(57)【要約】  骨がんの治療方法およびがんの転移拡散の予防方法を本発明において提供する。
2014527542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法：
【化８】
2014527542.tif 000011
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
ここで、Ｒｗは下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
（５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド；
Ｒ１は下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換アルキル、
（６）置換および非置換アルケニル、
（７）置換および非置換アルキニル、
（８）置換および非置換アリール、
（９）置換および非置換ヘテロアリール、
（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換シクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲ１ａＲ１ｂ、
ここで、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは独立に、下記からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換アルキル、
（ｃ）置換および非置換アリール、
（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換シクロアルキル；
Ｒ２は下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換アルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ、
ここで、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは独立に、下記からなる群から選択され：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換アルキル；
Ｒ３は下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換アルキル、
（６）置換および非置換アルケニル、
（７）置換および非置換アルキニル、
（８）置換および非置換アリール、
（９）置換および非置換ヘテロアリール、
（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換シクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ、
ここで、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立に、下記からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換アルキル、
（ｃ）置換および非置換アリール、
（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換シクロアルキル；
Ｒ４は下記からなる群から選択される
（１）水素、および
（２）ハロゲン］。
【請求項２】
ＷがＣＨを表し、
Ｒ１がＮ−モルホリニルを表し、
Ｒ２が水素を表し、
Ｒ３がトリフルオロメチルを表し、
Ｒ４が水素を表す、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨がんが、軟骨肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、線維肉腫、および悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）から選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法。
【請求項５】
ＷがＣＨを表し、
Ｒ１がＮ−モルホリニルを表し、
Ｒ２が水素を表し、
Ｒ３がトリフルオロメチルを表し、
Ｒ４が水素を表す、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
原発がん細胞が、乳房、肺、膵臓、腎臓、または前立腺のがんに由来する、請求項４から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
原発がん細胞が乳がん細胞である、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法。
【請求項９】
そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法。
【請求項１０】
そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、化合物Ａ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法：
【化９】
2014527542.tif 000012
【請求項１１】
骨がんが転移性骨がんである、請求項１から３、８および１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、化合物Ａ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨がんの治療方法およびがんの転移拡散の予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移性播種は、がんの最も恐れられる転帰および致死の主因である。原発腫瘍から分離する細胞は、身体のあらゆる器官および領域に到達することが可能である。しかし、各腫瘍型は、腫瘍固有および器官特異的な分子特性および細胞特性の相互作用に起因する特定の転移様式を示す（１，２）。例えば、乳がん播種の最も一般的な標的は、骨、肺、腹部内臓器官、および脳である（３〜６）。転移性骨がんは、原発がんによる転移性播種に起因し、多発性骨髄腫や骨髄で始まる白血病などの血液がんとは区別される。転移様式によって、無再発期間だけでなく、さらに重要なことに生活の質、ひいては生存が決まる。新規抗転移剤の探索は、依然として腫瘍学における重要な目標である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
したがって、一態様において、そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法を本明細書に記載する：
【０００４】
【化１】
2014527542.tif 000003
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
ここで、Ｒｗは下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
（５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド；
Ｒ１は下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換アルキル、
（６）置換および非置換アルケニル、
（７）置換および非置換アルキニル、
（８）置換および非置換アリール、
（９）置換および非置換ヘテロアリール、
（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換シクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲｌａＲ１ｂ、
ここで、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは独立に、下記からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換アルキル、
（ｃ）置換および非置換アリール、
（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換シクロアルキル；
Ｒ２は下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換アルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ、
ここで、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは独立に、下記からなる群から選択され：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換アルキル；
Ｒ３は下記からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換アルキル、
（６）置換および非置換アルケニル、
（７）置換および非置換アルキニル、
（８）置換および非置換アリール、
（９）置換および非置換ヘテロアリール、
（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換シクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ、
ここで、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立に、下記からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換アルキル、
（ｃ）置換および非置換アリール、
（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換シクロアルキル；
Ｒ４は下記からなる群から選択される
（１）水素、および
（２）ハロゲン］。
【０００５】
本方法のいくつかの実施形態において、骨がんは、軟骨肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、線維肉腫、および悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）から選択される。
【０００６】
別の態様において、そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【０００７】
本予防方法の一実施形態において、原発がん細胞は、乳房、肺、膵臓、腎臓、または前立腺のがんに由来する。別の実施形態において、原発がん細胞は乳がん細胞である。
【０００８】
別の態様において、そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【０００９】
さらに別の態様において、そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【００１０】
前述の治療方法および予防方法のいくつかの実施形態において、
ＷはＣＨを表し、
Ｒ１はＮ−モルホリニルを表し、
Ｒ２は水素を表し、
Ｒ３はトリフルオロメチルを表し、
Ｒ４は水素を表す。
【００１１】
さらに別の態様において、そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、化合物Ａ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する：
【００１２】
【化２】
2014527542.tif 000004
【００１３】
前述の骨がんの治療方法のいくつかの実施形態において、骨がんは転移性骨がんである。
【００１４】
特定の態様において、そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、化合物Ａ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】４５３−ＥＧＦＰ転移成長の化合物Ａによる多器官での阻害を示す図である。（Ａ）様々な部位における転移の発生率；脳、骨髄および肝臓において、化合物Ａによる阻害が有意であることが記録された。少なくともｐ＜０．０５、フィッシャーの正確検定。切開した対照および処置マウス脳（腹側図、Ｂ）および肺（Ｃ）の代表的な試料は、化合物Ａによる転移負荷の低下を示す。
【図２】化合物Ａの抗転移活性の定量分析を示す図である。各棒は、４５３−ＥＧＦＰ細胞を静脈内投与したマウス６〜９匹を１群とした平均およびＳＥＭを表し、阻害率（％）を各グラフの化合物Ａを表す棒の上に示す。（Ａ）ｑＰＣＲで評価した脳における転移負荷：材料および算出方法を参照のこと；（Ｂ、Ｄ）解離脳（Ｂ）および大腿骨骨髄（Ｄ）におけるＨＥＲ−２−陽性転移細胞の細胞蛍光定量；（Ｃ、Ｅ、Ｆ）マウス１匹当たりの転移部位の肉眼による計数。化合物Ａによる転移阻害の統計的評価：パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、少なくともｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．治療方法
転移性播種の一般的標的としては、骨、肺、脳、および腹部内臓器官（例えば、胃、肝臓、腸、脾臓、膵臓、ならびに泌尿および生殖器系の部分）が挙げられる。
【００１７】
本開示によれば、転移および転移性播種は、がん細胞が身体の原発部位から別の個所に拡散することを意味すると理解される。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、悪性細胞の原発腫瘍からの剥離、細胞外マトリックスの侵襲、内皮基底膜を貫通して体腔および血管に侵入、次いで血液による輸送後の標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移は、原発腫瘍の除去後でさえ、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発達させる可能性があるのでしばしば起こる。一実施形態において、本発明によれば「転移」という用語は、原発腫瘍から離れた転移に関する「遠位転移」に関する。
【００１８】
本開示はまた、骨髄に起こるがん（例えば、多発性骨髄腫や白血病などの血液がん）を除いて、骨の表面または内部での悪性細胞の成長異常を特徴とする病態である骨がんを治療および予防する方法にも関する。骨がんは限定されるものではないが、例えば軟骨肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、線維肉腫、および悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）などが挙げられる。骨の表面または内部に起こるがんを原発骨がんと呼ぶ。身体の別の部分（乳房、肺、または結腸など）で起こる骨のがんは、続発または転移性骨がんである。
【００１９】
したがって、一態様において、そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する：
【００２０】
【化３】
2014527542.tif 000005
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
ここで、Ｒｗは下記からなる群から選択され：（１）水素、（２）シアノ、（３）ハロゲン、（４）メチル、（５）トリフルオロメチル、（６）スルホンアミド；
Ｒ１は下記からなる群から選択され：（１）水素、（２）シアノ、（３）ニトロ、（４）ハロゲン、（５）置換および非置換アルキル、（６）置換および非置換アルケニル、（７）置換および非置換アルキニル、（８）置換および非置換アリール、（９）置換および非置換ヘテロアリール、（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、（１１）置換および非置換シクロアルキル、（１２）−ＣＯＲ１ａ、（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、（１９）−ＯＲ１ａ、（２０）−ＳＲ１ａ、（２１）−ＳＯＲ１ａ、（２３）−ＳＯ２ＮＲ１ａＲ１ｂ、ここで、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは独立に、下記からなる群から選択され：（ａ）水素、（ｂ）置換または非置換アルキル、（ｃ）置換および非置換アリール、（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに（ｆ）置換および非置換シクロアルキル；
Ｒ２は下記からなる群から選択され：（１）水素、（２）シアノ、（３）ニトロ、（４）ハロゲン、（５）ヒドロキシ、（６）アミノ、（７）置換および非置換アルキル、（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ、ここで、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは独立に、下記からなる群から選択され：（ａ）水素、および（ｂ）置換または非置換アルキル；
Ｒ３は下記からなる群から選択され：（１）水素、（２）シアノ、（３）ニトロ、（４）ハロゲン、（５）置換および非置換アルキル、（６）置換および非置換アルケニル、（７）置換および非置換アルキニル、（８）置換および非置換アリール、（９）置換および非置換ヘテロアリール、（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、（１１）置換および非置換シクロアルキル、（１２）−ＣＯＲ３ａ、（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ、（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、（１６）−ＯＲ３ａ、（１７）−ＳＲ３ａ、（１８）−ＳＯＲ３ａ、（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ、ここで、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立に、下記からなる群から選択され：（ａ）水素、（ｂ）置換または非置換アルキル、（ｃ）置換および非置換アリール、（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに（ｆ）置換および非置換シクロアルキル；
Ｒ４は（１）水素、および（２）ハロゲンからなる群から選択される］。
【００２１】
骨がんの治療方法の一実施形態において、骨がんは転移性骨がんである。
【００２２】
骨がんの治療方法の別の実施形態において、ＷはＣＨを表し、Ｒ１は置換および非置換ヘテロシクリルを表し、Ｒ２は水素を表し、Ｒ３は置換および非置換アルキルを表し、Ｒ４は水素を表す。別の実施形態において、ＷはＣＨを表し、Ｒ１はＮ−モルホリニルを表し、Ｒ２は水素を表し、Ｒ３はトリフルオロメチルを表し、Ｒ４は水素を表す。
【００２３】
本方法のいくつかの実施形態において、骨がんは、軟骨肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、線維肉腫、および悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）から選択される。
【００２４】
別の態様において、原発がん細胞の転移性播種の予防を必要とする対象における原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【００２５】
原発がん細胞の転移性播種を予防する方法の一実施形態において、原発がん細胞は、乳房、肺、膵臓、腎臓、または前立腺のがんに由来する。別の実施形態において、原発がん細胞は乳がん細胞である。さらに別の実施形態において、骨、肺、腹部内臓器官、および脳から選択される器官への原発がん細胞の播種が予防される。特定の一実施形態において、対象の骨への原発がん細胞の播種が予防される。
【００２６】
したがって、別の態様において、そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【００２７】
原発がん細胞の転移性播種を予防する方法のいくつかの実施形態において、ＷはＣＨを表し、Ｒ１は置換および非置換ヘテロシクリルを表し、Ｒ２は水素を表し、Ｒ３は置換および非置換アルキルを表し、Ｒ４は水素を表す。他の実施形態において、ＷはＣＨを表し、Ｒ１はＮ−モルホリニルを表し、Ｒ２は水素を表し、Ｒ３はトリフルオロメチルを表し、Ｒ４は水素を表す。
【００２８】
別の態様において、そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、化合物Ａ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する：
【００２９】
【化４】
2014527542.tif 000006
【００３０】
骨がんの治療方法の一実施形態において、骨がんは転移性骨がんである。
【００３１】
特定の態様において、そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、化合物Ａ、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【００３２】
好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ｐａｎ−ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン（本明細書では「化合物Ａ」と呼ぶ）である。
【００３３】
化合物Ａの合成は、国際公開第２００７／０８４７８６号（実施例１０、１３９〜１４０頁を参照のこと）に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。別段の指定のない限りまたは本文に明確な指示のない限り、本発明の式Ｉの化合物を示す言葉は、化合物の遊離塩基と化合物の薬学的に許容されるすべての塩とを包含する。
【００３４】
ＩＩ．医薬組成物
別の態様において、そのような治療を必要とする対象における骨がんの治療方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を、骨がんが治療されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【００３５】
骨がんの治療方法の一実施形態において、骨がんは転移性骨がんである。
【００３６】
さらに別の態様において、そのような予防を必要とする対象の骨への原発がん細胞の転移性播種を予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を、対象の骨への原発がん細胞の転移性播種が予防されるように対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。
【００３７】
本発明の化合物は、転移性播種を治療する際にインビトロまたはインビボで有用である。本化合物は単独または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と一緒に組成物として使用してもよい。本発明の医薬組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された本明細書に記載されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤化合物を治療有効量含む。本明細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、非毒性で不活性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。薬学的に許容される担体として機能することができる材料の一部の例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターや座剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油、およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルやラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムや水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の相溶性滑沢剤であり、製剤者の判断に従って、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤、および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も組成物中に存在してもよい。他の好適な薬学的に許容される賦形剤については、”Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Pub. Co., New Jersey, 1991に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本発明の化合物は、ヒトおよび他の動物に通常の薬学的に許容される非毒性の担体、アジュバント、およびビヒクルを所望通りに含む投与単位で経口投与、非経口投与、舌下投与、エアゾール投与または吸入噴霧投与、直腸投与、大槽内投与、腟内投与、腹腔内投与、頬側投与、または局所投与してもよい。局所投与では、経皮貼付剤またはイオン泳動装置などの経皮投与を用いる必要があることもある。本明細書では、非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入法を包含する。
【００３９】
製剤方法は当技術分野において周知であり、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition(1995)に開示されている。本発明で使用するための医薬組成物は、無菌の非発熱性液体液剤もしくは懸濁剤、被覆カプセル剤、坐剤、凍結乾燥散剤、経皮貼付剤の形態、または当技術分野において公知である他の形態をとることができる。
【００４０】
注射製剤、例えば水性または油性無菌注射懸濁剤は、公知技術に従って好適な分散剤または湿潤化剤および懸濁化剤を使用して製剤化してもよい。無菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液、懸濁液または乳濁液、例えば１，３−プロパンジオールまたは１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用してもよい許容されるビヒクルおよび溶媒のうちには、水、リンゲル液、米国薬局方および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌不揮発性油が溶媒または懸濁化媒体として通常使用される。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めて無菌性の不揮発性油を使用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射剤の調製に使用される。注射製剤は、例えば細菌保持フィルターに通す濾過によって、あるいは使用に先立って滅菌水または他の無菌注射媒体に溶解または分散することができる無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【００４１】
薬物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射による薬物の吸収を遅くすることがしばしば望ましい。これは、低水溶性の結晶質または非結晶質材料の液体懸濁剤を使用することによって行ってもよい。このとき薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、さらには溶解速度は結晶径および結晶形に依存する可能性がある。
【００４２】
あるいは、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって、非経口投与された薬物形態の遅延吸収を行ってもよい。ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって、注射可能なデポー形態を作製する。薬物とポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤は、体組織と適合性があるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによって調製してもよい。
【００４３】
直腸または腟内投与用の組成物は、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で融解し、活性化合物を放出するカカオバター、ポリエチレングリコール、または座剤ワックスなどの好適な非刺激性賦形剤または担体と本発明の化合物を混合することによって調製できる坐剤であることが好ましい。
【００４４】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、活性化合物を、クエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウムなど少なくとも１種の薬学的に許容される不活性な賦形剤もしくは担体ならびに／あるいはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保水剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリカート、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、アセチルアルコールやモノステアリン酸グリセリンなどの湿潤化剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、ならびにそれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含んでもよい。
【００４５】
同様のタイプの固体組成物を、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟および硬ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用してもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティングや製薬技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。これらは不透明化剤を場合によっては含んでもよく、活性成分を腸管のある部分でのみまたは優先的に、場合によっては遅延させて放出する組成物とすることもできる。使用することができる包埋組成物の例としては、重合体物質およびワックスが挙げられる。活性化合物は、上記に記載した１種または複数の賦形剤を含むマイクロカプセル化した形態とすることもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティング、および製薬技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。このような固体剤形では、活性化合物をスクロース、ラクトース、またはデンプンなど少なくとも１種の不活性な希釈剤と混合してもよい。このような剤形は、通常の慣行のように、不活性な希釈剤を除く追加の物質、例えばステアリン酸マグネシウムや微結晶セルロースなどの打錠用滑沢剤および他の打錠助剤も含んでもよい。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含んでもよい。これらは不透明化剤を場合によっては含んでもよく、活性成分を腸管のある部分でのみまたは優先的に、場合によっては遅延させて放出する組成物とすることもできる。使用することができる包埋組成物の例としては、重合体物質およびワックスが挙げられる。経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば水または他の溶媒など当技術分野においてよく使用される不活性な希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤を含んでもよい。不活性な希釈剤に加えて、経口用組成物は、湿潤化剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、および芳香剤などのアジュバントも含むことができる。
【００４６】
本発明の化合物の有効量としては、一般に骨がんまたはがん細胞の転移性播種を、本明細書に記載される分析のいずれか、当業者に公知の他の分析、または骨がんもしくはがん細胞の転移性播種の症状の抑制もしくは軽減の検出によって検出可能な程度に治療または予防するのに十分な任意の量が挙げられる。担体材料と組み合わせて、単一の剤形を形成できる活性成分の量は、治療される受容者および特定の投与方法に応じて様々である。
【００４７】
しかし、任意の特定患者の特定の用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身的健康状態、性別、食事、投与時期、投与経路、排泄速度、薬物併用、および治療中の特定疾患の重症度を含めて、様々な要因に依存することが理解されよう。所与の状況に対する治療有効量は、常法に従う実験方法で容易に決定することができ、通常の臨床医の技能および判断の範囲内である。
【００４８】
本発明の治療方法によれば、ヒトまたは下等哺乳類などの患者における転移性播種は、患者に治療有効量の本発明の化合物を、所望の結果を実現するのに必要とされるような量および時期で投与することによって低減または予防される。
【００４９】
ＩＩＩ．定義
「治療すること（treating）」は本明細書では、障害もしくは疾患に伴う症状の低減もしくは軽減、またはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化の停止、または疾患もしくは障害の予防（prevention）もしくは予防（prophylaxis）を意味するために使用される。例えば、骨がんの治療を必要とする患者を治療するという状況においては、成果をあげてきた治療としては、骨がんの発生の予防、あるいはがん性細胞の骨への転移性播種の予防、骨における癌性増殖もしくは腫瘍に関連した症状、毛細血管もしくは患部組織の増殖の軽減、毛細血管増殖の停止、またはがんなどの疾患の進行もしくはがん性細胞の増殖の停止が挙げられる。治療は、本発明において使用される化合物を他の療法と組み合わせて投与することを包含してもよい。例えば、本発明の化合物および医薬製剤を、外科的処置および／または放射線療法の前、最中、または後に投与してもよい。本発明の化合物をアンチセンスおよび遺伝子治療で使用されるものを含めて他の抗がん薬と一緒に投与することもできる。
【００５０】
本明細書では、「限定する（limit）」、「治療する（treat）」、および「治療（treatment）」は「限定すること（limiting）」および「治療すること（treating）」のように交換可能な用語であり、本明細書では予防的（preventative）（例えば、予防（prophylactic））治療および対症療法または予防的治療もしくは対症療法を提供する行為を包含する。
【００５１】
「対象」という用語は動物を包含するよう意図されている。対象の例としては、哺乳類、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびヒト以外のトランスジェニック動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、対象はヒト、例えば転移性骨がんを患っているヒト、患うリスクがあるヒト、または潜在的に患う可能性があるヒトである。
【００５２】
本発明の化合物の「治療有効量」は、いずれの医学的処置にも適用可能な合理的ベネフィット／リスク比で転移性播種を治療または予防するのに十分な化合物の量を意味する。しかし、本発明の化合物および組成物の合計１日使用量は、担当医が適切な医学的判断の範囲内で決定することを理解されたい。任意の特定患者に対する特定の治療有効量レベルは、治療対象の障害および障害の重症度；使用する特定の化合物の活性；使用する特定の組成物；患者の年齢、体重、全身的健康状態、性別、および食事；使用する特定の化合物の投与時期、投与経路、および排泄速度；治療期間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医術で周知の同様の要因を含めて種々の要因に依存する。
【００５３】
本発明の目的では、治療有効量は、通常、単回または分割投与で受容者に投与される合計１日用量であり、例えば１日に０．００１〜１０００ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは１日に１．０〜３０ｍｇ／体重１ｋｇの量であってもよい。１日用量を構成するために、投与単位組成物はその約数の量を含んでいてもよい。一般に、本発明による治療計画は、このような治療を必要とする患者に本発明の化合物を単回または反復投与で１日当たり約１０ｍｇ〜約２０００ｍｇ投与することを含む。
【００５４】
本明細書では、「用量範囲」という用語は、指定された薬剤量の許容される変動の上限と下限を指す。典型的には、指定された範囲内の任意の量である１回投与量の薬剤を、治療を受ける患者に投与することができる。
【００５５】
「約」または「およそ」という用語は、通常所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくはさらに５％以内を意味する。あるいは、特に生物学系においては、「約」という用語は、所与の値の約１ｌｏｇ（すなわち、１桁）以内、好ましくは２倍以内を意味する。
【００５６】
本明細書では、「アルキル」という用語はヘテロ原子を含まないアルキル基を指す。したがって、この用語は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルなどの直鎖アルキル基を包含する。この用語は、直鎖アルキル基の分枝鎖異性体も包含し、例として以下に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない：−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、など。したがって、「アルキル基」という用語は、第一級アルキル基、第二級アルキル基、および第三級アルキル基を包含する。好ましいアルキル基としては、１〜１２個の炭素原子または１〜６個の炭素原子を有する直鎖および分枝鎖アルキル基が挙げられる。
【００５７】
「アルケニル」という用語は、１個または複数の炭素−炭素二重結合を有する点以外は上記に定義したアルキル基に関して記載されたものなど、２〜約２０個の炭素原子を有する直鎖、分枝状、または環式基を指す。例としては、とりわけビニル、−ＣＨ＝Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（Ｈ）２、−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）＝ＣＨ２、シクロヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、およびヘキサジエニルが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアルケニル基としては、２〜１２個の炭素原子または２〜６個の炭素原子を有する直鎖および分枝状アルケニル基ならびに環式アルケニル基が挙げられる。
【００５８】
「アルキニル」という用語は、１個または複数の炭素−炭素三重結合を有する点以外は上記に定義したアルキル基に関して記載されたものなど、２〜約２０個の炭素原子を有する直鎖、分枝状、または環式基を指す。例としては、とりわけ−Ｃ≡Ｃ（Ｈ）、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ３）、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）、−Ｃ（Ｈ２）Ｃ≡Ｃ（Ｈ）、−Ｃ（Ｈ）２Ｃ≡Ｃ（ＣＨ３）、および−Ｃ（Ｈ）２Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアルキニル基としては、２〜１２個の炭素原子または２〜６個の炭素原子を有する直鎖および分枝状アルキニル基が挙げられる。
【００５９】
アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は置換されていてもよい。「置換アルキル」は、炭素または水素への結合１個または複数がＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩなどのハロゲン原子；ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、およびエステル基などの基の中の酸素原子；チオール基、アルキルおよびアリールスルフィド基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホキシド基などの基の中の硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミド、およびエナミンなどの基の中の窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、およびトリアリールシリル基などの基の中のケイ素原子；ならびに様々な他の基の中の他のヘテロ原子などの非水素原子および非炭素原子への結合で置換されている上記に定義したアルキル基を指すが、これらに限定されない。置換アルキル基としては、炭素または水素原子への結合１個または複数がオキソ、カルボニル、カルボキシル、およびエステル基中の酸素；イミン、オキシム、ヒドラゾン、およびニトリルなどの基の中の窒素などのヘテロ原子への高次結合（例えば、二重結合または三重結合）で置換されている基も挙げられる。置換アルキル基としては、炭素または水素原子への結合１個または複数がアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはシクロアルキル基への結合で置換されているアルキル基もさらに挙げられる。好ましい置換アルキル基としては、とりわけ炭素または水素原子への結合１個または複数がフルオロ、クロロ、またはブロモ基への結合１個または複数で置換されているアルキル基が挙げられる。別の好ましい置換アルキル基は、トリフルオロメチル基およびトリフルオロメチル基を含む他のアルキル基である。他の好ましい置換アルキル基としては、炭素または水素原子への結合１個または複数が酸素原子への結合で置換されており、置換アルキル基がヒドロキシル、アルコキシ、またはアリールオキシ基を含む基が挙げられる。他の好ましい置換アルキル基としては、アミン、または置換もしくは非置換アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、（アルキル）（アリール）アミン、ジアリールアミン、ヘテロシクリルアミン、ジヘテロシクリルアミン、（アルキル）（ヘテロシクリル）アミン、または（アリール）（ヘテロシクリル）アミン基を有するアルキル基が挙げられる。さらに他の好ましい置換アルキル基としては、炭素または水素原子への結合１個または複数がアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはシクロアルキル基への結合で置換されている基が挙げられる。置換アルキルの例は、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ３）、−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈである。置換アルキルの置換基の例は、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＯＨ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＦ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨＳＯ２ＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＣＨ３、−ＮＨＳＯ−２ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２ＮＨ２、ハロである。
【００６０】
「置換アルケニル」という用語は、置換アルキル基が非置換アルキル基に関して有していたのと同じ意味をアルケニル基に関して有する。置換アルケニル基としては、非炭素または非水素原子が別の炭素に二重結合しているある炭素に結合しているアルケニル基、および非炭素または非水素原子の１つが別の炭素への二重結合に関与していないある炭素に結合しているアルケニル基が挙げられる。
【００６１】
「置換アルキニル」という用語は、置換アルキル基が非置換アルキル基に関して有していたのと同じ意味をアルキニル基に関して有する。置換アルキニル基としては、非炭素または非水素原子がある炭素に三重結合で結合している別の炭素に結合しているアルキニル基、および非炭素または非水素原子がある炭素への三重結合に関与していない別の炭素に結合しているアルキニル基が挙げられる。
【００６２】
「アルコキシ」という用語は、ＲＯ−を指し、式中、Ｒはアルキルである。アルコキシ基の代表例としては、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、トリフロオロメトキシなどが挙げられる。
【００６３】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、クロロ、ブロモ、フルオロ、およびヨード基を指す。「ハロアルキル」という用語は、１個または複数のハロゲン原子で置換されているアルキル基を指す。「ハロアルコキシ」という用語は、１個または複数のハロゲン原子で置換されているアルコキシ基を指す。
【００６４】
「アルコキシアルキル」という用語は、−ａｌｋ１−Ｏ−ａｌｋ２基を指し、式中、ａｌｋ１はアルキルまたはアルケニルであり、ａｌｋ２はアルキルまたはアルケニルである。「アリールオキシアルキル」という用語は、−アルキルＯ−アリール基を指す。「アラルコキシアルキル」という用語は、−アルキレニル−Ｏ−アラルキル基を指す。
【００６５】
「カルボニル」という用語は、２価の−Ｃ（Ｏ）−基を指す。
【００６６】
「シクロアルキル」という用語は、単環式または多環式でヘテロ環式または炭素環式のアルキル置換基を指す。代表的なシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル、ならびに上記に定義したような直鎖および分枝鎖アルキル基で置換されている環が挙げられる。典型的なシクロアルキル置換基は、３〜８個の主鎖（すなわち、環）原子を有し、主鎖原子はそれぞれ、炭素またはヘテロ原子である。本明細書では、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、環構造に１〜５個、より典型的には１〜４個のヘテロ原子を有するシクロアルキル置換基を指す。本発明の化合物で使用される好適なヘテロ原子は窒素、酸素、および硫黄である。代表的なヘテロシクロアルキル部分としては、例えばモルホリノ、ピペラジニル（piperazinyl）、ピペラジニル（piperadinyl）などが挙げられる。カルボシクロアルキル基は、すべての環原子が炭素であるシクロアルキル基である。シクロアルキル置換基に関連して用いられるとき、本明細書では「多環式」という用語は縮合および非縮合アルキル環式構造を指す。
【００６７】
「アリール」という用語は、３〜１４個の主鎖炭素またはヘテロ原子を有する、場合によっては置換されている単環式および多環式芳香族基を指し、炭素環式アリール基とヘテロ環式アリール基とを包含する。この用語は、例としてフェニル、ビフェニル、アントラセニル、ナフテニルなどの基を指すが、これらに限定されない。炭素環式アリール基は、芳香族環のすべての環原子が炭素であるアリール基である。「ヘテロアリール」という用語は、本明細書では芳香族環の環原子として１〜４個のヘテロ原子を有し、残りの環原子が炭素原子であるアリール基を指す。
【００６８】
「非置換アリール」という用語は、ナフタレンなどの縮合環を含む基を包含する。この用語は、トリルなどのアリール基が本明細書では以下に記載する置換アリール基であると考えられるので、環員のうちの１つに結合しているアルキルまたはハロ基などの他の基を有するアリール基を包含しない。好ましい非置換アリール基はフェニルである。しかし、非置換アリール基は、親化合物の１個または複数の炭素原子、酸素原子、窒素原子、および／または硫黄原子に結合していてもよい。
【００６９】
「置換アリール基」という用語は、置換アルキル基が非置換アルキル基に関して有していたのと同じ意味を非置換アリール基に関して有する。しかし、置換アリール基は、芳香族炭素のうちの１個が上述した非炭素または非水素原子のうちの１個に結合しているアリール基も、アリール基の１個または複数の芳香族炭素が本明細書に定義する置換および／または非置換のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基に結合しているアリール基も包含する。この用語は、アリール基の２個の炭素原子がアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の２個の原子に結合して、縮合環系（例えば、ジヒドロナフチルまたはテトラヒドロナフチル）を定義する結合の配置を包含する。したがって、「置換アリール」という用語としては、とりわけトリルおよびヒドロキシフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書では、「置換ヘテロアリール」という用語は、ヘテロアリール基の水素原子のうちの１，２，または３個がＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、−ＯＨ、−ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ；アリール、ハロアルキル、チオアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、メルカプト、ニトロ、カルボキシアルデヒド、カルボキシ、アルコキシカルボニル、およびカルボキサミドで置換されているＣ１〜Ｃ６−アルコキシとの独立した置換によって置換されている、本明細書に定義するヘテロアリール基を指す。さらに、任意の１つの置換基は、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキル基であってもよい。
【００７１】
本明細書では、「置換ヘテロ環」、「複素環基」、「ヘテロ環」、または「ヘテロシクリル」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子を含む任意の３員もしくは４員環、または窒素、酸素、もしくは硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員もしくは６員環を指し（ここで、５員環は０〜２個の二重結合を有し、６員環は０〜３個の二重結合を有し、窒素および硫黄原子は場合によっては酸化されていてもよく、窒素および硫黄ヘテロ原子は場合によっては四級化されていてもよい）、上記のヘテロ環式環のいずれかがベンゼン環または独立して上記に定義した別の５員もしくは６員ヘテロ環式環に縮合している任意の２環式基を含む。ヘテロシクリル基の例としては、ピロリル、ジヒドロピリジル、ピリミジル、ピラジニル、テトラゾリル（例えば、１Ｈ−テトラゾリル、２Ｈ−テトラゾリル）などであるがこれらに限定されない１〜４個の窒素原子を含む不飽和３員〜８員環；イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、キノリル、インダゾリルなどであるがこれらに限定されない１〜４個の窒素原子を含む縮合不飽和複素環基；オキサジアゾリル（例えば、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル）などであるがこれに限定されない１〜２個の酸素原子と１〜３個の窒素原子を含む不飽和３員〜８員環；モルホリニルなどであるがこれに限定されない１〜２個の酸素原子と１〜３個の窒素原子を含む飽和３員〜８員環；１〜２個の酸素原子と１〜３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基、例えばベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサジニル（例えば、２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジニル）；チアジアゾリル（例えば、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，−チアジアゾリル）などであるがこれに限定されない１〜３個の硫黄原子と１〜３個の窒素原子を含む不飽和３員〜８員環；チアゾロジニルなどであるがこれに限定されない１〜２個の硫黄原子と１〜３個の窒素原子を含む飽和３員〜８員環；ジヒドロジチエニル、ジヒドロジチオニル、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピランなどであるがこれらに限定されない１〜２個の硫黄原子を含む飽和および不飽和の３員〜８員環；ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアジニル（例えば、２Ｈ−１，４−ベンゾチアジニル）、ジヒドロベンゾチアジニル（例えば、２Ｈ−３，４−ジヒドロベンゾチアジニル）などであるがこれらに限定されない１〜２個の硫黄原子と１〜３個の窒素原子を含む不飽和縮合ヘテロ環式環、フリルなどであるがこれに限定されない酸素原子を含む不飽和３員〜８員環；ベンゾジオキソイル（例えば、１，３−ベンゾジオキソイル）などの１〜２個の酸素原子を含む不飽和縮合ヘテロ環式環；ジヒドロオキサチエニルなどであるがこれに限定されない１個の酸素原子と１〜２個の硫黄原子を含む不飽和３員〜８員環；１，４−オキサチアンなどの１〜２個の酸素原子と１〜２個の硫黄原子を含む飽和３員〜８員環；ベンゾジチエニルなどの１〜２個の硫黄原子を含む不飽和縮合環；ならびにベンゾオキサチエニル（benzoxathienyl）などの１個の酸素原子と１〜２個の���素原子を含む不飽和縮合ヘテロ環式環が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヘテロ環としては、例えばジアザピニル、ピリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾイル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、アゼチジニル、Ｎ−メチルアゼチジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、チエニル、トリアゾリル、およびベンゾチエニルが挙げられる。ヘテロシクリル基は、環の１個または複数のＳ原子が１個または２個の酸素原子に二重結合している上述したもの（スルホキシドおよびスルホン）も包含する。例えば、ヘテロシクリル基としては、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオフェンオキシド、およびテトラヒドロチオフェン１，１−ジオキシドが挙げられる。好ましいヘテロシクリル基は５個または６個の環員を含む。より好ましいヘテロシクリル基としては、ピペラジン、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、テトラゾール、チオモルホリン、ホモピペラジン、オキサゾリジン−２−オン、ピロリジン−２−オン、キヌクリジン、およびテトラヒドロフランが挙げられる。
【００７２】
ヘテロ環式部分は非置換であってもよく、または独立して、ヒドロキシ、ハロ、オキソ（Ｃ＝Ｏ）、アルキルイミノ（ＲＮ＝、式中Ｒはアルキルまたはアルコキシ基である）、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、ポリアルコキシ、アルキル、シクロアルキル、もしくはハロアルキルから選択される様々な置換基で一置換もしくは二置換されていてもよい。「非置換ヘテロシクリル」はベンゾイミダゾリルなどの縮合ヘテロ環式環を包含するが、２−メチルベンゾイミダゾリルなどの化合物は置換ヘテロシクリル基であるので、環員のうちの１個に結合しているアルキルまたはハロ基など他の基を有するヘテロシクリル基を包含しない。
【００７３】
複素環基が様々な位置で結合していてもよいことは、本明細書の開示内容と共に有機薬化学技術の熟練者には自明である。複素環基は限定されるものではないが、例えば下記なども挙げられる：
【００７４】
【化５】
2014527542.tif 000007
［式中、Ｒは、本明細書に記載されたようにＨまたはヘテロ環式置換基である］。
【００７５】
代表的なヘテロ環式基としては、例えばイミダゾリル、ピリジル、ピペラジニル、アゼチジニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリルベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、インドリル、ナフタピリジニル（naphthpyridinyl）、インダゾリル、およびキノリジニルが挙げられる。
【００７６】
「場合によっては置換されている」または「置換されている」という用語は、水素の１個または複数の１価または２価の基との置換を指す。好適な置換基としては、例えばヒドロキシル、ニトロ、アミノ、イミノ、シアノ、ハロ、チオ、スルホニル、チオアミド、アミジノ、イミジノ、オキソ、オキサミジノ、メトキサミジノ、イミジノ、グアニジノ、スルホンアミド、カルボキシル、ホルミル、アルキル、置換アルキル、ハロアルキル、アルキアミノ（alkyamino）、ハロアルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシ−アルキル、アルキルカルボニル、アミノカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアラルキル−カルボニル、アルキルチオ、アミノアルキル、シアノアルキル、アリール、ベンジル、ピリジル、ピラゾリル、ピロール、チオフェン、イミダゾリルなどが挙げられる。
【００７７】
置換基はそれ自体置換されていてもよい。置換基上に置換されている基は、カルボキシル、ハロ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アミノカルボニル、−ＳＲ、チオアミド、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２Ｒ、またはシクロアルキルであってもよく、式中Ｒは典型的には水素、ヒドロキシル、またはアルキルである。
【００７８】
置換される置換基に直鎖基が含まれると、置換は、鎖内（例えば、２−ヒドロキシプロピル、２−アミノブチルなど）でも、鎖末端（例えば、２−ヒドロキシエチル、３−シアノプロピルなど）でも起り得る。置換される置換基は、共有結合している炭素原子またはヘテロ原子が直鎖状、分枝状、または環状に配置されているものとすることができる。
【００７９】
代表的な置換アミノカルボニル基としては、例えば以下に示す基が挙げられる。これらがヘテロシクリル基およびヘテロアリール基でさらに置換されてもよいことは、本明細書の開示内容と共に有機薬化学技術の熟練者には自明である。好ましいアミノカルボニル基としては、Ｎ−（２−シアノエチル）カルボキサミド、Ｎ−（３−メトキシプロピル）カルボキサミド、Ｎ−シクロプロピルカルボキサミド、Ｎ−（２−ヒドロキシ−イソプロピル）カルボキサミド、メチル２−カルボニルアミノ−３−ヒドロキシプロパノエート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）カルボキサミド、Ｎ−（２−ヒドロキシ−イソプロピル）カルボキサミド、Ｎ−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチル］カルボキサミド、Ｎ−（２−カルボニルアミノエチル）アセトアミド、Ｎ−（２−（２−ピリジル）エチル）カルボキサミド、Ｎ−（２−ピリジルメチル）カルボキサミド、Ｎ−（オキソラン−２−イルメチル）カルボキサミド、Ｎ−（４−ヒドロキシピロリジン−２−イル）カルボキサミド、Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］カルボキサミド、Ｎ−（４−ヒドロキシシクロヘキシル）カルボキサミド、Ｎ−［２−（２−オキソ−４−イミダゾリニル）エチル］カルボキサミド、Ｎ−（カルボニルアミノメチル）アセトアミド、Ｎ−（３−ピロリジニルプロピル）カルボキサミド、Ｎ−［１−（カルボニルアミノメチル）ピロリジン−３−イル］アセトアミド、Ｎ−（２−モルホリン−４−イルエチル）カルボキサミド、Ｎ−［３−（２−オキソピロリジニル）プロピル］カルボキサミド、４−メチル−２−オキソピペラジンカルバルデヒド、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ピロリジニルプロピル）カルボキサミド、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イルプロピル）カルボキサミド、Ｎ−｛２−［（５−シアノ−２−ピリジル）アミノ］エチル｝カルボキサミド、３−（ジメチルアミノ）ピロリジンカルバルデヒド、Ｎ−［（５−メチルピラジン−２−イル）メチル］カルボキサミド、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（１−ホルミルピロリジン−３−イル）アセトアミド、
【００８０】
【化６】
2014527542.tif 000008
が挙げられる。
【００８１】
代表的な置換アルコキシカルボニル基としては、例えば以下に示す基が挙げられる。これらのアルコキシカルボニル基がさらに置換されてもよいことは、本明細書の開示内容と共に有機薬化学技術の熟練者には自明である。
【００８２】
代表的な置換アルコキシカルボニル基としては、例えば以下に示す基が挙げられる。これらのアルコキシカルボニル基がさらに置換されてもよいことは、本明細書の開示内容と共に有機薬化学技術の熟練者には自明である。
【００８３】
【化７】
2014527542.tif 000009
【００８４】
「アミノ」という用語は、本明細書では−ＮＨ２基を指す。「アルキルアミノ」という用語は、本明細書では−ＮＲＲ’基を指し、式中、Ｒはアルキルであり、Ｒ’は水素またはアルキルである。「アリールアミノ」という用語は、本明細書では−ＮＲＲ’基を指し、式中、Ｒはアリールであり、Ｒ’は水素、アルキル、またはアリールである。「アラルキルアミノ」という用語は、本明細書では−ＮＲＲ’基を指し、式中、Ｒはアラルキルであり、Ｒ’は水素、アルキル、アリール、またはアラルキルである。
【００８５】
「アルコキシアルキルアミノ」という用語は、本明細書では−ＮＲ−（アルコキシアルキル）基を指し、式中、Ｒは典型的には水素、アラルキル、またはアルキルである。
【００８６】
「アミノカルボニル」という用語は、本明細書では−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を指す。「置換アミノカルボニル」は、本明細書では−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＲ’基を指し、式中、Ｒはアルキルであり、Ｒ’は水素またはアルキルである。「アリールアミノカルボニル」という用語は、本明細書では−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＲ’基を指し、式中、Ｒはアリールであり、Ｒ’は水素、アルキル、またはアリールである。「アラルキルアミノカルボニル」は、本明細書では−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＲ’基を指し、式中、Ｒはアラルキルであり、Ｒ’は水素、アルキル、アリール、またはアラルキルである。
【００８７】
「アミジノ」という用語は、Ｒ−Ｃ（＝Ｎ）−ＮＲ’−部分（基は「Ｎ１」窒素に存在する）およびＲ（ＮＲ’）Ｃ＝Ｎ−部分（基は「Ｎ２」窒素に存在する）を指し、式中、ＲおよびＲ’は水素、アルキル、アリール、またはアラルキルであってもよい。
【００８８】
本明細書では、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のピリミジン化合物の非毒性酸またはアルカリ土類金属塩を指す。これらの塩は、ピリミジン化合物の最終単離および精製において現場調製することができ、あるいは別個に塩基または酸官能基をそれぞれ好適な有機または無機の酸または塩基と反応させることによって調製することができる。代表的な塩としては、下記が挙げられるが、これらに限定されない：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロイオン酸塩（phenylproionate）、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩。また、塩基性窒素含有基は、塩化メチル、エチル、プロピル、およびブチル、臭化メチル、エチル、プロピル、およびブチル、ならびにヨウ化メチル、エチル、プロピル、およびブチルなどのハロゲン化アルキル；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルのような硫酸ジアルキル、塩化デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル、臭化デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル、ならびにヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルなどの長鎖ハロゲン化物、臭化ベンジルおよびフェネチルのようなハロゲン化アラルキルのような作用剤などを用いて、四級化することができる。四級化によって、水溶性もしくは油溶性または分散性生成物が得られる。
【００８９】
薬学的に許容される酸付加塩を形成するために使用してもよい酸としては、塩酸、ヒドロホウ酸、硝酸、硫酸、およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸のような有機酸、クエン酸、ならびにアスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸が挙げられる。
【００９０】
塩基性付加塩は、ピリミジン化合物の最終単離および精製において現場調製することができ、あるいは別個にカルボン酸部分を薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは炭酸水素塩などの好適な塩基、あるいはアンモニア、または第一級、第二級、もしくは第三級有機アミンと反応させることによって調製することができる。薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属およびアルカリ土類金属に基づくカチオン（ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩など）、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオン（例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。塩基付加塩の形成にとって有用な他の代表的な有機アミンとしては、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミンなど、ならびにアルギニン、リシン、およびオルニチンなどの塩基性アミノ酸が挙げられる。
【実施例】
【００９１】
ＩＶ．実験材料および方法
マウス：Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−種（breeder）は、実験動物中央研究所（日本、川崎）の野村博士（Ｄｒ．Ｔ．Ｎｏｍｕｒａ）および伊藤博士（Ｄｒ．Ｍ．Ｉｔｏ）から好意により提供された。次いで、マウスを本発明者らの動物施設で無菌条件下に飼育した。無胸腺Ｃｒｌ：ＣＤ−１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕマウス（ヌードマウスと呼ぶ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｔａｌｙから購入し、無菌条件下に維持した。実験はボローニャ大学の施設内倫理委員会によって認可され、イタリアおよび欧州のガイドラインに従って行われた。
【００９２】
細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ−４７４乳がん細胞株は、最初にＤｒ．  Ｓｅｒｅｎｅｌｌａ  Ｍ．  Ｐｕｐａ  （Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｄｅｉ  Ｔｕｍｏｒｉ，  Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）から入手した。細胞株は、２０１０年１１月１１日にＤＮＡ指紋法で鑑定した（ＤＳＭＺ社（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって鑑定）。１０％ウシ胎児血清を補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地で、細胞を通常培養し、３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で維持した。培地の構成要素はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）から購入した。転移細胞／病変を可視化するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、乳がん細胞株に高感度緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ））をトランスフェクトした。Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、安定なトランスフェクタントを選択した。ＥＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡観察で監視し、細胞蛍光分析で定量した。
【００９３】
転移誘導：本研究全体を通して、２０週齢のＲａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−雌マウス９匹を使用した。０．２ｍｌのＰＢＳ中１０７個の生ヒト腫瘍細胞を右後肢または左第４（腹部）乳腺の脂肪パッドのいずれかに皮下注射して、局所腫瘍が誘導された。腫瘍の直径をデジタルノギスで定期的に測定し、腫瘍容積をπ／２×［√（ａ×ｂ）］３／６）（式中、ａ＝最大腫瘍直径およびｂ＝ａに垂直な腫瘍長径）として算出した。静脈内（ｉ．ｖ．）投与の場合、０．４ｍｌのＰＢＳ中２×１０６個の細胞を尾静脈に注射した。ヒト腫瘍細胞を注射する２４時間前に、ヌードマウス（５〜６週齢）を抗−ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１抗血清（Ｗａｋｏ社（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））の１：３０のＰＢＳ希釈物０．４ｍｌで静脈内処置して、ＮＫ活性を枯渇させた。実験的転移を検出可能になった時刻を評価するために、各細胞株についてパイロット実験を行った。
【００９４】
転移検出および定量化：担腫瘍マウスを、腫瘍および転移成長に応じて様々な時刻に屠殺し（結果を参照のこと）、精密な屍検にかけた。肺を黒色インディアインクで染色して、転移の輪郭をより際立たせ、Ｆｅｋｅｔｅ’ｓ液中で固定した。解剖顕微鏡を使用して、肺および肝臓転移を計数した。ＥＧＦＰ発現細胞を注入すると、Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓイメージングシステム（Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，  ＣＡ））を使用して、マウス全体および解剖した器官を慎重に調査して、蛍光転移性沈着物（fluorescent metastatic deposit）を検出した。脳および骨髄における転移量（metastatic load）の定量化を、免疫蛍光検査と、その後に続く細胞蛍光分析およびリアルタイムＰＣＲで行った。脳をハサミで細切し、７０μｍの細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ，  ＵＳＡ））に通して、均質な細胞懸濁液を得た。ＰＢＳで両大腿骨から骨髄を洗い流し、７０μｍのストレーナーに通して濾過した。フィコエリトリンで標識されているヒトＨＥＲ−２に対するマウスモノクローナル抗体（クローンＮｅｕ  ２４．７、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ））を使用して、細胞蛍光分析でヒト細胞を定量した。５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン、０．４５％イゲパル、０．４５％ツイーン２０、および１２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（試薬はすべてＳｉｇｍａ社（Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ））を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ８．３）を用いて、５６℃で終夜インキュベートし、続いて９５℃で３０分間インキュベートして、プロテイナーゼＫを失活させることによって抽出したゲノムＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを行った。ヒト１７番染色体の一続きのアルファサテライト領域を増幅した。プライマーおよびプローブ配列はＢｅｃｋｅｒらに由来する（British Journal of Cancer 2002, 87:1328-1335）が、プローブにはクエンチャー非蛍光色素ＴＡＭＲＡを３’末端に有するという唯一の改変がなされている。最終量２５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ））中２５０ｎＭプライマーおよび１００ｎＭプローブを使用して、１試料当たり１００ｎｇのＤＮＡを増幅した。９５℃で１０分間の初期の変性ステップを行った後、４５サイクル（９５℃：３０秒＋６０℃：１分）の増幅を５７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。ヒト細胞を定量するために、スカラー量のＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト細胞をマウス全脳由来の細胞に添加することによって検量線を作成した。実験試料から得られたＣｔ（閾値サイクル数）値を、各ＰＣＲにおける検量線の範囲に内挿した。
【００９５】
化合物Ａを用いた転移療法：１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）／ポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ３００）（Ｆｌｕｋａ社）（１０／９０、体積／体積）で化合物Ａを製剤化した。溶液（７．５ｍｇ／ｍｌ）は、各処置日にあらたに調製し、慎重に遮光した。１群６〜９匹の雌性Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−に４５３−ＥＧＦＰ細胞を静脈内投与した。細胞注射の翌日から、１日５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを経口投与し、対照マウスにはビヒクルを単独で投与した。第１週には、マウスに４回薬物投与を行い、次週以降には５回薬物投与を行い、総計３７回処置を行った。最後に投与してから１〜４日後にマウスを屠殺した。
【００９６】
Ｖ．実験結果
Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスにおける腫瘍増殖および転移拡散：興味深い多くのヒト乳がん細胞株、特にＨＥＲ−２を発現するヒト乳がん細胞株は、ヌードマウスにおいて増殖が低く、ＮＫを枯渇させる抗体で受容者が処置されていることによって、ＮＫ活性が一時的に遮断されている場合でさえ、通常転移しない。ＨＥＲ−２＋  ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ−４７４細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍原性を示さなかった。同じ細胞が、Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスにおいて同所（乳房内）投与と皮下投与の後の両方に非常に短い潜伏時間で進行性局所腫瘍を生じた。
【００９７】
Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスにおける転移性播種は広範であり、肺、肝臓、骨、および脳を含めて、ヒト患者においてよく冒される部位すべてに到達した。興味深いことに、局所腫瘍からの転移拡散は、同所または皮下増殖する腫瘍間でわずかしか差がなく、悪性の高い方のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株および悪性の低い方のＢＴ−４７４に関係することは両方である。細胞の静脈内投与はＢＴ−４７４細胞の転移拡散を有意に高め、冒されたマウスの割合は１００％に達した。
【００９８】
様々な転移負荷を様々な器官において観察し、ＥＧＦＰタグを付加した細胞の使用は、骨、肝臓、および脳における転移性沈着物の精密な検出を可能にする助けとなった。しかし、Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスにおける転移拡散の評価は、ＥＧＦＰ検出に限定されなかった。例えば、本発明者らは、ヒト特異的プライマーを用いたｑＰＣＲを使用して、脳における転移負荷を定量し、フローサイトメトリーを使用して、骨髄におけるＨＥＲ−２−陽性播種性腫瘍細胞を検出した（図２）。
【００９９】
脳転移：脳は転移拡散がよく見られる部位であるが、免疫不全マウスにおける腫瘍増殖は、独特な細胞株、選択された変種、および／または特別な注入経路が使用されない限り、ヒト腫瘍のこの致命的な特性を再現できない。一方、局所腫瘍から脳への自発性転移は、Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスにおいてよくみられ、その頻度は静脈内注射後１００％に達した。要するに、Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスは、脳播種の研究の精巧なモデルである。
【０１００】
播種性ヒト乳がんの治療：現在の治療法は様々な器官における転移性再発のリスクを改変し、例えばモノクローナル抗体は脳転移のリスクを高めるように思われるので、ヒト乳がんの転移性播種は、治療上の大きな課題であり、動く標的である（７）。したがって、多器官転移性播種のマウスモデルは、新規抗転移薬を調査するための重要なツールである。血液−脳関門の透過が優れた選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤である（８）化合物Ａは、４５３−ＥＧＦＰ細胞の様々な標的臓器における転移成長に影響を及ぼした。化合物Ａは、極めて大幅で広範な転移負荷の低下をもたらした。複数の部位において、かなりの割合のマウスには転移がなかった（図１Ａ）。骨転移の数は６７％減少した（図２Ｃ）。脳や肺などのより重度にコロニー形成されている器官でさえ、化合物Ａは４５３−ＥＧＦＰの成長を強く阻害した（図１Ｂ−Ｃ）。脳転移に対する化合物Ａの治療活性をより適切に評価するために、ヒト特異的ｑＰＣＲまたはＨＥＲ−２フローサイトメトリーを使用して、ヒト細胞を定量した。化合物Ａで処置されたマウスの脳において、両方の技術を用いて、ヒト細胞の数で９０％を超える阻害が認められた（図２Ａ−Ｂ）。
【０１０１】
脳を含めて複数の器官における転移成長を制御する際の化合物Ａの有効性によって、類似の臨床症状における臨床的影響が予想される。
【０１０２】
ＶＩ．参考文献
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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