(57)【要約】インシトゥーで形成されるマトリクスの生産のためのスプレーシステムを記載し、それは、グリコール酸および乳酸に基づく少なくとも一種のポリマーを含む少なくとも一種の親脂性成分および0.2未満のXlogP3値を有する少なくとも一種の生体適合性溶媒、および少なくとも一種の親水性成分を含み、少なくとも二つの成分は使用する前に互いに別々に存在し、そしてヒト組織上にスプレーされたときにフィルムを形成する成分と、スプレーされるまで、またはスプレーの進行中には混合されない。
2014527886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）グリコール酸および乳酸に基づく少なくとも一種のポリマーを含む少なくとも一種の親脂性成分、および0.2未満のXlogP3値を有する少なくとも一種の生体適合性溶媒、および
b）少なくとも一種の親水性成分
を含み、
少なくとも二つの成分は、適用前に互いに別々に存在し、そして、ヒト組織上にスプレーされたときにフィルムを形成する成分と、スプレーのためにか、またはスプレーの際にだけしか混合されない、
インシトゥーで形成されるマトリクスを生成するためのスプレーシステム。
【請求項２】
さらに、二つの成分の一つにおいてか、または双方の成分において溶解および/または分散される活性薬剤が含まれることを特徴とする、請求項１に従うスプレーシステム。
【請求項３】
親脂性成分には、PLGAポリマーおよびPLGAポリマーのための生体適合性溶媒が含まれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項４】
生体適合性溶媒は0.2から-1.0までのXlogP3値を有することを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項５】
生体適合性溶媒は、テトラグリコール、ジメチルイソソルビドおよび/またはグリセロールホルマールから選ばれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項６】
溶媒は少なくとも1mg/mlでのLD50を有することを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項７】
ポリマーは、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)ポリマーであり、ラクチド対グリコリドの比が25：75から75：25までであること；および/またはポリマーは、0.16から0.70 dl/gまでの固有粘度値を有するPLGAであること；および/またはPLGAポリマーは、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定して、10から63kDaまでのモル質量を有することを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項８】
PLGAおよび生体適合性溶媒は、溶媒100部当たり5乃至60部のPLGAが溶解するように選ばれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項９】
親水性成分は水であり、随意にその中に溶解または分散させた活性薬剤を伴うことを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１０】
スプレー後に形成されるフィルムは適用の部位で2から6週間の分解率を有することを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１１】
活性薬剤には、少なくとも一種の核酸が含まれるとともに、核酸は、できれば、RNA、DNA、mRNA、siRNA、miRNA、piRNA、shRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、触媒性DNAおよび/またはそれらの混合物であることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１２】
線維素溶解因子、できれば、tPAをコードする核酸が含まれることを特徴とする、先行する請求項に従うスプレーシステム。
【請求項１３】
活性薬剤には、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを抑制する物質が含まれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１４】
PAI（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター）を抑制する物質がsiRNAであることを特徴とする、先行する請求項に従うスプレーシステム。
【請求項１５】
核酸は担体物質との複合体を形成して存在し；担体物質は、できれば、正に荷電した基を有する担体物質、最も可能なら、ポリエチレンイミンであることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１６】
形成されるフィルムは二相放出動態を示すことを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１７】
1から10までのN/P比を有するポリプレックスが含まれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１８】
5：1から1：5までの比でtPAコードDNAおよびPAIインヒビターが含まれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【請求項１９】
腹膜上の適用での使用のための、詳細には、外科的接着および瘢痕形成の防止用の使用のための、先行する請求項のいずれか一項に従うスプレーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着、特に外科的接着の防止用に使用するスプレーまたはアプリケーションシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷および手術後、頻繁に接着が形成される。それらは、癒着および傷（瘢痕）に発展し、そして術後合併症を導く。特に、腹部における外科的介入は、第一次的な手術後接着を患者の最大で94%にもたらす。腹膜は漿膜として腹腔のライニングを形成する。それは、漿液性ギャップ（serosen Spaltraum、serous gap）で、それが5から20mlまでの液体で充填され、そして器官の自由な滑り運動を可能にするものを有するビセラル（内臓の）およびパライエタル（壁側の）層からなる。組織学的に、腹膜は、扁平上皮の単層で、中皮層とも呼ばれるもの、および漿膜結合組織の薄い層を含む。数日以内に、中皮層の損傷は、二つの層と周囲の組織との間の永久的な接着の形成をもたらす。手術から生じる損傷のほか、中皮層は、スワブの使用、手術の間のその表面の乾燥によって、またはタルカム粉末を付けた手袋を介したタルク粉（滑石）との接触によってもう損傷を受けていることがある。最小限の侵襲性外科手術、たとえば、腹腔鏡検査などのようなものにおいてでさえ、活性化過程（活性化プロセス）は推進される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
腹膜癒着（腹膜接着）の病態生理学における一世紀よりも長い研究にもかかわらず、今日に至るまで、これらの知見はいまだに不完全である。図1は、腹膜接着の病因を要約して、可能な治療上のアプローチとともに示す。腹膜組織の外傷は、炎症細胞および可溶性フィブリンモノマーの滲出を伴って、炎症反応を引き起こすことが想定される。これらは、約3時間以内に繊維構造を形成し、それは十分な線維素溶解活性がある場合、セリンプロテアーゼのプラスミンによって最初の数日（2〜3日）以内に溶解されうる。しかし、これが起こらない場合は、その結果として、コラーゲンリッチ（豊富）な結合組織、すなわち、永久的な接着を形成し、それは、その後、問題を引き起こすであろう。
【０００４】
損傷後の最初の二日で、主に好中球が炎症プロセスに関与する一方、マクロファージおよび中皮細胞は、永久的な接着の発生に重要な役割を演ずる。双方の細胞タイプは、血流中に、プラスミノーゲン、プラスミンの前駆体を放出することが可能である。毛細血管において、プラスミノーゲンは、セリンプロテアーゼのプラスミノーゲン活性化因子（組織/ウロキナーゼのプラスミノーゲン活性化因子、t-PA/u-PA）によってプラスミンに転換される。これらのプロテアーゼは、同様に、中皮層によって分泌される。たとえば、腫瘍壊死因子（TNF）、トランスフォーミング増殖因子（TGFβ）、またはインターロイキンなどのような炎症性サイトカイン濃度の増加によって引き起こされると、活性なtPAの濃度は外傷後の相において減少する。これは、腹腔内で線維素溶解活性の著しい減少をもたらし、それは線維素溶解およびフィブリン形成の間の不均衡を招き、そして永久的な接着の形成を促進する。組織における活性t-PA濃度の低下は、順に、中皮細胞における減少したt-PA生産およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1型（PAI-1）、組織プラスミノーゲン活性化因子の最も重要なインヒビターの同時過剰発現の結果である。一次創傷閉鎖と同様に、血小板（Thrombozyten、thrombozytes）がますますPAI-1を分泌し、それによりフィブリンの早期溶解が防止され、そして従って、一次創傷閉鎖が開始され、外傷後相において、それは中皮細胞およびサブ中皮（submesothelialer、submesothelial）血管の内皮細胞によるプラスミノーゲン活性化因子インヒビターの増加した形成になる。したがって、t-PA/PAI-1バランスが腹膜接着の形成のためのキーポイントであると考えられる。
【０００５】
永久的な接着の治療のために様々なアプローチがあり、たとえば、次のものである。
i）損傷および炎症を避けることによる一次予防、
ii）抗凝固剤による血清含有滲出物の凝固の防止、
iii）線維素溶解剤による線維構造物の溶解、
iv）分離による中皮層の再生までの機械的なバリアの使用、
v）線維症（Fibronisierung、fibrosation）の予防。
【０００６】
線維素溶解剤の使用および物理的な障壁（バリア）の使用は有望な治療上のアプローチと考えられたが、しかし、これらのアプローチはいずれも、それらに関連する欠点を考慮して臨床的に受け入れられなかった。現在のところ利用可能な繊維素溶解剤（fibronolytic agents）は、おそらく、とりわけ、血しょう中のそれらの短い半減期のため、不十分な抗接着活性しか有しないことが見出された。結果として必要な高投与量は、それらの使用を妨げる強力な副作用を生じさせる。既知の線維素溶解剤は、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組換え生産されたt-PAタンパク質アルテプラーゼ〔Actilyse (R)（商標）（アクチラーゼ）として入手可能〕、およびその修飾された形態のレテプラーゼ〔商業上入手可能な形態Rapilysin (R) （ラピリシン）〕である。アルテプラーゼは血しょう中3乃至6分の半減期しか有さず、それは修飾された形態のレテプラーゼについて13乃至16分に増加させることができた。したがって、複数の適用およびインフュージョン（注入）ポンプが継続的な薬物レベルを得るために必要とされ、それは高い副作用を生じさせる。
【０００７】
物理的バリアもまた、接着を低減するために既に使用されている。しかしながら、これまでのところ、それは術後合併症にプラス効果を示すことができていない。現在利用可能な物理的なバリアシステムは、アプリケーション（適用）の局所分野に制限されている。既知の物理的なバリアは、主に、吸収性の組織であり、酸化されたセルロース繊維、ヒアルロン酸およびカルボキシメチルセルロースの組合せ、またはPEGゲルのようなものである。
【０００８】
たとえば、接着バリアとして生分解性ポリマーを使用することが、アメリカ合衆国特許出願公開第2011/0052712号明細書（US2011/0052712A1）から知られている。この文献は、接着バリアを生成するための調剤物を提案し、それには、生分解性ポリマーおよび少なくとも一種の水溶性ポリマーの高分子の組合せからの多数の粒子が含まれ、それは接着を防止するようにフィルムの形態において組織上に堆積される。適用後の水溶性ポリマーは、膨潤するために、組織から水を吸収することを意図し、このようにして、粒子が徐々に分解し、場合によっては含まれる活性薬剤を放出するように、フィルム形成および水の供給を可能にする。これらの粒子は、活性薬剤として、たとえば、抗炎症剤を含むことがある。しかし、この調剤物により得られるフィルムの特性は、適用の部位での利用可能な水の量に依存し、そして再現可能な方法において調節することができない。
【０００９】
また、付着を防止する必要がある損傷または手術の部位に活性剤を適用することが提案されている。液体は望ましい場所に長く留まらないので、これまで、システムは、活性剤、ひょっとすると、生分解性ポリマー中にカプセル化されたものが、作成済み（プレハブ）のマトリクスにおいて提供されるようにして開発された。しかしながら、固定システムは患者にとって、特に、腹腔の領域において心地よくない。それゆえ、また、代わりにゲルを用い、それが活性剤を含んでよいことが提案されている。このようにして、国際公開第2004/011054号（WO 2004/ 011054）は、たとえば、低乃至高分子量を有するポリマーの異なる種類のポリマー（重合体）マトリクスを含むポリマーデポー組成物を開示し、それはポリマーの可塑性を改善するために水に難混和性の溶媒を含む。提案された組成物は、様々なタイプのポリマーの複合システムであり、それで製造および使用において高価で、かつ、複雑である。
【００１０】
マトリクス中への水の吸収用に水溶性または水膨潤性ポリマーを含ませることによって、マトリクスを形成するために周囲からの水を用いる既知のシステムの欠点は、マトリクスに含まれる活性薬剤が水によってあまりにも急速に放出され、その結果、初期には作用部位における活性薬剤の濃度が高過ぎることにある。望ましいのは、当初に、いわゆる「バースト」を伴わない均一な放出である。この目的を達成するために、US 2009/0004273号には、タンパク質およびペプチドがポリマーシステムを用いてカプセル化させることが提案され、そのシステムは組織液と接触するときヒドロゲルを形成しない。活性薬剤の継続的な線形放出をもたらすこと、また当初にバーストを防ぐために、疎水性成分および親水性成分とからなる二つの異なるポリマーシステムが使用され、それはたとえば、フィルムまたはデバイスのコーティングの形態において供給することができる。
【００１１】
インプラント（移植片）の適用性を柔軟にする（flexibilize）ため、また、インシトゥー（その場）においてフィルムまたはインプラントを形成することが提案された。これに関連して、ドイツ連邦共和国特許第10001863号明細書（DE 100 01 863）は、たとえば、インプラントを記載し、それはキャリヤー（担体）物質と、適用のすぐ前に溶媒とを混合することによってその場で形成され、その結果として、担体物質の少なくとも若干が、次に、液晶相を体内で形成するように溶解する。担体物質は粉末化形態で提供され、そして例としては、噴霧乾燥によって得られる。特に、それが追加的に活性薬剤を含むとき、担体物質が生成されたマトリクス中に活性薬剤を均一に分配するために十分に混合されるように注意しなければならない。
【００１２】
また、インシトゥーで形成される担体システムは、インプラントの生産のために説明されている。温度およびpH値ならびに体内での直接的なマトリクス形成のための反応性成分における変化を用いることが可能でないため、最もよく用いられる技術は溶媒沈殿である。したがって、既知のプロセスにおいて、インプラントは、最もしばしば、水不溶性ポリマーの接触を通して固化され、有機溶媒において、組織液（リンパ液）を伴って溶解する。上述したように、既知の若干のプロセスにおいて、沈殿を促進するために、吸水性成分を組成物に添加し、たとえば、膨潤性ポリマーのようなものである。担体システムおよび用いる有機溶媒に応じ、粘性ゲルの形成を伴う粘度における増加またはマトリクス形成を伴う担体システムの真正な沈殿のいずれかになる。このため、乳酸とグリコール酸との共重合体が用いられることが多く、その沈殿は溶媒およびポリマーの選定によって制御しうる。薬学的活性成分の分子サイズにより、放出動態および放出持続時の双方を必要に応じて調整することができる。先行技術に記載の二つの技術は、水混和性溶媒としてN-メチル-2-ピロリドンが用いられるAtrigel(R)（アトリゲル）の技術、および難水混和性溶媒を採用するAlcamer (R)（アルカマー）の技術である。より一層高い水混和性が、より一層速いインプラント形成に、そして従ってマトリクスのより一層高い空隙率につながり、その一方、難水溶性溶媒または高度に濃縮されたポリマー溶液がより一層緩徐なインプラント形成につながることはよく知られた事実である。前者のアプローチは、組み込まれたコンポーネントの急速な放出に、および活性薬剤のより一層高い初期放出、いわゆる「バースト」にもつながる。後者のアプローチは、若干の時間後にだけ開始される放出とともに、持続的な放出をもたらす。Atrigel(R)技術に基づく生産物は、進行したホルモン関連前立腺ガン（prostata cancer）の処置のためのホルモン調製物の形態で商業上入手可能である。
【００１３】
そのようなシステムは、それらを望ましい部位に直接適用することができ、そして活性薬剤がまた、適用の間にマトリクス中に埋め込まれてもよいという点で有利である。しかし、インシトゥーにおいて形成された既知のインプラントを伴う最大の問題は、インプラントの形態制御、そして従って薬物放出のコントロールである。インプラントの形態は、適用の部位での条件に依存し、それによって再現性はほとんど不可能となり、そして放出動態の予め定められた設定が防止される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このように、すべての以前に知られたシステムは、いまだ欠点を有し、そして使用に際しまだ満足できるものではない。したがって、これらの欠点が克服され、使い易く、使用中に、複雑な、または高価な対策を必要とせず、そして損傷および手術後の接着を確実に防止するのに役立つシステムを提供することが本発明の目的であった。さらに、本システムは、活性薬剤のデリバリー（配送）の可能性を提供すべきで、そこでは、活性薬剤の放出は、初めにバーストを引き起こすことがないだけでなく、また過度に長時間の遅延を伴わずに、予測可能、調節可能であり、かつ、一定の様式において生じるべきである。
【００１５】
また、想定される部位上に直接的にスプレー（噴霧）することができるアプリケーション（適用）システムを提供することが本発明の目的であり、すなわち、それは、活性薬剤、たとえば、核酸、タンパク質またはペプチドなどの特定の親水性薬剤のようなものを吸収することが可能であり、そして制御された方法においてそれらを放出することができ、それは、適用部位での安定な膜を生成することができると共に、その放出特性が調整可能であり、そして最適化可能である。また、適用システムは、それが生理学的に適合性であり、そして、タンパク質、ペプチドおよび核酸（nucleid acids ）の活性を妨げず、それゆえに、活性生成物の放出を可能にすることが提供されるべきである。
【００１６】
加えて、外科的接着を効果的に防止し、そして永久的な接着を防ぐのに役立つことができる適用システムを提供することが本発明の目的であった。
【００１７】
上記の目的は、国際出願日のクレーム1に規定する噴霧可能な適用システムにより達成される。噴霧可能な適用システムは、以下、スプレーシステムとも称するが、溶媒中に溶解する少なくとも一つのポリマー（重合体）から形成される少なくとも一つの親脂（親油）性成分、および一つの水性成分、ならびに随意に少なくとも一つの活性薬剤を含む。それはさらなる成分を含んでもよい。
【００１８】
驚くべきことに、本発明において規定されるように特定の組成物は、使いやすく、安定であり、望ましい部位上および望ましい範囲（exent）に適用することができ、そして、望ましい時間の間および放出の望ましい速度で活性薬剤を提供することが可能な担体物質を提供することが見出された。
【００１９】
有利な特性は、二つの成分を含む噴霧システムによって達成されるとともに、一つの成分は、溶媒において溶解される少なくとも一つのポリマーを有し、および他の成分は少なくとも一つの水性溶媒を有するとともに、これらの成分は互いに適用の直前またはその間にブレンドされ、および噴霧によって適用されるとともに、本発明での成分はインシトゥーでマトリクスを形成し、それは予め定めた時間の間の後に分解し、そして、この時間の間において、随意に含まれる活性薬剤を制御された様式において放出することを伴う。
【００２０】
本発明に従うシステムにより形成された膜は、高品質を有し、そして、予め定めた（pretermined）時間の間、適用の部位にとどまり、そこでそれがその効果を発揮する。単に本発明での特色の組合せだけにより、望ましい特性を有する担体物質を得ることが可能である。
【００２１】
本発明の重要な特色は、ポリマーの種類および溶媒の種類だけでなく、適用の形態であり、すなわち、二つの成分が、噴霧の直前に、または噴霧にて、または噴霧中に接触させられる。
【００２２】
本発明に従うシステムの本質的な特色の一つは、グリコール酸と乳酸とに基づく少なくとも一つのポリマー、および前記ポリマーのための少なくとも一つの生体適合性の溶媒、予め定められるlogP値を有する溶媒を、以下により一層詳細に説明するように含む親脂性成分である。この親脂性成分は、次いで、少なくとも一つの水性溶媒を含む少なくとも一つの親水性成分と、噴霧の直前または噴霧にて、ブレンドされ、それは、ポリマーの沈降によってマトリクスを生成し、噴霧される部位にて物理的なバリアを形成し、そして、それは外科的な接着を効果的に防止することが可能である。好ましい具体化（好適な実施形態）では、親脂性（lipholic）成分および/または親水性成分は、少なくとも一つの活性薬剤を含み（単数も可能）、それは、噴霧およびフィルム（膜）形成の間に、フィルム中に埋め込まれ、そしてそこから制御された様式で放出され、そしてそれはさらに外科的な接着を、生理学的および/または生物学的手段によってブロックする。
【００２３】
本出願のシステムの特定の利益は、特異的に適用される成分の選定のため、ポリマーマトリクスが溶媒からのポリマーの沈殿によって噴霧中に形成されることにある。このポリマーマトリクスにおいて、活性薬剤が埋め込まれ、それはその組成物がそのものを含んでいる場合である。ポリマーの沈降は、ポリマーの溶解限度が超えていること、およびポリマーがもはや溶媒に溶解せず、あるいは完全には溶解しないことを意味する。個々の成分を調整することにより、沈殿速度およびフィルム形成速度および従って、結果として得られるマトリクスの空隙率を予め定めることが可能であり、それは制御された放出の特徴をもたらす。これらのポリマーの可変性を考慮して、最適な特性を調整するために、多くの可能性があるが；もっとも、特定のケースのために、最適な解決策を見出すことは必ずしも容易とは限らない。したがって、最適なシステムの選定を可能にするパラメーターを、以下に記載する。
【００２４】
本発明のシステムのための絶対的な因子は、主に次のとおりである。すなわち、用いられるポリマー、そのポリマーを溶解するために用いられる溶媒、ポリマー、溶媒および水性成分の含有量、ならびに、随意に活性薬剤の含有量および形態である。
【００２５】
マトリクス形成のために用いられる物質は滅菌されるべきであり、そしてそれは含有される活性薬剤の制御された放出を、接着形成または瘢痕形成が起こりうる時間の期間にわたって可能にしなければならならない。これは、少なくとも二週間から最大で六週間まで、およびできるだけ二から四週間までの範囲の時間の期間である。さらに、物質は、望ましい目的を達成するために、すなわち、接着を防止するために十分な時間についてそれを安定なままに保つような品質をもたなければならない。
【００２６】
適切なポリマーの選定のための重要なパラメーターはモル質量（分子量）である。適切な分子サイズの選定は、固有粘度（溶解した物質の濃度Cに基づく相対粘度の自然対数）を基礎として行われる。それ自体既知の様式で、PLGAポリマーの固有粘度は、25℃でCHCl3中0.1％とともに測定される。本発明のシステムのために、そのようなポリマーは、0.1から0.8までの範囲において、特に 0.15から0.7までで固有粘度を有することが好ましい。値が0.1未満である場合、ポリマーは、十分に長く活性を維持するには、しばしば小さすぎる。値が大きすぎる場合、フィルムの十分な品質が保証できず；また、放出が開始されるまでの遅延が長すぎることがありうる。最適な特性を達成するために、異なるモル質量を有するポリマーの混合物を用いることも可能である。
【００２７】
PLGAポリマーのモル質量は、また、慣習的な方法によって定めることができ、たとえば、ゲル浸透（パーミエーション）クロマトグラフィーによる。10から63kDaまでの範囲内のモル質量を有するPLGAポリマーがよく適していることが見出された。
【００２８】
本発明の適用システムに適したポリマーを選定するために役立つ更なる因子が存在する。本発明でのシステムは、噴霧可能である必要があり、それは生体適合性溶媒中に溶解し、または懸濁可能でなければならない意味を含む。
【００２９】
本発明による適用システムから形成されるフィルムの品質および機械的安定性の尺度は、マトリクスおよび/またはフィルムの品質であり、それは例において記載する方法を用いて定めることができる。図2は、ポリマーおよび溶媒の多数の組合せのフィルム品質に関して、例において記載した試験の結果を示す。フィルム品質は、本質的に溶媒の選択およびポリマーの分子量によって定められる。その決定のためには、用いるポリマーの総量を基準に上清（損失）において、および沈殿物（マトリクスの品質）においてポリマーの割合が確かめられる。得られる層または得られるフィルムのマトリクスの品質は、システムが少なくとも二および最大で六週間までの間機能しなければならないので、本発明のシステムのために絶対的である。このことは、形成されたフィルムまたは形成された層が十分に安定であり、および同時に、望ましい放出動態を提供する場合にだけ可能である。それゆえ、マトリクス品質は、80から100％まで、できれば、90から100％まで、および最も可能なら、95から100%までの範囲であるべきであり、その値は、室温、すなわち、およそ25℃で決定されるとともに、それらの方法は例において記載される。
【００３０】
マトリクスの品質は、とりわけ、ポリマーのモル質量に依存する。より一層高いモル質量を有するポリマーにより、マトリクス中により一層多くのポリマーを組み込むことが可能であったが、それに反して、より一層低いモル質量を有するポリマーにより、ポリマーの（フィルム形成のための）損失があったことが見出された。たとえば、75：25のラクチド対グリコリドの比、および0.5から0.7までの固有粘度を有し、すなわち、比較的高いモル質量を有し、かつ、エステル末端基を有するポリマーが使用されるPLGAポリマーについて、用いられるポリマーの量のほぼ100％はマトリクスを形成したことが見出された。対照的に、50：50のラクチド対グリコリドの比および＜0.6の固有粘度および自由末端基を有するPLGAポリマーについて、ポリマーはマトリクス形成中に失われたこと、すなわち、それはマトリクス中に埋め込まれなかったことが見出された。この効果は、溶媒によって高められ、または改善することができる。
【００３１】
上述したように、用いるポリマーはシステムの本質的な成分の一つである。本発明に従い、グリコール酸系および乳酸系ポリマー、言い換えれば、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、通常、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)、以下、PLGAポリマーとも称されるものは、その適用システムにおいて使用される。D,L-ラクチドに基づくポリマーおよびエナンチオピュアなL-ラクチドに基づくポリマーを使用することが可能である。
【００３２】
乳酸系および/またはグリコール酸系ポリマーは、かなり長い時間、放出制御のシステムについても知られている。概して、PLGAポリマーは微粒子またはインプラントに処理され、それは次に、様々な方法で使用することができる。PLGAポリマーは、生体適合性および生分解性であり、そしてそれらの特性は、それぞれの目的に適合させることができる。
【００３３】
本発明は、溶媒中に溶解しているグリコール酸系および乳酸系ポリマーを利用する。これらのポリマーの放出動態は、それらの分子量、分子量分布、およびそれらの末端基を用いて調整される。
【００３４】
このように、ポリマーおよび溶媒を具体的に選定することによって、結果として得られるマトリクスが、拡散制御され、浸食制御され、またはその双方の拡散制御および浸食制御された放出を果たさなければならないかどうかを選ぶことができる。高品質での迅速なマトリクス形成は、本発明に従って達成されるように、活性薬剤の初期の損失を伴わずに線形放出動態を達成するための重要なツールを構成する。
【００３５】
PLGAポリマーが、純粋なポリラクチド（PLA）または純粋なポリグリコリド（PGA）よりも本発明のシステムに適していることが発見された。乳酸単位対グリコール酸単位の比率を調整することにより、特性を、特に、分解特性を、それ自体既知の方法において正確に制御することができる。本発明の適用システムでは、このようなPLGAポリマーは、約75から約25まで対約25から約75までの範囲においてラクチド単位対グリコリド単位の割合を有するのが好ましいことが判明した。表現「ラクチド単位対グリコリド単位の比」が一貫してポリマー中の単位のモル比を意味する。また、PLGAポリマーの任意のタイプの混合物を使用することも可能である。PLGAポリマーの任意のタイプの混合物、例としては、ラクチド単位対グリコリド単位のモル比および/またはモル質量または固有粘度および/またはラクチド単位（D/LまたはL）および/または末端基の種類が複数変動/単数変動するポリマーの混合物を使用することが可能である。特定の目的に最も適した混合物を通常の試験で見出すことができる。
【００３６】
PLGAポリマーの分解率（分解速度）は、PGAまたはPLAの含量に依存し、PLGA共重合体は概してPLAポリマーまたはPGAポリマーよりも短い分解速度をもつ。このため、PLGAポリマーが好ましい。最短の分解時間は、50：50のラクチド対グリコリドの比を有するポリマーにより達成される。乳酸モノマーにおける追加のメチル基のため、PLA含量の増加は、ポリマーの加水分解を妨げ、およびそれと同時に、疎水性を増加させ、それはより一層長い分解時間を導く。また、ポリマー中のPGA含量の増加または純粋なステレオエナンチオマー（stereoenantiomere）のL-乳酸の使用は、モノマーのD-/L-乳酸と比較して、ポリマーの結晶化度を増加させることによって、ポリマーの分解時間を延長し、その理由は水がアモルファス領域中により一層簡単に拡散するからである。結果として、これらの領域は、結晶のものよりも迅速に分解される。それゆえ、ポリマーの結晶性が分解中に着実に増加する。このように、その比を調整することによって、結晶性および分解時間を予め定めた値に設定することが可能である。さらに、分解速度は、より一層短いポリマー鎖および遊離末端基によって加速することができる。遊離末端基、すなわち、遊離ヒドロキシ基および遊離カルボキシ基は、ポリマーの親水性を増加させ、その結果として、水の拡散速度およびポリマーマトリクスにおけるその含量は増加する。また、遊離カルボキシル基は、マトリクス内のpH値を低下させることによって、ポリマーの加水分解を触媒する。このようにして、遊離末端基を有するポリマーは、本発明に従って使用されるのが好ましい。
【００３７】
本発明によれば、自由末端基を有するPLGAポリマーを用いることが好ましく、それは40：60から60：40まで、より一層好ましくは約50：50のラクチド単位対グリコリド単位の比を有し、および/またはそれは0.6よりも小さい固有粘度を有する。エステル化された末端基を有するPLGAポリマーを用いるとき、75：25のラクチド単位対グリコリド単位の割合を伴うようなものが好ましい。
【００３８】
適切なPLGAポリマーは、商業上入手可能であり、たとえば、レソマー（resomer）ポリマー〔Evonik Industries（エボニック・インダストリーズ）AG、Essen（エッセン）、ドイツ連邦共和国から入手可能〕、特に、Resomer(R)HシリーズまたはResomer(R)Sシリーズからのリソマーなどのようなものである。特によく適したポリマーは、たとえば、Resomer(R)502H、503Hおよび504HまたはResomer(R)RG755Sである。次の表1は、好適なポリマーについての若干の特性をリストする。
【００３９】
【表１】
2014527886.tif 000003
*固有粘度（i.v.； 25℃でのクロロホルム中0.1％溶液）
**製造者の情報から採用した酸性基の数（電位差滴定）。
***モル質量、GPCにより測定、および
****放出データはEliaz（エリアズ）らの発表に由来する〔44[Eliaz、2000＃257]。Resomer(R)RG755Sおよび503Hについての放出データは、ウシ血清からのアルブミンの放出に関し[44]、およびResomer(R)RG 502Hおよび504Hについては、注入可能なインプラントからの胸腺DNAの放出[45]に関する〔テトラグリコール（テトラエチレングリコール）における10％乃至20％のPLGA(m/v)〕。
【００４０】
ポリマーマトリクスは、生体適合性モノマーの乳酸およびグリコール酸に、エステル加水分解を介して分解され、それはその後、CO2および水に、クレブス回路（Krebs cycle）を経由して代謝される。PLGAインプラントの分解パターンは、バルク侵食（bulk erosion）に基づき、それはポリマーが分解されるよりも速く、水がポリマーマトリクス中に拡散することにおいて特徴付けられる。したがって、このことは、ポリマーマトリクスの総断面にわたって均質な質量損失につながる。その分解プロセスは、概して、三つのセクションに細分することができる。すなわち、
1．水和：ポリマーは、すでに破壊されているエステル結合のスモールフラクション（小分画）とともに、水を吸収して膨潤する。しかし、質量損失はまだ発生しない。
2．分解：中間/平均モル質量が大幅に減少する。エステル結合の開裂によって生成されたカルボン酸基は、マトリクス内でのpH値における低下に、およびその結果としてエステル開裂の自触媒作用につながる。ポリマーは、機械的強度および/または機械的安定性を失う。
3．溶液：分解の終点に向かって、低分子のフラグメント（断片）およびオリゴマーは、周囲の媒体に溶解するとともに、溶解したポリマーフラグメントが順番に遊離のカルボン酸に加水分解される。
【００４１】
分解時間は、カプセル化されたマクロ分子およびナノスケールの担体物質の放出のために決定的であり、その理由は、それらのザイズを考慮して、それらは、主に、マトリクスの侵食によって放出されるからであり、その結果、分解速度を介して放出速度が特異的に制御されることを可能とされる。PLGAポリマーの分解時間は、それらの組成およびポリマーのモル質量によって制御することができる。商業上入手可能なPLGAポリマーの場合においては、固有粘度は概して、モル質量についてのディメンション（大きさ）として示される。
【００４２】
システムの粘弾性特性は、図3において、および例に示すように、同様にして、ある役割を果たす。
【００４３】
本発明の適用システムのためには、高品質物質が生成され、それが接着を防止するのに十分な時間、機械的強度および/または安定性を保持し、およびそれがその後続いて分解されることが不可欠である。本発明での適用システムから形成される担体システムは、活性薬剤と共に負荷されるとき、追加的に、活性薬剤が望ましい放出動態を伴って放出されることが必要である。
【００４４】
本発明の適用システムを用いて得られるフィルムのマトリクス品質は、使用されるポリマー、その溶液のために使用される溶媒、およびそれらの水への溶解度に依存する。PLGAポリマーを溶解するために使用される溶媒は、それにより生産されるマトリクスの品質に著しい効果を有することが見出された。PLGAの組合せによって生産されるマトリクスは、水性相とともに、溶媒において溶解され、それゆえ、溶媒のタイプおよび量により、特に、その親水性特性により依存する。
【００４５】
他方で、また、溶媒の選定もまた、用いるポリマーのタイプに依存する。より一層親脂性のポリマーでは、より一層親脂性の溶媒でなければならない。ポリマーの親脂性特性は、とりわけ、その末端基に依存し、その理由は、遊離酸性基を有するPLGAが、エステル化された末端基を有するPLGAよりも親水性だからである。
【００４６】
一方では、溶媒は、選定したポリマーを、ポリマーが噴霧可能な程度にまで溶解しなければならず、他方で、水における溶媒の溶解度は、二つの成分が、その上で噴霧した後、沈殿が急速に発生するのに十分に高くなければならない。適切な溶媒の選定のための有用なパラメーターはlogP値である。
【００４７】
上記のように、マトリクス品質も同様に、溶媒によるポリマーのモル質量に依存して変化することから、本発明の更なる本質的な特色はその溶媒である。溶剤を選定するための重要なパラメーターは水との混和性である。水との混和性がより一層高ければ、マトリクス形成はより一層速いが、もっとも、空隙率も増加する。水混和性がより一層低いと、マトリクス形成がより一層遅く、そしてより一層高品質である。
【００４８】
溶媒の水混和性は、logP値を介して決定することができる。
【００４９】
logP値は、オクタノール/水分配係数、すなわち、1-オクタノールと水の二相系中の溶媒の濃度の比を示す。logP値が次のように定義される。
【数１】
2014527886.tif 000004
【００５０】
logP値の算出または決定はそれ自体知られている。logP値を定めるのに適したアルゴリズムは、Cheng（チェン）らに記載されるように、XlogP3である〔Cheng T.、Zhaoy（チャオイ）、Lix（リークス）、Lin（リン）F.、Xu（スー）Y.、Zhang（チャン）X.ら、Computation of Octanol-Water Partition Coefficients by Guiding an Additive Model with Knowledge（情報との加法モデルをガイドすることによるオクタノール-水分配係数の計算）、J. Chem. Inf. Model.（ジャーナル・オブ・ケミカル・インフォメーション・アンド・モデリング）、2007年；47：2140-2148〕。このようにして算出されたlogP値は、親脂性物質のための正の値および親水性物質のための負の値を生じさせる。本発明の物質のシステムにおいて、用いられる物質は大して親脂性ではないことが見出され、その結果、溶媒は、負の、または少なくとも非常に小さな正のXlogP3値を有するのが好ましかった。
【００５１】
0.2より低い、好ましくは0よりも低い、および特に-0.2から-1.5までの範囲内のXlogP3値を有する溶媒、特に、好ましくは、-0.25および-1.0の間のXlogP3値を有する溶媒は、本発明のシステムのために適切であることが証明された。XlogP3値がより一層高いなら、用いられるポリマーはより一層親脂性である。
【００５２】
溶媒が0.2よりも低いlogP値を有するポリマー溶液を、水性成分と混合し、そして適用の部位上に噴霧するとき、沈殿は、予め設定可能で、かつ、再現可能な様式で起こり、それは望ましい特性を有するポリマーフィルムを生成することが見出された。
【００５３】
より一層親脂性のポリマーが用いられれば、より一層親脂性の溶媒が用いられなければならず、そしてその水混和性はより一層低い。溶媒または水において、ポリマーの溶解度の間の差がより一層大きいと、フィルム形成の動態に及ぼす効果はより一層強い。したがって、用いるPLGAポリマーは、エステル化された末端基を有するもので、そしてそれゆえにより一層高い親脂性であり、そのため、用いる溶媒は、同様に、より一層親脂性でなければならない。より一層親脂性の溶媒はより一層弱い水混和性を有し、そしてそれゆえに、高品質マトリクスをもたらす。ポリマーおよび溶媒のシステムが溶解限度に近く、そして溶媒が可能な限り最高の水混和性を有するとき、最良の結果が得られ、その結果、水性相の添加により、フィルム形成は、ポリマーがマトリクス中に高い割合で存在しつつ、迅速で、かつ、完全であることが見出された。
【００５４】
溶媒中のポリマーの溶解性は、同様に、ある役割を果たす。ポリマーがより一層良好に溶媒中に溶解するほど、より一層多くの水は、後にそのフィルムからポリマーを析出し、およびフィルムを形成するために必要とされるであろう。他方で、溶解度は、十分な量のポリマーを溶媒に溶解することができるようなものでなければならない。ある溶媒は、高品質のフィルムを形成するために適し、それは、用いられるPLGAのため、少なくとも5％（質量/容量）（m/v）、できれば、5から60％までの溶解度であり、特に、室温で10から30％までの溶解性を有することが見出された。適切な溶媒の選定は以下の相関関係に基づくべきである。すなわち、ポリマーのための溶媒への溶解度は、ポリマーのモル質量の増加と共に減少する。ポリマーがより一層親脂性であると、すなわち、ポリマーがより一層高くエステル化され、および/またはポリマー鎖がより一層長いほど、より一層親脂性の溶媒でなければならない。このように、高い水溶性の溶媒を有する高度に親脂性のポリマーを使用するとき、ポリマーは、非常にわずかな程度にまでしか溶解されず、その一方、より一層低い親脂性のポリマー、例は、遊離の酸性基およびより一層低いモル質量を有するポリマーは、親水性溶媒に容易に溶解する。他方では、ポリマーがより一層良好に溶解するほど、より一層多くの水が沈殿のために必要とされる。溶解度が5から15％までであり、溶媒が-0.3から-1.0までの範囲においてXlogP3値を伴うように、ポリマーおよび溶媒が選定されるとき、非常に良好な結果を得ることができる。この組合せでは、ポリマーは、非常に迅速に沈殿し、そして水を添加するとき、高品質のフィルムを形成する。この範囲でのXlogP3値を有する溶媒は、この技術において熟練する者（当業者）に既知である。
【００５５】
したがって、非常に適した溶媒は、ポリマーの望ましい量とともに、溶媒への溶解性が、適用温度、すなわち、30から40℃まででの飽和限界に近いように、良好な水混和性がポリマーの溶解性と組み合わせられる。いずれの場合も、室温での溶解度が安定な溶液を形成するために十分に高くなければならない。
【００５６】
テトラグリコール、グリセロールホルマールおよびジメチルイソソルビド（dimethyl isosorbite）（DMI）は特によく適していることが見出された。溶媒のテトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールは、また、テトラグリコールまたはグリコフロールと呼ばれ、長い間非経口用に使用されている溶媒である。最大で50％までの濃度が使用され、そしてこの希釈で、溶媒は低い毒性を見せるにすぎない。
【００５７】
グリセロールホルマールは、1,3-ジオキサン-5-オールおよび1,3-ジオキソラン-4-メタノールの混合物からなる低毒性を伴う無臭溶媒である。多くの薬および化粧品のための優れた溶媒である。特に、獣医学においては、それは注射のための溶媒として使用される。グリセロールホルマールは、例は、Ivumec(R) （イブメック）およびPTH(R)として商業上入手可能である。Ivumec TM（商品名）は、0.27％でブタにおける皮下適用のために承認され、そして通常は0.1mg/kgにて用いられる。
【００５８】
ジメチルイソソルビド（DMI）は局所適用のために知られる。DMIを含む商業上入手可能な調製物はMykosert(R)（マイコサート）およびIbuprop-Gel(R)（イブプロプ−ゲル）である。DMIは局所的に浸透増強物質として使用される。低溶血活性が観察されている。
【００５９】
本発明の適用システムによって形成されたフィルムの品質が、より一層高いと、用いる溶媒はより一層高い水混和性であることが見出された。例には、フィルム品質を定めるための試験を開示する。図4は、PLGAポリマーと溶媒との多数の組合せのフィルム品質を示す。上述の溶媒の水溶性は、次の順序で減少する。すなわち、グリセロールホルマール＞DMI＞テトラグリコールである。したがって、ほとんどの場合、グリセロールホルマールは、それが十分にポリマーを溶解することができる限り、本発明の適用システムのための最も好ましい溶媒であろう。以下の表2には、試験した溶媒の若干の特性の概要を提供する。
【００６０】
【表２】
2014527886.tif 000005
*動粘度ηは 25℃で回転式粘度計〔MRC 100、Paar Physics（パール・フィジックス）〕により定めた。
**XlogP3データは計算値である[32]。
***溶解度データは、Matschke（マチュケ）ら、2002年による刊行物[33]から採用した。
【００６１】
本発明のスプレーシステムによって形成されるマトリクスのフィルム厚は、水の拡散速度のためにある役割を果たす。たとえば、150から300μmまでのフィルム厚を有するPLGAシステムについて、そこでは水の拡散速度が制限され、表面侵食は追加的に検出された。用いる溶媒とは無関係に、粘弾性試験において、約300μmのフィルム層がResomer(R)RG 502 H系フィルムについて測定された。しかし、対照的に、長鎖ポリマーのためのフィルムのフィルム厚は、グリセロール（glyercol）ホルマール対テトラグリコールを介するDMIからの観察された放出動態と類似して増加した。
【００６２】
本発明の適用システムにおいて用いる溶媒のためのさらなる非常に重要な特色は、その生体適合性または組織耐性である。本出願では、組織耐性を、11時間の間にわたる代謝細胞生存率に対する溶媒の効果により決定する。決定方法は例において説明する。その方法で見出されたLD50値は毒性の尺度である。LD50値は、本出願のシステムのために考慮されるようにするために、溶媒について、少なくとも1、好適には、少なくとも10mg/mlでなければならない。上記の特に好ましい溶媒はこの要件を満たす。これに関連して、グリセロールホルマールが特に好適であることが見出された。それは、6時間より短いインキュベーション時間で約1g/mlのLD50値を有する。このように、グリセロールホルマールは、本発明のシステムのために特に好適な溶媒であることを意味する。図5は、インキュベーション時間の関数として好適な溶媒のLD50値を示す。
【００６３】
一つの実施形態において、本発明での適用システムは、上述したように、ポリマーと溶媒とを有する一つの親脂性成分、および第二成分として水を含むだけである。それらが、上記の要件を満たすことを条件に、これらの成分とともに、混合され、そして噴霧されることにより、インシ（インサイ）トゥーにおいてフィルムを生産することが可能であり、それは、効果的に外科的接着を防ぐことができる。
【００６４】
本発明のスプレーシステムが親脂性成分と、噴霧するまで互いから分けられる水性成分とを含むことは、本発明にとって不可欠である。それらの成分は、噴霧にて、またはその直前または噴霧中にだけ混合されうる。水の比較的小量の添加が早くもポリマー沈殿をもたらすことが見出された。早すぎる析出はフィルム形成に干渉することがあり、そしてまた、噴霧装置はおそらくポリマー堆積によって遮られることがありうる。したがって、混合は好ましくは、噴霧中に直に発生するべきであり、例は、双方の成分のそれぞれの量を混合室中に供給し、そしてその後、それらをそこから混合しながら、直接噴霧することによる。このように、混合および噴霧は、好適には実質同時に生じる必要がある。
【００６５】
さらなる実施形態では、一つの適用システムは追加的に活性薬剤が含まれて提供される。適切な活性薬剤は、標的にした適用部位にとって有用なすべての物質である。本発明の適用システムは、特に、核酸、タンパク質およびペプチドを放出するために有用である。これにより、タンパク質およびペプチド、ならびにそれらをコードする核酸、あるいはそれらの混合物を、直接放出することが可能である。本発明の適用システムおよびそこから得られるフィルムは、それらのその後の発現が可能であるような形態において核酸を放出することが見出された。本発明のシステムは、接着の防止のために提供されるので、好ましくは、線維素溶解タンパク質およびペプチドおよび/またはそれらをコードする対応する核酸が、活性薬剤として使用される。
【００６６】
活性薬剤は溶解または分散した状態において二つの成分の一つに存在することができる。水性相の量が多すぎると形成されたフィルムの品質に（負に）影響を及ぼしうることが見出された。したがって、活性薬剤が添加される場合、その水溶性が高度に濃縮された溶液を製造するために十分に高くなく、既に沈殿した形態の、例は、乾燥形態での活性薬剤を添加することが好ましい。親脂性成分において分散可能である小型の固形形態の凍結乾燥物またはポリプレックスが特に適する。このことは、固形形態において、活性薬剤がより一層高い貯蔵安定性を有するというさらなる利点を有する。
【００６７】
上述したように、特に、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子およびそれらの抑制剤（以下では、「阻害剤」とも言う）は、接着の形成にある種の役割を果たす。それゆえ、本発明の一実施形態に従い、その場で形成される「遺伝子活性化」膜は、腹膜癒着の処置のためにその上に噴霧することによって局所的に適用される。上述したように、腹腔内の手術後2乃至3週間のタイムスロット（時間帯）内で、永久的な接着が発展することがあり、そしてその後も、これは組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（tPA）とその抑制剤（PAI-1）の間の不均衡によって引き起こされことが想定され、この不均衡は、tPAの提供および/またはPAI-1の抑制によって本発明に従って変化される。これは、tPAおよび/またはPAI-1抑制剤および/またはそれらをコードする核酸が含まれるその場で形成された膜を用いて行われる。なお、本発明の噴霧システムが用いられるとき、それにはtPAをコードするプラスミドが含まれ、膜が形成されるとき、プラスミドはその膜マトリクス中に取り込まれ、徐々にそこから放出され、そして少なくとも二週間の間、生理的環境下でのtPAレベルを上昇させることが見出された。膜上に噴霧されたものの生理学的環境におけるtPAのレベルも、環境へのPAI- 1抑制剤を導入することによって、または双方の組合せによって上昇させることができる。例および図10および11において、このような膜を用いて得られた特性および結果を説明する。
【００６８】
これに関連して、細胞培養アッセイにおいてResomer(R)RG504Hを伴うグリセロールホルマールに基づく本発明の膜中へのtPAコード化プラスミドの取込みが、16日間のtPAレベルを2ng/mlにまで上げることができることが示された。このことは、コントロールと比較して、tPAの濃度の4倍の増加に相当する。手術の対象となる組織において、および炎症を起こした組織において、tPA濃度は標準値の五分の一およびそれ未満に低下することがあるので、それゆえ、tPAのレベルの治療上関連する増加で、先行技術の調剤物では達成することができなかったものを達成することは、延長時間の間、本発明の噴霧システムで生産された膜を用いて可能である。
【００６９】
また、さらにストレスを受けた、および/または炎症性組織において、抑制剤レベルは17倍まで増加させることができ、それはtPAレベルの有意な低下をもたらすことが見出された。その結果、tPA/PAI-1比は、正常な状態での3.5から炎症を起こした組織での0.4にまで変動することができる。それゆえ、さらにより一層効果的に手術後に発生するプロセスを制御するために、またさらにより一層好首尾に接着に対抗するために、本発明の噴霧システムは、特に好ましくは、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子またはそれをコードする核酸の少なくとも一つおよびプラスミノーゲン活性化因子抑制剤またはそれをコードする核酸の少なくとも一つの抑制剤の双方を含む。例に示すように、tPA/PAI-1バランスは、本発明のスプレーシステムを用い、tPAコード化プラスミドDNAおよびPAI-1に対するsiRNAの同時トランスフェクションを生じさせる膜を生成することによって効率よく復元することができる。tPAコード化プラスミドDNAおよびPAI-1に対するsiRNAのこの同時トランスフェクションが、トランスフェクション後の48時間tPA/PAI-1比の8.3倍の増加につながり、それに対し、プラスミド単独の適用は単に係数4.5だけの増加につながるにすぎないことを示すことができた。望ましい効果に応じて、本発明の噴霧システムは、このようにして、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子または少なくとも一つのPAI-1抑制剤または双方の組合せ、および/またはそれぞれの場合に対応する核酸のいずれかをも含むことができる。したがって、本発明によって提供されるシステムは、望ましい効果の非常に多様性のある制御を可能にする。
【００７０】
上述の実施形態では、核酸は、RNA、DNA、mRNA、siRNA、miRNA、piRNA、 shRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、触媒性DNAおよび/またはその混合物であってもよい。用語DNAには、たとえば、cDNA、ss（一本鎖）DNA、ds（二本鎖）DNA、などのようなDNAのすべての適切な形態が含まれ；用語RNAには、たとえば、mRNA、siRNA、miRNA、piRNA、shRNA、などのようなRNAのすべての適切な形態が含まれる。
【００７１】
核酸は線状または環状であってよく、それは一本鎖または二本鎖であることができる。用語「核酸」はまた、同一または異なるタンパク質またはペプチドをコードしうる核酸の混合物をカバーする。核酸のすべての形態が適切であり、それらは、望ましいタンパク質またはペプチドをコードし、そして望ましい部位でそれを発現することができる。この技術において熟練した者（当業者）は核酸の適切な形態を知っており、それで、最適なものを選定することができる。核酸は、任意の供給源から、例は、生物学的または合成原料から、遺伝子ライブラリーまたはコレクションから生じさせることができ、それは、細胞または微生物から得られたゲノムまたはサブゲノムのDNA、RNAまたは合成的に生成されたRNA、などであってもよい。核酸はその増幅および発現のために必要な要素、たとえば、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、リボソーム結合部位、テイル（尾部）、などを含むことができる。
【００７２】
核酸はDNAまたはRNAであることができ、そしてそれには、一またはそれよりも多く（一以上）の遺伝子またはフラグメント（断片）が含まれうる。核酸は、自己複製配列（自律的配列複製）または組込み配列（integrating sequence）であってもよく、それは、プラスミド、ベクターの形態または当業者によく知られた他の形態で存在することができる。それは線状または環状および一本鎖または二本鎖であってよい。細胞内のアクティブな任意の核酸は、ここで適する。「ネイキッド（裸）」核酸は、あまり安定でなく、そして細胞内で急速に不活性化または分解されるので、核酸を層で被覆することが好ましいとともに、いわゆるポリプレックスは特に好適な実施形態である。
【００７３】
核酸を保護するために、それを、いわゆるポリプレックスの形態において使用することができる。ポリプレックスは、ポリマーエンベロープによって取り囲まれた核酸分子である。好ましくは、カチオン性ポリマーがエンベロープ（外被）材料として使用される。カチオン荷電粒子が細胞によって中性またはアニオン荷電粒子よりも容易に取り込まれうることが見出された。しかしながら、それらはまた、より一層多くの非特異的吸着を促進することがある。核酸は、カチオン性物質により容易にエンベロープ化および保護することができるので、核酸を包むために、活性薬剤として、カチオン性エンベロープ材料が好ましい。それぞれの技術は当業者によく知られている。
【００７４】
エンベロープ材料は、脂質またはポリマーまたはオリゴマーなどのような、自然発生的な、合成またはカチオン誘導体化された天然物質であってよい。天然オリゴマーの例はスペルミン（spermin）である。合成ポリマーの例は、含窒素生分解性ポリマー、特に、プロトン性窒素（protonable nitrogen）原子を有するものである。特に、ポリエチレンイミン、とりわけ、分枝したポリエチレンイミンが好適であり、それは商業上入手される。たとえば、25kDaの平均分子量を有する分枝ポリエチレンイミンが好ましく、商業上入手可能である。このポリマーが、本発明の噴霧システムの他の成分と良好に適合性であることが見出された。また、脂質、とりわけ、自然な、または随意に誘導体化された膜形成性エンベロープ材料として、カチオン性または中性脂質を使用することも可能である。脂質は、多くの変形物において入手可能であり、そして、たとえば、リポソームを形成するために使用することができる。
【００７５】
ポリプレックスが活性薬剤として使用されるとき、エンベロープ材料対核酸の割合は、それ自体既知の方法において、核酸が十分に保護されるけれども、まだ放出後に発現することができるように調整する必要がある。十分なエンベロープ材料が存在しない場合には、核酸は十分に保護されない。エンベロープ材料の量があまりに多すぎる場合、このことは、一方では、耐性の問題につながり、他方では、エンベロープ材料の量が多すぎると、核酸はもはや放出されえないことがあり、および/またはもはや発現えないことがある。双方の場合において、転写効率（transfer efficiency）が低下する。少数のルーチンのテストを用い、当業者は、特定の場合について最適な比率を見つけることができる。エンベロープ材料対核酸の比率は重量を基準にして、10：1から1：4までの範囲にあるのが特に適していることが見出された。特に、4：1から1：4までのエンベロープ材料対核酸の比が好ましい。ポリプレックスが、ポリマーとしてポリエチレンイミンを含むとき、ポリマー含量はまた、ポリマー窒素含量対DNA-ホスフェート（リン酸エステル）含量（N/P）のモル比で表すことができ；好ましくは、NP比は、1から10まで、特に好ましくは4から8までの範囲にある。
【００７６】
ポリプレックス分子は、核酸が、貯蔵、輸送中、および適用まで保護され、および核酸が放出され、そして標的部位で発現されるように設計される。論文では、好適なポリマーは、何度も説明されており、そして当業者であれば多数の材料の中から最も適切なものを選定することができる。
【００７７】
1989年の年での最初の臨床試験以来、製薬上の物質としての核酸を用いる経験は、 1400体よりも多くの臨床研究で得られている。レトロウイルス遺伝子移入システムに加えて、主に、アデノウイルスのものが使用され、大きな利点としては、これらのシステムの効率性にあった。これにより、もはや単一のウイルス粒子の結合が標的細胞に感染するのに十分であることを示すことができた。免疫原性および潜在的な突然変異誘発に関して、非ウイルス遺伝子移入システムは、ウイルスシステムに対する安全な代替物である。非ウイルス遺伝子治療のアプローチに関連して、物理的方法、たとえば、エレクトロポレーションなどのようなものとの組合せ、ならびにカチオン性ポリマーのような合成担体システムを伴うナノスケール複合体の使用において、ネイキッド核酸の適用が記載され、それはまた、ポリプレックスと呼ばれている。ポリプレックスの生成および使用に関する情報は、たとえば、Godbey（ゴッドベイ）WT、Mikos（ミコス）AG、「Recent progress in gene delivery using non-viral transfer complexes（非ウイルス移入複合体を用いる遺伝子送達における最近の進歩）」〔J Control Release（ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース）、2001年、72：115-125〕の論説に、およびカチオン性リポソーム（リポプレックス）に関する情報は、Lee（リー）RJ、Huang（ファン）L、「Lipidic vector systems for gene transfer（遺伝子移入のための脂質性ベクターシステム）」〔Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.（クリティカル・レビューズ・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリヤー・システムズ）、1997年；14：173-206〕により、およびSimoes（シモンイス）S、Filipe（フィリペ）A、Faneca（フェーンカ）H、Mano（マノ）M、Penacho（ピーナチョ）N、Duzgunes（ドゥーズガンズ）Nら、「Cationic liposomes for gene delivery（遺伝子送達のためのカチオン性リポソーム）」、〔Expert Opin Drug Deliv.（エクスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー）、2005年、2：237-254〕による論説において見出すことができる。錯体形成システムは、生理学的条件下で、正に荷電した核酸および負に荷電した担体材料が自発的にナノスケールの粒子に蓄積する（「自己組織化」）という原理に基づく。
【００７８】
本発明のスプレーシステムは、長期にわたる遺伝子発現を達成するために、新しく、そして有望なアプローチを提供する。遺伝子活性化デポーシステムの形態での膜を形成することにより、そのローカルアプリケーションは、規定された時間の間、適用の領域において一定の核酸レベルに導かれえ、有利な特性が達成される。したがって、投薬頻度およびドーズ量を低減すること、望ましくない副作用、たとえば、他の組織のトランスフェクションのようなもの、すなわち、いわゆる「オフターゲット効果」 を避けること、非生理学的なタンパク質レベル、および核酸および担体物質による患者への負担を回避すること、および患者による受け入れを向上させることが可能である。
【００７９】
上述のように、PA対PAI-1抑制剤の比が外科的な接着の形成および瘢痕形成に影響を与えると想定される。このようにして、さらなる実施形態では、噴霧システムは、PAおよびPAI-1抑制剤および/またはそれらを活性薬剤としてコードする核（nucleid）酸の組合せを含むことが提供される。ここで、PA対PAI-1抑制剤の比が5：1から1：5までの範囲にあり；対応する核酸が使用されるとき、発現後に、5：1から1：5までのPA対PAI-1抑制剤の比が標的部位で見出されるように、その比を設定することができる。そのような組合せを適用するとき、特に効果的に外科的接着の形成を抑えることが可能であることが見出された。
【００８０】
本発明のスプレーシステムは、二成分の混合の際に、ポリマーが、非常に迅速に析出し、フィルムが形成され、随意に一または双方の成分において含まる活性薬剤が、同時にフィルムに共挿入される（co-integrated）ことを特徴とする。この目的のため、二つの成分は、使用前には別々の容器に貯蔵され、それらはスプレーに際し、またはスプレーの直前に混合され、またはそれらが混合されながら噴霧されるようにしてスプレーされる。それゆえ、本発明のスプレーシステムの二つの成分は適用のために混合される。好ましくは、二つの別々の成分は噴霧のために混合室に供給され、そしてそこから直接に噴霧される。好ましくは、それ自体既知の装置が噴霧用で使用され、そこでは、スプレー弁の起動の際に、一用量の各々が二つのリポジトリー（貯蔵所）から混合室に供給され、そこから一緒に噴霧される。このように、混合は、噴霧の際にスプレーアプリケーター内で直接発生し、このようにして、スプレーノズルがそれにより目詰まりすることがありえた時期尚早の析出が防止される。別個のスプレーアプリケーターからの二つの成分の連続噴霧により、高品質のフィルムを製造することは可能ではない。二つの成分は、それらのアプリケーションの前に、それらが互いに別々に維持されており、噴霧中に互いに接触することになり、その結果、スプレーミストの影響の際に、ポリマーの沈殿により形成された膜は、標的部位で安定することができるのが、本発明にとって必須である。前もって別々に保たれた二つの成分の混合/噴霧のために適したスプレーアプリケーターは、先行技術において知られている。本発明に従った用途に適した既知の装置は、図8に示され、そして会社Baxter（バクスター）からの噴霧セットとして入手可能である。
【００８１】
供給される二つの成分のドーズ量を制御することが可能である。それぞれのドーズ量は、使用の種類、成分のタイプ、および随意に活性薬剤に依存する。用途に応じ、二つの成分は、10：90から90：10までの、好ましくは、25：75から75：25までの比率で（溶液/液体の容積に基づき）、より一層好ましくは、40：60から60：40までの比率で混合されるべきである。膜を生成するために供給される成分の量は、膜の望ましいサイズおよび厚さに依存する。それは、それ自体既知の方法で調整することができる。腹腔内適用のために、各成分の0.5から5mlまでの、好ましくは、0.7から3mlまでの量が好適であることが見出された。
【００８２】
以下の組合せが特に有利であることが見出された。すなわち、
親脂性成分：グリセロールホルマール、テトラグリコールまたはDMI中、10％（m/v）PLGA溶液（Resomer(R)RG Hシリーズ）、
親水性成分：注入用の水、
活性薬剤：pDNA/L-PEIポリプレックス、親水性相において溶解した凍結乾燥物として（取り込みオプションA ）またはホモジナイザーを用いて親脂性PLGA溶液中に分散させたもの（取り込みオプションB ）。
随意に、凍結乾燥のために凍結保護剤（cryoprotector）として10％（m/v）の濃度でのショ糖（スクロース）
である。
【００８３】
本発明のスプレーシステムは治療上の適用のために提供される。それとともに形成されるマトリクスシステムのための適用の分野は、術後接着の防止であり、そのものは腹腔内で術後の組織特異的プラスミノーゲン活性化因子とその阻害剤の間の不均衡によって生じる永久的な接着に発展しうる[56、64、65]。ここで決定的に、術後2乃至5日の急性期を含む2週間の時間枠である。活性薬剤としてtPAコード化プラスミドを含有するデポーシステムが特に適する。薬理学的に活性な成分の他、ポリマーフィルムは、接着に対する追加の抗接着障壁を構成する。たとえば、本発明の噴霧システムは、腹腔内での内視鏡的介入の場合に、たとえば、内視鏡を介して噴霧することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
本発明は、さらに添付の図面によって示される。
図面は、本発明の実施形態およびそれとともに得られた結果と示す。
【図１】外科的接着の病因に関係する概略図を示す。
【図２】選定したResomer(R)RGポリマーのフィルム品質を比較して見せる図を示し、A）PLGA50：50、Hシリーズ、B）PLGA 75：25、Sシリーズである。それは、噴霧膜を形成する使用ポリマーの割合を示し、その一方で、残りは、可溶性部分として、上清中に失われる。データは、平均値±標準偏差（n=4）として与えられる。統計的に有意な差にはアスタリスクが付く〔P<0.05（*）、P<0.01（**）〕。
【図３】フィルムの粘弾性テストの結果の図を示す： 1Hzの周波数で比較した異なる溶媒を用いたResomer(R)RG HシリーズのA）ストレージモジュラス（貯蔵弾性率）（G′）；B）ロスモジュラス（損失弾性率）（G″）。
【図４】試験した溶媒を用いて達成されたフィルム品質を示す：A）Resomer(R)RG 503 Hを用いてインシトゥーで形成されたフィルム；B）分配係数Pに対してプロットしたフィルム品質。データはn=4の調製物の平均値±標準偏差として示す。
【図５】比較として試験溶媒のLD50値を示す：中皮細胞上のインキュベーション時間に応じた試験溶媒のLD50。それぞれの場合において、代謝細胞生存率をATPliteアッセイによって測定した。
【図６】インシトゥーで形成されたフィルムの異なる調剤物の放出動態上の図を示す：（A）Resomer(R)RG 502 H、親水性相中のポリプレック；（B）Resomer(R)RG 502 H、親脂性相中のポリプレックス；（C）Resomer(R)RG 504 H、親水性相中のポリプレックス；（D）Resomer(R)RG 504 H、親脂性相中のポリプレックス。凍結乾燥したポリプレックスを、異なるポリマー溶液〔DMI（黒丸●）、テトラグリコール（白丸○）およびグリセロールホルマール（黒逆三角）を使用してフィルムに組み込み、そしてpDNAの放出を30日間分析した。データは平均値（n=3）から平均値±標準偏差として与える。
【図７】異なる凍結保護剤を使用して、肺細胞系に対する凍結乾燥l-PEI/pDNAのポリプレックスのトランスフェクション効率を示す。DNAトポロジー-凍結乾燥pDNA/l-PEIポリプレックスを、ヘパラン硫酸（HS）の添加下でのアガロースゲル電気泳動により分離した。この目的のため、ポリプレックスを注入用の水（WfI）に再懸濁した。データは平均値±標準偏差として示す〔（a）n=07、（b）n=4〕）。統計的に有意な差にアスタリスクを付ける〔P<0.05（*）、P<0.01（**）〕。pCMV-Lucコントロール（C）、サイズマーカー（L）、注入用の水（WFI）、Ultra-Turrax（ウルトラタラックス）(R)（UT）、ホモジナイザー（H）。
【図８】インシトゥーで形成されるフィルムを製造するための実験的設定を示す。
【図９】図を、中皮細胞上への本発明のフィルムのインビトロ適用の結果とともに示す：中皮細胞上でResomer(R)RG 504 H系フィルムを適用した後のルシフェラーゼ遺伝子発現である。プラスミドDNA/l-PEIポリプレックスを、親水性相中に組み込み、そしてそれらの発現を、ルシフェラーゼアッセイを用いて29日の期間にわたって研究した。放出された光子（RLU）を、バックグラウンド修正後10秒間測定した。結果を、平均値±SEM（平均の標準誤差）（n=3）として与える。
【図１０】中皮細胞上でその場で形成されるフィルムのインビトロ適用の結果を示す。（A）Resomer(R)RG 504 H系フィルムからのマトリクス放出および（B）取り込まれたプラスミド-DNAのヨウ化プロピジウムでの染色後の蛍光記録。pCMV-tPA-IRES-Luc/l-PEIのポリプレックスを、親水性相中に溶解し、スプレーフィルムを、中皮細胞上に噴霧し、そしてtPAレベルを、ELISAを使って29日間にわたって測定した。結果を、平均±SEM値（n=3）として与えた。
【図１１】中皮細胞上でのプラスミドDNA/siRNAのコトランスフェクションを示す：a）ウエスタンブロットでの48時間後のPAI-1およびtPAの検出、b）時間の関数としてのtPA/PAI-1比。pCMV-TPA-IRES-Luc（ptPA）またはコントロールプラスミド（pUC）および異なるsiRNA（PAI-1、EGFP）を含むポリプレックスを、HBS中、10のN/P比で（pDNAの量に基づき）l -PEIを用いて調製した。比較のために、未処理の細胞（UN）の発現を示す。上清中のtPA-およびPAI-1レベルを、ウエスタンブロットによって異なる時点で決定した。
【図１２】pCMV-tPA-IRES-Lucプラスミドの概略図を示す。
【図１３】PBS中のl-PEI/pDNAポリプレックスの希釈系列を示す。
【図１４】ヒトtPA抗原アッセイの標準曲線を示す。
【図１５】異なる凍結保護剤を使用した粉末形態でのポリプレックスのトランスフェクション効率を示す：肺細胞株での凍結乾燥l-PEI/pDNAポリプレックスの、（A）異なる凍結保護剤〔10％（m/v）ショ糖またはマンノース、4％（m/v）デキストラン5000を用いての、B）凍結保護剤として10％（m/v）ショ糖を使用した凍結乾燥ポリプレックスの均質化（homogenizaton）後の、トランスフェクション効率。
【００８５】
本発明を、さらに以下の例により説明するが、それはどのような方法であれ、制限されることがない。
【実施例】
【００８６】
例１
【００８７】
材料および方法
【００８８】
核酸
【００８９】
プラスミドpCMVLucは、[19]において説明するように得ることができ、CMVプロモーター、サイトメガロウイルス由来のプロモーターの制御下にホタルPhotinus pyralis（ホティナス・ピラリス）のルシフェラーゼ遺伝子〔Luc（リュック）〕を含む。同様に、CMVプロモーターの制御下に、構築物pMetLucは、海洋カイアシ類Metridia longa（メトリディア・ロンガ）のルシフェラーゼ遺伝子、分泌型ルシフェラーゼ酵素[20]をコードする。
【００９０】
構築物pCMV-tPA-IRES-Lucをクローニングし、そして図12に模式的に示す。ルシフェラーゼ酵素（Luc）および組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）の配列に加え、それには、CMVプロモーター（CMV-IE、サイトメガロウイルス前初期）が含まれる。
【００９１】
pCMV-TPA-IRES-LucのプラスミドをpIRES-Lucベクター[21]を用いてクローニングした。組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）をコードする配列を、 CMVプロモーターの制御下で、制限酵素（エンドヌクレアーゼ）MluIおよびFseI〔New England Biolabs Inc.（ニュー・イングランド・バイオラボズ社）、USA〕を使用して、このベクター中にクローニングした。この目的のために、プラスミドpCMV-tPAの配列（インサート）を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）[22]を用いて増幅した。ルシフェラーゼ遺伝子に加えて、pIRES-Lucベクターは、互いに独立して、両方の転写物の翻訳を可能にする内部リボソーム侵入部位（IRES）を含んだ。
【００９２】
pUC21ベクター〔Invitrogen（ インビトロゲン社）、ドイツ国）は、発現カセットを欠き、そして単に細菌のバックボーンを含むにすぎないが、コントロールプラスミドとして用いた。
【００９３】
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。すなわち、siRNAを、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1（PAI-1、5'-GGAACAAGGAUGAGAUCAG [4、23]-3'）に対して、そしてコントロールとして、EGFP（5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU[dT][dT]-3'）に対するsiRNAを使用した。凍結乾燥試料を、20μMで、再懸濁緩衝液〔Qiagen（キアゲン）〕中に溶解し、そして100μMストック溶液での放出試験のために、90℃で1.5分間インキュベートし、37Cで1時間穏やかに振とうさせ、そして-20℃で一定分量にて蓄えた。
【００９４】
ポリエチレンイミン
【００９５】
22kDaのモル質量を有する線形ポリエチレンイミンを、Plank（プランク）らによる指示に従って合成した [24]。指示と類似して、線形PEIを、プロピオン酸（proponic acid）アミドポリ（2-エチル-2-オキサゾリン）50Daの、共沸混合物として合成バッチから連続的に引き出される放出プロピオン酸との酸加水分解（acidic hyrolysis）によって取得し、その結果、その反応はほぼ完全にそのコースを実行することができた。その後、遊離塩基を、pH12の水酸化ナトリウムを用いて沈殿させ、洗浄し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥されたl-PEIを、4℃で貯蔵し、そして必要に応じて、蒸留水に溶解させ、7.4のpH値に調整し、透析し〔ZelluTrans（ツェルトランス）透析膜T2、MWCO 8-10 kDa〕、そして滅菌ろ過に供した。
【００９６】
PEI溶液を測光法的に、分光光度計〔Ultrospec（ウルトロスペック）3100 Pro（プロ）〕により285nmでの硫酸銅試験を用いて定量した[25]。既知濃度のl-PEIバッチを基準として使用した。合成生成物の純度を、1H-NMR分光法〔Bruker（ブルカー）250MHz、Karlsruhe（カールスルーエ）〕により確認した。モル質量は、多角度レーザー光散乱検出器（GPC-MALLS）を用いたゲル浸透クロマトグラフィーにより測定し、そして20-22 kDaでのモル質量を示した。
【００９７】
PLGAポリマー
【００９８】
会社Boehringer Ingelheim（ベーリンガーインゲルハイム）、ドイツ国からの以下のポリマーを、フィルムの調製のために使用した。
・Resomer(R)（レソマー）RG 502、503および504H
・Resomer(R)RG 752、755S
【００９９】
細胞系
【０１００】
胸膜中皮細胞（ヒト）、手短には、Met5A、ATCCの、ドイツ国（CRL-9444）のものを使用した。細胞系は、37℃、5％CO2および湿度100％で、M199〔Gibco（ギブコ）-BRL、英国〕およびMCDB 105〔Sigma-Aldrich（シグマ-アルドリッチ社）、ドイツ国〕の1：2混合物中で培養した。10％ウシ胎仔血清〔PPA Laboratories（ラボラトリーズ）、オーストリア連邦〕に加え、上皮増殖因子（5ng/ml、Sigma-Aldrich、ドイツ国）およびヒドロコルチゾン（400ng/ml、Sigma-Aldrich、ドイツ国）を培地[に添加した[26]。さらに、細胞を、約80％のコンフルエンスで継代し、そして最大で 20継代までの試験のために使用した。
【０１０１】
ポリプレックスの調製
【０１０２】
複合体の形成は静電結合力によって自然に発生した。形成されたポリプレックスの特性は媒体のイオン強度、用いるポリマーおよびN/P比に実質的に依存した。後者は、ポリマー構造体のプロトン化窒素原子対核酸中の負に荷電したリン酸原子（P）のモル比（N）を指定する。小さな単分散粒子を得るために、より一層低い電荷密度を有する等容量の、核酸溶液を、より一層高い電荷密度を有する溶液、ポリマー溶液中にピペッティングし、およびピペットにより添加すること、および除去することによって混合した（5乃至8回）。続いて、さらなる試験を行う前に溶液を室温（RT）で20分間インキュベートした。注入（siRNA、プラスミドDNAの凍結乾燥物）のための水およびpH7.4のHBS（プラスミドDNA液体）を媒体として使用した。
【０１０３】
粉体形状でのポリプレックスの調製および特徴付け
【０１０４】
ポリプレックスを、注入用の水において、上述したように、10のN/P比でpCMVLucおよびl-PEIを用いて調製した。異なる凍結保護物質を試験するために、ポリプレックスを、インキュベーション期間の後、20％（m/v）のスクロース溶液、20％（m/v）のマンノース溶液または4％（m/v）のデキストラン5000溶液の1：2で希釈、混合、および等分した。次いで、アリコートを窒素中で急速冷凍し、そして凍結乾燥機において最大電力で約24時間凍結乾燥させることができた。凍結乾燥物を、それぞれの培地において、0.02μg/μlの最終濃度（等しい初期濃度）に対して再懸濁し、そしてトランスフェクションを、以下に記載されるように類似の方法で、96ウェルプレートにおいてBEAS-2B細胞上で行った。
【０１０５】
10分間のインキュベーション時間後、粉末状のショ糖を添加し、そして複合体を、ショ糖添加の前と後にPCSにより制御される粒子サイズを用い、さらに10分間インキュベーションした。凍結乾燥後、粉体を乳鉢中で乳棒により均質化することができ、そして続いてホモジナイザー、ガラス（glas）乳棒を有する円筒形ガラス容器〔Schutt Labortechnik（シャッツ・レイバーテクニック社、ドイツ国）を用い、またはUltra-Turrax(R)（ウルトラタラックス）〔レベル3、14秒、Ika Labortechnik（イカ・レイバーテクニック社、ドイツ国）によってPLGA溶液に懸濁させることができた。あるいは、粉体は、注入用の水に再懸濁した乳鉢において直接または均質化した後のものであった。凍結乾燥物を、0.02μg/μlの最終濃度までそれぞれの培地に再懸濁した。
【０１０６】
粒径およびゼータ電位の測定
【０１０７】
ポリプレックスの流体力学的断面は、二回蒸留した水において600μlのポリプレックス溶液（0.02μg/μlのpDNA）を有するセミミクロキュベット中での光子相関分光法により決定し、電気泳動光散乱によるゼータ電位のものは1.6mlのポリプレックス溶液を有するマクロキュベット中であった（それぞれ、 0.02および0.1μg/μlのpDNA）。以下の設定を使用した。すなわち、5つの測定値（寸法測定）、5回のランをサンプル当たり10サイクル（ゼータ電位）；水の粘度〔0.89cP（センチポイズ）〕および/またはHBS（1.14センチポイズ）；屈折率1.33；誘電定数78.5；温度25℃である。ゼータ電位は、Smoluchowski（スモルコフスキー）に従って計算した。サイズの評価は、標準曲線に基づいて行った。機器は、92nmの大きさのポリスチレンラテックス粒子〔Duke Scientific Cooperation（デューク・サイエンティフィック・コーポレイション）、CA（カリフォルニア州）、USA〕および+50mVの荷電を有するゼータ電位基準Bl-LC-ZRZ〔Laborchemie（レイバーケミー）、Vienna（ウィーン）、オーストリア国〕で、定期的にチェックした。
【０１０８】
アガロースゲル電気泳動
【０１０９】
アガロースゲル電気泳動により、ポリプレックス中の核酸（プラスミドDNA、mRNA）の複合体形成の程度を決定することが可能である。このために、上述したように、ポリプレックスを調製し、6倍濃縮ローディング緩衝液と組み合わせ、そして100ngのpDNAを、それぞれ、臭化エチジウムを含有する（10μg/100μl）0.8％アガロースゲルに適用した。対応するサイズマーカーを基準として適用した。電気泳動は、1×TAE緩衝液中で約1.5時間、125Vで行った。続いて、核酸のバンドをUV光（360nm）の下で検出し、そしてゲルカメラで撮影した。
【０１１０】
アガロースゲルにおいて、不完全な錯化は、ゲルのポケットに残っているポリプレックスと共に、ゲル中の遊離核酸が存在することによって認識することができる。また、ゲルポケットでの信号の強度から縮合の程度に関して結論を引き出すことができる。以下のものが適用される。すなわち、より一層弱いバンドは、より一層多くの核酸をカチオン性ポリマーにより縮合する。ポリアニオン〔0.1μgのヘパラン硫酸（HS）/100μgのpDNA、インキュベーション時間45分〕の添加によって、核酸は複合体から置換され、そして核酸の完全性（トポロジー、分解）を確認することが可能になった。
【０１１１】
例2
【０１１２】
インシトゥーで形成された膜の特徴付け
【０１１３】
生体材料および溶媒の関数としてのフィルム品質の決定
【０１１４】
使用する溶媒およびポリマータイプの関数としてフィルム形成のさらなる特徴付けを可能にするために、スプレー試験をペトリ皿で遂行した。このために、10％（m/v）のポリマー溶液をそれぞれの溶媒中で調製し、そして1mlのポリマー溶液それぞれ（シリンジ1 ）を、1.5bar（バール、1バール=0.1MPa）で注入用の水1ml（シリンジ2）と共にスプレーした。5分間の待機時間は、マトリクスの完全な形成を可能にすることを意味した。マトリクスの目視検査のために、水相をブリリアントブルーGで染色し、そしてスプレー表面までの距離を11cmで設定した。さらなる試験は固定せずに行ったが、それはより一層均質なフィルムを得ることができたからである。結果を図4に示す。
【０１１５】
マトリクスの品質のより一層良好な評価を可能にするために、上清を一定重量になるまで取り除き、そして減圧システム中で乾燥させた〔Speed-Vac（スピード-バック）、Dieter Piatkowski（ディーター・パイカウスキー）、ドイツ国〕。同様に、マトリクスを、同様に一定の重量まで、凍結乾燥機〔Lyovac（ライバック）GT 2、LH Leybold（レイボルド）、ドイツ国〕中で乾燥させた。その後、用いるポリマーの総量に基づき、ポリマー含量を、上清（損失）において、および沈殿物（マトリックス品質）において決定することが可能であった。
【０１１６】
溶媒の組織耐性の決定
【０１１７】
溶媒の細胞毒性を、ATPベースのアッセイ〔ATPlite、Perkin Elmer（パーキン・エルマー社）〕により定めた。細胞を、24時間、アッセイの前に、96ウェルプレートに播種し、培地をアッセイの前に、直ちに除去し、細胞を一回PBSで洗浄し、そして添加された抗生物質（antibotics）〔ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1％（v/v）、ゲンタマイシン0.5％（v/v）、Gibco（ギブコ）-BRL、英国〕を有する50μlの血清含有培地を添加した。次いで、異なる溶媒濃度（16-500μg/μl）の50μlの各々を、注入用の水で希釈し、添加し、そして37℃、5％CO2および100％湿度にて、異なる時間の長さでインキュベートした（15、30、60、221、360および640分）。インキュベーション期間後、培地を吸引し、細胞をPBSで一回洗浄し、50μlのPBSを各ウェルに添加し、そして細胞生存率を製造者の説明書に従って定めた。ルミネセンス（発光）は、100％の生存率を有する基準値として使用される未処理細胞の発光（注入用の50μlの水）を用いて、プレートリーダー〔Wallac（ワラック）Victor（ビクター）2/1420 Multilabel Counter（マルチラベルド・カウンター）、パーキン・エルマー社、USA〕において測定した。各時点について、溶媒の濃度を測定された細胞生存率に対してプロットし（n=4のランからの平均値±標準偏差）、そして非線形標準関数を適合させた。
【０１１８】
すなわち、
y=最小+[(最大-最小)/(1+(x/EC50)Hilfslope)]
【０１１９】
この関数はすべての溶媒について良好な調整を示した。すなわち、テトラグリコール（R2=0.9181-0.9900）、グリセロールホルマール（R2=0.9268-0.9945）、ジメチルイソソルビド（R2=0.9647-0.9894）。LD50値は、プロットされた回帰曲線の推定値から採取した。それはまだ50％の細胞生存率を測定することができる濃度である。
【０１２０】
インシトゥーで形成されたフィルムの粘弾性特性
【０１２１】
マトリクスの粘弾性特性のアイデアを得るために、レオロジー試験を行った。この目的のために、フィルムを、回転式粘度計〔Physica（フィジカ）MCR 301〕のプレート上にスプレーし、そして生体材料〔Resomer（レソマー）(R)RG 504 Hおよび502 H〕を、使用する溶媒に依存して動的剪断試験において試験した。ここで、規定された振幅および周波数を伴う調和して振動発振するせん断応力をサンプル（試料）に適用し、そして得られる剪断変形を測定し、それは二つの応答パラメーター、応答振幅および応答周波数によって特徴付けられ、また、位相シフトと呼ばれた。双方の応答パラメーターは、数学的に、ストレージモジュラス（貯蔵弾性率）G'およびロスモジュラス（損失弾性率）G''に変換することができ、貯蔵弾性率は貯蔵を、そして従って導入された動力学的および/または変形エネルギーの再利用可能なシェア（弾性シェア）を特徴付け、および損失弾性率は、振動当たりの熱において放出されるエネルギーの尺度、そして従って損失シェア（摩擦シェア）である。
【０１２２】
放出動態を決定するための試験
【０１２３】
放出動態を決定するための試験は、インキュベーター内で連続的に振とうさせながら37℃でロック可能なペトリ皿（吸収剤を伴わないペトリ皿50×9mm、PAll）で遂行した。この目的のために、注入用の水を用いて上述したように、試料を噴霧した。凍結乾燥したl-PEI/pCMVLuc複合体（N/P比10、10％ショ糖、25μgのpDNA/調製物）を、予め、ホモジナイズ形態（乳鉢および乳棒）において、PLGA溶液中に分散させ、または水相中に再懸濁させた。注入用の水をコントロールとして用いた。噴霧後、それを 5分間待機させ、上清を除去し（0時間値）、1mlのPBSを加えた。次いで、上清を完全に、一定間隔で交換し、試料を分析まで-20℃で保存した。
【０１２４】
インシトゥーで形成したマトリクスから放出されたプラスミドDNAを測光法により定量化した。この目的のために、サンプルを、測光定量化を妨げるであろうPLGAの分解生成物を分離するために、測定するのに先立ち、クロロホルムで抽出した（1ml、400g、RT、10分）[27]。続いて、サンプルを260nmにて測光法により測定した〔Nanodrop-1000（ナノドロップ-1000）、PEQLAB Biotech（PEQLABバイオテク社）、ドイツ国〕。前段階では、l-PEI/pDNAのポリプレックス（pDNA濃度100μg/ml）を、注入用の水において生産し、そしてPBSで段階希釈の標準シリーズを、260nmでの5日の個々の日に、それが放出された複合化プラスミドDNAの濃度を計算することが可能であったことに基づいて決定した。結果を図13に示す。コントロールとして、無負荷フィルムを分析（バックグラウンド修正）し、容量における小偏差を、水の密度に対する試料の重量を測定することによって考慮した。
【０１２５】
例3
【０１２６】
インビトロ分析
【０１２７】
トランスフェクション
【０１２８】
インビトロトでのランスフェクション調査を行うため、ウェルあたり90,000乃至120,000の細胞（24ウェルプレート）をトランスフェクション24時間前に播種した。継代20までの細胞だけを、トランスフェクションのために使用した。これは、トランスフェクションの日に約70％のコンフルエンスをもたらした。トランスフェクションの直前に、培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄し、および200μl（24ウェルプレート）の無血清培地を添加した。続いて、1μg（24ウェルプレート）のプラスミドDNAの量に対応するポリプレックスの50μlを培地に添加した。37℃、5％CO2および100％湿度で4時間のインキュベーション期間の後、ポリプレックスを除去し、細胞を再度PBSで一回洗浄し、そして抗生物質を添加した血清含有培地〔ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1％（v/v）、ゲンタマイシン0.5％（v/v）、Gibco（ギブコ）-BRL、英国〕で置き換えた。
【０１２９】
スプレー試験の実現
【０１３０】
L-PEI/プラスミドのDNAポリプレックス（N/P比10、100μgのpDNA/調製物）を、上記のように調剤し、10％のショ糖で凍結乾燥し、および乳鉢および乳棒を用いて均質化し、その結果として、それらを重量によって投薬し、およびPLGA溶液中に分散させるかのどちらかが可能であり、それは予め滅菌ろ過に供され、または水相（注入用の水）において再懸濁された。添加剤を含まない注入用の水を、陰性コントロールとして使用した。pMetLucおよびpCMV-tPA-IRES-Lucを、プラスミドDNAと等量で使用した。
【０１３１】
テスト前の3日間に、Met5A細胞をポリエチレンテレフタレート（PET）膜を有するハンギング（つるされた）インサート〔1μmPET Millicell（ミリセル）〕上に播種し、それは光学顕微鏡による細胞のコントロールを可能にした。1.5mlの細胞培養培地をそれぞれ提供し、2分間インサートをそこで平衡化し、そして続いてウェル当たり250,000の細胞を、1.5 mlの培地中で膜上に播種した。試験前に、培地を除去し、PBSで一回洗浄し、そして上記のようにサンプルを細胞上に噴霧した。最初に、サンプリングは、毎日行い、後には2乃至3日毎に行って、そして培地を完全に交換した。サンプルは直接的に氷上に置き、そして分析測定まで-80℃で保存した。
【０１３２】
ルシフェラーゼ活性測定によるトランスフェクション効率の決定
【０１３３】
レポーター遺伝子ルシフェラーゼをコードするpCMVLucプラスミドの使用に際し、遺伝子導入効率を分析するために、ルシフェラーゼ活性は、PBSで細胞を1回洗浄すること、100μlの1×細胞溶解バッファー（25mMのトリス/ HCl、pH7.8、0.01％トリトンX-100）をウェル当たり添加することにより、トランスフェクション後24時間測定し、および、 RTで10分間のインキュベーション時間の後、60秒間それらを振とうさせた。続いて、自動的に100μlのルシフェリン基質（470μMのD-ルシフェリン、270μMのコエンザイム、33.3mMのDTT 、530μMのATP、1.07mMの(MgCO3)4Mg2x5H2O、2.67mMのMgSO4、0.1mMのEDTA 0.1mM、20mMのトリシン）を50 μLのアリコートに追加すること、およびプレートリーダー〔Wallac Victor2/ 1420 Multilabel Counter（ワラック・ベクター2/1420マルチラベル・カウンター）、パーキン・エルマー社、米国〕での5秒の期間の発光を測定することが可能であった。基質の添加前に、バックグラウンドを、同様に、5秒間の期間測定した。ルシフェラーゼ活性は、放出された光子（相対光単位、RLU）として測定し、10秒間の期間、バックグラウンド修正した後に統合し、そして細胞塊の全体的なタンパク質量に基づいた。全体的なタンパク質は、以前に標準的なタンパク質アッセイによって定めた〔Biorad（バイオラッド）に従う方法〕。
【０１３４】
Metridia（メトリディア）ルシフェラーゼの発現を介したトランスフェクション効率の決定
【０１３５】
まず試験管内噴霧試験を、l-PEI/pMetLucおよびl-PEI/pIRES-Luc-tPAのポリプレックスの混合物を用いて行った。pMetLucプラスミドは、細胞によって分泌されるルシフェラーゼ酵素、メトリディアルシフェラーゼをコードし、そして従ってサンプルの上清中の酵素発現を介して遺伝子移入（遺伝子導入）効率の測定を可能にする。このルシフェラーゼは、セレンテラジンの今回の場合には、ルシフェリンの酸化的脱炭酸を触媒し、その一方で、同時に482nmの波長で光を放出する。選定したサンプリング時間でReady-To-Glow Automation Kit（レディー・ツー・グロー・オートメーション・キット）〔Clontech（クローンテック）、Takara Bio Company（タカラバイオ社）、フランス国〕を用いて、サンプルを氷上で解凍し、そして事前希釈せず5秒の期間にわたり、発光を、プレートリーダー（Wallac Victor2/ 1420 Multilabel Counter、PerkinElmer Inc.、米国）において製造者の指示に従って測定することによって分析した。基質の添加に先立ち、バックグラウンドを同様に5秒間の期間について測定し、その結果として、ルシフェラーゼ活性（RLU値）を、バックグラウンド修正後、10秒の期間統合することができ、そしてそれぞれの陰性コントロールはそれらの値から減算することができた。未処理の細胞は、ボーラス投与のための陰性コントロールとして役立ち（注入用の水において完全なpDNAの量の単回投与）、そしてアンロードデッド（無負荷）フィルムを、マトリクスシステムのための陰性コントロールとして使用した。
【０１３６】
ELISAによる合計組織プラスミノーゲン濃度の測定
【０１３７】
選定したサンプルでは、ルシフェラーゼ活性の測定に加え、合計組織プラスミノーゲン濃度を、細胞の上清中のELISA 〔Human tPA（ヒトtPA）Total Antigenassays（トータル抗原アッセイ）、Innovative Research（イノベーティブ・リサーチ）、Dunn Labortechnik GmbH（ダン・ラボテクニック社）、ドイツ国〕により決定した。使用するアッセイは、フリーの、そして従って活性tPAを検出するだけでなく、インヒビターに結合したその潜在形態を検出する。上清は細胞培養物から由来したので、標準を、FCSなしに使用される細胞の細胞培養培地中のサンプルと同様の手法で希釈した。以下のように、陽性コントロール（ボーラス投与）を希釈した。すなわち、1：50（48時間、9d）、1：10（16、23および29d）。内側のコンパートメント（区画）からのサンプルを、充填し〔30μlのサンプル、100μLまで（ad）〕、その一方、外側の区画からのサンプルは希釈せずに分析した。アッセイは、製造者の指示に従って行い、および450nmでの吸収をプレートリーダー（Wallac Victor2/ 1420 Multilabel Counter、PerkinElmer Inc.、USA）において0.1秒の期間にわたって測定した。標準曲線を図14に示す。陰性コントロールを上記のように使用した。
【０１３８】
蛍光顕微鏡写真
【０１３９】
噴霧試験が終了した後、培地を除去し、そしてマトリクスに残るプラスミドDNAをヨウ化プロピジウムで染色した。この目的のために、マトリクスは、RTで10分間PBS中1：10希釈においてヨウ化プロピジウムと一緒にインキュベーションし、画像を撮影する前に、再びPBSで洗浄し、そして落射蛍光顕微鏡〔Axiovert（オキシオバート）135、Carl Zeiss（カール・ツァイス）、Jena（イエナ）、10倍レンズ〕を用い、画像を撮影した。ヨウ化プロピジウムの励起は、470±20nmで発生し、その一方、発光は540±25nmで検出された。ソフトウェアAxioVision（オキシオビジョン）のLE 4.5を、評価のために使用し、および分析を、Brightfield（ブライトフィールド）でのAlexa（アレクサ）560nmフィルターを用いて行った。
【０１４０】
例4
【０１４１】
siRNAおよびプラスミドDNAのコトランスフェクションおよびウエスタンブロットによるtPA/PAI-1比の決定
【０１４２】
トランスフェクションは、わずかの識別された特色を伴って、24ウェルプレートにおいて、上記のように行った。それぞれの場合において、750ngのプラスミドDNAおよびl-PEIにより複合体化した30ピコモルのsiRNAを10のN / P比で（プラスミドDNAの量に基づいて）用いた。培地を6時間後に交換した。トランスフェクションの後、タンパク質、すなわち、組織特異的プラスミノーゲンアクチベーターおよび1型プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PAI-1）を、ウエスタンブロットにより分析した。タンパク質が分泌されたものであるので、それらは細胞の上清中に検出することができ、その結果として、異なる時点で、細胞の上清の各々20μlを除去し、調製当たりのサンプル（n=3）をプールし、そして死細胞を分離するために14.000rcfおよび4℃で10分間遠心分離した。サンプルは一貫して氷上で保存し、そして最終的な分析まで-20℃で凍結した。
【０１４３】
タンパク質をSDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、それらのモル質量に従って分離した。タンパク質の二次および三次構造を破壊するために、調製物〔3.75μlのサンプル、15μlの4×ローディングバッファー（130mMのトリス/HCl、pH7.4、20％のグリシン、10％SDS、0.06％ブロモフェノールブルー、4％DTT）、ad 60 μlの注入用の水〕を予め95℃で5分間変性させた。各調製物20μlを、7.5％のTris-HClゲル〔Bio-Rad Laboratories GmbH（バイオ-ラッド・ラボラトリーズ社）、ドイツ国〕上での電気泳動によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にエレクトロトランスファー（1時間、200mA、転写バッファー）した。ブロッティング後、膜を、50Da（サイズ標準、正確性プラスタンパク質標準）で、様々な一次抗体とのインキュベーションのために切断し、そして非特異的タンパク質結合部位をブロッキングバッファー〔20mMのトリス/ HCl、pH7.4、137mMのNaCl、0.1％のTween（トゥイーン）20中の5％粉乳〕において、穏やかに振とうしながら室温で1時間ブロックした。一次抗体とのインキュベーションは、穏やかな振とうと共に4℃で一晩行った〔マウス抗アルファ-アクチン1：15,000のChemicon（ケミコン社）、ドイツ国；マウス抗huPAI-1モノクローナル1：200のAmerican Diagnostics（アメリカン・ダイアグノスティック）、ドイツ国；マウス抗hutPAモノクローナル1:400のCalbiochem（カルビオケム）、ドイツ国を1：10ブロッキングバッファーで希釈した〕。検出のために、二次抗体（ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート、バイオラッドラボラトリーズ社、ドイツ国）を、1：10,000の希釈（tPA、PAI-1）において、または1：20,000の希釈（アクチン）において使用し、および膜を、穏やかに振とうしながらRTで1.5時間インキュベートした。次いで、標識されたタンパク質は、ECL化学発光〔Amersham Bioscience（アマシャム・バイオサイエンス社）、USA〕を用いて膜〔AmershamHyperfilm ECL（アマシャム・ハイパーフィルムECL）、GE Healthcare（GEヘルスケア）、ドイツ国〕上で検出することができ、そしてImage J Basics Version（イメージJベーシック・バージョン1.38により定量分析に供した。値を、未処理細胞のアクチンバンドに基づいて標準化した。
【０１４４】
統計的評価
【０１４５】
特に明記しない限り、結果は平均値±標準偏差として与える。統計学的に有意な差は対応のないt検定を利用して計算した。統計的有意性は、それぞれ、α=0.05（*）またはα=0.01（**）で仮定した。
【０１４６】
適切な溶媒の選定について関連するパラメーターは、i）製薬上の適用性、ii）良好な組織耐性、iii）水混和性、およびiv）溶媒におけるポリマーの溶解性であった。これらのパラメーターに基づいて、若干の溶媒をさらなるスクリーニングのために選んだ。
【０１４７】
注入可能なデポーシステムの適用のために広く用いられている溶媒は、テトラグリコール（テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコール）であり、グリコフロールと呼ばれる[28、29]。すでに、60年代以来、テトラグリコールが50％（v/v）までの濃度で非経口用の溶媒（静脈内、筋肉内）として使用されており、そしてこの希釈でのみ低毒性を示す[30]。
【０１４８】
グリセロールホルマール、同様に低毒性を有する無臭溶媒であり、1,3-ジオキサン-5-オールおよび1,3-ジオキソラン-4-メタノールの混合物からなる[30]。それは、膨大な数の調合薬および化粧品のための優れた溶媒である。このごろでは、主に、注射のための溶媒としての獣医学で使用される。たとえば、 Ivomec（イボメック）TM0.27％は、ブタにおいて皮下適用のために承認され、そして0.1ml/kgで使用される[31]。
【０１４９】
ジメチルイソソルビド（DMI）および乳酸エチルに関しては、殆どの研究は、溶剤の適合性について存在しない。乳酸エチルは、ステロイド製剤のために非経口適用可能なビヒクルとして使用され、そしてそのGRAS番号にもかかわらず、麻薬および軽度の溶血活性を伴う相対的に毒性があると考えられる。DMIは、主に局所的に、浸透促進剤として使用され、それについてわずかな溶血活性が、同様に観察された[30、34]。また、Matschke（マチュケ）らによる研究において、グリセロール（glyerol）エステルは良好な耐容性があり、PLGA/PLAポリマーに適した溶媒であることが示された[33]。この関連で、トリアセチンを試験し、短鎖トリグリセリドが低毒性を有し[35、36]、それが既に以前にインシトゥーで形成された持続放出調剤物のためにNMPおよびDMSOに代わるものとして記載されていた[29、37-39]。
【０１５０】
用いる溶媒に応じたフィルム品質の決定
【０１５１】
インシトゥーで形成されたデポーシステムの形成のための必須の前提条件は、溶媒中のポリマーの溶解性である。文献において、少なくとも10％の溶解性（m/v）を、PLGAに基づいてインシトゥーで形成されるシステムについて推定する[40]。古典的な溶媒、たとえば、NMPおよびDMSOなどのようなものにおいてだが、また、乳酸エチルでも、溶解性データは既に異なるPLGAポリマーのために収集されている[41]。それぞれの調査は、ポリマーの溶解性がモル質量の増加とともに減少したことを示した。さらに、水のその量が、用いる溶媒においてポリマーの溶解性と相関してインシトゥーでの析出のために要求された。用いる溶媒においてポリマーの溶解性が良好なほど、より多くの水がデポーマトリクスの形成のために必要であった。対照的に、水の必要量はポリマー含量が減少するにつれ増加した。
【０１５２】
第一の調剤物および溶解性の試験を、モデルポリマーのResomer(R)RG 503 Hを用いて作成した。より一層良好な視覚化のため、水相をブルー色素のブリリアントブルーで染色した。試験したすべての溶媒は、10％（m/v）のポリマー溶液を調製することができた。しかし、フィルムは、既に視覚的に、安定性、均一性およびマトリクス中への水相の取り込みに関して明確な差を示した。結果を図4に示す。見られるように、トリアセチンを溶媒として用いて、均質なフィルムを達成することは可能でなく、むしろ、明確に視認できるW/Oエマルションを形成する。すべての他の溶媒は、フィルムの形成をもたらし、大幅に変化する水相の取込みを伴った。マトリクスの染色に基づいて、水相の取込みは以下の順序で減少した。すなわち、トリアセチン≦乳酸エチル<<テトラグリコール<グリセロールホルマール〜DMI。
【０１５３】
一方を図4において個々の溶媒のlogP値を有するポリマーマトリクスへの水相の取り込みを比較する場合、フィルム品質への依存があることが明らかになり、それは、使用される溶媒の水への溶解性上での、上清におけるポリマーの低損失によって特徴付けられる。トリアセチンおよび乳酸エチルが、親脂性溶媒（XlogP>0）として、他の溶媒よりも低い水混和性を有し、それによってマトリクスの乏しいフィルム品質を説明することができることを想定しなければならない。したがって、これらの溶媒は、極めて親脂性のPLGAポリマーの溶液のために考慮されるに過ぎない。場合により、溶媒の混合物がより一層好適である。テストセットアップでトリアセチンを使用しながら、スプレーフィルム（溶射膜）を製造することは不可能であったが、乳酸エチルは、非常に少ない色素だけを組み込むことができる、どちらかといえば不均一な、多孔質フィルム構造をもたらした。対照的に、インシトゥーでのフィルムは、グリセロールホルマール、DMIまたはテトラグリコールを使用したときに形成した。したがって、できるなら、0より小さいXlogP値を有する溶媒が好ましい。
【０１５４】
より一層良好にフィルム品質を評価できるようにするため、上清において（損失）および沈殿物において（インプラント）のポリマーの量を、スプレー試験において乾燥したマトリクスのバック計量（backweighing）によって定量した。溶媒の分配係数Pをマトリクスの質に対してプロットするとき、図4Bにおいて示すように、フィルムの質は、溶媒の水混和性の線形関数であることが見出される。グラフは明らかに、マトリクス形成が溶媒の水混和性の増大に伴って改善されうることを示す。<0.25のP値での使用されるポリマーの量の約80％がマトリクス中に組み込まれた。
【０１５５】
さらなる試験のために、異なるポリマーを、溶媒のグリセロールホルマール、DMIおよびテトラグリコールと組み合わせて試験した。トリアセチンは、乏しいフィルム形成により、さらに調査されず、そして乳酸エチルは、不安定性および多孔質、不均一なフィルム構造のために、およびその強い溶血活性のために、さらに研究しなかった。
【０１５６】
溶媒の組織耐性
【０１５７】
また、代謝細胞生存率に対する溶媒の影響を11時間にわたって調べた。代謝細胞生存率は、生存能力の尺度である細胞のATP値によって定める。物質の急性毒性を伴って、値が急激に低下し、そして従って溶媒の組織耐性の査定が可能になる。図5は、試験したすべての溶媒について、インキュベーション時間の関数として試験から算出されたLD50値を示す。
【０１５８】
溶剤に対する耐性は次の順序で減少した。すなわち、グリセロール（glyercol）ホルマール>>DMI>テトラグリコール。およそ1μg/mlのLD50値を伴い、6時間未満のインキュベーション時間にて、グリセロールホルマールは試験した溶媒のうち最も低い毒性を示した。DMIおよびテトラグリコールに比べ、これは試験の終了時に、それぞれ220倍および400倍高かった耐性を意味する。
【０１５９】
例5
【０１６０】
バイオマテリアルの分析
【０１６１】
解析した生体材料は、乳酸およびグリコール酸の生分解性ポリマー、ポリ(D,L-ラクティック-コ-グリコール酸)（PLGA）ポリマーで、会社ベーリンガー・インゲルハイム（商品名ResomerRG(R)）からのもので、それは既にFDAによって非経口投与のために承認されている。
【０１６２】
選定されたポリマーに依存するマトリクス品質
【０１６３】
上記のように、使用する溶媒の水への溶解度に依存して、フィルムに組み込むことができるポリマー含量の割合を変化させた。同様に、マトリクスの質は、様々なポリマーを用いてより一層詳細に研究された。試験したポリマーに関して、テトラグリコールが蒸発することができなかったので、この溶媒のためにデータは存在しない。図2は、（a）遊離酸基（Hシリーズ）を有するPLA/PGA 50：50および（b）エステル化された末端基（Sシリーズ）を有するPLA/PGA 75：25の組成を有するポリマーについての結果を示す。それらのより一層高い乳酸含量およびエステル化された末端基のため、後者はHシリーズよりも親脂性である。
【０１６４】
グラフは、両シリーズにおけるポリマーのより一層高いモル質量と共に、ポリマーのより一層多くをマトリクス中に組み込むことができることを示す。この効果は、HシリーズでのDMIについて、およびSシリーズの双方の溶媒について有意であった。グリセロールホルマールおよびResomer(R)RG755 Sを用いたとき、用いたポリマーの量のほぼ100％がマトリクスを形成した（97.6±0.6％）。
【０１６５】
試験した溶媒との組合せでのポリマーシリーズの比較は、Sシリーズとのグリセロールホルマールが、Hシリーズと比較し、および双方のポリマーシリーズでのDMIと比較して、使用されるポリマーの量の20％より低い損失を有することを示した。これらの結果は、再び二つの溶媒の異なる水混和性によって説明することができ、それは溶媒中のポリマーの異なる溶解性をもたらし、そしてフィルム形成の動態に著しい影響を与えた。双方のシリーズはDMIにおいて容易に溶解可能である一方、Hシリーズに比べて、グリセロールホルマールにおいてSシリーズを溶解させることが困難であった。後者は、強い膨潤挙動を示した。このように、Sシリーズが、グリセロールホルマールにおいて、溶解度の限界に近いシステムを構成したことを想定しなければならない。グリセロールホルマールの良好な水混和性との組み合わせでは、これは、迅速、かつ、完全なフィルム形成をもたらした。
【０１６６】
インシトゥーで形成されたフィルムの粘弾性特性
【０１６７】
動的せん断試験では、フィルムの粘弾性特性を分析した。これに関連して、規定した振幅および周波数を伴う振動せん断応力をサンプルに適用し、そして得られたせん断変形を定め、それは、同様に、振幅および周波数によって特徴付けられ、また、位相シフトと呼ばれた。これらの二つの応答パラメーターは、その後、数学的に、ストレージモジュラスG'およびロスモジュラスG''に変換することができ、ストレージモジュラスは貯蔵を、そして従って導入された動力学的および/または変形エネルギーの再利用可能なシェア（弾性シェア）を特徴付け、およびロスモジュラスは、振動当たりの熱において放出されるエネルギーの尺度であり、そして従ってロスシェア（粘性シェア）を構成する。図3において、双方のモジュラスは、Hシリーズの異なるフィルムについて、1Hzの励起周波数で示される。
【０１６８】
双方のフィルムの弾性および粘性シェアを互いに比較するとき、あるものは異なる溶媒に関する粘弾性特性の異なる感度を認識する。502 Hフィルムの場合には、粘弾性特性を適当な溶媒〔最大ファクター：それぞれ29（G'）、22（G''）〕を選ぶことによって、非常に広範に調整することができる一方、504 Hフィルムは使用する溶媒とは無関係にレオロジー挙動を示した。後者は、マスル繊維（musle fibres）（8から17kPaまで）と比較できる2から4kPaまでの機械的強度を伴って示され[46]、および主に弾性的に支配された（G'/G''）>1の損失係数を伴い、その結果として試験において、これらのフィルムは、ソリッドボディ（固形物）と同様に挙動した。唯一の例外はDMIで、そのインシトゥーでのフィルムは0.85の損失係数により粘性的に支配された。>500μmの厚さを伴い、これらのフィルムは、Resomer(R)RG 502 Hフィルム（DMI：500μm、グリセロールホルマール：600μm、テトラグリコール：800μm）と比較して比較的厚かった。後者は、レオメーターのプレート上に広がり、そして使用する溶媒と無関係に単なる厚さ300μmを示した。
【０１６９】
すべてのResomer(R)RG 502 H系フィルムは、損失係数<1を有し、そしてゲル状の挙動を示し、溶媒の間で強度に有意な差が明らかであった。テトラグリコールでは、Resomer(R)RG 504 Hと比較可能なフィルム強度が0.79の損失係数で達成することができたにすぎない。それぞれ、130および900Paの強さを伴って、DMIおよびグリセロールホルマールはおおよそ比較できるものでさえなく、そしてかなり粘性的に支配された挙動を示した（損失係数>0.5）。
【０１７０】
例6
【０１７１】
インシトゥーで形成されたフィルムの調剤
【０１７２】
既に実行したスプレー試験からの知見に基づき、調剤物を開発し、i）PLGAポリマーで、既に使用した三つの溶媒の一つに溶解したもの、ii）水性相、およびiii）モデル活性薬剤としてプラスミドDNAを含む。理論的には、プラスミドDNAは「ネイキッド（ありのまま）」において、および複合形態においての双方でマトリクスに組み込むことができる。しかしながら、「ネイキッド」のプラスミドDNAは、かなり非効率的に細胞にトランスフェクトされるだけであるので、プラスミドDNAは、フィルムへの埋め込みの前に、l-PEI（N/P比10）と複合体を形成し、そしてナノスケールポリプレックスとしてマトリクス中に組み込まれた。これにより、それは、追加的にマトリクス内でのpHの低下から保護されることが可能であり、それは、マトリクス内でのポリマーのモノマーの放出を通してポリマー構造の分解の間に発生し、そして概して感受性のマクロ分子についての問題を構成する[47]。
【０１７３】
ポリプレックスは、水性相において溶解され[44]、またはPLGA溶液において分散される[28、45]いずれかのマトリクス中に組み込むことができる。しかし、すでに少量の水（約5％）の直接添加がポリマーの沈殿を誘導することができることが、例として、PLGA/テトラグリコールシステムを使用する予備試験において見出されている。したがって、スプレーフィルムの高負荷と共に、高濃度のプラスミドDNA溶液の使用が必要とされ、それはしかし、低い安定性を有し、そして凝集体が形成される傾向がある。したがって、PLGA溶液においてタンパク質調剤物[28、45]に類似した凍結乾燥物としてポリプレックスを分散させること、または使用前に水性相においてそれらを再懸濁することは、有利であった。大抵は、調剤物を次のように構成した。すなわち、
1）親脂性相（1ml）：グリセロールホルマール、テトラグリコールまたはDMI（Resomer(R)RG 502 H、504 H）において10％（m/v）PLGAポリマー
2）親水性相（1ml）：注入用の水
3）活性薬剤：親脂性または親水性相において再懸濁した凍結乾燥ポリプレックス
【０１７４】
粉体形状でのポリプレックスの調製
【０１７５】
製薬産業では、凍結乾燥は、貯蔵の間に調剤物を安定化させるための標準的な方法の一つである。アジュバントマトリクス中に分子を埋め込むことによって、調剤物を乾燥の間に安定化させることができる。乾燥相に応じて、異なるプロテクターを用いることができる。このようにして、寒冷（凍結）保護剤（cryoprotectors）は、凍結プロセスの間に溶液の結晶化を防ぐ。完全な相分離を伴わない過冷却溶融物（undercooled melt）（固化液体、ガラス）としてシステムが固化する。対照的に、リオ（凍結）プロテクター（保護剤）（lyoprotectors）は凍結プロセスのさらなる過程において保護を提供する。それらは、水素ブリッジ（水素結合）の形成下に水に対する活性薬剤の結合を置換する。
【０１７６】
ポリプレックスはまた、寒冷保護剤およびリオプロテクターの追加の下で凍結乾燥することができ、その結果として再懸濁後の凝集体形成を防止することができる[48、49]。凍結乾燥物として、ポリプレックスは良好に貯蔵することができ[48]、そして最大で1mg/mlのプラスミドDNA濃度までの溶液の濃度が可能となる[50]。シュガー（糖）、たとえば、ショ糖またはトレハロースなどのようなものが、リオプロテクターおよび寒冷保護剤として作用し、ポリプレックスを安定化させるのに適していることが見出されている[48、49]。水溶性物質は、それらと同様に、インシトゥーで形成されたPLGA系のフィルムからの高分子活性薬剤の放出をさらに加速することができる。水で満たされた孔は、マトリクス形成の間に、これらの物質の溶解の結果として発達し、その孔を通して、活性薬剤は、その後マトリクスから拡散することができる。同様の効果がマトリクスの高負荷について説明された[27、33]。
【０１７７】
種々のシュガーを標準的基準上で使用される濃度において試験した[48、49]。ポリプレックスは、l-PEIに基づいて、事前の均質化を伴わないで、凍結乾燥した後、注入用の水に再懸濁し、そしてそれらのトランスフェクション効率を、ヒト気管支の上皮細胞上で試験した。良好なトランスフェクション率は、新たに調製されたポリプレックスに比べて10倍の効率向上を有する二糖類のショ糖と共に用いる濃度で達成された。結果を図15に示す。比較可能な値がTalsma（タルスマ）らによってすでに記載された[48]。細胞内への粒子の増加した取込みを導く可能性がある浸透圧効果は、以降、2倍の濃度からとしてだけ期待できた[50]。しかしながら、粒子サイズの測定は、粒子サイズが凍結乾燥後にわずかに増加することを示した。新たに調製した粒子は〜100nmの粒子サイズを有し、その一方では、用いる分散媒に応じ、粒子は凍結乾燥後にPI<0.2乃至200-300nmまで増加した。
【０１７８】
粉体形状にあるポリプレックスを投薬すること、およびそれらを調剤物中に組み込むことができるように、それらを、凍結乾燥後、乳鉢において均質化し、そしてUltra-Turrax（ウルトラ・タラックス）（UT）またはガラスホモジナイザー（H）により、PLGA溶液において分散させる必要がある。注入用の水において均質化後およびその後の再懸濁後にポリプレックスの安定性を、トランスフェクション試験およびアガロースゲル電気泳動を使用して分析した。肺細胞系に対する試験の結果は、均質化によるトランスフェクション効率の変化を示さなかった（図15B）。ヘパラン硫酸の付加の下でプラスミドDNAのトポロジーのコントロールも同様に、注入用の水での凍結乾燥されたポリプレックスの間の差は示されなかった（図7）。
【０１７９】
注入用の水に再懸濁させたサンプル（未処理）、および再懸濁する前に、均質化（乳鉢において磨砕）されていたそれらのポリプレックスは、どちらも、分散の三つのすべての方法（UT、ホモジナイザー、溶解）について同様のバンドパターンを示した。コントロールと比較して、非複合体化プラスミドDNAは、すべての場合において、弛緩した形態のわずかな増加が観察された。注入用の水については、プラスミドDNAの劣化が明らかではなかった。
【０１８０】
一例として、グリセロールホルマールが溶媒として示される。未処理またはプレホモジナイズド（prehomogenized）のサンプルの間、および水コントロールに関して、バンドパターンにおける違いは見出せなかった。分散の方法としてホモジナイザーを用いても、変化はどちらも観察できなかった。Ultra-Turrax（ウルトラ-タラックス）により、pDNAは、主に複合化形式においてゲルのポケットに残っていた。ここでは、未処理のサンプルに対して二つのやや弱いバンドが他のサンプルと比較して検出可能であった。しかしながら、ヘパラン硫酸の同じ量をグリセロールホルマールの影響の下で用いたとき、概してより一層多いpDNAの量が、複合体化形態においてポケット内に残ったことに注目すべきである。均質化したUTサンプルに関して、わずかな汚れがゲルにおいて見られた。しかしながら、ここで再びプラスミドDNAの断片の形態における破壊は観察されなかった。
【０１８１】
例7
【０１８２】
調剤プラスミド-DNAポリプレックスの放出動態の決定
【０１８３】
インプラントからの活性薬剤の放出は、原則として、i）ポリマーマトリクスからの活性薬剤の拡散（拡散律速）に、またはii）マトリクスの浸食〔侵食律速（erosion controlled）〕に由来するかもしれない[51、52]。バルク浸食（bulk-eroding）ポリマーマトリクスからの活性薬剤の放出に関し、PLGAシステムの場合でのように、一または二相放出（two-phase release）プロファイルが、薬物負荷、用いるポリマーのモル質量、およびポリマー濃度に依存して説明される[53、54]。
【０１８４】
加えて、活性薬剤の初期放出は、ポリマーの完全な沈殿までさえも、発生する可能性がある。インシトゥーで形成されたフィルムの放出動態を、ポリマーのモル質量、使用した溶媒、および組込みオプションに依存させることで試験した。以下の組合せを試験した。すなわち、
1．親脂相（1ml）：グリセロールホルマール、テトラグリコール、またはDMIに溶解したResomer(R)RG 502 Hまたは504 H 10％（m/v）
2．親水性相（1ml）：注入用の水
3．活性薬剤：均質化された形態における凍結乾燥ポリプレックス（l-PEI/pDNA）
【０１８５】
凍結乾燥後、ポリプレックスを乳鉢において均質化し、そして親水相において再懸濁させる（組込みオプションA）か、または親脂性PLGA溶液においてホモジナイザーにより分散させる（組込みオプションB）かのどちらかを行った。異なる溶媒を用いる双方の組込みオプションの放出プロファイルを、Resomers(R)RG 502 Hおよび504 Hについて、図6において示す。
【０１８６】
図形（ダイアグラム）は次の、ダイアグラム（A）：Resomer(R)RG 502 H、親水性相におけるポリプレックス；ダイアグラム（B）：Resomer(R)RG 502 H、親脂性相におけるポリプレックス；ダイアグラム（C）：Resomer(R)RG 504 H、親水性相におけるポリプレックス：ダイアグラム（D）： Resomer(R)RG 504 H、親脂性相におけるポリプレックスを示す。
【０１８７】
親水性相において溶解することによるフィルム中へのポリプレックスの組込みを初めて見たとき、あるものは明らかに、使用されるポリマーの、および使用される溶媒のモル質量の放出動態への重要な影響を見ることができる（図6C）。短鎖ポリマーResomer(R)RG 502 Hとの組合せにおいて、溶媒としてDMIを用いることでは、活性薬剤は組み込まれなかった（図6A）。すでに、ポリマーの沈殿の間に、ポリプレックスの100％が放出された。しかしながら、長鎖ポリマー、Resomer(R)RG 504 Hを用いることにより、典型的な二相放出プロセスが達成された。これは、初期の拡散律速放出（相1、凹状放出プロファイル）、次いで侵食律速放出（相2、線形動力学）を含んだ（図6C）。これに関連して、DMIがすべてのケースで使用されたとき、最も高い初期放出が達成され、それは、組込みオプションおよびポリマーの鎖長に依存して10％からビス100％で変動したことが顕著であった。
【０１８８】
対照的に、グリセロールホルマールは、低い初期放出、次いで遅い拡散律速放出が続くことを示した。唯一、マトリクス侵食が侵食し始めると、ポリプレックスの加速された放出が観察され、それは、使用されるポリマーの鎖長に応じて、それぞれ、15および26日後に開始した。しかし、テトラグリコールをベースとするフィルムは、それぞれ、32％（Resomer(R)RG 502 H）および50％（Resomer(R)RG 504 H）び中程度の初期放出後、観察された時間枠における中等度からゼロまでの放出を示した。単に、長鎖ポリマーの場合、マトリクスの侵食による26日後に低放出があった（図6C）。
【０１８９】
しかし、ポリプレックスが、親脂性のPLGA溶液において分散されたとき（組込みオプションB）、ポリプレックスの初期放出速度およびマトリクスからの拡散は、すべてのポリマー/溶媒の組合せについて減少し、そして放出は、主に侵食律速を進行した（図6B、D）。試験溶媒は、違った強い遅滞を有する類似の放出曲線を示し、放出速度は、次の順序で増加し、すなわち、テトラグリコール<<グリセロールホルマール<DMI。DMIおよびグリセロールホルマールの放出プロファイルは、明らかに、短鎖502Hポリマーについて、長鎖504 Hポリマーよりも短い侵食速度を示した一方（17日対29日）、テトラグリコールのケースでは、マトリクスの強い遅滞により、ポリマー間に差は観察することができなかった（5.4％対8.8％の30日後累積放出）。
【０１９０】
要約すると、DMIは、長鎖または短鎖ポリマーおよび種々の組込みオプションのすべての組合せについて最速の放出を示した。活性薬剤の100％放出までの連続的な放出は、親水相中に活性薬剤を組み込むことによってResomer(R)RG 504 Hにより達成することができた。テトラグリコール系フィルムに組み込まれたポリプレックスは、拡散律速放出を示さなかった。時間の観察期間にわたり、初期放出後、追加的に最大で14％までのpDNAの量を放出することができ、初期放出は0および48％の間で変化した。組込みオプションAの場合には、それは比較的高く、その一方、ポリプレックスが親脂性相に分散するとき、初期放出は観察されなかった。グリセロールホルマールに基づいたフィルムは、埋め込み方法とは無関係に、低初期放出を示したが、しかし、これらのフィルムが使用された場合でも、ポリプレックスは、マトリクス侵食によって23日後に放出されることができただけである。
【０１９１】
例8
【０１９２】
インビトロでのトランスフェクション効率の分析
【０１９３】
まず、上述したように、インビトロ放出プロファイルを、レポーター遺伝子ルシフェラーゼを使用することにより定めた。これらのデータおよび剤形の必要条件に基づき、溶媒としてDMIと組み合わせたポリマーのResomer(R)RG 504 Hを、フィルムのために選定した。双方の活性薬剤は、マトリクスの親水性相中に凍結乾燥された形態で組み込まれることになった。予備試験から、55％の活性薬剤の初期放出が予想された。このことは、非常によく、手術後の急性期（日2乃至5）をカバーするために、術後癒着の分野での適用について理にかなうことができる[79-81]。しかし、ここでのtPA濃度における非生理的な増加は、腹膜における出血のリスクの増加の理由で、避けるべきである。代わりに、初期放出を伴わないフィルムを、Resomer(R)504 Hおよびグリセロールホルマールから構成して試験した。ここで再び、ポリプレックスを、親水性相において溶解した。調剤物は、最初、活性薬剤1を用いてインビトロで分析し、それを、l-PEIと複合体化し、そして10％ショ糖の添加の下で凍結乾燥した。追加的に、細胞によって分泌されるルシフェラーゼ酵素をコードするpMetLucプラスミドが、コントロールとして1：1混合物において使用された。
【０１９４】
細胞アッセイにおけるインビトロ試験のために、中皮細胞（Met5A）を、インサート上で増殖させ、そして続いてポリマーフィルムを細胞層上に噴霧した。インサートの使用は、腹膜においてインシトゥーでの解剖学的構造に匹敵する外側および内側のコンパーティメント（compartiment）を有する二つのチャンバーシステム中にウェルのパーティションを可能にし、その間で物質の一定の交換が可能であり、その結果として、細胞を、先端および側底側から培地と共に供給することができる。細胞形態は、光学的に、光学顕微鏡により制御されたが、フィルム上に噴霧することにより困難にされた。レポーター遺伝子ルシフェラーゼの発現は、双方の区画において30日間にわたってインサートを用いることで分析することができた。
【０１９５】
図10は上側区画を示す。ボーラス投与と比較して、全体プラスミドDNA用量が放出システムを伴わない注入用の水に適用され、インシトゥーで形成されたフィルムは、103から104の係数だけ低いルシフェラーゼレベルを示した。遺伝子発現は上述のように進行した。放出動態に関するこれらの研究では、DMIベースでのフィルムは、使用されるのpDNA量の56％の初期放出を示し、そして、更なる過程で、日26まで、さらに38％の放出を示した。この放出プロファイルに続いて、DMIベースでのフィルムについて、遺伝子発現の増加が、2日後にすでに観察され、それはさらに7日後、基礎的な値に低下し、23日まで再び値を緩和するために増加した。対照的に、グリセロールホルマールを溶媒として使用したとき、遺伝子発現は、ポリプレックスの初期放出を伴わずに、二つの相において発生した。最初の10日での発現率の第一の穏やかな増加の後、二倍増加した遺伝子発現のさらなる最大量を、23日後に観察することができた。細胞培養培地において低分子断片が開始侵食（beginning erosion）を示した。
【０１９６】
グリセロールホルマールおよびResomer(R)RG 504 Hを含むマトリクスからのtPA発現は、単一用量と、および活性薬剤を伴わないフィルム（非アクティブフィルム）と比較して、図10Aに示す。ルシフェラーゼ発現と同様に、デポーシステムを伴わない活性薬剤の単一用量は、29日の期間にわたって、基底値と比較して、tPA濃度の100乃至40倍増加を伴って、極めて高いタンパク質レベルを生じさせた。同様の濃度は、血しょうでの組換えtPA（アルテプラーゼ）の腹膜内投与後に達成された[82]。それゆえ、マトリクス調剤物によって達成することができる値は、生理的条件に非常に近いと考えられる。血しょうおよび腹水について、4から6ng/mlまでの遊離のtPA抗原濃度が説明されており[82-84]、および追加的に1.3ng/mlの平均値のtPAはPAI-1に結合される[84]。これらの値が既に、不活性フィルムを適用することによってわずかに増加し、放出の開始時に、活性膜を介して（埋め込まれた活性薬剤により）、不活性フィルムに比べて4倍の増加が達成されたことは驚くべきことである。効果は16日目まで同等になり、そして2ng/mlのtPAのレベルは基底値に低下した。このことはおそらく、15日までに、ほとんどこれ以上のポリプレックスがマトリックスから放出されることができなかったという事実のためである（章7.3を参照）。試験の終了時に、マトリクスは完全には侵食されず、その結果、埋め込まれたポリプレックスは溶射膜において検出することができた（図10B）。
【０１９７】
例9
【０１９８】
siRNAおよびpDNAの同時適用を通した組織プラスミノーゲン濃度での増加
【０１９９】
tPAをコードするプラスミドの適用によっての細胞外tPAの濃度における増加は、中皮細胞上に好首尾に示すことができた。tPA/PAI-1比での増加がどの程度まで（Inhowfar）、PAI-1に対するsiRNAの同時適用によって達成することができるかは、以下において分析されるであろう。
【０２００】
先の研究は、l-PEIがsiRNAおよびプラスミドDNAのインビボ（生体内）適用に主に適していることを示していた[23]。したがって、pDNA/siRNA/l-PEIポリプレックスを 10のN/P比（pDNA濃度に基づいて）でHBSにおいて調製し、そしてPAI-1に対する異なるsiRNA配列を試験した。異なるpDNA/siRNAの組合せによるtPA/PAI-1比を図11に示す。用いたsiRNA配列は、予備試験におけるPAI-1の発現（PAI-1A）を、0.12μMの最適化された濃度で最も効率的に抑制したものであった。トランスフェクション後の48時間、同時適用によるtPA/PAI-1比率は、未処理細胞と比較して8倍だけ増加した。pDNA単独での、または非機能的siRNA（EGFP siRNA）との組合せでの適用を通して、単に4倍および5倍の増加を、それぞれ達成することができた。コントロールプラスミド（pUC）を使用するとき、siRNAがtPA/PAI-1比の2倍だけの増加を引き起こしたことが見出された。
【０２０１】
例10
【０２０２】
ポリプレックスの制御された放出のためにインシトゥーで形成されたフィルムの開発を、図8に示すように、企業Baxter（バクスター）からのアプリケーションシステムに基づいて行った。この目的のために、二つのシリンジシステムに、親脂性成分（シリンジ1）で、有機溶媒中に溶解した生分解性ポリマーを含むもの、および水性成分（シリンジ2）で、注射用の水のものを装填した。凍結乾燥したpDNA/l-PEIポリプレックスを活性薬剤として使用した。これらは、その後、親脂性相に分散または親水性相中に溶解することができた。双方の組込みオプションを、放出動態に関して上記のように分析した。
【０２０３】
例11
【０２０４】
細胞生存率試験において、グリセロールホルマールは中皮細胞上で最良の適合性を示した。ここでは、LD50は、DMIおよびテトラグリコールと比べて、それぞれ、200および400倍高い値が測定された。6時間より少ないインキュベーション期間で、これらは約1g/mlにあり、すなわち、約780μlの純粋なグリセロールホルマールを用いたとき、中皮細胞の50％が死んだ。文献データは、げっ歯類動物におけるi.v.投与後、DMIおよびグリセロールホルマールについての同等のLD50値を明らかにし、その一方で、テトラグリコールは2から3倍より一層毒性である。Ivomec(R)、抗寄生虫動物用医薬品に関する製造者の情報から、50％グリセロールホルマール溶液のi.v.適用の際には4から4.8g/kg体重（マウス）までのLD50を導き出すことができる。これは、EMAが、the Committee for Veterinary Products（欧州動物用医薬品委員会）の概略レポートで説明したものと同様である[85]。DMIのi.v.投与後の急性毒性は最小限しかグリセロールホルマールとは異ならない。等張塩類溶液における40％DMI（v/v）の適用による5.4g/kg体重（ラット）のLD50および20％溶液の適用による6.9g/kg体重（マウス）のLD50を伴って、DMIは、i.v.投与後に、より一層良好に許容されると考えられる。すでに六十年代以降、テトラグリコールが最大で50％（v/v）までの濃度において、溶媒として、非経口（i.v.、i.m.）のために使用されており、そしてこの希釈では、非刺激性として分類される。希釈を伴わないi.v.投与後LD50は、他の二つの溶媒のために説明したよりも低い3.8g/kg体重（マウス）にある[86]。
【０２０５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月29日(2014.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
すなわち、
y=最小+[(最大-最小)/(1+(x/EC50)Hill slope)]
【国際調査報告】
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