(57)【要約】本発明は、既存の体液性応答を活用することによりワクチンの有効性を増強する、「免疫バンキング」と称するプロセスを提供する。このプロセスは、新たな抗原を、既存の抗体応答により認識される分子マーカーで標識するステップを伴う。この標識されたワクチン成分の認識により、新たなワクチンに対する獲得免疫応答が増強される。特定の実施形態では、本発明は、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープを提供する。
2014512182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープ。
【請求項２】
約１８〜２８アミノ酸の長さであり、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、請求項１に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項３】
ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）から本質的になる、請求項１に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項４】
ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）からなる、請求項１に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項５】
ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープ。
【請求項６】
約１８〜２８アミノ酸の長さであり、ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）を含む、請求項５に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項７】
ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）から本質的になる、請求項５に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項８】
ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）からなる、請求項５に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項９】
１８〜２８アミノ酸の長さであり、ＡＨＳＫＥＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴＡ（配列番号２）を含む、請求項５に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項１０】
ＡＨＳＫＥＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴＡ（配列番号２）から本質的になる、請求項５に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項１１】
ＡＨＳＫＥＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴＡ（配列番号２）からなる、請求項５に記載のＶＰ−１エピトープ。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープである抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物。
【請求項１３】
前記抗原を、アルファ−Ｇａｌ連結により前記ＡＲＥに結合させた、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記抗原を、リンカー分子により前記ＡＲＥに結合させた、請求項１２または１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記リンカー分子が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、および／またはスルホ−ＭＢＳである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記抗原が、感染因子抗原である、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記感染因子が、細菌性因子、真菌性因子、寄生生物性因子、ウイルス性因子、またはプリオン因子である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記感染因子が、細菌性因子である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記感染因子が、ウイルス性因子である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
前記抗原が、がん抗原である、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記抗原を抗体にさらに結合させて、抗体：抗原複合体を形成させる、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記抗体が、完全ヒト化抗体である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記抗体が、単鎖Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２６】
ハプテンを前記抗原に作動可能に連結して、ハプテン化抗原を形成させる、請求項１２から２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
前記ハプテンをさらなる抗原に作動可能に連結させる、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
コンジュゲーション分子に作動可能に連結させる、請求項１２から２７のいずれか一項に記載の化合物を含む複合体。
【請求項２９】
前記コンジュゲーション分子が、前記抗原またはＡＲＥではない、ペプチド、核酸、または多糖である、請求項２８に記載の複合体。
【請求項３０】
請求項１２から２７のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２８もしくは２９に記載の複合体、および生理学的に許容される非毒性のビヒクルを含む組成物。
【請求項３１】
アジュバントをさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
予備免疫化された動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項３０または３１に記載の組成物を前記動物に導入するステップを含む、方法。
【請求項３３】
前記組成物の前記導入を、予備免疫化の少なくとも１５日後に行う、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３０または３１に記載の第２の組成物を導入するステップをさらに含む、請求項３２または３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３０または３１に記載の組成物の反復用量を導入するステップをさらに含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記動物が、ヒトである、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
予備免疫化した動物において抗原に特異的な抗体を生成させる方法であって、請求項３０または３１に記載の組成物を前記動物に導入するステップを含む、方法。
【請求項３８】
請求項３０または３１に記載の組成物の第２の用量を前記動物に導入するステップをさらに含む、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
がんを処置する方法であって、請求項３０または３１に記載の組成物を患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項４０】
感染または感染性疾患を防止または処置する方法であって、請求項３０または３１に記載の組成物を患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項４１】
感染因子またはがんに対する予防的処置または治療的処置において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープである抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの精製抗原を含む化合物。
【請求項４２】
哺乳動物における感染因子またはがんに対する処置に有用な医薬を製造するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープである抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの精製抗原を含む化合物。
【請求項４３】
抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、前記抗原が、Ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質受託番号＃ＡＢＩ３６００３であるＡ型インフルエンザＨ５Ｎ１（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））に由来するヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）であり、前記ＡＲＥが、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープであり、前記ＡＲＥを、前記ＮＰに直接的に共有結合によって結合させた、化合物。
【請求項４４】
抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、前記抗原が、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＤＹ０００２４．１であるＡ型インフルエンザＨ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８−Ｖ２４／１９３４（Ｈ１Ｎ１））に由来するヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）であり、前記ＡＲＥが、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープであり、前記ＡＲＥを、前記ＮＰに直接的に共有結合によって結合させた、化合物。
【請求項４５】
抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、前記抗原が、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＤＹ０００２０．１であるＡ型インフルエンザＨ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８−Ｖ２４／１９３４（Ｈ１Ｎ１））に由来するヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）であり、前記ＡＲＥが、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープであり、前記ＡＲＥを、ＮＰに直接的に共有結合によって結合させた、化合物。
【請求項４６】
抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、前記抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスに由来するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であり、前記ＡＲＥが、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープであり、前記ＡＲＥを、ＮＰに直接的に共有結合によって結合させた、化合物。
【請求項４７】
抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、前記抗原が、Ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質受託番号＃ＡＢＩ３６００３であるＡ型インフルエンザＨ５Ｎ１（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））に由来するヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）であり、前記ＡＲＥが、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープであり、前記ＡＲＥを、前記ＴＮＰに直接的に共有結合によって結合させた、化合物。
【請求項４８】
抗原をコードする核酸に作動可能に連結した、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＶＰ−１エピトープをコードする核酸。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸に隣接して連結したプロモーターを含む発現カセット。
【請求項５０】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項４９に記載の発現カセット。
【請求項５１】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項４９に記載の発現カセット。
【請求項５２】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦａ−１プロモーター、またはＴ７プロモーターである、請求項４９に記載の発現カセット。
【請求項５３】
請求項４８から５２のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項５４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の優先権
この出願は、２０１１年４月４日に出願された米国仮出願第６１／４７１，５５３号に対する優先権を主張する。この仮出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫系は、極めて複雑であり、生物が感染性病原体およびがん細胞と闘うための多くの異なる経路を包含する。一般に、免疫系は、体液性免疫応答（ＨＩＲ）および／または細胞介在性免疫応答（ＣＭＩ）を起こすことが可能な系として考えられる。ＨＩＲは、Ｂリンパ球系統の細胞（Ｂ細胞）において産生される抗体の産生および分泌を伴う。分泌された抗体は、浸潤する微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面において抗原に結合する。次いで、抗体が結合した抗原は、免疫系内の多様な細胞により破壊される。体液性免疫はまた、抗体の産生およびそれに付随する付帯過程も指す。体液性免疫はまた、抗体のエフェクター機能であって、病原体および毒素の中和、古典的な補体の活性化、ならびにオプソニンによる食作用の促進、ならびに病原体の排除を包含する機能も指す。
【０００３】
免疫応答の第２の種類は、細胞介在性免疫（ＣＭＩ）である。ＣＭＩとは、抗体または補体を伴わないが、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球などの多様な免疫細胞の活性化、および抗原に応答する多様なサイトカインの放出を代わりに伴う免疫応答である。細胞性免疫は、抗原特異的Ｔリンパ球を活性化させることにより身体を防護しうる。これらの細胞は、ウイルス感染細胞、細胞内細菌に感染した細胞、および腫瘍抗原を提示するがん細胞など、それらの表面において外来抗原のエピトープを提示する体細胞においてアポトーシスを誘導する。Ｔ細胞は、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を活性化させ、それらが細胞内病原体を破壊することを可能とし、細胞が、獲得免疫応答および生得免疫応答に関与する他の細胞の機能に影響を及ぼす多様なサイトカインを分泌することを刺激する。細胞介在性免疫は、食細胞内で生存する微生物、および非食作用性細胞に感染した微生物を主に指向する。細胞介在性免疫は、ウイルス感染細胞を除去するのに最も有効であるが、また、真菌、原虫、がん、および細胞内細菌に対する防御にも関与する。
【０００４】
従来、世界保健機関により定義される通り、ワクチンとは、抗体の産生を刺激することにより、疾患に対する免疫をもたらすことを意図する任意の調製物である。ワクチンには、例えば、死滅させるかもしくは弱毒化させた微生物、または微生物の生成物もしくは派生物の懸濁液が含まれる。ワクチンを投与する最も一般的な方法は、接種によるが、一部のワクチンは、経口で、または鼻腔用スプレーにより施される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現行のワクチン法は、抗原の大量投与および／または再ワクチン接種（追加接種）に依拠し、全ての感染因子に対して防護を付与するわけではない。したがって、新たなワクチンが、現在のところ有効なワクチンが存在しない感染因子に対して防護を付与することが必要とされている。また、投与がより安全であり、作製がより低廉であり、かつ／または追加接種を要請しない新たなワクチンも必要とされている。追加接種を排すれば、免疫化の服薬遵守が増大するであろう。最後に、老齢者など、一部のヒト集団は、ワクチン接種に対する応答が概して微弱であり、より有効なワクチンであれば、この増大しつつあるワクチンレシピエントの類型をより良好に防護するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
特定の実施形態では、本発明は、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ；また、「抗体認識エレメント」または「抗体反応性エピトープ」とも称する）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープを提供する。特定の実施形態では、エピトープが約１８〜２８アミノ酸の長さであり、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む。特定の実施形態では、エピトープが、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）から本質的になるか、またはこれからなる。
【０００７】
特定の実施形態では、エピトープが、約１１〜２８アミノ酸の長さであり、ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）を含む。特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）を含む約１８〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープを提供する。特定の実施形態では、エピトープが、ＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ（配列番号３）から本質的になるか、またはこれからなる。特定の実施形態では、エピトープが、１８〜２８アミノ酸の長さであり、ＡＨＳＫＥＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴＡ（配列番号２）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、ＡＲＥが上記のＶＰ−１エピトープである化合物を提供する。特定の実施形態では、抗原を、アルファ−Ｇａｌ連結によりＡＲＥに結合させる。特定の実施形態では、抗原を、リンカー分子によりＡＲＥに結合させる。特定の実施形態では、リンカー分子が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、および／またはスルホ−ＭＢＳである。特定の実施形態では、抗原が、感染因子抗原である。特定の実施形態では、感染因子が、細菌性因子、真菌性因子、寄生生物性因子、ウイルス性因子、またはプリオン因子である。特定の実施形態では、感染因子が、細菌性因子またはウイルス性因子である。特定の実施形態では、抗原が、がん抗原である。
【０００９】
特定の実施形態では、抗原を抗体にさらにコンジュゲートして、抗体：抗原複合体を形成する。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ｓｃＦｖ、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、および抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片）を包含する。特定の実施形態では、抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗体が、単鎖Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片である。
【００１０】
特定の実施形態では、ハプテンを抗原に作動可能に連結し、ハプテン化抗原を形成する。特定の実施形態では、ハプテンをさらなる抗原に作動可能に連結する。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は、コンジュゲーション分子に作動可能に連結した抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によってコンジュゲートされた、少なくとも１つの抗原を含む化合物を含む複合体を提供する。特定の実施形態では、コンジュゲーション分子が、抗原またはＡＲＥではない、ペプチド、核酸、または多糖である。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明は、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）にコンジュゲートされた少なくとも１つの抗原と、生理学的に許容される非毒性のビヒクルとを含む化合物を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物が、アジュバントをさらに含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、予備免疫化された動物において免疫応答を誘発する方法であって、上記の組成物を動物に導入するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、組成物の導入を、予備免疫化の少なくとも１５日後に行う。特定の実施形態では、方法が、上記の第２の組成物を導入するステップをさらに含む。特定の実施形態では、方法が、組成物の反復用量を導入するステップをさらに含む。特定の実施形態では、動物が、ヒトである。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明は、抗原に特異的な抗体を生成させる方法であって、上記の組成物または複合体を動物に導入するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、方法が、組成物または複合体の動物への第２の用量を導入するステップをさらに含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明は、がんを処置する方法であって、上記の組成物または複合体を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、感染または感染性疾患を防止または処置する方法であって、上記の組成物または複合体を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、感染因子またはがんに対する予防的処置または治療的処置において用いられる、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）にコンジュゲートされた少なくとも１つの抗原を含む化合物を提供する。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物における感染因子またはがんに対する処置に有用な医薬を製造するための、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）にコンジュゲートされた少なくとも１つの抗原を含む化合物を提供する。
【００１９】
本発明は、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）に共有結合によって結合させた少なくとも１つの抗原を含む化合物であって、抗原が、Ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質受託番号＃ＡＢＩ３６００３であるＡ型インフルエンザＨ５Ｎ１亜型（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））に由来するヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）であり、ＡＲＥが、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープであり、ＡＲＥを、ＮＰに直接的に共有結合によって結合させた化合物を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、抗原をコードする核酸に作動可能に連結した、上記のＶＰ−１エピトープをコードする核酸を提供する。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、抗原をコードする核酸に作動可能に連結した、上記のＶＰ−１エピトープをコードする核酸に隣接して連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。特定の実施形態では、プロモーターが、組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターが、誘導性プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦａ−１プロモーター、またはＴ７プロモーターである。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、上記の発現カセットを含むベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、Ａｂ認識エレメント（ＡＲＥ）コンジュゲートＡｇに対する細胞性免疫応答の増強について提起される機構（複数可）を示す図である。マウス群ＩおよびＩＩは、ＡｇＡに対する体液性応答を示す。次いで、群Ｉを、ＡｇＡに由来するＡＲＥにコンジュゲートされたＡｇＢで免疫化する。これに対し、群ＩＩは、非コンジュゲートＡｇＢに対して免疫化される。ＡＲＥコンジュゲートＡｇＢを認識するＡｇＡ特異的体液性応答は、群ＩのＢ特異的獲得免疫応答を、群ＩＩのＢ特異的獲得免疫応答を超えて増強する。
【図２】図２は、メモリーＣＤ８  Ｔ細胞応答を示す図である。
【図３】図３は、マウスに抗原を注射するときの時系列、ならびに血液を回収してＡｇ１特異的抗体およびハプテン特異的抗体について調べる日を示す図である。
【図４】図４は、分泌されたＩｇの役割を調べるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験デザイン、および免疫応答の増強における可溶性Ｉｇの役割についてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験デザインを示す図である。
【図５】図５は、ＡＲＥコンジュゲート（ＡＲＥ−ｃｏｎｊ）による逐次的なワクチン接種についての時系列、およびＡＲＥ−ｃｏｎｊによる共時的なワクチン接種についての時系列を示す図である。
【図６】図６は、ＡＲＥハプテンである２，４，６，トリニトロフェニル（ＴＮＰ）に対してあらかじめ存在するＡｂ応答の活用であり、インフルエンザにより誘導される死亡に対する防護をもたらす、免疫バンキングを示す図である。
【図７】図７は、応答の増強における可溶性のＡｇ特異的免疫グロブリンの役割を示す図である。スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化されたマウスに由来する血清を、ＴＮＰコンジュゲートオボアルブミンと共にインキュベートした。結果として得られる、オボアルブミン−ＴＮＰおよびマウス血清、またはオボアルブミン−ＴＮＰ：抗体複合体を含有する混合物を、ナイーブマウス（１群当たり３匹ずつ）に注射した。オボアルブミン注射の７日後、ＯＶＡ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の百分率を、細胞内サイトカインの染色により決定した。ＡＲＥとしてのＴＮＰを用いる免疫複合体の注射により、ワクチンに対する細胞性応答が増強されることに注意されたい。
【図８】図８は、ＡＲＥ修飾ペプチドワクチンの有効性の決定を示す図である。ＡＲＥ特異的抗体を伴うマウスは、ワクチン接種およびインフルエンザによる感作の後で有病率の低下を示す。マウスにモック（ＰＢＳを伴うミョウバン）でワクチン接種するか、またはヒトワクチン（ミョウバン中のＨＢｓＡｇ）を用いてマウスをＢ型肝炎に対して免疫化した。被験群においてＨＢｓＡｇに血清転換したら、両群のマウスに、肝炎ＡＲＥ標識インフルエンザ核タンパク質ワクチン（ＨｅｐＰｅｐ（インフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）に共有結合によって連結された））を施した。次いで、両群を悪性インフルエンザで感作し、有病率を体重減少により決定した。ＨｅｐＰｅｐ−ＡＲＥ標識ワクチン群は、対照群より低い有病率を示す。
【図９】図９は、ＶＰ−１によるＡＲＥをＨＢｓＡｇに化学的に連結し、免疫複合体として施した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
サブユニットワクチンの免疫原性を増大させる技法の開発は、医療従事者、軍事従事者、および一般の公衆にとって主要な対象である。抗原の免疫原性を増大させることができれば、現行のワクチンが改善され、新たなワクチンの開発が増強されて、感染に関連する有病率および死亡率が低減される。感染性疾患に対抗することに加えて、ワクチン開発の進展は、免疫治療剤および免疫学的介入のそれぞれを介して、がん患者および化学物質依存者（例えば、コカインなど、活性化学物質に対するワクチン接種）に利益をもたらす。
【００２５】
免疫化の成功は、Ｂリンパ球（また、「Ｂ細胞」とも称する）を含めた獲得免疫細胞の活性化を結果としてもたらす。Ｂ細胞の活性化は、長寿命のＡｂ産生細胞（血漿細胞）およびメモリーＢ細胞のクローン的増殖およびこれらへの分化を誘導する。したがって、免疫化された個体は、各々が元のワクチン内に含有される特定のＡｇを認識することが可能な、可溶性のＡｂを発現させ、メモリーＢ細胞を維持する。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明は、既存の体液性応答を活用することによりワクチンの有効性を増強する、「免疫バンキング」と称するプロセスを提供する。免疫バンキングプロセスは、新たな抗原を、個体における既存の抗体応答により既に認識されている分子マーカーで標識するステップを伴う。この標識されたワクチン成分の認識は、新たなワクチンに対する獲得免疫応答を増強する。かつてのワクチン法は、抗原の大量投与および／または再ワクチン接種（追加接種）に依拠しており、全ての感染因子に対して防護を付与するわけではなかった。免疫バンキングプロセスは、ワクチンの有効性を増強することが可能であるために、これを用いて、現行のワクチンに対する用量の要件を低下させ、製造の費用を軽減し、追加接種に対する必要を低減する（これにより、免疫化の服薬遵守が増大するであろう）ことができる。免疫バンキングプロセスはまた、そのためのワクチンがいまだ存在していない新興の感染因子およびがんに対抗する新たなワクチンの創出も可能とする。このプロセスはまた、研究における使用または臨床的処置のためのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の産生も増強する。したがって、免疫バンキング法は、ヒトおよび動物両方のワクチンの作製者、実験的研究のためのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するバイオテクノロジー企業、ならびに疾患を処置するためのモノクローナル抗体を作製する製薬企業にとって多大な関心事である。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、ワクチン応答の有効性を拡張し、したがって、特定のワクチンに応答する患者の数を増大させる。本発明はまた、新生児におけるワクチンの有効性も増大させる。このプロセスの使用は、複数回にわたるワクチン接種または「追加接種」に対する要請、ワクチン成分の大量投与に対する必要、新生児にワクチン接種することの不可能性、特定の感染因子に対して防護する有効なワクチンの作製における困難、およびがんに対して防護するワクチンの調製における困難を含めた、現行のワクチンの使用における複数の問題を克服する。複数の研究が、抗原（Ａｇ）を免疫細胞の標的とするかまたは免疫細胞に方向付けることを介してワクチンの有効性を増大させれば、これらの問題を解決する一助となることを示唆している。実験室環境では、抗原を免疫細胞の標的とすることが、Ａｇの、細胞特異的リガンドまたは細胞特異的抗体とのコンジュゲーションにより達成されているが、このようなワクチンの大スケールでの作製および開発は、費用がかかり、多大な技術的障害に直面している。したがって、ワクチン抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の標的とする単純で、有効な、費用効率的方策が、最優先の方策である。免疫バンキングプロセスは、ワクチン抗原を免疫細胞の標的とするかまたは免疫細胞に方向付け、したがって、ワクチンに対する免疫応答を増強するのに、あらかじめ存在する体液性免疫応答を使用することにより、この目標を達成する。
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、動物（例えば、ヒト）を、公知の抗原に対して予備免疫化して、初期の免疫応答を発生させる（すなわち、ワクチンを投与し、動物の免疫系に免疫応答を起こさせる）。次いで、予備免疫化された動物に、抗体認識エピトープ（ＡＲＥ）にコンジュゲートされた少なくとも１つの抗原を含む化合物を投与する。免疫バンキングは、動物およびヒトのいずれも、公知の抗原によるワクチン接種下に日常的に置くことに基づいて構築される。特定の実施形態では、免疫バンキングワクチンが、ハプテン化抗原で修飾され、特定の状況では、免疫バンキングワクチンが、それらにコンジュゲートされたさらなる抗原を有する。特定の実施形態では、ＡＲＥが、ポリオＶＰ−１エピトープであって、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのエピトープである。特定の実施形態では、ＡＲＥを、アルファ−Ｇａｌ連結により抗原にコンジュゲートする。
【００２９】
あらかじめ存在する体液性応答を活用することによるワクチンの免疫原性の改善
ワクチンの免疫原性の増大は、現在利用可能なワクチンを改善し、感染に関連する有病率および死亡率を低減する新たなワクチンの開発を増強する。ＡｇのＡＰＣ特異的リガンドまたはＡｂとのコンジュゲーションにより抗原提示細胞（ＡＰＣ）の標的とされたワクチンは、免疫原性の増大を提示する。しかし、このようなワクチンの大スケールでの作製および開発は、費用の障害および技術的障害に直面している。ワクチンＡｇをＡＰＣの標的とする単純で、有効な、費用効率的方策が欠けている。免疫化の成功は、Ｂ細胞の活性化を結果としてもたらし、長寿命のＡｂ産生血漿およびメモリーＢ細胞のクローン的増殖およびこれらへの分化を誘導する。したがって、免疫化された個体は、各々が元のワクチンに由来するＡｇを認識することが可能な、可溶性のＡｂおよびメモリーＢ細胞を有する。本発明者らは、１回の免疫化に由来するＡＲＥを使用して新たなＡｇを修飾し、こうして、既存のメモリーＢ細胞による応答を活用することにより、新たなＡｇをＡＰＣの標的とする。ＡｇをＡＰＣの特異的な標的とすることにより、既存の体液性免疫応答を用い、ワクチンの免疫原性を改善する。これは、ワクチンの有効性の増大、および免疫化の反復に対する必要の軽減の両方を結果としてもたらす。
【００３０】
Ａｂによるフィードバック調節として公知の現象である、あらかじめ存在するＡｂによる新たなＡｂ応答の調節は元来、Ｅｍｉｌ  ｖｏｎ  Ｂｅｒｈｉｎｇにより１８９２年に記載された（Ｈｊｅｌｍ，  Ｆ．ら、２００６年、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、６４巻：１７７〜１８４頁）。実験モデルに応じて、新たなＡｂ応答の調節は、正（増強）の場合もあり、負（抑制）の場合もある（Ｈｅｙｍａｎ，  Ｂ．、２０００年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８巻：７０９〜７３７頁）。完全に理解されているわけではないが、増強の機構は、ＦｃＲ介在性のＡｂ：Ａｇ複合体の取込みの後のＡＰＣによるＡｇのＣＤ４  Ｔ細胞への提示に依存すると考えられている。次いで、これらのＴ細胞は、新たなＡｇ特異的Ｂ細胞に「支援」をもたらし、これにより、Ａｂ応答を増強することが可能である（Ｈｅｙｍａｎ，  Ｂ．、２０００年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８巻：７０９〜７３７頁；  Ｇｅｔａｈｕｎ，  Ａ．およびＢ．  Ｈｅｙｍａｎ、２００６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ、１０４巻：３８〜４５頁）。興味深いことに、Ａｂによるフィードバック調節の、ＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答に対する効果は、１００年以上も前に論じられ、Ｔリンパ球を伴うと考えられてはいるが、決定されていない。本明細書で概観される実験は、あらかじめ存在する体液性応答の、新たなＡｇへのＴ細胞応答の生成に対する効果、および新たな免疫化増強戦略としての潜在的な有用性を評価する。
【００３１】
図１は、ＡＲＥコンジュゲートＡｇに対する細胞性免疫応答の増強について提起される機構（複数可）を示す。マウス群ＩおよびＩＩは、ＡｇＡに対する体液性応答を示す。群Ｉを、Ａｇ−Ａに由来するＡＲＥにコンジュゲートされたＡｇＢで免疫化する。群ＩＩは、非コンジュゲートＡｇ−Ｂに対して免疫化される。ＡＲＥコンジュゲートＡｇＢを認識するＡｇ−Ａ特異的体液性応答は、群Ｉのリンパ球特異的獲得免疫応答を、群ＩＩの免疫応答を超えて増強する。
【００３２】
表１および図２は、ＡＲＥに対してあらかじめ存在する体液性応答が、ＣＤ８  Ｔ細胞による、新規のＡＲＥコンジュゲート免疫原への応答を増強したことを示す。
【００３３】
【表１】
2014512182.tif 000003
新規のＡｇに対する獲得免疫応答の増強における、あらかじめ存在するＡｂ応答の役割
まず、体液性免疫により増強されるＴ細胞応答およびＢ細胞応答の動態を測定する。ワクチンの有効性の尺度である、恒久的なＡｇ特異的Ａｂは、長寿命のＡｂ産生細胞を発生させるＢ細胞の活性化から生じる。Ａｂは、ＦｃＲを発現させる免疫細胞によるその食作用を容易とするＡｇのオプソニン化を部分的に介して免疫的防護をもたらす。内部化されたＡｇは、Ｔリンパ球への提示のためにプロセシングされる。ナイーブＢ細胞のワクチン接種への一次応答を定量化するため、５匹ずつのＣ５７Ｂｌ／６マウス群に、ＴＮＰ−ＫＬＨまたは対照Ａｇ（ＫＬＨ、ＫＬＨ−ＮＰ、ＢＳＡ−ＴＮＰ）を注射した。０日目には、血清を採取した後、コンジュゲートＡｇまたは非ハプテン化Ａｇ（ＫＬＨ、ＫＬＨ−ＮＰ、ＫＬＨ−ＴＮＰ、ＢＳＡ−ＴＮＰ、またはＰＢＳ単独）による腹腔内免疫化を行い、１４日目に追加免疫化を行う。血清は、１４日目から始めて３日ごとに回収し、免疫前血清と併せて、ハプテン特異的ＩｇＭおよびハプテン特異的ＩｇＧならびに担体特異的ＩｇＭおよび担体特異的ＩｇＧについて調べる（下記の「一般的な方法」を参照されたい）。２回目の免疫化の後で、Ａｇ特異的Ａｂが産生されない場合は、２８日目に３回目のＡｇ注射を施した後、再度３日ごとに血清中のＡｇ特異的Ａｂを測定する（図３を参照されたい）。
【００３４】
図２は、あらかじめ存在するＡｂ応答により認識されると、新たなＡｇに対するＴ細胞応答が増強されることを示す（図１のモデル）。免疫応答の増強の動態および表現型を、対照の免疫化を施されたマウスの動態および表現型と比較する。Ａｇ特異的応答のピークレベルおよび体液性応答増強の動態の両方を、応答の非増強と対比して比較するには、ＫＬＨ−ＴＮＰまたは対照Ａｇで予備免疫化されたマウスの腹腔内にＯＶＡ−ＴＮＰを施す。血清は、ＯＶＡによる免疫化の後、２日ごとに回収して、ＯＶＡ特異的Ａｂを評価し（ＥＬＩＳＡ）、血清中のサイトカインをモニタリングする（サイトカインのマルチプレックスモニタリング）。腹腔内免疫化後の、循環中のＡｇ特異的Ｔ細胞のレベルが比較的低いために、気管気管支（ＴＢ）の流入領域リンパ節（ＬＮ）を、１回当たり１群当たり３匹ずつのマウスから単離し、Ｔリンパ球応答を評価するのに用いる。ＬＮ細胞は、ＣＤ４免疫優勢ペプチドおよびＣＤ８免疫優勢ペプチド（表２；下記の「一般的な方法」を参照されたい）を伴うかまたは伴わずに、６時間および２４時間にわたり培養する。６時間にわたりインキュベートされた細胞を、フローサイトメトリーにより、Ｔリンパ球応答を示す系統特異的マーカー（ＣＤ４およびＣＤ８）および細胞内ＩＦＮ−γについて解析する。２４時間の試料に由来する上清を、複数のサイトカインについて、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）マルチプレックス法を用いて解析する。
【００３５】
固有のＡＲＥによる免疫化と新規のＡｇへの曝露との間で、体液性応答の増強を誘導するのに必要とされる最小限の時間を決定する。上記のモデルを用いて、ＯＶＡ−ＴＮＰによる免疫化を、ＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化されたマウスの血清中でＴＮＰ特異的Ａｂが見出された後の１日目に開始する。免疫前マウスを、１５日目に開始してピークの抗ＴＮＰ  Ａｂ応答まで３日目ごとのＯＶＡ−ＴＮＰ注射の回数に基づき、群に分ける。ハプテンの追加注射と、第２のＡｇの注射との間で、応答の増強を観察するのに必要な最小限の時間を決定することにより、最適なワクチン接種戦略を開発する。
応答の増強における、可溶性のＡｇ特異的免疫グロブリンの役割
体液性応答の、Ｔ細胞応答への寄与については明確に理解されていない。Ａｇに対する活性の体液性応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による、元の免疫原にコンジュゲートされた新たなＡｇに対する応答を増強する（図２）。このＴ細胞応答の増強は、Ｉｇ依存性機構：１）Ｉｇ：Ａｇ複合体の、ＡＰＣ（ＤＣおよびｍφ）におけるＦｃＲを介する取込み；および２）Ａｇの、元のＡｇに特異的なメモリーＢ細胞による取込みを介する、Ａｇの取込みの増大に起因する可能性が高い。
【００３６】
分泌されたＩｇの役割を調べるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ハプテン特異的血清または免疫前血清を、修飾蛍光色素ＰＥ（フィコエリトリン）または対照（ＴＮＰ−ＰＥ、ＰＥ、またはＤＰ−ＰＥ；非特異的ハプテン）と共にインキュベートする（図４）。ＷＴマウスおよびＦｃγＲ−／−マウスに由来するＢＭＤＣ（骨髄由来ＤＣ）（Ｔａｋａｉ，  Ｔ．ら、１９９４年、Ｃｅｌｌ、７６巻：５１９〜５２９頁）を、これらのＰＥ分子で処理する。ＢＭＤＣと会合した蛍光Ａｇを、フローサイトメトリーを用いて定量化する。ＯＶＡによる交差提示は、ＭＨＣ：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）特異的Ａｂを用いて、ＢＭＤＣを、ＭＨＣ：ＯＶＡペプチド発現について染色することにより決定する。ｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答の増強における可溶性Ｉｇの役割は、血清に吸収させたＯＶＡをマウスに腹腔内注射し、リンパ球の応答をモニタリングすることにより決定する。血清およびＴＢ−ＬＮを単離し、上記の通りに、ＯＶＡ特異的Ａｂ、サイトカイン、および系統特異的マーカーについて調べる。可溶性Ｉｇの役割は、ＦｃγＲＩおよびＩＩＩが非機能的であり（Ｔａｋａｉ，  Ｔ．ら、１９９４年、Ｃｅｌｌ、７６巻：５１９〜５２９頁）、ＡＰＣによる、ハプテンとコンジュゲートされたＡｇ、またはＡｂでオプソニン化されたＡｇに対する食作用を著しく損なう（Ｗｅｒｎｅｒｓｓｏｎ，  Ｓ．ら、１９９９年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３巻：６１８〜６２２頁）ＦｃγＲ−／−マウスにおける免疫化を介して決定する。逆に、膜ＩｇＭトランスジェニック（ｔｇ）マウスであるＣＢ−１７は、分泌が不可能なｔｇ  ＩｇＭのＨ鎖を保持する（Ｈａｎｎｕｍ，  Ｌ．ら、２０００年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９２巻：９３１〜９４２頁）。ＣＢ−１７は、Ｈ鎖がＩｇ−ｔｇであるので、Ａｂレパートリーは減殺される。しかし、λ  Ｌ鎖を伴うｍＩｇＭ  Ｈ鎖を発現させることにより、ハプテンであるＮＰの認識が付与され、２〜４％のＮＰ特異的Ｂ細胞が結果としてもたらされる（Ｈａｎｎｕｍ，  Ｌ．ら、２０００年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９２巻：９３１〜９４２頁；  Ｌｅｖｉｎｅ，  Ｍ．ら、２０００年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７巻：２７４３〜２７４８頁）。ＣＢ−１７を用いて、体液性の増強免疫化におけるＡＰＣとしてのＡｇ特異的Ｂ細胞の役割を決定する。各場合では、突然変異体マウスおよび対照マウスに、初期のＫＬＨ−ＮＰによる免疫化の後、ＯＶＡ−ＮＰによる免疫化を施し、ＯＶＡ特異的応答を解析する。ＣＢ−１７マウスは、Ａｂを分泌しないので、血清中Ｉｇについては調べない。ＣＢ−１７およびＦｃγＲ−／−マウスのいずれも、市販されている。
【００３７】
新たなＡＲＥ修飾Ａｇによる免疫化の反復の免疫効果の決定
ＡＲＥ  Ａｂの持続的な産生は、調節性Ｂ細胞の分化／増殖、阻害性ＦｃγＲＩＩｂとの相互作用、または免疫複合体のクリアランスを介する、ＡＲＥとコンジュゲートされた新たなＡｇに対する応答の遮蔽に起因して有害でありうる。これらの実験により、共時的または逐次的な、ＡＲＥとコンジュゲートされた新たなＡｇへの体液性応答の増強に対する潜在的な限界が同定される（図５）。まず、マウスをＫＬＨ−ＴＮＰに対して免疫化し（上記の通りに）、次いで、Ｔ細胞応答を最大とするように決定された時点でＯＶＡ−ＴＮＰに対して免疫化する。次に、ＢＳＡ−ＴＮＰを免疫原とした後で、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）−ＴＮＰを免疫原とする。新たな各Ａｇの後で、施された全ての免疫原に対するＴ細胞応答をモニタリングし、３日ごとの間隔でナイーブマウスおよび対照の免疫化マウスと比較する。ＯＶＡに対するＡｇ特異的Ｔ細胞応答は、規定されたＭＨＣクラスＩペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドを用いる細胞内染色（ＩＣＳ）により決定されるが、Ｂ６マウスのＰＣＣおよびＨＥＬについての免疫優勢ペプチドは未知であるので、ＰＣＣ特異的Ｔ細胞およびＨＥＬ特異的Ｔ細胞の計数には、Ａｇ提示ＢＭＤＣを用いる。多価ワクチンは、１回の投与で複数の病原体に対する防護を付与する。複数のＡＲＥコンジュゲートＡｇを同時に施す場合に、全てのＡＲＥ修飾Ａｇに対する獲得免疫の増強が観察されるのかどうかを決定する。ＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化したら、マウスに、ＯＶＡ−ＴＮＰ、ＨＥＬ−ＴＮＰ、およびＰＣＣ−ＴＮＰを含有する多価ワクチンを施す。対照には、非コンジュゲートＯＶＡワクチン、非コンジュゲートＨＥＬワクチン、および非コンジュゲートＰＣＣワクチンを施す。応答のＡＲＥに依存しない増幅についてのさらなる対照として、ＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化されたマウス群に、ＯＶＡ−ＴＮＰ、ＰＣＣ−ＴＮＰ、および非コンジュゲートＨＥＬを含有する多価ワクチンを施す。この群に由来するＨＥＬ特異的免疫応答を他の２群と比較することにより、多価ＡＲＥコンジュゲートワクチンを施すとき、ＡＲＥに依存しない獲得免疫の増強がなされるのかどうかが示される。
【００３８】
上記の実験では、ＡＲＥコンジュゲートＡｇを認識するマウスと、ＡＲＥコンジュゲートＡｇを認識しないマウスとの間で、獲得免疫応答が比較される。図２は、あらかじめ存在するＡｂ応答により、新たなＡｇコンジュゲートＡＲＥに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答が増強されることを示す。
【００３９】
ＡＲＥ修飾ペプチドワクチンの有効性の決定
ＡＲＥ戦略は、ハプテン：担体コンジュゲートによる免疫化または事前の免疫化により認識されるエピトープを用いる免疫化を要請する。多くの小児用ワクチンのＩｇ免疫優勢エピトープが公知であり、新たなＡｇにコンジュゲートされるＡＲＥとしての可能性を有する。以下の実験では、ＡＲＥコンジュゲートワクチンの防護レベルを、非ＡＲＥワクチンと対比して調べ、関与性のヒトＡＲＥの有用性をハプテンと対比して調べる。
【００４０】
ＡＲＥ修飾インフルエンザに関連するペプチドの免疫原性：上記のモデルを用いて、マウスを、ＫＬＨ、ＫＬＨ−ＴＮＰ、ＫＬＨ−破傷風トキソイド（ＴＴ）、またはＴＴ単独で免疫化する。次いで、各群を分け、ＴＮＰコンジュゲートＡ型インフルエンザタンパク質またはＴＴコンジュゲートＡ型インフルエンザタンパク質で免疫化する。次いで、相対免疫応答をインフルエンザ特異的Ａｂの力価（ＥＬＩＳＡ）およびＡｇ特異的Ｔ細胞応答により測定する。
【００４１】
インフルエンザ感染に対するワクチン誘導型防護：致死性の経鼻インフルエンザ感染からの防護について、従来のワクチン接種と比較したＡＲＥ修飾によるワクチン接種が検討される。マウス１匹当たり１．０×ＬＤ５０のＨ１Ｎ１を鼻腔内送達する。２日おきに、インフルエンザＮＰ  Ａｇに由来する免疫優勢ペプチドとの相互作用の後、ＩＣＳによりＴＢ−ＬＮに由来するＴ細胞をモニタリングする（「方法」）。肺における組織１ｇ当たりのウイルス力価を計数する（Ｌｅｇｇｅ，  Ｋ．  Ｌ．およびＴ．  Ｊ．  Ｂｒａｃｉａｌｅ．  ２００５年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２３巻：６４９〜６５９頁）。獲得免疫応答の増強を、ＮＰ特異的Ｔ細胞活性およびＡｂにより測定し、ＴＮＰコンジュゲートＫＬＨまたはＴＴコンジュゲートＫＬＨで免疫化されたマウスにおいてこれを予測する。
【００４２】
免疫化の反復に対する必要の軽減におけるＡＲＥ戦略の有効性の決定
ＡＲＥ修飾により誘導される免疫の増強は、追加接種に対する必要を低減する可能性があり、したがって、免疫化の服薬遵守の向上をもたらしうる。これは、個体がワクチン接種のために長距離を旅行することが多い開発途上世界では特に重要である。以下の実験では、従来の追加免疫化により発生する免疫応答を、ＡＲＥ修飾ワクチンを用いる単回の免疫化により発生する免疫応答と比較する。Ｂ型肝炎表面Ａｇ（ＨＢｓＡｇ）を、免疫原として用いる。Ｂ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｂ）ワクチン（ＨＢｓＡｇを含有する）による免疫化は、３回の注射（０、３０、および１８０日目）を要請する。注射レジメンに対する服薬遵守は、ワクチン接種間の期間に部分的に起因して、約６８％である（Ｔｒｅｖｉｓａｎ，  Ａ．ら、２００６年、Ａｍ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、３４巻：４６５〜４６６頁）。
【００４３】
マウスを、上記の通りにＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化する。血清転換の後、マウスに、ハプテン化ＨＢｓＡｇワクチンまたは等量の非ハプテン化ＨＢｓＡｇワクチンを施す。マウスを、免疫化後５日ごとに、ＨＢｓＡｇに対するＢ細胞応答およびＴ細胞応答についてモニタリングする。ＣＤ４  Ｔ細胞応答は、全ＡｇでパルスしたＢＭＤＣに応答するＩＣＳによりモニタリングする。ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、とりわけ、ＭＨＣクラスＩ特異的ペプチドを用いて測定する。
【００４４】
ＡＲＥ修飾Ｈｅｐ  Ｂワクチンの、Ｔ細胞応答に対する効果についての情報も重要であるが、Ａｂ力価が、Ｈｅｐ  Ｂ感染に対する防護と相関するので、Ａｇ特異的Ａｂの産生に重点を置く。
【００４５】
従来のＨｅｐ  Ｂ免疫化で必要な３回の免疫化とは対照的に、単回のＡＲＥコンジュゲートワクチンの後で、測定可能なＨｅｐ  Ｂ特異的体液性応答およびＨｅｐ  Ｂ特異的細胞性応答が期待される。１〜２回にわたるＡＲＥコンジュゲートＨｅｐ  Ｂワクチンの接種後における獲得免疫のレベルを、従来の戦略による３回のワクチン接種の各々により発生する応答と比較する。
【００４６】
応答の増強における可溶性のＡｇ特異的免疫グロブリンの役割
略述すると、ＫＬＨまたはＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化されたマウスに由来する血清を、ＴＮＰコンジュゲートオボアルブミンと共にインキュベートした（図７）。結果として得られる、オボアルブミン−ＴＮＰおよびマウス血清、またはオボアルブミン−ＴＮＰ：抗体複合体を含有する混合物を、ナイーブマウス（１群当たり３匹ずつ）に注射した。オボアルブミン注射の７日後、ＯＶＡ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の百分率を、細胞内サイトカインの染色により決定した。ＡＲＥとしてのＴＮＰを用いる免疫複合体の注射により、ワクチンに対する細胞性応答が増強されることに注意されたい。
【００４７】
ＡＲＥ修飾ペプチドワクチンの有効性の決定
ＡＲＥ特異的抗体を伴うマウスは、ワクチン接種およびインフルエンザによる感作の後で有病率の低下を示す（図８）。マウスにモックワクチン接種する（ＰＢＳを伴うミョウバン）か、またはヒトワクチン（ミョウバン中のＨＢｓＡｇ）を用いてマウスをＢ型肝炎に対して免疫化した。被験群においてＨＢｓＡｇに血清転換したら、両群のマウスに、肝炎ＡＲＥ標識インフルエンザ核タンパク質ワクチン（ＨｅｐＰｅｐ（インフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）に共有結合によって連結された））を施した。次いで、両群を悪性インフルエンザで感作し、有病率を体重減少により決定した。ＨｅｐＰｅｐ−ＡＲＥ標識ワクチン群は、対照群より低い有病率を示す。
【００４８】
ＡＲＥ−Ａｇコンジュゲート化合物
本発明は、ＡＲＥと抗原とのコンジュゲートであって、場合によって、リンカー部分により作動可能に連結した化合物を提供する。
【００４９】
Ａ．抗体認識エレメント（ＡＲＥ）
ＡＲＥ（抗体認識エレメント）とは、任意の免疫原のＢ細胞エピトープである。市販品として使用されるには、ＡＲＥが大規模な潜在的レシピエントのプールにより認識されることが重要である。したがって、一般に用いられる認識エレメントであって、各レシピエント群について、事前のワクチン接種または自然発生の感染に由来する認識エレメントに由来するＡＲＥが最良である。
【００５０】
本発明のＡＲＥは、ペプチドである。一実施形態では、ＡＲＥが、ＩＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡ（配列番号１）を含む、約１１〜２８アミノ酸の長さのポリオＶＰ−１エピトープである。別の実施形態では、ＡＲＥが、このＨＢｓＡｇエピトープの変異体であって、Ｎ末端における、ＲＡＧＧ（配列番号１０）の、このアミノ酸配列への付加を含有する変異体である。別の実施形態では、ＡＲＥが、スペーサーまたは反応性基として用いられる他のアミノ酸を含有する点で、ＨＢｓＡｇエピトープの変異体である。
【００５１】
Ｂ．抗原
ＡＲＥに連結された抗原は、細菌、真菌、寄生虫、プリオンおよびウイルス、またはがん抗原など、公知のヒト感染因子および動物感染因子のタンパク質性成分を包含する。ＡＲＥに連結されうる抗原の例は、以下を含めた、ヒトに影響を及ぼす多様な感染性疾患に由来する抗原である。
細菌性感染性疾患
炭疽病
細菌性髄膜炎
ボツリヌス中毒症
ブルセラ病
カンピロバクター感染症
ネコ引っ掻き病
コレラ
ジフテリア
流行性発疹チフス
淋病
膿痂疹
レジオネラ症
らい病（ハンセン病）
レプトスピラ症
リステリア症
ライム病
類鼻疽症
ＭＲＳＡ感染症
ノカルジア症（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓまたはＮｏｃａｒｄｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）
百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））
腺ペスト
肺炎球菌性肺炎
オウム病
Ｑ熱
ロッキー山紅斑熱
サルモネラ中毒
猩紅熱
細菌性赤痢
梅毒
破傷風
トラコーマ
結核
野兎病
腸チフス
発疹チフス
尿路感染症：膀胱炎または腎盂腎炎
真菌性感染性疾患
アスペルギルス症：アレルギー性気管支肺アスペルギルス症もしくは肺アスペルギルス腫または侵襲性アスペルギルス症
ブラストミセス症
カンジダ症
コクシジオイデス症
クリプトコッカス症
ヒストプラスマ症
足白癬
寄生性感染性疾患
アフリカトリパノソーマ症
アメーバ症
回虫症
バベシア症
チャーガス病
肝吸虫症
クリプトスポリジウム症
神経嚢虫症
裂頭条虫症
メジナ虫症
エキノコックス症
蟯虫症
肝蛭症
肥大吸虫症
フィラリア症
自由棲息アメーバ感染症（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉおよびＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ属により引き起こされる）
ジアルジア症
顎口虫症
小形条虫症（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａまたはＨｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）
イソスポーラ症
マラリア
メタゴニムス症
ハエ蛆症
オンコセルカ症
シラミ寄生症
疥癬
条虫症
トキソカラ症
トキソプラズマ症
施毛虫症
鞭虫症
トリコモナス症
トリパノソーマ症
プリオン感染性疾患
アルパーズ症候群
クロイツフェルト−ヤコブ病
致死性家族性不眠症
クールー病
伝染性海綿状脳症
ウイルス性感染性疾患
ＡＩＤＳ
水痘（ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ（ｖａｒｉｃｅｌｌａ））
風邪（急性ウイルス性鼻咽頭炎）
サイトメガロウイルス感染
コロラドダニ熱
デング熱
エボラ出血熱
手足口病（Ａ型コックサッキーウイルス）
肝炎
単純ヘルペス疱疹
帯状疱疹
ＨＰＶ
インフルエンザ（流感）
ラッサ熱
はしか
マールブルグ出血熱
感染性単核球症
おたふく風邪
ポリオウイルス感染症
進行性多巣性白質脳症
狂犬病
風疹
ＳＡＲＳ
天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ（ｖａｒｉｏｌａ））：Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒおよびＶａｒｉｏｌａ  ｍｉｎｏｒにより引き起こされる
ウイルス性脳炎
ウイルス性胃腸炎
ウイルス性髄膜炎
ウイルス性肺炎
ウェストナイル病
黄熱病  。
【００５２】
本発明の抗原はまた、獣医科動物由来でもありうる。例えば、「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、Ｈｉｒｓｈ，  ＤＣ、ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，  ＮＪ、およびＷａｌｋｅｒ，  ＲＬ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【００５３】
特定の実施形態では、Ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質受託番号＃ＡＢＩ３６００３である、Ａ型インフルエンザＨ５Ｎ１亜型（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））に由来するヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を、抗原として用いる。
【００５４】
Ｃ．カップリング剤／リンカー
ＡＲＥ−抗原カップリングは、従来の慣例に従い、直接的に、または化学的リンカーを用いて行う。
【００５５】
特定の実施形態では、ＡＲＥと抗原分子とを、化学架橋形成剤を用いて共有結合によって連結する。多くの異なる架橋形成剤を用いることができる。特定の実施形態では、架橋形成剤が、約４００〜１０００ドルトンであるか、または約３〜１２オングストロームの長さである。本発明で有用な架橋剤は、それらが、２つの分子であるＡＲＥを抗原分子に共有結合によって接合しうるように、少なくとも二価でなければならない。特定の実施形態では、架橋剤が、トリス−スクシンイミジルアミノ三酢酸（ＴＳＡＴ）；ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）；ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）；ビス（２−［スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ］エチルスルホン）（ＢＯＳＣＯＥＳ）（ｂｉｓ（２−［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｌｏｘｙ］ｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）（ＢＯＳＣＯＥＳ））；ビス（２−［スルホスクシンイミジルオキシカルボニルオキシ］エチルスルホン）（スルホ−ＢＯＳＣＯＥＳ）（ｂｉｓ（２−［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｌｏｘｙ］ｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）（Ｓｕｌｆｏ−ＢＯＳＣＯＥＳ））；エチレングリコールビス−（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）；エチレングリコールビス−（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＢＳ）；またはジメチル３，３’−ジチオビス−プロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）でありうる。特定の実施形態では、架橋剤が、ＢＳ３、スルホ−Ｂｏｓｃｏｅｓ、ＥＧＳ、スルホ−ＥＢＳ、またはＤＴＢＰなど、二価である。
【００５６】
当技術分野では、架橋剤を付着させるための方法が周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９５年、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７２８頁；Ｗｏｎｇ、１９９１年「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、３４０頁；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、１９９２年、「Ａ  ｂｒｉｅｆ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｙｅｓ，  ｈａｐｔｅｎｓ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、３巻：２〜１３頁を参照されたい）。
【００５７】
適切なリンカーの例には、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、および／またはスルホ−ＭＢＳ（ＭＢＳの水溶性の類似体）などが含まれる。カップリング剤／リンカーの例は、ワールドワイドウェブのｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｗｈｉｔｅ＿ｐａｐｅｒｓ／ｐｅｐｔｉｄｅおよびｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍおよびｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｒｏｗｓｅ．ｃｆｍ？ｆｌｄＩＤ＝０２０３０６において詳細に記載されている。
【００５８】
一般的な方法および手順：
Ａｇのコンジュゲーション：ＫＬＨ−ＴＮＰおよびＯＶＡ−ＴＮＰは、市販されている（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。さらなるコンジュゲートは、ワクチンＡｇの存在下でＴＮＰ−ｅ−アミノカプロイル−Ｏ−Ｓｕ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）を用いる還元により作製する。Ｔ細胞活性は、ＩＣＳによりモニタリングする。腹腔内流入領域ＴＢ−ＬＮを、上記の通りに採取する。ＬＮをホモジナイズし、ＬＮ１つ当たりの細胞数を数える。細胞懸濁液を、ブレフェルジンＡの存在下でＡｇ特異的ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチド（表２）を伴うかまたは伴わずに処理し、６時間にわたりインキュベートする。
【００５９】
【表２】
2014512182.tif 000004
試料をＴ細胞サブセットの表面発現マーカーについて染色し、固定し、透過処理し、細胞内ＩＦＮ−γについて染色する。フローサイトメトリーにより、ＩＦＮ−γ＋（Ａｇ応答性）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞の％を決定する（Ｋｒａｕｓ，  Ｚ．  Ｊ．ら、２００８年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８１巻：７８００〜７８０９頁）。ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの免疫優勢ペプチドが未知（表２）の場合は、同系のＢＭＤＣを発生させ、ＡＰＣとして用いる（Ｂｒｅｃｋｐｏｔ，  Ｋ．ら、２００４年、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ、６巻：１１７５〜１１８８頁；Ｓｕｄｏｗｅ，  Ｓ．ら、２００３年、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、８巻：５６７〜５７５頁；Ｂｒｏｓ，  Ｍ．ら、２００９年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４３巻：１３〜２０頁）。Ａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を刺激するには、ＢＭＤＣをＡｇで２４時間にわたりパルスし、ＢＭＤＣがＡｇをプロセシングし、ＭＨＣクラスＩＩを介して提示することを可能とする。ＣＤ８＋Ｔ細胞のＡｇは、細胞内の供給源からの発生がより効率的であるために、ＭＨＣクラスＩのローディングは、ＢＭＤＣを、所望のＡｇをコードするＤＮＡでトランスフェクトすることにより達成される。トランスフェクション後、ＢＭＤＣに、Ａｇを、３６時間にわたり産生、プロセシング、および提示させる。次いで、これらのＢＭＤＣを、パルスされなかったＢＭＤＣと併せて、ＴＢ−ＬＮに由来するＴ細胞を刺激するためのＡＰＣとして用いる。
【００６０】
体液性応答の解析は、Ａｇ特異的な血清中Ａｂを測定することにより実施する。Ａｇ特異的ＥＬＩＳＡは、既に記載されている通りである（Ｘｉｅ，  Ｐ．ら、２００７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２７巻：２５３〜２６７頁；Ｓｔｕｎｚ，  Ｌ．ら、２００４年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２１巻：２５５〜２６６頁）。マウスＩｇＭおよびマウスＩｇＧによる２０のＡｂを用いて、Ａｇ特異的な血清中Ａｂを検出する。ＯＤの読取りがバックグラウンドを＞２倍上回れば、陽性と考えられる（Ｘｉｅ，  Ｐ．ら、２００７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２７巻：２５３〜２６７頁；Ｓｔｕｎｚ，  Ｌ．ら、２００４年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２１巻：２５５〜２６６頁）。サイトカインは、マルチプレックスのＬｕｍｉｎｅｘを用いて、血清中および細胞培養物中で測定する。血清試料は、ＬＮ採取時に回収する。ＴＢ−ＬＮから単離された細胞は、記載される通りにペプチドで刺激する。２４時間後に上清を回収し、マルチプレックスのサイトカインアッセイにかける。
【００６１】
免疫バンキング
現行のアジュバント系は、炎症、組織損傷、なおまたは自己免疫疾患様症候群を結果としてもたらしうる、全体的で非特異的な免疫活性を誘導する。免疫バンキングプロセスの新規の利点の一つは、あらかじめ存在する抗体の、頑健な免疫応答を誘導することが可能な内因性アジュバントとしての使用である。しかし、現行のアジュバントとは対照的に、この応答は、免疫化抗原に対して高度に特異的であり、全体的で、非特異的な免疫の誘発を結果としてもたらさない。免疫バンキングが活用する、あらかじめ存在する免疫応答は、外来の生体分子に対する天然の防御として、レシピエントにより創出および保持されるために、この技法は、アジュバントによる副作用を低減し、レシピエントによる忍容が良好である。
【００６２】
一例では、免疫バンキングにより、ＡＲＥハプテンであるＴＮＰに対してあらかじめ存在するＡｂ応答が活用され、インフルエンザにより誘導される死亡に対する防護がもたらされた。ミョウバン単独、ミョウバン中のＫＬＨ、またはミョウバン中のＫＬＨ−ＴＮＰでワクチン接種されたマウスを、インフルエンザのＴＮＰ−ハプテン化組換えヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）を用いて、インフルエンザに対して免疫化した（図６）。次いで、マウスに致死性のインフルエンザ投与で感染させ、疾患についてモニタリングした。ＫＬＨ−ＴＮＰで免疫化されたマウスは、生存が０％の対照群と比較して６６％の生存率を示した。
【００６３】
ＡＲＥの抗原への連結
特定の実施形態では、ＶＰ−１によるＡＲＥを、ＨＢｓＡｇに化学的に連結し、免疫複合体として投与した。言い換えれば、ＨＢｓＡｇをＶＰ−１によるＡＲＥに化学的に連結し、次いで、ＡＲＥを認識する抗体と混合した。次いで、ＡＲＥで標識されたＨＢｓＡｇ＋抗体の複合体をワクチンとして注射し、抗体を伴わないＨＢｓＡｇと比較した。結果は、ＨＢｓＡｇ特異的抗体の産生により測定される通り、ＨＢｓＡｇに対する頑健な免疫応答であった。
【００６４】
特定の実施形態では、ＡＲＥを、組換えＤＮＡ法を介して抗原に連結した、すなわち、構築物を、ＡＲＥとして有効に機能する融合タンパク質として作製した。
【００６５】
本発明のワクチン
特定の実施形態では、本発明は、感染因子のコロニー形成および／もしくは感染に対して哺乳動物を防護するか、またはがんを処置するのに用いるためのワクチンを提供する。
【００６６】
「ハプテン」とは、それ自体では免疫応答を誘発することが可能でないが、担体分子に付着させると免疫応答を誘発する、低分子量の有機化合物を指す。本発明のコンジュゲート化合物、組成物、および方法において用いられる例示的なハプテンには、薬物、ホルモン、および毒素が含まれるが、これらの特殊なハプテンに限定されない。
【００６７】
「エピトープ」という用語は、個別の抗体またはＴ細胞受容体による認識の基本エレメントまたは最小単位を指し、したがって、前記抗体またはＴ細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域、または分子構造を指す。抗原が多数のエピトープからなる可能性があるのに対し、ハプテンが保有しうるエピトープは典型的に少数である。本明細書で用いられる「〜に本質的に対応する」とは、天然のエピトープが発生させる応答と少なくとも実質的に同等となる免疫応答を誘発するエピトープを指す。組成物またはワクチンに対する免疫応答とは、宿主における、対象のポリペプチドまたはワクチンに対する細胞性免疫応答および／または抗体介在性免疫応答の発生である。通常、このような応答は、とりわけ、対象の組成物中またはワクチン中に包含される１または複数の抗原を指向する、対象の産生する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞からなる。本発明のワクチンはまた、免疫応答を増強することが公知である有効量の免疫学的アジュバントも包含しうる。「有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な量を指す。組成物の有効量とは、この選択された結果を達成する量であり、このような量は、当業者により日常的な対象として決定されうるであろう。例えば、免疫系の欠損を処置するための有効量は、抗原への曝露時における抗原特異的免疫応答の発生を結果としてもたらす、免疫系の活性化を引き起こすのに必要な量でありうるだろう。この用語はまた、「十分量」とも同義である。任意の特定の適用のための有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、対象のサイズ、および／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じて変化しうる。当業者は、不要な実験を必要とすることなく、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００６８】
本明細書で用いられる「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激剤または宿主における貯留の生成を可能とする物質であって、本発明のワクチンおよび医薬組成物のそれぞれと組み合わされると、免疫応答のなおより大きな増強をもたらしうる刺激剤または物質を指す。多様なアジュバントを用いることができる。例には、フロイントの完全アジュバントおよび不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、ならびに修飾ムラミルジペプチドが含まれる。さらなるアジュバントは、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなど、潜在的に有用なヒトアジュバントである。当技術分野ではまた、このようなアジュバントも周知である。本発明の組成物と共に投与しうるさらなるアジュバントには、モノホスホリル脂質による免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント法が含まれるがこれらに限定されない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物も含みうる。
【００６９】
対象を免疫化するには、組成物を、通常適切なビヒクルによる筋内注射または皮下注射を介して非経口投与する。しかしまた、経口送達、鼻腔内送達、または皮内送達など、他の投与方式も許容可能である。
【００７０】
ワクチン処方物は、ビヒクル中に有効量の有効成分を含有し、有効量は当業者により容易に決定されるであろう。有効成分は典型的に、組成物の約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲であることも可能であり、適切な場合は、より高濃度または低濃度であることも可能である。投与される量は、ワクチン接種について考慮される動物対象またはヒト対象の年齢、体重、および全身状態などの因子に依存する。投与される量はまた、動物の免疫系が抗体を合成する能力、および所望の防護の程度にも依存する。有効用量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を介して、当業者により容易に確立されうる。対象は、バイオフィルムペプチドまたはその断片を、１回または複数回の投与で投与することにより免疫化する。複数回の投与は、対象の細菌に対する免疫状態を維持することが要請されるのに応じて投与することができる。
【００７１】
鼻腔内処方物は、鼻腔粘膜に対する刺激を引き起こしたり、線毛機能をそれほど攪乱したりしないビヒクルを包含しうる。水、生理食塩水溶液、または他の公知の物質などの希釈剤を、対象の発明と共に使用することができる。鼻腔用処方物はまた、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどであるがこれらに限定されない防腐剤も含有しうる。界面活性剤を存在させて、対象タンパク質の鼻腔粘膜による吸収を増強することができる。
【００７２】
経口液体調製物は、例えば、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシル剤の形態にある場合もあり、使用前に水または他の適切なビヒクルで再構成するための錠剤形態中または生成物中に乾燥させて存在させる場合もある。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（可食油を包含しうる）、または防腐剤など、従来の添加剤を含有しうる。
【００７３】
ワクチンを調製するには、精製組成物を、単離し、乾燥凍結させ、安定化させることができる。次いで、組成物を、適切な濃度に調整し、場合によって、適切なワクチンアジュバントと組み合わせ、使用のためにパッケージ化することができる。適切なアジュバントには、界面活性剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシル−グリセロール、およびプルロニックポリオール；ポリアニオン（ｐｏｌａｎｉｏｎ）、例えば、ピラン、デキストラン硫酸塩、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、Ｃａｒｂｏｐｏｌ；ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン（ａｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、タフトシン、油性エマルジョン、ミョウバン、およびこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。他の潜在的なアジュバントには、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素またはコレラ毒素のＢペプチドサブユニットが含まれる（ＭｃＧｈｅｅ，  Ｊ．Ｒ．ら、「Ｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｓｅｍ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．、３０巻：３〜１５頁（１９９３年））。最後に、免疫原性生成物を、ワクチン処方物において用いられるリポソームに組み込むこともでき、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または他のポリマーなどのタンパク質にコンジュゲートすることもできる。
【００７４】
定義
「結合した」とは、共有結合、例えば、化学的カップリングによる場合もあり、非共有結合、例えば、イオン的相互作用、疎水性相互作用、水素結合の場合もある、結合または付着を指す。共有結合による結合は、例えば、エステル結合、エーテル結合、ホスホエステル結合、アミド結合、ペプチド結合、イミド結合、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合などでありうる。「結合した」という用語はより広義であり、「コンジュゲートした」、「カップリングされた」、「融合した」、および「付着した」などの用語を包含する。
【００７５】
本明細書では、「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語が互換的に用いられる。本発明は、単離されたタンパク質組成物または実質的に精製されたタンパク質組成物を包摂する。本発明の文脈では、「単離」ポリペプチドまたは「精製」ポリペプチドが、その天然の環境とは別に存在するポリペプチドであり、したがって、天然の生成物ではない。ポリペプチドは、精製形態で存在する場合もあり、例えば、トランスジェニック宿主細胞など、非天然の環境に存在する場合もある。例えば、「単離」タンパク質もしくは「精製」タンパク質、またはその生物学的活性部分は、他の細胞内物質を実質的に含まないか、あるいは、組換え法により産生される場合は培養培地を実質的に含まないか、または、化学合成される場合は、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。細胞内物質を実質的に含まないタンパク質は、夾雑タンパク質が約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満であるタンパク質またはポリペプチドの調製物を包含する。本発明のタンパク質またはその生物学的活性部分を、組換えにより作製する場合、培養培地が占める化学的前駆体または対象のタンパク質以外の化学物質は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満であることが好ましい。本発明にはまた、開示されるタンパク質の断片および変異体またはこれによりコードされる部分長タンパク質も包摂される。「断片」または「部分」とは、ポリペプチドまたはタンパク質の全長以下のアミノ酸配列を意味する。
【００７６】
「自然発生の」とは、人工的に産生されるのとは異なるものとして天然で見出されうる対象について記載するのに用いられる。例えば、生物（ウイルスを含めた）内に存在するタンパク質配列またはヌクレオチド配列であって、天然の供給源から単離することが可能であり、実験室において人為により意図的に修飾されていないタンパク質配列またはヌクレオチド配列は、自然発生のタンパク質配列またはヌクレオチド配列である。
【００７７】
分子の「変異体」とは、天然分子の配列と実質的に類似する配列である。
【００７８】
「野生型」とは、正常な遺伝子、または天然で公知の突然変異を伴わずに見出される生物を指す。
【００７９】
「作動可能に連結した」とは、１つの分子の機能が他の分子の機能の影響を受けるような分子の会合を指す。
【００８０】
ペプチドの文脈における「実質的同一性」という用語は、ペプチドが、指定された比較域にわたり、基準配列に対する少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、または９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を伴う配列を含むことを示す。最適なアライメントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁（１９７０年）による、相同性アライメントのアルゴリズムを用いて実行する。２つのペプチド配列が実質的に同一であることの表徴は、１つのペプチドが、第２のペプチドに対する抗体と免疫学的に反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的置換だけによって異なる場合、あるペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。
【００８１】
配列を比較するには典型的に、１つの配列が、これに照らして被験配列を比較する基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合は、被験配列および基準配列をコンピュータに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、被験配列（複数可）について、基準配列と比べた配列同一性百分率を、指定されたプログラムパラメータに基づき計算する。
【００８２】
「変異体」ポリペプチドとは、１もしくは複数のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）、もしくは天然タンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端への付加；天然タンパク質中の１もしくは複数の部位における１もしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加；または天然タンパク質中の１もしくは複数の部位における１もしくは複数のアミノ酸の置換を介して、天然タンパク質に由来するポリペプチドを意図する。このような変異体は、例えば、遺伝子多型から生じる場合もあり、人為的な操作から生じる場合もある。当技術分野では、このような操作のための方法が一般に公知である。
【００８３】
したがって、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、および挿入を含めた多様な方策により改変することができる。当技術分野では、このような操作のための方法が一般に公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列の変異体は、ＤＮＡ中の突然変異により調製することができる。当技術分野では、突然変異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法が周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：４８８頁（１９８５年）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４巻：３６７頁（１９８７年）；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．」（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９８３年）、ならびにこれらにおいて引用される参考文献を参照されたい。対象のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についての指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら、「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、１９７８年）によるモデルにおいて見出すことができる。１つのアミノ酸の、類似する特性を有する別のアミノ酸との交換など、保存的置換が好ましい。
【００８４】
したがって、本発明のポリペプチドは、自然発生のタンパク質のほか、それらの変異体および修飾形態も包摂する。このような変異体は、所望の活性を依然として保有するものとする。本明細書に包摂されるポリペプチド配列の欠失、挿入、および置換は、ポリペプチドの特徴において根本的な変化をもたらすことが期待されるわけではない。しかし、それを進めてゆく中で、置換、欠失、または挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、これらの効果が日常的なスクリーニングアッセイにより評価されることを察知するであろう。
【００８５】
コードされる配列において、単一のアミノ酸または低比率のアミノ酸（典型的に、５％未満、より典型的に、１％未満）を変化させるか、付加するか、または欠失させる個別の置換、欠失、または付加は、変化が、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす「保存的修飾変異」である。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換の表が周知である。以下の５つの群の各々が、互いに保存的置換されたアミノ酸を含有する：脂肪族アミノ酸：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族アミノ酸：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄を含有するアミノ酸：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性アミノ酸：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。加えてまた、コードされる配列において、単一のアミノ酸または低比率のアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる個別の置換、欠失、または付加も「保存的修飾変異」である。
【００８６】
本明細書で用いられる「治療剤」という用語は、哺乳動物レシピエントに対して有益な効果を及ぼす任意の薬剤または物質を指す。したがって、「治療剤」は、核酸成分またはタンパク質成分を有する治療的分子および予防的分子の両方を包摂する。
【００８７】
本明細書で用いられる「処置する」とは、所与の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善し、所与の疾患または状態を治癒させ、かつ／または所与の疾患または状態の発症を防止することを指す。
【００８８】
「抗原」とは、抗体が結合することの可能な分子を指す。加えて、抗原は、免疫系により認識されることも可能であり、かつ／またはＢリンパ球および／もしくはＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答および／もしくは細胞性免疫応答を誘導することも可能である。抗原は、１または複数のエピトープ（Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープ）を有しうる。本明細書で用いられる抗原はまた、複数の個別の抗原の混合物でもありうる。「抗原決定基」とは、とりわけ、Ｂリンパ球またはＴリンパ球により認識される抗原の部分を指す。抗原決定基に応答するＢリンパ球が抗体を産生するのに対し、Ｔリンパ球は、増殖し、細胞性免疫および／または体液性免疫を媒介するのに極めて重要なエフェクター機能を確立することにより抗原決定基に応答する。
【００８９】
本明細書で用いられる、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合することが可能な分子を指す。この用語は、全抗体および単鎖抗体を含めたその抗原結合断片を包含する。特定の実施形態では、抗体が、ヒト抗原に結合する抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインを含む断片が含まれるがこれらに限定されない。抗体は、鳥類（例えば、ニワトリ）および哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなど）を含めた任意の動物に由来しうる。本明細書で用いられる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または１もしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックの動物であって、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号において記載される通り、内因性免疫グロブリンを発現させない動物から単離された抗体を包含する。
【００９０】
本明細書で用いられる、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の群、すなわち、群を構成する抗体が、少量で存在する自然発生の突然変異体を除いて均一な抗体群から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位と相互作用する。さらに、各モノクローナル抗体は、様々な抗原決定基に対する多様な抗体を含有することが典型的である一般的なポリクローナル抗体調製物と比較して、抗原上の単一の抗原決定基（エピトープ）を標的とする。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンと夾雑しないハイブリドーマ培養物から産生される点でも有利である。
【００９１】
「モノクローナル」という形容詞は、抗体の実質的に均一な群から得られる抗体の特徴を示すものであり、特定の方法により産生される抗体を特定するわけではない。例えば、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁、１９７５年）により作製することもでき、組換え法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することもできる。本発明において用いられるモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁、１９９１年；Ｍａｒｋｓら、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁、１９９１年）からも単離することができる。本発明のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）であって、重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の分子種または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに由来し、これらの鎖の残りの部分が、別の分子種、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに由来する「キメラ」抗体を含む。さらに本発明にはまた、突然変異体抗体およびその抗体断片も含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁、１９８４年）。
【００９２】
本明細書で用いられる「突然変異体抗体」という用語は、変異体のアミノ酸配列であって、１または複数のアミノ酸残基が改変されているアミノ酸配列を含む抗体を指す。例えば、抗体の可変領域を修飾して、抗原への結合など、その生物学的特性を改善することができる。このような修飾は、部位指向突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：４８８頁（１９８５年）を参照されたい）、ＰＣＲベースの突然変異誘発、カセットによる突然変異誘発などにより達成することができる。このような突然変異体は、抗体の重鎖または軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５％、その上より好ましくは、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。本明細書で用いられる「配列同一性」という用語は、配列がアライメントされ、必要に応じて配列同一性を最大化するようにギャップが適切に導入された後で決定される、抗体の元のアミノ酸配列における残基と同一な残基の百分率として定義される。
【００９３】
とりわけ、１つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の、別の配列との同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁、１９９３年）によるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸなどのプログラムは、このアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年）に基づき開発された。ＢＬＡＳＴに基づくＢＬＡＳＴＮに従いヌクレオチド配列を解析するためには、例えば、スコア＝１００およびワード長＝１２としてパラメータを設定する。他方、ＢＬＡＳＴに基づくＢＬＡＳＴＸによるアミノ酸配列を解析するために用いられるパラメータには、例えば、スコア＝５０およびワード長＝３が含まれる。各プログラムのためのデフォルトのパラメータは、ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップトＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合に用いられる。当技術分野では、このような解析のための特殊な技法が公知である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のウェブサイトであるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法で調製することができる。例えば、抗体は、下記の方法で調製することができる。
【００９４】
上記の通りに調製された抗原は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、およびヒツジなどの哺乳動物に施される。この免疫化は、典型的に用いられる静脈内注射、皮下注射、および腹腔内注射を含めた、任意の既存の方法により実施することができる。免疫化の間隔については制限が存在しない。免疫化は、数日間〜数週間、好ましくは４〜２１日間の間隔で実行することができる。マウスは、例えば、１０〜１００μｇ（例えば、２０〜４０μｇ）の抗原タンパク質による単回投与で免疫化しうるが、投与はこれらの値に限定されない。
【００９５】
１回目の免疫化の前に、かつ、２回目および後続の免疫化の３〜７日後に、動物から血液を回収し、血清を抗体の力価について解析する。免疫応答を促進するには、ミョウバンなどの凝集剤を用いることが好ましい。一般に、選択される哺乳動物抗体は、抗原への結合アフィニティーが十分に高い。抗体のアフィニティーは、飽和結合アッセイ、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または競合的アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ）を用いて決定することができる。
【００９６】
ポリクローナル抗体は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８年））において記載されている架橋解析など、従来の架橋解析によりスクリーニングすることができる。代替的な方法は、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７０巻：１３８８〜１３９４頁（１９９５年））である。ポリペプチドまたは抗体の力価を決定するための好ましい方法は、抗体結合アフィニティーの定量化を含む。他の実施形態ではまた、抗体結合アフィニティーを決定するための方法に加えて、またはその代わりに、抗体の１または複数の生物学的特性を評価するための方法も用いられる。このような解析法は、これにより抗体の治療的有効性が裏付けられるため、特に有用である。抗体がこのような解析において特性の改善を呈示する場合、その結合アフィニティーは一般に増強されるが、常に増強されるわけではない。
【００９７】
モノクローナル抗体を調製するのに用いられるハイブリドーマは、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８１年、７３巻、３〜４６頁）の方法により得ることができる。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞は、当業者に一般に利用可能であるマウス、ラット、およびヒトなど、多様な動物に由来する任意の細胞系でありうる。用いられる細胞系は薬物耐性であり、かつ、非融合状態では選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）中で生存できないが、融合状態では生存できる。ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地中では増殖できない、８−アザグアニン耐性細胞系が一般に用いられる。骨髄腫細胞には、多様な公知の細胞系、例えば、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９年）、１２３巻：１５４８〜１５５０頁）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８年）、８１巻：１〜７頁）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６年）、６巻：５１１〜５１９頁）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｄ．  Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ（１９７６年）、８巻：４０５〜４１５頁）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８年）、２７６巻：２６９〜２７０頁）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．  Ｇｒｏｔｈ，  Ｓ．  Ｆ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０年）、３５巻：１〜２１頁）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，  Ｉ．  Ｓ．、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．（１９７８年）、１４８巻：３１３〜３２３頁）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９年）、２７７巻：１３１〜１３３頁）、およびＰ３Ｕ１（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９７９年、１５０巻：５８０頁；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９７８年、８１巻：１頁）が含まれる。また、ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｃｌｏｍａ）細胞系も、ヒトモノクローナル抗体を作製するのに用いることができる（Ｋｏｚｂａｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年））。抗体産生細胞は、例えば、最終回の免疫化の２〜３日後に屠殺された動物から回収する。抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞、および末梢血細胞を包含する。一般には、脾臓細胞が用いられる。とりわけ、脾臓またはリンパ節などの組織は、上記の多様な動物から切除または回収する。次いで、組織を破砕し、結果として得られる物質を、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、またはＲＰＭＩ１６４０などの媒体または緩衝液中に懸濁させた後、ステンレスメッシュなどにより濾過した。次いで、これを遠心分離して、対象の抗体産生細胞を得る。
【００９８】
次いで、上記の骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを融合させた。細胞の融合は、融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間にわたり、骨髄腫細胞を、抗体産生細胞と、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０など、動物細胞を培養するための培地中１：１〜１：２０の比で接触させることにより達成する。細胞の融合を促進するには、市販されている細胞融合デバイスを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合することもでき、ポリエチレングリコール（平均分子量：１，０００〜６，０００（Ｄａ））もしくはポリビニルアルコールなどの融合促進剤、または仙台ウイルスなどの融合用ウイルスを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合することもできる。
【００９９】
対象のハイブリドーマは、細胞融合後の細胞から選択される。選択法には、選択培地において細胞の選択的増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を用いる方法が含まれる。とりわけ、細胞懸濁液を適切な培地で希釈し、次いで、細胞をマイクロ滴定プレートに播種する。選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）のアリコートを各ウェルに添加し、次いで、選択培地を適切に交換しながら細胞を培養する。結果として増殖した（ｇｒｏｗｎ）細胞は、ハイブリドーマとして取り置くことができる。
【０１００】
別の実施形態では、抗体または抗体断片を、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年））により報告されている技法を用いることにより作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年））およびＭａｒｋｓら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年））は、ファージライブラリーからのマウス抗体およびヒト抗体それぞれの単離について報告している。また、チェーンシャフリングに基づく高アフィニティー（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製について記載する報告（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年））、ならびに大スケールのファージライブラリーを構築するための方法であるコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えについて記載する報告（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年））もなされている。これらの技法はまた、モノクローナル抗体を単離するのに、モノクローナル抗体を作製するための従来のハイブリドーマ法を用いる代わりに用いることもできる。
【０１０１】
得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を調製するための方法には、標準的な細胞培養法および腹水の産生を含む方法が含まれる。細胞培養法では、ハイブリドーマを標準的な培養条件下（例えば、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気）、１０〜２０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０もしくはＭＥＭまたは無血清培地など、動物細胞用の培養培地中で２〜１４日間にわたり培養し、次いで、抗体を培養物上清から調製する。腹水の産生を含む方法では、ハイブリドーマを、骨髄腫細胞が由来する種と同じ種の哺乳動物個体の腹腔に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。次いで、１〜４週間後に腹水または血清を回収する。腹水の産生を増強するには、例えば、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を、腹腔にあらかじめ投与することができる。本発明で用いられる抗体は、プロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫酸塩による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせた使用など、公知の方法から選択される方法により適切に精製することができる。
【０１０２】
本発明は、遺伝子操作により作製される組換え抗体を用いることができる。上記の方法により得られた抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマから単離する。遺伝子を適切なベクターに挿入し、次いで、宿主に導入する（例えば、Ｃａｒｌ，  Ａ．  Ｋ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｊａｍｅｓ，  Ｗ．  Ｌａｒｒｉｃｋ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ、１９９０年を参照されたい）。本発明は、本発明の抗体をコードする核酸およびこれらの核酸を含むベクターを提供する。とりわけ、逆転写酵素を用いて、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを、ハイブリドーマのｍＲＮＡから合成する。対象の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを得た後で、それらを抗体の所望の定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡとライゲーションし、結果として得られるＤＮＡ構築物を発現ベクターに挿入する。代替的に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体のＣ領域のＤＮＡを含む発現ベクターに挿入することもできる。これらを、遺伝子を発現調節領域、例えば、エンハンサーおよびプロモーターの調節下で発現させるように、発現ベクターに挿入する。次いで、宿主細胞を発現ベクターで形質転換して、抗体を発現させる。本発明は、本発明の抗体を発現させる細胞を提供する。本発明の抗体を発現させる細胞には、このような抗体の遺伝子で形質転換された細胞およびハイブリドーマが含まれる。
【０１０３】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低減するように人工的に修飾された組換え抗体を用いることができる。例には、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。これらの修飾抗体は、公知の方法を用いて作製することができる。キメラ抗体は、互いと異なる分子種の可変領域および定常領域を含む抗体、例えば、マウスなど、ヒト以外の哺乳動物の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域とを含む抗体を包含する。このような抗体は、（１）マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡにライゲーションし、；（２）これを発現ベクターに組み込み；（３）ベクターを、抗体を作製するための宿主に導入することにより得ることができる。
【０１０４】
またリシェイプトヒト抗体とも称するヒト化抗体は、マウスなど、ヒト以外の哺乳動物の抗体のＨ鎖またはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体のＣＤＲで置換することにより得られる。このような抗体を調製するための従来の遺伝子組換え法は、公知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい）。とりわけ、マウス抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）とライゲーションするためにデザインされるＤＮＡ配列は、それらの端部に重複部分を含むように構築される複数のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより合成する。ヒト化抗体は、（１）結果として得られるＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡにライゲーションし；（２）これを発現ベクターに組み込み；（３）ベクターを、抗体を作製するための宿主にトランスフェクトすることにより得ることができる（欧州特許出願第ＥＰ２３９，４００号および国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７６号を参照されたい）。ＣＤＲを介してライゲーションされるヒト抗体のＦＲは、ＣＤＲが好適な抗原結合部位を形成する位置で選択する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入されるＣＤＲにも、フレームワーク配列にも包含されない、さらなるアミノ酸残基（複数可）を含みうる。このようなアミノ酸残基は通常、抗体が抗原を認識し、これに結合する能力をより正確に最適化するために導入される。例えば、必要に応じて、抗体可変領域のフレームワーク領域におけるアミノ酸は、リシェイプトヒト抗体のＣＤＲが、適切な抗原結合部位を形成するように、置換することができる（Ｓａｔｏ，  Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３年）、５３巻、８５１〜８５６頁）。
【０１０５】
また、ヒト抗体を得るための方法も公知である。例えば、抗原結合活性を伴う所望のヒト抗体は、（１）ヒトリンパ球を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて対象の抗原または対象の抗原を発現させる細胞で感作し；（２）感作されたリンパ球を、ヒト骨髄腫細胞Ｕ２６６（日本特許出願第特公平（ＪＰ−Ｂ）１−５９８７８号を参照されたい）などと融合することにより得ることができる。代替的に、所望のヒト抗体はまた、抗原を用いて、ヒト抗体遺伝子のレパートリーの部分または全体を含むトランスジェニック（Ｔｇ）動物を免疫化することによっても得ることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７巻：１３〜２１頁（１９９４年）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻：１４６〜１５６頁（１９９７年）；Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；国際特許出願第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９４／０２６０２号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、および同第ＷＯ９６／３３７３５号を参照されたい）。とりわけ、このようなＴｇ動物は、以下の通りに創出される：内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座が酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターなどを介して導入されたヒト以外の哺乳動物は、ノックアウト動物もしくはＴｇ動物を創出することにより、またはこのような動物を交配させることにより得られる。免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、例えば、Ｊ領域内またはＣ領域内（例えば、Ｃμ領域内）の特定の部位に欠損を導入することにより機能的に不活化させることができる。免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ鎖）は、例えば、Ｊ領域内もしくはＣ領域内、またはＪ領域およびＣ領域を含む領域内の特定の部位に欠損を導入することにより機能的に不活化させることができる。
【０１０６】
このようなヒト化抗体はまた、遺伝子操作法を用いて、真核細胞を、抗体の重鎖および軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、または、好ましくは、これらのｃＤＮＡを含むベクターで形質転換し、次いで、組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、培養物上清からも得ることができる。宿主とは、例えば、所望の真核細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、リンパ球、および骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞である。
【０１０７】
さらに、ヒト抗体ライブラリーでパニングすることによりヒト抗体を得る技法も公知である。例えば、ファージディスプレイ法を用いて、ヒト抗体の可変領域をファージの表面における単鎖抗体（ｓｃＦｖ）として発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列を同定する場合は、これらの配列を含む適切な発現ベクターを構築し、次いで、これを適切な宿主に導入し、発現させて、ヒト抗体を得ることができる。このような方法は既に周知である（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、およびＷＯ９５／１５３８８を参照されたい）。
【０１０８】
抗体遺伝子を単離し、適切な宿主に導入したら、宿主および発現ベクターを適切な組合せにおいて用いて、抗体を作製することができる。真核宿主細胞としては、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞を用いることができる。動物細胞には、（１）ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞などの哺乳動物細胞；（２）Ｘｅｎｏｐｕｓ属卵細胞などの両生動物細胞；または（３）ｓｆ９細胞、ｓｆ２１細胞、およびＴｎ５細胞、またはカイコ細胞などの昆虫細胞が含まれる。公知の植物細胞には、カルス培養しうる、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍなどのＮｉｃｏｔｉａｎａ属に由来する細胞が含まれる。公知の真菌細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒなどの糸状真菌が含まれる。また、原核細胞も、細菌細胞を使用する産生系において用いることができる。公知の細菌細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが含まれる。抗体は、形質転換を用いて、対象の抗体遺伝子を、これらの細胞に導入し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形質転換細胞を培養することにより得ることができる。
【０１０９】
本発明の抗体のアイソタイプは、限定されない。アイソタイプには、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥが含まれる。本発明の抗体はまた、抗原への結合の一因となる部分、またはその修飾断片を含む抗体断片でもありうる。「抗体断片」という用語は、全長抗体の部分を指し、抗原結合ドメインまたは可変領域を含む断片を一般に指す。このような抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、適切なリンカーと併せてカップリングされる重鎖Ｆｖおよび軽鎖Ｆｖを含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（複数可）、直鎖状抗体、ならびに抗体断片から調製される多重特異性抗体が含まれる。かつては、抗体断片が、天然の抗体をプロテアーゼで消化することにより産生されたが、現在ではまた、遺伝子操作法を用いて、それらを組換え抗体として発現させるための方法も公知である（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）；Ｃｏ，  Ｍ．  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、１５２巻、２９６８〜２９７６頁；Ｂｅｔｔｅｒ，  Ｍ．およびＨｏｒｗｉｔｚ，  Ａ．  Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９年、１７８巻、４７６〜４９６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．およびＳｋｅｒｒａ，  Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９年、１７８巻、４７６〜４９６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；Ｌａｍｏｙｉ，  Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９年、１２１巻、６６３〜６６９頁；Ｂｉｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ、１９９１年、９巻、１３２〜１３７頁を参照されたい）。
【０１１０】
「Ｆｖ」断片とは、最小の抗体断片であり、抗原認識部位および抗原結合部位の全体を含有する。この領域は、重鎖および軽鎖の各々の可変領域が、非共有結合による結合により強力に接合された二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）である。可変領域の各々の３つのＣＤＲは、互いと相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面において、抗原結合部位を形成する。言い換えれば、重鎖および軽鎖に由来する合計６つのＣＤＲが、併せて抗体の抗原結合部位として機能する。しかしまた、可変領域（または３つの抗原特異的ＣＤＲだけを含有するハーフＦｖ）単独でも、そのアフィニティーは結合部位全体のアフィニティーより低いが、抗原を認識し、これに結合しうることが公知である。したがって、本発明の好ましい抗体断片は、Ｆｖ断片であるがこれに限定されない。このような抗体断片は、重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲの抗体断片であって、保存されており、その抗原を認識し、これに結合しうる抗体断片を含むポリペプチドでありうる。
【０１１１】
Ｆａｂ断片（また、Ｆ（ａｂ）とも称する）はまた、軽鎖定常領域および重鎖定常領域（ＣＨ１）も含有する。例えば、抗体のパパイン消化は、２種類の断片：Ｆａｂ断片と称する抗原結合断片であって、単一の抗原結合ドメインとして用いられる重鎖および軽鎖の可変領域を含有する抗原結合断片と；容易に結晶化させうるために「Ｆｃ」と称する残りの部分とを産生する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端に由来する複数の残基であって、抗体のヒンジ領域に由来する１または複数のシステイン残基を含有する残基もまた有する点で、Ｆａｂ断片とは異なる。しかし、Ｆａｂ’断片は、いずれも重鎖および軽鎖の可変領域であって、単一の抗原結合ドメインとして用いられる可変領域を含む抗原結合断片である点で、Ｆａｂと構造的に同等である。本明細書では、抗原結合断片が、単一の抗原結合ドメインとして用いられる重鎖および軽鎖の可変領域であって、パパイン消化により得られる可変領域と同等であり、プロテアーゼ消化により産生される抗体断片と同一でない場合であっても「Ｆａｂ様抗体」と称する可変領域を含む。Ｆａｂ’−ＳＨとは、その定常領域内に、遊離チオール基を有する１または複数のシステイン残基を伴うＦａｂ’である。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域内のシステイン残基間のジスルフィド結合を切断することにより産生される。当業者にはまた、他の化学架橋される抗体断片も公知である。抗体のペプシン消化は、２つの断片であって、一方が、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応しうるＦ（ａｂ’）２断片であり、他方が、残りの断片（ｐＦｃ’と称する）である２つの断片をもたらす。本明細書では、ペプシン消化により得られる抗体断片と同等な抗体断片が、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応しうる場合、これを「Ｆ（ａｂ’）２様抗体」と称する。このような抗体断片はまた、例えば、遺伝子操作によっても産生される。このような抗体断片はまた、例えば、上記の抗体ファージライブラリーからも単離することができる。代替的に、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主から直接的に回収し、次いで、化学架橋によりＦ（ａｂ’）２断片を形成することを可能とすることもできる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。代替的な方法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主の培養物から直接的に単離することもできる。
【０１１２】
「ダイアボディ（Ｄｂ）」という用語は、遺伝子融合により構築される二価の抗体断片を指す（例えば、Ｐ．  Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１）。一般に、ダイアボディとは、２つのポリペプチド鎖の二量体である。ポリペプチド鎖の各々では、同一の鎖における軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを、それらが併せて結合しないように、短いリンカー、例えば、約５つの残基のリンカーを介して接合する。両者の間のリンカーが短すぎるために、同じポリペプチド鎖内のＶＬおよびＶＨは、単鎖Ｖ領域断片を形成することが可能でなく、代わりに二量体を形成する。したがって、ダイアボディは、２つの抗原結合ドメインを有する。２種類の抗原（ａおよびｂ）に対するＶＬ領域およびＶＨ領域を、約５つの残基のリンカーを介して組み合わせて、ＶＬａ−ＶＨｂおよびＶＬｂ−ＶＨａを形成し、次いで、共発現させる場合、それらは、二重特異性Ｄｂとして分泌される。本発明の抗体は、このようなＤｂでありうる。
【０１１３】
単鎖抗体（また、「ｓｃＦｖ」とも称する）は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とを連結することにより調製することができる（ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい）。当技術分野では、単鎖抗体を調製するための方法が公知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；同第５，２６０，２０３号；同第５，０９１，５１３号；および同第５，４５５，０３０号を参照されたい）。このようなｓｃＦｖでは、重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とを、リンカー、好ましくは、ポリペプチドリンカーを介して、併せて連結する（Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ、１９８８年、８５巻、５８７９〜５８８３頁）。ｓｃＦｖ内の重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域は、同じ抗体に由来する場合もあり、異なる抗体に由来する場合もある。Ｖ領域をライゲーションするのに用いられるペプチドリンカーは、１２〜１９残基からなる任意の単鎖ペプチドでありうる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、鋳型として、上記の抗体の重鎖または重鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ、および上記の抗体の軽鎖または軽鎖のＶ領域をコードするＤＮＡから選択される、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全体またはＤＮＡの部分を用い、かつ、２つの末端を規定するプライマー対を用いて、ＰＣＲにより増幅することができる。その後、ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡと、重鎖および軽鎖のそれぞれにライゲーションされるＤＮＡの両端を規定するプライマー対との組合せを用いて、増幅をさらに実行することができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築した後、従来の方法を用いて、これらのＤＮＡを含む発現ベクターを得、宿主をこれらの発現ベクターで形質転換することができる。さらに、結果として得られる宿主を用いる従来の方法に従い、ｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、抗体断片をコードする遺伝子を得、これらを上記で概観した通りに発現させることにより、宿主内で作製することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、多様な種類の分子に結合させた抗体を、修飾抗体として用いることができる。当技術分野では、抗体を修飾するための方法が、既に確立されている。本発明では、「抗体」という用語がまた、上記の抗体も包摂する。
【０１１４】
得られた抗体は、均一となるまで精製することができる。抗体は、タンパク質を単離および精製するのに日常的に用いられる方法により単離および精製することができる。抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、調製的ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動から適切に選択される１または複数の方法（「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．  Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）の使用を組み合わせることにより単離および精製することができる。このような方法は、上記で列挙された方法に限定されない。クロマトグラフィー法には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが含まれる。これらのクロマトグラフィー法は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーを用いて実施することができる。アフィニティークロマトグラフィーで用いられるカラムには、プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムが含まれる。例えば、プロテインＡカラムには、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびセファロースＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。抗体はまた、抗原を固定化した担体を用いる抗原への結合を使用することによって精製することもできる。
【０１１５】
本発明の抗体は、標準的な方法に従い調合することができ（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、最新版、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ａを参照されたい）、医薬として許容可能な担体および／または添加剤を含みうる。本発明は、本発明の抗体と、医薬として許容可能な担体および／または添加剤とを含む組成物（試薬および薬剤を含めた）に関する。例示的な担体には、界面活性剤（例えば、ＰＥＧおよびＴｗｅｅｎ）、賦形剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、香味剤、防腐剤、安定化剤、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、懸濁剤、等張剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、および矯味薬が含まれる。しかし、本発明で使用しうる担体は、このリストに限定されない。実際、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶質セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノ酢酸、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油６０、スクロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、無機塩など、他の一般に用いられる担体も適切に使用することができる。組成物はまた、他の低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどのタンパク質、ならびにグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、およびリシンなどのアミノ酸も含みうる。組成物を注射用の水溶液として調製する場合、組成物は、例えば、生理食塩液、デキストロースを含む等張性溶液、ならびに例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、および塩化ナトリウムを含めた他のアジュバントであって、また、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコールおよびＰＥＧ）、および非イオン性洗浄剤（ポリソルベート８０およびＨＣＯ−５０）も含有しうる他のアジュバントを含みうる。
【０１１６】
必要な場合、本発明の抗体は、マイクロカプセル（ヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリメチルメタクリレートなどから作製されるマイクロカプセル）内にカプセル化し、コロイド性の薬物送達系（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」１６版、Ｏｓｌｏ編（１９８０年）を参照されたい）の構成要素（リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に作製することができる。さらに、持続放出薬物を作製するための方法も公知であり、これらも本発明の抗体に適用することができる（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．、１５巻：１６７〜２７７頁（１９８１年）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．、１２巻：９８〜１０５頁（１９８２年）；米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ特許出願第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２巻：５４７〜５５６頁（１９８３年）；ＥＰ：１３３，９８８）。
【０１１７】
「免疫応答」とは、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球および／または抗原提示細胞の活性化または増殖をもたらす体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を指す。しかし、場合によって、免疫応答は、強度が低く、本発明に従う少なくとも１つの物質を用いるときに限り検出可能となる可能性もある。「免疫原性」とは、免疫系の１または複数の機能が増大し、免疫原性作用因子を指向するように、生存する生物の免疫系を刺激するのに用いられる作用因子を指す。「免疫原性ポリペプチド」とは、アジュバントの存在下または非存在下において、単独であれ、担体に連結されるのであれ、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を誘発するポリペプチドである。抗原提示細胞を活性化させうることが好ましい。
【０１１８】
免疫応答「を増強する」物質とは、この物質の添加により、この物質を添加せずに測定された同じ免疫応答と比較して、いかなる形であれ、免疫応答の増大または強化または逸脱が観察される物質を指す。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば、免疫化時にこの物質を用いて得られる試料中およびこの物質を用いずに得られる試料中における５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定することができる。ＣＴＬ溶解活性が、それを伴わないときのＣＴＬ溶解活性と比較して増強されるときのこの物質の量を、動物の抗原に対する免疫応答を増強するのに十分な量という。特定の実施形態では、免疫応答が、約３倍以上など、少なくとも約２倍増強される。また、分泌されるサイトカインの量または種類も、改変することができる。代替的に、誘導される抗体またはそれらのサブクラスの量を改変することもできる。
【０１１９】
「〜を免疫化する」もしくは「免疫化」という用語、または関連する用語は、標的抗原または標的エピトープに対する実質的な免疫応答（抗体および／またはエフェクターＣＴＬなどの細胞性免疫を含む）を起こす能力を付与することを指す。これらの用語は、完全な免疫が創出されることを要請するのではなく、ベースラインを実質的に超える免疫応答がもたらされることを要請する。例えば、本発明の方法を適用した後で、標的抗原に対する細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答が生じるならば、哺乳動物は、標的抗原に対して免疫化されていると考えることができる。
【０１２０】
「免疫治療剤」という用語は、疾患、障害、または状態を処置するための組成物を指す。より具体的に述べると、この用語は、ワクチン接種により、または免疫分子を導入することにより有益な免疫応答を発生させる処置法を指すのに用いられる。「免疫学的有効量」とは、個体に導入するときに、その個体における免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量を指す。活性な免疫化の文脈では、この用語が、「免疫原としての有効量」と同義である。免疫学的に有効であるために必要な組成物の量は、組成物、組成物中の他の成分（例えば、アジュバント）の存在、抗原、免疫化の経路、個体、事前の免疫、または生理学的状態などを含めた多くの因子に従い変化する。
【０１２１】
核酸分子、発現カセット、および発現ベクター
ＡＲＥおよびコンジュゲート化合物は、核酸配列によりコードされ、核酸配列はまた、プロモーターも包含しうる。核酸配列はまた、ポリアデニル化シグナルも包含しうる。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルが、合成のミニマルポリアデニル化シグナルまたは６Ｔ配列である。
【０１２２】
「核酸」という用語は、糖、リン酸、およびプリンまたはピリミジンである塩基を含有する単量体（ヌクレオチド）からなる一本鎖形態または二本鎖形態にある、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、およびそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、基準核酸と類似する結合特性を有し、自然発生のヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包摂する。別段に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾（例えば、縮重コドン置換）変異体、および相補配列のほか、明示的に示される配列も包摂する。とりわけ、縮重コドン置換は、１または複数の選択された（または全ての）コドンのうちの第３位が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることにより達成することができる。「核酸断片」とは、所与の核酸分子の部分である。
【０１２３】
「ヌクレオチド配列」とは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーであって、場合によって、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーへの組込みが可能な合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、または改変されたヌクレオチド塩基を含有しうるＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーである。
【０１２４】
「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、「核酸配列もしくは核酸セグメント」、または「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、また、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるＲＮＡとも互換的に用いられうる。
【０１２５】
本発明は、単離されるかまたは実質的に精製された核酸分子と、これらの分子を含有する組成物とを包摂する。本発明の文脈では、「単離」または「精製」されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が、その天然の環境とは別に存在するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、したがって、天然の生成物ではない。単離されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製形態で存在する場合もあり、例えば、トランスジェニック宿主細胞など、非天然の環境において存在する場合もある。例えば、「単離」核酸分子もしくは「精製」核酸分子、またはその生物学的活性部分は、他の細胞内物質を実質的に含まないか、あるいは、組換え法により産生される場合は、培養培地を実質的に含まないか、または、化学合成される場合は、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。一実施形態では、「単離」核酸が、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ内の天然ではその核酸を挟む配列（すなわち、その核酸の５’端および３’端に位置する配列）を含まない。例えば、多様な実施形態では、単離核酸分子が、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ内の天然ではその核酸分子を挟む、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有しうる。また、開示されるヌクレオチド配列の断片および変異体も、本発明に包摂される。「断片」または「部分」とは、全長以下のヌクレオチド配列を意味する。
【０１２６】
「自然発生の」、「天然の」、または「野生型」とは、人工的に産生されるのとは異なるものとして天然で見出されうる対象について記載するのに用いられる。例えば、生物（ウイルスを含めた）内に存在するタンパク質配列またはヌクレオチド配列であって、天然の供給源から単離することが可能であり、実験室において作為により意図的に修飾されていないタンパク質配列またはヌクレオチド配列は、自然発生のタンパク質配列またはヌクレオチド配列である。
【０１２７】
分子の「変異体」とは、天然分子の配列と実質的に類似する配列である。ヌクレオチド配列の場合、変異体は、遺伝子コードの縮重のために、天然タンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする配列を包含する。これらの変異体など、自然発生の対立遺伝子変異体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション法によりなど、分子生物学法を用いて同定することができる。変異体ヌクレオチド配列にはまた、例えば、部位指向突然変異誘発を用いることにより発生させたヌクレオチド配列であって、天然タンパク質をコードするヌクレオチド配列のほか、アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列など、合成的に誘導されるヌクレオチド配列も含まれる。一般に、本発明のヌクレオチド配列の変異体は、天然（内因性）ヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％まで、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％まで、一般に、少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％までの配列同一性を有するであろう。
【０１２８】
「トランス遺伝子」とは、形質転換によりゲノムに導入された遺伝子を指す。トランス遺伝子は、例えば、形質転換される特定の細胞のＤＮＡと異種または相同なＤＮＡを包含する。加えて、トランス遺伝子は、非天然の生物またはキメラ遺伝子に挿入された天然の遺伝子も包含しうる。
【０１２９】
「内因性遺伝子」という用語は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然の遺伝子を指す。
【０１３０】
本明細書では、「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語が互換的に用いられる。
【０１３１】
「野生型」とは、天然で見出される正常な遺伝子または生物を指す。
【０１３２】
「ゲノム」とは、生物の遺伝物質の全体を指す。
【０１３３】
「ベクター」とは、とりわけ、任意のウイルスベクターのほか、自己伝染性または可動性の場合もあり、そうでない場合もあり、細胞のゲノムへの組込みにより原核宿主または真核宿主を形質転換する場合もあり、染色体外に存在する場合（例えば、複製起点を伴う自己複製プラスミド）もある、二本鎖または一本鎖の直鎖状形態または環状形態にある任意のプラスミド、コスミド、ファージ、またはバイナリーベクターを包含すると定義される。
【０１３４】
本明細書で用いられる「発現カセット」とは、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を方向付けることが可能な核酸配列であって、終結シグナルに作動可能に連結しうる対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを包含しうる核酸配列を意味する。コード領域は通常、対象の機能的ＲＮＡ、例えば、エピトープまたはコンジュゲート化合物をコードするＲＮＡをコードする。対象のヌクレオチド配列を包含する発現カセットは、キメラの発現カセットでありうる。発現カセットはまた、自然発生の発現カセットでもありうるが、異種の発現に有用な組換え形態で得られている。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下でなされる場合もあり、宿主細胞が何らかの特定の刺激に曝露される場合に限り転写を開始させる調節可能なプロモーターの制御下でなされる場合もある。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発生段階に特異的でもありうる。
【０１３５】
このような発現カセットは、対象のヌクレオチド配列に連結された転写開始領域を包含しうる。このような発現カセットは、調節領域による転写の調節下に置かれる対象の遺伝子を挿入するための複数の制限部位を備える。
【０１３６】
「調節配列」とは、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’側の非コード配列）、コード配列内に位置するヌクレオチド配列、またはコード配列の下流に位置するヌクレオチド配列（３’側の非コード配列）であり、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列である。調節配列には、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化のシグナル配列が含まれる。調節配列は、天然配列および合成配列のほか、合成配列と天然配列との組合せでありうる配列も包含する。本明細書で言及される通り、「適切な調節配列」という用語は、プロモーターに限定されない。しかし、本発明で有用な一部の適切な調節配列には、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、調節可能型プロモーター、およびウイルスプロモーターが含まれるがこれらに限定されないであろう。
【０１３７】
「プロモーター」とは、そのコード配列に対して通常上流（５’側）のヌクレオチド配列であって、適正な転写に要請されるＲＮＡポリメラーゼおよび他の因子についての認識をもたらすことにより、コード配列の発現を方向付け、かつ／または制御するヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックスと、発現を制御するための制御エレメントが付加される転写開始部位を指定するのに用いられる他の配列とから構成される短いＤＮＡ配列である、ミニマルプロモーターを包含する。「プロモーター」はまた、ミニマルプロモーターに加えて、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能な調節エレメントを包含するヌクレオチド配列も指す。この種のプロモーター配列は、近位の上流エレメントおよびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと称することが多い。したがって、「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激することが可能であり、プロモーターの生得エレメントの場合もあり、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントの場合もある、ＤＮＡ配列である。エンハンサーは、両方向（順方向または逆方向）で作用することが可能であり、プロモーターから上流または下流に移動した場合でも機能することが可能である。エンハンサーおよび他の上流のプロモーターエレメントのいずれも、それらの効果を媒介する、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは、それらの全体において、天然の遺伝子に由来する場合もあり、天然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントからなる場合もあり、なお合成のＤＮＡセグメントから構成される場合もある。プロモーターはまた、生理学的条件または発生条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列も含有しうる。本発明において用いられうるプロモーターの例には、マウスＵ６  ＲＮＡプロモーター、合成ヒトＨ１ＲＮＡプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが含まれる。
【０１３８】
「開始部位」とは、転写される配列の部分であり、また、＋１位としても定義される、第１のヌクレオチド周囲の位置である。この部位に関しては、遺伝子の他の全ての配列およびその制御領域が番号付けされている。下流の配列（すなわち、３’方向の配列をコードするさらなるタンパク質）を正とする一方で、上流の配列（大半が５’方向の制御領域の配列）は負とする。
【０１３９】
プロモーターエレメント、特に、上流における活性化が存在しないときは非活性であるかまたはプロモーター活性が大きく低減されるＴＡＴＡエレメントを、「ミニマルプロモーターまたはコアプロモーター」と称する。適切な転写因子の存在下では、ミニマルプロモーターが、転写を可能とするように機能する。したがって、「ミニマルプロモーターまたはコアプロモーター」は、転写開始に必要とされる全ての基本エレメント、例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはイニシエーターだけからなる。
【０１４０】
「構成的発現」とは、構成的プロモーターまたは調節的プロモーターを用いる発現を指す。「条件付け発現」および「調節的発現」とは、調節的プロモーターにより制御される発現を指す。
【０１４１】
「作動可能に連結した」とは、配列のうちの一つの機能が別の配列の影響を受けるような、核酸配列の、単一の核酸断片における会合を指す。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように２つの配列が位置する場合（すなわち、そのコード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列「に作動可能に連結した」またはこれ「と会合した」という。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で、調節配列に作動可能に連結することができる。
【０１４２】
「発現」とは、細胞における内因性遺伝子、異種遺伝子もしくは異種核酸セグメント、またはトランス遺伝子の転写および／または翻訳を指す。例えば、エピトープ構築物の場合には、発現が、エピトープだけの転写を指す場合がある。加えて、発現は、センスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および安定的な蓄積も指す。発現はまた、タンパク質の産生も指す。
【０１４３】
「形質転換」という用語は、遺伝学的に安定的な遺伝を結果としてもたらす、核酸断片の宿主細胞ゲノムへの導入を指す。「宿主細胞」とは、外因性の核酸分子により形質転換されているか、またはこれによる形質転換が可能な細胞である。形質転換された核酸断片を含有する宿主細胞を、「トランスジェニック」細胞と称する。
【０１４４】
「形質転換された」、「形質導入された」、「トランスジェニック」、および「組換え」とは、異種核酸分子が導入された宿主細胞を指す。本明細書で用いられる「トランスフェクション」という用語は、ＤＮＡの真核（例えば、哺乳動物）細胞への送達を指す。本明細書では、「形質転換」という用語が、ＤＮＡの原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞への送達を指すのに用いられる。本明細書では、「形質導入」という用語が、細胞にウイルス粒子を感染させることを指すのに用いられる。当技術分野で一般に公知の通り、核酸分子は、ゲノムに安定的に組み込むことができる。公知のＰＣＲ法には、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを用いる方法が含まれるがこれらに限定されない。例えば、「形質転換」細胞、「形質転換体」細胞、および「トランスジェニック」細胞は、形質転換プロセスを経ており、それらの染色体に組み込まれた外来の遺伝子を含有する。「非形質転換」という用語とは、形質転換プロセスを経ていない正常な細胞を指す。
【０１４５】
「遺伝子的に変化させた細胞」とは、組換え核酸または異種核酸（例えば、１もしくは複数のＤＮＡ構築物またはそれらのＲＮＡ対応物）の導入により改変された細胞を示し、このような遺伝子改変の部分または全体を保持する、このような細胞の子孫細胞をさらに包含する。
【０１４６】
本発明の核酸分子
「単離および／または精製された」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける核酸の単離、例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のその天然の細胞内環境からの単離、ならびに配列決定、複製、および／または発現が可能であるような、核酸またはポリペプチドなど、細胞の他の成分との会合からの単離を指す。ＲＮＡまたはＤＮＡは、そのＲＮＡまたはＤＮＡの天然の供給源ではそれが通常は会合する少なくとも１つの夾雑核酸を含まず、好ましくは他の任意の哺乳動物のＲＮＡまたはＤＮＡを実質的に含まない場合に、「単離」されている。「それが通常は会合する供給源における少なくとも１つの夾雑核酸を含まない」という語句は、核酸を供給源または天然の細胞に再導入するが、異なる染色体内位置に再導入するか、または供給源の細胞内で通常は見出されない核酸配列、例えば、ベクターまたはプラスミド内の核酸配列により他の形で挟む場合を包含する。
【０１４７】
本明細書で用いられる「組換え核酸」、例えば、「組換えＤＮＡ配列または組換えＤＮＡセグメント」という用語は、核酸、例えば、任意の適切な細胞の供給源に由来するかまたはこれから単離されたＤＮＡであって、その後、その配列が自然発生でないか、またはそれらが外因性のＤＮＡで形質転換されていないゲノム内において配置される通りには配置されていない自然発生の配列に対応するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて化学的に改変されうるＤＮＡを指す。あらかじめ選択されたＤＮＡであって、供給源に「由来する」ＤＮＡの例は、所与の生物内で有用な断片として同定されたＤＮＡ配列であって、次いで、本質的に純粋な形態で化学合成されるＤＮＡ配列であろう。供給源から「単離された」このようなＤＮＡの例は、有用なＤＮＡ配列であって、本発明において用いるために、遺伝子操作法によりさらに操作しうる、例えば、増幅しうるように、供給源から化学的手段により、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いることにより切り出されるかまたは取り出されるＤＮＡ配列であろう。「組換えＤＮＡ」には、完全合成ＤＮＡ配列、半合成ＤＮＡ配列、生物学的供給源から単離されたＤＮＡ配列、およびＲＮＡに由来するＤＮＡ配列のほか、これらの混合物が含まれる。
【０１４８】
本発明の発現カセット
発現カセットを調製するための組換えＤＮＡ配列または組換えＤＮＡセグメントは、環状の場合も直鎖状の場合もあり、二本鎖の場合も一本鎖の場合もある。一般に、ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメントは、結果として得られる形質転換細胞内に存在する組換えＤＮＡの発現を促進する制御配列に挟まれたコード領域もまた含有しうる、プラスミドＤＮＡまたはプラスミドベクターなど、キメラＤＮＡの形態にある。
【０１４９】
本明細書で用いられる「キメラ」ベクターまたは発現カセットとは、少なくとも２つの異なる分子種に由来する核酸配列を包含するベクターもしくはカセット、または「天然」型もしくは野生型の分子種では生じない様式で連結されるかもしくは会合する同じ分子種に由来する核酸配列を有するベクターもしくはカセットを意味する。
【０１５０】
ＲＮＡ転写物の転写単位またはその部分として用いられる組換えＤＮＡ配列は別として、組換えＤＮＡの部分は転写されない場合があり、調節的機能または構造的機能をもたらす。例えば、組換えＤＮＡは、哺乳動物細胞において活性なプロモーターを有しうる。
【０１５１】
イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列など、宿主細胞において機能的な他のエレメントはまた、組換えＤＮＡの部分でもありうる。このようなエレメントは、ＤＮＡの機能に必要な場合もあり、必要でない場合もあるが、転写などに影響を及ぼすことによりＤＮＡの発現の改善をもたらす可能性がある。このようなエレメントを所望の通りにＤＮＡ中に組み入れて、細胞におけるＲＮＡの最適な効能を得ることができる。
【０１５２】
制御配列とは、特定の宿主生物における、作動可能に連結したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列である。原核細胞に適切な制御配列には、例えば、プロモーター配列が含まれ、場合によって、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが公知である。
【０１５３】
作動可能に連結した核酸とは、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた核酸である。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結しているか、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易とするように配置された場合に、コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列とは、隣接して連結されるＤＮＡ配列である。しかし、エンハンサーは、隣接しなくともよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドによるアダプターまたはリンカーを、従来の慣例に従い用いる。
【０１５４】
細胞に導入される組換えＤＮＡは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトするかまたは感染させることが求められる細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易とするために、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはこれらの両方を含有しうる。他の実施形態では、選択マーカーをＤＮＡの別個の小片に保有させ、共トランスフェクション手順において用いることができる。選択マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現を可能とする適切な調節配列で挟むことができる。当技術分野では、有用な選択マーカーが公知であり、例えば、ｎｅｏなどの抗生剤耐性遺伝子が含まれる。
【０１５５】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するのに用いられる。当技術分野では、容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が周知である。一般に、レポーター遺伝子とは、レシピエント生物内もしくはレシピエント組織内に存在しないか、またはレシピエント生物もしくはレシピエント組織に発現させる遺伝子であって、その発現が一部の容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明示されるタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、レポーター遺伝子には、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｎ９に由来するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、およびホタルであるＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後、適切な時点でアッセイする。
【０１５６】
当業者には、標的細胞をトランスフェクトしうる組換えＤＮＡを構築するための一般的な方法が周知であり、同じ組成物および構築法を使用して、本明細書で有用なＤＮＡを作製することができる。
【０１５７】
組換えＤＮＡは、本発明のＤＮＡ分子またはＤＮＡ配列を宿主細胞に発現させるように、特定の細胞への導入に有用な任意の手順、例えば、物理的方法または生物学的方法による、エピトープまたはコンジュゲート化合物をコードするＤＮＡからなる発現ベクターを伴うトランスフェクションを介して、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に容易に導入し、そのゲノムに安定的に組み込まれているか、またはエピソームエレメントとして既存の組換えＤＮＡを有する細胞をもたらすことができる。ＤＮＡは、ベクターを介して宿主細胞に導入されることが好ましい。宿主細胞は、真核生物由来、例えば、植物供給源、哺乳動物供給源、昆虫供給源、酵母供給源、または真菌供給源に由来することが好ましいが、また、真核生物以外に由来する宿主細胞も使用することができる。
【０１５８】
あらかじめ選択されたＤＮＡを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、電気穿孔などが含まれる。対象のＤＮＡを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡウイルスベクターおよびＲＮＡウイルスベクターの使用が含まれる。本明細書の下記で記載される哺乳動物の遺伝子治療には、コピー遺伝子を宿主ゲノムに挿入する効率的な手段を用いることが所望である。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞に挿入するのに最も広く用いられる方法となっており、とりわけ、レトロウイルスベクターはそうなっている。他のウイルスベクターは、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０１５９】
本明細書で論じられる通り、「トランスフェクトされた」または「形質導入された」宿主細胞または宿主細胞系とは、ゲノムが、少なくとも１つの異種核酸配列または組換え核酸配列の存在により改変または拡張された宿主細胞または宿主細胞系である。本発明の宿主細胞は典型的に、プラスミド発現ベクター内、ウイルス発現ベクター内のＤＮＡ配列、または単離直鎖状ＤＮＡ配列としてのＤＮＡ配列によるトランスフェクションを介して作製される。トランスフェクトされたＤＮＡは、染色体内に組み込まれた組換えＤＮＡ配列であって、エピトープまたはコンジュゲート化合物をコードする配列からなる組換えＤＮＡ配列となりうる。
【０１６０】
宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するには、多様なアッセイを実施することができる。アッセイには、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＰＣＲなど、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）により、または本発明の範囲内に収まる作用因子を同定するための、本明細書で記載されるアッセイにより特定のペプチドの存在または非存在を検出するなど、「生化学的」アッセイが含まれる。
【０１６１】
導入された組換えＤＮＡセグメントから産生されるＲＮＡを検出および定量化するには、ＲＴ−ＰＣＲを使用することができる。このＰＣＲ適用ではまず、逆転写酵素などの酵素を用いて、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、次いで、従来のＰＣＲ法を用いてＤＮＡを増幅することが必要である。大半の場合において、ＰＣＲ法は、有用ではあるが、ＲＮＡ産物の完全性を裏付けることがない。さらに、ＲＮＡ産物の性質についての情報は、ノーザンブロット法によっても得ることができる。この技法は、ＲＮＡ分子種の存在を裏付け、そのＲＮＡの完全性についての情報をもたらす。ＲＮＡ分子種の存在または非存在はまた、ドットブロットノーザンハイブリダイゼーションまたはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを用いても決定することができる。これらの技法は、ノーザンブロット法の変法であり、ＲＮＡ分子種の存在または非存在だけを裏付ける。
【０１６２】
サザンブロット法およびＰＣＲを用いて、問題の組換えＤＮＡセグメントを検出しうるが、それらは、あらかじめ選択されたＤＮＡセグメントが発現するのかどうかについての情報はもたらさない。発現は、とりわけ、導入された組換えＤＮＡ配列のペプチド産物を同定することにより評価することもでき、導入された組換えＤＮＡセグメントの宿主細胞における発現によりもたらされる表現型の変化を評価することにより評価することもできる。
【０１６３】
本発明の発現カセットを細胞に導入するための方法
核酸物質（例えば、エピトープまたはコンジュゲート化合物をコードする発現カセット）を、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、トランスフェクションまたは形質導入などの遺伝導入法により細胞に導入して、遺伝子改変細胞をもたらすことができる。当業者には、多様な発現ベクター（すなわち、外因性核酸の標的細胞への送達を容易にするためのビヒクル）が公知である。
【０１６４】
本明細書で用いられる、「細胞のトランスフェクション」とは、細胞による、付加されるＤＮＡの組込みを介する新たな核酸物質の獲得を指す。したがって、トランスフェクションとは、物理的方法または化学的方法を用いる、核酸の細胞への挿入を指す。当業者には、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、カチオン性リポソーム介在型トランスフェクション、タングステン粒子促進型微粒子銃、およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿を含め、複数のトランスフェクション法が公知である。
【０１６５】
これに対し、「細胞の形質導入」とは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを用いて、核酸を細胞に導入するプロセスを指す。本明細書では、核酸を細胞に導入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）を、形質導入用キメラレトロウイルスと称する。レトロウイルス内に含有される外因性核酸物質は、形質導入される細胞のゲノムに組み込む。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療剤をコードするｃＤＮＡを保有するアデノウイルス）により形質導入された細胞は、外因性核酸物質をそのゲノムに組み込んではいないが、細胞内の染色体外に保持される外因性核酸物質を発現させることが可能となる。
【０１６６】
外因性核酸物質は、転写を制御するプロモーターと併せて、エピトープまたはコンジュゲート化合物をコードする核酸も包含しうる。プロモーターは、転写を誘発するのに必要な特異的ヌクレオチド配列を有することが特徴的である。外因性核酸物質は、所望の遺伝子転写活性を得るのに要請されるさらなる配列（すなわち、エンハンサー）もさらに包含しうる。この議論の目的では、「エンハンサー」とは、コード配列（シスにおける）と共に働いて、プロモーターにより決まる基本的な転写レベルを変化させる任意の非翻訳ＤＮＡ配列であるに過ぎない。外因性核酸物質は、プロモーターとコード配列とを作動的に連結して、コード配列の転写を可能とするように、プロモーターからすぐ下流の細胞ゲノムに導入することができる。発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御する外因性のプロモーターエレメントを包含しうる。このような外因性のプロモーターは、構成的プロモーターおよび調節可能型プロモーターの両方を包含する。
【０１６７】
自然発生の構成的プロモーターは、不可欠な細胞機能の発現を制御する。結果として、構成的プロモーターの制御下にある核酸配列は、細胞増殖の全ての条件下で発現する。構成的プロモーターには、特定の構成的機能または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼのためのプロモーター、ベータ  −アクチンプロモーター、および当業者に公知の他の構成的プロモーターが含まれる。加えて、多くのウイルスプロモーターも、真核細胞内で構成的に機能する。これらには、とりわけ、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター；モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）；ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。
【０１６８】
調節可能型プロモーターの制御下にある核酸配列は、誘導作用因子もしくは抑制作用因子の存在下に限り、または誘導作用因子もしくは抑制作用因子の存在下で高度もしくは低度に発現する（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下における転写は、特定の金属イオンの存在下で大きく増大する）。調節可能型プロモーターには、それらの誘導因子が結合すると転写を刺激する応答性エレメント（ＲＥ）が含まれる。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、環状ＡＭＰ、ならびにテトラサイクリンおよびドキシサイクリンに対するＲＥが存在する。調節可能な応答を得るために、特定のＲＥを含有するプロモーターを選択することができ、場合によっては、ＲＥ自体を異なるプロモーターに付着させ、これにより、コードされる核酸配列に調節可能性を付与することもできる。したがって、適切なプロモーター（構成的プロモーター対調節可能型プロモーター；強いプロモーター対弱いプロモーター）を選択することにより、遺伝子改変細胞における核酸配列の存在および発現レベルの両方を制御することができる。核酸配列が、調節可能型プロモーターの制御下にある場合は、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて遺伝子改変細胞を、核酸配列の転写を可能とするための条件に曝露することにより、例えば、その治療剤の転写を制御する調節可能型プロモーターの特異的誘導剤を腹腔内注射することにより、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける治療剤の送達を誘発する。例えば、遺伝子改変細胞内のメタロチオネインプロモーターの制御下にある核酸配列のｉｎ  ｓｉｔｕにおける発現は、この遺伝子改変細胞を、適切な（すなわち、誘導性）金属イオンを含有する溶液と、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて接触させることにより増強される。
【０１６９】
したがって、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて生成するＲＮＡの量は、核酸配列の転写を方向付けるのに用いられるプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成的であるのか調節可能型であるのか、強いのか弱いのか）、および細胞内にあるエピトープまたはコンジュゲート化合物の配列をコードする外因性核酸配列のコピー数などの因子を制御することにより調節される。
【０１７０】
少なくとも１つのプロモーターおよびエピトープまたはコンジュゲート化合物の配列をコードする少なくとも１つの異種核酸配列に加えて、発現ベクターは、発現ベクターによりトランスフェクトまたは形質導入された細胞の選択を容易にするための選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子も包含しうる。
【０１７１】
細胞にはまた、少なくとも１つのベクターがエピトープまたはコンジュゲート化合物の配列をコードする核酸配列（複数可）を含有し、他のベクターが選択遺伝子を含有する、２つ以上の発現ベクターもトランスフェクトすることができる。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子、および／またはシグナル配列の選択は、不要な実験を伴わずに当業者の技術の範囲内にあるとみなされる。
【０１７２】
以下の議論は、本発明の多様な有用性に方向付けられる。例えば、本発明は、対象の遺伝子（複数可）の発現をサイレンシングするために適切な発現系としての有用性を有する。
【０１７３】
本発明はまた、哺乳動物レシピエントの細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝子改変するための方法も提供する。一実施形態に従い、方法は、哺乳動物レシピエントの細胞においてエピトープまたはコンジュゲート化合物の配列をｉｎ  ｓｉｔｕにおいて発現させるための発現ベクターを、例えば、ベクターをレシピエントに注射することにより導入するステップを含む。
【０１７４】
処方物および投与法
本発明のワクチンおよび組成物は、医薬組成物として調合し、ヒト患者などの哺乳動物宿主に、選択された投与経路に適合させた多様な形態で投与する、すなわち、経口投与、鼻腔内投与、皮内投与することもでき、静脈内経路、筋内経路、局所経路、または皮下経路を介して非経口投与することもできる。
【０１７５】
したがって、本化合物は、不活性の希釈剤または同化可能な可食担体など、医薬として許容可能なビヒクルと組み合わせて、全身投与、例えば、経口投与することができる。それらは、外殻が硬質または軟質のゼラチンカプセル内に封入することもでき、錠剤に圧縮することもでき、患者の食餌の食物と共に直接的に組み込むこともできる。治療的な経口投与のためには、活性化合物を、１または複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口内用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハーなどの形態で用いることができる。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するものとする。当然ながら、組成物および調製物の百分率は、変化させることができ、所与の単位剤形重量の約２〜約６０％の間であることが好都合でありうる。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量レベルが得られるような量である。
【０１７６】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、以下：トラガントガム、アカシアガム、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；二リン酸カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、果糖、ラクトース、もしくはアスパルテームなどの甘味剤；またはペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはサクランボ香味料などの香味剤も含有しうる。単位剤形がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなど、液体の担体を含有しうる。他の多様な物質を、コーティングとして存在させることもでき、固体の単位剤形の物理的形態を他の様式で修飾するのに存在させることもできる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、ゼラチン、蝋、セラック、または糖などでコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、または果糖、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、およびサクランボ香味またはオレンジ香味などの香味料を含有しうる。当然ながら、任意の単位剤形を調製するのに用いられる任意の物質は、使用される量で医薬として許容可能であり、実質的に非毒性であるものとする。加えて、活性化合物は、持続放出調製物および持続放出デバイスに組み込むこともできる。
【０１７７】
活性化合物はまた、注入または注射により、静脈内投与または腹腔内投与することもできる。活性化合物またはその塩の溶液は、水中で、場合によって、非毒性の界面活性剤と混合して調製することができる。また、分散液も、グリセロール、液体のポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物中ならびに油中で調製することができる。通常の保管条件下および使用条件下では、これらの調製物が、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０１７８】
注射または注入に適切な医薬剤形は、場合によって、リポソーム中にカプセル化された、滅菌注射溶液もしくは滅菌注射分散液または滅菌注入溶液もしくは滅菌注入分散液の即席調製物に適合させた有効成分を含む、滅菌水溶液もしくは滅菌分散液または滅菌粉末を包含しうる。全ての場合において、最終的剤形は、滅菌であり、流体であり、製造条件下および保管条件下で安定的であるものとする。液体の担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性のグリセリルエステル、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒の場合もあり、液体の分散媒の場合もある。適正な流動性は、例えば、リポソームを形成することにより、分散液の場合には要請される粒子サイズを維持することにより、または界面活性剤を用いることにより維持することができる。微生物作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、緩衝剤、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中で吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることによりもたらすことができる。
【０１７９】
滅菌注射溶液は、適切な溶媒中に要請される量の活性化合物を、上記で列挙した多様な他の成分と共に組み込み、要請に応じて、濾過滅菌することにより調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、既に濾過滅菌された溶液内に存在する有効成分に加えて、任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥法である。局所投与のためには、本化合物を純粋形態で適用することができる、すなわち、それらが液体である場合に適用することができる。しかし、それらを、皮膚科において許容可能な担体であって、固体の場合もあり液体の場合もある担体と組み合わせた組成物または処方物として皮膚に投与することが一般には所望であろう。
【０１８０】
有用な固体担体には、滑石、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなど、微粉化された固体が含まれる。有用な液体担体には、有効レベルで、場合によって、非毒性の界面活性剤の補助を伴って本化合物を溶解または分散させうる水、アルコールもしくはグリコール、または水−アルコール／グリコールブレンドが含まれる。所与の使用に応じて特性を最適化するために、芳香剤およびさらなる抗微生物剤などのアジュバントも添加することができる。結果として得られる液体組成物は、吸収パッドにより適用することもでき、包帯および他の包帯材に含浸させるように用いることもでき、ポンプ型の噴霧器またはエアゾール噴霧器を用いて罹患領域に噴霧することもできる。
【０１８１】
また、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩および脂肪酸エステル、脂肪アルコール、修飾セルロース、または修飾鉱物物質などの増粘剤も、液体担体とともに使用して、使用者の皮膚に直接的に適用するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。
【０１８２】
当技術分野には、本発明の化合物を皮膚に送達するのに用いうる有用な皮膚科用組成物の例が公知である（例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）、およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい）。
【０１８３】
本発明の化合物の有用な用量は、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性と、ｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおける活性とを比較することにより決定することができる。当技術分野には、マウスおよび他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法が公知である（例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい）。
【０１８４】
一般に、ローションなど、液体組成物中の本発明の化合物（複数可）の濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％となろう。ゲルまたは粉末など、半固体組成物中または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％となろう。
【０１８５】
処置における使用に要請される化合物、またはその活性塩もしくは誘導体の量は、特定の選択される塩により変化するだけでなく、また、投与経路、処置される状態の性質、患者の年齢および状態によっても変化し、最終的には主治医または臨床医の裁量に委ねられるであろう。
【０１８６】
しかし、一般に、適切な投与は、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり３〜約５０ｍｇ、好ましくは６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲など、１日当たり体重１キログラム当たり約０．５〜約１００ｍｇ、例えば、約１０〜約７５ｍｇの範囲となろう。
【０１８７】
化合物は、単位剤形により投与するのが好都合であり、例えば、単位剤形当たり５〜１０００ｍｇ、好都合には１０〜７５０ｍｇ、最も好都合には５０〜５００ｍｇの有効成分を含有する。
【０１８８】
理想的には、約０．５〜約７５μＭ、好ましくは約１〜５０μＭ、最も好ましくは約２〜約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように有効成分を投与するものとする。これは、例えば、場合によって、生理食塩液中の有効成分が０．０５〜５％である溶液の静脈内注射により達成することもでき、約１〜１００ｍｇの有効成分を含有するボーラスとして経口投与することもできる。所望の血中レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間をもたらす持続的注入により維持することもでき、約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの有効成分（複数可）を含有する間欠的注入により維持することもできる。
【０１８９】
所望の投与は、単回の投与により行うと好都合な場合もあり、適切な間隔で、例えば、１日当たり２、３、４回以上の部分投与として投与される分割投与として行うと好都合な場合もある。部分投与自体は、吸入器からの複数回の吸入、または眼内に複数回の滴下を適用することによる部分投与など、例えば、大まかな間隔での多数回の個別投与にさらに分けることができる。
【０１９０】
前出の本明細書および例は、本発明を完全に開示し、これを可能とするが、それらは、これに付属する特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１９１】
全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前出の明細書では、本発明について、その特定の実施形態との関連で記載し、多くの詳細を、例示を目的として提示してきたが、当業者には、本発明にはさらなる実施形態を受け入れる余地があり、本明細書で記載される詳細のうちのあるものは、本発明の基本原則から逸脱しない限りにおいて、大幅な変更しうることが明らかであろう。
【０１９２】
本発明について記載する文脈における「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」および「その」という用語ならびに類似する指示詞の使用は、本明細書で別段に示されるか、または文脈により明確に否認されない限り、単数および複数の両方を対象とするとみなされる。「〜を含む」、「〜を有する」、「〜を包含する」、および「〜を含有する」という用語は、別段に言及されない限り、非制限的用語とみなされる（すなわち、「〜が含まれるがこれらに限定されない」を意味する）ものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段に示されない限り、範囲内に収まる各別個の値を個別に指す簡略法として用いることだけを意図し、各別個の値は、本明細書において個別に列挙されたと仮定される場合と同様に本明細書に組み込まれる。本明細書で記載される全ての方法は、本明細書で別段に示されない限り、または文脈により明確に否認されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提示される任意の例および全ての例、または例示的な語法（例えば、「〜など」）の使用は、本発明をよりよく明示することだけを意図するものであり、別段に主張されない限り、本発明の範囲に対して限定を提起するものではない。明細書におけるいかなる語法も、特許請求されないエレメントを本発明の実施に不可欠であると示すものとはみなさないものとする。
【０１９３】
本明細書では、本発明を実施するために本発明者らに公知である最良の方式を含めた本発明の実施形態が記載される。前出の記載を読めば、当業者には、これらの実施形態の変化形が明らかでありうる。本発明者らは、当業者が、このような変化形を適切なものとして使用することを予測するものであり、本発明者らは、本発明が本明細書で具体的に記載される様式以外の様式で実施されることを意図するものである。したがって、本発明は、本明細書に付属する特許請求の範囲で列挙される対象物の全ての改変および同等物を、関連法規により許容されるものとして包含する。さらに、それらの全ての可能な変化形にある上記のエレメントの任意の組合せも、本明細書で別段に示されないか、または文脈により明確に否認されない限り、本発明に包摂される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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