(57)【要約】本発明は、抗ニューレグリン１抗体及び癌のような疾病又は疾患の治療における該抗体の使用方法を提供する。特定の実施態様では、抗ニューレグリン１抗体はニューレグリン１α及びニューレグリン１βアイソフォームの双方に結合する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューレグリン１αとニューレグリン１βに結合する単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項２】
抗体がニューレグリン１βのＥＧＦドメインとニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体がニューレグリン１βのＥＧＦドメインに、それがニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する親和性の２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍又は１０００倍を超える親和性で結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体がニューレグリン１βのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下のｋＤで結合し、ニューレグリン１αのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下のｋＤで結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がニューレグリン１βのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭのｋＤで結合する、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
親和性が表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される、請求項３から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体がニューレグリン１βのエピトープに結合し、ニューレグリン１βのエピトープが配列番号４のアミノ酸１−３７のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸３８−６４のアミノ酸配列を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ニューレグリン１βのエピトープが配列番号４のアミノ酸を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
抗体がニューレグリン１αのエピトープに更に結合し、ニューレグリン１αのエピトープが配列番号３のアミノ酸１−３６のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸３７−５８のアミノ酸配列を含む、請求項７又は８に記載の抗体。
【請求項１０】
ニューレグリン１αのエピトープが配列番号３のアミノ酸を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項１４】
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１６】
（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項１７】
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項１８】
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列と（ｂ）のＶＬ配列を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号２１のＶＨ配列と配列番号２６のＶＬ配列を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項２１】
配列番号５３のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体。
【請求項２２】
請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２４】
抗体が産生されるように請求項２３に記載の宿主細胞を培養することを含む抗体の産生方法。
【請求項２５】
請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害剤を含むイムノコンジュゲート。
【請求項２６】
請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤。
【請求項２７】
更なる治療剤を更に含む、請求項２６に記載の薬学的製剤。
【請求項２８】
更なる治療剤が、ゲムシタビン、パクリタキセル、又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの併用剤である請求項２７に記載の薬学的製剤。
【請求項２９】
医薬として使用される請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
癌の治療に使用される請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
医薬の製造における請求項１から２１の何れか一項の抗体の使用。
【請求項３２】
医薬が癌の治療のためのものである請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
癌が、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び結腸直腸癌からなる群から選択される請求項３０に記載の抗体又は請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
癌を有する個体の治療方法であって、請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む方法。
【請求項３５】
癌が、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び結腸直腸癌からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
個体に更なる治療剤を投与することを更に含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
更なる治療剤が、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチンの組み合わせ又は２又は３全てからなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
癌患者の腫瘍再発までの時間を増大させる方法において、請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体を該患者に投与することを含む方法。
【請求項３９】
患者に治療剤を投与することを更に含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
治療剤が化学療法剤又は二次抗体である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
化学療法剤が、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン、又はパクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチンの組み合わせ又は２又は３全てからなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
二次抗体が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４に結合するか、又はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４からなる群から選択される標的の二以上に結合する請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
癌が、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び結腸直腸癌からなる群から選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍再発までの期間の増加が、抗体の非存在下における再発までの期間より少なくとも１．２５倍大きいか又は少なくとも１．５０倍大きい請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１１年８月１７日に出願された米国仮出願第６１／５２４４２１号の優先権を主張し、その開示内容はその全体が出典明示によりここに援用される。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ-Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が出典明示によりここに援用される配列表を含む。２０１２年８月１４日に作成された上記ＡＳＣｉｉコピーはＰ４７２７Ｒ１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、６４６６４バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ニューレグリン抗体と癌のような疾病又は疾患の治療にその抗体を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
大部分の癌にとって、化学療法に対する乏しい応答又は化学療法後の疾患の再発は、死亡の主要な原因である。これは化学療法が疾患の全段階の患者を治療するために使用されるので、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の場合に特にしかりである。患者の３分の２以上が切除不能な進行疾患を呈しており、第一線の化学療法、放射線療法又はその二種の併用で治療される。しかしながら、ＮＳＣＬＳＣの治療における化学療法剤の積極的な使用にもかかわらず、局所進行疾患及び進行疾患のそれぞれに対して５年生存率は８％及び３．５％にとどまっている（Doebele等）。
【０００５】
化学療法に対する部分応答及び化学療法後の再発は、腫瘍細胞がその薬剤感受性において不均一であることを示唆している。幾つかの腫瘍細胞は与えられた薬剤によって効果的に死滅させられる一方、他のものは救われる。癌幹細胞（ＣＳＣ）は、それらが既存の治療法の失敗に対して可能な説明を提供するので、近年の集中的な研究領域である。幾つかのグループは、ＣＳＣが常套的な化学療法剤及び放射線治療（Bao等, 2006；Costello等, 2000；Dean等, 2005；Dylla等, 2008；Matsui等, 2004；Phillips等, 2006）に対して高まった耐性を報告している。しかしながら、樹立された腫瘍の増殖の維持又は原発又は遠位部位における化学療法後の腫瘍の再開におけるＣＳＣの役割は未解明のままである。化学療法後の腫瘍再増殖の原因である細胞は幹細胞ではなく、むしろ細胞周期の段階、ストロマ−ニッチ相互作用、又は生存促進性シグナルのレベルを反映しうる他の性質を通して耐性を達成する細胞でありうる。これらの細胞は「腫瘍再始原細胞（tumor reinitiating cells）」又はＴＲＩＣと称される。米国特許出願公開２０１１０２２９４９３。
【０００６】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤はしばしばＮＳＣＬＣ患者を治療するために使用され、その腫瘍がＥＧＦＲ活性化変異を有する患者の大部分の治療において効果的であることが示されている。過剰発現又は活性化変異を介するＥＧＦＲのシグナル伝達の調節解除は肺腺癌において比較的頻繁に起こる事象である（Dahabreh等, 2010)に概説）。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４を含むチロシンキナーゼのＥｒｂＢ又はＨＥＲファミリーの原型メンバーである。最近の証拠は、他のＨＥＲファミリーもまたＮＳＣＬＣにおいてある役割を果たしうることを示している。しかし、疾患に対するその寄与はあまりよく特徴付けられておらず、殆どの研究はＥＧＦＲシグナル伝達を活性化させるその能力に焦点が当てられている（Ding等, 2008；Johnson及びJanne, ２００６；Kuyama等, 200；Zhou等, 2006）。ヘレグリン１とも使用されるニューレグリン１（ＮＲＧ１）はＨｅｒ３及びＨｅｒ４受容体のリガンドである。
【０００７】
４種の既知のニューレグリンファミリーメンバー、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、及びＮＲＧ４が存在する（Falls 2003；Hirsh及びWu 2007）。ＮＲＧ１転写物は、少なくとも１５の異なるアイソフォームを生じる広範な選択的スプライシングを受ける。全ての活性なアイソフォームが、活性に必要かつ十分であるＥＧＦ様ドメインを共有している（Holmes 1992，Yarden 1991）。
【０００８】
ＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達は、肺上皮細胞増殖を調節し、ヒト肺の発達において役割を果たすことが示されており（Patel等, 2000）、ＥＧＦＲ阻害剤に対するＮＳＣＬＣの非感受性に関与している（Zhou等, 2006）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は抗ニューレグリン１（抗ＮＲＧ１）抗体とそれを使用する方法を提供する。
【００１０】
本発明の一態様は、ニューレグリン１αとニューレグリン１βに結合する単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、ニューレグリン１βのＥＧＦドメインとニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのＥＧＦドメインに、それがニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する親和性より大きい親和性で結合する。特定の実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのＥＧＦドメインに、それがニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する親和性の２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍又は１０００倍を超える親和性で結合する。
【００１１】
一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下のｋＤで結合し、ニューレグリン１αのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下のｋＤで結合する。特定の実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ以下、１×１０−２ｎＭ以下、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合する。抗ＮＲＧ１抗体の親和性は表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。
【００１２】
本発明の一態様は、ニューレグリン１βのエピトープに結合し、ニューレグリン１βのエピトープが配列番号４のアミノ酸１−３７のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸３８−６４のアミノ酸配列を含む、単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一実施態様では、ニューレグリン１βのエピトープは配列番号４のアミノ酸を含む。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１αのエピトープに更に結合し、ニューレグリン１αのエピトープは配列番号３のアミノ酸１−３６のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸３７−５８のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、ニューレグリン１αのエピトープは配列番号３のアミノ酸を含む。
【００１３】
ある実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。ある実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１αとニューレグリン１βに結合する抗体断片である。
【００１４】
本発明の他の態様は、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【００１６】
本発明の他の態様は、（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１８】
本発明の他の態様は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列と（ｂ）のＶＬ配列を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は配列番号２１のＶＨ配列を含む。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は配列番号２６のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は配列番号２１のＶＨ配列と配列番号２６のＶＬ配列を含む。
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号５３のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列を含む単離された抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００２０】
本発明の他の態様は、抗ＮＲＧ１抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明の他の態様は、抗ＮＲＧ１抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００２１】
本発明の他の態様は、抗体が産生されるようにそのような宿主細胞を培養することを含む抗ＮＲＧ１抗体の産生方法を提供する。
本発明の他の態様は、抗ＮＲＧ１抗体と細胞傷害剤を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【００２２】
本発明の他の態様は、抗ＮＲＧ１抗体と薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は更なる治療剤、例えばゲムシタビン、パクリタキセル、又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの併用剤を更に含む。
【００２３】
本発明の他の態様は、医薬として使用される抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
本発明の他の態様は、癌の治療に使用される抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
本発明の他の態様は、医薬の製造における抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一実施態様では、医薬は、癌、例えば非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び結腸直腸癌の治療のためのものである。
【００２４】
本発明の他の態様は、癌を有する個体の治療方法であって、抗ＮＲＧ１抗体の有効量を個体に投与することを含む方法を提供する。治療される癌は、例えば非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び結腸直腸癌である。一実施態様では、該方法は、個体に更なる治療剤、例えばゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチンの組み合わせ又は２又は３全てを投与することを更に含む。
【００２５】
本発明の他の態様は、患者に抗ＮＲＧ１抗体の有効量を投与することを含む、癌患者の腫瘍再発までの時間を増やすための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、患者に治療剤を投与することを更に含む。一実施態様では、治療剤は、化学療法剤又は二次抗体である。化学療法剤は、例えばゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン、又はパクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチンの組み合わせ又は２又は３全てである。ある実施態様では、二次抗体はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４に結合するか又はこれらの標的の二以上に結合する。ある実施態様では、治療される癌は、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び／又は結腸直腸癌である。一実施態様では、腫瘍再発までの期間の増加は、抗体の非存在下における再発までの期間より少なくとも１．２５倍大きい。一実施態様では、腫瘍再発までの期間の増加は、抗体の非存在下における再発までの期間より少なくとも１．５０倍大きい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】適宜摂取する飲料水中でビークル（スクロース）又はｄｏｘ（２ｍｇ／Ｌ）を投与された、Ｃａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍が樹立されたマウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフ。腫瘍体積は、研究期間中週２回測定された。線形混合効果（ＬＭＥ）として提示されるデータは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積の適合を作成した。
【図１Ｂ】化学療法＋スクロース又は化学療法＋ｄｏｘで治療された、Ｃａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍が樹立されたマウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフ。ＬＭＥとして示されるデータは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積の適合を作成した。
【図２Ａ】スクロース又はｄｏｘで治療された、Ｈ４４１−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍が樹立されたマウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフ（ｎ＝１２／群）。データは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として提示される。
【図２Ｂ】化学療法＋スクロース又は化学療法＋ｄｏｘで治療された、Ｈ４４１−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍が樹立されたマウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフ（ｎ＝１２／群）。データは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として提示される。
【図３Ａ】ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄの平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭを示すグラフ。ビヒクル＋コントロールＩｇＧ（ｎ＝６）、シスプラチン＋コントロールＩｇＧ（ｎ＝６）、又はシスプラチン＋ＨＥＲ４ＥＣＤ−Ｆｃ（ｎ＝８）で処置したマウスｐ５３Ｆｌ／＋マウス。ブタクサ、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体。
【図３Ｂ】９５％信頼区間を用いた治療レジメンによる腫瘍量の毎日の倍率変化を示すグラフ。
【図３Ｃ】ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄのベースライン±ＳＥＭからの腫瘍量の平均増減率を示すグラフ。ビヒクル＋コントロールのＩｇＧ（ｎ＝１０）、シスプラチン＋コントロールのＩｇＧ（ｎ＝１１）、シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ（ｎ＝８）又はビヒクル＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ（ｎ＝７）で処置したｐ５３Ｆｌ／Ｆｌマウス。
【図４Ａ】Ｋｒａｓ−ＬＳＬ−Ｇ１２ＤマウスＮＳＣＬＣモデルからの残留腫瘍細胞におけるＮＲＧ１ ｍＲＮＡ濃縮を示すグラフ。データは一マイクロアレイプローブから示され、独立のサンプルについてｑＰＣＲによって検証されている。
【図４Ｂ】ｑＰＣＲによって評価されたビヒクル処理及び残留化学療法剤処理Ｃａｌｕ３腫瘍細胞におけるＮＲＧ１の発現を示すグラフ。
【図４Ｃ】ｑＰＣＲによって評価されたビヒクル処理及び残留化学療法剤処理Ｈ４４１腫瘍細胞におけるＮＲＧ１の発現を示すグラフ。
【図４Ｄ】ｑＰＣＲによって評価されたビヒクル処理及び残留ゲムシタビン及びビノレルビン処理Ｃａｌｕ３及びＨ４４１腫瘍細胞におけるＮＲＧ１の発現を示すグラフ。
【図５】ＮＲＧ１α（配列番号３）又はＮＲＧ２β（配列番号４）のＥＧＦドメインの整列。
【図６】抗ＮＲＧ１抗体による１２５Ｉ−ＮＲＧβ１のＨＥＲ３−Ｆｃへの結合の阻害を示すグラフ。
【図７】親和性成熟抗ＮＲＧ１抗体変異体による１２５Ｉ−ＮＲＧβ１のＨＥＲ３−Ｆｃへの結合の阻害を示すグラフ。
【図８】ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)アッセイで測定されたＮＲＧ１βに対する５３８．２４親和性成熟変異体抗ＮＲＧ１ ＩｇＧの結合親和性。
【図９】ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)アッセイで測定されたＮＲＧ１αに対する５３８．２４親和性成熟変異体抗ＮＲＧ１ ＩｇＧの結合親和性。
【図１０】ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)アッセイで測定されたＮＲＧ１β及びＮＲＧ１αに対する５３８．２４．７１抗ＮＲＧ１抗体の結合親和性。
【図１１】ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)アッセイで測定されたＮＲＧ１β及びＮＲＧ１αに対する５３８．２４．７１抗ＮＲＧ１抗体の結合親和性。
【図１２】ＨＲＧ１αとＨＲＧ１βの双方への結合に対して５２６．０９抗体が５３８．２４．７１抗体と競合することを示すグラフ。
【図１３】ＫＩＲＡアッセイにおいて抗ＨＥＲ３抗体へのＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βの結合をブロックする５２６．０９抗ＮＲＧ１抗体の親和性成熟変異体の能力を示すグラフ。
【図１４】５２６．９０親和性成熟変異体のＢＶテストの結果を示すグラフ。
【図１５】ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)アッセイで測定されたＮＲＧ１β及びＮＲＧ１αに対する５３８．９０．２８抗ＮＲＧ１抗体の結合親和性。
【図１６】ＫＩＲＡを使用して決定されたＮＧＲ１α誘導ＨＥＲ３活性化を誘導する抗ＮＲＧ１抗体５２６．９０．２８及び５３８．２４．７１の能力を示すグラフ。
【図１７】ＫＩＲＡを使用して決定されたＮＧＲ１β誘導ＨＥＲ３活性化を誘導する抗ＮＲＧ１抗体５２６．９０．２８及び５３８．２４．７１の能力を示すグラフ。
【図１８】ヒト及びマウス細胞双方においてＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を示すウェスタンブロット。
【図１９】マウスモデル系におけるＨＮＳＣＣ腫瘍増殖に対する抗ＮＲＧ１抗体＋／−化学療法剤の効果を示すグラフ。
【図２０】マウスモデル系における肺癌腫瘍増殖に対する抗ＮＲＧ１抗体＋／−化学療法剤の効果を示す腫瘍増殖曲線と該モデル系における無増悪生存期間を示すカプラン・マイヤー曲線。
【図２１】マウスモデル系におけるＮＳＣＬＣ ＬＫＰＨ２腫瘍増殖に対する抗ＮＲＧ１抗体＋／−化学療法剤の効果を示す腫瘍増殖曲線と該モデル系における無増悪生存期間を示すカプラン・マイヤー曲線。
【図２２】マウスモデル系におけるＮＳＣＬＣ Ｈ５９６腫瘍増殖に対する抗ＮＲＧ１抗体＋／−化学療法剤の効果を示す腫瘍増殖曲線。
【図２３】マウスモデル系におけるＮＳＣＬＣ ＬＫＰＨ２腫瘍増殖に対する抗ＮＲＧ１抗体＋／−化学療法剤の効果を示す腫瘍増殖曲線と該モデル系における無増悪生存期間を示すカプラン・マイヤー曲線。
【図２４】ＮＲＧ１−ＨＥＲ３シグナル伝達によって駆動される腫瘍増殖（Ａ）及びＮＲＧ１−ＨＥＲ４シグナル伝達によって駆動される腫瘍増殖（Ｂ）に対する抗ＮＲＧ１抗体の効果を示す腫瘍増殖曲線。
【図２５】抗ＮＲＧ１抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２０）。
【図２６】抗ＮＲＧ１抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列（それぞれ配列番号２２−２７）。
【図２７】抗ＮＲＧ１抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列（それぞれ配列番号５２，５４，５６，５８，６０，６２，６３，６４，６６，６８，７０）。
【図２８】抗ＮＲＧ１抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列（それぞれ配列番号５３，５５，５７，５９，６１，５３，５３，６５，６７，６９，７１）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク”に由来する”アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００２８】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、以下で説明される。
【００２９】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００３０】
用語「抗ＮＲＧ１抗体」及び「ＮＲＧ１に特異的に結合する抗体」は、抗体がＮＲＧ１を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＮＲＧ１に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体の、無関係な非ＮＲＧ１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＮＲＧ１への結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、ＮＲＧ１へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。所定の実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体は、異なる種由来のＮＲＧ１間で保存されているＮＲＧ１のエピトープに結合する。
【００３１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３２】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３３】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイは、本明細書で提供される。
【００３４】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００３５】
用語「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長/細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫を含む、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。
【００３６】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３７】
本明細書で用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００３８】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
【００３９】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００４０】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００４１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４２】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
【００４４】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００４５】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第１−３巻にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００４６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げている抗体を指す。
【００４７】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).)ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633(2008)を参照のこと)特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００４８】
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害剤を含む。
【００４９】
「個体」又は「被検体」又は「患者」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体又は患者はヒトである。
【００５０】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００５１】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００５２】
「抗ＮＲＧ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００５３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００５４】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００５５】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００５６】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている指示書を指すために使用される。
【００５７】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００５８】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
【００５９】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００６０】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。 薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００６１】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＮＲＧ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ニューレグリン（ヘレグリンとしても知られる）を指す。その用語は、細胞内でのプロセシングから生じた「完全長」、未処理ＮＲＧ並びにＮＲＧの任意の形態を含む。その用語はまた、天然に存在するＮＲＧの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。ＮＲＧの４つの既知の型がある：ＮＲＧ１(Holmes, W.E. et al., Science 256:1205-1210 (1992));ＮＲＧ２(Caraway, K.L. et al., Nature 387:512-516 (1997)); ＮＲＧ３(Zhang, E. et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:9562-9567)); 及びＮＲＧ４(Harari, D. et al., Oncogene 18:2681-2689))。選択的スプライシングに起因する、ＮＲＧ１ａｌｐｈａ （ＮＲＧ１α）とＮＲＧ１ｂｅｔａ（ＮＲＧβ）と呼ばれる、受容体結合に必要とされるＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインの２つの活性なアイソフォームがある。例示的なヒトＮＲＧ１の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＫ０００３８３(Falls, D. L., Ex Cell Res, 284:14-30 (2003)及び米国特許第５３６７０６０号に示されている。一実施態様では、ＮＲＧ１αはＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ７ＲＴＶ８のアミノ酸配列を含む（配列番号１）。一実施態様では、ＮＲＧ１αのＥＧＦドメインは配列番号１のアミノ酸Ｓ１７７−Ｋ２４１のアミノ酸配列（配列番号３）を含む。一実施態様では、ＮＲＧβはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３９２５０のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。実施態様では、ＮＲＧ１βのＥＧＦドメインは配列番号２のアミノ酸Ｔ１７６−Ｋ２４６のアミノ酸配列（配列番号４）を含む。
【００６２】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は 「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗ＮＲＧ１抗体は疾患の発症を遅らせ、疾患の進行を遅らせ、再発を防ぎ、又は腫瘍の再発までの時間を増加させるために使用される。所定の実施態様において、処置は、腫瘍再発生細胞の数の減少又は完全な消失、腫瘍再発生細胞でない腫瘍の細胞に対する固形腫瘍中の腫瘍再発生細胞の数の減少、及び／又は腫瘍再発生細胞の増殖の阻害をもたらす。所定の実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体による処置は、腫瘍再発までの時間を、抗ＮＲＧ１抗体による処置無しにおける腫瘍再発までの時間よりも、少なくとも１．２５、１．５０、１．７５、２．０倍長く増加させる。
【００６３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために抗原を特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００６４】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【００６５】
ＩＩ．組成物及び方法
ニューレグリン（ＮＲＧ１）シグナル伝達は、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）又はＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）受容体の何れかを介して生じうるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＰＫＣ、ＭＡＰＫ及びＲａｓシグナル伝達経路を含む複数のシグナル伝達カスケードを惹起しうる。Junttila, T. T.等(2009)；Lee-Hoeflich等, (2008)；国際公開第２０１１１０３２４２号；米国特許出願公開第２０１１０２２９４９３号。更に、ＮＲＧ１シグナル伝達の阻害は、治療剤での治療後に腫瘍再発(relapse)又は再発(recurrence)を遅延させ又は防止する。実施例２−４及び国際公開第２０１１１０３２４２号、米国特許出願公開第２０１１０２２９４９３号。ＮＲＧ１誘導シグナル伝達を阻害する抗ＮＲＧ１抗体は自己分泌ＮＲＧ１シグナル伝達を含むＮＲＧ１シグナル伝達に関連する癌の治療に有用である。
【００６６】
従って、本発明の一態様は、ＮＲＧ１に結合する抗体（抗ＮＲＧ１抗体）を提供する。これらの抗体は、癌の治療において及び治療剤を用いた治療後の抵抗性及び／又は癌の再発の予防に用途が見出される。
【００６７】
一実施形態では、ニューレグリン１αとニューレグリン１βの双方のアイソフォームに結合する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、ニューレグリン１βのＥＧＦドメインとニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する。
【００６８】
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合し、ニューレグリン１αに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合する。
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合し、ニューレグリン１αのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合する。
【００６９】
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合する。
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのＥＧＦドメインに１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１×１０−１ｎＭ、１×１０−２ｎＭ、又は１×１０−３ｎＭ以下のｋＤで結合する。
【００７０】
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、ニューレグリン１αに結合するのと等しいかそれより大きい親和性でニューレグリン１βに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１αに結合する親和性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００倍以上の親和性でニューレグリン１βに結合する。
【００７１】
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合するのと等しいかそれより大きい親和性でニューレグリン１βのＥＧＦドメインに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する親和性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００倍以上の親和性でニューレグリン１βのＥＧＦドメインに結合する。
【００７２】
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１βに結合するのと等しいかそれより大きい親和性でニューレグリン１αに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１βに結合する親和性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００倍以上の親和性でニューレグリン１αに結合する。
【００７３】
幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１βのＥＧＦドメインに結合するのと等しいかそれより大きい親和性でニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、それがニューレグリン１βのＥＧＦドメインに結合する親和性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００倍以上の親和性でニューレグリン１αのＥＧＦドメインに結合する。
【００７４】
一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのエピトープとニューレグリン１αのエピトープに結合する。一実施態様では、エピトープは、ニューレグリン１βとニューレグリン１αのＥＧＦドメインに存在する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号４のアミノ酸配列からの、その中の、又はそれとオーバーラップするニューレグリン１βのエピトープに結合する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体が結合するニューレグリン１βのエピトープは、配列番号４のアミノ酸配列のセグメント、例えば配列番号４のアミノ酸１−３７、又は配列番号４のアミノ酸３８−６４からのものであり、その中にあり、又はそれにオーバーラップしている。
【００７５】
一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は配列番号３のアミノ酸配列からの、その中の、又はそれとオーバーラップするニューレグリン１αのエピトープと結合する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体が結合するニューレグリン１αのエピトープは、配列番号３のアミノ酸配列のセグメント、例えば配列番号３のアミノ酸１−３６、又は配列番号３のアミノ酸３７−５８からのものであり、その中にあり、又はそれにオーバーラップしている。
【００７６】
他の態様では、本発明はここに提供される抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープに結合する抗ＮＲＧ１抗体を提供する。他の態様では、本発明はここに提供される抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープへの結合に対して競合する抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００７７】
Ａ．例示的ＮＲＧ抗体
一態様では、本発明は配列番号：５、２８、３４、３７、３９、４１、及び７６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：６及び２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：７、３０、４２、４３、４４、４８、及び５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：８、１２、１６、１９、及び３１から選択されるアミノ酸配列を含む  ＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：９、１３、１７、３２、４６、及び４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：１０、１１、１４、１５、１８、２０、３３、３５、３６、３８、４０、４５、４７、及び５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：５、２８、３４、３７、３９、４１、及び７６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：６及び２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：７、３０、４２、４３、４４、４８、及び５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：８、１２、１６、１９、及び３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：９、１３、１７、３２、４６、及び４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：１０、１１、１４、１５、１８、２０、３３、３５、３６、３８、４０、４５、４７、及び５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００７８】
一態様では、本発明は、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：８、１２、１６、及び１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：９、１３、及び１７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：１０、１１、１４、１５、１８、及び２０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：８、１２、１６、及び１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：９、１３、及び１７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：１０、１１、１４、１５、１８、及び２０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００７９】
一態様では、本発明は配列番号：２８、３４、３７、３９、４１、及び７６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：３０、４２、４３、４４、４８、及び５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：１９及び３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：３２、４６、及び４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：３３、３５、３６、３８、４０、４５、４７、及び５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：２８、３４、３７、３９、４１、及び７６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：３０、４２、４３、４４、４８、及び５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：１９及び３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：３２、４６、及び４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：３３、３５、３６、３８、４０、４５、４７、及び５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００８０】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００８１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲを含む抗体を提供する。更なる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００８２】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲを含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８３】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号：７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号：１８を含むアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【００８４】
他の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｆ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【００８５】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００８６】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲを含む抗体を提供する。更なる実施態様では、抗体は（ａ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００８７】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は（ａ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８８】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号：４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【００８９】
他の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【００９０】
一態様では、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、及び２７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：２１のＶＨと、配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、及び２７から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００９１】
一態様では、本発明は、配列番号：５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６４、６６、６８、７０、及び７２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６４、６６、６８、７０、及び７２から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【００９２】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、及び２７から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列と、配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、及び２７から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
【００９３】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６４、６６、６８、７０、及び７２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６４、６６、６８、７０、及び７２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列と、配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
【００９４】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：２１において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：２１におけるＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００９５】
他の態様では、配列番号：２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＮＲＧ１抗体が提供される。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：２６において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：２６におけるＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００９６】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、上に提供された実施態様の何れかのＶＨと上に提供された実施態様の何れかのＶＬを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含むそれぞれ配列番号：２１及び配列番号：２６のＶＨ及びＶＬ配列を含む。
【００９７】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：６３において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：６３におけるＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００９８】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、配列番号：５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が提供される。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：５３において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：５３におけるＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００９９】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、上に提供された実施態様の何れかのＶＨと上に提供された実施態様の何れかのＶＬを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含むそれぞれ配列番号：６３及び配列番号：５３のＶＨ及びＶＬ配列を含む。
【０１００】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：７２において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：７２における重鎖配列を含む。
【０１０１】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、配列番号：７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む抗体が提供される。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：７３において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：７３における軽鎖配列を含む。
【０１０２】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、上に提供された実施態様の何れかの重鎖と上に提供された実施態様の何れかの軽鎖を含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含むそれぞれ配列番号：７２及び配列番号：７３の重鎖及び軽鎖配列を含む。
【０１０３】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：７４において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：７４における重鎖配列を含む。
【０１０４】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、配列番号：７５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む抗体が提供される。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：７５において全体で１から１０のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外側（つまり、ＦＲ内）の領域で起こる。場合によっては、抗ＮＲＧ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：７５における軽鎖配列を含む。
【０１０５】
他の態様では、抗ＮＲＧ１抗体であって、上に提供された実施態様の何れかの重鎖と上に提供された実施態様の何れかの軽鎖を含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含むそれぞれ配列番号：７４及び配列番号：７５の重鎖及び軽鎖配列を含む。
【０１０６】
更なる態様では、本発明は、ここに提供される抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープ（一又は複数）に結合する抗体を提供する。一実施態様では、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープ（一又は複数）に結合する抗体が提供される。
【０１０７】
一実施態様では、（ａ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープ（一又は複数）に結合する抗体が提供される。
【０１０８】
一実施態様では、配列番号：２１のＶＨ配列と配列番号：２６のＶＬ配列を含む抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープ（一又は複数）に結合する抗体が提供される。一実施態様では、配列番号：６３のＶＨ配列と配列番号：５３のＶＬ配列を含む抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープ（一又は複数）に結合する抗体が提供される。
【０１０９】
他の実施態様では、ここに記載の抗ＮＲＧ１抗体と同じエピトープ（一又は複数）への結合に対して競合する抗体が提供される。
【０１１０】
一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリン１βのエピトープとニューレグリン１αのエピトープに結合する。一実施態様では、エピトープはニューレグリン１β及びニューレグリン１αのＥＧＦドメインに存在する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列から、その中、又はそれにオーバーラップするニューレグリン１βのエピトープに結合する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体が結合しているニューレグリン１βのエピトープは配列番号：４のアミノ酸配列セグメント、例えば配列番号：４のアミノ酸１−３７又は配列番号：４のアミノ酸３８−６４からのものであり、その中にあり、又はそれにオーバーラップしている。
【０１１１】
一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は配列番号：３のアミノ酸配列からのものであり、その中にあり、又はそれにオーバーラップしているニューレグリン１αのエピトープに結合する。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体が結合しているニューレグリン１αのエピトープは配列番号：３のアミノ酸配列セグメント、例えば配列番号：３のアミノ酸１−３６又は配列番号：３のアミノ酸３７−５８からのものであり、その中にあり、又はそれにオーバーラップしている。
【０１１２】
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに係る抗ＮＲＧ１抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＮＲＧ１抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ(ａｂ')２断片である。他の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここに定義される他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様では、上記実施態様の何れかに係る抗ＮＲＧ１抗体は以下のセクション１−７に記載されるような特徴の何れかを単独で又は組み合わせて含んでいてもよい。
【０１１３】
１）抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【０１１４】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen等, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【０１１５】
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原 ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) （ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１１６】
２）抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１１７】
ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１１８】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。
【０１１９】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。
【０１２０】
３）キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１２１】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１２２】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号;Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (「FRシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１２３】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照); ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域 (例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照); 及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域 (例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)を含む。
【０１２４】
４）ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１２５】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。 また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、さらに種々のヒト定常領域と組み合わせることにより、例えば、更に改変される可能性がある。
【０１２６】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって製造することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している)及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している)に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１２７】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１２８】
５）ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１２９】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが個別ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１３０】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１３１】
６）多重特異性抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つはＮＲＧ１に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、ＮＲＧ１の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＮＲＧ１を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１３２】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び“ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ”エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照)、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照)、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１３３】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【０１３４】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＮＲＧ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１３５】
７）抗体変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
【０１３６】
ａ．置換、挿入、及び欠失変異体
所定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、関心の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
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【０１３７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１３８】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１３９】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１４０】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１４１】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１４２】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１４３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１４４】
ｂ．グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１４５】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の”幹”のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。
【０１４６】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)を含む。
【０１４７】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１４８】
ｃ．Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１４９】
所定の実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイでは、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号(例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照) 及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる(例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
【０１５０】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１５１】
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)
【０１５２】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１５３】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【０１５４】
増加した半減期及び胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）。
【０１５５】
Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１５６】
ｄ．システイン改変抗体変異体
所定の実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基のいずれか又は複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。  
【０１５７】
ｅ．抗体誘導体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
【０１５８】
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１５９】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＮＲＧ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は（例えば、〜で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクターを含む（例えばこれらで形質転換される）。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＮＲＧ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、場合によっては、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１６０】
抗ＮＲＧ１抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１６１】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で製造することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003),頁245-254,も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、さらに精製することができる。
【０１６２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１６３】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１６４】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１６５】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 255-268頁(2003)を参照。
【０１６６】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供されるＮＲＧ１抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０１６７】
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１６８】
その他の態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらのＮＲＧアンタゴニストを同定するために設けられている。生物学的活性は、例えば、ＮＲＧ誘導性受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達の阻害、腫瘍増殖の阻害、細胞増殖の阻害を含むことができる。インビボ及び／又はインビトロにおいてそうした生物学的活性を有する抗ＮＲＧ１抗体もまた提供される。
【０１６９】
所定の実施態様において、本発明の抗ＮＲＧ１抗体は、そのような生物学的活性について試験される。一実施態様では、ＮＲＧ１誘導性受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力は、潜在的な抗ＮＲＧ１抗体の存在下及び非存在下で、受容体チロシンキナーゼのチロシン残基のＮＲＧ１誘導性リン酸化のレベルを決定することによって測定することができる。Ｈｏｌｍｅｓら、１９９２年。以下は、受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態を決定するための例示的なアッセイである。Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３を発現する細胞は（例えば、Ｃａｏｖ３細胞、又はＨｅｒ２とＨｅｒ３を発現するように操作された細胞など）、潜在的な抗ＮＲＧ１抗体又はバッファー（コントロール）のいずれかで６０分間プレインキュベーションの後に、１０ｎＭのＮＲＧで刺激される。チロシンリン酸化のレベルを決定するために、全細胞溶解物を抗リン酸化チロシン抗体でプローブされるウェスタンブロット法で分析する。ブロットは抗リン酸化シグナルを定量するためにスキャンされ得る。バッファ・コントロールに比べて、抗ＮＲＧ１抗体は、チロシンリン酸化のレベルを減少させるであろう。一実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体は、未処置コントロールのと比較して、ＮＲＧ１誘導性チロシンキナーゼシグナル伝達を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％阻害する。
【０１７０】
所定の実施態様において、本発明の抗体は、インビトロでの細胞の成長又は増殖を阻害するその能力について試験される。細胞の成長や増殖を阻害するためのアッセイは、当該分野で周知である。本明細書中に記載される「細胞の死滅」アッセイによって例示される、細胞増殖についての特定のアッセイは、細胞の生存率を測定する。そのようなアッセイの一つは、プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン）から市販されている、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイである。そのアッセイは、代謝活性細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づき、培養液中で生存細胞の数を決定する。Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, 米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適するように、９６穴形式又は３８４穴形式で行うことができる。Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ法では、直接培養細胞に単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を追加することを含む。これにより、細胞溶解とルシフェラーゼ反応により生成した発光シグナルの生成を生じる。発光シグナルは、培養中に存在する生存細胞の数に直接的に比例しているＡＴＰの存在量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ撮像装置により記録することができる。発光出力は相対光単位（ＲＬＵ）として表される。
【０１７１】
他の細胞増殖アッセイは、「ＭＴＴ」アッセイであり、ミトコンドリア還元酵素による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物のホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭアッセイの様に、このアッセイは細胞培養中に存在する代謝的に活性な細胞数を示す。例えばMosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang et al. (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照のこと。
【０１７２】
一態様において、抗ＮＲＧ１抗体はインビトロでの細胞死誘導能力について試験される。細胞死を誘導するためのアッセイは、当該分野で周知である。いくつかの実施態様において、そのようなアッセイは、例えば、よう化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11を参照）又は７ＡＡＤの取り込みによって示される膜統合性の損失を測定する。例示的なＰＩ取り込みアッセイにおいて、細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：１０％の熱不活性ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２ｍＭＬ−グルタミンが補充されたＨａｍ'ｓ Ｆ−１２（５０：５０）において培養される。したがって、アッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で行われる。細胞は、１００×２０ｍｍのディッシュにおいてディッシュにつき３×１０６の密度で播種され、オーバーナイトで付着することができる。培地は取り除かれ、培地のみ、又は様々な濃度の抗体又はイムノコンジュゲートを含む培地で交換される。細胞は、３日間インキューベートされる。処理に続いて、単層はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によって分離される。細胞は４℃で、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離され、ペレットが３ｍｌの低温Ｃａ２＋結合緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）中に再懸濁され、細胞凝集塊の除去のために３５ｍｍの濾過器キャップの(strainer-capped)１２×７５ｍｍのチューブ（１ｍｌ／チューブ、処理群につき３つのチューブ）に等分される。そして、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を加える。サンプルはＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析される。ＰＩ取り込みによって決定される統計的に有意な水準の細胞死を誘導する抗体がこのように同定される。
【０１７３】
一態様において、抗ＮＲＧ１はインビトロでのアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導能力について試験される。アポトーシスを誘導する抗体又はイムノコンジュゲートの例示的なアッセイは、アネキシン結合アッセイである。前項で説明したように、典型的なアネキシン結合アッセイでは、細胞が培養され皿に播種される。培地は取り除かれ、培地のみ、又は０．００１から１０μｇ／ｍｌの抗体又はイムノコンジュゲートを含む培地で交換される。３日間のインキュベーションに続いて、単層はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によって分離される。次いで、細胞は遠心分離され、Ｃａ２＋結合バッファーに再懸濁し、前項で説明したように、チューブに等分される。チューブは、標識されたアネキシン（例えばアネキシンＶ−ＦＩＴＣ）（１μｇ／ｍｌ）を受け取る。サンプルはＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析される。コントロールに比較して、アネキシン結合の統計的に有意な水準を誘導する抗体が、このように同定される。アポトーシスを誘導する抗体又はイムノコンジュゲートについてのその他の例示的なアッセイは、ゲノムＤＮＡのヌクレオソーム劣化を検出するためのヒストンＤＮＡのＥＬＩＳＡ比色アッセイである。そのようなアッセイは例えば、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（ロシュ、パロアルト、カリフォルニア州）を用いて行うことができる。
【０１７４】
インビトロアッセイにおいて、上記のいずれかで使用するための細胞は、自然にＮＲＧ１を発現するか、又はＮＲＧ１を発現するように操作されている細胞又は細胞株が含まれる。そのような細胞は、同じ組織起源の正常細胞に比較してＮＲＧ１を過剰発現する腫瘍細胞を含む。そのような細胞はまた、ＮＲＧ１を発現する細胞株（腫瘍細胞株を含む）、及びＮＲＧ１を通常発現しないが、核酸をコードするＮＲＧ１でトランスフェクトされている細胞株を含む。
【０１７５】
一態様において、抗ＮＲＧ１抗体はインビボでの細胞成長又は増殖を阻害するその能力について試験される。所定の実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体はインビボでの腫瘍増殖を阻害するその能力について試験される。インビボのモデル系、例えば異種移植モデルを、そうした試験に使用することができる。例示的な異種移植システムでは、ヒト腫瘍細胞は、適当に免疫が低下した非ヒト動物、例えば、無胸腺「ヌード」マウスに導入される。本発明の抗体は、動物に投与される。腫瘍増殖を阻害又は減少させる抗体の能力が測定される。上記の異種移植システムの特定の実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者由来の腫瘍細胞である。このような異種移植モデルはＯｎｃｏｔｅｓｔ社（フライブルク、ドイツ）から市販されている。所定の実施態様において、ヒト腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞株由来の細胞である。所定の実施態様において、ヒト腫瘍細胞は、乳房脂肪パッドのような適当な部位に皮下注射又は移植によって、適切に免疫不全非ヒト動物に導入される。
【０１７６】
所定の実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体は、未処置コントロールと比較して、細胞増殖を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％阻害する。他の実施態様において、抗ＮＲＧ１抗体は、未処置コントロールと比較して、腫瘍増殖を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％阻害する。
【０１７７】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＮＲＧ１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１７８】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許４２５２３５Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照;Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993);及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１７９】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０１８０】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性コンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１８１】
抗体と細胞毒性薬剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992);米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０１８２】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを限定されないが明示的に意図している。
【０１８３】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗ＮＲＧ１抗体は、生物学的サンプル中のＮＲＧ１の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは、肺組織又は乳房組織などの細胞又は組織を含む。
【０１８４】
一実施態様において、診断又は検出の方法で使用するための抗ＮＲＧ１抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＮＲＧ１の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＮＲＧ１抗体のＮＲＧ１への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＮＲＧ１抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＮＲＧ１抗体とＮＲＧ１の間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ方法であり得る。一実施態様において、例えばＮＲＧ１が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＮＲＧ１抗体が抗ＮＲＧ１抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。
【０１８５】
一実施態様において、患者が治療に耐性を持つかその可能性が高い癌を持っている場合には、患者は抗ＮＲＧ１抗体による治療のために選択される。本発明の一態様は、患者が治療に耐性を持つかその可能性が高い癌を有するかを決定するアッセイを提供する。一実施態様において、アッセイは、ＮＲＧ１の発現について、患者から採取した腫瘍細胞をアッセイすることを含み、そこではＮＲＧ１の発現が、患者が治療に耐性を持つか又はその可能性が高い癌を持っていることを示す。一実施態様において、腫瘍におけるＮＲＧ１の発現レベルが、腫瘍のＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１の発現レベル未満である場合、患者は治療に耐性を持つか又はその可能性がある癌を有するものとして選択される。
【０１８６】
一実施態様において、患者が治療薬による治療後に再発する可能性のある癌を持っている場合には、患者は抗ＮＲＧ１抗体による治療のために選択される。本発明の一態様は、患者が治療薬による治療後に再発する可能性がある癌を有するかを決定するアッセイを提供する。一実施態様において、アッセイは、ＮＲＧ１の発現について、患者から採取した腫瘍細胞をアッセイすることを含み、そこではＮＲＧ１の発現が、患者が治療薬による治療後に再発する可能性がある癌を持っていることを示す。一実施態様において、腫瘍におけるＮＲＧ１の発現レベルが、腫瘍のＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１の発現レベル未満である場合、患者は治療薬による治療後に再発する可能性がある癌を有するものとして選択される。
【０１８７】
所定の実施態様において、診断アッセイは、例えば、免疫組織化学、インサイツハイブリダイゼーション法、又はＲＴ−ＰＣＲを使用して、腫瘍細胞におけるニューレグリンの発現を決定することを含む。他の実施態様において、診断アッセイは、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、腫瘍細胞におけるニューレグリンの発現レベルを決定することを含む。幾つかの実施態様において、診断アッセイは、例えば、非癌性隣接組織などのコントロール組織と比較して、ニューレグリンの発現レベルを決定することを包含する。
【０１８８】
所定の実施態様において、標識された抗ＮＲＧ１抗体が与えられる。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光、発色、高電子密度の化学発光、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応や分子間相互作用を介して間接的に検出されるような酵素やリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、ラジオアイソトープの３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０１８９】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＮＲＧ１抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのようなアンタゴニストと任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１９０】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１９１】
また、ここでの製剤は治療される特定の適応症に必要な一を越える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含みうる。例えば、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチンの組み合わせ又は２つ又は３つ全てを更に提供することが望ましい場合がある。他の例では、抗ＨＥＲ抗体を更に提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は意図される目的のために効果的である量で組合わせて適切に存在する。
【０１９２】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【０１９３】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体又はイムノコンジュゲートを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０１９４】
インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過により、直ぐに達成されうる。
【０１９５】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＮＲＧ１抗体を、治療方法で使用することができる。
本発明の一態様は、癌を治療する方法を提供する。本発明の一態様は、患者に抗ＮＲＧ１抗体を投与することによって、患者における治療剤での治療に対する抵抗を防止する方法を提供する。本発明の他の態様は、患者に抗ＮＲＧ１抗体を投与することによって、治療剤での治療後の癌の再発を防止することを提供する。
【０１９６】
特定の態様は、有効量の抗ＮＲＧ１抗体を患者に投与することを含む腫瘍再発を防止し又は腫瘍再発までの時間を増大させる方法を含む。一実施態様では、患者は治療剤、例えば化学療法剤又は抗原結合剤、例えば抗体で治療されている。一実施態様では、癌は腫瘍再始原細胞（tumor re-intiating cells）を含む。一実施態様では、癌は非小細胞肺癌である。一実施態様では、癌は乳癌である。一実施態様では、患者は化学療法剤で治療される。一実施態様では、化学療法剤は癌の看護治療の標準として使用される薬剤である。一実施態様では、化学療法剤はゲムシタビン、パクリタキセル又はシスプラチン又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせである。一実施態様では、化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤ではない。他の実施態様では、化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。一実施態様では、化学療法剤はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の阻害剤である。他の実施態様は抗ＮＲＧ１抗体との併用で患者に化学療法剤を更に投与することを含む。
【０１９７】
他の実施態様では、患者は抗体で治療される。一実施態様では、抗体は抗チロシンキナーゼ抗体である。一実施態様では、抗体はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４抗体である。他の実施態様は抗ＮＲＧ１抗体との併用で患者に抗体を更に投与することを含む。
【０１９８】
所定の実施態様では、腫瘍再発までの時間は抗ＮＲＧ１抗体の不存在下での腫瘍再発までの時間の少なくとも１．２５、１．５０、１．７５、２．０、２．５、５．０、１０、２０、又は５０倍長い。
【０１９９】
他の態様は、有効量の抗ＮＲＧ１抗体を患者に投与することを含む抵抗性癌の患者を治療する方法を提供する。一実施態様では、癌は腫瘍再始原細胞を含む。一実施態様では、癌は非小細胞肺癌である。一実施態様では、癌は乳癌である。一実施態様では、癌は化学療法剤での治療に抵抗性（耐性）である。一実施態様では、癌は、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン及びシスプラチンの２つ又は３つ全ての組み合わせでの治療に抵抗性である。一実施態様では、癌はチロシンキナーゼ阻害剤での治療に抵抗性である。一実施態様では、癌はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４阻害剤での治療に抵抗性である。他の実施態様は患者に化学療法剤を更に投与することを含む。一実施態様では、化学療法剤はゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン及びシスプラチンの２つ又は３つ全ての組み合わせである。一実施態様では、化学療法剤はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４阻害剤である。
【０２００】
一実施態様では、癌は治療用抗体での治療に抵抗性である。一実施態様では、癌はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４抗体での治療に抵抗性である。他の実施態様は患者に抗体を更に投与することを含む。一実施態様では、抗体はトラスツズマブ又はペルツズマブである。
【０２０１】
他の態様は癌を有する患者に有効量の抗ＮＲＧ１抗体及び治療剤を投与することを含む癌における抵抗性を防止する方法を提供する。一実施態様では、癌は腫瘍再始原細胞を含む。一実施態様では、癌は非小細胞肺癌である。一実施態様では、癌は乳癌である。一実施態様では、癌は化学療法剤での治療に抵抗性（耐性）である。一実施態様では、癌は、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン及びシスプラチンの２つ又は３つ全ての組み合わせでの治療に抵抗性である。一実施態様では、化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤ではない。他の実施態様では、化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。一実施態様では、化学療法剤はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の阻害剤である。他の実施態様は患者に化学療法剤を更に投与することを含む。一実施態様では、化学療法剤はゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチン又はパクリタキセル、カルボプラチン、及びシスプラチンの２つ又は３つ全ての組み合わせである。
【０２０２】
一実施態様では、癌は治療用抗体での治療に抵抗性である。一実施態様では、癌はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４抗体での治療に抵抗性である。他の実施態様は患者に抗体を更に投与することを含む。一実施態様では、抗体はトラスツズマブ又はペルツズマブである。
【０２０３】
所定の実施態様では、治療法に使用される抗ＮＲＧ１抗体が提供される。所定の実施態様では、本発明は、有効量の抗ＮＲＧ１抗体を個体に投与することを含む癌を有する個体の治療方法に使用するための抗ＮＲＧ１抗体を提供する。そのような一実施態様では、方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも一つの更なる治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、本発明は癌の再発を被った患者を治療するのに使用される抗ＮＲＧ１抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明は治療剤に対する抵抗を防止するために有効量の抗ＮＲＧ１抗体を個体に投与することを含む個体における治療剤での治療に対する抵抗を防止する方法に使用される抗ＮＲＧ１抗体を提供する。
【０２０４】
更なる態様では、本発明は医薬の製造又は調製における抗ＮＲＧ１抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は癌の治療のためのものである。更なる実施態様では、医薬は癌を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む癌の治療方法に使用されるためのものである。そのような一実施態様では、方法は例えば以下に記載のもののような、少なくとも一つの更なる治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、医薬は患者における治療剤での治療に対する抵抗を防止するためのものである。更なる実施態様では、医薬は患者における癌の再発を防止するためのものである。
【０２０５】
更なる態様では、本発明は、例えば上記の治療方法の何れかにおいて使用するための、ここに提供される任意の抗ＮＲＧ１抗体を含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤はここで提供される抗ＮＲＧ１抗体の何れかと薬学的に許容可能な担体を含有する。他の実施態様では、薬学的製剤はここで提供される抗ＮＲＧ１抗体と、例えば以下に記載されるような少なくとも一つの更なる治療剤を含有する。
【０２０６】
本発明の抗体は、治療において単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用されうる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも一つの更なる治療薬と同時投与されうる。更なる治療剤の例は以下に記載する。
【０２０７】
上述のそのような併用療法は、併用投与（２以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる場合）、及び本発明の抗体の投与が、更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、生じうる別個の投与を包含する。また、本発明の抗体は放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２０８】
本発明の抗体(及び任意の更なる治療剤)は、非経口的、肺内、及び鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与を含む。投薬は、投与が短期のものであるか長期のものであるかに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、なすことができる。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールがここで考えられる。
【０２０９】
本発明の抗体は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、用量決定され、投与されるであろう。こここで考慮される要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に知られている他の要因が含まれる。抗体は、必要ではないが、場合によっては当該問題の疾患を予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化されうる。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討された他の要因に依存する。これらは、一般に、同じ投薬量で、ここに記載された投与経路で、又はここに記載の用量のおよそ１〜９９％か、又は経験的／臨床的に適切であると決定された任意の用量及び任意の経路により、使用される。
【０２１０】
疾患の予防又は治療のために、（単独で又は一又は複数の他の付加的な治療剤との併用で使用される場合）本発明の抗体の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、過去の治療、患者の臨床病歴及び抗体に対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。抗体は一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。抗体の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）の一又は複数回の用量で患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量の抗体が投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。この治療法の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２１１】
上記の製剤又は治療方法のいずれかが、抗ＮＲＧ１抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２１２】
更なる治療剤
所定の実施態様では、更なる治療薬は、チロシンキナーゼ受容体経路を阻害する薬剤である。一実施態様では、更なる治療薬は、ＨＥＲ経路を阻害する。一実施態様では、更なる治療薬は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の阻害剤である。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、用語「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに結合するか又はそうでなければＥＧＦＲに直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４９４３５３３号，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎらを参照）及びその変異体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＩＴＵＸ(登録商標)）及び再形成ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号，Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．を参照）；ＩＭＣ−１１Ｆ８，完全ヒトＥＧＦＲ標的抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；タイプＩＩ変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５２１２２９０号）；米国特許第５８９１９９６号に記載されているようなＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ化抗体；及びＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えばＡＢＸ−ＥＧＦ又はパニツムマブ（国際公開第９８／５０４３３，Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎを参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliottoら Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)）；ＥＭＤ７２００（マツズマブ），ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦ及びＴＧＦ-α双方と競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体，ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３及びＥ７．６．３として知られ、米国特許第６２３５８８３号に記載されている完全なヒト抗体；ＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ）；及びｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６（Johnsら、 J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は細胞傷害剤とコンジュゲートされ得、よってイムノコンジュゲートを生じる（例えば、欧州特許出願公開第６５９４３９Ａ２号，Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨを参照）。ＥＧＦＲアンタゴニストは小分子、例えば米国特許第５６１６５８２号、同第５４５７１０５号、同第５４７５００１号、同第５６５４３０７号、同第５６７９６８３号、同第６０８４０９５号、同第６２６５４１０号、同第６４５５５３４号、同第６５２１６２０号、同第６５９６７２６号、同第６７１３４８４号、同第５７７０５９９号、同第６１４０３３２号、同第５８６６５７２号、同第６３９９６０２号、同第６３４４４５９号、同第６６０２８６３号、同第６３９１８７４号、同第６３４４４５５号、同第５７６００４１号、同第６００２００８号、及び同第５７４７４９８、並びに次のＰＣＴ公報：国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９８／５００３８号、国際公開第９９／０９０１６号、及び国際公開第９９／２４０３７号に記載されている化合物を含む。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＯＳＩ-７７４(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ，タルセバ(登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ １８３８０５（ＣＩ １０３３、２−プロペンアミ��、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−，二塩酸塩，Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡＴＭ）４−（３’−クロロ−４’−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ１０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチナミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｐｆｉｚｅｒ）；及びＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｐｆｉｚｅｒ）、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ラパチニブ（タイケルブ（ＴＹＫＥＲＢ）（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６又はＮ−［３−クロロ−４−［（３フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］６［５［［［２メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン；グラクソスミスクライン）を含む。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＥＲ２阻害剤」は、ＨＥＲ２に結合するか又はそうでなければＨＥＲ２に直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＨＥＲ２アンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＨＥＲ２に結合する抗体及び小分子を含む。特定のＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブとトラスツズマブを含む。本明細書で使用される場合、用語「ＨＥＲ３阻害剤」は、ＨＥＲ３に結合するか又はそうでなければＨＥＲ３に直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＨＥＲ３アンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＨＥＲ３に結合する抗体及び小分子を含む。本明細書で使用される場合、用語「ＨＥＲ４阻害剤」は、ＨＥＲ４に結合するか又はそうでなければＨＥＲ４に直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＨＥＲ４アンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＨＥＲ４に結合する抗体及び小分子を含む。
【０２１５】
ＨＥＲ抗体に関連した特許公報は、米国特許第５６７７１７１号、米国特許第５７２０９３７号、米国特許第５７２０９５４号、米国特許第５７２５８５６号、米国特許第５７７０１９５号、米国特許第５７７２９９７号、米国特許第６１６５４６４号、米国特許第６３８７３７１号、米国特許第６３９９０６３号、米国特許出願公開第２００２／０１９２２１１Ａ１号、米国特許第６０１５５６７号、米国特許第６３３３１６９号、米国特許第４９６８６０３号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第６４０７２１３号、米国特許第６７１９９７１号、米国特許第６８００７３８号、米国特許出願公開第２００４／０２３６０７８Ａ１号、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第６２６７９５８号、米国特許第６６８５９４０号、米国特許第６８２１５１５号、国際公開第９８／１７７９７号、米国特許第６３３３３９８号、米国特許第６７９７８１４号、米国特許第６３３９１４２号、米国特許第６４１７３３５号、米国特許第６４８９４４７号、国際公開第９９／３１１４０号、米国特許出願公開第２００３／０１４７８８４Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４Ａ１号、米国特許出願公開第２００５／０００２９２８Ａ１号、米国特許第６５７３０４３号、米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７Ａ１号、国際公開第９９／４８５２７号、米国特許出願公開第２００２／０１４１９９３Ａ１号、国際公開第０１／００２４５号、米国特許出願公開第２００３／００８６９２４号、米国特許出願公開第２００４／００１３６６７Ａ１号、国際公開第００／６９４６０号、国際公開第０１／００２３８号、国際公開第０１／１５７３０号、米国特許第６６２７１９６８１号、米国特許第６６３２９７９Ｂ１号、国際公開第０１／００２４４号、米国特許出願公開第２００２／００９０６６２Ａ１号、国際公開第０１／８９５６６号、米国特許出願公開第２００２／００６４７８５号、米国特許出願公開第２００３／０１３４３４４号、国際公開第０４／２４８６６号、米国特許出願公開第２００４／００８２０４７号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８４５Ａ１号、国際公開第０３／０８７１３１号、米国特許出願公開第２００３／０２２８６６３号、国際公開第２００４／００８０９９Ａ２号、米国特許出願公開第２００４／０１０６１６１号、国際公開第２００４／０４８５２５号、米国特許出願公開第２００４／０２５８６８５Ａ１号、米国特許第５９８５５５３号、米国特許第５７４７２６１号、米国特許第４９３５３４１号、米国特許第５４０１６３８号、米国特許第５６０４１０７号、国際公開第８７／０７６４６号、国際公開第８９／１０４１２号、国際公開第９１／０５２６４号、欧州特許出願第４１２１１６Ｂ１号、欧州特許出願第４９４１３５Ｂ１号、米国特許第５８２４３１１号、欧州特許出願第４４４１８１Ｂ１号、欧州特許出願第１００６１９４Ａ２号、米国特許出願公開第２００２／０１５５５２７Ａ１号、国際公開第９１／０２０６２号、米国特許第５５７１８９４号、米国特許第５９３９５３１号、欧州特許出願第５０２８１２Ｂ１号、国際公開第９３／０３７４１号、欧州特許出願第５５４４４１Ｂ１号、欧州特許出願第６５６３６７Ａ１号、米国特許第５２８８４７７号、米国特許第５５１４５５４号、米国特許第５５８７４５８号、国際公開第９３／１２２２０号、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許５８７７３０５号、国際公開第９３／２１３１９号、国際公開第９３／２１２３２号、米国特許第５８５６０８９号、国際公開第９４／２２４７８号、米国特許第５９１０４８６号、米国特許第６０２８０５９号、国際公開第９６／０７３２１号、米国特許第５８０４３９６号、米国特許第５８４６７４９号、欧州特許出願第７１１５６５号、国際公開第９６／１６６７３号、米国特許第５７８３４０４号、米国特許第５９７７３２２号、米国特許第６５１２０９７号、国際公開第９７／００２７１号、米国特許第６２７０７６５号、米国特許第６３９５２７２号、米国特許第５８３７２４３号、国際公開第９６／４０７８９号、米国特許第５７８３１８６号、米国特許第６４５８３５６号、国際公開第９７／２０８５８号、国際公開第９７／３８７３１号、米国特許第６２１４３８８号、米国特許第５９２５５１９号、国際公開第９８／０２４６３号、米国特許第５９２２８４５号、国際公開第９８／１８４８９号、国際公開第９８／３３９１４号、米国特許第５９９４０７１号、国際公開第９８／４５４７９号、米国特許第６３５８６８２Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／００５９７９０号、国際公開第９９／５５３６７号、国際公開第０１／２００３３号、米国特許出願公開第２００２／００７６６９５Ａ１号、国際公開第００／７８３４７号、国際公開第０１／０９１８７号、国際公開第０１／２１１９２号、国際公開第０１／３２１５５号、国際公開第０１／５３３５４号、国際公開第０１／５６６０４号、国際公開第０１／７６６３０号、国際公開第０２／０５７９１号、国際公開第０２／１１６７７号、米国特許第６５８２９１９号、米国特許出願公開第２００２／０１９２６５２Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０２１１５３０Ａ１号、国際公開第０２／４４４１３号、米国特許出願公開第２００２／０１４２３２８号、米国特許第６６０２６７０Ｂ２号、国際公開第０２／４５６５３号、国際公開第０２／０５５１０６号、米国特許出願公開第２００３／０１５２５７２号、米国特許出願公開第２００３／０１６５８４０号、国際公開第０２／０８７６１９号、国際公開第０３／００６５０９号、国際公開第０３／０１２０７２号、国際公開第０３／０２８６３８号、米国特許出願公開第２００３／００６８３１８号、国際公開第０３／０４１７３６号、欧州特許出願第１３５７１３２号、米国特許出願公開第２００３／０２０２９７３号、米国特許出願公開第２００４／０１３８１６０号、米国特許第５７０５１５７号、米国特許第６１２３９３９号、欧州特許出願第６１６８１２Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／０１０３９７３号、米国特許出願公開第２００３／０１０８５４５号、米国特許第６４０３６３０Ｂ１号、国際公開第００／６１１４５号、国際公開第００／６１１８５号、米国特許第６３３３３４８Ｂ１号、国際公開第０１／０５４２５号、国際公開第０１／６４２４６号、米国特許出願公開第２００３／００２２９１８号、米国特許出願公開第２００２／００５１７８５Ａ１号、米国特許第６７６７５４１号、国際公開第０１／７６５８６号、米国特許出願公開第２００３／０１４４２５２号、国際公開第０１／８７３３６号、米国特許出願公開第２００２／００３１５１５Ａ１号、国際公開第０１／８７３３４号、国際公開第０２／０５７９１号、国際公開第０２／０９７５４号、米国特許出願公開第２００３／０１５７０９７号、米国特許出願公開第２００２／００７６４０８号、国際公開第０２／０５５１０６号、国際公開第０２／０７０００８号、国際公開第０２／０８９８４２号、国際公開第０３／８６４６７号、及び米国特許出願公開第２０１０／０２５５０１０号を含む。
【０２１６】
所定の実施態様において、更なる治療薬は、化学療法剤である。「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物を指す。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ-９��（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及��ドキセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))、及びビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン(leucovovin)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロン酸(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロン酸(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体(ＥＧＦ-Ｒ)；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリフォシン(perifosine)、ＣＯＸ-２阻害剤(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾーム阻害剤(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；チピファルニブ(tipifarnib)(Ｒ１１５７７)；オラフィニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン-スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標)）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）；及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組合せ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を組合せた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが��まれる。
【０２１７】
ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)）、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ(登録商標)）、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲン受容体調節因子(ＳＥＲＭ)；アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲン受容体(ＥＲ)二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標))などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、メゲストロールアセテート(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール及び４(５)-イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。
【０２１８】
そのような併用療法は、（ｉ）脂質キナーゼ阻害剤、（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ及びＨ−Ｒａｓなどの接着細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）などのリボザイム、及びＨＥＲ２発現阻害剤、（ｉｖ）遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、（ｖ）ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）などの抗血管新生剤、及び薬学的に許容可能な塩類、酸類又は上記のいずれかの誘導体が挙げられる。
【０２１９】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗ＮＲＧ１抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。
【０２２０】
Ｈ．製造品
本発明の他の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、静脈内輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
【実施例】
【０２２１】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：方法
細胞株
ＮＳＣＬＣ細胞株Ｃａｌｕ３、Ｈ４４１、Ｈ１２９９、Ｈ１９９３、Ａ５４９及びＨ５９６、及びＫＰＬ４乳癌細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサスから得た。これらの細胞株は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含むＰＲＭＩで維持された。Ｃａｌｕ３は、ＲＰＭＩの代わりにＡＴＣＣ培地で培養された。Ｃａｌｕ３、Ｈ４４１及びＫＰＬ４細胞株はＴＺＶ−ｂ−アクチンｅＧＦＰのレンチウイルスで形質導入した。複数回の継代後、高ＧＦＰ発現細胞が選別されて増幅され、約９５％のＧＦＰ陽性細胞を得て、これらの下位株はＣａｌｕ３−ＧＦＰ及びＨ４４１−ＧＦＰ及びＫＰＬ４−ＧＦＰと記載された。マウスＮＳＣＬＣ細胞株のＬＫＰＨ１とＬＫＰＨ２は、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋、ｐ５３ＦＬ／＋、Ｚ／ＥＧ肺腫瘍担持マウスからの２つの独立した腫瘍由来であった。細胞株は、はじめに、５％のＦＢＳ、ウシ下垂体抽出物、Ｎ２サプリメント、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で樹立された。ＬＫＰＨ１及びＬＫＰＨ２は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。
【０２２２】
誘導性ｓｈＲＮＡレンチウイルス：本研究で使用したヘアピンオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである。
ｓｈＮＲＧ１：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号７７）
及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号７８）。
ｓｈＮＲＧ１．２：５’ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号７９）及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＣＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号８０）。
ｓｈＥｒｂＢ４：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３”（センス）（配列番号８１）及び
５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号８２）。
ｓｈＥｒｂＢ３：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号８３）及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号８４）。
マウスｓｈＮＲＧ１：５”−ＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号８５）及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧ−３”（アンチセンス）（配列番号８６）。
【０２２３】
相補的な二本鎖のｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドは、記載されているようにＴｅｔ誘導ウイルス遺伝子導入ベクターに挿入した(Hoeflich et al. Cancer Res. 2006)。ベクター系は、シャトルベクター及び、コドン最適Ｔｅｔリプレッサー内部リボソーム進入部位−ＤｓＲｅｄカセットを含む、ｄｓＲｅｄを発現するウイルスベクター骨格を含み、Ｔｅｔ調節ｓｈＲＮＡ発現を可能とする。ルシフェラーゼｓｈＲＮＡコンストラクトは、以前に記載されている（Ｈｏｅｆｌｉｃｈら）。
【０２２４】
ウイルスパッケージング及び細胞株の生成：誘導性ｓｈＲＮＡを有するレンチウイルスコンストラクトが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープ糖タンパク質及びＨＩＶ−１パッケージングタンパク質（ＧＡＧ−ＰＯＬ）を、リポフェクタミン（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に発現するプラスミドを有する所望のｓｈＲＮＡを含む、ｐＨＵＳＨ−レンティ−ＤｓＲｅｄコンストラクトをコ−トランスフェクトすることにより、前述の方法に基づいて作成された。標的細胞は、これらのウイルスで形質導入した。＞３継代後、収集され、プールされ、拡張された、上位約２０％のｄｓＲｅｄ発現細胞を選択するためにＦＡＣＳソーティングが用いられた。
【０２２５】
インビトロでの研究：ｓｈＲＮＡ発現を誘導するために、ドキシサイクリン誘導性ｓｈＮＲＧ１又はｓｈルシフェラーゼを保有する安定な細胞株を、計６日間、１ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンで増殖させた。誘導の初日に、細胞は１０％のＦＢＳで増殖させ、続いて、更に４日間にわたりＦＢＳの滴定が行われた。細胞は、増殖の最後の６時間の間は完全に血清飢餓であった。次いで、細胞はＲＮＡ抽出又はウェスタンブロッティングのために処理された。マウスの肺腫瘍細胞株におけるＨＥＲ４ＥＣＤ研究のために、ＬＫＰＨ細胞が２ｍｇ／ｍＬの濃度でのＨＥＲ４ＥＣＤの添加前に、２４時間、血清飢餓状態で増殖させた。ＬＫＰＨ細胞は、その後、ウエスタンブロット法において処理する前に、さらに４８時間インキュベートした。Ｈ４４１細胞に対する外因性ＮＲＧ１の添加は以下のように行った：Ｈ４４１細胞は、１ｕＭ換えヒトＮＲＧ１β−１細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は対照として１ｕＭ抗ブタクサＩｇＧ２Ａの添加前に１８時間血清飢餓であった。ＮＲＧ１又はブタクサの添加から１０分後に、細胞はウェスタンブロット法のために処理された。
【０２２６】
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製及びｑＰＣＲ：ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙマイクロキットを用いて単離した。相補的ＤＮＡは、製造元の指示に従って、ＡＢＩの高忠実度キットを用いて全ＲＮＡから調製した。ＮＲＧ１アルファ、ＮＲＧ１ベータ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４の発現は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ７５００）によって、ＡＢＩの遺伝子特異的プライマー／プローブを用いて決定した。遺伝子発現は、ＧＡＰＤＨ又はＲＡＢ１４ハウスキーピング遺伝子を用いて正規化した。
【０２２７】
インビボでの異種移植腫瘍の研究：腫瘍細胞（１０００万〜２０００万個）が無胸腺ヌードマウスの右脇腹に移植された。腫瘍の大きさが約２００立方ミリメートルに達したときに、マウスは異なる治療群に分けられた。マウスは、初期の研究のために、ビヒクル又は化学療法（パクリタキセル、静脈内＋シスプラチン、腹腔内）で処置された。化学療法の投与レジメンは、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与を一日おきに５用量、シスプラチンを、Ｃａｌｕ３モデルにおいては第１日と第７日に、Ｈ４４１モデルにおいては第１日と第１４日に、５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与であった。退行腫瘍及び時間を一致させたビヒクルコントロールが、化学療法の最終投与後少なくとも１週間で収集された。腫瘍はディスパーゼ／コラゲナーゼを用いて分離し、サンプルは、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞を収集するために、ＦＡＣＳソートした。ＮＲＧ１ノックダウン研究について、治療群は次のとおりだった：スクロース、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）、化学療法＋スクロース、及び化学療法＋ドキシサイクリン。スクロース又はドキシサイクリンによる処置は、化学療法の初回投与と同時に開始され、研究の期間継続した。５％スクロース水がビヒクル群に対して自由に与えられ、５％ショ糖中の１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンがドキシサイクリン群において与えられた。
【０２２８】
異種移植腫瘍増殖解析：時間をかけて同じ動物からの腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリングアプローチを用いた（Ｐｉｎｈｅｉｒｏら、２００９）。このアプローチは、反復測定と研究終了前の動物の無処置関連終結による適度な脱落率の両方を扱うことができる。キュービック回帰スプラインが、各処置群についてｌｏｇ２腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを適合するために使用された。
【０２２９】
インビボでのＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／＋及びＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／ＦｌＨｅｒ４ＥＣＤ研究：ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／＋はアデノＣｒｅウイルスで感染させ、腫瘍誘導後１６週間熟成させた。ベースラインＣＴスキャンが腫瘍誘導後１６週目（研究の０日目）に実施され、マウスは開始時の腫瘍体積の平均値が等しいようにグループ化された。マウスは研究期間中、３週間に一回シスプラチン（７ｍｇ／ｋｇ）、又はリン酸緩衝生理食塩水を、隔週でＨＥＲ４ＥＣＤ−ＦＣ（２５ｍｇ／ｋｇ）又は抗ブタクサＩｇＧ２Ａ（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与された。シリアルＣＴスキャンが１４日目、４５日目、６６日目に行われた。
【０２３０】
Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）：２つのマイクロＣＴシステム（ｖｉｖａＣＴ４０とｖｉｖａＣＴ７５、Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ、スイス）が、縦方向の肺イメージングのために利用された。動物は、マイクロＣＴシステム間で無作為に割り付けられ、ベースラインのイメージングに使用されるのと同じシステム上で再スキャンされた。データは３８μｍ（ｖｉｖａＣＴ４０）又は５０μｍ（ｖｉｖａＣＴ７５）の等方性ボクセルサイズで、１０００画像、２５０ミリ秒（ｖｉｖａＣＴ４０）又は２００ミリ秒（ｖｉｖａＣＴ７５）の積分時間で、４５ｋｅＶの光子エネルギー、１７７ミリアンペアの電流で得られた。生体内イメージングの期間中、動物は、２％イソフルランを含む医療空気で麻酔され、３７℃の定常温度で制御された温かい空気流によって維持された。各セッションの撮像時間は動物あたり約１５分（ｖｉｖａＣＴ７５）又は２５分（ｖｉｖａＣＴ４０）であり、推定された放射線量は、約０．２Ｇｙ（ｖｉｖａＣＴ７５）又は０．１Ｇｙ（ｖｉｖａＣＴ４０）であった。画像データは、画像解析ソフトウェアパッケージのＡＮＡＬＹＺＥ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州、米国）を使って冠状面で評価された。一度各腫瘍の最大断面が同定されると、最大の腫瘍直径（ｄ１）と最大垂直直径（ｄ２）の推定値が決定された。総腫瘍量は、すべての腫瘍の指向性推定値の外積（ｄ１×ｄ２）の和として算出した。インビボマイクロＣＴ腫瘍の分析は以前に検証され、エクスビボマイクロＣＴ分析によって決定されるように、十分に総腫瘍体積と相関することが見出された（Singh et al., 2010）。
【０２３１】
ｓｉＲＮＡ：ＨＥＲ３（Ｍ−００３１２７−０３）、ＨＥＲ１（Ｍ−００３１１４−０１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、及び非標的コントロールの低分子干渉ＲＮＡオリゴ（ｓｉＲＮＡ）のプールは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯから購入した。ｓｉＲＮＡは、リバーストランスフェクションによってＨ５２２細胞に導入した。細胞／ウェルは、製造元の推奨に従って、５０ｍｍｏｌ／ＬでプールされたＲＮＡｉオリゴとＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈されたＤｈａｒｍａＦＥＣＴ＃（Ｔ−２００１−０２，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）トランスフェクション試薬を事前にインキュベートした混合物を含む、９６穴マイクロタイタープレートに播種された。９６時間のトランスフェクション後、細胞増殖への影響はＡｌａｍａｒＢｌｕｅ染色によって測定した。
【０２３２】
ウェスタンブロッティング：インビトロでの細胞培養液のウエスタンブロットのために、付着細胞を氷冷した１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ホルトプロテアーゼ阻害剤、及びホルトホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解した。溶解液を回収し、ホモジナイズし、１０分間遠心分離することによって明らかにした。マウスの主腫瘍溶解物は、上記のようにＰＢＳ洗浄せずに、調製した。上清タンパク質は、４から１２％のＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分画した。ブロッティングは、製造業者の仕様に従ってｉＢｌｏｔドライブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ニトロセルロース膜のブロッキングと抗体染色は、製造者の指示に従って、オデッセイウエスタンブロット分析と赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ブロットはオデッセイスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。
【０２３３】
抗体：以下の一次抗体をウェスタンブロッティング実験に使用した：抗アクチン（６１２６５６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＧＡＰＤＨ（ｓｃ−２５７７８，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥＧＦ受容体（２２３２，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ノイ（ｓｃ−２８４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥｒｂＢ３（ｓｃ−２８５，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホＨＥＲ３（４７９１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥｒｂＢ４（ｓｃ−２８３，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホＨＥＲ４（４７５７，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ａｋｔ（４６９１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホＡｋｔ（４０５８，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、Ｓｔａｔ／ホスホＳｔａｔ抗体サンプラーキット（９９３９／９９１４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＭＥＫ１／２（９１２６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホ−ＭＥＫ１／２（２３３８，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＬＩ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの次の二次抗体を使用した：ＩＲＤｙｅ６８０結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩＲＤｙｅ８００ ＣＷ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ。
【０２３４】
ＢＩＡｃｏｒｅ
抗ＮＲＧ１ ＩｇＧの結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−Ｔ１００機器を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）によって測定した。抗ＮＲＧ１ヒトＩｇＧを、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に被覆したマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号ＢＲ−１００８−３９）によって捕捉しておよそ１０００応答単位（ＲＵ）を達成した。動態測定では、ヒトＮＲＧ１−α及びＮＲＧ１−βの２倍段階希釈物（５００ｎＭから０．２４５ｎＭ）を２５℃で３０μｌ／分の流量でＨＢＳ−Ｔバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号ＢＲ−１００３−６８）に注入した。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して計算した（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．２）。平衡解離定数（ＫＤ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。
【０２３５】
ＫＩＲＡ
培養ＭＣＦ７細胞
ＭＣＦ７細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Sigma Aldrich Corporation; St. Louis, MO）を含むＲＰＭＩ培地中、５０００細胞／ウェルの播種密度で９６ウェル培養プレート（No. 1270, BD Falcon; Franklin Lakes, NJ）に加えた。プレートを５％ＣＯ２中３７℃で３日間、培養した。３日目にＭＣＦ７細胞を無血清培地に切り替え、ニューレグリン１及び試験材料の添加前に３７℃で＞６時間の間、細胞を連続的にインキュベートした。
【０２３６】
ＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βにより誘導されるＨｅｒ３ヘテロ二量体リン酸化の阻害
１０通りの濃度を作製するために、試験材料（５３８．２４．７１及び５２６．９０．２８抗体）を０．５％ＢＳＡ、ペニシリン（１００μ／ｍＬ, Gibco Invitrogen; Carlsbad, CA)、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ，Gibco Invitrogen)、及びＬグルタミン（１０ｍＭ，Genentech)を含む血清非含有ＰＲＭＩ培地で段階的に希釈した。組換えヒトニューレグリン1 -α（ｒｈＮＲＧ１ａ、R& D systemカタログ番号296-HR/CF, Minneapolis, MN)を、（上述のような）血清非含有培地を用いて調製した。それぞれの希釈した試験物質を等体積のｒｈＮＲＧ１ａ（０．５ｎＭの最終濃度）と混合した。組換えヒトニューレグリン−１β（ｒｈＮＲＧ１ｂ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を（上述のような）非血清含有培地で希釈した。それぞれの希釈した試験物質を等体積のｒｈＮＲＧ１ｂ（０．２ｎＭの最終濃度）と混合した。
【０２３７】
ＭＣＦ７細胞を含むプレートをインキュベーターから除去した。試験材料及びｒｈＮＲＧ１ａ又はｒｈＮＲＧ１ｂを含む混合物を、ついで各ウェルに加えた。細胞を、５％ＣＯ２と共に３７℃で１５分間インキュベートした。サンプル含有培地をデカントし、プレートをペーパータオルに軽くたたいた。細胞を溶解し、受容体を可溶化するために、プロテアーゼインヒビターカクテルセットI 、番号539131、Calbiochem）を含む希釈した細胞溶解緩衝液（Cell Signaling Technologies, カタログ番号9803 ）を各ウェルに添加した。プレートを、溶解を完了させるために１５から６０分間、攪拌しながら室温でインキュベートした。可溶化物を−８０℃の冷凍庫で保存するか、ＥＬＩＳＡを使用するリン酸化の定量に直ぐに使用した。
【０２３８】
キナーゼレセプター活性化のためのＥＬＩＳＡ
マキシソープイムノプレート（4-64718, Nunc; Neptune, NJ）にＰＢＳ中の抗ｅｒｂ３ＭＡｂ（R+D Systems Duo Set IC Phospho-ErbB3キットパーツ番号841428, Minneapolis, MN）を一晩コートした。次の日に、捕捉ＭＡｂを除去し、プレートを洗浄バッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、ブロックバッファー（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ）で１〜２時間ブロックした。プレートを洗浄バッファーで洗浄し、細胞可溶化物及びコントロール（R+D Systems Duo Set IC Phospho-ErbB3キットパーツ番号841430, Minneapolis, MN）をブロックしたプレートに加え、プレートを室温で攪拌しながら２時間インキュベートして十分に結合させた。インキュベーション後、プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせた抗ホスホチロシンＭＡｂ（R+D Systems Duo Set IC Phospho-ErbB3キットパーツ番号841403, Minneapolis, MN）を各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、比色基質テトラメチルベンジジン（Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD）を添加した。色を２０分間発色させた。ついで、Ｈ３ＰＯ４を加えて反応を停止させた。プレートを、６２０ｎｍの基準で４５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（Thermo Lab Systems; Waltham, MA）で読み取った。吸光度をグラフ化し、阻害について分析した。データは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ４．０（Synergy Software; Reading, PA）に移し、最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、４パラメータシグモイドフィットを用いて計算した。
【０２３９】
実施例２−ＮＲＧ１ノックダウンは腫瘍増殖を阻害し化学療法後の腫瘍再発を遅延する
化学療法後の原発腫瘍の増殖や再発に対するＮＲＧ１ノックダウンの効果を、ＮＲＧ１ノックダウン単独又は化学療法との併用での効果を評価することにより決定した。ＨＥＲファミリー受容体の異なる発現パターンを示す３つのヒトＮＳＣＬＣのモデルが、この研究で用いられた。Ｃａｌｕ３モデルは、すべての受容体の高タンパク質レベルを有し、Ｈ４４１は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の強い発現、及びＨＥＲ１の中程度の発現を示し、Ｈ１２９９は、ＨＥＲ１、Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３の中程度の発現レベルを示している。
【０２４０】
Ｃａｌｕ３モデルにおけるＮＲＧ１ターゲティングの有効性を決定するためにＣａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１の瘍を有するマウスが４つのグループに割り当てられた；１）ビヒクル＋スクロース、２）ビヒクル＋ｄｏｘ、３）化学療法＋スクロース、及び４）化学療法＋ｄｏｘ。パクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、５用量を一日おき）とシスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、２用量を７日毎）と５％スクロース又はｄｏｘ（２ｇ／Ｌ）からなる化学療法剤が適宜飲料水で経口投与された。腫瘍体積を研究期間中週２回測定した。腫瘍増殖曲線が本研究で使用した個々のマウスについて作成され（ビヒクル＋スクロースについてｎ＝１２匹のマウス、ビヒクル＋ｄｏｘについてｎ＝１３匹のマウス）、図１Ａ及び１Ｂの自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍堆積の適合を生成した線形混合効果（ＬＭＥ）として提示される。ビヒクル＋ｄｏｘ群（２倍になる時間（ＴＤＴ）＝４４．５日）対ビヒクル＋スクロース（ＴＤＴ＝１７日）において、腫瘍体積倍加時間の有意な遅延が発生し、これは、ＮＲＧ１ノックダウンが部分的に腫瘍の増殖を阻害することを示唆している（図１Ａ）。
【０２４１】
腫瘍の再発に対するＮＲＧ１の効果を、化学療法＋スクロース群における腫瘍の増殖を化学療法＋ｄｏｘ群におけるものと比較することで評価した。化学療法＋スクロース（ＴＤＴ＝１２４日）に対して化学療法＋ｄｏｘ群（ＴＤＴ＞１８１日、研究の終了までに到達しなかった）において腫瘍再発に著しい遅延があった（図１Ｂ）。更に、化学療法を伴う場合と伴わない場合も、ｄｏｘで処置されたマウスからの再発腫瘍の多くは、生存可能な腫瘍組織はごくわずかな領域であって主に茶色／黒の粘液状の液体で構成されていた。したがって、測定された体積はｄｏｘ処置群における実際の腫瘍体積よりもかなり大きかった。Ｃａｌｕ３−ｓｈＬｕｃコントロール研究のグループのいずれの間にも差異は観察されなかった。更に、化学療法の最終投与３日後のＣａｌｕ３腫瘍において、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）が増殖マーカーＫｉ６７について行なわれた。化学療法＋スクロース腫瘍と比較して、化学療法＋ｄｏｘ処理腫瘍におけるＫｉ６７陽性細胞の割合が著しく低く、これは、ＮＲＧ１シグナル伝達が化学療法後の残存腫瘍細胞の増殖を刺激することを示唆している。
【０２４２】
初期及び後期の時点で収集された腫瘍細胞におけるＮＲＧ１αとＮＲＧ１βアイソフォームのｍＲＮＡレベルが測定された。ＮＲＧ１転写物は後期の時点で増加し、ノックダウンがインビボで維持されていないことを示している。
【０２４３】
Ｈ４４１異種移植モデルにおいて、ＮＲＧ１ノックダウンの効果も調べられた。原発腫瘍増殖において最小限度の効果があったが（自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として示された図２Ａ（ｎ＝１２／群）の腫瘍増殖曲線）、化学療法＋スクロース（ＴＤＴ＝９４日）に対して、化学療法＋ｄｏｘ群（ＴＤＴ＞１５０日、研究の終了までに到達せず）における腫瘍の再発に著しい遅延があった（図２Ｂ（ｎ＝１２／群））。インビボ研究でＨ４４１−ｓｈＬｕｃの腫瘍体積にはそのような差は認められなかった。Ｃａｌｕ３異種移植モデルと同様に、Ｈ４４１モデルはまた後半の時点でＮＲＧ１転写産物のレベルを増加を示した。
【０２４４】
ＮＲＧ１レベルの回復の背後にあるメカニズムを調べるために、腫瘍細胞をレンチウイルスで形質導入した遺伝子の発現について分析した。ｓｈＲＮＡで細胞を形質導入するために使用されるレンチウイルスはまたｄｓＲｅｄマーカー遺伝子を含んでいるので、初期及び後期の時点でのｄｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞の割合が、フローサイトメトリーによって比較された。レンチウイルス遺伝子発現のインビボでの損失が、早期（５日）及び後期の時点（＞１００日）での腫瘍について、レンチウイルスのｄｓＲｅｄ導入遺伝子を発現する腫瘍細胞（ヒト特異的ＥＳＡ陽性）の割合を調べるＦＡＣＳ解析により評価された。初期の時点でマウスはスクロース又はｄｏｘを投与され、後期の時点でマウスは化学療法＋スクロース又は化学療法＋ｄｏｘを投与された。スクロース及びｄｏｘで処置した腫瘍の両方において、後期の時点でのｄｓＲｅｄ陽性細胞の割合が有意な減少が観察され、その減少はｄｏｘ処置腫瘍について著しく大きかった（１．８倍対４．１倍、ｐ＝０．００７）。これは、ウイルス導入遺伝子発現の損失が、ＮＲＧ１レベルの回復と相関していることを示唆している。
【０２４５】
Ｃａｌｕ３及びＨ４４１両方の細胞がＨＥＲ３タンパク質レベルの増大を示しており、腫瘍再発におけるＮＲＧ１の役割が受容体の過剰発現を伴う腫瘍に特異的であるかどうかの質問を提起している。この問題に対処するために、ＨＥＲ３のはるかに低いレベルを持っているＨ１２９９異種移植モデルが用いられた。ＮＲＧ１単独のノックダウンは、Ｈ４４１モデルに類似して、原発腫瘍増殖へのわずかな影響があった。対照的に、Ｈ１２９９腫瘍の非常に高悪性な増殖にもかかわらず、ＮＲＧ１ノックダウンは化学療法への応答の増強をもたらし、化学療法＋スクロース（ＴＤＴ＝１１．５日）（ｎ＝１２／群）に対して化学療法＋ｄｏｘ群（ＴＤＴ＝３０．４５日）において腫瘍再発の有意な遅延を生じた。
【０２４６】
更に、ＮＲＧ１に対して異なるｓｈＲＮＡを発現するＨ１２９９の安定な亜系統が生成され、ＮＲＧ１のｍＲＮＡレベルにおいてより穏やかな減少を生じた。Ｈ１２９９−ｓｈＮＲＧ１．２を用いたインビボ研究においても、ＮＲＧ１ノックダウン時の化学療法への応答の増強が示された。しかし、増殖阻害の程度は、このモデルではより小さく、ＮＲＧ１ノックダウンの小さな程度と一致している。インビボ研究におけるＨ１２９９−ｓｈＬｕｃの化学療法を伴うか又は伴わないスクロース及びｄｏｃ処置群間の腫瘍体積において、差は認められなかった。
【０２４７】
ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンによるＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達の阻害は、原発腫瘍増殖に控えめから中程度の影響のみを与えたが、化学療法後の腫瘍再発の大幅な遅延を与えた。異種移植モデルにおいてＮＲＧ１の長期的なノックダウンを維持することができないにもかかわらず、我々は、ＮＲＧ１ノックダウンによって腫瘍再発の有意な遅延を観察した。これらの知見は、原発腫瘍の増殖、及び化学療法抵抗性、及び再発を調節する鍵となる経路に差異があることを示唆している。
【０２４８】
実施例３−ＮＲＧ１シグナル伝達の阻害は腫瘍再発を遅延する
ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／＋マウスモデルにおける化学療法後に再発を促進する上でＮＲＧ１シグナル伝達の役割を試験するために、ＮＲＧ１を隔離し、インビボでの受容体へのその結合を防止するために、リガンド−トラップ・アプローチを採用した。マウスＩｇＧ２ＡのＦｃに融合したヒトＨＥＲ４細胞外ドメインの融合（ＨＥＲ４−ＥＣＤ）が生成された。ＨＥＲ４はＮＲＧ１の高親和性結合を示している(Tzahar et al., 1994)。ＨＥＲ４−ＥＣＤが、インビトロで血清飢餓ＬＫＰＨ１とＬＫＰＨ２細胞に添加した場合、ＮＲＧ１／ＨＥＲ３シグナル伝達の阻害は、減少したＰ−ＨＥＲ３レベルにより示されるように観察された。従って、インビトロで、分子は、自己分泌媒介ＮＲＧ１シグナル伝達を妨害するにおいて期待されるように振る舞った。
【０２４９】
肺腫瘍を有するＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／＋マウスは、研究の開始時（０日目）にＸ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）により撮像され、等しい開始腫瘍量の三つのグループに分けて、次のように扱われた：１）ＰＢＳ＋コントロールのＩｇＧ２Ａ、２）シスプラチン＋コントロールのＩｇＧ２Ａ、及び３）シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ。マウスは、腫瘍量の変化を測定するために、縦のマイクロＣＴスキャンを受けた。平均腫瘍量の分析（図３Ａ（グラフは、平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ、ブタクサ、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体を表わす））、及び腫瘍増殖率（（図３Ｂ（グラフは９５％信頼区間を用いた治療レジメンによる腫瘍量におけるで毎日の倍率変化を示す））は、シスプラチン単独でなくシスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤの併用のみで、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことが明らかになった。シスプラチンを投与したマウスでは、化学療法後の最初のマイクロＣＴスキャンで腫瘍増殖の静止状態を示したが、研究の終了時の平均収容量と全体的な腫瘍増殖速度は、ビヒクル及びシスプラチン処置群との間に有意差は認められなかった（図３Ａ−Ｂ）。
【０２５０】
第二の研究が、上記のように、ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／Ｆｌマウスで実施された。しかし、この研究では、上記のグループに加えてＨＥＲ４−ＥＣＤ単剤群が含まれた。２８日目のマイクロＣＴによる腫瘍量の分析は、シスプラチン＋ビヒクル処置したマウス及び他のすべてのグループに比べて、シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤで処置したマウスにおける腫瘍量の有意な減少を明らかにした。これとは対照的に、腫瘍増殖においてＨＥＲ４−ＥＣＤ処置単独では効果が無く、化学療法及び／又は腫瘍の再増殖におけるＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達の固有の役割を更に支持している。この研究では、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆｌ／Ｆｌマウスが、ビヒクル＋コントロールＩｇＧ（ｎ＝１０）で、シスプラチン＋コントロールＩｇＧ（ｎ＝１１）と、シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ（ｎ＝８）又はビヒクル＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ（ｎ＝７）で処置された。図８Ｃ中のグラフは、ベースライン±ＳＥＭからの腫瘍量の平均変更率を表している。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定が、ビヒクルコントロールの＊＊ｐ＝０．００１６に対して処置群のすべてを比較するために利用された。組合せ活性は、その単独療法＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１に対
【０２５１】
実施例４
Ｚ／ＥＧ Ｃｒｅレポーター株（Novakら、2000）に交配されたＮＳＣＬＣのＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ遺伝子操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）（Jacksonら、2001）をＴＲＩＣ集団を特徴付けるために使用した。ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄマウスのシスプラチンの治療は腫瘍量の減少をもたらしたが、生存期間の延長は生ぜず、これは腫瘍が治療後増殖を再開することを示している（Oliverら、2010）。また、腫瘍がシスプラチン＋パクリタキセル二重化学療法に応答して退行するが、治療の中断の数週間後に増殖を再開する二種のヒト異種移植モデルを用いた。Ｃａｌｕ３及びＨ４４１ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片モデルのＧＦＰ発現亜系統を作製して、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）による腫瘍細胞の単離を可能にした。各モデルについて、腫瘍再増殖の開始前に化学療法を生き残ったＧＦＰ陽性細胞を、それらはＴＲＩＣ集団を含んでいたので、単離した。
【０２５２】
ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓＧ１２ＤマウスモデルにおけるＴＲＩＣｓを分析した。シスプラチンの最終用量の１週間後に肺を集め、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞をＦＡＣＳによって単離した。ビヒクル処理及び残存腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルの違いを特徴づけるために、ＲＮＡを腫瘍細胞（ＰＩ−及びＧＦＰ＋）から単離し、発現プロファイリングを実施した。アレイ上の全ての遺伝子のうち、ＮＲＧ１が、残留化学療法剤処理腫瘍細胞において最も統計的に有意な濃縮を示した−１３．７倍の濃縮（ｐ＜０．００１、ｑ＝１；ｎ＝６／群）。独立して作製されたサンプルでの定量リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ）でマイクロアレイの結果を検証した（図４Ａ）。
【０２５３】
Ｃａｌｕ３及びＨ４４１異種移植モデルから単離されたＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１の発現を解析した。選択的スプライシングのため、受容体結合に必要とされるＮＲＧ１ ＥＧＦ様ドメインの２つの活性型アイソフォームがあり、ＮＲＧ１αとＮＲＧ１βと称される。ＮＲＧ１αとＮＲＧ１βの発現は、これらのモデルからの残留化学療法剤処理腫瘍細胞において有意に濃縮されていた。Ｃａｌｕ３腫瘍モデルは、ＮＲＧ１αに対して４．７倍の濃縮（ｐ＝０．０２）を、ＮＲＧ１βに対して３．４倍の濃縮（ｐ＝０．０４）を示した。（図４Ｂ）。Ｈ４４１腫瘍モデルは、ＮＲＧ１αに対して１１．４倍の濃縮（ｐ＝０．０２）を、ＮＲＧ１βに対して１２．１倍の濃縮を示した（ｐ＝０．０４）。（図４Ｃ）。興味深いことに、ＨＥＲ３あるいはＨＥＲ４受容体の発現は何れも一貫して全てのモデルにおいて富んでいた。
【０２５４】
ＮＳＣＬＣを治療するために一般的に使用される他の化学療法剤での処置後のＣａｌｕ３及びＨ４４１異種移植モデルから単離されたＴＲＩＣＳ中のＮＲＧ１発現。ゲムシタビンでの処置はこれらのモデルの各々において腫瘍退縮をもたらし、残存腫瘍細胞ではＮＲＧ１が非常に濃縮されていた。Ｃａｌｕ３腫瘍モデルは、ＮＲＧ１では５２．５倍の濃縮を示した（ｐ＝０．０１１）。Ｈ４４１腫瘍モデルは、ＮＲＧ１では１１．７倍の濃縮を示した（ｐ＝０．０２５）（図４Ｄ）。しかしながら、Ｃａｌｕ３及びＨ４４１腫瘍はビノレルビンでの処理の際に増殖を続け、治療はＮＲＧ１の濃縮には至らなかった。
【０２５５】
ＮＲＧ１タンパク質レベル及びＮＲＧ１受容体のＨＥＲ３の活性化をまたウェスタンブロット法によって評価した。ＮＲＧ１タンパク質レベル及びホスホ−Ｈｅｒ３レベルはビヒクル処理腫瘍細胞に比べて残存腫瘍細胞において一貫して高いことが決定された。ＨＥＲ３の活性化は、ホスホ−ＨＥＲ３に対して腫瘍を免疫染色することにより調べた。残留腫瘍中の腫瘍細胞の大部分は、ｐ−ＨＥＲ３陽性であった一方、ビヒクル処置腫瘍はｐ−ＨＥＲ３陽性細胞の散乱したクラスターのみを示した。よって、残存腫瘍細胞がＮＲＧ１を発現し、増強された受容体活性化を示しており、これはＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達の増大を裏付けている。
【０２５６】
実施例５−ＮＳＣＬＣにおけるＮＲＧ１受容体の使用
どのＨＥＲ受容体が、ＮＳＣＬＣのＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達で使用されているかを理解するために、我々はＨＥＲ３及びＨＥＲ４のノックダウンの影響を評価した。Ｃａｌｕ３ ＮＳＣＬＣモデルは、他の細胞株と比較して、すべてのＨＥＲファミリー受容体を高レベルで発現した。安定したｄｏｘ誘導性ｓｈＨＥＲ３（Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３）とｓｈＨＥＲ４（Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４）Ｃａｌｕ３細胞亜系統、並びにルシフェラーゼにｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡを運ぶコントロール細胞株が生成された。ｑＰＣＲのによって測定されるようにＨＥＲ３及びＨＥＲ４転写レベルは、ｄｏｘ（２μｇ／ｍｌの）の存在下でＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３とＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４のそれぞれにおいて減少し、ウェスタンブロット法による測定でタンパク質量の減少をもたらした。興味深いことには、ｄｏｘの存在下でＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３で観察されたｐ−ＡＫＴのダウンレギュレーションの程度はＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４に見られるはるかに大きく、ＨＥＲ３がＣａｌｕ３モデルでＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達を仲介する優勢な受容体であることを示唆している。
【０２５７】
インビボでこの役割を確かめるために、スクロース又はｄｏｘの何れかで処置されたＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４異種移植モデルを用いた研究が実施された。Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３又はＣａｌｕ３−ｓｈＨｅｒ４異種移植腫瘍が樹立されたマウスは、それらの飲料水中に、適宜、ビヒクル（スクロース）又はｄｏｘ（２ｍｇ／Ｌ）が投与された（ｎ＝１４／群）。ｄｏｘの処置を受けたマウス（ＴＤＴ＝１９日）で、スクロース処置を受けたもの（ＴＤＴ＝１１日）に比べて、Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３腫瘍成長の実質的な阻害があった。しかし、インビボ研究において、Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４における腫瘍増殖の顕著な阻害は無かった。
【０２５８】
インビトロでの受容体解析及びインビボ研究は、高いＨＥＲ４レベルにもかかわらず、ＮＲＧ１自己分泌性シグナリングは、このモデルで主にＨＥＲ３を通して起こることを示している。
【０２５９】
ＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達は、ＨＥＲ４高レベルを発現するかＨＥＲ３を検出できないＨ５２２ヒトＮＳＣＬＣ細胞株において評価された。Ｈ５２２−ｓｈＮＲＧ１亜系統が生成された。血清飢餓Ｈ５２２−ｓｈＮＲＧ１細胞へのｄｏｘの投与は、ホスホ−ＨＥＲ４及びホスホ−Ｓ６のレベルの低下をもたらす。差はＨ５２２−ｓｈＬｕｃコントロール細胞では観察されず、ｓｉＲＮＡを介したニノックダウンが各ＨＥＲファミリーの必要性を試験するために用いられた。ＨＥＲ４のノックダウンのみで、細胞増殖の減少を生じ、他のＨＥＲファミリー受容体では無かった。これらのデータはＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達は、Ｈ５２２細胞におけるＨＥＲ４を通して起こることを示唆している。従って、ＮＳＣＬＣにおけるＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達はＨＥＲ３及びＨＥＲ４両方によって媒介され得る。
【０２６０】
実施例６−抗ＮＲＧ１抗体の産生
抗ＮＲＧ１抗体を同定するためのライブラリーソーティング及びスクリーニング
組換えヒトＮＲＧ１−αＥＧＦドメイン（R&D Systems, カタログ番号296-HR/CF ）（配列番号：３）及びＮＲＧ１−βＥＣＤドメイン（R＆D Systems、カタログ番号377-HB/CF）（配列番号：４）をライブラリーソーティングのための抗原として使用した。図５。Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを標的抗原（１０μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩コートし、ファージブロックバッファーＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０）で室温で１時間ブロックした。抗体ファージライブラリー（Lee等, J. Mol. Biol 340, 1073-1093, 2004, Liang等, JMB. 366: 815-829, 2007）を別々に抗原プレートに加え、室温で一晩インキュベートした。次の日に抗原被覆プレートを、ＰＢＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄し、結合ファージを５０ｍＭのＨＣｌ及び５００ｍＭのＮａＣｌで３０分間溶出させ、等量の１ＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ７）で中和させた。回収されたファージを大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中で増幅させた。その後の選択ラウンドの間、抗原コートプレートとの抗体ファージのインキュベーションを２〜３時間に短縮し、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に増加させた。
【０２６１】
５ラウンドのパニング後、有意な濃縮が観察された。１０００クローンをライブラリーソーティングから採取し、それらがヒトＮＲＧ１−α及びＮＲＧ１−βの両方に結合しているかどうかを判断した。これらのクローンの可変領域を配列決定して独特の配列クローンを同定した。
【０２６２】
ファージ抗体の親和性を、スポット競合ＥＬＩＳＡを用いてランク付けした。ファージ上清を、１００μｌの総体積で７５ｎｍのＮＲＧ１−αを伴うか伴わないＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）バッファー（０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１：５に希釈し、Ｆプレート（ＮＵＮＣ）において室温で少なくとも１時間インキュベートした。標的タンパク質を含むか含まない９５μｌの混合物を、標的タンパク質コートプレート（１μｇ／ｍｌのＮＲＧ１−αで一晩コート）に並べて移した。プレートを１５分穏やかに振盪し、標的タンパク質コートプレートへの未結合ファージの捕捉を可能にした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。結合を、ＥＬＩＳＡバッファー（１：５０００）中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗Ｍ１３抗体を加えることによって定量し、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルの１：１の比の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)）をウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。反応を、各ウェルに１００μｌの０．１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することによって停止させ、室温で５分間インキュベートした。各ウェルにおける黄色のＯ．Ｄ．（光学密度）を４５０ｎｍで標準的ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。ＯＤ減少（％）は次式により算出した。
ＯＤ４５０ｎｍ減少（％）＝［（競合体を含むウェルのＯＤ４５０ｎｍ)／(競合体を含まないウェルのＯＤ４５０ｎｍ）］＊１００
ＮＲＧ１−α標的に対して３０％より低いＯＤ４５０ｎｍ減少（％）を有していたクローンを採取し、個々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域をそれぞれＬＰＧ３及びＬＰＧ４ベクターにクローニングすることにより、完全長ヒトＩｇＧ１に再フォーマットした。これらのクローンは、その後、哺乳動物ＣＨＯ細胞中で一過性発現させ、プロテインＡカラムで精製した。
【０２６３】
機能的な抗体の選択
抗体を、ＨＥＲ３−ＦｃへのＮＲＧ１βの結合を阻害する能力について試験した。１２５Ｉ−ＨＲＧは過去に記載されているようにして（Sliwkowski等, JBC 1994）ジェネンテックで製造した。結合アッセイは、Ｎｕｎｃの離間ストリップウェル（Thermo-Fisher Scientific, Rochester, NY）で実施した。プレートに炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中の２５０ｎｇ／ウェルのＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を４℃で一晩コートした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で２回すすぎ、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００μＬのＰＢＳで３０分間ブロックした。０．２％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen; Carlsbad, CA）中の増加濃度の抗ＮＲＧ１抗体をＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃに前もって結合させた。１２５Ｉ−ＨＲＧ（比活性：２６６ｍＣｉ／ｍｇ、７５０００ＣＰＭ／ウェル）を１３０μＬの総アッセイ容量で直後に追加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、２回すすぎ、個々のウェルは、１００シリーズＩｓｏ Ｄａｔａ γカウンターを用いて計数した。サンプルは三組をアッセイした。プロットは、カレイダグラフ３．６ソフトウェアを用いて行った。図６に示されるデータは、試験された親抗ＮＲＧ１抗体のサブセットによるＮＲＧβの用量依存的阻害を示しており、５２６．０２、５３８．２４及び５２６．９０は最も強力なブロッカーを表している。（これらのクローン及びその親和性成熟変異体は、本明細書の所定の場所において数値識別子の前に「ＹＷ」を用いて識別される。）
抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を決定した。図２５、図２６、図２７、及び図２８。
【０２６４】
実施例７−抗ＮＲＧ１抗体の親和性成熟
選択された抗ＮＲＧ１抗体を親和性成熟させた。親及び親和性成熟変異体のアミノ酸配列を図２５、図２６、図２７、及び図２８に示す。
【０２６５】
ＶＨ又はＶＨＶＬライブラリー由来のクローンの親和性改善のための構築ライブラリー
ファージミドｐＷ０７０３（全てのＣＤＲ−Ｌ３位置に終止コドン（ＴＡＡ）を含み、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価のＦａｂを表示するファージミドｐＶ０３５０−２ｂ（Lee等, J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)から由来）を、親和性成熟のためのＶＨライブラリーから目的のクローンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を移植するためのライブラリテンプレートとした。ハード及びソフト両方のランダム化戦略は、親和性成熟のために使用した。ハードランダム化のために、３つの軽鎖ＣＤＲの選択された位置を有する１つの軽鎖ライブラリーを、天然ヒト抗体を模倣するために設計されたアミノ酸を使用して無作為化し、設計されたＤＮＡ縮重はＬｅｅ等（J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)）に記載されている通りとした。選択された位置に約５０％の変異率を導入したソフトランダム化条件を達成するために、変異原性ＤＮＡを、野生型ヌクレオチドを好む塩基の７０−１０−１０−１０混合物を用いて合成した（Gallop等, Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)）。ソフトランダム化では、ＣＤＲ−Ｌ３の９１−９６、ＣＤＲ−Ｈ１の３０−３３、３５、ＣＤＲ−Ｈ２の５０、５２、５３−５４、及び５６、ＣＤＲ−Ｈ３の９５−９８の位置の残基を標的とし、ＣＤＲループの２つの異なった組み合わせＨ１／Ｈ３／Ｌ３、Ｈ２／Ｌ３、及びＨ３／Ｌ３をランダム化のために選択した。
【０２６６】
ＶＨＶＬライブラリー由来のクローンでは、各ＣＤＲに４つの終止コドン（ＴＡＡ）を含み、Ｍ１３バクテリオファージの表面に一価のＦａｂを表示するファージミドを個別に生成させ、親和性成熟ライブラリーの構築のためのクンケル変異誘発のためのテンプレートとした。ＣＤＲ−Ｌ３の多様性がナイーブライブラリーに組み込まれたので、ソフトランダム化方策のみがＶＨＶＬライブラリー由来のクローンに使用された。ソフトランダム化条件を達成するために、ＣＤＲ−Ｌ１の２８−３１、ＣＤＲ−Ｌ２の５０、５３−５５、ＣＤＲ−Ｌ３の９１−９６、ＣＤＲ−Ｈ１の３０−３５、ＣＤＲ−Ｈ２の５０−５６、ＣＤＲ−Ｈ３の９５−１００の位置が標的とされ；ＣＤＲループの１０の異なった組み合わせ、Ｈ１*／Ｈ３、Ｈ１*／Ｈ２、Ｈ２*／Ｌ３、Ｈ３*、Ｈ３*／Ｌ２、Ｌ１*／Ｌ２、Ｌ１*／Ｌ３、Ｈ３／Ｌ３*、Ｌ２／Ｌ３*及びＨ１／Ｌ３*（ここで*はテンプレート上の終止コドンの位置を表す）をランダム化のために選択した。
【０２６７】
親和性改善をなすためのファージソーティング方策
親和性改善の選択では、ＮＲＧ１−β又はＮＲＧ１−αを、限定試薬条件下で最初にビオチン化し、得られたモノビオチン化種に逆相クロマトグラフィーを施した。ファージライブラリーを増加したストリンジェンシーで６ラウンドの溶液ソーティングに供した。初回の溶液ソーティングでは、ファージインプットの１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０における３Ｏ.Ｄ.／ｍｌを、ＮＲＧ１−α又はＮＲＧ１−βの何れかを３時間プレコートしたプレートにインキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。結合したファージを３０分間１５０ｕｌ／ウェルの５０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌで溶出させ、続いて５０ｕｌ／ウェルの１ＭのトリスｐＨ８中によって中和し、滴定し、次のラウンドのために増殖させた。その後のラウンドでは、ファージライブラリーのパニングを、溶液相で実施し、そこでは、ファージライブラリーを、１％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Pierce Biotechnology）と０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１００μｌバッファー中の１００ｎＭのビオチン化標的タンパク質（濃度は親クローンファージＩＣ５０値に基づく）と共に室温で２時間、インキュベートした。混合物を１％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで１０倍に更に希釈し、１００μｌ／ウェルを、穏やかに振とうしながら室温で３０分間、ニュートラアビジン被覆ウェル（１０μｇ／ｍｌ）に塗布した。バックグラウンド結合を決定するために、ファージを含むコントロールウェルを、ニュートラアビジン被覆プレート上に捕捉した。ついで、最初のラウンドで記載したようにして、結合したファージを洗浄し、溶出し、増殖させた。更に５ラウンドの溶液ソーティングを、選択ストリンジェンシーを増加させて実施した。最初の２回のラウンドは、ビオチン化標的タンパク質濃度を１００ｎＭから０．１ｎＭに減少させることによるｏｎ−ｒａｔｅ選択のためのものであり、最後の２回のラウンドは、室温でより弱いバインダーに競合させるために非ビオチン化標的タンパク質の過剰量（３００から１０００倍多い）を添加することによるｏｆｆ−ｒａｔｅ選択のためのものである。
【０２６８】
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ（単一スポット競合）
コロニーを６ラウンドのスクリーニングから採取した。コロニーを９６ウェルプレート（Falcon）中の５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１×１０１０／ｍｌのＭ１３ＫＯ７を含む１５０μｌ／ウェルの２ＹＴ培地で３７℃で一晩増殖させた。同じプレートから、ＸＬ−１感染した親ファージのコロニーをコントロールとして採取した。９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃で一晩ＰＢＳ中１００μｌ／ウェルのＮＲＧ１−α又はＮＲＧ１−β（０．５μｇ／ｍｌ）の何れかでコートした。プレートを１時間ＰＢＳ中１５０μｌの１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした。
【０２６９】
３５ｕｌのファージ上清を、５ｎＭのＮＲＧ１−α又はＮＲＧ１−βと共に又はこれを伴わないでＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）バッファー（０．５％ＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）７５ｕｌで希釈し、Ｆプレート（ＮＵＮＣ）において室温で１時間インキュベートした。９５μｌの混合物を抗原コートプレートに並べて移した。プレートを穏やかに１５分間振盪し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。結合を、ＥＬＩＳＡバッファー（１：２５００）中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗Ｍ１３抗体を加えることによって定量し、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ基質をウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。反応を、各ウェルに１００μｌの０．１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することによって停止させ、室温で５分間インキュベートした。各ウェルにおける黄色のＯ．Ｄ．（光学密度）を４５０ｎｍで標準的ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。親ファージ（１００％）のウェルのＯＤ４５０ｎｍ減少（％）と比較して、５０％より低いＯＤ４５０ｎｍ減少（％）を有していたクローンを配列分析のために採取した。独特のクローンをファージ調製のために選択し、親クローンとの比較によってＮＲＧ１−α及びＮＲＧ１−βの両方に対する結合親和性（ファージＩＣ５０）を決定した。ついで、最も親和性が改善されたクローンを、抗体産生及び更なるＢＩＡｃｏｒｅ結合動態解析及び他のインビトロ又はインビボアッセイのためにヒトＩｇＧ１に再フォーマットした。
【０２７０】
実施例８−親和性成熟５３８．２４抗ＮＲＧ１抗体の特徴付け
親和性成熟変異体をＨＥＲ３−ＦｃへのＨＲＧβの結合をブロックするその能力について試験した。１２５Ｉ−ＨＲＧは過去に記載されているようにして（Sliwkowski等, JBC 1994）ジェネンテックで製造した。結合アッセイは、Ｎｕｎｃの離間ストリップウェル（Thermo-Fisher Scientific, Rochester, NY）で実施した。プレートに炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中の２５０ｎｇ／ウェルのＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を４℃で一晩コートした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で２回すすぎ、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００μＬのＰＢＳで３０分間ブロックした。０．２％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ １６４０培地（Invitrogen; Carlsbad, CA）中の増加濃度の抗ＮＲＧ１抗体をＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃに前もって結合させた。１２５Ｉ−ＨＲＧ（比活性：２６６ｍＣｉ／ｍｇ、７５０００ＣＰＭ／ウェル）を１３０μＬの総アッセイ容量で直後に追加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、２回すすぎ、個々のウェルは、１００シリーズＩｓｏ Ｄａｔａ γカウンターを用いて計数した。サンプルは三組をアッセイした。プロットは、カレイダグラフ３．６ソフトウェアを用いて行った。
【０２７１】
図７に示されるデータは、５３８．２４抗体の幾つかの親和性成熟クローンによるＨｅｒ３への１２５Ｉ−ＮＲＧ１βの結合の用量依存的阻害を示す。５３８．２４．３８を除く全ては結合のブロックにおいて非常に有効であり、ＩＣ５０値はナノモル以下の範囲であった。
ＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに対する５３８．２４親和性成熟変異抗ＮＲＧ１ ＩｇＧの結合親和性は、実施例１に記載されたようにＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−Ｔ１００機器を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）により測定した。１２５ｎＭのＮＲＧ１βを使用するデータを図８に示し、２５０ｎＭのＮＲＧ１αを使用するデータを図９に示す。
更に、親和性分析を、６．２５ｎＭのＮＲＧ１ｂ又は６．２５ｎＭのＮＲＧ１ｂを使用して抗体５３８．２４．７１で、また７．８ｎＭのＮＲＧ１ｂ又は７．８ｎＭのＮＲＧ１ｂを使用して抗体５３８．２４．９４で実施した。結果を図１０（５３８．２４．７１）と図１１（５３８．２４．９４）に示す。
【０２７２】
実施例９−５２６．０９及び５２６．０２抗ＮＲＧ１抗体及びその親和性成熟変異体の特徴付け
競合アッセイを実施して５２６．０９及び５２６．０２抗体の結合特異性を決定した。図１２に示すように、５２６．９０はＨＲＧ１αとＨＲＧ１β両方に対して５３８．２４．１７と競合し、これは５２６．９０がこれらＨＲＧ１アイソフォームの両方に結合することを示している。
５２６．０９抗体の幾つかの親和性成熟変異体を実施例７に記載のようにして産生し、実施例１に詳細に記載されるようなＫＩＲＡアッセイにおいて抗ＨＥＲ３抗体へのＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βの結合をブロックするその能力について分析した。簡潔には、ＣＯ２インキュベーター中で１５分間、血清飢餓ＭＣＦ−７細胞を固定量のニューレグリン１−α又はニューレグリン−β及び増加量の試験材料（ＹＷ５３８．２４．７１及びＹＷ５２６．９０．２８）で処理した。培地をデカントした後、細胞を可溶化し、以前に記載されたＥＬＩＳＡ（Sadick等, 1999）で分析した。Ｈｅｒ３リン酸化を、捕捉ＭＡｂとして抗ＨＥＲ３（R+D Systems Duo Set IC ホスホ-ErbB3キットパーツ番号841428, Minneapolis, MN）を、検出として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせた抗ホスホチロシンＭＡｂ（R+D Systems Duo Set IC ホスホ-ErbB3キットパーツ番号841403, Minneapolis, MN）を使用して測定した。比色基質の添加後、プレートをマイクロプレートリーダー（Thermo Lab Systems; Waltham, MA）上で６２０ｎｍ参照で４５０ｎｍで読み取った。吸光度をグラフ化し、阻害について分析した。これらのアッセイの組み合わせた結果を図１３に示す。
親和性成熟変異体もまたＢＶ試験を使用して試験し、１４図に示す。
ＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βに対する５２６．９０．２８抗ＮＲＧ１抗体の結合親和性は、実施例１に記載されたようにＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−Ｔ１００機器を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）により測定した。６．２５ｎＭのＮＲＧ１βと６．２５ｎＭのＮＲＧ１αを使用するデータを図１５に示す。
【０２７３】
実施例１０−抗ＮＲＧ１抗体がＨｅｒ３リン酸化を阻害する
外因性ＮＲＧ１リガンドでの刺激に応答してＨｅｒ３リン酸化を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を、実施例１及び９に記載されたようなＫＩＲＡアッセイを使用して試験した。ＹＷ５３８．２４．７１とＹＷ５２６．９０．２８の双方が同様のＩＣ５０（それぞれ１４＋２．８ｎＭ及び１３．９＋４．８ｎＭ）でＮＲＧ１α刺激に応答してＨｅｒ３活性化を阻害した（図１６）。しかし、ＹＷ５３８．２４．７１はＹＷ５２６．９０．２８よりもより強力なＮＲＧ１β誘導Ｈｅｒ３活性化ブロッカーであった。（それぞれ、ＩＣ５００．１２＋０．０１７と１．４４＋０．５ｎＭ）（図１７）。
【０２７４】
実施例１１−抗ＮＲＧ１抗体はニューレグリンに特異的である
抗体特異性を確認するために、関連したＥＧＦファミリーリガンドＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、及びベータセルリン（ＢＴＣ）に対する抗体の結合を評価した。ＥＬＩＳＡでアッセイした場合、ＹＷ５３８．２４．７１とＹＷ５２６．９０．２８に対するこれらリガンドの検出可能な結合はなかった。
ＮＲＧ１、ＨＢ−ＥＧＦ及びＢＴＣはまたＨＥＲ４レセプターのリガンドである。従って、ＢＴＣ及びＨＢ＿ＥＧＦ誘発性ＨＥＲ４リン酸化を阻害するＹＷ５３８．２４．７１及びＹＷ５２６．９０．２８の能力を細胞ベースアッセイで分析した。ＹＷ５３８．２４．７１は潜在的にＮＲＧ１−Ｂ誘導性リン酸化を阻害したが、ウェスタンブロット分析により測定した場合、ＢＴＣ又はＨＢ−ＥＧＦ誘導性リン酸化に効果はなかった。
【０２７５】
実施例１２−抗ＮＲＧ１抗体はＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達を阻害する
ＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を決定した。
細胞を４８時間の間、示されるように０．１％ＦＢＳ＋抗体を含む培地中で増殖させた。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファーで可溶化した。可溶化物を回収し、ウェスタンブロッティングのために処理した。
データは、抗ＮＲＧ１抗体ＹＷ５３８．２４．７１が、ホスホ−Ｈｅｒ３及びホスホ−ＡＫＴレベルの用量依存的減少によって示されるように、ヒト及びマウス細胞の双方におけるＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達を阻害することを示している。図１８。
【０２７６】
実施例１３−抗ＮＲＧ１抗体はＨＮＳＣＣ腫瘍増殖を阻害する
頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）のマウスモデル系における腫瘍増殖を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を決定した。Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下的に５百万の腫瘍ＨＮＳＣＣ ＦＡＤＵ細胞を接種した。腫瘍が平均１５０−２５０ｍｍ３に達したとき、動物を同等の平均開始腫瘍体積を持つ治療群にグループ分けした。グループを、示された抗体及び用量で処理し、ｑｗｋ×４、ＩＰ投与した。腫瘍を、試験期間中少なくとも週一回測定した。図１９に示される結果は、双方の例示的な抗ＮＲＧ１抗体がＨＮＳＣＣ腫瘍増殖を阻害することを示している。
【０２７７】
実施例１４−抗ＮＲＧ１抗体は肺癌腫瘍増殖を阻害する
肺癌のマウスモデル系において腫瘍増殖を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を決定した。無胸腺ヌードマウスの右脇腹に１５００万個のヒト肺腺癌細胞株Ｃａｌｕ３細胞を皮下的に接種した。腫瘍が平均１５０−２５０ｍｍ３に達したとき、動物を同等の平均開始腫瘍体積を持つ治療群にグループ分けした。動物を次のように処理した：
グループ１：ビヒクル（抗体バッファー／カルボプラチンバッファー）、ｉ．ｐ．ｑｗｋ×２＋パクリタキセルバッファー、ＩＶ ｑ２ｄ×５
グループ２：５３８．２４．７１、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチンバッファー、ＩＰ ｑｗｋ×２＋パクリタキセルバッファー、ＩＶ ｑ２ｄ×５
グループ３：５２６．９０．２８、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチンバッファー、ＩＰ ｑｗｋ×２＋パクリタキセルバッファー、ＩＶ ｑ２ｄ×５。
グループ４：カルボプラチン、６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ ｑｗｋ×２＋パクリタキセル、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ ｑ２ｄ×５。
グループ５：５３８．２４．７１、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチン、６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ ｑｗｋ×＋パクリタキセル、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ ｑ２ｄ×５。
グループ６：５２６．９０．２８、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチン、６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ ｑｗｋ×＋パクリタキセル、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ ｑ２ｄ×５。
【０２７８】
腫瘍増殖曲線は自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積の適合を作成したリニア混合効果（ＬＭＥ）モデルとして提示される。無増悪生存期間（増悪はその始まりの体積の２倍に達する腫瘍と定義される）を示すカプランマイヤー曲線もまた提示される。Ｐ値はゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定により算出した。図２０。
【０２７９】
データは、単剤の抗ＮＲＧ１処理が腫瘍増殖を有意に阻害することを示している。更に、抗ＮＲＧ１処理は、標準ケア化学療法に対する応答期間を長くし、腫瘍再増殖を遅延させる。
【０２８０】
実施例１５−抗ＮＲＧ１抗体はＮＳＣＬＣ腫瘍増殖を阻害する
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のためのマウスモデル系において腫瘍増殖を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を決定した。無胸腺ヌードマウスの右側腹部にａ）２０００万のＨ５９６細胞又はｂ）２００万のＬＫＰＨ２細胞を皮下接種した。腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３の平均に達したとき、動物を、同等の平均開始腫瘍体積を持つ治療群にグループ分けした。動物を次のようにして処理した：
グループ１：ビヒクル：抗ブタクサ、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチンバッファー、ＩＰ ｑ４ｋ×５＋パクリタキセルバッファー、ＩＶ ｑ４ｄ×５
グループ２：Ｙ５３８．２４．７１：Ｙ５３８．２４．７１、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチンバッファー、ＩＰ ｑ４ｄ×５＋パクリタキセルバッファー、ＩＶ ｑ４ｄ×５
グループ３：化学療法剤＋ブタクサ：抗ブタクサ、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチン、６０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ ｑ４ｄ×５＋パクリタキセル、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ ｑ４ｄ×５。
グループ４：化学療法剤＋５３８．２４．７１：５３８．２４．７１、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、試験期間ｑｗｋ＋カルボプラチン、６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ ｑ４ｄ×５＋パクリタキセル、２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ ｑ４ｄ×５。
【０２８１】
腫瘍増殖曲線及びカプラン・マイヤー曲線を実施例１５に記載されているようにして作成した。図２１及び２２。
データは、抗ＮＲＧ１処理が、化学療法単独に応答して退行しないＮＳＣＬＣモデルにおいて化学療法に対する応答の大きさを増強することを示している。Ｈ５９６の研究に見られるように、腫瘍増殖に対する単剤抗ＮＲＧ１治療の効果がない場合でも、化学療法剤とのこの相乗効果は起こりうる。
【０２８２】
また、ＹＷ５３８．２４．７１もまた、ＮＳＣＬＣを治療するために一般に使用されている他の化学療法剤のゲムシタビン治療に対するＬＫＰＨ２腫瘍の応答を増強した。本研究では、ゲムシタビンは、１００ｍｇ／ｋｇで、４用量に対して４日毎にマウスに投与した。腫瘍増殖曲線及びカプラン・マイヤー曲線を実施例１５におけるように作成した。
【０２８３】
実施例１６−抗ＮＲＧ１抗体は乳癌腫瘍増殖を阻害する
乳癌のマウスモデル系において腫瘍増殖を阻害する抗ＮＲＧ１抗体の能力を決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５Ｔ腫瘍断片をベージュヌードマウスの乳房脂肪体中に移植した。０．３６ｍｇのエストロゲンペレットを腫瘍移植の１−３日前に移植した。腫瘍が１５０及び２５０ｍｍ３の平均に達したときにマウスをグループ分けし、次のようにして処理した：
グループ１：ビヒクル（ＰＢＳ）、ＩＰ、１×／週×４、ｎ＝８−１０
グループ２：抗ＨＥＲ３抗体、５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１×／週×４、ｎ＝８−１０
グループ３：５３８．２４．７１、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑｗｋ×４、ｎ＝８−１０
全注入量（１処置日当たり）は３００μｌ／マウスを超えない。
【０２８４】
１：１のＨＢＳＳ：マトリゲル溶液中のＮＣＩ−Ｈ５２２細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍が２５０−３５０ｍｍ３の平均に達したとき、マウスをグループ分けし、次のようにして処置した：
グループ１：ビヒクル（ＰＢＳ）、ＩＰ、１×／週×４週間、ｎ＝８−１０
グループ２：ペルツズマブ、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１×／週×４週間、ｎ＝８−１０
グループ３：ＨＥＲ４：１４６２、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１×／週×４週間、ｎ＝８−１０
グループ４：５２６．９０．２８、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１×／週×４週間、ｎ＝８−１０
グループ５：５３８．２４．７１、２５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１×／週×４週間、ｎ＝８−１０
【０２８５】
腫瘍を少なくとも週に一度測定し、動物を試験期間中少なくとも週２回モニターした。腫瘍部位は必要に応じて剃毛し、腫瘍測定を容易にした。
【０２８６】
腫瘍増殖曲線は自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積の適合を作成したリニア混合効果（ＬＭＥ）モデルとして提示される。腫瘍増殖曲線及びカプラン・マイヤー曲線を実施例１５におけるようにして作成した。％ＴＧＩは、全ての治療群にまだ幾らかの動物が存在している日に対してのみ適合した曲線に基づいてコントロールと比較したＡＵＣ／日（元のｍｍ３体積スケールで）減少パーセントである。図２４。
【０２８７】
これらのデータは、抗ＮＲＧ１ Ａｂでの単剤治療がＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達によって駆動される腫瘍の増殖を有意に阻害することを示している。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５モデルにおける腫瘍増殖阻害は、ＨＥＲ３受容体によって媒介されるＮＲＧ１シグナル伝達によって駆動される腫瘍増殖を阻害する抗ＮＲＧ１の能力を証明している（図２４Ａ）一方、ＨＥＲ３を発現しないＨ５２２モデルにおける増殖阻害はＮＲＧ１−ＨＥＲ４シグナル伝達によって駆動される腫瘍の増殖を阻害する抗ＮＲＧ１の能力を実証している（図２４Ｂ）。
【０２８８】
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2014526891.tif 000006
【０２８９】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、出典明示によりその全体が援用される。
【０２９０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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