(57)【要約】  本発明は、特に、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法に関し、当該方法は、ｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、特に、２つの対立遺伝子に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップ、及び／又は、ｉｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質の濃度を決定するステップを含み、前記患者は、ＨＥＲ２陽性癌を被っている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、
ｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、特に、両方の対立遺伝子に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップ、及び／又は、
ｉｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定するステップ、
を含み、前記患者は、ＨＥＲ２陽性癌を被っている、方法。
【請求項２】
前記患者は、ＨＥＲ２陽性乳癌を被っている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害薬は、ＨＥＲ２に対して作られる抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＥＲ２に対して作られる抗体は、トラスツズマブである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において決定した前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを、少なくとも１つの参照値と比較するステップ、
をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
患者におけるＨＥＲ２陽性癌を治療するための薬物として使用するためのＨＥＲ２阻害薬であって、前記患者は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法によって当該ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される、ＨＥＲ２阻害薬。
【請求項７】
請求項６に記載の使用のためのＨＥＲ２阻害薬であって、ＨＥＲ２に対して作られる抗体であるＨＥＲ２阻害薬。
【請求項８】
前記ＨＥＲ２に対して作られる抗体は、トラスツズマブである、請求項７に記載の使用のためのＨＥＲ２阻害薬。
【請求項９】
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、及び
−ＨＥＲ２陽性癌を治療するための少なくとも１つの他の薬剤、
を、患者におけるＨＥＲ２陽性癌を治療するための同時、別々、若しくは連続使用のための配合剤として含む製品であって、前記患者は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法によって前記ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される、製品。
【請求項１０】
前記阻害薬は、ＨＥＲ２に対して作られる抗体である、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
前記ＨＥＲ２に対して作られる抗体は、トラスツズマブである、請求項１０に記載の製品。
【請求項１２】
患者における癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏでの予後又は診断の方法であって、
α）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、特に、両方の対立遺伝子に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記癌は、予後不良を有した癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、前立腺癌、精巣癌、気管癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、腎癌、膀胱癌、及び、皮膚癌を含む群に含まれる、請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤治療に対する患者の応答を予測する分野に関する。特に、本発明は、ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜受容体ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。１８５ｋＤａのＨＥＲ２腫瘍性タンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、内因性チロシンキナーゼ活性を有する細胞内領域から成る（Ｂａｒｇｍａｎ等、１９８６；Ｙａｍａｍｏｔｏ等、１９８６）。ＨＥＲ２膜貫通糖タンパク質は、従って、細胞周期の進行を制御する遺伝子の転写の活性化をもたらすチロシンキナーゼ活性を有する。
【０００３】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、特に、乳癌（世界中の癌を被る女性の主な死亡原因）、卵巣癌、結腸癌、膵癌、前立腺癌、及び胃癌を含む「ＨＥＲ２陽性」癌と呼ばれる種々の癌において同定されてきた。この過剰発現は、より大きな腫瘍の病原力、増加する再発のリスク、及び予後不良と関連がある。特に、浸潤性乳癌の３０％のケースにおいてＨＥＲ２タンパク質をコードする遺伝子は２倍から２０倍を超えて増幅したこと、及び、この増幅は、患者の生存に対して非常に不良な予後と付随していることが研究により示されてきた（Ｓｌａｍｏｎ等、１９８７）。
【０００４】
しかし、ＨＥＲ２に対して作られた治療的抗体、特に、モノクローナル抗体トラスツズマブ（特に、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）という名で販売）の開発は、この予後を変えることを可能にしてきた（Ｄｅ  Ｌａｕｒｅｎｔｉｉｓ等、２００５）。従って、ＨＥＲ２陽性乳癌を被る患者をトラスツズマブで治療することは、これらの患者の全生存率を非常に有意に上げることを可能にしてきた（Ｇｉａｎｎｉ等、２０１１）。
【０００５】
トラスツズマブはＨＥＲ２陽性乳癌の治療において注目すべき進歩を構成するけれども、この抗体は、残念ながら全ての患者に対して効果的なわけではない。実際に、特定の患者は、一般的に転移の開始に続く年においてトラスツズマブ治療に対して抵抗性であるか又はトラスツズマブ治療に対して耐性ができる（Ｎａｈｔａ等、２００６）。
【０００６】
さらに、このタイプの治療は、非常に高価であるという欠点を有する。
【０００７】
従って、ＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する患者の応答を予測するための信頼できる方法を有することが有利であり、そのような方法は、治療処置を各患者に順応させること、あり得る副作用を回避すること、別の治療法を開発すること、及び、医療費を減らすことを可能にする。
【０００８】
特にいくつかの遺伝子の発現を決定することに基づき、ＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する患者の応答を予測することを目標とした方法は、従来技術において既知である。
【０００９】
例えば、国際出願ＷＯ２００９／１５０１２７は、ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測する方法を教示しており、該方法は、少なくとも４つの遺伝子の発現を決定するステップで構成されている。特に、この出願の発明者等は、トラスツズマブを用いた治療に対するＨＥＲ２陽性乳癌を被る患者の応答を予測するために２８の遺伝子の発現プロファイルを同定した（Ｖｅｇｒａｎ等、２００９）。しかし、そのような方法は、特定の欠点を有し、例えば、長く且つ費用がかかり得る多数の遺伝子の発現の解析を必要とする。さらに、そのような方法は、患者から腫瘍試料の採取を必要とし、それは、外科手術手技を要して、近くの組織において悪性細胞の発生を促進する危険を冒す、（瘢痕等の）後遺症を残す、又は、有痛性であり得る。
【００１０】
特定の方法は、国際出願ＷＯ２００６／０４１９５９において例示されているもの等、循環性癌細胞におけるＨＥＲ２タンパク質のレベルを検出することに基づいている。しかし、これらの方法は、実行するのが困難であり、且つ、全ての医療センターには現在存在しない特定の高価な機器を要し得る。
【００１１】
従って、従来技術において既知の方法は、特に、実行するのが困難である、費用がかかる、及び／又は、非常に信頼できるというわけではないという欠点を有し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、最大数の医療センターにおいて使用することができる、特に経済面、単純さ、速度、及び／又は信頼性という点で改善された特徴及び適用の条件を有した、ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測する方法の必要性が残り、これらの方法は、特に、ＨＥＲ２関連病状、特にＨＥＲ２陽性癌、特にＨＥＲ２陽性乳癌を被る各患者に対して臨床医が最も適切な治療決定をするのを可能にする。
【００１３】
意外にも、本発明者等は、現在、トリステトラプロリンタンパク質（ＴＴＰ）をコードする遺伝子においてサイレント多型を同定しており、その存在は、このタンパク質の減少した翻訳、及び、ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する応答の欠如と関連がある。
【００１４】
この関連は特に予想外である。実際、トリステトラプロリンタンパク質は、その半減期を減らすことによって、種々の癌において過剰発現した種々の遺伝子のｍＲＮＡの発現に対して負の調節をするということが研究によって示されてきた。これらのｍＲＮＡは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡファミリー（３’非翻訳領域又は３’ＵＴＲにおいてＡＵリッチな要素を含有するｍＲＮＡ）のメンバーであり、且つ、細胞分裂、アポトーシス、及び血管新生等の種々の細胞制御プロセスに関与する遺伝子の産物である。これらのＡＲＥ−ｍＲＮＡの発現の調節解除、すなわち、これらのＡＲＥ−ｍＲＮＡの過剰発現は、癌表現型を生じる。
【００１５】
従って、乳癌の場合において、トリステトラプロリンタンパク質によって調節される標的ｍＲＮＡは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡとして、ｕＰＡ、ＭＭＰＡ及びｕＰＡＲを含む種々の遺伝子の産物であるとして同定されてきた（Ａｌ−Ｓｏｕｈｉｂａｎｉ等、２０１０）。
【００１６】
しかし、ＨＥＲ２の過剰発現は種々の癌（特に乳癌）において示されてきており、且つ、ＨＥＲ２は細胞周期の進行に関与しているけれども、ＨＥＲ２をコードするｍＲＮＡは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡファミリーのメンバーではなく、トリステトラプロリンタンパク質の標的よりも重要でない物でさえある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、第１の態様により、本発明は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法に関し、当該方法は、
ｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップ、及び／又は、
ｉｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定するステップ、
を含む。
【００１８】
本発明の予測方法は、特に、以下の利点を有する。
−本発明の予測方法は、シンプル且つ高速である。特に、ステップｉ）は、患者からの腫瘍試料の採取を必要としない、従って、生検を行うことに関連する種々のリスク及び問題を回避するという利点を有する。実際、本発明の予測方法は、シンプルな分子生物学技術による患者からの通常の５から１０ｍｌの血液試料から実行することができる。本発明の予測方法は、単に、多くの医療センターにおいてすでに存在する標準的な分子生物学基盤を必要とする。さらに、ステップｉ）は、特に解析するのが容易な結果を提供するという利点を有する。ステップｉｉ）は、たった１つのタンパク質のレベルの解析のみを必要とするという利点を有する。
−本発明の予測方法は、信頼でき、再現でき、且つ安価である。
【００１９】
本発明の方法におけるステップｉ）及びｉｉ）の実行は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する患者の応答の予測を最適化するという利点を有する。
【００２０】
本発明のより優れた理解を可能にするために、特定の定義が提供される。明確に示されない限り、本願において使用される他の技術的用語も、その通常の意味において解釈されるべきである。
【００２１】
本発明と関連して、「ＨＥＲ２」は、ｅｒｂＢ−２、ＥＲＢＢ２、又はＮＥＵとも呼ばれる１８５ＫＤａの腫瘍性タンパク質を意味する。特に、ＨＥＲ２は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＰ＿００４４３９．２）を有する。
【００２２】
本発明と関連して、「ＨＥＲ２阻害薬」は、ＨＥＲ２機能を有意に抑制する、特にＨＥＲ２チロシンキナーゼ活性及び／又はＨＥＲ２発現を有意に抑制する（ＤＮＡ分子、干渉ＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片等を含む核酸分子等の）いかなる分子も意味する。
【００２３】
ＨＥＲ２機能、特にＨＥＲ２チロシンキナーゼ活性及び／又はＨＥＲ２発現の有意な抑制は、ＨＥＲ２阻害薬の非存在下での制御に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、特に少なくとも５０％のＨＥＲ２機能、特にＨＥＲ２チロシンキナーゼ活性及び／又はＨＥＲ２発現の減少に相当し得る。
【００２４】
Ｃｈｅｎ等による記事（２００３）に記載されるように、前記ＨＥＲ２阻害薬は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合し、ＨＥＲ２のホモ二量体形成及び／若しくはヘテロ二量体形成を抑制し、ＨＥＲ２の細胞内ドメインに結合し、ＨＥＲ２のチロシンキナーゼドメインを抑制し、並びに／又は、ＨＥＲ２をコードする遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２５】
特に、前記ＨＥＲ２阻害薬は、
−ＨＥＲ２細胞外ドメインに対して作られた抗体、特にトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、
−ＨＥＲ２に対して作られ、且つ、ＨＥＲ３等とのＨＥＲ２のホモ二量体形成及び／又はヘテロ二量体形成を抑制する抗体、特に、モノクローナル抗体ペルツズマブ（２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）とも呼ばれる）、
−抗ＨＥＲ２ワクチン、
−ＨＥＲ２チロシンキナーゼ活性の抑制剤、特にエモジン（３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノン）、クルクミン、ＯＳＩ−７７４（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ＺＤ−１８３９（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、ＣＩ−１０３３及びラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、ＧＷ５７２０１６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡ）、
−ＨＥＲ２に対して作られた、特にＨＥＲ２細胞外ドメインに対して作られた細胞内単鎖抗体であって、ＨＥＲ２の小胞体中の通過を回避するタイプの抗体、
−ＨＥＲ２をコードする遺伝子、特にアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の転写の抑制剤、及び、
−アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム等のＨＥＲ２をコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制剤、
から成る群から選択することができ、これらの種々のタイプのＨＥＲ２阻害薬は、特に、Ｃｈｅｎ等による記事（２００３）において例示されている。
【００２６】
前記ＨＥＲ２阻害薬は、当業者にはよく知られた技術に従って同定することができる。例えば、前記ＨＥＲ２阻害薬は、
−テストされることになる薬剤を、ＨＥＲ２を発現する細胞と接触させて置くステップ、
−ＨＥＲ２発現条件下で前記細胞を増殖させるステップ、
−ＨＥＲ２機能及び／又はＨＥＲ２発現レベルを決定するステップ、
−前記テストされることになる薬剤の存在下と非存在下でのＨＥＲ２機能、特にＨＥＲ２チロシンキナーゼ活性及び／又はＨＥＲ２発現レベルを比較するステップ、
で構成される方法によって同定することができ、前記テストされることになる薬剤の存在下でのＨＥＲ２機能、特にチロシンキナーゼ活性及び／又はＨＥＲ２発現レベルの有意の減少は、ＨＥＲ２阻害薬の存在を示している。
【００２７】
特に、前記ＨＥＲ２阻害薬は、ＨＥＲ２に対して作られた、特にＨＥＲ２細胞外ドメインに対して作られた、並びに／又は、ＨＥＲ２のホモ二量体形成及び／若しくはヘテロ二量体形成を抑制し、さらに、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）とも呼ばれる）で構成される群から特に選択され、さらにより好ましくはトラスツズマブの抗体である。
【００２８】
本願において使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異性抗体（例えば二特異性抗体等）、並びに、所望の生物学的活性を有する限り抗体断片（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体等）を含む。
【００２９】
本発明に関連して、「タンパク質に対して作られた抗体」は、このタンパク質に特異的に結合するいかなる抗体も意味する。
【００３０】
抗体は、１）結合活性閾値を有する場合、及び／又は、２）関連するポリペプチドとは有意に交差反応しない場合に「特異的に結合している」と言われる。例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ解析（１９４９）によって、又は、表面プラズモン共鳴によって当業者は、抗体の結合親和性を容易に決定することができる。
【００３１】
本発明に関連して、「トリステトラプロリンタンパク質」は、ＺＦＰ３６（亜鉛フィンガータンパク質３６）又はＴＴＰ又はＧ０Ｓ２４又はＧＯＳ２４又はＴＩＳ１１又はＮＵＰ４７５又はＲＮＦ１６２Ａとも呼ばれるタンパク質、ＡＲＥ−ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲ領域においてＡＵリッチな要素を含有するｍＲＮＡ）結合タンパク質ファミリーのメンバーを意味する。特に、トリステトラプロリンタンパク質は、配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２（ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＡＡＡ６１２４０．１、ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＰ＿００３３９８．１）を有する。
【００３２】
本発明に関連して、「ｒｓ３７４６０８３多型部位」は、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在するヒトゲノム上の位置ｒｓ３７４６０８３を意味する。ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴであり得、先祖ヌクレオチドは、Ｃヌクレオチドである（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ａ；ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｇ；ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｔ）。
【００３３】
特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドは、配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３４０７．２）の位置３６７のヌクレオチドに相当する。
【００３４】
特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドは、配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３４０７．２）の位置３６７のヌクレオチドである。
【００３５】
本発明に関連して、「ｒｓ３７４６０８３多型」は、ヒトゲノム上の位置ｒｓ３７４６０８３に位置している一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。ｒｓ３７４６０８３多型の対立遺伝子は、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ対立遺伝子であり得、先祖対立遺伝子は、Ｃ対立遺伝子である（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ａ；ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｇ；ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｔ）。特に、ｒｓ３７４６０８３多型は、配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３（ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３４０７．２）上の３６７Ｃ＞Ｔ多型に相当する。
【００３６】
前記患者からの生物学的試料内のトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップｉ）は、酵素消化、配列決定、特異的ハイブリダイゼーション、及び／又は特異的増幅によって等、当業者にはよく知られたいかなる技術によっても実行することができる。
【００３７】
配列決定は、ｒｓ３７４６０８３多型部位にてヌクレオチドを有した患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡに対して、よく知られた技術を使用して、特に、自動配列決定装置を使用して実行することができる。
【００３８】
増幅は、特異的核酸プライマーを使用して、種々の既知の技術によって実行し、ｒｓ３７４６０８３多型部位にてヌクレオチドを有した患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを増幅することができる。特に、そのようなプライマーは、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドに隣接する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡの部分と特異的にハイブリッド形成する能力を持つ。
【００３９】
増幅技術の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及び、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）に触れることができる。これらの技術は、商業的に入手可能な試薬及びプロトコルを使用して実行することができる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションによる検出の方法は、多型を検出するために使用される相補的な核酸配列とｒｓ３７４６０８３多型部位にてヌクレオチドを有した患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡとの特異的なハイブリッドの形成に基づいている。特に、検出技術は、ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子、Ｔ対立遺伝子、Ａ対立遺伝子、又はＧ対立遺伝子に特異的な核酸プローブの使用を含み、ハイブリッドの存在の検出が続く。プローブは、懸濁させるか、又は、基板若しくは支持体上、特にチップ上に固定化させることができる。プローブは、一般的に、ハイブリッドの検出を促進するようにマークされ、マーカーは、蛍光、化学発光、放射性、若しくは酵素のマーカー、染料、又はその他のものであり得る。
【００４１】
ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの欠如（ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子の欠如）は、制限酵素ＨｈａＩを用いた酵素消化によって容易に検出することができる、ｒｓ３７４６０８３多型部位にてヌクレオチドを有した患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡの増幅に先行され得る、さらに、任意選択で、増幅され且つ消化された断片の配列決定が続き得る。実際に、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの（ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子の）欠如は、ＨｈａＩ酵素制限部位を除去する。
【００４２】
ステップｉ）において得られた結果の評価は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する患者の応答を予測することを可能にする。
【００４３】
従って、本発明の予測方法において、患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの欠如は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する前記患者による応答がないというリスクを示している。前記患者は、従って、前記治療に対して応答性ではないと予測される。
【００４４】
従って、本発明の予測方法において、患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する前記患者による応答がないというリスクを示している。前記患者は、従って、前記治療に対して応答性ではないと予測される。
【００４５】
従って、本発明の予測方法において、患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在は、ｒｓ３７４６０８３多型部位にてＴヌクレオチドを欠く患者と比較して、特に、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子（両方のコピー）がｒｓ３７４６０８３多型部位にてＣヌクレオチドを含有する患者と比較して、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する患者による応答がないということのより高いリスクを示している。
【００４６】
従って、本発明の予測方法において、患者におけるｒｓ３７４６０８３多型部位でのヘテロ接合性（Ｔ／Ｃ）の同定（トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の１つの対立遺伝子に対するｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在、及び、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子のもう１つの対立遺伝子に対するｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）は、ｒｓ３７４６０８３多型部位にてホモ接合性（Ｃ／Ｃ）を有する患者と比較して、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する患者による応答がないということのより高いリスクを示している。
【００４７】
ｒｓ３７４６０８３多型部位にてヘテロ接合性（Ｔ／Ｃ）を有する患者は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対して応答性ではないと予測される。
【００４８】
ｒｓ３７４６０８３多型部位にてホモ接合性（Ｃ／Ｃ）を有する患者は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対して応答性であると予測される。
【００４９】
従って、本発明の方法において、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドが、前記患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対してＣヌクレオチドである場合に、患者は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対して応答性であると予測される。
【００５０】
前記本発明の予測方法は、以下の
−ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドが、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対してＣヌクレオチドでない場合に、特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドが、前記患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対してＴヌクレオチドである場合に、前記患者を非応答群に割り当てるステップ、又は、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドが、前記患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対してＣヌクレオチドである場合に、前記患者を応答群に割り当てるステップ、
をさらに含み得る。
【００５１】
本発明の方法は、ｒｓ３７４６０８３多型を有した連鎖不平衡の少なくとも１つの多型（特に、一塩基多型又はＳＮＰ）の検出を含み得る。そのようなｒｓ３７４６０８３多型を有した連鎖不平衡の多型は、当業者にはよく知られたいかなる技術によっても同定することができる。
【００５２】
例えば、ｒｓ３７４６０８３多型を有した連鎖不平衡の多型の同定は、（ａ）複数の患者のｒｓ３７４６０８３多型を含むか又は取り囲むゲノム領域の断片の増幅、（ｂ）前記ｒｓ３７４６０８３多型を含むか又はそれに隣接するゲノム領域における第２の多型の同定、（ｃ）前記ｒｓ３７４６０８３多型と前記第２の多型との連鎖不平衡の解析、及び、（ｄ）前記ｒｓ３７４６０８３多型を有する連鎖不平衡の前記第２の多型の選択を含み得る。
【００５３】
本発明に関連して、「生物学的試料」は、患者からのいかなる生物学的試料も意味する。この用語は、いかなる生物学的液体、組織、細胞、若しくは臓器の試料、生検、又は、それらから得られるいかなる組織若しくは細胞培養物を含む。
【００５４】
特に、前記生物学的試料は、病理学的組織又は細胞、特に癌性及びより具体的にはＨＥＲ２陽性の試料等、（病理学に特有である）「病理学的」生物学的試料であり得る。
【００５５】
「生物学的試料」という用語は、操作された、特に試薬によって、特定の要素の可溶化によって又は濃縮によって処理された試料も含む。従って、当業者にはよく知られた全ての技術によって、生物学的試料は、本発明の方法において使用する前に処理して、例えば、核酸又はタンパク質を単離及び／若しくは濃縮することができる。そのような技術の例として、（例えば機械的、物理的、化学的溶解等の）溶解、細胞濃縮、及び核酸希釈の技術に触れることができる。核酸は、酵素又は他の化学的若しくは物理的処理で処理して、核酸断片を生成することもできる。
【００５６】
特に、ステップｉ）において使用することができる前記生物学的試料は、前記患者の核酸、特にゲノムＤＮＡを含み、全血、血清、又は血漿等の血液の試料、唾液試料、精液試料、及び尿試料で構成される群から選択することができる。
【００５７】
特に、ステップｉｉ）において使用することができる前記生物学的試料は、前記患者からのタンパク質を含み、血液試料、組織又は細胞の試料、特に、乳房組織又は細胞、特に、癌組織又は細胞、さらに特には、ＨＥＲ２−陽性癌組織又は細胞で構成される群から選択することができる。
【００５８】
「患者」という用語は、本願において使用される場合、いかなる個々の患者、特に、予測、予後、診断、又は治療が望まれるいかなるヒトも意味する。特に、患者は、女性、特にＨＥＲ２陽性乳癌を被る女性である。
【００５９】
前記患者は、良性及び悪性腫瘍を含む、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療が有益である病態及び／又は疾患を被り得る。特に、前記患者は、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特にＨＥＲ２陽性病態、さらに特にはＨＥＲ２陽性癌を被る。
【００６０】
本発明に関連して、「ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患」という表現は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療が有益であるいかなる病態及び／又は疾患も意味する。
【００６１】
本発明に関連して、「ＨＥＲ２陽性病態、特にＨＥＲ２陽性癌」という表現は、ＨＥＲ２タンパク質が過剰発現される、すなわち、健康な患者若しくはこの病態を被っていない患者の細胞、組織、又は器官における発現のレベルに対して、この病態を被る患者の細胞、組織、又は器官において異常なレベルの発現を有するいかなる病態、特にいかなる癌も意味する。
【００６２】
ＨＥＲ２陽性癌は、特に、乳癌、卵巣癌、結腸癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む。
【００６３】
ＨＥＲ２陽性病態、特にＨＥＲ２陽性癌を被る患者は、ＨＥＲ２に対して作られた抗体を使用した電気泳動的及び免疫学的技術、又は、特に固定されたパラフィン包埋の組織切片上のＨＥＲ２をコードする遺伝子の増幅を検出するための色素産生インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ（登録商標））技術等、当業者には既知のいかなる技術を使用しても同定することができる。例えば、色素産生インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ（商標））によるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片におけるＨＥＲ２遺伝子の増幅を検出するためのＺｙｍｅｄ  Ｓｐｏｔ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）、ＨＥＲ２  ＣＩＳＨ  Ｋｉｔ（商標）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）により販売）に触れることができる。
【００６４】
本発明の方法は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答する患者を、応答しない患者から区別するのを可能にする。
【００６５】
本発明に関連して、「少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答する患者」は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  （ＲＥＣＩＳＴ）に従った、前記阻害薬を用いて治療された場合に、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特にＨＥＲ２陽性病態、さらに特にはＨＥＲ２陽性癌、なお特には、ＨＥＲ２陽性乳癌の臨床的に有意な軽減を示すいかなる患者も意味する。
【００６６】
本発明に関連して、「少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答しない患者」は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  （ＲＥＣＩＳＴ）に従った、前記阻害薬を用いて治療された場合に、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特にＨＥＲ２陽性病態、さらに特にはＨＥＲ２陽性癌、なお特には、ＨＥＲ２陽性乳癌の臨床的に有意な軽減を示さないいかなる患者も意味する。
【００６７】
患者からの生物学的試料内のトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定するステップｉｉ）は、当業者には既知のいかなる技術によっても実行することができる。
【００６８】
そのような技術は、おそらく生物学的試料内に存在することになるトリステトラプロリンタンパク質と選択的に相互作用する能力を持つ結合剤と接触させて生物学的試料を置くことを含み得る。
【００６９】
結合剤は、抗体、特にポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、さらに特には、トリステトラプロリンタンパク質に対して作られたモノクローナル抗体であり得る。
【００７０】
従って、トリステトラプロリンタンパク質のレベルは、トリステトラプロリンタンパク質に対して作られた抗体を使用した電気泳動的及び免疫学的技術によって決定することができる。例として、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の酵素テスト、ビオチン／アビジンタイプのテスト、放射免疫学的テスト、免疫電気泳動法、及び免疫沈殿法に触れることができる。これらの技術は、一般的に、トリステトラプロリンタンパク質と結合剤との、特に、抗原と、該抗原と反応した１つ又は複数の抗体との複合体の形成を検出するためのマーカーを含み、前記マーカーは、蛍光、化学発光、放射性、若しくは酵素のマーカー、染料、又はその他のものであり得る。
【００７１】
本発明の前記予測方法は、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において決定した前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを、少なくとも１つの参照値と比較するステップをさらに含み得る。
【００７２】
このステップｉｉｉ）は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に患者が応答性であるか又は非応答性であるかを決定することに寄与する。
【００７３】
前記参照値は、特に、非限定的な様式で、
−参照閾値、
−ステップｉｉ）においてトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定した腫瘍組織に隣接する健康な組織において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性の患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、又は
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性ではない患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、
であり得る。
【００７４】
本発明に関連して、「等価の生物学的試料」は、ステップｉｉ）のものと生理学的に相当するいかなる生物学的試料も意味する。例えば、ステップｉｉ）の生物学的試料が癌性の乳房組織の試料である場合に、等価の生物学的試料は、好ましくはステップｉｉ）のものと同じ領域からの、乳房組織試料であり得る。
【００７５】
従って、例えば、ステップｉｉ）において決定したトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、ステップｉｉ）においてトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定した腫瘍組織に隣接する健康な組織において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値に相当する参照値よりも有意に低い場合に、患者は、前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブに応答性ではないと予測される。
【００７６】
従って、例えば、ステップｉｉ）において決定したトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、ステップｉｉ）においてトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定した腫瘍組織に隣接する健康な組織において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値に相当する参照値以上である場合に、患者は、前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブに応答性であると予測される。
【００７７】
従って、例えば、ステップｉｉ）において決定したトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性の患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値に相当する参照値よりも有意に低い場合に、患者は、前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブに応答性ではないと予測される。
【００７８】
従って、例えば、ステップｉｉ）において決定したトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性の患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値に相当する参照値以上である場合に、患者は、前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブに応答性であると予測される。
【００７９】
例えば、ステップｉｉ）において決定したトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性ではない患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値に相当する参照値よりも有意に高い場合に、患者は、前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブに応答性であると予測される。
【００８０】
例えば、ステップｉｉ）において決定したトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性ではない患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値に相当する参照値以下である場合に、患者は、前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブに応答性ではないと予測される。
【００８１】
参照値よりも有意に高いトリステトラプロリンタンパク質のレベルは、参照値に対して少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％高いレベルに相当し得る。
【００８２】
参照値よりも有意に低いトリステトラプロリンタンパク質のレベルは、参照値に対して少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％低いレベルに相当し得る。
【００８３】
本発明の方法は、前記患者からの生物学的試料における対照タンパク質のレベルを決定するステップも含み得る。前記対照タンパク質は、特に、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対して応答性である及び応答性ではない患者においてレベルが一定であるタンパク質であり得る。
【００８４】
本発明の予測方法は、特に前記患者由来の生物学的試料から、予測に有用な相加的なパラメータを少なくとも１つ決定するステップも含み得る。「予測に有用な相加的なパラメータ」という表現は、それだけでは予測に使用することはできないが、例えば、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答する患者と応答しない患者との間に有意に異なる値を示すとして記載され、且つ、本発明の方法によって決定した予測を確かめるのに有用であり得るいかなるパラメータも意味する。予測に有用な１つのそのような相加的なパラメータは、
−ＧＰＲ２２（Ｇタンパク質共役受容体２２、特に、ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００５２９５）、ＰＥＸ１９（ペルオキシソーム生合成因子１９、特に、ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００２８５７）、ＧＲＨＬ２（グレイニーヘッド（ｇｒａｉｎｙｈｅａｄ）様２、特に、ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿０２４９１５）、及び、ＤＥＲＬ１（デルリン（Ｄｅｒｌｉｎ）１、特に、ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿０２４２９５）、ＨＥＲ２をコードする遺伝子（特に、ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＭ＿００４４４８）から成る群から選ばれた少なくとも１つの遺伝子の発現レベルであり得る。
【００８５】
本発明の前記予測方法は、
ｉｖ）ステップｉ）及び／又はステップｉｉ）において得た結果を評価することによって、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する前記患者の応答を予測するステップ、
をさらに含み得る。
【００８６】
別の態様によると、本発明は、患者におけるＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特にＨＥＲ２陽性病態、さらに特にはＨＥＲ２陽性癌、なお特には、ＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための薬物として使用するためのＨＥＲ２阻害薬に関し、前記患者は、本発明の予測方法によって当該ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される。
【００８７】
本発明は、患者におけるＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特にＨＥＲ２陽性病態、さらに特にはＨＥＲ２陽性癌、なお特には、ＨＥＲ２陽性乳癌を治療する薬物を製造するためのＨＥＲ２阻害薬の使用にも関し、前記患者は、本発明の予測方法によって当該ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される。
【００８８】
本発明は、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特にＨＥＲ２陽性病態、さらに特にはＨＥＲ２陽性癌、なお特には、ＨＥＲ２陽性乳癌を被る患者を治療するための方法にも関し、当該方法は、
−ａ）本発明の予測方法を実行することによって、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するステップ、及び、
−ｂ）ステップａ）において少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対して応答性であると予測した前記患者に治療量のＨＥＲ２阻害薬を投与するステップ、
を含む。
【００８９】
本発明に関連して、「治療量」は、ＨＥＲ２阻害薬の活性及び無毒な量を意味する。
【００９０】
これらの治療量は、前記ＨＥＲ２阻害薬の投与によって治療されようと努められたＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患に対する、特に、ＨＥＲ２陽性癌に対する、特にＨＥＲ２陽性乳癌に対する、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬の投与の効果の評価を含むルーチンテストにより当業者によって決定することができる。
【００９１】
例えば、これらのテストは、特に、少なくとも１人の患者由来の少なくとも１つの生物学的試料からの、これらのＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患に特有である一組（生物学的及び／又は臨床的）のマーカーに対する、種々の量の前記ＨＥＲ２阻害薬（特にトラスツズマブ）の投与の定量的効果及び定性的効果両方の解析によって実行することができる。
【００９２】
本発明は、
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、及び
−ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特に、ＨＥＲ２陽性病態、さらに特には、ＨＥＲ２陽性癌、なお特にはＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための少なくとも１つの他の薬剤、
を、患者におけるＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特に、ＨＥＲ２陽性病態、さらに特には、ＨＥＲ２陽性癌、なお特にはＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための同時、別々、若しくは連続使用のための配合剤として含む製品にも関し、前記患者は、本発明の予測方法によって当該ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される。
【００９３】
本発明は、患者におけるＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特に、ＨＥＲ２陽性病態、さらに特には、ＨＥＲ２陽性癌、なお特にはＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための同時、別々、若しくは連続使用のための配合剤を調製するための、
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、及び
−ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特に、ＨＥＲ２陽性病態、さらに特には、ＨＥＲ２陽性癌、なお特にはＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための少なくとも１つの他の薬剤
の使用にも関し、前記患者は、本発明の予測方法によって当該ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される。
【００９４】
本発明に関連して、「ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患を治療するための薬剤」は、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患を治療するためのいかなる化合物も意味する。
【００９５】
例として、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患、特に、ＨＥＲ２陽性病態、さらに特には、ＨＥＲ２陽性癌、なお特にはＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための前記他の薬剤は、
−特に乳癌の場合にはタキサン（特にドセタキセル又はＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、エピルビシン、又はシクロホスファミド等の化学療法の薬剤
−特に乳癌の場合にはタモキシフェン等のホルモン療法の薬剤、又は、
−放射線療法の薬剤
であり得る。
【００９６】
前記ＨＥＲ２阻害薬は、本発明の薬物及び配合剤において治療量で存在し得る。
【００９７】
前記ＨＥＲ２阻害薬、及び、ＨＥＲ２関連病態及び／又は疾患を治療するための前記他の薬剤は、本発明の配合剤において、１００／１から１／１００のモル比で存在し得る。
【００９８】
本発明の薬物及び配合剤は、特にＨＥＲ２阻害薬の種類に従って、種々の経路によって投与することができる。本発明の薬物及び配合剤に使用することができる投与経路の例として、経口、直腸、皮膚、肺、経鼻、舌下、及び非経口の経路に触れることができる。
【００９９】
本発明による薬物及び配合剤は、薬剤的に許容可能な担体をさらに含み得る。
【０１００】
本発明に関連して、「薬剤的に許容可能な担体」は、医薬品における使用に適切ないかなる物質も意味する。
【０１０１】
薬剤的に許容可能な担体の例として、ラクトース、（任意で加工された）デンプン、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ブドウ糖、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）、イノシトール、炭酸カルシウム、グリシン、ベントナイト、ポリビニルピロリドン、及びその混合物に触れることができる。
【０１０２】
本発明の薬物及び配合剤は、本発明の薬物又は配合剤の総重量に対して、重量により５％から９９％、特に、重量により１０％から９０％、特に、重量により２０％から７５％という薬剤的に許容可能な担体の含有量を含み得る。
【０１０３】
別の態様によると、本発明は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するためのキットを目標として有し、当該キットは、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定する手段、及び／又は、
−トリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定する手段、さらに任意で、
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するための前記手段を使用するための指示、
を含む。
【０１０４】
ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定する手段は、配列決定、増幅、及び／又はハイブリダイゼーションによってｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸プライマー及び／又はプローブであり得る。
【０１０５】
特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定する手段は、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを配列決定するための特異的なプライマー及び試薬、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを増幅するための特異的なプライマー及び試薬であって、特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドに隣接する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡの一部と特異的にハイブリッド形成する能力を持つ核酸プライマー、
−ヒトゲノム上の位置ｒｓ３７４６０８３に位置している多型のＣ対立遺伝子、Ｔ対立遺伝子、Ａ対立遺伝子、及びＧ対立遺伝子に対する特異的な核酸プローブ、並びに、多型を検出するために使用される相補的な核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成を検出するための試薬、
で構成される群から選択することができる。
【０１０６】
特に、トリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定する手段は、トリステトラプロリンタンパク質に対して作られ、特に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる抗体であり得る。
【０１０７】
本発明の予測キットは、緩衝液、試薬、マーカー、及び対照試料等、追加の要素をさらに含み得る。
【０１０８】
前記少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するための手段を使用するための指示は、特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定、及び／又は、患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定した後に得た結果を解釈するのを可能にする。
【０１０９】
例えば、患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの欠如が、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する前記患者による応答がないというリスクを示しているということを前記指示は示すことができる。前記患者は、次に、前記治療に応答性ではないと予測される。
【０１１０】
別の態様によると、本発明は、患者における癌、特に、予後不良を有した癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏでの予後又は診断の方法に関し、当該方法は、
α）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップを含む。
【０１１１】
Ｂｒｅｎｎａｎ等による記事（２００９）において例示されているように、前記癌は、トリステトラプロリンタンパク質が低発現される、すなわち、健康な患者若しくはこの癌を被っていない患者の細胞、組織、又は器官における発現のレベルに対して、この癌を被る患者の細胞、組織、又は器官において異常なレベルの発現を有するいかなる癌でもあり得る。
【０１１２】
特に、前記癌は、肺、乳房、子宮、卵巣、外陰部、前立腺、精巣、気管、甲状腺、肝臓、胃、腸、結腸、直腸、膵臓、腎臓、膀胱、並びに、皮膚の癌、特に、甲状腺、肺、卵巣、子宮、並びに乳房の癌、腺腫、及び腺癌、さらに特には乳癌を含む群に含まれ得る。
【０１１３】
本発明の予後又は診断の方法の特定の実施形態によると、前記癌は、予後不良を有した乳癌である。
【０１１４】
本発明の予後又は診断の方法において、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの欠如は、患者が、癌、特に、予後不良を有した癌、特に、予後不良を有した乳癌を被っているというリスクを示している。
【０１１５】
本発明の予後又は診断の方法において、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在は、患者が、癌、特に、予後不良を有した癌、特に、予後不良を有した乳癌を被っているというリスクを示している。
【０１１６】
従って、本発明の方法において、患者におけるｒｓ３７４６０８３多型部位でのヘテロ接合性（Ｔ／Ｃ）の同定（トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の１つの対立遺伝子に対するｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在、及び、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子のもう１つの対立遺伝子に対するｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）は、患者が、癌、特に、予後不良を有した癌、特に、予後不良を有した乳癌を被っているというリスクを示している。
【０１１７】
本発明の予後又は診断の方法は、特に以下の利点を有する。すなわち、
−本発明の予後又は診断の方法は、シンプル且つ高速である。ステップα）は、患者からの腫瘍試料の採取を必要としない、従って、生検を行うことに関連する種々のリスク及び問題を回避するという利点を有する。例えば、本発明の予後又は診断の方法は、シンプルな分子生物学技術による患者からの通常の５から１０ｍｌの血液試料から実行することができる。本発明の予後又は診断の方法は、多くの病院においてすでに存在する標準的な分子生物学基盤を必要とする。さらに、ステップα）は、特に解析するのが容易な結果を提供するという利点を有する。
−本発明の予後又は診断の方法は、信頼でき、再現でき、且つ安価である。
【０１１８】
本発明の予後又は診断の方法は、特に前記患者由来の生物学的試料から、予後又は診断に有用な相加的なパラメータを少なくとも１つ決定するステップも含み得る。「予後又は診断に有用な相加的なパラメータ」という表現は、それだけでは予後又は診断に使用することはできないが、例えば、癌を被る患者と癌を被っていない患者との間に有意に異なる値を示すとして記載されてきており、且つ、本発明の方法によって決定した予後又は診断を確かめるのに有用であり得るいかなるパラメータも意味する。予後又は診断に有用な１つのそのような相加的なパラメータは、
−ＨＥＲ２陽性癌の場合にＨＥＲ２をコードする遺伝子等、前記癌を被る患者において発現が調節される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル
であり得る。
【０１１９】
本発明は、特に予後不良を有した癌を被る患者を治療する方法にも関し、当該方法は以下の、
１）本発明の予後又は診断の方法を実行することによる、前記患者における癌の予後又は診断ステップ、
２）ステップ１）において特に予後不良を有した癌を被るとして診断した前記患者に対する治療量の抗癌剤の投与ステップ、
を含む。
【０１２０】
本発明によると、「抗癌剤」は、癌及び／又は癌関連疾患を治療するためのいかなる化合物も意味する。例えば、前記抗癌剤は、
−特に乳癌の場合にはタキサン（特にドセタキセル又はＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、エピルビシン、又はシクロホスファミド等の化学療法の薬剤
−特に乳癌の場合にはタモキシフェン等のホルモン療法の薬剤、又は、
−放射線療法の薬剤
であり得る。
【０１２１】
特に、前記抗癌剤は、前記患者において診断された癌に適している。例えば、患者がＨＥＲ２陽性乳癌を被っている場合に、前記薬剤は、タモキシフェン、ドセタキセル等であり得る。
【０１２２】
別の態様によると、本発明は、患者における癌、特に予後不良を有した癌の予後又は診断のためのキットに関し、当該キットは、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定する手段、及び任意で、
−患者における癌、特に予後不良を有した癌の予後又は診断を確立するための前記手段を使用するための指示、
を含む。
【０１２３】
ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定する手段は、配列決定、増幅、及び／又はハイブリダイゼーションによってｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸プライマー及び／又はプローブであり得る。
【０１２４】
特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定する手段は、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを配列決定するための特異的なプライマー及び試薬、
−ｒｓ３７４６０８３多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを増幅するための特異的なプライマー及び試薬であって、特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドに隣接する患者のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡの一部と特異的にハイブリッド形成する能力を持つ核酸プライマー、
−ヒトゲノム上の位置ｒｓ３７４６０８３に位置している多型のＣ対立遺伝子、Ｔ対立遺伝子、Ａ対立遺伝子、及びＧ対立遺伝子に対する特異的な核酸プローブ、並びに、多型を検出するために使用される相補的な核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成を検出するための試薬、
で構成される群から選択することができる。
【０１２５】
患者における癌、特に予後不良を有した癌の予後又は診断を確立するための前記手段を使用するための前記指示は、特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定後に得た結果を解釈するのを可能にする。
【０１２６】
例えば、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（少なくとも１つのコピー）、特に、両方の対立遺伝子（両方のコピー）に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの欠如は、患者が、癌、特に、予後不良を有した癌を被っているというリスクを示しているということを前記指示は示すことができる。
【０１２７】
本発明の他の利点及び特徴が、以下の実施例から明らかになる。
【０１２８】
これらの実施例は、例示のために与えられ、非限定的である。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１Ａ】乳癌細胞株におけるＴＴＰ（トリステトラプロリン）の発現を表した図であり、乳癌可溶化液及び不死化した乳房の細胞株における全ＴＴＰタンパク質の免疫ブロットである。（＋＋＋）は非常に高悪性度の乳癌細胞株であり、（＋／−）は非悪性乳癌細胞株であり、（−）は非腫瘍性の乳房の細胞株である。
【図１Ｂ】乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）及びＩＬ８（インターロイキン８）の発現を表した図であり、それぞれｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡによって決定したｍＲＮＡ並びに分泌性タンパク質ＶＥＧＦ及びＩＬ８のレベルである。
【図１Ｃ】乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）及びＩＬ８（インターロイキン８）の発現を表した図であり、それぞれｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡによって決定したｍＲＮＡ並びに分泌性タンパク質ＶＥＧＦ及びＩＬ８のレベルである。
【図２Ａ】ＴＴＰ−ＭＤＡ２３１誘導性クローンを表した図であり、テトラサイクリンの除去後の３つのクローンにおける種々のレベルのＴＴＰタンパク質誘導（低レベルのＴＴＰ＝ＰＡ１５、高レベルのＴＴＰ＝ＰＡ１及びＰＡ４８）である。
【図２Ｂ】ＴＴＰ−ＭＤＡ２３１誘導性クローンを表した図であり、ＴＴＰ−ＭＤＡ２３１クローンにおけるＶＥＧＦ及びＩＬ８  ｍＲＮＡ総量の定量的ＰＣＲである。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１
【図３Ａ】ｓｈＣＴＲＬ、ｓｈ６２−ＴＴＰ１、及びｓｈ６５−ＴＴＰ２の配列の遺伝子導入によって得た安定なＭＣＦ７クローンを表した図であり、３つの異なるクローンにおける全ＴＴＰｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲである。
【図３Ｂ】ｓｈＣＴＲＬ、ｓｈ６２−ＴＴＰ１、及びｓｈ６５−ＴＴＰ２の配列の遺伝子導入によって得た安定なＭＣＦ７クローンを表した図であり、免疫ブロットによって検出した対応するＴＴＰタンパク質レベルである。
【図３Ｃ】ｓｈＣＴＲＬ、ｓｈ６２−ＴＴＰ１、及びｓｈ６５−ＴＴＰ２の配列の遺伝子導入によって得た安定なＭＣＦ７クローンを表した図であり、３つのクローンにおけるＶＥＧＦ及びＩＬ８のｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲである。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１
【図４Ａ】誘導性ＭＤＡ２３１−ＴＴＰクローンの増殖に対するＴＴＰ発現の効果を表した図であり、テトラサイクリンの存在下又は非存在下での誘導性ＴＴＰ−ＭＤＡ２３１クローンＰＡ１及びＰＡ１５の増殖テストである。誘導後のＴＴＰ発現レベルが示されている（ＴＴＰ＋＋＋＝高レベル、及び、ＴＴＰ＋＝低レベル）。
【図４Ｂ】安定なｓｈＴＴＰ−ＭＣＦ７クローンの増殖に対するＴＴＰ発現の効果を表した図であり、細胞形態である。
【図４Ｃ】安定なｓｈＴＴＰ−ＭＣＦ７クローンの増殖に対するＴＴＰ発現の効果を表した図であり、ｓｃＣＴＲＬに対する２つの安定なｓｈＴＴＰ−ＭＣＦ７クローンの増殖テストである。
【図５Ａ】乳癌細胞株におけるＴＴＰの比較上の発現を表した図であり、免疫ブロットによって解析した乳癌及びＨＥＫ２９３の細胞株のタンパク質抽出である。
【図５Ｂ】乳癌細胞株におけるＴＴＰの比較上の発現を表した図であり、定量的ＰＣＲによって定量化された同じ細胞株における対応するｍＲＮＡレベルである。
【図６Ａ】Ｈｓ５７８Ｔ細胞におけるｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定（特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のＴヌクレオチドの検出）を表した図であり、ＭＤＡ２３１並びにＨｓ５７８Ｔの細胞から得たゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのＴＴＰコード領域のシーケンスクロマトグラム並びにＰＣＲ解析である。
【図６Ｂ】Ｈｓ５７８Ｔ細胞におけるｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定（特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のＴヌクレオチドの検出）を表した図であり、酵素ＨｈａＩで切断したＰＣＲ断片の消化の図及び解析である。
【図６Ｃ】Ｈｓ５７８Ｔ細胞におけるｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定（特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のＴヌクレオチドの検出）を表した図であり、野生型（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）及び配列変異体（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）に対するＭＦＯＬＤソフトウェアによって予測した二次ｍＲＮＡ構造である。
【図６Ｄ】Ｈｓ５７８Ｔ細胞におけるｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定（特に、ｒｓ３７４６０８３多型部位のＴヌクレオチドの検出）を表した図であり、ＭＣＦ７、Ｈｓ５７８ｔ、及びＭＤＡの細胞のＤＲＢ（５，６−ジクロロ−１−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール）動態によって決定したＴＴＰ  ｍＲＮＡ半減期である。
【図７Ａ】翻訳に対する野生型ＴＴＰ（ｗｔ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）又は変異体ＴＴＰ（ｖａｒ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）の効果を表した図であり、野生型（ｗｔ）及び変異体（ｖａｒ）のＴＴＰ−Ｍｙｃ発現プラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳である。
【図７Ｂ】翻訳に対する野生型ＴＴＰ（ｗｔ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）又は変異体ＴＴＰ（ｖａｒ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）の効果を表した図であり、ＨＥＫ２９３細胞において遺伝子導入した野生型及び変異体のＴＴＰ配列を保有した増加する量のＴｒｅｘプラスミド（５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ）である。タンパク質可溶化液を、免疫ブロットによって解析した。２つの独立したＤＮＡ調製を２００ｎｇの濃度で使用した。試料間での比較を、（材料及び方法のセクションにおいて説明されるように）遺伝子導入の効率を計算した後に実行した。
【図８Ａ】標的遺伝子の安定性に対する変異体ＴＴＰ対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）の機能効果を表した図であり、空のベクター、野生型ＴＴＰ遺伝子又は変異体ＴＴＰ遺伝子（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）を含有する発現ベクターの遺伝子導入後のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲと共役したルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性度のアッセイである。平均の相対ルシフェラーゼ活性度を、４つの独立した遺伝子導入に基づき計算した。
【図８Ｂ】標的遺伝子の安定性に対する変異体ＴＴＰ対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）の機能効果を表した図であり、野生型又は変異体ＴＴＰのコンストラクトを用いた遺伝子導入後の内在性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの半減期のＤＲＢ動態及び測定値である。
【図８Ｃ】標的遺伝子の安定性に対する変異体ＴＴＰ対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）の機能効果を表した図であり、ＤＲＢ処置の３時間後の内在性サイクリンＤ１ｍＲＮＡに対する野生型ＴＴＰ及び変異体ＴＴＰの効果である。０時間でのｍＲＮＡの量は、参照値（１００％）とみなされる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３０】
Ｉ．  材料及び方法
Ｉ．１  プラスミドの構築
ＭＤＡ２３１細胞におけるＴＥＴ−Ｏｆｆアプローチ（ＴＥＴ：テトラサイクリン）に対して、ｐＲＥＶ−ＴＴＰコンストラクトを、ｐＲＥＶプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位においてＴＴＰ  ｃＤＮＡの領域のコード化に対応する１ｋｂのＤＮＡ断片を挿入することによって得た（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７）。野生型配列（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）及びヒトＴＴＰの配列変異体（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）を含有するｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｙｓＡ（Ｔｒｅｘ−ＴＴＰ）コンストラクトを、センスプライマー（５’ＣＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＴＧＣＧ−３’）を用いてＨｓ５７８Ｔ細胞のｃＤＮＡから直接１ｋｂの領域を増幅することによって、並びに、その断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に挿入することによって作製した。ＴＴＰ  ｃＤＮＡ断片を、次に、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｙｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にＥｃｏＲＩ制限部位にて挿入した。２つの独立したプラスミド調製を、各コンストラクトに対して得た。
【０１３１】
Ｉ．２  ＲＮＡ調製及び定量的ＰＣＲによる解析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、第１のＤＮＡ鎖の合成を刺激するためにＯｌｉｇｏ（ｄｔ）プライマーを用いて、２マイクログラムの全ＲＮＡを逆転写に使用した。リアルタイムＰＣＲに対して、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びｑＰＣＲＣｏｒｅ  ｋｉｔ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）を使用した。細胞株におけるＴＴＰ、ＶＥＧＦ、及びＩＬ８のｍＲＮＡの相対発現を計算するために、２［ｄｄＣ（Ｔ）］方法を使用し（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００８）、さらに、ＲＰＬＰ０遺伝子（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７）を、標準化のために使用した。ｍＲＮＡの安定性を計算するために、２５μｇ／ｍｌの５，６−ジクロロ−１−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）を、培養した乳癌細胞に添加し、続いて、種々の時間に該細胞からＲＮＡを抽出した。培養液へのＤＲＢの添加前の０時間での各ｍＲＮＡの相対量を、１００％に設定した。
【０１３２】
Ｉ．３  細胞培養、切断、及びルシフェラーゼテスト
乳癌細胞株ＭＤＡ２３１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、及びＭＣＦ１０、並びに、ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３を、以前に記載されたように培養した（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７、Ｅｃｋｅｒｔ等、２００４）。ＲＡＷ２６４．７細胞を、３７℃の５％ＣＯ２の加湿した大気において、ウシ胎仔血清を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍにおいて増殖し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で刺激した。ＴＴＰ抗体を、ヒト型ＴＴＰを遺伝子導入されたＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞及びＨＥＫ２９３細胞のタンパク質抽出物に対する免疫ブロット解析によって検証した（Ｌａｙ等、１９９９）。安定なクローンを、ｐＲＥＶ−ＴＴＰプラスミドにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を遺伝子導入することによって取得し、さらに、ハイグロマイシン耐性クローンを、培養液からのテトラサイクリンの除去後に免疫ブロットによってスクリーニングした。ＭＣＦ７細胞におけるＴＴＰの不活性化を、細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＭＩＳＳＩＯＮ（商標）ｓｈＲＮＡレンチウイルスプラスミド（ＳＩＧＭＡ社）を遺伝子導入することによって得た。耐性クローンの選択を、培養液にピューロマイシンを添加することによって実行し、さらに、選択したクローンのスクリーニングを、ｑＰＣＲによって実行した。
【０１３３】
翻訳に対するＴＴＰ  ｒｓ３７４６０８３多型の機能テストを、リン酸カルシウム法を使用して、野生型ＴＴＰ（ｗｔ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）及び変異体ＴＴＰ（ｖａｒ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）に相当するプラスミドを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞に対して実行した（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７）。そのテストを、野生型ＴＴＰ配列及び配列変異体を保有する種々の量のｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｙｓＡ（各コンストラクトに対して２つの独立した調製）で二回実行した。同時に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミド（プラスミドｐＧＬ３）３００ｎｇを、各ウェルにおける遺伝子導入の効率の独立した対照として同時導入した。テストを、以前に記載されたように実行した（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７）。遺伝子導入の効率を、タンパク質量に対して標準化したルシフェラーゼレベルから計算した。同じレベルの遺伝子導入の効率（差＜２０％）を示した細胞のみを解析した。レムリ（ｌａｅｍｍｌｉ）溶解液を細胞に添加した。抽出物のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いて、フッ化ポリビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上に移した。免疫反応性タンパク質は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ検出システム（ＥＣＬ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ＩＬ）を用いて明らかにされる。
【０１３４】
Ｉ．４  仔牛腸由来のアルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用いた治療
ＣＩＡＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いた実験に対して、解析前の２４時間、ＭＤＡ２３１細胞からテトラサイクリンを取り除いた。細胞を、続いて、溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）において溶解した。ＣＩＡＰ（３５Ｕ）を、１時間３７℃の可溶化液に添加した。レムリ溶解緩衝液を添加することによって反応を中止させた。
【０１３５】
Ｉ．５  ＶＥＧＦ及びＩＬ−８分泌の測定
細胞上清におけるＶＥＧＦ及びＩＬ−８の存在を、ヒトＶＥＧＦ及びＩＬ−８に対する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。
【０１３６】
Ｉ．６  患者及び関連研究
乳癌を有した９２人の女性、及び、対照として８９人の女性を、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在に対して解析した。癌を被る患者全てが、ＨＥＲ２遺伝子（ＨＥＲ２陽性）の増幅と共に非常に高悪性度の腫瘍を有し、全員を、ＨＥＲ２に対して作られたモノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）を用いて治療した。ゲノムＤＮＡを、標準的な技術を使用して末梢血白血球から抽出した。ＳＮＰ  ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｔ（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）に対して、１つの４００ｂｐの増幅産物を、プライマー１０３Ｆ（５’−ＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧ−３’）及び１０３Ｒ（５’−ＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＴ）を使用して、及び、以下のＰＣＲ条件、すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応量における２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、５０ｐＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１Ｘ緩衝液、０．９ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、及び１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に従うことによって生じた。９５℃での１０分間の最初の変性の後、９５℃で４５秒間、６２℃で４５秒間、７２℃で４５秒間、次に、７２℃で１０分間最後の伸長という３５の増幅サイクルが続いた。ｒｓ３７４６０８３遺伝子座での変異体のＴ対立遺伝子の有無（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在；ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｔ）は、（製造者、すなわちＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社の指示に従い）制限酵素ＨｈａＩを用いた消化によって評価される。酵素消化の後、試料は、３％アガロースゲル上に堆積される。
【０１３７】
Ｉ．７  統計学的解析
対立遺伝子頻度は、遺伝子型データから推定される。患者群及び対照群は、統計学的有意性の基準としてｐ＝０．０５を規定することによってＦｉｓｈｅｒ直接確率法と比較される。Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡が、対照群においても患者群においてもカイ二乗検定を用いてテストされる。臨床研究のために、腫瘍パラメータをＡＮＯＶＡによって比較した。生存推定を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して計算した。生存期間の差を、ログランク検定を使用して評価した。カイ二乗検定を使用して、患者の遺伝子型と、（血液学的、消化性）毒性と、トラスツズマブに基づく治療に対する応答との関連性を決定した。
【０１３８】
ＩＩ．結果
ＩＩ．１  乳癌細胞株におけるＴＴＰ、ＶＥＧＦ、及びＩＬ８の発現
ＴＴＰタンパク質のレベルを、いくつかの乳癌細胞株：ＭＤＡ２３１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ７、及びＴ４７Ｄにおいて免疫ブロットによって解析した。ＭＤＡ２３１及びＨｓ５７８Ｔは、非常に高悪性度の細胞株であり、間葉系の表現型、（「トリプルネガティブ」表現型とも呼ばれる）エストロゲン並びにプロゲステロン受容体及びＨＥＲ２受容体の発現の欠如によって特徴づけられる一方で、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄは、より悪性度の低い上皮系の表現型、ＨＥＲ２タンパク質の増幅がないエストロゲン及びプロゲステロン受容体の発現を有する（Ｅｃｋｅｒｔ等、２００４）。ＴＴＰタンパク質の期待されるサイズは、３５ｋＤａであるが、市販の抗体（Ｓｕｓｗａｍ等、２００８、Ａｌ−Ｓｏｕｈｉｂａｎｉ等２０１０）も「ハウス（ｈｏｕｓｅ）」抗体（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７）も使用した従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット解析の間に４５ｋＤａから４７ｋＤａのバンドの形状で移動することが頻繁にある。２つの癌細胞株、ＭＤＡ２３１及びＨｓ５７８Ｔは、期待されたサイズのタンパク質を発現しなかったが、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞は、非腫瘍形成性の不死化した乳房の細胞株であるＭＣＦ１０のものに匹敵するレベルで発現したということを観察した（図１Ａ）。トリプルネガティブ細胞（ＭＤＡ２３１及びＨｓ５７８Ｔ）におけるＶＥＧＦ及びＩＬ８等の血管新生因子の、より悪性度の低い細胞株（ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ）よりも高い産生と、ＴＴＰタンパク質の発現の欠如が関連があるかどうかを調べた。そのためにも、４つの細胞株において、これらの因子のｍＲＮＡのレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって決定し、さらに、分泌されたタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ＭＤＡ２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞は、ＴＴＰタンパク質を発現しないが、ｍＲＮＡ及びタンパク質両方に関して大量のＶＥＧＦ及びＩＬ８を産生する（図１Ｂ及び１Ｃ）。これらのデータは、ＴＴＰレベルと乳腺腫瘍細胞の病原力との相互関係の基礎をなす。
【０１３９】
ＩＩ．２  ＴＴＰの発現の調節は、比較的に悪性度の低い又は非常に高悪性度の乳癌細胞において血管新生因子の発現に影響を与える
乳癌におけるＴＴＰタンパク質と血管新生因子との相互関係を研究するために、Ｍｙｃ−エピトープのタグをつけたテトラサイクリン誘導ＴＴＰ遺伝子を安定的に遺伝子導入したＭＤＡ２３１／ＴＥＴ−ＯＦＦ細胞のクローンを作製した。ＨｅＬａ／ＴＴＰ細胞に対して以前に観察されたように、ＴＥＴ−ＯＦＦモデルは、細胞増殖に関与する遺伝子の研究に対してより適しており、さらに、偽陽性クローンの選択を回避する（Ｓｕｓｗａｍ等、２００８）。テトラサイクリンの存在下では、ＴＴＰタンパク質は発現されない。培地からテトラサイクリンを除去することによって、ＴＴＰ誘導が可能になる。ＴＴＰタンパク質の弱誘導性の発現を有した１つのクローン（ＰＡ１５）、及び、高誘導性の発現を有した２つのクローン（ＰＡ１及びＰＡ４８）を得た（図２Ａ）。ＶＥＧＦ及びＩＬ８のｍＲＮＡの産生に対するＴＴＰタンパク質の効果を示すために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行し、ＶＥＧＦ及びＩＬ８のｍＲＮＡの発現に対するＴＴＰタンパク質の用量依存的な効果を観察した（図２Ｂ）。この実験によって、血管新生因子のｍＲＮＡのレベルの減少はＴＴＰタンパク質のレベル次第であるということが確かめられている。
【０１４０】
ＴＴＰタンパク質の発現と血管新生因子の産生との相互関係を評価するために、ＭＤＡ２３１細胞に対して得たデータを、相補的なアプローチの手段、すなわち、タンパク質を正常に発現するＭＣＦ７乳癌細胞株におけるＴＴＰタンパク質発現の不活性化（サイレンシング）によって確かめた。以前観察したように、ＭＣＦ７細胞は上皮形態を有し、ＴＴＰタンパク質の明確に検出可能なレベルによって特徴づけられる。
【０１４１】
２つの非依存的なｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ６２．ＴＴＰ及びｓｈ６５．ＴＴＰ）を発現する２つのクローンは、対照（ｓｈ−ｃｔｒｌ）に対するＴＴＰ  ｍＲＮＡレベルの３０％及び４０％の減少をそれぞれ有する（図３Ａ）。免疫ブロット解析は、ＴＴＰレベルにおける明白な減少を確かめている（図３Ｂ）。ＴＴＰタンパク質における減少と同時に、ＶＥＧＦ及びＩＬ８のｍＲＮＡのレベルにおける増加を、ｓｈ６２．ＴＴＰ細胞及びｓｈ６５．ＴＴＰ細胞において観察し、それによって、ＴＴＰレベルとＶＥＧＦ及びＩＬ８のレベルとの逆相関が確かめられる（図３Ｃ）。
【０１４２】
ＩＩ．３  乳癌細胞の増殖に対するＴＴＰの効果
ＴＴＰタンパク質の発現によって調節することができる別の腫瘍形成表現型は、癌細胞の増殖速度である（Ｂｒｅｎｎａｎ等、２００９）。それぞれ高レベル及び低レベルでＴＴＰタンパク質を発現する２つのＭＤＡ２３１クローン（ＰＡ１及びＰＡ１５）において、増殖速度における減少は、ＴＴＰタンパク質の発現次第である（図４Ａ）。ＭＤＡ２３１クローンの増殖の間（４日間まで）に、神経膠腫又はＨｅＬａ細胞に対して観察されたように（Ｓｕｓｗａｍ等、２００８、Ｂｒｅｎｎａｎ等、２００９）、形態学的変化も細胞死又はアポトーシスにおける増加も注目することはなかった。さらに、安定なＭＣＦ７−ＴＴＰノックダウンクローン（ｓｈ６２−ＴＴＰ１及びｓｈ６５−ＴＴＰ２）を使用して、増殖に対するＴＴＰタンパク質発現の効果を確かめた。形態学的観点から、これらのクローンは、コロニーの形状で増殖する能力、上皮間葉転換におけるＴＴＰタンパク質の損失の関与を実証し得る効果を有する（Ｇｅｂｅｓｈｕｂｅｒ等、２００９）（図４Ｂ）。２つのクローン（ｓｈ６２−ＴＴＰ１及びｓｈ６５−ＴＴＰ２）は、用量依存的ＴＴＰタンパク質の消失と相関した増殖速度における有意な増加を示した（図４Ｃ）。ＶＥＧＦ及びＩＬ８のｍＲＮＡの発現に対して先に記載したように、増殖に対する用量依存的効果を観察した。
【０１４３】
ＩＩ．４  乳癌におけるＴＴＰ発現
全てを考慮した上で、本データは、２つの血管新生因子、ＶＥＧＦ及びＩＬ８の産生、並びに、乳癌細胞増殖の調節におけるＴＴＰタンパク質レベルの重大な役割を明白に指摘している。これらの結果は、乳癌におけるＴＴＰタンパク質発現の頻繁な抑制を示す発表されたデータを明白に実証している。その結果、ＴＴＰタンパク質は、腫瘍の悪性度に対する予後因子として提案された（Ｂｒｅｎｎａｎ等、２００９）。乳癌に対する予後因子としてＴＴＰタンパク質発現速度を使用する可能性は非常に将来有望であるため、上記の乳癌細胞株におけるＴＴＰ  ｍＲＮＡ及びＴＴＰタンパク質レベルの相対量をテストし、ｍＲＮＡのレベルとＴＴＰタンパク質のレベルとの相互関係を示した。ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１、Ｔ４７Ｄ、及びＨｓ５７８Ｔ細胞をテストし、さらに、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を、これらの細胞がＴＴＰタンパク質の発現に対して負であるとして記載されてきた（Ｌａｙ等、１９９９）ことを考慮に入れ、負の対照として使用した。図５Ａにおいて示されているように、ＴＴＰタンパク質は、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞において明白に検出することができる一方で、ＨＥＫ２９３、ＭＤＡ２３１、及びＨｓ５７８Ｔ細胞においては欠如しているか又は弱く発現されている。ＴＴＰ  ｍＲＮＡを、ΔΔＣＴ法を使用して解析した。ＭＣＦ７細胞におけるｍＲＮＡレベルは、参照値（１００％）としてみなした。最も低いＴＴＰ  ｍＲＮＡレベルを、ＭＤＡ２３１細胞において発見し、有意なＴＴＰ  ｍＲＮＡレベルを、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞において検出した。意外にも、前記タンパク質を発現しないＨｓ５７８Ｔ細胞が、検出可能なレベルのＴＴＰ  ｍＲＮＡを明白に有している（図５Ｂ）。これらのデータは、ｍＲＮＡの発現レベルとＴＴＰタンパク質の発現レベルとの相互関係の明らかな欠如を示している。この相互関係の欠如は、ＴＴＰ  ｍＲＮＡのより短い半減期によるもの、又は、そのｍＲＮＡの翻訳レベルの相違によるものであり得る。
【０１４４】
ＩＩ．５  ＴＴＰ遺伝子の遺伝子解析
Ｈｓ５７８Ｔ細胞におけるＴＴＰタンパク質のレベルとｍＲＮＡのレベルとの相互関係の欠如を研究するために、ゲノムＤＮＡ上のＴＴＰタンパク質をコードする領域を配列決定し、さらに、ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡを対照として使用した。アルギニンに対応するコドンを修飾してＣＧＣをＣＧＴ（Ｒ１０３Ｒ）に形質転換する一塩基多型（ＳＮＰ）を、Ｈｓ５７８Ｔ細胞において検出した（ｒｓ３７４６０８３＝ＮＭ＿００３４０７．２：３６７Ｃ＞Ｔ、ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）。乳癌を被る女性の群（９２人：患者群）、及び、対照としての女性の群（８９人：対照群）を研究することによって、症例対照研究を実行して、乳房発癌における３６７Ｃ＞Ｔ変異体（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）が果たす役割を評価した。患者全てが、ＨＥＲ２遺伝子の増幅と共に非常に高悪性度の腫瘍を有し（ＨＥＲ２陽性）、症例全てを、ＨＥＲ２に対して作られたモノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）を用いて治療した（Ｈａｌｌ等、２００９）。患者群において１３のｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣ／Ｔヘテロ接合体を同定し（Ｔ対立遺伝子の頻度＝１４．１％）、且つ、対照群において５つのｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣ／Ｔヘテロ接合体を同定した（Ｔ対立遺伝子の頻度＝５．６％）。表１におけるｒｓ３７４６０８３多型のＣ及びＴ対立遺伝子の対立遺伝子頻度は、患者群におけるＴ対立遺伝子の頻度の増加を明らかにしたが、統計学的有意性の閾値には達していない（カイ二乗検定ｐ＝０．０９５、Ｆｉｓｈｅｒ検定を使用して確証ｐ＝０．０８０、ＯＲ＝２．７、ＣＩ９５％［０．９−１０．３］）。さらに、３６７Ｃ＞Ｔ変異体（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）が、生存率等の他の臨床パラメータと付随し得るかどうかを調べた。生存率との相互関係は同定されなかった。しかし、ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子の異なる分布を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）を用いた治療に対する患者の応答に関して観察した。表２において示されているように、ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）に耐性の患者の群において、統計学的に有意な値（カイ二乗検定ｐ＝０．０１０、Ｆｉｓｈｅｒ検定を使用して確証ｐ＝０．００９３、ＯＲ＝８．０、ＣＩ９５％［１．９−３３．４］）を有して、対照群よりも明瞭に高頻度であった。これらのデータは、ＴＴＰタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子に対するｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在がＴＴＰタンパク質発現に対して機能的効果を有し、さらに、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））治療に対する患者の差次的な反応に関連があるということを示している。
【０１４５】
【表１】
2014519330.tif 000002
【０１４６】
【表２】
2014519330.tif 000003
ＩＩ．６  ３６７Ｃ＞Ｔ遺伝子変異体（ＮＭ＿００３４０７．２）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）の機能解析
遺伝子解析の間に得た結果を考慮して、３６７Ｃ＞Ｔ変異体（ＮＭ＿００３４０７．２）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）が、Ｈｓ５７８Ｔ細胞において観察したｍＲＮＡのレベルとＴＴＰタンパク質のレベルの間の相違の原因であり得るかどうかを調べた。第一に、３６７Ｃ＞Ｔの変化（ＮＭ＿００３４０７．２）が、ｍＲＮＡの安定性又はタンパク質の翻訳に干渉することによって遺伝子の発現に影響を与え得るかどうかを調べた（Ｓａｕｎａ、２００７）。Ｈｓ５７８Ｔ細胞から得たＴＴＰ  ｃＤＮＡのＰＣＲ解析は、これらの細胞における、ＭＤＡ２３１細胞と比較して異常な別の転写物の存在を明らかにしなかった（図６Ａ）。野生型（Ｃ対立遺伝子）（ｗｔ）も変異体対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子）（ｖａｒ）も転写されたことを検証するために、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドの同定を、一方で、酵素ＨｈａＩを用いた消化を解析することによって、もう一方で、Ｈｓ５７８Ｔ細胞から得たゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡから生じるＰＣＲ産物を配列決定することによって実行した。２つの技術によって、Ｈｓ５７８Ｔ細胞において、（ｒｓ３７４６０８３多型の）Ｔ対立遺伝子が、野生型（ｒｓ３７４６０８３多型の）Ｃ対立遺伝子よりも発現されたことが示された（図６Ａ及び６Ｂ）。さらに、ＭＦｏｌｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用したＴＴＰ  ｍＲＮＡ構造の予測解析によって、（ｒｓ３７４６０８３多型の）Ｃ対立遺伝子に対応するｍＲＮＡ分子に対して、（ｒｓ３７４６０８３多型の）Ｔ対立遺伝子に対応するｍＲＮＡ分子のより安定な二次構造が示された（図６Ｃ）。ＴＴＰ  ｍＲＮＡの半減期は、ＭＣＦ７及びＭＤＡ２３１の細胞において１８分であり、さらに、Ｈｓ５７８Ｔ細胞においては２１分である（図６Ｄ）。非常に安定なＲＮＡ構造は、対応するｍＲＮＡの翻訳レベルに影響を与え得るため、非常に安定及び豊富なｍＲＮＡ分子は、より低いタンパク質レベルに付随し得ることを仮定した（Ｎａｃｋｌｅｙ等、２００６）。この仮説を機能的にテストするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳実験を、野生型対立遺伝子（ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子）に対しても、変異体対立遺伝子（ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子）に対してもタグをつけたＴＴＰコンストラクトを使用して実行した。従って、野生型ＴＴＰ遺伝子（ｗｔ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＣヌクレオチドの存在）の翻訳レベルは、変異体ＴＴＰ遺伝子（ｖａｒ）（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）よりも高い（図７Ａ）。これらのデータを確かめるために、両方の全長コード領域（ｒｓ３７４６０８３多型の野生型Ｃ対立遺伝子及び変異体Ｔ対立遺伝子）を真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−Ｈｉｓにおいてクローン化することによって実験モデルを開発し、ＴＴＰ陰性ＨＥＫ２９３細胞株における一過性導入まで進めた。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、遺伝子導入効率の制御として同時導入した。種々の量のＴＴＰプラスミド（１００、２００、及び５００ｎｇのＤＮＡ／１０５細胞）を用いた実験を実行して、���シフェラーゼ転写及び／又は安定性に影響を与えないか、又は、大量の細胞死を誘導しない最適なＴＴＰ濃度を決定した。細胞死に対する効果は観察されなかったが、５００ｎｇの遺伝子導入は、ルシフェラーゼ活性に有意に影響を与えたため、野生型コンストラクト（ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子）に対しても、ＴＴＰ変異体（ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子）に対しても除外した。匹敵する遺伝子導入効率によって特徴づけられた試料のみを比較することによって、１００又は２００ｎｇの発現プラスミドが遺伝子導入された場合に、野生型ＴＴＰプラスミド（ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子）が変異体ＴＴＰプラスミド（ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子）よりも多くの量のタンパク質を産生したということを示す（図７Ｂ）。
【０１４７】
野生型（ｒｓ３７４６０８３多型のＣ対立遺伝子）コンストラクトと、変異体（ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子）ＴＴＰコンストラクトとの差をさらに研究するために、機能解析を実行し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の下流でクローン化されるよく知られたＴＴＰタンパク質の標的であるＶＥＧＦ３’ＵＴＲに対する両方のプラスミドの効果をテストした（Ｅｓｓａｆｉ−Ｂｅｎｋｈａｄｉｒ等、２００７）。ＨＥＫ２９３細胞に野生型ＴＴＰ遺伝子を遺伝子導入した場合に、対照（ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−Ｈｉｓ空のベクター）に対して、ルシフェラーゼ活性の減少を観察したが、ＴＴＰの変異型の遺伝子導入は、空のベクターの遺伝子導入後に得たものと同等のルシフェラーゼ活性を与えるということに留意する（図８Ａ）。これらの結果を確認するために、内在性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの半減期を、ＨＥＫ２９３細胞において検証した。野生型ＴＴＰプラスミドの遺伝子導入の２４時間後に有意な差を得た。ＴＴＰの変異型の遺伝子導入は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの半減期に対して有意に影響を与えなかった（図８Ｂ）。これらのデータを確かめるために、ＤＲＢを使用して転写を抑制し、さらに、サイクリンＤ１の発現を検証した。サイクリンＤ１ｍＲＮＡは、ＴＴＰタンパク質の別の内在性標的である（Ｍａｒｄｅｒｏｓｉａｎ等、２００６）。図８Ｃにおいて示されているように、３時間のＤＲＢ処置の後、サイクリンＤ１ｍＲＮＡの量は、野生型ＴＴＰ遺伝子の遺伝子導入後のみ減少し、ＴＴＰの変異型は効果を有さなかった。これらのデータ全てが、ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）に対応するＴＴＰ  ｍＲＮＡの形状は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで同じ効率で翻訳されず、より低いタンパク質レベルを生じたことを示している。ｒｓ３７４６０８３多型のＴ対立遺伝子（ｒｓ３７４６０８３多型部位でのＴヌクレオチドの存在）に対応するＴＴＰ  ｍＲＮＡの存在は、より低いタンパク質レベルによって表され、標的ｍＲＮＡの半減期の増加をもたらす。
【０１４８】
参照文献
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Ｅｃｋｅｒｔ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｒｅｐａｓｋｙ，  Ｇ．Ａ．，  Ｕｌｋｔｉ，  Ａ．Ｓ．，  ＭｃＦａｌｌ，  Ａ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｈ．，  Ｓａｒｔｏｒ，  ＣＬ，  Ｄｅｒ，  Ｃ．Ｊ．  （２００４）  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒａｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ｉｎｖａｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｎｏｉｋｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６４，  ４５８５−４５９２．
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Ｓｌａｍｏｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｓ．  Ｇ．，  Ｌｅｖｉｎ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ａ．，  ａｎｄ  ＭｃＧｕｉｒｅ，  Ｗ．  Ｌ．  （１９８７）．  Ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｏｒｒeｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，  １７７−１８２．
Ｓｕｓｗａｍ，  Ｅ．，  Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，  Ｇ．  Ｙ，  Ｌｉ，  Ｘ．，  Ｓｈａｃｋａ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｌｕ，  Ｌ．，  Ｚｈｅｎｇ，  Ｌ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｐ．  Ｈ．  （２００８）  Ｔｒｉｓｔｅｔｒａｐｒｏｌｉｎ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６８，  ６７４−６８２．
Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｉｋａｗａ  Ｓ，  Ａｋｉｙａｍａ  Ｔ，  Ｓｅｍｂａ  Ｋ，  Ｎｏｍｕｒａ  Ｎ，  Ｍｉｙａｊｉｍａ  Ｎ，  Ｓａｉｔｏ  Ｔ，  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ  Ｋ．  １９８６  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ．  Ｊａｎ  １６−２２；３１９（６０５０）：２３０−４．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月13日(2014.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、
ｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、特に、両方の対立遺伝子に対して、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップ、及び／又は、
ｉｉ）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定するステップ、
を含み、前記患者は、ＨＥＲ２陽性癌を被っている、方法。
【請求項２】
前記患者は、ＨＥＲ２陽性乳癌を被っている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害薬は、ＨＥＲ２に対して作られる抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＥＲ２に対して作られる抗体は、トラスツズマブである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において決定した前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを、少なくとも１つの参照値と比較するステップ、
をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
患者におけるＨＥＲ２陽性癌を治療するための薬物を製造するためのＨＥＲ２阻害薬の使用であって、前記患者は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法によって前記ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される、ＨＥＲ２阻害薬の使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用であって、前記ＨＥＲ２阻害薬がＨＥＲ２に対して作られる抗体である、使用。
【請求項８】
前記ＨＥＲ２に対して作られる抗体は、トラスツズマブである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
−少なくとも１つのＨＥＲ２阻害薬、及び
−ＨＥＲ２陽性癌を治療するための少なくとも１つの他の薬剤、
を、患者におけるＨＥＲ２陽性癌を治療するための同時、別々、若しくは連続使用のための配合剤として含む製品であって、前記患者は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法によって前記ＨＥＲ２阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される、製品。
【請求項１０】
前記阻害薬は、ＨＥＲ２に対して作られる抗体である、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
前記ＨＥＲ２に対して作られる抗体は、トラスツズマブである、請求項１０に記載の製品。
【請求項１２】
患者における癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏでの予後又は診断の方法であって、
α）前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、特に、両方の対立遺伝子に対する、ｒｓ３７４６０８３多型部位のヌクレオチドを同定するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記癌は、予後不良を有した癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、前立腺癌、精巣癌、気管癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、腎癌、膀胱癌、及び、皮膚癌を含む群に含まれる、請求項１２又は１３に記載の方法。
【国際調査報告】
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