(57)【要約】  本発明は医療診断の分野に関する。撹乱された組織恒常性及び疾患を映す鏡として循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を使用して、対象における組織損傷の早期検出、疾患の早期診断及びモニタリング、及び／又は治療の有効性の評価のために、対象の健康状態を判定する方法及びキットを提供する。
2014507005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撹乱された組織恒常性及び疾患を映す鏡として循環組織マクロファージを使用して、対象における組織損傷の早期検出、疾患の早期診断及びモニタリング、及び／又は治療の有効性の評価のために、対象の健康状態を判定する方法であって、
ａ）循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を含む前記対象由来の生物学的試験試料を用意するステップ、
ｂ）異なるＣＴＭサブセットの特定及び列挙のために、前記骨格マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅ並びに好ましくは更にＨＬＡＤＲに対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記ＣＴＭを染色するステップ、
ｃ）その起源組織における個々のＣＴＭによる非ＣＴＭタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する１種類以上の検出抗体を使用した前記ＣＴＭの固定、透過化及び染色、それによって循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の少なくとも１つのサブセットを特定するステップ、
ｄ）個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定する前記染色ＣＴＭ及びＣＴＳＭの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、
ｅ）各ＣＴＭサブセット、及び測定された細胞内エピトープの各々を発現する各特定のＣＴＳＭサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
ｆ）（ｉ）評価された個々のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１セットによって規定された異なる正常及び変化組織から各々生ずる各ＣＴＭサブセット及び各特定のＣＴＳＭサブセット内の細胞の相対及び絶対数と、ｉｉ）評価された個々の細胞内ペプチドごとに関連付けられた抗体関連信号の量とを計算して、試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを得るステップ、並びに
ｇ）前記試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを各評価組織の正常ＣＴＳＭ染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び／又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）が、マーカーＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲに対する抗体で染色することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）が、さらに、マーカーＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ３６の１種類以上に対する抗体で染色することを含む、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）が、側方散乱（ＳＳＣ）分析と組み合わせてＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６、好ましくはＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲの細胞表面発現に基づくゲーティング戦略を実施することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲーティング戦略が、（ｉ）側方散乱（ＳＳＣ）分析と組み合わせて、ＣＤ３００ｅの発現、好ましくはＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲの発現に基づく古典的単球とＣＴＭの両方を包含する包含ステップと、（ｉｉ）それに続いて、前記古典的ＣＤ１４高／ＣＤ１６−単球をＣＴＭから識別し、前記ＣＴＭ集団内のサブセットを特定するサブセット特定ステップとで構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下のいずれか１つを含む、請求項５に記載の方法：
（ｉ）ＣＤ３００ｅを発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択するための、少なくともＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６についての染色、並びにＳＳＣとＣＤ３００ｅ＋細胞の組合せに対するゲーティング、
（ｉｉ）同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択するための、少なくともＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲについての染色、並びに側方散乱（ＳＳＣ）とＣＤ３００ｅ＋及びＨＬＡＤＲ＋細胞の組合せに対するゲーティング、又は
（ｉｖ）少なくともＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡＤＲについての染色、並びにＳＳＣとＣＤ３００ｅ＋、ＣＤ４５＋及びＨＬＡＤＲ＋細胞の組合せに対するゲーティング、好ましくは同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現するＣＤ４５を有する低〜中間ＳＳＣの細胞に対するゲーティング。
【請求項７】
前記サブセット特定ステップが、古典的（ＣＤ１４高／ＣＤ１６−）単球並びにＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ１４低／ＣＤ１６高及びＣＤ１４−／ＣＤ１６高〜ＣＤ１４−／ＣＤ１６低細胞として特定される２つの主要なＣＴＭサブセットの特定を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＴＭサブセット特定ステップが、
−後期ＣＴＭを表すＣＤ６４低対古典的単球プラス初期ＣＴＭを表すＣＤ６４高に対してゲーティングを行うこと、続いて
−他の初期ＣＴＭ細胞すべて（対古典的単球）をＣＤ１６＋／ＣＤ１４＋表現型を有する事象として選択することによって単球とＣＴＭを識別すること、並びにＣＴＭコンパートメント全体をＣＤ６４低として及びＣＤ１６＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ６４高として規定すること、続いて
−ＣＤ６４、ＣＤ１４及びＣＤ１６の発現レベルに基づいて選択されたＣＴＭを異なる機能又は成熟関連コンパートメントに更に細分すること、好ましくは前記異なるコンパートメントはＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低である
を含む、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記選択されたＣＴＭを更に細分するステップがＣＤ６４、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３６に基づき、好ましくは少なくとも１つの以下のＣＴＭサブセット、すなわちＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ３６高／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低／ＣＤ３６−〜低細胞の特定を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物試料が、末梢血、腹水、胸水、脳脊髄液、骨髄、リンパ節、リンパ液、滑液、又は固体組織から調製される単一細胞懸濁液を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）が以下の細胞内染色を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法：
ａ．細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する単一プロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｂ．１種類の細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｃ．単一器官又は組織の正常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｄ．単一器官又は組織の異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｅ．正常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも１種類の抗体と異常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも１種類の抗体の組合せを含めて、単一器官又は組織の正常及び異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、並びに
ｆ．２つ以上の器官又は組織の正常又は異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ。
【請求項１２】
前記少なくとも１種類の検出抗体によって異常タンパク質に由来する１種類以上のペプチドエピトープの検出が可能になり、好ましくは前記異常タンパク質が、発癌タンパク質、変異タンパク質、融合タンパク質、アレルゲンに由来するタンパク質、及びウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のような病原体に由来するタンパク質からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異なって標識された抗体のパネルが、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジン葉緑素タンパク質（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、ａｌｅｘａ  ６４７、ａｌｅｘａ  ７１０、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５、ｃｙａｎｉｎ  ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎ  ５．５（Ｃｙ５．５）、ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（ＰａｃＢ）、ｈｏｒｉｚｏｎ  ｖｉｏｌｅｔ  ４５０（ＨＶ４５０）、ｐａｃｉｆｉｃ  ｏｒａｎｇｅ（ＰａｃＯ）、ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）、ＨＶ５００、ＯＣ５１５、Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びＰＥ、ＡＰＣ又はＰｅｒＣＰと結合したその複合物（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５、ＰＥ／Ｃｙ５．５、ＰＥ／Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＰＣＣｙ７５０）から選択される適合蛍光色素の組合せ、又は任意の追加の適合蛍光色素若しくは蛍光色素タンデムを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第１の容器に１セットの骨格マーカーを含む診断キットであって、異なって標識された抗体を含み、前記骨格マーカーがＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６、好ましくは更にＨＬＡＤＲであり、場合によっては、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのＣＴＭサブセットの特定及び列挙のための前記キットの使用説明書を含む、診断キット。
【請求項１５】
前記第１の容器が、マーカーＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６、好ましくはＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲに対する抗体を含む、より好ましくは更にマーカーＣＤ３６、ＣＤ６４又はＣＤ４５に対する抗体の群から選択される少なくとも１種類の抗体を含む、請求項１４に記載の診断キット。
【請求項１６】
前記第１の容器がＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する抗体を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
さらに、その起源組織における個々のＣＴＭによる非ＣＴＭタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する少なくとも１種類の検出抗体を含む第２の容器を含む、請求項１４から１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
前記第２の容器が、悪性腫ようの早期診断及びモニタリングに使用される、上皮タンパク質、好ましくは乳房上皮タンパク質、食道上皮タンパク質、胃上皮タンパク質、すい臓上皮タンパク質、結腸上皮タンパク質、直腸−Ｓ状結腸上皮タンパク質、甲状腺上皮タンパク質、肺若しくは気管支上皮タンパク質、前立腺上皮タンパク質、ぼうこう上皮タンパク質、頚部上皮タンパク質、子宮上皮タンパク質、黒色腫タンパク質（例えば、Ｍｅｌａｎ−Ａ）、腎糸球体タンパク質の細胞内分解に由来する１個以上のプロテアーゼ誘導タンパク質断片に対する、又は別の上皮細胞マーカーに対する、少なくとも１種類の検出抗体を含み、場合によっては更に説明書も含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記第２の容器が、アルツハイマー病、神経こう腫又は多発性硬化症の早期診断及びモニタリングに使用される、好ましくはＡｐｏε４、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＧＦＡＰ及びミエリンからなる群から選択される、脳又は神経特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含み、場合によっては更に説明書も含む、請求項１７又は１８に記載の診断キット。
【請求項２０】
前記第２の容器が、それぞれ心臓、腎臓、肝臓又は肺移植を受けた患者における移植後の器官生存及び移植拒絶プロセスの評価に使用される、心筋特異的タンパク質（例えば、トロポニン又はＣＫ−ＭＢ）、腎臓／糸球体特異的タンパク質、肝臓特異的タンパク質又は肺特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含み、場合によっては更に説明書も含む、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療診断の分野に関する。本発明は、診断キットを含めた新しいツール、並びにとりわけ生理的プロセスの評価、生活習慣及び、環境暴露、疾患の早期診断及びモニタリング、及びその治療を目的とした、全身スキャン方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全身スキャンは、健康な状態及び疾病の診断及び治療を支援するための対象の全身のスキャンである。全身スキャンは、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）技術が使用される場合には全身ＣＴスキャンとしても知られるが、全身スキャンを実施することができる医用画像技術には多数のタイプがある。全身スキャンは、理論的に、初期の致死的疾患（例えば、癌）を捕らえて、命を救うことができる。しかし、実際には、現在知られている全身スキャンの利点はリスク及びコストにまさることができない。したがって、疾患があるとは診断されていない患者、又は疾患を示唆する症候のない患者のスクリーニングに全身スキャンを使用することについては論争がある。疾患をスクリーニングするどの試験とも同様に、全身ＣＴスキャンのリスクを初期の治療可能な疾患を特定する利点と比べる必要がある。ほとんどの他の診断Ｘ線処置と比較して、ＣＴスキャンは、放射線被曝が比較的多く、晩年に癌を発症する可能性が極めて小さいもののそれでも有意に増加し得る。重要なことには、現行の撮像技術は、一度に１人の対象しか分析することができない高価な装置を必要とする。それに対して、血液検査は、多数の個体で並行して実施することができ、必要な計測手段は多数の診断検査室で広範に利用可能である。さらに、血液検査の場合、患者は、スクリーニングセンターに行く必要がなく、血液試料を地元で採取し、その後送付すればよい。
【０００３】
本発明者らは、初期に治療可能な疾患を特定する利点がリスクを大きく上回る、対象の全身をスキャンする代替の手段及び方法が必要であることを認識した。本発明者らは、生理的プロセスの評価、健康状態全般のスクリーニング、並びに疾患の早期診断及びモニタリング及びその管理（例えば、治療）を目的とした概念的に新しい全身スキャンシステムを開発した。この全身スキャンシステムは、フローサイトメトリーボディスキャン（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｏｄｙ  Ｓｃａｎ）（ＦｌｏｗＢｏＳｃａｎ）、又は撹乱された組織恒常性及び疾患を映す鏡として組織マクロファージを血液中で使用する組織マクロファージスキャン（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｓｃａｎ）（ＴｉＭａＳｃａｎ）を含む。この新規ツールは、有害な照射に体を暴露させる必要がない。対照的に、ＴｉＭａＳｃａｎは、末梢血などの容易に入手可能な体試料に対して実施することができる。
【０００４】
ヒト及び動物の体の組織コンパートメントはすべて、細胞増殖と細胞死、主にアポトーシス（Ｉ型）及び自己貪食（ＩＩ型）によるプログラム細胞死の繊細な恒常性バランスによって維持されている。組織のタイプに応じて、恒常性活性は上下する。例えば、腸上皮細胞、骨髄造血細胞及び皮膚上皮は代謝回転が速いが、この代謝回転は神経系、肝臓、腎臓、筋肉などの別の組織では遅い。それでも、全組織において、恒常性レベルが高くても低くても細胞恒常性が維持される。基本的恒常性レベルに加えて、活性化、再生及び老化プロセスは、増殖及び細胞死の恒常性に影響を及ぼし、増大又は退縮をもたらす。例えば、頻繁な使用による活性化は、スポーツにおける特定の身体トレーニングによる筋肉体積及び組成の増加、練習中断時のこうした筋肉の退縮など、基本的恒常性レベルをより高い恒常性レベルに高める。さらに、重労働又は化学品暴露による皮膚の損傷は、手掌及び足裏の皮膚を厚くし、損傷が消滅すると皮膚肥厚は消失する。
【０００５】
以下の特定の症状は、細胞恒常性レベルを変化させ、さらには撹乱さえし得る。
【０００６】
−組織損傷（外傷又は外科的介入）及びそれに続く修復、
−アルコール中毒及び肝機能障害又はマラソン及びトライアスロン参加並びに筋肉疲労などの器官系の機能的ストレス、
−（早発性）加齢性退縮（老化）、
−例えばコルチコステロイドなどの薬物による、抑制及びそれに続く再生、
−例えば自己免疫疾患における、炎症並びにそれに続く再生及び／又は線維形成による修復、
−結核、ライム病、Ｑ熱などの持続性くすぶり型及び潜行性の感染症、
−増殖の調節不全と、それに続く過形成、潜在的にやはりそれに続く異形成及び悪性転換。
【０００７】
高い恒常性増殖及びアポトーシスレベルにもかかわらず、死細胞又は瀕死の細胞は組織切片にはめったに認められない。死細胞及びアポトーシス細胞は組織マクロファージによって素早く効率的に除去されていることが明白である。個々の組織マクロファージは、関係組織において特別な（限られた）領域のために働き、アポトーシス細胞及び他の組織損傷を効率的に除去できると考えられる。各組織マクロファージは、限られた数のアポトーシス細胞（例えば、細胞のサイズ及びタイプに応じて２０から４０個の細胞）を扱う可能性が高いので、監視領域の体積／サイズは、組織のタイプ及び関係組織の恒常性活性レベルに依存する。恒常性レベルが高いほど、又は修復若しくは増殖レベルが高いほど、関係組織を壊死組織片のない状態に維持し、組織の機能障害による構造的組織変化を回避するために、より多くの組織マクロファージが必要である。その結果、単位組織体積当たりの組織マクロファージ数は、組織タイプ、組織活性、損傷後の炎症又は修復の発生率などに応じて変わり得る。組織マクロファージがその作用空間におけるその局所的任務を果たすとすぐに、これらの末期マクロファージは、その作用部位を離れ、リンパ管を介して血流に移動し、恐らくはひ臓において、体から排除される。
【０００８】
骨髄中の単球分化経路は、ＣＤ１４高／ＣＤ１６−古典的単球（「組織流入」単球）を連続的に産生する。これは、血液中で利用可能になり、炎症性単球として患部組織に補充することができ、そこで成熟してＣＤ１４高／ＣＤ１６＋及びＣＤ１４高／ＣＤ１６高組織マクロファージの不均一な（ｈｅｔ）集団になる（図１）。これらの細胞がその監視及び食作用の任務を果たすとすぐに、それらは末期マクロファージとなり、リンパ管系を介してＣＤ１４ｈｅｔ／ＣＤ１６ｈｅｔ  ＣＴＭとして血流に移動し（「組織流出」単球／マクロファージ）、そこではそれらは脆弱な細胞であり、寿命が短い（図１）。
【０００９】
少なくとも部分的には、ＣＴＭは末梢血において検出可能である。正常血液においては、不均一にＣＤ１４及びＣＤ１６を発現する小集団のＣＴＭが検出可能である。これらのＣＴＭは、加齢中及び特定の臨床状態、例えば、幹細胞移植（ＳＣＴ）後、並びに炎症、敗血症、癌及び過剰な運動の場合に増加する（図２）。
【００１０】
推定される移動及び再循環プロセスは、古典的単球及びＣＴＭの相対度数が部位ごとに異なり、骨髄及び血液中では不均一ＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋及びＣＤ１４ｄｉｍ／ＣＤ１６高ＣＴＭの度数が低く、リンパ液中では度数が高いという知見によって支持される（表１）（Ｏｒｆａｏ等、未発表の結果）。
【表１】
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【００１１】
健常者と疾患状態の両方において、各組織マクロファージの食胞中のタンパク質断片及びペプチドのセットは、組織特異的ペプチドからなると考えられる。というのは、組織マクロファージの監視領域が１つの組織タイプ、恐らくは更に関係組織内の小組織領域に限られる可能性が高いからである。その結果、ある一定の瞬間における血液中のＣＴＭの全集団は、全身の組織すべての恒常性レベルを反映している。食胞ペプチドのセットに基づいて、個々のＣＴＭをその起源組織に帰属できるはずである。循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の相対組成は、血液中の相対及び絶対数において、並びに異なる組織由来のタンパク質断片及びペプチドのその含有量において、安定である可能性がある。ただし、年齢に関連した、性別に関連した、代謝に関連した、及び活性に関連した差が生じる。というのは、かかる差は細胞恒常性に影響を及ぼすからである。重要なことには、体内の任意の部位における（組織損傷などの）恒常性変化は、相対及び絶対数の変化、並びに循環組織マクロファージの集団におけるタンパク質断片及びペプチドの細胞内レベルの相対組成の変化をもたらす。かかる変化は、１つ以上の異なるサブセットのＣＴＭ及びＣＴＳＭを含み得る。かかる変化としては、通常は発現されるエピトープの欠如、通常は存在しないエピトープの異常発現、又は通常発現されるエピトープの発現レベルの変化が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明においては、本発明者らは、細胞表面マーカーの独特の組合せを使用した、血液中の循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）及びそのサブセットを検出及び同定するシステムを開発した。このシステムは、組織において単一ＣＴＭによって局所的に捕獲されたタンパク質（例えば、ペプチド）の（例えば、１種類以上のプロテアーゼによる）細胞内プロセシング及び分解に由来する産物に対するエピトープの認識に焦点をおいたものである。新規システムの具体的な能力は、個々のＣＴＭサブセットの起源について血液試料中のＣＴＭコンパートメント全体のスクリーニングが可能であることに関わり、複数の組織特異的タンパク質断片又はペプチドの組合せに基づいてこれらのサブセットの定義づけが可能であることに関わる。さらに、これらの循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の更なるサブセット化は、腫よう性タンパク質などの異常発現タンパク質に由来するペプチドなどの別のペプチドの発現に基づくことができる。このようにして、全ＣＴＭコンパートメントが、恒常性であろうと撹乱であろうと、全身の種々の組織における進行中のプロセスを示す（反映する）。これらのＣＴＭサブセットの測定によって、これらの疾患の組織局在化を含めて、健康状態のモニタリング、及び特定の疾患のスクリーニングが可能になる。診断が行われるとすぐに、関連するＣＴＭサブセットのモニタリングを、例えば、疾患の消滅又は安定性を評価するために、及び／又は治療の有効性を評価するために、個体の状態の経過観察に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】血液中のＣＤ１６＋組織マクロファージは、古典的ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６−単球に直接由来しないが、組織における監視及び食作用に能動的に寄与し、リンパ管系を介して血流に再循環した組織マクロファージに由来する（Ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ及びＯｒｆａｏ、未発表データ）。
【図２】幾つかのタイプの単球／マクロファージサブセットは、正確なフローサイトメトリーゲーティング戦略と、それに続くＣＤ１４及びＣＤ１６染色パターンの分析によって検出することができる。Ａ．健康なドナーにおいては古典的単球はＣＤ１４＋／ＣＤ１６−であるが、ＣＴＭ集団はＣＤ１４及びＣＤ１６の不均一な（ｈｅｔ）発現を示し、この集団が幾つかのサブセットからなることを示している。Ｂ．感染症（例えば、野兎病菌）患者においては、ＣＤ１４ｈｅｔ／ＣＤ１６ｈｅｔサブセットは相対的にも絶対的にも増加する。Ｃ．幾つかのＣＴＭサブセットは、野兎病菌感染患者のＣＤ１４−ＣＤ１６ドットプロットにおいて特定することができる（Ａ．Ｏｒｆａｏ等、未発表結果）。
【図３】ＣＤ１４高／ＣＤ１６−古典的単球とより不均一なＣＴＭの正確な識別は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲなどの評価マーカーすべての主成分分析（ＡＰＳ  ｖｉｅｗ、Ｉｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェア；Ｃｙｔｏｇｎｏｓ、サラマンカ、ＥＳ）によって改善することができる。Ａ．ＣＤ１４／ＣＤ１６ドットプロット及びＣＤ１４／ＣＤ１２３ドットプロットは、古典的単球とＣＴＭが連続体であることを示唆している。Ｂ．ＡＰＳ１における全８種類のマーカーの主成分分析によれば、古典的単球とＣＴＭは別々の集団である。ＡＰＳ２の図においては、これら２つの集団は密接に関連しているように見える。
【図４】血液白血球のＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲの発現に対する染色によって、古典的単球及び少なくとも３つのＣＴＭサブセット、すなわち、初期ＣＴＭ、後期ＣＤ３６＋ＣＴＭサブセット、及び後期ＣＤ３６−ＣＴＭサブセットが極めて正確に認識される。現れた染色においては、まず、中間ＳＳＣ及びＣＤ４５に対するゲーティングが行われ（パネルＡ）、続いてＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲ陽性に基づく包含ゲーティングが行われる（パネルＢ）。含まれる細胞は、古典的単球すべて及びＣＴＭすべてであり、これは更にＣＤ１４及びＣＤ１６マーカーを用いて評価することができ（パネルＣ）、３つの主サブセット、すなわち古典的単球、初期ＣＴＭ及び後期ＣＴＭを生成する（パネルＤ）。初期ＣＴＭの正確な認識、及びＣＴＭの更なるサブセット化はＣＤ６４及びＣＤ３６を使用して可能である（パネルＥ及びＦ）。ＣＤ６４は、初期ＣＴＭ（及び古典的単球）上でより高いレベルで発現されるが、他のＣＴＭサブセットはすべてＣＤ６４をより低いレベルで発現する（パネルＦ）。ＣＤ６４低ＣＴＭ（後期ＣＴＭ）は、高から陰性までの不均一なＣＤ３６発現を示す（パネルＥ及びＦ）。評価した全７種類のマーカーのＡＰＳ  ｖｉｅｗによれば、種々の単球／マクロファージ細胞集団（パネルＧ）、すなわち古典的単球、初期ＣＴＭ、ＣＤ３６−後期ＣＴＭサブセットを含めた後期ＣＴＭサブセットが明確に分離される（パネルＨ）。
【図５】血液白血球のＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲに対する染色によって、古典的単球及びＣＴＭサブセットが正確に認識される。これらの単球及びＣＴＭサブセットは、年齢（小児期、青年期、成体、高齢者）、疾患タイプ（局所的、全身的など）、病期（急性、慢性、くすぶり型など）に応じてその組成が異なり得る。パネルＡは、成体において典型的に見られるＣＤ３００ｅ／ＨＬＡＤＲ細胞集団のパターンを示す。それに対して、パネルＢの病気の子供の血液試料は異なるパターンを示し、成体血液では小さい又は存在しないＣＤ１６低／ＣＤ１４−／ＣＤ３６−／ＣＤ６４低ＣＴＭ集団の存在が顕著である。注：成体血液中のほとんどのＣＤ３６−後期ＣＴＭはＣＤ１６を高いレベルで発現する。
【図６】９名の健常対照群及び診断時の９名の神経こう腫患者の血液試料に対するＣＤ１４／ＣＤ１６／ＣＤ４５／ＣＤ３００ｅ／ＨＬＡＤＲ／ＧＦＡＰ染色の結果。抗ＧＦＡＰ抗体は、タンパク質のＮ末端エピトープに対するものであった。パネルＡ：健常対照群（左パネル）及び神経こう腫患者（右パネル）におけるＧＦＡＰ染色の例。神経こう腫患者においては、ＧＦＡＰ陽性初期ＣＴＭのクラスターが確認されたが、かかかる細胞は健常対照群では検出されなかった。パネルＢ：初期ＣＴＭ集団内のＧＦＡＰ＋細胞の割合を、全ＣＤ３００ｅ＋細胞（単球及びＣＴＭ）当たりの初期ＣＴＭの割合、及び神経こう腫のサイズに対してプロットした。実質的にすべての神経こう腫患者（７／９）が１％を超えるＧＦＡＰ＋初期ＣＴＭであった。重要なことには、ＧＦＡＰ陽性細胞の度数も、神経こう腫瘤のサイズと幾らかの相関を示す。
【図７】異なるタイプの疾患又は健康状態におけるＣＴＳＭの増加の例。Ａ．心筋梗塞。Ｂ．骨折。Ｃ．結腸癌。Ｄ．転移乳癌。Ｅ．骨における転移癌。Ｆ．アテローム性動脈硬化症。Ｇ．アルツハイマー病。Ｈ．多発性硬化症。Ｉ．自己免疫性甲状腺炎。Ｊ．シェーグレン症候群。Ｋ．１型真性糖尿病。Ｌ．全身性硬化症。Ｍ．ＳＬＥ患者における糸球体腎炎（Ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｅｓ）。Ｎ．ライム病。Ｏ．結核。Ｐ．肺アスペルギルス。Ｑ．筋肉トレーニング。Ｒ．組織損傷の外科的介入
【発明を実施するための形態】
【００１４】
したがって、一実施形態においては、本発明は、撹乱された組織恒常性及び疾患を映す鏡として循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を使用して、対象における組織損傷の早期検出、疾患の早期診断及びモニタリング、及び／又は治療の有効性の評価のために、対象の健康状態を判定する方法を提供する。この方法は以下のステップを含む。
【００１５】
ａ）循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を含む対象、好ましくはヒト対象由来の生物学的試験試料を用意するステップ、
ｂ）少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＣＴＭサブセットの特定及び列挙を目的とした、１セットの骨格マーカーに対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記ＣＴＭを染色するステップ、骨格マーカーはＣＤ１４、ＣＤ１６及びＩＲＥＭ２（ＣＤ３００ｅ）及び好ましくは更にＨＬＡＤＲ及び／又はＣＤ４５である、
ｃ）その起源組織における個々のＣＴＭによる非ＣＴＭタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する１種類以上の検出抗体を使用した前記ＣＴＭの固定、透過化及び染色、それによって循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の少なくとも１つのサブセットを特定するステップ、
ｄ）個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定する前記染色ＣＴＭ及びＣＴＳＭの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、
ｅ）ＣＴＭサブセット、及び測定された細胞内エピトープの各々を発現する特定のＣＴＳＭサブセット（単数又は複数）内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
ｆ）（ｉ）評価された個々のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１セットによって規定された異なる正常及び変化組織から各々生ずるＣＴＭサブセット及び特定のＣＴＳＭサブセット（単数又は複数）内の細胞の相対及び絶対数と、ｉｉ）評価された個々の細胞内ペプチドごとに関連付けられた抗体関連信号の量とを計算して、試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを得るステップ、及び
ｇ）前記試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを各評価組織の正常ＣＴＳＭ染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び／又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ。
【００１６】
ＩＲＥＭ２は「骨髄細胞によって発現される免疫受容体２」を表す。ＣＤ抗原の命名法においては、このタンパク質は、ＣＤ３００Ｅ又はＣＤ３００ｅと命名された。このタンパク質は、ＣＤ３００ＬＥ［ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーＬＥ］としても知られる。ＩＲＥＭ２発現は、単球、マクロファージ及び樹状細胞に限定されると考えられ、分化によって下方制御される。
【００１７】
ＨＬＡＤＲは、染色体６領域６ｐ２１．３１上のヒト白血球抗原複合体によってコードされるＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体である。ＨＬＡＤＲは、αβヘテロ二量体、細胞表面受容体であり、各サブユニットは２個の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端を含む。α鎖とβ鎖の両方は膜に固定される。ＨＬＡＤＲとそのリガンドの複合体、９アミノ酸長以上のペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のリガンドを構成する。
【００１８】
本明細書では略語「ＣＴＭ」は循環組織マクロファージを表す。「ＣＴＭサブセット」とは、ＣＤ１４高／ＣＤ１６＋、ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６高、ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ１４−／ＣＤ１６高、ＣＤ１４−／ＣＤ１６低ＣＴＭ、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１６＋、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１６高、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１６低ＣＴＭ、ＣＤ３３高／ＣＤ１６＋、ＣＤ３３高／ＣＤ１６高、ＣＤ３３＋／ＣＤ１６高、ＣＤ３３＋／ＣＤ１６低ＣＴＭ、ＣＤ３００ｅ＋／ＣＤ１６＋、ＣＤ３００ｅ＋／ＣＤ１６高、ＣＤ３００ｅ＋／ＣＤ１６低ＣＴＭ、ＣＤ１６＋、ＣＤ１６高、ＣＤ１６低ＣＴＭ、ＣＤ１４高／ＣＤ１６＋／ＣＤ３００ｅ＋／ＨＬＡＤＲ＋、ＣＤ１４高／ＣＤ１６高／ＣＤ３００ｅ＋／ＨＬＡＤＲ＋、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６高／ＣＤ３００ｅ＋／ＨＬＡＤＲ＋、ＣＤ１４−／ＣＤ１６高／ＣＤ３００ｅ＋／ＨＬＡＤＲ＋、及びＣＤ１４−／ＣＤ１６低／ＣＤ３００ｅ＋／ＨＬＡＤＲ＋ＣＴＭを含めて、ＣＴＭの種々のサブセットを指す。
【００１９】
「ＣＴＳＭ」とは、循環組織特異的マクロファージを指し、その組織特異性は、組織特異的タンパク質由来のプロテアーゼ消化断片（ペプチド）の細胞内染色によって規定される。「プロテアーゼ誘導タンパク質断片」は、摂取され、処理され、マクロファージの食胞中でプロテアーゼによって消化された非ＣＴＭタンパク質に由来する断片又はペプチドである。「骨格マーカー」という表現は、ＣＴＭコンパートメント及びＣＴＭサブセットの特定及び列挙のためのマーカーの反復セットを指す。これらのマーカーに加えて、追加の膜マーカー及び細胞内染色を、ＣＴＭサブセット、特に組織特異的マクロファージ、いわゆるＣＴＳＭサブセットの特定に使用することができる。
【００２０】
本発明によれば、骨格マーカーのセットは、少なくともマーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅに対する抗体を含み、好ましくはＨＬＡＤＲ及び／又はＣＤ４５が補充される。一実施形態においては、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅの組合せを使用する。別の一実施形態においては、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲの組合せを使用する。好ましくは、それは、さらに、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ４５及びＣＤ６４マーカーの１種類以上に対する抗体を含む。ＣＤ４５、ＣＤ３６及び／又はＣＤ６４抗体が特に好ましい。極めて有用である抗体パネルは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ６４；ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ６４；ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ６４；ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ４５；ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する抗体を含む、又は該抗体からなる。一態様においては、ＣＴＭの染色は、マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、ＣＤ８６、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡ−ＤＲに対する異なって標識された異なる抗体のパネルを用いて実施される。特定の一態様においては、ＣＴＭの染色は、マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する異なって標識された異なる抗体のパネルを用いて実施される。これにより、単球すべて及びＣＴＭすべての正確なゲーティング、単球とＣＴＭの正確な識別、及びＣＴＭのサブセット化が可能になる（図３）。
【００２１】
非マクロファージ起源の摂取タンパク質の場合のマクロファージ分析は、当該技術分野において記述されている。しかし、本発明による少なくとも３種類の特異的表面マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅプラスＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＣＤ４５）を発現する細胞のポジティブ選択に基づくマクロファージ標的集団のフローサイトメトリーサブセット化の利点は、記述も示唆もされていない。
【００２２】
Ｊａｐｉｎｋ等（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１３４巻４号（２００８−０４−０１）、Ａ−４８７ページ）は、直腸結腸新生物の早期検出又は再発のためのフローサイトメトリーによる血液試料由来のＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋細胞における細胞内癌胎児（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｙｏｎｉｃ）抗原（ＣＥＡ）の測定を開示している。
【００２３】
Ｈｅｒｗｉｇ等（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌ．、５巻２号、（２００６−０４−０１）、２７５ページ、ＸＰ００５５２２９８２及びＪ．ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、１８１巻４号（２００９−０４−０１）、６５３ページ、ＸＰ０２５９７９３８６）は、前立腺癌の診断における細胞内ＰＳＡ用の多色フローサイトメトリー分析ＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋末梢血単核球を開示している。
【００２４】
国際公開第２０１０／０１５６３３号は、組織から循環系に再循環する血液マクロファージによって組織から細胞内に吸収される分子マーカーを特徴付ける方法を記述している。そのために、ＣＤ１４／ＣＤ１６陽性標的集団が、場合によってはＣＤ５６、ＣＤ５７及び／又はＣＤ１６１発現細胞のネガティブ選択と組み合わせて、規定される。
【００２５】
国際公開第２００９／１０００９５３号は、Ａベータ断片の細胞内断片のための活性化マクロファージ（ＣＤ１４／ＣＤ１６）の分析に関する。Ａベータ断片は、貯留細胞溶解物を生成する細胞溶解及び免疫沈降後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって検出される。ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９に対する抗体の組合せを使用して、活性化マクロファージ及びＢ細胞集団を特定する。
【００２６】
Ａｌｍｅｉｄａ等（Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００巻３号、３２５〜３３８ページ、２００１）は、正常ヒト末梢血系列（−）／ＣＤ１６（＋）／ＨＬＡ−ＤＲ（＋）／ＣＤ１４（低）細胞、ＣＤ１４（＋）単球、及びＣＤ１６０樹状細胞の形態学的、細胞化学的、免疫表現型的及び機能的特性の比較分析を実施した。ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲプラス他の系列特異的マーカー（例えば、Ｔリンパ球の除外のためのＣＤ３、Ｂ細胞を除外するためのＣＤ１９、及びＮＫ細胞を除外するためのＣＤ５６）に対する抗体の組合せを使用した単核球の細胞選別を開示している。選別された細胞は、続いて、単球特異的特性の形態学的及び細胞化学的検査によって分析される。処理された組織特異的タンパク質の細胞内染色については記述も示唆もされていない。
【００２７】
本明細書の多色フローサイトメトリー法は、好ましくは、側方散乱（ＳＳＣ）分析と組み合わせた、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅ（ＩＲＥＭ２）、好ましくはＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ（ＩＲＥＭ２）及びＨＬＡＤＲの細胞表面発現に基づく特異的ゲーティング戦略を含む（図４）。単球−マクロファージ細胞集団のゲーティング戦略は、包含ステップ及びサブセット特定ステップで構成される。包含ステップは、「古典的単球」（「組織流入」単球）と組織マクロファージ（「組織流出」単球／マクロファージ＝循環組織マクロファージ；ＣＴＭ）の両方の包含を目的とする。後続ステップは、古典的単球をＣＴＭから識別すべきであり、特にＣＴＭ集団内のサブセットを特定すべきである。したがって、本発明の一実施形態においては、ゲーティング戦略は、（ｉ）古典的単球とＣＴＭの両方を含む包含ゲーティング戦略と、それに続く（ｉｉ）古典的単球をＣＴＭから識別し、ＣＴＭ集団内の１つ以上のサブセットを特定する、サブセット特定ゲーティング戦略を含む。
【００２８】
種々のゲーティング戦略を考えることができる。古典的単球すべて並びにＣＴＭの大多数及び一部のＣＴＭサブセット化を検出するための最も単純な戦略は、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅによる染色を含む。古典的単球すべて及び（すべてではないが）大部分のＣＴＭは、側方散乱（ＳＳＣ）とＣＤ３００ｅ（ＩＲＥＭ２）＋細胞の組合せに対するゲーティングによって検出される（ＣＤ３００ｅを発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択する）。古典的単球すべて並びに実質的にすべてのＣＴＭ及び一部のＣＴＭサブセット化を検出するためのより正確な戦略は、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲによる染色を含む。古典的単球すべてと実質的にすべてのＣＴＭは、側方散乱（ＳＳＣ）とＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲの組合せに対するゲーティングによって検出される（すなわち、同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択する）。古典的単球すべて並びにＣＴＭすべて及び一部のＣＴＭサブセット化を検出するための極めて正確な戦略は、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲによる染色を含む。全流入及び全流出単球／マクロファージは、側方散乱（ＳＳＣ）とＣＤ４５、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲ陽性細胞の組合せに対するゲーティングによって検出することができる。より具体的には、同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現するＣＤ４５を有する低〜中間ＳＳＣの細胞が選択される（図４Ａ及びＢ）。したがって、包含ステップは以下のいずれか１つを含むことができる。
【００２９】
（ｉ）ＣＤ３００ｅを発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択するための、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅによる染色、及びＳＳＣとＣＤ３００ｅ＋細胞の組合せに対するゲーティング、
（ｉｉ）同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択するための、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲによる染色、及び側方散乱（ＳＳＣ）とＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲ＋細胞の組合せに対するゲーティング、又は
（ｉｉｉ）少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲによる染色、及びＳＳＣとＣＤ４５、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲ陽性細胞の組合せに対するゲーティング、好ましくは同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現するＣＤ４５を有する低〜中間ＳＳＣの細胞に対するゲーティング（図４Ａ〜Ｄ）。
【００３０】
本発明は、ＣＴＭサブセットの特定のための幾つかのゲーティング戦略も提供する。一実施形態においては、その戦略によって、古典的単球（ＣＤ１４＋／ＣＤ１６−）及び一部のＣＴＭサブセットの特定が可能になる。ＣＴＭサブセットは、上記包含ゲートの一つ内で、好ましくは少なくともＳＳＣ、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲを使用して、少なくともＣＤ１４及びＣＤ１６の追加の使用に基づき、規定される。したがって、一実施形態においては、ゲーティング戦略は、古典的（ＣＤ１４＋／ＣＤ１６−）単球と、ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ１４高／ＣＤ１６高並びにＣＤ１４低／ＣＤ１６高〜ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ１４−／ＣＤ１６低として特定される２つの主要なＣＴＭサブセットとの特定を含む（図４Ｄ）。
【００３１】
別の一実施形態においては、サブセットゲーティング戦略は、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ６４の追加の使用に基づく、（好ましくは、少なくともＳＳＣ、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲを使用する）上記包含ゲートの一つ内の古典的単球及び幾つかのＣＴＭサブセットのより正確な検出を可能にする３ステップからなる。
【００３２】
第１ステップにおいては、古典的単球及びより成熟したＣＴＭ段階は、ＣＤ６４低（後期ＣＴＭ）対ＣＤ６４高（古典的単球プラス初期ＣＴＭ）に対するゲーティングによって特定される。第２ステップは、ＣＤ１６＋／ＣＤ１４＋表現型を有する事象としての他の初期ＣＴＭ細胞すべて（対古典的単球）の選択による単球とＣＴＭの識別を目的とする。その結果、ＣＤ６４低及びＣＤ１６＋／ＣＤ６４高として規定された選択細胞はＣＴＭコンパートメント全体を構成し、一方、一般的ゲーティングステップで選択された他のゲート細胞すべては古典的単球に相当する。第３ステップにおいては、選択されたＣＴＭ間のＣＤ６４、ＣＤ１４及びＣＤ１６の発現レベルに基づき、異なる機能又は成熟関連コンパートメントに更に細分することができる：ＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低。したがって、一態様においては、サブセット特定ステップは以下を含む。
【００３３】
−後期ＣＴＭを表すＣＤ６４低対古典的単球プラス初期ＣＴＭを表すＣＤ６４高に対してゲーティングを行うこと、続いて
−他の初期ＣＴＭ細胞すべて（対古典的単球）をＣＤ１６＋／ＣＤ１４＋表現型を有する事象として選択することによって単球とＣＴＭを識別すること、並びにＣＴＭコンパートメント全体をＣＤ６４低として及びＣＤ１６＋／ＣＤ６４高として規定すること、続いて
−ＣＤ６４、ＣＤ１４及びＣＤ１６の発現レベルに基づいて選択されたＣＴＭを異なる機能又は成熟関連コンパートメントに更に細分すること、好ましくは前記異なるコンパートメントはＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低である。
【００３４】
更なる別の一実施形態においては、本発明は、古典的単球の前駆体を含む特定の試料（例えば、小児末梢血又は成体骨髄）の場合に役立ち得る、ＣＴＭ集団の追加のサブセット化を可能にする戦略を提供する。ＣＤ６４と組み合わせたＣＤ３６の使用は、以下の亜集団を用いて前述の戦略の第３ステップにおいて古典的単球とＣＴＭの両方の成熟段階すべてをより良好に特定するのに寄与する（図４Ｅ〜Ｈ）。
【００３５】
−古典的単球：ＣＤ６４高／ＣＤ３６低（古典的単球の前駆体）〜ＣＤ６４高／ＣＤ３６高細胞（真の成熟単球）、
−ＣＴＭサブセット：ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ３６高ＣＤ１４低／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ３６高／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高〜ＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低／ＣＤ３６−〜低細胞。
【００３６】
これと共に、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６及びＣＤ６４に基づく選択ＣＴＭを更に細分するステップを含み、好ましくは少なくとも１つの以下のＣＴＭサブセットの特定を含む、方法も提供する。
【００３７】
ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ３６高／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低／ＣＤ３６−〜低細胞（図４及び図５）。
【００３８】
循環組織マクロファージを含むことが知られている、又は含むと思われている、ほ乳動物対象、典型的にはヒト対象から単離された任意のタイプの生物試料を使用することができる。例えば、生物学的試験試料は、末梢血、腹水、胸水、脳脊髄液、骨髄、リンパ節、リンパ液、滑液、又は固体組織から調製される単一細胞懸濁液を含む。末梢血は、静脈穿刺などの最小侵襲手順によって対象から容易に得ることができるので、特に適している。
【００３９】
本発明の方法は、ＣＴＳＭサブセットに関する情報の組合せを可能にする多管形式で実施するのが有利である。これは、正常な恒常性状態では、個々のＣＴＳＭが単一組織からのペプチド（タンパク質断片）にのみ陽性であるという妥当な仮定に基づく。したがって、２個以上の一定分量の同じ生物学的試験試料をＣＴＭサブセットの特定のために同じ骨格マーカーで、ただし個々のＣＴＳＭ集団のより詳細なサブセット化のための異なる追加の抗体試薬で、組織起源に従って、組織関連タンパク質に由来するプロテアーゼ誘導タンパク質断片の検出に基づき、全身の組織における恒常性状態のスキャニング及び組織恒常性の潜在的撹乱を目的として、並行して染色する方法も提供する。
【００４０】
Ｈｅｒｗｉｇ他（２００４、２００５、ＥＰ１５１６１８２）及びＬｅｅｒｓ等（２００８）は、彼らが細胞内前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を含むと主張する循環ＣＤ１４ｈｅｔ／ＣＤ１６ｈｅｔ組織マクロファージの存在の前立腺癌患者における検出を開示した。Ｌｅｅｒｓ等（２００８）は、良性過形成対限局性前立腺癌対転移前立腺癌の患者において、血液中のＰＳＡ陽性組織マクロファージの度数が次第に増加すると結論づけた（Ｌｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００８）。しかし、彼らの提示したフローサイトメトリーデータは、ＰＳＡ染色に関して偽陽性の結果を含むように見える。
【００４１】
−ＰＳＡ陽性細胞は、「制御された」マーカー設定によるＣＴＭ集団からのカットオフ以外、分離集団として検出することができない。
【００４２】
−外見上ＰＳＡ陽性のＣＤ１４ｄｉｍ／ＣＤ１６高組織マクロファージの高い度数は、光散乱プロットとＣＤ１４対ＣＤ１６プロットの両方で異常な位置にあり、二重形成を示し、その結果、ＰＳＡに対して偽陽性の可能性があることを示している。
【００４３】
したがって、ＣＴＭの高い度数は前立腺由来のものであろうとも、ＰＳＡ染色による決定的な証拠は説得力がない。これは、ＣＴＳＭ集団中に存在するＰＳＡペプチドに対する適用された抗ＰＳＡ抗体の反応性が不十分であることに起因する可能性が高い。この状況では、適用されたＰＳＡ抗体が、ＰＳＡの細胞内プロセシング及び分解に由来する断片又はペプチド上のエピトープではなく、無処置のＰＳＡタンパク質を認識するように選択されたことに注意しなければならない。その結果、ＰＳＡ抗体によって認識された最初のＰＳＡエピトープは、ＣＴＳＭ中に存在したＰＳＡペプチドでは失われ、したがって検出不可能である可能性が高い。
【００４４】
Ｈｅｒｗｉｇ等（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌ．、５巻２号、（２００６−０４−０１）、２７５ページ、ＸＰ００５５２２９８２及びＪ．ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、１８１巻４号（２００９−０４−０１）、６５３ページ、ＸＰ０２５９７９３８６）、Ｌｅｅｒｓ等（２００８）、Ｂｒｏｚｅｋ（国際公開第２０１０／０１５６３３号）、及びＪａｐｉｎｋ等（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１３４巻４号（２００８−０４−０１）、Ａ−４８７ページ）によるゲーティング戦略は、ＣＴＭすべての包含には不十分であり、すべての非ＣＴＭの除外にも不十分である。これは、主に、上記科学者らが、ＳＳＣ及びＣＤ４５のみに基づく包含ゲーティング、又はＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ５７及び／又はＣＤ１６１に基づくネガティブ選択を選択して、多重細胞（ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ）の適切な排除を確認しなかったことに起因する。かかるゲーティング戦略は、偽陽性の結果をもたらし、偽陰性の結果ももたらし得る。
【００４５】
他者（Ｈｅｒｗｉｇ等、Ｌｅｅｒｓ等及びＪａｐｉｎｋ等）及び本発明者ら自身のグループによる以前の研究とは対照的に、本発明者らは、ここで、Ｔ、ＮＫ及びＢリンパ球などの他の細胞を除外する必要なしに、追加の陽性マーカー選択（ＣＤ３００ｅ＋細胞及び好ましくは更にＨＬＡＤＲ＋）に基づく古典的単球及びＣＴＭの異なるサブセットすべてを特定する手順を提案する。かかる手順により、ＣＤ３００ｅ−リンパ球を直接除外することが容易になり、同時に、ＣＴＭの選択が専らＣＤ１４＋及び／又はＣＤ１６＋細胞に基づく場合に通常除外される後期ＣＤ１４−／ＣＤ１６低ＣＴＭの特定が容易になる（図４及び図５）。
【００４６】
本明細書に記載の包含マーカー及びＣＴＭサブセットマーカーのない診断ＣＴＭキットは、細胞集団の正確な相対及び絶対的定量化が必要である通常の診療に信頼して利用することができない。
【００４７】
本明細書に記載の方法のステップｃ）は、その起源組織における個々のＣＴＭによるタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する１種類以上の検出抗体を使用した循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の少なくとも１つのサブセットの特定を含む。当業者は、本発明の根底にある概念によれば種々の手法を企図できることが理解されるはずである。例えば、検出抗体試薬は、以下の細胞内染色のための抗体を含む（図６）。
【００４８】
ａ）細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する単一プロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｂ）１種類の細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｃ）単一器官又は組織の正常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｄ）単一器官又は組織の異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｅ）正常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも１種類の抗体と異常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも１種類の抗体の組合せを含めて、単一器官又は組織の正常及び異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、並びに
ｆ）２つ以上の器官又は組織の正常又は異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ。
【００４９】
一実施形態においては、ＣＴＭのサブセット化に使用される骨格試薬のパネルを、２つ以上の器官又は組織の正常又は異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープに対する１種類又は複数の試薬と組み合わせる。ＣＴＭのサブセット化に使用される試薬のパネルを、少なくとも１つが変化組織である異なる器官又は組織に由来する各々異なるタンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも２種類の試薬の組合せを含めて、２つ以上の異なる器官又は組織の正常及び異常細胞の２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープに対する１種類又は複数の試薬と組み合わせることができる。
【００５０】
一実施形態においては、少なくとも１種類の検出抗体によって異常タンパク質に由来する１種類以上のペプチドエピトープの検出が可能になり、好ましくは異常タンパク質が、発癌タンパク質、変異タンパク質、融合タンパク質、アレルゲンに由来するタンパク質、及びウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のような病原体に由来するタンパク質からなる群から選択される。
【００５１】
マクロファージ中に存在するプロテアーゼ並びに組織特異的及び疾患特異的タンパク質によれば、各ＣＴＳＭサブセットの食胞中に存在するペプチドを（少なくとも部分的に）予測することが可能である。関連する組織特異的タンパク質断片又はペプチドに対する抗体の開発によって、循環組織マクロファージの詳細な特性分析、及び異なるＣＴＳＭの複数のサブセットの特定が可能になる。全ＣＴＭ及びＣＴＳＭコンパートメントの組成が評価されると、例えば、加齢に関連した組織恒常性、組織ストレス、特定の疾患又は療法の変化に関係したＣＴＭ及びＣＴＳＭ集団のサイズ及び相対組成の変化を検出及び特定することができる。
【００５２】
このようにして、ＣＴＭ−ＣＴＳＭコンパートメントのサイズ及び組成を精査することは、組織恒常性及び組織恒常性の撹乱を映す鏡となる。その結果、経時モニタリングによって、特定の活動、老化、疾患、治療などに起因する恒常性変化の発生を見通すことができる。したがって、ＣＴＳＭサブセットのフローサイトメトリー分析は、組織統合性及び／又は組織撹乱の評価のための診断ツールを提供する。それによって、フローサイトメトリーＣＴＳＭサブセットスクリーニングは、全身スキャニング、いわゆる「フローサイトメトリーボディスキャニング」（ＦｌｏｗＢｏＳｃａｎ）又は「組織マクロファージスキャン」（ＴｉＭａＳｃａｎ）のための感度の高い方法になる。
【００５３】
ＦｌｏｗＢｏＳｃａｎ又はＴｉＭａＳｃａｎは、古典的ＣＴスキャン又は別の全身スキャン及び撮像システムよりも感度が高い可能性が高い。というのは、ＣＴＳＭコンパートメントは、損傷、炎症、癌などの恒常性が撹乱された組織に特に注目して単一細胞中に濃縮された組織すべてからの「組織ごみ」（アポトーシス及び死細胞）の集まりによって拡大ボディスキャンを提供するからである。その結果、本明細書に開示するＣＴＳＭに基づくスキャンは、したがって、欠陥が低レベルで散在するときと欠陥が小さい限局的な欠陥として存在するときの両方で、初期の組織損傷又は疾患を検出することができる。さらに、診断がなされ、治療が開始されるとすぐに、関連するＣＴＳＭサブセットをモニターして、療法の有効性、すなわち疾患過程に関係するＣＴＳＭの消滅（又は残存）を見通すことができる。
【００５４】
治療の有効性のモニタリングと並行して、施される療法の毒性も、望ましくない副作用、例えば、細胞毒の造血細胞関連毒性としてやはり療法によってより標的とされやすい別の組織に由来するＣＴＳＭサブセットを分析することによってモニターすることができる。その結果、組合せられたＣＴＳＭの結果に従って療法強度を誘導することさえ可能になり得る。この形式の個別化医療は、その後の続発症を防止し、それによって生活の質を高めるのにますます重要になってきている（Ａｌｌｌｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８）。
【００５５】
本発明による方法において提案された組織恒常性撹乱の測定は、一見、血清タンパク質の測定に似ているように思えるかもしれない。しかし、血清中の組織タンパク質の一部しか検出することができない（例えば、肝臓トランスアミナーゼ、ＰＳＡ及びカリクレインファミリーの別のセリンプロテアーゼ、又はミオグロビン）。さらに、心筋梗塞、肝損傷などの実質的な組織損傷の場合にのみ、これらの血清タンパク質レベルが増加する。血清中の他の組織タンパク質は容易に検出することができない。これは、分化した輸送タンパク質、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び他の血しょうタンパク質を介して、さらに、局所的細胞プロテアーゼ及び炎症又は食細胞（例えば、組織マクロファージ）による組織タンパク質破壊を介して、自己抗原を免疫監視から隠す生理学的機序と一致する。最後に、放出された組織特異的タンパク質は、正常な恒常性及び正常な恒常性の撹乱初期においては体全体で多量の組織液（例えば、リンパ）及び血清で希釈されて、典型的には検出不可能な濃度になる。
【００５６】
本明細書に記載のＣＴＳＭサブセットの検出及び特定システムは、単一ＣＴＳＭ細胞における細胞内プロセシング及び消化されたタンパク質（例えば、ペプチド）に由来する断片上のエピトープの検出に焦点がおかれている。このシステムは「ＦｌｏｗＢｏＳｃａｎ」又は「ＴｉＭａＳｃａｎ」と称され、ＣＴＭ及びＣＴＭサブセット並びにこれらのＣＴＭの組織特異的サブセットであるＣＴＳＭ及びＣＴＳＭサブセットの相対及び絶対的な度数の評価によるフローサイトメトリーボディスキャンである。上記システムの特定の能力は、個々のＣＴＳＭサブセットの起源について血液試料中のＣＴＳＭコンパートメント全体のスクリーニングが可能であることに関わり、腫よう性タンパク質、融合タンパク質、アレルゲン由来のタンパク質、微生物由来のタンパク質などの異常発現又は疾患関連タンパク質に由来するものを含めて、複数の組織特異的タンパク質断片（ペプチド）の組合せに基づいてこれらのサブセットの定義づけが可能であることに関わる。このようにして、全ＣＴＳＭコンパートメントが、恒常性であろうと撹乱であろうと、全身の種々の組織における進行中のプロセスを示す（反映する）。
【００５７】
血液中の標的細胞としては、ＣＤ１６＋組織マクロファージ（例えば、ＣＤ１４ｈｅｔ／ＣＤ１６ｈｅｔ  ＣＴＭ）、ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６−単球、及び骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１４−／ＣＤ１６−／ＨＬＡＤＲ＋）、形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１２３＋＋／ＣＤ１４−／ＣＤ１６−／ＨＬＡＤＲ＋）、樹状細胞前駆体などの循環樹状細胞の異なる集団が挙げられる。異なる器官及び組織に由来するＣＴＳＭは、正常な生理的条件下でリンパ管系及び血液を介して循環する。したがって、血液中の存在とは別に、それらは、その起源組織にも、とりわけ腹水、胸水、局所又は所属リンパ節に排出されるリンパ液などの別の関連体液にも見ることができる。本発明においては、本発明者らは、主に（ただしそれだけに限定されないが）血液中のＣＴＳＭコンパートメントに焦点を合わせる。
【００５８】
血液中のＣＴＳＭの特定及び列挙のために、多パラメータフローサイトメトリーが適切に使用される。フローサイトメトリー手順は、血液試料中のＣＴＭの全集団の同時特定、並びに１つ又は複数の器官及び組織において組織マクロファージによって処理された組織及び／又は疾患関連タンパク質由来の１個又は複数の断片又はペプチドの１種類以上のエピトープの細胞内存在に関して単一細胞レベルでのＣＴＭ全集団の特性分析（ＣＴＳＭサブセットの特定）を目的とする。
【００５９】
この目的のために、異なって標識された抗体マーカーの２つのグループの組合せで血液試料を染色する（表２参照）。
【００６０】
１．ＣＴＭの異なるサブセットの特定及び列挙を目的とした第１のセットの（骨格）マーカー、
２．その起源組織において個々のＣＴＭによって処理された１種類以上のタンパク質の分解に由来するタンパク質断片又はペプチドの１種類以上のエピトープの同時細胞内検出に向けた第２のグループのマーカー。
【００６１】
これらの抗体は、その別々の検出及び定量化を可能にする検出可能な標識が付けられている。検出可能な（例えば、蛍光色素）標識は、当該技術分野で知られている。例えば、異なって標識された抗体試薬のパネルは、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジン葉緑素タンパク質（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、ａｌｅｘａ  ６４７、ａｌｅｘａ  ７１０、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５、ｃｙａｎｉｎ  ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎ  ５．５（Ｃｙ５．５）、ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（ＰａｃＢ）、ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ（例えば、ＢＶ４２１）、ｈｏｒｉｚｏｎ  ｖｉｏｌｅｔ  ４５０（ＨＶ４５０）、ｐａｃｉｆｉｃ  ｏｒａｎｇｅ（ＰａｃＯ）、ＨＶ５００、Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ、ＯＣ５１５、量子ドット、及びＰＥ、ＡＰＣ又はＰｅｒＣＰと結合したその複合物（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５、ＰＥ／Ｃｙ５．５、ＰＥ／Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＡＰＣＣｙ７５０から選択される適合蛍光色素の組合せ、又は任意の追加の適合蛍光色素若しくは蛍光色素タンデムを含む。
【００６２】
別の一実施形態においては、異なって標識された抗体試薬のパネルは、適合放射性同位体の組合せを含む。
【００６３】
表２  ＣＴＭ及びＣＴＳＭの試料調製及び多色染色の例示的手順
────────────────────────────────────────
手順Ａ  ＣＴＭ及びＣＴＳＭの細胞表面マーカーの染色
１．各特異的ＣＴＭ又はＣＴＳＭ抗体パネルの推奨に従って細胞表面マーカーに対する適切な体積の抗体を添加する。  
２．必要に応じて、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを使用して最終体積１００μＬ／管にする。  
３．十分混合する。  
４．光から保護して室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートする。  
５．１×ＦＡＣＳ溶解液（蒸留水（ｄＨ２Ｏ）で１／１０ｖｏｌ／ｖｏｌ希釈された１０×ＦＡＣＳ溶解液；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンホゼ、ＣＡ）２ｍＬを添加する。 
６．十分混合する。 
７．光から保護して室温で１０分間インキュベートする。  
８．５４０ｇで５分間遠心分離する。  
９．パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約５０μＬを残す。  
１０．２ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを細胞ペレットに添加する。  
１１．十分混合する。  
１２．５４０ｇで５分間遠心分離する。  
１３．パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約５０μＬを残す。  
１４．細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに再懸濁させる。  
１５．染色後の細胞を得る、又は（すぐに得られない場合）多色フローサイトメーターで測定するまで４℃で最大３時間貯蔵する。  
手順Ｂ  細胞表面膜並びにＣＴＭ及びＣＴＳＭの細胞内マーカーの混合染色  
１６．手順Ａステップ１３から続く。  
１７．各特異的ＣＴＭ又はＣＴＳＭ抗体パネルの推奨に従って適切な体積の抗体を添加する。  
１８．必要に応じて、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを使用して体積１００μＬ／管にする。  
１９．十分混合する。  
２０．光から保護して室温で１５分間インキュベートする。  
２１．２ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを細胞ペレットに添加する。  
２２．十分混合する。  
２３．５４０ｇで５分間遠心分離する。  
２４．パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約５０Ｌを残す。  
２５．細胞ペレットを軽く混合して再懸濁させる。  
２６．試薬Ａ（固定液Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ（商標）、Ａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒｕｂ、ウィーン、オーストリア）１００μＬを添加する。＊ 
２７．光から保護して室温で１５分間インキュベートする。  
２８．２ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを細胞ペレットに添加する。  
２９．十分混合する。  
３０．５４０ｇで５分間遠心分離する。  
３１．パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約５０μＬを残す。  
３２．細胞ペレットを軽く混合して再懸濁させる。  
３３．試薬Ｂ（透過処理溶液Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ（商標））１００μＬを添加する。＊ 
３４．十分混合する。  
３５．細胞内ペプチド（タンパク質断片）に対する適切な体積の抗体を添加する。  
３６．十分混合する。  
３７．光から保護して室温で１５分間インキュベートする。  
３８．２ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを細胞ペレットに添加する。  
３９．十分混合する。  
４０．５４０ｇで５分間遠心分離する。  
４１．パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約５０μＬを残す。  
４２．細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに再懸濁させる。  
４３．染色後の細胞を得る、又は（すぐに得られない場合）多色フローサイトメーターで測定するまで４℃で最大３時間貯蔵する。  
────────────────────────────────────────
＊別の固定及び透過処理方法、例えば、ＦＡＣＳ溶解液を使用することもできる。
【００６４】
最少３種類、好ましくは４種類の骨格マーカーがＣＴＭの特定に必要である。この骨格マーカーセットは、少なくともＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅを含み、好ましくは更にＨＬＡＤＲを含む。更なる有用であるマーカーとしては、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４５及び／又はＣＤ６４細胞表面白血球抗原（例えば、ＣＤ１４／ＣＤ１６、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１６、ＣＤ３３／ＣＤ１６、ＣＤ６４／ＣＤ１６、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１４／ＣＤ１６、ＣＤ３３／ＣＤ１４／ＣＤ１６、ＣＤ３３／ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ／ＣＤ１４／ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ／ＨＬＡＤＲ／ＣＤ１４／ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ／ＨＬＡＤＲ／ＣＤ６４／ＣＤ１６／ＣＤ１４、ＣＤ３００ｅ／ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１６／ＣＤ６４、ＣＤ３００ｅ／ＨＬＡＤＲ／ＣＤ６４／ＣＤ３６／ＣＤ１６／ＣＤ１４、又はＣＤ４５が添加されたこれらのマーカーのマーカー組合せ）が挙げられる。単一細胞表面マーカー（又は２種類のマーカーでも）の発現のわずかな差は、ＣＴＭ及びＣＴＭサブセットすべての正確な認識には必ずしも十分ではないかもしれないが（図２Ｃ）、複数のマーカーの全体プロファイルは主成分分析（ＰＣＡ）などの多変量解析によって評価され、例えば、Ｉｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェアの自動集団分別−ＡＰＳ  ｖｉｅｗ−、又は多次元尺度（ＭＤＳ）分析を使用して、ＣＴＭ及びＣＴＭサブセットをより正確に特定することができる（図３）。図３に示す例においては、ＡＰＳ１及びＡＰＳ２の図において、第１対第２主成分及び第３対第４主成分の二次元表示が、ＣＤ１４、ＣＤ１６及び別の複数の骨格マーカーが染色されたＣＤ１４ｈｅｔ／ＣＤ１６ｈｅｔ細胞の場合について示されている。古典的単球とＣＴＭを識別する最も強力なパラメータの組合せは、それぞれ主成分１、２、３及び４の値を減少させることによって使用される。
【００６５】
したがって、本発明は、撹乱された組織恒常性及び疾患を映す鏡として循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を使用して、対象における組織損傷の早期検出、疾患の早期診断及びモニタリング、及び／又は治療の有効性の評価のために、対象の健康状態を判定する方法も提供する。この方法は以下のステップを含む。
【００６６】
ａ）循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を含む対象由来の生物学的試験試料を用意するステップ、
ｂ）異なるＣＴＭサブセットの特定及び列挙のために、骨格マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ並びに好ましくは更にＨＬＡＤＲ、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記ＣＴＭを染色するステップ（図４及び５）、
ｃ）個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定する前記染色ＣＴＭの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、前記分析は、例えば、Ｉｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェアの自動集団分別−ＡＰＳ  ｖｉｅｗ−、又は多次元尺度（ＭＤＳ）分析を使用した、多変量解析、好ましくは主成分分析（ＰＣＡ）を含む（図４及び５）、
ｄ）各ＣＴＭサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
ｅ）（ｉ）各ＣＴＭサブセット内の細胞の相対及び絶対数を計算するステップ、並びに
ｆ）試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを各評価組織の正常ＣＴＭ染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び／又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ。
【００６７】
ＰＣＡは、直交変換を使用して、相関している可能性がある変数の観測値のセットを、主成分と呼ばれる無相関の変数の値のセットに変換する数学的手順である。主成分の数は、元の変数の数以下である。この変換は、第１の主成分ができるだけ高い分散を有する（すなわち、データの可変性のできるだけ多くを説明する）ように限定され、次の各成分は、前述の成分に直交する（相関しない）制約の下でできるだけ高い分散を有する。主成分は、データセットが一緒に正規分布する場合にのみ独立していることが保証される。ＰＣＡは、元の変数の相対尺度に敏感である。適用分野に応じて、それは、離散型Ｋａｒｈｕｎｅｎ−Ｌｏｅｖｅ変換（ＫＬＴ）、Ｈｏｔｅｌｌｉｎｇ変換又は固有直交分解（ＰＯＤ）とも称される。ＰＣＡの代わりに、ＭＤＳ又は任意の他のタイプの確立された多変量解析を使用することもできる。
【００６８】
好ましい一実施形態においては、上記染色の評価は、≧４色フローサイトメトリー、より好ましい実施形態においては≧５色フローサイトメトリー手法を含む。≧１の使用マーカー（色）は、その起源組織において局所的に捕獲され、ＣＴＭによって処理された１種類又は複数の組織及び／又は疾患関連タンパク質の分解に由来する断片又はペプチドの細胞内エピトープを特定するマーカーに対応し、それ以外のマーカーはそれぞれ骨格マーカーである。
【００６９】
上記骨格マーカーに加えて、別のマーカーを別の非ＣＴＭ細胞集団の特異的除外に使用することができる。例えば、ＣＤ１５及び／又はＣＤ２４を好中球の除外に使用することができ、ＣＤ５６及び／又はＣＤ７をＮＫ細胞の除外に、ＣＤ３をＴリンパ球の除外に、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２０をＢ細胞の除外に、ＣＤ１２３を形質細胞様樹状細胞の除外に使用することができる。
【００７０】
試料中のＣＴＭ及び別の細胞集団の染色は、異なる十分に記述された細胞固定、細胞透過処理並びに赤血球溶解手順及び試薬と組み合わせた従来の直接免疫蛍光技術を使用した、細胞表面膜マーカーと細胞内マーカーの両方の染色を含む（表２参照）。
【００７１】
注目すべきことに、個々の末梢血試料の場合、ＣＴＭによって処理された１種類又は複数の組織及び／又は疾患関連タンパク質のタンパク質断片又はペプチドエピトープの数は、使用されるフローサイトメーターの多色分析能力が限られているので、選択された骨格マーカーと組み合わせて測定され得るよりも多くなり得る。こうした場合には、複数の一定分量の同じ末梢血試料が必要であり、同じセットの骨格マーカー、並びにＣＴＭによって処理された１種類又は複数の組織及び／又は疾患関連タンパク質由来のエピトープの異なる（部分的に重複した、又は重複していない）パネルで各々染色される。
【００７２】
従来のデータ収集手順を使用してフローサイトメーターで測定後、こうした場合においては、Ｉｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェア（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ  ＳＬ、サラマンカ、スペイン）の統合及び計算ツールを使用して、試料中に存在するＣＴＭ集団に含まれる個々の細胞の全タンパク質断片関連エピトープ測定値を含む単一データファイルを作成することが有利である。対象となるＣＴＭ細胞及びその（亜）集団を特定する場合、逐次ブール（Ｂｏｏｌｅａｎ）ゲーティングに基づくＩｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェアで実行されるものなどの多次元ゲーティング戦略、主成分分析、及び多次元尺度構成法をそれぞれ骨格マーカー及び特性分析マーカーに基づいて使用することができる。有用であるゲーティング戦略は上記されている。
【００７３】
さらに、単位試料体積当たりの特定されたＣＴＭ集団全体及びその異なる亜集団の絶対的細胞数を評価する従来手順を併用して、単位試料体積当たりの正確な細胞数を計算することができる。かかる手順は、容積測定手法、又はＴｒｕｅＣＯＵＮＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホゼＣＡ、ＵＳＡ）、ＦｌｏｗＣＯＵＮＴ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、ＦＬ、ＵＳＡ）、ＰｅｒｆｅｃｔＣＯＵＮＴ（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ  ＳＬ）ビーズなどの市販内部基準ビーズを使用することができる。
【００７４】
当業者は、ＣＴＭ分析に関するフローサイトメトリー研究を含む本発明が、種々の疾患、障害、又は他の生理学的変化及び異常（の早期検出）に使用できることを理解し、認識されたい。本明細書に開示する概念に基づく分析を実施するための試薬を含む診断キットを本明細書に記述する。
【００７５】
診断キットは、ＣＤ１４高／ＣＤ１６＋、ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６高、ＣＤ１４低／ＣＤ１６高  ＣＤ１４−／ＣＤ１６高、ＣＤ１４−／ＣＤ１６低、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１６＋、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１６高、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１６低、ＣＤ３３高／ＣＤ１６＋、ＣＤ３３高／ＣＤ１６高、ＣＤ３３＋／ＣＤ１６高、ＣＤ３３＋／ＣＤ１６低、ＣＤ３００ｅ＋／ＣＤ１６＋、ＣＤ３００ｅ＋／ＣＤ１６＋＋及びＣＤ３００ｅ＋／ＣＤ１６低ＣＴＭサブセットの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なるサブセットの特定及び列挙を目的とした、異なって標識された抗体を含む１セットの骨格マーカーを第１の容器に含むことができる。異なって標識された抗体を含む１セットの骨格マーカーを第１の容器に含み、骨格マーカーがＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６、好ましくは更にＨＬＡＤＲである、診断キットを提供する。キットは、場合によっては、好ましくは本明細書に開示する方法に従って、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのＣＴＭサブセットの特定及び列挙のためのキットの使用説明書。
【００７６】
第１の容器は、マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅ、好ましくはＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を含む。より好ましくは、マーカーＣＤ３６、ＣＤ６４又はＣＤ４５に対する抗体の群から選択される少なくとも１種類の追加の抗体が存在する。例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ４５に対する少なくとも１セットの抗体が、場合によっては、抗ＣＤ６４抗体と組み合わせて使用される。特定の一態様においては、第１の容器は、マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する抗体を含む。
【００７７】
好ましい一実施形態においては、診断キットは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのＣＴＭサブセットの特定及び列挙を目的とした、異なって標識された抗体を含む１セットの骨格マーカーを第１の容器に含む。骨格マーカーはＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅ、好ましくは更にＨＬＡＤＲである。特に好ましい一態様においては、本発明は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３００ｅ、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する抗体の組合せを含み、抗体の各々が異なる検出可能な標識と複合化された、キットを提供する（図４）。例えば、キットは、蛍光色素１（ＦＬ１）と複合化されたＣＤ１４抗体、蛍光色素２（ＦＬ２）と複合化されたＣＤ１６抗体、蛍光色素３（ＦＬ３）と複合化されたＣＤ３００ｅ抗体、蛍光色素４（ＦＬ４）と複合化されたＨＬＡＤＲ抗体、蛍光色素５（ＦＬ５）と複合化されたＣＤ４５抗体、蛍光色素６（ＦＬ６）と複合化されたＣＤ６４抗体、及び蛍光色素７（ＦＬ７）と複合化されたＣＤ３６抗体を含む。当業者は、蛍光色素のあらゆる有用な組合せを使用できることを理解されたい。例えば、キットは、蛍光色素組合せＡＰＣＨ７（例えば、抗ＣＤ１４−ＡＰＣＨ７）、ＰＥＣｙ７（例えば、抗ＣＤ１６−ＰＥＣｙ７）、ＡＰＣ（例えば、抗ＣＤ３００ｅ−ＡＰＣ）、ＰａｃＢ（例えば、抗ＨＬＡＤＲ−ＰａｃＢ）、ＦＩＴＣ（例えば、抗ＣＤ３６−ＦＩＴＣ）及びＰＥ（例えば、抗ＣＤ６４−ＰＥ）を含む。
【００７８】
組織特異的循環マクロファージを特定するために、キットは、その起源組織における個々のＣＴＭによるタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の標識された検出抗体を第２の容器に含むことができる。
【００７９】
理解されるように、抗体（単数又は複数）を検出する標的（単数又は複数）は、対象となる特定の症状又は疾患に応じて選択することができる。有用な（蛍光色素複合）抗体は市販されている。図７は、単に、各々異なる検出抗体を必要とする異なる適用例の任意のセットを示す。（参照により本明細書に援用する）国際公開第２０１０／０１５６３３号は、請求項９において、有用である抗体の標的のリストを開示している。
【００８０】
検出抗体標的を選択するために有用な考慮事項としては以下が挙げられる。抗原は、好ましくは、ＰＳＡ、ＣＥＡなどの分泌タンパク質ではない。というのは、このタンパク質の血清レベルが高いとＣＴＭサブセット中又は上で「バックグラウンド」が拡散する可能性があるからである。さらに、組織特異的タンパク質は、好ましくは、同じ組織の未成熟細胞上でも発現されるべきである。さらに、選択されたタンパク質ドメイン／エピトープは、好ましくは、「プロテオーム」、すなわち別のタンパク質において発生すべきでない。
【００８１】
考慮される別の関連する要素は、細胞増殖とアポトーシスの間の活性レベルが恒常的であるので、ほとんどの組織が、血液中の組織マーカー陽性ＣＴＭの正常なバックグラウンドを与えることである。しかし、一部の外側の上皮層はこの「正常なバックグラウンド」を与えない可能性が高い。例えば、健康な個体においては、連続的に更新される腸上皮は、主に腸管内腔に放出される。これは、腸特異的タンパク質断片を有するＣＴＭが血液中に実質的に存在しないと予想されることを意味している。しかし、腸上皮細胞が悪性浸潤細胞に転換すると、局所のＣＴＭは、アポトーシス悪性細胞を貪食し、腸（例えば、結腸）特異的タンパク質断片を有するＣＴＳＭとして血液中で検出可能になる。結腸特異的タンパク質断片を有する（増加した）循環ＣＴＳＭの検出は、結腸癌の早期検出のための全国的なスクリーニングプログラムに使用することができる。同じことが肺上皮細胞にもあてはまる可能性が高い。肺上皮細胞は、肺胞及び気管支に放出され、気管支を介して我々の体から除去される肺胞マクロファージによって貪食される可能性が高い（繊毛運動によって痰に除去された粘液）。しかし、（肺癌にあるような）浸潤上皮細胞は、血液中の肺上皮陽性ＣＴＳＭをもたらす。最後に、類似プロセスが皮膚でも起こり、正常なメラニン細胞は皮膚表面から失われる。これは、基底膜を通過して浸潤性になる黒色腫細胞とは対照的である。かかる状況下でのみ、網膜に由来するＭｅｌａｎ−Ａ陽性細胞の低いバックグラウンドの上に、血液中のＭｅｌａｎ−Ａ陽性ＣＴＳＭを検出することが可能になり得る。
【００８２】
本発明による方法又はキットの極めて重要な別の適用例は、潜行性感染症の場合などの非自己（すなわち外因性）タンパク質断片の検出である。特に、診断が極めて困難である潜行性感染症の場合。例えば、（肺外の）結核を診断することは、現在使用されている血清学的及びＰＣＲ試験がすべて高いレベルの誤った結果を示すので、極めて困難である。血液ＣＴＭサブセット中のマイコバクテリウム特異的タンパク質断片の検出は、体全体にわたって疾患の汎発を評価するためにも優れた代替の潜在的にはるかに信頼できる診断ツールを提供する。同じことがアスペルギルス症、ライム病、Ｑ熱などの別の病原体に起因する疾患にもあてはまる。
【００８３】
特定の一実施形態においては、本発明は、第２の容器が、それぞれ心臓、腎臓、肝臓又は肺移植を受けた患者における移植後の器官生存及び移植拒絶プロセスの評価を目的とした、心筋特異的タンパク質（例えば、トロポニン又はＣＫ−ＭＢ）、腎臓／糸球体特異的タンパク質、肝臓特異的タンパク質又は肺特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含む、診断キットを提供する。
【００８４】
第２の実施形態においては、第２の容器が、心筋特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含む診断キットは、（心筋梗塞を伴う）狭心症又は心臓の広範な虚血を検出する手段及び方法を提供する。損傷を受けた心筋由来の末期ＴＳＭは、リンパ管系を介して血液に移動し、そこで、心筋特異的タンパク質に由来するタンパク質断片を含むＣＴＳＭとして相対的にも絶対的にも多数検出することができる（図７Ａ）。かかる分析は、進行性狭心症の早期診断及び／又は心筋梗塞の程度及び修復のモニタリングに有用であり得る。
【００８５】
別の一実施形態においては、本発明のキット中の第２の容器は、骨折の複雑さ及び程度の評価、並びに骨折及び外科的介入後の骨再形成の進行の評価を可能にする、オステオカルシン、オステオポンチン、骨特異的アルカリホスファターゼなどの骨タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含む。例えば、骨再形成のモニタリングは、例えば複雑骨折の患者において実施することができる。骨特異的タンパク質（例えば、オステオカルシン、オステオポンチン及び／又は骨アルカリホスファターゼペプチド）由来の断片を含むＣＴＳＭの定期的な列挙によってかかるモニタリングが可能になる（図７Ｂ）。
【００８６】
別の一実施形態においては、本発明は、第２の容器が、悪性腫ようの早期診断及びモニタリングに使用される、上皮タンパク質、好ましくは乳房上皮タンパク質、食道上皮タンパク質、胃上皮タンパク質、すい臓上皮タンパク質、結腸上皮タンパク質、直腸−Ｓ状結腸上皮タンパク質、甲状腺上皮タンパク質、肺若しくは気管支上皮タンパク質、前立腺上皮タンパク質、ぼうこう上皮タンパク質、頚部上皮タンパク質、子宮上皮タンパク質、黒色腫タンパク質、腎糸球体タンパク質の細胞内分解に由来する１個以上のプロテアーゼ誘導タンパク質断片に対する、又は別の上皮細胞マーカーに対する、少なくとも１種類の検出抗体を含む、例えば悪性腫ようの早期診断及びモニタリングのための、キットを提供する。浸潤性結腸癌の早期診断及びモニタリングは、結腸上皮特異的タンパク質断片を含む血液中のＣＴＳＭの検出によって実施することができる（図７Ｃ）。かかる適用例は、定期的モニタリング（例えば、毎年又は６か月ごと）によって浸潤性結腸癌への大腸ポリポーシスの進行の早期診断が可能になり得るので、家族性大腸ポリポーシス患者に特に価値がある。
【００８７】
第５の実施形態においては、本発明は、肝臓における乳癌転移の早期検出手段及び方法を提供する。肝臓（又は骨、肺などの別の器官）における転移についての乳癌患者のスクリーニングは、乳房上皮タンパク質と肝臓特異的タンパク質の両方に由来するタンパク質断片を同時に含むＣＴＳＭを探索することによって可能になる（図７Ｄ）。１個のＣＴＳＭにおける２つの全く異なる組織由来の２つの異なるタイプのタンパク質断片の混在は、転移、例えば、肝臓、骨、肺又は中枢神経系（ＣＮＳ）への転移の存在を暗示する。一実施形態においては、本発明の方法は、乳癌、前立腺癌などの肝臓又は骨転移の尺度として、肝臓又は骨と癌細胞に由来する組織特異的タンパク質断片の複合検出を含む。
【００８８】
進行性浸潤性前立腺癌は、早期に検出する必要がある。本発明は、前立腺上皮タンパク質と骨特異的タンパク質（図７Ｅ）又は別のタイプのタンパク質、例えば、肝臓、肺及びＣＮＳの両方に由来するペプチドを含むＣＴＳＭの存在について前立腺癌患者をスクリーニングする手段及び方法を提供する。転移の検出及びモニタリングのための類似の手法は、すべてのタイプの癌に対して可能である。
【００８９】
別の一実施形態は、組織マクロファージが動脈硬化巣に侵入し、その役割が完了するとすぐに血管に直接戻る可能性が高い、アテローム性動脈硬化症に関する。かかるＣＴＳＭは、エンドセリン１などの内皮タンパク質由来のタンパク質断片を含む（図７Ｆ）。したがって、（例えば、アテローム性動脈硬化症、及びアテローム性動脈硬化症患者における内皮損傷の程度の評価を目的とした）かかる分析に使用される診断キットは、内皮タンパク質（例えば、エンドセリン１）の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含むことができる。
【００９０】
更なる一実施形態は、脳又は神経疾患、特にアルツハイマーの早期診断及びモニタリングのための方法及びキットに関し、少なくとも１種類の検出抗体によって、脳又は神経特異的タンパク質、例えば、Ａｐｏε４又はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出が可能になる。アルツハイマーの診断は、遅れて、確認が困難であることが多い。疾患進行のモニタリングも複雑である。その結果、本発明の独立した診断アッセイは、例えば、早期の支持療法及び時間内の財務管理のために、アルツハイマー患者及びその家族の介護を支援することができる。これは、Ａｐｏε４によって消化されたＡＰＰ及び／又は別の中枢神経系（ＣＮＳ）組織及び疾患関連タンパク質に由来する断片又はペプチドを含む、増加した、又は増加中のＣＴＳＭを検出することによって実施することができる（図７Ｇ）。ＡＰＰ−ペプチド陽性ＣＴＳＭの数値の上昇は初期アルツハイマーを暗示し得るものであり、かかるＡＰＰ陽性ＣＴＳＭの更なる増加は疾患進行を暗示し得る。
【００９１】
脳特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含むキットは、例えば反復性一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者における、脳血管障害（ＣＶＡ）の早期診断、並びに脳梗塞の程度及び回復のその後のモニタリングにも使用される。
【００９２】
別の一実施形態は、多発性硬化症（ＭＳ）に関する。ＭＳの診断は、複雑であるので、疾患進行のモニタリングに使用することもできる独立した診断アッセイの恩恵を受けるであろう。これは、神経を覆う髄鞘の分解に由来するミエリン特異的ペプチドを含むＣＴＳＭの相対及び絶対的度数の正確な検出を含む本明細書に記載の方法を使用して実施することができる（図７Ｈ）。
【００９３】
再生不良性貧血、Ｉ型真性糖尿病、甲状腺炎、自己免疫性ぼうこう炎、シェーグレン症候群、自己免疫性糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｆｒｉｔｉｓ）、リウマチ様関節炎、全身性硬化症、他の自己免疫性結合組織病などの自己免疫疾患の早期診断及び確認並びに自己免疫疾患のモニタリングに適切な診断キットを提供する。かかるキットは、内因子、ランゲルハンス島特異的タンパク質又はインスリン、甲状腺上皮タンパク質、ぼうこう上皮タンパク質、涙腺及び／又は唾液腺特異的タンパク質、腎糸球体特異的タンパク質、滑膜特異的タンパク質、筋肉及び結合組織特異的タンパク質からなる群から選択されるタンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を第２の容器に含むことができる。例えば、毒性又は自己免疫性甲状腺炎の早期診断又は確認は、甲状腺組織特異的タンパク質に由来するタンパク質断片を含むＣＴＳＭの相対及び絶対的度数の検出によって可能となり得る（図７１）。
【００９４】
シェーグレン症候群の診断は困難であり、やはり複雑な鑑別診断のゆえに、一般にかなり遅れて成される。耳下腺又は涙腺タンパク質の断片を含むＣＴＳＭの計数が高いと、診断過程を有意に支持することができる（図７Ｊ）。
【００９５】
頻繁に１型真性糖尿病を発症する家族の幼児は、ランゲルハンス島由来の断片若しくはペプチド、又はインスリンなどの別の特異的タンパク質を含むＣＴＳＭの存在をモニターすることができる（図７Ｋ）。かかるスクリーニングによって、顕性糖尿病を発症する前に早期診断することができ、それによって免疫調節又は免疫抑制による早期介入が可能になる。
【００９６】
さらに、全身性硬化症患者においては、診断は必ずしも容易ではない。したがって、結合組織タンパク質及び内皮細胞タンパク質の断片の存在を介した線維症及び脈管障害の早期検出にＣＴＭシステムを使用することができる（図７Ｌ）。
【００９７】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者は、頻繁に進行性糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｐｈｒｉｔｉｓ）を発症し、最後には不可逆的腎不全になる。かかる腎臓損傷は、一般に、ほとんどの腎機能が既に失われた後期に発見され、その結果、もはや免疫抑制治療が不可能である。したがって、本発明者らは、ＳＬＥ患者すべての腎臓特異的タンパク質の断片を含むＣＴＳＭの存在及び増加を定期的にモニターすることを提案する（図７Ｍ）。腎臓損傷の（高いクレアチニンレベルが見いだされるはるか前の）早期診断によって、免疫調節又は別の免疫抑制治療による早期介入が可能になる。
【００９８】
更なる一実施形態は、ライム病などの微生物（感染）に起因する疾患に関する。ライム病の診断は、非典型的な臨床像、及び／又はダニ咬傷に関連した皮膚病変部などの古典的症候の欠如という理由から、複雑であることが多い。ライム病患者における合併症の診断が遅れると、不可逆的な器官損傷となり得る。その結果、ライム病の診断に利用可能な独立した診断アッセイを有することが臨床的に有意義である。これは、ボレリア特異的タンパク質由来のペプチドを含むＣＴＳＭの検出によって実施することができる（図７Ｎ）。好ましくは、産生した抗体に対する選択されたエピトープは、ボレリア系統とは無関係であるべきであり、その結果、各タイプのボレリア感染を単一のアッセイで検出することができる。さもなければ、幾つかの異なるタイプのボレリア系統由来のペプチドに対する複数の抗体を使用して、特定の患者においてライム病を引き起こす関係したボレリア系統を特定することもできる。
【００９９】
従来の結核診断テストは、特に肺外結核の場合に、幾つかの制限がある。抗体に基づく幾つかの血清アッセイが開発されたが、そのすべてが少なくとも部分的に肺外診断を見落としている。しかし、マイコバクテリウム結核の断片を含むＣＴＳＭの検出は、肺外結核の正確な診断に寄与することができる（図７０）。
【０１００】
顆粒球減少症患者は、アスペルギルス症に対する感受性が高い。アスペルギルス症の診断が早いほど、疾患の結果は良好である。したがって、関係する系統とは無関係に、アスペルギルス由来の断片を含むＣＴＳＭの存在（及び増加）について顆粒球減少症患者すべてをモニターすることが賢明かもしれない（図７Ｐ）。
【０１０１】
したがって、肝炎、ライム病、結核、レプラ又はアスペルギルス症の早期検出（又は診断の確認）及びモニタリングのために、第２の容器が、肝炎ウイルス、ボレリア、マイコバクテリウム、アスペルギルスなどのウイルス、細菌、真菌のような病原体由来のタンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含む、診断キットも提供する。特定の一態様においては、診断キットは、結核の骨局在化及びアスペルギルス症の早期診断及びモニタリングを目的にし、骨タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体、並びにマイコバクテリウム又はアスペルギルス由来のタンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を第２の容器に含む。
【０１０２】
本発明は、持久力トレーニングにおけるスポーツマンの練習のモニタリング、より具体的には個体が練習不足か練習し過ぎかどうかを判定するためにも使用される。持久力スポーツは、競技会において適切な瞬間に正しいトレーニング状態に達するための注意深い練習プログラムを必要とする。最適な練習頻度及び強度は、個体間でかなり異なり、身体、環境、及び現時点では不明である遺伝（人種）的要素に依存し得る。さらに、レベルの高い運動後の回復は、個々のスポーツマンで異なり得る。持久力スポーツにおけるスポーツマンの練習及び回復の指導は、骨格タンパク質に由来するペプチドに陽性であるＣＴＳＭコンパートメントの注意深いモニタリングによって支援することができる（図７Ｑ）。これは、練習し過ぎと練習不足の両方を防止するために、練習スケジュールにおけるスポーツマンへの指導を改善し、個々のスポーツの結果をかなり改善することができる。
【０１０３】
更なる一実施形態は、例えば、手術における研修医の外科的技能を評価するための、又は同じ適応症に対する２つ以上の異なる外科的処置を評価するための、組織損傷の評価に関する。（骨格筋又は結合組織由来のペプチド、例えば、コラーゲン由来のペプチドを含む）ＣＴＭ又はＣＴＳＭの検出及び列挙はかかる評価に役立ち得る（図７Ｒ）。第２の容器が骨格筋の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含む、診断キットを提供する。かかるキットは、持久力スポーツ（例えば、マラソン、トライアスロン、スケート、水泳、サイクリング、クロスカントリースキー）などの（国際的な）スポーツ大会におけるスポーツマンの練習及び回復のモニタリング及び指導に使用される。
【０１０４】
更なる一実施形態においては、本発明は、健康状態の個人的ＣＴＳＭプロファイル評価を提供するのに使用することができる。ＣＴＳＭのサブセット分布は、かかる組成が年齢及び他のパラメータ、かかる生活習慣（例えば、喫煙及び飲酒）、スポーツなどの活動に依存するので、個体間でわずかに異なる可能性が高い。個体の定期的（例えば、毎年又は６か月ごとの）モニタリングによって、健康状態の良好な見通しを得ることができ、疾患の早期検出及び診断が可能になる。本発明によって、以下の特定のリスク及び害に対するスクリーニングに使用することができる個別化されたＣＴＳＭプロファイルの設計が可能になる。
【０１０５】
・職業的暴露（工業毒など）、
・生活習慣（喫煙、食事、飲酒など）、
・家族関連疾患（心血管、癌、アルツハイマーなど）
防止及び／又は早期診断を目的として、個体ごとに組織由来のペプチドの特定の個別化された組合せをモニターすることができる。
【実施例１】
【０１０６】
ＣＴＳＭに基づくフローサイトメトリー健康スキャニングの適用例：ＣＴＳＭサブセットの分布を求め、それによって細胞再生、維持、修復、老化及びアポトーシスの恒常性の生理学的及び非生理学的変化を求める。
【０１０７】
１．生理的条件：成長、加齢、妊娠、閉経、身体活動性、概日リズム、
・小児の成長：乳児期、小児期、青年期における器官の発達、例えば、骨コンパートメントにおける高い活性（成長及び再形成）、及び結果として骨由来ペプチドを含むＣＴＳＭサブセットの増加、
・幼児における大きい胸腺に反映されている、幼児における多数のＢ及びＴリンパ球の産生のための極めて活性なリンパ様前駆細胞コンパートメント、
・加齢：器官退縮及びＣＴＳＭサブセットの増加を伴う老化、
・妊娠：胎盤機能及び機能不全（胎盤中毒の早期検出及び分娩時間）、
・胸腺退縮及びＴ細胞産生の減少：多数のＴ細胞（約９０％）が胸腺においてネガティブ選択される、
・卵巣機能：卵巣ＣＴＳＭの減少による（早発）閉経の検出、
・骨形成及び骨密度：加齢中、例えば、思春期／青年期、加齢及び早期閉経における骨形成及び骨吸収の評価。
【０１０８】
２．生活習慣：例えば、
・喫煙：粘膜及び上皮細胞バランスの測定による肺損傷の評価、
・アルコール：アルコール摂取に関連した肝損傷の評価、
・スポーツ：回復能力の異なるトップスポーツマンに対して個別化された練習プログラムを設計するための耐久スポーツ（例えば、マラソン、トライアスロン）における筋肉由来ＣＴＳＭの評価、
・皮膚の太陽／ＵＶ光暴露：ＵＶ暴露レベル及び関連した損傷を評価するための皮膚上皮ペプチド及びメラニンペプチドの測定（ＵＶ露光の表面範囲及び強度）。
【０１０９】
３．環境物質（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｇｅｎｔｓ）への暴露
組織マクロファージにおける毒性成分の直接評価、又は以下の場合などの関係組織における間接的毒性測定
・石綿、
・塗料中の神経毒性材料、
・核事故後の放射線被曝の結果。
【０１１０】
４．一般組織損傷（皮膚、粘膜、筋肉及び／又は骨）：
・外傷：外傷の程度、及び回復の進行のモニタリング、
・外科的介入：例えば、手術における研修医の技能の評価のための、例えば、「手術の質」の尺度としての手術後組織損傷の評価、
・体全体にわたる複数の病変部を有する敗血症の影響、
・癌治療などの医療行為の器官損傷及び他の望ましくない毒性副作用、
・特定の組織、例えば、熱傷に対する温度の影響（サイズ、深さ及び体表）、
・骨折、並びに骨折の複雑さ及び広がり（例えば、オステオカルシンペプチド及び／又はオステオポンチンペプチド及び／又は骨アルカリホスファターゼペプチドの測定）。
【０１１１】
５．炎症及び自己免疫疾患：
・全身性硬化症などの自己免疫疾患の広がり、
・シェーグレン病：特定の上皮ペプチドの測定による涙腺及び唾液腺の関与についてのより早い診断及びより明確な定義、
・自己免疫性ぼうこう炎；ぼうこう上皮ペプチドを含むＣＴＳＭの測定、
・糸球体腎炎：自己免疫性腎炎における腎臓損傷の程度、又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者における腎臓損傷の早期検出、又は腎移植後の患者における拒絶プロセスの早期検出、
・リウマチ様関節炎：ＣＴＳＭ中の関節成分（滑膜ペプチド）の検出、
・血管炎：例えば、内皮細胞ペプチドを含むＣＴＳＭを有する側頭動脈炎。
【０１１２】
６．神経障害及び神経変性疾患：
・アルツハイマー病：変異Ａｐｏε４、ＡＰＰなどの疾患関連タンパク質由来のペプチドを含むＣＴＳＭを介した早期診断、
・多発性硬化症：例えば、ＣＴＳＭ中のミエリンペプチドの検出、
・パーキンソン病
・クロイツフェルト  ヤコブ病などのプリオン病。
【０１１３】
７．感染症（特に、持続性くすぶり型及び潜行性）：
同じＴＳＭサブセット中の組織特異的ペプチドと微生物特異的ペプチドの複合検出：
・マイコバクテリウム感染症：ＢＣＧ陽性患者及び小児における難しい診断、
・Ｑ熱：難しい診断及び難しい治療有効性評価、
・ライム病：疾患の診断が難題のままであるあいまいな愁訴を有する患者におけるボレリア由来ペプチドの検出、
・Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎：肝損傷及び／又はウイルスタンパク質由来ペプチドのモニタリング、
・侵襲性真菌及び酵母感染症の診断：アスペルギルス感染症の難しい診断；循環組織マクロファージにおける真菌抗原の検出、及び関係するＣＴＳＭの特定による関係組織の特定。
【０１１４】
８．代謝障害：
・肥満：例えば、脂肪細胞由来のタンパク質断片の異なる疾患特異的プロファイル、
・１型糖尿病（若年性インスリン依存性糖尿病）：すい臓中のインスリン産生細胞の主要な損傷が起こる前の初期段階における検出、
・２型糖尿病（遅発性）：アテローム硬化型合併症が存在する場合、機能（サイトカイン産生）の低下したＣＤ１４ｄｉｍ／ＣＤ１６＋＋組織マクロファージが増加、
・性腺機能低下におけるテストステロン治療：組織マクロファージの増加、ただし機能は低下。
【０１１５】
９．起源の不明な疾患：
例えば、筋肉由来ペプチド及び他の疾患マーカー（例えば、ウイルス成分）の検出：
・線維筋痛、
・慢性疲労症候群：組織マクロファージ中のウイルス成分の検出、
・起源の不明な（特発性）発熱：組織関連損傷の直接の反映としてのＣＴＳＭのプロファイルの定義。
【０１１６】
１０．悪性腫よう：
ほとんどの癌の場合、上皮膜抗原を１種類以上の組織特異的マーカーと組み合わせて一般的マーカーとして使用することができる。
【０１１７】
・癌全般：例えば、ＥＭＡ（上皮膜抗原）由来のペプチド、
・乳癌：例えば、ＣＡ１５−３抗原由来のペプチド、
・甲状腺癌：例えば、腫ようマーカーとしてのＲＥＴ由来のペプチド、
・食道癌、
・胃癌、
・結腸癌：例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）由来のペプチド、
・直腸／Ｓ状結腸癌、
・肺癌、
・子宮頚癌又は子宮癌、
・前立腺癌：例えば、ＰＳＡ及びＥＲＧペプチド、
・ぼうこう癌、
・黒色腫：例えば、メラニンペプチド；ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ
・すい臓癌、
・腎癌など、
・神経芽細胞腫：例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２由来のペプチド、
・脳腫よう、例えばＧＦＡＰ（図６）、
・中皮腫：石綿被爆労働者のスクリーニング、及び循環組織マクロファージ中の中皮由来ペプチドを介した早期診断、
・下垂体腫ようなどの診断が困難な希少癌。
【０１１８】
１１．腫よう転移の早期検出及びモニタリング：
同じＣＴＳＭサブセット中の腫よう由来のペプチドと浸潤組織由来のペプチドの複合検出、例えば、
・骨又は肝臓における乳癌転移：同じＴＳＭサブセット中の乳房由来のペプチドと骨又は肝臓由来のペプチドの複合検出、
・肝臓における結腸癌転移：同じＣＴＳＭサブセット中の結腸由来のペプチドと肝臓由来のペプチドの複合検出、
・骨における前立腺癌転移：同じＣＴＳＭサブセット中の結腸由来のペプチドと骨由来のペプチドの複合検出、
・血管内Ｂ細胞リンパ腫：同じＣＴＳＭサブセット中の内皮由来ペプチドとＢ細胞由来ペプチドの複合検出（検出された高レベルの組織マクロファージ：血液白血球の＞１０％）
・脳内リンパ腫：同じＣＴＳＭ中のＣＮＳペプチドとＢ細胞ペプチドの複合検出。
【０１１９】
１２．循環器疾患：
・狭心症：心筋梗塞を伴う又は伴わないＥＣＧ異常、
・血栓形成リスクのある患者における凝固障害
・ＩＩ型糖尿病患者におけるアテローム硬化型病変部。
【実施例２】
【０１２０】
神経こう腫患者及び健常対照群のＣＴＭにおけるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色
材料及び方法
まず、診断時の（外科的介入前の）神経こう腫患者（ｎ＝９）及び健常対照群（ｎ＝９）から新たに収集された血液試料を、表２（手順Ａ、ステップ１から１３）に記載の染色手順に従って、ＣＤ３００ｅ（ＵＰ−Ｈ２）−ＡＰＣ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ、サラマンカ、スペイン）、ＣＤ１４（ＭＯ−Ｐ９）−ＡＰＣＨ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ１６（３Ｇ８）−ＰＥＣｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ４５（ＨＩ３０）−ＰａｃＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ＮＹ、ＵＳＡ）、及びＨＬＡＤＲ（Ｌ２４３）−ＰａｃＢ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）で表面膜染色した。表面膜染色後、表２（手順Ｂ、ステップ１６から４３）に記載の染色手順に従って、抗ＧＦＡＰ（Ｎ−１８）−ＰＥ抗体で試料を細胞内染色した。抗ＧＦＡＰ抗体は、タンパク質のＮ末端エピトープに対するものであり、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。細胞固定及び透過化をＦｉｘ＆Ｐｅｒｍ（Ａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒｕｂ、ウィーン、ＡＴ）を用いて実施した。染色細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ多色フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定し、データをＩｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェア（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ、サラマンカ、スペイン）によって分析した。単球及びＣＴＭのゲーティングは、中間ＳＳＣ及びＣＤ４５発現に対するゲーティングとそれに続くＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲ陽性に対するゲーティングに基づいた（一般的染色パターンについては図４参照）。次いで、更にＣＤ１６及びＣＤ１４発現を分析し、続いて細胞内ＧＦＡＰ染色を評価した（図６Ａ参照）。
【０１２１】
結果
初期ＣＴＭの割合は、全評価集団（古典的単球＋ＣＴＭすべて）に対して表され、ＧＦＡＰ陽性は、初期ＣＴＭ集団内の陽性細胞割合として表された。健常対照群はすべて初期ＣＴＭが１０％未満であり、健常対照群の６／９は初期ＣＴＭが５％未満であった。９名の健常対照群におけるＧＦＡＰ陽性初期ＣＴＭの割合は、１％未満（０．６％、０．７％及び７回の０％）であった（図６Ｂ参照）。神経こう腫患者は初期ＣＴＭが８／９例で５％を超え、４／９例で１０％を超えた。ＧＦＡＰ陽性初期ＣＴＭ割合は、約１％から約３１％まで変動した（０．９％、１．０％、１．３％、１．４％、２．５％、４．５％、８．７％、２９．９％、３０．７％））。ＧＦＡＰ陽性ＣＴＭ割合は、神経こう腫瘤のサイズと幾らかの相関を示した（図６Ｂ参照）。
【図１】
2014507005.tif 000004
【図２】
2014507005.tif 000005
【図３】
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【図４】
2014507005.tif 000007
【図５】
2014507005.tif 000008
【図６】
2014507005.tif 000009
【図７（ａ）】
2014507005.tif 000010
【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月14日(2013.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ａ）循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を含む前記対象由来の生物学的試験試料を用意するステップ、
ｂ）異なるＣＴＭサブセットの特定及び列挙のために、骨格マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅ並びに好ましくは更にＨＬＡＤＲに対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記ＣＴＭを染色するステップ、
ｃ）その起源組織における個々のＣＴＭによる非ＣＴＭタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する１種類以上の検出抗体を使用した前記ＣＴＭの固定、透過化及び染色、それによって循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の少なくとも１つのサブセットを特定するステップ、
ｄ）個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定するための骨格マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅのゲーティングによる前記染色ＣＴＭ及びＣＴＳＭの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、
ｅ）各ＣＴＭサブセット、及び測定された細胞内エピトープの各々を発現する各特定のＣＴＳＭサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
ｆ）（ｉ）評価された個々のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１セットによって規定された異なる正常及び変化組織から各々生ずる各ＣＴＭサブセット及び各特定のＣＴＳＭサブセット内の細胞の相対及び絶対数と、ｉｉ）評価された個々の細胞内ペプチドごとに関連付けられた抗体関連信号の量とを計算して、試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを得るステップ、並びに
ｇ）前記試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを各評価組織の正常ＣＴＳＭ染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び／又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撹乱された組織恒常性及び疾患を映す鏡として循環組織マクロファージを使用して、対象における組織損傷の早期検出、疾患の早期診断及びモニタリング、及び／又は治療の有効性の評価のために、対象の健康状態を判定する方法であって、
ａ）循環組織マクロファージ（ＣＴＭ）を含む前記対象由来の生物学的試験試料を用意するステップ、
ｂ）異なるＣＴＭサブセットの特定及び列挙のために、骨格マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅ並びに好ましくは更にＨＬＡＤＲに対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記ＣＴＭを染色するステップ、
ｃ）その起源組織における個々のＣＴＭによる非ＣＴＭタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する１種類以上の検出抗体を使用した前記ＣＴＭの固定、透過化及び染色、それによって循環組織特異的マクロファージ（ＣＴＳＭ）の少なくとも１つのサブセットを特定するステップ、
ｄ）個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定するための骨格マーカーＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３００ｅのゲーティングによる前記染色ＣＴＭ及びＣＴＳＭの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、
ｅ）各ＣＴＭサブセット、及び測定された細胞内エピトープの各々を発現する各特定のＣＴＳＭサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
ｆ）（ｉ）評価された個々のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１セットによって規定された異なる正常及び変化組織から各々生ずる各ＣＴＭサブセット及び各特定のＣＴＳＭサブセット内の細胞の相対及び絶対数と、ｉｉ）評価された個々の細胞内ペプチドごとに関連付けられた抗体関連信号の量とを計算して、試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを得るステップ、並びに
ｇ）前記試験ＣＴＳＭ染色プロファイルを各評価組織の正常ＣＴＳＭ染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び／又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ｂ）が、マーカーＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲに対する抗体で染色することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）が、さらに、マーカーＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ３６の１種類以上に対する抗体で染色することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）が、側方散乱（ＳＳＣ）分析と組み合わせてＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６、好ましくはＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲの細胞表面発現に基づくゲーティング戦略を実施することを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲーティング戦略が、（ｉ）側方散乱（ＳＳＣ）分析と組み合わせて、ＣＤ３００ｅの発現、好ましくはＣＤ３００ｅ及びＨＬＡＤＲの発現に基づく古典的単球とＣＴＭの両方を包含する包含ステップと、（ｉｉ）それに続いて、前記古典的ＣＤ１４高／ＣＤ１６−単球をＣＴＭから識別し、前記ＣＴＭ集団内のサブセットを特定するサブセット特定ステップとで構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下のいずれか１つを含む、請求項５に記載の方法：
（ｉ）ＣＤ３００ｅを発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択するための、少なくともＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６についての染色、並びにＳＳＣとＣＤ３００ｅ＋細胞の組合せに対するゲーティング、
（ｉｉ）同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現する低〜中間ＳＳＣの細胞を選択するための、少なくともＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲについての染色、並びに側方散乱（ＳＳＣ）とＣＤ３００ｅ＋及びＨＬＡＤＲ＋細胞の組合せに対するゲーティング、又は
（ｉｉｉ）少なくともＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡＤＲについての染色、並びにＳＳＣとＣＤ３００ｅ＋、ＣＤ４５＋及びＨＬＡＤＲ＋細胞の組合せに対するゲーティング、好ましくは同時にＣＤ３００ｅとＨＬＡＤＲを同時発現するＣＤ４５を有する低〜中間ＳＳＣの細胞に対するゲーティング。
【請求項７】
前記サブセット特定ステップが、古典的（ＣＤ１４高／ＣＤ１６−）単球並びにＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ１４低／ＣＤ１６高及びＣＤ１４−／ＣＤ１６高〜ＣＤ１４−／ＣＤ１６低細胞として特定される２つの主要なＣＴＭサブセットの特定を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＴＭサブセット特定ステップが、
−後期ＣＴＭを表すＣＤ６４低対古典的単球プラス初期ＣＴＭを表すＣＤ６４高に対してゲーティングを行うこと、続いて
−他の初期ＣＴＭ細胞すべて（対古典的単球）をＣＤ１６＋／ＣＤ１４＋表現型を有する事象として選択することによって単球とＣＴＭを識別すること、並びにＣＴＭコンパートメント全体をＣＤ６４低として及びＣＤ１６＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ６４高として規定すること、続いて
−ＣＤ６４、ＣＤ１４及びＣＤ１６の発現レベルに基づいて選択されたＣＴＭを異なる機能又は成熟関連コンパートメントに更に細分すること、好ましくは前記異なるコンパートメントはＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低である
を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記選択されたＣＴＭを更に細分するステップがＣＤ６４、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ３６に基づき、好ましくは少なくとも１つの以下のＣＴＭサブセット、すなわちＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６低〜ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４高／ＣＤ１６高、ＣＤ６４高／ＣＤ３６高／ＣＤ１４低／ＣＤ１６高、ＣＤ６４低／ＣＤ３６高／ＣＤ１４−／ＣＤ１６高及びＣＤ６４低／ＣＤ１４−／ＣＤ１６低／ＣＤ３６−〜低細胞の特定を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物試料が、末梢血、腹水、胸水、脳脊髄液、骨髄、リンパ節、リンパ液、滑液、又は固体組織から調製される単一細胞懸濁液を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）が以下の細胞内染色を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法：
ａ．細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する単一プロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｂ．１種類の細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｃ．単一器官又は組織の正常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｄ．単一器官又は組織の異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、
ｅ．正常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも１種類の抗体と異常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも１種類の抗体の組合せを含めて、単一器官又は組織の正常及び異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ、並びに
ｆ．２つ以上の器官又は組織の正常又は異常細胞に由来する２種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する２個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の１種類以上のエピトープ。
【請求項１２】
前記少なくとも１種類の検出抗体によって異常タンパク質に由来する１種類以上のペプチドエピトープの検出が可能になり、好ましくは前記異常タンパク質が、発癌タンパク質、変異タンパク質、融合タンパク質、アレルゲンに由来するタンパク質、及びウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のような病原体に由来するタンパク質からなる群から選択される、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異なって標識された抗体のパネルが、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジン葉緑素タンパク質（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、ａｌｅｘａ  ６４７、ａｌｅｘａ  ７１０、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５、ｃｙａｎｉｎ  ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎ  ５．５（Ｃｙ５．５）、ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（ＰａｃＢ）、ｈｏｒｉｚｏｎ  ｖｉｏｌｅｔ  ４５０（ＨＶ４５０）、ｐａｃｉｆｉｃ  ｏｒａｎｇｅ（ＰａｃＯ）、ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）、ＨＶ５００、ＯＣ５１５、Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びＰＥ、ＡＰＣ又はＰｅｒＣＰと結合したその複合物（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５、ＰＥ／Ｃｙ５．５、ＰＥ／Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＰＣＣｙ７５０）から選択される適合蛍光色素の組合せ、又は任意の追加の適合蛍光色素若しくは蛍光色素タンデムを含む、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１セットの骨格マーカーに対する異なって標識された抗体を第１の容器に含む診断キットであって、前記骨格マーカーがＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６並びに好ましくは更にＨＬＡＤＲであり、場合によっては、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのＣＴＭサブセットの特定及び列挙のための前記キットの使用説明書である、診断キット。
【請求項１５】
前記第１の容器が、マーカーＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４及びＣＤ１６、好ましくはＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＨＬＡＤＲに対する抗体を含む、より好ましくは更にマーカーＣＤ３６、ＣＤ６４又はＣＤ４５に対する抗体の群から選択される少なくとも１種類の抗体を含む、請求項１４に記載の診断キット。
【請求項１６】
前記第１の容器がＣＤ３００ｅ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ３６に対する抗体を含む、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１７】
さらに、その起源組織における個々のＣＴＭによる非ＣＴＭタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも１個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の１種類以上のエピトープに対する少なくとも１種類の検出抗体を含む第２の容器を含む、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の診断キット。
【請求項１８】
前記第２の容器が、悪性腫ようの早期診断及びモニタリングに使用される、上皮タンパク質、好ましくは乳房上皮タンパク質、食道上皮タンパク質、胃上皮タンパク質、すい臓上皮タンパク質、結腸上皮タンパク質、直腸−Ｓ状結腸上皮タンパク質、甲状腺上皮タンパク質、肺若しくは気管支上皮タンパク質、前立腺上皮タンパク質、ぼうこう上皮タンパク質、頚部上皮タンパク質、子宮上皮タンパク質、黒色腫タンパク質（例えば、Ｍｅｌａｎ−Ａ）、腎糸球体タンパク質の細胞内分解に由来する１個以上のプロテアーゼ誘導タンパク質断片に対する、又は別の上皮細胞マーカーに対する、少なくとも１種類の検出抗体を含み、場合によっては更に説明書も含む、請求項１７に記載の診断キット。
【請求項１９】
前記第２の容器が、アルツハイマー病、神経こう腫又は多発性硬化症の早期診断及びモニタリングに使用される、好ましくはＡｐｏε４、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＧＦＡＰ及びミエリンからなる群から選択される、脳又は神経特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含み、場合によっては更に説明書も含む、請求項１７又は１８に記載の診断キット。
【請求項２０】
前記第２の容器が、それぞれ心臓、腎臓、肝臓又は肺移植を受けた患者における移植後の器官生存及び移植拒絶プロセスの評価に使用される、心筋特異的タンパク質（例えば、トロポニン又はＣＫ−ＭＢ）、腎臓／糸球体特異的タンパク質、肝臓特異的タンパク質又は肺特異的タンパク質の細胞内分解に由来する１種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも１種類の検出抗体を含み、場合によっては更に説明書も含む、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の診断キット。
【国際調査報告】
2014507005.tif 000013
2014507005.tif 000014