(57)【要約】  本発明は、薬理学的な試験で使用するための細管形成プラットフォーム及びインビトロの心臓血管モデルに関する。さらに本発明は、当該プラットフォーム及びモデルの製造方法、並びに当該プラットフォーム及び心臓血管モデルで試験物質の生物活性を決定する方法に関する。本発明はさらに、心臓障害の治療に使用するための移植可能な心臓構造物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）を含む単離された細管形成プラットフォームと、
ｉｉ）心筋細胞と
を含む、インビトロの心臓血管構造物。
【請求項２】
前記細管形成プラットフォームが、細管を形成する内皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の構造物。
【請求項３】
前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、内皮前駆細胞、及び遺伝学的改変により得られた内皮細胞からなる群より選択される、請求項２に記載の構造物。
【請求項４】
前記心筋細胞が、新生仔ラットの心筋細胞、ｈｉＰＳＣ由来心筋細胞、ｈＥＳＣ由来心筋細胞、成体幹細胞由来心筋細胞、分化転換によって誘導された心筋細胞、及びヒト初代心筋細胞からなる群より選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の構造物。
【請求項５】
合成ポリマー、天然ポリマー、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、及びその他の細胞外マトリックス構成成分、又はそれらの混合物からなる群より選択される外来性マトリックス構成成分又は追加生体材料をさらに含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の構造物。
【請求項６】
心疾患の治療に使用するための、請求項１から５までのいずれか一項に記載の構造物。
【請求項７】
前記心疾患が、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択される、請求項５に記載の構造物。
【請求項８】
ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）を含む単離された細管形成プラットフォーム。
【請求項９】
外来性マトリックス構成成分又は追加生体材料が存在しない、請求項８に記載のプラットフォーム。
【請求項１０】
ａ）ｈＡＳＣを用意するステップと、
ｂ）該ｈＡＳＣを、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２が補充された細胞培養培地中で、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で培養するステップと
を含む、請求項８に記載の細管形成プラットフォームの製造方法。
【請求項１１】
細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、該内皮細胞を前記ｈＡＳＣと共培養するステップとをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、及び内皮前駆細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養培地が、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、ＩＧＦ−１、及びＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の物質をさらに含む、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ｈＡＳＣ、心筋細胞、及び任意選択で細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、
ｂ）該ｈＡＳＣを、任意選択で該細管を形成する内皮細胞と共に培養するステップと、
ｃ）該心筋細胞を、ステップｂ）で形成された培養物の上部で培養するステップと、
ｄ）ステップｃ）で形成された細胞培養物に、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２を投与するステップと
を含む、請求項１に記載のインビトロの心臓血管構造物の製造方法。
【請求項１５】
前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、及び内皮前駆細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｃ）が、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、ＩＧＦ−１、及びＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の物質を投与することをさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）請求項１に記載のインビトロの心臓血管構造物又は請求項８に記載の細管形成プラットフォームを提供するステップと、
ｂ）該構造又はプラットフォームに、該試験物質を投与するステップと、
ｃ）該構造又はプラットフォームでの該試験物質の作用を決定するステップと、
ｄ）ステップｃ）で決定された作用と、それに対応する該試験物質の非存在下で決定された作用とを比較するステップと
を含む、試験物質の生物活性を決定する方法。
【請求項１８】
前記決定される生物活性が、細胞毒性、細管形成の調節活性、電気的特性、例えば、心筋細胞収縮の速度規則性、再分極時間の持続時間、催不整脈性の存在、機械的特性、例えば、心筋細胞の収縮力、及び細胞代謝からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
心疾患の治療を必要とする患者に請求項５に記載の心臓構造物を移植するステップを含む、心疾患の治療方法。
【請求項２０】
前記心疾患が、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学的な研究で使用するための細管形成プラットフォーム及びインビトロの心臓血管モデルに関する。さらに本発明は、当該プラットフォーム及びモデルの製造方法、並びに当該プラットフォーム及び心臓血管モデルで試験物質の生物活性を決定する方法に関する。さらに本発明は、心臓障害の治療に使用するための移植可能な心臓構造物に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管系は、呼吸器系及び中枢神経系と共に生命の維持に必要な臓器又は系に属しており、その機能は生命にとって極めて重要である。それゆえに、医薬、工業用化学物質、殺生物剤、食物及び飼料用保存剤、並びに化粧品などの化学物質は、心毒性について評価する必要がある。これらの試験はたいてい動物の使用を伴うが、動物ベースの試験は、ヒトにおける作用を予想することに関して不十分なモデルであることがしばしば実証されている。さらに動物試験は倫理的に問題があり、多大な費用と時間を要する。これらの理由から、欧州委員会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）及び米国規制機関（ＵＳ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｂｏｄｉｅｓ）はいずれも、安全性試験は非動物モデルで行うこととし、試験は、可能な限り厳密にヒトにおける状態を模擬するヒト細胞の器官型モデルをベースとした予測毒性経路に基づくものとするという方策を立てている（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ：Ａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ、２００７）。
【０００３】
心筋活動電位の異常は、先天性の突然変異又は傷害によるかどうかに拘らず、ヒトにおいて病変、特に不整脈を引き起こすことがある。心臓における有害な薬物反応は、１９８０年代及び１９９０年代に市場から排除された様々な薬物で観察されたように、一般的に重篤であり死に至る可能性もあることから、最も重要な問題である。このような死を招く事象が、規制への関心と２００５年に発表されたＩＣＨガイドラインＳ７Ｂ及びＥ１４の開発を喚起した。これらのガイドラインは、あらゆる試験対象薬物の不整脈を誘発する傾向の非臨床的及び臨床的な評価を形式化した。薬物誘発性のＱＴ延長による不整脈誘発は、薬物を取り下げる最も一般的な原因の二番目であり、ますます懸念されている。ＱＴ間隔は、心拍数の影響を受ける。新しい医薬の安全性についての薬理学的試験において今日使用されている最も一般的なモデルは、動物モデル、及びモルモット若しくはウサギから単離した心臓、又はイヌから単離したプルキンエ細胞を含むエキソビボのモデルである。これらの目的で使用することができる、有効性が確認されたインビトロの心臓モデルはない。
【０００４】
収縮特性と活動電位との両方を有するいくつかの異なるインビトロの三次元心臓組織構成物が開発されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２、９０：２２；Ａｋｉｙａｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２０１０、１１：２９１０）。既存の調査モデルの不利な点は、これらのモデルは、動物の生物学（ラット細胞）に基づいており、これらのモデルは、短い期間（数日）しか機能を維持できない点である。従って、短期間の作用しか評価できない。それゆえに、ヒトに関連する心臓の機能（心拍、鼓動の強さ、電気的活動、様々なチャンネル活性）を模擬するために、関連するバイオマーカーを有し、物理化学的な状態が制御及び維持されたヒト細胞ベースの機能性組織構成物の開発が必要であろう。
【０００５】
ＵＳ２００９／０１６９５２１は、心臓障害の治療に使用するための人工の三次元心臓構造を開示している。この構造は、人工足場上に又はその中に、心筋細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞を共に植え付けることにより得られる。外来性の足場は、多層の組織構成物において細胞間相互作用及び細胞アセンブリに干渉する可能性があるため（Ｎｏｒｏｔｔｅら．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９、３０：５９１０）、開示された心臓構造は、薬理学的な毒性試験に使用するには最適ではないと予想される。
【０００６】
化学物質及び生物学的物質の毒性試験に加えて、ヒト細胞ベースの器官型心臓モデルが、心臓血管疾患のための新規の医薬品の調査において必要であると予想される。西側諸国において、心臓血管疾患は最も一般的な死亡原因であり、心不全は最も一般的な疾患の１つである。そのために、心臓の機能を回復させるための医薬品及び組織工学的な治療を開発する緊急の必要性がある。１つのアプローチは、幹細胞療法を用いて障害のある領域を回復させることである。幹細胞療法の目的は、患者自身の幹細胞を機能的な心筋細胞に分化させ、その細胞を移植して、心筋の障害を受けた領域を回復させることである。しかしながら、幹細胞療法が臨床用途に適用できるようになるには、より多くの調査を行って、幹細胞の分化、増殖、及び挙動をよりよく理解する必要がある。組織工学的な治療は、血管支持体を含む、ヒト細胞をベースとする機能性心臓モデルから大きな利益を得るであろう。
【０００７】
従って、有効性が確認されたインビトロの心臓モデルの必要性が当業界において認められている。
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、単離された細管形成プラットフォームと心筋細胞とを含む、インビトロの心臓血管構造物を提供する。細管形成プラットフォームは、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で、ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）を含む。いくつかの実施形態において、プラットフォームはさらに、細管を形成する内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、内皮前駆細胞、又は遺伝学的改変により得られた内皮細胞を含む。
【０００９】
その他の態様において、本発明は、心疾患の治療に使用するためのインビトロの心臓血管構造物を提供する。
【００１０】
さらにその他の態様において、本発明は、上述の単離された細管形成プラットフォームを提供する。
【００１１】
さらにその他の態様において、本発明は、細管形成プラットフォームの製造方法を提供する。本方法は、ａ）ｈＡＳＣを用意するステップと、ｂ）前記ｈＡＳＣを、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２が補充された完全無血清培地中で、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で培養するステップとを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、その内皮細胞を前記ｈＡＳＣと共培養するステップとをさらに含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、上述のインビトロの心臓血管構造物の製造方法を提供する。本方法は、ａ）ｈＡＳＣ、心筋細胞、及び任意選択で細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、ｂ）前記ｈＡＳＣを、任意選択で前記細管を形成する内皮細胞と共に培養するステップと、ｃ）前記心筋細胞を、ステップｂ）で形成された培養物物の上部で培養するステップと、ｄ）ステップｃ）で形成された細胞培養物に、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２を投与するステップとを含む。
【００１３】
さらに本発明の一態様は、試験物質の生物活性を決定する方法に関する。本方法は、ａ）上述の細管形成プラットフォーム又はインビトロの心臓血管構造物を提供するステップと、ｂ）前記プラットフォーム又は構造物に、前記試験物質を投与するステップと、ｃ）前記プラットフォーム又は構造物で試験物質の作用を決定するステップと、ｄ）ステップｃ）で決定された作用と、それに対応する前記試験物質の非存在下で決定された作用とを比較するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定される生物活性は、細胞毒性、細管形成の調節活性、電気的特性、例えば、心筋細胞の収縮速度、機械的特性、例えば、心筋細胞の収縮力、又は／及び基礎的な細胞代謝からなる群より選択される。
【００１４】
本発明のさらなる一態様は、心疾患の治療を必要とする患者に上述の心臓構造物を移植するステップを含む、心疾患の治療方法を提供する。前記心疾患の非限定的な例は、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択することができる。
【００１５】
本発明のその他の態様、具体的な実施形態、目的、詳細、及び利点は、従属項、以下の図面、詳細な説明、及び実施例に記載される。
【００１６】
以下、本発明を、好ましい実施形態によって添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｈＡＳＣ単一培養及びｈＡＳＣ＋ＨＵＶＥＣ共培養の細管形成を示す写真である。細胞を、フォン・ウィルブランド因子抗体（抗フォン・ウィルブランド因子、１：５００、Ｓｉｇｍａ、赤色蛍光はＴＲＩＴＣ結合二次抗体、１：１００、Ｓｉｇｍａで示される）で染色した。図１Ａは、ｈＡＳＣ単一培養及びｈＡＳＣ＋ＨＵＶＥＣ共培養の細管形成の比較を示す写真である。細胞を培養し、増殖因子高含有ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で血管新生を３日間又は６日間誘導した。図１Ｂは、様々な処理間の細管形成の半定量分析を示す図である。３日目及び６日目にｈＡＳＣ単一培養とｈＡＳＣ＋ＨＵＶＥＣ共培養とを互いに比較した。Ｓａｒｋａｎｅｎら（Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０１１、１：１４７．）による半定量的なスケールである。結果は平均±標準偏差として報告し、差は、ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊、及びｐ＜０．００１＊＊＊の場合に有意とみなした。図１Ｃは、対照として、ＨＵＶＥＣを、細胞４０００個／ｃｍ２で覆って、増殖因子高含有ＥＧＭ−２中で増殖させ、ｈＡＳＣ＋ＨＵＶＥＣを増殖因子を外部から添加しないで共培養して増殖させたことを示す図である。図１Ｄは、ｈＡＳＣ＋ＨＵＶＥＣを、ヒト血清を含む増殖因子高含有ＥＧＭ−２（ＥＧＭ−２、２％ＨＳ）、又は血清を含まない増殖因子高含有ＥＧＭ−２（ＥＧＭ−２、血清なし）中で培養したことを示す図である。
【００１８】
【図２】増殖因子高含有ＥＧＭ−２培地で血管新生を誘導した後の細管構造における周細胞及び平滑筋細胞の分化マーカーの発現を示す写真である。細管形成を検出するために、細胞培養を、フォン・ウィルブランド因子抗体（抗フォン・ウィルブランド因子、１：５００、Ｓｉｇｍａ、赤色蛍光はＴＲＩＴＣ結合二次抗体、１：１００、Ｓｉｇｍａで示される）で免疫染色した。細管の成熟を検出するために、培養物を、いずれも緑色蛍光を示す抗αＳＭＡ（１：２００、Ｓｉｇｍａ）、抗ＣＯＬＩＶ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、抗ＰＤＧＦＲβ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、抗ＳＭＭＨＣ（１：８００、Ｓｉｇｍａ）又は抗カルポニン（１：８００、Ｓｉｇｍａ）のいずれか、及びＦＩＴＣ結合二次抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。示された画像は、６日目の二重の免疫蛍光を組み合わせた画像であるが、抗ＰＤＧＦＲβについては３日目であり、抗ＣＯＬＩＶ及び抗カルポニンについてはいずれも染色（小さい画像）及びＦＩＴＣ結合二次抗体−抗ＣＯＬＩＶ／抗カルポニン染色（大きい画像）を組み合わせた画像が示される。
【００１９】
【図３】１０日間培養したｈＡＳＣ、ＨＵＶＥＣ、及び新生仔ラットの心筋細胞に基づくインビトロの心臓血管モデルを示す写真である。スケールバーは１００μｍである。細管形成を検出するために、細胞培養を、フォン・ウィルブランド因子抗体（抗フォン・ウィルブランド因子、１：５００、Ｓｉｇｍａ、ＴＲＩＴＣ結合二次抗体、１：１００、Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。心筋細胞を検出するために、培養物を、心臓特異的な抗トロポニンＴ（１：５００、Ａｂｃａｍ）及びＦＩＴＣ結合二次抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。
【００２０】
【図４】１０日間培養したｈＡＳＣ、ＨＵＶＥＣ、及びヒト胚性幹細胞由来心筋細胞に基づくインビトロの心臓血管モデルを示す写真である。スケールバーは、１００μｍである。細管形成を検出するために、細胞培養を、フォン・ウィルブランド因子抗体（抗フォン・ウィルブランド因子、１：５００、Ｓｉｇｍａ、ＴＲＩＴＣ結合二次抗体、１：１００、Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。心筋細胞を検出するために、培養物を、心臓特異的な抗トロポニンＴ（１：５００、Ａｂｃａｍ）及びＦＩＴＣ結合二次抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。
【００２１】
【図５】モデルを構築してから４日後の、同調して収縮する心臓血管モデルからの電気信号を示す多電極アレイ（ＭＥＡ）の記録である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、薬理学的な安全性及び毒性の試験に使用するための、インビトロの心臓血管構造物、すなわち心臓血管モデルを提供する。本モデルは、細管形成プラットフォーム上で培養された心筋細胞を含む。驚くべきことに、このような機能的な心臓血管モデルは、外来性マトリックスを用いることも生体材料を添加することもなく、得ることができる。
【００２３】
多層の組織構成物を形成するのに一般的に使用される外来性の足場は、細胞間相互作用及び細胞アセンブリに干渉する可能性がある。従って、本発明の足場を含まない心臓血管モデルはこの点において有利である。最適な組織構成物は、動物由来の構成成分又は自然にはない足場材料を含まずに、組織中に自然に見出される増殖因子及びタンパク質のみを含むものとする。本発明の心臓血管モデルは、少なくともいくつかの実施形態において、これらの要求を満たしており、さらに成熟した血管の特徴を有する。すなわち細管構造の形成に加えて、本モデルは、周細胞の補充、基底膜の形成、及び平滑筋細胞の血管支持層の形成を特徴とする。
【００２４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で用いられる場合、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び「実質的に、〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【００２５】
用語「細管形成プラットフォーム」は、本明細書で用いられる場合、血管ネットワーク構造に自己集合する能力を有する多層の細胞構造を意味する。
【００２６】
一実施形態において、細管形成プラットフォームは、ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）などの脂肪由来の間質／幹細胞（ＡＳＣ）のみから構築されていてもよい。このタイプの細管形成プラットフォームを、単一培養モデルと称する。
【００２７】
用語「脂肪由来幹細胞（単数又は複数）」又は「ＡＳＣ（単数又は複数）」は、本明細書で用いられる場合、脂肪組識から得られる、分別されなかった間質血管細胞フラクションを意味する。このような細胞群は不均一であり、間葉幹細胞を含む。より近年の用語によれば、「ＡＳＣ」は、「脂肪由来間質細胞」と称される場合もある。ヒトＡＳＣ（ｈＡＳＣ）を得る方法は、当業界において容易に利用することができ、例えば、これに限定されないが、例１で開示された方法が挙げられる。ＡＳＣは、当業界でよく知られているように、様々な細胞型に分化する能力を有する。
【００２８】
その他の実施形態において、細管形成プラットフォームは、細管を形成する内皮細胞とｈＡＳＣとを共培養することによって構築される。このタイプの細管形成プラットフォームを、共培養モデルと称する。
【００２９】
用語「細管を形成する内皮細胞（単数又は複数）」は、本明細書で用いられる場合、血管ネットワークなどの血管構造を形成する能力がある内皮細胞を意味する。細管を形成する内皮細胞の非限定的な例としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、その他の組織からの内皮前駆細胞、及び遺伝学的改変により得られた内皮細胞が挙げられる。上述した細胞の内皮細胞への分化を誘導する手段及び方法は、当業者によく知られている。細管を形成する内皮細胞はまた、市販されてもいる。
【００３０】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、内皮細胞などの多種多様の異なる細胞型に分化する能力を有する多能性細胞である。胚性幹細胞を得る方法は、当業界において容易に利用することができる。加えて、ＷＯ２００７／１３０６６４は、ドナーの胎芽にダメージを与えることなくヒト胚性幹細胞を得るための割球生検という有望な新しいアプローチを開示している。
【００３１】
用語「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）は、本明細書で用いられる場合、発生のリプログラミングによって、分化細胞から、典型的には線維芽細胞などの成人の体細胞から生成した多能性幹細胞を意味する。このような細胞は、例えばＷＯ２００８／１５１０５８及びＵＳ２００８／０７６１７６で説明されている。ヒト誘導多能性幹細胞を、ｈｉＰＳＣと称する。
【００３２】
用語「分化転換」又は「系統リプログラミング」は、本明細書で用いられる場合、中間の多能性の状態又は前駆細胞型を経ずに、ある成熟した細胞型からその他の細胞型に転換することを意味する。
【００３３】
細管形成プラットフォームは、ｉ）ＡＳＣ、又はｉｉ）ＡＳＣ及び細管を形成する内皮細胞を、内皮細胞増殖を支持する細胞培養培地中で、例えば２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルのプレート又はマイクロプレートなどの細胞培養又は組織培養プレート上で培養する方法により得ることが可能である。このような培養培地の非限定的な例は、Ｌｏｎｚａから入手できるＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）である。細管形成は、あらゆる内皮細胞増殖培地（例えばＬｏｎｚａ、Ｐｒｏｖｉｔｒｏ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、ＢＤから供給される）；或いは低濃度でヒト若しくは動物血清を含むか又は含まず、さらにサプリメントとしてｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アスコルビン酸、ヘパリン、及び／又はヒドロコルチゾンを含む、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はノックアウト（ＫＯ）ＤＭＥＭ（例えばＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ、ＢＤ、Ｌｏｎｚａから供給される）中で誘導することが可能である。さらに含まれていてもよい任意選択の因子の非限定的な例は、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ｈＥＧＦ、トランスフェリン、及び／又はトリヨードチロニン（ｔｒｉｊｏｄｏｔｙｒｏｎｉｎｅ）などのホルモンである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞培養プレートの底部表面は、細管が望ましい方向を向いて形成されるように細管を並べるための溝やスクラッチが設けられてもよい。
【００３５】
単一培養モデルにおいて、細胞は、典型的には細胞約２４×１０４個／ｃｍ２又はそれより高い密度で培養されるが、必ずしもそうでなくてもよい。共培養モデルにおいて、ＡＳＣ及び内皮細胞は、典型的にはそれぞれ２：１〜８：１の比率で、好ましくは５：１の比率で培養されるが、必ずしもそうでなくてもよい。一実施形態において、ＡＳＣは、細胞約２０×１０４個／ｃｍ２の密度で培養され、細管を形成する内皮細胞は、細胞約４×１０４個／ｃｍ２の密度で培養される。いくつかの実施形態において、細管を形成する細胞、例えばＨＵＶＥＣは、ＡＳＣ、例えばｈＡＳＣより１〜３時間後に培養する。
【００３６】
本発明の心臓血管モデルは、心筋細胞を、細管形成プラットフォーム上に植え付け又は培養してヒト又は動物の心臓モデルを作製する方法により得られる。本モデルでの使用に適した心筋細胞の非限定的な例としては、新生仔ラットの心筋細胞、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来心筋細胞、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来心筋細胞、成体幹細胞由来心筋細胞、ヒトの分化転換によって誘導された心筋細胞、及びヒト心筋細胞が挙げられる。心筋細胞の分化を誘導する手段及び方法は当業界で知られており、例えば、これらに限定されないが、Ｍｕｍｍｅｒｙら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３、１０７：２７３３）により開発された内胚葉細胞から誘導される分化、Ｌａｆｌａｍｍｅら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７、２５（９）：１０１５）により開発されたアクチビンＡ及びＢＭＰ４から誘導される分化、並びにＫｅｈａｔら（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００２、９１：６５９）により開発された胚様体技術が挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、心筋細胞を、完全無血清培地（ＣＳＦＭ）中で細管形成プラットフォーム上で培養する。これは特にラットの心筋細胞に適用される。ＣＳＦＭ用の基礎培地としての使用に適した市販の細胞培養培地の非限定的な例は、ＤＭＥＭ（商標）、又はＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＫｎｏｃｋ−Ｏｕｔ（ＫＯ）ＤＭＥＭであり、これらはＧｉｂｃｏより入手可能である。
【００３８】
心臓血管構造物がヒト心筋細胞を用いて提供される場合、培養培地は、無血清であってもよいし、或いは最大約１０％のウシ又はヒト血清を含んでいてもよい。このようなケースにおいて、例えば、基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２が用いることができる。
【００３９】
典型的には、心筋細胞は、細胞約１×１０５又は約２×１０５個／ｃｍ２の密度で培養されるが、植え付けの密度はこれらの値に限定されない。
【００４０】
典型的には、細胞が細管形成プラットフォームを形成してから１日後に、心筋細胞が細管形成プラットフォーム上に植え付けられるが、必ずしもこの限りではない。本心臓血管モデルにとって、心筋細胞を植え付ける前に細管が必ずしも完全に形成されていなくてもよい。
【００４１】
リアルタイムで細管形成及び細管との心筋細胞のアライメントを追跡するために、細管を形成する内皮細胞及び／又は心筋細胞を、例えばレンチウイルス感染などで、緑色又は黄色蛍光タンパク質を内皮細胞のゲノムに挿入することによって蛍光標識してもよい。このような細胞はまた、遺伝子組換え（例えばレポーター遺伝子、疾患に特異的な遺伝子、分化関連の遺伝子の挿入など）がなされてもよい。
【００４２】
典型的には、心筋細胞を培養してから１日後、細管形成を誘導するために、細胞に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）が投与される。これは、培養培地を前記増殖因子が補充された新しいＣＳＦＭで交換することにより行ってもよい。ＶＥＧＦは、典型的には約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で用いられ、一方ＦＧＦ−２は、典型的には約０．５ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で用いられる。
【００４３】
本モデルにおいて血管新生の誘導を高めるための任意選択の物質としては、これらに限定されないが、アスコルビン酸、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、好ましくはヒトＥＧＦ、及び何れかのそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４４】
本発明のモデルにおいて血管新生（すなわち細管形成）を誘導するのに適した培養培地中のさらなる任意選択の成分としては、最大１０％濃度のウシ及びヒト血清、並びにウシ及びヒトアルブミンが挙げられる。当業者であれば容易に理解できるであろうが、本発明の細管形成プラットフォーム及び／又は心臓血管モデルを製造及び／又は利用するのに用いられる培養培地は、抗生物質、Ｌ−グルタミン、及びピルビン酸ナトリウムなどの細胞培養培地で典型的に使用される何れかの成分を含んでいてもよい。
【００４５】
本心臓血管モデルにおいて、心筋細胞は、これまで可能だった時間よりも長く生存可能で機能を維持する。いくつかの実施形態において、新生仔ラットの心筋細胞の収縮性は３週間維持することができるが、それに対してｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣ由来心筋細胞は数カ月維持することが可能である。心臓血管モデルにおいて、完全に形成された細管構造よりもまして心筋細胞の生存率及び収縮性のほうがより重要である。従って、適度に細管形成がなされた心臓血管モデルが、本発明の様々な実施形態に従って試験物質を試験するのに用いることができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明の心臓血管モデルにおいて試験される物質は、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２投与の１日後に細胞に添加される。化学物質が添加される前に、心筋細胞は機能特性を有していることが必須である。前記物質の作用は、心筋細胞の適用及び源に応じて、例えば２〜３週間追跡することができ、必要であれば数カ月でさえ追跡することができる。
【００４７】
決定される生物学的作用の例としては、これらに限定されないが、例えば様々な遺伝子の発現の増加又は減少を評価することによって決定されるような毒作用；様々な手段（例えばＭＴＴ試験、ニュートラルレッド取り込み（ＮＲＵ）分析、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能なライブデッド（ＬｉｖｅＤｅａｄ）分析）による細胞の生存率；電気的特性、例えば、心筋細胞の収縮速度及び再分極の時間の変化又は不整脈事象（例えばＱＴ間隔を測定することによって決定される）；機械的特性、例えば、様々な平面状のバイオセンサー又は散乱(distruction)によって測定されるような収縮力の変化；ＧＡＰ結合を検出するためのコネクシン−４３などの心臓マーカー、又は心臓特異的なトロポニンＴなどのマーカーの免疫染色；並びに細胞代謝の変化（例えば乳酸形成、カルシウム流動、イオンチャンネルの変化、グルコース消費、酸素消費、及び二酸化炭素放出）が挙げられる。これらの作用は、何れかの望ましい組み合わせで、別々に、連続的に、並行して、又は同時に評価してもよい。
【００４８】
本心臓血管モデルは、上述した細胞の作用のいずれかを評価するための、１種又は複数のセンサー、例えば平面のバイオセンサーを含んでいてもよい。適切なセンサーとしては、これらに限定されないが、電気化学的、電気的及び／又は光学的なセンサーが挙げられる。培養培地の物理化学的な特性をモニターし、必要に応じて調節するためのさらなるセンサーが含まれていてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、細管形成プラットフォームそのものが、試験物質の血管新生特性を評価するために用いることができる。評価される血管新生特性の非限定的な例としては、細管形成能（例えば、細管の長さ及び／又は分岐を測定すること、または内皮の密着結合（endothelial tight junctions）の存在を決定することによって）、並びに細管の成熟化する能力（例えば、基底膜の形成、成熟した細管構造の内側を覆う周細胞及び平滑筋細胞の存在を決定することによって）が挙げられる。このようなケースにおいて、細胞培養に心筋細胞は添加されない。試験物質は、上述した任意選択の血管新生誘導剤の存在下又は非存在下で、例えばＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２による血管新生誘導の１日後に細管形成プラットフォームに適用することができる。血管新生特性は、例えば数日又は２週間追跡してもよい。試験物質は、細管が完全に形成される前であっても本モデルに適用することができる。
【００５０】
本発明の心臓血管及び血管新生モデルにおいてスクリーニングされる試験物質の非限定的な例としては、低分子の化合物、ナノ粒子、ポリペプチド、抗体、及び増殖因子などの化学的及び生物学的な物質が挙げられる。
【００５１】
心臓血管構造及び細管形成プラットフォームは、外来性マトリックス構成成分及び追加の生体材料が全くない状態でも、薬理学的な安全性及び毒性試験の目的で十分機能し、干渉する非天然の構成成分なしで心臓組織を模擬するが、ある種のケースにおいては、本モデル及び／又は本プラットフォームにこのような構成成分が含まれるほうが有利な場合がある。このような実施形態は、例えば人工心臓構造物における試験物質の安全性及び毒性を試験するために用いることができる。心臓血管モデル及び／又は細管形成プラットフォームに提供される適切な外来性マトリックス構成成分又は生体材料の非限定的な例としては、これらに限定されないが、Ｉ型又はＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンなどの合成若しくは天然ポリマー、又はその他の細胞外マトリックス構成成分が挙げられる。
【００５２】
本発明のいくつかの態様において、外来性マトリックス構成成分及び／又は追加の生体材料を含む心臓血管構造物は、例えば、これらに限定されないが、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症などの心疾患の治療に使用するための移植可能な三次元心臓構造物として構築されてもよい。
【００５３】
用語「治療」又は「治療すること」は、本明細書で用いられる場合、完全な疾患の治癒だけでなく、疾患又はそれに関連する症状の予防、緩和、及び改善も意味する。
【００５４】
治療目的では、心臓構造物は異物がないこと(Xeno-free)、すなわち外来の源から生じるあらゆる構成成分を含まないこと、或いは外来病原体を含む条件下で製造されないことが重要である。さらに、治療目的で自己細胞を使用することが有利な場合がある。
【００５５】
当業者には明白であると予想されるが、技術の進歩に伴い、本発明の概念は様々な方法で実施が可能である。本発明及びその実施形態は、上述の例に限定されず、特許請求の範囲内で様々に変化させることが可能である。
【実施例】
【００５６】
全ての作業は、国の倫理委員会のガイドラインに従って行われた。いずれもタンペレ大学病院（Ｔａｍｐｅｒｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）からの適切な同意及びインフォームドコンセントのもとで、計画的な帝王切開によりヒト臍帯を得て、外科手術によりヒト脂肪組識試料を得た。さらにピルカンマー病院地域（Ｐｉｒｋａｎｍａａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ）の倫理委員会は、それぞれ承認番号Ｒ０８０７０及びＲ０５１１１６としてヒトｉＰＳ及びｈＥＳＣ細胞の誘導及び使用を承認した。
【００５７】
（例１）
共培養ベースの細管形成プラットフォームの構築及び特徴付け
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単離：
タンペレ大学病院によるインフォームドコンセント（ピルカンマー病院地域、Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄの倫理委員会による承認番号Ｒ０８０２８）のもとで計画的な帝王切開から得られた臍帯からＨＵＶＥＣ細胞を誘導した。ヒト臍帯静脈からの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単離は、Ｊａｆｆｅら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９７３、５２：２７４５）によって説明されているようにして、ただし過程をさらに最適化して行われた。胎盤から臍帯を分離し、臍帯静脈に２０ゲージの針を挿入した。外科用クランプで臍帯を針の上からクランプすることにより針を固定した。静脈を臍帯用緩衝液（ＵＢＳ；０．１４ＭのＮａＣｌ、０．００４ＭのＫＣｌ、及び０．０１１Ｍグルコースを含む０．１Ｍリン酸緩衝液）で潅流して血液を洗い流し、その後、臍帯静脈のもう一方の端部を外科用クランプでクランプした。静脈に０．０５％コラゲナーゼＩを注入した。臍帯を３７℃で、２０分まで水浴中でインキュベートした。インキュベート後、ＨＵＶＥＣを含むコラゲナーゼＩ溶液を、ＰＢＳでの潅流により臍帯から洗い流して５０ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に入れた。細胞を２００×ｇで１０分遠心分離し、培地で１回洗浄し、再度遠心分離し、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁し、７５ｃｍ２のフラスコに植え付けた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で培養した。２〜３日毎に培地を交換し、細胞がコンフルエントになったら細胞を分けた。分析対照として、ＨＵＶＥＣを細胞４０００個／ｃｍ２でプレートに植え付け、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で培養した。
【００５８】
単離されたＨＵＶＥＣを、顕微鏡でそれらの形態学、細胞培養純度、及び細胞増殖について毎日観察した。培地を２〜３日毎に交換した。細胞がコンフルエントになったら、トリプルエキスプレス（Ｔｒｙｐｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）で細胞を取り外した。優れた増殖能力を有する純粋なＨＵＶＥＣ培養物の継代培養は、初代培養（ｐ０）では１：２〜１：４の比率で、さらに第一継代（ｐ１）では１：３〜１：５の比率に高めて行われた。
【００５９】
レンチウイルス感染：
レンチウイルス構成物ｐＬＫＯ−ＭＩＳＳＩＯＮ−Ｂｒｉｇｈｔ−ＧＦＰを、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｕｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＢＭＧｅｎ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｕｍ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）から購入した。低継代のＨＵＶＥＣでの感染を、１ｍｌのＥＧＭ−２Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ培地（１Ｕ／ｍｌ）中の３００μｌのｐＬＫＯ−ＭＩＳＳＩＯＮ−Ｂｒｉｇｈｔ−ＧＦＰを用いて行った。ウイルス感染を８μｇ／ｍｌ臭化ヘキサジメトリン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。２４時間インキュベートした後、培地を新しいＥＧＭ−２培地と置き換えた。高度な蛍光を示すクローンをクローニングリングを用いて選択し、さらに希釈クローニングで選択して、純粋なＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ培養物を得た。感染したＨＵＶＥＣを増やした後、それらを以下で説明されているようなｈＡＳＣとＨＵＶＥＣとの共培養分析に用いた。
【００６０】
ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）の単離：
幹細胞の単離手順は、以前に説明されたようにして行われた（Ｇｉｍｂｌｅ及びＧｕｉｌａｋ、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２００３、５：３６２；Ｈｏｎｇら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００５、２７６。Ｎｉｅｍｅｌａら、Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ、２００７、１８：３２５〜３３５）。簡単に言えば、ヒト脂肪組識試料を細かく切断し、渦を巻いている水浴中で、ダルベッコ改変イーグル培地の栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で、３７℃で６０分、０．０５％コラゲナーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ）で酵素消化した。消化した組織を、室温（ＲＴ）で、６００×ｇで１０分間遠心分離した。消化した組織を１００μｍのフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でろ過し、遠心分離し、４０μｍフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）でろ過した。細胞を、１％Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ、Ｇｉｂｃｏ）、１％抗生−抗真菌性の混合物（ＡＢ／ＡＭ、Ｇｉｂｃｏ）、及び１５％ヒト血清（ＨＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で７５ｃｍ２のフラスコ（Ｎｕｎｃ  ＥａｓｙＦｌａｓｋ（商標）、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に植え付けた。次の日、細胞をＰＢＳで数回洗浄した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２の空気雰囲気下で、一定の湿度で維持し、２〜３日毎に培地を交換した。増殖して集密になったら、細胞を１：２〜１：３の比率で分けるか、又はさらに細胞培養研究に用いた。
【００６１】
ｈＡＳＣ及びＨＵＶＥＣの共培養：
ヒトＡＳＣ（第７継代まで）を、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）培養培地中で４８ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）マルチディッシュ、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に細胞２００００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。上述したようにして培養したＨＵＶＥＣ（第４継代まで）を即座にｈＡＳＣの上に慎重に細胞４０００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。プレートに植え付けた次の日、この共培養物にＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ−２（１ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
【００６２】
３日間又は６日間のいずれかで細胞を培養した後、免疫細胞化学又は定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。培地を交換し、これらの処理を、３日間培養した細胞に１回、６日間培養した細胞に２回行った。
【００６３】
免疫細胞化学：
細管形成を、フォン・ウィルブランド因子に対する内皮細胞特異的抗体（ウサギ産生抗ｖＷｆ一次抗体、１：５００、Ｓｉｇｍａ）で可視化した。ヒト脂肪幹細胞分化を評価するために、α−ｖＷｆでの平行した二連の免疫蛍光染色を行った。共通の周細胞マーカーであるα−平滑筋アクチン（モノクローナル抗αＳＭＡクローン１Ａ４、１：２００、Ｓｉｇｍａ）、血管平滑筋細胞マーカーである平滑筋ミオシン重鎖（抗ＳＭＭＨＣ、１：８００、Ｓｉｇｍａ）、収縮性の平滑筋細胞マーカーであるカルポニン（抗カルポニン、１：８００、Ｓｉｇｍａ）、周細胞及び平滑筋細胞前駆体マーカーである血小板由来増殖因子受容体−β（抗ＰＤＧＦＲβ、１：８００）又は基底膜マーカーであるＩＶ型コラーゲン（抗ＣＯＬＩＶ、１：５００、Ｓｉｇｍａ）のいずれかに対する一次抗体を、抗ｖＷｆと組み合わせた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、氷冷した７０％エタノールで２０分固定し、０．５％トリトンＸ−１００（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）で１５分間透過処理し、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）で３０分非特異的な染色をブロックした。ブロック後、細胞を一次抗体対と共に室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、抗ｖＷｆに対しては二次抗体のポリクローナル抗ウサギＩｇＧ  ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ）、並びに抗αＳＭＡ、抗ＣＯＬＩＶ、抗ＰＤＧＦＲ−β、及び抗ＳＭＭＨＣに対してはポリクローナル抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ）と共に３０分インキュベートした。細胞核を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８（１ｕｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で５分染色し、ＰＢＳで５回洗浄した。抗ＧＦＰ染色について、一次抗体対は、ＧＦＰに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、１：１００）及び抗ｖＷｆであり、二次抗体は、それぞれ抗マウスＩｇＧ  ＴＲＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ、１：１００）及びウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣに対するポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１：５００）であった。蛍光を、ニコンのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｓ顕微鏡（株式会社ニコン、東京、日本）で可視化し、画像をアドビフォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）ソフトウェア７．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びコーレルドロー（Ｃｏｒｅｌ  Ｄｒａｗ）ソフトウェア１０．０（Ｃｏｒｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｏｔｔａｗａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）で加工した。
【００６４】
細管形成の顕微鏡解析：
免疫細胞化学的染色の後に、４８ウェルプレートのウェル中の細管をニコンのＥｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００顕微鏡（株式会社ニコン、東京、日本）で４０倍の倍率で解析した。様々な培養物における細管の程度を、０〜１０の半定量的な格付けスケールを用いて目視で定量したが、この格付けは、我々の以前の研究（Ｓａｒｋａｎｅｎら、２０１１）で説明されているように細管形成、細管の長さ及び分岐に基づいていた。
【００６５】
統計的分析：
統計分析を行い、グラフをグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で加工した。細管形成及びＲＴ−ＰＣＲの結果を片側ＡＮＯＶＡで処理し、それに続いて適用できる場合はダネット及びボンフェローニの事後テストで処理した。結果を平均±標準偏差として報告し、ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊、及びｐ＜０．００１＊＊＊の場合に差を有意とみなした。
【００６６】
結果：
共培養物の細管形成能力及び抗ｖＷｆ陽性の内皮細管構造を、２種の異なるタイムポイント（３日目及び６日目）で評価して比較した。共培養物は、初期（３日目）に細管状のネットワーク形成を示し、これは再現可能で、細胞系又は細胞の継代数によらなかった。６日目に、共培養物は、極めて高い増殖速度を示し、充実した高密度の多層血管ネットワークが形成された。
【００６７】
細管形成の半定量的評価から、共培養物は、３日目よりも６日目に有意に多くの細管を有していたことが示された（ｐ＜０．００１）。増殖因子なしで増殖させた対照細胞、並びに増殖因子高含有ＥＧＭ−２培地中で増殖させたＨＵＶＥＣ単独は、それぞれ少しの細管しか形成されないか、又は細管が形成されないことが示された。
【００６８】
共培養物はまた、免疫細胞化学染色に供した。ＰＤＧＦＲβ発現は３日目で最も強く、継続的に成長する細管を取り囲むドット様の構造として観察された。６日目に、ある程度のＰＤＧＦＲβが観察された。ＣＯＬＩＶは、基底膜の成長を示しており、共培養物中でかなり広範囲に発現された。発現は、成長する細管と共に局在しており、細管を覆っていた。６日目、共培養物中でα−ＳＭＡ及びＳＭＭＨＣ陽性細胞は広範囲に発現され、これらは細管構造の分岐点及び細管と細管との間に局在することが多かった。ＳＭＭＨＣ発現は３日から６日の間に増加した。共培養モデルは、完全な基底膜の形成、及び細管の内側を覆う収縮特性を有する平滑筋細胞などの成熟した血管の特性を有する高密度の多層血管ネットワークを形成すると結論付けることができる。この共培養モデルは、以前に開発されたどの血管新生モデルよりも成熟している。
【００６９】
（例２）
単一培養ベースの細管形成プラットフォームの構築及び特徴付け
ヒトＡＳＣを例１で説明されているようにして得て、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で４８ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）マルチディッシュ、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に細胞２００００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。細胞を、３日間又は６日間のいずれかで、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地、すなわちＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、アスコルビン酸、ヘパリン、０．１％ゲンタマイシン／アンホテリシン−Ｂ、及び２％ＦＢＳを含む市販の増殖因子高含有培地中で、又は１５％ＨＳ、１ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、及び１％ＡＢ／ＡＭが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。培地を交換し、上記処理を、３日間培養した細胞に１回、６日間培養した細胞に２回行った。分析対照として、ｈＡＳＣを、１５％ＨＳ、１ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、及び１％ＡＢ／ＡＭが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。
【００７０】
結果：
ｈＡＳＣ単一培養では、血管新生への誘導は、共培養の場合ほど充実していなかった。しかしながら、単一培養では、血管を支持する周細胞及び平滑筋細胞マーカーがしばしば観察された。
【００７１】
（例３）
インビトロの心臓血管モデルの構築及び特徴付け
この実施例で使用されたＨＵＶＥＣ及びｈＡＳＣを例１で説明されているようにして得た。２〜３日齢の新生仔ラットから新生仔ラットの心筋細胞を抽出した。
【００７２】
４８ウェルプレートでインビトロの心臓血管モデルを以下のようにして構築した：
【００７３】
０日目：細管形成プラットフォームの構築
【００７４】
共培養モデル：ｈＡＳＣ（第４継代まで）を、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で４８ウェルプレートに細胞２００００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。１〜３時間後、ＥＧＭ−２培養培地中のＨＵＶＥＣ（第４継代まで）を慎重にｈＡＳＣの上に細胞４０００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。
【００７５】
単一培養モデル：ｈＡＳＣ（第４継代まで）を、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で４８ウェルプレートに細胞２４０００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。
【００７６】
１日目：インビトロの心臓血管モデルの構築
【００７７】
完全無血清培地（ＣＳＦＭ）中の新生仔ラットの心筋細胞（細胞１０００００個、２０００００個、又は４００００個）を細管形成プラットフォーム上に植え付けた。
【００７８】
２日目：分化の誘導
【００７９】
培地を、１０ｎｇ／ｍｌ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び１ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）が補充されたＣＳＦＭに交換した。培地を週３回新しい培地に交換した。
【００８０】
結果：
新生仔ラットの心筋細胞は、単一培養モデルでは約７日間、共培養モデルでは少なくとも１４日間、生存可能であり収縮性であった（表１を参照）。培養時間中ずっと、形態学的に筋状の細胞形態が維持された。培養中ずっと、心筋細胞は細管構造に沿って、又は細管構造に近接して配向され、同調して収縮した。
【表１】
2014519837.tif 000002
【００８１】
（ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔシングルクオーツ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔｓ）サプリメント、Ｌｏｎｚａ）及びヘパリン（ＥＧＭ−２シングルクオーツサプリメント、Ｌｏｎｚａ）。
【００８２】
培地３：２％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清．Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、及び１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２が補充されたＣＳＦＭ。
【００８３】
培地４：血管新生刺激培地：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、０．１％ゲンタマイシン（ＧＡ−１０００、Ｌｏｎｚａ）、２％ウシ胎仔血清、及び１ｍＭのＬ−グルタミンが補充された内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ−２、Ｌｏｎｚａ）。
【００８４】
培地５：血管新生刺激培地＋ヒト血清：１０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子及び１ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２、Ｓｉｇｍａ）、０．１％ゲンタマイシン（ＧＡ−１０００、Ｌｏｎｚａ）、及び２％ヒト血清（Ｌｏｎｚａ）血清、及び１ｍＭのＬ−グルタミンが補充された内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ−２、Ｌｏｎｚａ）。
【００８５】
（例４）
比較の結果
新生仔ラットの心筋細胞（ＮＲＣ）の細管形成及び心筋細胞の収縮性を、共培養ベースの細管形成プラットフォームの７種の異なる処理で評価した。
【００８６】
培地１：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）及び１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＣＳＦＭ（完全無血清培地）。
【００８７】
５０ｍｌのＣＳＦＭは、以下の成分で構成された：
−  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２                      ４２ｍｌ
−  ２００ｍＭのＬ−グルタミン              ０．６４ｍｌ
−  １００×ペニシリン／ストレプトマイシン  ０．５ｍｌ
−  ０．１ｎＭのＴ３                        ０．５μｌ
−  １０×ＢＳＡ                            ５ｍｌ
−  １００ｍＭのピルビン酸ナトリウム        １．４ｍｌ
−  ＩＴＳ                                  ０．５７６ｍｌ。
【００８８】
培地２：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、アスコルビン酸（ＥＧＭ−２シングルクオーツサプリメント、Ｌｏｎｚａ）、ヒドロコルチゾンが補充されたＣＳＦＭ、培地６：ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ）であり、この場合、２％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）を２％ヒト血清（Ｌｏｎｚａ）に置き換えた。
【００８９】
培地７：ウシ胎仔血清を含まないＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ−培地（Ｌｏｎｚａ）。
【表２】
2014519837.tif 000003
【００９０】
（例５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト心臓血管モデルの構築及び特徴付け
この実施例で使用されたＨＵＶＥＣ及びｈＡＳＣを例１で説明されているようにして得た。ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を、Ｍｕｍｍｅｒｙら（同じ個所）で説明されているようにして２週間分化させた。拍動する細胞群を切り出し、解離させ、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、及び１％グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＥＢ培地）中で培養した。
【００９１】
４８ウェルプレート中でインビトロの心臓血管モデルを以下のようにして構築した：
【００９２】
０日目：細管形成プラットフォームの構築
【００９３】
共培養モデル：ｈＡＳＣ（第４継代まで）を、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で４８ウェルプレートに細胞２００００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。１〜３時間後、ＥＧＭ−２培養培地中のＨＵＶＥＣ（第４継代まで）を慎重にｈＡＳＣの上に細胞４０００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。
【００９４】
単一培養モデル：ｈＡＳＣ（第４継代まで）を、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中で４８ウェルプレートに細胞２４０００個／ｃｍ２の密度で植え付けた。
【００９５】
１日目：インビトロの心臓血管モデルの構築
【００９６】
ＥＢ中のヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を、細管形成プラットフォーム上に植え付けた（４８ウェルプレートのウェル１つあたり細胞１〜７個の集合体）。
【００９７】
２日目：分化の誘導
【００９８】
培地を、１０ｎｇ／ｍｌ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び１ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）が補充されたＥＢに交換した。培地を週３回新しい培地に交換した。
【００９９】
結果：
図４は、共培養モデルでは、ヒト心筋細胞は機能的であり、すなわち収縮性があり、さらに１０日後でも成熟したような心筋細胞の典型的な形態を示したことを示している。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月24日(2014.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）を含む単離された細管形成プラットフォームと、
ｉｉ）心筋細胞
を含む、インビトロの心臓血管構造物。
【請求項２】
前記細管形成プラットフォームが、細管を形成する内皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の構造物。
【請求項３】
前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、内皮前駆細胞、及び遺伝学的改変により得られた内皮細胞からなる群より選択される、請求項２に記載の構造物。
【請求項４】
前記心筋細胞が、新生仔ラットの心筋細胞、ｈｉＰＳＣ由来心筋細胞、ｈＥＳＣ由来心筋細胞、成体幹細胞由来心筋細胞、分化転換によって誘導された心筋細胞、及びヒト初代心筋細胞からなる群より選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の構造物。
【請求項５】
合成ポリマー、天然ポリマー、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、及びその他の細胞外マトリックス構成成分、又はそれらの混合物からなる群より選択される外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料をさらに含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の構造物。
【請求項６】
心疾患の治療に使用するための、請求項１から５までのいずれか一項に記載の構造物。
【請求項７】
前記心疾患が、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択される、請求項６に記載の構造。
【請求項８】
ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）のみに由来する単離された細管形成プラットフォーム。
【請求項９】
外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない、請求項８に記載のプラットフォーム。
【請求項１０】
ａ）ｈＡＳＣを用意するステップと、
ｂ）該ｈＡＳＣを、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２が補充された細胞培養培地中で、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で培養するステップと
を含む、請求項８に記載の細管形成プラットフォームの製造方法。
【請求項１１】
ａ）ｈＡＳＣ、心筋細胞、及び任意選択で細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、
ｂ）該ｈＡＳＣを、任意選択で該細管を形成する内皮細胞と共に培養するステップと、
ｃ）該心筋細胞を、ステップｂ）で形成された培養物上で培養するステップと、
ｄ）ステップｃ）で形成された細胞培養物に、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２を投与するステップと
を含む、請求項１に記載のインビトロの心臓血管構造物の製造方法。
【請求項１２】
前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、及び内皮前駆細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）請求項１に記載のインビトロの心臓血管構造又は請求項８に記載の細管形成プラットフォームを提供するステップと、
ｂ）該構造又はプラットフォームに、該試験物質を投与するステップと、
ｃ）該構造又はプラットフォームで該試験物質の作用を決定するステップと、
ｄ）ステップｃ）で決定された作用と、それに対応する該試験物質の非存在下で決定された作用とを比較するステップと
を含む、試験物質の生物活性を決定する方法。
【請求項１４】
前記決定される生物活性が、細胞毒性、細管形成の調節活性、電気的特性、例えば、心筋細胞の速度規則性、再分極時間の持続時間、催不整脈性の存在、機械的特性、例えば、心筋細胞の収縮力、及び細胞代謝からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
基礎培地、
２００ｍＭのＬ−グルタミン、
１００×ペニシリン／ストレプトマイシン、
０．１ｎＭのＴ３、
１０×ＢＳＡ、
１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び
ＩＴＳ
を含む、完全無血清細胞培養培地。
【請求項１６】
ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン及びヘパリンをさらに含む、請求項１５に記載の細胞培養培地。
【国際調査報告】
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