(57)【要約】止血組成物  本発明は、コラーゲンの総重量に対して少なくとも７０重量％の、繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲン含有量を含んでなるフィブリル型のコラーゲン、および少なくとも一種の単糖、および所望により少なくとも一種の凝固因子およびグリコサミノグリカンから選択された少なくとも一種の化合物を含んでなる粉体形態の止血組成物に関する。本発明は、さらにそのような組成物の製造方法、およびそのような組成物およびスプレー装置を含んでなる装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンの総重量に対して少なくとも７０重量％含有量の繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなる、フィブリル型のコラーゲン、および
少なくとも一種の単糖、
を含んでなる、粉体形態にある止血組成物。
【請求項２】
前記組成物が、前記組成物の総重量に対して８０〜９０重量％含有量のコラーゲンを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、前記組成物の総重量に対して１〜１２．５重量％含有量の単糖を含んでなる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、重量比１０〜５０、好ましくは１９のコラーゲン／単糖を含んでなる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記コラーゲンが、前記コラーゲンの総重量に対して８５〜９５重量％含有量の繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、前記組成物の総重量に対して２〜２５重量％含有量のグリコサミノグリカンをさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、重量比２〜４０のコラーゲン／総炭水化物化合物（但し、前記総炭水化物化合物の重量が、前記単糖（複数可）の重量および前記グリコサミノグリカン（複数可）の重量の合計である）をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、凝固因子、特にトロンビンを前記組成物の０．０１ＩＵ／ｍｇ〜２０ＩＵ／ｍｇの量でさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、０．４ｇ／ｍＬを超えるタップ密度を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、少なくとも５０重量％の、サイズが２００μｍ〜４００μｍである粒子を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物の総重量に対して８６．３６重量％の量のコラーゲン、
前記組成物の総重量に対して４．５４重量％の量のグルコース、および
前記組成物の総重量に対して９．０９重量％の量のコンドロイチン硫酸、
を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
トロンビンを、前記組成物の０．２ＩＵ／ｍｇ〜２ＩＵ／ｍｇの量でさらに含んでなる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
止血組成物の製造方法であって、
ｅ）コラーゲンの総重量に対して少なくとも７０重量％含有量の繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲンを有するフィブリル型のコラーゲン、および少なくとも一種の単糖を含んでなる、水性懸濁液を形成する工程、
ｆ）生成物を、沈殿、ペーストまたはゲルの形態で、特に遠心分離またはデカンテーションにより回収する工程、
ｇ）前記生成物を乾燥させる工程、および
ｈ）前記生成物を所望の粒度に粉砕する工程、
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１４】
工程ａ）で使用する前記コラーゲンが、塩基性抽出により得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｄ）に続いて、
凝固因子、特にトロンビン、および
グリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびそれらの混合物、
から選択された少なくとも一種の化合物、を加える工程ｅ）をさらに含んでなる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
止血剤としての使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物または請求項１３に記載の方法により得られる組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２および１６のいずれか一項に記載の組成物、および
スプレー装置
を備えてなるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、止血組成物の分野に関し、止血試剤として特殊な化合物または組成物の使用、止血組成物の製造方法、および止血方法に関する。
【技術的背景】
【０００２】
外部または内部の外傷性または手術による傷は、出血を伴うことが多い。そのような出血は、重大な場合もあれば、そうでない場合もある。出血は、「止血」と呼ばれる一連の生理学的現象により阻止され、停止する。出血は、血管の破れを修復し、一般的に血管と組織の一体性を確保する。
【０００３】
血管が傷つくと、様々な段階が関与する自然の機構が引き起こされて血流を止める。第一に、出血を遅くする血管収縮が１５〜６０秒間起こり、複雑な反応のカスケードを誘発する。フィブリンから構成される繊維状のメッシュが血小板プラグの周りに形成され、最終的な血栓を形成し、フィブリンを安定化させる因子XIIIにより早期の溶解から保護する。最後に、フィブリンメッシュが引き締まり(収縮し)、傷口の縁部が一つになる、すなわち傷口が収縮する。次いで、安定した、架橋したフィブリンの中で、線維芽細胞が成長し、血栓内部で結合マトリックスに組織化され、最終的に傷が塞がれる。
【０００４】
循環している血液中には固体のフィブリンは存在せず、存在していれば、生きている細胞を直ちに妨害するであろう。しかし、フィブリン前駆物質であるフィブリノゲンは存在する。凝固因子により合成が活性化されるトロンビンの作用により、フィブリノゲンが不溶性のフィブリンに変換される。
【０００５】
最後に、傷が完全に治ってから数日または数週間後、フィブリンクラスターは、線維素溶解の際に破壊される。
【０００６】
この生物化学的現象にも関わらず、特に傷が大きすぎる場合、または広汎性出血の場合、「人工的に」止血を行う必要がある場合が多い。
【０００７】
止血を助ける「機械的」解決策、例えば圧力、結紮および電気凝固があり、これらは最重要処理として使用される。しかし、これらの解決策は、特定の場合、例えば少しずつ漏れる毛管出血、過静脈性器官、例えば脾臓または肝臓、の出血、広汎性出血につながる出血、例えば骨、および／または神経手術における出血にはほとんど、または全く効果が無い。
【０００８】
「化学的」解決策、特に特定の現状の止血製品で実施されている解決策もある。化学的解決策の成分は、一般的に「吸収性」または「活性」型の成分である。
【０００９】
吸収性止血製品、特に多糖類、例えば再生酸化セルロースまたはアルギン酸塩を含んでなる製品は、主として機械的作用および単純な吸収により機能する。これらの製品は、過剰膨潤の問題を引き起こすことが多い。膨潤が、液体、特に血液の急速な吸収につながる場合、「閉じた」環境で、例えば硬膜と接触して、または泌尿器科で使用する場合、好ましくない圧力につながることもある。
【００１０】
さらに、特定の製品、特に植物の多糖類、例えばセルロースまたはアルギン酸塩を含んでなる製品は、それらの再吸収の際に炎症反応をさらに引き起こす、および/またはホストにより認識されない分解生成物につながることがある。その結果、そのような物質を除去し、それらが体の中に残らず、従ってこれらの有害な影響を及ぼさないようにすることが望ましい。
【００１１】
活性止血製品、例えばトロンビンまたはフィブリンを含む製品は、血液に由来する製品であることが多い。そのような製品は、アレルギーや病気を伝える危険性、特に病気のベクターが、古典的に使用される処理により不活性化されていない場合を含む。さらに、下流の処理は、一般的に複雑である、および／または経費がかかる。最後に、一般的に、そのような製品は使用前に調製を必要とすることがあり、これは束縛となることがあり緊急時には実際に面倒である。
【００１２】
その上、フィブリンおよびトロンビンの両方を含む製品は、それらの作用様式が、その製品を構成する２種類の血液由来の物質間の相互作用に基づく。反応は、時として血液との相互作用無しに行われることがあり、その場合、製品が浮遊するといわれる。言い換えると、製品が、流れ続ける血液により押しやられ、場合により、製品が希釈または凝固し、血液の上でゲル形成する場合があり、血液の流れがブロックされない状況となる。従って、止血は達成されない。
【００１３】
今日、市場で入手できる製品は、
・スポンジまたはマトリックス：この物理的形態は、取り扱いが容易であるが、複雑な区域または腹腔鏡手術で使用する際には問題となる。
・繊維：この形態は、処理すべき区域が到達可能であれば、その区域に容易に配置することができ、埋め込む製品の量を少なくすることができるが、他方、血管には強く禁忌を指示する必要があり、特に循環中に繊維を通すことは避けるが、これは、そのような状況下では、塞栓症の危険性並びに器械に粘着する危険性があるためである。
・固化する液体、例えば生物学的接着剤：そのような組成物は、調製の際に一緒に混合し、反応させ、重合させる少なくとも２種類の物質を含んでなることが多い。該製品は、一般的に使用直前に、特に手術室の中で、調製する必要があり、調製に時間がかかり、予想されるものに使用する必要がある。
・スプレー：接着剤がスプレーの形態にあり、製品の推進に必要な空気を供給する装置にシリンジを接続するための特別な装置を使用する必要がある。用量、分布の均質性および／または堆積層の厚さを調整するのが困難であるか、または不可能である。
・粉体：デンプンから製造した粉体が市場で入手できる。止血粉体は、粉体により血液が吸収されることにより、機能する。デンプンは、血液に対する生物学的特性を全く有していない。この粉体の密度および粒度(サイズ等級)は非常に低く、粉体は、腹腔鏡手術には適していない埃を形成せずにスプレーすることができない。例えば国際公開第２００５／０７２７００号パンフレットに記載されている粉体は、特に腹腔鏡における傷口に均質に、正確にスプレーするのに適していない。
【００１４】
先行技術の組成物は、一般的にスポンジ、繊維またはスプレーできる粘性の液体、例えばフィブリン接着剤、の形態で提供される。しかし、スプレーするのに好適な粉体は、現在、入手できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７２７００号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０／１２５０８６号パンフレット
【特許文献３】仏国特許第ＦＲ２９４４７０６号
【特許文献４】国際公開第０１／９７８７３号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｍａｒｋｕｓ  Ｂｕｅｈｌｅｒによる「自然は強靭なコラーゲンを設計する：コラーゲンフィブリルのナノ構造を説明する（Ｎａｔｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｔｏｕｇｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ：  ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｅｒｓ）」（ＰＮＡＳ，  Ａｕｇｕｓｔ  １５，２００６，ｖｏｌ．１０３，ｎｏ．３３，ｐｐ／１２２８５−１２２９０）
【非特許文献２】「結合組織から中性塩溶液によるコラーゲンの抽出」ｂｙ  Ｊｅｒｏｍｅ  Ｇｒｏｓ，Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｈｉｇｈｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｏ．  Ｓｃｈｍｉｔｔ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＡＣＡＤＥＭＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４１  Ｎｕｍｂｅｒ  １  Ｊａｎｕａｒｙ  １５，１９５５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明は、上に述べた問題の全てまたは幾つかを解決する組成物、特に安全性、効果、使い易さ、および／またはコストに関して満足できる組成物を得ること目的とする。特に、製品または組成物は、各国における規則に適合できる。
【００１８】
より正確には、本発明は、十分な吸収能力、良好な止血能力、有害な影響が最小である(または有害な影響がない)こと、傷口縁部に固定する良好な能力およびスプレー可能性、スプレーした時に血流中に十分に浸透すること、および／または限られた膨潤性を有する組成物を得ることを目的とする。
【００１９】
特に、組成物は、ほとんどの外科手術手順、例えば開腹術、腹腔鏡検査、セリオスコピーおよびロボット手術技術、に適用できる、および／またはスプレーできることを目的としている。組成物およびその代謝生成物は、好ましくは十分に無害であり、安全性が改良されており、免疫応答が弱いか、または全く無く、発癌性が無い、および／または再吸収性である。特に、再吸収性は、手順の後、その場所に放置できるように、止血および回復の現象と相溶性がある。
【００２０】
組成物は、スプレーできる形態で提供することをさらに目的とする。
【００２１】
上記の問題の全部または一部を解決することに加えて、本発明は、次のような組成物、すなわち
・特にその貯蔵中に、止血作用に有用な全ての成分を含んでなる、乾燥した、スプレー可能な粉体の製品、換言すると、即使用可能な形態で貯蔵でき、使用直前に混合する必要が無い製品を得ることができる、および／または
・その主要成分または成分が、好ましくない圧力の危険性を生じる程多くの血液を吸収しない、および／または
・その成分が、止血、機械的および生物化学的、または生物学的作用を同時に有し、および／または
・調製や止血製品の取り扱いをすることなく、直ちに使用することができ、例えば腹腔鏡検査並びに開腹術において使用することができる組成物を得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
第一の態様により、本発明は、
フィブリル型のコラーゲンであるコラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％含有量の繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなるコラーゲン、
少なくとも一種の単糖、および
所望により、少なくとも一種の、
・特に血液に由来するか、またはバイオテクノロジー的方法により得た、凝固因子、特にトロンビン、および
・グリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびそれらの混合物
から選択された化合物を含んでなるか、またはそれらからなる止血組成物に関する。
【００２３】
好ましくは、コラーゲンの総重量に対して少なくとも７０重量％含有量の繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなるフィブリル型のコラーゲン、および少なくとも一種の単糖を含んでなる粉体形態の止血組成物を提案する。
【００２４】
本発明は、特に該組成物の粒子のサイズおよび／または密度の特性により、およびその成分により、膨潤を限られた程度に抑えながら、良好な止血特性を有する組成物を得ることができる。
【００２５】
一変形により、組成物は、血液から直接または間接的に得た成分を含まない。トロンビンが存在する場合、例えば、トロンビンは血液抽出したものか、または組換体トロンビンでよい。特に、組成物は、体内で急速に分解される、および／または生物学的相溶性がある化合物から構成される、つまり好ましくない応答を誘発しない。
【００２６】
組成物の、好ましいが、本発明を制限しない態様は、単独で、または組合せで、下記の通りである。
・組成物は、組成物の総重量に対して８０〜９０重量％含有量のコラーゲンを含む。
・組成物は、組成物の総重量に対して１〜１２．５重量％含有量の単糖を含む。
・組成物は、重量比１０〜５０、好ましくは１９のコラーゲン／単糖を含む。
・コラーゲンは、コラーゲンの総重量に対して85~95重量％含有量の繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲンを含む。
・組成物は、組成物の総重量に対して２〜２５重量％含有量のグリコサミノグリカンをさらに含む。
・組成物は、重量比２〜４０のコラーゲン／総炭水化物化合物をさらに含んでなり、その際、総炭水化物化合物の重量は、単糖(複数可)の重量およびグリコサミノグリカン(複数可)の重量の合計である。
・組成物は、凝固因子、特にトロンビンを、組成物の０．０１ＩＵ／ｍｇ〜２０ＩＵ／ｍｇの量でさらに含む。
・組成物は、０．４ｇ／ｍＬを超えるタップ密度を有する。
・組成物は、少なくとも５０重量％の、サイズが２００μｍ〜４００μｍである粒子を含む。
・請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物は、
・コラーゲンを、組成物の総重量に対して８６．３６重量％の量で、
・グルコースを、組成物の総重量に対して４．５４重量％の量で、
・コンドロイチン硫酸を、組成物の総重量に対して９．０９重量％の量で含んでなる。
・組成物は、トロンビンを、組成物の０．２ＩＵ／ｍｇ〜２ＩＵ／ｍｇの量でさらに含んでなる。
【００２７】
別の態様により、本発明は、止血組成物の製造方法であって、少なくとも下記の工程、即ち
ａ）コラーゲンの総重量に対して少なくとも７０重量％含有量の繊維状コラーゲンおよび／またはフィブリル状コラーゲンを有するフィブリル型のコラーゲン、および少なくとも一種の単糖を含んでなり、この工程で使用するコラーゲンが好ましくは塩基性抽出により得られる、水性懸濁液を形成する工程、
ｂ）生成物を、沈殿、ペーストまたはゲルの形態で、特に遠心分離またはデカンテーションにより回収する工程、
ｃ）前記生成物を乾燥させる工程、
ｄ）前記生成物を所望の粒度に粉砕する工程、
を含んでなる、方法に関する。
【００２８】
そのような方法は、工程ｄ）に続いて、
・凝固因子、特にトロンビン、および
・グリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸硫酸、ヒアルロン酸およびそれらの混合物
から選択された少なくとも一種の化合物を加える工程ｅ）を含んでもよい。
【００２９】
本発明は、さらに、上記の組成物およびそのような組成物を含み、推進するように設計されたスプレー装置を含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】例１３に記載する電気泳動の結果の例である。
【発明の詳細な説明】
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は下記の説明から明らかであり、この説明は、説明目的で記載するだけであり、本発明を制限するものではなく、添付の図面を参照して読むべきである。
【００３２】
下記の説明で、他に反対の指示が無い限り、重量％は、組成物の乾燥総重量に対して記載する。
【００３３】
本発明の状況下では、「組成物の乾燥総重量」とは、溶剤、特に水を含まない組成物の総重量を意味し、従って無水物質に対する総重量を意味する。
【００３４】
さらに、各成分の重量およびそこから得られる百分率は、これらの成分の無水重量に相当し、言い換えれば、水（成分が含むことができるであろう）を含まない成分の重量に相当する。これは、得られた百分率にも適用される。
【００３５】
組成物は、組成物の総重量に対して７０重量％以上、特に７５重量％以上、特に７７重量％以上、実際８０重量％以上の含有量のコラーゲンを含むことができる。
【００３６】
さらに、組成物は、組成物の総重量に対して９９重量％以下、特に９６重量％以下、特に９３重量％以下、実際９０重量％以下の含有量のコラーゲンを含むことができる。
【００３７】
従って、組成物は、組成物の総重量に対して７０〜９９重量％、特に７５〜９６重量％、特に７７〜９３重量％、実際８０〜９０重量％含有量のコラーゲンを含むことができる。好ましくは、コラーゲン含有量は、組成物の総重量に対して約８６重量％である。
【００３８】
コラーゲンは、哺乳動物における主要構造タンパク質である。コラーゲンは、長さが２８０〜３００nmで、直径が約１．５nmのトロポコラーゲン(ＴＣ)分子からなる。
【００３９】
用語「繊維状コラーゲン」は、繊維形態にあるコラーゲンを指し、フィブリルのアセンブリーに相当する。繊維は、一般的に、直径が１〜１０μｍである。用語「フィブリル状コラーゲン」は、フィブリルの形態にあるコラーゲンを意味する、より正確には、フィブリルは、一般的に直径が１０ｎｍ〜１μｍである。従って、フィブリルは、トロポコラーゲン分子がジグザグに配置された列から形成され、これらのフィブリルが配置されてコラーゲン繊維を形成することができる。繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンは、一般的に可溶ではないのに対し、非フィブリル状コラーゲンは可溶性が高い。
【００４０】
繊維状コラーゲンおよびフィブリル状コラーゲンの定義は、特にMarkus Buehlerにより「自然は強靭なコラーゲンを設計する：コラーゲンフィブリルのナノ構造を説明する(Nature designs tough collagen: explaining the nanostructure of collagen fibers)」PNAS, August 15, 2006, vol. 103, no. 33, pp/ 12285-12290に記載されている。
【００４１】
２８種類を超えるコラーゲンが発見され、３つの主なカテゴリー、すなわちフィブリル型のコラーゲン、非フィブリル型のコラーゲン、およびＦＡＣＩＴコラーゲン、に区分されている。
【００４２】
フィブリル型のコラーゲンは、大部分がフィブリル状および／または繊維状コラーゲンを含んでなるコラーゲンであり、非フィブリル状コラーゲン(例えばタイプＩのコラーゲン)はほとんど含まない。同様に、非フィブリル型のコラーゲンは、ほとんどが非フィブリル状コラーゲンを含んでなるコラーゲンである。幾つかの非フィブリル型のコラーゲンは、非フィブリル状コラーゲン(例えばタイプＩＶまたはＶのコラーゲン)のみからなることができる。
【００４３】
コラーゲンの工業的抽出および精製は、一般的に最初の組織を脱構造化し、１）汚染物となるタンパク質の全てまたは大部分を除去し、２）生成物の最終用途に応じて必要な構造化レベルを得る。コラーゲン抽出は一般的に、フィブリル状ではない、単分子状の可溶なコラーゲンを可溶化する酸性または塩基性条件下で行う。最終的なコラーゲンは、本来、フィブリル状／繊維状コラーゲンおよび非フィブリル状コラーゲンの混合物を含む。フィブリル状／繊維状コラーゲンと非フィブリル状コラーゲンの割合は、抽出および抽出プロセスに選択した組織に応じて異なる。
【００４４】
最終製品は、フィブリル状コラーゲンのみと非フィブリル状コラーゲンのみの人工的混合物により得たコラーゲンとは異なっている。「結合組織から中性塩溶液によるコラーゲンの抽出」と題する記事(Proceedings of the NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES Volume 41 Number 1 January 15, 1955 by Jerome Gros, John H. Highberger and Francis O. Schmitt)は、前に述べたように、これらの２種類のコラーゲンの混合物を得る特殊な抽出プロセス後に得たフィブリル状と非フィブリル状コラーゲン間の違いを示している。
【００４５】
本コラーゲンでは、コラーゲンがフィブリル型であり、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを、コラーゲンの総重量に対して少なくとも60重量％、特に少なくとも70重量％、特に少なくとも75重量％、実際少なくとも80重量％の量で含んでなる。
【００４６】
特に、コラーゲンは、組成物中のコラーゲンの総重量に対して少なくとも８５重量％、特に少なくとも９０重量％、特に少なくとも９５重量％、実際少なくとも９８重量％の繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなる。
【００４７】
組成物は、好ましくは組成物中のコラーゲンの総重量に対して８５〜９５重量％、最も好ましくは８５〜９０重量％の含有量で繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなる。
【００４８】
したがって、好ましい実施態様では、組成物が非フィブリル状コラーゲンを、組成物中のコラーゲンの総重量に対して５〜１５重量％、最も好ましくは１０〜１５重量％の含有量で含んでなることを意味する。
【００４９】
非フィブリル状コラーゲンに対する繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンのそのような割合を有する組成物を、特に止血粉体として使用するのが非常に有利である。事実、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンは、止血を行うのに十分な量で存在し、非フィブリル状コラーゲンは、生成物を凝集させるのに十分な量で、ただし、過剰な膨潤を避けるために多すぎない量で存在すべきである。
【００５０】
コラーゲンは、タイプＩコラーゲンまたはタイプＩおよびＩＩＩコラーゲンの中から選択することができる。コラーゲンは、様々な供給源組織、特に皮膚および腱から、全ての種から、特にブタ、ウシまたはウマの種から抽出することができる。
【００５１】
コラーゲンは、大部分、ブタを起源とする、皮膚および／または腱から抽出した繊維状コラーゲンから構成されたものでよい。腱から抽出されたコラーゲンの場合、抽出は、国際公開第２０１０／１２５０８６号パンフレットに記載されているようなものでよい。
【００５２】
上記のコラーゲン、特に繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンは、酸性または塩基性抽出に由来するものでよい。特別な実施態様では、該コラーゲンは、塩基性抽出に由来する。特別な実施態様では、コラーゲンは、例えば仏国特許出願ＦＲ２９４４７０６号に記載されているものでよい。
【００５３】
好ましくは、コラーゲンは、抽出されたコラーゲン中の繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンの含有量を最大限にすることができる塩基性抽出に由来する。さらに、そのような塩基性抽出は、抽出されたコラーゲン中のフィブリル状／繊維状コラーゲンと非フィブリル状コラーゲンの割合を制御するのに最適である。酸性抽出と異なり、塩基性抽出は、プロテオグリカンを加水分解することができる。この作用は、組織を脱構造化し、繊維を、その形を変えずに分離する。酸性条件では、繊維中にある内部コラーゲン分子の膨潤が、プロセス中に、それらの部分的脱構造化につながり、より大量の非フィブリル状の可溶性コラーゲンを放出する。
【００５４】
コラーゲンは、特に架橋の古典的な様式、例えば熱的脱水、架橋剤、例えばホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒド、の使用により、酸化された多糖類により、例えば国際公開第２０１０／１２５０８６号パンフレットに記載されている方法に従って、および／または酸化されたアミロペクチンまたはグリコーゲンにより、架橋させることができる。
【００５５】
組成物は、少なくとも一種の単糖を、単独で、または他の単糖との混合物で、含んでなる。該単糖は、リボース、スクロース、フルクトース、グルコースおよびそれらの混合物から選択することができる。本発明の組成物中に、単独で、または他の単糖との混合物で、存在する単糖は、特にグルコースである。
【００５６】
組成物は、単糖を、組成物の総重量に対して１〜１２．５重量％、特に１．５〜１０重量％、特に２〜８重量％、特に２．５〜７．５重量％の含有量で含むことができる。最も好ましくは、単糖の含有量は、組成物の総重量に対して約５重量％である。
【００５７】
組成物は、コラーゲン／単糖を重量比５〜１００、特に７〜６５、特に１０〜５０、特に１１〜４０で含むことができる。最も好ましくは、組成物は、コラーゲン／単糖を重量比約１９で含んでなる。
【００５８】
単糖、特にリボース、スクロース、フルクトース、グルコースおよびそれらの混合物、および特にグルコース、は、主として繊維状および／またはフィブリル状コラーゲン、および所望の特性、特にサイズおよび密度、を有する単糖を含んでなる粒子を特に得ることができる。コラーゲンの混合物中に単糖を配合することにより、さらに組成物中の電荷を下げることができ、これによって、容器、例えばチューブ、ブロワー、スプレー装置、の中に入れるのに適した粉体を形成することができる。
【００５９】
特に、単糖の存在により、所望の密度および／またはサイズを有する粒子を、特に組成物粉体の止血特性を改良することに関して、容易に、安価に得ることができる。
【００６０】
添加剤無しにコラーゲン粉体を接地することにより、繊維のサイズを下げ、粉体の密度を下げる。さらに、最終的な調製品は大量の電荷を含み、これが、最終製品の操作を妨げる。従って、コラーゲンを接地する前に単糖を加えることが推奨され、これによって、調製品が硬化して混合し、急速な接地(変性の制限)を可能にし、従って、電荷の少ない(粉体を容器、例えばスプレー装置、に入れるのに好適な)粉体を調製することができ、最終的な密度が組成物をスプレーするのに好適になる。
【００６１】
予想に反して、そのような単糖の添加は、生成物の最終的な活性に全く影響を及ぼさない。特に、単糖の添加は、最終的な生成物の生物活性を変化させない。 単糖には、止血効果はない。
【００６２】
さらに、そのような単糖の添加は、国際公開第０１／９７８７３号パンフレットの場合におけるように、発泡剤として挙動しない。国際公開第０１／９７８７３号パンフレットでは、希釈溶液の加熱がゼラチンの形成を引き起こす。高濃度のゼラチンは、非常に濃縮された溶液を得るために作ることができるが、最終生成物はゼラチンを含み、コラーゲンではない。ゼラチンは、コラーゲンよりも止血性が少ないことが分かっているが、これは、血小板凝集は、コラーゲンフィブリルの存在、およびゼラチン中には存在しない天然コラーゲンの構造を必要とするためである。
【００６３】
一実施態様では、組成物は、コラーゲンおよび、特にリボース、スクロース、フルクトース、グルコースおよびそれらの混合物から選択された単糖、特にグルコース、を含んでなる、実際、それらからなる粒子を含んでなり、実際それらからなる。
【００６４】
組成物は、少なくとも一種、特に一種類の凝固因子を含むことができる。凝固因子は、当業者にはよく知られている。好ましくは、凝固因子はトロンビンである。
【００６５】
凝固因子、特にトロンビンは、動物供給源に由来(動物の組織および液体から抽出)、または組換体供給源から(遺伝子的に変性した細胞の培地により製造)に由来することができる。凝固因子は、例えばヒト組織から抽出したトロンビンでよい。
【００６６】
凝固因子、特にトロンビンが存在する場合、その含有量は組成物の総重量に対して０．１重量％未満でよい。
【００６７】
トロンビンの場合、国際単位(ＩＵ)が一般的に使用される。従って、組成物は、トロンビン含有量が、組成物の０．０１ＩＵ／ｍｇ〜２０ＩＵ／ｍｇ、特に０．０５ＩＵ／ｍｇ〜１０ＩＵ／ｍｇ、特に０．１ＩＵ／ｍｇ〜５ＩＵ／ｍｇ、実際０．２ＩＵ／ｍｇ〜２ＩＵ／ｍｇである。トロンビンが存在する場合の最も好ましい含有量は、組成物の約０．８３ＩＵ／ｍｇである。
【００６８】
単糖に加えて、組成物は、少なくとも一種他の炭水化物化合物を含むことができ、これはグリコサミノグリカンでよい。そのような炭水化物化合物は、組成物の一部でよく、凝固因子、例えばトロンビン、を含むか、または含まない。
【００６９】
グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびそれらの混合物から選択することができ、特にコンドロイチン硫酸である。
【００７０】
グリコサミノグリカンは、血液が粉体により吸収される速度を改良することができる。より詳しくは、グリコサミノグリカンは、血液と止血製品、特にコラーゲンとトロンビン、との間の接触を促進することができる。
【００７１】
組成物は、組成物の総重量に対して２〜２５重量％、特に３〜２０重量％、特に４〜１５重量％、特に５〜１２．５重量％含有量のグリコサミノグリカンを含むことができる。最も好ましくは、グリコサミノグリカンの含有量は、存在する場合、組成物の総重量に対して約９重量％である。
【００７２】
組成物は、コラーゲン／グリコサミノグリカンの重量比が２．５〜５０、特に３．５〜３５、特に５〜２５、特に６．５〜２０でよい。
【００７３】
一実施態様では、組成物は、少なくとも一種、特に一種、の単糖、および少なくとも一種、特に一種、のグリコサミノグリカン、特に上に規定したようなものを、および上に規定した量で含んでなる。
【００７４】
炭水化物化合物は、特に単糖およびグリコサミノグリカンである。
【００７５】
組成物は、炭水化物を、組成物の総重量に対して２〜２５重量％、特に５〜２３重量％、特に７〜２１重量％、特に１０〜１８重量％の含有量で含むことができる。
【００７６】
組成物は、コラーゲン／炭水化物化合物を、２〜４０、特に２．５〜３０、特に３〜２０、特に３．５〜１５の重量比で含むことができる。
【００７７】
「炭水化物化合物の総重量」の表現は、上に規定する単糖の重量、および上記の他の炭水化物化合物の重量の合計を意味する。
【００７８】
一実施態様では、組成物は、
主として繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを、コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％の含有量で含んでなるコラーゲン、および
少なくとも一種、特に一種の単糖、
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００７９】
特に、組成物は、
組成物の総重量に対して７０〜９９重量％、特に７５〜９６重量％、特に７７〜９３重量％、実際８０〜９０重量％の量のコラーゲン、コラーゲンは、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを、コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％の含有量で含んでなる、および
組成物の総重量に対して１〜１２．５重量％、特に１．５〜１０重量％、特に２〜８重量％、および特に２．５〜７．５重量％の量の、少なくとも一種の単糖、特にグルコース、
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８０】
別の実施態様では、組成物は、
コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％含有量の、主として繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなるコラーゲン、
少なくとも一種、特に一種の単糖、
少なくとも一種、特に一種の凝固因子
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８１】
特に、組成物は、
組成物の総重量に対して７０〜９９重量％、特に７５〜９６重量％、特に７７〜９３重量％、実際８０〜９０重量％の量のコラーゲン、該コラーゲンは、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを、コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％の含有量で含んでなる、
組成物の総重量に対して１〜１２．５重量％、特に１．５〜１０重量％、特に２〜８重量％、および特に２．５〜７．５重量％の量の、少なくとも一種の単糖、特にグルコース、および
組成物の０．０１ＩＵ／ｍｇ〜２０ＩＵ／ｍｇ、特に０．０５ＩＵ／ｍｇ〜１０ＩＵ／ｍｇ、特に０．１ＩＵ／ｍｇ〜５ＩＵ／ｍｇ、実際０．２ＩＵ／ｍｇ〜２ＩＵ／ｍｇの、少なくとも一種、特に一種、の凝固因子、特にトロンビン
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８２】
別の実施態様では、組成物は、
コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％含有量の、主として繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなるコラーゲン、
少なくとも一種、特に一種の単糖、および
少なくとも一種、特に一種のグリコサミノグリカン
を含んでなり、実際、上記からなる。
【００８３】
特に、組成物は、
組成物の総重量に対して７０〜９９重量％、特に７５〜９６重量％、特に７７〜９３重量％、実際８０〜９０重量％の量のコラーゲン、該コラーゲンは、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを、コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％の含有量で含んでなる、
組成物の総重量に対して１〜１０重量％、特に１〜１２．５重量％、特に１．５〜１０重量％、特に２〜８重量％、および特に２．５〜７．５重量％の量の、少なくとも一種の単糖、特にグルコース、および
組成物の総重量に対して２〜２５重量％、特に３〜２０重量％、特に４〜１５重量％、特に５〜１２．５重量％の量の少なくとも一種のグリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸、
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８４】
さらに別の実施態様では、組成物は、
コラーゲンの総重量に対して少なくとも50重量％含有量の、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなるコラーゲン、
少なくとも一種、特に一種の単糖、
少なくとも一種、特に一種の凝固因子、および
少なくとも一種、特に一種のグリコサミノグリカン、
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８５】
特に、組成物は、
組成物の総重量、特に乾燥重量に対して７０〜９９重量％、特に７５〜９６重量％、特に７７〜９３重量％、実際８０〜９０重量％の量のコラーゲン、該コラーゲンは、繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを、コラーゲンの総重量に対して少なくとも５０重量％の含有量で含んでなる、
組成物の総重量に対して１〜１０重量％、特に１〜１２．５重量％、特に１．５〜１０重量％、特に２〜８重量％、および特に２．５〜７．５重量％の量の、少なくとも一種の単糖、特にグルコース、
組成物の０．０１ＩＵ／ｍｇ〜２０ＩＵ／ｍｇ、特に０．０５ＩＵ／ｍｇ〜１０ＩＵ／ｍｇ、特に０．１ＩＵ／ｍｇ〜５ＩＵ／ｍｇ、実際０．２ＩＵ／ｍｇ〜２ＩＵ／ｍｇの、少なくとも一種、特に一種、の凝固因子、特にトロンビン、および
組成物の総重量に対して２〜２５重量％、特に３〜２０重量％、特に４〜１５重量％、特に５〜１２．５重量％の量の少なくとも一種のグリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸、
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８６】
特別な実施態様では、組成物は、
フィブリル型のコラーゲン、大部分が繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなり、該フィブリル型のコラーゲンは、例えば、塩基性媒体中で抽出により得られ、組成物の総重量に対して約８５重量％の量である、
グルコース、組成物の総重量に対して約４．９重量％の量である、
トロンビン、組成物の０．２ＩＵ／ｍｇ〜２ＩＵ／ｍｇの量である、および
コンドロイチン硫酸、組成物の総重量に対して約１０重量％の量である
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８７】
特別な実施態様では、組成物は、
フィブリル型のコラーゲン、大部分が繊維状および／またはフィブリル状コラーゲンを含んでなり、該フィブリル型のコラーゲンは、例えば、塩基性媒体中で抽出により得られ、組成物の総重量に対して約８５重量％の量である、
グルコース、組成物の総重量に対して約５重量％の量である、および
コンドロイチン硫酸、組成物の総重量に対して約10重量％の量である
を含んでなり、実際、それらからなる。
【００８８】
本発明の状況下では、「約Ｘ％の量」の表現は、プラスまたはマイナス２０％の変動を意味する、言い換えれば、約１０％の量は８％〜１２％、特に、プラスまたはマイナス１０％の変動、実際プラスまたはマイナス５％の変動を意味する。
【００８９】
トロンビンを加える場合、トロンビンの粉体を、すでに調製したコラーゲン／単糖の均質な分子混合物の粉体と混合する。コンドロイチン硫酸を加える場合、先ずトロンビンをコンドロイチン硫酸粉体に加え、この混合物を、前のコラーゲン／単糖の混合物(すでに粉体に粉砕した)と混合する。トロンビンは、炭水化物によっても、コラーゲンによっても安定化されない。トロンビンは、単糖の溶液と決して接触しない(国際公開第９８／５７６７８号パンフレットと反対に)が、これは、タンパク質の変性、および再び適切な乾燥を不可能とする粉体の再水和を阻止する。
【００９０】
組成物は、幾つかの固体粉体の形態、特にスプレー可能な粉体、で提供することができる。本発明の組成物は、好ましくはスプレー可能な粉体である。
【００９１】
粉体形態にある組成物は、特に
フィブリル型のコラーゲンおよび少なくとも一種の単糖、特にグルコース、を含んでなるか、またはそれらからなる粒子、特に該粒子は、本説明で定義するようなサイズ、粒度および密度を有する、および
所望により、少なくとも一種のグリコサミノグリカン、特にコンドロイチン硫酸、および／または少なくとも一種の凝固因子、特にトロンビン、を含んでなるか、またはそれらからなる粒子、特に該粒子は、本説明で定義するようなサイズ、粒度および密度を有する
を含んでなるか、またはそれらからなることができる。
【００９２】
粉体形態、特にスプレー可能な粉体にある本組成物は、有利には、タップ密度が０．４ｇ／Ｌを超える、特に０．４１ｇ／Ｌ以上である。実際、粉体を止血剤として使用する場合、密度は、血流による製品の希釈および反発作用に十分に耐えられる必要がある。密度が０．４ｇ／Ｌを超える粉体組成物を与えることにより、粉体が血液により洗い流されるのを防止する。
【００９３】
手作業で使用する場合、外科医は、粉体をガーゼで押し付け、圧迫の最後まで製品が移動しないようにすべきである。
【００９４】
出血している傷の上に粉体組成物をスプレーすることを意図する場合、そのような組成物は、スプレー装置から放出された時に、粉体顆粒が特定の運動エネルギーに到達できるように、はるかに高い密度を有するのが好ましい。実際、低密度の粉体は、埃を生じることなく、空気により完全に移動して傷に到達することはできないが、これは、ほとんどの場合に必要とされる正確な使用とは相容れない。高い密度を有することにより、スプレー装置は、粉体に十分な運動エネルギーを与え、粉体を傷口まで飛ばす良好な衝撃力を与えることもできる。従って、粉体組成物は、好ましくは０．４ｇ／ｍＬを超えるタップ密度を有する。より好ましくは、粉体組成物は、０．６ｇ／ｍＬ以下のタップ密度を有する。
【００９５】
そのような密度特徴を有する粉体組成物を得る方法は、乾燥コラーゲンのケーキを接地することであり、そのようなケーキは、コラーゲンの硬い、緻密な調製品である。コラーゲンの凍結乾燥調製品を接地しても必要な密度に到達できないが、これは、最終的な粒子が平らになり、従って、スプレー可能ではなく、大量の静電荷を有する。例えば、国際公開第０１／９７８７３号パンフレットで調製された製品は、そのような密度およびそのようなスプレー可能な特徴を有する粉体に縮小できない。
【００９６】
国際公開第２００５／０７２７００号パンフレットに記載されている粉体は、密度が非常に低く、従って、この粉体はスプレーにより、特に腹腔鏡検査では標的とする器官に達することはできない。特に、必要な衝撃力をもって傷口に到達し、血流による反発力を阻止することはない。
【００９７】
特に粉体形態にある本組成物は、特にスプレー可能であり、好ましくはタップ密度が０．４ｇ／Ｌを超え、特に０．４１ｇ／Ｌを超えている。
【００９８】
より好ましくは、組成物粉体のタップ密度は、０．４ｇ／ｍＬを超え、最も好ましくは０．６ｇ／ｍＬ以下である。
【００９９】
かさ密度は、一般的に０．３ｇ／Ｌ以上であり、特に０．３１ｇ／Ｌ以上である。
【０１００】
かさ密度は、有利には０．３ｇ／Ｌを超え、特に０．３１ｇ／Ｌを超えている。
【０１０１】
これらの密度は、例に記載されている手順に従って測定する。
【０１０２】
本発明の組成物は、有利には１秒間〜６００秒間、特に１秒間〜２００秒間、特に１秒間〜６０秒間、実際１秒間〜４０秒間の止血能力を有する。止血能力は、例に記載されている手順に従って測定する。
【０１０３】
本発明の組成物は、少なくとも５０重量％の、２００μｍ〜４００μｍのサイズを有する粒子を含んでなるのが有利である。
【０１０４】
粉体を構成する粒子は、平均粒度が１０μｍ〜５００μｍ、特に５０μｍ〜４００μｍであるのが有利である。
【０１０５】
有利には、該粉体を構成する粒子の少なくとも９０重量％、特に１００重量％が、５００μｍ、特に４００μｍのメッシュを有するスクリーンを通過することができる。
【０１０６】
粉体を構成する粒子の少なくとも９０重量％、特に少なくとも９５重量％が、１０μｍ、特に２０μｍ、実際３０μｍ、実際５０μｍのメッシュを有するスクリーンにより保持される。
【０１０７】
この分割は、粉体をスプレーできるように選択されている。粒子径が小さすぎる場合、粉体は、粉になり易く、標的に適切に到達できず、粒子径が大きすぎる場合、粉体はスプレーできない。
【０１０８】
組成物の大多数の化合物、特にコラーゲン、は、２０分間における膨潤比が、例（例４参照）に記載されている手順に従って測定して、０．７〜１である。
【０１０９】
組成物は、特に該組成物が少なくとも一種のグリコサミノグリカンを含んでなり、特に該組成物がコンドロイチン硫酸を含んでなる場合、２０分間における膨潤比が、例（例５参照）に記載されている手順に従って測定して、５〜１５、特に８〜１２、特に１０〜１２である。
【０１１０】
好ましい実施態様では、組成物は、スプレー可能な乾燥粉体の形態で提供する。
【０１１１】
粉体形態の組成物は、特に
コラーゲンおよび単糖を含んでなる粒子、および
所望により、少なくとも一種のグリコサミノグリカンおよび／またはトロンビン、
を含んでなる。
【０１１２】
組成物は、
コラーゲン、単糖および所望により少なくとも一種のグリコサミノグリカンおよび／または凝固因子を含んでなる粒子、
コラーゲン、単糖および所望により凝固因子を含んでなる粒子および所望によりグリコサミノグリカン粒子、
コラーゲンおよび単糖を含んでなる粒子および少なくとも一種のグリコサミノグリカンおよび／または凝固因子を含んでなる粒子、
を含むことができる。
【０１１３】
本発明の状況下では、「乾燥粉末」の表現は、組成物が限られた含有量の溶剤、特に水、を含んでなることを意味する。該限られた含有量は、組成物の総重量に対して２０重量％未満、特に１５重量％未満、特に１０重量％未満、および特に５重量％未満を意味する。
【０１１４】
乾燥形態は、使用する溶剤の単純な蒸発により、有機溶剤の脱水により得られる。
【０１１５】
乾燥粉体形態にある組成物は、特にスプレーにより使用することができる。
【０１１６】
特に、本発明は、
本発明の組成物、および
スプレー装置、
を備えたキットに関する。
【０１１７】
組成物は、本説明により規定されるようなものである。粉体形態にある製薬組成物をスプレーするための様々なスプレー装置が当業者には知られている。
【０１１８】
特に、装置は、加圧ガスの貯蔵部を備えてなり、該圧力は、活性化するための活性化手段により、特にトリガーにより放出する。
【０１１９】
装置は、
活性化手段、
粉体貯蔵部、特に本発明の粉体を含んでなる、
粉体貯蔵部に接続されたガス貯蔵部、
粉体貯蔵部に接続されたスプレー装置、
活性化手段に連結されたバルブＡを備えてなり、前記バルブＡは、活性化手段が休止位置にあるときは閉鎖され、それによってガス貯蔵部と粉体貯蔵部の間のガス流をブロックし、活性化手段が活性化された時、前記バルブは開き、ガスを噴射し、粉体の少なくとも一部をスプレーする。
【０１２０】
ガス貯蔵部は、加圧ガスを供給する手段、例えば圧縮ガスのシステムまたは圧縮ガスのタンク、に連結し、システムを自動化することができる。
【０１２１】
装置は、ガス貯蔵部と供給手段との間に、バルブＢを備えてなり、前記バルブＢは、活性手段と連結させることができる。
【０１２２】
バルブＢは、活性化手段が活性化されていない時は、開いた位置にあり、活性化手段が活性化された時は、閉鎖される。
【０１２３】
従って、バルブＡが開いている時、バルブＢは閉じており、逆も同様である。これによって、予め決められた量の加圧ガスが発送されると、ある用量の粉体が発送され、同時に汚染物が装置の内側と接触するのが防止される。
【０１２４】
装置がガスの供給手段と連結していない時、バルブＢは好ましくは閉じている。これによって、装置内側が汚染される危険性を制限することができる。
【０１２５】
特に、粉体貯蔵部は、数回の用量の粉体を含んでなるシリンダーの形態にある。シリンダーは、粉体をスプレーするガス流により活性化されるプロペラと連結し、従って、活性化手段を活性化した後、シリンダーを回し、粉体の用量を変えることができる。
【０１２６】
シリンダー中に存在する用量は、ガス流が上記の用量を横切る時、引き裂いて開く構成部分により密封され、無菌にすることができる。これによって、用量を無菌環境に保存することができる。
【０１２７】
用量の体積は、約０．２ｃｍ３〜１ｃｍ３、特に約０．３ｃｍ３である。
【０１２８】
使用するガスは、空気、二酸化炭素またはいずれかの不活性ガスでよい。
【０１２９】
特に、装置は、ここに参考として含める欧州特許第ＥＰ１１１６３８２０．１号および米国特許仮出願第６１／４７９，８０５号（２０１１年４月２７日提出）に記載されている。
【０１３０】
本発明は、特に上記のような、止血組成物の製造方法であって、少なくとも下記の工程、即ち、
ａ）フィブリル型のコラーゲン−主として繊維状および／またはフィブリル状コラーゲン−および単糖、例えばグルコース、を含んでなり、実際、それらからなる水性懸濁液を形成する工程、
ｂ）沈殿物、ペーストまたはゲルの形態にある生成物を、特に遠心分離またはデカンテーションにより回収する工程、
ｃ）生成物を、例えば蒸発により、乾燥させる工程、
ｄ）生成物を所望の粒度に、特にハンマーミルにより粉砕する工程、
ｅ）所望により、トロンビンおよび／またはコンドロイチン硫酸を、特に固体形態で、特に粉体形態で加える工程、
を含んでなる、方法に関する。
【０１３１】
工程ａ）の繊維状／フィブリル状コラーゲンおよび単糖を含んでなる水性懸濁液の形成は、コラーゲン分子の周りに単糖を均質に配分する。さらに、コラーゲンと単糖の分子種間の緊密な接触により、脱水の後、必要な高密度を有する粉体を−接地により−得るのに好適な硬質のケーキが得られる。反対に、コラーゲン粉体およびグルコース粉体を混合しても、特に密度および電荷のために、均質で、スプレー可能な粉体にはならない。
【０１３２】
工程ａ）で、コラーゲンは、３０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの濃度で存在し得る。
【０１３３】
単糖は、懸濁液または均質なコラーゲンペーストに、本説明で規定する量で、より詳しくは、コラーゲンの総重量に対して約２〜５重量％加えることができる。
【０１３４】
工程ａ）で、単糖は、０．３ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの濃度で存在することができる。
【０１３５】
工程ａ）のコラーゲンの水性懸濁液は、酸性でよく、特に酸、例えば塩酸を含むことができる。酸は、濃度０．０１Ｍ〜０．５Ｍ、特に０．０２Ｍ〜０．１Ｍ、実際約０．０５Ｍで存在できる。懸濁液は、均質なペーストの形態でよい。
【０１３６】
工程ｂ）は、懸濁を型の中に流し込むことを含むことができる。
【０１３７】
工程ｃ）は、できるだけ濃度が高いケーキ（より好ましくは最終的な粒度が望ましい）を、すなわち非常に高い密度、およびケーキ中にはできるだけ少ない気泡(５％未満)が得られるように行う。
【０１３８】
工程ｄ）の後に、特に所望の粒度を得るための、粉体のスクリーニングを行うことができる。
【０１３９】
好ましい実施態様では、工程ａ）は、フィブリル型のコラーゲン９５重量％、およびグルコース５重量％を含んでなる混合物を形成することからなる。この混合物を乾燥（工程ｂ））および粉砕（工程ｃ））した後、コンドロイチン硫酸を混合物の総重量に対して１０重量％の含有量で加え、最終的な組成物が
コラーゲン：組成物の総重量に対して８６．３６重量％、
グルコース：組成物の総重量に対して４．５４重量％、
コンドロイチン硫酸：組成物の総重量に対して９．０９重量％
を含むようにする。
【０１４０】
トロンビンも加える場合、トロンビンの最終含有量が、組成物の総重量に対して０．０１重量％未満になる。上記の混合物で、トロンビンは、組成物の０．０８３ＩＵ／ｍｇの量でよい。
【０１４１】
別の実施態様では、本発明は、本発明の方法により得られる粉体にも関する。
【０１４２】
上記粉体製品の全てに関して、極めて明らかに、多かれ少なかれ完全な粉砕を行い、粉砕の種類およびその持続時間により、様々な粒度の粉体を得ることができる。
【０１４３】
もう一つの態様により、本発明は、上記のような組成物の、止血剤としての使用に関する。
【０１４４】
さらに別の態様により、本発明は、上記のような組成物を含んでなる、実際その組成物からなる、特に止血剤としての製薬組成物または薬物に関する。
【０１４５】
別の態様により、本発明は、上記のような組成物の、薬物または製薬組成物、特に止血薬または製薬組成物を製造するための使用に関する。
【０１４６】
別の態様により、本発明は、上記のような組成物を、動物の体の出血部分の上に堆積および／またはスプレーすることを含んでなる、止血方法に関する。特に、組成物は、手術手順、特に開腹術、腹腔鏡検査、セリオスコピーおよびロボット手術技術で使用できる。
【０１４７】
本発明は、本発明の組成物をスプレーする工程を含んでなる止血方法にも関する。
【０１４８】
別の態様により、本発明は、上記のような組成物の、生物学的接着剤としての使用に関する。
【０１４９】
さらに別の態様により、本発明は、上記のような組成物の、内部および外部の傷に対する瘢痕化剤としての使用に関する。「瘢痕化剤」の表現は、それが接触する組織の臨床的に満足できる瘢痕化を得ることができる製品を意味する。
【実施例】
【０１５０】
例１  密度測定の手順
特に粉体形態の試験すべき製品（６００ｍｇ）を５ｍＬメスシリンダーに入れる。製品の高さを測定し、対応する体積を記録する。測定を３回繰り返す。次いで、チューブを１００回硬い表面にタッピングすることにより、製品を３回充填する。製品の高さおよび対応する体積を再度測定する。これによって、それぞれかさ密度およびタップ密度と呼ぶ、充填の前および後の製品密度が得られる。
【０１５１】
例２  止血能力をインビトロ測定する手順
クエン酸（約０．１Ｍ）を加えたヒトの血液を、測定全体を通して、水浴中で３７℃に維持する。試験すべき製品（１０ｍｇ）を、キャップ付きの５ｍＬポリプロピレン試験管中に入れ、次いでクエン酸を加えた新しい血液（２ｍＬ）を加えた。次いで、ＣａＣｌ２を、血液中の最終的なＣａＣｌ２濃度が１５ｍＭになるまで加え、次いで試験管を閉じた。次いで、強く転倒させることにより（１０回）、内容物をあらかた混合し、次いで試験管を水浴中に沈め、試験管を１０秒間ごとに垂直位置に戻す。固まりが形成されるのに必要な時間を記録し、止血能力とする。
【０１５２】
例３  粒子径測定の手順
既知量の製品、特に粉体、を５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍおよび４００μｍスクリーンを２分間（スクリーン毎）に通して篩にかける。各スクリーンから得た画分を秤量する。各粒度範囲の割合を測定する。
【０１５３】
例４  組成物の主要成分の膨潤を測定する手順
組成物、特にコラーゲン（４０ｍｇ〜７０ｍｇ）、を計量ボートで秤量する。別の計量ボートに、６ｍＬの０．１５Ｍ  ＮａＣｌを載せる。試験すべき化合物を０．１５Ｍ  ＮａＣｌの上に載せる（ｔ＝０）。２０分後、過剰の液体を除去し、膨潤した物質を秤量する。乾燥出発物質の重量に対する水吸収量が膨潤比に相当する。
【０１５４】
例５  組成物の膨潤を測定する手順
１５ｍＬフラスコを秤量し（ｍｇでｍ０）、次いで乾燥組成物の粉体Ｘｍｇを加える（ｍｇでｍ０＋Ｘ）。０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液（２ｍＬ）を加え、組成物を２０分間放置して膨潤させ、次いでフラスコを１，０００ｒｐｍで遠心分離する。
【０１５５】
過剰のＮａＣｌをＰａｓｔｅｕｒピペットで除去し、フラスコを濾紙の上で逆さにして滴を除去し、次いでフラスコを湿った粉体と共に秤量する（ｍｇでｍ１）。
【０１５６】
膨潤比は、次のように計算する、すなわち（ｍ１−ｍ０）／（ｍ０＋Ｘ−ｍ０）。
【０１５７】
例６  塩基性抽出によるフィブリル型のコラーゲンの調製
ブタの真皮（３０ｋｇ）を、アセトンで脱脂し、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００ｋｇ中で膨潤させる。この真皮を切断ミルで細かく切断し、得られたペーストを０．０５Ｍ  ＮａＯＨ溶液５０リットルで希釈する。次いで、混合物を、加圧下で、１ｍｍスクリーンを通して篩にかける。次いで、得られたペーストをＨＣｌでｐＨ６〜７．５に調節し、得られた沈殿を遠心分離または１ｍｍスクリーンを通して濾過により集める。
【０１５８】
被保持物を、当業者に公知の方法により、アセトンで脱水する。従って、この脱水した被保持物は、フィブリル型のコラーゲンからなり、非フィブリル状コラーゲンに対して大含有量のフィブリル状／繊維状コラーゲンを含む。一般的に、そのような抽出されたコラーゲンは、コラーゲンの総重量に対して８５〜９５重量％のフィブリル状／繊維状コラーゲン、およびコラーゲンの総重量に対して５〜１５重量％の非フィブリル状コラーゲンを含んでなる。
【０１５９】
例７  止血粉体＃１の製造
例６で調製したフィブリル型のコラーゲン３０ｇを、０．０２ＭＨＣｌ水溶液１Ｌに加え、次いでこの混合物を５時間撹拌する。次に、得られた均質なペーストに、粉体化したフルクトースを、コラーゲンの重量に対して２％（０．６ｇ）の量で加える。
【０１６０】
混合物を１時間均質化し、次いで取り出し、脱水する。乾燥後、乾燥製品を、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋハンマーミルを使用し、調整された加熱下で、７，０００ｒｐｍで２５ｇ／分の速度で粉砕する。次いで生成物を機械的スクリーニングにかけ、４００μｍを超えるサイズの粒子を除去する。
【０１６１】
次いで、デルマタン硫酸をこの粉体に、粉体の乾燥成分に対して２重量％の量で加える（０．６１２ｇ）。
【０１６２】
次いで、混合物を、ボールミルを使用して均質化し、凍結乾燥させたトロンビンをこの混合物に粉体の１５ＩＵ／ｍｇの量で加え、最後にボールミルを使用して混合物を均質化する。
【０１６３】
例８  止血粉体＃２の製造
例６で調製したフィブリル型のコラーゲン７．５ｋｇを、０．０５ＭＨＣｌ水溶液５０Ｌに加え、次いでこの混合物を１６時間撹拌する。次に、得られた均質なペーストに、粉体化したフルクトースを、コラーゲンの重量に対して５％（３７５ｇ）の量で加える。
【０１６４】
混合物を３時間均質化し、次いでプレート上に配分し、脱水する。乾燥後、乾燥製品を、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋハンマーミルを使用し、調整された加熱下で、１２，０００ｒｐｍで５ｇ／分の速度で粉砕する。次いで生成物を機械的スクリーニングにかけ、４００μｍを超え、５０μｍ未満の粒子を除去する。
【０１６５】
粒度を測定し、分布が、試料の６０重量％が２００μｍを超える粒度を有するようにする。
【０１６６】
次いで、精製したコンドロイチン硫酸をこの粉体に、粉体の乾燥成分に対して２０重量％の量で加える（１．５７５ｋｇ）。ボールミルを使用して混合物を均質化する。
【０１６７】
最後に凍結乾燥させたトロンビンをこの混合物に粉体の１０ＩＵ／ｍｇの量で加える。前と同様に、混合物を、ボールミルを使用して均質化する。
【０１６８】
例９  止血粉体＃３の製造
例６で調製したフィブリル型コラーゲン１０００ｇを、０．０２ＭＨＣｌ水溶液６０ｍＬに加え、次いでこの混合物を５時間撹拌する。次に、得られた均質なペーストに、粉体化したグルコースを、コラーゲンの重量に対して５％（５０ｇ）の量で加える。
【０１６９】
混合物を１時間均質化し、次いで取り出し、脱水する。乾燥後、乾燥製品を、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋハンマーミルを使用し、調整された加熱下で、７，０００ｒｐｍで２５ｇ／分の速度で粉砕する。次いで生成物を機械的スクリーニングにかけ、４００μｍを超え、５０μｍ未満の粒子を除去する。
【０１７０】
次いで、コンドロイチン硫酸をこの粉体に、粉体の乾燥成分に対して１０重量％の量で加える（１０５ｇ）。ボールミルを使用して混合物を均質化する。
【０１７１】
そのような粉体組成物は、タップ密度が約０．４０８ｇ／ｍＬである。
【０１７２】
例１０  止血粉体＃４の製造
例６で調製したフィブリル型のコラーゲン５００ｇを、０．０２ＭＨＣｌ水溶液３００ｍＬに加え、次いでこの混合物を５時間撹拌する。次に、得られた均質なペーストに、粉体化したグルコースを、コラーゲンの重量に対して５％（２５ｇ）の量で加える。
【０１７３】
混合物を１時間均質化し、次いで取り出し、脱水する。乾燥後、乾燥製品を、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋハンマーミルを使用し、調整された加熱下で、７，０００ｒｐｍで２５ｇ／分の速度で粉砕する。次いで生成物を機械的スクリーニングにかけ、４００μｍを超え、５０μｍ未満の粒子を除去する。
【０１７４】
次いで、トロンビン粉体と混合したコンドロイチン硫酸をこの粉体に、粉体の乾燥成分に対して１０重量％の量で加える（５２．５ｇ）。トロンビンは、混合物に０．８５ＩＵ／ｍｇの最終的な量で加える。ボールミルを使用して混合物を均質化する。
【０１７５】
そのような粉体組成物は、タップ密度が約0.425g/mLである。
【０１７６】
例１１  粉体＃３を基剤とする止血コラーゲンの製造
例９で調製した、コラーゲン、グルコース、コンドロイチン硫酸を含み、トロンビンを含まない、コラーゲンを基剤とする粉体＃３を、インビボ実験の際に試験した。
【０１７７】
実験の手順は、下記の通りである。
左傍正中肝臓葉表面上にサイズが約１０×１０×１−３ｍｍ３の傷を造った。
次いで、供試製品を３０秒間で貼り付けた。傷を覆うのに十分な製品を貼り付け、供試製品は、ガーゼを使用して傷口に穏やかに圧迫して保持した。
次いで、出血の等級付けを行い、到達した止血の百分率を査定した。臨床的に妥当な止血に到達した場合には、実験を停止した。そうでない場合には、別の圧迫等級付けを、圧縮５回まで行った。一回毎に、実験中の製品を新しくした。
【０１７８】
実験は、下記の製品、すなわち止血組成物を全く含まないガーゼ（比較用と呼ぶ）、止血粉体＃３で覆ったガーゼ（ＧＨＰ＃３と呼ぶ）、Ｄａｖｏｌから入手した止血ガーゼ「Ａｖｉｔｅｎｅ」（「Ａｖｉｔｅｎｅ」と呼ぶ、コラーゲン繊維から構成）、Ｅｔｈｉｃｏｎから入手した止血ガーゼ「Ｓｕｒｇｉｃａｌ」（「Ｓｕｒｇｉｃａｌ」と呼ぶ、酸化セルロースから構成）で行った。
【０１７９】
結果は、各製品で到達した止血の百分率を示す下記の表Ｎｏ１に示す。
【表１】
2014512403.tif 000002
【０１８０】
実験から、提案する止血粉体は、効果が非常に急速に発揮され、２回目ですでに完全な止血が達成され、８０％を超える効率が１回目の後で得られたことを示している。
【０１８１】
「Ａｖｉｔｅｎｅ」に関しては、到達した止血の百分率低下が、２回目と３回目の間に傷口が再度出血したためである。
【０１８２】
例１２  粉体＃４を基剤とする止血コラーゲンの性能
例１０で調製した、コラーゲン、グルコース、コンドロイチン硫酸、およびトロンビンを含む、粉体＃４を基剤とするコラーゲンをインビボ実験の際に試験した。
【０１８３】
実験の手順は下記の通りである。
動物モデル：ヘパリンを投与したブタ
腹部手術
・正中線腹腔鏡検査、肝臓曝露、外科用メスで接線方向肝臓、約１０×１０×１−３ｍｍの傷、
・供試製品を、傷口が十分に覆われるように貼り付け、２分間圧迫、
・出血等級付け（スケール０〜４）、成功した場合、１回目で停止、そうでない場合、新たな圧迫および出血判定、５回まで許容。
腸骨稜手術
・背面、横方向の皮膚および筋肉を切開して腸骨稜を露出、スポンジ状骨露出によるコルチコトミー（約１２×１２×３ｍｍの傷）、
・供試製品を傷口が十分に覆われるように貼り付け、圧迫２分間、
・初期出血判定およびさらなる出血等級付け（スケール０〜４）、成功した場合１回目で停止、そうでなければ、さらに圧迫および出血判の回数を行い、５回目まで許容される。
【０１８４】
実験は、下記の製品、すなわち止血組成物を全く含まないガーゼ（比較用と呼ぶ）、止血粉体＃４で覆ったガーゼ（ＧＨＰ＃４と呼ぶ）、Ｂａｘｔｅｒから入手した止血ガーゼ「Ｆｌｏｓｅａｌ」（「Ｆｌｏｓｅａｌ」と呼ぶ、ゼラチンマトリックスゲル＋トロンビンから構成）、Ｅｔｈｉｃｏｎから入手した止血ガーゼ「Ｓｕｒｇｉｃａｌ」（「Ｓｕｒｇｉｃａｌ」と呼ぶ、酸化セルロースから構成）で行った。
【０１８５】
結果は次の通りである、すなわち
腹部手術（ｎ＝８〜１０反復）−１０分間の圧迫後に得た結果（＝２分毎の５回）
比較用：１０／１０失敗
ＧＨＰ＃４：１１／１１成功
Ｆｌｏｓｅａｌ：９／９成功
Ｓｕｒｇｉｃａｌ：８／１０成功、２／１０失敗
整形外科（ｎ＝４反復）−１０分間の圧迫後に得た結果（＝２分毎の５回）
比較用：１／４成功、３／４失敗
ＧＨＰ＃４：４／４成功
Ｆｌｏｓｅａｌ：３／４成功、１／４失敗
Ｓｕｒｇｉｃａｌ：４／４成功
【０１８６】
この実験は、提案した止血粉体が、傷に対してより特異的である市販の製品と反対に、あらゆる種類の傷に対して１００％有効であることを示している。
【０１８７】
例１３  コラーゲン特性試験→コラーゲン中の可溶性コラーゲンの存在、フィブリル状／繊維状コラーゲンと非フィブリル状コラーゲンの割合を決定
実験の目的は、コラーゲン（抽出したコラーゲンまたは粉体に粉砕したコラーゲン）中のフィブリル状／繊維状コラーゲンと非フィブリル状コラーゲンの割合を決定することである。そのような割合は、コラーゲン中の不溶なコラーゲンの割合（フィブリル状／繊維状コラーゲンに相当）および可溶なコラーゲン（非フィブリル状コラーゲンの割合）を研究することにより、決定できる。
【０１８８】
実験では、供試コラーゲン約２．５ｇを、ｐＨ１３の水１６６ｍＬに１６時間入れて可溶化する。次いで溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分間）する。次いで、上澄み液（非フィブリル状コラーゲンに対応）および残留物（繊維状／フィブリル状コラーゲンに対応）を分離する。残留物は、順次アセトン浴および調整された空気流中で直接乾燥させる。上澄み液のｐＨは、酢酸および６Ｍの塩酸でｐＨ３に調節した。上澄み液に含まれる固体コラーゲンは、０．６ＭのＮａＣｌを加え、遠心分離により得た。次いで、それをアセトン浴および調整された空気流中で乾燥させた。
【０１８９】
残留物から得たコラーゲン重量（Ｍ残留物）および上澄み液から得たコラーゲン重量（Ｍ上澄み液）を計算し、式Ｍ残留物／（Ｍ残留物＋Ｍ上澄み液）×１００により、コラーゲンの総量に対する繊維状コラーゲンが得られる。
【０１９０】
本発明では、Ｍ残留物／（Ｍ残留物＋Ｍ上澄み液）の比は、粉体の製造に使用するコラーゲンおよび最終的コラーゲン粉体の両方に対して８０％を超えていなければならない。好ましくは、この比は８５％を超えている。
【０１９１】
例えば、例６で調製したコラーゲンの３バッチで行った上記の実験は、それぞれ非常に近似した比９２．６７％、９４．６０％および９１．５１％を与えている。これら３バッチのコラーゲンを粉砕した後、その比は、９１．６３％、８８．０２％、および８８．６９％と非常に類似したままである。
【０１９２】
繊維状／フィブリル状コラーゲンおよび可溶性コラーゲンの両方の存在を示すもう一つの方法は、ＳＤＳペイジ（ｐａｇｅ）電気泳動法を行うことである。
【０１９３】
図１は、第一バッチ（例６で抽出したコラーゲンから製造した）の上澄み液に対応する試料Ｓ１、この第一バッチの残留物に対応する試料Ｓ２、および第二バッチ（やはり例６で抽出したコラーゲンから製造した）の上澄み液に対応する試料Ｓ３、この第二バッチの残留物に対応する試料Ｓ４による、そのような電気泳動法を示す。
【０１９４】
結果は、残留物から得たコラーゲンに関して、大量の繊維は、アクリル酸アミドゲルを通って移動することはできず、ゲルの停止位置で染色する。試料の調製により、各鎖はコラーゲンから分離できない。従って、アルファ鎖は非常に少ない量で存在する。上澄み液から得たコラーゲンは、ゲル中を完全に移動することができ、最上部でブロックされた繊維は無く、コラーゲンに由来する鎖は、電気泳動プロセスの際に適切に分割される。
【図１】
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【国際調査報告】
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