(57)【要約】  熱安定性真菌セルラーゼ酵素であるＥＧＶ、並びにこのセルラーゼの発現のためにヌクレオチドの破壊若しくは欠失を含むか、又は本質的に破壊若しくは欠失からなる修飾を有し、これによってＥＧＶの発現が防止される、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞に関する組成物及び方法が説明される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞であって、
トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞による熱安定性エンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）の生成を実質的に低減又は防止する、修飾と、
プロモーターに操作可能に連結した所望のポリペプチドをコードする、所望の外因性核酸分子とを含み、少なくとも１つの内因性ポリペプチド及び前記所望のポリペプチドがそれぞれ、前記トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞によってインビボで発現される、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項２】
前記修飾が、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失又は破壊を含む、請求項１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項３】
前記破壊又は欠失が、ＥＧＶ発現をコードする遺伝子の、ＥＧＶ発現のためのコーディング領域の、又はＥＧＶ発現のための前記プロモーター若しくは調節エレメントの、欠失又は破壊を含む、請求項２に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項４】
前記欠失又は破壊が、ｅｇｌ５の欠失又は破壊を含む、請求項３に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項５】
前記欠失又は破壊が、ｅｇｌ５の破壊を含む、請求項４に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項６】
前記欠失又は破壊が、ｅｇｌ５の欠失を含む、請求項４に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項７】
ｅｇｌ５が、相同組み換えによって欠失される、請求項６に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項８】
前記内因性ポリペプチドが、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項９】
熱不安定性酵素が、セルラーゼ又はヘミセルラーゼを含む、請求項８に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項１０】
前記トリコデルマ（Trichoderma）が、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）である、請求項１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項１１】
前記所望のポリペプチドが、ヒドロホビンＩＩである、請求項１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項１２】
前記所望のポリペプチドが、ヒドロホビンＩＩである、請求項１０に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項１３】
前記所望のポリペプチドが、熱安定性である、請求項１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項１４】
前記所望のポリペプチドが、感熱性又は熱不安定性である、請求項１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で、熱安定性である前記所望のポリペプチドを作製するための方法であって、当該方法は、
前記修飾された宿主細胞が前記所望の熱安定性ポリペプチド及び前記内因性ポリペプチドを生成するのに適した培地内で、前記修飾された宿主細胞をインキュベートし、これによって、前記内因性ポリペプチド及び前記所望の熱安定性ポリペプチドのそれぞれが、前記修飾された宿主細胞によって発現されることと、
前記所望の熱安定性ポリペプチド及び前記内因性ポリペプチドを昇温状態にさらすこととを含み、
前記昇温状態が、前記内因性ポリペプチドを実質的に不活性化するのに十分であるが、前記所望の熱安定性ポリペプチド及び存在するならばＥＧＶを不活性化するには不十分であり、
これによって前記所望の熱安定性ポリペプチドが、前記内因性ポリペプチドからの活性の実質的に非存在下で、活性形態又は機能的形態で生成される、方法。
【請求項１６】
前記所望のポリペプチド及び前記内因性ポリペプチドを前記昇温状態にさらす工程の前に、前記修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞からタンパク質混合物を単離することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾された宿主細胞が、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、又はこれらの組合せを発現する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記所望の熱安定性ポリペプチドは、可逆的な熱変性が可能である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記昇温状態が、約９０℃以上の温度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記昇温状態への暴露が、約５分以上の時間の間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記昇温状態への暴露が、約６０分以上の時間の間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞によって発現した、感熱性又は熱不安定性である前記所望のポリペプチドの活性を制御するための方法であって、当該方法は、前記所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチド及び前記内因性ポリペプチドを昇温状態にさらすことを含み、
前記昇温状態が、前記内因性ポリペプチド及び前記感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを不活性化するのに十分である、方法。
【請求項２３】
前記内因性ポリペプチドが、セルラーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを前記昇温状態にさらす前に、前記所望のポリペプチドを、前記所望のポリペプチドが作用する化合物と接触させることを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを前記昇温状態にさらす前に、前記所望のポリペプチドを、前記セルラーゼ及び前記所望のポリペプチドが作用する１つ以上の化合物と接触させることを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
糸状菌宿主細胞から得られた又は得ることができ、かつヒドロホビンＩＩを含む発酵ブロス組成物であって、当該発酵ブロスがセルラーゼ活性及び／又はマンナナーゼ活性を実質的に含まず、かつ前記ヒドロホビンＩＩが請求項１１又は１２のいずれか一項に記載の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で生成される、発酵ブロス組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）から得られた又は得ることができる、発酵ブロス組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発酵ブロスにおける前記所望のポリペプチド活性を制御する方法であって、前記所望のポリペプチドが感熱性又は熱不安定性であり、当該方法は、前記発酵ブロスを前記内因性ポリペプチド及び前記感熱性又は熱不安定性のポリペプチドを不活性化するのに十分な昇温状態に曝すことを含む、方法。
【請求項２９】
前記内因性ポリペプチドが、セルラーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発酵ブロスを前記昇温状態に曝す前に、前記発酵ブロスを前記所望のポリペプチドが作用する所望の化合物と接触させることを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記発酵ブロスを前記昇温状態に曝す前に、前記発酵ブロスを、前記セルラーゼ及び前記所望のポリペプチドが作用する１つ以上の化合物と接触させることを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られる組成物内に存在するセルラーゼの活性を制御するための方法であって、前記組成物がＥＧＶ以外の少なくとも１つのセルラーゼ酵素を含み、当該方法は前記組成物を前記所望のポリペプチドを不活性化するのに十分な昇温状態に曝すことを含み、かつ前記組成物を昇温状態に曝した後では、前記組成物はセルラーゼ活性が実質的に認められない、方法。
【請求項３３】
前記所望のポリペプチドが、感熱性又は熱不安定性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記所望のポリペプチドが、耐熱性又は熱安定性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物を昇温状態に曝すことが、食品又は飲料において行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記昇温状態が、約１００℃未満である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られる前記組成物が、ヒドロホビンを含む発酵ブロスである、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年１０月２０日に出願された米国特許仮出願シリアル番号第６１／３９４，９４６号、及び２０１０年１０月２０日に出願された欧州特許出願第１０１８８２８５．０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
前述の出願、並びにそこに又はそれらの審査中に引用されるすべての文書（「出願引用文献」）及びその出願引用文献において引用又は参照されるすべての文書、そして本明細書において引用又は参照されるすべての文書（「本明細書で引用される文書」）及び本明細書で引用される文書において引用又は参照されるすべての文書は、本明細書若しくは参照することにより本明細書に援用される任意の文書において言及される任意の製品の任意の製造者の指示、説明、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照することにより本明細書に援用され、発明の実施において用いられてもよい。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、破壊若しくは欠失を含むか、又は本質的にそれからなる修飾を有し、これによって熱安定性真菌セルラーゼ酵素（例えば、エンドグルカナーゼＶ（endoglucanase V（ＥＧＶ）））の発現が防止又は低減される、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞）であって、例えば、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失若しくは破壊、例えば、このセルラーゼの発現をコードする遺伝子、そのためのコード領域、又はそのためのプロモーター若しくは調節エレメントの破壊若しくは欠失を含むか、又は本質的にそれからなる修飾を有する、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞）に関する。そのような宿主細胞は、不必要なセルラーゼ活性を含まない熱安定性ポリペプチドを発現するために特に有用である。本発明は、有利に、所望のタンパク質をコードする外因性核酸分子、例えば、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）をコードする核酸分子を含み、かつ発現し、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドの１つ以上の欠失若しくは破壊を含むか又は本質的にそれからなる修飾を有し、これによって所望のタンパク質（例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビン）が、ＥＧＶ発現を防止若しくは低減させて発現される、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））に関する。例えば、トリコデルマ（Trichoderma）修飾は、ｅｇｌ５の欠失又は破壊から本質的になり得る。
【背景技術】
【０００４】
セルロース及びヘミセルロースは、光合成によって生成される最も豊富な植物材料である。それらは分解され、多数の微生物（例えば、細菌、酵母、及び菌類）によってエネルギー源として使用され得、単糖類に対するポリマー基質の加水分解が可能な細胞外酵素を生成する（Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４３０９〜１４）。
【０００５】
セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成をもたらす酵素である。セルラーゼは、伝統的に３つの主なクラスに分類されている：エンドグルカナーゼ（endoglucanase）（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ（exoglucanase）、又はセロビオヒドロラーゼ（cellobiohydrolase）（ＥＣ  ３．２．１．９１；「ＣＢＨ」）及びβ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（β-D-glucoside glucohydrolase）；ＥＣ  ３．２．１．２１；「ＢＧ」）（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５〜６１、及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：２３４〜４３）。エンドグルカナーゼ（endoglucanase）は、主にセルロース繊維の非晶質部分に作用し、低結晶化度の領域において、内部β−１，４−グルコシド結合を加水分解する。セロビオヒドロラーゼ（cellobiohydrolase）は、セルロースの還元性又は非還元性末端からセロビオースを加水分解し、結晶性セルロースを分解することができる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｔｔｉｌａ（１９９５）Ｍｙｃｏｔａ  ３０３〜３１９）。セルラーゼ系におけるセロビオヒドロラーゼ（cellobiohydrolase）（ＣＢＨ）の存在は、結晶性セルロースの効率的な可溶化に必要であると考えられる（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ７：１８９〜２０９）。β−グルコシダーゼ（β-glucosidase）は、セロビオース、セロオリゴ糖、及び他のグルコシドからＤ−グルコース単位を解放するように作用する（Ｆｒｅｅｒ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９３３７〜４２）。β−グルコシダーゼ（β-glucosidase）は、アルキル及び／又はアリールβ−Ｄ−グルコシド、例えば、メチル−β−Ｄ−グルコシド及びｐ−ニトロフェニルグルコシド、並びに炭水化物残基のみを含有するグリコシド、例えば、セロビオースの加水分解を触媒することも示された。
【０００６】
セルラーゼ（cellulase）は、大量の細菌、酵母、及び菌類によって生成されることが既知である。所定の菌類は、エキソセロビオヒドロラーゼ（exo-cellobiohydrolase）又はＣＢＨ型セルラーゼ（cellulase）、エンドグルカナーゼ（endoglucanase）又はＥＧ型セルラーゼ（cellulase）、及びβ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）又はＢＧ型セルラーゼ（cellulase）を含む、完全セルラーゼ系を生成する。他の菌類及び細菌は、ＣＢＨ型セルラーゼ（cellulase）をほとんど又はまったく発現しない。トリコデルマリーゼイ（T. reesei）（ハイポクレアジェコニア（Hypocrea jecorina）とも称される）は、２つのＣＢＨ、すなわち、ＣＢＨＩ（Ｃｅｌ７ａ）及びＣＢＨＩＩ（Ｃｅｌ６ａ）、少なくとも８つのＥＧ、すなわち、ＥＧＩ（Ｃｅｌ７ｂ）、ＥＧＩＩ（Ｃｅｌ５ａ）、ＥＧＩＩＩ（Ｃｅｌ１２ａ）、ＥＧＩＶ（Ｃｅｌ６１ａ）、ＥＧＶ（Ｃｅｌ４５ａ）、ＥＧＶＩ（Ｃｅｌ７４ａ）、ＥＧＶＩＩ（Ｃｅｌ６１ｂ）、及びＥＧＶＩＩＩ（Ｃｅｌ５ｂ）、及び少なくとも５つのＢＧ、すなわち、ＢＧ１（Ｃｅｌ３ａ）、ＢＧ２（Ｃｅｌ１ａ）、ＢＧ３（Ｃｅｌ３ｂ）、ＢＧ４（Ｃｅｌ３ｃ）、及びＢＧ５（Ｃｅｌ１ｂ）を含む、多数のセルラーゼを発現する。ＥＧＩＶ、ＥＧＶＩ、及びＥＧＶＩＩＩは、キシログルカナーゼ（xyloglucanase）活性も有する。
【０００７】
一部の例では、例えば、バイオマス変換、テキスタイル処理、紙パルプ処置等のセルラーゼ源として、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）から得られる全セルラーゼブロスを使用することが望ましい。他の例では、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）は、遺伝子操作を受けたセルラーゼ、他の有機体からのセルラーゼ、又は異なる酵素若しくは他のタンパク質全体（例えば、アミラーゼ（amylase）、プロテアーゼ（protease）、リパーゼ（lipase）、構造タンパク質等）の発現の優れた宿主有機体として機能する。特に後者の例において、内因性トリコデルマリーゼイ（T. reesei）セルラーゼの非存在下で、所望のタンパク質を発現することが望ましい場合がある。これは、内因性トリコデルマリーゼイ（T. reesei）セルラーゼ遺伝子を削除することによって達成され得るが、多数のこれらの遺伝子のために、そのようなアプローチは時間のかかる、大きな労働力を要するものとなる。
【０００８】
本出願におけるいずれの文書の言及又は識別も、そのような文書が本発明の先行技術として利用できることを承認するものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））において見出される熱安定性セルラーゼ酵素に関する組成物、例えば、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）などの所望のタンパク質を発現するように遺伝子操作された細胞を含む、修飾された細胞、及び方法を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止する修飾を含むか、又は本質的にそれからなるトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞を提供する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止する修飾を含むか、又は本質的にそれからなる、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞を提供し、修飾は、本質的に、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失又は破壊、例えば、このセルラーゼの発現をコードする遺伝子若しくはそのためのコード領域、又はそのためのプロモーター若しくは調節エレメントの欠失又は破壊からなる。
【００１２】
一実施形態において、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止する修飾を含むか、又は本質的にそれからなり、修飾は、ｅｇｌ５の欠失若しくは破壊を含むか、又は本質的にそれからなる。
【００１３】
幾つかの実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、破壊されたｅｇｌ５を含むか、又は本質的にそれからなる。
【００１４】
幾つかの実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、欠失したｅｇｌ５を含むか、又は本質的にそれからなる。
【００１５】
特定の実施形態では、ｅｇｌ５は、相同組換えによって欠失される。それはまた、相同組換えによって破壊され得る。
【００１６】
幾つかの実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、機能的ｅｇｌ５を含む、親宿主細胞を修飾することによって生成される。
【００１７】
幾つかの実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、１つ以上の内因性機能的遺伝子、若しくは熱不安定性酵素をコードすることによって熱不安定性酵素を発現させる核酸分子を含むか、又は本質的にそれらからなり、例えば、熱不安定性酵素は、セルラーゼ（cellulase）、ヘミセルラーゼ（hemi-cellulase）、プロテアーゼ（protease）、又はこれらの酵素のいずれか２つ若しくは３つすべてであり得る。幾つかの実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））は、エキソセロビオヒドロラーゼ（exo-cellobiohydrolase）、エンドグルカナーゼ（endoglucanase）、β−グルコシダーゼ（β-glucosidase）、又はこれらのタンパク質のいずれか２つ若しくは３つすべてであり得る、１つ以上の追加のタンパク質を発現させることができる。
【００１８】
幾つかの実施形態では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、所望の機能的遺伝子、又は所望のタンパク質をコードし発現を可能にするヌクレオチドを更に含む。
【００１９】
幾つかの実施形態では、所望の遺伝子がコードするか、又は所望のタンパク質が、熱安定性ポリペプチド、例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビンである。
【００２０】
別の態様では、本発明は、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞において、所望の熱安定性タンパク質を作製するための方法を提供し、所望のタンパク質がインビボで発現される条件下で、所望の熱安定性タンパク質をコードする核酸分子をトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞に導入する工程を含み、例えば、所望の核酸分子は、発現のプロモーター又は調節エレメントに動作可能に結合され、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止する修飾を含むか、又は本質的にそれからなり、その修飾は、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失又は破壊、例えば、このセルラーゼの発現をコードする遺伝子、若しくはそのためのコード領域、又はそのためのプロモーター若しくは調節エレメントから本質的になり、その修飾は、ｅｇｌ５の欠失又は破壊を含むか、又は本質的にそれからなる。所望の熱安定性タンパク質は、ヒドロホビン、例えば、ヒドロホビンＩＩであり得る。トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））は、１つ以上の追加の機能的タンパク質がインビボで発現される条件下で、追加の機能的タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子、又は追加の機能的タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を更に含むことができ、例えば、１つ以上の核酸分子は、発現のプロモーター及び／又は調節エレメントに動作可能に結合される。方法は、所望のタンパク質及び発現された追加の機能的タンパク質を発現産物に含む細胞の発現産物を、実質的に追加のタンパク質を不活性化するのに十分な昇温状態にさらす工程を更に含むことができ、昇温状態は、所望の熱安定性タンパク質を不活性化するのに不十分であって、ＥＧＶセルラーゼを不活性化するのに不十分であり、所望の熱安定性タンパク質は、追加のタンパク質からの活性の実質的に非存在下で、活性形態又は機能的形態で生成される。
【００２１】
別の態様では、発明は、所望の熱安定性タンパク質、例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビンを作製するための方法であって、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞から得られる発現産物を昇温状態にさらす工程を含む、方法を提供し、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞は、熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止する修飾を含むか、又は本質的にそれからなり、修飾は、本質的に、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失又は破壊、例えば、このセルラーゼの発現をコードする遺伝子若しくはそのためのコード領域、又はそのためのプロモーター若しくは調節エレメントの欠失又は破壊からなり、例えば、修飾は、ｅｇｌ５の欠失若しくは破壊を含むか、又は本質的にそれからなり、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））は、１つ以上の追加の機能的タンパク質がインビボで発現される条件下で、追加の機能的タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子、又は追加の機能的タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を更に含むことができ、例えば、１つ以上の核酸分子は、発現のプロモーター及び／又は調節エレメントに動作可能に結合され、昇温状態は、１つ以上の追加の機能的タンパク質を不活性化するのに十分であるが、存在するならば所望の熱安定性ポリペプチド又はＥＧＶを不活性化するには不十分であり、これによって所望の熱安定性ポリペプチドを、追加の機能的タンパク質からの活性の非存在下で、活性形態又は機能的形態で生成する。
【００２２】
前述の方法は、修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞が、所望のタンパク質、及び存在するならば追加の機能的タンパク質を生成するのに適した培地内で、修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞をインキュベートする工程を更に含むことができる。
【００２３】
前述の方法は、所望のタンパク質、及び存在するならば追加の機能的タンパク質を昇温状態にさらす工程の前に、発現産物（又はタンパク質混合物）を修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞から単離する工程を含むこともできる。
【００２４】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、ｅｇｌ５は、そうでなければ自然にｅｇｌ５を含む、宿主細胞内で破壊される。
【００２５】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、ｅｇｌ５は、そうでなければ自然にｅｇｌ５を含む、宿主細胞内で欠失される。
【００２６】
したがって、どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、破壊又は欠失されたｅｇｌ５は内因性である。
【００２７】
したがって、方法は、ｅｇｌ５を欠失若しくは破壊するか、ないしは別の方法で熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止するように、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））を修飾する工程を更に含むことができ、その修飾は、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失又は破壊、例えば、このセルラーゼの発現をコードする遺伝子若しくはそのためのコード領域、又はそのためのプロモーター若しくは調節エレメントの欠失又は破壊から本質的になる。
【００２８】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、ｅｇｌ５は、相同組換えによって欠失される。それはまた、相同組換えによって破壊され得る。
【００２９】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、１つ以上の追加のタンパク質は、熱不安定性タンパク質である。幾つかの実施形態では、１つ以上の追加のタンパク質は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、又はこれらの酵素のいずれか２つ若しくは３つすべてであり得る。幾つかの実施形態では、１つ以上の追加のタンパク質は、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、又はこれらのタンパク質のいずれか２つ若しくは３つすべてであり得る。
【００３０】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、所望のタンパク質は、可逆的に熱変性可能性であることに基づいて、熱安定性である。
【００３１】
どの方法の場合でも、特定の実施形態では、所望のタンパク質は、ヒドロホビン、例えば、ヒドロホビンＩＩである。
【００３２】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、昇温状態は、９０℃以上の温度である。有利な実施形態において、昇温状態は、約１００℃未満であってよい。
【００３３】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、昇温状態への暴露は、５分以上の時間の間である。
【００３４】
どの方法の場合でも、幾つかの実施形態では、昇温状態への暴露は、６０分以上の時間の間である。
【００３５】
なおも更なる態様では、これらの方法のいずれかによって生成される熱安定性又は可逆的に熱変性可能性のタンパク質が提供される。
【００３６】
関連態様では、発明は、糸状菌宿主細胞、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））から得られ、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）を含む発酵ブロス組成物を提供し、その発酵ブロスは、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を実質的に含まない。例えば、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を実質的に含まない発酵ブロスは、前述の方法のいずれかから得られたか、又は得ることができる。したがって、幾つかの実施形態では、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）は、熱不安定性セルラーゼ（cellulase）及び／又はマンナナーゼ（mannanase）の存在下で生成され、昇温状態にさらされてセルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドを不活性化する。
【００３７】
幾つかの実施形態では、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）は、セルラーゼ（cellulase）及び／若しくはマンナナーゼ（mannanase）の生成を実質的に低減若しくは防止する修飾を含むか、又は本質的にそれからなるトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））などの宿主細胞において生成され、その修飾は、セルラーゼ及び／若しくはマンナナーゼの発現に関与するヌクレオチドにおける１つ以上の欠失又は破壊から、例えば、セルラーゼ及び／若しくはマンナナーゼの発現をコードする遺伝子、若しくはそのためのコード領域、又はそのためのプロモーター若しくは調節エレメントの欠失又は破壊から本質的になり、これによって、ヒドロホビンを生成（及び含有）することから得られる発酵ブロスは、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を実質的に含まない。
【００３８】
幾つかの実施形態では、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）は、宿主細胞がセルラーゼ及び／若しくはマンナナーゼをコードする遺伝子又は核酸分子を欠失する修飾を含むか、又は本質的にそれからなるトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））などの宿主細胞において生成され、これによって、ヒドロホビンを生成（及び含有）することから得られる発酵ブロスは、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を実質的に含まない。
【００３９】
発酵ブロスの実施形態では、発酵ブロスは濃縮されてよく、セルラーゼ（cellulase）及び／又はマンナナーゼ（mannanase）以外の任意の数の宿主細胞タンパク質を更に含んでもよい。
【００４０】
本発明の実施形態のいずれかでは、所望のポリペプチドは、熱安定性、感熱性、又は熱不安定性であり得る。
【００４１】
本発明はまた、本発明の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞によって発現される所望のポリペプチドの活性を制御することに関し、所望のポリペプチドは、感熱性又は熱不安定性であり、該方法は、所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチド及び内因性ポリペプチドを昇温状態にさらす工程を含んでよく、その昇温状態は、内因性ポリペプチド及び感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを不活性化するのに十分であり得る。有利な実施形態では、内因性ポリペプチドは、セルラーゼであってよい。方法は、所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを昇温状態にさらす前に、所望のポリペプチドを、所望のポリペプチドが作用する化合物と接触させる工程を更に含み得る。方法は、所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを昇温状態にさらす前に、所望のポリペプチドを、セルラーゼ及び所望のポリペプチドが作用する１つ以上の化合物と接触させる工程を更に含んでもよい。
【００４２】
本発明の方法はまた、本発明の発酵ブロスにおける所望のポリペプチドの活性を制御するための方法に関し、その所望のポリペプチドは、感熱性又は熱不安定性であってよく、その方法は、発酵ブロスを内因性ポリペプチド及び感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを不活性化するのに十分な昇温状態に曝す工程を含み得る。有利な実施形態では、内因性ポリペプチドは、セルラーゼであってよい。方法は、発酵ブロスを昇温状態に曝す前に、発酵ブロスを、所望のポリペプチドが作用する所望の化合物と接触させる工程を更に含み得る。方法は、発酵ブロスを昇温状態に曝す前に、発酵ブロスを、セルラーゼ及び所望のポリペプチドが作用する１つ以上の化合物と接触させる工程を更に含んでもよい。
【００４３】
本発明はまた、修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られる組成物内に存在するセルラーゼの活性を制御するための方法であって、その組成物がＥＧＶ以外の少なくとも１つのセルラーゼ酵素を含み、その方法は、組成物を所望のポリペプチドを不活性化するのに十分な昇温状態に曝す工程を含んでよく、組成物を昇温状態にさらす工程の後の組成物は、セルラーゼ活性を実質的に含まない。所望のポリペプチドは、感熱性又は熱不安定性であってよい。別の実施形態では、ポリペプチドは耐熱性又は熱安定性であってよい。組成物を昇温状態に曝す工程は、食品又は飲料において行われ得る。別の実施形態では、昇温状態は約１００℃未満であってよい。別の実施形態では、修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られる組成物は、ヒドロホビンを含む発酵ブロスであり得る。
【００４４】
したがって、出願人が本権利を所有し、それによって任意の以前に既知の産物、プロセス、又は方法の権利否認を告知するように、任意の以前に既知の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法を本発明に包含しないことは、本発明の目的である。本発明は、出願人が本権利を所有し、それによって任意の前述の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法の権利否認を告知するように、ＵＳＰＴＯ（３５  ＵＳＣ  §  １１２、第１パラグラフ）又はＥＰＯ（ＥＰＣ条項８３）の文書記述及び実施可能要件を満たさない、任意の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことに更に注意する。
【００４５】
本開示において、特に請求項及び／又はパラグラフにおいて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、及び同様の語）」などの用語は、米国特許法においてそれに属する意味を有し得、例えば、それらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｅｄ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、及び同様の語）」などの用語を意味し得ること、並びに「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ及びｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、例えば、それらは明示的に列挙されない要素を許可するが、先行技術において見出されるか、又は発明の基本的特徴若しくは新規特徴に影響する要素を除外することに注意する。
【００４６】
用語「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ及びｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、ＥＧＶの発現に関与するヌクレオチドの欠失又は破壊、例えば、このセルラーゼをコードする遺伝子、若しくはそのためのコード領域の破壊又は欠失、例えば、ｅｇｌ５に関する欠失又は破壊が、熱安定性の外因性ポリペプチド、例えば、ヒドロホビン（ヒドロホビンＩＩなど）の発現及び／又は取得を支援することが予想外に見出されたためであって、請求項が、先行技術単独で、又は任意の組合せで開示され又は示唆される実施形態によって読み取られことを避けるようにするためのものである。
【００４７】
これら及び他の実施形態は、開示されるか、又は添付の図面を含む以下の詳細な説明から明らかであり、それらによって包含される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
例として示されるが、説明される特定の実施形態のみに発明を限定することを意図しない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて最も良く理解され得る。
【図１】ｐＦ１（ＥＧ５ＲＰｙｒ）のプラスミドマップ。
【図２】ｅｇｌ５の破壊後のトリコデルマリーゼイ（T. reesei）の一部分のマップ。
【図３】熱処理の存在及び非存在下で、対照及びｅｇｌ５欠失トリコデルマリーゼイ（T. reesei）培養物の上澄み液に存在する（in the in）セルラーゼ活性の量を示すグラフ。
【図４】グルコース検量線を示すグラフで。
【図５】対照株と比較して、ΔＥＧ５株からの上澄み液における熱安定性セルラーゼ活性の喪失を示すグラフ。
【図６】ｅｇｌ５の破壊及びｐｙｒ２マーカーの切除後のトリコデルマリーゼイ（T. reesei）染色体の一部分のマップ。
【図７Ａ】ヘキソキナーゼプロモーターと融合されたｓｕｃＡ遺伝子の断片を担持する３．５ｋｂ  ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号：１）。
【図７Ｂ】ヘキソキナーゼプロモーターと融合されたｓｕｃＡ遺伝子の断片を担持する３．５ｋｂ  ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号：１）。
【図８】ｐＵＣ１９からの複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子、並びにバクテリオファージｆ１複製起点を含む、ｐＦ１Ｘ，小プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号：２）。
【図９Ａ】ｅｇｌ５及びｐｙｒ２遺伝子の既知の染色体ＤＮＡ配列に基づく、破壊された遺伝子（即ち、「破壊カセット」）の推定ヌクレオチド配列（配列番号：３）。
【図９Ｂ】ｅｇｌ５及びｐｙｒ２遺伝子の既知の染色体ＤＮＡ配列に基づく、破壊された遺伝子（即ち、「破壊カセット」）の推定ヌクレオチド配列（配列番号：３）。
【図９Ｃ】ｅｇｌ５及びｐｙｒ２遺伝子の既知の染色体ＤＮＡ配列に基づく、破壊された遺伝子（即ち、「破壊カセット」）の推定ヌクレオチド配列（配列番号：３）。
【図９Ｄ】ｅｇｌ５及びｐｙｒ２遺伝子の既知の染色体ＤＮＡ配列に基づく、破壊された遺伝子（即ち、「破壊カセット」）の推定ヌクレオチド配列（配列番号：３）。
【図１０】ｅｇｌ５のヌクレオチド配列（配列番号：３２）。
【図１１】ＥＧＶのアミノ酸配列（配列番号：３３）。
【図１２】ベクトルｐＴｒｅｘ３ｇＭ（Ｈｆｂ２）及びｐＴｒｅｘ８Ｒ（Ｈｆｂ２）の機能的マップ及び部分制限マップ。
【図１３Ａ】ｐＴｒｅｘ３ｇＭ（Ｈｆｂ２）のヌクレオチド配列。
【図１３Ｂ】ｐＴｒｅｘ８Ｒ（Ｈｆｂ２）のヌクレオチド配列。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本組成物及び方法を詳細に説明する前に、以下の用語が明確にするために定義される。定義されていない用語は、関連技術において使用されるように、それらの通常の意味に従うべきである。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「セルラーゼ（cellulase）」は、β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解して、セルロースからグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成をもたらす酵素である。セルラーゼ（cellulase）は、例えば、エンドグルカナーゼ（endoglucanase）、エキソグルカナーゼ（exoglucanase）、β−グルコシダーゼ（β-glucosidase）等を含む。
【００５１】
本明細書で使用するとき、「エンドグルカナーゼ（ＥＧ）」は、主にセルロース繊維の非晶質部分に作用し、低結晶化度の領域において、内部β−１，４−グルコシド結合を加水分解するセルラーゼ（cellulase）である。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「ヘミセルラーゼ（hemicellulase）」及び「キシラナーゼ（xylanase）」は、互換的に使用され、５炭糖を含む多糖類において、グリコシド結合を加水分解することができる酵素を一般的に意味する。そのような酵素は、例えば、マンナナーゼ（mannanase）、アラビナナーゼ（arabinanase）、グルクロニダーゼ（glucuronidase）、アセチルキシランエステラーゼ（acetylxylan esterase）、アラビノフラノシダーゼ（arabinofuranosidase）、キシロシダーゼ（xylosidase）等を含む。
【００５３】
本明細書において使用するところの「トリコデルマリーゼイ（又はＴ．ｒｅｅｓｅｉ）」は、子嚢菌門（phylum Ascomycota）の糸状菌を指す。この有機体は、以前はハイポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）として知られていた。
【００５４】
本明細書において使用するところの「トリコデルマリーゼイ（T. reesei）ＥＧＶセルラーゼ」という表現は、配列番号：３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、配列番号：３３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の、若しくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し、セルロース基質でのエンドグルカナーゼ活性を有し、本明細書に記載のアッセイを使用して熱安定性である。「ＥＧＶ」は、本明細書において「ＥＧ５」と称される場合がある。
【００５５】
本明細書で使用するとき、「トリコデルマリーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ５遺伝子」又は「ｅｇｌ５」という表現は、本明細書に記載の通り、ＥＧＶセルラーゼをコードする核酸、又は関連ポリペプチドを指す。代表的なｅｇｌ５のヌクレオチド配列は、配列番号：３２として示される。ＥＧＶのアミノ酸配列は、配列番号：３３に示される。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「熱安定性」は、ポリペプチドに関して、ポリペプチドが、事前に選択した時間の間、事前に選択した昇温状態に曝された後に、生物活性を保持する能力を指す。生物活性は、ポリペプチドに特有の酵素活性（enymatic activity）、結合活性、界面活性特性、又は任意の他の活性若しくは特性であり得る。ポリペプチドは、事前に選択した時間の間、事前に選択した昇温状態に暴露された後に、その元の活性の少なくとも半分を維持するならば熱安定性であると見なされる。広義には、事前に選択した温度及び時間は、ＥＧＶ以外のトリコデルマリーゼイ（T. reesei）を実質的に不活性化するために必要な温度及び時間である。これらの条件は、ｅｇｌ５欠失を含むか、又はそれから本質的になるトリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞におけるセルラーゼ活性を分析することによって容易に確立され得る。
【００５７】
場合によっては、タンパク質が、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約９０℃、又は更には少なくとも約９５℃の温度に、少なくとも約３分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、又は更には少なくとも約６０分の時間の間暴露された後に、その生物活性の少なくとも半分（すなわち、少なくとも５０％）を保持するならば、熱安定性であると見なされる。一実施例では、事前に選択した温度は、約９０℃以上であり、事前に選択した時間は、約５分以上である。別の実施例では、事前に選択した温度は、約９０℃以上であり、事前に選択した時間は、約６０分以上である。熱安定性ポリペプチドは、それらの生物活性の少なくとも半分（すなわち、少なくとも５０％）が、記載の通り暴露後に回復されるように、昇温状態で可逆的に変性されるポリペプチドを含む。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「非耐熱性」、「非熱安定性」、及び「熱不安定性」とは、ポリペプチドに関して、互換的に使用され、ポリペプチドが、事前に選択した時間の間、事前に選択した温度に曝された後に、生物活性を保持できないことを指す。生物活性は、ポリペプチドに特有の酵素活性（enymatic activity）、結合活性、界面活性特性、又は任意の他の活性若しくは特性であり得る。ポリペプチドは、事前に選択した時間の間、事前に選択した温度に暴露された後、その元の活性の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は更には本質的に１００％を喪失するならば、非耐熱性であると見なされる。そのような温度及び時間は、直前に及び本記述の他の箇所で説明される。非耐熱性ポリペプチドの数又は型に関する制約はない。例には、これらに限定されないが、セルラーゼ（cellulase）、ヘミセルラーゼ（hemicellulase）、プロテアーゼ（protease）、リパーゼ（lipase）、アミラーゼ（amylase）、エステラーゼ（esterase）、ペルヒドロラーゼ（perhydrolase）、フィターゼ（phytase）、ラッカーゼ（laccase）、及び他の市販の関連酵素、結合タンパク質、及び構造タンパク質が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用するとき、「所望のタンパク質」という表現は、「トリコデルマリーゼイ（T. reesei）」において発現されることが望ましい、ＥＧＶ以外のポリペプチドを指す。そのようなタンパク質は、酵素、結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質等であってよい。所望のタンパク質は、熱安定性又は熱不安定性であり得る。定められている場合、熱安定性である。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「活性を実質的に含まない」という表現（又は同様の表現）は、特定の活性が、ポリペプチドの混合物中で検出不可能であるか、又は混合物の意図される目的を干渉しない量で存在するかのいずれかであることを意味する。
【００６１】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。アミノ酸残基について、本明細書では従来の１文字コード又は３文字コードが使用される。ポリマーは直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、自然に、又は介在によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との共役によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾物も定義内に含まれる。
【００６２】
本明細書で使用するとき、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのようなタンパク質は、異なるジャンル及び／若しくは種の有機体、又は更には異なる群の有機体（例えば、細菌及び真菌）から生じ得る。関連タンパク質は、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される、相同体も包含する。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「誘導体ポリペプチド／タンパク質」は、Ｎ末端若しくはＣ末端のいずれか又は両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列の１つの部位若しくは多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、タンパク質の一端若しくは両端又はアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、及び／又はアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によってタンパク質から生じるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列の好適な宿主への形質転換、及び誘導体タンパク質を形成するための修飾されたＤＮＡ配列の発現を修飾することによって達成され得る。
【００６４】
関連（及び誘導体）タンパク質は、「変異タンパク質」を含む。変異タンパク質は、少数のアミノ酸残基での置換、欠失、及び／又は挿入によって、比較タンパク質／親タンパク質、例えば、野生型タンパク質とは異なる。異なるアミノ酸残基の数は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異タンパク質は、比較タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％、若しくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有する。変異タンパク質は、選択したモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等においても比較タンパク質とは異なる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、用語「類似配列」は、所望のタンパク質（すなわち、典型的に所望の原タンパク質）と類似する機能、三次構造、及び／又は保存残基を提供するタンパク質内の配列を指す。例えば、α−立体らせん又はβ−シート構造を含むエピトープ領域において、類似配列における置き換えアミノ酸は、好ましくは同一の特定構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列も指す。幾つかの実施形態では、類似配列は、置き換えアミノ酸が、類似する機能又は改善された機能を示す変異酵素を生じるように開発される。幾つかの実施形態では、所望のタンパク質におけるアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、所望のセグメント若しくは断片に位置するか、又はその付近に位置する。したがって、所望のセグメント又は断片が、α−立体らせん又はβ−シート構造を含む場合、置き換えアミノ酸は、好ましくはその特定の構造を維持する。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「相同タンパク質」は、比較タンパク質に類似する活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。相同体が必ず進化的に関連することは意図しない。したがって、この用語は、異なる有機体から得られる同一、類似、又は対応する酵素（すなわち、構造及び機能に関して）を包含することが意図される。幾つかの実施形態では、比較タンパク質に類似する四次、三次、及び／又は一次構造を有する相同体を同定することが望ましい。幾つかの実施形態では、相同タンパク質は、比較タンパク質に類似する免疫学的応答を惹起する。幾つかの実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を有する酵素を生成するように遺伝子操作される。
【００６７】
配列間の相同性の程度は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して決定され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５を参照）。
【００６８】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定する有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的、ペアーワイズアラインメント（progressive，pair-wise alignment）を用いた群の関連配列から多配列アライメントを作成する。またアラインメントを作るために用いられたクラスター関係を示すツリー（tree）をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法の簡略化したものを使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されるものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップレングスウエイト、及び加重エンドギャップを含む。他の有用なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、及びＫａｒｌｉｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７）により記述される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０を参照）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」、及び「Ｘ」は、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のデフォルトとしてワードレングス（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両ストランドの比較を使用する。
【００６９】
本明細書で使用するとき、「実質的に類似の」及び「実質的に同一の」という表現は、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈において、典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約７５％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９１％同一性、少なくとも約９２％同一性、少なくとも約９３％同一性、少なくとも約９４％同一性、少なくとも約９５％同一性、少なくとも約９６％同一性、少なくとも約９７％同一性、少なくとも約９８％同一性、又は更には少なくとも約９９％同一性、又はそれ以上を有する配列を含む。配列同一性は、標準パラメーターを用いた、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬなどの既知のプログラムを使用して決定され得る（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５、Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３、及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７〜２４４を参照）。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）により公表されている。またデータベースは、ＦＡＳＴＡを使用して検索され得る（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８）。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの印は第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのポリペプチドが保存置換のみが異なるポリペプチド場合は実質的に第二ポリペプチドと同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である他の印は、２つの分子がお互いに厳格な条件（例えば、中程度から高度に厳格な条件の範囲内）においてお互いにハイブリッドすることである。
【００７０】
本明細書で使用するとき、「野生型」及び「天然の」遺伝子又はタンパク質は、自然界に見出されるものである。用語「野生型配列」及び「野生型遺伝子／タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、宿主細胞において天然又は自然発生する配列を指す。
【００７１】
本明細書で使用するとき、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムからのその除去を指す。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「遺伝子の破壊」は、広義に、宿主細胞における機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）の発現を実質的に防止する、任意の遺伝子操作又は化学操作を指す。代表的な破壊の方法は、遺伝子（ポリペプチドコード配列を含む）、プロモーター、エンハンサー、若しくは別の調節エレメントの任意の部分の完全又は部分的欠失、又はそれらの突然変異生成（置換、挿入、欠失、及びこれらの組合せを含む）を含み、機能的遺伝子産物の発現を実質的に防止する。
【００７３】
本明細書で使用するとき、「機能的遺伝子」は、細胞成分によって使用され、活性遺伝子産物、典型的にはタンパク質を生成することができる遺伝子である。「機能的」遺伝子は、細胞成分によって使用されて活性遺伝子産物を生成することができないように修飾されている「破壊された」遺伝子とは正反対のものである。代表的な機能的遺伝子には、これらに限定されないが、ＥＧＶ以外のセルラーゼ（cellulase）、ヘミセルラーゼ（hemi-cellulase）、プロテアーゼ（protease）、アミラーゼ（amylase）、リパーゼ（lipase）、ペルヒドロラーゼ（perhydrolase）、エステラーゼ（esterase）、ペクチン酸リアーゼ（pectate lyase）、ペクチナーゼ（pectinase）、ラッカーゼ（laccase）、オキシダーゼ（oxidase）、レダクターゼ（reductase）、アミダーゼ（amidase）、及び他の酵素、構造タンパク質、界面活性タンパク質、結合タンパク質等が挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用するとき、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）は、例えば、本明細書に記載の分析を使用して決定される通り、熱安定性セルラーゼ活性を呈するＥＧＶポリペプチドの生成を防止するように遺伝学的又は化学的に改変されているならば、「熱安定性ＥＧＶセルラーゼの生成を防止するように修飾されている」とされる。そのような修飾には、これらに限定されないが、ｅｇｌ５の欠失、ｅｇｌ５の破壊、コードされたＥＧＶポリペプチドが熱安定性でないようにするｅｇｌ５の修飾、コードされたＥＧＶポリペプチドがセルラーゼ活性を示さないようにするｅｇｌ５の修飾、コードされたＥＧＶポリペプチドが分泌されないようにするｅｇｌ５の修飾、ＥＧＶが発現されないようにするプロモーター又は調節エレメントの修飾、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用するとき、「機能的ポリペプチド／タンパク質」は、酵素活性、結合活性、界面活性特性などの活性を有し、そのものは、その活性を消滅させる（又は本質的に排除する）ような突然変異、切断、ないしは別の方法による修飾などを受けていないタンパク質である。機能的ポリペプチドは、規定されているように、熱安定性又は熱不安定性であってよい。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「不必要な活性」は、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞から生成されるタンパク質調製物において所望されない活性（例えば、酵素活性、結合活性、界面活性特性、又は同様のもの）である。不必要な活性は、典型的にはタンパク質調製物において発生し、所望の活性又は望ましい活性を有する、所望のタンパク質を更に含む。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「発酵ブロス組成物」は、ヒドロホビンなどの所望のタンパク質を含有する細胞増殖培地を指す。細胞増殖培地は、細胞及び／又は細胞残屑を含んでよく、濃縮されていてもよい。代表的な発酵ブロス組成物は、ヒドロホビンを含有する、限外濾過濃縮された発酵ブロスである。
【００７８】
本明細書で使用するとき、「マンナナーゼマンノース単位（ＭＭＵ）」は、０．２４％ローカストビーンガム（ＬＢＧ）の存在下、ｐＨ  ７．０及び５０℃で１分当たり１μｍｏｌの還元末端等価物（Ｄ−マンノースを含むがこれに限定されない）を生成するために必要なヒドロホビン１ｍｇ当たりのマンナナーゼの量である。
【００７９】
本明細書で使用するとき、「エンドグルカナーゼ単位（ＥＧＵ）」は、１分当たり１μｍｏｌの還元糖を生成するために必要なヒドロホビン１ｍｇ当たりのエンドグルカナーゼの量である。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「プロテアーゼ単位（ＰＵ）」は、ｐＨ  ６．２及び２５℃で１分当たり１μｍｏｌのＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）を加水分解するために必要なヒドロホビン１ｍｇ当たりのシステインプロテアーゼの量に対応する。
【００８１】
本明細書で使用するとき、材料における変化を生じさせるように食品又は他の材料を「処理する」ことは、その食品又は他の材料を、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞から生成されたタンパク質調製物と接触させることを意味し、タンパク質調製物に存在する１つ以上のタンパク質は、食品又は他の材料の成分に作用して、例えば、酵素活性、結合活性、界面活性特性、又は同様のものの結果として、化学変化をもたらす。処理の例には、焼いた食品をアミラーゼと接触させてアミロペクチンを加水分解すること、食品をリパーゼと接触させて乳化剤を生成すること、及び食品をヒドロホビンと接触させて歯ごたえを変更することが挙げられる。
【００８２】
本明細書で使用するとき、単数を表わす「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文意より明確に異なる意味に解せられない限りその複数形対象をも含む。本明細書に引用される参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
以下の省略形／頭字語は、特に定めのない限り、以下の意味を有する。
【００８４】
【表１】
2014503185.tif 000003
【００８５】
本組成物及び方法は、一部分において、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ５が熱安定性セルラーゼ酵素、すなわち、ＥＧＶをコードするという発見に基づく。対照的に、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）により発現された他の既知のセルラーゼは、非耐熱性である。ｅｇｌ５の産物が熱安定性であるという発見は、セルラーゼ活性を含み不必要な酵素活性の非存在下で、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）による内因性及び外因性ポリペプチドの両方の生成に関して広範囲にわたる影響を有するということである。
【００８６】
ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ  ２００５／０９３０７３号（「０７３  ＰＣＴ」）について言及する。０７３  ＰＣＴは、外因性融合タンパク質を発現するトリコデルマリーゼイ（T. reesei）に関する。ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ  ２００５／００１０３６号（「０３６  ＰＣＴ」）についても言及する。０３６  ＰＣＴは、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）における特定の遺伝子の同定及び単離に関する。ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ  ９８／１５６１９号（「６１９  ＰＣＴ」）について更に言及する。６１９  ＰＣＴは、トリコデルマロギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）によるＥＧＶＩの発現に関する。０７３  ＰＣＴ、０３６  ＰＣＴ、及び６１９  ＰＣＴのいずれも、個別に、又は任意の組合せのいずれかで、内因性の熱安定性セルラーゼ（例えば、ＥＧＶ）のトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））における発現を防止若しくは低減することを教示又は示唆し、特に、内因性熱安定性セルラーゼ（例えば、ＥＧＶ）のトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））における発現、及びヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）などの外因性熱安定性ポリペプチドのトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））による発現を防止若しくは低減することを教示又は示唆しない。
【００８７】
一態様では、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマ（T. reesei）リーゼイ）における熱安定性ポリペプチドを発現するための方法が提供され、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞内のｅｇｌ５を破壊する工程と、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内の熱安定性ポリペプチドを発現する工程と、得られる全細胞可溶化物、細胞ブロス、又は部分的に精製されたタンパク質調製物を昇温状態に暴露し、それによってすべての非耐熱性酵素活性をタンパク質調製物から実質的に排除する工程と、を含むか、又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、非耐熱性酵素活性は、セルラーゼ活性である。この方法の１つの重要な利点は、ｅｇｌ５が、所望の熱安定性タンパク質を発現するために使用されるトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で破壊され得るが、一方で非耐熱性酵素をコードする他の遺伝子は正常なままであって、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内に複数の欠失を作製する必要性を回避することができる。代表的な非耐熱性酵素は、プロテアーゼ（protease）、セルラーゼ（cellulase）、及びキシラナーゼ（xylanase）である。
【００８８】
関連態様では、破壊されたｅｇｌ５を有するか、又は本質的にそれからなるトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞が提供され、この宿主細胞は、不必要な酵素活性を含まない熱安定性ポリペプチドを発現するために好適である。上述のように、これらの遺伝子の発現産物は熱により不活性化され得るため、非耐熱性酵素をコードするトリコデルマ（Trichoderma）遺伝子は、宿主細胞内で正常なままであり得る。この方法において、ｅｇｌ５が破壊される限り、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞は、非耐熱性セルラーゼ（cellulase）をコードする任意の数の正常な遺伝子を含んでよい。
【００８９】
更に関連する態様では、破壊されたｅｇｌ５を有するか、又は本質的にそれからなるトリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞が提供され、この宿主細胞は非耐熱性ポリペプチドを発現するために好適であり、本質的にすべての酵素活性は、発現後の事前に選択した時間において、熱により不活性化され得る。前述のように、ｅｇｌ５が破壊される限り、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞は、非耐熱性酵素をコードする任意の数の正常な遺伝子を含んでよい。
【００９０】
別の態様では、熱安定性エンドグルカナーゼ（endoglucananse）Ｖ（ＥＧＶ）ポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止するように修飾され、この修飾は、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞からＥＧＶをコードする遺伝子を破壊又は欠失する工程を含むか、又は本質的にそれからなり、ＥＧＶをコードする遺伝子がｅｇｌ５であるトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞が提供される。
【００９１】
関連態様では、少量のセルラーゼ活性及び／又はマンナナーゼ活性の存在下、又は実質的にその非存在下で、ヒドロホビンポリペプチドを含む組成物が提供される。
【００９２】
幾つかの実施形態では、ヒドロホビンポリペプチドは、糸状菌宿主細胞から得られる。そのようなヒドロホビン組成物は、セルロース及びマンノースが存在する適用での使用に良く適しており、これらの複合糖（complex sugar）の酵素加水分解は望ましくない。幾つかの実施形態では、ヒドロホビンポリペプチドは、熱不安定性セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドの存在下で生成され、昇温状態に曝されて、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドを不活性化する。
【００９３】
場合によっては、ヒドロホビンポリペプチドは、活性セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドが宿主細胞内で生成されないように、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドをコードする破壊された遺伝子を有するか、又は本質的にそれからなる宿主細胞内で生成される。
【００９４】
更に他の場合、ヒドロホビンポリペプチドは、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドをコードする遺伝子又は核酸分子を欠失する宿主細胞内で生成される。
【００９５】
本明細書で言及されるｅｇｌ５遺伝子は、ジーンバンク登録番号Ｚ３３３８１（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：２１９〜２８）に対応する。ｅｇｌ５のヌクレオチド配列は、図１０に記載され、配列番号：３２として指定される。
【００９６】
ＥＧＶポリペプチドの対応するアミノ酸配列は、図１０に記載され、配列番号：３３として指定される。
【００９７】
ＥＧＶは、炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）族４５グリコシルヒドロラーゼ（glycosyl hydrolase）に属し、酵素分類（ＥＣ）番号（ＥＣ  ３．２．１．４）を有するエンド−１，４−β−グルカナーゼ（endo-1,4-beta-glucanase）である。これらの酵素は、以前はＫ族セルラーゼ（cellulase）／キシラナーゼ（xylanase）として知られていた。他の既知のトリコデルマリーゼイ（T. reesei）セルラーゼを区別する、ＥＧＶの重要な特徴は、ＥＧＶが熱安定性であるということである。
【００９８】
本組成物及び方法によるＥＧＶポリペプチドは、配列番号：３３のアミノ酸配列を有するＥＧＶセルラーゼと比較して、類似の構造及び機能を有するセルラーゼである。類似構造は、配列番号：３３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％、若しくはそれ以上の一次アミノ酸配列同一性を意味する。類似機能は、熱安定性エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を意味する。この文脈において、熱安定性とは、セルラーゼが、約９０℃以上の温度に約５分以上の時間で暴露された後に、その元の活性の少なくとも半分（すなわち、少なくとも５０％）を保持する能力を指す。
【００９９】
組成物及び方法の一態様は、機能的酵素の発現を不可能にする、ｅｇｌ５の欠失又は破壊を含む宿主細胞である。
【０１００】
組成物及び方法の別の態様は、機能的酵素の発現を不可能にする、ｅｇｌ５の欠失又は破壊を含むか、又は本質的にそれからなる宿主細胞である。欠失は、例えば、相同的組換え又は化学的突然変異生成により達成され得る、宿主細胞のゲノムからのｅｇｌ５の除去を指す。相同組換えは、標的とされた方法であるため、一般に好ましい。ｅｇｌ５の破壊は、広義に、酵素的に活性なＥＧＶセルラーゼの発現を実質的に回避する、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞の任意の遺伝子操作又は化学操作を指す。代表的な破壊の方法には、ｅｇｌ５の完全な欠失、ｅｇｌ５を含むゲノムの一部分の欠失、ｅｇｌ５の部分欠失（切頭を含む）、ｅｇｌ５プロモーター、エンハンサー、若しくは他の遺伝子制御要素の完全若しくは部分欠失、ｅｇｌ５をコードする配列、プロモーター、エンハンサー、若しくは他の遺伝子制御要素の突然変異発生、又は機能的ｅｇｌ５遺伝子産物（すなわち、ＥＧＶ）の発現を不可能にする任意の他の遺伝子修飾が挙げられる。そのような破壊は、例えば、相同組換え又は化学的突然変異生成により達成されてもよい。本組成物及び方法の目的で、ｅｇｌ５遺伝子の破壊は、ＥＧＶポリペプチドの熱安定性を消滅又は低減させる遺伝子修飾も含む。
【０１０１】
ｅｇｌ５を欠失又は破壊する過程において、多数の選択可能なマーカーが宿主細胞に導入されて、固体若しくは液体培地上の変異した宿主細胞の選択を可能にして、細胞分類（例えば、ＦＡＣＳ解析）による選択を可能にするか、又はＰＣＲ若しくはサザンブロット解析によるスクリーニングを容易にし得る。追加の宿主細胞遺伝子もまた、欠失又は破壊され得る。場合によっては、所望の遺伝子をｅｇｌ５の欠失又は破壊部位に導入することが望ましい場合がある。この方法において、本組成物及び方法は、熱安定性ポリペプチドをコードする核酸配列をトリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞に導入するための相同組換え部位として、ｅｇｌを使用することを意図する。
【０１０２】
所望の遺伝子は、セルラーゼ活性の非存在下、トリコデルマ（Trichoderma）内で発現することが望ましい所望のタンパク質をコードする。場合によっては、所望の遺伝子は、熱安定性ポリペプチドをコードする。そのような熱安定性ポリペプチドは、ｅｇｌ５が欠失又は破壊された宿主細胞内でそれらを発現させ、これらの宿主細胞からの宿主細胞可溶化物又は培地を熱応力にさらして、宿主細胞により発現されたセルラーゼを熱で不活性化して、セルラーゼ活性を実質的に含まない熱安定性ポリペプチドを回復する。
【０１０３】
熱安定性ポリペプチドは、酵素、構造タンパク質、核酸結合タンパク質、受容体等を含む。そのようなタンパク質は、これらに限定されないが、パイロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーマスアクアチクス（Thermus aquaticus）、サーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマスフラバス（Thermus flavus）、サーモアナエロバクテリウムサーモスルフリジン（Thermoanaerobacterium thermosulfurigene）、バシラスサーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteolyticus）、サーモトガマリタイム（Thermotoga maritime）、サーモマイセスラヌジノサス（Thermomyces lanuginosus）、バシラスサーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteolyticus）、及びバシラスステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）を含む、好熱性生物に由来し得る。代表的な好熱性タンパク質には、パイロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）からのクエン酸シンターゼ、ルブレドキシン、グルタミン酸脱水素酵素、及びメチオニンアミノペプチダーゼ、サーマスアクアチクス（Thermus aquaticus）及びサーマスサーモフィルス（Themius thermophilus）からのＥＦ−ＴＵ及びＥＦ−ＴＵ−ＴＳ、サーマスサーモフィルス（Themius thermophilus）からの無機プロハスファターゼ及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼ、バシラスステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）からの乳酸脱水素酵素、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、アデニル酸キナーゼ、及びホスホフルクトキナーゼ、サーマスフラバス（Thermus flavus）からのマレイン酸脱水素酵素、サーモアナエロバクテリウムサーモスルフリジン（Thermoanaerobacterium thermosulfurigene）からのシクロデキストリン、バシラスサーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteolyticus）からのサーモリシン、中性プロテアーゼ、及びフェレドキシン、サーモトガマリタイム（Thermotoga maritime,）からのｃｈｅＹ、並びにサーモミセスラヌジノサス（Thermomyces lanuginosus）からのエンド−１，４−βキシラナーゼが挙げられる。
【０１０４】
更なる熱安定性ポリペプチドには、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ポリメラーゼ、及び更にはセルラーゼが挙げられる。好熱性セルラーゼは、当該技術分野において既知であるが、ＥＧＶがトリコデルマリーゼイ（T. reesei）内で、少なくとも、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）からの細胞可溶化物全体、ブロス、又は部分的に精製された細胞タンパク質調製物において相当量のセルラーゼ活性を生成するような量で発現された唯一の熱安定性セルラーゼであったことがこれまで未知であったことに留意されたい。したがって、本組成物及び方法を使用して、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）宿主細胞内で外因性熱安定性セルラーゼを生成することができ、この外因性熱安定性セルラーゼは、不必要なトリコデルマリーゼイ（T. reesei）セルラーゼ活性を実質的に含まない。
【０１０５】
尚も更なる熱安定性ポリペプチドには、ほんの数例を挙げると、構造ポリペプチド、転写因子、シャペロニン、及びポリペプチド阻害剤を含む。本組成物及び方法を使用して生成され得る代表的なタンパク質群は、ヒドロホビンであり、糸状菌により発現されるシステインに豊むポリペプチドのクラスである。ヒドロホビンは、それらが自己組織化し、両親媒性タンパク質を形成する能力が知られている小（〜１００アミノ酸）ポリペプチドである。それらは、細胞及び人工材料を含む物体の表面上に疎水性コーティングを形成し得る。１９９１年にスエヒロタケコミューン（Schizophyllum commune）において最初に発見されたヒドロホビンは、現在多数の糸状菌において認識されている。疎水性親水性指標（ハイドロパシー）及び他の生物物理学的特性における差異に基づいて、ヒドロホビンは、クラスＩ又はクラスＩＩとして分類される。
【０１０６】
好適なヒドロホビンは、当該技術分野において既知の任意のクラスＩ又はクラスＩＩヒドロホビン、例えば、アガリクス（Agaricus）属（例えば、アガリクスビスポラス（Agaricus bisporus））、アグロサイブ（Agrocybe）属（例えば、ポプラキノコ（Agrocybe aegerita））、アジェロミセス（Ajellomyces）属（例えば、アジェロミセスカプスラタス（Ajellomyces capsulatus）、アジェロミセスデルマティティディス（Ajellomyces dermatitidis））、アスペルギルス（Aspergillus）属（例えば、アスペルギルスアルビ（Aspergillus arvii）、アスペルギルスブレビプス（Aspergillus brevipes）、アスペルギルスクラバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルスデリカウリス（Aspergillus duricaulis）、アスペルギルスエリプティカス（Aspergillus ellipticus）、アスペルギルスフラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルスフミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルスフミシネマタス（Aspergillus fumisynnematus）、アスペルギルスレンタス（Aspergillus lentulus）、アスペルギルスニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルスユニラテラリス（Aspergillus unilateralis）、アスペルギルスビリジニュータンス（Aspergillus viridinutans））、ボーベリア（Beauveria）属（例えば、ボーベリアバッシアナ（Beauveria bassiana））、クラビセプス（Claviceps）属（例えば、クラビセプスフシホルミス（Claviceps fusiformis））、コクシジオイド（Coccidioides）属（例えば、コクシジオイドポサダシ（Coccidioides posadasii））、コクリオボラス（Cochliobolus）属（例えば、コクリボルスヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus））、クリニペリス（Crinipellis）属（例えば、クリニペリスペルニキオサ（Crinipellis perniciosa））、クリフォネクトリア（Cryphonectria）属（例えば、クロフォネクトリアパラシティカ（Cryphonectria parasitica））、ダビディエラ（Davidiella）属（例えば、ダビディエラタシアナ（Davidiella tassiana））、ディクチオネマ（Dicxyonema）属（例えば、ディクチオネマグラブラタム（Dictyonema glabratum））、エメリセラ（Emericella）属（例えば、エメリセラニデュランス（Emericella nidulans））、フランムリナ（Flammulina）属（例えば、フランムリナベルティペス（Flammulina velutipes））、フサリウム（Fusarium）属（例えば、フサリウムクルモラム（Fusarium culmorum））、ギベレラ（Gibberella）属（例えば、ギベレラモニリホルミス（Gibberella moniliformis））、グロメレラ（Glomerella）属（例えば、グロメレラグラミニコラ（Glomerella graminicola））、グリフォラ（Grifola）属（例えば、グリフォラフロンドサ（Grifola frondosa））、ヘテロバシジオン（Heterobasidion）属（例えば、ヘテロバシイオンアンノサム（Heterobasidion annosum））、ハイポクレア（Hypocrea）属（例えば、ハイポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）、ハイポクレアリキシ（Hypocrea lixii）、ハイポクレアビレンス（Hypocrea virens））、ラッカリア（Laccaria）属（例えば、ラッカリアビカラ（Laccaria bicolor））、レンチヌラ属（Lentinula）（例えば、レンチヌラエドーデス（Lentinula edodes））、マグナポルテ（Magnaporthe）属（例えば、マグナポルテオリザエ（Magnaporthe oryzae））、マラスミウス（Marasmius）属（例えば、マラスミウスクラドフィラス（Marasmius cladophyllus））、モニリオフトラ（Moniliophthora）属（例えば、モニリオフトラペルニシオサ（Moniliophthora perniciosa））、ネオサルトリア（Neosartorya）属（例えば、ネオサ��トリアアウレオラ（Neosartorya aureola）、ネオサルトリアフェンネリア（Neosartorya fennelliae）、ネオサルトリアフィッシェリ（Neosartorya fischeri）、ネオサルトリアグラブラ（Neosartorya glabra）、ネオサルトリアヒラツカ（Neosartorya hiratsukae）、ネオサルトリアニシムラ（Neosartorya nishimurae）、ネオサルトリアオータニ（Neosartorya otanii）、ネオサルトリアスードフィッシェリ（Neosartorya pseudofischeri）、ネオサルトリアクアドリシンクタ（Neosartorya quadricincta）、ネオサルトリアスパスラタ（Neosartorya spathulata）、ネオサルトリアスピノサ（Neosartotya spinosa）、ネオサルトリアストラメニア（Neosartorya stramenia）、ネオサルトリアウダガワ（Neosartorya udagawae））、ニューロスポラ（Neurospora）属（例えば、ニューロスポラクラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラジスクレタ（Neurospora discreta）、ニューロスポラインターメディア（Neurospora intermedia）、ニューロスポラシトフィラ（Neurospora sitophila）、ニューロスポラテトラスペルマ（Neurospora tetrasperma））、オフィオストマ（Ophiostoma）属（例えば、オフィオストマノボ−ウルミ（Ophiostoma novo-ulmi）、オフィオストマクエルカス（Ophiostoma quercus））、パラコクシジオイド（Paracoccidioides）属（例えば、パラコクシジオイドブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis））、パッサローラ（Passalora）属（例えば、パッサローラフルバ（Passalora fulva）、パキシルスフィラメントサス（Paxillus filamentosus）、パキシラスインボルタス（Paxillus involutus））、ペニシリウム（Penicillium）属（例えば、ペニシリウムカメンベルチ（Penicillium camemberti）、ペニシリウムクリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシルムマルネッフェイ（Penicillium marneffei））、フレビオプシス（Phlebiopsis）属（例えば、フレビオプシスギガンテア（Phlebiopsis gigantea））、ピソリタス（Pisolithus）（例えば、ピソリサスティンクトリウス（Pisolithus tinctorius））、プレウロタス（Pleurotus）属（例えば、プレウロタスオストレアタス））、ポドスポラ（Podospora）属（例えば、ポドスポラアンセリナ））、ポスティア（Podospora）属（例えば、ポスティアプラセンタ（Postia placenta））、ピレノホラ（Pyrenophora）属（例えば、ピレノホラトリティキ−レペンティス（Pyrenophora tritici-repentis））、シゾフィリウム（Schizophyllum）属（例えば、シゾフィリウムコミューン））、タラロマイセス（Talaromyces）属（例えば、タラロマイセススティピタタス（Talaromyces stipitatus））、トリコデルマ（Trichoderma）属（例えば、トリコデルマアスペレラム（Trichoderma asperellum）、トリコデルマアトロビリデ（Trichoderma atroviride）、トリコデルマビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）［以前のハイポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）］））、トリコロマ（Tricholoma）属（例えば、トリコロマテレウム（Tricholoma terreum））、ウンキノカルプス（Uncinocarpus）属（例えば、ウンキノカルプスリーゼイ（Uncinocarpus reesii））、ベルティシリウム（Verticillium）属（例えば、ベルティシリウムダリア（Verticillium dahliae））、キサントダクチロン（Xanthodactylon）属（例えば、キサントダクチロンフランメウム（Xanthodactylon flammeum））、キサントリア（Xanthoria）属（例えば、キサントリアカルシコラ（Xanthoria calcicola）、キサントリアカペンシス（Xanthoria capensis）、キサントリアエクタネオイド（Xanthoria ectaneoides）、キサントリアフランメア（Xanthoria flammea）、キサントリアカロオエンシス（Xanthoria karrooensis）、キサントリアリグラタ（Xanthoria ligulata）、キサントリアパリエティナ（Xanthoria parietina）、キサントリアツルビナタ（Xanthoria turbinata））等からのヒドロホビンである。ヒドロホビンは、例えば、Ｓｕｎｄｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｉｃｒｏｎ  ３９：７７３〜８４、Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２９：８７７〜９６、及びＷｏｓｔｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：６２５〜４６において再調査されている。
【０１０７】
代替又は追加として、所望のタンパク質は、ＥＧＶ以外のセルラーゼを不活性化するために必要な温度で最小限に変性される、中温性タンパク質であり得る。所望のタンパク質は、それらの熱安定性に対して選択された遺伝子操作を受けたタンパク質であってもよい。所望のタンパク質は、活性的又は構造的に正常なタンパク質が、昇温状態への暴露後で回復されるように、ＥＧＶ以外のセルラーゼを不活性化するために必要な温度で可逆的に変性されるものであってもよい。
【０１０８】
所望のポリペプチド、特に所望の熱安定性ポリペプチドは、国際公開特許ＷＯ／２０１１／０１９６８６号で論じされるように、その発明の例えば実施例１の技法に従って有利に回復され得る。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、本組成物及び方法は、所望のタンパク質が、セルラーゼ、マンナナーゼ、及び／又はプロテアーゼ活性を含む、検出可能な酵素活性の実質的に非存在下で生成されることを可能にする。他の実施形態では、所望のタンパク質は、少量であるが検出可能な量の検出可能なセルラーゼ、マンナナーゼ、及び／又はプロテアーゼ活性の存在下で生成される。例えば、特定の実施形態では、所望のタンパク質は、約０．１ＥＧＵ未満、若しくは更には約０．０５ＥＧＵ、約０．１０ＭＭＵ未満、約０．０５ＭＭＵ未満、約０．０２５ＭＭＵ未満、約０．０２ＭＭＵ未満、約０．０１５ＭＭＵ未満、若しくは更には，約０．０１ＭＭＵ未満のエンドグルカナーゼ活性、及び／又は約１．３ＰＵ未満、若しくは更には約０．５ＰＵ未満の検出可能なシステインプロテアーゼ活性の存在下で生成される。所望のタンパク質が、例えば、食品適用を意図されたヒドロホビンである場合、そのような量の夾雑物活性（contaminating activity）は、一般に有害ではない。
【０１１０】
一般に、所望のタンパク質は、タンパク質が熱安定性を保持するか、又は熱応力に応答して、可逆的に変性する能力を保持する限り、任意の数のアミノ酸置換、挿入、及び／若しくは欠失、又は化学修飾を含み得る。好ましい所望のタンパク質は、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約９０℃、又は更には少なくとも約９５℃の温度に、少なくとも約３分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分の時間の間暴露された後に、その活性、結合能力、又は天然構造（タンパク質の型に応じて）の少なくとも半分（すなわち、少なくとも５０％）を保持する。特定の場合、所望のタンパク質は、少なくとも約９０℃の温度に少なくとも約５分の時間の間暴露された後で、その活性、結合能力、又は天然構造の少なくとも約５０％を保持する。
【０１１１】
所望の遺伝子又は所望の核酸分子は、相同組換え、一時発現ベクター、安定した統合発現ベクトル、若しくは人工染色体を使用する形質転換、ウイルス感染／形質導入、及び同様のものを含む、任意の既知の方法を使用して、トリコデルマ（Trichoderma）細胞に導入され得る。場合によっては、所望の遺伝子を、破壊されるｅｇｌ５の部位に導入することが望ましい場合がある。場合によっては、複数の所望の遺伝子又は核酸分子が存在し得る。
【０１１２】
一態様では、本組成物及び方法は、ｅｇｌ５に関して欠失又は破壊されるが、任意に他のセルラーゼ−遺伝子をコードする、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））宿主細胞を使用して、熱安定性タンパク質（例えば、ヒドロホビン）の発現を可能にする。熱安定性タンパク質の発現後に、トリコデルマ（Trichoderma）からの全細胞可溶化物、ブロス、又は部分的に精製された細胞タンパク質調製物は、非耐熱性酵素を不活性化するのに十分な温度でインキュベートされ、不必要なセルラーゼ（cellulase）［エンドグルカナーゼ（endoglucanase）（ＥＧＶを除く）、エキソグルカナーゼ（exoglucanase）、セロビオヒドロラーゼ（cellobiohydrolase）、β−グルコシダーゼ（β-glucosidase）、カルボキシメチルセルラーゼ（carboxymethyl cellulase）等を含む］、ヘミセルラーゼ（hemicellulase）（キシラナーゼ（xylanase）、マンナナーゼ（mannanase）、アラビナナーゼ（arabinanase）、グルクロニダーゼ（glucuronidase）、アセチルキシランエステラーゼ（acetylxylan esterase）、アラビノフラノシダーゼ（arabinofuranosidase）、キシロシダーゼ（xylosidase）等を含む）、プロテアーゼ（protease）、リパーゼ（lipase）、アミラーゼ（amylase）、エステラーゼ（esterase）、ペルヒドロラーゼ（perhydrolase）、フィターゼ（phytase）、ラッカーゼ（laccase）、及び他の市販の関連酵素活性を含むが、これらに限定されない不必要な酵素活性の非存在下で所望のタンパク質を生成し、その間、宿主細胞内の多数の異なる非耐熱性酵素をコードする遺伝子を破壊する必要性がない。これは、トリコデルマ（Trichoderma）内の遺伝子又は核酸分子の発現を著しく簡素化する。
【０１１３】
別の態様では、本組成物及び方法は、ｅｇｌ５に関して本質的に欠失又は破壊されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞を使用するが、任意に他のセルラーゼを発現させるか、又は他のセルラーゼ−遺伝子をコードして、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）などの熱安定性タンパク質の発現を可能にする。熱安定性タンパク質の発現後、トリコデルマ（Trichoderma）からの全細胞可溶化物、ブロス、又は部分的に精製された細胞タンパク質調製物は、非耐熱性酵素を不活性化するのに十分な温度でインキュベートされ、不必要なセルラーゼ［エンドグルカナーゼ（ＥＧＶを除く）、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ等を含む］、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビナナーゼ、グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシロシダーゼ等を含む）、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、及び他の市販の関連酵素活性を含むが、これらに限定されない不必要な酵素活性の非存在下で所望のタンパク質を生成し、その間、宿主細胞内の多数の異なる非耐熱性酵素をコードする遺伝子を破壊する必要性がない。
【０１１４】
別の態様では、本組成物及び方法は、熱安定性エンドグルカナーゼ（endoglucananse）Ｖ（ＥＧＶ）の生成を実質的に低減又は防止するように修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞を使用して、ヒドロホビンなどの熱安定性タンパク質の発現を可能にし、この修飾は、トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞からのＥＧＶをコードする核酸分子を欠失するか、又はその発現を提供することを含むか、又は本質的にそれからなり、ｅｇｌ５であるＥＧＶをコードする核酸分子が提供される。
【０１１５】
別の態様では、本組成物及び方法は、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性の非存在下で、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）が存在する宿主細胞から得られる組成物を提供する。そのような組成物は、熱不安定性セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドも生成する、糸状菌、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））などの宿主細胞内でヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）を生成し、次に宿主細胞により生成されたタンパク質を昇温状態にさらして、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドを不活性化することによって得られてよい。あるいは、ヒドロホビンは、セルラーゼ及び／若しくはマンナナーゼポリペプチドをコードするか、又はその発現に関与する欠失及び／若しくは破壊された核酸分子を有するか、又はセルラーゼ及び／若しくはマンナナーゼポリペプチドをコードする核酸分子を欠失する、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、トリコデルマリーゼイ（T. reesei））などの宿主細胞内で生成されてもよい。そのような組成物は、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性の存在が望ましくない場合、ヒドロホビン（例えば、ヒドロホビンＩＩ）を必要とする適用に有用である。
【０１１６】
本発明の組成物及び方法のこれら及び他の態様並びに実施形態は、本説明に照らして当業者に明らかとなるであろう。
【０１１７】
実際に、当業者は、本発明を、いずれも参照することにより本明細書に援用される、２０１１年３月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号６１／４６９，０６７号及び２０１１年４月１５日に出願されたシリアル番号６１／４７５，９３３号のそれぞれ又は両方と併せて実施できることが言及される。具体的には、当業者は、本発明と共に、ヒドロホビンＩＩが本発明の実施において発現された後の任意の（熱処理前又は後を含む）時点で、２０１１年４月１５日に出願された米国特許出願シリアル番号６１／４７５，９３３号のヒドロホビンＩＩを精製するための方法を使用することができ、精製するためのこの方法は、Ｃ１〜Ｃ３アルコール、例えば、イソプロパノールをヒドロホビン溶液に添加して、第１の沈殿物を生成する工程と、Ｃ１〜Ｃ３アルコール／ヒドロホビン溶液から上澄み液を移す工程と、Ｃ１〜Ｃ３アルコールをその上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成する工程と、を含んでよく、第２の沈殿物は、精製されたヒドロホビンＩＩであり得る。また本発明が実施されるとき、ヒドロホビンＩＩの発現の間に、２０１１年３月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号６１／４６９，０６７号の沈殿剤技法を使用してもよい。
【０１１８】
本発明はまた、本発明の修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞によって発現される所望のポリペプチドの活性を制御することに関し、その所望のポリペプチドは感熱性又は熱不安定性であり、その方法は所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチド及び内因性ポリペプチドを昇温状態に曝す工程を含んでよく、その昇温状態は内因性ポリペプチド及び感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを不活性化するのに十分であり得る。有利な実施形態では、内因性ポリペプチドは、セルラーゼであってよい。方法は、所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを昇温状態に曝す前に、所望のポリペプチドを、所望のポリペプチドが作用する化合物と接触させる工程を更に含み得る。方法は、所望の感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを昇温状態に曝す前に、所望のポリペプチドを、セルラーゼ及び所望のポリペプチドが作用する１つ以上の化合物と接触させる工程を更に含んでもよい。
【０１１９】
本発明の方法はまた、本発明の発酵ブロスにおける所望のポリペプチドの活性を制御するための方法に関し、その所望のポリペプチドは感熱性又は熱不安定性であってよく、その方法は発酵ブロスを内因性ポリペプチド及び感熱性又は熱不安定性ポリペプチドを不活性化するのに十分な昇温状態に曝す工程を含み得る。有利な実施形態では、内因性ポリペプチドは、セルラーゼであってよい。方法は、発酵ブロスを昇温状態に曝す前に、発酵ブロスを所望のポリペプチドが作用する所望の化合物と接触させる工程を更に含み得る。方法は、発酵ブロスを昇温状態に曝す前に、発酵ブロスを、セルラーゼ及び所望のポリペプチドが作用する１つ以上の化合物と接触させる工程を更に含んでもよい。
【０１２０】
所望のポリペプチド及び／又はセルラーゼが作用する化合物は、所望のポリペプチド及び／又はセルラーゼと直接又は間接的に相互作用する、任意の化合物であり得る。所望の化合物は、所望のポリペプチド及び／又はセルラーゼ、すなわち、シス作用化合物に直接結合する化合物であり得る。一実施形態では、所望の化合物は、所望のポリペプチド及び／又はセルラーゼの基質であってよく、例えば、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、ペクチン、又はこれらの誘導体であり得る。例には、これらに限定されないが、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ニトロセルロース（硝酸セルロース）、硫酸セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。別の実施形態では、所望の化合物は、所望のポリペプチド及び／又はセルラーゼ、すなわち、トランス作用化合物と間接的に相互作用する化合物であり得る。
【０１２１】
本発明はまた、修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られる組成物内に存在するセルラーゼの活性を制御するための方法であって、その組成物はＥＧＶ以外の少なくとも１つのセルラーゼ酵素を含み、その方法は組成物を、所望のポリペプチドを不活性化するのに十分な昇温状態に曝す工程を含んでよく、組成物を昇温状態に曝す工程の後で、組成物はセルラーゼ活性を実質的に含まない。所望のポリペプチドは、感熱性又は熱不安定性であってよい。別の実施形態では、ポリペプチドは、耐熱性又は熱安定性であってよい。組成物を昇温状態に曝す工程は、食品又は飲料において行われ得る。別の実施形態では、昇温状態は約１００℃未満であり得る。本発明の昇温状態は、熱安定性セルラーゼを破壊する、焼き、揚げ、低温殺菌、又は他の熱処理を包含することを意味しない。別の実施形態では、修飾されたトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られた組成物は、ヒドロホビンを含む発酵ブロスであり得る。
【０１２２】
以下の例は、これらに限定されないが、組成物及び方法を更に説明することが意図される。
【実施例】
【０１２３】
実施例１．破壊されたｐｒｙ２遺伝子を有するトリコデルマリーゼイ（T. reesei）株の構成
アスペルギルスニゲル（Aspergillus niger）からのｓｕｃＡ断片を、プライマーｏＡＮＳＵＣＡ５及びｏＡＮＳＵＣＡ３を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。同様に、ヘキソキナーゼ遺伝子プロモーターを、プライマーｏＨＸＫ５及びｏＨＸＫ３を使用して、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）の染色体から増幅させた。増殖されたｓｕｃＡ  ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＡｓｃＩによって制限した。ヘキソキナーゼプロモーターを担持する増幅されたＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｃＩによって消化されたプラスミドｐＴｒｅｘ３（ＡＧＬ５１Ｍ）（参照することにより本明細書に援用される国際公開特許ＷＯ  ０８／１１８３８２号を参照）との連結反応において、２つの消化された断片を一緒にインキュベートした。得られるベクターｐＴＨＸＫ（ＳＵＣＡ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、ヘキソキナーゼプロモーターと融合されたｓｕｃＡの断片を担持する３．５ｋｂのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離した。この断片のヌクレオチド配列は図７に提供され、本明細書では配列番号：１として指定される。
【０１２４】
ｐＦ１Ｘは、ｐＵＣ１９からの複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子、並びにバクテリオファージｆ１複製起点を含む、小プラスミドである。その完全ヌクレオチド配列は図８に提供され、本明細書では配列番号：２として指定される。
【０１２５】
トリコデルマリーゼイ（T. reesei）のｐｙｒ２遺伝子を、プライマーｏＰＹＲ２  ５１及びｏＰＹＲ２  ３１を使用して増幅した。得られた断片をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩによって消化し、同一酵素によって消化されたｐＦ１Ｘとの連結反応においてインキュベートした。得られたプラスミドは、ｐＦ１Ｘ（ｐｙｒ２ｈｘｋｓｕｃ）と指定された。大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を、ｐＦ１Ｘ（ｐｙｒ２ｈｘｋｓｕｃ）によって形質転換し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。ｐＦ１Ｘ（ｐｙｒ２ｈｘｋｓｕｃ）のファージミド形態からのＤＮＡを、標準的方法を使用して単離した（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からの使用説明書を参照）。
【０１２６】
ファージミドＤＮＡを、Ｈ−制限酵素緩衝液に約１ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解し、溶液を７５℃に加熱し、それを徐々に室温に冷ますことによって、２つのオリゴヌクレオチドｏＰＹＲ２Ｆ＿３Ｍ及びｏＰＹＲ２＿５Ｐ（いずれも５μＭの濃度で存在する）にアニールさせた。得られた部分的二本鎖のＤＮＡをＢａｍＨＩによって消化し、この消化から得られる２つのＤＮＡ断片のうちの大きい方を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１２７】
大きい方のＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を使用して、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）のクワド欠損（quad-deleted）（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇ１、及びΔｅｇ２）株（すなわち、「Ｑｕａｄ」、米国特許第５，６５０，３２２号）を芽胞電気穿孔法（spore electroporation）によって形質転換した（例えば、Ｍｉａｓｎｉｋｏｖ，Ａ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｓ．（２００９）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２５ｔｈ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ａｔ  Ａｓｉｌｏｍａｒ．ｐ．２３２を参照）。形質転換細胞を、それらが最小スクロース培地（スクロース、５ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．６ｇ／ｌ；ＭｇＣｌ２、１ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、０．１ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２、０．２５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４、５．０ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４、１．６ｍｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４、１．４ｍｇ／ｌ、ウリジン、１００ｍｇ／ｌ）上で増殖する能力について選択した。スクロース上で増殖した形質転換細胞を、１ｇ／ｌフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を有する同一培地を含むプレート上で継代培養（sub-culture）した。染色体ＤＮＡを、ＦＯＡの存在下で最も良く増殖することを示した形質転換細胞（コードされたＤＵＲＡ）から単離した。このＤＮＡを、プライマー対（ｉ）ｏＰＹＲ２ＦＤ＿Ｒ１及びｏＳＵＣ２＿Ｄ１、並びに（ｉｉ）ｏＰＹＲ２ＦＵ＿Ｄ１及びｏＳＵＣ２＿Ｒ１を使用して、ＰＣＲにより解析した。いずれの場合も、予想された大きさのＰＣＲ産物（それぞれ２．４及び１．８ｋｂ）が観測された。株ＤＵＲＡは、ウリジンを欠失する最小スクロース培地上で増殖せず、ｐｙｒ２遺伝子がこの株において破壊されることを確認した。
【０１２８】
この実施例において言及されたプライマーの配列は、表１に記述する。
【０１２９】
【表２】
2014503185.tif 000004
【０１３０】
実施例２  ｅｇｌ５遺伝子の破壊
トリコデルマリーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ５遺伝子を、テンプレートとしてトリコデルマリーゼイ（T. reesei）染色体ＤＮＡ、並びにプライマーｏＥＧ５＿５及びｏＥＧ５＿３を使用して、ＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩ及びＮｏｔＩによって消化し、同一酵素によって消化されたｐＦ１Ｘにクローン化させて、プラスミドｐＦ１Ｘ（ＥＧ５）を得た。ｅｇｌ５コード領域（後に「反復領域」と称される）の更に上流に位置する、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）染色体ＤＮＡの別の断片を、プライマーｏＥＧ５Ｒ＿５及びｏＥＧ５Ｒ＿３を使用して同様に増幅した。増幅された断片は、ＳｐｅＩ及びＳａＩＩによって消化し、ＡｖａＩＩ及びＸｈｏＩによって消化されたｐＦ１Ｘ（ＥＧ５）にクローン化させて、プラスミドｐＦ１Ｘ（ＥＧ５Ｒ）を生成した。
【０１３１】
ｅｇｌ５破壊カセットを構成する最終工程は、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）ｐｙｒ２遺伝子を、プライマーｏＰＹＲ２＿５５及びｏＰＹＲ２＿３５並びにクワド欠損したトリコデルマリーゼイ（T. reesei）株（上記）の染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＳｐｅＩによって消化し、消化された断片をＸｈｏＩ及びＸｂａＩ消化されたｐＦＩ（ＥＧ５Ｒ）との連結反応においてインキュベートすることであった。ｐＦＩＸ（ＥＧ５ＲＰｙｒ２）と指定された最終プラスミドは、ｐｙｒ２遺伝子の機能的コピー及びｅｇｌ５  ５’−反復領域（図１）の両方により破壊されたトリコデルマリーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ５遺伝子を担持した。破壊された遺伝子（すなわち、「破壊カセット」）のＤＮＡ配列は、ｅｇｌ５及びｐｙｒ２遺伝子の既知の染色体ＤＮＡ配列、前述の構成スキーム、及び複数の制限エンドヌクレアーゼ分析に基づいて推定された。配列は図９に提供され（図９Ａ及び９Ｂからなる）、本明細書では配列番号：３として指定される。
【０１３２】
破壊カセットは、テンプレートとしてｐＦ１Ｘ（ＥＧ５ＲＰｙｒ２）、並びにプライマーｏＥＧ５ｆ及びｏＥＧ５ｒを使用して、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を使用して、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）株ＤＵＲＡ（実施例１に記載）を形質転換し、ウリジン原栄養を付与した。染色体ＤＮＡを、多数の形質転換細胞から単離し、プライマー対ｏＥＧ５Ｒ＿Ｄ１及びｏＥＧ５Ｄ＿Ｒ１、ｏＥＧ５Ｒ＿Ｄ２及びｏＥＧ５ＤＲ２、ｏＥＧ５Ｒ＿Ｄ２及びｏＰＹＲ２Ｕ＿Ｒ２、並びにｏＰＹＲ２Ｄ＿Ｄ２及びｏＥＧ５Ｄ＿Ｒ２を使用するＰＣＲにより解析した。３つの形質転換細胞（すなわち、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  １８、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２２、及びＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２３）は、すべて４つのプライマー対を有する、予想された大きさのＰＣＲ産物を産出した（すなわち、それぞれ１．２ｋｂ、１．１５ｋｂ、１．４ｋｂ、及び１．５ｋｂ、図２）。これら３つの株は、それらのセルラーゼ活性の生化学的特徴について選択した。
【０１３３】
この実施例において言及されたプライマーの配列は、表２に説明される。
【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
実施例３．還元糖の検出に基づくトリコデルマリーゼイ（T. reesei）対照及びｅｇｌ５欠失株におけるセルラーゼ活性
トリコデルマリーゼイ（T. reesei）株クアド（対照として）並びに独立して単離された形質転換細胞ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  １８、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２２、及びＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２３は、２８℃で６日間、振盪フラスコ内で、炭素及びエネルギー源として１．６％グルコース−ソフォロース混合物を含む最小培地を使用して増殖させた。菌糸体は、０．２２γｍ膜を通して濾過により分離し、培養上澄み液は、１０ｋＤａカットオフ膜を使用する限外濾過により約１００倍に濃縮した。
【０１３６】
濃縮された培養上澄み液（１００μＬ）を水（１００μＬ）で希釈し、６０℃又は９０℃で６０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ  ＰＣＲマシン内で加熱した。次いで熱処理された上澄み液（１０μＬ）を、９６ウェルプレート内で１９５μＬ多糖類基質（０．５％カルボキシメチルセルロース、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．４５）と混合した。プレートをアルミニウムシールフィルムで被覆し、４０℃で１６時間、４００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。得られたセルラーゼ反応混合液の一部分（７５μＬ）を、９６ウェルＰＣＲプレート内で、７５μＬ  ＤＮＳ試薬（１％  ３，５−ジニトロサリチル酸、１％  ＮａＯＨ、０．２％フェノール、０．０５％メタ重亜硫酸ナトリウム、及び１０％酒石酸カリウムナトリウム）と混合し、９９℃で１０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ  ＰＣＲマシン内でインキュベートした。ＤＮＳを使用して、還元糖の量を測定する。得られたＤＮＳ反応液（１００μＬ）の５４０ｎｍにおける吸光度を、透明な底部の９６ウェルプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２  ＵＶプレートリーダー）内で測定した。活性は、放出されたグルコース（Ｇｌｃ）等価物の濃度として報告された（図３）。Ａ５４０読取り値をバックグラウンドについて補正し、グルコース検量線からのグルコース等価物と相関させた（図４）。
【０１３７】
セルラーゼ活性は、欠失されたｅｇｌ５遺伝子を有する３種のトリコデルマリーゼイ（T. reesei）株のいずれにおいても欠失されなかった。対照クアド株は、９０℃の熱処理を受けた後で、その元のセルラーゼ活性の約半分を保持した。３種の複製に基づく結果を表３に示す。
【０１３８】
この実験は、他の機能的セルラーゼ遺伝子を含む（すなわち、ｅｇｌ５を除く）トリコデルマリーゼイ（T. reesei）株からのｅｇｌ５遺伝子の欠失が、昇温状態への暴露によって、細胞材料内のすべてのセルラーゼ活性を消滅させ得ることを示す。昇温状態を使用してすべてのセルラーゼ活性を消滅させることは、ＥＧＶセルラーゼ遺伝子産物が熱安定性であるため、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）株が機能的ｅｇｌ５遺伝子を含む時には不可能である。
【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
実施例４．粘度の変化に基づくセルラーゼ活性の分析
多糖類基質［３００ｍＬ、１．０％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ５．４５）］を、４００ｍＬガラスビーカーに添加し、初期粘度を測定した（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＤＶ−ＩＩ  Ｐｒｏ、スピンドル６２、１０ｒｐｍ）。これらのＣＭＣ溶液／懸濁液への添加に備えて、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）対照又はｅｇｌ５欠失株からの濃縮された培養上澄み液（２２０μＬ）を４℃又は９０℃のいずれかで６０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ  ＰＣＲマシン内でインキュベートした。熱処理した上澄み液の一部分（１００μＬ）をＣＭＣ溶液／懸濁液に添加し、２２℃で１６時間、１５０ｒｐｍで攪拌した。反応液の最終粘度は、上記のように測定した。結果を表４及び図５に示す。活性は、１０ｒｐｍでのトルク％のログ変換された倍率変化（log fold change）として報告した。
【０１４１】
クアド（対照）株からの培養上澄み液を用いたＣＭＣ溶液／懸濁液のインキュベーションは、熱処理とは無関係に、粘度の著しい減少をもたらした。同様に、ＣＭＣ溶液／懸濁液の粘度において、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  １８株からの培養上澄み液は、著しい低減をもたらしたが、９０℃での熱処理後には無かった。これらの結果は、ＥＧＶがトリコデルマリーゼイ（T. reesei）細胞に存在する唯一の熱安定性セルラーゼであること、及びトリコデルマ（T. reesei）リーゼイ内のｅｇｌ５遺伝子の欠失が、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）培養上澄み液に存在するすべてのセルラーゼ酵素の熱不活性化を可能にすることを示唆した。
【０１４２】
【表５】
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【０１４３】
実施例５．ｅｇｌ５破壊された株からのｐｙｒ２マーカーの切除
株ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  １８、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２２、及びＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２３を胞子形成させて、芽胞懸濁液をウリジン及びＦＯＡを補充したスクロース最小培地の上で平板培養した。数個のＦＯＡ難消化性クローンを、３種の株のそれぞれの子孫から選択し、それらの染色体ＤＮＡを単離して、プライマー対（ｉ）ｏＥＧ５ＦＵ＿Ｄ１及びｏＥＧ５Ｄ＿Ｒ１、並びに（ｉｉ）ｏＥＧ５ＦＵ＿Ｄ２及びｏＥＧ５Ｄ＿Ｒ２を使用するＰＣＲにより解析した（表２に記載の通り）。解析されたクローンの大部分から得られる染色体ＤＮＡは、予想された（すなわち、約（aout）１．６〜１．７ｋｂ）のＰＣＲ産物を生成した後、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  １８、ＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２２、及びＤＵＲＡ  ΔＥＧ５  ２３の染色体内の２つの「反復領域」間の相同組換えをもたらした（図６）。
【０１４４】
実施例６．セルラーゼ及びマンナナーゼ（mannanse）活性の解析
以下の分析を使用して、ヒドロホビン調製物中のセルラーゼ活性及びマンナナーゼ活性を測定した。
【０１４５】
セルラーゼ分析
セルラーゼ活性は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）中で基質として４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−セロビオシド（４ＭＵＣ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｍ６０１８）を使用して測定した。標準セルラーゼ組成物（すなわち、ＥＧ３セルラーゼ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を参照として使用した。サンプル組成物（例えば、ヒドロホビンを含む発酵ブロス）及び標準セルラーゼ組成物のシリーズの希釈液を調製し、４ＭＵＣ試薬を用いて４０℃で１時間、プレート培養器内で４００ｒｐｍで振盪させることによってインキュベートした。
【０１４６】
以下のパラメーターを使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ蛍光プレートリーダー上で蛍光を読み取った：励起＝３６０ｎｍ、発光＝４６０ｎｍ、オートカットオフ＝４５５ｎｍ。実験サンプルによって生成された蛍光シグナルの量を、標準セルラーゼ組成物によって精製された蛍光シグナルの量と相関させ、ＮＰＣ／ｍＬ＝遊離したｏ−ニトロフェノールμｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍＬ（セルラーゼ活性の標準測定値）として報告した。
【０１４７】
マンナナーゼ分析
マンナナーゼ活性は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）中で基質として４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−マンノピラノシド（４ＭＵＭ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｍ０９０５）を使用して測定した。標準マンナナーゼ組成物（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を参照として使用した。サンプル組成物（例えば、ヒドロホビンを含む発酵ブロス）及び標準マンナナーゼ組成物のシリーズの希釈液を調製し、４ＭＵＭ試薬を用いて４０℃で１時間、プレート培養器内で４００ｒｐｍで振盪させることによってインキュベートする。
【０１４８】
以下のパラメーターを使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ蛍光プレートリーダー上で蛍光を読み取った：励起＝３６０ｎｍ、発光＝４６０ｎｍ、オートカットオフ＝４５５ｎｍ。実験サンプルによって生成された蛍光シグナルの量を、標準マンナナーゼ組成物によって精製された蛍光シグナルの量と相関させ、ＭＵ／Ｌ＝遊離したｏ−ニトロフェノールμｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍＬとして報告した。
【０１４９】
ヒドロホビンの分析は、上述のように行った。
【０１５０】
上述のように生成されるヒドロホビン含有発酵ブロス組成物における残留セルラーゼ及びマンナナーゼ活性は、上述のように、試料を４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−セロビオシド（セルラーゼ）又は４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−アンノピラノシド（マンナナーゼ）でインキュベートすることによって試験し、これらの値を、ＥＧ３セルラーゼ基準又はマンナナーゼ基準（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を使用して得られたもの（thos）と比較した。データ（表５に示される）は、溶液１ｍＬ（若しくは１Ｌ）当たりの活性として、又はヒドロホビン１グラム当たりの活性として表わされる。この発酵ブロス組成物において、精密濾過によって細胞を除去し、タンパク質を限外濾過によって濃縮したが、ヒドロホビンと他のタンパク質、例えば、残留マンナナーゼ及びセルラーゼとの比率を変更するための精製工程は行わなかった。
【０１５１】
【表６】
2014503185.tif 000008
【０１５２】
表に示されるように、残留マンナナーゼ及び特にセルラーゼ活性のレベルは、熱処理後に著しく低減した。
【０１５３】
実施例７．ｅｇｌ５−欠失した株におけるＨＦＢ２発現
ｐＴｒｅｘ８Ｒ（Ｈｆｂ２）及びｐＴｒｅｘ３ｇＭ（Ｈｆｂ２）の構成
２つのベクターはいずれも、強力なｃｂｈＩプロモーターの制御下で、その天然コード配列からＨＦＢ２の発現を駆動するように設計された。２つのベクターの発現カセットは同一であり、これら２つの分子間の唯一の相違は、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ（Ｈｆｂ２）は選択可能なマーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を有するが、ｐＴｒｅｘ８Ｒ（Ｈｆｂ２）はｐｙｒ２を有することである。いずれのベクターも、ＬＲ−Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローン化手順により、ｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ／Ｄベクター及び目的地ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ及びｐＴｒｅｘ８Ｒにおいてクローン化されたｈｆｂ２遺伝子の染色体コピーを使用して構成された。表６は、プラスミドｐＴｒｅｘ８Ｒ（ｈｆｂ２）及びｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ｈｆｂ２）における機能的要素の完全リストを提供する。表６に列挙されていない任意の配列は、ＬＲ−Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）反応により生成される制限部位又は配列のように、遺伝子工学の目的で使用される、ＤＮＡの短い断片である。プラスミドｐＴｒｅｘ８Ｒ（Ｈｆｂ２）及びｐＴｒｅｘ３ｇＭ（Ｈｆｂ２）の機能的及び部分的制限マップを、図１２に提供する。それらの完全ヌクレオチド配列を図１３に列挙する。
【０１５４】
【表７】
2014503185.tif 000009
【０１５５】
ＨＦＢ２発現カセットによるトリコデルマリーゼイ（T. reesei）ＤＵＤ５の形質転換
形質転換は、２つの連続段階で行った。最初に、株ＤＵＤ５を、プラスミドｐＴｒｅｘ８Ｒ（ｈｆｂ２）の単離された大ＳｆｉＩ断片を用いて、標準プロトプラスト変換技法を使用してウリジン原栄養に形質転換した。ランダムな形質転換細胞群の培養培地をスクリーニングした後、高レベルのＨＦＢ２発現のために３つのクローン（ＤＵＤ５  ＨＦＢ＃１７６、＃１９４、及び＃２２８）を選択した。これらの単離体は、プラスミドｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ｈｆｂ２）の大ＳｆｉＩ断片によって、アセトアミド同化表現型に更に形質転換した。２回目のスクリーニング後（同様に、ｃｂｈＩプロモーターを誘導する条件下で、液体培養物中で個別の形質転換細胞を増殖させ、培養培地をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって解析することによって）、クローンＤＵＤ５  ＨＦＢ２  Ｂ、ＤＵＤ５  ＨＦＢ２  Ｄ、ＤＵＤ５  ＨＦＢ２  Ｋ、及びＤＵＤ５  ＨＦＢ２  Ｎを最善のＨＦＢ２生成体として選択した。
【０１５６】
本発明は、以下の番号付き項目によって更に説明される。
【０１５７】
１．熱安定性ＥＧＶポリペプチドの生成を実質的に低減又は防止するように修飾されるトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１５８】
２．破壊されたｅｇｌ５遺伝子を含む、項目１に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１５９】
３．欠失されたｅｇｌ５遺伝子を含む、項目１又は２に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６０】
４．ｅｇｌ５遺伝子が相同組換えによって欠失される、項目１〜３のいずれか一項に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６１】
５．機能的ｅｇｌ５遺伝子を含む親宿主細胞を修飾することによって生成される、項目１〜４のいずれか一項に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６２】
６．熱不安定性酵素をコードする１つ以上の内因性機能的遺伝子を更に含む、項目１〜５のいずれか一項に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６３】
７．セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、及びプロテアーゼからなる群から選択される熱不安定性酵素をコードする１つ以上の機能的遺伝子を更に含む、項目１〜６のいずれか一項に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６４】
８．熱不安定性セルラーゼ又はヘミセルラーゼをコードする機能的遺伝子を更に含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６５】
９．所望の機能的遺伝子を更に含む、項目１〜８のいずれか一項に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６６】
１０．所望の遺伝子が、熱安定性ポリペプチドをコードする、項目９に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６７】
１１．熱安定性ポリペプチドがヒドロホビンである、項目１０に記載のトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞。
【０１６８】
１２．トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で所望の熱安定性タンパク質を作製するための方法であって、
所望の熱安定性タンパク質をコードする遺伝子を、破壊されたｅｇｌ５遺伝子と、追加の機能的タンパク質をコードする１つ以上の内因性遺伝子と、を有するをトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の中に導入する工程と、
所望のタンパク質及び追加の機能的タンパク質を生成するために好適な培地において宿主細胞をインキュベートする工程と、
所望のタンパク質及び追加の機能的タンパク質を、該追加のタンパク質を実質的に不活性化するのに十分な昇温状態に曝す工程と、を含み、
その昇温状態が、所望の熱安定性タンパク質を不活性化するのに不十分であり、かつ機能的ｅｇｌ５遺伝子により生成されるＥＧＶセルラーゼを不活性化するのに不十分であり、
その所望の熱安定性タンパク質が、追加のタンパク質からの活性の実質的に非存在下で、活性形態又は機能的形態で生成される、方法。
【０１６９】
１３．トリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で所望の熱安定性タンパク質を作製するための方法であって、
所望の熱安定性タンパク質及び１つ以上の追加の機能的タンパク質を、所望のタンパク質をコードする遺伝子と、破壊されたｅｇｌ５遺伝子と、１つ以上の追加の機能的タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子と、を含むトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で生成する工程と、
その宿主細胞から得られたタンパク質混合物を、１つ以上の追加の機能的タンパク質を実質的に不活性化するのに十分であるが、所望の熱安定性タンパク質及び機能的ｅｇｌ５により生成されるＥＧＶセルラーゼを不活性化するには不十分である、昇温状態に曝す工程と、を含み、
所望の熱安定性タンパク質が、追加のタンパク質からの活性の実質的に非存在下で、活性形態又は機能的形態で生成される、方法。
【０１７０】
１４．所望の熱安定性タンパク質をトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞内で作製するための方法であって、所望の熱安定性タンパク質をコードする遺伝子と、破壊されたｅｇｌ５遺伝子と、追加の機能的タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子と、を含むトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞から得られたタンパク質混合物を昇温状態に曝して、１つ以上の追加の機能的タンパク質を不活性化し、それによって追加の機能的タンパク質からの活性の非存在下で、活性形態又は機能形態で、所望の熱安定性タンパク質を生成する工程を含む。
【０１７１】
１５．ｅｇｌ５遺伝子が、ｅｇｌ５遺伝子を自然に含む宿主細胞内で破壊される、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１７２】
１６．ｅｇｌ５遺伝子が、ｅｇｌ５遺伝子を自然に含む宿主細胞内で欠失される、項目１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【０１７３】
１７．ｅｇｌ５が、相同組換えによって欠失される、項目１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０１７４】
１８．１つ以上の追加のタンパク質が、熱不安定性タンパク質である、項目１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【０１７５】
１９．１つ以上の追加のタンパク質が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、及びプロテアーゼからなる群から選択される、項目１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【０１７６】
２０．１つ以上の追加のタンパク質が、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ−グルコシダーゼからなる群から選択される、項目１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【０１７７】
２１．所望のタンパク質が、可逆的に熱変性可能性であることに基づいて熱安定性である、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０１７８】
２２．所望のタンパク質が、ヒドロホビンである、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０１７９】
２３．昇温状態が、９０℃以上である、項目１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１８０】
２４．昇温状態への暴露が、５分以上の時間の間である、項目１２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【０１８１】
２５．昇温状態への暴露が、６０分以上の時間の間である、項目１２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【０１８２】
２６．項目１２〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成される、熱安定性又は可逆的に熱変性可能性なタンパク質。
【０１８３】
２７．糸状菌宿主細胞から得られ、かつヒドロホビンポリペプチドを含む発酵ブロス組成物であって、当該発酵ブロスが、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を実質的に含まない、発酵ブロス組成物。
【０１８４】
２８．ヒドロホビンポリペプチドが、熱不安定性セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドの存在下で生成され、かつセルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドを不活性化するように昇温状態に曝される、項目２７に記載の発酵ブロス組成物。
【０１８５】
２９．ヒドロホビンポリペプチドが、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドをコードする破壊された遺伝子を有する宿主細胞内で生成される、項目２７に記載の発酵ブロス組成物。
【０１８６】
３０．ヒドロホビンポリペプチドが、セルラーゼ及び／又はマンナナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を欠失する宿主細胞内で生成される、項目２７に記載の発酵ブロス組成物。
【０１８７】
したがって、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明したが、上記項目により定
義される発明は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、その多くの明らかな変型が可能であるため、上記説明に記載された特定の詳細に限定されるものではないことを理解されたい。
【図１】
2014503185.tif 000010
【図２】
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【図３】
2014503185.tif 000012
【図４】
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【図５】
2014503185.tif 000014
【図６】
2014503185.tif 000015
【図７Ａ】
2014503185.tif 000016
【図７Ｂ】
2014503185.tif 000017
【図８】
2014503185.tif 000018
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2014503185.tif 000020
【図９Ｃ】
2014503185.tif 000021
【図９Ｄ】
2014503185.tif 000022
【図１０】
2014503185.tif 000023
【図１１】
2014503185.tif 000024
【図１２】
2014503185.tif 000025
【図１３Ａ】
2014503185.tif 000026
【図１３Ｂ】
2014503185.tif 000027
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2014503185.tif 000029
【配列表】
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【国際調査報告】
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