(57)【要約】  本発明は、破傷風から保護するためのワクチン、また特にアルミニウム塩に吸着させた破傷風トキソイドを含むワクチンの製造方法の分野に関する。破傷風トキソイドを、最適な結果のために規定された特性を有するアルミニウム塩アジュバント上に吸着させる方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2のタンパク質吸着能を有する、前記方法。
【請求項２】
破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.7、2.6〜3.6、2.7〜3.5、または2.8〜3.4のタンパク質吸着能を有する、前記方法。
【請求項３】
アルミニウム塩が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.9〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アルミニウム塩が、X線回折による測定で、3.3〜5.7nmの結晶サイズを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.6のタンパク質吸着能および2.9〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、前記方法。
【請求項７】
ジフテリアトキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを含む免疫原性組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、該アルミニウム塩粒子(これにジフテリアトキソイドを吸着させる)が、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2のタンパク質吸着能を有する、前記方法。
【請求項８】
アルミニウム塩粒子(これにジフテリアトキソイドが吸着される)が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ジフテリアトキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを含む免疫原性組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、該アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、前記方法。
【請求項１０】
アルミニウム塩粒子が、約17〜23mV、18〜22mVまたは19〜21mVの、pH7におけるゼータ電位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アルミニウム塩粒子が、約14〜22mV、15〜21mVまたは16〜20mVの、pH7におけるゼータ電位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドを、アルミニウム塩粒子に別々にまたは一緒に吸着させる、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
破傷風トキソイドが、破傷風毒素を化学的に無毒化することによって製造されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
破傷風トキソイドが、破傷風毒素を遺伝子的に無毒化することによって製造されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ジフテリアトキソイドが、ジフテリア毒素を化学的に無毒化することによって製造されている、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ジフテリアトキソイドが、ジフテリア毒素(特にCRM197)を遺伝子的に無毒化することによって製造されている、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、不活性化ポリオワクチンと共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、パータクチンと共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、線維状赤血球凝集素と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、百日咳トキソイドと共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
(前記さらなる工程の)アルミニウム塩粒子が、約17〜23mV、18〜22mVまたは19〜21mVの、pH7におけるゼータ電位を有する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
(前記さらなる工程の)アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2のタンパク質吸着能を有する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
(前記さらなる工程の)アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
アルミニウム塩がオートクレーブされていない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
アルミニウム塩が1回だけオートクレーブされている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アルミニウム塩が、滅菌を達成するために必要な最小限の時間、例えばオートクレーブサイクルの開始から終了まで90分以下でオートクレーブされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アルミニウム塩が放射線照射によって滅菌される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、b型インフルエンザ菌由来の莢膜糖と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、B型肝炎表面抗原と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
アルミニウム粒子がリン酸アルミニウムである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
アルミニウム塩粒子が、アルミニウム塩1mg当たりBSA 2.5〜3.7、2.5〜3.5、2.6〜3.6、2.6〜3.4、2.7〜3.5、2.7〜3.3、2.8〜3.4または2.9〜3.2mgのタンパク質吸着能を有する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンのうち1種以上を含むワクチンの作製方法であって、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンのうち1種以上をアルミニウムアジュバントに吸着させ、ここで該アジュバントは、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まない方法によって滅菌される、前記方法。
【請求項３４】
破傷風トキソイドおよび/またはジフテリアトキソイドが存在し、それらを前記アルミニウムアジュバントに吸着させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンが全て存在し、それらを前記アルミニウムアジュバントに吸着させる、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法によって作製された免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破傷風から保護するためのワクチンの分野、特にアルミニウム塩に吸着させた破傷風トキソイドを含むワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
破傷風菌(Clostridium tetani)を、典型的には百日咳菌(Bordetella pertussis)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)と組み合わせて予防することができるワクチンが知られている。かかるワクチンは、アルミニウム塩に吸着させた、破傷風菌、百日咳菌および/またはジフテリア菌に由来する抗原を1種以上含み得る。本発明者らは、驚くべきことに、アルミニウム塩の、タンパク質吸着および/またはX線回折で測定される結晶サイズが、上記アルミニウム塩に吸着させた抗原および特に破傷風菌に由来するトキソイド(例えば破傷風トキソイド)の免疫原性において重要であることを見出した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
従って、本発明は、破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、上記アルミニウム塩粒子がアルミニウム塩1mg当たりタンパク質2.5〜3.5mgのタンパク質吸着能を有する、上記方法を提供する。
【０００４】
本発明のさらなる態様において、破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、上記アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で2.8〜5.7nmの結晶サイズを有する、上記方法が提供される。
【０００５】
さらなる態様において、本発明は、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まない、アルミニウム塩アジュバントを滅菌する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】pH7.0におけるゼータ電位(mV) 対 タンパク質吸着(mg BSA/mg Al3+)
【図２】タンパク質吸着および表面電荷(ZP)に対する放射線照射の影響
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明者らは、破傷風トキソイドが吸着しているアルミニウム塩の、タンパク質吸着、ゼータ電位および/または結晶サイズが、破傷風トキソイドワクチンの免疫学的特性に極めて重要であることを見出した。従って本発明は、破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、上記アルミニウム塩粒子がアルミニウム塩1mg当たりタンパク質2.5〜3.5mgのタンパク質吸着能を有する、上記方法を提供する。
【０００８】
破傷風トキソイド(TT)およびその調製方法は、当技術分野において周知である。一実施形態において、TTは、破傷風菌の培養液から毒素を精製し、その後化学的に無毒化することによって製造されるが、別法では、この毒素の組み換えアナログ、または遺伝子的に無毒化されたアナログの精製によって作製される(例えばEP 209281に記載のとおり)。好ましい無毒化法は以下のとおりである。発酵後、その培養液を、濾過助剤としての珪藻土の存在下、0.1〜0.3μmフィルター上で濾過する。その回収物を0.22μmフィルターを通して清澄化し、濃縮し、30kDフラットシート膜上で10倍量のリン酸バッファー(20mM − pH7.3)に対して透析濾過する。次いで、透析濾過した毒素を、37℃において4週間、以下の条件下で無毒化する：ホルムアルデヒド20mM − リシン3mM − リン酸カリウム100mM − 初期pH7.3 − 500 Lf/ml。得られたトキソイドを硫安分画によって精製し、濃縮し、注射用水(WFI)に対して透析濾過し(30kD)、硫酸アンモニウムを除去する。最終濃度0.9％までNaClを添加し、pHを7.3に調整し、精製した破傷風トキソイドを滅菌濾過する。
【０００９】
任意の好適な破傷風トキソイドを使用することができる。「破傷風トキソイド」は、その完全長タンパク質の免疫原性フラグメントを包含し得る(例えばフラグメントC − EP 478602を参照)。
【００１０】
本発明の破傷風トキソイドは、アルミニウム塩に吸着させる。本発明の特定の実施形態において、アルミニウム塩は水酸化アルミニウムである。別の実施形態において、本発明の破傷風トキソイドは、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着させることができる。さらなる実施形態において、破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着させることができる。
【００１１】
破傷風トキソイドを含むタンパク質をアルミニウム塩に吸着させる方法は、当業者に周知である(例えばワクチン調製はVaccine Design “The subunit and adjuvant approach”(Powell M.F. & Newman M.J.編)(1995) Plenum Press New Yorkに一般的に記載されている)。
【００１２】
本発明の特定の実施形態において、アルミニウム塩は、アルミニウム塩1mg当たりタンパク質2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2mgのタンパク質吸着能、例えば2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4または3.5mgのタンパク質吸着能を有する。アルミニウム塩は、アルミニウム塩1mg当たりタンパク質(BSA)2.5〜3.7、2.6〜3.6、2.7〜3.5または2.8〜3.4mgのタンパク質吸着能、例えば3.6mgのタンパク質吸着能を有し得る。アルミニウム塩のタンパク質吸着能は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができる。本発明の特定の実施形態において、アルミニウム塩のタンパク質吸着能は、実施例1に記載の方法(BSAを利用する)またはその変法を用いて測定される。本発明の特定の実施形態において、アルミニウム塩のタンパク質吸着能は、2.9〜3.2mg BSA/mgアルミニウム塩である。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のアルミニウム塩は、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.9〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する。X線回折は、当業者に周知である。本発明の特定の実施形態において、結晶サイズは、実施例1に記載の方法を用いて測定される。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態において、アルミニウム塩は、約17〜23mV、18〜22mVまたは19〜21mV、例えば17、18、19、20、21、22、または23mVの、pH7におけるゼータ電位を有する。アルミニウム塩は、14〜22mV、15〜21mVまたは16〜20mV、例えば14、15または16mVの、pH7におけるゼータ電位を有してもよい。ゼータ電位は、当業者に公知の任意の手段、例えばデジタル光散乱(Digital Light Scattering)(DLS)によって測定することができる。本発明の特定の実施形態において、ゼータ電位は、実施例1に記載の方法を用いて測定される。
【００１５】
上記の範囲内のタンパク質吸着能を少なくとも有し、さらに場合により上記の範囲内の結晶サイズおよび/またはゼータ電位を有するアルミニウム塩は、破傷風トキソイドの効力ならびに共製剤化された抗原の免疫原性に関して、破傷風トキソイドを含む組み合わせワクチンの製剤化に最適であることが見出された。破傷風トキソイドなどの抗原の効力の増大は、より低量の抗原を使用して同レベルの免疫応答を達成する可能性を広げ、抗原の節約を容易にする。
【００１６】
本発明のアルミニウム塩は、当業者に公知の任意の方法によって作製することができる(例えば、ワクチン調製はVaccine Design “The subunit and adjuvant approach”(Powell M.F. & Newman M.J.編)（1995）Plenum Press New York、US4882140AおよびUA4826606Aに一般的に記載されており、これらを参照のこと)。当業者は、タンパク質吸着、結晶サイズおよび/または表面電荷(pH7におけるゼータ電位)を改変する方法を知っており、従って定めたパラメータ内でこれらの特性を示すアルミニウム塩を作製する方法についても知っている。
【００１７】
代替的には、本発明の方法において使用するためのアルミニウム塩は商業的に供給されており、例えばRehydragelTM HS(水中3％水酸化アルミニウム(General Chemical社))またはAlhydrogelTM 85(Brenntag BioSector社(デンマーク))が挙げられる。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載されるアルミニウム塩(例えばRehydragelTM HSまたはAlhydrogelTM 85)は、購入後オートクレーブされていない(AlhydrogelTM 85は、製造者によって(すなわち購入前に)オートクレーブされており、他方、RehydragelTM HSは、製造者により、代わりに放射線照射によって滅菌されている)。本発明の滅菌アルミニウム塩を製造するため、アルミニウム塩は、他の方法、特に放射線照射によって滅菌される。アルミニウム塩は、紫外線(UV)、放射性同位体供給源(例えばコバルト60)からのガンマ(λ)線、ベータ(β)線、電子ビームまたはX線照射を用いて放射線照射され、滅菌アルミニウム塩となる。特定の実施形態において、本発明のアルミニウム塩は、ガンマ線によって滅菌される。別の実施形態において、アルミニウム塩アジュバントを1回だけオートクレーブすることを含む、上記アジュバントを滅菌する方法が提供される。この実施形態において、アジュバントは、滅菌を達成するために必要な最小限の時間、例えばオートクレーブサイクルの開始から終了まで約90分以下でオートクレーブすることができる。場合により、1回オートクレーブしたアジュバントを放射線照射によって滅菌してもよい。
【００１９】
本発明者らは、本発明のアルミニウム塩をオートクレーブすることにより、上記アルミニウム塩に吸着させたタンパク質(特に破傷風トキソイド)の免疫原性を低減させることができることを示した。従って、本発明の1つの実施形態において、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まない、アルミニウム塩アジュバントを滅菌する方法が提供される。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、ジフテリアトキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドとジフテリアトキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、アルミニウム塩粒子が本明細書に記載されるとおりである、上記方法を提供する。
【００２１】
ジフテリアトキソイド(DT)およびそれらの調製方法は十分に文書化されている。任意の好適なジフテリアトキソイドを使用することができる。例えば、DTは、ジフテリア菌の培養物から得られた毒素を精製し、その後化学的に無毒化することによって製造し得るが、別法では、この毒素の組み換えアナログ、または遺伝子的に無毒化されたアナログ(例えばCRM197、またはUS 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827、およびUS 5,917,017に記載される他の変異体)の精製によって作製される。好ましい無毒化法は以下のとおりである。発酵後、ジフテリア毒素をTFF 0.45μmによって回収し、0.22μmフィルターを通して清澄化し、濃縮し、10kDフラットシート膜上で10倍量のリン酸バッファー(20mM − pH7.2)に対して透析濾過する。次いで透析濾過した毒素を、37℃において6週間、以下の条件下で無毒化する：ホルムアルデヒド50mM − リシン25mM − リン酸カリウム50mM − 初期pH7.2 − 300 Lf/ml。得られたトキソイドを硫安分画によって精製し、濃縮し、WFIに対して透析濾過し(30kD)、硫酸アンモニウムを除去する。最終濃度0.9％までNaClを添加し、pHを7.3に調整し、精製したジフテリアトキソイドを滅菌濾過する。
【００２２】
特定の実施形態において、破傷風トキソイドとジフテリアトキソイドを別々にまたは一緒にアルミニウム塩に吸着させる、本発明の方法が提供される。さらなる実施形態において、本発明の破傷風トキソイドを本発明のアルミニウム塩に吸着させ、ジフテリアトキソイドを、本発明のアルミニウム塩であってもよく、または任意の他のアルミニウム塩であってもよい異なるアルミニウム塩に吸着させる、本発明の方法が提供される。
【００２３】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物を、不活性化ポリオワクチンと共に製剤化する工程をさらに含む、本発明の方法が提供される。不活性化ポリオワクチン(IPV)は、IPV1型もしくはIPV2型もしくはIPV3型、またはIPV1型および2型、またはIPV1型および3型、またはIPV2型および3型、またはIPV1型、2型および3型を包み得る。
【００２４】
不活性化ポリオウイルス(IPV)の調製法は、当技術分野において周知である。一実施形態において、IPVは、ワクチン分野において一般的であるように1型、2型および3型を含むべきであり、ホルムアルデヒドで不活性化されたSalkポリオワクチンであってよい(例えば、Sutterら, 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59:113; Salkら, 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5):563; Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255を参照)。別法として、IPVは、Sabin株を使用して作製することができる(Sabin-IPV; Kerstenら(1999), Vaccine 17:2059)。
【００２５】
一実施形態においては、IPVは吸着させない(例えば他の成分と混合する前に)。別の実施形態において、本発明のIPV成分(1種または複数種)を、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着させてよい(例えば他の成分と混合する前または後に)。別の実施形態において、本発明のIPV成分(1種または複数種)を、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着させてよい。さらなる実施形態において、IPV成分(1種または複数種)を、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着させてよい。吸着させる場合、1種以上のIPV成分を、別々にまたは混合物として一緒に吸着させてよい。さらなる実施形態においては、IPVを、本明細書に記載されるアルミニウム塩/粒子に吸着させる。
【００２６】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物をパータクチンと共に製剤化する工程をさらに含む、本発明の方法が提供される。パータクチン(百日咳菌の69kDa抗原)は、熱安定性の外膜タンパク質であり、当技術分野で公知の方法によって調製することができる(EP0162639参照)。パータクチンを、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着させる。本発明の一実施形態において、パータクチンを水酸化アルミニウムに吸着させる。本発明の特定の実施形態において、パータクチンを本明細書に記載のアルミニウム塩に吸着させる。
【００２７】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物を線維状赤血球凝集素(FHA)と共に製剤化する工程をさらに含む、本発明の方法が提供される。FHAは、当技術分野において周知の方法で調製することができる(WO/1990/013313(US7479283)において開示され、また参照されている方法を参照)。FHAを、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着させる。本発明の一実施形態において、FHAを水酸化アルミニウムに吸着させる。本発明の特定の実施形態において、FHAを本明細書に記載のアルミニウム塩に吸着させる。
【００２８】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物を百日咳トキソイドと共に製剤化する工程をさらに含む、本発明の方法が提供される。百日咳トキソイドの製造法は、当業者に周知である。百日咳毒素は、ホルムアルデヒド処理の周知の方法によって、または変異(PT誘導体)を用いて無毒化することができる。このタンパク質のS1サブユニット内の残基の置換は、百日咳毒素の免疫学的特性および防御特性は保持しているが、毒性が低下しているかまたは無毒であるタンパク質をもたらすことが見出された(EP 322533)。EP322533の特許請求の範囲に記載されている無毒化変異は、本発明のPT無毒化変異体の例である。百日咳トキソイドを、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着させる。本発明の一実施形態において、百日咳トキソイドを水酸化アルミニウムに吸着させる。本発明の特定の実施形態において、百日咳トキソイドを本明細書に記載のアルミニウム塩に吸着させる。
【００２９】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、b型インフルエンザ菌(Hib)由来の莢膜糖と共に製剤化する工程をさらに含む、本発明の方法が提供される。
【００３０】
b型インフルエンザ菌に由来するポリリボシルリビトールリン酸莢膜糖(PRP)を、担体タンパク質にコンジュゲートさせてもよい。この糖は、リボース、リビトールおよびリン酸のポリマーである。Hib抗原は、場合によりWO97/00697に記載されているようにリン酸アルミニウムに吸着されていてもよいし、またはWO02/00249に記載されているように非吸着でもよく、または特定の吸着過程を経ていなくてもよい。
【００３１】
本明細書において、抗原が「アルミニウムアジュバント塩に非吸着」(「非吸着」または「吸着されていない」)であることは、例えば、抗原の、新たなアルミニウムアジュバント塩への高速または専用の吸着工程が、本発明の組成物の製剤化過程に含まれていないことを意味する。
【００３２】
Hibは、少なくとも1つのTヘルパーエピトープを提供することが可能であり、かつ破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM-197(ジフテリア毒素変異体)または無莢膜型（non-typeable）インフルエンザ菌由来のタンパク質Dであってよい任意の担体に、コンジュゲートさせることができる(EP0594610)。
【００３３】
さらなる実施形態において、免疫原性組成物をB型肝炎表面抗原と共に製剤化する工程をさらに含む、本発明の方法が提供される。
【００３４】
B型肝炎表面抗原(HBsAg)の調製は、十分に文書化されている。例えば、Hartfordら, 1983, Develop. Biol. Standard 54:125; Greggら, 1987, Biotechnology 5:479; EP0226846; EP0299108を参照のこと。B型肝炎表面抗原は、以下のように調製することができる。1つの方法は、HBV感染の際に肝臓内で大量のHBsAgが合成されて血流中に放出されることから、慢性B型肝炎保持者の血漿から粒子状の抗原を精製することを含む。別の方法は、組み換えDNA法によって上記のタンパク質を発現させることを含む。HBsAgは、サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母、ピキア(pichia)、昆虫の細胞(例えばHi5)または哺乳動物細胞中で発現させることによって調製することができる。HBsAgはプラスミド中に挿入し、そのプラスミドからの発現を、「GAPDH」プロモーター(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子由来)などのプロモーターで制御することができる。その酵母は、合成培地中で培養すればよい。その後、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および限外濾過などの工程を含む方法によってHBsAgを精製することができる。精製後、HBsAgを透析(例えばシステインを用いる)にかけてよい。HBsAgは、粒子形態で使用することができる。
【００３５】
本明細書において、「B型肝炎表面抗原」または「HBsAg」という表現は、HBV表面抗原の抗原性を示す任意のHBsAg抗原またはそれらのフラグメントを包含する。本明細書に記載されるHBsAgは、所望の場合、HBsAg S抗原の226アミノ酸配列(Tiollaisら, 1985, Nature 317:489およびその参考文献を参照)に加えて、上記の参考文献およびEP0278940中に記載されるプレS配列の全部または一部を含みうることは理解されよう。特に、HBsAgは、ad血清型のB型肝炎ウイルス上のオープンリーディングフレームに対してHBsAgのL-タンパク質の残基133-145およびそれに続く残基175-400を含むアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含み得る(このポリペプチドはL*と呼ばれる;EP0414374参照)。本発明の範囲内にあるHBsAgは、EP0198474(エンドトロニクス(Endotronics)社)に記載されるプレS1-プレS2−Sポリペプチドまたはそれらのアナログ、例えばEP0304578(マコーミック・アンド・ジョーンズ(McCormick and Jones)社)に記載されるものなども含み得る。本明細書において使用されるHBsAgは、変異体、例えばWO 91/14703またはEP0511855A1に記載される「エスケープ変異体」、特に145位のアミノ酸置換がグリシンからアルギニンへの置換であるHBsAgも指し得る。
【００３６】
HBsAgは、粒子形態であってよい。粒子は、例えばSタンパク質を単独で含んでいてもよく、または複合粒子、例えばL*,S)(ここでL*は上記に定義されるとおりであり、SはHBsAgのSタンパク質を表す)であってもよい。上記の粒子は、それが酵母中で発現される形態であるのが好都合である。
【００３７】
一実施形態において、HBsAgは、EngerixBTM(GlaxoSmithKline Biologicals S.A.)において使用される抗原であり、それはWO93/24148にさらに詳細に記載されている。
【００３８】
B型肝炎表面抗原は、場合によりアルミニウム塩(特にリン酸アルミニウム)に吸着させてよく、この吸着は、他の成分(WO93/24148に記載)との混合の前に行ってよい。B型肝炎成分は、実質的にチオメルサール非含有でなければならない(チオメルサールを含まないHBsAgの調製法は、EP1307473において既に公開されている)。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態において、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まない、アルミニウム塩アジュバントの滅菌法が提供される。放射線照射による滅菌は、当業者に公知の任意の方法によって行うことが可能であり、特に本明細書に記載されている放射線照射法のいずれかによって行うことができる。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態において、アルミニウム塩が水酸化アルミニウムであり、単位結晶のサイズがX線回折による測定で2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmであり、放射線照射が、紫外線(UV)、放射性同位体供給源(例えばコバルト60)からのガンマ(λ)線、ベータ(β)線、電子ビームまたはX線照射の群から選択されるような方法が提供される。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態において、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンのうち1種以上を含むワクチンの作製方法であって、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンのうち1種以上を、本明細書に記載される、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まないアルミニウム塩アジュバントの滅菌法のいずれかによって作製されたアルミニウムアジュバントに吸着させる、上記方法が提供される。
【００４２】
本発明の特定の実施形態において、破傷風トキソイドおよび/またはジフテリアトキソイドが存在し、これらを、本明細書に記載される、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まないアルミニウム塩アジュバントの滅菌法のいずれかによって作製されたアルミニウムアジュバントに吸着させる、本明細書に記載の方法が提供される。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンが全て存在し、これらを、本明細書に記載される、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まないアルミニウム塩アジュバントの滅菌法のいずれかによって作製されたアルミニウムアジュバントに吸着させる、本明細書に記載の方法が提供される。
【００４４】
本明細書に記載の用語「含む(comprising)」、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」は、それぞれ、いかなる場合も用語「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」および「からなる(consists of)」で代替可能であることが本発明者らにより意図される。
【００４５】
用語「免疫原性組成物」は、場合により、用語「ワクチン」と代替可能であり、逆の場合も同じである。
【００４６】
以下の実施例は、本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではない。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例に関する注釈：上述のとおり、AlhydrogelTM 85(およびAlhydrogelTM)は、購入前にオートクレーブされているが、他方、ReHydragelTM HSおよび他の「ReHydragelTM」はアルミニウム塩がオートクレーブされていないという特長がある。従って、「AlhydrogelTM」製品が、オートクレーブされている、または再オートクレーブされていることが示されている場合、これは、購入後にオートクレーブされた(すなわち2回目として)ことを意味する。「ReHydragelTM」製品がオートクレーブされていると記載されている場合、これは、購入後に行われた最初のオートクレーブであることを意味する。
【００４８】
実施例1：アルミニウム塩の特性評価
様々な水酸化アルミニウムについて、タンパク質吸着能、表面電荷(ゼータ電位；ZP)および結晶サイズを測定した。
【００４９】
1.1 水酸化アルミニウムのBSA吸着能
ウシ血清アルブミン(BSA)の原液(MilliQ水中6mg/ml含有)と、MilliQ水中の水酸化アルミニウム1mg Al3+/mlを調製した。
【００５０】
アルミニウム含量を、亜硝酸フレームを用いた原子分光分析法で測定した。塩酸(HCl)中で調製したアルミニウムの様々な標準溶液を使用して、標準曲線を確立した。HClをブランクとして使用した。既知量のアルミニウムのサンプルを、陽性対照として使用した。試験サンプルと陽性対照をHClに希釈し、標準曲線の範囲内でアルミニウムの最終濃度を得た。加熱による無機化の後、サンプルを室温まで冷まし、精製水で規定量とした。その後、亜酸化窒素-アセチレンフレームを用いてアルミニウム濃度を測定した。試験溶液中のアルミニウム含量は、標準曲線から決定した。
【００５１】
サンプルは、以下のように、異なる比のBSA/アルミニウムを有するように調製した。
【表１】
2014510129.tif 000002
【００５２】
BSA/Al3+の比率は、アルミニウム塩の推定吸着能に応じて以下のように適合させた。
【表２】
2014510129.tif 000003
【００５３】
pHは、NaOH 0.05NまたはHCl 0.1Nで6.1 +/-0.1に調整した。室温において、BSAを水酸化アルミニウムに一晩(16+/-4時間)吸着させた。その後、サンプルを、清澄な上清が観察されるまで4000rpmで20分間遠心分離した。上清中のBSA濃度は、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイ(Pierce社)によって計測され、水酸化アルミニウムに吸着されたBSAの量は、初期濃度と上清中の濃度との差を計算することによって計算した。吸着されたBSAを、上清中のBSAの関数としてプロットし、プラトーを示す曲線を提供した。プラトーの高さを吸着能として計算した。
【００５４】
1.2 アルミニウム塩の表面電荷(ZP)測定
DLS Malvern Zetasizer Nano S(マルバーン社のゼータサイザー ナノS)を用いてゼータ電位(ZP)を測定した。全てのサンプルおよび希釈液を室温とした。水酸化アルミニウムをMilliQ水に希釈し、濃度0.05〜0.2mg Al3+/mlとした。装置を較正し(-68mV標準)、以下の測定パラメータを用いてZPを測定した。 
測定種：  ゼータ電位
セル：        DTS1060
サンプル：    Smoluchowskyモデル、Al(OH)3
分散剤：      水
T°：          21℃ (室温)
平衡時間：    自動
測定数：      3または5
測定間の遅延： 30〜60秒
電圧：        自動
結果計算：    単一モード
【００５５】
1.3 X線回折による結晶サイズの測定
サンプルは、あらゆるNaClを(透析により)除去し、(デシケーションまたは凍結乾燥のいずれかにより)乾燥させることによって調製した。その後、以下の標準X線分析パラメーターを用いて結晶サイズを測定した：
角度5〜90°, ステップサイズ = 0.02°, ステップスキャン = 2,4 s, 連続モード
170分  データ取得
6mm 直径支持
チューブパワー、40V 40mA
その後、結晶サイズを以下のように計算した：
シェルラー(Sherrer)の法則は、回折ピークの半分の高さの幅を以下の平均結晶サイズと関連付ける。  
D = (k * λ) / (β * cos(θ))
式中、
D : 平均結晶サイズ
k : 形態(形状)因子、通常 = 1
λ: 波長0,154056 nm (Kalpha Cu)
β : 補正ピーク幅ラジアン
θ : ブラッグ角度(ここでは19,168°)
【００５６】
1.4 結果
様々な水酸化アルミニウムの吸着能力、表面電荷および結晶サイズを以下の2つの表に示す。示される値は、少なくとも1つの(しばしば複数の)バッチの各水酸化アルミニウムを含む複数の測定値から得られた平均値である。2つ目の表は1つ目の表と類似しているが、さらなる測定を行った後に後で作成された。
【表３】
2014510129.tif 000004
【００５７】
図1は、上記の表の値を用いてタンパク質吸着能に対してプロットされたゼータ電位を示す。
【表４】
2014510129.tif 000005
【００５８】
1.5 オートクレーブの影響
RehydragelTM HSおよびAlhydrogelTM 85の様々なロットについて、アルミニウム塩をオートクレーブすることの影響を測定した。以下の表に示されるとおり、オートクレーブはアルミニウム塩の吸着能を低下させた。
【表５】
2014510129.tif 000006
【００５９】
以下の表に示されるとおり、ゼータ電位として測定された表面電荷も、オートクレーブによって影響を受けた。
【表６】
2014510129.tif 000007
【００６０】
1.6 放射線照射の影響
オートクレーブがアルミニウム塩の表面電荷およびタンパク質吸着に影響を与えたため、放射線照射による滅菌の影響を調べた。
【００６１】
図２は、放射線照射が吸着能にも表面電荷にも影響を与えないことを示す。
【００６２】
実施例2：TTの効力
ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳 & 不活性化ポリオウイルス(DTaP IPV)組み合わせワクチン中の様々なアルミニウム塩のTT効力(破傷風トキソイドの効力)
DTとTTとの混合物を、様々なアルミニウム塩に吸着させ、TT効力を試験した。TT効力は、欧州薬局方(European Pharmacopoeia)(方法番号2.07.08)により要求される試験に従って試験した。結果を以下の表に示す(最終行のRehydragelTM HS DT濃縮物は、DTaP IPVへの製剤化を待つ間4℃で保存されたが、他の全てのDT濃縮物は、最終製剤化の前に37℃で7日間成熟させた)。この表では、実施例2の他の表と同様に、「DT」は「ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイド」を意味し、「効力T」は「破傷風トキソイドの効力」を意味し、「RP」は「相対効力」を意味し、「LCL」および「HCL」はそれぞれ、「下側信頼限界」および「上側信頼限界」を意味する。
【表７】
2014510129.tif 000008
【００６３】
第2の実験において、2種類の異なるTトキソイドを使用した(TT1に関する、表の最上行のオートクレーブされたAlhydrogelTM DT濃縮物は、DTaP IPVへの製剤化を待つ間4℃で保存したが、他の全てのDT濃縮物は、最終製剤化の前に37℃で7日間成熟させた)。
【表８】
2014510129.tif 000009
【００６４】
第3の実験において、2セットのDTおよびTT(これらの抗原は、異なる無毒化法を用いて製造された)を使用した(DT濃縮物は、最終製剤化の前に37℃で7日間保存した)。
【表９】
2014510129.tif 000010
【００６５】
DTaP HBV(B型肝炎ウイルス) IPV組み合わせワクチン中の様々なアルミニウム塩のTT効力
研究1
DTおよびTTを様々なアルミニウム塩に吸着させ、TT効力を試験した。TT効力は、欧州薬局方(European Pharmacopoeia)(方法番号2.07.08)により要求される試験に従って試験した。結果は以下の表に示す(DT濃縮物は全て、3〜4日間室温で保存され、その後DTaP HBV IPVへの製剤化を待つ間2〜8℃で保存された。オートクレーブされたAlhydrogelTM 85と、RehydragelTM HSとのそれぞれの上方効力値および下方効力値は各々、2種類の異なるDトキソイドを用いたDT濃縮物を表す)。
【表１０】
2014510129.tif 000011
【００６６】
研究2
DTおよびTTを異なるアルミニウム塩に吸着させ、TT効力を試験した。TT効力は、欧州薬局方(European Pharmacopoeia)(方法番号2.07.08)により要求される試験に従って試験した。結果を以下の表に示す(DT濃縮物は全て、DTaP HBV IPVへの最終製剤化の前に37℃で7日間成熟させた。4種類の異なるTTを使用した(異なる方法でトキソイド化された：破傷風TTS03-FA02、破傷風TTS03-FA4、破傷風TTS03-FA3および破傷風TTS02-FA21)。破傷風TTS03-FA02トキソイドに関する最終行(RehydragelTM HS)では、他のサンプルと比較して低減量のDTを使用した。)
【表１１】
2014510129.tif 000012
【００６７】
実施例3：臨床研究
詳細な表題
健常な乳児に一次ワクチン接種過程として2、3および4ヶ月齢において投与した場合の、GlaxoSmithKline BiologicalsのDTPa-HBV-IPV/Hibワクチンの新規製剤の安全性および免疫原性を評価するためのフェーズI/II二重盲検無作為化多施設研究
適応
生後1年の健常な乳児の、ジフテリア、破傷風、百日咳、B型肝炎、ポリオおよびb型インフルエンザ(Hib)疾患に対する一次免疫化。
【００６８】
研究および研究設計の論理的根拠
GSK Biologicalsは、以下のDTPa-HBV-IPV/Hibの2種類の新規製剤(それぞれ本発明の異なるアルミニウム塩に吸着させたD抗原およびT抗原を含む)を、前臨床の場において検証し、現在はこれらの製剤を臨床評価に進めている。  
・ワクチン(DATAPa-HBV-IPV/Hib)の製剤Aは、アミノ酸の存在下で無毒化されており、かつ、1回オートクレーブされさらに放射線照射を受けた平均して吸着能3.1およびゼータ電位16を有すると測定された水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されている、ジフテリア(D)抗原および破傷風(T)抗原を含むが、他の抗原は、認可製剤のInfanrix hexaに含まれる抗原と同一である。
【００６９】
・ワクチン(DBTBPa-HBV-IPV/Hib)の製剤Bは、アミノ酸の存在下で無毒化されており、かつ、放射線照射を受けた平均して吸着能3.6およびゼータ電位20を有すると測定された水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されている、ジフテリア(D)抗原および破傷風(T)抗原を含むが、他の抗原は、認可製剤であるInfanrix hexaに含まれる抗原と同一である。
【００７０】
本試験は、2種類の新規製剤を一次ワクチン接種過程として健常な乳児に2、3および4ヶ月齢において投与した場合の、これらの製剤の安全性および免疫原性を評価することを狙いとしたフェーズI/II研究である。
【００７１】
認可製剤のInfanrix hexaワクチンは、全てのワクチン抗原に対する免疫応答の非劣性を立証するための基準として使用されている。
【００７２】
本研究の目的は、これらの新規製剤の少なくとも1種の免疫原性が、ジフテリア抗原、破傷風抗原、B型肝炎抗原、ポリリボシルリビトールリン酸(PRP)抗原および百日咳抗原に関して現在認可されているワクチン製剤の免疫原性に対して非劣性であることを示すことである。
【００７３】
本研究は、新規製剤の評価におけるバイアスのあらゆる可能性を未然に防ぐために、無作為化二重盲検設計を採用する。
【００７４】
対象
一次免疫
・一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後に、少なくとも1種のDTPa-HBV-IPV/Hib製剤の免疫原性が、ジフテリア抗原、破傷風抗原、B型肝炎抗原およびPRP抗原に対する血清保護率、ならびに百日咳抗原に対する抗体幾何平均濃度(GMC)の点で認可製剤に対して非劣性であることを示すこと。
【００７５】
二次免疫
・一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後に、血清保護状態、血清反応陽性状態および抗体濃度または抗体力価に関して、本研究のワクチンに対する免疫学的応答を評価すること。
【００７６】
・一次ワクチン接種の第1回投与の前に、血清保護状態、血清反応陽性状態および抗体濃度に関して、ジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原およびポリオ抗原に対する免疫学的状態を評価すること。
【００７７】
・一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後に、ワクチン応答に関して、百日咳抗原に対する免疫学的応答を評価すること。
【００７８】
・応答型症状および非応答型症状、局所症状および全身症状ならびに重篤な副作用に関して、本研究のワクチンの安全性および反応原性を評価すること。
【００７９】
研究設計
・実験設計：3つの並行群を用いたフェーズI/II二重盲検無作為化多施設研究。
【００８０】
・1人の被験者につき、研究期間は約3ヶ月であった。
【００８１】
・対照：GSK BiologicalsのDTPa-HBV-IPV/Hibワクチン(Infanrix hexa)。
【００８２】
・ワクチンスケジュール：全ての被験者は、2、3および4ヶ月齢において、その群の割当に応じてDTPa-HBVIPV/Hibの3種類の製剤のうち1種について3回投与を受けた。
【００８３】
さらに、全ての被験者は、2、3および4ヶ月齢においてWyeth-Lederle社の13価肺炎球菌ワクチン(プレベナー(Prevenar)13)の3回投与を受けた。
【００８４】
治療群：概要表1は、本研究群および、本研究において投与されたワクチンを示す。
【表１２】
2014510129.tif 000013
【００８５】
・治療割当：  無作為化1：1：1。
【００８６】
・盲検法：この研究は、二重盲検研究である。
【００８７】
・採血：以下の2回のサンプル採取時点において、全ての被験者から血液サンプルを採取した：
＊  一次ワクチン投与前(Pre-Pri)に、少なくとも3.5mlの血液サンプルを採取した；
＊  3回目のワクチン投与の1ヶ月後(Post-Pri)に、5mlの血液サンプルを採取した。
【００８８】
・研究の種類：自己完結型
・データ収集：電子症例報告書(electronic case report forms (eCRFs))を用いた遠隔データ入力システム(Remote data entry (RDE))。
【００８９】
被験者数
・標的サンプルサイズは被験者720人(各グループ240人)であり、このうち648人の被験者(各グループ216人)について免疫原性が評価可能であった。免疫原性に関する実際のプロトコール遵守(ATP)コホートは、651人(製剤A = 215人；製剤B = 217人；対照 = 219人)であった。
【００９０】
エンドポイント
一次免疫
・本研究のワクチンの成分に関する免疫原性
＊  一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後の抗ジフテリア、抗破傷風、抗HBsおよび抗PRP血清保護状態。
【００９１】
＊  一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後の、抗百日咳トキソイド(抗PT)濃度、抗線維状赤血球凝集素(抗FHA)濃度および抗パータクチン(抗PRN)抗体濃度。
【００９２】
二次免疫
・本研究のワクチンの成分に関する免疫原性
＊  一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後の、抗ジフテリア、抗破傷風、抗HBs、抗ポリオウイルス1型、抗ポリオウイルス2型、抗ポリオウイルス3型、抗PRP、抗PT、抗FHA、抗PRN、抗肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F抗体の濃度または力価、ならびに血清保護状態および/または血清反応陽性状態。
【００９３】
＊  一次ワクチン接種の第3回投与の1か月後の、PT、FHAおよびPRNに対するワクチン応答。
【００９４】
＊  一次ワクチン接種の第1回投与前の、抗ジフテリア、抗破傷風、抗PT、抗FHA、抗PRN、抗ポリオウイルス1型、抗ポリオウイルス2型および抗ポリオウイルス3型抗体の濃度または力価、ならびに血清保護状態および/または血清反応陽性状態。
【００９５】
・応答型の局所的および全身的副作用
＊  各ワクチン接種後の、8日間(0日目〜7日目)の追跡期間中の応答型局所症状の発生。
【００９６】
＊  各ワクチン接種後の、8日間(0日目〜7日目)の追跡期間中の応答型全身症状の発生。
【００９７】
・非応答型副作用
＊  国際医薬用語集(Medical Dictionary for Regulatory Activities(MedDRA))分類に従った、各ワクチン接種後の、31日間(0日目〜30日目)の追跡期間中の非応答型副作用(AE)の発生。
【００９８】
・重篤な副作用
＊  第1回投与から研究終了までの重篤な副作用の発生。
【００９９】
結果
・予め、新規な方法によって製造され水酸化アルミニウムAlhydrogelTM(再オートクレーブ済)に吸着されているD抗原およびT抗原を含む、再製剤化されたDTPa-HBV-IPV/HibワクチンのフェーズII試験(無作為化、観察者盲検、自己完結型、一次免疫化、多施設研究)を行った。2、3および4ヶ月において、144人の乳児が試験ワクチンの接種を受け、149人の乳児が認可された対照の接種を受けた。第3回ワクチン投与の1ヶ月後、D血清保護およびT血清保護は、認可された対照に対して非劣性であった。しかし、HBVについての血清保護率に関する非劣性基準ならびに抗FHAおよび抗PRNについての幾何平均濃度(GMC)比に関する非劣性基準は満たさなかった。
【０１００】
・本研究において、製剤Aは、上記の先の試験における試験製剤と比較して大幅な改善を示すことが認められた。DおよびTに対する優れた免疫原性(DおよびT血清保護について非劣性基準を満たした)に加えて、HBV血清保護率は、先の試験におけるHBV血清保護率よりも有意に高く、認可製剤に対して非劣性であった。D、TおよびHBV抗原のGMCに関して、先の試験と比較してより高い免疫応答の傾向が同様に観察された。抗FHAのGMCは、同様に非劣性基準を満たし、一方、抗PRN GMCは、先の試験に対して少し改善を示し、非劣性限界値をわずかに上回った。また製剤Bも、D、T、HBVに対する血清保護率および抗FHA GMCについて非劣性を示したが、抗PRN GMCは、製剤Aにおける抗PRN GMCよりも低かった。
【図１】
2014510129.tif 000014
【図２】
2014510129.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月10日(2013.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2のタンパク質吸着能を有する、前記方法。
【請求項２】
破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.7、2.6〜3.6、2.7〜3.5、または2.8〜3.4のタンパク質吸着能を有する、前記方法。
【請求項３】
アルミニウム塩が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.9〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アルミニウム塩が、X線回折による測定で、3.3〜5.7nmの結晶サイズを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.6のタンパク質吸着能および2.9〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
破傷風トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、前記方法。
【請求項７】
ジフテリアトキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを含む免疫原性組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、該アルミニウム塩粒子(これにジフテリアトキソイドを吸着させる)が、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2のタンパク質吸着能を有する、前記方法。
【請求項８】
アルミニウム塩粒子(これにジフテリアトキソイドが吸着される)が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ジフテリアトキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる工程を含んでなる、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを含む免疫原性組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、該アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、前記方法。
【請求項１０】
アルミニウム塩粒子が、約17〜23mV、18〜22mVまたは19〜21mVの、pH7におけるゼータ電位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アルミニウム塩粒子が、約14〜22mV、15〜21mVまたは16〜20mVの、pH7におけるゼータ電位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドを、アルミニウム塩粒子に別々にまたは一緒に吸着させる、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
破傷風トキソイドが、破傷風毒素を化学的に無毒化することによって製造されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
破傷風トキソイドが、破傷風毒素を遺伝子的に無毒化することによって製造されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ジフテリアトキソイドが、ジフテリア毒素を化学的に無毒化することによって製造されている、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ジフテリアトキソイドが、ジフテリア毒素(特にCRM197)を遺伝子的に無毒化することによって製造されている、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、不活性化ポリオワクチンと共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、パータクチンと共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、線維状赤血球凝集素と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、百日咳トキソイドと共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
(前記さらなる工程の)アルミニウム塩粒子が、約17〜23mV、18〜22mVまたは19〜21mVの、pH7におけるゼータ電位を有する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
(前記さらなる工程の)アルミニウム塩粒子が、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2のタンパク質吸着能を有する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
(前記さらなる工程の)アルミニウム塩粒子が、X線回折による測定で、2.8〜5.7nm、例えば2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.7〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmの結晶サイズを有する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
アルミニウム塩がオートクレーブされていない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
アルミニウム塩が1回だけオートクレーブされている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アルミニウム塩が、滅菌を達成するために必要な最小限の時間、例えばオートクレーブサイクルの開始から終了まで90分以下でオートクレーブされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アルミニウム塩が放射線照射によって滅菌される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、b型インフルエンザ菌由来の莢膜糖と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
免疫原性組成物を、場合によりアルミニウム塩粒子に吸着されている、B型肝炎表面抗原と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
アルミニウム粒子がリン酸アルミニウムである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
アルミニウム塩粒子が、アルミニウム塩1mg当たりBSA 2.5〜3.7、2.5〜3.5、2.6〜3.6、2.6〜3.4、2.7〜3.5、2.7〜3.3、2.8〜3.4または2.9〜3.2mgのタンパク質吸着能を有する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質吸着能が、実施例１に記載の方法を用いて測定される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンのうち1種以上を含むワクチンの作製方法であって、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンのうち1種以上をアルミニウムアジュバントに吸着させ、ここで該アジュバントは、放射線照射の工程は含むがオートクレーブの工程は含まない方法によって滅菌される、前記方法。
【請求項３５】
破傷風トキソイドおよび/またはジフテリアトキソイドが存在し、それらを前記アルミニウムアジュバントに吸着させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素およびパータクチンが全て存在し、それらを前記アルミニウムアジュバントに吸着させる、請求項３４または３５に記載の方法。 
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法によって作製された免疫原性組成物。
【国際調査報告】
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