(57)【要約】  モグロシド化合物の酵素的合成のための方法および材料を記載する。
2014533518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モグロシド化合物を生産する方法であって、モグロシド化合物を生産するために、モグロールをウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）とともにインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項２】
モグロシド化合物が、モグロシドＩａである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モグロシド化合物が、モグロシドＩｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
モグロシド化合物が、Ｃ２５−ＯＨでグリコシル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＵＧＴが、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
モグロシド化合物を生産する方法であって、モグロシド化合物を生産するために、モグロールを、ＵＧＴを発現する組み換え宿主から調製された細胞溶解物に接触させることを含む、前記方法。
【請求項７】
モグロシド化合物が、モグロシドＩａである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
モグロシド化合物が、モグロシドＩｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
モグロシド化合物が、Ｃ２５−ＯＨでグリコシル化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＵＧＴが、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月２３日に出願された米国第61/563,303号の優先権を主張するものであり、参照によりその全開示が組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、モグロシド化合物の酵素的合成のための方法および材料に関し、より詳細には、様々なモグロシド化合物を生産するために、ウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を使用して、モグロールをグリコシル化することに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
モグロシドは、Momordica grosvenori（Swingle）としても知られているSiraitia grosvenorii（Swingle）の果実から単離されたトリテルペン配糖体のファミリーである。その果実の抽出物は、天然甘味料として商業的に使用される。４つの主要な化合物であるモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩおよび１１−オキソモグロシドＶは、Siraitia grosvenorii（Swingle）の果実から同定され、その果実の甘さの原因となっている。図１を参照。モグロシドＶは、乾果の約０．５７％（ｗ／ｗ）で、これら４つの化合物のうち最も豊富にあり、モグロシドＩＶおよびシアメノシドＩがこれに続き、夫々が４つのグルコース部分を含む。１１−オキソモグロシドＶは、Ｃ−１１に、ヒドロキシルの代わりにケトン基を有する。例えば、Takemoto, et al., Yakugaku Zasshi, 103, 1151-1154；1155-1166; 1167-1173, (1983)；Kasai, et al., Agric. Biol. Chem. 53, 3347-3349 (1989)；Matsumoto, Chem. Pharm. Bull. 38, 2030-2032 (1990)；およびPrakash, et al., J. Carbohydrate Chem. 30, 16-26 (2011) を参照。
【０００４】
全てのモグロシドは、モグロールと名付けられた同じトリテルペン母核を共有する。アグリコンであるモグロールは、様々なモグロシド化合物を形成するために、異なる個数のグルコース部分によりグリコシル化される。モグロシドは、以下のやり方で合成されるものと考えられる：共通のトリテルペン前駆体であるスクアレンからのククルビタジエノールの合成；アグリコンであるモグロールを生産するためのククルビタジエノールのＰ４５０酸化；および、モグロシドＶを生産するために、５個のグルコースを次々に加えるモグロールのグリコシル化。Tang, et al., BMC Genomics, 12, 343 (2011) を参照。ククルビタジエノールとモグロールとの両者の中間体は、微量な生産物として、それらが単離される果実中に存在する。Ukiya, et al., J. Agric. Food Chem. 50, 6710-6715 (2002) を参照。配糖体の中間体は、１１−ヒドロキシと１１−オキソとの両系列に存在し、果実が成熟するにつれ、モグロシドＩからモグロシドＶに徐々に変化する。これは、トリテルペン母核が、続くグリコシル化の前に、Ｐ４５０酵素により完全に酸化されることを意味する。しかしながら、モグロシドを生産する原因となるその酵素は同定されていない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
一側面において、この文書は、モグロシド化合物を生産する方法を取り上げるものである。本方法は、モグロシド化合物（例えば、モグロシドＩａ、モグロシドＩｂまたはＣ２５−Ｈでグリコシル化されたモグロシド化合物）を生産するため、モグロールをウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）とともにインキュベートすることを含む。ＵＧＴは、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択され得る。ＵＧＴは、組み換えで生産され得るか、または組み換え宿主の細胞溶解物中にあり得る。
【０００６】
本文書はまた、モグロシド化合物を生産する方法も取り上げるものである。本方法は、モグロシド化合物（例えば、モグロシドＩａ、モグロシドＩｂまたはＣ２５−ＯＨでグリコシル化されたモグロシド化合物）を生産するため、モグロールを、ＵＧＴを発現する組み換え宿主から調製された細胞溶解物に接触させることを含む。ＵＧＴは、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択され得る。
【０００７】
別段の定めがない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の、または等価な方法および材料が本発明を実施するのに使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載されている。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、参照によりそれら全体が組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、支配するものである。加えて、本材料、本方法および本例は、一例に過ぎず、限定することを意図していない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかであろう。出願人は、特許法の標準的な実務に従い、移行句である「含む」、「本質的にからなる」または「からなる」を使用し、開示されたいずれの発明も択一的に主張する権利を保有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の説明
【図１】図１は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩおよび１１−オキソモグロシドＶの化学構造を含む。
【０００９】
【図２】図２には、ＵＧＴを使用する、モグロールからのモグロシドＩａおよびモグロシドＩｂの生合成が描かれている。
【００１０】
【図３−１】図３−１は、以下のＵＧＴ：ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ５、ＵＧＴ７３Ｃ６、ＵＧＴ７３Ｅ１およびＵＧＴ８５Ｃ２のアミノ酸配列（夫々、配列番号１〜５）を含む。
【図３−２】図３−２は、以下のＵＧＴ：ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ５、ＵＧＴ７３Ｃ６、ＵＧＴ７３Ｅ１およびＵＧＴ８５Ｃ２のアミノ酸配列（夫々、配列番号１〜５）を含む。
【００１１】
【図４】図４は、ペクチナーゼおよび／またはセルラーゼとともにインキュベートした後、モグロシドＶから得られる生産物の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
この文書は、１または２以上のウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を使用するモグロールのグルコシル化のための方法および材料を提供する。以下に示すとおり、アグリコンであるモグロールをグリコシル化する少なくとも５つのＵＧＴが同定された。図２を参照。本明細書において同定されたＵＧＴの夫々は、グリコシルトランスフェラーゼファミリーＩに入るものである。ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２および７３Ｅ１は、Ｃ２４−ＯＨの位置でグリコシル化する（図２中、ＵＧＴ＃２）が、ＵＧＴ７３Ｃ５は、Ｃ３−ＯＨ（図２中、ＵＧＴ＃１）とＣ２４−ＯＨ（ＵＧＴ＃２）との両位置でグリコシル化する。ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ５および７３Ｃ６は、Arabidopsis thalianaに由来する。ＵＧＴの７３Ｅ１および８５Ｃ２は、Stevia rebaudianaに由来する。ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ５、７３Ｃ６、７３Ｅ１および８５Ｃ２のアミノ酸配列（配列番号１〜５）は、図３に記載されている。
【００１３】
本明細書に記載のＵＧＴポリペプチドは、任意の好適な方法を使用して生産され得る。例えば、ＵＧＴポリペプチドは、化学合成により生産され得る。代わりに、本明細書に記載のＵＧＴポリペプチドは、そのＵＧＴポリペプチドをコードする異種発現ベクターを使用する標準的な組み換え技術により生産され得る。発現ベクターは、コードされたポリペプチドの発現のために、（例えば、形質転換またはトランスフェクションにより）宿主細胞に導入され得る。ＵＧＴポリペプチドの小規模または大規模の生産のために使用され得る発現システムは、制限されることなく、本明細書に記載の核酸分子を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターにより形質転換された細菌（例えばE. coli および B. subtilis）等の微生物を含む。有用な発現システムはまた、本明細書に記載の核酸分子を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染された昆虫細胞システム、および、本明細書に記載の核酸分子を含む、組み換えウイルス発現ベクター（例えばタバコモザイクウイルス）により感染されたか、または、組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された、植物細胞システムも含む。ＵＧＴポリペプチドはまた、本明細書に記載の核酸の他に、哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインのプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルスの後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスのプロモーター）に由来するプロモーターを含む組み換え発現構築物を持つ哺乳動物発現システムを使用しても生産され得る。ＵＧＴポリペプチドは、後述するようなＮ末端またはＣ末端のタグを有し得る。
【００１４】
この文書はまた、ＵＧＴポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。「単離された核酸」は、ゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸を指し、ゲノム中の該核酸の片側または両側に通常隣接する核酸も含む。本明細書に使用される「単離される」という用語はまた、核酸に関して、非天然起源の核酸配列のいずれも含む。それは、かかる非天然起源の配列は、自然界に見出されず、天然起源のゲノムにおいて直に近接する配列を有さないからである。
【００１５】
単離された核酸は、例えば、天然起源のゲノム中、ＤＮＡ分子と直に隣接することが通常見出された核酸配列の１つが除去されたか、またはないならば、そのＤＮＡ分子であり得る。よって、単離された核酸は、制限することなく、ベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、パラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれか）または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれたＤＮＡと同様、他の配列と独立して、分離された分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限酵素処置により生産されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在するＤＮＡ分子を含む。加えて、単離された核酸は、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部であるＤＮＡ分子等の人工的な核酸を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリもしくはゲノムライブラリ、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲル薄片の中の、数百から数百万の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸とは見なされない。
【００１６】
いくつかの態様において、ＵＧＴポリペプチドをコードする核酸配列は、その後の操作を容易にする（例えば精製または検出を容易にする）か、コードされたポリペプチドの分泌または局在化を容易にするために設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされたタグがＵＧＴポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置付けられるように、ＵＧＴポリペプチドをコードする核酸配列に挿入され得る。コードされたタグの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳタグおよびＦｌａｇ（商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）が挙げられる。タグの他の例としては、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチドまたは分泌タグが挙げられる。
【００１７】
機能相同体
先に記載のポリペプチドの機能相同体もまた、本明細書に記載の方法および組み換え宿主における使用に好適である。機能相同体は、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、参照ペプチドの生化学的または生理学的な機能の１または２以上を達成するポリペプチドである。機能相同体および参照ポリペプチドは、天然起源のポリペプチドであってもよく、配列類似性は、収束進化的または分岐進化的な事象に起因しもよい。機能相同体それ自体は、文献において、時に、相同体またはオルソログまたはパラログと指定される。野生型コード配列の突然変異体にコードされるポリペプチド等の天然起源の機能相同体のバリアントは、それら自体が、機能相同体であってもよい。機能相同体はまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘発を介するか、または異なる天然起源のポリペプチドのコード配列に由来するドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によっても、創出され得る。本明細書に記載の機能ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を修飾するための技術は、知られており、とりわけ、定向進化技術、部位特異的突然変異誘発技術およびランダム突然変異誘発技術を含むものであり、ポリペプチドの特定の活性を増大し、基質特異性を変え、発現レベルを変え、細胞内位置を変え、または、所望のやり方でポリペプチド：ポリペプチド相互作用を修飾するのに有用であり得る。かかる修飾ポリペプチドは、機能相同体と見なされる。「機能相同体」という用語は、時には、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【００１８】
機能相同体は、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アライメントの分析により同定され得る。例えば、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のデータベース上でクエリを実行することによって、ＵＧＴポリペプチドの相同体が同定され得る。配列分析は、参照配列としてＵＧＴアミノ酸配列を使用する、非重複のデータベースBLAST、Reciprocal BLASTまたはPSI-BLASTの分析を含み得る。アミノ酸配列は、場合によっては、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有するデータベース中のそれらのポリペプチドは、ＵＧＴポリペプチドとして好適な、さらなる評価のための候補である。アミノ酸配列の類似性は、１つの疎水性残基の他への置換または１つの極性残基の他への置換等の保存的アミノ酸の置換を可能にする。所望する場合、さらなる評価のために候補の数を絞るため、かかる候補の手検測が行われ得る。手検測は、ＵＧＴポリペプチド中に存在するドメイン、例えば保存的機能ドメインを有するように見えるそれらの候補を選択することによって実行され得る。
【００１９】
保存的領域は、繰り返し配列であるか、二次構造（例えばへリックスおよびベータシート）を形成するか、正もしくは負に帯電したドメインを確立するか、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す、ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域を位置付けることによって同定され得る。例えば、ワールドワイドウェブ上の様々なタンパク質モチーフおよびドメインのためのコンセンサス配列を記載するウェブサイトPfam（sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/）を参照。Pfamデータベースに含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999) に記載されている。保存的領域もまた、近縁種と同じか、または関連するポリペプチドの配列をアライメントさせることによって決定され得る。近縁種は、好ましくは、同じファミリー由来である。いくつかの態様において、２つの異なる種に由来する配列のアライメントが適する。
【００２０】
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を呈するポリペプチドが、保存的領域を同定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存的領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を呈する。いくつかの態様において、保存的領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を呈する。配列同一性は、前記のとおりに決定され得る。
【００２１】
モグロシド化合物を生産する方法
モグロシド化合物は、モグロール基質を、本明細書に記載のＵＧＴポリペプチドの１または２以上とともにインキュベートし、その結果モグロシド生産物が生産されることによって生産され得る。いくつかの態様において、複数のグリコシル化が反応槽中で起こるように、反応混合物は、複数のＵＧＴポリペプチドを含む。他の態様において、反応混合物は、単一のＵＧＴポリペプチドを含み、そのポリペプチドによって触媒される１または２以上のグリコシル化が起こる。例えば、第１の反応槽は、中間体を生産するための基質および１または２以上のＵＧＴポリペプチドを含み得、該中間体は、次の中間体またはモグロシド生産物を生産するため、１または２以上の他のＵＧＴポリペプチドを含む第２の反応槽の中に導入され得る。第２の反応槽中で生産された生産物は、その後、回収され得る。
【００２２】
ＵＧＴポリペプチドの夫々は、精製されたポリペプチドであり得、例えば、所望のＵＧＴを重量で８０％、９０％、９５％または９９％超含む溶液として反応混合物に加え得る。代わりに、ＵＧＴポリペプチドは、ＵＧＴを発現する組み換え宿主から調製される細胞溶解物中に存在し得、モグロール基質とのインキュベートのために、細胞溶解物として反応混合物に加え得る。
【００２３】
生産物、基質および中間体のレベルは、公開された方法に従い、分析のための反応槽から試料を抽出することによって決定され得る。モグロシド化合物は、当該技術分野において知られている様々な技術を使用して反応槽から回収され得る。
本発明を以下の例においてさらに説明するが、当該例は、クレームに記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【００２４】
例
例１−モグロシドＶの精製
モグロシドＶを、以下のようにして、市販のモンク(monk)果実抽出物（PureLo(登録商標), Swanson）から精製した。３つの瓶のPureLo(登録商標)（２４０グラム）を水（９００ｍＬ）に溶解した後、HP-20レジン（４００グラムのレジン）のカラムにロードした。カラムを水（２．５リットル）で洗浄し；その後、さらに２０％メタノール−水で洗浄した。生産物をメタノールで溶出した。溶媒を蒸発後、高真空下で乾燥させ、モグロシドＶ（２．５グラム、〜８０％の純度、１１−オキソモグロシドＶが主な不純物であった）を得た。
【００２５】
例２−モグロシドＶからモグロールの酵素的合成
モグロシドＶ（３００ｍｇ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、１００ｍＬ）に溶解し、Aspergillus niger由来の粗ペクチナーゼ（２５ｍＬ、Sigma P2736）を加えた。混合物を５０℃で４８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した（２×１００ｍｌ）。有機抽出物を、真空下で乾燥させた後、分取ＨＰＬＣで精製した。純モグロール（４０ｍｇ）を得、その構造をＮＭＲと質量分析で確認した。図４を参照。
【００２６】
例３−モグロシドＶからの、モグロール３−Ｏ−グルコシド（モグロシドＩａ）およびモグロール２４−Ｏ−グルコシド（モグロシドＩｂ）の酵素的合成
モグロシドＶ（３００ｍｇ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、１００ｍｌ）に溶解し、Aspergillus niger由来の粗ペクチナーゼ（２５ｍｌ、Sigma P2736）を加えた。混合物を５０℃で６．５時間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチルで抽出した（２×１００ｍｌ）。有機抽出物を真空下で乾燥させた後、分取ＨＰＬＣで精製した。純モグロシドＩａ（１１．０ｍｇ）およびモグロシドＩｂ（８．０ｍｇ）を得た。それらの構造は、ＮＭＲと質量分析により確認した。図４を参照。
【００２７】
例４−in vitroでのＵＧＴのスクリーニングおよび反応
２３０のＵＧＴ酵素の一団によるモグロールのin vitroでの反応を実行し、生産物をＬＣ−ＭＳで分析した。in vitroでのＵＧＴ反応混合物には、４×Ｔｒｉｓ緩衝液、モグロール（２５０μＭ）、ＵＤＰ−グルコース（７５０μＭ）および１％アルカリホスファターゼが含まれた。部分的に精製されたＵＧＴ酵素または粗酵素の各５μｌを反応物に加え、反応体積を水で５０μｌにした。反応物を３０℃で終夜インキュベートし、滅菌された９６ウェルプレート中で実行した。インキュベート後、２５μＬのＤＭＳＯを各反応物に加え、反応プレートを５分間遠心分離した。４０μＬの試料を各ウェルから取り、濾過し、ＬＣ−ＭＳ分析用に使用した。
【００２８】
ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ６および８５Ｃ２は、全てのモグロール基質をモグロシドＩｂへ変換したことが見出された。ＵＧＴ７３Ｃ５は、モグロシドＩａおよびＩｂの両者を生成する。ＵＧＴ７３Ｅ１による反応において、該反応が完了しなかったにもかかわらず、新規のグリコシル化モグロール（モグロシドＩａでもＩｂでもなく；正確な質量からモグロシドＩであることが示され、好ましくはＣ２５−ＯＨ上のグリコシル化事象に起因する）と一緒にモグロシドＩｂが主要な生産物として見出された。
【００２９】
他の態様
本発明がその詳細な説明と併せて記載されているが、このような記載は説明することを意図し、添付のクレームの範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。他の側面、利点および修飾は、以下のクレームの範囲内である。
【図１】
2014533518.tif 000003
【図２】
2014533518.tif 000004
【図３−１】
2014533518.tif 000005
【図３−２】
2014533518.tif 000006
【図４】
2014533518.tif 000007
【配列表】
2014533518000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月23日(2013.9.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モグロシド化合物を生産する方法であって、該方法は、モグロシド化合物を生産するために、モグロールをウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）とともにインキュベートすることを含み、ここで該ＵＧＴが、Arabidopsis thalianaもしくはStevia rebaudianaのＵＧＴまたはその機能的相同体である、前記方法。
【請求項２】
モグロシド化合物が、モグロシドＩａである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モグロシド化合物が、モグロシドＩｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
モグロシド化合物が、Ｃ２５−ＯＨでグリコシル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＵＧＴが、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
モグロシド化合物を生産する方法であって、該方法は、モグロシド化合物を生産するために、モグロールを、ＵＧＴを発現する組み換え宿主から調製された細胞溶解物に接触させることを含み、ここで該ＵＧＴが、Arabidopsis thalianaもしくはStevia rebaudianaのＵＧＴまたはその機能的相同体である、前記方法。
【請求項７】
モグロシド化合物が、モグロシドＩａである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
モグロシド化合物が、モグロシドＩｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
モグロシド化合物が、Ｃ２５−ＯＨでグリコシル化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＵＧＴが、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ＵＧＴが、７３Ｃ３、７３Ｃ６および８５Ｃ２からなる群から選択され、モグロシド化合物が、モグロシドＩｂである、請求項１または６に記載の方法。
【請求項１２】
ＵＧＴが、ＵＧＴ７３Ｃ５であり、モグロシド化合物が、モグロシドＩａおよびモグロシドＩｂからなる群から選択される、請求項１または６に記載の方法。
【請求項１３】
ＵＧＴが、ＵＧＴ７３Ｅ１であり、モグロシド化合物が、Ｃ２５−ＯＨでグリコシル化される、請求項１または６に記載の方法。
【国際調査報告】
2014533518.tif 000008
2014533518.tif 000009
2014533518.tif 000010
2014533518.tif 000011