(57)【要約】本発明は、細胞透過性ペプチドならびに細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子のコンジュゲートを開示する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
Ｎ末端  ［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］  Ｃ末端
を有する少なくとも３個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで：
ドメイン１〜３中の残基を合わせた総数は４０より多くなく、
ドメイン１および３中のＲ（アルギニン）残基を合わせた数は少なくとも５であり、
ドメイン１および３中のＸ残基を合わせた数は少なくとも１であり、
ドメイン１および３中のＢ残基を合わせた数は少なくとも２であり、ここで
Ｘ＝アミノヘキサン酸およびＢ＝ベータアラニンであり、
ドメイン２はアミノ酸Ｚ１Ｚ２ＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９８］の少なくとも３個を含有する配列を含み、ここでＺ１はＹまたはＩであり、かつＺ２はＱまたはＲであり、かつ
ドメイン２はＩＬＦＱＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９９］、ＩＬＦＱ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８００］またはＩＬＩＱ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０１］のＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含有しない、前記ペプチド。
【請求項２】
配列：
Ｎ末端  ［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］  Ｃ末端
を有する少なくとも３個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで：
（ｉ）ドメイン１は以下の配列から選択される配列を含み：
ＲＸＲＺ３      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６２］
ここでＺ３は以下の配列の１つから選択され：
ＲＢＲＲＸＲ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６３］
ＲＢＲＲＸ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６４］
ＲＢＲＸ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６５］
ＲＢＲＸＲ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６６］
ＢＲＸ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６７］
ＢＸ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６８］
ＲＢＲ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６９］
ＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７０］、または
ＲＢＲＲ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７１］
（ｉｉ）ドメイン２はアミノ酸Ｚ１Ｚ２ＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９８］の少なくとも３個を含有する配列を含み、ここでＺ１はＹまたはＩであり、かつＺ２はＱまたはＲであり、かつここでドメイン２はＩＬＦＱＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９９］、ＩＬＦＱ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８００］またはＩＬＩＱ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０１］のＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含有せず、
（ｉｉｉ）ドメイン３は以下の配列から選択される配列を含み：
ＲＸＲＢＲＸＲＢ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２］
ＸＲＢＲＸＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］
ＲＸＲＲＢＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］
ＢＲＸＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］
ＸＲＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］
ＲＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］
ＸＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］
ＲＢＲＸＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］
ＲＸＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、または
ＢＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］
ここでＸ＝アミノヘキサン酸、Ｂ＝ベータアラニンである、前記ペプチド。
【請求項３】
ドメイン２がＹＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０２］、ＩＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０３］、ＹＲＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０４］、ＹＲＦＲＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０５］、ＦＱＩＬＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６］、ＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０７］、ＱＦＬ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０８］、またはＩＬＦＲＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１１］から選択されるＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
ドメイン１が以下の配列：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２］
ＲＸＲＲＢＲＲＸ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３］
ＲＸＲＲＢＲＸ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４］
ＲＸＲＢＲＸ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５］
ＲＸＲＲＢＲＸＲ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６］
ＲＸＲＲＢＲ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８７］
ＲＸＲＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８８］、または
ＲＸＲＲＢＲＲ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８９］
ＲＸＲＢＸ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９０］
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
ドメイン３が以下の配列：
ＲＸＲＢＲＸＲＢ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２］
ＸＲＢＲＸＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］
ＲＸＲＲＢＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］
ＢＲＸＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］
ＸＲＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］
ＲＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］
ＸＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］
ＲＢＲＸＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］
ＲＸＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、または
ＢＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
ドメイン２が４または５個のアミノ酸を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
ドメイン２が０、１、２または３個のＲ残基を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
ドメイン２が少なくとも１または２個のＲ残基を有し、ドメイン１が５個以下のＲ残基を有し、ドメイン３が４個以下のＲ残基を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
１個以上のＲ残基がＤ−アルギニンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
１個以上のＲ残基がＬ−アルギニンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
ドメイン１および３がＲ、ＸおよびＢ残基のみを含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
ドメイン１が２〜６個のＲ残基、１〜３個のＸ残基および１〜２個のＢ残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが１０残基より多くなく、かつ０、１または２個のＲ、ＸまたはＢではない残基を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３】
ドメイン３が２〜５個のＲ残基、１〜３個のＸ残基、および１〜３個のＢ残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが９残基より多くなく、かつ０、１または２個のＲ、ＸまたはＢではない残基を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
ペプチドが天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基を含めて３０残基の最大長を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
ドメイン１が４から１２残基までの長さを有し、ドメイン２が３から９残基までの長さを有し、かつドメイン３が４から１２残基までの長さを有し、ここで該長さに天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基が含まれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３０８または３１７〜７６１（図１８、２３〜３０、および４１）の１つから選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３０８または３１７〜７６１（図１８、２３〜３０、および４１）の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８】
Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、または７）の１つのドメイン１〜３の配列またはＰｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、または７）の１つのドメイン１〜３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９】
ペプチドがさらにＣ末端においてリンカーを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０】
リンカーがＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓ、ＸＢＣｙｓ、ＢＸ、またはＸＢから選択される、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
ペプチドがカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２２】
コンジュゲーションがペプチドのＣ末端においてである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
カーゴ分子が核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択される、請求項２１または２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
カーゴ分子が５，０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
カーゴ分子がＰＮＡＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９］もしくはＰＭＯＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］またはＰＮＡＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９］もしくはＰＭＯＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有する分子である、請求項２３または２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む、医薬組成物または薬剤。
【請求項２７】
さらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含む、請求項２６に記載の医薬組成物または薬剤。
【請求項２８】
疾患の処置の方法における使用のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２９】
疾患の処置における使用のための薬剤の製造における、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを患者に投与することを含む、処置を必要とする患者における疾患の処置の方法。
【請求項３１】
疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、メンケス病、β−サラセミア、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）、または癌から選択される、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のペプチド、使用または方法。
【請求項３２】
疾患が心臓の病気である、または心臓において明白である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のペプチド、使用または方法。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチドペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている、単離された核酸。
【請求項３４】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチドペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドに、特に、排他的にではないが、細胞透過性ペプチドに、ならびに細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子（ｃａｒｇｏ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
必須のＲＮＡ配列を標的とするオリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、細胞中の遺伝子発現の調節において、および可能性のある療法として、数多くの最近の適用を見出してきた１，２。ＲＮアーゼＨに誘導されるアンチセンスＯＮおよびＲＩＳＣに誘導されるｓｉＲＮＡ試薬を超える立体的遮断性（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）ＯＮの機構的利点はより優れた特異性であり、これはＯＮの不正確なＲＮＡに対する結合は望まれない標的以外への（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）生物学的作用を誘発する可能性がより低いためである。第２に、宿主のＲＮＡ切断酵素による分子認識の必要がないため、はるかに広い範囲の合成ＯＮ類似体を用いることができる。
【０００３】
立体的遮断薬として有用なＯＮ類似体の中で主要なものは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）３およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）４のような非荷電主鎖を有するＯＮ類似体である。ＰＮＡおよびＰＭＯ  ＯＮは両方とも療法の開発に向けたＲＮＡ標的化適用のためにインビボで用いられてきた５。細胞培養において、ＰＮＡおよびＰＭＯは両方ともかなり不十分にしか細胞に入らないことが観察されており、従って細胞送達を増進する方法を開発するために多くの努力が費やされてきた。特に有用なのは、ＰＮＡまたはＰＭＯにコンジュゲートした際にそれらの観察されたペプチドとしての細胞移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ）力を利用することができるという期待において、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えばＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｔａｔ（４８−６０）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、および（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４（Ａｈｘ＝アミノヘキサン酸）の結合であった６−９。
【０００４】
立体的遮断性ＯＮの活性を評価するための価値のあるアッセイは、ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞の核における１８マーの合成ＯＮ（７０５部位）による異常なサラセミアβグロブリンイントロンのスプライス修正およびそれに続くレポーターであるホタルルシフェラーゼの上方制御を含む、Ｋｏｌｅおよび同僚らにより確立されたアッセイである１０。このアッセイは、非常に低い活性レベルでさえも陽性発光の表示値（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）として測定され得るような、非常に高いダイナミックレンジを有する。７０５スプライス部位を標的としたＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートがこのアッセイで試験され、いくつかの異なるＣＰＰに関して、ＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートを添加される形質移入試薬の非存在下でＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞と共にインキュベーションした際に中程度の活性レベルが報告されており、一方でＰＮＡ単独は不活性である１１−１３。我々の研究室において、我々は、Ｔａｔ−ＰＮＡまたは（Ｌｙｓ）８−ＰＮＡコンジュゲートはそのアッセイにおいて有意な活性を見るためにエンドソーム溶解剤である１００μＭクロロキンとの同時インキュベーションを必要とするが１４，１５、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡおよび（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＭＯコンストラクトに関するμＭ範囲での活性がクロロキンの非存在下で得られることを見出した７，１６。
【０００５】
我々は、６個のＡｒｇ残基が既知のＣＰＰ  ＰｅｎｅｔｒａｔｉｎのＮ末端に付加されたＣＰＰも報告している１７，１８。ＨＩＶ−１のトランス活性化応答配列ＲＮＡに相補的なＰＮＡにジスルフィドでコンジュゲートされたＲ６−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ｒ６Ｐｅｎ）は、ルシフェラーゼ発現を阻害するために核送達およびＴＡＲ  ＲＮＡへの結合を必要とするＴａｔ依存性トランス活性化の阻害のＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて有意な活性を示した１８。
【０００６】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、主にジストロフィン遺伝子中のナンセンス変異またはフレームシフト変異により引き起こされるＸ連鎖性筋障害であり、約３５００人の男性の出生中１人の頻度で起こり、可能性のある療法が大いに必要とされている２９。ＤＭＤの患者は重篤な進行性の筋消耗を患い、一方でより軽度のベッカー型筋ジストロフィーは結果として短縮されているが部分的に機能するタンパク質の発現をもたらすインフレーム欠失により引き起こされる。配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、より短いジストロフィンの形態がベッカー型筋ジストロフィーの活性に類似した活性を有して産生されるように、標的化されたエキソンスキッピングを誘導して変異したジストロフィンのｍＲＮＡの読み枠を修正することが示されている３０，３１。細胞モデルにおいて、エキソン２３においてナンセンス変異を含有するｍｄｘジストロフィーマウスモデルにおいて３１−３３、そしてエキソンスキッピングのアプローチに顕著な有望性を示してきたイヌモデルにおいて、研究が実施されてきた。生物学的活性は、ＯＮが筋細胞核中のジストロフィンのプレｍＲＮＡに結合して“立体的遮断”機序によりスプライシングパターンの変更を引き起こす結果として達成される。
【０００７】
ＤＭＤを有する患者はしばしば心筋の変性を患い、それは心筋症およびＸ連鎖性拡張型心筋症のような心疾患の形態をもたらす。従って、心筋において機能する、または部分的に機能するジストロフィンの向上した発現を可能にするＣＰＰが必要とされている。
【０００８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは現在デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関する最も有望な療法的介入である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはジストロフィンのプレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、それによりジストロフィンの読み枠を特異的に修復し、切り詰められているが部分的に機能する（ｓｅｍｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ジストロフィンタンパク質を生成する。このアプローチの開発における難題は、比較的乏しい全身へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達および心臓を含む冒された非骨格筋組織における非効率的なジストロフィンの修正である。
【０００９】
エキソンスキッピングの効率を決定する最も重要な要因の１つは、ＯＮの化学的性質である。最も広く用いられてきたのは２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート（２’ＯＭｅＰＳ）である。この主鎖は最初に筋肉内注射を含むＤＭＤ患者におけるジストロフィンプレｍＲＮＡのエキソン５１を標的とする第Ｉ相臨床試験において試験された３４。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を用いて類似の第Ｉ相試験が実施された３５。ＤＭＤ患者における全身送達を含む第ＩＩ相臨床試験が、２’ＯＭｅＰＳ(Goermans N.M. et al (2011) New England J. Med., 364, 1513-1522)およびＰＭＯ化学(Cirak, S. et al (2011) The Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(11)60756-3)の両方に関して最近完了している。マウスにおける研究は、２’ＯＭｅＰＳと比較してＰＭＯを用いたエキソンスキッピングおよびジストロフィン発現の修復のより高いレベルを示唆してきた３５。ＰＭＯは非イオン性分子であり、標的細胞の細胞内分子と望まれない相互作用を形成する可能性がより低いと考えられている。
【００１０】
YinおよびWoodは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる別の非イオン性類似体をｍｄｘマウス中への筋肉内注射により調べ、エキソンスキッピングおよびジストロフィン産生の有意な誘導を見出している２３。ＰＭＯおよびＰＮＡは両方とも、医薬開発に関する重要な可能性を有する、高い配列特異性を有する非毒性のＯＮ類似体であると考えられている。エキソンスキッピングＰＭＯは、マウスにおいて９６０ｍｇ／ｋｇの投与量まで(Sazani, P. et al (2011) Int, J. Toxocol, 30, 322-333)、そしてサルにおいて３２０ｍｇ／ｋｇの投与量まで(Sazani, P. et al (2011) Int. J. Toxicol, 30, 313-321)十分に耐容されることが示されている。
【００１１】
いくつかの研究グループが、非イオン性ＯＮ（例えばＰＮＡまたはＰＭＯ）にコンジュゲートした際にそれらの細胞中への送達を助け（るがイオン性のタイプは助けず）、従ってそのＯＮの生物学的活性を高めるＣＰＰ（時々膜移行ペプチドとも呼ばれる）の設計に取り組んできた。ＰＭＯの場合、ＰＭＯにコンジュゲートした際に結果としていくつかの細胞およびインビボモデルにおいてより高いレベルの立体的遮断活性をもたらす、天然および非天然アミノ酸の両方を含有するペプチド（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−Ａｈｘ−Ｂが開示されている３６。これはマウスｍｄｘＤＭＤの研究において調べられている３７。
【００１２】
インビボでの適用に有用であるために、ＣＰＰは、例えばKoleらのスプライス修正ルシフェラーゼアッセイにより測定した際にＥＣ５０が約０．９０μＭ以下である有効なスプライス修正を可能にするために、特にＰＮＡまたはＰＭＯのようなカーゴに結合させた際に、細胞および核膜の有効な透過を示すことが好ましい。さらに、そのＣＰＰは細胞透過の前の分解に耐えるために優れた血清中安定性を有するべきである。また、療法的適用のために、ＣＰＰは低い毒性を有するべきである。
【００１３】
我々は以前に、２０マーの塩基配列ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９］を有するＰＮＡカーゴ（ＰＮＡＤＭＤと呼ばれる）または２５マーの塩基配列ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］を有するＰＭＯカーゴ（ＰＭＯＤＭＤと呼ばれる）のどちらかへのコンジュゲーションのための一連のＣＰＰを作成した。ＰＮＡＤＭＤおよびＰＭＯＤＭＤは両方とも、ｍｄｘ筋細胞（インビトロ）における、およびｍｄｘマウス（インビボ）におけるエキソンスキッピングに適したオリゴヌクレオチド類似体として一般的に用いられている。Ｐｉｐ  ５ｅ−ＰＭＯＤＭＤは、心筋におけるジストロフィン産生の誘導を含め、分化したマウスＨ２Ｋ筋細胞における、およびＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン発現の修復を示した。Ｐｉｐ  ５ｅは配列：ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＩＬＦＱＹＲＸＲＢＲＸＲＢＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］を有し、国際公開第２００９／１４７３６８号において、およびYin et al (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011)において開示されている。Ｐｉｐ  ５ｅペプチドの配列は、３個のドメイン：２個のアルギニンに富むドメイン（ＲＸＲＲＢＲＲＸＲおよびＲＸＲＢＲＸＲＢ）および中央の疎水性コア（ＩＬＦＱＹ）に分解することができる。Ｐｉｐ−５ｅはＰＭＯＤＭＤの心筋中への送達において優れた活性を有することが分かった。
【００１４】
Wu et al (Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No.15 5182-5191)は、オリゴＲ配列中にＸまたはＢ残基が挿入されているＣＰＰ−ＰＭＯＦ（Ｆは３’カルボキシフルオレセインタグを表す）コンジュゲートはスプライス修正活性および細胞取り込みを増大させ、血清結合を助けるが、そのコンジュゲートはＲ８およびＲ９コンジュゲートほど効率的に細胞に入らないことを報告した。彼らは、Ｘ残基の数が核のアンチセンス活性およびコンジュゲートの毒性の両方に影響を及ぼし、５より大きい個数のＸ残基のペプチドは細胞株において６０μＭで時間および濃度依存性の毒性を示すことも報告した。彼らは、毒性を低減するためにＸ残基の数を５未満に保つことを提案している。彼らは、（ＲＸ）ｎまたは（ＲＢ）ｎ中のＲＸまたはＲＢリピートの数を低減することは細胞取り込みを低減し、かつ（ＨｅＬａ細胞アッセイにおける）スプライス修正能力を低減することも報告した。
【００１５】
Abes et al (Nucleic Acids Research, 2008, 36, 6353-6354)は、（ＲＸＲ）ｎ−ＰＭＯ構造を有するＣＰＰ分子を論じ、試験したいくつかのスペーサー（Ｘ）分子の内で線状のＣ４（Ａｂｕ）、Ｃ６（Ａｈｘ）、またはＣ８（Ａｃｙ）スペーサーが最も有効であることを報告している。
【００１６】
Saleh et al (Bioconjugate Chem. Vol. 21 , No.10 1902-1911 (2010))は、ＰＮＡを有するコンジュゲートに関する線状（ＲＸＲ）ｎ配列中のアルギニン残基の数を１２および１６まで増やすことはＨｅＬａ細胞アッセイにおけるスプライス修正能力を増大させるが、細胞毒性も増大させることを報告した。鎖の分枝（２または４分枝）は結果として向上した活性をもたらさなかった。２鎖分枝および一部の４鎖分枝は１２および１６アルギニンコンストラクトに関して許容されたが、８アルギニンコンストラクトに関しては許容されなかった。
【００１７】
従って、スペーサー残基、例えばＸの数を増やすことは、オリゴＲペプチドと比較して毒性を増大させ、細胞侵入の効率を低減するようであるが、スプライス修正活性を増大させる可能性もある。一方で、大きい数のＲ残基は増大した細胞侵入効率をもたらすようであるが、望ましくない増大した毒性ももたらすようである。従って、優れた細胞侵入効率および低い毒性の釣り合いを提供するＣＰＰが必要とされている。加えて、ＣＰＰに関して、インビボで好都合な特性、例えばマウスモデル、ｍｄｘにおける、心筋を含む全ての筋タイプにおける高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生の方向付けを示すことが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４７３６８号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Goermans N.M. et al (2011) New England J. Med., 364, 1513-1522
【非特許文献２】Cirak, S. et al (2011) The Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(11)60756-3
【非特許文献３】Sazani, P. et al (2011) Int, J. Toxocol, 30, 322-333
【非特許文献４】Sazani, P. et al (2011) Int. J. Toxicol, 30, 313-321
【非特許文献５】Yin et al (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011)
【非特許文献６】Wu et al (Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No.15 5182-5191)
【非特許文献７】Abes et al (Nucleic Acids Research, 2008, 36, 6353-6354)
【非特許文献８】Saleh et al (Bioconjugate Chem. Vol. 21 , No.10 1902-1911 (2010))
【発明の概要】
【００２０】
本発明者らは、ここでＣＰＰの新規の系列を作成し、コンジュゲートしたカーゴ分子の細胞侵入を促進するそれらの能力およびそのＣＰＰの細胞毒性を評価した。
意外にも、本発明者らは、疎水性コアドメインの線状Ｎ〜Ｃ末端配列（すなわち一次配列）は細胞透過活性に本質的ではないこと、および（それらの一次配列ではなく）コアのアミノ酸の存在が重要な要因であることを確認した。従って、彼らは、構造−活性関係は疎水性コア中の特定の線状のアミノ酸の配列順序により提供される構造に依存するのではなく、疎水性コア中の特定のアミノ酸の存在に依存することを理解している。これは、本発明者らが本明細書で記述される細胞透過性ペプチドの新規の系列を設計することを可能にした。
【００２１】
従って、本発明者らは有望な細胞透過性ペプチドの新規の系列を同定した。そのペプチドは、細胞および核膜を越えるカーゴの移動を促進するための、そして場合によりカーゴを特定の器官のタイプ（例えば心臓）に送達するためのキャリヤー部分として作用することができる。ペプチド−カーゴコンジュゲートも提供される。
【００２２】
４つの新規のペプチド系列が調製され、ペプチド−ＰＭＯカーゴコンジュゲートとして試験された。そのペプチドおよび結合したカーゴを図１８および４１において示し、下記で要約する：
Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ、Ｐｉｐ−６ｇ、Ｐｉｐ−６ｈ、Ｐｉｐ−６ｉ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１０］；
Ｐｉｐ−７ａ、Ｐｉｐ−７ｂ、Ｐｉｐ−７ｃ、Ｐｉｐ−７ｄ、Ｐｉｐ−７ｂ２、Ｐｉｐ−７ｃ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１６］；
Ｐｉｐ−８ａ、Ｐｉｐ−８ｂ、Ｐｉｐ−８ｃ、Ｐｉｐ−８ｃ２、Ｐｉｐ−８ｄ、Ｐｉｐ−８ｄ２、Ｐｉｐ−８ｄ３［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７〜２０および３１７〜３１９］；または
Ｐｉｐ−９ｂ、Ｐｉｐ−９ｂ２、Ｐｉｐ−９ｃ、Ｐｉｐ−９ｃ２、Ｐｉｐ−９ｃ３、Ｐｉｐ−９ｄ、Ｐｉｐ−９ｄ２、Ｐｉｐ−９ｄ３、Ｐｉｐ−９ｄ４［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３２０〜３２８］。
【００２３】
ＰＭＯＤＭＤにコンジュゲートされたＰｉｐ−６ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］、Ｐｉｐ−６ｂ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３］、Ｐｉｐ−６ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］、Ｐｉｐ−６ｄ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］、Ｐｉｐ−６ｅ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、Ｐｉｐ−６ｆ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］、Ｐｉｐ−６ｇ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］、Ｐｉｐ−６ｈ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９］およびＰｉｐ−６ｉ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０］は全てインビトロでｍｄｘマウス細胞において高レベルのエキソンスキッピングを示す。Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂおよびＰｉｐ−６ｆはｍｄｘマウス（すなわちインビボ）で心筋においてＰｉｐ−５ｅに匹敵するエキソンスキッピングおよびジストロフィン（ｄｙｓｔｏｐｈｉｎ）産生を維持していた。Ｐｉｐ−８ｂ、Ｐｉｐ−８ｃ、Ｐｉｐ−９ｂ、Ｐｉｐ−９ｂ２、およびＰｉｐ−９ｃはまた、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、四頭筋および心臓において、明らかな毒性を伴わずに効率的なジストロフィン産生を示している。
【００２４】
従って、試験したＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートの細胞透過性ペプチド構成要素ならびに実質的に類似の配列同一性および構造を有するペプチドは、ＰＮＡ、ＰＭＯを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチドおよびタンパク質、ならびに小分子のようなカーゴの細胞および核への透過の促進において有用であることが予想される。
【００２５】
従って、本発明は、そのようなカーゴの細胞膜、例えば哺乳類細胞の形質膜および／または哺乳類細胞の核膜を越える取り込みの促進において有用であるペプチドを提供する。そのペプチドは“細胞透過性ペプチド”と呼ぶことができ、膜を越えるカーゴの輸送を促進するためにカーゴにコンジュゲートすることができる。
【００２６】
本発明のペプチドは、化学的に連続した単一の分子である配列を有する。そのペプチド配列は、アミノ酸および任意の非アミノ酸、例えばアミノヘキサン酸スペーサー残基で構成されていてよい。例えば、そのペプチドの一部の部分において、アミノヘキサン酸スペーサーが第１アミノ酸のＣ末端に、および第２アミノ酸のＮ末端に化学結合し、それによりその２個のアミノ酸を化学的に連結していてよい。この明細書において、アミノ酸は１個の“残基”として数えられ、スペーサー分子または非天然アミノ酸も１個の“残基”として数えられる。
【００２７】
そのペプチドには、修飾されたアミノ酸および非天然存在アミノ酸が含まれてよい。好ましくは、あらゆるスペーサー残基および修飾されたアミノ酸または非アミノ酸は、共有結合性ペプチド（アミド）結合［−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−］により隣接する残基に連結されている。
【００２８】
それぞれのペプチドは、以下の線状配列中の３個のドメインを含む、またはそれで構成される。
Ｎ末端  ［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］  Ｃ末端
それぞれのドメインは共通の配列特徴を有するが、それぞれのドメインの正確な配列は変更および修正することができる。従って、ある範囲の配列がそれぞれのドメインに関して可能である。それぞれの可能なドメイン配列の組み合わせがある範囲のペプチド配列をもたらし、それが本発明の一部を形成する。
【００２９】
コアペプチド配列は、ドメイン１〜３の連続したアミノ酸（および任意のスペーサー）配列により表される。カーゴへの連結を可能にするために配置される任意のリンカー配列が、典型的にはドメイン３のＣ末端に存在することができる。
【００３０】
以下の記述において、標準的な一文字アミノ酸コードが用いられる。非天然アミノ酸およびスペーサー分子は以下の１文字コードを用いて言及される：
Ｘ＝アミノヘキサン酸、アミノ酪酸、アミノカプリル酸、β−アラニル、ｐ−アミノベンゾイル、イソニペコチル（ｉｓｏｎｉｐｅｃｏｔｙｌ）、または４−アミノブチリルのいずれか、
Ｂ＝ベータアラニン
Ｒ＝アルギニン
ドメイン１はアルギニンに富む配列であり、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはより多くのアミノ酸長であってよい。好ましくは、ドメイン１は５、６、７、８、または９残基（例えばＸ、ＢまたはＲ）を有する。
【００３１】
好ましくは、ドメイン１は２個以上の陽イオン性アミノ酸を有し、疎水性アミノ酸またはスペーサー基がその陽イオン性アミノ酸の一部を隔てている。好ましい態様において、その陽イオン性アミノ酸はアルギニン（Ｒ）である。好ましくは、ドメイン１は少なくとも２個のアルギニン残基を有し、好ましくは２、３、４、５、または６個のアルギニン残基の１つを有する。一部の態様において、ドメイン１は３、４、５、６個、またはより多くのアルギニン残基を含有する。
【００３２】
ドメイン１は好ましくは１５残基未満、より好ましくは１３残基未満の最大長および４残基の最小長（例えばＸ、ＢまたはＲ）を有する。
好ましいドメイン１の配列は次の群から選択される：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２］
ＲＸＲＲＢＲＲＸ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３］
ＲＸＲＲＢＲＸ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４］
ＲＸＲＢＲＸ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５］
ＲＸＲＢＸ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９０］
ＲＸＲＲＢＲＸＲ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６］
ＲＸＲＲＢＲ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８７］
ＲＸＲＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８８］、または
ＲＸＲＲＢＲＲ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８９］。
【００３３】
ドメイン２はコアアミノ酸配列を含有する。これはアミノ酸Ｚ１Ｚ２ＦＬＩの少なくとも３個を含有する配列を含み、ここでＺ１はＹまたはＩであり、Ｚ２はＱまたはＲである。アミノ酸Ｚ１Ｚ２ＦＬＩはあらゆる順序であってよい。ドメイン２の一次配列（すなわちＮ末端からＣ末端までの順序）は細胞透過活性に本質的ではないことは、本発明者らの発見である。一部の特に好ましい態様において、ドメイン２はＩＬＦＱＹ、ＩＬＦＱまたはＩＬＩＱのＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含有しないが、それはこれらのアミノ酸を異なるＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列順序で含有してよい。
【００３４】
ドメイン２は、１、２、３、４または５個の追加のアミノ酸をその配列のＮまたはＣ末端の一方または両方において含有してよい。好ましくは、Ｎ末端に０、１または２個のアミノ酸が存在し、Ｃ末端に０、１または２個のアミノ酸が存在する。従って、ドメイン２は３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長であってよい。ドメイン２は好ましくは疎水性ドメインである。
【００３５】
ドメイン２は好ましくは１０残基未満、より好ましくは７残基未満の最大長および３残基、より好ましくは４または５残基の最小長を有する（それぞれの長さにはスペーサー基、例えばＸ、および非天然アミノ酸が含まれる）。好ましい態様において、ドメイン２は（スペーサー基、例えばＸ、および非天然アミノ酸を含めて）３、４、５、または６残基を有する。その追加のアミノ酸はあらゆるタイプのアミノ酸であってよい。
【００３６】
ドメイン３は陽イオン性ドメインであり、好ましくは以下の配列から選択される配列を有する：
ＲＸＲＢＲＸＲＢ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２］
ＸＲＢＲＸＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］
ＲＸＲＲＢＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］
ＢＲＸＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］
ＸＲＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］
ＲＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］
ＸＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］
ＲＢＲＸＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］
ＲＸＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、または
ＢＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］。
【００３７】
好ましくは、ドメイン３は２個以上の陽イオン性アミノ酸を有し、疎水性アミノ酸またはスペーサー基がその陽イオン性アミノ酸の一部を隔てている。好ましい態様において、その陽イオン性アミノ酸はアルギニン（Ｒ）である。好ましくは、ドメイン３は少なくとも２、３、または４個のアルギニン残基を有する。一部の態様において、ドメイン３は１、２、３、４、５、６個、またはより多くのアルギニン残基を含有する。
【００３８】
一部の態様において、ドメイン３は（スペーサー基、例えばＸ、および非天然アミノ酸を含めて）３アミノ酸の最小長および１５残基の最大長を有する。一部の態様において、そのスペーサー基を含む最小長は４以上であり、そのスペーサー基を含む最大長は１２以下である。一部の態様において、ドメイン３は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２残基の１つの長さを有する。
【００３９】
ドメイン１、２および３を合わせた中のアルギニン残基の総数は残基の総数の３０〜６０％であってよく、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％の１つであってよい。一部の態様において、ドメイン１、２および３を合わせた中のアルギニン残基の総数は残基の総数の３０〜５０％の範囲であってよく、または３０％〜４５％、もしくは３０％〜４０％、もしくは３５％〜４５％の範囲であってよい。
【００４０】
ドメイン１および３におけるアミノヘキサン酸およびベータアラニンの使用は、それがそのペプチドの免疫原性を最小限にし、タンパク質分解に対する耐性を増大させる点で好都合である。
【００４１】
そのペプチドのカーゴに対する化学結合を可能にするためにリンカーが配置されてよい。そのリンカーは、そのペプチドのドメイン１〜３部分をカーゴから隔てるためのスペーサーの役目も果たすことができる。ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール−マレイミド結合の形成を可能にするＣ末端システイン残基を有する配列を含め、ある範囲のリンカー配列が可能である。そのペプチドをカーゴに連結する他の方法には、オキシムを形成するためのＣ末端アルデヒドの使用、クリック反応の使用、またはその後にＸもしくはＢもしくはＸＢもしくはＢＸを含むドメイン３の前のスペーサー配列が続くことができるそのペプチド上の塩基性アミノ酸とのモルホリノ結合の形成が含まれる。
【００４２】
そのリンカー配列は（スペーサー基を含めて）１、２、３、４、５またはより多くのアミノ酸および／または残基長であってよい。そのリンカー配列は以下の基から選択されてよい：ＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓ、ＸＢＣｙｓ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸまたはＸＢ。あらゆるＢまたはＸは別のスペーサーにより置き換えられてよく、それは例えば４−アミノブチリル（Ａｉｂ）およびイソニコペコチル（ｉｓｏｎｉｃｏｐｅｃｏｔｙｌ）から選択されてよい。
【００４３】
そのリンカー配列は、そのペプチドを結合させる予定のカーゴの一部を形成していてよい。一部の態様において、そのカーゴの結合は直接ドメイン３配列のＣ末端に対してである。従って、一部の態様において、リンカー配列は必要ではなく、またはそれはカーゴおよびドメイン３配列の連結により提供される。
【００４４】
上記のことに従って、本発明のペプチドは以下のように表すことができ：
Ｚ４ＹＱＦＬＩＺ５      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９１］
Ｚ４ＩＱＦＬＩ，Ｚ５    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９２］
Ｚ４ＹＲＦＬＩＺ５      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９３］
Ｚ４ＹＲＦＲＬＩＺ５    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９４］
Ｚ４ＦＱＩＬＹＺ５      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９５］
Ｚ４ＱＦＬＩＺ５        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９６］
Ｚ４ＱＦＬＺ５          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９７］
ここで、Ｚ４は以下の１つから選択され：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２］
ＲＸＲＲＢＲＲＸ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３］
ＲＸＲＲＢＲＸ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４］
ＲＸＲＢＲＸ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５］
ＲＸＲＲＢＲＸＲ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６］
ＲＸＲＲＢＲ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８７］
ＲＸＲＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８８］、または
ＲＸＲＲＢＲＲ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８９］
かつＺ５は以下の１つから選択され：
ＲＸＲＢＲＸＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２］
ＸＲＢＲＸＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］
ＲＸＲＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］
ＢＲＸＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］
ＸＲＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］
ＲＲＢＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］
ＸＲＢＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］
ＲＢＲＸＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］
ＲＸＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、または
ＢＲＢＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］
ここでＺ５は場合によりそのＣ末端においてリンカーを含んでいてよく、それはＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓまたはＸＢＣｙｓ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸまたはＸＢの１つであってよい。
【００４５】
好ましいペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２〜３０８または３１７〜７６１（図１８、図２３〜３０および図４１）の１つから選択される配列を含んでいてよく、またはそれで構成されていてよい。
【００４６】
本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、６、または７のいずれか１つから選択されてよい。
カーゴ分子を除いて、本発明のペプチドは４０残基、より好ましくは３０残基、そしてさらにもっと好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０残基の１つの最大長、および１０残基、より好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０残基の１つの最小長を有していてよい（その最大および最小長には、あらゆるスペーサー分子、例えばＸ、および非天然アミノ酸または修飾されたアミノ酸が含まれる）。
【００４７】
本発明のペプチドはペプチド−カーゴコンジュゲートとして提供されてよく、ここでそのペプチドはさらにそのペプチドにそのペプチドのＮ末端またはＣ末端のどちらかにおいて、好ましくはＣ末端において化学結合した（好ましくは共有結合した）カーゴ分子を含む。化学結合はジスルフィド結合、チオエーテルもしくはチオール−マレイミド結合によるものであってよく、またはＣ末端カルボン酸を通したアミド結合によるものであってよい。
【００４８】
そのカーゴ分子は、あらゆる小分子、例えば小分子薬物、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、医薬または療法薬（例えば分子量１０，０００Ｄａ未満、好ましくは５，０００Ｄａ未満または３０００Ｄａ未満、そして一部の場合において１０００Ｄａ未満）であってよい。そのカーゴ分子は、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＰＮＡ、ＰＭＯ、ＬＮＡ）、またはｓｉＲＮＡであってよい。好ましいカーゴ分子は電気的に中性のオリゴヌクレオチド類似体、例えばＰＮＡまたはＰＭＯである。
【００４９】
１態様において、そのカーゴはＰＮＡ７０５（ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６］）である。別の態様において、そのカーゴはＰＮＡＤＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）である。別の態様において、そのカーゴはＰＭＯＤＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）である。そのカーゴ分子はＰＮＡＤＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）またはＰＭＯＤＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）の一方に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有していてよい。水溶性を向上させるために、リシン残基がこれらのＰＮＡまたはＰＭＯ分子の一方または両方の末端に付加されてよい。ジスルフィド結合の形成またはチオエーテルコンジュゲーションもしくはチオール−マレイミドコンジュゲーションのためのブロモアセチル化を可能にするために、システインがＣ末端またはＮ末端に付加されてよい。
【００５０】
本発明のペプチドは、カーゴ分子を有する、または有しない、単離または精製された形態で提供されてよい。
そのペプチドの誘導体も本発明の一部を形成する。ペプチド誘導体には、完全長ペプチドに対して実質的なアミノ酸配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）を有し、好ましくは同じまたはより優れたエキソンスキッピング活性または細胞生存度を有する、所与のペプチド配列（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３０８の１つ）の変異体が含まれる。ペプチド誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３０８の１つより１、２または３個多い、または少ないアミノ酸またはスペーサー分子を有していてよい。
【００５１】
配列同一性百分率（％）は、配列を整列させて必要であればギャップを導入して最大配列同一性を達成した後の、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯにより言及される）所与の列挙された配列中の残基と同一である候補配列中の残基（スペーサー基を含む）の百分率として定義され、保存的置換は配列同一性の一部としては一切考えない。配列同一性は好ましくはそれぞれの配列の全長にわたって計算される。
【００５２】
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者に既知の様々な方法で、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２．  Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成することができる。そのようなソフトウェアを用いる際、好ましくは、例えばギャップペナルティーおよび伸張ペナルティーに関して初期設定のパラメーターが用いられる。ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２の初期設定のパラメーターは以下の通りである：
タンパク質ギャップオープンペナルティー＝１０．０、タンパク質ギャップ伸張ペナルティー＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４。
【００５３】
ペプチド誘導体は、例えば以下の群内のアミノ酸の間であることができる保存的アミノ酸置換も含んでいてよい：
（ｉ）グリシン、アラニン、セリン、スレオニン；
（ｉｉ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；
（ｉｉｉ）アルギニン、ヒスチジンおよびリシン；
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミン；
（ｖ）イソロイシン、ロイシンおよびバリン；
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００５４】
本発明のペプチドは、好ましくはＰＭＯＤＭＤにコンジュゲートした場合に分化したマウスＨ２Ｋ筋細胞におけるエキソンスキッピング(Yin et al (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011)において高い活性を示す。好ましくは、このアッセイにおいて確立されるＥＣ５０は２μＭ未満である。一部の態様において、このアッセイにおいて確立されるＥＣ５０は１μＭ未満、０．９μＭ未満、０．８μＭ未満、０．７μＭ未満、または０．６μＭ未満である。本発明のペプチドは、好ましくはエキソンスキッピング細胞アッセイにおいてＰｉｐ−５ｅまたは（ＲＸＲＲＢＲ）２ＸＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１］の一方より高い、または同じ活性を示す（すなわち、それらはより低い、または同じＥＣ５０を有する）。
【００５５】
本発明のペプチドは好ましくは、血清（例えばマウスまたはヒト血清）中で２時間後にＲ６Ｐｅｎと比較して増大した血清安定性および好ましくはＰｉｐ−５ｅまたは（ＲＸＲＲＢＲ）２ＸＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１］と比較して同等の（または場合によりより優れた）血清安定性を示す。血清安定性は、Ｐｉｐ−ＰＭＯの分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）（１０ナノモル）を１００％マウス血清（１００μＬ）に添加し、３７℃で１２０または２４０分間インキュベーションすることにより測定することができる。それぞれの反応物を１Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ溶液（３００μＬ）および氷冷したアセトニトリル（６００μＬ）で希釈する。試料を混合し、−２０℃に保ち、沈殿した血清タンパク質を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）により分離する。遠心分離後、上清を集め、凍結乾燥し、残留物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、および逆相ＨＰＬＣによるペプチド分解に関する分析のために水中で溶解させる。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：カラム、Ｃ１８逆相（２５０×４．６ｍｍ）；溶媒Ａ、０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ、９０％アセトニトリル、１０％溶媒Ａ；勾配、２５分間における１０％〜５０％溶媒Ｂ。
【００５６】
本発明のペプチドおよびペプチドコンジュゲートにおいて、アミノ酸、アミノ酸スペーサーおよびカーゴ分子は全て好ましくは共有結合により化学的に連結されている。
本発明のペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、医学的処置の方法における使用のために提供されてよい。その医学的処置は、好ましくはそのカーゴ分子の細胞および場合によりその細胞の核中への送達を必要とし得る。
【００５７】
従って、疾患の処置における使用のためのペプチドおよび／またはペプチド−カーゴコンジュゲートが提供される。疾患の処置のための薬剤の製造におけるペプチドおよび／またはペプチド−カーゴコンジュゲートの使用も提供される。療法上有効量のペプチドおよび／またはペプチド−カーゴコンジュゲートを患者または対象に投与する工程を含む、疾患状態に関する処置を必要とする患者または対象の処置の方法も提供される。好ましくは、ペプチド−カーゴコンジュゲートのカーゴ構成要素はその疾患を処置、予防または改善することができる有効薬剤（例えば医薬品）を含む。
【００５８】
処置されるべき疾患には、医薬的または療法的分子による細胞および／または核膜の向上した透過が向上した療法的作用をもたらし得るあらゆる疾患が含まれ得る。処置されるべき疾患には、（完全にまたは部分的に）スプライシングの欠陥により引き起こされる疾患状態、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、ならびに他の筋疾患、例えば肢帯型筋ジストロフィー症（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＯＭＤ）、遠位型筋ジストロフィーおよびエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、ならびにメンケス病３８、β−サラセミア３９、前頭側頭型認知症を軽減するためのタウタンパク質のスプライス修正、パーキンソン症候群および脊髄性筋萎縮症３９、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群４０、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）４１、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー１型、または癌が含まれ得る。これらの疾患の一部の病理発生に関わっていることが示された遺伝子には、ジストロフィン（デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィー）、ＤＭＰＫ（ＤＭ１型ＭＤ）、ＺＮＦ９（ＤＭ２型ＭＤ）、ＰＡＢＰＮ１（ＯＭＤ）、エメリン、ラミンＡまたはラミンＣ（ＥＤＭＤ）、ミオチリン（ｍｙｏｔｉｌｉｎ）（ＬＧＭＤ−１Ａ）、ラミンＡ／Ｃ（ＬＧＭＤ−１Ｂ）、カベオリン−３（ＬＧＭＤ−１Ｃ）、カルパイン−３（ＬＧＭＤ−２Ａ）、ジスフェリン（ＬＧＭＤ−２Ｂおよび三好ミオパシー）、ガンマ−サルコグリカン（ＬＧＭＤ−２Ｃ）、アルファ−サルコグリカン（ＬＧＭＤ−２Ｄ）、ベータ−サルコグリカン（ＬＧＭＤ−２Ｅ）、デルタ−サルコグリカン（ＬＧＭＤ−２ＦおよびＣＭＤ１Ｌ）、テレソニン（ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ）（ＬＧＭＤ−２Ｇ）、ＴＲＩＭ３２（ＬＧＭＤ−２Ｈ）、フクチン関連タンパク質（ＬＧＭＤ−２Ｉ）、タイチン（ＬＧＭＤ−２Ｊ）、およびＯ−マンノシルトランスフェラーゼ−１（ＬＧＭＤ−２Ｋ）が含まれる。
【００５９】
そのようなスプライシング欠陥が関わっている疾患の場合、そのカーゴはそのスプライシング欠陥を防ぐ、もしくは修正する、および／または正しくスプライシングされたｍＲＮＡ分子の産生（例えば数）を増大させることができるオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＰＭＯまたはＬＮＡが含まれる他のオリゴヌクレオチドタイプを含んでいてよい。本発明は、当然、スプライシング欠陥を修正することができるカーゴ分子に限定されない。カーゴ分子には、他のオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＰＭＯまたはＬＮＡ分子、例えば遺伝子発現のノックダウンのためのｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを標的とすることができるオリゴヌクレオチド分子、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ならびに非オリゴヌクレオチド分子も含まれてよい。
【００６０】
ＰＭＯＤＭＤにコンジュゲートされた本発明のペプチドは、心筋におけるジストロフィンを含有する線維の産生をもたらすエキソンスキッピングにおける素晴らしい有効性を示してきた。心不全はＤＭＤを患う患者における主な死因であるため、本発明のペプチドは、心組織、特に心筋における正常なジストロフィンの産生をもたらすエキソンスキッピングを誘導することができるオリゴヌクレオチド（例えばＰＮＡまたはＰＭＯ）へのコンジュゲーションにより、ＤＭＤの処置において特に有用である。これは、骨格筋においてのみジストロフィンを修復する第ＩＩ相臨床試験（２’ＯＭｅおよびＰＭＯ）の成功を考慮すれば、特に重要である。これは心臓への作業負荷を増大させ、それにより心疾患を進行させる／心疾患の進行を加速する可能性がある懸念がある。ペプチド−ＰＭＯＤＭＤコンジュゲートはＤＭＤの処置において特に有用であると考えられている。
【００６１】
従って、本発明のペプチドは、カーゴ分子の心組織、特に心筋への送達に特に有用である。従って、本発明のペプチド−カーゴコンジュゲートは、心臓もしくは心筋の疾患もしくは病気、または心臓もしくは心筋において徴候を示す（ｍａｎｉｆｅｓｔ）疾患もしくは病気、例えば心疾患および心筋症の処置における使用のために提供される。
【００６２】
処置されるべき心筋疾患は、冠動脈心疾患、先天性心疾患、虚血性、高血圧性、炎症性または内因性心筋症であってよい。内因性心筋症には以下の障害（関係する遺伝子と共に）が含まれる：拡張型心筋症（ジストロフィン、Ｇ４．５、アクチン、デスミン、デルタ−サルコグリカン、トロポニンＴ、ベータ−ミオシン重鎖、アルファー−トロポミオシン、ミトコンドリア呼吸鎖）、伝導系疾患を伴う拡張型心筋症（ラミンＡ／Ｃ）、肥大型心筋症（ベータ−ミオシン重鎖、トロポニンＴ、トロポニンＩ、アルファー−トロポミオシン、ミオシン結合タンパク質Ｃ、ミオシン必須軽鎖、ミオシン制御軽鎖、タイチン）、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群を伴う肥大型心筋症（ＡＭＰＫ、ミトコンドリア呼吸鎖）、および左心室非圧縮（Ｇ４．５、アルファ−ジストロブレビン）。
【００６３】
処置されるべき患者または対象はあらゆる動物またはヒトであってよい。その患者または対象は非ヒト哺乳類であってよいが、より好ましくはヒトの患者である。その患者または対象は男性または女性であってよい。
【００６４】
本発明の観点に従う薬剤および医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、皮下、経口および経鼻が含まれるがそれらに限定されないいくつかの経路による投与のために配合することができる。その薬剤および組成物は、流体または個体の形態で配合することができる。流体配合物は、ヒトまたは動物の体の選択された領域への注射による投与のために配合することができる。
【００６５】
投与は好ましくは“療法上有効量”であり、これはその個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置される疾患の性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば投与量等に関する決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に既知の他の要因を考慮する。上記で言及された技法およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第２０版, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsにおいて見つけることができる。
【００６６】
そのペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、インビトロの方法における使用のためにも提供される。例えば、エキソンスキッピングアッセイまたは細胞生存度アッセイにおけるペプチドおよび／またはペプチド−カーゴコンジュゲートの使用が提供される。加えて、そのペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、ＤＭＤのマウスモデルであるｍｄｘマウスにおけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生に関する使用のために提供される。
【００６７】
用語“インビトロ”は培養状態の細胞を用いた実験を含むことを意図しており、一方で用語“インビボ”は完全な多細胞生物を用いた実験を含むことを意図している。
本発明のペプチドをコードする核酸も提供される。本発明のペプチドをコードする核酸に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された制御配列、例えばプロモーターを有する核酸ベクター、例えばプラスミドも提供される。そのベクターは好ましくは適切な細胞、例えば哺乳類、細菌または真菌細胞中に形質移入された際にそのペプチドを発現することができる。その核酸は単離または精製された形態で提供されてよい。
【００６８】
この明細書において、用語“作動可能に連結された”には、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列がヌクレオチドコード配列の発現をその制御配列の影響または制御下に置くような方法で共有結合的に連結されている状況が含まれてよい。従って、制御配列は、その制御配列が選択されたヌクレオチド配列の一部または全部を形成するヌクレオチドコード配列の転写をもたらすことができる場合、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。適切である場合、結果として生じる転写産物が次いで所望のペプチドに翻訳されることができる。
【００６９】
上記のことに従って、本発明の以下の観点および態様が提供される。
本発明の１観点において、次の配列を有する少なくとも３個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドが提供され：
Ｎ末端  ［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］  Ｃ末端
ここで
ドメイン１および３中のＲ（アルギニン）残基を合わせた数は少なくとも５であり、
ドメイン１および３中のＸ残基を合わせた数は少なくとも１であり、
ドメイン１および３中のＢ残基を合わせた数は少なくとも２であり、
ここでＸ＝アミノヘキサン酸およびＢ＝ベータアラニンであり、
かつここで
ドメイン２はアミノ酸Ｚ１Ｚ２ＦＬＩの少なくとも３個を含有する配列を含み、ここでＺ１はＹまたはＩであり、かつＺ２はＱまたはＲであり、かつ
ドメイン２はＩＬＦＱＹ、ＩＬＦＱまたはＩＬＩＱのＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含有しない。
【００７０】
ドメイン１〜３中の残基を合わせた総数は、好ましくは５０より多くなく、より好ましくは４０より多くなく、そして最も好ましくは２０〜３０である。
本発明の別の観点において、次の配列を有する少なくとも３個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドが提供され：
Ｎ末端  ［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］  Ｃ末端
ここで：
（ｉ）ドメイン１は以下の配列から選択される配列を含み：
ＲＸＲＺ３      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６２］
ここでＺ３は以下の配列の１つから選択され：
ＲＢＲＲＸＲ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６３］
ＲＢＲＲＸ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６４］
ＲＢＲＸ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６５］
ＲＢＲＸＲ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６６］
ＢＲＸ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６７］
ＢＸ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６８］
ＲＢＲ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６９］
ＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７０］、または
ＲＢＲＲ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７１］
（ｉｉ）ドメイン２はアミノ酸Ｚ１Ｚ２ＦＬＩの少なくとも３個を含有する配列を含み、ここでＺ１はＹまたはＩであり、かつＺ２はＱまたはＲであり、かつここでドメイン２はＩＬＦＱＹ、ＩＬＦＱまたはＩＬＩＱのＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含有せず、
（ｉｉｉ）ドメイン３は以下の配列から選択される配列を含み：
ＲＸＲＢＲＸＲＢ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２］
ＸＲＢＲＸＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］
ＲＸＲＲＢＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］
ＢＲＸＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］
ＸＲＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］
ＲＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］
ＸＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］
ＲＢＲＸＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］
ＲＸＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、または
ＢＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］
ここでＸ＝アミノヘキサン酸、Ｂ＝ベータアラニンである。
【００７１】
一部の態様において、ドメイン２はＹＱＦＬＩ、ＩＱＦＬＩ、ＹＲＦＬＩ、ＹＲＦＲＬＩ、ＦＱＩＬＹ、ＱＦＬＩ、またはＱＦＬから選択されるＮ〜Ｃ末端の連続した一次配列を含む。一部の態様において、ドメイン２は４または５アミノ酸を有する。一部の態様において、ドメイン２は０、１、２または３個のＲ残基を有する。
【００７２】
一部の態様において、ドメイン１は以下の配列から選択される配列を含む、またはそれで構成される：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２］
ＲＸＲＲＢＲＲＸ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３］
ＲＸＲＲＢＲＸ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４］
ＲＸＲＢＲＸ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５］
ＲＸＲＲＢＲＸＲ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６］
ＲＸＲＲＢＲ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８７］
ＲＸＲＲＢ            ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８８］、または
ＲＸＲＲＢＲＲ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８９］。
【００７３】
一部の態様において、ドメイン３は以下の配列から選択される配列を含む、またはそれで構成される：
ＲＸＲＢＲＸＲＢ    ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２］
ＸＲＢＲＸＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］
ＲＸＲＲＢＲＢ      ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］
ＢＲＸＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］
ＸＲＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］
ＲＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］
ＸＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］
ＲＢＲＸＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］
ＲＸＲＢＲＢ        ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、または
ＢＲＢＲＢ          ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］。
【００７４】
一部の態様において、そのペプチドは６〜１２個のＲ残基、好ましくは６、７、８、９、１０、１１または１２個のＲ残基の１つを有する。ドメイン２は１、２または３個のＲ残基を有することができる。ドメイン１は６個以下のＲ残基、例えば０、１、２、３、４、５、または６個のＲ残基を有することができる。ドメイン３は４個以下のＲ残基、例えば０、１、２、３、または４個のＲ残基を有することができる。そのＲ残基はＤ−アルギニンもしくはＬ−アルギニン、または両方の混合物であることができる。
【００７５】
一部の好ましい態様において、ドメイン１および３はＲ、ＸおよびＢ残基のみを含有し、またはＸもしくはＢではない１、もしくは２個の残基のみを有する。
従って、ドメイン１は（ｉ）２〜６個のＲ残基、（ｉｉ）１〜３個のＸ残基、および（ｉｉｉ）１〜２個のＢ残基のあらゆる組み合わせを有することができ、かつ好ましくは長さが１０残基より多くなく、かつ０、１または２個のＲ、ＸまたはＢではない残基を有する。ドメイン３は（ａ）２〜５個のＲ残基、（ｂ）１〜３個のＸ残基、および（ｃ）１〜３個のＢ残基のあらゆる組み合わせを有することができ、かつ好ましくは長さが９残基より多くなく、かつ０、１または２個のＲ、ＸまたはＢではない残基を有する。
【００７６】
一部の態様において、そのペプチドは天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基を含めて３０残基の最大長を有する。従って、一部の態様において、ドメイン１は４から１２残基までの長さを有することができ、ドメイン２は３から９残基までの長さを有することができ、かつドメイン３は４から１２残基までの長さを有することができ、ここでその長さには天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基が含まれる。
【００７７】
一部の態様において、そのペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３０８または３１７〜６６１（図１８、２３〜３０および４１）の１つから選択される配列を含む、またはそれで構成される。一部の態様において、そのペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３０８または３１７〜７６１（図１８、２３〜３０および４１）の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される。
【００７８】
一部の態様において、そのペプチドは、Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ、Ｐｉｐ−６ｇ、Ｐｉｐ−６ｈ、Ｐｉｐ−６ｉ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１０］；Ｐｉｐ−７ａ、Ｐｉｐ−７ｂ、Ｐｉｐ−７ｃ、Ｐｉｐ−７ｄ、Ｐｉｐ−７ｂ２、Ｐｉｐ−７ｃ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１６］；もしくはＰｉｐ−８ａ、Ｐｉｐ−８ｂ、Ｐｉｐ−８ｃ、Ｐｉｐ−８ｃ２、Ｐｉｐ−８ｄ、Ｐｉｐ−８ｄ２、Ｐｉｐ−８ｄ３［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７〜２０および３１７〜３１９］；もしくはＰｉｐ−９ｂ、Ｐｉｐ−９ｂ２、Ｐｉｐ−９ｃ、Ｐｉｐ−９ｃ２、Ｐｉｐ−９ｃ３、Ｐｉｐ−９ｄ、Ｐｉｐ−９ｄ２、Ｐｉｐ−９ｄ３、Ｐｉｐ−９ｄ４［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３２０〜３２８］の１つのドメイン１〜３の配列、またはＰｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ、Ｐｉｐ−６ｇ、Ｐｉｐ−６ｈ、Ｐｉｐ−６ｉ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１０］；Ｐｉｐ−７ａ、Ｐｉｐ−７ｂ、Ｐｉｐ−７ｃ、Ｐｉｐ−７ｄ、Ｐｉｐ−７ｂ２、Ｐｉｐ−７ｃ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１６］；もしくはＰｉｐ−８ａ、Ｐｉｐ−８ｂ、Ｐｉｐ−８ｃ、Ｐｉｐ−８ｃ２、Ｐｉｐ−８ｄ、Ｐｉｐ−８ｄ２、Ｐｉｐ−８ｄ３［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７〜２０および３１７〜３１９］；もしくはＰｉｐ−９ｂ、Ｐｉｐ−９ｂ２、Ｐｉｐ−９ｃ、Ｐｉｐ−９ｃ２、Ｐｉｐ−９ｃ３、Ｐｉｐ−９ｄ、Ｐｉｐ−９ｄ２、Ｐｉｐ−９ｄ３、Ｐｉｐ−９ｄ４［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３２０〜３２８］の１つのドメイン１〜３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される。
【００７９】
一部の態様において、そのペプチドはさらにそのＣ末端においてリンカー配列を含む。そのリンカー配列は、ＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓ、ＸＢＣｙｓ、ＢＸ、またはＸＢから選択されてよい。
【００８０】
一部の態様において、そのペプチドはカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている。そのコンジュゲーションはそのペプチドのＣ末端においてであってよい。
そのカーゴ分子は、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択されてよい。そのカーゴ分子は５，０００Ｄａ未満の分子量を有することができる。一部の態様において、そのカーゴ分子はＰＮＡＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９］もしくはＰＭＯＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］またはＰＮＡＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９］もしくはＰＭＯＤＭＤ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有する分子である。
【００８１】
本発明のさらなる観点において、本発明のペプチドを含む医薬組成物または薬剤が提供される。その医薬組成物または薬剤はさらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含むことができる。
【００８２】
本発明の別の観点において、本発明のペプチドは疾患の処置の方法における使用のために提供される。本発明の別の観点において、疾患の処置における使用のための薬剤の製造における本発明のペプチドの使用が提供される。
【００８３】
本発明のさらなる観点において、処置を必要とする患者における疾患の処置の方法が提供され、その方法は本発明のペプチドをその患者に投与することを含む。
本発明のさらなる観点において、単離された核酸が提供され、その単離された核酸は本発明のあらゆる観点または態様に従うペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている。そのような核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクターも提供される。
【００８４】
ペプチド模倣体
既知の薬学的または生物学的に有効な化合物に対する模倣体の設計は、“リード”化合物に基づく医薬および療法薬の開発のための既知のアプローチである。これは、その有効化合物を合成するのが困難もしくは費用がかかる場合、またはそれが特定の投与法に適さない場合に望ましい可能性があり、例えば一部のペプチドは、それらが消化管中のプロテアーゼにより急速に分解される傾向があるため、経口組成物に関して不適切な有効薬剤である可能性がある。模倣体の設計、合成および試験は、一般に標的特性に関して多数の分子をランダムにスクリーニングするのを避けるために用いられる。
【００８５】
所与の標的特性を有する化合物からの模倣体の設計において一般的に用いられるいくつかの工程がある。第１に、その標的特性の決定において決定的および／または重要であるその化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これはそのペプチド中のアミノ酸残基を例えばそれぞれの残基を順番に置換することにより系統的に変更することにより行うことができる。その化合物の活性な領域を構成しているこれらの部分または残基は、その“ファルマコフォア”として知られている。
【００８６】
一度そのファルマコフォアが見付かったら、その構造を、ある範囲の源、例えば分光分析技法、Ｘ線回折データおよびＮＭＲからのデータを用いて、その物理特性、例えば立体化学、結合、大きさおよび／または電荷に従ってモデルする（ｍｏｄｅｌｌｅｄ）。コンピューター分析、類似性マッピング（それは原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷および／または体積をモデルする）および他の技法をこのモデリングプロセスにおいて用いることができる。
【００８７】
このアプローチの変形において、リガンドおよびその結合パートナーの３次元構造をモデルする。これはリガンドおよび／または結合パートナーが結合の際に立体構造を変化させる場合に特に有用である可能性があり、その模倣体の設計においてそのモデルがこれを考慮することを可能にする。
【００８８】
次いでその上にそのファルマコフォアを模倣する化学基を移植することができる鋳型分子を選択する。その鋳型分子およびその上に移植された化学基は好都合には、その模倣体を合成し易い、それが薬学的に許容可能でありそうである、そしてインビボで分解せず、一方でそのリード化合物の生物学的活性を保持しているように選択することができる。次いでこのアプローチにより見付かった模倣体（単数または複数）を、それらがその標的特性を有するかどうか、またはどの程度までそれらがそれを示すかを調べるためにスクリーニングすることができる。次いで、インビボまたは臨床試験のための１種類以上の最終的な模倣体に到達するため、さらなる最適化または修飾を実施することができる。
【００８９】
本発明に関して、そのペプチド構造を修飾し、場合により続いてその修飾されたペプチドをスプライス修正アッセイもしくはエキソンスキッピングアッセイにおいて、および／または細胞生存度アッセイにおいて試験する工程を含む方法が提供される。このペプチドまたはペプチド模倣体の修飾のプロセスを、所望であるように、望まれるスプライス修正もしくはエキソンスキッピング活性および／または細胞生存度を有するペプチドが同定されるまで何回も繰り返してよい。
【００９０】
用いられる修飾工程は、そのペプチドまたはペプチド模倣体の長さを切り詰めること（これはより短い長さのペプチドまたはペプチド模倣体を合成することを含んでよい）、１個以上のアミノ酸残基もしくは化学基の置換、および／またはそのペプチドもしくはペプチド模倣体を化学的に修飾して細胞生存度、分解に対する耐性、細胞膜を越える輸送、および／または体からの排除に対する耐性を増大させること、および／または心筋中を含めてＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいてエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生における活性を提供することを含んでよい。
【００９１】
本発明には、記述された観点および好ましい特徴の組み合わせが、そのような組み合わせが明確に許容できない、または特に避けられる場合を除いて含まれる。
本明細書で用いられる節の見出しは組織化の目的のためだけのものであり、記述される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９２】
本発明の観点および態様は、ここで例として添付の図を参照して説明されるであろう。さらなる観点および態様は当業者には明らかであろう。本書において言及される全ての文書は参照により本明細書に援用される。
【００９３】
本発明の原理を説明する態様および実験は、ここで添付の図を参照して論じられ、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】分化したマウスＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ）のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を、０．１２５μＭ〜１μＭの範囲の濃度のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドＲＴ−ＰＣＲの産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ２３スキッピングの百分率として示される。
【図２】Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ−６ｇ、Ｐｉｐ−６ｈ、Ｐｉｐ−７ａ、Ｐｉｐ−７ｂ、Ｐｉｐ−７ｃ、Ｐｉｐ−７ｄ）のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。
【図３】Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ−６ｉ、Ｐｉｐ−７ｂ２、Ｐｉｐ−７ｃ２、Ｐｉｐ−８ａ、Ｐｉｐ−８ｂ、Ｐｉｐ−８ｃ）のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。
【図４】Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ−７ｂ、Ｐｉｐ−７ｂ２、Ｐｉｐ−８ｂ（それぞれ８個のＡｒｇを有する）、Ｂペプチド（ＲＸＲＲＢＲ）２ＸＢ））のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。
【図５】Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ−７ｃ、Ｐｉｐ−７ｃ２、Ｐｉｐ−８ｃ（それぞれ７個のＡｒｇを有する）、Ｂペプチド（ＲＸＲＲＢＲ）２ＸＢ））のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。
【図６】ｍｄｘマウス中の異なるマウス筋組織におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ、Ｐｉｐ−５ｅ）のウェスタンブロットでのタンパク質定量化の結果を示すグラフ（ＴＡ＝前脛骨筋、Ｑｕａｄ＝四頭筋、Ｇａｓ＝腓腹筋、ｄｉａｐｈ＝横隔膜筋、ｈｅａｒｔ＝心筋）。
【図７Ａ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）四頭筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心組織におけるエキソンスキッピング活性のｑＰＣＲの結果を示すグラフ。
【図７Ｂ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）四頭筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心組織におけるエキソンスキッピング活性のｑＰＣＲの結果を示すグラフ。
【図７Ｃ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）四頭筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心組織におけるエキソンスキッピング活性のｑＰＣＲの結果を示すグラフ。
【図８Ａ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）四頭筋、（Ｃ）横隔膜および（Ｄ）心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。
【図８Ｂ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）四頭筋、（Ｃ）横隔膜および（Ｄ）心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。
【図８Ｃ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）四頭筋、（Ｃ）横隔膜および（Ｄ）心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。
【図８Ｄ】Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスからの（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）四頭筋、（Ｃ）横隔膜および（Ｄ）心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。
【図９】ＰＭＯ−ペプチドＰｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスの異なる筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示すＲＴ−ＰＣＲの代表的な結果。
【図１０】ＰＭＯ−ペプチドＰｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆおよびＰｉｐ−５ｅに関するｍｄｘマウスの異なる筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す代表的なウェスタンブロット。
【図１１】Ｐｉｐ−５ｅ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１２】Ｐｉｐ−６ａ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１３】Ｐｉｐ−６ｂ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１４】Ｐｉｐ−６ｃ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１５】Ｐｉｐ−６ｄ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１６】Ｐｉｐ−６ｅ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１７】Ｐｉｐ−６ｆ−ＰＭＯに関するｍｄｘマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲの結果、（Ｂ）ウェスタンブロット、（Ｃ）定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。
【図１８】Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−６ａ、Ｐｉｐ−６ｂ、Ｐｉｐ−６ｃ、Ｐｉｐ−６ｄ、Ｐｉｐ−６ｅ、Ｐｉｐ−６ｆ、Ｐｉｐ−６ｇ、Ｐｉｐ−６ｈ、Ｐｉｐ−６ｉ、Ｐｉｐ−７ａ、Ｐｉｐ−７ｂ、Ｐｉｐ−７ｃ、Ｐｉｐ−７ｄ、Ｐｉｐ−７ｂ２、Ｐｉｐ７ｃ２、Ｐｉｐ−８ａ、Ｐｉｐ−８ｂ、Ｐｉｐ８ｃ、Ｐｉｐ−８ｃ２のアミノ酸配列を示す表。ドメイン１、２および３中の残基の総数およびＡｒｇ、ＸおよびＢ残基の数も示す。
【図１９】Ｂ−ペプチド−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−５ｅ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｃ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｆ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｈ−ＰＭＯの細胞生存度を添加されたＰｉｐ−ＰＭＯの濃度の関数として示すグラフ。
【図２０】Ｂ−ペプチド−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−８ａ−ＰＭＯ（９個のＡｒｇ残基を含有する）の細胞生存度を添加されたＰｉｐ−ＰＭＯの濃度の関数として示すグラフ。
【図２１】Ｂ−ペプチド−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｂ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｂ２−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−８ｂ−ＰＭＯ（８個のＡｒｇ残基を含有する）およびＢ−ＭＳＰ−ＰＭＯ（ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＡＳＳＬＮＩＡＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１０］, Yin, H. et al, (2010) Mol. Ther. 18, 1822-1827）の細胞生存度を添加されたＰｉｐ−ＰＭＯの濃度の関数として示すグラフ。
【図２２】Ｂ−ペプチド−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｃ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｃ２−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−８ｃ−ＰＭＯ（７個のＡｒｇ残基を含有する）の細胞生存度を添加されたＰｉｐ−ＰＭＯの濃度の関数として示すグラフ。
【図２３Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＹＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０２］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２］、ＲＸＲＲＢＲＲＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３］、ＲＸＲＲＢＲＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４］、ＲＸＲＲＢＲＸＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６］、ＲＸＲＢＲＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５］、ＲＸＲＢＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９０］、ＲＸＲＲＢＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８７］、ＲＸＲＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８８］、ＲＸＲＲＢＲＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８９］から選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２２］、ＸＲＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］、ＲＸＲＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］、ＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］、ＸＲＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］、ＲＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］、ＸＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］、ＲＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］、ＲＸＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、ＢＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］から選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２３Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＹＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０２］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２］、ＲＸＲＲＢＲＲＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３］、ＲＸＲＲＢＲＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４］、ＲＸＲＲＢＲＸＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６］、ＲＸＲＢＲＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５］、ＲＸＲＢＸ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９０］、ＲＸＲＲＢＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８７］、ＲＸＲＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８８］、ＲＸＲＲＢＲＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８９］から選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２２］、ＸＲＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３］、ＲＸＲＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４］、ＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５］、ＸＲＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６］、ＲＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７］、ＸＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８］、ＲＢＲＸＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９］、ＲＸＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０］、ＢＲＢＲＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１］から選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２４Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＩＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０３］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２４Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＩＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０３］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２５Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０７］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２５Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＱＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０７］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２６Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＱＦＬ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０８］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２６Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＱＦＬ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０８］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２７Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＹＲＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０４］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２７Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＹＲＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０４］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２８Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＦＱＩＬＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２８Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＦＱＩＬＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２９Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＹＲＦＲＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０５］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図２９Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＹＲＦＲＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０５］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図３０Ａ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＩＬＦＲＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１１］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図３０Ｂ】本発明のドメイン１〜３のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン２の配列ＩＬＦＲＹ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１１］を、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ、ＲＸＲＲＢＲＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸ、ＲＸＲＲＢＲＸＲ、ＲＸＲＢＲＸ、ＲＸＲＢＸ、ＲＸＲＲＢＲ、ＲＸＲＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＲから選択されるドメイン１の配列およびＲＸＲＢＲＸＲＢ、ＸＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＲＢＲＢ、ＢＲＸＲＢ、ＸＲＲＢＲＢ、ＲＲＢＲＢ、ＸＲＢＲＢ、ＲＢＲＸＲＢ、ＲＸＲＢＲＢ、ＢＲＢＲＢから選択されるドメイン３の配列と共に含有する。
【図３１】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する定量的免疫組織化学染色の平均値に関する統計表。未処置のｍｄｘマウスと比較したＰｉｐ６ａ〜ｆで処置されたｍｄｘマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された（****＝ｐ＜０．０００１、***＝ｐ＜０．００１、**＝ｐ＜０．０１、*＝ｐ＜０．０５、Ｎ／Ｓ＝有意ではない）。
【図３２】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する定量的免疫組織化学染色の平均値に関する統計表。Ｐｉｐ５ｅで処置されたマウスと比較したＰｉｐ６ａ〜ｆで処置されたｍｄｘマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された（****＝ｐ＜０．０００１、***＝ｐ＜０．００１、**＝ｐ＜０．０１、*＝ｐ＜０．０５、Ｎ／Ｓ＝有意ではない）。
【図３３】Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯ誘導体に関する化学的コンジュゲーション法。ＰＭＯ  ＡＯに対するペプチドのコンジュゲーションの方法。ペプチドをＰＭＯに、そのＰＭＯの３’末端におけるアミド結合を通してコンジュゲートし、続いてＨＰＬＣにより精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、ＨＯＢｔ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物、ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン。
【図３４Ａ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って５−ａａ疎水性コアＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３４Ｂ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って５−ａａ疎水性コアＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３４Ｃ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って５−ａａ疎水性コアＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３４Ｄ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って５−ａａ疎水性コアＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３４Ｅ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って５−ａａ疎水性コアＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３５Ａ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、およびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較した１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウス（Ｐｉｐ６ｃおよびＰｉｐ６ｄ）におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３５Ｂ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、およびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較した１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウス（Ｐｉｐ６ｃおよびＰｉｐ６ｄ）におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３５Ｃ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、およびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較した１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウス（Ｐｉｐ６ｃおよびＰｉｐ６ｄ）におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３５Ｄ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、およびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較した１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウス（Ｐｉｐ６ｃおよびＰｉｐ６ｄ）におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３５Ｅ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、およびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較した１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウス（Ｐｉｐ６ｃおよびＰｉｐ６ｄ）におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３１および３２を参照。回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロード対照に対して正規化した（定量化に関して図３８ａ参照）。
【図３６Ａ】Ｃ５７ＢＬ１０対照、ｍｄｘ未処置、ならびに１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従うＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体、Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウスならびにＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスに関してＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３９ａ，ｂを参照。ｂ．回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した（定量化に関して図３９ｃ参照）。
【図３６Ｂ】Ｃ５７ＢＬ１０対照、ｍｄｘ未処置、ならびに１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従うＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体、Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウスならびにＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスに関してＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３９ａ，ｂを参照。ｂ．回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した（定量化に関して図３９ｃ参照）。
【図３６Ｃ】Ｃ５７ＢＬ１０対照、ｍｄｘ未処置、ならびに１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従うＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体、Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウスならびにＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスに関してＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３９ａ，ｂを参照。ｂ．回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した（定量化に関して図３９ｃ参照）。
【図３６Ｄ】Ｃ５７ＢＬ１０対照、ｍｄｘ未処置、ならびに１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従うＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体、Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウスならびにＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスに関してＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３９ａ，ｂを参照。ｂ．回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した（定量化に関して図３９ｃ参照）。
【図３６Ｅ】Ｃ５７ＢＬ１０対照、ｍｄｘ未処置、ならびに１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従うＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体、Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウスならびにＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスに関してＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。（ａ）Ｃ５７ＢＬ１０、ｍｄｘ未処置およびｍｄｘ処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された（ｂにおいて示される）平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図３９ａ，ｂを参照。ｂ．回復スコアの百分率を下に示す。（ｃ）四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム（ｑ−ＲＴ）−ＰＣＲにより決定されたΔ２３エキソンスキッピングの百分率。（ｄ）ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング（ｓｋｉｐｐｅｄ）を示す代表的なリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ画像。上部のバンドは完全長（ＦＬ）またはスキップされなかった転写産物を示す。（ｅ）それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。５０％（５μｇタンパク質）および１０％（１μｇ）のＣ５７ＢＬ１０対照と比較して、１０マイクログラムの総タンパク質をロードし（ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋）、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した（定量化に関して図３９ｃ参照）。
【図３７Ａ】Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯに関するＨＰＬＣクロマトグラムおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ。（ａ）精製されたＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯコンジュゲートの４．６×２５０ｍｍ  Ｃ１８カラム（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：９０％アセトニトリル、１０％溶離液Ａ）上での２７分間で１０〜５０％Ｂの勾配を用いた分析的逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ｂ）Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。（ｃ）Ｐｉｐ６−ＰＭＯの計算された、および見出された分子量の表。
【図３７Ｂ】Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯに関するＨＰＬＣクロマトグラムおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ。（ａ）精製されたＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯコンジュゲートの４．６×２５０ｍｍ  Ｃ１８カラム（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：９０％アセトニトリル、１０％溶離液Ａ）上での２７分間で１０〜５０％Ｂの勾配を用いた分析的逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ｂ）Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。（ｃ）Ｐｉｐ６−ＰＭＯの計算された、および見出された分子量の表。
【図３７Ｃ】Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯに関するＨＰＬＣクロマトグラムおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ。（ａ）精製されたＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯコンジュゲートの４．６×２５０ｍｍ  Ｃ１８カラム（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：９０％アセトニトリル、１０％溶離液Ａ）上での２７分間で１０〜５０％Ｂの勾配を用いた分析的逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ｂ）Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。（ｃ）Ｐｉｐ６−ＰＭＯの計算された、および見出された分子量の表。
【図３８】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関するｑＲＴ−ＰＣＲの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。（ａ）Ｐｉｐ６−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する平均ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ百分率値。（ｂ）Ｐｉｐ６ａ〜ｆ処置のＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置（ｎ＝３）に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、５０％および１０％Ｃ５７ＢＬ１０対照に対して定量化し、それを平均した。
【図３９Ａ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体（Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ）で処置されたｍｄｘマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、ｑＲＴ−ＰＣＲの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のｍｄｘマウス（ａ）またはＰｉｐ６ｅで処置されたマウス（ｂ）と比較したＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈで処置されたｍｄｘマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された（****＝ｐ＜０．０００１、***＝ｐ＜０．００１、**＝ｐ＜０．０１、*＝ｐ＜０．０５、Ｎ／Ｓ＝有意ではない）。（ｃ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する平均ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ百分率値。（ｄ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置（ｎ＝３）に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、５０％および１０％Ｃ５７ＢＬ１０対照に対して定量化し、それを平均した。
【図３９Ｂ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体（Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ）で処置されたｍｄｘマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、ｑＲＴ−ＰＣＲの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のｍｄｘマウス（ａ）またはＰｉｐ６ｅで処置されたマウス（ｂ）と比較したＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈで処置されたｍｄｘマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された（****＝ｐ＜０．０００１、***＝ｐ＜０．００１、**＝ｐ＜０．０１、*＝ｐ＜０．０５、Ｎ／Ｓ＝有意ではない）。（ｃ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する平均ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ百分率値。（ｄ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置（ｎ＝３）に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、５０％および１０％Ｃ５７ＢＬ１０対照に対して定量化し、それを平均した。
【図３９Ｃ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体（Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ）で処置されたｍｄｘマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、ｑＲＴ−ＰＣＲの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のｍｄｘマウス（ａ）またはＰｉｐ６ｅで処置されたマウス（ｂ）と比較したＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈで処置されたｍｄｘマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された（****＝ｐ＜０．０００１、***＝ｐ＜０．００１、**＝ｐ＜０．０１、*＝ｐ＜０．０５、Ｎ／Ｓ＝有意ではない）。（ｃ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する平均ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ百分率値。（ｄ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置（ｎ＝３）に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、５０％および１０％Ｃ５７ＢＬ１０対照に対して定量化し、それを平均した。
【図３９Ｄ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、および１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体（Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ）で処置されたｍｄｘマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、ｑＲＴ−ＰＣＲの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のｍｄｘマウス（ａ）またはＰｉｐ６ｅで処置されたマウス（ｂ）と比較したＰｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈで処置されたｍｄｘマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された（****＝ｐ＜０．０００１、***＝ｐ＜０．００１、**＝ｐ＜０．０１、*＝ｐ＜０．０５、Ｎ／Ｓ＝有意ではない）。（ｃ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスに関する平均ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ百分率値。（ｄ）Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置（ｎ＝３）に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、５０％および１０％Ｃ５７ＢＬ１０対照に対して定量化し、それを平均した。
【図４０Ａ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６−ＰＭＯおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスの血液試料において評価された毒性アッセイ。（ａ）ｍｄｘ未処置および処置マウスと比較したＣ５７ＢＬ１０対照マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼのレベルの測定。（ｂ）ｍｄｘ未処置および処置マウスと比較したＣ５７ＢＬ１０対照マウスにおける血清血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチチン（ｃｒｅａｔｉｔｉｎｅ）レベルの測定。
【図４０Ｂ】Ｃ５７ＢＬ１０対照マウス、ｍｄｘ未処置マウス、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に従ってＰｉｐ６−ＰＭＯおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスの血液試料において評価された毒性アッセイ。（ａ）ｍｄｘ未処置および処置マウスと比較したＣ５７ＢＬ１０対照マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼのレベルの測定。（ｂ）ｍｄｘ未処置および処置マウスと比較したＣ５７ＢＬ１０対照マウスにおける血清血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチチン（ｃｒｅａｔｉｔｉｎｅ）レベルの測定。
【図４１】Ｐｉｐ−８ｄ、Ｐｉｐ−８ｄ２、Ｐｉｐ−８ｄ３、Ｐｉｐ−９ｂ、Ｐｉｐ−９ｂ２、Ｐｉｐ−９ｃ、Ｐｉｐ−９ｃ２、Ｐｉｐ−９ｃ３、Ｐｉｐ−９ｄ、Ｐｉｐ−９ｄ２、Ｐｉｐ−９ｄ３、Ｐｉｐ−９ｄ４のアミノ酸配列を示す表。ドメイン１、２および３中の残基の総数およびＡｒｇ、ＸおよびＢ残基の数も示す。
【図４２】Ｐｉｐ７、Ｐｉｐ８およびＰｉｐ９−ＰＭＯで処置されたｍｄｘ筋管における細胞生存度を示すチャート。
【図４３Ａ】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰｉｐ７−ＰＭＯコンジュゲートのスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎ）。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ６ｅ、Ｐｉｐ７ａ、Ｐｉｐ７ｂおよびＰｉｐ７ｂ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。（ａ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。（ｂ）Ｐｉｐ７−ＰＭＯコンジュゲートで処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の２週間後に処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１０マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。
【図４３Ｂ】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰｉｐ７−ＰＭＯコンジュゲートのスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎ）。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ６ｅ、Ｐｉｐ７ａ、Ｐｉｐ７ｂおよびＰｉｐ７ｂ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。（ａ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。（ｂ）Ｐｉｐ７−ＰＭＯコンジュゲートで処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の２週間後に処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１０マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。
【図４４Ａ】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰｉｐ８−ＰＭＯコンジュゲートのスクリーニング。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ８ｂ、Ｐｉｐ８ｃおよびＰｉｐ８ｃ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。（ａ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。（ｂ）Ｐｉｐ８−ＰＭＯコンジュゲートで処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の２週間後に処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１０マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。
【図４４Ｂ】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰｉｐ８−ＰＭＯコンジュゲートのスクリーニング。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ８ｂ、Ｐｉｐ８ｃおよびＰｉｐ８ｃ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。（ａ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。（ｂ）Ｐｉｐ８−ＰＭＯコンジュゲートで処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の２週間後に処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１０マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。
【図４５Ａ】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰｉｐ９−ＰＭＯコンジュゲートのスクリーニング。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ９ｂ、Ｐｉｐ９ｂ２、Ｐｉｐ９ｃ、Ｐｉｐ９ｄおよびＰｉｐ９ｄ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。（ａ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。（ｂ）Ｐｉｐ９−ＰＭＯコンジュゲートで処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の２週間後に処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１０マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。
【図４５Ｂ】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰｉｐ９−ＰＭＯコンジュゲートのスクリーニング。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ９ｂ、Ｐｉｐ９ｂ２、Ｐｉｐ９ｃ、Ｐｉｐ９ｄおよびＰｉｐ９ｄ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。（ａ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。（ｂ）Ｐｉｐ９−ＰＭＯコンジュゲートで処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の２週間後に処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１０マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。
【図４６Ａ】Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯを用いた静脈内注射後のジストロフィン修復の半定量分析。ＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋を免疫染色し、ＩｍａｇｅＰｒｏを用いて分析してジストロフィン発現を示し、定量化した。（ａ）ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を、ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告されたように（Arechavala-Gomeza et al., 2010）Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアにより分析し、Ｃ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの百分率として表した。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した（赤い棒により表した）。（ｂ）ジストロフィン染色強度をＣ５７ＢＬ／１０（１００％）およびｍｄｘ（０％）の筋肉の平均値に対して正規化した。それぞれの動物（ｎ＝３）に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した（赤い棒により表した）。（平均−ＳＥＭ；ｎ＝３；一元配置ＡＮＯＶＡ検定：ｍｄｘおよびＣ５７対照と比較して、ｎｓ、有意ではない、*ｐ＜０．０５、**＜０．００１、***＜０．０００１）。
【図４６Ｂ】Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯを用いた静脈内注射後のジストロフィン修復の半定量分析。ＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋を免疫染色し、ＩｍａｇｅＰｒｏを用いて分析してジストロフィン発現を示し、定量化した。（ａ）ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を、ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告されたように（Arechavala-Gomeza et al., 2010）Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアにより分析し、Ｃ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの百分率として表した。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した（赤い棒により表した）。（ｂ）ジストロフィン染色強度をＣ５７ＢＬ／１０（１００％）およびｍｄｘ（０％）の筋肉の平均値に対して正規化した。それぞれの動物（ｎ＝３）に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した（赤い棒により表した）。（平均−ＳＥＭ；ｎ＝３；一元配置ＡＮＯＶＡ検定：ｍｄｘおよびＣ５７対照と比較して、ｎｓ、有意ではない、*ｐ＜０．０５、**＜０．００１、***＜０．０００１）。
【図４７Ａ】１２．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＰｉｐ７〜９−ＰＭＯコンジュゲートにより処置されたｍｄｘマウスにおける肝および腎機能の血清マーカーの臨床生化学。血清をマウスの頚静脈から注射の２週間後におけるＣＯ２吸入による屠殺の直後に採取した。血清クレアチンキナーゼ、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルの分析を実施した。（平均−ＳＥＭ；ｎ＝３；両側ｔ検定：ｍｄｘまたはＣ５７ＢＬ／１０のどちらかと比較して、ｎｓ、有意ではない、*ｐ＜０．０５、**＜０．００１、***＜０．０００１）。
【図４７Ｂ】１２．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＰｉｐ７〜９−ＰＭＯコンジュゲートにより処置されたｍｄｘマウスにおける肝および腎機能の血清マーカーの臨床生化学。血清をマウスの頚静脈から注射の２週間後におけるＣＯ２吸入による屠殺の直後に採取した。血清クレアチンキナーゼ、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルの分析を実施した。（平均−ＳＥＭ；ｎ＝３；両側ｔ検定：ｍｄｘまたはＣ５７ＢＬ／１０のどちらかと比較して、ｎｓ、有意ではない、*ｐ＜０．０５、**＜０．００１、***＜０．０００１）。
【図４８】ＰＰＭＯ候補を用いた静脈内注射後のジストロフィン修復の半定量分析。ＴＡおよび心筋をジストロフィン抗体を用いて免疫染色し、ＩｍａｇｅＰｒｏを用いて分析してジストロフィン発現を示し、定量化した。（ａ）ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告された（Arechavala-Gomeza et al., 2010）ようにＩｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアにより分析し、Ｃ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの百分率として表した、ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を示すチャート。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した（赤い棒により表した）。（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／１０（１００％）およびｍｄｘ（０％）の筋肉の平均値に対して正規化したジストロフィン染色強度を示すチャート。それぞれの動物（ｎ＝３）に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した（横棒により表した）。
【図４９】ｍｄｘマウスにおける静脈内投与後のＰＰＭＯ候補の比較。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ８ｂ、９ｂ、９ｂ２、８ｃ、９ｃおよび９ｄ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での１回の静脈内注射後にエキソンスキッピングされたジストロフィンＲＮＡのレベルを評価した。より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。
【図５０Ａ】ｍｄｘマウスにおけるＰＰＭＯ候補の静脈内投与後のジストロフィンタンパク質レベルの定量化。ＰＰＭＯ候補を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Ｐｉｐ８ｂ、９ｂ、９ｂ２、８ｃ、９ｃおよび９ｄ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での注射の２週間後に、処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１５マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。（ａ）ＰＰＭＯ候補を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。（ｂ）Ｌｉｃｏｒソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート；ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。
【図５０Ｂ】ｍｄｘマウスにおけるＰＰＭＯ候補の静脈内投与後のジストロフィンタンパク質レベルの定量化。ＰＰＭＯ候補を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Ｐｉｐ８ｂ、９ｂ、９ｂ２、８ｃ、９ｃおよび９ｄ２の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での注射の２週間後に、処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１５マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。（ａ）ＰＰＭＯ候補を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。（ｂ）Ｌｉｃｏｒソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート；ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。
【図５１】ＰＰＭＯで処置されたｍｄｘの血清中のジストロｍｉｒ（ｄｙｓｔｒｏｍｉｒ）の発現を示すチャート。８週齢における１２．５ｍｇ／ｋｇのＰＰＭＯ候補（Ｐｉｐ８ｂ、９ｂ、９ｂ２、８ｃおよび９ｃ）の静脈内注射の２週間後に、血清をマウスの頚静脈からＣＯ２吸入による屠殺の直後に採取した。ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６のレベルをＰＰＭＯ処置したｍｄｘマウスの血清においてＱ−ＰＣＲにより調べ、ｍｉＲ−２２３に対して正規化した。ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６のレベルはＰＰＭＯ処置したｍｄｘマウスの血清において未処置のｍｄｘ対象と比較して有意に下方制御された。
【図５２】ｍｄｘマウスにおけるＨＰＬＣおよびフィルター脱塩したＰｉｐ９ｂ２とコンジュゲートしたＰＭＯの静脈内投与後のエキソンスキッピング効率の比較。８週齢のｍｄｘマウスにおけるＨＰＬＣおよびフィルター脱塩したＰｉｐ９ｂ−ＰＭＯの１２．５ｍｇ／ｋｇの用量での１回の静脈内注射後のジストロフィン発現。そのチャートはジストロフィン修復の半定量分析を示す。ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を、ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告されたように（Arechavala-Gomeza et al., 2010）Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアにより分析し、Ｃ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの百分率として表した。対象のそれぞれの領域（１２０個の領域）に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した（左側のパネル；棒により表した）。ジストロフィン染色強度をＣ５７ＢＬ／１０（１００％）およびｍｄｘ（０％）の筋肉の平均値に対して正規化した。それぞれの動物（ｎ＝４）に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した（右側のパネル；棒により表した）。
【図５３Ａ】ｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ９ｂ２とコンジュゲートしたＰＭＯの静脈内投与後のジストロフィンＲＮＡおよびタンパク質レベルの比較。Ｐｉｐ９ｂ２を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Ｐｉｐ９ｂ２−ＰＭＯの１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での注射の２週間後に、処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１５マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。（ａ）ＰＰＭＯ候補を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。（ｂ）Ｌｉｃｏｒソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート；ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。（ｃ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。
【図５３Ｂ】ｍｄｘマウスにおけるＰｉｐ９ｂ２とコンジュゲートしたＰＭＯの静脈内投与後のジストロフィンＲＮＡおよびタンパク質レベルの比較。Ｐｉｐ９ｂ２を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Ｐｉｐ９ｂ２−ＰＭＯの１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での注射の２週間後に、処置されたｍｄｘマウスの４種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの１５マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。（ａ）ＰＰＭＯ候補を用いて処置されたｍｄｘマウスからのＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。（ｂ）Ｌｉｃｏｒソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート；ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。（ｃ）より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるＲＮＡレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ。
【図５４】Ｐｉｐ９ｂ２−ＰＭＯで処置されたｍｄｘ筋管における細胞生存度を示すチャート。
【図５５】アミノヘキサン酸（アミノカプロン酸）の構造。
【図５６】ベータアラニン（３−アミノプロパン酸）の構造。
【図５７】Ｐｉｐ７ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ７ｂ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ７ｂ２−ＰＭＯ、Ｐｉｐ７ｃ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ７ｃ２−ＰＭＯ、Ｐｉｐ７ｄ−ＰＮＯの細胞生存度（培養されたＨｕｈ−７肝細胞）を添加されたＰｉｐ−ＰＭＯの濃度の関数として示すグラフ。
【図５８】Ｐｉｐ８ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ８ｂ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ８ｃ−ＰＭＯの細胞生存度（培養されたＨｕｈ−７肝細胞）を添加されたＰｉｐ−ＰＭＯの濃度の関数として示すグラフ。
【図５９】分化したマウスＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ７ａ、Ｐｉｐ７ｂ、Ｐｉｐ７ｂ２、Ｐｉｐ７ｃ、Ｐｉｐ７ｃ２、Ｐｉｐ７ｄ）のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を、０．１２５μＭ〜２μＭの範囲の濃度のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドＲＴ−ＰＣＲの産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ２３スキッピングの百分率として示される。
【図６０】分化したマウスＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ８ａ、Ｐｉｐ８ｂ、Ｐｉｐ８ｃ、Ｐｉｐ８ｃ２、Ｐｉｐ８ｄ）のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を、０．１２５μＭ〜２μＭの範囲の濃度のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドＲＴ−ＰＣＲの産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ２３スキッピングの百分率として示される。
【図６１】分化したマウスＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管におけるＰＭＯ−ペプチド（Ｐｉｐ９ｂ、Ｐｉｐ９ｂ２、Ｐｉｐ９ｃ、Ｐｉｐ９ｃ２、Ｐｉｐ９ｃ３、Ｐｉｐ９ｄ、Ｐｉｐ９ｄ２）のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を、０．１２５μＭ〜２μＭの範囲の濃度のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドＲＴ−ＰＣＲの産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ２３スキッピングの百分率として示される。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明の１個以上の態様の詳細を、本発明を実施するために本発明者らが意図する最高の方式の具体的な詳細を含めて下記の添付の記述で例として述べる。当業者には、本発明はこれらの具体的な詳細に限定されることなく実施されてよいことは明らかであろう。
【００９６】
本発明者らは、既に開示されたＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較してデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のｍｄｘマウスモデルにおける心筋中の高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を得る一方で全ての筋タイプにわたる高い活性を維持する上での中央の疎水性コア配列の役割を調べるために、ＰＭＯへのコンジュゲーションのために設計された細胞透過性ペプチドのさらなる系列を設計した。特に、本発明者らは、ａ）心筋におけるＰＭＯカーゴの高められた送達を示し、かつｂ）低い毒性を有するＣＰＰを設計することを求めてきた。
【００９７】
これを考慮して、本発明者らは２つの主な観点において前に開示されたＰｉｐ−２〜Ｐｉｐ−５系列と異なる一連のペプチドを設計している。
１）ドメイン２の疎水性コアのアミノ酸の配列が逆になっている、または混ぜられている。
【００９８】
２）カーゴ送達および細胞毒性への作用を決定するために、アルギニン残基の数が系統的に変更されている。
我々は、既に開示されたＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較してデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のｍｄｘマウスモデルにおける心筋中の高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を得る一方で全ての筋タイプにわたる高い活性を維持する上での中央の疎水性コアの役割を調べるためのＰＭＯへのコンジュゲーションのために設計した一連のペプチドを記述する。
【実施例】
【００９９】
実施例１
我々は以前に、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたアルギニンに富む細胞透過性ペプチド：Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯの１回投与後の高いスプライシング効率およびジストロフィン修復を含む印象的な心臓活性を報告してきた。しかし、この活性の基礎をなす機序は不十分にしか理解されていない。
【０１００】
ここで、我々は、そのＰｉｐ５ｅペプチドの疎水性コア領域に変異を含有するＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯの一連の誘導体（連続的にＰｉｐ６−ＰＭＯと割り当てる）の１回量投与（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を含む研究の結果を報告し、ここでこの中央のコア領域のアミノ酸配列は反転し、混ぜられ、または部分的に削除されている。これらの変化は、その対応するＰｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートの１回の低用量の静脈内注射の後に、心臓を含む多数の筋群におけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン修復のレベルに影響を及ぼす。その結果は、コアの長さにおける低減は心臓活性を低減するため、５アミノ酸（５−ａａ）のコアの長さが心臓のジストロフィン産生に必須であるようであることを示している。意外にも、１個のアルギニン残基はその疎水性コアの１つの位置において（部分的に）許容されたが、２個のアルギニン残基は許容されず、異なる位置における１個のアルギニンも許容されなかった。驚くべきことに、骨格のジストロフィン産生もこれらの２つの後者の場合において低減した。我々のデータは、Ｐｉｐ配列の疎水性コアは心臓へのＰＭＯの送達に決定的に重要であり、この領域への特定の修飾は活性をさらに高め得ることを示している。その結果は、ＤＭＤに関する療法用ＰＭＯの開発に関する含意を有する。
【０１０１】
結果
Ｐｉｐ６  ＣＰＰ系列の開発
我々の以前のリードＰｉｐ系列のＣＰＰであるＰｉｐ５ｅ[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]は、２個のアルギニンに富む側方の（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域および中央の疎水性コアを含有する。優れた心臓ジストロフィン産生の維持に関するその疎水性コアの構成の必要条件をさらに調べるため、我々は、その疎水性コア領域にのみ変異がなされている（例えばコア領域が混ぜられている、および部分的に削除されているペプチド）ある範囲のＰｉｐ５ｅ誘導体ペプチド（Ｐｉｐ６ａ〜ｆ）を合成した。
【０１０２】
Ｐｉｐ６ｅを除いて、全てのペプチドはＰｉｐ５ｅにおけるように側方の配列において同じ数のアルギニン残基（１０）を含有していた。これらのペプチドを、以前にｍｄｘマウスにおけるエキソンスキッピングに関して検証されたジストロフィンのエキソン２３に相補的な２５マーのＰＭＯ[Yin, H., et al., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): p. 3909-18; Yin, H., et al., A fusion peptide directs enhanced systemic dystrophin exon skipping and functional restoration in dystrophin-deficient mdx mice. Hum Mol Genet, 2009. 18(22): p. 4405-14.]にコンジュゲートした。我々が以前に利用したＰＭＯの５’末端へのコンジュゲーションの方法[Yin et al、上記]とは対照的に、Ｐｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートはＰＭＯの３’末端のＰｉｐペプチドのＣ末端カルボン酸部分へのコンジュゲーションにより調製された。我々は、ＰＭＯの３’末端に、または５’末端にコンジュゲートされたＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯに関するインビボでのジストロフィン産生またはエキソンスキッピング活性の間に有意な差がないことを報告しており、従ってこれらの実験に関して３’末端コンジュゲーションを利用することを選択した[Saleh AF, A.A.A., Yin H, Betts C, Hammond S, Wood MJA and Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3'-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academyof Sciences of the Czech Republic: Prague, p. 292-296]。
【０１０３】
代替カーゴＰＭＯオリゴヌクレオチドのＰｉｐコンジュゲートの合成
ＰＭＯ  ２５マーＭ２３Ｄ（＋７−１８）（５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］）（ＰＭＯＤＭＤ）は、ｍｄｘマウスにおけるエキソンスキッピングに適したオリゴヌクレオチド類似体として一般的に用いられている３７，４２，４３，４４。これらの例の多くで、Ｂペプチド（配列ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１］）をＰＭＯＤＭＤにコンジュゲートし、そのままの（ｎａｋｅｄ）ＰＭＯＤＭＤと比較してｍｄｘマウスにおける筋内または静脈内送達によるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を有意に増進することが示された。Ｂペプチド（（ＲＸＲ）４ＸＢとＸのＢ単位による２個のみの置換により異なる）は、ＤＭＤ処置のためのＰＭＯとのコンジュゲーションにおける臨床試験開発のためのリード候補ペプチドである４３。
【０１０４】
そのペプチドは、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ）上の標準的なＦｍｏｃに基づく固相合成により合成された。ペプチドをトリイソプロピルシラン（１％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）および水（２．５％）の存在下でのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、９４％）を用いた処理により樹脂から切り離し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ上でのアセトニトリル／３％水性ＴＦＡ（１：１、ｖ／ｖ）中で溶解させたβ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（１０ｍｇ／ｍｌ）のマトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。
【０１０５】
ペプチドＰｉｐ−６ａ〜Ｐｉｐ−６ｉ、Ｐｉｐ−７ａ〜Ｐｉｐ−７ｃ２およびＰｉｐ８ａ〜Ｐｉｐ−８ｃ２のアミノ酸配列を図１８において示す。
Ｐｉｐ−６ａ〜Ｐｉｐ−６ｉ、Ｐｉｐ−７ａ〜Ｐｉｐ−７ｃ２およびＰｉｐ８ａ〜Ｐｉｐ−８ｃ２ならびに対照のＢペプチドを、ＰＭＯＤＭＤのコンジュゲートとして合成した。ペプチドをＣ末端カルボン酸の２５マーＰＭＯの３’末端へのアミドカップリング反応によりコンジュゲートした（Yin et al. Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011を参照）。簡潔には、３’−アミド結合を以下のように実施した：ＤＭＳＯ中のＰＭＯ（１００ｎｍｏｌｅ）を、２倍過剰量のペプチドと、ＮＭＰ中でＴＢＴＵ：ＨＯＡｔ：ＤＩＥＡ（ペプチドに対して２．５：１．８：１．７モル過剰）を用いて３７℃において２時間カップリングさせた。そのコンジュゲートを陽イオン交換ＨＰＬＣ（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製し、ＨＬＢカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上で脱塩した。
【０１０６】
分化したＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋肉筋管における細胞培養エキソンスキッピングアッセイ
Ｐｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートのエキソンスキッピングの可能性を、分化したマウスＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋管において、一切の形質移入試薬の非存在下で（図１）、０．１２５μＭから１μＭまでの範囲の濃度で評価した。これは、培養された筋細胞におけるエキソンスキッピング活性は、Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯを含め、これらのコンストラクト全てに関して非常に類似していることを示した。これらの結果は、側方のアルギニンに富む配列は大部分が一定数のアルギニン残基（１０）を含有していたが間隔をアミノヘキサノイル（アミノヘキサン酸）およびβアラニン単位を代替で配置することにより変動させていた以前のＰｉｐ５系列[Yin et al、上記]とは異なっている。これは結果として、インビボでの活性とよく相関するエキソンスキッピング活性における小さな変動をもたらした。Ｐｉｐ６配列の場合、側方のアルギニンに富む配列は同一である（Ｐｉｐ６ｅを除く、それはコアの２番目の位置中に置換されているコアの直前の１個のアルギニンを除いて同一である）。その結果は、細胞のエキソンスキッピング活性はその疎水性コアの配列または長さに依存しないことを実証している。我々は以前にインビトロでのエキソンスキッピング活性における主な変化はむしろアルギニン残基の総数と相関していることを示していることを特筆する[Saleh, A.F., et al., Synthesis and splice-redirecting activity of branched, arginine-rich peptide dendrimer conjugates of peptide nucleic acid oligonucleotides. Bioconjug Chem, 2010. 21(10): p. 1902-11.]。
【０１０７】
Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管は、雄のＨ２Ｋ  ｍｄｘ  ｆ２マウスのＥＤＬ筋から得られたＨ２Ｋ  ｍｄｘ筋芽細胞に由来する。その細胞はジストロフィン欠損であり、熱不安定性シミアンウイルス４０ラージ腫瘍抗原（ｔｓＡ５８）の発現により条件付き不死である。その筋芽細胞はリッチ培養（ｒｉｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）において３３℃（１０％ＣＯ２）で増殖し、ウマ血清を含む培地中で３７℃で筋管に分化する。
【０１０８】
Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を調製し、わずかな変更があることを除いて以前に記述された方法(Wang, Q, Yin, H, et al. (2010) In vitro evaluation of novel antisense oligonucleotides is predictive of in vivo exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy)により、ペプチド−ＰＮＡおよびペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共に一切の形質移入剤の非存在下でインキュベーションした。
【０１０９】
ゼラチンコートされた２４ウェルプレート中に蒔いたコンフルエントなＨ２Ｋ  ｍｄｘ細胞から血清欠乏（５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ）の２日後に筋管を得た。コンジュゲートを０．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中で筋管と共に４時間インキュベーションし、次いでさらなる培養のために１ｍｌのＤＭＥＭ／５％ウマ血清培地により置き換えた。２０時間後、筋管をＰＢＳで２回洗浄し、総ＲＮＡを０．５ｍｌのＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ，英国）で抽出した。ＲＮＡ調製物をＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼ（２Ｕ）およびプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ）で処理した後、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、２５μＬ中で１μｇのＲＮＡ鋳型を用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、順方向プライマー５’ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＴＧＡＧ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２］および逆方向プライマー５’ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３］をプライマーとして（ｐｒｉｍｅｄ）実施された。最初のｃＤＮＡ合成を５５℃で３０分間実施し、続いて３０サイクルの９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、および６８℃で８０秒間を行った。次いでＲＴ  ＰＣＲ産物（１ｍＬ）を、２５μＬ中で０．５ＵのＳｕｐｅｒ  ＴＡＱポリメラーゼ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて順方向プライマー５’ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４］および逆方向プライマー５’ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴ３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５］をプライマーとして実施される二次ＰＣＲのための鋳型として用いた。サイクル条件は、９５℃で１分間、５７℃で１分間および７２℃で８０秒間を２５サイクルであった。生成物を２％アガロースゲルにより調べ、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ分析ソフトウェア（ＳｙｎＧｅｎｅ）を用いた走査後、エキソン２３スキッピングの相対量を３つの実験の複製にわたって平均されたコンジュゲートの所与の濃度における百分率として表した。
【０１１０】
その結果（図１）は、Ｐｉｐ−６ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｂ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｃ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｄ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｅ−ＰＭＯおよびＰｉｐ−６ｆ−ＰＭＯコンジュゲートの全てがｍｄｘ筋細胞において高いエキソンスキッピング活性を与えることを示した。
【０１１１】
Ｐｉｐ−６ｇ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｈ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−６ｉ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｂ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｂ２−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−７ｃ２、Ｐｉｐ−８ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ−８ｂ、およびＰｉｐ−８ｃコンジュゲートもｍｄｘ筋細胞において高いエキソンスキッピング活性を与え、Ｐｉｐ７ｃおよびＰｉｐ７ｄは中程度のエキソンスキッピングを与えた（図２〜５）。
【０１１２】
Ｐｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートのｍｄｘマウスにおけるインビボアッセイ
心組織におけるＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯの効力を考えると、疎水性コアの配列を（５−ａａの長さを維持しながら）変更する目的は、より低い用量でより効率的であり得るペプチドを同定することであった。これらの修飾には、その疎水性領域の反転（Ｐｉｐ６ａ）、チロシンのイソロイシンによる置換（Ｐｉｐ６ｂ）、第１のアルギニンに富む側方領域中のそのコアに直接隣接するアルギニンの置換によるＰｉｐ６ａ配列中のグルタミンの置換（Ｐｉｐ６ｅ）、および混ぜられた疎水性コアの配列（Ｐｉｐ６ｆ）が含まれていた。全てのＰｉｐ６ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートをｍｄｘマウスに１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの尾静脈経由の静脈内注射として投与し、２週間後に組織を採取し、ＲＮＡおよびタンパク質レベル両方で活性に関して評価した。
【０１１３】
全ての５−ａａコアＰｉｐ６−ＰＭＯに関するジストロフィン発現の免疫組織化学染色は、ＴＡ、横隔膜、および心臓を含め、骨格筋における高レベルのジストロフィン産生を明らかにした。免疫組織化学染色の定量化（図３４ａ，ｂ）は以前に記述されたように実施され[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., et al., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4): p. 265-74.]、それぞれのペプチド−ＰＭＯ処置に関する四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれの切片（ｎ＝３）に関してジストロフィン染色の４つの代表的なフレームを選んで、これをラミニン染色と相関させることにより達成された。未処置のｍｄｘマウスおよび処置されたｍｄｘマウスをＣ５７ＢＬ１０マウスに対して正規化した。この方法は、それぞれの処置群に関するラミニンと比較した筋線維膜におけるジストロフィンの染色強度の比較を可能にする。強度比はＣ５７ＢＬ１０試料に対して正規化され、筋線維膜における対象のそれぞれの領域（各処置群に関して１２０個の領域）を散布図上にプロットする。その５−ａａコアＰｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートの４つ全てに関して得られた相対強度値は、四頭筋および横隔膜に関して未処置のｍｄｘマウスの相対強度値と有意に異なっていた（図３４ｂおよび図３１）。横隔膜においてより高い回復スコアを有していたＰｉｐ６ｂを除いて（％ＲＳは３８．８７〜４８．４３％の範囲であり、Ｐｉｐ６ｂは５６．７２％である；図３４ｂ）、全ての処置に関して、四頭筋において（回復スコアパーセント−％ＲＳ−は２１．１０〜３３．４４％の範囲である；図３４ｂ）、および横隔膜において、非常に類似したジストロフィン修復レベルが存在していた。全ての５−ａａコアＰｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスは、Ｐｉｐ６ｅを除いて、心臓において高いジストロフィン強度値を示した（他のＰｉｐ６−ＰＭＯはｍｄｘと比較して統計的に有意であった＝ｐ＜０．０００１；図３１）。Ｐｉｐ６ａ−およびＰｉｐ６ｂ−ＰＭＯコンジュゲートは、図３４ｂにおいて観察されるように最も高い回復スコアを示し（それぞれ％ＲＳは３７．６６％および３４．２２％）、接近してＰｉｐ６ｆ−ＰＭＯ（％ＲＳは２６．２４％）、次いでＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯ（％ＲＳは１７．３２％）が続いた。Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯ処置と直接比較した場合、Ｐｉｐ６ａ−ＰＭＯのみが心臓において有意に優れていた（図３２）。これらの５−ａａコアＰｉｐ６−ＰＭＯは、ＴＡ筋における免疫組織化学染色により説明されるように、他のジストロフィン複合体タンパク質、すなわちｎＮＯＳ、α−サルコグリカンおよびβ−サルコグリカンも修復することが示された。
【０１１４】
ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析は、免疫染色と類似した結果を示した。ＲＴＰＣＲの代表的な画像（図３４ｄ）は分析した全ての組織における高いエキソンスキッピング効率を説明している。これは、四頭筋、横隔膜および心臓に関するリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果により、よりよく示されている（図３４ｃ）。デルタ２３転写産物はそれぞれの筋群（ｎ＝３）に関して‘総ジストロフィン’に対して正規化されている。このデータの定量化は、全ての５−ａａ  Ｐｉｐ６−ＰＭＯで処置されたマウスの四頭筋における類似のΔ２３スキッピングのレベルを明らかにした。そのデータの傾向は、Ｐｉｐ６ｆ−およびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯは横隔膜において最も高いエキソンスキッピングを示し、Ｐｉｐ６ｆ−ＰＭＯは心臓において最も高いエキソンスキッピングを示すことを示唆している（スプライシングの平均値に関して図３８ａを参照）。ウェスタンブロット（図３４ｅ）をそれぞれのマウスの組織に対して実施し、５０％および１０％  Ｃ５７ＢＬ１０対照に対して定量化した。これらの結果を平均し、図３８ｂにおいて示す。Ｐｉｐ６ａ−、Ｐｉｐ６ｂ−、Ｐｉｐ６ｅ−およびＰｉｐ６ｆ−ＰＭＯコンジュゲートは、ＴＡおよび四頭筋において最も高いジストロフィンタンパク質修復を示した。横隔膜におけるジストロフィン修復のレベルはこれらの処置の全てにわたって一様であり、一方で心臓の場合はＰｉｐ６ｂ−およびＰｉｐ６ｆ−ＰＭＯコンジュゲートが最も高いジストロフィン修復を示した。
【０１１５】
免疫組織化学染色により測定されるようなタンパク質修復は、ウェスタンブロット分析により計算されるタンパク質修復よりも一貫して高い。これらの違いは、用いられた異なる‘ハウジングタンパク質（ｈｏｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）’に帰することができ、すなわち、免疫組織化学染色により定量化されるジストロフィン修復はラミニンに対して正規化されており、一方でウェスタンブロット分析はアルファ−アクチニンを正規化のために用いている。ウェスタンブロットの定量化はごく最近ジストロフィンに関して報告されており、現在化学発光法を用いている。従って、絶対値をではなくウェスタンブロットにより明らかにされるジストロフィンタンパク質レベルにおける傾向をより重視することは賢明であり得る。従って、その結果全体を考えると、４種類の５−ａａコアＰｉｐ６−ＰＭＯ（Ｐｉｐ６ａ−、Ｐｉｐ６ｂ−、Ｐｉｐ６ｅ−およびＰｉｐ６ｆ−ＰＭＯ）のそれぞれで処置されたｍｄｘマウスは、以前のリード候補であるＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと比較して、ＴＡ、四頭筋および心筋において向上したジストロフィン産生およびエキソンスキッピングを示すようである。
【０１１６】
加えて、これらの５−ａａコアＰｉｐ６−ＰＭＯは、関連する毒性バイオマーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびクレアチンキナーゼの血漿レベルにより評価した際に、毒性の証拠を示さない（図４０ａ参照）。血液尿素窒素およびクレアチニンレベルは未処置のｍｄｘのレベルに類似していた（図４０ｂ参照）。全てのＰｉｐ６−ＰＭＯ処置群は、未処置のＣ５７ＢＬ１０対照に類似したバイオマーカーのレベルを示している。
【０１１７】
上記で記述したように、Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯを１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で処置された成体のｍｄｘマウス（４．５月齢）におけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生に関してＰｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートと比較し、体の広い範囲の組織を２週間後に採取した。
【０１１８】
処置されたｍｄｘの筋群において免疫組織化学染色（データは示していない）を用いてジストロフィンタンパク質の産生（およびその筋線維膜における正しい再局在）を可視化し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてエキソンスキッピングされた産物を検出した。ｑＰＣＲはスプライシングされた産物の定量化を可能にし、ウェスタンブロットを用いてＣ５７ＢＬ１０および未処置のｍｄｘ対照マウスと比較した場合の処置されたｍｄｘマウスからの筋肉中で産生されたジストロフィンタンパク質の量を定量化した。
【０１１９】
その結果（図６〜１７）は、Ｐｉｐ−６ａ（Ｐｉｐ−５ｅから反転したコア（ドメイン２）配列を含有する）、Ｐｉｐ−６ｂ（コア配列においてＹがＩに変化している）、Ｐｉｐ−６ｅ（Ｒがコア配列中に移動している）およびＰｉｐ−６ｆ（混ぜられたコア配列を含有する）は全て、Ｐｉｐ−５ｅと類似して心筋におけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を維持しており、一方で切り詰められたコア配列を含有するペプチド（Ｐｉｐ−６ｃおよびＰｉｐ−６ｄ）は心筋において活性を失っていることを示した。全ての他の筋タイプにおける活性は、６種類のＰｉｐ−６（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）ＰＭＯコンストラクト全てに関して大まかに類似していた。
【０１２０】
これらの結果はＰＭＯＤＭＤの心筋への効率的な送達のためにそのペプチド配列は重要ではないことを示しており、それは特定の細胞侵入シグナルはないことを示唆している（例えば、混ぜられたコア：Ｐｉｐ−６ｆはＰＭＯＤＭＤの心筋への優れた送達を示す）。従って、５アミノ酸の疎水性コア配列の保持は重要であるが、Ｐｉｐ−５ｅと比較して心筋における活性を失うことのないコア配列の反転およびかき混ぜ（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）により実証されるように、その疎水性コア配列のＮ〜Ｃの順序（一次配列）は重要ではない。しかし、他の筋タイプ、例えば骨格筋および平滑筋への送達に関しては、５アミノ酸の疎水性コア配列を有する必要条件は、Ｐｉｐ−６ｃおよびＰｉｐ−６ｄによる非心臓性の筋肉における優れた活性により実証されるように、重要性がより低い。
【０１２１】
細胞生存度アッセイ
Ｈｕｈ−７細胞を、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下において１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補ったＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、９６ウェルプレート中にウェルあたり１．５×１０４細胞で蒔いた。一夜培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中のＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートをそのウェルに３通りで（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）添加した。４時間のインキュベーション後、培地を１００μｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで置き換えることによりコンジュゲートを除去し、さらに２０時間培養した。２０μｌのＭＴＳ細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を１００μｌのＤＭＥＭを含有するウェルに添加し、プレートを１〜２時間インキュベーションした後、４９０ｎｍでのＵＶ測定を行った。細胞生存度の百分率を、３通りの試料の平均吸光度を未処置の試料の平均値に対して正規化することにより決定した。
【０１２２】
示した結果（図１９〜２２）は２回の独立した実験の平均であり、より少ないアルギニン残基を含有するペプチドの増大した細胞生存度（すなわちより低い細胞毒性）と一致している。例えば、ドメイン１〜３を合わせた中に合計７個のアルギニン残基を有するペプチドは、８または９個のアルギニン残基を有するペプチドよりも高い細胞生存度（より低い細胞毒性）を示した。
【０１２３】
Ｐｉｐ−ＰＭＯコンジュゲートの血清安定性
血清安定性を、Ｐｉｐ−ＰＭＯの分割量（１０ナノモル）を１００％マウス血清（１００μＬ）に添加し、３７℃で１２０または２４０分間インキュベーションすることにより測定した。それぞれの反応物を１Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ溶液（３００μＬ）および氷冷したアセトニトリル（６００μＬ）で希釈した。試料を混合し、−２０℃に保ち、沈殿した血清タンパク質を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）により分離した。遠心分離後、上清を集め、凍結乾燥し、残留物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、および逆相ＨＰＬＣによるペプチド分解に関する分析のために水中で溶解させた。ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：カラム、Ｃ１８逆相（２５０×４．６ｍｍ）；溶媒Ａ、０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ、９０％アセトニトリル、１０％溶媒Ａ；勾配、２５分間における１０％〜５０％溶媒Ｂ。その結果は、Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ６ａ−ＰＭＯ、Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯおよびＰｉｐ６ｆ−ＰＭＯに関して１２０分において残っている主成分を未変化のＰｉｐ−ＰＭＯコンジュゲートとして同定することができること、ならびにペプチドの断片にコンジュゲートしたＰＭＯのレベルは（ＲＸＲＲＢＲ）２ＸＢ−ＰＭＯに関するレベルと非常に類似していることを示した。
【０１２４】
Ｐｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートの疎水性コアの部分的削除は心臓のジストロフィン産生を消失させる
高い効率および心臓への送達を有するＰｉｐ−ＰＭＯを同定する必要性に加えて、心臓への送達に重要であるＰｉｐペプチドの疎水性コアの要素をよりよく定めることはさらなる目的であった。この目的のため、疎水性コアの１アミノ酸（チロシンの除去；Ｐｉｐ６ｃ）および２アミノ酸（イソロイシンおよびチロシンの除去；Ｐｉｐ６ｄ）の部分的な欠失を含有するＰｉｐペプチドをＰＭＯコンジュゲートとして合成した。
【０１２５】
ｍｄｘマウスの処置後、免疫組織化学染色を実施し、これはこれらの欠失Ｐｉｐ６−ＰＭＯの両方に関して骨格筋、例えばＴＡおよび横隔膜における一部のジストロフィン発現を明らかにした。その免疫組織化学染色の定量化は、四頭筋における、他のＰｉｐ６−ＰＭＯと比較した場合の、接近してＰｉｐ６ｃ−ＰＭＯが続く、Ｐｉｐ６ｄ−ＰＭＯ処理による最も低いジストロフィン修復を明らかにした（図３５ａ、ｂおよび図３１）。同様に、Ｐｉｐ６ｄ−ＰＭＯは横隔膜において最も低いジストロフィン修復を示した。心臓におけるＰｉｐ６ｃ−およびＰｉｐ６ｄ−ＰＭＯコンジュゲートに関する回復スコアは非常に低く、これはそれらの乏しい効率を示している（Ｐｉｐ６ｃ  ％ＲＳ  −１．０６％およびＰｉｐ６ｄ  ２．５０％；図３５ｂ）。
【０１２６】
これらの結果は、ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により確証されている。ＲＴ−ＰＣＲの代表的な画像（図３５ｄ）およびｑＲＴ−ＰＣＲのエキソンスキッピングの結果（図３５ｃ）は両方とも、Ｐｉｐ６ｃ−およびＰｉｐ６ｄ−ＰＭＯコンジュゲートを用いて処置されたｍｄｘマウスにおける四頭筋および横隔膜における低減したエキソンスキッピングならびに心臓における無視できるほどのエキソンスキッピングを示している。ウェスタンブロット分析は、ＴＡおよび四頭筋における非効率的なジストロフィンタンパク質産生ならびに心臓における無視できるほどのジストロフィン修復を明らかにした（図３５ｅおよび図３８ｂ）。
【０１２７】
これらの結果は、疎水性コアの長さは優れた心臓ジストロフィン産生に決定的に重要であるだけでなく、一部の他の筋群における活性にも決定的に重要であることを示している。従って、ＣＰＰ単独のアルギニン含有量はこのクラスのペプチドに関するジストロフィン産生およびエキソンスキッピング効率の唯一の予測因子ではない。
【０１２８】
疎水性コア中のアルギニンの位置の変更または第２のアルギニンの付加はジストロフィン産生に有害である
側方領域からコア中へのアルギニンの位置変更は、意外にも許容された（Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯ）。従って、２種類のさらなるＰｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートをＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯの誘導体として合成した。Ｐｉｐ６ｇ−ＰＭＯは第２のアルギニン残基を含有し、それは第２の側方領域から中央の疎水性コア中に移動しており、Ｐｉｐ６ｈ−ＰＭＯは１個のアルギニンの位置がコア内で変更されるようにＰｉｐ６ｅの疎水性領域の反転を含有する。
【０１２９】
驚くべきことに、疎水性コアに対するこれらの変更は、免疫組織化学染色において、およびその定量化において観察されたように、結果として心臓においてだけでなく全ての他の組織においてもジストロフィン発現のさらなる低減をもたらした（図３６ａ，ｂ）。免疫組織化学染色の代表的な画像は、ＴＡおよび四頭筋を除いて全ての組織における非常に少数しかないジストロフィン陽性線維を明らかにした。その定量化に関して、Ｐｉｐ６ｇ−ＰＭＯは四頭筋または横隔膜において未処置のｍｄｘと有意に異なっていなかった（図３９ａ）。両方のＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体は心筋において未処置のｍｄｘと有意に異なっておらず、これはこれらの２種類のペプチドの一般的な非効率性を説明している。同様に、これらのＰｉｐ６ｅ−ＰＭＯ誘導体は、全ての組織において、代表的なＲＴ−ＰＣＲ画像（図３９ｄ）において、およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析（図３６ｃおよび図３９ｃ）において説明されるように、エキソンスキッピングにおける低減した効率を示した。ウェスタンブロットは、ＴＡ筋を除いて全ての組織における無視できるほどのジストロフィンタンパク質修復（図３６ｅおよび図３９ｄ）を明らかにした。これらのデータは、Ｐｉｐ６ｅの疎水性領域におけるアルギニンの数の増大または１個のアルギニンの位置の変更は、心臓ならびに骨格筋のジストロフィン産生の両方に有害であることを示している。
【０１３０】
材料および方法
ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートの合成
ペプチドは標準的なＦｍｏｃ化学により合成され、ＨＰＬＣにより精製された。ＰＭＯ配列（５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］）はＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  ＬＬＣから購入した。ペプチドを、以前に予備報告[Saleh AF, A.A.A., Yin H, Betts C, Hammond S, Wood MJA and Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3 '-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciencesof the Czech Republic: Prague, p. 292-296]において記述したように、ＰＭＯの３’末端におけるアミド結合によりＰＭＯにコンジュゲートし、続いてＨＰＬＣにより精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートを使用前に滅菌水中で溶解させ、０．２２μｍセルロースアセテート膜を通して濾過した。
【０１３１】
ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により観察されたように、Ｐｉｐ６ａ、Ｐｉｐ６ｂ、Ｐｉｐ６ｅおよびＰｉｐ６ｆのＰＭＯのコンジュゲートは１００％血清中、３７℃で２時間において主に安定であり、Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯと類似した安定性を有することが分かった。そのコンジュゲートは全て類似した分解パターンを示し、４時間に至るまで完全なコンジュゲートがまだ観察された（データは示していない）。
【０１３２】
インビトロアッセイ：ｍｄｘマウス筋管におけるエキソンスキッピング
Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を調製し、以前に記述した方法により[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303.]、一切の形質移入剤の非存在下で、０．１２５、０．２５、０．５および１．０μＭの濃度のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共にインキュベーションした。単離されたＲＮＡ全体からのネステッドＲＴ−ＰＣＲの産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Δ２３転写産物レベルの定量化をデンシトメトリーを用いて計算した。ＭＴＳ細胞生存度試験（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、その研究において用いられたペプチド−ＰＭＯコンジュゲートの最も高い濃度における１００％の生存を示した（データは示していない）。
【０１３３】
動物および静脈内注射
４．５月齢〜５  １／２月齢のｍｄｘマウスをこれらの実験において用いた（ｎ＝３）。その実験は、オックスフォード大学生物医学ユニットにおいて英国内務省により認可された手順に従って実施された。Ｐｉｐ６−ＰＭＯコンジュゲートは０．９％生理食塩水溶液中で１２．５ｍｇ／ｋｇの最終的な用量で調製された。１６０μｌの総量を麻酔したマウスの尾静脈経由で投与した。２週間後、マウスをＣＯ２吸入により屠殺し、筋肉および他の組織を採取し、冷却したイソペンタン中で瞬時に凍結させた（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）後、−８０℃で保管した。
【０１３４】
ジストロフィン発現の免疫組織化学および定量化
ジストロフィン発現の実験のために組織試料の横断切片を切った（８μｍ厚）。ジストロフィンの可視化および定量化のため、切片をウサギ抗ジストロフィン（Ａｂｃａｍ）およびラット抗ラミニン（Ｓｉｇｍａ）を用いて共染色し、それぞれヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５９４およびヤギ抗ラットＩｇＧ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した。画像をＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢ顕微鏡およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて捕捉した。定量的免疫組織化学を以前に記述されたように実施した[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., et al., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4):p. 265-74.]。それぞれの処置に関する代表的な画像を選んだ。定量化のため、ジストロフィンおよび相関するラミニンの４つの代表的なフレームをそれぞれの処置に関する四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれの切片（ｎ＝３）に関して選んだ。ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを用いて、対象の１０個の領域をランダムにラミニン画像上に配置し、それを対応するジストロフィン画像の上に重ねた。１２０個の領域に関する最小および最大蛍光強度をそれぞれの処置に関して記録した。バックグラウンド蛍光に関して補正するためにそれぞれの領域に関して強度の差を計算し、未処置のｍｄｘおよび処置されたｍｄｘをＣ５７ＢＬ１０に対して正規化した。これらの値を散布図上にプロットした。その‘相対強度平均値’をマルチレベル統計モデルを用いて計算した。これらの値を用いて、回復スコアの百分率をＴＲＥＡＴＮＭＤのウェブサイト(http://www.treatnmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.1.1_001.pdf)上に記載されているような次の方程式:（処置されたｍｄｘマウスのジストロフィン回復−未処置のｍｄｘマウスのジストロフィン回復）／（Ｃ５７ＢＬ１０マウスのジストロフィン回復−未処置のｍｄｘマウスのジストロフィン回復）を実行することにより計算した。ジストロフィン関連タンパク質の染色は、以前に記述されたように[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]、ＭＯＭブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）およびα−サルコグリカンおよびα−ジストログリカン（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）抗体（１：１００希釈）を用いて実施した。ｎＮＯＳ染色は、ヤギ抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて実施した。
【０１３５】
ｍｄｘマウス組織におけるエキソンスキッピング
総ＲＮＡを、対照マウスおよび処置されたマウスの組織からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて抽出した。
【０１３６】
ＲＴ−ＰＣＲ：４００ナノグラムのＲＮＡ鋳型を、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）および遺伝子特異的プライマー（実施例２０〜２６、順方向：５’−ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  Ｇ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２］、逆方向：５’−ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３］）を用いる５０μｌの逆転写反応において用いた。サイクル条件は以下の通りであった：５０℃で３０分間、続いて３０サイクルの９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、および７２℃で２分間。２マイクロリットルのｃＤＮＡを、以下のサイクル条件を用いる５０μｌのネステッドＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲキット）においてさらに増幅した：９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間を２４サイクル（実施例２０〜２６：順方向：ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４］、逆方向：ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５］）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。
【０１３７】
定量的リアルタイムＰＣＲ：２マイクログラムのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。エキソンスキッピングｑＰＣＲを、Ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、プライマーセット（ＩＤＴ）およびＳｔｅｐＯｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。用いたプライマーセットは以下の通りであった：総ジストロフィン転写産物、実施例１９〜２０：順方向：ＧＣＣＡＴＡＧＣＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１２］、逆方向：ＧＣＡＴＴＡＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＴＴＧＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１３］；デルタ２３  ｄｍｄ転写産物、順方向：ＧＣＧ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１４］、逆方向：ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＣＣ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１５］。プラスミド（総ジストロフィンおよびデルタ２３スキップ）を標準曲線のために用いた。
【０１３８】
タンパク質抽出およびウェスタンブロット
対照および処置された筋試料を、５％２−メルカプトエタノールを補った７５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）および１０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶解緩衝液中でホモジナイズした。試料を１００℃で３分間加熱した後、遠心分離して上清を除去した。タンパク質レベルをブラッドフォードアッセイ（Ｓｉｇｍａ）により測定し、ＢＳＡ標準を用いて定量化した。１０〜１５μｇの未処置および処置されたｍｄｘ試料のタンパク質、ならびにこれらの濃度の５０％および１０％のＣ５７ＢＬ１０タンパク質（陽性対照）を、３〜８％トリス−酢酸ゲル上にロードした。タンパク質をＰＶＤＦ膜上にブロットし、ジストロフィンに関してＤＹＳ１抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）を用いて、およびロード対照に関してα−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて調べた。一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧの結合により、ｌｕｍｉｇｅｎを用いて検出した。ウェスタンブロットを画像化し（ＬｉＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏｄｙｓｓｅｙ画像化システムを用いて分析した。
【０１３９】
臨床生化学
血漿試料をｍｄｘマウスの頚静脈からＣＯ２吸入による屠殺の直後に採取した。毒性バイオマーカーの分析は、ＭＲＣ、Ｍａｒｙ  Ｌｙｏｎセンター臨床病理学実験室（英国ハーウェル）により実施された。
【０１４０】
統計分析
全てのデータは平均値±ＳＥＭを報告した。マルチレベル、繰り返し測定モデルをこの試験に関して実行した。そのマルチレベル統計アプローチは伝統的な統計法に基づいており、社会科学、医学および生物科学においてますます実施されている[Butterfield, A., et al., PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution. BMC Bioinformatics, 2004. 5: p. 1; Brooks, G., et al., Referral Source and Outcomes of Physical Therapy Care in Patients With Low Back Pain. J Orthop Sports Phys Ther, 2012; Bernier, J., Y. Feng, and K. Asakawa, Strategies for handling normality assumptions in multilevel modeling: a case study estimating trajectories of Health Utilities Index Mark 3 scores. Health Rep, 2011. 22(4): p. 45-51; Winter, E.M., R.G. Eston, and K.L. Lamb, Statistical analyses in the physiology of exercise and kinanthropometry. J Sports Sci, 2001. 19(10): p. 761-75.]。この研究のために用いられたモデルは、免疫組織化学染色の定量化において実施される際、多数の‘相対強度単位’（レベル１）を、それぞれのマウスに関して（レベル２）、それぞれの処置に関して（レベル３）考慮する。この実施例では、ｍｄｘ未処置マウスおよびＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯで処置されたマウスを定数／固定されたパラメーターとして適用し、それに対して他の処置および野生型対照を比較した。これは正規分布を確実にするために実施されたＢｏｘ−Ｃｏｘべき乗変換に従っていた。統計分析はＭＬｗＩＮバージョン２．２５を用いて実施された。
【０１４１】
ペプチドおよびペプチド−ＰＭＯコンジュゲートの合成
ＰＭＯ配列（５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］）はＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  ＬＬＣから購入した。ペプチドは標準的な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学によりＬｉｂｅｒｔｙペプチド合成装置（ＣＥＭ）を用いて１００μｍｏｌｅスケールで合成され、標準的な逆相ＨＰＬＣにより９０％より大きい純度まで精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより特性付けられた。ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートは、２００ｎｍｏｌｅ  ＰＭＯスケールで、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基をＰＭＯの３’末端の第二級アミンに結合させることによるアミド結合により調製された（図１ｃ）。ペプチド（ＰＭＯに対して２．５倍モル過剰量）のＣ末端カルボン酸を、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中で２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を用いて、ペプチドに対してＨＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡ（２．３：２．０：２．３）モル過剰量を用いて活性化した。その混合物をＤＭＳＯ中で溶解させたＰＭＯ（１０ｍＭ）の溶液に添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。次いでその混合物を４倍過剰量の水で希釈し、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ  ６−ｍｌカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でリン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ：２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５％アセトニトリル、ｐＨ７．０）、緩衝液Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５％アセトニトリル、ｐＨ７．０）、４ｍｌ／分の流速および２５分間で０〜７５％緩衝液Ｂの勾配を用いて精製してコンジュゲートしなかったＰＭＯおよび過剰なペプチドを除去した。次いでそのコンジュゲートをＯａｓｉｓ  ＨＬＢカラム（４．６ｍｍ×２０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）上にロードし、水で洗浄して塩類を除去し、６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶離した。そのコンジュゲートを凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより、およびＨＰＬＣにより分析した（図３７）。ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートを使用前に滅菌水中で溶解させ、０．２２μｍセルロースアセテート膜を通して濾過した。全体の収率は、ＰＭＯに基づいて２０〜２５％であった。
【０１４２】
ペプチド−ＰＭＯ合成のスケールアップ
コンジュゲーションは、ＨＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡに関して上記で記述した比率と同じ比率を保って、出発するＰＭＯの１０００ナノモルスケールにおいて向上した。コンジュゲーション反応をマイクロ波オーブン（ＣＥＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）を用いて実施し、反応の温度を６５℃に上げ、これは反応時間の１５分への減少をもたらした。重要な精製工程もこのプロセスで向上した。粗反応混合物をＨＰＬＣにより、より大きいイオン交換カラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＨＲ１６／１０、ベッド体積１８ｍｌ）を用いて精製し、過剰なペプチドおよびコンジュゲートしなかったＰＭＯを除去し、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、１．０Ｍ）の溶液を用いて溶離して、ペプチド−ＰＭＯの塩化物塩を得た。脱塩工程を用いて、特別注文のＯａｓｉｓ  ＨＬＢ脱塩カラム（Ｗａｔｅｒｓ、１９×３０ｍｍ）上で過剰なＮａＣｌを除去した。そのカラムを（ＨＰＬＣグレードの水の代わりに）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅグレードの水を用いて１０分間洗浄した後、ＰＰＭＯを水中６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶離した。５００ナノモルを１回の注入で用いて、収率は多数回の注入（例えば２×２５０ｎｍｏｌ）を用いるよりも高かった。これは結果としてこのワンポットコンジュゲーション反応の収率におけるおおよそ４０％までの増大をもたらした。
【０１４３】
論考
重篤に衰弱させる神経筋障害であるＤＭＤに関する今までで最も有望な療法はＡＯを用いた処置であり、それはジストロフィンのプレｍＲＮＡの読み枠をエキソンスキッピングにより修復する。２種類のＡＯ、ＰＭＯ[Cirak, S., et al., Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an openlabel, phase 2, dose-escalation study. Lancet, 2011. 378(9791): p. 595-605; Miller, F., C.F. Moseley, and J. Koreska, Spinal fusion in Duchenne muscular dystrophy. Dev Med Child Neurol, 1992. 34(9): p. 775-86.]および２’ＯＭｅオリゴヌクレオチド[van Deutekom, J.C., et al., Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med, 2007. 357(26): p. 2677-86; Goemans, N.M., et al., Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2011. 364(16): p. 1513-22.]は現在臨床試験中であり、早期の有望な結果がＤＭＤ患者に関する希望を増大させてきた。しかし、非常に高い用量のそのままのＰＭＯのｍｄｘマウス中への投与を含む研究は、体の広い範囲の骨格筋におけるごく部分的なジストロフィンの修復および心臓における無視できるほどの修正を示してきた[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(2): p. 345-54; Malerba, A., et al., Dosing regimen has a significant impact on the efficiency of morpholino oligomer-induced exon skipping in mdx mice. Hum Gene Ther, 2009. 20(9): p. 955-65.]。心臓においてジストロフィンを修正する必要性は、骨格の表現型の修正が結果として心臓の作業負荷における増大をもたらし、そうして心筋症のさらなる進行をもたらした研究[Malerba, A., L. Boldrin, and G. Dickson, Long-term systemic administration of unconjugated morpholino oligomers for therapeutic expression of dystrophin by exon skipping in skeletal muscle: implications for cardiac muscle integrity. Nucleic Acid Ther, 2011.21(4): p. 293-8; Townsend, D., et al., Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther, 2008. 16(5): p. 832-5.]を受けて、今まで以上に明らかである。ＣＰＰとコンジュゲートしたＰＭＯはｍｄｘマウスにおいてそのままのＰＭＯよりもはるかにもっと有効なジストロフィン修正を達成することができるという発見は、細胞およびインビボ送達を向上することによる高められたＡＯの有効性に関する新たな有望性をもたらしてきた。
【０１４４】
我々は以前に、１回の２５ｍｇ／ｋｇの投与後に心臓を含む全ての筋タイプにおいてジストロフィンタンパク質を高いレベルまで修復することができる有望なペプチド−ＰＭＯ候補Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯを報告した[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(7): p. 1295-303.]。アルギニンに富む配列に加えて、Ｐｉｐペプチドは以前のＢ−ペプチドリードには存在しない５−ａａの疎水性区間を含有し[Perez, F., et al., Antennapedia homeobox as a signal for the cellular internalization and nuclear addressing of a small exogenous peptide. J Cell Sci, 1992. 102(Pt 4): p. 717-22.]、それがおそらく向上した心臓活性の原因であるように思われる。そのＰｉｐ６系列は、心臓ジストロフィン産生に必要とされる疎水性コアの側面を明らかにする、およびまた、さらにもっと有効なＰｉｐ−ＰＭＯコンジュゲートを同定する試みにおいて、Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯの誘導体として開発された。適度な１回量の投与計画を用いる我々の研究は、いくつかの驚くべき結果をもたらしてきた。
【０１４５】
重要な発見は、疎水性コア領域の５アミノ酸長の維持は優れた心臓ジストロフィン産生に必須であることである。コア中に連続的なアミノ酸欠失を有するＰｉｐ６ｃ−ＰＭＯおよびＰｉｐ６ｄ−ＰＭＯに関する心臓における減少したジストロフィン修復の効率は、結果としてもたらされるより低い疎水性およびそれ故に低減した細胞に入る能力と相関している可能性があると想像するかもしれない[Gupta, A., et al., Hydrophobicity drives the cellular uptake of short cationic peptide ligands. Eur Biophys J, 2011. 40(6): p. 727-36.]。しかし、インビトロでの結果は、これらのコンストラクトの全てが、それらは全て筋細胞において完全にエキソンスキッピングすることができるため、細胞に入ることができることを示唆していると考えられる。従って、５−ａａの疎水性コアの長さは、インビボでの心臓送達に不可欠な異なるパラメーターに影響を及ぼしているにちがいない。蛍光標識されたＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯのＢ−ＰＭＯと比較して増進された全心臓薄片中への取り込みは、むしろ別の障壁（例えば心臓の内皮の裏層）の横断（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）が向上していることを示唆した[Yin, H., et al., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): p. 3909-18.]。さらなる心臓の研究が、この問題に取り組むのを助け得るＰｉｐ６−ＰＭＯを用いて続けられている。より驚くべきことは、おそらく、Ｐｉｐ６ｃ−ＰＭＯおよびＰｉｐ６ｄ−ＰＭＯに関して他の筋タイプにおけるジストロフィン産生のいくらかの喪失もあったことである。これは、ＣＰＰ中の疎水性および陽イオン性残基の疎水性／陽イオン性バランスおよび／または正確な間隔はインビボでの送達のパラメーターにより微妙な作用を及ぼしていることを示唆している。Ｐｉｐ６−ＰＭＯ類似体から生じた別の明確な結論は、疎水性コア内の疎水性残基の特定の順序は、反転した配列（Ｐｉｐ６ａ）、等しく疎水性の残基の単一の置換（Ｐｉｐ６ｂ）、および混ぜられた配列（Ｐｉｐ６ｆ）は少なくともＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯと同じくらい有効であり、心臓および一部の筋群ではより効率的であった（図３８）ため、心臓ジストロフィン産生の維持において重要性がより低いことである。
【０１４６】
これらの結果は、Ｐｉｐペプチドの疎水性コアが心組織を透過するのに必要な膜障壁中の特異的な受容体を認識する特定のアミノ酸配列を含有していることはなさそうであり、代わりにそのコアはある種の疎水性スペーサーの役目を果たしていることの証拠を提供する。
【０１４７】
しかし、最も驚くべきことは、ウェスタンおよびｑＲＴ−ＰＣＲの結果により示されるように、Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯが心筋においていくらかのジストロフィンスプライシングおよびタンパク質修復を誘導したことである（注釈：免疫免疫組織化学染色の定量化では有意に異なっていない）。Ｐｉｐ−６ｅペプチドにおいて、１個のアルギニン残基が疎水性コア中に移動しており、それは結果としてそのコアに隣接する疎水性Ｘ残基の整列ももたらす（Ｘ−ＹＲＦＬＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１６］）。ここで陽イオン性アミノ酸（アルギニン）がコア中に含まれているため、このコンジュゲートでは心臓ジストロフィン産生が完全に失われていると予想したかもしれない。対照的に、そのような心臓活性はＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯ（Ｘ−ＩＬＦＲＹコア［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１７］）および二重アルギニンコアコンジュゲートＰｉｐ６ｇ−ＰＭＯ（ＸＹＲＦＲＬＩ−Ｘコア［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１８］）に関しては失われた。意外にも、ジストロフィン産生はＰｉｐ６ｇ−およびＰｉｐ６ｈ−ＰＭＯの両方に関して四頭筋および横隔膜においても失われた。Ｐｉｐ６ｅ、Ｐｉｐ６ｇおよびＰｉｐ６ｈに関する活性の結果内の予想外の不一致、ならびにＰｉｐ６ｃ−およびＰｉｐ６ｄ−ＰＭＯに関する活性の喪失は、おそらく、外側の疎水性アミノ酸スペーサー（ＸおよびＢ）および内側の疎水性コア残基両方に関するＰｉｐペプチド内のアルギニン残基の正確な間隔がそれぞれのコンジュゲートの薬理学的特性を劇的に変化させる可能性があるという認識により、最もよく説明される。これは、陽イオン性／疎水性バランスにおける変化によってだけでなく、代わりにそのＰｉｐ６−ＰＭＯの二次または三次構造の変化によっても起こっている可能性があり、それが今度は血清タンパク質の結合もしくは循環での半減期を変化させる別のパラメーターに影響を及ぼす可能性があり、またはそれが筋組織を透過するために必要な障壁を越える能力に影響を及ぼす可能性がある。
【０１４８】
いくつかのコンジュゲート（Ｐｉｐ６ａ、Ｐｉｐ６ｂおよびＰｉｐ６ｆ−ＰＭＯ）は、前の候補であるＰｉｐ５ｅ−ＰＭＯのジストロフィン産生活性さえも超える有望なジストロフィン産生活性を示している。興味深いことに、５−ａａ  Ｐｉｐ６−ＰＭＯ処置の１つ（Ｐｉｐ６ｅ−ＰＭＯ）からの血清試料の分析は、１回の１２．５ｍｇ／ｋｇの投与後に、３種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６）の野生型レベル付近までの部分的な正常化を示した[Thomas C. Roberts, K.E.M.B., Graham McClorey, Samir EL Andaloussi, Caroline Godfrey, Corinne Betts, Thibault Coursindel, Michael J. Gait, and C.I.E.S.a.M.J.A. Wood, Expression analysis in multiple muscle groups and serum reveals complexity in the microRNA transcriptome of the mdx mouse with implications for therapy. Nucleic Acid Ther, 2012]。これは、Ｐｉｐ６−ＰＭＯに関して、それは最適なペプチドであるとは考えられないであろうが、なおこの群のペプチドの有意な療法的作用を実証しているため、大いに有望である。これらの新規のリードは、筋肉および心臓機能の詳細な生理学的研究に適したＰｉｐ−ＰＭＯ候補の同定ならびに１つのそのようなＰｉｐ−ＰＭＯが臨床試験へと進むであろうことを予想した用量の段階的増大の研究を含む完全な毒性プロファイリングのための優れた基礎を提供する。
【０１４９】
実施例２−ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートの合成
そのＰＭＯ配列（５’−ＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ−３’）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０］はＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣから購入した。ペプチドは標準的な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学により社内で合成され、９０％より大きい純度まで精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより特性付けられた。ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートは、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基をＰＭＯの３’末端の第二級アミンに結合させることによるアミド結合により調製された（図３３）。しかし、我々はペプチド−ＰＭＯのコンジュゲーションおよび最後の精製に関して以下のことを含むいくつかの改変を行った：ａ）（１５μｍｏｌのＰＭＯに至るまでの）大規模コンジュゲーション反応、ｂ）ペプチド−ＰＭＯの個々の構成要素からの精製のためのより大規模なイオン交換カラムの使用（表１）、およびｃ）脱塩に関する、以前に用いられた逆相ＨＰＬＣカラムの代わりのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置の使用。結果として、収率は二倍より大きくなり、ＰＭＯ配列に基づいてルーチン的に４０〜５５％であった。
【０１５０】
【表１−１】
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【０１５１】
【表１−２】
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【０１５２】
ペプチド（ＰＭＯに対して２．５倍モル過剰量）のＣ末端カルボン酸を、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中で２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を用いて、ペプチドに対してＨＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡ（２．３：２．０：２．３）モル過剰量を用いて活性化した（表２）。ペプチドの濃度は１００ｍＭであった。混合した後、その混合物をＰＭＯのＤＭＳＯ溶液（１０ｍＭ）に２．５：１のモル比で添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。次いでその混合物を、大きい陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ  ２００−ｍｌカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、リン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ：２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５％アセトニトリル、ｐＨ７．０）、緩衝液Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５％アセトニトリル、ｐＨ７．０）、１４ｍｌ／分の流速および６０分間で０〜１００％緩衝液Ｂの勾配を用いて精製してコンジュゲートしなかったＰＭＯおよび過剰なペプチドを除去した。
【０１５３】
【表２】
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【０１５４】
次いでそのコンジュゲートを３ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてその試料を濃縮する（ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｎｇ）（２５℃で３２２０ｒｃｆにおける１時間の遠心分離）ことにより脱塩し、次いでその濃縮物をＨ２Ｏで１２ｍｌに希釈した。そのプロセスを２回繰り返した。そのコンジュゲートを凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＨＰＬＣにより分析した。ペプチド−ＰＭＯコンジュゲートを使用前に（内毒素を含まない）滅菌水中で溶解させ、０．２２μｍセルロースアセテート膜を通して濾過した。濃度を、０．１Ｎ  ＨＣｌ中で２６５ｎｍの紫外線により、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓからのデータシートにおいて提供された通りのＰＭＯの吸光係数を用いて測定した。
【０１５５】
実施例３−Ｐｉｐ７〜９ペプチド
インビトロでのＰｉｐ７〜９−ＰＭＯの毒性評価
Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯの毒性試験を細胞生存度アッセイを用いて行った。これらは、１０アルギニン−ＰＭＯコンジュゲート（Ｐｉｐ６ｅ）は高レベルの細胞毒性を有することを示した（図４２）。従って、可能性のある細胞毒性を最小限にするために、アルギニンおよびアミノヘキシル（アミノヘキサン酸）残基の数を減らすことにより、Ｐｉｐ６ａ（Ｐｉｐ８系列）、Ｐｉｐ６ｅ（Ｐｉｐ７系列）およびＰｉｐ６ｆ（Ｐｉｐ９系列）を親ペプチドとして用いて、Ｐｉｐ７〜９系列を合成した。細胞生存度はＰｉｐ７〜９−ＰＭＯで処置されたｍｄｘ筋管においてＰｉｐ６ｅで処置された細胞と比較して実質的に増大し（図４２）、これはそれに続くインビボでの試験に関する有望性を示唆している。
【０１５６】
Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯの１回の静脈内注射は結果としてｍｄｘの骨格筋／周辺の筋肉における広範囲に及ぶジストロフィン発現をもたらす
Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯ化合物のエキソンスキッピング効率を評価するため、８週齢のｍｄｘマウスに１２．５ｍｇ／ｋｇのＰｉｐ７〜９−ＰＭＯを静脈内注射した。注射の２週間後に、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、四頭筋および心筋においてジストロフィン発現を分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたｍＲＮＡおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した（図２〜４）。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの比率として表した（図５）。エキソンスキッピングされたジストロフィン陽性筋線維の顕著な発現が、Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯを注射された骨格筋、例えばＴＡ、四頭筋および横隔膜筋の全てにおいて、注射の２週間後に観察された（図４３〜４６）。しかし、Ｐｉｐ８ｂ、Ｐｉｐ８ｃ、Ｐｉｐ９ｂ、Ｐｉｐ９ｂ２およびＰｉｐ９ｃのみが心臓において有意なジストロフィン発現を与えた（図４６）。Ｐｉｐ７ａ、Ｐｉｐ７ｂ、Ｐｉｐ７ｂ２、Ｐｉｐ８ｃ２、Ｐｉｐ９ｄおよびＰｉｐ９ｄ２は結果として心臓において無視できる程度のジストロフィン産生をもたらした（図４６）。そのペプチドの構造を考慮すると、Ｐｉｐ９系列の混ぜられた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）疎水性コアでさえも心臓においてＰｉｐ８系列と類似したジストロフィン発現をもたらしたため、疎水性コア領域中のアミノ酸の順序は重要性がより低いことは明らかである。
【０１５７】
Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯの全身投与後の毒性学的評価
Ｐｉｐ７〜９−ＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスにおける毒性応答を評価するため、我々は処置されたマウスおよび対照から血清を抽出して分析することによりＰｉｐ７〜９−ＰＭＯ化合物の全身投与の２週間後に肝および腎機能の予備的評価を行っている。血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルの分析を実施した。ＰＰＭＯで処置されたｍｄｘの血清において、未処置のｍｄｘの対照と比較して、腎毒性に関するマーカーである尿素およびクレアチニンならびに肝毒性に関するマーカーであるＴＢＩＬのレベルにおける上昇はなかった（図４７）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰおよびＬＤＨのレベルは未処置のｍｄｘマウスにおいて上昇した。ＰＰＭＯで処置されたｍｄｘの血清において、未処置のｍｄｘの対照と比較して、これらのマーカーのレベルにおける上昇はなかった。ＣＫレベルはマウス間で変動性があった。
【０１５８】
ｍｄｘマウスにおけるリードＰＰＭＯ（エキソン２３マウス）のさらなる同定
我々はｍｄｘマウスにおいて骨格筋および心筋の両方で高レベルのジストロフィン修復を与えるＰＰＭＯを同定してきた。Ｐｉｐ８ｂ、９ｂ、９ｂ２、８ｃおよび９ｃは、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、四頭筋および心臓における明白な毒性を伴わない非常に効率的なジストロフィン修復により重要な有望性を示してきた。
【０１５９】
リードＰＰＭＯのエキソンスキッピング効率を比較するため、８週齢のｍｄｘマウスに１２．５ｍｇ／ｋｇのＰＰＭＯを静脈内注射した。注射の２週間後、ジストロフィン発現をＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋において分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたｍＲＮＡおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した（図４８〜５０）。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの比率として表した（図４８）。エキソンスキッピングされたジストロフィンＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、Ｐｉｐ８ｂ、９ｂおよびＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯを注射された骨格筋、例えばＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋において、注射の２週間後に顕著に発現していた（図４９〜５０）。しかし、Ｐｉｐ８ｃおよび９ｃ−ＰＭＯはＰｉｐ８ｂ、９ｂおよびＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯと比較して低減したジストロフィン発現を与えた。さらに、Ｐｉｐ９ｄ２−ＰＭＯは結果としてＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋において無視できるほどのジストロフィン産生をもたらし（図４８〜５０）、これは効率的なエキソンスキッピングを誘導するためにそのペプチドの疎水性領域の長さを維持することの重要性を説明している。
【０１６０】
ＰＰＭＯで処置されたｍｄｘの筋肉におけるジストロフィンタンパク質レベルをウェスタンブロット分析により定量化した。ジストロフィンのバンドの密度をＬｉｃｏｒソフトウェアを用いて定量化し、ビンキュリンをロード対照として用いた。そのバンド密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。エキソンスキッピングされたジストロフィンタンパク質のレベルは、Ｐｉｐ８ｂ、９ｂおよびＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯを注射された骨格筋、例えばＴＡ、四頭筋および横隔膜筋において、注射の２週間後において類似していた（図５０）。しかし、Ｐｉｐ８ｃおよび９ｃは８ｂ、９ｂおよび９ｂ２−ＰＭＯと比較して低減したジストロフィン発現を与えた。さらに、９ｄ２−ＰＭＯは結果としてＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋において無視できるほどのジストロフィン産生をもたらした（図５０）。
【０１６１】
リードＰＰＭＯ（エキソン２３マウス）で処置されたｍｄｘマウスにおける調節不全のマイクロＲＮＡレベルの修復
我々は、ＰＰＭＯ候補により誘導されるエキソンスキッピングされたジストロフィンの、ｍｄｘマウスにおいて筋病理を改善することによりマイクロＲＮＡレベルを修正する能力を試験した。我々はジストロｍｉｒ（ジストロフィン欠損症において調節不全になっているマイクロＲＮＡ）、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３ａのレベルを評価し、それはｍｄｘの血清中で増大しており、かつｍｄｘの組織中で減少しているか変化していないかのどちらかであり、従ってこれらは有用な血清マーカーを構成し得る。８週齢のｍｄｘマウスにおける１２．５ｍｇ／ｋｇのＰＰＭＯ（Ｐｉｐ８ｂ、９ｂ、９ｂ２、８ｃおよび９ｃ）の静脈内注射の２週間後に、ＰＰＭＯで処置された血清においてｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６のレベルを定量的（Ｑ）−ＰＣＲにより調べ、参照マイクロＲＮＡとしてのｍｉＲ−２２３に対して正規化した。ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６のレベルはＰＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスの血清中で未処置のｍｄｘ対照と比較して有意に下方制御されており、これは筋病理がＰＰＭＯにより改善されたことを暗示している（図５１）。
【０１６２】
ＰＰＭＯ合成の向上
ＨＰＬＣおよびフィルター脱塩した９ｂ２−ＰＭＯのエキソンスキッピング効率を比較するため、８週齢のｍｄｘマウスに１２．５ｍｇ／ｋｇのＰＰＭＯを静脈内注射した。注射の２週間後に、ジストロフィン発現をＴＡ、四頭筋、横隔膜および心筋において分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたｍＲＮＡおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した（図５２〜５４）。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをＣ５７ＢＬ／１０の筋肉の強度レベルの比率として表した（図５２）。ＨＰＬＣおよびフィルター脱塩した９ｂ２−ＰＭＯにより誘導された筋線維膜において、エキソンスキッピングされたジストロフィンの強度レベルには変化はなかった。エキソンスキッピングされたジストロフィンＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、フィルター脱塩したＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯを注射された骨格筋において、ＨＰＬＣ濾過されたＰＭＯで処置された筋肉、例えばＴＡ、四頭筋および横隔膜と比較して、注射の２週間後においてわずかに増大していた（図５３）。
【０１６３】
Ｐｉｐ９ｂ２−ＰＭＯの培養されたｍｄｘマウス筋管における毒性評価
ＨＰＬＣおよびフィルター脱塩したＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯの毒性試験を、細胞生存度アッセイを用いて行った。細胞生存度は、それらを６０μＭのＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯを用いて処理した際に、フィルター脱塩したＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯで処理したｍｄｘ筋管において、ＨＰＬＣ脱塩したＰｉｐ９ｂ２−ＰＭＯで処理した細胞と比較してわずかに増大していた（図５４）。
【０１６４】
要約
ｍｄｘマウスにおいて骨格筋および心筋の両方において高レベルのジストロフィン修復を与えるＰＰＭＯ候補を同定してきた。特に、Ｐｉｐ８ｂおよび９ｂならびにＰｉｐ９ｂ２、８ｃおよび９ｃは前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、四頭筋および心臓における明白な毒性を伴わない効率的なジストロフィン修復を示している。
【０１６５】
インビボでのＤＭＤ処置の定量的評価に関して、ｍｄｘの血清中で増大しているジストロｍｉｒ（ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６）のレベルを評価してきた。ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−２０６のレベルは、ＰＰＭＯで処置されたｍｄｘマウスの血清において、未処置のｍｄｘ対照と比較して有意に下方制御されていた。
【０１６６】
実施例４−細胞生存度（Ｐｉｐ７およびＰｉｐ８系列）
Ｐｉｐ７およびＰｉｐ８系列のペプチドを、以下のように細胞生存度アッセイにおいて試験した。Ｈｕｈ−７肝細胞を、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下において１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補ったＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、９６ウェルプレート中にウェルあたり１．５×１０４細胞で蒔いた。一夜培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中のＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートをそのウェルに３通りで添加した。４時間のインキュベーション後、培地を１００μｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで置き換えることによりコンジュゲートを除去し、さらに２０時間培養した。２０μｌのＭＴＳ細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を１００μｌのＤＭＥＭを含有するウェルに添加し、プレートを１〜２時間インキュベーションした後、４９０ｎｍでのＵＶ測定を行った。細胞生存度の百分率を、３通りの試料の平均吸光度を未処置の試料の平均値に対して正規化することにより決定した。
【０１６７】
示した結果（図５７〜５８）は、より少ないアルギニン残基を含有するペプチドの増大した細胞生存度（すなわちより低い細胞毒性）と一致している。例えば、ドメイン１〜３を合わせた中に合計７個のアルギニン残基を有するペプチドは、８または９個のアルギニン残基を有するペプチドよりも高い細胞生存度（より低い細胞毒性）を示した。
【０１６８】
実施例５−インビトロアッセイ：ｍｄｘマウス筋管におけるエキソンスキッピング；Ｐｉｐ７、Ｐｉｐ８およびＰｉｐ９系列
以前に記述された方法[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303.]により、Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ筋管を調製し、０．１２５、０．２５、０．５、１．０および２．０μＭの濃度のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートと共に一切の形質移入試薬の非存在下でインキュベーションした。単離されたＲＮＡ全体からのネステッドＲＴ−ＰＣＲの産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Δ２３転写産物レベルの定量化をデンシトメトリーを用いて計算した。
【０１６９】
その結果（図５９〜６１）は、Ｐｉｐ７ａ、Ｐｉｐ７ｂ、Ｐｉｐ７ｂ２、Ｐｉｐ７ｃ、Ｐｉｐ７ｃ２、Ｐｉｐ８ａ、Ｐｉｐ８ｂ、Ｐｉｐ８ｃ、Ｐｉｐ８ｃ２、Ｐｉｐ８ｄ、Ｐｉｐ９ｂ、Ｐｉｐ９ｂ２、Ｐｉｐ９ｃ、ｐｉｐ９ｃ２、Ｐｉｐ９ｃ３、ｐｉｐ９ｄおよびＰｉｐ９ｄ２  ＰＭＯコンジュゲートはｍｄｘ筋細胞において高いエキソンスキッピング活性を与えたことを示している。
【０１７０】
参考文献
【０１７１】
【化１】
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【０１７２】
【化２】
2014526238.tif 000006
【図１８】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【国際調査報告】
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