(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)由来の6〜20アミノ酸残基からなるペプチドであって、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含むペプチド、ならびにこれらのペプチドと結合する抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)由来の6〜20アミノ酸残基からなるペプチドであって、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含むペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸配列が、YTTAWWLGIDQS(配列番号1)、YGYTTAWWLGIDQSID(配列番号7)、TTAWWLGIDQS(配列番号8)、TAWWLGIDQS(配列番号9)、AWWLGIDQS(配列番号10)、WWLGIDQS(配列番号11)、YTTAWWLGIDQ(配列番号13)、YTTAWWLGID(配列番号14)、TTAWWLGIDQ(配列番号18)、およびTTAWWLGID(配列番号19)からなる群から選ばれることを特徴とする、ペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドであって、そのCおよび/またはN末端にシステイン残基を含むことを特徴とする、ペプチド。
【請求項４】
アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するために用いる請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
アテローム性動脈硬化症関連疾患が、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、卒中性脳発作、および脳卒中からなる群から選ばれることを特徴とする請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg/免疫の量で個体に投与することを特徴とする請求項４または５記載のペプチド。
【請求項７】
少なくとも１の、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチドを含むワクチン。
【請求項８】
少なくとも１のペプチドが、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペット・ヘモシアニン)と結合または融合していることを特徴とする請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
少なくとも１のペプチドが皮内、皮下、または筋肉内投与用に製剤化されることを特徴とする請求項７または８に記載のワクチン。
【請求項１０】
少なくとも１のペプチドが、アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムと共に製剤化されることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg/免疫の量の少なくとも１のペプチドを含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するために用いる請求項７〜１１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】
アテローム性動脈硬化症関連疾患が、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、卒中性脳発作、および脳卒中からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２記載のワクチン。
【請求項１４】
請求項1〜3のいずれかに記載のペプチドと結合する抗体。
【請求項１５】
重鎖可変(「VH」)領域および抗体軽鎖可変(「VL」)領域を含み、各領域が相補性決定領域を含むことを特徴とする請求項１４記載の抗体であって、
VH領域の相補性決定領域が、アミノ酸配列NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(配列番号104)、EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号105)、DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号106)、またはQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(配列番号107)の１またはそれ以上を有し、
該VL領域が、アミノ酸配列DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(配列番号108)、QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(配列番号109)、DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(配列番号110)、またはDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(配列番号111)の１またはそれ以上を有する、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CETPのin vivo活性に影響を及ぼすことができるペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症関連疾患、例えば心血管疾患(CVD)および脳卒中、ならびに末梢動脈閉塞性疾患は、米国、ヨーロッパ、およびアジアの大部分で死亡の主原因の一つである。CVDの死亡率は2020年には1990年に比べて90%増加しているだろう。
【０００３】
種々のリスクファクター（危険因子）がアテローム性動脈硬化症病変の形成をもたらす。この点で、循環リポタンパク質プロフィール、動脈性高血圧、およびニコチン中毒は特に重要である。
【０００４】
総合的疫学研究において、血清コレステロールレベルと冠動脈性心疾患の発生には正の相関がみられた。低密度リポタンパク質コレステロール(LDLc)レベルが高いと心血管系リスクが高くなり、アテローム性動脈硬化症のリスクの増加に直接関連する。スタチンは、HMG-CoA還元酵素インヒビターとして一般的に用いられ、循環LDLレベルを低下させることができる。しかしながら、積極的なスタチン治療による冠動脈イベントの減少にも関わらず、かなりの残った心血管系リスクが課題のままである。したがって、新たな治療薬が至急必要である。
【０００５】
LDLコレステロールレベルに加えて、血管を保護する高比重リポタンパクコレステロール(HDLc)レベルも心血管疾患のリスクプロフィールを評価する時に重要な役割をはたす。疫学的研究は、HDLcレベルとアテローム性動脈硬化症には反比例の関係があることを証明した。HDLcレベルは、LDLc値とは無関係に強力な予測因子である。したがって、HDLcレベルはアテローム保護効果があると思われる。したがって、HDLcレベルの上昇は、大きな目標であり、さらなる目的である。
【０００６】
スタチンによる単独療法は、HDLcレベルを上昇させるには有効ではなく、この種の医薬化合物によるアテローム性動脈硬化症の治療および予防は不十分である。HDLcレベルを上昇させるための現在の選択肢は、フィブラートおよびナイアシンである。特にナイアシンは有効であるが、その使用は患者のコンプライアンスが低くなるという有害作用により限定される。スタチンによる補完的LDL減少に対してHDLcレベルを上昇させるための効率的で安全な方法が至急求められている。この点で、単独療法またはアドオン療法としてのCETPの阻害が魅力的な目標である。
【０００７】
コレステロールエステル転送タンパク質(CETP)は、リポタンパク質間のコレステリルエステルおよびトリグリセリド(TG)を含む中性脂質の転送を担う血漿糖タンパク質である。アテローム保護 HDL由来のコレステリルエステルは、TGと引き換えにアテローム生成促進的アポリポタンパク質(apo) Bリポタンパク質(LDLおよびVLDL)に転送される。これはHDLレベルの低下とLDLおよびVLDLレベルの上昇をもたらす。
【０００８】
おそらく代謝的背景に依存してCETPは血漿中HDLレベルの増加を目的とする重要な治療目標である。
【０００９】
多くの種はCETPを持たない。アテローム性動脈硬化症に感受性のある種、例えばウサギおよびヒトでは、CETP活性が高い。アテローム性動脈硬化症に抵抗性のある他の種は、CETPを持たず、HDLcレベルが高い。
【００１０】
ウサギとハムスターの動物実験において、抗CETPモノクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはCETPインヒビターによるCETPの一過性の阻害はHDLレベルの増加をもたらす。
【００１１】
種々のクラスのCETPインヒビターが記載されており、そのいくつかはすでに臨床試験の段階にある(例えば、ダルセトラピブ(Stein EA、Eur Heart J. 31(4)(2010):480-8)、アナセトラピブ(Cannon CP、N Engl J Med. 363(25)(2010):2406-15、およびトルセトラピブ(Nissen SE、N Engl J Med. 356(13)(2007):1304-16)。
【００１２】
US 5,512,548およびWO 93/011782には、HDLからVLDLおよびLDLへのコレステロールエステルの転送を触媒するCETPを阻害することができ、患者に投与すると抗アテローム性動脈硬化症活性を有するポリペプチドとそのアナログが記載されている。これらの文献によれば、そのようなCETPポリペプチドインヒビターは、種々の供給源のapoC-Iから誘導され、特にアミノ酸36までのN末端断片がCETPインヒビターであることが分かっている。
【００１３】
US 5,880,095 Aは、個体のCETP活性を阻害することができるCETP結合ペプチドを開示している。
【００１４】
US 2006/0276400およびWO 96/034888は、T細胞および/またはB細胞エピトープを含むCETP由来のペプチドを開示している。これらペプチドは、in vivoでCETP特異抗体の形成を誘導することができる。
【００１５】
US 2004/0087481およびUS 6,410,022 B1は、CETP特異的免疫反応の誘導により、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症などを治療および予防するために用いることができるペプチドを開示している。これらペプチドは、CETP由来でないTヘルパー細胞エピトープとCETP由来のB細胞（後者）から直接誘導することができる少なくとも１のB-細胞エピトープを含む。Tヘルパー細胞エピトープは、好都合には破傷風トキソイド由来であり、CETPの少なくとも１のB-細胞エピトープと共有結合している。生物（organism）とは異質のTヘルパー細胞エピトープを用いることにより、少なくとも１のCETP-B-細胞エピトープからなるペプチド部分に対して誘導される抗体を、個体の体内で誘導することができるようになる。
【００１６】
WO 2006/029982には、アテローム性動脈硬化症の治療または予防用の医薬を製造するために用いるCETPミトトープが記載されている。
【００１７】
CETPに関するワクチンアプローチに対する示唆がすでにある。ウサギをCETPのC末端由来のペプチドを抗原として含むワクチンで処置した。免疫したウサギは、CETP活性が低下し、リポタンパク質レベルの変化がみられ、HDL値は増加し、LDL値は低下した。さらに、処置した被験アテローム性動脈硬化症モデル動物も、コントロール動物と比べてアテローム性動脈硬化症病変の減少を示した(Rittershaus CW、Arterioscler Thromb Vasc Biol 20(2000): 2106-12)。
【００１８】
American biotechnology company Avantが実施したワクチン CETi-1を用いた第二相臨床試験の結果が公表された(BioCentury Extra For Wednesday、October 22、2003)。この第二相試験では、先の第一相試験同様に、いかなる問題となる副作用もなく非常に良好な安全性プロフィールが証明され、抗CETPワクチネーションアプローチでは副作用がないと予期されるという結論を導くことができた。しかしながら、有効性に関して、Avantワクチンは、プラセボ処置より有意に良好なHDLレベルの増加をもたらさなかったため期待外れであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は個体におけるCETP活性の減少させる手段と方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)由来の6〜20アミノ酸残基からなるペプチドであって、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含むペプチドに関する。
【００２１】
驚くべきことに、アミノ酸配列 WWLGIDを含むペプチドは、哺乳動物、具体的にはマウスにおいてCETPに対する抗体を誘導することができることがわかった。これら抗体は、CETPと結合することができ、さらに該タンパク質の活性を減少させる。CETP活性を有する哺乳動物において、例えばワクチネーション(Thomas et al, Human Vaccines 5(2009)：79-84)または低分子インヒビター（Luscher et al., Eur Heart J 33(2012)：857-865；Krauss et al., J Lipid Res 53(2012)：540-547）によるこの活性の低下は、HDLレベルの増加をもたらすことはよく知られている。哺乳動物にHDLレベルの増加は、アテローム性動脈硬化症および他のアテローム性動脈硬化症関連疾患、具体的には心血管疾患の軽減をもたらす。
【００２２】
アミノ酸配列 WWLGIDを含む本発明のペプチドは、ヒトCETPの断片であるアミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)を有するペプチド(Protein Data Bank Accession No. 2OBD_A GI:126031487)から誘導される。アミノ酸配列 配列番号23を有するペプチドは、成熟CETPタンパク質のアミノ酸残基92〜121を含む。アミノ酸配列 WWLGIDを含むこのCETPタンパク質断片およびその切断（truncated）変異体は、先に記載のように、CETPと特異的に結合する抗体の形成を誘導する。しかしながら、成熟CETPタンパク質のアミノ酸残基47〜55、152〜165、290〜300、300〜316、および403〜415を含むCETP由来の他の断片は、完全長CETPタンパク質の表面に存在するが、CETPタンパク質に対する（すなわち結合する）抗体の形成をもたらさないが、哺乳動物に対するそのような断片の投与は、断片特異抗体の形成を誘導する。このことは、当業者がCETPタンパク質表面に露出したCETP断片はCETPタンパク質に対する抗体の形成を誘導するのに必要であると予期するであろうことは明らかであるので、驚くべきことである。
【００２３】
より長いペプチドがそのようなワクチンに望ましくない１またはそれ以上のT-細胞エピトープを含む確率が高いことは当該分野でよく知られている。細胞障害性T細胞エピトープ(CD4およびCD8)の活性化は、望ましくない有害事象(AE)を誘導する自己反応T細胞の誘導をもたらし得る。したがって、ワクチンの望ましくないエピトープを避けるために当業者は、抗原特異的液性免疫反応を誘導するためにできるだけ短いペプチドを抗原として用いるだろう。したがって、より短いペプチドは、はるかに化学的に合成しやすいことに加えて好ましい。
【００２４】
WO 02/098915には、本発明のアミノ酸配列 配列番号23を含む100アミノ酸以下のポリペプチドが開示されている。WO 02/098915のポリペプチドを用いてCETPに対する抗体を誘導する。WO 02/098915に記載のペプチドの長さによっては、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患の治療または予防に有用でないかもしれない抗体も誘導されるが、それはそのような抗体はCETPの重要でない部分に特異的だからである。
【００２５】
本明細書で用いている用語「ペプチド」は、ペプチド結合により互いに結合する少なくとも６アミノ酸残基を有するポリマー分子を表す。
【００２６】
本発明のペプチドの文脈において用いられる用語「から誘導される（由来の）」は、本発明のペプチドがアミノ酸配列 配列番号23を有するペプチドの断片であることを意味する。したがって、用語「から誘導される」は、「の断片である」と互換性に用いることができる。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)から誘導される6〜20 アミノ酸残基からなるペプチドは6〜16アミノ酸残基からなるかまたは含みうる。
【００２８】
本発明の特に好ましい態様によれば、該ペプチドは、8〜20、好ましくは8〜16アミノ酸残基を含む。本発明のペプチドがCおよび/またはN末端システイン残基を含む場合は、該ペプチドは、9〜21、好ましくは9〜17、または10〜22、好ましくは10〜18アミノ酸残基を含みうる。
【００２９】
本発明のペプチドがアミノ酸配列 配列番号23の少なくとも８連続アミノ酸残基を含む場合は、該ペプチドは、好ましくは、アミノ酸配列 配列番号10、配列番号11、配列番号18、および/または配列番号19からなるかまたはそれらを含む。
【００３０】
本発明の別の好ましい態様によれば、該ペプチドのアミノ酸配列は、YTTAWWLGIDQS(配列番号1)、YGYTTAWWLGIDQSID(配列番号7)、TTAWWLGIDQS(配列番号8)、TAWWLGIDQS(配列番号9)、AWWLGIDQS(配列番号10)、WWLGIDQS(配列番号11)、YTTAWWLGIDQ(配列番号13)、YTTAWWLGID(配列番号14)、TTAWWLGIDQ(配列番号18)、およびTTAWWLGID(配列番号19)からなる群、特に好ましくは、TAWWLGIDQS(配列番号9)、AWWLGIDQS(配列番号10)、およびWWLGIDQS(配列番号11)からなる群から選ばれる。
【００３１】
本発明のペプチドは、当該分野でよく知られている方法により化学的に合成することができる。もちろん、組換え法を用いて本発明のペプチドを製造することもできる。該ペプチドは、微生物、例えば細菌、酵母、もしくは真菌；真核細胞、例えば哺乳動物もしくは昆虫細胞；または組換えウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、もしくはセンダイウイルスを用いて製造することができる。該ペプチドを製造するのに適した細菌には、E. coli、B. subtilis、またはそのようなペプチドを発現させることができる他のあらゆる細菌が含まれる。本発明のペプチドを発現させるのに適した酵母細胞には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Candida、Pichiapastoris、またはペプチドを発現することができる他のあらゆる酵母が含まれる。対応する手段および方法も当該分野でよく知られている。組換え的に製造したペプチドの単離、精製方法も当該分野でよく知られており、例えばゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどが含まれる。
【００３２】
本発明のペプチドの単離を促進するために、該ペプチドがアフィニティクロマトグラフィにより単離することができるヘテロローガスなポリペプチドと翻訳的に融合（共有結合）した融合ポリペプチドを作成することができる。典型的なヘテロローガスなポリペプチドには、His-Tag(例えばHis6；6ヒスチジン残基)、GST-Tag(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)などがある。該融合ポリペプチドは、ペプチドの精製を促進するだけでなく、精製工程中の該ペプチドの分解を抑制することもできる。精製後にヘテロローガスなポリペプチドを除去することが望ましい場合は、該融合ポリペプチドは、該ペプチドと該ヘテロローガスなポリペプチドの間の接合部に開裂部位を含むことができる。該開裂部位は、該部位のアミノ酸配列に特異的な酵素（例えばプロテアーゼ）により開裂されるアミノ酸配列からなりうる。
【００３３】
本発明のペプチドは、そのNおよび/またはC末端にそれと結合するシステイン残基も含みうる。
【００３４】
ペプチドのNおよび/またはC末端にシステイン残基を供給すると、その担体との結合を促進し、および/または該ペプチドの免疫原性を増強することができる。本発明のペプチドのCおよび/またはN末端にシステイン残基を付加すると、本明細書に記載のアミノ酸残基の数が明らかに１または２アミノ酸残基増加する。したがって、アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)から誘導される6〜20 アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含むペプチドは、7〜21または8〜22アミノ酸残基からなりうる。
【００３５】
CまたはN末端システイン残基を有する本発明の特に好ましいペプチドは、C-YTTAWWLGIDQS、C-YGYTTAWWLGIDQSID、C-TTAWWLGIDQS、C-TAWWLGIDQS、C-AWWLGIDQS、C-WWLGIDQS、C-YTTAWWLGIDQ、C-YTTAWWLGID、C-TTAWWLGIDQ、およびTTAWWLGID-Cからなる群から選ばれる。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、該ペプチドは、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するために用いられる。
【００３７】
上記のように、本発明のペプチドは、特にヒトに存在するCETPと特異的に結合することができる抗体の形成を誘導することができる。該抗体とCETPとの結合は、in vivoでCETP活性の低下をもたらす。その結果としてHDLレベルが増加する。
【００３８】
アテローム性動脈硬化症関連疾患は、好ましくは、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、卒中性脳発作、および脳卒中からなる群から選ばれる。
【００３９】
用語「アテローム性動脈硬化症関連疾患」は、アテローム性動脈硬化症によって生じる結果である疾患を表す。該疾患には、特に、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、および卒中性脳発作が含まれる(例えば、Steinberg D.、J. Lipid Res. 46(2005): 179-190； Steinberg D et al.、J. Lipid Res. 47(2006): 1339-1351)。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、該ペプチドは0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg/免疫の量で個体に投与される。しかしながら、本発明のペプチドは、あるいは0.1ng〜10mg、好ましくは10ng〜1mg、具体的には100ng〜300μg/kg体重の量で個体に投与することができる。
【００４１】
担体物質と混合して単一剤形を製造することができるペプチドの量は、治療する宿主と具体的投与方法によって変化する。該ワクチンの用量は、病期、個体の年齢、性別、および体重、および個体に望む反応を誘導する抗体の能力などの因子に応じて変化しうる。投薬計画は、最適治療反応をもたらすように調整することができる。例えば、分割した用量を毎日投与するか、または該用量を治療状況の緊急性が示すように比例的に減少させることができる。該ワクチンの用量は、状況に応じて最適予防用量反応をもたらすように変更することもできる。例えば、本発明のペプチドおよびワクチンは、常にCETPに対する抗体のレベルに応じて、数日、１または２週間、または数カ月間の間隔で個体に投与することができる。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、該ペプチド/ワクチンは、2〜10回、好ましくは2〜7回、より好ましくは5回以下、最も好ましくは３回以下で適用される。特に好ましい態様において、次のワクチネーションとの時間間隔は、２週間〜５年間またはそれ以上、好ましくは、1月間〜3年間（以下）、より好ましくは2カ月間〜1.5年間で選ばれる。本発明の該ペプチド/ワクチンの反復投与は、治療的ワクチネーションの最終効果を最大にし得る。
【００４３】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)から誘導される6〜30アミノ酸残基を含み、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含む上記の少なくとも１のペプチドを含むワクチンに関する。
【００４４】
本発明のワクチンは、YTTAWWLGIDQS(配列番号1)、YGYTTAWWLGIDQSID(配列番号7)、TTAWWLGIDQS(配列番号8)、TAWWLGIDQS(配列番号9)、AWWLGIDQS(配列番号10)、WWLGIDQS(配列番号11)、YTTAWWLGIDQ(配列番号13)、YTTAWWLGID(配列番号14)、TTAWWLGIDQ(配列番号18)、およびTTAWWLGID(配列番号19)からなる群から選ばれるペプチドの１またはそれ以上、好ましくは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10を含みうる。
【００４５】
ペプチドの特に好ましい組み合わせは、配列番号10および11；配列番号8および9；配列番号8および10；配列番号8および11；配列番号9および10；配列番号9および11；配列番号8、9および10；配列番号8、9および11；配列番号8、9、10および11；配列番号10、11および18；配列番号8、9および18；配列番号8、10および18；配列番号8、11および18；配列番号9、10および18；配列番号9、11および18；配列番号8、9、10および18；配列番号8、9、11および18；配列番号8、9、10、11および18；配列番号8および18；配列番号9および18；配列番号10および18；配列番号11および18を含む。
【００４６】
本発明のワクチンは、CETPの他のペプチド断片またはその変異体、またはin vivoでCETP、特にヒトCETPに対する抗体の形成を誘導することができるあらゆる他のペプチドも含みうる。WO 2009/021254に記載のペプチドが特に適している。本明細書が開示するペプチドは、アミノ酸配列 FX8(F)oPX9HX10X11X12DX2X3X4X5X6X7［ここで、X8はG、A、F、Y、およびKからなる群から選ばれる。X9は、E、Y、A、Q、K、およびSからなる群から選ばれる。X10は、H、V、L、F、およびIからなる群から選ばれる。X11は、L、W、S、I、F、およびYからなる群から選ばれる。X12は、V、T、F、またはIである。X2は、F、A、W、R、S、L、Q、VおよびMからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。X3は、L、A、S、W、E、R、IおよびHからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。X4は、Q、A、H、D、K、R、SおよびEからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。X5はSまたはYである。X6はL、A、またはIである。X7は、S、N、またはTである。oは0または1である。］を有する。好ましい組み合わせは、本発明のペプチドと以下からなる群から選ばれる１またはそれ以上のペプチドを含む：FGFPEHLLVDFLQSLS、FPEHLLVDFLQSL、AGFPEHLLVDFLQSLS、FAFPEHLLVDFLQSLS、FGAPEHLLVDFLQSLS、FGFAEHLLVDFLQSLS、FGFPAHLLVDFLQSLS、FGFPEALLVDFLQSLS、FGFPEHALVDFLQSLS、FGFPEHLAVDFLQSLS、FGFPEHLLADFLQSLS、FGFPEHLLVAFLQSLS、FGFPEHLLVDALQSLS、FGFPEHLLVDFAQSLS、FGFPEHLLVDFLASLS、FGFPEHLLVDFLQALS、FGFPEHLLVDFLQSAS、FGFPEHLLVDFLQSLA、FAFPAHLLVDFLQALA、FGFPGHLIWDSLHSLS、FGFPYHHLVDQLHSLS、FGFPYHVQVDVLQSLS、FGFPSHHLQDSLQSLS、FGFPLHFRSDRIQSLS、FGFPKHLYADMSQSLS、FGFPAHLSRDLRQSLS、FGFPFHFAQDSWQSLS、FGFPQHLTTDRAQSLS、FGFPQHLTTDWAQSLS、FGFPQHLTTDRLQSLS、FGFPQHLTTDWLQSLS、ATPSHLIIDRAQ、ATPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDWAQSLS、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPSHLIIDWSQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQLLS、FGFPAHVSIDWLQWLS、FGFPAHVSIDWLQNLS、FGFPAHVSIDWLQTLS、FGFPAHVSIDWLQYLS、FGFPAHVSIDWLQSIS、FGFPAHVSIDWLQSLT、FGFPAHVSIDWLQSLY、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFPAHVSIDRAQSLS、FGFPTHVSIDWLQSLS、FGFPFHVSIDWLQSLS、FGFPAHISIDWLQSLS、FGFPAHIIIDWLQSLS、FGFPAHLTTDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVSLDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、FGFPAHVWIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN、FGFPAHFSIDWLQSLS、FGFPAHVSFDWLQSLS、FGFPEHVFIDWLQSLS、FGFPQHLFTDWLQSLS、FGFPKHLLVDFLQSLS、FGFPAHVSIDWSQSLS、FGFPAHVSIDFSQSLS、FGFPSHIIIDWLQSLS、FGFPSHLIIEWLQSLS、FAFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQALS、FGFPAHVFIDWLQSLA、FAFPAHVFIDWLQALA、FGFPEHLFVDFLQSLS、FGFPAHVHIDWLQSLS、FGFPAHVPIDWLQSLS、FGFPSHLFIDWAQSLS、FGFPAHVYIDWLQ、およびFGFPAHVFIDWLQ。
【００４７】
本発明のワクチンは、ヒトの体内でLDLおよび/またはHDLレベルの調節にも関与する他のタンパク質由来の抗原も含みうる。例えば、本発明のCETP断片は、WO 2008/125623、WO 2010/057242およびWO 2011/027257に記載のPCSK9(前駆タンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシン タイプ9)から誘導されるエピトープと組み合わせることができる。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、該少なくとも１のペプチドは、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペット・ヘモシアニン)と結合または融合する。
【００４９】
本発明の好ましい態様によれば、該ペプチドは、医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペット・ヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、B型肝炎コア抗原、ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP)、ペプチドリンカー(または隣接領域)、またはCRM、好ましくはCRM197と結合または融合し、ならびにSingh et al.、Nat. Biotech. 17(1999): 1075-1081(具体的には該文献の表１に記載のもの)、およびO'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)(2003): 727-735(具体的には、その中に記載の内因性免疫増強化合物および送達系)に記載のアジュバント物質またはその組み合わせと混合する。この文脈において共役化学（例えば、ヘテロ二機能性化合物、例えばGMBSおよびもちろん「Bioconjugate Techniques」、Greg T. Hermansonに記載の他のものを介する)は、当業者に知られた反応から選ぶことができる。さらに、ワクチン組成物は、アジュバント、好ましくは低溶解性アルミニウム組成物、具体的には水酸化アルミニウムと製剤化することができる。もちろん、アジュバント、例えば、MF59リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン(例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン(例えばQS21)、MDP誘導体、CpGオリゴヌクレオチド、LPS、MPL、ポリホスファゼン、エマルジョン(例えばフロインド（Freund's）、SAF)、リポソーム、リポペプチド、ビロソーム、イスコム、コクレアート、PLG微小粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、易熱性エンテロトキシン(LT)、コレラトキシン(CT)、変異体毒素(例えば、LTK63およびLTR72)、微小粒子、および/または重合リポソームも用いることができる。
【００５０】
本発明のペプチドは、好ましくは、NHS-ポリ(エチレンオキシド)(PEO)(例えば、NHS-PEO4-マレイミド)からなる群から選ばれるリンカーを介して担体またはアジュバントと結合する。
【００５１】
本発明のペプチドおよび医薬的に許容される担体を含むワクチンは、あらゆる適切な適用方法、例えば、皮内(i.d.)、静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、鼻内、経口、皮下(s.c.)などにより、あらゆる適切な送達手段を用いて投与することができる(O'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)(2003): 727-735)。本発明の化合物は、好ましくはs.c.、i.d.、またはi.m.投与用に製剤化される(例えば、「Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations」、Sarfaraz Niazi、CRC Press Inc、2004)。
【００５２】
本発明のワクチンは、好ましくはi.d.、s.c.、またはi.m.投与用に製剤化される少なくとも１のペプチドを含む。
【００５３】
該ワクチン中の      少なくとも１のペプチドは、好ましくはアジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムと共に製剤化される。
【００５４】
典型的には、該ワクチンは、本発明のペプチドを0.5〜500μg、好ましくは1〜100μg、あるいは0.1ng〜10mg、好ましくは10ng〜1mg、具体的には100ng〜100μg、あるいは例えば、100fmol〜10μmol、好ましくは10pmol〜1μmol、具体的には100pmol〜100nmolの量で含む。典型的には、該ワクチンは、補助物質、例えば緩衝剤、安定化剤なども含みうる。
【００５５】
本発明の特に好ましい態様によれば、該ワクチンは、以下の成分の２またはそれ以上を含むことができる：
2014519512.tif 000002
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、該ワクチンは、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患（ここで、アテローム性動脈硬化症関連疾患は、好ましくは、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈性心疾患、卒中性脳発作、および脳卒中からなる群から選ばれる。）を予防および/または治療するために用いられる。
【００５７】
本発明の別の局面は、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および/または治療するためのワクチンを製造するための本発明の少なくとも１のペプチドの使用に関する。
【００５８】
本発明のさらに別の局面は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患に罹患しているかまたは罹患するリスクのある個体の治療方法であって、その過程で、本発明のペプチドまたはワクチンを該個体に投与する方法に関する。
【００５９】
本発明のワクチンに次いで、治療すべき個体には、ヒトおよび哺乳動物のLDLおよび/またはHDLレベルに影響を及ぼすことが知られている他の活性成分、例えば、スタチン、フィブラート、ニコチン酸、コレステロール吸収阻害剤(例えばエゼチミブ)、ApoA1 Milano、脱脂HDL、植物ステロール、PCSK9インヒビターなども投与することができる。
【００６０】
本明細書で用いている「治療する」は、すでに存在する病態または病状を治すことを意味する。治療するには、阻害する、すなわち病態または病状の発現を停止させること、および改善する、すなわち疾患の軽減をもたらすことも含まれうる。
【００６１】
本明細書で用いている用語「予防する」は、特に患者または対象が病態または病状に罹るようなリスクの素因がある場合に、患者または対象に病態または病状が生じることを完全またはほぼ完全に防ぐことを意味する。
【００６２】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列 VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(配列番号23)から誘導される6〜20 アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列 WWLGID(配列番号24)を含む本発明のペプチドと結合するか、該ペプチドに対する抗体に関する。
【００６３】
本発明のペプチドに対する抗体を用いてヒトまたは動物の体内のCETP活性を阻害することができる。したがって、該抗体は、ヒトおよび動物の受動ワクチネーションに用いることができる。
【００６４】
モノクローナルまたはポリクローナルでありうる本発明の抗体は、当該分野で知られたごとく製造することができる。モノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体方法論、例えば、KohlerおよびMilstein(1975) Nature 256: 495の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により製造することができる。他のモノクローナル抗体製造技術、例えばBリンパ球のウイルスまたは発癌形質転換を用いることもできる。
【００６５】
好ましい態様によれば、該抗体は、それぞれ相補性決定領域を含む重鎖可変(「VH」)領域および抗体軽鎖可変(「VL」)領域を含み、VH領域の相補性決定領域は以下のアミノ酸配列NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(配列番号104)、EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号105)、DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号106)、またはQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(配列番号107)の１またはそれ以上を有し、VL領域は、アミノ酸配列DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No 108)、QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(配列番号109)、DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(配列番号110)、またはDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(配列番号111)の１またはそれ以上を有する。
【００６６】
NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(配列番号104)を含むVH領域とDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No 108)を含むVL領域の組み合わせ、またはEVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号105)を含むVH領域とQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(配列番号109)を含むVL領域の組み合わせ、またはDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号106)を含むVH領域とDIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(配列番号110)を含むVL領域の組み合わせ、またはQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(配列番号107)を含むVH領域とDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK(配列番号111)を含むVL領域の組み合わせ、を含む抗体が特に好ましい。
【００６７】
一本鎖抗体(scFv)を作製するには、VHおよびVLをコードするDNA断片をフレキシブルリンカーをコードする別の断片と機能的に結合させて、VLドメインとVHドメインをフレキシブルリンカーで連結し、VHおよびVL配列が連続する一本鎖タンパク質として発現することができるようにする(例えば、Bird et al.、Science 242:423-426(1988)；Huston et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)；McCafferty et al.、Nature 348:552-554(1990))。一本鎖抗体は、１個のVHおよびVLのみを用いる場合は一価、２個のVHおよびVLを用いる場合は二価、３個以上のVHおよびVLを用いる場合は多価でありうる。CETPと別の分子に特異的に結合する二特異性または多価抗体を生成することができる。
【００６８】
別の局面において、他の修飾抗体を、抗体をコードする核酸分子を用いて製造することができる。例えば、「κ（Kappa）抗体」(III et al.、Protein Eng. 10: 949-57(1997))、「ミニボディ」(Martin et al.、EMBO J. 13: 5303-9(1994))、「ディアボディ」(Holliger et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993))、または「Janusins（ヤヌシン）」(Traunecker et al.、EMBO J. 10:3655-3659(1991)およびTraunecker et al.、Int. J. Cancer(Suppl.) 7:51-52(1992))は、本明細書の開示に従い標準的分子生物学的技術を用いて製造することができる。
【００６９】
本発明の抗体は、好ましくはヒト化されている。そのような抗体を得る方法は当該分野でよく知られている。１つの方法は、本明細書に記載の可変領域をヒト抗体骨格（scaffold）に挿入することである(例えば、Hou S、et al. J Biochem 144(2008): 115-20参照)。
【００７０】
本発明を以下の図および実施例でさらに説明するが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】CETPアミノ酸配列から区分された配列番号１〜６および２２のペプチドについての抗ペプチド価中央値（図１A）および抗タンパク質力価中央値（ｎ＝５/群）（図１Ｂ）を示す。
【図２】配列番号1および7〜21(切断ペプチド)のペプチドについての抗ペプチド力価中央値（図2A）および抗タンパク質力価中央値（ｎ＝５/群）（図2B）を示す。
【図３】配列番号1および7〜21(切断ペプチド)のペプチドについてのCETP活性を阻害する抗体を有するマウスの数（ｎ＝５/群）を示す。
【図４】アミノ酸配列 配列番号1、7、8、9、10、11、13、14、15、18および19を有するペプチドでワクチネーションしたマウス（ｎ＝５/群）から得た血清のCETP活性阻害パーセントを示す。
【図５】本発明のモノクローナル抗体によるヒトCETPタンパク質の認識を示す。
【図６】本発明のモノクローナル抗体によるヒト血清中のCETP活性の阻害を示す。
【実施例】
【００７２】
材料と方法
ワクチン
該ペプチドをヘテロ二機能性リンカーGMBS(4-マレイミド酪酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を介してKLH(キーホールリンペット・ヘモシアニン)と結合させた。
【００７３】
15μgの該ペプチドを水酸化アルミニウムに懸濁させた(水酸化アルミニウムの最終濃度は0.2％であった)。緩衝剤としてマンニトール/ホスフェートを用いた。
【００７４】
動物実験
５匹のBalb/cマウスの皮下に免疫した。マウスに不断給餌および給水し、12時間の明暗周期下においた。実験開始時のマウスの年齢は通常8〜10週間であった。
マウスに、KLHと結合させた正味ペプチド15μgをアジュバントとしてアラムに吸着させたもの総容量１mlを2週間間隔で３回、s.c.経路で注射した。
最終注射から約２週間後に血液を採取した。
【００７５】
ペプチドELISA
該ワクチンの免疫原性を測定するために、96ウェルNunc-Maxisorbプレートを0.1M NaHCO3中ウシ血清アルブミン(BSA)（pH 9.2〜9.4）と結合させた各ペプチド１μMでコートした。無関係なペプチドを陰性コントロールに用いた。KLHを陽性コントロールとして含め、1μg/mlの濃度でコートした。非特異的結合を、ブロッキング緩衝液（PBS中5％BSA）とインキュベーションしてブロックした。適切な血清希釈をウェルに加え、１：２倍に連続希釈し、３７℃で約１時間インキュベーションした。すべてのELISAプレート上で標準血清を内部コントロールとして含めた。結合した抗体をビオチン化ヤギ抗マウスIgG、次いでストレプトアビジン結合ホースラディッシュパーオキシダーゼとインキュベーションして検出した。基質としてABTSを加え、Microwellプレートリーダーを用いて吸光度(OD)405nmで測定した。力価を、アッセイでODmaxの50％に達する血清希釈で定義した。
【００７６】
タンパク質ELISA
「ペプチドELISA」の項に記載したプロトコールを用いて、ワクチネーションにより誘導された抗体のN末端にGSTが融合した組換え発現ヒトCETP(「GST-CETP」)と結合する能力を測定した。
【００７７】
CETP活性阻害アッセイ
CETP活性は、Roar CETP活性アッセイキット(RB-CETP；Roar Biomedical)を用い、製造業者が提供するプロトコールにしたがって蛍光標識した基質の変換を測定することにより測定した。マウスは内因性CETP活性を持たないので、このプロトコールの修飾を導入した。ヒト血清をCETP供給源として用い、受容体粒子および供与体粒子（CETP活性アッセイキットの成分）とともに、ワクチネーションしたマウス由来の血清の同量と混合した。
CETP阻害抗体を含むマウス血清は本アッセイにおけるシグナルの低下をもたらす。無関係のペプチドを注射したマウス由来の血清を陰性コントロールとして用いた。
モノクローナル抗体による阻害を試験するために、示した量の精製抗体をヒト血清に加えた。
【００７８】
実施例１：種々の潜在的CETPエピトープの比較
2014519512.tif 000003
注射したペプチドおよびCETPに対する抗体価中央値(図1Aおよび1B参照)。
2014519512.tif 000004
【００７９】
これらのデータは、アミノ酸配列 配列番号1を含むか、または該配列からなるペプチドの投与がペプチドそれ自身に対する抗体だけでなく成熟CETPタンパク質に対する抗体の形成をもたらすことを明確に示している。他のCETP断片の投与は、成熟CETPタンパク質ではなく該各断片に対する抗体の形成のみを誘導した。
【００８０】
実施例２：配列番号1およびその切断型に対する免疫応答の比較
2014519512.tif 000005
【００８１】
注射したペプチドおよびCETPに対する抗体価中央値、およびヒト血清のCETP活性を低下させる抗体を有するマウスの数、および単回ワクチネーションマウス由来の血清の添加によるヒト血清におけるCETP活性阻害パーセント(図2A、2B、3、および4参照)。
2014519512.tif 000006
【００８２】
これらのデータは、WWLGID(配列番号24)を含むCETP断片は、成熟CETPに対する抗体の形成を誘導することができる。これに対して、アミノ酸配列 配列番号24を含まない配列番号23由来の他のCETP断片はこれらの効果を示さなかった。
【００８３】
実施例３：CETP活性の阻害
2014519512.tif 000007
n.t. 抗タンパク質力価が低いため試験せず。
【００８４】
実施例４：
モノクローナル抗体：
Balb/cマウスを、KLH結合正味ペプチド配列番号10  15μgでワクチネーションした。アルヒドロゲルをアジュバントとして用いた。高抗CETPタンパク質力価のマウスの脾臓細胞を標準的技術によりマウスミエローマ細胞と融合させた(Koehler、G.およびMilstein、C. Nature. 256(1975): 495-497に記載のプロトコール)。ハイブリドーマクローンの、注射したペプチドおよび組換え発現ヒトCETPタンパク質を特異的に認識する抗体の産生を標準的ELISAで試験した。選択したクローンを培養し、標準的プロトコールに従ってモノクローナル抗体を組織培養上清から精製した。
【００８５】
モノクローナル抗体のシーケンシング：
RNAをハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNAをオリゴ(dT)プライマーを用いる逆転写により作製した。次に、モノクローナル抗体DNAのVHおよびVL両領域を増幅する可変ドメインプライマーを用いるPCR反応を行った。VHおよびVL産物を抽出し、ゲル精製し、シーケンシングベクター中にクローンし、次いでTOP10中に形質転換した。選択したクローンを採取し、シーケンシングで分析した。
【００８６】
４つの選択したモノクローナル抗体のデータ：
クローンCJ7-6-B7、5/C7-6-C8、12/B3-5-B11、およびBTS4-1。
ヒトCETPタンパク質ELISAおよびCETP活性阻害は上記のごとく行った。
モノクローナル抗体によるヒトCETPタンパク質の認識(図5参照)。
これらのデータは、４つすべての抗体がコートされたCETPタンパク質を認識することを示した。ELISAによる力価測定は、すべての抗体について同量で出発した(2mg/ml希釈)。予期したように、モノクローナル抗体はそのELISAシグナルが異なり、これはコートしたタンパク質に対するアフィニティが異なることにより説明されるかもしれない。
モノクローナル抗体によるヒト血清中のCETP活性の阻害（図６参照）。
これらのデータは、４つすべての抗体がCETPと結合するだけでなく、CETP活性を阻害することを示した。加える抗体の量が多くなると、CETP活性はより低下する。
【００８７】
モノクローナル抗体の配列（可変ドメインのみを示す）：
CJ7-6-B7
重鎖：
NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA
軽鎖：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK
【００８８】
5C7-6-C8
重鎖：
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS
軽鎖：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK
【００８９】
12B3-5-B11
重鎖：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS
軽鎖：
DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK
【００９０】
BTS4-1
重鎖：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS
軽鎖：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCFQGSRVPPTFGGGTKLEIK
【図１Ａ】
2014519512.tif 000008
【図１Ｂ】
2014519512.tif 000009
【図２Ａ】
2014519512.tif 000010
【図２Ｂ】
2014519512.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月14日(2014.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014519512000001.app
【国際調査報告】
2014519512.tif 000016
2014519512.tif 000017
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