(57)【要約】抽出物および／または薬用植物画分ならびに医薬製剤は、本発明の目的に関してＤＬＢＳ１４４９と呼ばれるファレリア・マクロカルパ(Phaleria macrocarpa)抽出物を含有する。本発明の教示による薬用植物抽出物は、血圧を上昇させることなく、コレステロールエステルトランスフェラーゼタンパク質（ＣＥＴＰ）の発現および活性を阻害し、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させ、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるために、効果的に適用でき、したがってさらにアテローム性硬化症療法に適用できる。【選択図】図１
2014512378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含むプロセスにより得られる、ファレリア・マクロカルパ(Phaleria macrocarpa)の抽出物および／またはそれに由来するそれの画分もしくはそれの化合物群：
（ａ）有機溶媒を用いて１０〜６０℃の温度で撹拌しながらファレリア・マクロカルパを抽出し、
（ｂ）工程（ａ）で用いた有機溶媒を蒸発させる。
【請求項２】
抽出プロセスに、限定するものではないが濃度７０〜９６％のアルコールを含む有機溶媒を使用する、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
特定の生物学的作用をする、少なくとも、脂肪酸、ならびにサポニンおよびフェノールの化合物群、ならびに他の二次代謝産物、またはそれの組合わせを含む、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
単一有効成分としての、または組み合わせた、ＣＥＴＰ遺伝子の発現および活性を抑制するのに有効な量または用量の、請求項１に記載の抽出物。
【請求項５】
単一有効成分としての、または組み合わせた、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させるのに有効な量または用量の、請求項１に記載の抽出物。
【請求項６】
ファレリア・マクロカルパ(Phaleria macrocarpa)抽出物がＡｐｏＡ−１タンパク質レベルを上昇させ、ＳＲ−Ｂ１遺伝子発現を抑制する、請求項５に記載の抽出物。
【請求項７】
単一有効成分としての、または組み合わせた、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるのに有効な量または用量の、請求項１に記載の抽出物。
【請求項８】
ファレリア・マクロカルパ(Phaleria macrocarpa)抽出物がＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現を増大させ、ＡｐｏＢ遺伝子発現を抑制する、請求項７に記載の抽出物。
【請求項９】
ファレリア・マクロカルパ(Phaleria macrocarpa)抽出物が血圧を上昇させない、請求項１に記載の抽出物。
【請求項１０】
抽出物がＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子発現を抑制する、請求項９に記載の抽出物。
【請求項１１】
アテローム性硬化症発生の阻害に関連する抗アテローム形成剤としての医薬組成物、サプリメント、食品または飲料を調製するための、医薬的に許容できる生理的に適したキャリヤー（単数または複数）、賦形剤（単数または複数）または添加剤（単数または複数）を含有する単一形態でまたは組み合わせて有効成分として有効な量の請求項１に記載の抽出物の使用。
【請求項１２】
単一形態でまたは組み合わせて有効成分として使用される請求項１に記載の抽出物を含有する医薬組成物であって、医薬的に許容できる生理的に適したキャリヤー（単数または複数）、賦形剤（単数または複数）または添加剤（単数または複数）を含有し、これにより固体、半固体または液体の、無菌または非無菌製剤として調製される医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の抽出物および／または画分を単一有効成分としてまたは組み合わせて含む、健康上の有益性を増進するための食品または飲料製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明の目的に関してＤＬＢＳ１４４９と呼ばれるファレリア・マクロカルパ(Phaleria macrocarpa)抽出物に関するものであり、抽出方法、ならびにコレステロールエステルトランスフェラーゼタンパク質（ＣＥＴＰ）の発現および活性に対する阻害活性を示す抽出物の生物活性が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールエステルトランスフェラーゼタンパク質（ＣＥＴＰ）は７４−ｋＤａの糖タンパク質であり、疎水性をもつ１。このタンパク質は主に肝臓で合成され、血漿に分泌される。さらに、ＣＥＴＰはリンパ、脂肪組織、心臓、腎臓および小腸においてもより低い濃度で発現する２。ＣＥＴＰはコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）プロセスにおいて役割を果たし、その際、このタンパク質は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子中のコレステロールエステルを低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）粒子中のトリグリセリドと交換するのを仲介する１，３−５。多数の先の研究により、ＣＥＴＰはＬＤＬ粒子におけるコレステロールエステル蓄積プロセスを促進し、これによって血液循環からのコレステロール排除プロセスが阻害されることが示された４。遺伝的ＣＥＴＰ欠損を伴う対象はＨＤＬコレステロールの量がより高く、ＬＤＬコレステロールの量がより低いことが、疫学的研究において報告されている。したがって、ＣＥＴＰは異脂肪血症およびアテローム硬化症の処置のための薬物探索において有望な療法標的となる。
【０００３】
最近、ＣＥＴＰ活性ならびにそれがヒト血漿中のＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドのレベルの変化に及ぼす作用を調べる試みとして、ＣＥＴＰに重点を置く研究が行われている５，６。ＨＤＬコレステロールレベルとアテローム硬化症リスク因子の間に負の相関性があると報告されていることにより７、ＣＥＴＰ発現低下の結果としての高いＨＤＬコレステロール量はきわめて重要である。ＨＤＬのアテローム防御特性は、末梢細胞における過剰のコレステロールが肝臓へ分配されて排出されるＲＣＴプロセスにそれの役割がある６。製造および探知された幾つかのＣＥＴＰ阻害薬がある：たとえば、コレステロールエステルトランスフェラーゼタンパク質阻害ペプチドおよびＣＥＴＰアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）８，９。しかし、それら２種類の阻害剤はまだ試験中である。そのほか、臨床試験の段階まで開発されたＣＥＴＰとしての薬物、すなわちトルセトラピブ(torcetrapib)があった。しかし、その薬物を摂取した患者の死亡数が高かったことを考慮すると、この製品は臨床試験でプラスの結果を示さなかった１０。さらに調査が行われた結果、トルセトラピブは患者の血圧を上昇させ、それが死亡をもたらした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cho KH, Shin YW, Choi MS, Bok SH, Jang SH, Park YB. In vivo effects of CETP inhibitory peptides in hypercholesterolemic rabbit and cholesteryl ester transfer protein-transgenic mice. J Biochem Mol Biol. 2002; 35(2):172-177.
【非特許文献２】Hirano R, Igarashi O, Kondo K, Itakura H, Matsumoto A. Regulation by long-chain fatty acids of the expression of cholesteryl ester transfer protein in HepG2 cell. Lipids. 2010;36(4):401-6.
【非特許文献３】Goff WL, Guerin M, Petit L, Chapman MJ, Thillet J. Regulation of human CETP gene expression: role of SP1 and SP3 transcription factors at promoter sites -690, -692, and -37. J Lipid Res. 2003;44(7):1322-1331.
【非特許文献４】Klerkx AH, El Harchaoui K, van der Steeg WA, Boekholdt SM, Stroes ES, Kastelein JJ, Kuivenhoven JA. Cholesterol ester transfer protein (CETP) inhibition beyond raising high-density lipoprotein cholesterol levels: Pathways by which modulation of CETP activity may alter atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26(4):706-15.
【非特許文献５】Barter PJ, Brewer BH. Chapman MJ, Hennekens, CH, Rader DJ, Tall AR. Cholesterol ester transfer protein, a novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerotic. Atherioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:160-167.
【非特許文献６】Shah PK. Inhibition of CETP as a novel therapeutic strategy for reducing the risk of atherosclerotic disease. Eur Heart J. 2007. 28:5-12.
【非特許文献７】Fusegawa Y, Kelley KL, Sawyer JK, Shah RN, Rudel LL. Influence of dietary fatty acid composition on the relationship between CETP activity and plasma lipoprotein in monkeys. J Lipid Res. 2001;42(11):1849-57.
【非特許文献８】Liu K, Ou J, Saku K, Jimi S, Via DP, Sparrow JT, Zhang B, Pownall HJ, Smith LC, Arakawa K. Efficient nuclear delivery of antisense oligodeoxynucleotides and selective inhibition of CETP expression by Apo E peptide in a human CETP-stably transfected CHO cell line. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999;19:2207-2213.
【非特許文献９】Buchko GW, Rozek A, Kanda P, Kennedy MA, Cushley RJ. Structural studies of a baboon (Papio sp.) plasma protein inhibitor of cholesteryl ester transferase. Protein Sci. 2000;9:1548-1558.
【非特許文献１０】Tall AR. CETP inhibitors to increase HDL cholesterol levels. N Eng J Med. 2007;356:1364-1366.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明において、薬用植物のひとつであるファレリア・マクロカルパの抽出方法および使用を教示する。ファレリア・マクロカルパ（地域によってはmahkota dewaとして知られる）はインドネシア在来植物であり、通常は庭で鑑賞植物として、また庭園で陰生植物としてみられる。意外なことに、この植物はそれの幹、生の果実、または葉を利用することにより、ＣＥＴＰ阻害剤として使用できる。本発明以前には、本発明において主張するＣＥＴＰ阻害剤としてのファレリア・マクロカルパ抽出物の使用または有益性を説明する研究はなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明が提示する目的および／または解決策を好ましい態様に述べる。示した態様は本発明を理解するためのものであって、本発明の実施から知ることができる変更および／または組合わせおよび／または改変した他の態様の可能性を制限するものではない。本発明において教示される目的および／または解決策は、特許請求の範囲に詳述する要素および組合わせから理解されるであろう。
【０００７】
解決策を得るために、本発明の目的に従って、本明細書中の態様に説明しかつおおまかに記載するように、本発明の第１観点は、有機溶媒中への抽出により調製されるファレリア・マクロカルパ抽出物であって、コレステロールエステルトランスフェラーゼタンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤として効果的に作用するものに関する。
【０００８】
本発明の第２観点は、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させ、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるのに有効な量または用量の、単一有効成分としての、または組み合わせた、ファレリア・マクロカルパの抽出物またはそれの画分（単数または複数）もしくはそれの化合物群に関する。
【０００９】
本発明の第３観点は、ＣＥＴＰ阻害剤（これに限定されない）として機能する、下記のものを含む医薬組成物に関する：（１）有効な量または用量の、単一有効成分としての、または組み合わせた、ファレリア・マクロカルパの抽出物またはそれの画分（単数または複数）、および（２）医薬的に許容できる生理的に適したキャリヤー（単数または複数）、賦形剤（単数または複数）または添加剤（単数または複数）。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の図面の説明を以下に記載する。
【図１】図Ｎｏ．１は、０〜１００μｇ／ｍｌの濃度のＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ遺伝子発現レベルに及ぼす作用を示す図である。
【図２】図Ｎｏ．２は、ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ活性にタンパク質レベルで及ぼす作用を示す図である。
【図３】図Ｎｏ．３は、ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰおよびＡｐｏＡ−１にタンパク質レベルで及ぼす作用を示すウェスタンブロット分析の結果としてのタンパク質バンドである。
【図４】図Ｎｏ．４は、ＤＬＢＳ１４４９処理が、ＣＥＴＰ転写調節プロセスに関与するＬＸＲ−αおよびＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。
【図５】図Ｎｏ．５は、ＤＬＢＳ１４４９処理が、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）プロセスに関与するＬＤＬ−Ｒ、ＳＲ−Ｂ１およびＡｐｏＢ遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。
【図６】図Ｎｏ．６は、ＤＬＢＳ１４４９がＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。
【図７】図Ｎｏ．７は、ＤＬＢＳ１４４９がＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。
【図８】図Ｎｏ．８は、不飽和脂肪酸であるアラキドン酸およびリノール酸ならびにそれらとＤＬＢＳ１４４９の組合わせがＣＥＴＰ遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
例を挙げることにより本発明を詳細に考察するが、提示した例に本発明の範囲を限定するものではない。
【００１２】
本発明の教示による抽出物および／または画分は、ファレリア・マクロカルパから得られる。ＤＬＢＳ１４４９の抽出方法およびＣＥＴＰ阻害剤としての効果を本明細書に記載する。
【実施例】
【００１３】
Ａ．ファレリア・マクロカルパの抽出方法
本発明は、ＣＥＴＰ阻害剤としての活性をもつ抽出物を得ることができる、ファレリア・マクロカルパの抽出方法を教示する。本発明において教示する抽出方法は、有機溶媒による浸軟(maceration)および／またはパーコレーション方式を採用する。ファレリア・マクロカルパの乾燥片、好ましくはそれの生の果実を、原料の重量の８〜１２倍量の有機溶媒で抽出し、および／または１０〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃の温度の抽出器内でパーコレーションした。このプロセスに用いた有機溶媒はアルコール類であるがこれらに限定されず、これにはメタノールおよびエタノールが含まれるがこれらに限定されない；これらは無水状態のもの（９６％）、または希釈剤としての水を含むものであり、多様な比較において好ましい有機溶媒濃度は７０〜９６％であった。抽出プロセスを、６０ｒｐｍで撹拌しながら２〜６時間（または調節可能）続けた。抽出液を濾過によりパルプから分離した。乾燥抽出物を得るために、抽出液を回転式蒸発器により４０〜８０℃の温度および７０〜５５０ｍｂａｒの圧力範囲（または調節可能）で蒸発させた。さらに、濃縮物を真空オーブンで２〜４時間乾燥させて、乾燥抽出物を得た。この乾燥抽出物は、本発明の目的に関してＤＬＢＳ１４４９と呼ばれる。
【００１４】
本発明において教示する方法により得られたＤＬＢＳ１４４９をさらに特性分析し、その結果は、ＤＬＢＳ１４４９が、特定の生物学的作用をもたらすことができる、少なくとも、脂肪酸、サポニンおよびフェノールの化合物群（単数または複数）、ならびに他の二次代謝産物、またはそれらの組合わせを含むことを示した。さらにまた、ＤＬＢＳ１４４９を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法で定量同定した。このＴＬＣ法には、固定相としてのシリカゲルプレートおよび移動相としてのクロロホルム：メタノール（１０：１）を用いた。このＴＬＣ結果は、ＤＬＢＳ１４４９が特定の生物活性をもつＲｆ  ０．１６〜０．３５の化合物群（単数または複数）を含有することを示し、これについて本明細書中でさらに記載する。
【００１５】
Ｂ．ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰの発現および活性に及ぼす作用
本発明に用いた細胞培養物はヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２であり、ＣＥＴＰは大部分がその肝細胞において合成される。細胞は、１０％の血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加した、最小必須アルファ培地で培養されていた。それらの細胞を次いで３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【００１６】
方法
インビトロでＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ遺伝子発現に及ぼす作用
ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートで７０％の細胞密度に達するまで培養した。次いで無血清培地を用いて培地交換を行ない、次いで２４時間インキュベートした。それらの細胞を次いで０（対照）、２５、５０、７５および１００μｇ／ｍｌの濃度のＤＬＢＳ１４４９で２４時間処理した。
【００１７】
ＲＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲ
ＤＬＢＳ１４４９で処理したＨｅｐＧ２細胞の総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ溶液を用いてその溶液から得られる操作に従って単離した。次いでＮａｎｏＤｒｏｐ機器を用いて総ＲＮＡを測定し、電気泳動法で視覚化した。さらに、良好な品質をもつＲＮＡを使用し、ＰＣＲサーモサイクラー機器を最適化した特定条件で用いるＲＴ−ＰＣＲ法により、ｃＤＮＡを合成した。
【００１８】
ＣＥＴＰ活性の測定
この測定は、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、キットから得られるマニュアルに従って実施された。用いたＤＬＢＳ１４４９の濃度は０、２５、５０、７５および１００μｇ／ｍｌであり、三重試験法で行われ、ＣＥＴＰを添加しない同じＤＬＢＳ１４４９試料を対照として用いた。
【００１９】
結果と考察
ＰＣＲを用いた試験により、ＤＬＢＳ１４４９はＣＥＴＰ遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで低下させことができるということが示された。ＣＥＴＰ遺伝子発現の低下は、ＤＬＢＳ１４４９の投与レベルが上昇するのに伴って増大する（図１）。ＣＥＴＰ遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで低下させるほか、図２に示すようにＤＬＢＳ１４４９はタンパク質レベルでのＣＥＴＰ活性の阻害剤としての能力も備えている。この阻害活性は用量依存性である。先の研究で、ＣＥＴＰ阻害はＨＤＬコレステロールレベルを上昇させるための方策のひとつであると主張されている５，６。ＣＥＴＰの欠損はＨＤＬからＶＬＤＬおよびＬＤＬコレステロールへのコレステロールエステル輸送プロセスを阻害し、したがってＶＬＤＬおよびＬＤＬ粒子の形成が低下し、ＨＤＬレベルが上昇する。ＨＤＬコレステロールの量が増加したこの状態は抗アテローム形成性をもたらし、これは動脈壁におけるアテローム形成または斑の阻害と関係する６。したがって、ＤＬＢＳ１４４９は、本発明において教示するようにＣＥＴＰの発現および活性を阻害することにより血中のＨＤＬコレステロールレベルを上昇させ、ＬＤＬコレステロールレベル低下に伴ってアテローム硬化症の可能性を阻止することができると考えられる。コレステロールレベルの上昇をさらにインビボで分析した。
【００２０】
Ｃ．インビボでＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ活性、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロールならびにトリグリセリドのレベルに及ぼす作用
ＤＬＢＳ１４４９投与がＣＥＴＰ活性、ＨＤＬ、ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドのレベルに及ぼす作用を確認するために、雄ニュージーランドシロウサギにおいてインビボ試験を実施した。
【００２１】
方法
実験動物を２グループに配属した：対照グループ、およびＤＬＢＳ１４４９で処理した処理グループ。対照グループのウサギはＤＬＢＳ１４４９で処理されず、他方で、処理グループのウサギには３５ｍｇ／１，５ｋｇ体重の用量のＤＬＢＳ１４４９を経口投与した。ＤＬＢＳ１４４９をウサギに４週間投与した。ＣＥＴＰ活性、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロールならびにトリグリセリドのレベルの測定を、抽出物投与の前と後に実施した。用いた試料は、各ウサギの耳から採取した血漿であった。測定はそれぞれの有効性パラメーターに特異的なキットを用いて実施された。
【００２２】
結果と考察
表２に示すように、試験結果は、ウサギに対する４週間のＤＬＢＳ１４４９処理がＣＥＴＰ活性を０．３％低下させ、一方で対照グループではＣＥＴＰ活性が５．１３％増大したことを示した。低下はＬＤＬコレステロールについてもみられ、処理グループにおける低下は６．８％であり、これは対照グループにおける３．２％の低下より高かった。表２において、対照ウサギのＨＤＬコレステロールレベルが１３．３％低下し、他方で、処理したウサギではそれが１５．９％上昇したことも分かる。さらに、各実験動物グループにおけるトリグリセリドレベルが上昇したことが認められたが、処理グループにおける上昇は対照グループのものより低かった：それぞれ３．５％および１６．５％。
【００２３】
その結果は、ＤＬＢＳ１４４９がウサギの血中コレステロールレベルを効果的に制御でき、その際、ＨＤＬレベルが上昇し、ＣＥＴＰ活性ならびにＬＤＬおよびトリグリセリドのレベルが低下したことを示した。このインビボ試験結果はインビトロ試験結果と一致し、ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ阻害剤として作用できることを示す。
【００２４】
表１．実験ウサギにおける種々の有効性パラメーターの特性および初期レベル
【００２５】
【表１】
2014512378.tif 000003
【００２６】
表２．ＤＬＢＳ１４４９抽出物で処理したウサギおよび処理しなかったウサギにおける、ＣＥＴＰ活性、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロールならびにトリグリセリドのレベルなど種々の有効性パラメーターの初期レベルに対する変化率
【００２７】
【表２】
2014512378.tif 000004
【００２８】
Ｄ．ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰおよびＡｐｏＡ−１にタンパク質レベルで及ぼす作用
ＨｅｐＧ２細胞をフラスコＴ−７５内で７０％の細胞密度に達するまで培養した。次いで増殖培地を無血清培地と交換し、２４時間インキュベートすると、細胞密度は８０〜９０％に達した。次いで細胞を０、５０および１００μｇ／ｍｌのＤＬＢＳ１４４９で処理した。
【００２９】
方法
細胞外タンパク質の単離
処理した培地を採集し、タンパク質をそれらの分子量に基づいて分離できる膜を備えた遠心チューブを用いて、初期体積の１０倍濃縮した。この場合、用いた膜は１０ｋＤａより大きな分子量をもつタンパク質とそれ以下のものとを分離できる膜であった。この分離は、５０００ｒｐｍで１５分間の遠心により実施された。採集したタンパク質は、１０ｋＤａより大きな分子量をもつタンパク質であった。次いで、ブラッドフォード(Bradford)法を用いて濃縮培地のタンパク質濃度をアッセイした。
【００３０】
ウェスタンブロット法を用いたＣＥＴＰおよびＡｐｏＡ−１タンパク質のアッセイ
単離したタンパク質を、次いで１０％アクリルアミドを含有するゲルを用いてそれの分子量に従って分離した。このＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動プロセスを１００Ｖの電圧で１５０分間実施した。ゲル中のタンパク質を、５００ｍＡで作動するブロッティングキットにより７５分間、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜へ転移させた。転移プロセスの後、膜をブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ−ｔ緩衝液中の５％スキムミルク）と共に２時間インキュベートした。次いで、ヒトＡｐｏＡ−１およびＣＥＴＰタンパク質を認識するポリクローナル抗体と共に、膜を一夜インキュベートした。内部対照として、チューブリンタンパク質を認識するポリクローナル抗体を用いた。次いで、先にＡｐｏＡ−１およびＣＥＴＰタンパク質に結合したポリクローナル抗体を認識してそれに結合する二次抗体と共にインキュベートしながらプロセスを続けた。このインキュベーションプロセスを２時間実施した。次いで、膜にルミノール試薬を付与した。二次抗体はルミノール試薬中の基質を分解して発光を生じ、これを暗室で感光紙上に検出することができた。
【００３１】
結果と考察
ウェスタンブロットの結果は、ＤＬＢＳ１４４９がＨｅｐＧ２細胞により培地に排出されるＣＥＴＰタンパク質を減少させることができることを示した。それは図３にみることができ、その際、ＣＥＴＰタンパク質バンドはＤＬＢＳ１４４９濃度の上昇に伴って薄くなった。この結果は、ｍＲＮＡレベルでのＣＥＴＰ発現の低下を示した図１の結果と一致した。発現低下が大きくなるほど、タンパク質の産生量は少なくなるであろう。
【００３２】
インビボ試験結果から、ＨＤＬコレステロールのレベルはＤＬＢＳ１４４９処理後に上昇することが認められた。したがって、ウェスタンブロットアッセイをＡｐｏＡ−１についても実施した；このタンパク質はＨＤＬ粒子の主要部分である。図３は、ＡｐｏＡ−１タンパク質の量が特に１００μｇ／ｍｌの濃度で増大したことを示す。この結果は、ＨＤＬコレステロールの量の増加が細胞により合成されるＡｐｏＡ−１タンパク質のレベルの上昇の結果であることを明らかにする。ＨＤＬ血漿は、コレステロールを末梢組織から肝臓中のコレステロールエステルへ輸送して胆汁酸として排出することにより、アテローム硬化症に対して防御する。この経路の第１段階は、ＡｐｏＡ−１がコレステロールを受容してそれをＨＤＬへ渡すことである１１。したがって、ＡｐｏＡ−１の増加は、アテローム硬化症の予防において重要な役割を果たすＨＤＬコレステロールレベルを上昇させる際の最も重要な要因のひとつである。
【００３３】
Ｅ．ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ転写プロセス、コレステロール輸送および血圧に及ぼす作用
方法
この遺伝子分析には、種々の濃度のＤＬＢＳ１４４９で処理したＨｅｐＧ２細胞を用いた。ＨｅｐＧ２細胞からＲＮＡを単離し、次いで定量リアルタイムＰＣＲ法を用いて分析した；その際、各遺伝子の発現（ＬＸＲ−α、ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲ−Ｂ１、ＬＤＬ−Ｒ、ＡｐｏＢ、ＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１）を、内部対照遺伝子としてのアクチン遺伝子の発現に対して正規化した。この方法には各遺伝子に対して特異的なプライマーおよびアニーリング温度を用いた。この方法の結果は、リアルタイムＰＣＲ機器のソフトウェアによって相対発現計数法を用いて直接に示された。
【００３４】
結果と考察
ＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ転写を調節する遺伝子の発現に及ぼす作用
ＣＥＴＰ転写は、それのプロモーターに作用する調節遺伝子により調節されている。この実験では、そのプロセスに作用する遺伝子に肝Ｘ受容体アルファ（ＬＸＲ−α）およびステロール調節エレメント結合タンパク質−１（ＳＲＥＢＰ−１）が含まれることを調べた。図４にみられるように、ＤＬＢＳ１４４９処理は両遺伝子の発現を低下させる。
【００３５】
ＬＸＲ−αは、ＣＥＴＰ転写を誘導し、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）プロセスを維持する核内受容体である１２。この遺伝子はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に結合するとヘテロ二量体を形成し、この複合体は体内のコレステロールレベルの調節において重要な役割をもつ。肝臓において、ＬＸＲ−αはＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現を誘導することによりコレステロール代謝を仲介する。したがって、ＬＸＲ−α遺伝子の減少は、この実験に示されるようにＳＲＥＢＰ−１遺伝子の減少をも引き起こすであろう。
【００３６】
ＳＲＥＢＰ−１は他の遺伝子（そのひとつがＣＥＴＰである）を活性化することによりコレステロール合成を調節する転写因子である。ＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現の低下はさらに、ＣＥＴＰ遺伝子発現の低下の指標となる。その相関性は、小胞体の過剰量のコレステロールが肝臓へ分配されることと関係する負のフィードバックシステムを表わす１１。先に調べたＣＥＴＰ発現の低下は、体内のＣＥＴＰ遺伝子自体の阻害または低下をもたらすそのＣＥＴＰ転写因子発現の低下と一致する。本発明は、ＣＥＴＰをそれの転写レベルとそれのタンパク質レベルで阻害することによりＤＬＢＳ１４４９がコレステロールレベルを制御していることを明瞭に示す。
【００３７】
ＤＬＢＳ１４４９がコレステロール輸送プロセスに関与する遺伝子の発現に及ぼす作用
ＤＬＢＳ１４４９は、ＣＥＴＰに対するそれの作用のほかに、体内でのコレステロール代謝に関係する他の遺伝子にも作用すると考えられる。この例では、ＤＬＢＳ１４４９がコレステロール分布に及ぼす作用およびそれの構成遺伝子に対するそれの作用をさらに調べた。コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）には、細胞から動脈壁へのコレステロール輸送、血漿を介した肝臓へのコレステロール分配、および胆汁を介した排出プロセスが含まれる。このプロセスは、そのコレステロール輸送を促進する遺伝子に関係する６。それらの遺伝子には、スカベンジャー受容体クラスＢタイプ１（ＳＲ−Ｂ１）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）、アポリポタンパク質−Ｂ（ＡｐｏＢ）が含まれる。
【００３８】
この実験の結果は、コレステロール輸送において役割を果たす遺伝子のレベルをＤＬＢＳ１４４９が制御できることを示した。図５において、ＳＲ−Ｂ１遺伝子、すなわちＨＤＬコレステロール受容体の発現は投与量の増加（２５〜１００μｇ／ｍｌ）に伴って低下し、一方でＬＤＬ−Ｒ遺伝子はそれの遺伝子発現が増大したことが分かる。このＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現は５０μｇ／ｍｌのＤＬＢＳ１４４９で最高の増大を示し、それは対照発現の場合の３．４倍であった；一方、より高い濃度のＤＬＢＳ１４４９、すなわち７５および１００μｇ／ｍｌでは、遺伝子発現はやはり増大しているけれどもより低いレベルであり、対照の場合と比較してそれぞれ２．６および１．５倍であった（図５）。そのほか、図５において、ＬＤＬコレステロール構成要素であるＡｐｏＢ遺伝子の発現は投与量の増加（２５〜１００μｇ／ｍｌ）に伴って低下した。
【００３９】
ＳＲ−Ｂ１遺伝子発現の低下は血中のＨＤＬコレステロールレベルに逆比例しており、したがってＨＤＬ代謝が低下して血中におけるＨＤＬコレステロールレベルの上昇が生じた。ＳＲ−Ｂ１はＬＤＬ代謝プロセスを仲介することにより作動することが知られているが、それは分解プロセスにおいては役割をもたず、ＨＤＬ成分として使われることもない１１，１３。そのほか、ＲＣＴプロセスを補助するＣＥＴＰ活性の低下はＳＲ−Ｂ１経路を介してＨＤＬ代謝を選択的に増大させることができることを示す幾つかの証拠が見いだされている。ＳＲ−Ｂ１遺伝子発現およびＣＥＴＰ活性の低下により、次いでＨＤＬコレステロールが増加する。他方で、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現が増大し、かつＡｐｏＢ遺伝子発現が低下する状態は、肝臓によるＬＤＬ受容体を介したＬＤＬコレステロール代謝が増大し、かつＡｐｏＢ遺伝子遺伝子により仲介される新たなＬＤＬ粒子合成がないことを示した。したがって、血中のコレステロールレベルは低下する。
【００４０】
ＤＬＢＳ１４４９がＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１に及ぼす作用
臨床試験相に入ったことがあるＣＥＴＰ阻害剤のひとつはトルセトラピブである。しかし、この薬物は、その薬物を摂取した患者の死亡数が高かったため臨床試験に合格できなかった。患者の死亡は血圧の上昇が原因であった。幾つかの文献から、それはヒトの血圧と関連するＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１の発現ならびにアルドステロンシンターゼの量の増大により起きたことが明らかになった。ＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１は、それぞれコルチゾールおよびアルドステロンの生合成の最終プロセスで作動する２種類の酵素である１４。同様な事象を避けるために、次いでＤＬＢＳ１４４９がＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子に及ぼす作用を分析した。この実験の結果は、ＤＬＢＳ１４４９がＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子発現を低下させることができることを示した。ＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子発現はＤＬＢＳ１４４９の用量が５０μｇ／ｍｌになるまで低下し、ＤＬＢＳ１４４９用量が１００μｇ／ｍｌになるまで見掛け上は一定であり（図６）、その際、低下は正常状態の６０％に達した。そのほか、遺伝子発現の低下は最高１００μｇ／ｍｌのＤＬＢＳ１４４９で処理したＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子にもみられ、その際、低下は７５〜８０％に達した（図７）。したがって、本発明の教示によればＣＹＰ１１Ｂ２およびＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子発現の低下をもたらすＤＬＢＳ１４４９は、血圧を上昇させることなく安全にＣＥＴＰ阻害剤として使用できると結論される。
【００４１】
Ｆ．二重不飽和脂肪酸とＤＬＢＳ１４４９がＣＥＴＰ遺伝子発現に及ぼす併用効果
種々の鎖長および不飽和レベルをもつ脂肪酸が脂質代謝における酵素およびタンパク質の発現に対する作用をもつことが知られている。この実験では、二重不飽和脂肪酸およびそれとＤＬＢＳ１４４９の組合わせがＣＥＴＰ遺伝子発現に及ぼす作用も調べた。二重不飽和脂肪酸はＣＥＴＰ遺伝子発現を低下させることができることが知られている。この実験で用いた脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＡ）およびリノール酸（ＬＡ）であり、これらのタイプの脂肪酸は高い不飽和レベルをもち、ＣＥＴＰ遺伝子の減少に対して有意の効果をもつことが知られている。
【００４２】
方法
ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートで６０％の細胞密度に達するまで培養した。次いで、無血清培地を用いて培地交換を行ない、２４時間インキュベートした。次いでそれらの細胞を４種類の異なる処理法で処理した：３０μＭのアラキドン酸、３０μＭのリノール酸、アラキドン酸と７５μｇ／ｍｌのＤＬＢＳ１４４９の組合わせ、およびリノール酸と７５μｇ／ｍｌのＤＬＢＳ１４４９の組合わせ。これらの処理を２４時間実施した。
【００４３】
ＲＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲ
ＤＬＢＳ１４４９で処理したＨｅｐＧ２細胞の総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ溶液を用いてその溶液から得られる操作に従って単離した。次いでＮａｎｏＤｒｏｐ機器を用いて総ＲＮＡを測定し、電気泳動法で視覚化した。さらに、良好な品質をもつＲＮＡを使用し、ＰＣＲサーモサイクラー機器を最適化した特定条件で用いるＲＴ−ＰＣＲ法により、ｃＤＮＡを合成する。
【００４４】
結果と考察
３０μＭの濃度で、これら２種類の二重不飽和脂肪酸、アラキドン酸およびリノール酸はＣＥＴＰ遺伝子発現を低下させることができ、その際、リノール酸の方がより大きく低下させた（図８）。それらの不飽和脂肪酸を７５μｇ／ｍｌのＤＬＢＳ１４４９と組み合わせると、ＣＥＴＰ遺伝子発現の低下はより高くなった（図８）。リポタンパク質粒子中の脂肪酸の濃度はＣＥＴＰにより仲介されるコレステロールエステル輸送に影響を与え、低い濃度の脂肪酸はＣＥＴＰ活性を刺激して増大させ、他方で、脂肪酸濃度を最適レベルに上昇させるとＣＥＴＰ活性を阻害するであろう２。
【００４５】
ｍＲＮＡレベルについてのアッセイは、ＣＥＴＰタンパク質分泌プロセスにおける主要な決定因子である。この実験で、不飽和脂肪酸によってＣＥＴＰ発現がｍＲＮＡレベルで低下することが示された。ＣＥＴＰ発現の低下は、先の研究でみられたように、生成するＣＥＴＰ量にも影響を与える２。そのほか、本発明は不飽和脂肪酸とＤＬＢＳ１４４９の組合わせがＣＥＴＰ遺伝子発現に及ぼす作用も教示する。データは二重不飽和脂肪酸とＤＬＢＳ１４４９の間にＣＥＴＰ遺伝子発現における正の相関性があることを示し（図８）、ＤＬＢＳ１４４９の添加によってＣＥＴＰ遺伝子発現はより大きく低下した。
【００４６】
Ｇ．組成物、医薬製剤および栄養補助食品
本発明は、単独または組合わせの両方における、有効成分として有効な量または用量のＤＬＢＳ１４４９を含有する医薬組成物であって、医薬的に許容できる生理的に適したキャリヤー材料、賦形剤または添加剤を含有する医薬組成物を含む。
【００４７】
本発明において教示される医薬組成物を調製する方法において、有効成分ＤＬＢＳ１４４９を賦形剤（単数または複数）と混合し、もしくはそれに溶解し、またはキャリヤー（単数または複数）に混入し、それをカプセル、サッシェ、紙、および他の包装材料に入れた形態にすることができる。
【００４８】
医薬用として承認された賦形剤を溶媒として用いる場合、賦形剤は固体、半固体または液体（経口または注射）の形態であってよく、それは有効成分に対するキャリヤーまたは媒体として作用する。したがって、本発明による医薬組成物は、丸剤、カプセル剤、錠剤、散剤、サッシェ剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液剤、発泡錠、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、およびマウスウォッシュ、マッサージオイル、坐剤、または注射剤の形態で調製できる。そのほか、本発明によるＤＬＢＳ１４４９を含有する医薬組成物は、サプリメント、ビタミン剤、ならびに食品および飲料製品として調製することもできる。
【００４９】
適切な賦形剤の若干例は、微結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウムその他である。本発明の教示に適した配合物は、滑沢剤（たとえば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油）、湿潤剤、保存剤、甘味剤および着香剤を含有することもできる。
【００５０】
本発明による組成物は、患者にそのような用量を投与した後に有効成分を直接放出、持続放出または制御放出させる配合で、医薬業界で適用されている方法を用いて調製することができる。本発明による錠剤または丸剤は、コートして抽出物の半減期を延長し、これによりそれの使用頻度を減らすことができる。
【００５１】
錠剤などの固体剤形でこの組成物を配合する方法において、有効成分としてのＤＬＢＳ１４４９を賦形剤（単数または複数）と混合して、本発明による組成物から均一な混合物を含有する初期配合物を形成することができる。この初期配合物は、均一に分散した有効成分ＤＬＢＳ１４４９を含有する混合物であり、したがって適正な用量に従って、たとえばカプセル剤、錠剤または丸剤などの剤形に分配することができる。
【００５２】
本発明による錠剤または丸剤にさらに保護コートを付与して、組成物または有効物質ＤＬＢＳ１４４９からの苦味を抑制または隠蔽することができる。
【００５３】
本発明の教示による有効な濃度または用量のＤＬＢＳ１４４９は、その抽出物がＣＥＴＰ阻害剤として作用する濃度または用量である。有効濃度は、患者の身体状態（体重、年齢、その他の要因を含む）；ならびに癌細胞のタイプ、サイズおよび個数、ならびに目標とする他の病理学的状態に依存する。液体剤形、たとえば薬用植物配合物からの飲料は、有効成分ＤＬＢＳ１４４９を、水、または他の界面活性剤、たとえばヒドロキシプロピルセルロース、または他の適合性材料と混合することにより調製できる。
【００５４】
薬用植物配合物においてシロップ剤形を調製するためには、前記に説明した飲料を調製するための材料などが必要である。ただし、シロップ調製には、他の成分（単数または複数）、たとえば増粘剤、安定剤その他が必要である。
【００５５】
半固体剤形、たとえばゼリー剤の調製は、有効成分ＤＬＢＳ１４４９を特定のヒドロコロイド、たとえばゼラチン、カラゲニン、ペクチン、アラビアゴム、グアーゴム、および／または他の材料と混合することにより実施できる。
【００５６】
固形食品状の薬用植物配合物、たとえばビスケット、パンおよびケーキの調製は、有効成分ＤＬＢＳ１４４９を身体の健康に対して重要な効果をもつ成分として用いて実施できる。本発明の教示による固形食品、たとえばビスケット、パンおよびケーキの調製は、一般的な調製法に従い、バター、砂糖、卵、食塩、および他の補助材料などの材料を用いて実施できる。
【００５７】
Ｈ．産業上の利用
ＤＬＢＳ１４４９の抽出物または医薬組成物は産業的規模で調製でき、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させかつＬＤＬコレステロールレベルを低下させるためのＣＥＴＰ阻害剤としてそれを使用する際に、抽出物、乾燥粉末および／または医薬組成物の調製に際して、特に経口投与剤形は固体、半固体もしくは液体、または食品および飲料のいずれであってもよい。
【００５８】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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