(57)【要約】  放射線に曝露された又は放射線曝露の危険性がある被験体において放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防する方法であって、放射線に関連する副作用を軽減するのに有効な量の食用メラニン源を被験体に経口投与することを含む、方法及び組成物が提供される。
2014510104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線に曝露された又は放射線曝露の危険性がある被験体において放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防する方法であって、放射線に関連する副作用を軽減するのに有効な量の食用メラニン源を前記被験体に経口投与することを含む、方法。
【請求項２】
複数の被験体を死亡させる可能性が高い量の放射線に曝露された該複数の被験体の生存率を増大させる方法であって、前記複数の被験体を死亡させる可能性が高い量の放射線に曝露された該複数の被験体の生存率を増大させるのに有効な量の食用メラニン源を、該複数の被験体の各々に経口投与することを含む、方法。
【請求項３】
前記被験体（単数又は複数）に、該被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８ｍｇの精製メラニンに相当する量のメラニンを投与する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記メラニンを、メラニンが乾燥重量の少なくとも１０％を占めるメラニン含有生物源から単離若しくは誘導するか、又は乾燥重量で少なくとも１０％のメラニンを含むメラニン含有生物源を投与することによってメラニンを供給する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物源がメラニンを含有する植物、細胞、真菌又は微生物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物源をメラニン前駆体の存在下で成長させる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記メラニン前駆体が、Ｌ−ドーパ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、Ｄ−ドーパ、カテコール、５−ヒドロキシインドール、チラミン、ドーパミン、チロシン、システイン、ｍ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、４−アミノカテコール、２−ヒドロキシル−１，４−ナフタキノン、４−メチルカテコール、３，４−ジヒドロキシナフタレン、没食子酸、レゾルシノール、２−クロロアニリン、ｐ−クロロアニソール、２−アミノ−ｐ−クレゾール、４，５−ジヒドロキシナフタレン、１，８−ジヒドロキシナフタレン、２，７−ジスルホン酸、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール及びｐ−クレゾールの１つ又は複数である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記真菌がメラニン含有キノコである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記真菌がアウリクラリア・アウリクラ・ユダエである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８０ｍｇの食用物質中でメラニンを投与する、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８０ｍｇの乾燥キノコとしてメラニンを投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体の内臓器官が放射線から防護される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記防護される器官が、骨髄、肝臓、脾臓、腎臓、肺及び胃腸管からなる群から選択される１つ又は複数の器官である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記放射線に関連する副作用が急性悪心、嘔吐、腹痛、下痢、眩暈、頭痛、発熱、皮膚放射線症候群、低血球数、白血球減少による感染、血小板減少による出血、赤血球減少による貧血、又は死亡の１つ又は複数である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
放射線への曝露後の前記被験体の生存可能性が増大する、請求項１又は３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体が受ける放射線量が、放射線防護の非存在下で該被験体にとって致死的である、請求項１又は３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記放射線が電離放射線を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記放射線がγ放射線、ｘ線放射線、太陽放射線、宇宙放射線、電磁放射線、制動放射線、紫外放射線及び微粒子放射線の１つ又は複数を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記放射線が人為的な放射線源に由来する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記放射線源が、疾患の治療に用いられるラジオセラピー、医療用撮像装置からの放射線、放射線手術、核兵器、原子炉に用いられる放射線、高空放射線である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記放射線源が原子力発電所によるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記食用メラニン源が、前記被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための該被験体への経口投与用にパッケージングされた飲用メラニン懸濁液を含み、該飲用メラニン懸濁液が少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
１つ又は複数の抗生物質を前記被験体（単数又は複数）に投与することを更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための該被験体への経口投与用にパッケージングされた食用メラニン源であって、該被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８ｍｇの精製メラニンに相当する量のメラニンを供給する、食用メラニン源。
【請求項２５】
被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための該被験体への経口投与用にパッケージングされた飲用メラニン懸濁液であって、少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む、飲用メラニン懸濁液。
【請求項２６】
少なくとも１００ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む、請求項２５に記載の飲用メラニン懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電離放射線等の放射線への曝露に伴う副作用を軽減するための経口投与用のメラニン含有物質、例えば黒色キノコベースの栄養補助食品の使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年３月１８日付で出願された米国仮出願第６１／４５４，２４２号（その内容が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の利益を主張するものである。
【０００３】
［政府支援の陳述］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ５１５１９、ＡＩ０８７６２５、ＡＩ５２７３３−０７及びＳ１０ＲＲ０２７３０８による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
本願全体を通して、様々な刊行物が括弧内で言及される。それらの参考文献の完全な引用は、本明細書の最後の特許請求の範囲の直前に見ることができる。それらの刊行物の開示は、本願が関連する技術分野をより完全に説明するように、全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００５】
メラニンは、自然界に偏在し、様々な生物学的機能を有する高分子量色素である（５）。メラニンは全生物界に見られる。この色素は、最も安定で、不溶性で、耐性のある生体物質である（６）。メラニンは、生合成経路及び前駆体分子に応じて異なる構造を有し得る。メラニンの定義の一部は、規定の構造ではなく、メラニンの化学的特性及び物理的特性に重点を置いている（７）。メラニンは、実験室内で化学的手段又は多くの生物によって合成することができる。フェノール化合物の酸化重合によって形成されたメラニンは、通常は暗褐色又は黒色である（６）。しかしながら、ドーパミンに由来するメラニンが赤褐色であるという所見によって説明されるように、メラニンは他の色を有する場合もある。真菌は、前駆体１，８−ジヒドロキシナフタレン（ＤＨＮメラニン）、又はジヒドロキシフェニルアラニンのような好適なチロシン誘導体の酸化（ＤＯＰＡ−メラニン）を用いる少なくとも２つの主要生合成経路によりメラニンを生成することができる（６）。真菌のクリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）は、ラッカーゼ酵素によって酸化される多様なフェノール化合物からメラニンを生成することができる（８〜１０）。多くの真菌がメラニンを構成的に合成する（１１）。
【０００６】
米国では毎年１４０万人ががんと診断され、その半数が疾患の経過中に何らかの放射線療法を受けている。放射線防護化合物が利用可能となれば、放射線曝露に関連する死亡率が軽減し得る。また、放射線診断法の際に何百万もの患者が受ける線量は非常に高く（マルチスライス心臓ＣＴスキャンの線量は、３００回の胸部Ｘ線による線量に等しい）、同様に大いに懸念されている。このため、かかる患者も安価かつ有効な放射線防護剤によって利益を得る。原発事故又はテロ攻撃の際に容易に利用可能な放射線防護剤を提供することは公共の安全にとっても重要である。
【０００７】
放射線曝露の前に、又は更にはその際中に与えることができる放射線防護剤は、電離放射線への曝露に関連する副作用を軽減する点で重要な価値があり得る。現在、ＦＤＡに認可された放射線防護剤は存在しない。放射線防護薬の非存在下でのニッチを埋めることができる栄養補助食品を利用することは、何億もの人々にとって極めて有益であり得る。
【０００８】
真菌メラニンは、高エネルギー電磁放射線を捕獲し、それを真菌細胞にとって有用なエネルギー形態に転換することが可能なエネルギー変換分子として機能し得る（１）。さらに、真菌メラニンは放射線に対する有効な遮蔽であり得る。メラニンによる放射線防護の有効性は、その化学組成及び空間配置に依存する（２）。反応性フリーラジカル捕捉に加えて、メラニンによる放射線防護は、反跳電子の運動エネルギーがその色素中に存在する安定なフリーラジカルによって捕獲されるのに十分なほど低くなるまで、π電子が豊富なメラニンにより反跳電子エネルギーが段階的に散逸することによる、コンプトン反跳電子によるフリーラジカル発生の防止を伴う（３）。メラニンベースのナノ粒子が、外部全身放射線照射又は放射免疫療法に供したマウスにおいて骨髄を防護することも示されている（４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、メラニンベースの生成物を用いることで、放射線曝露の危険性があるヒトにおける放射線防護体の必要性に応える。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、放射線に曝露された又は放射線曝露の危険性がある被験体において放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防する方法であって、放射線に関連する副作用を軽減するのに有効な量の食用メラニン源を被験体に経口投与することを含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明は、複数の被験体を死亡させる可能性が高い量の放射線に曝露された複数の被験体の生存率を増大させる方法であって、複数の被験体を死亡させる可能性が高い量の放射線に曝露された複数の被験体の生存率を増大させるのに有効な量の食用メラニン源を、複数の被験体の各々に経口投与することを含む、方法も提供する。
【００１２】
本発明は、被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための被験体への経口投与用にパッケージングされた食用メラニン源であって、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８ｍｇの精製メラニンに相当する量のメラニンを供給する、食用メラニン源も提供する。
【００１３】
本発明は、被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための被験体への経口投与用にパッケージングされた飲用メラニン懸濁液であって、５００ｍＬ以下の容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む、飲用メラニン懸濁液も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】９Ｇｙの全身放射線量の前に合成フェオメラニンを与えたＣＤ１マウスの生存を示す図である。９Ｇｙの全身線量を与える３時間前に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の合成フェオメラニンに続く５日間の抗生物質補助、又はＰＢＳに続く５日間の抗生物質補助、又はＰＢＳ単独を経口強制飼養によって与えた。ＡＢ−抗生物質補助。１群当たり１０匹のマウスを使用した。フェオメラニン群の生存をＰＢＳ群及びＰＢＳ＋抗生物質群と比較すると、Ｐ値はそれぞれ０．００１及び０．００２であった。
【図２】９Ｇｙの全身放射線量後のＣＤ１マウスの生存を示す図である。９Ｇｙの全身線量を与える３時間前に、マウスにＰＢＳに懸濁した１ｇ／ｋｇ（体重）のアウリクラ・ユダエキノコ、又は１ｇ／ｋｇ（体重）のアウリクラ・ユダエキノコに続く５日間の抗生物質補助、又はＰＢＳに続く５日間の抗生物質補助、又はＰＢＳ単独を経口強制飼養によって与えた。ＰＢＳ単独群及びＰＢＳ＋抗生物質補助群のマウスは５匹であり、キノコ群及びキノコ＋抗生物質群のマウスは６匹であった。ＰＢＳ単独対照及びＰＢＳ＋抗生物質対照と比較して、キノコ及びキノコ＋抗生物質のどちらについてもＰ値は０．０１５であった。Ａｂ−抗生物質補助、Ｍｕｍ−キノコ。
【図３】様々な供給源に由来するメラニンの化学組成及びメラニンの外観、並びに研究に使用したキノコを示す図である：ａ）ユーメラニンオリゴマーの構造；ｂ）フェオメラニンオリゴマーの構造；ｃ）精製微生物メラニン（メラニン「ゴースト（ghosts）」）の電子顕微鏡写真；ｄ）合成メラニン−ユーメラニン（黒色）（左側）及びフェオメラニン（褐色）（右側）；ｅ）研究に使用した食用キノコ−ボレタス・エデュリス（Boletus edulis）（白色キノコ）（左側）及びアウリクラリア・アウリクラ・ユダエ（黒色キノコ）（右側）。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｇ    黒色キノコ及び白色キノコの物理化学的特性化を示す図である：ａ、ｂ）乾燥キノコのＥＰＲ：ａ）黒色キノコ；ｂ）白色キノコ；ｃ〜ｅ）黒色キノコから精製したメラニンの酸化的ＨＰＬＣ：ｃ）バックグラウンド溶液；ｄ）８分で溶出するＰＤＣＡ標準；ｅ）ＰＤＣＡピークを示す黒色キノコに由来するメラニン；ｆ、ｇ）抗酸化物質の存在についてのＤＰＰＨアッセイの結果：ｆ）ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）陽性対照；ｇ）黒色キノコ及び白色キノコからのメタノール抽出物。
【図４Ｂ】図４Ａの記載参照。
【図４Ｃ】図４Ａの記載参照。
【図４Ｄ】図４Ａの記載参照。
【図４Ｅ】図４Ａの記載参照。
【図４Ｆ】図４Ａの記載参照。
【図４Ｇ】図４Ａの記載参照。
【図５Ａ】黒色食用キノコを摂取させた照射ＣＤ−１マウスの生存、生存マウスにおける血球数、並びにＧＩ管及び骨髄の組織像を示す図である。マウスを５、６匹の群に分け、１ｇ／ｋｇ（体重）の黒色キノコのＰＢＳ懸濁液、又はＰＢＳ単独、又は１ｇ／ｋｇの白色キノコ懸濁液、又は１００ｍｇ／ｋｇの合成メラニンを添加した１ｇ／ｋｇの白色キノコ懸濁液を強制飼養針によって摂取させた。キノコ投与の１時間後、マウスに９Ｇｙ線量のＣｓ−１３７放射線を２．５Ｇｙ／分の線量率で照射した。ａ）カプラン・マイヤー生存曲線。実験は２回行い、４５日目に終了した；ｂ）白血球数；ｃ）血小板数；ｄ〜ｈ）対照マウス及び照射マウスに由来する組織のＨ＆Ｅ染色スライド。左、非照射対照；中央、黒色キノコ群；右、メラニンを添加した白色キノコ、ｄ）胃、倍率４００倍；ｅ）ＬＩ、倍率４００倍；ｆ）ＳＩ、倍率２００倍；ｇ）骨髄、倍率４００倍；ｈ）脾臓、倍率１００倍。
【図５Ｂ】図５Ａの記載参照。
【図５Ｃ】図５Ａの記載参照。
【図５Ｄ】図５Ａの記載参照。
【図５Ｅ】図５Ａの記載参照。
【図５Ｆ】図５Ａの記載参照。
【図５Ｇ】図５Ａの記載参照。
【図５Ｈ】図５Ａの記載参照。
【図６Ａ】種々の用量の合成フェオメラニン及び／又は抗生物質を摂取させ、９Ｇｙのγ放射線を２．５Ｇｙ／分で照射したＣＤ−１マウスにおける生存及び体重変化を示す図である：ａ）０ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）のフェオメラニンを摂取させたマウス；ｂ）１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニンに続いて抗生物質を５日間摂取させたマウス、又はＰＢＳのみを与えたマウス、又はＰＢＳに続いて抗生物質を５日間与えたマウス；ｃ）ａ）とｂ）とを合わせた結果；ｄ）線形回帰を用いてモデル化した照射群の体重変化。ＡＢ−抗生物質
【図６Ｂ】図６Ａの記載参照。
【図６Ｃ】図６Ａの記載参照。
【図６Ｄ】図６Ａの記載参照。
【図７Ａ】９Ｇｙのγ放射線を２．５Ｇｙ／分で照射した後の生存マウスにおける組織の組織学的評価を示す図である：ａ）胃、小腸、大腸、肝臓及び骨髄。マウスに１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン＋抗生物質（上段）；７５ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン（中段）；０ｍｇ／ｋｇ＋抗生物質（下段）を与えた；ｂ）１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン＋抗生物質を与えたマウスに由来する組織−小腸の限局性微小腺腫（左パネル）及び骨髄（右パネル）；ｃ）０ｍｇ／ｋｇ＋抗生物質群の唯一の生存マウスの盲腸。盲腸の同じ領域を左パネルに２５０倍、中央パネルに４００倍、右パネルに１０００倍の倍率で示す。各スライドはより高倍率の同じ領域である。ａ）及びｂ）の倍率４００倍。
【図７Ｂ】図７Ａの記載参照。
【図７Ｃ】図７Ａの記載参照。
【図８Ａ】非照射ＣＤ−１マウスにおける微生物ユーメラニン及び合成ユーメラニンの毒性評価を示す図である：ａ）１５ｍｇ／ｋｇの微生物ユーメラニン又は合成ユーメラニンを摂取させたマウスの体重；ｂ）微生物ユーメラニンを摂取させ、２４時間後に屠殺したＣＤ−１マウスに由来するＧＩ器官の組織像：左、胃；中央、小腸；右、結腸。原倍率４００倍。
【図８Ｂ】図８Ａの記載参照。
【図９】１５ｍｇ／ｋｇ（体重）の微生物ユーメラニン又は合成ユーメラニンを摂取させ、９Ｇｙのγ放射線を２．５Ｇｙ／分で照射したＣＤ−１マウスにおける放射線の影響を示す図である：（ａ〜ｆ）照射の４時間後（ａ〜ｃ）及び２４時間後（ｄ〜ｆ）に屠殺した照射ＣＤ−１マウスから得たＧＩ管組織の組織像：ａ）胃、合成ユーメラニン群；ｂ）胃、微生物ユーメラニン群；ｃ）胃、ＰＢＳ。微生物メラニンを摂取させたマウスの胃組織におけるアポトーシス細胞は、合成ユーメラニン群又はＰＢＳ群よりも少なかった；ｄ）結腸、合成ユーメラニン群；ｅ）結腸、微生物ユーメラニン群；ｆ）結腸、ＰＢＳ対照群；ｇ）ＣＤ−１マウスの累積体重減少；ｈ）照射マウスの生存。原倍率４００倍。
【図９Ｇ】図９の記載参照。
【図９Ｈ】図９の記載参照。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、放射線に曝露された又は放射線曝露の危険性がある被験体において放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減する方法であって、放射線に関連する副作用を軽減するのに有効な量の食用メラニン源を被験体に経口投与することを含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明は、複数の被験体を死亡させる可能性が高い量の放射線に曝露された複数の被験体の生存率を増大させる方法であって、複数の被験体を死亡させる可能性が高い量の放射線に曝露された複数の被験体の生存率を増大させるのに有効な量の食用メラニン源を、複数の被験体の各々に経口投与することを含む、方法も提供する。当業者には、複数の被験体を死亡させる可能性が高い放射線の量は文献から知られている。例えば、ヒトについては、急性全身放射線曝露によるヒトにおけるＬＤ５０／６０ｄ（すなわち、６０日間の曝露で５０％の死亡率を引き起こす線量）は、２５０ラド（２．５Ｇｙ）を超え、通常はおよそ４００ラド〜５００ラド（４Ｇｙ〜５Ｇｙ）である。
【００１７】
メラニンは、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８ｍｇの精製メラニンに相当する量で被験体に投与するのが好ましい。例えば、メラニンを、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８０ｍｇの食用物質（乾燥重量で少なくとも１０％のメラニンを含有する）中で投与することができる。例えば、メラニンを、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８０ｍｇの乾燥キノコ（乾燥重量で少なくとも１０％のメラニンを含有する）として投与することができる。一実施形態では、メラニンを飲用懸濁液の形態で投与する。一実施形態では、食用メラニン源は、被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための被験体への経口投与用にパッケージングされた飲用メラニン懸濁液を含み、該飲用懸濁液は少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む。
【００１８】
本発明は、被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための被験体への経口投与用にパッケージングされた食用メラニン源であって、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８ｍｇの精製メラニンに相当する量のメラニンを供給する、食用メラニン源も提供する。一実施形態では、食用メラニン源は、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ又は２０ｍｇの精製メラニンに相当する量のメラニンを供給する。
【００１９】
本発明は、被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための被験体への経口投与用にパッケージングされた飲用メラニン懸濁液であって、少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも２５０ｍｇのメラニンを含む、飲用メラニン懸濁液も提供する。一実施形態では、少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む。一実施形態では、飲用懸濁液は、少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも５６０ｍｇのメラニンを含む。一実施形態では、飲用懸濁液は少なくとも２５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、１２５ｍＬ、１５０ｍＬ、１７５ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ又は７５０ｍＬ中にメラニンを含む。一実施形態では、実質的に全てのメラニンが微粒子状であるか、又はより小さい。飲用懸濁液は生薬（galenical）であってもよい。
【００２０】
本発明は、飲用液体での希釈によって飲用懸濁液を作製するためのパッケージングされた粉末状のメラニンも提供する。粉末状のメラニンは、例えば小袋にパッケージングすることができる。一実施形態では、粉末状のメラニンは、少なくとも１０ｍＬ、２５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、１２５ｍＬ、１５０ｍＬ、１７５ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ又は７５０ｍＬでの再構成により、飲用懸濁液を飲む被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも８ｍｇの精製メラニンを供給する飲用懸濁液を可能にするように配合される。一実施形態では、粉末状のメラニンは、少なくとも１０ｍＬ、２５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、１２５ｍＬ、１５０ｍＬ、１７５ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ又は７５０ｍＬでの再構成により、少なくとも２５０ｍｇ、５００ｍｇ又は５６０ｍｇのメラニンを供給する飲用懸濁液を可能にするように配合される。
【００２１】
メラニンは、メラニンが乾燥重量の少なくとも１０％を占めるメラニン含有生物源から単離又は誘導することができる。メラニンは化学合成することもできる。乾燥重量で少なくとも１０％のメラニンを含むメラニン含有生物源を投与することによって、メラニンを供給することもできる。一実施形態では、メラニンは真菌物質を実質的に含まない組成である。
【００２２】
生物源は例えば、メラニンを含有する植物、細胞、真菌、又は細菌等の微生物であり得る。好ましい真菌としては、メラニン含有食用キノコ、例えばアウリクラリア・アウリクラ・ユダエ又はプレウロタス・シスチディオサス（Pleurotus cystidiosus）が挙げられる。化学メラニン源は、Ｌ−ドーパのような或る特定のフェノール化合物の自家重合又は触媒重合であり得る。
【００２３】
生物源はメラニン前駆体、例えばＬ−ドーパ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、Ｄ−ドーパ、カテコール、５−ヒドロキシインドール、チラミン、ドーパミン、チロシン、システイン、ｍ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、４−アミノカテコール、２−ヒドロキシル−１，４−ナフタキノン、４−メチルカテコール、３，４−ジヒドロキシナフタレン、没食子酸、レゾルシノール、２−クロロアニリン、ｐ−クロロアニソール、２−アミノ−ｐ−クレゾール、４，５−ジヒドロキシナフタレン、１，８−ジヒドロキシナフタレン、２，７−ジスルホン酸、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール及びｐ−クレゾール等の１つ又は複数の存在下で成長させることができる。
【００２４】
メラニンはアロメラニン、フェオメラニン及び／又はユーメラニンを含み得る。ユーメラニンは、前駆体のチロシンから誘導される。フェオメラニンは、前駆体のチロシン及びシステインから誘導される。アロメラニンは、カテコール及び１，８−ジヒドロキシナフタレン等の無窒素前駆体から形成される。一実施形態では、フェオメラニン対ユーメラニンの比率は少なくとも１：１である。メラニンは二価硫黄を含有するのが好ましい。
【００２５】
被験体の１つ又は複数の内臓器官が放射線から防護されるのが好ましい。好ましくは、防護される器官は骨髄、肝臓、脾臓、腎臓、肺及び胃腸管からなる群から選択される１つ又は複数の器官である。
【００２６】
放射線に関連する副作用は悪心、嘔吐、腹痛、下痢、眩暈、頭痛、発熱、皮膚放射線症候群、低血球数、白血球減少による感染、血小板減少による出血、赤血球減少による貧血、又は死亡の１つ又は複数であり得る。放射線への曝露後の被験体の生存可能性が増大するのが好ましい。一実施形態では、被験体が受ける放射線量は、放射線防護の非存在下で被験体にとって致死的であり得る。
【００２７】
被験体は任意の動物であり得る。被験体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００２８】
放射線は電離放射線を含み得る。電離放射線は、原子を電離させるのに十分に高エネルギーである。放射線は例えば、γ放射線、ｘ線放射線、制動放射線、紫外放射線及び微粒子放射線（例えば、α放射線及びβ放射線）の１つ又は複数であり得る。放射線源は医療用アイソトープであってもよい。好ましい実施形態では、電離放射線はγ放射線、α放射線又はβ放射線である。好ましい実施形態では、放射線は人為的な放射線源によるものである。例えば、放射線源は、疾患の治療（ラジオセラピー等）に用いられる放射線療法、医療用撮像装置（ＣＴスキャナー等）からの放射線、放射線手術（例えば定位放射線手術）、核兵器、若しくは発電所若しくは潜水艦内の原子炉等の原子炉に用いられる放射線、又は例えば民間飛行若しくは軍事飛行、若しくは宇宙飛行中に受ける高空放射線（high-altitude radiation）であり得る。一実施形態では、高空放射線は、２００００フィートを超える高度で受ける天然電離放射線である。放射線源はテロ攻撃に起因する場合もある。このため、人為的な放射線源は、天然放射性同位体に由来するが人為的な療法、電源又は装置に適用されるものを含み得る。
【００２９】
本発明によって利益を得ることが期待される被験体としては、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。がんと診断された米国内の患者（米国では年間１４０万人が診断される）の２人に１人が、疾患の経過中に何らかの放射線療法を受ける。利益を得る別の患者群は、ＣＴ（コンピューター断層撮影）スキャンを受ける患者である。米国では毎年７２００万回のＣＴスキャンが行われる。このスキャン（多くの場合、年に数回受けることが推奨される）の間に多くの患者が受ける高い放射線量について懸念が高まっている。１回の高分解能心臓マルチスライスＣＴスキャンによる線量は、およそ１００回〜６００回の胸部Ｘ線、又は自然バックグラウンド放射線の３年分超に相当する。本発明によって利益を得る可能性のある更に別の患者群は、動静脈奇形、良性脳腫瘍、及び三叉神経痛、本態性振戦及びパーキンソン振戦／強剛を含む機能障害等の病態に対して、いわゆる定位放射線手術（粒子ビーム（陽子）によって行われる）、又はコバルト６０ベース（光子）若しくは線形加速器ベースの放射線手術を受ける人々である。本発明によって利益を得る可能性のある付加的な被験体は、線量が放射線職業労働者に対する年限度を超えることが知られるフリークエントフライヤー及び航空機搭乗員、核医学及び放射線医学の専門家、原子力発電所及び原子炉の職員、並びに原子力潜水艦内の軍人、並びに放射線事故及びテロ攻撃の被害者である。
【００３０】
上記方法の一実施形態では、治療は、被曝被験体が長期にわたる慢性放射線曝露の結果としてがんを発症する可能性の低減をもたらす。
【００３１】
メラニンは、口当たりのよい液体に懸濁した乾燥黒色キノコの形態（「メラニンシェーキ（melanin shakes）」）で与えることができる。使用することができるキノコとしては、アウリクラリア・アウリクラ・ユダエ等の黒色食用キノコが挙げられる。アウリクラリア・アウリクラ・ユダエ等のキノコは、他の食用キノコのように湿気及び養分を与えて建物の地下室で成長させ、乾燥させ、粉末状にし、フレーバーウォーター又はフルーツジュースと混合することによって「メラニンシェーキ」に配合することができる。種々のフレーバーのシェーキを作製することができる。包装容器（packaging）は、例えば１００ｍＬ容の標準的な個別のジュースパックであり得る。メラニンは他の食用形態、例えばメラニンブラウニー（melanin brownies）で与えることもできる。代替的には、天然メラニン又は合成メラニンをそれぞれ単離又は合成し、食品に添加して、経口摂取に好適な製品を作製することができる。非限定的な実施形態では、黒色キノコに由来するメラニンを加工して、粒状又は粉末状にすることができる。一実施形態では、メラニンは、生体内でのメラニン産生（放射合成（radiosynthesis））を増大させるのに有効な量の放射線に曝露された真菌等の生物に由来する。一実施形態では、生物はメラニン前駆体の存在を含む条件下で成長させたものである。放射合成の方法及びメラニン前駆体の存在下で成長させる方法はどちらも、２００９年１２月３１日付で公開された米国特許出願公開第２００９−０３２８２５８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【００３２】
被験体の放射線への曝露に関連する１つ又は複数の副作用を軽減及び／又は予防するための被験体への経口投与用にパッケージングされた飲用メラニン懸濁液であって、少なくとも１０ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む、飲用メラニン懸濁液も提供される。一実施形態では、飲用懸濁液は、少なくとも１００ｍＬの容量中に少なくとも５００ｍｇのメラニンを含む。
【００３３】
一実施形態では、被験体は１０ｍＧｙ、２０ｍＧｙ、５０ｍＧｙ、１００ｍＧｙ、５００ｍＧｙ、１Ｇｙ、１．５Ｇｙ、２Ｇｙ以上、５Ｇｙ以上、７．５Ｇｙ以上、１０Ｇｙ以上又は１０Ｇｙ超の単回放射線曝露を受けたことがある、受けている、又は受ける予定である。ヒトでは、１回に５Ｇｙ以上の高エネルギー放射線への全身曝露は、通常は１４日以内に死亡を招く。
【００３４】
上記方法及び懸濁液を含む組成物の実施形態では、メラニンはメラニン化したナノ粒子の形態ではない。
【００３５】
一実施形態では、上記方法は、１つ又は複数の抗生物質を被験体に投与することを更に含む。
【００３６】
本明細書に記載の様々な要素の全ての組合せが、本明細書中で特に指定のない限り又は文脈上特に明らかに否定されない限り、本発明の範囲内である。
【００３７】
本発明は、以下の実験の詳細からよりよく理解される。しかしながら、当業者であれば、論考される具体的な方法及び結果が、添付の特許請求の範囲により完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。
【実施例】
【００３８】
実験の詳細
実施例１
合成メラニンによる放射線防護：
真菌メラニン及び合成メラニンの放射線防護特性を、合成フェオメラニンをマウスに経口投与した後、致死線量の１．５倍（９Ｇｙ）のγ放射線に全身曝露することによって試験した。９Ｇｙの全身線量は、ヒトの致死線量の２．５倍でもある。得られるメラニンで防護されたマウスの生存（図１）から、放射線曝露の危険性があるヒトにおける放射線防護体としてのメラニンベースの生成物の使用及び開発が促進された。
【００３９】
黒色食用キノコによる放射線防護：
追跡実験において、合成メラニンによる結果が天然メラニンに当てはまるか否かを検討した。食用真菌のアウリクラリア・アウリクラ・ユダエは高度にメラニン化しているため、これを選択した。９Ｇｙの全身線量を与える３時間前に、５、６匹のＣＤ１マウス群に、１ｇ／ｋｇ（体重）のＰＢＳに懸濁したアウリクラリア・アウリクラ・ユダエキノコ、又は１ｇ／ｋｇ（体重）のアウリクラリア・アウリクラ・ユダエキノコに続く照射後５日間の抗生物質補助、又はＰＢＳに続く照射後５日間の抗生物質補助、又はＰＢＳ単独を経口強制飼養によって与えた。放射線防護実験ではマウスは３０日を超えて生存し続けると考えられるため、マウスを生存について３０日間モニタリングした。実験の結果を図２に示す。黒色キノコのアウリクラリア・アウリクラ・ユダエは致死照射マウスの生存を有意に延長し、キノコ単独又は抗生物質補助を加えたキノコを与えたマウスの３０％が３０日間生存した。ＰＢＳ単独群及びＰＢＳ＋抗生物質補助群のマウスは５匹であり、キノコ群及びキノコ＋抗生物質群のマウスは６匹であった。ＰＢＳ単独対照及びＰＢＳ＋抗生物質対照と比較して、キノコ及びキノコ＋抗生物質のどちらについてもＰ値は０．０１５であった。
【００４０】
合成メラニン及び微細真菌中のメラニンが、食用キノコに見られるメラニンと同様の構造を有することを考えると、メラニンを、例えば口当たりのよい液体に懸濁した乾燥黒色キノコの形態（「メラニンシェーキ」）で放射線曝露を受ける個体に供給するために、栄養補助食品を使用することができる。メラニンの経口投与による研究では、精製メラニンの防護用量はマウスでは１００ｍｇ／ｋｇであったが、マウスとヒトとで体重対体表面積比が異なることを考慮すると、ヒトでは８ｍｇ／ｋｇの精製メラニンとなる。メラニンが乾燥キノコ重量の少なくとも１０％を占めるとして、上記のマウス実験では、マウスに１ｇ／ｋｇのアウリクラリア・アウリクラ・ユダエ（ヒトでは８０ｍｇ／ｋｇ、すなわち７０ｋｇのヒトについては５．６ｇの乾燥キノコに等しい）を与えた。アウリクラリア・アウリクラ・ユダエは、他の食用キノコのように湿気及び養分を与えて建物の地下室で成長させ、乾燥させ、粉末状にし、フレーバーウォーター又はフルーツジュースと混合することによって「メラニンシェーキ」に配合することができる。種々のフレーバーのシェーキを作製することができる。包装容器は、例えば１００ｍＬ容の標準的な個別のジュースパックであり得る。
【００４１】
実施例２
メラニン含有食用キノコは、抗生物質補助なしに最高度の放射線防護をもたらした。天然食物源として送達されたメラニンの放射線防護有効性を評価した。食用メラニン源として黒色食用キノコのアウリクラリア・アウリクラ・ユダエ（通俗名キクラゲ（Jelly Ear or Judas Ear））、メラニン欠乏対照として白色キノコのボレタス・エデュリス（通俗名ヤマドリタケ（porcino or bun bun））を選択した（図３Ｅ）。どちらのタイプのキノコも、西洋料理及びアジア料理に使用され、乾燥状態で市販されている担子菌類である。アウリクラリア・アウリクラ・ユダエ（黒色キノコ）中のメラニンの存在及びボレタス・エデュリス（白色キノコ）中のその非存在を、黒色キノコにおける特徴的なメラニンの「シグネチャー」シグナル（図４Ａ）及び白色キノコにおけるバックグラウンドのみ（図４Ｂ）から電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）によって実証した。本発明者らの研究室で開発したプロトコル（１９）を用いて黒色キノコから精製したメラニンは、黒色キノコの乾燥重量のおよそ１０％を占め、元素分析及び酸化的高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって更に特性化した。ユーメラニンは、６％〜９％の窒素を含む、５，６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）モノマー単位と５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）モノマー単位とから構成される（２０、２１）。また、真菌は同時にペンタケチド合成経路によって１，８−ジヒドロキシナフタレン（ＤＨＮ）からユーメラニンを合成し、かかるメラニンはその構造内に窒素を含有しない（２２）。元素分析から、黒色キノコのメラニン中に４４％の炭素、５％の水素及び２％の窒素が存在することが決定された。窒素の割合が低いことから、この色素が主にＤＨＮ−メラニンであることが示唆され、酸化メラニンのＨＰＬＣによってその構造に関する付加的な情報が得られた（図４Ｃ〜図４Ｅ）。酸化メラニン中のＤＨＩ由来単位の酸化生成物であるピロール−２，３−ジカルボン酸（ＰＤＣＡ）の存在から、黒色キノコ中のメラニンがＤＨＮメラニンとＤＨＩメラニンとの混合物であることが結論付けられた。加えて、キノコに関連する抗酸化物質が放射線防護効果に寄与し得るか否かについて考察し、２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）アッセイを用いて黒色キノコ及び白色キノコの抗酸化物質含量を比較した。ＤＰＰＨは、溶液中で濃いスミレ色を有する安定なフリーラジカルである。サンプルのラジカル捕捉活性は、ＤＰＰＨ１２の不対電子の捕獲後の脱色効果として測定することができる。黒色キノコと白色キノコとで可溶性抗酸化物質含量に違いがなかったため（図４Ｆ、図４Ｇ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでの黒色キノコによる放射線防護の根拠として抗酸化物質の違いは除外される。メタノールに抽出される可溶性抗酸化物質のみがこのアッセイで測定されることに留意すべきである。安定なフリーラジカルであるために同様に強力なフリーラジカル捕捉特性を有するメラニン（２４）は、メタノール又は任意の他の共通溶媒に可溶性でないため、このアッセイの結果に寄与することはない。
【００４２】
マウスにおける食用キノコの放射線防護特性を試験するために、照射時にＧＩ管（消化管）にキノコが存在するように、初めにマウスのキノコの摂取と照射との間の時間を決定する必要がある。白色キノコの天然自己蛍光を利用して蛍光イメージングを行った。マウスに強制飼養針を用いてキノコ懸濁液を与え、摂取の１５分後、３０分後及び６０分後にＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍでイメージングした。６７５／３０ｎｍ及び８４０／２０ｎｍのフィルターを、それぞれ励起及び発光に使用した。マウスに１ｇ／ｋｇ（体重）の白色キノコの水懸濁液を強制飼養針によって与え、イソフルラン麻酔下、背臥位でイメージングした。キノコは摂取の１５分後及び３０分後は胃内に存在し、６０分の時点で大部分が腸内に移動する（データは示さない）。腸は胃よりも電離放射線に対する感受性が高いことから、ＧＩ管の最も感受性の高い部分の最大防護を確保するために、放射線を投与する時点として６０分を選択した。これらの結果に基づいて、９Ｇｙの致死全身線量を与えたマウスにおいて放射線防護研究を行った。５、６匹のＣＤ−１マウス群を実験に使用し、実験を繰り返して、同様の結果を得た。黒色キノコを滅菌ＰＢＳ中の懸濁液として１ｇ／ｋｇ（体重）で強制飼養によって投与した。対照群には、滅菌ＰＢＳのみを与えたマウス又は１ｇ／ｋｇ（体重）用量で白色キノコを与えたマウスが含まれていた。メラニン色素が実際に黒色キノコにおける放射線防護物質であることを立証するために、付加的なマウス群に、黒色キノコ中のその含量に適合させるために投与される１００ｍｇ／ｋｇの合成メラニンを添加した白色キノコを１ｇ／ｋｇ（体重）用量で与えた。ＰＢＳ群の全てのマウス及び白色キノコ摂取群の８０％のマウスが、照射後１４日目までに死亡した（図５Ａ）。白色キノコ処理群の残りの２０％のマウスは２５日目までに死亡した。このＰＢＳ単独群と比べた生存延長傾向は、統計的に有意ではなかったが（Ｐ＝０．０７）、消化器内で局所防護効果をもたらした可能性がある白色キノコ中の抗酸化物質の存在によって説明することができる。驚くべきことに、黒色キノコ及び合成メラニンを添加した白色キノコの群では、それぞれ６０％及び７５％のマウスが４５日目まで生存し続け（Ｐ＝０．００２及び０．００１）、この時点で実験を終了し、それらの組織の組織学的検査を行った（図５Ａ）。一方、黒色キノコ群及びメラニン添加群の白血球数は非照射対照とは異ならず（Ｐ＝０．０６）（図５Ｂ）、血小板数はどちらの照射群も低かったが（Ｐ＝０．０３）（図５Ｃ）、放射線治療を受けるマウスの回復を保証するレベルであった（２５）。致死照射マウスでは、死亡率はＧＩ粘膜等の急速に分裂する組織の損傷（２６）及び骨髄抑制（２７、２８）に起因する。黒色キノコ群及びメラニン添加群の生存マウスにおいて胃、大腸及び小腸（それぞれＬＩ及びＳＩ）に放射線による損傷の兆候は見られなかった（図５Ｄ〜図５Ｆ）。照射マウスの骨髄の骨髄細胞過形成は僅かであり（図５Ｇ）、脾臓構築は幾らかの髄外造血はあるが正常であった（図５）。
【００４３】
抗生物質と組み合わせた合成フェオメラニンは、マウスの大半を致死放射線量から防護した。合成フェオメラニンの高い線減衰係数及び安定なラジカル含量（１８）は、マウスにおける放射線防護につながると仮定した。用量応答実験から、合成フェオメラニンの経口投与は、９Ｇｙを２．５Ｇｙ／分で照射したマウスを用量依存的に防護することが実証された。４０日間の生存研究にわたって、２５ｍｇ／ｋｇのフェオメラニンを与えたマウスでは防護は特定されなかった。５０ｍｇ／ｋｇを摂取させたマウスは６．６％の生存率を有し（Ｐ＝０．０２）、７５ｍｇ／ｋｇを与えたマウスは２０％の生存率を有していた（Ｐ＝０．０１）（図６Ａ）。しかしながら、フェオメラニン用量を１００ｍｇ／ｋｇに増大させると防護は観察されなかった（Ｐ＝０．０６）。より高いメラニン用量での防護の欠如が、動物を細菌性敗血症に罹患しやすくする腸管関連作用の結果であることの可能性を考察した。したがって、追跡研究において、フェオメラニン投与及び致死照射の後の生存に対する抗菌薬療法の効果を評価した。マウスにＰＢＳ単独、又は抗生物質と組み合わせたＰＢＳ、又は抗生物質と組み合わせた１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニンを与えたところ、それぞれ０％、１６．７％及び８０％の４０日間生存率が得られた（Ｐ＝０．００５）（図６Ｂ、図６Ｃ）。
【００４４】
種々の治療群における体重減少率を線形回帰によって分析した（図６Ｄ）。最大の体重減少は、ＰＢＳ単独又は抗生物質と組み合わせたＰＢＳを与えた群において観察された：それぞれ１日当たり１．６％及び１．１％の総体重の減少。フェオメラニンを与えたマウスは、ＰＢＳ単独群と比較して有意に低い体重減少を示した。５０ｍｇ／ｋｇのフェオメラニンで処理した群は体重が１日当たり１．０％減少したが（Ｐ＝０．０２）、７５ｍｇ／ｋｇで処理した群は体重が１日当たり０．７％減少した（Ｐ＝０．０１５）。最も重要なことに、１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン＋抗生物質を与えたマウスは、実際に体重が照射後１日当たり１．０％の割合で増加し、その差は他の全ての群と比べて有意であった（Ｐ＜０．０５）。
【００４５】
生存マウスの組織の組織学的評価から、１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン＋抗生物質（図７Ａ、上段）又は７５ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン（図７Ａ、中段）で処理した生存マウスにおいて胃、小腸、大腸、肝臓及び骨髄の損傷がないことを明らかにすることで体重データを裏付けた。１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン＋抗生物質群の生存マウス（８０％の生存）のうち、１匹のマウスのみが小腸に限局性微小腺腫を有し（図７Ｂ、左パネル）、骨髄細胞性がやや失われていた（図７Ｂ、右パネル）。ＰＢＳ＋抗生物質群の唯一の生存者は、肝臓において多発性のリンパ組織球性及び形質細胞性の門脈周囲浸潤を示し（図７Ａ、下段）、慢性活動性腹膜炎とともに盲腸に限局性穿孔を示した（図７Ｃ）。
【００４６】
微生物ユーメラニン及び合成ユーメラニンは、致死照射マウスの生存を延長した。照射研究を行う前に、ＣＤ−１マウスに対して微生物メラニン及び合成メラニンの経口投与に関連する任意の毒性が存在するか否かを評価した。毒性の尺度は、１０日間の体重及び消化器組織の組織学的評価であった。微生物及び合成のユーメラニン及びフェオメラニンは、観察期間中マウスの体重が着実に増加することから非毒性であることが証明され、これは消化器の正常組織像によって確認された（図８）。
【００４７】
微生物メラニン及び合成メラニンの毒性の欠如を受けて、致死照射からのＣＤ−１マウスの防護における経口投与した合成ユーメラニン及び微生物ユーメラニンの有効性を評価した。１３７Ｃｓ供給源から９Ｇｙを２．５Ｇｙ／分で照射した４時間後にマウスから得たＧＩ組織の組織学的評価によって、微生物ユーメラニンを摂取させたマウスが、胃組織において合成ユーメラニン又はＰＢＳを供給したマウスよりもおよそ４０％少ないアポトーシス細胞を有することが明らかになった（図１０Ａ〜Ｃ）。２４時間の時点でもこの傾向は継続し、微生物ユーメラニンを摂取させたマウスの胃における腺細胞は、合成ユーメラニンを摂取させたマウスに比べてそれほど減少しなかった。同時に、両方のユーメラニン群で、対照ＰＢＳ摂取マウスと比べておよそ２５％多い有糸分裂像及び少ないアポトーシス細胞が認められた。小腸では治療群間の明白な違いは見られなかった。２４時間の時点で、微生物ユーメラニンを摂取させたマウスの結腸腺では、細胞反応及びアポトーシスが他の結腸サンプルと比較して３０％少なかった（図９Ｄ〜図９Ｆ）。
【００４８】
照射後の最初の４日間は、微生物ユーメラニンを摂取させたマウスの体重減少は、ＰＢＳ又は合成ユーメラニンを摂取させたマウスよりも僅かに少なかった（図９Ｇ）。５日目までに全ての群の累積体重減少は等しくなり、観察期間の残りの間、合成ユーメラニンを摂取させたマウスの体重減少が最も顕著でなかった。照射後１１日目の全生存は合成ユーメラニン群で１００％、微生物ユーメラニン群で６６％、ＰＢＳを摂取させた対照マウスで３３％であり、この群の最後のマウスは１６日目に死亡した（図９Ｊ）。研究期間中、微生物ユーメラニンを摂取させたマウスの平均生存は１３日間、対照ＰＢＳ摂取マウスは１２．７日間、合成ユーメラニン群は１９日間であった（Ｐ＝０．０１、マンテル・コックス検定）。
【００４９】
論考
安価であり、貯蔵及び輸送に冷蔵（「コールドチェーン」）を必要とせず、最近の福島第一原子力発電所での原発事故のような放射線緊急時の際に大勢の人々に配布するのに好適な経口放射線防護剤が、引き続き緊急に必要とされている。この必要性は、多くの発展途上国が化石燃料の代替として原子力への依存度を高めることを検討しており、核計画の大規模な拡大が、一世代の間に２回のチェルノブイリ原発及び福島第一原発での重大事故からも明らかなように重大なリスクを伴うという事実によって高められる。広く研究されている有力な放射線防護剤の１つはアミホスチンである（２８〜３０）。アミホスチンは、アミノチオール及びホスホロチオエートを含むフリーラジカル捕捉剤群に属し、有効な活性型にまで代謝される必要があるプロドラッグとして投与される。この薬剤は幾らかの放射線防護有効性を有するが、比較的低い放射線防護能、アナフィラキシー等の深刻な副作用を起こす可能性及び静脈内投与の必要性を含む、幾つかの望ましくない特性も有する。Burdelya et al.による研究（３１）では、照射細胞におけるアポトーシスを薬理学的に抑制することによって異なる放射線防護アプローチが取られている。これは、トール様受容体５に結合し、核因子κＢシグナル伝達を活性化するフラジェリン誘導ポリペプチドで実験動物を前処理することによって行われた。この方法は幾らか有望であったが、この薬剤も非経口投与しなければならず、アポトーシス過程を妨げるために発がん性の副作用を有し得る。
【００５０】
本明細書では、９Ｇｙの致死線量を高い線量率で受けたマウスのＧＩ管に対する、経口投与した種々のタイプのメラニンの防護効果を評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行った。メラニンの放射線防護効果は、コンプトン電子と細胞環境との相互反応回数の減少をもたらすメラニンによるコンプトン電子エネルギーの散逸の制御、及びメラニンによる反応性フリーラジカルの捕捉に基づくことが提唱されている（１８）。クリプトコッカス・ネオフォルマンスから精製した微生物ユーメラニン及び市販の合成ユーメラニンという２つのユーメラニンの防護効果を比較した。照射マウスの胃及び結腸の組織学的検査から、微生物ユーメラニンを与えたマウスが、合成ユーメラニンを与えたマウス又は対照よりも良好に防護されることが明らかになった。しかしながら、この微生物ユーメラニンの初期防護効果が長期防護にまで及ばない一方で、合成ユーメラニン投与は統計的に有意な生存延長をもたらした。この驚くべき観察結果は、厳密な多段階精製後も持続する、その構造と結び付いた免疫原性タンパク質及び多糖の存在のために、微生物ユーメラニンが粘膜において引き起こし得る炎症によって説明することができる（３２）。メラニン化真菌細胞に由来するメラニン「ゴースト」は、免疫原性が高いことが知られる細胞壁構成成分を含有する。例えば、酵母細胞壁から調製されるザイモサン粒子は、炎症誘発性であることで有名であり（３３）、クリプトコッカス・ネオフォルマンスに由来するメラニンは直接炎症を誘発することが示されている（３４）。かかる炎症は放射線によって受ける損傷を増大させ、浮腫を伴う可能性があり、これにより、照射後の最初の４日間における合成ユーメラニン群及び対照群と比べてあまり顕著でない微生物ユーメラニン群の体重減少が説明され得る。合成ユーメラニンは全実験期間にわたって統計的に有意な生存延長をもたらし、これにより、ユーメラニンよりも多数の安定なフリーラジカルを有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで放射線防護性がより高い合成フェオメラニンをマウスに経口投与することによる、放射線防護におけるその役割の更なる調査の推進力がもたらされた（１８）。
【００５１】
フェオメラニンは、２５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜７５ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量範囲でマウスを用量依存的に防護した。１００ｍｇ／ｋｇ用量ではマウスは防護されなかったため、より高用量のメラニンが損傷組織において予期せぬ有害作用を有する可能性があると仮説を立てた。関連菌血症の死亡率への寄与を検証するため、照射後に抗生物質をマウスに投与した。抗生物質投与は、１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニンで処理した照射マウスの８０％の生存をもたらした。公表データと比較すると、フェオメラニン＋抗生物質はアミホスチン（１Ｇｙ／分での９Ｇｙの送達後６０％の生存（１７））よりも防護性が高く、フラジェリン誘導ポリペプチド（２．３Ｇｙ／分での９Ｇｙの送達後８０％の生存（２０））に等しかった。放射線量率の増大は、細胞修復機構の効率を悪くすることが知られる（３５）。フェオメラニン単独又はフェオメラニンと抗生物質とで防護された群の生存マウスの組織学的評価から、主要器官に対する明白な放射線損傷がないことが明らかになった。１００ｍｇ／ｋｇのフェオメラニン＋抗生物質を与えた群の生存マウスのうち、１匹のマウスのみが、骨髄の僅かな枯渇及び小腸の孤立性微小腺腫からなる主要器官の何らかの異常を有していた。これらの異常が照射の影響を反映するものであるか否かは分からない。対照的に、抗生物質のみの群の唯一の生存マウスは、限局性虫垂炎及び腹膜炎を伴う穿孔を有していた。電離放射線は粘膜構造の破壊を誘導し、潰瘍を伴うことが多い（２６、３６）。限局性潰瘍はよく見られるが、固有層の急性炎症を伴う上皮層の単純喪失から、腸壁、更には漿膜の様々な深さまで到達し得る潰瘍まで様々である。虫垂穿孔及び関連する腹膜炎は、患者において電離放射線への曝露によって頻繁に生じる臨床的帰結である（２６）。盲腸穿孔が放射線傷害の結果として生じ、マウスが致死性腹膜炎を予防する抗生物質の投与により研究の終了時まで生存することが結論付けられた。
【００５２】
理想的な放射線防護剤は防護性かつ費用効果的である。天然形態の黒色食用キノコは、容易に利用可能な天然放射線防護剤をもたらす。黒色キノコ又はメラニンを添加した白色キノコで防護されたマウスの等しい生存は、黒色キノコ中のメラニンの存在とそれらの放射線防護特性との因果関係を立証するものである。興味深いことに、抗生物質を与えないキノコを用いた実験と、抗生物質の添加が防護に必要とされる合成フェオメラニンを用いた実験とでほぼ同じ割合のマウスが生存した。この効果は、メラニンとキノコ中に存在する可溶性抗酸化物質との組合せによるものである可能性が最も高い（図２）。黒色キノコ又はメラニンを添加した白色キノコを摂取させたマウスの相当な割合が長期生存マウスとなったことを考えると、ＧＩ管におけるメラニンの存在が、これらのマウスを回復させる局所防護をもたらすということになる。ＧＩ粘膜の防護はＧＩ症候群及び敗血症による死亡を予防し得る。したがって、局所ＧＩ防護は全身防護につながるようであり、この観察結果から、放射線病を防ぐアプローチにおいて新たな概念が確立される。黒色食用キノコは、口当たりのよい液体中の懸濁液として調製し、栄養補助食品として被災者に配布することができる。この放射線防護は、放射線によるＧＩ管の傷害が外部放射線ビーム療法（ＥＢＲＴ）を受ける患者においてよく見られるため、放射線治療を受けるがん患者にも利益をもたらし得る。
【００５３】
材料及び方法
メラニン源及び物理化学的分析
チロシンから作られた市販の合成ユーメラニンは、Sigma-Aldrichから得た。「ゴースト」の形態のクリプトコッカス・ネオフォルマンス２４０６７株に由来する微生物ユーメラニン（全ての細胞内容物を多段階精製法によって除去した中空メラニン球）は、先に記載されるように精製した（８）。５−Ｓ−システイニルドーパを用いた合成フェオメラニンは、０．５ｍｍｏｌの５−Ｓ−システイニルドーパを、触媒として添加した０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中の０．０２５ｍｍｏｌのＬ−ＤＯＰＡ、及び８３００単位（２ｍｇ／ｍＬ溶液を７７３μＬ）の量のキノコチロシナーゼ（Sigma）とともに、絶えず撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートすることによって生成した。一晩インキュベートした後、２５０μＬの６Ｍ  ＨＣｌを添加して、ｐＨをおよそ３．０まで低下させることによって酸化反応を停止させた。この酸性化混合物を２℃に１時間維持した。沈殿物を遠心分離によって回収し、１５ｍＬの１％酢酸で３回、１５ｍＬのアセトンで２回、１５ｍＬの１％酢酸で更に１回洗浄し、脱イオン水に再懸濁した。次いで、得られたフェオメラニンを凍結乾燥し、ＰＢＳに１２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁して、ストック懸濁液を作製した。
【００５４】
乾燥アウリクラリア・アウリクラ・ユダエ（黒色キノコ）及びボレタス・エデュリス（白色キノコ）は、Trader Joe's（Monrovia，CA）から購入した。黒色キノコに由来するメラニンは、先に記載されるように精製した（１９）。メラニンの元素分析はQTI（Whitehouse，NJ）によって行われた。乾燥キノコのＥＰＲ及び過マンガン酸塩の酸化を用いたメラニンの酸化的ＨＰＬＣは、（１８）に記載のように行った。ＤＰＰＨアッセイにおける黒色キノコ及び白色キノコに由来するメタノール抽出物の抗酸化能は、（２３）に記載のように測定した。
【００５５】
メラニンの潜在毒性の評価
全ての動物研究は、アルベルト・アインシュタイン医学校の動物実験委員会のガイドラインに従って行った。６週〜８週齢のＣＤ−１雌性マウス（Charles River Breeding Laboratories，Portage，MI）を全ての実験に使用した。マウスを５匹の群に分け、１５ｍｇ／ｋｇ（体重）の合成ユーメラニン若しくは微生物ユーメラニン、又は１００ｍｇ／ｋｇの合成フェオメラニン、又はＰＢＳを強制飼養針によって摂取させた。マウスを体重及びその健康状態について毎日評価した。１群当たり２匹のマウスをメラニン摂取の２４時間後に人道的に屠殺し、残りのマウスを１４日目に屠殺した。胃並びに小腸及び大腸を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋のために通常どおり加工した。サンプルを５μｍの切片にし、組織学的評価のためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００５６】
イメージング
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを、励起及び発光用のそれぞれ６７５／３０ｎｍ及び８４０／２０ｎｍのフィルターを備える落射蛍光モードのＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Caliper Life Sciences，Hopton，MA）で行った。マウスに、非蛍光性飼料を５日間摂取させた後、イメージング実験前に一晩絶食させ、飼料の残留自己蛍光の干渉を排除した。マウスに、１ｇ／ｋｇ（体重）の白色キノコの水懸濁液を強制飼養針によって与え、摂取の１５分後、３０分後及び６０分後にイソフルラン麻酔下、背臥位でイメージングした。
【００５７】
様々なメラニンを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ放射線防護
微生物ユーメラニン及び合成ユーメラニン
ＣＤ−１マウス（１群当たり１３匹のマウス）に、合成ユーメラニン又は微生物ユーメラニン又はＰＢＳを強制飼養針によって１５ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で摂取させた。ユーメラニン摂取の１時間後に、９Ｇｙの全身線量を２．５Ｇｙ／分で送達する１３７−Ｃｓ照射装置においてマウスを全身照射に供した。４時間及び２４時間の時点で、１群当たり２匹のマウスを人道的に屠殺し、それらの胃、小腸及び結腸を取り出し、先に記載されるように加工した。残りの動物を死亡するまで毎日の体重測定によってモニタリングした。瀕死の動物は人道的に安楽死させた。
【００５８】
合成フェオメラニン
ＣＤ−１マウスを１５匹のマウスの５つの群に分けた。群を０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇのメラニンのＰＢＳ懸濁液で強制飼養によって処理した。摂取の１時間後に、９Ｇｙの全身線量を２．５Ｇｙ／分で送達する１３７−Ｃｓ照射装置においてマウスを全身照射に供し、それらの体重及び生存を４０日間モニタリングした。体重変化率を、線形回帰分析（Ｐｒｉｓｍ、GraphPad，San Diego，CA）を用いて定量化した。追跡研究では、マウスを３つの群に分けた。群１を１００ｍｇ／ｋｇのメラニンのＰＢＳ懸濁液で経口強制飼養によって処理し、群２及び群３をＰＢＳのみで経口強制飼養によって処理し、続いて３つ全ての群に上記のような照射を行った。照射の２日後から開始して、群１及び群２にペニシリン（１００００単位／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）（Sigma，St. Louis，MO）１２０μＬを５日間にわたって１日２回皮下投与した。４０日目の研究の終了時に、全ての生存マウスを屠殺し、それらの胃、小腸、大腸、肝臓、胸骨及び大腿骨を取り出し、組織学的評価のために先に記載されるように加工した。
【００５９】
黒色キノコ
乾燥黒色キノコは１０％のメラニンを含有するため、黒色キノコを滅菌ＰＢＳ懸濁液として１ｇ／ｋｇ（体重）で強制飼養によって投与し、純粋な合成メラニンを用いる上記の実験のメラニン濃度に適合させた。ＣＤ−１マウスを５、６匹の群に分け、１ｇ／ｋｇ（体重）の黒色キノコのＰＢＳ懸濁液、又はＰＢＳ単独、又は１ｇ／ｋｇの白色キノコ懸濁液、又は１００ｍｇ／ｋｇの合成メラニンを添加した１ｇ／ｋｇの白色キノコ懸濁液を強制飼養針によって摂取させた。キノコ投与の１時間後、マウスに９Ｇｙ線量のＣｓ−１３７放射線を２．５Ｇｙ／分の線量率で照射した。マウスを体重及びそれらの健康状態について４５日間毎日評価した。実験は２回行った。実験の終了時に、生存マウスを人道的に屠殺し、それらの血液化学を白血球数及び血小板数について分析し、肉眼的病理検査（gross pathology）を行い、胃、小腸及び大腸、脾臓並びに骨髄を組織学的評価に供した。ログランク検定を用いてマウスの生存を分析し、ＷＢＣ数及び血小板数を片側スチューデント検定によって分析した。結果の差は、Ｐが０．０５未満である場合に統計的に有意であるとみなした。
【００６０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
2014510104.tif 000013
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【国際調査報告】
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