群より選択されるインフルエンザ構造タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＢ  ＨＡまたはインフルエンザＨ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
インフルエンザＢ  ＨＡが、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インフルエンザＢ  ＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
インフルエンザＨ３が、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来またはインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号５１および配列番号６１からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号３０、配列番号５４および配列番号６４のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号４１および配列番号５８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３および配列番号４６からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号２５および配列番号４８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の核酸配列が、１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーに動作可能に連結した前記第１の調節領域、前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列、および１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントを含み、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第３の核酸が、前記植物または前記植物の一部分中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーがコモウイルスＵＴＲである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記コモウイルスＵＴＲがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＵＴＲである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントが、マメ黄萎ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＬＩＲ）およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＳＩＲ）から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＢ  ＨＡまたはインフルエンザＨ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
インフルエンザＢ  ＨＡが、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記インフルエンザＢ  ＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
インフルエンザＨ３が、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来またはＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号５１および配列番号６１からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号３０、配列番号５４および配列番号６４のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号４１および配列番号５８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３および配列番号４６からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号２５および配列番号４８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、構造ウイルスタンパク質またはその断片、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールを順番にコードするキメラヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物において一過的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物において安定に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ｄ）前記植物を収穫し、前記ＶＬＰを精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＶＬＰが、ウイルスのマトリックスタンパク質もコアタンパク質も含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）植物または前記植物の一部分中に、前記植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を含み、かつ前記植物において活性でかつ、チャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を含む、前記植物または前記植物の一部分を準備するステップ、
ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記チャネルタンパク質がプロトンチャネルタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロトンチャネルタンパク質が、Ｍ２またはＢＭ２から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法によって生成された、ＶＬＰ。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法によって生成された、ＶＬＰ。
【請求項４３】
植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含む、請求項４１または４２に記載のＶＬＰ。
【請求項４４】
１つまたは複数のウイルスタンパク質が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変されたＮ−グリカンを含む、請求項４１または４２に記載のＶＬＰ。
【請求項４５】
免疫応答を誘発するための有効用量の請求項４１または４２に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項４６】
請求項４１または４２に記載のＶＬＰを投与するステップを含む、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する方法。
【請求項４７】
前記ＶＬＰが、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４１または４２に記載のＶＬＰを使用して調製された、ポリクローナル抗体。
【請求項４９】
請求項１または３８に記載の方法によって生成されたＶＬＰを含む、植物物質。
【請求項５０】
被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発するのに使用するための、請求項４９に記載の植物物質。
【請求項５１】
請求項５０に記載の植物物質を含む、栄養補助食品。
【請求項５２】
第３の核酸配列を導入するステップをさらに含み、前記第３の核酸配列が、サイレンシングのサプレッサーをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
第４の核酸配列を導入するステップをさらに含み、前記第４の核酸配列が、サイレンシングのサプレッサーをコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項５４】
サイレンシングの前記サプレッサーが、群ＨｃＰｒｏおよびｐ１９から選択される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＶＬＰが前記チャネルタンパク質を含まない、請求項１または３８に記載の方法。
【請求項５６】
前記構造ウイルスタンパク質がＨＡ０タンパク質である、請求項１または３８に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｍ２タンパク質が、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４およびインフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９を含む群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５８】
配列番号４１および配列番号５８からなる群より選択される配列のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項５９】
請求項５８に記載のポリペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項６０】
配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列のヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載の核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物においてウイルスタンパク質を生成することに関する。より具体的には、本発明は、植物においてウイルス様粒子を生成することおよびウイルス様粒子の生成を増加させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスによって引き起こされる。これらのウイルスには３つの型が存在し、これらは、３つの異なる型のインフルエンザ：Ａ型、Ｂ型およびＣ型を引き起こす。インフルエンザウイルスＡ型ウイルスは、哺乳動物（ヒト、ブタ、フェレット、ウマ）および鳥類に感染する。これは、世界的パンデミックを引き起こしたウイルスの型であるので、人類にとって非常に重要である。インフルエンザウイルスＢ型（単にインフルエンザＢとしても公知）は、ヒトのみに感染する。これは、インフルエンザの局所的大流行を時折引き起こす。インフルエンザＣウイルスもまた、ヒトのみに感染する。これらは人々が若い場合にほとんどの人々に感染し、重篤な病気を引き起こすことは稀である。
【０００３】
ワクチン接種は、感染前に防御を開始するように被験体を仕向けることによって、類似の要因によって引き起こされる疾患に対する保護を提供する。従来、これは、免疫原としての感染性要因の生弱毒化形態または全不活化形態の使用を介して達成されてきた。全ウイルス（例えば、死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルス）をワクチンとして使用することの危険を回避するために、組換えウイルスタンパク質、例えばサブユニットが、ワクチンとして追及されてきた。ペプチドワクチンおよびサブユニットワクチンの両方は、いくつかの潜在的な制限を受ける。サブユニットワクチンは、不正確な折り畳みまたは乏しい抗原提示のおかげで、乏しい免疫原性を示し得る。主要な問題は、操作されたタンパク質のコンフォメーションがその天然の環境にある抗原のコンフォメーションを模倣することを確実にすることの困難さである。適切なアジュバント、およびペプチドの場合には担体タンパク質が、免疫応答をブーストするために使用されなければならない。さらに、これらのワクチンは、体液性応答を主に惹起し、従って、有効な免疫を誘起できない可能性がある。サブユニットワクチンは、全不活化ウイルスが保護を提供することを実証できる疾患に対して、有効でない場合が多い。
【０００４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、免疫原性組成物中に含めるための潜在的な候補である。ＶＬＰは、成熟ビリオンと密接に類似しているが、ウイルスゲノム材料を含まない。従って、ＶＬＰは、性質が非複製的であり、そのためにワクチンとしての投与に安全なものとなっている。さらに、ＶＬＰは、ＶＬＰの表面上にウイルス糖タンパク質を発現するように操作され得、これは、ＶＬＰの最も天然の生理学的立体配置である。さらに、ＶＬＰはインタクトなビリオンと類似しており、多価粒子状構造であるので、ＶＬＰは、可溶性外被タンパク質抗原よりも糖タンパク質に対する中和抗体を誘発する際により有効であり得る。
【０００５】
ＶＬＰは、植物において（特許文献１（国際公開第２００９／００９８７６号）；特許文献２（国際公開第２００９／０７６７７８号）；特許文献３（国際公開第２０１０／００３２２５号）；特許文献４（国際公開第２０１０／００３２３５号）；特許文献５（国際公開第２０１１／０３５２２号）；特許文献６（国際公開第２０１０／１４８５１１号）；これらは、参照によって本明細書中に組み込まれる）、ならびに昆虫および哺乳動物の系において（Noad,  R.およびRoy,  P.、２００３年、Trends  Microbiol  １１巻:４３８〜４４頁；Neumannら、２０００年、J.  Virol.、７４巻、５４７〜５５１頁）、生成されてきた。LathamおよびGalarza（２００１年、J.  Virol.、７５巻、６１５４〜６１６５頁）は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（neuramindase）（ＮＡ）、Ｍ１およびＭ２遺伝子を同時発現する組換えバキュロウイルスが感染した昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。この研究は、インフルエンザビリオンタンパク質が真核生物細胞における同時発現の際に自己アセンブルすること、およびＭ１マトリックスタンパク質がＶＬＰ生成に必要であったことを実証した。しかし、Gomez-Puertasら、（１９９９年、J.  Gen.  Virol、８０巻、１６３５〜１６４５頁）は、Ｍ２の過剰発現が、ＭＤＣＫ培養物に対するＣＡＴ  ＲＮＡ伝達を完全に遮断したこともまた示した。
【０００６】
Ｍ２はイオンチャネルタンパク質として機能し、このタンパク質が過剰発現される場合、同時発現されたＨＡの細胞内輸送が阻害され、原形質膜における赤血球凝集素（heamaglutinin）（ＨＡ）の蓄積が７５〜８０％低減されることが示されている（Sakaguchiら、１９９６年；HenkelおよびWeisz、１９９８年）。さらに、Ｍ２を過剰発現することによって、原形質膜におけるウイルス膜タンパク質の蓄積が低減され、従って、生成される機能的ＶＬＰの数が劇的に低減される。
【０００７】
Ｍ２タンパク質は、インフルエンザＡ感染細胞の細胞表面において豊富に発現される（Lambら（１９８５年）Cell、４０巻、６２７〜６３３頁）。このタンパク質は、ウイルス粒子自体の膜においても見出されるが、はるかに少ない量であり、ビリオン１つ当たり１４〜６８分子のＭ２である(ZebedeeおよびLamb（１９８８年）J.  Virol.  ６２巻、２７６２〜７２頁）。このＭ２タンパク質は、５０位のシステイン上でのパルミチン酸の付加によって翻訳後修飾される（Sugrueら（１９９０年）Virology  １７９巻、５１〜５６頁）。
【０００８】
このＭ２タンパク質は、非共有相互作用によって一緒になった、２つのジスルフィド連結した二量体から構成されるホモ四量体である（SugrueおよびHay(１９９１年)Virology  １８０巻、６１７〜６２４頁）。部位特異的変異誘発によって、HolsingerおよびLamb、（１９９１年）Virology  １８３巻、３２〜４３頁は、１７位および１９位のシステイン残基が、ジスルフィド架橋の形成に関与することを実証した。１７位のシステインだけが、分析した全てのウイルス中に存在する。システイン１９もまた存在するウイルス株では、第２のジスルフィド架橋が同じ二量体（Ｃｙｓ１７−Ｃｙｓ１７によって既に連結されている）中で形成されるか他の二量体と形成されるかは知られていない。
【０００９】
Smithら（特許文献７（米国特許出願公開第２０１０／０１４３３９３号））およびSongら（Plos  ONE  ２０１１年６巻（１号）:ｅ１４５３８頁）は、インフルエンザＭ２タンパク質を含むワクチンおよびＶＬＰを記載している。ＶＬＰは、Ｍ１などの少なくとも１つのウイルスコアタンパク質を含む。このコアタンパク質は、昆虫宿主細胞からの粒子の出芽および放出を駆動する。
【００１０】
Szecsiら（Virology  Journal、２００６年、３巻:７０頁）は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）から誘導された複製欠損コア粒子上にＶＬＰをアセンブルした。操作されたインフルエンザＶＬＰは、細胞表面ウイルス成分（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２）および内部ウイルス成分（Ｇａｇ、ＧＦＰマーカーゲノム）を一過的に同時発現することによって誘導され、それらの表面に、Ｈ７Ｎ１またはＨ５Ｎ１ウイルスから誘導されたＨＡ、ＨＡおよびＮＡもしくはＭ２のいずれか、または３つ全てのタンパク質を保有する。Szecsiらによれば、Ｆｌｕ−ＶＬＰ生成の間のＭ２の発現は、ウイルス粒子上へのＨＡまたはＮＡの組み込みに影響を与えなかった（Szecsiら中の２頁目、右欄、第２段落）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９／００９８７６号
【特許文献２】国際公開第２００９／０７６７７８号
【特許文献３】国際公開第２０１０／００３２２５号
【特許文献４】国際公開第２０１０／００３２３５号
【特許文献５】国際公開第２０１１／０３５２２号
【特許文献６】国際公開第２０１０／１４８５１１号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１０／０１４３３９３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、植物においてウイルスタンパク質を生成することに関する。より具体的には、本発明は、植物においてウイルス様粒子を生成することおよびウイルス様粒子の生成を増加させることに関する。
【００１３】
本発明の目的は、植物においてウイルス様粒子の生成を増加させるための改善された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法（Ａ）であって、
ａ）この植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を、この植物または植物の一部分中に導入するステップ、
ｂ）この植物において活性でかつ、チャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップ、
ｃ）これらの核酸の発現を可能にする条件下でこの植物または植物の一部分をインキュベートすることによって、ＶＬＰを生成するステップ、
を含む方法が提供される。植物において活性な第１の調節領域および植物において活性な第２の調節領域は、同じでも異なっていてもよい。
【００１５】
上記方法（Ａ）のチャネルタンパク質は、プロトンチャネルタンパク質であり得る。このプロトンチャネルタンパク質は、Ｍ２またはＢＭ２から選択され得る。さらに、このプロトンチャネルタンパク質は、プロトンチャネルシグネチャー配列ＨＸＸＸＷを含み得る。このＭ２タンパク質は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（配列番号１４）からまたはインフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（配列番号１１）から得られたＭ２タンパク質であり得る。
【００１６】
本発明は、構造ウイルスタンパク質が三量体化ドメインを含む、上記方法（Ａ）もまた提供する。さらに、この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、抗原性ウイルスタンパク質またはその断片、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールを順番にコードするキメラヌクレオチド配列を含む。この構造ウイルスタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質を含み得る。さらに、このインフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループは、欠失され得る。
【００１７】
本発明は、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、Ｂ  ＨＡ、Ｃ、ＨＡ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群より選択され得る、上記方法（Ａ）を提供する。例えば、この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｂ型ＨＡまたはＨ３であり得る。この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４もしくはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡ、またはインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９もしくはＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３であり得る。さらに、この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３、２８、４３、４６、５１、５７または６１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。この構造ウイルスタンパク質の配列はまた、配列番号２５、３０、４１、４８、５４、５８または６４の配列を含み得る。
【００１８】
本発明は、第１の核酸配列が、１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーに動作可能に連結した第１の調節領域、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントを含み、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第３の核酸が、植物または植物の一部分中に導入される、上記方法（Ａ）もまた含む。この１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーは、コモウイルスＵＴＲ、例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ  ５’および／または３’ＵＴＲなどのササゲモザイクウイルス高翻訳可能（hyperanslatable）（ＣＰＭＶ−ＨＴ）ＵＴＲであり得る。１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントは、マメ黄萎ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＬＩＲ）、およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＳＩＲ）から選択され得る。さらに、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｂ型ＨＡまたはＨ３であり得る、例えば、この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３、２８、４３、４６、５１、５７または６１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し得る。この構造ウイルスタンパク質の配列はまた、配列番号２５、３０、４１、４８、５４、５８または６４の配列を含み得る。
【００１９】
上記方法（方法Ａ）は、ＨｃＰｒｏまたはｐ１９などのサイレンシングのサプレッサーをコードする別の核酸配列を導入するステップもまた含み得る。
【００２０】
本発明は、導入するステップ（ステップａ）において、核酸が植物において一過的に発現される、上記方法（Ａ）もまた含む。あるいは、導入するステップ（ステップａ）において、核酸は植物において安定に発現される。
【００２１】
上記方法（Ａ）は、
ｄ）植物を収穫し、ＶＬＰを精製するステップをさらに含み得る。
【００２２】
本発明は、このＶＬＰがウイルスのマトリックスタンパク質もコアタンパク質も含まない、上記方法（Ａ）もまた含む。
【００２３】
本発明は、上記方法（Ａ）によって生成されたＶＬＰを提供する。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含み得る。このＶＬＰは、チャネルタンパク質を含まないことによっても特徴付けられ得る。さらに、ＶＬＰの構造ウイルスタンパク質は、ＨＡ０タンパク質であり得る。このＶＬＰの１つまたは複数のウイルスタンパク質は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変されたＮ−グリカンを含み得るＶＬＰから構成される。本発明は、このＶＬＰを使用して調製されたポリクローナル抗体もまた提供する。
【００２４】
本発明は、免疫応答を誘発するための有効用量の上記ＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物を含む。
【００２５】
本発明は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する方法であって、上記ＶＬＰを被験体に投与するステップを含む方法もまた含む。このＶＬＰは、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与され得る。
【００２６】
本発明は、上記方法（Ａ）によって生成されたＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発するのに使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
【００２７】
本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法（Ｂ）であって、
ａ）植物またはこの植物の一部分中に、この植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を含み、かつこの植物において活性でかつ、チャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を含む、植物または植物の一部分を準備するステップ、
ｂ）これらの核酸の発現を可能にする条件下でこの植物または植物の一部分をインキュベートすることによって、ＶＬＰを生成するステップ、
を含む方法もまた提供する。
植物において活性な第１の調節領域および植物において活性な第２の調節領域は、同じでも異なっていてもよい。
【００２８】
上記方法（Ｂ）のチャネルタンパク質は、プロトンチャネルタンパク質であり得る。このプロトンチャネルタンパク質は、Ｍ２またはＢＭ２から選択され得る。さらに、このプロトンチャネルタンパク質は、プロトンチャネルシグネチャー配列ＨＸＸＸＷを含み得る。
【００２９】
本発明は、構造ウイルスタンパク質が三量体化ドメインを含む、上記方法（Ｂ）もまた提供する。さらに、この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、抗原性ウイルスタンパク質またはその断片、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールを順番にコードするキメラヌクレオチド配列を含む。この構造ウイルスタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質を含み得る。さらに、このインフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループは、欠失され得る。
【００３０】
本発明は、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、Ｂ  ＨＡ、Ｃ、ＨＡ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群より選択され得る、上記方法（Ｂ）を提供する。例えば、この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｂ型ＨＡまたはＨ３であり得る。この構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４もしくはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡ、またはインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９もしくはＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３であり得る。
【００３１】
本発明は、第１の核酸配列が、１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーに動作可能に連結した第１の調節領域、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントを含み、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第３の核酸が、植物または植物の一部分中に導入される、上記方法（Ｂ）もまた含む。この１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーは、コモウイルスＵＴＲ、例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ  ５’および／または３’ＵＴＲなどのササゲモザイクウイルス高翻訳可能（ＣＰＭＶ−ＨＴ）ＵＴＲであり得る。さらに、１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントは、マメ黄萎ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＬＩＲ）、およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＳＩＲ）から選択され得る。
【００３２】
上記方法（方法Ｂ）は、ＨｃＰｒｏまたはｐ１９などのサイレンシングのサプレッサーをコードする別の核酸配列を導入するステップもまた含み得る。
【００３３】
本発明は、導入するステップ（ステップａ）において、核酸が植物において一過的に発現される、上記方法（Ｂ）もまた含む。あるいは、導入するステップ（ステップａ）において、核酸は植物において安定に発現される。
【００３４】
上記方法（Ｂ）は、
ｄ）植物を収穫し、ＶＬＰを精製するステップをさらに含み得る。
【００３５】
本発明は、このＶＬＰがウイルスのマトリックスタンパク質もコアタンパク質も含まない、上記方法（Ｂ）もまた含む。
【００３６】
本発明は、上記方法（Ｂ）によって生成されたＶＬＰを提供する。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含み得る。このＶＬＰは、チャネルタンパク質を含まないことによっても特徴付けられ得る。さらに、ＶＬＰの構造ウイルスタンパク質は、ＨＡ０タンパク質であり得る。このＶＬＰの１つまたは複数のウイルスタンパク質は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変されたＮ−グリカンを含み得るＶＬＰから構成される。本発明は、このＶＬＰを使用して調製されたポリクローナル抗体もまた提供する。
【００３７】
本発明は、免疫応答を誘発するための有効用量の上記方法（Ｂ）によって作製されたＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物を含む。
【００３８】
本発明は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、上記ＶＬＰを被験体に投与するステップを含む方法もまた含む。このＶＬＰは、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与され得る。
【００３９】
本発明は、上記方法（Ｂ）によって生成されたＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するのに使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
【００４０】
本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列（タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡ）を含むポリペプチド、および配列番号４１のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。この核酸配列は、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み得る。本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むＶＬＰを提供する。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含み得る。このＶＬＰは、チャネルタンパク質を含まないことによっても特徴付けられ得る。このＶＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変されたＮ−グリカンを含み得る。本発明は、免疫応答を誘発するための有効用量の配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物を提供する。本発明は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する方法であって、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬＰを被験体に投与するステップを含む方法もまた含む。このＶＬＰは、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与され得る。本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発するのに使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
【００４１】
構造ウイルスタンパク質を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質と共に同時発現させることによって、増加した収量の構造ウイルスタンパク質およびＶＬＰが観察される。ＨＡは、ｐＨ依存的なコンフォメーション変化を受けることが公知である。理論に束縛されることは望まないが、成熟化および移動の間のＨＡ生成細胞のゴルジ体内のｐＨは、ＨＡの折り畳みに影響を与え得、ＨＡの安定性をもたらし得、ＨＡの分解を増加させ得るか、それらの組合せであり得る。例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をＨＡと共に同時発現させることによって、ゴルジ体内のｐＨは増加し得、安定性の増加、分解の低減、またはそれらの組合せを生じ得、ＨＡ収量を増加させ得る。
【００４２】
本発明の概要は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載しているわけではない。
【００４３】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面について言及する以下の説明からより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１−１】図１Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（配列番号３）を示す。図１Ｃは、構築物１１９１の模式的表示を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。図１Ｆは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
【図１−２】図１Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（配列番号３）を示す。図１Ｃは、構築物１１９１の模式的表示を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。図１Ｆは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
【図１−３】図１Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（配列番号３）を示す。図１Ｃは、構築物１１９１の模式的表示を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。図１Ｆは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
【図１−４】図１Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（配列番号３）を示す。図１Ｃは、構築物１１９１の模式的表示を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。図１Ｆは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
【図１−５】図１Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（配列番号３）を示す。図１Ｃは、構築物１１９１の模式的表示を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。図１Ｆは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
【図２−１】図２Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（配列番号７）を示す。図２Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（配列番号８）を示す。図２Ｃは、合成されたＭ２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ５０８８６０由来の７１５〜９８２に接続されたｎｔ１〜２６に対応する）（配列番号９）を示す。図２Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１２６１を示す。インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１０）。図２Ｅは、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図２−２】図２Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（配列番号７）を示す。図２Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（配列番号８）を示す。図２Ｃは、合成されたＭ２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ５０８８６０由来の７１５〜９８２に接続されたｎｔ１〜２６に対応する）（配列番号９）を示す。図２Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１２６１を示す。インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１０）。図２Ｅは、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図３−１】図３Ａは、合成されたＭ２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ４６７８２４由来のｎｔ７４０〜１００７に接続されたｎｔ２６〜５１に対応する）（配列番号１２）を示す。図３Ｂは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号８５９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１３）。図３Ｃは、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図３−２】図３Ａは、合成されたＭ２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ４６７８２４由来のｎｔ７４０〜１００７に接続されたｎｔ２６〜５１に対応する）（配列番号１２）を示す。図３Ｂは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号８５９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１３）。図３Ｃは、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図４−１】図４Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ２＋４ｃ（配列番号１５）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ１−４ｒ（配列番号１６）を示す。図４Ｃは、合成されたＨ１遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６６９７４）（配列番号１７）を示す。図４Ｄは、構築物１１９２の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図４Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９２を示す。プラストシアニン（Plastocyanine）−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号１８）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号４８４を示す。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ１に下線を付す（配列番号１９）。図４Ｇは、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図４−２】図４Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ２＋４ｃ（配列番号１５）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ１−４ｒ（配列番号１６）を示す。図４Ｃは、合成されたＨ１遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６６９７４）（配列番号１７）を示す。図４Ｄは、構築物１１９２の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図４Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９２を示す。プラストシアニン（Plastocyanine）−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号１８）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号４８４を示す。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ１に下線を付す（配列番号１９）。図４Ｇは、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図４−３】図４Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ２＋４ｃ（配列番号１５）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ１−４ｒ（配列番号１６）を示す。図４Ｃは、合成されたＨ１遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６６９７４）（配列番号１７）を示す。図４Ｄは、構築物１１９２の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図４Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９２を示す。プラストシアニン（Plastocyanine）−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号１８）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号４８４を示す。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ１に下線を付す（配列番号１９）。図４Ｇは、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図４−４】図４Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ２＋４ｃ（配列番号１５）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ１−４ｒ（配列番号１６）を示す。図４Ｃは、合成されたＨ１遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６６９７４）（配列番号１７）を示す。図４Ｄは、構築物１１９２の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図４Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９２を示す。プラストシアニン（Plastocyanine）−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号１８）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号４８４を示す。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ１に下線を付す（配列番号１９）。図４Ｇは、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図４−５】図４Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ２＋４ｃ（配列番号１５）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ１−４ｒ（配列番号１６）を示す。図４Ｃは、合成されたＨ１遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６６９７４）（配列番号１７）を示す。図４Ｄは、構築物１１９２の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図４Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９２を示す。プラストシアニン（Plastocyanine）−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号１８）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号４８４を示す。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ１に下線を付す（配列番号１９）。図４Ｇは、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図５−１】図５Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｃ（配列番号２１）を示す。図５Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｒ（配列番号２２）を示す。図５Ｃは、合成されたＨ３遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＧＱ２９３０８１由来のｎｔ２６〜１７２６に対応する）（配列番号２３）を示す。図５Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０１９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３に下線を付す（配列番号２４）。図５Ｅは、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図５−２】図５Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｃ（配列番号２１）を示す。図５Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｒ（配列番号２２）を示す。図５Ｃは、合成されたＨ３遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＧＱ２９３０８１由来のｎｔ２６〜１７２６に対応する）（配列番号２３）を示す。図５Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０１９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３に下線を付す（配列番号２４）。図５Ｅは、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図５−３】図５Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｃ（配列番号２１）を示す。図５Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｒ（配列番号２２）を示す。図５Ｃは、合成されたＨ３遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＧＱ２９３０８１由来のｎｔ２６〜１７２６に対応する）（配列番号２３）を示す。図５Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０１９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３に下線を付す（配列番号２４）。図５Ｅは、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図６−１】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−２】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−３】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−４】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−５】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−６】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−７】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図６−８】図６Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号２６）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号２７）を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号２８）を示す。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号２９）。図６Ｅは、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図６Ｆは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図６Ｇは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。図６Ｈは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
【図７−１】図７Ａは、プライマーｄＴｍＨ５Ｉ−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号３３）を示す。図７Ｂは、プライマーＢ  Ｂｒｉｓ−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｃ（配列番号３４）を示す。図７Ｃは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａＳ４−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｒ（配列番号３５）を示す。図７Ｄは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００９を示す。ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴに下線を付す（配列番号３６）。図７Ｅは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図７−２】図７Ａは、プライマーｄＴｍＨ５Ｉ−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号３３）を示す。図７Ｂは、プライマーＢ  Ｂｒｉｓ−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｃ（配列番号３４）を示す。図７Ｃは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａＳ４−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｒ（配列番号３５）を示す。図７Ｄは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００９を示す。ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴに下線を付す（配列番号３６）。図７Ｅは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図７−３】図７Ａは、プライマーｄＴｍＨ５Ｉ−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号３３）を示す。図７Ｂは、プライマーＢ  Ｂｒｉｓ−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｃ（配列番号３４）を示す。図７Ｃは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａＳ４−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｒ（配列番号３５）を示す。図７Ｄは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００９を示す。ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴに下線を付す（配列番号３６）。図７Ｅは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図８−１】図８Ａは、プライマー１０３９＋１０５９．ｒ（配列番号３８）を示す。図８Ｂは、プライマー１０３９＋１０５９．ｃ（配列番号３９）を示す。図８Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０５９を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号４０）。図８Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。図８Ｅは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのヌクレオチド配列（配列番号４３）を示す。
【図８−２】図８Ａは、プライマー１０３９＋１０５９．ｒ（配列番号３８）を示す。図８Ｂは、プライマー１０３９＋１０５９．ｃ（配列番号３９）を示す。図８Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０５９を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号４０）。図８Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。図８Ｅは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのヌクレオチド配列（配列番号４３）を示す。
【図８−３】図８Ａは、プライマー１０３９＋１０５９．ｒ（配列番号３８）を示す。図８Ｂは、プライマー１０３９＋１０５９．ｃ（配列番号３９）を示す。図８Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０５９を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号４０）。図８Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。図８Ｅは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのヌクレオチド配列（配列番号４３）を示す。
【図９】図９は、構築物番号１００８のプラスミドマップを示す。構築物番号１００８は、インフルエンザ株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現を指向する。この構築物は、ＤＮＡ増幅のためのＢｅＹＤＶ由来エレメントを含む。
【図１０】図１０は、構築物番号１００９のプラスミドマップを示す。構築物番号１００９は、その膜貫通ドメインおよびサイトゾル側末端がインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５由来のＨ５のもので置き換えられた、インフルエンザ株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のキメラＨＡの発現を指向する。この構築物は、ＤＮＡ増幅のためのＢｅＹＤＶ由来のエレメントを含む。
【図１１】図１１は、構築物番号１０２９のプラスミドマップを示す。構築物番号１０２９は、インフルエンザ株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現を指向する。
【図１２】図１２は、構築物番号１０５９のプラスミドマップを示す。構築物番号１０５９は、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザ株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現を指向する。この構築物は、ＤＮＡ増幅のためのＢｅＹＤＶ由来のエレメントを含む。
【図１３】図１３は、構築物番号１０１９のプラスミドマップを示す。構築物番号１０１９は、インフルエンザ株Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来の野生型の発現を指向する。
【図１４】図１４は、構築物番号４８４のプラスミドマップを示す。構築物番号４８４は、インフルエンザ株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型Ｈ１の発現を指向する。
【図１５】図１５は、構築物番号４８９のプラスミドマップを示す。構築物番号４８９は、インフルエンザ株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来の野生型Ｈ５の発現を指向する。
【図１６】図１６は、構築物番号１２６１のプラスミドマップを示す。構築物番号１２６１は、インフルエンザ株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型Ｍ２の発現を指向する。
【図１７】図１７は、構築物番号８５９のプラスミドマップを示す。構築物番号８５９は、インフルエンザ株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型Ｍ２の発現を指向する。
【図１８】図１８は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡが、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と同時発現される。「Ｃ＋」：陽性対照、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｏｏｄｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ由来の半精製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ウイルス；「Ｃ−」：陰性対照、モック浸潤した植物；「１００８」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１００８＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ｍ２との同時発現；「１００９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のキメラＨＡの、Ｍ２との同時発現；「１０２９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の非存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１０２９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の非存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。
【図１９】図１９は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン「Ｃ＋」：陽性対照、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｏｏｄｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ由来の半精製されたＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１５／２００９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス；「Ｃ−」：陰性対照、モック浸潤した植物；「１０１９」：Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来の野生型ＨＡの発現；「１０１９＋１２６１」：Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。
【図２０】図２０は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン「Ｃ＋」：陽性対照、ＮＩＢＳＣウイルス（ＮＩＢＳＣコード０９／１４６）由来の半精製されたＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ＮＹＭＣ  Ｘ−１７９Ａ；「Ｃ−」：陰性対照、モック浸潤した植物；「４８４」：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型ＨＡの発現；「４８４＋１２６１」：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。
【図２１】図２１は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン「Ｃ＋」：陽性対照、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５由来の精製された組換えＨ５、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（製品番号ＩＴ−００３−０５２ｐ）；「Ｃ−」：陰性対照、モック浸潤した植物；「４８９」：Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）由来の野生型ＨＡの発現；「４８９＋１２６１」：Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。
【図２２】図２２Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。「１００８」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１００８＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。３つの別個の浸潤由来の植物を分析した（Ａ、ＢおよびＣ）。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。図２２Ｂは、ＨＡ生成植物由来の粗製タンパク質抽出物の赤血球凝集能の比較を示す。
【図２３】図２３は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。図２３Ａ：「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。「１０５９＋８５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４由来のＭ２との同時発現。３つの別個の浸潤由来の植物を分析した（Ａ、ＢおよびＣ）。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。図２３Ｂ：「１０１９」：Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来の野生型ＨＡの発現；「１０１９＋１２６１」：Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；「１０１９＋８５９」：Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４由来のＭ２との同時発現。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。
【図２４】図２４は、いくつかの株のインフルエンザ由来のＨＡの配列アラインメントを示す。前駆体ＨＡ０の切断部位を矢印で示す。
【図２５−１】図２５Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．Ｓ２＋４ｃ（配列番号４４）を示す。図２５Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号４５）を示す。図２５Ｃは、合成されたＨ３遺伝子のヌクレオチド配列（ＧＩＳＡＩＤ単離体番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０１５０６  ＨＡ配列由来のｎｔ２５〜１７２５に対応する）（配列番号４６）を示す。図２５Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１３９１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３に下線を付す（配列番号４７）。図２５Ｅは、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。図２５Ｆは、構築物１３９１の模式的表示を示す。
【図２５−２】図２５Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．Ｓ２＋４ｃ（配列番号４４）を示す。図２５Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号４５）を示す。図２５Ｃは、合成されたＨ３遺伝子のヌクレオチド配列（ＧＩＳＡＩＤ単離体番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０１５０６  ＨＡ配列由来のｎｔ２５〜１７２５に対応する）（配列番号４６）を示す。図２５Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１３９１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３に下線を付す（配列番号４７）。図２５Ｅは、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。図２５Ｆは、構築物１３９１の模式的表示を示す。
【図２５−３】図２５Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．Ｓ２＋４ｃ（配列番号４４）を示す。図２５Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号４５）を示す。図２５Ｃは、合成されたＨ３遺伝子のヌクレオチド配列（ＧＩＳＡＩＤ単離体番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０１５０６  ＨＡ配列由来のｎｔ２５〜１７２５に対応する）（配列番号４６）を示す。図２５Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１３９１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３に下線を付す（配列番号４７）。図２５Ｅは、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ−Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。図２５Ｆは、構築物１３９１の模式的表示を示す。
【図２６−１】図２６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。図２６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。図２６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図２６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。図２６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。図２６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。図２６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。図２６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
【図２６−２】図２６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。図２６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。図２６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図２６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。図２６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。図２６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。図２６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。図２６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
【図２６−３】図２６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。図２６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。図２６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図２６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。図２６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。図２６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。図２６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。図２６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
【図２６−４】図２６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。図２６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。図２６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図２６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。図２６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。図２６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。図２６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。図２６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
【図２６−５】図２６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。図２６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。図２６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図２６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。図２６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。図２６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。図２６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。図２６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
【図２６−６】図２６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。図２６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。図２６Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図２６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。図２６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。図２６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。図２６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。図２６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
【図２７−１】図２７Ａは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｒ（配列番号５５）を示す。図２７Ｂは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｃ（配列番号５６）を示す。図２７Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６７のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５７）。図２７Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。図２７Ｅは、構築物１４６７の模式的表示を示す。
【図２７−２】図２７Ａは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｒ（配列番号５５）を示す。図２７Ｂは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｃ（配列番号５６）を示す。図２７Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６７のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５７）。図２７Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。図２７Ｅは、構築物１４６７の模式的表示を示す。
【図２７−３】図２７Ａは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｒ（配列番号５５）を示す。図２７Ｂは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｃ（配列番号５６）を示す。図２７Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６７のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５７）。図２７Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。図２７Ｅは、構築物１４６７の模式的表示を示す。
【図２８−１】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２８−２】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２８−３】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２８−４】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２８−５】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２８−６】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２８−７】図２８Ａは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（配列番号５９）を示す。図２８Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（配列番号６０）を示す。図２８Ｃは、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する）を示す図であり、Ｔ７５９Ｃ変異およびＣ８８８Ｇ変異に下線を付す（配列番号６１）。図２８Ｄは、構築物１９４の模式的表示を示す図であり、プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。図２８Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号６２）。図２８Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１６３１のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡに下線を付す（配列番号６３）。図２８Ｇは、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ−ＨＡのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。図２８Ｈは、構築物１６３１の模式的表示を示す。
【図２９】図２９は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＨＡを、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と同時発現させる。１レーン当たり２０マイクログラムのタンパク質抽出物をロードした。「Ｃ＋」：陽性対照、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ由来の半精製されたＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウイルス；「１６３１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来の野生型ＨＡの発現；「１６３１＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来の野生型ＨＡの、Ｍ２との同時発現。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。
【図３０】図３０Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡを、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と同時発現させる。１レーン当たり１０マイクログラムのタンパク質抽出物をロードした。「Ｃ＋」：陽性対照、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ由来の半精製されたＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０ウイルス；「１４６２」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の野生型ＨＡの発現；「１４６７」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の変異体ＨＡの発現；「１４６２＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の野生型ＨＡの、Ｍ２との同時発現；「１４６７＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の変異体ＨＡの、Ｍ２との同時発現。比は、発現実験および同時発現実験において使用した各Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物についての光学密度を示す。図３０Ｂは、ＡＧＬ１／１４６２、ＡＧＬ１／１４６７、ＡＧＬ１／１４６２＋ＡＧＬ１／１２６１およびＡＧＬ１／１４６７＋ＡＧＬ１／１２６１で形質転換した植物由来の粗製タンパク質抽出物の赤血球凝集能の比較を示す。
【図３１】図３１は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｈ３／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨＡを、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と同時発現させる。１レーン当たり２０マイクログラムのタンパク質抽出物をロードした。「Ｃ＋」：陽性対照、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｏｏｄｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ由来の半精製されたＨ３／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１５／２００９ウイルス；「１３９１」：Ｈ３／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の野生型ＨＡの発現；「１３９１＋１２６１」：Ｈ３／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の野生型ＨＡの、Ｍ２との同時発現。比は、発現実験および同時発現実験において使用した各Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物についての光学密度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
以下の記載は、好ましい実施形態の記載である。
【００４６】
本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびに植物においてＶＬＰを生成する方法ならびにＶＬＰの収量および生成を増加させる方法に関する。
【００４７】
本発明は、植物または植物の一部分においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法を一部提供する。この方法は、第１の核酸および第２の核酸をこの植物中に導入するステップを含む。第１の核酸は、この植物または植物の一部分において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む。第２の核酸は、この植物において活性でかつ、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む。この第１の調節領域および第２の調節領域は、同じでも異なっていてもよい。この植物または植物の一部分は、これらの核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートされ、それによりＶＬＰを生成する。所望の場合、この植物または植物の一部分が収穫され得、ＶＬＰが精製され得る。好ましくは、このＶＬＰは、Ｍ１も、ウイルスのマトリックスタンパク質もコアタンパク質も含まない。本発明は、この方法によって生成されたＶＬＰもまた提供する。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質を含み得る。このＶＬＰは、免疫応答を誘発するための有効用量のＶＬＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物を調製するために使用され得る。
【００４８】
本発明は、上記第１の核酸および第２の核酸を発現させることによって生成されたＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する際に使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
【００４９】
本発明のＶＬＰは、上記第１の核酸および第２の核酸を含む植物または植物の一部分を準備し、この第１の核酸および第２の核酸の発現を可能にする条件下でこの植物または植物の一部分をインキュベートすることによってＶＬＰを生成することによっても、生成され得る。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質を含み得る。このＶＬＰは、免疫応答を誘発するための有効用量のＶＬＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物を調製するために使用され得る。本発明は、第１の核酸および第２の核酸を発現させることによって生成されたＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する際に使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
【００５０】
本発明のＶＬＰは、１つまたは複数のウイルスタンパク質を含む。例えば、限定とはみなされないが、この１つまたは複数のウイルスタンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）などの構造ウイルスタンパク質、または例えばＭ２などのプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質であり得る。ＨＡは、任意のＨＡ、例えば、国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号；国際公開第２０１０／００３２３５号；国際公開第２０１１／０３５２２号；これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるような、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型ＨＡであり得る。
【００５１】
以下により詳細に記載するように、ＶＬＰは、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸と共に同時発現させることによって、植物において生成され得る。この第１の核酸および第２の核酸は、同じステップで植物に導入され得るか、または連続的に植物に導入され得る。この第１の核酸および第２の核酸は、一過的な様式または安定な様式で植物において導入され得る。さらに、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸を発現する植物は、第１の核酸および第２の核酸の両方がこの植物において同時発現されるように、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質（第２の核酸）で形質転換され得る。あるいは、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質（第２の核酸）を発現する植物は、第１の核酸および第２の核酸の両方がこの植物において同時発現されるように、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸で形質転換され得る。さらに、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸を発現する第１の植物が、ウイルスタンパク質および例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をそれぞれコードする第１の核酸および第２の核酸を同時発現する後代植物を生成するために、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸を発現する第２の植物と交雑され得る。
【００５２】
本発明は、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸と共に同時発現させることによって、植物におけるウイルスタンパク質の発現および収量を増加させる方法もまた提供する。この第１の核酸および第２の核酸は、同じステップで植物に導入され得るか、または連続的に植物に導入され得る。この第１の核酸および第２の核酸は、一過的な様式または安定な様式で植物において導入され得る。さらに、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸を発現する植物は、第１の核酸および第２の核酸の両方がこの植物において同時発現されるように、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質（第２の核酸）で形質転換され得る。あるいは、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質（第２の核酸）を発現する植物は、第１の核酸および第２の核酸の両方がこの植物において同時発現されるように、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸で形質転換され得る。さらに、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸を発現する第１の植物が、ウイルスタンパク質および例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をそれぞれコードする第１の核酸および第２の核酸を同時発現する後代植物を生成するために、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸を発現する第２の植物と交雑され得る。
【００５３】
チャネルタンパク質
「チャネルタンパク質」は、膜を介したイオンおよび／または小分子の横断を可能にする、リン脂質膜を横切るチャネルを形成することが可能なタンパク質を意味する。チャネルタンパク質は、イオンおよび／または小分子のサイズおよび／または電荷について選択的であり得る。チャネルタンパク質の非限定的な例は、低分子量化合物に対する膜の透過性を変更する非特異的チャネルタンパク質、および例えばクロライドチャネル、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネルおよびプロトンチャネルなどのイオンチャネルタンパク質である。
【００５４】
「プロトンチャネルタンパク質」は、リン脂質二重層を横切るプロトン選択的チャネルを形成することが可能なタンパク質を意味する。プロトンチャネルタンパク質は、疎水性ドメインが隣接する膜貫通（ＴＭ）ドメインを有する１回膜貫通型膜タンパク質であり得る。プロトンチャネルのＴＭドメインは、配列ＨＸＸＸＷ（配列番号１）を含み得る。
【００５５】
ＨＡ０の切断後、ＨＡは、ｐＨに対して感受性になり、エンドソームのｐＨ（＜ｐＨ６．０）において不可逆的なコンフォメーション変化を受ける。前駆体ＨＡ０のコンフォメーションは、低いｐＨで安定であるが、切断されたＨＡ１−ＨＡ２形態は準安定である（Bullough  PAら、１９９４年、Nature.３７１巻:３７〜４３頁）。異なるＨＡにおいてコンフォメーション変化を誘発するｐＨ閾値に関する研究は、この閾値が、Ｂ株についてはおよそｐＨ５．８〜５．９であるが、Ａ型ＨＡについてはより酸性（ｐＨ５．１〜５．３）であることを示している（Beyer  WEPら、１９８６年、Archives  Virol、９０巻:１７３頁）。植物バイオマスの抽出（５〜６の間のｐＨ）の間、ＨＡ１−ＨＡ２のコンフォメーション変化は、Ｂ型ＨＡでも生じ得る。
【００５６】
理論に束縛されることは望まないが、ゴルジ体が含まれる、ＨＡを含む細胞区画のｐＨは従って、ＨＡの折り畳み、安定性および／またはタンパク質分解に重要であり得る。例えばインフルエンザＭ２タンパク質およびＢＭ２タンパク質などのプロトンチャネルタンパク質は、細胞区画におけるｐＨを調節し得る。例えば、Ｍ２は、インフルエンザウイルス複製の後期段階および初期段階の両方において細胞内区画を緩衝化することによって、膜融合の増強を調節する。ウイルス粒子のエンドサイトーシス取り込み後の新たな細胞の感染の初期には、Ｍ２プロトンチャネル活性の活性化が、脱コート化プロセスの間のビリオンの内部の酸性化を導く。ウイルス生成の間の感染の後期には、Ｍ２は、トランスゴルジ網を介した移行の間にｐＨを上昇させるように作用し、同時輸送されたタンパク質、例えばインフルエンザの場合にはＨＡの低ｐＨ誘発される不活化を防止する。構造ウイルスタンパク質を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質と共に同時発現させることによって、増加した収量の構造ウイルスタンパク質およびＶＬＰが観察される。ＨＡは、ｐＨ依存的なコンフォメーション（confirmation）変化を受けることが公知である。理論に束縛されることは望まないが、成熟化および移動の間のＨＡ生成細胞のゴルジ体内のｐＨは、ＨＡの折り畳みに影響を与え得、ＨＡの安定性をもたらし得、ＨＡの分解を増加させ得るか、それらの組合せであり得る。例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をＨＡと共に同時発現させることによって、ゴルジ体内のｐＨは増加し得、安定性の増加、分解の低減、またはそれらの組合せを生じ得、ＨＡおよび／またはＶＬＰの発現レベルおよび収量を増加させ得る。
【００５７】
構造ウイルスタンパク質を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質と共に植物において同時発現させることによって、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質の同時発現なしに構造ウイルスタンパク質を発現する植物と比較した場合に、増加した収量の構造ウイルスタンパク質および／またはＶＬＰが観察される。
【００５８】
さらに、ＨＡなどの構造ウイルスタンパク質を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質と共に植物において同時発現させることによって、このＨＡタンパク質は、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質と共に同時発現されないＨＡタンパク質と比較して、より高い赤血球凝集能によって示される増加した活性を示し得る。活性の増加とは、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質の非存在下で生成された同じＨＡタンパク質の活性と比較した場合の、当技術分野で標準的な技術を使用して決定される、約２％〜約１００％またはそれらの間の任意の量の、例えば、約１０％〜約５０％またはそれらの間の任意の値の、例えば、約２、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％の、赤血球凝集能の増加を意味する。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、用語「Ｍ２」、「Ｍ２タンパク質」、「Ｍ２配列」および「Ｍ２ドメイン」とは、任意の天然に存在するもしくは人工的に生成されたインフルエンザウイルス株もしくは単離体から単離された、またはそれらに基づいた、またはそれら中に存在する、Ｍ２タンパク質配列の全てまたは一部分を指す。従って、用語Ｍ２などは、ウイルスの生活環の間の変異によって生成されたまたは選択圧（例えば、薬物治療、宿主細胞トロピズムの拡大、または感染性など）に応答して生成された天然に存在するＭ２配列バリアント、ならびに組換えにより生成されたまたは合成により生成されたＭ２配列を含む。使用され得るチャネルタンパク質の例には、表１に列挙したプロトンチャネルタンパク質などのプロトンチャネルタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用され得る配列の非限定的な例には、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２およびＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２が含まれる。例示的なＭ２タンパク質は、配列番号１１または１４に示されるアミノ酸配列からなる。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、用語「ＢＭ２」、「ＢＭ２タンパク質」、「ＢＭ２配列」および「ＢＭ２ドメイン」とは、任意の天然に存在するもしくは人工的に生成されたインフルエンザウイルス株もしくは単離体から単離された、またはそれらに基づいた、またはそれら中に存在する、ＢＭ２タンパク質配列の全てまたは一部分を指す。従って、用語ＢＭ２などは、ウイルスの生活環の間の変異によって生成されたまたは選択圧（例えば、薬物治療、宿主細胞トロピズムの拡大、または感染性など）に応答して生成された天然に存在するＢＭ２配列バリアント、ならびに組換えにより生成されたまたは合成により生成されたＢＭ２配列を含む。使用され得るチャネルタンパク質の例には、表２に列挙したプロトンチャネルタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
さらなる例示的なプロトンチャネルタンパク質配列は、表１および表２に示されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の下で寄託された配列からなる。
【表１−１】
2014530006.tif 000003
【表１−２】
2014530006.tif 000004
【表１−３】
2014530006.tif 000005
【表１−４】
2014530006.tif 000006
【表１−５】
2014530006.tif 000007
【表２−１】
2014530006.tif 000008
【表２−２】
2014530006.tif 000009
【００６２】
構造ウイルスタンパク質
構造ウイルスタンパク質（構造ウイルスタンパク質ともいう）は、例えばウイルス糖タンパク質またはウイルス外被（envelop）タンパク質であるがこれらに限定されない、ウイルス抗原性タンパク質またはその断片であり得る。この構造ウイルスタンパク質は、キメラウイルスタンパク質であり得る。このウイルスタンパク質は、一量体、二量体、三量体またはそれらの組合せとして存在し得る。三量体は、３つの通常は非共有結合したタンパク質によって形成される巨大分子複合体である。理論に束縛されることは望まないが、タンパク質の三量体化ドメインは、かかる三量体の形成に重要であり得る。従って、この構造ウイルスタンパク質またはその断片は、三量体化ドメインを含み得る。構造ウイルスタンパク質の非限定的な例は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）またはＨＡの断片である。本発明に従って使用され得るＨＡまたはＨＡの断片の非限定的な例には、国際公開第２００９／００９８７６号、国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号、国際公開第２０１０／００３２３５号、国際公開第２０１１／０３５２２号、国際公開第２０１０／００６４５２号、国際公開第２０１０／１４８５１１号、国際公開第２０１１／０３５４２２号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されたものが含まれる。
【００６３】
さらに、この構造ウイルスタンパク質は、ＨＡのプロセシングされていない前駆体タンパク質であり得る。ＨＡタンパク質は、表面において伸長した三量体タンパク質へとアセンブルする、約７５ｋＤａの前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成される。この前駆体タンパク質は、保存された活性化切断部位において、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）へと切断される。
【００６４】
タンパク質分解性ループ（切断部位）改変
この構造ウイルスタンパク質は、赤血球凝集素タンパク質内のタンパク質分解性ループ（切断部位）の欠失または改変を有する、インフルエンザＢ赤血球凝集素タンパク質またはインフルエンザＡ赤血球凝集素タンパク質であり得る。タンパク質分解性ループの欠失または改変は、ＨＡ分子のほとんどがＨＡ０前駆体として維持されることを確実にする。
【００６５】
ＨＡは、前駆体タンパク質ＨＡ０として合成され、これは、タンパク質分解性プロセシングを受けて、ジスルフィド架橋によって一緒に連結された２つのサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）になる。哺乳動物インフルエンザウイルス株および非病原性トリインフルエンザウイルス株は、ＨＡ０前駆体を細胞外で切断できるプロテアーゼを分泌する限定された範囲の細胞の結果として、解剖学的に限局化された感染を引き起こす（Chen  Jら、1998年、Cell.９５巻:４０９〜４１７頁）。ヒトのインフルエンザ感染におけるＨＡ０の切断を担うプロテアーゼは、気道の細胞によって、または同時感染する細菌もしくはマイコプラズマによって分泌されるか、あるいは感染に対する炎症応答において生成され得る。主要なプロテアーゼ候補は、細気管支上皮のＣｌａｒａ細胞によって生成される、限定的な組織分布（上部気道）を有するトリプターゼＣｌａｒａである。このプロテアーゼは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ６の切断部位において見出される一塩基配列Ｑ／Ｅ−Ｘ−Ｒに特異的である。Ｈ９株およびＢ株由来のＨＡは、それぞれＳＳＲ配列およびＫＥＲ配列を有する、僅かに異なる一塩基切断部位を示す（図２４を参照のこと）。水生鳥類において見られる腸管感染および呼吸器感染を引き起こすインフルエンザウイルスの大部分について、プロテアーゼは同定されていない。実験室において、ほとんどの株化細胞は、外因性プロテアーゼ（通常はトリプシン）が添加されない限り、複数サイクルの複製を支持しない。
【００６６】
しかし、高度に病原性のトリ株は、より広範な細胞内プロテアーゼのファミリーによって切断され、全身感染を生じる。病原性におけるこの差異は、ＨＡ０切断部位における構造的差異と相関する。病原性株は、一塩基部位内に、または一塩基部位の隣に、多塩基アミノ酸の挿入を有する。この場合における切断は細胞内で生じ、関与するプロテアーゼは、ゴルジにおいて見出される、ホルモンおよび増殖因子前駆体の翻訳後プロセシングに関与するフューリンおよび他のスブチリシン様酵素として同定されている。フューリン認識配列Ｒ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−Ｒは、Ｈ５およびＨ７のＨＡ０切断部位における頻出の挿入アミノ酸である（図２４を参照のこと）。この酵素の広い組織分布および細胞内切断の効率は、これらのウイルスによって引き起こされる広範で毒性の全身感染に寄与する。
【００６７】
Horimoto  Tら（２００６年、Vaccine、２４巻:３６６９〜３６７６頁）は、Ｈ５におけるＨ５の多塩基切断部位（ＲＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇ）の消滅を記載している。最初の４つの荷電アミノ酸（ＲＥＲＲ）の欠失および多塩基切断部位を不活化するための（ＴＥＴＲによるＲＫＫＲの）改変を有する変異体を含む、選択された変異体が、マウスにおける免疫原性研究に供された。切断部位の消滅は、変異体Ｈ５の免疫原性特性に影響を与えなかった。変異体ＮＩＢＳＣ  ０５／２４０  ＮＩＢＳＣインフルエンザ参照ウイルスＮＩＢＧ−２３を生成するための多塩基部位の消滅（ＲＥＴＲによって置き換えられたＧＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇ）もまた、報告されている。Hoffmanら（２００２年、２００２、Vaccine、２０巻:３１６５〜３１７０頁）は、卵における発現をブーストするために、Ｈ６の一塩基部位で、Ｈ５  ＨＡの多塩基切断部位を置き換えた。最初の４残基を欠失させ、多塩基部位の最後の４つのアミノ酸をＩＥＴＲによって置き換えた（ＩＥＴＲ↓ＧによるＲＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇの置き換え）。この変異体Ｈ５は、高い発現レベル、潜在的なタンパク質分解および低いｐＨでのコンフォメーション変化を示したが、免疫原性データは報告されなかった。これらの研究は、切断部位の改変が、ウイルス粒子の毒性を減退させるために使用され得ることを示している（真のウイルスが複製される場合、宿主卵を殺すことなくウイルスが複製するのを可能にする）。かかる変異がない場合、ウイルスは、高い力価に達する前に卵を殺してしまう。
【００６８】
ＨＡの折り畳みおよびゴルジを介した分泌の間、ＨＡの表面におけるループ上に位置付けられる赤血球凝集素前駆体切断部位は、プロテアーゼによるタンパク質分解のために十分にアクセス可能である。理論に束縛されることは望まないが、前駆体ＨＡ０のタンパク質分解がＥＲにおけるＨＡの折り畳みの間に一塩基部位または多塩基部位において生じる場合、植物のゴルジの内側およびアポプラスト中のｐＨ環境は僅かに酸性であるので、タンパク質のコンフォメーション変化は、分泌の間にゴルジ体中で起こり得る。低ｐＨコンフォメーションのＨＡが生成され得、発現のレベルおよび粒子の固有の安定性の両方を減少させる。従って、ほとんどの未切断ＨＡ０前駆体タンパク質は、原形質膜から出芽する。
【００６９】
「タンパク質分解性ループ」または「切断部位」は、前駆体ＨＡ０の切断に関与するタンパク質分解部位のコンセンサス配列を意味する。本明細書中で使用する場合、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、複数の配列、例えば特定のインフルエンザＨＡ０配列のサブタイプのアラインメントの分析に基づく関連配列の配列可変性を含む配列（アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のいずれか）を意味する。インフルエンザＨＡ０切断部位のコンセンサス配列は、例えば、コンセンサスＨ１、コンセンサスＨ３またはインフルエンザＢコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列を含む、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列を含み得る。コンセンサス配列の非限定的な例を図２４に示す。
【００７０】
ＨＡのアミノ酸配列中で、タンパク質分解性ループは、ＨＡ２部分の最初の２０個のアミノ酸からなる融合ペプチドの前に位置付けられる。Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／６８由来のＨＡ０の結晶構造は決定されている（Chen,  J.、１９９８年.Cell  ９５巻:４０９〜４１７頁；参照により本明細書中に組み込まれる）。溶媒に曝露される残基は、伸長した高度に曝露された表面ループを形成する切断部位の一部であると一般に考えられている。コンセンサス配列は、この特異的ペプチド配列から、この選択された領域において決定され得る（Bianchiら、２００５年、Journal  of  Virology、７９巻:７３８０〜７３８８頁；参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００７１】
タンパク質分解性ループを消滅させるために、Ｂ  ＨＡの構造を試験した。ＨＡのタンパク質分解性切断部位のみの欠失は、ＨＡ１のＣ末端およびＨＡ２のＮ末端を離れさせ、長いリンカーが設計される必要があった。しかし、タンパク質分解性（proteotic）切断部位と共に融合ペプチドの一部を欠失させることで、完全タンパク質分解性ループを除去し、２アミノ酸の最小ペプチドリンカーによって残りのＨＡ１配列とＨＡ２配列とを接続することが可能になった。まとめると、Ｂバリアントは、ＨＡ２のＮ末端アミノ酸ＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＧの欠失に加えて、ＨＡ１のＣ末端における配列ＡＬＫＬＬＫＥＲの欠失を含む。短縮されたＨＡ１−ＨＡ２は、ＧＧリンカーによって一緒に連結した。
【００７２】
図２２Ｂに示すように、ＨＡ０のタンパク質分解性ループを欠失することによって、得られたＨＡ０タンパク質は、そのタンパク質分解性ループが除去されていないＨＡタンパク質と比較した場合、より高い赤血球凝集能によって示される増加した活性を示す。活性の増加とは、そのタンパク質分解性ループが除去されていない同じＨＡタンパク質の活性と比較した場合の、当技術分野で標準的な技術を使用して決定される、約２％〜約１００％またはそれらの間の任意の量の、例えば、約１０％〜約５０％またはそれらの間の任意の値の、例えば、約２、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％の、赤血球凝集能の増加を意味する。
【００７３】
「キメラウイルスタンパク質」または「キメラウイルスポリペプチド」は、「キメラタンパク質」または「キメラポリペプチド」ともいい、例えば、単一のポリペプチドとして融合した、２つ以上のインフルエンザ型もしくはサブタイプまたは異なる起源のインフルエンザであるがこれらに限定されない、２つまたは２つより多い供給源由来のアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドを意味する。このキメラタンパク質またはポリペプチドは、そのポリペプチドまたはタンパク質の残部と同じまたは異種のシグナルペプチドを含み得る。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、キメラヌクレオチド配列からの転写物として生成され得、合成後に切断されたキメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、必要に応じて会合して、多量体タンパク質を形成する。従って、キメラタンパク質またはキメラポリペプチド（polpypeptide）は、ジスルフィド架橋を介して会合したサブユニットを含むタンパク質またはポリペプチド（即ち、多量体タンパク質）もまた含む。例えば、２つまたは２つより多い供給源由来のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドは、サブユニットへとプロセシングされ得、これらのサブユニットがジスルフィド架橋を介して会合して、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドを生成し得る。キメラウイルスタンパク質は、第１のインフルエンザウイルスの抗原性タンパク質またはその断片、ならびに膜貫通ドメインおよびサイトゾル側末端ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）を含む、第２のウイルスインフルエンザＨＡ由来の膜貫通ドメイン複合体（ＴＤＣ）もまた含み得る。このポリペプチドは赤血球凝集素（ＨＡ）であり得、このポリペプチドを構成する２つまたは２つより多いアミノ酸配列の各々は、キメラＨＡまたはキメラインフルエンザＨＡを生成するために、異なるＨＡから得られ得る。キメラＨＡは、タンパク質合成の後またはその間に切断される異種シグナルペプチドを含むアミノ酸配列（キメラＨＡ前タンパク質）もまた含み得る。好ましくは、このキメラポリペプチドまたはキメラインフルエンザＨＡは、天然には存在しない。キメラポリペプチドをコードする核酸は、「キメラ核酸」または「キメラヌクレオチド配列」と記載され得る。キメラＨＡから構成されるウイルス様粒子は、「キメラＶＬＰ」と記載され得る。
【００７４】
このキメラタンパク質またはポリペプチドは、そのポリペプチドまたはタンパク質の残部と同じまたは異種のシグナルペプチドを含み得る。用語「シグナルペプチド」は、当技術分野で周知であり、特定のオルガネラに対する新たに翻訳されたポリペプチドの転位を指向し得、他に対するそのポリペプチド鎖の特異的ドメインを配置することを補助し得る、ポリペプチドのＮ末端において一般に見出される、アミノ酸の短い（約５〜３０アミノ酸の）配列を一般に指す。非限定的な例として、このシグナルペプチドは、小胞体中へのタンパク質の転位を標的化し得るおよび／または例えば成熟ＨＡタンパク質であるが限定とみなすべきではない成熟タンパク質の切断および折り畳みを補助するために新生ポリペプチドの膜アンカードメインに対して近位のＮ末端ドメインを配置することを補助し得る。
【００７５】
本発明に従って使用され得るキメラウイルスタンパク質またはキメラ（chimieric）ウイルス核酸の非限定的な例は、国際公開第２００９／０７６７７８号、国際公開第２０１０／００３２３５号または国際公開第２０１０／１４８５１１号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００７６】
シグナルペプチド
シグナルペプチド（ＳＰ）は、抗原性タンパク質もしくはウイルスタンパク質にとってネイティブであってもよく、またはシグナルペプチドは、発現されている抗原性タンパク質またはウイルスタンパク質の一次配列に関して異種であってもよい。抗原性タンパク質またはウイルスタンパク質は、１つまたは１つより多い異なるインフルエンザ型、サブタイプまたは株由来のＨＡとバランスを取って、第１のインフルエンザ型、サブタイプまたは株由来のシグナルペプチドを含み得る。例えば、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはインフルエンザＢ型のネイティブシグナルペプチドは、植物系においてキメラウイルスタンパク質を発現させるために使用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＳＰは、インフルエンザＢ型、Ｈ１、Ｈ３もしくはＨ５のもの；またはサブタイプＨ１／Ｂｒｉ、Ｈ１／ＮＣ、Ｈ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ３／ＢｒｉもしくはＢ／Ｆｌｏのものであり得る。
【００７７】
シグナルペプチドは、非ネイティブ、例えば、抗原性タンパク質、ウイルスタンパク質もしくはウイルスタンパク質以外のウイルスの赤血球凝集素由来、または植物、動物もしくは細菌のポリペプチド由来、であってもよい。使用され得るシグナルペプチドの非限定的な例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（「ＰＤＩＳＰ」；アクセッション番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／１４８５１１号または国際公開第２０１０／００３２３５号もまた参照のこと、これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）である。従って、本発明は、ネイティブまたは非ネイティブのシグナルペプチドを含むキメラウイルスタンパク質、およびかかるキメラウイルスタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００７８】
従って、本発明は、キメラウイルスタンパク質をコードする第１の核酸が、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸と共に同時発現される、植物においてキメラＶＬＰを生成する方法もまた提供する。この第１の核酸および第２の核酸は、同じステップで植物に導入され得るか、または連続的に植物に導入され得る。
【００７９】
ＨＡ
インフルエンザウイルスに関して、用語「赤血球凝集素」または「ＨＡ」は、本明細書中で使用する場合、インフルエンザウイルス粒子の外側で見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、シグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、ならびにＣ末端における膜貫通アンカー部位および小さい細胞質テールを含むＨＡ２ドメインを一般に含む、ホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質である。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知であり、入手可能である−例えば、ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ｂａｓｅ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照のこと）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（URL:ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）、これらは共に、参照により本明細書中に組み込まれる、を参照のこと。
【００８０】
用語「ホモ三量体（「homotrimer」または「homotrimeric」）」は、オリゴマーが３つのＨＡタンパク質分子によって形成されていることを示す。理論に束縛されることは望まないが、ＨＡタンパク質は、動物細胞において、表面において伸長した三量体タンパク質へとアセンブルする、約７５ｋＤａの一量体前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成される。三量体化が起こる前に、この前駆体タンパク質は、保存された活性化切断部位（融合ペプチドともいう）において、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）へと切断される。このＨＡ１セグメントは３２８アミノ酸長であり得、このＨＡ２セグメントは２２１アミノ酸長であり得る。この切断はウイルスの感染性にとって重要であり得るが、タンパク質の三量体化には必須でない可能性がある。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内のＨＡの挿入、シグナルペプチドの切断およびタンパク質のグリコシル化は、同時翻訳事象である。ＨＡの正確な再折り畳みには、タンパク質のグリコシル化および６つの鎖内ジスルフィド結合の形成が必要である。ＨＡ三量体は、シスゴルジ複合体およびトランスゴルジ複合体内でアセンブルし、その膜貫通ドメインが、三量体化プロセスにおいて役割を果たす。ブロメライン処理した、膜貫通ドメインを欠くＨＡタンパク質の結晶構造は、インフルエンザ株間で高度に保存された構造を示している。前駆体ＨＡ０が２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２へと切断されることを必要とする感染プロセスの間に、ＨＡが主要なコンフォメーション変化を受けることもまた、確立されている。ＨＡタンパク質は、プロセシングされていてもよく（即ち、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含む）か、プロセシングされていなくてもよい（即ち、ＨＡ０ドメインを含む）。ＨＡタンパク質は、植物または植物細胞の発現系を使用した、ＶＬＰの生成または形成において使用され得る。
【００８１】
本発明のＨＡは、任意のサブタイプから得られ得る。例えば、ＨＡは、サブタイプＨ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはインフルエンザＢ型ＨＡのものであり得る。本発明の組換えＨＡは、当技術分野で公知の任意の赤血球凝集素の配列に基づくアミノ酸配列もまた含み得る−例えば、ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ｂａｓｅ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照のこと）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）を参照のこと。さらに、ＨＡは、１つまたは複数の新興のインフルエンザウイルスまたは新たに同定されたインフルエンザウイルスから単離された赤血球凝集素の配列に基づき得る。
【００８２】
本発明に従って使用され得るＨＡまたはＨＡの断片の非限定的な例には、国際公開第２００９／００９８７６号、国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号、国際公開第２０１０／００３２３５号、国際公開第２０１０／００６４５２号、国際公開第２０１１／０３５４２２号または国際公開第２０１０／１４８５１１号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。
【００８３】
図１８に示すように、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉においては発現が低い（レーン「１００８」または「１０２９」を参照のこと）。しかし、ＨＡ−Ｂ型の、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現は、ＨＡ発現における有意な増加を生じる（レーン「１００８＋１２６１」；「１００９＋１２６１」および「１０２９＋１２６１」を参照のこと）。ＨＡ発現の増加は、ネイティブＢ型ＨＡまたはキメラＨＡ  Ｂ型の両方において観察された。ＨＡ発現は、増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下または非存在下で、種々の希釈のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにわたって観察された。Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来のＨ３を、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と同時発現させた場合、Ｈ３発現において同様の増加が観察された（図１９；レーン「１０１９」Ｈ３単独を、「１０１９＋１２６１」Ｍ２と同時発現させたＨ３と比較されたい）。
【００８４】
ＶＬＰ
用語「ウイルス様粒子（「virus  like  particle」（ＶＬＰ）または「virus-like  particles」）」または「ＶＬＰ」とは、自己アセンブルし、ウイルスタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質などの構造ウイルスタンパク質、または例えばＭ２などのプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質、あるいはこれらのタンパク質の組合せを含む構造を指す。ＶＬＰは一般に、感染において生成されるビリオンと形態学的および抗原性的に類似しているが、複製するのに十分な遺伝子情報を欠いており、従って非感染性である。いくつかの例では、ＶＬＰは、単一のタンパク質種または１つより多いタンパク質種を含み得る。１つより多いタンパク質種を含むＶＬＰについて、これらのタンパク質種は、同じ種のウイルス由来であり得るか、または異なる種、属、亜科もしくは科のウイルス（ＩＣＴＶ命名法によって指定される）由来のタンパク質を含み得る。他の例は、ＶＬＰを含むタンパク質種のうち１つまたは複数は、天然に存在する配列から改変され得る。ＶＬＰは、植物宿主細胞および昆虫宿主細胞を含む適切な宿主において生成され得る。宿主細胞からの抽出後、適切な条件下での単離およびさらなる精製の際に、ＶＬＰは、インタクトな構造として精製され得る。
【００８５】
さらに、ＨＡサブタイプの組合せを含むＶＬＰが生成され得る。例えば、ＶＬＰは、サブタイプＨ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、サブタイプＢ  ＨＡからの１つもしくは１つより多いＨＡまたはそれらの組合せを含み得る。ＨＡの組合せの選択は、ＶＬＰから調製されたワクチンの意図された使用によって決定され得る。例えば、鳥類を接種するのに使用されるワクチンは、ＨＡサブタイプの任意の組合せを含み得るが、ヒトを接種するのに有用なＶＬＰは、サブタイプＨ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、サブタイプＢ  ＨＡのうち１つまたは１つより多いサブタイプを含み得る。しかし、他のＨＡサブタイプの組合せが、ＶＬＰの使用に依存して調製され得る。ＨＡサブタイプの組合せを含むＶＬＰを生成するために、所望のＨＡサブタイプが、植物細胞などの同じ細胞内で同時発現され得る。
【００８６】
以下により詳細に記載するように、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＢ型ＨＡまたはＨ３の発現は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２が同時発現される場合、増加する（図１８および１９を参照のこと）。類似の増加は、Ｈ１またはＨ５をＭ２と同時発現させた場合には観察されず、Ｈ１またはＨ５の高い発現レベルが、Ｍ２の存在下または非存在下で観察される（それぞれ、図２０および２１）。ＨＡは、ｐＨ依存的様式でプロセシングされることが公知であり（Reed  M.  L.ら  Journal  of  Virology、２０１０年２月、１５２７〜１５３５頁、８４巻、３号を参照のこと）、ｐＨ依存的なコンフォメーション変化を受けることが公知である（Skehel  J.J.ら１９８２年、PNAS７９巻:９６８〜９７２頁）。Ｈ１およびＨ５は、Ｈ３およびＢ型ＨＡのいずれかで観察されるｐＨよりも低いｐＨでコンフォメーション変化を示す。理論に束縛されることは望まないが、成熟化および移動の間のゴルジ体内のｐＨは、Ｈ１の折り畳みに対してもＨ５の折り畳みに対しても影響を有さない可能性があるが、ゴルジ体内の低いｐＨは、Ｈ３およびＢ型ＨＡの折り畳みをもたらし得る。例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質を、Ｈ３またはＢ型ＨＡと共に同時発現させることによって、ゴルジ体内のｐＨが増加し得、ＨＡ収量の増加を導くＨＡの折り畳みを生じ得る。さらに、Ｈ１およびＨ５は、Ｈ３およびＢ型ＨＡよりもより低いｐＨでより安定であり得る。従って、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質を、Ｈ３またはＢ型ＨＡと共に同時発現させることによって、ゴルジ体内の分解されるＨＡが少なくなる。
【００８７】
本発明に従ってインフルエンザ由来のタンパク質から生成されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質は、ＶＬＰ調製物の汚染物質であるＲＮＡ（WakefieldおよびBrownlee、１９８９年）に結合することが公知である。ＲＮＡの存在は、ＶＬＰ製品についての規制認可を得る場合には望ましくなく、従って、ＲＮＡを欠くＶＬＰ調製物が有利であり得る。
【００８８】
本明細書に記載されるように生成されたＶＬＰは、典型的にはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかし、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが望まれる場合、ＮＡは、ＨＡと共に同時発現され得る。
【００８９】
本発明は、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質外被を得るウイルス由来のＶＬＰもまた含むが、これに限定されない。例えば、ＶＬＰが植物ベースの系で発現される場合、このＶＬＰは、細胞の原形質膜から脂質外被を得ることができる。
【００９０】
一般に、用語「脂質」とは、脂溶性（親油性）の天然に存在する分子を指す。この用語は、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドならびにリン脂質を含む）、ならびに他の脂溶性ステロール含有代謝物またはステロールをより具体的に指すためにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロールおよびタンパク質と共に、全ての生物膜の主要成分である。リン脂質の例には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンなどが含まれる。ステロールの例には、動物ステロール（例えば、コレステロール）および植物ステロールが含まれる。２００を超える植物ステロールが、種々の植物種において同定されており、最も一般的なものは、カンプエステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウコステロール（daunosterol）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはベータ−シトステロールである。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞の培養条件または増殖条件あるいはその細胞が得られる生物によって変動し得る。
【００９１】
細胞膜は一般に、脂質二重層ならびに種々の機能のためのタンパク質を含む。特定の脂質の局在化された濃縮が、脂質二重層において見出され得、「脂質ラフト」と呼ばれる。理論に束縛されることは望まないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染性要因の進入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞または生物の他の構造成分、例えば、細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックスとの相互作用において、重要な役割を有し得る。
【００９２】
植物では、インフルエンザＶＬＰは、原形質膜から出芽し、従って、ＶＬＰの脂質組成はその起源を反映する。本発明に従って生成されたＶＬＰは、植物由来の脂質と複合体化した、１つまたは１つより多い型またはサブタイプのインフルエンザのＨＡを含む。植物脂質は、特異的免疫細胞を刺激でき、誘発された免疫応答を増強できる。植物膜は、脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から構成され、スフィンゴ糖脂質、サポニンおよび植物ステロールもまた含む。さらに、脂質ラフトは、植物原形質膜においても見出される−これらのマイクロドメインは、スフィンゴ脂質およびステロールにおいて富化されている。植物では、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む種々の植物ステロールが存在することが公知である（Mongrandら、２００４年）。
【００９３】
ＰＣおよびＰＥ、ならびにスフィンゴ糖脂質は、哺乳動物免疫細胞、例えば、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに胸腺および肝臓におけるＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞によって発現されるＣＤ１分子に結合できる（Tsuji  M,.２００６年）。ＣＤ１分子は、クラスＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と構造的に類似しており、その役割は、ＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）に糖脂質抗原を提示することである。活性化の際に、ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞および樹状細胞などの自然免疫細胞を活性化し、抗体生成Ｂ細胞およびＴ細胞などの獲得免疫細胞もまた活性化する。
【００９４】
種々の植物ステロールが原形質膜において見出され得る−特定の相補体は、いくつかの因子を命名するために、種、増殖条件、栄養素源または病原体状態に依存して変動し得る。一般に、ベータ−シトステロールは、最も豊富な植物ステロールである。
【００９５】
原形質膜由来の外被などの、脂質二重層と複合体化したインフルエンザＶＬＰ中に存在する植物ステロールは、有利なワクチン組成物を提供し得る。理論に束縛されることは望まないが、原形質膜由来の外被などの、脂質二重層と複合体化した、植物が生成したＶＬＰは、他の発現系で生成されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘発し得、生または弱毒化全ウイルスワクチンによって誘発される免疫反応と類似であり得る。
【００９６】
従って、いくつかの実施形態では、本発明は、植物由来の脂質二重層と複合体化したＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態では、植物由来の脂質二重層は、ＶＬＰの外被を構成し得る。植物由来の脂質は、ＶＬＰが生成される植物の原形質膜の脂質成分を含み得、この脂質成分には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質、植物ステロールまたはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。植物由来の脂質は、代替的に「植物脂質」と呼ばれ得る。植物ステロールの例は当技術分野で公知であり、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールが含まれる−例えば、Mongrandら、２００４年を参照のこと。
【００９７】
ＶＬＰは、例えば、赤血球凝集アッセイ、電子顕微鏡によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて評価され得る。
【００９８】
サイズ排除クロマトグラフィーのために、総可溶性タンパク質は、凍結し破砕した植物材料の試料を抽出緩衝液中でホモジナイズし（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）、不溶性材料を遠心分離で除去することによって、植物組織から抽出され得る。ＰＥＧによる沈殿が使用され得る。可溶性タンパク質が定量され、抽出物を、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）であるがこれに限定されないサイズ排除マトリックスを通過させる。クロマトグラフィー後、画分は、画分のタンパク質相補体を決定するために、イムノブロットによってさらに分析され得る。
【００９９】
理論に束縛されることは望まないが、ＨＡが異なる動物由来のＲＢＣに結合する能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡの親和性、およびＲＢＣの表面上のこれらのシアル酸の存在によって駆動される。インフルエンザウイルス由来のウマＨＡおよびトリＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシを含むいくつかの種由来の全ての赤血球を凝集させる；一方、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット（guina  pig）、ヒトおよびヒツジの赤血球に結合するであろう（Ito  T.ら、１９９７年、Virology、２２７巻、４９３〜４９９頁；およびMedeiros  Rら、２００１年、Virology、２８９巻、７４〜８５頁もまた参照のこと）。
【０１００】
折り畳み（シャペロン）
発現されたウイルスタンパク質の正確な折り畳みは、他の特徴のなかでも、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、ウイルスタンパク質の機能、および抗体によるウイルスタンパク質の認識にとって重要であり得る。タンパク質の折り畳みおよび蓄積は、タンパク質の配列、タンパク質の相対的な存在量、細胞内クラウディングの程度、細胞区画中のｐＨ、折り畳まれたタンパク質、部分的に折り畳まれたタンパク質または折り畳まれていないタンパク質に結合し得るまたはこれらと一過的に会合し得る補因子の利用可能性、１つまたは複数のシャペロンタンパク質の存在などが含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数の因子によって、影響され得る。
【０１０１】
ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、このシャペロンタンパク質は、タンパク質合成、細胞内輸送、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリ、タンパク質の折り畳み、ならびにタンパク質脱凝集を含む種々の細胞プロセスに関与し得る。かかるシャペロンタンパク質の例には、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが含まれるがこれらに限定されない（例えば、Macario,  A.J.L.、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Res.２５巻:５９〜７０頁.１９９５年；Parsell,  D.A.およびLindquist,  S.  Ann.  Rev.  Genet.  ２７巻:４３７〜４９６頁（１９９３年）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照のこと）。本明細書中に記載するように、例えばＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０であるがこれらに限定されないシャペロンタンパク質は、ウイルスタンパク質の折り畳みを確実にするために使用され得る。
【０１０２】
Ｈｓｐ７０の例には、哺乳動物細胞由来のＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓなどのマイコバクテリア由来のＤｎａＫ（例えば、カルメット・ゲラン桿菌：本明細書中でＨｓｐ７ｌと呼ばれる）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母および他の原核生物由来のＤｎａＫ、ならびにＡ．ｔｈａｌｉａｎａなどの真核生物由来のＢｉＰおよびＧｒｐ７８が含まれる（Linら  ２００１年(Cell  Stress  and  Chaperones  ６巻:２０１〜２０８頁）。Ｈｓｐ７０の特定の例は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｈｓｐ７０（Ｇｅｎｂａｎｋ参照：ＡＹ１２０７４７．１によってコードされる）である。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰならびに折り畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに特異的に結合することが可能であり、それによってタンパク質の折り畳みおよび折り畳みなし、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリに関与する。
【０１０３】
Ｈｓｐ４０の例には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアなどの原核生物由来のＤｎａＪ、ならびにアルファルファなどの真核生物由来のＨＳＪ１、ＨＤＪｌおよびＨｓｐ４０が含まれる（Frugisら、１９９９年.  Plant  Molecular  Biology  ４０巻:３９７〜４０８頁）。Ｈｓｐ４０の特定の例は、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＭｓＪ１（Ｇｅｎｂａｎｋ参照：ＡＪ０００９９５．１）である。Ｈｓｐ４０は、他の細胞活性の中でも、タンパク質折り畳み、熱耐性およびＤＮＡ複製において分子シャペロンとしての役割を果たす。
【０１０４】
Ｈｓｐｓ、Ｈｓｐ７０およびそのコシャペロンのうち、Ｈｓｐ４０は、合成が完了する前の、翻訳中のポリペプチドおよび新たに合成されたポリペプチドの安定化に関与する。理論に束縛されることは望まないが、Ｈｓｐ４０は、折り畳まれていない（新生のまたは新たに移行された）ポリペプチドの疎水性パッチに結合し、従って、Ｈｓｐ７０−ＡＴＰ複合体とこのポリペプチドとの相互作用を促進する。ＡＴＰ加水分解は、ポリペプチドとＨｓｐ７０とＡＤＰとの間の安定な複合体の形成、およびＨｓｐ４０の放出を導く。Ｈｓｐ７０−ＡＤＰ複合体とポリペプチドの疎水性パッチとの会合は、それらが他の疎水性パッチと相互作用することを防止し、不正確な折り畳みおよび他のタンパク質との凝集体の形成を防止する（Hartl,  FU.  １９９６年.  Nature  ３８１巻:５７１〜５７９頁に概説される）。
【０１０５】
ネイティブのシャペロンタンパク質は、低いレベルの組換えタンパク質の正確な折り畳みを促進できる可能性があるが、発現レベルが増加するにつれ、ネイティブシャペロンの存在量は制限因子となり得る。アグロ浸潤した葉におけるウイルスタンパク質の高いレベルの発現は、サイトゾルにおけるウイルスタンパク質の蓄積を導き得、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０またはＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０の両方などの１つまたは１つより多いシャペロンタンパク質の同時発現は、誤って折り畳まれたまたは凝集したタンパク質のレベルを低減させ得、ウイルス様粒子の形成を可能にする三次構造上および四次構造上の特徴を示すタンパク質の数を増加させ得る。
【０１０６】
従って、本発明は、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸が、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸、およびシャペロンをコードする第３の核酸と共に同時発現される、植物においてウイルスタンパク質ＶＬＰを生成する方法もまた提供する。第１、第２および第３の核酸は、同じステップで植物に導入され得るか、または連続的に植物に導入され得る。
【０１０７】
Ｎ−グリカン
植物内で生成されたＶＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含むウイルスタンパク質を誘発し得る。従って、本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンを有するウイルスタンパク質を含むＶＬＰを提供する。
【０１０８】
さらに、植物におけるＮ−グリカンの改変は公知であり（例えば、国際公開第２００８／１５１４４０号；国際公開第２０１０／００６４５２号；または米国仮出願第６０／９４４，３４４号を参照のこと；これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）、改変されたＮ−グリカンを有するウイルスタンパク質が生成され得る。例えば、フコシル化された、キシロシル化されたまたはフコシル化されかつキシロシル化されたＮ−グリカンが低減した、改変されたグリコシル化パターンを含むウイルスタンパク質が得られ得るか、あるいは、フコシル化、キシロシル化またはそれら両方を欠き、かつ増加したガラクトシル化（galatosylation）を含む、改変されたグリコシル化パターンを有するウイルスタンパク質が得られ得る。さらに、翻訳後修飾のモジュレーション、例えば、末端ガラクトースの付加は、ウイルスタンパク質を発現する野生型植物と比較した場合、発現されたウイルスタンパク質のフコシル化およびキシロシル化の低減を生じ得る。
【０１０９】
例えば、限定とみなすべきでないが、改変されたグリコシル化パターンを有するウイルスタンパク質の合成は、例えば哺乳動物ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴであるがこれらに限定されないベータ−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードするヌクレオチド配列と共に対象のタンパク質を同時発現させることによって達成され得るが、別の供給源由来のＧａｌＴもまた使用され得る。ＧａｌＴの触媒ドメインはまた、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を生成するために、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１）のＣＴＳドメイン（即ち、細胞質テール、膜貫通ドメイン、ステム領域）に融合され得、このハイブリッド酵素が、ウイルスタンパク質と共に同時発現され得る。このウイルスタンパク質はまた、例えば哺乳動物ＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩであるがこれに限定されないＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（N-acetylglucosaminyltrasnferase）ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列と共に同時発現され得、他の供給源由来のＧｎＴ−ＩＩＩもまた使用され得る。さらに、ＧｎＴ−ＩＩＩに融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素もまた使用され得る。
【０１１０】
従って、本発明は、改変されたＮ−グリカンを有する１つまたは複数のウイルスタンパク質を含むＶＬＰもまた含む。
【０１１１】
配列
本発明で使用され得る配列の非限定的な例には以下が含まれる：
この核酸分子によってコードされるＨ２タンパク質は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ３タンパク質は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ６タンパク質は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ７タンパク質はまた、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）株由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株由来であり得る；
この核酸によってコードされるＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８株由来であり得る。
【０１１２】
本発明で使用され得る配列の非限定的な例には、参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号；国際公開第２０１０／１４８５１１号；国際公開第２０１０／００３２３５号；国際公開第２０１０／００６４５２号に記載された配列もまた含まれる。Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６およびＢ型ＨＡ由来のかかるＨＡタンパク質をコードするアミノ酸分子の配列の例は、当技術分野で公知である。例えば、Ｈ３またはＢサブタイプは、配列番号２５または３０を含む。構造ウイルスタンパク質をコードする配列は、例えば、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４もしくはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡ、またはインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９もしくはＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３であり得る。他の例には、そのＨＡタンパク質のタンパク質分解性ループが欠失されたＨＡタンパク質をコードする核酸分子の配列が含まれ、例えば配列番号４１に規定される配列であるがこれに限定されない。
【０１１３】
本発明には、例えばＨ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型ＨＡ由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列もまた含まれるが、これらに限定されない。例えば、それぞれ、Ｂ、タンパク質分解性ループが欠失したＢ、またはＨ３由来のＨＡをコードする配列番号２８、４３、２３、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２８、４３、２３にハイブリダイズするヌクレオチド配列、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２８、４３、２３の相補体（compliment）にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列は、発現された場合にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、このＶＬＰは、抗体の生成を誘発する。例えば、植物細胞内のヌクレオチド配列の発現は、ＶＬＰを形成し、このＶＬＰは、ＢまたはＨ３由来の成熟ＨＡを含むＨＡに結合することが可能な抗体を生成するために使用され得る。ＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。このヌクレオチド配列はまた、ヌクレオチド配列配列番号９、１２、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号９、１２にハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号９、１２の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であるがこれらに限定されない配列などの、チャネルタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列と共に同時発現され得、この第２のヌクレオチド配列は、ＶＬＰを形成するプロトンチャネルタンパク質をコードする。好ましくは、ＶＬＰは、抗体の生成を誘発し、このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
【０１１４】
例えば、植物細胞内のヌクレオチド配列の発現は、ＶＬＰを形成し、このＶＬＰは、ＨＡ０、そのタンパク質分解性ループが欠失または改変されたＨＡ０タンパク質、例えばサブタイプＨ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、サブタイプＢ  ＨＡであるがこれらに限定されないものなどの１つまたは複数のインフルエンザ型またはサブタイプのＨＡ１またはＨＡ２が含まれるがこれらに限定されないＨＡなどのウイルスタンパク質に結合することが可能な抗体を生成するために使用され得る。このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
【０１１５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは当技術分野で公知である（例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら、編、１９９５年および補遺；Maniatisら、Molecular  Cloning  (A  Laboratory  Manual)、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、１９８２年；SambrookおよびRussell、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、２００１年を参照のこと；これらはそれぞれ、参照により本明細書中に組み込まれる）。１つのかかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃で４×ＳＳＣ中での約１６〜２０時間のハイブリダイゼーション、その後６５℃で０．１×ＳＳＣ中での１時間の洗浄、または６５℃で０．１×ＳＳＣ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、であり得る。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で一晩（１６〜２０時間）、その後６５℃で０．１×ＳＳＣ中での１時間の洗浄、または６５℃で０．１×ＳＳＣ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間または一晩（１６〜２０時間）の２回の洗浄、あるいは６５℃でＣｈｕｒｃｈ水性リン酸塩緩衝液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ  ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７．２；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でのハイブリダイゼーション、５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間のいずれかでの２回の洗浄、または６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、であり得る。
【０１１６】
さらに、本発明は、Ｂ（配列番号２８）、タンパク質分解性ループが欠失もしくは改変されたＢ（配列番号４３）、Ｈ３（配列番号２３）由来のＨＡ、または配列番号２３、２８、４３、４６、５１、５７もしくは６１のうちいずれか１つもしくは複数によってコードされるＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれらの間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴付けられるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、発現される場合にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、このＶＬＰは、抗体の生成を誘発する。例えば、植物細胞内のヌクレオチド配列の発現は、ＶＬＰを形成し、このＶＬＰは、ＢもしくはＨ３由来のプロセシングされていないＨＡおよび／もしくは成熟ＨＡ、またはタンパク質分解性ループが欠失されたプロセシングされていないＨＡおよび／もしくは成熟ＨＡを含むＨＡに結合することが可能な抗体を生成するために使用され得る。このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
【０１１７】
本発明は、Ｍ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号９、１２）と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれらの間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴付けられるヌクレオチド配列もまた含み、このヌクレオチド配列は、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードし、これは、構造ウイルスタンパク質と共に同時発現される場合、ＶＬＰを形成する。好ましくは、ＶＬＰは、抗体の生成を誘発し、このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
【０１１８】
配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されるものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定され得る（例えば、以下であるがこれらに限定されないパラメータを使用する：ＧＡＰペナルティー５、トップダイアゴナル（top  diagonal）の数５、固定ＧＡＰペナルティー１０、ｋ−タプル（k-tuple）２、浮動ギャップ（floating  gap）１０、およびウインドウサイズ５）。しかし、例えば、SmithおよびWaterman（１９８１年、Adv.  Appl.  Math.  ２巻:４８２頁）、NeedlemanおよびWunsch（J.  Mol.  Biol.  ４８巻:４４３頁、１９７０年）、PearsonおよびLipman（１９８８年、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻:２４４４頁）のアルゴリズム、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）による、あるいは手動のアラインメントおよび目視検査によるなどの、比較のための配列のアラインメントの他の方法は、当技術分野で周知である。異なる株のインフルエンザ由来のＨＡの配列アラインメントの例は、図２４中に見出され得る。
【０１１９】
「免疫応答」は一般に、獲得免疫系の応答を指す。獲得免疫系は一般に、体液性応答および細胞媒介性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系譜の細胞（Ｂ細胞）において生成される分泌された抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌された抗体は、侵入性微生物（例えば、ウイルスまたは細菌）の破壊のための旗信号を出す、かかる侵入性微生物の表面上の抗原に結合する。体液性免疫は、抗体生成またはそれに付随するプロセス、ならびにＴｈ２細胞活性化およびサイトカイン生成、メモリー細胞生成、食作用のオプソニン促進、病原体排除などを含む抗体のエフェクター機能を指すために一般に使用される。用語「モジュレートする」または「モジュレーション」などは、そのうちのいくつかが本明細書中に例示される一般に公知のまたは使用されるいくつかのアッセイのいずれかによって決定されるように、特定の応答またはパラメータにおける増加または減少を指す。
【０１２０】
細胞媒介性応答は、抗体を含まないが、抗原に応答した、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および種々のサイトカインの放出を含む、免疫応答である。細胞媒介性免疫は、ある種のＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化およびＴ細胞媒介性応答を指すために一般に使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染に応答して特に重要なものである。
【０１２１】
例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定され得る；ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は、増殖アッセイを使用して測定され得る。抗インフルエンザ抗体力価は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量され得る；抗原特異的抗体または交差反応性抗体のアイソタイプは、抗アイソタイプ抗体（例えば、抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）を使用しても測定され得る。かかるアッセイを実施するための方法および技術は、当技術分野で周知である。
【０１２２】
交差反応性ＨＡＩ力価は、ワクチンサブタイプに関連する他の株のウイルスに対する免疫応答の効力を実証するためにも使用され得る。例えば、第１の株のワクチン組成物（例えば、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ５／０５のＶＬＰ）で免疫した被験体由来の血清は、第２の株の全ウイルスまたはウイルス粒子（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）を用いるＨＡＩアッセイにおいて使用され得、ＨＡＩ力価が決定され得る。
【０１２３】
サイトカインの存在またはレベルもまた、定量され得る。例えば、Ｔヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＯｐｔＥＩＡキット）を使用することにより、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４分泌細胞の測定によって特徴付けられるであろう。被験体から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または脾細胞が培養され得、上清が分析され得る。Ｔリンパ球は、マーカー特異的蛍光標識および当技術分野で公知の方法を使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によっても定量され得る。
【０１２４】
マイクロ中和アッセイもまた、被験体における免疫応答を特徴付けるために実施され得る。例えば、Roweら、１９７３年の方法を参照のこと。ウイルス中和力価は、以下を含むいくつかの方法で得られ得る：１）細胞のクリスタルバイオレット固定／呈色後の溶解プラークの計数（プラークアッセイ）；２）培養物における細胞溶解の顕微鏡観察；３）ＮＰウイルスタンパク質のＥＬＩＳＡおよび分光光度的検出（宿主細胞のウイルス感染と相関する）。
【０１２５】
構築物
本発明は、植物において作動する調節エレメントに動作可能に連結した、上記のような、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質または構造ウイルスタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子構築物にさらに関する。植物細胞において作動する、本発明に従って使用され得る調節エレメントの例には、プラストシアニン調節領域（米国特許第７，１２５，９７８号；これは参照により本明細書中に組み込まれる）、またはリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの調節領域（ＲｕＢｉｓＣＯ；米国特許第４，９６２，０２８号；これは参照により本明細書中に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Leutwilerら；１９８６年；これは参照により本明細書中に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と会合する、Stockhausら１９８７年、１９８９年に記載される；これは参照により本明細書中に組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
調節エレメント
本出願における用語「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモーター」の使用は、典型的ではあるがいつもというわけではなく、遺伝子のタンパク質コード領域の上流の、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成され得る、核酸の一部分を反映する意味である。調節領域が活性である場合、および対象の遺伝子と動作可能に会合または動作可能に連結した場合、これは、対象の遺伝子の発現を生じ得る。調節エレメントは、器官特異性を媒介することが可能であり得るか、または発生的もしくは時間的な遺伝子活性化を制御することが可能であり得る。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基底プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘発性のエレメント、プロモーター活性を媒介するエレメント、例えば陰性調節エレメントまたは転写エンハンサーを含み得る。「調節領域」は、本明細書中で使用する場合、転写後に活性であるエレメント、例えば、遺伝子発現をモジュレートする調節エレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子もまた含み得る。これらの後者のエレメントのいくつかは、コード領域に対して近位に位置付けられ得る。
【０１２７】
本開示の文脈において、用語「調節エレメント」または「調節領域」は典型的に、特定の部位において転写を開始するのに必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子に対する認識を提供することによってコード領域の発現を制御する、構造遺伝子のコード配列に対して通常はであるがいつもというわけではなく上流（５’）の、ＤＮＡの配列を指す。しかし、この配列のイントロン内または３’に位置付けられた他のヌクレオチド配列もまた、対象のコード領域の発現の調節に寄与し得ることを、理解すべきである。特定の部位における開始を確実にするための、ＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子に対する認識を提供する調節エレメントの例は、プロモーターエレメントである。全てではないがほとんどの真核生物プロモーターエレメントは、転写開始部位のおよそ２５塩基対上流に通常は位置する、アデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基対から構成される保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基底プロモーターエレメント、ならびに遺伝子発現を改変する他の調節エレメント（上に列挙したもの）を含む。
【０１２８】
発生的に調節されるもの、誘発性のものまたは構成的なものを含むいくつかの型の調節領域が存在する。発生的に調節されるまたはその制御下の遺伝子の示差的発現を制御する調節領域は、その器官または組織の発生の間に、特定の時間において、特定の器官または器官の組織内で活性化される。しかし、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特定の発生段階において特定の器官または組織内で優先的に活性であり得、発生的に調節される様式で、または植物内の他の器官もしくは組織において基底レベルでも同様に、活性であり得る。組織特異的調節領域の例には、ナピン（napin）プロモーターおよびクルシフェリン（cruciferin）プロモーター（Raskら、１９９８年、J.  Plant  Physiol.  １５２巻:５９５〜５９９頁；Bilodeauら、１９９４年、Plant  Cell  １４巻:１２５〜１３０頁）が含まれる−例えば、特異的調節領域を参照のこと。葉特異的プロモーターの例には、プラストシアニンプロモーターが含まれる（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７，１２５，９７８号を参照のこと）。
【０１２９】
誘発性調節領域は、誘導因子に応答して、１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することが可能な調節領域である。誘導因子の非存在下では、このＤＮＡ配列または遺伝子は転写されないであろう。典型的には、誘導性調節領域に特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し得、この不活性形態は次いで、誘発因子によってその活性形態へと直接的または間接的に変換される。しかし、タンパク質因子は存在しなくてもよい。この誘発因子は、例えば、タンパク質、代謝物、増殖調節因子、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学的要因、あるいは熱、低温、塩もしくは毒性エレメントによって直接的にまたはウイルスなどの病原体および疾患要因の作用を介して間接的に課される生理学的ストレスであり得る。誘発性調節領域を含む植物細胞は、噴霧、散水、加熱または類似の方法などによって、細胞または植物に対して誘発因子を外部から適用することによって、誘発因子に曝露され得る。誘発性調節エレメントは、植物遺伝子または非植物遺伝子のいずれかから誘導され得る（例えば、Gatz,  C.およびLenk,  LR.P.、１９９８年、Trends  Plant  Sci.  ３巻、３５２〜３５８頁；これは参照により組み込まれる）。潜在的な誘発性プロモーターの例には、テトラサイクリン誘発性プロモーター（Gatz,  C.、１９９７年、Ann.  Rev.  Plant  Physiol.  Plant  Mol.  Biol.  ４８巻、８９〜１０８頁；これは参照により組み込まれる）、ステロイド誘発性プロモーター（Aoyama.  T.およびChua,  N.H.、１９９７年、Plant  1.  ２巻、３９７〜４０４頁；これは参照により組み込まれる）およびエタノール誘発性プロモーター（Salter,  M.G.,ら、１９９８年、Plant  10urnal  １６巻、１２７〜１３２頁；Caddick,  M.X.ら、１９９８年、Nature  Biotech.  １６巻、１７７〜１８０頁、これらは参照により組み込まれる）サイトカイニン誘発性ＩＢ６およびＣＫＩ  １遺伝子（Brandstatter,  I.およびK.ieber,  1.1.、１９９８年、Plant  Cell  １０巻、１００９〜１０１９頁；Kakimoto,  T.、１９９６年、Science  ２７４巻、９８２〜９８５頁；これらは参照により組み込まれる）およびオーキシン誘発性エレメント、ＤＲ５（Ulmasov,  T.ら、１９９７年、Plant  Cell  ９巻、１９６３〜１９７１頁；これは参照により組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
構成的調節領域は、植物の種々の部分の至る所で、および植物の発生の至る時期で連続して、遺伝子の発現を指向する。公知の構成的調節エレメントの例には、ＣａＭＶ  ３５Ｓ転写物（Odellら、１９８５年、Nature、３１３巻：８１０〜８１２頁）、イネアクチン１（Zhangら、１９９１年、Plant  Cell、３巻:１１５５〜１１６５頁）、アクチン２（Anら、１９９６年、Plant  J.、１０巻:１０７〜１２１頁）、またはｔｍｓ２（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，４２８，１４７号）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Xuら、１９９４年、Plant  Physiol.  １０６巻:４５９〜４６７頁）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejoら、１９９３年、Plant  Mol.  Biol.  ２９巻:６３７〜６４６頁）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン１および６遺伝子（Holtorfら、１９９５年、Plant  Mol.  Biol.  ２９巻:６３７〜６４６頁）、ならびにタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Mandelら、１９９５年、Plant  Mol.  Biol.  ２９巻:９９５〜１００４頁）に関連するプロモーターが含まれる。
【０１３１】
用語「構成的」は、本明細書中で使用する場合、構成的調節領域の制御下の遺伝子が、全ての細胞型において同じレベルで発現されるが、この遺伝子が、存在量におけるバリエーションがしばしば観察されるとはいえ広範な細胞型において発現されることを、必ずしも示さない。構成的調節エレメントは、それらが動作可能に連結するヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに増強するために、他の配列とカップリングされ得る。例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ系は、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳領域から誘導され、関連するコード配列の増強された翻訳を実証する。「ネイティブ」とは、その核酸またはアミノ酸配列が天然に存在すること、即ち「野生型」であることを意味する。「動作可能に連結した」とは、特定の配列、例えば、調節エレメントおよび対象のコード領域が相互作用して、意図した機能、例えば遺伝子発現の媒介またはモジュレーションを直接的または間接的のいずれかで実行することを意味する。動作可能に連結した配列の相互作用は、例えば、動作可能に連結した配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
【０１３２】
１つまたは複数のウイルスタンパク質、例えば、構造ウイルスタンパク質または例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質は、ウイルスベースの、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現系、例えば、コモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルスベースの増幅エレメントであるがこれらに限定されない発現系を含む発現系において発現され得る。
【０１３３】
本明細書中に記載される発現系は、二分ウイルス、即ち二分ゲノムを有するウイルスに基づく発現カセットを含み得る。例えば、二分ウイルスは、コモウイルス科のものであり得る。コモウイルス科の属には、コモウイルス、ネポウイルス、ファバウイルス、ケラウイルス（Cheravirus）およびサドワウイルス（Sadwavirus）が含まれる。コモウイルスには、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲ重症モザイクウイルス（Cowpea  severe  mosaic  virus）（ＣＰＳＭＶ）、スカッシュモザイクウイルス（ＳｑＭＶ）、アカツメクサ斑紋ウイルス（Red  clover  mottle  virus）（ＲＣＭＶ）、ビーンポッド斑紋ウイルス（Bean  pod  mottle  virus）（ＢＰＭＶ）、カブ輪点ウイルス（ＴｕＲＳＶ）、ソラマメトゥルーモザイクウイルス（ＢＢｔＭＶ）、ソラマメステインウイルス（ＢＢＳＶ）、ダイコンモザイクウイルス（ＲａＭＶ）が含まれる。本発明の種々の態様で有用であり得るエンハンサーエレメントを含むコモウイルスＲＮＡ−２配列の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３５５０）、ＲＣＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３７３８）、ＢＰＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３４９５）、ＣＰＳＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３５４４）、ＳｑＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３８００）、ＴｕＲＳＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０１３２１９．１）、ＢＢｔＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ８１０９０４）、ＢＢＳＶ  ＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ０２８６５０）、ＲａＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３８００）。
【０１３４】
二分コモウイルスＲＮＡゲノムのセグメントは、ＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と呼ばれる。ＲＮＡ−１は、複製に関与するタンパク質をコードするが、ＲＮＡ−２は、細胞から細胞への移動に必要なタンパク質および２つのカプシドタンパク質をコードする。ＣＰＭＶ、ＣＰＳＭＶ、ＳｑＭＶ、ＲＣＭＶまたはＢＰＭＶを含む任意の適切なコモウイルスベースのカセットが使用され得、例えば、発現カセットはＣＰＭＶに基づき得る。
【０１３５】
「発現カセット」は、宿主細胞における対象の核酸の転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあるまたはそれらに作動可能に（または動作可能に）連結した対象の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。
【０１３６】
ＣＰＭＶの両方のゲノムＲＮＡの全長の複製コンピテントなｃＤＮＡコピーでのＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの形質転換は、増殖性感染を生じ得ることが示されている（Liuら、２００４年、Virology  ３２３巻、３７〜４８頁、参照により本明細書中に組み込まれる）。ＣＰＭＶベースの発現カセットの例は、国際公開第２００７／１３５４８０号；国際公開第２００９／０８７３９１号；およびSainsbury  F.ら、（２００８年、Plant  Physiology;１４８巻:１２１２〜１２１８頁；Sainsbury  F.ら、（２００８年、Plant  Biotechnology  Journal;６巻:８２〜９２頁；Sainsbury  F.ら、２００９年、Plant  Biotechnology  Journal;７巻:６８２〜６９３頁；これらの文献は、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。限定とはみなされない例として、５’リーダー配列中に見出される最初の２つの翻訳開始コドンが欠失した、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）のゲノムＲＮＡ２から得られた非翻訳領域（ＵＴＲ）は、国際公開第２００９／０８７３９１号に記載されたように使用され得る。ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターおよびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ターミネーターと組み合わせた場合、改変されたＣＰＭＶ  ＵＴＲは、隣接するコード領域の翻訳を増強した。ＣＰＭＶベースの発現系をＣＰＭＶ−ＨＴ（高翻訳可能）と命名した。従って、本発明の発現カセット、発現構築物および発現系は、例えばＣＰＭＶ−ＨＴ発現系などのＣＰＭＶベースの発現系もまた含み得る。
【０１３７】
本明細書中に記載するように、標的開始部位が変異した、コモウイルスなどの二分ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントからその配列が誘導された（またはＲＮＡ−２ゲノムセグメントと相同性を共有する）発現エンハンサー配列が、対象の核酸配列を発現させるために使用され得る。本発明は、二分ウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントから誘導された配列の発現または翻訳増強活性を増加させるためのプロセスをさらに提供し、このプロセスは、その中の標的開始部位を変異させるステップを含む。
【０１３８】
「エンハンサー」配列（またはエンハンサーエレメント）には、標的開始部位が変異した、コモウイルスなどの二分ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントから誘導された（またはＲＮＡ−２ゲノムセグメントと相同性を共有する）配列が含まれる。かかる配列は、それらが取り付けられる異種ＯＲＦの下流での発現を増強し得る。限定ではないが、かかる配列は、転写されたＲＮＡ中に存在する場合、それらが取り付けられる異種ＯＲＦの翻訳を増強し得ると考えられる。
【０１３９】
この発現系は、ジェミニウイルス由来の増幅エレメント、例えばマメ黄萎ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の増幅エレメントもまた含み得る。ＢｅＹＤＶは、双子葉植物に適応したマストレウイルス（Mastreviruses）属に属する。ＢｅＹＤＶは、一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する一分であり、ローリングサークル機構によって非常に高いコピー数まで複製できる。ＢｅＹＤＶ由来のＤＮＡレプリコンベクター系は、植物における迅速で高収量のタンパク質生成のために使用されてきた。
【０１４０】
本明細書中で使用する場合、語句「増幅エレメント」は、ジェミニウイルスゲノムのうち１つまたは複数の長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部分を含む核酸セグメントを指す。本明細書中で使用する場合、「長い遺伝子間領域」は、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による切り出しおよび複製を媒介することが可能なｒｅｐ結合部位を含む長い遺伝子間領域の領域を指す。いくつかの態様では、１つまたは複数のＬＩＲを含む核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）をさらに含み得る。本明細書中で使用する場合、「短い遺伝子間領域」は、相補鎖（マストレウイルスの短いＩＲ（ＳＩＲ））を指す。任意の適切なジェミニウイルス由来の増幅エレメントが、本明細書中で使用され得る。例えば、国際公開第２０００／２０５５７号；国際公開第２０１０／０２５２８５号；Zhang  X.ら（２００５年、Biotechnology  and  Bioengineering、９３巻、２７１〜２７９頁）、Huang  Z.ら（２００９年、Biotechnology  and  Bioengineering、１０３巻、７０６〜７１４頁）、Huang  Z.ら（２００９年、Biotechnology  and  Bioengineering、１０６巻、９〜１７頁）；これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。１つより多いＬＩＲ、例えば２つのＬＩＲが構築物において使用される場合、プロモーター、ＣＭＰＶ−ＨＴ領域および対象の核酸配列ならびにターミネーターは、２つのＬＩＲの各々によってひとまとめにされる。
【０１４１】
本明細書中で記載されるように、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のアグロ浸潤による、マメ黄萎ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来のベクターとＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターとの同時送達は、十分なレプリコン増幅および強力なタンパク質生成を生じる。
【０１４２】
コモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルス由来増幅エレメントは、それぞれ第１のベクターおよび第２のベクター中に含まれ得るか、またはこれらの成分部分は１つのベクター中に含まれ得る。２つのベクターが使用される場合、この第１のベクターおよび第２のベクターは、植物細胞中に同時にまたは個別に導入され得る。
【０１４３】
ウイルスレプリカーゼもまた、対象の核酸の発現を増加させるために、本明細書中に記載されるような発現系中に含まれ得る。レプリカーゼの非限定的な例は、ＢｅＹＤＶ  ＲｅｐおよびＲｅｐＡをコードするＢｅＹＤＶレプリカーゼ（ｐＲＥＰ１１０）（Ｃ２／Ｃ１；Huangら、２００９年、Biotechnol.  Bioeng.  １０３巻、７０６〜７１４頁；これは、参照により本明細書中に組み込まれる）である。
【０１４４】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、植物における導入遺伝子の限定的な発現に関与し得、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ  ｐ１９）またはジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）由来のサイレンシングのサプレッサーの同時発現は、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を相殺するために使用され得る（Brignetiら、１９９８年）。
【０１４５】
代替的なサイレンシングのサプレッサーは当技術分野で周知であり、本明細書中に記載されるように使用され得（Chibaら、２００６年、Virology  ３４６巻:７〜１４頁；これは、参照により本明細書中に組み込まれる）、例えば、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトクリンクルウイルス（Tomato  crinkle  virus）のカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ；ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルス（Blueberry  scorch  virus）のｐ１６、（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザ（tristexa）ウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス（Grapevine  leafroll-associated  virus）−２のｐ２４、（ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４）、ブドウウイルス（Grapevine  virus）Ａのｐ１０、（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド潜在ウイルス（Heracleum  latent  virus）のｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）またはニンニク普通潜在ウイルス（Garlic  common  latent  virus）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）であるがこれらに限定されない。従って、例えばＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ  ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であるがこれらに限定されないサイレンシングのサプレッサーは、植物内での高レベルのタンパク質生成をさらに確実にするために、対象のタンパク質をコードする核酸配列と共に同時発現され得る。
【０１４６】
「同時発現される」とは、２つまたは２つより多いヌクレオチド配列が、その植物内でほぼ同時に、および植物の同じ組織内で、発現されることを意味する。しかし、ヌクレオチド配列は、正確に同時に発現される必要はない。むしろ、２つ以上のヌクレオチド配列は、コードされた産物が相互作用する機会を有するような様式で発現される。例えば、対象のタンパク質のグリコシル化を改変するタンパク質は、対象のタンパク質のグリコシル化の改変が起こるように、対象のタンパク質が発現される期間の前またはその間のいずれかに発現され得る。２つまたは２つより多いヌクレオチド配列は、２つまたは複数の配列が、両方の配列が発現される条件下でほぼ同時に植物内に導入される場合、一過的発現系を使用して同時発現され得る。あるいは、対象のタンパク質のグリコシル化プロファイルを改変するタンパク質をコードする配列などのヌクレオチド配列のうち１つを含むプラットフォーム植物は、対象のタンパク質をコードするさらなる配列により、一過的にまたは安定な様式でのいずれかで、形質転換され得る。この場合、対象のタンパク質のグリコシル化プロファイルを改変するタンパク質をコードする配列は、発生の所望の段階の間に所望の組織内で発現され得るか、またはその発現は、誘発性プロモーターを使用して誘発され得、対象のタンパク質をコードするさらなる配列は、これらのヌクレオチド配列が同時発現されるのを確実にするために、類似の条件下で同じ組織中で発現され得る。
【０１４７】
１つまたは複数のウイルスタンパク質は、ヌクレオチド配列からの転写物として生成され得、合成後にタンパク質は切断され得、必要に応じて会合して、多量体タンパク質を形成し得る。従って、１つまたは複数のウイルスタンパク質は、ジスルフィド架橋を介して会合したサブユニットを含むタンパク質またはポリペプチド（即ち、多量体タンパク質）もまた含む。例えば、２つまたは２つより多い供給源由来のアミノ酸配列を含むタンパク質は、サブユニットへとプロセシングされ得、これらのサブユニットがジスルフィド架橋を介して会合して、タンパク質を生成し得る。
【０１４８】
本発明の１つまたは複数の核酸配列または遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列または構築物またはベクターによって形質転換される任意の適切な植物宿主において発現され得る。適切な宿主の例には、アルファルファ、セイヨウアブラナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．、トウモロコシ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウマメ、カラスムギ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタなどを含む農業作物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明の１つまたは複数の遺伝子構築物は、３’非翻訳領域をさらに含み得る。３’非翻訳領域とは、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことが可能な任意の他の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラックの付加をもたらすことによって、通常特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、正準形態５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって一般に認識されるが、バリエーションが一般的でないわけではない。適切な３’領域の非限定的な例は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、例えばノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子、植物遺伝子、例えばダイズ貯蔵タンパク質遺伝子、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；米国特許第４，９６２，０２８号；これは、参照により本明細書中に組み込まれる）のポリアデニル化シグナルを含む３’側の転写された非翻訳領域、米国特許第７，１２５，９７８号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるプラストシアニン発現を調節するのに使用されるプロモーターである。
【０１５０】
本発明の遺伝子構築物のうち１つまたは複数は、必要に応じて、翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれかであるさらなるエンハンサーもまた含み得る。エンハンサーは、転写される配列に対して５’側または３’側に位置付けられ得る。エンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドン、隣接配列などを含み得る。開始コドンは、存在する場合、転写された配列の正確な翻訳を提供するために、コード配列のリーディングフレームと同期し（「インフレーム」であり）得る。
【０１５１】
「形質転換」とは、遺伝子型的に、表現型的にまたはその両方で顕在化される遺伝子情報（ヌクレオチド配列）の種間移行を意味する。構築物から宿主への遺伝子情報の種間移行は一過的であり得、遺伝子情報の移行が遺伝性でないか、またはこの移行は遺伝性であり得、遺伝子情報の移行は安定とみなされる。
【０１５２】
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して、植物細胞中に導入され得る。かかる技術の概説については、例えばWeissbachおよびWeissbach、Methods  for  Plant  Molecular  Biology、Academy  Press、New  York  VIII、４２１〜４６３頁（１９８８年）；GeiersonおよびCorey、Plant  Molecular  Biology、第２版（１９８８年）；ならびにMikiおよびIyer、Fundamentals  of  Gene  Transfer  in  Plants.  In  Plant  Metabolism、第２版  DT.  Dennis、DH  Turpin、DD  Lefebrve、DB  Layzell  (編)、Addison  Wesly、Langmans  Ltd.  London、５６１〜５７９頁（１９９７年）を参照のこと。他の方法には、直接的ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、例えばプロトプラストを使用するエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃またはウィスカー、および減圧浸潤が含まれる。例えば、Bilang、ら（Gene  １００巻:２４７〜２５０頁（１９９１年）、Scheidら（Mol.  Gen.  Genet.  ２２８巻:１０４〜１１２頁、１９９１年）、Guercheら（Plant  Science  ５２巻:１１１〜１１６頁、１９８７年）、Neuhauseら（Theor.  Appl  Genet.  ７５巻:３０〜３６頁、１９８７年）、Kleinら、Nature  ３２７巻:７０〜７３頁（１９８７年）；Howellら（Science  ２０８巻:１２６５頁、１９８０年）、Horschら（Science  ２２７巻:１２２９〜１２３１頁、１９８５年）、DeBlockら、Plant  Physiology  ９１巻:６９４〜７０１頁、１９８９年）、Methods  for  Plant  Molecular  Biology（WeissbachおよびWeissbach、編、  Academic  Press  Inc.、１９８８年）、Methods  in  Plant  Molecular  Biology（SchulerおよびZielinski、編、Academic  Press  Inc.、１９８９年）、LiuおよびLomonossoff（J  Virol  Meth、１０５巻:３４３〜３４８頁、２００２年）、米国特許第４，９４５，０５０号；米国特許第５，０３６，００６号；および米国特許第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日出願の米国特許出願第０８／４３８，６６６号、および１９９２年９月２５日出願の米国特許出願第０７／９５１，７１５号（これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１５３】
以下に記載するように、一過的発現法が、本発明の構築物を発現するために使用され得る（LiuおよびLomonossoff、２００２年、Journal  of  Virological  Methods、１０５巻:３４３〜３４８頁を参照のこと；これは、参照により本明細書中に組み込まれる）。あるいは、参照により本明細書中に組み込まれるKapilaら、１９９７年に記載されるような、減圧ベースの一過的発現法が使用され得る。これらの方法には、例えば、アグロ接種またはアグロ浸潤、シリンジ浸潤の方法が含まれ得るがこれらに限定されないが、他の一過的方法もまた、上記のように使用され得る。アグロ接種、アグロ浸潤またはシリンジ（synringe）浸潤を用いて、所望の核酸を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａの混合物が、葉などの組織、植物の大気中の一部分（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部分（茎、根、花）、または植物全体の細胞間隙に進入する。表皮を横切った後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａは細胞に感染し、その細胞中にｔ−ＤＮＡコピーを移行させる。ｔ−ＤＮＡは、エピソームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞における対象のタンパク質の生成をもたらすが、核の内側でのｔ−ＤＮＡの継代は一過的である。
【０１５４】
形質転換された植物細胞の同定を補助するために、本発明の構築物は、植物の選択マーカーを含むようにさらに操作され得る。有用な選択マーカーには、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンなどの化学物質、またはフォスフィノスリシン（phosphinothrycin）、グリホサート、クロルスルフロン（chlorosulfuron）などの除草剤などに対する抵抗性を提供する酵素が含まれる。同様に、色変化によって同定可能な化合物の生成を提供する酵素、例えばＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）、または発光、例えばルシフェラーゼもしくはＧＦＰが、使用され得る。
【０１５５】
用語「植物物質」は、植物から誘導された任意の材料を意味する。植物物質は、植物全体、組織、細胞またはそれらの任意の画分を含み得る。さらに、植物物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せ由来の、植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはそれらの組合せを含み得る。植物物質は、いずれのプロセシングステップにも供されていない、植物またはその一部分を含み得る。しかし、植物材料が、以下に規定されるような最小限のプロセシングステップまたはより厳密なプロセシングに供され得、かかる処理には、クロマトグラフィー、電気泳動などが含まれるがこれらに限定されない当技術分野で一般に公知の技術を使用した部分的なまたは実質的なタンパク質精製が含まれることもまた、企図される。
【０１５６】
用語「最小限のプロセシング」は、植物抽出物、ホモジネート、植物ホモジネートの画分などを得るために部分的に精製された（即ち、最小限の処理をされた）対象のタンパク質を含む、植物またはその一部分などの植物物質を意味する。部分的精製は、植物細胞構造を破壊することにより、可溶性植物成分および不溶性植物成分を含む組成物を創出することを含み得るがこれに限定されず、これらの成分は、例えば遠心分離、濾過またはそれらの組合せによって分離され得るが、これらに限定されない。これに関して、葉または他の組織の細胞外間隙内に分泌されるタンパク質は、減圧または遠心分離抽出を使用して容易に得ることができるか、あるいは組織は、細胞外間隙内からこのタンパク質を圧搾するまたは遊離させるために、ローラーを通過させることまたは粉砕などによって圧力下で抽出され得る。最小限のプロセシングは、可溶性タンパク質の粗製抽出物の調製もまた含み得るが、これは、これらの調製物が、植物副産物からの無視できる汚染を有するからである。さらに、最小限のプロセシングは、葉からの可溶性タンパク質の水性抽出と、その後の任意の適切な塩での沈殿とを含み得る。他の方法には、抽出物の直接的な使用を可能にするための、大規模なマセレーションおよびしぼり汁抽出が含まれ得る。
【０１５７】
植物材料または組織の形態の植物物質は、被験体に経口送達され得る。この植物物質は、健康補助食品の一部として、他の食品と共に、またはカプセル化されて投与され得る。この植物物質または組織はまた、嗜好性を改善もしくは増加させるために濃縮され得、または必要に応じて、他の材料、構成要素もしくは医薬添加剤と共に提供され得る。
【０１５８】
対象のタンパク質を含む植物または対象のタンパク質を含むＶＬＰを発現する植物は、要件および状況に依存して種々の方法で、被験体または標的生物に投与され得ることが企図される。例えば、植物から得られた対象のタンパク質は、粗製形態、部分的に精製された形態または精製された形態のいずれかで、その使用の前に抽出され得る。タンパク質が精製される場合、このタンパク質は、食用植物または非食用植物のいずれかにおいて生成され得る。さらに、タンパク質が経口投与される場合、この植物組織は収穫されて被験体に直接給餌され得るか、または収穫された組織が給餌の前に乾燥され得るか、または動物が、事前の収穫を行わずに植物上で放牧され得る。収穫された植物組織が、動物のエサ内の栄養補助食品として提供されることも、本発明の範囲内で考慮される。植物組織が、さらなるプロセシングをほとんどまたは全く伴わずに被験体または動物に給餌される場合、投与される植物組織は食用であることが好ましい。
【０１５９】
本発明に従って生成されたＶＬＰは、当業者に公知の方法を使用して、植物、植物の一部分もしくは植物物質から精製され得、部分的に精製され得、または経口ワクチンとして投与され得る。精製は、国際公開第２０１１／０３５４２２号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるようなアポプラスト画分の生成を含み得る。調製的サイズ排除クロマトグラフィーのために、ＶＬＰを含む調製物が得られ得、不溶性材料が遠心分離によって除去され得る。ＰＥＧを用いた沈殿もまた使用され得る。回収されたタンパク質は、従来の方法（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ、ＢＣＡ）を使用して定量され得、抽出物を、例えばＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）または類似の媒体を使用してサイズ排除カラムを通過させ得、画分が収集され得る。Ｂｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００または適切なタンパク質が、較正標準として使用され得る。この抽出物をまた、カチオン交換カラムを通過させ得、活性画分が収集され得る。クロマトグラフィー後、画分は、画分のＶＬＰおよびタンパク質相補体の存在を確認するために、タンパク質電気泳動、イムノブロットまたはそれら両方によってさらに分析され得る。
【０１６０】
本発明のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物、植物細胞、種子またはその任意の画分もまた、本発明の考慮される部分である。植物細胞から植物全体を再生する方法もまた、当技術分野で公知である。一般に、形質転換された植物細胞は、抗生物質などの選択剤を含み得る適切な培地中で培養され、形質転換された植物細胞の同定を容易にするために選択マーカーが使用される。一旦カルスが形成すると、苗条形成が、公知の方法に従って適切な植物ホルモンを使用することによって促され得、苗条は、植物の再生のために発根培地に移され得る。次いで、植物は、種子からまたは栄養繁殖技術を使用してのいずれかで、反復性の生成を確立するために使用され得る。トランスジェニック植物は、組織培養物を使用することなしにでも生成され得る。
【０１６１】
図１８に示すように、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉においては発現が乏しい（レーン「１００８」または「１０２９」を参照のこと）。しかし、ＨＡ−Ｂ型の、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現は、ＨＡ発現における有意な増加を生じる（レーン「１００８＋１２６１」；「１００９＋１２６１」および「１０２９＋１２６１」を参照のこと）。ＨＡ発現における増加が、ネイティブＢ型ＨＡまたはキメラＨＡ  Ｂ型の両方において観察された。ＨＡ発現は、増幅（amplication）エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下または非存在下で、種々の希釈のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにわたって観察された。Ｈ３発現における類似の増加が、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来のＨ３を、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と共に同時発現させた場合に、観察された（図１９；レーン「１０１９」Ｈ３単独を、「１０１９＋１２６１」Ｍ２と同時発現させたＨ３と比較されたい）。
【０１６２】
本発明は、表３に示されるヌクレオチド配列を含む。
【表３−１】
2014530006.tif 000010
【表３−２】
2014530006.tif 000011
【表３−３】
2014530006.tif 000012
【０１６３】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【０１６４】
材料および方法：：発現カセットのインフルエンザタンパク質とのアセンブリ
【０１６５】
Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。完全Ｈ５コード配列を含む断片を、構築物番号９７２（構築物番号９７２の配列については、図９４、参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１０／００３２２５号の配列番号１３４を参照のこと）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系においてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｄ、配列番号４）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ  ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号４８９を与えた（図１Ｅ、配列番号５）。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列を１Ｆに示す（配列番号６）。プラスミド４８９の表示を図１５に示す。
【０１６６】
Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）
インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。完全Ｍ２コード配列を含む断片を、合成されたＭ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ５０８８６０由来のｎｔ７１５〜９８２に接続されたｎｔ１〜２６に対応する）（図２Ｃ、配列番号９）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（図２Ａ、配列番号７）およびＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（図２Ｂ、配列番号８）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系においてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｃ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ  ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号１２６１を与えた（図２Ｄ、配列番号１０）。インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列を図２Ｅに示す（配列番号１１）。プラスミド１２６１の表示を図１６に示す。
【０１６７】
Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２  Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／ＮＯＳ（構築物番号８５９）
インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。完全Ｍ２コード配列を含む断片を、合成されたＭ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ４６７８２４由来のｎｔ７４０〜１００７に接続されたｎｔ２６〜５１に対応する）（図３Ａ、配列番号１２）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（図２Ａ、配列番号７）およびＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（図２Ｂ、配列番号８）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系においてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｃ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ  ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。ベクターはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号８５９を与えた（図３Ｂ、配列番号１３）。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列を図３Ｃに示す（配列番号１４）。プラスミド８５９の表示を図１７に示す。
【０１６８】
Ｄ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８４）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＨ１をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨ１コード配列を含む断片を、合成されたＨ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６６９７４）（図４Ｃ、配列番号１７）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ２＋４ｃ（図４Ａ、配列番号１５）およびＩＦ−Ｈ１Ａ−Ｃ−０９．ｓ１−４ｒ（図４Ｂ、配列番号１６）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２（図４Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４Ｅに示す（配列番号１８）。得られた構築物に番号４８４を与えた（図４Ｆ、配列番号１９）。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ１のアミノ酸配列を図４Ｇに示す（配列番号２０）。プラスミド４８４の表示を図１４に示す。
【０１６９】
Ｅ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｐｅｒｔｈ／ＮＯＳ（構築物番号１０１９）
インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＨ３をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨ３コード配列を含む断片を、合成されたＨ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＧＱ２９３０８１由来のｎｔ２６〜１７２６に対応する）（図５Ｃ、配列番号２３）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｃ（図５Ａ、配列番号２１）およびＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｈ３  Ｐｅｒ．ｒ（図５Ｂ、配列番号２２）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２（図４Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた企図する。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４Ｅに示す（配列番号１８）。得られた構築物に番号１０１９を与えた（図５Ｄ、配列番号２４）。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３のアミノ酸配列を図５Ｅに示す（配列番号２５）。プラスミド１０１９の表示を図１３に示す。
【０１７０】
Ｆ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０２９）
インフルエンザＢ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（図６Ｃ、配列番号２８）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（図６Ａ、配列番号２６）およびＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（図６Ｂ、配列番号２７）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２（図４Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４Ｅに示す（配列番号１８）。得られた構築物に番号１０２９を与えた（図６Ｄ、配列番号２９）。インフルエンザＢ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列を図６Ｅに示す（配列番号３０）。プラスミド１０１９の表示を図１１に示す。
【０１７１】
ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）
インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（図６Ｃ、配列番号２８）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（図６Ａ、配列番号２６）およびＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（図６Ｂ、配列番号２７）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ増幅系中に、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９４（図６Ｆおよび６Ｇを参照のこと）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９４は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の、ＢｅＹＤＶ増幅系中への「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図６Ｇに示す（配列番号３１）。得られた構築物に番号１００８を与えた（図６Ｈ  配列番号３２）。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８由来のインフルエンザＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列を図６Ｅに示す（配列番号３０）。プラスミド１００８の表示を図９に示す。
【０１７２】
ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＨ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ膜貫通ドメインおよび細胞質テール（Ｈ５Ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴ）／ＮＯＳ（構築物番号１００９）
Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインに融合したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８外部ドメイン由来のＨＡをコードする配列を、Darveauら（Methods  in  Neuroscience  ２６巻:７７〜８５頁（１９９５年））によって提示されたＰＣＲベースのライゲーション法を使用して、以下のように、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、ネイティブシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有さないＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ外部ドメインコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（図６Ｃ、配列番号２８）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（図６Ａ、配列番号２６）およびｄＴｍＨ５Ｉ−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（図７Ａ、配列番号３３）を使用して増幅した。Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む第２の断片を、構築物番号４８９（図１Ｅ、配列番号５を参照のこと）を鋳型として使用して、プライマーＢ  Ｂｒｉｓ−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｃ（図７Ｂ、配列番号３４）およびＩＦ−Ｓ１ａＳ４−ｄＴｍＨ５Ｉ．ｒ（図７Ｃ、配列番号３５）を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（図６Ａ、配列番号２６）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図７Ｃ、配列番号３４）をプライマーとして使用する増幅の第２ラウンドのための鋳型として使用した。得られた断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ増幅系中に、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９４（図６Ｆおよび６Ｇ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９４は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の、ＢｅＹＤＶ増幅系中への「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図６Ｇに示す（配列番号３１）。得られた構築物に番号１００９を与えた（図７Ｄ、配列番号３６）。ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／Ｈ５ｉｎｄｏ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列を図７Ｅに示す（配列番号３７）。プラスミド１００９の表示を図１０に示す。
【０１７３】
ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への、Ｉ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＰＤＩＳＰ−ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号１０５９）
タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、Darveauら（Methods  in  Neuroscience  ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））によって提示された以下のＰＣＲベースのライゲーション法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、ｎｔ４６からｎｔ１０６５までのＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（図６Ｃ、配列番号２８）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（図６Ａ、配列番号２６）および１０３９＋１０５９．ｒ（図８Ａ、配列番号３８）を使用して増幅した。ｎｔ１１２３からｎｔ１７５８までのＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む第２の断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（図６Ｃ、配列番号２８）を鋳型として使用して、プライマー１０３９＋１０５９．ｃ（図８Ｂ、配列番号３９）およびＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（図６Ｂ、配列番号２７）を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｃ（図６Ａ、配列番号２６）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ  ＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ  Ｂｒｉｓ．ｒ（図６Ｂ、配列番号２７）をプライマーとして使用する増幅の第２ラウンドのための鋳型として使用した。得られた断片（断片間のＧＧリンカーと共にＨＡ  Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８  Δａ．ａ．３５６〜３７４をコードする）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９４（図６Ｆおよび６Ｇ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９４は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の、ＢｅＹＤＶ増幅系中への「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた企図する。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図６Ｇに示す（配列番号３１）。得られた構築物に番号１０５９を与えた（図８Ｃ、配列番号４０）。タンパク質分解性ループが欠失したＰＤＩＳＰ−ＨＡ  Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のアミノ酸配列を図８Ｄに示���（配列番号４１）。プラスミド１０５９の表示を図１２に示す。
【０１７４】
Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１３９１）
インフルエンザＡ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＨ３をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨ３コード配列を含む断片を、合成されたＨ３遺伝子（ＧＩＳＡＩＤ  ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０１５０６単離体ＨＡ配列由来のｎｔ２５〜１７２５に対応する）（図２５Ｃ、配列番号４６）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．Ｓ２＋４ｃ（図２５Ａ、配列番号４４）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図２５Ｂ、配列番号４５）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２（図４Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４Ｅに示す（配列番号１８）。得られた構築物に番号１３９１を与えた（図２５Ｄ、配列番号４７）。インフルエンザＡ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）由来のＰＤＩＳＰ／Ｈ３のアミノ酸配列を図２５Ｅに示す（配列番号４８）。プラスミド１３９１の表示を図２５Ｆに示す。
【０１７５】
ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）
インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡをコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。完全ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）（図２６Ｃ、配列番号５１）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（図２６Ａ、配列番号４９）およびＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（図２６Ｂ、配列番号５０）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系中に２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中でクローニングした。構築物１９３（図２６Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１９３は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系中への、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた企図する。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図２６Ｅに示す（配列番号５２）。得られた構築物に番号１４６２を与えた（図２６Ｆ、配列番号５３）。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列を図２６Ｇに示す（配列番号５４）。プラスミド１４６２の表示を図２６Ｈに示す。
【０１７６】
ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への、Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（構築物番号１４６７）
タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡをコードする配列を、Darveauら（Methods  in  Neuroscience  ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））によって提示された以下のＰＣＲベースのライゲーション法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、ｎｔ１からｎｔ１０６２までのＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）（図２６Ｃ、配列番号５１）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（図２６Ａ、配列番号４９）およびＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｒ（図２７Ａ、配列番号５５）を使用して増幅した。ｎｔ１１２０からｎｔ１７５５までのＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎコード配列を含む第２の断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）（図２６Ｃ、配列番号５１）を鋳型として使用して、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｃ（図２７Ｂ、配列番号５６）およびＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（図２６Ｂ、配列番号５０）を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（図２６Ａ、配列番号４９）およびＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（図２６Ｂ、配列番号５０）をプライマーとして使用する増幅の第２ラウンドのための鋳型として使用した。得られた断片（断片間のＧＧリンカーと共にＨＡ  Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０  Δａ．ａ．３４０〜３５８をコードする）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中でクローニングした。構築物１９３（図２６Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１９３は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系中への、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた企図する。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図２６Ｅに示す（配列番号５２）。得られた構築物に番号１４６７を与えた（図２７Ｃ、配列番号５７）。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列を図２７Ｄに示す（配列番号５８）。プラスミド１４６７の表示を図２７Ｅに示す。
【０１７７】
ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＤ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１６３１）
インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＨＡをコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ  Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ１２４２７５由来のｎｔ３１〜１７４３に対応する。サイレント変異Ｔ７５９ＣおよびＣ８８８Ｇを、ＤｒａＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を改変するために、合成された配列中に挿入した）（図２８Ｃ、配列番号６１）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ２＋４ｃ（図２８Ａ、配列番号５９）およびＩＦ−ＨＢ−Ｍ−０４．ｓ１−４ｒ（図２８Ｂ、配列番号６０）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系中に、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１９４（図２８Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１９４は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系中への、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでの対象の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ  Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた企図する。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図２８Ｅに示す（配列番号６２）。得られた構築物に番号１６３１を与えた（図２８Ｆ、配列番号６３）。インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列を図２８Ｇに示す（配列番号６４）。プラスミド１６３１の表示を図２８Ｈに示す。
【０１７８】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍトランスフェクション
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＡＧＬ１を、D’Aoustら２００８年（Plant  Biotechnology  Journal  ６巻:９３０〜９４０頁）に記載される方法を使用して、ＤＮＡ構築物を用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトしたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地中で、０．６と１．６との間のＯＤ６００まで増殖させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁物を、使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁した。
【０１７９】
植物バイオマス、接種材料およびアグロ浸潤の準備
用語「バイオマス」および「植物物質」は、本明細書中で使用する場合、植物から誘導された任意の材料を反映する意味である。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、組織、細胞またはそれらの任意の画分を含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せ由来の、植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはそれらの組合せを含み得る。植物の一部分は、植物物質またはバイオマスを含み得る。
【０１８０】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、市販のピートモス基材を満たした苗用木箱において種子から成長させた。これらの植物を、１６／８の光周期および２５℃日中／２０℃夜間の温度体制の下で温室中で成長させた。播種の３週間後、個々の小植物を取り上げ、植木鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間温室中で成長させた。
【０１８１】
各構築物でトランスフェクトしたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地中で、それらが０．６と１．６との間のＯＤ６００に達するまで増殖させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁物を、使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。浸潤の日に、培養物バッチを２．５培養容量中に希釈し、使用前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの減圧下で、２分間にわたって気密ステンレス鋼タンク中で細菌懸濁物中に逆さまに置いた。植物を、収穫まで２〜６日間のインキュベーション期間にわたり、温室に戻した。
【０１８２】
葉の収穫および総タンパク質抽出
インキュベーション後、植物の大気中の部分を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕してかけらにした。総可溶性タンパク質を、３容量の冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル中で、凍結し破砕した植物材料の各試料をホモジナイズすることによって（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）抽出した。ホモジナイゼーション後、スラリーを１０，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離し、これらの清澄化した粗製抽出物（上清）を分析のために維持した。
【０１８３】
タンパク質分析およびイムノブロッティング
清澄化した粗製抽出物の総タンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを参照標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニリデンジフルオライド（polyvinylene  difluoride）（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電気泳動転写した。イムノブロッティングの前に、これらのメンブレンを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中５％のスキムミルクおよび０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で、４℃で１６〜１８時間ブロッキングした。
【０１８４】
イムノブロッティングを、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％中２％のスキムミルク中２μｇ／ｍｌの一次抗体（表４は、各ＨＡの検出のために使用した抗体および条件を示す）との第１のインキュベーションを用いて実施した。化学発光検出に使用した二次抗体は、表４に示すとおりであり、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％中２％のスキムミルク中に、示したように希釈した。免疫反応性複合体を、基質としてルミノール（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して化学発光によって検出した。ヒトＩｇＧ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素コンジュゲート化を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅコンジュゲーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して実施した。
【表４】
2014530006.tif 000013
【０１８５】
赤血球凝集アッセイ
赤血球凝集アッセイは、NayakおよびReichl（２００４年）に記載された方法に基づいた。簡潔に述べると、試験試料（１００μＬ）の段階二重希釈を、１００μＬ  ＰＢＳを含むＶ底９６ウェルマイクロタイタープレート中で作製し、１ウェル当たり１００μＬの希釈された試料にした。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁物（Ｂｉｏ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ）を各ウェルに添加し、室温で２時間プレートをインキュベートした。完全赤血球凝集を示す最も高い希釈の逆数を、ＨＡ活性として記録した。並行して、組換えＨＡ標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）をＰＢＳ中に希釈し、各プレートに対する対照として実施した。
【０１８６】
（実施例１）
Ｂ  ＨＡおよびＨ３の蓄積レベルに対するインフルエンザＭ２同時発現の影響
異なるインフルエンザ株由来のＨＡの蓄積レベルに対するインフルエンザＭ２同時発現の影響を、アグロ浸潤ベースの一過的形質転換系において、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２の発現のための構築物と共に、ＨＡの発現を駆動する構築物を同時トランスファーする（co-transferring）ことによって分析した。
【０１８７】
Ｍ２発現構築物（構築物番号１２６１）の存在下または非存在下で、インフルエンザＢ  ＨＡ（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来）の発現を駆動する遺伝子構築物（構築物番号１００８、１００９および１０２９）で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、Ｍ２の同時発現が、インフルエンザＢ  ＨＡの増加した蓄積を生じることが示された（図１８）。同様に、Ｍ２とインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来のＨ３との同時発現（構築物番号１０１９＋１２６１）は、図１９に示されるように、Ｈ３発現構築物（構築物番号１０１９）のみで形質転換した植物と比較した場合、形質転換された植物においてＨ３の増加した蓄積を生じた。
【０１８８】
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９由来のＨ１と共にＭ２を同時発現する植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、Ｍ２とＨ１との同時発現が、Ｈ１蓄積レベルにおける僅かな減少を生じたことが示された（図２０、４８４対４８４＋１２６１）。Ｍ２とインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５由来のＨ５との同時発現もまた、Ｈ５を単独で発現させた場合と比較して、低減したＨ５蓄積を生じた（図２１、４８９対４８９＋１２６１）。
【０１８９】
Ｍ２の同時発現を、改変されたインフルエンザＢ  ＨＡの蓄積レベルに対するその影響についてさらに評価した。構築物番号１０５９は、そのタンパク質分解性ループが２アミノ酸のリンカーによって置き換えられた（ａａ３４１〜３５９の代わりにＧＧ）インフルエンザＢ  ＨＡをコードする。図２２Ａに示されるウエスタンブロット分析からの結果は、タンパク質分解性ループの除去が増加したインフルエンザＢ  ＨＡ蓄積レベルを生じたこと（１００８を１０５９と比較されたい）、およびＭ２と改変されたインフルエンザＢ  ＨＡとの同時発現がＨＡ蓄積レベルをさらに増加させたこと（図２２Ａ、１０５９対１０５９＋１２６１）を示す。改変ありまたはなし、およびＭ２の同時発現ありまたはなしでの、インフルエンザＢ  ＨＡで形質転換した植物由来の粗製タンパク質抽出物に対する赤血球凝集活性の分析により、ネイティブインフルエンザＢ  ＨＡ（図２２Ｂ、１００８対１００８＋１２６１）および改変されたインフルエンザＢ  ＨＡ（図２２Ｂ、１０５９対１０５９＋１２６１）の蓄積レベルに対する、Ｍ２同時発現の陽性効果が確認された。
【０１９０】
インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２が、改変されたインフルエンザＢ  ＨＡおよびＨ３の蓄積を増加させる効力を、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２の効力と比較した。改変されたインフルエンザＢ  ＨＡについて、構築物１０５９、１０５９＋１２６１および１０５９＋８５９で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によって比較を行った。Ｈ３については、１０１９、１０１９＋１２６１および１０１９＋８５９で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物に対して類似の比較を行った。得られた結果は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２（構築物番号８５９によってコードされる）の同時発現が、改変されたインフルエンザＢ  ＨＡ（図２３Ａ）およびＨ３（図２３Ｂ）の両方の蓄積を増加させるのに、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２（構築物番号１２６１によってコードされる）の同時発現と同程度に効率的であったことを実証した。
【０１９１】
（実施例２）
異なる株のＢ  ＨＡおよびＨ３の蓄積レベルに対するインフルエンザＭ２同時発現の影響
Ｍ２発現構築物（構築物番号１２６１）の存在下または非存在下での、インフルエンザＢ  ＨＡ（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来）の発現を駆動する遺伝子構築物（構築物番号１６３１）で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、Ｍ２の同時発現がインフルエンザＢ  ＨＡの増加した蓄積を生じることが示された（図２９）。
【０１９２】
Ｍ２発現構築物（構築物番号１２６１）の存在下または非存在下での、インフルエンザＢ  ＨＡ（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来）の発現を駆動する遺伝子構築物（構築物番号１４６２）で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、Ｍ２の同時発現がインフルエンザＢ  ＨＡの増加した蓄積を生じることが示された（図３０）。
【０１９３】
Ｍ２の同時発現を、改変されたインフルエンザＢ  ＨＡの蓄積レベルに対するその影響についてさらに評価した。構築物番号１４６７は、そのタンパク質分解性ループが２アミノ酸のリンカーによって置き換えられた（ａａ３４１〜３５９の代わりにＧＧ）インフルエンザＢ  ＨＡをコードする。図３０Ａに示されるウエスタンブロット分析からの結果は、タンパク質分解性ループの除去が増加したインフルエンザＢ  ＨＡ蓄積レベルを生じたこと（１４６２を１４６７と比較されたい）、およびＭ２と改変されたインフルエンザＢ  ＨＡとの同時発現がＨＡ蓄積レベルをさらに増加させたこと（図３０Ａ、１４６７対１４６７＋１２６１）を示す。改変ありまたはなし、およびＭ２の同時発現ありまたはなしでの、インフルエンザＢ  ＨＡで形質転換した植物由来の粗製タンパク質抽出物に対する赤血球凝集活性の分析により、ネイティブインフルエンザＢ  ＨＡ（図３０Ｂ、１４６２対１４６２＋１２６１）および改変されたインフルエンザＢ  ＨＡ（図２６Ｂ、１４６７対１４６７＋１２６１）の蓄積レベルに対する、Ｍ２同時発現の陽性効果が確認された。
【０１９４】
Ｍ２発現構築物（構築物番号１２６１）の存在下または非存在下での、インフルエンザＨ３（Ｈ３／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来）の発現を駆動する遺伝子構築物（構築物番号１３９１）で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、Ｍ２の同時発現がインフルエンザＨ３の増加した蓄積を生じることが示された（図３１）。
全ての参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
本発明を１つまたは複数の実施形態に関して記載してきた。しかし、いくつかのバリエーションおよび改変が、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかであろう。
【図１−２】
2014530006.tif 000014
【図１−３】
2014530006.tif 000015
【図１−４】
2014530006.tif 000016
【図１−５】
2014530006.tif 000017
【図２−１】
2014530006.tif 000018
【図２−２】
2014530006.tif 000019
【図３−１】
2014530006.tif 000020
【図３−２】
2014530006.tif 000021
【図４−１】
2014530006.tif 000022
【図４−３】
2014530006.tif 000023
【図４−４】
2014530006.tif 000024
【図４−５】
2014530006.tif 000025
【図５−１】
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【図５−２】
2014530006.tif 000027
【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
2014530006.tif 000039
【図８−２】
2014530006.tif 000040
【図８−３】
2014530006.tif 000041
【図２４】
2014530006.tif 000042
【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
2014530006.tif 000050
【図２８−１】
2014530006.tif 000051
【図２８−２】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
2014530006.tif 000054
【図２８−６】
2014530006.tif 000055
【図１−１】
2014530006.tif 000056
【図４−２】
2014530006.tif 000057
【図６−４】
2014530006.tif 000058
【図９】
2014530006.tif 000059
【図１０】
2014530006.tif 000060
【図１１】
2014530006.tif 000061
【図１２】
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【図１３】
2014530006.tif 000063
【図１４】
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【図１５】
2014530006.tif 000065
【図１６】
2014530006.tif 000066
【図１７】
2014530006.tif 000067
【図１８】
2014530006.tif 000068
【図１９】
2014530006.tif 000069
【図２０】
2014530006.tif 000070
【図２１】
2014530006.tif 000071
【図２２】
2014530006.tif 000072
【図２３】
2014530006.tif 000073
【図２５−３】
2014530006.tif 000074
【図２６−２】
2014530006.tif 000075
【図２６−６】
2014530006.tif 000076
【図２７−３】
2014530006.tif 000077
【図２８−３】
2014530006.tif 000078
【図２８−７】
2014530006.tif 000079
【図２９】
2014530006.tif 000080
【図３０】
2014530006.tif 000081
【図３１】
2014530006.tif 000082
【配列表】
2014530006000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月28日(2014.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）前記植物において活性でかつ、ＢおよびＨ３からなる群より選択されるインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を、前記植物または前記植物の一部分中に導入するステップ、
ｂ）前記植物において活性でかつ、プロトンチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップ、
ｃ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記プロトンチャネルタンパク質が、Ｍ２またはＢＭ２から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロトンチャネルタンパク質が、プロトンチャネルシグネチャー配列ＨＸＸＸＷを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インフルエンザＢ  ＨＡが、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記インフルエンザＢ  ＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インフルエンザＨ３が、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来またはインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号５１および配列番号６１からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の配列が、配列番号３０、配列番号５４および配列番号６４のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の配列が、配列番号４１および配列番号５８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３および配列番号４６からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の配列が、配列番号２５および配列番号４８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の核酸配列が、１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーに動作可能に連結した前記第１の調節領域、前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列、および１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントを含み、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第３の核酸が、前記植物または前記植物の一部分中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーがコモウイルスＵＴＲである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コモウイルスＵＴＲがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＵＴＲである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントが、マメ黄萎ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＬＩＲ）およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＳＩＲ）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号５１および配列番号６１からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の配列が、配列番号３０、配列番号５４および配列番号６４のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の配列が、配列番号４１および配列番号５８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３および配列番号４６からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の配列が、配列番号２５および配列番号４８のうちの少なくとも１つに示される通りである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物において一過的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物において安定に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ｄ）前記植物を収穫し、前記ＶＬＰを精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＶＬＰが、ウイルスのマトリックスタンパク質もコアタンパク質もチャネルタンパク質も含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）植物または前記植物の一部分を準備するステップであって、前記植物または前記植物の一部分は、前記植物において活性でかつ、ＢおよびＨ３からなる群より選択されるインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を含み、かつ前記植物において活性でかつ、プロトンチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を含む、ステップ、
ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記プロトンチャネルタンパク質が、Ｍ２またはＢＭ２から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法によって生成された、ＶＬＰ。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法によって生成された、ＶＬＰ。
【請求項３２】
植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含む、請求項３０または３１に記載のＶＬＰ。
【請求項３３】
１つまたは複数のウイルスタンパク質が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変されたＮ−グリカンを含む、請求項３０または３１に記載のＶＬＰ。
【請求項３４】
免疫応答を誘発するための有効用量の請求項３０または３１に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項３５】
被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発するための組成物であって、請求項３０または３１に記載のＶＬＰを含む、組成物。
【請求項３６】
前記ＶＬＰが、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項３０または３１に記載のＶＬＰを使用して調製された、ポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項１または２８に記載の方法によって生成されたＶＬＰを含む、植物物質。
【請求項３９】
被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発するのに使用するための、請求項３８に記載の植物物質を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の植物物質を含む、栄養補助食品。
【請求項４１】
第３の核酸配列を導入するステップをさらに含み、前記第３の核酸配列が、サイレンシングのサプレッサーをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
第４の核酸配列を導入するステップをさらに含み、前記第４の核酸配列が、サイレンシングのサプレッサーをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項４３】
サイレンシングの前記サプレッサーが、ＨｃＰｒｏおよびｐ１９からなる群から選択される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＶＬＰが前記プロトンチャネルタンパク質を含まない、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質がＨＡ０タンパク質である、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｍ２タンパク質が、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４およびインフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９を含む群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４７】
配列番号４１および配列番号５８からなる群より選択される配列のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項４９】
配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列のヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載の核酸配列。
【請求項５０】
植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）前記植物において活性でかつ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質Ｂをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を、前記植物または前記植物の一部分中に導入するステップであって、前記インフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、ステップ、
ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明の概要は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載しているわけではない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）前記植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を、前記植物または前記植物の一部分中に導入するステップ、
ｂ）前記植物において活性でかつ、チャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップ、
ｃ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記チャネルタンパク質がプロトンチャネルタンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プロトンチャネルタンパク質が、Ｍ２またはＢＭ２から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記プロトンチャネルタンパク質が、プロトンチャネルシグネチャー配列ＨＸＸＸＷを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記構造ウイルスタンパク質が、三量体化ドメインを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＨＡタンパク質をコードする、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記インフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｂ  ＨＡ、Ｃ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群より選択されるインフルエンザ構造タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＢ  ＨＡまたはインフルエンザＨ３である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
インフルエンザＢ  ＨＡが、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記インフルエンザＢ  ＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
インフルエンザＨ３が、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来またはインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号５１および配列番号６１からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号３０、配列番号５４および配列番号６４のうちの少なくとも１つに示される通りである、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号４１および配列番号５８のうちの少なくとも１つに示される通りである、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３および配列番号４６からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号２５および配列番号４８のうちの少なくとも１つに示される通りである、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の核酸配列が、１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーに動作可能に連結した前記第１の調節領域、前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列、および１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントを含み、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第３の核酸が、前記植物または前記植物の一部分中に導入される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記１つまたは１つより多いコモウイルスエンハンサーがコモウイルスＵＴＲである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記コモウイルスＵＴＲがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＵＴＲである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記１つまたは１つより多いジェミニウイルス増幅エレメントが、マメ黄萎ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＬＩＲ）およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ  ＳＩＲ）から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＢ  ＨＡまたはインフルエンザＨ３である、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
インフルエンザＢ  ＨＡが、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記インフルエンザＢ  ＨＡタンパク質の１つまたは複数のタンパク質分解性ループが欠失されている、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
インフルエンザＨ３が、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来またはＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号５１および配列番号６１からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号３０、配列番号５４および配列番号６４のうちの少なくとも１つに示される通りである、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号４１および配列番号５８のうちの少なくとも１つに示される通りである、項目１９に記載の方法。
（項目３１）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３および配列番号４６からなる群より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、項目１９に記載の方法。
（項目３２）
前記構造ウイルスタンパク質の配列が、配列番号２５および配列番号４８のうちの少なくとも１つに示される通りである、項目１９に記載の方法。
（項目３３）
前記構造ウイルスタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、構造ウイルスタンパク質またはその断片、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールを順番にコードするキメラヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物において一過的に発現される、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物において安定に発現される、項目１に記載の方法。
（項目３６）
ｄ）前記植物を収穫し、前記ＶＬＰを精製するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記ＶＬＰが、ウイルスのマトリックスタンパク質もコアタンパク質も含まない、項目１に記載の方法。
（項目３８）
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）植物または前記植物の一部分中に、前記植物において活性でかつ、構造ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節領域を含む第１の核酸を含み、かつ前記植物において活性でかつ、チャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の調節領域を含む第２の核酸を含む、前記植物または前記植物の一部分を準備するステップ、
ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって、前記ＶＬＰを生成するステップ、
を含む、方法。
（項目３９）
前記チャネルタンパク質がプロトンチャネルタンパク質である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記プロトンチャネルタンパク質が、Ｍ２またはＢＭ２から選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
項目１に記載の方法によって生成された、ＶＬＰ。
（項目４２）
項目３８に記載の方法によって生成された、ＶＬＰ。
（項目４３）
植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含む、項目４１または４２に記載のＶＬＰ。
（項目４４）
１つまたは複数のウイルスタンパク質が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変されたＮ−グリカンを含む、項目４１または４２に記載のＶＬＰ。
（項目４５）
免疫応答を誘発するための有効用量の項目４１または４２に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
（項目４６）
項目４１または４２に記載のＶＬＰを投与するステップを含む、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する方法。
（項目４７）
前記ＶＬＰが、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
項目４１または４２に記載のＶＬＰを使用して調製された、ポリクローナル抗体。
（項目４９）
項目１または３８に記載の方法によって生成されたＶＬＰを含む、植物物質。
（項目５０）
被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発するのに使用するための、項目４９に記載の植物物質。
（項目５１）
項目５０に記載の植物物質を含む、栄養補助食品。
（項目５２）
第３の核酸配列を導入するステップをさらに含み、前記第３の核酸配列が、サイレンシングのサプレッサーをコードする、項目１に記載の方法。
（項目５３）
第４の核酸配列を導入するステップをさらに含み、前記第４の核酸配列が、サイレンシングのサプレッサーをコードする、項目１９に記載の方法。
（項目５４）
サイレンシングの前記サプレッサーが、群ＨｃＰｒｏおよびｐ１９から選択される、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ＶＬＰが前記チャネルタンパク質を含まない、項目１または３８に記載の方法。
（項目５６）
前記構造ウイルスタンパク質がＨＡ０タンパク質である、項目１または３８に記載の方法。
（項目５７）
前記Ｍ２タンパク質が、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４およびインフルエンザＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９を含む群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５８）
配列番号４１および配列番号５８からなる群より選択される配列のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目５９）
項目５８に記載のポリペプチドをコードする、核酸配列。
（項目６０）
配列番号４３、および配列番号５７の下線部分からなる群より選択される配列のヌクレオチド配列を含む、項目５９に記載の核酸配列。
【国際調査報告】
2014530006.tif 000083
2014530006.tif 000084
2014530006.tif 000085
2014530006.tif 000086
2014530006.tif 000087
2014530006.tif 000088