(57)【要約】  ＡＤＡＭ１０などのセクレターゼによるＴａｕタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含む、神経変性状態に関連するペプチド断片を定量するためのバイオアッセイの方法であって、血液由来の試料を、前記ネオエピトープに特異的な抗体と接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの前記試料中のペプチド断片に対する結合レベルを決定するステップとを含む、方法。ネオエピトープを含むペプチドのレベルは、認知機能と逆相関を示すことが見出されている。
2014522643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セクレターゼによるタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片を定量するためのバイオアッセイの方法であって、前記方法が、前記ペプチド断片を含む試料を、前記ネオエピトープに特異的な結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの前記試料中のペプチド断片に対する結合レベルを決定するステップとを含み、前記タンパク質が、Ｔａｕタンパク質である、方法。
【請求項２】
前記免疫学的結合パートナーが、Ｔａｕタンパク質のＣ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に特異的な結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫学的結合パートナーが、Ｔａｕタンパク質のＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に特異的な結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、Ｔａｕ−Ａである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ネオエピトープが、ＡＤＡＭ１０またはＢＡＳＥ−１によるＴａｕタンパク質の切断によって形成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫学的結合パートナーが、以下に示すＴａｕ部分配列：
【表１Ａ】
2014522643.tif 000021
【表１Ｂ】
2014522643.tif 000022
【表１Ｃ】
2014522643.tif 000023
【表１Ｄ】
2014522643.tif 000024
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれか１つを生成するプロテアーゼによるＴａｕタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片に特異的な結合親和性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＮ末端における以下の配列：
【表２Ａ】
2014522643.tif 000025
【表２Ｂ】
2014522643.tif 000026
【表２Ｃ】
2014522643.tif 000027
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれかに特異的な結合親和性を有する、
または、ペプチドのＣ末端における以下の配列：
【表３Ａ】
2014522643.tif 000028
【表３Ｂ】
2014522643.tif 000029
【表３Ｃ】
2014522643.tif 000030
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれかに特異的な結合親和性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＮ末端における以下の配列：ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）に特異的な結合親和性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫学的結合パートナーが、特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫学的結合パートナーおよび競合物質を前記試料の存在下でインキュベートし、前記競合物質を前記試料中の前記ペプチド断片と競合させて、前記免疫学的結合パートナーに結合させる競合的イムノアッセイとして行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記競合物質が、合成ペプチドである、または前記ネオエピトープが出現するように前記エピトープの元となるタンパク質を切断することによって形成された精製された天然ペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記競合物質が、Ｎ末端配列ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）を含むペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、尿、血清、血液、血漿または唾液試料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、患者由来の試料であり、前記方法が、前記ペプチド断片の前記決定された結合レベルを、（ａ）比較可能な健康な個体および／または（ｂ）病理学的な神経変性状態に特徴的な値と比較するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔａｕタンパク質のセクレターゼ切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープに対する免疫学的結合パートナー。
【請求項１６】
アミノ酸配列：
【表４Ａ】
2014522643.tif 000031
【表４Ｂ】
2014522643.tif 000032
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれか１つのＮ末端、
または、アミノ酸配列：
【表５Ａ】
2014522643.tif 000033
【表５Ｂ】
2014522643.tif 000034
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれか１つのＣ末端と特異的に免疫反応性である、請求項１５に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１７】
モノクローナル抗体またはその結合断片である、請求項１５または１６に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１８】
請求項１７に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
【請求項１９】
請求項６に記載の前記Ｔａｕタンパク質の部分配列のいずれか１つの末端における、セクレターゼによるＴａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドに対する免疫応答を起こすためのハプテンとして担体にコンジュゲートした、あるいはイムノアッセイに使用するために固体表面に固定した、または、検出可能なマーカーにコンジュゲートした、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
請求項６に記載の前記Ｔａｕタンパク質の部分配列のいずれか１つにおいて、セクレターゼによる前記Ｔａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２２】
請求項６に記載の前記タンパク質の部分配列のいずれか１つにおいて、セクレターゼによる前記Ｔａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現をコードする発現シグナルとコード配列とを含む核酸配列を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターで形質転換され、前記ペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーと結合する競合物質と、任意選択的に、洗浄試薬、緩衝液、停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、較正標準、抗マウス抗体、および前記キットを用いたアッセイを行うための説明書のうちの１つ以上とを含むイムノアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性状態または神経変性のバイオマーカーの開発に関し、より詳細には、治療計画に対する応答を示す生化学的マーカーを含む、アルツハイマー病および病気発症の予後を診断するのに有用な生化学的マーカーを検出するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、しばしばアルツハイマーとも称され、主として６５歳より高齢の人々に影響を与える、進行性の、最終的には死に至る神経学的状態である。世界的に、推定３億５６００万人の人がＡＤに罹っており（２００９年）、その数は、２０年毎に２倍なると予想される。米国だけでも、ＡＤにかかるコストは、年間１４８０億ドルを超えており、その金額は、世界規模では３２００億ドルを超え［３］、認知症（そのうち５０〜７５％のケースがＡＤである）のケアにかかるコストを比較したところ、そのコストは癌および心疾患のケアにかかるコストよりも明らかに高く、このことから、ＡＤは、個人の観点からも健康管理の観点からも深刻な社会的負担であることがわかる。アルツハイマー病の経過は個人個人で異なるが、共通の症状があり、そのうち最も初期は認知に関するものであり、しばしば加齢またはストレスに起因するものと誤って認識される［３７］。初期症状としては、短期記憶の衰えが挙げられ、疑わしい場合は、行動評価および認知テストが行われ、可能性がある場合は、診断を強固なものにするために脳のＭＲスキャンが行われる［３７］。病気が進行するにつれ、症状としては、錯乱、興奮および攻撃性、言葉の崩壊、長期持続記録の損失などの一連の神経学的な問題が挙げられ、それにより個体は内向的になる［２］。最終的に身体機能が崩壊し始め、最後には死に至り、診断後の平均余命はおよそ７年である［２、２８］。
【０００３】
ＡＤをよりよく治療し理解することに関する主な問題は、病気の発症初期がはっきりしないため、ＡＤが完全に明らかになり診断がなされるまで数年進行してしまうことが多いことである［１３］。さらにほとんどの場合、ＡＤの症状を有する個体は、一般的には、症状を引き起こす可能性のあるその他の原因が除外されたときだけ、病気の「可能性がある」罹患者と診断される。知的機能テストの使用により診断基準は標準化されてきているが、ＡＤは、病理解剖でしか確実に診断できないと一般に認識されている［２７］。
【０００４】
近年の研究によれば、イメージング技術に加えて生化学的マーカーを用いることで、ある程度の発展がなされたことが示されている。しかしながら、これらのアプローチは、それでもなおさらなる特徴付けおよび確認を要するため、発症の初期段階における感度が欠如していることによりしばしば限定的である［２４、３３、３４、３８、３９］。
【０００５】
現在用いられている治療は、わずかな一時的な緩和効果しかなく、見込みのあるＡＤ治療法を同定するために５００回を超える臨床試験が行われても、これまでに誰も治療可能性を確認していない事実からも説明されるように、進行を遅延または予防する能力による治療は、熱望されており利用価値の高いものである［１］。これらのデータ、加えて確立されたＡＤバイオマーカーがないことから明らかに示されるように、病気の発症、進行、および治療応答などのＡＤの重要な局面をより正確に反映することができるバイオマーカーの開発への投資が必要である。
【０００６】
アルツハイマーのリスク評価は、ＡＰＯＥε４変異体が関与するケースを除き不可能に近い［８］。さらに、試験薬物の有効性をモニターすることは可能であるが、全体的なＡＤの病理学というよりも薬物の作用機序に直接的に関連付けられることが多い［８］。
【０００７】
ＡＤ個体の脳組織の解析によれば、主に２つの重要な現象、すなわちベータアミロイド（Ａβ）を含む斑の形成と、Ｔａｕタンパク質の修飾型を含む神経原線維のもつれの形成［１０］とを示す細胞外マトリックスのリモデリング障害が強調されている［１２］。これらの過程はいずれも病気の進行に大いに関連しており、興味深いことに、斑中のＡβの堆積は、実際のニューロン損傷よりも先に起こるが［３０］、神経原線維のもつれの形成開始にかかわっており［３２］、これが、神経細胞死の主な原因のようである［５、１８］。ＡＰＰは、多くの組織で発現される内在性膜タンパク質であり、ニューロンのシナプスで濃縮される。ＡＰＰの基本的な機能は知られておらす、ＡＰＰは、最も一般的には、３９〜４２個のアミノ酸からなるペプチドであるベータアミロイド（Ａβ）の前駆体分子として研究されており、このベータアミロイドは、繊維状アミロイドの形態で存在する場合、アミロイド斑の主成分である［１０］。Ａβは、２種類のタンパク質分解による切断によって生産され、第一の切断は、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ−１）によってなされ、第二の切断は、γ−セクレターゼによってなされる。これらの連続的な生化学的現象は、Ａβ形成に必須である［１０］。さらに、その他の酵素的な切断、例えばＡＤＡＭ１０（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）１０）およびプレセニリン−１による切断、加えてその他のタイプのＡＰＰの翻訳後修飾により、修飾されたペプチド断片が生成し、この臨床的有意性はまだ完全に解明されていないが、このような断片は病気の進行に関与することが予想される［１０、１１、１９、２５、４０］。
【０００８】
Ｔａｕタンパク質は、微小管を安定化するタンパク質であり、Ｔａｕタンパク質は、中枢神経系のニューロン中に非常に豊富に存在するがＣＮＳ以外にはほとんど存在せず、さらにＴａｕは、ＡＤにおける神経原線維のもつれの形成における重要な構成要素である［１０］。さらに、Ｔａｕにおける突然変異は、タウオパチーと称される一群の神経変性障害に関連するが、Ｔａｕタンパク質の変化を伴う最も一般的な病気はＡＤである［１０、１７］。リン酸化および酵素的な切断などの翻訳後修飾は、Ｔａｕの微小管を安定化させる能力を調節して、神経原線維のもつれを形成し、加えて小さい毒性タンパク質凝集体も形成する可能性があり、このような凝集体は、神経細胞死およびそれによる病気の進行に寄与する可能性がある［１０、１９］。ｔａｕタンパク質をコードするＭＡＰＴ（微小管結合タンパク質Ｔａｕ）遺伝子は、１６個のエキソンを含む第１７染色体ｑ２１に存在している。ヒト脳における主要なｔａｕタンパク質は、１１個のエキソンによってコードされている。エキソン２、３、および１０がオルタナティブスプライシングされることにより、６つの組み合わせが生じる（２−３−１０−、２＋３−１０−、２＋３＋１０−、２−３−１０＋、２＋３−１０＋、２＋３＋１０＋）。従って、ヒト脳において、ｔａｕタンパク質は、アミノ酸を３５２〜４４１個の範囲で含む６種のアイソフォームのファミリーによって構成される。これらのアイソフォームは、Ｎ末端部分（エキソン２および３）に２９個のアミノ酸のインサートを０、１または２個有すること、およびエキソン１０が欠失したＣ末端部分に３または４つの反復領域を有する点で異なる。従って、ＣＮＳにおいて最長のアイソフォームは、４つの反復（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４）と２つのインサート（合計で４４１個のアミノ酸）とを有し、一方で最も短いアイソフォームは、３つの反復（Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４）を有し、インサートを有さない（合計で３５２個のアミノ酸）［２０］。ＭＡＰＴ遺伝子は、２つのハプログループ、Ｈ１およびＨ２を有し、その遺伝子は、逆方向を向いているようである。ハプログループＨ２は、欧州において、および先祖が欧州系の人々においてのみ一般的である。ハプログループＨ１は、アルツハイマー病などの所定の認知症の発生率の増加と関連があるようである。これらのアイソフォームはいずれもニューロンに見出されるが、アルツハイマー病の病理にそれぞれのアイソフォームがどの程度の役割を果たしているのかは明らかではない［２０］。
【０００９】
Ｔａｕプロセシングに関与する酵素としては、カスパーゼ、トロンビン、加えて、ＭＭＰなどのニューロンにおける組織代謝に高い関連があるその他のプロテアーゼが挙げられる［４、１０、１０、１４、１５、１９、２６、２９、３１］。しかしながら本発明は、さらなる酵素群、すなわちセクレターゼに関する。
【００１０】
セクレターゼには３つのタイプ、すなわちα、β、およびγ−セクレターゼがある［１０］。セクレターゼと称される酵素は、古典的には細胞外におけるタンパク質切断との関連が示されており、アルツハイマーについては、主にアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の切断、それによるアミロイド斑形成の主要な決定因子のアミロイドβ生成との関連が示されている［１０］。これらのカテゴリーは、セクレターゼがＡＰＰを切断するタンパク質中の部位によって定義されるが、病理学的な関連性に関して、３つのタイプのセクレターゼのいずれかの機能に障害があると、アルツハイマーのような病理を引き起こすことがわかっている［１０、１１、３５、３６］。酵素の一覧としては、以下が挙げられる：
α−セクレターゼ、例えばＡＤＡＭ９、１０、１７（ＴＡＣＥ）、１９、およびＢＡＣＥ２
β−セクレターゼ、例えばＢＡＣＥ１および２
γ−セクレターゼ複合体：プレセニリン１および／または２、ニカストリン、Ａｐｈ−１ａ、Ａｐｈ１ｂ、ならびにＰｅｎ−２。
【００１１】
これらの酵素の役割はセクレターゼとして説明されてきたため、これらの酵素のＴａｕ分解能はこれまでに評価されてこなかった。しかしながら、Ｔａｕは、アルツハイマー病が進行する間にかなりプロセシングされていることがよく知られている［１４、１５、１７、２６、２９］。Ｔａｕを切断することがわかっており、このことから神経細胞死の誘導に関与することが示されている酵素としては、カスパーゼファミリーおよびカルパインが挙げられ、これらの酵素でＴａｕを処理すると、よく説明された一連の断片の生成が起こることから、このような酵素は神経細胞死を引き起こすという仮説が立てられている［１０、３２］。
【発明の概要】
【００１２】
ここで本発明者らは、セクレターゼが介在するＴａｕの切断により断片が生成し、このような断片が、アルツハイマー病のバイオマーカーとして使用できるという可能性を調査した。
【００１３】
ここで本発明は、第一の態様において、セクレターゼによるタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片を定量するためのバイオアッセイ方法であって、前記方法が、前記ペプチド断片を含む試料を、前記ネオエピトープに特異的な結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの前記試料中のペプチド断片に対する結合レベルを決定するステップとを含み、前記タンパク質が、Ｔａｕタンパク質である、方法を提供する。
【００１４】
Ｔａｕタンパク質は、あらゆる哺乳動物由来のものであってもよく、このような動物としては、げっ歯類、例えばマウスまたはラットが挙げられ、さらにイヌまたはサルも挙げられるが、好ましくはヒトである。
【００１５】
ネオエピトープは、好ましくは、カスパーゼファミリーおよび／またはカルパインによるＴａｕの切断によって形成されたものではないネオエピトープである。
【００１６】
任意選択的に、前記免疫学的結合パートナーは、Ｔａｕタンパク質のＣ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に特異的な結合親和性を有する。あるいは前記免疫学的結合パートナーは、Ｔａｕタンパク質のＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に特異的な結合親和性を有する。
【００１７】
Ｔａｕタンパク質は、Ｔａｕ−Ａ、またはＴａｕファミリーの他のあらゆるメンバーであってよい。ネオエピトープは、２種以上または全てのＴａｕタンパク質に共通していてもよい。
【００１８】
ネオエピトープは、好ましくは、ＡＤＡＭ１０またはＢＡＳＥ−１によるＴａｕタンパク質の切断によって形成されてもよい。ネオエピトープは、１種または複数のセクレターゼによって形成されてもよい。
【００１９】
前記免疫学的結合パートナーは、好ましくは、以下に示すヒトＴａｕ部分配列（表１）：
【表１Ａ】
2014522643.tif 000003
【表１Ｂ】
2014522643.tif 000004
【表１Ｃ】
2014522643.tif 000005
【表１Ｄ】
2014522643.tif 000006
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれか１つを生成するプロテアーゼによるＴａｕタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片に特異的な結合親和性を有する。
【００２０】
前記免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列（表２）：
【表２Ａ】
2014522643.tif 000007
【表２Ｂ】
2014522643.tif 000008
【表２Ｃ】
2014522643.tif 000009
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれかに特異的な結合親和性を有していてもよく、またはペプチドのＣ末端における以下の配列（表３）：
【表３Ａ】
2014522643.tif 000010
【表３Ｂ】
2014522643.tif 000011
（表中、Ｍは酸化されたメチオニンを示す）
のいずれかに特異的な結合親和性を有していてもよい。
【００２１】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における配列ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）に特異的な結合親和性を有する。
【００２２】
前記免疫学的結合パートナーは、特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片であってもよい。
【００２３】
前記方法は、前記免疫学的結合パートナーおよび競合物質を前記試料の存在下でインキュベートし、競合物質を、試料中のペプチド断片と競合させて、免疫学的結合パートナーに結合させる競合的イムノアッセイとして行ってもよい。前記競合物質は、合成ペプチドであってもよいし、または、前記ネオエピトープが出現するように前記エピトープの元となるタンパク質を切断することによって形成された精製された天然ペプチドであって、特に、Ｎ末端における配列ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）を含むペプチドであってもよい。
【００２４】
試料は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、イヌまたはサルの試料であってもよいが、特にヒトの髄液、尿、血清、血液、血漿または唾液試料であってもよい。試料は、患者由来の試料であってもよく、前記方法は、前記ペプチド断片の前記決定された結合レベルを、（ａ）比較可能な健康な個体および／または（ｂ）病理学的神経変性状態、特にアルツハイマーに特徴的な値と比較するステップをさらに含む。測定されたレベルは、同じ患者から得られた前の測定値と比較してもよい。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、セクレターゼによるＴａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープに対する免疫学的結合パートナーを含む。免疫学的結合パートナーは、表２に記載のアミノ酸配列のいずれか１つのＮ末端または表３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つのＣ末端と特異的に免疫反応性であってもよい。
【００２６】
免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体またはその結合断片であってもよい。本発明は、このようなモノクローナル抗体または結合断片を産生する細胞株を含む。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、表１に記載の前記Ｔａｕタンパク質の部分配列のいずれか１つの末端における、セクレターゼによるＴａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドを含む。前記ペプチドは、前記ペプチドに対する免疫応答を起こすためのハプテンとして担体にコンジュゲートしてもよいし、あるいはイムノアッセイに使用するために固体表面に固定してもよいし、または検出可能なマーカーにコンジュゲートしてもよい。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、表１に記載の前記Ｔａｕタンパク質の部分配列のいずれか１つ中の、セクレターゼによる前記Ｔａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２９】
よりさらなる態様において、本発明は、表１に記載の前記タンパク質の部分配列のいずれか１つ中の、セクレターゼによる前記Ｔａｕタンパク質の切断によって形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現をコードする発現シグナルとコード配列とを含む核酸配列を含むベクターを提供する。
【００３０】
よりさらなる態様において、本発明は、上述したベクターで形質転換され、前記ペプチドを発現する宿主細胞を提供する。
【００３１】
よりさらなる態様において、本発明は、上述した免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーと結合する競合物質と、任意選択的に洗浄試薬、緩衝液、停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、較正標準、抗マウス抗体、および前記キットを用いたアッセイを行うための説明書のうちの１つ以上とを含むイムノアッセイキットを提供する。
【００３２】
添付の図面を参照しながら、本発明をさらに説明し図説する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】０、０．７８２、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍＬの濃度で選択ペプチドまたは伸長ペプチドのいずれかを用いた標準曲線の例を示すグラフである。
【図２】対照またはＴｇ４５１０マウス（アルツハイマー病モデル）のいずれかから抽出された脳で測定された競合的ＥＬＩＳＡ試験の結果を示すグラフである。
【図３】野生型およびＴｇ４５１０マウスからの脳抽出物を比較したウェスタンブロットを示す図である。右：未切断のＴａｕ（ＭＡＢ３４２０  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を認識する抗体を用いて行われたウェスタンブロットである。右：自社製の抗体（ＮＢ１９１）を用いて行われたウェスタンブロットである。
【図４】ＣＳＦおよび血清試料中のＡＤＡＭ１０によって生成したＴａｕ断片のレベルの相関を示すグラフであり、これは、Ｔａｕ断片が、両方の試料においてモニターが可能なことを示す。
【図５】Ｔａｕ断片は年齢とは相関するがＢＭＩとは相関しないことを示すグラフである。
【図６】女性における重度のアルツハイマーの進行を追跡するための、Ｔａｕ断片レベルの能力を示すグラフである。
【図７Ａ−Ｆ】Ｔａｕ−Ａアッセイを特徴付け、その生物学的バリデーションを示す実施例２の結果を示す図である。  Ａ）０、０．５９、１．１７、２．３４、４．６９、９．３８、１８．７５、３７．５、７５、１５０、および３００ｎｇ／ｍｌの濃度で選択ペプチドまたは伸長ペプチドのいずれかを用いた標準曲線。Ｂ）インビトロでのＴａｕ消化におけるＴａｕ−Ａ断片の測定。Ｃ）抽出された組織のウェスタンブロット。Ｄ）ＡＤＡＭ１０の存在下または非存在下における脳抽出物のＥＬＩＳＡ測定。Ｅ）ＥＬＩＳＡを用いて測定された、対照またはＴｇ４５１０マウス（アルツハイマー病モデル）のいずれかから抽出された脳におけるＴａｕ−Ａレベル。Ｆ）野生型およびＴｇ４５１０マウスからの脳抽出物を比較するウェスタンブロット。左：未切断のＴａｕ（ＭＡＢ３４２０  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を認識する抗体を用いてを行われたウェスタンブロット。右：自社製の抗体（ＮＢ１９１）を用いてを行われたウェスタンブロット。
【図８】Ｔａｕ−Ａレベルの病理学的に関連する変化を示すグラフであり、これにより、Ｔａｕ−ＡとＭａｔｔｉｓ認知症評価スケール（ＭＤＲＳ）との逆相関が実証される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下の実施例において本発明をさらに説明し例示する。
【実施例１】
【００３５】
＜インビトロでの切断＞
活性化ＡＤＡＭ１０またはＢＡＣＥ１のいずれかを用いて組換えＴＡＵを切断した。セクレターゼ緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）中で１００μｇおよび１μｇの酵素（ＡＤＡＭ１０またはＢＡＣＥ１）を３日間混合することによってプロテアーゼによる切断を行った。最後に、切断を、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）銀染色キット（カタログ番号ＬＣ６１００、インビトロｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ、ＵＳＡ）を製造元の説明書に従って用いて可視化することにより確認した。
【００３６】
＜ペプチドの同定＞
マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）および、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて、インビトロ切断試料中のペプチド断片を同定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料を、Ｃ１８ジップチップ（カタログ番号ＺＴＣ１８ＳＯ２４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を仕様書に従って用いて精製し、０．１μｇの材料を、ＭＴＰ３８４研削スチール製ターゲットプレート（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に溶出させた。ＭＡＬＤＩタンデムの質量スペクトルを、ＢｒｕｋｅｒのウルトラフレックスＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に陽イオンリフレクターモードで記録した。質量スペクトルを、ウシβ−ラクトグロブリンをトリプシン消化することにより生成したペプチドを用いて８００〜４０００ｍ／ｚの範囲に外部較正した。ｍ／ｚソフトウェア「Ｆｌｅｘａｎａｌｙｓｉｓ」（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスペクトルを解析した。ＬＣＭＳ試料を限外濾過して、１０ｋＤａより大きいタンパク質を除去し、ギ酸を用いてｐＨを２．０に調節し、４μＬの試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。ＬＣを、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）で、ギ酸／アセトニトリルの濃度勾配を用いて行った。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、Ｓｙｎａｐｔ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ四重極型飛行時間型質量分析計（ＱＵＡＤ−ＴＯＦ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）で、３５０〜１６００ｍ／ｚ（ＭＳ）および５０〜２０００ｍ／ｚ（ＭＳ／ＭＳ）の捕捉範囲で行った。ソフトウェア「ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  ＳＥＲＶＥＲ（ＰＬＧＳ）」（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてスペクトルを解析し、ピークのリストを得た。ペプチドを同定するために、Ｍａｓｃｏｔ２．２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦまたはＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ設定のいずれかで用いて、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータをＴａｕ（ＦＡＳＴＡ）タンパク質データベースで検索した。
【００３７】
以下のペプチド断片を同定した。
Ｍは酸化されたメチオニンを示す。
Ｔａｕ＋ＢＡＣＥ１
【表４】
2014522643.tif 000012
Ｔａｕ＋ＡＤＡＭ１０
【表５Ａ】
2014522643.tif 000013
【表５Ｂ】
2014522643.tif 000014
【表５Ｃ】
2014522643.tif 000015
【００３８】
＜免疫化のためのペプチドの選択＞
ＭＳによって同定された配列それぞれの遊離末端の最初の６個のアミノ酸を、対象のプロテアーゼによって生成したネオエピトープとみなした。得られた全てのプロテアーゼによって生成した配列を相同性および他の切断部位への距離に関して解析し、続いてＮＰＳ＠：ネットワークタンパク質配列解析を用いて相同性に関してＢＬＡＳＴ解析を行った。
【００３９】
＜試薬およびペプチド＞
全ての試薬は、ＭｅｒｃｋおよびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社から得た標準的な高品質の化学物質であった。モノクローナル抗体生産および確認に用いられた合成ペプチドは、（ａ）免疫原性ペプチド：ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ−ＧＧＣ−ＫＬＨ（配列番号２４８−ＫＬＨ）（キーホール−リンペット−ヘモシニアン）、（ｂ）スクリーニングペプチドＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）、（ｃ）Ｎ末端で１つのアミノ酸を伸長させた除外ペプチドＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４７）（これは、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａから購入した）であった。ペプチドのコンジュゲート試薬を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって生産した。
【００４０】
＜ＥＬＩＳＡに用いられた緩衝液＞
コーティングのペプチドを溶解させるのに用いられた緩衝液は、以下のもの、すなわち（１５０ｍＭトリズマ、１％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、０．３６％ブロニドックスＬ５、ｐＨ８．０（トリスＢＴＢ）で構成され、反応停止緩衝液は、０．１％Ｈ２ＳＯ４で構成された。
【００４１】
アッセイの開発に用いられたＥＬＩＳＡプレートを、Ｒｏｃｈｅのストレプトアビジン（カタログ：１１９４０２７９）でコーティングした。全てのＥＬＩＳＡプレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ、（ＣＡ、ＵＳＡ）のＥＬＩＳＡリーダーで解析した。
【００４２】
＜ＥＬＩＳＡの開発＞
モノクローナル抗体開発の方法は、これまでに説明された通りである（［６］。簡単に言えば、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に２００μｌの乳化した抗原および５０μｇのＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ−ＧＧＣ−ＫＬＨ（配列番号２４８−ＫＬＨ）を入れることにより免疫化した。安定な血清抗体価レベルに達するまでフロイント不完全アジュバント中で２週間の間隔で連続的に免疫化し、２回目の免疫化後のマウスから採血した。採血ごとに血清抗体価を検出し、最高の抗血清抗体価を示したマウスを融合用に選択した。選択されたマウスを１ヶ月安静にさせ、続いて、細胞融合のために脾臓を取り出す３日前に、１００μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液中の５０μｇのＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ−ＧＧＣ−ＫＬＨ（配列番号２４８−ＫＬＨ）で静脈内に追加免疫した。
【００４３】
＜融合＞
骨髄腫細胞としてＳＰ２／０を用いて、これまでに説明されている融合法［１６］を行った。半固形培地を用いる方法で、融合細胞を３５ｍｍの細胞培養皿中でクローニングし、培養皿をＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。続いてクローンを１６個の９６ウェルマイクロタイタープレートで平板培養し、３日間そのままにし、続いて培養上清をスクリーニングした。
【００４４】
＜抗体のスクリーニング＞
競合ＥＬＩＳＡの設定で上清をスクリーニングした。選択ペプチドとしてペプチドＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）を用い、伸長ペプチドとしてＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４７）を用いた。選択ペプチドに特異的であり、伸長ペプチドに対する交差反応性がない細胞株を選択し、抗体を精製した。
【００４５】
＜Ｔａｕ−Ａ  ＥＬＩＳＡの手順＞
予備実験において、本発明者らは、数々の交差力価解析を行うことによって試薬、それらの濃度、およびインキュベート期間を最適化した。Ｔａｕ−Ａ  ＥＬＩＳＡを以下のように開発した。ストレプトアビジンで予めコーティングした９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートをさらに、トリスＢＴＢ緩衝液中に溶解させた６ｎｇ／ｍｌの合成ペプチドＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ−ビオチン（配列番号２４６−ビオチン）で、２０℃で３０分、３００ｒｐｍで一定して振盪することによりコーティングした。プレートを洗浄緩衝液中で５回洗浄し、２０μｌの試料を添加し、続いて１００μｌのペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトｍＡｂ−Ｔａｕ−Ａ溶液（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。プレートを、１００ｍＭトリスＢＴＢ緩衝液中で、３００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で１時間インキュベートした。
【００４６】
再度プレートを５回洗浄し、続いて１００μｌのテトラメチルベンジニジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｎｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ４３８ＯＨ）を添加した。プレートを暗所で１５分インキュベートし、３００ｒｐｍで振盪した。反応を止めるために、１００μｌの停止溶液（９５〜９７％Ｈ２ＳＯ４、Ｍｅｒｃｋカタログ番号：１．００７３１）を添加し、ＥＬＩＳＡリーダーで、４５０ｎｍでプレートを解析し、参照として６５０ｎｍを使用した。
【００４７】
＜標準＞
標準曲線を、ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ−ビオチン（配列番号２４６−ビオチン）の連続希釈によって得た。標準濃度は、０、０．７８２、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍｌであった。
【００４８】
＜抗体の天然の反応性を試験するための試料＞
アッセイの開発および確認に、様々な年齢および性別の健康な成人の対象の血清を用いた。血清試料は、２３〜４５歳の若い健康な志願者から得た。本発明者らはまた、種間の交差反応性のレベルを決定するために、マウスおよびラットなどの異なる種の血清試料も試験した。最後に、本発明者らはまた、髄液（ＣＳＦ）および血漿試料も試験した。
【００４９】
＜動物試料＞
５月齢の５匹の野生型マウスおよび５匹のＴｇ４５１０タウオパチーマウスの急速冷凍した脳［９］を以下のプロトコールに従って抽出した。
【００５０】
Ｂｅｓｓｍａｎ粉砕機を用いて組織を粉砕して、重さを量った。抽出緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５％グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤（カタログ番号０５  ０５６  ４８９００１）、最終ｐＨ８．３）１ｍＬあたり２５０ｍｇの組織を用いて、組織を抽出した。溶解産物を超音波破砕で透明化し、４℃／５分／１００００ｒｐｍで遠心分離した後に上清を回収した。ＢｉｏＲａｄのＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用いてタンパク質濃度を決定した。
【００５１】
＜ウェスタンブロッティング＞
１００μｇの各抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。［２３］で説明されているようにして、ゲルを泳動し、試料をニトロセルロースメンブレンに移した。スキムミルク粉末を含むＴＢＳ−Ｔ中で１００ｎｇ／ｍＬに希釈した一次抗体とインキュベートすることによって、Ｔａｕ−Ａ断片および全Ｔａｕタンパク質のレベルを検出した［２２］。続いて、これまでに説明されているようにしてホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートマウスＩｇＧを認識する二次抗体を用いて、最後に増強した化学発光を用いてブロットを可視化した［２１］。
【００５２】
＜ヒト試料＞
２セットのヒト試料を用いた。１つのセット（５１試料）は、変形性関節症研究の血清試料のコレクションであり、この研究は、１８〜７５歳の参加者、加えて肥満指数データを含んでいた［７］。
【００５３】
第二のセットの試料は、重度のアルツハイマー病患者の一対の血清およびＣＳＦ試料であった。これらの試料は、基準時および経過観察時（１８ヶ月後）に、同じ個体で回収された試料のサブセットを含んでいた。
【００５４】
＜統計的分析＞
アッセイを確認するために、検量線に４つのパラメーターのロジスティック回帰を適用して、光学密度を分析物濃度に対してフィッティングした。全ての標準および試料について、平均、標準偏差、パーセンテージ変動係数（％ＣＶ）、および理論値からの差を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量データを解析した。ガウス分布を仮定するのではなくスチューデントの対応のない両側ｔ検定を用いて平均間の有意差を決定した。線形回帰を用いて、血清Ｔａｕ値と研究されたその他の変数との相関を解析した。データを平均±標準誤差として示し、ｐ値が０．０５またはそれより低い場合に平均および差を有意とみなした。
【００５５】
［結果］
＜ＥＬＩＳＡの技術的な詳細＞
脾臓および骨髄腫細胞の融合の後に生成した抗体産生クローンから、アッセイで最も良い天然型の反応性、親和性、および安定性を示した抗体を選択した。抗体精製およびそれに続くＥＬＩＳＡの開発のために選択されたクローンは、ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ（配列番号２４６）に対して発生したＮＢ１９１−３Ｃ４であった。
【００５６】
＜標準曲線および回収＞
図１に典型的な標準曲線を示したが、これは、０、０．７８２、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍＬのペプチド濃度に基づいて試料濃度を決定するための、選択された標準および４つのパラメーターでフィッティングした方程式を示す。加えて、抗体の特異性は、まったく反応を示さなかった同じ濃度の伸長ペプチドとの比較により示される。
【００５７】
異なる試料における希釈による直線性または回収率の決定は、以下の通りの結果であった。希釈された試料１＋１、１＋２、１＋３、１＋４、１＋５、１＋６、および１＋７から希釈されていない試料に逆算することにより決定された平均回収率は、１００％に近く、推奨される±１０％の範囲内であった（データ示さず）。
【００５８】
＜アルツハイマーマウスおよびその対照からの脳の分離＞
Ｔｇ４５１０マウスおよびそれに対応する対照から抽出された脳をＮＢ１９１−３Ｃ４  ＥＬＩＳＡの構成で測定することによって、それらを評価した。図２でみられるように、極めて明確な分離が観察され、すなわちＴｇ４５１０は、対応する対照と比較して１０倍高いレベルのＴａｕ−Ａを示した。加えて、ウェスタンブロットを行ったところ、図３でみられるように、Ｔｇ４５１０マウスは、極めて高いレベルのＴａｕ−Ａを示したが、対照マウスは、等量のタンパク質をローディングしたとしても極めてわずかなレベルのＴａｕ−Ａしか示さなかった（データ示さず）。その他の再度の精査でも、この病理におけるＴａｕ凝集と相関するＴｇ４５１０において高分子量バンドの強度はより強かったが、全Ｔａｕに対する抗体を用いたブロットは、全Ｔａｕでほぼ同じレベルを示した。
【００５９】
＜Ｔａｕ−ＡのＣＳＦおよび血清レベルの相関＞
ＣＳＦと血清の組み合わせ試料３３個について、本発明者らは、２つの分析物においてＴａｕ−Ａレベルの相関があるかどうかについて調査した。図４でみられるように、両方の分析物おいて有用なレベルのＴａｕ−Ａが検出され、顕著ではないが適度な相関が観察された。
【００６０】
＜Ｔａｕ−Ａは年齢とは相関するが肥満指数とは相関しない＞
ＯＡ研究の血清試料において、本発明者らは、Ｔａｕ−Ａレベルの評価を年齢および肥満指数との相関に関して行った。ここで（図５）本発明者らは、年齢とは正相関を示す傾向があるが、ＢＭＩとは相関しないことを見出した。これらのデータから、Ｔａｕ−Ａは、アルツハイマー病のマーカーとして加齢に伴って増加することが示される。
【００６１】
＜病気の進行の指標＞
アルツハイマーのコホートの血清試料のサブセットは、基準時および１８ヶ月後に回収された試料であった。これらのデータは女性のもののみであるが、図６では、これらの７人の女性において、基準時から経過観察時にかけてＴａｕ−Ａレベルが増加していることが強く示されており、従って、アルツハイマーの進行は連続的な過程であることがよく知られているように、Ｔａｕ−Ａは、病気が進行するにつれて増加することが示される。
【実施例２】
【００６２】
＜抗体の天然の反応性を試験するための試料＞
アッセイの開発および確認のために、男女両方の２３〜４５歳の健康な成人の志願者１５人の血清および血漿を用いた。本発明者らはまた、種間の交差反応性のレベルを決定するために、マウスおよびラットの血清試料も試験した。
【００６３】
＜動物試料＞
５匹の６月齢のスプレーグ・ドーリー・ラットから単離された脳、肝臓、筋肉、結腸、腎臓、肺、皮膚、および膵臓などの組織と、野生型またはＴｇ４５１０マウスそれぞれの５つの脳とを液体窒素中で瞬間冷凍し、Ｂｅｓｓｍａｎ粉砕機を用いて粉砕した。「粉末」をバイアルに移して、重さを量った。抽出緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１５％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０５０５６４８９００１）、ｐＨ８．３）を組織２５０ｍｇにつき緩衝液１ｍＬの量で添加した。超音波破砕によって溶解産物を透明化した。超音波破砕後、死細胞片を４℃／５分／１００００ｒｐｍで遠心除去し、上清を回収し、次に使用するまで−８０℃で保存した。ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてタンパク質濃度を決定した。
【００６４】
＜インビトロでの組織の切断＞
ＭＭＰ緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭ酢酸亜鉛、ｐＨ８．０）中で１００μｇの組織抽出物と１μｇのＡＤＡＭ１０とを混合し、７日間インキュベートすることによって、プロテアーゼによる切断を行った。最後に、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ解析で切断を確認した。
【００６５】
＜ウェスタンブロッティング＞
２０μｇの各ラット組織抽出物および１００μｇの各マウス組織抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。これまでに説明されたようにして１５、ゲルを泳動し、試料をニトロセルロースメンブレンに移した。次に、ポンソーレッド染色を用いて、メンブレン上に同量のタンパク質がローディングされたことを確認した。Ｔａｕ−Ａ断片および全Ｔａｕタンパク質のレベルを、スキムミルク粉末を含むＴＢＳ−Ｔ中で１００ｎｇ／ｍＬに希釈した一次抗体とインキュベートすることによって検出した１５。次に、これまでに説明されたようにして１５、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートマウスＩｇＧを認識する二次抗体を添加し、最後に増強した化学発光を用いてブロットを可視化した。
【００６６】
＜ヒト試料＞
アルツハイマー病患者（ｎ＝２１）の血清試料を得た。特徴は、７０（＋／−７）歳の発病年齢、女性／男性（１６／６）、１１２（＋／−１２）の基準時のＭＤＲＳスコア、８４９（＋／−１００９）の無傷のｔａｕレベルである。
【００６７】
＜Ｔａｕ−Ａ  ＥＬＩＳＡアッセイの特徴付け＞
ＡＤＡＭ１０によって生成したＴａｕの切断配列（ＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱ、配列番号２４６）を認識する抗体を選択し、ＥＬＩＳＡ（Ｔａｕ−Ａ）の開発に用いた。図７Ａでみられるように、このアッセイは、反応性を失わせるように１つのアミノ酸で配列を伸長させた切断部位に特異的であった。さらにＡＤＡＭ１０で分解された組換えｔａｕまたは脳抽出物を用いて特異性を確認したところ、切断されたｔａｕへの特異性が確認された（図７Ｂ〜Ｃ）。加えて、組織のプロファイリングにより、Ｔａｕは主として脳由来であることが確認された。検出下限（ＬＬＯＤ）は２．９ｎｇ／ｍＬと決定され、検出上限（ＵＬＯＤ）は２２６．３ｎｇ／ｍＬであった。このアッセイは技術的にロバストであり、ヒト血清および血漿だけでなくマウスおよびラット血清でも１＋２〜１＋６の希釈範囲内でＴａｕ−Ａレベルを検出することができた（データ示さず）。加えて、上述した希釈範囲内で直線的な添加回収率を得た（データ示さず）。イントラアッセイの変動係数は５．８％であり、一方でインターアッセイのＣＶ％は１２．６％であった。５回の連続した凍結融解サイクル後でも反応性の損失は観察されなかった。
【００６８】
＜Ｔａｕ−Ａ  ＥＬＩＳＡの生物学的な確認＞
ＥＬＩＳＡを用いた解析から、Ｔｇ４５１０マウスの脳は、それに対応する野生型対照よりも１０倍高いレベルのＴａｕ−Ａを有することが明らかになった（図７Ｅ）。またウェスタンブロッティングによっても、Ｔｇ４５１０マウスは、極めて高いレベルのＴａｕ−Ａを有するが、一方で対照マウスは、極めてわずかなＴａｕ−Ａしか有さないことが示された（図７Ｆ）。全Ｔａｕに対する抗体を用いたブロットを再度精査したところ、Ｔｇ４５１０において、高分子量バンドの強度がより強かったが、全Ｔａｕでほぼ同じレベルを示した。
【００６９】
＜Ｔａｕ−ＡレベルはＭＤＲＳスコアと相関する＞
マーカーとＡＤ病の段階との関係を確認できるかどうかを調査するために、本発明者らは、ＡＤ患者におけるＴａｕ−Ａレベルと、Ｍａｔｔｉｓ認知症評価スケール１０を用いて得られたスコアとを関連付けたところ、ＭＤＲＳとＴａｕ−Ａとの間に有意な（ｐ＝０．００３）逆相関があることを見出した（図８）。このコホートにおいて、ＣＳＦ中の無傷のＴａｕまたは年齢などのその他のパラメーターとの相関は観察することはできなかった（データ示さず）。
【００７０】
＜考察＞
血清および／または血漿ベースの潜在的ＡＤマーカーは広く調査されているが、これまでのところ認知機能との相関を示す唯一のバイオマーカーしか同定されていない１〜３。これは、本発明者らが知る限り、血清中のＴａｕのタンパク質分解過程をモニターする最初の生化学的マーカーであり、ＡＤ病理の重要な第一歩と思われる９。このマーカーはまた、認知機能と相関する脳特異的タンパク質の最初の唯一の血清バイオマーカーでもある。ＡＤにおいてネオエピトープが広く調査されてきたが、Ａβ４２およびリン酸化Ｔａｕの測定値が、病気の結果として形成されるネオエピトープとして報告されており４、これまでにインビトロで生成したＴａｕ断片に関する選択的な血清のスクリーニングはなされてこなかった。
【００７１】
この研究のために選択されたＡＤＡＭ１０とＴａｕとの組み合わせは、ＡＤが進行する間、Ｔａｕは、脳中で直接的に、あるいはその他の脳のプロテアーゼによって生成した断片としてセクレターゼによる切断に曝露され、続いてＴａｕが循環系に入ると二次的にプロセシングされという新しい仮説に基づいているが、これは、さらなる研究を必要とする。本発明者らは、血清中で特異的なＡＤＡＭ１０によって生成したＴａｕペプチド断片を検出することができ、加えてＴｇ４５１０マウスの脳中で極めて高レベルであることも検出することができた。これらの観察により、確認すべき正確な作用機序はまだ残っているが、ＡＤＡＭ１０によるＴａｕのプロセシングは、ＡＤ中の神経細胞死に関連する過程であることが示唆される。
【００７２】
要約すると、本発明者らは、病理学的なＴａｕ断片を検出する最初の血清ベースのアッセイを開発した。この断片は、認知機能に直接的で逆の相関を示した。本アッセイは、ニューロンの損失を診断するための有用で実用的なツールを提供し、治療有効性およびＡＤの進行をモニターするのに用いることができる。
【００７３】
本明細書において、明確に他の指定がない限り、「または（ｏｒ）」という言葉は、述べられている条件のうちどちらかまたはその両方が満たされる場合に真値を返す演算子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）の意味で用いられ、条件のうち一つだけが満たされていればよい演算子「排他的ｏｒ（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｒ）」とは対照的である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という意味で用いられる。上記で認められた先の教示はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されたどの先の公開文書も、それらの教示が、その文書の日付においてオーストラリアやその他の国で共通の一般的な知見であるということの容認または表明と解釈されないものとする。
【００７４】
＜参考文献＞
【表６Ａ】
2014522643.tif 000016
【表６Ｂ】
2014522643.tif 000017
【表６Ｃ】
2014522643.tif 000018
【表６Ｄ】
2014522643.tif 000019
【表６Ｅ】
2014522643.tif 000020
【図１】
2014522643.tif 000035
【図２】
2014522643.tif 000036
【図５】
2014522643.tif 000037
【図６】
2014522643.tif 000038
【図８】
2014522643.tif 000039
【図３】
2014522643.tif 000040
【図４】
2014522643.tif 000041
【図７Ａ−Ｆ】
2014522643.tif 000042
【配列表】
2014522643000001.app
【国際調査報告】
2014522643.tif 000043
2014522643.tif 000044
2014522643.tif 000045
2014522643.tif 000046
2014522643.tif 000047
2014522643.tif 000048