(57)【要約】  セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができ、前記方法が、（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、および、（ｂ）工程（ａ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにすることを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができ、前記方法が、
（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、および、
（ｂ）工程（ａ）から生じる前記細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにし、それにより、前記単離された細胞集団を作製すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ＰＢＭＣに由来する非接着性細胞を工程（ａ）の前に枯渇化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＢＭＣに由来するＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を工程（ａ）の前に枯渇化することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ４５ＲＡ＋細胞および／またはＣＤ４５ＲＯ−細胞を工程（ａ）の前に前記ＰＢＭＣから選択することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＢＭＣはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）から生じる前記細胞を、工程（ａ）の後で、工程（ｂ）の前に、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）とともに培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第三者抗原（１つまたは複数）は樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記樹状細胞は、放射線照射された樹状細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第三者抗原（１つまたは複数）が、第三者細胞、細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、タンパク質抽出物、自己の提示細胞によって、非自己の提示細胞によって、または、人工小胞もしくは人工抗原提示細胞に提示される精製されたタンパク質および合成されたペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第三者細胞は、末梢血リンパ球、脾臓またはリンパ節、サイトカイン動員されたＰＢＬ、インビトロ拡大培養された抗原提示細胞（ＡＰＣ）、インビトロ拡大培養された樹状細胞、および人工抗原提示細胞から精製される細胞からなる群から選択される刺激細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、移植片対白血病（ＧＶＬ）活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができ、前記方法が、
（ａ）非接着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を枯渇化することができる作用因により処理して、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るようにすること、
（ｂ）前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において第三者樹状細胞と１２時間〜５日間接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、
（ｃ）工程（ｂ）から生じる前記細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記第三者樹状細胞とともに１２時間〜３日間培養すること、および、
（ｄ）工程（ｃ）から生じる前記細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において５日間〜２０日間培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにし、それにより、前記単離された細胞集団を作製すること
を含む方法。
【請求項１２】
セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、前記細胞は抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができ、前記方法は、
（ａ）非接着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を枯渇化することができる作用因により処理して、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るようにすること、
（ｂ）前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において非同系樹状細胞と１２時間〜５日間接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、
（ｃ）工程（ｂ）から生じる前記細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記非同系樹状細胞とともに１２時間〜３日間培養すること、および、
（ｄ）工程（ｃ）から生じる前記細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において５日間〜２０日間培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにし、それにより、前記単離された細胞集団を作製すること
を含む方法。
【請求項１３】
ＣＤ４５ＲＡ＋細胞および／またはＣＤ４５ＲＯ−細胞を、工程（ａ）の後で、工程（ｂ）の前に前記ＰＢＭＣから選択することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記樹状細胞は、インビトロ拡大培養された樹状細胞を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹状細胞は、放射線照射された樹状細胞を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＬ−２１の存在下において接触させることが１２時間〜５日間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２１の存在下において接触させることが２〜３日間行われる、請求項１，１１または１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩＬ−２１の存在下において接触させることが３日間行われる、請求項１，１１または１２に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）の後で、工程（ｂ）の前に、活性化された細胞について選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）の後で、工程（ｃ）の前に、活性化された細胞について選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記活性化された細胞について選択することが、ＣＤ１３７＋細胞および／またはＣＤ２５＋細胞を選択することによって行われる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化された細胞について選択することが、前記接触させることの１２時間後〜７２時間後に行われる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記第三者抗原（１つまたは複数）とともに培養することが１２時間〜３日間行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原非存在の環境で、前記ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養することが５日間〜２０日間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原非存在の環境で、前記ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養することが７日間〜１１日間行われる、請求項１，１１または１２に記載の方法。
【請求項２７】
同種反応性細胞を工程（ｂ）の後で枯渇化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
同種反応性細胞を工程（ｄ）の後で枯渇化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記同種反応性細胞を枯渇化することが、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）を含む前記細胞を宿主の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させた後でＣＤ１３７＋細胞および／またはＣＤ２５＋細胞を枯渇化することによって行われる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は対象に対して同系である、請求項１または１２に記載の方法。
【請求項３１】
前記末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は対象に対して非同系である、請求項１または１１に記載の方法。
【請求項３２】
前記非同系ＰＢＭＣは対象に対して異種または同種である、請求項１１または３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｔセントラルメモリー表現型を有する前記抗第三者細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含む、請求項１，１１または１２に記載の方法。
【請求項３４】
前記単離された細胞集団の少なくとも５０％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、その少なくとも５０％が前記シグナチャーを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団であって、前記単離された細胞集団の少なくとも５０％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、その少なくとも５０％が、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含み、さらに、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる、単離された細胞集団。
【請求項３６】
セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団であって、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができ、請求項１〜３４に記載の方法に従って作製される、単離された細胞集団。
【請求項３７】
悪性疾患、ウイルス性疾患および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に請求項３５または３６に記載の単離された細胞集団の治療効果的な量を投与し、それにより、前記対象を処置することを含む方法。
【請求項３８】
前記悪性疾患は白血病またはリンパ腫を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離された細胞集団は前記対象と同系である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離された細胞集団は前記対象と非同系である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
細胞移植または組織移植を必要としている対象を処置する方法であって、
（ａ）細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること、および、
（ｂ）前記対象に請求項３５または３６に記載の単離された細胞集団の治療効果的な量を投与し、それにより、前記対象を処置すること
を含む方法。
【請求項４２】
前記対象を、前記移植する前に、亜致死的条件、致死的条件または超致死的条件のもとで前処理することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞移植片または組織移植片は前記対象と同系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞移植片または組織移植片は、ＨＬＡ同一の同種ドナー、ＨＬＡ非同一の同種ドナー、および、異種ドナーからなる群から選択されるドナーに由来する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞移植片または組織移植片は未成熟造血細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞移植片または組織移植片が、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、腸、および、リンパ系／造血系の組織または臓器からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞移植または組織移植は複数の臓器の同時移植を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記同時移植は、未成熟造血細胞および実質臓器を移植することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記未成熟造血細胞および前記実質臓器が、同じドナーから得られる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記未成熟造血細胞が、前記実質臓器の移植の前に、または、前記実質臓器の移植と同時に、または、前記実質臓器の移植の後で移植される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記単離された細胞集団が、前記細胞移植または組織移植の前に、あるいは、前記細胞移植または組織移植と同時に、あるいは、前記細胞移植または組織移植の後で投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記単離された細胞集団は前記対象と同系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記単離された細胞集団は前記対象と非同系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞移植片または組織移植片および前記単離された細胞集団は、同じドナーに由来する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞移植片または組織移植片は前記対象と同系であり、かつ、前記単離された細胞集団は前記対象と非同系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞移植片または組織移植片は前記対象と同系であり、かつ、前記単離された細胞集団は前記対象と同系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
未成熟造血細胞の移植を必要としている対象を処置する方法であって、
（ａ）未成熟造血細胞を前記対象に移植すること、および、
（ｂ）前記対象に請求項３５または３６に記載の単離された細胞集団の治療効果的な量を投与し、それにより、前記対象を処置すること
を含む方法。
【請求項５８】
前記単離された細胞集団が、前記未成熟造血細胞の前に、または、前記未成熟造血細胞と同時に、または、前記未成熟造血細胞の後で投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記未成熟造血細胞および前記単離された細胞集団は、同じドナーに由来する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ドナーは前記対象と非同系である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記未成熟造血細胞および前記単離された細胞集団は、前記対象に由来する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象を、前記移植する前に、亜致死的条件、致死的条件または超致死的条件のもとで前処理することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象はヒト対象である、請求項３７，４１または５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴリンパ球表現型を含む寛容誘導性および／または移植片対白血病反応性の抗第三者細胞に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、当該細胞の作製方法、ならびに、移植および疾患処置における当該細胞の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄（ＢＭ）移植は、血液学的悪性腫瘍および他の血液学的障害を有する多くの患者のための治療的処置を提供する。しかしながら、ＢＭ移植片は、宿主抗原（Ａｇ）に応答し、多系統の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすドナーのＴ細胞を含有する。８０年代初期において、ＧＶＨＤの有害影響を伴わない骨髄移植（ＢＭＴ）が、ハプロタイプ一致の（３つのＨＬＡ遺伝子座が一致していない）状況で、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者において実証された。ＧＶＨＤの問題は、そのような状況ではほとんど一様に致死的であるが、Ｔ細胞枯渇によって完全に防止された。
【０００３】
しかしながら、白血病患者では、ＧＶＨＤ防止の利益が移植片拒絶反応の著しく増大した割合によって相殺されたので、Ｔ細胞枯渇ＢＭの臨床的結果は期待はずれであった。拒絶反応が、放射線化学療法抵抗性の宿主由来のＴ細胞によって媒介されることが示された［Ｒｅｉｓｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、（１９８６）、８３：４０１２〜４０１５］。この問題を克服するための１つの方法が、ＢＭＴを、免疫抑制薬物を使用する宿主Ｔ細胞の超致死的前処理および機能的不活性化の後で行うことである。それにもかかわらず、この戦略は、遅い免疫再構成に起因する日和見感染症および免疫抑制剤の少なからぬ毒性によって妨げられている。
【０００４】
高リスクの白血病患者では、そのような移植関連の死亡率は許容され得るが、平均余命が長い患者に適用されるならば、この死亡率は容認できないと思われる。したがって、ＧＶＨＤに対する低下した危険性と関連するＴ枯渇ＢＭ（ＴＤＢＭ）移植片の生着を可能にするために、軽減された強度の前処理をそれほど激しくない免疫消失とともに使用することが、正当化される。ドナータイプのキメラ現象をそのような軽減された前処理のもとで確立することが、移植生物学における最も望ましい目標といえる。これには、元のドナーに由来する細胞または組織に対する長続きする寛容性が一般に伴うからである。それにもかかわらず、著しいレベルの宿主免疫細胞が穏和な一連の調製処理法の最後まで残ることが、ドナー細胞の生着のための困難な障壁となっている。
【０００５】
同種ＴＤＢＭの拒絶反応を克服するための１つの取り組みでは、大量の細胞が使用された。「大用量」のＴＤＢＭ移植により、Ｔ細胞媒介の移植片拒絶反応が克服され得ることが、齧歯類モデルにおいて初めて明らかにされた［Ｌａｐｉｄｏｔ他、Ｂｌｏｏｄ、（１９８９）、７３：２０２５〜２０３２；Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、（１９９５）、１：１２６８〜１２７３；Ｕｈａｒｅｋ他、Ｂｌｏｏｄ、（１９９２）、７９：１６１２〜１６２１］。しかしながら、ＢＭ接種物における著しい増大はこれまで、ヒトにおいて達成することが困難であった。この問題を克服するために、ＢＭからの造血幹細胞（ＨＳＣ、ヒトではＣＤ３４＋細胞）の動員を促進させる顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、血液から採取されるＨＳＣの産生量を増大させるために使用されてきており、また、Ｔ細胞枯渇ＨＳＣが従来のＴＤＭＢに補充された［Ａｖｅｒｓａ他、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、（１９９８）、３３９：１１８６〜１１９３；Ａｖｅｒｓａ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、（２００５）、２３：３４４７〜３４５４；ＲｅｉｓｎｅｒおよびＭａｒｔｅｌｌｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、（１９９９）、２０：３４３〜３４７；Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ他、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、（２００１）、２７：７７７〜７８３］。
【０００６】
ＣＤ３４の「大用量」移植は、これらの細胞が、宿主の細胞傷害性Ｔリンパ球前駆体（ＣＴＬ−ｐ）によって示されるバリアをどのように克服するかに関する興味深い疑問を提起した。この疑問に対する答えが部分的には、ＣＤ３４画分内の細胞が、強力な拒否活性を備えるという発見によってもたらされた［Ｇｕｒ他、Ｂｌｏｏｄ、（２００５）、１０５：２５８５〜２５９３；Ｇｕｒ他、Ｂｌｏｏｄ、（２００２）、９９：４１７４〜４１８１；Ｒａｃｈａｍｉｍ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、（１９９８）、６５：１３８６〜１３９３］。他の細胞タイプもまた、拒否活性を媒介することが示されており、これらには、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞が含まれる。様々な細胞タイプの拒否反応性の直接的な比較により、ＣＴＬが最も強い拒否効果を含むことが明らかにされた［Ｒｅｉｃｈ−Ｚｅｌｉｇｅｒ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２００４）、１７３：６６５４〜６６５９］。
【０００７】
ベトＣＴＬを、ＧＶＨ反応性を伴うことなく作製するために開発された１つの取り組みが、Ｒｅｉｓｎｅｒおよび共同研究者によって記載され、この場合、ＣＴＬが内因性ＩＬ−２の非存在下において第三者刺激細胞に対して刺激された。この取り組みは、活性化されたＣＴＬｐのみが初代培養においてＩＬ−２遮断を生き延びることができたという観測結果に基づいていた。この方法は、第三者ベトＣＴＬからのＧＶＨ反応性を激減させることがインビトロおよびインビボで示された［ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１／０４９２４３；Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇ他、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０２：１９４３〜１９５０；Ａｖｉｎｅｒ他、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２００５）、６６：６４４〜６５２］。これらの第三者ベトＣＴＬを（移植片と一緒に）レシピエントに導入することにより、移植片拒絶反応が、ＧＶＨＤを誘導することなく防止された（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１／０４９２４３）。
【０００８】
様々な取り組みが、移植片拒絶反応および／または移植片対宿主病を伴わない移植片の移植のために検討されてきており、一部が下記に要約される。
【０００９】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０２３４９１は、被験者における非同系移植片の移植片拒絶反応を軽減または防止するための寛容原性細胞の使用を開示する。開示された寛容原性細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）は、被験者および移植片の両方に関して非同系であるどのようなドナーにも由来することができる（「第三者」寛容原性細胞）。移植片（例えば、骨髄）は、被験者に関して同種または異種であるどのような移植片ドナーにも由来することができる。
【００１０】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００２／１０２９７１は、ドナーからレシピエントに移植された移植片に対する寛容性を誘導するための、高まった拒否活性を含む培養された造血始原体細胞（ＨＰＣ）の使用を開示する。開示される寛容原性細胞は好ましくは、ＣＤ３３を発現しており、移植片（例えば、細胞移植片または臓器移植片）の移植の前に、またはその移植と同時に、またはその移植の後で投与される。
【００１１】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００２／０４３６５１は、免疫エフェクター細胞のＧＶＨＤ非誘導性集団の、疾患処置のための使用を開示する。免疫エフェクター細胞のＧＶＨＤ非誘導性集団に達するために、第１の細胞集団（例えば、Ｔリンパ球）が、被験者に関して非同系であり、かつ、第１の細胞集団に関しては非同系である第２の細胞集団（例えば、ＥＢＶ感染のＢリンパ球）と、ＩＬ−２飢餓、その後でＩＬ−２補充を含む条件のもとで共培養される。生じた免疫エフェクター細胞を、悪性疾患、ウイルス性疾患および自己免疫疾患などの疾患を処置するために使用することができる。
【００１２】
米国特許第６７５９０３５号は、実質臓器移植片のレシピエントにおいて移植片拒絶反応を阻害し、かつ、Ｔ細胞寛容性を誘導する方法を開示する。開示される方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をドナーおよびレシピエントから取り出すこと、ドナーおよびレシピエントの前記細胞を、Ｔ細胞サプレッサー活性を誘導する化合物（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５およびＩＬ−２）の存在下において一緒に培養すること、そして、レシピエントのサプレッサーＴ細胞を、レシピエントのＴ細胞がドナーの細胞を殺傷することを防止するために移植片と一緒にレシピエントに投与し、それにより、移植片の寛容性および長期生存を誘導することを含む。
【００１３】
米国特許第６８０３０３６号は、ドナーの細胞を、レシピエント患者における移植片対宿主病を改善するために処理するための方法を開示する。開示される方法は、ＰＢＭＣをドナーから取り出すこと、および、前記細胞を、Ｔ細胞寛容性を誘導するために十分な期間にわたって抑制組成物（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５およびＴＧＦ−β）により処理することを含む。細胞がその後、レシピエント患者に導入される。処理された細胞を患者への導入の前にドナーの幹細胞に加えることができる。
【００１４】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０４９９３５は、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有するＧＶＨＤ非誘導の第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を開示した。
【発明の概要】
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、および、（ｂ）工程（ａ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにし、それにより、前記単離された細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、移植片対白血病（ＧＶＬ）活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、（ａ）非接着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を枯渇化することができる作用因により処理して、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るようにすること、（ｂ）前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において第三者樹状細胞と１２時間〜５日間接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、（ｃ）工程（ｂ）から生じる細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記第三者樹状細胞とともに１２時間〜３日間培養すること、および、（ｄ）工程（ｃ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において５日間〜２０日間培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにし、それにより、前記単離された細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、（ａ）非接着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を枯渇化することができる作用因により処理して、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るようにすること、（ｂ）前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において非同系樹状細胞と１２時間〜５日間接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、（ｃ）工程（ｂ）から生じる細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記非同系樹状細胞とともに１２時間〜３日間培養すること、および、（ｄ）工程（ｃ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において５日間〜２０日間培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにし、それにより、前記単離された細胞集団を作製することを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離された細胞集団が提供され、ただし、この場合、前記単離された細胞集団の少なくとも５０％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、その少なくとも５０％が、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含み、さらに、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団で、本発明の方法に従って作製される単離された細胞集団が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、悪性疾患、ウイルス性疾患および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に本発明の単離された細胞集団の治療効果的な量を投与し、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、細胞移植または組織移植を必要としている対象を処置する方法であって、（ａ）細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること、および、（ｂ）前記対象に本発明の単離された細胞集団の治療効果的な量を投与し、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、未成熟造血細胞の移植を必要としている対象を処置する方法であって、（ａ）未成熟造血細胞を前記対象に移植すること、および、（ｂ）前記対象に本発明の単離された細胞集団の治療効果的な量を投与し、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＰＢＭＣに由来する非接着性細胞を工程（ａ）の前に枯渇化することを含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＰＢＭＣに由来するＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を工程（ａ）の前に枯渇化することを含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞および／またはＣＤ４５ＲＯ−細胞を工程（ａ）の前に上記ＰＢＭＣから選択することを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＰＢＭＣはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、工程（ａ）から生じる細胞を、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）とともに培養することを含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第三者抗原（１つまたは複数）は樹状細胞を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記樹状細胞は、放射線照射された樹状細胞である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第三者抗原（１つまたは複数）が、第三者細胞、細胞抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、タンパク質抽出物、自己の提示細胞によって、非自己の提示細胞によって、または、人工小胞もしくは人工抗原提示細胞に提示される精製されたタンパク質および合成されたペプチドからなる群から選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第三者細胞は、末梢血リンパ球、脾臓またはリンパ節、サイトカイン動員されたＰＢＬ、インビトロ拡大培養された抗原提示細胞（ＡＰＣ）、インビトロ拡大培養された樹状細胞、および人工抗原提示細胞から精製される細胞からなる群から選択される刺激細胞である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞および／またはＣＤ４５ＲＯ−細胞を、工程（ａ）の後で、工程（ｂ）の前に上記ＰＢＭＣから選択することを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＣＤ８＋Ｔ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記樹状細胞は、インビトロ拡大培養された樹状細胞を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記樹状細胞は、放射線照射された樹状細胞を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−２１の存在下において接触させることが１２時間〜５日間行われる。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−２１の存在下において接触させることが２〜３日間行われる。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−２１の存在下において接触させることが３日間行われる。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、工程（ａ）の後で、工程（ｂ）の前に、活性化された細胞について選択することを含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、工程（ｂ）の後で、工程（ｃ）の前に、活性化された細胞について選択することを含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、活性化された細胞について選択することが、ＣＤ１３７＋細胞および／またはＣＤ２５＋細胞を選択することによって行われる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、活性化された細胞について選択することが、上記接触させることの１２時間後〜７２時間後に行われる。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において上記第三者抗原（１つまたは複数）とともに培養することが１２時間〜３日間行われる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養することが５日間〜２０日間行われる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養することが７日間〜１１日間行われる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、同種反応性細胞を工程（ｂ）の後で枯渇化することを含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、同種反応性細胞を工程（ｄ）の後で枯渇化することを含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記同種反応性細胞を枯渇化することが、上記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）を含む上記細胞を宿主の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させた後でＣＤ１３７＋細胞および／またはＣＤ２５＋細胞を枯渇化することによって行われる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は対象に対して同系である。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は対象に対して非同系である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記非同系ＰＢＭＣは対象に対して異種または同種である。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔセントラルメモリー表現型を有する上記抗第三者細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含む。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団の少なくとも５０％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、その少なくとも５０％が上記シグナチャーを有する。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記悪性疾患は白血病またはリンパ腫を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は上記対象と同系である。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は上記対象と非同系である。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記対象を、上記移植する前に、亜致死的条件、致死的条件または超致死的条件のもとで前処理することを含む。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片は上記対象と同系である。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片は、ＨＬＡ同一の同種ドナー、ＨＬＡ非同一の同種ドナー、および、異種ドナーからなる群から選択されるドナーに由来する。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片は未成熟造血細胞を含む。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片が、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、腸、および、リンパ系／造血系の組織または臓器からなる群から選択される。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植または組織移植は複数の臓器の同時移植を含む。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記同時移植は、未成熟造血細胞および実質臓器を移植することを含む。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記未成熟造血細胞および上記実質臓器が、同じドナーから得られる。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記未成熟造血細胞が、上記実質臓器の移植の前に、または、上記実質臓器の移植と同時に、または、上記実質臓器の移植の後で移植される。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団が、上記細胞移植または組織移植の前に、あるいは、上記細胞移植または組織移植と同時に、あるいは、上記細胞移植または組織移植の後で投与される。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は上記対象と同系である。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は上記対象と非同系である。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片および上記単離された細胞集団は、同じドナーに由来する。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片は上記対象と同系であり、かつ、上記単離された細胞集団は上記対象と非同系である。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞移植片または組織移植片は上記対象と同系であり、かつ、上記単離された細胞集団は上記対象と同系である。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団が、上記未成熟造血細胞の前に、または、上記未成熟造血細胞と同時に、または、上記未成熟造血細胞の後で投与される。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記未成熟造血細胞および上記単離された細胞集団は、同じドナーに由来する。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ドナーは上記対象と非同系である。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記未成熟造血細胞および上記単離された細胞集団は、上記対象に由来する。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記対象を、上記移植する前に、亜致死的条件、致死的条件または超致死的条件のもとで前処理することを含む。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記対象はヒト対象である。
【００７８】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００８０】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｂは、ヒトの自己状況（図１Ａ）および同種状況（図１Ｂ）を示す概略図である。注目すべきことに、これら２つの状況は、骨髄（ＢＭ）ドナーの起源（宿主対同種）、Ｔｃｍ作製に関与する応答細胞（宿主対同種）および刺激細胞（任意の同種ドナー対宿主ＭＨＣ交差非反応性第三者）において互いに異なる。
【００８１】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｂは、マウスの同系状況（図２Ａ）および同種状況（図２Ｂ）を示す概略図である。注目すべきことに、これら２つの状況は、ＢＭドナーの起源（同系またはＦ１対同種）、Ｔｃｍ作製に関与する応答細胞（同系またはＦ１対同種）および刺激細胞（同種対第三者）において互いに異なる。
【００８２】
【図３Ａ】図３Ａは、Ｔｃｍを作製するための自己ヒト用プロトコル（図３Ａ）を同系マウス用プロトコル（図３Ｂ）との比較で示す概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、同系マウス用プロトコル（図３Ｂ）をＴｃｍを作製するための自己ヒト用プロトコル（図３Ａ）との比較で示す概略図である。
【００８３】
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは抗第三者セントラルメモリー作製（「参照コントロール実験」）の速度論を示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において４：１の比率で３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞を、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含有する培地において１２．５日目まで拡大培養した。７．５日目、１０．５日目および１２．５日目に、細胞を、ＦＡＣＳ分析を使用して表現型（表面マーカー発現）（図４Ａ）、および、ＣＤ８  Ｔ細胞からのＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合（図４Ｂ）について評価し、トリパンブルー排除によって細胞数について評価した（図４Ｃ）。それぞれの時点について、データは、ｎ回の独立した実験の平均±ＳＥを表す。
【００８４】
【図５Ａ】図５Ａは、同種ＤＣによる初回抗原刺激の役割を明らかにする典型的な実験を示す。注目すべきことに、ＩＬ−２１単独、または、ＩＬ−７＋ＩＬ−１５は、ＤＣの初回抗原刺激を伴わない場合、セントラルメモリー表現型をナイーブＣＤ８  Ｔ細胞において誘導せず、また、それらの拡大培養を十分には支援していない。図５Ａは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において４：１の比率で３日間刺激されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”＝ｄ（０−３）ＩＬ２１＋ＤＣ  ｄ（３−１３）ＩＬ７＋ＩＬ１５）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、同種ＤＣによる初回抗原刺激の役割を明らかにする典型的な実験を示す。注目すべきことに、ＩＬ−２１単独、または、ＩＬ−７＋ＩＬ−１５は、ＤＣの初回抗原刺激を伴わない場合、セントラルメモリー表現型をナイーブＣＤ８  Ｔ細胞において誘導せず、また、それらの拡大培養を十分には支援していない。図５Ｂは、ＩＬ−２１とともに、刺激の非存在下、１０日目または１３日目までそれぞれ培養されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。
【図５Ｃ】図５Ｃは、同種ＤＣによる初回抗原刺激の役割を明らかにする典型的な実験を示す。注目すべきことに、ＩＬ−２１単独、または、ＩＬ−７＋ＩＬ−１５は、ＤＣの初回抗原刺激を伴わない場合、セントラルメモリー表現型をナイーブＣＤ８  Ｔ細胞において誘導せず、また、それらの拡大培養を十分には支援していない。図５Ｃは、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の組合せとともに、刺激の非存在下、１０日目または１３日目までそれぞれ培養されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。
【００８５】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、参照コントロール群と比較してＴｃｍレベルおよび拡大倍数に対する平均相対的影響によって明らかにされる、同種ＤＣによる初回免疫刺激の役割を示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において４：１の比率で３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”＝ｄ（０−３）ＩＬ２１＋ＤＣ  ｄ（３−１３）ＩＬ７＋ＩＬ１５）。代替として、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、ＩＬ−２１とともに、または、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の組合せとともに、刺激の非存在下、１３日目まで培養した。細胞をトリパンブルー排除によって細胞数について評価し（図６Ａ）、ＦＡＣＳ分析を使用してＣＤ８  Ｔ細胞からのＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合について評価した（図６Ｂ）。それぞれの時点について、データは、ｎ回の独立した実験の平均±ＳＥを表す。
【００８６】
【図７Ａ】図７Ａは、抗第三者Ｔｃｍの初回免疫刺激段階および拡大培養段階におけるＩＬ−２１の役割を明らかにする典型的な実験を示す。注目すべきことに、初回免疫刺激段階からのＩＬ−２１の除去は拡大培養およびＴｃｍ誘導の両方を低下させ、一方、培養期間中を通したＩＬ−２１の存在はＴｃｍ誘導を増大させた。図７Ａは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において４：１の比率で３日間刺激されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”＝ｄ（０−３）ＩＬ２１＋ＤＣ  ｄ（３−１３）ＩＬ７＋ＩＬ１５）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗第三者Ｔｃｍの初回免疫刺激段階および拡大培養段階におけるＩＬ−２１の役割を明らかにする典型的な実験を示す。注目すべきことに、初回免疫刺激段階からのＩＬ−２１の除去は拡大培養およびＴｃｍ誘導の両方を低下させ、一方、培養期間中を通したＩＬ−２１の存在はＴｃｍ誘導を増大させた。図７Ｂは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の非存在下において４：１の比率で３日間刺激されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞はさらなる活性化を受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、抗第三者Ｔｃｍの初回免疫刺激段階および拡大培養段階におけるＩＬ−２１の役割を明らかにする典型的な実験を示す。注目すべきことに、初回免疫刺激段階からのＩＬ−２１の除去は拡大培養およびＴｃｍ誘導の両方を低下させ、一方、培養期間中を通したＩＬ−２１の存在はＴｃｍ誘導を増大させた。図７Ｃは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の非存在下において４：１の比率で３日間刺激されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞は放射線照射された同種第三者ＤＣにより、４：１の比率で、初回免疫刺激段階（ＩＬ−２１単独）および拡大培養段階（ＩＬ−７およびＩＬ−１５と一緒）の両方においてＩＬ−２１の連続した存在とともに刺激した（図７Ｃ）。
【００８７】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｂは、最適なＴｃｍ産生（数回の独立した実験の平均）のためにＩＬ−２１が要求されることを示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を上記のように処理し、培養物をトリパンブルー排除によって細胞数について評価し（図８Ａ）、ＦＡＣＳ分析を使用してＣＤ８  Ｔ細胞からのＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合について評価した（図８Ｂ）。それぞれの実験の結果が別々に示され、線はｎ回の実験についての平均結果を示している。
【００８８】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｂは、Ｔｃｍ表現型の誘導およびロバストな拡大培養のための最適な応答細胞／ＤＣ比率を示す。４×１０５個のナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、増大する数での放射線照射された同種第三者ＤＣに対して、ＩＬ−２１の存在下において３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”＝ｄ（０−３）ＩＬ２１＋１００００ＤＣ  ｄ（３−１３）ＩＬ７＋ＩＬ１５）。培養物をトリパンブルー排除によって細胞数について評価し（図９Ａ）、ＦＡＣＳ分析を使用してＣＤ８  Ｔ細胞からのＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合について評価した（図９Ｂ）。それぞれの実験の結果が別々に示され、線はｎ回の実験についての平均結果を示している。
【００８９】
【図１０】図１０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の濃縮に対する種々のＧＭＰ規格試薬の影響の評価を示す。ドナーＰＢＭＣを、接着性の骨髄性細胞を除くために特別に設計されたプレートにおける一晩のインキュベーションによって接着性細胞から枯渇させ（上段パネル）、０日目において、非接着性細胞を４つの試験群に分割し、それぞれを異なる磁気的選別プロトコルに供した。細胞をＦＡＣＳ分析によって細胞組成およびＴｃｍ表現型について評価した。左側の欄における結果（ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＡ）は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞に対してゲート制御される。結果は、行われた２回の独立した実験からの典型的な実験を表す。
【００９０】
【図１１】図１１は、Ｔｃｍ表現型を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合と、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞による混入とに対する、ＣＤ８  Ｔ細胞の単離のために使用された種々のＧＭＰ規格試薬の影響を第三者ＤＣによる刺激の７日後において示す典型的な実験を示す。ＩＬ−７単独との培養で維持された刺激されていない細胞（上段パネル）を参照として使用した。最も左側の欄における結果（ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＡ）および最も右側の欄における結果（ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ）はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞に対してゲート制御される。
【００９１】
【図１２】図１２は、Ｔｃｍ表現型を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合と、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞による混入とに対する、ＣＤ８  Ｔ細胞の単離のために使用された種々のＧＭＰ規格試薬の影響を第三者ＤＣによる刺激の１４日後において示す典型的な実験を示す。ＩＬ−７単独との培養で維持された刺激されていない細胞（上段パネル）を参照として使用した。最も左側の欄における結果（ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＡ）および最も右側の欄における結果（ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ）はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞に対してゲート制御される。
【００９２】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、Ｔｃｍ表現型を有するＣＤ８  Ｔ細胞のレベルに対する、ＣＤ８  Ｔ細胞の単離のために使用された種々のＧＭＰ規格試薬の影響を第三者ＤＣに対する７日間の刺激の後において示す。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＮＫＴ−  Ｔ細胞の平均割合（図１３Ａ）およびＴｃｍの平均割合（図１３Ｂ）が、４つすべての試薬（ＣＤ４／ＣＤ５６／ＣＤ１９／ＣＤ４５ＲＡ）を使用する最適なコントロール群において達成されるレベルのパーセントとして示される。
【００９３】
【図１４Ａ−１４Ｃ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、Ｔｃｍ表現型を有するＣＤ８  Ｔ細胞の最終的産生量に対する、ＣＤ８  Ｔ細胞の単離のために使用された種々のＧＭＰ規格試薬の影響を第三者ＤＣに対する１０日間の刺激の後において示す。１０日目における０日目からの平均拡大倍数（図１４Ａ）、および、磁気的選別後の平均産生量（図１４Ｂ）が、４つすべての選択試薬（ＣＤ４／ＣＤ５６／ＣＤ１９／ＣＤ４５ＲＡ）を使用する最適なコントロール群において達成されるレベルのパーセントとして示される。１０日目におけるＴｃｍの産生量（図１４Ｃ）を、（０日目における）磁気的選別後の産生量に（１０日目における）０日目からの拡大倍数を乗じることによって計算した。
【００９４】
【図１５】図１５は、同種ＤＣ刺激細胞のための供給源を変更することはＴｃｍ細胞の拡大培養能に対するほんの些細な影響を有しただけであったことを示す。ＣＤ８  Ｔ細胞を、解凍された白血球除去輸血から、ＣｌｉｎｉＭａｃｓシステムを使用するＣＤ４＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の枯渇化によって濃縮した。濃縮されたＣＤ８  Ｔ細胞をその後、２つの試験群に分割し、それぞれを、異なる放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において６：１の比率で、培養バッグにおいて３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含有する培地において１１日目まで拡大培養した。培養の５日目、７日目、９日目および１１日目に、細胞数をトリパンブルー排除によって求めた。
【００９５】
【図１６Ａ】図１６Ａは、同種ＤＣ刺激細胞のための供給源を変更することは細胞組成に対するほんの些細な影響を有しただけであったことを示す。ＣＤ８  Ｔ細胞を、解凍された白血球除去輸血から、ＣｌｉｎｉＭａｃｓシステムを大規模単離のために使用するＣＤ４＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の枯渇化によって濃縮した。濃縮されたＣＤ８  Ｔ細胞をその後、２つの試験群に分割し、それぞれを、異なる放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において６：１の比率で、培養バッグにおいて３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含有する培地において１１日目まで拡大培養した。培養の０日目、５日目、９日目および１２日目に、細胞をＦＡＣＳ分析によって細胞組成について評価した。すべての結果がリンホゲート（ｌｙｍｐｈｏｇａｔｅ）およびライブゲート（ｌｉｖｅ  ｇａｔｅ）（７ＡＡＤ−）からゲート制御される。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、同種ＤＣ刺激細胞のための供給源を変更することは細胞組成に対するほんの些細な影響を有しただけであったことを示す。ＣＤ８  Ｔ細胞を、解凍された白血球除去輸血から、ＣｌｉｎｉＭａｃｓシステムを大規模単離のために使用するＣＤ４＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の枯渇化によって濃縮した。濃縮されたＣＤ８  Ｔ細胞をその後、２つの試験群に分割し、それぞれを、異なる放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において６：１の比率で、培養バッグにおいて３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含有する培地において１１日目まで拡大培養した。培養の０日目、５日目、９日目および１２日目に、細胞をＦＡＣＳ分析によって細胞組成について評価した。すべての結果がリンホゲート（ｌｙｍｐｈｏｇａｔｅ）およびライブゲート（ｌｉｖｅ  ｇａｔｅ）（７ＡＡＤ−）からゲート制御される。
【００９６】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａ〜図１７Ｂは、同種ＤＣ刺激細胞のための供給源を変更することは細胞組成に対するほんの些細な影響を有しただけであったことを示す。ＣＤ８  Ｔ細胞を、解凍された白血球除去輸血から、ＣｌｉｎｉＭａｃｓシステムを使用するＣＤ４＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の枯渇化によって濃縮した。濃縮されたＣＤ８  Ｔ細胞をその後、２つの試験群に分割し、それぞれを、異なる放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において６：１の比率で、培養バッグにおいて３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含有する培地において１１日目まで拡大培養した。培養の０日目、５日目、９日目および１２日目に、細胞をＦＡＣＳ分析によってＴｃｍ表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）組成について評価した。すべての結果が、リンホゲートおよびライブゲート（７ＡＡＤ−）、ならびに、ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６−ＣＤ１６−）からゲート制御される。
【００９７】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、Ｂ細胞リンパ腫細胞株および形質細胞性白血病細胞株との２２時間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の後におけるパーセントアポトーシス細胞を示す。カルセインＡＭにより事前に標識されたＤａｕｄｉ細胞株、Ｈ．Ｍｙ２  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異細胞株またはＬ３６３細胞株を、５倍過剰の抗第三者Ｔｃｍを伴って、または伴うことなく２２時間インキュベーションした。アネキシンＶ＋細胞をＦＡＣＳによって求めた。データが、五連の培養物の平均±ＳＤとして示される。＊＊＊ｐ＜０．００１の値は、Ｔｃｍの非存在下で培養されたサンプルと比較して統計学に有意な変化を示している。
【００９８】
【図１８】図１８は、非ＣＤ８  Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球および赤血球系細胞）を、磁気ビーズ選別を使用して大々的に枯渇化することによる、移植片対白血病（ＧＶＬ）アッセイの１４日前のＣＤ８  Ｔ細胞についての濃縮を示す典型的な実験を示す。
【００９９】
【図１９Ａ−１９Ｄ】図１９Ａ〜図１９Ｄは、カルセインＡＭ（細胞死時に放出される生体染色色素）により標識され、その後、抗第三者Ｔｃｍ細胞に有利になるように１対５の比率で抗第三者Ｔｃｍ細胞を伴って、または伴うことなく２２時間インキュベーションされた、Ｈ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ（“Ｎｅｏ”）およびＨ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異トランスフェクタント（“Ｋ６６Ａ”）のＢ細胞リンパ芽球様細胞株を示す。２２時間後、細胞を回収し、ＦＡＣＳによって、生存しているカルセイン＋染色細胞の数を測定することにより生存について、また、カルセイン＋集団からのアネキシンＶ＋細胞によりアポトーシスについて分析した。図１９Ａ〜図１９Ｂおよび図１９Ｃ〜図１９Ｄは２回の独立した実験をそれぞれ表す；図１９Ａおよび図１９Ｃは死滅を示し、一方、図１９Ｂおよび図１９Ｄはアポトーシスを示す。
【０１００】
Ｂリンパ芽球系細胞死滅の割合を下記の式によって計算した：
2014526244.tif 000002
【０１０１】
負の値は、Ｂ細胞リンパ芽球細胞株がＴｃｍの存在下において増殖したことを意味する。
【０１０２】
特異的アポトーシスを受けるＢリンパ芽球系細胞の割合を下記の式によって計算した：＝（アッセイウエルにおける％カルセイン＋アネキシンＶ＋のＢリンパ芽球系細胞）−（コントロールウエルにおける％カルセイン＋アネキシンＶ＋のＢリンパ芽球系細胞）。
【０１０３】
【図２０】図２０は、Ｋ６６Ａ死滅のレベルに対する、ＣＤ８  Ｔ細胞の単離のために使用された種々のＧＭＰ規格試薬の影響を示す。Ｈ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異トランスフェクタント細胞株を、抗第三者Ｔｃｍ細胞に有利になるように１対５の比率で抗第三者Ｔｃｍ細胞を伴って、または伴うことなく２２時間インキュベーションした。２２時間後、細胞を回収し、生存しているカルセイン＋染色細胞の数をＦＡＣＳによって測定することにより生存について分析した（２回の独立した実験の平均）。４つすべての試薬（ＣＤ４／ＣＤ５６／ＣＤ１９／ＣＤ４５ＲＡ）を使用して単離された最適なコントロール群において達成されるレベルのパーセントとして示される、Ｈ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異細胞の死滅の平均パーセント。
【０１０４】
【図２１】図２１は、自己移植用のＴｃｍ作製プロトコルである。
【図２２】図２２は、同種移植用のＴｃｍ作製プロトコルを示す概略的例示である。
【０１０５】
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ〜図２３Ｂは、同種の第三者単球由来の成熟ＤＣによって刺激されるＣＤ８  Ｔ細胞におけるＴｃｍ表現型の誘導に対するサイトカイン添加時期の役割を明らかにする典型的な実験を示す。図２３Ａは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において４：１の比率で３日間刺激されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”＝ｄ（０−３）ＩＬ２１＋ＤＣ  ｄ（３−１３）ＩＬ７＋ＩＬ１５）；図２３Ｂは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で７日間刺激されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞はさらなる活性化を受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した。
【図２３Ｃ−２３Ｄ】図２３Ｃ〜図２３Ｄは、同種の第三者単球由来の成熟ＤＣによって刺激されるＣＤ８  Ｔ細胞におけるＴｃｍ表現型の誘導に対するサイトカイン添加時期の役割を明らかにする典型的な実験を示す。図２３Ｃは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、４：１の比率で、初回免疫刺激段階（ＩＬ−２１単独）および拡大培養段階（ＩＬ−１５と一緒）の両方においてＩＬ−２１の連続した存在とともに刺激されたＣＤ８  Ｔ細胞を例示する；図２３Ｄは、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、サイトカイン遮断とともに４：１の比率で７日間刺激されたＣＤ８  Ｔ細胞を例示する。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−１５単独とともに１３日目まで拡大培養した。
【０１０６】
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａ〜図２４Ｂは、ヒト同種モデルにおけるサイトカイン添加時期の役割；実験の概要を示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１を含有する培地において４：１の比率で３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１３日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”＝ｄ（０−３）ＩＬ２１→ｄ（３−１３）ＩＬ７＋ＩＬ１５）。それ以外の群は、グラフの下に示されるように処理された。細胞をトリパンブルー排除によって細胞数について評価し（図２４Ａ）、ＦＡＣＳ分析を使用してＣＤ８  Ｔ細胞からのＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合について評価した（図２４Ｂ）。それぞれの時点について、データは、示された数（ｎ）の独立した実験の平均±ＳＥを表す。
【０１０７】
【図２５】図２５は、ＣＤ１３７＋細胞の正の選択による抗第三者特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮を示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において（５．７：１の比率で）刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ１３７の発現をＦＡＣＳによって評価した。
【０１０８】
【図２６】図２６は、ＣＤ１３７＋細胞の正の選択による抗第三者特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮はＴｃｍ表現型の取得を低下させないことを示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”）。代替として、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において５．７：１の比率で刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日目まで再刺激した。その後で、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した。細胞を、ＦＡＣＳ分析によって、ＣＤ８  Ｔ細胞からのＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合について評価した。
【０１０９】
【図２７】図２７は増殖速度論の比較を示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日間刺激した。細胞はその後でのさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”）。代替として、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において５．７：１の比率で刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日目まで再刺激した。その後で、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した。１０日目に、細胞を２つの試験群に分割した。第１の群において、細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養され続け（“抗第三者ＣＤ１３７＋”）、一方、第２の試験群における細胞は、放射線照射された宿主ＰＢＭＣにより、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において（１：２の比率で）活性化された。２４時間後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別によって枯渇化した。ＣＤ１３７枯渇細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに再置床し、１４日目まで培養した（“抗第三者ＣＤ１３７＋および抗宿主ＣＤ１３７−”）。示された日に、細胞をトリパンブルー排除によって計数した。
【０１１０】
【図２８】図２８は、放射線照射された宿主ＰＢＭＣによる活性化の後でＣＤ１３７＋細胞を枯渇化することによる抗宿主特異的クローンの枯渇化を示す。培養の１０日目に、すなわち、抗第三者特異的クローンの正の選択を行った９日後に、細胞を、放射線照射された宿主ＰＢＭＣによって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において（宿主ＰＢＭＣに有利になるように１：２の比率で）活性化した。２４時間後、細胞はＣＤ１３７＋細胞が枯渇化された。ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ１３７の発現をＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０１１１】
【図２９】図２９は、ＣＤ８  Ｔ細胞の抗原特異的な活性化の後におけるＣＤ１３７のアップレギュレーションに基づく２段階の磁気的選別技術は抗宿主クローンを首尾よく枯渇化し、第三者抗原に対して特異的である細胞のパーセントを増大させることを示す。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日間刺激した。細胞はその後でのさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”）。代替として、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において５．７：１の比率で刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日目まで再刺激した。その後で、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した。１０日目に、細胞を２つの試験群に分割した。第１の群において、細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養され続け（“抗第三者ＣＤ１３７＋”）、一方、第２の試験群における細胞は、放射線照射された宿主ＰＢＭＣにより、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において（１：２の比率で）活性化された。２４時間後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別によって枯渇化した。ＣＤ１３７枯渇細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに再置床し、１４日目まで培養した（“抗第三者ＣＤ１３７＋および抗宿主ＣＤ１３７−”）。１４日目に、抗第三者および抗宿主の同種反応性を、第三者ＰＢＭＣまたは放射線照射された宿主ＰＢＭＣに対するＣＦＳＥアッセイによって評価した。ＣＦＳＥアッセイのために、１×１０６個のＣＦＳＥ＋応答細胞を、２×１０６個の放射線照射（２０Ｇｙ）されたＰＢＭＣ刺激細胞を伴って、または伴うことなく、ＩＬ−７の存在下において８４時間インキュベーションした。８４時間後、細胞を回収し、ＣＦＳＥ低染色されたＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６−）細胞の数をＦＡＣＳによって測定することによって細胞分裂について分析した。細胞の絶対値を得るために、サンプルを一定量の体積で懸濁し、それぞれのサンプルについてのフローサイトメトリーカウント数を一定の所定の期間の期間中に得た。特定の分裂細胞の数＝（ＡＰＣを伴う分裂細胞の数）−（ＡＰＣを伴わない分裂細胞の数）。負の値は、宿主ＰＢＭＣによる活性化に対する応答における分裂細胞の数が、活性化を何ら伴わない分裂細胞の数よりも一層少なかったことを意味する。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴリンパ球表現型を含む寛容誘導性および／または移植片対白血病反応性の抗第三者細胞に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、当該細胞の作製方法、ならびに、移植および疾患処置における当該細胞の使用に関連する。
【０１１３】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【０１１４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【０１１５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、リンパ節へのホーミングを移植後に行い、かつ、寛容性および抗疾患活性（例えば、移植片対白血病（ＧＶＬ）活性）を、移植片対宿主（ＧＶＨ）反応を誘導することなく誘導する抗第三者セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞の改善された集団を発見している。
【０１１６】
本明細書中下記および下記の実施例において示されるように、本発明者らは、同種適用および自己適用のためのＴｃｍ細胞を作製する新しい方法を提供している。図１Ａおよび図２１に示されるように、抗疾患活性（例えば、抗腫瘍活性）を備える自己Ｔｃｍ細胞が、最初に、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において３日間、同種刺激（例えば、樹状細胞）にさらし、続いて、ＩＬ−１５およびＩＬ−７を、この抗原性刺激とともにさらに１日間〜２日間、この細胞に加えることによって作製された。次に、生じた細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下においてさらに６日間〜８日間培養した。
【０１１７】
図１Ｂおよび図２２に示されるように、寛容性誘導細胞であり、かつ、ＧＶＬ活性を備える同種Ｔｃｍ細胞が、最初に、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において３日間、第三者刺激（例えば、樹状細胞）にさらすことによって作製された。培養開始からおよそ１４時間で、活性化された細胞をＣＤ１３７＋の正の選択によって選択し、これらの細胞をＩＬ−２１とともに再培養した。続いて、ＩＬ−１５およびＩＬ−７を、さらに１日間〜２日間、この抗原性刺激とともにＩＬ−２１培養物に加えた。次に、生じた細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下においてさらに６日間〜８日間培養した。培養が終了したとき、Ｔｃｍ細胞は、同種反応性細胞が、ＣＤ１３７＋細胞を枯渇させ、その後、Ｔｃｍ細胞を宿主タイプの抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）と接触させることによって枯渇化された。
【０１１８】
本発明者らによって作製された細胞は、５０％を超えるＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を含み（その５０％超がＴｃｍ細胞である（すなわち、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含む；例えば、下記の実施例の節の実施例１を参照のこと））、かつ、ＴＣＲ非依存的な抗白血病活性を含んでいた（実施例２を参照のこと）。
【０１１９】
まとめると、これらの結果は、移植を容易にする細胞としての、また、同種移植が正当化される状況（例えば、造血幹細胞移植または実質臓器移植）での疾患処置における使用のための抗第三者Ｔｃｍ細胞の使用を実証している。そのうえ、これらの結果は、自己移植が血液学的悪性腫瘍などのために必要となる状況での疾患処置における抗第三者Ｔｃｍ細胞の使用を実証している。
【０１２０】
したがって、本発明の１つの態様によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有するＧＶＨＤ非誘導性の抗第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団が提供される。
【０１２１】
表現「単離された細胞集団」は、本明細書中で使用される場合、それらの天然の環境（例えば、ヒト身体）から単離されている細胞を示す。
【０１２２】
用語「非ＧＶＨＤ」は、本明細書中で使用される場合、移植片対宿主誘導活性が実質的に減少されているかまたは移植片対宿主誘導活性を実質的に有さないことを示す。したがって、本発明の細胞は、移植の１００日後の移植された対象の生存率、体重、および全体的な外観によって証明されるように、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を著しく生じさせることがないように作製される。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、用語「同系（の）」は、本質的には当該対象と遺伝子的に同一である個体に由来する細胞または組織を示す。典型的には、本質的に完全に同系交配された哺乳動物、哺乳動物クローン、または、ホモ接合性双胎哺乳動物が同系である。
【０１２４】
同系の細胞または組織の例には、当該対象に由来する細胞または組織（これらは「自己（由来）」としてこの技術分野では示される）、当該対象のクローン、あるいは、当該対象のホモ接合性双胎子が含まれる。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、用語「非同系（の）」は、当該対象のリンパ球に関して同種または異種である個体に由来する細胞または組織を示す。
【０１２６】
本明細書中で使用される場合、用語「同種（の）」は、当該対象と同じ種であるが、当該対象とは実質的に非クローンであるドナーに由来する細胞または組織を示す。典型的には、同じ種の非近交系の非接合体（ｎｏｎ−ｚｙｇｏｔｉｃ）双胎哺乳動物は互いに同種である。同種ドナーは対象に関してＨＬＡ同一またはＨＬＡ非同一であってもよいことが理解される。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、用語「異種（の）」は、当該対象のリンパ球の実質的割合の種に対して異なる種の抗原を実質的に発現する細胞または組織を示す。典型的には、異なる種の非近交系哺乳動物は互いに異種である。
【０１２８】
本発明では、異種の細胞または組織が様々な種に由来すること、例えば、ウシ属の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ブタ類（例えば、ブタ）、オビド類（ｏｖｉｄｓ）（例えば、ヤギ、ヒツジ）、ネコ属の動物（例えば、イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、イヌ科の動物（例えば、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）または霊長類（例えば、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、マーモセット）など（これらに限定されない）に由来することが想定される。
【０１２９】
異種起源（例えば、ブタ起源）の細胞または組織が好ましくは、人畜共通感染症（例えば、ブタの内因性レトロウイルスなど）を有しないことが知られている供給源から得られる。同様に、ヒト由来の細胞または組織が好ましくは、実質的に病原体非含有の供給源から得られる。
【０１３０】
表現「抗第三者細胞」は、本明細書中で使用される場合、第三者抗原（１つまたは複数）に対して（例えば、Ｔ細胞認識によって）向けられるリンパ球（例えば、Ｔリンパ球）を示す。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、表現「第三者抗原（１つまたは複数）」は、下記で詳しく示されるように、ドナーまたはレシピエントのどちらにも存在しない可溶性または非可溶性（例えば、膜結合型）の抗原（１つまたは複数）を示す。
【０１３２】
例えば、第三者抗原は、第三者細胞、ウイルス（例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など）の抗原、細菌の抗原（例えば、フラジェリンなど）が可能である。ウイルスまたは細菌の抗原を、それに感染した細胞（例えば、細胞株）によって、または、そうでない場合にはウイルス／細菌タンパク質を発現させるために作製される細胞（例えば、細胞株）によって提示させることができる。自己または非自己の抗原提示細胞を、それに融合または負荷された短い合成ペプチドを提示するために使用することができる。そのような短いペプチドは、ウイルス由来のペプチド、または、何らかの他の抗原を表すペプチドであり得る。
【０１３３】
専用のソフトウエアを、ウイルス配列または他の配列を分析して、免疫原性の短いペプチド（すなわち、クラスＩのＭＨＣまたはクラスＩＩのＭＨＣの状況で提示可能なペプチド）を特定するために使用することができる。
【０１３４】
第三者細胞は、（下記でさらに詳しく説明される）レシピエントに関して同種または異種のどちらも可能である。同種の第三者細胞の場合、そのような細胞は、そのような細胞に対して作製された抗第三者細胞が移植片またはレシピエント抗原に対する反応性を有しないように、ドナーのＨＬＡ抗原とは異なるが、レシピエントのＨＬＡ抗原との交差反応性がないＨＬＡ抗原を有する。
【０１３５】
本発明の１つの実施形態によれば、同種または異種の第三者細胞は刺激性細胞であり、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、脾臓またはリンパ節、サイトカイン動員されたＰＢＬ、インビトロ拡大培養された抗原提示細胞（ＡＰＣ）、インビトロ拡大培養された樹状細胞（ＤＣ）、および人工抗原提示細胞から精製される細胞からなる群から選択される。
【０１３６】
本発明の人工ＡＰＣは、自己ＭＨＣを、外因性ペプチドによりパルス刺激されることなく、第三者ペプチドまたは第三者ＭＨＣにより示すように操作される場合がある。したがって、１つの実施形態によれば、人工ＡＰＣは、［以前に記載されたように、例えば、Ｓｕｈｏｓｋｉ  ＭＭ他、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、（２００７）、１５（５）：９８１〜８に記載されたように］第三者ＭＨＣ決定基および共刺激分子によりトランスフェクションされたＫ５６２腫瘍細胞、または、これらによりトランスフェクションされた線維芽細胞を含む。
【０１３７】
第三者抗原を、細胞表面、ウイルス表面または細菌表面に提示させることができ、あるいは、それらから得ることができ、かつ／または精製することができる。加えて、ウイルス抗原または細菌抗原を感染細胞の表面に呈示させることができ、細胞抗原を、人工ビヒクル（例えば、リポソームまたは人工ＡＰＣ（例えば、第三者抗原（１つまたは複数）によりトランスフェクションされた線維芽細胞または白血病細胞株）など）の表面に呈示させることができる。
【０１３８】
第三者抗原はさらに、自己の提示細胞、非自己の提示細胞によって、あるいは、人工小胞において、または、人工抗原提示細胞において提示される合成されたペプチドを含む場合がある。
【０１３９】
加えて、第三者抗原は、例えば、様々な供給源から抽出または精製されるタンパク質が可能である。本発明による第三者抗原として役立ち得る精製タンパク質の一例がオボアルブミンである。他の様々な例が想定される。
【０１４０】
細胞、ウイルス、細菌、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、ウイルスペプチド提示細胞または細菌ペプチド提示細胞を第三者抗原として利用することが特に好都合である。これは、そのような第三者抗原は多様な一連の抗原決定基を含み、かつ、そのようなものとして、多様な集団の抗第三者細胞の形成を導き、そして、この抗第三者細胞がさらに、Ｔ細胞のより早い再構成において、そのような再構成が要求される場合に、例えば、致死的または亜致死的な放射線照射手順または化学療法手順の後で役立ち得るからである。
【０１４１】
さらに、抗第三者細胞が第三者抗原に対して向けられるとき、細胞は、抗疾患活性を備える。用語「抗疾患活性」は、疾患している細胞（例えば、ガン細胞）に対するＴｃｍ細胞の活性（例えば、殺傷能力）（移植片対白血病（ＧＶＬ）活性など）に言及する。この活性は、典型的には、ＬＦＡ１−ＩＣＡＭ１結合によって媒介されるＴＣＲ非依存的な殺傷に起因する［Ａｒｄｉｔｔｉ他、Ｂｌｏｏｄ（２００５）、１０５（８）：３３６５〜７１。Ｅｐｕｂ：２００４年７月６日］。
【０１４２】
１つの実施形態によれば、第三者細胞は樹状細胞を含む。
【０１４３】
１つの実施形態によれば、第三者細胞は、成熟した樹状細胞を含む。
【０１４４】
Ｔｃｍ細胞を誘導するための刺激細胞として使用される場合がある第三者樹状細胞を作製する様々な方法が、この技術分野では広く知られている。したがって、限定されない一例として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、第三者の非同系細胞ドナーから得られる場合がある［例えば、Ｔｃｍ細胞が同系（例えば、自己）である場合、樹状細胞（ＤＣ）は非同系であってもよく、例えば、対象に対して同種であってもよい；これに対して、Ｔｃｍ細胞が非同系（例えば、同種）であるならば、ＤＣは、非同系（例えば、同種）であるドナーから選択され、ＨＬＡが対象およびＴｃｍ細胞の両方と不一致である］。単球がその後、プラスチック接着によって単離され、ヒト血清（例えば、１％ヒト血清）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ならびに、ＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）から入手可能である）が補充されるＤＣ細胞培地（例えば、Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ培地）を使用して（例えば、細胞培養プレートで）培養される場合がある。約４８時間の培養の後、ＧＭ−ＣＳＦ（１６００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＣ培地が加えられる場合がある。約２４時間後、非接着性細胞が集められる場合があり、大型の細胞（主として未成熟ＤＣ）が、ＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５由来、１０ｎｇ／ｍｌで）およびＩＦＮγ（１００ＩＵ／ｍｌ）（例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）から入手可能である）を含有する新鮮な培地に再懸濁され、置床され、一晩インキュベーションされる場合がある。翌日、非接着性細胞が捨てられる場合があり、接着性細胞が、例えば、氷上での２０分間のインキュベーションの後、冷ＰＢＳ／１％ＨＳを使用して穏やかに取り出される場合があり、それにより、成熟ＤＣからなる大型の細胞が得られる。
【０１４５】
１つの実施形態によれば、第三者細胞は、放射線照射された樹状細胞を含む。
【０１４６】
したがって、１つの実施形態によれば、ＤＣには、約５Ｇｙ〜１０Ｇｙの放射線が照射され、約１０Ｇｙ〜２０Ｇｙの放射線が照射され、約２０Ｇｙ〜３０Ｇｙの放射線が照射され、約２０Ｇｙ〜４０Ｇｙの放射線が照射され、約２０Ｇｙ〜５０Ｇｙの放射線が照射され、約１０Ｇｙ〜５０Ｇｙの放射線が照射される。１つの具体的な実施形態によれば、ＤＣには、約１０Ｇｙ〜５０Ｇｙ（例えば、３０Ｇｙ）の放射線照射が行われる。
【０１４７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗第三者細胞はセントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む。
【０１４８】
表現「セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型」は、本明細書中で使用される場合、リンパ節へホーミングするＴ細胞傷害性細胞のサブセットを示す。Ｔｃｍ表現型を有する細胞はヒトにおいては、典型的には、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ４５ＲＡ−のシグナチャーを含む。Ｔｃｍ細胞はこれらのシグナチャーマーカーのすべてを１個の細胞において発現し得るか、または、これらのシグナチャーマーカーの一部のみを１個の細胞において発現し得ることが理解されるであろう。
【０１４９】
少なくとも、単離された細胞集団の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％さえもが、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であることが理解されるであろう。特定の実施形態によれば、単離された細胞集団は、約７０〜９０％のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を含む。
【０１５０】
上記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、それどころか１００％がＴｃｍ細胞シグナチャーを有することが理解されるであろう。１つの具体的な実施形態によれば、上記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約３０％〜８０％がＴｃｍ細胞シグナチャーを有する（例えば、４０％〜５０％）。
【０１５１】
１つの実施形態によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する第三者細胞を含む単離された細胞集団が提供され、ただし、この場合、前記単離された細胞集団の少なくとも５０％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、その少なくとも５０％が、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋のシグナチャーを含み、さらに、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性（例えば、移植片対白血病（ＧＶＬ）活性）を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる。
【０１５２】
述べられたように、Ｔｃｍ細胞は典型的には、移植後、リンパ節へホーミングする。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は、移植後、リンパ節のいずれかへホーミングすることができ、例えば、末梢リンパ節および腸間膜リンパ節のようなリンパ節へホーミングすることができる。これらの細胞のホーミング性により、これらの細胞はその寛容効果を迅速かつ効率的な様式で発揮することができる。
【０１５３】
したがって、本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は寛容性誘導細胞である。
【０１５４】
表現「寛容性誘導細胞」は、本明細書中で使用される場合、レシピエントの細胞（例えば、レシピエントのＴ細胞）と接触したとき、投与された寛容性誘導細胞の非存在下におけるレシピエントの細胞の応答性と比較して、低下した応答性を誘発する細胞を示す。寛容性誘導細胞には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１／０４９２４３および同第ＷＯ２００２／１０２９７１において以前に記載されたように、ｖｅｔｏ細胞（すなわち、宿主Ｔ細胞と接触したときに宿主Ｔ細胞のアポトーシスを引き起こすＴ細胞）が含まれる。
【０１５５】
いくつかの実施形態によれば、本発明のＴｃｍ細胞は遺伝子非改変細胞または遺伝子改変細胞（例えば、特定の遺伝子、マーカーもしくはペプチドを発現させるために、または発現させないために、あるいは、特定のサイトカインを分泌させるために、または分泌させないために遺伝子操作されている細胞）である場合がある。この技術分野で知られている方法はどれも、細胞を、例えば、関連遺伝子（１つまたは複数）の不活性化、または、ポリペプチド発現を妨害するアンチセンスＲＮＡの挿入によって遺伝子操作することにおいて実行することができる（例えば、国際公開ＷＯ／２０００／０３９２９４を参照のこと。これは本明細書により参照によって組み込まれる）。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、および、（ｂ）工程（ａ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにすることを含む方法が提供される。
【０１５７】
本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は典型的には、最初、同系または非同系の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２１を補充された培養（さもなくば、サイトカイン非含有の培養、すなわち、いかなる追加のサイトカインの添加が行われない培養）において第三者抗原（１つまたは複数）（例えば、上記で記載されるものなど）と接触させることによって作製される。この工程は典型的には、約１２時間〜２４時間、約１２時間〜３６時間、約１２時間〜７２時間、２４時間〜４８時間、２４時間〜３６時間、約２４時間〜７２時間、約４８時間〜７２時間、１日間〜２日間、２日間〜３日間、１日間〜３日間、２日間〜４日間、１日間〜５日間、２日間〜５日間、２日間〜６日間、１日間〜７日間、５日間〜７日間、２日間〜８日間、８日間〜１０日間、または１日間〜１０日間にわたって行われ、抗原反応性細胞の濃縮を可能にする。１つの具体的な実施形態によれば、同系または非同系のＰＢＭＣをＩＬ−２１補充の培地（他の場合にはサイトカイン非含有培地）において第三者抗原（１つまたは複数）（例えば、上記で記載される第三者抗原など）と接触させることが、１日間〜５日間（例えば、３日間）行われる。この工程は典型的には、約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１の存在下において行われる。１つの具体的な実施形態によれば、ＩＬ−２１の濃度は１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）である。
【０１５８】
１つの具体的な実施形態によれば、同系または非同系のＰＢＭＣを第三者抗原（１つまたは複数）と接触させることが、サイトカイン非含有培地（例えば、ＩＬ−２１のみが補充されるサイトカイン非含有培地）において行われ、そのような培養条件は、当該第三者抗原（１つまたは複数）（すなわち、抗原反応性細胞の当該第三者抗原）による刺激および活性化を受けるそのような細胞のみの生存および濃縮を可能にする。これは、これらの細胞が、それらの生存を可能にするサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を分泌するからである（残りの細胞のすべてがこれらの培養条件のもとでは死滅するからである）。
【０１５９】
第三者抗原（１つまたは複数）（例えば、樹状細胞）対ＰＢＭＣの比率が典型的には、約１：２から約１：１０までであり、例えば、約１：４、約１：６、約１：８または約１：１０である。１つの具体的な実施形態によれば、第三者抗原（１つまたは複数）（例えば、樹状細胞）対ＰＢＭＣの比率が約１：２から約１：８までである（例えば、１：４）。
【０１６０】
次に、抗第三者細胞が、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下、抗原非存在の環境で培養されて、その結果、Ｔｃｍ表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにされる。この工程は典型的には、約１２時間〜２４時間、約１２時間〜３６時間、約１２時間〜７２時間、２４時間〜４８時間、２４時間〜３６時間、約２４時間〜７２時間、約４８時間〜７２時間、１日間〜２０日間、１日間〜１５日間、１日間〜１０日間、１日間〜５日間、５日間〜２０日間、５日間〜１５日間、５日間〜１０日間、１日間〜２日間、２日間〜３日間、１日間〜３日間、２日間〜４日間、２日間〜５日間、２日間〜８日間、２日間〜１０日間、４日間〜１０日間、４日間〜８日間、６日間〜８日間、８日間〜１０日間、７日間〜９日間、７日間〜１１日間、７日間〜１３日間、７日間〜１５日間、１０日間〜１２日間、１０日間〜１４日間、１２日間〜１４日間、１４日間〜１６日間、１４日間〜１８日間、１６日間〜１８日間、または、１８日間〜２０日間行われる。１つの具体的な実施形態によれば、抗第三者細胞が、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下、抗原非存在の環境で約７日間〜１１日間（例えば、８日間）培養される。
【０１６１】
この工程は典型的には、約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１の濃度でのＩＬ−２１の存在下において行われる。１つの具体的な実施形態によれば、ＩＬ−２１の濃度は１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）である。
【０１６２】
この工程は典型的には、約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５の濃度でのＩＬ−１５の存在下においてさらに行われる。１つの具体的な実施形態によれば、ＩＬ−１５の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ（例えば、５ｎｇ／ｍｌ）である。
【０１６３】
この工程は典型的には、約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、０．０５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の濃度でのＩＬ−７の存在下において行われる。１つの具体的な実施形態によれば、ＩＬ−７の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ（５ｎｇ／ｍｌ）である。
【０１６４】
本発明者らは、移植片対宿主（ＧＶＨ）反応性細胞を欠き、かつ／または、抗疾患（例えば、ＧＶＬ）反応性細胞について強化される、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む抗第三者細胞の増殖を改善するために利用され得るいくつかの基準を、労力を要する実験およびスクリーニングにより集めてきた。
【０１６５】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣは、非接着性細胞が、ＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させる前に枯渇化される。
【０１６６】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞が、ＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させる前に枯渇化される。
【０１６７】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣは、ＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と接触させる前に、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞について選択される。
【０１６８】
ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞の枯渇化が、この技術分野で知られているいずれかの方法を使用して、例えば、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕獲ＥＬＩＳＡ標識化の使用による精製など）によるなどによって行われる場合がある。そのような工程は、培養物内のＣＤ８＋細胞の純度を増大させるために（すなわち、細胞培養物内における他のリンパ球（例えば、Ｔ  ＣＤ４＋細胞またはＮＫ細胞）を排除するために）、または、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増大させるために有益である場合がある。
【０１６９】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣは非接着性細胞を含む。
【０１７０】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣはＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。
【０１７１】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣはナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。
【０１７２】
ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞の選択が、ＣＤ４５ＲＡ＋を発現する細胞、および／または、ＣＤ４５ＲＯ−を発現する細胞を選択することによって行われる場合があり、また、この技術分野で知られているいずれかの方法を使用して、例えば、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕獲ＥＬＩＳＡ標識化の使用による精製など）によるなどによって行われる場合がある。
【０１７３】
１つの実施形態によれば、ＰＢＭＣはＣＤ４５ＲＡ＋細胞を含む。
【０１７４】
本発明の教示に従って行われることがあるさらなる工程は、第三者抗原（１つまたは複数）を細胞培養物から除く前に（すなわち、抗原非存在の環境を生じさせる前に）、ＰＢＭＣ細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）とともに培養することを含む。この工程は典型的には、約１２時間〜２４時間、約１２時間〜３６時間、約１２時間〜７２時間、２４時間〜４８時間、２４時間〜３６時間、約２４時間〜７２時間、約４８時間〜７２時間、１日間〜２日間、２日間〜３日間、１日間〜３日間、２日間〜４日間、１日間〜５日間、または、２日間〜５日間行われ、かつ、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の上記で示される同じ用量で行われる。１つの具体的な実施形態によれば、ＰＢＭＣ細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）とともに培養することが、１２時間〜４日間（例えば、１日間〜２日間）行われる。
【０１７５】
加えて、または、代替として、活性化された細胞の選択および単離を可能にするさらなる２工程のプロセスが行われる場合がある。そのような選択工程は、（下記でさらに詳しく記載されるように）、ＰＢＭＣが対象に対して非同系である状況における潜在的な宿主反応性Ｔ細胞の除去を助ける。
【０１７６】
したがって、活性化された細胞を単離することが２段階の取り組みで行われる場合がある。第１の段階において、活性化された細胞が、当該細胞をＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において培養する前に選択される。この第１の段階は典型的には、ＰＢＭＣをＩＬ−２１の存在下において第三者抗原（１つまたは複数）と最初に接触させた後で行われる。この選択プロセスにより、第三者抗原によって活性化されたそのような細胞（例えば、下記で記載されるような活性化マーカーを発現するそのような細胞）のみが選ばれ、この選択プロセスは典型的には、ＰＢＭＣを第三者抗原（１つまたは複数）と最初に接触させた後において約１２時間〜２４時間、約２４時間〜３６時間、約１２時間〜３６時間、約３６時間〜４８時間、約１２時間〜４８時間、約４８時間〜６０時間、約１２時間〜６０時間、約６０時間〜７２時間、約１２時間〜７２時間、約７２時間〜８４時間、約１２時間〜８４時間、約８４時間〜９６時間、約１２時間〜９６時間行われる。１つの具体的な実施形態によれば、この選択プロセスは、ＰＢＭＣを第三者抗原（１つまたは複数）と最初に接触させた後において約１２時間〜２４時間（例えば、１４時間）行われる。
【０１７７】
活性化された細胞を単離することが、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕獲ＥＬＩＳＡ標識化の使用による精製など）によって行われる場合があり、また、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＦＳＥ、ＣＤ１３７など、これらに限定されない）または非細胞表面マーカー（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２など、これらに限定されない）を含めて、どのような活性化マーカーに対しても行われる場合がある。活性化された細胞を単離することがまた、この技術分野で知られているいずれかの方法を使用する（例えば、ＦＡＣＳによる）形態学に基づく精製（例えば、大型の細胞を単離すること）によって行われる場合がある。典型的には、活性化された細胞はまた、ＣＤ８＋細胞の発現について選択される。そのうえ、上記方法のどのような組合せも、活性化された細胞を効率よく単離するために利用される場合がある。
【０１７８】
本発明の１つの実施形態によれば、活性化された細胞について選択することが、ＣＤ１３７＋細胞および／またはＣＤ２５＋細胞を選択することによって行われる。
【０１７９】
活性化された細胞を単離する第２の段階が典型的には、培養が終了したときに（すなわち、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７を伴う抗原非存在の環境における培養の後で）行われる。この段階により、同種反応性細胞が、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）を、放射線照射された、宿主の抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、樹状細胞）と接触させた後で活性化されたそのような細胞の枯渇化によって枯渇させられる。上記で述べられたように、活性化された細胞を単離することが、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕獲ＥＬＩＳＡ標識化の使用による精製など）によって行われる場合があり、また、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＦＳＥ、ＣＤ１３７など、これらに限定されない）または非細胞表面マーカー（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２など、これらに限定されない）を含めて、どのような活性化マーカーに対しても行われる場合がある。
【０１８０】
本発明の１つの実施形態によれば、同種反応性細胞を枯渇させることが、ＣＤ１３７＋細胞および／またはＣＤ２５＋細胞の枯渇化によって行われる。
【０１８１】
下記は、本発明のいくつかの実施形態に従って使用することができるプロトコルのいくつかの限定されない例である。
【０１８２】
本発明の１つの実施形態によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は寛容性誘導細胞であり、かつ／または、抗疾患活性（例えば、移植片対白血病（ＧＶＬ）活性）を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、（ａ）非接着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を枯渇化することができる作用因により処理して、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るようにすること、（ｂ）前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において第三者樹状細胞と１２時間〜５日間接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、（ｃ）工程（ｂ）から生じる細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記第三者樹状細胞とともに１２時間〜３日間培養すること、および、（ｄ）工程（ｃ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において５日間〜２０日間培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにすることを含む方法が提供される。
【０１８３】
上記プロトコルは典型的には、非同系移植のために使用され、したがって、使用されるＰＢＭＣが典型的には、対象に対して同種である（例えば、同種ドナーから得られる）。
【０１８４】
本発明の１つの実施形態によれば、セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞（ただし、前記細胞は抗疾患活性（例えば、抗腫瘍細胞活性）を備え、かつ、リンパ節へのホーミングを移植後に行うことができる）を含む単離された細胞集団を作製する方法であって、（ａ）非接着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ５６＋細胞を枯渇化することができる作用因により処理して、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るようにすること、（ｂ）前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下において非同系樹状細胞と１２時間〜５日間接触させて、その結果、抗原反応性細胞の濃縮を可能にするようにすること、（ｃ）工程（ｂ）から生じる細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において前記非同系樹状細胞とともに１２時間〜３日間培養すること、および、（ｄ）工程（ｃ）から生じる細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下において５日間〜２０日間培養して、その結果、前記セントラルメモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にするようにすることを含む方法が提供される。
【０１８５】
上記プロトコルは典型的には、同系移植のために使用され、したがって、使用されるＰＢＭＣが典型的には、対象に対して自己である（例えば、対象から得られる）。
【０１８６】
したがって、述べられたように、ＰＢＭＣは対象に対して同系または非同系である場合がある。
【０１８７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の非同系ＰＢＭＣは、（本明細書中下記でさらに詳しく説明されるように）対象に対して同種または異種である場合がある。
【０１８８】
ＰＢＭＣの供給源が、細胞の意図された使用に関して決定されるであろうし（本明細書中下記のさらなる詳細を参照のこと）、また、ＰＢＭＣの供給源は、とりわけ本明細書中に提供される詳細な開示に照らして十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１８９】
寛容性誘導細胞の使用は、移植片拒絶反応を排除し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を克服する必要がある状況において、例えば、同種または異種の細胞または組織の移植などにおいて、とりわけ有益である。
【０１９０】
したがって、本発明の別の態様によれば、細胞移植または組織移植を必要としている対象を処置する方法であって、細胞移植片または臓器移植片を前記対象に移植すること、および、前記対象に上記単離された細胞集団の治療効果的な量を投与することを含む方法が提供される。
【０１９１】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１９２】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」または用語「その必要性のある対象」は、細胞移植または組織移植を必要としているか、またはＴｃｍ細胞によって処置されることができる疾患にかかっている、任意の年齢の雄性または雌性の哺乳動物（好ましくは、ヒト）を示す。典型的には、対象は、細胞移植または組織移植による処置を受け入れることができる障害、あるいは、病理学的または望まれない健康状態または状態または症候群、あるいは、物理的、形態学的または生理学的な異常のために、細胞移植または組織移植を必要としている（対象はまた、本明細書中ではレシピエントとして示される）。そのような障害の例が下記においてさらに示される。
【０１９３】
本明細書中で使用される場合、表現「細胞移植片または組織移植片」は身体の細胞（例えば、１個だけの細胞または細胞群）または組織（例えば、充実組織／器官または軟部組織、これらは全体または一部を移植することができる）を示す。本発明の教示に従って移植され得る例示的な組織または器官には、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、腸およびリンパ系／造血系組織（例えば、リンパ節、パイエル板、胸腺または骨髄）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の教示に従って移植され得る例示的な細胞には、幹細胞を含む未成熟造血細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明ではまた、臓器全体の移植、例えば、腎臓、心臓、肺、肝臓または皮膚などの移植が意図される。
【０１９４】
適用に依存して、上記方法は、対象と同系または非同系である細胞または組織を使用して行うことができる。
【０１９５】
本発明の１つの実施形態によれば、対象およびドナーの両方がヒトである。
【０１９６】
適用および利用可能な供給源に依存して、本発明の細胞または組織は、出生前の生物ドナー、出生後の生物ドナー、成体ドナーまたは死体ドナーから得ることができる。そのうえ、必要とされる適用に依存して、細胞または組織はナイーブであり得るか、または、遺伝子操作され得る。そのような決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９７】
この技術分野で知られているどの方法も、（例えば、移植用の）細胞または組織を得るために用いることができる。
【０１９８】
細胞または組織を対象に移植することを、様々なパラメーターに依存して、例えば、細胞タイプまたは組織タイプ；レシピエントの疾患（例えば、臓器不全）のタイプ、段階または重篤度；対象に特異的な物理的パラメーターまたは生理学的パラメーター；および／あるいは、所望される治療結果などに依存して、数多くの様式で行うことができる。
【０１９９】
本発明の細胞移植片または組織移植片を移植することを、適用に依存して、細胞移植片または組織移植片を様々な解剖学的場所のいずれか１つに移植することによって行うことができる。細胞移植片または組織移植片は同位置の解剖学的場所（移植片のための通常の解剖学的場所）に移植することができ、または、異所性の解剖学的場所（移植片のための変則的な解剖学的場所）に移植することができる。適用に依存して、細胞移植片または組織移植片は好都合には、腎被膜下に、あるいは、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、門脈、肝臓、脾臓、心臓腔、心臓、胸腔、肺、皮膚、膵臓および／または腹腔内空間の中に埋め込むことができる。
【０２００】
例えば、本発明の教示に従って、肝臓組織を、肝臓、門脈、腎被膜、皮下組織、網、脾臓および腹腔内空間に移植することができる。様々な解剖学的場所（例えば、これらなど）への肝臓の移植が、肝臓移植による処置を受け入れることができる疾患（例えば、肝不全）を処置するためにこの技術分野では一般に実施される。同様に、膵臓組織を本発明に従って移植することを、組織を門脈、肝臓、膵臓、精巣脂肪、皮下組織、網、腸ループ（小腸のＵループの漿膜下組織）および／または腹腔内空間に移植することによって都合よく行うことができる。膵臓組織の移植を、膵臓移植による処置を受け入れることができる疾患（例えば、糖尿病）を処置するために使用することができる。同様に、組織の移植、例えば、腎臓組織、心臓組織、肺組織または皮膚組織などの移植を、例えば、腎不全、心不全、肺不全または皮膚損傷（例えば、火傷）に苦しむレシピエントを処置するという目的のために上記のいずれかの解剖学的場所に対して行うことができる。
【０２０１】
本発明の方法はまた、例えば、未成熟造血細胞移植を必要とする疾患に苦しむレシピエントを処置するために使用することができる。
【０２０２】
後者の場合、未成熟な自己、同種または異種の造血細胞（幹細胞を含む）で、例えば、ドナーの骨髄、動員された末梢血（例えば、白血球除去法によるもの）、胎児肝臓、卵黄嚢および／または臍帯血に由来することができ、かつ、好ましくは、Ｔ細胞枯渇化されたＣＤ３４＋の未成熟な造血細胞であるものを、疾患に苦しむレシピエントに移植することができる。そのような疾患には、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性非リンパ芽球性白血病（ＡＮＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）（アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含む）、大理石病、再生不良性貧血、ゴーシュ病、サラセミア、および、他の先天的造血系異常または遺伝的に決定された造血系異常などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０３】
本発明の未成熟な自己、同種または異種の造血細胞は、細胞移植のためにこの技術分野で知られているいずれかの方法を使用して、例えば、細胞注入（例えば、Ｉ．Ｖ．）、腹腔内経路を介する方法（これらに限定されない）などを使用してレシピエントに移植され得ることが理解されるであろう。
【０２０４】
必要に応じてであるが、本発明の細胞移植片または組織移植片を、欠陥臓器を有する対象に移植するときには、最初、その機能不全臓器を対象から少なくとも部分的に除き、その結果、移植片の最適な発達、および、対象の解剖学的構造／生理機能とのその構造的／機能的な一体化を可能にするようにすることが好都合である場合がある。
【０２０５】
１つの実施形態によれば、未成熟造血細胞および単離された細胞集団は、同じドナーに由来する。
【０２０６】
１つの実施形態によれば、未成熟造血細胞および単離された細胞集団は、同じ対象に由来する。
【０２０７】
本発明の方法ではまた、いくつかの臓器（例えば、心臓および肺組織）の同時移植が、対象にそのような手法によって利益が達成され得る場合には想定される。
【０２０８】
１つの実施形態によれば、同時移植は、未成熟造血細胞および実質組織／臓器またはいくつかの実質組織／臓器を移植することを含む。
【０２０９】
１つの実施形態によれば、未成熟造血細胞および実質臓器は、同じドナーから得られる。
【０２１０】
別の実施形態によれば、未成熟造血細胞および実質臓器／組織（１つまたは複数）は、異なる（非同系）ドナーから得られる。
【０２１１】
１つの実施形態によれば、未成熟造血細胞が、実質臓器の移植の前に、または、実質臓器の移植と同時に、または、実質臓器の移植の後で移植される。
【０２１２】
１つの実施形態によれば、造血系のキメラ現象が、未成熟造血細胞を本発明のＴｃｍ細胞と併せて移植し、これにより、同じドナーから移植される他の組織／臓器の寛容性を引き起こすことによって対象に最初に導入される。
【０２１３】
１つの実施形態によれば、本発明のＴｃｍ細胞は、移植された組織／臓器、同じドナーから移植された臓器の拒絶反応を軽減するためにそれ自体で使用される。
【０２１４】
さらなる実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片および単離された細胞集団は、同じドナーに由来する。
【０２１５】
さらなる実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片が対象と同系であり、かつ、単離された細胞集団が対象と非同系である。
【０２１６】
さらなる実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片が対象と同系であり、かつ、単離された細胞集団が対象と同系である。
【０２１７】
細胞移植片または組織移植片を本発明の教示に従って対象に移植した後では、標準的な医療実務によれば、臓器の成長、機能性および免疫適合性をこの技術分野における様々な標準的技術のいずれか１つに従ってモニターすることが望ましい。例えば、膵臓組織移植片の機能性を標準的な膵臓機能試験（例えば、インスリンの血清中レベルの分析）によって移植後にモニターすることができる。同様に、肝臓組織移植片を標準的な肝機能試験（例えば、アルブミン、総タンパク質、ＡＬＴ、ＡＳＴおよびビリルビンの血清中レベルの分析、ならびに、血液凝固時間の分析）によって移植後にモニターすることができる。細胞または組織の構造的発達をコンピューター断層撮影法または超音波造影によりモニターすることができる。
【０２１８】
移植背景に依存して、細胞移植片または組織移植片の生着を促進させるために、上記方法はさらに好都合には、対象を、上記移植する前に、亜致死的条件、致死的条件または超致死的条件のもとで前処理することを含む場合がある。
【０２１９】
本明細書中で使用される場合、本発明の対象の前処理に関連するときにおける用語「亜致死的」、用語「致死的」および用語「超致死的」は、当該対象の代表的集団に適用されるとき、それぞれ典型的には、無菌の通常の条件のもとで当該集団の本質的にすべてのメンバーに対して非致死的であり、または、当該集団のすべてのメンバーではなく、一部のメンバーに対して致死的であり、または、当該集団の本質的にすべてのメンバーに対して致死的である骨髄毒性処置および／またはリンパ球毒性処置を示す。
【０２２０】
１つの実施形態によれば、前処理工程が、対象を超致死的条件のもとで前処理することによって、例えば、骨髄機能破壊的条件のもとなどで前処理することによって行われる。
【０２２１】
代替において、前処理工程が、対象を致死的条件または亜致死的条件のもとで前処理することによって、例えば、対象を骨髄機能低下条件のもとで前処理することなどによって行われる場合がある。
【０２２２】
対象を前処理するために使用される場合がある前処理作用因の例には、限定されないが、（本明細書中に記載されるように）放射線照射、薬理学的作用因および寛容性誘導細胞が含まれる。
【０２２３】
薬理学的作用因の例には、骨髄毒性薬物、リンパ球毒性薬物および免疫抑制薬物が含まれる。
【０２２４】
骨髄毒性薬物の例には、限定されないが、ブスルファン、ジメチルミレラン、メルファランおよびチオテパが含まれる。
【０２２５】
上記方法はさらに好都合には、対象を、細胞移植片または組織移植片の移植の前に、あるいは、細胞移植片または組織移植片の移植と同時に、あるいは、細胞移植片または組織移植片の移植の後で免疫抑制療法により前処理することを含む場合がある。
【０２２６】
好適なタイプの免疫抑制療法の例には、免疫抑制薬物、寛容性誘導細胞集団（本明細書中下記で詳しく記載されるようなもの）および／または免疫抑制放射線照射を施すことが含まれる。
【０２２７】
移植のための好適な免疫抑制療法を選択し、施すための十分な指針がこの技術分野の文献において提供される（例えば、下記を参照されたい：Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ＣＨ．およびＲｏｗｌａｎｄｓ  ＤＴ  Ｊｒ．、１９９２、ＪＡＭＡ．、２６８、２９５２；Ｈｉｇｉｎｓ  ＲＭ．他、１９９６、Ｌａｎｃｅｔ、３４８、１２０８；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ  Ｍ．およびＳｔｒｏｍ  ＴＢ．、１９９６、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３１、３６５；Ｍｉｄｔｈｕｎ  ＤＥ．他、１９９７、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．、７２、１７５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＶＡ．他、１９９４、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．、９７、１４；Ｈａｎｔｏ  ＤＷ．、１９９５、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．、４６、３８１；Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ  ＡＭ．他、１９９７、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．、１２６、８８２；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｆ．他、１９９８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３８、１６１；Ｄａｎｔａｌ  Ｊ．他、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ、３５１、６２３）。
【０２２８】
好ましくは、免疫抑制療法は、少なくとも１つの免疫抑制剤を対象に投与することからなる。
【０２２９】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、エタネルセプト、ＴＮＦ．アルファ．遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、および、非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤、トラマドール、ラパマイシン（シロリムス）およびラパマイシンアナログ（例えば、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３）が含まれるが、これらに限定されない。これらの薬剤は個々に投与することができ、または、組み合わせて投与することができる。
【０２３０】
移植片タイプにかかわらず、移植片拒絶反応および移植片対宿主病を回避するために、本発明の方法では、（本明細書中上記で詳しく記載されるような）新規な抗第三者Ｔｃｍ細胞が利用される。
【０２３１】
本発明の方法によれば、これらの抗第三者Ｔｃｍ細胞が、細胞移植片または組織移植片の移植と同時に、あるいは、細胞移植片または組織移植片の移植の前に、あるいは、細胞移植片または組織移植片の移植の後でのいずれかで投与される。
【０２３２】
抗第三者Ｔｃｍ細胞は、細胞移植のためにこの技術分野で知られているいずれかの方法（例えば、細胞注入（例えば、Ｉ．Ｖ．）など（これに限定されない））により、または、腹腔内経路により投与される場合がある。
【０２３３】
理論にとらわれることはないが、治療効果的な量は、ＧＶＨＤを誘導することなく、寛容化、抗腫瘍効果および／または免疫再構成のために十分である抗第三者Ｔｃｍ細胞の量である。本発明のＴｃｍ細胞はリンパ節へのホーミングを移植後に行うので、（以前に使用された細胞用量（例えば、国際公開ＷＯ２００１／０４９２４３を参照のこと）と比較して）より少ない量の細胞が、当該細胞の有益な効果（例えば、寛容化、抗腫瘍効果および／または免疫再構成）を達成するために必要となる場合がある。より少ないレベルの免疫抑制薬物が本発明のＴｃｍ細胞との併用において必要となる場合があることが理解されるであろう（例えば、治療プロトコルからのラパマイシンの除外など）。
【０２３４】
治療効果的な量の決定は、とりわけ本明細書中に提供される詳細な開示に照らして十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２３５】
本発明の方法で使用されるどのような調製物についても、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量を、所望される濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて策定することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０２３６】
例えば、組織移植の場合、レシピエントに注入される抗第三者Ｔｃｍ細胞の数は１×１０４個／Ｋｇ体重よりも多くなければならない。レシピエントに注入される抗第三者Ｔｃｍ細胞の数は典型的には、１×１０３個／Ｋｇ体重〜１×１０４個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４個／Ｋｇ体重〜１×１０５個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４個／Ｋｇ体重〜１×１０６個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４個／Ｋｇ体重〜１×１０７個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４個／Ｋｇ体重〜１×１０８個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０３個／Ｋｇ体重〜１×１０５個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４個／Ｋｇ体重〜１×１０６個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０６個／Ｋｇ体重〜１×１０７個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０５個／Ｋｇ体重〜１×１０７個／Ｋｇ体重の範囲、１×１０６個／Ｋｇ体重〜１×１０８個／Ｋｇ体重の範囲でなければならない。１つの具体的な実施形態によれば、レシピエントに注入される抗第三者Ｔｃｍ細胞の数は１×１０５個／Ｋｇ体重〜１×１０７個／Ｋｇ体重の範囲でなければならない。
【０２３７】
したがって、本発明の新規な抗第三者Ｔｃｍ細胞は、（本明細書中上記で記載されるように）細胞移植または組織移植のための補助療法として使用される場合がある。加えて、本発明の新規なＴｃｍ細胞はまた、抗疾患活性（例えば、本明細書中上記でさらに詳しく記載されるように、抗腫瘍細胞活性）を備えており、したがって、疾患処置のためにそれ自体で使用される場合がある。
【０２３８】
１つの具体的な実施形態によれば、移植片対病的細胞活性（例えば、抗腫瘍効果、例えば、抗白血病処置など）を得るために、同系の細胞、同様にまた、非同系の細胞が使用される場合がある。
【０２３９】
したがって、本発明の方法は、悪性疾患、移植片の移植に伴う疾患、感染性疾患（例えば、ウイルス性疾患または細菌性疾患など）、炎症性疾患および／または自己免疫疾患（これらに限定されない）などのどのような疾患をも処置するために適用される場合がある。
【０２４０】
本発明の方法を使用して処置されることがある疾患には、下記の疾患が含まれるが、それらに限定されない：悪性疾患、例えば、白血病［例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性プレＢ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄性白血病、Ｂ細胞白血病、好塩基球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性白血病、Ｂ細胞白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球性白血病または骨髄球性白血病、ヘアリー細胞白血病、リンパ球性白血病、巨核芽急性白血病、単球性白血病、単球マクロファージ白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、形質細胞白血病、プレＢ細胞白血病、前骨髄球性白血病、亜急性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ系新生物、骨髄系悪性腫瘍の素因、急性非リンパ性白血病、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）］、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺性リンパ腫）、ガン腫、芽細胞腫および肉腫；移植片の移植に伴う疾患（例えば、移植片拒絶反応、慢性的移植片拒絶反応、亜急性的移植片拒絶反応、超急性的移植片拒絶反応、急性的移植片拒絶反応および移植片対宿主病）；感染性疾患、これには、慢性的感染性疾患、亜急性的感染性疾患、急性的感染性疾患、ウイルス性疾患（ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶ）、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫性疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が含まれるが、これらに限定されない；炎症性疾患（例えば、慢性炎症性疾患および急性炎症性疾患）；ならびに、自己免疫疾患（例えば、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患）。
【０２４１】
したがって、本発明の方法はさらに、（例えば、細胞移植片または組織移植片および抗第三者細胞が、同じドナーに由来する状況では）抗第三者Ｔｃｍ細胞と同系である細胞または組織の移植片の生着を同時に容易にしながら、疾患を対象において処置することに対して都合良く適用することができる。
【０２４２】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２４３】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２４４】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２４５】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２４６】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２４７】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２４８】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０２４９】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２５０】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２５１】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２５２】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２５３】
一般に、本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌ���ｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２５４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって患者の全血から、また、健康な志願者から単離した。示されるときには、細胞を、以前に記載されたように清学的方法によってクラスＩ  ＨＬＡについてタイプ分類した［Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＨ  ＤＨＥＷ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ７６−５４５、１９７６、２２頁］。
【０２５５】
腫瘍細胞株
Ｈ．Ｍｙ２  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａトランスフェクタント細胞およびＨ．Ｍｙ２  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  ｗ．ｔ．トランスフェクタントＢ細胞株を使用した。
【０２５６】
Ｃ１Ｒ、すなわち、以前に記載されたように［Ｓｔｏｒｋｕｓ  ＷＪ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９８９）、８６：２３６１〜２３６４］、ガンマ線照射、その後で、クラスＩモノクローナル抗体および補体についての選択を行うことによってＨｍｙ．２  Ｂ−ＬＣＬに由来する、表面ＨＬＡのＡ抗原およびＢ抗原を欠くヒトＢ細胞リンパ芽球様系統を使用した。
【０２５７】
Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ、すなわち、以前に記載されたように［Ｇｒｕｍｅｔ  ＦＣ他、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９４）、４０：２２８−２３４］、改変されたネオマイシン薬物抵抗性真核生物ベクターｐＳＰ６５−Ｎｅｏ（このベクターは挿入物を運んでいなかった）を用いたＣ１Ｒ細胞株のエレクトロポレーションによって１９８７年に樹立された安定なトランスフェクタント細胞株を使用した。
【０２５８】
樹状細胞の作製
単球をプラスチック接着によって単離し、１％ヒト血清およびペニシリン／ストレプトマイシンならびにＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）が補充される３ｍｌのＣｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ培地を使用して６ウエルプレートにおいて培養した。４８時間の培養の後、１．５ｍｌの培地を加えた（ＧＭ−ＣＳＦを１６００ＩＵ／ｍｌで、かつ、ＩＬ４を２０ｎｇ／ｍｌで）。２４時間後、非接着性細胞を集め、大型の細胞（主として未成熟ＤＣ）を計数し、ＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５由来のＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌで）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）およびＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００ＩＵ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地に再懸濁し、２ｍｌにおいてウエルあたりおよそ１０６個のＤＣで置床し、一晩インキュベーションした。翌日、非接着性細胞を捨て、接着性ＤＣを、氷上での２０分間のインキュベーションの後、冷ＰＢＳ／１％ＨＳを使用して穏やかに取り出した。成熟ＤＣからなる大型の細胞を計数した。細胞への３０Ｇｙの放射線照射を、ごく少数の潜在的に混入しているＮＫ細胞またはメモリーＴ細胞の成長を避けるために行い、その後、細胞をＴ細胞刺激のために使用した。
【０２５９】
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞のＰＢＭＣからの単離
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、ＣＤ８負選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の説明書に従って使用して最初の負の選択によって単離した。その後、抗原経験のＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＯ−ビーズを使用して、かつ、ＬＤカラムで枯渇させた。
【０２６０】
抗第三者セントラルメモリー・ヒトＣＤ８  Ｔ細胞の作製
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を単離し、ＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３０ｎｇ／ｍｌ）が補充されるＴ細胞培地に再懸濁した。放射線照射されたＤＣを、４８ウエルプレートのウエルあたり４×１０５個のＴ細胞に関して１：４のＤＣ：Ｔ細胞比率で加えた。それぞれのウエルの総体積が５００μｌであった。
【０２６１】
培養開始後７２時間で、ＩＬ−７およびＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、５ｎｇ／ｍｌの最終濃度）を伴う５００μｌのＴ細胞培地を加え、続いて、細胞に、結果の節で概略されるように２日〜３日毎に与えた。
【０２６２】
ＧＶＬアッセイ
Ｈ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ（“Ｎｅｏ”）およびＨ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ  Ａ２  Ｋ６６Ａ変異トランスフェクタント（“Ｋ６６Ａ”）のＢリンパ芽球系細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって得て、０．１５μｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）（細胞死のときに放出される生体染色色素）により製造者の説明書に従って標識した。次に、２×１０５個のカルセイン標識されたＢリンパ芽球系細胞を、抗第三者Ｔｃｍを伴って、または伴うことなく、２４ウエルプレートにおいて抗第三者Ｔｃｍに有利になるように１対５の比率で２２時間インキュベーションした。共培養の前に、抗第三者Ｔｃｍを負選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）によってＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮した。外因性サイトカインをＭＬＲに何ら加えなかった。細胞を回収し、生存しているカルセイン染色されたＢリンパ芽球系細胞の数をＦＡＣＳによって測定することにより生存について分析した。アネキシンＶ＋によるアポトーシスの検出のために、サンプルを５μｌのアネキシンＶ−ＡＰＣ（ＢＤ）と室温で１５分間インキュベーションした。続いて、非結合のアネキシンＶを洗い流し、サンプルをＦＡＣＳによって分析した。細胞の絶対値を得るために、サンプルを一定量の体積で懸濁し、それぞれのサンプルについてのフローサイトメトリーカウント数を一定の所定の期間の期間中に得て、一定体積および一定数の投入細胞を用いて得られるフローサイトメトリーカウント数と比較した。生存率が、Ｂリンパ芽球系細胞単独の生存に対して示される。
【０２６３】
Ｂリンパ芽球系細胞死滅の割合を下記の式によって計算した：
2014526244.tif 000003
【０２６４】
特異的アポトーシスを受けるＢリンパ芽球系細胞の割合を下記の式によって計算した：＝（アッセイウエルにおける％カルセイン＋アネキシンＶ＋のＢリンパ芽球系細胞）−（コントロールウエルにおける％カルセイン＋アネキシンＶ＋のＢリンパ芽球系細胞）。
【０２６５】
ＣＤ１３７活性化マーカーに基づく、同種反応性を枯渇化するための２段階の磁気的選別取り組み
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において６：１の比率で刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において４：１の比率で３日目まで再刺激した。その後で、細胞を５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに１０日目まで拡大培養した。１０日目に、細胞を２つの試験群に分割した。第１の群において、細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養され続け、一方、第２の試験群における細胞は、放射線照射された宿主ＰＢＭＣにより、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において（１：２の比率で）活性化された。２４時間後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別によって枯渇化した。ＣＤ１３７枯渇細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに再置床し、１４日目まで培養した（“抗第三者ＣＤ１３７＋および抗宿主ＣＤ１３７−”）。１４日目に、抗第三者および抗宿主の同種反応性を、第三者ＰＢＭＣまたは放射線照射された宿主ＰＢＭＣに対するＣＦＳＥアッセイによって評価した。ＣＦＳＥアッセイのために、１×１０６個のＣＦＳＥ＋応答細胞を、２×１０６個の放射線照射（２０Ｇｙ）されたＰＢＭＣ刺激細胞を伴って、または伴うことなく、ＩＬ−７の存在下において８４時間インキュベーションした。８４時間後、細胞を回収し、ＣＦＳＥ低染色されたＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ５６−）の数をＦＡＣＳによって測定することにより細胞分裂について分析した。細胞の絶対値を得るために、サンプルを一定量の体積で懸濁し、それぞれのサンプルについてのフローサイトメトリーカウント数を一定の所定の期間の期間中に得た。特定の分裂細胞の数＝（ＡＰＣを伴う分裂細胞の数）−（ＡＰＣを伴わない分裂細胞の数）。負の値は、宿主ＰＢＭＣによる活性化に対する応答における分裂細胞の数が、活性化を何ら伴わない分裂細胞の数よりも一層少なかったことを意味する。
【０２６６】
実施例１
ヒト抗第三者Ｔセントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞の作製および最適化
以前に示されたマウス研究を臨床応用に移すために、手順を、ヒト抗第三者細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製するために最適化した。その目的のために、種々のパラメーターを、応答細胞のＣＤ８細胞を単離するための種々の試薬、刺激細胞の組成、および、サイトカイン環境を含めて評価した。
【０２６７】
潜在的には、以前に示されたマウスモデルにおいて見出されたように、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）による処置は、自己骨髄移植に関連して［Ｌａｓｋ  Ａ他、Ｂｌｏｏｄ（ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）、（２０１０）、１１６：４２４］、または、同種骨髄移植（ＢＭＴ）において［Ｏｐｈｉｒ  Ｅ他、Ｂｌｏｏｄ、（２０１０）、１１５（１０）：２０９５〜１０４；Ｏｐｈｉｒ  Ｅ．、３７ｔｈ  ＥＢＭＴ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ、２０１１年４月３日〜６日、Ｐａｒｉｓ（フランス）、Ｏｒａｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｒ：６６２］、そのどちらでも有益であり得ると思われる。
【０２６８】
ヒトの自己状況において（図１Ａ）、抗第三者Ｔｃｍを自己ＢＭＴと一緒に投与することができる。患者自身のＣＤ８＋Ｔ細胞が単離され、同種ドナーからの同種樹状細胞に対して刺激される。
【０２６９】
ヒトの同種状況において（図１Ｂ）、抗第三者Ｔｃｍを同種のＴ枯渇ＢＭ細胞と一緒に投与することができる。同種ＢＭドナーに由来するナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が応答細胞として働き、第三者ドナーの樹状細胞が、宿主非反応性Ｔｃｍの作製を可能にするための刺激細胞として使用される。ＧＶＨＤを避けるために、第三者ドナーが、そのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のどれもが宿主のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子と共有されないことを保証するように選択される。
【０２７０】
マウスおよびヒトの両方において、基本的な想定されるプロトコルは類似して、ＣＤ８  Ｔ細胞の単離、その後で、第三者細胞に対する刺激を含んでいた（図１Ａ〜図１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｂ）が、いくつかの他のパラメーターを、表１（下記）に概略されるように、ヒト用プロトコルでは変更しなければならなかった。
【０２７１】
自己ＴｃｍはＧＶＨＤの危険性がないことを考慮して、産生プロトコルの最適化は主として、セントラルメモリー表現型を有する抗第三者ＣＤ８  Ｔ細胞の効果的な拡大培養を達成することに集中した。
【０２７２】
図３Ａにおいて認められ得るように、新しいプロトコルが、下記の３つの主要な工程に基づいて開発された：ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞のＰＢＭＣからの選択、ｂ）ＩＬ−２１の存在下における３日間の、同種樹状細胞（ＤＣ）に対する刺激、および、ｃ）さらに８日間にわたる、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を伴う抗原非存在の環境における拡大培養。
【０２７３】
したがって、この新しく開発されたプロトコルにおいて、様々なパラメーターが、マウスＴｃｍの作製のために使用されるパラメーターと異なる（表１および図３Ａ〜図３Ｂ）。主要な違いは、応答細胞および刺激細胞のための起源となる組織（ＰＢＭＣ対脾細胞）、刺激細胞（樹状細胞対脾細胞）、ならびに、サイトカイン組成に関する。
【０２７４】
2014526244.tif 000004
【０２７５】
ヒト抗第三者Ｔｃｍを作製するためのＧＭＰ規格プロトコルの最適化：
抗第三者Ｔｃｍを作製するためのヒト用プロトコルを開発するための最初の試みは、セントラルメモリー表現型を有するヒト抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を作製するための手順を記載したＷｏｌｆｌ他による近年の研究に基づいていた［Ｗｏｌｆｌ  Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、（２０１１）、６０（２）：１７３〜１８６］。
【０２７６】
今回の取り組みは、抗原によりパルス刺激されたＤＣに対する、ＩＬ−２１の存在下での３日間の刺激と、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるさらに８日間のその後の拡大培養とに基づいていた。
【０２７７】
抗第三者Ｔｃｍの感嘆させる拡大培養をもたらし、その後には、さらなる最適化のための参照として役立ったこれらの初期の実験では、下記の工程を使用した：ａ）非ＣＤ８＋細胞（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球および赤血球系細胞）の枯渇化によるＰＢＭＣからのＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮；ｂ）ＣＤ４５ＲＯを発現する活性化細胞の枯渇化によるナイーブ細胞の濃縮；およびｃ）ＩＬ−２１の存在下における３日間の、同種樹状細胞に対するナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の刺激、その後、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を伴う抗原非存在の環境でのさらに８日間の拡大培養。
【０２７８】
これらの初期の参照実験の結果が図４Ａ〜図４Ｃに示されるが、これらの結果は、プロトコルにおける種々のパラメーターの役割を評価することを、（下記で詳しく記載されるように）細胞拡大のレベルおよびＴｃｍ表現型の発現レベルに対するそれぞれのパラメーターの影響を明確にすることによって可能にした。
【０２７９】
第三者ＤＣによる初回抗原刺激の役割
自己Ｔｃｍは、当然のこととして、ＧＶＨＤの危険性がないことを考慮して、評価された最初のパラメーターは、第三者ＤＣに対する刺激の役割であった。この工程は元々、同種状況におけるＧＶＨＤの危険性を、ＧＶＨＤを媒介する抗宿主クローンの刺激の非存在下における抗第三者クローンの選択的拡大培養によって軽減させるために意図された。
【０２８０】
図５Ａ〜図５Ｃおよび図６Ａ〜図６Ｂに例示されるように、樹状細胞による同種刺激の非存在下においてＩＬ−２１を用いて成長させたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞は、低い増殖レベル（参照コントロール群によって示される増殖レベルの２．７±１．１％）を示し、これにより、７日目において、０日目からのおよそ０．４倍の拡大を表し（ほとんどの細胞が１０日目までに死滅した）、かつ、それらのナイーブ表現型（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋、小さい形態学）を維持した（Ｔｃｍレベルが参照コントロール群のＴｃｍレベルからのほんの１０％にすぎなかった）。分化および拡大培養の類似した不良なレベルが、細胞が樹状細胞による同種刺激の非存在下においてＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに維持されたときに見出された；これらの条件のもとで、細胞はそれらのナイーブ表現型を維持し（Ｔｃｍレベルが参照コントロール群のＴｃｍレベルからのほんの７±１．６％にすぎなかった）、だが、若干の増殖が誘導された（コントロール群の値の１２±３．２％、これは、１３日目において、０日目からのおよそ６倍の拡大を表す）。したがって、同種第三者ＤＣの役割は、Ｔｃｍ表現型の誘導のために、また、ロバストな細胞拡大培養のために非常に重要であった。
【０２８１】
抗第三者Ｔｃｍの初回抗原刺激段階および拡大培養段階におけるＩＬ−２１の役割
一般に、マウス用およびヒト用の両方の従来のＴ細胞拡大培養プロトコルでは、拡大培養段階が抗原非存在の環境で行われる。しかしながら、マウス用プロトコルでは、ＩＬ−１５のみが添加された（図３Ｂ）が、Ｗｏｌｆｌ他（Ｗｏｌｆｌ他、２０１１、上掲）によって記載されるヒト用プロトコルでは、細胞拡大培養が、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において行われた。そのうえ、ＩＬ−２１は、最初の初回抗原刺激段階の期間中に加えられたならば、有益であることが示されたことを考慮して、ＩＬ−２１の役割をここで評価した。
【０２８２】
興味深いことに、図７Ａ〜図７Ｃおよび図８Ａ〜図８Ｂに示されるように、ＩＬ−２１の存在下または非存在下における同種ＤＣによるナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の初回抗原刺激は、細胞組成に対するほんの些細な影響を有しただけであった（データは示されず）が、ＩＬ−２１の非存在下における初回抗原刺激はＴｃｍ表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）の獲得を妨げ（参照コントロール群におけるＴｃｍレベルのほんの６９±１８％）、低下した増殖もまたもたらした（参照コントロール群における拡大レベルの７６±２３％）（図８Ａ〜図８Ｂ）。４つのうちのただ１つの実験においてでさえ、この場合、拡大が低下しなかった（参照コントロール群の１４０％）が、Ｔｃｍ表現型が、参照コントロール群におけるＴｃｍレベルのほんの３５％にすぎず、このことは、ＩＬ−２１の存在下における初回抗原刺激が、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞集団からのＴｃｍ表現型の拡大と、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞集団からのＴｃｍ表現型の誘導との両方のために重要であることを示唆していた。
【０２８３】
興味深いことに、初回抗原刺激段階（ＩＬ−２１単独）および拡大培養段階（ＩＬ−７およびＩＬ−１５と一緒での）の両方におけるＩＬ−２１の連続した存在は、セントラルメモリー表現型の細胞の誘導を一貫して改善させた（参照コントロール群におけるＴｃｍレベルの１０８±１．９％）（図７Ａ〜図７Ｃおよび図８Ａ〜図８Ｂ）。細胞拡大培養に対する連続したＩＬ−２１存在の影響は、より大きい平均増大（参照コントロール群において見出される値の１３５±４７％）を明瞭に引き起こしたにもかかわらず、あまり一貫しておらず、３つのうちの２つの実験では、わずかに低下した拡大（参照値の９５％および８１％、それぞれ）を引き起こし、一方、第３の実験では、劇的に高まった拡大（２２８％）を示し、このことは、ＩＬ−２１を初回抗原刺激段階および拡大培養段階の両方において加えることが望ましいかもしれないことを示していた（図８Ａ〜図８Ｂ）。
【０２８４】
刺激細胞としての第三者細胞の組成
上記の結果は、ＩＬ−２１、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の逐次添加には、Ｔｃｍ表現型の成功した誘導のための、また、ロバストな細胞拡大培養のための単球由来の成熟ＤＣによる同種刺激が伴わなければならないことを示す。
【０２８５】
手順を簡略化するために、実験を、不可欠な同種刺激が、４日間の調製を必要とする単球由来の成熟ＤＣの代わりに、放射線照射されたＰＢＭＣによってもたらされ得るかどうかを評価するために行った。
【０２８６】
表２（下記）において認められ得るように、培養の７日目で、刺激細胞としてのＰＢＭＣによるＴｃｍ表現型の誘導効率が、刺激細胞としての単球由来の成熟ＤＣ（ｍｄ−ｍＤＣ）とは対照的に、精製されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞が応答細胞として働いたとき（９２％対９２％、それぞれ）と、非分離のＣＤ８  Ｔ細胞が応答細胞として働いたとき（７７％対８０％、それぞれ）との両方において非常に類似していた。しかしながら、ＰＢＭＣ刺激細胞は、ＤＣと比較して同じレベルのＴｃｍ拡大を、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞（６．７５対２０．５、それぞれ）または非分離のＣＤ８  Ｔ細胞（１．８対１６）のどちらかを応答細胞として使用して誘発することができなかった。
【０２８７】
2014526244.tif 000005
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞または非分離のＣＤ８  Ｔ応答細胞が、ＩＬ−２１を含有する培地において３日間、同じ同種ドナーに由来する単球由来の成熟ＤＣ（８：１の応答細胞／ＤＣ比率）またはＰＢＭＣ（１：１の応答細胞／ＰＢＭＣ比率）に対して刺激されたＭＬＲ培養。その後で、細胞を、さらなる活性化を伴うことなく７日目まで、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を用いて成長させた。培養の７日目に、これらの異なる群をＦＡＣＳ分析によってＴｃｍの割合について評価し、トリパンブルー排除によって細胞数について評価した。
【０２８８】
したがって、放射線照射された脾細胞が、拡大培養を誘導するために十分であったマウス用プロトコルとは異なって、ヒト用プロトコルでは、同種の単球由来の成熟ＤＣが、Ｔｃｍ細胞の良好な拡大培養のために極めて重要であり、同種ＰＢＭＣによって置き換えることができない。
【０２８９】
Ｔｃｍ表現型の誘導および細胞拡大培養のための最適な応答細胞／ＤＣ比率を明確にすること。
最適な応答細胞／ＤＣ比率を明確にするために、ＭＬＲシステムを、種々の応答細胞／ＤＣ比率が試験されたことを除いて上記で記載されるように使用した。図９Ａ〜図９Ｂにおいて認められ得るように、４×１０５個の応答細胞を使用したとき、Ｔｃｍ表現型の最適な取得が、５０〜１００×１０３個のＤＣを加えたときに達成され、一方、拡大は、最も低いＤＣ濃度で最適であった。より低い応答細胞／ＤＣ比率でのさらなる実験を調べた。
【０２９０】
ＧＭＰ規格の試薬にもっぱら基づく最終的な自己用プロトコルを明確にすること。
抗第三者Ｔｃｍを作製するための満足すべき自己用プロトコルを確立したとき、実験を、現在市販されているＧＭＰ規格の試薬だけに基づく同等な手順を開発するために行い、その結果、この取り組みをヒト患者において試験することを可能にするようにした。
【０２９１】
プラスチック製ディッシュにおける接着性細胞の枯渇化。
ＣＤ８  Ｔ細胞選択のプロセスを最適化する前に、実験を、ＰＢＭＣに存在するプラスチック接着性細胞を除去することによる著しい初期濃縮を達成するために行った。このプロセスは、所望されるＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度を増大させるだけでなく、マウスモデルにおいて使用される新鮮な脾細胞とは対照的に、凍結保存されたヒトＰＢＭＣを処理するときにも有用である。この実験は、１０％ヒト血清およびＩＬ−７を伴う一晩のインキュベーションにより、解凍された細胞を、磁気的濃縮プロセスに供される前に回復させることができたことを明らかにした（データは示されず）。
【０２９２】
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮
次に、焦点は、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮を、できる限り少ない抗体を使用して臨床規格の試薬に適合化することについてであった。
【０２９３】
図１０（これは典型的な実験を表す）に示されるように、ＣＤ８  Ｔ細胞の所望される集団は、接着細胞の枯渇化後において０日目の細胞の２１％に相当し、一方、それ以外の主要な「混入している」亜集団には、ＣＤ４  Ｔ細胞（６１％）、Ｂ細胞（７％）およびＮＫ細胞（７％）が含まれる。したがって、このＣＤ４細胞が最大の汚染となっており、また、ＣＤ８  Ｔ細胞と競合することが以前に示されていた；したがって、このような細胞は除かれなければならなかった。同様に、ＩＬ−１５培養物において拡大することが知られているＮＫ細胞を除くことが重要であった。対照的に、Ｂ細胞は、これらの培養条件のもとでは死滅する傾向がある。したがって、抗ＣＤ４および抗ＣＤ５６の磁気ビーズを用いた、可能性のある枯渇化を最初に、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の枯渇化を伴って、または伴うことなく評価した。
【０２９４】
加えて、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者のＰＢＭＣでは、ＣＤ８  Ｔ細胞のレベルが、健康なドナーと比較してより低いので、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮をＣＤ４５ＲＡ＋細胞の正の選択によって省略することの可能性を調べる並行した評価を行った。これは、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の正の選択は、回収されたＣＤ８  Ｔ細胞の数をさらに低下させるからである。
【０２９５】
したがって、１日前に、ドナーＰＢＭＣを最初に、接着性の骨髄性細胞を除くために特別に設計されたｇｒｅｉｂｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＣＥＬＬＳＴＡＲ組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｌｔｄ．、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）における一晩のインキュベーションによって接着性細胞から枯渇させ、０日目に、非接着性細胞を４つの試験群に分割し、それぞれを異なる磁気的選別プロトコルに供した。培養の０日目、７日目、１０日目および１４日目に、細胞をＦＡＣＳ分析によって細胞組成およびＴｃｍ表現型について評価し、また、生細胞をトリパンブルー排除に基づいて計数することによって拡大について評価した。
【０２９６】
図１０において認められ得るように、抗ＣＤ４および抗ＣＤ５６のビーズのみを使用する最小限の磁気的細胞選別は、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合を６１％および７％から１２％および１％にそれぞれ低下させ、これにより、２３％から６０％へのＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮をもたらした。しかしながら、この手順には、７％から２４％へのＢ細胞レベルの濃縮が伴っていた。抗ＣＤ１９を枯渇化カクテルに加えることにより、Ｂ細胞が完全に枯渇化され、これにより、ＣＤ８  Ｔ細胞の改善された濃縮（９０％）がもたらされた。抗ＣＤ４５ＲＡによるナイーブ細胞の正の濃縮を行う第２の工程を加えることにより、ナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋に対してゲート制御される）のパーセントが両方の群において磁気的選別前の５３％から９１％に増大した。しかしながら、この工程は際立った影響をＣＤ８  Ｔ細胞の最終的レベルに与えず、ＣＤ８  Ｔ細胞の最終的レベルが、抗ＣＤ４および抗ＣＤ５６を使用したときには６０％から６６％に増大し、または、負の選択工程が抗ＣＤ１９もまた含んだときには９０％から９４％に増大した。
【０２９７】
磁気的細胞選別の後、４つすべての群を、ＩＬ−２１の存在下において３日間、同種樹状細胞による初回抗原刺激に供し、その後で、細胞を、ＩＬ−２１、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において、抗原非存在の環境で１４日目まで拡大培養した。拡大培養されなかったコントロール群として、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５６および抗ＣＤ１９を使用する枯渇化工程、ならびに、抗ＣＤ４５ＲＡを使用する正の濃縮工程によって濃縮されるナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、抗原非存在の環境で、ＩＬ−７のみの存在下において１４日目まで維持した。
【０２９８】
興味深いことに、０日目において、抗ＣＤ１９により処置されたか、または処置されなかった群は、ＣＤ８  Ｔ細胞の著しく異なるレベルを示したが、この違いが、おそらくは培養物におけるＢ細胞の選択的な死のためであると考えられるが、７日目もの初期にはなくなり（図１１）、また、１４日目に試験されたときにもまたなくなった（図１２）。同様に、ＣＤ８  Ｔ細胞の最初の精製の後におけるＣＤ４５ＲＡ＋細胞の正の選択は、Ｔｃｍ表現型を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の最終的な濃縮にほんのわずかに寄与しただけであった。したがって、４つすべての群が、所望される細胞の類似したレベルを示し、些細な利点が、抗ＣＤ４５ＲＡによってナイーブ細胞について同様に濃縮された２つの群について認められた。
【０２９９】
典型的な実験において上記で示されるこの初期の結果を、最適な細胞単離試薬（“ＣＤ４−ＣＤ５６−ＣＤ１９−ＣＤ４５ＲＡ＋”）にさらされたコントロール群において達成される平均結果を、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ４５ＲＡの使用を除外しようとする試みが行われた他の群と比較することによってさらに分析した。
【０３００】
したがって、最適なコントロール群において達成されるレベルのパーセントとして計算されるときのＣＤ８  Ｔ細胞の平均パーセント（図１３Ａ）、および、より重要なことに、実験群のすべてにおけるパーセントＴｃｍ（図１３Ｂ）が、非常に類似していた。
【０３０１】
対照的に、顕著な違いが、培養の１０日目で試験されたときのそれぞれの細胞調製物の平均拡大において見出され、この場合、平均拡大が、６５．６±０．５％から、１０５．２％±６．８％にまで及んでいた（図１４Ａ）。しかしながら、拡大能における違いが、第２の精製工程に伴う低下した産生量によって打ち消された（図１４Ｂ）。
【０３０２】
図１４Ｃ（これは、１０日目におけるＴｃｍの最終的な計算された産生量を示す）において認められ得るように、抗ＣＤ４５ＲＡによるナイーブ細胞の正の濃縮を行う第２の工程を加えることにより、Ｔｃｍ細胞の最終的な産生量が、抗ＣＤ４および抗ＣＤ５６による最初の枯渇化を使用したときには１４１％から１２３％に低下しただけであり、または、負の選択工程が抗ＣＤ１９もまた含んだときには１５７％から１００％に低下しただけであった。
【０３０３】
まとめると、これらの結果は、ＣＤ８  Ｔ細胞を単離するための試薬の最小限の使用に基づくプロトコル、すなわち、抗ＣＤ４および抗ＣＤ５６による負の選択が、自己状況における臨床適用のために申し分ないことを示唆している。
【０３０４】
実施例２
ＧＭＰ規格の試薬を使用するプラスチック製バックにおけるヒト抗第三者Ｔｃｍの大規模調製
患者自身のＰＢＭＣを自己Ｔｃｍの作製のために使用するときに予想される条件をシミュレーションするために、最初、２つの大規模な白血球除去輸血手順を２名の正常なドナーから行い、多数の単核細胞を（数個のバッチ物に分割して）凍結保存した。それぞれのバッチ物を１つの大規模な実験のために使用した。第１の実験では、ＤＣをＷｕｒｚｂｕｒｇプロトコルに従って凍結バッグ物から作製することにおける困難さ、および、生物学的活性が明確でない新しいＧＭＰ規格ＩＬ−１５を調達したことを含めて、いくつかの技術的問題に直面した。これらの問題は、ＣＤ８  Ｔ細胞の非常に不良な拡大（３倍前後）をもたらしたが、（上記で記載されるような）ＤＣのための現在記載されるプロトコルを使用することによって、かつ、ＩＬ−１５の適切な濃度（すなわち、３００Ｕ／ｍｌ）を使用することによってその後の実験において修正された。
【０３０５】
図１５において認められ得るように、同じドナーのＰＢＭＣが２つの異なる第三者ＤＣに対して２つの大規模実験で作製されたとき、ＣＤ８  Ｔ細胞の類似した拡大が、１１日目において２６．８倍から３１．０倍にまで及んで達成された。この日において、細胞が直線的な成長を示したことを考慮すると、さらなる拡大がより後の時点で達成され得るであろうことが考えられる。しかしながら、このレベルの拡大は、体重１Ｋｇあたり３×１０７個までの細胞を潜在的には投与することを可能にするので申し分ないものである。興味深いことに、０日目において、白血球除去輸血調製物には、ＣＤ１４＋単球およびＣＤ２０  Ｂ細胞が主として混入していたことが見出されたが、これらの細胞は細胞培養時に消失し、１２日目における最終的な細胞組成は９４％および９８％のＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をそれぞれ含んでいた（図１６Ａ〜図１６Ｂ）。
【０３０６】
重要なことに、異なるＤＣに対してこれら２つの培養物で達成されたＴｃｍ表現型は小規模実験の範囲内であり、だが、いくらかの変動が生じていた（図１７Ａ〜図１７Ｂ）。したがって、両方の実験における５日目で、高レベルのＴｃｍ表現型（７７％および７１％、それぞれ）が見出されたが、このレベルが、第２のＤＣドナーに対する培養物において、９日目（６５％対４６％）および１２日目（６２％対３５％）ではより著しく低下した。小規模実験では著しく観測されなかったこの変動性は、部分的には、ＤＣを５日目で除くことの相対的困難さによって説明され得ると思われる。これは、細胞が、小規模実験で使用されるプレートに対するそれらの接着と比較して、プラスチック製バッグには接着しにくいからである。したがって、より長期の存在およびＤＣによる刺激により、Ｔｃｍ表現型からＴｅｆｆ表現型へのより顕著な移行が引き起こされ得ると思われる。
【０３０７】
実施例３
樹立された細胞株に対するヒト第三者ＴｃｍのＧＶＬ能
自己状況では、抗第三者Ｔｃｍの起こり得る使用が、残存腫瘍細胞を根絶するためにだけであること（同種状況では、抗第三者Ｔｃｍはまた、ＢＭ細胞の生着を高めるために働くこと）を考慮すると、患者へのＴｃｍの注入の前に品質管理のために使用され得るであろうエクスビボでの細胞毒性能についての直接的なアッセイを開発することが重要である。その目的のために、ＴＣＲ非依存的アッセイを、ＭＨＣ変異のためにＴＣＲによって認識され得ないＭＨＣ変異型系統が依然として、それらのＴＣＲ非依存的殺傷機構を介して抗第三者ＣＴＬによって殺傷され得るという、Ｌａｓｋ他［Ｌａｓｋ  Ａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２０１１）、１８７（４）：２００６〜１４］による実証に基づいて使用した。明らかに、ヒトＴｃｍのためにまた適用可能であるならば、そのような殺傷様式は、このＴｃｍ殺傷をＮＫ細胞によって示されるＴｃｍ殺傷と区別するために役立ち得ると思われる。
【０３０８】
この疑問を検討するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株および形質細胞性白血病細胞株を標的とする抗第三者Ｔｃｍを用いて行い、パーセントアポトーシス細胞を２２時間後に測定した。図１７Ｃ（これは典型的な実験を表す）において認められ得るように、顕著なＧＶＬ反応性がそのようなＴｃｍによって示された。
【０３０９】
異なる実験において、ＣＤ８  Ｔ細胞を最初に、非ＣＤ８  Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球および赤血球系細胞）を、磁気ビーズ選別を使用して大々的に枯渇化することによって濃縮した。図１８（これは典型的な実験を表す）において認められ得るように、混入しているＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のパーセントが、試験された４つすべての群について非常に低かった（ＮＫ細胞については０．１％未満、ＮＫＴ細胞については１．９％未満）。
【０３１０】
高度に精製されたＣＤ８  Ｔ細胞をその後、下記の２つのタイプの細胞とインキュベーションした：ａ）ＴＣＲ非依存的殺傷を明らかにするためのＨ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ−Ａ２  Ｋ６６Ａ変異細胞株（Ｋ６６Ａ）、および、ｂ）Ｈ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ（ｎｅｏ）、すなわち、表面ＨＬＡのＡ抗原およびＢ抗原を欠き、したがって、Ｔｃｍ上のＣＤ８分子と、標的の白血病細胞のＭＨＣにおけるα３ドメインとの間での相互作用を必要とする機構を介するＴｃｍによる殺傷に対して非感受であるＢ細胞リンパ芽球様系統。
【０３１１】
図１９Ａ〜図１９Ｄに示されるように、ＭＨＣ−Ｉ欠損のＨ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ（ｎｅｏ）細胞と比較してＫ６６Ａ変異の標的細胞の顕著な殺傷が抗第三者Ｔｃｍによって示された。したがって、ヒト抗三者ＣＴＬと同様に、ヒトＴｃｍは、ＴＣＲ非依存的殺傷機構を介してＢ細胞腫瘍細胞を殺傷することができ、これは、標的細胞におけるＭＨＣ発現を必要とするＮＫ媒介の殺傷とは対照的である。
【０３１２】
最も重要なことに、最適な細胞単離試薬（“ＣＤ４−ＣＤ５６−ＣＤ１９−ＣＤ４５ＲＡ＋”）にさらされたコントロール群において達成される平均結果を、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ４５ＲＡの使用（図１９Ａ〜図１９Ｄ）が低減された他の群と比較することによってさらに分析されたとき、実験群のすべてにおけるＨ．Ｍｙ  Ｃ１Ｒ  ＨＬＡ−Ａ２  Ｋ６６Ａ変異細胞株のパーセントＴＣＲ非依存的殺傷（これは、最適なコントロール群において達成されるレベルのパーセントとして計算された）が非常に類似していた（図２０）（Ｐ＞０．０５、３つすべての試験群を参照コントロール群と比較したとき）。
【０３１３】
まとめると、これらの結果は、ＣＤ８  Ｔ細胞を単離するための試薬の最小限の使用により単離される細胞によって示されるＧＶＬ反応性が、より大々的な単離プロトコルに伴うＧＶＬ反応性よりも劣っていないことを示唆している。
【０３１４】
インビボでのＴｃｍによる自己Ｂ−ＣＬＬ腫瘍細胞の殺傷が、抗第三者ＣＴＬによるそのようなＢ−ＣＬＬ殺傷を実証するために以前に用いられたＨｕ／ＳＣＩＤモデルを使用して行われる。
【０３１５】
実施例４
同種ヒト抗第三者Ｔｃｍ細胞の作製
同種ヒト抗第三者Ｔｃｍを使用したときのＧＶＨＤの危険性を最小限に抑えるための新しいＧＭＰ規格取り組みの開始
マウスモデルにおいて以前に明らかにされたように、抗第三者Ｔｃｍは、同種ＢＭＴにおいて寛容性誘導体のために非常に有用であり得ると思われる［Ｏｐｈｉｒ  Ｅ他、Ｂｌｏｏｄ、（２０１０）、１１５（１０）：２０９５〜１０４］。この場合、同種ＢＭドナーに由来するナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が応答細胞として働き、第三者ドナーの樹状細胞（ＤＣ）が、宿主非反応性Ｔｃｍ細胞の作製を可能にするための刺激細胞として使用される。ＧＶＨＤを避けるために、第三者ドナーが、そのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のどれもが宿主のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子と共有されないことを保証するように選択される。
【０３１６】
それにもかかわらず、ヒト患者は近交系マウスよりもＧＶＨＤを受けやすい場合があることを考慮すると、この取り組みの臨床転換は慎重に進めなければならない。さらなる同種枯渇化（ａｌｌｏ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）工程、例えば、抗第三者同種刺激期間が終了したときの活性化された細胞の光枯渇化または選択などが、ＧＶＨＤの危険性をさらに軽減するために必要とされるかもしれない。
【０３１７】
（同種用プロトコルのための）自己ヒト用プロトコルの改変
図２１〜図２２に示されるように、同種状況のためのＴｃｍを作製するためのプロトコルは、２つの主要な段階において自己状況のためのプロトコルと異なる：
ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞を単離した後におけるＣＤ４５ＲＡ＋細胞の選択。メモリーＴ細胞は、メモリーＴ細胞画分の非特異的なサイトカイン主導の拡大を引き起こすことができるナイーブＴ細胞よりも低い活性化閾値を有する。これらの細胞には、宿主抗原と交差反応し、したがって、ＧＶＨＤ誘導の危険性を増大させるクローンが含まれる場合がある。異なるヒトドナーの間でのナイーブＴ細胞の割合における差によって引き起こされる影響を最小限に抑えるために、また、ＧＶＨＤの危険性を軽減させるために、ナイーブＣＤ８  Ｔ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８＋）細胞を、Ｔｃｍ細胞を作製するための供給源として使用した。
ｂ）ＣＤ１３７＋の活性化されたＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇化による培養終了時における潜在的に宿主反応性のＴ細胞の除去。
【０３１８】
ＩＬ−７およびＩＬ−１５の遮断期間の延長
自己培養物（本明細書中上記）について記載されたように、本発明者らは、ＩＬ−７およびＩＬ−１５にさらされたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞が抗原非依存的様式で増殖することを認めている。他方で、同種刺激の非存在下においてＩＬ−２１にさらされたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞は増殖せず、培養の７日目を越えて生存さえしなかった。したがって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加を３日目から７日目に遅らせることは潜在的には、第三者刺激細胞に対する応答性を有しない抗宿主クローンの選択的枯渇化を引き起こし得ると思われる。
【０３１９】
サイトカインを添加するための最適な時期を同種反応性枯渇化に関して明確にするために、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下または非存在下において４：１の比率で７日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに（図２３Ｂ）、または、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１とともに（図２３Ｃ）、または、ＩＬ−１５単独とともに（図２３Ｄ）、１３日目まで拡大培養した；生じた細胞集団を、参照コントロール群に従って培養され、自己状況について記載されるように拡大培養されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞（ＩＬ２１およびＤＣを伴うｄ（０−３）でのインキュベーション；ＩＬ７＋ＩＬ１５の添加を伴うｄ（３−１３）でのインキュベーション）と比較した（図２３Ａ）。
【０３２０】
時期は異なるが、参照コントロール群と同じ順序のサイトカイン添加を使用した場合、すなわち、ＩＬ−２１の添加を３日から７日に延ばし、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を、３日目ではなく、７日目に加えた場合、細胞の拡大培養が妨げられた（図２４Ａ）（参照コントロール群によって示される増殖のほんの５４±７％に達する増殖）。しかしながら、セントラルメモリー表現型の誘導は類似していた（図２４Ｂ）（参照コントロール群によって示されるセントラルメモリー表現型の９９±１４．８％）。
【０３２１】
示されるように、ＩＬ−７を除き、かつ、ＩＬ−２１の添加を培養終了時にまで延ばすことにより、細胞の拡大が低下し（図２４Ａ）（参照コントロール群によって示される増殖の６０±１３％）、同様にまた、セントラルメモリー表現型の獲得が低下した（参照コントロール群によって示されるＴｃｍレベルの８２±６．８％、図２４Ｂ）。
【０３２２】
７日間のサイトカイン遮断、その後、７日目からのＩＬ−１５のみの添加を使用するナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の初回抗原刺激は、細胞の拡大能を劇的に低下させ（参照コントロール群によって示される増殖のほんの５±１．３％の増殖）、セントラルメモリー表現型の獲得もまた低下させた（図２４Ｂ）（参照コントロール群によって示されるＴｃｍレベルの６８±２６％）。
【０３２３】
最も重要なパラメーター、すなわち、（ＨＬＡクラスＩにおいて、刺激のために使用される第三者細胞と完全に異なる適切なドナーに関して試験される）宿主反応性クローンの枯渇化が調べられる。サイトカイン遮断期間を最適化するためのさらなる実験もまた行われる。
【０３２４】
ＣＤ１３７活性化マーカーに基づく、同種反応性を枯渇化するための２段階の磁気的選別取り組み
第三者概念に基づいて抗宿主クローンを枯渇化するための洗練された方法が、下記のＣＤ１３７選択工程を含む２段階の磁気的選別技術によって達成されるかもしれない：
ａ．培養開始時における抗第三者特異的クローンの正の選択。
ｂ．培養終了間近における抗宿主特異的クローンの枯渇化。
【０３２５】
近年、ＣＤ１３７は、ＣＤ１３７が休止ＣＤ８＋Ｔ細胞では発現されず、かつ、その発現が２４時間の刺激の後で確実に誘導されるので、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的な活性化のための好適なマーカーであることが記載されている。
【０３２６】
この取り組みを評価するために、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において３日目まで再刺激した。その後で、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養し、その後、放射線照射された宿主ＰＢＭＣにより、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において活性化した。２４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別によって枯渇化した。ＣＤ１３７枯渇細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに再置床し、１４日目まで培養した。選択された日に、細胞をトリパンブルー排除によって細胞数について評価し、また、ＦＡＣＳ分析を使用してＣＤ８  Ｔ細胞集団内のＴｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合について評価した。抗第三者および抗宿主の同種反応性細胞の頻度を第三者または宿主の放射線照射ＰＢＭＣに対するＣＦＳＥアッセイによって評価した。これらの結果を、ＩＬ−２１の存在下において３日間刺激され、その後で、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに拡大培養されたコントロール群（“参照コントロール群”）において達成される結果と比較した。
【０３２７】
したがって、図２５において認められ得るように、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞について濃縮した直後（０日目）では、総ＣＤ８  Ｔ細胞のほんの０．７％が、ＩＬ−２１の存在下において１４時間にわたって第三者ＤＣに対して活性化されたときにはＣＤ１３７を発現したが、総ＣＤ８  Ｔ細胞区画からの、ＣＤ１３７＋を発現するＣＤ８  Ｔ細胞の割合が、ＤＣ刺激の非存在下における２．５％とは対照的に、８．３％に増大した。活性化された細胞のこの亜集団の磁気的選別は、ＣＤ１３７＋細胞の顕著な濃縮（８５％、それぞれ）をもたらし、また、総ＣＤ８  Ｔ細胞区画におけるＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８  Ｔ細胞のレベルが８４％から１４％に劇的に低下した（データは示されず）。
【０３２８】
表５（下記）に示されるように、この正の選択には、低下した細胞回収が伴った。したがって、０日目において、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞についての濃縮の後における、接着性細胞が枯渇化されたＰＢＭＣからの産生量が７．６％であり、また、１日目において、ＣＤ１３７＋についての正の選択の後では、産生量が０．２５％に低下した（７．６％の３．３％）。培養の７日目で評価されたとき、ＣＤ１３７＋細胞についての正の選択に供されたＣＤ８  Ｔ細胞の試験群は、Ｔｃｍ細胞のパーセントにおいて参照コントロール群に非常に似ており（６７％対７０％、それぞれ）、パーセントＴｃｍにおける群間のこの類似性はまた、培養の１０日目において維持された（５４％対５２％、それぞれ）（図２６）。
【０３２９】
2014526244.tif 000006
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日間刺激した。細胞はその後でのさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”）。代替として、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において５．７：１の比率で刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日目まで再刺激した。その後で、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した。１０日目に、細胞を、放射線照射された宿主ＰＢＭＣにより、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において（１：２の比率で）活性化した。２４時間後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別によって枯渇化した。ＣＤ１３７枯渇細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに再置床し、１４日目まで培養した（“抗第三者ＣＤ１３７＋および抗宿主ＣＤ１３７−”）。示された日に、細胞をトリパンブルー排除によって計数した。
ａ＝ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮後の産生量（ＰＢＭＣ−接着細胞の開始数のパーセントとして表される）。
ｂ＝第三者ＤＣによる活性化およびＣＤ１３７＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の濃縮の後における産生量（ＰＢＭＣ−接着細胞の開始数のパーセントとして表される）。
ｃ＝１３日目における０日目からの拡大倍数。
ｄ＝１４日目における０日目からの拡大倍数。
ｅ＝最終的細胞数＝（産生量）×（０日目からの拡大倍数）（ＰＢＭＣ−接着細胞の開始数のパーセントとして表される）。
【０３３０】
そのうえ、細胞組成（％ＣＤ８  Ｔ細胞、％ＮＫ細胞および％ＮＫＴ細胞）を培養の７日目および１０日目で評価したとき、ＣＤ１３７＋細胞の正の選択に供されたＣＤ８  Ｔ細胞の試験群は、その細胞組成において参照コントロール群に非常に似ていた（表６、下記）。
【０３３１】
2014526244.tif 000007
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日間刺激した。その後で、細胞はさらなる活性化を何ら受けず、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した（“参照コントロール群”）。代替として、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において５．７：１の比率で刺激した。１４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別による正の選択に供した。ＣＤ１３７＋細胞をその後、放射線照射された同種第三者ＤＣにより、ＩＬ−２１の存在下において４：１の比率で３日目まで再刺激した。その後で、細胞をＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１０日目まで拡大培養した。細胞をＦＡＣＳ分析によって細胞組成について評価した。
【０３３２】
他方で、図２７に示されるように、ＣＤ１３７＋細胞の正の選択に供されたＣＤ８  Ｔ細胞の試験群は、両方の時点で参照コントロール群との比較において優れた拡大能を示した（７日目において０日目から３５倍の拡大対７倍の拡大（それぞれ）、および、１０日目において０日目から１１９倍の拡大対３４倍の拡大（それぞれ））。１０日目に、ＣＤ１３７＋細胞の正の選択に供された群のＣＤ８  Ｔ細胞を２つの試験群に分割した。第１の群において、細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに１４日目まで拡大培養され続け（“抗第三者ＣＤ１３７＋”）、一方、第２の試験群における細胞は、放射線照射された宿主ＰＢＭＣにより、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において活性化された。２４時間の活性化の後、ＣＤ１３７＋細胞を磁気的選別によって枯渇化した。ＣＤ１３７枯渇細胞をその後、ＩＬ−７およびＩＬ−１５とともに再置床し、１４日目まで培養した（“抗第三者ＣＤ１３７＋および抗宿主ＣＤ１３７−”）。
【０３３３】
１３日目で評価されたとき、ＣＤ１３７＋の正の選択に供された試験群に由来するＣＤ８  Ｔ細胞は、両方の時点で参照コントロール群との比較において優れた拡大能を示し続けた（１３４倍の拡大対６１倍の拡大、それぞれ）。対照的に、ＣＤ１３７＋の正の抗第三者選択と、抗宿主ＣＤ１３７＋細胞の枯渇化との両方に供された試験群に由来するＣＤ８  Ｔ細胞は、１４日目で評価されたとき、より低い拡大能を示した（７２倍の拡大）（図２７）。このことは、１１日目から１４日目までの間における細胞拡大は、ＣＤ１３７＋の抗宿主特異的な同種反応性Ｔ細胞の枯渇化によって引き起こされる細胞喪失を補うことができなかったことを示している。
【０３３４】
図２８に示されるように、ＣＤ１３７の発現が１０日目で評価されたとき、ＣＤ１３７＋細胞の正の選択に供されたＣＤ８  Ｔ細胞における総ＣＤ８  Ｔ細胞区画のほんの０．５％がＣＤ１３７＋を発現しただけであった。したがって、この群におけるＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ１３７の発現を（１日目における８５％から、１０日目におけるほんの０．５％にまで）相当にダウンレギュレーションした。
【０３３５】
しかしながら、放射線照射された宿主ＰＢＭＣによる（宿主ＰＢＭＣに有利になるように１：２の比率での）２４時間の活性化の後では、総ＣＤ８  Ｔ細胞区画からの、ＣＤ１３７＋を発現するＣＤ８  Ｔ細胞のパーセントが１６％に増大した。磁気的選別によるこれらのＣＤ１３７＋細胞の枯渇化は、総ＣＤ８  Ｔ細胞区画の、ＣＤ１３７を発現するＣＤ８  Ｔ細胞のパーセントを１６％から３％に低下させた。
【０３３６】
残存する抗宿主同種反応性の最後の分析を、ＩＬ−７の存在下における第三者ＰＢＭＣとは対照的に、宿主ＰＢＭＣに対して刺激したときのＣＦＳＥ保持細胞のレベルを比較することによって１４日目で行った。
【０３３７】
図２９に示されるように、第三者ＰＢＭＣによる刺激の後において特異的に分裂する細胞の数が、参照コントロール群と比較して、ＣＤ１３７に基づく正の選択および負の選択に供された群ではおよそ３倍多かった（２２５９個の分裂細胞対７４１個の分裂細胞、それぞれ）。最も重要なことに、培養終了近くでのＣＤ１３７＋細胞の除去は、検出可能な増殖（１３４個の分裂細胞）を示した参照コントロール群とは対照的に、宿主ＰＢＭＣに対する応答における増殖を完全に妨げた。興味深いことに、培養終了時における抗宿主クローンの除去を伴うことなく第三者に対して活性化された細胞の正の選択を受ける群は、コントロール群と比較して、より高いレベルの宿主反応性細胞を示した。このことは、（ＨＬＡタイプ分類によって故意に不一致させたが）、宿主刺激細胞および第三者刺激細胞のＭＨＣアロタイプの間での起こり得る交差反応性を示している。したがって、培養終了時における抗宿主枯渇化工程の重要性が明瞭に示されるが、さらなる研究が、抗第三者活性化細胞の最初の正の選択の潜在的な役割を評価するために必要である。
【０３３８】
しかしながら、表５（上記）に示されるように、ＣＤ１３７に基づく２段階の磁気的選別による抗宿主特異的クローンの成功した枯渇化は、全体的に見て、より低い細胞回収を培養終了時にもたらしている（１８％対４６３％、ＰＢＭＣ−接着性細胞の投入数からのパーセントとしてそれぞれ表される）。
【０３３９】
まとめると、この予備的実験は、ＣＤ１３７活性化マーカーに基づく２段階の磁気的選別による同種反応性の枯渇化が実行可能であり、そして、宿主非反応性の同種Ｔｃｍ細胞を作製するための今回のプロトコルに組み込まれるかもしれないであろうことを示している。示された勇気づける特質として、下記のことが挙げられる：１）正の選択を行ったときの同種活性化によって誘導される高い発現レベルが１０日目において完全にダウンレギュレーションされ、このことは、宿主抗原に対する別の同種活性化を可能にした。２）細胞組成およびＴｃｍ細胞のパーセントが、ＣＤ１３７活性化マーカーに基づく磁気的選別によって劇的に影響されなかった。３）培養終了近くでのＣＤ１３７＋細胞の除去は、検出可能な増殖（１３４個の分裂細胞）を示した参照コントロール群とは対照的に、宿主ＰＢＭＣに対する応答における増殖を完全に妨げた。現在の研究は下記のことを含む：１）正の選択工程の前におけるＦｃＲ阻止の使用。２）宿主ＤＣを、培養終了時における宿主反応性細胞のより効果的な検出のためにＰＢＭＣの代わりに使用すること。３）ＣＤ２５またはＩＦＮガンマ捕捉のようなより多くの臨床利用可能な活性化マーカーを枯渇化工程に加えること。
【０３４０】
結論：
Ｔｃｍ作製終了時におけるＣＤ１３７枯渇化の使用は、これらの細胞から同種反応性をさらに枯渇させるための実行可能な取り組みをもたらすかもしれないであろう。
【０３４１】
ＣＤ２５枯渇化と併用でのＣＤ１３７枯渇化の使用（それらの両方がＧＭＰ試薬として利用可能である）を改良し続けるための試みが探求される。
【０３４２】
加えて、様々な実験が、ただ１つだけのＨＬＡ−Ｉ対立遺伝子を有する人工ＡＰＣを使用することによって潜在的な交差反応性を最小限に抑えるために行われる。
【０３４３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３４４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ−１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【図２３Ｃ−２３Ｄ】
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【図２４Ａ−２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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