(57)【要約】血清アルブミンについての結合特異性を伴う新たな設計リピートタンパク質、ならびにそのような血清アルブミン結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、治療的に関連するポリペプチドの薬物動態を改変するためのそのようなタンパク質の使用、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用を記載する。本発明のリピートタンパク質は、血清アルブミンに結合しないタンパク質と比較して、血漿中で実質的に増加した半減期を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、該アンキリンリピートドメインは、配列番号４９、５０、５１、及び５２ならびに配列番号４９、５０、５１、及び５２における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む結合タンパク質。
【請求項２】
少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該リピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、該アンキリンリピートドメインは、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により欠損している結合タンパク質。
【請求項３】
アンキリンリピートドメインが、配列番号３２のアンキリンリピートドメインと比較して、哺乳動物において少なくとも５倍高い血漿中終末相半減期を有する、請求項１又は２の結合タンパク質。
【請求項４】
アンキリンリピートドメインが、ヒトにおいて、少なくとも１日の血漿中終末相半減期を有する、請求項１又は２の結合タンパク質。
【請求項５】
生物活性化合物をさらに含む請求項１又は２の結合タンパク質であって、ここで、該結合タンパク質が、未修飾の生物活性化合物での血漿中終末相半減期と比較して、哺乳動物において少なくとも２倍高い血漿中終末相半減期を有し、ここで、より高い終末相半減期が、アンキリンリピートドメインにより、該結合タンパク質に与えられる結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化１７】
2014501509.tif 000021
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｉ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｗ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ａ、及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｇ及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｎ、Ｔ、及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｎ、Ｖ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ７は、Ｅ、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｔ、及びＧからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ８は、Ｅ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ９は、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｈ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号５３においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項７】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化１８】
2014501509.tif 000022
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｉ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｗ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ａ、及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｎ、Ｔ、及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｎ、Ｖ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｅ、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｔ、及びＧからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｈ、及びＮ；好ましくは、Ｙ及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１０においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項８】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化１９】
2014501509.tif 000023
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｄ、Ｋ、及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｅ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｔ、及びＧからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｇ及びＤからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、及びＧからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｈ、Ｙ、Ａ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１１においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項９】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化２０】
2014501509.tif 000024
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｆ、Ｓ、Ｌ、及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｖ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｒ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｓ及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｔ、及びＥからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号５４においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化２１】
2014501509.tif 000025
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｆ、Ｓ、Ｌ、及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｖ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｒ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｓ及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１２においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化２２】
2014501509.tif 000026
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｋ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ａ、及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｉ及びＭからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｈ、Ｙ、Ｋ、Ａ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１３においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１又は２記載の結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメインが、アンキリンリピート配列モチーフ
【化２３】
2014501509.tif 000027
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｑ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｌ及びＰからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｈ、Ｎ、Ｙ、及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｇ及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ａ、Ｖ、Ｔ、及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｖ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１４においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される結合タンパク質。
【請求項１３】
アンキリンリピートドメインが、哺乳動物の血清アルブミンへの結合について、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合する、請求項１又は２記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択され、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により欠損している、請求項１又は２記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の結合タンパク質又は請求項１５記載の核酸、及び、場合により、医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む医薬的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、血清アルブミンについての結合特異性を伴う設計リピートタンパク質、ならびにそのような血清アルブミン結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、生物活性化合物の薬物動態を改変するためのそのようなタンパク質の使用、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
それらの薬物動態（ＰＫ）のインビボ特性を調節又は増加させることにより、生物活性化合物（例えばタンパク質治療法など）の有効性を増加させる医薬品業界の強い関心がある。これは、特に、腎クリアランスにより循環から迅速に排除される生物活性化合物について当てはまる。腎臓は、一般的に、見掛けの分子量６０kDa未満を有する分子を循環からろ過排泄する。そのような小さな生物活性化合物の薬物動態特性を改善するための１つの戦略は、例えば、非タンパク質性ポリマー部分（例えばポリエチレングリコールポリマー又は糖残基など）の付加あるいはタンパク質性ポリマー部分（例えば球状タンパク質など）又は非構造ポリペプチド（例えばWO 2007/103515及びWO 2008/155134に記載されるものなど）の付加を通じて、単純に見掛けの分子量を増加させること（即ち、それらの流体力学半径を増加させること）である。
【０００３】
他の戦略では、血清タンパク質（例えば免疫グロブリン及び血清アルブミンなど）の長い循環半減期を活用する。６７kDaの分子量を有する血清アルブミンは、血漿中で最も豊富なタンパク質であり、約５０mg/ml（０．６mM）で存在し、ヒトにおける１９日の血清中半減期を有する。血清アルブミンは、血漿ｐＨを維持するために役立ち、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役割を果たす。記載されてきた、アルブミン中のいくつかの主要な小分子結合部位がある。
【０００４】
血清アルブミンとの非共有結合的な会合によって、短命の小分子又はポリペプチドの半減期を延ばすことができることが示されている（WO 1991/001743）。血清アルブミンに特異的に結合しており、それにより、それらに結合された他の分子のインビボでの半減期に延ばすことができるポリペプチドは、細菌アルブミン結合ドメインの変異体（例、WO 2005/097202及びWO 2009/016043）、小さなペプチド（例、Dennis, M.S., et al., J. Biol. Chem. 277(3), 35035-43, 2002及びWO 2001/045746）、及び免疫グロブリンのフラグメント（例、WO 2008/043822、WO 2004/003019; WO 2008/043821; WO 2006/040153; WO 2006/122787及びWO 2004/041865）を含む。WO 2008/043822は、免疫グロブリンのフラグメント以外の結合タンパク質、例えばプロテインＡドメイン、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計アンキリンリピート、及びＰＤＺドメインに基づく分子などを指し、それらは、血清アルブミンに特異的に結合するように生成されうる。それにもかかわらず、WO 2008/043822には、血清アルブミン（ＳＡ）についての結合特異性を伴う設計アンキリンリピートドメインも、ＳＡに特異的に結合するリピートドメインの具体的なリピート配列モチーフの選択も開示されていない。さらに、ポリペプチドのインビボでの半減期が、血清アルブミンへのそれらの遺伝子融合により延長することができることが記載された（例、WO 1991/001743）。薬物のインビボでの半減期のそのような変化は、それらの薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）特性をポジティブに変えうる。これは、新たな効率的な治療法及び疾患処置方法の開発における重要な問題である。従って、当技術分野において、生物活性化合物のＰＫ及び／又はＰＤを変える新たな方法の必要性がある。
【０００５】
抗体の他、標的分子に特異的に結合させるために使用することができる新規の結合タンパク質又は結合ドメインがある（例、Binz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat.Biotechnol.23, 1257-1268, 2005）。結合タンパク質又は結合ドメインの１つのそのような新規のクラスは、設計リピートタンパク質又は設計リピートドメインに基づく（WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol.22, 575-582, 2004；Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008）。WO 2002/020565には、リピートタンパク質の大きなライブラリーをどのように構築することができるのか、及び一般的な適用が記載されている。それにもかかわらず、WO 2002/020565には、ＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインも、ＳＡに特異的に結合するリピートドメインの具体的なリピート配列モチーフの選択も開示されていない。さらに、WO 2002/020565には、ＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインを使用し、他の分子のＰＫ又はＰＤを調節することができることは示唆されていない。これらの設計リピートドメインは、リピートタンパク質のモジュラー性質を活用し、ドメインの疎水性コアを遮蔽することにより、設計リピートドメインを凝集から防止するためのＮ末端及びＣ末端キャッピングモジュールを持つ（Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. and Pluckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003）。これらのキャッピングモジュールは、天然グアニン−アデニン結合タンパク質（ＧＡ結合タンパク質）のキャッピングリピートに基づいた。これらの設計アンキリンリピートドメインの熱的及び熱力学的安定性は、ＧＡ結合タンパク質に由来するＣ末端キャッピングリピートを改善することによりさらに増加されうることが示された（Interlandi, G., Wetzel, S.K, Settanni, G., Pluckthun, A. and Caflisch, A., J. Mol. Biol. 375, 837-854, 2008；Kramer, M.A, Wetzel, S.K., Pluckthun, A., Mittl, P.R.E, and Grutter, M.G., J. Mol. Biol. 404, 381-391, 2010）。著者らは、このキャッピングモジュール中に合計８つの変異を導入し、３つの異なるアミノ酸を加えることにより、そのＣ末端ヘリックスを伸張させた。それにもかかわらず、Ｃ末端キャッピングモジュールにおけるこれらの修飾の導入は、この変異Ｃ末端キャッピングモジュールを保有する設計リピートドメインの不要な二量体化の傾向をもたらした。このように、アンキリンリピートドメインのさらなる最適化されたＣ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングリピートの生成についての必要性がある。
【０００６】
現在利用可能なアプローチを用いてＰＫ及び／又はＰＤを調節するためにＳＡを標的化することは、常に効果的であるわけではない。ＳＡをハイジャックすることによる分子のＰＫ及び／又はＰＤの調節は複雑でまだ完全には理解されていないことが次第に明らかになってきている。
【０００７】
全体的として、癌及び他の病理学的状態を処置するための治療的な関連分子又はポリペプチドのＰＫ及び／ＰＤを改善させることができるＳＡについての特異性を伴う、改善された結合タンパク質についての要望が存在する。
【０００８】
本発明の根底にある技術的問題は、癌及び他の病理学的状態の改善された処置のための治療的な関連分子のＰＫ及び／ＰＤを改変することができる、新規の結合タンパク質、例えば、ＳＡへの結合特異性を伴うリピートドメインなどを同定することである。この技術的問題への解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施態様を提供することにより達成される。
【０００９】
発明の概要
本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号４９、５０、５１、及び５２、ならびに、配列番号４９、５０、５１、及び５２中の９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により置換されている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む。
【００１０】
さらなる実施態様において、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記リピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により欠損している。
【００１１】
特に、本発明は、本明細書において定義される結合タンパク質に関し、ここで、アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンへの結合について、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合する。
【００１２】
さらに、本発明は、生物活性化合物を含むそのような結合タンパク質、特に、前記の未修飾の生物活性化合物での血漿中終末相半減期と比較して、哺乳動物において少なくとも２倍高い血漿中終末相半減期を有する生理活性化合物を含む結合タンパク質に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質をコードする核酸分子、及び上で言及する結合タンパク質又は核酸分子の１つ又はそれ以上を含む医薬的組成物に関する。
【００１４】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質を使用した病理学的状態の処置の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】ＳＥＣによる、選択されたＤＡＲＰｉｎの安定性解析。ｘＳＡについての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実行の溶出プロファイルであって、ＰＢＳ中の３０mg/ml（〜２mM）での４０℃で２８日間にわたるインキュベーション前（図１ａ）、後（図１ｂ）、又は、−８０℃で１ヶ月間にわたる保存後（図１ｃ）、Superdex 200カラム5/150を用いて（図１ａ又は図１ｂ）又はSuperdex 20010/300GL（図１ｃ）を用いて解析した。全てのサンプルを、実施例１に記載する通りに発現及び精製した。ＳＥＣ解析のために、サンプルを濃度５００μMに希釈した。分子量スタンダード、アプロチニン（ＡＰ）６．５kDa、炭酸脱水酵素（ＣＡ）２９kDa、及びコンアルブミン（ＣＯ）７５kDaを矢印で示している。ｘＳＡ、哺乳動物の血清アルブミン、Ａ、２８０nmでの吸光度；ｔ、分での保持時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１９）；ＤＡＲＰｉｎ＃２０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２０）；ＤＡＲＰｉｎ＃２１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２１）；ＤＡＲＰｉｎ＃２２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２２）；ＤＡＲＰｉｎ＃２７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２７）；ＤＡＲＰｉｎ＃２８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２８）；ＤＡＲＰｉｎ＃２９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２９）；ＤＡＲＰｉｎ＃３０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３０）；ＤＡＲＰｉｎ＃４３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４３）；ＤＡＲＰｉｎ＃４４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４４）；ＤＡＲＰｉｎ＃４５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４５）；ＤＡＲＰｉｎ＃４６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４６）；ＤＡＲＰｉｎ＃４７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４７）；ＤＡＲＰｉｎ＃４８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４８）。
【図１ｂ】ＳＥＣによる、選択されたＤＡＲＰｉｎの安定性解析。ｘＳＡについての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実行の溶出プロファイルであって、ＰＢＳ中の３０mg/ml（〜２mM）での４０℃で２８日間にわたるインキュベーション前（図１ａ）、後（図１ｂ）、又は、−８０℃で１ヶ月間にわたる保存後（図１ｃ）、Superdex 200カラム5/150を用いて（図１ａ又は図１ｂ）又はSuperdex 20010/300GL（図１ｃ）を用いて解析した。全てのサンプルを、実施例１に記載する通りに発現及び精製した。ＳＥＣ解析のために、サンプルを濃度５００μMに希釈した。分子量スタンダード、アプロチニン（ＡＰ）６．５kDa、炭酸脱水酵素（ＣＡ）２９kDa、及びコンアルブミン（ＣＯ）７５kDaを矢印で示している。ｘＳＡ、哺乳動物の血清アルブミン、Ａ、２８０nmでの吸光度；ｔ、分での保持時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１９）；ＤＡＲＰｉｎ＃２０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２０）；ＤＡＲＰｉｎ＃２１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２１）；ＤＡＲＰｉｎ＃２２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２２）；ＤＡＲＰｉｎ＃２７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２７）；ＤＡＲＰｉｎ＃２８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２８）；ＤＡＲＰｉｎ＃２９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２９）；ＤＡＲＰｉｎ＃３０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３０）；ＤＡＲＰｉｎ＃４３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４３）；ＤＡＲＰｉｎ＃４４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４４）；ＤＡＲＰｉｎ＃４５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４５）；ＤＡＲＰｉｎ＃４６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４６）；ＤＡＲＰｉｎ＃４７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４７）；ＤＡＲＰｉｎ＃４８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４８）。
【図１ｃ】ＳＥＣによる、選択されたＤＡＲＰｉｎの安定性解析。ｘＳＡについての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実行の溶出プロファイルであって、ＰＢＳ中の３０mg/ml（〜２mM）での４０℃で２８日間にわたるインキュベーション前（図１ａ）、後（図１ｂ）、又は、−８０℃で１ヶ月間にわたる保存後（図１ｃ）、Superdex 200カラム5/150を用いて（図１ａ又は図１ｂ）又はSuperdex 20010/300GL（図１ｃ）を用いて解析した。全てのサンプルを、実施例１に記載する通りに発現及び精製した。ＳＥＣ解析のために、サンプルを濃度５００μMに希釈した。分子量スタンダード、アプロチニン（ＡＰ）６．５kDa、炭酸脱水酵素（ＣＡ）２９kDa、及びコンアルブミン（ＣＯ）７５kDaを矢印で示している。ｘＳＡ、哺乳動物の血清アルブミン、Ａ、２８０nmでの吸光度；ｔ、分での保持時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１９）；ＤＡＲＰｉｎ＃２０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２０）；ＤＡＲＰｉｎ＃２１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２１）；ＤＡＲＰｉｎ＃２２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２２）；ＤＡＲＰｉｎ＃２７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２７）；ＤＡＲＰｉｎ＃２８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２８）；ＤＡＲＰｉｎ＃２９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２９）；ＤＡＲＰｉｎ＃３０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３０）；ＤＡＲＰｉｎ＃４３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４３）；ＤＡＲＰｉｎ＃４４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４４）；ＤＡＲＰｉｎ＃４５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４５）；ＤＡＲＰｉｎ＃４６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４６）；ＤＡＲＰｉｎ＃４７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４７）；ＤＡＲＰｉｎ＃４８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４８）。
【図２ａ】選択されたＤＡＲＰｉｎの熱的安定性。ｐＨ７．４のＰＢＳ中（図２ａ）及びｐＨ５．８のＭＥＳ緩衝液中（図２ｂ）（２５０mM（２−Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ｐＨ５．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１から４（ｖ／ｖ）に混合し、ｐＨを５．８に調整）でのｘＳＡについての特異性（それに続く、緩衝液中に存在する色素ＳＹＰＲＯオレンジの蛍光強度の増加）を伴うＤＡＲＰｉｎの熱変性からのトレース。Ｆ、相対蛍光単位（ＲＦＵ）、５１５〜５３５nmでの励起、５６０〜５８０nmでの検出；Ｔ、℃での温度；ＤＡＲＰｉｎの定義、上を参照のこと。
【図２ｂ】選択されたＤＡＲＰｉｎの熱的安定性。ｐＨ７．４のＰＢＳ中（図２ａ）及びｐＨ５．８のＭＥＳ緩衝液中（図２ｂ）（２５０mM（２−Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ｐＨ５．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１から４（ｖ／ｖ）に混合し、ｐＨを５．８に調整）でのｘＳＡについての特異性（それに続く、緩衝液中に存在する色素ＳＹＰＲＯオレンジの蛍光強度の増加）を伴うＤＡＲＰｉｎの熱変性からのトレース。Ｆ、相対蛍光単位（ＲＦＵ）、５１５〜５３５nmでの励起、５６０〜５８０nmでの検出；Ｔ、℃での温度；ＤＡＲＰｉｎの定義、上を参照のこと。
【図３ａ】マウスにおける、選択されたＤＡＲＰｉｎの血漿クリアランス。ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）についての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎ及びコントロールＤＡＲＰｉｎの血漿からのクリアランスを、マウスにおいて評価した。（図３ａ）ＭＳＡについての結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２（下を参照のこと）と比較した、ＭＳＡについての結合特異性を伴うちょうど１つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ。（図３ｂ）ＭＳＡについての結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した、２つのタンパク質ドメイン（その１つが、ＭＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインである）を含むＤＡＲＰｉｎ。ＤＡＲＰｉｎを、Ｈｉｓタグを介して、９９ｍＴｃ−カルボニル化合物を用いて標識し、マウスにおいて静脈内注射した。注射されたマウスの血液での放射活性を、注射後の異なる時間点で測定し、９９ｍＴｃ（%ＩＤ）の放射性崩壊について補正された注射用量の比率として示した。近似曲線は、異なる時間点で測定された放射活性の非線形回帰の結果を示す−二相崩壊（Graphpad Prism）。各々のデータポイントは、１群当たり２匹のマウスでの平均を示す。%ＩＤ、９９ｍＴｃの放射性崩壊について補正された注射用量のパーセント；ｔ、時間での時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１８）；ＤＡＲＰｉｎ＃２３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２３）；ＤＡＲＰｉｎ＃２５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２５）；ＤＡＲＰｉｎ＃３２（ｘＳＡへの結合特異性を伴わないネガティブコントロールＤＡＲＰｉｎ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３２）；ＤＡＲＰｉｎ＃３３（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３３）；ＤＡＲＰｉｎ＃３５（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３５）；ＤＡＲＰｉｎ＃３６（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３６）。
【図３ｂ】マウスにおける、選択されたＤＡＲＰｉｎの血漿クリアランス。ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）についての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎ及びコントロールＤＡＲＰｉｎの血漿からのクリアランスを、マウスにおいて評価した。（図３ａ）ＭＳＡについての結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２（下を参照のこと）と比較した、ＭＳＡについての結合特異性を伴うちょうど１つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ。（図３ｂ）ＭＳＡについての結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した、２つのタンパク質ドメイン（その１つが、ＭＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインである）を含むＤＡＲＰｉｎ。ＤＡＲＰｉｎを、Ｈｉｓタグを介して、９９ｍＴｃ−カルボニル化合物を用いて標識し、マウスにおいて静脈内注射した。注射されたマウスの血液での放射活性を、注射後の異なる時間点で測定し、９９ｍＴｃ（%ＩＤ）の放射性崩壊について補正された注射用量の比率として示した。近似曲線は、異なる時間点で測定された放射活性の非線形回帰の結果を示す−二相崩壊（Graphpad Prism）。各々のデータポイントは、１群当たり２匹のマウスでの平均を示す。%ＩＤ、９９ｍＴｃの放射性崩壊について補正された注射用量のパーセント；ｔ、時間での時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１８）；ＤＡＲＰｉｎ＃２３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２３）；ＤＡＲＰｉｎ＃２５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２５）；ＤＡＲＰｉｎ＃３２（ｘＳＡへの結合特異性を伴わないネガティブコントロールＤＡＲＰｉｎ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３２）；ＤＡＲＰｉｎ＃３３（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３３）；ＤＡＲＰｉｎ＃３５（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３５）；ＤＡＲＰｉｎ＃３６（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３６）。
【図４ａ】カニクイザルにおける選択されたＤＡＲＰｉｎの血漿クリアランス。ＣＳＡ（カニクイザル血清アルブミン）についての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎ及びコントロールＤＡＲＰｉｎの血漿からのクリアランスを、カニクイザルにおいて評価した。（図４ａ）ＤＡＲＰｉｎ＃２６を、ＣＳＡへの結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した。（図４ｂ）ＤＡＲＰｉｎ＃２４、３４、及び１７を、ＣＳＡへの結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した。以下のＤＡＲＰｉｎを、カニクイザルにおいて、ｔ＝０時間で、濃度０．５mg/ml（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２６、ＤＡＲＰｉｎ＃２４、ＤＡＲＰｉｎ＃１７、及びＤＡＲＰｉｎ＃３２）又は１mg/ml（ＤＡＲＰｉｎ＃３４）で静脈内注射した。サルの血漿中でのＤＡＲＰｉｎの濃度を、ＥＬＩＳＡにより、注射後の異なる時間点で測定した。曲線は、異なる時間点で測定された濃度の非線形回帰の結果を示す−二相崩壊（Graphpad Prism）。第二相から、ＤＡＲＰｉｎの血漿中終末相半減期を決定することができる。各々の単一のデータポイントは、同じ血清サンプルの２つの非依存的なＥＬＩＳＡ測定値の平均を示す。Ｃ、nMでのＤＡＲＰｉｎ濃度；ｔ、時間での時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１７）；ＤＡＲＰｉｎ＃２４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２４）；ＤＡＲＰｉｎ＃２６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２６）；ＤＡＲＰｉｎ＃３２（ｘＳＡへの結合特異性を伴わないネガティブコントロールＤＡＲＰｉｎ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３２）；ＤＡＲＰｉｎ＃３４（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３４）。
【図４ｂ】カニクイザルにおける選択されたＤＡＲＰｉｎの血漿クリアランス。ＣＳＡ（カニクイザル血清アルブミン）についての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎ及びコントロールＤＡＲＰｉｎの血漿からのクリアランスを、カニクイザルにおいて評価した。（図４ａ）ＤＡＲＰｉｎ＃２６を、ＣＳＡへの結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した。（図４ｂ）ＤＡＲＰｉｎ＃２４、３４、及び１７を、ＣＳＡへの結合特異性を有していないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した。以下のＤＡＲＰｉｎを、カニクイザルにおいて、ｔ＝０時間で、濃度０．５mg/ml（ＤＡＲＰｉｎ  ＃２６、ＤＡＲＰｉｎ＃２４、ＤＡＲＰｉｎ＃１７、及びＤＡＲＰｉｎ＃３２）又は１mg/ml（ＤＡＲＰｉｎ＃３４）で静脈内注射した。サルの血漿中でのＤＡＲＰｉｎの濃度を、ＥＬＩＳＡにより、注射後の異なる時間点で測定した。曲線は、異なる時間点で測定された濃度の非線形回帰の結果を示す−二相崩壊（Graphpad Prism）。第二相から、ＤＡＲＰｉｎの血漿中終末相半減期を決定することができる。各々の単一のデータポイントは、同じ血清サンプルの２つの非依存的なＥＬＩＳＡ測定値の平均を示す。Ｃ、nMでのＤＡＲＰｉｎ濃度；ｔ、時間での時間；ＤＡＲＰｉｎ＃１７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号１７）；ＤＡＲＰｉｎ＃２４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２４）；ＤＡＲＰｉｎ＃２６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号２６）；ＤＡＲＰｉｎ＃３２（ｘＳＡへの結合特異性を伴わないネガティブコントロールＤＡＲＰｉｎ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３２）；ＤＡＲＰｉｎ＃３４（２つのリピートドメインを含むＤＡＲＰｉｎ、ｘＳＡについての結合特異性を伴う１つ、そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３４）。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明に従った結合ドメインは、哺乳動物の血清アルブミン（ｘＳＡ）について特異的である。好ましくは、本発明に従った結合ドメインは、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、サル、又はヒト由来の血清アルブミンについて特異的である。より好ましくは、本発明に従った結合ドメインは、ヒト由来の血清アルブミン（ＨＳＡ）について特異的である。
【００１７】
用語「タンパク質」はポリペプチドを指し、ここで、ポリペプチドの少なくとも部分は、そのポリペプチド鎖内及び／又は間の二次、三次、又は四次構造を形成することにより、定義された三次元配置を有する、又は、得ることができる。タンパク質が２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む場合、個々のポリペプチド鎖は非共有結合的又は共有結合的に、例えば、２つのポリペプチドの間のジスルフィド結合により連結されうる。タンパク質の部分は、二次又は三次構造を形成することにより定義された三次元配置を個々に有する、又は、得ることができ、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【００１８】
用語「組換え」は、組換えタンパク質、組換えタンパク質ドメイン、組換え結合タンパク質などで使用される通り、前記ポリペプチドが、当業者により周知である組換えＤＮＡ技術の使用により産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例、遺伝子合成により産生される）を、細菌発現プラスミド（例、ｐＱＥ３０、Qiagen）、酵母発現プラスミド、又は哺乳動物発現プラスミド中にクローン化することができる。例えば、そのような構築された組換え細菌発現プラスミドは、適切な細菌（例、大腸菌）中に挿入される場合、この細菌は、この組換えＤＮＡによりコードされるポリペプチドを産生することができる。対応して産生されたポリペプチドは、組換えポリペプチドと呼ばれる。
【００１９】
本発明に関連して、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数、即ち、２つ又はそれ以上のアミノ酸の１つ又は複数の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結された８を上回るアミノ酸からなる。
【００２０】
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に付着したアミノ酸配列を指し、ここで、前記アミノ酸配列は、前記ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、又は標的化のために有用であり、あるいは、ここで、前記アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、あるいは、ここで、前記アミノ酸配列はエフェクター機能を持つ。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグ、成分、及び／又はドメインを、互いに直接的に又はポリペプチドリンカーを介して接続してもよい。これらのポリペプチドタグは、全て、当技術分野において周知であり、当業者に完全に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小さなポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ（例、配列番号１５のＨｉｓタグ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、もしくはＳｔｒｅｐタグ又は部分、例えば酵素など（例えば、アルカリフォスファターゼなどの酵素）、それらは前記ポリペプチド／タンパク質の検出を許し、又は標的化のため（例えば免疫グロブリン又はそのフラグメントなど）及び／又はエフェクター分子として使用することができる部分である。
【００２１】
用語「ポリペプチドリンカー」はアミノ酸配列を指し、それらは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非ポリペプチド部分（例えばポリエチレングルコールなど）、又は２つの配列タグを連結することができる。そのような追加ドメイン、タグ、非ポリペプチド部分、及びリンカーは、当業者に公知である。例のリストは、特許出願WO 2002/020565の明細書に提供されている。そのようなリンカーの特定の例は、可変長のグリシン−セリンリンカー及びプロリン−スレオニンリンカーである；好ましくは、前記リンカーは２〜２４個の間のアミノ酸の長さを有する；より好ましくは、前記リンカーは、２〜１６個の間のアミノ酸の長さを有する。グリシン−セリンリンカーの例を、配列番号１６に提供する。
【００２２】
用語「ポリマー部分」は、タンパク質性ポリマー部分又は非タンパク質性ポリマー部分のいずれかを指す。「タンパク質性ポリマー部分」は、好ましくは、安定な三次構造を形成しないものの、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の濃度約０．１mMで室温（ＲＴ）で１ヶ月間にわたり保存した場合、１０%以下、好ましくは、５%以下；また、好ましくは、２%以下；さらにより好ましくは、１%以下；及び、最も好ましくは、検出不能量のオリゴマー又は凝集物を形成するポリペプチドである（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定される）。そのようなタンパク質性ポリマー部分は、ＳＥＣ用の分子量スタンダードとして球状タンパク質を使用した場合、ＳＥＣにおいてそれらの有効分子量よりも高い見掛かけの分子量で流れる。好ましくは、ＳＥＣにより決定される前記タンパク質性ポリマー部分の見掛けの分子量は、それらのアミノ酸配列から算出されたそれらの有効分子量よりも１．５×、２×、又は２．５×高い。また、好ましくは、ＳＥＣにより決定される前記非タンパク質性ポリマー部分の見掛けの分子量は、それらの分子組成から算出された、それらの有効分子量よりも２×、４×、又は８×高い。好ましくは、前記タンパク質性ポリマー部分のアミノ酸の５０%、７０%、又はさらに９０%超は、円偏光二色性（ＣＤ）測定により決定される通り、ＰＢＳ中での濃度約０．１ｍＭで、室温で安定な二次構造を形成しない。最も好ましくは、前記タンパク質性ポリマーは、ランダムコイル立体構造の典型的な近紫外ＣＤスペクトルを示す。そのようなＣＤ解析は、当業者に周知である。また、好ましいのは、５０を上回る、好ましくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００を上回る、又は最も好ましくは８００を上回るアミノ酸からなるタンパク質性ポリマー部分である。タンパク質性ポリマー部分の例は、XTEN（登録商標）（Amunixの登録商標；WO 2007/103515）ポリペプチド、又はプロリン残基、アラニン残基、及びセリン残基を含むポリペプチド（WO 2008/155134に記載されている通り）である。そのようなタンパク質性ポリマー部分を、例えば、標準的なＤＮＡクローニング技術、それに続く、それらの標準的な発現及び精製を使用した遺伝子融合ポリペプチドの生成により、本発明の結合ドメインに共有結合的に付着させることができる。
【００２３】
本発明のポリマー部分は、分子量において広く変動しうる（即ち、約１kDa〜約１５０kDaまで）。好ましくは、ポリマー部分は、少なくとも２、より好ましくは少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、又は最も好ましくは少なくとも１００kDaの分子量を有する。好ましくは、前記ポリマー部分は、ポリペプチドリンカーにより結合ドメインに接続される。
【００２４】
非タンパク質ポリマー部分の例は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンである。用語「ＰＥＧ化された」は、ＰＥＧ部分が、例えば、本発明のポリペプチドに共有結合的に付着されていることを意味する。
【００２５】
特定の実施態様において、ＰＥＧ部分又は任意の他の非タンパク質性ポリマーを、例えば、マレイミドリンカーを介して、システインチオールに結合することができ、システインは、本明細書に記載する通り、ペプチドリンカーを介して、結合ドメインのＮ又はＣ末端に結合されている。
【００２６】
用語「結合タンパク質」は、下でさらに説明する通り、１つ又は複数の結合ドメイン、１つ又は複数の生物活性化合物、及び１つ又は複数のポリマー部分を含むタンパク質を指す。好ましくは、前記の結合タンパク質は、４つまでの結合ドメインを含む。より好ましくは、前記の結合タンパク質は、２つまでの結合ドメインを含む。最も好ましくは、前記の結合タンパク質は、１つだけの結合ドメインを含む。さらに、任意のそのような結合タンパク質は、結合ドメイン、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、及び／又は単一のＣｙｓ残基ではない追加のタンパク質ドメインを含みうる。多量体化部分の例は、ペアになり、機能的な免疫グロブリンＦｃドメインを提供する免疫グロブリン重鎖定常領域、及びロイシンジッパー又は遊離チオールを含むポリペプチド（２つのそのようなポリペプチド間に分子間ジスルフィド結合を形成する）である。単一のＣｙｓ残基は、例えば、当業者に周知のマレイミド化学を使用することにより、他の部分をポリペプチドに共役するために使用してもよい。好ましくは、前記結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。また、好ましくは、結合タンパク質の結合ドメインは、異なる標的特異性を持つ。
【００２７】
用語「結合ドメイン」は、タンパク質スキャフォールドと同じ「フォールディング」（三次元配置）を示し、所定の特性を有するタンパク質ドメインを意味する（下に定義する通り）。そのような結合ドメインは、合理的な、又は最も一般的な、当技術分野において公知のコンビナトリアルタンパク質操作技術により得てもよい（Binz et al., 2005、前掲文献）。例えば、所定の特性を有する結合ドメインは、以下の工程を含む方法により得ることができる：（ａ）タンパク質スキャフォールド（下にさらに定義する）と同じフォールディングを示すタンパク質ドメインの多様なコレクションを提供すること；及び（ｂ）前記の多様なコレクションをスクリーニングこと及び／又は前記の所定の特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを得るために前記の多様なコレクション選択すること。タンパク質ドメインの多様なコレクションは、使用中のスクリーニング及び／又は選択システムに従ったいくつかの方法により提供され、当業者に周知の方法（例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイなど）の使用を含みうる。好ましくは、前記の結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
【００２８】
用語「タンパク質スキャフォールド」は、アミノ酸挿入、置換、又は欠失が高度に耐容できる露出表面積を伴うタンパク質を意味する。本発明の結合ドメインを生成するために使用することができるタンパク質スキャフォールドの例は、抗体又はそのフラグメント、例えば単鎖Ｆｖ又はＦａｂフラグメント、黄色ブドウ球菌からのプロテインＡ、モンシロチョウ（Pieris brassicae）からのビリン結合タンパク質又は他のリポカリン、アンキリンリピートタンパク質又は他のリピートタンパク質、及びヒトフィブロネクチンなどである。タンパク質スキャフォールドは、当業者に公知である（Binz et al., 2005、前掲文献；Binz et al., 2004、前掲文献）。
【００２９】
用語「所定の特性」は、特性（例えば標的への結合、標的の遮断、標的媒介反応の活性化、酵素活性、及び関連するさらなる特性など）を指す。所望の特性の型に依存して、当業者は、所望の特性を伴う結合ドメインのスクリーニング及び／又は選択を実施するためのフォーマット及び必要な工程を同定することができる。好ましくは、前記の所定の特性は、標的への結合である。
【００３０】
リピートタンパク質についての以下の定義は、特許出願WO 02/20565中のものに基づく。特許出願WO 2002/020565は、さらに、リピートタンパク質の特性、技術、及び適用の一般的な記載を含む。
【００３１】
用語「リピートタンパク質」は、１つ又は複数のリピートドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、４つまでのリピートドメインを含む。さらに好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、２つまでのリピートドメインを含む。最も好ましくは、リピートタンパク質の各々は、１つだけのリピートドメインを含む。さらに、前記リピートタンパク質は、追加の非リピートタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はポリペプチドリンカーを含みうる。
【００３２】
用語「リピートドメイン」は、構造単位として２つ又はそれ以上の連続リピート単位（モジュール）を含むタンパク質ドメインを指し、ここで、前記構造単位は同じフォールディングを有し、そして堅固に積み重なり、例えば、結合疎水性コアを有する超らせん構造を作製する。好ましくは、リピートドメインは、さらに、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）を含む。さらにより好ましくは、前記Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）は、キャッピングリピートである。
【００３３】
用語「設計リピートタンパク質」及び「設計リピートドメイン」は、特許出願WO 2002/020565に説明する、本発明の手順の結果として得られる、リピートタンパク質又はリピートドメインをそれぞれ指す。設計リピートタンパク質及び設計リピートドメインは、合成であり、天然からではない。それらは、それぞれ、対応して設計された核酸の発現により得られる、人工タンパク質又はドメインである。好ましくは、発現は、真核細胞もしくは原核細胞（例えば細菌細胞など）中で、又は、無細胞インビトロ発現系を使用することにより行われる。したがって、設計アンキリンリピートタンパク質（即ち、ＤＡＲＰｉｎ）は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む、本発明の結合タンパク質に対応する。
【００３４】
用語「構造単位」は、ポリペプチドの局所的に順序付けられた部分を指し、ポリペプチド鎖に沿って互いに近い二次構造の２つ又はそれ以上のセグメントの間の三次元相互作用により形成される。そのような構造単位は、構造モチーフを示す。用語「構造モチーフ」は、少なくとも１つの構造単位中に存在する二次構造エレメントの三次元配置を指す。構造モチーフは、当業者に周知である。構造単位単独では定義された三次元配置を得ることはできない；しかし、例えば、リピートドメイン中でのリピートモジュールとしてのそれらの連続配置は、隣接単位の相互安定化に導き、超らせん構造をもたらす。
【００３５】
用語「リピート単位」は、１つ又は複数の天然リピートタンパク質のリピート配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、ここで、前記「リピート単位」は複数のコピーにおいて見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての前記モチーフに共通する定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのようなリピート単位は、リピートタンパク質の「リピート構造単位（リピート）」（Forrer et al., 2003、前掲文献により記載される）又はリピートタンパク質の「連続相同構造単位（リピート）」（Binz et al, 2004、前掲文献により記載される）に対応する。そのようなリピート単位は、フレームワーク残基及び相互作用残基を含む。そのようなリピート単位の例は、アルマジロリピート単位、ロイシンリッチリピート単位、アンキリンリピート単位、テトラトリコペプチドリピート単位、ＨＥＡＴリピート単位、及びロイシンリッチ変異体リピート単位である。２つ又はそれ以上のそのようなリピート単位を含む天然タンパク質は、「天然リピートタンパク質」として言及される。リピートタンパク質の個々のリピート単位のアミノ酸配列は、互いに比較された場合、有意な数の変異、置換、付加、及び／又は欠失を有しうるが、リピート単位の一般的なパターン、又はモチーフを依然として実質的に保持する。
【００３６】
用語「アンキリンリピート単位」は、アンキリンリピート（例えば、Forrer et al., 2003、前掲文献により記載される）であるリピート単位を意味するものとする。アンキリンリピートは、当業者に周知である。
【００３７】
用語「フレームワーク残基」は、リピート単位のアミノ酸残基、又はリピートモジュールの対応するアミノ酸残基に関し、それは、フォールディングトポロジーに寄与し、即ち、それは、前記リピート単位（又はモジュール）のフォールディングに寄与する、又は、隣接単位（又はモジュール）との相互作用に寄与する。そのような寄与は、リピート単位（又はモジュール）における他の残基との相互作用、あるいはαヘリックスもしくはβシート中に見出されるポリペプチド骨格の立体構造、又は直線状ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸ストレッチに対する影響でありうる。
【００３８】
用語「標的相互作用残基」は、リピート単位のアミノ酸残基、又はリピートモジュールの対応するアミノ酸残基を指し、それは、標的物質との相互作用に寄与する。そのような寄与は、標的物質との直接的な相互作用、又は他の直接的に相互作用する残基に対する影響（例、リピート単位（又はモジュール）のポリペプチドの立体構造を安定化し、前記標的と直接的に相互作用する残基の相互作用を許す又は増強することによる）でありうる。そのようなフレームワーク残基及び標的相互作用残基は、物理化学的方法（例えばＸ線結晶解析、ＮＭＲ、及び／又はＣＤ分光法など）により得られる構造データの分析により、あるいは、構造生物学及び／又は生物情報学における当業者に周知である公知の及び関連する構造情報との比較により同定してよい。
【００３９】
好ましくは、リピート配列モチーフの推定のために使用されるリピート単位は、相同なリピート単位であり、ここで、リピート単位は同じ構造モチーフを含み、ここで、前記リピート単位のフレームワーク残基の７０%超が互いに相同である。好ましくは、前記リピート単位のフレームワーク残基の８０%超が相同である。より好ましくは、前記リピート単位のフレームワーク残基の９０%超が相同である。ポリペプチドの間の相同性のパーセントを決定するためのコンピュータプログラム（例えばＦａｓｔａ、Ｂｌａｓｔ、又はＧａｐなど）は、当業者に公知である。さらに好ましくは、リピート配列モチーフの推定のために使用されるリピート単位は、標的上で選択されたリピートドメインから得られ（例えば、実施例１に記載される通り）、同じ標的特異性を有する、相同なリピート単位である。
【００４０】
用語「リピート配列モチーフ」は、アミノ酸配列を指し、それは１つ又は複数のリピート単位又はリピートモジュールから推定される。好ましくは、前記のリピート単位又はリピートモジュールは、同じ標的についての結合特異性を有するリピートドメインからである。そのようなリピート配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。前記フレームワーク残基位置は、リピート単位（又はモジュール）のフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、前記の標的相互作用残基位置は、リピート単位（又はモジュール）の標的相互作用残基の位置に対応する。リピート配列モチーフは、固定化された位置及び無作為化された位置を含む。用語「固定化された位置」は、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、ここで、前記位置は特定のアミノ酸に設定される。ほとんどの場合、そのような固定化された位置は、フレームワーク残基の位置及び／又は特定の標的について特異的である標的相互作用残基の位置に対応する。用語「無作為化された位置」は、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、ここで、２つ又はそれ以上のアミノ酸がアミノ酸位置で許され、例えば、ここで、通常の２０の天然アミノ酸のいずれかが許され、又は、ここで、２０の天然アミノ酸の大半が許され、例えばシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などである。ほとんどの場合、そのような無作為化された位置は、標的相互作用残基の位置に対応する。しかし、フレームワーク残基の一部の位置も無作為化してもよい。
【００４１】
用語「フォールディングトポロジー」は、前記のリピート単位又はリピートモジュールの三次構造を指す。フォールディングトポロジーは、αヘリックス又はβシートの少なくとも部分を形成するアミノ酸のストレッチ、又は直線状ポリペプチド又はループを形成するアミノ酸ストレッチ、又はαヘリックス、βシート、及び／又は直線状ポリペプチド／ループの任意の組み合わせにより決定される。
【００４２】
用語「連続」は配置を指し、ここで、リピート単位又はリピートモジュールがタンデムに配置される。設計リピートタンパク質中に、少なくとも２つ、通常は約２〜６、特に少なくとも約６、高頻度には２０又はそれ以上のリピート単位（又はモジュール）がある。大半の場合において、リピートドメインのリピート単位（又はモジュール）は、高度の配列同一性（対応する位置での同じアミノ酸残基）又は配列類似性（アミノ酸残基は異なるが、しかし、類似の物理化学的特性を有する）を示し、アミノ酸残基の一部は、強く保存されている重要残基でありうる。しかし、リピートドメインの異なるリピート単位（又はモジュール）の間でのアミノ酸の挿入及び／又は欠失、及び／又は置換による高度な配列変動性は、リピート単位（又はモジュール）の共通のフォールディングトポロジーが維持される限り可能でありうる。
【００４３】
物理化学的手段（Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、又はＣＤ分光法など）によりリピートタンパク質のフォールディングトポロジーを直接的に決定するための方法が、当業者に周知である。リピート単位又はリピート配列モチーフを同定及び決定するため、又は、そのようなリピート単位又はモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定するための方法、例えば、ホモロジー検索（ＢＬＡＳＴなど）は、生物情報学の分野において十分に確立されており、当業者に周知である。初期リピート配列モチーフを改良する工程は、反復プロセスを含みうる。
【００４４】
用語「リピートモジュール」は、設計リピートドメインの繰り返しアミノ酸配列を指し、それらは、本来、天然のリピートタンパク質のリピート単位に由来する。リピートドメイン中に含まれる各々のリピートモジュールは、天然のリピートタンパク質のファミリー又はサブファミリー（例、アルマジロリピートタンパク質又はアンキリンリピートタンパク質のファミリー）の１つ又は複数のリピート単位に由来する。
【００４５】
「リピートモジュール」は、対応するリピートモジュールの全てのコピー中に存在するアミノ酸残基を伴う位置（「固定化された位置」）及び異なる又は「無作為化された」アミノ酸残基を伴う位置（「無作為化された位置」）を含みうる。
【００４６】
本発明に従った結合タンパク質は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含み、ここで、前記リピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミン（ｘＳＡ）についての結合特異性を有する。
【００４７】
用語「標的についての結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、ＰＢＳ中で、無関係のタンパク質（例えば大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）など）よりも低い解離定数を用いて、標的に結合することを意味する。好ましくは、標的についてのＰＢＳ中での解離定数は、ＭＢＰについての対応する解離定数よりも、少なくとも１０、より好ましくは１０２、さらにより好ましくは１０３、又は最も好ましくは１０４倍低い。
【００４８】
本発明の結合タンパク質は、抗体又はそのフラグメント（例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントなど）ではない。抗体及びそれらのフラグメントは、当業者に周知である。
【００４９】
また、本発明の結合ドメインは、抗体中に存在する免疫グロブリンフォールド及び／又はフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含まない。免疫グロブリンフォールドは、２つのβシート中に配置された約７つの逆平行βストランドの２層のサンドイッチからなる、共通の全βタンパク質フォールドである。免疫グロブリンフォールドは、当業者に周知である。例えば、免疫グロブリンフォールドを含むそのような結合ドメインは、WO 2007/080392又はWO 2008/097497に記載されている。
【００５０】
特に、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号４９、５０、５１、及び５２、ならびに、配列番号４９、５０、５１、及び５２における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む。
【００５１】
好ましくは、配列番号４９、５０、５１、及び５２における８つまでのアミノ酸が、他のアミノ酸により交換され、配列番号４９、５０、５１、及び５２における、より好ましくは７つまでのアミノ酸、より好ましくは６つまでのアミノ酸、より好ましくは５つまでのアミノ酸、さらにより好ましくは４つまでのアミノ酸、より好ましくは３つまでのアミノ酸、より好ましくは２つまでのアミノ酸、より好ましくは１つまでのアミノ酸、及び最も好ましくは無アミノ酸が交換される。
【００５２】
好ましくは、アミノ酸が配列番号４９、５０、５１、及び５２において交換される場合、これらのアミノ酸は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より；より好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群より選択される。また、好ましくは、アミノ酸の置換は、相同アミノ酸による；即ち、アミノ酸は、類似の生物物理学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸により交換される。例えば、負荷電アミノ酸Ｄは、負荷電アミノ酸Ｅにより置換されうる。又は、疎水性アミノ酸（例えばＬなど）は、Ａ、Ｉ、又はＶにより置換されうる。相同アミノ酸によるアミノ酸の置換は、当業者に周知である。
【００５３】
好ましい結合タンパク質は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含み、ここで、前記リピートドメインは、ＰＢＳ中で１０−４M未満の解離定数（Ｋｄ）を用いてｘＳＡに結合する。好ましくは、前記リピートドメインは、ＰＢＳ中で１０−４M未満、より好ましくは１０−５M、１０−６M、１０−７M、又は最も好ましくは１０−８M未満のＫｄを用いてｘＳＡに結合する。
【００５４】
タンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を決定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの技術（例、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量計（ＩＴＣ）などが、当業者に周知である。特定のタンパク質−タンパク質相互作用の測定Ｋｄ値は、異なる条件（例、塩濃度、ｐＨ）下で測定した場合、変動しうる。このように、Ｋｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及び標準化緩衝液（例えばＰＢＳなど）を用いて行われる。
【００５５】
ＰＢＳ中で１０−４M未満のＫｄを用いてｘＳＡに結合するアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質を、実施例に示す。
【００５６】
本発明の結合タンパク質のアンキリンリピートドメインは、ｘＳＡに結合する。好ましいのは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質である。
【００５７】
さらに好ましいのは、７０〜３００の間のアミノ酸、特に１００〜２００の間のアミノ酸を含む結合ドメインである。
【００５８】
さらに好ましいのは、遊離Ｃｙｓ残基を欠く結合タンパク質又は結合ドメインである。「遊離Ｃｙｓ残基」は、ジスルフィド結合の形成に含まれない。さらにより好ましいのは、任意のＣｙｓ残基のない結合タンパク質又は結合ドメインである。
【００５９】
本発明の結合ドメインは、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインであり（Binz et al., 2004、前掲文献）、好ましくは、WO 2002/020565に記載されている通りである。設計アンキリンリピートドメインの例を、実施例に示す。
【００６０】
さらなる実施態様において、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記リピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により欠損している。
【００６１】
好ましくは、本発明の結合タンパク質中のそのようなアンキリンリピートドメインは、配列番号２１、２７、及び４６；好ましくは、２７及び４６からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上に定義した通り、前記アンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で１０−４M未満の解離定数（Ｋｄ）を用いてｘＳＡに結合する。好ましくは、前記リピートドメインは、ＰＢＳ中で１０−４Ｍ未満、より好ましくは１０−５M、１０−６M、１０−７M、又は最も好ましくは１０−８M未満のＫｄを用いてｘＳＡに結合する。
【００６２】
好ましくは、本発明の結合タンパク質中のそのようなアンキリンリピートドメインは、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択されるアンキリンリピートドメイン中の「無作為化されたリピート単位」又は「無作為化された位置」と少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を伴うアミノ酸配列を含む。
【００６３】
好ましくは、７０%のアミノ酸配列同一性の代わりに、本発明の結合タンパク質中のそのようなアンキリンリピートドメインは、少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、又は最も好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を伴うアミノ酸配列を含む。
【００６４】
特定の実施態様において、配列番号４９、５０、５１、及び５２のアンキリンリピートモジュール中の９つまでのアミノ酸の置換により定義される、又は、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸同一性により定義される、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を伴う結合タンパク質は、哺乳動物の血清アルブミンに結合しない対応する結合タンパク質、例えば、配列番号３２のアンキリンリピートドメインと比較して、哺乳動物において少なくとも５倍高い血漿中終末相半減期を有する。そのような好ましい結合タンパク質において、ヒトにおける最小限の血漿中終末相半減期は、少なくとも１日、より好ましくは少なくとも３日、さらにより好ましくは少なくとも５日である。
【００６５】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化１】
2014501509.tif 000002
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９は、互いに独立して、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
好ましくは、ここで、
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、及びＫ；より好ましくは、Ｋ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｉ、及びＹ；より好ましくは、Ｉ、Ｅ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｗ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ａ、及びＦ；より好ましくは、Ｗ、Ｒ、及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｇ及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｎ、Ｔ、及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｎ、Ｖ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ７は、Ｅ、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｔ、及びＧ；より好ましくは、Ｅ、Ｙ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ８は、Ｅ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ９は、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｈ、及びＮ；より好ましくは、Ｙ及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号５３においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００６６】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化２】
2014501509.tif 000003
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、及びＫ；好ましくは、Ｋ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｉ、及びＹ；好ましくは、Ｉ、Ｅ及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｗ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ａ、及びＦ；好ましくは、Ｗ、Ｒ、及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｎ、Ｔ、及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｎ、Ｖ、及びＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｅ、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｔ、及びＧ；好ましくは、Ｅ、Ｙ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｈ、及びＮ；好ましくは、Ｙ及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１０においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００６７】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化３】
2014501509.tif 000004
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｄ、Ｋ、及びＡ；好ましくは、Ｋ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、及びＳ；好ましくは、Ｇ及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｅ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｔ、及びＧ；好ましくは、Ｑ、Ｄ、及びＮ；より好ましくは、Ｑ及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｇ及びＤからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、及びＧ；好ましくは、Ｅ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｈ、Ｙ、Ａ、及びＮ；好ましくは、Ｈ、Ａ、及びＹ；より好ましくは、Ａ及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１１においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００６８】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化４】
2014501509.tif 000005
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｆ、Ｓ、Ｌ、及びＫ；好ましくは、Ｓ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｖ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｒ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｓ及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｔ、及びＥ；好ましくは、Ｄ及びＱからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、及びＮ；好ましくは、Ａ及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号５４においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００６９】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化５】
2014501509.tif 000006
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｆ、Ｓ、Ｌ、及びＫ；好ましくは、Ｓ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｖ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｒ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｓ及びＮからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、及びＮ；好ましくは、Ａ及びＨからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１２においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００７０】
好ましいのは、結合タンパク質であって、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１２のアンキリンリピート配列モチーフを伴うリピートモジュールを含み、配列番号１１のアンキリンリピート配列モチーフを伴うリピートモジュールにより先行される。
【００７１】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化６】
2014501509.tif 000007
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｋ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、及びＹ；好ましくは、Ｋ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、及びＹ；好ましくは、Ｅ、Ｄ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ａ、及びＦ；好ましくは、Ｒ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｉ及びＭからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ｈ、Ｙ、Ｋ、Ａ、及びＮ；好ましくは、Ｋ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１３においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００７２】
さらなる実施態様において、本発明は結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列モチーフ
【化７】
2014501509.tif 000008
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、Ｑ及びＫからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２は、Ｌ及びＰからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ３は、Ｈ、Ｎ、Ｙ、及びＡ；好ましくは、Ｈ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ４は、Ｇ及びＳからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ５は、Ａ、Ｖ、Ｔ、及びＳ；好ましくは、Ｓ及びＡからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ６は、Ｖ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；そして、
ここで、場合により、配列番号１４においてＸを用いて表示される位置以外における５までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
【００７３】
好ましいのは、結合タンパク質であって、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１４のアンキリンリピート配列モチーフを伴うリピートモジュールを含み、配列番号１３のアンキリンリピート配列モチーフを伴うリピートモジュールにより先行される。
【００７４】
用語「キャッピングモジュール」は、リピートドメインのＮ又はＣ末端リピートモジュールに融合されたポリペプチドを指し、ここで、前記キャッピングモジュールは、前記リピートモジュールと強固な三次相互作用（即ち、三次元構造相互作用）を形成し、それにより、連続リピートモジュールと接触しない側で、溶媒から前記リピートモジュールの疎水性コアを遮蔽するキャップを提供する。前記Ｎ及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位又はリピート単位に隣接する天然リピートタンパク質中で見出される他の構造単位でありうる、又は、それに由来しうる。用語「キャッピング単位」は、天然の折り畳まれたポリペプチドを指し、ここで、前記ポリペプチドは、リピート単位のＮ又はＣ末端に融合された特定の構造単位を定義し、ここで、前記ポリペプチドは、前記リピート単位と強固な三次相互作用を形成し、それにより、一方の側の前記リピート単位の疎水性コアを、溶媒から遮蔽するキャップを提供する。好ましくは、キャッピングモジュール又はキャッピング単位は、キャッピングリピートである。用語「キャッピングリピート」は、前記の隣接リピート単位（又はモジュール）と類似の又は同じフォールディング及び／又は前記の隣接リピート単位（又はモジュール）との配列類似性を有するキャッピングモジュール又はキャッピング単位を指す。キャッピングモジュール及びキャッピングリピートは、WO 2002/020565において、及び、Interlandi et al., 2008（前掲文献）により記載される。例えば、WO 2002/020565には、アミノ酸配列
【化８】
2014501509.tif 000009
を有するＮ末端キャッピングモジュール（即ち、キャッピングリピート）及びアミノ酸配列
【化９】
2014501509.tif 000010
を有するＣ末端キャッピングモジュール（即ち、キャッピングリピート）が記載される。Interlandi et al., 2008（前掲文献）には、アミノ酸配列
【化１０】
2014501509.tif 000011
及び
【化１１】
2014501509.tif 000012
を有するＣ末端キャッピングモジュールが記載される。
【００７５】
例えば、配列番号１７のＮ末端キャッピングモジュールは、位置１〜３２のアミノ酸によりコードされ、配列番号１７のＣ末端キャッピングモジュールは、位置９９〜１２６のアミノ酸によりコードされる。
【００７６】
好ましいＮ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフ
【化１２】
2014501509.tif 000013
を含み、
ここで、Ｘ１はアミノ酸残基Ｇ、Ａ、又はＤを表し；
ここで、Ｘ２はアミノ酸残基Ｇ又はＤを表し；
ここで、Ｘ３はアミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、又はＭ；好ましくは、Ｌ又はＭを表し；そして、
ここで、Ｘ４はアミノ酸残基Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表す。
【００７７】
さらに好ましいのは、Ｎ末端キャッピングリピートを含む任意そのようなＮ末端キャッピングモジュールであって、ここで、前記キャッピングリピート中のアミノ酸残基の１つ又は複数が、対応するキャッピング単位又はリピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により置換される。
【００７８】
好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフ
【化１３】
2014501509.tif 000014
を含み、
ここで、Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
ここで、Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦ；好ましくは、Ｓ又はＦを表し；
ここで、Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
ここで、Ｘ４はアミノ酸残基Ａ又はＦを表し；
ここで、Ｘ５はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
ここで、Ｘ６はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
ここで、Ｘ７はアミノ酸残基Ｉ又はＡを表し；
ここで、Ｘ８はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表し；
ここで、Ｘ９はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
ここで、Ｘ１０はアミノ酸残基Ｌ又はＩを表し；
ここで、Ｘ１１はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表し；そして、
ここで、Ｘ４がＦを表し、Ｘ７がＩを表し、Ｘ８がＮ又はＥが表す場合、Ｘ２はＦを表さない。
【００７９】
さらなる好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフ
【化１４】
2014501509.tif 000015
を含み、
ここで、Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
ここで、Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦ；好ましくは、Ｓ又はＦを表し；
ここで、Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
ここで、Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
ここで、Ｘ５はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
ここで、Ｘ６はアミノ酸残基Ｉ又はＡを表し；
ここで、Ｘ７はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表し；
ここで、Ｘ８はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
ここで、Ｘ９はアミノ酸残基Ｌ又はＩを表し；そして、
ここで、Ｘ１０はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表す。
【００８０】
さらなる好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、配列モチーフ
【化１５】
2014501509.tif 000016
を含み、
ここで、Ｘ１はアミノ酸残基Ｑ又はＫを表し；
ここで、Ｘ２はアミノ酸残基Ａ、Ｓ、又はＦ；好ましくは、Ｓ又はＦを表し；
ここで、Ｘ３はアミノ酸残基Ａ又はＰを表し；
ここで、Ｘ４はアミノ酸残基Ｉ又はＬを表し；
ここで、Ｘ５はアミノ酸残基Ｓ又はＡを表し；
ここで、Ｘ６はアミノ酸残基Ａ、Ｅ、又はＮ；好ましくは、Ａ又はＮを表し；
ここで、Ｘ７はアミノ酸残基Ｎ又はＨを表し；
ここで、Ｘ８はアミノ酸残基Ｌ又はＩ；そして、
ここで、Ｘ９はアミノ酸残基Ｉ又はＶを表す。
【００８１】
好ましくは、配列番号６、７、又は８の配列モチーフを含む、そのようなＣ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸残基Ａ、Ｉ、又はＫ；好ましくは、Ｉ又はＫを；前記配列モチーフの位置３に対応する位置に有する。
【００８２】
また、好ましくは、配列番号６、７、又は８の配列モチーフを含む、そのようなＣ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸残基Ｒ又はＤを、前記配列モチーフの位置１４に対応する位置に有する。
【００８３】
好ましいＣ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列
【化１６】
2014501509.tif 000017
を有するＣ末端キャッピングモジュールである。
【００８４】
さらに好ましいのは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールであって、
ここで、
位置１のアミノ酸残基は、Ｑ又はＫであり；
位置４のアミノ酸残基は、Ｓ又はＦであり；
位置９のアミノ酸残基は、Ａ又はＦであり；
位置１３のアミノ酸残基は、Ａ又はＩであり；
位置１５のアミノ酸残基は、Ａ、Ｅ、又はＮであり；そして、
ここで、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号２、３、又は４のアミノ酸配列を有さない。
【００８５】
さらに好ましいのは、アラインメント上で、配列番号９又は２と、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、又は最も好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールである。好ましくは、アラインメント上の配列番号９の位置４に対応する位置での前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基は、Ｓであり、アラインメント上の配列番号９の位置９に対応する位置での前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基は、Ａであり、アラインメント上の配列番号９の位置１３に対応する位置での前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基は、Ａであり、アラインメント上の配列番号９の位置１５に対応する位置での前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基は、Ａである。さらに好ましくは、アラインメント上の配列番号９の位置９に対応する位置での前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基及び／又はアラインメント上の配列番号９の位置１３に対応する位置での前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基は、Ａである。また、好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、２８のアミノ酸を含む。
【００８６】
さらに好ましいのは、配列番号２又は９のアミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールであって、ここで、前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数が、対応するＣ末端キャッピングリピート又はキャッピング単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸により交換され、ここで、
位置４のアミノ酸残基はＳであり；
位置９のアミノ酸残基はＡであり；
位置１３のアミノ酸残基はＡであり；及び／又は、
位置１５のアミノ酸残基はＡである。
【００８７】
好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基の３０%までを交換し、より好ましくは、アミノ酸残基の２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までを交換する。また、好ましくは、そのようなＣ末端キャッピングモジュールは、天然のＣ末端キャッピングリピートである。
【００８８】
また、好ましいのは、配列番号９に基づく上記Ｃ末端キャッピングモジュールのいずれかの位置１〜２５まで又は位置１〜２６までのアミノ酸を含むＣ末端キャッピングモジュールである。
【００８９】
さらに好ましいのは、アミノ酸Ｇの前にＮを含まないアミノ酸配列を有する、そのようなＣ末端キャッピングモジュールである。
【００９０】
また、好ましいのは、配列番号９に基づく上記Ｃ末端キャッピングモジュールのいずれかと又は配列番号９自体と、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、又は最も好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有するＣ末端キャッピングモジュールである。
【００９１】
さらに好ましいのは、配列番号２又は９と、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、又は最も好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有するＣ末端キャッピングモジュールであって、ここで、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置９にアミノ酸Ａを有し；好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置９及び１３にアミノ酸Ａを有し；より好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置９、１３、及び１５にアミノ酸Ａを有し；最も好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置９、１３、及び１５にアミノ酸Ａならびに位置４にＳを有する。
【００９２】
さらに好ましいのは、位置１４にアミノ酸Ｒを有さない及び／又は位置１５にアミノ酸Ｅを有さない、そのようなＣ末端キャッピングモジュールである。
【００９３】
また、好ましいのは、配列番号２、３、又は４と同一であるアミノ酸配列を有さない、そのようなＣ末端キャッピングモジュールである。
【００９４】
さらに好ましいのは、配列番号９に基づくアミノ酸配列を有する、そのようなＣ末端キャッピングモジュールであって、ここで、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置２６、２７、及び２８にＡ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｋ、及びＮ；より好ましくは、Ａ、Ｌ、Ｒ、及びＫ；及び、最も好ましくは、Ｋ、Ａ、及びＬからなる群より選択されるアミノ酸を有する。
【００９５】
リピートドメインのキャッピングモジュールを、本発明のキャッピングモジュールにより、当業者に公知の技術（例えばアミノ酸配列のアラインメント、変異誘発、及び遺伝子合成など）を組み合わせることにより交換することができる。例えば、配列番号１７のＣ末端キャッピングリピートを、配列番号９のＣ末端キャッピングリピートにより、（ｉ）配列番号９を伴う配列アラインメントによる、配列番号１７（即ち、配列位置９９〜１２６）のＣ末端キャッピングリピートの決定、（ｉｉ）配列番号１７の決定されたＣ末端キャッピングリピートの配列を、配列番号９の配列を用いて交換すること、（ｉｉｉ）交換されたＣ末端キャッピングモジュールをコードするリピートドメインをコードする遺伝子の生成、（ｉｖ）大腸菌の細胞質中での改変リピートドメインの発現、及び（ｖ）標準的な手段による改変リピートドメインの精製により交換することができる。
【００９６】
さらに、本発明のリピートドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール（即ち、配列番号１のＮ末端キャッピングリピート）、それに続く、１つ又は複数のリピートモジュール（即ち、配列番号１７の位置３３〜９８までのアミノ酸残基を含むリピートモジュール）、及びＣ末端キャッピングモジュール（即ち、配列番号９のＣ末端キャッピングリピート）を、遺伝子合成の手段により組み立てることにより遺伝的に構築することができる。遺伝的に組み立てられたリピートドメイン遺伝子を、次に、上に記載する通りに、大腸菌において発現させることができる。
【００９７】
また、好ましいのは、結合タンパク質であって、ここで、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインは、配列番号６、７、又は８の配列モチーフを伴うＣ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、前記キャッピングモジュールは、位置３にアミノ酸Ｉを有し、ここで、前記リピートモジュールは、配列番号１２のアンキリンリピート配列モチーフを伴うリピートモジュールにより先行される。
【００９８】
さらに好ましいのは、結合タンパク質、リピートドメイン、アミノ酸Ｃ、Ｍ、又はＮを欠くアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングモジュールである。
【００９９】
さらに好ましいのは、結合タンパク質、リピートドメイン、アミノ酸Ｇの前にＮを欠くアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングモジュールである。
【０１００】
さらに好ましいのは、Ｃ末端キャッピングリピートを含む、任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールであって、ここで、前記キャッピングリピート中のアミノ酸残基の１つ又は複数が、対応するキャッピング単位又はリピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により置換される。
【０１０１】
さらに好ましいのは、任意のそのようなＮ末端又はＣ末端キャッピングモジュールを含む結合タンパク質である。
【０１０２】
そのようなＣ末端キャッピングモジュールのアミノ酸配列の例は、配列番号１９、２１、２７、２８、３８、４０、及び４２中の位置９９〜１２６までのアミノ酸配列である。実施例６は、リピートドメインの熱的安定性が、それらのＣ末端キャッピングモジュールを、本発明のキャッピングモジュールにより交換することにより増加させることができることを実証する。
【０１０３】
用語「標的」は、個々の分子、例えば核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然分子（そのような個々の分子の任意の部分、あるいは、そのような分子の２つ又はそれ以上の複合体を含む）などを指す。標的は、全細胞もしくは組織サンプルでよく、又は、それは任意の非天然分子もしくは部分でよい。好ましくは、標的は、天然もしくは非天然ポリペプチド又は化学的修飾（例えば、天然もしくは非天然のリン酸化、アセチル化、又はメチル化により修飾される）を含むポリペプチドである。本発明の特定の適用において、標的はｘＳＡである。
【０１０４】
用語「ｘＳＡ」は、哺乳動物の血清アルブミン（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル、又はヒトからの血清アルブミンなど）を指す。用語「ＭＳＡ」は、マウス血清アルブミン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ一次受入番号Ｐ０７７２４）を指す。用語「ＣＳＡ」は、カニクイザル（即ち、ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）血清アルブミン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ一次受入番号Ａ２Ｖ９Ｚ４）を指す。用語「ＨＳＡ」は、ヒト血清アルブミン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ一次受入番号Ｐ０２７６８）を指す。
【０１０５】
用語「コンセンサス配列」は、アミノ酸配列を指し、ここで、前記コンセンサス配列は、複数のリピート単位の構造的及び／又は配列整列化により得られる。２つ又はそれ以上の構造的及び／又は配列整列化リピート単位を使用し、そしてアラインメント中でのギャップを許すことで、各々の位置での最も高頻度なアミノ酸残基を決定することが可能である。コンセンサス配列は、各々の位置で最も高頻度に表わされるアミノ酸を含むその配列である。２つ又はそれ以上のアミノ酸が、平均を上回り単一の位置で表わされる事象において、コンセンサス配列は、それらのアミノ酸のサブセットを含みうる。２つ又はそれ以上のリピート単位は、単一のリピートタンパク質中に含まれるリピート単位から、あるいは、２つ又はそれ以上の異なるリピートタンパク質から取ってもよい。
【０１０６】
コンセンサス配列及びそれらを決定するための方法は、当業者に周知である。
【０１０７】
「コンセンサスアミノ酸残基」は、コンセンサス配列中の特定の位置で見出されるアミノ酸である。２つ又はそれ以上、例、３、４、又は５つのアミノ酸残基が、前記の２つ又はそれ以上のリピート単位において類似の確率で見出される場合、コンセンサスアミノ酸は、最も高頻度で見出されるアミノ酸の１つ、あるいは、前記の２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の組み合わせでありうる。
【０１０８】
さらに好ましいのは、非天然キャッピングモジュール、リピートモジュール、結合タンパク質、又は結合ドメインである。
【０１０９】
用語「非天然」は、合成又は天然からではないことを意味し、より具体的には、この用語はヒトの手で作られたことを意味する。用語「非天然結合タンパク質」又は「非天然結合ドメイン」は、前記結合タンパク質又は前記結合ドメインが、合成（即ち、アミノ酸からの化学的合成により産生される）又は組換えであり、天然からではないことを意味する。「非天然結合タンパク質」又は「非天然結合ドメイン」は、それぞれヒトが作ったタンパク質又はドメインであり、対応する設計核酸の発現により得られる。好ましくは、発現は、真核細胞もしくは細菌細胞中で、又は、無細胞インビトロ発現系を使用することにより行われる。さらに、この用語は、前記結合タンパク質又は前記結合ドメインの配列が、配列データベース中、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ、又はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ中の非人工配列エントリーとして存在しないことを意味する。これらのデータベース及び他の類似の配列データベースは、当業者に周知である。
【０１１０】
本発明は、結合ドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、前記結合ドメインはアンキリンリピートドメインであり、ｘＳＡに特異的に結合し、ここで、前記結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、ＰＢＳ中での熱的アンフォールディング時に４０℃を上回る中点変性温度（Ｔｍ）を有し、ＰＢＳ中で、３７℃で１時間にわたりインキュベートされた場合、濃度１０g/Lまでで５%（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集物を形成する。
【０１１１】
用語「ＰＢＳ」は、１３７mM  ＮａＣｌ、１０mMリン酸、及び２．７mM  ＫＣｌを含み、ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝水溶液を意味する。
【０１１２】
好ましくは、結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、ｐＨ７．４のＰＢＳ中又はｐＨ５．８のＭＥＳ緩衝液中での熱的アンフォールディング時に、４５℃を上回る、より好ましくは５０℃を上回る、より好ましくは５５℃を上回る、最も好ましくは６０℃を上回る中点変性温度（Ｔｍ）を有する。本発明の結合タンパク質又は結合ドメインは、生理学的条件下で、定義された二次及び三次構造を持つ。そのようなポリペプチドの熱的アンフォールディングは、その三次及び二次構造の喪失をもたらし、それは、例えば、円偏光二色性（ＣＤ）測定により追跡することができる。熱的アンフォールディング時での結合タンパク質又は結合ドメインの中点変性温度は、温度を約１０℃から約１００℃までゆっくりと増加させることによる、前記のタンパク質又はドメインの熱変性時での生理学的緩衝液における協同転移の中点の温度に対応する。熱的アンフォールディング時での中点変性温度の決定は、当業者に周知である。熱的アンフォールディング時での結合タンパク質又は結合ドメインのこの中点変性温度は、前記ポリペプチドの熱的安定性を示している。
【０１１３】
また、好ましいのは、５日間にわたり、好ましくは１０日間にわたり、より好ましくは２０日間にわたり、より好ましくは４０日間にわたり、最も好ましくは１００日間にわたり、３７℃で、ＰＢＳ中でインキュベートした場合、濃度２０g/Lまで、好ましくは４０g/Lまで、より好ましくは６０g/Lまで、さらにより好ましくは８０g/Lまで、最も好ましくは１００g/Lまでの５%（ｗ／ｗ）の不溶性凝集物を形成する結合タンパク質及び／又は結合ドメインである。不溶性凝集物の形成は、視覚的な沈殿の出現、ゲルろ過、又は動的光散乱により検出することができ、それらは、不溶性凝集物の形成時に強く増加する。不溶性凝集物は、タンパク質サンプルから、１０’０００ｘｇで１０分間にわたる遠心により除去することができる。好ましくは、結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、言及したインキュベーション条件下で、３７℃で、ＰＢＳ中で、２%未満、より好ましくは１%、０．５%、０．２%、０．１%、又は、最も好ましくは０．５%（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集物を形成する。不溶性凝集物のパーセンテージは、可溶性タンパク質からの不溶性凝集物の分離、それに続く、標準的な定量化方法による可溶性及び不溶性画分中のタンパク質量の決定により決定することができる。
【０１１４】
また、好ましいのは、１００mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むＰＢＳ中での１又は１０時間にわたる３７℃でのインキュベーション時に、その天然三次元構造を失わない結合タンパク質及び／又は結合ドメインである。
【０１１５】
１つの特定の実施態様において、本発明は、アンキリンリピートドメインである結合ドメインを含み、ｘＳＡに特異的に結合し、上に定義する通りの、示された又は好ましい中点変性温度及び非凝集特性を有する結合タンパク質に関し、ここで、前記結合タンパク質は、血清タンパク質（例えばｘＳＡなど）に結合しない結合ドメインと比較して、哺乳動物において少なくとも５倍高い血漿中終末相半減期を有する。
【０１１６】
好ましくは、前記結合ドメインは、血清タンパク質（例えばｘＳＡなど）に結合しない結合ドメインと比較して、哺乳動物において、少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、４０倍、１００倍、３００倍、又は、最も好ましくは少なくとも１０３倍高い血漿中終末相半減期を有する。
【０１１７】
また、好ましくは、前記ｘＳＡに結合しない結合ドメインは、ｘＳＡの結合についての１０−４Mを上回る、より好ましくは１０−３Mを上回る、又は、最も好ましくは１０−２Mを上回るＫｄにより示される。ｘＳＡに結合しない結合ドメインの例は、配列番号３２のリピートドメインである。
【０１１８】
さらに好ましくは、前記結合ドメインは、リピートドメインであって、配列番号３２のリピートドメインと比較して、又は、ＤＡＲＰｉｎ＃３２、ＤＡＲＰｉｎ＃４１、もしくはＤＡＲＰｉｎ＃４２と比較して、哺乳動物において少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、１００倍、３００倍、又は、最も好ましくは少なくとも１０３倍高い（即ち、長い）血漿中終末相半減期を有する。
【０１１９】
好ましい結合タンパク質は、ヒトにおいて、１を上回る、より好ましくは、３、５、７、１０、１５を上回る、又は、最も好ましくは、２０日を上回る血漿中終末相半減期を有するＨＳＡについての結合特異性を伴う結合ドメインを含む。
【０１２０】
結合ドメインの血漿中終末相半減期を、当業者に周知のアッセイにより決定することができる（Toutain, P.L., and Bousquet-Melou, A., J. Vet.Pharmacol.Ther.27(5), 427-439, 2004）。血漿中終末相半減期の決定に関する例を、実施例に与える。
【０１２１】
薬物、例えば、本発明の結合タンパク質又は結合ドメインなどの用語「血漿中終末相半減期」は、偽平衡に達した後に、哺乳動物に適用される薬物の血漿中濃度の半分に達するために要求される時間を指す。この半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排除するために要求される時間として定義されない。
【０１２２】
１つの特定の実施態様において、本発明は、アンキリンリピートドメインである結合ドメインを含み、ｘＳＡに特異的に結合し、生物活性化合物を含む結合タンパク質に関する。
【０１２３】
用語「生物活性化合物」は、前記疾患を有する哺乳動物に適用された場合に、疾患修飾性である化合物を指す。生物活性化合物は、アンタゴニスト特性又はアゴニスト特性を有しうるが、タンパク質性の生物活性化合物又は非タンパク質性の生物活性化合物でありうる。
【０１２４】
そのようなタンパク質性の生物活性化合物は、例えば、本発明の結合ドメインに、標準的なＤＮＡクローニング技術、それに続く、それらの標準的な発現及び精製を使用した遺伝子融合ポリペプチドの生成により、共有結合的に付着させることができる。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃３６は、ヒト成長因子（即ち、生物活性化合物）についての結合特異性を伴うリピートドメイン、それに続くＨＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインを含む。
【０１２５】
そのような非タンパク質性の生物活性化合物を、例えば、本発明の結合ドメインに、化学的手段により、例えば、マレイミドリンカーを介したシステインチオールへの結合により、共有結合的に付着することができ、システインは、本明細書に記載する通りに、ペプチドリンカーを介して、結合ドメインのＮ又はＣ末端に結合されている。
【０１２６】
タンパク質性の生物活性化合物の例は、異なる標的特異性を有する（例、それに結合することにより成長因子を中和する）結合ドメイン、サイトカイン（例、インターロイキン）、成長因子（例、ヒト成長ホルモン）、抗体及びそれらのフラグメント、ホルモン（例、ＧＬＰ−１）、及び任意の可能なタンパク質性薬物である。
【０１２７】
非タンパク質性の生物活性化合物の例は、毒素（例、ImmunoGenからのＤＭ１）、ＧＰＣＲを標的とする小分子、抗生物質、及び任意の可能な非タンパク質性薬物である。
【０１２８】
１つの特定の実施態様において、本発明は、ｘＳＡに特異的に結合するアンキリンリピートドメインを含み、生物活性化合物をさらに含む結合タンパク質に関し、ここで、前記結合タンパク質は、前記の未修飾の生物活性化合物の終末相半減期と比較して、哺乳動物において少なくとも２倍高い終末相半減期を有し、ここで、前記のより高い終末相半減期が、前記リピートドメインにより、前記結合タンパク質に与えられる。
【０１２９】
好ましくは、前記結合タンパク質は、前記の未修飾の生物活性化合物と比較して、哺乳動物において、少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、１００倍、３００倍、又は、最も好ましくは１０３倍高い血漿中終末相半減期を有する。
【０１３０】
別の好ましい実施態様は、ｘＳＡに特異的に結合する結合ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、ここで、前記結合ドメインは、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインである。そのようなアンキリンリピートドメインは、ｘＳＡへの結合に関与する１つ、２つ、３つ、又それ以上の内部リピートモジュールを含みうる。好ましくは、そのようなアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール、２〜４の内部リピートモジュール、及びＣ末端キャッピングモジュールを含む。好ましくは、前記結合ドメインは、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインである。また、好ましくは、前記キャッピングモジュールは、キャッピングリピートである。
【０１３１】
特に、本発明は、本明細書において上に定義する通りの結合タンパク質に関し、ここで、アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンへの結合について、配列番号１７〜３１及び４３〜４８；好ましくは配列番号１７〜３１；より好ましくは配列番号１９、２１、２７、及び２８、特に、配列番号１９及び２７からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合する。
【０１３２】
最も好ましくは結合タンパク質であり、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１７〜３１及び４３〜４８からなる群より選択され、ここで、前記アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により欠損している。
【０１３３】
また、好ましくは、前記リピートドメインは、ｘＳＡへの結合について、ＤＡＲＰｉｎ＃１７〜３１及び４３〜４８の群より選択される結合タンパク質と競合する。好ましくは、前記リピートドメインは、ｘＳＡへの結合について、ＤＡＲＰｉｎ＃１９、２１、２７、２８、４５、４６、４７、及び４８の群より選択される結合タンパク質と競合する。より好ましくは、前記リピートドメインは、ｘＳＡへの結合について、結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ＃１９、４５、４６、４８、又は２７と競合する；さらにより好ましくは、前記リピートドメインは、ｘＳＡへの結合について、結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ＃４６又は２７と競合する。
【０１３４】
用語「結合について競合する」は、同じ標的に同時に結合するための本発明の２つの異なる結合ドメインの不能を意味し、両方が個々に同一の標的に結合することができる。このように、そのような２つの結合ドメインは、前記標的への結合について競合する。好ましくは、前記の２つの競合する結合ドメインは、前記標的上のオーバーラップする又は同じ結合エピトープに結合する。２つの結合タンパク質が標的への結合について競合するか否かを決定するための方法、例えば競合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は競合ＳＰＲ測定（例、BioRadからのProteon機器を使用することによる）は、当業者に周知である。
【０１３５】
別の好ましい実施態様は、配列番号１７〜３１のリピートドメインからなる群より選択される、ｘＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインを含む結合タンパク質である。好ましくは、前記リピートドメインは、配列番号１９、２１、２７、又は２８のリピートドメインである。より好ましくは、前記リピートドメインは、配列番号１９のリピートドメインである。また、より好ましくは、前記リピートドメインは、配列番号２１のリピートドメインである。また、より好ましくは、前記リピートドメインは、配列番号２７のリピートドメインである。また、より好ましくは、前記リピートドメインは、配列番号２８のリピートドメインである。
【０１３６】
さらに好ましいのは、結合タンパク質であって、ここで、ｘＳＡについての結合特異性を伴う前記リピートドメインは、リピートドメインの前記群のリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記のアミノ酸配列同一性は、少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、及び、最も好ましくは少なくとも９５%である。
【０１３７】
さらに好ましいのは、結合タンパク質であって、ここで、ｘＳＡについての結合特異性を伴う前記リピートドメインは、リピートドメインの前記群のリピートドメインのリピートモジュールと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するリピートモジュールを含む。好ましくは、前記のアミノ酸配列同一性は、少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、及び、最も好ましくは少なくとも９５%である。
【０１３８】
さらに好ましいのは、結合タンパク質であって、ここで、前記結合タンパク質は、ｘＳＡについての結合特異性を伴う前記リピートドメインの２つ又はそれ以上を含む。好ましくは、前記結合タンパク質は、前記リピートドメインの２つ又は３つを含む。前記の２つ又はそれ以上のリピートドメインは、同じ又は異なるアミノ酸配列を有する。
【０１３９】
本発明に従ったリピートドメインを含む結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、前記リピートドメインのリピートモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数を、リピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換する。好ましくは、３０%までのアミノ酸残基を交換し、より好ましくは、２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までのアミノ酸残基を交換する。最も好ましくは、そのようなリピート単位は、天然リピート単位である。
【０１４０】
本発明に従ったリピートドメインを含む結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、前記リピートドメインのＮ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数を、Ｎ末端キャッピング単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換する。好ましくは、３０%までのアミノ酸残基を交換し、より好ましくは、２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までのアミノ酸残基を交換する。最も好ましくは、そのようなＮ末端キャッピング単位は、天然Ｎ末端キャッピング単位である。
【０１４１】
本発明に従ったリピートドメインを含む結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、前記リピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数を、Ｃ末端キャッピング単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換する。好ましくは、３０%までのアミノ酸残基を交換し、より好ましくは、２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までのアミノ酸残基を交換する。最も好ましくは、そのようなＣ末端キャッピング単位は、天然Ｃ末端キャッピング単位である。
【０１４２】
さらに別の特定の実施態様において、アミノ酸残基の３０%まで、より好ましくは、アミノ酸残基の２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までを、リピート単位、Ｎ末端キャッピング単位、又はＣ末端キャッピング単位の対応する位置において見出されないアミノ酸を用いて交換する。
【０１４３】
さらなる実施態様において、本明細書において記載するｘＳＡ結合タンパク質又はドメインのいずれかを、１つ又は複数の追加の部分、例えば、異なる標的に結合し、二重特異的結合薬剤を作る部分、生物活性化合物、標識部分（例、蛍光標識、例えばフルオレセイン、又は放射活性トレーサーなど）、タンパク質精製を促進する部分（例、小ペプチドタグ、例えばＨｉｓタグ又はｓｔｒｅｐタグなど）、改善された治療的効力のためにエフェクター機能を提供する部分（例、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性を提供する抗体のＦｃ部分、毒性タンパク質部分、例えば緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ）など、又は小分子毒性薬剤、例えばメイタンシノイド又はＤＮＡアルキル化薬剤など）、又は改善された薬物動態を提供する部分などに共有結合的に結合させてもよい。改善された薬物動態は、認知された治療的な必要性に従って評価されうる。しばしば、恐らくは、タンパク質が、投与後に、血清中で利用可能なままである時間を増加させることにより、バイオアベイラビリティを増加させること及び／又は用量の間の時間を増加させることが望ましい。一部の例において、経時的なタンパク質の血清濃度の連続性を改善させる（例、投与後から短時間での濃度と次の投与前から短時間での濃度の間のタンパク質の血清濃度における差を減少させる）ことが望ましい。
【０１４４】
さらなる実施態様において、本発明は、特定の結合タンパク質、特定のＮ末端キャッピングモジュール、又は特定のＣ末端キャッピングモジュールをコードする核酸分子に関する。さらに、前記核酸分子を含むベクターを考える。
【０１４５】
さらに、上で言及した結合タンパク質、特に、リピートドメインを含む結合タンパク質、又は特定の結合タンパク質をコードする核酸分子の１つ又は複数、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む医薬的組成物を考える。医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤は当業者に公知であり、下でより詳細に説明する。さらに、上で言及した結合タンパク質、特に、リピートドメインを含む結合タンパク質の１つ又は複数を含む診断用組成物を考える。
【０１４６】
医薬的組成物は、上に記載する結合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤を含む（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]に記載される通り）。当業者に公知の適した担体、賦形剤、又は安定剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の５%デキストロース、等張性及び化学的安定性を改善させる物質、緩衝液、ならびに保存剤である。他の適した担体は、それ自体が、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、及びアミノ酸共重合体などを含む。医薬的組成物は、また、追加の活性薬剤（例えば抗癌剤又は抗血管形成剤など）を含む組み合わせ製剤でありうる。
【０１４７】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌又は滅菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通したろ過により容易に達成される。
【０１４８】
医薬的組成物は、当業者の知識内の任意の適した方法により投与されうる。好ましい投与の経路は非経口的である。非経口投与において、本発明の医薬は、上に定義する医薬的に許容可能な賦形剤との関連において、単位投与量の注射可能な形態（例えば、溶液、懸濁液、又は乳濁液など）において製剤化される。投与量及び投与の様式は、処置される個人及び特定の疾患に依存する。一般的に、医薬的組成物は、本発明の結合タンパク質が、１μg/kg〜２０mg/kgの間、より好ましくは１０μg/kg〜５mg/kgの間、最も好ましくは０．１〜２mg/kgの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、それはボーラス用量として与えられる。連続注入も使用してもよく、浸透圧ミニポンプを介した連続的な皮下送達を含む。そのような場合、医薬的組成物は、５〜２０μg/kg/分の間、より好ましくは７〜１５μg/kg/分の間の用量で注入されうる。
【０１４９】
さらに、上で言及する医薬的組成物のいずれかが、障害の処置のために考えられる。本発明は、さらに、処置の方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、本発明の結合タンパク質の治療的に効果的な量を投与することを含む。
【０１５０】
さらに、それを必要とする患者に、上で言及する医薬的組成物の効果的な量を投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物において病理学的状態を処置する方法が考えられる。
【０１５１】
本発明に従った結合タンパク質は、いくつかの方法、例えばバクテリオファージ（WO 1990/002809、WO 2007/006665）又は細菌細胞（WO 1993/010214）の表面上でのディスプレイ、リボソームディスプレイ（WO 1998/048008）、プラスミド上でのディスプレイ（WO 1993/008278）、又は共有結合的ＲＮＡリピートタンパク質ハイブリッド構築物を使用することにより（WO 2000/032823）、又は細胞内発現及び選択／スクリーニング、例えばタンパク質相補性アッセイ（WO 1998/341120）などにより得られうる及び／又はさらに進化されうる。そのような方法は、当業者に公知である。
【０１５２】
本発明に従った結合タンパク質の選択／スクリーニングのために使用されるアンキリンリピートタンパク質のライブラリーは、当業者に公知のプロトコールに従って得てもよい（WO 2002/020565、Binz, H.K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003、及びBinz et al., 2004、前掲文献）。ｘＳＡに特異的なＤＡＲＰｉｎの選択のための、そのようなライブラリーの使用を、実施例１に与える。同様に、上に提示されるアンキリンリピート配列モチーフを、ｘＳＡに特異的なＤＡＲＰｉｎの選択又はスクリーニングのために使用されうるアンキリンリピートタンパク質のライブラリーを構成するために使用することができる。さらに、本発明のリピートドメインは、本発明に従ったリピートモジュール及び適切なキャッピングモジュール又はキャッピングリピート（Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003）から、標準的な組換えＤＮＡ技術（例、WO 2002/020565、Binz et al., 2003、前掲文献、及びBinz et al., 2004、前掲文献）を使用して、モジュール組み立てされうる。
【０１５３】
本発明は、実施例に記載される特定の実施態様に制限されない。他の供給源を、以下に記載する一般的な概要に従って使用及び加工してよい。
【０１５４】
実施例
下に開示される出発材料及び試薬の全てが、当業者に公知であり、商業的に利用可能である、又は、周知の技術を使用して調製することができる。
【０１５５】
材料
化学薬品はFluka（スイス）から購入した。オリゴヌクレオチドはMicrosynth（スイス）からであった。特記なき場合、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、New England Biolabs（ＵＳＡ）又はFermentas（リトアニア）からであった。クローニング及びタンパク質産生株は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Stratagene、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Novagen、ＵＳＡ）であった。異なる種からの精製血清アルブミン及び血清を購入した（例、Sigma-Aldrich、Switzerland又はInnovative Research、ＵＳＡから）。異なる種のビオチン化血清アルブミンを、標準的なビオチン化試薬及び方法を使用して、精製血清アルブミンの１級アミンへのビオチン部分の結合を介して化学的に得た。
【０１５６】
分子生物学
特記なき場合、方法は、記載されるプロトコールに従って実施する（Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory 1989, New York）。
【０１５７】
設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリー
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーが記載されている（WO 2002/020565; Binz et al. 2003、前掲文献；Binz et al. 2004、前掲文献）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ中の桁は、Ｎ末端とＣ末端キャッピングモジュールの間に存在する無作為化リピートモジュールの数を記載する。リピート単位及びモジュール内部の位置を定義するために使用される命名法は、Binz et al. 2004、前掲文献に基づき、アンキリンリピートモジュール及びアンキリンリピート単位の境界が、１つのアミノ酸位置だけシフトしているという改変を伴う。例えば、Binz et al. 2004（前掲文献）のアンキリンリピートモジュールの位置１は、本開示のアンキリンリピートモジュールの位置２に対応する。結果的に、Binz et al. 2004（前掲文献）のアンキリンリピートモジュールの位置３３は、以下の本開示のアンキリンリピートモジュールの位置１に対応する。
【０１５８】
全てのＤＮＡ配列をシークエンシングにより確認し、全ての記載されたタンパク質の算出された分子量を質量分析により確認した。
【０１５９】
実施例１：ｘＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Hanes, J. and Pluckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997）を使用し、ｘＳＡについての結合特異性を伴う多くの設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、Binz et al.2004（前掲文献）により記載されるＮ２Ｃ又はＮ３Ｃ  ＤＡＲＰｉｎより選択した。特異的（ｘＳＡ；即ち、ＭＳＡ、ＨＳＡ、又はＣＳＡ）及び非特異的（ＭＢＰ、大腸菌マルトース結合タンパク質）標的に向けた、選択されたクローンの結合を、粗抽出物ＥＬＩＳＡにより評価し、ｘＳＡ結合タンパク質が成功裏に選択されたことを示す。配列番号１７〜３１のリピートドメインは、ｘＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。選択された結合剤の配列解析によって、選択された結合剤の特定のファミリーに固有の特定のアンキリンリピート配列モチーフが明らかになった。ｘＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメイン中に存在する、そのようなアンキリンリピート配列モチーフを、配列番号１１〜１４に提供する。
【０１６０】
リボソームディスプレイによる血清アルブミンに特異的なアンキリンリピートタンパク質の選択
血清アルブミンに特異的なアンキリンリピートタンパク質の選択は、リボソームディスプレイ（Hanes and Pluckthun、前掲文献）により、標的タンパク質としてのＨＳＡ、ＣＳＡ、又はＭＳＡ、記載される設計アンキリンリピートタンパク質のライブラリー（WO 2002/020565、Binz et al., 2003、前掲文献、及びBinz et al., 2004、前掲文献）、及び確立されたプロトコール（Zahnd, C., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007）を使用して実施した。リボソームディスプレイ選択ラウンドを、ＨＳＡ、ＣＳＡ、又はＭＳＡ（ニュートラアビジン又はストレプトアビジン上に固定化されたＨＳＡ又はＭＳＡのビオチン化変異体を含む）上で、Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ  ＤＡＲＰｉｎライブラリーの両方を用いて、確立されたプロトコール（Binz et al. 2004、前掲文献）を使用して実施した。各々の選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲサイクルの数を、４０から３０に、一定に低下させ、結合剤の濃縮に起因する収率に調整した。ＨＳＡ、ＣＳＡ、又はＭＳＡ上での４つの選択ラウンドは、マイクロモルからナノモルの親和性ＤＡＲＰｉｎのプールをもたらし、単一クローンのＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ測定により明らかにされた通りである。特定のＤＡＲＰｉｎの親和性を、さらに、当業者に周知の方法による親和性成熟を使用して、改善した（上に記載する通りに、改善された結合剤についてのエラープローンＰＣＲならびに選択及びスクリーニングによりＤＡＲＰｉｎクローンを多様化することによる）。
【０１６１】
選択されたクローンは、粗抽出物ＥＬＩＳＡにより示される通り、血清アルブミンに特異的に結合する
ｘＳＡに特異的に結合する個々の選択されたＤＡＲＰｉｎを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、ＤＡＲＰｉｎ発現細胞の大腸菌粗抽出物を使用して、標準的なプロトコールを使用して同定した。リボソームディスプレイにより、選択されたクローンを、ｐＱＥ３０（Qiagen）発現ベクター中にクローン化し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Strategene）中に形質転換し、次に、３７℃で、１mlの成長培地（１%グルコース及び１００μg/mlアンピシリンを含む２ＹＴ）を含む９６深底ウェルプレート（単一ウェル中に各々のクローン）中で一晩成長させた。５０μg/mlアンピシリンを含む１mlの新鮮２ＹＴに、新たな９６深底ウェルプレートにおいて、１００μlの一晩培養物を用いて接種した。２時間にわたる３７℃でのインキュベーション後、発現を、ＩＰＴＧ（１mM最終濃度）を用いて誘導し、３時間にわたり継続させた。細胞を収集し、１００μlのＢ−ＰＥＲＩＩ（Pierce）中に再懸濁し、室温で振盪しながら１５分間にわたりインキュベートした。次に、９００μlのＰＢＳ−ＴＣ（０．２５%カゼイン加水分解物、０．１% Tween20（登録商標）、ｐＨ７．４を添加したＰＢＳ）を加え、細胞細片を遠心により除去した。１００μlの各々の溶解クローンを、ｘＳＡ又はそれらのビオチン部分を介して固定化された無関係のＭＢＰのいずれかを含む、NeutrAvidinコーティングしたMaxiSorpプレートのウェルに適用し、１時間にわたり室温でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（０．１%  Tween 20（登録商標）を添加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いた十分な洗浄後、プレートを、モノクローナル抗ＲＧＳ（Ｈｉｓ）４抗体（３４６５０、Qiagen）を一次抗体として、アルカリフォスファターゼと共役させたポリクローナルヤギ抗マウス抗体（Ａ３５６２、Sigma）を二次試薬として使用した標準的なＥＬＩＳＡ手順を使用して開発した。結合を、次に、２ナトリウム４−ニトロフェニルリン酸（４ＮＰＰ、Fluka）をアルカリフォスファターゼのための基質として使用することにより検出した。色の発生を、４０５nmで測定した。そのような細胞粗抽出物ＥＬＩＳＡによる数百のクローンのスクリーニングによって、ｘＳＡについての特異性を伴う百を上回る異なるＤＡＲＰｉｎが明らかになった。これらの結合タンパク質を、さらなる解析のために選んだ。ｘＳＡに特異的に結合する、選択されたリピートドメインのアミノ酸配列の例を、配列番号１７〜３１、３７〜４０、及び４３〜４８において提供する。
【０１６２】
ｘＳＡについての結合特異性を伴う、選択されたリピートドメインからのリピート配列モチーフの推定
ｘＳＡについての結合特異性を伴う、選択されたリピートドメインのアミノ酸配列を、さらに、当業者に公知の配列解析ツールにより解析した（WO 2002/020565; Forrer et al., 2003、前掲文献；Forrer, P., Binz, H.K., Stumpp, M.T.及びPluckthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004）。しかしながら、天然リピートモチーフを使用し、リピート配列モチーフを推定したWO 2002/020565とは対照的に、本明細書において、リピート配列モチーフを、ｘＳＡについての結合特異性を伴う、選択されたリピートドメインのリピート単位から推定した。それにより、共通のリピート配列モチーフを含む、選択されたリピートドメインのファミリーを決定した。ｘＳＡについての結合特異性を伴うリピートドメイン中に存在する、そのようなリピート配列モチーフを、配列番号１１〜１４に提供する。
【０１６３】
ＤＡＲＰｉｎの高レベル及び可溶性発現
さらなる解析のために、上に記載する通りの細胞粗抽出物ＥＬＩＳＡにおいて特異的なｘＳＡ結合を示す、選択されたクローンを、大腸菌ＢＬ２１又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞において発現させ、標準的なプロトコールを使用し、それらのＨｉｓタグを使用して精製した。２５mlの一晩静置培養物（ＬＢ、１%グルコース、１００mg/Lアンピシリン；３７℃）を使用し、１Lの培養物（同じ媒質）に接種した。６００nmでの吸光度０．７で、培養物を、０．５mMのＩＰＴＧを用いて誘導し、３７℃で４時間にわたりインキュベートした。培養物を遠心し、結果として得られたペレットを、４０mlのTBS500（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、超音波処理した。ライセートを再遠心し、グリセロール（１０%（ｖ／ｖ）最終濃度）及びイミダゾール（２０mM最終濃度）を、結果として得られた上清に加えた。タンパク質を、製造業者（QIAgen、ドイツ）の指示に従い、Ｎｉニトリロ三酢酸カラム（２．５mlカラム容積）上で精製した。あるいは、６ｘＨｉｓタグを欠くＤＡＲＰｉｎ又は選択されたリピートドメインを、陰イオン交換クロマトグラフィー、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより、標準的な樹脂及び当業者に公知のプロトコールに従って精製した。血清アルブミンへの結合特異性を伴う、高度に可溶性のＤＡＲＰｉｎの２００mgまでを、１リットルの大腸菌培養物から精製することができ、ＳＤＳ−１５%  ＰＡＧＥから推定した通り、純度＞９５%を伴う。そのような精製ＤＡＲＰｉｎを、さらなる特徴付けのために使用する。
【０１６４】
実施例２：ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの安定性解析及びサイズ排除クロマトグラフィー
ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎ＃１９〜２２及びＤＡＲＰｉｎ＃２７〜３０を、上に記載する通り、それらのＨｉｓタグを使用して、均質近くまで精製し、２８日間にわたり、３０mg/ml（〜２mM）で、４０℃でＰＢＳ中に保存した（安定性試験）。０日目（図１ａ）及び２８日目（図１ｂ）に、サンプルを取り、５００μMまで希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により解析し、それらの見掛けの分子量及び安定性（即ち、それらの凝集、多量体化、又は分解傾向）を経時的に評価した。
【０１６５】
さらなる実験（図１ｃ）において、ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎ＃１９及びＤＡＲＰｉｎ＃４３〜４８を、上に記載する通り、それらのＨｉｓタグを使用して、均質近くまで精製し、２８日間にわたり、約１００mg/mlで、−８０℃でＰＢＳ中に保存し、５００μMまで希釈し、特徴付け（即ち、それらの凝集、多量体化、又は分解傾向）のためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により解析した。注目すべきは、最初の解析シリーズと比較して、より大きなカラムを使用した（下を参照のこと）。
【０１６６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析的ＳＥＣを、Superdex 200 5/150カラム（図１ａ及び図１ｂ）又はSuperdex 200 10/300GLカラム（図１ｃ）（GE Healthcare）のいずれかを使用したＨＰＬＣシステム（Agilent 1200シリーズ）を使用して、２０℃で行った。Superdex 200 5/150カラムは、床容積３．０ml、及び空隙容積１．０８mlを有する（ブルーデキストランを使用して実験的に決定）。Superdex 20010/300GLカラムは、床容積２４ml、及び空隙容積約８mlを有する。測定は、当業者に公知の標準的手順に従って実施した。泳動を、流速０．２ml/分及び最高圧力１５バール（Superdex 200 5/150）又は０．６ml/分及び最高圧力１８バール（Superdex 200 10/300GL）で、ＰＢＳ中で行った。タンパク質のサンプルを、ＰＢＳ中で約２０〜５００μMまで希釈し、ろ過し（０．２２μm）、希釈サンプルの２０〜１００μlを、分離のために、カラム上に注入した。タンパク質サンプルの溶出プロファイルを、２８０nmでの吸光度を読むことにより記録した。分子量６．５kDaを伴うアプロチニン（ＡＰ）、分子量２９kDaを伴う炭酸脱水酵素（ＣＡ）、及び分子量７５kDaを伴うコンアルブミン（ＣＯ）を標準タンパク質として使用し、サンプルタンパク質の見掛けの分子量を決定することができる較正曲線を得た。
【０１６７】
結果を図１に示す。ＤＡＲＰｉｎ＃１９−２２及び２７−３０は、安定性試験の０日目及び２８日目での区別不能なＳＥＣクロマトグラム（即ち、区別不能な溶出プロファイル）を示す。結論的には、全てのＤＡＲＰｉｎが、アッセイ条件下で単量体として溶出し、ＤＡＲＰｉｎ＃１９−２３及び２７−３０は、４０℃で、ＰＢＳ中で、少なくとも１ヶ月間にわたり安定である（即ち、それらの溶出プロファイルによって、いかなる凝集、多量体化、又は分解傾向も示さなかった）。
【０１６８】
実施例３：ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの熱的安定性
ｘＳＡについての特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて解析した（Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221, 2007）。それにより、タンパク質（即ち、そのようなＤＡＲＰｉｎ）がアンフォールディングする温度を、タンパク質の疎水性部分（タンパク質がアンフォールディングする時に露出される）についての親和性を伴う色素（例、SYPRO Orange; Invitrogen、カタログ番号Ｓ６６５０）の蛍光における増加により測定する。それにより得られた蛍光遷移の中点（より低い蛍光強度からより高い蛍光強度まで）での温度は、次に、分析したタンパク質の中点変性温度（Ｔｍ）に対応する。
【０１６９】
蛍光ベースの熱的安定性アッセイ
ＳＹＰＲＯオレンジを蛍光色素として使用したＤＡＲＰｉｎの熱的変性を、リアルタイムＰＣＲ機器（即ち、ＣＦＸ９６光学システム（BioRad）との組み合わせにおけるC1000サーマルサイクラー（BioRad））を使用して測定した。ＤＡＲＰｉｎを、８０μM濃度で、１ｘSYPRO Orange（５’０００ｘ  SYPRO Orange原液から希釈、Invitrogen）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）又はＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）のいずれかにおいて調製し、５０μlのそのようなタンパク質溶液又は緩衝液だけを、白色９６ウェルＰＣＲプレート（Bio-Rad）中に加えた。プレートを、Microseal 'B' Adhesive Seals（Bio-Rad）を用いてシールし、リアルタイムＰＣＲ機器において２０℃から９５℃まで、０．５℃増分（各々の温度増分後の２５秒の保持段階を含む）で加熱した。ＤＡＲＰｉｎの熱的変性の後に、各々の温度増分でのサンプルの相対蛍光単位の測定が続いた。プレートのウェル中の相対蛍光単位を、リアルタイムＰＣＲ機器のチャネル２（即ち、励起は５１５〜５３５nmであり、検出は５６０〜５８０nmであった）を使用して測定した。緩衝液だけについて得られた、対応する値を減算した。それにより得られた熱的変性転移の中点から、分析されたＤＡＲＰｉｎ  についてのＴｍ値を決定することができる。
【０１７０】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）又はＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）中での熱的変性、それに続く、SYPRO Orangeの蛍光強度における増加の結果を、図２及び図３に示す。測定された熱的変性転移は、分析された、ｘＳＡについての結合特異性を伴う全てのＤＡＲＰｉｎが、（ｐＨ７．４及びｐＨ５．８の両方で）４０℃を十分に上回るＴｍ値を有する。
【０１７１】
実施例４：表面プラズモン共鳴解析による、ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの特徴付け
ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎを、フローセル中で、それらのＨｉｓタグを介して、コーティングされたα−ＲＧＳ−Ｈｉｓ抗体（Qiagen、カタログ番号３４６５０）に固定化し、ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、マウス、ラット、ウサギ、及びイヌの血清アルブミンと固定化ＤＡＲＰｉｎとの相互作用を解析した。
【０１７２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析
ＳＰＲを、ProteOn機器（BioRad）を使用して測定した。測定は、当業者に公知の標準的な手順に従って実施した。泳動緩衝液は、０．０１%  Tween 20（登録商標）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）であった。抗ＲＧＳ  Ｈｉｓ抗体を、約２０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまで、ＧＬＣチップ（BioRad）上に共有結合的に固定した。抗体コーティングされたチップ上でのＤＡＲＰｉｎの固定化を、次に、３００秒において１５０μlの１μM  ＤＡＲＰｉｎ溶液を注射することにより実施した（流速＝３０μl/分）。異なる種の血清アルブミンとの相互作用を、次に、６０秒間で、濃度４００、２００、１００、５０nmで異なる血清アルブミンを含む容積１００μl泳動緩衝液（０．０１%  Tween（登録商標）を含むＰＢＳ）（オン速度測定）、それに続く、１０〜３０分間にわたる泳動緩衝液流（流速＝１００μl/分）（オフ速度測定）を注入することにより測定した。非コーティングレファレンスセル及びレファレンス注入（即ち、泳動緩衝液だけの注入）のシグナル（即ち、共鳴単位（ＲＵ）値）を、血清アルブミンの注入後に得られたＲＵトレースから減算した（ダブルレファレンス）。オン速度及びオフ速度の測定値から得られたＳＲＰトレースから、対応するＤＡＲＰｉｎ血清アルブミン相互作用のオン及びオフ速度を決定することができる。
【０１７３】
結果を表１及び表２にまとめる。解離定数（Ｋｄ）を、推定されたオン及びオフ速度から、当業者に公知の標準的な手順を使用して算出し、約３〜約３００nmまでの範囲であることが見出された。ヒト及びカニクイザルの血清アルブミンは、分析された全てのＤＡＲＰｉｎにより結合され、ウサギ、マウス、ラット、及びイヌの血清アルブミンは、これらのＤＡＲＰｉｎのサブセットだけにより結合される。
【０１７４】
【表１】
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【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
実施例５：ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの血漿中終末相半減期
マウス及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、また、「ｃｙｎｏ」として省略される）におけるＤＡＲＰｉｎの血漿中終末相半減期を、当業者に公知の標準的な手順に従って決定した（Toutain, et al.、前掲文献）。特定の量のＤＡＲＰｉｎを、哺乳動物中に静脈内注射し、血漿からのＤＡＲＰｉｎクリアランスを、その血漿中濃度を追跡することにより経時的に追跡した。ＤＡＲＰｉｎ濃度は、最初に、偽平衡に達するまで減少し（アルファ相）、血漿中でのＤＡＲＰｉｎ濃度の指数関数的なさらなる減少が続いた（ベータ相）。このベータ相から、ＤＡＲＰｉｎの血漿中終末相半減期を、次に、算出することができる。
【０１７７】
マウスにおけるＤＡＲＰｉｎ血漿クリアランスの決定
ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの血漿クリアランスを評価するために、テストタンパク質を放射標識し、未感作Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈中に注射した。以下のＤＡＲＰｉｎを注射した：ＤＡＲＰｉｎ＃１９、ＤＡＲＰｉｎ＃２１、ＤＡＲＰｉｎ＃２３、ＤＡＲＰｉｎ＃２５、ＤＡＲＰｉｎ  ＃１８，  、ＤＡＲＰｉｎ＃３２、ＤＡＲＰｉｎ＃３５、ＤＡＲＰｉｎ＃３６  、ＤＡＲＰｉｎ＃３３、ＤＡＲＰｉｎ＃３４、ＤＡＲＰｉｎ＃３７、ＤＡＲＰｉｎ＃３８、ＤＡＲＰｉｎ＃４３、ＤＡＲＰｉｎ＃４４、ＤＡＲＰｉｎ＃４５、ＤＡＲＰｉｎ＃４６、ＤＡＲＰｉｎ＃４７、及びＤＡＲＰｉｎ＃４８。ＤＡＲＰｉｎを、以前に記載された通りに、９９ｍＴｃカルボニル複合体を用いて放射標識した（Waibel, R., et al., Nature Biotechnol.17(9), 897-901, 1999）。ＤＡＲＰｉｎ（４０μg）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４００μlに希釈する前に、１時間にわたり、９９ｍＴｃカルボニル（０．８〜１．６mCi）を用いてインキュベートした。各々のマウスに、それにより得られた標識ＤＡＲＰｉｎ溶液（１０μgタンパク質及び０．２〜０．４mCiと等価）の１００μlを用いて静脈内注射した。マウスの血液サンプルを、初回注射後１時間、４時間、２４時間、及び４８時間目に採取し、サンプルの放射活性を測定した。特定の時間点で測定した放射活性のレベルは、その時間点で血漿中に依然として存在するＤＡＲＰｉｎの量についての直接的な測定値である。%注射用量は、９９ｍＴｃの放射活性崩壊について補正された注射サンプルの全放射活性と比べた、特定の時間点で測定されたマウスの全血液（１８gのマウスについて１．６ml）での全放射活性のパーセンテージである。
【０１７８】
ＭＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎは、ｘＳＡについての結合特異性を有さないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較した場合、マウスにおいて強く増加した血漿中終末相半減期を有する（図４）。ＤＡＲＰｉｎ＃１９、ＤＡＲＰｉｎ＃２１、ＤＡＲＰｉｎ＃２３、ＤＡＲＰｉｎ＃３３、ＤＡＲＰｉｎ＃３７、ＤＡＲＰｉｎ＃４３、ＤＡＲＰｉｎ＃４４、ＤＡＲＰｉｎ＃４５、ＤＡＲＰｉｎ＃４６、ＤＡＲＰｉｎ＃４７、及びＤＡＲＰｉｎ＃４８は、マウスにおける血漿中終末相半減期約２〜２．５日を有した。
【０１７９】
カニクイザルにおけるＤＡＲＰｉｎ血漿クリアランスの決定
ＰＢＳ中で希釈したＤＡＲＰｉｎを、カニクイザルの橈側皮静脈内にボーラス注射として注射した。以下のＤＡＲＰｉｎを注射した：ＤＡＲＰｉｎ＃２６（０．５mg/kg）、ＤＡＲＰｉｎ＃２４（０．５mg/kg）、ＤＡＲＰｉｎ＃１７（０．５mg/kg）、ＤＡＲＰｉｎ＃３４（１mg/kg）、及びＤＡＲＰｉｎ＃３２（０．５mg/kg）。注射後の異なる時間点で、血漿を、動物の大腿静脈から採取した血液から生成した。血漿サンプル中のＤＡＲＰｉｎの濃度を、次に、当業者に公知の標準的なプロトコールを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ及び公知のＤＡＲＰｉｎ濃度を伴う適切なＤＡＲＰｉｎ標準曲線により決定した。
【０１８０】
カニクイザルの血漿サンプルを、抗ＤＡＲＰｉｎ特異的ウサギモノクローナル抗体を用いてコーティングしたMaxiSorp ELISAプレート上で、ＰＢＳ−Ｃ（０．２５%カゼインを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で連続希釈した。ＰＢＳ−Ｔ（０．１%  Tween 20（登録商標）を添加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いた十分な洗浄後、プレートを、ホースラディッシュペルオキシダーゼＨＲＰ（Qiagen）を用いて標識したモノクローナル抗ＲＧＳ（Ｈｉｓ）４抗体を用いて開発した。結合を、次に、１００μlのBM-Blue POD基質（Roche Diagnostics）を使用することにより検出した。反応を、５０μlの１M  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止した。４５０nmでの吸光度（６２０nmでの吸光度を減算）を測定した。血漿サンプル中のＤＡＲＰｉｎの濃度を、サル血清中で希釈したＤＡＲＰｉｎの標準曲線上で単一指数回帰を実施することにより算出した（Graphpad Prism）。ＤＡＲＰｉｎの血漿中終末相半減期を、注射後２４０時間までの決定された濃度値について非線形回帰（二相崩壊）を実施することにより算出した。第二（ベータ）相の半減期は、血漿中終末相半減期に対応する。
【０１８１】
ｘＳＡについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎは、ｘＳＡについての結合特異性を有さないＤＡＲＰｉｎ＃３２と比較して、カニクイザルにおいて増加した血漿中終末相半減期を有する（図５、表３）。ＤＡＲＰｉｎ＃１９、ＤＡＲＰｉｎ＃２１、ＤＡＲＰｉｎ＃４３、ＤＡＲＰｉｎ＃４４、ＤＡＲＰｉｎ＃４５、ＤＡＲＰｉｎ＃４６、ＤＡＲＰｉｎ＃４７、及びＤＡＲＰｉｎ＃４８は、カニクイザルにおける血漿中終末相半減期約１０〜１５日を有した。
【０１８２】
【表３】
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【０１８３】
実施例６：改善されたＣ末端キャッピングモジュールを伴うＤＡＲＰｉｎのより高い熱的安定性
ＤＡＲＰｉｎの熱的安定性を、実施例３に記載する通り、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて分析した。あるいは、ＤＡＲＰｉｎの熱的安定性を、ＣＤ分光法により、即ち、当業者に周知の技術による２２２nmでのその円偏光二色性（ＣＤ）シグナルに従うことによる、その熱変性の測定により分析した。サンプルのＣＤシグナルを、１℃／分の温度勾配を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で濃度０．０２mMのタンパク質を２０℃から９５℃までゆっくり加熱しながら、Jasco J-715機器（Jasco、日本）において２２２nmで記録した。これは、ＤＡＲＰｉｎの変性を追跡するための効果的な手段である。なぜなら、それらは、主に、アンフォールディング時に、２２２nmでのそれらのＣＤシグナルにおける強い変化を示すアルファヘリックスからなるからである。ＤＡＲＰｉｎについてのそのような測定されたＣＤシグナルトレースの観察された転移の中点は、そのＴｍ値に対応する。
【０１８４】
ＤＡＲＰｉｎ＃３７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３７）の熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ＃３８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３８）の熱的安定性と比較した。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールを除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ＃３８（しかし、ＤＡＲＰｉｎ＃３７ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＣキャッピングモジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ＃３７及びＤＡＲＰｉｎ  ＃３８について決定されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＴｍ値は、それぞれ約６３℃及び約７３℃であった。ＤＡＲＰｉｎ＃３７及びＤＡＲＰｉｎ＃３８について決定されたＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）中のＴｍ値は、それぞれ約５４．５℃及び約６６℃であった。
【０１８５】
ＤＡＲＰｉｎ＃３９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号３９）の熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを使用して、ＤＡＲＰｉｎ＃４０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号１５）を伴う配列番号４０）の熱的安定性と比較した。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールを除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ＃４０（しかし、ＤＡＲＰｉｎ＃３９ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＣキャッピングモジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ＃３９及びＤＡＲＰｉｎ＃４０について決定されたＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）中のＴｍ値は、それぞれ約５１℃及び約５５℃であった。
【０１８６】
ＤＡＲＰｉｎ＃４１（配列番号４１）の熱的安定性を、ＣＤ分光法を使用して、ＤＡＲＰｉｎ＃４２（配列番号４２）の熱的安定性と比較した。これらの２つのＤＡＲＰｉｎは、それらのリピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールを除き、同一のアミノ酸配列を持つ。ＤＡＲＰｉｎ＃４２（しかし、ＤＡＲＰｉｎ  ＃４１ではない）のリピートドメインは、本明細書に記載する通り、改善されたＣキャッピングモジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ＃４１及びＤＡＲＰｉｎ＃４２について決定されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＴｍ値は、それぞれ約５９．５℃及び約７３℃であった。
【図１ａ】
2014501509.tif 000028
【図１ｂ】
2014501509.tif 000029
【図１ｃ】
2014501509.tif 000030
【図２ａ】
2014501509.tif 000031
【図２ｂ】
2014501509.tif 000032
【図３ａ】
2014501509.tif 000033
【図３ｂ】
2014501509.tif 000034
【図４ａ】
2014501509.tif 000035
【図４ｂ】
2014501509.tif 000036
【配列表】
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【国際調査報告】
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