(57)【要約】  提供されるスキャホールドは、様々なドメイン（たとえば、ＣＨ２およびＣＨ３）において非対称である重鎖を有し、天然ホモ二量体（対称性）Ｆｃ分子で達成可能である選択性を超えた、エフェクター機能の調節に関与する様々なＦｃ受容体間における選択性、および、それにより得られる変異体Ｆｃヘテロ二量体の、増加した安定性および純度が達成される。これらの新規分子は、天然抗体の自然の振る舞いを変化させるよう設計され、治療剤としての使用が見いだされる、異種成分の複合体を含有する。【選択図】図１
2014533243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物であって、前記改変ＣＨ３ドメインは、
野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、
ここで、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つは、Ｋ３９２Ｊのアミノ酸改変を含有し、ここで、Ｊは、Ｌ、Ｉまたは側鎖体積が、Ｋの側鎖体積よりも大幅に大きくないアミノ酸であり、
ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも約７４℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９５％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し、および、
ここで、アミノ酸改変の少なくとも一つは、前記第一および前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドの間の境界面にあるアミノ酸のものではない、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２】
Ｔ３５０Ｘ改変を少なくとも１つ含有し、ここで、Ｘは、バリン、イソロイシン、メチオニンおよびそれらの誘導体または変異体から選択される、天然または非天然アミノ酸である、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項３】
Ｔ３５０Ｖ改変を少なくとも１つ含有する、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項４】
前記改変ＣＨ３ドメインが、少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５】
前記改変ＣＨ３ドメインが約７７℃またはそれ以上のＴｍを有する、請求項４に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項６】
前記改変ＣＨ３ドメインが約８０℃またはそれ以上のＴｍを有する、請求項４〜５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項７】
少なくとも１つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１，Ｆ４０５およびＹ４０７のうちの少なくとも一つのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項８】
少なくとも１つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６のアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項９】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６、Ｋ３９２およびＴ３９４の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１０】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する、請求項９に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１１】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する、請求項９に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１２】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する、請求項９に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１３】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する、請求項９に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１４】
前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも１つが、Ｓ４００の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１５】
Ｓ４００Ｚ改変を含有し、Ｚが陽荷電アミノ酸および陰荷電アミノ酸から選択される、請求項１２に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１６】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒから選択されるアミノ酸改変を含有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１７】
前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも１つが、Ｎ３９０の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１８】
Ｎ３９０Ｚ改変を含有し、Ｚが陽荷電アミノ酸および陰荷電アミノ酸から選択される、請求項１５に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項１９】
前記第二ＣＨ３ドメインが、Ｎ３９０Ｒアミノ酸改変を含有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２０】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｓ４００Ｅのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｎ３９０Ｒのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２１】
前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのそれぞれが、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記改変ＣＨ３ドメインポリペプチドの一つはＱ３４７Ｒのアミノ酸改変を含有し、他方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＫ３６０Ｅのアミノ酸改変を含有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２２】
少なくとも一つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｋ４０９およびＴ４１１のうちの少なくとも一つのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２３】
Ｋ４０９Ｆ、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄのうち少なくとも一つを含有する、請求項２２に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２４】
少なくとも一つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｄ３９９のアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２５】
Ｄ３９９ＲおよびＤ３９９Ｋのうち少なくとも一つを含有する、請求項２４に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２６】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｋ４０９Ｆ、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄから選択されるアミノ酸改変を少なくとも一つ含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｄ３９９ＲおよびＤ３９９Ｋから選択されるアミノ酸改変を少なくとも一つ含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２７】
第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６ＭおよびＴ３６６Ｌのアミノ酸改変のうち一つを含有し、第二改変ＣＨ３ドメインが、Ｌ３５１Ｙのアミノ酸改変を含有する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２８】
第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｅのアミノ酸改変のうち一つを含有し、第二改変ＣＨ３ドメインが、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｖのアミノ酸改変のうち一つを含有する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項２９】
第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドおよび第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物であって、各改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが少なくとも４つのアミノ酸変異を含有し、
ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つは、Ｎ３９０ＺおよびＳ４００Ｚから選択される変異を含有し、ここで、Ｚは、陽荷電アミノ酸および陰荷電アミノ酸から選択され、および、
前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９０％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを選択的に形成する、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項３０】
第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドおよび第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物であって、各改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸変異を含有し、
ここで、前記第一および前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄから選択される変異を含有し、
ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９０％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを選択的に形成する、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項３１】
前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置でアミノ酸改変を含有し、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３９４の位置でアミノ酸改変を含有する、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３２】
前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１の位置でアミノ酸改変を含有する、請求項３１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３３】
前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６位およびＫ３９２位のうちの少なくとも一つの改変を含有する、請求項３１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３４】
前記改変ＣＨ３ドメインが、少なくとも約７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、少なくとも約９５％の純度で形成される、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３５】
少なくとも一つの改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｎ３９０Ｒ、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒのうちの少なくとも一つのアミノ酸改変を含有する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３６】
前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち一つが、３４７位のアミノ酸改変を含有し、他方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、３６０位にアミノ酸改変を含有する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３７】
前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つが、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３８】
前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変を少なくとも１つを含有し、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗから選択されるアミノ酸改変を少なくとも一つ含有する、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３９】
前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｄ３９９位およびＹ４０７位でアミノ酸改変を含有し、第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＫ４０９位およびＴ４１１位でアミノ酸改変を含有する、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４０】
前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１位でアミノ酸改変を含有し、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６位およびＫ３９２位でアミノ酸改変を含有する、請求項３９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４１】
前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つが、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する、請求項４０に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４２】
前記改変ＣＨ３ドメインが、少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、少なくとも約９５％の純度で形成される、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４３】
前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｒ、Ｓ４００Ｋ、Ｙ４０７ＡおよびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変を含有し、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｉ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｔ４１１ＤおよびＴ４１１Ｅから選択されるアミノ酸改変を含有する、請求項３９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４４】
Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項４５】
Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項４６】
Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項４７】
Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項４８】
Ｇ型イムノグロブリン（ＩｇＧ）に基づく改変Ｆｃ領域を含有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項４９】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３のうちの一つである、請求項４８に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５０】
イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）に基づく改変Ｆｃ領域を含有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５１】
イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）に基づく改変Ｆｃ領域を含有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５２】
イムノグロブリンＤ（ＩｇＤ）に基づく改変Ｆｃ領域を含有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５３】
イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）に基づく改変Ｆｃ領域を含有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５４】
前記ヘテロ多量体が、二重特異性抗体である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５５】
前記ヘテロ多量体が、多特異性抗体である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５６】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物、および薬学的に受容可能な担体を含有する組成物。
【請求項５７】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物をコードする核酸を含有する、哺乳類宿主細胞。
【請求項５８】
治療用抗体を少なくとも一つ含有する、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項５９】
前記ヘテロ多量体が、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ゴリムマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム（Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ）（商標）、レンカレックス（Ｒｅｎｃａｒｅｘ）（商標）、ウステキヌマブ、およびザルツムマブからなる群から選択される治療用抗体を少なくとも一つ含有している、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物。
【請求項６０】
癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者における癌の治療方法であって、前記方法が、前記患者に、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６１】
免疫抗原により特徴付けられる免疫疾患を有する患者における免疫疾患の治療方法であって、前記方法が、前記患者に、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１１年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６１／５５６，０９０号、２０１１年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６１／５５７，２６２号、および２０１２年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６４５，５４７号の優先権を主張し、その各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、概して、ポリペプチドヘテロ二量体、その組成物、およびそのようなポリペプチドヘテロ二量体の作製方法および使用方法を提供する。より具体的には、本発明は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含有する、熱安定性の多特異的（二重特異的を含む）抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
二重特異的治療剤は、２つの別々の明確に異なる標的、または同一抗原の異なるエピトープに同時に結合することができる抗体ベースの分子である。二重特異性抗体は、イムノグロブリンドメインをベースとした実体から構成され、抗体分子の成分を構造的に、および機能的に模倣しようとしたものである。二重特異性抗体の使用法の一つには、たとえば、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）による腫瘍細胞殺傷力の増強へと、細胞傷害性免疫エフェクター細胞を仕向けるものである。この関連においては、二重特異性抗体の一つの腕は腫瘍細胞上の抗原に結合し、他の腕はエフェクター細胞上に発現されている決定基に結合する。腫瘍細胞とエフェクター細胞を架橋させることにより、二重特異性抗体は腫瘍細胞のすぐ近傍にエフェクター細胞を誘導するだけでなく、エフェクター細胞の活性化をも同時にもたらし、効果的に腫瘍細胞を殺傷させる。二重特異性抗体はまた、腫瘍組織内の化学療法剤または放射線治療剤の効果を高め、正常組織への有害作用を最小限にするためにも用いられている。この場合においては、二重特異性抗体の一つの腕は標的細胞上に発現されている抗原に、破壊を目的として結合し、そして他の腕は、化学療法剤、放射性同位体、または毒素を運び込む。二重特異的というだけではなく、同時に複数の様式を目的とすることによって、タンパク質性治療剤の効果を得る必要性がある。複数標的への結合および多機能的な特性をタンパク質に入れ込むように設計することによって、そのように複合的で、新規の生物学的効果を有するタンパク質治療剤を得ることができる。
【０００４】
これらの多機能で複数標的に結合する治療剤を設計するためには、他の機能的な実弾頭または標的タンパク質結合ドメインを融合するフレームワークをもたらすようなしっかりとした足場（スキャホールド）が必要となる。理想的には、スキャホールドはフレームワークをもたらすだけではなく、治療に関連する有益な他の多くの特性を、設計された治療剤にもたらすものでなければならない。抗体ベースの二重特異的治療剤および多機能治療剤の一般的な開発における主要な障害は、前臨床および臨床試験の両方に十分な量および質の材料を提供することが困難なことである。可変Ｆｃ領域に連結されるタンパク質結合ドメインとしての単一可変ドメインを含有するポリペプチド構築物に対する必要性が当分野において未だ存在し、前記可変Ｆｃは、向上した安定性および純度を有するヘテロ二量体を選択するために改変されたＣＨ３ドメインを含有する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一つの態様により、改変ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸の改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸の改変を含有する第二改変ＣＨ３改変ドメインポリペプチドを含有し、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも１つは、Ｋ３９２Ｊのアミノ酸改変を含有し、ここで、Ｊは、Ｌ、Ｉまたは、Ｋの側鎖体積よりも大幅に大きくない側鎖体積を有するアミノ酸から選択され、ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも約７４℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９５％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し、ならびに、ここで、少なくとも一つのアミノ酸改変は、前記第一および前記第二のＣＨ３ドメインポリペプチドの間の境界面にあるアミノ酸の改変ではない。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体Ｆｃ構築物は、少なくとも一つのＴ３５０Ｘ改変を含有し、ここで、Ｘは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびそれらの誘導体もしくは変異体から選択される天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＴ３５０Ｖ改変を含有する。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、改変ＣＨ３ドメインが約７７℃またはそれ以上のＴｍを有する。ある実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、約８０℃またはそれ以上のＴｍを有する。ある実施形態において、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、少なくとも一つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１、Ｆ４０５、およびＹ４０７のうちの少なくとも一つのアミノ酸の改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６のアミノ酸改変をさらに含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインであり、そして、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＹおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。さらなる実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃがあり、前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有し、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つがＳ４００の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。さらなる実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、Ｓ４００Ｚの改変を含有し、ここで、Ｚは、陽荷電アミノ酸および陰荷電アミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、陽荷電アミノ酸は、リジンまたはアルギニンであり、陰荷電アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＳ４００ＥおよびＳ４００Ｒから選択されるアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つがＮ３９０の位置でアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｎ３９０の改変はＮ３９０Ｚであり、Ｚは陽荷電アミノ酸および陰荷電アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｎ３９０Ｚは、Ｎ３９０Ｒである。本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物のある特定の実施形態において、前記第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＳ４００Ｅのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＮ３９０Ｒのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物のいくつかの実施形態において、第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドの各々が、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、一つの前記改変ＣＨ３ドメインがＱ３４７Ｒのアミノ酸改変を含有し、他方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＫ３６０Ｅのアミノ酸改変を含有する。
【０００６】
一つの態様において、改変ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、そして、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、ここで、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つは、Ｋ３９２Ｊのアミノ酸改変を含有し、ここで、Ｊは、Ｌ、Ｉ、またはＫの側鎖体積よりも大幅には大きくない側鎖体積を有するアミノ酸から選択され、ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは少なくとも約７４℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９５％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３を優先的に形成し、ならびに、ここで、少なくとも一つのアミノ酸改変は、前記第一および前記第二ＣＨ３ドメインポリペプチドの間の境界面にあるアミノ酸の改変ではない。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載されるヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＴ３５０Ｘ改変を含有し、ここで、Ｘは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびそれらの誘導体もしくは変異体から選択される天然アミノ酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＴ３５０Ｖ改変を含有する。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有している。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、改変ＣＨ３ドメインが約７７℃またはそれ以上のＴｍを有している。ある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、約８０℃またはそれ以上のＴｍを有している。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｋ４０９およびＴ４１１のうち少なくとも１つのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、Ｋ４０９Ｆ、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄのうち少なくとも一つを含有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｄ３９９のアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｄ３９９のアミノ酸改変は、Ｄ３９９ＲおよびＤ３９９Ｋのうちの少なくとも一つである。
【０００７】
一つの態様において、改変ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、そして、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、ここで、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つは、Ｋ３９２Ｊのアミノ酸改変を含有し、ここで、Ｊは、Ｌ、Ｉ、またはＫの側鎖体積よりも実質的には大きくない側鎖体積を有するアミノ酸から選択され、ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも約７４℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９５％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し、ならびに、少なくとも一つのアミノ酸改変は、前記第一および前記第二のＣＨ３ドメインポリペプチドの間の境界面にあるアミノ酸の改変ではない。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載されるヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＴ３５０Ｘの改変を含有し、ここで、Ｘは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびそれらの誘導体もしくは変異体から選択される天然アミノ酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、少なくとも一つのＴ３５０Ｖ改変を含有する。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有している。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、改変ＣＨ３ドメインが約７７℃またはそれ以上のＴｍを有している。ある実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、約８０℃またはそれ以上のＴｍを有している。本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物のある特定の実施形態において、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＫ４０９Ｆ、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄから選択されるアミノ酸改変を少なくとも一つ含有している改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、および、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドがＹ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｄ３９９ＲおよびＤ３９９Ｋから選択されるアミノ酸改変を少なくとも一つ含有している改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物のうちの任意の一つがあり、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６ＭおよびＴ３６６Ｌのアミノ酸改変のうちの一つを含有している第一改変ＣＨ３ドメインをさらに含有し、および、Ｌ３５１Ｙのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインをさらに含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物のうちの任意の一つがあり、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｅのアミノ酸改変のうちの一つを含有している第一改変ＣＨ３ドメインを含有し、および、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｖのアミノ酸改変のうちの一つを含有している第二改変ＣＨ３ドメインを含有している。
【０００８】
本明細書において、第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドおよび第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、各改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは少なくとも４つのアミノ酸変異を含有し、ここで、前記第一および前記第二の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つはＮ３９０ＺおよびＳ４００Ｚから選択される変異を含有し、ここでＺは、陽荷電アミノ酸および陰荷電アミノ酸から選択され、ならびに、ここで前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９０％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成する。ある実施形態において、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＦ４０５およびＹ４０７の位置でアミノ酸の改変を含有し、そして前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３９４の位置でアミノ酸の改変を含有している。ある実施形態において、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１の位置でアミノ酸の改変を含有している。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６およびＫ３９２のうち少なくとも一つの位置での改変を含有している。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、少なくとも一つの改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＮ３９０Ｒ、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒのうち少なくとも一つのアミノ酸改変を含有している。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち一つが３４７位でアミノ酸改変を含有し、他の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが３６０位でアミノ酸改変を含有している。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つがＴ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有している。特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変の少なくとも一つを含有し、そして、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗから選択されるアミノ酸改変の少なくとも一つを含有している。本明細書に記載されるある実施形態においては、単離ヘテロ多量体があり、第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＤ３９９位およびＹ４０７位でアミノ酸の改変を含有し、第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＫ４０９位およびＴ４１１位でアミノ酸の改変を含有している。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１位でアミノ酸の改変を含有し、第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６位およびＫ３９２位でアミノ酸の改変を含有している。特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つがＴ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する。ある実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある実施形態において、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｒ、Ｓ４００Ｋ、Ｙ４０７Ａ、およびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸の改変を含有し、そして前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｉ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｔ４１１ＤおよびＴ４１１Ｅから選択されるアミノ酸の改変を含有する。
【０００９】
本明細書において、第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドおよび第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、各改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは少なくとも３つのアミノ酸変異を含有し、ここで、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち一つは、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄから選択される変異を含有し、ならびに、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）および少なくとも９０％の純度を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成する。ある実施形態において、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＦ４０５およびＹ４０７の位置でアミノ酸の改変を含有し、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３９４の位置でアミノ酸の改変を含有する。ある実施形態において、単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１の位置でアミノ酸の改変を含有する。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６およびＫ３９２のうち少なくとも一つの位置で改変を含有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、少なくとも一つの改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｎ３９０Ｒ、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒのうち少なくとも一つのアミノ酸の改変を含有する。いくつかの実施形態においは、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち一つが３４７位のアミノ酸改変を含有し、他方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが３６０位のアミノ酸改変を含有する。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一および第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つがＴ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する。特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変の少なくとも一つを含有し、そして前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗから選択されるアミノ酸改変の少なくとも一つを含有する。本明細書に記載されるある特定の実施形態においては、単離ヘテロ多量体があり、第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＤ３９９およびＹ４０７の位置でアミノ酸の改変を含有し、そして第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＫ４０９およびＴ４１１の位置でアミノ酸の改変を含有する。いくつかの実施形態においは、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１の位置でアミノ酸の改変を含有し、そして第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６およびＫ３９２の位置でアミノ酸の改変を含有する。特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つがＴ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインが少なくとも約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供され、前記第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｒ、Ｓ４００Ｋ、Ｙ４０７ＡおよびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変を含有し、そして前記第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｉ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｔ４１１ＤおよびＴ４１１Ｅから選択されるアミノ酸改変を含有する。
【００１０】
本明細書において、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１１】
ある態様において、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１２】
ある特定の態様において、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１３】
いくつかの態様において、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１４】
ある態様において、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１５】
ある態様において、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｒ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提示される。
【００１６】
ある態様において、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１７】
ある態様において、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１８】
一つの態様において、Ｔ３６６Ｖ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ４０９ＦおよびＴ４１１Ｅのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、およびＹ４０７Ａのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００１９】
一つの態様において、Ｔ３６６Ｖ、Ｋ３９２ＬＥ、Ｋ４０９ＦおよびＴ４１１Ｅのアミノ酸改変を含有する第一改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および、Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００ＲおよびＹ４０７Ａのアミノ酸改変を含有する第二改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する、改変ＣＨ３ドメインを含有する単離ヘテロ多量体Ｆｃ構築物が提供される。
【００２０】
本発明の一つの態様により、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含有し、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進する非対称のアミノ酸改変を少なくとも一つ含有する可変ＣＨ２ドメインをさらに含有する。一つの実施形態において、可変ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａ受容体に選択的に結合する。一つの実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、約７０℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。ある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、少なくとも約７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは少なくとも約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００２１】
他の態様において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、当該ヘテロ二量体Ｆｃ領域はアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含有しており、当該改変ＣＨ３ドメインは約７０℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、そして前記改変ＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異を含有していないＣＨ３ドメインと比較して向上したヘテロ二量体Ｆｃ領域の構造をもたらす。一つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比べて、ＣＨ３ドメインに付加的なジスルフィド結合を含有しない。代替的な実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、付加的なジスルフィド結合が無い場合には約７０℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）であるという条件下で、野生型Ｆｃ領域と比べて、改変ＣＨ３ドメイン中に少なくとも１つの付加的なジスルフィド結合を含有する。他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比べて、改変ＣＨ３ドメイン中に少なくとも一つの付加的なジスルフィド結合を含有し、ここで、当該改変ＣＨ３ドメインは、約７７．５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００２２】
一つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、当該ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、アミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含有しており、ここで、当該改変ＣＨ３ドメインは、約７０℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有しており、および、当該ヘテロ二量体Ｆｃ領域は約９０％超の純度で形成され、またはヘテロ二量体Ｆｃ領域は約９５％以上の純度で形成され、またはヘテロ二量体Ｆｃ領域は約９８％以上の純度で形成される。
【００２３】
また、ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、当該ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、前記一つ以上のアミノ酸変異を含有しないＣＨ３ドメインと比較して、向上したヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成をもたらすアミノ酸変異の一つ以上を含有する改変ＣＨ３ドメインを含有し、ここで、当該改変ＣＨ３ドメインは、約７０℃もしくはそれ以上、または約７１℃もしくはそれ以上、または約７４℃もしくはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有している。他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、約９８％またはそれ以上の純度、および約７３℃のＴｍで、溶液中で形成され、または、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、約９０％またはそれ以上の純度、および約７５℃のＴｍで形成される。
【００２４】
ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、ここで、前記第一および第二ＣＨ３ドメインポリペプチドのうち少なくとも一つはＴ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が開示され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸改変を含有する第二ＣＨ３ドメインポリペプチドもまた含有する。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置でアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３９４の位置でアミノ酸改変を含有する第二ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する。第一ＣＨ３ドメインポリペプチドはＤ３９９およびＹ４０７の位置でアミノ酸改変を含有し、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４０９およびＴ４１１の位置でアミノ酸改変を含有する。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリぺプチドを含有し、および、Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆのアミノ酸改変を含有する第二ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する。一つの態様において、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドまたは第二ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０またはＫ３９２の位置でさらにアミノ酸改変を含有する。Ｔ４１１の位置でのアミノ酸改変は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１ＥまたはＴ４１１Ｗから選択される。Ｄ３９９の位置でのアミノ酸改変は、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９ＹまたはＤ３９９Ｋから選択される。Ｓ４００の位置でのアミノ酸改変は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋから選択される。Ｆ４０５の位置でのアミノ酸改変は、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＶまたはＦ４０５Ｗから選択される。Ｎ３９０の位置でのアミノ酸改変は、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄから選択される。Ｋ３９２の位置でのアミノ酸改変は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＦまたはＫ３９２Ｅから選択される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｔ３５０ＶおよびＬ３５１Ｙのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３５０ＶおよびＬ３５１Ｙのアミノ酸改変を含有する第二ＣＨ３ドメインポリペプチドもまた含有する。
【００２６】
他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｙ４０７Ａのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、および、Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆのアミノ酸改変を含有する第二ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する。一つの態様において、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドまたは第二ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９ＲおよびＳ４００Ｒのアミノ酸改変をさらに含有する。他の態様において、第一ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００ＲおよびＹ４０７Ａのアミノ酸改変を含有し、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２ＥおよびＴ４１１Ｅのアミノ酸改変を含有する。さらなる実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、約７４℃もしくはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、および、ヘテロ二量体は約９５％もしくはそれ以上の純度を有している。
【００２７】
他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｌ３５１の位置でアミノ酸改変、およびＹ４０７Ａのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、ならびに、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６の位置でアミノ酸改変、およびＫ４０９Ｆのアミノ酸改変を含有する。一つの態様において、Ｌ３５１の位置でのアミノ酸改変は、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１ＲまたはＬ３５１Ｆから選択される。他の態様において、Ｙ４０７の位置でのアミノ酸改変は、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｓから選択される。さらに他の態様において、Ｔ３６６の位置でのアミノ酸改変は、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６ＶまたはＴ３６６Ｗから選択される。一つの実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、約７５℃またはそれ以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体は、約９０％またはそれ以上の純度を有している。
【００２８】
他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｆ４０５の位置でアミノ酸改変、ならびにＬ３５１ＹおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、ならびに、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。一つの態様において、第一ＣＨ３ドメインポリペプチド、または第二ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ３９２、Ｔ４１１、Ｔ３６６、Ｌ３６８またはＳ４００の位置でアミノ酸改変を含有する。Ｆ４０５の位置でのアミノ酸改変は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＶまたはＦ４０５Ｗである。Ｋ３９２の位置でのアミノ酸改変は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＦまたはＫ３９２Ｅである。Ｔ４１１の位置でのアミノ酸改変は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１ＥまたはＴ４１１Ｗである。Ｓ４００の位置でのアミノ酸改変は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋである。Ｔ３６６の位置でのアミノ酸改変は、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６ＶまたはＴ３６６Ｗである。Ｌ３６８の位置でのアミノ酸改変は、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８ＳおよびＬ３６８Ａである。
【００２９】
他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、ならびに、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。一つの態様において、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｉのアミノ酸改変を含有する。
【００３０】
さらに他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｙ３４９Ｃ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変のうち少なくとも一つを含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。
【００３１】
ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗ、ならびにＴ３６６ＬおよびＴ３６６Ｉのうちの一つのアミノ酸改変を含有する。
【００３２】
他の実施形態において、二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。
【００３３】
他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖのアミノ酸改変を含有する第一ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有し、第二ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３６６ＩおよびＴ３９４Ｗのアミノ酸改変を含有する。
【００３４】
ヘテロ多量体のある特定の実施形態において、二重特異性抗体または他特異性抗体が提供される。
【００３５】
他の実施形態において、本発明のヘテロ多量体および薬学的に受容可能な担体を含有する組成物が提供される。
【００３６】
他の実施形態において、本発明のヘテロ多量体をコードする核酸を含有する宿主細胞が提供される。
【００３７】
ある特定の実施形態において、ヘテロ多量体が提供され、ここで、ヘテロ多量体は、少なくとも一つの治療抗体を含有する。一つの態様において、治療抗体は、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ（ａｕｒｏｇｒａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ゴリムマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ（ｍｙｃｏｇｒａｂ）、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム（Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ）（商標）、レンカレックス（Ｒｅｎｃａｒｅｘ）（商標）、ウステキヌマブ、およびザルツムマブからなる群から選択される。
【００３８】
本発明のヘテロ多量体の他の実施形態において、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者の癌治療法が提供され、前記方法は、前記患者にヘテロ多量体の治療有効量を投与することを含む。
【００３９】
本発明のヘテロ多量体の他の実施形態において、免疫抗原により特徴づけられる免疫疾患を有する患者の免疫疾患治療法が提供され、前記方法は、前記患者にヘテロ多量体の治療有効量を投与することを含む。
【００４０】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体構築物で用いられる改変Ｆｃ領域は、Ｇ型イムノグロブリン、たとえばクラス２イムノグロブリン（ＩｇＧ２）またはクラス３イムノグロブリン（ＩｇＧ３）と定義されるイムノグロブリンを含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体構築物に用いられる改変Ｆｃ領域は、イムノグロブリンＭ（またはＩｇＭ）を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体構築物に用いられる改変Ｆｃ領域は、イムノグロブリンＡ（またはＩｇＡ）を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体構築物に用いられる改変Ｆｃ領域は、イムノグロブリンＤ（またはＩｇＤ）を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体構築物に用いられる改変Ｆｃ領域は、イムノグロブリンＥ（またはＩｇＥ）を含有する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ多量体構築物に用いられる改変Ｆｃ領域は、全種類のイムノグロブリンＧアイソタイプ、たとえば、クラス１イムノグロブリン（ＩｇＧ１）、クラス２イムノグロブリン（ＩｇＧ２）、クラス３イムノグロブリン（ＩｇＧ３）またはクラス４イムノグロブリン（ＩｇＧ４）と定義されるイムノグロブリンを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＣＨ３領域（上）、ＣＨ２領域（中央）および受容体領域を示す、野生型抗体の３Ｄ構造図である。左側の点線の長方形は、右側に拡大され、ＣＨ３の標的部分である２つの領域（領域１、領域２）を示す。
【図２】野生型の３６８位の残基を示す３Ｄグラフィックの図である。
【図３】変異した３６８位を示す、領域１の３Ｄグラフィックの図である。
【図４】領域２の追加の変異の３Ｄグラフィックの図である。
【図５】最初の３つの変異体（ＡＺ１、ＡＺ２およびＡＺ３）に対する、クラッシュスコア、境界面の差異、パッキング差異、静電エネルギーの差異、ならびに総合的な「アフィニティスコア」の、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏによる計算値の表である。
【図６】変異体ＡＺ１を「元にして構築された」変異体ＡＺ２およびＡＺ３を示す３Ｄイメージの図を示す。
【図７】ＡＺ２およびＡＺ３変異体の３Ｄグラフィックの図を示す。
【図８】図５で示したものと同様の表であるが、ＡＺ１、ＡＺ２およびＡＺ３ヘテロ二量体ならびに可能性のあるホモ二量体に対するものである。アフィニティスコアは、ホモ二量体に対しては意味を成さないので示さない。
【図９】野生型（左）および変異ＡＺ４（右）の３Ｄグラフィックの図である。
【図１０】ＡＺ４ヘテロ二量体および可能性のあるホモ二量体に対する、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏによる計算値を示す、図５と同様の表である。
【図１１】ＣＨ３変異体ＡＺ５（左）およびＡＺ６（右）のグラフィック表示の図である。
【図１２】ＡＺ４、ＡＺ５およびＡＺ６に対するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏによるデータを示す、図５と同様の表である。
【図１３】ヘテロ二量体のアプローチを用いた、受容体領域での結合特性の可能性を図示しながら、左側に抗体を示す３Ｄグラフィックの図である。
【図１４】ＩｇＧ分子の略図である。
【図１５】Ｆｃγ受容体の多重配列アライメントを示す。Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｕｎｉｐｒｏｔ配列番号は、以下の通りである。ＦｃγＲＩＩＡ（ｓｐ  Ｐ１２３１８）、ＦｃγＲＩＩＢ（ｓｐ  Ｐ３１９９４）、ＦｃγＲＩＩＣ（ｇｉ  １２６１１６５９２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ｓｐ  Ｐ０８６３７）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ｓｐ  Ｏ７５０１５）
【図１６】Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体［ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｔ８３、Radaev & Sun］の結晶構造図である。ＦｃおよびＦｃγ受容体の１：１の複合体が、Ｆｃの２鎖およびＦｃγＲの間の非対称な接触とともに観察された。
【図１７】本明細書に記載されるヘテロ二量体変異体により形成された非対称Ｆｃスキャホールドに基づいた、多機能分子の図を示す。非対称Ｆｃスキャホールドおよび非対称Ｆｃ単量体ＩｇＧアーム。
【図１８】本明細書に記載されるヘテロ二量体変異体により形成された非対称Ｆｃスキャホールドに基づいた、多機能分子の図を示す。非対称Ｆｃ一重特異的ＩｇＧアームおよび非対称Ｆｃ二重特異的ＩｇＧアーム（共通軽鎖）。
【図１９】本明細書に記載されるヘテロ二量体変異体により形成された非対称Ｆｃスキャホールドに基づいた、多機能分子の図を示す。非対称Ｆｃ二重特異的ＩｇＧアームおよびたとえば毒素等の機能的分子。
【図２０】本明細書に記載されるヘテロ二量体変異体により形成された非対称Ｆｃスキャホールドに基づいた、多機能分子を図示する。非対称Ｆｃ単一ｓｃＦｖアームおよび非対称Ｆｃ二重特異的ｓｃＦｖアーム。
【図２１】本明細書に記載されるヘテロ二量体変異体により形成された、非対称Ｆｃスキャホールドに基づいた、代替的な多機能分子の図である。非対称Ｆｃ三重特異的ｓｃＦｖアームおよび非対称Ｆｃ四重特異的ｓｃＦｖアーム。
【図２２】より良いＦｃγＲ選択性を目的としたＦｃの一面上の非対称変異設計により、ＦｃγＲ相互作用に対しては生産的な側面が生み出され、そして野生型様の相互作用とは非生産的な面が生み出される。Ｆｃの非生産的な面上の変異は、ＦｃＲとの相互作用を阻害し、生産的な面のみが相互作用するよう、Ｆｃの極性を偏らせるために導入することができる。
【図２３】野生型ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を示す。
【図２４】以下に詳述される、ポジティブ設計戦略およびネガティブ設計戦略を組み合わせた、Ｆｃヘテロ二量体設計の反復プロセスを示す。
【図２５】図２５Ａ〜Ｃは、ヘテロ二量体の純度を測定するために用いられたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを示す。アッセイは、異なる分子量の２つのＦｃ重鎖を有する完全長一重特異性抗体スキャホールドに基づいて行われた。重鎖Ａは、Ｃ末端にＨｉｓＴａｇ（Ｈｉｓ）を有し、重鎖ＢはＣ末端に開裂可能なｍＲＦＰＴａｇ（ＲＦＰ）を有している。２つの重鎖Ａ（Ｈｉｓ）およびＢ（ＲＦＰ）は、定量の軽鎖と共に異なる相対比で発現されており、異なる分子量を有する、可能な二量体を３種、発現させる。ａ）ホモ二量体  鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ａ（Ｈｉｓ）（約１５０ｋＤａ）、ｂ）ヘテロ二量体  鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約１７５ｋＤａ）、ｃ）ホモ二量体  鎖Ｂ（ＲＦＰ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約２００ｋＤａ）。発現後、実施例２に記載されるように、ヘテロ二量体と２つのホモ二量体の比率は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（分子量によって３つの二量体を分離させる）により測定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルは、クマシーブリリアントブルーで染色された。図２５Ａ：検証された変異体は、ＷＴ鎖Ａ（Ｈｉｓ）のみ、ＷＴ鎖Ｂ（ＲＦＰ）のみ、ＷＴ鎖Ａ（Ｈｉｓ）＋鎖Ｂ（ＲＦＰ）、対照１鎖Ａ（Ｈｉｓ）＋鎖Ｂ（ＲＦＰ）（純度が９５％超であることが確認されている）である。二量体バンドの組成は、上で示したように、ＩｇＧ−Ｆｃ（抗Ｆｃ）、ｍＲＦＰ  Ｔａｇ（抗ｍＲＦＰ）、およびＨｉｓＴａｇ（抗Ｈｉｓ）に対する抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｈｉｓ／Ｈｉｓホモ二量体に対しては１つのバンド、Ｈｉｓ／ＲＦＰヘテロ二量体に対しては２つのバンド、ＲＦＰホモ二量体に対しては複数のバンドが示されている。複数のバンドは、ｍＲＦＰ  Ｔａｇのアーチファクトであり、Ｆｃヘテロ二量体の物理的特性に影響を与えないことが確認されている。図２５Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイは、対照として、公知のＦｃヘテロ二量体変異体対照１〜４を用いて認証された（表Ａを参照のこと）。変異体は、鎖Ａ（Ｈｉｓ）と鎖Ｂ（ＲＦＰ）が異なる相対比で発現された。具体的には、比率１：３はＬＣ，ＨＣ＿Ｈｉｓ、ＨＣ＿ｍＲＦＰの比率が、それぞれ２５％、１０％、６５％と等しく、比率１：１は２５％、２０％、５５％、比率３：１は２５％、４０％、３５％と等しい（鎖Ｂ（ＲＦＰ）に対する鎖Ａ（Ｈｉｓ）の見かけ上の１：１の発現は、野生型Ｆｃの２０％／５５％（Ｈｉｓ／ＲＦＰ）に近いものであることが測定されている）。図２５Ｃは、スキャホールド１変異体のヘテロ二量体純度を測定するための非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを示す。Ｆｃ変異体は、鎖Ａ（Ｈｉｓ）と鎖Ｂ（ＲＦＰ）が異なる相対比で発現されており、図２に記載されるように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。具体的には、比率１：３は、ＬＣ、ＨＣ＿Ｈｉｓ、ＨＣ＿ｍＲＦＰの比率がそれぞれ２５％、１０％、６５％と等しく、比率１：１は２５％、２０％、５５％と等しく、比率３：１は２５％、４０％、３５％と等しい（鎖Ｂ（ＲＦＰ）に対する鎖Ａ（Ｈｉｓ）の見かけ上の１：１の発現は、野生型Ｆｃの２０％／５５％（Ｈｉｓ／ＲＦＰ）に近いものであることが測定されている）。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、図２５Ａ〜２５Ｃに記載されるように、鎖Ｂ（ＲＦＰ）に対して鎖Ａ（Ｈｉｓ）が特定の比率で発現され（表２を参照のこと）、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィで精製され、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された、Ｆｃヘテロ二量体変異体を示す。図２６Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の目視検査により観察された純度に基づくヘテロ二量体分類を図示する。比較のために、等量のプロテインＡ精製産物がゲルに負荷された。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく純度のこの定義は、選択された変異体で、ＬＣ／ＭＳにより確認されている（図２８を参照のこと）。図２６Ｂは、選択されたプロテインＡ精製ヘテロ二量体変異体（ＡＺ９４、ＡＺ８６、ＡＺ７０、ＡＺ３３およびＡＺ３４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を例示する。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｂは、本明細書に記載されるヘテロ二量体変異体により形成されたヘテロ二量体ＣＨ３−ＣＨ３ドメインの融解温度を測定するためのＤＳＣ分析を図示する。２つの独立した方法を用いて、融解温度を測定した。図２７Ａは、４つの独立した非二状態遷移に合わせ、ＣＨ２の値を算出するために最適化されたサーモグラムであり、Ｆａｂ遷移は文献で報告されているハーセプチンの値（約７２℃（ＣＨ２）および約８２℃（Ｆａｂ））に近いことを示している。図２７Ｂは、ヘテロ二量体変異体に対して正規化し、基準線を修正したサーモグラムは、ＣＨ３遷移のみに対する正負のピーク差異を算出するために、ＷＴから差し引かれたことを示す。
【図２８】実施例２に記載される変異体ＡＺ７０のＬＣ／ＭＳ分析例を図示する。グリコシル化ヘテロ二量体およびホモ二量体の予測（算出された平均）質量を示す。ヘテロ二量体質量と一致する領域は、グリシンの消失（−５７Ｄａ）および１つまたは２つのヘキソースの付加（それぞれ、＋１６２Ｄａおよび＋３２４Ｄａ）に一致するメジャーピークを含有している。もしホモ二量体のいずれかと一致する明らかなピークが無ければ、ヘテロ二量体の純度は９０％超と分類される。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｄは、ＷＴ  ＦｃのＣＨ３境界面（図２９Ａ）、ＡＺ６のＣＨ３境界面（図２９Ｂ）、ＡＺ３３のＣＨ３境界面（図２９Ｃ）、ＡＺ１９のＣＨ３境界面（図２９Ｄ）を示す。包括的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析（本発明を実施するための形態の項で詳述される）およびＷＴに対する変異体の比較により、ＷＴよりも最初のＡＺ３３ヘテロ二量体の安定性が低いことの理由の一つが、Ｙ４０７およびＴ３６６のコア境界面／パッキングの消失にあることが示された。最初のＡＺ３３は、図２９Ｂに図示されるように、この疎水性コアで、最適ではないパッキングを示しており、このことから、この領域の最適化、特に、Ｔ３６６の位置での最適化がＡＺ３３の安定性を改善しうることが示唆される。このことは、Ｔ３６６ＩおよびＴ３６６Ｌで、図２９Ｃおよび図２９Ｄにおいても図示される。実験データは、この構造分析と相関しており、Ｔ３６６ＬによりＴｍが最も改善されることが示されている（実施例５を参照のこと）。
【図３０】最初のスキャホールド１変異体ＡＺ８で実証される、構造動力学分析の有用性及び重要性を図示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの変異生成後の構造（主鎖構造はＷＴに似ている）を、５０ｎｓ分子動力学シミュレーション分析の典型的な構造と重ね合わせている。図は、ＷＴとＡＺ８変異体のＤ３９９−Ｓ４００ループ領域における大きな構造的差異を強調しており、それは、次いで、疎水性コアを溶媒に露出し、ＡＺ８にヘテロ二量体の安定性低下の原因となっている。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｃは、包括的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析およびＭＤシミュレーションから得られた情報を、上述のポジティブ設計戦略にどのように用いたかを図示している。図３０に図示されるように、ＡＺ８の安定性がＷＴよりも低いことの理由のひとつは、ループ３９９−４００の４０９との相互作用が弱いことであり、それは主に、Ｆ４０５パッキング相互作用が失われているためである（図３１Ａ（ＷＴ）と図３１Ｂ（ＡＺ８）の比較を参照のこと）。ポジティブ設計戦略の一つは、３９９−４００ループ構造安定化のための疎水性パッキング域の最適化である。これは、図３１Ｃに図示されるように、Ｋ３９２Ｍの変異により達成することができた。図３１Ｃにおいて、当初のネガティブ設計変異体ＡＺ８のＴｍ６８℃に対して、Ｔｍ７４℃を有するヘテロ二量体ＡＺ３３を示す。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、分子動力学軌道の主成分分析を用いて観察されたＦｃ分子の動力学を図示する。図３２Ａは、対照として、Ｆｃ構造の主鎖線を示す。図３２ＢおよびＣは、Ｆｃ構造におけるモーションのトップ２の主モードに沿って観察された動力学を重ね合わせたものを示す。鎖ＡおよびＢのＣＨ２ドメインは、互いに応じて、大きく開／閉のモーションを示す一方で、ＣＨ３ドメインは比較的固定されたままである。ＣＨ３境界面の変異は、相対的な柔軟性および、ＣＨ２ドメインにおけるこの開／閉モーションの動力学に影響を与える。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＷＴに対する、２つのスキャホールド２変異体の疎水性コアパッキングを図示する。図３３Ａは、ＷＴ  Ｆc、図３３Ｂは、ＡＺ６３、図３３Ｃは、ＡＺ７０である。最初のスキャホールド２変異体に対する包括的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、Ｙ４０７−Ｔ３６６のコアＷＴ相互作用の消失が、最初のスキャホールド２変異体の安定性がＷＴよりも低いことの理由の一つであることが示唆された。Ｙ４０７−Ｔ３６６の消失は、Ｋ４０９Ｆの変異により部分的に補填されるが、図３３Ｂに図示されるように、特にＴ３６６Ａ変異が疎水性コアに空洞を開け、それによってＷＴと比較し、変異体は不安定となっている。図３３ＣのＦｃ変異体ＡＺ７０に示されるように、この疎水性コアを標的とし、Ｔ３６６Ｖ＿Ｌ３５１Ｙの変異を加えることによって改善が認められ、ＡＺ７０は、７５．５℃のＴｍを有することが実験的に測定された（表４および実施例６を参照のこと）。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、ＷＴに対する、２つのスキャホールド２変異体のループ３９９−４００の相互作用を図示し、図３４Ａは、ＷＴ  Ｆc、図３４Ｂは、ＡＺ６３、図３４Ｃは、ＡＺ９４を示す。最初のスキャホールド２変異体の包括的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、Ｋ４０９Ｆ変異によるＷＴの塩橋Ｋ４０９−Ｄ３９９の消失（図３４Ａ）およびそれゆえのＤ３９９の不飽和化（図３４Ｂ）が、３９９−４００ループ構造がより「開いた」ものになることの原因となっていることが示唆された。このことにより、疎水性コアがさらに溶媒に露出され、ＷＴに対して変異体がより不安定化することとなった。３９９−４００ループを安定化させ、Ｋ４０９−Ｄ３９９相互作用の消失を補填するために用いた戦略の一つは、付加的な塩橋Ｄ３９９Ｒ−Ｔ４１１ＥおよびＳ４００Ｒ−Ｋ３９２Ｅの設計であった（変異体ＡＺ９４について、図３４Ｃに図示する）。実験データより、９５％超の純度および７４℃のＴｍが示された（表４および実施例６を参照のこと）。さらに、ＡＺ９４は当初のスキャホールド２変異体（９０％未満の純度、Ｔｍ７１℃）と比較して、大幅に高い純度と安定性を有しているが、ＡＺ９４の疎水性コア変異は、変異体ＡＺ７０（図３３）で特定された「もっとも良い」疎水性コア変異よりはあまり好ましいものではない。ＡＺ７０の疎水性コアでの変異（Ｔ３６６Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ）は、ループ３９９−４００でのＡＺ９４の塩橋変異から遠位にあるので、ＡＺ７０アミノ酸変異にＡＺ９４変異を付加する組み合わせは、ＡＺ７０またはＡＺ９４よりもさらに高い融解温度を有すると期待される。実施例１〜４において記載されるように、この組み合わせを検証することができる。
【図３５】６つのＦｃガンマ受容体に結合する、ホモ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃ、ヘテロ二量体変異体ｈｅｔ１（対照１）Ａ：Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｂ：Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗおよびｈｅｔ２（対照４）：Ａ：Ｋ４０９Ｄ＿Ｋ３９２Ｄ／Ｂ：Ｄ３９９Ｋ＿Ｄ３５６Ｋの結合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を図示する。ヘテロ二量体Ｆｃ変異体は、野生型ＩｇＧ１と比較して、Ｆｃガンマ受容体にやや変化した結合を示す傾向にある（実施例７を参照のこと）。
【図３６】図３６Ａは、野生型を対照とした結合強度に基づく、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃならびにその様々なホモ二量体および非対称変異形態の、ＩＩｂF、ＩＩＢＹおよびＩＩａＲ受容体への相対結合強度を示す。（Ｈｏｍｏ  Ｆｃ＋Ｓ２６７Ｄ）は、両鎖上にＳ２６７Ｄ変異を有するホモ二量体Ｆｃの結合強度を指す。（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋ａｓｙｍＳ２６７Ｄ）は、Ｆｃの２鎖のうちの一つにＳ２６７Ｄ変異が導入されたヘテロ二量体Ｆｃの結合強度を指す。２つのＦｃ鎖のいずれかに変異を導入することにより得られた結合強度の平均を報告する。一つの鎖にこの変異を導入することにより、ホモ二量体の様式での同じ変異に対して観察された強度の、およそ半分にまで結合強度が減少した。（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋ａｓｙｍ  Ｓ２６７Ｄ＋ａｓｙｍ  Ｅ２６９Ｋ）は、２つのＦｃ鎖のうちの１つに非対称の様式で導入したＳ２６７Ｄ変異およびＥ２６９Ｋ変異の両方を有するヘテロ二量体Ｆｃの結合強度を指す。Ｅ２６９Ｋ変異はＦｃの面のうちの一つへのＦｃｇＲの相互作用を阻害し、それ自身により非対称Ｓ２６７Ｄ変異体（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋Ｓ２６７Ｄ）で観察された結合強度のおよそ半分にまで結合強度を減少させる。ここでＨｅｔ  Ｆｃは、図３５の変異体ｈｅｔ２（対照４）で示されたように、ＣＨ３変異から構成される。図３６Ｂは、様々なＦｃおよびその変異体と、いくつかののＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂおよびＦｃｇＲＩＩＩａアロタイプとの結合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す。野生型ＩｇＧ１Ｆｃの様々なＦｃｇ受容体へのＫａは、水平の影の棒グラフで表されている。垂直の影のバー（ホモ二量体ベース２）は、変異Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ変異を有するホモ二量体ＦｃのＫａを表す。傾斜した影の棒グラフは、ＣＨ２ドメインにおける非対称変異Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２６９ＫおよびＢ：Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａを有するヘテロ二量体ＦｃのＫａを表す。非対称変異の導入により、ＩＩＩａおよびＩＩａ／ＩＩｂ受容体の間の選択性を増加させることができる。ここでヘテロ二量体Ｆｃは、図３５の変異体ｈｅｔ２（対照４）に対して示されたように、ＣＨ３変異から構成される。図３６Ｃは、野生型ＩｇＧ１と他の３つの変異体（Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインにホモ二量体変異または非対称変異を含む）の結合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す。野生型ＦｃのＫａは、格子を伴う影を付けた棒グラフで表される。Ｆｃの両鎖にホモ二量体の様式で導入されたベース変異Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ（ホモ二量体ベース１）を有するＦｃ変異体のＫａを、傾斜パターンの棒グラフで示す。ヘテロ二量体Ｆｃの鎖ＡおよびＢにおける非対称様式での関連変異（ヘテロベース１）の導入は、水平線で示される。垂直の影線の棒グラフは、Ｅ２６９Ｋ変異を含む非対称変異体（ヘテロベース１＋ＰＤ）を表す。ここでヘテロ二量体Ｆｃは、図３５で変異体ｈｅｔ２（対照４）に対して示されたように、ＣＨ３変異から構成される。
【図３７】図３７−表６は、スキャホールド１に対して実施例５に記載されるように、３番目の設計段階に基づく、変異体ＣＨ３ドメインのリストである。
【図３８】図３８−表７は、スキャホールド２に対して実施例６に記載されるように、３番目の設計段階に基づく、改変ＣＨ３ドメインのリストである。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｂは、ＬＣ／ＭＳを用いた、いずれのＣ末端Ｔａｇも有さない変異体の純度測定を図示する。図３９Ａは、１つの代表的な変異体（ＡＺ１６２：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ）のＬＣ／ＭＳスペクトルを示す。変異体は、３つの異なる重鎖Ａと重鎖Ｂの比率（１：１．５（ＡＺ１３３−１）、１：１（ＡＺ１３３−２）および１．５：１（ＡＺ１３３−３））を用いて、実施例で記載されるように一時的共発現により発現された。試料は精製され、ＥｎｄｏＳで３７℃、１時間、脱グリコシル化された。ＭＳ分析の前に、試料はＰｏｒｏｓＲ２カラム上に注入され、３分間で２０〜９０％ＡＣＮ、０．２％ＦＡの勾配で溶出された。ＬＣカラムのピークは、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分光計（Ｃｏｎｅ電圧：５０  Ｖ’  Ｔｕｂｅレンズ：２１５Ｖ；ＦＴ解像度：７，５００）で分析され、Ｐｒｏｍａｓｓソフトウエアに統合させ、分子量プロファイルを作製した。図３９Ｂにおいて、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ変異体の典型例である対照２試料のＬＣ／ＭＳスペクトルを示す。変異体は、３つの異なる重鎖Ａと重鎖Ｂの比率（１：１．５（コントロール２−１）、１：１（コントロール２−２）および１．５：１（コントロール２−３））を用いて、実施例で記載されるように一時的共発現により発現された。試料は精製され、１時間、３７℃で、Ｅｎｄｏ  Ｓで脱グリコシル化された。ＭＳ分析の前に、試料はＰｏｒｏｓＲ２カラム上に注入され、３分間で２０〜９０％ＡＣＮ、０．２％ＦＡの勾配で溶出された。ＬＣカラムのピークは、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分光計（Ｃｏｎｅ電圧：５０  Ｖ’  Ｔｕｂｅレンズ：２１５Ｖ；ＦＴ解像度：７，５００）で分析され、Ｐｒｏｍａｓｓソフトウエアに統合させ、分子量プロファイルを作製した。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｂ。二重特異的結合を、Ｆｃヘテロ二量体の鎖Ａおよび鎖ＢのＮ末端に融合させたＦｃヘテロ二量体抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ３  ｓｃＦｖｓを用いて実証した。得られた変異体である、二重特異的ＨＥＲ２／ＨＥＲ３変異体および２つの一価一重特異的ＨＥＲ２、ＨＥＲ３変異体を、図４０Ａに図示する（鎖Ａは暗灰色、鎖Ｂは明灰色）。図４０Ｂにおいて、二重特異的結合の検証を実証する。
【図４１】野生型ＩｇＧ１  ＦｃとＡＺ３００３を比較する、コンピューターモデルを図示する。ＡＺ３００２に対するコンピューターモデルは、Ｔ３５０の位置でのＡＺ３００３に対するものと同一である。表に、選択されたヘテロ二量体変異体および、ＣＨ３融解温度へのＴ３５０Ｖ変異の安定化効果を要約する。図は、実施例１１に記載されるように、ヘテロ二量体変異体が発現され、精製されたことを示す。ＤＳＣは、実施例３に詳述されるように実施され、ＬＣ／ＭＳ定量は、実施例１１に詳述されるように実施された。
【図４２】リードヘテロ二量体の結晶構造と予測モデルの比較を図示する。変異接合面残基（表に示す）は、漫画的描写で強調されている。
【図４３】精製されたリードヘテロ二量体のグリコシル化パターン分析を描写する。
【図４４】精製されたリードヘテロ二量体の強制分解評価の結果を図示する。
【図４５】産業標準抗体精製プロセスのスキームを描写する。
【図４６】ＡＺ３００３ヘテロ二量体変異体の下流精製評価の要約（段階的な産生と回収を示す）を描写する（詳細は実施例１５を参照のこと）。ヘテロ二量体は、実施例１１に詳述されるように、１０Ｌの過渡的ＣＨＯで作製された。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書では、ヘテロ多量体の形成を促進するための、特定のアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインを提供する。一実施形態では、この改変ＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体の形成を促進するための特定のアミノ酸改変を含む（例えば表１．１〜１．３を参照のこと）。別の実施形態では、この改変ＣＨ３ドメインは、向上した安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進するための、特定のアミノ酸改変を含む（例えば表４、表６および表７を参照のこと）。安定性は、ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）として測定され、また、向上した安定性とは、約７０℃以上のＴｍを指す。このＣＨ３ドメインは、ヘテロ多量体、多重特異性抗体のＦｃ領域の一部分を構成する。本明細書の一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有するヘテロ多量体を提供し、このヘテロ二量体Ｆｃ領域はヘテロ二量体形成を促進するためのアミノ酸変異を含む改変ＣＨ３ドメインを含み、この改変ＣＨ３ドメインは表１に挙げられている変異体から選択される。第２の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有するヘテロ多量体を提供し、ここでこのヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、この改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は、約７０℃以上である。
【００４３】
改変ＣＨ３ドメインを生成するのに使用されるアミノ酸改変には、アミノ酸の挿入、欠損、置換、および再配列が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書では、ＣＨ３ドメインの改変と改変ＣＨ３ドメインはまとめて、「ＣＨ３の改変」、「改変ＣＨ３ドメイン」、「改変ＣＨ３ドメイン」または「ＣＨ３変異体」と呼ぶ。ある特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは選択した分子に組み込まれる。従って一実施形態では、改変ＣＨ３ドメインが組み込まれたＦｃ領域（本明細書で使用する場合「Ｆｃ領域」という用語や同様の用語は、少なくともＣＨ３ドメインの一部分を含有する、任意の重鎖定常領域ドメインを包含する）を含有する分子、例えば免疫グロブリン（例えば、抗体）などのポリペプチド、および他の結合タンパク質を提供する。本明細書において、改変ＣＨ３ドメイン（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠損、置換、または再配列を含有するＣＨ３ドメイン）を含有しているＦｃ領域を含有する分子を、「Ｆｃ変異体」、「ヘテロ二量体」または「ヘテロ多量体」と呼ぶ。本発明のＦｃ変異体は、ヘテロ二量体のＦｃ変異体または領域を生成するように非対称に改変されたＣＨ３ドメインを含む。このＦｃ領域は、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド、すなわちＡ鎖およびＢ鎖から構成されており、Ｆｃ領域が１つのＡ鎖ポリペプチドと１つのＢ鎖ポリペプチドを含む場合には、これらは交換可能である。アミノ酸改変はＣＨ３に非対称に導入されており、２つの改変ＣＨ３ドメインがＦｃ変異体を形成すると、ヘテロ二量体が生じる（例えば表１を参照のこと）。本明細書で使用する場合、非対称なアミノ酸改変とは、ヘテロ二量体またはＦｃ変異体を構成している第１のポリペプチド（例えば、「Ａ鎖」）の特定の位置にあるアミノ酸が、第２のポリペプチド（例えば、「Ｂ鎖」）の同じ位置にあるアミノ酸とは異なる、いずれもの改変を指す。非対称な改変は、Ｆｃ変異体のＡ鎖およびＢ鎖の、２つのアミノ酸のうちの１つだけを改変した結果であっても、あるいは、２つのアミノ酸の両方を改変した結果であってもよい。改変ＣＨ３ドメインが１つ以上非対称なアミノ酸改変を含むと理解される。
【００４４】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドと前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドとの境界面にあるアミノ酸とは、第１または第２のＣＨ３ドメインポリペプチド上にあって、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドと相互作用して、二量体ＣＨ３ドメインを形成する任意のアミノ酸である。第１のＣＨ３ドメインポリペプチドと前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドとの境界面にないアミノ酸は、第１または第２のＣＨ３ドメインポリペプチド上にあって、その他のＣＨ３ドメインポリペプチドとは相互作用しない、任意のアミノ酸である。本明細書に記載の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドと前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドとの境界面にはない改変されたアミノ酸とは、第１または第２のＣＨ３ドメインポリペプチド上にある任意のアミノ酸であって、本明細書に記載したように改変した後に、他方のＣＨ３ドメインポリペプチド上にあるアミノ酸とは相互作用しないアミノ酸である。例えば、本明細書に記載のある特定の実施形態では、Ｔ３５０のアミノ酸を改変する。実施例１２および図４２で提供する結晶構造で示すように、Ｔ３５０は２つのＣＨ３ドメインポリペプチドの相互作用には関与しない。Carter et al. Biochemistry 1998, 37, 9266に記載されているように、Ｔ３５０をどのように改変しても、ＣＨ３二量体の形成にはほとんど影響がないことが分かっている。本明細書に記載のヘテロ多量体Ｆｃ構築物では、Ｔ３５０への改変は、ＣＨ３二量体自体の形成には直接関与しないものの、変異体ＣＨ３ドメインに対する安定性に、予期せぬ効果があることが認められた。例えば、少なくとも１つのＴ３５０Ｘ改変を含有する変異体は（ここでＸは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびその誘導体または変異体から選択される天然のまたは天然のものではないアミノ酸である）、非常に安定な変異体ＣＨ３ドメインを形成する。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴ３５０Ｖ改変を含有する、本明細書に記載のに記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物がある。ある特定の態様では、第１および第２の変異体ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３５０Ｖ改変を含み、この改変は、このような改変を含有しない対応するＣＨ３ドメインと比べた場合の、変異体ＣＨ３ドメインの予期せぬ向上した安定性に寄与するものである。
【００４５】
本明細書では、別段の指定のない限り、濃度の範囲、パーセンテージの範囲、比率の範囲、または整数の範囲はいずれも、記載されている範囲に入っているいずれもの整数値、および、適切であれば、その端数（例えばある整数の１０分の１〜１００分の１）を包含すると理解される。本明細書で使用する場合、「約」は、別段の指定のない限り、示した範囲、値、配列、または構造の±１０％を意味する。本明細書で使用する場合「１つ」という用語は、別段の指定のない限りまたは文脈から示されない限り、列挙した構成要素が１つまたはそれ以上であることを指すことに留意されたい。選択的な用語（例えば「または」）の使用は、いずれか１つ、両方、またはそれら選択肢の任意の組み合わせを意味することを理解するべきである。本明細書で使用する場合「含む」および「含有する」という用語は同じ意味で使用される。加えて、本明細書に記載の個々の一本鎖ポリペプチドまたは構造体や置換基の多様な組み合わせに由来するヘテロ二量体（例えば、改変ＣＨ３ドメイン）は、あたかも各一本鎖ポリペプチドやヘテロ二量体がそれぞれ個別に示されているかのように同様の程度まで、本出願で開示されると理解されるべきである。従って、個々の一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するための、特定の構成要素の選択も本開示の範囲内である。
【００４６】
「第１のポリペプチド」とは、第２のポリペプチドと関連のある任意のポリペプチドであり、本明細書では「Ａ鎖」とも呼ぶ。第１のおよび第２のポリペプチドは「境界面」で接触している。「第２のポリペプチド」とは、「境界面」を介して第１のポリペプチドと関連する任意のポリペプチドであり、本明細書では「Ｂ鎖」とも呼ばれる。「境界面」は、第２のポリペプチドの境界面にある１つ以上の「接触」アミノ酸残基と相互作用する、第１のポリペプチドの境界面にある「接触」アミノ酸残基を含む。本明細書で使用する場合、境界面は、好ましくはＩｇＧ抗体に由来する、最も好ましくはヒトＩｇＧ１抗体に由来する、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインを含む。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「単離した」ヘテロ多量体とは、特定され、かつ、その天然の細胞培養環境から分離および／または回収されたヘテロ多量体を意味する。その天然の環境に由来する汚染物質とは、ヘテロ多量体の診断または治療への使用を妨害するであろう物質であり、これらには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様のまたは非タンパク質様の溶質などが挙げられ得る。
【００４８】
第１のアミノ鎖よりも、側鎖の体積が「大幅に大きくない」アミノ酸とは、A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24: 107-123, 1972からの側鎖体積の値に従って、第１のアミノ酸よりも、側鎖の体積の増加分が２０Å３を超えないアミノ酸である。ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸と比較した側鎖の体積の増加分は１０Å３を超えない。いくつかの実施形態では、第１のアミノ酸と比較した体積の増加分は５Å３を超えない。例えば、本明細書に記載のある特定の実施形態では突然変異はリシン（Ｋ）の変異、例えばＫ３９２Ｊがあり、ここでＪは、Ｌ、Ｉまたは、Ｋの側鎖体積よりも大幅に大きくない体積の側鎖をもつアミノ酸から選択される。
【００４９】
変異体Ｆｃヘテロ二量体は通常精製されて、実質的に均一である。「実質的に均一」、「実質的に均一な形態」および「実質的な均一性」という句は、その産物が、望ましくないポリペプチドの組み合わせ（例えばホモ二量体）に由来する副産物を実質的に含まないことを示すために使用される。純度に関して使用する場合、実質的な均一性とは、副産物の量が１０％を超えないこと、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、ここでパーセンテージは重量％である。
【００５０】
本明細書では異なる意味に使用されることが明示されていない限り、抗体技術の分野の当業者によって理解される用語はそれぞれ、当該分野で理解されているものと同じ意味を有する。抗体は可変領域、ヒンジ領域、および定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造と機能に関しては、例えば、Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988）にまとめられている。
【００５１】
野生型ホモ二量体からの変異体Ｆｃヘテロ二量体の設計は、安定性と特異性のバランスをとることにより、タンパク質工学の文脈におけるポジティブ設計およびネガティブ設計の概念として例示説明されている。ポリペプチドを細胞培養の条件で発現させた時に、ホモ二量体が形成されるよりも多くのヘテロ二量体の形成を誘導する目的で突然変異が導入される。ネガティブ設計の戦略では、ホモ二量体の形成に関する好ましくない相互作用を最大化する。この最大化は、例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈで開発されたｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ法により（Ridgway JB, Presta LG, Carter P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21; Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol. 270(1):26-35 (1997)）、一方の鎖に大きな側鎖を導入し、他方の鎖には小さい側鎖を導入することで、または例えば、Ａｍｇｅｎで開発された静電ステアリング法（Gunaskekaran K, et al. Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. JBC 285 (25): 19637-19646 (2010)）を用いた静電的な改変によって、ホモ二量体形成の反発を引き起こすことで行われる。これら２つの例では、ネガティブ設計の非対称な点突然変異が野生型ＣＨ３ドメインに導入され、ヘテロ二量体の形成が誘導された。Ｆｃヘテロ二量体の開発にはこれまで、ネガティブ設計しか用いられてこなかった。公表されている結果からは、ネガティブ設計のアプローチのみを用いて設計されたヘテロ二量体は、９５％を超える高い特異性を有するヘテロ二量体を生じるが、複合体が著しく不安定になることが示されている（上記）。これらネガティブ設計によるヘテロ二量体の改変ＣＨ３ドメインの融解温度は６９℃以下で、野生型よりも多くのジスルフィド結合は含んでいない。下記表Ａを参照のこと。
【００５２】
【表１】
2014533243.tif 000003
＊我々の行った実験では、対照１の純度は９０％を上回っていたが、文献で報告されているように、１００％にはならなかった。
＊＊我々の実験系では、対照４のＴｍは７７℃を上回っていた；この変異体のＴｍは報告されていない。
ＮＰ−対照３のＴｍは報告されておらず、我々の実験系でも試験しなかった。
野生型ＩｇＧ１の融解温度に関しては、使用した実験系により、８１〜８３の範囲であることが報告されおり、我々の実験系では８１．５℃と報告する。
【００５３】
ネガティブ設計とは対照的に、タンパク質の改変に用いられている一般的な概念がポジティブ設計である。この場合には、タンパク質の中の好ましい相互作用、またはタンパク質同士の好ましい相互作用を最大化するために、ポリペプチドにアミノ酸改変を導入する。この方法では、ホモ二量体への影響を考慮せず、所望のヘテロ二量体を特異的に安定化する複数の突然変異を導入すると、正味の効果は、ホモ二量体に対してよりも、所望のヘテロ二量体に対して選択性の高いものとなり、その結果、ヘテロ二量体の特異性が高まると仮定している。タンパク質工学においては、ポジティブ設計法では、所望のタンパク質の相互作用の安定性が最適化されるが、９０％を超える特異性が達成されることはほとんどないと認識されている（Havranek JJ & Harbury PB. Automated design of specificity in molecular recognition.Nat Struct Biol. 10(1):45-52 (2003); Bolon DN, Grant RA, Baker TA, Sauer RT. Specificity versus stability in computational protein design. Proc Natl Acad Sci U S A. 6;102(36):12724-9 (2005); Huang PS, Love JJ, Mayo SL. A de novo designed protein protein interface Protein Sci. 16(12):2770-4 (2007)）。本開示より前には、Ｆｃヘテロ二量体の設計にはポジティブ設計法は用いられてこなかった。なぜならば、治療用抗体の産生および開発に関しては、安定性よりも特異性が重要視されていたからである。加えて、ポジティブ設計における有用な突然変異を予測することは難しい。Ｆｃヘテロ二量体の安定性を高めるために、ジスルフィド結合を増やすなど、安定性を向上させるための他の方法論が試みられてきたが、分子の改善の成功例は限られている（表Ａを参照のこと）。これはおそらく、改変したＦｃＣＨ３ドメインのジスルフィド結合が全て溶媒に曝される場所にあるため、このジスルフィド結合の寿命が短くなり、その結果、特に、改変ＣＨ３ドメインのＴｍが７０℃未満で、追加のジスルフィド結合がない場合に（Ｔｍが６９℃でジスルフィドを含まない対照４のように（対照２を参照のこと）、ヘテロ二量体の長期安定性に影響を及ぼすためだと考えられる。ＣＨ３ドメインの固有の安定性（融解温度で測定する）がジスルフィド結合を含まずに７０℃以上の場合、特に、ＣＨ３ドメインの固有の安定性（融解温度で測定する）がジスルフィド結合を含まずに７２℃以上の場合、ジスルフィド結合などの他の方法を本発明のＦｃ変異体に用いて安定性を向上させても良いと想定される。
【００５４】
その結果我々は、本明細書において、安定で、かつ、高い特異性でヘテロ二量体を形成するＦｃヘテロ二量体を設計するための新規方法を開示する。この設計方法は、構造学的およびコンピューターを使ったタンパク質工学技術に則って、ネガティブ設計とポジティブ設計を組み合わせたものである。この強力な方法によって、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの中に、新しい組み合わせの突然変異を設計することが可能になり、標準的な細胞培養の条件でも、ホモ二量体と比較して、ヘテロ二量体が９０％を上回る純度で形成され、かつ、得られるヘテロ二量体の融解温度は７０℃以上であった。例となる実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は７３℃以上であり、かつ、純度は９８％を超える。他の例となる実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は７５℃以上で、かつ、純度は９０％を上回る。本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ変異体のある特定の実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は７７℃以上で、かつ、純度は９８％を上回る。本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ変異体のいくつかの実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は７８℃以上で、かつ、純度は９８％を上回る。本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ変異体のある特定の実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は７９℃以上で、かつ、純度は９８％を上回る。本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ変異体のある特定の実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は８０℃以上で、かつ、純度は９８％を上回る。本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ変異体のある特定の実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の融解温度は８１℃以上で、かつ、純度は９８％を上回る。
【００５５】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を提供し、ここで、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は、７０℃以上である。本明細書で使用する場合「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７０℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７２℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７４℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７５℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７６℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７８℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が７９℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が８０℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。ある特定の実施形態において「向上した安定性」または「安定なヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の形成において融解温度が８１℃以上の、改変ＣＨ３ドメインを指す。加えて、本明細書において「ヘテロ二量体の形成を促進する」という用語は、ＣＨ３ドメイン中にあるアミノ酸変異で、ホモ二量体の形成と比較して、９０％を超えるヘテロ二量体を形成するアミノ酸変異を指すと理解される。
【００５６】
さらなる実施形態では、ジスルフィド結合がさらに付加されていなくても、安定性が高い。具体的には、ＣＨ３ドメインにジスルフィド結合がさらに付加されていなくても、安定性が高い。一実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは野生型ＣＨ３ドメインと比較して、ジスルフィド結合のさらなる付加がない。別の実施形態では、改変ＣＨ３の融解温度が、ジスルフィド結合がない場合に７０℃以上であるという条件で、この改変ＣＨ３は野生型ＣＨ３ドメインに比べて、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。一実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインと比較して、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、かつ、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７７．５℃以上である。ある実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは野生型ＣＨ３ドメインと比較して、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、かつ、この改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７８℃以上である。別の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは野生型ＣＨ３ドメインと比較して、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、かつ、この改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７８℃より高い、または約７８．５℃より高い、または約７９℃より高い、または約７９．５℃より高い、または約８０℃より高い、または約８０．５℃より高い、または約８１℃より高い、または約８１．５℃より高い、または約８２℃より高い、または約８２．５℃より高い、または約８３℃より高い。
【００５７】
一実施形態では、改変ＣＨ３ドメインの融解温度は、約７０℃より高い、または約７０．５℃より高い、または約７１℃より高い、または約７１．５℃より高い、または約７２℃より高い、または約７２．５℃より高い、または約７３℃より高い、または約７３．５℃より高い、または約７４℃より高い、または約７４．５℃より高い、または約７５℃より高い、または約７５．５℃より高い、または約７６℃より高い、または約７６．５℃より高い、または約７７℃より高い、または約７７．５℃より高い、または約７８℃より高い、または約７８．５℃より高い、または約７９℃より高い、または約７９．５℃より高い、または約８０℃より高い、または約８０．５℃より高い、または約８１℃より高い、または約８１．５℃より高い、または約８２℃より高い、または約８２．５℃より高い、または約８３℃より高い。別の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインの融解温度は、約７０℃、または約７０．５℃、または約７１℃、または約７１．５℃、または約７２℃、または約７２．５℃、または約７３℃、または約７３．５℃、または約７４℃、または約７４．５℃、または約７５℃、または約７５．５℃、または約７６℃、または約７６．５℃、または約７７℃、または約７７．５℃、または約７８℃、または約７８．５℃、または約７９℃、または約７９．５℃、または約８０℃、または約８０．５℃、または約８１℃である。さらに別の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインの融解温度は、約７０℃〜約８１℃、または約７０．５℃〜約８１℃、または約７１℃〜約８１℃、または約７１．５℃〜約８１℃、または約７２℃〜約８１℃、または約７２．５℃〜約８１℃、または約７３℃〜約８１℃、または約７３．５℃〜約８１℃、または約７４℃〜約８１℃、または約７４．５℃〜約８１℃、または約７５℃〜約８１℃、または約７５．５℃〜約８１℃、または７６℃ｔｏ約８１℃、または約７６．５℃〜約８１℃、または約７７℃〜約８１℃、または約７７．５℃〜約８１℃、または約７８℃〜約８１℃、または約７８．５℃〜約８２℃、または約７９℃〜約８１℃である。一層さらに別の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインの融解温度は、約７１℃〜約７６℃、または約７２℃〜約７６℃、または約７３℃〜約７６℃、または約７４℃〜約７６℃である。
【００５８】
改善された安定性に加えて、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含む。ヘテロ二量体の形成を促進するためのこれらアミノ酸変異は、ホモ二量体の形成と比較されるものであると理解される。ホモ二量体の形成と比較されるこのヘテロ二量体の形成は、本明細書ではまとめて、「純度」もしくは「特異性」または「ヘテロ二量体の純度」もしくは「ヘテロ二量体の特異性」と呼ぶ。ヘテロ二量体の純度が、溶液中・標準的な細胞培養の条件において形成され、ヘテロ二量体種に選択的な精製を行う前の、所望のヘテロ二量体の、ホモ二量体種と比較した場合のパーセンテージを指すことに留意されたい。例えば、ヘテロ二量体の純度が９０％であるとは、溶液中の二量体種の９０％が所望のヘテロ二量体であることを示している。一実施形態では、Ｆｃ変異体のヘテロ二量体の純度は、約９０％より高い、または約９１％より高い、または約９２％より高い、または約９３％より高い、または約９４％より高い、または約９５％より高い、または約９６％より高い、または約９７％より高い、または約９８％より高い、または約９９％より高い。別の実施形態では、Ｆｃ変異体のヘテロ二量体の純度は、約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％である。
【００５９】
具体的な実施形態では、単離したヘテロ多量体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は７０℃以上で、かつ、得られるヘテロ二量体の純度は９０％を超える。一態様では、得られるＦｃ変異体ヘテロ二量体の純度は９８％を超え、かつ、改変ＣＨ３ドメインの融解温度は、約７０℃より高い、または約７１℃より高い、または約７２℃より高い、または約７３℃より高い、または約７４℃より高い、または約７５℃より高い、または約７６℃より高い、または約７７℃より高い、または約７８℃より高い、または約７９℃より高い、または約８０℃より高い、または約８１℃より高い。さらなる態様では、改変ＣＨ３ドメインの融解温度は、７０℃以上であり、かつ、得られるＦｃ変異体ヘテロ二量体の純度は、約９０％より高い、または約９１％より高い、または約９２％より高い、または約９３％より高い、または約９４％より高い、または約９５％より高い、または約９６％より高い、または約９７％より高い、または約９８％より高い、または約９９％より高い。
【００６０】
改善された安定性と純度を有するこれらのＦｃ変異体を設計するために、コンピューターを用いた設計の反復工程、および、実験的にスクリーニングの用いて、ポジティブ設計法とネガティブ設計法の最も有効な組み合わせを選択した（図２４を参照のこと）。
【００６１】
具体的には、最初の設計段階では、異なるネガティブ設計のＦｃ変異体ヘテロ二量体を作成し、実施例１〜３に記載するように、発現と安定性に関する試験を行った。最初の設計段階では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ１−ＡＺ１６を作成した（表１を参照のこと）。安定性が低いと予測した（例えば、Ｔｍが７１℃未満）このネガティブ設計のＦｃ変異体ヘテロ二量体の最初の組から、純度が９０％を超えていて、かつ、融解温度が約６８℃以上のＦｃ変異体ヘテロ二量体をその後の開発のために選択した。これらには、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体のＡＺ６、ＡＺ８およびＡＺ１５が含まれた。二回目の設計段階では、選択したこれらのＦｃ変異体ヘテロ二量体を、詳細なコンピューターによる解析および構造解析に従うポジティブ設計によってさらに改変して、安定性と純度の両方を与えた。選択したＦｃ変異体ヘテロ二量体（ＡＺ６、ＡＺ８、およびＡＺ１５）をそれぞれ、コンピューターを用いた方法と包括的な構造機能分析によって解析し、これらのＦｃ変異体が野生型Ｆｃホモ二量体の安定性（ＩｇＧ１の安定性は８１℃）よりも低いことの構造的な原因を特定した。Ｆｃ変異体ヘテロ二量体およびＴｍ値に関しては、表４を参照のこと。
【００６２】
ある特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＡＺ１、またはＡＺ２、またはＡＺ３、またはＡＺ４、またはＡＺ５、またはＡＺ６、またはＡＺ７、またはＡＺ８、またはＡＺ９、またはＡＺ１０、またはＡＺ１１、またはＡＺ１２、またはＡＺ１３、またはＡＺ１４、またはＡＺ１５、またはＡＺ１６から選択される。選択した実施形態では、改変ＣＨ３ドメインはＡＺ６、またはＡＺ８またはＡＺ１５である。
【００６３】
コンピューターツールおよび構造機能分析には、分子動態解析（ＭＤ）、側鎖／主鎖再パッキング（ｒｅ−ｐａｃｋｉｎｇ）、ナレッジベースポテンシャル（Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＫＢＰ）、空洞および（疎水性）パッキング解析（ｃａｖｉｔｙ  ａｎｄ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）ｐａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＬＪ、ＣＣＳＤ、ＳＡＳＡ、ｄＳＡＳＡ（炭素／全原子））、静電ＧＢ計算（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ−ＧＢ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）、ならびに結合解析（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が含まれたが、これらには限定されない（コンピューターを用いた方法の概要については図２４を参照のこと）。
【００６４】
タンパク質工学アプローチのある態様は、Ｘ線結晶解析から得られたＦｃ  ＩｇＧタンパク質の構造の情報を、ＣＨ３ドメインの野生型および変異体形態のコンピューターモデリングおよびシミュレーションと組み合わせることに依存するものであった。これにより、個々のアミノ酸の可能性のある役割やそれらの協同的な作用について、新たな構造的および物理化学的な知見を得ることができた。複数の改変ＣＨ３ドメインから得られたこれらの構造的および物理化学的な知見は、結果として生じる、それらの安定性および純度に関連する経験的なデータと共に、本発明者らが、Ｆｃホモ二量体やシミュレートした構造モデルと比較して、Ｆｃヘテロ二量体の純度および安定性の関係性について理解を深めることの手助けとなった。シミュレーションを実行するために、本発明者らは、完全で現実的なモデルを構築し、ＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃ構造の品質を改良することから開始した。Ｘ線結晶解析によるタンパク質の構造は、生理的条件下の水性媒体における、タンパク質の特定の特徴に関する細部を欠いており、本発明者らの改良方法は、これらの制限に対処した。それらには、タンパク質構造の欠けている領域、多くの場合、ループおよびいくつかの残基側鎖などのようなタンパク質の可動性の部分を構築すること、中性および荷電残基のプロトン化状態ならびにタンパク質と関連する可能性のある機能的に関連する水分子の配置を評価し、定めることが含まれる。
【００６５】
分子動態（ＭＤ）アルゴリズムは本発明者らが使用したツールの１つであり、タンパク質構造をシミュレートすることで、水性環境におけるＦｃホモ二量体および改変ＣＨ３ドメインの、固有の動的な性質を評価した。分子動態シミュレーションは、タンパク質およびその局所的な環境におけるすべての原子要素、この場合、Ｆｃおよびその周囲の水分子を構成する原子、の間に作用する相互作用および力から生じる運動に起因する分子の動的な軌道を追跡する。分子動態シミュレーションの後に、Ｆｃホモ二量体および変異体Ｆｃヘテロ二量体の構造的なおよび動的な特徴に関する知見を得るために、軌道の様々な側面を解析し、これらを使用して、分子の純度および安定性の両方を改善する特定のアミノ酸変異を特定した。
【００６６】
そのため、Ｆｃ構造に固有の、低頻度で生じる動きを明らかにするために、主成分解析などの方法を用いて生成したＭＤの軌道を調べた。これにより、タンパク質が取り得る配座の準安定状態に関する知見が得られる（図３２を参照のこと）。Ｆｃ領域のＡ鎖とＢ鎖の間の決定的なタンパク質間相互作用はＣＨ３ドメインの境界面で起こるが、本発明者らのシミュレーションは、この境界面が、互いに関連しているＣＨ２ドメインＮ末端の「開口」および閉鎖」に関係する運動においてヒンジとして作用することを示した。ＣＨ２ドメインは、図１６において見られるように、この末端でＦｃｇＲと相互作用する。したがって、理論によって束縛されることを望むものではないが、ＣＨ３境界面へのアミノ酸変異の導入は、ＦｃのＮ末端での開／閉運動の度合および性質に影響を与え、その結果、ＦｃがＦｃｇＲとどのように相互作用するかに影響を及ぼすと考えられる。例４と表５を参照のこと。
【００６７】
生成されたＭＤの軌道をさらに調べ、アミノ酸残基の柔軟性およびそれらの環境の解析に基づいて、Ｆｃ構造における特定のアミノ酸残基位置の変異性を決定した。このアルゴリズムによって、タンパク質の構造および機能に影響を及ぼし得る残基を特定することが可能になり、その後の改変ＣＨ３ドメインの設計段階用に、残基の特徴および変異性に関する類のない知見が得られた。また、この解析によって、複数のシミュレーションを比較し、プロファイリング後の異常値に基づいて変異性を評価することが可能になった。
【００６８】
また、生成されたＭＤの軌道を調べ、タンパク質内の相関している残基の運動および、それらが結合した結果生じる、残基ネットワークの形成を決定した。Ｆｃ構造内の残基の動的な相関およびネットワークを調べることは、動的な要素としてタンパク質を理解し、遠位部位の突然変異の影響についての理解を深めるのに決定的なステップとなる。例えば実施例６を参照のこと。
【００６９】
このように、本発明者らは、突然変異の部位の局所的な環境に対する突然変異の影響を詳細に研究した。Ａ鎖とＢ鎖の間のＣＨ３境界面で、十分にパッキングされたコアが形成されることは、安定したＦｃ構造中で、２つの鎖が自発的に対合することにとって重要である。好適なパッキングは、相互作用分子パートナーの間の、構造的に強い相補性とともに、接触する基の間の好ましい相互作用の結果である。好ましい相互作用は、溶媒曝露から十分に離れた埋没した疎水性接触および／または親水性極性基の間の相補的な静電接触の形成に起因する。これらの疎水性および親水性接触は、ＣＨ３境界面での二量体形成の自由エネルギーに対するエントロピーおよびエンタルピーに寄与する。本発明者らは様々なアルゴリズムを用いて、Ａ鎖およびＢ鎖の間のＣＨ３境界面でのパッキングを正確にモデル化し、続いて、いくつかの関連する物理化学的特性を等級付けることによって、境界面の熱力学的特性を評価する。
【００７０】
本発明者らは、柔軟性をもつ主鎖を含むいくつかのタンパク質パッキング法を用い、コンピューターを用いてスクリーニングした多くの変異体について、モデル構造を最適化し、調製した。パッキングした後に、接触密度、衝突スコア、水素結合、疎水性、および静電学を含むいくつかの事項を評価した。溶媒和モデルの使用によって、溶媒環境の影響により正確に対応し、特定の位置にあるタンパク質を別の残基型に変化させた後の自由エネルギーの差を対比することが可能になった。接触密度および衝突スコアは、有効なタンパク質パッキングの決定的な側面である相補性の基準を提供する。これらのスクリーニング法は、ナレッジベースポテンシャルまたは残基相互作用エネルギーの対比較およびエントロピー計算に依存する結合解析手法の適用に基づくものである。
【００７１】
この網羅的なインシリコ解析によって、境界面ホットスポット、非対称性の部位、空洞およびパッキングが不十分な領域、個々の部位の構造の動態、および局所的なアンフォールディングの部位に関して、野生型と比較した、それぞれのＦｃ変異体の差異についての詳細な理解が提供された。記載のコンピューター解析の結果を合わせて、最適化されておらず、組み合わせてより低い安定性（例えば６８℃のＴｍ）および／または９０％未満の純度のより低い特異性の原因となる特定の残基、配列／構造モチーフ、および空洞を決定した。第２の設計段階で本発明者らは、これらの仮説に特定的に取り組むために、さらなる点突然変異によって標的化したポジティブ設計を使用し、上に記載の方法および解析法を使用して、インシリコ改変によってこれらを試験した（図２４を参照のこと）。第２段階で標的としたそれぞれの設計の安定性と純度を向上させるために設計したＦｃ変異体ヘテロ二量体（Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ１７〜ＡＺ１０１）の発現および安定性を実施例１〜４で記載するように実験的に検証した。
【００７２】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインは、ＡＺ１７、またはＡＺ１８、またはＡＺ１９、またはＡＺ２０、またはＡＺ２１、またはＡＺ２２、またはＡＺ２３、またはＡＺ２４、またはＡＺ２５、またはＡＺ２６、またはＡＺ２７、またはＡＺ２８、またはＡＺ２９、またはＡＺ３０、またはＡＺ２１、またはＡＺ３２、またはＡＺ３３、またはＡＺ３４、またはＡＺ３５、またはＡＺ３６、またはＡＺ３７、またはＡＺ３８、またはＡＺ３９、またはＡＺ４０、またはＡＺ４１、またはＡＺ４２、またはＡＺ４３、またはＡＺ４４、またはＡＺ４５、またはＡＺ４６、またはＡＺ４７、またはＡＺ４８、またはＡＺ４９、またはＡＺ５０、またはＡＺ５１、またはＡＺ５２、またはＡＺ５３、またはＡＺ５４、またはＡＺ５５、またはＡＺ５６またはＡＺ５７、またはＡＺ５８、またはＡＺ５９、またはＡＺ６０、またはＡＺ６１、またはＡＺ６２、またはＡＺ６３、またはＡＺ６４、またはＡＺ６５、またはＡＺ６６、またはＡＺ６７、またはＡＺ６８、またはＡＺ６９、またはＡＺ７０、またはＡＺ７１、またはＡＺ７２、またはＡＺ７３、またはＡＺ７４、またはＡＺ７５、またはＡＺ７６、またはＡＺ７７、またはＡＺ７８、またはＡＺ７９、またはＡＺ８０、またはＡＺ８１、またはＡＺ８２、またはＡＺ８３、またはＡＺ８４、またはＡＺ８５、またはＡＺ８６、またはＡＺ８７、またはＡＺ８８、またはＡＺ８９、またはＡＺ９０、またはＡＺ９１、またはＡＺ９２、またはＡＺ９３、またはＡＺ９４、またはＡＺ９５、またはＡＺ９６、またはＡＺ９７、またはＡＺ９８、またはＡＺ９９、またはＡＺ１００またはＡＺ１０１である。例となる実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＡＺ１７、またはＡＺ１８、またはＡＺ１９、またはＡＺ２０、またはＡＺ２１、またはＡＺ２２、またはＡＺ２３、またはＡＺ２４、またはＡＺ２５、またはＡＺ２６、またはＡＺ２７、またはＡＺ２８、またはＡＺ２９、またはＡＺ３０、またはＡＺ２１、またはＡＺ３２、またはＡＺ３３、またはＡＺ３４、またはＡＺ３８、またはＡＺ４２、またはＡＺ４３、またはＡＺ４４、またはＡＺ４５、またはＡＺ４６、またはＡＺ４７、またはＡＺ４８、またはＡＺ４９、またはＡＺ５０、またはＡＺ５２、またはＡＺ５３、またはＡＺ５４、またはＡＺ５８、またはＡＺ５９、またはＡＺ６０、またはＡＺ６１、またはＡＺ６２、またはＡＺ６３、またはＡＺ６４、またはＡＺ６５、またはＡＺ６６、またはＡＺ６７、またはＡＺ６８、またはＡＺ６９、またはＡＺ７０、またはＡＺ７１、またはＡＺ７２、またはＡＺ７３、またはＡＺ７４、またはＡＺ７５、またはＡＺ７６、またはＡＺ７７、またはＡＺ７８、またはＡＺ７９、またはＡＺ８１、またはＡＺ８２、またはＡＺ８３、またはＡＺ８４、またはＡＺ８５、またはＡＺ８６、またはＡＺ８７、またはＡＺ８８、またはＡＺ８９、またはＡＺ９１、またはＡＺ９２、またはＡＺ９３、またはＡＺ９４、またはＡＺ９５、またはＡＺ９８、またはＡＺ９９、またはＡＺ１００またはＡＺ１０１である。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＡＺ３３またはＡＺ３４である。別の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＡＺ７０またはＡＺ９０である。
【００７３】
例となる実施形態では、ＣＨ３ドメインは第１のポリペプチドと第２のポリペプチド（本明細書ではＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）を含み、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６I、Ｋ３９２Ｍおよび１３９４Ｗを含む。別の実施形態では、第１のポリペプチドはアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６I、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含む。
【００７４】
コンピューターによる構造機能解析、標的化エンジニアリング、および実験的な検証のこの反復プロセスを使用して、続く設計段階において、表１において列挙される残りのＦｃ変異体を設計し、９０％を超える純度及ＣＨ３ドメインの融解温度が７０℃を超える向上したＦｃ変異体ヘテロ二量体を得た。ある特定の実施形態においてＦｃ変異体は、ＡＺ１〜ＡＺ１３６から選択されるアミノ酸変異を含む。さらなる態様においてＦｃ変異体は、表４に列挙されるＦｃ変異体から選択されるアミノ酸変異を含む。
【００７５】
第１および第２の設計段階から、２つのコア足場、すなわち足場１および足場２を特定し、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の純度および安定性を微調整するために、さらなるアミノ酸改変をこれらの足場に導入した。ＡＺ８、ＡＺ１７〜６２、および表６に列挙した変異体を含む足場１の開発の詳細な説明については、実施例５を参照のこと。ＡＺ１５およびＡＺ６３〜１０１ならびに表７に列挙した変異体を含む足場２の開発の詳細な説明については、例６を参照のこと。
【００７６】
足場１のコア突然変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗを含む。足場１ａは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、足場１ｂは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む。実施例５を参照のこと。
【００７７】
ある特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてはＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで、第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む。一態様では、改変ＣＨ３ドメインは、Ｆ４０５および／またはＫ３９２の位置に点突然変異をさらに含む。Ｋ３９２の位置のこれらの突然変異は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅを含むが、これらには限定されない。Ｆ４０５の位置のこれらの突然変異には、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗが含まれるが、これらには限定されない。別の態様では、改変ＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１および／またはＳ４００の位置に点突然変異をさらに含む。Ｔ４１１の位置のこれらの突然変異には、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗが含まれるが、これらには限定されない。Ｓ４００の位置のこれらの突然変異には、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋが含まれるが、これらには限定されない。さらに別の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは第１および第２のポリペプチドを含み、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含み、第１および／または第２のポリペプチドは、Ｔ３６６および／またはＬ３６８の位置にさらなるアミノ酸改変を含む。Ｔ３６６の位置のこれらの突然変異には、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｗが含まれるが、これらには限定されない。例となる実施形態では、Ｔ３６６の位置のアミノ酸変異は、Ｔ３６６Ｉである。別の例となる実施形態では、Ｔ３６６位のアミノ酸変異は、Ｔ３６６Ｌである。Ｌ３６８の位置の突然変異には、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、およびＬ３６８Ａが含まれるが、これらには限定されない。
【００７８】
ある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６ＩおよびＴ３９４Ｗを含む。
【００７９】
ある特定の他の態様において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで、第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは。アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み、ここで第１のポリペプチドはアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６I、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含む。
【００８０】
一層さらに別の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで、第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含む。
【００８１】
ある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで、第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６ＬおよびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６ＩおよびＴ３９４Ｗを含む。
【００８２】
例となる実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７４℃以上である。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７４℃以上であり、ヘテロ二量体の純度は約９８％以上である。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超え、および改変ＣＨ３ドメインは表６から選択される。
【００８４】
足場２のコア突然変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを含む。足場２ａは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆを含み、足場２ｂは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを含む。例６を参照のこと。
【００８５】
ある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含む。一態様において、改変ＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６、Ｌ３５１、およびＹ４０７の位置に点突然変異をさらに含む。Ｔ３６６の位置のこれらの突然変異には、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｗが含まれるが、これらには限定されない。特定の実施形態では、Ｔ３６６の位置の突然変異は、Ｔ３６６Ｖである。Ｌ３５１の位置の突然変異には、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、またはＬ３５１Ｆが含まれるが、これらには限定されない。Ｙ４０７の位置の突然変異には、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｓが含まれるが、これらには限定されない。表１および表４および実施例６におけるＣＨ３変異体ＡＺ６３〜ＡＺ７０を参照のこと。
【００８６】
例となる実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６ＶおよびＫ４０９Ｆを含む。
【００８７】
例となる実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７５．５℃以上である。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７５℃以上であり、ヘテロ二量体の純度は約９０％以上である。
【００８８】
他のある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１ＹおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含み、改変ＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、および／またはＫ３９２の位置に１つ以上のアミノ酸改変を含む。Ｄ３９９の位置のこれらの突然変異には、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、またはＤ３９９Ｋが含まれるが、これらには限定されない。Ｔ４１１の位置の突然変異には、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、またはＴ４１１Ｗが含まれるが、これらには限定されない。Ｓ４００の位置の突然変異には、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋが含まれるが、これらには限定されない。Ｆ４０５の位置の突然変異には、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、またはＦ４０５Ｗが含まれるが、これらには限定されない。Ｎ３９０の位置の突然変異には、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、またはＮ３９０Ｄが含まれるが、これらには限定されない。Ｋ３９２の位置の突然変異には、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、またはＫ３９２Ｅが含まれるが、これらには限定されない。表１および表４および実施例６のＣＨ３変異体ＡＺ７１〜１０１を参照のこと。
【００８９】
例となる実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖およびＢ鎖とも呼ばれる）、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６ＡおよびＫ４０９Ｆを含む。一態様では、この改変ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９ＲおよびＳ４００Ｒをさらに含む。さらなる実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、第１および第２のポリペプチドを含み、ここで第１のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００ＲおよびＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２ＥおよびＴ４１１Ｅを含む。
【００９０】
例となる実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７４℃以上である。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は約７４℃以上であり、かつ、ヘテロ二量体の純度は約９５％以上である。
【００９１】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体を本明細書において提供し、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は７０℃を超え、改変ＣＨ３ドメインは表７から選択される。
【００９２】
さらに、改善した安定性および純度を有するＦｃ変異体ヘテロ二量体を設計するこの新しい方法は、他のクラスおよびアイソタイプのＦｃ領域に適用することができる。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域である。さらなる実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来するものである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプである。
【００９３】
【表２−１】
2014533243.tif 000004
【表２−２】
2014533243.tif 000005
【表２−３】
2014533243.tif 000006
【表２−４】
2014533243.tif 000007
【表２−５】
2014533243.tif 000008
【表２−６】
2014533243.tif 000009
【００９４】
【表３】
2014533243.tif 000010
【００９５】
【表４】
2014533243.tif 000011
【００９６】
本明細書で定義するＦｃ領域は、ＣＨ３ドメインまたはその断片を含み、さらに、ヒンジ、ＣＨ１、またはＣＨ２などの、１つ以上のさらなる定常領域ドメインまたはその断片を含んでいてもよい。当然のことながら、Ｆｃのアミノ酸残基の付番は、Kabat et al., 1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Vaに記載されている、ＥＵインデックス番号である。「Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  Ｋａｂａｔ抗体のＥＵインデックス番号を指す。便宜を図るために、表Ｂに、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアミノ酸に、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従って付番したものを提供する。
【００９７】
【表５】
2014533243.tif 000012
【００９８】
本発明の一態様に従って、改変したヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供する。前記改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含み；ここで前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つはＫ３９２Ｊのアミノ酸改変を含み、Ｊは、Ｌ、ＩまたはＫの側鎖体積よりも大幅に大きくない側鎖を有するアミノ酸から選択され；前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも約７４℃で、純度が少なくとも９５％のヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し；および少なくとも１つのアミノ酸改変は、前記第１および前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドの境界面にあるアミノ酸のものではない。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載のヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、この構築物は少なくとも１つのＴ３５０Ｘ改変を含み、ここでＸは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびその誘導体または変異体から選択される、天然のまたは非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのＴ３５０Ｖ改変を含有する、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物がある。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５℃以上である。一実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで改変ＣＨ３ドメインのＴｍは約７７℃以上である。ある特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインのＴｍは約８０℃以上である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、ここでＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、およびＹ４０７のうちの少なくとも１つのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態においてはは、単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここでＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｔ３６６のアミノ酸改変をさらに含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、およびＹ４０７の位置にアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６、Ｋ３９２、およびＴ３９４の位置にアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。ある実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドがアミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む。さらなる実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはアミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｓ４００の位置にアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。さらなる実施形態においては、Ｓ４００Ｚ改変を含有する本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここでＺは、正に帯電したアミノ酸および負に帯電したアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、正に帯電したアミノ酸はリシンまたはアルギニンであり、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒから選択されるアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、ここで前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｎ３９０の位置にアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｎ３９０の改変はＮ３９０Ｚであり、ここでＺは、正に帯電したアミノ酸および負に帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態では、Ｎ３９０ＺはＮ３９０Ｒである。本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物のある特定の実施形態では、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸改変Ｓ４００Ｅを含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸改変Ｎ３９０Ｒを含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物のいくつかの実施形態では、第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはそれぞれ改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、前記改変ＣＨ３ドメインポリペプチドの１つがアミノ酸改変Ｑ３４７Ｒを含み、他方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがアミノ酸改変Ｋ３６０Ｅを含む。
【００９９】
一態様では、改変したヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、前記改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、ここで前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つはＫ３９２Ｊのアミノ酸改変を含み、Ｊは、Ｌ、ＩまたはＫの側鎖体積よりも大幅に大きくない側鎖を有するアミノ酸から選択され、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも約７４℃で、かつ、純度が少なくとも９５％のヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し、および少なくとも１つのアミノ酸改変は、前記第１および前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドの境界面にあるアミノ酸には生じない。ある特定の実施形態においては、少なくとも１つのＴ３５０Ｘ改変を含む本明細書に記載のヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここでＸは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびその誘導体または変異体から選択される、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態のおいては、少なくとも１つのＴ３５０Ｖ改変を含む、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物がある。ある実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５℃以上である。ある実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで改変ＣＨ３ドメインのＴｍは約７７℃以上である。ある特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインのＴｍは約８０℃以上である。ある実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここでＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｋ４０９およびＴ４１１のアミノ酸改変のうちの少なくとも１つを含む改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。ある特定の実施形態においては、Ｋ４０９Ｆ、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄのうちの少なくとも１つを含む、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここでＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｄ３９９のアミノ酸改変を含む改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｄ３９９のアミノ酸改変は、Ｄ３９９ＲおよびＤ３９９Ｋのうちの少なくとも１つである。
【０１００】
一態様では、改変したヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含有する単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、前記改変ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、および野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、少なくとも３つのアミノ酸改変を含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含み；ここで前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、アミノ酸改変Ｋ３９２Ｊを含み、Ｊは、Ｌ、ＩまたはＫの側鎖体積よりも大幅に大きくない側鎖を有するアミノ酸から選択され、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも約７４℃で、かつ、純度が少なくとも９５％のヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成し、および少なくとも１つのアミノ酸改変は、前記第１および前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドの境界面にあるアミノ酸には生じない。ある特定の実施形態においては、少なくとも１つのＴ３５０Ｘ改変を含有する、本明細書に記載のヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここでＸは、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびその誘導体または変異体から選択される、天然のまたは非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのＴ３５０Ｖ改変を含有する、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物がある。ある実施形態では、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５℃以上である。ある実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体Ｆｃ構築物があり、ここで改変ＣＨ３ドメインのＴｍは約７７℃以上である。ある特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインのＴｍは約８０℃以上である。本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物のある特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ４０９Ｆ、Ｔ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドであり、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７I、Ｙ４０７Ｖ、Ｄ３９９ＲおよびＤ３９９Ｋから選択される、少なくとも１つのアミノ酸改変を含有する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６I、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｍ、およびＴ３６６Ｌのうちの１つを含有する第１の改変ＣＨ３ドメイン、およびアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインをさらに含む、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物のいずれか１つがある。いくつかの実施形態においては、アミノ酸改変Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｅのうちの１つを含有する第１の改変ＣＨ３ドメイン、およびアミノ酸改変Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｖのうちの１つを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインを含む、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物のいずれか１つがある。
【０１０１】
本明細書においては、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、それぞれの改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、少なくとも４つのアミノ酸変異を含み、前記第１および前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つのは、Ｎ３９０ＺおよびＳ４００Ｚから選択される変異を含み、Ｚは、正に帯電したアミノ酸および負に帯電したアミノ酸から選択され、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも約７０℃で、かつ、純度が少なくとも９０％のヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成する。ある実施形態では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、ここで前記第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置にアミノ酸改変を含み、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３９４の位置にアミノ酸改変を含む。ある実施形態では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１の位置にアミノ酸改変を含有する。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６およびＫ３９２の位置の少なくとも１つに改変を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５℃であり、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、少なくとも１つの改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｎ３９０Ｒ、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒのうちの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。いくつかの態様においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドの一方は３４７の位置にアミノ酸改変を含み、他方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３６０の位置にアミノ酸改変を含む。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖを含む。特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変をお含み、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６I、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。本明細書に記載のある特定の実施形態においては、単離したヘテロ多量体があり、第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｄ３９９とＹ４０７の位置にアミノ酸改変を含み、第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ４０９とＴ４１１の位置にアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１の位置にアミノ酸改変を��み、第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６とＫ３９２の位置にアミノ酸改変を含む。特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖを含む。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５０Ｃ以上で、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、前記第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｒ、Ｓ４００Ｋ、Ｙ４０７Ａ、およびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変を含み、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６I、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２I、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｔ４１１ＤおよびＴ４１１Ｅから選択されるアミノ酸改変を含む。
【０１０２】
本明細書では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドはそれぞれ、少なくとも３つのアミノ酸変異を含み、前記第１および前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドの一方はＴ４１１ＥおよびＴ４１１Ｄから選択される変異を含み、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、融解温度（Ｔｍ）が少なくとも約７０℃で、かつ、純度が少なくとも９０％のヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを優先的に形成する。ある実施形態では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、ここで前記第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｆ４０５とＹ４０７の位置にアミノ酸改変を含み、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３９４の位置にアミノ酸改変を含む。ある実施形態では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１の位置にアミノ酸改変を含む。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６およびＫ３９２の位置の少なくとも１つに改変を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５℃であり、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、少なくとも１つの改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｎ３９０Ｒ、Ｓ４００ＥおよびＳ４００Ｒのうちの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの一方が３４７の位置にアミノ酸改変を含み、もう一方の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３６０の位置にアミノ酸改変を含む。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１および第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドの少なくとも１つがＴ３５０Ｖのアミノ酸改変を含む。特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、前記第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドがＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６I、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。本明細書に記載されるある特定の実施形態においては、単離したヘテロ多量体があり、第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドはＤ３９９とＹ４０７の位置にアミノ酸改変を含み、第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４０９とＴ４１１の位置にアミノ酸改変を含む。いくつかの態様においては、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体があり、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドがＬ３５１の位置にアミノ酸改変を含み、第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドはＴ３６６およびＫ３９２の位置にアミノ酸改変を含む。特定の実施形態��おいては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体があり、前記第１および第２のＣＨ３ドメインポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸改変を含む。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離されたヘテロ多量体があり、ここで改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）は少なくとも約７５０Ｃ以上であり、かつ、少なくとも約９５％の純度で形成される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、前記第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｒ、Ｓ４００Ｋ、Ｙ４０７Ａ、およびＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸改変を含み、前記第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６I、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２I、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｔ４１１ＤおよびＴ４１１Ｅから選択されるアミノ酸改変を含む。
【０１０３】
本明細書においては、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１０４】
ある態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと、アミノ酸改変Ｔ３６６I、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１０５】
ある特定の態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１０６】
いくつかの態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドとアミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１０７】
ある態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドとアミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１０８】
ある態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｒ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドとアミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１０９】
ある態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１１０】
ある態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドとアミノ酸改変Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１１１】
一態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ４０９ＦおよびＴ４１１Ｅを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドと、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、およびＹ４０７Ａを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１１２】
一態様では、単離したヘテロ多量体Ｆｃ構築物を提供し、この構築物は、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ、Ｋ３９２ＬＥ、Ｋ４０９ＦおよびＴ４１１Ｅを含有する第１の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドとアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００ＲおよびＹ４０７Ａを含有する第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、このＦｃ変異体はＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは変異体ＣＨ２ドメインである。いくつかの態様では、変異体ＣＨ２ドメインは、第１および／または第２のポリペプチド鎖に非対称なアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態においてヘテロ多量体は、ＣＨ２ドメイン中に非対称なアミノ酸置換を含み、それによって、前記ヘテロ多量体のうちの１本の鎖が、Ｆｃ受容体に選択的に結合する。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体はＦｃ受容体に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体ファミリーのメンバーである。いくつかの態様では、この受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂから選択される。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｆｃガンマ受容体への選択的な結合を促進する、非対称なアミノ酸改変を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、ＦｃγＲＩＩＩａに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、Ｓ２６７Ｄ、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄから選択される非対称なアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、ＦｃγＲＩＩａに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、Ｓ２３９Ｄ、Ｋ３２６Ｅ、Ａ３３０ＬおよびI３３２Ｅから選択される非対称なアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、ＦｃγＲＩＩｂに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９ＫおよびＩ３３２Ｅから選択される非対称なアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｓ、およびＳ２９８Ａから選択される非対称なアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、ヘテロ多量体は、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅから選択される非対称なアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに選択的に結合する。いくつかの態様では、ヘテロ多量体は、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｓ、Ｓ２９８ＡおよびＩ３３２Ｅから選択される非対称なアミノ酸置換を含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヘテロ多量体を含む多機能性治療薬を設計する方法を提供する。いくつかの実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体を含む二機能性治療薬を設計する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインでの突然変異によって生じた変異体Ｆｃヘテロ二量体のＣＨ２ドメインに、非対称性の突然変異を設計するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、非対称性のＦｃでの突然変異に基づいて、異なるＦｃガンマ受容体への選択性を設計するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、Ｆｃガンマ受容体の結合をＦｃ分子の一方の面に偏らせる突然変異を設計するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、Ｆｃγ受容体が本明細書に記載のヘテロ多量体の非対称性のＦｃ足場の一方の面のみと相互作用するように、Ｆｃγ受容体を偏らせる極性ドライバー（ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｄｒｉｖｅｒ）を設計するための方法を提供する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、優先的なＦｃガンマ受容体選択特性を導く、非対称のＦｃのＣＨ２ドメインにおける突然変異を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインにおける突然変異によって、優先的にヘテロ二量体Ｆｃが形成される。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の非対称なＦｃに基づいて二重特異性治療成分を設計するための方法がある。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の非対称性のＦｃに基づいて多重特異性治療成分を設計するための方法がある。
【０１１８】
ＩｇＧなどのようなモノクローナル抗体は、２つの等価な重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドから構成される対称な分子であり（図１４）、それぞれ、複数の、免疫グロブリン（Ｉｇ）の構造ドメインを含む。ｍＡｂのＩｇＧクラスは、４つのイソ型、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のうちの１つで存在する。重鎖は４つのＩｇドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）から、軽鎖は２つのＩｇドメイン（ＶＬおよびＣＬ）から、それぞれ構成される。重鎖それぞれのＶＨおよびＣＨ１ドメインは、軽鎖のＶＬおよびＣＬドメインと組み合わさってｍＡｂの２つのＦａｂ（「抗原結合断片」）アームを形成する。２つの重鎖のＣＨ３およびＣＨ２ドメインは、ＣＨ３ドメインでのタンパク質間接触およびＣＨ２ドメインでのグリコシル化を介して相互作用し、ホモ二量体Ｆｃ（「結晶化可能な断片」）領域を形成する。抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間のリンカー領域は、抗体分子のヒンジ領域を構成する。ｍＡｂのＦａｂおよびＦｃ領域をつなぐこととは別に、ヒンジはまた、２つの重鎖にわたるジスルフィド結合を維持し、それらを一緒に保持する。ヒンジ領域におけるアミノ酸の数とジスルフィド結合の数は、ＩｇＧの４つのイソ型によって顕著に異なる。ＩｇＧ分子のグリコシル化のパターンも著しく多様になり得、ＩｇＧ分子では、約３０の異なる炭水化物成分が認められている［Arnold J.N.; Wormald M.R.; Sim R.B.; Rudd P.M. and Dwek R.A. (2007) Annual Reviews of Immunology 25, 21-50］。
【０１１９】
モノクローナル抗体の構造が対称であることによって、両方のＦａｂアームが、同じエピトープを認識するように親和性成熟した抗原結合能力を有するようになる。一方、抗体分子のＦｃ成分は、免疫または「エフェクター」細胞上の様々な受容体分子との相互作用に関与し、これらの相互作用のいくつかは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、および補体活性化などのようなエフェクター機能の媒介を担う。一般に、エフェクター機能は、体液性免疫系から病原体または毒素中和および排除、補体活性化、ならびに食作用性応答を導く免疫応答を伴う。エフェクター細胞上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）分子は、複合的な抗体−抗原免疫複合体を伴う活性化ＩｇＧ抗体のＦｃに接触してエフェクター応答を媒介・調節する。モノクローナル抗体を使ったタンパク質治療剤をこれらのＦｃγ受容体との相互作用に関して最適化することにより、これらの薬剤候補の効能を改善することができる。
【０１２０】
ヒトでは、それぞれのクラスの中で、さらなる多型タイプを有する３つクラスのＦｃγＲがあることが知られている。ＩｇＧ１分子中のＦｃは、ナノモル範囲の解離定数でＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に結合することが知られているが、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびfｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、マイクロモル範囲で結合する［Bruhns P.; lannascoli B.; England P.; Mancardi D.A.; Fernandez N.; Jorieux S. and Daeron M. (2009) Blood 113: 3716-25］。高親和性のＦｃγＲＩ受容体は、単量体形態のＩｇＧに結合することができるが、低親和性のＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ受容体は、アビディティ効果の結果として抗原−抗体免疫複合体またはＩｇＧ集合体のみに結合することができる。異なる形態のＩｇＧは、異なるＦｃγＲに対する様々な親和性を有する。具体的には、ＩｇＧ１とＩｇＧ３はより強い活性を示す。Ｆｃγ受容体は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインであり、細胞内のシグナル伝達経路の調節に関与する細胞質ドメインを有する。抗体媒介性の免疫複合体と結合して免疫細胞表面上に密集すると、これらの細胞表面受容体の細胞質末端にある、ＦｃγＲに連結されたシグナル伝達ユニットの性質に応じて、これらの分子は、エフェクター応答を調節する［Nimmerjahn F. and Ravetch J.V. (2008) Nature Immu Rev 8(1):34-47］。
【０１２１】
ヒト染色体のレベルでは、３つの遺伝子が、ＦｃγＲＩ（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ）およびＦｃγＲＩＩ（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ）をコードし、２つの遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードしている。ＩｇＧ結合ヒトＦｃγ受容体の中では、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＡタイプが、エフェクター機能の活性化を誘導する細胞質免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する、共通のγ−鎖シグナルアダプタータンパク質と膜結合することが示されている。ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＣも細胞質ＩＴＡＭを含んでいるが、共通のγ−鎖シグナルアダプタータンパク質を有していない。同時に、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に連結している。ＦｃγＲＩＩＢが活性化されてＩＴＩＭがリン酸化すると、活性化シグナル伝達カスケードが阻害される。ＦｃγＲＩＩＩＢは、チロシンベースの免疫調整細胞質側末端のどちらかを欠くが、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーを有し、ＦｃγＲＩＩＡの存在下において顆粒球の活性化にいくぶんか寄与することが示されている。
【０１２２】
【表６】
2014533243.tif 000013
ＩＴＡＭ：免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ；ＩＴＩＭ：免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ；ＧＰＩ：グリコホスホイノシトール
【０１２３】
ＩＴＡＭモチーフおよびＩＴＩＭモチーフ、ならびに関連する受容体分子の機能的な役割が知られているが、組合せにおけるシグナル伝達の調整の性質およびメカニズムは、とりわけ、シグナル伝達に関与する多数の他の免疫細胞表面受容体およびアダプター分子（例えばＢＣＲ、ＣＤ２２、ＣＤ４５など）の宿主の活性との組み合わせにおけるシグナル伝達の調整の性質およびメカニズムは、完全に解明されていない。この関連において、これらのＦｃγ受容体と相互作用することができ、精巧な選択特性を有するＦｃ様分子の設計は、わずかな調節活性によりそのような受容体分子の効果解析し、調節するいずれの試みにおいても、有益な足がかりとなる。
【０１２４】
ＦｃγＲを識別することができる抗体分子の設計と関連する試みは、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ受容体型の細胞外Ｆｃ結合部の配列相同性が高いという事実によって複雑になる（図１５）。この高い相同性は、少なくとも部分的には、祖先の部分的重複に起因し得る。主要な２つの型のＦｃγＲＩＩ受容体であるＡとＢは、６９％の配列同一性を有し、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＩＡは、約４４％の配列同一性を示す。ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣの細胞外領域は、２つの残基しか違わないが、細胞内領域は著しく異なる。注目すべきは、ＩＴＩＭおよびＩＴＡＭそれぞれのモチーフの存在である。その結果、一方の受容体に結合することが必要とされる治療用抗体分子が、他の受容体クラスにも結合する可能性があり、意図されない治療効果がもたらせる可能性が予期され得る。
【０１２５】
さらに面倒なことには、それぞれの受容体クラスには、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）とコピー数多型（ＣＮＶ）がある。その結果生じる受容体の多様性は、それらのＩｇＧに対する親和性とその作用機構に様々な影響を与える。これらの遺伝的変異は、Ｆｃγ受容体に対する特定のＩｇＧサブクラスの親和性に影響を及ぼし、下流のエフェクター事象を変化させるか、あるいは、受容体発現のレベルを変化させる機構に影響を及ぼし、機能的に関連する表現型、非機能性または機能的に未知の受容体変異体をもたらし得る（Bournazos S.; Woof J.M.; Hart S.P. and Dransfield I. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157(2):244-54）。それらは、複雑な影響を生じ、活性化および阻害性受容体シグナル伝達の間のバランスを変化させ、疾患感受性の表現型の生成をもたらす可能性がある。
【０１２６】
これらの対立遺伝子変異のうちのいくつかを表Ｃに列挙する。特に、ＦｃγＲＩＩａのＲ１３１変異体は、ＩｇＧ１に高い反応を示すが、別のＨ１３１変異体は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３とより効率的な相互作用を示す。ＦｃγＲＩＩＩａの場合には、１５８の位置のＶがホモ接合性の提供者は、Ｆ／Ｆ１５８ホモ接合性の個人と比較して、高いＮＫ細胞活性を示し、これは、前者のアロタイプの方が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に対する親和性が高いことによる。ＦｃγＲＩＩＩｂの対立遺伝子変異体であるＮＡ１およびＮＡ２は、４つのアミノ酸置換の結果であり、この置換は次いで、受容体のグリコシル化における差異を生じる。ＮＡ１対立遺伝子は、高い結合と好中球による免疫複合体の食作用を示す。ＦｃγＲＩＩＢは、２つの既知の対立遺伝子変異体である２３２Ｉおよび２３２Ｔを有する。２３２Ｔ変異体は、その負の調節活性が強く損なわれていることが知られている。ＦｃγＲ多型の頻度ならびにそれぞれの感染に対する応答性または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、脈管炎、免疫媒介性血小板減少性紫斑病（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）（ＩＴＰ）、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、および免疫ニューロパチー（ｉｍｍｕｎｏ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ））などのような疾患状態への素因との関連が報告されている。
【０１２７】
ＦｃγＲ遺伝子座での、具体的には、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩｃ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子座でのコピー数多型が示されており、このような差と、これらの受容体の細胞表面での発現に関するさらなる相関が注目されている。対照的に、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂは、遺伝子コピー数多型を示さない。ＦｃγＲＩＩＩｂのコピー数が少ないことは、実際に、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）における糸球体腎炎と関連している［Aitman TJ et al. (2006) Nature16;439(7078):851-5］。非シグナル伝達ＧＰＩモジュールがＦｃγＲＩＩＩｂ受容体を固定するという事実を考慮すれば、これは非常に興味深い。これらＦｃγＲＩＩＩｂ受容体が、他のシグナル伝達ＦｃγＲとのＦｃ相互作用に対する競合的阻害剤として作用し可能性があると仮定することができる。ＦｃγＲＩＩｃにおけるコピー数多型の効果もまた、とりわけ興味深い。ＦｃγＲＩＩｃの２０２番目のＣ／Ｔ  ＳＮＰは、グルタミン残基を終止コドンに変換し、機能性タンパク質の生成を妨げる。ＦｃγＲＩＩｃの機能性オープンリーディングフレームは、健康な個人（白人集団）の９％で発現する。ＩＴＰ集団では対立遺伝子が著しく過剰出現（１９％）し、ＩＴＰに関するこれら表現型への素因を暗示している［Breunis WB et al. (2008) Blood111(3):1029-38］。ＮＫ細胞に機能性ＦｃγＲＩＩｃが発現している個人では、この受容体によって媒介されるＡＤＣＣの惹起の程度が、ＦｃγＲＩＩＩａに媒介されるよりも大きいことが実証されている。これらの多型や遺伝的変異と関連するそのような複雑性から、特定の目的に、高度に合わせた治療を必要とする、個別化治療戦略の必要性が強調されている。
【０１２８】
様々なエフェクター細胞は、これらＦｃγ受容体の提示ならびにそれらの体液性分布および組織分布の点で異なっており、このような差は、Ｆｃγ受容体の活性化機構および作用機構における違いの一因である［表Ｄ］。特定のＦｃγＲ型を認識するように、治療用抗体の選択性を微調整すること、および特定のクラスのエフェクター細胞の影響を調節することは、エフェクター機構の特定の疾患状態に対する最適化を導く。これは、治療している疾患状態に応じて、特定のエフェクター様式を選択的に活性化するまたは阻害することを意味する。
【０１２９】
【表７】
2014533243.tif 000014
【０１３０】
さらに、ＦｃγＲはまた、濾胞樹状細胞、内皮細胞、小グリア細胞、破骨細胞、およびメサンギウム細胞でも発現する。これまでのところ、これらの他の細胞におけるＦｃγＲ発現の機能的異議は分かっていない。
【０１３１】
親和性が高いＦｃγＲＩは、３つのＣ型免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインから構成されるが、親和性が低いＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはそれぞれ、２つのＣ型ＩｇＳＦドメインから構成される。ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂ受容体タンパク質の構造は、結晶学によって解明されている。これら構造中の２つのＩｇＳＦドメインは、互いに対して５０〜５５度で位置し、ヒンジによってつながれている。
【０１３２】
Ｆｃ−ＦｃγＲ共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）の公的に入手可能な構造は、Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂ系のものであり、複合体のＦｃγＲの形状は、タンパク質のａｐｏ状態において観察されるものに非常に近い形状に維持されている［Sondermann P.; Huber R.; Oosthuizen V. and Jacob U. (2000) Nature 406, 267-273. ; Radaev S.; Motyaka S.; Fridman W.; Sautes-Fridman C. and Sun P.D. (2001) J Biol Chem 276, 16469-16477; Sondermann P. et al. Biochem Soc Trans. 2002 Aug;30(4):481-6; Sondermann P, Oosthuizen V. Immunol Lett. 2002 Jun 3;82(1-2):51-6; Radaev S, Sun P. Mol Immunol. 2002 May;38(14):1073- 83］［図１６］。受容体同士の配列や構造の高い類似性は、他の受容体に結合するＦｃの比較モデルの基礎を形成する。その一方、これら受容体分子同士の配列や構造の類似性によって、受容体およびそれらの多様イソ型間の精巧な選択性を有するＦｃの設計が困難にもなる。
【０１３３】
結晶学に基づいたＦｃ−ＦｃγＲ複合体の構造の評価を行う前に、Ｆｃ分子の対称軸が２倍であるということは、２つの結合部位がある可能性やＦｃ−ＦｃγＲ間結合について有効な２：１化学量論を意味するかどうかという疑問があった。核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いたＦｃ−ＦｃγＲ間相互作用の構造研究から、分子の一方の面上であるＦｃがＦｃγＲの１つに結合すると、同じ抗体分子のＦｃに対する第２のＦｃγＲ分子の結合を防止するコンフォメーションの変化が誘発されることを示している［Kato K. et al (2000) J Mol Biol. 295(2):213-24］。Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂの入手可能な共結晶複合体の形状により、１：１化学量論での非対称性の配向でのＦｃへのＦｃγＲの結合が確認される。図１６で示すように、ＦｃγＲは、馬蹄形をしたＦｃ分子の一方の末端のくぼみに結合し、両方の鎖由来のＣＨ２ドメインに接している。
【０１３４】
アラニンスキャニング突然変異誘発［Shields RL et al. (2001) JBC 276(9): 6591-604］では、多様な型の受容体と接触し、それによってＦｃ−ＦｃγＲ間相互作用と認識に関与するＦｃの残基に関する知見が提供される。従来より、治療用抗体の最適化は、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩへの結合の増大［米国特許第６、７３７、０５６号］またはＦｃγＲＩＩｂへの親和性の減少［ＵＳ２００９／００１０９２０Ａ１］を示す突然変異に集中してきた。これらのすべての代替の変異体において、突然変異は、両方の鎖に同時に導入される。
【０１３５】
モノクローナル抗体は多くの場合、標的およびエフェクター免疫細胞の空間的な局在を誘導することによって、その治療活性を示す。天然の抗体は、そのＦａｂドメインを使用して標的と、そしてＦｃドメインを使用してエフェクター細胞と相互作用することによって局在の誘導を媒介する。それらは、細胞媒介性の応答を誘発することができるように、エフェクター細胞と向かい合って、免疫複合体を並置させることができる。免疫作用における時空間的な構成の意義の別の例としては、複数の抗体分子による単一の標的のターゲティングを伴う免疫複合体の形成の際に生じる、ＦｃγＲシグナル伝達に必要なアビディティ効果がある。
【０１３６】
ｍＡｂ分子のエフェクター活性の一部として誘発される細胞シグナル伝達にも時空間的側面がある。ＦｃγＲ分子活性化に基づくものなどのような細胞シグナル伝達は、脂質ラフトと呼ばれる膜ドメインの領域内における、関連する受容体分子の局在化を伴う。脂質ラフトは、スフィンゴ糖脂質およびコレステロール、ならびにＳｒｃファミリーキナーゼを含むいくつかのクラスの上流シグナルトランスデューサーに富んでいる。細胞刺激に際して、様々なシグナル伝達分子、アダプタータンパク質、およびシグナル伝達キナーゼならびにホスファターゼが動員される。脂質ラフトでの分子の集合がシグナル伝達にとって重要である。
【０１３７】
異なる抗原特異性と高いアビディティを組み合わせて結合特性をより高める非自然設計戦略は、二重特異性治療薬設計の基礎である。二重特異性抗体または他の形態の二重特異性もしくは多重機能性タンパク質治療薬は、標的と様々なエフェクター細胞間の相互作用を媒介するように設計される［Muller & Kontermann (2010) BioDrugs 24(2):89-98］。多重特異性治療用分子は、ヘルパーＴ細胞または他の免疫エフェクター細胞を、特定の標的細胞に方向付け直すように操作されている。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、および／またはＦｃγＲＩＩＩａに対する計算された結合親和性に基づいて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＦｃ変異体ポリペプチドを特定するための方法に関する。他の実施形態においてこの方法は、前記Ｆｃ変異体ポリペプチドの静電気、溶媒和、パッキング、パッキング密度、水素結合、およびエントロピー効果をインシリコで計算することをさらに含む。さらに別の実施形態において本発明の方法は、Ｆｃ変異体ポリペプチドを構築することおよび治療用抗体との関連において前記ポリペプチドを発現させること、さらに哺乳動物細胞において前記抗体を発現させることをさらに含む。その上さらに別の実施形態において本発明の方法は、インシリコで特定したＦｃ変異体ポリペプチドを、部位特異的突然変異生成、ＰＣＲを使用した突然変異生成、カセット突然変異生成、またはデノボ合成によって構築することを含む。
【０１３９】
合成Ｆｃ足場の設計において考慮に入れられる因子は、立体反発に関するインシリコでの計算、埋没した境界面面積の変化、相対的な接触密度、相対的な溶媒和、および静電効果を含む。これらのマトリックスをすべて、親和性スコアになるように使用した。
【０１４０】
一態様において、本出願は、ヘテロ二量体Ｆｃに基づいて構築された非対称な足場の設計を介して精巧なＦｃγＲ選択性プロファイルを達成するための分子設計を記載する。この足場によって、様々な新規選択特性を達成するための、ＣＨ２ドメインにおける非対称な突然変異が可能になる。さらにこの足場は、多機能性（二、三、四、または五機能性）治療用分子を改変するための固有な特徴を有する。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、非対称性の足場を、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性の結合特性について最適化し、分子のより良い再利用を可能にし、その半減期および関連する薬物動態学的特性を向上させる。
【０１４２】
非対称性の足場は、機能的に関連するＦｃγＲＩ受容体アロタイプへの結合について最適化することができる。ＦｃγＲＩは、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乾癬、およびいくつかの肺疾患などの慢性の炎症性障害に関与するマクロファージに顕著なマーカーである。
【０１４３】
非対称性の足場は、プロテインＡ結合について最適化することができる。プロテインＡ結合は、抗体分子の分離および精製のために使用されることが多い。突然変異は、保存している間に治療薬が凝集することを避けるために、非対称性の足場中に導入することができる。
【０１４４】
そのため具体的には、本発明のＦｃ変異体は、とりわけ、血清半減期の延長、結合親和性の向上、免疫原性の低下、産生の増大、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の増強もしくは低下、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の改変を含むがこれらには限定されない好ましい特徴を有する抗体をもたらす、１つ以上のさらなるアミノ酸残基置換、突然変異、および／または改変を含有していてもよいことが想定される。
【０１４５】
本発明のＦｃ変異体が、類似の分子に比べて、哺乳動物、特にヒトにおけるインビボでの長い半減期（例えば血清半減期）；インビボ（例えば血清半減期）および／もしくはインビトロ（例えば有効期間）における向上した安定性、ならびに／または高い融解温度（Ｔｍ）を含む、他の変化した特徴を有していてもよいと想定される。一実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、または５か月を超える、インビボにおける半減期を有する。別の態様では、本発明のＦｃ変異体が、１５日を超える、３０日を超える、２か月を超える、３か月を超える、６か月を超える、または１２か月を超える、または２４か月を超える、または３６か月を超える、または６０か月を超える、インビトロでの半減期を有する（例えば液体または粉末製剤）。
【０１４６】
また当業者であれば、本発明のＦｃ変異体が、対象に投与した場合、変化した免疫原性を有していてもよいことも理解できる。したがって、Ｆｃ変異体の免疫原性を最小限に抑える変異体ＣＨ３ドメインが、治療上の適用に一般により望ましいことが想定される。
【０１４７】
本発明のＦｃ変異体は、エフェクター機能を変化させる改変を含むがこれには限定されない他のＦｃ改変と組み合わせてもよい。本発明は、本発明のＦｃ変異体を他のＦｃ改変と組み合わせて、抗体またはＦｃ融合タンパク質に付加的な、相乗的な、または新規な特性を与えることを包含する。そのような改変は、ヒンジ、ＣＨ１、もしくはＣＨ２（または、それが、本発明の改変ＣＨ３ドメインの安定性および純度の特性を負に変化させないことを条件として、ＣＨ３）ドメインまたはその組合せにおけるものであってもよい。本発明のＦｃ変異体が、それらが組み合わせられる改変の特性を向上させることが想定される。例えば、本発明のＦｃ変異体を、野生型Ｆｃ領域を含む類似の分子よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合することが知られている突然変異体と組み合わせる場合、本発明の突然変異体との組合せによって、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性の、より高い向上倍数をもたらす。
【０１４８】
一実施形態では、本発明のＦｃ変異体を、Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490）；米国特許第５，６２４，８２１号；同第５，８８５，５７３号；同第６，１９４，５５１号；米国特許出願第６０／６０１，６３４号および同第６０／６０８，８５２号；国際公開第００／４２０７２号および同第９９／５８５７２号において開示されるものなどのような他の既知のＦｃ変異体と組み合わせてもよい。
【０１４９】
当業者は、本発明のＦｃ変異体が、変化したＦｃリガンド（例えばＦｃγＲ、Ｃ１ｑ）結合特性（結合特性の例としては、これらには限定されないが、結合特異性、平衡解離定数（ＫＤ）、解離および結合速度（それぞれ、ＫｏｆｆおよびＫｏｎ）、結合親和性、ならびに／またはアビディティが挙げられる）を有していてもよいこと、ならびに特定の変化が、多かれ少なかれ、望ましいものであることも理解するであろう。平衡解離定数（ＫＤ）がｋｏｆｆ／ｋｏｎとして定義されることは当該分野においてよく知られている。一般に、ＫＤが低い結合分子（例えば、および抗体）がＫＤが高い結合分子（例えば、および抗体）より好ましいと理解されている。しかしながら、いくつかの例では、ＫＤの値よりも、ｋｏｎまたはｋｏｆｆの値の方が適切である場合がある。当業者は、どの動力学的指標が所与の抗体適用にとって最も重要かを決定することができる。例えば、負の制御因子であるＦｃγＲＩＩＢへのＦｃ結合を変化させないかあるいはさらに低下させながら、１つ以上の正の制御因子（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ）へのＦｃ結合を増強する改変ＣＨ３および／またはＣＨ２が、ＡＤＣＣ活性の向上にとってより好都合であろう。あるいは、１つ以上の正の制御因子への結合を低下させるおよび／またはＦｃγＲＩＩＢへの結合を増強する改変ＣＨ３および／またはＣＨ２は、ＡＤＣＣ活性を低下させるのに好都合であろう。したがって、結合親和性（例えば平衡解離定数（ＫＤ））の比が、Ｆｃ変異体のＡＤＣＣ活性が高まるかまたは低下するかを示す場合がある。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比の低下は、ＡＤＣＣ活性の向上と相関するであろうが、比の増大は、ＡＤＣＣ活性の減少と相関するであろう。
【０１５０】
Ｆｃ変異体の特徴付けの一環として、Ｆｃ変異体をＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）に対する結合親和性について試験し、野生型ＩｇＧ１と比較した場合の比として報告した（実施例４および表５を参照のこと）。この例では、活性化および阻害性Ｆｃ受容体への結合に対するＣＨ３ドメイン突然変異の影響を評価することが可能であった。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離したヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超え、ヘテロ二量体のＣＤ１６ａへの結合が野生型ホモ二量体と同等である、単離したヘテロ多量体を本明細書において提供する。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体のＣＤ１６ａへの結合は、野生型ホモ二量体よりも高い。代替の態様では、ヘテロ二量体のＣＤ１６ａへの結合は、野生型ホモ二量体とよりも低い。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する単離したヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超え、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体とほぼ同等である、単離したヘテロ多量体を本明細書において提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合は野生型ホモ二量体とよりも高い。代替の実施形態では、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合は野生型ホモ二量体よりも低い。
【０１５２】
当業者は、Ｆｃ変異体の野生型ホモ二量体に対する比として結合しているＣＤ１６ａとＣＤ３２ｂのＫＤを報告する代わりに、Ｆｃ変異体のＣＤ３２ｂへの結合の、Ｆｃ変異体のＣＤ１６ａへの結合の比としてＫＤを報告することができることを理解するであろう（データは示さない）。この比は、より詳細に下記に記載される、改変ＣＨ３ドメイン突然変異がＡＤＣＣに及ぼす影響の指標、野生型と比較して不変、増大〜減少を提供するであろう。
【０１５３】
本発明のＦｃ変異体のＦｃγＲに対する親和性および結合特性は、Ｆｃ−ＦｃγＲ間相互作用、つまりＦｃγＲに対するＦｃ領域の特異的な結合を決定するための、当技術分野において知られているインビトロアッセイ（生化学または免疫学ベースのアッセイ）を使用して最初に決定される。当該分野において知られているインビトロアッセイとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ（以下の「特徴付けおよび機能的アッセイ」と題する節を参照のこと）、ならびに間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー（例えばゲル濾過）などのような他の方法が挙げられるがこれらには限定されない。これらおよび他の方法は、検査している１つ以上の構成成分上に標識を利用してもよく、および／または発色性、蛍光、発光、もしくは同位体標識を含むが、これらに限定されない様々な検出方法を用いてもよい。結合親和性および反応速度の詳細な説明は、抗体−免疫原相互作用に焦点をあてている、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)において見ることができる。
【０１５４】
また、本発明の分子の結合特性が、１つ以上のＦｃγＲメディエーターエフェクター細胞機能を決定するためのインビトロでの機能的アッセイによって特徴付けられることも想定される（以下の「特徴付けおよび機能的アッセイ」と題する節を参照のこと）。ある特定の実施形態において本発明の分子は、インビトロでのアッセイにおける結合特性と同様の結合特性を、インビボモデル（本明細書において記載され開示されるものなど）においても有する。しかしながら、本発明は、インビトロのアッセイでは所望の表現型を示さないが、インビボでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除しない。
【０１５５】
本発明は、類似の分子よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に結合するＦｃ変異体を包含する。具体的な実施形態において本発明のＦｃ変異体は、類似の分子に比べて、高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、変化のないまたは低下した結合親和性でＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）に結合する。さらに別の実施形態において本発明のＦｃ変異体は、類似の分子によりも低い、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。
【０１５６】
類似の分子に比べて低い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に結合するＦｃ変異体もまた、本発明に包含される。具体的な実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、類似の分子に比べて低い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子と比較して変わらないかまたは高い結合親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。
【０１５７】
一実施形態においてＦｃ変異体は、高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。具体的な実施形態では、前記Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子の少なくとも２倍または少なくとも３倍または少なくとも５倍または少なくとも７倍または少なくとも１０倍または少なくとも２０倍または少なくとも３０倍または少なくとも４０倍または少なくとも５０倍または少なくとも６０倍または少なくとも７０倍または少なくとも８０倍または少なくとも９０倍または少なくとも１００倍または少なくとも２００倍を超える。他の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくともＳ０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ高い。
【０１５８】
別の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃリガンド（例えばＦｃγＲ、Ｃ１ｑ）に対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子に比べて約２分の１〜１０分の１または約５分の１〜５０分の１または約２５分の１〜２５０分の１または約１００分の１〜５００分の１または約２５０分の１〜１０００分の１だけ低下している。
【０１５９】
別の実施形態では、当該Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子に比べて少なくとも２分の１または少なくとも３分の１または少なくとも５分の１または少なくとも７分の１または少なくとも１０分の１または少なくとも２０分の１または少なくとも３０分の１または少なくとも４０分の１または少なくとも５０分の１または少なくとも６０分の１または少なくとも７０分の１または少なくとも８０分の１または少なくとも９０分の１または少なくとも１００分の１または少なくとも２００分の１または少なくとも４００分の１または少なくとも６００分の１だけ低下している。他の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ低下している。
【０１６０】
一実施形態においてＦｃ変異体は、変わらないかまたは低い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。具体的な実施形態では、前記Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する親和性は、類似の分子に比べて変わらないか、または少なくとも１分の１だけもしくは少なくとも３分の１だけもしくは少なくとも５分の１だけもしくは少なくとも１０分の１だけ、もしくは少なくとも２０分の１だけもしくは少なくとも５０分の１だけもしくは少なくとも１００分の１だけ低下している。他の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する親和性は、類似の分子と比べて変わらないかまたは、少なくとも１０％もしくは少なくとも２０％もしくは少なくとも３０％もしくは少なくとも４０％もしくは少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％もしくは少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％だけ低下している。
【０１６１】
別の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子と比べて変わらないかまたは少なくとも２倍もしくは少なくとも３倍もしくは少なくとも５倍もしくは少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍もしくは少なくとも２０倍もしくは少なくとも３０倍もしくは少なくとも４０倍もしくは少なくとも５０倍もしくは少なくとも６０倍もしくは少なくとも７０倍もしくは少なくともＳ０倍もしくは少なくとも９０倍もしくは少なくとも１００倍もしくは少なくとも２００倍だけ高まっている。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子と比べて変わらないか、または少なくとも１０％もしくは少なくとも２０％もしくは少なくとも３０％もしくは少なくとも４０％もしくは少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％もしくは少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％だけ高まっている。
【０１６２】
その上さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子と比べて変わらないかまたは低い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１倍だけまたは少なくとも３倍だけ、または少なくとも５倍だけまたは少なくとも１０倍だけまたは少なくとも２０倍だけまたは少なくとも５０倍だけまたは少なくとも１００倍だけ高まっている。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する親和性は、類似の分子と比べて変わらないかまたは少なくとも２分の１もしくは少なくとも３分の１もしくは少なくとも５分の１もしくは少なくとも７分の１もしくは少なくとも１０分の１もしくは少なくとも２０分の１もしくは少なくとも５０分の１もしくは少なくとも１００分の１だけ低下している。他の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ高まっており、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する親和性は、類似の分子と比べて変わらないかまたは少なくとも１０％もしくは少なくとも２０％もしくは少なくとも３０％もしくは少なくとも４０％もしくは少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％もしくは少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％だけ高まっている。
【０１６３】
一層さらに  別の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比は、類似の分子に比べて低い。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比は、類似の分子に比べて少なくとも１分の１だけまたは少なくとも３分の１だけまたは少なくとも５分の１だけ、または少なくとも１０分の１だけまたは少なくとも２０分の１だけまたは少なくとも５０分の１だけまたは少なくとも１００分の１だけ低下している。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ低下している。
【０１６４】
別の実施形態においてＦｃ変異体は、類似の分子に比べて低い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。具体的な実施形態では、前記Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１分の１だけ、または少なくとも３分の１だけ、または少なくとも５分の１だけ、または少なくとも１０分の１だけ、または少なくとも２０分の１だけ、または少なくとも５０分の１だけ、または少なくとも１００分の１だけ低下している。他の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ低下している。
【０１６５】
その上さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、低い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子と比べて変わらないかまたは高い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１分の１だけ、または少なくとも３分の１だけ、または少なくとも５分の１だけ、または少なくとも１０分の１だけ、または少なくとも２０分の１だけ、または少なくとも５０分の１だけ、または少なくとも１００分の１だけ低下している。別の具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する親和性は、類似の分子の少なくとも２倍または少なくとも３倍または少なくとも５倍または少なくとも７倍または少なくとも１０倍または少なくとも２０倍または少なくとも５０倍または少なくとも１００倍である。他の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ低下しており、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する親和性は、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ高まっている。
【０１６６】
その上さらに別の実施形態では、Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子と比較した場合、少なくとも１倍だけ、または少なくとも３倍だけ、または少なくとも５倍だけ、または少なくとも１０だけ、または少なくとも２０倍だけまたは少なくとも５０倍だけ高まっている。具体的な実施形態では、前記Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢに対する平衡解離定数（ＫＤ）は、類似の分子に比べて少なくとも２分の１にまたは少なくとも３分の１にまたは少なくとも５分の１にまたは少なくとも７分の１にまたは少なくとも１０分の１にまたは少なくとも２０分の１にまたは少なくとも５０分の１にまたは少なくとも１００分の１だけ低下している。
【０１６７】
ＦｃγＲ選択性についてのＣＨ２変異
この複合体におけるＦｃとＦｃγＲのタンパク質間相互作用は、Ｆｃ分子の２つの鎖がＦｃγＲ分子上の２つの異なる部位と相互作用することを示すものである。天然のＦｃ分子では２つの重鎖は対称であるが、一方の鎖の残基周辺の局所的なＦｃγＲ環境は、反対のＦｃ鎖の同じ残基位置を取り囲むＦｃγＲ残基とは異なる。この２つの対称的に関連している位置は、異なる選択のＦｃγＲ残基と相互作用する。
【０１６８】
ＦｃとＦｃγＲへの関連における非対称性を考慮すれば、Ｆｃ分子のＡ鎖とＢ鎖に突然変異が同時に生じても、ＦｃγＲとの相互作用に対称な様式では影響を与えない。ホモ二量体Ｆｃ構造において、その局所的なＦｃγＲ環境を考慮して、Ｆｃの一方の鎖に、相互作用を最適化するための突然変異を導入する場合、第２の鎖における対応する突然変異は、好ましい、好ましくない、または必要とされるＦｃγＲ結合および選択性プロファイルに寄与しない可能性がある。
【０１６９】
Ｆｃの両方の鎖に同じ突然変異を導入する従来のＦｃ設計戦略のこれらの限界を克服するために、構造およびコンピューターの使用により導かれるアプローチを使用して、Ｆｃの２つの鎖における非対称性の突然変異を改変する。結合を向上させるために、受容体分子に対面するＦｃの２つの鎖を、それぞれ独立して最適化すれば、受容体間でのより良い結合選択性を達成することができる。
【０１７０】
例えば、Ｆｃの一方の鎖上の特定の位置の突然変異を、特定の残基に対する選択性を向上させるために設計することができ（ポジティブ設計の試み）、さらに、同じ残基位置を、別のＦｃγ受容体型の局所的な環境となるべく相互作用しないように突然変異させることができ（ネガティブ設計の試み）、よって、２つの受容体の間でより良い選択性が達成される。ある特定の実施形態では、異なるＦｃガンマ受容体と比較して、一つのＦｃガンマ受容体に選択的に結合する（例えば、ＦｃｇＲＩＩｂの代わりにＦｃｇＲＩＩＩａに選択的に結合する）、ＣＨ２ドメインにおける非対称性のアミノ酸改変を設計するための方法を提供する。他のある特定の実施形態では、ヘテロ二量体形成を促進するための、ＣＨ３ドメインにアミノ酸改変を含有する変異体Ｆｃヘテロ二量体のＣＨ２ドメインにおける非対称性のアミノ酸改変を設計するための方法を提供する。別の実施形態では、ＣＨ２ドメインに非対称性のアミノ酸改変を含有する変異体Ｆｃヘテロ二量体に基づいて、異なるＦｃガンマ受容体に対する選択性を設計するための方法を提供する。さらに  別の実施形態では、Ｆｃガンマ受容体の結合を、Ｆｃ分子の一方の面へ偏らせる非対称性のアミノ酸改変を設計するための方法を提供する。他のある特定の実施形態では、Ｆｃガンマ受容体が、ＣＨ２ドメインに非対称性のアミノ酸改変を含有する変異体Ｆｃヘテロ二量体の一方のみの面とのみ相互作用するように偏らせる極性ドライバーを設計するための方法を提供する。
【０１７１】
ＣＨ２ドメインの突然変異を非対称に設計することで、ＦｃγＲをＦｃ分子の一方の面上で認識するように合わせることができる。これは、非対称性のＦｃ足場の生産的な面を構成するが、反対の面は、設計された選択特性をもたない、野生型様の相互作用の性質を示し、非生産的な面と見なすことができる。ネガティブ設計戦略を用いて、ＦｃγＲと非対称性のＦｃ足場のこの側面に対する相互作用を遮断するために、非生産的な面上に突然変異を導入することができ、それによって、Ｆｃγ受容体への所望の相互作用傾向を強いることができる。
【０１７２】
【表８】
2014533243.tif 000015
（↑／−）は、特定の受容体型またはそのアロタイプのうちの１つに対して、高いまたは野生型用の結合を示す変異体を表している。（×）は、受容体またはアロタイプの小集団に対してほとんど結合しないことを示す。
【０１７３】
本発明はまた、Ｆｃ領域に融合された結合ドメインを含有する融合ポリペプチドであって、Ｆｃ領域が、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超える、融合ポリペプチドにも関する。具体的には、改変ＣＨ３ドメインを含有するヘテロ二量体を含む分子は、当業者によく知られている方法によって生成してもよいと想定される。簡単に説明すると、そのような方法は、所望の特異性を有する可変領域または結合ドメイン（例えば、ファージディスプレイもしくは発現ライブラリーから単離されたまたはヒトもしくは非ヒト抗体または受容体の結合ドメインに由来する可変領域）を変異体Ｆｃヘテロ二量体と組み合わせることを含むが、これらに限定されない。あるいは、当業者は、Ｆｃ領域を含む分子（例えば抗体）のＦｃ領域中のＣＨ３ドメインを改変することによって、変異体Ｆｃヘテロ二量体を生成してもよい。
【０１７４】
一態様においてＦｃ変異体は、抗体またはＦｃ融合タンパク質である。具体的な実施形態では、本発明は、向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む抗体であって、変異体ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超える、抗体を提供する。そのような抗体は、Ｆｃ変異体を生成するように改変することができるＣＨ３ドメインを含有するＦｃ領域を天然に含むＩｇＧ分子または変異体ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含有するように操作された抗体誘導体を含む。本発明のＦｃ変異体は、改変ＣＨ３ドメインが組み入れられたＦｃ領域を含む抗原に好ましくは特異的に結合する（つまり、特定の抗原−抗体結合を試験するための当技術分野においてよく知られているイムノアッセイによって決定されるように、非特異的結合に競合する）、任意の抗体分子を含む。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、一重特異性、二重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、およびＶＬもしくはＶＨドメインを含有する断片、またはさらに、ある場合には、変異体Ｆｃヘテロ二量体を含有するように操作されたもしくはそれに融合された、抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらには限定されない。
【０１７５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害の一形態を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」では、特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に分泌された抗体が結合することによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原治療（ａｎｔｉｇｅｎ−ｈｅａｌｉｎｇ）標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させるのことを可能にしている。標的細胞の表面に対して特異的な高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を「武装させ」、そのような死滅に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は、細胞外のものであり、直接的な細胞同士の接触を必要とし、補体を伴わない。
【０１７６】
任意の特定の抗体がＡＤＣＣによって標的細胞の溶解を媒介する能力を試験することができる。ＡＤＣＣ活性を評価するためには、目的の抗体を、免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に添加する。このことは、抗原−抗体複合体によって活性化され、標的細胞の細胞溶解をもたらし得る。細胞溶解は一般に、溶解した細胞からの標識（例えば放射性基質、蛍光色素、または自然細胞内タンパク質）の放出によって検出される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。インビトロＡＤＣＣアッセイの具体的な例は、Wisecarver et al., 1985, 79:277; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183; Patel et al., 1995J Immunol Methods 184:29、ならびに本明細書（以下の「特徴付けおよび機能的アッセイ」と題する節を参照のこと）に記載されている。あるいは、またはそれに加えて、目的の抗体のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652において開示されるものなどのような動物モデルを使用してインビボで評価してもよい。
【０１７７】
本発明のＦｃ変異体は、１つまたは複数のＦｃγＲメディエーターエフェクター細胞機能を決定するためのインビトロでの機能性アッセイによって特徴付けられると想定される。具体的な実施形態において本発明の分子は、インビボモデル（本明細書において記載され、開示されるものなど）でも、インビトロでのアッセイにおけるものと同様の結合特性およびエフェクター細胞機能を有する。しかしながら、本発明は、インビトロでのアッセイでは所望の表現型を示さないが、インビボでは所望の表現型を示す、本発明の分子を排除しない。
【０１７８】
本発明はさらに、ＣＤＣ機能が向上したＦｃ変異体を提供する。一実施形態においてＦｃ変異体は、高いＣＤＣ活性を有する。一実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２倍または少なくとも３倍または少なくとも５倍または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍または少なくとも１００倍のＣＤＣ活性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２倍または少なくとも３倍または少なくとも５倍または少なくとも７倍または少なくとも１０倍または少なくとも２０倍または少なくとも５０倍または少なくとも１００倍の親和性でＣ１ｑに結合する。さらに他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ向上したＣＤＣ活性を有する。具体的な実施形態では、本発明のＦｃ変異体は向上した親和性でＣ１ｑに結合し、高いＣＤＣ活性を有し、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０１７９】
本発明はまた、低いＣＤＣ機能を有するＦｃ変異体をも提供する。一実施形態においてＦｃ変異体は、低下したＣＤＣ活性を有する。一実施形態においてＦｃ変異体は、類似の分子の少なくとも２分の１または少なくとも３分の１または少なくとも５分の１または少なくとも１０分の１または少なくとも５０分の１または少なくとも１００分の１のＣＤＣ活性を有する。別の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１分の１だけまたは少なくとも３分の１だけまたは少なくとも５分の１だけまたは少なくとも１０分の１だけまたは少なくとも２０分の１だけまたは少なくとも５０倍分の１だけまたは少なくとも１００分の１だけ低下した親和性でＣ１ｑに結合する。別の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％または少なくとも１５０％または少なくとも２００％だけ減少したＣＤＣ活性を有する。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体は、低い親和性でＣ１ｑに結合し、低下したＣＤＣ活性を有し、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ変異体が、１つ以上の改変したグリコフォーム、つまり、Ｆｃ領域を含有する分子に共有結合された炭水化物組成物を含む。改変したグリコフォームは、様々な目的（エフェクター機能を増強するまたは低下させることを含むが、これに限定されない）に有用であり得る。改変したグリコフォームは、当業者に知られている方法のいずれかによって、例えば、改変したもしくは変異体発現株を使用することによって、１種類以上の酵素、例えばβ（１、４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）と同時に発現させることによって、Ｆｃ領域を含む分子を、様々な生物もしくは様々な生物由来の細胞株で発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子を発現させた後に炭水化物を改変することによって生成してもよい。改変したグリコフォームを生成するための方法は、当技術分野において知られており、Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) 米国特許第６，６０２，６８４号; 米国出願番号１０／２７７，３７０；米国出願番号第１０／１１３，９２９号；国際公開第００／６１７３９号Ａ１；同第０１／２９２２４６号Ａ１；同第０２／３１１１４０号Ａ１；同第０２／３０９５４Ａ１において記載されるもの；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．プリンストン、ニュージャージー）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化エンジニアリング技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、チューリッヒ、スイス）を含むが、これらには限定されない。例えば国際公開第０００６１７３９号；欧州特許出願第０１２２９１２５号；米国特許第２００３０１１５６１４号；Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49を参照のこと。
【０１８１】
Ｆｃ変異体が可変領域とヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する抗体を含み、ここでヘテロ二量体Ｆｃ領域は向上したヘテロ二量体の形成を促進するためのアミノ酸変異を含有する改変ＣＨ３ドメインを含み、改変ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超えることが想定される。抗体であるＦｃ変異体は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する可変ドメインまたはその断片を、改変ＣＨ３ドメインを含有するヘテロ二量体Ｆｃ領域と組み合わせることによって、「デノボで」産生されてもよい。あるいは、ヘテロ二量体Ｆｃ変異体を、抗原に結合する抗体を含有するＦｃ領域のＣＨ３ドメインを改変することによって産生してもよい。
【０１８２】
本発明の抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、イントラボディ、一重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖ＦｖＦｃ（ｓｃＦｖＦｃ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含み得るが、これらには限定されない。具体的には、本発明の方法において使用される抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な成分を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、いかなるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。
【０１８３】
本発明の抗体は、鳥および哺乳動物（例えばヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含む任意の動物に由来するものであってよい。具体的な実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、特に二重特異性モノクローナル抗体である。本明細書で使用する場合「ヒト」抗体とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたはヒト遺伝子から抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【０１８４】
抗体は、すべてのポリペプチドと同様に等電点（ｐＩ）を有し、等電点は一般的に、ポリペプチドが実効電荷を持たないｐＨと定義される。タンパク質の溶解度は、溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）と等しい場合、典型的に最も低いことが当技術分野において知られている。、抗体中のイオン化可能な残基の数および位置を変化させて、ｐＩを調整することによって、溶解度を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、適切なアミノ酸置換を行うことによって（例えば、アラニンなどの無電荷の残基とリシンなどのような荷電したアミノ酸を置換することによって）操作することができる。いかなる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、前記抗体のｐＩの変化をもたらす抗体のアミノ酸置換は、抗体の溶解度および／または安定性を改善し得る。当業者は、特定の抗体にとって、どのアミノ酸置換が所望のｐＩを達成するのに最も適切であるかを理解するであろう。タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動および様々なコンピューターアルゴリズムを含むが、これらに限定されない様々な方法によって決定することができる（例えばBjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023を参照のこと）。一実施形態では、本発明のＦｃ変異体のｐＩは、ｐＨ６．２〜ｐＨ８．０である。他の態様では、本発明の抗体のｐＩは、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．４である。一実施形態では、本発明のＦｃ変異体のｐＩに変化をもたらす置換は、抗原に対するその結合親和性を著しく減少させないであろう。向上した安定性をもつ改変ＣＨ３ドメインが、ｐＩの変化をもたらす可能性があることも想定される。一実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体は特に、安定性および純度の向上の両方ならびにｐＩにおける任意の所望の変化を達成するために選択される。
【０１８５】
本発明の抗体は、一重特異性、二重特異性、三重特異性であっても、またはより大きな多重特異性を有していてもよい。多重特異性抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに特異的に結合してもよく、または標的分子と異種エピトープ（異種ポリペプチドもしくは固体支持体など）の両方に特異的に結合してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６９０号；同第９３／１７７１５号；同第９２／０８８０２号；同第９１／００３６０号；および同第９２／０５７９３号；Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号、および同第５，６０１，８１９号、ならびにKostelny et al., 1992, J. Immuno1.148:1547を参照のこと）。
【０１８６】
多機能性ターゲティング分子の様々な実施形態は、図２０において示されるように、この非対称性足場を使用して設計することができる。
【０１８７】
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。そのような分子は通常、２つの抗原のみに結合するであろうが（つまり二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体などのようなさらなる特異性を有する抗体も本発明に包含される。ＢｓＡｂの例としては、限定されないが、一方のアームが腫瘍細胞抗原に対するもので、他方のアームが細胞傷害性分子に対するもの、両方のアームが２つの異なる腫瘍細胞抗原に対するもの、両方のアームが２つの異なる可溶性リガンドに対するもの、一方のアームが可溶性リガンドに対し、他方のアームが細胞表面受容体に対するもの、または両方のアームが２つの異なる細胞表面受容体に対するものが挙げられる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている。
【０１８８】
様々なアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものであってもよい。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体の少なくとも１つに含まれることが想定される。免疫グロブリン重鎖融合体、および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖、をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターの中に挿入され、適した宿主生物の中に一緒に導入される。これによって、構築に使用する３種類のポリペプチド鎖の比が不均一なときに収率が最高になる実施形態では、３種類のポリペプチド断片の相互の割合を調整が、非常に柔軟なものになる。実施例１および表２を参照のこと。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖が等しい比で発現すると収率が高くなる場合またはその比が特に重要でない場合、１つの発現ベクター中に２または３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１８９】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロ接合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ接合体に含まれている抗体のうちの一方がアビジンに結合することができ、他方がビオチンに結合することができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞が望ましくない細胞を標的とするようにさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）ならびにＨＩＶ感染の治療に関して（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、および欧州特許第０３０８９号）提唱されている。ヘテロ接合体抗体は、適した架橋方法のいずれを使用して作製してもよい。好適な架橋剤は、当技術分野においてよく知られており、多くの架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号において開示されている。
【０１９０】
改変ＣＨ３ドメインが組み込まれた、２を上回る結合価を有する抗体と、その結果生じる、本発明のＦｃヘテロ二量体が想定される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)を参照のこと。
【０１９１】
本発明の抗体はまた、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、または５か月を超える、哺乳動物（例えばヒト）における半減期（例えば血清半減期）を有するものをも包含する。哺乳動物（例えばヒト）における本発明の抗体の増大した半減期は、哺乳動物において前記抗体または抗体断片のより高い血清力価をもたらし、したがって、前記抗体もしくは抗体断片の投与頻度が低下するおよび／または投与されることとなる前記抗体または抗体断片の濃度が低下する。インビトロでの増大した半減期を有する抗体は、当業者らに既知の技術によって生成することができる。例えば、インビトロでの増大した半減期を有する抗体は、ＦｃドメインおよびＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関与するとして特定されたアミノ酸残基を改変する（例えば置換する、欠失させる、または追加する）ことによって生成することができる（例えば、国際公開第９７／３４６３１号；同第０４／０２９２０７号；米国特許第６，７３７，０５６号、および米国特許出願公開第２００３／０１９０３１１号を参照のこと）。
【０１９２】
具体的な実施形態では、改変ＣＨ３ドメインを含む変異体Ｆｃヘテロ二量体は、多重特異性抗体（本明細書において本発明の抗体と呼ばれる）であり、本発明の抗体は、目的の抗原に特異的に結合する。具体的には、本発明の抗体は、二重特異性抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、ポリペプチド抗原に特異的に結合する。別の実施形態では、本発明の抗体は、非ポリペプチド抗原に特異的に結合する。さらに他の実施形態では、疾患または障害に罹患している哺乳動物への本発明の抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらす可能性がある。
【０１９３】
実質的に、タンパク質の以下のリストならびにタンパク質の以下のリストに属するサブユニット、ドメイン、モチーフ、およびエピトープを含むがこれらには限定されない任意の分子が、本明細書で提供する変異体Ｆｃヘテロ二量体タンパク質（例えば抗体、Ｆｃ融合タンパク質）によって標的にされてもおよび／またはその中に組み込まれてもよい：レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ１抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩ因子、ファクターＶＩＩＩＣ、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンウィルブランド因子などのような凝固因子；プロテインＣなどのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのようなプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性増殖因子；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化と同時に調節、正常Ｔ細胞が発現し、分泌する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどのような血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータラクタマーゼなどのような微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などのような細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；例えばＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなどのようなホルモンまたは増殖因子に対する受容体；アルファインターフェロン（α−ＩＦＮ）、ベータインターフェロン（β−ＩＦＮ）、およびガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）などのようなインターフェロン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経増殖因子などのような神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ＡＦＧＦおよびＰＦＧＦなどのような線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、またはＴＧＦ−５を含むＴＧＦアルファおよびＴＧＦベータなどのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、およびＣＤ１４７などのようなＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導性因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマなどのようなインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦなどのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１３；ＴＮＦα、スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；解離促進因子；例えば、エイズエンベロープの一部、例えばｇｐ１２０などのようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ  １、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、およびＶＣＡＭ、その１つまたは複数のサブユニットを含むａ４／ｐ７インテグリンおよびＸｖ／ｐ３インテグリンなどのような細胞接着分子、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、アルファＩＩｂ、アルファＩＥＬｂなどのようなインテグリンアルファサブユニット；ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ベータ５、ベータ６、ベータ７、およびベータ８などのようなインテグリンベータサブユニット；αＶβ３、αＶβ５、およびα４β７を含むが、これらに限定されないインテグリンサブユニットの組合せ；アポトーシス経路のメンバー；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐ１受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２などのようなＥｐｈ受容体；ＨＬＡ−ＤＲなどのようなヒト白血球抗原（ＨＬＡ）；補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑ、ならびにＣ３およびＣ５などのような他の補体因子などのような補体タンパク質；ＧｐＩｂα、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、およびＣＤ２００などのような糖タンパク質受容体；ならびに上記に列挙されるポリペプチドのいずれかの断片。
【０１９４】
また、ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ  １／４全癌腫（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性ホスフェート（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；メラノーマ関連抗原ｐ９７；メラノーマ抗原ｇｐ７５；高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多型上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＣＡ  １９−９、ＣＴＡ−１、およびＬＥＡなどのような結腸直腸腫瘍関連抗原；バーキットリンパ腫抗原−３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢ−リンパ腫抗原ＣＤ２０；ＣＤ３３；ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、およびガングリオシドＧＭ３などのようなメラノーマ特異的抗原；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；Ｔ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルス、およびＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原；結腸のＣＥＡ、５Ｔ４癌胎児性トロホブラスト糖タンパク質、および膀胱腫瘍癌胎児性抗原などのような癌胎児性抗原アルファフェトプロテイン；ヒト肺癌抗原Ｌ６およびＬ２０などのような分化抗原；線維肉腫の抗原；ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴリピド；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）などのような乳癌抗原；ＮＹ−ＢＲ−１６；ＮＹ−ＢＲ−１６およびＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）；多型上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１；胎児赤血球において見出されるＩ抗原などのような分化抗原；成体型赤血球において見出される一次内胚葉Ｉ抗原（ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ）；着床前胚；胃腺癌において見出されるＩ（Ｍａ）；乳房上皮において見出されるＭ１８、Ｍ３９；骨髄性細胞において見出されるＳＳＥＡ−１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；Ｖａ４−Ｄ５；結腸直腸癌において見出されるＤ１５６−２２；ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）；精巣および卵巣癌において見出されるＳＣＰ−１；結腸腺癌において見出されるＣ１４；肺腺癌において見出されるＦ３；胃癌において見出されるＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌細胞において見出されるＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞において見出されるＥＧＦ受容体；膵癌において見出されるＥ１シリーズ（血液型Ｂ）；胚性癌細胞において見出されるＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌において見出されるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌において見出されるＮＳ−１０；ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体において見出されるＧ４９；結腸腺癌において見出されるＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌において見出される１９．９；胃癌ムチン；骨髄性細胞において見出されるＴ５Ａ７；メラノーマにおいて見出されるＲ２４；胚性癌細胞において見出される４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、およびＭ１：２２：２５：８ならびに４〜８細胞期の胚において見出されるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ−１抗原；シアリルＴｎ（ＳＴｎ）抗原；結腸癌抗原ＮＹ−���Ｏ−４５；肺癌抗原ＮＹ−ＬＵ−１２変異体Ａ；腺癌抗原ＡＲＴ１；腫瘍随伴性関連脳精巣癌抗原（腫瘍ニューロン（ｏｎｃｏｎｅｕｒｏｎａｌ）抗原ＭＡ２；腫瘍随伴性ニューロン抗原）；神経腫瘍腹側抗原２（Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖｅｎｔｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２）（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；腫瘍関連抗原ＣＯ−０２９；腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ−Ｂ１（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ−Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４−ａ、ＭＡＧＥ−４−ｂ、およびＭＡＧＥ−Ｘ２；癌精巣抗原（ＮＹ−ＥＯＳ−１）、ならびに上記に列挙されるポリペプチドのいずれかの断片を含むがこれらには限定されない癌抗原に特異的に結合する本発明の抗体も提供する。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヘテロ多量体は、少なくとも１つの治療用抗体を含む。いくつかの実施形態では、治療用抗体は、癌標的抗原に結合する。ある実施形態では、治療用抗体は、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムバブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム（Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ）（商標）、レンカレックス（Ｒｅｎｃａｒｅｘ）（商標）、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、および他のいかなる抗体から選択されるものの１つであってよい。
【０１９６】
本発明の抗体は、改変された誘導体を含む（つまり、共有結合のような、任意のタイプの分子の抗体への共有結合によって）。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体は改変された抗体、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基もしくは遮断基による誘導体化、タンパク分解性の切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などを含む。多数の化学改変のいずれも、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知の技術によって実行されてもよい。加えて誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１９７】
インビボでの半減期が増大した抗体またはその断片は、抗体または抗体断片に、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのような高分子を付加することによって生成することができる。ＰＥＧは、多機能性リンカーを用いてまたは用いないで、ＰＥＧを前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端に部位特異的に結合させることによって、あるいは、リシン残基のイプシロンアミノ基を介して、抗体または抗体断片に付加することができる。生物学的活性の損失を最小限に抑える、直線状ポリマーまたは分岐ポリマー誘導体化が使用される。結合の度合をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によって厳密にモニターし、ＰＥＧ分子の抗体への結合が適切であることを確認する。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。
【０１９８】
さらに、抗体または抗体断片をインビボでより安定したものにするためにまたはインビボでより長い半減期を有するように、抗体をアルブミンに結合させることができる。そのような技術は当技術分野においてよく知られており、例えば、国際公開第９３／１５１９９号、同第９３／１５２００号、および同第０１／７７１３７号；ならびに欧州特許４１３，６２２を参照のこと。本発明は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、および有機分子を含むがこれらには限定されない１つ以上の成分に結合したまたは融合した抗体またはその断片の使用を包含する。
【０１９９】
本発明は、融合タンパク質を生成するために、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）に、組換えによって融合したまたは化学的に結合した（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗体またはその断片の使用を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介したものであってもよい。例えば、抗体は、特定の細胞表面受容体に対して特異的な抗体に抗体を融合するまたは結合することによって、インビトロでまたはインビボで、異種ポリペプチドが特定の細胞型を標的とするように使用してもよい。異種ポリペプチドに融合したまたは結合した抗体も、当技術分野において既知の方法を使用して、インビトロ免疫アッセイおよび精製方法で使用することができる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号；欧州特許第４３９，０９５号；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; U.S. Pat.No. 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432;およびFell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452を参照のこと。
【０２００】
本発明はさらに、抗体断片に融合したまたは結合した異種タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬ  ＣＤＲ、またはその断片に融合または結合することができる。ポリペプチドを抗体成分に融合または結合させるための方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号；欧州特許第３０７，４３４号および同第３６７，１６６号；国際公開第９６／０４３８８号および同第９１／０６５７０号；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600;ならびにVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照のこと。
【０２０１】
例えば、ある抗原に特異的に結合する抗体（例えば上記）のさらなる融合タンパク質を、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と呼ばれる）の技術を介して生成してもよい。ＤＮＡシャフリングを用いて、本発明の抗体またはその断片の活性を変化させてもよい（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはその断片）。全般的に、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号，および同第５，８３７，４５８号、ならびにPatten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308-313を参照のこと。抗体もしくはその断片またはコードされている抗体もしくはその断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることによって変化させてもよい。抗体または抗体断片をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上の部分であって、ある抗原に特異的に結合する部分を、１種類以上の異種分子の１つ以上の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組換えてもよい。
【０２０２】
本発明はさらに、治療薬に結合された変異体Ｆｃヘテロ二量体またはその断片の使用を包含する。
【０２０３】
抗体またはその断片を、細胞毒、例えば細胞増殖抑制もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射性金属イオン、例えばアルファ放射体などのような治療用成分に結合してもよい。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に有害ないかなる作用物質をも含む。例としては、リボヌクレアーゼ、モノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）ＥおよびＦ、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミドならびにそのアナログまたは相同体を含む。治療剤は、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるがこれらには限定されない。治療用成分のより広範囲なリストは、国際公開第０３／０７５９５７号に見ることができる。
【０２０４】
さらに、抗体またはその断片を、所与の生物反応を変化させる治療薬または薬剤成分に結合してもよい。治療薬または薬剤成分は、古典的で化学的な治療薬に限定されるとは解釈されない。
【０２０５】
例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（もしくは他の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などのような毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス作用物質、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567）、およびＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号を参照のこと）、血栓症作用物質または抗血管新生剤、例えばアンジオスタチンもしくはエンドスタチンなどのようなタンパク質；または例えばリンホカイン（例えばインターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、もしくは増殖因子（例えば成長ホルモン（「ＧＨ」））などのような生物学的応答調節物質を含んでいてもよい。
【０２０６】
さらに、抗体を、放射性金属イオンを結合するのに有用な放射性物質または大環状キレート剤などのような治療用成分に結合することができる（放射性物質の例については上記を参照のこと）。ある特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に付加することができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般的に知られており、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; および Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943に記載されている。
【０２０７】
抗体をポリペプチド成分に融合または結合する方法は当技術分野において知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号，および同第５，１１２，９４６号；欧州特許第３０７，４３４号；同第３６７，１６６号；国際公開第９６／０４３８８号および同第９１／０６５７０号；Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590; および Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337を参照のこと。抗体の成分への融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して行われてもよい。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般的に知られており、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171において記載されている。
【０２０８】
Ｆｃ変異体、その誘導体、アナログ、または断片（例えば本発明の抗体または融合タンパク質）の組換え発現には、Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）をコードしているポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを構築することが必要である。Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが一度得られたら、Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）を産生するためのベクターを、当技術分野においてよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードするＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法を、本明細書に記載する。当業者らによく知られている方法を利用して、Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）のコード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組換えが含まれる。したがって本発明は、プロモーターに操作可能に連結された本発明のＦｃ変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば国際公開第８６／０５８０７号；同第８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号）ならびに抗体の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、あるいは、完全長抗体鎖（例えば重鎖もしくは軽鎖）、または抗体でないものに由来するポリペプチドと少なくとも改変ＣＨ３ドメインを組み込んだＦｃ領域との融合体を含む完全なＦｃ変異体を発現させるために、Ｆｃ変異体を生成するためのポリペプチドを、そのようなベクターの中にクローニングしてもよい。
【０２０９】
発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞に導入し、次いで、形質転換細胞を標準的な技術によって培養して、本発明のＦｃ変異体を産生する。したがって本発明は、異種プロモーターに操作可能に連結された、本発明のＦｃ変異体をコードしているポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二重鎖抗体を含むＦｃ変異体を発現させるための具体的な実施形態では、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、下記に詳述するように、宿主細胞で同時に発現させてもよい。
【０２１０】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質分子）を発現させることができる（例えば米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルに相当するが、また、適切なヌクレオチドコード配列を導入したまたは適切なヌクレオチドコード配列で形質転換した場合に、その場で本発明のＦｃ変異体を発現し得る細胞にも相当する。これらは、Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などのような微生物；Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えばサッカロミセス、ピキア）；Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したもしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）を含むが、これらには限定されない。ある特定の実施形態では、大腸菌または真核細胞などのような細菌細胞が、組換え抗体または融合タンパク質分子であるＦｃ変異体の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）エレメントなどのベクターと併用した哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が、抗体に有用な発現系である（Foecking et al., 1986, Gene 45:101; および Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。具体的な実施形態では、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列の発現は、恒常的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって制御される。
【０２１１】
細菌の系では、発現するＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを好都合に選択することができる。例えば、Ｆｃ変異体の医薬組成物を生成するために、そのようなタンパク質を大量に産生する場合、容易に精製される融合タンパク質産物を、高いレベルで発現するベクターが望ましいだろう。そのようなベクターとしては、ｌａｃ  Ｚとの融合タンパク質が産生されるように、Ｆｃ変異体コード配列がｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームでベクターの中に個々にライゲーションされてもよい大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられるがこれらには限定されない。ｐＧＥＸベクターを使用して、外性ポリペプチドを、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。そのような融合タンパク質は概して可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後に続く遊離グルタチオン存在下における溶出によって、容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ成分から放出することができる。
【０２１２】
昆虫の系では、オートグラファ核多核体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用し、外来遺伝子を発現させる。このウイルスは、ヨトウガ細胞中で成長する。Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）のコード配列を、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置してもよい。
【０２１３】
哺乳動物の宿主細胞では、いくつかのウイルスを用いた発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的のＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションしてもよい。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウイルスのゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１またはＥ３領域）への挿入は、感染宿主において生存可能であり、Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう（例えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照のこと）。挿入した抗体のコード配列を効率的に翻訳するためには、特定の開始シグナルも必要とされ得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、挿入した配列全体を確実に翻訳するために、開始コドンは、所望のコード配列の読み枠と同調していなければならない。これらの外生の翻訳制御シグナルや開始コドンは、天然および合成の両方の、様々なものに由来するものであってよい。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの含めることで発現効率を向上させることができる（例えばBittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照のこと）。
【０２１４】
Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）の発現は、当技術分野において知られている、任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントで制御してもよい。Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）をコードする遺伝子の発現を制御するために使用してもよいプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモーター（Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551）；β−ラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25；Scientific American, 1980, 242:74-94の「Useful proteins from recombinant bacteria」も参照のこと）などのような原核生物発現ベクター；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871）および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120）；Ｇａｌ  ４プロモーターなどのような酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきた以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、睾丸、乳房、リンパ様、および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45:485-495）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓において活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58）；肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94）；脳における乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）；ニューロン細胞において活性なニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83）；ニューロン細胞において活性な脳由来神経栄養因子���ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823）；アストロサイトにおいて活性なグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Gomes et al., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619-631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83）、および視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378）が挙げられるが、これらには限定されない。
【０２１５】
本発明のＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）をコードしている遺伝子の挿入配列を含有する発現ベクターは、３つの一般的なアプローチ、すなわち（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無、および（ｃ）挿入された配列の発現、によって特定することができる。第１のアプローチでは、発現ベクターに含まれるペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質をコードする遺伝子の存在を、それぞれのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質をコードする挿入遺伝子に相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主系を、抗体または融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列がベクターに挿入されることによって引き起こされる、特定の「マーカー」遺伝子の機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける包埋体形成など）の有無に基づいて特定し、選択することができる。例えば、Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）をコードしているヌクレオチド配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、抗体または融合タンパク質の挿入配列をコードしている遺伝子を含有する組換え体は、マーカー遺伝子が機能しないことによって特定することができる。第３のアプローチでは、組換え体によって発現される遺伝子産物（例えば抗体または融合タンパク質）をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを特定することができる。そのようなアッセイは例えば、インビトロアッセイ系における融合タンパク質の物理的または機能的特性、例えば抗生物活性分子抗体との結合に基づくものであってよい。
【０２１６】
さらに、所望の特異的な方法において挿入された配列の発現を調整するまたは遺伝子産物を改変し、プロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘発因子を含めることで上昇させることができ、それによって、遺伝的に改変した融合タンパク質の発現を制御し得る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）について特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にするように選ぶことができる。例えば、細菌系で発現させると非グリコシル化産物を産生され、酵母で発現させると、グリコシル化産物が産生される。
【０２１７】
遺伝子産物の一次転写物を適切にプロセシングする細胞機構（例えばグリコシル化およびリン酸化）を有する真核生物の宿主細胞を使用してもよい。そのような哺乳動物の宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＮＳ０、特に、例えばＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫（Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫（Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460）、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽腫（He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144-1148）、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ膠芽腫細胞（Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Cancer Res., 1970, 30: 2110-2118）、１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 4816）、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Br. J. Cancer, 1984, 49: 269）、Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫星状細胞腫（Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486）、Ａ１７２ヒト膠芽腫（Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523-2529）、Ｃ６ラット神経膠腫細胞（Benda et al., 1968, Science 161: 370-371）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽細胞腫（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129-136）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184-1190）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Bolin et al., 1994, J. Virol. Methods 48: 211-221）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常アストロサイト（Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827-833）、Ｍｐｆシロイタチ脳（Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952-960）、ならびに例えばＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどのような、例えばＣＴＸ  ＴＮＡ２ラット正常皮質脳（Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471）などのような正常細胞系などのようなニューロン細胞系が挙げられるが、これらには限定されない。さらに、それぞれのベクター／宿主発現系は、それぞれ異なる程度までプロセシング反応を達成する可能性がある。
【０２１８】
組換えタンパク質の長期的な高収率産生には、安定して発現することが好ましい場合が多い。例えば、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）を安定して発現する細胞系を改変してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後に、改変した細胞を栄養強化倍地において１〜２日間成長させ、次いで、選択培地に入れ替えられる。組換えプラスミドに含まれる選択マーカーは、選択圧に対する抵抗性を付与し、細胞が、それらの染色体の中にプラスミドを安定して組み込み、成長してコロニーを形成し、これがひいてはクローニングされ、細胞株へと増殖することを可能にする。この方法を都合よく用いて、抗原に特異的に結合するＦｃ変異体を発現する細胞株を操作改変してもよい。そのような改変した細胞系は、抗原に特異的に結合するＦｃ変異体（例えばポリペプチドまたは融合タンパク質）の活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０２１９】
いくつかの選択系を使用することができ、そのような選択系としては、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において使用できる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:817）遺伝子が挙げられるがこれらには限定されない。また、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1）；およびヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）遺伝子については、代謝拮抗薬抵抗性を選択の基準として使用することができる。
【０２２０】
本発明のＦｃ変異体（例えば抗体、または融合タンパク質）が組換え発現によって一旦産生されれば、それは、タンパク質の精製に関して当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的な抗原に対する親和性によって、およびサイズ排除カラムクロマトグラフイー）、遠心分離、溶解度差によって、またはタンパク質の精製についての任意の他の標準的な技術によって精製することができる。
【０２２１】
大抵の場合、Ｆｃ変異体は分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるが、分泌シグナルなしで直接産生される場合、宿主細胞溶解産物から回収してもよい。Ｆｃ変異体が膜結合型である場合、適した界面活性剤の溶液（例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用して、膜から放出させることができる。
【０２２２】
Ｆｃ変異体がヒトに由来する細胞以外の組換え細胞で産生される場合、それは、ヒト由来のタンパク質またはポリペプチドを全く含まない。しかしながら、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＦｃ変異体を精製して、Ｆｃ変異体が実質的に均一な調製物を得る必要である。第１のステップとしては通常、培養培地または溶解産物を遠心分離し、粒状の細胞残渣を除去する。
【０２２３】
抗体定常ドメインを有するＦｃヘテロ二量体は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができ、生成技術としては、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカを用いたクロマトグラフィー、ヘパリン−セファロースを用いたクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）を用いたクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿などのもまた、回収するポリペプチドに応じて利用可能である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖を基本とする免疫グロブリンＦｃ領域を精製するために使用することができる（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。プロテインＧは、マウスのすべてのイソ型およびヒトγ３に推奨される（Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)）。親和性リガンドを結合させる担体は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の担体も利用可能である。制御されたガラス多孔体（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどのような機械的に安定した担体では、アガロースよりも速い流速および短い処理時間が可能になる。イムノアドヘシンをプロテインＡまたはＧアフィニティーカラムに結合させるための条件は、Ｆｃドメインの特徴、すなわち、その種およびイソ型によって全面的に決定される。適切なリガンドが選択されれば、通常、無馴化培養液から直接、効率的な結合が生じる。結合した変異体Ｆｃヘテロ二量体は、酸性ｐＨ（３．０以上）でまたは弱カオトロピック塩を含有する中性ｐＨバッファーで、効率的に溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィーステップによって、９５％を上回る純粋な変異体Ｆｃヘテロ二量体を調製することができる。
【０２２４】
Ｆｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）の発現レベルは、ベクター増幅によって高めることができる（総説、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照のこと）。例えば、抗体または融合タンパク質を発現するベクター系に含まれているマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養に含まれる阻害剤のレベルを高めると、マーカー遺伝子のコピーの数が増える。増幅される領域は抗体遺伝子と関連するため、抗体または融合タンパク質の産生もまた、増大するであろう（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２２５】
宿主細胞に、本発明の発現ベクターを２つ一緒に導入してもよい。例えば、第１のベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードする。これら２つのベクターは、同一の選択マーカーを含有していてもよく、それによって、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同程度の発現が可能になる。あるいは、融合タンパク質または重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現させることができる単一のベクターを使用してもよい。融合タンパク質または重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでいてもよい。
【０２２６】
特徴解析および機能解析
本発明のＦｃ変異体（例えば抗体または融合タンパク質）は、様々な方法で特徴付けることができる。一実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ウェスタンブロット、濃度測定、または質量分析法を含むがこれらは限定されない、当技術分野においてよく知られている技術を使用して、変異体Ｆｃヘテロ二量体の純度を評価する。タンパク質の安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー、紫外可視分光法およびＣＤ分光法、質量分光法、示差光散乱（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、ベンチトップ安定性アッセイ（ｂｅｎｃｈ  ｔｏｐ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）、他の特徴解析技術を伴う凍結融解、示差走査熱量測定、示差走査蛍光分析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動、受容体結合アッセイ、または相対的なタンパク質発現レベルに限定されない、多くの技術を使用して特徴付けることができる。例となる実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体の安定性は、示差走査熱量測定または示差走査蛍光分析などのような当技術分野においてよく知られている技術を使用して、野生型ＣＨ３ドメインと比較した、改変ＣＨ３ドメインの融解温度によって評価される。
【０２２７】
本発明のＦｃ変異体を、リガンド（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｃ１ｑ）に特異的に結合する能力に関してアッセイしてもよい。そのようなアッセイは、溶液中で（例えばHoughten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992）、ビーズ上で（Lam, Nature, 354:82-84, 1991）、チップ上で（Fodor, Nature, 364:555-556, 1993）、細菌上で（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869, 1992）、またはファージ上で（Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1990; Devlin, Science, 249:404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382, 1990;およびFelici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991）実行することができる。次いで、リガンド（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｃ１ｑ、または抗原に）に特異的に結合することが特定された分子について、リガンドに対するそれらの親和性をアッセイすることができる。
【０２２８】
本発明のＦｃ変異体を、当技術分野において既知の任意の方法によって、抗原（例えば癌抗原および他の抗原との交差反応性）またはリガンド（例えばＦｃγＲ）などの分子への特異的な結合に関してアッセイしてもよい。特異的な結合および交差反応性を解析するために使用することができる免疫アッセイとしては、いくつかの例を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどのような技術を使用する競合的および非競合的アッセイ系があるがこれらには限定されない。そのようなアッセイは、当技術分野では一般的であり、よく知られている（例えばAusubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。
【０２２９】
抗原またはリガンド（例えばＦｃγＲ）などの分子への本発明のＦｃ変異体の結合親和性および相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例としては、標識したリガンド、例えばＦｃγＲ（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉで標識した目的の分子（例えば本発明のＦｃ変異体））を、多量の標識していないリガンド、例えばＦｃγＲの存在下でインキュベートし、その後、標識されたリガンドに結合した分子を検出することを含む、放射性免疫アッセイがある。本発明の分子のリガンドに対する親和性と結合解離速度は、スキャッチャード解析によって飽和データから決定することができる。
【０２３０】
Ｆｃ変異体の動力学的指標はまた、当技術分野で知られている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用した任意のアッセイ（例えばＢＩＡｃｏｒｅ反応速度解析）を使用して決定することができる。ＳＰＲを使用した技術の総説として、Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照のこと。さらに、米国特許第６，３７３，５７７号；同第６，２８９，２８６号；同第５，３２２，７９８号；同第５，３４１，２１５号；同第６，２６８，１２５号に記載されているタンパク質間相互作用を測定するためのＳＰＲ機器およびＳＰＲを使用した方法はいずれも、本発明の方法において想定される。
【０２３１】
当業者らに知られている技術のいずれかを使用した蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、Ｆｃ変異体の細胞表面上に発現される分子（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ）への結合を特徴付けることができる。フローソーターは、ライブラリー挿入配列を含有する多くの個々の細胞を急速に検査することができる（例えば毎時１０〜１００万個の細胞）（Shapiro et al., Practical Flow, Cytometry, 1995）。生物細胞をソートし、検査するためのフローサイトメーターは、当技術分野においてよく知られている。既知のフローサイトメーターは、例えば米国特許第４，３４７，９３５号；同第５，４６４，５８１号；同第５，４８３，４６９号；同第５，６０２，０３９号；同第５，６４３，７９６号；および同第６，２１１，４７７号に記載されている。他の既知のフローサイトメーターには、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙによって製造されたＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）システムおよびＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａによって製造されたＣＯＰＡＳ（商標）システムがある。
【０２３２】
本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲ媒介性のエフェクター細胞機能を媒介するそれらの能力によって特徴付けることができる。アッセイすることが可能なエフェクター細胞機能の例としては、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、オプソニン作用、オプソニン化貪食作用、Ｃ１ｑ結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）が挙げられるがこれらには限定されない。エフェクター細胞機能活性を決定するための、当業者らに知られている任意の細胞ベースのまたは無細胞アッセイを使用することができる（エフェクター細胞アッセイについては、Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown E J. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8:403-411を参照のこと）。
【０２３３】
具体的には、本発明のＦｃ変異体は、当業者らに知られている標準的な方法のいずれかを使用して、エフェクター細胞（例えばナチュラルキラー細胞）におけるＦｃγＲ媒介性ＡＤＣＣ活性についてアッセイすることができる（例えばPerussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92を参照のこと）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を決定するためのアッセイの例としは５１Ｃｒ放出アッセイに基づくものがあり、このアッセイは、［５１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４で標的細胞を標識すること（この細胞膜透過性分子は、細胞質タンパク質に結合し、ゆっくりとした反応速度で細胞から自発的に放出されるが、標的細胞が壊死した後は大量に放出されるので、標識として一般的に使用される）；本発明のＦｃ変異体で標的細胞をオプソニン化すること；オプソニン化した放射性標的化細胞とエフェクター細胞とを適切な比で、マイクロタイタープレート上で組み合わせること；細胞混合物を３７℃で１６〜１８時間インキュベートすること；上清を回収すること；および放射活性を解析することを含む。次いで、本発明の分子の細胞傷害を、例えば以下の式を使用して決定することができる：溶解％＝（実験ｃｐｍ−標的リークｃｐｍ）／（界面活性剤溶解ｃｐｍ−標的リークｃｐｍ）×１００％、あるいは、溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自発的放出）。特異的な溶解は、式：特異的溶解＝本発明の分子による溶解％−本発明の分子の非存在下における溶解％、を使用して計算することができる。標的とエフェクター細胞の比または抗体濃度を変えることによって、図を生成することができる。
【０２３４】
Ｆｃ変異体がＣ１ｑに結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する能力を特徴付けるための方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｃ１ｑへの結合を決定するために、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを実施してもよい。例となるアッセイは、以下を含むことができる：アッセイプレートを、コーティング緩衝液中、４Ｃで、ポリペプチド変異体または出発ポリペプチド（対照）で一晩コーティングしてもよい。次いで、プレートを洗浄、ブロッキングしてもよい。洗浄の後に、ヒトＣ１ｑの分割量をそれぞれのウェルに添加し、室温で２時間インキュベートしてもよい。さらに洗浄した後、１００uＬのヒツジ抗補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼ結合抗体をそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートしてもよい。プレートを洗浄緩衝液で再び洗浄してもよく、１００uｌのＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸化合物（Ｓｉｇｍａ））を含有する基質緩衝液をそれぞれのウェルに添加してもよい。黄色の呈色によって観察される酸化反応を３０分間進行させ、１００uｌのＮＨ２ＳＯ４（４．５Ｎ）を添加することで停止させてもよい。次いで、吸光度を（４９２〜４０５）ｎｍで測定してもよい。
【０２３５】
補体活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを行ってもよい（例えばGazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods 202:163において記載されるように）。簡単に説明すると、様々な濃度のＦｃ変異体およびヒト補体を緩衝液で希釈してもよい。Ｆｃ変異体が結合する抗原を発現する細胞を、約１×１０６細胞／ｍｌの密度まで希釈してもよい。Ｆｃ変異体、希釈したヒト補体、および抗原を発現する細胞の混合物を組織培養用の平底９６ウェルプレートに添加し、補体媒介性細胞溶解を容易にするために、３７Ｃおよび５％ＣＯ２で２時間、インキュベートしてもよい。次いで、５０uＬのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、それぞれのウェルに添加し、３７Ｃで一晩インキュベートしてもよい。吸光度は、５３０ｎｍの励起および５９０ｎｍの放射で９６ウェル蛍光光度計を使用して測定する。結果を、相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で表してもよい。試料濃度は標準曲線から計算することができ、目的のＦｃ変異体の活性パーセントは、類似の分子（つまり非改変または野生型ＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む分子）との比較で報告される。
【０２３６】
補体アッセイは、モルモット、ウサギ、またはヒトの血清を使って実施することができる。標的細胞の補体溶解度は、Korzeniewski et al., 1983, Immunol. Methods 64(3): 313-20; および Decker et al., 1988, J. Immunol Methods 115(1): 61-9に記載されているように、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などの細胞内酵素の放出をモニタリングすることで、または標的細胞を標識しているユーロピウム、クロム５１、もしくはインジウム１１１などの細胞内標識の放出をモニタリングすることによって検出することができる。
【０２３７】
方法
本発明は、疾患、障害、または感染と関連する１つ以上の症状を予防する、治療する、または回復させるために、動物、特に哺乳動物、具体的にはヒトに、１つ以上の本発明のＦｃ変異体（例えば抗体）を投与することを包含する。本発明のＦｃ変異体は、エフェクター細胞機能（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ）の効能の変化が所望される疾患または障害の治療または予防に特に有用である。Ｆｃ変異体およびその組成物は、原発性または転移性新生物疾患（つまり癌）および感染症の治療または予防に特に有用である。本発明の分子は、当技術分野において知られているまたは本明細書に記載の薬学上許容可能な組成物中に提供されてもよい。下記に詳述するように、本発明の分子は、癌（特に受動免疫療法において）、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染症を治療するまたは予防するための方法において使用することができる。
【０２３８】
本発明のＦｃ変異体はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染症の治療または予防のために、当技術分野において既知の他の治療薬と組み合わせて好都合に利用されてもよい。具体的な実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、例えば、分子と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大させ、免疫応答を増大させるように働くモノクローナルもしくはキメラ抗体、リンホカイン、または造血性増殖因子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、およびＩＬ−７など）と組み合わせて使用されてもよい。本発明のＦｃ変異体はまた、例えば抗癌剤、抗炎症剤、または抗ウイルス剤などのような、疾患、障害、または感染を治療するために使用される１つ以上の薬剤と組み合わせて、好都合に利用されてもよい。
【０２３９】
したがって、本発明は、本発明の１つ以上のＦｃ変異体を投与することによって、癌および関連する状態と関係のある１つ以上の症状を予防する、治療する、または回復させるための方法を提供する。作用のいかなるメカニズムによっても拘束されるつもりはないが、類似の分子よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＡに結合し、類似の分子よりも低い親和性でＦｃγＲＩＩＢにさらに結合する本発明のＦｃ変異体ならびに／または当該Ｆｃ変異体は、向上したエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、オプソニン化作用などを有し、癌細胞の選択的なターゲティングおよび効率的な破壊をもたらすであろう。
【０２４０】
本発明はさらに、現行の標準的なおよび実験的な化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、または外科手術を含むがこれらには限定されない、癌の治療または予防について当業者らに知られている他の療法と組み合わせて、１つ以上の本発明のＦｃ変異体を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を、癌の治療および／または予防について当業者らに知られている、治療上または予防上有効な量の１つ以上の抗癌剤、治療用抗体、または他の作用物質と組み合わせて投与してもよい。本発明のＦｃ変異体と組み合わせて使用することができる処方計画および療法の例は、当技術分野においてよく知られており、詳細に別記されている（例えば国際公開第０２／０７０００７号および同第０３／０７５９５７号を参照のこと）。
【０２４１】
本発明の方法および組成物によって治療することができるまたは予防することができる癌および関連する障害は、以下を含むが、これらに限定されない：白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨および結合組織肉腫、脳腫瘍、乳癌、副腎癌、甲状腺癌、膵癌、下垂体癌、眼癌、膣癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌（ｐｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、皮膚癌、腎臓癌、膀胱癌（そのような障害の総説については、Fishman et al., 1985, Medicine,第２版, J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.,米国、を参照のこと）。
【０２４２】
本発明はさらに、本発明の改変ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域を抗体が含むように、癌および関連する障害の治療および／または予防のための当技術分野において既知の抗体のいずれかを操作することを想定する。
【０２４３】
具体的な実施形態では、本発明の分子（例えば変異体Ｆｃヘテロ二量体を含む抗体）は原発性腫瘍の成長または癌細胞の転移を、本発明の前記分子が存在しない場合の原発性腫瘍の成長または転移と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％だけ阻害または低下させる。
【０２４４】
本発明は、対象における炎症性障害と関連する１つ以上の症状を予防する、治療する、または管理するための本発明の１つ以上のＦｃ変異体の使用を包含する。作用のいかなるメカニズムによっても拘束されるつもりはないが、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強したＦｃ変異体は、活性化受容体を弱ることで免疫応答を弱め、かつ、自己免疫障害を治療するおよび／または予防するための治療効果を有するであろう。さらに、炎症性障害と関連のある、２つ以上の標的に結合する抗体（変異体Ｆｃヘテロ二量体を含む二重特異性抗体など）は、一価療法を超えて相乗的効果をもたらす可能性がある。
【０２４５】
本発明はさらに、本発明のＦｃ変異体を、治療上または予防上有効量の１つ以上の抗炎症剤と組み合わせて投与することを包含する。本発明はまた、本発明のＦｃ変異体を、治療上または予防上有効量の１つ以上の免疫調節作用物質と組み合わせて前記対象に投与することをさらに含む、自己免疫疾患と関連する１つ以上の症状を予防する、治療する、または管理するための方法をも提供する。本発明のＦｃ変異体を投与することによって治療され得る自己免疫障害の例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円盤状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少症紫斑（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエル病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多発内分泌腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、高安動脈炎および側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎などのような血管炎、尋常性白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。炎症性障害の例は、喘息、脳炎、炎症性腸感染、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節障害（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、未分化型関節障害（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染に起因する慢性炎を含むが、これらに限定されない。いくつかの自己免疫障害は、炎症性の状態を伴い、したがって、自己免疫障害および炎症性障害と見なされるものの間に重複がある。そのため、いくつかの自己免疫障害は、炎症性障害とも見なされてもよい。本発明の方法に従って予防する、治療するまたは管理することができる炎症性障害の例は、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節障害、未分化型関節障害、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染に起因する慢性炎を含むが、これらに限定されない。
【０２４６】
本発明のＦｃ変異体を使用して、炎症性障害を有する動物、特に哺乳動物が経験する炎症を低下させることもできる。具体的な実施形態では、本発明のＦｃは、当該分子を投与されない動物における炎症に比べて、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％だけ、動物における炎症を低下させる。
【０２４７】
本発明はさらに、抗体が本発明の変異体Ｆｃヘテロ二量体を含むように、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療および／または予防のための当技術分野において既知の抗体のいずれかを操作することを想定する。
【０２４８】
本発明はまた、治療上または予防上有効量の１つ以上の本発明のＦｃ変異体を投与することを含む、対象における感染症を治療するまたは予防するための方法を包含する。本発明のＦｃ変異体によって治療するまたは予防することができる感染症は、ウイルス、細菌、菌類、原生動物、およびウイルスを含むが、これらに限定されない感染病原体によって引き起こされる。
【０２４９】
本発明のＦｃ変異体を本発明の方法と併用することで治療するまたは予防することができるウイルス性疾患は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱、または天然痘などのようなウイルス性疾患の病原体によって引き起こされるものを含むが、これらには限定されない。
【０２５０】
細菌によって引き起こされる、本発明のＦｃ変異体を本発明の方法と関連して治療するまたは予防することができる細菌性疾患は、ミコバクテリア・リケッチア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ、ナイセリア、Ｓ．ニューモニエ、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽病）、テタヌス、連鎖球菌、ブドウ球菌、ミコバクテリウム、テタヌス、ペルチサス（ｐｅｒｔｉｓｓｕｓ）、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびレジオネラを含むが、これらには限定されない。原生動物によって引き起こされる、本発明の分子を本発明の方法と関連して治療するまたは予防することができる原虫症は、リーシュマニア、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ、またはマラリアを含むが、これらには限定されない。寄生虫によって引き起こされる、本発明の分子を本発明の方法と併用することで治療するまたは予防することができる寄生虫症は、クラミジアおよびリケッチアを含むが、これらに限定されない。
【０２５１】
いくつかの態様では、本発明のＦｃ変異体が、感染症の治療および／または予防のための、当業者らに知られている、治療上または予防上有効量の１つまたはさらなる治療薬と組み合わせて投与されてもよい。本発明は、抗生物質、抗真菌剤、および抗ウイルス剤を含むがこれらには限定されない、感染症の治療および／または予防のための、当業者らに知られている他の分子と組み合わせて、本発明の分子を使用することを想定する。
【０２５２】
本発明は、方法および本発明のＦｃ変異体（例えば抗体、ポリペプチド）を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、有効量の本発明の少なくとも１つのＦｃ変異体または本発明の少なくとも１つのＦｃ変異体を含む医薬組成物を対象に投与することによる、疾患、障害、または感染と関連する１つ以上の症状の治療、予防、および回復の方法を提供する。一態様では、Ｆｃ変異体が、実質的に精製される（つまり、ホモ二量体や他の細胞物質などの、Ｆｃ変異体効果を制限するまたは望ましくない副作用をもたらす物質が実質的に含まれない）。具体的な実施形態では、対象は、非霊長動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）ならびに霊長動物（例えば、カニクイザルなどのようなサルおよびヒト）を含む哺乳動物などのような動物である。具体的な実施形態において対象はヒトである。さらに他の具体的な態様では、本発明の抗体は、対象と同じ種に由来するものである。
【０２５３】
組成物の投与経路は、治療される状態に依存する。例えば、静脈内注射は、リンパ腺癌または転移した腫瘍などのような全身性の障害の治療に好ましいことがある。投与される組成物の投与量は、標準的な用量反応研究と併せて、不必要な実験作業を伴わないで、当業者によって決定することができる。それらの決定を下す際に考慮されることとなる関連する環境は、治療する状態、投与する組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症状の重篤度を含む。状態に応じて、組成物は、経口的に、非経口的に、鼻腔内に、経膣的に、直腸に、舌側に、舌下に、頬側に、頬内に、および／または経皮的に、患者に投与することができる。
【０２５４】
したがって、経口、舌側、舌下、頬側、および頬内投与のために設計された組成物は、例えば不活性の希釈剤または食用の担体と共に、当技術分野においてよく知られている手段によって、不必要な実験作業を伴わないで作製することができる。組成物は、ゼラチンカプセル中に封入されていても、または錠剤として打錠されていてもよい。経口治療で投与する目的のためには、本発明の医薬組成物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート、チューインガムなどの剤形で使用されてもよい。
【０２５５】
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどはまた、結合剤、レシピエント、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、および／または香料を含有してもよい。結合剤のいくつかの例としては、結晶セルロース、トラガカントゴム、およびゼラチンが挙げられる。賦形剤の例には、デンプンおよびラクトースが含まれる。崩壊剤のいくつかの例としては、アルギン酸、コーンスターチなどが挙げられる。滑沢剤の例には、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸カリウムが含まれる。滑剤の例には、コロイド状二酸化ケイ素がある。甘味料のいくつかの例は、スクロース、サッカリンなどを含む。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味料などを含む。これら様々な組成物を調製するのに使用される物質は、使用される量において薬学的に純粋であり、無毒性であるべきである。
【０２５６】
本発明の医薬組成物は、例えば静脈内、筋肉内、鞘内、および／または皮下注射によって、非経口的に投与することができる。非経口投与は、溶液または乳液の中に本発明の組成物を組み込むことによって達成することができる。そのような溶液または乳液はまた、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、および／または他の合成溶媒などのような、無菌の希釈剤を含んでいてもよい。非経口製剤はまた、例えばベンジルアルコールおよび／またはメチルパラベンなどのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸および／または亜硫酸水素ナトリウムなどのような酸化防止剤、ならびにＥＤＴＡなどのようなキレート化剤を含んでいてもよい。さらに、アセテート、シトレート、およびホスフェートなどのような緩衝剤ならびに塩化ナトリウムおよびデキストロースなどのような張度の調節のための作用物質を追加してもよい。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨ての注射器、および／または多用量バイアル中に封入することができる。直腸投与は、直腸および／または大腸の中に組成物を投与することを含む。これは、坐剤および／または浣腸剤を使用して達成することができる。坐剤製剤は、当技術分野における既知の方法によって作製することができる。経皮的投与は、皮膚を通しての組成物の経皮吸収を含む。経皮的製剤は、パッチ、軟膏剤、クリーム剤、ゲル、軟膏などを含む。本発明の組成物は、患者に経鼻的に投与することができる。本明細書で使用する場合、経鼻的に投与することまたは経鼻投与は、患者の鼻孔および／または鼻腔の粘膜に組成物を投与することを含む。
【０２５７】
本発明の医薬組成物は、疾患、障害、または感染と関連する１つ以上の症状を予防する、治療する、または回復させるための本発明の方法に従って使用することができる。本発明の医薬組成物は滅菌されており、対象への投与に適した形態をしていることを想定する。
【０２５８】
一実施形態では、本発明の組成物は、内毒素および／または関連する発熱性物質を実質的に含まない、発熱物質を含まない製剤である。内毒素には、微生物内に限られ、微生物が分解されたまたは死亡した場合に放出される毒素が含まれる。発熱性物質はまた、細菌および他の微生物の外膜由来の発熱誘発性で熱安定性の物質（糖タンパク質）をも含む。これらの物質は両方ともヒトに投与された場合、発熱、低血圧、およびショックを引き起こし得る。有害な影響を及ぼす可能性があることから、静脈内投与用の医薬水剤から、内毒素を、低量であっても除去することは好都合である。米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内用薬剤に使用される内毒素の上限を、１時間の期間とした１用量で、体重１キログラム当たり、５内毒素単位（ＥＵ）と設定している（The United States Pharmacopeial Convention、Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000)）。治療用タンパク質が、モノクローナル抗体の場合にあり得るように、体重１キログラム当たり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、極微量であっても、内毒素を除去することが好都合である。具体的な実施形態では、組成物中の内毒素および発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満または５ＥＵ／ｍｇ未満または１ＥＵ／ｍｇ未満または０．１ＥＵ／ｍｇ未満または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０２５９】
本発明は、疾患、障害、または感染と関連する１つ以上の症状を予防する、治療する、または回復させるための方法を提供し、この方法は、（ａ）予防上または治療上有効量の１つ以上のＦｃ変異体を含む組成物を、それを必要とする対象に投与すること、および（ｂ）Ｆｃ変異体の血漿濃度を、抗原に継続的に結合する望ましいレベル（例えば約０．１〜約１００μｇ／ｍｌ）に維持するために、１つ以上の続く用量の前記Ｆｃ変異体を投与することを含む。具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体の血漿濃度は、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌに維持される。具体的な実施形態では、投与される前記Ｆｃ変異体の有効量は、１用量当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。他の具体的な実施形態では、投与される前記Ｆｃ変異体の有効量は、１用量当たり少なくとも４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。さらに他の具体的な実施形態では、投与される前記Ｆｃ変異体の有効量は、１用量当たり５０ｍｇ〜２５０ｍｇである。さらに他の具体的な実施形態では、投与される前記Ｆｃ変異体の有効量は、１用量当たり１００ｍｇ〜２００ｍｇである。
【０２６０】
本発明はまた、Ｆｃ変異体が、Ｆｃ変異体および／または変異体融合タンパク質以外の治療（例えば予防または治療薬）と組み合わせて使用される、疾患、障害、または感染と関連する１つ以上の症状を予防する、治療する、または回復させるための手順も包含する。本発明は部分的に、本発明のＦｃ変異体が、現行の標準的なおよび実験的な化学療法を含む他の癌療法の効能を高め、それと相乗作用を示す、その効力を増強する、そのトレランスを改善する、および／またはそれによって引き起こされる副作用を低下させるという認識に基づく。本発明の併用療法は、付加的な効力、付加的な治療効果、または相乗効果を有する。本発明の併用療法によって、前記対象の生活の質を改善するためにおよび／または予防もしくは治療効果を達成するために、疾患、障害、もしくは感染と関連する１つもしくは複数の症状を予防する、治療する、もしくは回復させるためにＦｃ変異体と併用して利用される治療（例えば予防もしくは治療薬）の投薬量をより少なくするおよび／または疾患、障害、もしくは感染を有する対象へのそのような予防もしくは治療薬の投与の頻度を低下させることが可能になる。さらに、本発明の併用療法により、現行の単剤治療および／または既存の併用療法と関連する不要なまたは有害な副作用が低下するかまたは回避され、それにより、患者の治療手順へのコンプライアンスが改善される。本発明のＦｃ変異体と組み合わせて利用することができる多数の分子は、当技術分野においてよく知られている。例えば国際公開第０２／０７０００７号；同第０３／０７５９５７号、および米国特許出願公開第２００５／０６４５１４号を参照のこと。
【０２６１】
本発明は、検出可能な物質、治療薬、または薬剤に結合したまたは融合した抗原に特異的に結合する、ＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑに対する変化した結合親和性ならびに変化したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を有する１つ以上のＦｃ変異体を含み、１つ以上の容器に入っている、疾患、障害、または感染と関連する１つ以上の症状をモニタリングする、診断する、予防する、治療する、または回復させるのに使用するためのキットを提供する。
【実施例】
【０２６２】
以下の実施例は、本発明の実施を説明するために提示される。それらは本発明の全範囲を制限または定義することは意図されていない。
【０２６３】
実施例１：ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一重特異性抗体の作製
抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳類発現に最適化されたコドンを用いて遺伝子合成を介して構築した。Ｆａｂ配列は、既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂ（Carter P. et al. (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. Proc Nat/ Acad Sci 89, 4285.）から作製され、Ｆｃは、ＩｇＧ１アイソタイプ（配列番号１）であった。最終的な遺伝子産物を、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）へとサブクローニングした（Durocher, Y., Perret, S. & Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human HEK293- EBNA1 cells. Nucleic acids research 30, E9 (2002)）。ＣＨ３ドメインにおける変異は、ｐＴＴ５鋳型ベクターの部位指向性突然変異生成を介して導入された。作製された改変ＣＨ３ドメイン変異のリストは、表１、表６、表７を参照のこと。
【０２６４】
ヘテロ二量体の形成を推定し、ホモ二量体とヘテロ二量体の比率を決定するために、異なるサイズのＣ末端伸長を伴う２つのヘテロ二量体重鎖を設計した（具体的には、鎖Ａは、Ｃ末端ＨｉｓＴａｇ、鎖Ｂは、Ｃ末端ｍＲＦＰ＋ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩを伴う）。この分子量の違いにより、図２５Ａにおいて図示されるように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるホモ二量体とヘテロ二量体の差異化が可能となる。
【０２６５】
対数増殖期（１．５〜２百万個の細胞／ｍＬ）にあるＨＥＫ２９３細胞に、水性２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）１ｍｇ／ｍＬを、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比率でトランスフェクトした（Raymond C. et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55(1):44-51 (2011)）。ヘテロ二量体形成の最適な濃度範囲を決定するために、２つの重鎖を３つの別々の比率で、ＤＮＡにトランスフェクトした。たとえば、５％ＧＦＰ、４５％サケ精子ＤＮＡ、２５％軽鎖および２５％総重鎖から構成される２ｍｌの培養量およびトランスフェクションＤＮＡで行われ、ここで、重鎖Ａプラスミド（Ｃ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ付き）および重鎖Ｂプラスミド（Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ＋ＲＦＰ付き）は、６５％／５５％／３５％または１０％／２０％／４０％で、１０％／６５％；２０％／５５％；４０％／３５％の３つの異なる相対比（鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ｂ（ｍＲＦＰ））でサンプリングされた（ＷＴ＿Ｈｉｓ／ＷＴ＿ｍＲＦＰヘテロ二量体の見かけ上の１：１発現比は、ＤＮＡ比率２０％／５５％に近いものであることが測定されていた）。Ｆ１７無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中でトランスフェクションの４〜４８時間後、ＴＮ１ペプトンを最終濃度０．５％となるまで添加する。発現抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、最適なヘテロ二量体形成のための重鎖と軽鎖の最良の比率が決定された（図２５ＢおよびＣを参照のこと）。
【０２６６】
選択されたＤＮＡ比率（たとえば、５％ＧＦＰおよび４５％サケ精子ＤＮＡと共に、５０％軽鎖プラスミド、２５％重鎖Ａプラスミド、２５％重鎖Ｂ（ＡＺ３３およびＡＺ３４））を用いて、上述のように１５０ｍＬの細胞培養物にトランスフェクトした。５〜６日後、トランスフェクトされた細胞を４０００ｒｐｍでの遠心および０．４５μｍのフィルターを用いて浄化させた培養培地で回収した。さらなる分析（純度および融解温度の測定を含む）のために作製された、ＣＨ３変異を有する各抗体のスケールアップしたトランスフェクション分析において用いられた軽鎖ならびに重鎖Ａおよび重鎖Ｂプラスミドのパーセンテージのリストについては、以下の表２を参照のこと。
【表９】
2014533243.tif 000016
【０２６７】
実施例２：ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一重特異性抗体の精製
浄化した培養培地をＭａｂ選択ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラム上にロードし、カラムの１０倍体積のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。抗体を、カラムの１０倍体積のクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で溶出し、抗体を含む分画プールを、ＴＲＩＳ（ｐＨ１１）で中性化した。Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、タンパク質を最終的に脱塩した。重鎖Ｂ上のＣ末端ｍＲＦＰタグは、抗体をエンテロキナーゼ（ＮＥＢ）と、１：１０，０００の比率で、２５oＣ、ＰＢＳ中で一晩、インキュベートすることにより除去した。ゲルろ過により混合物から抗体を精製した。ゲルろ過については、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬにまで濃縮し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣを介して、１ｍＬ／分の流速で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を流速１ｍＬ／分で用いた。精製抗体に相当する分画を採取し、約１ｍｇ／ｍＬにまで濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２６８】
ホモ二量体と比較したヘテロ二量体の形成を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法を用いて分析した。プロテインＡ精製抗体を、４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元ゲル上で泳動し、エンテロキナーゼ（ＥＫ）処置前のヘテロ二量体形成のパーセンテージを測定した（図２６を参照のこと）。質量分析法については、すべてのＴｒａｐ  ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）実験は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ２質量分析器と接続されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステム上で実行された。ゲルろ過精製された抗体５μｇを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｔｒａｐ（１．０×８．０ｍｍ）に注入し、１％アセトニトリルで８分間、１〜２０％アセトニトリル／０．１％ギ酸の濃度勾配で２分間、洗浄し、次いで、２０〜６０％アセトニトリル／０．１％ギ酸の濃度勾配で２０分間、溶出した。溶出物（３０〜５０μＬ／分）は、毎秒ごとにスペクトルを取りながら（ｍ／ｚ  ８００〜４，０００）、分光器へと移動した（図２８を参照のこと）。９０％を超えるヘテロ二量体を有する変異体を、さらなる分析のために選択した（８５％超のヘテロ二量体形成を有するＡＺ１２およびＡＺ１４のそれぞれは例外とする）。
【０２６９】
実施例３：示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いた、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一重特異性抗体の安定性測定
すべてのＤＳＣ実験は、ＧＥ  ＶＰキャピラリー機器を用いて実施された。タンパク質はＰＢＳ（ｐＨ７．４）へとバッファー交換され、０．４〜０．５ｍｇ／ｍＬに希釈され、サンプルセル内へと０．１３７ｍＬがロードされ、２０〜１００℃の間、１℃／分のスキャン速度で測定された。データは、ＰＢＳ緩衝液のバックグラウンドを差し引いて、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析された（図２７を参照のこと）。検証された変異体および測定された融解温度のリストは表３を参照のこと。７０℃以上の融解温度を有する変異体および各変異体の具体的なＴｍのリストは表４を参照のこと。
【表１０】
2014533243.tif 000017
【表１１】
2014533243.tif 000018
【０２７０】
実施例４：表面プラズモン共鳴を利用したＦｃガンマＲ結合の評価
すべての結合実験は、ＢｉｏＲａｄＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器を用いて、２５℃で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）で実施した。組換えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５、ＥｒｂＢ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ））は、残りの活性基をクエンチさせたまま、およそ３０００共鳴単位（ＲＵｓ）が固定されるまで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）に溶解した４．０μｇ／ｍＬを２５μＬ／分で注入することにより、活性化ＧＬＭセンサーチップ上で捕捉された。安定したベースライン構築のための緩衝液投入後、４０μｇ／ｍＬの精製抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（改変ＣＨ３ドメインを含有）を、２４０秒、２５μＬ／分で投入した際に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を結合させることにより、センサーチップ上で間接的に捕捉した（およそ５００ＲＵを得られた）。ＦｃガンマＲ（ＣＤ１６ａ（アロタイプ）およびＣＤ３２ｂ）濃縮物（６，０００、２，０００、６６７，２２２および７４．０ｎＭ）を、一連の結合センサーグラムを得るための１８０秒の解離フェーズとともに、１２０秒間、６０μＬ／分で投入した。得られたＫＤ値を、３つの独立したランの平均として報告された値でのＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｆｉｔモデルを用いた結合等温線から決定した。比較は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインで作製され、結合は、変異体ｋＤに対するＷＴ  ｋＤの比率として表された（表５を参照のこと）。
【０２７１】
【表１２−１】
2014533243.tif 000019
表５の続き。
【表１２−２】
2014533243.tif 000020
表５の続き。
【表１２−３】
2014533243.tif 000021
【０２７２】
実施例５：Ｆｃ＿ＣＨ３エンジニアリングを用いたＦｃ変異体の合理的設計−スキャホールド１（１ａおよび１ｂ）。そして、ＡＺ１７−６２およびＡＺ１３３−ＡＺ２４３８の開発。
向上した安定性と純度を有するＡＺ変異体を得るために、上述の構造およびコンピューター予測による戦略を実施した（図２４を参照のこと）。たとえば、ＡＺ８の綿密な構造−機能分析により、野生型ヒトＩｇＧ１と比較して、ＡＺ８、Ｌ３５１Ｙ＿Ｖ３９７Ｓ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｋ３９２Ｖ＿Ｔ３９４Ｗの各変異導入に対する詳細な理解が得られ、重要なコアヘテロ二量体変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗであり、Ｖ３９７Ｓ、Ｋ３９２Ｖは、ヘテロ二量体形成に関連が無いことが示唆された。コア変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ）は、本明細書において、「スキャホールド１」変異と呼称される。さらに、分析により、野生型（ＷＴ）ホモ二量体形成に対しては存在していない重要な境界面のホットスポットは、ＷＴ−Ｆ４０５−Ｋ４０９、Ｙ４０７−Ｔ３６６の相互作用、ならびに、Ｙ４０７−Ｙ４０７、および−Ｆ４０５のパッキングであることが明らかとなった（図２９を参照のこと）。これは、パッキング、空洞、およびＭＤ分析に反映されており、ループ領域Ｄ３９９−Ｓ４００−Ｄ４０１（図３０を参照のこと）およびＫ３７０での関連βシートにおける大きな構造的差異を示した。これは、鎖間相互作用Ｋ４０９−Ｄ３９９の消失をもたらし（図３０を参照のこと）、および、Ｅ３５７に対する強力なＫ３７０水素結合の弱体化をもたらした（Ｋ３７０はもはやＳ３６４およびＥ３５７に直接的な接触はできないが、完全に溶媒に露出されている）。ＷＴ  ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおいて、これらの領域は、バルク溶媒の競合からコア相互作用を防御し、好ましい疎水性ファンデルワールス相互作用の動的な発生を増加させる、辺縁の境界面を係留する。その結果、ＷＴと比較してＡＺ８の表面域をより低く沈み込ませ、疎水性コアへ溶媒がアクセスしやすくさせる。このことから、ＷＴと比較してＡＺ８の安定性が低いことの最も重要な要因は、ａ）ＷＴ−Ｆ４０５−Ｋ４０９相互作用およびＦ４０５のパッキングの消失、ならびに、ｂ）Ｙ４０７−Ｙ４０７およびＹ４０７−Ｔ３６６の強力なパッキング相互作用の消失であることが示唆される（図２９を参照のこと）。
【０２７３】
結果として、我々はＷＴと比較してＡＺ８の安定性が低いことの原因となっている重要な残基／配列モチーフを特定した。これらを踏まえ、ＡＺ８の安定性とヘテロ二量体特異性を改善するために、次なるポジティブ設計エンジニアリングの試みを、より「閉じられた」ＷＴ様構造での、３９９−４０１位のループ構造の安定化（図３０を参照のこと）、ならびに、Ｔ３６６およびＬ３６８位での疎水性コアの全体的にやや低い（緩い）パッキング（図２９を参照のこと）の補填に特に焦点を当てて行った。
【０２７４】
３９９−４０１位のループ構造の安定化を得るために、前述のコンピューター予測によるアプローチを用いて、異なる標的設計の我々のアイデアを評価した。具体的に、Ｆｃ変異体ＡＺ８の３つの異なる独立したオプションを分析し、安定性改善に重要と認定されている領域を最大限活用した。第一に、Ｋ４０９位に近接している結合ポケットおよびＦ４０５Ａを、疎水性コアの防御および３９９−４００のループ構造の安定化の両方のための、より良い疎水性パッキングについて評価した（図３０を参照のこと）。それらにはＦ４０５およびＫ３９２位の付加的点変異が含まれているが、これらに限定されない。第二に、３９９−４００のループ構造の安定化および疎水性コアの防御のために、３９９−４０９位の静電気的相互作用の改善のためのオプションを評価した。これにはＴ４１１およびＳ４００位での付加的点変異が含まれるが、これらに限定されない。第三に、コア疎水性パッキングの改善のために、Ｔ３６６，Ｔ３９４ＷおよびＬ３６８位のコアパッキングでの結合ポケットを評価した（図２９を参照のこと）。これらにはＴ３６６およびＬ３６８位の追加の点変異が含まれているが、これらに限定されない。異なる独立したポジティブ設計のアイデアを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで検証し、コンピュータツールを使用したある好適な変異体（ＡＺ１７−ＡＺ６２）を、実施例１〜４に記載されるように、発現および安定性について実験的に確認した。表４は、７０℃またはそれ以上の融解温度を有する、このデザイン戦略から構成された、特定のＦｃベースのヘテロ二量体構築物のリストである。
【０２７５】
Ｆｃ変異体ＡＺ３３は、スキャホールド１を改変し、安定性と純度を改善するためのスキャホールド１ａを得たＦｃ変異体の開発例である。このＦｃ変異体は、３９９−４００のループ構造の安定化および疎水性コアの防御の両方のために、３９２−３９４−４０９および３６６の位置での疎水性パッキング改善を目的に、ＡＺ８をベースに設計された。このＦｃ変異体ＡＺ３３ヘテロ二量体は、ＡＺ８のコア変異とは異なる、追加の２つの点変異、Ｋ３９２ＭおよびＴ３６６Ｉを有している。Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖの変異は、本明細書において、「スキャホールド１ａ」変異と呼称される。Ｋ３９２Ｍ変異は、３９９−４００のループ構造の安定化および疎水性コアの防御のために、Ｋ４０９およびＦ４０５Ａの位置に近接する空洞でのパッキングを改善するために設計された（図３１を参照のこと）。Ｔ３６６Ｉは、Ｔ３９４Ｗ鎖のホモ二量体の形成を除外し、コア疎水性パッキングを改善するために設計された（図２９を参照のこと）。ＡＺ３３の実験データ（ＡＺ３３は７４℃のＴｍおよび９８％超のヘテロ二量体含有量を有する）より、他のネガティブ設計Ｆｃ変異体（たとえば、ＡＺ８（Ｔｍ  ６８℃））を超える安定性の有意な改善が示された（図２５Ｃを参照のこと）。
【０２７６】
Ｆｃ変異体ヘテロ二量体のフェーズ３設計における、スキャホールド１変異を用いたＦｃ変異体の開発
ＡＺ３３は、当初の開始変異体ＡＺ８を超える有意な安定性および特異性（または純度）の改善を示したが、我々の分析からは、ＡＺ３３の実験データおよび上述の設計法を用いたさらなるアミノ酸改変を使用して、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の安定性をより改善できることが示唆されている。異なる設計案が、独立して、発現および安定性を検証されたが、独立設計案は、移転可能であり、もっとも好適なヘテロ二量体は、異なる設計の組み合わせを含有する。特に、ＡＺ８の最適化に対し、Ｋ４０９−Ｆ４０５Ａ−Ｋ３９２に近接した空洞でのパッキング変異は、Ｌ３６６Ｔ−Ｌ３６８残基でのコアパッキングを最適化する変異から独立して評価された。これらの２つの領域、３６６−３６８および４０９−４０５−３９２は互いに離れており、独立していると考えられる。たとえばＦｃ変異体ＡＺ３３は、４０９−４０５−３９２でのパッキングに最適化されているが、３６６−３６８では最適化されておらず、そのため、これらの最適化変異が別々に評価された。３６６−３６８変異の比較から、Ｔ３６６Ｌおよび、Ｔ３６６Ｉ（Ｆｃ変異体ＡＺ３３の開発で用いられた点変異）もまた、Ｔ３６６の安定性を超えた改善をもたらすことが示唆された。結果として、本実験データからは、たとえば、Ｔ３６６Ｉの代わりにＴ３６６Ｌを導入することによる、ＡＺ３３のさらなる最適化が直ちに提案される。それゆえ、ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、本明細書において、「スキャホールド１ｂ」変異と呼称される。
【０２７７】
類似の様式で、全実験データを分析し、現行のＦｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ３３をさらに改善するために用いることができる点変異を特定した。これらの特定された変異は、上述のコンピューター予測アプローチ法を用いて分析され、ＡＺ３３をベースとした付加的なＦｃ変異体ヘテロ二量体のリストを挙げるためにランク付けされた（表６に示す）。
【０２７８】
実施例６：Ｆｃ＿ＣＨ３エンジニアリングを用いたＦｃ変異体の合理的設計−スキャホールド２（ａおよびｂ）、および、ＡＺ６３−１０１およびＡＺ２１９９−ＡＺ２５２４の開発。
安定性および純度を目的として、最初のネガティブ設計フェーズのＦｃ変異体を改善するために、上述の構造的およびコンピューター予測戦略を実施した（図２４を参照のこと）。たとえば、Ｆｃ変異体ＡＺ１５の綿密な構造−機能分析により、野生型（ＷＴ）ヒトＩｇＧ１と比較した、ＡＺ１５、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｅ３５７Ｌ＿Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ＿Ｔ４１１Ｎの各変異導入に対する詳細な理解が深まり、重要なコアヘテロ二量体変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆである一方、Ｅ３５７Ｌ、Ｔ４１１Ｎはヘテロ二量体形成および安定性には直接的には関与しないことが示唆された。コア変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）は、本明細書において、「スキャホールド２」変異と呼称される。さらなる分析により、野生型（ＷＴ）ホモ二量体形成に関しては存在していない重要な接合面ホットスポットは、塩橋Ｄ３９９−Ｋ４０９、水素結合Ｙ４０７−Ｔ３６６およびＹ４０７−Ｙ４０７のパッキングであることが明らかとなった。以下に示される詳細な分析により、どのように我々のオリジナルのＦｃ変異体ＡＺ１５の安定性を改善したのか、ならびに、安定性が改善されたこれらＦｃ変異体を得るために作製されたアミノ酸改変および位置が説明される。
【０２７９】
スキャホールド２を用いたＦｃ変異体の開発および、スキャホールド２ａ変異のさらなる開発。
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、たとえば、ＡＺ１５変異Ｋ４０９Ｆ＿Ｔ３６６Ａ＿Ｙ４０７Ａ等の従前のＦｃ変異体設計のパッキングが最適ではないこと、およびＷＴ−Ｙ４０７−Ｙ４０７相互作用の消失による疎水性コアのパッキングの全体的な減少が示唆された。本明細書に記載されるヘテロ多量体は、より最適なパッキングで設計されている。本明細書に記載されるポジティブ設計の試みの一部は、当初のＦｃ変異体ＡＺ１５におけるパッキングの欠点を補うための点変異に焦点が当てられていた。標的残基としては、Ｔ３６６、Ｌ３５１、およびＹ４０７位が挙げられる。これらの異なる組み合わせがｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで検証され、コンピューターのツールを用いて最も良いとランク付けされたＦｃ変異体（ＡＺ６３−ＡＺ７０）を、実施例１〜４に記載されるように、発現および安定性に対して実験的に確認した。
【０２８０】
Ｆｃ変異体ＡＺ７０は、スキャホールド２を改変し、安定性および純度を改善するためのスキャホールド２ａ変異を得たＦｃ変異体の開発例である。このＦｃ変異体は、上述の疎水性コアでのより良いパッキングを得ることを目的として、ＡＺ１５を元にして設計された。Ｆｃ変異体ＡＺ７０は、Ｔ３６６がＴ３６６Ａの代わりにＴ３６６Ｖへと変異されていることを除き、上述と同一のスキャホールド２コア変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有している（図３３）。Ｌ３５１Ｙ変異により、３６６Ａ＿４０９Ｆ／４０７Ａ変異体の融解温度が、７１．５℃から７４℃に改善され、さらなる付加的な変更（３６６Ａから３６６Ｖへ）により、Ｔｍは７５．５℃に改善される（表４のＡＺ６３、ＡＺ６４およびＡＺ７０（それぞれ７１．５℃、７４℃および７５．５℃のＴｍを有する）を参照のこと）。コア変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ）は、本明細書において、「スキャホールド２ａ」変異と呼称される。Ｆｃ変異体ＡＺ７０の実験データから、最初のネガティブ設計Ｆｃ変異体ＡＺ１５（Ｔｍ７１℃）を超える安定性の有意な改善が示された（ＡＺ７０は、７５．５℃のＴｍ、および９０％超のヘテロ二量体含有量を有する）（図３３および２７）。
【０２８１】
スキャホールド２変異を用いたＦｃ変異体の開発、およびスキャホールド２ｂ変異のさらなる開発。
分子動力学シミュレーション（ＭＤ）およびパッキング分析により、好ましい、より「開かれた」ループ３９９−４００構造を取る傾向が示され、それは、ＷＴ塩橋Ｋ４０９−Ｄ３９９の消失によるものであるらしいことが示された。これはまた同様に、Ｋ３９２との相互作用を補う傾向があり、より「開かれた」ループ構造を誘導する、不飽和のＤ３９９をもたらした。このより「開かれた」ループ構造により、全体的なパッキングの減少と、コアＣＨ３ドメイン境界面残基へのより高い溶媒アクセスがもたらされ、それは同様にヘテロ二量体複合体を有意に不安定化する。それゆえ、ポジティブ設計の試みの標的の一つは、このループを、Ｄ３９９−Ｋ４０９塩橋の消失およびＫ４０９のパッキング相互作用を補う付加的な点変異によるＷＴ様の構造である、より「閉じられた」状態に結びつけることであった。標的残基としては、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、Ｋ３９２位およびそれらの組み合わせが挙げられる。異なるパッキング、疎水性および静電気性のポジティブエンジニアリング戦略を、上述の位置についてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで検証し、コンピューター予測のツールを用いて最も良いとランクづけられたＦｃ変異体（ＡＺ７１−ＡＺ１０１）を、実施例１〜４に記載のように、発現および安定性に対して実験的に確認した。
【０２８２】
Ｆｃ変異体ＡＺ９４は、スキャホールド２を改変し、安定性および純度を改善するための付加的な点変異と共にスキャホールド２ｂ変異を得た、Ｆｃ変異体の開発例である。このＦｃ変異体は、上述のＤ３９９−Ｋ４０９塩橋の消失の補填、および、ＷＴ様構造のより「閉じられた」状態にループ３９９−４００を結び付けることを目的として設計された。Ｆｃ変異体ＡＺ９４は、スキャホールド２（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）に４つの追加の点変異を有し、このＦｃ変異体のコア変異として（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を残したままＬ３５１Ｙを野生型Ｌ３５１に戻した。コア変異Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆは、本明細書において、「スキャホールド２ｂ」変異と呼称される。ＡＺ９４の４つの追加の点変異は、Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒである。Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒの変異は、追加の塩橋を形成し、Ｋ４０９／Ｄ３９９相互作用の消失を補うように設計された（図３４）。さらに、この塩橋は、両方の潜在的なホモ二量体における電荷−電荷相互作用を損ねることによってホモ二量体形成を阻害するよう、設計された。Ｋ３９２Ｅ／Ｓ４００Ｒの追加変異は、他の塩橋の形成を意図しており、ゆえに、３９９＿４００ループを、ＷＴ様構造のように、より「閉じて」さらに結びつける（図３４）。ＡＺ９４の実験データより、最初のネガティブ設計Ｆｃ変異体ＡＺ１５（Ｔｍ  ７１℃、９０％超の純度）を超える安定性と純度の改善が示された（Ｆｃ変異体ＡＺ９４は、７４℃のＴｍおよび９５％超のヘテロ二量体含有量または純度を有する）。
【０２８３】
Ｆｃ変異体ヘテロ二量体のフェーズ３設計におけるスキャホールド２変異を用いたＦｃ変異体の開発。
Ｆｃ変異体ＡＺ７０およびＡＺ９４は、最初のネガティブ設計Ｆｃ変異体（たとえば、ＡＺ１５）を超える安定性および純度の明らかな改善を示したが、我々の分析およびＡＺ７０とＡＺ９４の比較から、さらなるアミノ酸改変により、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の安定性に予想外の改善をもたらすことができることが直接示唆される。たとえば、Ｆｃ変異体ＡＺ７０およびＡＺ９４は、最初の変異体ＡＺ１５の２つの独特な非最適化領域を標的とするよう設計され、それは疎水性コアでのパッキングの改善およびコア境界面残基の外側に変異を入れることにより達成され、３９９−４０１位のループ構造を安定化させる追加の塩橋および水素結合がもたらされた。Ｆｃ変異体ＡＺ７０およびＡＺ９４の追加の点変異は互いに遠く、それゆえ、独立しており、スキャホールド２（２ａおよび２ｂ変異を含む）コア変異とほぼ同じ設計をされた他のＦｃ変異体へ転移可能である。特に、ＡＺ７０のみが最適化されたコア変異、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを有しているが、追加の塩橋はなく、一方で、ＡＺ９４は４つの静電気性の追加の変異（Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒ）を含有しているが、疎水性コア境界面には一つ少ない変異（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有している。これらのスキャホールド２ｂ変異は、ＡＺ７０ほど安定ではないが（たとえば、ＡＺ９４と同等のコア変異および７２℃のＴｍを有しているＡＺ６３を参照のこと）、Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒ変異の付加により補填されている。提示された安定性および純度の実験データからは、ＡＺ７０（疎水性コアを最適化する）と、ＡＺ９４の静電気性変異の組み合わせにより、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の安定性および純度がさらに改善されることが示唆される。同様の方法で、スキャホールド２  Ｆｃ変異体（ＡＺ６３−１０１）の全実験データを分析し、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ７０およびＡＺ９４をさらに改善するために用いることができる点変異を特定した。これら特定された変異を上述のコンピューター予測によるアプローチでさらに分析し、ＡＺ７０およびＡＺ９４を元にしたさらなるＦｃ変異体ヘテロ二量体のリストを作るためにランク付けした（表７に示す）。
【０２８４】
実施例７：ＦｃｇＲ結合へのヘテロ二量体ＣＨ３の効果
ＦｃｇＲを有するヘテロ二量体Ｆｃ活性の原型的な例として、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を有する２つの変異体抗体を、ＦｃｇＲ結合に対し、実施例４に記載されるＳＰＲアッセイで、Ａ：Ｋ４０９Ｄ＿Ｋ３９２Ｄ／Ｂ：Ｄ３９９Ｋ＿Ｄ３５６Ｋ（コントロール１（図３５のｈｅｔ１））、および、Ｈｅｒ２結合Ｆａｂアームを有する、Ａ：Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｂ：Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ（コントロール４（図３５のｈｅｔ２））を検証した。図３５に示されるように、我々は、両方のヘテロ二量体Ｆｃ領域が、異なるＦｃガンマ受容体に、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と同一の相対強度で結合することを観察しているが、総合的には、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型抗体よりもやや良い程度に、ＦｃｇＲのそれぞれに結合した。このことより、ＦｃのＣＨ３境界面での変異は、我々の分子動力学シミュレーションおよび分析で観察されたように、ＣＨ２ドメイン全域で、Ｆｃガンマ受容体に対するＦｃ領域の結合強度に影響を与えうることが示唆される。
【０２８５】
実施例８：ＦｃｇＲ結合に対するヘテロ二量体ＦｃのＣＨ２における非対称変異の影響。
Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインにおける、２６７位のセリンのアスパラギンへの変異（Ｓ２６７Ｄ）は、ＣＨ２ドメインの２つの鎖においてホモ二量体の様式で導入された際、ＦｃガンマＩＩｂＦ、ＩＩｂＹおよびＩＩａＲ受容体への結合が増強されることが知られている。図３６Ａの指標のデータから示されるように、この変異を、ヘテロ二量体Ｆｃ分子のＣＨ２ドメインのうちの一つのみに導入し、ホモ二量体ＣＨ２Ｆｃにこの変異が導入された場合と比較して、およそ半分の結合強度の改善を得ることができる。他方で、Ｆｃのホモ二量体ＣＨ２ドメインにおけるＥ２６９Ｋ変異は、Ｆｃ領域のＦｃｇＲへの結合を阻害する。我々は、ＦｃのＣＨ２ドメインにおける２鎖のうちの１つに、これらの有益な、および無益な変異を非対称性に導入することによる、Ｆｃ領域のＦｃｇ受容体への結合強度の増強操作に関するスキームを提示する。ヘテロ二量体Ｆｃの一つのＣＨ２鎖への、非対称性のＥ２６９Ｋ変異導入は、それが提示されている面で、ＦｃｇＲの結合阻害による極性ドライバーとして振る舞う一方で、Ｆｃの他の面は、通常どおりにＦｃｇＲと相互作用させる。この実験結果を図３６Ａに示す。独立した様式で、Ｆｃの両鎖を介して結合強度を選択的に変える機会は、ＦｃとＦｃｇ受容体の間の結合強度および選択性を操作する機会を増加させる。ゆえに、ＣＨ２ドメインにおける変異のそのような非対称性の設計を行うことにより、ある結合モデルに都合良く働く、もしくは働かないポジティブ設計およびネガティブ設計を導入することができ、選択性を導入する機会が増す。
【０２８６】
次の実験において、我々は、ＦｃガンマＩＩＩａＦおよびＩＩＩａＶ受容体への結合強度の増加を示す一方で、ＦｃガンマＩＩａＲ、ＩＩｂＦおよびＩＩｂＹ受容体への結合の弱体化を示し続ける、Ｆｃ変異のベースＳ２３９Ｄ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｉ３３２Ｅ＿Ｓ２９８Ａの選択性プロファイルを改造した。図３６Ｂの結合プロファイルにおいて、これを示す。鎖Ａに非対称性の変異Ｅ２６９Ｋを導入すること、および鎖ＢにおけるＩ３３２Ｅ変異を避けることにより、我々は、さらにＩＩａおよびＩＩｂ受容体への結合を弱体化させ、ＦｃをよりＩＩＩａ受容体結合に特化させる、新規のＦｃｇＲ結合プロファイルを作製することができた。
【０２８７】
図３６Ｃの他の例において、ＣＨ２ドメインのＳ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ変異を含有するホモ二量体Ｆｃと比較した非対称変異に焦点を当てている。野生型ＩｇＧ１  Ｆｃと比較して、この変異体は、ＩＩＩａ受容体への結合の増強を示しているが、ＩＩａおよびＩＩｂ受容体へもまた野生型Ｆｃよりもやや強く結合する。ＩＩＩａ結合を減じさせながら、非対称の様式でのＡ：Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２ＥおよびＢ：Ｓ２９８Ａのこれらの変異を導入することはまた、ＩＩａ／ＩＩｂ受容体結合を増加させ、プロセスにおける選択性を減じてしまう。このヘテロ二量体変異体に非対称Ｅ２６９Ｋを導入することにより、すなわち、Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２６９ＫおよびＢ：Ｓ２９８Ａを導入することにより、ＩＩａ／ＩＩｂ結合は、野生型レベルに減少する。このことから、ＦｃのＣＨ２ドメインに非対称変異を導入することにより、ＦｃガンマＲ選択性を改善する設計を行うための重要な機会が提供されうるという事実が明らかにされる。
【０２８８】
実施例で用いられた試薬は市販されているか、または市販の機器類、方法もしくは公知の試薬を用いて調製することが可能である。前述の実施例は本発明の様々な態様および本発明の方法の実施を解説する。実施例は、本発明の多くの異なる実施形態を完全に記載するものではない。ゆえに、前述の発明は、理解の明確化を目的として図示および実施例により、いくらか詳細に記載されているが、当業者であれば、添付のクレームの主旨および範囲から離れることなく、多くの変更および改変が、本発明に作製されうることが理解される。
【０２８９】
実施例９：ＳＰＲによるＦｃＲｎ結合測定
ＦｃＲｎへの結合は、２つの異なる方向性で、ＳＰＲにより測定された。
１．固定化ＦｃＲｎへのヘテロ二量体変異のフロー：この実験において、高密度表面（およそ５０００ＲＵ）を、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリングを用いて作製した。ＭＥＳ  ｐＨ６ランニング緩衝液での６００秒の解離と共に、ＷＴおよび各変異体を１００ｎＭ、３重で、５０ｕＬ  分で１２０秒間、投入した。
２．間接的に捕捉されたヘテロ二量体変異体への、ＦｃＲｎのフロー：このＳＰＲ実験において、ヤギ抗ヒトＩｇＧ表面を用いて、間接的に抗体を捕捉し（それぞれ、およそ４００ＲＵ）、次いで、３倍のＦｃＲｎ希釈系列（６０００ｎＭの高濃度）を注入した。ランニング緩衝液は、１０ｍＭ  ＭＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０５  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ６）であった。ヤギポリクローナル表面へのＦｃＲｎの有意な結合はなかった。全ての変異体は、ＷＴと類似したセンサーグラムを示している。以下の表８において、間接固定とＦｃＲｎのフロー（２．）により測定された、Ｋｄを示す。
【表１３】
2014533243.tif 000022
【０２９０】
実施例１０：本明細書に記載されるＦｃヘテロ二量体の二重特異的結合。
二重特異的結合が、鎖Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ，鎖Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗの変異を有するＦｃヘテロ二量体、ならびに、Ｆｃヘテロ二量体の鎖Ａおよび鎖ＢのＮ末端に融合した抗ＨＥＲ２ｓｃＦvならびに抗ＨＥＲ３ｓｃＦvを用いて示された。得られた変異体である、二重特異的ＨＥＲ２／ＨＥＲ３変異体、および２つの一価一重特異的ＨＥＲ２変異体、ＨＥＲ３変異体を、図４０Ａに図示する。二重特異的結合を検証するために、２つの一価変異体（図４０Ａに図示される、抗ＨＥＲ２一価および抗ＨＥＲ２一価）の投与範囲および二重特異的抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体を、ＭＡＬＭＥ−Ｍ３メラノーマ細胞とインキュベートし、次いで、ＦＡＣＳ分析を行い、各分子の明白な結合アフィニティを測定した（図４０Ｂに示す）。分析システムは、「Antitumor activity of a novel bispecific antibody that targets the ErbB2/ErbB3 oncogenic unit and inhibits heregulin-induced activation of ErbB3", McDonagh CF et al., Mol Cancer Ther. 11(3):582-93 (2012)」に記載されるプロトコールに従い、設定した。
【０２９１】
実施例１１：ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一重特異性抗体の発現および精製、ならびに、ＬＣ／ＭＳによる純度の定量化。
ヘテロ二量体変異体ＡＺ１３３（Ａ：Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ）、ＡＺ１３８（Ａ：Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ）、ＡＺ３００２（Ａ：Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ）、ＡＺ３００３（Ａ：Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ）、および他のＡＺ構築物ＡＺ３０００−ＡＺ３０２１を、実施例１および２に記載されるように作製および精製した。ヘテロ二量体形成の頑健性、およびヘテロ二量体の純度に対する、ヘテロ二量体鎖のうちの一つの過剰量の影響を推定するために、選択されたヘテロ二量体を、２つの重鎖ＡおよびＢの３つの異なるＤＮＡ比率（たとえば、Ａ：Ｂの比率が、１：１．５、１：１、１．５：１）を用いて、一時的に発現させた。
【０２９２】
ヘテロ二量体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、実施例１に詳述されるように、ヒト／哺乳類発現に最適化されたコドンを用いた遺伝子合成により構築された。Ｆａｂ配列は、既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂ（Carter P. et al. (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. Proc Nat/ Acad Sci 89, 4285）から作製され、Ｆｃは、ＩｇＧ１アイソタイプ（配列番号１）であった。変異体は、重鎖Ａと重鎖Ｂの３つの異なる比率（１：１．５、１：１、および１．５：１）を用いて、実施例１〜２に記載されるように、一時的共発現により発現された。試料は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィおよび予備的ゲルろ過により精製された（詳細については実施例２を参照のこと）。精製された試料は、３７℃、一晩、ＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化された。ＭＳ分析の前に、試料はＰｏｒｏｓＲ２カラム上に注入され、３分で、２０〜９０％  ＡＣＮ、０．２％  ＦＡの勾配で溶出された。ＬＣカラムのピークは、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計で分析され（Ｃｏｎｅ電圧：５０  Ｖ’  Ｔｕｂｅレンズ：２１５Ｖ；ＦＴ解像度：７，５００）、分子量プロファイルを作製するために、Ｐｒｏｍａｓｓソフトウエアに統合された。
【０２９３】
ヘテロ二量体およびホモ二量体の相対ピーク高を用いて、ヘテロ二量体の純度を推定した（図３９を参照のこと）。
【０２９４】
実施例１２：ヘテロ多量体ＡＺ３００２およびＡＺ３００３の結晶構造。
ＡＺ３００２およびＡＺ３００３のヘテロ二量体Ｆｃ構築物は、ＣＨＯで一時的に発現され、ｐＡおよびＳＥＣにより均質になるまで精製された。精製されたＦｃヘテロ二量体は、マイクロシーディングを用いて、５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１８％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３３５０、および０．１５Ｍアンモニウムヨウ化物から構成される母溶液を超える２：１の比率で、懸滴蒸気拡散法を介して、インキュベーションの約２４時間後、１８℃で結晶化された。結晶は、エチレングリコールの濃度を３０％（ｖ／ｖ）まで増加させることにより凍結防止させ、次いで、液体窒素中で瞬間冷却させた。両結晶からの回析データは、０．５度の振幅（トータルで２００度）を用いて、１００Ｋで採取され、およびＸＤＳで処理された１。ＡＺ３００２の構造は、クエリタンパク質としてＰＤＢＩＤ：２Ｊ６Ｅを用いたＰｈａｓｅｒでの分子置換を介して解析された２。次いで、ＡＺ３００２の構造を用いて、同様の様式でＡＺ３００３を解析した。プリフェクトな双晶（ｐｒｅｆｅｃｔ  ｔｗｉｎ）を適合させるために、結晶学的非対称ユニットに存在するＡｚｙｍｅｔｒｉｃなヘテロ二量体の相互関係（たとえば、分子Ａの占有率は、分子Ｂにより記載されるものと等しく、逆もまた然りである）、すなわち、二つの可能性のあるヘテロ二量体のペアを、それぞれ０．５原子占有率で、Ｒｅｆｍａｃで精密化し、Ｃｏｏｔでモデル化した３，４。回析データ処理および構造精密化統計を、表９に示す。
【表１４】
2014533243.tif 000023
【０２９５】
結晶構造の重ね合わせを図４２に示す。ＡＺ３００２およびＡＺ３００３ヘテロ二量体の結晶構造は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデルと非常によく一致しており（ＲＭＳＤ全原子＝０．７０６Å、ＣＨ３ドメインに対するＲＭＳＤ主鎖＝０．６５９Å）、結晶コアパッキング残基の予想構造を確定させる。
【０２９６】
実施例１３： ＡＺ３００３のグリコシル化分析
ＡＺ３００３ヘテロ二量体を、実施例１１に記載されるように発現、精製した。グリカンを標準的なメーカ―のプロトコールを用いて、ＩｎｓｔａｎｔＡＢ（登録商標（Ｐｒｏｚｙｍｅ））とＧｌｙｋｏＰｒｅｐ（登録商標）Ｒａｐｉｄ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎで分析した。
【０２９７】
結果を図４３に示し、ＡＺ３００３は典型的なグリコシル化パターンを有することを示す。
【０２９８】
実施例１４：強制分解条件下でのＡＺ３００３の安定性評価
ＡＺ３００３ヘテロ二量体の安定性を、強制分解条件下のインキュベーションにより評価した。強制分解条件下のｍＡｂの安定性は、長期間安定性および製剤安定性の良い推定となりうる。
【０２９９】
精製されたヘテロ二量体試料（実施例１１に記載されるように発現および精製）を、凝集の兆候なく、１００ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。試料を適切な緩衝液内へ希釈し、以下の表１０に記載されるような強制分解条件下で評価した。処理された試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析された。
【０３００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ＬＯＮＺＡから購入した、プレキャストの勾配ゲルで、還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下で実施した。タンパク質バンドは、クマシンブリリアントブルーＧ−２５０で染色することにより、可視化された。
【０３０１】
分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣを、ランニング緩衝液として、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１０％イソプロパノールを用いて、０．８ｍｌ／分の流速で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＢＩＯＳＥＰ−ＳＥＣ−Ｓ４０００、またはＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＴＳＫ  ４０００  ＨＰＬＣカラムのいずれかを用いて実施した。このことにより、種々の、推定の高分子および低分子の定量化が可能となった。
【０３０２】
【表１５】
2014533243.tif 000024
結果は図４４に示し、ＡＺ３００３ヘテロ二量体が安定であり、産業標準ｍＡｂと合致する安定性プロファイルを示すことが示されている。
【０３０３】
実施例１５：ＡＺ３００３の下流精製評価。
ＡＺ３００３の製造可能性評価を実施し、図４５に示されるように、産業標準の抗体精製プロセススキームを用いた場合のＡＺ３００３の性状を評価した。このプロセスには、３つのカラムステップのプラットフォームが含まれており、製品捕捉のためのプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、次いで、凝集塊、溶出されたプロテインＡおよびＨＣＰの除去のための陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィ、そして最後に、ウイルス、ＤＮＡおよび陰電荷の混合物を捕捉するためのフロースルーモードでの陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィが含有される。この評価を用いて、研究／開発段階での早期薬物候補（複数含む）にある潜在的な製造上の問題点（たとえば、プロセス安定性、製品安定性および品質）を特定する。
【０３０４】
製造可能性評価の間、クロマトグラフィの挙動、タンパク質の安定性、および製品の品質を、図４６に示されるように、産業標準精製プロセスを用いて評価した。以下の表１１に、評価に用いた主な基準、すなわち、ステップ産生量、Ｈｉｈｅｒ分子量凝集物（ＨＭＷ）含有量、および溶出量をリストアップする。ステップ産生量が高く、精製過程で溶出量が低ければ、反応が良く進み、安定なタンパク質であることを示唆している。最終生産物中にタンパク質凝集物（ＨＭＷ種）が存在すると、活性の減少、患者体内での免疫原性の反応、および／または薬剤の保存可能期間中の微粒状物質の形成がもたらされうるため、ＨＭＷ含有量をモニターし、精製過程でそれを除去することは、必要不可欠である。凝集物が高レベルであると、除去のためのさらなる精製ステップが必要となり、製造時間とコストが増加するため、最少の当初ＨＭＷ含有量（４％未満）でのＭａｂの発現が望ましい。
【表１６】
2014533243.tif 000025
標準的な産業精製プロセスを使用して、ＡＺ３００３の安定性、クロマトグラフィの挙動および製品の品質を検証した。
【０３０５】
１．１  プロテインＡ捕捉
ＣＭ発現ＡＺ３００３を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入したボトルトップのフィルター（ＰＥＳ）を用いて、０．２２μｍでろ過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の５ＣＶで平衡化したＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（１．６×２５ｃｍ）カラムに投入した。ロードした後、カラムをＡ２８０吸光度が安定したベースラインになるまで平衡化緩衝液で徹底的に洗浄した。ＡＺ３００３を０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ３．６で溶出し、すぐに１Ｍトリス塩基を１／１０量、添加することにより、ｐＨ５．２まで滴定した。
【０３０６】
溶出ステップの後、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３．０でカラムを洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、カラムＦＴ中にＭａｂが検出されなかったため、すべてのＭａｂがカラムに結合したことが示されている。高度精製Ｍａｂは、ｐＨ３．６の溶出緩衝液中で検出された。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを用いた第一の捕捉および精製ステップからは９０％を超える純度の製品が得られている。
【０３０７】
１．２  低ｐＨ維持実験
下流プロセスの次のステップは、低ｐＨ維持であり、ウイルスを不活化するために実施される。プロテインＡカラムからの溶出の後、Ｍａｂ（約１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ４．０）を１０％酢酸でｐＨ３．６まで滴定し、攪拌しながら室温で９０分間、インキュベートした。低ｐＨ処理に対するＡＺ３００３の安定性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、およびＡ４１０ｎｍでの濁度測定により評価された。ＡＺ３００３は低ｐＨ維持ステップに良く耐容し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣで変化を示さなかった。さらに、９０分のインキュベーションの後、濁度の増加は認められず、このことから、精製過程の間に問題となりうる不溶性凝集物の形成（すなわち、製造過程のフィルターおよびカラムを詰まらせ、製品のロスとなること）が無いことが示唆される。これらのデータから、ＡＺ３０００３が低ｐＨ維持ステップに対し安定であることが示される。
【０３０８】
１．３  陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）
ＣＥＸを、精製プロセスの第二ステップとして調査した。２つの樹脂を評価した：Ｍｅｒｋ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから得たＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３（Ｍ）、および、ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓから得たＳＰ  ＨＰ。
【０３０９】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３（Ｍ）、ｐＨ５．２：Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅのプール（３５ｍｇ）を、１０％（ｖ／ｖ）の１Ｍのトリス塩基を添加することによりｐＨ５．２まで滴定し、次いで、２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．２）の平衡化緩衝液で２倍希釈した。このプールを、２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．２）の５ＣＶで平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３（Ｍ）カラムに投入した。カラムを平衡化緩衝液でＡ２８０吸光度が安定したベースラインとなるまで洗浄した。Ｍａｂを、直線塩勾配（０〜６００ｎＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２、１０ＣＶ超）で、カラムから溶出した。残りの混入物を、２０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２でカラムから取り除き、次いで、１Ｎ  ＮａＯＨで処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を実施し、ＨＭＷレベルおよび、このカラム上のメインのＭａｂ分画からのこれらの除去をモニターした。ステップ産生率（Ａ２８０ｎｍでの読み取りに基づく）は、７３％であった。
【０３１０】
ＳＰ  ＨＰ、ｐＨ５．２：Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプール（５０ｍｇ）を、１０％（ｖ／ｖ）の１Ｍのトリス塩基を添加することによりｐＨ５．２まで滴定し、次いで、平衡化緩衝液（２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．２）で等量希釈した。このプールを、５ＣＶの２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．２で平衡化したＳＰ  ＨＰカラム（１．６×２．５ｃｍ／５ｍｌ）に投入した（図２１）。カラムを、Ａ２８０吸光度が安定なベースラインとなるまで平衡化緩衝液で洗浄した。Ｍａｂを、直線塩勾配（０〜６００ｎＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２、１０ＣＶ超）で、カラムから溶出した。残りの混入物を、２０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２でカラムから取り除き、次いで、１Ｎ  ＮａＯＨで処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を実施し、凝集レベルおよび、このカラム上のそれらの分離をモニターした。ステップ産生率（Ａ２８０ｎｍでの読み取りに基づく）は、８７％であった。
【０３１１】
１．４  陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）
陰イオン交換（たとえば、４級アミン、Ｑ）は、モノクローナル抗体精製で広く用いられている。ＡＥＸ培地は、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウイルスおよびエンドトキシンを保持させながら、ＦＴ中にＭａｂが現れる、フロースルーモードで操作される。
【０３１２】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３  Ｍ  プール、ｐＨ５．２（２５ｍｇ）を、１Ｍのトリス塩基でｐＨ７．０まで滴定し、５ＣＶの１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ  ＦＦに投入した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。しかしながら、今回のケースでは、安定したベースラインは得られなかった。結果的として、カラムをＰＢＳで洗浄し、残余として結合したＭａｂをいくらか溶出した。次いで、カラムを１０ｍＭのリン酸塩、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、結合混合物をいくらか除去した。このステップは、フロースルー中にすべてのＭａｂ分画を存在させるためにさらに最適化する必要がある。ステップ産生率（Ａ２８０ｎｍの読み取りに基づく）は８２％であり、推定純度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで９８％超であった。
【０３１３】
１．５  下流精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３５）を、各精製ステップからの溶出物に対して実施し、工程全体に渡る混合物の除去をモニターし、最終生産物の品質と純度を評価した。ゲル分析により、非還元条件下および還元条件下でのＭａｂに対する移動パターンは予測通りであることが示された。２つのＣＥＸ樹脂由来のプールのゲル比較により、生産物プロファイルにおいて大きな違いは無いことが示されている。ＣＥＸ、ＣＨＴおよびＨＩＣ（ｐＨ５．０およびｐＨ７．０）由来の最終プールはすべて、純度および混合物バンドに関して、類似している。
【０３１４】
１．７  ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度推定
３つのカラムクロマトグラフィステップ、すなわちプロテインＡ；ＣＥＸ；ＡＥＸフロースルーモード後の精製ＡＺ３００３を、天然条件下でＳＥＣ（サイズ排除）ＨＰＬＣにより評価した（図４６）。
【０３１５】
ＡＺ３００３は、天然ＩｇＧ１に対する予測１５０ｋＤａ領域内で溶出するシングルピークを示している。純度は、９８％超と推定された。
【０３１６】
１．８  ＡＺ３００３精製に対するプロセス産生率
下流精製プロセスに対するプロセス産生率を算出し、図４６にリストアップした。ＡＺ３００３のステップ産生率は、産業標準の３つのカラム精製プロセスを用いて精製されたＩｇＧに典型的なものであった。
【０３１７】
産業標準精製プロセス（プロテインＡアフィニティ樹脂、ＣＥＸ、次いで、ＡＥＸ）を用いたＣＭから、ＡＺ３００３は成功裏に精製された。
【０３１８】
これらの結果から、ＡＺ３００３は全体的な収率において、標準ｍＡｂと同等であることが示唆され（Kelley B. Biotechnol. Prog. 2007, 23, 995-1008を参照のこと）、観察された凝集は最小限であった。ＡＺ３００３はまた、低ｐＨ維持およびＣＨＴ（セラミックヒドロキシアパタイト）およびＨＩＣ（疎水的相互作用クロマトグラフィ）（フェニルＨＰ  ｐＨ５およびｐＨ７）に関し、凝集することなく効率よく回収されると評価された。図４６において、リードヘテロ二量体は、産業標準精製プロセス（プロテインＡアフィニティ樹脂、ＣＥＸ、次いで、ＡＥＸ）を用いたＣＭから、成功裏に精製されたことが示されている。
【０３１９】
本明細書において言及されているすべての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願のそれぞれが具体的および個々に、参照により本明細書に援用されると示されるのと同程度に、本明細書内へ参照によりここに援用される。
【図１】
2014533243.tif 000026
【図２】
2014533243.tif 000027
【図３】
2014533243.tif 000028
【図４】
2014533243.tif 000029
【図５】
2014533243.tif 000030
【図６】
2014533243.tif 000031
【図７】
2014533243.tif 000032
【図８】
2014533243.tif 000033
【図９】
2014533243.tif 000034
【図１０】
2014533243.tif 000035
【図１１】
2014533243.tif 000036
【図１２】
2014533243.tif 000037
【図１３】
2014533243.tif 000038
【図１４】
2014533243.tif 000039
【図１５】
2014533243.tif 000040
【図１６】
2014533243.tif 000041
【図１７】
2014533243.tif 000042
【図１８】
2014533243.tif 000043
【図１９】
2014533243.tif 000044
【図２０】
2014533243.tif 000045
【図２１】
2014533243.tif 000046
【図２２】
2014533243.tif 000047
【図２３】
2014533243.tif 000048
【図２４】
2014533243.tif 000049
【図２５−１】
2014533243.tif 000050
【図２５−２】
2014533243.tif 000051
【図２６】
2014533243.tif 000052
【図２７】
2014533243.tif 000053
【図２８】
2014533243.tif 000054
【図２９】
2014533243.tif 000055
【図３０】
2014533243.tif 000056
【図３１】
2014533243.tif 000057
【図３２】
2014533243.tif 000058
【図３３】
2014533243.tif 000059
【図３４】
2014533243.tif 000060
【図３５】
2014533243.tif 000061
【図３６−１】
2014533243.tif 000062
【図３６−２】
2014533243.tif 000063
【図３６−３】
2014533243.tif 000064
【図３７−１】
2014533243.tif 000065
【図３７−２】
2014533243.tif 000066
【図３７−３】
2014533243.tif 000067
【図３７−４】
2014533243.tif 000068
【図３７−５】
2014533243.tif 000069
【図３７−６】
2014533243.tif 000070
【図３７−７】
2014533243.tif 000071
【図３７−８】
2014533243.tif 000072
【図３７−９】
2014533243.tif 000073
【図３７−１０】
2014533243.tif 000074
【図３７−１１】
2014533243.tif 000075
【図３７−１２】
2014533243.tif 000076
【図３７−１３】
2014533243.tif 000077
【図３７−１４】
2014533243.tif 000078
【図３７−１５】
2014533243.tif 000079
【図３７−１６】
2014533243.tif 000080
【図３７−１７】
2014533243.tif 000081
【図３７−１８】
2014533243.tif 000082
【図３７−１９】
2014533243.tif 000083
【図３７−２０】
2014533243.tif 000084
【図３７−２１】
2014533243.tif 000085
【図３７−２２】
2014533243.tif 000086
【図３７−２３】
2014533243.tif 000087
【図３７−２４】
2014533243.tif 000088
【図３７−２５】
2014533243.tif 000089
【図３７−２６】
2014533243.tif 000090
【図３７−２７】
2014533243.tif 000091
【図３７−２８】
2014533243.tif 000092
【図３７−２９】
2014533243.tif 000093
【図３７−３０】
2014533243.tif 000094
【図３７−３１】
2014533243.tif 000095
【図３７−３２】
2014533243.tif 000096
【図３７−３３】
2014533243.tif 000097
【図３７−３４】
2014533243.tif 000098
【図３７−３５】
2014533243.tif 000099
【図３７−３６】
2014533243.tif 000100
【図３７−３７】
2014533243.tif 000101
【図３７−３８】
2014533243.tif 000102
【図３７−３９】
2014533243.tif 000103
【図３７−４０】
2014533243.tif 000104
【図３８−１】
2014533243.tif 000105
【図３８−２】
2014533243.tif 000106
【図３８−３】
2014533243.tif 000107
【図３８−４】
2014533243.tif 000108
【図３８−５】
2014533243.tif 000109
【図３８−６】
2014533243.tif 000110
【図３８−７】
2014533243.tif 000111
【図３８−８】
2014533243.tif 000112
【図３８−９】
2014533243.tif 000113
【図３９−１】
2014533243.tif 000114
【図３９−２】
2014533243.tif 000115
【図４０−１】
2014533243.tif 000116
【図４０−２】
2014533243.tif 000117
【図４１】
2014533243.tif 000118
【図４２】
2014533243.tif 000119
【図４３】
2014533243.tif 000120
【図４４】
2014533243.tif 000121
【図４５】
2014533243.tif 000122
【図４６】
2014533243.tif 000123
【国際調査報告】
2014533243.tif 000124
2014533243.tif 000125
2014533243.tif 000126
2014533243.tif 000127
2014533243.tif 000128
2014533243.tif 000129