(57)【要約】直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter spp）菌種に由来するフィターゼと組み合わせて含む、試料添加用組成物、並びに対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料要求率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、に関係する方法であって、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter spp）菌種に由来するフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種に由来するフィターゼと組み合わせて含む、飼料添加用組成物。
【請求項２】
前記フィターゼが：シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、及びシトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）からなる群から選択されるシトロバクター（Citrobacter）細菌に由来するものである、請求項１に記載の飼料添加用組成物。
【請求項３】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する、請求項１又は２に記載の飼料添加用組成物。
【請求項４】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３に由来するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項５】
前記フィターゼが６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）である、請求項１に記載の飼料添加用組成物。
【請求項６】
前記フィターゼが：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項７】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９９．１％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項８】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、前記１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：４Ｐ、４６Ｅ、１０７Ｇ、１１１Ｐ、１１９Ｋ、１６２Ｃ、２２３Ｅ、２４１Ｑ、２７３Ｌ、２７６Ｋ、３７９Ｋ、３８５Ｄ、９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、３１Ｃ、１１９Ｋ、２０２Ｎ、２８６Ｑ、及び３６２Ｋ、Ｒ、から選択される、請求項６又は７に記載の飼料添加用組成物。
【請求項９】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、前記１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、から選択される、請求項８に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１０】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ４．５の範囲である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１１】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ３．５の範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１２】
前記直接給与微生物が、抗病原性直接給与微生物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１３】
前記直接給与微生物が生細菌である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１４】
前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上の細菌を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１５】
前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus  amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）、ビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp．animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上の細菌を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１６】
前記直接給与微生物が、次の：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ１８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１７】
前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１８】
前記フィターゼが、２００ＦＴＵ／飼料添加用組成物（ｇ）〜１００００ＦＴＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項１９】
前記プロテアーゼが、１０００ＰＵ／飼料添加用組成物（ｇ）及び６００００ＰＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項２０】
前記ＤＦＭが、３．７５×１０７ＣＦＵ／飼料添加用組成物（ｇ）及び１×１０１１ＣＦＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項２１】
対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、のための方法であって、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種に由来するフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を投与する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記フィターゼが：シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、及びシトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）、からなる群から選択されるシトロバクター（Citrobacter）細菌に由来するものである、請求項２０又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３に由来する、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記フィターゼが６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記フィターゼが：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９９．１％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：４Ｐ、４６Ｅ、１０７Ｇ、１１１Ｐ、１１９Ｋ、１６２Ｃ、２２３Ｅ、２４１Ｑ、２７３Ｌ、２７６Ｋ、３７９Ｋ、３８５Ｄ、９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、３１Ｃ、１１９Ｋ、２０２Ｎ、２８６Ｑ、及び３６２Ｋ、Ｒ、から選択される、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ４．５の範囲である、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ３．５の範囲である、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記直接給与微生物が抗病原性直接給与微生物である、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記直接給与微生物が生細菌である、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）、ビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記直接給与微生物が、次の：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ１８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）、のうちの１種以上である、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項２１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、を目的として、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種に由来するフィターゼと組み合わせて使用する、方法。
【請求項４０】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を使用する、請求項３９に記載の使用法。
【請求項４１】
前記フィターゼが：シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、及びシトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）、からなる群から選択されるシトロバクター（Citrobacter）細菌に由来するものである、請求項３９又は４０に記載の使用法。
【請求項４２】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４３】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３に由来する、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４４】
前記フィターゼが６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）である、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記フィターゼが：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項４６】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９９．１％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：４Ｐ、４６Ｅ、１０７Ｇ、１１１Ｐ、１１９Ｋ、１６２Ｃ、２２３Ｅ、２４１Ｑ、２７３Ｌ、２７６Ｋ、３７９Ｋ、３８５Ｄ、９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、３１Ｃ、１１９Ｋ、２０２Ｎ、２８６Ｑ、及び３６２Ｋ、Ｒ、から選択される、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、から選択される、請求項４７に記載の使用法。
【請求項４９】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ４．５の範囲である、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ３．５の範囲である、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記直接給与微生物が、抗病原体用直接給与微生物である、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記直接給与微生物が生細菌である、請求項３９〜５１のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５３】
前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５４】
前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）、ビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項３９〜５３のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５５】
前記直接給与微生物が、次の株：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ１８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５６】
前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項３９〜５５のいずれか一項に記載の使用法。
【請求項５７】
直接給与微生物（ＤＦＭ）、シトロバクター（Citrobacter spp.）菌種に由来するフィターゼ、場合により少なくとも１種のビタミン、場合により少なくとも１種のミネラル）、及び投与用の指示書を含む、キット。
【請求項５８】
前記キットが、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記フィターゼが：シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、及びシトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）、からなる群から選択されるシトロバクター（Citrobacter）細菌に由来するものである、請求項５７又は５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する請求項５７〜５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３からに由来する、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６２】
前記フィターゼが６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）である、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
前記フィターゼが：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項５７〜６２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６４】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９９．１％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項５７〜６３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６５】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：４Ｐ、４６Ｅ、１０７Ｇ、１１１Ｐ、１１９Ｋ、１６２Ｃ、２２３Ｅ、２４１Ｑ、２７３Ｌ、２７６Ｋ、３７９Ｋ、３８５Ｄ、９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、３１Ｃ、１１９Ｋ、２０２Ｎ、２８６Ｑ、及び３６２Ｋ、Ｒ、から選択される、請求項５７〜６４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記フィターゼが、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含み、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、から選択される、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ４．５の範囲である、請求項５７〜６６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６８】
前記フィターゼの至適ｐＨがｐＨ  ３〜ｐＨ  ３．５の範囲である、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６９】
前記直接給与微生物が、抗病原体用直接給与微生物である、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
前記直接給与微生物が生細菌である、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７１】
前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項５７〜７０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７２】
前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）、ビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項５７〜７１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７３】
前記直接給与微生物が、次の株：枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）；ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項５７〜７２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７４】
前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項５７〜７３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７５】
直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter spp.）菌種に由来するフィターゼと混合する工程、及び（所望により）パッケージングする工程、を含む、飼料添加用組成物の製造法。
【請求項７６】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。
【請求項７７】
前記フィターゼが、４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７６に記載の飼料。
【請求項７８】
前記ＤＦＭが、７．５×１０４ＣＦＵ／飼料（ｋｇ）及び１×１０７ＣＦＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項７６〜７７のいずれか一項に記載の飼料。
【請求項７９】
飼料成分を請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物と混合する工程を含む、家畜飼料の製造法。
【請求項８０】
直接給与微生物を、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ、並びに少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む飼料添加用組成物を含むプレミックス。
【請求項８１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を、少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む、プレミックス。
【請求項８２】
対象においてコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
【請求項８３】
壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症の予防及び／又は処置法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の有効量の飼料添加用組成物を対象に投与する、方法。
【請求項８４】
図面及び実施例を参照して本明細書において全体を定義される通りの飼料添加用組成物又は飼料又はキット又は方法又は使用法又はプレミックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直接給与微生物を、シトロバクター（Citrobacter）菌種に由来する（好ましくは、シトロバクター（Citrobacter）菌種に由来する）フィターゼ、特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する（好ましくは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する）フィターゼと組み合わせて用い、飼料組成物を改良するための方法、並びに直接給与微生物を、シトロバクター（Citrobacter）菌種に由来するフィターゼ、特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する（好ましくは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）に由来する）フィターゼと組み合わせて含む飼料添加用組成物、に関する。本発明は、更に、使用法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素添加物は、栄養効率及び生産効率を向上させるという方法として、動物用飼料、特に家禽及び豚用飼料に添加剤として使用されている。酵素ブレンドを利用することで、大豆ミール、動物性タンパク質ミール、又は高繊維飼料副産物を含有している試料の栄養価を改良することができる。直接給与微生物（ＤＦＭ）という概念は、ストレス期（疾患、飼料の移行、環境ストレス又は生産期）にあるブロイラーなどの動物に、有益な微生物を給与することに関与する。この分類に当てはまる飼料添加物にはプロバイオティクスという別称があり、これまでにプロバイオティクス又はＤＦＭは、管理下試験において、動物の生産性能を向上させることが示されている。ＤＦＭは、直接給与微生物及び／又は酵母系の産物を含有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＤＦＭと一部の酵素とを組み合わせることはこれまでも企図されてきたが、ＤＦＭと外来性酵素とを動物用飼料に組み込むことについては完全には解明されていない。本発明は、動物の生産性能を非常に向上させる新規の特定の組み合わせに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＤＦＭを、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは由来する）フィターゼと組み合わせることで、動物性能に対し非常に有益な効果が得られるという発見に基づくものである。
【０００５】
詳細には、本発明は、ＤＦＭを、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは由来する）フィターゼと組み合わせることで、動物性能に対し、次の：飼料要求率（ＦＣＲ）、原材料の消化性能（例えば、栄養素消化性能、アミノ酸の消化性能など）、窒素保持、生存時間、枝肉歩留まり、成長速度、体重増加、飼料要求率、壊死性腸炎に対する動物の抵抗性、対象とする動物の免疫応答性、対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖、のうちの１つ以上の点で、非常に有益な効果が得られるという発見に基づくものである。
【０００６】
その他に本発明は、対象とする動物から得られる糞尿の成分に含まれる排出栄養素量を減少させ得る（例えば、窒素及びリンの排出を減少させる）という点でも、驚くべきものである。
【０００７】
一態様では、本発明は、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼと組み合わせて含む（又は組み合わせることで本質的に構成される、又は組み合わせることで構成される）、飼料添加用組成物を提供する。
【０００８】
他の態様では、本発明は、対象とする動物の性能の向上、又は飼料に含まれる原材料に対する消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料要求率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、に関係する方法を提供し、本方法は、直接給与微生物を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む。
【０００９】
本発明の更に他の態様では、対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料要求率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、を目的として、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼと組み合わせて使用する。
【００１０】
本発明の更なる態様は、直接給与微生物（ＤＦＭ）、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼ、任意に少なくとも１種のビタミン、任意に少なくとも１種のミネラル、及び投与についての指示書、を含む、キットを提供する。
【００１１】
他の態様では、本発明は、飼料添加用組成物の製造法を提供し、方法は、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼと混合する工程と、（任意に）パッケージングする工程と、を含む。
【００１２】
本発明の更に他の態様では、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼと組み合わせてを含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）、飼料又は動物用飼料を提供する。
【００１３】
直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼ、及び少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を含む、プレミックス。
【００１４】
他の態様では、本発明は、直接給与微生物（ＤＦＭ）を、シトロバクター（Citrobacter）菌種（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii））に由来する（好ましくは、由来する）フィターゼと組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物と、飼料成分とを混合する工程を含む、動物用飼料の製造法を提供する。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、対象とする動物におけるコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための、本発明の飼料添加用組成物に関する。
【００１６】
本発明は、壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症を予防及び／又は処置する方法を更に提供し、本方法は、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３由来のフィターゼ（６−フィターゼ）活性を有するポリペプチドの配列（配列番号１）を示す。配列鎖の最初のＸａａはＧｌｙであり、配列鎖の２番目のＸａａはＰｒｏである。最初の２２個のアミノ酸（下線）は、成熟タンパク質では切断されているシグナルペプチドである。したがって、成熟タンパク質は、アミノ酸配列の第２３番目のアミノ酸から開始する。したがって、成熟タンパク質は第２３番目〜第４３３番目のアミノ酸からなる。この酵素は、ＤＳＭ／ＮｏｖｏｚｙｍｅｓからＲｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）として市販される。
【図２】シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）由来のフィターゼ活性を有するポリペプチドの配列（配列番号２）を示す。配列鎖の最初のＸａａはＧｌｙであり、配列鎖の２番目のＸａａはＰｒｏである。最初の２２個のアミノ酸（下線）は、成熟タンパク質では切断されているシグナルペプチドである。したがって、成熟タンパク質は、アミノ酸配列の第２３番目のアミノ酸から開始する。したがって、成熟タンパク質は第２３番目〜第４３３番目のアミノ酸からなる。
【図３】フィターゼ（６−フィターゼ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列（配列番号３）を示す。配列番号３のヌクレオチド６７〜１２９９は、フィターゼ活性を有するポリペプチド（すなわち、配列番号１に示すポリペプチド）をコードする（ｒはｇ又はａを意味し、ｙはｔ／ｕ又はｃを意味し、かつｓはｇ又はｃを意味する）。
【図４】フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列（配列番号４）を示す。配列番号４のヌクレオチド６７〜１２９９は、フィターゼ活性を有するポリペプチド（すなわち、配列番号２に示すポリペプチド）をコードする（ｒはｇ又はａを意味し、ｙはｔ／ｕ又はｃを意味し、かつｓはｇ又はｃを意味する）。
【図５】シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼ（６−フィターゼ）活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図６】フィターゼ活性を有するポリペプチド（すなわち、配列番号５に示すポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図７】シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５由来のフィターゼ（６−フィターゼ）活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図８】コウジカビ（Aspergillus oryzae）で発現させた、ペニフォラ・リシイ（Peniphora lycii）由来のフィターゼ（６−フィターゼ）を含むアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＤＳＭ  ＆  ＮｏｖｏｚｙｍｅｓからＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ（商標）として市販。
【図９】シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来の、フィターゼ活性を有するポリペプチドの配列（配列番号９）を示す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受諾番号Ｑ６７６Ｖ７）。
【図１０】シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来の、フィターゼ活性を有するポリペプチドの配列（配列番号１０）を示す（ＥＢＩ受託番号ＥＭ−ＰＲＯ：ＡＹ３９０２６２）。
【図１１】フィターゼ活性を有するポリペプチド（すなわち、配列番号１０に示すポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
好ましくは、本発明で使用する酵素は、ＤＦＭにとって外来性のものである。換言すれば、好ましくは、酵素はＤＦＭに加えられ、又はＤＦＭと混合される。
【００１９】
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びに、Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くについての一般的辞書を当業者に提供する。
【００２０】
本開示は、本明細書において開示される代表的な方法及び材料に限定されるものではなく、本開示の実施形態を実施又は試験するにあたって、本明細書に開示されるものと類似する又は同等である任意の方法及び材料を使用することができる。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。別途記載のない限り、任意の核酸配列は、それぞれ、左から右に５’→３’の向きで記載され、アミノ酸配列は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記載される。
【００２１】
本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。
【００２２】
本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸名、３文字略記、又は１文字略記により参照される。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを包含する。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【００２５】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に対し一般的な１文字表記及び２文字表記が用いられる場合がある。アミノ酸の３文字表記は、ＩＵＰＡＣＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義される通りのものである。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。
【００２６】
用語についての他の定義は本明細書中で明らかになる場合がある。実施例をより詳細に説明する前に、本開示は記載される具体的な実施形態に制限されるものではなく、言うまでもなく、多岐にわたることは理解される。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるであろう。
【００２７】
値について範囲が提供される場合、文脈上明記されていない限り、下限とする単位の少数第一位までが開示されているものとし、それ以外には、範囲の上限値及び下限値の間の各数値も明確に開示されているものとする。規定の任意の値又は規定の範囲に含まれる値、及びその他の任意の規定の値又は規定の範囲に含まれる値、に挟まれる、より小さな各々の範囲も本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に包含させることができ、あるいは除外させることができ、かつ各範囲が、記載の範囲内の任意の特定の制限を包含するよう、上限及び下限のいずれかを包含し、又はいずれも包含せず、又はいずれをも包含する、より小さな範囲も本開示に包含させる。規定の範囲が上限又は下限のいずれか又は両方を含有する場合、これらの含有される上限又は下限のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【００２８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。したがって、例えば、「酵素（an enzyme）」には、複数の候補となる剤が包含され、「飼料（the feed）」を参照する場合には、当業者に知られる１種以上の飼料及びその同等物等が包含される。
【００２９】
本明細書で述べる開示は、本開示の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術に相当するものと解釈すると判断される記載は存在しない。
【００３０】
本発明において使用される酵素は、バッチ培養法、フェドバッチ培養法、及び連続培養法などの、固体培養又は液内培養のいずれかにより製造することができる。培養は、水溶性無機塩類培地、有機増殖因子、炭素供給源及びエネルギー供給源、酸素分子、及び言うまでもなく、採用した１種以上の特定の微生物の初回接種材料、を含む、増殖培地で実施する。
【００３１】
直接給与微生物（ＤＦＭ）
本明細書において、用語「微生物（microbial）」は、「微生物（microorganism）」と互換的に使用される。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語、「ＤＦＭ」は、直接給与微生物を意味する。
【００３３】
好ましくはＤＦＭは生細菌を含む。好ましくは、ＤＦＭは生細菌、又は生酵母、又は生真菌を含む。
【００３４】
好ましくはＤＦＭは生細菌を含む。
【００３５】
用語「生細菌」は、代謝的に活性であるか、又は分化することのできる微生物を意味する。
【００３６】
一実施形態では、ＤＦＭは、芽胞形成細菌であってよく、すなわち用語「ＤＦＭ」は、芽胞、例えば細菌芽胞からなり、又は芽胞を含有する。したがって、一実施形態では、本明細書で使用される用語「生細菌」には、芽胞又は分生子などの細菌芽胞が包含される場合がある。
【００３７】
他の実施形態では、本発明に従う飼料添加用組成物に含まれるＤＦＭは、細菌芽胞、例えば、芽胞又は分生子からは構成されず、又は細菌芽胞を含有しない。
【００３８】
微生物は天然に生じる微生物であっても、あるいは形質転換を起こした微生物であってもよい。微生物は、好適な微生物の組み合わせであってもよい。
【００３９】
一部の態様では、本発明に従うＤＦＭは、微生物、酵母、又は真菌のうちのいずれか１種以上であり得る。
【００４０】
好ましくは、本発明に従うＤＦＭはプロバイオティク微生物である。
【００４１】
本発明では、用語「直接給与微生物（ＤＦＭ）」は、直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与真菌、及びこれらの組み合わせを包含する。
【００４２】
好ましいＤＦＭは、直接給与微生物である。
【００４３】
好ましくは、ＤＦＭは２種以上、例えば、３種以上又は４種以上の細菌を含む混合物である。
【００４４】
好ましくは、これらの単独種又は複数種の微生物は、単離されたものである。
【００４５】
好適なＤＦＭは、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、バチルス（Bacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属及びメガスフェラ（Megasphaera）属、並びにこれらの組み合わせ、のうちの１種以上に由来する細菌を含み得る。
【００４６】
一実施形態では、ＤＦＭは、次のバチルス菌種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）から選択され得る。
【００４７】
一実施形態では、ＤＦＭは２種以上のバチルス（Bacillus）株を含む混合物であり得る。
【００４８】
一実施形態では、ＤＦＭは２種以上のバチルス（Bacillus）株を含む混合物であり得る。
【００４９】
一実施形態では、ＤＦＭは、２種以上の枯草菌（Bacillus subtilis）株、３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）、２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）、ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）、及びＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）の混合物であり得る。
【００５０】
株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、及び２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）より公的に入手可能である。
【００５１】
株２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５）は、米国の農業研究サービス機関の系統保存株（ＮＲＲＬ）より公的に入手可能である。枯草菌（Bacillus subtilis）株ＬＳＳＡ０１はしばしば枯草菌８と呼ばれる。
【００５２】
これらの株については米国特許第７，７５４，４６９（Ｂ２）号に教示される。
【００５３】
枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＳ  １８及び枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＳ  ２７８は、ブダペスト条約の下、Ａｎｄｙ  Ｍａｄｉｓｅｎ（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６，ＵＳＡ）又はＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６，ＵＳＡ）により、農業研究サービス機関の微生物株保存施設（ＮＲＲＬ）（１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）に、それぞれ寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３及びＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４で２０１２年１月９日に寄託されている。
【００５４】
Ａｎｄｙ  Ｍａｄｉｓｅｎ（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６，ＵＳＡ）及びＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｗ２２７  Ｎ７５２  Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ  Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ  ５３１８６）、ＵＳＡ  ａｕｔｈｏｒｉｓｅ  Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ（Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ  １，ＰＯ  Ｂｏｘ  １７，ＤＫ−１００１，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）は、本開示において、これらの寄託された生物材料を指すものであり、制限は受けておらず、かつ取り消しを受けぬよう、寄託された材料は公共に利用され得るものであると承認されている。
【００５５】
一部の実施形態では、ＤＦＭは、次の表に詳しく記載する枯草菌（Bacillus subtilis）株を含む混合物であり得る。
【００５６】
【表１】
2014509846.tif 000002
【００５７】
一実施形態では、ＤＦＭは次のラクトコッカス種（Lactococcus spp）：ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、及びラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、及びこれらの混合物から選択され得る。
【００５８】
一実施形態では、ＤＦＭは次のラクトバチルス菌種：ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ビフィダス（Lactobacillus bifidus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス・へルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、発酵ラクトバチルス（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、デルブリュッキ菌（Lactobacillus delbreuckii）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ガセリ菌（Lactobacillus gasseri）、ジョンソニイ菌（Lactobacillus johnsonii）、及びラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、並びにこれらのうちの任意の組み合わせから選択され得る。
【００５９】
一実施形態では、ＤＦＭは次のビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）：ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidium）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及びビフィドバクテリウム・アンギュラツム（Bifidobacterium angulatum）、並びにこれらのうちの任意の組み合わせ、から選択され得る。
【００６０】
好適なＤＦＭは次の属：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）、ビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、枯草菌（Bacillus subtilis）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含み得る。
【００６１】
本発明に使用される直接給与微生物は、同じ種類（属、種及び株）であってよく、又は複数の属、種、及び／又は株の混合物を含んでよい。
【００６２】
本発明に従う好適なＤＭＦは、次の表に記載される通りの１種以上の製品、又はこれらの製品に含有される微生物を含んでよい。
【００６３】
【表２−１】
2014509846.tif 000003
【００６４】
【表２−２】
2014509846.tif 000004
【００６５】
一実施形態では、好適なＤＦＭはＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）である場合がある。Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから市販されている製品であり、バチルス（Bacillus）株２０８４  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲｌ  Ｂ−５００１３、バチルス（Bacillus）株ＬＳＳＡＯ１  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０４及びバチルス（Bacillus）株１５Ａ−Ｐ４  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０７の混合物である（米国特許第７，７５４，４６９（Ｂ）号に教示の通りのものである−参照により本案件に組み込まれる）。
【００６６】
好適には、ＤＦＭにはサッカロミセス菌種（Saccharomyces spp）由来の酵母を含ませることができる。
【００６７】
好ましくは、本発明に従って使用されるＤＦＭは、一般に安全であると認識されている微生物であり、好ましくはＧＲＡＳにより認可されている微生物である。
【００６８】
当業者であれば、食品産業及び／又は農産業において使用され、動物による消費に好適であると一般的に考えられ、本明細書に記載の属の範囲に含まれる微生物の、具体的な種及び又は株は容易に見当がつくであろう。
【００６９】
好ましくは、本発明に従って使用されるＤＦＭは、動物による消費に好適なものである。
【００７０】
有利なことに、製品は飼料又は飼料添加用組成物であり、生活性を有するＤＦＭは、製品の一般的な「販売期限」又は「消費期限」の間、すなわち飼料又は飼料添加用組成物が販売業者によって販売される期間中は効果を保持すべきである。所望の期間及び一般的な貯蔵寿命は、家畜用飼料によって異なる場合があり、当業者であれば、貯蔵寿命は、家畜用飼料の種類、家畜用飼料の容量、保管温度、加工条件、梱包材料及び梱包装置に応じ変化することを認識するであろう。
【００７１】
一部の実施例では、ＤＦＭが熱に耐性を有すること、すなわち熱耐性であることが重要である。これは特に、飼料がペレット形態である場合に当てはまる。したがって、一実施形態では、ＤＦＭは熱耐性微生物であり、例えば、バチルス菌種（Bacillus spp）などの熱耐性細菌であってよい。
【００７２】
一部の実施例では、ＤＦＭが芽胞形成細菌、例えば、バチルス菌種などのバチルス（Bacilli）であることが好ましい場合がある。バチルス（Bacilli）は、増殖に望ましくない条件下で安定な芽胞を形成することができる微生物であり、熱、ｐＨ、湿度、及び殺菌剤に対し非常に抵抗性である。
【００７３】
一実施形態では、ＤＦＭは、腸内での病原微生物（ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又は大腸菌（E. coli）及び／又はサルモネラ菌（Salmonella spp）及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）など）の増殖を低減又は予防できることが好適である。
【００７４】
本発明のＤＦＭは、任意の好適なＤＦＭであってよい。一実施形態では、本発明に従うＤＦＭは、阻害株（又は抗病原体株）であってよい。一実施形態では、次のアッセイ「ＤＦＭアッセイ」により、ＤＦＭに好適な微生物を判定することができる。誤解を避けるため、一実施形態では、本明細書で教示する「ＤＦＭアッセイ」に従って抑制株（又は抗病原ＤＦＭ）として選別されたＤＦＭは、本発明に従って使用するのに、すなわち、本発明に従う飼料添加用組成物に使用するのに好適なＤＦＭである。
【００７５】
ＤＦＭアッセイ：
各試験管に、代表的なクラスターの代表的な病原体を接種した。
【００７６】
可能性の高いＤＦＭの好気的又は嫌気的増殖物の上清を試験管に接種し、インキュベートした。
【００７７】
インキュベート後、各病原体について、対照処理及び上清処理を行った試験管の吸光度（ＯＤ）を測定した。
【００７８】
対照と比較してＯＤの値が低かった株（潜在的ＤＦＭ）のコロニーを阻害株（又は抗病原性ＤＦＭ）として分類した。
【００７９】
本明細書で使用するＤＦＭアッセイは、米国特許第２００９／０２８００９０号（参照により本案件に組み込まれる）により詳細に説明される。
【００８０】
好ましくは、アッセイに使用される代表的な１種（以上の）病原体は、次の：ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、及び／又は大腸菌（E. coli）、及び／又はサルモネラ菌種（Salmonella spp）、及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）などのクロストリジウム（Clostridium）属である。好ましい実施形態では、アッセイは、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、及び／又は大腸菌（E. coli）のうちの１種以上を用い実施され、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、より好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）を用い実施される。
【００８１】
一実施形態では、本発明のＤＦＭは好ましくは抗病原体である。
【００８２】
本明細書で使用するとき、用語「抗病原性」は、ＤＦＭが、病原体のもつ作用（例えば、負の効果）に対抗することを意味する。
【００８３】
一実施形態では、ＤＦＭが本発明に従う抗病原性のものであるかどうかを判定するのに、上記のＤＦＭアッセイを使用できる。上述の「ＤＦＭアッセイ」において、特に、病原体がウェルシュ菌（Clostridium perfringens）である際に阻害株であると分類された場合、ＤＦＭは抗病原性又は抗病原性ＤＦＭであると見なされる。
【００８４】
一実施形態では、抗病原体ＤＦＭは、次の微生物：枯草菌（Bacillus subtilis）株２０８４  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３、
枯草菌（Bacillus subtilis）株ＬＳＳＡＯ１  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０４、
枯草菌（Bacillus subtilis）株１５Ａ−Ｐ４  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０７、
枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０６、及び
枯草菌（Bacillus subtilis）株ＢＳ２７  ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０５、のうちの１種以上であり得る。誤解を避けるため、これらの株は入手可能なものであり、かつ米国特許第７，７５４，４５９（Ｂ）に引用されるものである。
【００８５】
一実施形態では、本発明に従って使用されるＤＦＭは、国際公開第２００８／０１６２１４号に教示されるようなガセリ菌（Lactobacillus gasseri）ＢＮＲ  １７株Ａｃｃ番号ＫＣＴＣ  １０９０２ＢＰではない。
【００８６】
好ましくは、ＤＦＭは、不活性化した微生物ではない。
【００８７】
一実施形態では、本明細書で使用されるＤＦＭは、本明細書に記載の通りのＤＦＭ微生物を１種以上含む組成物である。組成物には、本発明の酵素を更に含ませることができる。組成物は、直接給与微生物（ＤＦＭ）として動物に給与することができる。１つ以上の担体又はその他の材料をＤＦＭに添加することもできる。ＤＦＭは、例えば、トップドレス、若しくは液体ドレンチ剤に使用される水溶性濃縮物として、又は代用乳、ゼラチンカプセル、若しくはゲルに加えるなどして、様々な物理形態で存在させることができる。トップドレス形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び／又はアルミノ珪酸ナトリウムなどの担体に添加する。水溶性濃縮物の一実施形態では、液体ドレンチ剤用又は代用乳添加剤用の凍結乾燥させた発酵産物を、水溶性担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、乾燥デンプン、アルミノ珪酸ナトリウムに添加し、液体を加えてドレンチ剤を生成するか、又は乳又は代用乳に添加剤を加えるかする。ゼラチンカプセル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、糖、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び／又はアルミノ珪酸ナトリウムに加える。一実施形態では、微生物及び担体は分解性ゼラチンカプセルに封入される。ゲル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、ゲルを形成するための、担体、例えば植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、及び／又は合成着色料に加える。
【００８８】
ＤＦＭは、所望により添加剤の乾燥製剤と混合してよく、このような乾燥製剤としては、増殖基質、酵素、糖、炭水化物、抽出物、及び増殖促進目的の微量成分が挙げられるが、これらに限定されない。糖としては、次の：ラクトース、麦芽糖、ブドウ糖、マルトデキストリン、ブドウ糖、フルクトース、マンノース、タガトース、ソルボース、ラフィノース、及びガラクトースが挙げられる。糖はそれぞれ又は合計して５０〜９５％の範囲である。抽出物には、可溶性の酵母又は乾燥酵母発酵産物が５〜５０％含有され得る。増殖促進剤には、トリプチケースが５〜２５％、乳酸ナトリウムが５〜３０％、及びＴｗｅｅｎ  ８０が１〜５％含有され得る。炭水化物としては、マニトール、ソルビトール、アドニトール、及びアラビトールが含まれ得る。炭水化物はそれぞれ又は合計して５〜５０％の範囲である。微量成分としては、炭酸カルシウムが０．５〜５．０％、塩化カルシウムが０．５〜５．０％、リン酸二カリウムが０．５〜５．０％、リン酸カルシウムが０．５〜５．０％、マンガンプロテアーゼが０．２５〜１．００％、及びマンガンが０．２５〜１．０％の範囲で含有され得る。
【００８９】
本明細書で記載のＤＦＭを調製する際、培養物及び担体（使用する場合）をリボンミキサー又はパドルミキサーに加え、約１５分混合することができる。ただし、この混合時間は増減させてよい。培養物と単体が均一に混合されるように成分を混合する。最終生成物は好ましくは流動性の乾燥粉末である。次に、ＤＦＭ又はこれを含む組成物を動物用飼料又は飼料プレミックスに添加することができ、又は動物用飲用水に添加することができ、又は当該技術分野で既知の他の手法により投与することができる（好ましくは、本発明の酵素とともに同時に）。動物用飼料には、本明細書に記載の１種以上のＤＭＦを添加でき、あるいは本明細書に記載の組成物を添加できる。
【００９０】
「少なくとも２種の株からなる混合物」は、２、３、４、５、又は６種以上の株の混合物を意味する。一部の実施例の株混合物では、割合は１％〜９９％で変化し得る。株混合物の他の実施例は２５％〜７５％である。株混合物の追加例では、各株約５０％である。混合物が２種を超える株を含む場合、この株は混合物中に実質的に同じ比率で、又は異なる比率で存在し得る。
【００９１】
ＤＦＭは適切に投与できる。
【００９２】
飼料へのＤＦＭの好適な投与量は、約１×１０３ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０９ＣＦＵ／飼料（ｇ）、好適には約１×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０８ＣＦＵ／飼料（ｇ）、好適には約７．５×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０７ＣＦＵ／飼料（ｇ）であり得る。
【００９３】
一実施形態では、ＤＦＭは約１×１０３ＣＦＵ／飼料（ｇ）超、好適には約１×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）超、好適には約７．５×１０４ＣＦＵ／飼料（ｇ）超で飼料に添加される。
【００９４】
飼料添加用組成物へのＤＦＭの好適な添加量は、約１×１０５ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０１３ＣＦＵ／組成物（ｇ）、好適には約１×１０６ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０１２ＣＦＵ／組成物（ｇ）、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０１１ＣＦＵ／組成物（ｇ）であり得る。
【００９５】
一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加用組成物に、約１×１０５ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１×１０６ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／組成物（ｇ）超で添加される。
【００９６】
一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加用組成物に、約２×１０５ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２×１０６ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／組成物（ｇ）超で添加される。
【００９７】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を意味し、単一の前駆細胞から分裂した細胞の凝集塊を示すコロニーに含まれる生細菌数に関する尺度である。
【００９８】
フィターゼ
フィチン酸（ｒｏｙｏ−イノシトール六リン酸）は、シリアル、豆類、及び油糧種子作物に含まれる重要な成分である。これらの植物において、リンの主要な貯蔵形態はフィターゼ塩の形態である。
【００９９】
フィターゼは、フィチン酸のリン酸モノエステルの加水分解を触媒し、これにより、段階的にミオ−イノシトールペンタキス−、テトラキス−、トリス−、ビス−及びモノホスフェートが生成され、並びに無機リン酸塩が遊離する。
【０１００】
用語「フィターゼ」は、フィチン酸などのリン酸エステルを加水分解して、無機リン酸を放出させることのできるタンパク質又はポリペプチドを意味する。フィターゼは、フィチン酸の他に、中程度にリン酸化されている少なくとも一部のイノシトールリン酸も加水分解することができる。
【０１０１】
本発明で使用されるフィターゼは、６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６として分類）、又は３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８として分類）に分類され得る。
【０１０２】
一実施形態では、フィターゼは、好ましくは６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）である。
【０１０３】
本発明で使用されるフィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）細菌に由来する（好ましくは由来する）。
【０１０４】
本発明で使用されるフィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）のフィターゼであり、好ましくは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）のフィターゼである。
【０１０５】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）（例えば、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３）、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）（例えば、Ｃ．フレウンディイ（C. freundii）ＮＣＩＭＢ  ４１２４７）、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）（例えば、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０５又はシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０７）、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）（例えば、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）ＤＳＭ  １３６９４）、シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、シトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）、又はシトロバクター（Citrobacter）種からなる群から選択されるシトロバクター（Citrobacter）細菌に由来し、好ましくは由来するものである。
【０１０６】
一実施形態では、フィターゼは、例えば、
・国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３に由来する、シトロバクター（Citrobacter）・フィターゼ−この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１として記載され、並びにこれらの変異体は、例えば、国際公開第２００７／１１２７３９号（参照により本案件に組み込まれる）及び同第２０１１／１１７３９６号（参照により本案件に組み込まれる）に記載の通りのものである、
・国際公開第２００４／０８５６３８号に記載の通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５−この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号７として記載される。
【０１０７】
・シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）、好ましくは、例えば、国際公開第２００６／０３８０６２号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２００６／０３８１２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのＣ．フレウンディイ（C. freundii）ＮＣＩＭＢ  ４１２４７、並びにそれらの変異体、又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受諾番号Ｑ６７６Ｖ７（本明細書において配列番号９として示す）又はＥＢＩ受諾番号ＥＭ−ＰＲＯ：ＡＹ３９０２６２（本明細書において配列番号１０として示す）により教示されるシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）のフィターゼ。
【０１０８】
・国際公開第２００６０３７３２７号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、好ましくは、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０５又はシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０７、
・シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、好ましくは国際公開第２００６０３７３２７号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）ＤＳＭ  １３６９４、又は
・シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、
・シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、
・シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、
・シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、
・シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、
・シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）、
・シトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）、
・シトロバクター・ファルメリ（Citrobacter farmeri）。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３に由来し得る、又は由来する、本明細書において配列番号１として示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ、並びに例えば、国際公開第２００７／１１２７３９号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２０１１／１１７３９６号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのこれらの誘導体であり、あるいはシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）、好ましくはＣ．フレウンディイ（C. freundii）ＮＣＩＭＢ  ４１２４７に由来し得る、又は由来する、本明細書において配列番号５として示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ、又はこれらの誘導体、例えば、国際公開第２００６／０３８０６２号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２００６／０３８１２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのこれらの誘導体であり、あるいはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受諾番号Ｑ６７６Ｖ７（本明細書において配列番号９として示す）に教示されるシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼ、あるいはＥＢＩ受諾番号ＥＭ−ＰＲＯ：ＡＹ３９０２６２に教示されるシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼ（本明細書において配列番号１０として示す）、あるいは国際公開第２００４／０８５６３８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５からに由来し得る、又は由来する、かつ本明細書において配列番号７として示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ、又はこれらの誘導体、である。
【０１１０】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３に由来し得る（又は由来する）フィターゼ（例えば、６−フィターゼ）、又はこれらの誘導体、例えば、国際公開第２００７／１１２７３９号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２０１１／１１７３９６号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りの誘導体である。
【０１１１】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、の断片、からなる群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドを含む。
【０１１２】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、の断片、からなる群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドを含む。
【０１１３】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、フィターゼ活性を有し、かつ配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９９．１％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含む。
【０１１４】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは：（ａ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、及び（ｂ）配列番号３又は配列番号４のアミノ酸６７〜１２９９と少なくとも９８．３％同一であるポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされていてよい。
【０１１５】
本発明で使用されるフィターゼは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１〜６６、又は（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１〜６６、からなるシグナルペプチドをコードしている、ヌクレオチド配列によりコードされていてよい。
【０１１６】
一部の実施例では、本発明で使用されるフィターゼは、上清を２部に分割し、一方を６０℃で３０分インキュベートし、他方を５℃で３０分インキュベートして、続いていずれについても３７℃、ｐＨ  ５．５にてｐ−ニトロフェニルホスフェートにより活性を評価することにより、残存活性を測定した場合に、熱安定性が向上していることが示される。ここで、フィターゼの持つ残存活性とは、６０℃でインキュベートした場合にサンプルが有する活性を、５℃でインキュベートした場合にサンプルが有する活性により除算したものであり、本明細書において配列番号１として示す参照フィターゼの残存活性は、同様の条件下で測定した場合に少なくとも１０５％である。
【０１１７】
一部の実施例では、本発明で使用するフィターゼは、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含んでよく、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：４Ｐ、４６Ｅ、１０７Ｇ、１１１Ｐ、１１９Ｋ、１６２Ｃ、２２３Ｅ、２４１Ｑ、２７３Ｌ、２７６Ｋ、３７９Ｋ、３８５Ｄ、９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑ、３１Ｃ、１１９Ｋ、２０２Ｎ、２８６Ｑ及び３６２Ｋ、Ｒ、から選択される。
【０１１８】
一部の実施例では、本発明で使用するフィターゼは、配列番号１又は配列番号２と比較して少なくとも１つ以上４つ以下の変更を含んでよく、１〜４つの変更のうち、少なくとも１つは、次の：９１Ｃ／４６Ｃ、５２Ｃ／９９Ｃ、３１Ｃ／１７６Ｃ、３１Ｃ／１７７Ｃ、５９Ｃ／１００Ｃ、１４１Ｃ／１９９Ｃ、１６２Ｃ／２４７Ｃ、１１１Ｐ／２４１Ｑから選択される。
【０１１９】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）として市販されているフィターゼである。
【０１２０】
酵素Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）は、本明細書において配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、本明細書において配列番号７として示されるアミノ酸配列、又はこれらの配列と少なくとも７５％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは９８％同一であるアミノ酸配列、を有する、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５フィターゼである。
【０１２２】
一実施形態では、フィターゼは、国際公開第２００６／０３８１２８号（参照により本案件に組み込まれる）に教示されるフィターゼ酵素などのシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来のフィターゼ、又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受諾番号Ｑ６７６Ｖ７（本明細書において配列番号９として示される）に教示されるシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼ、又はＥＢＩ受諾番号ＥＭ−ＰＲＯ：ＡＹ３９０２６２（本明細書において配列番号１０として示す）に教示されるシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼである。
【０１２３】
一実施形態では、フィターゼは、例えば、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来のフィターゼであってよく、国際公開第２００６／０３８１２８号（この開示は参照により本案件に組み込まれる）において教示されるフィターゼ酵素であってよい。
【０１２４】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、配列番号５、配列番号９、又は配列番号１０で示される通りのアミノ酸配列、あるいは配列番号５、配列番号９、又は配列番号１０と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である配列、あるいはこれらの機能性断片を含んでよい。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、用語「機能性断片」は、フィターゼ活性を有することを意味する。好ましくは「機能性断片」は、断片が、フィターゼ活性の種類及び／又は活性の程度の点から、完全長の配列の持つフィターゼ活性と同様の活性を有することを意味する。
【０１２６】
一実施形態では、好ましくは本発明で使用されるフィターゼは：（ａ）配列番号５、配列番号９、又は配列番号１０と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、並びに（ｂ）配列番号６又は配列番号１１と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド、からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１２７】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、次に示すヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号６として記載のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号６として記載のヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）として提示したヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
（ｄ）厳密な条件下で、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）として提示したヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列、
（ｅ）（ｄ）に詳述したヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、によりコードされる。
【０１２８】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、配列番号５に示される通りのアミノ酸配列を含んでもよく、この配列は、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼのものであるか、又はシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼと少なくとも９０％同一であり、ポリペプチドは、
配列番号５に対する付番に従って付番した次の：Ｒ２８８Ｍ；
Ｋ４６Ｅ／Ｑ８２Ｈ／Ｅ１６８Ｄ／Ｑ２７４Ｌ；Ｑ８２Ｋ／Ｔ１５４Ｉ／Ｑ２７９Ｅ／Ｎ３０８Ｔ；Ｑ８２Ｒ／Ｄ１１２Ｖ／Ｑ２７４Ｈ／Ｔ３６２Ａ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｔ１９９Ｉ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ；Ｋ４６Ｅ／Ｑ８２Ｈ／Ｎ１４８Ｄ／Ｔ１５４Ｉ／Ｔ３６２Ｉ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ｋ３５８Ｒ；Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｔ１５４Ｉ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ；
Ｋ４６Ｅ／Ｑ８２Ｈ／Ｎ９５Ｄ／Ｄ１１２Ｖ／Ｋ１４２Ｒ／Ｄ３８３Ｖ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｍ１５２Ｖ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ａ３９３Ｐ；Ｄ５３Ｋ／Ｄ５７Ｙ／Ｍ１５２Ｖ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ａ３９３Ｐ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｆ８８Ｙ／Ｍ１５２Ｖ／Ｐ２２９Ｓ／Ｑ２７９Ｅ／Ｎ３０８Ｔ；Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｍ１５２Ｖ／Ｅ２０４Ｖ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ａ３９３Ｐ；Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｍ１５２Ｖ／Ｔ１５４Ｉ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ａ３９３Ｐ；Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｑ８２Ｈ／Ｇ１０３Ｅ／Ｍ１５２Ｖ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ａ３９３Ｐ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｔ１４３Ｉ／Ｍ１５２Ｖ／Ｌ１７６Ｖ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ａ３９３Ｐ；Ｑ８２Ｋ／Ｆ８８Ｙ／Ｎ９６Ｐ／Ｑ９７Ｔ／Ｔ９８Ｇ／Ｖ１０５Ｉ／Ｑ２７４Ｈ／Ｑ２７９Ｅ／Ａ３９３Ｐ；Ｑ８２Ｒ／Ｆ８８Ｙ／Ｎ９５Ｐ／Ｎ９６Ｐ／Ｑ９７Ｔ／Ｑ２７９Ｅ／Ｉ３８４Ｌ／Ｐ３８６Ｑ／Ａ３９３Ｐ；Ｈ１８Ｑ／Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｅ７５Ｖ／Ｍ１５２Ｖ／Ａ１７０Ｔ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ｑ３８５Ｒ／Ａ３９３Ｐ；Ｑ８２Ｋ／Ｆ８８Ｙ／Ｎ９６Ｐ／Ｔ９８Ｇ／Ｙ１３６Ｎ／Ｍ１５２Ｖ／Ｙ１７７Ｆ／Ｔ３６２Ｉ／Ｉ３８４Ｆ／Ａ３９３Ｐ／Ｄ３９７Ｎ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｆ８８Ｙ／Ｎ９５Ｐ／Ｎ９６Ｐ／Ｖ１０５Ｉ／Ｄ１１２Ｖ／Ｙ１３６Ｎ／Ｎ１４８Ｄ／Ｎ１６４Ｄ／Ｑ２７４Ｈ／Ｔ３６２Ｉ／Ｉ３８４Ｌ／Ａ３９３Ｐ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｑ８２Ｋ／Ｆ８８Ｙ／Ｎ９５Ｐ／Ｐ１０２Ｌ／Ｖ１０５Ｉ／Ｙ１３６Ｎ／Ｎ１４８Ｄ／Ｙ１７７Ｆ／Ｑ２７４Ｈ／Ｑ２７９Ｅ／Ｔ３６２Ｉ／Ａ３９３Ｐ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｑ８２Ｋ／Ｆ８８Ｙ／Ｎ９６Ｐ／Ｔ９８Ｇ／Ｖ１０５Ｉ／Ｄ１１２Ｖ／Ｙ１７７Ｆ／Ｑ２７４Ｌ／Ｇ３４３Ａ／Ｔ３６２Ｉ／Ｉ３８４Ｌ／Ａ３９３Ｐ；
Ｅ２３Ｋ／Ｋ４６Ｅ／Ｑ８２Ｈ；
Ｋ４６Ｅ／Ｑ８２Ｈ／Ｑ３８５Ｒ；
Ｄ５３Ｎ／Ｄ５７Ｙ／Ｅ７５Ｖ／Ｍ１５２Ｖ／Ａ１７０Ｔ／Ｐ２２９Ｓ／Ｒ２８８Ｍ／Ｑ３８５Ｒ／Ａ３９３Ｐ；
からなる群から選択される変異を組み合わせて含み、
単離ポリペプチドは、配列番号５に示す配列を有するポリペプチドと比較して、熱安定性が向上している。
【０１２９】
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、配列番号７で示される通りのアミノ酸配列、又は配列番号７で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である配列、又はこれらの機能性断片を含んでよい。
【０１３０】
一実施形態では、好ましくは、本発明に従うシトロバクター（Citrobacter）フィターゼの至適ｐＨは３〜４．５の範囲である。一実施形態では、好ましくは、本発明に従うシトロバクター（Citrobacter）フィターゼは、ｐＨ約３〜３．５で高い活性を示し得る。
【０１３１】
国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３（この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１として示される）、並びに国際公開第２００４／０８５６３８号に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５（この酵素のアミノ酸配列は本明細書において配列番号７として示される）、のいずれも、至適ｐＨは３〜４．５の範囲である。
【０１３２】
国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３（この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１として示される）も、ｐＨ約３〜３．５下で最も高く活性を示し得る。
【０１３３】
国際公開第２００４／０８５６３８号に記載される通りのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５（この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号７として示される）は、ｐＨ約４下で最も高く活性を示し得る。
【０１３４】
好ましくは、１種以上のフィターゼを、例えば、２又は３種類のフィターゼを組み合わせて使用することができる。
【０１３５】
本発明では、１種以上のシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ（例えば、同一又は異なる種又は株由来のフィターゼ）を組み合わせて使用することもできることも企図される。あるいは、本明細書に詳述する通りの少なくとも１種のシトロバクター（Citrobacter）フィターゼを、シトロバクター（Citrobacter）のものではない１種以上のフィターゼと組み合わせて使用することもできる。
【０１３６】
一実施形態では、好ましくは、本発明に使用するシトロバクター（Citrobacter）フィターゼは、６−フィターゼである。
【０１３７】
一実施形態では、好ましくは、本発明に使用するシトロバクター（Citrobacter）フィターゼは、その他のフィターゼ（例えば、その他のシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ、又はシトロバクター（Citrobacter）のものではないフィターゼ）とは組み合わせずに使用される。
【０１３８】
好ましくは、フィターゼは、動物用飼料中に、約２００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約３００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約７５０ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約５００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で存在する。
【０１３９】
一実施形態では、フィターゼは、動物用飼料中に、約２００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約３００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超で存在する。
【０１４０】
一実施形態では、フィターゼは、動物用飼料中に、約１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約７５０ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）未満で存在する。
【０１４１】
好ましくは、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約４０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約８０ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約２０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約１００ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約２００ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）の範囲で存在する。
【０１４２】
一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約６０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１００ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１５０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２００ＦＴＵ／組成物（ｇ）超で存在する。
【０１４３】
一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約２０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１５，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満で存在する。
【０１４４】
１ＦＴＵ（フィターゼ単位）は、ＩＳＯ  ２００９フィターゼアッセイ−すなわち、国際標準ＩＳＯ／ＤＩＳ  ３００２４：１〜１７，２００９に見られる、フィターゼ活性及び１ＦＴＵを定量するための標準アッセイ−に定義される反応条件下で、基質から１分あたり１μｍｏｌの無機オルトリン酸を放出させるのに必要とされる酵素量であることは理解されるであろう。
【０１４５】
一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＦＴＵの定量に関し本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。
【０１４６】
利点
驚くべきことに、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ（特に、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼ及び／又はシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼ）をＤＦＭと組み合わせることで、壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性が向上すること（例えば、障害スコアの低下が見られる）が判明した。
【０１４７】
特に、本明細書に教示する通りのシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ（例えば、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）及び／又はシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来）を、ＤＦＭと組み合わせた場合に、壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性が、その他の既知のフィターゼ（例えば、シトロバクター（Citrobacter）以外の生物由来）と比較して格段に向上することは驚くべきことである。
【０１４８】
一実施形態では、この効果は、その他のシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株（例えば、ＹＨ−１５株由来のＣ．ブラアキイ（C. braakii）フィターゼ−この配列は、本明細書において配列番号７として示される）由来のフィターゼよりも、本明細書で教示される通りにＲｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）として市販されるシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼに関しより明白であり、このような効果は完全に想定の範囲外のものであった。
【０１４９】
更に、理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをＤＦＭと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びＤＦＭをどのように組み合わせればよいのかを提案する。一例としては、Ｃ．ブラアキイ（C. braakii）フィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低ｐＨ（例えば、３．５〜４．５）での活性が高い。単胃家畜（例えば、ブタ又は鶏）の胃腸（ＧＩ）管の胃領域はｐＨが低いことから、ＧＩ管のこの領域ではＣ．ブラアキイ（C. braakii）フィターゼの活性がより高くなることは明らかであり、したがって、これらのフィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較してより迅速に、フィチン酸基質から、リン、及びその他の栄養素、例えば、タンパク質を放出させ得る。特にｐＨの上昇に伴い、ミネラル及びタンパク質などのその他の基質と複合体を形成する傾向があるフィチン酸に対し、可能な限り迅速に作用させることが望ましい場合などの、多くの状況下で有利である。フィチン酸が複合体を形成した場合には、酵素が接近してフィチン酸を分解する可能性は低くなる。したがって、ｐＨが低いＧＩ管の胃領域において、フィターゼ基質に作用させることが望ましい。しかしながら、ＧＩ管の胃領域においてフィチン酸を分解させると、ＧＩ管の空腸及び以降の腸領域におけるリンの可用性が比較的低くなり、ラクトバチルス（これまでに、免疫系の調節、及び腸内ｐＨを低下させる有機酸の産生などの、有益な効果を有すると示されている）などの常在性の「善玉」細菌集団に対し、悪影響が生じる恐れがある。常在性の「善玉」細菌に対し、このように悪影響が及ぼされることにより、日和見的に病原菌が増殖することになり、ひいては腸内細菌の全体的な平衡が崩れることになる。
【０１５０】
本発明に関し、驚くべきことに、Ｃ．ブラアキイ（C. braakii）フィターゼを使用した場合の副作用は、１種以上のＤＦＭと組み合わせて使用することで克服できることが判明している。ＤＦＭは、腸内細菌の平衡を回復させ、ひいては病原菌に起因する腸の損傷を軽減させ、対象とする動物の性能を向上させる。
【０１５１】
この場合もやはり理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをＤＦＭと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びＤＦＭをどのように組み合わせればよいのかを提案する。シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低ｐＨ（例えば、３．５〜４．５）での活性が高い。胃腸（ＧＩ）管の胃領域はｐＨが低いことから、Ｃ．ブラアキイ（C. braakii）フィターゼは、ＧＩ管のこの領域においてより活性を示すことは明らかである。フィチン酸はタンパク質と結合して複合体を形成し得ることから、フィターゼがＧＩ管の胃領域で活性であることにより、対象とする動物によるタンパク質の消化性も向上し得る。胃領域でタンパク質吸収が増加すると、動物による塩酸（ＨＣｌ）の産生が減少する場合がある。塩酸（ＨＣｌ）の産生が減少すると、ＧＩ管の以降の領域のｐＨが上昇することから、ＧＩ管の以降の領域において悪影響を与える可能性がある。病原体を腸内で増殖させる機会を増やすことから、ＧＩ管の腸以降の領域でｐＨが上昇することは、有利ではない。驚くべきことに、本発明により、これらの副作用は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼをＤＦＭと組み合わせることで克服されることが判明している。
【０１５２】
驚くべきことに、Ｃ．ブラアキイ株ＡＴＣＣ  ５１１１３（配列番号１のアミノ酸配列を有する）由来の６−フィターゼは、その他のＣ．ブラアキイ６−フィターゼ酵素、例えば、Ｃ．ブラアキイ株ＹＨ−１５由来の６−フィターゼ（配列番号７のアミノ酸配列を有する）と比べて、更に良い影響を受ける。
【０１５３】
ＤＦＭと酵素の処方
ＤＦＭと酵素は、活性ＤＦＭと活性酵素とを処方に確実に含有させるのに好適な方法で処方できる。
【０１５４】
一実施形態では、ＤＦＭと酵素は液体、乾燥粉末、又は顆粒として処方され得る。
【０１５５】
乾燥粉末又は顆粒は、トップスプレー式流動床コーター、ボトムスプレー式Ｗｕｒｓｔｅｒコーター又はドラム式造粒（例えば、高せん断造粒）、押出、パンコーティング又はマイクロミキサーなど、当業者に既知の手法により製造できる。
【０１５６】
一部の実施形態ではＤＦＭ及び／又は酵素は被覆してよく、例えば、カプセル封入してよい。好適には、ＤＦＭと酵素は同一の被覆内に配合してよく又は同一のカプセル内にカプセル封入してよい。あるいは、いずれか又は両方の酵素を同一の被覆内に配合してもよく、あるいは同一のカプセル内にカプセル封入してもよく、かつＤＦＭは、いずれかの又は両方の酵素とは別にして被覆中に配合することもできる。ＤＦＭが芽胞を産生し得る一部の実施形態では、ＤＦＭには何ら被覆を行わなくてもよい場合もある。このような状況では、ＤＦＭの芽胞は、いずれか又は両方の酵素と単純に混合してもよい。後者の場合、酵素を被覆してもよく、例えば、カプセル封入してもよく、例としては、いずれか又は両方の酵素を被覆してもよく、例えばカプセル封入してもよい。酵素は酵素の混合物（すなわち、いずれか又は両方の酵素の混合物）としてカプセル封入することができ、あるいは酵素は別個に、例えば、単一の酵素としてカプセル封入することもできる。一部の好ましい実施形態では、両方の酵素を一緒に被覆してよく、例えば、一緒にカプセル封入してよい。
【０１５７】
一実施形態では、被覆は熱から酵素を保護し、熱保護材としてみなすことができる。
【０１５８】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）又は同第１９９７／０１６０７６号又は同第１９９２／０１２６４５号（これらの各々が参照により本案件に組み込まれる）に記載の通り、乾燥粉末又は顆粒剤中に配合される。
【０１５９】
一態様では、本発明の飼料は、蒸気処理し造立した飼料組成物を含み、この飼料組成物は、コア及び一層以上のコーティングを含む。コアは、表面上に層が形成されるよう酵素溶液を噴霧された塩顆粒又は同様物であってよい。コアは、少なくとも、本発明のフィターゼ及び／又はＤＦＭなどの活性成分を、１種以上含む。少なくとも一層のコーティングは、防湿コーティングであってよい。一部の実施例では、少なくとも一層のコーティングは、塩を含む。特定の実施形態では、顆粒剤の粒径は、約２１０〜３９０μｍである。一部の実施形態では、顆粒剤の粒径は、４５０μｍ以上、又は５００μｍ以上であってよい。このような実施例は、国際公開第２００６／０３４７１０号、同第００／０１７９３号、同第９９／３２５９５号、同第２００７／０４４９６８号、同第００／４７０６０号、同第０３／０５９０８６号、同第０３／０５９０８７号、同第２００６／０５３５６４号、及び米国特許第２００３／００５４５１１号に見出される。これらの開示の各々は参照により本案件に組み込まれる。
【０１６０】
ペレットのコーティング用には、国際公開第２００６／０３４７１０号に記載される１種以上の塩が好ましい（参照により本案件に組み込まれる）。ペレットをコーティングするのに好ましい塩の例としては：Ｎａ２ＳＯ４  ＮａＣｌ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＮＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、ＮＨ４ＣＬ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ＫＨＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＺｎＳＯ４、及びクエン酸ナトリウム、又はこれらの混合物のうちの１つ以上が挙げられる。一部の態様については、ペレットをコーティングするのに好ましい塩の例としては、１種以上のＮａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＨＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＺｎＳＯ４、又はこれらの混合物などの、一種以上の硫酸塩が挙げられる。一部の態様については、ペレットをコーティングするのに好ましい塩の例としては、１種以上のＮａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、及びＭｇＳＯ４、又はこれらの混合物が挙げられる。一部の態様については、ペレットをコーティングするのに好ましい塩は、少なくともＮａ２ＳＯ４であり、又は少なくともＮａ２ＳＯ４を含む。
【０１６１】
特定の態様では、本発明の飼料は、コアを含む顆粒からなり、コアは、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び／又はＤＦＭを含み、かつ一層以上のコーティングにより被覆されており、少なくとも一層のコーティングは防湿層からなる。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
【０１６２】
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒はコアを含み、コアは、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び／又はＤＦＭを含み、かつ一層以上のコーティングで被覆され、少なくとも一層のコーティングは、防湿剤として機能し得る塩を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
【０１６３】
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒は、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び／又はＤＦＭを含む、コアを含み、コアは、一層以上のコーティングで被覆され、少なくとも一層のコーティングは、Ｎａ２ＳＯ４  ＮａＣｌ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＮＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、ＮＨ４ＣＬ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ＫＨＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＺｎＳＯ４、及びクエン酸ナトリウム、又はこれらの混合物のうちの１つ以上を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
【０１６４】
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒はコアを含み、コアは、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び／又はＤＦＭを含み、かつ一層以上のコーティングを備え、少なくとも一層のコーティングは、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＨＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＺｎＳＯ４、又はこれらの混合物のうちの１種以上といった硫酸塩を１種以上含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
【０１６５】
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒は、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び／又はＤＦＭを含む、コアを含み、コアは一層以上のコーティングを備え、少なくとも一層のコーティングはＮａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、及びＭｇＳＯ４、又はこれらの混合物のうちの１種以上を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
【０１６６】
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒は、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び／又はＤＦＭを含む、コアを含み、コアは一層以上のコーティングを備え、少なくとも一層のコーティングはＮａ２ＳＯ４であり、又は少なくともＮａ２ＳＯ４を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
【０１６７】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、活性剤、及び少なくとも１つの被覆を含む飼料組成物用の顆粒として配合されてよく、顆粒に含まれる活性剤は、ａ）飼料のペレット加工、ｂ）蒸気加熱による飼料の前処理加工）、ｃ）貯蔵、ｄ）ペレット加工していない混合物としての材料の貯蔵、及びｅ）微量元素、有機酸、還元糖、ビタミン、塩化コリン、及び化合物から選択される少なくとも１種の化合物を含む飼料ベースミックス又は飼料プレミックスとしての成分の貯蔵、のうちの１つ以上から選択される条件で処理した後に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％の活性を保持する。
【０１６８】
顆粒に関しては、少なくとも１つのコーティングは湿分水和材料（moisture hydrating material）を含み得る。この材料は顆粒の少なくとも５５重量％を構成し、及び／又は少なくとも１つのコーティングには２つのコーティングが含まれ得る。２つのコーティングは、湿分水和コーティング（moisture hydrating coating）及び防湿コーティングであってもよい。一部の実施形態では、湿分水和コーティングは顆粒の２５重量％〜６０重量％であってよく、防湿コーティングは顆粒の２重量％〜１５重量％であってよい。湿分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン、及びマルトデキストリンから選択されてよく、かつ防湿コーティングは、ポリマー、ガム、乳清、及びデンプンから選択されてよい。
【０１６９】
顆粒は、飼料のペレット加工により製造してよく、飼料の前処理加工は、７０℃〜９５℃で、例えば８５℃〜９５℃で最大で数分間実施してよい。
【０１７０】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、貯蔵後及び顆粒が材料となる蒸気加熱ペレット加工後に活性を少なくとも８０％保持している活性剤、防湿コーティング、及び顆粒の少なくとも２５重量％の湿分水和コーティング、蒸気加熱ペレット加工前の水分活性が０．５未満である顆粒、を含む、動物飼料用の顆粒に配合することができる。
【０１７１】
顆粒はポリマー及びガムから選択される防湿コーティングを有してよく、湿分水和材料は無機塩であってよい。湿分水和コーティングは顆粒の２５重量％〜４５重量％であってよく、防湿コーティングは顆粒の２重量％〜１０重量％であってよい。
【０１７２】
顆粒は、蒸気加熱ペレット加工により製造することができ、このペレット加工は８５℃〜９５℃で最大で数分間実施することができる。
【０１７３】
一部の実施例では、粉末澱粉、又は石灰石などの希釈剤を用いて、ＤＦＭ（例えば、ＤＦＭの芽胞）を希釈してもよい。
【０１７４】
一実施形態では、組成物は消費に好適な液体配合物であり、好ましくは、緩衝材、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールのうちの１つ以上を含有する液体製剤などである。
【０１７５】
他の実施形態では、飼料添加用組成物は、塗布により、例えば、酵素の担体基材、例えば粉末小麦などへの噴霧により配合することができる。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、プレミックスとして配合され得る。例えば、プレミックスは１種以上の飼料成分、例えば、１種以上のミネラル及び／又は１種以上のビタミンを含み得る。
【０１７７】
一実施形態では、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、マルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、小麦又は小麦成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩（sorbiate）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１種の生理学的に許容できる担体とともに配合される。
【０１７８】
パッケージング
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は動物用飼料はパッケージ化される。
【０１７９】
好ましい一実施形態では、飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は動物用飼料は、袋、例えば紙袋によりパッケージ化される。
【０１８０】
代替的な実施形態では、飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は動物用飼料は、容器に密閉され得る。任意の好適な容器を使用できる。
【０１８１】
飼料
本発明の飼料添加用組成物は、飼料として、又は飼料の調製に使用できる。
【０１８２】
本明細書において、用語「飼料」は、「動物用飼料」と同義に使用される。
【０１８３】
飼料は、使用及び／又は適用態様及び／又は投与態様に応じ、液体又は固体形態であり得る。
【０１８４】
飼料として使用する際、又は試料の調製に使用する際、本発明の組成物は、次の：栄養学的に許容できる担体、栄養学的に許容できる希釈剤、栄養学的に許容できる賦形剤、栄養学的に許容できる補助剤、栄養学的有効成分のうちの１つ以上と組み合わせて使用できる。
【０１８５】
好ましい実施形態では、本発明の飼料添加用組成物を飼料成分と混合して動物用飼料を製造する。
【０１８６】
本明細書で使用するとき、用語「飼料成分」は、動物用飼料の全て又は一部を意味する。「動物用飼料の一部」は、動物用飼料に含まれる成分のうちの１つ、あるいは動物用飼料に含まれる成分のうちの１つ以上、例えば、２、又は３、又は４を意味し得る。一実施形態では、用語「飼料成分」は、プレミックス又はプレミックス成分を包含する。
【０１８７】
好ましくは、飼料は、飼い葉又はそれらの混合物、配合飼料又はそれらのプレミックスであり得る。一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、配合飼料又は配合飼料成分と混合してよく、あるいは配合飼料のプレミックス、又は飼い葉、飼い葉成分、若しくは飼い葉プレミックスと混合してよい。
【０１８８】
本明細書で使用するとき、用語「飼い葉」は、動物に提供される（動物がそれを求めて探しまわるというものではない）任意の食物を意味する。飼い葉には、切断済みの植物を包含する。
【０１８９】
用語「飼い葉」には、干し草、わら、貯蔵牧草、圧縮及びペレット化飼料、油及び混合飼料、並びに同様に発芽穀類及びマメ科植物が包含される。
【０１９０】
飼い葉は次の植物：アルファルファ（ルーサン）、大麦、シャジクソウ（birdsfoot trefoil）、アブラナ属、シャウ・モエラー（Chau moellier）、ケール、菜種（キャノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、カブ、ツメクサ、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽エンバク（false oat grass）、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒース・グラス（heath grass）、牧草（牧草地及び草原の草が自然と混ぜ合わされたもの）、カモガヤ、ホソムギ、オオアワガエリ、コーン（ｍａｉｚｅ）、アワ、エンバク、サトウモロコシ、大豆、樹木（まぐさ用に刈り込まれた枝葉）、小麦、及びマメ科植物のうちの１種以上から得られる。
【０１９１】
用語「配合飼料」は、粉末、ペレット、ナッツ、ケーキ、又はクランブルの形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、各種原材料及び添加剤を配合したものであってよい。これらの配合物は、対象とする動物の求める具体的な必要量に従って配合される。
【０１９２】
配合飼料は、１日に必要とされる栄養分をすべて提供する完全飼料、飼料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃厚飼料、又はミネラル及びビタミンなどのその他の微量栄養素のみを提供する栄養補助剤であってよい。
【０１９３】
配合飼料には、コーン、大豆、サトウモロコシ、オーツ麦、小麦、及び大麦などの飼料用穀類が主成分として使用される。
【０１９４】
本明細書で記載される通りに好適なプレミックスは、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵産物、及びその他の必須成分などの微量成分からなる組成物であり得る。一般的に、プレミックスは、市販の飼料に配合するのに好適な組成物である。
【０１９５】
本発明の任意の動物用飼料は、ａ）シリアル類、例えば、小粒穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大粒穀物（例えば、コーン又はサトウモロコシなど）など、ｂ）シリアル類を原料とする製品、例えば、コーングルテンミール、コーン等の穀物からアルコールを作製した後の蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート（wheat shorts）、米ぬか、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプ、ｃ）タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質など、ｄ）油類及び脂肪類、例えば、植物資源及び動物資源から得られる油類及び脂肪類、ｅ）ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。
【０１９６】
本発明の動物用飼料は、コーン及び大豆ミール、又はコーン及び高脂肪分大豆又は小麦ミール又はヒマワリミールを、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％含有し得る。
【０１９７】
これに加え、又はこれに代替して、本発明の動物用飼料には、少なくとも１種の高繊維飼料材料及び／又は少なくとも１種の高繊維飼料材料の少なくとも１種の副産物を含有させて、動物用高繊維飼料を提供することもできる。高繊維飼料材料の例としては、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、穀類由来の副産物、例えば、コーングルテンミール、コーン等の穀物からアルコールを作製した後の蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート、コメヌカ、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプが挙げられる。一部のタンパク質資源：ヒマワリ、ルピナス、ソラマメ、及び綿などの資源から得られたタンパク質も、高繊維であるとみなすことができる。
【０１９８】
本発明では、飼料は、次の：ペレット、ナッツ又は（ウシ用）ケーキなどの配合飼料及びプレミックス、農作物又は農作物廃棄物：コーン、大豆、サトウモロコシ、オーツ麦、大麦、コーン茎葉、コプラ、麦わら、まぐさ、サトウダイコン廃棄物；魚粉；刈りたての牧草類及びその他の飼料用植物；肉骨粉飼料；糖蜜；油かす及び圧搾ケーキ；オリゴ糖；保存加工した飼料植物：まぐさ及び貯蔵牧草；海草；全粒の又は圧砕、製粉などを施した種子及び穀類；発芽粒及び豆類；酵母エキス、のうちの１つ以上であり得る。
【０１９９】
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、ペットフードも包含する。ペットフードは、ドッグフード又はキャットフードなど、ペットによる消費が意図された植物性又は動物性物質である。ドッグフード及びキャットフードなどのペットフードは、犬用キブルなどの乾燥形態、又はウェットタイプの缶詰のいずれかであってもよい。キャットフードには、アミノ酸のタウリンを含有させてもよい。
【０２００】
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、魚用飼料も包含する。一般的に、魚用飼料は、飼育している魚の健康を良好に保つのに必要とされる多量栄養素、微量栄養素、及びビタミンを含有している。魚用飼料は、フレーク、顆粒、又は錠剤形態で有り得る。顆粒形態の飼料のうち、一部の迅速に沈降する飼料は、多くの場合、大型の魚又は水槽底部で生活する種に使用される。一部の魚用飼料は、観賞魚の発色を人工的に改良する目的で、βカロテン又は性ホルモンなどの添加剤も含有する。
【０２０１】
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、鳥用飼料も包含する。鳥用飼料には、バードフィーダーに用いられるもの及びペットの鳥に給餌するためのものの両方の飼料が包含される。典型的な鳥用サンプルは多様な種子から構成されるが、獣脂（牛脂又は羊脂）を含有させてもよい。
【０２０２】
本明細書で使用するとき、用語「接触」は、本発明の組成物が間接的に又は直接的に製品（例えば、飼料）に適用されていることを意味する。使用することのできる本開示の適用例としては、限定するものではないが、飼料添加用組成物を材料として含む製品を処理する工程、飼料添加用組成物を製品と混合して直接適用する工程、飼料添加用組成物を製品表面に噴霧する工程、又は製品を飼料添加用組成物の調合液に浸漬する工程、が挙げられる。
【０２０３】
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、好ましくは製品（例えば、動物用飼料）と混合させる。別の方法としては、飼料添加用組成物は、動物用飼料の乳濁液又は原材料に含有させてもよい。
【０２０４】
一部の用途に関しては、組成物を作用させる／組成物で処理する製品表面上に又は表面に対して利用可能であるように、組成物を製造することが重要である。これにより、組成物に次の望ましい特性：性能利益のうちの１つ以上を付与する。
【０２０５】
本発明の飼料添加用組成物は、ＤＦＭ及び酵素の量を調整して、製品（例えば、動物用飼料、又は動物用飼料の原材料）に点在、被覆、及び／又は含浸させることができる。
【０２０６】
ＤＦＭ及び酵素は、同時に（例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも）、又は連続的に（例えば、これらを別の経路により送達した場合）使用できる。一実施形態では、好ましくはＤＦＭと酵素は同時に適用する。好ましくは、ＤＦＭと酵素は、動物用飼料への送達前に、又は動物用飼料の原材料への送達前に混合させる。
【０２０７】
本発明の飼料添加用組成物に含まれるＤＦＭは、好適な濃度で添加でき、例えば、最終的な飼料製品中で、日用量あたり約２×１０５ＣＦＵ〜約２×１０１１ＣＦＵ、好適には約２×１０６〜約１×１０１０、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ〜約１×１０１０ＣＦＵの濃度になるよう添加できる。
【０２０８】
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、約７０℃、約８５℃、又は約９５℃までの熱処理に対して熱安定性である。熱処理は、最大で約１分、約５分、約１０分、約３０分、約６０分まで実施することができる。用語「熱安定性」は、特定温度への加熱前に添加剤中に存在した／添加剤中で活性であった酵素成分及び／又はＤＦＭのうちの少なくとも約７５％が、室温への冷却後も存在する／活性であることを意味する。好ましくは、特定温度への加熱前に添加剤中に存在しかつ活性であった酵素成分及び／又はＤＦＭのうちの少なくとも約８０％が、室温への冷却後も存在しかつ活性である。
【０２０９】
特に好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を均質化させて、粉末を製造する。
【０２１０】
代替的な好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）に記載の通りに顆粒に配合する。
【０２１１】
他の好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を顆粒に配合する場合、顆粒は、タンパク質コアを被覆する防水塩を含む。このような塩コーティングには、熱耐性の向上、貯蔵安定性の向上、及びそのままでは酵素及び／又はＤＦＭに対し悪影響を及ぼすその他の飼料添加物からの保護、という利点がある。
【０２１２】
好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、２０℃下で、６０％超の一定湿度と、０．２５超の水分活性を有する。
【０２１３】
好ましくは、塩コーティングは、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【０２１４】
飼料添加用組成物の製造法は、更に、粉末をペレット化する工程も含み得る。粉末は、当該技術分野において知られているその他の成分と混合させることもできる。粉末、又は粉末を含む混合物に、ダイを通過させ、得られたストランドを望ましい長さで好適なペレットに切断する。
【０２１５】
任意に、ペレット化工程は、ペレットの製造前の蒸気処理、又は調整工程を包含し得る。粉末を含む混合物は、調整槽に、例えば、蒸気噴射装置を備えるミキサーに入れることができる。混合物を調整槽内で、規定の温度まで、例えば６０〜１００℃に加熱する。典型的な加熱温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃である。滞留時間は、例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び１時間などのように、秒単位から分単位、及び更には時間単位で変化させることができる。
【０２１６】
本発明の飼料添加用組成物は、任意の適切な飼料材料に添加するのに好適であることは理解されるであろう。
【０２１７】
本明細書で使用するとき、用語「飼料材料」は、動物により消費されている基本的な飼料材料を意味する。飼料材料には、例えば、少なくとも１種以上の未加工の穀類、及び／又は加工植物、及び／又は大豆ミール又は骨粉などの動物性材料が含まれ得ることは更に理解されるであろう。
【０２１８】
本明細書で使用するとき、用語「動物用飼料」は、１種以上の飼料添加組成物が添加されている飼料材料を意味する。
【０２１９】
異なる動物種は異なる動物用飼料を必要とすること、並びに同種の動物であってさえも、動物の飼育目的に応じ、異なる動物用飼料を必要とする場合があることは、当業者により理解されるであろう。
【０２２０】
好ましくは、動物用飼料は、コーン（ｍａｉｚｅすなわちｃｏｒｎ）、小麦、大麦、ライ小麦、米、タピオカ、サトウモロコシ、及び／又は任意の副産物、並びに大豆ミール、ナタネミール、セイヨウアブラナミール、綿実ミール、ヒマワリ種子ミール、動物性残渣、及びこれらの混合物などの高タンパク質成分を含むサンプル材料を含み得る。より好ましくは、動物用飼料は、動物性脂肪及び／又は植物油を含み得る。
【０２２１】
場合により、動物用飼料には、カルシウムなどの追加のミネラル、及び／又は追加のビタミン類を含有させることもできる。
【０２２２】
好ましくは、動物用飼料は、コーン／大豆ミール混合物である。
【０２２３】
一実施形態では、好ましくは、飼料はペットフードではない。
【０２２４】
他の態様では、動物用飼料の製造方法を提供する。動物用飼料では、典型的には、最初に原材料を安定な粒経に挽き、次に適切な添加剤と混合する。次に、動物用飼料を水で溶くか、又はペレット化することができる。後者の場合、典型的には、目的とする高さまで温度を上昇させ、次に飼料をダイに通過させて、特定の大きさのペレットを製造する手法を包含する。ペレットを冷却させる。続いて、脂肪、及び酵素などの液性添加物を添加してもよい。動物用飼料の製造には、特に、少なくとも蒸気の使用を包含し得る適切な技術により、ペレット化の前に押し出す又は膨張させることを含む、追加工程を包含させてもよい。
【０２２５】
動物用飼料は、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラ種鶏、七面鳥、鴨、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全年齢種）、ペット（例えば、イヌ類、ネコ類）、又は魚などの単胃動物用の動物用飼料であってよく、好ましくは、動物用飼料は家禽用である。
【０２２６】
一実施形態では、動物用飼料は産卵鶏用のものではない。
【０２２７】
ほんの一例として、鶏、例えば、ブロイラー用の鶏用動物飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％（%ages）で含み得る。
【０２２８】
【表３】
2014509846.tif 000005
【０２２９】
ほんの一例として、ブロイラーなどの鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２３０】
【表４】
2014509846.tif 000006
【０２３１】
ほんの一例として、産卵鶏用飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２３２】
【表５】
2014509846.tif 000007
【０２３３】
ほんの一例として、産卵鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２３４】
【表６】
2014509846.tif 000008
【０２３５】
ほんの一例として、七面鳥用飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２３６】
【表７】
2014509846.tif 000009
【０２３７】
ほんの一例として、七面鳥用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２３８】
【表８】
2014509846.tif 000010
【０２３９】
ほんの一例として、子豚用の飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２４０】
【表９】
2014509846.tif 000011
【０２４１】
ほんの一例として、子豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２４２】
【表１０】
2014509846.tif 000012
【０２４３】
ほんの一例として、育成期／出荷期の豚用の飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される日齢％で含み得る。
【０２４４】
【表１１】
2014509846.tif 000013
【０２４５】
ほんの一例として、育成期／仕上げ期の豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
【０２４６】
【表１２】
2014509846.tif 000014
【０２４７】
形態
本発明の飼料添加用組成物、及び他の成分及び／又は他の成分を含む家畜飼料は、任意の好適な形態で使用できる。
【０２４８】
本発明の飼料添加用組成物は、固体又は液体製剤の形態で、又はこれらの代替形態で使用できる。固体製剤例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、カプセル、ペレット、タブレット、細粉、及び可溶性のもの、噴霧乾燥させたもの、又は凍結乾燥させものであり得る顆粒が挙げられる。液体製剤例としては、限定するものではないが、水溶液、有機溶液、又は有機溶媒水溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられる。
【０２４９】
一部の用途では、本発明のＤＦＭ又は飼料添加用組成物は、飼料と混合してもよく、又は飲用水に投与してもよい。一実施形態では、水に含有させる際の投与範囲は、約１×１０３ＣＦＵ／動物／日〜約１×１０１０ＣＦＵ／動物／日、及びより好ましくは約１×１０７ＣＦＵ／動物／日である。
【０２５０】
好適な形態例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、ペレット、タブレット、丸剤、カプセル、腔坐剤、溶液又は懸濁液のうちの１つ以上が挙げられ、これらには、即効性、徐放性、修飾性（modified-）、持続性、周期性、拍動性、又は放出制御性投与用の着香剤又は着色剤を含有させることもできる。
【０２５１】
例えば、本発明の組成物を固体形態、例えば、ペレット形態で使用する場合、組成物には、賦形剤（例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム及びグリジンなど）、崩壊剤（例えば、デンプン（好ましくは、コーン、ポテト、又はタピオカ澱粉）、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の珪酸塩複合体など）、造粒結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルク）のうちの一種以上を含有させることもできる。
【０２５２】
成形の際に使用するにあたって栄養学的に許容できる担体例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル（petroethral fatty acid esters）、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０２５３】
成形に好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２５４】
水懸濁液及び／又はエリキシル剤の場合には、本発明の組成物は、各種甘味料又は着香料、着色剤又は染料、乳化剤及び／又は懸濁剤、並びに希釈剤（例えば、水、プロピレングリコール及びグリセリン、及びこれらの組み合わせ）と組み合わせることができる。
【０２５５】
多くの場合、非吸湿性乳清は、ＤＦＭ用（特に、微生物系ＤＦＭ）の担体として使用され、ＤＦＭの増殖開始に良好な培地である。
【０２５６】
ペーストを含有している微生物性ＤＦＭは、植物油及び不活性なゲル化材料と配合することもできる。
【０２５７】
穀類副産物を担体とし、これに真菌製品を配合することもできる。
【０２５８】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、国際公開第２００５／１２３０３４号に教示される微小粒子などの微小粒子系の形態ではない。
【０２５９】
投与
本発明のＤＦＭ及び／又は飼料添加用組成物は、単回投与用に設計することができ、又は日単位での供給を目的として設計することもできる。
【０２６０】
本発明と組み合わせて使用する組成物（及び組成物に含まれる各成分）の最適量は、処理する製品、及び／又は組成物を製品に接触させる方法、及び／又は製品の使用目的に応じて異なる。
【０２６１】
組成物に使用するＤＦＭ及び酵素の量は、有効性を得るために、及びかかる組成物を含有している飼料を給与された動物の性能を向上させるのに十分な有効性を保持させるために、十分な量でなくてはならない。このような有効時間の長さは、少なくとも製品（例えば、飼料添加用組成物、又は飼料添加用組成物を含有している飼料）が利用される時間だけ延長させるべきである。
【０２６２】
飼料に含まれるＤＦＭ対各酵素の比は、下記範囲で有り得る：
ＤＦＭ：フィターゼ（ＣＦＵ／ＦＴＵ）：５．０×１０２ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＦＴＵ酵素〜５．０×１０９ＣＦＵ：１ＦＴＵ酵素、好ましくは７．５×１０４ＣＦＵ  ＤＦＭ：１ＦＴＵ酵素〜２．５×１０７ＣＦＵ：１ＦＴＵ酵素の範囲。
【０２６３】
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む：
フィターゼを少なくとも５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、並びに
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２６４】
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む：
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２６５】
他の実施形態では、動物用飼料は、次のものを含む：
フィターゼを６２５ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）；及び
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）（ＤＦＭ）を３７，５００ＣＦＵ／ｇ〜７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２６６】
好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、動物用飼料に投与するのに十分な量の酵素及びＤＦＭを含む：
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２６７】
好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、動物用飼料に投与するのに十分な量の酵素及びＤＦＭを含む：
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）（ＤＦＭ）を３７，５００ＣＦＵ／ｇ〜７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。
【０２６８】
これらの好ましい実施形態に掲載したＥｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）は、本明細書に教示される任意の他のＤＦＭと置き換えることができる。
【０２６９】
好ましくは、これらの好ましい実施形態に掲載されるフィターゼは：（ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、に１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は保存的置換を含む、変異体；並びに／あるいは（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３、及び／又は（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２の成熟ポリペプチド部分、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号７、及び／又は（ｉｖ）配列番号５、及び／又は（ｖ）配列番号９、及び／又は（ｖｉ）配列番号１０、の断片、からなる群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドを含む。
【０２７０】
好ましくは、これらの好ましい実施形態に記載されるフィターゼは、酵素Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）であり、又は配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸を有する。
【０２７１】
好ましい組み合わせでは、試料添加用組成物は、酵素Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）を、又は配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸を有するフィターゼを、ＤＦＭと組み合わせて含み、好ましくはＤＦＭは、Ｅｎｖｉｖｏ  Ｐｒｏ（登録商標）、Ｃａｌｓｐｏｒｉｎ（登録商標）、Ｃｌｏｓｔａｔ（登録商標）、Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）、ＧａｌｌｉｐｒｏＭａｘ（登録商標）、Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）Ｔｅｃｔ（登録商標）、Ｐｏｕｌｔｒｙ  ｓｔａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｘｉｎ（登録商標）、Ｐｒｏｆｌｏｒａ（登録商標）、Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）、Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ、Ｆｏｒｔｉｆｌｏｒａ（登録商標）、ＢｉｏＰｌｕｓ２Ｂ（登録商標）、Ｌａｃｔｉｆｅｒｍ（登録商標）、ＣＳＩ（登録商標）、Ｙｅａ−Ｓａｃｃ（登録商標）、Ｂｉｏｍｉｎ  ＩＭＢ５２（登録商標）、Ｂｉｏｍｉｎ  Ｃ５（登録商標）、Ｂｉａｃｔｏｎ（登録商標）、Ｏｒａｌｉｎ  Ｅ１７０７（登録商標）、Ｐｒｏｂｉｏｓ−ｐｉｏｎｅｅｒ  ＰＤＦＭ（登録商標）、Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）、Ａｎｉｍａｖｉｔ（登録商標）、Ｂｏｎｖｉｔａｌ（登録商標）、Ｌｅｖｕｃｅｌｌ  ＳＢ  ２０（登録商標）、Ｌｅｖｕｃｅｌｌ  ＳＣ  ０  ＆  ＳＣ１０（登録商標）、ＭＥ  Ｂａｃｔｏｃｅｌｌ  ＡｃｔｉＳａｆ（登録商標）（旧称ＢｉｏＳａｆ（登録商標））、Ｍｉｙａ−Ｇｏｌｄ（登録商標）、Ｆｅｃｉｎｏｒ、Ｆｅｃｉｎｏｒ  Ｐｌｕｓ（登録商標）、ＩｎｔｅＳｗｉｎｅ（登録商標）、ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ（登録商標）、Ｐｒｏｖｉｔａ（登録商標）、ＰｅｐＳｏｙＧｅｎ−Ｃ（登録商標）、Ｔｏｙｏｃｅｒｉｎ（登録商標）、及びＴＯＹＯＣＥＲＩＮ（登録商標）からなる群から選択される。
【０２７２】
一実施形態では、試料添加用組成物は、フィターゼ、すなわち酵素Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）を、又は配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸を有するフィターゼを、ＤＦＭと組み合わせて含み、好ましくはＤＦＭは：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせからなる属から選択される細菌である。
【０２７３】
試料添加用組成物は、フィターゼ、すなわち酵素Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＨｉＰｈｏｓ（商標）を、又は配列番号１又は配列番号２の配列のアミノ酸２３〜４３３と少なくとも９８．６％同一であるアミノ酸を有するフィターゼを、ＤＦＭと組み合わせて含み、好ましくはＤＦＭは次の種（species）：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）、ビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、枯草菌（Bacillus subtilis）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、並びにこれらの組み合わせの１つ以上に由来する細菌からなる群から選択される。
【０２７４】
好ましい組み合わせでは、試料添加用組成物は：シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）（例えば、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ  ５１１１３）；シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）（例えば、Ｃ．フレウンディイ（C. freundii）ＮＣＩＭＢ  ４１２４７）；シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）（例えば、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０５又はシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ  ２５４０７）；シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）（例えば、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）ＤＳＭ  １３６９４）；シトロバクター中間種（Citrobacter intermedius）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・ムルリニアエ（Citrobacter murliniae）、シトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクター・ベルクマニイ（Citrobacter werkmanii）及びシトロバクター・ヤンガエ（Citrobacter youngae）からなる群から選択されるシトロバクター（Citrobacter）細菌に由来する、好ましくは由来するフィターゼを、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）、Ｃａｌｓｐｏｒｉｎ（登録商標）、Ｃｌｏｓｔａｔ（登録商標）、Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）、ＧａｌｌｉｐｒｏＭａｘ（登録商標）、Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）Ｔｅｃｔ（登録商標）、Ｐｏｕｌｔｒｙ  ｓｔａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｘｉｎ（登録商標）、Ｐｒｏｆｌｏｒａ（登録商標）、Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）、Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ、Ｆｏｒｔｉｆｌｏｒａ（登録商標）、ＢｉｏＰｌｕｓ２Ｂ（登録商標）、Ｌａｃｔｉｆｅｒｍ（登録商標）、ＣＳＩ（登録商標）、Ｙｅａ−Ｓａｃｃ（登録商標）、Ｂｉｏｍｉｎ  ＩＭＢ５２（登録商標）、Ｂｉｏｍｉｎ  Ｃ５（登録商標）、Ｂｉａｃｔｏｎ（登録商標）、Ｏｒａｌｉｎ  Ｅ１７０７（登録商標）、Ｐｒｏｂｉｏｓ−ｐｉｏｎｅｅｒ  ＰＤＦＭ（登録商標）、Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）、Ａｎｉｍａｖｉｔ（登録商標）、Ｂｏｎｖｉｔａｌ．（登録商標）、Ｌｅｖｕｃｅｌｌ  ＳＢ  ２０（登録商標）、Ｌｅｖｕｃｅｌｌ  ＳＣ  ０  ＆  ＳＣ１０（登録商標）、ＭＥ  Ｂａｃｔｏｃｅｌｌ  ＡｃｔｉＳａｆ（登録商標）（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ＢｉｏＳａｆ（登録商標））、Ｍｉｙａ−Ｇｏｌｄ（登録商標）、Ｆｅｃｉｎｏｒ、Ｆｅｃｉｎｏｒ  Ｐｌｕｓ（登録商標）、ＩｎｔｅＳｗｉｎｅ（登録商標）、ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ（登録商標）、Ｐｒｏｖｉｔａ（登録商標）、ＰｅｐＳｏｙＧｅｎ−Ｃ（登録商標）、Ｔｏｙｏｃｅｒｉｎ（登録商標）、及びＴＯＹＯＣＥＲＩＮ（登録商標）からなる群から選択されるＤＦＭと組み合わせて含む。
【０２７５】
他の成分との組み合わせ
本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び酵素は、他の成分と組み合わせて使用できる。したがって、本発明は、組み合わせにも関係する。本明細書において、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ（例えば、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼ、又はシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）フィターゼ）と組み合わせたＤＦＭを、「本発明の試料添加用組成物」として呼ぶことができる。
【０２７６】
本発明の組み合わせは、本発明の飼料添加用組成物（又はこれらの構成成分の１種以上）と、動物による消費に好適でありかつ消費者に薬用効果又は生理学的効果を提供し得る他の成分と、を含む。
【０２７７】
一実施形態では、「その他の成分」は、１つ以上の追加の飼料用酵素で有り得る。
【０２７８】
本発明で使用するのに好適な追加の酵素は：アミラーゼ、キシラナーゼ、及び／又はプロテアーゼからなる群から選択される酵素のうちの１種以上で有り得る。
【０２７９】
一実施形態では、好ましくは「他の成分」は、更なる酵素又は更なるＤＦＭではない。
【０２８０】
成分はプレバイオティクスであってもよい。典型的には、プレバイオティクスは、難消化性糖質（オリゴ糖類又は多糖類）、又は糖アルコールであり、上部消化管内では分解されず、すなわち吸収されない。市販品として用いられており、本発明に有用である既知のプレバイオティクスとしては、イヌリン（フラクトオリゴ糖、又はＦＯＳ）、及びトランス型ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ又はＴＯＳ）が挙げられる。好適なプレバイオティクスとしては、パラチノースオリゴ糖、大豆オリゴ糖、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、難消化性デンプン、ラクトスクロース（lactosaccharose）、ラクツロース、ラクチトール、マルチトール、マルトデキストリン、ポリデキストロース（すなわち、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標））、ラクチトール、ラクトスクロース（lactosucrose）、大豆オリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖及びキシロオリゴ糖、ペクチン断片、食物繊維、マンナンオリゴ糖が挙げられる。
【０２８１】
食物繊維としては、非デンプン性多糖類、例えば、アラビノキシラン、セルロース、及びその他の多くの植物成分、例えば、難消化性デキストリン、イヌリン、リグニン、ワックス、キチン、ペクチン、β−グルカン、及びオリゴ糖が挙げられる。
【０２８２】
一実施形態では、本発明は、本発明の飼料添加用組成物（又は飼料添加用組成物の１種以上の成分）と、プレバイオティクスとの組み合わせに関する。他の実施形態では、本発明は、ＤＦＭと、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びプレバイオティクスとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物に関する。
【０２８３】
プレバイオティクスは、本発明の飼料添加用組成物（又はこれらの成分）と同時に（例えば、一緒に混合することにより、又は同一の若しくは異なる経路により送達することにより同時に）、又は連続的に（例えば、同一の若しくは異なる経路により送達することにより連続的に）投与することができる。
【０２８４】
本発明の組み合わせの他の成分としては、ポリデキストロース、例えば、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標）、及び／又はマルトデキストリン、及び／又はラクチトールが挙げられる。場合によりこれらのその他の成分を飼料添加用組成物に添加することで、乾燥加工を補助し、かつＤＦＭの生存を助けることもできる。
【０２８５】
他の好適な成分の更なる例としては、次の：増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤、甘味剤（人口甘味剤を包含する）、レオロジー改質剤、安定化剤、抗酸化剤、染料、酵素、担体、賦形剤、添加剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、懸濁剤、崩壊剤、造粒結合剤などが挙げられる。これらのその他の成分は天然素材であってもよい。これらのその他の成分は化学的手法及び／又は酵素的手法を用い調製してもよい。
【０２８６】
一実施形態では、ＤＦＭ及び／又は酵素はカプセル封入することができる。一実施形態では、飼料添加用組成物、及び／又はＤＦＭ、及び／又は酵素は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）に記載される通りの乾燥粉末又は顆粒として配合される。
【０２８７】
一実施形態では、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、１種以上の脂質と組み合わせて使用することもできる。
【０２８８】
例えば、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、１種以上の脂質ミセルと組み合わせて使用することもできる。脂質ミセルは、単純脂質ミセル又は脂質ミセル複合体であってよい。
【０２８９】
脂質ミセルは、脂質及び／又は油などの配向性両親媒性分子の集合体であってよい。
【０２９０】
本明細書で使用するとき、用語「増粘剤又はゲル化剤」は、不混和性の液体の液滴、空気、又は不溶性固体のうちのいずれかの粒子の移動を緩慢にさせるか又は予防することにより、分離を防ぐ製品を指す。個々の水和分子の粘性が上昇し、分離が緩慢になった場合に、増粘がもたらされる。水和分子が結合して３次元ネットワークを形成し、粒子を捕捉し不動化させた場合に、ゲル化がもたらされる。
【０２９１】
本明細書で使用するとき、用語、「安定化剤」は、経時変化から製品（例えば、食品）を保護する成分又は成分の組み合わせとして定義される。
【０２９２】
本明細書で使用するとき、用語「乳化剤」は、エマルションの分離を予防する成分（例えば、食品成分）を指す。エマルションは、２種の不混和性の物質のうちの他方が液滴形態で存在し、他方に含有されている状態を指す。エマルションは、水中油型（油が液滴又は分散相となり、水が連続相となる）、又は油中水型（水が分散相となり、油が連続相となる）で構成される場合がある。液中気体の状態である発泡体、及び液中固体の状態である懸濁液も、乳化剤を使用して安定化させることができる。
【０２９３】
本明細書で使用するとき、用語「結合剤」は、物理的又は化学的反応により製品を互いに結合させる成分（例えば、飼料成分）を指す。例えば、「ゲル化」中に水が吸収されることで、結合効果が得られる。しかしながら、結合剤は、油などの他の液体を吸収し、製品中に保持する場合もある。典型的には、本発明の文脈において、結合剤は、例えば、焼成製品、ペストリー、ドーナッツ、及びパンなどの、固体又は低湿分製品に使用されることになる。
【０２９４】
「担体」又は「賦形剤」は、ＤＦＭ及び／又は酵素の投与に好適な材料を意味し、このような材料としては、例えば、当該技術分野で知られている任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、又は可溶化剤などの任意の材料が挙げられる。これらの材料は、非毒性であり、かつ組成物に関係する任意の成分と有害な様式で相互作用しない。
【０２９５】
本発明は、ＤＦＭ及びサイトロバクターフィターゼを、少なくとも１種のマルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩（sorbiate）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ブドウ糖、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１種の生理学的に許容できる担体と混合する工程を含む、飼料添加用組成物の製造方法を提供する。
【０２９６】
賦形剤の例としては：微結晶セルロース及びその他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム、グリジン、デンプン、乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールのうちの１種以上が挙げられる。
【０２９７】
崩壊剤の例としては：デンプン（好ましくはコーン、ポテト、又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の珪酸塩複合体のうちの１種以上が挙げられる。
【０２９８】
造粒結合剤の例としては：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチン、及びアカシアのうちの１種以上が挙げられる。
【０２９９】
滑沢剤の例としては：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクのうちの１種以上が挙げられる。
【０３００】
希釈剤の例としては：水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上が挙げられる。
【０３０１】
他の成分は、同時に（例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも）、又は連続的に（例えば、これらを別の経路により送達した場合）使用できる。
【０３０２】
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物を他の成分と混合した場合にもＤＦＭは生存活性を保持する。
【０３０３】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物はクロム又は有機クロムを含まない。
【０３０４】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はグルカナーゼを含有しない。
【０３０５】
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はソルビン酸を含有しない。
【０３０６】
濃縮物
本発明での使用を目的としたＤＦＭは、濃縮物の形態であってもよい。典型的には、これらの濃縮物は、実質的に高濃度のＤＦＭを含む。
【０３０７】
本発明の飼料添加用組成物には、生細菌成分（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を含ませることができ、含有量は、少なくとも１０４ＣＦＵ／ｇ（好適には、少なくとも１０５ＣＦＵ／ｇ、例えば、少なくとも１０６ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０７ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０８ＣＦＵ／ｇ）〜約１０１０ＣＦＵ／ｇ（又は更には約１０１１ＣＦＵ／ｇ若しくは約１０１２ＣＦＵ／ｇ）の範囲である。
【０３０８】
ＤＦＭが濃縮物の形態である場合、本発明の飼料添加用組成物には生細菌を少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１０１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは少なくとも１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１０１２ＣＦＵ／ｇの範囲で含ませることができる。
【０３０９】
濃縮形態の粉末、顆粒及び液体組成物を水で希釈するか、あるいは水又はその他の好適な希釈剤（例えば、ミルク又は鉱物油若しくは植物油などの好適な増殖培地）に再懸濁するかして、使用に際して組成物を用意することもできる。
【０３１０】
本発明のＤＦＭ又は飼料添加用組成物、あるいは濃縮形態の本発明の組み合わせは、当該技術分野で知られている手法により製造することができる。
【０３１１】
本発明の一態様では、酵素又は飼料は、濃縮形態の組成物と接触している。
【０３１２】
本発明の組成物は、当該技術分野で知られている手法により噴霧乾燥又は凍結乾燥させてもよい。
【０３１３】
噴霧乾燥工程を用い粒子を製造するための典型的な加工法は、固体材料を適切な溶媒に溶解させること（例えば、発酵培地でのＤＦＭの培養）を伴う。別の方法としては、材料を非溶媒に懸濁又は乳化させて懸濁液又はエマルションを生成することもできる。場合により、この段階で、他の成分（上述のもの）、又は例えば、抗菌剤、安定化剤、染料、及び乾燥工程の助剤などの要素を添加してもよい。
【０３１４】
次に溶液を霧化して、液滴の微細な霧を生成する。この液滴を直ちに乾燥チャンバに入れ、ガスと接触させる。液滴から乾燥ガス中に溶媒を蒸発させ、液体を固化させることで、粒子を生成する。次に粒子を乾燥ガスから分離し、回収する。
【０３１５】
対象とする動物
本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物（subject）」は、本発明の飼料添加用組成物、又は本発明の飼料添加用組成物を含む動物用飼料を、投与される又は投与されている動物（animal）を意味する。
【０３１６】
本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物（subject）」は、動物（animal）を意味する。好ましくは、対象は、例えば、家畜類（livestock）、又は家畜（domesticated animal）（例えば、ペット）などの哺乳類、鳥類、魚類、又は甲殻類である。
【０３１７】
一実施形態では、「対象とする動物」は家畜類である。
【０３１８】
本明細書で使用するとき、用語「家畜類」は、任意の飼育動物を指す。好ましくは、家畜類は、雌牛又は雄牛（仔牛を含む）、豚（子豚を含む）、家禽（ブロイラー、鶏及び七面鳥を含む）、鳥類（例えば、アヒル、ライチョウ、キジ、及びウズラ）、魚類（サーモン、タラ、トラウト及びコイ科の魚（例えば、鯉）などの淡水魚、並びに海産魚（例えば、シーバス）を含む）、甲殻類（エビ、イガイ、及びホタテ貝など）、馬（競走馬を含む）、羊（子羊を含む）のうちの１種以上である。
【０３１９】
一実施形態では、用語「家畜類及び／又は家禽及び／又は鶏」には産卵鶏は包含されない。
【０３２０】
他の実施形態では、「対象とする動物」は家畜又はペット又は動物園などの環境で飼育されている動物である。
【０３２１】
本明細書で使用するとき、用語「家畜」又は「ペット」、又は「動物園などの環境で飼育されている動物」は、イヌ科の動物（例えば、犬）、ネコ科の動物（例えば、猫）、げっ歯目（例えば、モルモット、ラット、マウス）、鳥類、魚類（淡水魚及び海産魚を含む）、並びに馬などの任意の関係性のある動物を指す。
【０３２２】
一実施形態では、対象とする動物は腸内病原菌に曝露されている場合がある。
【０３２３】
例えば、対象とする動物の腸又は消化管内には１種以上の腸内病原菌が存在している場合がある。例えば、対象とする動物の腸又は消化管内には１種以上の腸内病原菌が次の程度存在している場合がある：
ｉ）動物の性能が低下する程度、及び／又は
ｉｉ）臨床的に意義のある程度、又は
ｉｉｉ）無症状の程度。
【０３２４】
例えば、腸内病原菌はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）であり得る。
【０３２５】
性能
本明細書で使用するとき、「動物性能」は、飼料要求率及び／又は動物の体重増加により、並びに／あるいは飼料要求率により、並びに／あるいは飼料に含まれる栄養分の消化性（例えば、アミノ酸の消化性）及び／又は飼料に含まれるエネルギー又は代謝エネルギーの消化性により、並びに／あるいは窒素保持により、並びに／あるいは動物が壊死性腸炎の悪影響を回避する能力により、並びに／あるいは対象とする動物の免疫応答性により、決定することができる。
【０３２６】
好ましくは「動物性能」は、飼料要求率及び／又は動物の体重増加により、並びに／あるいは飼料要求率により決定される。
【０３２７】
「動物性能の向上」により、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用した場合に、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料と比較して、飼料要求率の向上、及び／又は体重増加の向上、及び／又は飼料要求率の減少、及び／又は飼料に含まれる栄養分若しくはエネルギーの可消化性の向上、及び／又は窒素保持の向上、及び／又は壊死性腸炎による悪影響を回避する能力の向上、及び／又は対象とする動物の免疫応答性の向上が得られることを意味する。
【０３２８】
好ましくは、「動物性能の向上」により、飼料要求率の向上及び／又は体重増加の上昇及び／又は飼料要求率の減少が意味される。
【０３２９】
本明細書で使用するとき、用語「飼料要求率」は、一定期間の間、動物に飼料を適宜又は規定量で給与した場合に生じる、体重増加の程度を指す。
【０３３０】
「飼料要求率の向上」は、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用することで、飼料取り込み単位あたりの体重増加率が、既存の飼料添加用組成物を使用した場合と比較して向上していることを意味する。
【０３３１】
飼料要求率（ＦＣＲ）
本明細書で使用するとき、用語「飼料要求率」は、体重を特定量だけ増加させるために動物に給与する飼料量を指す。
【０３３２】
飼料要求率の向上とは、飼料要求率が低くなることを意味する。
【０３３３】
「飼料要求率の減少」又は「飼料要求率の向上」は、飼料に飼料添加用組成物を使用した場合に、動物の体重を特定量だけ増加させるために動物に給餌する必要のある飼料量が、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料を同量使用した場合と比較して少なくなることを意味する。
【０３３４】
栄養素消化性
本明細書で使用するとき、栄養素消化性は、胃腸管又は胃腸管の特定の分節（例えば、小腸）から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化性は、対象とする動物に投与した量と、対象とする動物の糞便に分泌された量、又は胃腸管の特定の分節、例えば回腸において消化物中に残存している量との差として測定することができる。
【０３３５】
本明細書で使用するとき、栄養素消化性は、期間中の排泄物の総回収量を用いて、栄養素の摂取量と排出量の差から測定することができ、あるいは動物により吸収されず、かつ胃腸管又は胃腸管分節において消失した栄養素の量が研究者により算出可能な不活性マーカーを用い、測定することができる。このような不活性マーカーとしては、二酸化チタン、酸化クロム、又は酸不溶性灰分が挙げられる。消化能は、飼料に含まれる栄養素の割合（％）として、又は飼料に含まれる栄養素の質量単位あたりの可消化栄養素の質量単位として、表すことができる。
【０３３６】
本明細書で使用するとき、栄養素消化性能は、デンプン消化性、脂肪消化性、タンパク質消化性、ミネラル消化性、及びアミノ酸の可消化性能を包含する。
【０３３７】
本明細書で使用するとき、「エネルギー消化率」は、飼料に含まれる総エネルギーから糞便に含まれる総エネルギーを減じるか、あるいは消費された飼料に含まれる総エネルギーから動物の胃腸管の特定の分節、例えば回腸に残存している総エネルギーを減じるかして算出された値を意味する。本明細書で使用するとき、「代謝エネルギー」は、見かけの代謝エネルギーを指し、消費された飼料に含まれる総エネルギーから、糞便、尿、及び消化に由来するガスに含まれる総エネルギーを減じた値を意味する。エネルギー消化率及び代謝エネルギーは、栄養素消化率の測定法と同様の方法を用い、飼料の代謝エネルギーを算出するために窒素排出について適切な補正を行って、摂取総エネルギーと、糞便に分泌された又は胃腸管の特定の分節に存在する消化物に残存する総エネルギーとの差として測定することができる。
【０３３８】
窒素保持
本明細書で使用するとき、「窒素保持」は、対象とする動物が、食物由来の窒素を体重として保持する能力を意味する。窒素の排出が日常摂取量を超過した場合に負の窒素バランスが生じ、多くの場合、筋肉量の減少が見られる。正の窒素バランスは、多くの場合に筋肉の成長と関連付けられ、これは成長期の動物において顕著である。
【０３３９】
窒素保持は、期間中の糞尿の総回収量を用いて、窒素摂取量と窒素排出量の差から測定することができる。窒素排出量には、飼料由来の未消化タンパク質、内因性のタンパク質性分泌物、微生物タンパク質、及び尿窒素が包含されることは理解されるであろう。
【０３４０】
生存率
本明細書で使用するとき、用語「生存率」は、対象とする動物が生存し続ける率を意味する。用語「生存率の向上」は、「斃死率の低下」と言い換えることができる。
【０３４１】
枝肉歩留まり及び精肉歩留まり
本明細書で使用するとき、用語「枝肉歩留まり」は、食肉処理に関係する商業工程又は試験工程後に得られる枝肉が生体重に占める割合を意味する。用語「枝肉」は、頭部、尾部、肢部、及び羽又は皮を取り除き食用に食肉処理された動物の肉体を意味する。本明細書で使用するとき、用語「精肉歩留まり」は、食肉が生体重に占める割合、あるいは特定の切り出し肉が生体重に占める割合を意味する。
【０３４２】
体重増加
本発明は、更に、対象とする動物、例えば、家禽又はブタにおいて、体重増加率を向上させる方法を提供し、この方法は、本発明の飼料添加用組成物を含む動物用飼料を、対象とする動物に給与する工程を含む。
【０３４３】
「体重増加の向上」は、飼料添加用組成物を含む飼料の給与を受けた動物の体重増加が、この飼料添加用組成物を含まない飼料の給与を受けた動物の体重増加と比較して向上していることを指す。
【０３４４】
壊死性腸炎
壊死性腸炎は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）により引き起こされる急性又は慢性の腸毒血症であり、世界中の鶏、七面鳥、及びアヒルで観察されている。多くの場合、壊死性腸炎は、一般的に小腸中央部に生じる線維素壊死性腸炎により特徴づけられる。斃死率は５〜５０％であり、一般的には１０％付近である。感染は、糞口感染により生じる。原因となる生物の芽胞は非常に耐性が高い。素因としては、コクシジウム症（coccidiosis/coccidiasis）、飼料（高タンパク）が挙げられ、アヒルでは、極度のストレス、高粘度の食餌（多くの場合、飼料のライ麦及び小麦含量が高いことに関係付けられる）、汚染された飼料及び／又は水、その他の衰弱を招く疾患などが挙げられる。
【０３４５】
本発明は、対象とする動物の壊死性腸炎に対する耐性を向上させる工程に関する。換言すれば、本発明は、壊死性腸炎の副作用を回避する又は減少させる工程に関する。
【０３４６】
本明細書で使用するとき、用語「に対する耐性」には、用語「〜耐性」を包含し得る。したがって、一実施形態では、対象とする動物は、壊死性腸炎耐性でない場合にも壊死性腸炎耐性とされる場合があり、すなわち、対象とする動物の性能に悪影響が現れない場合などがこれに当てはまる。
【０３４７】
一実施形態では、本発明は、対象とする動物において壊死性腸炎を処理又は予防するための、本発明の飼料添加用組成物に関する。通常、対象とする動物は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はエイメリア（Eimeria）種を保有しているか、又はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はエイメリア（Eimeria）種に対し曝露されている。このような曝露は、環境に起因するか、あるいは例えば、コクシジウム生ワクチンが使用された場合など、飼料若しくは飲用水に生細菌が適用されたことに起因するものであり得る。
【０３４８】
他の実施形態では、本発明は、対象とする動物においてコクシジウム症を予防及び／又は処置するための飼料添加用組成物に関する。
【０３４９】
本発明は、壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症を予防及び／又は処置する方法を更に提供し、本方法は、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与するものである。
【０３５０】
免疫応答
本明細書で使用するとき、免疫応答は、抗体産生の増加、細胞介在性免疫の上方制御、炎症促進性サイトカインの上方制御、及びｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の増強など、ＤＦＭが動物の免疫系を調節する複数の経路のうちの１つを意味する。ＤＦＭによる胃腸管の免疫賦活は疾患から宿主を保護するのに有益な場合があり、及び胃腸管の免疫抑制は、免疫機能の支持に使用される栄養素及びエネルギーがより少なくなることから、宿主に有益な場合があることは、理解されるであろう。
【０３５１】
好ましくは、免疫応答は、細胞性免疫応答である。
【０３５２】
好ましくは、免疫応答は、免疫マーカーの観察により測定される。
【０３５３】
病原菌
本明細書で使用するとき、用語「病原菌」は、例えば、毒素産生性のクロストリジウム（Clostridium）属例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又は大腸菌（E. coli）、及び／又は、サルモネラ菌種（Salmonella spp）、及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）を意味する。一実施形態では、病原菌は、トリ病原性大腸菌（E. coli）属であり得る。
【０３５４】
本発明は、対象とする動物の胃腸管において、病原菌数を減少させることができる。
【０３５５】
栄養素の排出
一実施形態では、本発明は、糞尿への栄養素の排出の減少に関する。これにより、環境ハザードの減少に正の効果が得られる。例えば、好ましい実施形態では、本発明は、対象とする動物の糞尿に含まれる窒素、及び／又はリン含量を減少させることに関する。したがって、環境中の窒素及び／又はリンの量が減少することになり、都合がよい。
【０３５６】
プロバイオティクス
一部の態様では、本発明の組成物に含まれるＤＦＭは、プロバイオティクス培養効果を発揮し得ると考えられている。本発明の組成物に更にプロバイオティクス及び／又はプレバイオティクスを添加することも同様に本発明の範囲内に含まれる。
【０３５７】
本明細書において、プレバイオティクスは、
「有益な細菌のうち１種又は限定種の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することで宿主に有効に作用する難消化性食品成分」である。
【０３５８】
本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス培養物」は、例えば、必要数だけ経口摂取又は局所適用された場合に、宿主生物に有利に作用する、すなわち、１種以上の実証可能な健康効果を宿主生物に付与する、生細菌（例えば、細菌又は酵母など）であると定義する。プロバイオティクスは、１箇所以上の粘膜表面において、微生物のバランスを改善し得る。例えば、粘膜表面は腸、尿路、気道又は皮膚であり得る。本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス」は、免疫系の有効な分岐を刺激し得ると同時に、例えば、腸などの免疫表面において炎症応答を減少させる生細菌も包含する。
【０３５９】
プロバイオティクス摂取の下限又は上限は存在しないものの、日用量として、少なくとも１０６〜１０１２、好ましくは少なくとも１０６〜１０１０、好ましくは１０８〜１０９ｃｆｕを用いることが、対象とする動物において有利な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。
【０３６０】
本明細書で使用するとき、用語「善玉細菌」は、腸内に存在し、共生する、非病原性の細菌である。「善玉細菌」としては、ラクトバチルス菌種（Lactobacillus spp）（例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium））が挙げられる。善玉細菌は、あまり望ましくない細菌が増殖しにくい環境を作り出し、疾患を予防する。
【０３６１】
単離
一態様では、本発明で使用される好適な酵素又はＤＦＭは、単離形態であってよい。用語「単離」は、酵素又はＤＦＭが、少なくとも１種のその他の成分を少なくとも実質的に不含であることを意味し、少なくとも１種のその他の成分は、酵素又はＤＦＭと、自然界において天然に関係するものであり、天然に見られる通りのものである。本発明の酵素又はＤＦＭは、本来であればこの物質が関連付けられていたであろう１種以上の汚染物質を実質的に不含の形態で提供され得る。したがって、例えば、混入する可能性のある１種以上のポリペプチド及び／又は核酸分子を実質的に含まない。
【０３６２】
精製
一態様では、好ましくは本発明に従う酵素及び／又はＤＦＭは精製された形態である。用語「精製」は、酵素及び／又はＤＦＭが高濃度で存在していることを意味する。酵素及び／又はＤＦＭは、組成物中に存在する主成分として望ましいものである。好ましくは、酵素及び／又はＤＦＭは、考慮中の総組成物に対し少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の濃度で存在し、この濃度は、乾燥重量／乾燥重量基準で決定される。
【０３６３】
本明細書に記載の任意の特徴を組み合わせて本発明の範囲内に包含させるよう本発明の実施例を組み合わせ得ることも本発明の範囲内であると見なされる。特に、細菌に関係する何らかの治療上の効果が付随して発揮され得ることも本発明の範囲内のものであると見なされる。
【０３６４】
ヌクレオチド配列
本発明の範囲は、本明細書に定義される通りの特性を有するタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を包含する。
【０３６５】
本明細書で使用するとき、用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びに変異体、相同体、断片、及びこれらの誘導体（これらの一部分など）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来、合成由来、又は組み換え由来であってよく、センス鎖又はアンチセンス鎖に関わらず二本鎖又は一本鎖であり得る。
【０３６６】
本発明に関係する用語「ヌクレオチド配列」としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられる。好ましくはＤＮＡを意味し、より好ましくは本発明をコードしているｃＤＮＡ配列を意味する。
【０３６７】
好ましい実施形態では、本発明の範囲それ自体に関係するとき、及び本発明の範囲それ自体に包含されるとき、ヌクレオチド配列は、天然の状態であるならば、及び同様にその天然の状態である天然に関連付けられる配列と結合しているならば、本発明に従うネイティブなヌクレオチド配列を含有しない。参照しやすさのため、出願人らは、この好ましい実施形態のことを「非ネイティブなヌクレオチド配列」と呼ぶことにする。この観点で、用語「ネイティブなヌクレオチド配列」は、ネイティブな状態のヌクレオチド配列全長を意味し、かつ天然に関連付けられる完全なプロモータに操作可能に連結させてある場合には、このプロモータもネイティブな状態のものである。しかしながら、本発明の範囲に包含されるアミノ酸配列は、ネイティブな生物においてヌクレオチド配列を発現させた後で単離することができ、及び／又は精製することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の範囲内に包含されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によりそのネイティブな生物において発現させることができるものの、本明細書では、ヌクレオチド配列は、生物内で天然に関連付けられるプロモータの制御下にはない。
【０３６８】
典型的には、本発明の範囲内に包含されるヌクレオチド配列は、組み換えＤＮＡ技術を用い調製される（すなわち、組み換えＤＮＡ）。しかしながら、本発明の代替的な実施形態においては、ヌクレオチド配列は、当該技術分野で広く知られる化学な手法により、その全体又は一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３及びＨｏｒｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２を参照されたい）。
【０３６９】
ヌクレオチド配列の調製
本明細書に定義される通りの特性を有するタンパク質又は修飾に好適なタンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列は、このタンパク質を生産する任意の細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製することができる。当該技術分野ではヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製に関し各種手法が広く知られている。例えば、同定及び／又は単離及び／又は精製された好適な配列をより多量に調製するためには、ＰＣＲによる増幅法を使用できる。
【０３７０】
更なる例に関しては、酵素を産生する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用い、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリを構築することができる。酵素のアミノ酸配列が既知のものである場合、標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用い、生物から作成したゲノムライブラリ由来のクローンをコードしている酵素を同定することもできる。別の方法としては、その他の既知の酵素遺伝子と配列相同性である、標識化したオリゴヌクレオチドプローブを使用して、クローンをコードしている酵素を同定することもできる。後者の場合、厳密度の低いハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件が用いられる。
【０３７１】
別の方法としては、ゲノムＤＮＡ断片を、プラスミドなどの発現ベクターに挿入し、これにより得られるゲノムＤＮＡライブラリにより、酵素の発現が陰性の細菌を形質転換させ、この形質転換させた細菌を、酵素用の基質（すなわち、マルトース）を含有している寒天プレートに播種することにより、酵素を発現しているクローンを同定することもできる。
【０３７２】
更に他の態様では、酵素をコードしているヌクレオチド配列を、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，ｐ  １８５９〜１８６９により記載のホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，ｐ  ８０１〜８０５により記載の方法などの、確立されている標準法により合成し、調製することもできる。ホスホラミダイト法では、例えば、ＤＮＡ自動合成装置によりオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、アニーリングされ、適切なベクターにライゲーションされ、及びクローン化される。
【０３７３】
ヌクレオチド配列は、合成起点、ゲノム起点、又はｃＤＮＡ起点（必要に応じて）の断片を、一般的な手法により連結することで調製される、ゲノム起点と合成起点の混合物、合成起点とｃＤＮＡ起点の混合物、又はゲノム起点とｃＤＮＡ起点の混合物、であってよい。ライゲートした各断片は、完全なヌクレオチド配列の各部位に対応する。ＤＮＡ配列は、特異的なプライマーを用い、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号又はＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ  ４８７〜４９１）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできる。
【０３７４】
アミノ酸配列
本発明の範囲には、本明細書に定義される通りの特性を有する酵素のアミノ酸配列も包含される。
【０３７５】
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０３７６】
アミノ酸配列は、好適な供給源から調製／単離することができ、あるいは合成することができ、あるいは組み換えＤＮＡ法により調製することができる。
【０３７７】
本発明に包含されるタンパク質は、他のタンパク質、特に酵素と組み合わせて使用することもできる。したがって、本発明は、タンパク質の組み合わせも範囲とし、この組み合わせには、本発明のタンパク質／酵素、及びその他のタンパク質／酵素が含まれ、その他のタンパク質／酵素は、本発明のその他のタンパク質／酵素であってよい。
【０３７８】
好ましくは、アミノ酸配列は、本発明の範囲に関係する場合、及び本発明の範囲に包含される場合、ネイティブな酵素ではない。この点において、用語「ネイティブな酵素」は、そのネイティブな環境に存在し、かつネイティブなヌクレオチド配列により発現されたものである場合、完全な酵素を意味する。
【０３７９】
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に定義される特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列と、又はこのようなポリペプチドをコードしている任意のヌクレオチド配列と、ある程度の配列同一性又は配列相同性を有する、配列の使用も包含する（本明細書において、以降「相同性配列」として参照する）。本明細書において、用語「相同性」は、参照している配列が、対象とするアミノ酸配列及び対象とするヌクレオチド配列と一定の相同性を有することを意味する。本明細書において、用語「相同性」は、「同一性」と等しい。
【０３８０】
相同性アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持し及び／又は酵素活性を増大させるポリペプチドを提供及び／又はコードしなくてはならない。
【０３８１】
本文脈では、相同性配列は、対象とする配列と少なくとも７５、８５、又は９０％同一性である、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一性であるアミノ酸配列を含有する。一般的には、相同性配列は、対象とするアミノ酸配列と同様の活性部位などを含み得る。相同性は、類似度（すなわち、アミノ酸残基が類似する化学特性／機能を有する程度）の観点から考慮することもできるものの、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表現するのが好ましい。
【０３８２】
本発明の文脈では、相同性配列は、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（参照配列）と少なくとも７５、８５又は９０％同一である、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を包含する。一般的には、相同性配列は、対象とする配列の活性部位などをコードする配列と同様の配列を含む。相同性は、類似度（すなわち、アミノ酸残基が類似する化学特性／機能を有する程度）の観点から考慮することもできるものの、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表現するのが好ましい。
【０３８３】
相同性比較は、目視検査により実施することができ、あるいはより一般的には、すぐに利用できる配列比較プログラムの補助により実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムでは、２つ以上の配列の相同性（％）を算出することができる。
【０３８４】
相同性（％）は、連続する配列間で算出することができ、すなわち１つの配列を他の配列と整列させ、一方の配列に含まれる各アミノ酸を、他方の配列に含まれる対応するアミノ酸と一度に一残基ずつ直接比較することで算出することができる。この手法は「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアライメントは、残基数が比較的少ない場合にのみ実施される。
【０３８５】
この手法は非常に単純でかつ着実な手法であるものの、例えば、本来であれば同一である配列対において、１箇所に挿入又は欠失が入っている場合を考慮に入れることができず、以降のアミノ酸残基はアラインメントから除外されることになり、したがって、グローバルアラインメントを実施した場合に、相同性（％）が大幅に低下する可能性がある。これらを踏まえ、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに対して重すぎるペナルティーを設けずに、可能性のある挿入及び欠失を考慮に入れ、最適なアラインメントを生成するよう設計されている。この手法は、配列アラインメント時に「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化させることで実施される。
【０３８６】
しかしながら、これらのより複雑な手法は各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てるものであり、同数の同一のアミノ酸に関し可能な限りギャップが少なくなる−比較する２つの配列間の関連性がより大きく反映される−ような配列アラインメントは、ギャップを多く含むアラインメントと比較してより高いスコアが付けられるようになる。「アフィンギャップコスト」は、一般的に用いられる手法であり、この手法では、ペナルティは、ギャップの伸長に対して比較的重く設定され、ギャップ中で続く各残基に対しては軽く設定される。この手法は、最も一般的に使用されているギャップスコアリング系である。当然のことながら、ギャップペナルティが高い場合には、ギャップ数がより少なくなるよう最適化されたアラインメントが得られることになる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較の際にこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用することが好ましい。
【０３８７】
したがって、配列の最大一致度を計算するには、まず第一にギャップペナルティを考慮に入れて最適アラインメントを行うことが必要とされる。このようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータプログラムはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実行するソフトウェアの例としては、限定するものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照されたい）、ＢＬＡＳＴ  ２（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）、及びＡｌｉｇｎＸが挙げられる。オフライン及びオンライン検索には、少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２及びＦＡＳＴＡを利用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９９，ｐａｇｅｓ  ７〜５８〜７〜６０を参照されたい）。
【０３８８】
最終的な相同性（％）は、同一性の観点から評価され得るものの、アラインメント方法は、典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。その代わりに、一般的にはスケールを用いた類似性スコアマトリックスが用いられ、各一対比較に対し、科学的類似性又は進化距離に基づきスコアが割り当てられる。一般的に用いられるこのようなマトリックス例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスが挙げられ、この場合、プログラムにはＢＬＡＳＴ向けのデフォルトのマトリックスが適する。ベクターＮＴＩプログラムには、概して、一般的なデフォルト値、又は提供された場合にはカスタムされたシンボル比較表のいずれかが用いられる（更なる詳細については使用者マニュアルを参照されたい）。一部の用途に関しては、ベクターＮＴＩパッケージにはデフォルト値を用いることが好ましい。
【０３８９】
別の方法としては、相同性（％）は、ＣＬＵＳＴＡＬ．（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７〜２４４）に類似するアルゴリズムに基づき、ベクターＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）における多重配列アラインメントによる特性を用い、算出することができる。
【０３９０】
ソフトウェアにより最適アラインメントを生成すれば、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこの算出を行い、計算結果を生成する。
【０３９１】
配列同一性を決定する場合にはギャップペナルティを用いるべきであり、好ましくは、ペアワイズアラインメントに関し以降のパラメータを用いる：
【０３９２】
【表１３】
2014509846.tif 000015
【０３９３】
【表１４】
2014509846.tif 000016
【０３９４】
一実施形態では、ギャップペナルティ及びギャップ伸長については上記の通りの設定を用い、ＣＬＵＳＴＡＬを使用することができる。
【０３９５】
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドにわたって決定される。
【０３９６】
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、配列全長にわたって決定することができる。
【０３９７】
ハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の核酸配列に対する相補的配列、あるいは本発明の配列又は本発明の配列に相補的な配列のいずれかとハイブリッド形成し得る配列に対する相補的配列、も包含する。
【０３９８】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する工程」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で実施される増幅工程を包含するものとする。
【０３９９】
本発明は、本明細書において示す配列に相補的な配列に対してハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列、又は任意の誘導体、断片、あるいはこれらの誘導体の使用も包含する。
【０４００】
用語「変異体」は、本明細書において示すヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成し得る配列に相補的な配列も包含する。
【０４０１】
好ましくは、相補的配列は、厳密な条件下（例えば、５０℃かつ０．２ｘＳＳＣ  ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ  ７．０｝）で、本明細書に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得る。
【０４０２】
より好ましくは、相補的配列は、非常に厳密な条件下（例えば、６５℃かつ０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ  ７．０｝）で、本明細書に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得る。
【０４０３】
より好ましい態様では、本発明は、非常に厳密な条件下（例えば、６５℃かつ０．１ｘＳＳＣ）で、本発明のヌクレオチド配列、又はその相補配列とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列を含む。
【実施例】
【０４０４】
実施例１
方法
４０００羽の１日齢のＣｏｂｂ雄雛を民間の孵化場から購入する。試験の開始時に５０羽の雄を一集団として各処理区画に割りつけ、一処理につき計９区画を用意する。試験は、次の処理から構成される（表１）：
表１．実施例１の試験設計
【０４０５】
【表１５】
2014509846.tif 000017
【０４０６】
１  「バチルス（Bacillus）ＤＦＭ」：Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓより提供される、枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１及び１５ＡＰ４を組み合わせた商品である、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）を、１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）で投与。
【０４０７】
２  「ラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭ」：Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎより提供される、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）及びラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）を組み合わせた商品である、Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）を、３５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）で投与。
【０４０８】
３  「Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ（登録商標）」は、コウジカビ（Aspergillus oryzae）において発現させた、ペニフォラ・リシイ（Peniphora lycii）由来の６−フィターゼである。このアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８として提供される。（これは「シトロバクター（Citrobacter）以外」の６フィターゼである）
４  シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＡＴＣＣ  ５１１１３由来の６−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１として提供される。
【０４０９】
５  シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＹＨ−１５由来の６−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号７として提供される。
【０４１０】
各区画の鳥類の体重を、試験初日、２３日目、３５日目、及び最終日（４２日）に測定する。各区画を測定単位とする。ブロイラー用の飼料は、マッシュ飼料として給与する。飼料は、ＮＲＣ標準を満たすか、又は超過する（表２）。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサーはフラッシングする。すべての処理飼料は、Ｄａｖｉｓ  Ｓ−２０ミキサーを用い混合する。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料から試料を回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びＤＦＭの存在を確認した。
表２．実施例１の試験飼料の組成
【０４１１】
【表１６】
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【０４１２】
鳥類に適宜給餌し、０日〜４２日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＤＦＭは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供される。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防する。試験の２１日目に、前期飼料から後期飼料に変えた。試験の３５日目に、育成飼料を仕上げ飼料に変える。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填する。試験の最終日に飼料を計量する。各区画の斃死を毎日確認する。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量（ｋｇ）を記録する。すべての斃死又は間引き鶏に対し、肉眼剖検を実施し、性別及び推定される死因を判定する。壊死性腸炎の兆候を記録する。
【０４１３】
すべての区画は約１０．２ｃｍ（４インチ）に組み立て、床敷を敷き詰めた。区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ）を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種する。１８、１９、及び２０日目に、処理群１を除きすべての鳥類にウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のブロス培地を投与する。ＮＥを引き起こすことが知られており、商用ブロイラーの運用に由来する、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の野生分離株を曝露菌として利用する。毎日、新鮮な摂取材料を使用する。滴定レベルは約１．０×１０８〜９である。各区画に対する接種は同量で行う。接種材料は、チューブフィーダーのベースに一般的に見られる飼料に混合して投与する。２１日目に、各区画から５羽の鳥を選別し、屠殺し、グループを計量し、及び壊死性腸炎領域の病変の程度について評価する。採点は、０〜３点で行う。０が正常であり、３が最も深刻である（０＝所見なし、１＝わずかに症状が見られる、２＝中等度の症状が見られる、３＝顕著な／深刻な症状が見られる；Ｈｏｆａｃｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｕｌｔ．Ｒｅｓ．１２：６０〜４）。試験の間、薬剤の併用は行わない。新鮮なサンプル（０．５ｇ）を５ｍＬの脱イオン水で希釈し、ガラス製の参照微小電極を併用して、空腸内容物のｐＨを測定した。
【０４１４】
サンプル採取
２１日目に、各処理毎に計８羽の鳥を屠殺し、それぞれの鳥から砂嚢〜回腸・盲腸接合部までの消化管をすべて回収し、氷で冷やしながら一晩のうちに研究室に送る。研究室で、試料を更に細断し、メッケル憩室周辺の空腸（２０ｃｍ）を得て、腸管の残りは廃棄する。このようにして得た空腸断片を０．１％ペプトンですすぎ洗いし、腸内容物を洗い流し、長手方向軸に沿って切り開いて上皮層を露出させる。９９ｍＬの０．１％ペプトンを用い、空腸断片を７．０ストローク／ｓで６０秒間処理しパルプ状にし、粘膜関連細菌を放出させる。１２，０００×ｇで１０分遠心分離し、パルプ溶液から細菌を回収する。得られる細菌ペレットを、１０ｍＬのＭＲＳブロス＋１０％グリセロールに再懸濁し、液体窒素で瞬間冷凍し、更なる解析までの間−２０℃で保存する。
【０４１５】
ＤＮＡ単離
フェノールクロロホルム抽出を行い、すべての試料からゲノムＤＮＡを単離し、ロシュ・アプライド・サイエンスのＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用い精製する。
【０４１６】
パイロシーケンス
Ｄｏｗｄ（Ｄｏｗｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８；８，１２５）の記載の通りに、細菌タグをコードさせたＦＬＸアンプリコンのパイロシーケンスを実施する。各鳥の腸粘膜から単離した同量のＤＮＡを解析する。プライマー２８Ｆ（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＮＴＧＧＣＴＣＡＧ）及び５１９Ｒ（５’−ＧＴＮＴＴＡＣＮＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ）を用い、各試料において１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１〜Ｖ３領域を増幅させる。配列決定後、生データを選別し、品質に応じてトリミングする。個々の試料のバーコード配列をもとに、配列を選別する。バーコードタグを除去し、非細菌性リボソーム配列を除去する。ＢｌａｓｔＮ比較により、細菌集団の組成を決定して品質を制御し、かつＮＣＢＩのデータベースを手作業で精選する。各試料毎に、各細菌ＩＤの相対量を決定する。ＮＣＢＩ命名法により、各分類レベルをもとにデータを編集する。
【０４１７】
統計解析
ペアワイズｔ検定により性能データの中央値を分別する。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用する。計数データ、及び分類によるモデル解析を用い解析した結果ををもとに、次いで、ＪＭＰ  ８．０．２（ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）によりカイ二乗検定を行った。この場合、各サンプルは実験単位として１羽の鳥から構成される。
【０４１８】
結果及び考察
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）処理群では、未処理対照群と比較して、体重増加及び飼料要求率が有意に低下する。ＮＥによる処理前では、ＤＦＭを添加した又は非添加のシトロバクター（Citrobacter）フィターゼは、他の処理群と比較して、ブロイラーの体重増加及び飼料要求率を有意に改善する。１８〜２０日の間の処理期間を含む、全試験期間において（０〜４２日）、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ、バチルス（Bacillus）ＤＦＭ、又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭ添加処理群では、対照処理群と比較して体重増加及び飼料要求率がわずかに向上する（０〜４２日）。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ及びバチルスＤＭＦ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭを組み合わせて投与した場合には、ブロイラーの体重増加又は飼料要求率は、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ単独又はＤＦＭ単独で投与した場合と比較して有意には向上しない。これとは対照的に、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ（シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡ又はＢのいずれか）と、いずれかのＤＦＭとを組み合わせた場合には、ブロイラーの体重増加及び飼料要求率は、未処理対照群よりも向上するため、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びＤＦＭを組み合わせた生成物が相乗効果することが示される。この効果は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢよりも、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター（Citrobacter）ＡをＤＦＭと組み合わせて用いることで、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢをＤＦＭと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
【０４１９】
バチルス（Bacillus）又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭのいずれかを添加した場合、非処理対照群と比べて同等と行かないでも、それにある程度近い程度まで、斃死率及び病変スコアが低下するのが観察された。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐは、対照群と比較して斃死率及び病変スコアを低下させるものの、非処理対照群と同程度にまでは低下させない。シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡ及びＢは、病変スコアの深刻度に対し、又は処理対照群と比較してＮＥに起因する斃死率に対し、有意な変化は与えない。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを、バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭのいずれかと組み合わせた場合、ＮＥによる斃死率、及び病変スコアが非処理対照群と同程度にまで低下した。シトロバクター（Citrobacter）フィターゼを、バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭのいずれかと組み合わせた場合、ＮＥによる斃死率、及び病変スコアが、非処理対照群と比較してわずかに改善された（斃死率及び病変スコアがより低い）。この効果は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢよりも、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター（Citrobacter）ＡをＤＦＭと組み合わせて用いることで、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢをＤＦＭと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
【０４２０】
いずれのＤＦＭも、処理対照群と比較して空腸内容物のｐＨを低下させた。それに対しＲｏｎｏｚｙｍｅ  ＰはｐＨを変化させず、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼはｐＨを上昇させた。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢを、バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭと組み合わせた場合、空腸内容物のｐＨは、処理対照群及び非処理対照群よりも低下する。空腸内容物のｐＨは、ラクトバチルス（Lactobacillus）菌種のＤＮＡが、２１日齢の時点での空腸粘膜に含まれる総細菌ＤＮＡに占める割合と逆の相関がある。また、ラクトバチルス（Lactobacillus）菌種の相対的な割合は、処理後（２１日齢〜３５日齢）の体重増加及び飼料要求率と正の相関がある。
【０４２１】
シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ（特に、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡ）をＤＦＭと組み合わせた場合、特にウェルシュ菌（C. perfringens）による処理時の損失を予防し、かつミネラル、タンパク質、及びエネルギーの可消化性に対し本フィターゼが有する効果を最大化するという効果があり、言い換えれば、処理対照群及び非処理対照群と比較して、飼料要求率及び体重増加が増大するという効果がある。これらの効果は、本発明の示す組み合わせにより、フィターゼを単独で用いた処理群及び処理対照群と比較して、腸の損傷が減少すること及びＮＥにより斃死率が低下することにからも認められる。
【０４２２】
考察
この場合もやはり理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをＤＦＭと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びＤＦＭをどのように組み合わせればよいのかを提案する。一例としては、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低ｐＨ（例えば、３．５〜４．５）での活性が高い。単胃家畜（例えば、ブタ又は鶏）の胃腸（ＧＩ）管の胃領域はｐＨが低いことから、ＧＩ管のこの領域ではシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼの活性がより高くなることは明らかであり、したがって、これらのフィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較してより迅速に、フィチン酸基質から、リン、及びその他の栄養素、例えば、タンパク質を放出させ得る。特にｐＨの上昇に伴い、ミネラル及びなどのその他の基質と複合体を形成する傾向があるフィチン酸に対し、可能な限り迅速に作用させることが望ましい場合などの、多くの状況下で有利である。フィチン酸が複合体を形成した場合には、酵素が接近してフィチン酸を分解する可能性は低くなる。したがって、ｐＨが低いＧＩ管の胃領域において、フィターゼ基質に作用させることが望ましい。しかしながら、ＧＩ管の胃領域においてフィチン酸を分解させると、ＧＩ管の空腸及び以降の腸領域におけるリンの可用性が比較的低くなり、ラクトバチルス（これまでに、免疫系の調節、及び腸内ｐＨを低下させる有機酸の産生などの、有益な効果を有すると示されている）などの常在性の「善玉」細菌集団に対し、悪影響が生じる恐れがある。常在性の「善玉」細菌に対し、このように悪影響が及ぼされることにより、日和見的に病原菌が増殖することになり、ひいては腸内細菌の全体的な平衡が崩れることになる。
【０４２３】
本発明に関し、驚くべきことに、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼを使用した場合の副作用は、１種以上のＤＦＭと組み合わせて使用することで克服できることが判明している。ＤＦＭは、腸内細菌の平衡を回復させ、ひいては病原菌に起因する腸の損傷を軽減させ、対象とする動物の性能を向上させる。
【０４２４】
この場合もやはり理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをＤＦＭと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びＤＦＭをどのように組み合わせればよいのかを提案する。シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低ｐＨ（例えば、３．５〜４．５）での活性が高い。胃腸（ＧＩ）管の胃領域はｐＨが低いことから、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）フィターゼは、ＧＩ管のこの領域においてより活性を示すことは明らかである。フィチン酸はタンパク質と結合して複合体を形成し得ることから、フィターゼがＧＩ管の胃領域で活性であることにより、対象とする動物によるタンパク質の消化性も向上し得る。胃領域でタンパク質吸収が増加すると、動物による塩酸（ＨＣｌ）の産生が減少する場合がある。塩酸（ＨＣｌ）の産生が減少すると、ＧＩ管の以降の領域のｐＨが上昇することから、ＧＩ管の以降の領域において悪影響を与える可能性がある。病原体を腸内で増殖させる機会を増やすことから、ＧＩ管の腸以降の領域でｐＨが上昇することは、有利ではない。驚くべきことに、本発明により、これらの副作用は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼをＤＦＭと組み合わせることで克服されることが判明している。
【０４２５】
驚くべきことに、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＡＴＣＣ  ５１１１３（配列番号１のアミノ酸配列を有する）由来の６−フィターゼは、その他のシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）６−フィターゼ酵素、例えば、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＹＨ−１５由来の６−フィターゼ（配列番号７のアミノ酸配列を有する）と比べて、更に良い影響を受ける。
【０４２６】
実施例２−性能試験
方法
４０００羽の１日齢のＣｏｂｂ雄雛を民間の孵化場から購入する。試験の開始時に５０羽の雄を一集団として各処理区画に割りつけ、一処理につき計８区画を用意する。試験は、次の処理から構成される（表１）：
表１．実施例２の実験設計
【０４２７】
【表１７】
2014509846.tif 000019
【０４２８】
2014509846.tif 000020
【０４２９】
１  「バチルス（Bacillus）ＤＦＭ」：Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓより提供される、枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１及び１５ＡＰ４を組み合わせた商品である、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）を、１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）で投与。
【０４３０】
２  「ラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭ」：Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎより提供される、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）及びラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）を組み合わせた商品である、Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）を、３５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）で投与。
【０４３１】
３  「Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ（登録商標）」は、コウジカビ（Aspergillus oryzae）において発現させた、ペニフォラ・リシイ（Peniphora lycii）由来の６−フィターゼである。このアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８として提供される。（これは「シトロバクター（Citrobacter）以外」の６フィターゼである）
４  シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＡＴＣＣ  ５１１１３由来の６−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１として提供される。
【０４３２】
５  シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＹＨ−１５由来の６−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号７として提供される。
表２．実施例２の試験飼料の組成
【０４３３】
【表１８】
2014509846.tif 000021
2014509846.tif 000022
【０４３４】
鳥類に適宜給餌し、０日〜４２日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＤＦＭは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供される。飼料の相互混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。２１日目に前期飼料を後期飼料に置き換え、３５日目に後期飼料を仕上げ飼料に置き換える。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填する。試験の最終日に飼料を計量する。各区画の斃死を毎日確認する。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量（ｋｇ）を記録する。
【０４３５】
すべての区画は約１０．２ｃｍ（４インチ）に組み立て、マツ材の新しい床敷を敷き詰めた。区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ）を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種する。試験の間、薬剤の併用は行わない。
【０４３６】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取する。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用する。
【０４３７】
結果及び考察
４２日経過時点で、陰性対照処理群では、体重増加は有意に低下する。いずれのＤＦＭを添加した場合にも、性能に有意な向上は見られなかった。これとは対照的に、飼料にシトロバクター（Citrobacter）フィターゼを添加した場合、陽性対照群と同程度にまで体重増加が向上した。しかしながら、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐは、陰性対照に対し有意な向上を示さなかった。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐとバチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭを組み合わせた場合、４２日経過時点で、陰性対照と比較して体重増加は非常に向上する。シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びバチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭは、陽性対照飼料と比較して有意な向上を示すため、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びＤＦＭの効果が増大していることが示される。
【０４３８】
飼料要求率（ＦＣＲ）を解析した場合にも同様の結果が観察される。いずれかのプロバイオティクスを添加した場合、数値はわずかに上昇したものの、飼料要求率に有意な効果は観察されない。フィターゼを単独で添加する場合、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼでのみ有意な効果が見られ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐでは効果は観察されない。同様に、ラクトバチルス（lactobacillus）又はバチルスのいずれかとＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを組み合わせて添加した場合、陰性対照よりも有意な向上は観察されない。しかしながら、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼを、バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭのいずれかと組み合わせた場合、ＦＣＲが陽性対照と比較して有意に低くなるよう改善され（飼料要求率が向上する）、かつラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭ又はバチルス（Bacillus）ＤＦＭのいずれか、及びフィターゼを単独で添加した場合に得られる効果よりも良好である（飼料要求率が向上する）。この効果は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢよりも、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター（Citrobacter）ＡをＤＦＭと組み合わせて用いることで、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢをＤＦＭと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
【０４３９】
要するに、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及び各ＤＦＭ、すなわちバチルス及びラクトバチルス（Lactobacillus）との間には好ましい効果が存在する。これは、体重増加及び飼料要求率の増加率が、これらのいずれかを単独で添加した場合に得られる増加率よりも大きいことからも裏付けられる。この効果は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢと比較して、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡについてより顕著である。
【０４４０】
実施例３−消化性試験
方法
１０００羽の雄Ｒｏｓｓ  ３０８ブロイラーを、１２日齢まで床区画で生育し、一般的な市販の前期飼料を給与する。１３日目に、１処理につき合計６４羽の鳥を８区画に割りつける（ケージ毎に８羽ずつ割りつける）。１３日齢〜２１日齢の間、処理飼料を給与した（表１）。
表１．実施例３の試験設計
【０４４１】
【表１９】
2014509846.tif 000023
2014509846.tif 000024
【０４４２】
１  「バチルス（Bacillus）ＤＦＭ」：Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓより提供される、枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１及び１５ＡＰ４を組み合わせた商品である、Ｅｎｖｉｖａ  Ｐｒｏ（登録商標）を、１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）で投与。
【０４４３】
２  「ラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭ」：Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎより提供される、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）及びラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）を組み合わせた商品である、Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）を、３５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）で投与。
【０４４４】
３  「Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ（登録商標）」は、コウジカビ（Aspergillus oryzae）において発現させた、ペニフォラ・リシイ（Peniphora lycii）由来の６−フィターゼである。このアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８として提供される。（これは「シトロバクター（Citrobacter）以外」の６フィターゼである）
４  シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＡＴＣＣ  ５１１１３由来の６−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１として提供される。
【０４４５】
５  シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢは、シトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）株ＹＨ−１５由来の６−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号７として提供される。
【０４４６】
ブロイラー飼料はマッシュとして給与する。飼料はＮＲＣ飼養標準に一致するか超過した（表２）。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサーはフラッシングする。すべての処理飼料は、Ｄａｖｉｓ  Ｓ−２０ミキサーを用い混合する。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料から試料を回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びＤＦＭの存在を確認する。
表２．実施例３の試験飼料の組成
【０４４７】
【表２０】
2014509846.tif 000025
2014509846.tif 000026
【０４４８】
０〜２１日齢の間、鳥類には適宜適切な餌を給与する。試験の間、薬剤の併用は行わない。すべての試験処理群に関し、酵素及びＤＦＭは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供される。直接的な接触を予防して、相互混入を避ける目的で、ケージには物理的に仕切りを設ける。試験の最終日に、鳥類、並びにフィーダー内の試料を計量する。
【０４４９】
１８、１９、及び２０日目に糞便飼料を回収し、回収日に計量及び記録した後、−２０℃で保存する。続いて各処理群毎に排泄物をプールし、ブレンダにより混合し、サンプルを２本採取した。飼料を凍結乾燥させ、０．５ｍｍシーブを通して粉砕し、再凍結させ、以降の；乾燥重量（ＤＭ）、総エネルギー（ＧＥ）、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、及びカルシウム（Ｃａ）についての解析までの間保管する。
【０４５０】
２１日目に、すべての鳥を屠殺し、回腸の下半分の含有物を蒸留水で押し流して得る。各ケージの鳥から得た排泄物をプールし、回収後直ちに凍結する。飼料、回腸消化物及び排泄物を、ＤＭ、Ｎ、アミノ酸、ＧＥ、Ｃａ、Ｐ、及び不活性マーカーについて２度ずつ近似分析する。
【０４５１】
ＤＭは、全てのサンプルを１００℃で２４時間乾燥させて測定する。飼料及び回腸消化物に対して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施して、相対的なアミノ酸濃度を評価する。リン及びカルシウム濃度は、誘導結合プラズマ原子発光分光法により測定し、エネルギーはカロリーメーター（Ｍｏｄｅｌ  １２６１，Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｍｏｌｉｎｅ，ＩＬ）を用い測定する。最後に、燃焼法（Ｍｏｄｅｌ  ＦＰ２０００，ＬＥＣＯ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＩ）によりＮ含有を測定する。糞便及び回腸消化物の両方について、消化吸収率を算出する。
【０４５２】
ペアワイズｔ検定により中央値を分取する。各ケージを試験単位として用い、Ｐ＜０．０５の場合、有意な差があるものと見なした。
【０４５３】
結果及び考察
バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭを単独で添加する陰性対照と比較して、回腸におけるリン可消化性に対し有意な効果は観察されない。しかしながら、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼを添加することで、回腸におけるリン可消化性は陽性対照群と同程度にまで増加する。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを単独で飼料に添加する場合と比較して、回腸におけるリン可消化性は有意に増加する。シトロバクター（Citrobacter）フィターゼとＤＦＭを組み合わせて飼料に添加した場合、回腸におけるリン可消化性は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼを単独で添加する場合と比較して増加する。これとは対照的に、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ及びＤＦＭを組み合わせて飼料に添加する場合、回腸におけるリン可消化係数は、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを単独で加えた場合に観察されるものと同様である。これらの傾向は、腸管全体のリン可消化性を反映している。
【０４５４】
シトロバクター（Citrobacter）フィターゼを飼料に添加した場合、陰性対照群と比較して、回腸におけるアミノ酸の可消化性は有意に増加する。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを添加した場合、陰性対照と比較して、回腸におけるアミノ酸の可消化性はわずかに増加する。バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭを単独で添加した場合には、回腸におけるアミノ酸の可消化性はほんのわずかに増加する。シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びバチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭを組み合わせて添加した場合、ＤＦＭ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼを単独で添加した場合と比較して、アミノ酸の可消化性に対して有意な効果が存在し、この効果は、いずれかを単独で添加した場合の増加効果を足し合わせたものよりも大きい。この増加効果は、ＲｏｎｏｚｙｍｅＰ及びＤＦＭを組み合わせて飼料に添加した場合には観察されない。この効果は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢよりも、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター（Citrobacter）ＡをＤＦＭと組み合わせて用いることで、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢをＤＦＭと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
【０４５５】
エネルギー可消化性（ＡＭＥ）は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼを飼料に添加した場合に、陰性対照の場合と比べて有意に増加する。これは、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを飼料に添加した場合には当てはまらない（Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐを飼料に添加した場合には、ＡＭＥの増大はほんの僅かにしか観察されない）。バチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭのいずれかを飼料に添加した場合、ＡＭＥは顕著に増加するものの、陰性対照群との有意な差はない。いずれかのＤＦＭをシトロバクター（Citrobacter）フィターゼと組み合わせて添加した場合、フィターゼ又はいずれかのＤＦＭを単独で加えた場合の増分を足し合わせたものと比較して、ＡＭＥは有意に増加する。これは、いずれかのＤＦＭをＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐフィターゼと組み合わせて添加した場合には観察されなかった。
【０４５６】
結論として、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼ及びバチルス（Bacillus）ＤＦＭ又はラクトバチルス（Lactobacillus）ＤＦＭの間には有意な作用が存在する。この効果は、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢよりも、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＡについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター（Citrobacter）ＡをＤＦＭと組み合わせて用いることで、シトロバクター（Citrobacter）フィターゼＢをＤＦＭと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。この効果は、Ｐ、ＡＭＥ、及び回腸におけるアミノ酸の可消化性が増加するという点に反映される。生成物を組み合わせて添加した場合の可消化係数における増加は、いずれかを単独で添加した場合の増加分よりも大きい。
【０４５７】
本明細書においてこれまでに言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明に関し記載される手法及び系に対し、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく加えられる各種修正及び変更は当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは明白である。加えて、生化学及びバイオテクノロジー又は関連する分野に属する当業者には本発明を実施する際に記載のモデルに関し加えられる各種修正は明白なものであり、このような修正も以降の特許請求の範囲内で意図されるものとする。
【図１】
2014509846.tif 000027
【図２】
2014509846.tif 000028
【図３】
2014509846.tif 000029
【図４】
2014509846.tif 000030
【図５】
2014509846.tif 000031
【図６】
2014509846.tif 000032
【図７】
2014509846.tif 000033
【図８】
2014509846.tif 000034
【図９】
2014509846.tif 000035
【図１０】
2014509846.tif 000036
【図１１】
2014509846.tif 000037
【配列表】
2014509846000001.app
【国際調査報告】
2014509846.tif 000038
2014509846.tif 000039
2014509846.tif 000040
2014509846.tif 000041
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