(57)【要約】修飾された高度精製酵母ＲＮＡを含む、多くのウイルスに対して多重作用を有する新たな抗ウイルス化合物を得る方法、そのようなＲＮＡを含む医薬組成物、ならびに、ウイルス性疾患の症状を改善するのに有効な量のリボ核酸を含む組成物を患者に投与することを含む、ウイルス性疾患を治療および予防する方法。外因性修飾された酵母ＲＮＡは、顕著な多重抗ウイルス作用を広範な濃度で有する。修飾された酵母ＲＮＡは、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、肝炎、ヘルペスウイルス科、エンテロウイルス、およびアデノウイルスからのウイルスの増殖を阻害し得る。他にも、修飾酵母ＲＮＡは、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、陰部ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス、およびコクサッキーＢ群ウイルスの増殖を阻害し得る。
2014509589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者においてウイルスによる感染症を予防または治療する方法であって、
前記患者に、糖と組み合わせた精製ＲＮＡ抽出物を含む組成物を、前記感染症を予防または治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が、ウイルス増殖を阻害し得る量の精製酵母ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞においてウイルス複製をもたらす前記ウイルスの受容体を阻害するのに有効な量の前記組成物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
オルトミクソウイルス科から選択されるウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが、アンスロポノーシス急性呼吸器ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
パラミクソウイルス科からのウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
肝炎種ウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヘルペスウイルス科からのウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが陰部ヘルペスウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス感染症がＨ１Ｎ１株のインフルエンザである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルス感染症が、Ｈ５Ｎ２株のインフルエンザである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト免疫不全ウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エンテロウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスがコクサッキーＢ群ウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アデノウイルスによる感染症を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物を鼻腔内、皮下、経口、腹腔内、筋肉内、静脈内で、またはウイルス感染の領域もしくは感染の病巣で局所的に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物を、注射剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、ゲル剤、または噴霧剤の形態で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
糖と組み合わせた精製ＲＮＡ抽出物を含む、ウイルスによる感染症を予防または治療するための組成物。
【請求項２２】
前記ＲＮＡが、酵母からの抽出物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈｓｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記精製ＲＮＡ抽出物が、タンパク質、ＤＮＡ、およびヌクレオチドを実質的に含有しない、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記精製ＲＮＡが、窒素１４．５重量％超およびリン８．５重量％超を含有する酵母抽出物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記精製ＲＮＡが、２５±１０のヌクレオチドを有する断片を少なくとも７５重量％含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ抽出物が、組成物のうちの少なくとも約５０重量％を占めている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＲＮＡ抽出物および前記糖が、重量で約１．５：１から約３．５：１のＲＮＡ抽出物：糖の割合で存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＲＮＡが、２５±１０のヌクレオチドを有するヌクレオチド断片を少なくとも９９重量％の純度で含む酵母ＲＮＡ抽出物であり、
前記酵母ＲＮＡ抽出物が、マンニトールと共に加熱されていて、
前記酵母ＲＮＡ抽出物およびマンニトールが、重量で約２：１から約３：１の割合で組成物中に存在し、
前記ＲＮＡ抽出物が、組成物の少なくとも約５０重量％を占めている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
ウイルスによる感染症を予防または治療するための組成物を調製する方法であって、少なくとも１種の糖と共に、精製酵母ＲＮＡ抽出物を４０〜７０℃の範囲の温度に加熱することを含む、方法。
【請求項３２】
前記糖がマンニトールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡ抽出物をアルカリ性アミノ酸と共に処理することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡ抽出物をアルギニンと共に処理することを含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗ウイルス薬に対する耐性率が急速に高まっていることによって、異なる作用機序を有する新たな併用薬物、さらには、新たに発見された標的に対して作用する新規薬物が必要とされている。ウイルス性疾患は往々にして、いくつかの種類のウイルスに関連しているので、可能な限り多くのウイルスに対して複数の作用機序を有する新規な抗ウイルス薬について調査することが、治療成績を改善するためには特に重要である。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ分子は、幅広い多様な立体配座を採用し、ある範囲の細胞機能を果たし得る。このことは、特異的なＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−タンパク質相互作用の形成を可能にするその構造によって達成される。これらのＲＮＡ相互作用の研究の功績によって、様々な障害を治療する新規な方法を開発することが可能となった。今までのところ、遺伝子阻害薬、遺伝子修正薬（ｇｅｎｅ  ａｍｅｎｄｅｒ）、タンパク質阻害薬、および免疫賦活性ＲＮＡとして分類され得る治療用ＲＮＡが、最も大きな注目を受けている（Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１８、７月１１日、２５２〜２５８頁）。
【０００３】
遺伝子阻害薬は、その標的転写物を、配列依存的にそれと共に塩基対を形成することによって特異的に認識する相補性ＲＮＡによって代表される。それらは、アンチセンスＲＮＡとも称される。このＲＮＡ二本鎖の形成は、標的ＲＮＡの分解、またはその翻訳の阻害をもたらすと考えられる。ある種のＲＮＡはＲＮＡ加水分解において触媒作用を果たし得るというさらなる発見が、トランス切断性リボザイムと呼ばれる新規な群の治療用ＲＮＡの開発につながった。そのようなリボザイムは、塩基対相互作用を介して基質ＲＮＡに結合し、結合した標的ＲＮＡを切断し、これにより、切断生成物を放出する（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ，Ｃ．、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｋ．、Ｍａｒｓｈ，Ｔ．、Ｐａｃｅ，Ｎ．  ＆  Ａｌｔｍａｎ，Ｓ、「Ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｍｏｉｅｔｙ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｐ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ」、Ｃｅｌｌ、１９８３、３５、８４９〜８５７頁）。いくつかの第Ｉ相および第ＩＩ相試験が、少数の感染症患者においてトランス切断性リボザイムを使用して開始されている（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，  Ｆ．、Ｐｏｅｓｃｈｌａ，  Ｅ．  Ｍ．  ＆  Ｌｏｏｎｅｙ，  Ｄ．  Ｊ．、「Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  Ｐｈａｓｅ  １  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅｓ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ」、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９８、９、２４０７〜２４２５頁）。残念なことに、これらの試験において示されているとおり、長期間持続する効果は達成されていない（Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１８、７月１１日、２５２〜２５８頁）。これらの合成リボザイム効力試験の成功を決定する重要な因子には、インビボでリボザイムを適切な細胞に有効に送達する能力、ならびに疾患の進行速度を遅くするのに必要な標的遺伝子阻害のレベルおよび期間が包含される。癌、ＨＩＶ感染、およびＣ型肝炎などの慢性疾患を有する患者に役立つためには、標的転写物の長期かつ高レベルの阻害が必要である。実際問題として、特に高発現ウイルスＲＮＡを標的化している場合には、このことは達成困難であり得る。
【０００４】
タンパク質阻害薬は、高い親和性および特異性で標的タンパク質との結合を可能にする複雑な二次構造を採用し得る、人工的に産生されたＲＮＡによって代表される（Ｄａｌｅｙ  Ｄ．  Ｔ．  Ａ．、Ｌｕｓｃｏｍｂｅ  Ｎ．  Ｍ．、Ｂｅｒｍａｎ  Ｈ．  Ｍ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  Ｊ．  Ｍ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、４、９４３〜９５４頁）。１５〜３５ヌクレオチド長さを有するオリゴヌクレオチドを代表する、これらの生物学的に活性なＲＮＡを選択するためには、いくつかの方法が開発されている。そのようなオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質と特異的に結合し得る（Ａ．  Ｄ．  Ｋｅｅｆｅ、Ｓ．  Ｐａｉ、Ａ．  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ、２０１０、９、５３７〜５５０頁）。
【０００５】
まず第一に、オリゴヌクレオチド合成の技術が開発されたことで、合成オリゴヌクレオチドを広範な標的タンパク質と、高い親和性で結合させることができるようになった。標的タンパク質には、サイトカイン、プロテアーゼ、キナーゼ、細胞表面受容体、および細胞接着分子が包含される。現在、生体に全身投与することができ、血液中の標的（トロンビン、ＩＸａ因子、フォンヴィレブランド因子など）、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などの細胞表面標的と結合し得る合成オリゴヌクレオチドが開発中である。化学合成によって製造されたオリゴヌクレオチドは、有望な治療可能性を有し、現在、眼、血液の疾患、および癌の治療について治験で評価されている（Ｋｅｅｆｅ  Ａ．Ｄ．、Ｓｃｈａｕｂ  Ｒ．Ｇ．、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８年４月、８（２）、１４７〜５２頁、Ｅｐｕｂ  １月２８日、２００８；Ｂａｒｂａｓ  Ａ．Ｓ．、Ｍｉ  Ｊ．、Ｃｌａｒｙ，Ｂ．Ｍ．、Ｗｈｉｔｅ  Ｒ．Ｒ．、「Ａｐｔａｍｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．、２０１０年７月、６（７）、１１１７〜２６頁）。
【０００６】
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドのうちの大部分は、血清中ヌクレアーゼによるヌクレアーゼ媒介分解、腎臓濾過、肝臓、脾臓、および他の組織による取り込みを受ける。したがって、修飾ヌクレオチドによって保護されていないオリゴヌクレオチドの半減期は、２分を超えることはない。これはかなり多くの作業を要するプロセスであるが、ヌクレオチドは、３’末端で特異的に修飾され得、血清中ヌクレアーゼの作用に対して保護され得る（Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．ら、「Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｐｔａｍｅｒｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９９９、１５４、１６９〜１７９頁；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，  Ｌ．ら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ２’，５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９５、２３、３９８９〜３９９４）。この戦略によって、これらのオリゴヌクレオチドの血清中半減期を約１０倍に延長することができる。腎臓での除去を遅延させるために、オリゴヌクレオチドは、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共役させられる。マウスモデルでは、非共役オリゴヌクレオチドは、５〜１０分間の半減期で血液から除去されるのに対して、４０ｋＤａのＰＥＧ複合体は、１日の半減期で循環中に残存する（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，  Ｐ．  Ｅ．ら、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ａｐｔａｍｅｒ  ｔｏ  ＶＥＧＦ．」、Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００５、１２、２５〜３３）。
【０００７】
今日までに、臨床評価を終えて、現在審査中である数種の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドが存在する。２００４年１２月に、初めて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであるペガプタニブが、治療用途について米国食品医薬品局から承認され、ＰｆｉｚｅｒおよびＥｕｅｔｅｃｈからＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）として現在販売されている。これは、２７ヌクレオチドからなる血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）結合性配列を有するオリゴヌクレオチドである。これは、加齢黄斑変性の患者において視力を改善するために、６週間隔で硝子体内注射によって投与される（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，  Ｕ．ら、「Ｙｅａｒ  ２  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ２  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｅｇａｐｔａｎｉｂｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、２００６、１１３、ｅ１〜ｅ２５）。
【０００８】
ＲＥＧ１は、３４ヌクレオチドＩＸａ凝固因子結合性配列を有するオリゴヌクレオチドである。現在、第ＩＩ相治験において評価されている。これはインビボで、静脈内投与の後に、抗凝固の迅速な開始、および解毒薬ＲＢ００７で当初レベルまで戻る抗凝固効果の迅速な逆転を示す（Ｃｈａｎ  Ｍ．  Ｙ．ら、「Ｐｈａｓｅ  １ｂ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｄｏｔｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」、ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００８、１１７、２８６５〜２８７４頁）。
【０００９】
ＡＲＣ１９０５は、現在第Ｉ相治験で評価されている３９配列オリゴヌクレオチドである。これは、ラニビズマブ（ＶＥＧＦ特異的モノクローナル抗体断片である）と組み合わされて、加齢性黄斑変性の治療において使用される（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ  Ｇ．ら、「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ５」、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９９、４２、１〜３、２１９〜２３０頁）。
【００１０】
これらの薬剤の大部分はタンパク質阻害薬に属しているので、それらの最終的な成功は、大部分のオリゴヌクレオチドと共に現在、前臨床研究において評価中である他の群の治療薬と競合する能力（特に、モノクローナル抗体と競合する能力）に左右される。さらに、オリゴヌクレオチドは、タンパク質を標的化する高い特異性によって特徴付けられる。各オリゴヌクレオチドは、ただ１種の特異的タンパク質を阻害し得るが；そのことによって、オリゴヌクレオチドは、ウイルス性疾患を治療するためには信頼性が非常に低い薬剤となっている。ウイルスは、特異的阻害薬に対する耐性をもつようになることが知られており、したがって、ウイルス性疾患を治療するために、そのような高特異的オリゴヌクレオチドを使用する展望は不確実である。
【００１１】
酵母由来のＲＮＡ分子が、治療薬として長く使用されている（Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ｖ．Ｍ．、Ｌｉｄａｋ  Ｍ．、Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ａ．Ｍ．、Ｍｉｋｓｔａｙｓ  Ｕ．Ｙａ．、「Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｒｉｇａ、Ｚａｎａｔｎｅ、１９８５、１９１頁）。しかしながら、この場合、酵母由来ＲＮＡのナトリウム塩が使用される。これは精製されておらず、高い分子量不均一性によって特徴付けられる（ジヌクレオチドから小さなトランスポートＲＮＡに至るまで、全スペクトルのヌクレオチド成分を含有する）。これは他にも、免疫を調節する特性を有する（Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ａ．Ｍ．、Ｐｅｒｅｄｅｒｉｙ  Ｖ．Ｇ．、Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ｖ．Ｍ．、Ｂｙｃｈｋｏｖａ  Ｎ．Ｇ．、「Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  аｃｉｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｋｉｅｖ、Ｈｅａｌｔｈｙ、１９９４、２３２頁）。酵母由来ＲＮＡは、創傷治癒に使用されることが知られている（Ｋｕｌｋａｒｎｉら、「Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、米国特許第５，７１２，２５６号、  Ｊａｎ．  ２７，  １９８８年１月２７日）。しかしながら、この場合、ＲＮＡ加水分解の産物が使用されている（ＲＮＡ自体ではなく、ある種の配列、または二次配置）。均一な分子量を有する高度に精製された酵母由来ＲＮＡが、炎症および炎症関連障害を治療するために提案された（Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｚ．、「Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、米国特許第６，７３７，２７１号、２００４年５月１８日）。この物質に基づき、治療薬ヌクレイナート（Ｎｕｃｌｅｉｎａｔ）が案出された。これは、臨床評価の第ＩＩ相を成功裏に完了し、急性および慢性肺炎症性障害、腎臓の炎症、および他の炎症性疾患を治療するために有効な抗炎症薬であると証明されている。しかしながら、高度に精製された酵母由来のＲＮＡには、特異的抗ウイルス活性が欠けている。今まで、核酸、特にＲＮＡが、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）抗ウイルス作用を有する特異的抗ウイルス薬として使用されたことはない。
【００１２】
インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、３種の血清型：Ａ、Ｂ、およびＣを有する。ＡおよびＢ血清型ウイルスは、同じ属に属し、Ｃ血清型ウイルスは異なる属である。各血清型は、核タンパク質（ＮＰ）抗原およびマトリックス（Ｍ）タンパク質抗原によって決定されるそれぞれ特有の抗原特性セットによって特徴付けられる。Ａ型インフルエンザウイルスは、自然界に広く流行していて、ヒトが、さらには一部の哺乳動物およびトリも罹患し得る。Ｂ型インフルエンザウイルスが、ヒトからしか単離されないのに対して、Ｃ型ウイルスは、ヒトおよびブタの両方から単離され得る。Ａ型およびＢ型のウイルスが、毎年のインフルエンザの流行の原因である。Ａ血清型は、異なる血球凝集素（Ｈ）特性およびノイラミニダーゼ（Ｎ）特性によって特徴付けられるサブタイプからなる。Ａ血清型ウイルスおよび、規模は小さいがＢ血清型ウイルスは、自然の条件下で抗原構造が頻繁に変化することによって特徴付けられる。サブタイプ特異的血球凝集素に対する抗体応答が、インフルエンザ免疫の基本である。現在、脊椎動物において循環するＡ型インフルエンザウイルスには、１５種の公知の血球凝集素（Ｈ）のサブタイプ、および１０種のノイラミニダーゼ（Ｎ）のサブタイプが存在する。ウイルス学的、免疫学的、および血清考古学的研究によって、１８８９年以来、流行および大流行は、血球凝集素Ｈ１、Ｈ２、またはＨ３と、ノイラミニダーゼＮ１、またはＮ２とを含有するウイルスによって引き起こされていることが判明している。これらのウイルスは、Ａ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ２Ｎ２）、およびＡ（Ｈ３Ｎ２）と定義された３種のヒトＡ型インフルエンザサブタイプに分類されている。それらがインフルエンザの大発生の原因であり、その際、同じウイルス株の周期的再来を予測することができる。ウイルスは、鼻咽頭の粘膜および上気道粘膜の上皮で複製し、血管および毛細血管を冒す強力な毒素を産生する。
【００１３】
流行の間、インフルエンザウイルスは、多数の人々を攻撃して、各国の経済にマイナスの影響を及ぼす。したがって、ウイルスの増殖をブロックし得る化学療法薬を探索し、使用することが非常に重要になっている。最近まで、インフルエンザ、さらには他のウイルス性疾患の有効な化学的予防は、非常に複雑であった。１９６３年にＪａｃｋｓｏｎおよび共著者が、１−アミノ−アダマンタンの抗ウイルス作用について初めて言及した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｇ．  Ｇ．、Ｍｕｌｄｏｎ  Ｒ．Ｌ．、Ａｋｅｒｓ  Ｌ．  Ｗ．、「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｌ  ｄｒｕｇ  ａｍａｎｔａｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，  ｉｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓ．  １．、Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９６４、７０３〜７０７頁）。１９６４年には、Ｄｅｖｉｃｅおよび共著者らが、実験結果を刊行した（Ｄａｖｉｅｓ  Ｗ．  Ｌ．、Ｇｒｕｎｅｒｔ  Ｒ．  Ｒ．、Ｄｅ  Ｓｏｍｅｒ  Ｐ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉ−ａｄａｍａｎｔａｎａｍｉｎｅ  （ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６４、１４４、８６２〜８６３頁）。レマンタジンは、インフルエンザを予防および治療するために広く使用される最初の薬物となった。
【００１４】
１９７０年には、Ａ型およびＢ型インフルエンザのウイルスノイラミニダーゼの結晶構造が発見され、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ構成要素を阻害すると、ウイルスの増殖が遅れることが証明された（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ．  Е．、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ，  ｉｎ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｍａｎ」、Ｇ．  Ｊ．  Ｇａｌｌａｓｓｏら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９、７７〜１４９頁；Ｈａｙ  ｄｅｎ  Ｆ．  Ｇ．、Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  Ａ．Ｄ．、Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ．  Ｊ．ら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒ−ａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｚａｎａｍｉｖｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｉｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、ＧＧ  １６７  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、１９９７、３３７、１３、８７４〜８８０頁）。このことによって、Ａ型およびＢ型ウイルス種のノイラミニダーゼの活性をブロックする薬物であるオセルタミビルおよびザナミビルの案出が可能になった。これらの薬物は、気道の上皮細胞を感染から守り、ウイルスが体内に広がるのを防ぐ。オセルタミビルおよびザナミビルは、高い予防および治療有効性を、平均で２〜３日ほどの治療期間の短縮およびより軽い疾患経過と共に示した［Ｍｏｎｔｏ  Ａ．  Ｓ．、Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｄ．  Ｍ．、Ｈｅｎｒｙ  Ｄ．ら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｚａｎａｍｉｖｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  В  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９９、１８０、２、２５４〜２６１頁；Ｉｏｚｚｏ  Ｍ．、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｚａｎａｍｉｖｉｒ」、Ｊ．  Ａｃａｄ．  Ｐｈｙｓ．  Ａｓｓｉｓｔａｎｔｓ、２００１、２、２、１８６〜１８８頁；Ｈｏｙｄｅｎ  Ｆ．  Ｇ．、Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ．  Ｊ．、Ｆｒｉｔｚ  Ｒ．  Ｓ．ら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｓｅｔｔａｍｉｖｉｒ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．、１９９９、２８２、１３、４８〜５０頁）。
【００１５】
インフルエンザおよび急性呼吸器ウイルス感染症の流行は、脆弱な個体群では高い死亡率および重篤な合併症を随伴する。リスク群には、慢性状態、特に心臓血管疾患を有する人々が包含される（Ｄａｖｉｓ  Ｍ．  Ｍ．、Ｔａｕｂｅｒｔ  Ｋ．、Ｂｅｎｉｎ  Ａ．  Ｌ．ら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｄｖｉｓｏｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」、Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６、１１４、１５４９〜１５５３頁）。
【００１６】
急性呼吸器ウイルス感染症およびインフルエンザが心臓発作を引き起こすという説得力のある証拠が存在し、ウイルス感染に対する薬物が、心臓血管疾患を有する人々における心臓発作のリスクを低下させる有効な方法であることが証明されている（Ｗａｒｒｅｎ−Ｇａｓｈ  С、Ｓｍｅｅｔｈ  Ｌ．、Ｈａｙｖｉａｒｄ  Ａ．  Ｃ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｓ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２００９、９、６０１〜６１０頁）。
【００１７】
インフルエンザおよびＡＲＶＤの流行は、脆弱な一群の人々の間では、高い死亡率および危険な合併症を随伴する。リスクのある個体群には、慢性的な病状、特に心臓血管疾患などを有する人々が属する（Ｄａｖｉｓ  Ｍ．Ｍ．、Ｔａｕｂｅｒｔ  Ｋ．、Ｂｅｎｉｎ  Ａ．Ｌ．ら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｄｖｉｓｏｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６年、１１４、１５４９〜１５５３頁）。これまで、ＡＲＶＤおよびインフルエンザの感染と、急性心筋梗塞との間の関係は長年、不明なままであった。種々の研究が、心臓血管による死亡率モデルの季節性を報告しており、このことによって、ＡＲＶＤおよびインフルエンザ循環のモデルが気付かれた（Ａｉｌｉｎｇ  Ｄ．Ｗ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ  Ｗ．Ｃ．、Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓ  Ｃ．Ｈ．、「Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  １９６８−１９７６」、Ａｍ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９８１、１１３、３０〜３３頁；Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｓ．Ｄ．、「Ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ」、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐ．、１９３２、４７、２１５９〜２１７９頁；Ｅｉｃｋｈｏｆｆ  Ｔ．、Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｉ、Ｓｅｒｆｌｉｎｇ  Ｒ．、「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、ＪＡＭＡ、１９６１、１７６、７７６〜７８２頁；Ｈｏｕｓｗｏｒｔｈ  Ｊ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ａ．Ｄ．、「Ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  １９５７−１９６６」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９７４、１００、４０〜４８頁）。
【００１８】
高い体温、筋肉痛、および倦怠などの明瞭な全身的影響を対象とするインフルエンザ患者における臨床スコアによっても、頻繁な心筋虚血エピソードが示された（Ｇｒｅａｖｅｓ  Ｋ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｊ．Ｓ．、Ｐｒｉｃｅ  Ｃ．Ｐ．、Ｃｌａｒｋｅ  Ｇ．Ｈ．、Ｃｒａｋｅ  Ｔ．、「Ｔｈｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ：  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｔ  ｉｎ  １５２  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ａｒｃｈ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  ２００３、１６３、１６５〜１６８頁；Ｉｓｏｎ  Ｍ．Ｇ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｖ．、Ｒｅｍｂｏｌｄ  Ｃ．、Ｄｅｎｔ  Ｊ．、Ｈａｙｄｅｎ  Ｆ．Ｇ．、「Ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｕｎｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ａｄｕｌｔｓ」、Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２００５、４０、４１５〜４２２頁；Ｐａｕｌ  Ｂ．Ｋ．、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」、Ｉｎｄｉａｎ  Ｍｅｄ．  Ｊ．、１９６３、５７、２５１〜２８３頁；Ｖｅｒｅｌ  Ｄ．、Ｗａｒｒａｃｋ  Ａ．Ｊ．、Ｐｏｔｔｅｒ  Ｃ．Ｗ．、Ｗａｒｄ  Ｃ．、Ｒｉｃｋａｒｄｓ  Ｄ．Ｆ．、「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａ２  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ」、Ａｍ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．、１９７６、９２、２９０〜９６頁）。これらの結果から、インフルエンザは、心臓血管の襲撃（ｉｎｃｒｕｓｉｏｎ）を引き起こす急性炎症性刺激の役割を果たし得るという推論に至った。ヒトにおける血管疾患のリスクを予測するために、全身炎症および炎症性細胞活性化のマーカーが、重要な構成要素として使用されるようになった。
【００１９】
インフルエンザウイルスは、炎症、凝固、および代謝の経路に多大な影響を及ぼすことが知られており（Ｍａｄｊｉｄ  Ｍ．、Ａｂｏｓｈａｄｙ  Ｉ．、Ａｗａｎ  Ｉ．、Ｉｉｔｏｖｓｋｙ  Ｓ．、Ｃａｓｓｃｅｌｌｓ  Ｓ．Ｗ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｃａｕｓａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ」、Ｔｅｘ．  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔ．  Ｊ．、２００４、３１、４〜１３頁）、これらは、アテローム斑不安定化をもたらし得、それによって、急性梗塞の主な原因である冠状血管の部分的閉塞または完全な閉塞をもたらし得る（Ｗｈｉｔｅ  Ｈ．Ｄ．、Ｃｈｅｗ  Ｄ．Ｐ．、「Ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ、２００８、３７２、５７０〜５８４頁）。さらに、インフルエンザは、内皮における迅速な変化の急性炎症性および凝固促進刺激として作用する（Ｈｏｕｓｗｏｒｔｈ  Ｊ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ａ．Ｄ．、「Ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  １９５７−１９６６」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９７４、１００、４０〜４８頁；Ｍａｄｊｉｄ  Ｍ．、Ａｗａｎ  Ｉ．、Ａｌｉ  Ｍ、Ｆｒａｚｉｅｒ  Ｌ．、Ｃａｓｓｃｅｌｌｓ  Ｗ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｄ．  Ｔｈｅｒ．、２００５、５、９１〜９６頁）。心筋炎、心膜炎などのインフルエンザ感染の結果としての心臓合併症はよく知られているが、いまだ、急性心筋梗塞のトリガー機序の特徴の下でのインフルエンザの役割は、明確には証明されていない。同時に、課題特異的な文献において、インフルエンザ（疾患および急性呼吸器感染症としてのインフルエンザも含む）は、急性心筋梗塞を、または血管死さえ促進し得るという多くの事実が判明した。異なる条件で、異なる方法を使用して行われた多数の調査によって、インフルエンザと急性心筋梗塞との間には緊密な関係が存在することが示されている。同時に、インフルエンザおよびＡＲＶＤの患者において抗ウイルス性および心保護的な薬物療法を使用することによって、心臓血管合併症のリスクを低下させる可能性を調査する臨床研究は多くない。僅か２つの小さな無作為化調査において、心臓血管疾患患者における心臓発作の予防に対する抗インフルエンザワクチン接種のプラスの影響が推定されており、インフルエンザに対するワクチン接種は、血管死に対してかなりの保護をもたらすことが示された。無作為化結果のモデルで得られた要約評価は、些細ではあるが、ワクチン接種のなお保護的な効果を意味している。著者らは、示されているケースでは、特に、多くの場合に予め決定されているワクチン接種の対抗的コード（ｏｐｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｄｅ）を有する心臓血管疾患を有するヒトでは、抗インフルエンザワクチン接種が奨励されるべきであると判断している（Ｗａｒｒｅｎ−Ｇａｓｈ  Ｃ、Ｓｍｅｅｔｈ  Ｌ、Ｈａｙｖｉａｒｄ  ＡＣ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｓ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ａｃｕ��ｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２００９、９、６０１〜６１０頁）。
【００２０】
したがって、インフルエンザは急性心筋梗塞の発症、血管死の増加を引き起こし得るが、抗ウイルス薬を利用することが、心臓血管疾患患者において心臓発作のリスクを低下させる有効な方法であり得るという事実の明快な証拠が存在する。
【００２１】
肝炎ウイルス
世界保健機関（ＷＨＯ）によると、肝炎は、感染性または毒性因子によって引き起こされる肝臓の炎症と定義される。多くの場合に、肝炎は、５種のウイルス因子：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＢＶ関連デルタ因子またはＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のうちの１種によって引き起こされる。
【００２２】
Ａ型肝炎は、胃腸管、特に肝臓が主に罹患する急性感染症である。Ａ型肝炎は、汚染された食品または水を介して広がるＡ型肝炎ウイルスによって引き起こされる。急性Ａ型肝炎を有するヒトが、感染源である。肝臓細胞死および肝機能障害に至るので、該疾患は危険である。
【００２３】
Ｂ型肝炎は、炎症を引き起こすことによって肝臓を冒すＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる。世界中で約６００，０００人が毎年、Ｂ型肝炎関連合併症で死亡している。ＨＢＶは、感染しているヒトから、血液、または精液、膣分泌物、および唾液などの他の体液を介して伝染する。Ｂ型肝炎ウイルスの伝染機序は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の伝染機序と同じであるが、後者（ＨＩＶ）と比較して、ＨＢＶ感染力は５０〜１００倍高い。ＨＩＶとは異なり、ＨＢＶは、人体から出た環境中で少なくとも７日間は耐え得る。
【００２４】
Ｄ型肝炎。Ｄ型肝炎は、Ｄ型肝炎ウイルス（またはデルタウイルス）によって引き起こされ、大規模な肝細胞損傷を伴う急性発症によって特徴付けられる。デルタウイルスは、それ自体では複製することができず、その複製および発現には、ＨＢＶの存在を必要とする。Ｄ型肝炎は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎と同様の伝染機序に従う。その潜伏期間は、３から７週間である。Ｄ型肝炎の臨床症状は、Ｂ型肝炎の臨床症状に類似している。Ｂ型肝炎に対するワクチン接種によってＤ型肝炎も予防される。
【００２５】
Ｅ型肝炎。Ｅ型肝炎は、その症状についてＡ型肝炎に類似している。Ｅ型肝炎の伝染機序も、Ａ型肝炎の伝染機序に類似している。Ｅ型肝炎は、汚染された水または食品を介して広がり、血液を介しても伝染し得る。これは主に、中央アジアおよびアフリカ諸国で発生している。
【００２６】
Ｆ型肝炎ウイルスおよびＧ型肝炎ウイルスなどの他の因子が最近同定されたが、今のところ、大規模には研究されていない。
【００２７】
Ｃ型肝炎は、ウイルス感染であり、非経口伝染機序は最も多くの場合に、輸血後肝炎の形態で生じる。ＨＣＶは１９８９年に、肝炎患者において発見され、その血液は、構成においてフラビウイルスのＲＮＡに類似しているウイルスＲＮＡを含有した。Ｃ型肝炎は、フラビウイルス科のＲＮＡ含有ウイルスによって引き起こされる。そのウイルス粒子は、直径３０から６０ｎｍであると推定されている。今日までに、１１種までの別個のＨＣＶ遺伝子型が同定されている：１ａ、１ｂ、１ｃ  ２ａ、２ｂ、２ｃ  ３ａ、３ｂ  ４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ  ５ａ  ６ａ  ７ａ、７ｂ  ８ａ、８ｂ  ９ａ  １０ａ  １１ａ型。ＨＣＶは、構造的（カプシドおよびエンベロープ）および非構造的ウイルスタンパク質からなり、低い力価で血液中を循環する傾向がある。これは、低密度リポタンパク質、およびＨＣＶタンパク質に対する抗体と関連している。感染の源は、症状発現を伴う患者およびＣ型肝炎の潜伏形態を伴う患者である。ウイルスは、血液、および血液産生物を介して非経口経路によって伝染する。数カ国で承認されているＣ型肝炎の現行の標準治療は、抗ウイルス療法と、αインターフェロンおよびリバビリンとの併用である。これは、持続的な血清ＡＬＴレベルの上昇および顕著な組織学的肝臓損傷を有するＨＣＶ−ＲＮＡ陽性患者において適応される。ＨＣＶの遺伝子型に応じて、かつ個々の患者の特徴および宿主のゲノムによって決定される治療に対する応答に応じて、治療の期間は、１２から７２週間の範囲であり得る。Ｃ型肝炎療法の有効性についての現行の基準には、生化学的緩解の持続（抗ウイルス療法後のアラニンアミノ転移酵素レベルの持続的正常化）、およびウイルス血症が存在しないこと（すなわち、治療の終了後６ヶ月目でのＨＣＶ  ＲＮＡのクリアランス）が包含される。
【００２８】
Ｃ型肝炎ウイルスは、世界的な健康問題である。その因子は、ＲＮＡ含有ウイルスであり、これは経口で伝染し、６０〜８０％の症例で硬変または肝臓癌に至り得る急性か、または永続性の肝炎を引き起こす。ＷＨＯの情報によると、世界人口のうちの約１％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。感染源はヒトであり；１００％の症例で、ウイルスは、感染患者の血液中に見出される。Ｃ型肝炎ウイルスは、「サイレントキラー」と呼ばれる。症例のうちの７０％において、該疾患は、潜伏形態を取っている。重篤度（ｓｅｖｅｒａｎｃｅ）にもかかわらず、５０〜８０％の症例において、Ｃ型肝炎ウイルスは、硬変、癌腫が結果として発生する永続的な疾病へと変形し、神経細胞を損傷し、重症の結果を引き起こす。
【００２９】
該ウイルスは、フラビウイルス科のＣ型肝炎様ウイルスに分類され（Ａｌｔｅｒ  Ｙ．Ｊ．、「Ｔｏ  ｏｒ  ｎｏｔ  ｔｏ  Ｃ：  ｔｈｅｓｅ  ａｒｅ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ」、Ｂｌｏｏｄ、１９９５、８５、１６８１〜１６９５頁；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７、２６、２〜１０頁）、陽極性ＲＮＡを含有し（Ｌｉｎｄｓａｙ  Ｋ．Ｌ．、「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７、２６、７１５〜７７５頁）、その陽極性ＲＮＡは、高度の不均質性を有する（Ｙｏｈｋｏ  Ｋ．Ｓ．、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｙ．、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｖ．、１９９５、１、５９〜６５頁；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７、２６、２〜１０頁）。α−インターフェロン治療薬（ＩＦＮ）（レアフェロン（ｒｅａｆｅｒｏｎ）、ロエフロン（ｒｏｅｆｒｏｎ）Ａ、イントロンＡなど）が、ＨＣＶ感染症を治療するための基本であり続けているが（ＥＡＳＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．  Ｐａｒｉｓ、Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９９、３０、９７６〜９９５頁）、しかしながら、信頼することができる抗ウイルス効果（治療から６ヶ月後の血清中にＨＣＶ  ＲＮＡが存在しない）は、α−インターフェロンで治療された患者のうちの８〜１２％でしか観察され得ない（Ｌｉｎｄｓａｙ  Ｋ．Ｌ．、「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７、２６、７１５〜７７５頁）。したがって、ＨＣＶ感染療法の別の方式を探すことは、現今でも重要であり続けている。
【００３０】
多様な群の高分子量および低分子量の天然および合成化合物であり、ＩＦＮ産生をもたらすその能力によって関連のあるＩＦＮ誘導体は、ＨＣＶを含めたウイルス感染を治療するための有望な群である。ＩＦＮ誘導体は、ＩＦＮに典型的な抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を有する（Ｅｒｓｈｏｖ  Ｆ．Ｙ．、「Ａｎｔｉ−ｖｉｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」、Ｍｏｓｃｏｗ、１９９８、２４０頁）。
【００３１】
ＨＣＶに対するワクチンは、まだ開発されてなく、体内でウイルス複製を阻害し得る有効な薬物は存在しない。ＨＣＶに対する予防療法および治療療法を見出す際の困難は、ＨＣＶを有効に治療し得る薬物を同定するためのスクリーニングテストに必要な実験用ウイルスモデルを得る試みが成功していないことに関連している。
【００３２】
ヘルペスウイルス
ヘルペスウイルス（Ｌａｔｉｎ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）は、ヒトおよび他の哺乳動物においてだけでなく、トリ、爬虫類、両生類、サカナにおいても様々な疾患を引き起こすＤＮＡ含有ウイルスの大きなファミリーである。ヘルペスウイルスには、地球上の個体群のうちの大部分が感染している（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ．、「Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｈａｒｖｅｙ  Ｌｅｃｔ．、１９７４、７０  Ｓｅｒｉｅｓ、５７〜７４頁）。
【００３３】
ヘルペス感染は、潜伏感染プロセスの古典的な例である。患者のうちの７０％超は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）との最初の接触の後に、高い抗ヘルペス抗体レベルにも関わらず、感染が再発する。ヘルペス感染は、明らかでない形態、無症状形態、および明らかな臨床形態を含む様々な種類の臨床経過を伴う、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）によって引き起こされる一群の人畜共通（ａｎｔｈｒｏｐｏｚｏｏｎｏｔｉｃ）感染症である（Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ  Ｔ．、「Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ」、Ｃｏｒｎｅａ、１９９９、第１８巻、第６号、７３９頁）。
【００３４】
ヘルペス（「むずむずすること」を意味するギリシャ語に由来）は、最も流行していて、かつ制御しきれていないヒト感染症の１種である。正常な免疫系を有する宿主では、ヘルペスウイルスは、無症候性に循環し得るが、免疫無防備状態の個体では、それらは、重症に、ともすれば致命的になり得る。ヒトにおいては、８種のヘルペスウイルスが同定されている：これらは、電子顕微鏡で識別可能である、類似の形態を有するＤＮＡ含有ウイルスによって表される（「Ｂａｒｏｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｂａｒｏｎ  Ｓら、第４版；  Ｕ．  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ、１９９６；「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｍｏｓｂｙ、２００５内の「Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ」）。ヒトの器官に侵入すると、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、その宿主を永久的に感染させて、時折、多様な再発を引き起こす。その潜伏状態におけるＨＳＶは、Ｌ−ＰＲＥＰ粒子の形態で脊椎傍知覚神経節に限局されている。
【００３５】
最も一般的なヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）は、１型単純ヘルペスウイルスまたはＨＳＶ−１であり、口腔顔面ヘルペスを引き起こす。類似の形態学的、抗原的、化学的、および物理的特性が、陰部ヘルペスを引き起こす２型ヒトヘルペス（ＨＳＶ−２、またはＨＨＶ−２）によって共有されている。陰部ヘルペス（ＧＨ）は、最も流行している性行為感染症の１つである特殊なヘルペス感染症である。その顕著な特徴は、原因因子がキャリアと共に、その男性キャリア／女性キャリアの余生にわたって生き残ること（潜伏性）である。このことが、高い発生率および頻繁な疾患の再発の理由である。
【００３６】
ＧＨの発症は多くの場合に、ＨＳＶ−２と関連している。このことは、疫学で見出されるこのウイルスの血清型に対する抗体（Ａｂ）の高い発生率によって裏付けられている。以前に、ＨＳＶ−１は、顔面、体幹、および上肢に関する皮膚感染症において、より多くの場合に同定されると判断されている。現在では、ＧＨは、ＨＳＶ−１によって引き起こされ得ることが、十分に確立されている。ＨＳＶ−１によって引き起こされるＧＨは、低い再発率によって特徴付けられ、再発は、高い力価の抗−ＨＳＶ−２抗体を有する患者において、より頻繁に観察される。ＨＳＶ  ＤＮＡと、子宮頸癌および子宮頚管悪性病変のための外科手術の間に得られた組織のＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって証明されているとおり、このウイルスは、子宮頸癌の病因において役割を果たしている。
【００３７】
３型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−３）は、２つの異なる臨床的実体、すなわち水痘帯状疱疹および帯状ヘルペスを引き起こす。４型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−４）またはエプスタイン−バーウイルスは、感染性単核細胞症、バーキットリンパ腫、上咽頭癌、毛舌白板症の原因因子である。５型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−５）は、サイトメガロウイルス感染症を引き起こし、最後に、６型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−６）は、最近の研究によると、乳児における突発性発疹および成人における慢性疲労症候群に関連している。現行の文献報告によって、ＨＨＶ−６は、リンパ肉芽腫症、悪性Ｂ細胞リンパ腫、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、クローン病、自己免疫性甲状腺炎、非エプスタイン−バーウイルス感染性単核細胞症の発生に役割を果たし得ることが示されている。ＨＨＶ−６は、致命的な結果を伴う劇症肝炎を含めた子供および成人における急性肝炎を引き起こすこともある。１９９０年に、ＨＨＶ−７およびＨＨＶ−８が発見されたが、それらの役割は未だ確立されていない。ＨＨＶ−７が、リンパ増殖性障害および慢性疲労症候群に関連しているのに対して、ＨＨＶ−８は、カポジ肉腫に関連している。
【００３８】
ヘルペス感染症の治療は、依然として大変なことである。長期持続性の慢性プロセスは、免疫系にマイナスの調節をもたらす。二次的な免疫不全、細胞性免疫の抑制、および非特異的抵抗性の低下が観察され、白血球がα−およびγ−インターフェロン（ＩＦＮ）を合成する能力の低下、低免疫グロブリン血症、ウイルス抗原に対する感作として症状発現する（「Ｂａｒｏｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｂａｒｏｎ  Ｓら、第４版、Ｕ．  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ、１９９６；「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｍｏｓｂｙ、２００５内の「Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ」）。
【００３９】
現在、抗ヘルペス薬は、利用可能な抗ウイルス薬のうちの約８０％を占めており、このことが、問題の重要性を再び強調している。それらのうちの大部分は、異常ヌクレオシドによって表される。その作用機序は、ウイルスの複製に必要な酵素（チミジンキナーゼ、ＤＮＡ−ポリメラーゼ）の阻害を、ＩＦＮ合成の誘発と組み合わせる。したがって、かなりの数および種類の抗ウイルス薬があるにも関わらず、なぜヘルペス感染症は未だにほとんど制御されていないのか、という疑問が存在する。最近の報告によって、抗ヘルペス異常ヌクレオシドに対するＨＳＶの抵抗性は、年を追って高まっていることが示されている。
【００４０】
しかしながら、最も効率的な方法は、ウイルス複製の初期段階、すなわち、細胞への吸着および細胞との融合に影響を及ぼし得る抗ウイルス薬の開発である。新規な抗ウイルス薬は、宿主細胞と相互作用する間に、天然構成要素と競合的に置き換わり得るリガンド模倣物または受容体模倣物として形成されている。本研究の目的は、上述の特性を有するＲＮＡ調製物の抗ウイルス作用の有効性を評価することであった。
【００４１】
ヒト免疫不全ウイルス
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の第１の症例は、米国において１９８３年に報告された。患者は２ヶ月後に死亡した。現在では、毎日約１４，０００の新たな感染が生じている。原因因子は、三角形の核の中にらせん構造を有するウイルスである。これはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）として知られており、これには３種、すなわち：西ヨーロッパで非常に流行しているＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と、たいていはアフリカ人およびアメリカ人の間で流行しているＨＩＶ−３がある。該ウイルスは、その複製に寄与するＴリンパ球と、生体全体にウイルスを広げるマクロファージに影響を及ぼす。ＡＩＤＳ自体は、致命的な疾患ではないが、ＨＩＶは、人体の免疫系をダウンレギュレートさせるので、一般的な感冒でさえ、死をもたらし得る。ＨＩＶはＴリンパ球を破壊し、人体は防御機構を失って、通常の感染症に対する脆弱性が高まる。致命的感染症、神経系併発、および癌のリスクが劇的に上昇する。感染源は、ＨＩＶキャリアである。伝染は、ＨＩＶ感染者との性交の間か、血液接触によって起こり得る。感染している母親が、子供を出産する場合、その子供は必ずしもウイルスキャリアではない。抗レトロウイルス療法は、母子感染のリスクを６パーセントまで低下させ得る（Ｓｅｐｋｏｗｉｔｚ  Ｋ．Ａ．、「ＡＩＤＳ−−ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ２０  ｙｅａｒｓ」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、２００１、３４４、２３、１７６４〜７２頁；Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、２００３）。アジドチミジンとして知られている最初の抗レトロウイルス薬は１９６４年に初めて合成され、１９８７年には、ＨＩＶ感染症を治療するために承認され、それ以来、抗レトロウイルス薬として広く使用されている（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ  Ｊ．、Ｎａｅｓｅｎｓ  Ｌ．、Ａｑｕａｒｏ  Ｓ．、Ｋｎｉｓｐｅｌ  Ｔ．、Ｐｅｒｎｏ  Ｃ．−Ｆ．、Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ．、Ｍｅｉｅｒ  Ｃ．、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｓａｌｉｇｅｎｙｌ  ３’−ａｚｉｄｏ−２’−３’−ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ａ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ３’−ａｚｉｄｏ−２’−３’−ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  （Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９９、５６、１３５４〜１３６１頁）。９０年代半ばには、サキナビル、リトナビル、およびインジナビルを含めた最初のプロテアーゼ阻害薬が利用可能となった。それらの使用によって、死亡率を３８パーセントから２２パーセントまで低下させることができた（Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｄ．Ｗ．、Ｈｅａｔｈ−Ｃｈｉｏｚｚｉ  Ｍ．、Ｄａｎｎｅｒ  Ｓ．、Ｃｏｈｅｎ  Ｃ、Ｋｒａｖｃｉｋ  Ｓ．、Ｍａｕｒａｔｈ  Ｃ．、Ｓｕｎ  Ｅ．、Ｈｅｎｒｙ  Ｄ．、Ｒｏｄｅ  Ｒ．、Ｐｏｔｔｈｏｆｆ  Ａ．、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｊ．、「Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｉｔｏｎａｖｉｒ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＩＶ−１  ｄｉｓｅａｓ���」、Ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＩＶ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８、３５１、９１０２、５４３〜５４９頁）。１９９６年には、最初の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬であるネビラピン、および他のプロテアーゼ阻害薬であるネルフィナビルが導入された。欧州においては、新たな薬物の使用によって、ＡＩＤＳ関連罹患率を３０．７から２．５パーセントまで低下させることができた（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｍ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｃ．Ｃ．、「Ｈｉｔ  ＨＩＶ−１  ｈａｒｄ，  ｂｕｔ  ｏｎｌｙ  ｗｈｅｎ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ」、Ｌａｎｃｅｔ、２０００、３５５、９２２１、２１４７〜５２頁）。
【００４２】
しかしながら、数多くのかなり高価な抗レトロウイルス薬にもかかわらず、ＨＩＶ多剤耐性の問題が大きくなっている。このことによって、多数のＨＩＶタンパク質を標的化する新たな薬剤を探索する重要性が再び強調されている。ＨＩＶだけでなく、他のウイルス（例えば、往々にしてＨＩＶ陽性患者における随伴感染症である肝炎ウイルス）の複製も阻害し得る新たな抗ウイルス薬の必要性が、特に重大である。
【００４３】
エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科に属する。これらは、ヒトに対して病原性であり、３種のポリオウイルス、２３種の血清型のコクサッキーウイルスＡ群、６種の血清型のコクサッキーウイルスＢ群、および他からなる６７種の血清型を包含する。胃腸管において増殖するその能力によって、エンテロウイルスはそのように名付けられている。その名称にもかかわらず、これらのウイルスが顕著な腸炎を引き起こすことは、まれである。ヒトエンテロウイルスは、切断されて１１種の異なるタンパク質になるポリタンパク質をコードする一本鎖ＲＮＡを含有する。エンテロウイルスＲＮＡゲノムは、４種のウイルスタンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４）を含む正二十面体カプシドによって囲まれている。ＶＰ１は、有力な標的中和抗体である。エンテロウイルスは、普遍的に（ｕｂｉｑｕｉｔａｒｙ）分布している。コクサッキーウイルスは、ヒトにおける広域な疾患、最も一般的には、無菌性髄膜炎および筋肉痛の原因である。これらのウイルスは、他のエンテロウイルスと同様に、糞口経路によって広がる。コクサッキーウイルスは、Ａ群およびＢ群に分けられる。Ａ群は、水疱性口峡炎、無菌性髄膜炎、心外膜炎、心嚢炎、非特異性熱性疾病などをもたらす約２４種の血清型を包含する。Ｂ群は、ボルンホルム病（胸膜痛、筋肉痛）の原因である。Ａ群およびＢ群のコクサッキーウイルスに関連する疾患は、別個の臨床的特徴を有する。コクサッキーウイルスＢ４群は、中枢神経系および末梢神経系の両方を冒し、頭痛（特に、後頭部痛）、および胸痛をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４４】
【特許文献１】米国特許第５，７１２，２５６号
【特許文献２】米国特許第６，７３７，２７１号
【非特許文献】
【００４５】
【非特許文献１】Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１８、７月１１日、２５２〜２５８頁
【非特許文献２】Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ，Ｃ．、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｋ．、Ｍａｒｓｈ，Ｔ．、Ｐａｃｅ，Ｎ．  ＆  Ａｌｔｍａｎ，Ｓ、「Ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｍｏｉｅｔｙ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｐ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ」、Ｃｅｌｌ、１９８３、３５、８４９〜８５７頁
【非特許文献３】Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，  Ｆ．、Ｐｏｅｓｃｈｌａ，  Ｅ．  Ｍ．  ＆  Ｌｏｏｎｅｙ，  Ｄ．  Ｊ．、「Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  Ｐｈａｓｅ  １  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅｓ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ」、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９８、９、２４０７〜２４２５頁
【非特許文献４】Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１８、７月１１日、２５２〜２５８頁）
【非特許文献５】Ｄａｌｅｙ  Ｄ．  Ｔ．  Ａ．、Ｌｕｓｃｏｍｂｅ  Ｎ．  Ｍ．、Ｂｅｒｍａｎ  Ｈ．  Ｍ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  Ｊ．  Ｍ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、４、９４３〜９５４頁
【非特許文献６】Ａ．  Ｄ．  Ｋｅｅｆｅ、Ｓ．  Ｐａｉ、Ａ．  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ、２０１０、９、５３７〜５５０頁
【非特許文献７】Ｋｅｅｆｅ  Ａ．Ｄ．、Ｓｃｈａｕｂ  Ｒ．Ｇ．、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８年４月、８（２）、１４７〜５２頁、Ｅｐｕｂ  １月２８日、２００８
【非特許文献８】Ｂａｒｂａｓ  Ａ．Ｓ．、Ｍｉ  Ｊ．、Ｃｌａｒｙ，Ｂ．Ｍ．、Ｗｈｉｔｅ  Ｒ．Ｒ．、「Ａｐｔａｍｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．、２０１０年７月、６（７）、１１１７〜２６頁
【非特許文献９】Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．ら、「Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｐｔａｍｅｒｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９９９、１５４、１６９〜１７９頁
【非特許文献１０】Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，  Ｌ．ら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ２’，５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９５、２３、３９８９〜３９９４頁
【非特許文献１１】Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，  Ｐ．  Ｅ．ら、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ａｐｔａｍｅｒ  ｔｏ  ＶＥＧＦ．」、Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００５、１２、２５〜３３頁
【非特許文献１２】Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，  Ｕ．ら、「Ｙｅａｒ  ２  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ２  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｅｇａｐｔａｎｉｂｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、２００６、１１３、ｅ１〜ｅ２５
【非特許文献１３】Ｃｈａｎ  Ｍ．  Ｙ．ら、「Ｐｈａｓｅ  １ｂ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｄｏｔｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」、ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００８、１１７、２８６５〜２８７４頁
【非特許文献１４】Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ  Ｇ．ら、「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ５」、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９９、４２、１〜３、２１９〜２３０頁
【非特許文献１５】Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ｖ．Ｍ．、Ｌｉｄａｋ  Ｍ．、Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ａ．Ｍ．、Ｍｉｋｓｔａｙｓ  Ｕ．Ｙａ．、「Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｒｉｇａ、Ｚａｎａｔｎｅ、１９８５、１９１頁
【非特許文献１６】Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ａ．Ｍ．、Ｐｅｒｅｄｅｒｉｙ  Ｖ．Ｇ．、Ｚｅｍｓｋｏｖ  Ｖ．Ｍ．、Ｂｙｃｈｋｏｖａ  Ｎ．Ｇ．、「Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  аｃｉｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｋｉｅｖ、Ｈｅａｌｔｈｙ、１９９４、２３２頁
【非特許文献１７】Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｇ．  Ｇ．、Ｍｕｌｄｏｎ  Ｒ．Ｌ．、Ａｋｅｒｓ  Ｌ．  Ｗ．、「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｌ  ｄｒｕｇ  ａｍａｎｔａｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，  ｉｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓ．  １．、Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９６４、７０３〜７０７頁
【非特許文献１８】Ｄａｖｉｅｓ  Ｗ．  Ｌ．、Ｇｒｕｎｅｒｔ  Ｒ．  Ｒ．、Ｄｅ  Ｓｏｍｅｒ  Ｐ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉ−ａｄａｍａｎｔａｎａｍｉｎｅ  （ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６４、１４４、８６２〜８６３頁
【非特許文献１９】Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ．  Е．、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ，  ｉｎ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｍａｎ」、Ｇ．  Ｊ．  Ｇａｌｌａｓｓｏら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９、７７〜１４９頁
【非特許文献２０】Ｈａｙ  ｄｅｎ  Ｆ．  Ｇ．、Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  Ａ．Ｄ．、Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ．  Ｊ．ら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒ−ａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｚａｎａｍｉｖｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｉｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、ＧＧ  １６７  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、１９９７、３３７、１３、８７４〜８８０頁
【非特許文献２１】Ｍｏｎｔｏ  Ａ．  Ｓ．、Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｄ．  Ｍ．、Ｈｅｎｒｙ  Ｄ．ら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｚａｎａｍｉｖｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  В  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９９、１８０、２、２５４〜２６１頁
【非特許文献２２】Ｉｏｚｚｏ  Ｍ．、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｚａｎａｍｉｖｉｒ」、Ｊ．  Ａｃａｄ．  Ｐｈｙｓ．  Ａｓｓｉｓｔａｎｔｓ、２００１、２、２、１８６〜１８８頁
【非特許文献２３】Ｈｏｙｄｅｎ  Ｆ．  Ｇ．、Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ．  Ｊ．、Ｆｒｉｔｚ  Ｒ．  Ｓ．ら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｓｅｔｔａｍｉｖｉｒ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．、１９９９、２８２、１３、４８〜５０頁
【非特許文献２４】Ｄａｖｉｓ  Ｍ．  Ｍ．、Ｔａｕｂｅｒｔ  Ｋ．、Ｂｅｎｉｎ  Ａ．  Ｌ．ら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｄｖｉｓｏｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」、Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６、１１４、１５４９〜１５５３頁
【非特許文献２５】Ｗａｒｒｅｎ−Ｇａｓｈ  С、Ｓｍｅｅｔｈ  Ｌ．、Ｈａｙｖｉａｒｄ  Ａ．  Ｃ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｓ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２００９、９、６０１〜６１０頁
【非特許文献２６】Ａｉｌｉｎｇ  Ｄ．Ｗ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ  Ｗ．Ｃ．、Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓ  Ｃ．Ｈ．、「Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  １９６８−１９７６」、Ａｍ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９８１、１１３、３０〜３３頁
【非特許文献２７】Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｓ．Ｄ．、「Ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ」、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐ．、１９３２、４７、２１５９〜２１７９頁
【非特許文献２８】Ｅｉｃｋｈｏｆｆ  Ｔ．、Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｉ、Ｓｅｒｆｌｉｎｇ  Ｒ．、「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、ＪＡＭＡ、１９６１、１７６、７７６〜７８２頁
【非特許文献２９】Ｈｏｕｓｗｏｒｔｈ  Ｊ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ａ．Ｄ．、「Ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  １９５７−１９６６」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９７４、１００、４０〜４８頁
【非特許文献３０】Ｇｒｅａｖｅｓ  Ｋ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｊ．Ｓ．、Ｐｒｉｃｅ  Ｃ．Ｐ．、Ｃｌａｒｋｅ  Ｇ．Ｈ．、Ｃｒａｋｅ  Ｔ．、「Ｔｈｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ：  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｔ  ｉｎ  １５２  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ａｒｃｈ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  ２００３、１６３、１６５〜１６８頁
【非特許文献３１】Ｉｓｏｎ  Ｍ．Ｇ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｖ．、Ｒｅｍｂｏｌｄ  Ｃ．、Ｄｅｎｔ  Ｊ．、Ｈａｙｄｅｎ  Ｆ．Ｇ．、「Ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｕｎｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ａｄｕｌｔｓ」、Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２００５、４０、４１５〜４２２頁
【非特許文献３２】Ｐａｕｌ  Ｂ．Ｋ．、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」、Ｉｎｄｉａｎ  Ｍｅｄ．  Ｊ．、１９６３、５７、２５１〜２８３頁
【非特許文献３３】Ｖｅｒｅｌ  Ｄ．、Ｗａｒｒａｃｋ  Ａ．Ｊ．、Ｐｏｔｔｅｒ  Ｃ．Ｗ．、Ｗａｒｄ  Ｃ．、Ｒｉｃｋａｒｄｓ  Ｄ．Ｆ．、「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａ２  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ」、Ａｍ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．、１９７６、９２、２９０〜９６頁
【非特許文献３４】Ｍａｄｊｉｄ  Ｍ．、Ａｂｏｓｈａｄｙ  Ｉ．、Ａｗａｎ  Ｉ．、Ｉｉｔｏｖｓｋｙ  Ｓ．、Ｃａｓｓｃｅｌｌｓ  Ｓ．Ｗ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｃａｕｓａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ」、Ｔｅｘ．  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔ．  Ｊ．、２００４、３１、４〜１３頁
【非特許文献３５】Ｗｈｉｔｅ  Ｈ．Ｄ．、Ｃｈｅｗ  Ｄ．Ｐ．、「Ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ、２００８、３７２、５７０〜５８４頁
【非特許文献３６】Ｈｏｕｓｗｏｒｔｈ  Ｊ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ａ．Ｄ．、「Ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  １９５７−１９６６」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９７４、１００、４０〜４８頁
【非特許文献３７】Ｍａｄｊｉｄ  Ｍ．、Ａｗａｎ  Ｉ．、Ａｌｉ  Ｍ、Ｆｒａｚｉｅｒ  Ｌ．、Ｃａｓｓｃｅｌｌｓ  Ｗ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｄ．  Ｔｈｅｒ．、２００５、５、９１〜９６頁
【非特許文献３８】Ｗａｒｒｅｎ−Ｇａｓｈ  Ｃ、Ｓｍｅｅｔｈ  Ｌ、Ｈａｙｖｉａｒｄ  ＡＣ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｓ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２００９、９、６０１〜６１０頁
【非特許文献３９】Ａｌｔｅｒ  Ｙ．Ｊ．、「Ｔｏ  ｏｒ  ｎｏｔ  ｔｏ  Ｃ：  ｔｈｅｓｅ  ａｒｅ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ」、Ｂｌｏｏｄ、１９９５、８５、１６８１〜１６９５頁
【非特許文献４０】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７、２６、２〜１０頁
【非特許文献４１】Ｌｉｎｄｓａｙ  Ｋ．Ｌ．、「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７、２６、７１５〜７７５頁
【非特許文献４２】Ｙｏｈｋｏ  Ｋ．Ｓ．、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｙ．、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｖ．、１９９５、１、５９〜６５頁
【非特許文献４３】ＥＡＳＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．  Ｐａｒｉｓ、Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９９、３０、９７６〜９９５頁
【非特許文献４４】Ｅｒｓｈｏｖ  Ｆ．Ｙ．、「Ａｎｔｉ−ｖｉｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」、Ｍｏｓｃｏｗ、１９９８、２４０頁
【非特許文献４５】Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ．、「Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｈａｒｖｅｙ  Ｌｅｃｔ．、１９７４、７０  Ｓｅｒｉｅｓ、５７〜７４頁
【非特許文献４６】Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ  Ｔ．、「Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ」、Ｃｏｒｎｅａ、１９９９、第１８巻、第６号、７３９頁
【非特許文献４７】「Ｂａｒｏｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｂａｒｏｎ  Ｓら、第４版；Ｕ．  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ、１９９６；「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｍｏｓｂｙ、２００５内の「Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ」
【非特許文献４８】Ｓｅｐｋｏｗｉｔｚ  Ｋ．Ａ．、「ＡＩＤＳ−−ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ２０  ｙｅａｒｓ」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、２００１、３４４、２３、１７６４〜７２頁
【非特許文献４９】Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、２００３
【非特許文献５０】Ｂａｌｚａｒｉｎｉ  Ｊ．、Ｎａｅｓｅｎｓ  Ｌ．、Ａｑｕａｒｏ  Ｓ．、Ｋｎｉｓｐｅｌ  Ｔ．、Ｐｅｒｎｏ  Ｃ．−Ｆ．、Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ．、Ｍｅｉｅｒ  Ｃ．、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｓａｌｉｇｅｎｙｌ  ３’−ａｚｉｄｏ−２’−３’−ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ａ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ３’−ａｚｉｄｏ−２’−３’−ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  （Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９９、５６、１３５４〜１３６１頁
【非特許文献５１】Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｄ．Ｗ．、Ｈｅａｔｈ−Ｃｈｉｏｚｚｉ  Ｍ．、Ｄａｎｎｅｒ  Ｓ．、Ｃｏｈｅｎ  Ｃ、Ｋｒａｖｃｉｋ  Ｓ．、Ｍａｕｒａｔｈ  Ｃ．、Ｓｕｎ  Ｅ．、Ｈｅｎｒｙ  Ｄ．、Ｒｏｄｅ  Ｒ．、Ｐｏｔｔｈｏｆｆ  Ａ．、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｊ．、「Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｉｔｏｎａｖｉｒ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＩＶ−１  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＩＶ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８、３５１、９１０２、５４３〜５４９頁
【非特許文献５２】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｍ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｃ．Ｃ．、「Ｈｉｔ  ＨＩＶ−１  ｈａｒｄ，  ｂｕｔ  ｏｎｌｙ  ｗｈｅｎ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ」、Ｌａｎｃｅｔ、２０００、３５５、９２２１、２１４７〜５２頁
【非特許文献５３】Ｊａｎｅｗａｙ  Ｊｒ．，  Ｃ．Ａ．、「Ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｙｍｐｔｏｔｅ？  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８９、５４、１、１〜１３頁
【非特許文献５４】Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、  Ｋｙｉｖ、２００１、３７１〜３９６頁
【非特許文献５５】Ｍｅｔｔｅ  Ｍ．Ｆ．、Ａｕｔｓａｔｚ  Ｗ．、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｅｎ  Ｊ．、Ｍａｔｚｋｅ  Ｍ．Ａ．、Ｍａｔｚｋｅ  Ａ．Ｊ．Ｍ．、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２０００、１９、５１９４〜５２０１頁
【非特許文献５６】Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９６５、１３６頁）
【非特許文献５７】Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．「Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８３、６５、５５〜６３頁
【非特許文献５８】Ａｍｍｉｎｏｆｆ  Ｄ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｉａｌｏｍｕｃｏｉｄｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、１９６１、８１、３８４〜３９２頁
【非特許文献５９】Ｄｅｒｙａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｉｓａｅｖ  Ｅ．Ｉ．、Ｖｙａｚｏｖ  Ｓ．Ｏ．ら、Ｖｏｐｒ．ｖｙｒｕｓｏｌ、１９９７、６、２５１〜２５３頁
【非特許文献６０】Ｈｅｌｂｉｇ  Ｋ．Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．、Ｂｅａｒｄ  Ｍ．Ｒ．、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉ−ＴＡＣ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００５、３２、２、１３７〜１４３頁
【非特許文献６１】Ｄｅｒｉａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｖｏｖ  Ｄ．Ｋ．、Ｉｓａｅｖａ  Ｅ．Ｉ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ」、２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ、１９９９、１３、２頁
【非特許文献６２】Ｈｅｌｂｉｇ  Ｋ．Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．、Ｂｅａｒｄ  Ｍ．Ｒ．、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉ−ＴＡＣ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ．」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００５、３２、２、１３７〜１４３頁
【非特許文献６３】Ｖｅｎｉｓｏｎ  Ｌ．Ｖ．、Ｓｏｂｏｌｅｖ  Ｂ．Ｎ．、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｃ，  Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ」、１９９９、１２、１１〜１７頁
【非特許文献６４】Ｄｅｒｉａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｖｏｖ  Ｄ．Ｋ．、Ｉｓａｅｖａ  Ｅ．Ｉ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ」、２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ、１９９９、１３、２頁
【非特許文献６５】Ｂｏｏｍ  Ｒ．  Ｃ．、Ｓｏｌ  Ｊ．  Ａ．、Ｓａｌｉｍａｎｓ  Ｍ．  Ｍ．  Ｍ．、Ｊａｎｓｅｎ  Ｃ．  Ｌ．、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ  Ｐ．  Ｍ．  Ｅ．、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ  Ｊ．、「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０、２８、３、４９５〜５０３頁
【非特許文献６６】Ｃａｒｔｅｒ  Ｍ．  Ｊ．およびＭｉｌｔｏｎ  Ｉ．  Ｄ．、「Ａｎ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃａ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、１０４４頁
【非特許文献６７】Ｄｕｇｏｕｎｄ  Ｄ．、Ｆｅｎｎ  Ｊ．、Ｓｉｕ  Ｒ．ら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ，  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｇｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＣＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７１、３９１〜３９８頁
【非特許文献６８】Ｄｕｇｏｕｎｄ  Ｄ．、Ｓｉｕ  Ｒ．、Ｆｅｎｎ  Ｊ．ら、「Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２、３６、１２５９〜１２６５頁
【非特許文献６９】Ｂｌｕｍｋｉｎ  Ｖ．Ｎ．、Ｚｈｄａｎｏｖ  Ｖ．Ｍ．、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ」、Ｍ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９７３
【非特許文献７０】Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｋｙｉｖ、２００１、３７１〜３９６頁
【非特許文献７１】Ｍａｒｅｎｎｉｋｏｖａ  Ｓ．Ｓ．、Ｍａｔｓｅｖｉｃｈ  Ｇ．Ｒ．、Ｃｈｅｋｕｎｏｖａ  Ｅ．Ｖ．ら、「Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｖｏｐｒ．  ｖｉｒｕｓｏｌ．、１９８６、１、５９〜６５頁
【非特許文献７２】Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｚ．ＹＵ．、Ｒｙｂａｌｋｏ  Ｓ．Ｌ．、Ｓｅｍｅｒｎｉｋｏｖａ  Ｌ．Ｉ．、Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｖ．Ｖ．、Ｚａｖｅｌｅｖｉｃｈ  Ｍ．Ｐ．、Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｌ．Ｖ．、Ｍｙｈａｙｌｏｐｕｌｏ  Ｉ．、Ｍａｔｓｕｋａ  Ｈ．ＫＨ．、「Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’，５’−ｔｒｙｏｌｉｈｏａｄｅｎｉｌａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｐｏｘｙ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ、１９９９、１５、４、３１４〜３１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４６】
新たな抗ウイルス薬の必要性
現在、様々なウイルス性疾患に対して多重作用を有する新規な抗ウイルス薬の開発が必要とされている。これらの薬剤は、宿主細胞へのウイルス侵入およびウイルス放出を担う機序を妨害すべきである。
【００４７】
多くの代表的なウイルス科を阻害し得る抗生物質の可能性の認識は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｊａｎｅｗａｙおよび彼の追従者による発見に基づいた（Ｊａｎｅｗａｙ  Ｊｒ．，  Ｃ．Ａ．、「Ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｙｍｐｔｏｔｅ？  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８９、５４、１、１〜１３頁）。第一に、全ての生体は、先天免疫を有することが示された。先天免疫は、遺伝レベルで存在し、外来微生物、移植片、毒素、腫瘍細胞、およびウイルスに感染した細胞と戦う生体の能力を提供している。先天免疫系は、病原体が最初に出現した際に活性化し、病原体生体に特異的な一定の群の抗原と反応する。第二に、先天免疫を有する細胞は、これらの群の抗原を認識して、先天免疫を活性化させるＴｏｌｌ様受容体、ＴＬＲと呼ばれる受容体を有する。第三に、ＴＬＲは、一定の群の感染症に特異的であり、すなわち、一般的であるよりもむしろ、特異的な種類の外来構造、例えば、ウイルス感染ＲＮＡを認識し得る。ヒトは、一定の群の病原体にそれぞれ特殊化している１０種超のＴＬＲを有する。あるものは、ウイルス感染のＲＮＡを認識し、他のものは、細菌や他のものの多糖、単細胞寄生虫などのタンパク質を認識する。該受容体は、皮膚および上皮の細胞を含めた異なる種類の細胞に位置する。
【００４８】
ウイルス因子を認識する場合には、ＴＬＲの助力を伴う感染細胞は、ウイルスタンパク質合成のスイッチを切り、感染細胞のプログラム死（アポトーシス）を開始し得る。ウイルスを同定した免疫細胞は、炎症を誘発する因子であるサイトカインを発現させるシグナルを出すことができ、他にも、インターフェロンなどの抗ウイルス因子を放出し得る。
【課題を解決するための手段】
【００４９】
これまで、大抵の抗ウイルス薬の作用は、１種の特異的な感染因子に焦点を当てるものであったが、ウイルスは、薬物耐性を迅速に発達させるようになっている。一態様では、本発明は、ウイルス成長の種々の段階で多重抗ウイルス作用を提供する、ＲＮＡをベースとする薬剤および治療方法を提案する。ＲＮＡをベースとする薬剤の長期持続性抗ウイルス作用によって、この種の薬剤に対するウイルス耐性の急速な発達が不可能となる。数種のウイルス性疾患は、多数のウイルスの作用と関連していて、多重抗ウイルス薬の使用を必要としているので、本発明は、多数のウイルスに対して活性な薬剤を提供する。例えば、急性上気道感染症は往々にして、インフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの複合作用と関連している。ＨＩＶが往々にして肝炎ウイルスと関連する場合には、同様の状況が、ＡＩＤＳにおいて見出される。該薬剤を使用することで、数種のこれらのウイルスに対して作用することができる。
【００５０】
既に示唆したとおり、ＲＮＡをベースとする治療薬は、化学合成によって生産されているが、これらは、技術の観点からかなり高価であり、大規模ウイルス性疾患を治療するためには適用することができない。他の態様では、本発明は、安価な天然物質である酵母由来のリボ核酸から合成された薬剤を提供する。これは、カプセル剤、錠剤、および他の利用可能な投与の形態で広く使用することができる。
【００５１】
ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎などのウイルス感染は、往々にして毒性および神経精神医学的副作用に関連する抗生物質および他の抗ウイルス薬と組み合わせた複合管理を必要とする。他の態様では、本発明は、複合療法で長期間使用することによって、副作用を伴わない非毒性薬剤を提案する。
【００５２】
本発明の他の態様では、配座においてウイルスＲＮＡに類似しているＲＮＡ化合物は、先天免疫系を活性化させることができ、汎流行性インフルエンザ、Ｃ型肝炎、陰部ヘルペス、およびＡＩＤＳなどのヒトにおいて重症の疾患を引き起こす様々なウイルスに対する抗生物質として作用することができることが認識された。対応して、温度処理を施された、高度に精製された酵母ＲＮＡは、改良された特性を有する。
【００５３】
下記で報告するとおり、種々のインビトロおよびインビボモデルにおいて、酵母由来リボ核酸（ＲＮＡ）を含有する薬剤の複合研究を行った。試験モデルは、ウイルス誘発プロセスの特定の種類に対応した。ＲＮＡ含有薬剤の作用を、抗ウイルス療法で現在承認されている薬物の作用と比較した。
【００５４】
１．  インビトロおよびインビボでのインフルエンザウイルスモデル
インビトロでの抗インフルエンザ活性を、既存のガイドラインに従って、集密層を有する再接種ＭＤＣＫ細胞系（イヌ腎臓細胞）で証明した（Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、  Ｋｙｉｖ、２００１、３７１〜３９６頁）。インビボでの抗インフルエンザ活性は、投与の予防レジームおよび治療レジームを使用して、マウスでのインフルエンザ肺炎モデルで研究した。
【００５５】
こうして、ＲＮＡをベースとする薬物は、抗インフルエンザ医薬品であることが証明されている。
【００５６】
特定の実施形態では、最大許容濃度は５，０００ｍｋｇ／ｍｌであり、最小活性濃度は３１ｍｋｇ／ｍｌであり；化学療法係数は１６１である。
【００５７】
インビトロで算出されるＲＮＡ抽出物−糖の組み合わせ（ここで、糖は例えば、マンニトールである）（ＲＮＡ−Ｍ）の有効用量は有利には、予防目的では１．２５〜１０ｍｇ／ｍｌであり、治療では０．６ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。薬物の高い抗インフルエンザ活性は、１５から１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で腹腔内および静脈内導入されたマウスでの予防治療において証明されている。鼻腔内導入では、有効な用量は例えば、少なくとも１０倍高い。ＲＮＡ−Ｍの抗インフルエンザ作用は、インフルエンザウイルス粒子との相互作用の間における、ノイラミニダーゼおよび血球凝集素の阻害にあることが証明されている。他にも、ＲＮＡ抽出物−糖の組合せは、インビボ試験においては、α−インターフェロンの長期誘導体である。投与用量は、化合物中のＲＮＡの量で算出される。
【００５８】
したがって、抗インフルエンザ薬を評価するために使用されたインビトロおよびインビボモデルによって、酵母由来ＲＮＡ含有薬剤は、強力な抗ウイルス活性によって特徴付けられることが証明されている。その抗ノイラミニダーゼおよび抗血球凝集素活性に関して、この薬剤を、特異的な抗インフルエンザ活性を有すると判断し得る。
【００５９】
２．  インビトロおよびインビボでの肝炎ウイルスモデル
本発明の他の態様では、酵母ＲＮＡ由来薬物の抗ＨＣＶ活性を、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染したＭＴ−４懸濁細胞培養の実験モデルで、他にもＨＣＶ  ｃＤＮＡ（ＭＴ−４−ＨＣＶ  ｃＤＮＡモデル）が貫通（ｔｒａｎｓｆｉｘｅｄ）している産生性細胞培養の新たなモデルで、ならびにＨＣＶおよびウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）の代理試験モデルで証明した。
【００６０】
ＲＮＡをベースとする薬物は、ＨＣＶ、特にヒトＨＣＶに対して高度に有効であることが、今や発見されている。
【００６１】
培養ヒトＨＣＶに感染している培養モデルＭＴ−４に対する、糖（例えばマンニトール）と組み合わせた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物を本質的に含有する調製物の有効性についての研究結果によって、ＲＮＡをベースとする薬物の有利な実施形態では、その最大許容濃度は５０ｍｇ／ｍｌに等しく、最小活性濃度は０．２５ｍｇ／ｍｌであり、化学療法係数は２００であることが示された。
【００６２】
ＭＤＶＫ−ＢＶＤＶモデルに対する、糖（例えばマンニトール）と組み合わせた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物を本質的に含有する調製物の抗ウイルス活性についての研究結果によって、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、薬物は、ウイルス増殖を２．０  ｌｇ  ＩＤ５０だけ阻害し、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、対応して３．０  ｌｇ  ＩＤ５０だけ阻害することが示されている。
【００６３】
要約すると、ＲＮＡ−Ｍ調製物は、ヒトＨＣＶの増殖を阻害し得る高度に有効な抗ウイルス薬として分類され得る。
【００６４】
実験結果によって他にも、糖（例えばマンニトール）と組み合わされた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物は、ＨＣＶの療法において有益に使用されることが証明された。すなわち、Ｃ型肝炎患者の治療について、高い有効性が確認された。患者の気分の改善、生化学的指数の安定化、ウイルス複製量の低下が、血清において示されている。組成物はよく許容され、副作用は記録されなかった。
【００６５】
３．  インビボでのヘルペスウイルスモデル
ＲＮＡ−Ｍの予防および治療作用のインビボ研究を、ウサギ腎臓細胞系（ＲＫ１３）で行った。ＲＮＡ−Ｍ抗ヘルペス作用のインビボ研究を、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）によって引き起こされたマウスヘルペス性髄膜脳炎のモデルで、さらにＨＳＶ−２に感染したモルモットでの陰部ヘルペス感染のモデルで研究した。ラットガッセル神経節神経鞘腫のＨＳＶ感受性細胞にて、細胞学的解析を行った。
【００６６】
ＲＮＡをベースとする薬物は強力な抗ヘルペス作用を有することが、今や発見されている。
【００６７】
特に、糖（例えばマンニトール）と組み合わせた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物を本質的に含有する調製物は、活性な抗ヘルペス薬であることが証明された。インビトロで、有利な実施形態では、そのウイルス阻害活性は、６０ｍｃｇ／ｍｌから１，０００ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌの範囲内であり、その最小活性濃度（ＭＡＣ）は６０ｍｃｇ／ｍｌであり、最大許容濃度（ＭＴＣ）は５，０００ｍｃｇ／ｍｌであり、その化学療法係数は８３．３である。
【００６８】
投与の予防レジームおよび治療レジームにおける、糖（例えばマンニトール）と組み合わせた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物を本質的に含有する調製物のインビトロでの有効性は、０．６ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの幅広い濃度範囲内である。そのような調製物は、０．１ｍｇ／ｍｌの予防用量、および１ｍｇ／ｍｌの治療用量で分裂係数にも、病的有糸分裂の数にも、不利な影響を及ぼさなかった。
【００６９】
特に、ヘルペス性髄膜脳炎のモデルにおいて、ＲＮＡ−マンニトールの組み合わせ（ＲＮＡ−Ｍ）０．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与の治療レジームは、４１．２の有効指数をもたらした。特に有効な実施形態では、ＲＮＡ−Ｍを、陰部ヘルペスのモデルにおいて局所的に使用した。ＲＮＡ−Ｍ０．１ｍｇ／ｍｌの投与の予防レジームおよびＲＮＡ−Ｍ１．０ｍｇ／ｍｌの投与の治療レジームでは、治療活性指数（ＴＡＩ）はそれぞれ、１００％および７３．２％であった。動物研究において、ＲＮＡ−Ｍは、参照薬剤として使用されたＶｉｒｏｌｅｘ（登録商標）よりも驚くほど優れていると考えられた。
【００７０】
抗ヘルペス薬を選択するために使用されるインビトロおよびインビボモデルによって、糖（例えばマンニトール）と、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物との組合せは、強力な抗ヘルペス作用を有するとの結論を下すことができた。
【００７１】
特に、ヘルペスウイルス性疾患の治療、特に陰部ヘルペス治療における有効性が証明された。
【００７２】
４．  インビボでのＡＩＤＳウイルスモデル
本発明の一態様で、糖（例えばマンニトール）と組み合わせた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物は、ＨＩＶ増殖を阻害する際に有効であることが証明された。
【００７３】
特に、ＨＩＶ感染者に投与すると、ＨＩＶウイルス負荷レベルの低下、およびＣＤ４＋Ｔリンパ球量の増大が生じた。
【００７４】
５．  インビボでのエンテロウイルスモデル
本発明の一態様で、マンニトールなどの糖と組み合わせた、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物は、高い抗エンテロウイルス活性を有する活性な抗ウイルス薬であることが証明されている。
【００７５】
６．  組成物および投与
一般に、投与は、予防のためには少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ／日および治療のためには少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ／日の、例えば、薬学的に許容されるビヒクル、担体、増量剤（フィラー）、および希釈剤のうちの少なくとも１種と糖と共に熱処理された後の精製ＲＮＡ化合物であってよい。さらに、投与用量は、化合物中のＲＮＡの量で算出される。
【００７６】
インフルエンザを予防するためには、腹腔内または静脈内投与量は好ましくは、約１．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、鼻腔内投与量は好ましくは、少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００７７】
インフルエンザを治療するためには、腹腔内または静脈内投与量は好ましくは、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日であり、鼻腔内投与は好ましくは、約２．５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００７８】
赤血球凝集を低下させるために有効な用量は好ましくは、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌである。
【００７９】
組織培養においてＨＣＶ増殖を阻害する有効な用量は好ましくは、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌである。
【００８０】
抗ヘルペス薬の予防レジームおよび治療レジームのために有効な用量は、０．６ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの幅広い濃度範囲内である。
【００８１】
投与の予防レジームおよび治療レジームにおいて有効な用量は、例えば酵母に由来する精製ＲＮＡ抽出物と、糖（例えばマンニトール）との組合せが約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの幅広い濃度範囲内であり、特に予防用量では、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ程度であり、治療用量では、約１．０ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ程度である。０．１ｍｇ／ｍｌの予防用量および１ｍｇ／ｍｌの治療用量は、分裂係数にも、病的有糸分裂の数にも、不利な影響を及ぼさなかった。
【００８２】
例えば、薬物の有効な治療用量は、１日当たり１ｋｇ当たりＲＮＡ５〜１０ｍｇである。抗ウイルス治療の期間は有利には、ＡＲＶＩでの７日間から、ヘルペスウイルスでの少なくとも約３〜５ヶ月、Ｃ型肝炎ウイルスでは１年半以上までである。経口投与のために準備された例示的な製品は、酵母ＲＮＡ２５０ｍｇおよびマンニトール１００ｍｇを含有する、経口摂取が可能な錠剤またはカプセル剤の形態をとる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（１）高い体温の平均値の動態を測定しているグラフである。
【図２】図２は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（２）頭痛の平均値の動態を評価するグラフである。
【図３】図３は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（３）カタル性症候の平均値の動態を評価するグラフである。
【図４】図４は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（４）全身衰弱の平均値の動態を評価するグラフである。
【図５】図５は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（５）関節痛の平均値の動態を評価するグラフである。
【図６】図６は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（６）筋肉痛の平均値の動態を評価するグラフである。
【図７】図７は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（７）鼻涙管内のそう痒、およびひりひりとした痛みの平均値の動態を評価するグラフである。
【図８】図８は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（８）易疲労性の平均値の動態を評価するグラフである。
【図９】図９は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（９）発熱の平均値の動態を評価するグラフである。
【図１０】図１０は、疾患の主観的愁訴および客観的症状である、（１０）咽頭痛の平均値の動態を評価するグラフである。
【図１１】図１１は、一次変数である、（ｉ）体温が正常化するまでの時間、（ｉｉ）頭痛が軽減するまでの時間、および（ｉｉｉ）全身衰弱が軽減するまでの時間による、（１１）インフルエンザウイルスに感染している患者サブグループにおける試験群と対照群との間の応答を示す比較ダイアグラムである。
【図１２】図１２は、一次変数である、（ｉ）体温が正常化するまでの時間、（ｉｉ）頭痛が軽減するまでの時間、および（ｉｉｉ）全身衰弱が軽減するまでの時間による、（１２）インフルエンザウイルスＢにおける試験群と対照群との間の応答を示す比較ダイアグラムである。
【図１３】図１３は、一次変数である、（ｉ）体温が正常化するまでの時間、（ｉｉ）頭痛が軽減するまでの時間、および（ｉｉｉ）全身衰弱が軽減するまでの時間による、（１３）パラインフルエンザウイルスにおける試験群と対照群との間の応答を示す比較ダイアグラムである。
【図１４】図１４は、一次変数である、（ｉ）体温が正常化するまでの時間、（ｉｉ）頭痛が軽減するまでの時間、および（ｉｉｉ）全身衰弱が軽減するまでの時間による、（１４）アデノウイルスにおける試験群と対照群との間の応答を示す比較ダイアグラムである。
【図１５】図１５は、ＤＳ−Ｎａおよび７Ｍの尿素を含有するＰＡＡＧ１５％中での小型ＲＮＡの電気泳動の結果を示す。薬物：Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ（ストライプ−１、セクター−ａ）、２５員オリゴヌクレオチド（ストライプ−１、セクター−ｂ）、高度に精製された酵母ＲＮＡ（ストライプ−２）、酵母ＲＮＡのナトリウム塩（ストライプ−３）。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
特定の実施形態の詳細な説明
実施例１．  抗ウイルスＲＮＡを得る方法の例
実施例１．１．  ＲＮＡの抽出、精製、および分析
一態様では、ＲＮＡをベースとする薬物は、精製ＲＮＡ抽出物、例えば、酵母ＲＮＡを含有する。２種の酵母、すなわちＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓを有利には、酵母ＲＮＡを抽出および精製するために使用することができる。これに関連して、これら２種類の酵母から抽出された産業用酵母ＲＮＡ化合物を、本明細書に示されているとおりに使用することができるが、該ＲＮＡ抽出物は、本明細書に記載されている抗ウイルス有効性についての要件を満たすことを条件として、他の供給源から得ることもできる。
【００８５】
ＲＮＡ抽出物の分子質量および純度に対してそれぞれの基準が好ましい：分子質量については、ＲＮＡが主に、分子質量で約４２００から約９８００の範囲に対応する２５±１０のヌクレオチドを有する断片からなることが好ましい。特定の実施形態は主に、２５±５のヌクレオチドを有する断片、または例えば、２５±２のヌクレオチドを有する断片、有利には、２５のヌクレオチドを有する断片からなる。例えば、ＲＮＡ抽出物は、酵母ＲＮＡ抽出物全体に対して、実質的に少なくとも７５重量％の、約４２００から約９８００の分子質量を有するオリゴヌクレオチド、より好ましくは、実質的に少なくとも９０重量％の、２０から２５のヌクレオチドを有する断片を含有する。好ましくは、上記のヌクレオチド数の範囲もしくは分子質量範囲のいずれか、またはそれら両方に関する割合は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、なおより好ましくは実質的に１００重量％、例えば、少なくとも９９重量％である。有利には、下記のうちの１つまたは複数が当てはまる：分子質量は約７０００であり；窒素含有率は１４％超であり；リン含有率は８．５％超であり；ＤＮＡ含有率は１％未満であり；タンパク質含有率は、ビウレット試験では陰性である。例えば、精製ＲＮＡ抽出物は、窒素１４．５重量％超およびリン８．５重量％超を含有する。精製ＲＮＡ抽出物は好ましくは、タンパク質、ＤＮＡ、およびヌクレオチドを実質的に含有せず、例えば、少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９９重量％純粋である。分子質量は、ＤＳ−Ｎａおよび７Ｍの尿素を含有するポリアクリルアミドゲル（ＰＡＡＧ）１５％中での小型ＲＮＡの電気泳動研究によって決定することができる（Ｍｅｔｔｅ  Ｍ．Ｆ．、Ａｕｔｓａｔｚ  Ｗ．、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｅｎ  Ｊ．、Ｍａｔｚｋｅ  Ｍ．Ａ．、Ｍａｔｚｋｅ  Ａ．Ｊ．Ｍ．、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２０００、１９、５１９４〜５２０１頁）。
【００８６】
例えば、酵母ＲＮＡ抽出物の電気泳動研究によって、分子質量にかなりの差違が示された（図１５）。図１５で見ることができるとおり、Ｅ．  Ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡおよび２５員のオリゴヌクレオチドの分子質量に従って、、高度に精製された酵母ＲＮＡのマーカーは、均一なストライプとして２５ヌクレオチド域内で移動したが、酵母ＲＮＡのナトリウム塩は、不均一なストライプとして、分子質量１９０００を有するｔＲＮＡのマーカーから出発して、分子質量７０００を有する２５員のヌクレオチドのストライプまではるばる移動した。このことは、高度に精製された酵母ＲＮＡ調製物は、分子質量について非常に均質であり、多くが、またはなお本質的に２５±１０のヌクレオチドを含有することを示している。
【００８７】
その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３７，２７１号（Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｚ．、「Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、米国特許第６，７３７，２７１号、２００４年５月１８日）に記載されているような、酵母ＲＮＡ全体を精製する方法を使用することができる。
【００８８】
精製ＲＮＡ抽出物をさらに修飾して、予防または治療用途のためのＲＮＡをベースとする組成物を得ることができる。したがって、本発明による抗ウイルス薬として有利に使用されるＲＮＡをベースとする薬物として使用される組成物において、すぐに投与することができる組成物中の精製ＲＮＡ抽出物の量は、少なくとも約５０重量％、好ましくは約６０から約８０％、より好ましくは約６５％から約７５％、なおより好ましくは少なくとも約７０％である。
【００８９】
本発明の特定の態様では、組成物は他にも、糖を含有し、組成物中におけるＲＮＡ抽出物−糖の割合は、重量で、好ましくは約１．５：１から約３．５：１、より好ましくは約２：１から約３：１、なおより好ましくは約２．５：１である。したがって、例示的なＲＮＡ−Ｍは、マンニトールを、ＲＮＡ：マンニトール  ２．５：１で有し、すなわち、この薬物は、少なくとも７０％のＲＮＡを含有する。糖の全量は、前記の通りの割合であるように、他の糖、例えばラクトースをＲＮＡ−Ｌで、マンニトールの代わりに、またはマンニトールに加えて使用することができる。
【００９０】
例えば、ＲＮＡ−アルギニン（および／またはリシン、ヒスチジン、スペリミン（ｓｐｅｒｉｍｉｎ）、スペルミジン、グアニジン）に関して、組成物中でのＲＮＡ抽出物−アルカリ性有機化合物の割合は、重量で、有利には約１：１から約２：１、より好ましくは約２．５：２から約３．５：２、なおより好ましくは約３：２である。したがって、例示的なＲＮＡ−Ａは、ＲＮＡ：アルギニン  ３：２の割合を有する。他のアルカリ性アミノ酸であるリシン、およびヒスチジンも、スペルミン、スペルミジン、およびグアニジンと同様に、同じ割合で使用することができる。
【００９１】
本発明の他の態様では、ＲＮＡ抽出物を少なくとも１種のマンニトールなどの糖と共に加熱することによって、ＲＮＡ抽出物および糖含有組成物が得られる。
【００９２】
加熱温度は例えば、約４０℃から約７０℃、有利には約５０℃から約７０℃、なおより好ましくは約５５℃から約６５℃の範囲内、例えば、約６０℃である。
【００９３】
したがって、ＲＮＡ−Ｍをベースとする例示的な組成物を得るためには、２．５：１の割合の酵母ＲＮＡ：マンニトールの溶液を調製し、水に溶かし、６０〜６５℃の温度に加温し、１０分間維持する。次いで、その溶液を室温に冷却し、真空乾燥させる。乾燥させた化合物を、上記のとおりの抗ウイルス研究のために使用する。
【００９４】
組成物中の追加の物質は、糖、マンニトール、ラクトース、アルギニン、リシン、ヒスチジンなどのアルカリ性アミノ酸、およびグアニジンなどの脂肪族ポリアミド、スペルミン、およびスペルミジンから選択することができる。例えば、ＲＮＡ抽出物を、アルギニンなどのアルカリ性アミノ酸で処理する。
【００９５】
様々な薬理学的に許容される増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）、担持剤（ｂｅａｒｅｒ）、担体、希釈剤を、すぐに投与することができる組成物中で使用することができる。
【００９６】
実施例１．２．  抗ウイルス活性を有するＲＮＡの修飾および選択
タミフルなどの抗インフルエンザ薬の大多数は、抗ノイラミニダーゼ活性のみを有し、血球凝集素受容体に対しては作用しないことは公知である。したがって、本発明者らは先ず、抗血球凝集素活性を有する薬物を選択することを決定した。一般的な方法論に従って（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９６５、１３６頁）、血球凝集の反応を、ニワトリ赤血球１％、またはモルモット赤血球０．７５％に平行して行った。濃度１％および３％での、精製プロセスから生じた酵母ＲＮＡ、ならびにその塩であるアルギニンＲＮＡおよびナトリウムＲＮＡの抗血球凝集素活性である。下記の表１．２．１．に示されている実験結果によって示唆されているとおり、酵母ＲＮＡおよびそのナトリウム塩は、抗血球凝集素活性を有さないが、酵母ＲＮＡのアルギニン塩は、特に濃度１％で、かなりの抗血球凝集素特性を有する。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
第２のステップにおいて、本発明者らは、酵母ＲＮＡと、追加の物質として医療用物質の製造において一般的に使用されるマンニトール（Ｍ）およびラクトースなどの糖との複合調製物を研究した。酵母ＲＮＡおよびマンニトールを組み合わせた化合物を調製するために、本発明者らは、その抗血球凝集素活性を介して、その溶液に対する温度の作用を研究した。酵母ＲＮＡおよびマンニトールの水溶液を、２．５：１の質量対応で調製し；次いで、その溶液を、５０、６０、７０、８０、および９０℃で、さらに室温でも１０分間保持した。次いで、ＲＮＡおよびマンニトールの溶液を室温に冷却し、乾燥させ、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、インフルエンザウイルスＡＦＭ１／４７Ｈ１Ｎ１の血球凝集素活性に対する、得られたＲＮＡ−Ｍの調製物の作用について研究した。酵母ＲＮＡおよびマンニトールの原液を対照として使用した。実験結果を、下記の表１．２．２に示す。
【００９９】
【表２】
2014509589.tif 000004
【０１００】
実験で示されたとおり、６０±１０℃の加熱によって得られた複合調製物ＲＮＡ−Ｍは、インフルエンザウイルスの血球凝集素の活性をかなり低下させる。最良の抗血球凝集素活性が、ＲＮＡおよびマンニトールの溶液を６０℃で加熱することによって得られる調製物によって証明された。さらに、本発明者らは、本発明者らがＲＮＡ−Ｍとして示す最適な温度調製で得られたものの抗ウイルス活性を研究した。
【０１０１】
酵母ＲＮＡと組み合わせた他の糖も、その抗血球凝集素活性を刺激するであろうことが仮定され得た。ＲＮＡ−Ｍと、ＲＮＡ−Ｍの調製について上記されたとおり温度６０℃で調製された、糖としてラクトースを使用した酵母ＲＮＡの調製物（ＲＮＡ−Ｌ）との抗血球凝集素活性の比較分析である。その比較分析の結果を下記の表１．２．３に示す。
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
実験結果から分かるとおり、温度処理されたマンニトールを含む酵母ＲＮＡ調製物が、ウイルスＡＦＭ１／４７  Ｈ１Ｎ１に関して最も高い抗血球凝集素活性を有した。同時に、本発明者らは、他のポリリボヌクレオチドおよびその抗血球凝集素活性を研究した。下記の表１．２．４における試験結果に示されているとおり、調製物ポリＩのみが、インフルエンザウイルスＡＦＭ１／４７  Ｈ１Ｎ１に関して、顕著な抗血球凝集素活性を有した。
【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
化合物ポリＣ、Ｉ、Ｇ、およびポリＩＣは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  「Ｖｅｃｔｏｒ」（Ｂｅｒｄｙａｎｋｓ、ロシア連邦）から得た。
【０１０６】
上記の表１．２．４．に示されているとおり、ポリリボヌクレオチド調製物は、低い抗血球凝集素活性を有した。２本鎖ポリイノシン酸：ポリシチジル酸および１本鎖ポリイノシン酸のみが、有意な抗血球凝集素活性を示したが、ＲＮＡ−Ｍよりも低かった。
【０１０７】
５５〜６５℃の温度で得られたＲＮＡ−Ｍは、最も高い抗血球凝集素活性を示したので、これを、インビトロモデルおよびインビボモデルにおいて抗ウイルス活性をさらに調査するために使用した。
【０１０８】
したがって、得られた酵母ＲＮＡおよびマンニトールの複合調製物（ＲＮＡ−Ｍ）は、最も高い抗血球凝集素活性を示した。その結果、これを、さらなる抗ウイルス研究のために使用した。
【０１０９】
実施例２．  実験モデルおよび結果の要約
実施例  ２．１．  インフルエンザウイルスのモデル
実施例  ２．１．１．  インフルエンザウイルスのインビトロモデル
化合物  試験化合物はＲＮＡ−Ｍ。タミフル−オセルタミビル（Ｒｏｃｈｅｎ製）（１カプセル当たり７５ｍｇ）。ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）−（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製のエタロン誘導体インターフェロン）。ノイラミニダーゼ−Ａｓｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ１ユニットを含むノイラミニダーゼ化合物Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｒｎ。
【０１１０】
ウイルス。インビトロでの実験用のインフルエンザウイルス：Ａ／ＦＭ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、ＭＤＣＫでの感染力価は３．０〜７．０ｌｇ  ＩＤ５０。インビボでの実験用のインフルエンザウイルス：マウスで１５継代させた白色マウスの肺に適合するＡ／ＦＭ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、感染力価は４．０ｌｇＬＤ５０；５日以内のマウスの致死率は１００％。ｖｉｒｕｓ  ｍｕｓｅｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（モスクワ）から得た水疱性口内炎ウイルス、Ｉｎｄｉａｎａ株。細胞培養Ｌ４１における感染力価は、４．０〜５．０ｌｇ  ＴＣＤ５０であった。
【０１１１】
細胞培養。ＭＤＣＫ−イヌ腎臓由来の必然的に再移植される（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｒｅ−ｇｒａｆｔｅｄ）細胞培養。培養環境：ＲＰＭＩ−１６４０＋１０ウシ胎児血清＋抗生物質。Ｌ４１−リンパ芽球ヒト細胞。ＯＨ−１−リンパ芽球マウス細胞。
【０１１２】
薬物の最大耐久濃度（ＭＥＣ）および最小活性濃度（ＭＡＣ）の決定。ＭＥＣは、細胞変性を誘発しない最高用量である；ＭＡＣは、ウイルス特異性細胞病原性作用（ＣＰＡ）の発生を５０％阻害する薬物最小量である。インフルエンザウイルスに関する薬物の化学療法係数（ＣＴＩ）は、ＭＡＣに対するＭＥＣの比を決定することによって判明した。ＣＰＡが対照ウイルスでは存在するに対して、実験においてＣＰＡが存在しないこと、さらに、対照インフルエンザウイルスと比較した場合の実験における感染力価の差違によって、薬物のＭＡＣを算出することができた。インビトロでの薬物の抗インフルエンザ活性を、必然的に再移植される細胞培養ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）で固体層を用いて研究した。本発明者らが算出したＲＮＡ−ＭのＭＥＣは、５０００マイクログラム／ｍｌ；ＭＡＣは、３１マイクログラム／ｍｌ、ＣＴＩは、１６１であった。これらの指標ＭＥＣ、ＭＡＣ、およびＣＴＩによって、ＲＮＡ−Ｍは、高度に活性な化合物として分類され得る。
【０１１３】
インビトロでＲＮＡ−Ｍ化合物の抗インフルエンザ活性を試験する場合には、その予防作用および治療作用を判断した。得られた、下記の表２．１．１に報告されている証拠によると、ＲＮＡ−Ｍは、予防レジームでは１．２５〜１０ｍｇ／ｍｌ、および治療レジームでは０．６〜１０ｍｇ／ｍｌの用量で有効であった。
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
実施例２．１．２．  インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ２のインビトロモデル
ウイルスおよび細胞。単層が達成されるまで、ＭＤＣＫ細胞を、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）（ＵＳＡ）９６ウェルプレート内で培養した。使用した培地は、ゲンタマイシン１００ｍｃｇ／ｍｌ、細胞増殖のための５％ウシ胎児血清、およびウイルス維持および培養のためのトリプシン１ｍｃｇ／ｍｌを加えたＭＥＭであった。インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１０２１８／８４（Ｈ５Ｎ２）をＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのウイルスコレクションから得、１０〜１２日齢のニワトリ胚の尿膜腔中、３７℃で４８時間継代させた。
【０１１６】
薬物細胞毒性の評価。研究薬の濃度を確立するために、生成物の毒性をＭＤＣＫ細胞系で研究した。薬物希釈物（５０００〜１６０ｍｃｇ／ｍｌ）を細胞に加え、同じ条件で４８時間インキュベートした。その後に、細胞をリン酸緩衝食塩水中で２回、５分間洗浄した。生存細胞の数を、ミトコンドリア呼吸の強度を特徴付けるマイクロテトラゾリウム試験（ＭＴＴ）で査定した（１）。これは、生理食塩水中に溶解させた３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ａｕｒｏｒａ、ＯｈｉｏＩ在）１００ｍｃｌ（マイクロリットル）（５ｍｇ／ｍｌ）のウェルに加えることによって行った。細胞を５％ＣＯ２空気中、３７℃で２時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水中で５分間洗浄した。沈降物を、１ウェル当たりジメチルスルホキシド（ＤＮＳＯ）１００ｍｃｌに溶解させ；その後、ウェルの光学密度を、多機能マイクロプレートリーダーＶｉｃｔｏｒ  １４２０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、フィンランド）で波長５３５ｎｍで測定した。各生成物での試験結果によって、５０％細胞毒性用量（ＣＴＤ５０）、すなわち、培養細胞の５０パーセントの死をもたらす薬物濃度を確立することができた。
【０１１７】
抗ウイルス薬物作用の評価。細胞培養（物）を、ＲＮＡ−Ｍと接触させてから１時間後に感染させた。１０−１から１０−７の範囲の研究薬の種々の系列１０倍希釈物を、ＭＤＣＫ細胞培養を有するウェルプレートに導入した。続いて、細胞をサーモスタット内、３７℃で４８時間インキュベートした。ウイルスに感染した細胞培養を陽性対照として使用し、無傷の細胞培養（研究薬の代わりに、維持培地が導入されている）を陰性対照として用いた。インキュベーションの４８時間後に、結果を査定した。ウイルス感染力価を、培養液をその中に移した免疫アッセイのためのウェルプレート内で査定した。等体積の１％ニワトリ赤血球を加えた。研究ウェルおよび対照ウェル内での赤血球凝集を評価することによって、ウイルスの存在を査定した。ウイルスの赤血球凝集力価を、ニワトリ赤血球を赤血球凝集させた最も高いｌｏｇウイルス希釈の逆数として定義した。対照と比較した場合の感染力価の低下を評価することによって、抗ウイルス活性を査定した。得られたデータによって、薬物の中央有効用量（ＥＤ５０）、すなわち、対照と比較した場合にウイルス活性を１／２に低下し得る薬物濃度、および細胞と比較した場合に、ウイルス阻害薬物作用の選択性を特徴付ける、ＥＤ５０に対するＣＴＤ５０の比として定義される選択指数を推定することができた（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．「Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８３、６５、５５〜６３頁）。
【０１１８】
研究結果によって、ＲＮＡ−Ｍの細胞毒用量は、５０００ｍｃｇ／ｍｌ超であることが示されている。インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの場合には、ＲＮＡ−Ｍの有効な用量（ＥＣ５０）は、５００ｍｃｇ／ｍｌに等しく、その選択指数は、＞１０であった。トリインフルエンザウイルスＡ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１０２１８／８４（Ｈ５Ｎ２）の場合には、薬物は、より高い濃度（ＥＣ５０＝１５１９ｍｃｇ／ｍｌ）で有効であり、その選択指数は＞３である。
【０１１９】
実施例２．１．３．  インフルエンザウイルスのインビボモデル
インビボでのＲＮＡ−Ｍの抗インフルエンザ活性を、予防レジームおよび治療レジームの両方において、マウスでのインフルエンザ肺炎のモデルで研究した。化合物溶液を非近交マウスに静脈内で、または鼻腔内で、マウスの肺培養に適合させたインフルエンザウイルスでの鼻腔内感染の２４時間前に１０ＬＤ５０の用量で（予防レジーム）、かつインフルエンザウイルスに感染してから２４時間後に（治療レジーム）導入した。同時に、インフルエンザウイルスを用いた対照群を、予防レジームおよび治療レジームのために形成した。致死阻害有効性の指数およびインフルエンザ感染力価によって、薬物の有効性をマウス肺培養で試験した。
【０１２０】
インターフェロン活性の決定を、一般に使用されるＣＰＡ水疱性口内炎ウイルスの阻害方法に従って、細胞培養ＯＨ−１中で行った。
【０１２１】
ノイラミニダーゼ活性の算出を、Ｄ．Ａｍｉｎｏｆｆ．による方法に従って行った（Ａｍｍｉｎｏｆｆ  Ｄ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｉａｌｏｍｕｃｏｉｄｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、１９６１、８１、３８４〜３９２頁）。赤血球凝集反応を、ニワトリ赤血球１％またはモルモット赤血球０．７５％に平行して、一般に認められている方法に従って実施した。インフルエンザウイルスの感染力価を、ウイルスの赤血球凝集の存在によって決定した（「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｒｉｃｋｅｔｓｉａ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｍｏｓｃｏｗ  Ｍｅｄｅｃｉｎｅ、１９６５、１３６頁）。
【０１２２】
下記の表２．１．２に示されているとおり、インビボでのＲＮＡ−Ｍの抗インフルエンザ活性についての研究を、種々の導入方法を用いて、予防レジームおよび治療レジームの両方で実施した。
【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
予防レジームにおいて、腹腔内および静脈内導入の場合の有効な用量は、１５、５０、１５０ｍｇ／ｋｇであり；鼻腔内導入の場合には、これは、かなり高く１０００ｍｇ／ｋｇであった。治療レジームでは、腹腔内導入の場合ならびに鼻腔内導入では、それぞれ２５ｍｇ／ｋｇ（ＩＥ＝６０．０）および５０ｍｇ／ｋｇ（ＩＥ＝６０．０）のより低い用量で、化合物は有効であった。
【０１２５】
ＲＮＡ−Ｍの作用機序を研究する場合には、ノイラミニダーゼ、赤血球凝集、およびインターフェロン形成（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｅｇｅｎｉｃ）活性を検討した。Ａ／ＦＭ／１／４７（Н１Ｎ１）インフルエンザウイルスの赤血球凝集活性に対するＲＮＡ−Ｍの作用についての実験を化合物用量１．０；３．０；１０．０；３０．０ｍｇ／ｍｌを使用して行った。結果によると、ＲＮＡ−Ｍは用量１．０；３．０；１０．０ｍｇ／ｍｌで、統計学的に確実に（４倍）インフルエンザウイルス血球凝集素の赤血球凝集活性を低下させ：上述の用量での力価は１６±２．４であるのに対して、対照力価は６４±９．６であった。
【０１２６】
ＲＮＡ−Ｍのノイラミニダーゼ活性を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの例でＲＮＡ−Ｍ１．０；３．０；１０．０；３０．０ｍｇ／ｍｌを用いて研究した（化合物との接触を１時間および１８時間続けた）。下記の表２．１．３．に報告されている実験結果によって、１時間の間に１０および３０．０ｍｇ／ｍｌの用量で化合物を作用させる場合には、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ活性の阻害は、全て１００％であり、１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌの用量では、５０％であることが証明された。
【０１２７】
【表７】
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【０１２８】
比較的長い接触（１８時間）の場合には、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの全ての阻害が、用量３．０；１０、および３０．０ｍｇ／ｍｌで化合物を作用させた場合に記録され、１ｍｇ／ｍｌの用量では、５０％であった。したがって、ＲＮＡ−Ｍは１．０；３．０；１０．０、および３０．０ｍｇ／ｍｌの用量で、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼを５０％および１００％不活化させ；１．０；１０．０、および３０．０ｍｇ／ｍｌの用量では統計学的に確実に、その赤血球凝集活性を低下させる。
【０１２９】
インビボでの実験で、ＲＮＡ−Ｍ化合物によるインターフェロン誘導の試験をマウスで実施し、マウスに、薬物５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内導入した。１、２、３、および６日後に、動物の血清中のインターフェロンの存在を、マウスＯＨ−１（リンパ芽球マウス細胞）の必然的に再移植される細胞培養における水疱性口内炎のＣＰＡを阻害する一般的方法に従って試験した。
【０１３０】
マウスでのＲＮＡ−Ｍによるインターフェロン誘導の動態によって、インターフェロンの最大活性は、初日に記録され、後で１／２に低下して、６日目まで同じレベルで維持されることが証明された（表４）。酸性持久性マーカーインターフェロンによって、ＲＮＡ−Ｍ誘発インターフェロンは、α−インターフェロンであることが示されている。
【０１３１】
【表８】
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【０１３２】
得られた結果を解析する際には、ＲＮＡ−Ｍの抗インフルエンザ作用の機序は、ノイラミニダーゼおよび血球凝集素の活性に対する作用、ならびにα−インターフェロンの誘導によって行われることに注意することが必要である。
【０１３３】
実施例２．１．４．  ヒト患者におけるインフルエンザおよびＡＲＶＤの治療
治験を、非盲検無作為化比較並行として実行した。この治験を、優越性試験として計画した。患者１７０人が、この試験には包含され、単純な無作為化方法を使用して、試験群（患者８５人）および対照群（患者８５人）に分けられた。急性呼吸器ウイルス感染（ＡＲＶＩ）またはインフルエンザと診断されている１８歳から７０歳の男性および女性が、治験に参加した。治験に参加する患者の主な基準は：ウイルスが存在すること（免疫蛍光試験陽性）；発熱および疼痛症候群を伴って体温≧３８℃；主観的愁訴（衰弱、筋肉痛、頭痛、咽喉炎および／または咳）であった。ＲＮＡ−Ｍに対する比較抗ウイルス薬物として、タミフルを使用した。さらに、患者を疾病分類学で標準的なプロトコルに従って治療した。薬物ＲＮＡ−Ｍを初めに、１日３回０．５グラムで５〜７日間投与し、次いで、１４日目まで、１日２回０．２５グラムを投与した。指示に従って、タミフルを処方した。
【０１３４】
各群での治療有効性の解析を、一次変数：頭痛、衰弱、カタル性症候（咳）、体温（３７℃未満）を使用して推定した。この治験での二次変数としては、：発熱、咽喉炎、関節痛、筋肉痛、易疲労性、鼻汁、そう痒、および鼻涙管内のひりひりとした痛み、カタル性症候（咳、鼻炎など）を採用し、それらの強度を、言葉によるアナログ尺度（ｖｅｒｂａｌ  ａｎａｌｏｇ  ｓｃａｌｅ）（０〜３ポイント）に従って推定した。研究は、モノクローナル抗体で行われた免疫検査を含んだ。インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスＡおよびインフルエンザウイルスＢのｍＲＮＡの同定によって同定した。インフルエンザウイルスＡについての結果が陽性である場合には、インフルエンザウイルスＡ／Ｈ１／Ｎ１についての追加のＰＣＲ分析をＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００増幅装置で行った。インフルエンザおよびＡＲＶＩの診断を、免疫蛍光高速法（ＭＦＡ）によって、かつ血清学的に（ＨＩＲ）確認した。それによって、インフルエンザウイルスＡが、患者のうちの３２．９４％で検出され、インフルエンザウイルスＢが、患者のうちの８．２４％で検出され、パラインフルエンザウイルスが、患者のうちの４１．１８％で検出され、アデノウイルス感染が患者のうちの８．２４％で検出され、呼吸器合胞体感染が患者のうちの９．４１％で検出された。
【０１３５】
統計的方法。データ分析を、統計的解析のための内蔵モジュールであるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびプログラムＳＰＳＳ  １３．０を使用して行った。データ解析のために、記述統計法（数量変数としてｎ、平均値、中央値、標準偏差、最小値、最大値を算出し、かつカテゴリー変数としてカウントおよび百分率を算出した）、グラフ法、信頼区間推定法（データ分布の正規性に応じて、平均値および中央値での９５％ＣＩの推定）、単純対比のさらなる利用と組み合わせたモデルを使用する二元ＡＮＯＶＡの方法を使用した。独立したサンプルではマン−ホイットニー検定またはスチューデントｔ検定（データ分布の正規性に応じて）を使用して、２つの群の間での差違関係を決定し、対データではウィルコクソン符号順位検定またはスチューデント検定を使用して、治療前後のデータを比較した。データの正規性を、シャピロ−ウィルク検定によってチェックした。２つの中央値の差違についての信頼区間を、ホッジス−レーマン法によって算出した。本発明者らが採用したシャピロ−ウィルク検定では、有意水準は０．０１に等しく、他の検定では全て、０．０５であった。
【０１３６】
疾患症状の変数に基づく有効性解析。疾患症状の変数の強度を、ＶＡＳ（言葉によるアナログ尺度）に従って測定したが、ＶＡＳには、ポイント数に相当する下記の順位序列による区分が包含された：０ポイント＝症候なし、１ポイント＝軽度、２＝中程度、３＝重度。
【０１３７】
グラフによって、疾患の主観的愁訴および客観的症状の平均値の動態を図１〜図１０に示す。
【０１３８】
当初状態（０日目）と比較した場合の主な群における症状の強度（高い体温、発熱、頭痛、咽喉炎、関節痛、筋肉痛、掻痒、および鼻のひりひりとした痛み、疲労、全身衰弱、およびカタル性症候）の低下は、４日目から統計学的に有意であった。
【０１３９】
図１〜４は、主な疾患の症状：高い体温、頭痛、カタル性症候、および全身衰弱の動態をグラフで示している。上述のグラフで見られるとおり、曲線は相似していて、全ての変数における差（ｉ日目−０日目）による群間の差違は、４日目から統計学的に有意である。このことは、主な群における症状強度の低下は、対照群と比較して既に４日目からかなり大きいことを示している。そのような低下は、「高い体温」などの変数では１４日目まで（図１）、「頭痛」では１０日目まで（図２）、カタル性症候では６日目まで（図３）、さらに２１日目にも有意であり続け、「全身衰弱」の変数では、この低下は、６日目まで有意であり続ける。そのような結果は、対照群と比較して、主群における主な症状強度の低下がかなり早く現れ（４日目に）、２つの変数におけるこの差違が包括的に１４日目までおよび２１日目に有意であり続けることを意味している。
【０１４０】
得られた結果は、対照群と比較して主群における主な症状強度の低下がかなり大きく、その低下がより早く生じ、主に２〜３日間でのこの低下が、治療が終了するまで、無視できないほど大きいまま維持されることを示している。
【０１４１】
図１〜１０に示されているデータに基づき、主群では、対照群よりも早く症状強度が低下する傾向が見られたと述べることができるであろう。
【０１４２】
各群での症状強度を評価するために、混合モデル：従属変数＝解析されている症状基準、「時間」因子＝固定（レベル：０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１０日目、１４日目、および２１日目）、「患者」因子＝無作為によって、ＤＡを行った。ＡＮＯＶＡと一致しなかったこれらの従属変数については（残留分布正規性（ｒｅｓｉｄｕａｌｓ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｉｔｙ））、ＡＮＯＶＡを順位で使用した。
【０１４３】
ＡＮＯＶＡ結果によると、「時間」因子の効果は有意であり、これは、主群においても、対照群と同様に、症状強度の低下について、プラスの治療作用を示している。
【０１４４】
異なるウイルスに感染しているサブグループにおける治療有効性の解析。加えて、異なるウイルスに感染している患者サブグループにおいて、試験群と対照群との間の比較解析を、下記の一次変数に従って行った：
体温正常化までの時間
頭痛軽減までの時間
全身衰弱の軽減までの時間。
【０１４５】
解析されたデータは、ガウス分布と相関していなかったので、全ての変数についての中心傾向の尺度として、本発明者らは中央値を採用し、その値を、比較ダイアグラムに示す（図１１〜１４）。
【０１４６】
試験群および対照群の対応するサブグループのマン−ホイットニー検定比較を使用することで、一次変数に基づき、試験群と対照群との間には、統計学的に有意な変化が存在すると述べることができ、かつ、対照群と比較した場合に、主群では平均値が低下する傾向があると結論づけることができた。
【０１４７】
したがって、上述の変数（温度正常化までの時間、頭痛軽減までの時間、全身衰弱軽減までの時間）に基づき、ＲＮＡ−Ｍを包含する試験群における療法有効性は、慣用の療法のみの有効性よりも高いと述べることができるであろう。
【０１４８】
我々の治験の結果によって、患者の８０％を構成するウイルス（インフルエンザまたはパラインフルエンザ、アデノウイルス感染）とは独立に、薬物は、主なＡＲＶＩ症状が減衰するまでの時間を本質的に短縮することが示されている。
【０１４９】
実施例２．２．  Ｃ型肝炎ウイルスのモデル
新薬の活性についての研究には、ＨＣＶ感染症についての実験モデルが必要である。しかしながら、長いあいだ、その実験モデルを作成することは困難であった。なぜなら、ＨＣＶ複製のインビトロシステムのレベルは低く、ＰＣＲ法によってしか記録できなかったためである（Ｄｅｒｙａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｉｓａｅｖ  Ｅ．Ｉ．、Ｖｙａｚｏｖ  Ｓ．Ｏ．ら、Ｖｏｐｒ．ｖｙｒｕｓｏｌ、１９９７、６、２５１〜２５３頁）。著者らによって使用された標準的なモデルは、ＭＴ−４細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、本発明者らと同じくＨｅｌａ細胞、ＨＣＶの構造遺伝子を含有する形質転換組換えプラスミド（ｐＢＫ−ＣＭＣ−ＨＣＶレプリコン）、およびｌｙｕｔｓｅｆｉｒａｚａレポーターコンストラクトｐＧＬ３による、ヒト血腫のトランスフェクト細胞Ｈｕｈ−７である（Ｈｅｌｂｉｇ  Ｋ．Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．、Ｂｅａｒｄ  Ｍ．Ｒ．、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉ−ＴＡＣ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００５、３２、２、１３７〜１４３頁）。由来の異なる細胞培養において高い力価で凝集し得るＨＣＶの細胞病原性バージョンの感染者の血清から最近成功裏に達成された抽出によって、ＨＣＶ感染を研究および治療するための新たなモデルの探索が可能となった（Ｄｅｒｉａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｖｏｖ  Ｄ．Ｋ．、Ｉｓａｅｖａ  Ｅ．Ｉ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ」、２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ、１９９９、１３、２頁）。
【０１５０】
ＨＣＶの抽出および培養については、著者らは、実験モデルとして、副腎のヒト腺癌の再移植細胞培養ＳＷ−１３、リンパ芽球由来の細胞の再移植培養ＭＴ−４、新生マウス脳の原細胞培養を使用した（Ｈｅｌｂｉｇ  Ｋ．Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．、Ｂｅａｒｄ  Ｍ．Ｒ．、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉ−ＴＡＣ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ．」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００５、３２、２、１３７〜１４３頁）。ウイルスの細胞病原効果の同定は、フラビウイルスの増殖を許容する培養：ブタ胚の腎臓細胞の再移植系、ブタ精巣細胞の再移植系で行われた。得られたウイルスは、ＨＣＶ特異的抗体によって有効に中和される高い感染性および抗原性を有した。
【０１５１】
中和反応、特異的抗体による赤血球凝集の阻害、免疫酵素法、免疫蛍光法、および寒天への拡散沈殿反応によって、ＨＣＶの細胞病原性分離株を同定した。このウイルスバージョンのＲＮＡをＨＣＶゲノムとして、ＰＣＲで、ヌクレオカプシドタンパク質のコード化を担うＨＣＶゲノムエリア上で５’−ＮＴＲプライマーを使用して、さらに、ＨＣＶのヌクレオカプシドタンパク質のコード化を担うＨＣＶゲノム断片の塩基配列決定法で同定した。著者ら（Ｖｅｎｉｓｏｎ  Ｌ．Ｖ．、Ｓｏｂｏｌｅｖ  Ｂ．Ｎ．、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｃ，  Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ」、１９９９、１２、１１〜１７頁；Ｄｅｒｉａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｖｏｖ  Ｄ．Ｋ．、Ｉｓａｅｖａ  Ｅ．Ｉ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ」、２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ、１９９９、１３、２頁）は、ＨＣＶの抽出の証明、インビトロでの産生性および持続性感染のモデリングを示した。しかしながら、著者らによって抽出されたＨＣＶは国際収集には登録されておらず、標準的ではない。
【０１５２】
実施例２．２．１．  ＨＣＶに感染した懸濁培養ＭＴ−４のモデル
本実験では、１０％胎児血清溶液および抗生物質を含む栄養培地ＲＰＭＩ−１６４０で培養されたリンパ芽球由来の再移植懸濁培養ＭＴ−４を使用した。下記の表２．２．１．に示されているとおり、ＨＣＶ源として、種々のウイルス量でＨＣＶ  ＲＮＡを有するＨＣＶを保有する患者の未希釈血清を使用した。
【０１５３】
【表９】
2014509589.tif 000011
【０１５４】
ＨＣＶ中の構造タンパク質の分裂が細胞ペプチダーゼおよびウイルスプロテアーゼによって行われることは、知られている。したがって、試験培養中でＨＣＶの培養を成功させるために、子ウシの膵臓に由来するＸＩＩＩ型のＴＰＣＫトリプシン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で細胞を先に処理する方法を使用した。このために、ＴＰＣＫトリプシン２ｍｃｌ／ｍｌを含有する培地ＤＭＥＭ６ｍｌで単層を３回洗浄した。トリプシン処理された細胞に、ＨＣＶ感染患者に由来する未希釈の滅菌血液を０．２ｍｌの量で接種した。接触の３０分後に、細胞の単層を、吸収されたなかったウイルスを除去するために２回洗浄し、２％の胎児血清および抗生物質を有する栄養培地ＲＰＭＩ−１６４０に包埋した。感染細胞を３６．５℃で７日間インキュベートした。
【０１５５】
５日目に、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｅキットを使用するＰＣＲ法（Ｂｏｏｍ  Ｒ．  Ｃ．、Ｓｏｌ  Ｊ．  Ａ．、Ｓａｌｉｍａｎｓ  Ｍ．  Ｍ．  Ｍ．、Ｊａｎｓｅｎ  Ｃ．  Ｌ．、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ  Ｐ．  Ｍ．  Ｅ．、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ  Ｊ．、「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０、２８、３、４９５〜５０３頁）によって、ただし、変更（Ｃａｒｔｅｒ  Ｍ．  Ｊ．およびＭｉｌｔｏｎ  Ｉ．  Ｄ．、「Ａｎ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃａ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、１０４４頁）を加えて、細胞培養中のウイルスを試験した。
【０１５６】
ウイルス量を定量査定するために、増幅ＤＮＡ滴定の方法を使用した。ＨＣＶの感染ウイルス力価を、１０倍希釈ＨＣＶ溶液を用いてのＭＴ−４培養の感染の５日目に決定した。細胞培養ＭＴ−４の感染は、ＨＣＶ含有ヒト血清で行った。ＨＣＶを細胞培養中、ＰＣＲ法によって、培養の５日目に決定した。血清のバージョンに応じて、ウイルス量は、１，０００から１０，０００、および１００，０００ｇ／ｅｑｖであった。感染細胞ＭＴ−４では、ＨＣＶは大量と決定され、したがって、ウイルス放出の有効性は高かった。細胞培養ＭＴ−４の培養安定性は、後続の継代においてＨＣＶ増殖を決定することによって証明された。
【０１５７】
培養ウイルスの感染力価の決定は、ＰＣＲを用いて、かつ細胞培養におけるウイルス細胞変性作用（ＣＰＡ）を算出することによって行った。ウイルスの感染力価は、５．５ｌｇ  ＩＤ５０であった。抗ＨＣＶ不活化血清は、ＲＮＡ−ＨＣＶで発現されるウイルス感染性を力価１：６４０まで完全に中和した。ＨＣＶ対照は、１００，０００〜１，０００，０００ｇ／ｅｑｖであった。
【０１５８】
ＨＣＶのウイルス量を５０％阻害する最小薬物量である最小活性濃度（ＭＡＣ）に対する最大許容濃度（ＲＮＡ−ＭのＭＴＣは５０ｍｇ／ｍｌ）の対応を決定することによって、薬物の化学療法係数（ＣＴＩ）を決定することから、ＨＣＶモデルでのＲＮＡ−Ｍの抗ウイルス活性の研究を開始した。
【０１５９】
細胞培養ＭＴ−４におけるＭＡＣを算出するために、試験ウイルスを、用量１００ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌで導入し、３７℃で１時間阻害した。ウイルスの吸着の後に、細胞上の残りを除去し、細胞を栄養培地ＲＰＭＩ−１６４０によって洗浄した。この後、０．１２５から１ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡ−Ｍを、支持培地（ＲＰＭＩ−１６４０および２％のウシ血清）に導入した。下記の表２．２．２．に示されているとおり、ウイルス増殖をＰＣＲによって、細胞当たりのゲノム／当量によって算出した。
【０１６０】
【表１０】
2014509589.tif 000012
【０１６１】
ＲＮＡ−ＭによるＨＣＶ増殖の阻害の有効性は、５０％から１００％まで伸び、対応する薬物濃度である０．２５ｍｇ／ｍｌから０．５ｍｇ／ｍｌに依存することが証明された。
【０１６２】
ＲＮＡ−Ｍの研究結果によって、その最大許容濃度は５０ｍｇ／ｍｌであり；最小活性濃度は０．２５ｍｇ／ｍｌであり、化学療法係数は２００であることが示された。これらの指標によって、ＲＮＡ−Ｍは、高度に活性な抗ＨＣＶ薬物として分類され得る。
【０１６３】
実施例２．２．２．  ＨＣＶのｃＤＮＡをトランスフェクトされた細胞の培養モデル
実験を、ＭＴ−４細胞系、リンパ芽球由来の中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｖｅ）懸濁細胞培養で行った。ＨＣＶ含有源として、著者らは、異なるウイルス量でＨＣＶ  ＲＮＡを含有する、ＨＣＶを保有する患者の未希釈血漿を使用した。
【０１６４】
産生性ＨＣＶ細胞培養の配合のために、ＨＣＶ  ＲＮＡを抽出した。試料であるＨＣＶ保有患者の血清または血漿１００ｍｃｌを、溶解溶液４５０ｍｃｌおよび内部対照試料（ＩＣＳ）５ｍｃｌ（マイクロリットル）を含有する試験管に導入した。再懸濁吸着剤２５ｍｃｌを、別々のチップを用いて各試験管に導入した。吸着を室温で５分間行い、ボルテックスでスラリー化した。次いで、試験管を、１０，０００ｒｅｖ／分で３０秒間、微量遠心機で速度沈降させた。上清を、真空を用いて吸引除去した。洗浄用溶液Ｎｏ．１  ４００ｍｃｌを、沈降物に加えた。次いで、これを、吸着剤の再懸濁が完了するまで、ボルテックスで混合し、１０，０００ｒｅｖ／分で３秒間、速度沈降させた。上清を、真空を用いて吸引除去した。沈降物を洗浄用溶液Ｎｏ．３（５００ｍｃｌ）と７０％エタノールとで２回洗浄した。吸着剤を再懸濁させ、１０，０００ｒｅｖ／ｍｉｎで沈降させた。上清を、真空を用いて吸引除去した。前回の洗浄と同様に、最後の洗浄をアセトン（４００ｍｃｌ）を用いて行い、上清を、各試験管から採った。沈降物をサーモスタット「Ｂｉｏｋｏｍ」（ロシア）内、温度６０℃で１０分間乾燥させた。ＲＮＡ溶離を、脱イオン水５０ｍｃｌ中でリボヌクレアーゼを含有せずに行い、サーモスタット内、６０℃で３分間インキュベートした。上清は、精製ＲＮＡを含有していた。これらのプローブは、逆転写およびＰＣＲの反応のためにすぐに利用できた。
【０１６５】
製造者の推奨に従って、感染因子のＲＮＡマトリックス上でｃＤＮＡを得て、ＰＣＲ法によってさらに解析するように設計されている試薬キット「Ｒｅｖｅｒｔａ−Ｌ」（ＦＧＵＮ「ＣＮＩＩＥ」Ｒｏｓｐｏｔｒｅｂｎａｄｚｏｒ、Ｍｏｓｃｏｗ）で、逆転写の反応を行った。試薬キット「ＲＹＢＯ−ｓｏｒｂ」（（ＦＧＵＮ「ＣＮＩＩＥ」Ｒｏｓｐｏｔｒｅｂｎａｄｚｏｒ、Ｍｏｓｃｏｗ）を使用して抽出されたＲＮＡ溶液を試験物質として使用した。反応混合物は、凍結乾燥ＤＴＴ、ＲＴ混合溶液１２５ｍｃｌ、および逆転写酵素（ＭＭＬＶ）６ｍｃｌから構成されていた。ＲＮＡプローブ１０ｍｃｌを、すぐに使える反応溶液１０ｍｃｌに加えた。逆転写を３７℃で３０分間行うと、ｃＤＮＡの配合が生じた。
【０１６６】
懸濁培養ＭＴ−４のトランスフェクションを、リン酸カルシウム法を用いて行った（Ｄｅｒｙａｂｉｎ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｖｏｖ  Ｄ．Ｋ．、Ｉｓａｅｖａ  Ｅ．Ｉ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ」、２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ、１９９９、１３、２頁）。このために、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸塩、およびＤＮＡを含む等張性溶液を塩化カルシウムと混合すると；生じた沈降物は、リン酸カルシウム粒子およびＤＮＡから構成されていた。懸濁液を、その粒子を吸収する細胞培養に加えた。溶液Ａ（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１、３００ｍｃｌ）および溶液Ｂ（２ＭのＣａＣｌ２、３００ｍｃｌ）を調製した。溶液Ｂの調製では、ＨＣＶのｃＤＮＡ２０ｍｋｇをＣａＣｌ２３６ｍｃｌに加え、蒸留水を用いて３００ｍｃｌにした。次いで、溶液Ａを溶液Ｂに滴加して、空気を導通させ、沈降するまで、室温で３０分間保持した。沈降物を、細胞培養ＭＴ−４に滴加した。貫通ｃＤＮＡ  ＨＣＶの培養をサーモスタット内、３４℃で、５％ＣＯ２を流入させながらインキュベートした。ＭＴ−４細胞培養中のウイルスの試験は、ＰＣＲ法によって、第２継代で培養の９日目に、かつ第５継代で培養の１７日目に行った。
【０１６７】
培養の３０日後に、ＨＣＶをトランスフェクトされた産生性細胞ＭＴ−４の培養を液体窒素で凍結させた。細胞培養を凍結させる２４時間前に、栄養培地（ＲＰＭＩ−１６４０  ＋  １０％胎児血清）を、支持培地（ＲＰＭＩ−１６４０  ＋  ２％胎児血清）に代えた。先に冷却しておいた細胞ミックスに導入されていたジメチルスルホキシド（ＤＮＳＯ）を、凍結のために使用した。次いで、細胞を液体窒素に移した。１ヶ月後に、ＨＣＶトランスフェクトされた産生性ＭＴ培養を解凍し、サーモスタット内、温度３６．６℃で、５％ＣＯ２を流入させながら培養した。
【０１６８】
ＨＣＶのｃＤＮＡをトランスフェクトされた細胞の産生性培養モデルでのＲＮＡ−Ｍの抗ウイルス活性についての研究。ＲＮＡ−Ｍの抗ウイルス活性についてのさらなる研究を、ＨＣＶのｃＤＮＡをトランスフェクトされた細胞の産生性培養のモデルで行った。高い一次ウイルス濃度で生じさせるためには、細胞培養中におけるＨＣＶの増殖は劣悪すぎることが知られている。したがって、これらの薬物を実験によって研究するためには、「代理」ウイルスを使用する（Ｄｕｇｏｕｎｄ  Ｄ．、Ｆｅｎｎ  Ｊ．、Ｓｉｕ  Ｒ．ら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ，  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｇｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＣＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７１、３９１〜３９８頁）。代理ウイルスは、細胞培養中で必要量で増殖し得ないウイルスの代わりに用いられる。ＨＣＶウイルスの代理は、ＨＣＶの試験モデルであるウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）である（Ｄｕｇｏｕｎｄ  Ｄ．、Ｓｉｕ  Ｒ．、Ｆｅｎｎ  Ｊ．ら、「Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２、３６、１２５９〜１２６５頁）。
【０１６９】
研究の過程において、本発明者らは、貫通ＭＴ−４細胞の凍結前およびその解凍後のいずれにおいてもＨＣＶを安定に増殖させるｃＤＮＡ  ＨＣＶをトランスフェクトされたＭＴ−４細胞の産生性培養を得た。
【０１７０】
各ＨＣＶウイルス（産生性培養ＭＴ−４−ｃＤＮＡでのＨＣＶのＲＮＡ中のウイルス量は１２３２０ｇ／ｅｑｖであった）およびＢＶＤＶ（対照でのＢＶＤＶの感染力価は７，０ｌｇ  ＩＤ５０であった）を含有するＭＴ−４−ｃＤＮＡ細胞培養を、濃度１ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ−Ａで処理した。抗ウイルス活性を、ＰＣＲでのＨＣＶの感染力価およびｌｇ  ＩＤ５０によって査定した。ＭＰＣＣ−ＢＶＤＶモデルでのＲＮＡ−Ｍの抗ウイルス活性についての研究結果によって、薬物は濃度１ｍｇ／ｍｌで、ウイルス増殖を２．０ｌｇ  ＩＤ５０だけ阻害し、一方、濃度０．５ｍｇ／ｍｌでは、−３．０ｌｇ  ＩＤ５０だけ阻害することが示された。
【０１７１】
したがって、ＲＮＡ−Ｍは、用量０．５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌで、全ての試験系：ウシウイルス性下痢症ウイルスの代理ＨＣＶ、培養ウイルス、およびＨＣＶの産生性培養ＭＴ−４−ｃＤＮＡにおいて、ウイルス増殖を阻害した。
【０１７２】
実施例２．２．３．  ヒトにおけるＣ型肝炎の治療
Ｃ型肝炎ヒト患者の治療において、複合療法の「ゴールドスタンダード」であるペグ−インターフェロンおよびリバビリンは、６０％の有効性しかもたらさず、高価である。ウイルス増殖の段階にあるＣ型肝炎患者の複合治療におけるＲＮＡ−Ｍの検査室有効性（血清１ｍｌ中でのＰＣＲ  ＲＮＡ  ＨＣＶウイルス量）を群（６人）からなる群で、研究した。薬物をチャートで定めた：第１月は、１日当たりＲＮＡ−Ｍ３カプセルおよびＲｉｂａｒｉｎ  「Ｐａｒｍａｓｔａｒｔ」Ｕｋｒａｉｎｅ（リバビリン）５カプセル、第２月は、１日当たりＲＮＡ−Ｍ  ２カプセルおよびＲｉｂａｒｉｎ５カプセル。
【０１７３】
初期のウイルス学的応答（治療開始後２ヶ月）は、全ての患者において見られた。治療を開始するまで、患者の血清１ｍｌ中でのウイルス量は、ＲＮＡ  ＨＣＶ１．７２×１０６から３．８×１０６コピー／ｍｌの範囲（平均で２．９９×１０６）で足踏みしていた。患者のＲＮＡ  ＨＣＶの血漿中での対照定量決定によって、１／１．６〜１／３．５倍のウイルス量の低下（平均で１／２．７倍）が示され、ＲＮＡ  ＨＣＶ５．６×１０５から２．３×１０６コピー／ｍｌの範囲（平均で１．２８×１０６）が生じた。
【０１７４】
ＲＮＡ−Ｍの高い有効性が、Ｃ型肝炎患者の治療で確認された。患者の気分の改善、生化学的指数の安定化、ウイルスコピー量の低下が血清中で示される。ＲＮＡ−Ｍはよく許容され、副作用は記録されなかった。
【０１７５】
実施例２．３．  ヘルペスウイルスのモデル
実施例２．３．１．  ヘルペスウイルスのインビトロモデル
薬物。ＲＮＡ−Ｍを、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇから１ｇの範囲の用量で投与する。Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）（ＫＲＫＡ、Ｓｌｏｖｅｎｉａ）、ＰｏｌｙＩ：ＰｏｌｙＣ、標準的なＩＦＮ誘導体「Ｃａｌｂｉｃｈｅｍ」。
【０１７６】
ウイルスおよび細胞培養。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）：凍結乾燥された抗原１型ウイルス、Ｄ．  Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのミュージアムから得られたＶＣ株を使用した。ＲＫ−１３細胞培養におけるウイルス細胞病原性から推定される感染力価は５．０〜５．５ｌｇ  ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌであり、脳内感染した白色マウスでは、４．０〜４．５ｌｇ  ＬＤ５０／０．０３ｍｌであった。単純ヘルペス  ウイルス（ＨＳＶ−２）、ＢＨ株。該ウイルスを、ＲＫ−１３細胞培養における連続継代で維持した。細胞培養における細胞病原性から推定される感染力価は、５．５〜６．０ｌｇ  ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌであった。実験による研究を開始する前に、ウイルスを−７０℃で保存した。細胞培養。ラットガッセル神経節神経鞘腫（ＮＧＵＫ−１）の細胞を、エチルニトロソウレアの経胎盤投与によって誘発されるラットガッセル神経節神経鞘腫から得た。再接種ウサギ腎臓細胞系（ＲＫ−１３）は、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  （ＣＤＣ）  ｃｅｌｌ  ｍｕｓｅｕｍ  （Ａｔｌａｎｔａ、Ｇｅｏｒｇｉａ）の収集から得た。再接種系を３７℃＋５％ＣＯ２で、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清、および抗生物質からなる培地中で培養した。
【０１７７】
最大許容濃度の決定。最大許容濃度（ＭＴＣ）を、ＲＫ１３およびＭＤＣＫ細胞を使用して研究した。培地中での各薬物希釈のために、細胞培養を含むプレート内の少なくとも１０ウェル列を、実験で使用した。細胞培養を含むウェルプレートを３７℃で、５％ＣＯ２を含有するガス混合物中で５日間インキュベートした。細胞変性作用（ＣＰＡ）の有無について、研究細胞および対照細胞の培養を毎日評価した。細胞形態解析（丸まり、細胞収縮、およびウェルプレートからの変質細胞の分離）によって、４ポイント尺度で、ＣＰＡの程度を査定した。最大許容濃度（ＭＴＣ）を、細胞変性を引き起こしていない薬物の最大濃度と定義した。
【０１７８】
化学療法係数の評価。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）およびインフルエンザウイルスに関しての薬物の化学療法係数（ＣＴＩ）を、最小活性濃度（ＭＡＣ）に対するＭＰＣの比として算出した。ＭＡＣを、ウイルス特異的ＣＰＡを５０％阻害し得る最低薬物濃度と定義した。ＭＡＣを評価するために、１００ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌの試験−ウイルス用量をＲＫ１３およびＭＤＣＫ細胞培養に導入し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞にウイルスが吸着した後に、これを除去し、細胞を培地で洗浄した。続いて、ＲＮＡ−Ｍを６０から１０００ｍｃｇ／ｍｌの用量で、維持培地（ＲＰＭＩ−１６４０  ＋  ２％胎児血清）に加えた。実験中にＣＰＡが存在しないこと（対照では存在した）、さらに対照と比較した場合の実験における感染力価の差によって、薬物のＭＡＣを決定することができた。
【０１７９】
細胞学的解析。カバーガラス上で培養したＨＳＶ感受性細胞を、Ｓｈａｂａｄａｓｈ液（Ｓｈａｂａｄａｓｈ  ｆｌｕｉｄ）中で３０分間、固定した後に、細胞学的に解析した。Ｓｈａｂａｄａｓｈ液は、中性ホルマリン１部と混合されているエチルアルコール中の硝酸銅９部からなる。ヘマトキシリン−エオシンを用いる標準的な染色を行った。分裂係数を、３，０００〜１０，０００細胞中での有糸分裂の回数をカウントすることによって算出し、１，０００細胞当たりの有糸分裂の回数として表した（‰）。同時に、病的有糸分裂の存在についての査定を行った。病的有糸分裂を、Ｂｌｉｕｍｋｉｎ分類に従って分類した（Ｂｌｕｍｋｉｎ  Ｖ．Ｎ．、Ｚｈｄａｎｏｖ  Ｖ．Ｍ．、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ」、Ｍ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９７３）。細胞学的標本を、×１００および×４０の対物レンズで、ならびに×１０の接眼レンズで、Ｓｔａｎｄａｒｄ２０  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して解析した。
【０１８０】
ＲＫ１３細胞で査定されたＲＮＡ−Ｍの最大許容濃度は、５，０００ｍｃｇ／ｍｌであることが見出された。ウイルス特異的ＣＰＡを５０％阻害し得る最低薬物濃度として定義されるＲＮＡ−Ｍの化学療法係数を、ＭＰＡに対するＭＰＣの比として算出した。ＲＮＡ−Ｍを、６０〜１，０００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で研究した。その結果によって、ｌｇ  ＩＤ５０＞２のＲＮＡ−Ｍの阻害活性は、６０から１，０００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内にあり、そのＭＡＣは６０ｍｃｇ／ｍｌに等しく、そのＭＰＣは５０００ｍｃｇ／ｍｌであり、その化学療法係数は８３．３であることが示された。現行のガイドラインによって（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｋｙｉｖ、２００１、３７１〜３９６頁）、物質または薬物は、ｌｇ  ＩＤ５０≧２でウイルス複製を阻害し得るならば、抗ウイルス特性を有すると判断される。これによって、ＲＮＡ−Ｍは、高い抗ウイルス活性を有する物質として分類され得る。
【０１８１】
ＲＮＡ−Ｍの予防効果および治療効果の研究を、ウサギ腎臓細胞培養（ＲＫ１３）で行った。１型ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、ＶＣ株）、感染力価４．０  ｌｇ  ＣＣＩＤ５０、および２型ヘルペスウイルス（ＢＨ株）、感染力価４．０〜５．０  ｌｇ  ＣＣＩＤ５０を使用した。ＲＮＡ−Ｍの予防効果を研究するためには、細胞培養をウイルスに感染させる２４時間前に異なる濃度の薬物を導入し、ＲＮＡ−Ｍの治療効果を研究するためには、ウイルスに感染させてから２４時間後に異なる濃度の薬物を細胞培養に加えた。培養をサーモスタット内で、ＣＯ２を供給しながら、５日間インキュベートし、その際、ウイルス複製を毎日、顕微鏡で管理し、単層が何ら影響を受けなかった対照培養と比較して、ＲＫ１３細胞に対するウイルスの細胞変性作用を査定した。細胞変性作用は形態学的には、合胞体または丸形細胞の形成と、さらに巨大多核細胞の形成によって特徴付けられる。５日後に、培地をウェルプレートから除去して、ＲＮＡ−Ｍの予防作用および治療作用を受けた各試料における感染力価を査定した。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２複製の結果を、下記の表２．３．１．に示す。
【０１８２】
【表１１】
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【０１８３】
表２．３．１．から分かるとおり、ＲＮＡ−Ｍは、ＲＫ１３細胞培養に投与する治療レジーム、さらには予防レジームにおいて、０．６から１０ｍｇ／ｍｌの広範な濃度で、高い抗ヘルペス活性を示した。
【０１８４】
下記の表２．３．２．に示されているとおり、ＲＮＡ−Ｍ０．１ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌを投与する予防レジームおよび治療レジームにおける有糸分裂特性をＮＧＵＫ細胞で研究した。
【０１８５】
【表１２】
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【０１８６】
表２．３．２．から分かるとおり、ＲＮＡ−Ｍ０．１ｍｇ／ｍｌを予防投与することによって、細胞有糸分裂レジームの変化が予防された。研究群の有糸分裂活性は、対照群（インタクトな細胞）の有糸分裂活性と有意に異ならなかった。有糸分裂の病的形態の解析によっても、有意な差違は判明しなかった。したがって、ＲＮＡ−Ｍ０．１ｍｇ／ｍｌ（予防目的）およびＲＮＡ−Ｍ１ｍｇ／ｍｌ（治療目的）は、有糸分裂活性指数にも、病的有糸分裂数にも有害な影響を及ぼさなかった。
【０１８７】
実施例２．３．２．  ヘルペスウイルスのインビボモデル
動物。使用した動物は、標準的な動物施設条件下に保管されている体重１４から１８ｇの白色非近交マウスであった。体重２５０から３００ｇのモルモット（雄）。ＲＮＡ−Ｍ抗ヘルペス作用（ＨＳＶ−１）を、ヘルペス性髄膜脳炎のモデルで研究した。動物を、ウイルス懸濁液０．０３ｍｌを脳内注射することによって感染させた。ウイルス活性評価は、動物致死率査定に基づいた。使用モデルは、症候解析に便利であり、１００％の再現性によって特徴付けられ、追加の対照を必要としない。臨床症状の発症は、感染の後、５日目から６日目に観察され、１３日目から１４日目にその最大に達した。続いて、臨床症状の低下が、生存動物のさらなる再回復と共に観察された。急性ヘルペス感染の存在を、免疫蛍光によって確認した。最も強力な蛍光が、脳組織、特に脳幹領域で観察された。これは、臨床症状の発症と相関して、感染から６〜７日後に観察された。単純ヘルペスウイルスに感染した動物の致死率は１００％であった。
【０１８８】
ＲＮＡ−Ｍ抗ヘルペス活性（ＨＳＶ−２）も、モルモットにおける陰部ヘルペス感染のモデルで研究した。Ｍａｒｅｎｎｉｋｏｖａ法（Ｍａｒｅｎｎｉｋｏｖａ  Ｓ．Ｓ．、Ｍａｔｓｅｖｉｃｈ  Ｇ．Ｒ．、Ｃｈｅｋｕｎｏｖａ  Ｅ．Ｖ．ら、「Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｖｏｐｒ．  ｖｉｒｕｓｏｌ．、１９８６、１、５９〜６５頁）に従って、モルモットを、感染力価５．０〜５．５  ｌｇ  ＣＣＩＤ５０／ｍｌを有するウイルス含有液で感染させることによって、感染をモデリングした。ウイルス含有液を、予め乱切処理しておいた陰茎皮膚にすりこんだ。乱切処理はエーテル麻酔下で、外科用ランセットで行った。乱切処理表面は４〜７ｍｍ２であった。ウイルス含有液を、乱切処理の直後にピペットを用いて施与し、続いて摩擦した。実験陰部ヘルペスの臨床症状を、治療開始前、かつその後の全疾患期間を通して毎日記録した。感染プロセスの重症度を評価する基準には、具体的な病変の表面積および程度、浮腫、充血、睾丸炎の存在が包含された。各特性を、４ポイント尺度で査定した（４ポイントが、最大症状発現と定義された）。追跡を全ての動物について２１日間行った。各研究群は、動物３匹から構成されていた。ＲＮＡ−Ｍを乱切処理された皮膚に、１日１回５日間施与した。Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）軟膏剤（ＫＲＫＡ、Ｓｌｏｖｅｎｉａ）を、比較のための標準薬物として使用した。同様に、Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）を、乱切処理された皮膚に、毎日５日間施与した。ＲＮＡ−ＭまたはＶｉｒｏｌｅｘ（登録商標）での治療を、感染から２時間後に開始した。
【０１８９】
インビボでのＲＮＡ−Ｍ抗ヘルペス活性を、ヘルペス性髄膜脳炎の白色非近交マウスモデルで研究した。ヘルペスウイルスに感染してから２４時間後に、ＲＮＡ−Ｍ（０．５ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌ）およびＶｉｒｏｌｅｘ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射（０．２ｍｌ）した。ＲＮＡ−Ｍの０．５ｍｇ／ｋｇ濃度は、高い治療効力を有することが示され、その有効性指数は４１．２であり、すなわち、標準薬物であるＶｉｒｏｌｅｘ（登録商標）（有効性指数５０．０）の指数にほぼ等しかった。ＲＮＡ−Ｍの抗ウイルス活性もまた、モルモットでの陰部ヘルペスのモデルで査定した。ＲＮＡ−Ｍでの治療では、ヘルペスウイルスに感染する前およびその後に、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与した。Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）を、対照薬物として使用した。実験は、５群の動物を用いた：ヘルペスウイルスに感染しただけの動物；ヘルペスウイルスに感染し、Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）で処置された動物；ヘルペスウイルスに感染し、局所ＲＮＡ−Ｍ１．０ｍｇ／ｋｇで処置された動物；ヘルペスウイルスに感染し、ＲＮＡ−Ｍ０．１ｍｇ／ｋｇで処置された動物；局所ＲＮＡ−Ｍ１．０ｍｇ／ｋｇを投与され、さらにヘルペスウイルスに感染した動物。モルモットにおける陰部ヘルペスのモデルに対するＲＮＡ−Ｍ有効性の評価の結果を、下記の表２．３．３に表す。
【０１９０】
【表１３】
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【０１９１】
ＲＮＡ−Ｍ（０．１ｍｇ／ｋｇ、および１．０ｍｇ／ｋｇ）を投与する予防レジームでは、疾患の症状発現の平均強度は、０に等しく、治療活性指数は１００％であった。Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）作用の同指数は、かなり低かった。感染後にＲＮＡ−Ｍで動物を処置した場合の効果も、Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）よりも有意に優れていた。疾患症状発現の平均強度は、ＲＮＡ−Ｍでは１４に等しく、Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）では２２に等しく、治療活性指数はそれぞれ、７３．２および５６．０であった。
【０１９２】
本研究の結果によって、投与の予防レジームおよび治療レジームの両方において、広範な濃度でのＲＮＡ−Ｍの高い抗ウイルス活性が証明されている。これは、Ｖｉｒｏｌｅｘ（登録商標）よりも有意に優れていることが判明した。
【０１９３】
２．３．３．    ヒト患者におけるヘルペスウイルス性疾患の治療
ウイルスＤＮＡポリメラーゼを競合的に阻害することによってウイルスＤＮＡの合成およびウイルス複製を阻害する異常ヌクレオシド（アシクロビルおよびその誘導体）を包含する化学療法薬には、ヘルペスウイルス性疾患の治療における主導的役割が存在する。しかしながら、これらの薬物は、特に長期的な使用では毒性を有し、場合によっては、ヘルペスウイルス耐性の発達によって、効力を失う。
【０１９４】
したがって、ヒト患者において陰部ヘルペスを治療する際のＲＮＡ−Ｍの使用の有効性を査定した。
【０１９５】
研究には、陰部ヘルペスに関して該当した患者が包含された。膣擦過または尿道からのスワブにおける１／２型ヘルペス複製の調査を、ポリメラーゼ連鎖反応によって行った。全ての患者が、高濃度のＤＮＡコピー（＋＋＋）ＨＳＶ１型または２型で登録された。ＲＮＡ−Ｍでの療法を患者に、１日３回食後に０．５グラムの投薬量で処方した。同様のＰＣＲ結果を有するが、「プラセボ」で治療した患者を、対照群として使用した。全ての患者を、療法の開始後から１ヶ月後に再び検査した。
【０１９６】
ポリメラーゼ連鎖反応は、治療群の症例のうちの８３．３％において陰性であり、低濃度（＋）での病原体ＤＮＡの存在が、調査のうちの１６．７％にあった。ＰＣＲでの追加の検査で陽性結果を有する患者のうちの７１．４％は、対照群で観察された。
【０１９７】
これらの結果によって、陰部ヘルペス治療におけるＲＮＡ−Ｍの使用の有効性および実行可能性が確認された。
【０１９８】
実施例２．４．  ＨＩＶのモデル
実施例２．４．１．  ＨＩＶ増殖モデル
Ｄ．  Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙのミュージアムから得た産生性細胞培養ＭＴ４／ＢＩＩＩ  ＬＢＫ（ヒトＴリンパ球）産生性ＨＩＶ−１ウイルスの形態におけるヒト免疫不全ウイルス（参考株ＢＵＩ−１ＲＦ）。該ウイルスを−７０℃で保存した。ＨＩＶ源は、ＭＴ４／ＢＩＩＩ  ＬＢＫ細胞の培地であった。ｐ−２４  ＨＩＶ抗原に対するモノクローナル抗体で、間接的な免疫蛍光によって予め検出されたとおり、感染細胞の数は、ほぼ１００％に達した。中和反応によって、ＭＴ４／ＢＩＩＩ  ＬＢＫ細胞によって産生される株に対するＨＩＶ−１の類似性が確認された。
【０１９９】
細胞培養。リンパ芽球系ＭＴ−４細胞を、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｕｋｒａｉｎｅの細胞リポジトリから得た。栄養媒体は、８８％のＲＰＭＩ  １６４０（「Ｓｉｇｍａ」）培地、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（「Ｓｉｇｍａ」）、および抗生物質から構成されていた。細胞を５０ｍｌプラスチック製培養ボトル（「Ｎｕｎｃ」）内、３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。３〜４日毎に、トリパンブルーを使用して生存細胞をカウントし、１ｍｌ当たり２．５×１０５細胞の初期濃度で播種した。
【０２００】
ＲＮＡ−Ｍの抗ＨＩＶ作用の研究。一次ＨＩＶ感染した懸濁ＭＴ−４細胞の標準モデルを使用した。４〜５×１０５細胞／ｍｌを含有する細胞懸濁液にウイルス（１００ＩＤ３０／ウェル）を加えることによって、ＭＴ−４細胞のＨＩＶ感染を行った。培養５日目に、免疫酵素アッセイを使用してウイルス抗原を定量評価することによって、薬物の阻害効果を査定した。ＨＩＶ−１感染力価は、下記のとおりに査定された：試験培地の１０倍希釈物を、ＭＴ−４細胞を含有するポリスチレン製ウェルプレートに導入した。３７℃、５％ＣＯ２ガス混合物中で感染細胞を５日間培養した。その後、免疫酵素アッセイ「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＨＩＶ−１  Ａｇ  ＥＩＡ」（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ｐ２４抗原の存在について、各ウェルからの培養液を解析した。ＨＩＶ感染力価は、４．０〜６．５  ｌｇ  ＩＤ５０に等しかった。
【０２０１】
細胞培養における特異的抗ＨＩＶ  ＲＮＡ−Ｍ活性の研究。懸濁培養ＭＴ−４中、および再接種ラットガッセル神経節神経鞘腫（ＲＧＧＮ）細胞培養中でＨＩＶを培養した。ＨＩＶ−１特性を下記の表２．４．１に表す。
【０２０２】
【表１４】
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【０２０３】
Ｍ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−Ａの研究を、ＭＴ−４細胞培養で行った（Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｚ．ＹＵ．、Ｒｙｂａｌｋｏ  Ｓ．Ｌ．、Ｓｅｍｅｒｎｉｋｏｖａ  Ｌ．Ｉ．、Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｖ．Ｖ．、Ｚａｖｅｌｅｖｉｃｈ  Ｍ．Ｐ．、Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｌ．Ｖ．、Ｍｙｈａｙｌｏｐｕｌｏ  Ｉ．、Ｍａｔｓｕｋａ  Ｈ．ＫＨ．、「Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’，５’−ｔｒｙｏｌｉｈｏａｄｅｎｉｌａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｐｏｘｙ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ、１９９９、１５、４、３１４〜３１９頁）。ＲＮＡ−Ｍを、ウイルス感染から２４時間後に加えた。ＨＩＶを各試料に導入し、その後、５日間培養した。次いで、感染力価を各試料で測定した。研究薬を、研究サイクル全体を通じて培地中に維持した。Ｒｅｔｒｏｖｉｒ（登録商標）０．２５希釈物を、参照薬物として使用した。ＲＮＡ−ＭおよびＲＮＡ−Ａの調製物は、ＨＩＶの増殖を、注射薬を使用するスキームにおいて１．９Ｌｇ  ＩＤ５０で有意に阻害することが示された。Ｒｅｔｒｏｖｉｒは、同様の効果を有した。本研究の結果によって、投与の治療レジームでのＲＮＡ−ＭおよびＲＮＡ−Ａの高い抗ウイルス活性が証明されている。これらは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ（登録商標）よりも有意に優れていることが見出された。このことによって、ＲＮＡ−ＭおよびＲＮＡ−Ａは、ＨＩＶ増殖の阻害において有効であると結論付けることができた。
【０２０４】
実施例２．４．２．  ヒト患者でのＡＩＤＳの治療
ＨＩＶ感染患者の処置法（ｔａｃｔｉｃ  ｏｆ  ｃｏｎｄｕｃｔ）は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびウイルス負荷の後での規則正しい検査室管理にある。その場合、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の量が、血液１ｍｃｌ中３５０細胞未満になり、ウイルス負荷が血液１ｍｌ中ＨＩＶ  ＲＮＡ１００，０００コピー超になったときには、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）を処方すべきである。ＨＩＶ感染者におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球の量およびウイルス負荷の量に対するＲＮＡ−Ｍの適用効果を研究した。
【０２０５】
臨床病期１期および２期である男性からなる３つの群が、ＲＮＡ−Ｍを１日当たり０．７５ｇｒを２ヶ月間にわたって服用した。いわゆる証言はないが、彼らは、特定のＡＲＴを受けていなかった。治療１ヶ月および２ヶ月で、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびウイルス負荷のレベルの決定を行った。この群にＲＮＡ−Ｍを最初に１ヶ月間適用した後、ウイルス負荷は、当初の指数と比較して、１／１．７、１／１．９、および１／１２．７倍に低下した。３つの群の全てにおいて、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の絶対量は、平均で血液１ｍｃｌ中２８５細胞に増殖した（３５０、３５１、および１５４細胞／ｍｃｌ）。リンパ球の全体量は、末梢血中において、平均で血液１ｍｃｌ中５７９．６７細胞に増えた。第１の群では２ヶ月の治療の後に、血液１ｍｌ中にＨＩＶのＲＮＡコピー１３，０００から１，１９０まで、ウイルス負荷が低下した（１／１０．９倍）。第２群の患者では、ＨＩＶのウイルス負荷は、血液１ｍｌ中にＲＮＡコピー１，７８０から１５１へと変化した。第３群の患者では、ウイルス負荷は、１／３．３倍に低下した。ＲＮＡ−Ｍを使用した最初の月および第２の月の間、生化学的血液検査試験（トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、尿素、クレアチニン、コレステロール、および他の同様のもの）の指数においては、このことは発見されていない。ＨＩＶ感染者に１日当たり０．７５ｍｇの用量でＲＮＡ−Ｍを適用することによって、ＨＩＶのウイルス負荷のレベルが低下し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の量が増大する。
【０２０６】
実施例２．５．  エンテロウイルス感染のモデル
Ｈｅｐ−２細胞培養を、ヒト喉頭癌腫細胞培養に再接種する。栄養培地（Ｉｇｌａ  ＭＥＭ  ＋  １０％胚血清、３７℃  ＋  ５％ＣＯ２）。ウイルス−コクサッキーＢ群ウイルス、感染力価４  ｌｇＥＩＤ５０。ＲＮＡ−ＭおよびＲＮＡ−Ａの最大許容濃度（ＭＴＣ）またはＣＤ５０は５ｍｇ／ｍｌであった。最大許容濃度（ＭＴＣ）は、生存細胞の数を５０％まで低下させていた最大薬物濃度と定義された。コクサッキーＢ群ウイルスに関するＲＮＡ−ＭおよびＲＮＡ−Ａの化学療法係数（ＣＴＩ）は、最小活性濃度（ＭＡＣ）に対するＭＴＣの比として算出された。ＭＡＣは、ウイルス特異的細胞変性作用を５０％阻害し得る最低薬物濃度と定義された。ＭＡＣ評価では、試験ウイルスの感染用量を、Ｈｅｐ−２細胞培養に導入し、３７℃で５％ＣＯ２を含有するガス混合物中で１時間インキュベートした。細胞へのウイルス吸着の後に、ウイルスを除去し、細胞をＨａｎｋｓ液で３回洗浄した（１ウェル当たり０．４ｍｌ）。その後、異なる濃度の研究薬を含む維持培地０．２ｍｌを各ウェルに導入した。３つのウェルを各薬物濃度で使用した。維持培地中でインキュベートした感染細胞を対照として使用した。５％ＣＯ２を含有するガス混合物中で、３７℃で４８時間細胞をインキュベートした。対照ウェルには存在するのに対して、研究ウェルには細胞変性作用が存在しないことによって、薬物ＭＡＣを確立することができた。ウイルス性増殖を２．０  ｌｇ以上低下させ得るならば、薬物は抗ウイルス特性を有すると判断される。したがって、ＲＮＡ−ＡのＭＡＣは、＞５００ｍｃｇ／ｍｌ（５００ｍｃｇ／ｍｌを超える）と推定され、ＲＮＡ−ＭのＭＡＣは、１２５ｍｃｇ／ｍｌであるようである。コクサッキーＢ群ウイルスに関する両方の薬物の化学療法係数の評価によって、ＲＮＡ−Ｍでは、その値は４０であり、ＲＮＡ−Ａでは、１０に等しいことが示された。したがって、両方の薬物のＭＴＣ、ＭＡＣ、および化学療法係数によって、ＲＮＡ−Ｍを活性な抗ウイルス薬として分類することができ、一方、ＲＮＡ−Ａは低い抗エンテロウイルス活性を有する薬物に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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