(57)【要約】本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体アンタゴニストとしての、式（Ｉ）に記載の新規な置換ベンジルピペリジン化合物、それらの製造、および、がん、線維症または関節炎などの増殖性または炎症性疾患の処置のためのそれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014526526.tif 000041
で表される化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物であって、
式中、
Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立して、Ｈ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ａ、ＮＨ（ＬＡ）、Ｎ（ＬＡ）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（ＬＡ）、ＳＯ２（ＬＡ）、Ｏ（ＬＡ）、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＬＡ）、ＳＯ２Ｎ（ＬＡ）２であり、
Ｘ、Ｙ、Ｚは、独立してＣＨ、Ｃ（ＬＡ）、Ｃ（Ｈａｌ）またはＮであり、
Ｑは、ＮＲ２、ＯまたはＳであり、
ＬＡは、１、２、３または４個の炭素原子を有する、非分枝または分枝アルキルであり、ここで、１つ、２つまたは３つのＨ原子はＨａｌにより置き換えられてもよく、
Ｒ３は、ＨまたはＬＡであり、
Ａｒは、０、１、２、３または４個のＮ、Ｏおよび／またはＳ原子および、５、６、７、８、９または１０個の骨格原子を有する単環式または二環式の芳香族同素環または芳香族複素環であり、それらは非置換であるか、または互いに独立して、Ｒ５’、Ｒ５’’により単置換または二置換されてもよく、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
但し、前記化合物は３−エチル−２−１［−（フェニルメチル）−２−ピペリジニル］−１Ｈ−インドールではない。
【請求項２】
式（Ｉ’）
【化２】
2014526526.tif 000042
式中、すべての残基は、式（Ｉ）について示された意味を有する、
に準拠する、
請求項１に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物。
【請求項３】
より詳細に指定されていない残基は、式（Ｉ）について示された意味を有するが、
副次式１において、
Ｒ１’、Ｒ１’’は、独立してＨ、メチル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＳＯ２ＮＨ２であり、
副次式２において、
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり、
副次式３において、
Ｒ３は、Ｈまたはメチルであり、
副次式４において、
Ａｒは、フェニル、フリル、ピリジル、チアゾリルまたはインダゾリルであり、
副次式５において、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆ、メチル、エチル、メトキシ、トリフルオロメチル、 ヒドロキシまたはニトロであり、
副次式６において、
Ｒ１’、Ｒ１’’は、独立してＨ、メチル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＳＯ２ＮＨ２であり、
Ｒ３は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり、
Ａｒは、フェニル、フリル、ピリジル、チアゾリルまたはインダゾリルであり、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆ、メチル、エチル、メトキシ、トリフルオロメチル、 ヒドロキシまたはニトロであり、
副次式７において、
Ｒ３は、Ｈであり、
副次式８において、
Ｒ４は、Ｈであり、
副次式９において、
Ａｒは、フェニルであり、
副次式１０において、
Ｑは、ＮＲ２であり、
Ｒ２は、Ｈ、メチルまたはイソプロピルであり、
Ｚは、Ｎであり、
副次式１１において、
Ｑは、ＮＲ２であり、
Ｒ２は、Ｈ、メチルまたはイソプロピルであり、
Ｚは、ＣＨであり、
副次式１２において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ（ＬＡ）またはＣ（Ｈａｌ）であり、
Ｘは、Ｎであり、
副次式１３において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ（ＬＡ）またはＣ（Ｈａｌ）であり、
Ｘは、ＣＨであり、
副次式１４において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ３またはＣ−Ｆであり、
Ｘは、Ｎであり、
副次式１５において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ３またはＣ−Ｆであり、
Ｘは、ＣＨであり、
副次式１６において、
Ｑは、ＮＨであり、
Ｚは、ＣＨであり、
Ｒ１’は、Ｈであり、
Ｒ１’’は、Ｆであり、
副次式１７において、
Ｑは、ＮＨであり、
Ｙは、ＣＨであり、
副次式１８において、
Ａｒは、フェニルであり、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆまたはメチルであり、
副次式１９において、
Ｒ３は、Ｈであり、
Ｒ４は、Ｈであり、
Ａｒは、フェニルであり、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆまたはメチルであり、
Ｑは、ＮＨであり、
Ｙは、ＣＨである、
請求項１または２のいずれか一項に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物。
【請求項４】
化合物が、
２−［１−（２−エチル−チアゾール−４−イルメチル）−ピペリジン−２−イル］−５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
２−［１−（２−エチル−チアゾール−４−イルメチル）−ピペリジン−２−イル］−５−フルオロ−１Ｈ−インドール、
２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピラジン、
２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−スルホン酸アミド、
２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
２−［（Ｒ）−１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
２−［（Ｒ）−１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−５−フルオロ−１Ｈ−インドール、
２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−スルホン酸アミド、
２−［１−（４−フルオロ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−クロロ−２−［１−（４−メトキシ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
２−［（Ｒ）−１−（４−フルオロ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［（Ｒ）−１−（４−フルオロ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［１−（３−メトキシ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［１−（４−フルオロ−ベンジル）−６−メチル−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［１−（４−メトキシ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［１−（４−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［６−メチル−１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−フルオロ−２−［６−メチル−１−（５−メチル−フラン−２−イルメチル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
５−メトキシ−２−［１−（３−メトキシ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール、
６−ブロモ−２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−ブロモ−２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−クロロ−２−［（Ｒ）−１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、
６−クロロ−２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−クロロ−２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、
６−クロロ−２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−５−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−クロロ−２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−クロロ−２−［１−（４−フルオロ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、
６−クロロ−５−メチル−２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−クロロ−５−メチル−２−［１−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
からなる群から選択される、
請求項１に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物を活性成分として薬学的に許容し得る担体とともに含む、医薬組成物。
【請求項６】
増殖性または炎症性疾患の処置における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物。
【請求項７】
疾患が、がん、皮膚の良性過形成、再狭窄、血管形成または血管新生に関連する疾患、腫瘍の血管新生、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、線維症、膵炎、関節炎、乾癬からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のための化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物。
【請求項８】
増殖性または炎症性疾患を処置するために医薬を調製するのための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物の使用。
【請求項９】
疾患が、がん、皮膚の良性過形成、再狭窄、血管形成または血管新生に関連する疾患、腫瘍の血管新生、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、線維症、膵炎、関節炎、乾癬からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記それぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物を対象に投与することを含む、増殖性または炎症性疾患を処置するための方法。
【請求項１１】
疾患が、がん、皮膚の良性過形成、再狭窄、血管形成または血管新生に関連する疾患、腫瘍の血管新生、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、線維症、膵炎、関節炎、乾癬からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または、その立体異性体もしくは互変異性体、または前記のそれぞれの薬学的に許容し得る塩、または全ての比率でのそれらの混合物の有効量、および
ｂ）さらなる医薬活性成分の有効量
の個別のパックからなるセット（キット）。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表される化合物の製造方法であって、
式（ＩＩＩ）
【化３】
2014526526.tif 000043
で表される化合物は、式（ＩＩ）
【化４】
2014526526.tif 000044
で表される化合物とアミノ化により反応し、
ここで、Ｒ６’は脱離基であってＲ６’’はＨであるか、または、Ｒ６’およびＲ６’’は、式（Ｉ）で表される化合物を得るために、共に脱離基を形成する、
前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、増殖性または炎症性疾患、例えば、哺乳動物における、がん、線維症または関節炎などの処置において有用である、一連の新規な置換ベンジルピペリジン化合物に関する。本発明にまた包含されるものは、哺乳動物、特にヒトにおける増殖性または炎症性疾患の処置におけるかかる化合物の使用および、かかる化合物を含有する医薬組成物である。
【背景技術】
【０００２】
関連する技術の概要
リゾリン脂質は、膜由来の生理活性脂質メディエーターである。リゾリン脂質は、増殖、分化、生存、遊走、接着、浸潤、および形態形成を含む基本的な細胞機能に影響を与える。これらの機能には、限定されるものではないが、神経新生、血管新生、創傷治癒、線維症、免疫、炎症、および発癌を含む多くの生物学的プロセスに影響を与える。
【０００３】
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、自己分泌およびパラ分泌様式で特異的Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のセットを介して作用することが示されているリゾリン脂質である。同族のＧＰＣＲ（ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５、ＬＰＡ６）に結合するＬＰＡは、様々な生物学的反応を生成する細胞内シグナル伝達経路を活性化する。
ＬＰＡ受容体アンタゴニストは、特に、がん、線維症または関節炎などの増殖性または炎症性疾患においてＬＰＡが役割を果たす疾患、障害または状態の処置における用途を見出す。
【０００４】
卵巣がん患者の腹水および血漿中のＬＰＡレベルの上昇が検出された。ＬＰＡは、腫瘍細胞の増殖、生存、遊走および浸潤を促進することが示されている。ＬＰＡレベルの上昇、受容体発現の変化、およびＬＰＡに対する応答の変化は、卵巣がんの開始、進行または結果に寄与し得る。ＬＰＡは、潜在的に、前立腺がん、乳がん、黒色腫、頭頸部がん、大腸がんおよび甲状腺がんなどの、多くの他のタイプのがんにも関与する。したがって、ＬＰＡ受容体アンタゴニスト（好ましくは選択的サブタイプ）は、これらの効果を減少させることができるはずであり、がんの進行において肯定的な結果をもたらす可能性が高い。ＬＰＡは、ＥＤＧ−２／ＬＰＡ１、ＥＤＧ−４／ＬＰＡ２、ＥＤＧ−７／ＬＰＡ３、ＧＰＲ２３／ＬＰＡ４、ＧＰＲ９３／ＬＰＡ５、ｐ２ｙ５／ＬＰＡ６などのＧタンパク質共役型受容体を介してその生物学的効果を主に発揮する。特にＥＤＧ−４／ＬＰＡ２およびＥＤＧ−７／ＬＰＡ３は、悪性卵巣上皮細胞において、一貫して上方制御され、ＬＰＡに対する卵巣がん細胞の異常な応答の一因になる。これらの受容体は、細胞内のＧｉ、Ｇｑ，１１、またはＧ１２，１３経路を介したシグナル伝達を開始する。これらの経路を介したシグナル伝達の変化は、ＧＰＣＲを標的とするすべての薬剤に共通し、今日様々な適応症において市販される薬剤の半分より多くを占める。
【０００５】
高レベルのＬＰＡは、ホスファチジン酸をＬＰＡに変換する血小板からのホスホリパーゼＰＬＡ１およびｓＰＬＡ２の放出に起因して、血液凝固の際に生成される。ＬＰＡは、細胞の成長のためにin vitroで使用される、血清において最も有効な成長因子の１つであると考えられている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の説明
本願発明の目的は、増殖性または炎症性疾患、特に、ＬＰＡの亢進に関連する疾患、例えば、哺乳動物における、がん、線維症または関節炎などの処置において有用な、新規なＬＰＡ受容体アンタゴニストを提供することであり、それらの可溶性だけでなく、それらの活性の両方に関して優れた薬理学的特性、代謝クリアランスおよび生物学的利用能特性を有する、新規なＬＰＡ受容体アンタゴニストを提供することである。
結果として、本発明は、ＬＰＡアンタゴニストであり、医薬として有用であり、特に上述の疾患の処置において有用である、新規な置換ベンジルピペリジン化合物または、それらの立体異性体もしくは互変異性体、または薬学的に許容し得る塩を提供する。
【０００７】
化合物は式（Ｉ）：
【化１】
2014526526.tif 000002
式中、
Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立して、Ｈ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ａ、ＮＨ（ＬＡ）、Ｎ（ＬＡ）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（ＬＡ）、ＳＯ２（ＬＡ）、Ｏ（ＬＡ）、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＬＡ）、ＳＯ２Ｎ（ＬＡ）２であり、
Ｘ、Ｙ、Ｚは、独立してＣＨ、Ｃ（ＬＡ）、Ｃ（Ｈａｌ）またはＮであり、
Ｑは、ＮＲ２、ＯまたはＳであり、
ＬＡは、１、２、３または４個の炭素原子を有する、非分枝または分枝アルキルであり、ここで、１つ、２つまたは３つのＨ原子はＨａｌにより置き換えられてもよく、
Ｒ３は、ＨまたはＬＡであり、
Ａｒは、０、１、２、３または４個のＮ、Ｏおよび／またはＳ原子および、５、６、７、８、９または１０個の骨格原子を有する単環式または二環式の芳香族同素環または芳香族複素環であり、それらは非置換であるか、または互いに独立して、Ｒ５’、Ｒ５’’により単置換または二置換されてもよく、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
により定義される。
【０００８】
一般に、複数回出現する全ての残基は、同一であっても、または異なっていてもよく、すなわち、互いに独立している。本明細書中において他に明示的に記載しない限り、残基およびパラメータは、式（Ｉ）について示される意味を有する。したがって、本発明は、特に、式（Ｉ）で表される化合物に関し、ここで、少なくとも一つの前記残基が、以下に示す好ましい意味の１つを有する。
【０００９】
Ｈａｌは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、特に、フッ素または塩素を意味する。
「ＬＡ」は、１、２、３または４個のＣ原子を有する非分枝または分枝状の直鎖アルキルを意味し、１、２または３個のＨ原子は、Ｈａｌにより置き換えられてよく、例えば、メチル、エチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、１，１，１−トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルにより置き換えられてよい。
【００１０】
「Ａｒ」は、例えば、非置換フェニル、またはナフチルを意味し、さらに好ましくは、例えば、フェニルまたはナフチルを意味し、それら各々は、メチル、エチル、イソプロピル、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ニトロ、シアノ、ホルミル、アセチル、プロピオニル、トリフルオロメチル、メタンスルホニル、アミノ、メチルアミノ、ジメチル-アミノ、ジエチルアミノ、カルボキシル、メトキシカルボニルにより単置換または二置換されている。
【００１１】
「Ａｒ」は、さらに、フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−トリル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アミノフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−メチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−メチルアミノカルボニル）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アセトアミドフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エトキシカルボニルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−エチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（メチルスルホンアミド）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（メチルスルホニル）フェニルを意味し、さらに好ましくは、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−または３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−または３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−または３，５−ジブロモフェニル、２，４−または２，５−ジニトロフェニル、２，５−または３，４−ジメトキシフェニル、３−ニトロ−４−クロロフェニル、３−アミノ−４−クロロ−、２−アミノ−３−クロロ−、２−アミノ−４−クロロ−、２−アミノ−５−クロロ−または２−アミノ−６−クロロフェニル、２−ニトロ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−または３−ニトロ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル、２，３−ジアミノフェニル、ｐ−ヨードフェニル、４−フルオロ−３−クロロフェニル、２−フルオロ−４−ブロモフェニル、３−ブロモ−６−メトキシフェニル、３−クロロ−６−メトキシフェニル、３−フルオロ−４−メトキシフェニル、３−アミノ−６−メチルフェニルを意味する。
【００１２】
「Ａｒ」は、さらに好ましくは、２−または３−フリル、２−または３−チエニル、  １−、２−または３−ピロリル、１−、２，４−または５−イミダゾリル、１−、３−、４−または５−ピラゾリル、２−、４−または５−オキサゾリル、３−、４−または５−イソオキサゾリル、２−、４−または５−チアゾリル、３−、４−または５−イソチアゾリル、２−、３−または４−ピリジル、２−、３−または４−ピリジルメチル、２−、３−または４−ピリジルエチル、２−、４−、５−または６−ピリミジニル、２−、３−、５−、または６−ピラジン−１−または４−イルを意味し、さらに好ましくは、１，２，３−トリアゾール−１−、−４−または−５−イル、１，２，４−トリアゾール−１−、−３−または５−イル、１−または５−テトラゾリル、１，２，３−オキサジアゾール−４−または５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−または−５−イル、１，３，４−オキサジアゾール−２−イル、１，３，４−チアジアゾール−２−または−５−イル、１，２，４−チアジアゾール−３−または−５−イル、１，２，３−チアジアゾール−４−または−５−イル、３−または４−ピリダジニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−または７−インドリル、２−、３−、４−、５−、６−または７−インダゾリル、２−、３−、４−または５−イソインドリル、２−、６−、または８−プリニル、１−、２−、４−または５−ベンゾイミダゾリル、１−、３−、４−、５−、６−または７−ベンゾピラゾリル、２−、４−、５−、６−または７−ベンゾオキサゾリル、３−、４−、５−、６−または７−ベンゾイソオキサゾリル、２−、４−、５−、６−または７−ベンゾチアゾリル、２‐、４‐、５‐、６‐または７‐ベンゾイソチアゾリル、４−、５−、６−または７−ベンゾ−２，１，３−オキサジアゾリル、１−、３−、４−、５−、６−、７−または８−イソキノリニル、３−、４−、５−、６−、７−または８−キノリニル、２−、４−、５−、６−、７−または８−キナゾリニル、キノキサリン−２−、３−、４−または５−イル、４−、５−、または６−フタラジニル、２−、３−、５−、６−、７−または８−２Ｈ−ベンゾ−１，４−オキサジニルを意味し、それら各々は、非置換であるか、メチル、エチル、イソプロピル、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ニトロ、シアノ、ホルミル、アセチル、プロピオニル、トリフルオロメチル、メタンスルホニル、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、カルボキシル、メトキシカルボニルにより単置換または二置換される。
【００１３】
化合物３−エチル−２−１［−（フェニルメチル）−２−ピペリジニル］−１Ｈ−インドールは、特許文献ＦＲ７０９９９（ＣＡＳ登録番号１０６５４５−８３−９）から知られており、したがって、本願の特許請求の範囲から除外される。
【００１４】
式（Ｉ）の好ましい態様において、ピペリジン環のキラル炭素原子における立体化学は、式（Ｉ’）：
【化２】
2014526526.tif 000003
式中、すべての残基は、式（Ｉ）について示された意味を有する、
に示される通りである。
【００１５】
さらに好ましいものは、式（Ｉ）および（Ｉ’）の副次式１〜１９で表される化合物であり、ここで、
副次式１において、
Ｒ１’、Ｒ１’’は、独立してＨ、メチル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＳＯ２ＮＨ２であり、
副次式２において、
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり、
副次式３において、
Ｒ３は、Ｈまたはメチルであり、
副次式４において、
Ａｒは、フェニル、フリル、ピリジル、チアゾリルまたはインダゾリルであり、
副次式５において、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆ、メチル、エチル、メトキシ、トリフルオロメチル、 ヒドロキシまたはニトロであり、
副次式６において、
Ｒ１’、Ｒ１’’は、独立してＨ、メチル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＳＯ２ＮＨ２であり、
Ｒ３は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり、
Ａｒは、フェニル、フリル、ピリジル、チアゾリルまたはインダゾリルであり、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆ、メチル、エチル、メトキシ、トリフルオロメチル、 ヒドロキシまたはニトロであり、
副次式７において、
Ｒ３は、Ｈであり、
副次式８において、
Ｒ４は、Ｈであり、
副次式９において、
Ａｒは、フェニルであり、
副次式１０において、
Ｑは、ＮＲ２であり、
Ｒ２は、Ｈ、メチルまたはイソプロピルであり、
Ｚは、Ｎであり、
【００１６】
副次式１１において、
Ｑは、ＮＲ２であり、
Ｒ２は、Ｈ、メチルまたはイソプロピルであり、
Ｚは、ＣＨであり、
副次式１２において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ（ＬＡ）またはＣ（Ｈａｌ）であり、
Ｘは、Ｎであり、
副次式１３において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ（ＬＡ）またはＣ（Ｈａｌ）であり、
Ｘは、ＣＨであり、
副次式１４において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ３またはＣ−Ｆであり、
Ｘは、Ｎであり、
副次式１５において、
Ｙは、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ３またはＣ−Ｆであり、
Ｘは、ＣＨであり、
【００１７】
副次式１６において、
Ｑは、ＮＨであり、
Ｚは、ＣＨであり、
Ｒ１’は、Ｈであり、
Ｒ１’’は、Ｆであり、
副次式１７において、
Ｑは、ＮＨであり、
Ｙは、ＣＨであり、
副次式１８において、
Ａｒは、フェニルであり、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆまたはメチルであり、
副次式１９において、
Ｒ３は、Ｈであり、
Ｒ４は、Ｈであり、
Ａｒは、フェニルであり、
Ｒ５’、Ｒ５’’は、独立してＨ、Ｆまたはメチルであり、
Ｑは、ＮＨであり、
Ｙは、ＣＨであり、
残りの残基は、式（Ｉ）について示された意味を有する。
【００１８】
式（Ｉ）で表される化合物は、１つまたは２つ以上のキラル中心を有してもよい。したがって、それらは様々なエナンチオマー形態において生じ、ラセミ体または光学活性体の形態であってもよい。本発明は、したがってまた、これらの化合物の光学活性体、エナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマー、まとめて：立体異性体に関する。本発明の化合物のラセミ体または立体異性体の薬学的活性が異なり得るため、エナンチオマーを使用することが望ましい場合がある。これらの場合において、最終生成物または中間体までもを、当業者に公知の化学的もしくは物理的手段によってエナンチオマー化合物に分けることができ、または、合成においてそのように採用することもできる。
【００１９】
ラセミ体アミンの場合において、ジアステレオマーが混合物から光学活性な分割剤との反応によって形成される。好適な分割剤の例は、光学的に活性な酸、例えば酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸などのＲおよびＳ形態、好適にはＮ保護アミノ酸（例えばＮ−ベンゾイルプロリンもしくはＮ−ベンゼンスルホニルプロリン）、または様々な光学活性なカンファースルホン酸である。また有利なのは、光学的に活性な分割剤（例えばシリカゲル上に固定化されたジニトロベンゾイルフェニルグリシン、三酢酸セルロースまたは炭水化物もしくはキラルに誘導体化されたメタクリレートポリマーの他の誘導体）の補助によるクロマトグラフィーを用いたエナンチオマー分割である。この目的のための好適な溶離剤は例えば、例えば比率８２：１５：３におけるヘキサン／イソプロパノール／アセトニトリルなどの、水性またはアルコール性溶媒混合物である。
エステル基（例えばアセチルエステル）を含有するラセミ体の分割のためのエレガントな方法は、酵素、特にエステラーゼの使用である。
【００２０】
本発明の化合物は、プロドラッグ化合物の形態であることができる。「プロドラッグ化合物」は、本発明の生物学的に活性な化合物に、生体における生理学的条件下で、例えば各々が酵素的に、または酵素の関与を伴わずに行われる酸化、還元、加水分解などによって変換される誘導体を意味する。
【００２１】
プロドラッグの例は、本発明の化合物中のアミノ基がアシル化、アルキル化もしくはリン酸化される化合物、例えばエイコサノイルアミノ、アラニルアミノ、ピバロイルオキシメチルアミノであり、または水酸基がアシル化、アルキル化、リン酸化されるかもしくはホウ酸塩に変換される化合物、例えばアセチルオキシ、パルミトイルオキシ、ピバロイルオキシ、スクシニルオキシ、フマリルオキシ、アラニルオキシであり、またはカルボキシル基がエステル化もしくはアミド化される化合物、またはスルフヒドリル基が担体分子と共にジスルフィド架橋を形成する化合物、例えばペプチドであり、それは薬剤を標的に、および／または細胞のサイトゾルに選択的に送達する。
これらの化合物を、本発明の化合物から周知の方法に従って製造することができる。プロドラッグの他の例は、本発明の化合物中のカルボキシレートが例えばアルキル−、アリール−、コリン−、アミノ、アシルオキシメチルエステル、リノレノイル−エステルに変換される化合物である。本発明の化合物またはそれらのプロドラッグの互変異性、例えばケト−エノール互変異性が生じ得る場合には、個々の形態、例えばケトまたはエノール形態を、個別に、およびあらゆる比率における混合物として共にクレームする。同一のことが、立体異性体、例えばエナンチオマー、シス／トランス異性体、配座異性体などに当てはまる。
【００２２】
所望により、異性体を、当該分野において周知の方法によって、例えば液体クロマトグラフィーによって分離することができる。同一のことが、例えばキラル固定相を使用することによるエナンチオマーに当てはまる。さらに、エナンチオマーを、それらをジアステレオマーに変換することにより、すなわち、エナンチオマー的に純粋な補助化合物とカップリングさせ、得られたジアステレオマーをその後分離し、補助の残留物を切断することにより、単離してもよい。あるいはまた、本発明の化合物のあらゆるエナンチオマーを、光学的に純粋な出発物質を使用した立体選択的合成から得てもよい。
【００２３】
本発明の化合物は、薬学的に許容し得る塩、薬学的に許容し得る溶媒和物、または薬学的に許容し得る塩の薬学的に許容し得る溶媒和物の形態であることができる。
用語「薬学的に許容し得る塩」は、無機塩基または無機酸および有機塩基または有機酸を含む薬学的に許容し得る塩基または酸から調製した塩を指す。本発明の化合物が１つまたは２つ以上の酸性基または塩基性基を含有する場合において、本発明はまた、それらの対応する薬学的に許容し得る塩を含む。したがって、酸性基を含有する本発明の化合物は塩形態において存在することができ、本発明において例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩として、またはアンモニウム塩として使用することができる。
【００２４】
かかる塩のより正確な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩あるいはアンモニアまたは有機アミン、例えばエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミンもしくはアミノ酸との塩が挙げられる。１つまたは２つ以上の塩基性基、すなわちプロトン化することができる基を含有する本発明の化合物は、塩形態において存在することができ、本発明において無機または有機酸とのそれらの付加塩の形態において使用することができる。好適な酸の例としては、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバリン酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、および当業者に知られている他の酸が挙げられる。
【００２５】
本発明の化合物が酸性および塩基性基を分子中に同時に含有する場合には、本発明はまた、記載された塩形態に加えて、内塩またはベタイン（両性イオン）を含む。それぞれの塩を、当業者に知られている慣習的な方法によって、例えばこれらを有機もしくは無機酸もしくは塩基と、溶媒または分散剤中で接触させることにより、または他の塩とのアニオン交換もしくはカチオン交換によって得ることができる。本発明はまた、低い生理学的適合性のために調剤において使用するには直接適していないが、例えば化学反応のための、または薬学的に許容し得る塩の調製のための中間体として使用することができる本発明の化合物のすべての塩を含む。
【００２６】
用語「薬学的に許容し得る溶媒和物」は、当量または非当量のいずれかの溶媒を含有する薬学的に許容し得る溶媒との付加形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶性固体状態において固定されたモル比の溶媒分子を捕獲する傾向を有し、したがって溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合には、生成した溶媒和物は水和物、例えば一または二水和物である。溶媒がアルコールである場合には、生成した溶媒和物はアルコラート、例えばメタノラートまたはエタノラートである。溶媒がエーテルである場合には、生成した溶媒和物はエーテラート、例えばジエチルエーテラートである。
【００２７】
したがって、以下の項目がまた、本発明に従う：
ａ）  化合物のすべての立体異性体または互変異性体、およびすべての比率でのこれらの混合物
ｂ）  化合物のプロドラッグ、またはこれらのプロドラッグの立体異性体もしくは互変異性体、
ｃ）  化合物の、ならびに（ａ）および（ｂ）で述べた項目の、薬学的に許容し得る塩、
ｄ）  化合物の、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で述べた項目の、薬学的に許容し得る溶媒和物。
【００２８】
本明細書中での化合物へのすべての言及は、これらの項目、特に化合物の薬学的に許容し得る溶媒和物、またはそれらの薬学的に許容し得る塩の薬学的に許容し得る溶媒和物を含むことを意味することを理解するべきである。
【００２９】
さらに、本発明は、薬学的に許容し得る担体と一緒の活性成分としての、本発明の化合物、またはその立体異性体もしくは互変異性体、または前記の各々の薬学的に許容し得る塩、およびすべての比率でのそれらの混合物を含む、医薬組成物に関する。
【００３０】
「医薬組成物」は、１種または２種以上の活性成分および、担体を構成する１種または２種以上の不活性成分、ならびに成分の任意の２種または３種以上の組み合わせ、錯化または凝集から、または成分の１種もしくは２種以上の解離から、または成分の１種もしくは２種以上の他のタイプの反応もしくは相互作用から、直接もしくは間接的に生じるあらゆる生成物を意味する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容し得る担体を混合することにより作製されたあらゆる組成物を包含する。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、さらに活性成分として１種または２種以上の他の化合物、例えば本発明の１種または２種以上の追加の化合物または他のＬＰＡアンタゴニストを含んでもよい。
【００３２】
医薬組成物は、経口、直腸内、局所的、非経口（皮下、筋肉内および静脈内を含む）、目の（眼の）、肺（鼻もしくは頬側吸入）、または経鼻投与に適している組成物を含むが、任意の所定の場合における最も好適な経路は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに活性成分の性質に依存する。それらは、単位投薬形態において好都合に提示され、薬学の分野において周知の方法のいずれによっても調製され得る。
【００３３】
１つの態様において、前記化合物および医薬組成物は、がん、例えば脳、肺、結腸、類表皮、扁平細胞、膀胱、胃、膵臓、乳房、頭部、頸部、腎臓部(renal)、腎臓(kidney)、肝臓、卵巣、前立腺、結腸直腸、子宮、直腸、食道、睾丸、婦人科学的、甲状腺癌、黒色腫、血液系腫瘍、例えば急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、骨髄細胞白血病、神経膠腫、カポジ肉腫など、またはあらゆる他のタイプの固形もしくは液性腫瘍の処置のためである。好ましくは、処置するべきがんは、神経膠芽腫、黒色腫、卵巣、前立腺、乳房、頭頸部、腸および甲状腺癌から選択される。
【００３４】
本発明はまた、本発明の化合物の、哺乳動物におけるＬＰＡの活動亢進と関係する増殖性または炎症性疾患およびＬＰＡによって調節される疾患、または異常な増殖によって媒介される障害、例えば癌などの処置のための医薬の調製のための使用に関する。
本発明はまた、哺乳動物における異常な細胞成長を抑制するための化合物または医薬組成物に関し、ある量の本発明の化合物をある量の別の抗癌療法と組み合わせて含み、ここで当該量の化合物および別の抗癌療法は、ともに異常な細胞成長を阻害するにあたって有効である。多くの抗癌療法が、現在当該分野において知られている。
１つの態様において、抗癌療法は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答変更因子、抗ホルモン薬、血管新生抑制剤、インテグリンアンタゴニスト、例えばシレンジタイドなど、および抗アンドロゲン薬からなる群から選択された化学療法である。
【００３５】
別の態様において、抗癌療法は、ベバシズマブ、ＣＤ４０特異的抗体、ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ、デノスマブ、ザノリムマブ、ＩＧＦ１Ｒ特異的抗体、リンツズマブ、エドレコロマブ、ＷＸ  Ｇ２５０、リツキシマブ、チシリムマブ、トラスツズマブおよびセツキシマブからなる群から選択された抗体である。尚別の態様において、抗癌療法は、プロテインキナーゼの阻害剤、例えばＡｋｔ、Ａｘｌ、オーロラＡ、オーロラＢ、ｄｙｒｋ２、ｅｐｈａ２、ｆｇｆｒ３、ｉｇｆ１ｒ、ＩＫＫ２、ＪＮＫ３、Ｖｅｇｆｒ１、Ｖｅｇｆｒ２、Ｖｅｇｆｒ３（またＦｌｔ−４として知られている）、ＫＤＲ、ＭＥＫ、ＭＥＴ、Ｐｌｋ１、ＲＳＫ１、Ｓｒｃ、ＴｒｋＡ、Ｚａｐ７０、ｃＫｉｔ、ｂＲａｆ、ＥＧＦＲ、Ｊａｋ２、ＰＩ３Ｋ、ＮＰＭ−Ａｌｋ、ｃ−Ａｂｌ、ＢＴＫ、ＦＡＫ、ＰＤＧＦＲ、ＴＡＫ１、ＬｉｍＫ、Ｆｌｔ−３、ＰＤＫ１およびＥｒｋなどである。
本発明はさらに、哺乳動物における異常な細胞成長を阻害するかまたは増殖性疾患を処置するための方法に関し、当該哺乳動物に、ある量の本発明の化合物あるいは医薬組成物を放射線療法と組み合わせて投与することを含み、ここで当該量の化合物または医薬組成物を、哺乳動物において異常な細胞成長を阻害するかまたは増殖性疾患を処置するにあたって有効な放射線療法と組み合わせる。
【００３６】
放射線療法を施すための手法は当該分野において知られており、これらの手法を本明細書中に記載した併用療法において使用することができる。本発明の化合物または医薬組成物のこの併用療法における投与を、本明細書中に記載したように決定することができる。本発明の化合物は、異常な細胞を、かかる細胞を死滅させ、かつ／またはその成長を阻害する目的のための放射線での処置に対してより感受性にすることができると考えられる。
【００３７】
したがって、本発明はさらに、哺乳動物における異常な細胞を放射線での処置に対して感作するための方法に関し、当該哺乳動物に、ある量の本発明の化合物あるいは医薬組成物を投与することを含み、当該量が異常な細胞を放射線での処置に対して感作するにあたって有効である。この方法における化合物の量は、本明細書中に記載される化合物の有効量を確認するための手段に従って決定することができる。
実際の使用において、本発明の化合物は、従来の医薬配合技術に従い、医薬担体との密な混合物中の活性成分として組み合わせることができる。担体は、投与のために所望される製剤の形態に依存して多種多様な形態、例えば経口または非経口（静脈内を含む）を採ってもよい。経口投薬形態のための組成物を調製するにあたって、通常の医薬媒体のいずれも、例えば水、グリコール、油、アルコール、調味剤、防腐剤、着色剤などを、採用してもよい。
【００３８】
経口液体製剤の場合において、いずれの通常の医薬媒体、例えば懸濁液、エリキシル剤および溶液など、またはいずれの担体、例えばデンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などを採用してもよい。経口固体製剤の場合において、組成物は例えば散剤、硬質および軟質カプセルならびに錠剤の形態を採ってもよく、固体経口製剤が液体製剤にまさって好ましい。
【００３９】
それらの投与の容易さのために、錠剤およびカプセルは最も有利な経口投薬単位形態を表し、この場合において固体の医薬担体が明らかに採用される。所望により、錠剤を標準的な水性の、または非水性の手法によって被覆してもよい。かかる組成物および製剤は、少なくとも０．１パーセントの活性化合物を含有すべきである。活性化合物のこれらの組成物中の百分率を当然変化させてもよく、好都合には当該単位の重量の約２パーセント〜約６０パーセントであってもよい。かかる治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効な投与量が得られる程度の量である。活性化合物をまた、鼻腔内に例えば液体ドロップまたはスプレーとして投与することができる。
【００４０】
錠剤、丸剤、カプセルなどはまた、結合剤、例えばトラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば第二リン酸カルシウムなど；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムなど；および甘味剤、例えばスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどを含有してもよい。投薬単位形態がカプセルである場合には、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体の担体、例えば脂肪油などを含有してもよい。
【００４１】
様々な他の材料は、コーティングとして、または投薬単位の物理的な形態を変更するために存在し得る。例えば、錠剤をセラック、糖または両方で被覆してもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素および風味剤、例えばサクランボまたはオレンジフレーバーを含有してもよい。
【００４２】
本発明の化合物をまた、非経口的に投与してもよい。これらの活性化合物の溶液または懸濁液を、界面活性剤、例えばヒドロキシ−プロピルセルロースなどと好適に混合した水中で調製することができる。分散液をまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物において、油中で調製することができる。保管および使用の通常の条件の下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【００４３】
注射可能な使用に適している医薬形態は、滅菌水溶液または滅菌分散液および、注射可能な滅菌溶液または滅菌分散液の即座の調製のための滅菌粉末を含む。すべての場合において、当該形態は無菌でなければならなず、容易なシリンジ通過性(syringability)が存在する程度に流動性を有しなければならない。それは製造および保存の条件の下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および菌類の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、その好適な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【００４４】
あらゆる好適な投与の経路を、哺乳動物、特にヒトに、有効な用量の本発明の化合物を供給するために採用してもよい。例えば、経口、直腸内、局所的、非経口、眼内、肺内、鼻腔内などを、採用してもよい。投薬形態は、錠剤、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エアゾールなどを含む。好ましくは、本発明の化合物を経口的に投与する。
【００４５】
用いられる活性成分の有効な投与量は、用いる特定の化合物、投与の方式、処置される状態および処置される状態の重篤度に依存して変化し得る。かかる投与量は、当業者によって容易に確認され得る。
【００４６】
本発明の化合物が適応されるがん、炎症または他の増殖疾患を処置するかまたは予防する場合には、一般的に満足な結果は、本発明の化合物を、体重１キログラムあたり約０．０１ミリグラム〜約１００ミリグラムの１日投与量で投与する場合に得られ、好ましくは１日一回の用量として与えられる。ほとんどの大型の哺乳動物について、合計の１日投与量は、約０．１ミリグラム〜約１０００ミリグラム、好ましくは約０．２ミリグラム〜約５０ミリグラムである。７０ｋｇの成人のヒトの場合において、合計の１日用量は、一般的に約０．２ミリグラム〜約２００ミリグラムであろう。この投薬計画を、最適な治療的応答を提供するために調整してもよい。
本発明はまた、
ａ）  本発明の化合物またはその立体異性体もしくは互変異性体、または前記の各々の薬学的に許容し得る塩、あるいはすべての比率でのそれらの混合物の有効量、および
ｂ）  さらなる医薬活性成分の有効量
の個別のパックからなるセット（キット）に関する。
【００４７】
当該セットは、好適な容器、例えば箱、個別のビン、袋またはアンプルを含む。
例によって、当該セットは、各々が本発明の化合物の有効量を含有する個別のアンプル、および溶解したかまたは凍結乾燥した形態におけるさらなる医薬活性成分の有効量を含んでもよい。
【００４８】
実験の章
本出願中に出現し得るいくつかの略語は、以下のとおりである：
略語
【表１】
2014526526.tif 000004
【００４９】
本発明の化合物を、以下のスキームおよび例の手順に従って、好適な材料を使用して調製することができ、以下の特定の例によってさらに例示する。
【００５０】
さらに、本明細書中に記載した手順を当該分野における通常の技術と組み合わせて利用することによって、ここでクレームした本発明の追加の化合物を容易に調製することができる。しかしながら、例において例示する化合物を本発明として考慮される唯一の種類を形成するものとして解釈するべきではない。例は、さらに本発明の化合物の調製についての詳細を例示する。当業者は、以下の調製的手順の条件およびプロセスの既知の変形形態を、これらの化合物を調製するために使用できることを容易に理解するであろう。
【００５１】
本化合物を、一般的にそれらの薬学的に許容し得る塩、例えば上述したものなどの形態において単離する。単離した塩に対応するアミン非含有塩基を、好適な塩基、例えば炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムでの中和、ならびに遊離アミン非含有塩基の有機溶媒中への抽出、続いて蒸発によって生成させることができる。このようにして単離したアミン非含有塩基を、有機溶媒への溶解、続いて適切な酸の添加およびその後の蒸発、沈殿または結晶化によって、別の薬学的に許容し得る塩にさらに変換することができる。
【００５２】
本発明を、以下の例に記載した特定の態様への言及によって例示するが、それらには限定されない。スキームにおいて他に示さない限り、変数は上に記載したのと同一の意味を有する。
他に特定しない限り、すべての出発物質を商業的な供給者から得、さらに精製せずに使用する。他に特定しない限り、すべての温度を℃において表し、すべての反応を室温で行う。化合物をシリカクロマトグラフィーまたは分取ＨＰＬＣのいずれかによって精製した。
【００５３】
本発明はまた、式（Ｉ）で表される化合物の製造方法であって、
ここで、式（ＩＩＩ）
【化３】
2014526526.tif 000005
で表される化合物を、式（ＩＩ）
【化４】
2014526526.tif 000006
で表される化合物とアミノ化により反応し、
ここで、Ｒ６’は脱離基であってＲ６’’はＨであるか、または、Ｒ６’およびＲ６’’は、式（Ｉ）で表される化合物を得るために、共に脱離基を形成する、
前記製造方法に関する。
アミノ化反応が求核置換である場合、好ましくは、Ｒ６’はＨａｌであり、例えばＣｌまたはＢｒなどである。アミノ化反応が還元的アミノ化である場合、Ｒ６’およびＲ６’’はともに脱離基を形成し、好ましくはカルボニル酸素である。
【００５４】
例
以下に提示する実施例は、本発明の特定の態様を例示することを意図し、いかなる方法においても明細書または特許請求の範囲を限定することを意図しない。
化学合成
この章において、多数の式（Ｉ）による代表的な化合物例およびその合成中間体のための実験的詳細を提供する。
【００５５】
２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール（化合物例２）の合成
【化５】
2014526526.tif 000007
【００５６】
ａ．  ２−アセチルピリジン１（５．９９ｇ、４０．９ｍｍｏｌ）を無水エタノール（５０ｍＬ）に溶解し、フェニルヒドラジン（８．８５ｇ、８１．８ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を３０分間還流した。室温まで冷却した後、得られた沈殿物を濾過により回収し、冷エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させた。オフホワイトの固体を９２．４％（８．６７ｇ、３７．８ｍｍｏｌ）の収率で化合物２として同定し、さらに精製することなく使用した。
【００５７】
ｂ．  ヒドラゾン２（７．７４ｇ、３６．６ｍｍｏｌ）を、肉厚ビーカー内で、ポリリン酸（４３．５ｇ）と混合し、１１０℃で１．５時間加熱した。冷却後、混合液を１０％ＮａＯＨで塩基性化し、ジクロロメタンで抽出した。一体化した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。残渣を、溶出系（eluent system）としてヘキサン：ジクロロメタン１：１を使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（５．３１ｇ、２７．３ｍｍｏｌ、７５％）と同定する無色固体を産出した。
【００５８】
ｃ．  化合物３（５．１６ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１００ｍＬ）  に溶解し、０．２ｍｌ酢酸および１０％Ｐｄ／Ｃを添加した。混合液を、５０℃のＨ２（８０気圧）条件下におけるオートクレーブ中で水素化した。１２時間撹拌した後、１ｇのＰｄ／Ｃおよび０．２ｍｌの酢酸をさらに添加し、混合液を５０°のＨ２（８０気圧）条件下で１２時間水素化した。冷却後、反応混合物を珪藻土を通して濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル（ヘキサン：ジクロロメタン１：１）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、続いてエチルエーテルから結晶化させた。化合物４を無色固体（５．１４ｇ、２５．７ｍｍｏｌ、９６％）として得た。
【００５９】
ｄ．  ジクロロメタン（５ｍＬ）中の化合物４（２００ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液に、３−メチルベンズアルデヒド（１２０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を１５分間継続した。この溶液にトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（３００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を１２時間継続した。反応液に水を添加し、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物を、溶出系として０％〜０．５％のメタノール勾配でジクロロメタン：メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。最終化合物５を無色固体（２２８ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、７５％）として得た。
代替手順：アセトニトリル（５ｍＬ）中の化合物４（１００ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（６９．１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）および３−メチルベンジルブロミド（９２．５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を１５時間８０℃で継続した。水および酢酸エチルを反応液に添加し、水層を２回、酢酸エチルで分離および抽出した。一体化した有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール）により単離した。最終化合物５を無色固体（８２．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、４８％）として得た。
【００６０】
表１に示すように、この手順に従って、以下の化合物例：１−１０、１３−２５、４２−４４、５４−６０、６３、６５−７１、７３、８２、８４−８６、１０７−１１２、１２４、１２５、１３２、１３６−１３９および１４３を合成した。
例７２化合物は、手順ｄと同様に、対応するピペリジン誘導体と１−（４−フルオロフェニル）−エタノンを反応させることによって調製した。
【００６１】
化合物例７５を合成するために、２−アセチルピリジンの代わりに１−ピリジン−２−イル−プロパン−１−オンを手順ａにおいて使用した。以下の手順は手順ｂ〜ｄに従って行った。
【００６２】
５−フルオロ−２−［１−（４−フルオロ−ベンジル）−６−メチル−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール（化合物例３６）の合成
【化６】
2014526526.tif 000008
【００６３】
ｅ．  ２−アセチル−６−メチルピリジン６（１０．０ｇ、９９％、７３．２ｍｍｏｌ）  を無水エタノール（１００ｍＬ）に溶解し、４−フルオロ−フェニルヒドラジン（２５．１ｇ、９５％、１４７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を３０分間還流した。室温まで冷却した後、得られた沈殿物を濾過により回収し、冷エタノールで洗浄した。残渣を飽和炭酸ナトリウム溶液に再溶解し、ジクロロメタンで２回抽出した。一体化した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。オフホワイトの固体を９２．５％（１６．５ｇ、６７．８ｍｍｏｌ）の収率で化合物７として同定し、さらに精製することなく使用した。
【００６４】
ｆ．  ヒドラゾン７（１６．５ｇ、６７．５ｍｍｏｌ）を、肉厚ビーカー内で、ポリリン酸（４２．０ｇ、９９％、４２４ｍｍｏｌ）と混合し、１１０℃で１．５時間加熱した。冷却後、混合液を１０％ＮａＯＨで塩基性化し、ジクロロメタンで抽出した。一体化した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。残渣を、化合物８（５．６２ｇ、９５％、２４．８ｍｍｏｌ、３７％）として同定する無色固体で得るために、溶出系としてヘキサン：ジクロロメタン３：２を使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００６５】
ｇ．  化合物８（１．５９ｇ、９５％、６．６８ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２５ｍＬ）に溶解し、０．２ｍｌ酢酸および１０％Ｐｄ／Ｃを添加した。混合液を、５０°のＨ２（７６気圧）条件下において１２時間オートクレーブ中で水素化した。冷却後、反応混合物を珪藻土を通して濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ジクロロメタン１：１）により精製し、続いてエチルエーテルから結晶化させた。化合物９を無色固体（０．７７ｇ、３．３１ｍｍｏｌ、５０％）として得た。
【００６６】
ｈ．  ジクロロメタン（４ｍＬ）中の化合物９（１０５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロベンズアルデヒド（７１ｍｇ、９５％、０．５４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を１５分間継続した。この溶液にトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（３００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を５０℃で１２時間継続した。さらに、１．２当量（eq）のアルデヒドおよび２当量のＮａＢＨ（ＯＡｃ）３を添加し、反応混合液を室温で３時間撹拌し、その後５０℃で３日間撹拌した。反応液に水を添加し、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物を、溶出系として０％〜０．５％のメタノール勾配でジクロロメタン：メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。最終化合物１０を無色固体（７２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、４７％）として得た。
【００６７】
表１に示すように、この手順に従って、２−アセチル−５−メチルピリジン、２−アセチル−４−メチルピリジンおよび２−アセチル−３−メチルピリジンから出発する、以下の化合物例：例２６−４１、４５、４６、６１、６２、６４、６８、７４、  ７６、７９−８１、８３、８７を合成した。
【００６８】
６−クロロ−２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物例１２８）
【化７】
2014526526.tif 000009
ｉ．  ５−クロロ−２，３−ジアミノピリジン（３００ｍｇ、９８％、２．０５ｍｍｏｌ）および１−ｔｅｒｔ
ブトキシカルボニルピペリジン−２−カルボン酸（５４０ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）をポリリン酸（１．５ｍＬ）に溶解し、１６０℃で１８時間撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、酢酸エチル／ブタノールで２回抽出した。一体化した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。残渣を、化合物１１として同定し、さらに精製することなく使用した（４６２ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、９５％）。
【００６９】
ｊ．  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中の化合物１１（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（７０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）および３，４−ジメチルベンジル酸クロリド（９５ｍｇ、７０％純度、０．４３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を室温で１５時間継続した。反応液に水および酢酸エチルを添加し、水層を２回、酢酸エチルで分離および抽出した。一体化した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール）により単離した。最終化合物１２を無色固体（８５．０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、５７％）として得た。
【００７０】
ｋ．  化合物１２（５０ｍｇ）を、エタノール（５ｍＬ）中に溶解し、５ｘ５０ｃｍキラルパックＡＤカラムと、２０μｍの材料と、溶媒ｎ−ヘプタン／エタノール７０／３０を１２０ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用するキラルＨＰＬＣにより、エナンチオマーへと分離した（表１中例１４０、１４１を参照）。１８．１ｍｇの１３ａおよび１９，３ｍｇの１３ｂを得た。
【００７１】
表１に示すように、この手順に従い、以下の化合物例：例１２８、１３０、１３３、１３４、１４４もまた、２，３−ジアミノピラジンを使用して、合成した。
【００７２】
６−クロロ−５−メチル−２−［１−（３−メチル−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（化合物例１０６）の合成
【化８】
2014526526.tif 000010
ｌ．  ４−クロロ−５−メチルベンゼン−１，２−ジアミン（２．００ｇ、９５％、  １２．１ｍｍｏｌ）および１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピペリジン−２−カルボン酸（２．７８ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を、ポリリン酸（１１．９ｇ、１２１ｍｍｏｌ）に溶解し、１７０℃で１２時間撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、酢酸エチル／ブタノールで２回抽出した。一体化した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。残渣を、化合物１４として同定し、さらに精製することなく使用した（２．００ｇ、８．０１ｍｍｏｌ、６６％）。
【００７３】
ｍ．    Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の化合物１４（３５０ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１９３ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）および３−メチルベンジル酸クロリド（１９７ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を室温で１５時間継続した。反応液に水および酢酸エチルを添加し、水層を２回、酢酸エチルで分離および抽出した。一体化した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール）により単離した。最終化合物１５を無色固体（２０８ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、４２％）として得た。
【００７４】
手順kに従って、ラセミ混合物はエンチオマーに分離することができる。
表１に示すように、この手順に従い、以下の化合物例：例４７、４９、５１、８８−１０６、１１３−１２３、１２６−１３１、１３５、１４２を合成した。
【００７５】
２−［１−（４−フルオロ−ベンジル）−ピペリジン−２−イル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物例１４４）の合成
【化９】
2014526526.tif 000011
ｎ．  ３−ヨード２−アミノピリジン（１．００ｇ、９９％、４．５４ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（２８９ｍｇ、６．８１ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１．９３ｇ、  １８．２ｍｍｏｌ）は、１００℃の真空オーブンで１時間乾燥させた。反応容器をアルゴンで溢流させ、室温に冷却した。この混合物に、乾燥した脱気Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）、２−エチニルピリジン（５６３ｍｇ、５．４５ｍｍｏｌ）および触媒Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２＊ＣＨ２Ｃｌ２（３７１ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を１００℃で１８時間継続した。室温まで冷却後、水を添加し、混合物を酢酸エチルで２回抽出した。一体化した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、化合物１６（５５５ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ、６３％）として同定する無色固体を得るために、溶出系としてシクロヘキサン：酢酸エチル１：１〜酢酸エチル１００％までの勾配を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００７６】
ｏ．化合物１６（５４５ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中に溶解し、水素化ナトリウム（鉱油中６０％、３６６ｍｇ、９．２０ｍｍｏｌ、乾燥ヘキサンで２回洗浄）を少量で添加し、５分間にわたって、この混合物を密閉容器中で８０°Ｃ）で２日間（２ｄ）撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、酢酸エチルで３回抽出した。一体化した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。残渣を、化合物１７（３１１ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ、５７％）として同定する無色固体を得るために、溶出系としてシクロヘキサン：酢酸エチル１：１〜１００％酢酸エチルまでの勾配を使用してシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００７７】
ｐ．化合物１７（３１１ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）を無水メタノール／酢酸（１０ｍＬ、１：１）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．３０ｇ）を添加した。混合物を室温でＨ２（１気圧）条件下のオートクレーブ中で水素化した。１８時間の撹拌の後、１ｇＰｄ／Ｃをさらに添加し、混合物を室温でさらに４０時間、水素化した。冷却後、反応混合物を珪藻土を通して濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン:メタノール）により精製した。化合物１８を無色固体（９２．１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、２９％）として得た。
【００７８】
ｑ．アセトニトリル（２．５ｍＬ）中の化合物１８（４６．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（３１．６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）および臭化４−フルオロベンジル（４３．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を８０℃で１５時間継続した。反応液に水および酢酸エチルを添加し、水層を２回、酢酸エチルで分離および抽出した。一体化した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール）により単離した。最終化合物１９を無色固体（２１．８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、３１％）として得た。
【００７９】
２−［１−（３，４−ジメチル−ベンジル）−４−イソプロピル−ピペラジン−２−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（化合物例５３）の合成
【化１０】
2014526526.tif 000012
【００８０】
ｒ．  市販されているアセトニトリル（２．５ｍＬ）中の２−（４−イソプロピル−ピペラジン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（１４．７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）に、炭酸カリウム（９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）および塩化３，４−ジメチルベンジル（１３．９ｍｇ、７０％、０．０６ｍｍｏｌ）を室温で添加し、撹拌を室温で１５時間継続した。反応液に水および酢酸エチルを添加し、水層を２回、酢酸エチルで分離および抽出した。一体化した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。純粋な生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール）により単離した。最終化合物２０を無色固体（７．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、３６％）として得た。
【００８１】
この手順に従い、また市販されている２−ベンゾフラン−２−イル−ピペリジンは、化合物例４８および５０に、そして２−ピペリジン−２−イル−ベンゾチアゾールは、化合物例５２に反応させることができる。
【００８２】
生物学的活性
１．  ＬＰＡ活性についての生化学的酵素アッセイ
アッセイは、ＬＰＡ２受容体のそのリガンドＬＰＡによる活性化の際に細胞で発生した細胞内カルシウムを検出する。この一時的なカルシウム流動を、商業的なカルシウム検出キット（例えばMolecular Devicesから）を使用してモニタリングすることができる。かかるキットの主な構成品は染料であり、それはカルシウムが存在する場合には蛍光性になり、−リガンドの試験ウェルへの添加の後の一時的な蛍光シグナルが、結果である。例えばＦＬＩＰＲ(Molecular Devices)などの読取装置を使用して、かかる一時的な「Ｃａ−フラックス」シグナルをモニタリングすることができる。
シグナルを、基線を引いたピーク最大値に従って計算する。
ＬＰＡのアンタゴニストである化合物によって、細胞内カルシウムの低下した流動およびしたがってより低いシグナルがもたらされる。アッセイを、マイクロプレート（プレートあたり３８４ウェル）中で行う。
【００８３】
試薬
細胞培養
培養細胞株                              Ｕ２ＯＳ、組換え発現ＬＰＡ２Ｒ
マッコイ培地                            Invitrogen # 26600-021
ＤＭＥＭ                                Gibco #41965
ペニシリン／ストレプトマイシン          Gibco #15140
ＦＣＳ                                  PAA # A15-043
ジェネティシン                          Invitrogen #10131-027
ＰＢＳ                                  Gibco
ＨＥＰＥＳ                              Gibco #15630-056
ＨｙＱ−Ｔａｓｅ                        HyClone #SV30030.01
【００８４】
アッセイ
１０×ＨＢＳＳ                          Gibco #14065
１ＭのＨＥＰＥＳ                        Merck #1.10110
ＮａＣｌ                                Merck #1.06404
ＫＣｌ                                  Merck #1.04936
ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ                    Merck #1.05886
ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ                    Merck #1.02382
Ｄ（＋）−グルコース×１Ｈ２Ｏ          Merck #1.04074
ＢＳＡ、脂肪酸非含有                    Roche #10 77 58 35 001
リガンド（ＬＰＡ）、１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、                                  Avanti #857130P
プロベネシド、水溶性                    Invitrogen #P36400
検出溶液（カルシウム色素）              Bulk Kit (Molecular Devices #R8141)
マイクロプレート３８４ｂｌｃｋ、ｃｌ底  Falcon # 353692
【００８５】
細胞培養／増殖
培地      マッコイ培地、１０％ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン
培養条件  ３７℃、Ｔ７５フラスコ中５％のＣＯ２
採取      ＰＢＳで洗浄
フラスコあたり１ｍＬＨｙＱ−Ｔａｓｅで剥離
インキュベーション５ｍｉｎ
１０ｍＬの培地の添加
遠心分離
１０ｍＬの培養培地との再懸濁
【００８６】
ＬＰＡ２Ｒ−カルシウムフラックスアッセイプロトコル
アッセイを以下の手順に従って行う：
５０ｕＬの播種細胞（１００００細胞／ウェル、ＤＭＥＭ緩衝液中）
３７℃、１０％ＣＯ２で２４ｈインキュベートする
培地を吸引する
５０ｕＬ、カルシウム色素１×ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液を加える。
３７℃で１ｈインキュベートする（「ローディング」）
ＲＴで１０ｍｉｎ平衡化する。
５ｕＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の化合物を加える。
１０００ｒｐｍで１０秒振盪する
ＲＴで１５ｍｉｎインキュベートする
２０ｕＬ、クレブス緩衝液／ＢＳＡ中のＬＰＡ（FLIPR Tetra中）を加え、測定。
細胞を、ＤＭＥＭ緩衝液（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中に播種する。
色素ローディングを、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍＬの１０×ＨＢＳＳ＋２０ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ＋８８０ｍＬの水、ｐＨ７．４）中で行う。
ＬＰＡを、クレブス／ＢＳＡ緩衝液（１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．６２ｍＭのＭｇＳＯ４、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＤ（＋）−グルコース、０．２％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に加える。
【００８７】
化合物を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）であらかじめ希釈し、それによってアッセイにおける最終的なＤＭＳＯ含量を１％に維持する。化合物を、マイクロプレート上に用量反応系列を発生させるためにあらかじめ希釈する。用量反応系列は、各化合物につき最終３０ｕＭから最終１ｎＭまでの１０の濃度からなる。すべての化合物ウェルから、得られたシグナルを対照ウェル（各プレート上の化合物ウェルの横に配置された）に対して、％活性の点において参照する。
【数１】
2014526526.tif 000013
【００８８】
これらの％活性値から−対応する化合物濃度の変化に従い−ＩＣ５０値を、各化合物について、例えばGraphpad Prismなどの標準的なフィッティングプログラムを使用して当てはめる。ここで、手法「ｌｏｇ（インヒビター）ｖｓ  反応−−変数傾斜」を使用する。
【００８９】
読取装置設定(FLIPR Tetra)
Ｅｘｃ波長：  ４７０＿４９５
Ｅｍ．波長：  ５１５＿５７５
増幅率：      ５０
Ｅｘｐ時間：  ０．４
Ｅｘｃ強度：  ８０
【００９０】
ＴＦでの読取
第１の読取間隔：１．００ｓ
第１の読取の数：２４０
分注前の読取：  １０
第２の読取間隔：１．００ｓ
第２の読取の数：０
保存画像：なし
化合物のＬＰＡ２Ｒに対する阻害能を評価するために、ＩＣ５０値を以下の表１に示すように決定し、それによって以下の区分を使用する：
ＩＣ５０＜０．５μＭ              「＋＋＋＋」
０．５μＭ≦ＩＣ５０≦５μＭ      「＋＋＋」
５μＭ＜ＩＣ５０≦１５μＭ        「＋＋」
ＩＣ５０＞１５μＭ                「＋」
【００９１】
表１
【表２】
2014526526.tif 000014
【表３】
2014526526.tif 000015
【表４】
2014526526.tif 000016
【表５】
2014526526.tif 000017
【表６】
2014526526.tif 000018
【表７】
2014526526.tif 000019
【表８】
2014526526.tif 000020
【表９】
2014526526.tif 000021
【表１０】
2014526526.tif 000022
【表１１】
2014526526.tif 000023
【表１２】
2014526526.tif 000024
【表１３】
2014526526.tif 000025
【表１４】
2014526526.tif 000026
【表１５】
2014526526.tif 000027
【表１６】
2014526526.tif 000028
【表１７】
2014526526.tif 000029
【表１８】
2014526526.tif 000030
【表１９】
2014526526.tif 000031
【表２０】
2014526526.tif 000032
【表２１】
2014526526.tif 000033
【表２２】
2014526526.tif 000034
【表２３】
2014526526.tif 000035
【表２４】
2014526526.tif 000036
【表２５】
2014526526.tif 000037
【表２６】
2014526526.tif 000038
【表２７】
2014526526.tif 000039
【表２８】
2014526526.tif 000040
【００９２】
（１）ＨＰＬＣ手法（非極性）
溶媒Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．０８％ＴＦＡ
流量：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
勾配：  ０．０  ｍｉｎ  ２０％Ｂ
５．０  ｍｉｎ  １００％Ｂ
５．５  ｍｉｎ  １００％Ｂ
６．０  ｍｉｎ  ２０％Ｂ
６．５  ｍｉｎ  ２０％Ｂ
カラム：Chromolith Performance RP18e 100-3
（２）ＨＰＬＣ手法（極性）
溶媒Ａ：水＋０．０５％ギ酸
溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
流量：２．４ｍｌ／ｍｉｎ  波長：２２０ｎｍ
勾配：  ０．０  ｍｉｎ  ４％Ｂ
２．８  ｍｉｎ  １００％Ｂ
３．３  ｍｉｎ  １００％Ｂ
３．４  ｍｉｎ  ４％Ｂ
カラム：Chromolith Speed ROD RP18e 50-4.6 mm
（３）ＨＰＬＣ／ＭＳ
溶媒Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ
流量：２ｍｌ／ｍｉｎ  波長：２５４ｎｍ
勾配：  ０  ｍｉｎ  ５％Ｂ
８  ｍｉｎ  １００％Ｂ
８．１  ｍｉｎ  １０％Ｂ
カラム：Chromolith Speed ROD RP18e 50-4.6 mm
（４）例番号１１、１２、４３、５３、７７、７８および８０は意図的に省略した。
【国際調査報告】
2014526526.tif 000045
2014526526.tif 000046
2014526526.tif 000047
2014526526.tif 000048