(57)【要約】  二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素を発現しかつＧＤＰ−Ｌ−フコースをイン・ビボで産生することができる酵母株を提供する。ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターおよび／またはフコシルトランスフェラーゼを二機能性酵素で発現する酵母細胞も提供する。更に、前記の酵母は、異種グリコシル化経路とＥＲ／ゴルジ体保持配列との融合タンパク質のための１以上の発現カセットを含む。最後に、本発明は、目的とする組換え糖タンパク質を産生する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素の発現のためのカセットを含んでなる、遺伝子組換え酵母。 
【請求項２】
二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素がバチルス・フラジリス(Bacillus fragilis)のＦｋｐまたはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のＦＫＧｐである、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素が、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項１または２に記載の酵母株。
【請求項４】
少なくとも１つの追加カセットを含んでなり、前記のカセットがＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターおよび／またはフコシルトランスフェラーゼの発現のためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項５】
ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターの発現のための追加カセットとフコシルトランスフェラーゼの発現のための追加カセットとを含んでなる、請求項４に記載の酵母株。
【請求項６】
酵母細胞がマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項７】
酵母細胞が、ＯＣＨ１遺伝子および／またはＭＮＮ１遺伝子および／またはＭＮＮ９遺伝子の欠失を含んでなる、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項８】
酵母において異種グリコシル化酵素を発現するための少なくとも１つの追加カセットを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項９】
前記の異種グリコシル化酵素が、α−マンノシダーゼＩ（α−１，２−マンノシダーゼ）、α−マンノシダーゼＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、ガラクトシルトランスフェラーゼＩ、シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノースアミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ、シチジンモノホスフェートＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼからなる群から選択される、請求項８に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
前記の追加発現カセットが、異種グリコシル化酵素の接触ドメインとＥＲ／ゴルジ体残留シグナルの融合タンパク質をコードする、請求項８または９に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
残留シグナルが、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のＨＤＥＬ小胞体残留／回収配列およびＯｃｈ１、Ｍｓｎ１、Ｍｎｎ１、Ｋｔｒ１、Ｋｒｅ２、Ｍｎｔ１およびＭｎｎ９タンパク質のターゲッティングシグナルからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記の酵母細胞が、更にトランスポーターのための１以上の発現カセットを含み、前記のトランスポーターがＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターおよびＵＤＰＧＡＬトランスポーターからなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
前記のＹＡＣが、更に酵母タンパク質シャペロンのため発現カセットを含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
前記の発現カセットが、ｐＧＡＰＤＨ、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１０、ｐＰＧＫ、ｐＴＥＦ、ｐＭＥＴ２５、ｐＡＤＨ１、ｐＰＭＡ１、ｐＡＤＨ２、ｐＰＹＫ１、ｐＰＧＫ、ｐＥＮＯ、ｐＰＨＯ５、ｐＣＵＰ１、ｐＰＥＴ５６、ｐｎｍｔ１、ｐａｄｈ２、ｐＳＶ４０、ｐＣａＭＶ、ｐＧＲＥ、ｐＡＲＥおよびｐＩＣＬからなる群から選択されるプロモーターを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
前記の発現カセットが、ＣＹＣ１、ＴＥＦ、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＵＲＡ３、ＡＤＨ１、ＰＤＩ１、ＫＡＲ２、ＴＰＩ１、ＴＲＰ１、Ｂｉｐ、ＣａＭＶ３５Ｓ、およびＩＣＬからなる群から選択されるターミネーターを含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
前記の酵母細胞が、発現カセット１を含み、前記のカセット１がプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるＦｋｐ遺伝子またはＦＫＧｐを含み、前記の酵母細胞が、下記の発現カセット：
カセット２であって、ＳＶ４０プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるヒトＳＬＣ３５Ｃ１遺伝子を含む前記のカセット２、
カセット３であって、ｎｍｔ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるヒトＦＵＴ８遺伝子を含む前記のカセット３、
カセット４であって、ＴＤＨ３プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるα−マンノシダーゼＩとＨＤＥＬ小胞体残留／回収配列の融合体をコードする遺伝子を含む前記のカセット４、
カセット５／６であって、ＡＤＨ１プロモーターとＴＥＦターミネーターの制御下にあるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩとサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)Ｍｎｎ９保持配列との融合体をコードする遺伝子、およびＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターの制御下にあるＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子を含む前記カセット５／６、
カセット７であって、ＴＥＦプロモーターとＵＲＡターミネーターの制御下にあるα−マンノシダーゼＩＩ遺伝子を含む前記のカセット７、
カセット８であって、ＰＭＡ１プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターの制御下にあるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)Ｍｎｎ９保持配列との融合体をコードする遺伝子を含む前記のカセット８、
カセット９であって、ＣａＭＶプロモーターとＰＨＯ５ターミネーターの制御下にあるヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼとサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)Ｍｎｔ１保持配列との融合体をコードする遺伝子を含む前記のカセット９、
カセット１０であって、内在性ターミネーターと共にダイバージェント配る向で、両方ともｐＧＡＬ１／１０プロモーターの制御下にあるサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)ＰＤＩ１およびＫＡＲ２遺伝子を含む前記のカセット１０
の１以上を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
前記の酵母細胞が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２から選択される配列を有する１以上のカセットを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１８】
前記の発現カセットが、前記の酵母細胞のゲノムＤＮＡに組込まれている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
前記の酵母細胞が酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含み、前記のＹＡＣが前記の発現カセットを有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
前記の酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素の発現のためのカセットを酵母細胞に導入し、
形質転換のゲノムに挿入される前記カセットを含む前記の形質転換体を選択する
段階を含んでなる、請求項１８に記載の酵母を得る方法。
【請求項２２】
１以上の発現カセットを空のＹＡＣベクターに挿入することを含んでなる、請求項１８に記載のＹＡＣを構築する方法。
【請求項２３】
前記の空のＹＡＣベクターが、下記の要素：
１つの酵母複製起点と１つのセントロメアＯＲＩ ＡＲＳ１／ＣＥＮ４、
２つのテロメア配列ＴＥＬ、
それぞれのアームに２つの選択マーカー：ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２、ＢＬＡ、
組換体の負の選択のための１つの選択マーカー：ＵＲＡ３、
１つの多重クローニング部位（ＬＹＳ２の上流）、
１つの大腸菌複製起点と１つのアンピシリン耐性遺伝子、
４つの線状化部位：２つのＳａｃＩ部位と２つのＳｆｉＩ部位
を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の空のＹＡＣベクターが、配列番号１３のＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
目的とする組換え糖タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）組換え糖タンパク質をコードする核酸を請求項１〜２０のいずれか一項に記載の酵母細胞に導入する工程、
（ｂ）宿主細胞中で核酸を発現させて、糖タンパク質を産生させる工程、および
（ｃ）組換え糖タンパク質を宿主細胞から単離する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
グリコシル化は、真核生物のタンパク質の機能およびそれらの薬理特性の両方にとって本質的なものである。最適なＮ−またはＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を生産する目的で、多くの技術的解決法が提案されてきた。例えば、様々なグリコシルトランスフェラーゼによりガラクトース、グルコース、フコースまたはシアル酸のような糖残基の付加によって、または特定の糖残基の抑制、例えば、マンノシダーゼによるマンノース残基の除去によってイン・ビトロでグリカン構造を付加することが提案されてきた（ＷＯ０３／０３１４６４号）。しかしながら、この方法は、同一糖タンパク質上に存在する数個のオリゴ糖の逐次修飾に幾つかの連続段階をともなうので、工業的規模で用いることは困難である。それぞれの段階において、レシピエントタンパク質上で同種のグリカン構造を得るには、反応をしっかりと制御しなければならない。更に、精製酵素の使用は、現実的な経済的解決法であるとは思われない。同様の問題は、ＷＯ２００６／１０６３４８号およびＷＯ２００５／０００８６２号に記載されているような化学的カップリング技術でも起きる。それらは、保護／脱保護および多数の制御を有する多数の長たらしい反応を伴う。同一糖タンパク質が幾つかのオリゴ糖鎖を有するときには、逐次反応によって望ましくない異質の修飾物が生じる危険性が高い。
【０００２】
最近、マンノシダーゼおよび幾つかのグリコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドで酵母または単細胞糸状菌を形質転換することによってこれらの微生物で糖タンパク質を産生することが提案されてきている（例えば、ＷＯ０１／４５２２号、ＷＯ０２／００８７９号、ＷＯ０２／００８５６号を参照されたい）。しかしながら、これらの微生物が高容量発酵装置で時間を通して安定であることは今日まで明らかにされていない。従って、このような細胞系が臨床ロットの生産に確実に用いることができるかどうかは、知られていない。
【０００３】
最適のイン・ビボ活性が得られるようにデザインされたグリカン構造を有するタンパク質を得るために、本発明者らは、以前に、ゲノムの様々な部位にターゲッティング配列を有する哺乳類のグリコシル化酵素の様々な融合体を含む発現カセットを挿入することによって遺伝子組換え酵母を構築した（ＷＯ２００８／０９５７９７号）。更に、これらの株を、高マンノースＮ−グリカンの産生に関与している選択された内在性のグリコシル化酵素を除去することによって修飾した。これらの生成株により、同種で特徴がはっきりしたＮ−グリコシル化パターンを有するタンパク質が強力に発現された。
【０００４】
動物の糖タンパク質のＮ−グリカンは、典型的にはガラクトース、フコースおよび末端シアル酸を含む。これらの糖は、大部分の酵母や糸状菌で産生される糖タンパク質では見られない。ヒトでは、総ての範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコースなど）はサイトゾルで合成され、ゴルジ体に運ばれ、そこでそれらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に付着する。
【０００５】
動物およびヒト細胞は、あるタンパク質上のＮ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃ残基にフコース残基を付加するフコシルトランスフェラーゼ経路を有する。この経路は、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースから始まり、第一の段階は特異的ヌクレオチド−糖デヒドラターゼであるＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）によって触媒される脱水反応である。これは、不安定なＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースを形成し、これが次の３，５−エピマー化に続いてＮＡＤＰＨ依存性還元を受けることによって、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを形成する。これらの後の二段階は、単一の二機能性酵素ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ／４−レダクターゼ（ヒトでは、ＦＸとして知られる）によって触媒される。ＧＤＰ−Ｌ−フコースは次に、ゴルジ体膜に位置したＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターによってゴルジ装置に運ばれた後、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ヒトでは、ＦＵＴ８によってコードされる）によってＮ−グリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基の６位に移される。
【０００６】
再利用経路と呼ばれるＧＤＰ−Ｌ−フコースを生産する第二の経路は、報告されている(Reiter and Vanzin,Plant Mol Biol, 47(1-2): 95-113, 2001; Coyne et al., Science, 307: 1778-1781, 2005)。この再利用経路では、遊離のサイトゾルフコースはＬ−フコキナーゼによってリン酸化されてＬ−フコース−Ｌ−ホスフェートを形成し、これは次にＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼによって触媒される反応で更にＧＤＰ−Ｌ−フコースに転換される。細菌および植物では、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性を両方とも有する単一の二機能性酵素が、Ｌ−フコースからＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成を触媒することが示されている。この酵素は、それぞれ、バクテロイデス（Bacteroides）(Coyne et al., Science, 307: 1778-1781, 2005; Fletcher et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 104(7): 2413-2418, 2007; Xu et al., PloS Biol, 5(7): e156, 2007)およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）(Kotake et al., J Biol Chem, 283(13): 8125-8135, 2008)におけるＦｋｐおよびＦＫＧｐ遺伝子によってコードされる。これらの酵素を発現する遺伝子組換え大腸菌（Escherichia coli）株は、フコシル化乳化合物を産生することができる（ＷＯ２０１０／０７０１０４号明細書）。精製されたバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）酵素は、フコシル化化合物 (Wang et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 106(38): 16096-16101, 2009)またはＧＤＰ−Ｌ−フコース(Zhao et al., Nat Protoc, 5(4): 636-46, 2010)をイン・ビトロで合成するのに使用されてきた。
【０００７】
ＩｇＧ１抗体のＮ−グリカンからフコースを除去するとそれらの抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増すが（例えば、ＷＯ００／６１７３９号、Shields et al., J Biol Chem., 277(30): 26733-26740, 2002, Mori et al., Cytotechnology, 55(２−３): 109-114, 2007, Shinkawa et al., J Biol Chem., 278(5): 3466-73, 2003, ＷＯ０３／０３５８３５号、Chowdury and Wu, Methods, 36(1): 1１−24, 2005; Teillaud, Expert Opin Biol Ther., 5(Suppl 1): S15-27, 2005; Presta, Adv Drug Deliv Rev., 58(5-6): 640-656, 2006)、フコシル化Ｎ−グリカンは他の糖タンパク質にとって重要であると思われる。例えば、白血球増加症の顕著な特徴を有する極めて稀なヒト疾患は、感染症の発生を増加させ、精神遅滞ＬＡＤ  ＩＩは白血球上の選択リガンドの欠如へと導くＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーター活性における欠損と関連づけられている(Luhn et al., 2001; Etzioni, 2005)。α１，６−フコシルトランスフェラーゼを欠いているマウスはα４β１インテグリン／ＶＣＡＭ−１相互作用が低下し、プレＢ細胞再増殖が損なわれ、免疫グロブリンの産生が減少することも示されている (Li et al., Glycobiology, 18(1): 114-124, 2008)。更に一般的には、マウスにおけるＦＵＴ８の崩壊は、成長の著しい阻害、生後発育中の早期の死、および肺における肺気腫様変化を引き起こす。これらの表現型は、少なくとも部分的にはＴＧＦ−β１およびＥＧＦレセプターのフコシル化の減少による可能性がある(Wang et al., Meth Enzymol, 417: 11-22, 2006)。更に、抗体の少なくとも一部がフコシル化されてＡＤＣＣ活性を減少させない抗体組成物を産生することが望ましい場合がある。
【０００８】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースを化学的に合成する方法は、記載されている（欧州特許第５０２２９８号明細書、米国特許第５，３７１，２０３号明細書）。その特異的糖ヌクレオチドの産生は原核生物で行った後、それを培養培地に分泌することもできる（米国特許第６，８７５，５９１号明細書）。しかしながら、これらの合成法の価格は、工業的過程でのそれらの使用に負の影響を与える。
【０００９】
もう一つの方法は、酵母細胞におけるＧＤＰ−Ｌ−フコース合成経路の組込みからなっている。酵母細胞では、グリコシル化は主としてマンノシル化に制限されている。これらの細胞は、それら自身のフコース代謝を有することは知られていない。特に、酵母はＧＤＰ−Ｌ−フコースを合成せず、これは何か他の手段によって提供しなければならない。例えば、欧州特許第１１９９３６４号明細書およびＷＯ２００８／１１２０９２号には、ヒトＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼおよびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ／４−レダクターゼ酵素を発現する酵母細胞の構築が記載されている。この方法では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを産生することができる酵母細胞を得ることができるが、酵母に２種類の外来タンパク質を類似の量で同時に発現させる必要があり、これは工業的に達成が困難なことがある。
【００１０】
フコシル化糖タンパク質の組換え生成のための遺伝学的に増強された酵母細胞が、未だに求められている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐＧＬＹ−ｙａｃ＿ＭＣＳのマップ。
【図２】本発明のＹＡＣの構築。
【図３】ＦＫＧｐ−およびＦＫｐ−発現酵母クローンのＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１−５：ＣＲ０３３（配列番号１４）およびＣＲ０３４（配列番号１５）によるＦＫＧｐの増幅；レーン１：ＦＫＧｐ形質転換体；レーン２：ＲＮアーゼで処理したＦＫＧｐ形質転換体（ネガティブコントロール）；レーン３：Ｌｅｕ３９−酵母（ネガティブコントロール）；レーン４：ＲＮアーゼで処理したＬｅｕ３９−酵母（ネガティブコントロール）；レーン５：Ｈ２Ｏ（ネガティブコントロール）；レーン６−１０：ＣＲ０３５（配列番号１６）およびＣＲ０３６（配列番号１７）によるＦＫｐの増幅；レーン６：ＦＫｐ形質転換体；レーン７：ＲＮアーゼで処理したＦＫｐ形質転換体（ネガティブコントロール）；レーン８：Ｌｅｕ３９−酵母（ネガティブコントロール）；レーン９：ＲＮアーゼで処理したＬｅｕ３９−酵母（ネガティブコントロール）；レーン１０：Ｈ２Ｏ（ネガティブコントロール）。
【図４】フコースキナーゼおよびピロホスホリラーゼ活性分析
【図５】ＦＫＧｐ−およびＦＫｐ−発現酵母クローンからスフェロブラスト調製についての活性試験。野生型（ストリップトバー）、ＦＫＧｐ（淡灰色バー）およびＦＫｐ（暗灰色バー）株におけるフコキナーゼおよびピロホスホリラーゼ活性の比較。フコキナーゼ活性／左パネル：フコキナーゼ活性の２０分キネティック。データーは３回の分析の平均である。右パネル：ＦＫｐ株におけるフコキナーゼ活性の４０分キネティック。データーは２回の分析の平均である。ピロホスホリラーゼ活性／左パネル：フコキナーゼ活性の２０分キネティック。データーは３回の分析の平均である。右パネル：ＦＫｐ株におけるフコキナーゼのキナーゼ活性の４０分キネティック。データーは１回の分析の結果である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
説明
本発明は、フコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することができる遺伝子組換え酵母細胞を提供する。また、遺伝子組換え酵母細胞を得る方法並びにフコシル化糖タンパク質を産生する方法も提供される。
【００１３】
本発明による酵母は、異種タンパク質の大規模生産に用いることができる任意の種類の酵母である。従って、本発明の酵母は、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizzosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラマエ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・ミヌタ(Pichia minuta)(オガタエア・ミヌタ(Ogataea minuta)、ピキア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピキア・オプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピキア・ピジペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア種(Pichia sp.)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)のような種を含んでなる。好ましくは、本発明の酵母は、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)である。「酵母細胞」、「酵母株」、「酵母培養物」という表現は互換的に用いられ、このような名称は総て後代(progeny)を包含する。例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、初代被験体細胞、およびトランスファーの数には関係なくそれに由来する培養物を含む。意図的なまたは偶然の突然変異により、総ての子孫はＤＮＡの内容が精確に同一ではないことがあることも理解されている。最初に形質転換した細胞でスクリーニングしたのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が含まれる。別個の名称を付けようとする場合には、前後関係から明らかになる。
【００１４】
「グリコシル化」という用語は、糖タンパク質へのオリゴ糖（互いに連結した２つ以上の単糖、例えば、互いに連結した２〜約１２個の単糖を含む炭水化物）の付着を意味する。オリゴ糖側鎖は、典型的にはＮ−またはＯ−結合を介して糖タンパク質の主鎖に連結している。生じる本発明のオリゴ糖は、通常はＮ−結合したオリゴ糖としてのＦｃ領域のＣＨ２ドメインに結合している。「Ｎ−結合したグリコシル化」は、従って、糖タンパク質鎖におけるアスパラギン残基への炭水化物部分の結合を表す。
【００１５】
本明細書で用いられる「Ｎ−グリカン」という用語は、Ｎ−結合したオリゴ糖、例えば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に結合しているものを表す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを表し、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す）の共通の五糖コアを有する。Ｎ−グリカンに関して用いられる「トリマンノースコア」という用語も、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）を表す。Ｎ−グリカンに関して用いられる「ペンタマンノースコア」または「マンノース−５コア」または「Ｍａｎ５」は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を表す。
【００１６】
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に結合している周辺糖(peripheral sugars)（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含んでなる分枝（触角）の数および性質に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝した成分（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）に従って分類される。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、少なくとも５つのマンノース残基を含んでなる。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的にはトリマンノースコアの１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンは、場合によってはシアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」（式中、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表す）で修正されているガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有することもある。複合Ｎ−グリカンは、典型的には、例えばＮｅｕＮＡｃ−、ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−、ＮｅｕＡｃα２−３／６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−、ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−（ムチンのみ）、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−（血液グループＨ）のようなオリゴ糖で終わる少なくとも１つの分枝を有する。硫酸エステルはガラクトース、ＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ残基上に存在することができ、リン酸エステルはマンノース残基上に存在することができる。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）は、Ｏ−アセチル化し、あるいはＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換することができる。複合Ｎ−グリカンは、「二分割」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含んでなる鎖内置換を有することもある。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上に０個以上のマンノースを有する。
【００１７】
真核生物のタンパク質のＮ−グリコシル化は、小胞体（ＥＲ）内腔およびゴルジ装置で起こる。この過程は、細胞質で合成した分枝したドリコール結合オリゴ糖Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＥＲ内腔にフリップしてコアオリゴ糖Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を形成することで始まる。オリゴ糖を、次に初期ポリペプチド鎖のＮ−グリコシル化コンセンサス配列のアスパラギン残基に移し、末端グルコース残基を除去するα−グルコシダーゼＩおよびＩＩ、および末端マンノース残基を開裂させるα−マンノシダーゼによって順次にトリムする。生成するオリゴ糖Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２は、接合中間体であり、これは更にトリムして、哺乳類細胞などの高等真核細胞では複合型構造をもたらす最初の基質であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じ、またはマンノース残基の付加によって伸長して、下等真核細胞ではＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２をゴルジ装置に生じることがある。
【００１８】
ヒトグリコシル化反応のレパートリーの中心部分は、２種類の別個なマンノシダーゼ（すなわち、α−１，２−マンノシダーゼおよびマンノシダーゼＩＩ）によるマンノースの連続除去、Ｎ−アセチルグルコサミンの付加（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよびＩＩによる）、ガラクトースによる（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ)、および最後にシアリルトランスフェラーゼによるシアル酸の付加を必要とする。他の反応は、追加の酵素、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、ＩＶおよびＶまたはフコシルトランスフェラーゼによって制御して、複合Ｎ−グリカン型の様々な組合せを生成することができる。
【００１９】
第一の態様では、本発明は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースをイン・ビボで合成することができる酵母細胞に関する。従って、本発明は、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素活性を両方とも発現する遺伝子組換え酵母細胞を提供する。
【００２０】
「フコキナーゼ」とは、本明細書では、ホスフェートをＬ−フコースに付加する酵素活性を表す。従って、本発明のフコキナーゼ活性は、具体的にはホスフェートドナーとしてＡＴＰを用いてＬ−フコースをＬ−フコース−１−Ｐに転換する（例えば、Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243: 1103-1109, 1968を参照されたい）。この酵素は、当該技術分野では、「フコキナーゼ（リン酸化）」、「フコースキナーゼ」、「Ｌ−フコースキナーゼ」、「ＡＴＰ：６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース１−ホスホトランスフェラーゼ」、「Ｌ−フコキナーゼ」、「ＡＴＰ：Ｌ−フコース１−ホスホトランスフェラーゼ」または「ＡＴＰ：β−Ｌ−フコース１−ホスホトランスフェラーゼ」としても知られている。好ましくは、本発明のフコキナーゼ活性は、ＥＣ２．７．１．５２と呼ばれる酵素活性に相当する。
【００２１】
「ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ」とは、本明細書では、ＧＤＰの存在下にてＬ−フコース−１−ＰをＧＤＰ−Ｌ−フコースに転換する酵素活性を表す（例えば、Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243: 1110-1115, 1968を参照されたい）。この酵素は、文献では「フコース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ」、「ＧＤＰフコースピロホスホリラーゼ」、「グアノシンジホスフェートＬ−フコースピロホスホリラーゼ」、「ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ」、「ＧＴＰ：Ｌ−フコース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ」または「ＧＴＰ：β−Ｌ−フコース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ」としても知られている。好ましくは、本発明のＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼは、ＥＣ２．７．７．３０と呼ばれる酵素活性に相当する。
【００２２】
本発明の一実施態様では、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性のそれぞれは、別のポリペプチドによって運ばれる。このようなタンパク質は当該技術分野で知られており、それ自体当業者にとって利用可能である。例えば、豚フコキナーゼはPark et al.（J Biol Chem, 273(10): 5685-5691, 1998）において、および豚ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼはPastuszak et al.（J Biol Chem, 273(46): 30165-3074, 1998）において特性決定されている。この実施態様によれば、本発明は、２種類のポリペプチドであって、一方はフコキナーゼ活性を有し、他方はＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性を有するものを発現する酵母細胞に関する。
【００２３】
本発明は、前記の、すなわち２種類の酵素活性のそれぞれは別個のポリペプチドと関連している状況を包含するが、本発明の目的には、両方の酵素活性が同一ポリペプチドによって運ばれるのが有利である。これによって、１種類のみのタンパク質を発現させることによってＬ−フコースからＧＤＰ−Ｌ−フコースのイン・ビボ産生が可能になる。
【００２４】
この実施態様によれば、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性は、単一の二機能性タンパク質によって運ばれる。既知の二機能性タンパク質は、バクテロイデス(Bacteroides)のＦｋｐタンパク質（Coyne et al., Science, 307: 1778-1781, 2005; Fletcher et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 104(7): 2413-2418, 2007; Xu et al., PloS Biol, 5(7): e156, 2007）およびシロイヌナズナ(A. thaliana)のＦＫＧｐタンパク質（Kotake et al., J Biol Chem, 283(13): 8125-8135, 2008）である。本発明による他の二機能性酵素は、すなわち、Ｆｋｐおよび／またはＦＫＧｐタンパク質との配列同一性に基づいて、配列比較によって当業者が同定することができる。Ｆｋｐタンパク質とは、本明細書では、バクテロイデス(Bacteroides)属に含まれておりかつフコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性を両方とも有する細菌タンパク質を表す。Ｆｋｐタンパク質の一例は、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)Ｆｋｐタンパク質であり、これはGenbank ID番号ＡＡＸ４５０３０．１．を有する。好ましくは、本発明のＦｋｐタンパク質は、配列番号２と同一の配列を有する。ＦＫＧｐとは、本明細書では、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性を両方とも有し、Genbank ID番号ＮＰ＿５６３６２０．１．を有するシロイヌナズナ(A. thaliana)のタンパク質を意味する。本発明のＦＫＧｐタンパク質は、好ましくは配列番号４と同一のポリペプチド配列を有する。好ましい実施態様では、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ活性を両方とも有する二機能性タンパク質は、ＦｋｐおよびＦＫＧｐからなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、前記の二機能性タンパク質は、配列番号２および配列番号４からなる群から選択される配列を有するタンパク質である。
【００２５】
本発明のもう一つの態様では、前記の遺伝子組換え酵母細胞は、上記のように二機能性タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる発現カセットを含んでなる。好ましい実施態様では、本発明の遺伝子は、ＦｋｐおよびＦＫＧｐからなる群から選択されるタンパク質をコードする。更に好ましい実施態様では、本発明の遺伝子は、配列番号２および配列番号４からなる群から選択される配列を有するタンパク質をコードする。好ましくは、本発明の遺伝子は、配列番号１および配列番号３の群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する。最も好ましい実施態様では、本発明の遺伝子は、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を有する。
【００２６】
本発明による発現カセットは、目的のタンパク質をコードする遺伝子の他に、前記タンパク質の発現を指示するのに必要な総ての配列を含む。これらの調節要素は、プロモーター、リボソーム開始部位、開始コドン、停止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびターミネーターを含んでなることがある。更に、エンハンサーが遺伝子発現に必要なことが多い。これらの要素は、所望なタンパク質をコードする配列に操作可能に連結していることが必要である。「操作可能に連結している」発現制御配列は、発現制御配列が目的の遺伝子と隣接して目的の遺伝子を制御する結合、並びにイン・トランス(in trans)または離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列を表す。
【００２７】
開始および停止コドンは、一般的には所望なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と考えられている。しかしながら、これらの要素は、遺伝子構築物が導入される細胞で機能性であることが必要である。開始および終止コドンは、コード配列とイン・フレーム(in frame)でなければならない。
【００２８】
遺伝子の発現に必要なプロモーターとしては、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫなどの構成的発現プロモーターおよびＧＡＬ１、ＣＵＰ１などの誘導的発現プロモーターが何ら特別な制限なしに挙げられる。前記プロモーターは、内在性プロモーター、すなわち異種Ｎ−グリコシル化酵素を発現する同一酵母種由来のプロモーターであることができる。あるいは、それらは別の種由来であることができ、唯一の要件は、前記プロモーターが酵母で機能性であることである。一例として、遺伝子の一つの発現に必要なプロモーターは、ｐＧＡＰＤＨ、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１０、ｐＰＧＫ、ｐＴＥＦ、ｐＭＥＴ２５、ｐＡＤＨ１、ｐＰＭＡ１、ｐＡＤＨ２、ｐＰＹＫ１、ｐＰＧＫ、ｐＥＮＯ、ｐＰＨＯ５、ｐＣＵＰ１、ｐＰＥＴ５６を含んでなる群から選択することができ、前記群は、異種プロモーターｐｎｍｔ１、ｐａｄｈ２（いずれも、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizzosaccharomyces pombe)由来）、ｐＳＶ４０、ｐＣａＭＶ、ｐＧＲＥ、ｐＡＲＥ、ｐＩＣＬ（カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)）をも含んでなる。ターミネーターは、ＣＹＣ１、ＴＥＦ、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＵＲＡ３、ＡＤＨ１、ＰＤＩ１、ＫＡＲ２、ＴＰＩ１、ＴＲＰ１、Ｂｉｐ、ＣａＭＶ３５Ｓ、およびＩＣＬを含んでなる群において選択される。
【００２９】
これらの調節配列は、当該技術分野で広く用いられている。当業者であれば、何ら困難なしにデーターベースでそれらを同定するであろう。例えば、当業者であれば、発芽期の酵母プロモーターおよび／またはターミネーター配列を検索する目的でサッカロマイセス(Saccharomyces)ゲノムデーターベースウェブサイト(http://www.yeastgenome.org/)を調べるであろう。
【００３０】
本発明において酵母にＮ−グリコシル化タンパク質を産生させるには、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを、本発明の二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素によるその産生の結果として最初に細胞質内に蓄積させる。次いで、酵母細胞質内に蓄積したＧＤＰ−Ｌ−フコースをゴルジ装置に輸送しなければならず、そこでグリコシルトランスファー反応および糖タンパク質の合成が起こる。この反応は、真核生物細胞ではＧＤＰ−フコーストランスポーターによって行われる。ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、幾つかの種で同定されている。例えば、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター（Ｆｕｃｔ１）は、グリコシル化−ＩＩの先天性疾患に関連したものとして同定されている（Lubke et al, Nat. Genet., 28: 73-76, 2001）。それは、ＳＬＣ３５Ｃ１遺伝子によってコードされる。ＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する相同遺伝子は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)（Ishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 102:18532-18537, 2005）、ラット肝（Puglielli and Hirschberg; J. Biol. Chem., 274: 35596-35600, 1999）、推定的ＣＨＯ（Chen et al., Glycobiology; 15: 259-269, 2005）およびシロイヌナズナ(A. thaliana)ホモログ（米国特許出願公告第２００６／００９９６８０号明細書）のような他の種で同定されている。好ましくは、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターは、ヒトＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターであり、これはＳＬＣ３５Ｃ１遺伝子（受入番号：ＮＭ＿０１８３８９）によってコードされる。
【００３１】
更に、本発明においてＧＤＰ−Ｌ−フコースを糖ドナーとして利用するには、フコシルトランスフェラーゼは本発明の酵母細胞で発現しなければならない。現在のところ、８種類のフコシルトランスフェラーゼが哺乳類におけるＡｓｎに結合したムチン型の糖鎖のシンターゼとして知られている。「フコシルトランスフェラーゼ」は、１種類以上のフコースを糖タンパク質に付加する酵素である。例としては、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．６９；ＦＵＴ１およびＦＵＴ２によってコードされる）、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（糖タンパク質３−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ、ＥＣ２．４．１．２１４；ＦＵＴ３−ＦＵＴ７およびＦＵＴ９によってコードされる）、α１，４−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．６５；ＦＵＴ３によってコードされる）、およびα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（糖タンパク質 ６−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ、ＥＣ２．４．１．６８；ＦＵＴ８によってコードされる）が挙げられる。一般に、α１，２−フコシルトランスフェラーゼは、フコースをα１，２結合によってＮ−グリカンの末端ガラクトース残基に移動させ、一般に、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，４−フコシルトランスフェラーゼは、フコースをＮ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃ残基に移動させる。一般に、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、フコシル残基をＧＤＰ−Ｌ−フコースからアスパラギンに結合したオリゴ糖の最内側のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−グリカン）への移動を触媒する。典型的には、フコースを還元末端のＧｌｃＮＡｃに付加させることができるようにするためには、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、トリマンノースコアの少なくとも１本の分枝の非還元末端に末端ＧｌｃＮＡｃ残基を必要とする。しかしながら、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、フコースを還元末端のＧｌｃＮＡｃに付加させることができるようにするためには、非還元末端に末端ガラクトシド残基を必要とすることが確認されている（Wilson et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 72: 909-916, 1976)）。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを欠いているＣＨＯ細胞では、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、フコシレートＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをフコシル化することも報告されている（Lin et al., Glycobiol., 4: 895-901, 1994）。ブタおよびヒトα１，６−フコシルトランスフェラーゼは、Uozumi et al.（J. Biol. Chem., 271: 27810-27817, 1996）およびYanagidani et al.（J. Biochem., 121: 626-632, 1997）にそれぞれ記載されている。好ましくは、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼは、ヒトタンパク質であり、これはＦＵＴ８（受入番号：ＮＭ＿１７８１５６）によってコードされる。
【００３２】
本発明は、二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素をコードする遺伝子を含む発現カセットの他に、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子および／またはフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する少なくとも１つの発現カセットを含む遺伝子組換え酵母細胞にも関する。換言すれば、本発明は、二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素をコードする遺伝子を含み、かつ少なくとも１つの追加カセットであって、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターおよび／またはフコシルトランスフェラーゼの発現のための前記カセットを含んでなる遺伝子組換え酵母株に関する。ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターおよびフコシルトランスフェラーゼの発現のためのこれらのカセットは、ＷＯ２００８／０９５７９７号に記載されている。好ましくは、本発明の酵母細胞は、二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素をコードする遺伝子を含む発現カセットの他に、２つの発現カセットであって、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子を含む第一のカセットとフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むもう一方のカセットを含んでなる。更に好ましくは、本発明のフコシルトランスフェラーゼは、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである。この最後の実施態様では、本発明は、酵母細胞において完全フコシル化経路の発現を可能にする発現カセットであって、
第一の発現カセットが二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素をコードし、
第二の発現カセットがＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターコードし、かつ
第三の発現カセットがα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする
ものを含んでなる前記酵母細胞に関する。
【００３３】
ヒトＮ−グリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースおよびシアル酸で伸長されたトリマンノースコア上に構築された複合型のものであるが、酵母Ｎ−グリコシル化は、１００までまたはそれ以上のマンノース残基を含む高マンノース型である（超マンノシル化(hypermannosylation)）。小胞体（ＥＲ）におけるＭａｎ８中間体の形成までは、両経路は同一である。これらの経路は、この中間体の形成後に別れ、酵母酵素では更なるマンノース残基を付加するが、哺乳類経路はα−１，２−マンノシダーゼに依存してマンノース残基を更にトリムする。従って、酵母で複合グリコシル化を獲得するには、最初に内在性のマンノシルトランスフェラーゼ活性を不活性化する必要がある。１種類以上のマンノシルトランスフェラーゼを不活性化する突然変異を含む酵母は、マンノース残基をＡｓｎ結合した内部オリゴ糖Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に付加することができない。
【００３４】
第一の実施態様では、本発明は、少なくとも１種類のマンノシルトランスフェラーゼ活性が欠けておりかつ上記のような二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素に対して少なくとも１種類の発現カセットを含む酵母細胞に関する。更に好ましい実施態様では、少なくとも１種類のマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている酵母細胞は、二機能性フコキナーゼ/ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素に対する発現カセットと少なくとも１種類の発現カセットであって、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターまたはフコシルトランスフェラーゼをコードする前記他の発現カセットを含む。好ましくは、少なくとも１種類のマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている酵母細胞は、フコシル化経路に対する発現カセットを含む。
【００３５】
「マンノシルトランスフェラーゼ」とは、本明細書では、マンノース残基を糖タンパク質に付加する酵素活性を表す。これらの活性は当業者に周知であり、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母におけるグリコシル化経路は広範囲に検討されてきた（Herscovics and Orlean, FASEB J., 7(6): 540-550, 1993; Munro, FEBS Lett., 498(2-3): 223-227, 2001. Karhinen and Makarow, J. Cell Sci., 117(2): 351-358, 2004)）。好ましい実施態様では、マンノシルトランスフェラーゼは、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)遺伝子ＯＣＨ１、ＭＮＮ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＴＴＰ１、ＹＧＬ２５７ｃ、ＹＮＲ０５９ｗ、ＹＩＬ０１４ｗ、ＹＪＬ８６ｗ、ＫＲＥ２、ＹＵＲ１、ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＫＴＲ３、ＫＴＲ４、ＫＴＲ５、ＫＴＲ６およびＫＴＲ７の産物、またはそれらのホモログからなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、マンノシルトランスフェラーゼは、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)遺伝子ＯＣＨ１、ＭＮＮ１およびＭＮＮ９の産物、またはそれらのホモログからなる群から選択される。更に一層好ましい実施態様では、マンノシルトランスフェラーゼは、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)ＯＣＨ１の産物またはそのホモログである。もう一つの更に好ましい実施態様では、マンノシルトランスフェラーゼは、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)ＭＮＮ１の産物、またはそのホモログである。更にもう一つの更に好ましい実施態様では、マンノシルトランスフェラーゼは、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)ＭＮＮ９の産物、またはそのホモログである。更に一層好ましい実施態様では、本発明の酵母は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされるマンノシルトランスフェラーゼおよび／またはＭＮＮ１遺伝子によってコードされるマンノシルトランスフェラーゼおよび／またはＭＮＮ９遺伝子によってコードされるマンノシルトランスフェラーゼを欠いている。
【００３６】
本発明によれば、マンノシルトランスフェラーゼ活性が酵母細胞に実質的に存在しないときには、マンノシルトランスフェラーゼ活性は、この細胞には欠けている。これは、前記マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の転写または翻訳の妨害によって起こる可能性がある。更に好ましくは、マンノシルトランスフェラーゼは、前記酵素をコードする遺伝子における突然変異により、欠けている。更に一層好ましくは、マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子は、部分的または全体的にマーカー遺伝子によって置換されている。遺伝子ノックアウトの創成は、酵母および真菌の分子生物学界で定着した手法であり、当該技術分野で通常の技術を有する何人によっても生じさせることができる（R Rothstein, Methods in Enzymology, 194: 281-301, 1991）。本発明の更に好ましい実施態様によれば、マーカー遺伝子は、抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。更に一層好ましくは、ＯＣＨ１遺伝子は、カナマイシン耐性カセットによって分断され、および／またはＭＮＮ１遺伝子は、ハイグロマイシン耐性カセットによって分断され、および／またはＭＮＮ９は、フェロマイシンまたはブラストサイジンまたはヌールセオスリシン(nourseothricin)耐性カセットによって分断される。本明細書で用いられる「抗生物質耐性カセット」は、タンパク質をコードする遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドであって、前記タンパク質が前記抗生物質に対する耐性を付与することができ、すなわち、宿主酵母細胞を抗生物質の存在下にて増殖させることができるものを指す。前記ポリヌクレオチドは、前記タンパク質をコードするオープンリーディングフレームだけでなく、プロモーター、リボソーム開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびターミネーター等その発現に必要な総ての調節シグナルも含んでなる。
【００３７】
更に、本発明の酵母細胞は、１種類以上の追加の発現カセットであって、前記酵母細胞において異種グリコシル化酵素を発現させる前記の追加カセットを含んでなる。例えば、前記酵素は、α−マンノシダーゼ（α−マンノシダーゼＩまたはα−１，２−マンノシダーゼ、α−マンノシダーゼＩＩ）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、ＧｎＴ−ＩＩＩ、ＧｎＴ−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖ）Ｉ、ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＴ）、シアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａＴ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、シチジンモノホスフェートＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＣＳＳ）、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼなどの１以上の活性を含む。このような酵素は、多年にわたって広範囲に特性決定されてきた。
【００３８】
前記酵素をコードする遺伝子も、クローニングされて、研究されてきた。例えば、カエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)α−１，２−マンノシダーゼ（ＺＣ４１０．３、Ｍａｎ（９）−α−マンノシダーゼ、受入番号：ＮＭ＿０６９１７６)をコードする遺伝子、ネズミマンノシダーゼＩＩ（Ｍａｎ２ａ１、受入番号：ＮＭ＿００８５４９．１）をコードする遺伝子、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＭＧＡＴ１、受入番号：ＮＭ＿００１１１４６２０．１）をコードする遺伝子、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＭＧＡＴ２、受入番号：ＮＭ＿００２４０８．３）をコードする遺伝子、ネズミＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＭＧＡＴ３、受入番号：ＮＭ＿０１０７９５．３）をコードする遺伝子、ヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（Ｂ４ＧＡＬＴ１、受入番号：ＮＭ＿００１４９７．３）をコードする遺伝子、ヒトシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧＡＬ４、受入番号：ＮＭ＿００６２７８）をコードする遺伝子、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ、受入番号：ＮＭ＿００１１２８２２７）をコードする遺伝子、ヒトＮ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＮＡＮＳ、受入番号：ＮＭ＿０１８９４６．３）をコードする遺伝子、ヒトシチジンモノホスフェートＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＣＭＡＳ、受入番号：ＮＭ＿０１８６８６）をコードする遺伝子、細菌性（ナイセリア・メニンギティジス(N. meningitidis)）のシアル酸シンターゼ（ＳｉａＡ、受入番号：Ｍ９５０５３．１）をコードする遺伝子、細菌性（ナイセリア・メニンギティジス(N. meningitidis)）のＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＳｉａＢ、受入番号：Ｍ９５０５３．１）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３９】
他の種由来の関連遺伝子は、当業者に知られている方法のいずれかによって、例えば、配列の比較を行うことによって容易に同定することができる。
【００４０】
２つのアミノ酸配列における配列比較は、通常は最良のアライメントに従って以前に整列されているこれらの配列を比較することによって行われ、この比較は、比較のセグメントについて、類似性の局所領域を同定および比較する目的で行われる。比較を行うための最良の配列アライメントは、手動による他、Smith and Watermanによって開発されたグローバル・ホモロジー・アルゴリズムの使用（Ad. App. Math., 2: 482-489, 1981）、Neddleman and Wunschによって開発されたローカル・ホモロジー・アルゴリズムの使用（J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）、Pearson and Lipmanによって開発された類似度法の使用（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448, 1988)、これらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウェアの使用（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl USAにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、ＭＵＳＣＬＥマルチプルアライメントアルゴリズムの使用（Edgar, Nucl. Acids Res., 32: 1792-1797, 2004）によって行うことができる。最良のローカルアライメントを得るために、好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ３０マトリックスを用いるＢＬＡＳＴソフトウェアを用いることができる。２つのアミノ酸配列の同一性率は、最適に整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され、アミノ酸配列は、これら２つの配列の間に最適アライメントを得るためのリファレンス配列に関して付加または欠失を含んでなることができる。同一性率は、これら２つの配列の間の同一位置の数を決定し、この数を比較した位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛けて計算し、これら２つの配列間の同一性率を得る。
【００４１】
更に、多数の公表文献には、他の種の関連酵素も記載されており、当業者であれば、目的の遺伝子の配列を誘導することができる（例えば、ＷＯ０１／２５４０６号、Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 9948-9952, 1990、Sarkar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 88: 234-238, 1991、D'Agostero et al., Eur. J. Biochem., 183: 211-217, 1989、Mash et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 157: 657, 1988、Wang et al. Glycobiology, 1: 25-31, 1990、Lai et al., J Biol Chem., 269: 9872-9881, 1984、Herscovics et al., J Biol Chem., 269: 9864-9871, 1984、Kumar et al., Glycobiology 2: 383-393, 1992、Nishikawa et al., J Biol Chem., 263: 8270-8281, 1988、Barker et al., J Biol Chem., 247: 7135, 1972、Yoon et al., Glycobiology, 2: 161-168, 1992、Masibay et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 5733-5737, 1989、Aoki et al., EMBO J., 9: 3171, 1990、Krezdom et al., Eur. J. Biochem., 212: 113-120, 1993を参照されたい）。
【００４２】
従って、当業者であれば、哺乳類のグリコシル化に関与する活性のそれぞれをコードする遺伝子を容易に同定することができるであろう。
【００４３】
当業者であれば、発現に用いられる遺伝子および細胞の起源によっては、コドン最適化はコードされた二機能性タンパク質の発現増加を促進することがあることも分かるであろう。「コドン最適化」とは、酵母宿主細胞におけるコドン使用頻度について配列を改良する細菌酵素についてのコード配列の変更を表す。多くの細菌または植物は、酵母ではさほど頻繁に用いられない多数のコドンを用いている。一般に用いられる酵母コドンに相当するようにこれらを変化させることによって、本発明の酵母細胞における二機能性酵素の発現を増加させることができる。コドン使用表は、酵母細胞並びに様々な他の生物についての技術分野で知られている。
【００４４】
糖タンパク質は、ＥＲでの合成から後期ゴルジ体での完全な成熟まで進行するので、哺乳類のＮ−グリコシル化酵素は連続的に作用する。酵母で哺乳類発現系を再構成するには、哺乳類のＮ−グリコシル化活性を適宜ゴルジ体またはＥＲに標的化する必要がある。これは、これらのタンパク質のそれぞれのターゲッティング配列を所望な酵素を正確な細胞コンパートメントにターゲッティングすることができる配列に置換することによって行うことができる。もちろん、特定の酵素のターゲッティング酵素が酵母で機能を有しかつ前記酵素をゴルジ体および／またはＥＲに向けることができるときには、この配列を置換する必要がないことは容易に理解されるであろう。ターゲッティング配列は公知であり、科学文献および公表データーベースに記載されている。本発明によるターゲッティング配列（または保持配列；本明細書で用いられるこれら２つの用語は同じ意味を有し、同じものと解釈すべきである）は、このような配列を有するタンパク質を特定の細胞コンパートメントに輸送し、保持するように指示するペプチド配列である。好ましくは、前記細胞コンパートメントはゴルジ体またはＥＲである。当業者であれば、多数のＥＲまたはゴルジ体ターゲッティングシグナル、例えば、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のＨＤＥＬ小胞体残留／回収配列、またはＯｃｈ１、Ｍｎｓ１、Ｍｎｎ１、Ｋｔｒ１、Ｋｒｅ２、Ｍｎｎ９またはＭｎｎ２タンパク質のターゲッティングシグナルを選択することができる。これらの遺伝子の配列並びに任意の酵母遺伝子の配列は、サッカロマイセスゲノムデーターベースウェブサイトに見出すことができる(http://www.veastqenome.org/)。
【００４５】
従って、本発明の目的は、更に１種類以上の発現カセットであって、異種グリコシル化酵素とＥＲ／ゴルジ体保持配列の融合体をコードする前記の追加発現カセットを含んでなる、上記で定義した本発明の酵母細胞を提供することである。
【００４６】
本発明によれば、前記融合体は、慎重に設計した後に構築される。従って、本発明の融合体は、グリコシル化活性を正確な細胞コンパートメントに正確に局在化させる融合体を見出すためにランダムな融合体のライブラリーのスクリーニングを教示している従来技術とは対照的である。
【００４７】
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列にカップリングしたポリペプチドまたは断片を含んでなるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２種類以上の異なるタンパク質から２種類以上の所望な機能要素を含むように構築することができるので、有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチド由来の少なくとも１０の連続するアミノ酸、更に好ましくは少なくとも２０または３０のアミノ酸、更に一層好ましくは少なくとも４０、５０または６０のアミノ酸、更にもっと好ましくは少なくとも７５、１００または１２５のアミノ酸を含んでなる。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはインフレームのその断片をコードする核酸配列を異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列で構築した後、融合タンパク質を発現させることによって組換えによって産生することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋させることによって化学的に産生させることができる。
【００４８】
更に、本発明の前記酵母細胞は、好都合にはＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのような様々な活性化したオリゴ糖前駆体の輸送体を含むことがある。前記輸送体は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）など、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、ＵＤＰＧＡＬ輸送体、およびＣＭＰ−シアル酸輸送体のような糖ヌクレオチド輸送体の群を含んでいる。これらの輸送体をコードする遺伝子は、多数の種においてクローニングされ、配列決定されている。例えば、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体をコードする遺伝子（ＳＬＣ３５Ａ３、受入番号：ＮＭ＿０１２２４３）、分裂酵母のＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子（Ｇｍｓ１、受入番号：ＮＭ＿００１０２３０３３．１）、ネズミのＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードする遺伝子（Ｓｌｃ３５Ａ１、受入番号：ＮＭ＿０１１８９５．３）を挙げることができる。従って、好ましい実施態様では、本発明の前記ＹＡＣは、輸送体に対して１種類以上の発現カセットを含んでなることがあり、前記輸送体は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、およびＵＤＰＧＡＬ輸送体からなる群から選択される。
【００４９】
更に、本発明の酵母株は、酵母シャペロンタンパク質の１種類以上の発現カセットを含んでなることがある。好ましくは、これらのタンパク質は、酵母細胞で産生される組換え異種タンパク質と同じ調節配列によって支配されている。これらのシャペロンタンパク質の発現によって、発現した異種タンパク質を正確にフォールディングすることができる。
【００５０】
好ましい実施態様では、本発明の発現カセットは、下記のものを含んでいる。
・カセット１は、適当なプロモーターと適当なターミネーターの制御下にあるＦｋｐ遺伝子を含むか、またはカセット１は、前記プロモーターと前記ターミネーターの制御下にあるＦＫＧｐ遺伝子を含む。
・カセット２は、ＳＶ４０プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるヒトＳＬＣ３５Ｃ１遺伝子を含む。
・カセット３は、ｎｍｔ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるヒトＦＵＴ８遺伝子を含む。
・カセット４は、ＴＤＨ３プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下にあるα−マンノシダーゼＩとＨＤＥＬ小胞体残留／回収配列の融合体をコードする遺伝子を含む。
・カセット５／６は、ＡＤＨ１プロモーターとＴＥＦターミネーターの制御下にあるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩとサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)Ｍｎｎ９保持配列の融合体をコードする遺伝子、およびＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターの制御下にあるＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子を含む。
・カセット７は、ＴＥＦプロモーターとＵＲＡターミネーターの制御下にあるα−マンノシダーゼＩＩ遺伝子を含む。
・カセット８は、ＰＭＡ１プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターの制御下にあるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)Ｍｎｎ９保持配列の融合体をコードする遺伝子を含む。
・カセット９は、ＣａＭＶプロモーターとＰＨＯ５ターミネーターの制御下にあるβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼとサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)Ｍｎｔ１保持配列の融合体をコードする遺伝子を含む。
・カセット１０は、内在性ターミネーターと共にダイバージェント配向で、両方ともｐＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下にあるサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)ＰＤＩ１およびＫＡＲ２遺伝子を含む。
【００５１】
更に好ましい実施態様によれば、本発明の発現カセットは、配列番号７〜１２から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
本発明の酵素は安定的に発現しかつ詳細には発現カセットが世代間にわたって喪失しないことが望ましい。従って、本発明の発現カセットを酵母の染色体ＤＮＡに組込むのが好都合である。一つの実施態様では、染色体ＤＮＡは前記酵母のゲノムＤＮＡであり、一方、もう一つの実施態様では、それは人工染色体、すなわち酵母人工染色体（ＹＡＣ）のＤＮＡである。
【００５３】
第一の態様では、本発明は、１種類以上の発現カセットが前記酵母のゲノムＤＮＡに組込まれている酵母細胞を提供する。この酵母細胞は、従って、詳細には前記酵母のゲノムＤＮＡ中に組込まれた本発明の二機能性酵素についての発現カセットを含む。
【００５４】
従って、本発明は、フコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することができる遺伝子組換え酵母細胞を得る方法であって、
・二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素の発現のためのカセットを酵母細胞に導入し、
・ゲノムに挿入される前記カセットを含む形質転換体を選択する
段階を含んでなる前記方法にも関する。
【００５５】
前記酵母細胞のゲノムＤＮＡに組込まれる上記した１種類以上の追加の発現カセットを含む本発明の酵母細胞も、本発明の方法によって得ることができる。この実施態様によれば、本発明の二機能性酵素の発現のためのカセットの他に１種類以上の哺乳類グリコシル化酵素の発現のための発現カセットが酵母細胞に導入され、次いで前記カセットの総てが前記酵母のゲノムＤＮＡに組込まれる。特定の実施態様では、哺乳類グリコシル化経路に必要な総ての発現カセット、すなわちフコシル化経路の酵素（二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターおよびフコシルトランスフェラーゼ）のカセットなどがこのようにして本発明の酵母に導入され、この導入によりそれらが前記酵母細胞のゲノムに組込まれる。
【００５６】
本発明のカセットを染色体に挿入する方法は、特に限定されていないが、前記カセットは下記の方法によって前記カセットを含むＤＮＡで酵母を形質転換し、このカセットを異種組換えによって染色体のランダムな位置に挿入する方法によって、または前記カセットを含むＤＮＡを所望の位置に相同組換えによって挿入する方法によって挿入することができる。この方法は、好ましくは相同組換えによる方法である。
【００５７】
前記カセットを含むＤＮＡを相同組換えによって染色体の所望の位置に挿入する方法は、例えば、前記カセットを含むＤＮＡの上流または下流の所望の位置に相同領域を付加するようにデザインされたプライマーを用いることによってＰＣＲを行い、下記の方法によって得られるＰＣＲ断片により酵母を形質転換する方法であるが、それらに限定されない。更に、ＰＣＲ断片は、好ましくは形質転換体を容易に選択するための酵母選択可能マーカーを含む。このようなＰＣＲ断片を得る方法は、例えば、ＷＯ２００８／０９５７９７号に記載されている。
【００５８】
例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーションの方法を用いて、このようにして得られた本発明の増幅カセットを含んでなるＰＣＲ断片を酵母に導入することができる。当業者は、本発明の前記発現カセットをレシピエント酵母に導入するのに、酵母形質転換の通常の手法（例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーションなど、例えば、Johnston, J. R.（監修）：Molecular Genetics of Yeast, a Practical Approach. IRL Press, Oxford, 1994；Guthrie, C. and Fink, G. R.（監修）： Meth Enzymol, Vol. 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Acad. Press, NY, 1991；Broach, J. R., Jones, E. W. and Pringle, J. R.（監修）：The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 1, Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics)」Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1991；Jones, E. W., Pringle, J. R. and Broach, J. R.（監修）： The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 2. Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1992；Pringle, J. R., Broach, J. R. and Jones, E. W.（監修）； The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 3. Cell cycle and Cell .Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1997) を用いるであろう。
【００５９】
本発明のもう一つの態様では、本発明の酵母細胞は、ＹＡＣ（酵母人工染色体）を含み、前記ＹＡＣは、本発明の発現カセットを有している。従って、このＹＡＣは、詳細には本発明の二機能性酵素の発現カセットを含む。本発明のＹＡＣは、更に１種類以上の上記発現カセットを含むことがある。この実施態様によれば、本発明のＹＡＣは、本発明の二機能性酵素の発現のためのカセットの他に、１種類以上の哺乳類グリコシル化酵素の発現のための発現カセットを有する。特定の実施態様では、本発明のＹＡＣを用いて、哺乳類グリコシル化経路を酵母に再構築することができる。
【００６０】
本明細書で用いられる「ＹＡＣ」または「酵母人工染色体」（２つの用語は同義であり、本発明の目的には同様であると解釈すべきである）は、酵母染色体の総ての構成要素を含むベクターを指す。本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、核酸分子が結合していた別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。
【００６１】
従って、本明細書で用いられるＹＡＣは、好ましくは線状で、１つの酵母複製起点、セントロメアおよび２つのテロメア配列を含むベクターを指す。また、薬物耐性を与えまたは宿主の代謝障害を補完する遺伝子のような少なくとも１つの選択マーカーを有するそれぞれの構造物を提供することも好ましい。このマーカーの存在は、その後の形質転換体の選択において有用であり、例えば、酵母では、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ、ＨＰＨ、ＮＡＴまたはＳＨ  ＢＬＥ遺伝子を用いることができる。多数の選択マーカーが知られており、酵母、真菌、植物、昆虫、哺乳類および他の真核生物宿主細胞での使用に利用可能である。
【００６２】
本発明のＹＡＣは、上記の発現カセットを１つ以上含むことがある。以下に詳記するように、異なる発現カセット、例えば、異なるグリコシル化酵素を組み合わせて、特異的なグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生することは極めて容易である。従って、本発明のＹＡＣの使用は、発現カセットを細胞のゲノムに直接挿入することによる新たな宿主細胞の構築より遙かに容易でかつ遙かに速やかである。
【００６３】
本発明のＹＡＣは、空のＹＡＣベクターに１つ以上の発現カセットを挿入することによって構築することができる。好ましい実施態様では、前記の空のＹＡＣベクターは、環状のＤＮＡ分子である。更に好ましい実施態様では、本発明の空のＹＡＣベクターは、下記の要素を含んでなる。
・１つの酵母複製起点と１つのセントロメアＯＲＩ  ＡＲＳ１／ＣＥＮ４、
・２つのテロメア配列ＴＥＬ、
・それぞれのアームに２つの選択マーカー：ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２、ＢＬＡ、
・組換体の負の選択のための１つの選択マーカー：ＵＲＡ３、
・１つの多重クローニング部位（ＬＹＳ２の上流）、
・１つの大腸菌複製起点と１つのアンピシリン耐性遺伝子、
・４つの線状化部位：２つのＳａｃＩ部位と２つのＳｆｉＩ部位。
【００６４】
更に好ましい実施態様では、空のＹＡＣベクターはｐＧＬＹ−ｙａｃ＿ＭＣＳと呼ばれ、配列番号１３を有する。空のＹＡＣベクターを、図１に示す。
【００６５】
本発明のＹＡＣは、空のＹＡＣベクターを消化して、１種類以上の発現カセットを当業者に知られている任意の方法によって前記ＹＡＣに挿入することによって構築される。例えば、一つの実施態様によれば、空のＹＡＣベクターを、ユニークな制限酵素で消化する。あるいは、前記の空のＹＡＣベクターを、少なくとも２種類の制限酵素で消化する。ＹＡＣに挿入される発現カセットは、前記酵素の少なくとも１つについてそれぞれの末端に制限部位を有しており、消化される。このカセットを（複数の）前記の同じまたは適合酵素で消化した後、カセットをＹＡＣに連結し、次いで大腸菌に形質転換する。カセットを受け取ったＹＡＣベクターを、制限消化または任意の他の適当な方法（例えば、ＰＣＲ）によって同定する。関連する実施態様では、連結混合物を酵母に直接形質転換する。もう一つの実施態様では、ＹＡＣベクターと消化されたカセットを、（何ら先行する連結段階なしに）酵母に形質転換する。この実施態様によれば、カセットは、酵母細胞内での組換えによって消化されたＹＡＣベクターに挿入される。酵母組換え経路を用いる他の手法は、当業者に利用可能である（例えば、Larionov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 491-496、WO 95/03400号、WO 96/14436号）。
【００６６】
ＹＡＣは、好ましくは線状分子である。好ましい実施態様では、選択マーカーは、空のＹＡＣベクターの消化によって切出され、環状のＹＡＣベクターを対向選択(counter-selection)することができる。
【００６７】
次いで、本発明のＹＡＣを、酵母細胞に適宜導入することができる。当業者であれば、前記ＹＡＣをレシピエント酵母に導入するのに、酵母形質転換の通常の手法（例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーションなど、例えば、Johnston, J. R.（監修）：Molecular Genetics of Yeast, a Practical Approach. IRL Press, Oxford, 1994；Guthrie, C. and Fink, G. R.（監修）： Meth Enzymol, Vol. 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Acad. Press, NY, 1991；Broach, J. R., Jones, E. W. and Pringle, J. R.（監修）：The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 1, Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics.  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1991；Jones, E. W., Pringle, J. R. and Broach, J. R.（監修）： The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 2. Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1992；Pringle, J. R., Broach, J. R. and Jones, E. W.（監修）； The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol. 3. Cell cycle and Cell Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1997)を用いるであろう。
【００６８】
詳細には、本発明のＹＡＣは、工業的規模で糖タンパク質発現に適する酵母細胞に導入することができる。
【００６９】
従って、本発明のもう一つの目的は、発酵装置でしっかり増殖することができる適当な複合グリコフォーム(complex glycoform)を有する標的タンパク質を製造するための酵母細胞を提供することである。本発明の酵母細胞は、ヒト様グリカン構造を有する標的糖タンパク質を多量に産生することができる。特に、本発明の酵母細胞で産生されるオリゴ糖はフコース残基を含み、すなわち、糖タンパク質はフコシル化されている。その上、更なる変異が生じれば、本発明の酵母細胞は、臨床形態の生産に必要とされるように元の形態に容易に修復することができる。本発明は、最適化した均一なヒト化オリゴ糖構造を有する糖タンパク質を製造するための遺伝子修飾した酵母に関する。
【００７０】
本発明の酵母細胞は、フコース残基を含む複合Ｎ−グリカン構造を前記酵母で発現した異種タンパク質に付加する目的で用いることができる。
【００７１】
従って、本発明のもう一つの態様は、目的とする組換え糖タンパク質を製造する方法を提供することである。特定の実施態様によれば、本発明の方法は、
（ａ）組換え糖タンパク質をコードする核酸を上記した宿主細胞の１つに導入する工程、
（ｂ）宿主細胞中で核酸を発現させて、糖タンパク質を産生させる工程、および
（ｃ）組換え糖タンパク質を宿主細胞から単離する工程
を含んでなる。
【００７２】
前記の糖タンパク質は、目的とする任意のタンパク質であり、詳細には治療目的のタンパク質であることができる。このような治療タンパク質としては、制限なしに、サイトカイン、インターロイキン、成長ホルモン、酵素、モノクローナル抗体、ワクチンタンパク質、可溶性レセプター、およびあらゆる種類の他の組換えタンパク質のようなタンパク質が挙げられる。
【００７３】
前記のタンパク質をコードする遺伝子は、上記したように発現カセットの一部として本発明の酵母に導入することができる。前記のタンパク質を発現するのに適当なプロモーターは、当業者に知られており、上記されている。ｐＧＡＬ１−１０プロモーターのような高レベルの誘導プロモーターを用いるのが好都合である。それらは、前記の糖タンパク質の発現を一層良好に制御することができる。更に、それらにより、糖タンパク質が一層良好な収率で得られる。前記のカセットは、上記したように相同組換えによってゲノムに挿入して、前記のタンパク質の安定な発現を確実にすることができる。あるいは、この発現カセットをベクターにクローニングすることができ、これは次いで酵母中に形質転換される。
【００７４】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものと解釈される。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律複製が可能である（例えば、ｐＲＳ３１４およびｐＲＳ３２４および関連ベクターのような細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム酵母ベクター；Sikorski and Hieter, Genetics, 122: 19-27, 1989を参照されたい）。他のベクター（例えば、ｐＲＳ３０４および関連ベクターのような非エピソーム酵母ベクター；Sikorski and Hieter, Genetics, 122: 19-27, 1989を参照されたい）は、宿主細胞へ導入する際に宿主細胞のゲノムに組込むことができ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。あるベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ手法で用いられる発現ベクターは、プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も普通に用いられる形態であるので、互換的に用いられる。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドおよびこれらの分子を含んでなるベクターは、本発明の酵母細胞の形質転換に用いることができる。酵母細胞の形質転換は、上記した方法のいずれか、すなわちリチウム形質転換、エレクトロポレーションなどを用いて行うことができる。本発明の糖タンパク質は、形質転換した宿主細胞の培養物を所望の糖タンパク質を発現させるのに必要な培養条件下で増殖させることによって調製することができる。生成する発現した糖タンパク質は、次いで培養培地または細胞抽出物から精製することができる。本発明の糖タンパク質の可溶性形態は、培養液上清から回収することができる。次いで、それを、タンパク質精製の当業者に知られている任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にＩｇＧ抗体についてのプロテインＡアフィニティーによるなど）によって、遠心分離、示差溶解度(differential solubility)、またはタンパク質の精製ための任意の他の標準的手法によって精製することができる。適当な精製方法は、当業者には明らかになるであろう。
【００７６】
本発明の糖タンパク質は、未修飾および／または未精製タンパク質と比較してそのグリコシル化の増加に基づいて更に精製することができる。多数の方法が、この目的を達成するのに存在する。１つの方法では、未精製ポリペプチドの供給源、例えば、本発明の宿主細胞の培養培地を所望なオリゴ糖を結合することが知られているレクチンを有するカラムを通過させる。特定のレクチンを選択することによって、所望な型のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を濃縮することができる。
【００７７】
本発明の酵母細胞で発現したポリペプチドについてグリコシル化の範囲を調べるため、これらのポリペプチドを還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、分析することができる。グリコシル化は、単離したポリペプチドを特定のレクチンと反応させることによって決定することができ、あるいは当業者によって理解されるように、ＨＰＬＣに続いて質量分析法を用いて糖型を確認することができる（Wormald et al., Biochem, 36(6): 1370-1380, 1997）。ＩｇＧ抗体におけるＮ−グリカンの定量的シアル酸確認（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基）、炭水化物組成分析および定量的オリゴ糖マッピングは、本質的に以前に報告された方法で行うことができる（Saddic et al., Methods Mol. Biol., 194: 23-36, 2002; Anumula et al., Glycobiology, 8:685-694, 1998）。
【００７８】
本発明の実施では、特に断らない限り通常の手法またはタンパク質化学、分子ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学を用い、これらは当該技術分野の技術範囲内にある。このような手法は、文献に詳細に説明されている（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 監修, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985、およびSambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989、Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003)、Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ、Handbook of Biochemistry: Section A Proteins,Vol I 1976 CRC Press、Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press、Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)を参照されたい）。本明細書に記載の分子および細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学および医化学および薬化学に関して用いた命名法および実験室での手順および手法は、公知でありかつ当該技術分野で普通に用いられているものである。
【００７９】
特に断らない限り、本明細書で用いられる総ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって普通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００８０】
本発明を総括的に記載してきたが、本発明の特徴や利点は、例示のためにのみ本明細書に提供され特に断らない限り制限的なものと解釈されない特定の実施例および図を参照することによって、更に理解することができる。
【実施例】
【００８１】
二機能性フコキナーゼ／ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ酵素ＦｋｐおよびＦＫＧｐの配列は、位置指定突然変異誘発によってサッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)で発現のために最適化されたコドンである。制限部位を配列のそれぞれの５‘および３’部位に付加し、酵母発現ベクターにおけるそれらのクローニングを容易にし、すなわち、ＡｐａＩおよびＳａｌＩ部位をそれぞれのオープンリーディングフレームに付加した。
【００８２】
次いで、コドン最適化配列を、ｐＧＡＬ誘導プロモーターの制御下にてｐＥＳＣ−ＬＥＵ酵母発現ベクター(Agilent Technologies)にクローニングする。次に、組換えベクターを酢酸リチウム法によって酵母細胞に形質転換する。形質転換体を、ＰＣＲによってチェックする。
【００８３】
インサートの転写の確認
ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦｋｐまたはｐＥＳＣ−ＬＥＵ-ＦＫＧｐによって形質転換した野生型酵母の培養物を、ＹＮＢ−ＣＳＭからＬＥＵを除きグルコース２％を加えたもので３０℃にて２４時間増殖させた。クローニングした遺伝子の転写は、培養培地を洗浄し、それをＹＮＢ−ＣＳＭからＬＥＵを除きグルコース２％を加えたものに置き換えることによって誘発され、その中で次に細胞を３０℃で更に１６時間増殖させた。
【００８４】
酵母細胞を回収し、ＲＮＡを抽出して精製した(RNeasy mini kit Qiagen)。それぞれのＲＮＡ試料を２つに分け、半分をＲＮアーゼ(Sigma-Aldrich)で室温にて３０分間処理し、他のものは未処理のままにした。逆転写を、ＲＮアーゼで処理したネガティブコントロールを包含する総てのＲＮＡ試料について行った。水からなるＰＣＲのネガティブコントロールを、反応に含めた。
【００８５】
【化１】
2014509864.tif 000002
【００８６】
下記のプライマーを、逆転写反応に用いた。
【化２】
2014509864.tif 000003
【００８７】
ｃＤＮＡに対するＰＣＲは、ミックスダイナザイム(mix Dynazyme)１２．５μｌ、それぞれのプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１．２５μｌ、Ｈ２Ｏ  ９．５μｌおよびｃＤＮＡ  ０．５μｌを含む２５μｌ中で行った。ｃＤＮＡを最初に９５℃で５分間変性させた後、９５℃で３０秒間の３０サイクルの変性、５３℃で３０秒間のハイブリダイゼーションおよび７２℃で１分３０秒間の伸長を行った後、伸長を７２℃で５分間行った。
【００８８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に流し、シロイヌナズナ(A. thaliana)の１１５３ｂｐのバンド（レーン１）またはバクテロイデス・フラジリス(B. fragilis)の１４２５ｂｐのバンド（レーン６）の存在を確かめた。図３に示されている結果は、ガラクトース誘発酵母培養物における予想サイズのバンドの特異的増幅を示している。
【００８９】
従って、ＦｋｐおよびＦＫＧｐ遺伝子はいずれも、対応する形質転換体がガラクトースで増殖するときに発現する。
【００９０】
異種酵素活性の確認
ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦｋｐまたはｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＦＫＧｐによって形質転換した野生型酵母の発芽期の酵母培養物を、ＹＮＢ−ＣＳＭからＬＥＵを除きグルコース２％を加えたもので３０℃にて２４時間増殖させた。クローニングした遺伝子の転写は、培養培地を洗浄し、それをＹＮＢ−ＣＳＭからＬＥＵを除きグルコース２％を加えたものに置き換えることによって誘発され、その中で次に細胞を３０℃で更に１６時間増殖させた。
【００９１】
ＦｋｐおよびＦＫＧｐのそれぞれの酵素活性を、最初にスフェロブラスト製剤についてイン・ビトロで評価した。
【００９２】
簡単に説明すれば、細胞のペレットをＨ２Ｏで洗浄し、３０００ｇで５分間遠心分離した。細胞を１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ９．４、１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液に再懸濁し、３０℃にて１０分間インキュベーションした。上清を、遠心分離段階（１０００ｇ、５分間）の後に除去した。ペレットをスフェロブラスト緩衝液（０．６ｍＭソルビトール、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＤＴＴ）に懸濁し、リチカーゼ４００Ｕを加えた。ＯＤ８００ｎｍを測定した（試料は１／１００ｅｍｅに希釈）。懸濁液は、吸光度が８０％だけ減少するまで３０℃でインキュベーションした。スフェロブラストペレットは、遠心分離（１０００ｇ、５分間）によって回収した。
【００９３】
スフェロブラストペレットをリライシス緩衝液（０．４Ｍソルビトール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、０．１５Ｍ酢酸カリウムおよび２ｍＭ酢酸マグネシウム）に再懸濁し、室温にて１０分間インキュベーションした。１Ｍソルビトール２容を加え、懸濁液を４℃、６５００ｇで５分間遠心分離した。サイトゾルを含む上清を、新しい１．５ｍｌ試験管に移し、タンパク質定量をブラッドフォード試験によって行った。
【００９４】
最初に、酵素のフコースキナーゼ活性を測定した。用いた評価法（図４に記載）では、フコキナーゼ活性により、ＡＴＰの分子はＡＤＰに変換する。ピルベートキナーゼ（ＰＫ）活性は、次に、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）をピルベートに変換するときにＡＴＰの前記分子を再生する。生成するピルベートは、次いでＮＡＤＨ消費下にてＬ−ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によりＬ−ラクテートに転換される。ＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化は、３４０ｎｍにおける吸収の減少によって監視する。
【００９５】
次に、この酵素のピロホスホリラーゼ活性は、市販のキットを用いるＧＴＰ加水分解から得られるＰＰｉの量を測定することによって評価した（Notice EnzChek（商標） Pyrophosphate Assay Kit）。この試験では、無機リン酸塩（Ｐｉ）は、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）の存在下でホスファターゼによって消費される。ＭＥＳＧの酵素転換は、３６０ｎｍでの吸光度の増加によって測定される。
【００９６】
図５は、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)で発現した二機能性酵素（バクテロイデス・フラジリス(B. fragilis)およびシロイヌナズナ(A. thaliana)由来）の双方のイン・ビトロ活性を示す。これらの結果は、フコキナーゼおよびピロホスホリラーゼ活性（ＦＫ活性およびピロホスホリラーゼ活性  左パネル）の両方について、植物性酵素より細菌性酵素の方が、応答が大きいことを示している。次に、ＦＫｐ酵素をより広い時間範囲で試験した。これらの結果は、安定な活性を示しており、２０分でプラトーに達した。このように、細菌性ＦＫｐ酵素は、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)で発現するときには、機能的かつ活性である。
【００９７】
フコシル化ＥＰＯの産生
Ｎ−グリコシル化についてヒト化酵母で用いられるようにするには、Ｆｋｐ遺伝子（またはＦＫＧｐ遺伝子）の配列を酵母ゲノムに挿入しなければならない。従って、酵母プロモーター、Ｆｋｐ遺伝子および酵母ターミネーターを含んでなる発現カセットを構築する。ＦＫＧｐについての対応する発現カセットも、構築される。次に、これらのカセットを、ＷＯ２００８／０９５７９７号に記載の酵母株のゲノムに挿入する。
【００９８】
次に、酵母株を、３Ｎ−グリコシル化部位を有するエリトロポエチン（ＥＰＯ）の前記の株における発現によってフコースを糖タンパク質のＮ−グリカンへ付加する能力について試験する。
【００９９】
組換え酵母におけるＥＰＯの発現に用いられるプラスミドは、プロモーター Ｇａｌ１を含む。このプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)で知られている最強のプロモーターであり、現在は組換えタンパク質の産生に用いられている。このプロモーターは、ガラクトースによって誘導され、グルコースによって抑制される。実際に、グリセロール中でのサッカロマイセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)の培養物では、ガラクトースの添加によりＧＡＬ遺伝子を約１，０００倍誘導することができる。一方、培地にグルコースを添加すると、ＧＡＬ１プロモーターの活性が抑制される。本発明者らのプラスミドにおけるヒトＥＰＯの組込み配列は、ポリヒスチジンタグを付加することによって５’において修飾され、産生されたタンパク質の検出および精製が促進された。
【０１００】
ヒトＥＰＯの産生に用いる酵母は、最初に選択ドロップアウトＹＮＢ培地、２％グルコース中で、ＯＤ６００＞１２となるまで培養する。２４〜４８時間培養した後、２％ガラクトースを培養物に加え、目的とする本発明者らのタンパク質を誘導する。０、６、２４および４８時間の誘導後に、試料を採取する。
【０１０１】
酵母細胞を、遠心分離によって除去する。上清を、最初にイミダゾール５ｍＭ、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  １Ｍ、ｐＨ＝９を所望なｐＨになるまで加え、ｐＨ７．４で緩衝する。次いで、上清を０．８μｍおよび０．４５μｍで濾過した後、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍｌカラム(GE Healthcare)に入れる。ＥＰＯを、製造業者の指示に従って精製する（平衡緩衝液：Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、イミダゾール５ｍＭ、ｐＨ＝７．４；溶出緩衝液：Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、イミダゾール５ｍＭ、ｐＨ＝７．４）。
【０１０２】
産生されたＥＰＯは、溶離液中に回収される。カラムから溶出したタンパク質を、１２％アクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析する。
【０１０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移動後、タンパク質をクーマシーブルーによる染色またはウェスタンブロット法によって分析する。ウェスタンブロット法については、全タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗ＥＰＯ抗体(R&D Systems)による検出を続行する。転写後、膜をブロッキング溶液（ＰＢＳ、５％脂肪乳）で１時間飽和させる。次いで、膜を抗ＥＰＯ抗体溶液（希釈度１：１０００）と１時間接触させる。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回すすいだ後、膜を二次抗マウス−ＨＲＰ抗体と接触させ、比色検出を続行する。
【０１０４】
このようにして、約３５ｋＤａにおけるタンパク質を検出することができる。このタンパク質は、クーマシーブルー染色によって検出される主要タンパク質であり、ウェスタンブロット分析における抗ＥＰＯ抗体によって明らかにされている。α１，６結合を介して初期ＧｌｃＮＡｃに連結したフコース残基の存在は、アレウリア・アウランティア(Aleuria aurantia)ＡＡＬまたはレンズ・クリナリス(Lens culinaris)ＬｃＨのレクチンとの相互作用によって検証されている。
【０１０５】
精製タンパク質のＮ−グリコシル化を、次に、質量分析法によって分析する。ＥＰＯを含む溶出画分を、Amicon Ultra-15(Millipore)上で、１０ｋＤａのカットオフで、４℃での遠心分離により濃縮する。約５００μｌの容積が得られたときに、精製タンパク質の量を分析する。ＰＮＧアーゼ処理後のＮ−グリカン分析は、酵母株で産生したｒＨｕＥＰＯは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２の型の複合グリカン構造を有することを示している。
【図３】
2014509864.tif 000004
【図４】
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【図１】
2014509864.tif 000006
【図２】
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【図５】
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【配列表】
2014509864000001.app
【国際調査報告】
2014509864.tif 000009
2014509864.tif 000010
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