(57)【要約】メソ−ビリベルジンを生産するための方法および物質が、提供され、当該方法は、フィコシアノビリンを、溶媒中で両性化合物と反応させる工程であって、メソ−ビリベルジンを生成する、工程、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィコシアノビリンを、両性化合物と反応させる工程であって、メソ−ビリベルジンを生成する、工程、を含む、メソ−ビリベルジンの生産方法。
【請求項２】
前記メソ−ビリベルジンが、メソ−ビリベルジンＩＸαを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メソ−ビリベルジンが、メソ−ビリベルジンＩＸαからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記両性化合物が、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、および炭酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記両性化合物が、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フィコシアノビリンが、エタノールまたはtert-ブタノール中で、前記両性化合物と反応する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フィコシアノビリンが、エタノール中で、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムと反応する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記両性化合物が、前記フィコシアノビリンの重量に比べて、１〜５倍の重量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記両性化合物が、前記フィコシアノビリンの重量に比べて、２〜４倍の重量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物を培養する工程であって、前記両性化合物と反応させるフィコシアノビリンを生成する、工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物が、廃水を含む培地で培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物からフィコシアノビリンを抽出する工程；および
前記抽出したフィコシアノビリンを異性化する工程であって、メソ−ビリベルジンを形成する、工程、
を含む、メソ−ビリベルジンの生産方法。
【請求項１３】
前記抽出工程が、
硫酸アンモニウムを、前記シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物および水と混合する工程であって、フィコシアニンを生成する、工程、
前記フィコシアニンを、洗浄溶媒で洗浄する工程、
フィコシアニンからフィコシアノビリンを切断する工程、および
前記フィコシアノビリンを精製する工程、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記洗浄溶媒が、エタノールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記異性化工程が、
前記抽出したフィコシアノビリンを、両性化合物と反応させる工程であって、メソ−ビリベルジンを生成する、工程、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記両性化合物が、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、および炭酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記両性化合物が、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、
フィコシアノビリンの抽出前に、シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物を培養する工程、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法により生産されたメソ−ビリベルジン。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法により生産されたメソ−ビリベルジン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年１０月１２日提出の米国仮出願第６１／５４６，４４２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、化学組成物およびそれらの生産に関する。より詳しくは、それはメソ−ビリベルジンおよびメソ−ビリベルジンの生産方法に関する。
【０００３】
ビリベルジンＩＸαは、天然に見られるいくつかのビリベルジン異性体の最も一般的な形態である（以下に示す）。
【化１】
2014530822.tif 000002
ビリベルジンＩＸαは、動物、植物および微生物中で生産される。生物学的なプロセスにおいて、ビリベルジンＩＸαは、細胞膜と次々に結合するビリルビンＩＸαへの変換を経ることが知られており、そこでそれは活性酸素種の増殖を抑制する。２０１０年１１月４日に提出された米国特許出願第１２／９３９，８８０号は、ビリベルジンＩＸαの生産方法およびその関連した複数の用途について説明しており、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
従来、ビリベルジンＩＸαおよび他のビリベルジン異性体は、高価で、生産が、特に臨床研究および／または臨床用途のために必要となるであろう量の生産が困難である。したがって、米国特許出願第１２／９３９，８８０号に例示されるように、ビリベルジンおよび関連する異性体の新しく、改善された生産方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
実施態様および実施形態中の本開示は、メソ−ビリベルジンを生産するための方法および物質を提供することにより、これらの様々なニーズおよび課題を扱う。前記方法は、フィコシアノビリンと、両性化合物とを溶媒中で反応させる工程であって、メソ−ビリベルジンを生成する、工程を含む。好適な両性化合物は、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、および炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含むことがある。好適な溶媒は、エタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールのうちの少なくとも１つを含むことがある。
【０００６】
複数の実施形態が、フィコシアノビリンと、両性化合物とを反応させてメソ−ビリベルジンを生成することによるメソ−ビリベルジンの生産方法を含む。一部の実施形態では、メソ−ビリベルジンは、メソ−ビリベルジンＩＸαを含む。他の実施形態では、メソ−ビリベルジンは、メソ−ビリベルジンＩＸαからなる。一部の実施形態では、両性化合物は、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、および炭酸ナトリウムからなる群より選択されてもよい。所定の実施形態では、両性化合物は、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、フィコシアノビリンは、エタノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール中で、両性化合物と反応させてもよい。一部の実施形態では、フィコシアノビリンは、エタノール中で、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムと反応する。
【０００８】
一部の実施形態では、両性化合物は、フィコシアノビリンの重量に比べて、１〜５倍の重量で存在してもよい。他の実施形態では、両性化合物は、フィコシアノビリンの重量に比べて、２〜４倍の重量で存在してもよい。
【０００９】
本明細書に記載の方法の所定の実施形態では、当該方法は、シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物を培養する工程であって、前記両性化合物と反応させるフィコシアノビリンを生成する、工程をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、前記シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物は、廃水を含む培地で培養される。
【００１０】
また、本明細書に記載の方法および物質は、メソ−ビリベルジンの生産方法を含み、当該方法は、シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物からフィコシアノビリンを抽出する工程；および前記抽出したフィコシアノビリンを異性化する工程であって、メソ−ビリベルジンを形成する工程、を含む。このような方法では、前記抽出工程は、硫酸アンモニウムを、前記シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物および水と混合する工程であって、フィコシアニンを生成する、工程、前記フィコシアニンを洗浄溶媒で洗浄する工程、フィコシアニンからフィコシアノビリンを切断する工程、および前記フィコシアノビリンを精製する工程、を含んでもよい。このような方法の一部の実施形態では、前記洗浄溶媒は、エタノールを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、異性化工程は、前記抽出したフィコシアノビリンを、両性化合物と反応させる工程であって、メソ−ビリベルジンを生成する、工程を含んでもよい。一部の実施形態では、両性化合物は、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、および炭酸ナトリウムからなる群より選択される。所定の実施形態では、両性化合物は、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カリウムを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、前記方法は、フィコシアノビリンの抽出前に、シアノバクテリア、紅色植物、クリプト藻、またはこれらの混合物を培養する工程を含んでもよい。
【００１３】
また、本明細書では、上記方法のいずれかにより生産されたメソ−ビリベルジンが記載される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、メソ−ビリベルジン（以下に示す）の生産のための、方法、組成物、試薬、およびキットを包含する。
【化２】
2014530822.tif 000003
【００１５】
以下の説明では、具体的な好ましい実施形態の十分な理解のための数多くの具体的な詳細が提供される。しかしながら、当業者は、１以上の具体的な詳細がなくとも、または他の方法、成分、物質などによっても、実施形態を実施することができることを理解する。一部の場合では、好ましい実施形態の面を不明りょうにすることを避けるため、周知の構造、物質、または操作は示されないまたは詳細に説明されない。さらに、記載される特徴、構造、または特性は、種々の代替の実施形態において、任意の適当な方法で組み合わされてもよい。したがって、以下の本発明の実施形態のより詳細な説明は、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明の各実施形態を単に表すものである。
【００１６】
この明細書および続く請求の範囲では、「ａ」、「an」および「the」などの単数形は、別段の定めがない限り、複数形を含む。本明細書で開示される全ての範囲は、特に示さない限り、全ての端点および中間の値を含む。加えて、「任意の」または「任意に」は、例えば、続いて記載される状況が起こってもよいしまたは起こらなくてもよい場合を指し、当該状況が起こる場合と当該状況が起こらない場合とを含む。用語「１以上」および「少なくとも１つ」は、例えば、続いて記載される状況の１つが起こる場合、および続いて記載される状況の２以上が起こる場合を指す。
【００１７】
実施形態では、本発明の方法は、（１）微生物生産、（２）フィコシアノビリン抽出、および（３）フィコシアノビリンからメソ−ビリベルジンへの変換、の工程のうち少なくとも１つを含んでもよい。
【００１８】
微生物生産
任意の適切なシアノバクテリア種（「ラン藻」としても知られる）、紅色植物またはクリプト藻種（紅藻またはクリプト藻類としても知られる）を用いて、フィコシアニン、胆汁色素タンパク質複合体を生産してもよく、当該胆汁色素タンパク質複合体は、光合成シアノバクテリアに効率よく集光する。フィコシアニンは、胆汁色素発色団としてフィコシアノビリン（以下に示す）を含み、フィコシアノビリンはタンパク質成分に（チオール結合を介して）共有結合している。
【化３】
2014530822.tif 000004
【００１９】
一部のシアノバクテリアまたは紅色植物は、総細胞可溶性タンパク質の最大５０％の濃度でフィコシアニンを生産する。このような生産は、シアノバクテリアが、例えば、弱光条件下など、可能な限り多くの光を集める必要がある場合に起こることがある。このため、より高濃度のフィコシアニンを生産する性質を有するシアノバクテリア、紅色植物、およびクリプト藻が、現在の方法において理想的である。しかしながら、任意のシアノバクテリア、紅色植物、もしくはクリプト藻または１以上の種を使用してもよい。例えば、Arthrospira platensis（スピルリナともいわれる）を使用してもよい。
【００２０】
また、フィコシアニン生産種を増殖させるため、任意の適当な増殖培地を用いてもよい。例えば、従来の増殖培地を使用してもよい。従来の増殖培地に加えてまたは代わりに、汚水および／または廃水のみを、または従来の増殖培地と組み合わせて汚水および／または廃水を使用してもよい。例示的な汚水および／または廃水としては、生産水、清浄水、商業用水、工業用水、農業用水、および／または表面流出廃水が挙げられる。また、生産水としては、石油および天然ガス回収作業から生じた汚染廃水が挙げられる。１９９９年には世界的に推定７７０億ガロンの生産水が生じた（原油１バレル当たり３バレル）（Katib および Verbeek、２００３年）。生産水は、環境上、地表水に排出するのに適していない。汚水源を使用することにより、その水は少なくとも部分的に浄化され、その廃水のバイオレメディエーションが促進される。
【００２１】
一部の実施形態では、廃水は、揮発性ガスを除去するため振とうまたは他の処理を行ってもよい。水中の栄養分に応じて、水を、１Ｌ当たり約１５〜約１５００ｍｇの量の硝酸ナトリウムおよび／または１Ｌ当たり約２〜約２００ｍｇの量のリン酸二カリウムなどの適当な栄養分および増殖因子で補ってもよい。
【００２２】
増殖条件としては、振とう、撹拌（stirring）、および撹拌（agitating）が挙げられる。培地は、栄養分濃度および培養温度に応じて、自然光および／または人工光に、２日〜２週間以上の期間さらされる。培養温度は、約２０℃〜約４０℃、約２５℃〜３３℃、または約２６℃でもよい。
【００２３】
一部の用途では、米国特許出願公開第２０１１／０２１７７６４号に記載されているように、生物膜を作製するために大量の水中で藻類バイオリアクターの回転を用いてもよい。
【００２４】
フィコシアノビリンの抽出
シアノバクテリアからフィコシアノビリンを抽出するための任意の適当な抽出方法を使用してもよい。上述した培養条件を用いてもよいが、任意のシアノバクテリア源を抽出プロセスで使用してもよい。細胞が培地にある場合、それらははじめに回収され、またはさらに濃縮されなければならない。細胞は、スラリー中、ペースト状、もしくは部分的に乾燥した条件で、溶解かつ乾燥されてもよく、または溶解かつ保持されてもよい。一部の実施形態では、予備乾燥されたスピルリナなどの、予備乾燥されたシアノバクテリア、紅色植物、またはクリプト藻を、抽出のために特に培養された生物体の代わりにフィコシアノビリン源として使用してもよい。
【００２５】
一部の実施形態では、抽出プロセスは、以下の工程に分けてもよい：（１）フィコシアニン抽出、（２）フィコシアニンからのフィコシアノビリンの切断、および（３）フィコシアノビリン精製。
【００２６】
フィコシアニンの抽出と回収のために、任意の適当なバクテリア細胞の切断および分取方法を使用してもよい。例えば、水とシアノバクテリア細胞とを含むスラリーを振とう、沈降細胞への遠心分離、（機械的または化学的な）細胞切断、沈降非破壊細胞とデブリへの遠心分離、非沈降細胞抽出物の回収、および続く沈殿フィコシアニンへの硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）の添加により調製してもよい。保温および追加の遠心分離の後、沈降した濃青色のフィコシアニンを回収し、洗浄溶媒で、例えば、メタノールまたはエタノールで洗浄してもよい。例えば、Silveira et al., Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design, Bioresour Technol. 2007, 98(8):1629-34を参照。
【００２７】
フィコシアニンからのフィコシアノビリンの切断は、任意の適当な方法により行ってもよい。例えば、フィコシアニンを、メタノールまたはエタノールなどの溶媒中でボイルし、還流条件下で、色素とタンパク質との間の結合を切断してもよい。Beuhler et al., Cleavage of phycocyanobilin from C-phycocyanin. Separation and mass spectral identification of the products, J. Biol. Chem. 1976, 251(8):2405-2411を参照。
【００２８】
フィコシアノビリンは、遠心分離または他の適当な精製方法、続くクロロホルムを用いるなどの適当な方法によるフィコシアノビリンの抽出により、さらに濃縮および精製してもよい。この抽出後、そのクロロホルム溶液を、ヘキサンなどの有機溶媒に添加し、次いで遠心分離により純粋なフィコシアノビリン粉末を生成してもよい。
【００２９】
フィコシアノビリンからメソ−ビリベルジンへの変換
任意の適当な源からのフィコシアノビリンをメソ−ビリベルジンへ変換してもよい。適当なフィコシアノビリンは、上述した抽出プロセスにより抽出されたフィコシアニンを含む。フィコシアノビリンの他の源も使用してもよい。所望のメソ−ビリベルジンを生成するために、フィコシアノビリンの異性化を行ってもよい。従来より、異性化および／または酸化は、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、およびクロロホルムを用いて行われてきた。Beuhler et al., Cleavage of phycocyanobilin from C-phycocyanin. Separation and mass spectral identification of the products, J. Biol. Chem. 1976, 251(8):2405-2411を参照。苛性のおよび刺激の強い反応物、特にＫＯＨを使用する代わりとして、異性化の代替の方法を以下に述べる。
【００３０】
フィコシアノビリンをメソ−ビリベルジンへ変換するために、フィコシアノビリンを両性化合物と共に溶媒に溶解させる。適当な両性化合物としては、例えば、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられる。適当な溶媒としては、例えば、試薬用エタノール（９５％）などのエタノール（ＥｔＯＨ）、が挙げられる。同様に、tert-ブチルアルコールを溶媒として使用してもよい。
【００３１】
試薬の割合は様々であってもよい。一部の実施形態では、フィコシアノビリンに比べて、３，４，または５倍など、１〜５倍の重量のＮａＨＣＯ３およびＫ２ＣＯ３を使用してもよい。反応物を溶解するために十分な量の溶媒を使用してもよい。例えば、約３ｍＬのエタノールを、約５ｍｇのフィコシアノビリンと共に使用してもよい。
【００３２】
反応は、約２４〜４８時間、または約８０℃で２４時間など、約１２〜４８時間行ってもよい。反応混合物をセライトを通してろ過し、その残渣をさらにエタノールを用いて洗浄およびろ過してもよい。その溶媒を除去して、メソ−ＢＶを与えるために所望によりＨＰＬＣによりさらに精製してもよい。
【００３３】
この異性化反応は、上述した方法などの従来の方法に対して多くの利点を有する。利点としては、例えば、（１）苛性で生成物の精製後の処分が困難となることがあるＫＯＨの使用の回避；および（２）毒性で精製後の処分が困難となることがあるメタノールおよびクロロホルムの使用の回避が挙げられる。
【００３４】
一部の実施形態では、（１）微生物生産、（２）フィコシアノビリン抽出、および（３）フィコシアノビリンからメソ−ビリベルジンへの変換の全体のプロセスは、反応溶媒および洗浄溶媒にエタノールなど、天然化合物を用いて行ってもよい。
【００３５】
以下の実施例は、例示目的であり、なんら本開示を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：シアノバクテリア生産
Arthrospira platensisを、あらかじめ数日間振とうして揮発性ガスを除去し、硝酸ナトリウムとリン酸カリウムで補充した生産水で増殖させた。増殖は、振とう、および２６℃で数日〜２週間の蛍光灯で生じた。次いで、その細胞を回収し、乾燥させた。
【００３７】
実施例２：フィコシアノビリン抽出
フィコシアニン抽出。１６０ｇのスピルリナ粉末を、２Ｌ（２０００ｍＬ）の精製水（０．０８ｇ／ｍＬ）に添加し、ロータリーシェーカーで、２００ｒｐｍ、３７℃で終夜（１６時間）撹拌することにより、抽出を行った。サンプルを９５００ＲＰＭ、４℃で９０分間遠心分離した。５３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（分子量１３２．１４）をその上澄み液に添加し、５０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液を与えた。その溶液を氷浴（０℃）で３０分間保温した。９５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、その濃青色のフィコシアニンを回収し、７００ｍＬのメタノールで洗浄した。遠心分離と洗浄を、各３００ｍＬのメタノールを用いて、４回繰り返した。
【００３８】
フィコシアニンからのフィコシアノビリンの切断
そのフィコシアニンを、還流下、６００ｍＬのメタノール中で撹拌しながら、１６時間ボイルすることにより、フィコシアノビリンを切断した。
【００３９】
フィコシアノビリン精製
６０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、ロータリーエバポレーターにより上澄み液の容量を約４０ｍＬまで減少させた。その濃縮したフィコシアノビリン溶液および２５ｍＬのクロロホルムを、３００μｌの０．５ＮのＨＣｌを含む２００ｍＬの精製水に添加した。フィコシアノビリンをクロロホルムに抽出した。１０ｍＬのクロロホルムを用いて、クロロホルム抽出を３回繰り返した。そのクロロホルムを混合し、そのクロロホルムの容量を窒素ガスにより約１０ｍＬまで減少させた。そのクロロホルム溶液を６０ｍＬのヘキサンに添加した。フィコシアノビリンを、５０００ｒｐｍで３分間の遠心分離により回収した。空気乾燥後、１１２ｍｇのフィコシアノビリンを得た。
【００４０】
実施例３：フィコシアノビリンからメソ−ビリベルジンへの変換
３ｍＬの試薬用ＥｔＯＨ中で、５ｍｇの精製したフィコシアノビリンを、２０ｍｇのＮａＨＣＯ３および２０ｍｇのＫ２ＣＯ３と混合した。その反応を１日行った。その反応後、約５ｍｇの粗メソ−ビリベルジンＩＸα（以下に示す）を生成した。
【化４】
2014530822.tif 000005
【００４１】
種々のこれまでに開示したおよび他の特徴、機能またはその代替が、多くの他の異なるシステムまたは用途に好ましく組み合され得ることが理解される。また、様々な現在予想外のまたは予期しないその代替、変更、バリエーションまたは改良は、当業者によりその後なされてもよく、以下の請求の範囲により包含されることが意図される。
【国際調査報告】
2014530822.tif 000006
2014530822.tif 000007