(57)【要約】本発明は、ｍｉＲ−１２２阻害剤でのＨＣＶ療法に対する適当なレスポンダーとして同定されるＨＣＶに感染した対象の治療方法に関する。本発明はまた、抗ＨＣＶ剤、例えば、ｍｉＲ−１２２阻害剤でのＣ型肝炎感染症の治療の適合性を決定するための予測方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤でのＨＣＶ感染症に感染したヒト対象の治療の適合性を決定するための予測方法であって、
ａ．ＨＣＶに感染したヒト対象から血液サンプルを得る工程
ｂ．血清サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｃ．所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと１またはそれ以上の対照サンプルまたは対照値を比較する工程を含み、該対象が、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤でのＨＣＶ感染症の治療に適している可能性があるかまたはそれに適している（すなわち、適当なｍｉＲ−１２２阻害剤レスポンダー）かどうかを決定する、方法。
【請求項２】
ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤が、オリゴヌクレオチド全体を通して、ミクロＲＮＡ−１２２またはその部分配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＨＣＶに感染した対象が、治療を受けていない、および／または、無症状である、および／または、過去３年以内にＨＣＶと診断されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種のバイオマーカーが、ＨＣＶ感染症の治療に対する反応性で識別される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種のバイオマーカーが、肝機能バイオマーカーである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種のバイオマーカーが、血清ミクロＲＮＡ、ガンマＧＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＴからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のバイオマーカーが、ミクロＲＮＡ，例えば肝臓で発現したミクロＲＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ミクロＲＮＡがミクロＲＮＡ−１２２である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種のバイオマーカーが、肝機能バイオマーカー、例えば肝酵素である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
肝酵素が、ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、およびＧＧＴからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２種の肝酵素バイオマーカーレベルが測定される、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に用いるための予測キットであって、ヒトｍｉＲ−１２２の定量化アッセイ、および少なくとも１種のさらなるバイオマーカーの少なくとも１種のさらなる定量化アッセイを含む、キット。
【請求項１３】
ＨＣＶ感染症を患う対象への投与のための、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンの適当な有効量を決定する方法であって、
ｉ）対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと１またはそれ以上の対照サンプルまたは対照値を比較する工程を含み、ＨＣＶ感染症を軽減するために対象への投与のミクロＲＮＡ−１２２阻害剤の適当な有効量を決定する、方法。
【請求項１４】
ＨＣＶ治療剤、例えばミクロＲＮＡ−１２２阻害剤のコンパニオン診断として用いるための、肝特異的ミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２の検出プローブ。
【請求項１５】
該プローブが、ＨＣＶ治療剤での治療に対する、（例えば、慢性）ＨＣＶの治療を必要とする対象の適合性を決定するための予測方法にて用いるためのものである、請求項１４記載の検出プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝機能の診断および予測方法、例えばＣ型肝炎の適切な治療を選択するのに用いられる診断および予測方法の分野に関する。また、ｍｉＲ−１２２阻害剤でのＨＣＶ療法に対する適当なレスポンダーとして同定されているＨＣＶに感染した対象の治療方法も開示されている。本発明はまた、抗ＨＣＶ剤、例えばｍｉＲ−１２２阻害剤でのＣ型肝炎感染症の治療の適合性を決定するための予測方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、欧州および米国における慢性肝疾患の最も一般的な感染原因である。世界的に、約３％の人口が感染していると推定されている；これは、約２億人の人々が重篤な肝疾患を発症する恐れがあることに相当する。
【０００３】
ミクロＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）は、肝特異的ミクロＲＮＡである。ｍｉＲ−１２２は脂質およびコレステロール代謝に関与し、齧歯類におけるインビボのｍｉＲ−１２２阻害は血清コレステロールレベルの低下をもたらす。それによってｍｉＲ−１２２がコレステロール代謝を制御する分子機構は、現在のところ知られていないようである。
【０００４】
肝ｍｉＲ−１２２レベルは、慢性ＨＣＶ感染症に関連する臨床パラメータと逆相関している（Ｍａｒｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１０）。血清ｍｉＲ−１２２は、ＮＡＦＬＤおよびＨＣＶ感染症と正に相関しており、ＮＡＦＬＤのバイオマーカーとして示唆されている（例えば、Ｃｅｒｍｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１１）。Ｃｅｒｍｅｌｌｉらによれば、循環と肝ｍｉＲ−１２２レベルの間に相関関係はない。血清ｍｉＲ−１２２は、ＨＣＶ感染患者における壊死性炎症のバイオマーカーであり、血清ＡＬＴレベルと適度に相関している（Ｂｉｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｓｅｐｔ．２０１１）。Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｒｕｍ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１２２  Ｌｅｖｅｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」  ＡＡＳＬＤ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１１は、ｍｉＲ−１２２血清レベルが、治療効果を示す高濃度のｍｉＲ−１２２血清レベルで、インターフェロン／リバビリン治療に対する反応性と相関することを報告している。
【０００５】
ミラビルセン（Ｍｉｒａｖｉｒｓｅｎ）は、チンパンジーおよびヒトの患者の両方においてＣ型肝炎（ＨＣＶ）の治療に有効性を示した最初のミクロＲＮＡ治療薬である。ミラビルセンは、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤である。本発明者らは、ＨＣＶ療法に反応しなかったＨＣＶ患者の亜集団を肝機能の識別的血液バイオマーカーアッセイによって同定したことを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｒｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１０
【非特許文献２】Ｃｅｒｍｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１１
【非特許文献３】Ｂｉｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｓｅｐｔ．２０１１
【非特許文献４】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｒｕｍ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１２２  Ｌｅｖｅｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」  ＡＡＳＬＤ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＨＣＶ療法に反応しないＨＣＶ患者の亜集団を識別的血液バイオマーカーアッセイによって同定することができるという驚くべき所見は、ＨＣＶ療法に対する適合性を確認するためにＨＣＶ感染患者をスクリーニングするための予測方法ならびに１種またはそれ以上の識別的血液バイオマーカーレベルによってＨＣＶ療法に適するように同定されるＨＣＶ感染患者の治療を可能にする。適当には、該治療には、有効量のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンの投与が含まれる。
【０００８】
本発明は、対象における（例えば、慢性）Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療方法であって、（例えば、慢性）Ｃ型肝炎感染症を患う患者にミクロＲＮＡ−１２２阻害剤を投与することを含み、該対象が、正常な肝機能を示すミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での治療前の血液（例えば、血清または血漿）バイオマーカーを有する、方法を提供する。
【０００９】
本明細書に記載されるように、ミクロＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）阻害剤は、オリゴヌクレオチド全体を通してｍｉＲ−１２２に相補的な、例えば完全に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばミラビルセンでありうる。
【００１０】
本発明は、対象における（例えば、慢性）Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療方法であって、（例えば、慢性）Ｃ型肝炎感染症を患う対象にミクロＲＮＡ−１２２阻害剤を投与することを含み、該対象がＨＣＶ感染症に対して無症状である、方法を提供する。
【００１１】
本発明は、対象における（例えば、慢性）Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療方法であって、慢性Ｃ型肝炎感染症を患う対象にミクロＲＮＡ−１２２阻害剤を投与することを含み、ＨＣＶ関連線維症（または壊死性炎症）のステージが、Ｉｓｈａｋ採点システムにおけるステージ３、またはＭｅｔａｖｉｒ段階におけるステージＦ２に達していない、方法を提供する。適当には、いくつかの実施態様において、対象は、不完全肝硬変または肝硬変を患っていないか、あるいはいくつかの実施態様において、架橋線維症(bridging fibrosis)または門脈線維症を患っていない。
【００１２】
本発明は、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での（例えば、慢性）ＨＣＶ感染症を患う哺乳動物（例えば、ヒト）対象の治療の適合性を決定する方法であって、
ｉ）ＨＣＶに感染した対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと１またはそれ以上の対照サンプルまたは対照値を比較する工程を含み、該対象が、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での（例えば、慢性）ＨＣＶ感染症の治療に適している可能性があるかまたはそれに適している（すなわち、ｍｉＲ−１２２阻害剤レスポンダー）かどうかを決定する、方法を提供する。
【００１３】
あるいは、上記［予測］方法は、対象が、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでのＨＣＶ感染症の治療に反応する（または反応性を示す）可能性があるかどうかを決定するために用いられうる。
【００１４】
したがって、該方法は、有効量のミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンの投与により効果的に治療される（すなわち、反応する）可能性がある（例えば、慢性）ＨＣＶ感染症を患う個別の対象を同定するために用いられうる。
【００１５】
上記方法は、予測方法と称されうる。予測方法は、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での治療に対する非レスポンダー（あるいは、部分レスポンダー）を同定するために用いられうる。
【００１６】
上記方法はまた、（例えば、慢性）ＨＣＶの治療方法であって、上記方法および前記対象に前記ｍｉＲ−１２２阻害剤を投与する次の工程を含む、方法において利用されうる。
【００１７】
本発明は、ＨＣＶに感染したヒト対象における（例えば、慢性）ＨＣＶの治療に用いるためのｍｉＲ−１２２阻害剤であって、例えば本明細書に記載の［予測］方法を用いて、ｍｉＲ−１２２阻害剤に対するレスポンダーとしてすでに同定されている対象に使用する、ｍｉＲ−１２２阻害剤を提供する。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載の予測方法または治療方法において用いるための予測キットを提供し、前記キットは、ｍｉＲ−１２２検出アッセイ（例えば、１またはそれ以上のｍｉＲ−１２２検出プローブ（例えば、１またはそれ以上のｍｉＲ−１２２特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー）、ヒトｍｉＲ−１２２に特異的な定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたはヒトｍｉＲ−１２２の検出プローブおよび少なくとも１種のさらなるバイオマーカーの少なくとも１種のさらなる検出アッセイ（本明細書に記載）、例えば、ＧＧＴ、ＡＬＴ、ＡＳＴまたはそれらの組み合わせの検出アッセイを含む。
【００１９】
本発明は、（例えば、慢性）ＨＣＶ感染症を患う対象への投与のための、ｍｉＲ−１２２阻害剤（ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤）、例えばミラビルセンの適当な有効量を決定する方法であって、
ｉ）対象からの血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと１またはそれ以上の対照サンプルまたは対照値を比較する工程を含み、（例えば、慢性）ＨＣＶ感染症を軽減するために対象への投与のためのミクロＲＮＡ−１２２阻害剤の適当な有効量を決定する、方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ヒト対象における（例えば、慢性）Ｃ型肝炎の進行度、例えば、肝臓の壊死性炎症レベルを決定するための予測方法であって、
ｉ）ＨＣＶに感染したヒト対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中のミクロＲＮＡ−１２２レベル、および血液サンプル中の少なくとも１種のさらなるバイオマーカーを測定する工程
ｉｉｉ）ミクロＲＮＡ−１２２および少なくとも１種のさらなるバイオマーカーレベルと既知レベルの壊死性炎症を患う１またはそれ以上の対象から得られた１またはそれ以上の対照サンプルまたは対照値を比較する工程を含み、対象におけるＣ型肝炎の進行度を決定する、方法を提供する。
【００２１】
本発明は、ミクロＲＮＡ、例えば、肝特異的ミクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２の検出プローブ、またはＨＣＶ治療剤、例えばミクロＲＮＡ−１２２阻害剤（例えば、ミラビルセン）のコンパニオン診断（予測）として用いるための、前記検出プローブを含むアッセイを提供する。コンパニオン診断は、適当には、ＨＣＶ（例えば、慢性ＨＣＶ）の治療を必要とする対象の適合性を決定する予測アッセイ、例えば、本明細書に記載のものにおいて用いられるべきである。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験の週数に対する反応グレードの分布。太い横線は中央値を示す。箱は第１ないし第３四分位数を含む。ひげは最大値および最小値を示す。
【図２】ミラビルセンの各反応グレードの各投与量の患者の分布。Ａ．棒グラフ(barplot)およびＢ．分割表として示される。
【図３】オブザーバブルとミラビルセンの反応グレード間の有意な関連性。各サブ図(subfigure)において、＋／−１の標準偏差を示すエラーバーを伴うグループごとの平均値の棒グラフ、およびグレードごとの全値の散布図が示される。Ａ．ｍｉＲ−１２２、Ｂ．ＧＧＴ、Ｃ．ＡＬＡＴおよびＤ．ＡＳＡＴ。
【図４】完全連結法を用いる臨床オブザーバブルの階層的クラスター分析。相関関係をスピアマンの順位相関係数、ｒとして算出した。距離を１−ｒ２として算出した。
【図５】ミラビルセンのレスポンダーまたは非レスポンダーのいずれかとして患者を分類する二分決定木。木の４種のオブザーバブル各々のカットオフ値は、正常上限値に相対的な値として示される。
【図６】二分決定木を裏付けるミラビルセン治療ＣＨＣ患者からのデータ。Ａ．ＡＬＡＴ対ＡＳＡＴおよびＢ．ＧＧＴ対ｍｉＲ−１２２によるＣＨＣ患者の散布図。図５からのカットオフ値は破線として示される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
治療方法
本発明は、ＨＣＶに感染した対象の治療方法であって、有効な量で該対象に抗ＨＣＶ剤を投与する工程を含み、該対象が、治療効果を示す、１つまたはそれ以上の肝機能に関する血清バイオマーカーの治療前レベルを有する、方法を提供する。
【００２５】
本発明は、対象における慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療方法であって、慢性Ｃ型肝炎感染症を患う対象にミクロＲＮＡ−１２２阻害剤（本明細書では、該ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤(the inhibitor of microRNA-122)とも称される）を投与することを含み、該対象が、正常な肝機能を示す、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での治療前の１つまたはそれ以上の血清バイオマーカーを有する、方法を提供する。
【００２６】
本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に有効量（すなわち、治療投与量）のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、治療前に、正常上限値を下回る血清ＡＬＴレベルを有する、方法を提供する。
【００２７】
本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に有効量（すなわち、治療投与量）のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、治療前に、正常上限値を下回る血清ＡＳＴレベルを有する、方法を提供する。
【００２８】
本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に有効量（すなわち、治療投与量）のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、治療前に、正常上限値を下回る血清ＧＧＴレベルを有する、方法を提供する。
【００２９】
本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に有効量（すなわち、治療投与量）のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、治療前に、正常上限値を下回る血清ミクロＲＮＡ−１２２レベルを有する、方法を提供する。
【００３０】
本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に治療投与量のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、治療前に、１または１未満の血清ＡＳＴ／ＡＬＴ比を有する、方法を提供する。
【００３１】
本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に治療量のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、治療前に、１４秒未満のＰＴ値を有する、方法を提供する。
【００３２】
該対象は、本明細書に記載のレスポンダーとして定義されうる。
【００３３】
本発明は、上記のおよび本明細書に定義の対象におけるＨＣＶ感染症の治療のための、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを提供する。
【００３４】
本発明は、上記のおよび本明細書に定義の対象におけるＨＣＶ感染症の治療のための医薬の製造のためのミクロＲＮＡ−１２２阻害剤の使用を提供する。
【００３５】
正常な肝機能の決定
肝機能は、例えば、血清バイオマーカーが正常上限値を下回るとみなされる場合に正常であると決定されうる。血清バイオマーカー、例えばｍｉＲ−１２２、ＡＬＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴに関して、正常とは、正規分布の中央部分（９５％）（すなわち、「正常範囲」内）を示す。正常（９５％）レベルの上限カットオフ値は、「正常上限値」と称される。正常値の正確な上限は、例えば、対照正規母集団、性別、年齢、ある場合においては、用いられる特異的アッセイ条件によって変化しうることを認識すべきである。
【００３６】
したがって、本発明に関して、「正常な肝機能」は、対象の集団からの対照サンプルまたは対照値と正常な肝機能との比較によって決定されうることを認識すべきである。血清バイオマーカーレベルが正常上限値を超えると決定される対象は、いくつかの実施態様において、非レスポンダーまたは低レスポンダーである可能性が高いかもしれない。
【００３７】
あるいは、正常な肝機能の決定は、本明細書に記載されるように、１つまたはそれ以上のバイオマーカーレベルに対する適当な所定のカットオフ値の選択によって決定されうる。特定のカットオフ値を決定するために用いられるアッセイは、本明細書では、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＡＬＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴプロトコールと認定されるけれども、同様のプロトコールはまた、（インタープロトコール／アッセイ感度／多様性を考慮して）用いられうる。かかるカットオフ値の非限定的な例は、本明細書にて提供される。そのようなものとして、正常範囲は、健常な肝機能に関連するレベル、または本明細書に記載のカットオフ値を下回ると考えられうる。
【００３８】
本発明の治療方法において、対象は、治療前に、正常上限値を下回る、ｍｉＲ−１２２、ＡＬＴ、ＡＳＴおよび／またはＧＧＴ血清レベルを有しうる。
【００３９】
したがって、本発明に関して、「正常な肝機能」は、正常な肝機能を有する１またはそれ以上の対象（好ましくは、適当な大きさの集団）からの対照サンプルまたは対照値と比較することにより決定されうることを認識すべきである。この点について、正常な肝機能の決定は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のバイオマーカーレベルの適当な所定のカットオフ値によって決定されうる。かかるカットオフ値の非限定的な例は、本明細書において提供される。したがって、正常範囲は、本明細書に例示および詳述される非レスポンダーに関連するレベルを下回ると考えられうる。したがって、本発明の治療方法では、いくつかの実施態様において、対象は、治療前に、正常範囲内にある、ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ガンマＧＴ、ミクロＲＮＡ−１２２レベルを有する。例として、本発明は、ＨＣＶの治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象に有効量（例えば、治療投与量）のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、治療前の該対象が、６９ＩＵ／Ｌ未満のＡＬＴ血清レベルを有し、所望により、ΔＣｔで決定された＜３の血清ミクロＲＮＡ−１２２レベルを有していてもよく、および／または所望により、１５８Ｕ／Ｌ未満の血清ＧＧＴレベルを有していてもよい、方法を提供する。他の同様の方法は、本明細書に記載の種々の分類器を用いて利用されうる。
【００４０】
別法としてまたは組み合わせて、正常な肝機能は、例えば、平均値周辺の正常範囲内の血清バイオマーカーの存在、例えば、健常集団群内の平均レベルの血清バイオマーカーの標準分布の９５％で示されうる。対照集団における正常肝機能を確立するために用いられる血清バイオマーカーは、好ましくは、例えば、本明細書に記載の、ｍｉＲ−１２２、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴおよび／またはＡＳＴ／ＡＬＴ比である。健常集団群は、ＨＣＶに感染しておらず、通常、人口統計学的に同様であるべきであり、例えば、正常な肝バイオマーカーは、健常な男性および女性の人口層間で異なりうる。
【００４１】
臨床データの分析において、そして、実施例に示されるように、
−正常上限値を下回る治療前ＡＬＴレベルを有する対象は、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療に対するレスポンダーである可能性が高い。いくつかの実施態様において、レスポンダーおよび非レスポンダーまたは部分レスポンダーは、（適当な）レスポンダーを示す正常上限値を下回るＡＬＴレベル、および（適当な）非レスポンダーまたは（適当な）部分レスポンダーを示す正常上限値を超える、例えば１．５倍の正常上限値を下回る、例えば２倍の正常上限値を下回る、例えば３倍の正常上限値を下回る、例えば４倍の正常上限値を下回る、例えば５倍の正常上限値を下回る、ＡＬＴレベルを用いて、それらの血清ＡＬＴレベルによって識別されうる。
−正常上限値を下回る治療前ＡＳＴレベルを有する対象は、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療に対するレスポンダーである可能性が高い。いくつかの実施態様において、レスポンダーおよび非レスポンダーまたは部分レスポンダーは、（適当な）レスポンダーを示す正常上限値を下回るＡＳＴレベル、および（適当な）非レスポンダーまたは（適当な）部分レスポンダーを示す正常上限値を超える、例えば１．５倍の正常上限値を下回る、例えば２倍の正常上限値を下回る、例えば３倍の正常上限値を下回る、例えば４倍の正常上限値を下回る、例えば５倍の正常上限値を下回る、ＡＳＴレベルを用いて、それらの血清ＡＳＴレベルによって識別されうる。
−正常上限値を下回る治療前ＧＧＴレベルを有する対象は、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療に対するレスポンダーである可能性が高い。いくつかの実施態様において、レスポンダーおよび非レスポンダーまたは部分レスポンダーは、レスポンダーを示す正常上限値を下回るＧＧＴレベル、および非レスポンダーまたは部分レスポンダーを示す正常上限値を超える、例えば１．５倍の正常上限値を下回る、例えば２倍の正常上限値を下回る、例えば３倍の正常上限値を下回る、例えば４倍の正常上限値を下回る、例えば５倍の正常上限値を下回る、ＧＧＴレベルを用いて、それらの血清ＧＧＴレベルによって識別されうる。
−正常上限値を下回る治療前ｍｉＲ−１２２レベルを有する対象は、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療に対するレスポンダーである可能性が高い。いくつかの実施態様において、レスポンダーおよび非レスポンダーまたは部分レスポンダーは、（適当な）レスポンダーを示す正常上限値を下回るｍｉＲ−１２２レベル、および（適当な）非レスポンダーまたは（適当な）部分レスポンダーを示す正常上限値を超える、例えば１．５倍の正常上限値を下回る、例えば２倍の正常上限値を下回る、例えば３倍の正常上限値を下回る、例えば４倍の正常上限値を下回る、例えば５倍の正常上限値を下回る、ｍｉＲ−１２２レベルを用いて、それらの血清ｍｉＲ−１２２レベルによって識別されうる。
【００４２】
本明細書に示されるように、複数の、例えば、２、３または４種の血清バイオマーカーのアッセイ結果を組み合わせることによって、レスポンダー対非レスポンダーまたは部分レスポンダーの予測の正確性を非常に高めることができ、そうして予測値は改善されうる。下表は、用いられうる血清バイオマーカーの組み合わせのいくつかの例を示す：
【表１】
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【００４３】
以下に示されるように、血清バイオマーカーの組み合わせを用いる場合、異なる分類器構造は、予測(predictive)（予測(prognostic)）値を最適化するために用いられうる。
【００４４】
分類器／決定木
いくつかの実施態様において、血清バイオマーカー、例えば、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ｍｉＲ−１２２、および／またはＧＧＴのレベルが（対象からの）血清サンプル中で検出される場合、それらは、分類器（または決定木）を用いて、治療に対するレスポンダーまたは非レスポンダーのいずれかとして患者を分類するために用いられうる。かかる分類器は、レスポンダーおよび非レスポンダーにおけるＡＬＴ、ＡＳＴ、ｍｉＲ−１２２、およびＧＧＴレベルのパターン間の「有意差」に基づきうる。かかるパターン間の有意差は、異なる実施態様において、統計的有意差を示し、あるいは他の実施態様において、当業者によって認識される有意差を示す。有利なことには、本発明の方法は、治療に対する無反応または反応のいずれかに関連する病態を患う患者から得られたサンプルのパターン間を識別するために、学習の活用およびパターン認識分析器、クラスタリングアルゴリズムなどを利用しうる。該有意差はまた、かかる手法で得られた所定の分類規則または閾値に関する検定サンプルのパターンを評価しうる。一つの実施態様において、分類規則は、実施例５に記載されるように、決定木の形態でありうる。
【００４５】
予測方法
本発明は、抗ウイルス剤、例えばミクロＲＮＡ−１２２阻害剤（例えば、ミラビルセン）でのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した対象の治療の適合性を決定する方法を提供する。本発明は、ＨＣＶに感染した対象の血清に存在する肝機能マーカーが、前記ＨＣＶ療法に反応する対象とＨＣＶ療法に反応しない（またはＨＣＶ療法に部分的にのみ反応する）対象の亜集団を識別するために用いられうるという驚くべき所見に基づく。レスポンダーと非レスポンダーを識別することに加えて、本発明の方法は、ＨＣＶに感染した（および前記ＨＣＶ感染症の有効な治療を必要とする）対象における前記ＨＣＶ療法の（適当な）有効量を決定するために用いられうる。
【００４６】
血清バイオマーカー
肝機能に関する多数の血清バイオマーカーが既知であり、非限定的な例として、以下のものが、肝機能に関するマーカーまたは適当なマーカーとして関与している：レクチン反応性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ−Ｌ３）、Ｄｅｓ−ガンマ−カルボキシ−プロトロンビン（ＤＣＰ）、ＥＲ６Ｑ、ビメンチン、アクチンアルファ１骨格筋タンパク質、ｈＭＦＡＰ４、トロポミオシン、ＰＴＧＥＳ２、アミロイドＰ成分、トランスジェリン、カルポニン１、ヒトｐ２０タンパク質、１７ｋＤａミオシン軽鎖、Ｈ鎖Ｈ  Ｉｇｇ  Ｂ１２、プロリル  ４−ヒドロキシラーゼ、βサブユニットメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ１、ＰＲＯ２６１９、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１、フィブリノーゲンアルファ鎖プレプロタンパク質、フルクトース二リン酸アルドラーゼＢ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、Ｅｅｆｌａ２、ＡＴ  Ｐ  ５  Ａｌ、α−２アクチン、レグカルシン、血清アルブミン、ミトコンドリアのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ミトコンドリアのアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパスコア(Hepascore)、プロトロンビン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、アポリポタンパク質Ａ１（ＰＧＡ）指数、年齢血小板（ＡＰ）指数、Ｂｏｎａｃｉｎｉ指数、Ｐｏｈｌスコア、Ｆｏｒｎｓ指数、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／血小板の比（ＡＰＲＩ）、ＭＰ３（ＭＭＰ１，ＰＩＩＮＰ）指数、ＦＩＢ４、およびＦｉｂｒｏＩｎｄｅｘ．
【００４７】
肝機能に関する（血液）血清バイオマーカーには、例えば、ミクロＲＮＡ−１２２レベル（例えば、配列番号２）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ガンマＧＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）が含まれる。他の肝機能マーカーは本明細書において提供され、結果は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴおよびミクロＲＮＡ−１２２血清レベルが最も多い予測値のバイオマーカーであるのに対し、評価された多数のバイオマーカーは、ほとんど予測値がないかまたは全くないことを示す。いくつかの実施態様において、肝機能マーカーは、肝障害に関連しうる。特定の理論に制限されるつもりはないが、本発明は、ミラビルセン治療に対して無反応であったかまたは低量のミラビルセン（例えば、３ｍｇ／ｋｇ／体重以下）で反応しなかったＨＣＶ感染対象が、その血液中に肝臓障害に関連するバイオマーカー、特に、ミクロＲＮＡ−１２２、ＡＬＴ、ＡＳＴおよび／またはＧＧＴのレベルを非常に上昇させていたという所見に基づく。
【００４８】
血清バイオマーカーレベルは、典型的には、治療前に評価される。該バイオマーカーは、肝機能を示すかあるいは肝機能に関連する血清バイオマーカーでありうる。典型的には、血清バイオマーカーは、対象から得られた血清サンプル中で評価される。血液バイオマーカーは、例えば、血清または血漿中に存在するバイオマーカーでありうる。
【００４９】
血清バイオマーカーの評価時点
適当には、血清バイオマーカー（複数可）レベルは、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤との初回（またはいくつかの実施態様において、次回）投与前に、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療前、例えば約６ヶ月以内、例えば約５ヶ月以内、例えば約４ヶ月以内、例えば約３ヶ月以内、例えば約２ヶ月以内、例えば約１ヶ月以内、例えば約４週間以内、例えば約３週間以内、例えば約２週間以内、例えば約１週間以内、例えば約１、２、３、４、５または６日以内に評価される。いくつかの実施態様において、血清バイオマーカーレベルの評価は、ｉ）ＨＣＶに感染したヒト対象から血液サンプルを得る工程、およびｉｉ）血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程の逐次的工程に関与する。
【００５０】
ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での治療中、対象が、ウイルス価の増加によって測定されるように、治療に対して反応しなくなる場合、本発明の方法は、増加した投与量のミクロＲＮＡ−１２２阻害剤が治療の有効性を回復させるのに必要でありうるかどうかを決定するために利用されうることが分かるであろう。したがって、本発明の方法は、治療期間前または治療期間中のいずれかに対象に投与される、有効量のミクロＲＮＡ−１２２阻害剤を確保するために用いられうる。
【００５１】
血清ミクロＲＮＡの予測値
いくつかの態様において、本発明は、ミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２の血清レベルがミラビルセン治療に対する反応性を識別するといった驚くべき所見に基づく。したがって、本発明は、ミクロＲＮＡの発現または過剰発現に関連する疾患を患う対象の治療の適合性を決定する方法であって、
ｉ）対象から血清サンプルを得る工程
ｉｉ）血清サンプル中の少なくとも１種のミクロＲＮＡバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のミクロＲＮＡバイオマーカーレベルと１つまたはそれ以上の対照サンプルまたは対照値を比較する工程を含み、対象が、疾患の治療に適している可能性があるかまたはそれに適しているかどうかを決定する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、ミクロＲＮＡは、肝臓で発現したミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２であり、疾患は、肝疾患、例えば、肝炎、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎もしくはＤ型肝炎または非アルコール性脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎である。肝臓で発現したミクロＲＮＡには、限定されるものではないが、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２００、およびｍｉＲ−２２１が含まれる（Ｌａｎｄｇｒａｆ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｔｌａｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｃｅｌｌ  １２９（７）：１４０１−１４）。
【００５２】
血清バイオマーカーとしてのｍｉＲ−１２２
本発明において、上昇したまたは高レベルの血清ミクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２は、一般的に、ミラビルセン反応グレードの低下と相関することが見出された。これは、肝ｍｉＲ−１２２レベルの低下が不良な反応と相関する場合のインターフェロンでの治療について報告されたことと対極するものである。したがって、血清ｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンで治療効果を示すバイオマーカーである。
【００５３】
ミクロＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）は、肝臓に非常に豊富にあるミクロＲＮＡであり（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ（２００２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ  ｖｏｌ  １２  ｐｐ７３５−７３９）、ＨＣＶの５’非コーディング領域とのオリゴマー複合体を形成することによって肝細胞に豊富にあるＨＣＶ  ＲＮＡに必須であることが報告されている、異なる宿主細胞因子である（Ｊｏｐｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｍａｃｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１１）。ｍｉＲ−１２２は、多数の形態（成熟ミクロＲＮＡ（配列番号２）を含む）およびその前駆体、例えば、配列番号１で示される配列で存在する。成熟ミクロＲＮＡは、２つの形態で存在し、１つは配列番号２に示される２２ｎｔ  ミクロＲＮＡ配列であり、さらなる形態は、さらに３’Ｕ残基がある。
【００５４】
ｍｉＲ−１２２シード配列は、成熟ｍｉＲ−１２２配列の５’末端から２ないし８個のヌクレオシド、すなわち、５’−ＧＧＡＧＵＧＵ−３’を示す。
【００５５】
ｍｉＲＢａｓｅによれば、ヒトｍｉＲ−１２２配列、ｈｓａ  ｍｉＲ−１２２の配列は、以下の通りである：
＞ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２前駆体配列（ｍｉＲＢａｓｅ）  ＭＩ００００４４２：
ＣＣＵＵＡＧＣＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵＧＵＣＵＡＡＡＣＵＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＵＵＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡＡＵＡＧＣＵＡＣＵＧＣＵＡＧＧＣ（配列番号１）
【００５６】
成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２配列（ｍｉＲＢａｓｅ）  ＭＩＭＡＴ００００４２１：
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（Ｕ）（配列番号２）
【００５７】
血清ミクロＲＮＡレベル、例えば成熟ｍｉＲ−１２２レベルは、非限定的な例として、限定されるものではないが、Ａｓｕｒａｇｅｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｒｏｕｐ（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）によって確立された方法およびｍｉＲ−１２２に特異的なＲＴ−ｑＰＣＲ，例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，）によるかかるＲＮＡサンプルにおける血清ｍｉＲ−１２２レベルの定量化を用いて、血清サンプルからＲＮＡを抽出することによって定量化されうる。潜在的な免疫学的アッセイ、例えばＥＬＩＳＡを含む、他のアッセイも適用可能でありうると予測される。
【００５８】
血清中に存在するｍｉＲ−１２２レベルは、絶対値としてまたは基準値に対する比率として決定されうる。ｍｉＲ−１２２値の正規化の基準として用いられうるミクロＲＮＡのバイオマーカーには、血漿中レベルが一定であるミクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−３４５および／またはｍｉＲ−１７／１８ａの組み合わせ（安定な正規化基準）が含まれる。
【００５９】
ｍｉＲ１２２のカットオフ値および範囲の例：
いくつかの実施態様において、ΔＣｔ（ｍｉＲ−１２２）＞３、例えば＞４、例えば＞５、例えば＞６、例えば＞７、例えば＞８は、非レスポンダーまたは低レスポンダーを示す。
【００６０】
ΔＣｔは、対照ミクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１７またはｍｉｒ−１８ａの閾値サイクルの平均値から減算されたｍｉｒ−１２２の閾値サイクル（Ｃｔ）として定義される。閾値サイクル（Ｃｔ）は、ｑＰＣＲ反応中に生成された蛍光が閾値を超えるサイクル数を示す。そのように特定のウェルに付与されたＣｔ値は、十分な数の単位複製配列が、そのウェルにおいて、基準値を超える統計的に有意な時点になるように積み重なる反応中の時点を示す。
【００６１】
いくつかの実施態様において、適当な非レスポンダーまたは低レスポンダーの血中ｍｉＲ−１２２レベルは、ｍｉＲ−１２２の正常な血清レベルの、正常上限値の５倍を上回る、例えば６倍の正常上限値を上回る、例えば７倍の正常上限値を上回る、例えば８倍の正常上限値を上回る、例えば９倍の正常上限値を上回る、例えば９倍の正常上限値を上回る、例えば１０倍の正常上限値を上回る、例えば１１倍の正常上限値を上回る、例えば１２倍の正常上限値を上回る、例えば１３倍の正常上限値を上回る、例えば１４倍の正常上限値を上回る、例えば１５倍の正常上限値を上回る。
【００６２】
ミクロＲＮＡは、多数の方法で、例えばマイクロアレイ、ノーザンブロット、ドットブロット、ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ、定量的質量分析、シークエンシング、または種々の定量的ＰＣＲによる技法によって検出されうる。したがって、血清ミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２レベルは、非限定的な例として、限定されるものではないが、Ａｓｕｒａｇｅｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｒｏｕｐによって確立された方法（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いてヒト血清サンプルからＲＮＡを抽出し、次いで、ｍｉＲ−１２２に特異的なＲＴ−ｑＰＣＲ、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，）によってかかるＲＮＡサンプル中の血清ｍｉＲ−１２２レベルを定量することによって、通常定量化されうる。ｍｉＲ−１２２値の正規化の基準として用いられうる、血清ミクロＲＮＡバイオマーカーには、血清中の発現が一定であるミクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−３４５および／またはｍｉＲ−１７／１８ａの組み合わせ（安定な正規化基準）が含まれる。
【００６３】
ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（本明細書では、ＧＧＴとも称される）
ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼまたはガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（また、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ＧＧＴ、ＧＧＴＰ、ガンマ−ＧＴ）（ＥＣ  ２．３．２．２）は、ガンマ−グルタミル官能基を転移する酵素である。それは、多数の組織で見出されており、その代表は肝臓であり、診断マーカーとして医薬の分野で重要である。血清ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）レベルの増加は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症でよく観察され、ＧＧＴの上昇は、慢性Ｃ型肝炎におけるより進行した肝疾患の間接的マーカーである。
【００６４】
ＧＧＴの血液試験結果は、集団の９７．５パーセンタイル値（いわゆる、「正常上限値」）は女性では約４５ＩＵ／Ｌであり、男性では約７５ＩＵ／Ｌであることを示唆しているが、対照集団および用いられるアッセイによって決まる。
【００６５】
ガンマＧＴカットオフ値／範囲の例：
いくつかの実施態様において、推定非／部分レスポンダーの血清中ＧＧＴレベルは、＞１．５倍の正常上限値、例えば＞２倍の正常上限値、例えば＞３倍の正常上限値、例えば＞４倍の正常上限値、例えば＞５倍の正常上限値である。
【００６６】
いくつかの実施態様において、雌の推定非／部分レスポンダーのＧＧＴレベルは、＞６０ＩＵ／Ｌ、例えば＞７０ＩＵ／Ｌ、例えば＞８０ＩＵ／Ｌ、例えば＞９０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１００ＩＵ／Ｌである。
【００６７】
いくつかの実施態様において、雄の推定非／部分レスポンダーのＧＧＴレベルは、＞１００ＩＵ／Ｌ、例えば＞１１０ＩＵ／Ｌ，例えば＞１２０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１３０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１４０ＩＵ／Ｌである。
【００６８】
プロトロンビン時間
プロトロンビン時間（ＰＴ）は、血液凝固の外因経路の測定値である。それは、血液の凝固傾向を決定するために用いられ、肝臓障害（肝機能）の程度ならびに他の因子を決定するために用いられうる。標準アッセイを用いて、プロトロンビン時間の対照範囲は通常、約１０−１３秒である。上昇したＰＴ、例えば１７秒は、重篤な肝臓障害を示す。いくつかの実施態様において、推定非／部分レスポンダーのＰＴレベルは、＞１倍の正常値、例えば＞１．１倍の正常値、例えば＞１．２倍の正常値、例えば＞１．３倍の正常値、例えば＞１．４倍の正常値、例えば＞１．５倍の正常値を超える。
【００６９】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（本明細書では、ＡＬＴまたはＡＬＡＴとも称される）
背景：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）または血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ｓＧＰＴ）としても知られており、細胞窒素代謝、アミノ酸代謝および肝臓でのグルコール新生に関与するホモ二量体細胞質ピリドキサルリン酸塩依存性酵素である。ＡＬＴは、主な中間代謝産物の変換を媒介し、アラニンとα−ケトグルタル酸間の可逆的アミノ基転移を触媒して、ピルビン酸およびグルタミン酸を形成する。ＡＬＴは、多数の組織に広く分布されているが、肝臓において最も多量に見出される。肝臓中のＡＬＴの主な役割は、アラニンのグルコースへの変換であり、次いで、それは多数のプロセスにて利用されるために体内に輸送される。
【００７０】
ＡＬＴ測定：ＡＬＴ活性の測定は、一般的に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を利用する共役反応系においてＮＡＤＨ酸化の割合を測定することによって行われる。ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化は、３４０ｎｍでの吸光度の低下を伴う。ＡＬＴ活性が律速である場合、割合の減少は、サンプル中のＡＬＴ活性に直接的に比例する。ＡＬＴを測定するためのプロトコールは、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＬＴアッセイ（０３８１５１５１  Ｒｅｖ．Ｂ  ２００７−０５）（本明細書によって引用される）であってもよい。
【００７１】
ＡＬＴは、肝機能を決定するために、肝細胞損傷の診断的評価の一部として臨床的に一般に測定される。診断に用いられる場合、それは、ほとんどの場合、国際単位／リットル（Ｕ／Ｌ）で測定される。元の値(source)が特定の正常範囲値によって変化する場合、大部分は、正常値である５−６０Ｕ／Ｌを示す。ＡＬＴレベルの上昇が血中で見出される場合、可能性のある根本的原因は、他の酵素を測定することによってさらに絞り込むことができる。例えば、肝細胞損傷によるＡＬＴレベルの上昇は、アルカリホスファターゼを測定することによって胆管の問題と区別されうる。ＡＬＴの上昇は、多くの場合、ＨＣＶ関連疾患および肝臓障害の進行に関連しており、免疫学に基づく試験の導入前は、ＡＬＴの上昇は潜在的なＨＣＶ感染症のスクリーニング検査に用いられていた。
【００７２】
いくつかの実施態様において、推定非／部分レスポンダーの血清中ＡＬＴレベルは、（例えば、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓアッセイを使用する場合）＞６９ＩＵ／Ｌ、例えば＞７０ＩＵ／Ｌ、例えば＞７５ＩＵ／Ｌ、例えば＞８０ＩＵ／Ｌ、例えば＞９０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１００ＩＵ／Ｌ、例えば＞１１０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１２０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１３０ＩＵ／Ｌ、例えば＞１５０ＩＵ／Ｌ、例えば＞２００ＩＵ／Ｌである。
【００７３】
いくつかの実施態様において、推定非／部分レスポンダーの血清中ＡＬＴレベルは、＞１．３倍の正常値、例えば＞１．４倍の正常値、例えば＞１．５倍の正常値、例えば＞２倍の正常値、例えば＞３倍の正常値、例えば＞４倍の正常値、例えば＞５倍の正常値である。
【００７４】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（本明細書では、ＡＳＡＴとも称される）
背景：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）または血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）としても知られており、ピリドキサルリン酸塩（ＰＬＰ）依存性トランスアミナーゼ酵素である。ＡＳＴは、アスパラギン酸とグルタミン酸間のα−アミノ基の可逆的転移を触媒し、それ自体としてアミノ酸代謝における重要な酵素である。ＡＳＴは、肝臓、心臓、骨格筋、腎臓、脳および赤血球細胞にて見出され、肝臓の健康のマーカーとして臨床的に一般に測定される。
【００７５】
測定：一般的に、ＡＳＴ活性アッセイは、ＡＳＴによって産生されるオキサロ酢酸の定量化に基づく。該アッセイにおいて、オキサロ酢酸およびＮＡＤＨは、酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼによってリンゴ酸とＮＡＤに変換される。３４０ｎｍでのＮＡＤＨ吸光度の減少は、ＡＳＴ活性に比例する。
【００７６】
基本的方法：例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  Ｈ．Ｕ．，Ｓｃｈｅｉｂｅ  Ｐ．およびＷａｈｌｅｆｅｌｄ  Ａ．Ｗ．（１９７８）．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２４（１）：５８−７３またはＢｏｗｅｒｓ  Ｊｒ  Ｇ．Ｎ．およびＭｃＣｏｍｂ  Ｒ．Ｂ．（１９８４）．Ａ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｃａｌｅ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０（７）：１１２８−１１３６を参照。ＡＬＴを測定するためのプロトコールは、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＬＴアッセイ（０３９０３１６６  Ｒｅｖ．Ｂ２００７−０５）（本明細書によって引用される）であってもよい。
【００７７】
いくつかの実施態様において、推定非／部分レスポンダーの血清中ＡＳＴレベルは、＞１．３倍の正常値、例えば＞１．４倍の正常値、例えば＞１．５倍の正常値、例えば＞２倍の正常値、例えば＞３倍の正常値、例えば＞４倍の正常値、例えば＞５倍の正常値である。
【００７８】
いくつかの実施態様において、非または部分レスポンダーを示す血液（血清／血漿）中ＡＳＴレベルは、（例えば、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓアッセイを用いる場合）＞５０ＩＵ／Ｌ、例えば＞５５ＩＵ／Ｌ、例えば＞６０ＩＵ／Ｌ、例えば＞６５ＩＵ／Ｌ、例えば＞７０ＩＵ／Ｌ、例えば＞７５ＩＵ／Ｌ、例えば＞８０ＩＵ／Ｌ、例えば＞８５ＩＵ／Ｌ、例えば＞９０ＩＵ／Ｌ、例えば＞９５ＩＵ／Ｌ、例えば＞１００ＩＵ／Ｌである。
【００７９】
ＡＳＴ／ＡＬＴ比：
ＡＳＴ：ＡＬＴ＞１または＝１は、非常に特異的であるが、慢性ＨＣＶ感染症を患う患者における肝硬変の存在を診断するものではないことが報告されている。該比率は、これらの患者における線維症の悪性度を示す。いくつかの実施態様において、推定非／部分レスポンダーの血清中ＡＳＴ／ＡＬＴ比は、少なくとも１、例えば＞１、例えば＞１．１、例えば＞１．２、例えば＞１．３、例えば＞１．４、例えば＞１．５である。
【００８０】
ミクロＲＮＡの検出プローブおよびアッセイ：
本発明は、ＨＣＶ治療剤、例えばミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療のための対象の適合性の可能性または適合性を決定することに用いるための、１つまたはそれ以上のミクロＲＮＡ、例えば１つまたはそれ以上の肝特異的ミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２（例えば、成熟ｍｉＲ−１２２）（を含む）の検出プローブ（または検出プローブのペア）を提供する。本明細書におけるミクロＲＮＡ−１２２阻害剤で例示されるように、血清中肝特異的ミクロＲＮＡレベルは、治療のための対象の適合性に逆相関しうる。
【００８１】
したがって、本発明の検出プローブは、コンパニオン診断として用いられうる。検出プローブは、キット（本明細書では、診断キットとも称される）の形態でありうる。したがって、検出プローブ（複数可）は、定量化アッセイの一部を構成しうる。キットは、例えば、本明細書に記載の他の血清バイオマーカー、例えばＡＬＴ、ＡＳＴおよび／またはＧＧＴ、および／または１つもしくはそれ以上の対照ミクロＲＮＡ、例えば１つもしくはそれ以上の血清中レベルが一定であるミクロＲＮＡの定量化アッセイをさらに含む。
【００８２】
ミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２は、ハイブリダイゼーションによる技法を用いてサンプル中で検出されうる。ミクロＲＮＡ−１２２検出プローブは、例えば、成熟ミクロＲＮＡ−１２２配列に存在する少なくとも６個、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドに相補的である連続した核酸塩基配列を含む、オリゴヌクレオチド（オリゴマー）であってもよい。オリゴマーは、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤に関して本明細書に定義のとおりであってもよい−例えば、ヌクレオシド類似体、例えばＬＮＡの使用によって改変されてもよい。検出プローブは、連続した核酸塩基配列と同じ長さであってもよくまたはいくつかの実施態様において、より長くてもよい、例えば、長さが最大３０、例えば最大４０、例えば最大５０のヌクレオチドであってもよい。
【００８３】
検出プローブは、典型的には、ヌクレオチド標的に相補的な認識配列、例えばＲＮＡ（またはＤＮＡ）標的配列を含む。検出プローブは、ラベル化されうる、すなわち、１またはそれ以上のラベルを含む。本明細書に用いられる、用語「ラベル」は、検出可能（好ましくは、定量化可能）なシグナルを提供するために用いられ、核酸またはタンパク質に結合しうる、任意の原子または分子を示す。ラベルは、蛍光、放射線、比色分析、Ｘ線回折また吸収、磁気、酵素活性、免疫活性などによって検出できるシグナルを提供しうる。本発明に記載の検出プローブの検出素子は、（例えば、プローブの各末端または内部位置にラベルを含むことによって）一重ラベル化または二重ラベル化されうる。一つの態様において、検出プローブは、該プローブが標的配列にハイブリダイズする場合にシグナルまたはシグナルの変化を検出できるように、シグナルを生成するかまたはシグナルを修飾しようとして互いに相互作用しうる２つのラベルを含む。特定の態様は、２つのラベルが消光分子およびレポーター分子を含む場合である。「ステム領域を有する分子指標」と称される本発明の特定の検出態様は、認識部分がヘアピンを形成するためにアニールしうる第１および第２の相補的ヘアピン形成配列によって配置されている場合である。レポーターラベルは、１つの相補的配列の末端に結合し、消光部分は、他の相補的配列の末端に結合する。第１および第２の相補的配列がハイブリダイズする場合（すなわち、プローブ認識部分がその標的とハイブリダイズしない場合）に形成されるステムは、これらの２つのプローブが互いに極めて近い位置を保持し、レポーターによって得られたシグナルを蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)によって消光させる。２つのラベルの近接は、プローブが標的配列とハイブリダイズし、近接の変化がラベル間の相互作用の変化をもたらす場合に縮小される。したがって、プローブのハイブリダイゼーションは、検出および／または定量化されうる、レポーター分子によってもたらされるシグナル（例えば、蛍光）をもたらす。本発明に関して、用語「ラベル」は、その自体または検出シリーズの一部として検出可能である、レポーター基を意味する。レポーター基の官能基部分の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基（特定の波長の電磁放射、例えば、光またはＸ線を吸収することが可能であり、続いて、より長い波長の放射線として吸収されるエネルギーを再放射する、基；例として、ＤＡＮＳＹＬ（５−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−４，４−ジメチルオキサゾリジン）、ＰＲＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン）、ＴＥＭＰＯ（Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、Ｃｙ３およびＣｙ５（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の商標）、エリトロシン、クマリン酸、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒｏｘ、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン、フルオレセイン、ユーロピウム、ルテニウム、サマリウム、および他の希土類金属が挙げら��る）、放射性同位体ラベル、化学発光ラベル（化学反応中、発光を介して検出可能であるラベル）、スピンラベル（フリーラジカル（例えば、置換有機ニトロキシド）または電子スピン共鳴分光法の使用によって検出可能である生体分子と結合する他の常磁性プローブ（例えば、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋））である。特に興味深い例は、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム、ユーロピウム、Ｃｙ５、Ｃｙ３などである。
【００８４】
ミクロＲＮＡ発現検出法（Ｗａｎｇ，Ｚｈｉｇｕｏ，Ｙａｎｇ，Ｂａｏｆｅｎｇ）  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＩＳＢＮ  ９７８−３−６４２−０４９２７−９は、サンプル中のミクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２を検出および定量化するために用いられうるミクロＲＮＡ検出法のレビューを提供する。方法には、ｍｉＲＮＡアッセイ、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ｍｉＲ−Ｑ  ＲＴ−ＰＣＲ、ステム−ループＲＴ−ＰＣＲが含まれる。
【００８５】
ハイブリダイゼーション／ＰＣＲに基づくアッセイの例として、
・ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）検出プローブ／アッセイ（Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ）
・Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＰＣＲシステム
・Ａｍｂｉｏｎ  ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍｉＲＮＡ検出キット、
・ＡＢ  Ｔａｑｍａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイ
・Ｍｉｒ−Ｘ  ｍｉＲＮＡ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＳＹＢＲ（登録商標）キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）
が挙げられる。
【００８６】
他のアッセイには、
・ＥＬＩＳＡアプローチ（例えば、ＨＦＨによる）
・Ｓｉｇｎｏｓｉｓ  ｍｉＲＮＡプレートアッセイ（および同様のストレプトアビジン／ビオチンＨＲＰ化学発光アッセイ）
が含まれる。
【００８７】
ｑＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用する場合、特異的ミクロＲＮＡの発現レベルの１つの測定は、実施例に記載の、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた、Ｃｔで示される、「閾値サイクル値」である。特異的ミクロＲＮＡの発現レベルの別の測定は、同様にリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた、Ｃｐで示される、「クロッシングポイント値」である。ミクロＲＮＡ発現レベルのＣｔおよびＣｐ測定は、大体同様の測定を提供する、Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ（編集者）  Ａ−Ｚ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，  ＩＵＬ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５（２００４）を参照。ＣｔまたはＣｐの使用は、アッセイを実施する機械によって決まる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０リアルタイムＰＣＲシステムで増幅される場合、特異的ミクロＲＮＡの発現レベルはＣｐを用いる。応用Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ装置で増幅される場合、特異的ミクロＲＮＡの発現はＣｐを用いる。
【００８８】
対照サンプルまたは対照値
いくつかの実施態様において、ＨＣＶ感染症を患う対象から得られた血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルは、対照サンプルまたは対照値の少なくとも１種のバイオマーカーレベルと比較される。
【００８９】
予測方法において用いるために、典型的には、対照サンプルまたは対照値は、既知のまたは所定のレベルのバイオマーカーおよび前記治療（例えば、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセン）に対する既知の反応性を有する少なくとも１の対象（適当な対象集団）から得られる。いくつかの実施態様において、少なくとも１種のバイオマーカーレベルは、既知のまたは所定のレベルのバイオマーカーおよび前記治療に対する既知の反応性を有する対象集団から得られた対照値のデータベースと比較される。いくつかの実施態様において、対照値は、本明細書に記載の、正常上限値を示す値またはその数値（倍数）であってもよい。
【００９０】
そのため、いくつかの実施態様において、対照値は、対照値のデータベースから決定された所定のカットオフ値であってもよい。本明細書において、適当なカットオフ値の例が提供される。データベースがより包括的になるにつれて、個々のカットオフ値を付与しうる精度が改善されることを認識すべきである。さらに、本明細書にて示されるように、任意の１種の血液バイオマーカーに付与される実際のカットオフ値は、血液バイオマーカーレベルがアッセイされている状況、例えば、他の血液バイオマーカーおよび比較段階において用いられる分類器構造の選択によって決まる。
【００９１】
いくつかの点において、対照値は、少なくとも１種の前記バイオマーカーの正常レベルまたは範囲である。
【００９２】
本明細書に記載の診断方法において、対照サンプルまたは対照値は、既知のまたは所定のレベルのバイオマーカーおよびヒト対象におけるＣ型肝炎の既知の進行度、例えば、肝臓中の壊死性炎症のレベル（例えば、本明細書に記載の肝生検組織によって評価される）を有する少なくとも１の対象（適当な対象集団）から得られる。
【００９３】
いくつかの実施態様において、本発明は、前記対照値のデータベースおよび対象から得られた血液サンプルから得られるバイオマーカー値（複数可）と対照値のデータベースとを比較するプログラムを含むコンピュータシステムに関する。コンピュータプログラムは、いくつかの実施態様において、１またはそれ以上の分類器アルゴリズムを含みうる。
【００９４】
カットオフ値／分類器の例
推定非／部分レスポンダーは、血清バイオマーカーレベルが対象が非または部分レスポンダーでありうる尤度（または傾向）を示す、対象である。本明細書に記載されるように、複数の、例えば、２、３、４、５または６種のバイオマーカーの血清バイオマーカー値を組み合わせることによって、非または部分レスポンダーの指定において達成される信頼度は非常に強化されうる。これに関して、バイオマーカー、例えばｍｉＲ−１２２、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ガンマＧＴおよびＰＴは推定非レスポンダーの優れた指標であるけれども、非レスポンダー、部分レスポンダーおよびレスポンダーを正確に識別するための能力は、複数のバイオマーカーを統合することによって非常に強化される。
【００９５】
いくつかの実施態様において、少なくとも２種のバイオマーカー、例えば、本明細書に記載の、例えばｍｉＲ−１２２、ガンマＧＴ、ＡＳＡＴ、およびＡＬＡＴ（またはＡＳＡＴ／ＡＬＡＴ比）からなる群から選択される、少なくとも２種のバイオマーカーのレベルを測定する。
【００９６】
いくつかの実施態様において、少なくとも３種のバイオマーカー、例えば、本明細書に記載の、例えば、血液凝固（例えば、ＰＴ）、ｍｉＲ−１２２、ガンマＧＴ、ＡＳＡＴ、およびＡＬＡＴ（またはＡＳＡＴ／ＡＬＡＴ比）からなる群から選択される、少なくとも３種のバイオマーカーのレベルを測定する。
【００９７】
いくつかの実施態様において、少なくとも４種のバイオマーカー、例えば、本明細書に記載の、例えば、血液凝固（例えば、ＰＴ）、ｍｉＲ−１２２、ガンマＧＴ、ＡＳＡＴ、およびＡＬＡＴ（またはＡＳＡＴ／ＡＬＡＴ比）からなる群から選択される、少なくとも４種のバイオマーカーのレベルを測定する。
【００９８】
本明細書に例示されるように、非レスポンダーまたは部分レスポンダーを識別するバイオマーカーの特異的組み合わせは、対象が、レスポンダー、部分レスポンダーまたは非レスポンダーである非常に正確に予測できるように異なるバイオマーカーから得られた結果を統合する分類器に分類されうる。得られた結果に基づく、非限定的な例によれば、１の特に有用な分類器は図３に示され、ＡＬＡＴの正常レベル（例えば、６９ＩＵ／Ｌ以下）がレスポンダーを予測しているのに対し、ＡＬＡＴ＞６９ＩＵ／Ｌのレベルは非レスポンダーを予測しうるが、ｍｉＲ−１２２のレベルが上昇するか（例えば、−デルタＣγ＞３）、またはＧＧＴが上昇する（例えば、＞１５８ＩＵ／Ｌ）場合に、非レスポンダーを完全に予測している。したがって、実施例に示されるように、対象が、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤での治療に対して、非レスポンダーであること、そして、レスポンダーであることを非常に正確に予測することは可能である。
【００９９】
ＨＣＶ感染症／ウイルス価アッセイ
血清または肝臓中のＨＣＶ ＲＮＡの存在は、ＨＣＶ感染症の第１の根拠である。ＨＣＶ ＲＮＡは、一部接種材料の大きさに応じて、曝露後数日ないし８週以内にＰＣＲによって血清中で検出可能である。
【０１００】
分子ウイルス学的技法は、診断および治療のモニタリングにおいて重要な役割を果たす。ウイルスを培養することは困難であるため、Ｃ型肝炎ウイルス感染症は、核酸テスト（ＮＡＴ）を介するウイルスＲＮＡの検出によって確認され、これらのテストは、抗ウイルス療法に対する反応をモニターするために用いられる（Ｓｃｏｔｔ  ＪＤ  ａｎｄ  Ｇｒｅｔｃｈ  ＤＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｎ．２００７；２９７：７２４−３２．）。
【０１０１】
抗ＨＣＶ ＥＬＩＳＡテストは、早ければ曝露後第８週に陽性になる。症候性急性感染症を患う約半数の患者は、初めて症状が見つかる場合、ＥＬＩＳＡによって検出可能なＨＣＶに対する抗体を有する。しかしながら、ＨＣＶ抗体の成長は、無症状感染症を患う患者では遅延しうる。
【０１０２】
核酸テストは、増殖および検出技法を組み合わせて、ＨＣＶ ＲＮＡの存在を直接的に検出する。特定の稀な臨床的状況を除き、ＮＡＴは、ＨＣＶ感染症を確認するための好ましいテストとして組換え免疫ブロット法に取って代わった。核酸テストは、定性試験（定性ポリメラーゼ鎖反応［ＰＣＲ］、転写増幅法［ＴＭＡ］）、定量試験（分枝鎖ＤＮＡ［ｂＤＮＡ］増殖法、定量化ＰＣＲ／リアルタイムＰＣＲ）に分類される。
【０１０３】
標準的ＨＣＶ療法において、抗ウイルス療法の全ての候補は、ＨＣＶ ＲＮＡ定量化アッセイを用いてウイルス価を試験すべきである。標的増幅アッセイおよびシグナル増幅分枝アッセイの両方とも、１０１ないし１０６ＩＵ（ｍＬ）の定量化の範囲で、通常用いられる。療法の終わりのウイルス学的反応（治療終了反応）または治療終了後６ヶ月のＳＶＲ（持続ウイルス反応）のドキュメンテーションについて、より高感度な定量的ＨＣＶ ＲＮＡアッセイ（例えば、〜５０ＩＵ／ｍＬの感度閾値を有する、リアルタイムＴａｑＭａｎポリメラーゼ鎖反応）または定性的ＨＣＶ ＲＮＡアッセイ（５０〜ＩＵ／ｍＬの定量下限値を有する、ポリメラーゼ鎖反応または転写増幅法に基づく）が推奨される。ＨＣＶ定量化アッセイは、治療に対するウイルス学的反応を立証するために通常用いられ、典型的には、同一アッセイは、治療前および治療後に用いられる。典型的には、インターフェロン療法について、ＨＣＶレベルは、反応の尤度の予測的指標である（Ｄｉｅｎｓｔａｇ  ａｎｄ  ＭｃＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，ＡＧＡ  Ｖｏｌ  １３０，ｐｐ２３１−２６４）。本研究において、ミラビルセン治療について、ＨＣＶレベルが、本明細書に記載の血清バイオマーカーに比べてより低い予測値を有することが見出された。
【０１０４】
対象
対象は、典型的には、ＨＣＶに感染したヒトである。いくつかの実施態様において、対象は、慢性ＨＣＶ感染症を患う。
【０１０５】
典型的には、対象は、Ｃ型感染症と診断されるかまたは診断されている。これに関して、本明細書に記載の血液バイオマーカーは、ＨＣＶ感染症の診断テストと同時に、またはＨＣＶ感染症の診断後に、実施されうる。
【０１０６】
対象は、１ａ、１ｂ、２、３、４、５および６からなる群から選択される遺伝子型のＨＣＶに感染しうる。いくつかの実施態様において、ＨＣＶの遺伝子型は１ａである。いくつかの実施態様において、ＨＣＶの遺伝子型は１ｂである。
【０１０７】
対象は、慢性Ｃ型肝炎の有効な治療を必要とするヒトでありうる。
【０１０８】
有効な治療は、本明細書に記載のＨＣＶウイルス価における、少なくとも１の対数減少（すなわち、１／１０倍）によって決定される（下記レスポンダー／非レスポンダーを参照）。いくつかの実施態様において、有効な治療は、少なくとも２の対数減少（すなわち、１／１００倍）である。部分レスポンダーは、典型的には、１と２の対数減少の間の減少を示す。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、対象は、治療を受けていなくてもよい、すなわち、ＨＣＶ感染症の治療の治療的介入歴がない。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、対象は、最近、例えば、過去２年以内、または過去１年以内、または６月以内、例えば３月以内に診断されている。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、対象は、無症状または軽い症状のみであってもよい。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、ＨＣＶ関連線維症（または壊死性炎症）のステージは、Ｉｓｈａｋの採点システムにおけるステージ３、またはＭｅｔａｖｉｒステージにおけるステージＦ２に達していない。適当には、いくつかの実施態様において、対象は、不完全肝硬変もしくは肝硬変、またはいくつかの実施態様において、架橋線維症もしくは門脈線維症を患っていない。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、軽い症状は、Ｉｓｈａｋスコアにおけるステージ３もしくは４未満、またはＭＥＴＡＶＩＲスコアにおけるステージ２もしくは３未満に相当する症状を伴う対象（またはそれと診断された対象）を示しうる。
【０１１４】
非レスポンダーおよびレスポンダー
反応グレード：各患者における、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療に対する反応は、０ないし４のスコアで分類される。該グレードは、基準値と比較して、ＨＣＶにおける最大対数（底は１０）減少に基づいて付与される。
【０１１５】
具体的には、
（ｉ）    グレード０：ＨＣＶウイルス量の１未満の対数減少、
（ｉｉ）  グレード１：ウイルス量の１以上であって、２未満の対数減少、
（ｉｉｉ）グレード２：ウイルス量の２以上であって、３未満の対数減少、
（ｉｖ）  グレード３：ウイルス量の３以上であって、４未満の対数減少、
（ｖ）    グレード４：ＨＣＶウイルス量の４以上の対数減少。１と２の間のグレードは、部分レスポンダーと見なされる。部分レスポンダーは、特にＨＣＶ治療剤、例えばｍｉＲ−１２２阻害剤（例えば、ミラビルセン）の増加した用量を投与する場合、今もなおＨＣＶ療法が有益となりうる。
【０１１６】
血清ＨＣＶレベルは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｔａｑｍａｎアッセイ（例えば、ＣＯＢＡＳ（登録商標）  ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）  ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＨＣＶテスト）を用いて測定されうる。
【０１１７】
非侵襲性診断アッセイ
従来、ＨＣＶ感染対象における壊死性炎症レベルは、肝生検、肝臓の状態に関する情報および今後の疾患進行の予測情報を提供するための米国で広く使用されている侵襲性および有痛性方法によって測定される（Ｄｉｅｎｓｔａｇ  ａｎｄ  ＭｃＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，ＡＧＡ  Ｖｏｌ  １３０，ｐｐ２３１−２６４）。インターフェロン療法は、従来、肝生検が中等度から重度の線維症を示した場合（Ｉｓｈａｋ採点システムにおけるステージ３以上、またはＭｅｔａｖｉｒステージにおけるステージＦ２以上）にのみ用いられる。
【表２】
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【０１１８】
肝生検が軽度の組織学的疾患を示す場合、差し迫ったインターフェロン治療を伴うことなくモニタリングを正当化するのに進行は十分遅いと考えられうる。しかしながら、本発明に示されるように、ミラビルセンの治療は、かかる対象がレスポンダーを示す血清バイオマーカーを有する可能性が高いので、早期の疾患に特に適しうる。経皮的肝生検は、予測される合併症（出血（１％−３％）、疼痛（２０％−３０％）、胆汁性腹膜炎（＜１％）、気胸（＜１％）、内臓破裂（＜１％）、および死を含む）に関連している。
【０１１９】
本発明の優れた予測値は、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンでの治療のために、肝生検が回避されうることを示す。本明細書で報告された臨床データはまた、有効なミラビルセン治療が軽度のＨＣＶ疾患の段階に関連し、そうして本発明はまた、ＨＣＶ疾患の進行の段階の決定において有意な診断的価値を有しうるので、肝生検の非侵襲性代替物でありうることを示す。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、ヒト対象におけるＣ型肝炎の進行度、例えば肝臓の壊死性炎症レベルを測定する診断方法であって、
ｉ）ＨＣＶに感染したヒト対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中のミクロＲＮＡ−１２２レベル、および血液サンプル中の少なくとも１種のさらなるバイオマーカーを測定する工程
ｉｉｉ）ミクロＲＮＡレベルおよび少なくとも１種のさらなるバイオマーカーとＣ型肝炎の既知の進行度（例えば、壊死性炎症レベル）である１もしくはそれ以上の対象から得られた対照サンプルまたは１もしくはそれ以上の対照値とを比較し、該対象におけるＣ型肝炎の進行度を決定する工程
を含む、方法を提供する。
【０１２１】
適当には、対照値は、Ｃ型肝炎感染症の既知の進行度である対象集団から得られた対照値のデータベースの形式である。
【０１２２】
例として、少なくとも１種のさらなるバイオマーカーは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴ、ＡＬＴおよびＡＳＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴ、ならびにＡＬＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴからなる群から選択される。
【０１２３】
ＨＣＶの進行度は、例えば、ＭＥＴＡＶＩＲまたはＩｓｈａｋスコアにしたがって決定されうる（Ｉｓｈａｋ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９９５；２２：６９６−６９９；Ｂｅｄｏｓｓａ  Ｐ  ＆  Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＭＥＴＡＶＩＲ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９４；２４：２８９−２９３）。
【０１２４】
壊死性炎症レベルがＨＣＶに感染していない哺乳類対象において測定され、そうして本発明が、対象における肝機能のレベルを測定する方法であって、
ｉ）哺乳類対象、例えばヒトから血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中のミクロＲＮＡ−１２２レベル、および血液サンプル中の少なくとも１種のさらなるバイオマーカーを測定する工程
ｉｉｉ）ミクロＲＮＡレベルおよび少なくとも１種のさらなるバイオマーカーと既知の肝機能レベルを有する１もしくはそれ以上の対象から得られた対照サンプルまたは１もしくはそれ以上の対照値とを比較する工程を含み、前記対象の肝機能レベルを決定する、方法を提供することがまた認識される。
【０１２５】
例として、少なくとも１種のさらなるバイオマーカーは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴ、ＡＬＴおよびＡＳＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴ、ならびにＡＬＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴからなる群から選択される。したがって、本発明は、哺乳類対象の肝機能の程度を決定するためのミクロＲＮＡ−１２２定量化アッセイの使用であって、血液サンプル中で前記少なくとも１種のさらなるバイオマーカーと組み合わせられる、使用を提供する。いくつかの実施態様において、対象はＨＣＶに感染しうる。いくつかの実施態様において、対象は、ＨＣＶに感染しえない。いくつかの実施態様において、対象は、肝炎、例えばＢ型、Ｃ型およびＤ型肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎、サイトメガロウイルス感染症、住血吸虫感染症およびレプトスピラ症からなる群から選択される障害と診断されうる。
【０１２６】
ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンの適当な有効量を決定する方法
フェーズ２ａの臨床試験から得られたデータは、一部の対象がミラビルセン治療、特に低用量のミラビルセン（例えば、３ｍｇ／ｋｇ）で反応しないことを示す。ミラビルセンに対する反応性と用量間の相関関係は、ミラビルセン治療に対する反応性のＨＣＶ感染患者集団内の不均一性を示し、そうして本発明は、慢性ＨＣＶ感染を患う対象への投与のための、ｍｉＲ−１２２阻害剤（ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤）、例えばミラビルセンの適当な有効量を決定する方法であって、
ｉ）対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと１またはそれ以上の対照サンプルまたは対照値とを比較する工程を含み、慢性ＨＣＶ感染症を軽減するために対象への投与のためのミクロＲＮＡ−１２２阻害剤の適当な有効量を決定する、方法を提供する。
【０１２７】
上記方法は診断方法と組み合わせてもよい−例えば、１またはそれ以上の、正常範囲外であるが、非レスポンダーと示される所定のカットオフ値を超えない、血液バイオマーカースコアを有する対象は、高用量のミラビルセン、例えば５ｍｇ／ｋｇまたは７ｍｇ／ｋｇの用量で有効に治療されうる。あるいは、治療期間は延長されてもよい。
【０１２８】
用語「［治療上の］有効量」は、一般的に、個体における疾患の症状を軽減するのに必要な量を示す。用量は、各具体的事例における個々の要件に応じて調整される。その投与量は、多数の因子、例えば、治療される疾患の重症度、患者の年齢および一般的健康状態、患者が治療を受けている他の医薬、投与経路および形態ならびに関係のある医師の選好および経験に応じて広い範囲内で変化しうる。一般的に、いくつかの実施態様において、治療は、化合物の最適量未満である少量の投与量で開始される。したがって、投与量は、個々の患者に対する最適な効果に達するまで少しずつ増加しうる。本明細書に記載の疾患の治療における当業者は、過度の実験を行うことなく、個人の知識、経験および本願の開示にしたがって、所定の疾患および患者に対する本発明の化合物の治療上の有効量を確認することができる。
【０１２９】
（例えば、１日／１週／１月の用量）は、例えば、１日当たり約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、または１日当たり１．０〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。したがって、７０ｋｇのヒトへの投与について、いくつかの実施態様において、投与量範囲は、１日当たり約７ｍｇ〜０．７ｇであってもよい。いくつかの実施態様において、オリゴマー、例えばミラビルセンの各用量は、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ）であってもよい。したがって、個々の用量は、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．６ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．７ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．８ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．９ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｍｇ／ｋｇ、例えば約２ｍｇ／ｋｇ、例えば約３ｍｇ／ｋｇ、例えば約４ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ、例えば約６ｍｇ／ｋｇ、例えば約７ｍｇ／ｋｇ、例えば約８ｍｇ／ｋｇ、例えば約９ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。いくつかの実施態様において、オリゴマーの用量は、７ｍｇ／ｋｇを下回る、例えば５ｍｇ／ｋｇを下回るかまたは３ｍｇ／ｋｇを下回る。いくつかの実施態様において、オリゴマーの用量は、０．５ｍｇ／ｋｇを超える、例えば１ｍｇ／ｋｇを超える。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、治療期間中のｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンの各投与間の時間間隔は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日および１週からなる群から選択されうる。いくつかの実施態様において、投与間の時間間隔は、少なくとも１日おき、例えば少なくとも３日ごと、例えば少なくとも４日ごと、例えば少なくとも５日ごと、例えば少なくとも６日ごと、例えば１週おき、例えば少なくとも２週ごと（隔週）または少なくとも３もしくは４週ごと、あるいは少なくとも１月おきである。
【０１３１】
オリゴマー、例えばミラビルセンは、例えば、非経口投与されうる。非経口、皮下、皮内または経皮投与について、処方物には、滅菌希釈剤、緩衝剤、浸透張力調節剤および抗菌剤が含まれうる。セイライン溶液中のオリゴマーは、例えば、静脈内(i.v.i)または皮下(s.c.)投与されうる。静脈内または皮下投与について、好ましい担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。他の投与方法、例えば、経口投与、鼻腔投与、直腸投与が用いられうる。
【０１３２】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬処方物および組成物において用いられうる。適当には、該組成物は、医薬的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適当かつ好ましい医薬的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供する−それらは本明細書によって引用される。適当な投与量、処方物、投与経路、組成物、剤形および他の治療剤との組合せ剤、プロドラッグ処方物もまた、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２で提供される−それらもまた、本明細書によって引用される。ミラビルセンナトリウムは、好ましい医薬組成物である。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤は、水または食塩水に投与される。いくつかの実施態様において、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤は、非経口投与経路、例えば、静脈内または皮下を介して投与される。いくつかの実施態様において、投与経路は、経口投与を用いる（ＷＯ２０１１／０４８１２５（本明細書によって引用される）を参照）。
【０１３４】
本明細書において用いられるミクロＲＮＡ−１２２阻害剤は、いくつかの実施態様において、単位処方物（すなわち、単位用量）、例えば、治療患者において重篤な副作用をもたらすことなく治療上の有効量を患者に輸送するのに十分な量の医薬的に許容される担体または希釈剤中にありうる。
【０１３５】
医薬組成物の投与量は、治療すべき病状の重症度および反応性、ならびに数日ないし数ヶ月、または治療効果がもたらされるまでもしくは病状の減退が達成されるまで続く治療過程によって決まる。最適な投与スケジュールは、患者の体内の薬物の蓄積の測定値から算出されうる。最適投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性に応じて変化しうる。一般的に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されるＥＣ５０に基づき、推定されうる。一般的に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１ｇであり、１日、１週、または１月に１回またはそれ以上投与されうる。投与の繰り返し率は、体液または組織中の薬物の測定された滞留時間および濃度に基づき、推定されうる。
【０１３６】
抗ＨＣＶ剤
抗ＨＣＶ剤は、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤（ｍｉＲ−１２２阻害剤）でありうる。ミクロＲＮＡ阻害剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、インビボでミクロＲＮＡ−１２２活性を阻害する下流効果を測定することによって決定されうる。例えば、直接ミクロＲＮＡ−１２２の脱抑制は、例えば、マウスまたは霊長類における、インビボのｍＲＮＡ（二次指数）または血清コレステロール（三次指数）を標的とする（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００８）。しかしながら、ＨＣＶウイルスとのｍｉＲ−１２２相互作用のメカニズムがｍｉＲ−１２２を介在するｍＲＮＡ抑制のメカニズムとは根本的に異なるという発見は、ｍｉＲ−１２２のｍＲＮＡ標的のインビボ阻害に基づくアッセイが、臨床的に関連のあるＨＣＶ複製の阻害を予測するには不十分な可能性があるという強い根拠となる。これに関して、インビボにおけるＨＣＶの治療において有効でありうるミクロＲＮＡ−１２２阻害剤は、典型的には、ｍＲＮＡ標的を脱抑制するのに非常に有効であり（例えば、マウスにおいてインビボのＡｌｄｏＡまたはＮｄｒｇ３の少なくとも３倍の脱抑制）、および／または血清コレステロールを低下させるのに非常に有効である（例えば、マウスおよび非ヒト霊長類において大体少なくとも３０〜４０％まで−Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００８を参照）。好ましい抗ＨＣＶ剤には、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばアンチセンスオリゴマーが含まれる。さらに、ミクロＲＮＡ−１２２の低分子阻害剤は、すでに記載されている。
【０１３７】
ｍｉＲ−１２２阻害剤−低分子阻害剤
Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ  ２０１０，１３２，７９７６−７９８１（本明細書によって引用される）に報告されているように、ｍｉＲ１２２の低分子阻害剤をアッセイすることは可能であり、ｍｉＲ−１２２の低分子阻害剤は、例えば、以下に示されるものが知られている：
【化１】
2014533099.tif 000004
【０１３８】
数値はｍｉＲ−１２２脱抑制によるルシフェラーゼ発現を示し、１を超える値はｍｉＲ−１２２阻害を示す。
【０１３９】
ｍｉＲ−１２２阻害剤−アンチセンスオリゴマー
ｍｉＲ−１２２阻害剤は、アンチセンスオリゴマーでありうる。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ剤は、成熟ｈｓａ−ミクロＲＮＡ−１２２を標的とするアンチセンスオリゴマーである。
【０１４０】
アンチセンスオリゴマーは、ｍｉＲ−１２２配列の一部、例えば、成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２配列に相補的である、少なくとも６個、例えば少なくとも７個の連続した核酸塩基を含みうる。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、アンチｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨを本質的にリクルートすることができないように、例えば、ミクスマーまたはトータルマー構造を利用することによって設計されうる。ＲＮＡｓｅＨを本質的にリクルートすることができないオリゴヌクレオチドは、文献において周知である、例えば、ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００７／１１２７５３、またはＷＯ２００９／０４３３５３を参照。ミクスマーは、アフィニティー強化ヌクレオチド類似体の混合物、例えば、非限定的な例として、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、３フルオロヘキシトールモノマー（３Ｆ  ＨＮＡ）、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡを含むように設計されうる。さらなる実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを全く含まないが、アフィニティー強化ヌクレオチド類似体のみからなり、そのような分子はトータルマーとも称される。いくつかの実施態様において、ミクスマーは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡと一緒に１種のアフィニティー強化ヌクレオチド類似体のみを含む。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１種以上のヌクレオチド類似体、例えば、非限定的な例として、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡのみからなる。
【０１４２】
長さ
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜２５（連続）ヌクレオチド長、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４（連続）ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜１０（連続）ヌクレオチド長、またはある場合には、７〜１６ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも８（連続）ヌクレオチド長、１０〜１７または１０〜１６または１０〜１５（連続）ヌクレオチド長、例えば１２〜１５（連続）ヌクレオチド長を有する。
【０１４３】
ＲＮＡｓｅＨを本質的にリクルートすることができないオリゴマー
ＥＰ  １  ２２２  ３０９は、ＲＮａｓｅＨをリクルートする能力を決定するために用いられうる、ＲＮａｓｅＨ活性を測定するためのインビトロ方法を提供する。オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的が提供される場合に、ＥＰ  １  ２２２  ３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法を用いて、２’置換がなく、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％未満の、ｐｍｏｌ／ｌ／分の単位で測定される、初速度を有する場合、ＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートできると見なされる。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的、およびＲＮａｓｅＨが提供される場合に、ｐｍｏｌ／ｌ／分の単位で測定される、少なくとも０．５％のＲＮａｓｅＨの初速度が、ＥＰ  １  ２２２  ３０９の実施例９１−９５によって提供される方法を用いて、２’置換がなく、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定された、１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満または２０％未満の初速度である場合、ＲＮａｓｅＨを本質的にリクルートすることができないと見なされる。
【０１４５】
ミクスマーまたはトータルマーであるオリゴヌクレオチドは通常、ＲＮＡｓｅＨを本質的にリクルートすることができず、それ自体が本明細書に記載のＲＮａｓｅＨを本質的にリクルートすることができない用語として使用される場合には、たとえかかるオリゴマーが実際にＲＮａｓｅＨをリクルートする有意な能力を有する場合、例えば、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡとのＤＮＡミクスマーを用いる場合においても、いくつかの実施態様において、そのような用語は、本明細書に記載の用語ミクスマーまたはトータルマーで置き換えられうることを認識すべきである。
【０１４６】
トータルマー
いくつかの実施態様において、オリゴマーまたはその連続したヌクレオチド配列は、ヌクレオチド類似体、例えばアフィニティー強化ヌクレオチド類似体の連続した配列からなる−本明細書では、「トータルマー」と称される。
【０１４７】
トータルマーは、非天然のヌクレオチドのみを含む一本鎖オリゴマーである。オリゴマーは、トータルマーであってもよい−実際、種々のトータルマー構造は、特にミクロＲＮＡ（アンチｍｉＲ）を標的とする場合、治療オリゴマーとしてまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、トータルマーは、少なくとも１つのＸＹＸまたはＹＸＹ配列モチーフ、例えば繰り返し配列ＸＹＸまたはＹＸＹを含むかまたはそれらからなり、ここで、ＸはＬＮＡであり、Ｙは別の（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチド類似体、例えば、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡユニットおよび２’−フルオロＤＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、上記の配列モチーフは、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸでありうる。
【０１４９】
いくつかの実施態様において、トータルマーは、８〜１６個のヌクレオチド、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のヌクレオチド、例えば８〜１２個のヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含みうるかまたはそれらからなりうる。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、トータルマーの連続したヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％のＬＮＡユニットを構成する。残りのユニットは、本明細書に記載の非ＬＮＡヌクレオチド類似体、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、ＬＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡユニット、および２’ＭＯＥ  ＲＮＡユニット、または基２’−ＯＭｅ  ＲＮＡユニットおよび２’−フルオロＤＮＡユニットからなる群から選択されるものから選択されうる。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、トータルマーは、ＬＮＡユニットのみからなる連続したヌクレオチド配列からなるかまたはそれらを含む。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、トータルマーは、米国仮出願第６０／９７９２１７号および第６１／０２８０６２号、ならびにＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４（それら全て、その全内容が本明細書によって引用される）に記載されるように、ミクロＲＮＡに対する標的にされうる（すなわち、アンチｍｉＲでありうる）。
【０１５３】
ミクスマー
用語「ミクスマー」は、ギャップマー(gapmer)、テイルマー(tailmer)、ヘッドマー(headmer)およびブロックマー(blockmer)とは対照的に、５個以上の天然由来のヌクレオチド、例えばＤＮＡユニットの連続した配列が存在しない天然由来および非天然由来のヌクレオチドを含むオリゴマーを示す。
【０１５４】
本発明に記載のオリゴマーは、ミクスマーでありうる−実際に、種々のミクスマー構造は、特にミクロＲＮＡ（アンチｍｉＲ）、ｍＲＮＡ上のミクロＲＮＡ結合部位（Ｂｌｏｃｋｍｉｒ）を標的とする場合、治療オリゴマーとしてまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、オリゴマーはまた、ミクスマーであってもよく、実際に、ミクスマーのそれらの標的に効率的かつ特異的に結合する能力によれば、治療オリゴマーとしてのミクスマーの使用は、標的ＲＮＡを減少させるのに特に有効であると考えられている。
【０１５６】
いくつかの実施態様において、ミクスマーは、ヌクレオチド類似体および天然由来のヌクレオチドの繰り返しパターンの連続したヌクレオチド、または第１種のヌクレオチド類似体および第２種のヌクレオチド類似体を含むかまたはそれらからなる。例えば、繰り返しパターンは、１つおきまたは２つおきのヌクレオチドがヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡであり、残りのヌクレオチドが天然由来のヌクレオチド、例えば、ＤＮＡであるかまたは２’置換ヌクレオチド類似体、例えば、本明細書に記載の２’ＭＯＥまたは２’フルオロ類似体であるか、あるいはいくつかの実施態様において、本明細書に記載のヌクレオチド類似体の群から選択されるものである。ヌクレオチド類似体の繰り返しパターン、例えば、ＬＮＡユニットは、定位置、例えば、５’または３’末端でヌクレオチドアナログと結合しうることが認識される。
【０１５７】
いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、オリゴマーの第１ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡヌクレオチドである。
【０１５８】
同一または異なっていてもよい、いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、オリゴマーの第２ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡヌクレオチドである。
【０１５９】
同一または異なっていてもよい、いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、オリゴマーの第７および／または第８ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡヌクレオチドである。
【０１６０】
同一または異なっていてもよい、いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、オリゴマーの第９および／または第１０ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡヌクレオチドである。
【０１６１】
同一または異なっていてもよい、いくつかの実施態様において、フォリゴマー（foligomer）の５’末端は、ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡヌクレオチドである。
【０１６２】
上記の構造特性は、いくつかの実施態様において、ミクスマー構造、例えばアンチｍｉＲミクスマーに組み込まれうる。
【０１６３】
いくつかの実施態様において、ミクスマーは、４個以上の連続したＤＮＡヌクレオチドユニットまたは３個連続したＤＮＡヌクレオチドユニットの領域を含まない。いくつかの実施態様において、ミクスマーは、２個以上の連続したＤＮＡヌクレオチドユニットの領域を含まない。
【０１６４】
いくつかの実施態様において、ミクスマーは、少なくとも２個の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えば少なくとも２個の連続したＬＮＡユニットからなる領域を含む。  
【０１６５】
いくつかの実施態様において、ミクスマーは、少なくとも３個の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えば少なくとも３個の連続したＬＮＡユニットからなる領域を含む。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、本発明のミクスマーは、７個以上の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えばＬＮＡユニットの領域を含まない。いくつかの実施態様において、本発明のミクスマーは、６個以上の連続したヌクレオチド類似体ユニット、ＬＮＡユニットの領域を含まない。いくつかの実施態様において、本発明のミクスマーは、５個以上の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えばＬＮＡユニットの領域を含まない。いくつかの実施態様において、本発明のミクスマーは、４個以上の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えばＬＮＡユニットの領域を含まない。いくつかの実施態様において、本発明のミクスマーは、３個以上の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えばＬＮＡユニットの領域を含まない。いくつかの実施態様において、本発明のミクスマーは、２個以上の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えばＬＮＡユニットの領域を含まない。
【０１６７】
３’末端から数えて、３〜８番目の位置のヌクレオチドの修飾を示す、ミクスマーの実施態様において、ＬＮＡユニットは、他のヌクレオチド類似体、例えば、本明細書に記載のものと置き換えられうる。したがって、「Ｘ」は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット（２’フルオロ）、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）ユニット、ＬＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡユニットからなる群から選択されうる。「ｘ」は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、最も好ましくはＤＮＡである。
【０１６８】
いくつかの実施態様において、ミクスマー、例えばアンチｍｉＲミクスマーは、３’末端から数えて、３〜８番目の位置で修飾される−すなわち、３〜８番目の位置に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。該配列の構造は、存在する非ＬＮＡユニットの数によってまたは存在するＬＮＡユニットの数によって定義されうる。前者のいくつかの実施態様において、３’末端から数えて、３〜８番目の位置の少なくとも１個、例えば１個のヌクレオチドは、非ＬＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、３〜８番目の位置の少なくとも２個、例えば２個のヌクレオチドは、非ＬＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、３〜８番目の位置の少なくとも３個、例えば３個のヌクレオチドは、非ＬＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、３〜８番目の位置の少なくとも４個、例えば４個のヌクレオチドは、非ＬＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、３〜８番目の位置の少なくとも５個、例えば５個のヌクレオチドは、非ＬＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、３’末端から数えて、３〜８番目の位置の全６個のヌクレオチドは、非ＬＮＡユニットである。
【０１６９】
いくつかの実施態様において、オリゴマーは、ｉ）ｍｉＲＮＡ標的に存在する連続したヌクレオチドの部分配列に完全に相補的でありうるか、またはｉｉ）前記ＲＮＡ標的に存在する連続したヌクレオチドの部分配列の相補鎖にわずか１個のミスマッチしか含んでいない。そのようなオリゴヌクレオチドは、標的配列の対応領域に完全に相補的であるか、または標的配列の対応領域でわずか１個のミスマッチしか含んでいないという点で、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ＲＮＡ標的は、典型的には、病状または疾患に関連しており、いくつかの実施態様において、例えば、ミクロＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。したがって、オリゴマーは、例えば、アンチｍｉＲ、ミクロＲＮＡ模倣体、ミクロＲＮＡ  ｂｌｏｃｋｍｉｒ、またはアンチセンスオリゴマーであってもよい。
【０１７０】
したがって、オリゴマーは、ミクロＲＮＡ−１２２（の対応領域）に完全に相補的であるかまたはそれにわずか１個のミスマッチしか含んでいない、連続したヌクレオチド配列を標的とする（すなわち、含むまたはそれらからなる）アンチｍｉｒであってもよい。かかるオリゴヌクレオチドは、アンチ−ミクロＲＮＡオリゴヌクレオチドと称されうる。
【０１７１】
本発明において有用なミクロＲＮＡ−１２２のモジュレータの例
本発明に用いられる特に好ましい化合物は、ミクロＲＮＡ−１２２を標的とするものである。ｍｉＲ−１２２の配列は、ミクロＲＮＡデータベース「ｍｉｒｂａｓｅ」(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)にて見出されうる。ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤は、多数の特許および論文に記載されており、当業者に周知である。いくつかの実施態様において、有用なミクロＲＮＡ−１２２モジュレータを記述するかかる文献の例は、ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００７／１１２７５３、またはＷＯ２００９／０４３３５３（それら全て、本明細書によって引用される）である。いくつかの実施態様において、かかるミクロＲＮＡ−１２２モジュレータは、ＷＯ２００９／２０７７１、ＷＯ２００８／９１７０３、ＷＯ２００８／０４６９１１、ＷＯ２００８／０７４３２８、ＷＯ２００７／９００７３、ＷＯ２００７／２７７７５、ＷＯ２００７／２７８９４、ＷＯ２００７／２１８９６、ＷＯ２００６／９３５２６、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００５／２３９８６、またはＷＯ２００５／１３９０１、またはＷＯ２０１０／１２２５３８（それら全て、本明細書によって引用される）に記載のものである。
【０１７２】
ミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）
好ましい実施態様において、アンチセンスオリゴマーは、式：
【化２】
2014533099.tif 000005
［式中：小文字はＤＮＡユニットを特定し、大文字はＬＮＡユニットを特定し、ｍＣは５−メチルシトシンＬＮＡを特定し、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド内結合を特定し、ＬＮＡユニットは、ＬＮＡ残基の後のｏ上付き文字によって特定される、ベータ−Ｄ−オキシである］
を有する、ミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）である。
【０１７３】
ミラビルセンは、臨床試験を実施するための最初のミクロＲＮＡ標的薬剤である。ミラビルセンは、単独療法としてまたは慢性ＨＣＶ感染症のインターフェロン不含治療として直接作用型抗ウイルス剤と組み合わせて用いられうる。
【０１７４】
本発明に関する用語「オリゴマー」は、２個またはそれ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を示す。本明細書では、単一ヌクレオチド（ユニット）は、モノマーまたはユニットとも称されうる。いくつかの実施態様において、用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」および「モノマー」は交互に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列を示す場合、示されるものが、塩基、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵの配列であることが認識される。
【０１７５】
オリゴマーは、典型的には、７〜２５ユニットの連続したヌクレオチド配列からなるかまたはそれらを含む。
【０１７６】
種々の実施態様において、本発明の化合物は、ＲＮＡ（ユニット）を含まない。本発明に記載の化合物は、直鎖分子であるかまたは直鎖分子として合成されることが好ましい。オリゴマーは、一本鎖分子であり、好ましくは、同一オリゴマー内の同等の領域に相補的である（すなわち、二本鎖）、例えば、少なくとも３、４または５個の連続したヌクレオチドの短い領域を含まない−この点に関して、オリゴマーは、（本質的には）二本鎖ではない。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、本質的には二本鎖ではない、例えばｓｉＲＮＡではない。種々の実施態様において、本発明のオリゴマーは、全て連続したヌクレオチド領域からなりうる。したがって、オリゴマーは、実質的に自己相補的ではない。
【０１７７】
用語「対応ヌクレオチド類似体」および「対応ヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体中のヌクレオチドおよび天然由来のヌクレオチドが同一であることを示すことを意図とする。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボースユニットがアデニンと結合する場合、「対応ヌクレオチド類似体」は、アデニンと結合する（２−デオキシリボースとは異なる）ペントースユニットを含有する。
【０１７８】
本明細書に用いられる、用語「逆相補鎖(reverse complement)」、「逆相補的配列(reverse complementary)」および「逆相補性(reverse complementarity)」は、用語「相補鎖」、「相補的配列」および「相補性」と交換可能である。
【０１７９】
ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体
いくつかの実施態様において、用語「ヌクレオシド類似体」および「ヌクレオチド類似体」は、交互に用いられる。
【０１８０】
本明細書に用いられる、用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分および共有結合基（結合基）、例えばホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド内結合基を含むグリコシドを示し、天然由来のヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、および修飾された糖および／または塩基部分を含む非天然由来のヌクレオチド（本明細書では、「ヌクレオチド類似体」とも称される）の両方を包含する。本明細書では、単一ヌクレオチド（ユニット）は、モノマーまたは核酸ユニットとも称されうる。
【０１８１】
生物化学分野において、用語「ヌクレオシド」は、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを示すために一般的に用いられるため、オリゴマーのヌクレオチド間のヌクレオチド内結合によって共有結合される、ヌクレオチドユニットを示す場合に用いられうる。バイオテクノロジー分野において、用語「ヌクレオチド」は、核酸モノマーまたはユニットを示すためによく用いられ、オリゴヌクレオチドの文脈中のそのものは、塩基−例えば、「ヌクレオチド配列」を示しうる、典型的には、核酸塩基配列を示す（すなわち、糖骨格の存在およびヌクレオシド内結合は、潜在的である）。同様に、特に１またはそれ以上のヌクレオシド内結合基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合に、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」を示してもよく、例えば、用語「ヌクレオチド」はヌクレオシド間結合の存在または特性を明確にする場合でさえ用いられうる。
【０１８２】
当業者であれば分かるように、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、５’ヌクレオチド内結合基を含まないが、５’末端基を含んでいても含んでいなくてもよい。
【０１８３】
非天然由来のヌクレオチドには、糖部分を修飾したヌクレオチド、例えば二環式ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチド、例えば２’置換ヌクレオチドが含まれる。
【０１８４】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分の修飾による、天然ヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの変種である。類似体は、原則として、オリゴヌクレオチドの文脈中の天然ヌクレオチドに対して単に「無変化」または「同等」でありうる、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を抑制するように機能する方法への機能的効果を有していない。にもかかわらず、かかる「同等の」類似体は、例えば、それらが、製造がより容易もしくは安価であるか、または保存もしくは製造条件でより安定であるか、またはタグもしくはラベルを示す場合、有用でありうる。しかしながら、好ましくは、類似体は、標的に対する結合アフィニティーの増加および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増加および／または細胞内への輸送の容易性の増加をもたらすことによって、オリゴマーが発現を阻害するように機能する方法に対して機能的効果がある。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３  ａｎｄ  Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、およびスキーム１に記載されている：
【化３】
2014533099.tif 000006
【０１８５】
したがって、オリゴマーは、天然由来のヌクレオチドの単純配列−好ましくは、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書では、一般に「ＤＮＡ」と称される）だが、場合によりリボヌクレオチド（本明細書では、一般に「ＲＮＡ」と称される）、または該天然由来のヌクレオチドおよび１種またはそれ以上の非天然由来のヌクレオチド、すなわち、ヌクレオチド類似体の組み合わせを含みうるかまたはそれらから構成されうる。かかるヌクレオチド類似体は、適当には、標的配列に対するオリゴマーのアフィニティーを強化しうる。
【０１８６】
適当かつ好ましいヌクレオチド類似体は、ＷＯ２００７／０３１０９１によって提供されるかまたはその中で言及されている。
【０１８７】
オリゴマーにおけるアフィニティー強化ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡまたは２’−置換糖の取り込みは、特異的に結合するオリゴマーの大きさを縮小することができ、また、非特異的または変形結合が生じる前にオリゴマーの大きさに対する上限まで縮小してもよい。
【０１８８】
いくつかの実施態様において、オリゴマーは、少なくとも１個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、少なくとも２個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、３〜８個のヌクレオシド類似体、例えば、６または７個のヌクレオチド類似体を含む。圧倒的に最も好ましい実施態様において、少なくとも１個の前記ヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（ＬＮＡ）である；例えば、少なくとも３個または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個のヌクレオチド類似体は、ＬＮＡでありうる。いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡでありうる。
【０１８９】
ヌクレオチドのみからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列を示す場合、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、オリゴマー／標的二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを強化する、前記配列に存在する１種またはそれ以上のヌクレオチド、例えば、ＬＮＡユニットまたは他のヌクレオチド類似体（すなわち、アフィニティー強化ヌクレオチド類似体）の代わりに対応ヌクレオチド類似体を含む。
【０１９０】
いくつかの実施態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列と標的配列間の任意のミスマッチは、好ましくは、アフィニティー強化ヌクレオチド類似体の外部領域、例えば、本明細書に記載の領域Ｂ、および／または本明細書に記載の領域Ｄで、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡヌクレオチドなどの非修飾部位で、および／または連続したヌクレオチド配列に対する５’領域または３’領域で見出される。
【０１９１】
ヌクレオチドのかかる修飾の例として、２’−置換基を提供するかまたは結合アフィニティーを強化し、また、ヌクレアーゼ耐性を増大しうる、架橋（ロックド核酸）構造をもたらす糖部分を修飾することが挙げられる。
【０１９２】
好ましいヌクレオチド類似体は、ＬＮＡ、例えばオキシ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、およびアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）、および／またはアミノ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）および／またはチオ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）および／またはＥＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−ＥＮＡおよびアルファ−Ｌ−ＥＮＡ）である。ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡが最も好ましい。
【０１９３】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマー内（例えば、本明細書に記載の領域ＡおよびＣ）に存在するヌクレオチド類似体は、独立して、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’−フルオロ−ＡＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡ（インターカレーティング核酸(intercalating nucleic acid)−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，２００２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００２  ３０：４９１８−４９２５（本明細書によって引用される））ユニットまたは２’ＭＯＥユニットから選択される。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマーに存在するヌクレオチド類似体の上記の１種のみ、またはその連続したヌクレオチド配列が存在する。
【０１９４】
いくつかの実施態様において、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーまたはＬＮＡヌクレオチド類似体であり、そのようなものとして本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３種の類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含んでいてもよく、またはその３種から選択される類似体の１種のみを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、少なくとも１個の前記ヌクレオチド類似体は、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチドユニットである。いくつかの実施態様において、少なくとも１個の前記ヌクレオチド類似体は、２’−フルオロＤＮＡ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチドユニットである。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のオリゴマーは、少なくとも１個のロックド核酸（ＬＮＡ）ユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、または８個のＬＮＡユニット、例えば３〜７もしくは４〜８個のＬＮＡユニット、または３、４、５、６もしくは７個のＬＮＡユニットを含む。いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡである。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、ベータ−Ｄもしくはアルファ−Ｌ配置のいずれかまたはその組み合わせにおいて、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、および１またはそれ以上の以下のＬＮＡユニット：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／またはＥＮＡの両方を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、全てのＬＮＡシトシンユニットは、５’メチル−シトシンである。本発明のいくつかの実施態様において、オリゴマーは、ＬＮＡユニットおよびＤＮＡユニットの両方を含んでいてもよい。好ましくは、ＬＮＡユニットおよびＤＮＡユニットの組み合わせの総数は、１０〜２５、例えば１０〜２４、好ましくは１０〜２０、例えば１０〜１８、さらにより好ましくは１２〜１６である。本発明のいくつかの実施態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列、例えば連続したヌクレオチド配列は少なくとも１個のＬＮＡからなり、残りのヌクレオチドユニットはＤＮＡユニットである。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、ＬＮＡヌクレオチド類似体および所望により、修飾ヌクレオチド内結合、例えばホスホロチオエート結合を有していてもよい、天然由来のヌクレオチド（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）のみを含む。
【０１９６】
用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を示し、天然型変種および非天然型変種の両方を包含する。したがって、「核酸塩基」は、既知のプリンおよびピリミジン複素環のみならず複素環類似体およびその互変異性体をも包含する。
【０１９７】
核酸塩基の例として、限定されるものではないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン（pseudoisocytosine）、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンが挙げられる。
【０１９８】
いくつかの実施態様において、オリゴマーに存在する少なくとも１つの核酸塩基は、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾された核酸塩基である。
【０１９９】
ＬＮＡ
用語「ＬＮＡ」は、「ロックド核酸」として知られる、二環式ヌクレオシド類似体を示す。それはＬＮＡモノマーを示してもよく、または、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」に関連して用いられる場合、ＬＮＡは、１つまたはそれ以上のかかる二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを示す。ＬＮＡヌクレオチドは、例えば、下記のビラジカルＲ４＊−Ｒ２＊として示される、リボース糖環のＣ２’とＣ４’間のリンカー基（例えば、架橋）の存在によって特徴付けられる。
【０２００】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物に用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式Ｉ：
【化４】
2014533099.tif 000007
［式中：全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されてもよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−から選択され、例えばいくつかの実施態様において、−Ｏ−であり；
Ｂは、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−４−アルコキシ、所望により置換されていてもよいＣ１−４−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ１−４−アシルオキシ、核酸塩基（天然型を含む）および核酸塩基類似体、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、レポーター基、またはリガンドから選択され；好ましくは、Ｂは、核酸塩基または核酸塩基類似体であり；
Ｐは、隣接したモノマーに対するヌクレオチド内結合、または５’−末端基を示し、かかるヌクレオチド内結合または５’−末端基は、所望により置換基Ｒ５または同等に適用可能な置換基Ｒ５＊を含んでいてもよく；
Ｐ＊は、隣接したモノマーに対するヌクレオチド内結合、または３’−末端基を示し；
Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、または＞Ｃ＝Ｚから選択される、１〜４個の基／原子からなる二価のリンカー基を示し、ここで、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂは、各々独立して、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホン(sulphono)、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、レポーター基、またはリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは一緒になって、所望により置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示し、全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されてもよく；および
存在する、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊は、各々独立して、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２-１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１-１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホン、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、レポーター基、またはリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基は一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノ、または所望により置換されていてもよいメチレンを示してもよく；ここで、ＲＮは、水素またはＣ１−４−アルキルから選択され、２個の隣接した（非ジェミナル）置換基が二重結合をもたらすさらなる結合を示してもよく；そして、ＲＮ＊は、存在しビラジカルに寄与しない場合、水素またはＣ１-４−アルキルから選択される］
で示される構造およびその塩基性塩および酸付加塩を有する。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。
【０２０１】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−ＮＲａ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、およびＣ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−からなる群から選択される基からなるビラジカルを示し、ここで、ＲａおよびＲｂは、所望により各々独立して、選択されてもよい。いくつかの実施態様において、ＲａおよびＲｂは、所望により、水素およびＣ１−６アルキル、例えばメチルからなる群から選択されてもよく、例えば水素である。
【０２０２】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、Ｒ位またはＳ位のいずれかで、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸−Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ）を示す。
【０２０３】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、Ｒ位またはＳ位のいずれかで、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸−Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ）を示す。
【０２０４】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、Ｒ位またはＳ位のいずれかで、ビラジカル-Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を示す。いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、ラジカル-Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−を示す（Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ）。
【０２０５】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｏ−ＮＲ−ＣＨ３−を示す（Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ）。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、ＬＮＡユニットは、以下の基：
【化５】
2014533099.tif 000008
から選択される構造を有する。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。
【０２０８】
いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。
【０２０９】
いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。
【０２１０】
いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素である。
【０２１１】
いくつかの実施態様において、Ｒ５およびＲ５＊は、各々独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ２からなる群から選択される。適当には、いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは水素であるのに対し、他の基（Ｒ５またはＲ５＊、それぞれ）は、Ｃ１−５アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換されたＣ１−６アルキル、置換されたＣ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルキニルおよび置換されたアシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）からなる群から選択され；ここで、各置換された基は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換されたＣ２−６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ、Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２から選択される置換基で一置換または多置換され、ここで、ＸはＯまたはＳであり；そして、Ｊ１およびＪ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アミノアルキル、置換されたＣ１−６アミノアルキルまたは保護基である。いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換されたＣ１−６アルキルである。いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換されたメチレンであり、ここで、好ましい置換基には、Ｆ、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、ＯＪ１、ＳＪ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ、Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立して選択される１またはそれ以上の基が含まれる。いくつかの実施態様において、Ｊ１およびＪ２は、各々独立して、ＨまたはＣ１−６アルキルである。いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、メチル、エチルまたはメトキシメチルである。いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、メチルである。さらなる実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、エチレニルである。いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換されたアシルである。いくつかの実施態様において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２である。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。かかる５’修飾二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００７／１３４１８１（その全内容は本明細書によって引用される）に開示されている。
【０２１２】
いくつかの実施態様において、Ｂは、核酸塩基（核酸塩基類似体および天然型核酸塩基を含む）、例えばプリンもしくはピリミジン、または置換されたプリンもしくは置換されたピリミジン、例えば本明細書に記載の核酸塩基、例えばアデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、および／または修飾もしくは置換された核酸塩基、例えば５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２’チオ−チミン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、および２，６−ジアミノプリンからなる群から選択される核酸塩基である。
【０２１３】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）-Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｎ（Ｒｅ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、または−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｓ−から選択されるビラジカルを示し、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１-１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１-６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１-６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホン、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、レポーター基、またはリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは一緒になって、所望により置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示してもよい。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。
【０２１４】
さらなる実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−、および-ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−Ｏ−、および／または、−ＣＨ２−ＣＨ２−、または−ＣＨ＝ＣＨ−から選択されるビラジカル（二価の基）を示す。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。
【０２１５】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ-を示し、ここで、ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択され、例えば、水素であり；および、Ｒｃは、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択され、例えば水素である。
【０２１６】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−を示し、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択され、例えば水素である。
【０２１７】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ビラジカル−ＣＨ（Ｚ）−Ｏ−を形成し、ここで、Ｚは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、置換されたＣ１−６アルキル、置換されたＣ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルキニル、アシル、置換されたアシル、置換されたアミド、チオールおよび置換されたチオからなる群から選択され；ここで、置換された基は、各々独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２またはＣＮから独立して選択される所望により保護されていてもよい置換基で一置換または多置換されており、Ｊ１、Ｊ２およびＪ３は、各々独立して、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＪ１である。いくつかの実施態様において、Ｚは、Ｃ１−６アルキルまたは置換されたＣ１−６アルキルである。いくつかの実施態様において、Ｚは、メチルである。いくつかの実施態様において、Ｚは、置換されたＣ１−６アルキルである。いくつかの実施態様において、前記置換基は、Ｃ１−６アルコキシである。いくつかの実施態様において、Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。かかる二環式ヌクレオチドは、ＵＳ７，３９９，８４５（その全内容は本明細書によって引用される）に開示されている。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３＊は水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上記およびＷＯ２００７／１３４１８１に記載の水素以外のものでありうる。
【０２１８】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、架橋内に置換されたアミノ基を含むビラジカルを示し、例えば、ビラジカル−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−（ここで、ＲｃはＣ１−１２アルキルオキシである）から構成されるかまたはそれらを含む。いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｃｑ３ｑ４−ＮＯＲ−を示し、ここで、ｑ３およびｑ４は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択され、置換された基は、各々独立して、ハロゲン、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ＝Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立して選択される置換基で一置換または多置換され、ここで、ＸはＯまたはＳであり；そして、Ｊ１およびＪ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは保護基である。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる。かかる二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００８／１５０７２９（その全内容は本明細書によって引用される）に開示されている。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上記のおよびＷＯ２００７／１３４１８１に記載の水素以外のものでありうる。いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒になって、ビラジカル（二価の基）Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−を示し、ここで、ＲａおよびＲｂは、各々独立して、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換されたＣ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換されたＣ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換されたＣ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であるか；あるいは、ＲａおよびＲｂは一緒になって、＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）であり；ｑ３およびｑ４は、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは置換されたＣ１−Ｃ１２アルキルであり；置換された基は、各々独立して、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２から独立して選択される置換基で一置換または多置換され；Ｊ１およびＪ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、置換されたＣ１−Ｃ６アミノアルキルまたは保護基である。かかる化合物は、ＷＯ２００９００６４７８Ａ（その全内容は本明細書によって引用される）に開示されている。
【０２１９】
いくつかの実施態様において、Ｒ４＊およびＲ２＊はビラジカル−Ｑ−を形成し、ここで、Ｑは、Ｃ（ｑ１）（ｑ２）Ｃ（ｑ３）（ｑ４）、Ｃ（ｑ１）＝Ｃ（ｑ３）、Ｃ［＝Ｃ（ｑ１）（ｑ２）］−Ｃ（ｑ３）（ｑ４）またはＣ（ｑ１）（ｑ２）−Ｃ［＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）］であり；ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４は、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、置換されたＣ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、置換されたＣ１−１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であり；Ｊ１およびＪ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アミノアルキルまたは保護基であり；そして所望により、ＱがＣ（ｑ１）（ｑ２）（ｑ３）（ｑ４）であり、ｑ３またはｑ４の一方がＣＨ３である場合、ｑ３もしくはｑ４の他方またはｑ１およびｑ２の一方の少なくとも１つは、Ｈ以外である。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかにて見出されうる。かかる二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００８／１５４４０１（その全体が本明細書によって引用される）に開示されている。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、置換されたＣ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルまたは置換されたＣ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシル、置換されたＣ１−６アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ１−６アミノアルキルおよび置換されたＣ１−６アミノアルキルからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施態様において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上記およびＷＯ２００７／１３４１８１またはＷＯ２００９／０６７６４７（アルファ−Ｌ−二環式核酸類似体）に記載の水素以外のものでありうる。
【０２２０】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物に用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式ＩＩ：
【化６】
2014533099.tif 000009
［式中：Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒｅ）および／または−ＣＨ２−からなる群から選択され；ＺおよびＺ＊は、独立して、ヌクレオチド内結合、ＲＨ、末端基または保護基の中から選択され；Ｂは、天然または非天然由来のヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、ＲＨは、水素またはＣ１−４−アルキルから選択され；Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは、所望により独立して、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１-１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホン、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、レポーター基、およびリガンドからなる群から選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは一緒になって、所望により置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示し；そして、ＲＨは、水素またはＣ１−４−アルキルから選択される］
で示される構造を有する。いくつかの実施態様において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは、所望により独立して、水素およびＣ１−６アルキル、例えばメチルからなる群から選択されてもよい。全てのキラル中心について、不斉基は、Ｒ位またはＳ位のいずれかで見出されうる、例えば、２個の具体的な立体化学異性体には、以下に示されうる、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌアイソフォームが含まれる：
【化７】
2014533099.tif 000010
【０２２１】
ＬＮＡユニットの具体例は、以下に示される：
【化８】
2014533099.tif 000011
【０２２２】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＹが、Ｓまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−配置の両方で存在しうる。
【０２２３】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択され、Ｒが、水素またはＣ１−４−アルキルから選択される、ロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−配置の両方で存在しうる。
【０２２４】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＹが−Ｏ−を示す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−配置の両方で存在しうる。
【０２２５】
用語「ＥＮＡ」は、上記の一般式におけるＹが、−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に結合する）である、ロックドヌクレオチドを含む。Ｒｅは、水素またはメチルである。
【０２２６】
いくつかの具体的な実施態様において、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡまたはベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡから選択され、特にベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０２２７】
ヌクレオチド内結合
本明細書に記載のオリゴマーのモノマーは、結合基を介して一緒に結合する。適当には、各モノマーは、結合基を介して３’隣接モノマーと結合する。
【０２２８】
本発明に関して、オリゴマーの末端の５’モノマーは、５’結合基を含まないが、５’末端基を含んでいても含んでいなくてもよいことを当業者であれば理解するであろう。
【０２２９】
用語「結合基」または「ヌクレオチド内結合」は、２個のヌクレオチドと一緒に共有結合しうる基を意味することを意図とする。具体的かつ好ましい例として、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が挙げられる。
【０２３０】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続したヌクレオチド配列は、結合基を介して一緒に結合する。適当には、各ヌクレオチドは、結合基を介して３’隣接ヌクレオチドと結合する。
【０２３１】
適当なヌクレオチド内結合には、ＷＯ２００７／０３１０９１に列挙されたもの、例えば、ＷＯ２００７／０３１０９１（本明細書によって引用される）の第３４頁の第１段落で列挙されたヌクレオチド内結合が含まれる。
【０２３２】
いくつかの実施態様において、その標準ホスホジエステルからヌクレアーゼ攻撃により耐性を示すものへのヌクレオチド内結合、例えばホスホロチオエートまたはボラノホスフェートを修飾することが好ましい−これら２種は、ＲＮａｓｅ  Ｈによって開裂されるものであり、また、標的遺伝子の発現を減少させるアンチセンス阻害経路をもたらす。
【０２３３】
いくつかの実施態様、例えば、上記の実施態様において、適当かつ明確に示されていない場合、全ての残りの結合基は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれか、またはその混合物である。
【０２３４】
いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド内結合基は、ホスホロチオエートである。
【０２３５】
コンジュゲート
本明細書における、用語「コンジュゲート」は、１つまたはそれ以上の非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分に対する本明細書に記載のオリゴマーの共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成される異種分子を示すことを意図とする。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例として、高分子物質、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせが挙げられる。典型的には、タンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であってもよい。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールであってもよい。
【０２３６】
したがって、種々の実施態様において、本発明のオリゴマーは、典型的には連続したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド領域、およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでいてもよい。連続したヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーを示す場合、化合物は、非ヌクレオチド成分、例えばコンジュゲート成分を含みうる。
【０２３７】
本発明の種々の実施態様において、オリゴマー化合物は、例えば、オリゴマー化合物の細胞内取り込み量を増加させるために用いられうる、リガンド／コンジュゲートと結合する。ＷＯ２００７／０３１０９１は、適当なリガンドおよびコンジュゲートを提供し、それは本明細書によって引用される。
【０２３８】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明の化合物、および前記化合物と共有結合する少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。したがって、本発明の化合物が、本明細書に記載されるように、特定の核酸またはヌクレオチド配列からなる種々の実施態様において、化合物はまた、前記化合物と共有結合する少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない）を含んでいてもよい。
【０２３９】
（コンジュゲート部分に対する）コンジュゲーションは、本発明のオリゴマーの活性、細胞内分布または細胞内取り込み量を強化しうる。かかる部分には、限定されるものではないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム  １，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０２４０】
本発明のオリゴマーはまた、活性薬剤物質、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質とコンジュゲートしうる。
【０２４１】
ある実施態様において、コンジュゲートした部分は、ステロール、例えばコレステロールである。
【０２４２】
種々の実施態様において、コンジュゲートした部分は、正電荷ポリマー、例えば、長さ１〜５０、例えば２〜２０、例えば３〜１０個のアミノ酸残基の正電荷ペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えばポリエチルグリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールを含むかまたはそれらで構成される−ＷＯ２００８／０３４１２３（本明細書によって引用される）を参照。適当には、正電荷ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドは、リンカー、例えばＷＯ２００８／０３４１２３に記載の切断可能なリンカーを介して本発明のオリゴマーと結合しうる。
【０２４３】
例として、以下のコンジュゲート部分は、本発明のコンジュゲートに用いられうる：
【化９】
2014533099.tif 000012
【０２４４】
活性化オリゴマー
本明細書に用いられる、用語「活性化オリゴマー」は、１種または複数のコンジュゲートした部分、すなわち、核酸またはモノマーその物ではない部分にオリゴマーが共有結合し、本明細書に記載のコンジュゲートを形成することを可能にする、少なくとも１つの官能基に共有結合する（すなわち、官能化する）本発明のオリゴマーを示す。典型的には、官能基は、例えば、３’−ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外ＮＨ２基を介してオリゴマーと共有結合しうる化学基、好ましくは親水性であるスペーサーおよびコンジュゲートした部分と結合しうる末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を含む。いくつかの実施態様において、該末端基は、保護されていない、例えば、ＮＨ２基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、任意の適当な保護基、例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ  Ｍ  Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）に記載のものによって保護されている。適当なヒドロキシル保護基の例として、エステル、例えば酢酸エステル、アラルキル基、例えばベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチル、およびテトラヒドロピラニルが挙げられる。適当なアミノ保護基の例として、ベンジル、アルファ−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えばトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルが挙げられる。いくつかの実施態様において、官能基は、自己開裂する。他の実施態様において、官能基は、生分解性である。例えば、米国特許番号第７，０８７，２２９号（その全体は本明細書によって引用される）を参照。
【０２４５】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマーは、コンジュゲートした部分をオリゴマーの５’末端に共有結合させるために５’末端で官能化される。他の実施態様において、本発明のオリゴマーは、３’末端で官能化されうる。また他の実施態様において、本発明のオリゴマーは、骨格に沿ってまたは複素環塩基部分で官能化されうる。さらに他の実施態様において、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、骨格または塩基から独立して選択される１以上の位置で官能化されうる。
【０２４６】
いくつかの実施態様において、本発明の活性化オリゴマーは、合成中に官能基と共有結合する１またはそれ以上のモノマーを組み込むことによって合成される。他の実施態様において、本発明の活性化オリゴマーは官能化されていないモノマーと合成され、該オリゴマーは合成終了すると官能化される。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダートエステルと官能化され、ここで、アルキル部は式（ＣＨ２）ｗ（式中：ｗは、１〜１０の範囲の、好ましくは約６の整数である）を有し、アルキルアミノ基のアルキル部は直鎖または分枝鎖であってもよく、官能基はエステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＮＨ）を介してオリゴマーに結合する。
【０２４７】
他の実施態様において、オリゴマーは、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカー（式中：ｗは、１〜１０の範囲の、好ましくは約６の整数である）を含有するヒンダートエステルと官能化され、ここで、アルキルアミノ基のアルキル部は直鎖または分枝鎖であってもよく、官能基はエステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＳＨ）を介してオリゴマーに結合する。
【０２４８】
いくつかの実施態様において、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、（ジスルフィド結合を形成して）ポリマー部分、例えばポリエチレングリコールまたはペプチドとコンジュゲートされる。
【０２４９】
上記のヒンダートエステルを含有する活性化オリゴマーは、当該分野にて周知の任意の方法によって、特にＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０３４１２２およびその中の実施例（その全内容は本明細書によって引用される）に記載の方法によって合成されうる。
【０２５０】
また他の実施態様において、本発明のオリゴマーは、米国特許番号第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載の実質的な官能化試薬、すなわち、保護または非保護スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む反対の末端に親水性スペーサー鎖を介して結合する一方の末端にホスホルアミダイトを有する実質的な直鎖試薬(substantially linear reagent)によってオリゴマーにスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を導入することによって官能化される。かかる試薬は、最初に、オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施態様において、かかる活性化オリゴマーは、オリゴマーの５’−ヒドロキシル基と結合する官能化試薬を有する。他の実施態様において、活性化オリゴマーは、３’−ヒドロキシル基と結合する官能化試薬を有する。また他の実施態様において、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの骨格上のヒドロキシル基と結合する官能化試薬を有する。またさらなる実施態様において、本発明のオリゴマーは、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号（その全内容は本明細書によって引用される）に記載の１種以上の官能化試薬で官能化される。かかる官能化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマーに組み込む方法は、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載されている。
【０２５１】
いくつかの実施態様において、固相結合オリゴマーの５’末端は、ジエニルホスホルアミダイト誘導体と官能化し、次いで、例えば、ディールス・アルダー付加環化反応を介してアミノ酸またはペプチドと脱保護オリゴマーとがコンジュゲートする。
【０２５２】
種々の実施態様において、オリゴマーへの２’−糖修飾、例えば２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖を含有するモノマーの導入は、オリゴマーの糖へのコンジュゲートした部分の共有結合を促進する。他の実施態様において、１種またはそれ以上の２’位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーは、例えば、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシ  ホルホルアミダイトなどの試薬を用いて調製される。例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９１，３４，７１７１を参照。
【０２５３】
またさらなる実施態様において、本発明のオリゴマーは、核酸塩基（Ｎ６プリンアミノ基、グアニンの環外Ｎ２、またはシトシンのＮ４もしくは５位を含む）上にアミン含有官能基を有しうる。種々の実施態様において、かかる官能化は、オリゴマー合成においてすでに官能化されている市販の試薬を用いて達成されうる。
【０２５４】
いくつかの官能基は、商業的に入手可能である、例えば、ヘテロ二機能性およびホモ二機能性結合部分は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）から入手可能である。いくつかの実施態様において、他の商業的に入手可能な結合基は、５’−アミノ−修飾因子Ｃ６および３’−アミノ−修飾因子試薬であり、両方ともＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．）から入手可能である。５’−アミノ−修飾因子Ｃ６はまた、アミノリンク−２としてＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能であり、３’−アミノ−修飾因子はまた、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【０２５５】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬製剤および組成物に用いられうる。適当には、かかる組成物は、医薬的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適当なおよび好ましい医薬的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供する−それは、本明細書によって引用される。適当な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ剤、プロドラッグ製剤はまた、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２にて提供される−それはまた、本明細書によって引用される。
【０２５６】
実施態様
１．対象におけるＣ型肝炎感染症（ＨＣＶ）の治療方法であって、ＨＣＶに感染した対象にｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミクロＲＮＡ−１２２のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、例えばミラビルセンを投与することを含み、該対象が、正常な肝機能を示す、前記治療前の血清バイオマーカーを有する、方法。
２．血清バイオマーカーが、ｍｉＲ−１２２、ガンマＧＴ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびＡＳＴ／ＡＬＴの１種またはそれ以上からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
３．血清バイオマーカーが、血清ｍｉＲ−１２２を含む、実施態様１〜２のいずれか１つに記載の方法。
４．血清ｍｉＲ−１２２のレベルが、正常上限値を下回る、実施態様３記載の方法。
５．血清バイオマーカーが、血清ＡＬＴを含む、実施態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．血清ＡＬＴが、正常上限値を下回る、実施態様５記載の方法。
７．血清バイオマーカーが、血清ＡＳＴを含む、実施態様１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．血清ＡＳＴが、正常上限値をかなり下回る、実施態様７に記載の方法。
９．血清バイオマーカーが、血清ＧＧＴを含む、実施態様１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．血清ガンマＧＴが、正常上限値を下回る、実施態様９記載の方法。
１１．血清バイオマーカーが、血清ＡＳＴ／ＡＬＴ比を含む、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．ＡＳＴ／ＡＬＴ比が１未満である、実施態様１１記載の方法。
１３．対象が、治療を受けていない、および／または、無症状である、および／または、過去３年以内にＨＣＶと診断されている、実施態様１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．ＡＬＴの血清レベルおよびＡＳＴの血清レベルが、正常上限値を下回る、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ＡＬＴの血清レベルおよびｍｉＲ−１２２の血清レベルが、正常上限値を下回る、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１６．ＡＳＴの血清レベルおよびｍｉＲ−１２２の血清レベルが、正常上限値を下回る、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１７．ＧＧＴの血清レベルおよびｍｉＲ−１２２の血清レベルが、正常上限値を下回る、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１８．ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤を用いて、ＨＣＶ感染症に感染したヒト対象の治療の適合性を決定する予測方法であって、
ｉ）ＨＣＶに感染したヒト対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血清サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと対照サンプルまたは対照値とを比較する工程を含み、該対象が、ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤でのＨＣＶ感染症の治療に適している可能性があるかまたはそれに適している（すなわち、適当なｍｉＲ−１２２阻害剤レスポンダー）かどうかを決定する、方法。
１９．ミクロＲＮＡ−１２２阻害剤が、オリゴヌクレオチド全体を通して、ミクロＲＮＡ−１２２またはその部分配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様１８記載の方法。
２０．ＨＣＶに感染した対象が、治療を受けていない、および／または、無症状である、および／または、過去３年以内にＨＣＶと診断されている、実施態様１８または１９記載の方法。
２１．少なくとも１種のバイオマーカーが、ＨＣＶ感染症の治療に対する反応性で識別される、実施態様１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．少なくとも１種のバイオマーカーが、肝機能バイオマーカーである、実施態様２１記載の方法。
２３．少なくとも１種のバイオマーカーが、血清ミクロＲＮＡ、ガンマＧＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＴからなる群から選択される、実施態様１８〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２４．少なくとも１種のバイオマーカーが、ミクロＲＮＡ、例えば肝臓で発現したミクロＲＮＡである、実施態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２５．ミクロＲＮＡが、ミクロＲＮＡ−１２２またはその前駆体である、実施態様２４記載の方法。
２６．ミクロＲＮＡが、成熟ｍｉＲ−１２２である、実施態様２５記載の方法。
２７．ミクロＲＮＡバイオマーカーレベルが、血清サンプル中の少なくとも１種の対照ミクロＲＮＡ、例えば血清レベルが一定であるミクロＲＮＡのレベルと比較される、実施態様１８〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．対照ミクロＲＮＡが、１つまたはそれ以上の、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−３４５、およびｍｉＲ−１６からなる群から選択される、実施態様２７記載の方法。
２９．少なくとも１種のバイオマーカーが、肝機能バイオマーカー、例えば肝酵素である、実施態様１８〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．肝酵素が、ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、およびＧＧＴからなる群から選択される、実施態様２９記載の方法。
３１．少なくとも２種の肝酵素バイオマーカーレベルが測定される、実施態様２９または３０記載の方法。
３２．少なくとも２、３、または４種のバイオマーカーレベルが測定される、実施態様１８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．少なくとも２種の肝酵素バイオマーカーレベルならびに少なくとも１種のミクロＲＮＡバイオマーカーレベルが測定される、実施態様１８〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３４．ミクロＲＮＡバイオマーカーがｍｉＲ−１２２である、実施態様３３記載の方法。
３５．少なくとも２種の肝酵素バイオマーカーが、ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、およびガンマＧＴからなる群から選択される、実施態様３３または３４記載の方法。
３６．血液サンプル中のＡＬＡＴおよび／またはｍｉＲ１２２および／またはＧＧＴのレベルを測定する工程を含み、ＡＬＡＴおよび／またはｍｉＲ−１２２、ＡＬＡＴおよび／またはＧＧＴ、またはＡＬＡＴおよびｍｉＲ−１２２および／またはＧＧＴの上昇が、ｍｉＲ−１２２阻害剤での治療に適していない対象を示す、実施態様３５記載の方法。
３７．血液サンプル中のＡＬＡＴおよび／またはｍｉＲ１２２および／またはＧＧＴのレベルを測定する工程を含み、ＡＬＡＴおよび／またはｍｉＲ−１２２、ＡＬＡＴおよび／またはＧＧＴ、またはＡＬＡＴおよびｍｉＲ−１２２および／またはＧＧＴの上昇なしが、ｍｉＲ−１２２阻害剤での治療に適している対象（［適当な］レスポンダー）を示す、実施態様３５または３６記載の方法。
３８．対照サンプルまたは対照値が、ＨＣＶに感染していない１またはそれ以上の対象から得られる、例えば、比較ＨＣＶ感染していない健常集団からの平均値である、実施態様１８〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．ＨＣＶの治療方法であって、実施態様１８〜３８のいずれか１つに記載の方法を含み、さらに前記対象、例えば適当なレスポンダーと同定された対象に前記ｍｉＲ−１２２阻害剤を投与する工程を含む、方法。
４０．ＨＣＶに感染したヒト対象におけるＨＣＶの治療に用いるためのｍｉＲ−１２２阻害剤であって、例えば実施態様１８〜３８のいずれか１つに記載の方法によって、ｍｉＲ−１２２阻害剤に対するレスポンダーとしてすでに同定されている対象に使用する、ｍｉＲ−１２２阻害剤。
４１．上記方法にて用いるための予測キットであって、ヒトｍｉＲ−１２２の定量化アッセイ、および少なくとも１種のさらなるバイオマーカーの少なくとも１種のさらなる定量化アッセイを含む、キット。
４２．ＨＣＶ感染症を患う対象への投与のための、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えばミラビルセンの適当な有効量を決定する方法であって、
ｉ）対象から血液サンプルを得る工程
ｉｉ）血液サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーレベルを測定する工程
ｉｉｉ）所望により、少なくとも１種のバイオマーカーレベルと１つまたはそれ以上の対照サンプルまたは対照値とを比較する工程を含み、ＨＣＶ感染症を軽減するために対象に投与するためのミクロＲＮＡ−１２２阻害剤の適当な有効量を決定する、方法。
４３．ＨＣＶ治療薬、例えばミクロＲＮＡ−１２２阻害剤のコンパニオン診断として用いるための、肝特異的ミクロＲＮＡ、例えばミクロＲＮＡ−１２２の検出プローブ。
４４．ＨＣＶ治療剤での治療のための、（例えば、慢性）ＨＣＶの治療を必要とする対象の適合性を決定するための予測アッセイに用いられる、実施態様４３記載の検出プローブ。
４５．血清中肝特異的ミクロＲＮＡレベルが、治療対象の適合性と逆相関している、実施態様４３または４４記載の検出プローブ。
【実施例】
【０２５７】
（実施例）
トランスアミナーゼバイオマーカーアッセイ：
ＡＬＴを測定するために用いられるバイオマーカープロトコールは、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＬＴアッセイ（０３９０３１６６  Ｒｅｖ．Ｂ  ２００７−０５）であった；ＡＬＴを測定するためのプロトコールは、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＬＴアッセイ（０３８１５１５１  Ｒｅｖ．Ｂ  ２００７−０５）であり、ＧＧＴを測定するためのプロトコールは、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＬＴアッセイ（０４１３０７５６  Ｒｅｖ．Ｂ  ２００７−０５）であった。
【０２５８】
ミクロＲＮＡを、ＡＢＩのＴａｑｍａｎアッセイを用いて検出した。ミクロＲＮＡの別の供給業者の例は、本明細書の他の部分で提供され、例えば、Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ  ｍｅｒｃｕｒｙ  ＬＮＡ（登録商標）試薬が含まれる。
【０２５９】
実施例１：ミラビルセンでの治療に対するウイルス学的反応の等級付け
慢性ＨＣＶ遺伝子型１感染症を患う３６人の治療を受けていない患者を用いて、ランダム化二重盲検プラセボ対照漸増反復投与フェーズ２ａ試験を実施した。患者を、３つのコホートの１つに順に分類した（１コホート当たり９の活性剤：３のプラセボ）。ミラビルセンを、コホート１では３ｍｇ／ｋｇで、コホート２では５ｍｇ／ｋｇで、そして、コホート３では７ｍｇ／ｋｇの用量で、２９日にわたって毎週皮下注射した（合計で５回注射した）。
【０２６０】
試験中の全患者から、血液を治療開始前に２回サンプリングした：試験への参加に対する適合性を評価するためのスクリーニング訪問時、および最初の治療投与直前の基準時。治療開始後、最初の治療投与後第１８週まで、毎週サンプリングした。
【０２６１】
血清を各サンプルから単離し、ＨＣＶウイルス価を、サンプル中のｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＨＣＶ ＲＮＡレベルを評価することによって定量化した。
【０２６２】
各患者におけるミラビルセンでの治療に対する反応は、０〜４のスコアで等級付けされた。該グレードは、基準値と比較して、ＨＣＶ ＲＮＡにおける最大対数（底は１０）減少に基づいて付与される。
【０２６３】
具体的には、
（ｉ）    グレード０：１未満の対数減少、
（ｉｉ）  グレード１：１以上であって、２未満の対数減少、
（ｉｉｉ）グレード２：２以上であって、３未満の対数減少、
（ｉｖ）  グレード３：３以上であって、４未満の対数減少、
（ｖ）    グレード４：４以上の対数減少。
【０２６４】
一部の患者は、全１８週の試験期間を終了せずに、様々な理由により早期に試験を終了した。さらに、コホート３では、現時点で全ての患者が第１８週に達していなかった。所定の患者の反応グレードは、その患者の全試験期間中に観測された最大反応に基づくことから、本発明者らは異なる試験期間が反応グレードにバイアスをかけるかどうかを確認した。該目的のために、本発明者らは、反応グレートと試験期間（すなわち、終了した週数）間にそのような関連性があるかどうかを評価した。図１は、終了した週数に応じた反応グレードの箱ひげ図を示す。
【０２６５】
図１から明らかなように、反応グレードと試験期間の間には関連性がない。これは、グレードが、一部の患者について１８週より短い試験期間によってバイアスがかからないことを立証している。
【０２６６】
ＦＤＡ抗ウイルス薬諮問委員会は、１２週でＨＣＶ ＲＮＡの＜１のｌｏｇ１０減少を伴う患者として慢性Ｃ型肝炎感染症の治療に対するヌルレスポンダーを定義する（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４６  Ｎｏ．６）。同様に、部分レスポンダーは、１２週でＨＣＶ ＲＮＡの＞１だが＜２のｌｏｇ１０減少として定義される。したがって、比較すると、本明細書で定義されるグレード０はヌルレスポンダーの一部であり、グレード１は部分レスポンダーの一部である。
【０２６７】
実施例２：ミラビルセン投与レベルへの反応グレード依存性
次に、本発明者らは、実施例１に示される単純な５段階の等級付けによって定量化されるミラビルセンでの治療に対するウイルス学的反応が、化合物の用量レベルに依存しうると仮定した。
【０２６８】
したがって、フェーズ２ａ試験（実施例１）に用いられる３つの用量レベルについて、本発明者らは、反応グレードと用量レベル間に関連性があるかどうかを評価した。
【０２６９】
各反応グレードについて、用量レベルごとの患者数を図２Ａに示す。低級グレード（０および１）では、３ｍｇ／ｋｇの用量レベルが大きな比率を占める。対照的に、高級グレード（３および４）では、３ｍｇ／ｋｇの用量レベルは存在していない。５および７ｍｇ／ｋｇの用量レベルを比較しても、明確な差はない。フィッシャーの直接確立検定を利用するこれらのデータの統計的分析は、５および７ｍｇ／ｋｇの用量レベル間の反応グレードに有意差がないことを裏付ける（Ｐ＝０．７８）。本発明者らが、５および７ｍｇ／ｋｇの用量レベルをプールし、これを３ｍｇ／ｋｇ投与と比較する場合、反応グレードの分布は、境界有意差である（Ｐ＝０．０９）。
【０２７０】
治療投与量の関数としての反応グレードの分布はまた、図２Ｂの分割表として示される。ここで、各反応−治療投与量の組み合わせにおいて患者が十分になるように、反応グレードを０および１対２、３および４に分類し、治療投与量を３ｍｇ／ｋｇ対５および７ｍｇ／ｋｇに分類する。明らかなように、ほとんどの高級反応グレード（２、３および４）は、高治療用量（５および７ｍｇ／ｋｇ）で達成される。治療用量と反応グレードとのこの関連性は、統計的に有意である（フィッシャーの直接確立検定によるＰ＜０．０５）。
【０２７１】
両方のアプローチは、３ｍｇ／ｋｇの低量で投与された少なくともいくつかの低レスポンダー（グレード０）が、高濃度のミラビルセンが投与された場合に、反応を示したかもしれないことを意味する。したがって、本発明者らは、グレード０の５または７ｍｇ／ｋｇで投与された３人の患者（図２Ａを参照）が、ミラビルセンでの療法にほとんど反応しない患者を最も明確に示すと結論付ける。
【０２７２】
実施例３：スクリーニング時および基準時のＨＣＶ患者の血清サンプル中のバイオマーカーの測定
実施例１に記載のフェーズ２ａ臨床試験に参加する全ての患者は、（試験の参加／除外を評価するための）スクリーニング時および（最初の治療投与前の）基準時に採血した。所定の患者についてスクリーニング時と基準時のサンプリングの間に６〜３４日あった、その差は、平均２０＋／−６日であった。
【０２７３】
各サンプルについて、４０種の異なるオブザーバブルを評価した。これらには、バイオマーカー測定および機能試験が含まれ、そして、Ａｓｕｒａｇｅｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）によって行われたミクロＲＮＡ定量化を除いて、２つの臨床化学室で行われた、表１を参照。
【表３−１】
2014533099.tif 000013
【表３−２】
2014533099.tif 000014
【０２７４】
臨床化学実験室測定は、別の部分に記載されるように行われた。
【０２７５】
基準時の血清サンプルのみにおいて、ミクロＲＮＡ測定が行われた。簡潔に言えば、ＲＮＡを、Ａｓｕｒａｇｅｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｒｏｕｐによって確立された抽出方法を用いて、各血清サンプルから抽出した。各ＲＮＡサンプルにおいて、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１７、およびｍｉＲ−１８ａのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。これらの測定は、ＴａｑＭａｎ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、２段階ＲＴ−ＰＣＲ製法として行われた。第１段階は、成熟ｍｉＲＮＡ／ＲＴ−プライマーキメラ単位複製配列を生成する、標的特異的ステム−ループ逆転写酵素プライマーを用いて全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に関する。第２段階では、該単位複製配列を単位複製配列特異的順方向および逆方向プライマーを用いて標準ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイで増幅した。プライマーに加えて、蛍光標識された単位複製配列特異的ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲが進むにつれて、単位複製配列の量の増加をモニターするために用いられた。ＴａｑＭａｎプローブからの蛍光シグナルが、Ｃｔ値として定義される、ノイズを上回る閾値を超える、サイクル数は、サンプル中のｃＤＮＡの初期濃度の測定値として用いられる（Ｃｔ値が低くなるほど、少ないサイクルはノイズを上回るシグナルを増幅する必要があり、そして、多くの開始ｃＤＮＡ物質が存在しなくてはならない）。独立した試験において、本発明者らは、ＨＣＶ感染患者と健常なコントロール対象の間で安定に発現される、ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１８ａを同定した。したがって、本発明者らは、ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１８ａのＣｔ値を平均し（ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１８ａの平均Ｃｔ値）、該平均値からｍｉＲ−１２２のＣｔ値を減算した。これは、全ての血清サンプルを比較できるｍｉＲ−１２２のｄＣｔ、ｄＣｔ（ｍｉＲ−１２２）＝（Ｃｔ（ｍｉＲ−１７）＋Ｃｔ（ｍｉＲ−１８ａ））／２−Ｃｔ（ｍｉＲ−１２２）を立証する。具体的には、ｄＣｔ値が大きくなるほど、サンプル中のｍｉＲ−１２２の発現が大きくなる。
【０２７６】
経時的にロバスト性を評価するために、各サンプルにおける各オブザーバブルについて、本発明者らは、スクリーニング時と基準時の測定値の間の関連性を評価した。具体的には、各オブザーバブルについて、本発明者らは、患者のスクリーニング時と基準時の測定値の間の相関性を算出した。結果を表２の最初の２列に示す。明らかなように、２０種のオブザーバブルは、スクリーニング時と基準時の測定値の間に強力かつ有意な相関性を示し（ｒ≧０．７、Ｐ＜０．０００１）、６種のオブザーバブルは弱い相関性を示すかまたは相関性を示さない（ｒ＜０．４、Ｐ＞０．０１）。
【０２７７】
表２．スクリーニング時および基準時の測定値の比較。スクリーニング時および基準時の両方で全ての患者において測定された３３種のオブザーバブルについて、２つの比較値が記載されている。第１列および第２列では、患者のスクリーニング値と基準値を比較する場合の各オブザーバブルの相関係数およびその関連有意性が示されている（スピアマンの順位相関検定）。第３列では、スクリーニング時および基準時の平均値の差を評価する場合の有意差が示されている（ウィルコクソンの符号付き順位検定）。
【０２７８】
相関関係に加えて、本発明者らは、基準時およびスクリーニング時に測定された値の全体的な変化を評価した。そのような値の変化の有意性は、表２の第３列に記載されている。ヘマトクリット値、ヘモグロビン、およびカルシウムのみ（境界有意性）が、有意な値の全変化を示すとして判断される（Ｐ＜０．００５）。
【表４】
2014533099.tif 000015
【０２７９】
実施例４：オブザーバブルの基準レベルとミラビルセンの反応グレード間の関連性の同定
本発明者らは、２つのアプローチ：ウィルコクソンの順位和検定によって評価される、低レスポンダー（グレード０）とその他（グレード１−４）の間の平均測定レベルの有意差、または、スピアマンの順位相関検定によって評価される、測定レベルおよび反応グレード間の有意な相関関係のいずれかを用いて、オブザーバブルの基準レベル（実施例３を参照）とミラビルセンでの治療に対する反応（実施例１を参照）間の関連性を同定した。
【０２８０】
低量群のグレード０レスポンダーの一部が、高用量で投与された場合に、より高いグレードの反応を示すかもしれないけれども、本解析では全３つのコホートからの患者が参加する（実施例２を参照）。
【０２８１】
基本データを有する４０種のオブザーバブルのうち、順位和検定および／または順位相関検定によって評価される反応グレードと最も有意に関連し、また、スクリーニング値と基準値間で高い一致率（ｒ＞０．８、実施例３を参照）を示した４つは、ｍｉＲ−１２２、ＧＧＴ、ＡＬＡＴ、およびＡＳＡＴであった、図３および表３を参照。
【表５】
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【０２８２】
これらの４種のオブザーバブルは全て、肝機能または肝疾患／障害の血清バイオマーカーとして報告されている（ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、およびＧＧＴについては、周知であり、ｍｉＲ−１２２については、Ｂｉｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．６を参照）。
【０２８３】
ＰＴもまた、反応と有意な相関関係を有するものとして同定された（表３）。
【０２８４】
さらに、測定された全てのオブザーバブルについて、本発明者らは、ペアワイズ相関を算出した。これにより、本発明者らは、オブザーバブル間の正の相関関係の程度に基づき、オブザーバブルをクラスター化する、下図４を参照。明らかなように、ｍｉＲ−１２２、ＧＧＴ（ガンマＧＴ）、ＡＬＡＴ、およびＡＳＡＴは、緩やかなペアワイズ相関（平均ペアワイズ相関ｒ＝０．４６）のために一緒にクラスター化する。
【０２８５】
実施例５：予測分類器の構築
実施例４において、本発明者らは、（ａ）肝機能のパラメータ、特に各オブザーバブル、ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ＧＧＴ、およびｍｉＲ−１２２のレベルとミラビルセンの治療反応グレード間の有意な関連性を同定した。さらに、本発明者らは、（ｂ）これらの４種のバイオマーカーが、非常に漠然だが互いに相関していることを示した。最終的に、実施例３では、本発明者らは、（ｃ）ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ＧＧＴについて、スクリーニング時間の測定も利用可能であった場合に、ほとんどの患者において、スクリーニング時および基準時の測定は非常に同様であったことを示した。これら３つの特性、（ａ）有意性、（ｂ）独立性、および（ｃ）ロバスト性は、反応グレードの正確な予測を構築するための１またはそれ以上のこれらのオブザーバブルの有用性を研究する気にさせた。
【０２８６】
本発明者らの予測方法は、決定木（Ｄｕｄａ，Ｈａｒｔ，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｋ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；第２版，２０００）、具体的には二分決定木として周知の分類アルゴリズムによって構築される。
【０２８７】
二分決定木は、聞かれた質問が、現在の質問に対する回答、はいまたはいいえのいずれかによって決定する、一連の質問、または決定として理解されうる。かかる一連の決定は、他のノードを導く枝（回答）で結ばれたノード（質問）からなる木のような構造に示されうる。慣習により、最初のノード（最初の質問）は、木が逆さまになるように、先端に示される。
【０２８８】
本ケースでは、ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ＧＧＴ、およびｍｉＲ−１２２が測定された所定のサンプルについて、二分決定木による分類は、各質問が、１種またはそれ以上のこれらのオブザーバブルが特定のカットオフ値と同じであるかまたは上方にあるかどうかを評価する場合に、一連の質問として進行する。該スキームは、病理学者の検査プロセスに類似しており、ここで、サンプルは、一連の鑑別診断検査を介してだんだん細分化された亜集団に付与される。具体例は、図５に示される。
【０２８９】
図５の木構造の論理的根拠は、図６に示される。図６Ａでは、ミラビルセンで治療した全ての患者のＡＬＡＴおよびＡＳＡＴ測定値（正常上限値に対して表される、実施例３を参照）を、互いにプロットするＡＬＡＴ＜１およびＡＳＡＴ＜１（図６Ａの破線）の全ての患者は、治療効果を示した（反応グレード＞０）。該所見は、図５の最初の質問（ルートノード）によって得られる。図６Ｂでは、ＡＬＡＴ＜１およびＡＳＡＴ＜１でなかった１３の患者のみが示される。これらの患者について、ｍｉＲ−１２２およびＧＧＴ測定値を互いにプロットする。ｍｉＲ−１２２＜２．８２およびＧＧＴ＜４．８７（図６Ｂの破線）について、残りの患者は、ミラビルセンで治療効果を示すものと治療効果を示さないものに完全に分類される。該所見は、図５の第２の質問で得られる。
【０２９０】
該分類モデルは、ミラビルセンでの治療効果が低いかまたは全くない患者は、肝機能障害または肝臓障害がある：正常上限値に比べて、ＡＬＡＴおよび／またはＡＳＡＴのレベルが上昇し、そして、正常上限値に比べて、ｍｉＲ−１２２および／またはＧＧＴのレベルが非常に上昇したことを示す。
【０２９１】
実施例６：分類器の学習および検定
次に、決定木を作製または「拡大」するために学習データを使用する事項について検討する。任意の決定木は、サンプルをますます小さなサブセットに徐々に分類する。理想的には、各サブセットは、最終的に、同一ラベル（例えば、グレード０）が付与されたサンプルのみを含有すべきである。また、好ましくは、１個のみまたは数個のサブセットは、所定のラベルを有するサンプルを含有すべきである。最終的に、本発明者らは、データを説明する最も単純なモデルが、一般的に、好ましいモデルであるという一般的所見に照らして、単純でコンパクトな木を選択した。
【０２９２】
分類後のサブグループにおける単一ラベル「純度」を最適化する複数の異なる数学的測定が提案されている（Ｄｕｄａ，Ｈａｒｔ，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｋ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；第２版，２０００）。１つの例は、分散不純物測定ｉ（Ｎ）＝Ｐ１Ｐ２（式中：Ｐｊは、ラベルｊを有するノードＮのサンプルの関数である）である。該測定を用いて、分類後の不純物の降下、Δｉ（Ｎ）を最大にする所定のカットオフ値のオブザーバブルは、勾配降下アルゴリズムを組み合わせて包括的な検索によって見出されうる。ここで、不純物の降下Δｉ（Ｎ）は、Δｉ（Ｎ）＝ｉ（Ｎ）−ＰＬｉ（ＮＬ）−（１−ＰＬ）ｉ（ＮＲ）と定義され、ここで、ＮＬおよびＮＲは、左側および右側の派生ノードであり、ｉ（ＮＬ）およびｉ（ＮＲ）は、それらの不純物であり、所定のオブザーバブルおよびカットオフ値が用いられる場合にＮＬに移行するノードＮのパターンの画分である。
【０２９３】
学習データが、分類器が検定時に直面する全てのバイオマーカー測定を示す場合に、かかる測定は最もよく機能する。実際に、これは、学習データ中の患者数が、木の構造およびカットオフ値に大きな影響を与えることなく、学習データ中の一部の患者、約５〜１０％を除くことができるように十分に多い必要があることを意味する。そのため、そのような学習した木は、ロバスト性であると言われている。
【０２９４】
そのような確実に学習した分類器の予測能力（正確性、特異性、感受性など）の不偏推定値は、患者の独立した新しいセット、試験データを用いて構築されうる。最も重要なことは、試験データは、分類器を学習する任意の方法で用いられてはいけない。
【０２９５】
本明細書に記載の方法によって確実に学習した木に含まれるバイオマーカーならびに同定されたカットオフ値は、分類器を患者の独立した試験セットに適用して高い精度を達成する場合に、一般的に予測可能であると認められうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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