(57)【要約】  本発明は、異なる対立遺伝子の間で配列の多様性を識別するための組成物、方法、及びキットを提供する。より詳細には、一部の実施形態では、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）、又はヌクレオチドの挿入若しくは欠失など、希少な（例えば、突然変異体の）対立遺伝子多型の存在及び／又はレベルを、豊富な（例えば、野生型の）対立遺伝子多型を含む試料中で、高い感度及び／又は特異性により決定する（例えば、定量化する）ための組成物、方法、及びキットを提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、体細胞突然変異を、例えば、極めて低レベルの突然変異体対立遺伝子と比較して豊富なレベルの野生型対立遺伝子を含有する試料中で検出するための、高度に選択的な方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列の少なくとも第２の対立遺伝子多型を有することが疑われる核酸試料中で、標的配列の第１の対立遺伝子多型を検出又は定量化するための方法であって、
（ａ）（ｉ）核酸試料、
（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであり、少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、
（ｉｉｉ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであり、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、
（ｉｖ）検出用プローブ、並びに
（ｖ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー
を組み合わせることにより反応混合物を形成するステップと、
（ｂ）遺伝子座特異的プライマー及び対立遺伝子特異的プライマーを用いて反応混合物に対して増幅反応を実行して単位複製配列を形成するステップと、
（ｃ）検出用プローブの検出可能な特性の変化を検出することにより単位複製配列を検出し、これにより、核酸試料中の標的遺伝子の第１の対立遺伝子多型を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的プライマーの５’端及び／又は３’端に配置される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対立遺伝子特異的プライマー内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の内部位置に配置される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検出用プローブが、タックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）プローブを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸試料が、血液、血清、血漿、微細針吸引物、腫瘍組織、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
増幅反応の間の第２の対立遺伝子多型のバックグラウンドシグナルを低減する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）核酸分子、
（ｂ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、
（ｃ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、
（ｄ）検出用プローブ、並びに
（ｅ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー
を含む反応混合物。
【請求項１８】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項１７に記載の反応混合物。
【請求項１９】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的プライマーの５’端及び／又は３’端に配置される、請求項１７又は１８に記載の反応混合物。
【請求項２０】
対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２１】
対立遺伝子特異的プライマー内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２２】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２３】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の内部位置に配置される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２４】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２５】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２６】
伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２７】
伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２８】
伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２９】
検出用プローブが、タックマン（登録商標）プローブを含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３０】
核酸分子が、血液、血清、血漿、微細針吸引物、腫瘍組織、及びこれらの組合せからなる群から選択される試料から得られる、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３１】
第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である、請求項１７〜３０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３２】
（ａ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、並びに
（ｂ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
を含む組成物。
【請求項３３】
（ｃ）検出用プローブ、及び／又は（ｄ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマーをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項３２又は３３に記載の組成物。
【請求項３５】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的プライマーの５’端及び／又は３’端に配置される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
対立遺伝子特異的プライマー内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の内部位置に配置される、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
２つ以上の容器のうちの１つに独立に分配された以下の構成要素
（ａ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、並びに
（ｂ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
を含む２つ以上の容器を含むキット。
【請求項４７】
（ｃ）検出用プローブ、及び／又は（ｄ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマーをさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項４６又は４７に記載のキット。
【請求項４９】
対立遺伝子特異的プライマー内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的プライマーの５’端及び／又は３’端に配置される、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５０】
対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
対立遺伝子特異的プライマー内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の少なくとも１つの核酸修飾のうちの１つが、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の内部位置に配置される、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む、請求項４６〜５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である、請求項４６〜５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
標的配列の第２の対立遺伝子多型を有することが疑われる核酸試料中で、標的配列の第１の対立遺伝子多型を検出又は定量化するための、対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブの使用のための指示書をさらに含む、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、それらの開示が全ての目的についてそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年８月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／５２５，１３７号、及び２０１２年１月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／５８８，１５１号の優先権を主張する。
【０００２】
［発明の背景］
[0002]一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムにおける遺伝子多様性の最も一般的なタイプであり、ヒトゲノムＤＮＡ内の１，０００ヌクレオチド中に約１つ以下のＳＮＰの頻度で生じる（Ｋｗｏｋ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２：２３５〜２５８（２００１））。ＳＮＰは、遺伝子障害、異なる疾患への感受性、薬物に対する有害反応への素因に関与しており、法医学的探索において用いられている。したがって、ＳＮＰ（又は希少な突然変異）の検出は、血液中の循環腫瘍細胞の検出など、早期疾患の診断において大きな可能性をもたらし、出産前診断法のほか、混合細胞集団内での疾患に関連する突然変異の検出にも大きな可能性をもたらす。
【０００３】
[0003]ＳＮＰ遺伝子型決定のための多数の手法が、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、又はＤＮＡポリメラーゼを伴う方法に基づき開発されている（Ｃｈｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．、３：７７〜９６（２００３））。例えば、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳ−ＰＣＲ）は、ＤＮＡ配列の変異を検出するために広く用いられている戦略である（Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２７５７〜２７６０（１９８９））。その名称が含意する通り、ＡＳ−ＰＣＲとは、プライマーの一方又は両方を配列変異の部位にアニールするようにデザインするＰＣＲベースの方法であり、これにより、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子を区別する能力がもたらされる。ＡＳ−ＰＣＲは、マッチした３’側塩基を有するプライマーの１００〜１００，０００分の１とはるかに低い効率でミスマッチした３’側塩基を有するプライマーを伸長させるＤＮＡポリメラーゼの忠実性を利用する（Ｃｈｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．、３：７７〜９６（２００３））。ミスマッチしたプライマーを伸長させることが困難である結果として、ＰＣＲ増幅は減弱し、これは容易に検出することができる。
【０００４】
[0004]しかし、ＡＳ−ＰＣＲの特異性及び選択性は、ＰＣＲの指数関数的増幅の性質に大部分が依存し、このために、対立遺伝子識別力の減衰は急速となる。プライマーを、特異的な変異体にマッチして、この変異体だけを選択的に増幅するようにデザインしても、実際には、著しいミスマッチ増幅の生じることが多い。さらに、ＡＳ−ＰＣＲの対立遺伝子多型を区別する能力は、突然変異の種類又は突然変異若しくはＳＮＰの周囲の配列（Ａｙｙａｄｅｖａｒａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８４：１１〜１８（２０００））、試料中に存在する対立遺伝子多型の量のほか、代替的な対立遺伝子間の比に影響される可能性がある。まとめると、これらの因子は、偽陽性結果の頻繁な出現の一因となることが多く、多くの研究者に、ＡＳ−ＰＣＲの信頼性を増大させようと試みることを促している（Ｏｒｏｕら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．、６：１６３〜１６９（１９９５）；Ｉｍｙａｎｉｔｏｖら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３３：４８４〜４９０（２００２）；ＭｃＫｉｎｚｉｅら、Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．、５１７：２０９〜２２０（２００２）；Ｌａｔｏｒｒａら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．、２２：７９〜８５（２００３））。
【０００５】
[0005]対立遺伝子多型を識別するために用いられるプローブハイブリダイゼーション法を伴う別の技法は、タックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）遺伝子型決定である。しかし、ＡＳ−ＰＣＲと同様に、この方法を用いる選択性は限定されたものであり、混合試料中の希少な（≧１，０００のうちに１つの）対立遺伝子又は突然変異を検出するには適さない。
【０００６】
[0006]したがって、当技術分野では、野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する単一点の置換（例えば、ＳＮＰ）、挿入、又は欠失を、１０００倍以上の感度及び特異性で検出するための、改善された組成物及び方法が必要とされている。本発明は、この必要を満たし、関連する利点ももたらす。
【０００７】
［発明の概要］
[0007]本発明は、異なる対立遺伝子の間で配列の変異を識別するための組成物、方法、及びキットを提供する。より詳細には、一部の実施形態では、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）、又はヌクレオチドの挿入若しくは欠失など、希少な（例えば、突然変異体の）対立遺伝子多型の存在及び／又はレベルを、豊富な（例えば、野生型の）対立遺伝子多型を含む試料中で、高い感度及び／又は特異性によって決定する（例えば、定量化する）ための組成物、方法、及びキットを提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、体細胞突然変異を、例えば、極めて低レベルの突然変異体対立遺伝子と比較して高レベルの野生型対立遺伝子を含有する試料中で検出するための、高度に選択的な方法を提供する。
【０００８】
[0008]一態様では、本発明は、核酸試料中の対立遺伝子多型の同定及び／又は定量化において用いられる組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物が、（ａ）対立遺伝子特異的プライマー、（ｂ）対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｃ）検出用プローブ、及び／又は（ｄ）遺伝子座特異的プライマーのうちの１つ、２つ、３つ以上を含みうる。
【０００９】
[0009]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、標的特異的部分と、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分とを含む。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、テールをさらに含みうる。一部の例示的な実施形態では、テールが、対立遺伝子特異的プライマーの５’端に配置される。他の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーのテールで、グアニン残基及びシトシン残基が反復される（「ＧＣに富む」）。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー全体の融解温度（「Ｔｍ」）が、約５０℃〜約６７℃の範囲である。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー濃度が、約２０〜９００ｎＭの間である。
【００１０】
[0010]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、３’末端に配置される。非限定的な例として述べると、「Ａ」が突然変異体対立遺伝子である多型部位を検出及び／又は定量化する場合は、「Ｔ」が、対立遺伝子特異的プライマーの３’側の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる。別の非限定的な例として述べると、「Ｇ」が突然変異体対立遺伝子である多型部位を検出及び／又は定量化する場合は、「Ｃ」が、対立遺伝子特異的プライマーの３’側の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる。
【００１１】
[0011]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、３’末端において伸長不可能なブロッカー部分を含む。ブロッカー部分は、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド配列の３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、オリゴヌクレオチドのリボース環３’−ＯＨの任意の修飾を含みうる。一部の例示的な実施形態では、限定なしに述べると、伸長不可能なブロッカー部分には、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、副溝結合剤（ＭＧＢ）、アミン（ＮＨ２）、ビオチン、ＰＥＧ、ＰＯ４、及びこれらの組合せが含まれる。好ましい実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）を含む。特定の場合には、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのブロッカー部分から、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドなど、約５〜約１５又は約５〜約１０ヌクレオチド隔てて配置される。他の特定の場合には、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、ＰＣＲ増幅時において切断されない。さらなる場合には、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのＴｍが、約５８℃〜約６６℃の範囲である。
【００１２】
[0012]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。さらなる実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【００１３】
[0013]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーが、少なくとも１、２、３、４、５、若しくは６つの（例えば、不連続な）塩基修飾、糖修飾、及び／又は骨格修飾を含む。特定の場合には、（１又は複数の）修飾によって、マッチした標的配列とミスマッチした標的配列とのＴｍ差を増大させ、及び／又はミスマッチプライミングの効率を低下させ、これによって、アッセイの特異性及び／又は選択性を改善することができる。このような修飾の非限定的な例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸、５’メチル−デオキシシチジン、２’−フルオロ、８−アザ−７−デアザ−ｄＡ（ｐｐＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＧ（ｐｐＧ）、２’−デオキシシュードイソシチジン（イソｄＣ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ｆｄＵ）、及び２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）修飾、及びこれらの修飾の組合せが含まれる。好ましい実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーにおいて存在する修飾が、１又は複数のＬＮＡ修飾を含む。特定の実施形態では、修飾が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマー内の（ａ）３’端、（ｂ）５’端、（ｃ）内部位置、又は（ａ）、（ｂ）、若しくは（ｃ）の任意の組合せに配置される。一部の好ましい実施形態では、修飾残基のヌクレオシドが、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、修飾（例えば、ＬＮＡ）が、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。他の好ましい実施形態では、修飾残基のヌクレオシドが、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、修飾（例えば、ＬＮＡ）が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。
【００１４】
[0014]一部の実施形態では、検出用プローブが、配列ベースの検出用プローブ又は遺伝子座特異的検出用プローブを含む。他の実施形態では、検出用プローブが、５’ヌクレアーゼプローブを含む。一部の例示的な実施形態では、検出用プローブが、ＭＧＢ部分、レポーター部分（例えば、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）、又はサイバー（ＳＹＢＲ）（登録商標）グリーン（Ｇｒｅｅｎ））、消光剤部分（例えば、ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（商標）又はＴＡＭＲＡ（商標））、及び／又はパッシブリファレンス（例えば、ＲＯＸ（商標））を含む。一部の実施形態では、検出用プローブが、その開示が参照によってその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７２７，３５６号において記載される方法及び原理に従ってデザインされる。特定の実施形態では、検出用プローブが、タックマン（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含む。
【００１５】
[0015]一部の実施形態では、本発明の組成物が、ポリメラーゼ；デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）；増幅に適する他の試薬及び／若しくは緩衝液；並びに／又は鋳型配列若しくは核酸試料をさらに含みうる。一部の実施形態では、ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼでありうる。一部の他の実施形態では、ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなど、熱安定性でありうる。他の実施形態では、鋳型配列又は核酸試料が、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのＤＮＡでありうる。他の実施形態では、鋳型配列又は核酸試料が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのＲＮＡでありうる。
【００１６】
[0016]別の態様では、本発明は、対立遺伝子特異的配列を増幅するための方法を提供する。これらの方法のうちの一部は、（ａ）対立遺伝子特異的プライマーを、第１の対立遺伝子（対立遺伝子１）を含む第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップ、（ｂ）対立遺伝子特異的ブロッカープローブを、第２の対立遺伝子（対立遺伝子２）を含む第２の核酸分子とハイブリダイズさせるステップであって、対立遺伝子２が、対立遺伝子１と同じ遺伝子座に対応するステップ、（ｃ）検出用プローブを、第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップ、（ｄ）遺伝子座特異的プライマーを、対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物とハイブリダイズさせるステップ、及び（ｅ）対立遺伝子１を含む第１の核酸分子をＰＣＲ増幅するステップのうちの１又は複数を含みうる。
【００１７】
[0017]さらに別の態様では、本発明は、他の対立遺伝子を含むプールされた試料中又は混合試料中で、対立遺伝子多型を検出及び／又は定量化するための方法を提供する。これらの方法のうちの一部は、（ａ）第１の対立遺伝子特異的プライマーを、第１の反応混合物中の、第１の対立遺伝子（対立遺伝子１）を含む第１の核酸分子とハイブリダイズさせ、第２の対立遺伝子特異的プライマーを、第２の反応混合物中の、第２の対立遺伝子（対立遺伝子２）を含む第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップであって、対立遺伝子２が、対立遺伝子１と同じ遺伝子座に対応するステップ、（ｂ）第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブを、第１の反応混合物中の、対立遺伝子２を含む第２の核酸分子とハイブリダイズさせ、第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブを、第２の反応混合物中の、対立遺伝子１を含む第２の核酸分子とハイブリダイズさせるステップ、（ｃ）第１の検出用プローブを、第１の反応混合物中の、第１の核酸分子とハイブリダイズさせ、第２の検出用プローブを、第２の反応混合物中の、第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップ、（ｄ）第１の遺伝子座特異的プライマーを、第１の反応混合物中の、第１の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物とハイブリダイズさせ、第２の遺伝子座特異的プライマーを、第２の反応混合物中の、第２の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物とハイブリダイズさせるステップ、（ｅ）第１の核酸分子をＰＣＲ増幅して、単位複製配列の第１のセット又は試料を形成し、第２の核酸分子をＰＣＲ増幅して、単位複製配列の第２のセット又は試料を形成するステップ、並びに（ｆ）単位複製配列の第１のセットを、単位複製配列の第２のセットと比較して、対立遺伝子２を含む試料中の対立遺伝子１及び／又は対立遺伝子１を含む試料中の対立遺伝子２を定量化するステップのうちの１又は複数を含みうる。
【００１８】
[0018]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーが、標的特異的部分と、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分とを含む。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーが、テールをさらに含みうる。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマー全体のＴｍが、約５０℃〜約６７℃の範囲である。場合によって、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーの濃度は、約２０〜９００ｎＭの間である。
【００１９】
[0019]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分と、第２の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分とが、同じ配列を含む。他の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分と、第２の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分とが同じ配列である。
【００２０】
[0020]一部の実施形態では、テールが、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーの５’端に配置される。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーの５’テールと、第２の対立遺伝子特異的プライマーの５’テールとが、同じ配列を含む。他の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーの５’テールと、第２の対立遺伝子特異的プライマーの５’テールとが、同じ配列である。他の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーのテール及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーのテールが、ＧＣに富む。
【００２１】
[0021]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、ＳＮＰの第１の対立遺伝子（対立遺伝子１）に特異的であり、第２の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、同じＳＮＰの第２の対立遺伝子（対立遺伝子２）に特異的である。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、３’末端に配置される。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の選択が、識別性の高い塩基の使用を伴う。
【００２２】
[0022]他の特定の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、伸長不可能なブロッカー部分を３’末端において独立に含む。ブロッカー部分は、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド配列の３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、オリゴヌクレオチドのリボース環３’−ＯＨの任意の修飾を含みうる。例示的な実施形態では、限定なしに述べると、伸長不可能なブロッカー部分には、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、副溝結合剤（ＭＧＢ）、アミン（ＮＨ２）、ビオチン、ＰＥＧ、ＰＯ４、及びこれらの組合せが含まれる。好ましい実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）を含む。特定の場合には、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブのブロッカー部分から約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドなど、約５〜約１５又は約５〜約１０ヌクレオチド隔てて配置される。他の特定の場合には、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、ＰＣＲ増幅時において切断されない。さらなる場合には、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブのＴｍが、約５８℃〜約６６℃の範囲である。
【００２３】
[0023]特定の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）及び／又はＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【００２４】
[0024]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／若しくは第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ並びに／又は第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／若しくは第２の対立遺伝子特異的プライマーが、少なくとも１つの核酸修飾を含む。一部の実施形態では、（１又は複数の）修飾により、マッチした標的配列とミスマッチした標的配列とのＴｍ差を増大させ、及び／又はミスマッチプライミングの効率を低下させ、これにより、アッセイの特異性及び／又は選択性を改善することができる。限定なしに述べると、このような（１又は複数の）修飾の例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、及びトリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）など、本明細書で記載される修飾塩基、核酸類似体、及びリボース修飾核酸が含まれる。特定の実施形態では、１又は複数の（例えば、２〜６つの、又は２、３、４、５、又は６つの）ＬＮＡなどの核酸修飾が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーにおいて存在する。好ましい実施形態では、プローブ又はプライマーにおける複数の修飾が、不連続又は非隣接である、例えば、２つのＬＮＡなどの修飾が、プローブ配列内又はプライマー配列内で互いと隣り合わない。特定の実施形態では、（１又は複数の）核酸修飾が、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内及び／若しくは第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内並びに／又は第１の対立遺伝子特異的プライマー内及び／若しくは第２の対立遺伝子特異的プライマー内の（ａ）３’端、（ｂ）５’端、（ｃ）内部位置、又は（ａ）、（ｂ）、若しくは（ｃ）の任意の組合せに配置される。一部の好ましい実施形態では、１つの修飾（例えば、ＬＮＡ）が、この修飾が、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。他の好ましい実施形態では、１つの修飾（例えば、ＬＮＡ）が、この修飾が、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。
【００２５】
[0025]一部の実施形態では、対立遺伝子識別の特異性を、第１の対立遺伝子特異的プライマー内及び／若しくは第２の対立遺伝子特異的プライマー内並びに／又は第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内及び／若しくは第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内に核酸修飾を含めることによって、非修飾の対立遺伝子特異的プライマープローブ又は対立遺伝子特異的ブロッカープローブの使用と比較して改善する。一部の実施形態では、特異性の改善が、少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍など）である。
【００２６】
[0026]他の実施形態では、対立遺伝子識別の特異性が、Ｍｏｒｌａｎら、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ、４：ｅ４５８４（２００９）において記載されるブロッキング試薬（ＡＳＢ−ＰＣＲ）法による対立遺伝子特異的ＰＣＲを用いる対立遺伝子識別の特異性の、少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍など）である。
【００２７】
[0027]一部の実施形態では、方法が、２段階のサイクリングプロトコールをさらに含む。一部の実施形態では、２段階のサイクリングプロトコールの第１段階におけるサイクル数が、第２段階において用いられるサイクル数より少ないサイクルを含む。他の実施形態では、第１段階におけるサイクル数が、第２段階におけるサイクル数より約９０％少ないサイクルである。さらに他の実施形態では、第１段階におけるサイクル数が、３〜７サイクルの間であり、第２段階におけるサイクル数が、４２〜４８サイクルの間である。
【００２８】
[0028]一部の実施形態では、２段階のサイクリングプロトコールの第１のサイクリング段階において用いられるアニーリング温度／伸長温度が、第２段階において用いられるアニーリング温度／伸長温度より約１〜３℃の間低い。特定の実施形態では、２段階のサイクリングプロトコールの第１のサイクリング段階において用いられるアニーリング温度／伸長温度が、５６〜５９℃の間であり、第２段階において用いられるアニーリング温度／伸長温度が、６０〜６２℃の間である。
【００２９】
[0029]一部の実施形態では、方法が、前増幅ステップをさらに含む。特定の実施形態では、前増幅ステップが、対立遺伝子特異的プライマー及び遺伝子座特異的プライマーの少なくとも２つの完全なセットであって、各セットが、対象の特異的なポリヌクレオチドを増幅するのに適するか又は作動的なセットを用いるマルチプレックスの増幅反応を含む。他の実施形態では、マルチプレックスの増幅反応の産物が、副次的なシングルプレックスの増幅反応であって、各シングルプレックスの反応が、マルチプレックスの反応において既に用いられた少なくとも１つのプライマーセットを含有する反応に分けられる。さらに他の実施形態では、マルチプレックスの増幅反応が、複数の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをさらに含む。一部の実施形態では、マルチプレックスの増幅反応が、反応を増幅の直線相内に保つのに適する多数のサイクルにわたり実行される。
【００３０】
[0030]一部の実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが同じである。一部の実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが異なる。一部の実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが、配列ベースの検出用プローブ又は遺伝子座特異的検出用プローブである。他の実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが、５’ヌクレアーゼプローブである。一部の例示的な実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが、ＭＧＢ部分、レポーター部分（例えば、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）、又はサイバー（登録商標）グリーン）、消光剤部分（例えば、ブラックホールクエンチャー（商標）又はＴＡＭＲＡ（商標））、及び／又はパッシブリファレンス（例えば、ＲＯＸ（商標））を含む。一部の実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが、その開示が参照によってその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７２７，３５６号において記載される方法及び原理に従ってデザインされる。詳細な実施形態では、第１の検出用プローブ及び／又は第２の検出用プローブが、タックマン（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含む。
【００３１】
[0031]一部の実施形態では、第１の遺伝子座特異的プライマーと、第２の遺伝子座特異的プライマーとが、同じ配列を含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子座特異的プライマーと、第２の遺伝子座特異的プライマーとが、同じ配列である。
【００３２】
[0032]一部の実施形態では、第１の反応混合物及び／又は第２の反応混合物が、ポリメラーゼ；ｄＮＴＰ；他のＰＣＲ増幅に適する試薬及び／若しくは緩衝液；並びに／又は鋳型配列若しくは核酸試料をさらに含みうる。一部の実施形態では、ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼでありうる。一部の実施形態では、ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなど、熱安定性でありうる。一部の実施形態では、鋳型配列又は核酸試料が、ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡなどのＤＮＡでありうる。他の実施形態では、鋳型配列又は核酸試料は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡでありうる。
【００３３】
[0033]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、第２の対立遺伝子特異的プライマーと同じ鎖又は配列に結合するのに対し、第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、第１の対立遺伝子特異的プライマーと同じ鎖又は配列に結合する。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いて、第２の対立遺伝子及び／又は第１の対立遺伝子のそれぞれから発生するバックグラウンドシグナルの量を低減する。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが伸長不可能であり、第２の対立遺伝子又は第１の対立遺伝子のそれぞれへと優先的にアニールし、これによって、例えば、伸長可能な第１の対立遺伝子特異的プライマーの第２の対立遺伝子へのアニーリング、及び／又は伸長可能な第２の対立遺伝子特異的プライマーの第１の対立遺伝子へのアニーリングをブロッキングする。
【００３４】
[0034]一部の例示的な実施形態では、第１の対立遺伝子が、希少な（例えば、低頻度の）対立遺伝子又は突然変異体対立遺伝子である。他の例示的な実施形態では、第２の対立遺伝子が、豊富な（例えば、高頻度の）対立遺伝子又は野生型対立遺伝子である。
【００３５】
[0035]別の態様では、本発明は、第２の対立遺伝子多型を含む試料中で、第１の対立遺伝子多型を検出又は定量化するためのキットであって、（ａ）第１の対立遺伝子特異的プライマー、（ｂ）第２の対立遺伝子特異的プライマー、（ｃ）第１の遺伝子座特異的プライマー、（ｄ）第２の遺伝子座特異的プライマー、（ｅ）第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｆ）第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｇ）第１の遺伝子座特異的検出用プローブ、及び（ｈ）第２の遺伝子座特異的検出用プローブのうちの１又は複数を含むキットを提供する。
【００３６】
[0036]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーが、標的特異的部分と、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分とを含む。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーが、テールをさらに含みうる。本発明のキット内の第１の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は第２の対立遺伝子特異的プライマーに関する他の実施形態は、上記に記載されている。
【００３７】
[0037]一部の実施形態では、本発明の組成物、方法、及びキットが、対立遺伝子の識別における高度な特異性及び選択性を提供する。一部の実施形態では、特異性及び／又は選択性の定量的な決定が、単位複製配列（アンプリコン）の第１のセットと単位複製配列の第２のセットとの間のＣｔ値の比較を含む。一部の実施形態では、選択性が、別の１又は複数の対立遺伝子の約１００万のコピー中で、所与の対立遺伝子の単一のコピーが検出されうるレベルにある。
【００３８】
[0038]特定の実施形態では、本発明の組成物、方法、及びキットが、以下の構成要素（ａ）識別塩基の位置において、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの核酸修飾を含む対立遺伝子特異的プライマー（例えば、多型部位において３’端のＬＮＡを含有する対立遺伝子特異的プライマー）、（ｂ）３’末端において、Ｃ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、ヘキサンジオール）修飾などの伸長不可能なブロッカー部分を含み、且つ、識別塩基の位置において、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ（例えば、３’端において、ヘキサンジオール化学基を含有し、且つ、例えば、ブロッカープローブの中央部のブロッキング部分から約５〜１５（例えば、約１０）ヌクレオチド離れた位置にある多型部位において、単一のＬＮＡを含有するブロッカーオリゴヌクレオチド）、（ｃ）タックマン（登録商標）プローブ（例えば、タックマン（登録商標）ＭＧＢ  ＦＡＭプローブ）などの検出用プローブ、及び（ｄ）リバースプライマーなどの遺伝子座特異的プライマーのうちの１つ、２つ、３つ以上を用いて、対立遺伝子多型の検出及び識別の改善を提供する。特定の場合には、ブロッカー部分が、ホスホルアミダイト連結を介して対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチド配列の３’端へとコンジュゲートされたＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、ヘキサンジオール）を含む。他の特定の場合には、当業者に知られる任意の種類のリアルタイムＰＣＲ装置を用いうるが、本発明のアッセイ法は、ＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲインストゥルメント（ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で実施される。特定の実施形態では、反応特徴が、以下：段階１：９５．０℃で１０：００分間；段階２：４０回にわたる反復：９５．０℃で０：２０分間、６０．０℃で０：４５分間を含む。
【００３９】
[0039]以下の詳細な説明及び図面から、当業者には本発明の他の目的、特色、及び利点が明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】[0040]本発明の体細胞突然変異検出アッセイの一実施形態を描示する図である。
【図２】[0041]３’端においてロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（「Ｇ１２Ｓ  ＡＳＰ−ＬＮＡ」における「＋Ａ」）を含む対立遺伝子特異的プライマー、並びにオリゴヌクレオチド配列の中央部におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｓブロッカー−ＬＮＡ」における「＋Ｇ」）及び３’−ヘキサンジオール修飾（「Ｇ１２Ｓブロッカー−ＬＮＡ」における「Ｃ６」）を含む対立遺伝子特異的プライマーの使用によって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ  ＳＮＰにおける対立遺伝子多型の識別が改善されることを例示する図である。
【図３】[0042]３’端におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｒ  ＡＳＰ−ＬＮＡ」における「＋Ｃ」）を含む対立遺伝子特異的プライマー、並びにオリゴヌクレオチド配列の中央部におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「＋Ｇ」）及び３’−ヘキサンジオール修飾（「Ｇ１２Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「Ｃ６」）を含む対立遺伝子特異的プライマーの使用によって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ  ＳＮＰにおける対立遺伝子多型の識別が改善されることを例示する図である。
【図４】[0043]３’端におけるＬＮＡ修飾（「Ｈ１０４７Ｒ  ＡＳＰ−ＬＮＡ」における「＋Ｇ」）を含む対立遺伝子特異的プライマー、並びにオリゴヌクレオチド配列の中央部におけるＬＮＡ修飾（「Ｈ１０４７Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「＋Ａ」）及び３’−ヘキサンジオール修飾（「Ｈ１０４７Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「Ｃ６」）を含む対立遺伝子特異的プライマーの使用によって、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ  ＳＮＰにおける対立遺伝子多型の識別が改善されることを例示する図である。
【図５】[0044]本発明のＬＮＡで修飾された対立遺伝子特異的プライマー及びプローブを用いる、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ多型部位における対立遺伝子多型の識別の改善を例示する図である。
【図６】[0045]本発明のＬＮＡで修飾された対立遺伝子特異的プライマー及びプローブを用いる、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ多型部位における対立遺伝子多型の識別の改善を例示する図である。
【図７】[0046]全血液に由来する豊富な量の野生型ＤＮＡの、Ｈ１０４７Ｒ陽性ＫＰＬ４細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異体対立遺伝子の検出の干渉に対する作用を例示する図である。
【図８】[0047]全血液に由来する豊富な量の野生型ＤＮＡの、Ｇ１２Ｒ陽性ＰＳＮ１細胞におけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ変異体対立遺伝子の検出の干渉に対する作用を例示する図である。
【図９】[0048]１５０例のＣＲＣ組織試料のスクリーニングによって、陰性試料からの干渉は観察されず、弱いシグナルの検出を滴定によって検証しうることが明示されたことを示す図である。
【図１０】[0049]ＤｘＳ／Ｑｉａｇｅｎ製のスコルピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）アッセイが、ＳＷ１１１６（Ｇ１２Ａ陽性）細胞の希釈系列でスパイクされた全血液の混合物中の、１０００個の細胞を検出しうるに過ぎないことを示す図である。
【図１１】[0050]Ｉｎｏｓｔｉｃｓ製のビーミング（ＢＥＡＭｉｎｇ）アッセイが、不正確な判定を下し、突然変異体試料１５例中１４例を野生型の試料として同定したことを例示する図である。
【図１２】[0051]本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイが、全血液混合物中に５０〜１００個という低量の陽性細胞のシグナルも検出可能であったことを例示する図である。
【図１３】[0052]本発明の例示的な実施形態であって、本明細書で記載される方法を用いて、希少な対立遺伝子は選択的に増幅されるが、野生型対立遺伝子は選択的に増幅されない実施形態を例示する図である。ＬＮＡ修飾（図１３におけるＣ）及びヘキサンジオール修飾を伴うブロッカープローブが野生型対立遺伝子とハイブリダイズするために、野生型対立遺伝子は増幅産物を産生せず、これによって、リアルタイムＰＣＲ増幅が妨害される。ＬＮＡ修飾（図１３におけるＴ）を伴う対立遺伝子特異的プライマーは、ブロッカープローブではなく、突然変異体対立遺伝子と好んでハイブリダイズし、これにより、リアルタイムＰＣＲによる増幅産物の産生を容易にする。
【図１４】[0053]これもまた、対立遺伝子特異的プライマーが、野生型（陰性対照）対立遺伝子及び突然変異体（陽性対照）対立遺伝子の両方を増幅しうることを示す図である。増幅プロットは、対立遺伝子特異的ＬＮＡプライマーによるアッセイが高感度であることを例示する。ＬＮＡを伴うプライマーは、突然変異体の対立遺伝子多型を選択的に増幅する。
【図１５】[0054]対立遺伝子特異的プライマーに戦略的に配置されたＬＮＡ修飾によって、増幅が改善され、Ｃｔ値が低下することを示す図である。アッセイの性能は、複数のＬＮＡの使用によって改善されうる。
【図１６】[0055]対立遺伝子特異的プライマーにＬＮＡ修飾を３つ以上連続で配置すると、増幅産物が産生されないことを示す図である。
【図１７】[0056]本発明で用いうる例示的なＬＮＡ分子及び他の修飾ＬＮＡを示す図である。本発明の対立遺伝子特異的プライマーは、２つ〜６つのＬＮＡを含みうる。
【図１８】[0057]例示的なＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖（左）及びＰＮＡ修飾（図１８におけるＴ；右）を伴う例示的な対立遺伝子特異的プライマーを示す図である。
【図１９】[0058]例示的なＴＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（左）及びＴＮＡ修飾（図１９におけるＴ；右）を伴う例示的な対立遺伝子特異的プライマーを示す図である。
【図２０】[0059]例示的なＺＮＡオリゴヌクレオチド（左）及び例示的なＺＮＡ修飾（右；図２０におけるＴ）された対立遺伝子特異的プライマーを示す図である。
【図２１】[0060]例示的なＴｚＤＮＡ分子（左）及びＴｚＤＮＡ修飾（右；図２１におけるＴ）を伴う例示的な対立遺伝子特異的プライマーを示す図である。
【図２２】[0061]本発明のＧ１２Ａ  ＫＲＡＳアッセイのための例示的なブロッカープローブを例示する図である。ブロッカープローブ（オリゴヌクレオチド）は、野生型対立遺伝子とハイブリダイズし、対立遺伝子多型の増幅に影響を及ぼすことなしに、とりわけ夾雑する野生型のゲノムＤＮＡの増幅を効率的且つ選択的に阻害するようにデザインする。
【図２３】[0062]ＬＮＡプライマーとヘキサンジオールを伴うブロッカープローブとを含むＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイによって、対立遺伝子多型（Ａ）が特異的に増幅され、野生型対立遺伝子（Ｇ）の増幅が阻害されたことを例示する図である。アッセイの選択性は、対立遺伝子特異的プライマーにおけるＬＮＡの存在と組み合わせたブロッカーの使用により改善される。
【図２４】[0063]ヘキサンジオール修飾（３’炭素テール）を伴うブロッカープローブとリン酸基を伴うブロッカープローブとの比較を示す図である。ヘキサンジオールを伴うブロッカープローブは、リン酸化されたブロッカーのＣｔである３１．２と比較して、２８．４という低いＣｔでより良好に機能した。
【図２５】[0064]ＬＮＡ修飾を伴うブロッカープローブのＣｔ値が、ＬＮＡを伴わないブロッカープローブの場合と比較して低いことを示す図である。図２５はまた、ＬＮＡを伴うブロッカープローブを使用する本発明の方法によって、突然変異体が効率的且つ選択的に増幅され、優れた対立遺伝子の識別が示されることも例示する。
【図２６】[0065]ＬＮＡを含有する対立遺伝子特異的プライマー及びＬＮＡを含有するブロッカープローブを用いる本発明の例示的な方法によって、突然変異体対立遺伝子に対する高度な特異性がもたらされ、特異的な増幅産物が産生されることを示す図である。図２６はまた、野生型対立遺伝子が増幅されなかったことも示す。
【図２７】[0066]同じ配列及び３’ヘキサンジオール修飾を伴うが、ブロッカー配列におけるＬＮＡの位置が異なる２つのブロッカープローブの間の融解温度差（Ｔｍ）及びＣｔ値を示す図である。これは、ブロッカー配列内のＬＮＡの位置が、アッセイの性能にどのように影響するかを例示する。対立遺伝子多型を有する塩基に配置されたＬＮＡは、ＬＮＡが対立遺伝子多型ヌクレオチドから隔てて配置されたブロッカーと比較してＣｔを低下させることによって、アッセイの性能を改善する。
【図２８】[0067]図２８Ａ：ブロッカープローブのＴｍの、アッセイの性能に対する影響を示す図である。図２８Ｂ：また、ＬＮＡを伴わないブロッカーのＴｍ及びＣｔ値と、２つのＬＮＡを伴うブロッカーのＴｍ及びＣｔ値との差も示す図である。ＬＮＡが存在するためにＴｍが上昇する結果として、本発明のアッセイの感度及び選択性が改善される。Ｔｍが高ければ、ブロッカープローブは、伸長時において、その標的へのアニーリングを維持し、これによって、野生型対立遺伝子が増幅に干渉することを効率的にブロッキングし、変異体が優先的且つ選択的に増幅されることを可能とする。２つのＬＮＡを付加したところ、同じブロッカー配列のＴｍが、５９．９℃から６８℃へと上昇した。
【図２９】[0068]ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド位置に配置されたＬＮＡを含め、６つの連続ＬＮＡ修飾を配置したところ、ＰＣＲサイクリングにおける増幅が完全に停止したことを示す図である。
【図３０】[0069]ΔＣｔ値を用いて、アッセイの実行可能性及びその選択性を決定しうることを示す図である。ＬＮＡを含有するプライマー及びプローブによって得られるΔＣｔ値の増大は、本発明のアッセイの実行可能性及び選択性を示す。
【図３１】[0070]ΔΔＣｔ値を、多様な体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイに由来するＣｔ値からどのように計算するかを示す図である。ＬＮＡを含有するプライマー及びブロッカーによってデザインされた本図のアッセイＡは、連続ＬＮＡを伴うプライマー及びプローブを含有する他のアッセイより良好に機能した。
【図３２】[0071]未知の試料中に存在する突然変異体の百分率を定量化するための、本発明のＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋアッセイの使用を例示する図である。図３２Ａ：ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ対立遺伝子多型及びＭＣＦ  ７細胞株についての検量線を示す図である。検量線は、本明細書で記載される方法を用いて創出した。図３２Ｂ：結腸直腸がんを伴う患者に由来する２つの未知の試料（試料Ａ及びＢ）及び陽性対照（ＭＣＦ  ７細胞株）についての遺伝子型決定アッセイを用いて作成した増幅曲線を示す図である。図３２Ｃ：演算子によって決定される、試料中に存在する突然変異体であるＥ５４５Ｋの量及び百分率（突然変異パーセント）を示す図である。
【図３３】[0072]未知の試料中に存在する突然変異体の百分率を定量化するための、本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄアッセイの使用を例示する図である。図３３Ａ：ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ遺伝子型決定アッセイ及びＬＳ  １７４Ｔ細胞株についての増幅プロット及び検量線を示す図である。図３３Ｂ：膵臓がんを伴う患者に由来する２つの未知の試料（試料Ａ及びＢ）及び陽性対照（ＬＳ  １７４Ｔ細胞株）について本発明の方法を用いて作成した増幅プロットを示す図である。図３３Ｃ：突然変異体を発現させる試料Ａ中のＤＮＡの量が、演算子を用いて、３．２５ｎｇ又は陽性対照と比べて９．６％であると決定されることを示す図である。
【図３４】[0073]未知の試料中に存在する突然変異体の百分率を定量化するための、本発明のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ＥＧＦアッセイの使用を例示する図である。図３４Ａ：Ｈ１６５０細胞株のＥＧＦＲ遺伝子のＥ７４６−Ａ７５０欠失についての増幅プロット及び検量線を示す図である。図３４Ｂ：肺がんを伴う患者に由来する未知の試料（試料Ａ）及び陽性対照（Ｈ１６５０細胞株）について本発明の方法を用いて作成した増幅プロットを示す図である。図３４Ｃ：ＥＧＦＲ欠失変異体を発現させる試料Ａ中のＤＮＡの量が、演算子を用いて、３．２５ｎｇ又は陽性対照と比べて９．６％であると決定されることを示す図である。
【図３５】[0074]未知の試料中に存在する対立遺伝子多型の百分率を定量化するための、本発明のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦアッセイの使用を例示する図である。図３５Ａ：ＨＴ  ２９細胞株のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ対立遺伝子多型についての増幅プロット及び検量線を示す図である。図３５Ｂ：肺がんを伴う患者に由来する未知の試料（試料Ａ）及び陽性対照（Ｈ１６５０細胞株）について本発明の方法を用いて作成した増幅プロットを示す図である。図３５Ｃ：ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異体を発現させる試料Ａ中のＤＮＡの量が、０．１８ｎｇ又は陽性対照と比べて１．２％と計算されたことを示す図である。
【図３６】[0075]Ｈ＆Ｅ染色された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腫瘍試料の凍結切片を示す図である。図３６Ａ：高百分率の腫瘍細胞（白色矢印は、腫瘍細胞を示す）を有する切片を示す図である。図３６Ｂ：腫瘍細胞（白色矢印）と、血管（黒色矢印）を伴う間質と、炎症性細胞（例えば、リンパ球；赤色矢印）と、マクロファージで満たされた肺胞（緑色矢印）との混合物からなる切片を示す図である。
【図３７】[0076]胃がん試料中又は膵臓がん試料中のサイトケラチン（ＣＫ）レベルと対立遺伝子多型の発現との関係を例示する図である。図３７Ａ：胃がん試料＃１、２、及び４では、ＣＫレベルが高いが、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ対立遺伝子多型、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ対立遺伝子多型、ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ対立遺伝子多型、又はＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ対立遺伝子多型についての突然変異パーセントが低いことを例示する図である。これらの結果は、試料＃１、２、及び４中では、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ＳＮＰ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ＳＮＰ、ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ  ＳＮＰ、又はＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ  ＳＮＰを保有する可能性が高い腫瘍細胞が少ないことを示す。しかし、試料＃５中では、ＣＫレベルが高く、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ突然変異についての突然変異パーセントも高かった（例えば、９０％）。この結果は、試料＃５中の腫瘍細胞の大半が、Ｇ１３Ｄ突然変異を保有する可能性が高いことを示す。図３７Ｂ：膵臓がん試料＃１では、ＣＫレベルが高く、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異体についての突然変異パーセントも高く（１００％）、これによって、腫瘍細胞の大半が、突然変異体対立遺伝子を保有する可能性が高いことが表示されることを示す図である。これに対し、膵臓がん試料＃３では、ＣＫレベルは高いが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ＳＮＰについての突然変異パーセントは低い（例えば、５％）。少数の腫瘍細胞試料＃３は、Ｇ１２Ｄ突然変異を保有する可能性が高い。
【図３８】[0077]本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイ）の感度を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（ｃａｓｔＰＣＲ）（商標）突然変異アッセイと比較して例示する図である。図３８Ａ：本発明の遺伝子型決定アッセイの増幅曲線を例示する図である。図３８Ｂ：同じ被験試料に対して実施されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）突然変異アッセイの増幅曲線を例示する図である。図３８Ｃ：本発明のアッセイによって、被験試料の含有する陽性腫瘍細胞が２５０個という少数の場合にも、Ｇ１２Ａ突然変異が検出されたことを示す図である。比較により、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）突然変異アッセイを用いて突然変異を検出するためには、より大きな数の腫瘍細胞が必要とされた。
【図３９】[0078]本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイ）の感度を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）突然変異アッセイと比較して例示する図である。図３９Ａ：本発明の遺伝子型決定アッセイを用いる被験試料の増幅曲線を示す図である。図３９Ｂ：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）アッセイの増幅曲線を示す図である。図３９Ｃ：本発明のアッセイでは、１００個という少数の陽性腫瘍細胞中でもＧ１２Ｓ  ＫＲＡＳ対立遺伝子多型が検出されたのに対し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）突然変異アッセイでは、検出が不可能であったことを示す図である。
【図４０】[0079]本発明の方法を用いて、乳がん試料中の以下のＳＮＰ：ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを検出（例えば、存在又は非存在を）及び／又は定量化（例えば、突然変異パーセントを）することにより得られる結果を示す図である。この図は、乳がん試料において、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ  ＳＮＰが、異なる百分率で発現したことを示す。
【図４１】[0080]乳がん試料のさらなるセットにおいて、ＰＩＫ３ＣＡのＳＮＰ（Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｄ、Ｅ５４５Ｋ、及びＨ１０４７Ｒ）もまた、検出及び定量化（例えば、突然変異パーセント）されたことを示す図である。４５例の乳がん試料を、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ対立遺伝子多型、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ対立遺伝子多型、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ対立遺伝子多型、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子多型についてスクリーニングした。
【図４２】[0081]本発明の方法を用いて、肺がん試料を、ＳＮＰについてスクリーニングしうることを示す図である。この実施形態では、２５例の肺がん試料中で、多様なＳＮＰの存在及び突然変異パーセントを決定した。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。
【図４３】[0082]さらなる３２例のヒト肺がん試料に対して本発明の方法を用いることから得られる結果を例示する図である。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。
【図４４】[0083]胃がん試料を、本発明の方法を用いてスクリーニングして、多様なＳＮＰの存在及び突然変異パーセントを検出しうることを示す図である。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。この実施形態では、各アッセイを、４０ｎｇの試料（例えば、ＤＮＡ）により実行した。
【図４５】[0084]異種移植片試料に対して本発明の方法を用いて、多様なＳＮＰの存在及び突然変異パーセントを検出することから得られる結果を示す図である。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。ＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失は、試料＃５８５〜５８８中に存在し、試料中の細胞の１００％中に存在することが予測された。ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子は、試料＃５８１〜５８４中に、それぞれ、３．４％、１．２％、１％、及び１．８％の突然変異の百分率で検出された。
【図４６】[0085]本発明の方法を用いて、結腸直腸がん試料中で、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型を検出及び定量化（例えば、突然変異パーセント）しうることを例示する図である。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。
【図４７】[0086]本発明の方法を用いて、さらなる結腸直腸がん試料中で、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型を検出及び定量化しうることを例示する図である。
【図４８】[0087]本発明の方法を用いて、結腸直腸がんを伴う患者に由来する肝臓がん組織及び結腸がん組織を、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型についてスクリーニングしうることを例示する図である。結果は、試料のうちの一部が、複数のＳＮＰを有したことを示す。
【図４９】[0088]膵臓がんを伴う患者に由来する試料は、本発明の方法に従って、ＳＮＰについてスクリーニングし、突然変異パーセントを決定しうることを例示する図である。この実施形態では、微細針吸引物試料を患者から得、本明細書で記載されるＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを用いてスクリーニングした。被験膵臓がん試料では、多様なＫＲＡＳ突然変異が検出されたが、ＰＩＫ３ＣＡ（例えば、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｄ、Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）突然変異、ＥＧＦＲ（例えば、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ）突然変異、及びＢＲＡＦ（例えば、Ｖ６００Ｅ）突然変異は検出されなかった。
【００４１】
［発明の詳細な説明］
Ｉ．序説
[0089]対象の対立遺伝子の選択的増幅は、ミスマッチした対立遺伝子特異的プライマーの、代替的な対立遺伝子におけるミスプライミング及び伸長を含めた因子により複雑化されることが多い。このようなミスプライミング及び伸長は、過剰な別の対立遺伝子多型を多く含む試料中に存在する、希少な対立遺伝子の検出においてとりわけ問題となりうる。十分に過剰な場合、他の対立遺伝子多型のミスプライミング及び伸長は、対象の対立遺伝子の検出を遮る可能性がある。ＰＣＲベースの方法を用いる場合、代替的な対立遺伝子多型を含有する試料における特定の対立遺伝子の識別は、試料中に存在する他の対立遺伝子の増幅を最小化又は阻止しながらの、対象の対立遺伝子の選択的増幅に依拠する。
【００４２】
[0090]単独で又は組み合わされて、対立遺伝子特異的ＰＣＲの識別力の増強に寄与する多数の因子が同定されている。本明細書で開示される通り、ミスマッチした対立遺伝子特異的プライマーとマッチした対立遺伝子特異的プライマーとの間のΔＣｔ値を増大させる因子は、対立遺伝子多型のより大きな識別力を示す。本発明の方法を用いて対立遺伝子多型の識別を改善することが見出されたこのような因子には、例えば、（ａ）テールを付加した対立遺伝子特異的プライマー、（ｂ）低濃度の対立遺伝子特異的プライマー、（ｃ）Ｔｍが低くなるようにデザインされた対立遺伝子特異的プライマー、（ｄ）識別塩基を標的とするようにデザインされた対立遺伝子特異的プライマー、（ｅ）試料における代替的で潜在的により豊富な対立遺伝子多型からの増幅を阻止するようにデザインされた対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、並びに（ｆ）マッチした標的配列とミスマッチした標的配列との間のデルタＴｍを増大させるために、例えば、修飾塩基、核酸類似体、及び／若しくはリボース修飾核酸などの核酸修飾を含むようにデザインされた対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／若しくは対立遺伝子特異的プライマーのうちの１又は複数の使用が含まれる。
【００４３】
[0091]上述の因子は、とりわけ組み合わせて用いられる場合、対立遺伝子特異的ＰＣＲの、試料中に存在する異なる対立遺伝子の間における識別能に影響しうる。したがって、本発明は、上記の因子のうちの１又は複数を使用して、ＰＣＲ時における対立遺伝子多型の識別を、例えば、ΔＣｔ値を増大させることによって改善する新規の増幅法に一般に関する。
【００４４】
[0092]特定の態様では、本発明は、野生型対立遺伝子の増幅を阻止するためのヘキサンジオール３’修飾を含有するブロッカーオリゴヌクレオチドによる対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲを用いるロックド核酸（ＬＮＡ）化学反応に基づく。本発明の方法の検出限界は、２〜１０ＤＮＡコピーであると有利である。本発明はまた、体細胞突然変異の大規模なパネルの選択的で頑健な検出も提供する。非限定的な例として述べると、本発明は、全血液バックグラウンド中で、極めて低コピー数の突然変異体対立遺伝子（例えば、０．０１％〜０．１％）の検出を可能とする。一部の場合では、本明細書で記載される突然変異アッセイにおいて用いられるサロゲート試料に、血液、血清、血漿、組織（例えば、ＦＮＡ、ＣＴＣ、コア生検、ＦＦＰＥ組織）、及びこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
【００４５】
[0093]特定の態様では、本発明の突然変異アッセイが、対立遺伝子特異的ＰＣＲに基づく。特定の実施形態では、検出が、タックマンプローブ法を用いるリアルタイム法である。好ましい実施形態では、単一のＬＮＡ塩基の突然変異をその３’端に含有する対立遺伝子特異的プライマー（ＡＳＰ）を、とりわけ、突然変異体対立遺伝子を検出するのに用いることができる。これらの実施形態では、野生型配列と相補的なブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカー）を、任意の非特異的な野生型対立遺伝子の増幅を抑制するのに用いることができる。このブロッカーは、野生型のヌクレオチド位置に位置する単一のＬＮＡ変異体を含有しうる。場合によって、任意の伸長を阻止するために、ブロッカーが、３’端においてヘキサンジオール化学基を含む。他の場合には、本発明は、反応を完了させるためのリバースプライマーをさらに含む。特定の理論に束縛されることなしに述べると、ＬＮＡ修飾塩基の存在は、野生型対立遺伝子と突然変異体対立遺伝子との識別を増大させることから、標的対立遺伝子に対するより大きな特異性及びブロッキングの有効性を可能とする。特定の実施形態では、ＬＮＡが、ＰＣＲプローブの特異性及び二重鎖の熱安定性を増大させるのに用いられる修飾塩基である。ＬＮＡ修飾塩基は、単一のヌクレオチドの識別が可能であり、これによって、ＡＳプライマーと野生型対立遺伝子との可能なミスマッチを最小化する。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー及び／又はブロッキングオリゴヌクレオチドが、対立遺伝子多型の位置におけるＬＮＡ修飾塩基、１、２、３、４、５、６、７つ以上のさらなる不連続若しくは非隣接のＬＮＡ修飾、及び／又は５’端におけるＬＮＡ修飾塩基を含む。
【００４６】
[0094]したがって、本発明の組成物及び方法は、血液、血漿、血清、及び／又は組織（ＦＮＡ、ＣＴＣ、コア生検、ＦＦＰＥ組織など）を含めた試料中で、極めて低レベルの突然変異体（体細胞）ＤＮＡの検出を有利に可能にする。特に、本発明のアッセイは、新規のブロッキングオリゴヌクレオチドデザインと組み合わせたＬＮＡ化学反応を用いることによって、既に記載された対立遺伝子特異的ＰＣＲ突然変異の検出に対する著しい改善である。したがって、本発明は、感度がビーミング（ビーズ、エマルジョン、増幅、及び磁気）アッセイ（Ｉｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ／ＡＲＭＳ反応（Ｑｉａｇｅｎ）、及びキャストＰＣＲアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）など、当技術分野で知られる検出法の１０〜１００倍の突然変異解析を提供する。加えて、本発明は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、Ｅ５４５Ｋ  ＰＩＫ３ＣＡ、及びＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦなど、発がん性の抵抗性突然変異体を検出する能力を伴う方法も提供する。
【００４７】
定義
[0095]本明細書で用いられる以下の用語は、別段に指定されない限りにおいて、それらに帰せられている意味を有する。
【００４８】
[0096]本明細書で用いられる「対立遺伝子」という用語は、例えば、相同染色体などのＤＮＡセグメントの同じ物理的遺伝子座（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｌｏｃｕｓ）における代替的なＤＮＡ配列を含む。対立遺伝子は、単一の細胞内又は生物内の相同染色体において見出される同じ物理的遺伝子座の間で異なるＤＮＡ配列を指す場合もあり、複数の細胞又は生物の同じ物理的遺伝子座において異なるＤＮＡ配列を指す場合もある（「対立遺伝子多型」）。ある場合には、対立遺伝子が、特定の物理的遺伝子座における単一のヌクレオチドの差違に対応しうる。他の場合には、対立遺伝子が、ヌクレオチド（単一又は複数の）の挿入又は欠失に対応しうる。
【００４９】
[0097]「対立遺伝子特異的プライマー」という用語は、対象の対立遺伝子を含む配列とハイブリダイズさせ、ＰＣＲにおいて用いると、伸長して第１鎖のｃＤＮＡの合成をもたらすオリゴヌクレオチド配列を含む。対立遺伝子特異的プライマーは、所与の標的ＤＮＡ又は遺伝子座の特定の対立遺伝子に特異的であり、標的配列内の１ヌクレオチドという小さな差違を検出するようにデザインすることができる。対立遺伝子特異的プライマーは、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分、標的特異的部分、及び／又はテールを含みうる。
【００５０】
[0098]本明細書で用いられる「対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分」又は「対立遺伝子特異的標的ヌクレオチド」という用語は、対立遺伝子特異的プライマー内の１又は複数のヌクレオチドであって、同じ遺伝子座における他の対立遺伝子（例えば、対応する高頻度の対立遺伝子又は野生型対立遺伝子）を排除して、所与の遺伝子座における１つの対立遺伝子（例えば、低頻度の対立遺伝子又は突然変異体対立遺伝子）に選択的にハイブリダイズしてここから伸長しうるヌクレオチドを含む。
【００５１】
[0099]「標的特異的部分」という用語は、標的のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする対立遺伝子特異的プライマーの領域を含む。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分が、検出される対立遺伝子多型の５’側のプライミング領域において標的配列と相補的なプライミングセグメントである。対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含みうる。他の場合には、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分が、３’側の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分と隣接する。
【００５２】
[0100]本明細書で用いられる「テール」又は「５’テール」という用語は、プライマーの３’端以外を含む。この領域は、解析される標的のポリヌクレオチド配列と相補的でない配列を典型的は含有するがこれを含有する必要はない。５’テールは、約２〜３０、２〜５、４〜６、５〜８、６〜１２、７〜１５、１０〜２０、１５〜２５、若しくは２０〜３０ヌクレオチドのうちのいずれか、又は任意の中間の長さの範囲でありうる。
【００５３】
[0101]「対立遺伝子特異的ブロッカープローブ」又は「ブロッカープローブ」又は「ブロッカー」という用語は、対立遺伝子特異的プライマーが結合する鎖と同じ鎖、逆鎖、又は相補鎖に配置される特定の対立遺伝子多型を含むＤＮＡ鎖に結合するオリゴヌクレオチド配列を含み、この特定の対立遺伝子多型の増幅を低減又は阻止する。本明細書で論じられる通り、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、修飾、例えば、リボース環の３’−ＯＨを一般に含み、これによって、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻止する。対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、対立遺伝子特異的プライマーがアニールする鎖と同じ鎖又は逆鎖へとアニールするようにデザインすることができ、その３’末端におけるブロッキング基（例えば、「伸長不可能なブロッカー部分」）で修飾することができる。したがって、ブロッカープローブは、例えば、対立遺伝子特異的プライマーの伸長によって突然変異体対立遺伝子（例えば、希少な対立遺伝子多型）を含む同じ鎖又は逆鎖において増幅を生じさせながら、野生型対立遺伝子の増幅を抑制するために、野生型対立遺伝子（例えば、豊富な対立遺伝子多型）に厳密に結合するようにデザインすることができる。例示的な例では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、蛍光標識、放射性標識、又は化学発光標識などの標識を含まない。
【００５４】
[0102]本明細書で用いられる「伸長不可能なブロッカー部分」又は「ブロッカー部分」という用語は、例えば、ＰＣＲ反応においてその相補的配列とハイブリダイズさせると、ポリメラーゼによる伸長を不可能とする、プローブ及び／又はプライマーなどのオリゴヌクレオチド配列における修飾を含む。ブロッカー部分の例には、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド配列の３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、オリゴヌクレオチドのリボース環の３’−ＯＨの修飾が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、限定なしに述べると、伸長不可能なブロッカー部分には、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、副溝結合剤（ＭＧＢ）、アミン（ＮＨ２）、ビオチン、ＰＥＧ、ＰＯ４、及びこれらの組合せが含まれる。ＭＧＢの例には、ＣＣ１０６５類似体、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４、６−ジアミノ−２−フェニルインドール、及びピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン、及びＤＰＩ３が含まれる。
【００５５】
[0103]本明細書で用いられる「修飾塩基」という用語は、自然発生の核酸において見出される塩基とは構造が異なる、核酸内の任意の塩基の修飾又は塩基の化学的連結を含む。このような修飾は、核酸内の塩基の化学構造の変化、若しくは塩基の化学的連結の変化、又は核酸の骨格構造の変化を含みうる。例えば、Ｌａｔｏｒｒａら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．、２：７９〜８５（２００３）；Ｎａｋｉａｎｄｗｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ、３：２（２００７）を参照されたい。
【００５６】
[0104]「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」という用語は、リボース環が、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とをつなぐメチレン架橋によって「ロックされた」核酸類似体のクラスを含む。ＬＮＡヌクレオシドは、一般的な核酸塩基（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｕ、及びｍＣ）を含有し、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合規則に従って塩基対を形成することが可能である。しかし、分子をメチレン架橋で「ロックする」ことによって、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合に理想的なコンフォメーションにおいてＬＮＡを束縛する。
【００５７】
[0105]「ペプチド核酸」、「ペプチド性核酸」、又は「ＰＮＡ」という用語は、アミド結合により連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の骨格と接合させた、多様な自然発生又は非自然発生の核酸塩基を含む、自然発生でなく人工的に合成された核酸類似体又は核酸模倣体を含む。プリン塩基及びピリミジン塩基は、メチレンカルボニル連結を介して非帯電骨格と接合させる。ＤＮＡと同様に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合規則は、ペプチド核酸にも当てはまる。
【００５８】
[0106]「ジップ核酸」又は「ＺＮＡ」という用語は、標的核酸鎖との静電斥力を減少させ、オリゴヌクレオチドのそれらの標的に対するアフィニティーを増大させる、カチオン性スペルミン部分のうちの１又は複数とコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含む。
【００５９】
[0107]「トリアゾール核酸」、「ＴｚＮＡ」、「トリアゾールデオキシ核酸」、「ＴｚＤＮＡ」、「デオキシリボ核酸のトリアゾール連結類似体」、又は「ＴＬＤＮＡ」という用語は、非自然発生のトリアゾール連結を含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００６０】
[0108]「（３’−２’）α−Ｌ−トレオース核酸」、「トレオース核酸」、又は「ＴＮＡ」という用語は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合規則に従い、代替的な糖−リン酸骨格に結合する核酸の探索において発見された非自然発生の核酸を含む（例えば、Ｉｃｈｉｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３：５２１９〜５２２５（２００５）を参照されたい）。ＴＮＡは、天然の核酸より１原子短い反復配列単位を有するが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＴＮＡ自体と塩基対合しうる。特定の理論に束縛されることを欲しないが、ＴＮＡは、ＤＮＡのＡ形態及びＲＮＡの良好な模倣体であるため、ＤＮＡと強くハイブリダイズし、ＲＮＡとはなおより強くハイブリダイズすると考えられる。ＴＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の、類似のＤＮＡ−ＤＮＡ複合体と比較した安定性の増大は、対立遺伝子多型のミスマッチの識別の改善を結果としてもたらす。
【００６１】
[0109]本明細書で用いられる「検出用プローブ」という用語は、増幅を示す多様なシグナル伝達分子のうちのいずれかを含む。例えば、サイバー（登録商標）グリーン及び他のＤＮＡ結合色素は、検出用プローブである。一部の検出用プローブは、配列ベースのプローブ（本明細書ではまた、「遺伝子座特異的検出用プローブ」とも称する）、例えば、５’ヌクレアーゼプローブでありうる。当技術分野では、多様な検出用プローブが知られており、これらには、本明細書で記載される（また、米国特許第５，５３８，８４８号も参照されたい）タックマン（登録商標）プローブ、多様なステムループ型分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号、及び同第５，９２５，５１７号；Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９６、１４：３０３〜３０８を参照されたい）、ステムレスビーコン又は直鎖状ビーコン（例えば、国際出願ＰＣＴ国際公開第９９／２１８８１号パンフレットを参照されたい）、ＰＮＡモレキュラービーコン（ＰＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）（商標）（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号、及び同第６，５９３，０９１号を参照されたい）、直鎖状ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａら、２００１、ＳＰＩＥ、４２６４：５３〜５８を参照されたい）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照されたい）、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）（登録商標）／アンプリフルオル（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）（登録商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、ステムループ型スコルピオン（商標）プローブ及び二重鎖型スコルピオン（商標）プローブ（例えば、Ｓｏｌｉｎａら、２００１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９：Ｅ９６；米国特許第６，５８９，７４３号を参照されたい）、バルジループ型プローブ（例えば、米国特許第６，５９０，０９１号を参照されたい）、シュードノット型プローブ（例えば、米国特許第６，５８９，２５０号を参照されたい）、サイクリコン（例えば、米国特許第６，３８３，７５２号を参照されたい）、ＭＧＢエクリプス（ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ）（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピン型プローブ（例えば、米国特許第６，５９６，４９０号を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアッププローブ、自己組織化ナノ粒子プローブ、並びに、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｉａｎｇａら、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５：４６３〜４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：８０４〜８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ、１４：３２１〜３２８；Ｓｖａｎｖｉｋら、２０００、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８１：２６〜３５；Ｗｏｌｆｆｓら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７６６：７６９〜７７１ ；Ｔｓｏｕｒｋａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：４２０８〜４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：４０８８〜４０９３；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｓｈａｎｇｈａｉ、���４：３２９〜３３２；Ｍａｘｗｅｌｌら、２００２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：９６０６〜９６１２；Ｂｒｏｕｄｅら、２００２、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：２４９〜５６；Ｈｕａｎｇら、２００２、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１５：１１８〜１２６；及びＹｕら、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１４：１１１５５〜１１１６１において記載されるフェロセン修飾プローブが含まれるがこれらに限定されない。検出用プローブは、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）又はテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）などのレポーター色素を含みうる。検出用プローブはまた、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アイオワブラック（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ）（ＩＤＴ）、ＱＳＹ消光剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、並びにダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）スルホネート／カルボキシレート消光剤及びダブセル（Ｄａｂｃｅｌ）スルホネート／カルボキシレート消光剤（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの消光剤部分も含みうる。一部の実施形態では、検出用プローブが、例えば、蛍光体を一方のプローブに置き、消光剤を他方のプローブに置く２つのプローブであって、標的において２つのプローブが一体となるハイブリダイゼーションによりシグナルをクエンチングするか、又は標的へのハイブリダイゼーションによる蛍光の変化を介してシグナルシグネチャーを変化させるプローブを含みうる。検出用プローブはまた、カルボキシレート基でなはくＳＯ３による、フルオレセイン色素のスルホン酸誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のホスホルアミダイト形態も含みうる。
【００６２】
[0110]「遺伝子座特異的プライマー」という用語は、ＰＣＲ反応において第１のプライマー（対立遺伝子特異的プライマーなど）の伸長に由来する産物とハイブリダイズし、この産物の第２の鎖であるｃＤＮＡの合成をもたらしうるオリゴヌクレオチド配列を含む。したがって、一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、フォワードＰＣＲプライマーとして用いられ、遺伝子座特異的プライマーが、リバースＰＣＲプライマーとして用いられるか、又はこの逆が成り立つ。一部の好ましい実施形態では、遺伝子座特異的プライマーを、対立遺伝子特異的プライマーと比較して高濃度で存在させる。
【００６３】
[0111]本明細書で用いられる「希少な対立遺伝子多型」という用語は、別の対立遺伝子多型と比較して、試料中に低レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを含む。希少な対立遺伝子多型はまた、「低頻度の対立遺伝子多型」及び／又は「突然変異体の対立遺伝子多型」とも称しうる。例えば、希少な対立遺伝子多型は、所与のＳＮＰ又は遺伝子について、別の対立遺伝子多型と比較して約１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、又は１／１，０００，０００，０００未満の頻度で見出すことができる。代替的に、希少な対立遺伝子多型は、例えば、試料容量又は反応容量１、１０、１００、又は１，０００マイクロリットル当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、又は１，０００，０００コピー未満でありうる。
【００６４】
[0112]「豊富な対立遺伝子多型」という用語は、別の対立遺伝子多型と比較して、試料中に高レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを含む。豊富な対立遺伝子多型はまた、「高頻度の対立遺伝子多型」及び／又は「野生型対立遺伝子多型」とも称しうる。例えば、豊富な対立遺伝子多型は、所与のＳＮＰ又は遺伝子について、別の対立遺伝子多型と比較して約１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、１００，０００，０００倍、又は１，０００，０００，０００倍を超える頻度で見出すことができる。代替的に、豊富な対立遺伝子多型は、例えば、試料容量又は反応容量１、１０、１００、１，０００マイクロリットル当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００コピーを超えうる。
【００６５】
[0113]特定の実施形態では、「第１の」及び「第２の」という用語は、第１の反応の構成要素（例えば、「第１の」反応；「第１の」対立遺伝子特異的プライマー）と、第２の反応の構成要素（例えば、「第２の」反応；「第２の」対立遺伝子特異的プライマー）とを区別するのに用いられる。慣例により、第１の反応により、第１の（例えば、希少な）対立遺伝子多型を増幅し、第２の反応により、（例えば、豊富な）対立遺伝子多型を増幅するか、又はこの逆が成り立つ。
【００６６】
[0114]本明細書で用いられる「第１の対立遺伝子多型」及び「第２の対立遺伝子多型」のいずれも、同じ生物に由来する所与の遺伝子座の対立遺伝子に関しうる。例えば、これは、野生型対立遺伝子を含むヒト試料（例えば、細胞）であって、野生型対立遺伝子の一部が突然変異して、低頻度の対立遺伝子又は希少な対立遺伝子を形成しているヒト試料における場合でありうるだろう。場合によって、第１の対立遺伝子多型と第２の対立遺伝子多型とは、異なる生物に由来する対立遺伝子を指す。例えば、第１の対立遺伝子は、遺伝子改変生物の対立遺伝子である可能性があり、第２の対立遺伝子は、野生型生物の対応する対立遺伝子でありうる。特定の場合には、第１の対立遺伝子多型及び第２の対立遺伝子多型が、ｇＤＮＡのほか、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ、並びに、一般に任意の標的核酸であって、例えば、（１又は複数の）ＳＮＰ又はヌクレオチドの挿入突然変異及び／又は欠失突然変異に起因する配列可変性を呈示する標的核酸に含有されうる。
【００６７】
[0115]「熱安定性の」又は「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に安定性であるか又は熱に抵抗性であり、核酸鎖と相補的なプライマーの伸長産物を形成するデオキシリボヌクレオチドの重合化を触媒する酵素を含む。本明細書において有用な熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅時に一本鎖核酸の不安定化又は二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温下に置かれても不可逆的には不活化されない。酵素の不可逆的な変性とは、酵素活性の実質的な喪失を指す。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅に典型的には要求されるような条件下、約９０℃〜１００℃で不可逆的に変性しないことが好ましい。
【００６８】
[0116]本明細書で用いられる「ＰＣＲ増幅すること」又は「ＰＣＲ増幅」という用語は、例えば、Ｉｎｎｉｓら、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）において記載される通り、相補鎖とハイブリダイズするプライマーを使用する、ポリメラーゼを介する核酸の指数関数的増幅のサイクリングを含む。指定された波長の光線を発することが可能な蛍光指示薬を含有する組成物と共に熱サイクリング反応を実施し、蛍光色素の強度を読み取り、各サイクル後における蛍光の強度を表示しうるデバイスが開発されている。サーマルサイクラー、光線エミッター、及び蛍光シグナル検出器を含むデバイスは、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号；同第６，０１５，６７４号；同第６，１７４，６７０号；及び同第６，８１４，９３４号において記載されており、ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）７７００シークエンスディテクションシステム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＡＢＩジーンアンプ（ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）５７００シークエンスディテクションシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＢＩジーンアンプ（登録商標）７３００シークエンスディテクションシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＢＩジーンアンプ（登録商標）７５００シークエンスディテクションシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ステップワン（Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ）（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＡＢＩジーンアンプ（登録商標）７９００シークエンスディテクションシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
[0117]「前増幅」又は「前増幅する」という用語は、複数のプライマー対がマルチプレックスのＰＣＲ増幅反応に含まれる工程を含み、ＰＣＲベースの前増幅反応は、ＰＣＲのプラトー及び／又は試薬の枯渇の前に終了するように、マルチプレックスの増幅反応が限定されたサイクル数を経る。「ＰＣＲベースの前増幅」という用語は、典型的にはＰＣＲベースの前増幅反応よりプレックスレベルの低い副次的増幅反応をその後に実施することを示すと考えることができる。この副次的増幅反応、典型的には複数の個別の副次的増幅反応では、マルチプレックスのＰＣＲベースの前増幅反応において用いられるプライマーによってコードされるプライマー対を使用することができる。しかし、各副次的増幅反応は、典型的には、単一又は少数のプライマー対を含む。ＰＣＲベースの前増幅手法のさらなる例は、例えば、それらの開示が全ての目的についてそれらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６０５，４５１号及び米国特許出願公開第１０／７２３，５２０号において見出すことができる。
【００７０】
[0118]本明細書で用いられるオリゴヌクレオチドの「Ｔｍ」又は「融解温度」という用語は、一本鎖オリゴヌクレオチドの集団内の分子のうちの５０％が、それらの相補的配列とハイブリダイズし、集団内の分子のうちの５０％が、前記相補的配列とハイブリダイズしない温度（摂氏度）を含む。プライマー又はプローブのＴｍは、融解曲線により経験的に決定することができる。一部の実施形態では、Ｔｍはまた、当技術分野でよく知られた式（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：１９８２を参照されたい）を用いて計算することもできる。
【００７１】
[0119]本明細書で用いられる「感度」という用語は、所与のアッセイにより検出されうる鋳型の最小量（コピー数又は重量）を含む。
【００７２】
[0120]本明細書で用いられる「特異性」という用語は、マッチした鋳型からの増幅を、ミスマッチした鋳型からの増幅と対比させて区別するアッセイの能力を含む。特異性は、ΔＣｔ＝Ｃｔｍｉｓｍａｔｃｈ−Ｃｔｍａｔｃｈとして表されることがしばしばである。本明細書では、特異性の改善又は「特異性改善」又は「倍数差」が、２（ΔＣｔ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ１−ΔＣｔ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ２）として表される。
【００７３】
[0121]「選択性」という用語は、ＡＳ−ＰＣＲアッセイを用いて、混合物中の低頻度の（突然変異体であることが多い）対立遺伝子を、高頻度の（野生型であることが多い）対立遺伝子からの干渉なしに決定しうる程度を含む。選択性は、比又は百分率として表されることが多い。例えば、１つの突然変異体の鋳型を、１００の野生型の鋳型の存在下で検出しうるアッセイは、１：１００又は１％の選択性を有するという。本明細書で用いられるアッセイの選択性はまた、１／２ΔＣｔとしても計算することができ、（１／２ΔＣｔ×１００）を用いて百分率としても計算することができる。
【００７４】
[0122]「Ｃｔ」又は「Ｃｔ値」という用語は、閾値サイクルを含み、単位複製配列の生成を示すレポーターからのシグナル（例えば、蛍光）が、初めてバックグラウンドレベルを上回って検出可能となる、ＰＣＲ増幅アッセイのサイクルを意味する。一部の実施形態では、閾値サイクル又は「Ｃｔ」が、ＰＣＲ増幅が指数関数的となるサイクル数である。
【００７５】
[0123]本明細書で用いられる「デルタＣｔ」又は「ΔＣｔ」という用語は、２つの異なる試料又は反応の間の、シグナルが一定の閾値を超えるサイクル数の数値による差を含む。一部の実施形態では、デルタＣｔが、数値によるサイクル数の差であって、２つの異なる試料又は反応の間の、指数関数的増幅が達せられるサイクル数の差である。一部の実施形態では、デルタＣｔを用いて、対応する標的核酸配列にマッチしたプライマーと、同じ対応する標的核酸配列にミスマッチしたプライマーとの間の特異性を同定することができる。
【００７６】
[0124]一部の実施形態では、ミスマッチしたプライマーとマッチしたプライマーとの間のデルタＣｔ値の計算を、対立遺伝子特異的ＰＣＲの識別力の１つの尺度として用いる。一般に、標的配列（例えば、対象の対立遺伝子多型を含む配列）にマッチしたプライマーを用いる増幅反応についてのＣｔ値と、ミスマッチしたプライマーのＣｔ値との差を増大させる任意の因子は、より大きな対立遺伝子の識別力を結果としてもたらす。
【００７７】
[0125]多様な実施形態によれば、Ｃｔ値は、ＰＣＲ曲線の導関数を用いて決定することができる。例えば、Ｃｔ値を決定するために、ＰＣＲ曲線に対して一次導関数法、二次導関数法、又はｎ次導関数法を実施することができる。多様な実施形態では、導関数の特徴を、Ｃｔ値の決定に用いることができる。このような特徴には、二次導関数の正の変曲、二次導関数の負の変曲、二次導関数のゼロ交差、又は一次導関数の正の変曲が含まれうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃｔ値を、閾値化法及びベースライン化法を用いて決定することができる。例えば、ＰＣＲ曲線の指数関数相の上界は、導関数法を用いて確立しうるのに対し、ＰＣＲ曲線の指数関数相の下界は、ＰＣＲ曲線のベースラインを決定して確立することができる。ＰＣＲ曲線の上界及び下界から閾値を確立することができ、閾値からＣｔ値を決定する。当技術分野で知られる、Ｃｔ値を決定するための他の方法は、例えば、フィットポイント（ｆｉｔ  ｐｏｉｎｔ）法の多様な実施形態、及びシグモイド法の多様な実施形態であるがこれらに限定されない。例えば、それらの開示が全ての目的についてそれらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３０３，３０５号；同第６，５０３，７２０号；同第６，７８３，９３４号、７，２２８，２３７号；及び米国特許出願公開第２００４／００９６８１９号を参照されたい。
【００７８】
[0126]本明細書で用いられる「試料」という用語は、患者から得られる任意の生物学的検体を含む。限定なしに述べると、試料には、全血液、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核細胞）、乳管洗浄液、乳首吸引物、リンパ（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄吸引物、腹水、胸膜流出物、唾液、尿、大便（すなわち、糞便）、痰、気管支洗浄液、涙液、微細針吸引物（ＦＮＡ）（例えば、乳輪周囲におけるランダムな微細針吸引により採取される）、他の任意の体液、腫瘍生検（例えば、注射針生検）又はリンパ節生検（例えば、前哨リンパ節生検）などの組織試料（例えば、腫瘍組織）、手術による腫瘍の切除などの組織試料（例えば、腫瘍組織）、及びこれらの細胞抽出物が含まれる。一部の実施形態では、試料が、全血液又は血漿、血清、若しくは細胞ペレットなどのその画分成分である。他の実施形態では、試料を、当技術分野で知られている任意の技法を用いて、充実性腫瘍の循環細胞又はそれらの細胞画分を全血液から単離することによって得る。さらに他の実施形態では、試料が、例えば、充実性腫瘍に由来する、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
【００７９】
[0127]「対象」又は「患者」又は「個体」という用語は、典型的にはヒトを含むが、また、例えば、他の霊長動物、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなど、他の動物も含む。
【００８０】
ＩＩＩ．実施形態についての記載
[0128]一態様では、本発明は、核酸試料中の対立遺伝子多型の同定及び／又は定量化において用いられる組成物を提供する。これらの組成物のうちの一部は、（ａ）対立遺伝子特異的プライマー、（ｂ）対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｃ）検出用プローブ、（ｄ）遺伝子座特異的プライマー、及び（ｅ）任意のこれらの組合せを含みうる。一部の実施形態では、組成物が、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ増幅に適する試薬及び／若しくは緩衝液、並びに／又は鋳型配列若しくは核酸試料をさらに含みうる。場合によって、ポリメラーゼが、熱安定性でありうる。
【００８１】
[0129]別の態様では、本発明は、核酸試料中の対立遺伝子多型の同定及び／又は定量化において用いられる組成物であって、（ｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、及び／又は（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第２の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、核酸修飾を含み、３’末端において伸長不可能なブロッカー部分を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブを含みうる組成物を提供する。
【００８２】
[0130]一部の例示的な実施形態では、組成物が、第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマーをさらに含みうる。さらに他の実施形態では、組成物が、検出用プローブをさらに含む。
【００８３】
[0131]別の態様では、本発明は、対立遺伝子特異的配列を増幅するための方法を提供する。これらの方法のうちの一部は、（ａ）対立遺伝子特異的プライマーを、標的対立遺伝子を含む第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップと、（ｂ）対立遺伝子特異的ブロッカープローブを、別の対立遺伝子を含む第２の核酸分子とハイブリダイズさせるステップであって、別の対立遺伝子が、標的対立遺伝子と同じ遺伝子座に対応するステップと、（ｃ）遺伝子座特異的検出用プローブを、第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップと、（ｄ）遺伝子座特異的プライマーを、対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物とハイブリダイズさせるステップと、（ｅ）標的対立遺伝子をＰＣＲ増幅するステップとを含みうる。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、３’末端において伸長不可能なブロッカー部分を含む。他の特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブの両方が、例えば、修飾塩基（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、ＺＮＡ、及びＴｚＤＮＡ）、核酸類似体、又はリボース修飾核酸などの核酸修飾を、標的対立遺伝子及び別の対立遺伝子のそれぞれの位置において独立に含む。
【００８４】
Ａ．プライマー及び／又はプローブのためのオリゴヌクレオチドのＬＮＡ修飾、ＰＮＡ修飾、ＴＮＡ修飾、ＺＮＡ修飾、又はＴｚＮＡ修飾
[0132]一態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドが、３’末端において、少なくとも１つの核酸修飾及び／又は伸長不可能なブロッカー部分を含む、オリゴヌクレオチド組成物を提供する。
【００８５】
[0133]非限定的な核酸修飾の例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せが含まれる。
【００８６】
[0134]好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含む。ＬＮＡは、リボース環が、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とをつなぐメチレン架橋により「ロックされた」核酸類似体のクラスを含む。ＬＮＡヌクレオシドは、一般的な核酸塩基（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｕ、及びｍＣ）を含有し、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合規則に従って塩基対を形成することが可能である。ＤＮＡオリゴヌクレオチドへと組み込まれると、ＬＮＡは、相補的なヌクレオチド鎖とより急速に対合し、結果としてもたらされる二重鎖の安定性を増大させる。ＬＮＡの単量体のオリゴヌクレオチドへの組込みによるアフィニティー増強効果は、ＬＮＡ単量体１個当たり２〜８℃の二重鎖融解温度の上昇によって裏付けられる。場合によって、ＬＮＡとは、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、及びアミノ−ＬＮＡなどであるがこれらに限定されないＬＮＡの修飾を指す。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２００４、３２、ｅ５５；Ｌａｔｏｒｒａら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．、２００３、２２、７９；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００５、３９、６４４を参照されたい。
【００８７】
[0135]一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含む。ＰＮＡとは、自然発生でなく、人工的に合成された、核酸類似体又は核酸模倣体であって、アミド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位を反復する骨格と接合させた多様な自然発生又は非自然発生の核酸塩基を含む、核酸類似体又は核酸模倣体である。ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との静電斥力が欠如するために、類似するＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖と比較してより大きな強度で、より高い安定性で、より迅速に、より大きな特異性で結合することが当業者によって理解される。より大きな安定性は、類似するＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖と対比したＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍの高さにより反映される。ＰＮＡ複合体は、熱安定性が大きく、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼによる分解に対する感受性が小さい。ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、塩濃度から部分的に独立であることが示されている。加えて、単一塩基のミスマッチは、１５マーのＰＮＡ／ＤＮＡ内の単一のミスマッチが、融点（Ｔｍ）を、１５マーのＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖についての４℃〜１６℃と対比して８℃〜２０℃低下させるために、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションによって決定しうる可能性がいっそう高い。これは、マッチした配列とミスマッチした配列との識別を改善する効果を及ぼす。例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．及びＥｇｈｏｌｍ，Ｍ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１；８９〜１０４（１９９９）；Ｏｒｕｍら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ＤＮＡ」、Ｇｒａｈａｍ  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．及びＥｇｈｏｌｍ，Ｍ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１；８９〜１０４（１９９９）；Ｇａｙｌｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０２：３４〜３９（２００５）を参照されたい。
【００８８】
[0136]ＰＮＡは、鋳型におけるミスマッチした塩基との反応には干渉せずに、完全にマッチした鋳型におけるプライマーのアニーリング及び鎖伸長をとりわけブロッキングしうる。ＰＮＡを用いて、非対称ＰＣＲクランプ法、融解曲線解析（例えば、Ｏｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．、１２：４１８〜４２４（２０１０）；Ｏｒｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２１：５３３２〜５３３６（１９９３）；Ｌｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３４：ｅ１２（２００６）；Ｋａｒｋａｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７１：５７５〜５８６（２００６）を参照されたい）などであるがこれらに限定されないＳＮＰ解析における野生型対立遺伝子の増幅を抑制することによって、突然変異の検出を改善することができる。
【００８９】
[0137]一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのジップ核酸（ＺＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含みうる。ＺＮＡとは、１又は複数のカチオン性スペルミン部分とコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドである。この構造は、その標的核酸鎖との静電斥力を減少させ、その標的に対するオリゴヌクレオチドのアフィニティーを増大させる。オリゴヌクレオチドの任意の位置に接合させたカチオン単位の数により、分子の全体的な電荷を調節することができ、これにより、ＺＮＡ二重鎖（例えば、ＺＮＡ−ＺＮＡ二重鎖、ＺＮＡ−ＤＮＡ二重鎖、及びＺＮＡ−ＲＮＡ二重鎖）の対応するＴｍを、直線的且つ予測可能な形で上昇させることができる。ＺＮＡは、低いマグネシウム濃度及び高いアニーリング温度で効果的であり、これは、対立遺伝子多型を正確に検出するために有利でありうる。ＺＮＡは、蛍光部分及び蛍光消光剤で単一標識されるか又は二重標識されうる。ＺＮＡは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。例えば、Ｖｏｉｒｉｎら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２：１３６０〜１３６７（２００７）、Ｎｏｉｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３０；１３５００〜１３５０５（２００８）、Ｍｏｒｅａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３７：ｅ１３０（２００９）；Ｐａｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３８：ｅ９５（２０１０）を参照されたい。
【００９０】
[0138]他の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのトリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含む。ＴｚＮＡオリゴヌクレオチドは、クリック化学反応（例えば、銅触媒型アジド−アルキン付加環化反応）を用いて合成することができる。ＡＺＴベースのトリアゾール連結を含有するオリゴヌクレオチドは、増幅のための多様なポリメラーゼを伴うＰＣＲ鋳型として用いることができる（Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３１：３９５８〜３９６４（２００９））。また、トリゾールリンカーを含有する遺伝子も、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で機能的でありうる（Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０８：１１３３８〜１１３４３（２０１１））。例えば、Ｉｓｏｂｅら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、１０：３７２９〜３７３２（２００８）；Ｆｕｊｉｎｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、５０：４１０１〜４１０３（２００９）；ｖｏｎ  Ｍａｔｔら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｓ．、７：１５５３〜１５５６（１９９７）を参照されたい。
【００９１】
[0139]さらに他の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのトレオース核酸（ＴＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含む。ＴＮＡは、天然の核酸より１原子短いが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれ自体と塩基対合しうる反復単位を有する。特定の理論に束縛されることを欲しないが、ＴＮＡは、ＤＮＡのＡ形態及びＲＮＡの良好な模倣体であるため、ＤＮＡと強くハイブリダイズし、ＲＮＡとはなおより強くハイブリダイズすると考えられる。ＴＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の、類似のＤＮＡ−ＤＮＡ複合体と比較した安定性の増大は、対立遺伝子多型のミスマッチの識別の改善を結果としてもたらす。例えば、Ｉｃｈｉｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３：５２１９〜５２２５（２００５）を参照されたい。
【００９２】
[0140]修飾塩基は、１又は複数の官能基の付加又は欠失、ヘテロ環構造の差違（すなわち、炭素のヘテロ原子への置換、又はこの逆）、及び／又は１又は複数のリンカーアーム構造の塩基への接合によって自然発生の塩基と異なる塩基であると考えられる。一部の実施形態ではまた、自然発生塩基、修飾塩基、及び塩基類似体の全ての互変異性形態も、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブに含まれうる。
【００９３】
[0141]さらなる実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットのうちの１又は複数において、修飾された糖又は糖類似体が存在しうる。糖修飾には、糖の２’、３’及び／又は４’側炭素原子への置換基の接合、糖の異なるエピマー形態、グリコシド結合のα−立体配置又はβ−立体配置の差違、及び他のアノマー変化が含まれるがこれらに限定されない。糖部分には、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、リボース、デオキシリボース、ブドウ糖、アラビノース、ペントフラノース、キシロース、リキソース、及びシクロペンチルが含まれるがこれらに限定されない。
【００９４】
[0142]特定の実施形態では、１又は複数の修飾インターヌクレオチド連結又は修飾骨格連結を、本発明のオリゴヌクレオチドに存在させることができる。このような修飾連結には、ペプチド、リン酸、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、リン酸アルキル、アルカンホスホネート、チオリン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、置換されたホスホルアミデートなどが含まれるがこれらに限定されない。当業者には、プローブ及び／又はプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドにおけるそれらの使用と適合可能な、塩基連結、糖連結、及び／又はインターヌクレオチド連結のさらなる修飾が明らかであろう。
【００９５】
[0143]伸長不可能なブロッカー部分は、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド配列の３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、ブロッカープローブのリボース環３’−ＯＨの任意の修飾を含みうる。一部の実施形態では、限定なしに述べると、ブロッカー部分には、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、副溝結合剤（ＭＧＢ）、アミン（ＮＨ２）、ビオチン、ＰＥＧ、ＰＯ４、及びこれらの混合物が含まれうる。特定の実施形態では、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオールが、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端へのメタンジオール修飾、エタンジオール修飾、１，３−プロパンジオール修飾、１，４−ブタンジオール修飾、１，５−ペンタンジオール修飾、１，６−ヘキサンジオール修飾、１，７−ヘプタンジオール修飾、又は１，８−オクタンジオール修飾を含む。一部の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１２、Ｃ２〜Ｃ２０、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１０、Ｃ４〜Ｃ８、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、又はＣ１２アルキルジオールを含む。他の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２０、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１０、Ｃ４〜Ｃ８、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、若しくはＣ１２アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２０、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１０、Ｃ４〜Ｃ８、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、若しくはＣ１２アルキニルジオールを含む。
【００９６】
[0144]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）及び／若しくはＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、メタンジオール修飾、エタンジオール修飾、１，３−プロパンジオール修飾、１，４−ブタンジオール修飾、１，５−ペンタンジオール修飾、１，６−ヘキサンジオール修飾、１，７−ヘプタンジオール修飾、若しくは１，８−オクタンジオール修飾、又は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１２、Ｃ２〜Ｃ２０、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１０、Ｃ４〜Ｃ８、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、又はＣ１２アルキルジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、若しくは置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール（例えば、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２０、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１０、Ｃ４〜Ｃ８、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、若しくはＣ１２アルケニルジオール修飾、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２０、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１２、Ｃ４〜Ｃ１０、Ｃ４〜Ｃ８、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、若しくはＣ１２アルキニルジオール修飾）、又はこれらの混合物から本質的になるか、又はこれらからなる。
【００９７】
[0145]「置換されていてもよい」という用語は、少なくとも１つの水素原子の置換基による置きかえを含む。「オキソ」置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子を置きかえる。置換基の非限定的な例には、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙ［式中、ｎは、０、１、又は２であり、Ｒｘ及びＲｙは、同じであるか又は異なり、独立に水素、アルキル、又はヘテロ環であり、アルキル置換基及びヘテロ環置換基の各々を、本明細書で記載される置換基のうちの１又は複数でさらに置換することができる］が含まれる。置換基のリストの前で用いられる場合の「置換されていてもよい」という用語は、リスト中の置換基の各々を、場合によって、本明細書で記載される通りに置換しうることを意味する。
【００９８】
[0146]特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのブロッカー部分から、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドなど、約５〜約１５又は約５〜約１０ヌクレオチド隔てて配置される。他の特定の場合には、ＰＣＲ増幅時において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが切断されない。さらなる場合には、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのＴｍが、約５８℃〜約６６℃の範囲である。
【００９９】
[0147]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーが、少なくとも約１、２、３、４、５、又は６つ（例えば、２〜６つ）の核酸修飾を含む。特定の場合には、１又は複数の修飾が、マッチした標的配列とミスマッチした標的配列とのＴｍ差を増大させ、及び／又はミスマッチプライミングの有効性を低下させ、これによって、アッセイの特異性及び／又は選択性を改善することができる。他の特定の場合には、１又は複数の修飾が、循環腫瘍細胞試料の対立遺伝子の識別を改善する。このような修飾の非限定的な例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、５’メチル−デオキシシチジン、２’−フルオロ修飾核酸、８−アザ−７−デアザ−ｄＡ（ｐｐＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＧ（ｐｐＧ）、１Ｈ−ピラゾロ［４，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（ｐｐＸ）、２’−デオキシシュードイソシチジン（イソｄＣ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ｆｄＵ）、及び２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）修飾、及びこれらの修飾の組合せが含まれる。特定の実施形態では、２つのＬＮＡ塩基が配列中で互いと隣り合わないように、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーにおいて存在するＬＮＡ修飾が、不連続又は非隣接である。
【０１００】
[0148]好ましい実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーにおいて存在する核酸修飾が、１又は複数のＬＮＡヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾を、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマー内の（ａ）３’端、（ｂ）５’端、（ｃ）内部位置、又は（ａ）、（ｂ）、若しくは（ｃ）の任意の組合せに配置する。一部の好ましい実施形態では、この修飾が、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、１つの修飾（例えば、ＬＮＡ）が、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。他の好ましい実施形態では、この修飾が、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、１つの修飾（例えば、ＬＮＡ）が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。さらに他の好ましい実施形態では、核酸修飾（例えば、ＬＮＡ）が、対立遺伝子特異的プライマー及び／又は対立遺伝子特異的ブロッカープローブの連続位置又は隣接位置に配置されない。
【０１０１】
[0149]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び／又は対立遺伝子特異的プライマーにおいて存在する核酸修飾が、１又は複数の（少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は全ての）ＰＮＡヌクレオチド、ＺＮＡヌクレオチド、ＴＮＡヌクレオチド、及び／又はＴｚＤＮＡヌクレオチドを独立に含む。
【０１０２】
[0150]本発明で用いうる核酸修飾の他の例は、例えば、その開示が参照によってその全体において全ての目的で本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５１７，９７８号において記載されている。
【０１０３】
[0151]例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＺＮＡ、ＴＮＡ、ＴｚＤＮＡ、ｐｐＡ、ｐｐＧ、及び５−フルオロ−ｄＵ（ｆｄＵ）を含めた多くの修飾核酸部分は市販されており、当技術分野でよく知られているオリゴヌクレオチド合成法において用いることができる。一部の実施形態では、修飾プライマー及びプローブの合成は、これもまた当技術分野でよく知られている標準的な化学的手段を用いて実行することができる。例えば、修飾部分又は修飾塩基は、（ａ）ＤＮＡ合成支持体としての修飾ヌクレオシド、（ｂ）ホスホルアミダイトとしての修飾ヌクレオシド、（ｃ）ＤＮＡ合成時における試薬（例えば、ＤＮＡ配列へと組み込む場合の、転換可能なアミダイトのベンジルアミン処理）、又は（ｄ）合成後修飾を用いることによって導入することができる。
【０１０４】
[0152]加えて、一部の実施形態では、本発明の対立遺伝子特異的プライマー及び／又は対立遺伝子特異的ブロッカープローブのオリゴヌクレオチドへと組み込まれるヌクレオチド単位が、塩基のうちの１又は複数に、例えば、連結アームを介して共有結合的に結合する架橋形成官能基（アルキル化剤）も有しうる。
【０１０５】
[0153]さらに別の態様では、本発明は、混合試料中の対立遺伝子多型を検出及び／又は定量化するための方法を提供する。これらの方法のうちの一部は、（ａ）第１の対立遺伝子特異的プライマーを、第１の反応混合物中の、第１の対立遺伝子（対立遺伝子１）を含む第１の核酸分子とハイブリダイズさせ、第２の対立遺伝子特異的プライマーを、第２の反応混合物中の、第２の対立遺伝子（対立遺伝子２）を含む第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップであって、対立遺伝子２が、対立遺伝子１と同じ遺伝子座に対応するステップと、（ｂ）第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブを、第１の反応混合物中の、対立遺伝子２を含む第２の核酸分子とハイブリダイズさせ、第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブを、第２の反応混合物中の、対立遺伝子１を含む第２の核酸分子とハイブリダイズさせるステップと、（ｃ）第１の検出用プローブを、第１の反応混合物中の、第１の核酸分子とハイブリダイズさせ、第２の検出用プローブを、第２の反応混合物中の、第１の核酸分子とハイブリダイズさせるステップと、（ｄ）第１の遺伝子座特異的プライマーを、第１の反応混合物中の、第１の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物とハイブリダイズさせ、第２の遺伝子座特異的プライマーを、第２の反応混合物中の、第２の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物とハイブリダイズさせるステップと、（ｅ）第１の核酸分子をＰＣＲ増幅して、単位複製配列の第１のセット又は試料を形成し、第２の核酸分子をＰＣＲ増幅して、単位複製配列の第２のセット又は試料を形成するステップと、（ｆ）単位複製配列の第１のセットを、単位複製配列の第２のセットと比較して、対立遺伝子２を含む試料中の対立遺伝子１及び／又は対立遺伝子１を含む試料中の対立遺伝子２を定量化するステップとを含みうる。
【０１０６】
[0154]さらに別の態様では、本発明は、標的配列の少なくとも第２の対立遺伝子多型を含むことが疑われる核酸試料中で、標的配列の第１の対立遺伝子多型を検出するための方法を提供する。このような方法の非限定的な例は、以下の構成要素（ｉ）核酸試料、（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、本明細書で記載される核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、（ｉｉｉ）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含する、第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、本明細書で記載される伸長不可能なブロッキング部分及び核酸修飾を含む対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｉｖ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー、並びに／又は（ｖ）検出用プローブのうちの１若しくは複数を組み合わせることによって、反応混合物を形成するステップを含む。特定の場合には、第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子を含み、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子を含む。
【０１０７】
[0155]次に、遺伝子座特異的プライマー及び対立遺伝子特異的プライマーを用いて、反応混合物に対して増幅反応、典型的にはＰＣＲ増幅反応を実行して単位複製配列を形成する。次いで、単位複製配列を、単位複製配列へと結合したときの検出用プローブの検出可能な特性の変化によって検出し、これによって、核酸試料中の標的遺伝子の第１の対立遺伝子多型を検出する。例示的な実施形態における検出用プローブは５’ヌクレアーゼプローブであり、例示的な実施形態における検出可能な特性は蛍光である。
【０１０８】
[0156]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの５’側標的領域の３’側ヌクレオチド位置が、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの位置である。他の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの中央部に配置する。
【０１０９】
[0157]特定の実施形態では、第１の対立遺伝子多型の量を、検出用プローブの検出可能な特性の変化を評価することによって決定する。
【０１１０】
[0158]一部の実施形態では、核酸試料中の標的配列内の対立遺伝子多型を検出するための本発明の方法が、以下のサイクリングプロトコール
（ａ）以下の構成要素
（ｉ）核酸試料、
（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、本明細書で記載される第１の対立遺伝子多型の位置に核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、
（ｉｉｉ）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含する、第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、ブロッキング部分及び本明細書で記載される第２の対立遺伝子多型の位置における核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、
（ｉｖ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー、及び
（ｖ）検出用プローブ
のうちの１又は複数を含む反応混合物を形成するステップ、
（ｂ）アニーリング温度／伸長温度で実行されるいくつかのサイクルを含むサイクリングプロトコールを用いて標的配列をＰＣＲ増幅するステップ、並びに
（ｃ）ステップ（ｂ）により産生される標的配列の増幅産物中の検出用プローブの検出可能な特性の変化を検出するステップ
を含む。
【０１１１】
[0159]本発明の方法には、いくつかの主要な利点が存在する。まず、本明細書で記載される遺伝子型決定アッセイは、マッチした標的又は対立遺伝子についてのＣｔ値を低下させることによって検出感度を改善する。次に、本明細書で記載される遺伝子型決定アッセイは、マッチした配列のＣｔ値とミスマッチした配列のＣｔ値との間のΔＣｔを増大させることによって、特異性を改善する。加えて、本明細書で記載される遺伝子型決定アッセイは、多様なアッセイにわたる有効性の均一性を改善する。
【０１１２】
[0160]他の実施形態では、本発明の方法は、２段階のサイクリングプロトコールを含みうる。一部の実施形態では、核酸試料中の標的配列内の対立遺伝子多型を検出するための方法が、
（ａ）以下の構成要素
（ｉ）核酸試料、
（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、本明細書で記載される第１の対立遺伝子多型の位置に核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、
（ｉｉｉ）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含する、第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、ブロッキング部分及び本明細書で記載される第２の対立遺伝子多型の位置における核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、
（ｉｖ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー、及び
（ｖ）検出用プローブ
のうちの１又は複数を含む反応混合物を形成するステップと、
（ｂ）
（ｉ）第１のアニーリング温度／伸長温度で実行される第１のサイクル数を含む第１の増幅ステップ、及び
（ｉｉ）第２のアニーリング温度／伸長温度で実行される第２のサイクル数を含む第２の増幅ステップ
を含む２段階のサイクリングプロトコールを用いて標的配列をＰＣＲ増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）により産生される標的配列の増幅産物中の検出用プローブの検出可能な特性の変化を検出するステップと
を含む。
【０１１３】
[0161]場合によって、ステップ（ｂ）における第１のサイクル数が、第２のサイクル数より少なく、第１のアニーリング温度／伸長温度が、第２のアニーリング温度／伸長温度より低い。一部の実施形態では、サイクリングプロトコールの第１段階において用いられるサイクル数が、第２段階において用いられるサイクル数全体の約２％〜２０％、４％〜１８％、６％〜１６％、８％〜１４％、１０％〜１２％、又は任意の中間の百分率である。他の実施形態では、第１段階において、約１〜１０サイクル、２〜８サイクル、３〜７サイクル、４〜６サイクルの間、又は任意の中間のサイクル数、例えば、２、３、４、５、６、又は７サイクルを使用する。
【０１１４】
[0162]一部の実施形態では、サイクリングプロトコールの第２段階において用いられるサイクル数が、第１段階において用いられるサイクル数の約５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、１８倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍である。一部の実施形態では、第２段階において、約３０〜５０サイクル、３５〜４８サイクル、４０〜４６サイクルの間、又は任意の中間のサイクル数、例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０，４１、４２、４３、４４、４５、又は４６サイクルを使用する。
【０１１５】
[0163]一部の実施形態では、第１のサイクリング段階において用いられる低いアニーリング温度／伸長温度が、第２のサイクリング段階において用いられるアニーリング温度／伸長温度より約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、又は約５℃低い。場合によって、第１段階のアニーリング温度／伸長温度が、約５０℃〜６０℃、５２℃〜５８℃、又は５４℃〜５６℃の間、例えば、５３℃、５４℃、５５℃、又は５５℃である。他の特定の実施形態では、第２段階のアニーリング温度／伸長温度が、約５６℃〜６６℃、５８℃〜６４℃、又は６０℃〜６２℃の間、例えば、５８℃、６０℃、６２℃、又は６４℃である。
【０１１６】
[0164]別の態様では、本発明は、以下の構成要素（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、（ｉｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第２の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、核酸修飾を含み、オリゴヌクレオチド配列の３’端にブロッカー部分を含む対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｉｖ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー、及び／又は（ｖ）検出用プローブを含む反応混合物を提供する。
【０１１７】
[0165]一部の実施形態では、本発明の方法が、所与のＳＮＰ又は遺伝子について、第２の対立遺伝子多型の約１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、又は１／１，０００，０００，０００未満、及びこれらの間の任意の部分範囲（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｒａｎｇｅ）の頻度で存在する第１の対立遺伝子多型を検出するのに用いられる。他の実施形態では、本発明の方法が、試料容量又は反応容量１、１０、３００、５００、又は１，０００マイクロリットル当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、又は１，０００，０００コピー未満、及びこれらの間の任意の部分範囲で存在する第１の対立遺伝子多型を検出するのに用いられる。
【０１１８】
[0166]特定の実施形態では、第１の対立遺伝子多型が突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である。一部の実施形態では、本発明の方法が、少なくとも約１，０００〜１，０００，０００など、約１，０００〜１０，０００、約１０，０００〜１００，０００、又は約１００，０００〜１，０００，０００個の野生型分子のバックグラウンド中に１個、又はこれらの間の任意の部分範囲にある突然変異体分子を検出するステップを伴いうる。一部の実施形態では、方法が、タックマン（登録商標）ベースのアッセイと少なくとも同等な高感度及び有効性をもたらしうる。
【０１１９】
[0167]別の態様では、本発明は、別の第２の対立遺伝子多型を含む試料中の第１の対立遺伝子多型を定量化するためのキットであって、（ａ）対立遺伝子特異的プライマー、（ｂ）対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（ｃ）遺伝子座特異的プライマー、（ｄ）検出用プローブ、及び／又は（ｅ）ポリメラーゼを含むキットを提供する。
【０１２０】
[0168]さらに別の態様では、本発明は、２つ以上の容器のうちの１つに独立に分配された以下の構成要素（ｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、本明細書で記載される核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的プライマー、（ｉｉ）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含する、第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び本明細書で記載される核酸修飾を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブを含む２つ以上の容器を含むキットを提供する。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、標的配列の第２の対立遺伝子多型と相補的な対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分であって、核酸修飾を含む対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含み、ここで、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、オリゴヌクレオチド配列の３’端においてブロッカー部分を含む。
【０１２１】
[0169]一部の実施形態では、キットが、第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマーをさらに含みうる。他の実施形態では、キットが、検出用プローブをさらに含みうる。さらに他の実施形態では、キットが、前増幅に用いられるさらなる構成要素をさらに含みうる。
【０１２２】
[0170]一部の実施形態では、本発明の組成物、方法、及び／又はキットが、早期のがん診断のための血液又は微細針吸引物（ＦＮＡ）など、試料中の腫瘍細胞を検出するのに有用である。他の実施形態では、本発明の組成物、方法、及び／又はキットが、がん又は疾患に関連する遺伝子変異又は体細胞突然変異の検出及び検証に有用である。さらに他の実施形態では、組成物、方法、及び／又はキットを、二対立遺伝子性のＳＮＰ、三対立遺伝子性のＳＮＰ、又は四対立遺伝子性のＳＮＰを遺伝子型決定するために用いることができる。他の実施形態では、本発明の組成物、方法、及び／又はキットを、単一又は複数のヌクレオチドの挿入突然変異又は欠失突然変異を同定するために用いることができる。一部の実施形態では、本発明の組成物、方法、及び／又はキットを、ＱＣアッセイ及びヒト同定アッセイ、細胞汚染についての細胞株ＱＣ、対立遺伝子発現解析、ウイルスタイピング／希少病原体の検出、プールされた試料からの突然変異の検出、血液中の循環腫瘍細胞の検出、並びに／又は出産前診断法のための混合ＤＮＡ試料からのＤＮＡタイピングのために用いることができる。
【０１２３】
Ｂ．対立遺伝子特異的プライマー
[0171]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、約１６〜２８、約１７〜２６、約１８〜２４、若しくは約２０〜２２ヌクレオチドの長さ、又は任意の中間の範囲など、約１５〜３０ヌクレオチドの長さの範囲の短いオリゴマーである。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーのＴｍが、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６６℃、約５６℃〜６４℃、約５８℃〜６２℃、又は任意の中間の温度（例えば、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃）など、約５０℃〜７０℃の範囲である。他の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーのＴｍが、増幅時に使用されるＰＣＲサイクリング条件のアニール／伸長温度より約３℃〜６℃高い。特定の場合には、低いＴｍでデザインされる対立遺伝子特異的プライマーが、対立遺伝子多型の識別力を増大させる。
【０１２４】
[0172]本発明の一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー濃度を低くすることにより、選択性を改善する。特定の場合には、対立遺伝子特異的プライマーの濃度を、９００ｎＭを下回って低減することにより、マッチした配列とミスマッチした配列との間のデルタＣｔを増大させる。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの濃度が、約５０ｎＭ〜７００ｎＭ、約１００ｎＭ〜５００ｎＭ、約２００ｎＭ〜４００ｎＭ、約２００ｎＭ〜３００ｎＭ、約４００ｎＭ〜５００ｎＭ、又は任意の中間の範囲など、約２０ｎＭ〜９００ｎＭの範囲である。
【０１２５】
[0173]一部の実施形態では、本発明の対立遺伝子特異的プライマーが、標的である対象の対立遺伝子に特異的な対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含みうる。対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、遺伝子の１つの対立遺伝子と相補的であるが、その遺伝子の別の対立遺伝子とは相補的でない。言い換えれば、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、遺伝子の異なる対立遺伝子多型に異なるヌクレオチドを含むことが知られたヌクレオチド位置である、遺伝子の１又は複数の可変的なヌクレオチド位置に結合する。対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、少なくとも１つのヌクレオチドの長さである。例示的な実施形態では、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、１ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を、対立遺伝子特異的プライマーの３’末端に配置する。他の実施形態では、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を、対立遺伝子特異的プライマーの最３’端から約１〜２、３〜４、５〜６、７〜８、９〜１１、１２〜１５、又は１６〜２０ヌクレオチドに配置する。
【０１２６】
[0174]識別塩基を標的とするようにデザインされた対立遺伝子特異的プライマーはまた、対立遺伝子多型の識別も改善しうる。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分のヌクレオチドが、識別性の高い塩基（例えば、Ａ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ａ／Ｃ、又はＣ／Ａ対立遺伝子を検出するための塩基）を標的とする。識別性が低い塩基は、例えば、Ｃ／Ｃ、Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｃ／Ｔ対立遺伝子の検出を伴いうる。一部の実施形態では、例えば、検出される対立遺伝子が、Ａ／Ｇ  ＳＮＰ又はＣ／Ｔ  ＳＮＰを伴う場合、Ａ又はＧを、対立遺伝子特異的プライマーの３’側の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いることもでき（例えば、Ａ又はＴが、高頻度の対立遺伝子である場合）、Ｃ又はＴを、対立遺伝子特異的プライマーの３’側の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いることもできる（例えば、Ｃ又はＧが、高頻度の対立遺伝子である場合）。他の実施形態では、Ａ／Ｔ  ＳＮＰを検出及び／又は定量化する場合、Ａを、対立遺伝子特異的プライマーの３’端におけるヌクレオチド特異的部分（例えば、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分）として用いることができる。さらに他の実施形態では、Ｃ／Ｇ  ＳＮＰを検出及び／又は定量化する場合、Ｇを、対立遺伝子特異的プライマーの３’端におけるヌクレオチド特異的部分として用いることができる。
【０１２７】
[0175]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、対象のポリヌクレオチド配列（又は遺伝子座）に特異的な標的特異的部分を含みうる。他の実施形態では、標的特異的部分が、対象の標的であるポリヌクレオチド配列と約７５〜８５％、８５〜９５％、９５〜９９％、又は１００％相補的である。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分が、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含みうる。他の実施形態では、標的特異的部分を、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に対して５’側に配置する。標的特異的部分は、約４〜３０、約５〜２５、約６〜２０、約７〜１５、又は約８〜１０ヌクレオチドの長さでありうる。一部の実施形態では、標的特異的部分のＴｍが、ＰＣＲサイクリングに用いられるアニール／伸長温度を約５℃下回る。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分のＴｍが、約５３℃〜６０℃、約５２℃〜５９℃、約５３℃〜５８℃、約５４℃〜５７℃、約５５℃〜５６℃、又は約５０℃〜約６０℃の範囲である。
【０１２８】
[0176]２つの対立遺伝子特異的プライマーを用いる実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分と第２の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分とが、同じ配列を含むか、又は同じ配列である。
【０１２９】
[0177]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、自然発生の塩基（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシル）と異なる１又は複数の修飾核酸塩基又はヌクレオシド塩基を含みうる。一部の実施形態では、修飾塩基が、アデニン部分、グアニン部分、シトシン部分、ウラシル部分、又はチミン部分を含有する核酸単位と有効にハイブリダイズすることがやはり可能である。一部の実施形態では、（１又は複数の）修飾塩基によって、マッチした標的配列とミスマッチした標的配列とのＴｍ差を増大させ、及び／又はミスマッチプライミングの効率を低下させ、これによって、アッセイの特異性、選択性、及び再現性を改善することができる。一部の実施形態では、（１又は複数の）修飾塩基によって、対立遺伝子特異的プライマーの、その相補的ＤＮＡ標的に対する結合アフィニティーを増大させることができる。
【０１３０】
[0178]特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、少なくとも１つ、２つ、又はこれを超える修飾塩基を含む。修飾塩基の例には、限定なしに述べると、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）及びトリアゾールＤＮＡ（ＴｚＤＮＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＡ（ｐｐＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＧ（ｐｐＧ）、２’−デオキシシュードイソシチジン（イソｄＣ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ｆｄＵ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）塩基、及びこれらの組合せが含まれる。
【０１３１】
[0179]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、２つ〜６つのＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、ＺＮＡ、又はリボース修飾核酸を含む。これらの修飾塩基は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡに対する熱安定性を呈示し、これによって、本発明の方法における優れたミスマッチ識別が可能となる。これらの修飾塩基の高度な結合アフィニティーは、高度な特異性、選択性、及び／又は再現性を要求するハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることができる。
【０１３２】
[0180]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーにおいて存在する修飾塩基が、１又は複数のＬＮＡ修飾を含む。これらの実施形態では、ＬＮＡ修飾を、対立遺伝子特異的プライマーにおける連続位置に配置しない。特定の実施形態では、修飾塩基を、対立遺伝子特異的プライマー内の（ａ）３’端、（ｂ）５’端、（ｃ）内部位置、又は（ａ）、（ｂ）、若しくは（ｃ）の任意の組合せに配置する。一部の実施形態では、ＬＮＡヌクレオシドが、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、修飾塩基（例えば、ＬＮＡヌクレオシド）が、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。
【０１３３】
[0181]好ましい実施形態では、ＬＮＡ修飾を、対立遺伝子特異的プライマーの３’端に配置する。対立遺伝子多型の３’端にＬＮＡを伴うと、対立遺伝子特異的プライマーの融解温度（Ｔｍ）が上昇し、これによって、本発明のアッセイの対立遺伝子多型に対する選択性が増強される。加えて、選択的対立遺伝子多型の増幅は、ＰＣＲサイクリング時の増幅温度が高いときにも生じうる。場合によって、３’端におけるＬＮＡの存在はまた、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’プルーフリーディングのエクソヌクレアーゼ活性を緩徐化する一助ともなる。他の場合には、端部から２番目の位置におけるＬＮＡの存在が、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エクソヌクレアーゼ活性に対する保護をもたらしうる（例えば、Ｇｉｕｓｔｏ，Ｄ及びＫｉｎｇ，Ｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２：３、ｅ  ３２、１〜８（２００４）を参照されたい）。
【０１３４】
[0182]一部の実施形態では、複数のＬＮＡをプライマー内に存在させ、３’端から５〜１０塩基の間のいずれかの位置に間隔をあけて配置する。他の実施形態では、プライマーが、３’端から２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０塩基の間のいずれかの位置に間隔をあけて配置された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のＬＮＡを含有しうる。さらに他の実施形態では、ＬＮＡ修飾が、このプライマーの３’端に対して端部から２番目の位置、３’端、５’端、及びこれらの組合せに配置される。これらの実施形態では、ＬＮＡ修飾が、典型的には、プライマー配列の連続位置に配置されない。
【０１３５】
[0183]オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡ修飾は、相補的ＤＮＡ標的に対する結合アフィニティーを増大させる。高アフィニティーは、リボースのロックされた３’端コンフォメーションのコンフォメーション的な柔軟性の低減と関連する。ＤＮＡ塩基と同様に、ＬＮＡ塩基は、同じリン酸骨格によって連結され、これによって、ＬＮＡ−ＤＮＡプライマーがその相補的ＤＮＡに効率的に結合することを可能とし、これによって、二重鎖のＴｍの上昇を結果としてもたらす。識別効果は、プライマーが、ゲノムＤＮＡへと結合し、ＰＣＲサイクリング時において、結合を維持する能力に依存する。これは、ＬＮＡ−ＤＮＡプライマーの高度な結合アフィニティーによって達成される。ＬＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の高いＴｍは、その結合アフィニティーと良好に相関する。ＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマーは、ＰＣＲサイクリング時における高い反応温度を可能とし、Ｔｍが低い非ＬＮＡプライマーと比較して、遺伝子型決定アッセイの特異性を増強する。
【０１３６】
[0184]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー、ブロッカープローブ及び／又は検出用プローブが、ＰＮＡ修飾を含む。対立遺伝子特異的プライマーにおけるＰＮＡ修飾は、そのＤＮＡ標的に対する高度な特異性及び感度をもたらす。ＰＮＡの高度な結合アフィニティー及び高いＴｍは、本明細書で記載される方法に高度な特異性及び再現性をもたらす。
【０１３７】
[0185]ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との静電斥力が欠如するために、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖と比較してより大きな強度で、より高い安定性で、より迅速に、より大きな特異性で結合することが当業者によって理解される。安定性の増大は、類似するＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖と対比したＰＮＡ−二重鎖のＴｍの高さによって反映される。ＰＮＡ複合体は、熱安定性が大きく、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼによる分解に対する感受性が小さい。ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、塩濃度から部分的に独立であることが示されている。一部の実施形態では、ＰＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマー及び／又はブロッカープローブが、塩の非存在下において、二次構造の存在にもかかわらず、その核酸標的に結合しうる。例えば、それらの各々の開示が全ての目的についてそれらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．及びＥｇｈｏｌｍ，Ｍ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１；８９〜１０４（１９９９）；Ｇａｙｌｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０２：３４〜３９（２００５））を参照されたい。
【０１３８】
[0186]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、ジップ核酸（ＺＮＡ）分子のうちの１又は複数を含む。ＺＮＡプライマーは、核酸鎖間の静電斥力を減少させるために、その相補的な標的ＤＮＡに対するアフィニティーを増大させる。対立遺伝子特異的プライマーにおけるＺＮＡ修飾のうちの１又は複数の存在は、ＺＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍを上昇させ、本発明の方法における対立遺伝子の識別を改善しうる。
【０１３９】
[0187]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、（３’−２’）α−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）のうちの１又は複数を含む。ＴＮＡは、ＤＮＡと強くハイブリダイズすることが可能であり、ＤＮＡ及びＲＮＡのＡ形態の良好な模倣体である。類似するＤＮＡ−ＤＮＡ複合体と比較して、ＴＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の安定性が増大するため、ＴＮＡを、本発明の対立遺伝子特異的プライマー法において用いることによって、対立遺伝子多型のミスマッチ識別を改善することができる。
【０１４０】
[0188]他の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、トリアゾール連結されるＤＮＡ（ＴｚＤＮＡ）分子のうちの１又は複数を含む。ＴｚＤＮＡは、類似するＤＮＡプライマーと比較して、マッチしたそのＤＮＡ標的に対する熱安定性を増大させているので、ＴｚＤＮＡ対立遺伝子特異的プライマーを、対立遺伝子多型の識別を改善するための本発明の方法において用いることができる。
【０１４１】
[0189]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、テールを含む。場合によって、対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの全長を短縮することを可能とし、これにより、アッセイ感度に対する著しい影響を伴わずに、Ｔｍを低下させるテールを含む。場合によって、テールは、対立遺伝子特異的プライマーの５’末端に存在する。他の場合には、テールを、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分及び／又は対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の５’側に配置する。一部の実施形態では、テールが、対象の標的であるポリヌクレオチド配列と約６５〜７５％、約７５〜８５％、約８５〜９５％、約９５〜９９％、又は約１００％非相補的である。一部の実施形態では、テールが、約４〜３０、約５〜２５、約６〜２０、約７〜１５、又は約８〜１０ヌクレオチドの長さなど、約２〜４０ヌクレオチドの長さでありうる。一部の実施形態では、テールが、ＧＣに富む。例えば、一部の実施形態では、テール配列が、約５０〜１００％、約６０〜１００％、約７０〜１００％、約８０〜１００％、約９０〜１００％、又は約９５〜１００％のＧヌクレオチド及び／又はＣヌクレオチドを含む。
【０１４２】
[0190]対立遺伝子特異的プライマーのテールは、テール領域が、プライマーの伸長後に、プライマーの伸長産物内の相補的配列（存在する場合）とハイブリダイズすることが可能な立体配置が含まれるがこれに限定されない、多数の異なる様態で構成することができる。非限定的な例として述べると、対立遺伝子特異的プライマーのテールは、遺伝子座特異的プライマーの伸長から結果として生じる伸長産物内の相補的配列とハイブリダイズしうる。
【０１４３】
[0191]２つの対立遺伝子特異的プライマーを用いる実施形態では、第１の対立遺伝子特異的プライマーのテールと、第２の対立遺伝子特異的プライマーのテールとが、同じ配列を含むか、又は同じ配列である。
【０１４４】
Ｃ．対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
[0192]一部の実施形態では、本発明の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、第１の対立遺伝子とハイブリダイズし、第２の対立遺伝子（ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖａｒｉａｎｔ）の増幅に影響を及ぼすことなしに、とりわけ第１の対立遺伝子の増幅を効率的且つ選択的に阻害するようにデザインされる。本発明の一部の態様では、ブロッカープローブが、野生型対立遺伝子とハイブリダイズし、突然変異体対立遺伝子の増幅に影響を及ぼすことなしに、とりわけ野生型対立遺伝子の増幅を阻害するようにデザインされる。
【０１４５】
[0193]対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、一本鎖であり、長さが約１００ヌクレオチド以下、約５０ヌクレオチド以下、約３０ヌクレオチド以下、約２０ヌクレオチド以下、又は約５〜２０ヌクレオチドの、短いオリゴマーとしてデザインすることができる。
【０１４６】
[0194]一部の実施形態では、ブロッカープローブのＴｍが、５８℃〜７０℃、６１℃〜６９℃、６２℃〜６８℃、６３℃〜６７℃、６４℃〜６６℃、若しくは約６０℃〜約６３℃、又は任意の中間の範囲である。さらに他の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのＴｍが、増幅時に使用されるＰＣＲサイクリング条件内のアニール／伸長温度より約３℃〜６℃高い。
【０１４７】
[0195]一部の実施形態では、ブロッカープローブが、ＰＣＲ増幅時において切断されない。一部の実施形態では、ブロッカープローブが、それらの３’端において伸長不可能なブロッカー部分を含む。他の実施形態では、ブロッカープローブが、さらなる伸長不可能なブロッカー部分、消光剤部分、蛍光の部分などが含まれるがこれに限定されない他の部分を、それらの３’端、５’端、及び／又は任意の中間の内部位置においてさらに含む。他の特定の実施形態では、対立遺伝子位置を、それらの標的配列とハイブリダイズすると伸長不可能な対立遺伝子特異的ブロッカープローブのブロッカー部分から、約５〜１５など、約５〜１１、約６〜１０、約７〜９、約７〜１２、又は約９〜１１など、約６、約７、約８、約９、約１０、又は約１１ヌクレオチド隔てて配置される。一部の実施形態では、限定なしに述べると、伸長不可能なブロッカー部分には、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又はＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、副溝結合剤（ＭＧＢ）、アミン（ＮＨ２）、ビオチン、ＰＥＧ、ＰＯ４、及びこれらの混合物が含まれうる。本明細書で開示される通り、例えば、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の３’−ヘキサンジオール修飾など、伸長不可能なブロッカー部分の使用によって、対立遺伝子特異的ＰＣＲの特異性を増大させることができる。伸長不可能なブロッカー部分を対立遺伝子特異的ブロッカープローブへとコンジュゲートするのに適する方法は、当業者に知られている。例えば、Ｃ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、ヘキサンジオール）を含むブロッカー部分は、ホスホルアミダイト連結を介して、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端へとコンジュゲートすることができる。
【０１４８】
[0196]一部の態様では、ヘキサンジオール修飾を伴うブロッカープローブは、リン酸化を伴うブロッカープローブより良好に機能する。炭素鎖の柔軟性及び疎水性は、ブロッカーが、立体障害されることなく、その野生型の標的とハイブリダイズすることを可能とする。３’端のリン酸基は、野生型配列の標的に結合するが、効率は、リン酸基のバルク性及びイオン性の性質により減弱しうる。
【０１４９】
[0197]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。さらなる実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【０１５０】
[0198]一部の実施形態では、ブロッカープローブが、ＤＮＡポリメラーゼによる３’側伸長を阻止する３’側の連鎖停止剤である、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）部分を有する。
【０１５１】
[0199]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、自然発生の塩基（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシル）と異なる１又は複数の修飾核酸塩基又はヌクレオシド塩基を含みうる。一部の実施形態では、修飾塩基が、アデニン部分、グアニン部分、シトシン部分、ウラシル部分、又はチミン部分を含有する核酸単位と有効にハイブリダイズすることがやはり可能である。一部の実施形態では、（１又は複数の）修飾塩基によって、マッチした標的配列とミスマッチした標的配列とのＴｍ差を増大させ、及び／又はミスマッチプライミングの効率を低下させ、これによって、アッセイの特異性及び選択性を改善することができる。
【０１５２】
[0200]当業者によって、プローブのミスマッチ識別能は、マッチしたプローブ−標的二重鎖とミスマッチしたプローブ−標的二重鎖との融解温度差（ΔＴｍ）に依拠することが理解される。ミスマッチは、二重鎖に対してより大きな不安定化効果を及ぼすために、プローブサイズが減少する場合は、典型的にはΔＴｍは増大する。一般に、マッチした配列とミスマッチした配列との識別が良好な対立遺伝子特異的プローブほど、ΔＴｍ値も大きい。
【０１５３】
[0201]特定の実施形態では、本発明の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、少なくとも１つ、２つ以上の修飾塩基を含む。修飾塩基の非限定的な例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＡ（ｐｐＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＧ（ｐｐＧ）、２’−デオキシシュードイソシチジン（イソｄＣ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ｆｄＵ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）塩基、及びこれらの組合せが含まれる。好ましい実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブにおいて存在する修飾塩基が、１又は複数のＬＮＡ修飾を含む。特定の実施形態では、修飾塩基を、（ａ）３’端、（ｂ）５’端、（ｃ）内部位置、又は対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（ａ）、（ｂ）、若しくは（ｃ）の任意の組合せに配置する。一部の好ましい実施形態では、ＬＮＡヌクレオシドが、対立遺伝子多型を識別するのに用いられる核酸塩基を含むように、修飾塩基（例えば、ＬＮＡヌクレオシド）が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。
【０１５４】
[0202]一部の実施形態では、ブロッカープローブのＴｍが上昇するにつれて、ブロッカープローブの阻害効果が増大する。ブロッカー内のＬＮＡの位置に応じて、Ｔｍを１〜８℃上昇させることができる（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５４：３６０７〜３６３０（１９９８）、Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３９：５４０１〜５４０４（１９９８）、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、９：１１４７〜１１５０（１９９９）を参照されたい）。Ｔｍの高いブロッカーは、伸長時における野生型対立遺伝子へのアニーリングを維持し、これによって、効率的なＰＣＲ増幅を阻害しうる。二重鎖形成についての反応速度研究は、ＬＮＡを含有するＤＮＡ二重鎖の解離速度が、天然ＤＮＡの二重鎖の場合と比較して遅いことを示している。また、ＬＮＡの強固な構造が、そのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの相互作用に影響を及ぼすことも示されている。（Ｌａｒｏｔｔａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１７：２５３〜２５９（２００３））。
【０１５５】
[0203]本発明の一部の態様では、ブロッカープローブが、１又は複数のＬＮＡ修飾を保有しうる。一部の実施形態では、ＬＮＡを、ブロッカー配列の中央位置、端部から２番目の位置、５’端、ブロッカー配列の異なる区間、及び／又はこれらの組合せに配置する。一部の実施形態では、ＬＮＡが、野生型対立遺伝子（ｔｈｅ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｖａｒｉａｎｔ）と相補的な変異体ヌクレオチドに配置される。他の実施形態では、ブロッカープローブが、連続ＬＮＡを含有しない。
【０１５６】
[0204]２つの対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いる実施形態では、第１の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、第１の対立遺伝子特異的プライマーと同じ鎖又は配列に結合するのに対し、第２の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、第１の対立遺伝子特異的プライマーと逆鎖又は相補的配列に結合する。
【０１５７】
[0205]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブの両方が、ＬＮＡを含む。プライマー及びブロッカープローブの両方における修飾塩基の存在は、本発明のアッセイの特異性を増強する。二重鎖形成についての反応速度研究では、ＬＮＡを含有する複合体の解離速度が遅いのは、天然ＤＮＡのハイブリダイゼーション能と比較したそのハイブリダイゼーション能の差違に起因することが示されている。ＬＮＡ分子の強固な構造であれば、それがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと相互作用する様態を変化させうるであろう（Ｌａｒｏｔｔａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、１７：２５３〜２５９（２００３））。
【０１５８】
Ｄ．検出用プローブ
[0206]一部の態様では、本発明の方法が、融解温度が高くて長さが短い検出用プローブの使用を要求する。Ｔｍが高くて長さが短いプローブは、良好な対立遺伝子の識別、とりわけ、Ｇ→Ａ又はＧ→Ｔなどの困難な突然変異を取り扱う場合に必要である。検出用プローブの例には、副溝結合（ＭＧＢ）プローブ、Ｚｅｎプローブ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）プローブ、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブが含まれるがこれらに限定されない。
【０１５９】
[0207]一部の実施形態では、検出用プローブが、約１６、約１８、約２２、約２４、約３０、又は中間の任意の数のヌクレオチドなど、約１５〜３０ヌクレオチドの範囲の短いオリゴマーとしてデザインされる。一部の実施形態では、検出用プローブのＴｍが、約６０℃〜７０℃、約６１℃〜６９℃、約６２℃〜６８℃、約６３℃〜６７℃、約６４℃〜６６℃、又は任意の中間の温度の範囲である。
【０１６０】
[0208]一部の実施形態では、検出用プローブが、遺伝子座特異的検出用プローブ（ＬＳＴ）である。他の実施形態では、検出用プローブが、５’ヌクレアーゼプローブである。一部の実施形態では、検出用プローブが、ＭＧＢ部分、レポーター部分（例えば、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）、又はサイバー（登録商標）グリーン）、消光剤部分（例えば、ブラックホールクエンチャー（商標）又はＴＡＭＲＡ（商標））、及び／又はパッシブリファレンス（例えば、ＲＯＸ（商標））を含みうる。一部の例示的な実施形態では、検出用プローブが、その開示が参照によってその全体において全ての目的で本明細書に組み込まれる米国特許第６，７２７，３５６号において記載される方法及び原理に従ってデザインされる。
【０１６１】
[0209]特定の実施形態では、検出用プローブが、タックマン（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）である。タックマンプローブは、このプローブが、その相補的ＤＮＡ標的と共に超安定化された二重鎖を形成する一助となるように、ＭＧＢリガンドと共にデザインする（例えば、Ａｆｏｎｉｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２５：２６５７〜２６６０（１９９７）を参照されたい）。二重鎖の安定性の増大は、Ｔｍの上昇と関連する。例えば、ＭＧＢを伴う１２マーのタックマンプローブのＴｍ（６５℃）は、ＭＧＢを伴わない２７マーのＤＮＡプローブのＴｍ（６６℃）とほぼ同一である。短いプローブを伴うＭＧＢは、プローブ全体の安定性により大きく寄与することが示されている。３’−ＭＧＢ  ＤＮＡプローブは、ＰＣＲサイクリング時における配列特異性を増大させることが示されている（Ｋｕｔｙａｖｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２８：６５５〜６６１（２０００））。本発明のＭＧＢプローブは、対立遺伝子多型に特異的であるか、対立遺伝子多型に近いか、又は対立遺伝子多型から隔たったゲノム配列を検出するようにデザインする。例えば、ＭＧＢプローブによって、対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いるＰＣＲサイクリングによって生成させた増幅産物の３’端を検出することができる。
【０１６２】
[0210]他の実施形態では、検出用プローブが、Ｚｅｎプローブ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）である。ＺＥＮ二重消光プローブが、オリゴヌクレオチドプローブ、５’ＦＡＭフルオロフォア、３’ＩＢＦｑ消光剤、及び内部ＺＥＮ消光剤を含む。ＺＥＮ消光剤は、バックグラウンドを低下させ、従来の色素−消光剤プローブ（例えば、５’ＦＡＭ−３’ＴＡＭＲＡ、５’ＦＡＭ−３’ＩＢＦＱ、５’ＦＡＭ−３’エクリプス、５’ＦＡＭ−３’ＢＨＱ１と比較して高度なシグナルを発生させる。内部ＺＥＮ消光剤は、色素と消光剤との間の長さをわずか９塩基対へと短縮し、これにより、バックグラウンドの蛍光が著しく低減され、より完全な消光がもたらされる。終点シグナルが増大し、Ｃｔ（閾値サイクル；閾値を上回ると蛍光が増大するサイクル数の比）値が低減されるにつれて、ＺＥＮプローブの感度が増大する。
【０１６３】
[0211]さらに他の実施形態では、検出用プローブが、１又は複数のジップ核酸（ＺＮＡ）修飾及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含む。ＺＮＡプローブのカチオン電荷の安定性が増大するために、本発明の方法は、短い二重標識されたＺＮＡプローブを含みうる。ＺＮＡプローブは、標準的な検出用プローブを超えて、標的認識の増強、感度の増大、高度な特異性、及びＴｍの上昇を示す。別の実施形態では、検出用プローブが、ＰＮＡプローブである。ＰＮＡ修飾によって、単一塩基レベルにおける高レベルの識別がもたらされるために、本発明の短いＰＮＡプローブは、高度な特異性をもたらしうる。
【０１６４】
[0212]一部の実施形態では、検出用プローブに、２つ〜６つのＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、ＺＮＡ、又はリボース修飾核酸を含む修飾塩基又は核酸類似体を伴うオリゴヌクレオチドを用いる。これらの修飾塩基は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡに対する熱安定性を呈示し、これによって、本発明の方法における優れたミスマッチ識別が可能となる。
【０１６５】
[0213]他の実施形態では、遺伝子座特異的検出用プローブが、その開示が参照によりその全体において全ての目的で本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７２７，３５６号において記載される原理及び方法に従ってデザインされる。例えば、蛍光発生プローブは、一本鎖ＤＮＡの３’末端における消光剤及び５’末端におけるフルオロフォアにより調製することができる。このような例では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡ鎖を切断し、これにより、フルオロフォアを消光剤から分離し、蛍光シグナルを発光させることができる。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅のプライマーの伸長ステップにおいて、検出用プローブを鋳型鎖とハイブリダイズさせる（例えば、６０℃〜６５℃で）。他の実施形態では、ＭＧＢを、遺伝子座特異的検出用プローブの消光剤部分と共有結合的に接合させる（例えば、リンカーを介して）。
【０１６６】
[0214]２つの検出用プローブを用いる実施形態では、第１の検出用プローブと第２の検出用プローブとが同じであるか、及び／又は同じ配列を含むか、又は同じ配列である。
【０１６７】
Ｅ．遺伝子座特異的プライマー
[0215]一部の実施形態では、遺伝子座特異的プライマーを、約１６、約１８、約２２、約２４、約３０、又は中間の任意の数のヌクレオチドなど、約１５〜３０ヌクレオチドの範囲の短いオリゴマーとしてデザインする。一部の実施形態では、遺伝子座特異的プライマーのＴｍが、約６０℃〜７０℃、約６１℃〜６９℃、約６２℃〜６８℃、約６３℃〜６７℃、若しくは約６４℃〜６６℃、又は任意の中間の範囲にわたる。
【０１６８】
[0216]２つの遺伝子座特異的プライマーを用いる実施形態では、第１の遺伝子座特異的プライマー及び／又は第２の遺伝子座特異的プライマーが、同じ配列を含むか、又は同じ配列である。
【０１６９】
Ｆ．さらなる構成要素
[0217]当技術分野では、本発明を実施するのに適するポリメラーゼ酵素がよく知られており、多数の供給源に由来しうる。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、市販されている（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．から）多様な好熱性細菌から、当業者によく知られている方法を用いて得ることができる。例えば、米国特許第６，２４５，５３３号を参照されたい。細菌細胞は、当業者によく知られている特定の種の活性培養物を増殖させるのに適する培養培地及びインキュベーション条件を用いる標準的な微生物学法に従って増殖させることができる。例えば、Ｂｒｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．、９８（ｌ）：２８９〜２９７（１９６９）；Ｏｓｈｉｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２４（１）：１０２−ｌ１２（１９７４）を参照されたい。熱安定性ポリメラーゼの供給源としての使用に適するのは、好熱性細菌であるテルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコックス・ウォーシイー（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ）、及びピロコックス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の他の種、バチルス・ストレアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スルホロブス・アチドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、テルモプラズマ・アチドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、テルムス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、テルムス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、テルムス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、テルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）及びテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の他の種、並びにメタノバクテリウム・テルモアウトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、並びにこれらの種の各々の突然変異体である。好ましい熱安定性ポリメラーゼには、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらの突然変異体、誘導体、若しくは断片が含まれうるがこれらに限定されない。
【０１７０】
Ｇ．対立遺伝子多型の定量化
[0218]特定の態様では、核酸試料中の標的配列の対立遺伝子多型を定量化する方法が、対立遺伝子多型について陽性の細胞株から確立された検量線を用いて、試料中に存在する対立遺伝子多型の量及び／又は百分率を決定するステップを含む。特定の実施形態では、試料中に存在するＤＮＡの量（例えば、対立遺伝子多型を保有する核酸の量）を、Ｃｔ値を用いる検量線から計算する（例えば、ナノグラム（ｎｇ）又は他の任意の重量単位で）。場合によって、検量線が、対立遺伝子多型について１００％の突然変異を保有する細胞株に基づく。他の場合には、検量線に由来するＤＮＡの量（例えば、試料中の対立遺伝子多型を保有する核酸の量）を、細胞株に基づく対立遺伝子多型の突然変異パーセントへと変換する。
【０１７１】
[0219]本発明のアッセイは、高度な選択性を有し、希少な変異体対立遺伝子を野生型対立遺伝子から差別化し、定量化しうる。アッセイによるデータはまた、直線状でもあり、対立遺伝子多型の定量的情報を導出する、例えば、試料中に存在する対立遺伝子多型の量又は百分率を検出、決定、又は計算するのに用いることができる。
【０１７２】
[0220]一部の態様では、対立遺伝子（ｔｈｅ  ｖａｒｉａｎｔ）について陽性の細胞株に由来する対立遺伝子多型についての検量線を作成する。一部の実施形態では、以下の陽性細胞株に由来するＫＲＡＳ対立遺伝子多型：ＳＷ１１１６細胞株に由来するＧ１２Ａ；ＮＣＩ−Ｈ２３細胞株に由来するＧ１２Ｃ；ＬＳ  １７４Ｔ細胞株に由来するＧ１２Ｄ；ＰＳＮ１細胞株に由来するＧ１２Ｒ；Ａ  ５４９細胞株に由来するＧ１２Ｓ；ＳＷ  ４０３細胞株に由来するＧ１２Ｖ；Ｈ  １７３４細胞株に由来するＧ１３Ｃ；Ｔ  ８４細胞株に由来するＧ１３Ｄ；及び／又はＨ  ４６０細胞株に由来するＱ６１Ｈについての検量線を作成する。他の実施形態では、以下の陽性細胞株に由来するＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型：ＳＷ９４８細胞株に由来するＥ５４２Ｋ；Ｓｕｐ  Ｔ１細胞株に由来するＥ５４５Ｄ；ＭＣＦ  ７細胞株に由来するＥ５４５Ｋ；及び／又はＫＰＬ４細胞株に由来するＨ１０４７Ｒについての検量線を作成する。さらに他の実施形態では、以下の陽性細胞株に由来するＥＧＦＲ対立遺伝子多型：Ｈ１９７５細胞株に由来するＴ７９０Ｍ及びＬ８５８Ｒ、並びに／又はＨ１６５０細胞株に由来するＥ７４６−Ａ７５０欠失（Ｅ７４６  ｄｅｌ）についての検量線を作成する。さらに他の実施形態では、ＨＴ  ２９細胞株に由来するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体についての検量線を作成する。場合によって、陽性細胞株に由来するＤＮＡ（例えば、１００、１０、１、０．１、及び／又は０．０１ｎｇ）の希釈系列に対して本発明のアッセイを実施することから検量線を創出する。
【０１７３】
[0221]他の態様では、核酸試料中の標的配列の対立遺伝子多型を定量化する方法が、試料中に存在する対立遺伝子多型の量及び／又は百分率を、対立遺伝子多型について陽性の細胞株から確立された検量線に基づく演算子を用いて決定するステップを含む。特定の実施形態では、対立遺伝子多型に特異的な突然変異パーセント演算子を、対立遺伝子多型の検量線から確立する。演算子を用いて、核酸試料中の突然変異の量を、本発明の方法から得られるＣｔ値から計算することができる。場合によって、対立遺伝子多型の突然変異パーセントを、陽性細胞株の突然変異パーセントは、対立遺伝子多型について１００％であるという仮定に基づき計算することもできる。
【０１７４】
[0222]特定の実施形態では、試料中に存在する対立遺伝子多型の量又は百分率を、本明細書で記載される遺伝子型決定アッセイを、試料から得られる核酸に対して実施する場合に得られるＣｔ値を決定することによって定量化することができる。対立遺伝子多型についての検量線は、対立遺伝子多型について陽性の細胞株に由来する核酸試料の希釈系列に対して、本明細書で記載される遺伝子型決定アッセイを実施することによって作成することができる。次いで、検量線を用いて、陽性対照（例えば、細胞株）試料中に存在する特異的な核酸の量についてのＣｔ値を決定することができる。検量線はまた、陽性対照試料について得られるＣｔ値を、陽性対照反応１回当たりのＤＮＡ量の関数としてプロットする場合の直線の傾き及び／又は直線の切片の値を決定するのにも用いることができる。
【０１７５】
[0223]図３２〜３５は、検量線及び／又は増幅曲線から得られる情報に基づき、試料中に存在する対立遺伝子多型の量及びパーセント（例えば、突然変異パーセント）を定量化するための検量線プロット（例えば、陽性対照試料について）、増幅曲線（例えば、未知の（被験）試料及び陽性対照試料についての）、及び演算子の非限定的な例を提示する。特定の実施形態では、突然変異パーセントを、試料中の出発核酸の量（例えば、ＤＮＡ）に対する突然変異の量から計算する。試料中の出発核酸の量（例えば、ＤＮＡ）は、ｌｏｇ１０値（例えば、ナノグラム単位の）として表すことができる。他の実施形態では、演算子により、本明細書で記載される遺伝子型決定アッセイを用いて作成した検量線及び／又は増幅曲線から得られるＣｔ値、直線の傾きの値、及び／又は直線の切片の値などの情報に基づき、試料中に存在する対立遺伝子多型の量及び／又はパーセント（例えば、突然変異パーセント）を定量化する。さらなる実施形態では、未知の（被験）試料中に存在する対立遺伝子多型について計算される突然変異パーセントが、陽性対照と比べた（例えば、対立遺伝子多型について突然変異パーセントが１００％の陽性細胞株と比較した）突然変異パーセントである。
【０１７６】
ＩＶ．例示的な実施形態
[0224]一態様では、本発明は、標的配列の少なくとも第２の対立遺伝子多型を有することが疑われる核酸試料中で、標的配列の第１の対立遺伝子多型を検出又は定量化するための方法であって、
（ａ）（ｉ）核酸試料、
（ｉｉ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであり、少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的プライマー、
（ｉｉｉ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであり、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、
（ｉｖ）検出用プローブ、及び
（ｖ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー
を組み合わせることによって反応混合物を形成するステップと、
（ｂ）遺伝子座特異的プライマー及び対立遺伝子特異的プライマーを用いて反応混合物に対して増幅反応を実行して単位複製配列を形成するステップと、
（ｃ）検出用プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって単位複製配列を検出し、これによって、核酸試料中の標的遺伝子の第１の対立遺伝子多型を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０１７７】
[0225]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的プライマーの５’端、及び／又は対立遺伝子特異的プライマーの３’端の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７８】
[0226]他の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分及び／又は内部位置に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。場合によって、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７９】
[0227]一部の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む。特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む。
【０１８０】
[0228]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。さらなる実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【０１８１】
[0229]一部の実施形態では、検出用プローブが、タックマン（登録商標）プローブを含む。特定の実施形態では、核酸試料が、血液、血清、血漿、微細針吸引物、腫瘍組織、及びこれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態では、第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である。特定の実施形態では、方法が、増幅反応の間の第２の対立遺伝子多型のバックグラウンドシグナルを低減する。
【０１８２】
[0230]特定の実施形態では、標的遺伝子の第１の対立遺伝子多型を、閾値サイクル又はＣｔ値を決定することにより定量化することができるが、この場合、検出用プローブの検出可能な特性の変化が、初めてバックグラウンドレベルを上回って検出可能となる。一部の実施形態では、第１の対立遺伝子多型についての検量線を、本発明の方法を対立遺伝子多型について陽性の細胞株に由来する核酸試料の希釈系列に対して実施することにより作成することができる。場合によって、第１の対立遺伝子多型を、試料について得られるＣｔ値を、検量線によるＣｔ値と比較することにより定量化する。詳細な実施形態では、検量線を用いて、対立遺伝子多型について陽性の細胞株に由来する核酸試料の希釈系列に対して本発明の方法を実施することにより得られる１又は複数のＣｔ値（例えば、陽性対照試料中の出発核酸の量と比べて）、直線の傾きの値、及び／又は直線の切片の値を決定する。他の実施形態では、以下：試料中の出発核酸の量（例えば、ｎｇ単位又は他の任意の重量単位のｌｏｇ１０値として表しうる反応１回当たりのＤＮＡ量）；Ｃｔ値；直線の傾きの値（例えば、検量線による）；直線の切片の値（例えば、検量線による）；及びこれらの組合せのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つに基づき、試料中に存在する第１の対立遺伝子多型の量及び／又はパーセント（例えば、突然変異パーセント）を計算する。
【０１８３】
[0231]別の態様では、本発明は、
（ａ）核酸分子、
（ｂ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的プライマー、
（ｃ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
（ｄ）検出用プローブ、並びに
（ｅ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマー
を含む反応混合物を提供する。
【０１８４】
[0232]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的プライマーの５’端、及び／又は対立遺伝子特異的プライマーの３’端の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１８５】
[0233]他の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分及び／又は内部位置に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。場合によって、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１８６】
[0234]一部の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む。特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む。
【０１８７】
[0235]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。さらなる実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【０１８８】
[0236]一部の実施形態では、検出用プローブが、タックマン（登録商標）プローブを含む。特定の実施形態では、核酸分子が、血液、血清、血漿、微細針吸引物、腫瘍組織、及びこれらの組合せからなる群から選択される試料から得られる。他の実施形態では、第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である。
【０１８９】
[0237]さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的プライマー、並びに
（ｂ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
を含む組成物を提供する。
【０１９０】
[0238]一部の実施形態では、組成物が、（ｃ）検出用プローブ；並びに／又は（ｄ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマーをさらに含む。
【０１９１】
[0239]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的プライマーの５’端、及び／又は対立遺伝子特異的プライマーの３’端の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１９２】
[0240]他の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分及び／又は内部位置に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。場合によって、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１９３】
[0241]一部の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む。特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む。
【０１９４】
[0242]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。さらなる実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【０１９５】
[0243]さらなる実施形態では、第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である。
【０１９６】
[0244]別の態様では、本発明は、２つ以上の容器のうちの１つに独立に分配された以下の構成要素
（ａ）対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第１の対立遺伝子多型と相補的である対立遺伝子特異的プライマーであって、少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的プライマー、並びに
（ｂ）第２の対立遺伝子多型を含む標的配列の領域と相補的な対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、伸長不可能なブロッカー部分及び少なくとも１つの核酸修飾（例えば、１又は複数の核酸修飾）を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
を含む２つ以上の容器を含むキットを提供する。
【０１９７】
[0245]一部の実施形態では、キットが、（ｃ）検出用プローブ；並びに／又は（ｄ）第１の対立遺伝子多型の３’側にあり、逆鎖に存在する、標的配列の領域と相補的な遺伝子座特異的プライマーをさらに含む。
【０１９８】
[0246]一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的プライマーの５’端、及び／又は対立遺伝子特異的プライマーの３’端の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１９９】
[0247]他の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分及び／又は内部位置に配置される。特定の実施形態では、対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、２つ以上の不連続核酸修飾を含む。場合によって、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（１又は複数の）核酸修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、トリアゾール核酸（ＴｚＮＡ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０２００】
[0248]一部の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ポリメラーゼによる３’端へのさらなる塩基の付加を阻止する、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの３’端への修飾を含む。特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオール、及びこれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、対立遺伝子特異的ブロッカープローブへの３’−ヘキサンジオール修飾を含む。
【０２０１】
[0249]特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、副溝結合剤（ＭＧＢ）を含まないか、又はこれらを包含しない。他の特定の実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、ＰＯ４基を含まないか、又はこれらを包含しない。さらなる実施形態では、伸長不可能なブロッカー部分が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキルジオール（例えば、３’−ヘキサンジオール修飾）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルケニルジオール、又は置換されていてもよいＣ２〜Ｃ２４アルキニルジオールから本質的になるか、又はこれらからなる。
【０２０２】
[0250]一部の実施形態では、第１の対立遺伝子多型が、突然変異体対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多型が、野生型対立遺伝子である。他の実施形態では、キットが、標的配列の第２の対立遺伝子多型を有することが疑われる核酸試料中で、標的配列の第１の対立遺伝子多型を検出又は定量化するための、対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブの使用のための指示書をさらに含む。
【実施例】
【０２０３】
[0251]本発明を、特定の例によりいっそう詳細に記載する。以下の実施例は、例示を目的として示されるものであり、いかなる形であれ、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変化させるか又は改変しうる多様なそれほど重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【０２０４】
実施例１  体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ法
[0252]図１は、本発明の体細胞突然変異検出アッセイの一実施形態を描示する。血液試料又は微細針吸引物（ＦＮＡ）試料などの試料において各一塩基多型（ＳＮＰ）を解析するために、対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いる。対立遺伝子特異的プライマーが、３’端において変異体（例えば、突然変異体）対立遺伝子に特異的なロックド核酸（ＬＮＡ）を含みうるのに対し、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、３’端においてヘキサンジオールブロッカー部分を含み、野生型対立遺伝子に特異的なブロッカー部分（例えば、オリゴヌクレオチド配列の中央部における）の５’側の約５〜１５ヌクレオチドの間の位置にＬＮＡを含みうる。
【０２０５】
[0253]本発明のアッセイ方法は、ＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲインストゥルメント上で実施することができるが、当業者に知られる任意の種類のリアルタイムＰＣＲ装置を用いることができる。例示的な反応条件には、以下：段階１：９５．０℃で１０：００分間；段階２：反復：４０回、９５．０℃で０：２０分間、及び６０．０℃で０：４５分間が含まれる。
【０２０６】
[0254]図１に描示する通り、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ（例えば、「ブロッカーＬＮＡヘキサンジオールオリゴヌクレオチド」）の、野生型対立遺伝子とのハイブリダイゼーションが、野生型対立遺伝子の増幅を阻止するのに対し、対立遺伝子特異的プライマー（例えば、「対立遺伝子特異的ＬＮＡプライマー」）の、突然変異体対立遺伝子とのハイブリダイゼーションは、突然変異体対立遺伝子が高感度及び低バックグラウンドで選択的に増幅されることを可能とする。特定の実施形態では、ＬＮＡヌクレオシドの使用によって、シグナル対ノイズ比が改善され、野生型のバックグラウンドシグナルが実質的に低減される。
【０２０７】
実施例２  ＳＮＰを検出するための例示的な体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ
[0255]本実施例は、修飾塩基を含有する対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブの使用によって、対立遺伝子多型の識別が改善されることを例示する。
【０２０８】
[0256]特に、図２は、３’端におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｓ  ＡＳＰ−ＬＮＡ」における「＋Ａ」）を含む対立遺伝子特異的プライマー、並びにオリゴヌクレオチド配列の中央部におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｓブロッカー−ＬＮＡ」における「＋Ｇ」）及び３’−ヘキサンジオール修飾（「Ｇ１２Ｓブロッカー−ＬＮＡ」における「Ｃ６」）を含む対立遺伝子特異的ブロッカープローブの使用によって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ多型部位における対立遺伝子多型の識別が改善されることを示す。ＬＮＡ修飾を伴わない対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いて実施された対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲは、突然変異体対立遺伝子について陰性の細胞株（すなわち、Ｈ１９７５細胞株、Ｈ１９９３細胞株、Ｕ８７ＭＧ細胞株、Ａ３７５細胞株、ＰＣ３細胞株、Ａ４３１ＮＳ細胞株、＃２８細胞株、及び＃２９細胞株）の８つ全てにおいて、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ突然変異体対立遺伝子の存在の検出が不正確であった。これに対し、ＬＮＡ修飾及びヘキサンジオール修飾を含む本発明の対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いて実施された対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲは、これらの細胞株を、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ突然変異について陰性として正確に同定した。ＬＮＡ修飾を伴わない対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ  陽性Ａ５４９細胞株におけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ突然変異を同定したが、ΔＣｔ値は９（＃２９についての「Ｃｔ」値を、Ａ５４９についての「Ｃｔ」値と対比して比較されたい）であり、これは、観察される本明細書で記載されるＬＮＡ修飾及びヘキサンジオール修飾を伴うプライマー及びプローブのΔＣｔ値である１２より著しく低かった。特定の理論に束縛されることなしに述べると、ΔＣｔ値の増大は、ＰＣＲ時における対立遺伝子多型の識別の改善を示す。加えて、本発明の修飾プライマー及び修飾プローブの使用によって、多量の野生型対立遺伝子を含有する試料中であっても、野生型のバックグラウンドシグナルが実質的に低減される。
【０２０９】
[0257]同様に、図３は、３’端におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｒ  ＡＳＰ−ＬＮＡ」における「＋Ｃ」）を含む対立遺伝子特異的プライマー、並びにオリゴヌクレオチド配列の中央部におけるＬＮＡ修飾（「Ｇ１２Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「＋Ｇ」）を含む対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び３’−ヘキサンジオール修飾（「Ｇ１２Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「Ｃ６」）の使用によって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ多型部位における対立遺伝子多型の識別が改善されることを示す。ＬＮＡ修飾を伴わない対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いて実施された対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲは、突然変異体対立遺伝子について陰性の細胞株のうちのいくつかにおいて、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ突然変異体対立遺伝子の存在の検出が不正確であった。これに対し、ＬＮＡ修飾及びヘキサンジオール修飾を含む本発明の対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いて実施された対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲは、これらの細胞株の全てを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ突然変異について陰性として正確に同定した。
【０２１０】
[0258]同様に、図４は、３’端におけるＬＮＡ修飾（「Ｈ１０４７Ｒ  ＡＳＰ−ＬＮＡ」における「＋Ｇ」）を含む対立遺伝子特異的プライマー、並びにオリゴヌクレオチド配列の中央部におけるＬＮＡ修飾（「Ｈ１０４７Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「＋Ａ」）を含む対立遺伝子特異的ブロッカープローブ及び３’−ヘキサンジオール修飾（「Ｈ１０４７Ｒブロッカー−ＬＮＡ」における「Ｃ６」）の使用によって、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ多型部位における対立遺伝子多型の識別が改善されることを示す。ＬＮＡ修飾を伴わない対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブは、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ陽性ＫＰＬ４細胞株におけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ突然変異を同定した。しかし、本発明のＬＮＡ修飾及びヘキサンジオール修飾を施されたプライマー及びプローブの使用は、ＬＮＡ修飾を伴わないＰＣＲについて約４〜６のΔＣｔ値の、ＬＮＡ修飾を伴うＰＣＲについて１０を超えるΔＣｔ値との比較に基づき、ΔＣｔ値を実質的に増大させた（ここで、ΔＣｔ値は、ＫＰＬ４細胞株のＣｔ値を、Ｈ１９７５細胞株、Ｈ１９９３細胞株、Ｕ８７ＭＧ細胞株、Ａ３７５細胞株、ＰＣ３細胞株、Ａ４３１ＮＳ細胞株、＃２８細胞株、又は＃２９細胞株のうちのいずれかのＣｔ値から減じることによって計算した）。本明細書で論じられる通り、ΔＣｔ値の増大は、ＰＣＲ時における対立遺伝子多型の識別の改善を示す。加えて、本発明の修飾プライマー及び修飾プローブの使用によって、多量の野生型対立遺伝子を含有する試料中であっても、野生型のバックグラウンドシグナルが実質的に低減される。
【０２１１】
[0259]図５及び６は、本発明のＬＮＡで修飾された対立遺伝子特異的プライマー及びプローブを用いる、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ多型部位及びＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ多型部位のそれぞれにおける対立遺伝子多型の識別の改善の例を例示する。ＬＮＡ修飾を伴わない対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いて実施された対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲは、突然変異体対立遺伝子について陰性の細胞株（すなわち、Ｈ１９９３細胞株、Ｕ８７ＭＧ細胞株、Ａ３７５細胞株、ＰＣ３細胞株、＃２９細胞株、＃３１細胞株、及び＃３２細胞株）の７つ全てにおいて、ＥＧＦＲ突然変異の両方の存在の検出が不正確であった。これに対し、ＬＮＡ修飾及びヘキサンジオール修飾を含む本発明の対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブを用いて実施された対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲは、これらの細胞株の７つ全てを、ＥＧＦＲ突然変異の両方について陰性と正確に同定し、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ陽性Ｈ１９７５細胞株及びＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ陽性Ｈ１９７５細胞株を、突然変異体対立遺伝子の両方を含有すると正確に同定した。
【０２１２】
[0260]図７は、全血液に由来する豊富な量の野生型ＤＮＡの、Ｈ１０４７Ｒ陽性ＫＰＬ４細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異体対立遺伝子など、対象の突然変異体対立遺伝子の検出の干渉に対する作用を例示する。図８は、全血液に由来する豊富な量の野生型ＤＮＡの、Ｇ１２Ｒ陽性ＰＳＮ１細胞におけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ変異体対立遺伝子など、対象の突然変異体対立遺伝子の検出の干渉に対する作用を例示する。図８において示される通り、スパイクされた全血液試料中の、１００個という低量（全血液カウントのうちの０．０１％を表す）のＧ１２Ｒ陽性ＰＳＮ１細胞でも、Ｇ１２Ｒシグナルはやはり検出可能である。
【０２１３】
実施例３  体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ法による結腸直腸がん試料のスクリーニング
[0261]本実施例は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異体対立遺伝子の存在についての、結腸直腸がん（ＣＲＣ）組織試料のスクリーニングであって、ＬＮＡ修飾を含めた修飾塩基を含有する本発明の対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いるスクリーニングを例示する。
【０２１４】
[0262]図９は、１５０例のＣＲＣ組織試料のスクリーニングによって、陰性試料からの干渉は観察されず、弱いシグナルの検出を滴定によって検証しうることが明示されたことを示す。Ｈ１０４７Ｒ陽性試料＃５３２及び＃５２８は、滴定によって検証されたが、Ｈ１０４７Ｒ陰性試料＃９４、＃９５、及び＃９６のＨ１０４７Ｒ変異体対立遺伝子レベルは、全ての被験濃度において検出不能であった。
【０２１５】
[0263]まとめると、本実施例は、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイが高感度であり、極めて特異的であり、高度に選択的であり、且つ頑健であり、臨床試料を調べて、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＥＧＦＲなどの遺伝子中の対立遺伝子多型を検出及び／又は定量化するのに用いうることを裏付ける。
【０２１６】
実施例４  体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ法の、スコルピオンアッセイ及びビーミングアッセイとの比較
[0264]本実施例は、量を変化させたＳＷ１１１６（Ｇ１２Ａ陽性）細胞でスパイクされた全血液におけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａの検出についての、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイと、Ｑｉａｇｅｎ製のスコルピオンアッセイ又はＩｎｏｓｔｉｃｓ製のビーミングアッセイとの比較を例示する。
【０２１７】
[0265]図１０は、ＳＷ１１１６（Ｇ１２Ａ陽性）細胞の希釈系列でスパイクされた全血液の混合物中の、ＤｘＳ／Ｑｉａｇｅｎ製のスコルピオンアッセイは、１０００個の細胞を検出しうるに過ぎないことを示す。１００個の細胞では感度が低下する。これに対し、本発明の遺伝子型決定アッセイ（「本発明のアッセイ」）を用いれば、全血液混合物中の、１０〜１００個という低量のＳＷ１１１６陽性細胞でも、Ｇ１２Ａシグナルはやはり検出可能である。１００個の細胞とは、全血液カウントのうちの０．０１％を表す。１０００個の細胞の場合でも、ＤｘＳ／Ｑｉａｇｅｎ製のスコルピオンアッセイでは、Ｃｔ曲線が厳密ではなかった。
【０２１８】
[0266]図１１は、全血液（ＷＢ）中に１０、５０、１００、２５０、及び５００個の細胞でスパイクされたＫＰＬ４（Ｈ１０４７Ｒ）細胞、Ａ５４９（Ｇ１２Ｓ）細胞、及びＰＳＮ１（Ｇ１２Ｒ）細胞の希釈系列を示す。注目すべきは、Ｉｎｏｓｔｉｃｓ製のビーミングアッセイが、不正確な判定を下し、突然変異体試料１５例中１４例を野生型の試料として同定したことである。実際、Ｉｎｏｓｔｉｃｓ製のアッセイが突然変異を検出したのは、全血液中に１０００個の細胞が存在する場合に過ぎず、５００個以下の細胞では感度を提示しなかった。これに対し、図１２は、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ（「本発明のアッセイ」）には、ＷＢ混合物中に５０〜１００個という低量の陽性細胞によるシグナルも検出可能であったことを示す。１００個の細胞とは、全血液カウントのうちの０．０１％を表す。
【０２１９】
[0267]まとめると、本実施例は、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイによって、対立遺伝子ＰＣＲアッセイが、Ｑｉａｇｅｎ製のスコルピオンアッセイ及びＩｎｏｓｔｉｃｓ製のビーミングアッセイと比較して劇的に改善されることを裏付ける。特に、弱いシグナルは、滴定によって検証することができ、本発明のアッセイによって、豊富なレベルの野生型対立遺伝子を伴うバックグラウンドの全血液中に０．０１％という低量の、突然変異体対立遺伝子を伴う細胞を検出することができる。したがって、本明細書で記載される方法は、全血液などの試料中で、スコルピオンアッセイ及びビーミングアッセイを凌駕する。
【０２２０】
実施例５  核酸修飾を用いる体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ法
[0268]本実施例は、本発明の体細胞突然変異検出アッセイの複数の実施形態を例示する。本実施例には、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイを、本発明の方法を例示するための例示的なアッセイとして選択した。特に、本明細書で記載される実験は、アッセイの以下の構成要素（１）ＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマー、及びＬＮＡを伴わない対立遺伝子特異的プライマー、（２）ブロッカープローブにおける３’端修飾、（３）Ｔｍが異なるブロッカープローブ、（４）ＬＮＡを伴うブロッカープローブ、及びＬＮＡを伴わないブロッカープローブ、並びに（５）ＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブの組合せ、並びにＬＮＡを伴わない対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブの組合せに取り組む。
【０２２１】
[0269]本実施例において記載される方法は、遺伝子座特異的プライマー、対立遺伝子特異的プライマー、ブロッカープローブ、及び検出用プローブと組み合わせたリアルタイムの対立遺伝子特異的ＰＣＲに基づく。方法は、突然変異体対立遺伝子の存在を野生型の対立遺伝子から差別化して定量化するのに高度に選択的であり高感度であるようにデザインした。特に、例示的なアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）製のＧＴエクスプレス（ＧＴＸｐｒｅｓｓ）（商標）マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）を用いて実施した。リアルタイムＰＣＲ反応には、以下のサイクリング条件：段階１：９５．０℃で１０：００分間、並びに段階２：反復：４０回、９５．０℃で０：２０分間、及び６０．０℃で０：４５分間を用いた。
【０２２２】
[0270]実験１は、ＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマーを含む本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイが、突然変異体対立遺伝子を高度な選択性及び感度で増幅するのに成功したことを示す。本発明の本実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの変異体ヌクレオチド（Ｔ）がロックド核酸（ＬＮＡ）であり、このプライマーの３’端に配置した。ブロッカープローブは、３’端にＬＮＡ修飾及びヘキサンジオール修飾を有した。検出用プローブは、タックマンプローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。リアルタイムＰＣＲアッセイの結果は、ブロッカープローブが、野生型対立遺伝子とハイブリダイズし、その増幅をブロッキングしたことを示す（図１３）。加えて、突然変異体対立遺伝子は、アッセイによって高感度で選択的に増幅された（図１３）。
【０２２３】
[0271]実験２は、本発明のＳＮＰ遺伝子型決定アッセイによって、対立遺伝子特異的プライマーが、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む場合、対立遺伝子の識別のための選択性及び感度が改善されたことを示す。図１４は、対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブにおいてＬＮＡを伴わないＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイが、陽性対照（突然変異体対立遺伝子）試料及び陰性対照（野生型対立遺伝子）試料から増幅産物を生成させたことを示す。本発明の本実施形態は、対立遺伝子多型に十分な選択性を示さなかった。しかし、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイによる対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブにおけるＬＮＡ修飾は、陽性対照試料は選択的に増幅することが可能であったが、陰性対照試料は選択的に増幅することが可能でなかった。図１４は、変異体ヌクレオチド（Ｔ）においてＬＮＡを伴うアッセイによって、突然変異体対立遺伝子が高感度で増幅されたことを示す。
【０２２４】
[0272]実験３は、ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイの対立遺伝子特異的プライマーに２つのＬＮＡを存在させることによって、アッセイの性能が改善されたことを示す。本発明の本実施形態では、２つの対立遺伝子特異的プライマーのデザインを比較した。一方のプライマーは、変異体ヌクレオチド（Ｔ）においてＬＮＡを有した。他方のプライマーは、第２のＬＮＡ（Ａ）を、変異体ヌクレオチドの５’側に位置させた。戦略的に配置された２つのＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマーを含むアッセイは、良好な増幅及びＣｔ値の低下を示した（図１５）。ＬＮＡは、対立遺伝子特異的プライマーの３’端及び３’端から２、３、４、５、又は６塩基に配置することができる。ＬＮＡは、対立遺伝子特異的プライマーの５’端及び３’端に配置することができる。
【０２２５】
[0273]実験４は、本発明の対立遺伝子特異的プライマーにおける連続ＬＮＡが、アッセイにおいて増幅産物を発生させなかったことを示す。図１６は、連続ＬＮＡ（ＧＡＴ）［配列中、Ｔは変異体ヌクレオチドである］を伴う対立遺伝子特異的プライマーを描示し、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａの突然変異体対立遺伝子を増幅させなかったことを示す。図１６はまた、６つの連続ＬＮＡ（変異体ヌクレオチドのＴ及びＴの上流における、突然変異体対立遺伝子と相補的な５つのＬＮＡ）を伴う対立遺伝子特異的プライマーも描示する。このプライマーは、アッセイにおいて試料中の突然変異体対立遺伝子を検出せず、増幅産物を生成させなかった。
【０２２６】
[0274]本実施例は、本発明の対立遺伝子特異的プライマー、ブロッカープローブ、及び検出用プローブが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、α−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）及びトリアゾールＤＮＡ（ＴｚＤＮＡ）など、（１又は複数の）修飾塩基を含みうることを示す。図１７は、例示的なＬＮＡ分子及び他の修飾ＬＮＡを示す。図１８は、例示的なＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖（左）及び例示的なＰＮＡ（図１８におけるＴ；右）を伴う対立遺伝子特異的プライマーを示す。図１９は、オリゴヌクレオチドを含有する例示的なＴＮＡ（左）及びＴＮＡ（図１９におけるＴ；右）を伴う例示的な対立遺伝子特異的プライマーを示す。図２０は、例示的なＺＮＡオリゴヌクレオチド（左）及び例示的なＺＮＡ修飾（右；図２０におけるＴ）対立遺伝子特異的プライマーを示す。図２１は、例示的なＴｚＤＮＡ分子（左）及びＴｚＤＮＡ（右；図２１におけるＴ）を伴う例示的な対立遺伝子特異的プライマーを示す。
【０２２７】
[0275]実験５は、３’端にヘキサンジオール修飾を伴うブロッカープローブによって、本発明のアッセイの選択性が改善されることを示す。ブロッカープローブを伴わずにアッセイを実施したところ、野生型対立遺伝子及び突然変異体対立遺伝子のいずれもが同様に増幅され、識別することが不可能であった（図２２のＩ部）。ブロッカープローブを伴う本発明の実施形態では、ヘキサンジオールを伴うブロッカープローブを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ  ＳＮＰの野生型対立遺伝子とハイブリダイズさせ、リアルタイムＰＣＲ増幅を妨害した（図２２のＩＩ部）。このアッセイでは、突然変異体対立遺伝子が選択的に増幅された（図２２のＩＩＩ部）。
【０２２８】
[0276]実験６は、ＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマー、ヘキサンジオールを伴うブロッカープローブ、タックマンプローブ、及びリバースプライマーを含む本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイが、突然変異体対立遺伝子（陽性対照）に特異的な増幅産物を生成させたが、野生型対立遺伝子は生成させなかったことを示す。図２３のＩ部は、突然変異体対立遺伝子特異的プライマーによって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ  ＳＮＰの野生型対立遺伝子及び突然変異体対立遺伝子のいずれもが増幅されたことを示す。図２３のＩＩ部は、その３’端に位置する変異体ヌクレオチドにおいて単一のＬＮＡを伴う突然変異体対立遺伝子特異的プライマーによって、突然変異体対立遺伝子は増幅されたが、野生型対立遺伝子は増幅されなかったことを示す。
【０２２９】
[0277]実験７は、変異体ヌクレオチドにおけるＬＮＡを伴う対立遺伝子特異的プライマーを含む本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイにおいて、オリゴヌクレオチドの３’端においてヘキサンジオール（Ｃ６）修飾を伴うブロッカープローブが、３’側リン酸基（ＰＯ４）を伴うプローブより良好に機能したことを裏付ける。図２４は、ヘキサンジオールブロッカープローブによるアッセイが、ＰＯ４ブロッカープローブによるアッセイより、低いＣｔ（２８．４のＣｔ対３１．２のＣｔ）でより良好に機能したことを示す。炭素鎖の柔軟性及び疎水性によって、ヘキサンジオールブロッカーを、立体障害されることなく良好にハイブリダイズさせることが可能となる。ブロッカープローブの３’端におけるリン酸基はまた、野生型対立遺伝子にも結合しうるが、結合の有効性は、リン酸基のバルク性及びイオン性の性質によって減弱しうる。
【０２３０】
[0278]実験８は、本発明のアッセイにおいて、ＬＮＡを伴うブロッカープローブが、ＬＮＡを伴わないブロッカープローブと比較してより良好に機能したことを裏付ける。図２５は、ブロッカーＬＮＡプローブのＣｔ値が、ＬＮＡを伴わないブロッカープローブのＣｔ値より低かったことを例示する。ＬＮＡを伴うブロッカープローブ及びヘキサンジオール修飾を含む本発明の方法は、対立遺伝子多型の効果的で選択的な増幅をもたらし、これにより、対立遺伝子の識別を改善しうる。
【０２３１】
[0279]実験９は、本発明の突然変異体対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブにおけるＬＮＡが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ  ＳＮＰの突然変異体対立遺伝子の高度に特異的な増幅を結果としてもたらしたことを示す。図２６は、ＬＮＡプライマー及びＬＮＡブロッカーを伴うアッセイが、突然変異体対立遺伝子（陽性対照）は増幅したが、野生型対立遺伝子（陰性対照）は増幅しなかったことを示す。
【０２３２】
[0280]実験１０は、ブロッカープローブ配列においてＬＮＡを戦略的に配置して、本発明のＳＮＰアッセイの性能を改善しうることを示す。図２７Ａは、実験において調べられるアッセイの構成要素を示す。図２７Ｂにおいて描示される通り、ブロッカー．１．ＬＮＡとブロッカー．４．ＬＮＡとは、同じブロッカー配列を有するが、ＬＮＡ修飾の位置が異なる。ブロッカー．１．ＬＮＡが、５’端及び対立遺伝子多型ヌクレオチドにＬＮＡを有するのに対し、ブロッカー．４．ＬＮＡは、この配列の５’端及び３’端においてＬＮＡを有する。ブロッカー．１．ＬＮＡによるアッセイは、ブロッカー．４．ＬＮＡによるアッセイと比較してより良好な対立遺伝子の識別及びＣｔの低下を提示した（図２７Ｃ）。
【０２３３】
[0281]図２８Ａは、ブロッカープローブのＴｍのアッセイの性能に対する影響を示す。ブロッカー．１．ＬＮＡのＴｍは、５９．９℃である。ブロッカー．４．ＬＮＡのＴｍは、６８℃である。図２８Ｂはまた、ＬＮＡを伴わないブロッカーのＴｍ及びＣｔ値と、２つのＬＮＡを伴うブロッカーのＴｍ及びＣｔ値との差も示す。本発明のアッセイにおいて、ＬＮＡを伴い、Ｔｍの高いブロッカープローブは、対立遺伝子多型に対する良好な特異性、良好な感度、及び野生型の効果的な阻害を示す。
【０２３４】
[0282]実験１１は、本発明のブロッカープローブにおける連続ＬＮＡが、突然変異体の増幅を完全にブロッキングし、これによって、アッセイの性能を著しく低下させることを示す。図２９は、ブロッカープローブに６つの連続ＬＮＡ（野生型（Ｇ）と相補的なシトシン（Ｃ）及び野生型の対立遺伝子と相補的な上流の５塩基）を配置したところ、ＰＣＲサイクリングにおける増幅が完全に停止したことを示す。
【０２３５】
[0283]図３０は、ΔＣｔ値を用いて、アッセイの実行可能性及びその選択性を決定しうることを示す。ＬＮＡを含有するプライマー及びプローブによって得られるΔＣｔ値の増大は、本発明のアッセイの実行可能性及び選択性の増大を示す。図３１は、ΔΔＣｔ値を、多様な体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイに由来するＣｔ値からどのように計算するかを示す。ＬＮＡを含有するプライマー及びブロッカーによってデザインされた図のアッセイＡは、連続ＬＮＡを伴うプライマー及びプローブを含有する他のアッセイより良好に機能した。
【０２３６】
[0284]まとめると、本実施例は、対立遺伝子特異的プライマー及びブロッカープローブにおける修飾塩基（例えば、ＬＮＡ）など、核酸修飾の使用が、本発明の遺伝子型決定アッセイの性能を改善することを示す。同様に、対立遺伝子多型の識別についての選択性及び感度も増大する。
【０２３７】
実施例６  体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイを用いる未知の試料中に存在する対立遺伝子多型の百分率の定量化
[0285]本実施例は、ＰＩＫ３ＣＡの遺伝子のＥ５４５Ｋ、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ、ＥＧＦＲ遺伝子のＥ７４６−Ａ７５０欠失、又はＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅについて、対立遺伝子多型を定量化するための修飾塩基を含有する対立遺伝子特異的プライマー、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、及び検出用プローブの使用を例示する。本実施例はまた、本発明の方法が、突然変異体を野生型から差別化及び定量化するのに高度に選択的であることも例示する。加えて、本実施例は、本発明のアッセイが直線的であり、対立遺伝子多型の定量的情報を決定するのに用いうることも示す。
【０２３８】
[0286]本明細書で記載される方法を用いて、体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイを実施した。修飾塩基、核酸類似体、及び／又はブロッカー部分を含有する、本発明の対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いて、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、及びＢＲＡＦ遺伝子の多様な対立遺伝子多型の存在について検出した。表１で、前出の遺伝子突然変異を一覧する。
【０２３９】
【表１】
2014526892.tif 000003
【０２４０】
[0287]所与の試料中に存在する対立遺伝子多型の量を定量化するために、検量線を作成した。検量線は、この特異的な突然変異について陽性の細胞株に由来する各突然変異について作成した。検量線は直線状であるために、未知の試料中の対立遺伝子多型を定量化するのに用いることができる。表１は、検量線を創出するのに用いられる対立遺伝子多型及び陽性細胞株を示す。細胞株に由来するＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮイージーブラッド＆ティシューキット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｕｕｅ  Ｋｉｔ）を用いて抽出した。各陽性細胞株に由来するＤＮＡの希釈系列（例えば、１００、１０、１、０．１、及び０．０１ｎｇ）を作製して、対立遺伝子特異的検量線を創出した。本実施例では、ＰＩＫ３ＣＡのＥ５４５Ｋ、ＫＲＡＳのＧ１２Ｄ、ＥＧＦＲのＥ７４６−Ａ７５０欠失、及びＢＲＡＦのＶ６００Ｅについての検量線を作成した。
【０２４１】
[0288]対立遺伝子特異的演算子（例えば、数学的解析）は、作成された検量線から、陽性細胞株の突然変異パーセントが１００％であると仮定して確立した。細胞株のうちの一部については、突然変異％を、野生型対立遺伝子と優先的にハイブリダイズする対立遺伝子特異的プライマーを用いることによって決定した。
【０２４２】
[0289]未知の試料中の突然変異の量を決定するため、本発明の方法を用いて試料をアッセイした。次いで、突然変異パーセント演算子を用いて試料の対立遺伝子多型についてのＣｔ値を解析して、試料中に存在する変異体の量及びパーセントを決定した。
【０２４３】
[0290]図３２Ａは、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ対立遺伝子多型及びＭＣＦ  ７細胞株についての検量線を示す。検量線は、本明細書で記載される方法を用いて創出した。ＤＮＡ量と対比させたＣｔ値の検量線プロットは、ｌｏｇ１０スケールで直線状となった。図３２Ｂは、結腸直腸がんを伴う患者に由来する２つの未知の試料（試料Ａ及びＢ）及び陽性対照（ＭＣＦ  ７細胞株）についての遺伝子型決定アッセイを用いて作成した増幅曲線を示す。図３２Ｃは、試料中に存在する突然変異体であるＥ５４５Ｋの量及び百分率（突然変異パーセント）を示す。試料中に存在する対立遺伝子多型の量及びパーセント（突然変異パーセント）は、演算子を用いて決定した（図３２Ｃ）。特に、突然変異パーセントは、試料中の出発ＤＮＡ量に対する突然変異の量から計算した。試料Ａの突然変異パーセントは、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ変異体について、陽性対照と比べて１５％であることが決定された。試料Ｂの突然変異パーセントは、同じ変異体について、陽性対照と比べて７．３％である。注目すべきことに、試料Ｂに由来する２０ｎｇのＤＮＡ中で、突然変異体対立遺伝子が検出された。
【０２４４】
[0291]図３３は、未知の試料中に存在する突然変異体の百分率を定量化するための、本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄアッセイの使用を例示する。検量線プロットは、ｌｏｇ１０スケールで直線状であり、未知の試料の突然変異の量及びパーセントを定量化するのに用いた。図３３Ａは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ遺伝子型決定アッセイ及びＬＳ  １７４Ｔ細胞株についての増幅プロット及び検量線を示す。図３３Ｂは、膵臓がんを伴う患者に由来する２つの未知の試料（試料Ａ及びＢ）及び陽性対照（ＬＳ  １７４Ｔ細胞株）について本発明の方法を用いて作成した増幅プロットを示す。図３３Ｃは、突然変異体を発現させる試料Ａ中のＤＮＡの量が、３．２５ｎｇ又は陽性対照と比べて９．６％と計算されたことを示す。
【０２４５】
[0292]図３４は、未知の試料中に存在する突然変異体の百分率を定量化するための、本発明のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ＥＧＦアッセイの使用を例示する。図３４Ａは、Ｈ１６５０細胞株のＥＧＦＲ遺伝子のＥ７４６−Ａ７５０欠失についての増幅プロット及び検量線を示す。図３４Ｂは、肺がんを伴う患者に由来する未知の試料（試料Ａ）及び陽性対照（Ｈ１６５０細胞株）について本発明の方法を用いて作成した増幅プロットを示す。図３４Ｃは、ＥＧＦＲ欠失変異体を発現させる試料Ａ中のＤＮＡの量が、３．２５ｎｇ又は陽性対照と比べて９．６％と計算されたことを示す。
【０２４６】
[0293]図３５は、未知の試料中に存在する対立遺伝子多型の百分率を定量化するための、本発明のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦアッセイの使用を例示する。図３５Ａは、ＨＴ  ２９細胞株のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ対立遺伝子多型についての増幅プロット及び検量線を示す。図３５Ｂは、肺がんを伴う患者に由来する未知の試料（試料Ａ）及び陽性対照（Ｈ１６５０細胞株）について本発明の方法を用いて作成した増幅プロットを示す。図３５Ｃは、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異体を発現させる試料Ａ中のＤＮＡの量が、０．１８ｎｇ又は陽性対照と比べて１．２％と計算されたことを示す。
【０２４７】
[0294]本実施例は、本発明のアッセイ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、及びＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ遺伝子型決定アッセイ）がｌｏｇ１０スケールで直線状であり、このアッセイを用いて患者の組織試料中の対立遺伝子多型についての定量的情報を決定しうることを示す。
【０２４８】
実施例７  腫瘍の遺伝子異質性の決定
[0295]本実施例は、がんバイオマーカーのレベルと発がん性遺伝子の特定の対立遺伝子多型についての突然変異パーセントとの相関を例示する。胃がん試料では、協同的酵素増強反応（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ）（ＣＥＥＲ）イムノアッセイを用いて検出される高レベルのサイトケラチン（ＣＫ）が、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ対立遺伝子多型についての高い突然変異パーセントに対応した。膵臓がん試料では、高いＣＫレベルが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ対立遺伝子多型について１００％の突然変異パーセントと相関した。本実施例は、組織試料の腫瘍含量は、本発明の遺伝子型決定アッセイ及びＣＥＥＲイムノアッセイを用いて評価しうることを例示する（また、ＣＯＰＩＡとしても知られている；例えば、それらの開示が全ての目的についてそれらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ特許国際公開第２００８／０３６８０２号及び同国際公開第２００９／１０８６３７号を参照されたい）。
【０２４９】
[0296]腫瘍組織試料は、腫瘍細胞と非腫瘍細胞（例えば、血液又は隣接する非腫瘍組織）の混合物であることが多い。固形腫瘍の組織試料中の腫瘍細胞は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって評価することができる。図３６は、Ｈ＆Ｅ染色された、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腫瘍試料の凍結切片を示す。図３６Ａは、高百分率の腫瘍細胞を伴う切片（白色矢印は、腫瘍細胞を示す）を示す。図３６Ｂは、腫瘍細胞（白色矢印）と、血管（黒色矢印）を伴う間質と、炎症性細胞（例えば、リンパ球；赤色矢印）と、マクロファージで満たされた肺胞（緑色矢印）との混合物からなる切片を示す。
【０２５０】
[0297]サイトケラチンを、腫瘍細胞を検出するためのバイオマーカーとして用いた。腫瘍試料では、高いＣＫレベルが観察されたが、隣接する正常組織では、低レベルが検出された。本発明者らは、高いＣＫレベルが、特定の突然変異体対立遺伝子についての高い突然変異パーセントと相関するかどうかを決定するため、ＣＫレベル、並びに多様な胃がん試料及び膵臓がん試料における、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型の突然変異パーセントを評価した。
【０２５１】
[0298]図３７Ａは、胃がん試料では、高いＣＫレベル、及びＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異体、ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ変異体、又はＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ変異体についての低い突然変異パーセントの両方によって、腫瘍細胞の全てがＳＮＰを保有する可能性が高いとは限らないと示されることを例示する。図３７Ａはまた、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄの高い突然変異パーセント（例えば、９０％）を伴う高いＣＫレベルによって、試料中の腫瘍細胞の大半が、突然変異を保有する可能性が高いと示されたことも示す。図３７Ｂは、高レベルのＣＫが、膵臓がん試料中のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異体について、高い突然変異パーセント（１００％）と相関することを示す。
【０２５２】
[0299]まとめると、本実施例は、本発明の遺伝子型決定アッセイを用いて、患者の腫瘍試料の突然変異パーセントを計算しうることを示す。本実施例は、発がん性遺伝子の特異的な対立遺伝子多型の突然変異パーセントが、がんバイオマーカーの発現レベルと相関しうることをさらに例示する。
【０２５３】
実施例８  全血液試料中の腫瘍細胞の識別における体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイの感度
[0300]本実施例では、突然変異を保有する腫瘍細胞でスパイクされた全血液試料に対して、ＫＲＡＳのＧ１２Ａ突然変異又はＧ１２Ｓ突然変異についてのアッセイを実施することによって、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイの感度を決定した。ＬＮＡ修飾など修飾塩基を含有する本発明の対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いて、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ変異体対立遺伝子又はＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ変異体対立遺伝子の存在を検出した。本実施例ではまた、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイの感度とＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）突然変異アッセイの感度との比較も行う。
【０２５４】
[0301]本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイ（例えば、「本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ」）の感度は、全血液試料中のＫＲＡＳ突然変異を検出するために必要とされる陽性腫瘍細胞（例えば、ＳＷ１１６細胞株）の最小量を決定することによって調べた。被験試料は、ＳＷ１１６細胞株の細胞（例えば、試料１例当たり、１００，０００；１０，０００；１，０００；５００；２５０；１００；５０；１０；又は０個の腫瘍細胞）でスパイクされた全血液を含んだ。被験試料に由来するゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮイージーブラッド＆ティシューキットを用いて抽出した。本発明のアッセイは、本明細書で示される方法を用いて実施した。図３８Ａは、本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａアッセイから作成された増幅曲線を例示する。図３８Ｂは、同じ被験試料に対して実施されたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）突然変異アッセイによる増幅曲線を例示する。
【０２５５】
[0302]図３８Ｃにおいて示される通り、本発明の遺伝子型決定アッセイは、被験試料の含有する陽性腫瘍細胞が２５０個という少数の場合にも、Ｇ１２Ａ突然変異を検出した。比較により、キャストＰＣＲ（商標）アッセイには、試料中に最小１，０００個の腫瘍細胞が必要とされた。結果は、本発明のアッセイが、全血液試料中のＧ１２Ａ  ＫＲＡＳ突然変異を検出するために、キャストＰＣＲ（商標）アッセイより大きな感度を有することを示す。
【０２５６】
[0303]本発明のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓアッセイを評価するために、全血液試料を、Ａ５４９細胞株の細胞（例えば、被験全血液試料中に１００，０００；１０，０００；１，０００；５００；２５０；１００；５０；１０；又は０個の陽性腫瘍細胞）でスパイクした。Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮイージーブラッド＆ティシューキットを用いて、被験試料のゲノムＤＮＡを抽出した。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ変異体の存在を、本発明のアッセイ及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）アッセイを用いて検出した。アッセイの感度を比較した。図３９Ａは、本発明のアッセイを用いる被験試料の増幅曲線を示す。図３９Ｂは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）アッセイについての増幅曲線を示す。
【０２５７】
[0304]本発明のアッセイは、１００個という少数の腫瘍細胞を伴う試料中でＧ１２Ｓ突然変異を検出した（図３９Ｃ）。キャストＰＣＲ（商標）は、１０分の１の感度であり、アッセイは、１，０００個以上の陽性腫瘍細胞を含有する被験試料の突然変異を検出した。図３９Ｃは、本発明の遺伝子型決定アッセイが、全血液試料中のＧ１２Ｓ  ＫＲＡＳ突然変異を検出するために、キャストＰＣＲ（商標）より大きな感度を有することを例示する。
【０２５８】
[0305]まとめると、本実施例は、本発明の体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイが、対立遺伝子ＰＣＲアッセイを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキャストＰＣＲ（商標）アッセイと比較して劇的に改善することを裏付ける。
【０２５９】
実施例９  試料中の対立遺伝子多型を検出し、変異体の百分率を決定するための、例示的な体細胞突然変異遺伝子型決定アッセイ
[0306]本実施例は、試料中の発がん性一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し、試料中のＳＮＰの突然変異パーセントを定量化するための本発明の方法を例示する。本実施例はまた、修飾塩基を含有する本発明の対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いる、希少な（例えば、突然変異体）変異体の対立遺伝子の存在についての試料（例えば、がんを伴う患者に由来するがん細胞株及びがん組織）のスクリーニングも例示する。特に、対立遺伝子特異的プライマーは、３’端において、変異体対立遺伝子に特異的なロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、３’端において、ヘキサンジオールブロッカー部分を含み、野生型対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド配列の中央部の位置において、ＬＮＡを含む。本実施例では、検出される対立遺伝子多型に、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれる。本実施例はまた、本発明の方法を、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、及び膵臓がんなどのがん及び腫瘍；細胞株（例えば、結腸直腸がん細胞株）及び異種移植組織に由来する多様な試料と共に用いうることも示す。
【０２６０】
[0307]対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲアッセイなど、本発明の方法を用いて、変異体を発現させる細胞株に対して実施されたアッセイから検量線を確立し、各変異体についての突然変異パーセント演算子を創出して、試料中の多様なＳＮＰの存在を決定し、試料中で検出される変異体の百分率を定量化した。略述すると、対立遺伝子多型についての検量線を確立するために、本発明のＳＮＰ検出アッセイを、対立遺伝子多型について陽性の細胞株の希釈系列を用いて実施した。アッセイの結果を用いて、検量線を作成し、次いで、試料について得られるＳＮＰ検出アッセイからのデータに基づき、試料中に存在する対立遺伝子多型の量を予測しうる、対立遺伝子多型についての突然変異パーセント演算子を創出した。
【０２６１】
[0308]図４０は、乳がん試料中の以下のＳＮＰ：ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを検出（例えば、存在又は非存在を）及び／又は定量化（例えば、突然変異パーセントを）するための本発明の方法を用いることにより得られる結果を示す。ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ  ＳＮＰは、試料において異なる百分率で発現することが決定された。例えば、試験１が、Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子を１２％で発現させたのに対し、試験３３は、同じＳＮＰを４１％で発現させた。試験２は、突然変異体を１％で発現させた。試験３４は、別のＰＩＫ３ＣＡのＳＮＰ（例えば、Ｅ５４５Ｋ）を１００％で発現させたが、これによって、被験試料中の全ての細胞がＥ５４５Ｋ変異体を有することが予測される。
【０２６２】
[0309]図４１は、乳がん試料の別のセットではまた、ＰＩＫ３ＣＡのＳＮＰ（Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｄ、Ｅ５４５Ｋ、及びＨ１０４７Ｒ）も検出及び定量化されることを示す。４５例の乳がん試料を、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ対立遺伝子多型、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ対立遺伝子多型、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ対立遺伝子多型、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子多型についてスクリーニングした。変異体の突然変異パーセントは、上記の方法及び実施例６における方法を用いて定量化した。結果は、試料＃７４４が、極めて低い百分率（例えば、０．１３％）でＥ５４２Ｋを発現させ、試料＃７４３が、高百分率の１００％でＨ１０４７Ｒを発現させたことを示す。Ｅ５４２Ｋ変異体を発現させた他の試料は、試料＃７６２が２％であり、試料＃７６７が３．５５％であった。Ｈ１０４７Ｒ変異体を発現させた他の試料は、８９％の突然変異を伴う試料＃７４６、５１．８％の突然変異を伴う＃７７５、６．８％の突然変異を伴う＃７４０、及び５．９％の突然変異を伴う＃７６９であった。
【０２６３】
[0310]図４２は、肺がん試料が、本発明の方法を用いて、ＳＮＰについてスクリーニングしうることを示す。この実施形態では、２５例の肺がん試料中の多様なＳＮＰの存在及び突然変異パーセントを決定した。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。試料＃３５２〜３５５は全て、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋを１００％で発現させ、これは、これらの試料中の全ての細胞が突然変異体を有することを示す。試料＃３７１〜３７５及び３８１は全て、ＥＧＦＲ  Ｌ８４８Ｒを１００％で発現させた。ＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失変異体は、２つの試料（＃１６４及び＃３８１）において極めて低い割合（それぞれ０．１％及び０．２％）で検出された。セット中でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を発現させた唯一の試料は試料＃２１３であり、その突然変異百分率は、０．２％であった。
【０２６４】
[0311]図４３は、さらなる３２例のヒト肺がん試料に対して本発明の方法を用いることから得られる結果を例示する。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。このセットの試料＃９は、ＫＲＡＳ突然変異であるＧ１２Ｓを０．３％で、Ｇ１２Ｖを２％で、Ｇ１３Ｄを０．３％で発現させた。試料＃３及び１２は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ変異体を、１００％で発現させた。試料＃２５は、ＰＩ３ＫＣＡ  Ｅ５４５Ｄを、０．２％で発現させ、試料＃６は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒを、０．０６％で発現させた。試料＃１３及び１９が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃを、１００％で有したのに対し、試料＃２２は、同じ変異体を２％だけ有した。また、試料＃２２も、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を５４％で発現させた。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異体は、試料＃１４中に、１００％の百分率で存在し、試料＃１５中に、０．１％で存在した。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体は、試料＃４及び３１中に、それぞれ、４７％及び３４％で検出された。
【０２６５】
[0312]図４４は、胃がん試料が、本発明の方法を用いてスクリーニングしうることを示す。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。この実施形態では、各アッセイを、４０ｎｇの試料（例えば、ＤＮＡ）で実行した。アッセイされた１７例の試料のうち、試料＃２３３は、０．００１％のＧ１２Ｒ、２．３％のＧ１２Ｖ、「低」百分率のＧ１３Ｄ、及び０．５％のＱ６１Ｈなど、４つのＫＲＡＳ突然変異を発現させた。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異体は、試料＃２４１中に「低い」百分率で検出した。ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ対立遺伝子は、試料＃２５３中に０．６％で検出し、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ対立遺伝子は、試料＃２２３中に０．２％で検出した。乳がん及び肺がんなど、他の腫瘍試料と比較して、被験胃がん試料におけるＳＮＰの突然変異パーセントは、スクリーニングされる任意の対立遺伝子多型について１００％を超えなかった。
【０２６６】
[0313]図４５は、異種移植片試料と共に本発明の方法を用いることから得られる結果を示す。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、及びＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。ＥＧＦＲ  Ｅ７４６欠失は、試料＃５８５〜５８８中に存在し、試料中の細胞の１００％において存在することが予測された。ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子は、試料＃５８１〜５８４中にそれぞれ、３．４％、１．２％、１％、及び１．８％の突然変異百分率で検出された。
【０２６７】
[0314]図４６は、本発明の方法を用いて、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型を、結腸直腸がん試料中で検出及び定量化しうることを例示する。ＳＮＰには、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ；並びにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが含まれた。データは、試料＃１２１が、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異体を６％で発現させ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ変異体を５８％で発現させたことを示す。試料＃１３０は、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｖ変異体を５４％で発現させ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ変異体を５％で発現させた。
【０２６８】
[0315]図４７はまた、本発明の方法を用いて、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型を、さらなる結腸直腸がん試料中で検出及び定量化しうることも例示する。データは、試料＃１４７が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異体及びＰＩＫ３ＣＡ変異体を１００％で発現させたことから、試料中の全ての細胞が、変異体を発現させると予測されることが明示されることを示す。試料＃１４９は、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異体を２４％で発現させ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異体を０．１％で発現させた。試料＃１６３は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄを３４％で発現させ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋを３％で発現させた。
【０２６９】
[0316]図４８は、本発明の方法を用いて、結腸直腸がんを伴う患者に由来する肝臓がん組織及び結腸がん組織を、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの対立遺伝子多型についてスクリーニングしうることを例示する。結果は、試料のうちの一部が、複数のＳＮＰを有したことを示す。例えば、試料＃２０７及び＃２０８は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋを発現させた。本発明の方法を用いてまた、試料＃２０７が、Ｇ１２Ｓを２２％で発現させ、試料＃２０８が、同じ変異体を６３％発現させることも決定された。試料＃２０７は、Ｅ５４５Ｋ変異体を４０％で発現させ、試料＃２０８は、同じ変異体を７９％で発現させた。試料＃２１５は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを１％で有し、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋを５％で有した。試料＃２１６は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを９％で有し、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋを２３％で有した。試料＃２１７は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを２％で発現させ、ＰＩＫ３ＣＡ  ５４５Ｋを５％で発現させた。試料＃２１７は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを４％で有し、ＰＩＫ３ＣＡ  ５４５Ｋを９％で有した。
【０２７０】
[0317]図４９は、膵臓がんを伴う患者に由来する試料を、本発明の方法に従って、ＳＮＰについてスクリーニングし、突然変異パーセントを決定しうることを例示する。この実施形態では、微細針吸引物試料を患者から得、本明細書で記載されるＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを用いてスクリーニングした。被験膵臓がん試料では、多様なＫＲＡＳ突然変異が検出されたが、ＰＩＫ３ＣＡ（例えば、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｄ、Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）突然変異、ＥＧＦＲ（例えば、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ）突然変異、及びＢＲＡＦ（例えば、Ｖ６００Ｅ）突然変異は検出されなかった。試料＃２８は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異体を発現させた。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異体は、＃１９、２１、２６、２７、及び３５中に、それぞれ、６３％、０．２％、４％、１％、及び３％の突然変異百分率で存在した。試料＃９及び１１は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異体を、１００％で発現させた。この変異体はまた、試料＃２、６、１２、２３、２４、３７、３９、及び４０中にも、それぞれ、１．１％、２９％、７．４％、５％、５％、３２％、５．４％、及び０．９％で発現した。スクリーニングされたＳＮＰは、セット内の他の膵臓がん試料中では検出されなかった。
【０２７１】
[0318]まとめると、本実施例は、本発明の体細胞遺伝子型決定アッセイを用いて、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＢＲＡＦなど、遺伝子中の対立遺伝子多型を検出及び／又は定量化しうることを裏付ける。本実施例は、本発明の方法を用いて、患者に由来するがん試料中及び腫瘍組織試料中の複数の対立遺伝子多型を検出しうることを示す。さらに、試料中の対立遺伝子多型の百分率も、決定することができる。
【０２７２】
[0319]前出の本発明を、理解を明確にする目的で例示及び例によりある程度詳細に記載してきたが、当業者は、付属の特許請求の範囲内で、特定の変更及び改変を実施しうることを理解するであろう。加えて、本明細書で提示される各参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み込まれると仮定した場合と同じ程度に、参照によりその全体において組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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