(57)【要約】  本発明は、麹発酵から得られる酵素調製物であって、麹発酵はアスペルギルスで発酵させたキノコを含む、酵素調製物を提供する。本発明はまた、キノコと穀物との混合物のアスペルギルスでの発酵から得られる酵素調製物、該酵素調製物を製造する方法、及び該調製物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹発酵から得られる酵素調製物であって、麹発酵はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）で発酵させたキノコを含む、酵素調製物。
【請求項２】
麹発酵は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）で発酵させた穀物をさらに含む、請求項１に記載の酵素調製物。
【請求項３】
穀物は、小麦、大麦又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の酵素調製物。
【請求項４】
麹発酵は、１０〜９９ｗｔ％のキノコ及び１０〜６０ｗｔ％の穀物を含む、請求項２又は３に記載の酵素調製物。
【請求項５】
麹発酵は、６０〜９０ｗｔ％のキノコ及び１０〜４０ｗｔ％の穀物を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項６】
麹発酵は、９０ｗｔ％のキノコ及び１０ｗｔ％の穀物を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項７】
穀物は小麦である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項８】
麹発酵は、全混合物の０．１〜１０ｗｔ％の範囲で増殖培地をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項９】
増殖培地の量は全混合物の１〜３ｗｔ％である、請求項８に記載の酵素調製物。
【請求項１０】
増殖培地は、脱脂大豆ケーキ、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８又は９に記載の酵素調製物。
【請求項１１】
キノコは、アガリクス・ブルネセンス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｒｕｎｎｅｓｃｅｎｓ）、コプリヌス・コマトゥス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｏｍａｔｕｓ）、レンティヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ）、アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、アガリクス・カンペストリス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒプシジグス・テッスラトゥス（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ  ｔｅｓｓｕｌａｔｕｓ）、プレウロトゥス・オストレアトゥス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、プレウロトゥス・シトリノピレアトゥス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）、プレウロトゥス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、ボレトゥス・エドゥリス（Ｂｏｌｅｔｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）、クラテレルルス・コルヌコピオイデス（Ｃｒａｔｅｒｅｌｌｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉｏｉｄｅｓ）、クラテレルルス・トゥバエフォルミス（Ｃｒａｔｅｒｅｌｌｕｓ  ｔｕｂａｅｆｏｒｍｉｓ）、アガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、ヴォルヴァリエルラ・ヴォルヴァケア（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ  ｖｏｌｖａｃｅａ）、アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）、ガノデルマ・ルキドゥム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項１２】
穀物は、全粒穀物、穀物グルテン、糠、穀物外皮及び細根、加工穀物、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項１３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵素調製物を製造する方法であって、アスペルギルスでキノコを発酵させる工程を含む方法。
【請求項１５】
穀物が発酵工程に含まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抽出、分離、濃縮又はそれらの任意の組み合わせによって酵素調製物を精製する工程をさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
穀物製品、肉製品又はそれらの組み合わせを加水分解するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵素調製物の使用。
【請求項１８】
食品（例えば、調味ソース、調味料、スープ、乾燥調味料、ブイヨン、ペースト）を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵素調製物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹発酵から得られる酵素調製物であって、麹発酵はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）で発酵させたキノコを含む、酵素調製物に関する。本発明はまた、キノコと穀物との混合物の発酵から得られる酵素調製物、該酵素調製物を製造する方法、及び該調製物の使用に関する。
【背景】
【０００２】
植物タンパク質の加水分解は、食品バイオテクノロジーの最古の方法のうちの１つである。アジア諸国では何世紀もの間、大豆タンパク質を加水分解して、とりわけ醤油（ｓｈｏｙｕ，ｓｏｙ  ｓａｕｃｅ）（西洋世界では中国料理とほぼ同義になっている一般的な調味料）を製造してきた。これらのうんざりするほど長く、時に永続的ともいえる方法において、必要なペプチド分解活性は、アスペルギルス、乳酸菌及び酵母のそれぞれの植物基質での増殖による連続発酵に由来する。
【０００３】
西洋諸国では、速度論的に非常に安定なペプチド結合を効率的に開くために、小麦、米又はピーナッツのタンパク質を使用して、また、酵素加水分解を（例えば塩酸を用いる）酸加水分解に置き換えて上記方法を模倣してきた。その生成物（通常、植物タンパク質加水分解物（ＨＶＰ）と呼ばれる。）は液体調味料であり、あるいは濃縮されて、ペースト、粉末、又はスープ若しくはソース組成物で使用されるプレミックス、又は固形スープの素になる。この方法のいずれの段階にも肉は含まれないが、生成物はすべて肉のような匂いと風味を与える。
【０００４】
加水分解完了後に酸を中和しなければならないので、水酸化ナトリウムを添加する。この中和反応中に形成された塩化ナトリウムは、植物加水分解物の風味向上性を補助し、多くの場合、最終生成物において歓迎されるものである。
【０００５】
しかしながら、酸加水分解には多くの欠点がある。強酸及びアルカリは危険物質であり、特に１００℃超の温度での安全かつ食品グレードの操作にはもはや適合しないものと考えられている。さらに問題なのは、動物給餌研究で発癌性が示されているジクロロ化合物（例えば、１，２−ジクロロプロパノール、１，３−ジクロロプロパノール）の形成が避けられないことである。また、原材料の脂質画分と塩酸との接触は塩素化ステロイドを生成し、また、５−（クロロメチル）フルフラール等の化合物がメイラード経路から誘導される。
【０００６】
危険又は有毒な化合物の形成を回避するために、これらの化合物が必要とされず、また形成されることもない酵素法が再び注目されている。その結果、酵素法の改善に大きな関心が持たれている。そのような方法で使用される酵素は通常ペプチダーゼ及び／又はプロテアーゼである。
【０００７】
一般的なペプチダーゼとしては、例えば、アルカラーゼ（バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのセリンペプチダーゼ）、パパイン（カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）からのシステインペプチダーゼ）、組換えムコール（Ｍｕｃｏｒ）菌株からのキモシン（レンネット）、及びニュートラーゼ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの金属ペプチダーゼ）が挙げられる。米国特許第３，６９４，３１６号には、担子菌からプロテアーゼを調製する方法が記載されている。他の市販ペプチダーゼ（例えば、プロナーゼ、Ｆｌａｖｏｒｚｙｍｅ（登録商標））は、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）等の細菌又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等の子嚢菌（真菌）によって生成される、種々の活性を有する混合物である。
【０００８】
その生体触媒的性質により、酵素法は穏やかな物理的条件で行うことができ、それ故、対応する酸触媒法よりも環境に優しい。しかし、酸加水分解とは対照的に、酵素法はしばしば完了に至らず、苦味を有する部分加水分解生成物をもたらす可能性がある。苦さのレベルは、加水分解度の増加と共に増大して最大になり、次いで、加水分解の進行と共に低下する。
【０００９】
酵素法の促進（Ｊ．Ｐｅｄｒｏｃｈｅら，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３年）及び苦味ペプチドの形成の回避（Ｋ．Ｍａｅｈａｓｈｉら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，２００２年，４７〜６８頁）に関する多数の試みが発表されている。
【００１０】
植物のタンパク質（Ｂ．Ｐ．Ｌａｍｓａｌら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，８３（８），７３１〜７３７頁，２００６年）若しくは動物起源のタンパク質（Ｊ．Ｊｅら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２１（１〜２），１５７〜１６２頁，２００５年）又は米糠等の加工廃棄物（Ａ．Ｊａｒｕｎｒａｔｔａｎａｓｒｉら，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，８３〜９７頁，２００５年）が基質として使用されている。ヘモグロビン、カゼイン、インスリン等の基質も調査されている（Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５年，６６巻，９８３〜９９０頁）。
【００１１】
大豆及び小麦は、依然として最も一般的な酵素加水分解基質である。生体触媒がインタクトな細胞（例えば微生物）でない場合に、酵素調製物（例えば、ニュートラーゼ（国際公開第２００６／１０３６２８号パンフレット）、又は植物酵素と微生物酵素との組み合わせ（国際公開第２００２／０７８４６１号パンフレット；中国特許第１３９７６４４号））が示唆されている。
【００１２】
小麦グルテンのペプチド分解は、特に、アルカラーゼ、パンクレアチン若しくはペプシン（Ｘ．Ｋｏｎｇら，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，  ６１５〜６２０頁，２００７年）、又はパパイン（Ｊ．Ｗａｎｇら，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，  １６５８〜１６６３頁，２００７年）を用いて実現されている。そして、市販の酵素調製物（例えばＦｌａｖｏｒｚｙｍｅ（登録商標））を用いて小麦グルテンを酵素的に加水分解することも知られている。しかし、ＷＧＨ−ｔｅ（小麦グルテン加水分解物−工業用酵素）法の開発における重要な点は、依然として、主に、これらの酵素が高価なこと、入手可能な酵素調製物のタンパク質分解活性が例えば酸加水分解法と比較して不十分なこと、加水分解物中の不溶残留物（例えば、糖タンパク質に富む画分）の消化が不十分なこと、及び該方法が無塩又は低塩濃度で、また、ある種の腐敗微生物の成長が可能な温度で行われるため、加水分解物中の微生物が保護されることである。
【００１３】
すなわち、穀物製品の加水分解に関して改善された特性を有する酵素調製物が求められている。
【００１４】
驚くべきことに、本出願人は、発酵プロセスの原材料のベースとしてキノコを用いる麹発酵から得られる酵素調製物が、アスペルギルスからのプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼの発現を増大させることを見出した。穀物製品（例えば、小麦又は大麦）が発酵プロセスに存在すると、これらの酵素のタンパク質分解活性がさらに増大した。発酵プロセスに少量の増殖培地を添加することによって、生産及び／又は活性をさらに増大させることができた。
【００１５】
このようにして得られた粗酵素調製物は、市販の酵素調製物（例えばＦｌａｖｏｒｚｙｍｅ（登録商標））よりも活性があり、小麦グルテンに対するタンパク質分解活性が増強され、より迅速であった。これにより、この酵素調製物を穀物製品（例えば、小麦、大豆）のより効率的な加水分解プロセスに使用することが可能となり、結果として、それらの原材料の加水分解の改善をもたらす。この加水分解プロセスはより迅速であり、これにより、望ましくない微生物による腐敗のリスクが低減され、また、精製済みの市販酵素を使用する代わりに粗酵素調製物を使用することで製造コストが低減された。さらに、強力な市販酵素（例えばアルカラーゼ）を使用した場合とは異なり、異風味（すなわち苦味）は検出されなかった。
【００１６】
すなわち、本発明の目的は、既知の酵素調製物の上記欠点の少なくとも１つを少なくとも部分的に克服することを可能とする酵素調製物を提供することにある。
【発明の概要】
【００１７】
第１の態様において、本発明は、麹発酵から得られる酵素調製物であって、麹発酵はアスペルギルスで発酵させたキノコを含む、酵素調製物を提供する。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、酵素調製物を製造する方法であって、アスペルギルスでキノコを（好ましくは穀物と一緒に）発酵させる工程を含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の一態様は、穀物製品若しくは肉製品を加水分解するため又は食品を調製するための、本発明の酵素調製物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の粗酵素調製物を調製するためのプロセスの工程を示す。
【図２】Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  クロマトグラフィーシステムによる溶出後の粗酵素調製物のタンパク質分画を示す。
【図３】キノコベースの麹調製物からの酵素のタンパク質分解活性とＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）調製物からのものとの比較を示す。値は、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）の活性を１００％として標準化している。
【詳細な説明】
【００２１】
本発明は、麹発酵から得られる酵素調製物であって、麹発酵はキノコをアスペルギルスで発酵させる工程を含む、酵素調製物に関する。好ましくは、麹発酵は、アスペルギルスで発酵させた穀物をさらに含む。
【００２２】
「麹発酵」という語は、様々な伝統的な食物及び飲物製品（例えば、味噌、ソイソース、酒）を製造するための、カビ（例えばアスペルギルス）を用いた大豆、小麦、大麦及び／又は米の発酵プロセス（例えば固体発酵プロセス）を指す。
【００２３】
本発明の麹発酵はキノコを含むか、あるいはキノコと、好ましくは、小麦、大麦、米又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の穀物と、の混合物を含む。驚くべきことに、発明者らは、発酵混合物中にキノコが存在すると、穀物からのグルテンに対するタンパク質分解活性が著しく増強された麹が生成されることを見出した。混合物は、約１０〜９９ｗｔ％のキノコ、好ましくは約６０〜９０ｗｔ％のキノコ、及び／又は約１０〜６０ｗｔ％の穀物、好ましくは約１０〜４０ｗｔ％の穀物を含むことができる。一実施形態では、小麦が好ましい穀物である場合、混合物は、約９０ｗｔ％のキノコ及び１０ｗｔ％の穀物を含む。穀物製品の添加は、例えば固体麹発酵の粘稠性及び通気性に有利であることが分かった。これによって、例えば、麹中のアスペルギルス属のカビのより良好な成長、麹床のより良好な加湿、及び発酵温度の制御が可能になる。
【００２４】
穀物は、全粒穀物、穀物グルテン、糠、穀物外皮、穀物細根、加工穀物又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。
【００２５】
酵素調製物の活性は、麹発酵に少量の増殖培地を添加することでさらに増大させることができる。利点は、そのような増殖培地は、得られる酵素の収率、及び発酵プロセスの活性、並びに麹発酵プロセスの安定性をさらに高めることである。したがって、本発明の麹発酵は、全混合物の約０．１〜１０ｗｔ％、好ましくは約１〜６ｗｔ％、より好ましくは１〜約３ｗｔ％の範囲でそのような増殖培地をさらに含む。増殖培地は、脱脂大豆ケーキ、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択する。
【００２６】
本発明の麹発酵はキノコ又はキノコの混合物を含むことができ、キノコは、コプリヌス・コマトゥス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｏｍａｔｕｓ）、レンティヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ）、アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、アガリクス・カンペストリス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒプシジグス・テッスラトゥス（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ  ｔｅｓｓｕｌａｔｕｓ）、プレウロトゥス・オストレアトゥス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、プレウロトゥス・シトリノピレアトゥス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）、プレウロトゥス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、ボレトゥス・エドゥリス（Ｂｏｌｅｔｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）、クラテレルルス・コルヌコピオイデス（Ｃｒａｔｅｒｅｌｌｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉｏｉｄｅｓ）、クラテレルルス・トゥバエフォルミス（Ｃｒａｔｅｒｅｌｌｕｓ  ｔｕｂａｅｆｏｒｍｉｓ）、アガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、ヴォルヴァリエルラ・ヴォルヴァケア（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ  ｖｏｌｖａｃｅａ）、アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  Ａｅｇｅｒｉｔａ）、ガノデルマ・ルキドゥム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）又はそれらの任意の組み合わせからなる群から好ましくは選択することができる。キノコ又はキノコの混合物は、新鮮なキノコ、乾燥済み若しくは加工済みのキノコ、キノコ全体若しくはキノコの任意の部分（例えば、軸、子実体）、及び／又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。新鮮なキノコに比べて乾燥済み又は加工済みのキノコを使用する利点は、産業環境においてこの植物材料は貯蔵性がより優れており、加工もより容易なことである。さらなる利点は価格にあり、また、そのような原材料が通年で入手可能な点にある。
【００２７】
本発明の麹は、糸状菌のアスペルギルス・オリゼーで発酵させることが好ましい。アスペルギルス・オリゼーは、従来の麹発酵で使用されている十分に承認された糸状菌であるという長所を有する。これは食物消費にとって絶対に安全であり、典型的な発酵ソイソースタイプの風味特徴を与える。
【００２８】
本発明の他の一態様は、本発明に記載の酵素調製物を製造する方法であって、キノコと少なくとも１種の穀物との混合物をアスペルギルスで発酵させる工程を含む方法である。したがって、発酵プロセスの前にキノコと少なくとも１種の穀物との混合物にアスペルギルスを接種することができる。あるいは、アスペルギルスを接種したキノコを、発酵プロセスの前に穀物と混合することができる。この方法で得られた粗酵素調製物は、以下に記載するような用途に直接適用することができる。この方法の利点は、産業用小麦グルテン加水分解法で現在使用されている一般に周知のどの市販酵素調製物よりも活性のある粗酵素調製物が得られることである。さらなる利点は、異風味（例えば苦味）が本発明の加水分解生成物において検出されなかったことである。
【００２９】
本方法は、例えば、抽出、分離、濃縮又はそれらの技術の任意の組み合わせによって、酵素調製物を少なくとも部分的に精製する工程をさらに含むことができる。酵素調製物は、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって分離及び濃縮を行うことができる。酵素調製物の分離及び濃縮工程はまた、膜分離技術を含むことができる。利点は、例えば、酵素調製物の活性をさらに増大させることができ、それによって、選択された原材料の加水分解収率がさらに向上し得ることである。さらに、保管、例えばある工場から別の工場への搬送、及び／又は工場内での取り扱いも容易で安価に行うことができる。
【００３０】
本発明のさらに他の一態様は、穀物製品（例えば、小麦又は大豆製品）を加水分解するための、本発明の酵素調製物の使用である。酵素調製物を使用すると、例えば、発酵プロセスの収率、速度及び費用を含む、穀物グルテンの加水分解プロセスの改善を通じて、望ましくない微生物による腐敗のリスクを低減し、味を改善し、加水分解物の異味を低減することが可能となる。
【００３１】
すなわち、より具体的には、酵素調製物の使用は食品（例えば、調味ソース、調味料、スープ、乾燥調味料、ブイヨン、ペースト）の調製に関連する。本発明の方法で得られる粗酵素調製物を適用することができる。
【００３２】
本明細書に開示する本発明の特徴はすべて自由に組み合わせることができることは、当業者ならば分かるであろう。特に、本発明の製品に関して記載する特徴は、本発明の方法と組み合わせることができ、また逆も同様である。さらに、本発明の様々な実施形態に関して記載する特徴を組み合わせることができる。
【００３３】
本発明のさらなる利点及び特徴は図及び実施例から明らかである。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例に関してさらに説明する。特許請求の範囲に記載の発明がこれらの実施例によって限定されるものでないことは理解されよう。
【００３５】
実施例１（粗酵素調製物）：
粗酵素調製物を図１に従って調製した。まず、麹基質の試料を、キノコベース（ササクレヒトヨダケ（Ｓｈａｇｇｙ  Ｍａｎｅ）キノコ（コプリヌス・コマトゥス））、小麦グルテン、全粒小麦及び小麦糠を表１に示す比で混合することにより調製した。次いで、得られた各麹基質１０ｇを水５ｇと混合し、アスペルギルス・オリゼーの胞子を接種し、その後、従来の固体麹発酵系で発酵させた。発酵は、水分湿度８０％ＲＨ（相対湿度）の下、３０℃で３０時間行った。次いで、発酵させた麹を４℃で水８０ｍｌを用いて１時間洗浄した。次いで、麹をろ過し、濃縮水を粗酵素調製物として保持した。
【００３６】
表１：麹組成
【表１】
2014501112.tif 000002
【００３７】
実施例２（酵素アッセイ）：
種々の粗酵素調製物の酵素活性を次のように決定した。粗酵素調製物２０ｍｌを、小麦グルテン１ｇを含む０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）３０ｍｌに添加し、その後の混合物に５０℃で３０分間接種した。その後、さらなる酵素反応を終了させるために混合物を１００℃で１０分間加熱した。次いで、ホルモール窒素（ＦＮ）を、Ｈａｗｋ，Ｐ．Ｂ．，Ｏｓｅｒ，Ｂ．Ｌ．及びＳｕｍｍｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｆｏｒｍｏｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，Ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１３版，ニューヨーク，ブラキストン，１９５４年，８９７〜８９９頁のプロトコールに従って決定した。溶液中に生成した遊離アミノ酸の量をホルモール値から見積もる。酵素測定のブランク試料として、まず、酵素を不活性化するために粗酵素調製物を１００℃まで１０分間加熱し、その後、ホルモール窒素含有量の測定に使用した試料と同様に処理した。酵素活性値を下記のように計算した。
ΔＦＮ＝［（（試料のＦＮ））−（ブランクのＦＮ）］／小麦グルテン［ｍｇ／ｇ］／分（インキュベーション）
結果を表２に示す。
【００３８】
表２：小麦グルテン加水分解に対する粗酵素調製物の影響
【表２】
2014501112.tif 000003
【００３９】
酵素加水分解中に放出されたホルモール窒素（ＦＮ）をタンパク質分解の指標としてモニターした。小麦グルテン溶液のタンパク質分解を最適化するのに最も重要な発酵麹ベース中の成分はキノコベースであることが分かった。麹試料１の生成物から最良の結果が得られた。この結果と一致して、キノコ含有量が最も高い麹混合物からの酵素ミックスを用いて加水分解したとき、加水分解工程後の小麦グルテン溶液が最も澄明、すなわち最も透きとおった試料であることも観察された。発酵させた麹中にキノコベースが存在する場合は常に後続の小麦グルテン溶液の加水分解が向上すると結論づけることができる。例えば、発酵させた麹中に９０ｗｔ％のキノコ及び１０ｗｔ％の小麦糠を含む試料１のように、高い割合のキノコベースを用いた場合に最良の結果が得られる。
【００４０】
実施例３：
麹基質を、主成分としてキノコ（約９０ｗｔ％）、小麦糠（１０ｗｔ％）（実施例１の試料１）、及び様々な量の種々の補充物を用いて調製した。様々な発酵実験からの小麦グルテン加水分解に関する酵素活性を直交実験デザインによって決定した。結果のいくつかを表３に示す。値は、対照試料（すなわち補充物なしの発酵）（実施例２からの試料１）と２ｗｔ％の脱脂大豆、酵母エキス又はペプトンの補充物ありの発酵とから得られた平均差を示している。
【００４１】
表３：小麦グルテンからのホルモール窒素（ＦＮ）生成に対する、脱脂大豆、酵母エキス又はペプトンが補充された試料の影響
【表３】
2014501112.tif 000004
【００４２】
試験した補充物のうちで、ペプトンがＦＮの生成に最も強い正の効果を示した。ペプトンはエキソプロテアーゼの発現を促進し、試験した小麦グルテン溶液の遊離アミノ酸の放出に対して強い正の効果を示した。脱脂大豆ケーキ及び酵母エキスは、タンパク質分解活性への全体的な影響はペプトンに関して観察されたほど強くなかったにもかかわらず、エキソプロテアーゼの発現を同様に促進した。すなわち、特定の選択された補充物を麹発酵に添加することにより、酵素調製物のタンパク質分解効果をさらに向上させることができる。
【００４３】
実施例４：
実施例１の粗酵素調製物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  クロマトグラフィーシステムにかけた。図２はその結果を示す。グラフ中の各ピークは、酵素調製物中に存在したタンパク質を表す。タンパク質の各ピークについてタンパク質分解活性を分析し、図２の矢印「２」で示した１つのピークのみが顕著なプロテアーゼ活性を有することが分かった。当業者に知られている標準手順に従って、硫安沈殿並びにそれに続くＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ５０及びブチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ  クロマトグラフィーにより、発酵させたキノコベースの麹からのプロテアーゼの生化学的精製を行った。
【００４４】
キノコベースの麹から単離したプロテアーゼの特性は下記の通りであった。
−  相対分子量：５３．８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイオントラップＭＳ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰに基づく。）
−  等電点：４．１〜４．２
−  比活性：２２７４．７Ｕ／ｍｇ
【００４５】
この部分精製調製物は、酵素活性が６７．１倍に増加した酵素調製物となった。精製処理での酵素の回収率は１１．３％であった。キノコベースの麹で製造され、その後部分的に精製された酵素調製物のタンパク質分解活性を、市販の精製済みＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）のタンパク質分解活性と、小麦グルテン又はカゼインの加水分解の際に比較した。結果を図３に示す。図中、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）のタンパク質分解活性は１００％として本発明の部分精製酵素調製物と比較されている。キノコベースの麹で製造された部分精製酵素調製物のタンパク質分解活性は、市販の広く使用されているＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）より優れていた。
【００４６】
実施例５：
麹基質（乾燥キノコ及び小麦グルテンを含有）を水に混合し、アスペルギルス・オリゼーの胞子を接種し、３０℃、８０％ＲＨで３０時間インキュベートした。麹を採取し、水及び小麦グルテンに混合し、５０℃で３時間保持した。溶液をろ過し、上清を９０℃超で１０分間加熱して、反応を停止させた。製造したソースを略式食味検査によって評価した。加水分解した小麦グルテンソースの典型的な風味特徴が得られ、苦い異風味は認められなかった。
【００４７】
本発明を特定の実施形態に関して説明してきたが、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく変形及び改変を加えることができることを理解されたい。また、特定の特徴に対して既知の等価物が存在する場合、そのような等価物は、あたかも本明細書中に具体的に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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