(57)【要約】本発明は、融合前コンフォメーションを安定化させるまたは融合後コンフォメーションを不安定化させる１または複数のアミノ酸変異を含有する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびポリペプチドに関する。本発明はまた、融合前ＲＳＶ  Ｆに対する免疫応答を誘発するための方法にも関する。一局面において、少なくとも２つの導入されたシステイン残基を含む融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドが提供され、ここで、上記システインが互いと近接し、上記融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを安定化させるジスルフィド結合を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの導入されたシステイン残基を含む融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドであって、前記システインが互いと近接し、前記融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを安定化させるジスルフィド結合を形成する、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項２】
前記システイン変異が互いから約１０Å以下離れている、請求項１に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項３】
ＨＲＢ領域ならびにＤＩおよび／またはＤＩＩ領域が、導入されたシステイン残基を含有し、前記ＨＲＢ領域内の前記導入されたシステイン残基と、前記ＤＩまたはＤＩＩ領域内の前記導入されたシステイン残基との間でジスルフィド結合が形成される、請求項１または２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項４】
ＨＲＡ領域およびＤＩＩＩ領域が、導入されたシステイン残基を含有し、前記ＨＲＡ領域内の前記導入されたシステイン残基と、前記ＤＩＩＩ領域内の前記導入されたシステイン残基との間でジスルフィド結合が形成される、請求項１または２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項５】
ＨＲＡ領域が、少なくとも２つの導入されたシステイン残基を含有し、前記ＨＲＡ領域内の前記導入されたシステイン残基間でジスルフィド結合が形成される、請求項１または２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項６】
ＨＲＡヘリックスの欠失、ＨＲＢヘリックスの欠失、点変異の導入、グリコシル化部位の付加、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される融合後修飾を含む融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドであって、前記融合後修飾が融合後コンフォメーションを不安定化させる、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項７】
不安定化させる前記融合後修飾が、前記ＨＲＢヘリックスの欠失である、請求項６に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項８】
融合ペプチドの欠失をさらに含む、請求項７に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項９】
不安定化させる前記融合後修飾が、グリコシル化部位の付加である、請求項６に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１０】
前記グリコシル化部位が、１７３位、１７５位、および１８４位からなる群より選択される残基上にある、請求項９に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１１】
３つのＲＳＶ  Ｆ単量体を含む融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドであって、前記単量体のうちの少なくとも２つが、導入されたシステイン残基を含有し、前記導入されたシステイン残基が互いと近接し、前記融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを安定化させるジスルフィド結合を形成する、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１２】
ＲＳＶ  Ｆの可溶性細胞外ドメインまたはＲＳＶ  Ｆの可溶性細胞外ドメインの三量体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１３】
１または複数のＲＳＶ  Ｆの中和エピトープを含有する、ＲＳＶ以外のウイルスに由来する安定化されたＦタンパク質を含むキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項１４】
前記安定化されたＦタンパク質が、パラインフルエンザウイルスＦポリペプチドまたはメタ肺炎ウイルスＦポリペプチドに由来する、請求項１３に記載のキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項１５】
前記安定化されたＦタンパク質が、ＰＩＶ５融合前ＦポリペプチドまたはＮＤＶ融合前Ｆポリペプチドである、請求項１３に記載のキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項１６】
前記安定化されたＦタンパク質が、可溶性細胞外ドメインである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項１７】
前記ＲＳＶ  Ｆの中和エピトープが、ＲＳＶ  ＦのＨＲＡ領域に由来する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項１８】
前記中和エピトープが、モタビズマブ、パリビズマブ、ｍＡｂ  １１、ｍＡｂ  １５１、ｍＡｂ  １１２９、ｍＡｂ  １１５３、ｍＡｂ  １２００、ｍＡｂ  １２１４、ｍＡｂ  １２３７、ｍＡｂ  ４７Ｆ、ｍＡｂ  ７Ｃ２、ｍＡｂ  Ｂ４、Ｆａｂ  １９、ｍＡｂ  ＡＫ１３Ａ２、ｍＡｂ  ７．９３６、ｍＡｂ  ９．９３６、ｍＡｂ  １９、ｍＡｂ  ２０、ｍＡｂ  １０１Ｆ、およびこれらの組み合わせにより認識されるエピトープからなる群より選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項１９】
異種オリゴマー化ドメイン、エピトープ、またはシグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項２０】
前記異種オリゴマー化ドメインが、三量体化ドメインである、請求項１９に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項２１】
前記三量体化ドメインが、インフルエンザヘマグルチニン、ＳＡＲＳスパイク、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＮａｄＡ、修飾ＧＣＮ４、ＧＣＮ４、またはＡＴＣアーゼに由来する、請求項２０に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはキメラ融合前Ｆタンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはキメラ融合前Ｆタンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２３】
アジュバントをさらに含む、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、水中スクアレンエマルジョン、ベンゾナフチリジン化合物、リン脂質化合物、低分子免疫強化剤、および前出のうちのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはキメラ融合前Ｆタンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２６】
自己複製ＲＮＡ分子である、請求項２５に記載の単離核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の自己複製ＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物。
【請求項２８】
ＲＮＡ送達系をさらに含む、請求項２６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
被験体においてＲＳＶ  Ｆに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記被験体へと投与する工程を含む、方法。
【請求項３０】
被験体においてＲＳＶ  Ｆに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項２７または２８に記載の免疫原性組成物を前記被験体へと投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１１年５月１３日に出願された米国仮出願第６１／４８６，００５号に対する優先権を主張する。上記出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１２年５月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５４５７．ｔｘｔと名付けられ、９８，３８５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）とは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属内の、エンベロープを有する非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶは、生後１年目の小児における細気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。ＲＳＶはまた、あらゆる年齢において、とりわけ高齢者または心臓系、肺系、もしくは免疫系が障害された患者において発症しうる重度の下気道疾患を含めた反復感染も引き起こす。
【０００４】
宿主細胞に感染するには、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶなど、他のエンベロープウイルスと同様、ＲＳＶなどのパラミクソウイルスは、ウイルス膜の宿主細胞の膜との融合を必要とする。ＲＳＶでは、保存的な融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）が、不可逆的なタンパク質リフォールディングを、これらの膜の近位とカップリングさせることにより、ウイルスと細胞膜とを融合させる。パラミクソウイルス研究に基づく最新のモデルでは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、まず「融合前」コンフォメーションへとフォールドする。細胞への侵入時に、融合前コンフォメーションは、リフォールディングおよびコンフォメーション変化を経て、その「融合後」コンフォメーションへと至る。
【０００５】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ｍＲＮＡから、Ｆ０と称する約５７４アミノ酸のタンパク質へと翻訳される。Ｆ０の翻訳後プロセシングは、小胞体内のシグナルペプチダーゼによるＮ末端シグナルペプチドの除去を包含する。Ｆ０はまた、トランスゴルジ内の細胞性プロテアーゼ（特にフリン）により、２つの部位（１０９／１１０および１３６／１３７）においても切断される。この切断は、短い介在型配列の除去を結果としてもたらし、互いとの会合を保持するＦ１（約５０ｋＤａ；Ｃ末端；おおよそ残基１３７〜５７４）およびＦ２（約２０ｋＤａ；Ｎ末端；おおよそ残基１〜１０９）と称する２つのサブユニットを発生させる。Ｆ１は、そのＮ末端において疎水性の融合ペプチドを含有し、また、２つの両親媒性の７アミノ酸反復領域（ＨＲＡおよびＨＲＢ）も含有する。ＨＲＡは、融合ペプチドの近傍にあり、ＨＲＢは、膜貫通ドメインの近傍にある。３つのＦ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオンの表面においてＦ１−Ｆ２のホモ三量体としてアセンブルされる。
【０００６】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在のところ入手可能ではないが、所望されている。ワクチン候補は、主要なＲＳＶ中和抗原であるＦ糖タンパク質に基づくが、安定性、純度、再現性、および効力に関する問題に起因して、完全な失敗に帰している。類縁のパラインフルエンザＦ糖タンパク質の結晶構造により、融合前状態と融合後状態との間の大規模なコンフォメーション変化が明らかとなっている。再構成の規模により、融合後のＦ抗原では、おそらく融合前コンフォメーションにおいて露出されるエピトープに結合しなければならない中和抗体が効率的に惹起されないことが示唆される。したがって、ＲＳＶに対するワクチンを作製しようとする努力は、ＲＳＶ  Ｆの融合前形態を含有するサブユニットワクチンを開発することに焦点を絞っている（たとえば、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照されたい）。このＲＳＶ  Ｆの融合前形態への焦点の絞込みは、入手可能なＲＳＶ  Ｆのモデルにより裏付けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１４９７４５号
【特許文献２】国際公開第２０１０／１４９７４３号
【特許文献３】国際公開第２００９／０７９７９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
融合前Ｆとは、より低エネルギーの融合後状態へと容易に再構成され、次いで、疎水性の融合ペプチドの露出に起因して凝集する「準安定」構造である（Ｂｅｇｏｎａ  Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏ，  Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２９８巻、３１７〜３２６頁（２００２年）（１４２））。棒付きキャンデー形の融合前Ｆ三量体と松葉杖形の融合後Ｆ三量体との間の大規模な構造的差違は、ネガティブ染色された検体についての電子顕微鏡法の分解能においてもなお明らかであることから、融合前のＦと融合後のＦとは抗原として異なりうることが示唆されている（Ｃａｌｄｅｒ，  Ｌ．  Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１巻、１２２〜１３１頁（２０００年）（１４３））。ウイルスの侵入を防止するために、Ｆ特異的中和抗体は、ウイルスエンベロープが細胞性膜と融合する前に、おそらくビリオン上の融合前Ｆのコンフォメーションに結合しなければならない。しかし、可溶性の安定化された融合前Ｆサブユニット抗原を生成させようとする努力は、いまだヒトにおける試験に適した候補物質をもたらしていない。さらに、モタビズマブ−ペプチド複合体の分析および相同性モデル化からは、パリビズマブおよびモタビズマブにより認識される優性中和エピトープであれば、三量体Ｆ内に包埋されている可能性があることから、抗体の結合を可能とする表面への露出のためには少なくとも局所的な解離が必要とされることが示唆されている（ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１７巻、２４８〜２５０頁（２０１０年））。改善されたＲＳＶ  Ｆタンパク質組成物およびＲＳＶ  Ｆタンパク質組成物を作製するための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドおよび融合前キメラＦポリペプチドに関する。
【００１０】
いくつかの態様では、融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドが、少なくとも２つの導入されたシステイン残基であって、互いと近接し、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを安定化させるジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む。具体的な実施形態では、ＨＲＢ領域が、導入されたシステイン残基を含有し、ＤＩおよび／またはＤＩＩ領域が、導入されたシステイン残基を含有し、ＨＲＢ領域内の導入されたシステイン残基と、ＤＩまたはＤＩＩ領域内の導入されたシステイン残基との間でジスルフィド結合が形成される。他の実施形態では、ＨＲＡ領域が、導入されたシステイン残基を含有し、ＤＩＩＩ領域が、導入されたシステイン残基を含有し、ＨＲＡ領域内の導入されたシステイン残基とＩＩＩ領域内の導入されたシステイン残基との間でジスルフィド結合が形成される。他の実施形態では、ＨＲＡ領域が、少なくとも２つの導入されたシステイン残基を含有し、ＨＲＡ領域内の導入されたシステイン残基間でジスルフィド結合が形成される。
【００１１】
他の態様では、融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドが、ＨＲＡヘリックスの欠失、ＨＲＢヘリックスの欠失、点変異の導入、グリコシル化部位の付加、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される融合後修飾を含み、前記融合後修飾が融合後コンフォメーションを不安定化させる。いくつかの実施形態では、不安定化融合後修飾が、全体または部分におけるＨＲＢヘリックスの欠失である。所望の場合、不安定化融合後修飾は、全体または部分における融合ペプチドの欠失をさらに含みうる。他の実施形態では、不安定化融合後修飾が、１７３位、１７５位、および１８４位からなる群より選択される残基におけるグリコシル化など、グリコシル化部位の付加を包含する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、３つのＲＳＶ  Ｆ単量体を含む融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質であって、単量体のうちの少なくとも２つが、導入されたシステイン残基を含有し、導入されたシステイン残基が互いと近接し、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を安定化させるジスルフィド結合を形成する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、１または複数のＲＳＶ  Ｆの中和エピトープを含有する、パラインフルエンザウイルスＦポリペプチドまたはメタ肺炎ウイルスＦポリペプチドなど、ＲＳＶ以外のウイルスに由来する安定化されたＦタンパク質を含むキメラ融合前Ｆタンパク質である。適した中和エピトープは、モタビズマブ、パリビズマブ、ｍＡｂ  １１、ｍＡｂ  １５１、ｍＡｂ  １１２９、ｍＡｂ  １１５３、ｍＡｂ  １２００、ｍＡｂ  １２１４、ｍＡｂ  １２３７、ｍＡｂ  ４７Ｆ、ｍＡｂ  ７Ｃ２、ｍＡｂ  Ｂ４、Ｆａｂ  １９、ｍＡｂ  ＡＫ１３Ａ２、ｍＡｂ  ７．９３６、ｍＡｂ  ９．９３６、ｍＡｂ  １９、ｍＡｂ  ２０、ｍＡｂ  １０１Ｆ、およびこれらの組み合わせにより認識されるエピトープからなる群より選択することができる。
【００１４】
本発明は、被験体において抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘発するための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質または融合前キメラＦタンパク質を含む有効量の免疫原性組成物を被験体へと投与する工程を含む方法に関する。誘発される免疫応答は、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御的免疫を特徴とすることが好ましい。
【００１５】
具体的な態様では、本発明は、被験体において抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘発するまたはもたらすための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質または融合前キメラＦタンパク質を含む有効量の免疫原性組成物を被験体へと投与する工程を含む方法に関する。
【００１６】
具体的な態様では、本発明は、被験体においてＲＳウイルス（ＲＳＶ）に対する防御的免疫を誘発するまたはもたらすための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質または融合前キメラＦタンパク質を含む有効量の免疫原性組成物を被験体へと投与する工程を含む方法に関する。
【００１７】
具体的な態様では、本発明は、融合前ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質または融合前キメラＦタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。
【００１８】
本発明において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、完全長または細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠く可溶性細胞外ドメインなどの切断型でありうる。融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、たとえば完全長または可溶性細胞外ドメインは、１０９／１１０位および１３６／１３７位において機能的なフリン切断部位を含みうる。いくつかの好ましい実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質（たとえば完全長または可溶性細胞外ドメイン）が、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質の対応する部分（たとえば細胞外ドメイン）のアミノ酸配列を含有する。本発明の態様のうちのいずれかでは、所望に応じてアジュバントとともに、またはアジュバントを伴わずに融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を投与することができ、所望の場合、免疫原性組成物は、アジュバントを含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、４つのＦタンパク質の構造ベースの配列アラインメント、二次構造の割り当て、および鍵となる特色を示す図である。ＲＳＶ  Ｆ（配列番号３３）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆ（配列番号３４）、ＰＩＶ３  Ｆ（配列番号３６）、およびＰＩＶ５  Ｆ（配列番号３５）のアラインメントをＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）により生成し、ＣＣＰ４シリーズのプログラムによるＬｓｑｋａｂを使用する構造的重合せに基づき手作業で調整し、ＥＳＰｒｉｐｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．２（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＳＰｒｉｐｔ／）を使用して表示した。ＲＳＶ  Ｆの特色は、配列の上方に示され、ＰＩＶ３  Ｆの特色は、配列の下方に示される。＊ＣＨＯは、ＲＳＶ  Ｆのグリコシル化部位を示す。二次構造エレメントは、βシートを指示する配列と平行な矢印、α−ヘリックスを指示する円筒、ターンを指示する「ＴＴ」、および３１０ヘリックスを指示するコイルにより示される。ＲＳＶのヘリックスα５およびα６の場合を除き、二次構造記号のドメインの場所を示し（ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩ）、それらがモタビズマブ結合部位ならびにβ２０およびβ２１を形成することを示すように標識し、それらが１０１Ｆ結合部位を形成することを示すように標識した。丸で囲った番号（ＲＳＶ）または三角で囲った番号（ＰＩＶ３）は、ジスルフィド結合を形成する残基を指示し、ジスルフィド連結された対における各パートナーについて同じ番号である。ＲＳＶ  ＦおよびＰＩＶ３  Ｆのフリン切断部位は、Ｆｒと標識された垂直の矢印で示す。フリン切断の後でタンパク質から放出されるＲＳＶ  Ｆ  ｐ２７領域は、黒色バーで示す。ＲＳＶ  ＦおよびＰＩＶ３  Ｆの融合ペプチドに標識する。融合ペプチド内の矢印は、この研究において使用される融合ペプチド欠失構築物におけるＦ１断片の第１の残基を示す。４つのタンパク質すべてにおいて同一な残基は、影を付したボックスで示す。中和結合部位を精査するために使用されるペプチドはオープンボックスで示し、耐性変異はアスタリスクで示す。
【図２】図２は、ＲＳＶ  Ｆ融合後三量体の電子顕微鏡法および円偏光二色性分析を示す図である。図２Ａでは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の電子顕微鏡写真が、融合後Ｆタンパク質の構造と符合する均一な松葉杖表現型の視野を示す。図２Ｂは、２１０ｎｍで観察された融合後ＲＳＶ  Ｆ三量体のＣＤ融解曲線、フォールドしたＲＳＶ  Ｆタンパク質の観察されたスペクトルの極小を示す図である。ｙ軸のＣＤ吸光度を、ｘ軸の温度に対してプロットする。図２Ｃは、２０℃および９５℃における融合後ＲＳＶ  Ｆ三量体のＣＤスペクトルを示す図である。スペクトルは、３２０〜１９０ｎｍにおいて記録され、フォールドしたタンパク質に特徴的なヘリックスの極小を両方の温度において示す。
【図３】図３は、結晶化したＲＳＶ  Ｆタンパク質の代表的な電子密度を示す図である。図３Ａは、元の分子交換溶液モデルの側面図であって、ＰＩＶ３融合後ヘッドをＲＳＶ  Ｆの６ヘリックスバンドルとインフレームで内包し、実空間３回ＮＣＳ平均化を反復した後で計算される初期の電子密度マップ（１σ）、ヒストグラムマッチング、および７．０〜３．２Åにおける位相拡張を伴うが位相組換えは伴わない溶媒平滑化において示される側面図である。電子密度によるヘッド領域のフィットは良好でない。図３Ｂは、側面図である。図４Ａで記載される平均化電子密度マップにおいて示されるＲＳＶ  Ｆの最終モデルである。図３Ｃは、図４Ａにおいて示されるＲＳＶ  Ｆタンパク質構造の上面図を示す。図３Ｄは、図３Ｂの上面図を示す。図４Ｂと同様に示されたモデルおよび電子密度。図３Ｅは、スティック表示の最終モデルによる代表的な平均化電子密度（グレー）の拡大図である。図３Ｆは、図４Ｅと同じ図を示すが、１．５σで成形された最終２ｍＦｏ−ｄＦｃ電子密度マップを示す図である。
【図４】図４は、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン構造を示す図である。図４Ａは、線状の概略図である。列挙される残基数は、各セグメントのＮ末端、フリン切断部位（矢印ヘッド）、およびＣ末端に対応する。ＤＩ〜ＩＩＩ：ドメインＩ〜ＩＩＩ；ｐ２７：切り出されたペプチド；ＦＰ：融合ペプチド；ＨＲＡ、Ｂ、およびＣ：７アミノ酸反復配列Ａ、Ｂ、およびＣ。図４Ｂは、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン三量体の１つのサブユニットのリボン表示を示す図である。ドメインには、図４Ａと同様に標識して影を付し、グリカンは黒色で示す。図４Ｃは、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン三量体の表面表示を示す図である。１つのサブユニットのドメインには、図４Ａと同様に標識して影を付し、他の２つのサブユニットのドメインは白色およびグレーとする。
【図５】図５は、ＲＳＶ  ＦのドメインＩおよびＩＩと、ＰＩＶ３  ＦのドメインＩおよびＩＩとの重合せを示す図である。図５Ａは、共通のβシートをマッチングさせることにより重ね合わせたＲＳＶおよびＰＩＶ３に由来するドメインＩのリボン概略図を示す図である。図５Ｂは、共通のβストランドに基づき重ね合わせたＲＳＶ  ＦおよびＰＩＶ３  Ｆに由来するドメインＩＩのリボン概略図を示す図である。ＲＳＶ  Ｆの二次構造エレメントに標識する。
【図６】図６は、ＲＳＶとＰＩＶ３との間の比較を例示する図である。図６Ａは、ＲＳＶ  ＦドメインＩＩＩのリボン概略図である。図６Ｂは、図６Ａにおいて示される方向に一致するように方向付けたＰＩＶ３ドメインＩＩＩのリボン概略図を示す図である。図６Ｃは、ドメインＩＩＩのβシートに基づき重ね合わせたＲＳＶおよびＰＩＶ３（ＲＳＶとＰＩＶ３とは異なる形で影を付す）のドメインＩＩＩヘリックスバンドルの詳細を示す図である。図６Ｄは、それらの６ヘリックスバンドルに基づき重ね合わせたＲＳＶ  ＦおよびＰＩＶ３  Ｆの細胞外ドメインの三量体（図６Ａおよび図６Ｂと同様に影を付す）を示す図である。左側の図像は、３回転軸に対して垂直に見たリボン概略図を示す図であり、右側の図像は、ヘッドのトップから３回転軸に沿って見た表面表示を示す図である。
【図７】図７は、モタビズマブのエピトープを例示する図である。図７Ａは、ＲＳＶ  Ｆ融合後三量体に由来するモタビズマブの結合ヘリックスであるα５およびα６と、ペプチド−モタビズマブ複合体（ＰＤＢコード：３ＩＸＴ）に由来するモタビズマブの結合ヘリックスであるα５およびα６との重合せを示す図である。融合後三量体構造とペプチド−モタビズマブ複合体構造とに異なる形で影を付す。モタビズマブが結合するＲＳＶ残基をスティック表示で示す。アスタリスクは、パリビズマブのエスケープ変異を指示する。図７Ｂは、リボン表示によるモタビズマブ−ＲＳＶ  Ｆ融合後三量体複合体のモデル化を示す図である。ＦａｂのＶＨおよびＶＬドメインに標識し、ＲＳＶ  Ｆ構造に由来するヘリックスα５およびα６と、ペプチド−モタビズマブの構造に由来するヘリックスα５およびα６とに異なる形で影を付し、ＲＳＶ  Ｆにおけるグリカンを黒色とし、ＲＳＶ  Ｆの残りを白色とする。
【図８】図８は、ＲＳＶ  Ｆのコンフォメーション変化、抗原性構造、およびパリビズマブの結合を例示する図である。図８Ａは、融合後構造の表面表示である。抗原性部位ＡおよびＣの輪郭を描き、これらに標識する。アスタリスクは、中和エスケープ改変体内で選択される残基、または中和抗体−ペプチド複合体の決定された構造において抗体との接触を形成する残基を示す。ＨＲＡ表面およびＨＲＢ表面に影を付す。図８Ｂは、図８Ａと同様に注釈を付けた、融合前モデルの表面表示である。図８Ｃは、パリビズマブの融合後ＲＳＶ  Ｆへの結合の、免疫化されていないマウスまたはＲＳＶ  Ｆ抗原により免疫化したマウスからプールされた血清による阻害を示すグラフである。パリビズマブの結合（競合血清を用いないＥＬＩＳＡシグナルのパーセンテージ）を、プールされた競合血清の希釈率の関数としてプロットする。
【図９】図９は、融合後ＲＳＶ  Ｆ構造（Ａ）および融合前ＲＳＶ  Ｆモデル（Ｂ）におけるモタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｕｚｕｍａｂ）のエピトープの露出を示す図である。図９Ａは、融合後構造に由来する１つのサブユニットのドメインＩＩＩを黒色およびグレーの影を付して示す一方で、ＲＳＶ  Ｆの残りの部分は白色とすることを示す図である。融合前と融合後との間で著明に変化しない構造エレメントを黒色とする一方で、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの移行においてリフォールドするＨＲＡ（矢印で標識した）はより明るいグレーとする。また、２つのサブユニットにおけるモタビズマブのエピトープにも標識する。三量体表面には第３のモタビズマブのエピトープが存在するが、この方向では容易に見ることができない。モタビズマブのエピトープのα５およびα６ヘリックスは、一例上に標識する。図９Ｂは、Ａと同様に影を付した融合前モデルのドメインＩＩＩを示す。融合ペプチド領域に影を付し、ＦＰと標識する。ＨＲＡ領域を、構造エレメントα１、α２、α３、β１、およびβ２へと分け、１つのサブユニットについて標識し、グレーの影を付した。融合前構造および融合後構造のいずれにおいても、モタビズマブのエピトープのα５およびα６ヘリックスは、表面に露出される。しかし、融合前モデルでは、ＨＲＣループをシフトさせて、抗体の結合に対応する必要がありうる（矢印により示される）。
【図１０】図１０は、融合後ＲＳＶ  Ｆ三量体へと結合した中和抗体１０１Ｆのモデルを示す図である。図１０Ａは、ＲＳＶ  Ｆ構造の同等な残基（βストランド２０〜βストランド２１）に重ね合わせた、１０１Ｆ  Ｆａｂ−ペプチド複合体構造（ＰＤＢコード：３Ｏ４１２１）に由来するペプチド（残基４３１〜４３５）（配列番号３７）を示す図である。図１０Ｂは、ＲＳＶ  Ｆ融合後三量体へと結合した１０１Ｆ  Ｆａｂモデルのリボン表示である。１０１Ｆ  ＦａｂのＶＨおよびＶＬドメインに標識し、ＲＳＶ  Ｆのβストランド２０およびβストランド２１にＡと同様に標識する。ＲＳＶ  Ｆの残りの部分を白色とする。図１０Ｂは、「ＩＩＫＴＦ」を配列番号３７として開示する図である。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、ジスルフィドを形成するのに適切な距離内にある残基が、最新のＲＳＶ  Ｆ融合前モデルに基づき同定されうることを示す図である。図１１Ａ（中央）：融合前ＲＳＶ  Ｆモデルに影を付して／着色して、標識される構造特色（ＨＲＢ、ＨＲＡ、ＤＩＩＩ）を示す図である。図１１Ｂ（左側）は、融合前モデルのドメインＩＩＩにおけるＨＲＡパッキングの拡大図である。対の番号は、近接する残基であって、システインへと変異させればジスルフィド結合を形成しうる残基を示す。図１１Ｃ（右側）は、ドメインＩおよびＩＩＩにおけるＨＲＢストークパッキングの拡大図である（白色）。対の番号は、システインへと変異させればジスルフィド結合を形成しうる残基を示す。融合前モデルにおいて、アミノ酸残基１６５および２９６ならびに５６および１６４は、ジスルフィド結合を形成するのに互いと理想的な距離にはないが、正しい方向にあり、それに基づいてモデルが構築されたＰＩＶ５構造によりモデルを付勢させれば、ジスルフィドを形成しうる。
【図１２】図１２は、ＨＲＢ欠失ＲＳＶ  Ｆ構築物（ＲＳＶ  Ｆ  ｄｅｌＨＲＢ  ＨＩＳ：配列番号２８）のネガティブ染色された電子顕微鏡写真を示す図である。ＨＲＢ欠失ＲＳＶ  Ｆ構築物についての電子顕微鏡法は、このＲＳＶ  Ｆタンパク質が、おそらく融合ペプチドを介して、ロゼットを形成することを顕示した。融合ペプチドを介するロゼットの形成は、融合前Ｆタンパク質の予測される挙動ではなく、融合後ＲＳＶ  Ｆの特色である（Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら、２００４年（１４２）およびＣｏｎｎｏｌｌｙら、２００６年（１４４））。この結果は、ＨＲＢ欠失ＲＳＶ  Ｆ構築物が、タンパク質を、所望の融合前コンフォメーションにおいてそれほどは安定化させないことを示す。
【図１３】図１３は、ある変異を導入して６ヘリックスバンドル形成を阻害したＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造を示す図である。ＨＲＢヘリックスを除去し、仮説的なランダムコイル（線により表される）と交換したＲＳＶ  Ｆ融合後構造が示される。融合後ＲＳＶ  Ｆの伸長ＨＲＡヘリックスに標識する。番号は、融合後構造に特徴的な６ヘリックスバンドルの形成に干渉する、グリコシル化部位または他の変異の導入のための潜在的な部位を表す。ＨＲＡヘリックスにＨＲＢとの相互作用に干渉する変異があれば、融合後コンフォメーションを不安定化させ、タンパク質を好適な融合前コンフォメーションにとどまらせるであろう。
【図１４】図１４ＡおよびＢは、煮沸還元条件下で抗Ｈｉｓタグ抗体を使用する、細胞溶解物（図１４Ａ：全発現を示す）または培地（図１４Ｂ：分泌されたタンパク質を示す）のウェスタンブロットである。ウェスタンブロットは、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の発現を示し、システイン残基を作出したタンパク質が発現し、鎖内ジスルフィド結合を含有したことを示す。ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＦ０からＦ１／Ｆ２への切断および細胞からの分泌は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の適正なタンパク質フォールディングの証拠である。非切断型Ｆ０および切断型Ｆ１について、移動が示される。ゲルレーン標識付けについての注記をブロットの上方に示す。（図１４Ａ）全タンパク質発現を示す細胞溶解物のウェスタンブロットである。細胞は各タンパク質構築物を良好に発現させた。（図１４Ｂ）培地へと分泌されたＲＳＶ  Ｆのウェスタンブロットである。分泌されたタンパク質は主に切断型（Ｆ１）であり、分泌量はタンパク質間で変動した。この分析の結果は、Ｔ５８ＣおよびＶ１６４Ｃタンパク質構築物、Ｋ１６８ＣおよびＶ２９６Ｃタンパク質構築物、ならびにＭ３９６ＣおよびＦ４８３Ｃタンパク質構築物が、最良の発現／分泌タンパク質構築物であった（Ｒ０４９：ＲＳＶ−Ｆ  ｆｕｓ  ｄｅｌ  Ｒ４２９Ｓ  Ｉ４３２Ｔ  Ｋ４３３Ｔ  Ｓ４３６Ｆ  ｔｒｕｎｃ（配列番号３９）；Ｒ０５０：ＲＳＶ−Ｆ  ＨＲＡ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ２  Ｉ５７Ｃ  Ｓ１９０Ｃ  ｔｒｕｎｃ（配列番号４０）；Ｒ０５１：ＲＳＶ−Ｆ  ＨＲＡ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ３  Ｔ５８Ｃ  Ｖ１６４Ｃ  ｔｒｕｎｃ（配列番号６）；Ｒ０５２：ＲＳＶ−Ｆ  ＨＲＡ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ５  Ｋ１６８Ｃ  Ｖ２９６Ｃ  ｔｒｕｎｃ（配列番号８）；Ｒ０５３：ＲＳＶ−Ｆ  ｆｕｓ  ｄｅｌ  Ｎ２６２Ｙ  Ｎ２６８Ｉ  Ｋ２７２Ｍ  Ｒ４２９Ｓ  Ｉ４３２Ｔ  Ｋ４３３Ｔ  Ｓ４３６Ｆ  ｔｒｕｎｃ（配列番号４１）；Ｒ０５４  ＲＳＶ−Ｆ  ＨＲＡ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ１  Ｖ５６Ｃ  Ｖ１６４Ｃ  ｔｒｕｎｃ（配列番号４）；Ｒ０５５  ＲＳＶ−Ｆ  ＨＲＡ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ４  Ｎ１６５Ｃ  Ｖ２９６Ｃ  ｔｒｕｎｃ（配列番号７）；Ｒ０５６  ＲＳＶ−Ｆ  ＨＲＢジスルフィドＭ３９６Ｃ  Ｆ４８３Ｃ  ｔｒｕｎｃ（配列番号９））ことを示す。
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは、ＲＳＶ  Ｆ鎖内ジスルフィドのＳＥＣ分析を示す図である。融合後Ｆロゼットおよび融合ペプチド欠失ＲＳＶ  Ｆ三量体を使用して、ロゼットと三量体とを差別化するためのＨＰＬＣ−ＳＥＣアッセイを開発した。（図１５Ａ）ＳＥＣにより、融合ペプチド安定化ＲＳＶ  Ｆロゼットが、空隙容量と共に移動した（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ２５０  ＳＥＣカラム上で５分間の保持時間）ことを示す図である。抗ＨＩＳタグによるウェスタンブロット法は、このタンパク質が空隙容量ピーク内にあることを確認した。（図１５Ｂ）融合ペプチド欠失ＲＳＶ  Ｆ三量体が、約６．５分間のＳＥＣ保持時間で移動したことを示す図である。抗ＨＩＳタグによるウェスタンブロットは同様に、タンパク質が包含容量の三量体ピーク内にあることを確認した。空隙ピークは包含容量ピークより大きいが、抗ＨＩＳによるウェスタンブロットは、ほぼ等量のＲＳＶ  Ｆが２つのピーク内に存在することを示す。（図１５Ｃ）これらのデータは、ＲＳＶ  Ｆ  Ｔ５８Ｃ  Ｖ１６４Ｃ構築物がロゼットではなく単分散三量体の形態にある切断型ＲＳＶ  Ｆの集団を有したことから、このタンパク質構築物の集団は融合前形態にあったことが示唆されることを示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、作出されたシステインを含有するＲＳＶ  Ｆタンパク質構築物の精製および分析を示す図である。図１６Ａは、ＲＳＶ  Ｆ  Ｎ１６５Ｃ／Ｖ２９６Ｃ構築物の精製を示す図である。カラムを、キレート化精製からのフロースルー（ＦＴ）、洗浄（Ｗ）、溶出（Ｅ）、および樹脂（Ｒ）について標識する。導入されたジスルフィド変異を含有し、昆虫細胞内で発現させた他のタンパク質構築物とは異なり、Ｎ１６５Ｃ／Ｖ２９６Ｃは、哺乳動物細胞内で発現させた場合のそのプロファイルと類似する切断型分子種として分泌された。図１６Ｂは、Ｋ１６８Ｃ／Ｖ２９６Ｃ  ＲＳＶ  Ｆタンパク質構築物およびＭ３９６Ｃ／Ｆ４８３Ｃ  ＲＳＶ  Ｆタンパク質構築物のゲルシフト分析を示す図である。標準物質の左側では、２つの構築物を、煮沸して還元剤を存在させながら泳動させる。標準物質の右側では、２つの構築物を、煮沸の後で還元剤を伴わずに（ｂ／ｎｒ）、または煮沸せず還元剤も伴わずに（ｎｂ／ｎｒ）泳動させる。ウェスタンブロットは、タンパク質が大部分非切断型であるが、予想に反して鎖間ジスルフィド結合が形成されなかったことを示す。煮沸なしのＫ１６８Ｃ／Ｖ２９６Ｃは、三量体バンドへとシフトしたが、非煮沸Ｍ３９６Ｃ／Ｆ４８３Ｃは、単量体バンドとして泳動した。図１６Ｃは、還元して煮沸したＫ１６８Ｃ／Ｖ２９６Ｃ  ＲＳＶ  Ｆタンパク質構築物およびＭ３９６Ｃ／Ｆ４８３Ｃ  ＲＳＶ  Ｆタンパク質構築物のクーマシー染色ゲルを示す図である。材料のうちの約５０％は、切断型であった。
【図１７】図１７（Ａ）は、融合前Ｆについて予想される球体状のヘッドを伴い、少量のロゼット様凝集物を伴うＮＤＶ  Ｆ（融合前）の電子顕微鏡法分析を示す図である。図１７（Ｂ）は、ＮＤＶ融合前Ｆがロッド様結晶を形成することを示す図である。単離されたロッドを分析したところ、完全性が約９５％であるデータセットが約３．７オングストロームまで記録された。図１７（Ｃ）は、ＮＤＶ融合前Ｆが、両錐体結晶（５０×５０×５０μｍのサイズ）を形成することを示す図である。
【図１８】図１８Ａ〜Ｅは、複数のＲＳＶ  Ｆタンパク質構築物の分析を示す図である。図１８Ａは、１００％がロゼットを形成したことを示すＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌ−ＨＲＢのＥＭ分析を示す図である。タンパク質は、ＳＥＣカラムから空隙／ロゼット保持ピーク内に溶出した。図１８（Ｂ）は、Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰ  ＲＳＶ  Ｆ構築物の分析／精製を示す図である。タンパク質は、空隙ピーク内および三量体保持ピーク内の両方において見いだされた。図１８Ｃは、部分的に切断されたＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰが、空隙ピーク内および三量体ピーク内の両方に存在したことを示唆するゲル分析を示す図である。図１８Ｄは、少量のロゼット様凝集物を伴う融合前Ｆについて予想される球体状のヘッドを示すＮＤＶ  Ｆ（融合前）のＥＭを示す図である。図１８Ｅは、ＳＥＣによる三量体ピークに由来するＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌ−ＨＲＢが、ロゼット様構造、融合後松葉杖、および融合前ヘッド様の球体状分子種の不均一なミックスを含有することを示す図である。
【図１９】図１９は、ＲＳＶ  Ｆ／ＮＤＶキメラタンパク質構築物およびＲＳＶ  Ｆ／ＰＩＶ５  Ｆキメラタンパク質構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。６つの構築物（１：ＲＳＶ−Ｆ  ＮＤＶ  ＨＲＢ  ｄｅｌ  ｆｕｓ  ｔｒｕｎｃ；２：ＲＳＶ−Ｆ  ＮＤＶ  ＨＲＢ  ｔｒｕｎｃ；３：ＲＳＶ−Ｆ  ＮＤＶ  ＨＲＢ２  ｄｅｌ  ｆｕｓ  ｔｒｕｎｃ；４：ＲＳＶ−Ｆ  ＮＤＶ  ＨＲＢ２  ｔｒｕｎｃ；５：ＲＳＶ−Ｆ  ＰＩＶ５  ＨＲＢ  ｄｅｌ  ｆｕｓ  ｔｒｕｎｃ；６：ＲＳＶ−Ｆ  ＰＩＶ５  ＨＲＢ  ｔｒｕｎｃ）のうちの１つによりトランスフェクトした細胞に由来する上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。（ｄｅｌ  ｆｕｓ）融合ペプチドを有するまたは有さない構築物を作出した。示される通り、タンパク質は、ＮＤＶ  ＨＲＢ、追加のグリシン残基をリンカー（ＨＲＢ２）として有するＮＤＶ  ＨＲＢ、またはＰＩＶ５  ＨＲＢを有した。各構築物について、切断型Ｆ１タンパク質は、プロセシングされたＦタンパク質と符合することが観察された。各タンパク質１リットルずつの発現を実行した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書において使用される「融合前」ＲＳＶ  Ｆタンパク質とは、ＲＳＶ  Ｆ融合後構造ではなく、ＰＩＶ５の融合前構造により類似する一般的構造アーキテクチャーを共有するＲＳＶ  Ｆタンパク質である。融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、以下の特徴：ＨＲＡ領域が、ＲＳＶ  Ｆヘッド領域内のドメインＩＩＩに対してパッキングされる特徴、および／またはＨＲＢ領域が、ＨＲＡ領域と、６ヘリックスバンドルの文脈において会合するのではなく、ドメインＩおよびＩＩに近接する三量体コイル−コイルストークを形成する特徴を包含する。
【００２１】
本明細書において使用されるＲＳＶ  Ｆタンパク質の「融合後コンフォメーション」とは、より一般的な構造アーキテクチャーを、ＰＩＶ５の融合前構造ではなく、ＲＳＶ  Ｆ融合後構造と共有するＲＳＶ  Ｆタンパク質である。融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルを包含する。
【００２２】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  ＦにおけるＨＲＡ領域とは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１３７〜２３９近傍（配列番号１および２）であり、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、およびストランドβ２を含む。図９Ｂを参照されたい。
【００２３】
本明細書において使用される融合後ＲＳＶ  ＦにおけるＨＲＡヘリックスは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１５５〜２２６近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００２４】
本明細書において使用される融合ペプチドは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１３７〜１５４（配列番号１および２）により定義される。
【００２５】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ領域内のヘリックスα１は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１４５〜１５７近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００２６】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ領域内のヘリックスα２は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１５８〜１６７近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００２７】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ領域内のヘリックスα３は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１６８〜１７６近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００２８】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ領域内のヘリックスα４は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１９４〜２１２近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００２９】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ領域内のストランドβ１は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１７７〜１８４近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３０】
本明細書において使用される融合前ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ領域内のストランドβ２は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基１８５〜１９３近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３１】
本明細書において使用されるＲＳＶ  Ｆ内のＨＲＢ領域とは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基４６１〜５１５近傍（配列番号１および２）であり、ＨＲＢヘリックスおよびＨＲＢリンカーを包含する。
【００３２】
本明細書において使用されるＲＳＶ  Ｆ内のＨＲＢヘリックスは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基４８５〜５１５近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３３】
本明細書において使用されるＲＳＶ  Ｆ内のＨＲＢリンカーは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基４６１〜４８４近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３４】
本明細書において使用されるドメインＩ（ＤＩ）は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基２６〜５０および３０９〜４０１近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３５】
本明細書において使用されるドメインＩＩ（ＤＩＩ）は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基４００〜４６０近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３６】
本明細書において使用されるドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のうちの残基５１〜９８および２０６〜３０８、または５１〜３０８近傍（配列番号１および２）により形成される。
【００３７】
本明細書において使用される「精製」タンパク質またはポリペプチドとは、組換えもしくは合成により作製された、またはその天然の宿主により産生されたタンパク質またはポリペプチドであり、組換えもしくは合成による作製系または天然の宿主の他の成分から単離されており、組成物中に存在する他の高分子成分と比べたタンパク質の量が、粗調製物中に存在するタンパク質の量より実質的に高量である。一般的に、精製タンパク質は、少なくとも約５０％均一であり、より好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または実質的に均一である。
【００３８】
本明細書において使用される「脂質およびリポタンパク質を実質的に含まない」とは、タンパク質および／またはポリペプチド（たとえばＲＳＶ  Ｆポリペプチド）の純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で観察し、全タンパク質含量を、ＵＶ２８０における吸光度またはＢＣＡ分析を使用して測定し、脂質およびリポタンパク質の含量を、ホスホリパーゼＣアッセイ（和光純薬工業株式会社；コード番号：４３３−３６２０１）を使用して決定する場合に、質量ベースで少なくとも約９５％脂質およびリポタンパク質を含まない組成物、タンパク質、およびポリペプチドを指す。
【００３９】
本明細書において使用される「近接」とは、約１０Å以下、約８Å以下、約６Å以下、約４Å以下、または約２Å以下の距離を指す。２つ以上のアミノ酸残基が近接する場合、アミノ酸残基のアルファ炭素間の距離は、約１０Å以下、約８Å以下、約６Å以下、約４Å以下、または約２Å以下である。
【００４０】
本明細書では、本発明において使用するのに適したＲＳＶ  Ｆタンパク質の特色が、Ａ２株に由来するＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列中のアミノ酸の位置により同定される特定のアミノ酸（配列番号１）を参照しながら記載される。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、Ａ２株または他のあらゆる所望の株に由来するＦタンパク質のアミノ酸配列を有することができる。Ａ２株以外の株に由来するＦタンパク質を使用する場合、Ｆタンパク質のアミノ酸は、Ａ２株に由来するＦタンパク質のナンバリングを参照しながら、必要に応じてギャップを挿入しながらナンバリングされる。これは、所望されるあらゆるＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列をＡ２株のＦタンパク質によりアラインすることにより達成することができる。配列アライメントは、Ｃｏｒｐｅｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８年、１６巻（２２号）：１０８８１〜１０８９０頁により開示されているアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使用して作製することが好ましい（Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２の記号による比較表、ギャップオープンペナルティー：１２、ギャップエクステンションペナルティー：２）。
【００４１】
本明細書において記載および例示される通り、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合後形態について、３．２Åのｘ線結晶構造が決定されている。ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態のモデルは、ＲＳＶ  Ｆの融合後ｘ線結晶構造を融合前および融合後のパラインフルエンザウイルスＦタンパク質の公知の構造と比較することにより作製した。このＲＳＶ  Ｆの融合前形態のモデルは、融合前ＲＳＶ  Ｆの既存モデルの構造特色とは異なる構造特色を明らかにし、ＲＳＶ  Ｆの安定化された融合前形態の合理的構造ベースの設計を可能とする。
【００４２】
したがって、本発明は、融合前ＲＳウイルスＦ（ＲＳＶ  Ｆ）ポリペプチドおよび／またはタンパク質、ならびに融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。本発明はまた、ＲＳＶに対する免疫応答および／または防御的免疫を誘発するための方法、ならびにこれらの方法のための融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質の使用にも関する。本発明はまた、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質をコードする核酸にも関する。
【００４３】
一般的に、免疫原性組成物は、中和抗体を引き起こす融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／またはタンパク質を含む。たとえば抗体は、パリビズマブ、モタビズマブ、および１０１Ｆと同じエピトープに結合する。
【００４４】
融合前および融合後のＰＩＶ  Ｆ構造は、ドメインのシフト、ならびにＨＲＡおよびＨＲＢの大規模な再構成を全体で明らかにする。融合前ＰＩＶ５構造のドメインＩＩＩでは、ＨＲＡが、長い融合後ＨＲＡヘリックスではなく、３つのαヘリックスおよび２つのβストランドへとフォールドする（Ｙｉｎら、２００６年）。しかし、融合前および融合後の個別のＰＩＶ  Ｆドメインのコンフォメーションを比較すると、再構成されない部分がよく重なり合う。融合後ＲＳＶ  Ｆドメインをそれらの融合前のＰＩＶ５  Ｆの対応物へと重ね合わせたところ、大きな不調和を結果としてもたらさず、ドメイン間のジスルフィド結合を形成するすべてのシステイン対を互いと近接して配置した。融合後ＲＳＶ  Ｆのｘ線結晶構造に由来する情報と融合前ＰＩＶ５  Ｆ構造に由来する情報とをこのように組み合わせることにより得られた融合前ＲＳＶ  Ｆモデルは、ＰＩＶ５の融合前構造だけに基づく融合前ＲＳＶ  Ｆの既存の相同性モデルからは明らかとならない特色を明らかにした（ＭｃＬｅｌｌａｎら、ＮＳＭＢ、２０１０年（１４１））。パリビズマブ／モタビズマブ（Ｍｏｔｉｖｉｚｕｍａｂ）のエピトープのヘリックスは、融合後ＲＳＶ  Ｆ三量体のｘ線結晶構造上にあるので、融合前ＲＳＶ  Ｆ三量体モデルの表面においても露出される（図９）。本発明者らによる融合前ＲＳＶ  Ｆモデルでは、β４とＨＲＣ（ドメインＩＩＩの部分）とを接続するループであれば、パリビズマブまたはモタビズマブの、それらのエピトープへの接触を妨げうるであろう。しかし、このループは、抗体の結合を可能とする代替的なコンフォメーションを取るのに十分な可撓性を有する可能性が高い（図９Ｂ）。
【００４５】
本明細書において開示される、ＲＳＶ  Ｆの融合後ｘ線結晶構造およびＰＩＶ５の融合前構造（Ｙｉｎら、２００６年（１４５））に基づく融合前モデルは、融合後ＲＳＶ  Ｆ（残基１３７〜２１２）の伸長したＨＲＡヘリックスが、ＰＩＶ５融合前結晶構造と類似するストランドおよびヘリックスへとフォールドすることを示す。ＲＳＶ  Ｆの融合ペプチドである残基１３７〜１５４は、ＲＳＶ  Ｆ融合前ヘッドへとパッキングされるコイルおよびヘリックスを形成する。４つのヘリックスが形成される；ヘリックスａ１は、残基１４５〜１５７近傍にあり、ヘリックスａ２は、残基１５８〜１６７近傍にあり、ヘリックスａ３は、残基１６８〜１７６近傍にあり、ヘリックスａ４は、残基１９４〜２１２近傍にある。２つのストランドが形成される；ストランドｂ１は、残基１７７〜１８４近傍にあり、ストランドｂ２は、残基１８５〜１９３近傍にある（図９）。
【００４６】
融合前コンフォメーション
本発明は、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよびタンパク質ならびに融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよびタンパク質を含有する免疫原性組成物を包含する。ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびポリペプチドは、融合前コンフォメーションを安定化させるまたは融合後コンフォメーションを不安定化させる１または複数のアミノ酸の交換、欠失、および／または付加を含有する可能性があり、たとえばジスルフィド結合により安定化される融合前ＲＳＶ  Ｆ、または融合後コンフォメーションを不安定化させることにより形成される融合前ＲＳＶ  Ｆを含有しうる。
【００４７】
ジスルフィド結合を介する安定化
ＲＳＶ  Ｆ融合前モデルを、融合前コンフォメーションにおいて互いと近接するアミノ酸残基、および融合後コンフォメーションにおいてもはや近接しないアミノ酸残基を選択するための指針として使用することができる。このようなアミノ酸をシステイン残基へと変異させて、たとえばＨＲＢヘリックスがＨＲＡヘリックスと会合することを防止し、したがって融合後コンフォメーションへのリフォールディングを防止することにより融合前コンフォメーションを安定化させるジスルフィド形成を可能とすることができる。
【００４８】
本発明の安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、あらゆる２つの構造エレメント間、または１つの構造エレメントと残りのＲＳＶ  Ｆタンパク質との間、または三量体の１つのサブユニットの構造エレメントと同じ三量体の別のサブユニットの構造エレメントとの間のジスルフィド結合を含みうる。一般的に、１つの構造エレメント内の第１のアミノ酸と、異なる構造エレメント内または別個の単量体における同じ構造エレメント内にある第２のアミノ酸であって、融合前モデルにおける第１のアミノ酸ともまた近接する第２のアミノ酸とを、システインとの交換のために選択する。残基（たとえばアルファ炭素）間の距離は、約１０Å未満、約８Å未満、約６Å未満、約５Å未満、約４Å未満、または約３Å未満でありうる。第１のアミノ酸と第２のアミノ酸とのシステイン交換、およびそれらの間のジスルフィド結合は、モデル化することができる。いくつかの実施形態では、モデル化されたジスルフィド結合の長さが、ジスルフィド結合に最適であると考えられる約２Åの長さに正確にマッチするわけではない。好ましくは、モデル化されたジスルフィド結合の長さ（硫黄核間の距離）は、約０．５Å〜３．５Å、約１．０Å〜３．０Å、または約１．５Å〜２．５Åであり、これらは、構造の可撓性に起因して、タンパク質内でジスルフィド結合を形成すると予想される。
【００４９】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を、第２の構造エレメント内の少なくとも１つの他のシステイン（天然であるまたは導入された）と近接する第１の構造エレメントにおける、または残りのＲＳＶ  Ｆヘッド領域における少なくとも１つのシステイン変異の導入を介して、融合前コンフォメーションにおいて安定化させることができる。導入されたシステイン間では、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止するジスルフィド結合が形成される。たとえば融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、異なる構造領域（たとえばＨＲＡヘリックス領域、ＨＲＢヘリックス領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、ＤＩ、ＤＩＩ、またはＤＩＩＩから選択される）内の少なくとも１つの他のシステイン（天然であるまたは導入された）と近接する、ＨＲＡヘリックス領域、ＨＲＢヘリックス領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、ＤＩ、ＤＩＩ、またはＤＩＩＩにおける少なくとも１つのシステイン変異を導入し、これにより融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する１または複数のジスルフィド架橋を形成することを介して、融合前コンフォメーションにおいて安定化させることができる。
【００５０】
システインをＨＲＢまたはＨＲＢリンカーへと導入して、これらのシステイン間でジスルフィド結合を創出することができる。一実施形態では、１または複数のシステインをＨＲＢリンカー領域およびＨＲＢヘリックス領域（残基４５２〜５１５近傍）へと導入して、ＲＳＶ  Ｆヘッド領域部分とのジスルフィドを形成することができる。別の実施形態では、ＨＲＢリンカーまたはＨＲＢヘリックスと残りのＲＳＶ  Ｆタンパク質との間のジスルフィド結合を使用して、タンパク質を融合前コンフォメーションにおいて安定化させることができる。好ましい実施形態では、ＨＲＢ融合前ストークとヘッドの「トップ」（たとえばＭ３９６Ｃ＋Ｆ４８３Ｃ）におけるＤＩまたはＤＩＩ領域との間でジスルフィド架橋が形成される。
【００５１】
好ましい実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｍ３９６ＣおよびＦ４８３Ｃを含み、これにより、ＨＲＢ融合前ストークとＤＩ領域との間のジスルフィド結合を含む。
【００５２】
他の好ましい実施形態では、ジスルフィド架橋が、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間で形成される。たとえばＲＳＶ  Ｆタンパク質は、Ｖ５６Ｃ＋Ｖ１６４Ｃ、Ｉ５７Ｃ＋Ｓ１９０Ｃ、Ｔ５８Ｃ＋Ｖ１６４Ｃ、Ｎ１６５Ｃ＋Ｖ２９６Ｃ、Ｋ１６８Ｃ＋Ｖ２９６Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸交換を含有しうる。
【００５３】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＡ領域内の第１のシステイン変異と、融合前ＨＲＡ領域のうちの融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００５４】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＢヘリックス領域内の第１のシステイン変異と、ＤＩまたはＤＩＩ内の第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００５５】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合ペプチド内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡ領域、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ伸長ヘリックスが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００５６】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヘリックスα１内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡ領域、融合ペプチド、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００５７】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヘリックスα２内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡ領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００５８】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヘリックスα３内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡ領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００５９】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヘリックスα４内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡ領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ストランドβ１、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６０】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ストランドβ１内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡ領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ２、またはＤＩＩＩにおける第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６１】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ストランドβ２内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡヘリックス領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ＤＩ、ＤＩＩ、またはＤＩＩＩにおけるシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６２】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＤＩ領域内の第１のシステイン変異と、ＨＲＢヘリックス領域内の第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６３】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＤＩＩ領域内の第１のシステイン変異と、ＨＲＢヘリックス領域内の第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６４】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＤＩＩＩ領域内の第１のシステイン変異と、ＨＲＡヘリックス領域内の第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６５】
別の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＡヘリックス領域、ＨＲＢヘリックス領域、融合ペプチド、ヘリックスα１、ヘリックスα２、ヘリックスα３、ヘリックスα４、ストランドβ１、ストランドβ２、ＤＩ、ＤＩＩ、またはＤＩＩＩ領域における第１の導入されたシステインと、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のあらゆる他の領域内の第２のシステインであって、導入されたシステインと近接する第２のシステイン（天然であるまたは導入された）とを含む。この実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、融合後ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ヘリックスバンドルが形成されることを防止する、第１のシステインと第２のシステインとの間のジスルフィド結合を含む。
【００６６】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、Ｖ５６Ｃ＋Ｖ１６４Ｃ、Ｉ５７Ｃ＋Ｓ１９０Ｃ、Ｔ５８Ｃ＋Ｖ１６４Ｃ、Ｎ１６５Ｃ＋Ｖ２９６Ｃ、およびＫ１６８Ｃ＋Ｖ２９６Ｃ、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される２つのシステイン変異を含み、これにより、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００６７】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｖ５６ＣおよびＶ１６４Ｃを含み、これにより、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００６８】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｉ５７ＣおよびＳ１９０Ｃを含み、これにより、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００６９】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｔ５８ＣおよびＶ１６４Ｃを含み、これにより、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００７０】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｎ１６５ＣおよびＴ２９６Ｃを含み、これにより、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００７１】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｋ１６８ＣおよびＴ２９６Ｃを含み、これにより、ＨＲＡ領域とＤＩＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００７２】
一実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、２つのシステイン変異Ｍ３９６Ｃ＋Ｆ４８３Ｃを含み、これにより、ＨＲＢ領域とＤＩＩ領域との間のジスルフィド架橋を含む。
【００７３】
本発明のＲＳＶ  Ｆ融合前タンパク質は、三量体を形成する融合前サブユニットを安定化させる変異により、融合前コンフォメーションにおいて安定化する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＳＶ  Ｆ融合前タンパク質が、ＲＳＶ  Ｆ単量体の三量体であり、融合前コンフォメーションは、異なる単量体へと導入されるシステイン残基間の１または複数のジスルフィド結合により安定化する。
【００７５】
導入されたシステイン残基であって、融合前コンフォメーションを安定化させるシステイン残基を含有するＲＳＶ  Ｆ単量体の例示的なアミノ酸配列を以下に提示する（配列番号４〜９）。提示される配列は、シグナルペプチドおよびＨＩＳタグ（ＧＧＳＡＧＳＧＨＨＨＨＨＨ；配列番号３）を含有する。本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、以下に示されるアミノ酸配列であって、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグを有するまたは有さないアミノ酸配列のうちのいずれかを含有しうる。
【００７６】
【化１】
2014519819.tif 000002
【００７７】
【化２】
2014519819.tif 000003
融合後ＲＳＶ  Ｆの不安定化
ＲＳＶ  Ｆ融合後構造の主要な特色は、ストーク領域内の６ヘリックスバンドルである。融合後コンフォメーションでは、３つのＨＲＡヘリックスと３つのＨＲＢヘリックスとが、極めて安定な６ヘリックスバンドルを形成する。本発明の安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を作製するための代替的戦略は、融合後６ヘリックスバンドルを不安定化させること、および／または６ヘリックスバンドルの形成を防止すること（たとえばＨＲＢヘリックスの欠失、点変異の導入、グリコシル化部位または他の修飾部位の付加を介して）を介する。
【００７８】
６ヘリックスバンドル形成は、ＨＲＡヘリックスまたはＨＲＢヘリックスを欠失させることにより防止することができる。
【００７９】
ＨＲＢヘリックス領域を欠失または変異させて、融合後コンフォメーションの形成を防止することが好ましい。ＨＲＢ領域は、ＲＳＶ  Ｆ融合前コンフォメーションのストークを形成し、ウイルス膜と近接し、重要な中和エピトープを含有しない可能性が高い。ＨＲＢヘリックスの欠失（残基４８４およびＣ末端）は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の、融合前状態から融合後状態へのリフォールディングを防止しうる。
【００８０】
本発明の安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＨＲＢ領域を欠失または変異させたＲＳＶ細胞外ドメイン配列を含むことができ、残りの細胞外ドメイン配列に対する追加の変異または欠失をさらに含むことが好ましい。たとえばＲＳＶ細胞外ドメインは、本明細書において記載される融合前構造を安定化させるジスルフィド架橋を創出するように導入される１もしくは複数のシステイン、フリン切断部位の変異もしくは欠失、融合ペプチド配列の変異もしくは欠失、またはその全体において本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／００８９７４において既に記載されている他の変異を含みうる。ＲＳＶ細胞外ドメインは、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞外ドメインであってもよく、またはＨＲＡもしくはＨＲＢ領域の欠失および／もしくは変異に加えて変異を含有してもよい。
【００８１】
一実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞外ドメインであって、ＨＲＢ領域を欠失させ、フリン切断部位（すなわち、配列番号１および２のアミノ酸１０９および１３６）の一方または両方における切断を防止する１または複数の変異を存在させた細胞外ドメインを含む。
【００８２】
一実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞外ドメインであって、ＨＲＢ領域を欠失させ、融合ペプチド（配列番号１または２のアミノ酸１３７および１５３）を変異させた細胞外ドメインを含む。たとえばこの領域を、全体または部分において欠失させることができる。
【００８３】
別の実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＢ領域および融合ペプチドを全体または部分において欠失させた、野生型のＲＳＶ細胞外ドメインを含む。
【００８４】
別の実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＢ領域を欠失させ、オリゴマー化配列を追加した、野生型のＲＳＶ細胞外ドメインを含む。オリゴマー化配列を存在させる場合、それは三量体化配列であることが好ましい。当技術分野では、適したオリゴマー化配列が周知であり、たとえば酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパータンパク質のコイルドコイル、バクテリオファージＴ４フィブリチンに由来する三量体化配列（「フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）」）、およびインフルエンザＨＡの三量体ドメインが含まれる。
【００８５】
別の実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＢ領域を欠失させ、全体または部分におけるｐ２７領域の欠失を含め、ｐ２７領域（配列番号１または２のアミノ酸１１０〜１３６）を変異させた、野生型のＲＳＶ細胞外ドメインを含む。たとえばｐ２７領域（配列番号１または２のアミノ酸１１０〜１３６近傍）内のリシンおよび／またはアルギニン残基を置換するまたは欠失させることができる。
【００８６】
別の実施形態では、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＨＲＢ領域を欠失させ、プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列を追加した、野生型のＲＳＶ細胞外ドメインを含む。一般的に、プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列は、膜貫通ドメインのアミノ末端（配列番号１または２のアミノ酸５２５）から約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３０アミノ酸、約２０アミノ酸、約１０アミノ酸以内に、またはこれに実質的に隣接して配置される。
【００８７】
融合ペプチドおよびＨＲＢを欠失させて融合前コンフォメーションを安定化させたＲＳＶ  Ｆ単量体の例示的なアミノ酸配列を、以下に提示する（配列番号１０）。提示された配列は、シグナルペプチドおよびＨＩＳタグ（ＧＧＳＡＧＳＧＨＨＨＨＨＨ；配列番号３）を含有する。本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、以下に示されるアミノ酸配列であって、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグを有するまたは有さないアミノ酸配列を含有しうる。
【００８８】
【化３】
2014519819.tif 000004
本発明の安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質はまた、作出された点変異またはグリコシル化部位（たとえばＡｓｎＸａａＳｅｒ／Ｔｈｒ；配列番号１１）もしくは他の修飾部位（たとえば脂質化、リン酸化）の導入を介してＨＲＡまたはＨＲＢ領域内（それぞれ残基１５４〜２１２および４８４〜５１３近傍）の６ヘリックスバンドル形成を妨げることによっても形成することができる。静電障害もしくは立体障害を介して６ヘリックスバンドル形成に干渉するグリコシル化部位、または他の翻訳後修飾部位もしくは点変異は、ＨＲＡまたはＨＲＢヘリックス領域を介して導入することができる。グリコシル化は、６ヘリックスバンドル形成に干渉し、ＲＳＶ  Ｆ構築物の融合後コンフォメーションへのフリッピングを防止しうる。
【００８９】
本発明の安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＨＲＡまたはＨＲＢヘリックス領域内に１または複数のグリコシル化部位を形成する１または複数の変異を含みうる。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＨＲＡまたはＨＲＢヘリックス領域内にグリコシル化部位を導入する変異または欠失に加えた変異または欠失も含有しうる。
【００９０】
一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、Ｓ１７３ＮおよびＮ１７５Ｔの変異を含み、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が当該のセリン残基１７３においてグリコシル化部位を有する。
【００９１】
別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、変異Ａ１７７Ｔを含み、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が当該の残基Ｎ１７５においてグリコシル化部位を有する。
【００９２】
別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、Ｇ１８４ＮおよびＳ１８６Ｔの変異を含み、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が当該の残基Ｇ１８４においてグリコシル化部位を有する。
【００９３】
関連するＲＳＶ  Ｆエピトープを有するキメラ融合前Ｆ構造
本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に由来する中和エピトープを含有するキメラ融合前Ｆタンパク質にも関する。一般的に、キメラ融合前Ｆタンパク質は、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＰＩＶ４、ＰＩＶ５）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、ヘンドラウイルス、ニパウイルス（ＮｉＶ）、ヒトメタ肺炎ウイルス、または鳥類メタ肺炎ウイルスなど、異なるウイルスに由来する安定化されたＦタンパク質であって、その中のタンパク質の表面において露出された部分がＲＳＶ  Ｆの対応する部分と交換されたＦタンパク質を含む。露出された部分は、ＲＳＶ  Ｆの中和エピトープを含有することが好ましい。
【００９４】
たとえば融合前コンフォメーションにおいて安定化させた（たとえばＣ末端においてＨＲＢ領域へと融合させたＧＣＮ三量体ドメインを介して）ＲＳＶ以外の（たとえばパラインフルエンザウイルスまたはメタ肺炎ウイルスの）あらゆるＦタンパク質を、本タンパク質のための鋳型として使用することができる（すなわち非切断型ＮＤＶ  Ｆ−ＧＣＮ融合タンパク質）。たとえばＹｉｎら、２００６年（１４５）により記載されているＰＩＶ５融合前Ｆタンパク質のＳＶ５、またはＳｗａｎｓｏｎら、２０１０年（１４６）により記載されているＮＤＶ融合前Ｆを、キメラＦタンパク質構築物において使用することができる。次いで、鋳型を変異させて、公知のまたはそれと疑われるＲＳＶ  Ｆ中和エピトープを導入することができる。したがって、本タンパク質は、ＲＳＶ  Ｆの中和エピトープは呈示するが中和エピトープ以外は呈示しない融合前Ｆ構造を有しうる。この構築物に対する明らかな利益は、非中和ＲＳＶ  Ｆ抗体をもたらさないことである。
【００９５】
本発明の融合前キメラタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆの中和エピトープを導入するように変異させた、融合前コンフォメーションにおいて安定化されたパラインフルエンザウイルスＦタンパク質を含みうる。パラインフルエンザウイルスＦタンパク質は、あらゆるパラインフルエンザウイルスＦタンパク質、好ましくはＹｉｎら、２００６年（１４７）により記載されているＰＩＶ５融合前Ｆタンパク質のＳＶ５またはＳｗａｎｓｏｎら、２０１０年（１４６）により記載されているＮＤＶ融合前Ｆでありうる。変異により導入されうる例示的な中和エピトープには、表１において開示されるエピトープが含まれる。たとえば表１に列挙された抗体により認識されるエピトープを形成するアミノ酸は、融合前コンフォメーションにおいて安定化させたＲＳＶ−Ｆ以外のタンパク質（たとえばパラインフルエンザウイルスＦタンパク質またはメタ肺炎ウイルスＦタンパク質）の対応する位置（たとえば構造に基づくアライメントなど、構造比較により同定される）へと導入することができる。たとえばキメラＦタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆの部位Ａエピトープまたは部位Ｃエピトープを含有しうる。具体的な例では、キメラＦタンパク質が、ＲＳＶ  Ｆの２６２位〜２７６位におけるアミノ酸残基から選択される１または複数のＲＳＶ  Ｆ残基を含有する。別の具体的な例では、キメラＦタンパク質が、ＲＳＶ  Ｆの４２９位〜４４７位におけるアミノ酸残基から選択される１または複数のＲＳＶ  Ｆ残基を含有する。
【００９６】
【表１】
2014519819.tif 000005
一実施形態では、本発明のキメラＦタンパク質が、ＮＤＶ−ＧＣＮ融合前Ｆの同等なＨＲＡ残基の代わりにＲＳＶ  ＦのＨＲＡ領域（残基１３７〜２１２）を含む。したがって、融合前Ｆタンパク質（ＮＤＶ−ＧＣＮ）は、融合前Ｆヘッドのトップにおける潜在的な中和エピトープ部位（ＲＳＶ  ＦのＨＲＡ領域）と共に発現し、ＲＳＶ  Ｆ中和抗体を引き起こすことを可能とする。所望の場合、追加の中和エピトープ、たとえばモタビズマブのエピトープまたは１０１Ｆエピトープを追加することができる。
【００９７】
ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡアミノ酸配列を包含するように変異させた融合前ＮＤＶ  Ｆを含有する、キメラタンパク質の例示的なアミノ酸配列を、以下に提示する（配列番号１３）。提示される配列は、シグナルペプチド、ＧＣＮ三量体化ドメイン、およびＨＩＳタグを含有する。本発明のキメラ融合前Ｆタンパク質は、以下に示されるアミノ酸配列であって、シグナルペプチドおよび／またはＧＣＮ三量体化ドメインおよび／またはＨＩＳタグを有するまたは有さないアミノ酸配列を含有しうる。
ＮＤＶ  ＲＳＶ  ＨＲＡ  ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ（下線を付した部分はＲＳＶ  ＨＲＡであり、斜字体部分はＣ末端のＧＣＮ三量体ドメインおよびＨＩＳ６（配列番号１２）アフィニティー精製タグである（配列番号１３））。
【００９８】
【化４】
2014519819.tif 000006
ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質
ＲＳＶのＦ糖タンパク質は、ビリオンのエンベロープと宿主細胞の細胞膜との間の融合を介してウイルスの透過を方向付ける。ＲＳＶのＦ糖タンパク質は、４つの一般的ドメイン：Ｎ末端のＥＲ移行シグナル配列（ＳＳ）、細胞外ドメイン（ＥＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞質テール（ＣＴ）を有するＩ型の１回貫通内在性膜タンパク質である。ＣＴは、単一のパルミトイル化システイン残基を含有する。Ｆタンパク質の配列は、ＲＳＶ分離株の中で高度に保存的であるが、恒常的に進化しつつある（７）。大半のパラミクソウイルスとは異なり、ＲＳＶ中のＦタンパク質は、他のウイルスタンパク質に依存せずに侵入および合胞体形成を媒介しうる（他のパラミクソウイルスでは通例、Ｆに加えてＨＮが必要である）。
【００９９】
ｈＲＳＶ  Ｆ  ｍＲＮＡは、Ｆ０と称する５７４アミノ酸の前駆体タンパク質であって、Ｎ末端において、小胞体内のシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列を含有する前駆体タンパク質へと翻訳される。Ｆ０は、トランスゴルジ網内の細胞性プロテアーゼ（特にフリン）により２つの部位（アミノ酸１０９／１１０および１３６／１３７）で切断され、短いグリコシル化介在型配列を除去し、Ｆ１（約５０ｋＤａ；Ｃ末端；残基１３７〜５７４）およびＦ２（約２０ｋＤａ；Ｎ末端；残基１〜１０９）と称する２つのサブユニットを生成させる（たとえば図４Ａを参照されたい）。Ｆ１は、そのＮ末端において疎水性の融合ペプチドを含有し、また、２つの疎水性７アミノ酸反復領域（ＨＲＡおよびＨＲＢ）も含有する。ＨＲＡは、融合ペプチドの近傍にあり、ＨＲＢは、膜貫通ドメインの近傍にある（たとえば図４Ａを参照されたい）。Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン内でホモ三量体としてアセンブルされる。
【０１００】
ＲＳＶは、単一の血清型として存在するが、２つの抗原亜群であるＡおよびＢを有する。２つの群のＦ糖タンパク質は約９０％同一である。本発明では、Ａ亜群、Ｂ亜群、または両方の亜群の組み合わせもしくはハイブリッドを使用することができる。Ａ亜群の配列例は配列番号１であり（Ａ２株；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ：１３８２５１；Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ０３４２０）、Ｂ亜群の配列例は配列番号２である（１８５３７株；ＧＩ：１３８２５０；Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ１３８４３）。配列番号１および配列番号２はいずれも５７４アミノ酸の配列である。Ａ２株におけるシグナルペプチドはアミノ酸１〜２１であるが、１８５３７株におけるシグナルペプチドはアミノ酸１〜２２である。いずれの配列においても、ＴＭドメインはアミノ酸５３０〜５５０近傍であるが、代替的には５２５〜５４８として報告されている。
【０１０１】
【化５】
2014519819.tif 000007
本発明は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２に対する同一性を有する配列など、あらゆる所望のＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列を使用しうる。典型的に、所望のＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列は、配列番号１または２に対する少なくとも７５％の同一性、たとえば配列番号１または２に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するであろう。配列は、ＲＳＶ中に天然で見いだされうる。
【０１０２】
本発明が、全体または部分においてＦタンパク質の細胞外ドメインを使用する場合、Ｆタンパク質の細胞外ドメインは以下を含みうる：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２２〜５２５近傍を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２３〜５２５近傍を含むポリペプチド、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも７５％の同一性（たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の断片を含むポリペプチドであって、断片が少なくとも１つのＦタンパク質エピトープを含むポリペプチド。断片は通例、少なくとも約１００アミノ酸の長さ、たとえば少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０アミノ酸の長さであろう。
【０１０３】
細胞外ドメインは、シグナルペプチドを有するもしくは有さないＦ０形態であってもよく、または互いと会合している２つの別個のペプチド鎖（たとえばＦ１サブユニットおよびＦ２サブユニット）を含んでもよい、たとえばサブユニットは、ジスルフィド架橋により連結されうる。したがって、アミノ酸１１０〜１３６など、アミノ酸１０１近傍〜１６１近傍の全部または一部が、細胞外ドメインに存在しなくてもよい。したがって、細胞外ドメインは、全体または部分において以下を含みうる：
（ｖ）第１のペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と会合した第２のペプチド鎖であって、第１のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸２２近傍〜アミノ酸１０１近傍に対するまたは配列番号２のアミノ酸２３近傍〜アミノ酸１０１近傍に対する少なくとも７５％の同一性（たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、なおまたは１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含み、第２のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸１６２近傍〜アミノ酸５２５近傍に対するまたは配列番号２のアミノ酸１６２〜５２５近傍に対する少なくとも７５％の同一性（たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、なおまたは１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖、
（ｖｉ）第１のペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と会合した第２のペプチド鎖であって、第１のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸２２近傍〜アミノ酸１０１近傍または配列番号２のアミノ酸２３近傍〜アミノ酸１０９近傍の断片を含むアミノ酸配列を含み、第２のペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸１６２近傍〜アミノ酸５２５近傍または配列番号２のアミノ酸１６１近傍〜アミノ酸５２５近傍の断片を含む、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖。断片のうちの一方または両方が、少なくとも１つのＦタンパク質エピトープを含むであろう。第１のペプチド鎖中の断片は通例、少なくとも２０アミノ酸の長さ、たとえば少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０アミノ酸の長さであろう。第２のペプチド鎖中の断片は通例、少なくとも１００アミノ酸の長さ、たとえば少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０アミノ酸の長さであろう、
（ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）をフリン消化させることにより得ることが可能な分子。
【０１０４】
したがって、本発明と共に使用されるアミノ酸配列は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（たとえばＴＭおよびＣＴを欠く可溶性のＲＳＶ  Ｆタンパク質、配列番号１または２のアミノ酸５２２〜５７４近傍）において天然で見いだされうる、および／または本発明と共に使用されるアミノ酸配列は、天然のＲＳＶ配列と比べて１または複数の（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の）単一のアミノ酸変異（挿入、欠失、または置換）を有しうる。たとえばＦタンパク質を変異させて、それらのフリン切断配列を消失させ、これにより細胞内プロセシングを防止することが公知である。ある実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＴＭおよびＣＴ（配列番号１または２のアミノ酸５２２〜５７４近傍）を欠き、天然のＲＳＶ配列と比べて１または複数の（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の）単一のアミノ酸変異（挿入、欠失、または置換）を含有する。
【０１０５】
フリン切断、トリプシン切断、および融合ペプチドの変異
所望の場合、融合後ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはタンパク質に、１または複数の変異、たとえばフリン切断部位（すなわち配列番号１および２のアミノ酸１０９および１３６）の一方または両方における切断を防止する変異、トリプシン切断部位の切断を防止するもしくはこれを導入する変異、ｐ２７領域における変異および／または融合ペプチドにおける変異を含有させてもよい。このような変異は、可溶性のポリペプチドまたはタンパク質の凝集を防止することができ、これにより精製を容易にすることができ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質がウイルスレプリコン（たとえばアルファウイルスのレプリコン粒子）からの発現などにより細胞の表面において発現する場合、またはＲＳＶ  Ｆタンパク質がウイルス様粒子の成分である場合、細胞間融合を防止することができる。
【０１０６】
適したフリン切断の変異の例は、配列番号１または２のアミノ酸残基１０６〜１０９のＲＡＲＫ（配列番号１４）、ＲＡＲＱ（配列番号１５）、ＱＡＱＮ（配列番号１６）、またはＩＥＧＲ（配列番号１７）との交換を包含する。代替的に、または加えて、配列番号１または２のアミノ酸残基１３３〜１３６を、ＲＫＫＫ（配列番号１８）、ΔΔΔＲ、ＱＮＱＮ（配列番号１９）、ＱＱＱＲ（配列番号２０）、またはＩＥＧＲ（配列番号１７）と交換することもできる（Δは、アミノ酸残基を欠失させたことを示す）。所望の場合、これらのフリン切断の変異を、トリプシン切断の変異および融合ペプチドの変異など、本明細書において記載される他の変異と組み合わせることができる。
【０１０７】
適したトリプシン切断の変異の例は、配列番号１もしくは２の１０１位近傍と１６１位との間のあらゆるリシン残基もしくはアルギニン残基の欠失、またはあらゆるこのようなリシン残基もしくはアルギニン残基のリシンもしくはアルギニン以外のアミノ酸との交換を包含する。たとえばｐ２７領域（配列番号１または２のアミノ酸１１０〜１３６近傍）内のリシン残基および／またはアルギニン残基を、置換するまたはｐ２７領域の全体または部分における欠失を含め欠失させることができる。
【０１０８】
所望の場合、本明細書において記載される変異は、あらゆる組み合わせにより組み合わせることができる。たとえばフリン変異を、融合ペプチド領域の部分的もしくは完全な欠失および／またはＨＲＡもしくはＨＲＢヘリックス領域の欠失と組み合わせることができる。
【０１０９】
上記の変異、たとえばフリン切断および融合ペプチドの変異、あるいは代替的に膜貫通領域および細胞質テールを欠く可溶性ＲＳＶ  Ｆポリペプチドもしくはタンパク質などの可溶性ＲＳＶ  Ｆポリペプチドもしくはタンパク質、またはＨＲＡおよびＨＲＢの欠失、またはシステイン変異に加えて、１または複数のオリゴマー化配列を含有させてもよい。オリゴマー化配列を存在させる場合、それは三量体化配列であることが好ましい。当技術分野では、適したオリゴマー化配列が周知であり、たとえば酵母ＧＣＮ４のロイシンジッパータンパク質のコイルドコイル、バクテリオファージＴ４のフィブリチンに由来する三量体化配列（「フォルドン」）、およびインフルエンザＨＡの三量体ドメインが含まれる。本明細書では、これらの適したオリゴマー化配列および他の適したオリゴマー化配列がより詳細に記載される。
【０１１０】
具体的な実施形態では、ＲＳＶ  Ｆのポリペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端の配列が、４８０位から開始して、
【０１１１】
【化６】
2014519819.tif 000008
である。
【０１１２】
所望の場合、膜貫通領域を含有するＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはタンパク質は、プロテアーゼ切断部位を提供する追加のアミノ酸配列を含有しうる。この種類のＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたはタンパク質は、細胞の表面における発現により作製し、細胞表面からの切断後に適切なプロテアーゼを使用して可溶性形態において回収することができる。一般的に、プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列は、膜貫通ドメインのアミノ末端（配列番号１または２のアミノ酸５２５）から約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３０アミノ酸、約２０アミノ酸、約１０アミノ酸以内に、またはこれに実質的に隣接して配置されるであろう。当技術分野では、市販のプロテアーゼにより切断された多くの適したアミノ酸配列が周知である。たとえばトロンビンは、配列ＬＶＰＲ（配列番号２６）を切断し、因子Ｘａは、配列ＩＥＧＲ（配列番号１７）を切断し、エンテロキナーゼは、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号２７）を切断する。これらのアミノ酸配列を、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドへと導入することができる。
【０１１３】
本発明に従って使用される免疫原性ポリペプチドは通例、単離または精製される。したがって、本発明に従って使用される免疫原性ポリペプチドは、妥当な場合はそれらが通常天然において共に見いだされる分子と会合しないであろう。たとえば本発明と共に使用されるＦタンパク質は、ＲＳＶビリオンの形態にはないであろう（ビロソームまたはＶＬＰなどの人工ビリオンの形態ではありうるが）。
【０１１４】
ポリペプチドは通例、組換え宿主系における発現により調製されるであろう。一般的に、ポリペプチド（たとえばＲＳＶ細胞外ドメイン）は、適した組換え宿主細胞において細胞外ドメインをコードする組換え構築物の発現により作製されるが、あらゆる適した方法を使用することができる。適した組換え宿主細胞には、たとえば昆虫細胞（たとえばＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳動物細胞（たとえばヒト、非ヒト霊長動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯動物（たとえばハムスター）、鳥類細胞（たとえばニワトリ、アヒル、およびガチョウ）、細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種）、酵母細胞（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ属の細胞（たとえばＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはこれらの組み合わせが含まれる。当技術分野では、多くの適した昆虫細胞および哺乳動物細胞が周知である。適した昆虫細胞には、たとえばＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉのＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４親細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するクローン分離株）が含まれる。適した哺乳動物細胞には、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、メイディン−ダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、メイディン−ダービーイヌ腎臓（「ＭＤＣＫ」）細胞（たとえばＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ＢＨＫ２１−Ｆなどのベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨＫＣＣ細胞などが含まれる。適した鳥類細胞には、たとえばニワトリ胚性幹細胞（たとえばＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒル細胞（たとえばＶａｃｃｉｎｅ、２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）およびＷＯ２００５／０４２７２８において記載されている、たとえばＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐ��Ｘ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ））、ＥＢ６６細胞などが含まれる。
【０１１５】
当業者には、バキュロウイルス系などの適した昆虫細胞発現系が公知であり、たとえばＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１５５５号（１９８７年）において記載されている。バキュロウイルス／挿入細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で、とりわけＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから市販されている。当業者にはまた、鳥類細胞発現系も公知であり、たとえば米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許第ＥＰ０７８７１８０Ｂ号；欧州特許出願第ＥＰ０３２９１８１３．８号；ＷＯ０３／０４３４１５；ならびにＷＯ０３／０７６６０１において記載されている。同様に当技術分野ではまた、細菌発現系および哺乳動物細胞発現系も公知であり、たとえばＹｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９年）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【０１１６】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする組換え構築物は、通常の方法を使用して適したベクター内で調製することができる。当技術分野では、昆虫細胞または哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現に適した多数のベクターが周知であり通常のものである。適したベクターは、以下：複製起点；選択マーカー遺伝子；転写制御エレメント（たとえばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１もしくは複数の翻訳シグナルなど、１もしくは複数の発現制御エレメント；ならびに選択された宿主細胞内の分泌経路を標的とするためのシグナル配列もしくはリーダー配列（たとえば哺乳動物を起源とする、または異種哺乳動物もしくは哺乳動物以外の種に由来する）のうちの１または複数が含まれるがこれらに限定されない多数の成分を含有しうる。たとえば昆虫細胞における発現のためには、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適したバキュロウイルス発現ベクターを、組換えバキュロウイルス粒子を作製するために使用する。バキュロウイルス粒子を増幅し、昆虫細胞に感染させて、組換えタンパク質を発現させるために使用する。哺乳動物細胞における発現のためには、所望の哺乳動物の宿主細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞）における構築物の発現を駆動するベクターを使用する。
【０１１７】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドは、あらゆる適した方法を使用して精製することができる。当技術分野では、たとえばイムノアフィニティークロマトグラフィーにより融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを精製するための方法が公知である（Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８５巻：３６７７〜３６８７頁（２００４年））。当技術分野では、沈殿ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、キレート化クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーなどの多様な種類のクロマトグラフィーを含め、所望のタンパク質を精製するのに適した方法が周知である。これらの適した方法または他の適した方法のうちの２つ以上を使用して適した精製スキームを創出することができる。所望の場合、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドは、エピトープタグまたはＨＩＳタグなど、精製を容易にする「タグ」を包含しうる。このようなタグ付けされたポリペプチドは、たとえば馴化培地から、キレート化クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に精製することができる。
【０１１８】
融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはまた、対象の細胞において融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸の発現によって、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいても作製することができる。たとえば本明細書において記載される自己複製ＲＮＡの発現を介する。
【０１１９】
ポリペプチドは、融合前ＲＳＶ配列に加えて追加の配列を包含しうる。たとえばポリペプチドは、精製を容易にする配列（たとえばポリ−Ｈｉｓ配列）を包含しうる。同様に、発現の目的では、Ｆタンパク質の天然のリーダーペプチドを、異なるリーダーペプチドで代用することができる。たとえば参考文献６では、天然のリーダーペプチドの代わりにミツバチのメリチンリーダーペプチドが使用されている。
【０１２０】
自己複製ＲＮＡ
本明細書において記載される融合前ＲＳＶ−Ｆポリペプチドは、対象の細胞においてポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により作製することができる。被験体に投与して融合前ＲＳＶ−Ｆポリペプチドを産生させうる好ましい核酸は、自己複製ＲＮＡ分子である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに基づくが、１または複数の構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く。自己複製ＲＮＡ分子は、翻訳されて、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質および自己複製ＲＮＡによりコードされる異種タンパク質を作製することが可能である。
【０１２１】
自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、また、５’および３’末端シス活性複製配列ならびに所望の場合、所望のアミノ酸配列（たとえばタンパク質、抗原）をコードする異種配列を含む。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターは、自己複製ＲＮＡ中に含むことができる。所望の場合、異種配列は、自己複製ＲＮＡにおける他のコード領域に対してインフレームで融合されてもよいおよび／または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあってもよい。
【０１２２】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘発することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製ＲＮＡにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子が、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｅｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づくものである場合、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子は、取り除くことができる。所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘発するようにまたは１回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。
【０１２３】
自己複製ＲＮＡ分子は、あらゆるタンパク質がなくても、脊椎動物細胞に送達された場合、それ自体からの（またはそれ自体のアンチセンスコピーからの）転写によって複数の娘ＲＮＡの産生を導くことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達した後に、直接翻訳することができ、この翻訳は、送達されたＲＮＡから転写物をその後産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生を導く。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに関してアンチセンスであり、遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすためにそれら自体翻訳されてもよいまたはコードされるＲＳＶ−Ｆポリペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕ発現を提供するために翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物を提供するために転写されてもよい。
【０１２４】
自己複製を達成するのに適したある系は、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらの＋鎖レプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）を産生するために細胞に送達した後に翻訳される。レプリカーゼは、＋鎖送達ＲＮＡのゲノム−鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらの−鎖転写物は、＋鎖の親ＲＮＡのさらなるコピーを提供するために、また、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードするサブゲノム転写物をも提供するために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の翻訳は、したがって、感染細胞によるＲＳＶ−Ｆポリペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕ発現を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【０１２５】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼでありうる。
【０１２６】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことができる。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子（複数可）によって使用され、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。
【０１２７】
したがって、本発明による有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有しうる。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、たとえばさらなる所望の遺伝子産物をコードする、追加の（下流）オープンリーディングフレームを有していてもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の５’配列を有することができる。
【０１２８】
一態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来するまたはそれに基づく。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖ＲＮＡウイルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を含む。
【０１２９】
自己複製ＲＮＡは、送達系と結合させてもよい。自己複製ＲＮＡは、アジュバントと共にまたはなしで、投与されてもよい。
【０１３０】
ＲＮＡ送達系
本発明の自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡ送達または細胞への侵入を容易にする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせたものなどの様々なモダリティーの送達に適している。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した技術を使用して、たとえば直接的な注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃｓ）、およびその他同種のものによって、標的細胞または被験体の中に導入することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第６，０９０，６１９号；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１頁（１９８８年）；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８巻：８８５０頁（１９９１年）を参照されたい。たとえば、米国特許第６，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（たとえば配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有する環状ペプチド）にカップリングされているポリカチオン部分（たとえば３〜１００リシン残基を有するポリＬ−リシン）に核酸を結合することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。
【０１３１】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たとえば米国特許第６，０７１，８９０号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容易にそれを取り込むことができる。
【０１３２】
自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（たとえば単にＲＮＡの水溶液として）送達することができるが、細胞への侵入およびまた続く細胞間の効果をも増強するために、自己複製ＲＮＡは、好ましくは、微粒子またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて投与される。多くの送達系は、当業者らに周知である。そのような送達系は、たとえばリポソームベースの送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３年）国際公開第９３／２４６４０号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻（７号）：６８２〜６９１頁；Ｒｏｓｅ  米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１年）ＷＯ  ９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４巻：７４１３〜７４１４頁）ならびにウイルスベクターの使用（たとえばアデノウイルス（たとえばＢｅｒｎｓら（１９９５年）Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．７７２巻：９５〜１０４頁；Ａｌｉら（１９９４年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１巻：３６７〜３８４頁；およびＨａｄｄａｄａら（１９９５年）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻（Ｐｔ  ３）：２９７〜３０６頁を検討のために参照されたい）、パピローマウイルス、レトロウイルス（たとえばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）２７３１〜２７３９頁；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、（１９９０年）Ｖｉｒｏｌ．１７６巻：５８〜５９頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２３７４〜２３７８頁；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、ならびにＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３年）ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版  Ｐａｕｌ（編）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中の参考文献、ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）前掲を参照されたい）、ならびにアデノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０巻：３８〜４７頁；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９年）米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら  ＷＯ  ９３／２４６４１（１９９３年）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５巻：７９３〜８０１頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｓｔ．９４巻：１３５１頁、およびＳａｍｕｌｓｋｉ（前掲）をＡＡＶベクターの概要について参照されたい；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５巻（１１号）：３２５１〜３２６０頁；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，４巻：２０７２〜２０８１頁；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６４６６〜６４７０頁��ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁もまた、参照されたい）、ならびにその他同種のものを含む。
【０１３３】
３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）無毒性で生分解性のポリマー微粒子、および（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。
【０１３４】
リポソーム
様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包するために、水性環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性の親水性頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有することができる。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表２に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ  ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびドデシルホスホコリンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。
【０１３５】
リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。たとえば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必要があるとは限らない、たとえば、１つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと混合することができる。
【０１３６】
脂質の親水性部分は、ペグ化することができる（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾することができる）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜２８７頁において開示されるものなどの技術を使用してＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
【０１３７】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧ、およびコレステロールの混合物は、本実施例で使用される。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡを被包する。
【０１３８】
リポソームは、３つの群に通常分けられる：多重膜小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；また大型単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、いくつかの別々の水性コンパートメントを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的に、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物については：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。
【０１３９】
適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年．ＩＳＢＮ  １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻．（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２００６年；ならびにＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年を参照されたい。１つの有用な方法は、（ｉ）脂質のエタノール性の溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液、および（ｉｉｉ）緩衝剤を混合し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含む（Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁．）。
【０１４０】
ＲＮＡは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性ＲＮＡ含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含むことができる（たとえばリポソームの表面上に）が、少なくともＲＮＡの半分（理想的には、そのすべて）は、被包される。
【０１４１】
ポリマー微粒子
様々なポリマーは、ＲＮＡを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することができる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることができることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの処方物を調製するのを支援するために滅菌することもできる。
【０１４２】
適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）などのポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）などのラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば２０：８０〜８０：２０、たとえば２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：２５の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものを含む。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば５，０００〜２００，０００Ｄａ、たとえば１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有するものを含む。
【０１４４】
微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。
【０１４５】
適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂｕ  ＆  Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６年．（特に第７章）、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年を参照されたい。ＲＮＡの吸着を容易にするために、微粒子は、たとえばＯ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５巻：９０３７〜９０４３頁；およびＳｉｎｇｈら（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：２４７〜２５１頁において開示されるように、カチオン性界面活性剤および／または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第２００９／１３２２０６号において開示されるように成形し、硬化することによるものである。
【０１４６】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有することができる。ＲＮＡは、微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料（たとえばカチオン性脂質）を含めることによって容易になる。
【０１４７】
水中油型カチオン性エマルジョン
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）、たとえばＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるＭＦ５９（商標）アジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントについて公知である。エマルジョンが１つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、本発明にしたがうＲＮＡ送達は、水中油型エマルジョンを利用し得る。たとえば、カチオン性脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含むことができる。
【０１４８】
エマルジョンは、１つまたは複数の油を含む。適した油（複数可）は、たとえば、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）の油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、および他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。
【０１４９】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚油を例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。
【０１５０】
他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（たとえばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。
【０１５１】
好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含む（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）。
【０１５２】
エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１５３】
エマルジョンの水性成分は、淡水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（たとえばｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それは、緩衝液を形成するための塩（たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸塩）を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１５４】
エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ、たとえばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルアンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２ＢＵ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリＬ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ＾ＧｌｕＰｈＣｎＮ）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃｌ４ＧＩｕＣｎＮ＋）を含むが、これらに限定されない）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンを含むが、これらに限定されない）である。他の有用なカチオン性脂質は、参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ  ２００８／００８５８７０およびＵＳ  ２００８／００５７０８０において記載される。カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【０１５５】
油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商標下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返しのエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）を含むが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１５６】
これらの界面活性剤の混合物、たとえばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物は、エマルジョン中に含むことができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含むことができる。
【０１５７】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積による％）は、２〜２０％、たとえば５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量は、特に有用である。
【０１５８】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、０．００１％〜８％である。たとえば、０．２〜４％、特に０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％、または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート８０など）；０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％のソルビタンエステル（ソルビタントリオレエートなど）；０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）；０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％、または約０．５％のポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）。
【０１５９】
油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながらも、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての４：１〜５：１の重量比は、典型的である（過剰な油）。
【０１６０】
エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ）範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、たとえば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数で）は、直径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これらは、典型的に、動的光散乱および／または単一粒子光学検知法（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の技術、たとえば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能な機器のＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズ、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。
【０１６１】
理想的には、液滴サイズの分布（数による）は、１つの最大値だけを有する、すなわち、２つの最大値を有するのではなく、平均値（モード）のあたりで分布する液滴の単一の集団がある。好ましいエマルジョンは、＜０．４、たとえば０．３、０．２、またはそれ以下の多分散性を有する。
【０１６２】
サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーションの使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行することができる。
【０１６３】
マイクロフルイダイゼーションの代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供することができる。
【０１６４】
好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。
【０１６５】
ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、たとえば０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【０１６６】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロールのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、たとえば２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。
【０１６７】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含んでいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、たとえば１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む。
【０１６８】
カテーテルまたは同様のデバイスは、標的器官または組織の中に、裸のＲＮＡとしてまたは送達系と組み合わせて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を送達するために使用されてもよい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，１８６，７４５号；第５，３９７，３０７号；第５，５４７，４７２号；第５，６７４，１９２号；および第６，１２９，７０５号において開示される。
【０１６９】
本発明は、単独でまたは他の高分子と組み合わせて、たとえば、免疫応答を引き起こすために、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡ分子を送達するために、被包されたまたは吸着された自己複製ＲＮＡを有するリポソーム、ポリマー微粒子、またはサブミクロンエマルジョン微粒子などの適した送達系の使用を含む。本発明は、吸着されたおよび／または被包された自己複製ＲＮＡ分子を有するリポソーム、微粒子、およびサブミクロンエマルジョンならびにその組み合わせを含む。
【０１７０】
本実施例でさらに実証されるように、リポソームおよびサブミクロンエマルジョン微粒子と結合した自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞に有効に送達することができ、自己複製ＲＮＡによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる。
【０１７１】
免疫原性組成物
本発明は、免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、単一の活性の免疫原性作用因子または複数の免疫原性作用因子を包含しうる。たとえば免疫原性組成物は、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたは融合前キメラＲＳＶ  Ｆポリペプチドの組み合わせを含みうる。免疫原性組成物は、融合前ＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡを含むことができ、リポソーム、ポリマー微粒子、水中油型エマルジョン、およびこれらの組み合わせなど、適した送達系も含むことが好ましい。
【０１７２】
本発明の免疫原性組成物はまた、１または複数の免疫調節剤も含む。免疫調節剤のうちの１または複数は、１つまたは複数のアジュバント、たとえば２つ、３つ、４つ以上のアジュバントを包含することが好ましい。アジュバントは、以下においてさらに論じられるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを包含しうる。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質の融合前コンフォメーション内に存在するエピトープを提示するポリペプチドを含む。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、２つの異なる融合前ＲＳＶ以外のＦタンパク質（たとえばメタ肺炎ウイルス、ＰＩＶ５、ＮＤＶなどのパラインフルエンザ）に基づく１または複数の融合前キメラタンパク質であって、いずれのＦタンパク質も同じＲＳＶ  Ｆ中和エピトープをタンパク質表面上で変異させたキメラタンパク質を含む。
【０１７５】
本発明の組成物は、ヒトなどの哺乳動物被験体へと投与するのに適していることが好ましく、アジュバントを含めた１または複数の薬学的に許容される担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を包含する。参考文献２９では、このような成分についての完全な考察が入手可能である。組成物は、一般的に水性形態であろう。組成物が免疫原性組成物である場合、組成物は、ヒトなどの哺乳動物へと投与されると免疫応答を引き起こすであろう。免疫原性組成物を使用して、哺乳動物を免疫化するためのワクチン処方物を調製することができる。
【０１７６】
免疫原性組成物は、単一の活性の免疫原性作用因子または複数の免疫原性作用因子を包含しうる。たとえば融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、完全長ポリペプチドまたは細胞外ドメインポリペプチドであってもよく、単一の形態（たとえば非切断型単量体、切断型単量体、非切断型三量体、切断型三量体）または２つ以上の形態（たとえば非切断型単量体と非切断型三量体との混合物または非切断型単量体と非切断型三量体との間の動的平衡）であってもよい。加えて組成物は、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および１もしくは複数の他のＲＳＶタンパク質（たとえばＧタンパク質および／またはＭタンパク質）を含有してもよく、かつ／または他の病原体に由来する免疫原と組み合わせてもよい。
【０１７７】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの防腐剤を包含しうる。しかし、ワクチンは、水銀性材料を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、たとえばチオメルサール非含有とすることが好ましい。水銀を含有しない免疫原性組成物がより好ましい。防腐剤非含有免疫原性組成物が特に好ましい。
【０１７８】
張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理学的塩を包含することが好ましい。１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在しうる塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましい。存在しうる他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【０１７９】
組成物の重量オスモル濃度は一般的に２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間であり、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に収まるであろう。
【０１８０】
組成物は、１または複数の緩衝液を包含しうる。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントと共に）、またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液は典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で包含される。組成物のｐＨは一般的に５．０〜８．１の間であり、より典型的に、６．０〜８．０の間であり、たとえば６．５〜７．５の間であり、または７．０〜７．８の間であろう。したがって本発明のプロセスは、バルクワクチンのｐＨをパッケージングの前に調整するステップを包含しうる。
【０１８１】
組成物は、無菌であることが好ましい。組成物は、非発熱性であることが好ましく、たとえば１用量当たり＜１ＥＵ（内毒素単位：標準的尺度）を含有し、１用量当たり＜０．１ＥＵを含有することが好ましい。組成物は、グルテン非含有であることが好ましい。ヒトワクチンは、典型的に約０．５ｍｌの投与容積で投与するが、小児には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与することができる。
【０１８２】
アジュバント
ＲＳＶ−ＦポリペプチドまたはＲＳＶ−Ｆポリペプチドをコードする核酸を含有する本発明の組成物はまた、組成物を受ける患者において引き起こされる免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能しうる、１つまたは複数のアジュバント、たとえば２つ、３つ、４つ以上のアジュバントも包含しうる。アジュバントには、ＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれうる。本発明の組成物中で使用しうるアジュバントには、以下が含まれるがこれらに限定されない：
・ミネラル含有組成物。本発明におけるアジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物には、カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはこれらの混合物）などの無機塩が含まれる。本発明は、水酸化物（たとえばオキシ水酸化物）、リン酸塩（たとえばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など、または異なるミネラル化合物のあらゆる適した形態（たとえばゲル、結晶質、アモルファスなど）を取る化合物との混合物であり、吸着によることが好ましい混合物などの無機塩を包含する。カルシウム塩には、リン酸カルシウム（たとえば参考文献３８において開示される「ＣＡＰ」粒子）が含まれる。アルミニウム塩には、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが含まれる。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子としても調合することができる（３９）。アルミニウム塩アジュバントは、以下においてより詳細に記載される。
【０１８３】
・油エマルジョン組成物（より詳細には以下を参照されたい）。本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物には、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと調合される５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０および０．５％のＳｐａｎ）などのスクアレン−水エマルジョンが含まれる。
【０１８４】
・サイトカイン誘発剤（より詳細には以下を参照されたい）。本発明における使用に適したサイトカイン誘発剤には、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニスト（たとえばＷＯ２００９／１１１３３７において開示されるベンゾナフチリジン化合物）が含まれる。
【０１８５】
・広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、茎、根、およびまた花において見いだされるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であるサポニン（参考文献７４の２２章）。Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物には、ＱＳ２１などの精製処方物の他、ＩＳＣＯＭなどの脂質処方物も含まれる。ＱＳ２１は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）として市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技法を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含めた特定の精製画分が同定されている。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。参考文献４０では、ＱＳ２１を作製する方法が開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールも含む（４１）。サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる（参考文献７４の２３章）。ＩＳＣＯＭはまた典型的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も包含する。あらゆる公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣのうちの１または複数を包含することが好ましい。参考文献４１〜４３では、ＩＳＣＯＭがさらに記載されている。任意選択により、ＩＳＣＯＭは、追加の洗浄剤を欠くこともできる（４４）。参考文献４５および４６では、サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説を見いだすことができる。
【０１８６】
・水中油型エマルジョン、腸内細菌のリポ多糖、リン脂質化合物（合成のリン脂質二量体であるＥ６０２０など）などに由来する修飾天然リピドＡを含めた脂肪アジュバント（より詳細には以下を参照されたい）。
【０１８７】
・細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（たとえばＥ．ｃｏｌｉの易熱性腸内毒素「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）、ならびにＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２（４７）として公知の変異体毒素など、これらの解毒誘導体。参考文献４８では、解毒ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用が記載されており、参考文献４９では、非経口アジュバントとしての使用が記載されている。
【０１８８】
・エステル化されたヒアルロン酸のマイクロスフェア（５０）またはキトサンおよびその誘導体（５１）などの生体接着剤および粘膜接着剤。
【０１８９】
・生体分解性で非毒性である材料（たとえばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）であって、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましく、任意選択により、負に帯電させた表面を有するように処理した（たとえばＳＤＳにより）、または正に帯電させた表面を有するように処理した（たとえばＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤により）材料から形成される微粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、または直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。
【０１９０】
・リポソーム（参考文献７４の１３および１４章）。参考文献５２〜５４では、アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例が記載されている。
【０１９１】
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（５５）。このような処方物には、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（５６）の他、オクトキシノールなど、少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（５７）がさらに含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ−８−ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１９２】
・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、またはＴｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）などのムラミルペプチド。
【０１９３】
・第２のグラム陰性菌に由来するリポ糖調製物と組み合わせた第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質のプロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）調製物であって、外膜タンパク質のプロテアソーム調製物およびリポ糖調製物が安定な非共有結合的アジュバント複合体を形成する調製物。このような複合体は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜およびリポ多糖からなる複合体である「ＩＶＸ−９０８」を包含する。
【０１９４】
・ポリオキシドニウムポリマー（５８、５９）または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【０１９５】
・メチルイノシン５’−一リン酸（「ＭＩＭＰ」）（６０）。
【０１９６】
・以下の式を有するピロリジジン化合物またはこれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体など、ポリヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｘｌａｔｅｄ）ピロリジジン化合物（６１）：
［式中、Ｒは、水素、直鎖状または分枝状で、非置換または置換で、飽和または不飽和のアシル基、アルキル（たとえばシクロアルキル）基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基を含む群から選択される］。例には、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１９７】
・α−グリコシルセラミド（６２〜６９）（たとえばα−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなどのＣＤ１ｄリガンド。
【０１９８】
・アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）などのガンマイヌリン（７０）またはその誘導体。
【０１９９】
・ウイロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）。これらの構造は一般的に、ウイルスに由来する１または複数のタンパク質であって、任意選択により、リン脂質と組み合わせたまたは調合されたタンパク質を含有する。それらは一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に天然のウイルスゲノムのうちのいずれも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されうるまたは全ウイルスから単離されうる。ウイロソームまたはＶＬＰにおいて使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質など）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が含まれる。
【０２００】
参考文献７４および７５では、これらのアジュバント−活性物質および他のアジュバント−活性物質がより詳細に論じられている。
【０２０１】
組成物は、２つ、３つ、４つ以上のアジュバントを包含しうる。たとえば本発明の組成物は、水中油型エマルジョンおよびサイトカイン誘発剤の両方、またはミネラル含有組成物およびサイトカイン誘発剤の両方、または２つの水中油型エマルジョンアジュバント、または２つのベンゾナフチリジン化合物などを包含すると有利でありうる。
【０２０２】
組成物中の抗原およびアジュバントは典型的に、混合物中に存在するであろう。
【０２０３】
油エマルジョンアジュバント
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物には、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと調合される５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５）などのスクアレン−水エマルジョンが含まれる。また、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）も使用することができる。
【０２０４】
多様な水中油型エマルジョンが公知であり、それらには典型的に、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、これらの油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生体分解性（代謝可能）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般的に直径が５μｍ未満であり、直径がなおサブミクロンの可能性もあり、これらの小型のサイズは、安定なエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーにより達成される。サイズが２２０ｎｍ未満の液滴は、濾過滅菌に供することができるので好ましい。
【０２０５】
本発明は、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来する油などの油と共に使用することができる。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀類が含まれる。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油が、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油には、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが含まれる。穀類の群では、コーン油が最も容易に入手可能であるが、また、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなど、他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）の油も用いてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、天然では種子油中に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料を加水分解、分離、およびエステル化することにより調製することができる。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明を実施するのに使用することができる。当技術分野では、動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化、および他の手段のための手順が周知である。大半の魚類は、容易に回収しうる代謝可能な油を含有する。たとえばタラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本発明において使用しうる複数の魚油を例示する。多数の分枝鎖油が５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、これらを一般的にテルペノイドと称する。サメ肝油は、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンであるスクアレンとして公知の分枝状の不飽和テルペノイドを含有し、これは本発明では特に好ましい。また、スクアレンに対する飽和アナログであるスクアランも、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当技術分野において公知の方法により得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロールである（以下を参照されたい）。油の混合物も使用することができる。
【０２０６】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤のＨＬＢは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５であり、より好ましくは少なくとも１６である。本発明は、以下が含まれるがこれらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと称する）、とりわけポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売される、酸化エチレン（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、および／または酸化ブチレン（ＢＯ）のコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動しうるオクトキシノールであって、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深いオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）など、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般的に公知）。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に包含するのに好ましい界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ  ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０２０７】
界面活性剤の混合物、たとえばＴＷＥＥＮ  ８０（商標）／Ｓｐａｎ  ８５混合物を使用することができる。また、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ  ８０（商標））などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールとの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールに加えてラウレス９を含む。
【０２０８】
界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＴＷＥＥＮ  ８０（商標）など）が０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤など）が０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）が０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％であり、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【０２０９】
本発明と共に有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントには、以下が含まれるがこれらに限定されない：
・スクアレン、ＴＷＥＥＮ  ８０（商標）、およびＳｐａｎ  ８５のサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの容積による組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ  ８５でありうる。重量では、これらの比が、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ  ８５となる。このアジュバントは、参考文献７４の１０章および参考文献７５の１２章においてより詳細に記載される通り、「ＭＦ５９」として公知である（７１〜７３）。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、たとえば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を包含すると有利である。
【０２１０】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴＷＥＥＮ  ８０（商標）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を包含しうる。エマルジョンはまた、Ｓｐａｎ  ８５（たとえば１％で）および／またはレシチンをも包含しうる。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴＷＥＥＮ  ８０（商標）を有することができ、スクアレン：トコフェロールの重量比は、これがより安定なエマルジョンを提供するので、＜１であることが好ましい。スクアレンとＴＷＥＥＮ  ８０（商標）とは、約５：２の容積比で存在させうる。１つのこのようなエマルジョンは、ＴＷＥＥＮ  ８０（商標）をＰＢＳ中に溶解させて２％の溶液をもたらし、次いで、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで、この混合物をマイクロフルイダイズすることにより作製することができる。結果として得られるエマルジョンは、たとえば平均直径が１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍであるサブミクロンの油滴を有しうる。
【０２１１】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（たとえばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照されたい）をも包含しうる。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有しうる。
【０２１２】
・ポリソルベート（たとえばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（たとえばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（たとえばα−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０（たとえば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）の質量比で包含することができ、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分のあらゆる寄与を包含するべきである。エマルジョンはまた、スクアレンも包含しうる。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照されたい）も包含しうる。水性相は、リン酸緩衝液を含有しうる。
【０２１３】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中で調合することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰと共に使用されている（７６）（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバント中のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用することができる（７７）（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０２１４】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（たとえばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（たとえばソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ  ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、熱可逆性であり、かつ／または油滴のうちの少なくとも９０％（容積で）のサイズが２００ｎｍ未満であることが好ましい。エマルジョンはまた、アルジトール、凍結防止薬剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（たとえばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１または複数も包含しうる。このようなエマルジョンを、凍結乾燥しうる。
【０２１５】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献７８において記載される通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０２１６】
・非代謝可能油（軽鉱油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）など）と少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、ＴＷＥＥＮ  ８０（商標）、またはＳｐａｎ  ８０など）とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性コンジュゲート（参考文献７９において記載され、脂肪族アミンを、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、デスアシルサポニンへと付加することにより作製されるＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤を包含することができる。
【０２１７】
・鉱油、非イオン性の親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性の親水性界面活性剤（たとえばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン。
【０２１８】
・鉱油、非イオン性の親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性の親油性界面活性剤（たとえばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン。
【０２１９】
・サポニン（たとえばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（たとえばコレステロール）とをヘリックスミセルとして会合させたエマルジョン（８０）。
【０２２０】
エマルジョンは、抗原と送達時に即席で混合しうる。したがって、アジュバントおよび抗原は、パッケージまたは配布されるワクチンにおいて、使用時の最終処方物のための用意ができた状態で別個に保持しうる。抗原は一般的に水性形態にあり、ワクチンは、２つの液体を混合することにより最終的に調製される。混合するための２つの液体の容積比は、変動させることができる（たとえば５：１〜１：５の間で）が、一般的には約１：１である。
【０２２１】
サイトカイン誘発剤
本発明の組成物中に包含するためのサイトカイン誘発剤は、患者へと投与すると、インターフェロンおよびインターロイキンを含めたサイトカインを放出するように免疫系を引き起こすことが可能である。好ましい薬剤は、インターフェロン−γ；インターロイキン１；インターロイキン２；インターロイキン１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦのうちの１または複数の放出を引き起こすことができる。好ましい薬剤は、Ｔｈ１型の免疫応答、たとえばインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン２と関連するサイトカインの放出を引き起こす。インターフェロン−γおよびインターロイキン２の両方の刺激が好ましい。
【０２２２】
したがって、本発明の組成物を受ける結果として、患者は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質により刺激されると、抗原特異的な様式で所望のサイトカイン（複数可）を放出するＴ細胞を有するであろう。たとえばそれらの血液から精製されるＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＦタンパク質へと露出されると、γ−インターフェロンを放出するであろう。当技術分野では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のこのような応答を測定するための方法が公知であり、これらには、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、およびリアルタイムＰＣＲが含まれる。たとえば参考文献８１は、破傷風トキソイドに対する抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答、とりわけ、γ−インターフェロン応答がモニターされる研究を報告し、ＥＬＩＳＰＯＴが抗原特異的ＴＴ誘発性応答を自発的応答から区別する最も感度が高い方法であるが、フローサイトメトリーによる細胞質内のサイトカイン検出が再刺激効果を検出する最も効率的な方法であることを見いだした。
【０２２３】
適したサイトカイン誘発剤には、以下が含まれるがこれらに限定されない：
・ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によりグアノシンへと連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、または回文配列を含有するオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【０２２４】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（また「ＭＰＬ（商標）」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）（８２〜８５）。
【０２２５】
・ＩＭＩＱＵＩＭＯＤ（商標）（「Ｒ−８３７」）（８６、８７）、ＲＥＳＩＱＵＩＭＯＤ（商標）（「Ｒ−８４８」）（８８）、およびそれらのアナログ；ならびにこれらの塩（たとえば塩酸塩）などのイミダゾキノリン化合物。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献８９〜９３において見いだすことができる。
【０２２６】
・（ａ）以下の式を有する化合物：
［式中、
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＨＮ（Ｒ９）２、−ＳＲ７、−（ＣＨ２）ｎＯＲ７、−（ＣＨ２）ｎＲ７、−ＬＲ８、−ＬＲ１０、−ＯＬＲ８、−ＯＬＲ１０、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル［式中、Ｒ４のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択によりハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ７、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、および−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８から独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
各Ｌは独立に、結合、−（Ｏ（ＣＨ２）ｍ）ｔ−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、およびＣ２〜Ｃ６アルキニレン［式中、ＬのＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、およびＣ２〜Ｃ６アルキニレンは各々、任意選択によりハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から独立に選択される１つ〜４つの置換基で置換されている］から選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル［式中、Ｒ７のＣ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択により１つ〜３つのＲ１３基で置換されている］から選択され；
各Ｒ８は独立に、Ｈ、−ＣＨ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシ［式中、Ｒ８のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシ基は各々、任意選択により−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＲ９、−ＯＲ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
各Ｒ９は独立に、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択される、または各Ｒ９は独立に、付着したＮと一緒になってＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルを形成するＣ１〜Ｃ６アルキル［式中、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環は、任意選択によりＮ、Ｏ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を含有し、式中、Ｒ９のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、またはＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択により−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］であり；
各Ｒ１０は独立に、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリール［式中、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリール基は任意選択によりハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２から選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
Ｒ１１およびＲ１２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル［式中、Ｒ１１およびＲ１２のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択によりハロゲン、−ＣＮ、Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシから独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
またはＲ１１およびＲ１２は各々独立にＣ１〜Ｃ６アルキルであり、付着したＮ原子と一緒になって、任意選択によりＮ、Ｏ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を含有する、任意選択により置換されるＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環を形成し；
各Ｒ１３は独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−ＯＬＲ９、−ＬＲ１０、−ＬＯＲ１０、−ＯＬＲ１０、−ＬＲ８、−ＬＯＲ８、−ＯＬＲ８、−ＬＳＲ８、−ＬＳＲ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ１０、−ＬＯＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１１、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ８、−ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｒ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ８ＯＨ、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２および−ＯＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択され；
各ＲＡは独立に、−Ｒ８、−Ｒ７、−ＯＲ７、−ＯＲ８、−Ｒ１０、−ＯＲ１０、−ＳＲ８、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−Ｃ（ＮＯＲ８）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）３Ｒ８、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＳＯ２Ｒ８、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ９）２、および−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８から選択される、または環Ａ上の２つの隣接するＲＡ置換基は、最大２つのヘテロ原子を環員として含有する５〜６員環を形成し；
ｎは各出現において独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、または８であり；
各ｍは独立に、１、２、３、４、５、および６から選択され；
ｔは、１、２、３、４、５、６、７、または８である］
；（ｂ）以下の式を有する化合物：
［式中、
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＨＮ（Ｒ９）２、−ＳＲ７、−（ＣＨ２）ｎＯＲ７、−（ＣＨ２）ｎＲ７、−ＬＲ８、−ＬＲ１０、−ＯＬＲ８、−ＯＬＲ１０、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル［式中、Ｒ４のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択によりハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ７、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、および−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８から独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
各Ｌは独立に、結合、−（Ｏ（ＣＨ２）ｍ）ｔ−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、およびＣ２〜Ｃ６アルキニレン［式中、ＬのＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、およびＣ２〜Ｃ６アルキニレンは各々、任意選択によりハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から独立に選択される１つ〜４つの置換基で置換されている］から選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル［式中、Ｒ７のＣ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択により１つ〜３つのＲ１３基で置換されている］から選択され；
各Ｒ８は独立に、Ｈ、−ＣＨ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシ［式中、Ｒ８のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケン、Ｃ２〜Ｃ８アルキン、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシ基は各々、任意選択により−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＲ９、−ＯＲ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
各Ｒ９は独立に、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択される、または各Ｒ９は独立に、付着したＮと一緒になってＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキルを形成するＣ１〜Ｃ６アルキル［式中、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環は、任意選択によりＮ、Ｏ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を含有し、式中、Ｒ９のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、またはＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択により−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］であり；
各Ｒ１０は独立に、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリール［式中、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリール基は任意選択によりハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２から選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
Ｒ１１およびＲ１２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル［式中、Ｒ１１およびＲ１２のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は各々、任意選択によりハロゲン、−ＣＮ、Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシから独立に選択される１つ〜３つの置換基で置換されている］から選択され；
またはＲ１１およびＲ１２は各々独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、付着したＮ原子と一緒になって、任意選択によりＮ、Ｏ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を含有する、任意選択により置換されたＣ３〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル環を形成し；
各Ｒ１３は独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−ＯＬＲ９、−ＬＲ１０、−ＬＯＲ１０、−ＯＬＲ１０、−ＬＲ８、−ＬＯＲ８、−ＯＬＲ８、−ＬＳＲ８、−ＬＳＲ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ１０、−ＬＯＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１１、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ８、−ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｒ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ８ＯＨ、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２および−ＯＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択され；
各ＲＡは独立に、−Ｒ８、−Ｒ７、−ＯＲ７、−ＯＲ８、−Ｒ１０、−ＯＲ１０、−ＳＲ８、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−Ｃ（ＮＯＲ８）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）３Ｒ８、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＳＯ２Ｒ８、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ９）２、および−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８から選択され；
ｎは各出現において独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、または８であり；
各ｍは独立に、１、２、３、４、５、および６から選択され；
ｔは、１、２、３、４、５、６、７、または８である］
；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のうちのいずれかの薬学的に許容される塩などのベンゾナフチリジン化合物。
【０２２７】
他のベンゾナフチリジン化合物、およびベンゾナフチリジン化合物を作製する方法は、ＷＯ２００９／１１１３３７において記載されている。ベンゾナフチリジン化合物またはその塩は、それ自体でまたは１もしくは複数のさらなる化合物と組み合わせて使用することができる。たとえばベンゾナフチリジン化合物は、水中油型エマルジョンまたはミネラル含有組成物と組み合わせて使用することができる。具体的な実施形態では、ベンゾナフチリジン化合物を、水中油型エマルジョン（たとえばＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン）またはミネラル含有組成物（たとえばアルミニウム塩またはカルシウム塩などの無機塩）と組み合わせて使用する。
【０２２８】
・参考文献９４において開示されるチオセミカルバゾン化合物などのチオセミカルバゾン化合物。参考文献９４にはまた活性化合物を調合し、製造し、これについてスクリーニングする方法も記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生させるためにヒト末梢血単核細胞を刺激するときに特に有効である。
【０２２９】
・参考文献９５において開示されるトリプタントリン化合物などのトリプタントリン化合物。参考文献９５にはまた活性化合物を調合し、製造し、これについてスクリーニングする方法も記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生させるためにヒト末梢血単核細胞を刺激するときに特に有効である。
【０２３０】
・ヌクレオシドアナログ、例えば、（ａ）Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献９６〜９８において開示される化合物；（ｆ）以下の式を有する化合物：
［式中、
Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｒ３は、非存在、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は各々独立に、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキルである、または併せて結合して以下のＲ４〜５：
Ｒ４〜５
［結合は、ａにより示される結合において達成される］と同様の５員環を形成し；
Ｘ１およびＸ２は各々独立に、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、またはＲ９ａ［式中、Ｒ９ａは以下：
Ｒ９ａ
［結合は、ａにより示される結合において達成される］
である］であり；
Ｒ１０およびＲ１１は各々独立に、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
各ＲａおよびＲｂは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６〜１０アリールであり；
各Ｒｃは独立に、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり；
各Ｒｄは独立に、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ６〜１０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートであり；
各ｎは独立に、０、１、２、または３であり；
各ｐは独立に、０、１、または２である］
；または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの互変異性体、もしくはこの互変異性体の薬学的に許容される塩。
【０２３１】
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）（９９）。
【０２３２】
・以下を含めた、参考文献１００において開示される化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物（１０１、１０２）、ヒドロフタルアミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物（１０３）、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンズアゾール化合物（１０４）。
【０２３３】
・参考文献１０５において開示される化合物。
【０２３４】
・ＲＣ−５２９などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（１０６、１０７）。
【０２３５】
・たとえば参考文献１０８および１０９において記載されるポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）などのホスファゼン。
【０２３６】
・以下などの低分子免疫強化剤（ＳＭＩＰ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロパ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−［４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【０２３７】
本発明において使用するためのサイトカイン誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストでありうる。たとえば本発明において使用するためのサイトカイン誘発剤は、ヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９タンパク質のうちの１または複数のアゴニストでありうる。好ましい薬剤は、ＴＬＲ４のアゴニスト（たとえば腸内細菌のリポ多糖に由来する修飾天然リピドＡ、合成のリン脂質二量体であるＥ６０２０などのリン脂質化合物）、ＴＬＲ７のアゴニスト（たとえばベンゾナフチリジン、イミダゾキノリン）、および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの薬剤は、生得的免疫経路を活性化するのに有用である。
【０２３８】
サイトカイン誘発剤は、その作製時の多様な段階において組成物へと添加することができる。たとえばサイトカイン誘発剤を抗原組成物中に存在させてもよく、次いで、この混合物を水中油型エマルジョンへと添加することができる。代替法としては、サイトカイン誘発剤を水中油型エマルジョン中に存在させてもよいが、この場合、サイトカイン誘発剤を、乳化前のエマルジョン成分へと添加する、または乳化後のエマルジョンへと添加することができる。同様に、サイトカイン誘発剤は、エマルジョン液滴中でコアセルベート化してもよい。サイトカイン誘発剤の最終組成物内の場所および分布は、その親水性／親油性特性に依存し、たとえばサイトカイン誘発剤は、水性相中、油性相中、および／または油水間界面に位置することができる。
【０２３９】
サイトカイン誘発剤は、抗原（たとえばＣＲＭ１９７）など、別個の作用因子へとコンジュゲートすることができる。低分子のためのコンジュゲーション技法の一般的総説は、参考文献１１０に提供されている。代替法としては、アジュバントを追加の薬剤と、疎水性またはイオン性相互作用を介するなど、非共有結合的に会合させてもよい。
【０２４０】
好ましいサイトカイン誘発剤は、（ａ）ベンゾナフチリジン（ｂｅｎｚｏｎａｐｔｈｒｉｄｉｎｅ）化合物、（ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および（ｃ）３ｄＭＰＬである。
【０２４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／アナログを包含することができ、二本鎖または（ＲＮＡの場合を除き）一本鎖でありうる。参考文献１１１、１１２、および１１３は、可能なアナログ置換、たとえばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる交換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１４〜１１９においてさらに論じられている。ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ（１２０）など、ＴＬＲ９へと方向付けられうる。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）など、Ｔｈ１免疫応答を誘発するのに特異的であってもよく、またはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど、Ｂ細胞応答を誘発するのにより特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１２１〜１２３において論じられている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体を認識するために接触可能であるように構築することが好ましい。任意選択により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端において接合して「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してもよい。たとえば参考文献１２０および１２４〜１２６を参照されたい。有用なＣｐＧアジュバントは、またＰＲＯＭＵＮＥ（商標）（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知のＣｐＧ７９０９である。
【０２４２】
ＣｐＧ配列を使用することの代替法として、またはこれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することもできる（１２７）。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくともよい。
【０２４３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンに富んでもよい。たとえば免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つを超える連続するチミジンヌクレオチド（たとえば参考文献１２７において開示されるＴＴＴＴ）を含んでもよく、かつ／または＞２５％のチミジン（たとえば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してもよい。たとえば免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つを超える連続するシトシンヌクレオチド（たとえば参考文献１２７において開示されるＣＣＣＣ）を含んでもよく、かつ／または＞２５％のシトシン（たとえば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくともよい。
【０２４４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも２０ヌクレオチドを含むであろう。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１００より少ないヌクレオチドを含みうる。
【０２４５】
３ｄＭＰＬ（また３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元性末端グルコサミンの３位を脱アシル化したアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａの七炭糖を欠く変異体から調製されており、リピドＡに化学的に類似するが、酸不安定性のホスホリル基および塩基不安定性のアシル基を欠く。３ｄＭＰＬは、単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含めた複数のサイトカインの放出を刺激する（また、参考文献１２８も参照されたい）。３ｄＭＰＬの調製は、元は参考文献１２９において記載された。
【０２４６】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化（たとえば異なる長さでありうる３、４、５、または６つのアシル鎖を有する）により変動する類縁分子の混合物の形態を取ることができる。２つのグルコサミン（また２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知である）単糖は、それらの２位の炭素において（すなわち２位および２’位において）Ｎ−アシル化し、また３’位におけるＯ−アシル化も存在する。２位の炭素へと接合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。２’位の炭素へと接合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。３’位の炭素へと接合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は、以下の通りである：
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立に、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは８〜１６の間、より好ましくは９〜１２の間であり、最も好ましくは１０である。
【０２４７】
基Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’は各々独立に、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４［式中、Ｒ４は、−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３［式中、ｍの値は、好ましくは８〜１６の間であり、より好ましくは１０、１２、または１４である。２位において、ｍは、１４であることが好ましい。２’位において、ｍは、１０であることが好ましい。３’位において、ｍは、１２であることが好ましい］である］でありうる。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’は、ドデカン酸、テトラデカン酸、またはヘキサデカン酸に由来する−Ｏ−アシル基であることが好ましい。
【０２４８】
Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のすべてが−Ｈであれば、３ｄＭＰＬは、アシル鎖を３つだけ（２位、２’位、および３’位の各々において１つずつ）有する。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちの２つだけが−Ｈであれば、３ｄＭＰＬは、４つのアシル鎖を有しうる。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちの１つだけが−Ｈであれば、３ｄＭＰＬは、５つのアシル鎖を有しうる。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちのいずれも−Ｈでなければ、３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有しうる。本発明に従って使用される３ｄＭＰＬアジュバントは、３つ〜６つのアシル鎖を有するこれらの形態の混合物でありうるが、混合物中に６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬを包含し、特にヘキサアシル鎖形態が全３ｄＭＰＬのうちの重量で少なくとも１０％、たとえば＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％以上を構成することを確実にすることが好ましい。６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬは、最も高いアジュバント活性形態であることが見いだされている。
【０２４９】
したがって、本発明の組成物中に包含するのに最も好ましい３ｄＭＰＬの形態は、以下に示される式（ＩＶ）を有する。
【０２５０】
３ｄＭＰＬを混合物の形態において使用する場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に対する言及は、混合物中の組み合わされた３ｄＭＰＬ分子種を指す。
【０２５１】
水性条件において、３ｄＭＰＬは、たとえば直径が＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍである、異なるサイズのミセル凝集物または粒子を形成しうる。これらの一方または両方を、本発明と共に使用することができ、日常的アッセイによりより良好な粒子を選択することができる。本発明に従う使用のためには、それらの優れた活性のために、より小型の粒子（たとえば３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液をもたらすのに十分な程度に小型の）が好ましい（１３０）。好ましい粒子の平均直径は、２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満であり、平均直径は、なお１００ｎｍ未満でもありうる。しかし、大半の場合、平均直径が５０ｎｍを下回ることはないであろう。これらの粒子は、濾過滅菌に適するのに十分な程度に小型である。粒子の直径は、粒子の平均直径を明らかにする日常的な動的光散乱技法により評価することができる。粒子の直径がｘｎｍであるといわれる場合、一般的にこの平均の近傍に粒子の分布が見られるが、粒子の数で少なくとも５０％（たとえば＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％以上）の直径はｘ＋２５％の範囲内にあるであろう。
【０２５２】
３ｄＭＰＬは、水中油型エマルジョンと組み合わせると有利に使用することができる。３ｄＭＰＬの実質的にすべては、エマルジョンの水性相中に位置させることができる。
【０２５３】
３ｄＭＰＬは、それ自体でまたは１もしくは複数のさらなる化合物と組み合わせて使用することができる。たとえば３ｄＭＰＬをＱＳ２１サポニン（１３１）（水中油型エマルジョンを含めた（１３２））免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム（１３３）、水酸化アルミニウム（１３４）、またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて使用することが公知である、
式（ＩＶ）  。
【０２５４】
脂肪アジュバント
本発明と共に使用しうる脂肪アジュバントは、上記の水中油型エマルジョンを包含し、またたとえば以下も包含する：
・「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」たとえば：
ＥＲ８０４０５７
ＥＲ−８０３０２２
など、参考文献１３５において規定される式Ｉ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ：
Ｉ  ＩＩ  ＩＩＩ
のリン脂質化合物またはその塩。ＥＲ８０４０５７はまた、Ｅ６０２０とも呼ばれている。式Ｉ、ＩＩ、もしくはＩＩＩのリン脂質化合物またはその塩は、それ自体でまたは１もしくは複数のさらなる化合物と組み合わせて使用することができる。たとえば式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物は、水中油型エマルジョンまたはミネラル含有組成物と組み合わせて使用することができる。具体的な実施形態では、Ｅ６０２０を、水中油型エマルジョン（たとえばＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン）またはミネラル含有組成物（たとえばアルミニウム塩またはカルシウム塩などの無機塩）と組み合わせて使用する。
【０２５５】
・ＯＭ−１７４など、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するリピドＡの誘導体（参考文献１３６および１３７において記載される）。
【０２５６】
・アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパナミニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（商標）」）、またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパナミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）など、カチオン性脂質と（通例中性の）共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）との処方物。（＋）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（シン−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウム塩を含有する処方物が好ましい（１３８）。
【０２５７】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（上記を参照されたい）。
【０２５８】
・ＴＬＲ４アンタゴニストであるＥ５５６４など、ホスフェート含有非環状骨格へと連結された脂質を含有する化合物（１３９、１４０）：
・グリセリルシステインに基づくリポペプチドなどのリポペプチド（すなわち１または複数の脂肪酸残基および２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物）。このようなペプチドの特定の例には、以下の式の化合物が含まれる：
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は、任意選択によりまた酸素官能基でも置換された、８〜３０個、好ましくは１１〜２１個の炭素原子を有する飽和または不飽和、脂肪族または脂肪族−環状脂肪族混合の炭化水素ラジカルを表し、Ｒ３は、水素またはラジカルＲ１−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−［式中、Ｒ１ は、上記と同じ意味を有し、Ｘは、ペプチド連結により結合し、遊離カルボキシ基、エステル化されたカルボキシ基、もしくはアミド化されたカルボキシ基を有するアミノ酸、または末端カルボキシ基が、遊離形態、エステル化形態、もしくはアミド化形態にある２〜１０アミノ酸のアミノ酸配列を表す］を表す。ある実施形態では、アミノ酸配列が、Ｄ−アミノ酸、たとえばＤ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）またはＤ−ガンマ−カルボキシ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌａ）を含む］。
【０２５９】
細菌のリポペプチドは一般的に、ＴＬＲ６の関与を必要とすることなくＴＬＲ２を認識する。（ＴＬＲは、共同的に作用して多様なトリガーの特異的な認識をもたらし、ＴＬＲ６に加えたＴＬＲ２が併せてペプチドグリカンを認識するのに対し、ＴＬＲ２はＴＬＲ６なしにリポペプチドを認識する。）細菌のリポペプチドは、場合によって天然のリポペプチドおよび合成のリポペプチドとして分類される。合成のリポペプチドは、同様に挙動する傾向があり、主にＴＬＲ２により認識される。
【０２６０】
アジュバントとしての使用に適したリポペプチドには、以下の式を有する化合物が含まれる：
［式中、＊で標識したキラル中心および＊＊＊で標識したキラル中心のいずれもがＲ立体配置にあり；＊＊で標識したキラル中心は、ＲまたはＳ立体配置にあり；
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは独立に、任意選択により酸素官能基で置換された７〜２１個の炭素原子を有する、脂肪族もしくは環状脂肪族−脂肪族の炭化水素基である、またはＲ１ａおよびＲ１ｂのうちの１つはＨであるがいずれもがＨであるわけではなく；
Ｒ２は、１〜２１個の炭素原子を有し、任意選択により酸素官能基で置換された脂肪族もしくは環状脂肪族の炭化水素基であり；
ｎは、０または１であり；
Ａｓは、−Ｏ−Ｋｗ−ＣＯ−または−ＮＨ−Ｋｗ−ＣＯ−［式中、Ｋｗは、１〜１２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である］を表し；
Ａｓ１は、Ｄ−またはＬ−アルファ−アミノ酸であり；
Ｚ１およびＺ２は各々独立に、アミノ−（低級アルカン）−スルホン酸またはＤ−およびＬ−アルファアミノカルボン酸ならびにアミノ−低級アルキル−スルホン酸から選択される最大６アミノ酸を有するペプチドのＤ−またはＬ−アルファアミノ酸の−ＯＨまたはＮ末端ラジカルを表し；
Ｚ３は、Ｈまたは−ＣＯ−Ｚ４［式中、Ｚ４は、アミノ−（低級アルカン）−スルホン酸またはＤおよびＬ−アルファアミノカルボン酸ならびにアミノ−低級アルキル−スルホン酸から選択される最大６アミノ酸を有するペプチドのＤ−またはＬ−アルファアミノ酸の−ＯＨまたはＮ末端ラジカルである；またはこのような化合物のカルボン酸から形成されるエステルもしくはアミドである］である。適したアミドは、−ＮＨ２およびＮＨ（低級アルキル）を包含し、適したエステルは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルエステルを包含する。（本明細書において使用される低級アルキルまたは低級アルカンは、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状または分枝状アルキルを指す）］。
【０２６１】
このような化合物は、ＵＳ４，６６６，８８６においてより詳細に記載されている。具体的な一実施形態では、リポペプチドが以下の式を有する。
【０２６２】
リポペプチド分子種の別の例は、ＬＰ４０と呼ばれ、ＴＬＲ２のアゴニストである（Ａｋｄｉｓら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３３巻：２７１７〜２６頁（２００３年））。
【０２６３】
リポペプチド分子種は、ムレインリポタンパク質と称する、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するリポペプチドの公知のクラスと類縁である。Ｈａｎｔｋｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４巻：２８４〜２９６頁（１９７３年）では、ムレインリポペプチドと呼ばれるタンパク質のある部分的な分解産物が記載されている。これらはＮ−アセチルムラミン酸へと連結されたペプチドを含み、したがって、Ｂａｓｃｈａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４５巻（２０号）：６３３１〜６３６０頁（１９８９年）において記載されているムラミルペプチドと類縁である。
【０２６４】
アルミニウム塩アジュバント
「水酸化アルミニウム」および「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントを使用することができる。これらの名称は通常のものであるが、便宜のためだけに使用されるものである。なぜなら、どちらも存在する実際の化合物の正確な記述ではないからである（たとえば参考文献７４の９章を参照されたい）。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントのうちのいずれかを使用することができる。
【０２６５】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的に、通例少なくとも部分的に結晶質であるアルミニウムオキシ水酸化物塩である。式ＡｌＯ（ＯＨ）により表されうるオキシ水酸化アルミニウムは、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３など、他のアルミニウム化合物から、赤外線（ＩＲ）分光法により、特に１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１における強いショルダーの存在（参考文献７４の９章）により識別することができる。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶度は、より小型の晶子サイズに起因してより大きな線の広がりを示す低結晶質粒子による回折バンドの半値幅（ＷＨＨ）により反映される。表面積は、ＷＨＨが増大するのに応じて増大し、ＷＨＨがより高値のアジュバントは、抗原吸着能がより大きいことが認められている。繊維状の形状（たとえば透過型電子顕微鏡写真において見られる）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に、約１１である、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を帯びる。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４においてＡｌ＋＋＋１ｍｇ当たり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の間の吸着能が報告されている。
【０２６６】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的に、しばしばまた少量の硫酸塩も含有するヒドロキシリン酸アルミニウム（すなわちヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）である。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿時の反応条件および濃度が、塩中のヒドロキシルのホスフェートへの置換度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に、ＰＯ４／Ａｌのモル比が０．３〜１．２の間である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在により厳密なＡｌＰＯ４から識別することができる。たとえばＩＲスペクトルの３１６４ｃｍ−１におけるバンド（たとえば２００℃まで加熱した場合の）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す（参考文献７４の９章）。
【０２６７】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋のモル比は、一般的に０．３〜１．２の間、好ましくは０．８〜１．２の間であり、より好ましくは０．９５＋０．１であろう。リン酸アルミニウムは、一般的に、特にヒドロキシリン酸塩では、アモルファスであろう。典型的なアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌのモル比が０．８４〜０．９２の間の、１ｍｌ当たり０．６ｍｇのＡｌ３＋で含まれた、アモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的に、粒子状（たとえば透過型電子顕微鏡写真において見られる平板様の形状）である。粒子の典型的な直径は、あらゆる抗原吸着の後で０．５〜２０μｍ（たとえば約５〜１０μｍ）の範囲にある。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４においてＡｌ＋＋＋１ｍｇ当たり０．７〜１．５ｍｇのタンパク質の間の吸着能が報告されている。
【０２６８】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートへの置換度と逆相関し、この置換度は、沈殿により塩を調製するために使用される反応物の反応条件および濃度に応じて変動しうる。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させる（より多くのホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）ことによって、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝液を添加することによっても改変される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムのＰＺＣは、一般的に４．０〜７．０の間、より好ましくは５．０〜６．５の間で、たとえば約５．７であろう。
【０２６９】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（たとえばリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液）を含有しうるが、これが常に必要なわけではない。懸濁液は、無菌であり、発熱物質非含有であることが好ましい。懸濁液は、たとえば１．０〜２０ｍＭの間、好ましくは５〜１５ｍＭの間、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離水性リン酸イオンを包含しうる。懸濁液はまた、塩化ナトリウムも含みうる。
【０２７０】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、水酸化アルミニウムより多くのリン酸アルミニウムが、たとえば少なくとも２：１、たとえば＞５：１、＞６：１、＞７：１、＞８：１、＞９：１などの重量比で存在しうる。
【０２７１】
患者へと投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、たとえば＜５ｍｇ／ｍｌ、＜４ｍｇ／ｍｌ、＜３ｍｇ／ｍｌ、＜２ｍｇ／ｍｌ、＜１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌの間である。１用量当たり最大０．８５ｍｇであることが好ましい。
【０２７２】
１つまたは複数のアルミニウム塩アジュバントを包含する他、アジュバント成分は、１つまたは複数のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤も包含しうる。このような追加の成分には、ベンゾナフチリジン化合物、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／または水中油型エマルジョンが含まれるがこれらに限定されない。３ｄ−ＭＰＬは、また、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとも称されている。この名称は、モノホスホリルリピドＡにおける還元性の末端グルコサミンの３位が脱アシル化されることを示す。３ｄ−ＭＰＬは、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａの七炭糖を欠く変異体から調製されており、リピドＡに化学的に類似するが、酸不安定性のホスホリル基および塩基不安定性のアシル基を欠く。３ｄ−ＭＰＬは、単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含めた複数のサイトカインの放出を刺激する。３ｄ−ＭＰＬの調製は、元は参考文献１２９において記載されており、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより、名称ＭＰＬ（商標）で製品が製造および販売されている。さらなる詳細は、参考文献８２〜８５において見いだすことができる。
【０２７３】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は特に小児において有用であり、抗原は一般的にこれらの塩へ吸着する。水中スクアレンエマルジョンはまた、特に高齢者においても好ましい。有用なアジュバントの組み合わせは、ＣｐＧとミョウバン、またはｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄとミョウバンなど、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントとの組み合わせを包含する。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを使用することができる。使用しうる他の組み合わせには、ミョウバンとベンゾナフチリジン化合物またはＳＭＩＰ、水中スクアレンエマルジョン（ＭＦ５９など）とベンゾナフチリジン化合物またはＳＭＩＰ、およびＥ６０２０とＭＦ５９などの水中スクアレンエマルジョン）またはミョウバンが含まれる。
【０２７４】
本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方を引き起こしうる。
【０２７５】
ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の２つの種類のＴ細胞が、一般的に細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／または増強するために必要であると考えられている。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現させることができ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と一般的に称する。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原を認識する、またはこれと相互作用することが可能である。
【０２７６】
ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現させることができ、ヘルパーＴ細胞と一般的に称する。ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子へと結合した抗原性ペプチドを認識することが可能である。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインなどの因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与する他の細胞を活性化することができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセット：それらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型へとさらに分けることができる。
【０２７７】
活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫（抗原特異的ＣＴＬの産生の増大を含めた）を増強し、したがって細胞内感染に対する応答において特に価値がある。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βのうちの１または複数を分泌しうる。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することにより局所的炎症反応を結果としてもたらしうる。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２によりＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することにより免疫応答を拡大させるようにも作用しうる。ＴＨ１により刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌しうる。
【０２７８】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体の産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する応答において価値がある。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のうちの１または複数を分泌しうる。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および将来の防御のためのメモリーＢ細胞の産生を結果としてもたらしうる。
【０２７９】
免疫応答の増強は、ＴＨ１免疫応答の増強およびＴＨ２免疫応答のうちの１または複数を包含しうる。
【０２８０】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増大、ＴＨ１免疫応答と関連するサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βなど）のうちの１もしくは複数の増大、活性化されたマクロファージの増大、ＮＫ活性の増大、またはＩｇＧ２ａの産生の増大のうちの１または複数を包含しうる。ＴＨ１免疫応答の増強は、ＩｇＧ２ａの産生の増大を包含することが好ましい。
【０２８１】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して引き起こすことができる。ＴＨ１アジュバントは、一般的にＩｇＧ２ａ産生レベルの、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比べた上昇を引き起こすであろう。本発明において使用するのに適したＴＨ１アジュバントには、たとえばサポニン処方物、ウイロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが含まれうる。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本発明において使用するのに好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０２８２】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連するサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０など）のうちの１もしくは複数の増大、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の産生の増大のうちの１または複数を包含しうる。ＴＨ２免疫応答の増強は、ＩｇＧ１の産生の増大を包含することが好ましい。
【０２８３】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して引き起こすことができる。ＴＨ２アジュバントは、一般的にＩｇＧ１産生レベルの、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比べた上昇を引き起こすであろう。本発明において使用するのに適したＴＨ２アジュバントには、たとえばミネラル含有組成物、油エマルジョン、ならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体が含まれる。アルミニウム塩などのミネラル含有組成物は、本発明において使用するのに好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０２８４】
組成物は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを包含しうる。このような組成物は、アジュバントを用いない免疫化と比べたＴＨ１応答の増強およびＴＨ２応答の増強、すなわちＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生の両方の産生の増大を引き起こすことが好ましい。ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一のアジュバントによる免疫化と比べた（すなわちＴＨ１アジュバント単独による免疫化またはＴＨ２アジュバント単独による免疫化と比べた）ＴＨ１免疫応答の増大および／またはＴＨ２免疫応答の増大を引き起こすことがさらにより好ましい。
【０２８５】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方でありうる。免疫応答は、ＴＨ１応答の増強およびＴＨ２応答の増強の一方または両方を提供することが好ましい。
【０２８６】
免疫応答の増強は、全身性免疫応答および粘膜性免疫応答の一方または両方でありうる。免疫応答は、全身性免疫応答の増強および粘膜性免疫応答の増強の一方または両方を提供することが好ましい。粘膜性免疫応答は、ＴＨ２免疫応答であることが好ましい。粘膜性免疫応答は、ＩｇＡの産生の増大を包含することが好ましい。
【０２８７】
処置方法および投与方法
本発明の組成物は、哺乳動物へと投与するのに適し、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、本発明の組成物（たとえば免疫原性組成物）を哺乳動物へと投与するステップを含む方法を提供する。組成物（たとえば免疫原性組成物）を使用して、哺乳動物を免疫化するためのワクチン処方物を作製することができる。哺乳動物は典型的にヒトであり、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は典型的にヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質である。しかし、哺乳動物は、ウシＲＳＶに感染した可能性のあるウシなど、ＲＳＶ感染に対して感受性の任意の他の哺乳動物でありうる。たとえば免疫応答は、精製ＲＳＶ  Ｆタンパク質、アルファウイルス粒子、または自己複製ＲＮＡの投与後に惹起されうる。
【０２８８】
本発明はまた、各々がタンパク質表面上で変異させた同じＲＳＶ  Ｆ中和エピトープを有する、２つ以上の異なるＲＳＶ以外の（たとえばパラインフルエンザウイルス、メタ肺炎ウイルス）Ｆ融合前タンパク質（すなわちＰＩＶ５およびＮＤＶ）に基づく２つ以上の融合前キメラタンパク質の使用も提供する。したがって１つのキメラ融合前Ｆによる接種、および第２の融合前Ｆによる第２の接種は、複数の抗体（ある抗体はＲＳＶに対し、ある抗体は鋳型のタンパク質骨格に対する）を刺激（ｐｒｉｍｅ）しうる。第２の接種は、共有されるＲＳＶ  Ｆ中和エピトープだけの追加免疫に付勢しうる。
【０２８９】
本発明はまた、たとえば患者をＲＳＶ感染に対して免疫化するときに使用するための医薬として使用するための本発明の組成物も提供する。
【０２９０】
本発明はまた、上記のポリペプチドの、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における使用も提供する。
【０２９１】
これらの方法および使用により惹起される免疫応答は、一般的には抗体応答、好ましくは防御的抗体応答を包含する。当技術分野では、ＲＳＶワクチン接種の後で抗体応答を評価するための方法が周知である。
【０２９２】
本発明の組成物は、筋内注射（たとえば腕部または脚部への）、皮下注射、鼻腔内投与、経口投与、皮内投与、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与など、多数の適した方式で投与することができる。適切な投与経路は、哺乳動物の年齢、健康、および他の特徴に依存するであろう。医師は、これらの因子および他の因子に基づき、適切な投与経路を決定することが可能であろう。
【０２９３】
免疫原性組成物およびワクチン処方物を使用して、小児および妊婦を含めた成人の両方を処置することができる。したがって、被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でありうる。ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢者（たとえば＞５０歳、＞６０歳、好ましくは＞６５歳）、若年者（たとえば４〜６歳、＜５歳など、＜６歳）、および妊婦である。ワクチンは、これらの群だけに適しているわけではなく、集団中でより一般的に使用することができる。
【０２９４】
処置は、単回の用量スケジュールまたは複数回の用量スケジュールを介することができる。複数回の用量は、初回の免疫化スケジュールおよび／または追加免疫の免疫化スケジュールにおいて使用することができる。複数回の用量スケジュールでは、同じ経路または異なる経路の多様な用量、たとえば非経口による初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および経粘膜による追加免疫、経粘膜による初回刺激および非経口による追加免疫などを施すことができる。免疫学的にナイーブな患者においては、１回を超える用量（典型的には２回の用量）の投与が特に有用である。複数回の用量は典型的に、少なくとも１週間間隔（たとえば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）で投与することになる。
【０２９５】
本発明の組成物を使用して作製されるワクチン処方物は、他のワクチンと実質的に同時に（たとえば医療従事者またはワクチン接種施設への同じ診療または来訪時に）患者へと投与することができる。
【０２９６】
一般
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の他、「〜から成る」および「〜から本質的に成る」を包含し、たとえばＸ「を含む」組成物は、Ｘからもっぱら成ってもよく、または追加の何か、たとえばＸ＋Ｙを包含してもよい。
【０２９７】
語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、たとえばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から取り除くことができる。
【０２９８】
数値ｘとの関連における用語「約」は、たとえばｘ±１０％を意味する。
【０２９９】
具体的に述べない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、任意の特定の混合する順序を必要としない。したがって、成分は、あらゆる順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いと組み合わせることができ、次いで組み合わせを、第３の成分などと組み合わせることができる。
【０３００】
動物（特にウシ）材料を細胞の培養において使用する場合、これらの材料は、伝染性海綿状脳症（ｅｎｃａｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ）（ＴＳＥ）を含まず、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体として、動物に由来する材料の完全な非存在下において細胞を培養することが好ましい。
【０３０１】
化合物を組成物の一部として体内へと投与する場合、代替的にこの化合物を適したプロドラッグと交換することもできる。
【０３０２】
細胞基材を再集合または逆遺伝学手順のために使用する場合、この細胞基材は、たとえば欧州薬局方（Ｐｈ  Ｅｕｒ）、総則５．２．３章にあるように、ヒトワクチンの作製における使用について承認されている細胞基材であることが好ましい。
【０３０３】
ポリペプチド配列間の同一性は、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップエクステンションペナルティー＝１のパラメータを使用するアフィンギャップ探索を使用するＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実装されているスミス−ウォーターマン相同性探索アルゴリズムにより決定することが好ましい。
【０３０４】
表２：リン脂質
ＤＤＰＣ  １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ  １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ  １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ  １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ  １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ  １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ  １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ  １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ  １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ  １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ  １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＭＰＥ  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ  １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＯＰＡ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰｙＰＥ  １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＳＰＥ  １，２−ジオステアルピル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＥＰＣ  卵ＰＣ
ＨＥＰＣ  水素添加卵ＰＣ
ＨＳＰＣ  高純度水素添加大豆ＰＣ
ＨＳＰＣ  水素添加大豆ＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ  ＭＹＲＩＳＴＩＣ  １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＰＡＬＭＩＴＩＣ  １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＳＴＥＡＲＩＣ  １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ  １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ  １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ  １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ  １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ  １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセリン）．．．］
ＰＳＰＣ  １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ  １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ  １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ  １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン  。
【実施例】
【０３０５】
１．融合後構造および融合前モデル
融合後ＲＳＶ  Ｆ構造
安定で非凝集性で可溶性のＲＳＶ  Ｆサブユニット抗原を、融合ペプチド、膜貫通領域、および細胞質ドメインの欠失により調製した（図１）。この作出されたＦを効率的に発現させ、容易に精製した。ネガティブ染色された検体についての電子顕微鏡法は、この作出されたＦが非凝集性で均一の松葉杖形の分子を形成し、融合後Ｆ三量体と符合することを示した（図２Ａ）。この作出されたＦ三量体は安定であり、円偏光二色性分光法は、９５℃までの温度で著明な融解を明らかにしなかった（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【０３０６】
このＲＳＶ  Ｆタンパク質は結晶化しており、分子交換および３回の非結晶学的対称性（ｎｏｎ−ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）（ＮＣＳ）平均化を介してその構造を決定した（表３および図３）。この構造は、ｐ２７断片（切断されると失われる２つのフリン部位間のペプチド）、融合ペプチド、膜貫通領域、または細胞質ドメインを包含しない（図４）。
【０３０７】
【表２】
2014519819.tif 000009
融合後ＲＳＶ  Ｆの全体のアーキテクチャーは、他の融合後パラインフルエンザ融合タンパク質と共通である。このタンパク質は、３つの緊密に絡み合ったサブユニットから構成され、球体状ヘッドおよび細長いストークを形成する。各サブユニットは、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩと称する３つのドメインを含有する（図４Ａ〜Ｃ）。ドメインＩおよびＩＩは、三量体ヘッドのトップにあり、冠状の三角形を形成する。ドメインＩＩＩは、ヘッドの基部を形成する。長いヘリックスであるＨＲＡは、ドメインＩＩＩから伸長して、ストークの中心において三量体のコイルドコイルを形成する。ＨＲＢヘリックスは、ドメインＩＩへと繋留され、ストークのヘッドに対する遠位末端へと到達し、そこで、ＨＲＡの内側コイルドコイルと共に６ヘリックスバンドルの外側コイルを形成する。完全長Ｆでは、疎水性の融合ペプチド（ＨＲＡに対してＮ末端）および膜貫通領域（ＨＲＢに対してＣ末端）が、ストークの底部で並置され、標的細胞膜へと挿入されるであろう。
【０３０８】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）Ｆタンパク質、およびパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）Ｆタンパク質のドメインＩおよびＩＩは、構造的に保存されている（図５Ａおよび５Ｂ）。それらの共通のβシートと比べた著明な差違は、ドメインＩの唯一のヘリックスの方向だけに存在する（ＲＳＶ  Ｆのη３およびＰＩＶ３  ＦおよびＰＩＶ５  Ｆのα６）。これに対し、ＲＳＶ  ＦのドメインＩＩＩは、パラインフルエンザベースのモデル化からは予測されなかった特色を有する（図６）。ＲＳＶ  ＦドメインＩＩＩの４本鎖のβシートとＰＩＶ３  ＦドメインＩＩＩの４本鎖のβシートとを重ね合わせたところ、ドメインのヘリックス領域内で鍵となる差違が明らかである。ヘリックスＨＲＡは、ＰＩＶ３  Ｆ内よりＲＳＶ  Ｆ内のよりＮ末端に近い位置においてよじれており、ストークの回転と比べたヘッドの回転に約６０°の差違を引き起こしている（図６Ａ、６Ｂ、６Ｄ）。また、インフルエンザヘマグルチニンも、それらのストークの方向と比べたそれらのヘッドの方向において変動し、亜型間の回転の差違が３０°〜５０°である（Ｈａ，  Ｙ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２１巻、８６５〜８７５頁（２００２年））。
【０３０９】
ＲＳＶ  ＦドメインＩＩＩのヘリックスバンドル領域は、余剰のヘリックス（α６）を含有し、バンドル化されたヘリックスの方向を、パラインフルエンザＦにおけるヘリックスの方向と比べて変化させている（図６Ａ〜Ｃおよび図１）。ＲＳＶ  Ｆのヘリックスα５とα６とは、ほぼ平行であり、三量体表面上に露出されており、ＰＩＶ３ヘリックスバンドルにおけるＲＳＶ  Ｆのα６ヘリックスの同等物（α５：図６Ｃ）は、三量体のサブユニット間界面に包埋されている。ＲＳＶ  Ｆのヘリックスα５とα６とは、類縁の中和抗体であるパリビズマブおよびモタビズマブが結合するエピトープを形成する。モタビズマブのＦａｂと、α５およびα６を包含する２４残基のＲＳＶ  Ｆペプチドとの間の複合体の構造が報告されている（ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１７巻、２４８〜２５０頁（２０１０年））。この構造と融合後ＲＳＶ  Ｆ構造との比較により、α５ヘリックス−α６ヘリックス間の緊密なマッチが明らかとなった（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．＝０．５２Å；図７Ａ）。これらのヘリックスに基づく２つの構造の重合せにより、モタビズマブと融合後ＲＳＶ  Ｆとの間の複合体がモデル化される（図７Ｂ）。このモデルは、モタビズマブ（またはおそらくパリビズマブ）が融合後ＲＳＶ  Ｆへと結合することを防止する立体障害を明らかにしない。表面プラズモン共鳴を使用して、溶液中の融合後Ｆの細胞外ドメインへのパリビズマブの結合（４．２×１０−１０ＭのＫＤ）が確認された。
【０３１０】
融合前および融合後のパラインフルエンザＦ構造は全体で、ドメインのシフトならびにＨＲＡおよびＨＲＢの大規模な再構成を明らかにする。融合前ＰＩＶ５  Ｆ構造のドメインＩＩＩ（唯一報告されている融合前パラインフルエンザＦ構造）では、ＨＲＡが、長い融合後ＨＲＡヘリックスではなく、３つのα−ヘリックスおよび２つのβ−ストランドへとフォールドする（Ｙｉｎ，  Ｈ．  Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４３９巻、３８〜４４頁（２００６年））。しかし、個別のパラインフルエンザＦタンパク質ドメインの融合前および融合後のコンフォメーションを比較すると、再構成されない部分は、良好に重ね合わされる。融合後ＲＳＶ  Ｆドメインをそれらの融合前のＰＩＶ５  Ｆの対応物へと重ね合わせたところ、大きな不調和を結果としてもたらさず、ドメイン間のジスルフィド結合を形成するすべてのシステイン対を近接して配置した（図８Ｂ）。
【０３１１】
結果として得られる融合前ＲＳＶ  Ｆモデルは、ＰＩＶ５融合前ドメイン構造に基づく融合前ＲＳＶ  Ｆドメインをモデル化することからは明らかでない特色を明らかにする（ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１７巻、２４８〜２５０頁（２０１０年））。モタビズマブのエピトープのヘリックスは、融合後ＲＳＶ  Ｆの三量体上にあるのと同様、融合前ＲＳＶ  Ｆ三量体の表面においても露出される（図９）。最新の融合前ＲＳＶ  Ｆモデルでは、β４とＨＲＣ（ドメインＩＩＩの部分）とを接続するループであれば、パリビズマブまたはモタビズマブの、このエピトープへの接触を妨げるであろう。しかし、このループは、抗体の結合を可能とする代替的なコンフォメーションを取るのに十分な可撓性を有しうる（図９Ｂ）。
【０３１２】
ＲＳＶ  Ｆの抗原性構造は、多様な技法によりマッピングされている（図１）。最もよく記載されているエピトープクラスターがＡおよびＣと称され（Ｂｅｅｌｅｒ，  Ｊ．  Ａ．およびｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，  Ｋ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６３巻、２９４１〜２９５０頁（１９８９年））、その他のものも提案されている。ＲＳＶ  Ｆ三量体上における部位の露出は疑問に付されたが、モタビズマブのペプチド構造により部位Ａの場所が裏付けられ（ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１７巻、２４８〜２５０頁（２０１０年））、１０１Ｆ中和抗体へと結合したＲＳＶ  Ｆペプチドの結晶構造（残基４２２〜４３６）により部位Ｃの場所が裏付けられた（ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８４巻、１２２３６〜１２２４４頁（２０１０年））。ＲＳＶ  Ｆの融合後構造および融合前ＲＳＶ  Ｆモデルは、部位ＡおよびＣが依然として露出され、いずれのコンフォメーションにおいても構造的に類似することを示す（図８Ａおよび８Ｂ）。ＲＳＶ  Ｆの融合前モデルおよび融合後構造に対する１０１Ｆ−ペプチド複合体の重合せにより、いずれのコンフォメーションにおいても１０１ＦはＦと不調和でないことが確認された（図１０）。
【０３１３】
付録では、ＲＳＶ  Ｆの融合後構造およびＰＩＶ５の融合前構造に対する配列／ドメインアライメントに基づくＲＳＶ  Ｆ融合前モデルのＰＤＢファイルが提供される。このＰＤＢファイルは、融合前モデルのための原子座標を含有し、分子の可視化および分析に適したソフトウェアを使用して（たとえばＲｏｇｅｒ  ＳａｙｌｅおよびＥ．  Ｊａｍｅｓ  Ｍｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ、「ＲａｓＭｏｌ：  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＴＩＢＳ）、１９９５年９月、２０巻、９号、３７４頁）モデルを表示することができる。モデルには、融合ペプチドおよびＨＲＡ領域をＰＩＶ５の場合と同様にフォールドさせてＤＩＩＩとの著明な接触をもたらす３つのサブユニット鎖が含有される。３つのサブユニットのＨＲＢ領域は、融合前ストークへと三量体化され、ＤＩおよびＤＩＩと会合する。
【０３１４】
２．ＨＲＢヘリックスの欠失を介する融合後６ヘリックスバンドルの不安定化
ＨＲＢ欠失構築物を、融合後コンフォメーションの形成を防止するように設計した。この戦略に取り組むために、２つの構築物を設計した。第１の構築物は、Ｄｅｌ  ＨＲＢと呼ばれるＨＲＢ領域（ＲＳＶ  Ｆの残基１〜４８３）を欠く野生型の細胞外ドメインである。
【０３１５】
以下に提示される配列は、シグナルペプチドおよびＨＩＳタグ（ＧＧＳＡＧＳＧＨＨＨＨＨＨ；配列番号３）を含有する。本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、以下に示されるアミノ酸配列であって、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグを有するまたは有さない配列を含有しうる。
【０３１６】
【化７】
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上記の配列は、両方のフリン切断部位を未改変で有し、細胞によりプロセシングされることが予想された。加えて、上記の配列は、野生型の融合ペプチド配列も有する。かつての実験では、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメインベースのタンパク質が細胞により切断され、融合ペプチドを含有すれば、それらは、ＲＳＶ  Ｆロゼットの形態にある細胞残屑を伴う可溶性の凝集物を形成した。この構築物が融合前コンフォメーションのままであれば（融合後コンフォメーションに必要とされると考えられるＨＲＢヘリックスの欠如に起因して）、融合ペプチドはＲＳＶ  Ｆヘッドドメイン内に包埋され、ロゼット凝集物を形成しないはずである。この構築物を、発現させ、アフィニティー精製により精製し、ＥＭ分析により評価した（図１２）。
【０３１７】
ＳＥＣカラム上の空隙容量におけるその移動、ならびにＥＭ顕微鏡写真の両方により、この構築物が、融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質により形成されるロゼットと類似するロゼットを形成したことが明らかである。その伸長ヘリックス形成においてＨＲＡを安定化させるのにＨＲＢが必要とされる（ＨＲＡペプチドが三量体を形成しないことが観察されるので）と仮説が立てられていたので、この結果は驚くべきことであった。したがって、本発明者らは、互いとまたは細胞残屑と結合する融合ペプチドが、それらの伸長、融合後形成においてＨＲＡヘリックスを安定化させていると仮説を立てた。
【０３１８】
本発明者らは、ＤｅｌＨＲＢ構築物の融合後様表現型が、融合ペプチドの互いとの結合または細胞残屑との結合により、ＨＲＡを伸長ヘリックスへと安定化することに起因すると仮説を立てた。この仮説を検証するため、本発明者らは、ＤｅｌＨＲＢと類似するが、本発明者らによる融合後三量体と符合する融合ペプチドの欠失を有する以下の構築物を生成させている（ｄｅｌＨＲＢ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ：下記）。本発明者らは、ＥＭ顕微鏡法により構築物の表現型を検証して、構築物が、文献において公表されている棒付きキャンデー表現型の球体形状と類似する融合前ヘッド形状を形成する場合、それがＤｅｌＨＲＢのロゼットにおいて観察される融合後様表現型の松葉杖様構造と類似する松葉杖様構造を形成するかどうかを見るであろう。
【０３１９】
以下に提示される配列は、シグナルペプチドおよびＨＩＳタグ（ＧＧＳＡＧＳＧＨＨＨＨＨＨ；配列番号３）を含有する。本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、以下に示されるアミノ酸配列であって、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグを有するまたは有さないアミノ酸配列を含有しうる。
【０３２０】
【化８】
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３．鎖内ジスルフィド結合形成による融合前安定化
ＲＳＶ  Ｆ融合後構造およびＰＩＶ５の融合前構造に基づくＲＳＶ  Ｆモデルを、ＲＳＶ  Ｆを融合前コンフォメーションにおいて安定化させるジスルフィド結合の形成を意図するシステイン変異を作出するために使用した（図１１）。鎖内ジスルフィド結合構築物を発現させ、細胞から培地へと分泌させ、次いで、Ｆ０からＦ１／Ｆ２へと多様な程度まで切断した（図１４）。ＲＳＶ  Ｆ  Ｔ５８Ｃ／Ｖ１６４Ｃ（哺乳動物細胞内で発現させる）は、培地へと分泌される切断型分子種として発現することが見いだされた。この材料をキレート化精製により精製し、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ２５０  ＳＥＣカラムを移動相としての２×ＰＢＳと共に使用するロゼット／三量体ＨＰＬＣ−ＳＥＣアッセイにより評価した（図１５）。これは、融合ペプチドを含有する切断型Ｆであるので、融合後形態にあり、ロゼットを形成し、融合後ＲＳＶ  Ｆロゼットと類似する空隙容量内を移動することが予想された（図１５Ａ）。融合ペプチドを保有する切断型Ｆタンパク質が融合前形態においてフォールドしたとすれば、その融合ペプチドは、ロゼット形成を防止する融合前ヘッド領域内に包埋されることが予想されるであろう。融合前三量体ならば、融合ペプチドを欠くＲＳＶ  Ｆ融合後三量体と類似する保持時間で、包含容量内を移動するはずである（図１５Ｂ）。ＲＳＶ  Ｆ  ＨＲＡ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｔ５８Ｃ  Ｖ１６４ＣにＨＰＬＣ−ＳＥＣを流過させたところ、材料の大半は、カラムの空隙容量内を移動したことから、材料は凝集するまたは融合後Ｆのロゼットを形成することが示された。このタンパク質のより小さい部分は、Ｆ三量体と符合する保持時間で包含容量内を移動したことから、一部の材料は所望の安定化された融合前Ｆを形成することが示唆された。
【０３２１】
その後、ジスルフィド構築物をバキュロウイルス発現ベクターへとクローニングし、３つの構築物（ＨＲＡ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ  Ｎ１６５Ｃ／Ｖ２９６ＣおよびＫ１６８Ｃ／Ｖ２９６Ｃ、ならびにＨＲＢ  Ｍ３９６Ｃ／Ｆ４８３Ｃ）を発現させた。哺乳動物細胞内で発現させると切断されたＫ１６８Ｃ／Ｖ２９６ＣおよびＭ３９６Ｃ／Ｆ４８３Ｃが、昆虫細胞では主に非切断型分子種として分泌された（抗ＨＩＳウェスタンブロットにより示される）。いずれの構築物も、空隙画分内を移動したが、これは、非切断型分子種が単量体として流過するかつての観察と符合しなかった。タンパク質は、不適正なジスルフィド形成を介して凝集した可能性がある。抗ＨＩＳウェスタンを使用するゲルシフト分析（図１６）は、鎖内ジスルフィド結合が形成されないことを示唆した。ＳＥＣの空隙画分から採取された純粋な材料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析したところ、各タンパク質は約５０％が切断型であることが見いだされた（図１６）。第３のジスルフィド構築物を発現させたところ、ウェスタンブロットにより判定される通り、Ｎ１６５Ｃ／Ｖ２９６Ｃは、主に所望の切断型産物として分泌された（図１６Ａ）。
【０３２２】
４．ＲＳＶ−ＮＤＶキメラサブユニットのさらなる開発のためのＮＤＶ  Ｆ融合前構造
ＲＳＶ  ＨＲＡ融合前エピトープをレスキューするための戦略を開発して、ＮＤＶ  Ｆ融合前構築物を生成させ、ＨＲＡの選択された残基を、ＲＳＶ  Ｆの残基へと変異させた。ＮＤＶのＨＲＡをＲＳＶのＨＲＡと交換する初期の試みは、細胞からは発現しない／分泌されない構築物を生成させた。これは、タンパク質がミスフォールドすることを示した。変異誘発に利用可能なＮＤＶ  Ｆ残基（すなわちタンパク質表面上に位置するもの）のさらなる精緻化が必要とされた。ＳＥＣ分析により、新たな構築物である、ＧＣＮ三量体化ドメインにより安定化されたＮＤＶ  Ｆ（非切断型）は、三量体として移動した。この構築物が融合前三量体であることは電子顕微鏡法により示されていたので、このことは予想されていた（Ｓｗａｎｓｏｎら、２０１０年）。
【０３２３】
５．ＮＤＶ融合前構築物と関連するＨＲＢおよび融合ペプチドを欠失させたＲＳＶ  ＦのＥＭ分析
融合ペプチドを保有するＨＲＢ欠失ＲＳＶ  Ｆを生成させ、タンパク質を精製した。構築物は、ＲＳＶ  Ｆロゼットと符合する、ＳＥＣカラムの空隙容量内を移動した。構築物をＥＭにより評価したところ、融合後ＲＳＶ  Ｆと類似するロゼットを形成することが示された（図１８Ａ）。ＨＲＢおよび融合ペプチドの両方を欠失させたＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰ）を生成させ、発現させ、精製した。ＨＲＢおよび融合ペプチドを欠失させたＲＳＶ  Ｆは、ＳＥＣ上を部分的に三量体として流過した（図１８Ｂ）。ゲル分析は、ＲＳＶ  Ｆ  ｄｅｌ−ＨＲＢおよびＤｅｌ−ＦＰが、凝集／ロゼットピーク内および三量体ピーク内の両方を移動することを示した（図１８Ｃ）。比較のために述べると、非切断型ＮＤＶ融合前構築物は、空隙画分内にごくわずかな材料しか有さなかった（図１８Ｃ）。ＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰを三量体容量から収集し、ＥＭにより評価した。
【０３２４】
ＮＤＶ融合前構築物の電子顕微鏡写真は、主に融合前Ｆについて予想される球体状のヘッドを示した（図１８Ｄ）。材料の一部はロゼット様凝集物内で会合していると考えられたが、この構築物は非切断型でかつ融合前であるので、会合は可能とならないはずである。この会合の量は、ＨＩＳタグによる凝集に起因する可能性があり、なぜ融合ペプチドが存在しない場合であってもＲＳＶ  Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰが一部の凝集物／ロゼットを含有するのかを説明しうる。ＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰのＥＭ分析は、この材料が不均一であることを示した（図１８Ｅ）。ＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌ−ＨＲＢ  Ｄｅｌ−ＦＰは、ＮＤＶ  Ｆの他、融合後様「松葉杖」および融合前様「球体」と類似するロゼット様構造を形成した。
【０３２５】
【化９】
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６．ＲＳＶ  Ｆの非天然ＨＲＢ構築物の設計
ＨＲＢ領域を、ＮＤＶのＨＲＢ領域（追加のグリシンリンカー：ＨＲＢ２を有するまたは有さない）またはＰＩＶ５のＨＲＢ領域と交換することにより、安定なＲＳＶ融合前Ｆを生成させた。哺乳動物による非天然ＨＲＢ構築物の発現は、構築物の各々が良好に発現して分泌されることを示した（図１９）。加えて、観察されるバンドが切断型Ｆ１分子種と符合して移動したことから、タンパク質が適正にプロセシングされたことが示唆された。構築物は融合ペプチドを有するまたは有さずに存在した（図１９に示される）。
【０３２６】
追加の参考文献
以下の参考文献は、それらが教示するすべてについて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２７】
【化１０】
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【０３２８】
【化１１】
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【０３２９】
【化１２】
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【０３３０】
【化１３】
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【０３３１】
【化１４】
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【０３３２】
【化１５】
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【０３３３】
【化１６】
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【０３３４】
【化１７】
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本明細書に引用された全ての書類の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
【０３３５】
付録
（付録は、出現する順番で、それぞれ配列番号２９〜３２、２９〜３２および２９〜３２を開示する）
【０３３６】
【化１８】
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【０３３７】
【化１９】
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【０３３８】
【化２０】
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【０３４０】
【化２２】
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【０３９４】
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【化８４】
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【０４９８】
【化１８０】
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【化１８１】
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【０５００】
【化１８２】
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【０５０１】
【化１８３】
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【０５０２】
【化１８４】
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【０５０３】
【化１８５】
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【０５０４】
【化１８６】
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【０５０５】
【化１８７】
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【０５０６】
【化１８８】
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【０５０７】
【化１８９】
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【０５０８】
【化１９０】
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【０５０９】
【化１９１】
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【化１９２】
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【０５１１】
【化１９３】
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【０５１２】
【化１９４】
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【化１９５】
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【０５１４】
【化１９６】
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【０５１５】
【化１９７】
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【０５１６】
【化１９８】
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【０５１７】
【化１９９】
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【０５１８】
【化２００】
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【化２０１】
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【０５２０】
【化２０２】
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【０５２１】
【化２０３】
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【０５２２】
【化２０４】
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【０５２３】
【化２０５】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2014519819.tif 000210
【図３ｃ】
2014519819.tif 000211
【図３ｄ】
2014519819.tif 000212
【図３ｅ】
2014519819.tif 000213
【図３ｆ】
2014519819.tif 000214
【図１２】
2014519819.tif 000215
【図１３】
2014519819.tif 000216
【図１】
2014519819.tif 000217
【図２】
2014519819.tif 000218
【図４】
2014519819.tif 000219
【図５】
2014519819.tif 000220
【図６】
2014519819.tif 000221
【図７】
2014519819.tif 000222
【図８】
2014519819.tif 000223
【図９】
2014519819.tif 000224
【図１０】
2014519819.tif 000225
【図１１】
2014519819.tif 000226
【図１４】
2014519819.tif 000227
【図１５】
2014519819.tif 000228
【図１６】
2014519819.tif 000229
【図１７】
2014519819.tif 000230
【図１８】
2014519819.tif 000231
【図１９】
2014519819.tif 000232
【配列表】
2014519819000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月15日(2014.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014519819000001.app
【国際調査報告】
2014519819.tif 000233
2014519819.tif 000234
2014519819.tif 000235
2014519819.tif 000236
2014519819.tif 000237