(57)【要約】本発明は、特に緑内障に関して、網膜ジストロフィー／網膜症及び視神経症における正常な視覚機能を回復する、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）に基づく点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。前記製剤は、そのままの眼の表面に局所的に投与することができ、緑内障などの網膜ジストロフィー／網膜症及び視神経症の様々な形態の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障に関連する視覚障害の治療のための担体及びＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）を含有する局所眼科用製剤。
【請求項２】
ＰＡＣＡＰがＰＡＣＡＰ２７又はＰＡＣＡＰ３８である請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
視覚障害が、神経節細胞死の発症前の緑内障の初期段階に関係する請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
溶液、懸濁液、ゲルまたは軟膏の形態で、０．２から５０μｇ／μｌまでの範囲の濃度でＰＡＣＡＰを含有する請求項１乃至３の１つ以上に記載の製剤。
【請求項５】
担体が、カルボキシメチルセルロース、カルボポール、ヒドロキシプロピルセルロース、多糖類、グリコサミノグリカン、ならびにこれらの混合物及び誘導体から選ばれる、増粘剤を任意に含有する生理食塩水である請求項１乃至４の１つ以上に記載の製剤。
【請求項６】
増粘剤がタマリンド種子多糖（ＴＳＰ）である請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
ＴＳＰが０．０５から２％（重量／体積−ｗ／ｖ）までの濃度で存在する請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
増粘剤は、０．０１から２％（ｗ／ｖ）までの範囲の割合のカルボキシメチルセルロースナトリウムである請求項５に記載の製剤。
【請求項９】
増粘剤が、ＴＳＰと任意混合の、０．０５％から０．８％（ｗ／ｖ）までの濃度のヒアルロン酸である請求項５に記載の製剤。
【請求項１０】
疾患の初期段階で正常な視覚を回復するために、網膜、視神経及び外側膝状体の神経変性疾患の治療のための点眼剤の形態で薬剤を調製するためのＰＡＣＡＰの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、網膜を含む、中枢神経系の多数の領域で発現されるペプチド、すなわちＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）（Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide）を含む点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。
【０００２】
前記製剤は、緑内障(先天性緑内障、小児緑内障、若年性緑内障、成人緑内障、慢性原発開放隅角緑内障、慢性原発閉塞隅角緑内障、および色素性緑内障、医原性緑内障、急性緑内障を含む続発性緑内障)のような網膜ジストロフィー／網膜症や視神経症における正常な視覚機能を回復するのに有用である。特に、本発明は、網膜神経節細胞の損失につながる事象の進行はまだ可逆的である、緑内障の疾患の初期段階における正常な視覚機能を回復するように設計されている。
【背景技術】
【０００３】
先行技術
ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ（血管作動性腸管ポリペプチド）／グルカゴン／セクレチンファミリーに属するペプチドは、その生物学的作用の観点から最も興味深いペプチドの一つであると考えられている。脊椎動物の規模でこのように保存される構造と機能特性は、ＰＡＣＡＰが、さまざまな重要な機能に関与していることを示唆しており、実際に、実験的な知見は、様々な臓器、内分泌、循環器、呼吸器、生殖、神経系における機能、および免疫応答と概日リズムの発達に関与していることを実証している。それは、神経伝達物質、神経修飾物質や神経栄養因子として機能している多面的な役割を持つ、網膜を含む中枢神経系のさまざまな領域で合成されている。ＰＡＣＡＰは、より長い３８アミノ酸ペプチド(ＰＡＣＡＰ３８)とより短い２７アミノ酸ペプチド(ＰＡＣＡＰ２７)の二つの形態で発現され、長い形態は主に中枢神経系で発現される。受容体の２つの基本タイプがＰＡＣＡＰ２７と３８の両方を結合することができ、クラス１受容体（ＰＡＣ１、高い親和性）とクラス２受容体(ＰＡＣＡＰとＶＩＰに等しい親和性；クラス２受容体の２つのタイプはＶＰＡＣ１および２に区別することができる)である。ＰＡＣ１に結合した後、ＰＡＣＡＰは、アデニル酸シクラーゼ及びホスホリパーゼＣの活性化を誘導し、サイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)レベルの増加を導く。ＰＡＣＡＰはまた、その特異的リガンド、それぞれＮＧＦとＢＤＮＦの非存在下でチロシンキナーゼＡ及びＢ(それぞれＴｒｋＡおよびＴｒｋＢ)を活性化することができ、それにより複数の細胞内標的のリン酸化を誘導する受容体のファミリーである、Ｇタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)のリガンドとしても考えられている(Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｏ，２００２；Ｒａｊａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４)。
【０００４】
ＰＡＣＡＰを合成および放出することができる網膜細胞の分布が、神経節細胞、アマクリン細胞のサブグループ、および水平細胞に限定されるようである(Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｈａｎｎｉｂａｌ  ａｎｄ  Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ  ２００４)。特定のＰＡＣ１受容体の分布は、神経節細胞に加えて、アマクリン細胞およびミュラー細胞のいくつかのタイプを含む(Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；２０００；Ｄ’Ａｇａｔａ  ａｎｄ  Ｃａｖａｌｌａｒｏ  １９９８；Ｋｕｂｒｕｓｌｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５)。
【０００５】
したがって、また、ＰＡＣＡＰは、それらを発現する網膜細胞、特に神経節細胞、及びアマクリン細胞とミュラー細胞における神経保護効果を発揮する、網膜に存在する受容体の２つのタイプ、ＰＡＣ１とＰＡＣ２に結合することができる作用物質として考えられるべきであると提案されている。この特定の場合において、「神経保護効果」は、多数の網膜症の細胞死特性に反対する薬理学的活性分子の能力を指す。例えば、ＰＡＣＡＰ(ＰＡＣＡＰ３８および２７)は、虚血性網膜症などの様々な血管障害における網膜細胞への損傷を防止し、視神経の病変後の神経細胞の死を防止し、神経保護として作用することが証明されている。ＰＡＣＡＰは、また、グルタミン酸やカイニン酸などの興奮毒による処理により生じる網膜細胞の死、紫外線照射によって引き起こされる細胞死を防ぐ(Ｓｉｌｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ａｔｌａｓｚ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ａｔｌａｓｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。
【０００６】
これらの研究は、ＰＡＣＡＰは、神経保護の分野で、より具体的には種々の動物網膜症モデルにおける網膜細胞の死を防ぐために、使用されていることを示している。さらに、ＰＡＣＡＰによる影響を受けた網膜細胞への直接の作用によりそれらの通常の機能を回復すること、特に細胞死に先行する神経変性の初期の段階における直接の作用は、記載されていない。
【０００７】
これは、緑内障に罹患している患者において、および実験的な緑内障モデルにおいて、神経細胞の変性／死は、結果として生じるそれらの網膜密度の減少とともに、緑内障の進行した段階を表すことが知られている(Ｑｕｉｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｂｏｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｑｕｉｇｌｅｙ  ２０１１）。しかしながら、緑内障の初期段階では、神経節細胞はまだ死ぬほどに損傷を受けていないが、異常に機能し始め、視覚的な能力の低下につながる。これらの機能変更は、構造化された視覚刺激(パターンＥＲＧ、Ｐ−ＥＲＧ)によって誘発された網膜電図を記録することによって検出することができ、その源は、神経節細胞のレベルで、内顆粒層内にある（Ｍａｆｆｅｉ  ａｎｄ  Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｉ，１９８２；Ｍａｆｆｅｉ  ａｎｄ  Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｉ，１９８５）。Ｐ−ＥＲＧは、眼内高血圧または緑内障を患っている実験動物モデルと患者の両方で内顆粒層への早期損傷を検出するために有用であることが分かった(Ｄｏｍｅｎｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｖｅｎｔｕｒａ  ａｎｄ  Ｐｏｒｃｉａｔｔｉ  ２００６；Ｐａｒｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｆａｌｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８)。
【０００８】
ＰＡＣＡＰの投与方法に関して、最近のデータは、ＰＡＣＡＰ３８および２７は、血液脳関門を通過することができることを示しており、全身治療におけるそれらの可能な薬理学的応用への道を開いている(Ｎｏｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｄｏｇｒｕｋｏｌ−Ａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００９)。しかしながら、それは概日リズムの調節に対する影響などのような副作用を引き起こす可能性があるため、ＰＡＣＡＰの全身使用(静脈内、筋肉内または腹腔内注射による)は避けるべきである(Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０)。実際には、ＰＡＣ１受容体ノックアウトマウスは概日リズムに変化を引き起こす(Ｈａｎｎｉｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００８)。さらに、ＰＡＣＡＰによる全身治療は、網膜に直接分子を放出するＰＡＣＡＰの硝子体内注射と違って、動物モデルにおいて網膜細胞の変性を完全に防ぐことはできない(Ｂａｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６)。現在では、従って、網膜にＰＡＣＡＰを運ぶために非侵襲的技術によって投与することができる新たなＰＡＣＡＰ製剤を特定する必要がある。これにより、例えば、眼球内、網膜下または球後注射のような投与技術、眼球の穿孔を引き起こす関連した危険性による慢性的な長期治療に不適当な高い侵襲的方法、感染症、または出血を避けることができる。
【０００９】
米国第２００８／０３００１８２は、様々な網膜症モデルにおける網膜細胞死を防ぐのに有用であるＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ２７および３８を含む眼科用製剤が記載されている。ＰＡＣＡＰの神経保護活性は、網膜細胞死が薬理学的に誘導された実験モデルにおいて硝子体内注射によってｉｎ  ｖｉｖｏで実証されている。しかしながら、点眼薬の形態における局所的な投与も、ｉｎ  ｖｉｖｏの緑内障モデルでの使用も報告されていない。網膜細胞死の防止は、ＰＡＣ１受容体を発現するミュラー網膜細胞によるインターロイキン−６(ＩＬ−６)、炎症性サイトカインの放出に起因する。しかし、ＰＡＣ１受容体は主に、その文献で報告されるように、内顆粒層、すなわち神経節細胞に集中している。また、網膜におけるＩＬ−６の増加は、炎症過程に関与する他のサイトカインと同様に、フラッシュ網膜電位で測定することができる光に対する網膜応答の変化を生じさせる(ｆｌａｓｈ  ＥＲＧ；Ｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８)。したがって、ＩＬ−６の増加は、治療というよりむしろ、さらなる視覚障害を誘導する可能性がある
また、緑内障における細胞死は神経節細胞および視神経への損傷の後期段階を表し、その時点で、視覚機能は深刻な損傷を受けており、回復することが困難である。
【００１０】
米国６２２４２５６３は、哺乳動物における細胞死の予防および様々なタイプの疾患(パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患、心血管疾患、糖尿病、網膜症、腎臓病)の治療のためのＰＡＣＡＰの類似体を提案している。細胞死の防止は、それらの疾患での治療活性によるものであると述べられており、それらの間で網膜症はただ総称的に記載されているのみである。そのため、米国２００８／０３００１８２についての上述したコメントは適用される。
【００１１】
ＪＰ１０−５０５８６３(特許文献１)は、様々なタイプの脳疾患における神経細胞死を防ぐための、ＰＡＣＡＰの使用を開示している。ここでも、目的は神経細胞死を防ぐためのものであり、米国２００８／０３００１８２についてなされたコメントは適用される。
【００１２】
ＥＰ１７５２１５８は、その角膜感度を高め、「ドライアイ」と角膜上皮の外傷性病変に苦しむ患者を治療するために、角膜細胞の生成を促進するＰＡＣＡＰまたは類似体の使用を開示している。
【００１３】
ＷＯ２００８２３７１７は、ＰＡＣ１受容体に作用することによって涙液の分泌を促進するＰＡＣＡＰを含有する眼科用製剤を開示しており、それゆえ網膜症に関するものではない。
【００１４】
ＥＰ１５４６１９８は、幹細胞が神経変性疾患を治療するために使用することができるように、前脳基底の幹細胞の増殖と分化する能力を増大させるＰＡＣＡＰの使用を開示している。
【００１５】
ＥＰ１５０７５５１は、神経系の様々な変化を治療するため、成体脳中に存在する神経前駆細胞の増殖／分化する能力を高めるＰＡＣＡＰの使用を開示している。
【００１６】
米国２００２０１８２７２９は、神経系の様々な障害を治療するために、発生中のニューロン及び増殖段階における細胞周期を調節するＰＡＣＡＰの使用に基づく方法を開示している。
【００１７】
細胞死の減少および／または防止におけるＰＡＣＡＰの効果は、ＣＮＳの他の領域に影響を及ぼすいくつかの網膜症および／または神経変性疾患において示唆されてきたが、緑内障患者に正常な視力を回復するためのＰＡＣＡＰまたはその類似体の治療的な使用は記載されておらず、また、その技術水準からも推定されるものでもない。
【００１８】
緑内障は、適切に治療しなければ、神経節細胞の損失および視神経線維の進行性萎縮による失明に至る、眼に影響を与える進行性疾患類の一つである。緑内障は、とくにその最も頻度の高い原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ；緑内障の症例の７０〜８０％）と称される形態は、ほとんどの患者において、房水の排水路が徐々に狭くなることを伴う眼圧の上昇(ＩＯＰ)によって特徴づけられる。この慢性疾患を迅速に診断、治療されていない場合、進行した段階で、それは神経節細胞死および視神経への損傷に繋がることができ、これらの変化は実質的に不可逆的である。発展期において、網膜と同様に、緑内障は、外側膝状体のような視覚中枢に影響を与えることができ、最終的には視覚野に影響を与え、その段階での治療は役に立たない。近年、患者の相当数は、現在の薬物治療に耐性があり、視覚機能の進行性、不可逆的な損失を被っているが、薬物治療は、ＩＯＰを低減することを目的としている。
【００１９】
上述のように、緑内障の薬理学的治療は、副作用(全身投与)や眼球穿孔、感染症や出血(硝子と網膜下投与)のリスクを回避する局所眼投与方法を必ず必要とする。
【００２０】
網膜は中枢神経系の部分的に分かれた部分である。巨大分子のような非特異的な化合物の網膜への拡散を防ぐ、血液網膜関門を含む様々なタイプの障壁が存在する。局所的に与えられた薬理学的に活性な化合物の眼内浸透は、角膜と結膜、強膜、脈絡膜と脈絡膜血管に位置する障壁によって、またそれらの組織に存在する酵素により影響される浸透性吸収や代謝分解によって制御される。一度滴下されたら、薬理学的に活性な化合物は、網膜の所まで横たわっている組織を貫通するため、血液網膜関門を含む、障壁の複雑なシステムを横断する必要がある。
【００２１】
また、網膜は、視神経線維が起こる神経節細胞を介して、外側膝状体の背の部分(ｄＬＧＮ)などの視覚中枢に視神経を介して接続されている。
【００２２】
したがって、侵襲的な方法の使用に伴うリスクを回避するために局所的に塗布することができ、それらの死の前に、神経節細胞と視神経における緑内障によって誘発される疾患の進行を抑制するだけでなく、何より不可逆的になる前に視覚的な変化を正常に回復するのに、効果的な濃度で網膜に達することができる、ＰＡＣＡＰのような分子を同定することが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特開平１０−５０５８６３号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の説明
緑内障において局所眼投与により投与した場合、ＰＡＣＡＰ(またはその類似体)は、網膜細胞、特に神経節細胞の正常な機能を回復することが今回発見された。したがって、神経節細胞死が起こる前に、ＰＡＣＡＰは、緑内障の初期段階の視覚障害特性を弱める。
【００２５】
本発明は、緑内障の自発的なマウスモデルにおけるＰＡＣＡＰによる処置が、内顆粒層(神経節細胞)における正常な機能を回復し、Ｐ−ＥＲＧによって評価される資格能力の回復を導く、という実証に基づいている。この回復は、神経節細胞死により特徴付けられる段階に先行する疾患段階で起こり、その網膜密度を解析することによって評価される。
【００２６】
したがって、本発明は、緑内障の通常視覚能力を回復するように設計されているＰＡＣＡＰを含有する眼科用製剤に関する。
【００２７】
本発明に係る眼科用製剤は、好ましくはＰＡＣＡＰ(下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、ＰＡＣＡＰ２７またはＰＡＣＡＰ３８)を含有する点眼剤の形態をとる。
【００２８】
本発明はまた、早期段階で正常な視力を回復することを目的として、網膜、視神経及び外側膝状体の神経変性疾患の治療のための点眼剤の形態で医薬品を調製するためのＰＡＣＡＰの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＰＡＣＡＰ３８の局所適用後の網膜におけるｃＡＭＰレベルの測定を示すグラフである。
【図２】自発緑内障(ＤＢＡ／２Ｊマウス)の実験モデルの様々な年齢での眼圧(ＩＯＰ)レベルの測定を示すグラフである。
【図３】増加したＩＯＰに関連する異なる年齢で測定した、緑内障における神経節細胞の密度；自発緑内障(ＤＢＡ／２Ｊマウス)の実験モデルで行われた研究を示す。
【図４】異なる年齢でのネズミ緑内障モデル(ＤＢＡ／２Ｊマウス)におけるパターン網膜電図(Ｐ−ＥＲＧ)を示す。
【図５】ＰＡＣＡＰ３８の局所適用は、神経節細胞の密度低下に先行する緑内障段階における内顆粒層内の神経節細胞に由来する網膜応答の変化を大幅に減少させる。自発的な緑内障の実験モデル(ＤＢＡ／２Ｊマウス)で行われた研究を示すグラフである。
【図６】光受容体及び外核層における機能変化の完全欠損を実施説明するための、ＰＡＣＡＰによる局所治療後に自発的な緑内障の実験モデル(マウスＤＢＡ／２Ｊ)で記録されたフラッシュＥＲＧを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明に係る組成物は、好ましくは０．２及び５０μｇ／μｌの間の濃度(好ましくは１−１０μｇ／μｌ)で、ＰＡＣＡＰを含有する溶液、懸濁液、ゲルまたは軟膏の形態をとる。治療日用量は、およそ４及び１００００μｇの間(好ましくは２０−２０００μｇ)であり、結膜へ局所点眼される１０−１００μｌの点眼液の一日二回以上の投与で到達される。
【００３１】
ＰＡＣＡＰ(２７および３８)は、単独で、または、β遮断薬、プロスタグランジン及び炭酸脱水酵素阻害剤などのような他の活性成分と組み合わせて投与することができる。
【００３２】
製剤は、薬学的に許容され、活性成分と適合し、目で容認される、適切な担体を含む。
【００３３】
前記担体の例としては、好ましくは０．９％塩化ナトリウムを含有する、生理食塩水溶液、および／または、カルボキシメチルセルロース、カルボポール、ヒドロキシプロピルセルロース、多糖類、グリコサミノグリカン、およびそれらの混合物およびそれらの誘導体(例えば塩)のような、粘度調整剤を含む溶液が挙げられる。
【００３４】
粘性調整剤の使用は、より迅速に結膜から洗い流される食塩水で投与した場合よりも、遅く、緩やかなＰＡＣＡＰの移動を保証し、生物学的利用能を向上させることができる。
【００３５】
粘度調整剤は、好ましくは、タマリンド種子多糖(ＴＳＰ)、ＥＰ０８９２６３６に開示されるようなタマリンド植物(Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ  ｉｎｄｉｃａ)の種子から抽出した多糖類である。
【００３６】
ＴＳＰの含有量は、好ましくは０．０５および２％(重量/体積−ｗ/ｖ)の間で変えることができ、より好ましくは０．２５および０．５％(ｗ/ｖ)の間で変えることができる。
【００３７】
ＴＳＰは、溶液中で透明である。溶液は、粘弾性、無菌であり、角膜や結膜を保護するために使用される。ＴＳＰはまた、眼表面上に長続きする膜を形成し、角膜や結膜を滑りやすくする。
【００３８】
別の好ましい態様によれば、粘性化溶液は、０．０１および２％(ｗ/ｖ)の間の範囲の割合でカルボキシメチルセルロースナトリウムを含み、好ましくは０．２および０．４％(ｗ/ｖ)の間である。カルボキシメチルセルロースナトリウムは、非毒性、不活性であり、かつ溶液中で安定なｐＨを有する。また、およそ１％の濃度は、涙と同様の屈折率を有する。
【００３９】
さらなる好ましい態様は、粘性化溶液がヒアルロン酸を含み、より好ましくはＴＳＰとの組み合わせでヒアルロン酸を含むことである。
【００４０】
ヒアルロン酸の含有量は、０．０５％および０．８％(ｗ/ｖ)の間の範囲に及ぶことができ、好ましくは０．２および０．４％(ｗ/ｖ)の間の範囲に及ぶことができる。
【００４１】
好ましい実施形態によれば、製剤は、０．９％ＮａＣｌを含有する生理食塩水に２ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＡＣＡＰを含有する。
【００４２】
別の好ましい実施形態によれば、製剤は、０．２％カルボキシメチルセルロースナトリウムを含有する生理食塩水に２ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＡＣＡＰを含有する。
【００４３】
さらに好ましい実施形態によれば、製剤は、０．２５％ＴＳＰを有する食塩水に１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＡＣＡＰを含有する。
【００４４】
点眼製剤は、そのままの眼の表面に局所的に直接的に投与することができ、すなわち、非侵襲的技術によって、眼内、網膜下と球後注射などのような侵襲的方法の使用を回避する。具体的には、製剤は、結膜嚢に投与することができる。調製物はまた、眼帯として、またはコンタクトレンズで製剤化することができる。
【００４５】
実験の項で示したように、本発明に従って局所的に投与された場合、ＰＡＣＡＰは、網膜に搬送され、先行技術の導入で報告したように、ＰＡＣＡＰ受容体の活性化の細胞内標的の一つである、網膜細胞内の二次ｃＡＭＰメッセンジャーの網膜濃度の増加を誘発する。これらの結果は、ＰＡＣＡＰは、局所治療および網膜への拡散後、種々の組織の障壁を通過することができるだけでなく、神経節細胞を含む様々な網膜細胞で発現されているその特異的な受容体に結合し活性化することが可能な構造を保持することができることを示している。
【００４６】
本発明に係る製剤は、網膜、視神経と外側膝状体の神経変性疾患、特に緑内障の様々な形態(先天性緑内障、小児緑内障、若年性緑内障、成人の緑内障、慢性原発開放隅角緑内障、慢性原発閉塞隅角緑内障、及び色素性緑内障、医原性緑内障、急性緑内障を含む続発性緑内障)の予防及び／又は治療のために使用することができる。
【実施例】
【００４７】
下記実施例は本発明をさらに説明する。
【００４８】
例１  ＰＡＣＡＰベース製剤による目の６時間の局所治療後の網膜におけるｃＡＭＰレベルの決定
ＰＡＣＡＰ３８を含有する生理食塩水(０．９％ＮａＣｌ)に基づいた製剤を用いた
試験は、マウス(Ｃ５７ＢＬ−６Ｊ、ハーラン、イタリア)で行った。
ＰＡＣＡＰ３８は、局所的に適用され、片目の結膜嚢に注入され、一方、対照として用いられたもう片方の眼は、生理食塩水(プラセボ)のみで処置された。
【００４９】
網膜におけるｃＡＭＰレベルの測定
動物は、深い麻酔が腹腔内ウレタン注入(２０％)によって誘発されていたとき、局所適用後６時間で屠殺された。それから眼は取り除かれ、ｃＡＭＰレベルが、ＰＡＣＡＰで処理された眼の、及び生理食塩水のみで処理されたもう片方の眼(対照の眼)の、網膜のホモジネートで測定された。測定はサイクリックＡＭＰ  ＥＩＡキット(ケイマンケミコン社)を用いて、サイクリックＡＭＰアッセイにより実施した。図１のグラフに示される結果は、生理食塩水(０．９％ＮａＣｌ)および酢酸(５％)でのＰＡＣＡＰ(５０μＭ；０．２２６μｇ／μｌ)の局所適用で得られ、対照の眼と比較した相対値(％)として表されている。
【００５０】
統計解析は、スチューデントｔ検定により行い、ＰＡＣＡＰで処理された眼を対照の目と比較した。すべてのケースで、ｃＡＭＰレベルが対照の眼よりも処置された眼で有意に高かった（＊，Ｐ＜０．０５）。
【００５１】
これらの結果は、ＰＡＣＡＰは、様々な障壁を通過し、結膜嚢内への局所適用後に網膜に到達できることを示している。ＰＡＣＡＰはまた、ｃＡＭＰの増加を引き起こすその細胞受容体を活性化することができると思われる。
【００５２】
例２  ネズミ緑内障モデルの様々な年齢におけるＰＡＣＡＰの反復局所適用によって誘発される効果
ＰＡＣ１と呼ばれるＰＡＣＡＰレセプターは、神経節細胞で発現することが知られている(Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；２０００；Ｄ’Ａｇａｔａ  ａｎｄ  Ｃａｖａｌｌａｒｏ  １９９８；Ｈａｎｎｉｂａｌ  ａｎｄ  Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ  ２００４；Ｋｕｂｒｕｓｌｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５)。ＰＡＣＡＰの活性は、自発緑内障の最も一般的な実験モデル、ＤＢＡ／２Ｊと呼ばれる二重変異マウスにおいて検証された(Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９)。ＤＢＡ／２Ｊマウスは、２つの別々の遺伝子のホモ接合変異を示す。まず、メラノソームのタンパク質をコードするチロシン関連タンパク質(Ｔｙｒｐ１−/−)であり、第二は、膜糖タンパク質(Ｇｐｎｍｂ−/−)である。色素顆粒は、色素性緑内障の形態に似て、小柱網に蓄積して、小柱変性、虹彩の委縮及び房水の流出の進行性障害という結果を引き起こし、ＩＯＰの増加につながる。このマウスは、内顆粒層／神経節細胞に依存する構造化された視覚刺激(異なるコントラストや大きさで、暗いストリップまたはチェスの駒が交互になっている薄いストリップによって形成された格子であってもよい)に対する網膜の反応の進行性の消失とともに、ＩＯＰにおける進行性の増加によって特徴付けられる。ヒト及び動物モデルにおいて、この応答は、網膜電位図のパターンと呼ばれる(Ｐ−ＥＲＧ；Ｄｏｍｅｎｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｖｅｎｔｕｒａ  ａｎｄ  Ｐｏｒｃｉａｔｔｉ，２００６；Ｆａｌｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８)。神経節細胞の機能不全は、後期において、それらの密度の減少と視神経の進行性の委縮とともに、神経節細胞の変性をもたらす(Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８)。このマウス緑内障モデル(ＤＢＡ／２Ｊ)では、図２に示すように、ＩＯＰは、出生後の５及び６ヶ月の間に増加し始める。６．５ヶ月で、ＤＢＡ／２ＪマウスでのＩＯＰはすでに正常なマウス(Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ)や、５ヶ月の年齢、すなわち疾患の発症前でのＤＢＡ／２Ｊマウスで測定されたものよりも有意に高く現れる(ｔ−ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０５)。１１ヶ月の年齢ではＩＯＰはさらに上昇する。したがって、ヒト患者において起こるものと同様の疾患の進行も推定することができる。
【００５３】
私達は、ＩＯＰの増加は、細胞死の増加や、密度が減少する神経節細胞の結果として生じる損失に対応するかどうかを評価した。図３のグラフは、Ａ−シヌクレインを検出することができる蛍光抗体で標識された神経節細胞の分布の共焦点顕微鏡分析によって測定された神経節細胞の密度を表す(Ｓｕｒｇｕｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８)。グラフは、周辺網膜から始まる神経節細胞の密度のわずかな減少は、１１ヶ月の高い年齢で出始めているのみであることを示している。これらの結果は、神経節細胞の死は、緑内障のマウスモデル、すなわちＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて、１１ヶ月の高い年齢で、つまりＩＯＰの初期増加から約５ヶ月で見られるようになり始めることを示す。バッキンガムら(２００８)は、細胞死の最大レベルはＤＢＡ／２Ｊマウスで１６ヶ月後に起こることを示唆している。以前に緑内障を患っている患者に実施された研究は、マウスモデルにおいて報告されたものに沿っており、視覚障害は、神経節細胞の密度が低減され、視神経繊維が委縮する前に、初期段階で現れ始めることを示唆している(Ｑｕｉｇｌｅｙ，１９８９；Ｈａｒｗｅｒｔｈ，Ｑｕｉｇｌｅｙ，２００６)。
【００５４】
網膜神経節細胞、とくにそれらのシナプスの異常な機能によって引き起こされる初期の視覚障害は、初期段階であっても、内顆粒層、特に神経節細胞の機能変化を検出することができる非侵襲的方法である、パターン網膜電位図(ＥＲＧ−Ｐ)を記録することによって、患者および動物モデルで容易に測定可能である(Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｆａｌｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；２００９)。図４は、アンプに接続され、オンライン分析のためのコンピュータに接続された角膜電極によって記録された構造化された視覚刺激(刺激として使用される視覚格子は、水平格子であり、その輝度プロファイルは、０．０５、０．１、０．２サイクル(cycles)／度(degree)空間周波数、及び２［Ｈｚ］の時間周波数で反転された９０％コントラストによって特徴付けられた)によって誘発されたＰ−ＥＲＧを示しています。図４に示すように、Ｐ−ＥＲＧは増加したＩＯＰ(図２)に対応して７ヶ月齢のマウスＤＢＡ／２Ｊですでに変わっている(０．０５および０．２ｃ／ｄｅｇの空間周波数を用いた視覚刺激により誘発されるＰ−ＥＲＧ振幅の有意な低下、スチューデントｔ検定＊Ｐ＜０．０５）。８ヶ月の歳のとき、すなわち、ＩＯＰが不変の基盤で増加している(図２)が、神経節細胞の密度の減少がなかった(図３)とき、食塩水におけるＰＡＣＡＰの繰り返し局所適用での２週間の処置が片方の眼に施され(４８時間毎に１回処置)、もう片方の眼(対照の眼）には担体(生理食塩水）が施された。三つの異なるＰＡＣＡＰ濃度を使用した(群当たりＮ＝３のＤＢＡ／２Ｊマウス)。５００ｎＭ(０．００２２μｇ／μｌ)、１μＭ(０．００４５μｇ／μｌ)、５０μＭ(０．２２６μｇ／μｌ)。最高濃度(５０μＭ、０．２２６μｇ／μｌ)だけが効果的であると証明された。図５におけるヒストグラムは、８と８．５ヶ月の間の２週間の５０μＭ(０．２２６μｇ／μｌ)の濃度でのＰＡＣＡＰによる局所治療(４８時間毎に１回適用)が、ＤＢＡ／２ＪマウスにおけるＰ−ＥＲＧの変化を妨げ、疾患の進行を止め(処置した眼のデータと対照の眼を比較；スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５)、内顆粒層の神経節細胞の視覚反応を正常に回復させることを示している。
【００５５】
光に対する光受容体と外核層の応答を測定する他のタイプの網膜電図、フラッシュＥＲＧは、緑内障で全く損傷していないように見え、これは、少なくとも早期段階において、内顆粒層、すなわち神経節細胞に影響を与える疾患の一種であるという説をさらに支持している。図６は、光(フラッシュＥＲＧ)に対する外顆粒層(光受容体及びポスト受容体細胞)の応答の振幅を示しており、未処理のＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて光に対する外顆粒層の応答が存在し、完全に正常であることを示す。図６に示す第二の結果は、特に重要である。食塩水中のＰＡＣＡＰ(５０μＭ)で局所的に治療されたＤＢＡ／２Ｊマウスの眼は(２週間、４８時間毎に１回処置)、正常なフラッシュＥＲＧを示す。この第二の結果は、米国第２００８／０３００１８２で提案されるように、このタイプの治療が網膜レベルでのＩＬ−６の増加を誘導した場合(Ｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００８)に予想されるように、ＰＡＣＡＰは、光受容体の外側のセグメントに含まれる光色素を修正することができず、結果的に光(フラッシュＥＲＧ)に対する光受容体の応答を変えることができないことを示唆している。
【００５６】
データは、効果的な濃度でのＰＡＣＡＰによる反復局所治療は、神経節細胞の機能変化を防止し、初期段階での実験的緑内障モデルにおける網膜の視覚能力を回復するという結論を導く。神経節細胞機能の保護効果を発揮することができるＰＡＣＡＰの最小有効濃度は０．２２６μｇ／μｌであった。
【００５７】
参考資料（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
【００５８】
【表１−１】
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【００５９】
【表１−２】
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【００６０】
【表１−３】
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【００６１】
【表１−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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