(57)【要約】  本発明は、比較的高濃度のFVIIIを含む水溶液においてFVIIIを安定化するための方法に関する。本発明はさらに、このような水溶液およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも濃度300mMの塩および濃度5〜30%のグリセロールを含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μg/mlでありpHが5.5〜8.5である水溶液においてFVIIIを安定化する方法。
【請求項２】
前記水溶液が濃度2〜20mMの二価陽イオンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液が濃度0.05〜0.3g/kgの界面活性剤を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記塩がNaClである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液中の前記塩濃度が300〜1000mMである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
FVIIIがBドメイン切断型変異体であり、前記FVIII濃度が少なくとも1μg/mlであり、前記塩濃度が約500mMであり、前記グリセロール濃度が10〜20%であり、前記二価陽イオン濃度が約10mMであり、前記界面活性剤濃度が0.1〜0.2g/kgであり、かつ前記溶液のpHが6〜8である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1μg/mlのFVIIIを含み、pHが5.5〜8.5であり、少なくとも濃度300mMの塩および濃度5〜30%のグリセロールを含む、FVIII水溶液。
【請求項８】
濃度0.05〜0.3g/kgの界面活性剤をさらに含む、請求項7に記載の溶液。
【請求項９】
濃度2〜20mMの二価陽イオンをさらに含む、請求項7または8に記載の溶液。
【請求項１０】
前記塩がNaClである、請求項7から9のいずれか一項に記載のFVIII溶液。
【請求項１１】
前記水溶液中の前記塩濃度が300〜1000mMである、請求項7から10のいずれか一項に記載のFVIII溶液。
【請求項１２】
FVIIIがBドメイン切断型変異体であり、前記FVIII濃度が少なくとも1μg/mlであり、前記塩濃度が約500mMであり、前記グリセロール濃度が10〜20%であり、前記二価陽イオン濃度が約10mMであり、前記界面活性剤濃度が0.1〜0.2g/kgであり、かつ前記溶液のpHが6〜8である、請求項7から11のいずれか一項に記載のFVIII溶液。
【請求項１３】
請求項1から6のいずれか一項に記載の方法および請求項7から12のいずれか一項に記載の溶液を用いた分離または精製の間にFVIIIが安定化される、サイズ排除クロマトグラフィーによるFVIIIの分離または精製のための方法。
【請求項１４】
請求項1から6のいずれか一項に記載の方法および請求項7から12のいずれか一項に記載の溶液を用いた修飾工程の間にFVIIIが安定化される、FVIIIの翻訳後修飾のための方法。
【請求項１５】
FVIIIを安定化するための、請求項7から12のいずれか一項に記載の溶液または請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第VIII因子の収率を改善するための方法の分野に関する。特に、本発明は、第VIII因子凝集物形成/沈殿を減少させるのに有用な方法および緩衝液組成/水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
FVIII/第VIII因子は、血漿由来の形態、または、場合によっては例えば化学的方法および/もしくは酵素的方法によって翻訳後修飾されてもよい、組換えタンパク質の形態のいずれかで、血友病Aの治療法/予防法において使用される大型の複合糖タンパク質である。
【０００３】
高濃度の大型タンパク質を溶解状態で維持することは、それらが凝集物を形成する傾向があるため、通常は困難を伴う。(Bドメインを有するまたは有していない)FVIIIは他の大半のタンパク質と比べて溶解性が低いことが周知である。可視沈殿は、15μg/mlという低濃度で発生することがあり、不可視沈殿は、はるかに低い濃度で起こり、このことは、例えば、1μg/mlをかなり上回るようにFVIII濃度を維持することが望ましいタンパク質の翻訳後修飾との関係から、特に不適切である。また、高濃度のFVIIIを保存することが、例えば、FVIIIの貯蔵および/または精製に関して望ましい場合もある。最後に、Bドメイン欠失型/切断型変異体として発現される場合でさえ、哺乳動物細胞株において発現されるrFVIIIの高収率を実現することは困難である。したがって、FVIII濃度が少なくとも0.5μg/mlである溶液においてFVIII沈殿に伴う収率低下を最小限にするために、rFVIII凝集物形成の量を減少させるための対策をとることがきわめて望ましい。
【０００４】
in vitroのFVIII凝集物形成を減少させうる方法に関する提案は過去にない。国際公開第09108806号では、塩濃度250mMのNaClが、翻訳後修飾の後のFVIII精製に関連した溶離ステップにおいて使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第09108806号
【特許文献２】国際公開第03031464号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、少なくとも濃度300mMの塩および濃度5〜30%のグリセロールを含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μg/mlでありpHが5.5〜8.5である水溶液においてFVIIIを安定化する方法に関する。本発明はさらに、このような溶液およびその使用に関する。
【０００７】
この成分の組合せによって、比較的高いFVIII濃度という条件下でFVIIIが沈殿する傾向を弱めうることが、本明細書において本発明者らによって示される。本発明の方法および溶液は、例えば、濃度が少なくとも0.5μg/mlまで上昇するFVIIIの濃縮および/または精製に関してなど、FVIII濃度が0.5μg/mlより低い状況に関しても有用である。
【０００８】
発明の説明
「FVIII/第VIII因子」は、肝細胞によって主に産生される大型の複合糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含む2351個のアミノ酸からなり、相同性に基づいて定義されるいくつかの独特なドメインを含む。3つのAドメイン、1つの独特なBドメイン、および2つのCドメインがある。ドメインの順序はNH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHのように記載することができる。FVIIIは、B-A3境界線で隔てられた2本の鎖として血漿中を循環している。これらの鎖は、二価の金属イオン結合によって連結されている。A1-A2-B鎖は、重鎖(HC)と呼ばれ、一方A3-C1-C2は軽鎖(LC)と呼ばれる。本明細書において、「FVIII」は、血漿由来のFVIIIもしくは組換えFVIII、野生型(wt)FVIII、または例えば発色アッセイにおいてFVIII活性を有する任意のFVIII変異体であると理解される。このようなFVIII変異体の例としては、Bドメイン切断型/欠失型変異体、および/または1つもしくは複数の側基に結合したFVIII(例えば、PEG、他の水溶性のポリマー、脂肪酸誘導体、Fc:FVIII融合物)、ならびに/あるいは1つまたは複数のAドメインおよび/またはCドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸修飾を有するFVIII変異体などが挙げられる。このようなFVIII修飾の内の1つまたは複数の結果として、野生型FVIIIと比べて循環半減期が長いFVIII変異体が生じうる。
【０００９】
「Bドメイン」:野生型FVIII分子中のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。Bドメイン切断型FVIII分子/変異体中のBドメインの長さは、約10から約800アミノ酸、例えば、約10アミノ酸から約700アミノ酸(例えば、約12〜500アミノ酸、12〜400アミノ酸、12〜300アミノ酸、12〜200アミノ酸、15〜100アミノ酸、15〜75アミノ酸、15〜50アミノ酸、15〜45アミノ酸、20〜45アミノ酸、20〜40アミノ酸、または20〜30アミノ酸など)などまで様々でありうる。切断されたBドメインは、重鎖および/もしくは軽鎖の断片ならびに/または野生型FVIII分子には存在しない人工的に導入された配列を含みうる。「Bドメイン切断型」および「Bドメイン欠失型」という用語は、本明細書において同義的に使用されてよい。
【００１０】
溶液の「イオン強度/I」は、その溶液におけるイオン濃度の周知の指標である。溶液のイオン強度Iは、その溶液中に存在するすべてのイオンの濃度の関数である。Table 1(表1)では、本発明に関連して使用されうる様々な塩のモル濃度をイオン強度に変換している。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
本明細書において、「水溶液/水性緩衝液」とは、水が主な溶媒であり、かつ有機溶媒を全く含まないか、または微々たる量および/もしくは極微量の有機溶媒、例えば1%未満の有機溶媒などを含む、溶液であると理解される。
【００１３】
本明細書において、「塩」とは、任意の塩、例えば、table 1(表1)に記載の塩の内の1つまたは複数であると理解される。
【００１４】
本発明の文脈における「グリセロール」とは、グリセロールならびにグリセロールの代わりとなりうる他の化合物、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、1,3-プロパンジオール、ジエタノールアミン、スクロース、デキストロース、トレハロース、グルコースなどの例えば多価アルコールなどを意味する。このタイプの化合物が水溶液におけるFVIIIの安定化に関してグリセロールの代わりとなりうることは、当業者に周知である。
【００１５】
本明細書において、「界面活性剤/表面活性剤」とは、任意の界面活性剤/表面活性剤、例えば、次の界面活性剤:SDS、Triton X-100、X114、CHAPS、DOC、NP-40、Tween 80およびTween 20の内の1つまたは複数を含むと意図される。
【００１６】
本発明によれば、二価陽イオン、例えばMg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+が溶液に添加される。「Ca2+」は、table 1(表1)に記載した塩の内の1つまたは複数ならびにCa(OH)2の形態で添加されうる。
【００１７】
「サイズ排除クロマトグラフィー/SEC/ゲル濾過クロマトグラフィー」とは、溶液中の分子がそれらのサイズ(より正確には、それらの流体力学的体積)に基づいて分離されるクロマトグラフィー方法である。有機溶媒が移動相として使用される場合に使用されるゲル浸透クロマトグラフィーという名称に対して、典型的には、カラムを通して試料を輸送するのに水溶液が使用される場合、この技術はゲル濾過クロマトグラフィーとして公知である。SECは、ポリマーに関して優れた分子量(Mw)の結果をもたらすことができるため、広く使用されているポリマーの特性決定方法である。ゲル濾過クロマトグラフィーの主な用途は、タンパク質および他の水溶性ポリマーの分画であるのに対し、ゲル浸透クロマトグラフィーは、有機可溶性ポリマーの分子量分布を解析するのに使用される。
【００１８】
本明細書において、「FVIIIの翻訳後修飾」とは、例えば、その分子と親水性ポリマー(例えばポリエチレングリコール(PEG))、脂肪酸誘導体、アルブミン、Fcドメインなどとの結合のような、rFVIIIまたは血漿由来FVIIIの任意の修飾であることが意図される。FVIIIの修飾/変換は、例えば、化学的アプローチおよび/または酵素的アプローチを用いて起こすことができる。ペプチドの酵素的翻訳後修飾のための方法の一例は、国際公開第03031464号において開示されている。
【００１９】
本明細書において、「FVIIIの安定化」は、活性FVIIIの損失の減少であると意図される。比較的高いFVIII濃度を伴う条件下でのFVIIIの貯蔵、精製および翻訳後修飾に関して、FVIII収率低下の主な原因は、FVIII分子の「凝集/沈殿」である。したがって、本明細書において、「安定化」とは、高濃度FVIII溶液におけるFVIII沈殿の減少と考えることができる。実施例において、本発明による溶液および/または方法がFVIII収率低下の軽減をどのようにもたらすかが示される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
実施形態の一覧:
実施形態1:したがって、第1の態様において、本発明は、少なくとも濃度300mMの塩、濃度5〜35%のグリセロール、濃度2〜20mMの二価陽イオン(好ましくはCa2+)、および濃度0.05〜0.3g/kgの界面活性剤を含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μg/mlでありpHが5.5〜8.5である水溶液においてFVIIIを安定化する方法に関する。
【００２１】
実施形態2:実施形態のいずれかに記載の方法のFVIII濃度は、少なくとも約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、または25,000μg/mlであってよい。
【００２２】
実施形態3:本発明による任意の実施形態のFVIII濃度は、例えば、1〜25,000μg/ml、例えば、1〜20,000μg/ml、1〜15,000μg/ml、1〜10,000μg/ml、1〜5000μg/ml、1〜4000μg/ml、1〜3000μg/ml、1〜2000μg/ml、1〜1000μg/ml、1〜900μg/ml、1〜800μg/ml、1〜700μg/ml、1〜600μg/ml、1〜500μg/ml、1〜400μg/ml、1〜300μg/ml、1〜200μg/ml、1〜100μg/ml、5〜5000μg/ml、5〜4000μg/ml、5〜3000μg/ml、5〜2000μg/ml、5〜1000μg/ml、5〜900μg/ml、5〜800μg/ml、5〜700μg/ml、5〜600μg/ml、5〜500μg/ml、5〜400μg/ml、5〜300μg/ml、5〜200μg/ml、5〜100μg/ml、10〜25,000μg/ml、10〜20,000μg/ml、10〜15,000μg/ml、10〜10,000μg/ml、10〜5000μg/ml、10〜4000μg/ml、10〜3000μg/ml、10〜2000μg/ml、10〜1000μg/ml、10〜900μg/ml、10〜800μg/ml、10〜700μg/ml、10〜600μg/ml、10〜500μg/ml、10〜400μg/ml、10〜300μg/ml、10〜200μg/ml、10〜100μg/ml、15〜25,000μg/ml、15〜20,000μg/ml、15〜10,000μg/ml、15〜5000μg/ml、15〜4000μg/ml、15〜3000μg/ml、15〜2000μg/ml、15〜1000μg/ml、15〜900μg/ml、15〜800μg/ml、15〜700μg/ml、15〜600μg/ml、15〜500μg/ml、15〜400μg/ml、15〜300μg/ml、15〜200μg/ml、15〜100μg/ml、20〜5000μg/ml、20〜4000μg/ml、20〜3000μg/ml、20〜2000μg/ml 20〜1000μg/ml、20〜900μg/ml、20〜800μg/ml、20〜700μg/ml、20〜600μg/ml、20〜500μg/ml、20〜400μg/ml、
20〜300μg/ml、20〜200μg/ml、または20〜100μg/mlなどの範囲であってよい。
【００２３】
実施形態4:塩が、1つもしくは複数のナトリウム塩および/または1つもしくは複数のアンモニウム塩からなる群から選択される一価の塩である、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。このような塩の例はtable 1(表1)に記載されている。
【００２４】
実施形態5:塩がNaClである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００２５】
実施形態6:水溶液中の塩濃度が275〜1500mM、例えば、275〜1400mM、275〜1300mM、275〜1200mM、275〜1100mM、275〜100mM、275〜1000mM、275〜900mM、275〜800mM、275〜700mM、275〜600mM、275〜500mM、275〜400mM  300〜1500mM、300〜1400mM、300〜1300mM、300〜1200mM、300〜1100mM、300〜1000mM、300〜900mM、300〜800mM、300〜700mM、300〜600mM〜  300〜500mM、300〜400mM、325〜1500mM、325〜1400mM、325〜1300mM、325〜1200mM、325〜1100mM、325〜1000mM、325〜900mM、325〜800mM、325〜700mM、325〜600mM、325〜500mM、325〜400mM、350〜1500mM、350〜1400mM、350〜1300mM、350〜1200mM、350〜1100mM、350〜1000mM、350〜900mM  350〜800mM、350〜700mM、350〜600mM、350〜500mM、350〜400mM、400〜1500mM、400〜1400mM、400〜1300mM、400〜1200mM、400〜1100mM、400〜1000mM、400〜900mM、400〜800mM、400〜700mM、400〜600mM、400〜500mM、450〜1500mM、450〜1400mM、450〜1300mM、450〜1200mM、450〜1100mM、450〜1000mM、450〜900mM、450〜800mM、450〜700mM、450〜600mM、500〜1500mM、500〜1400mM、500〜1300mM、500〜1200mM、500〜1100mM、500〜1000mM、500〜900mM、500〜800mM、500〜700mM、または500〜600mMなどである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００２６】
実施形態7:FVIIIがBドメイン切断型変異体である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００２７】
実施形態8:グリセロール濃度が5〜35%、例えば、5〜30%、5〜25%、5〜20%、5〜15%、5〜10%、12.5〜35%、12.5〜30%、12.5〜25%、12.5〜20%、12.5〜15%、15〜35%、15〜30%または15〜20%(W/W)などである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００２８】
実施形態9:二価陽イオン濃度が2〜20mM、例えば、2〜15mM、2〜10mM、2〜5mM、5〜20mM、5〜15mM、5〜10mM、10〜20mMまたは10〜15mMなどである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。二価陽イオンは、例えば、table 1(表1)に記載したカルシウム塩の形態で添加されてよい。
【００２９】
実施形態10:界面活性剤濃度が0.05〜0.5g/kg、例えば、0.05〜0.4g/kg、0.05〜0.3g/kg、0.05〜0.2g/kg、0.05〜0.1g/kg、0.1〜0.5g/kg、0.1〜0.4g/kg、0.1〜0.3g/kgまたは0.1〜0.2g/kgなどである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。本発明に関連して使用するのに適した界面活性剤の例としては、SDS、Triton X-100、X114、CHAPS、DOC、NP-40、Tween 80およびTween 20が挙げられる。
【００３０】
実施形態11:溶液のpHが5.5〜8.5、例えば、5.5〜8.0、5.5〜7.5、5.5〜7.0、5.5〜6.5、5.5〜6.0、6.0〜8.5、6.0〜8.0、6.0〜7.5、6.0〜7.0、6.0〜6.5、6.5〜8.5、6.5〜8.0、6.5〜7.5、6.5〜7.0、7.0〜8.5、7.0〜8.0、7.0〜7.5、7.5〜8.5、7.5〜8.0、または8.0〜8.5などである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００３１】
実施形態12:FVIII分子がBドメイン切断型変異体であり、FVIII濃度が少なくとも1μg/mlであり、塩濃度が約500mMであり、グリセロール濃度が10〜20%であり、二価陽イオン濃度が約10mMであり、Tween濃度が0.1〜0.2g/kgであり、かつ溶液のpHが6〜8である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００３２】
実施形態13:少なくとも1μg/mlのFVIIIを含み、pHが5.5〜8.5であり、少なくとも濃度300mMの塩、濃度5〜30%のグリセロール、濃度2〜20mMの二価陽イオン(好ましくはCa2+)および濃度0.05〜0.3g/kgの界面活性剤を含む、FVIII水溶液。界面活性剤は、好ましくはTween 20である。
【００３３】
実施形態14:塩が、ナトリウム塩またはアンモニウム塩からなる群から選択される一価の塩である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。
【００３４】
実施形態15:塩がNaClである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。
【００３５】
実施形態16:水溶液中の塩濃度が300〜1000mMである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。好ましくは、塩はNaClである。
【００３６】
実施形態17:FVIII分子がBドメイン切断型変異体であり、FVIII濃度が少なくとも1μg/mlであり、塩濃度が約500mMであり、グリセロール濃度が10〜20%であり、Ca2+濃度が約10mMであり、Tween濃度が0.1〜0.2g/kgであり、かつ溶液のpHが6〜8である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。
【００３７】
実施形態18:本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液は、実施形態2に関して説明したFVIII濃度、実施形態6において説明した塩濃度、実施形態8において説明したグリセロール濃度、実施形態9において説明した二価陽イオン濃度、実施形態10において説明した界面活性剤濃度、および実施形態11において説明したpHをさらに備えていてもよい。具体的な塩は、本明細書において提案する選択肢のいずれかから選択することができる。二価陽イオンの具体的な供給源も、本明細書において提案する選択肢のいずれかから同様に選択することができる。界面活性剤の具体的な供給源も、本明細書において提案する選択肢のいずれかから同様に選択することができる。
【００３８】
実施形態19:本発明の実施形態のいずれか1つに記載の方法および/または本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液を用いた分離または精製の間にFVIIIが安定化される、サイズ排除クロマトグラフィーによるFVIIIの分離または精製のための方法。
【００３９】
実施形態20:本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法および/または本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液を用いた修飾工程の間にFVIIIが安定化される、FVIIIの翻訳後修飾のための方法。
【００４０】
実施形態21:FVIIIを安定化するための、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液および/または本発明の実施形態のいずれか1つに記載の方法の使用。
【００４１】
実施形態22:少なくとも濃度300mMの塩および濃度5〜30%のグリセロールを含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μg/mlでありpHが5.5〜8.5である水溶液においてFVIIIを安定化する方法。
【００４２】
実施形態23:水溶液が濃度2〜20mMの二価陽イオンを含む、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。
【００４３】
実施形態24:二価陽イオンがMgCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。
【００４４】
実施形態25:二価陽イオンがCaCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。
【００４５】
実施形態26:水溶液が濃度0.05〜0.3g/kgの界面活性剤を含む、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の方法。界面活性剤は、好ましくはTweenである。
【００４６】
実施形態27:少なくとも1μg/mlのFVIIIを含み、pHが5.5〜8.5であり、少なくとも濃度300mMの塩、および濃度5〜30%のグリセロールを含む、FVIII水溶液。
【００４７】
実施形態28:濃度0.05〜0.3g/kgの界面活性剤をさらに含む、本発明の実施形態のいずれかに記載の溶液。界面活性剤は、好ましくはTweenである。
【００４８】
実施形態29:濃度2〜20mMの二価陽イオンをさらに含む、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液。
【００４９】
実施形態30:二価陽イオンがMgCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の溶液。
【００５０】
実施形態31:二価陽イオンがCaCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の溶液。
【００５１】
(実施例)
(実施例1)
FVIII溶液を10mM HEPES、0.5M NaCl、20%(v/v)グリセロール、2mM CaCl2、0.02%tween80、pH7.5にバッファー交換し、約30mg/mlまで濃縮した。以下のパターンの緩衝液を用いて、タンパク質結晶化のための96ウェルマイクロタイタープレートを準備した:
横列(第VIII因子と混合した後の最終濃度):
A. 50mM酢酸Na、pH5.0、
B. 50mM His、pH5.5、
C. 50mM His、pH6.0、
D. 50mMイミダゾール、pH6.5、
E. 50mMイミダゾール、pH7.0
F. 50mM HEPES、pH7.5
G. 50mM HEPES、pH8.0
H. 50mM Gly-gly、pH9.0
縦列:
1および7:0M NaCl
2および8:0.08M NaCl
3および9:0.2M NaCl
4および10:0.33M NaCl
5および11:0.53M NaCl
6および12:0.8M NaCl
【００５２】
ウェルはすべて、20%グリセロール、0.02% tween80を含有した。縦列1〜6は2mM CaCl2を含有し、縦列7〜12は16mM CaCl2を含有した。FVIII溶液200nl+緩衝液400nlを液滴として混合し、透明なフィルムでプレートを密封し、24時間インキュベートし、顕微鏡下で検査した。次の尺度に基づいて、液滴の沈殿を採点した:なし:清澄、低度:わずかな沈殿物、高度:多量の沈殿物。これらの結果を下記の表に示す。
【００５３】
【表２】
2014501227.tif 000003
【００５４】
0.33M以上のNaCl濃度(縦列4〜6、10〜12)が、特に最低pH値において沈殿を回避するのに最も好都合であることが認められる。
【００５５】
(実施例2)
第VIII因子溶液を10mM HEPES、0.5M NaCl、20%(v/v)グリセロール、10mM CaCl2、0.02% tween80、pH7.5にバッファー交換し、アミコン(amicon)スピンフィルターを用いて19mg/mlまで濃縮した。以下のパターンを用いて、384ウェルのマイクロタイタープレートを準備した:
横列(第VIII因子と混合した後の最終濃度):
A 50mM His、pH5.5、
B 50mM His、pH6.0、
C 50mMイミダゾール、pH6.5
D 50mMイミダゾール、pH7.0
E 50mM HEPES、pH7.5
F 50mM HEPES、pH8.0
縦列:
1:0M NaCl
2:0.17M NaCl
3:0.23M NaCl
4:0.3M NaCl
5:0.4M NaCl
6:0.5M NaCl
【００５６】
ウェルはすべて、20%グリセロール、0.02% tween80および10mM CaCl2を含有した。第VIII因子の最終濃度が5mg/mlになるように、緩衝液および第VIII因子を混合した。各ウェルの光散乱の強度をWyatt DynaProプレートリーダーによって測定した。強度が高いほど、自己会合が多いことが示される。これらの結果を下記の表に示す。
【００５７】
【表３】
2014501227.tif 000004
【００５８】
自己会合の低度が低いことを示す最低の強度は、NaClが高濃度の場合に見出されることが認められる。
【００５９】
本発明のいくつかの特徴を本明細書において示し説明してきたが、当業者は多くの改良、代用、変更および均等物に想到するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内であるこのような改良および変更すべてを包含することを意図することを理解すべきである。
【００６０】
(実施例3)
UF/DF
N8を含む溶液2150gのpHおよびCaCl2をそれぞれ6.13および合計10mmol/kgに調整した。続いて、N8を含む溶液を限外濾過によって約4mg/mlまで濃縮し、次いで、5倍体積量の緩衝液(20mmol/kgヒスチジン、9mmol/kg HCl、0.5mol/kg NaCl、10mM/kg CaCl2、20%グリセロールを含有する、pH6.16)を用いたダイアフィルトレーションによってバッファー交換した。次いで、N8を含む溶液を9.54mg/mlまでさらに濃縮した。収率は、分析方法によって97〜98%の範囲であった。濃縮完了後に測定した全HMWPのレベルを下記の表に示す。結論として、これにより、高濃度NaClという条件下では、FVIII濃度は有意に上昇するもののHMWP形成はないことが実証される。
【００６１】
【表４】
2014501227.tif 000005
【００６２】
(実施例4)
FVIIIのPEG化
出発原料は、結果としてpH6.1となる、0.5M塩化ナトリウム、10mM塩化カルシウム、20%グリセロール、20mMヒスチジンおよび9mM塩酸中に7.5mg/mlのFVIIIを含有する溶液であった。この溶液210mlにシアリダーゼ1.3mg、ST3Gal1 42mgおよび40K PEG 1.7gを添加し、周囲の室温で17.7時間、反応させた。反応の最後の時点で、濁りの徴候も沈殿の徴候もなかった。
【００６３】
(実施例5)
FVIII分子のフロースルーモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィー
このステップの目的は、40Kポリエチレングリコール基によって共有結合的に修飾されたFVIII分子のシアル酸付加のために使用された酵素(ST3Gal3)およびHMWP(高分子量タンパク質)を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて除去することであった。直径0.5cmのカラムをTSKフェニル5PW樹脂でベッド高10.5cmまで充填して、ベッド容積2.1mlとした。450mM塩化ナトリウム、10mM塩化カルシウム、10%グリセロール、0.02%ポリソルベート80、20mMヒスチジンおよび9mM塩酸からなる5カラム容量の緩衝液でカラムを平衡化して、pH6.1および約35mS/cmの導電率を得た。濃度1.05mg/mlのFVIII分子および0.025mg/mlのST3Gal3を含むロード試料(load)に塩化ナトリウムを添加して、平衡緩衝液と同じ導電率(35mS/cm)に到達させ、かつヒスチジンおよび塩酸を加えてpH6.1に調整した。ロード試料(37.5ml)、続いて平衡緩衝液をカラムに通過させた。精製されたFVIII産物は、カラムに結合せず、通過画分中に回収され、濃度0.85mg/mlで41.1mlが得られた。収率は88.7%であった。高分子量タンパク質の含有量は1.5%から1.0%に減少した。ST3Gal3は約24000ppmから1328ppmに減少し、これは約18分の1への減少に相当した。
【００６４】
(実施例6)
SEC実施例
40K PEGに共有結合されているrFVIIIaならびにその反応物質(rFVIIIおよびPEG)の双方を含有する反応混合物に対して、GE Healthcareから入手したAKTAエクスプローラーおよびSuperdex 200 1.8L(10×23.5cm h)を充填したBPG10カラムを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。流速は0.8CV/時(4.24ml/分)であり、温度は22℃であり、ランニング緩衝液は以下からなった:
【００６５】
【表５】
2014501227.tif 000006
【００６６】
添加する前に、1CVの水酸化ナトリウムを用いてカラムを清掃し、UVを自動ゼロ設定する前に1.2CVの緩衝液で平衡化した。
【００６７】
濃度1.05mg/mlの反応混合物92ml(CVの約5%)(合計97mg)をカラムに添加した。
【００６８】
UV吸光度のシグナルが0.15AU/cmを超えた場合、プール(pool)を採取した。濃度0.46mg/mlのプール体積202mlが得られ、収率は98%となった。
【００６９】
説明したサイズ排除クロマトグラフィーのステップは、加工酵素ならびに他の混在物を減少させるために使用される。加工酵素ST3Gal3は、SECステップによって330分の1に(約1328ppmから4ppmまで)減少した。
【国際調査報告】
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