(57)【要約】本発明は、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の薬理学的に有効および／または安定な変異体、ＦＧＦ２１変異体を含む医薬組成物、ならびにそのような変異体を使用して、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせを治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ（配列番号１）
である、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の変異体を、それを必要とする患者に投与することを含む、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせを治療する方法。
【請求項４】
治療に使用するための請求項１に記載の変異体。
【請求項５】
２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、あるいはそれらの任意の組み合わせの治療に使用するための請求項１に記載の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の変異体、ＦＧＦ２１変異体を含む医薬組成物、および２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドロームまたはそれらの任意の組み合わせを治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＧＦ２１はグルコースおよび脂質恒常性の重要な代謝調節因子として機能するホルモンである。ＦＧＦ２１は、インスリンのものと異なる機構である、ＧＬＵＴ１発現を上方制御することにより脂質細胞においてグルコース取り込みを促進する。糖尿病の齧歯動物およびサルにおいて、ヒトＦＧＦ２１は、グルコースの空腹時血清濃度を低下させ、トリグリセリド、インスリンおよびグルカゴンの空腹時血清濃度を減少させる。さらに、食餌性肥満の齧歯動物モデルにおいて、ＦＧＦ２１の投与は用量依存的に累積的な体重損失を導いた。したがって、ＦＧＦ２１は、糖尿病、肥満、脂質異常症、およびメタボリックシンドロームの治療についての潜在的有用性を有する。
【０００３】
ヒトＦＧＦ２１の変異体は、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６５４３９号
【特許文献２】国際公開第２００６／０２８５９５号
【特許文献３】国際公開第２００５／０６１７１２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒト野生型ＦＧＦ２１および公知のヒトＦＧＦ２１の変異体に関する問題は、分子の低い薬理学的効果および／または薬学的安定性である。したがって、有効および／または安定である代替のＦＧＦ２１変異体についての必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒト野生型ＦＧＦ２１および当該技術分野において開示される公知のヒトＦＧＦ２１の変異体より利点を有するヒトＦＧＦ２１の代替の変異体を提供する。これらの利点は、改善された薬理学的効果および／または改善された薬学的安定性を含む。本発明の特定のＦＧＦ２１変異体は、インビボでの低いタンパク質分解、酸化に対する低い感受性、高濃度で凝集する低い傾向、哺乳動物細胞系における産生後の低いレベルの翻訳後修飾、特定の保存剤との高い適合性、および／または改善された化学的安定性を含む、治療用タンパク質として効果的に製造および／または処方するのに有用である１つ以上の有益な生理学的特徴を有する。さらに、本発明のＦＧＦ２１変異体は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドロームまたはそれらの任意の組み合わせの治療に潜在的に有用である。
【０００７】
本発明は、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の変異体であって、そのアミノ酸配列は、
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ１ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＸ２ＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＸ３Ｘ４ＬＶＸ５ＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ（配列番号１３）
であり、ここで、Ｘ１はＬまたはＤであり、Ｘ２はＰまたはＷであり、Ｘ３はＬまたはＹであり、Ｘ４はＳまたはＲであり、Ｘ５はＧまたはＥである、変異体を提供する。
【０００８】
本発明は、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の変異体であって、そのアミノ酸配列は、
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ（配列番号１）
である、変異体を提供する。
【０００９】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明のヒトＦＧＦ２１の変異体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、任意の他の治療成分とを含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明のヒトＦＧＦ２１の変異体を、患者に投与することを含む、患者における２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせを治療する方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者における２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせを治療する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、治療に使用するための、本明細書に記載される本発明のヒトＦＧＦ２１の変異体を提供する。好ましくは、本発明は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせの治療に使用するための、本明細書に記載される本発明のヒトＦＧＦ２１の変異体を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせを治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される本発明のヒトＦＧＦ２１の変異体の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
完全長ヒト野生型ＦＧＦ２１は２７個のアミノ酸シグナルペプチドを含有する２０８個のアミノ酸ポリペプチドである。成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１は２７個のアミノ酸シグナルペプチドを有さない完全長ポリペプチドを含み、１８１個のアミノ酸ポリペプチド（配列番号２）が得られる。本発明のＦＧＦ２１変異体のアミノ酸位置の変化は成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１（配列番号２）のポリペプチドにおけるアミノ酸位置から決定される。このように、「Ａ３１Ｃ」として本明細書に記載される置換は、成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１タンパク質の３１位における野生型アミノ酸Ａｌａについてのアミノ酸Ｃｙｓの置換を指す。
【００１５】
特定の変異体における１つのアミノ酸残基の置換は全体として変異体の特性に影響を与え得ること、ならびに全体的効果は、薬理学的効果および／または薬学的安定性に有益または有害になり得ることを留意することが重要である。例えば、１つのアミノ酸置換、Ｐ１１５Ｗは、ＦＧＦ２１変異体の有効性を増加するが、Ｐ１１５Ｗはまた、凝集を引き起こす自己相互作用の原因となると考えられる（実施例５を参照のこと）。したがって、全体的効果は変異体に有害となるので、置換Ｐ１１５Ｗは本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体に含まれない。
【００１６】
本発明のヒトＦＧＦ２１の特定の変異体は、実施例２および３において配列番号１について実証しているように有効な生物学的に活性なタンパク質である。本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体は、一緒に薬理学的効果を改善するだけでなく、他のアミノ酸変化と適合性もあり、それにより、改善された薬理学的特性を提供し、インビボ安定性を増加させる、アミノ酸置換を含有する。効果を改善する本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体におけるアミノ酸置換の群には、Ｄ１２７Ｋ、Ｓ１６７Ｒ、Ｇ１７４Ｌ、Ｒ１７５Ｌ、およびＡ１８０Ｌが含まれる（実施例２および３を参照のこと）。
【００１７】
ｍ−クレゾールなどの医薬品保存剤に対するヒト野生型ＦＧＦ２１の濃縮タンパク質溶液の曝露は、凝集体を形成させるタンパク質の特性を増加させる。さらなるジスルフィド結合の導入による構造的安定化は、保存剤の適合性およびヒト野生型ＦＧＦ２１の熱安定性を改善する。本発明のＦＧＦ２１変異体は、生物学的活性を損なわずに熱安定性および保存剤の適合性を非常に改善するアミノ酸置換Ａ３１ＣおよびＧ４３Ｃを組み込む。Ａ３１Ｃ／Ｇ４３Ｃ置換も含むＦＧＦ２１の非常に有効な変異体は以前に記載されている。これらの報告された変異体は、野生型ＦＧＦ２１に対する顕著に高い保存剤の適合性を示すが、それらは依然として凝集する傾向がある。凝集は免疫原性の危険性を増加させることが知られているので、治療タンパク質としての変異体の許容性を減少させる。
【００１８】
この有害な凝集を最小化するために、本発明の好ましい変異体はアミノ酸置換Ｌ９８Ｄを含み、それは高濃度で顕著に低い高分子量の凝集体形成を生じる（実施例５を参照のこと）。有益には、アミノ酸置換Ｌ９８Ｄは変異体の有効性を低下させない。
【００１９】
本発明のＦＧＦ２１変異体を製造するための好ましい商業的な発現系は哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。しかしながら、哺乳動物細胞株ＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３は、１７９位におけるチロシン側鎖の硫酸化によりヒト野生型ＦＧＦ２１を成熟させるために翻訳後修飾を引き起こし得る。（存在する場合）１７９および１８０位におけるチロシン残基の硫酸化は有効性を減少させ、生成物不均一性の望ましくない起源である。したがって、１７９および／または１８０位におけるＴｙｒを有するＦＧＦ２１タンパク質がＣＨＯ−Ｋ１またはＨＥＫ２９３細胞株から発現される場合、発現タンパク質の一部の割合は１７９位において硫酸化され得、他は１８０位において硫酸化され得るが、他は両方の位置で硫酸化されてもよく、一部はいずれの位置で硫酸化されなくてもよい。これにより、低下した有効性を有する不均一および予測不可能なタンパク質集団が生じる。
【００２０】
本発明のＦＧＦ２１は、変異体内にアミノ酸置換Ｙ１７９Ｆを含むことにより、この有害な硫酸化を解決した。Ｙ１７９ＦはＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞における生成物から生じる硫酸化を排除する（実施例４を参照のこと）。さらに、アミノ酸置換Ｙ１７９Ｆは、本発明の他の支持されるアミノ酸置換と適合し、有効性に関して中立の変化であると決定される。
【００２１】
ヒト野生型ＦＧＦ２１はインビボでのタンパク質分解に影響を受けやすい。マウスまたはカニクイザルの静脈注射または皮下注射後に血清から回収された多くのタンパク質分解断片は１７１位において終了する断片である。以前に、残基１〜１７１に及ぶＦＧＦ２１断片は、インビトロ有効性アッセイにおいて約１００倍未満であることが決定されている。このタンパク質分解による切断部位を排除することで、活性薬物に対する曝露が増加することにより薬効が向上する。アミノ酸置換Ｇ１７０Ｅはマウスにおいて非常にゆっくり切断することが示されており（データは示さず）、カニクイザルにおいて、２４時間後に１７１位におけるタンパク質分解が実質的に排除される（実施例６を参照のこと）。Ｇ１７０Ｅ置換は有効性に影響を与えず、所望の生理化学的安定性プロファイルと適合する。したがって、アミノ酸置換Ｇ１７０Ｅは本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体内に組み込まれる。
【００２２】
ヒト野生型ＦＧＦ２１はＣＨＯ−Ｋ１製造において産生されるカルボキシペプチダーゼに影響を受けやすく、アミノ酸置換Ｓ１８１Ｇはこのプロセシングを示すので、発現されるタンパク質の長さの不均一性（すなわち、細胞株により発現される成熟タンパク質におけるアミノ酸残基の数の不均一性）を減少させる。アミノ酸置換Ｓ１８１Ｇは哺乳動物細胞発現においてＣ末端タンパク質分解を排除しないが、それは、本発明のＦＧＦ２１変異体に見出される他の所望のアミノ酸置換に関して所望の有効性を維持しながらタンパク質分解を遅延するのにかなり効果的である。この有益な特徴を考慮して、アミノ酸置換Ｓ１８１Ｇは本発明のＦＧＦ２１変異体に組み込まれる。
【００２３】
本発明はまた、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る上記の変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、そのＤＮＡはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。本発明の変異体をコードするコード配列は遺伝コードの冗長性または縮退の結果として変化してもよい。
【００２４】
本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは以下を含んでもよい：変異体についてのコード配列のみ、変異体についてのコード配列および機能的ポリペプチドなどのさらなるコード配列、またはリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列；変異体についてのコード配列およびイントロンなどの非コード配列または変異体についてのコード配列の非コード配列５’および／もしくは３’。したがって、「変異体をコードするポリヌクレオチド」という用語は、変異体についてのコード配列のみではなく、さらなるコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも含み得るポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結した後、宿主細胞内で発現される。発現ベクターは典型的に、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの全体部分として宿主生物内で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の選択を可能にするように、選択マーカー、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素を含有する。
【００２６】
本発明のＦＧＦ２１変異体は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞内；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはシュードモナスフルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）などの細菌細胞内；あるいは真菌または酵母細胞内で容易に作製され得る。当該技術分野において周知の技術を使用して宿主細胞は培養される。好ましい哺乳動物宿主細胞は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現系を含有するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株である（米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）。
【００２７】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、ＦＧＦ２１の変異体および発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する、周知の方法により宿主細胞内に移され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞のために一般に利用されるのに対して、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞宿主のために使用されてもよい。
【００２８】
タンパク質精製の種々の方法が利用されてもよく、そのような方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−８９（１９９０）およびＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ（１９９４）に記載されている。
【００２９】
本発明のＦＧＦ２１変異体の医薬組成物は、一般に２型糖尿病、肥満、脂質異常症、もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの任意の組み合わせを治療することを意図する目的を達成する、当該技術分野において公知の任意の手段により投与されてもよい。好ましい投与経路は非経口である。投与される用量は、受容者の年齢、健康、および体重、併用療法の種類、もしあれば、治療頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。典型的な用量レベルは、標準的な臨床技術を使用して最適化されてもよく、投与様式および患者の病態に依存し、当業者により決定され得る。
【００３０】
本発明のＦＧＦ２１変異体は薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法に従って製剤化される。所望の製剤は、任意の薬学的に許容可能な担体、保存剤、賦形剤または安定剤と共に、高純度の適切な希釈剤または適切な溶液を用いて再構成される安定な凍結乾燥製剤である［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１９９５］。
【００３１】
本発明のＦＧＦ２１変異体は薬学的に許容可能な緩衝液と組み合わされてもよく、ｐＨは薬学的安定性を提供し、投与に許容可能なｐＨに調整される。さらに、本発明のＦＧＦ２１変異体は、バイアル、カートリッジ、ペン送達装置、シリンジ、静脈内投与チューブまたは静脈内投与バッグなどの容器内に配置されてもよく、ここで、容器は単位用量容器である。
【００３２】
「脂質異常症」という用語は、リポタンパク質過剰産生または欠損を含む、リポタンパク質代謝の障害を意味する。脂質異常症は、総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに／または血液中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の低下により現れ得る。
【００３３】
「メタボリックシンドローム」という用語は、ヒトにおける代謝リスク因子の群により特徴付けられる。それらには以下が挙げられる：腹部脂肪、ほとんどの男性において４０インチのウエストまたはそれ以上；高血糖、空腹後に少なくとも１１０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）；高トリグリセリド、血流中に少なくとも１５０ｍｇ／ｇＬ；低いＨＤＬ、４０ｍｇ／ｄｌ未満；および／または１３０／８５以上の血圧。
【００３４】
「肥満」という用語は、除脂肪体重に対して過剰な皮下脂肪が存在する状態と定義される（Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ２８版、２００６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）。
【００３５】
「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３６】
「治療している」（または「治療する」または「治療」）という用語は、症状、障害、病態、または疾患の進行または重症度を遅延、減少、または反転させることを意味する。
【００３７】
「治療有効量」という用語は、患者への単回または複数回投与により、所望の治療を与える、本発明のＦＧＦ２１の変異体の量または用量を指す。
【００３８】
「２型糖尿病」という用語は、インスリンの利用可能性にも関わらず、過剰なグルコース産生、および不十分なグルコースクリアランスの結果として循環グルコースレベルが過度に高いままであることにより特徴付けられる。
【００３９】
以下の実施例は本質的に以下に示すように実施され得る。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞におけるＦＧＦ２１変異体の発現
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１ＳＶ）細胞を使用して哺乳動物細胞発現系において本発明のＦＧＦ２１変異体を産生する。ＦＧＦ２１変異体をコードする遺伝子を、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を含有する発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド）内でサブクローニングする。ＦＧＦ２１変異体をコードするｃＤＮＡ配列を、組織培養培地内への所望の産物の分泌を増強するために好ましいシグナルペプチド配列のコード配列とフレーム内で融合する。好ましいシグナルペプチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列に示されるようなポリペプチドである。
【００４１】
発現はウイルスであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動する。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞をエレクトロポレーションおよび適切な量の組換え発現プラスミドを使用して安定にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、適切な細胞密度で懸濁培養物中に維持する。トランスフェクトした細胞の選択は、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含有する無血清培地中の増殖により達成し、３５〜３７℃および５〜７％ＣＯ２にてインキュベートする。
【００４２】
フローサイトメトリーの使用によりクローンに由来する細胞株を生成する。哺乳動物細胞におけるＦＧＦ２１変異体の発現は、通常、天然のＮ末端配列、ＨＰＩＰ、すなわちＮ末端においてメチオニン残基を有さない、例えば配列番号１のアミノ酸配列により示されるＦＧＦ２１変異体を産生する。
【００４３】
ＣＨＯ細胞から培地内に分泌されるＦＧＦ２１変異体は、清浄した細胞培養培地を、最大２時間、５０〜６０℃で加熱し、冷却し、ウイルス不活性化のために洗浄剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で処理し、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）混合モードクロマトグラフィーカラムに適用する、プロセスにより精製する。ＦＧＦ２１変異体はｐＨ８の緩衝液を使用してカラムから溶出し、その後、生成物のプールを、ウイルス不活性化のために５０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を用いて１時間、３．２〜３．５のｐＨ範囲に調整する。Ｔｒｉｓ緩衝液を添加することにより溶液をｐＨ６．７〜７．３に調整し、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して疎水性交換クロマトグラフィーによりＦＧＦ２１変異体をさらに精製する。疎水性相互作用カラムを、ｐＨ７にて硫酸ナトリウムの減少させた勾配で溶出する。ＨＩＣ精製したＦＧＦ２１変異体を、ｐＨ８にてＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝液に緩衝液を交換し、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する。アニオン交換カラムはｐＨ８にて増加させた濃度の塩化ナトリウムで溶出する。Ｐｌａｎｏｖａ２０Ｎ（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ）ウイルス保持フィルタを通して精製したＦＧＦ２１変異体を通過させ、続いて、再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上での接線流限外濾過を使用して１０Ｍクエン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７内で濃縮／血液透析濾過する。
【００４４】
実施例２
３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞グルコース摂取アッセイ
３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞は、野生型マウスβＫｌｏｔｈｏのコード配列およびブラストサイジン耐性マーカーを含有するＣＭＶにより駆動される哺乳動物発現ベクターのレトロウイルス形質導入により３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞から生成する。１５μＭのブラストサイジンの存在下で１４日間の増殖後にブラストサイジン耐性細胞を選択し、βＫｌｏｔｈｏタンパク質発現を、抗βＫｌｏｔｈｏ抗体を用いた免疫ブロットにより検証する。実験での使用のために播種するまで、１０％のウシ血清、および１５μＭのブラストサイジンを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞を維持する。
【００４５】
グルコース摂取に関して、３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維細胞を、９６ウェルプレート中に２０，０００個の細胞／ウェルにて播種し、１０％のウシ血清を有するＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートする。細胞を、目的のＦＧＦ２１変異体を有するまたは有さない０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＤＭＥＭ中で３時間インキュベートし、続いて、ＦＧＦ２１変異体を有するまたは有さない１００μＭの２−デオキシ−Ｄ−（１４Ｃ）グルコースを含有するクレブス・リンガーリン酸（ＫＲＰ）緩衝液（１５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．１％のＢＳＡ）中で１時間インキュベートする。非特異的結合を、１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−（１４Ｃ）グルコースを含有するクレブス・リンガー重炭酸塩／Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＢＨ）緩衝液中での選択ウェルのインキュベーションにより決定する。２０μＭのサイトカラシンＢを細胞に添加することにより反応を停止させ、液体シンチレーションカウンタを使用してグルコース摂取を測定する。
【００４６】
３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞グルコース摂取アッセイにおいて配列番号１のＦＧＦ２１変異体のインビトロ効力は０．０２６ｎＭであった。配列番号１のＦＧＦ２１変異体は、公知の配列番号１１のＦＧＦ２１変異体（国際公開第２００６／０２８５９５号に開示されている）と比較して有効なＦＧＦ２１変異体である。３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞グルコース摂取アッセイにおいて配列番号１１のＦＧＦ２１変異体のインビトロ効力は０．４９ｎＭであった。
【００４７】
実施例３
ヒト２９３細胞−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥルシフェラーゼアッセイ
２９３−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥｌｕｃレポーター細胞の構築：
３７℃、５％ＣＯ２にて、ダルベッコ改変イーグル培地中に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する増殖培地中でＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓細胞）を培養する。ＣＭＶプロモーターにより駆動されるβＫｌｏｔｈｏ発現カセットを含有するプラスミドおよび血清反応要素（ＳＲＥ）により駆動されるリスフェラーゼ発現カセットを含有するプラスミドを用いて細胞を共トランスフェクトする。βＫｌｏｔｈｏ発現プラスミドもまた、アミノグリコシド系抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与えるためにＳＶ４０プロモーターにより駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含有する。トランスフェクトプラスミドがゲノム内に組み込まれている細胞を選択するために６００μｇ／ｍＬのＧ４１８を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を選択する。希釈により選択した細胞をクローニングし、ＦＧＦ２１の添加の２４時間後にルシフェラーゼ産物の増加について試験する。最大のＦＧＦ２１に依存したルシフェラーゼの増加を示しているクローンを、関連するＦＧＦ２１変異体活性を測定するために使用する細胞株として選択する。
【００４８】
２９３−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥｌｕｃＦＧＦ２１活性アッセイ：
２９３−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥｌｕｃ細胞をリンスし、ＣＤ２９３懸濁培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に入れる。３７℃、６％ＣＯ２、１２５ｒｐｍにて細胞を懸濁液中で一晩増殖させる。細胞を計数し、遠心分離によりペレット化し、０．１％ＢＳＡを含有するＣＤ２９３培地中で再懸濁する。２５，０００個の細胞／ウェルにて細胞を白色９６ウェルプレート内に入れる。ＣＤ２９３／０．１％ＢＳＡ中での４倍連続希釈を、１００ｎＭ〜０．００６ｎＭの最終濃度で８個の希釈物を生成するために各ＦＧＦ２１変異体について調製する。希釈物を３連で細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２にて１６〜２０時間インキュベートする。等体積のＯｎｅＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、相対蛍光を測定することによりルシフェラーゼレベルを決定する。曲線を適合するために４パラメータロジスティックモデル（ＸＬｆｉｔバージョン５．１）を使用してデータを分析し、ＥＣ５０を決定する。
【００４９】
ヒト２９３細胞−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥｌｕｃアッセイにおける配列番号１のＦＧＦ２１変異体のインビトロ効力は０．２５ｎＭであった。配列番号１のＦＧＦ２１変異体は、公知の配列番号１１のＦＧＦ２１変異体（国際公開第２００６／０２８５９５に開示されている）と比較して有効なＦＧＦ２１変異体である。ヒト２９３細胞−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥｌｕｃアッセイにおける配列番号１１のＦＧＦ２１変異体のインビトロ効力は２２．３９ｎＭであった。
【００５０】
実施例４
哺乳動物細胞における製造の間のチロシン硫酸化
ヒト野生型ＦＧＦ２１は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞における哺乳動物タンパク質発現の間、１７９位におけるチロシン硫酸化に影響を受けやすい（データは示さず）。この硫酸化は不均質を生じることを導き、タンパク質の異なる形態（すなわち硫酸化を有するおよび有さない）が発生し得ることを意味する。生成物の同質性は生物製剤の所望の特性である。治療タンパク質の産生の間に起こる翻訳後修飾は望ましくない。なぜなら、修飾は活性または他の生物薬剤特性の相違を導き得るからである。
【００５１】
ＦＧＦ２１変異体が硫酸化されるかどうかを評価するために、試料の１μＬのアリコートを９９μＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合する。以下の条件を使用して、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により試料を分析する：移動相Ａは０．１％ＴＦＡ／１０％アセトニトリルであり、移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡであり、カラムは２．１×１２．５ｍｍＣ８ガードを有する、Ｃ８カラム、３．５μｍ２．１×１５０ｍｍであり、注入体積は試料濃度に応じて１２〜２０μＬであり、約１μｇのタンパク質が注入される。
【００５２】
【表１】
2014530220.tif 000002
【００５３】
Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標）質量分析計を、４００〜１９９０ａｍｕの質量範囲、極性ＥＳ＋、毛細管２０００、試料錐体４０Ｖに設定し、開口１は３０Ｖであり、ソース温度は１０５℃であり、錐体ガス流は５０Ｌ／時間であり、脱溶媒和温度は３００℃であり、脱溶媒和ガス流は６００Ｌ／時間である。
【００５４】
【表２】
2014530220.tif 000003
【００５５】
表２から見られ得るように、予想される質量（硫酸化を有さない）は配列番号１のＦＧＦ２１変異体について観測された質量とほぼ同じであり、硫酸化は配列番号１のＦＧＦ２１変異体において検出されなかったことが示される。したがって、アミノ酸置換Ｙ１７９Ｆは、配列番号１のＦＧＦ２１変異体における１７９位において硫酸化が発生するのを防いだ。この結果は、治療タンパク質産物として、より許容可能である、より均質な産物を提供する。
【００５６】
実施例５
Ｐ１１５Ｗは凝集を促進するのに対して、Ｌ９８Ｄは物理的安定性および製剤中のベンジルアルコールとの適合性を増加させる
タンパク質自己会合および凝集の量を測定するために、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法を使用して、高分子量凝集体のパーセント（％ＨＭＷ）を測定する。タンパク質の初期ストック溶液をＳＥＣにより特徴付けて、ＨＭＷの開始レベルを決定する（表３）。
【００５７】
【表３】
2014530220.tif 000004
【００５８】
４℃で２ｍｇ／ｍＬの濃度にて一晩、（表４〜６に記載した）試料緩衝液内に（１０，０００ダルトンの分画分子量を有する透析カセットを使用して）透析することにより各タンパク質の試料を調製する。透析後、試料を滅菌濾過（０．２２μｍ膜）し、２８０ｎｍにおける吸光度により定量する。次に、試料を、１０，０００ＭＷカットオフ遠心分離フィルタを使用して４℃で３０００ｒｐｍにて、≧６０ｍｇ／ｍＬの標的濃度に濃縮する。試料を濃縮した後、タンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度により定量し、ＳＥＣアッセイを使用して％ＨＭＷを決定する。
【００５９】
ＳＥＣ法は３０ｃｍ×０．７８ｃｍの寸法を有するＴｏｓｏＨａａｓモデルＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを利用する。移動相は、０．５ｍＬ／分の流速で０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４である。低濃度の試料を１０μＬの注入として適用し、２１４ｎｍの吸光度波長にてモニターし、一方で、濃縮した試料を１μＬの注入として適用し、２８０ｎｍにてモニターする。
【００６０】
表４はＦＧＦ２１変異体の配列番号８および配列番号９の濃縮溶液中のタンパク質濃度および％ＨＭＷを報告している。単量体（非凝集形態）中に存在したままの各変異体のパーセンテージを表に記載しているが、１００％−報告した％ＨＭＷに等しい。配列番号８のＦＧＦ２１変異体および配列番号９のＦＧＦ２１変異体は、１１５において効力を増強するトリプトファン残基を含有する配列番号８のＦＧＦ２１変異体（Ｐ１１５Ｗ）および野生型プロリン残基を含有する配列番号９のＦＧＦ２１変異体（Ｐ１１５Ｐ）を有するアミノ酸位置１１５のみが異なる。種々の製剤緩衝条件下で、配列番号８のＦＧＦ２１変異体（Ｐ１１５Ｗ）についての％ＨＭＶは配列番号９のＦＧＦ２１変異体と比較して著しく高く、凝集および自己会合を促進することに対する１１５位においてトリプトファンを有する原因となる効果を示している。同様に、１１５位においてトリプトファン残基を含有する配列番号１０のＦＧＦ２１変異体は、１１５位においてアミノ酸プロリンを含有する配列番号１のＦＧＦ２１変異体と比較して実質的に高い％ＨＭＷを有する。
【００６１】
【表４】
2014530220.tif 000005
【００６２】
【表５】
2014530220.tif 000006
【００６３】
物理的安定性および０．９％の保存剤レベル濃度におけるベンジルアルコールとの適合性を、ＳＥＣアッセイにおいて％ＨＭＷとして測定し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０の存在または非存在下で、ｐＨ７．０にて１５０ｍＭのＮａＣｌを有する緩衝液１０ｍＭヒスチジン中でモニターする。試料を３０ｍｇ／ｍＬにて調製し、４℃、２５℃、および４０℃にて４週間インキュベートする。新たに製剤化したＦＧＦ２１変異体（すなわち時間ゼロ）および４週間インキュベートしたものを、ＳＥＣ法により％ＨＭＷについて分析する。表６は、時間ゼロの試料（「初期」）および４０℃にて４週間インキュベートしたものを比較している、分析の結果をまとめている。
【００６４】
【表６】
2014530220.tif 000007
【００６５】
配列番号１のＦＧＦ２１変異体はアミノ酸置換Ｌ９８Ｄを含有する。配列番号９のＦＧＦ２１変異体は、アミノ酸置換Ｌ９８Ｄを含有せず、代わりに９８位において野生型アミノ酸ロイシンを含有する。各タンパク質を製剤条件下で３０ｍｇ／ｍＬにて製剤化した場合にアミノ酸置換Ｌ９８Ｄの利点を観測する（表６）。試験した全ての条件下で、４０℃で４週間、ＦＧＦ２１変異体にストレスを加えた結果、配列番号１のＦＧＦ２１変異体と比較して配列番号９のＦＧＦ２１変異体について実質的に高い％ＨＭＷを生じる。さらに、多くの医薬製剤に使用される一般的な保存剤である０．９％ベンジルアルコールの添加は、配列番号９のＦＧＦ２１変異体について％ＨＭＷの増加を悪化させるが、配列番号１のＦＧＦ２１変異体については悪化させない。このベンジルアルコールとの不適合性はまた、開始試料調製物の分析にも観測され、０．９％ベンジルアルコールの存在下の％ＨＭＷは、ベンジルアルコールの非存在下の０．９７％のみと比較して１１％である。配列番号９のＦＧＦ２１変異体も配列番号１のＦＧＦ２１変異体のいずれもＰ１１５Ｗ残基を含有していないので、これらの条件下での不十分な物理的安定性はＰ１１５Ｗ残基に起因し得ない。アミノ酸置換Ｌ９８Ｄがなされた後、０．９％ベンジルアルコールの存在下で高い物理的安定性が観測される。
【００６６】
これらのデータは、特定の置換が、特にベンジルアルコールなどの特定の保存剤の存在下で高分子量種内の凝集に起因して全タンパク質の安定性に影響を与え得ることを示す。これらのＨＭＷ凝集体の最小化が治療タンパク質について好ましい。これは、配列番号１に示されるＦＧＦ２１変異体におけるＬ９８ＤなどのＦＧＦ２１変異体タンパク質における特定の置換により達成され得る。Ｐ１１５Ｗなどの他の置換は、変異体における凝集のレベルを増加させることなどの有害作用を有し得る。
【００６７】
実施例６
インビボでのタンパク質分解
オスのカニクイザル、ｎ＝２／群に、配列番号１のＦＧＦ２１変異体の単回の２ｍｇ／ｋｇ注射を皮下投与する。活性化合物の量を定量化するために質量分析によりインビボタンパク質分解の２４時間の評価の間、血清を経時的に得る（０．２５〜１２時間後に引き抜く）。
【００６８】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）解析を実施する。各血清試料の１００μＬアリコートを、磁性ビーズに共有結合する抗ＦＧＦ２１モノクローナル抗体で免疫沈降させる。免疫沈降した試料を別のアリコートに分け、インタクトなタンパク質および典型的に消化されるタンパク質の検出を可能にする。インタクトなタンパク質を、Ｃ５でコーティングした３μｍ粒子を含有するＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）Ｂｉｏワイドポアカラム、１００×０．３２ｍｍｉ．ｄ．上に注入する。典型的に消化した試料を、Ｃ１８でコーティングした３μｍ粒子を含有するＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏワイドポアカラム、１００×０．３２ｍｍｉ．ｄ．上に注入する。全ての注入についてのクロマトグラフ条件は、移動相Ａ（０．１／１００、ギ酸：水）および移動相Ｂ（０．１／１００、ギ酸：アセトニトリル）からなる２勾配を使用する。ＬＣからの流出物は、陽イオンモードにおいて質量スペクトル検出用のＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｓｙｎａｐｔ（登録商標）Ｑ−Ｔｏｆ質量分析計に直接接続される。Ｍａｓｓｌｙｎｘ（ｖ４．１）およびＭａｘＥｎｔ１デコンボリューションソフトウェアを使用してＱ−Ｔｏｆ質量分析計からのデータを収集する。
【００６９】
ＦＧＦ２１タンパク質の１７１位における切断はタンパク質の生物活性を１００倍以上減少させることが見出されている。したがって、この部位においてタンパク質分解を減少させることにより、完全な活性薬物の曝露を増強させることが望ましい。上記のＬＣ／ＭＳ法で分析する場合、配列番号１のＦＧＦ２１変異体は、２４時間の評価にわたってタンパク質分解産物が検出されなかったことを示す。これらのデータは、配列番号１のＦＧＦ２１変異体におけるＧ１７０Ｅの置換が、Ｇ１７０Ｅのアミノ酸置換を含有しない、配列番号７のＦＧＦ２１変異体と比較してオスのカニクイザルにおいて２４時間にわたってインビボでのタンパク質分解を減少させることを実証する。
【００７０】
実施例７
Ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおけるグルコース低下
オスのｏｂ／ｏｂ（Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐ＋／ＯｌａＨｓｄ）マウスおよび年齢を一致させたｏｂ／ｍ痩せた対照（Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐ＋／ＯｌａＨｓｄ）は、到着時に７〜８週齢で、治療開始時に１０〜１１週齢である。到着時に全てのマウスをケージ当たり３匹で収容し、治療の開始前に３週間馴れさせる。マウスにＰｕｒｉｎａ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ５０１５を与え、水を自由に与える。マウスを７０°Ｆに設定した周囲温度で１２時間明／暗周期に収容する。治療の開始の前日に、マウスを２時間絶食させ、尾出血によりヘパリン化毛細管内に血液試料を採取する。Ａｓｃｅｎｓｉａ  Ｃｏｎｔｏｒ血糖測定器を用いて血糖値を測定し、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅマウス／ラットインスリンアッセイキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して血漿インスリンレベルを定量する。治療の開始日（０日）に、前日の体重、血糖、および血漿インスリンに基づいてマウスを分類する。無菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を用いてＦＧＦ２１変異体を希釈し、ミニ浸透圧Ａｌｚｅｔポンプにより皮下投与する。５日目に、明サイクルの開始後約２時間で、供給した血糖および血漿インスリンレベルを測定する。５日目に全てのマウスを一晩絶食させ、６日目に経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施する。グルコース（２ｇ／ｋｇ）の経口投与前に尾を切断することによりヘパリン化した毛細管内にマウスを出血させる。経口グルコース投与後、３０、６０および１２０分にさらに血液試料を採取する。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のグルコースアッセイキットを用いて血漿グルコースを測定する。４パラメータロジスティック回帰モデルフィットを６日目に、正規化したグルコースＡＵＣ値で実施する。
【００７１】
５日目、ビヒクル処置したマウスは、２４０．４±１５．０ｍｇ／ｄｌにて測定した平均血糖値（平均±ＳＥＭ）を有して高血糖であったのに対して、ｏｂ／ｍ痩せた対照マウスは、１５０．６±６．０ｍｇ／ｄｌ（平均±ＳＥＭ）の血糖値を有した。配列番号１のＦＧＦ２１変異体および配列番号１１のＦＧＦ２１変異体の両方は、ｏｂ／ｍ痩せた対照に匹敵するレベルまで用量依存的に血糖を低下させた。配列番号１のＦＧＦ２１変異体のＥＤ５０は０．７μｇ／ｋｇ／ｈｒであったのに対して、配列番号１１のＦＧＦ２１変異体のＥＤ５０は３．１μｇ／ｋｇ／ｈｒであった。配列番号１のＦＧＦ２１変異体は、配列番号１１のＦＧＦ２１変異体よりｏｂ／ｏｂマウスにおいて低い血糖で約４．４倍効果があった。したがって、配列番号１のＦＧＦ２１変異体は、公知の配列番号１１のＦＧＦ２１変異体と比較して有効なＦＧＦ２１変異体である（国際公開第２００６／０２８５９５号に開示されている）。
【００７２】
配列
配列番号１−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
配列番号２−野生型ＦＧＦ２１（ホモサピエンス）
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
配列番号３−ヒトトランスフェリン（ｈＴｒｆ）シグナルペプチド
ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡ
配列番号４−ヒト線維芽細胞増殖因子結合タンパク質−１（ｈＦＧＦＰ−１）シグナルペプチド
ＭＫＩＣＳＬＴＬＬＳＦＬＬＬＡＡＱＶＬＬＶＥＧ
配列番号５−ウシリゾチームシグナルペプチド
ＭＫＡＬＶＩＬＧＦＬＦＬＳＶＡＶＱＧ
配列番号６−マウス軽鎖（ｍカッパ）シグナルペプチド
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号７−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＧＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
配列番号８−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＷＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＹＳＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
配列番号９−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＹＳＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
配列番号１０−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＷＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
配列番号１１−ＦＧＦ２１変異体
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＡＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
配列番号１２−（ＤＮＡ）ＦＧＦ２１変異体
ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣ
配列番号１３−ＦＧＦ２１変異体−コンセンサス
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ１ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＸ２ＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＸ３Ｘ４ＬＶＸ５ＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
Ｘ１はＬまたはＤであり、
Ｘ２はＰまたはＷであり、
Ｘ３はＬまたはＹであり、
Ｘ４はＳまたはＲであり、
Ｘ５はＧまたはＥである。
【配列表】
2014530220000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月31日(2014.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014530220000001.app
【国際調査報告】
2014530220.tif 000011
2014530220.tif 000012