(57)【要約】  本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の生存および／または転移の転帰をインビトロで予測するための方法であって、ＧＩＳＴの患者由来の生物学的試料における、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのプールのレベルの測定を含むことを特徴とする方法、ならびにＧＩＳＴに罹患している患者の生存転帰のインビトロでの予測、および／またはＧＩＳＴのために治療されているもしくはＧＩＳＴに罹患している患者における転移の発症のインビトロでの予測、および／またはＧＩＳＴについての治療の効果の予測のためのキットであって、試料中で、ＡＵＲＫＡの発現またはレベルを検出するおよび／または定量化するための手段ならびにＧＩの計算のための手段を含むことを特徴とするキットに関する。本発明はまた、ＧＩＳＴの治療において使用するための化合物をスクリーニングするための方法およびＧＩＳＴの治療において使用するためのＡＵＲＫＡ阻害剤に関する。
2014501496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の生存および／または転移の転帰をインビトロで予測するための方法であって、ＧＩＳＴの患者由来の生物学的試料における、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのプールのレベルの測定を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリペプチドのプールのレベルの前記測定が、ＡＵＲＫＡに存在するポリヌクレオチドのプールの発現レベルの測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＩＳＴを、ＡＵＲＫＡが下方調節されている場合５年以内に転移を発症する危険度がない群と比較して、ＡＵＲＫＡが上方調節されている場合、５年以内に転移を発症する危険度が高い、すなわち５年以内に転移を発症する危険度が８０％超である群に分類する、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
以下の式：
ＧＩ＝Ａ２×Ｃ
［式中、ＡはＧＩＳＴゲノムの変化の数であり、ＣはＧＩＳＴにおける関与染色体の数である］
による、ゲノム指数（ＧＩ）、すなわちＧＩＳＴゲノムの変化の数および種類の計算を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＡＵＲＫＡが下方調節されており、かつＧＩが１０以下である場合、ＧＩＳＴを転移および疾患がない生存群のグループに分類する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＡＵＲＫＡ発現が９．１３未満である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡＵＲＫＡ発現が、ＡＵＲＫＡ発現の平均値以下であり、かつＧＩが１０以下である場合、ＧＩＳＴを、５年以内に転移を発症する危険度が低い、すなわち５年以内に転移を発症する危険度が０％である群に分類する方法であって、前記平均値が複数のＧＩＳＴにおけるＡＵＲＫＡ発現の平均値である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ＡＵＲＫＡ発現が、ＡＵＲＫＡ発現の平均値超であり、かつＧＩが１０超である場合、ＧＩＳＴを、５年以内に転移を発症する危険度が高い、すなわち５年以内に転移を発症する危険度が７５％超である群に分類する方法であって、前記平均値が複数のＧＩＳＴにおけるＡＵＲＫＡ発現の平均値である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ＧＩＳＴに罹患している患者の生存転帰のインビトロでの予測、および／またはＧＩＳＴのために治療されているもしくはＧＩＳＴに罹患している患者における転移の発症のインビトロでの予測、および／またはＧＩＳＴについての治療の効果の予測のためのキットであって、試料中で、ＡＵＲＫＡの発現またはレベルを検出するおよび／または定量化するための手段ならびにＧＩの計算のための手段を含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
ＧＩＳＴの治療において使用するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．試験化合物を、ＧＩＳＴ細胞を含有する患者由来の生物学的試料と接触させる段階、
ｂ．ＡＵＲＫＡの発現またはレベルを測定する段階、
ｃ．ＡＵＲＫＡの前記発現またはレベルを、前記試験化合物と前記試料との接触前のＡＵＲＫＡの発現と比較する段階、
ｄ．ＡＵＲＫＡの発現の下方調節を可能にする前記試験化合物を選択する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
ｈ．ＧＩを計算する段階、
ｉ．前記ＧＩを前記試験化合物と前記試料との接触前のＧＩと比較する段階、
ｊ．ＧＩの１０以下への下方調節を可能にする前記試験化合物を選択する段階
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＩＳＴの治療において使用するためのＡＵＲＫＡ阻害剤。
【請求項１３】
ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＬＮ８２３７およびＭＫ−５１０８の中から選択される、請求項１２に記載のＡＵＲＫＡ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の生存および／または転移の転帰をインビトロで予測するための方法、（ｉ）ＧＩＳＴに罹患している患者の生存転帰のインビトロでの予測、および／または（ｉｉ）ＧＩＳＴのために治療されているもしくはＧＩＳＴに罹患している患者における転移の発症のインビトロでの予測、および／または（ｉｉ）ＧＩＳＴについての治療の効果の予測のためのキットに関する。本発明はまた、ＧＩＳＴに治療において使用するための化合物をスクリーニングするための方法、およびＧＩＳＴの治療において使用するための化合物に関する。
【０００２】
したがって、本発明は、医学および薬学分野において、特に診断の分野において有用性を有する。
【０００３】
以下の説明において、括弧（［］）内への参照は、本文の最後に記載されている参考文献のリストを指す。
【背景技術】
【０００４】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は胃腸管の最も頻度の高い間葉腫瘍であり、軟組織肉腫の約２５％を占める。ＧＩＳＴは、カハールの介在細胞から（１）または一般的な前駆細胞から（２）生じると考えられる。
【０００５】
ＫＩＴチロシンキナーゼまたは血小板由来因子受容体α（ＰＤＧＦＲＡ）活性化突然変異は、ＧＩＳＴにおける初期腫瘍形成事象である。大部分のＧＩＳＴ（８０％）は、ＫＩＴチロシンキナーゼ受容体の活性化突然変異を特徴とするが、一部（８％）は血小板由来因子受容体α（ＰＤＧＦＲＡ突然変異を保有する（３、４）。これらの突然変異に加えて、他の遺伝子変化が起こり、報告されている最も多い変化は１４ｑ、２２ｑおよび１ｐ欠失である（５）。全体として、ＧＩＳＴの細胞発生は極めて単純であり、不均衡は主として完全染色体または染色体の腕に関係する。特に、ＧＩＳＴの分子および細胞発生プロフィールは疾患の進行と相関する。それにもかかわらず、進行した腫瘍において変化がより頻繁であり、より複雑であることが認められている。さらに、ＧＩＳＴの転移転帰の遺伝的基礎はまだ十分には理解されていない。
【０００６】
ＧＩＳＴの臨床管理は、主として、活性化突然変異によって誘発されるＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡシグナル伝達異常を標的することが明らかにされているイマチニブメシル酸塩（Ｇｌｅｅｖｅｃ、以前のＳＴＩ５７１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）を用いたアジュバントまたはネオアジュバント標的療法を伴う外科的切除から成る（７）。症例の大半は外科的切除だけによって治癒され得るが、２０〜４０％の患者は、再発性疾患の最も一般的な症状発現である遠隔肝転移を再発する。
【０００７】
ＧＩＳＴを有する患者の転帰を予測するために、腫瘍の部位、大きさ、細胞型、壊死の程度および有糸分裂速度に基づく多くの病理学的基準が提案されている。２００１年に腫瘍の大きさおよび有糸分裂数に基づいてＧＩＳＴの相対的危険度を評価するためのコンセンサスが国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）によって見出され（８）、２００６年には、米軍病理学研究所（Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（ＡＦＩＰ）が腫瘍の場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を考慮に入れた最新のシステムを提案した（９）。これら２つのシステムがＧＩＳＴの転移危険度を判定するのに特に効率的であるとしても、それらは腫瘍の攻撃性の間接的な組織病理学的徴候に基づく。さらに、これらの基準のためのカットオフ値は経験的に決定されており、熟練病理学者の評価において不可避の主観性を導く。したがって、転帰予測の特異性と再現性を高める客観的なバイオマーカーを同定するために、ＧＩＳＴの攻撃性の基礎となる生物学をより深く理解する必要がある。
【０００８】
有効で信頼できる、試験者に依存しないＧＩＳＴの予後判定の方法の開発は、特に、多くの患者がイマチニブを摂取するが、小さな割合だけしかそのような治療から恩恵を受けないと考えられる、アジュバント治療に関連して、ＧＩＳＴ患者の適切な臨床管理のために必須である（１９）。
【０００９】
この目的を達成するため、ゲノムおよび発現プロファリングが既に使用されているが、部分的で不均一な結果しか報告されていない。ゲノムレベルでは、ゲノムの複雑度のレベルが腫瘍の病期と共に増大することが示されているが（６、１０）、閾値は全く定義されておらず、またｐ１６ＩＮＫ４Ａの変化を除いて特異的な変化は提案されていないが、ｐ１６ＩＮＫ４Ａの変化の転移発症における役割にはまだ議論の余地がある（１１〜１６）。発現レベルでは、Ｙａｍａｇｕｃｈｉらが遺伝子発現シグネチャーを提案している：彼らは、胃起源のＧＩＳＴだけに限られるが、ＣＤ２６を予後マーカーとして同定した。それにもかかわらず、著者らは、ＣＤ２６が胃のＧＩＳＴの悪性進行の原因ではないと考えられると結論づけた。さらに、このシグネチャーは数症例（３２例のＧＩＳＴ）でしか確認されておらず、胃のＧＩＳＴにおいてのみ転帰を予測し（小腸のＧＩＳＴでは転帰を予測しない）、そして「ゴールドスタンダード」とみなされる組織病理学的評価方法とは比較されていないので、このシグネチャーは限定される（１７）。
【００１０】
この試験の前に実施されたより少ない数のＧＩＳＴを使用した少数のゲノムまたは発現プロファイリング分析の中で、１つだけが（３５）、本発明者らが本明細書で提示するゲノムおよび転写プロファイリングを合わせた統合的な分析を提示している。この試験は２５名の患者に基づき、過去１５年以内に記述された変化した領域内に位置する標的遺伝子を同定することを目的とした。基本的に、多くの試験がＧＩＳＴゲノムを記述しており、ＧＩＳＴの細胞発生が極めて単純であって、少数の異常にのみ反映され、獲得よりも欠失がより頻繁であることを明らかにした（６、１０、１１、１２、３６、３７）。これらの試験はすべて、染色体１４番、２２番および１ｐの欠失が最も頻度の高い異常であると結論づけた。また、低／中間危険度のＧＩＳＴにおけるよりも高危険度で非常に悪性のＧＩＳＴにおいて変化がより頻繁であることも示されているが（６、１０）、１つの変化と予後との間の強い関連性は、上記で論じたＣＤＫＮ２Ａ変化を除き、まだ同定されていない。発現レベルでは、試験の大半は、診断の描写説明を強化するため（３８、３９）またはＫＩＴもしくはＰＤＧＦＲＡの突然変異状態による発現の差を同定するため（４０〜４２）に設定されている。
【００１１】
染色体２０ｑ１３にマッピングされる遺伝子にコードされるＡＵＲＫＡは、有糸分裂中心体プロテインキナーゼである（２０）。ＡＵＲＫＡは周知の癌遺伝子であり、腫瘍発症におけるその主たる役割は、有糸分裂の間の染色体分離の制御である（２１）。遺伝子増幅およびＡＵＲＫＡ過剰発現は、多くの癌型において広く記述されている（２２）。特に、ＡＵＲＫＡの過剰発現は、乳癌細胞のトランスフォーメーションを導く中心体の重複−分布異常および異数性を誘導することが明らかに示されている（２３）。実際に、中心体は、細胞分裂の間に双極性紡錘体の確立を通してゲノムの安定性を維持し、複製された染色体の２つの娘細胞への均等な分離を確実にする。ＡＵＲＫＡ発現はまた、主として乳癌（２４）、結腸癌（２５、２６）、神経芽細胞腫（２７）および頭頸部扁平上皮癌（２８）における予後不良と結びついてきた。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＡＵＲＫＡ発現の上方調節が、野生型遺伝子発現の再プログラム化を導くゲノムの複雑度を確立し、転移の発症のための最適条件を作り出すうえでの主要な駆動事象であり得ることを指示する。ＡＵＲＫＡ阻害剤は現在臨床試験下にある（２９〜３３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これらの要素すべてを考慮して、ＧＩＳＴの転帰を予測することを可能にする、特に現在の技術水準の不具合、欠点および障害を軽減する新しいツールの必要性が明らかにまだ存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
多大の研究後に、出願人は、意外にも原発性ＧＩＳＴの臨床転帰についての予後指標となる１つの遺伝子発現シグネチャーを見出した。
【００１４】
驚くべきことに、ＣＩＮＳＡＲＣシグネチャー（肉腫における複雑度指標（ＣＩＮＳＡＲＣ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ＩＮｄｅｘ  ｉｎ  ＳＡＲＣｏｍａ）、肉腫におけるゲノムの複雑度に関連する６７遺伝子発現の予後シグネチャー、国際特許出願第ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００３２３号、［５５］）および／または新しい１遺伝子発現シグネチャーがＧＩＳＴにおける転移転帰を予測することおよびこれらのシグネチャーの各々とゲノム不均衡との組合せが、患者の予後を判定するうえで現在の組織病理学的評価方法をしのぐことが出願人によって明らかにされた。より詳細には、これらの分子シグネチャーは、米軍病理学研究所分類によって中間危険度と階層化された症例の中で「危険度の高い患者」を同定する。
【００１５】
出願人は、ＧＩ（ゲノム指数）とＡＵＲＫＡ発現との間に正の相関が存在することを示す。
【００１６】
出願人は、驚くべきことに、ＧＩおよびＡＵＲＫＡ発現に基づく決定アルゴリズムを構築する。
【００１７】
好都合には、シグネチャーの適用は、医原性死亡率の低下および個々の患者にとっての転帰の改善をもたらすより選択的なイマチニブ療法を可能にする。
【００１８】
したがって、第一の態様では、本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の生存および／または転移転帰をインビトロで予測するための方法であって、ＧＩＳＴの患者由来の生物学的試料における、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのプールのレベルの測定を含む方法を提供する。
【００１９】
「生存および／または転移転帰をインビトロで予測する」とは、本明細書では、患者がＧＩＳＴの転帰後に生存する可能性または転移を発症する危険性があるかどうかを予測することを指す。生存または転移の発症は、転移の診断を受けた患者に関して最初の診断の日から１回目の転移、再発、最後のフォローアップまたは死亡の日まで計算され得る。本発明の特定の実施形態によれば、ＧＩＳＴは、ＧＩＳＴの転帰の５年以内に転移を発症する危険度が高い群、または５年以内に転移を発症する危険性がない群、または中間の群に分類され得る。より詳細には、５年以内に転移を発症する危険度が高い患者の群は、ＡＵＲＫＡが下方調節されている場合５年以内に転移を発症する危険度がない群と比較して、ＡＵＲＫＡが上方調節されている場合、８０％超の５年以内に転移を発症する危険度を特徴とする。
【００２０】
「ＧＩＳＴの患者由来の生物学的試料」とは、本明細書では、ＧＩＳＴ細胞を含有する、ＧＩＳＴのために治療されているまたはＧＩＳＴに罹患している患者から得た任意の生物学的試料を指す。例えば、ＧＩＳＴは未処置の原発性腫瘍であり得る。
【００２１】
「ポリペプチド」は、本明細書では、ＡＵＲＫＡタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９８４３３；配列番号：１）、ＡＵＲＫＡタンパク質フラグメント、ＡＵＲＫＡタンパク質領域またはＡＵＲＫＡタンパク質の誘導体を指す。例えば、ポリペプチドは、ＡＵＲＫＡタンパク質のペプチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはＡＵＲＫＡタンパク質のペプチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはＡＵＲＫＡタンパク質のペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、上記で定義したポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド、または上記で定義したポリペプチドをコードするポリペプチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする任意のポリヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれか、例えば配列番号：２の配列であり得る。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡのいずれかの形態であり得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＩＳＴから調製された全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を使用してＲＴ−ＰＣＲによって直接増幅されたもののいずれかであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【００２３】
ポリペプチドのレベルの測定は、当業者に公知の任意の適切な技術によって実施され得る。例えば、ＡＵＲＫＡタンパク質を特異的に認識する抗体のハイブリダイゼーション後にタンパク質の発現を測定する、免疫組織化学技術であり得る。
【００２４】
ポリヌクレオチドのレベルの測定は、当業者に公知の任意の適切な技術によって実施され得る。例えば、ゲノムＤＮＡのコピー数を調べるためまたはゲノムＤＮＡの発現を定量化するための、ゲノムｑＰＣＲ（定量的重合化連鎖反応）、ＣＧＨアレイ（比較ゲノムハイブリダイゼーション）またはＲＴ−ｑＰＣＲ（リアルタイムｑＰＣＲ）の方法であり得る。
【００２５】
好都合には、ＡＵＲＫＡ発現はＧＩＳＴの生存および／または転移の転帰を予測することを可能にし、他の遺伝子またはタンパク質発現は測定する必要がない。
【００２６】
本発明の方法は、以下の式：
ＧＩ＝Ａ２×Ｃ
［式中、ＡはＧＩＳＴゲノムの変化の数であり、ＣはＧＩＳＴにおける関与染色体の数である］
による、ゲノム指数（ＧＩ）、すなわちＧＩＳＴゲノムの変化の数および種類の計算を含み得る。
【００２７】
「ＧＩＳＴゲノムの変化の数」とは、本明細書では種々の数的および部分的な獲得と喪失を指す。変化には、例えば染色体腕全体もしくは再配列を含まない染色体、または染色体内の獲得もしくは喪失が含まれ得る。ＧＩＳＴゲノムの変化の数は、ＣＧＨアレイなどの当分野で公知の技術によって測定され得る。
【００２８】
「ＧＩＳＴにおける関与染色体の数」とは、本明細書では変化を有するＧＩＳＴ細胞の染色体の数を指す。染色体の数はＣＧＨアレイによって測定され得る。
【００２９】
好都合には、ＧＩＳＴは、ＡＵＲＫＡが下方調節されており、かつＧＩが１０以下である場合、転移および疾患がない生存群のグループに分類される。この場合、ＡＵＲＫＡ発現は９．１３未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満であり得る。この場合、５年間の生存が存在する、すなわちＧＩＳＴの転帰後または治療の終了後５年間、転移または疾患が存在しない。特定の実施形態では、ＧＩＳＴは、ＡＵＲＫＡ発現が、ＡＵＲＫＡ発現の平均値以下であり、かつＧＩが１０以下である場合、５年以内に転移を発症する危険度が低い、すなわち５年以内に転移を発症する危険度が０％〜１０％である群に分類され得、前記平均値は、複数のＧＩＳＴ、例えば５０〜７０のＧＩＳＴのシリーズ、例えば６０ＧＩＳＴにおけるＡＵＲＫＡ発現／レベルの平均値である。この場合、５年間転移または疾患が存在しない。
【００３０】
あるいは、ＧＩＳＴは、ＡＵＲＫＡ発現が、ＡＵＲＫＡ発現の平均値超であり、かつＧＩが１０超である場合、５年以内に転移を発症する危険度が高い、すなわち５年以内に転移を発症する危険度が７５％超である群に分類され得、前記平均値は、複数のＧＩＳＴ、例えば５０〜７０のＧＩＳＴのシリーズ、例えば６０ＧＩＳＴにおけるＡＵＲＫＡ発現の平均値である。この場合、ＧＩＳＴの転帰後または治療の終了後５年間に７５％の転移または疾患の症例が存在する。
【００３１】
本発明の別の目的は、ＧＩＳＴに罹患している患者の生存転帰のインビトロでの予測、および／またはＧＩＳＴのために治療されているもしくはＧＩＳＴに罹患している患者における転移の発症のインビトロでの予測、および／またはＧＩＳＴについての治療の効果の予測のためのキットであって、試料中で、ＡＵＲＫＡ発現／レベルを検出するおよび／または定量化するための手段ならびにＧＩの計算のための手段を含むことを特徴とするキットである。
【００３２】
「ＡＵＲＫＡ発現／レベルを検出するための手段」は、当業者に公知のタンパク質またはポリヌクレオチドのレベルを検出するための任意の手段であり得る。前記手段は、例えば免疫組織化学分析、ウエスタンブロット法またはｑＰＣＲを実施するための手段であり得る。
【００３３】
「ＧＩの計算のための手段」は、本明細書では、ＧＩＳＴゲノムの変化の数およびＧＩＳＴにおける関与染色体の数の計算を可能にする任意の手段を指す。
【００３４】
本発明の別の目的は、ＧＩＳＴの治療において使用するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．試験化合物を、ＧＩＳＴ細胞を含有する患者由来の生物学的試料と接触させる段階、
ｂ．ＡＵＲＫＡの発現またはレベルを測定する段階、
ｃ．ＡＵＲＫＡの前記発現またはレベルを、前記試験化合物と前記試料との接触前のＡＵＲＫＡの発現と比較する段階、
ｄ．ＡＵＲＫＡの発現／レベルの下方調節を可能にする前記試験化合物を選択する段階
を含む方法である。
【００３５】
「下方調節」は、本明細書ではＡＵＲＫＡタンパク質またはポリヌクレオチドの発現またはレベルの何らかの減少を指す。
【００３６】
前記方法はまた、
ｅ．ＧＩを計算する段階、
ｆ．前記ＧＩを前記試験化合物と前記試料との接触前のＧＩと比較する段階、
ｇ．ＧＩの１０以下への下方調節を可能にする前記試験化合物を選択する段階
も含み得る。
【００３７】
本発明の別の目的は、ＧＩＳＴの治療において使用するためのＡＵＲＫＡ阻害剤である。
【００３８】
「阻害剤」は、本明細書では、阻害剤をＧＩＳＴと接触させた場合、ＡＵＲＫＡタンパク質の発現／レベルの低下、またはＡＵＲＫＡの生物学的作用の低減を可能にする任意の化合物を指す。ＡＵＲＫＡ阻害剤は、ＰＨＡ−７３９３５８（２９、５４）、ＭＬＮ８２３７（３０）、ＭＫ−５１０８（３３）であり得る。
【００３９】
本発明の別の目的は、ＧＩＳＴの治療を必要とする被験者におけるＧＩＳＴの治療の方法であって、前記患者に上記で定義した阻害剤の医薬的有効用量を投与する段階を含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】ＣＩＮＳＡＲＣ層別化による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。重心は、以前に公表された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８）３２ＧＩＳＴのシリーズにおいて再トレーニングされており（ａ）、その後６０ＧＩＳＴの本シリーズに適用した（ｂ）。
【図１−２】ＣＩＮＳＡＲＣ層別化による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。重心は、以前に公表された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８）３２ＧＩＳＴのシリーズにおいて再トレーニングされており（ａ）、その後６０ＧＩＳＴの本シリーズに適用した（ｂ）。
【図１−３】ＣＩＮＳＡＲＣ層別化による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。重心は、以前に公表された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８）３２ＧＩＳＴのシリーズにおいて再トレーニングされており（ａ）、その後６０ＧＩＳＴの本シリーズに適用した（ｂ）。
【図２−１】ＡＵＲＫＡ発現による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。ＡＵＲＫＡを今回の６０ＧＩＳＴシリーズにおいて同定して、このシリーズを（ａ）「トレーニングセット」とみなし、Ｙａｍａｇｕｃｈｉのシリーズを（ｂ）「バリデーションセット」とみなす。Ａ１は、平均より下のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。
【図２−２】ＡＵＲＫＡ発現による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。ＡＵＲＫＡを今回の６０ＧＩＳＴシリーズにおいて同定して、このシリーズを（ａ）「トレーニングセット」とみなし、Ｙａｍａｇｕｃｈｉのシリーズを（ｂ）「バリデーションセット」とみなす。Ａ１は、平均より下のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。
【図２−３】ＡＵＲＫＡ発現による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。ＡＵＲＫＡを今回の６０ＧＩＳＴシリーズにおいて同定して、このシリーズを（ａ）「トレーニングセット」とみなし、Ｙａｍａｇｕｃｈｉのシリーズを（ｂ）「バリデーションセット」とみなす。Ａ１は、平均より下のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。
【図３】極めてわずかな再配列を有するＧＩＳＴ（ＧＩＳＴ  Ｎｏ．８）、中等度に再配列されたＧＩＳＴ（ＧＩＳＴ  Ｎｏ．４９およびＮｏ．１１）ならびに高度に再配列されたＧＩＳＴ（ＧＩＳＴ  Ｎｏ．３８）を示す４症例のＣＧＨプロフィール。ゲノム変化をＸ軸上に提示し、１〜２２番染色体に体系化して、Ｙ軸上に対数比の値を報告する。有意の獲得または喪失を、各々のプロフィールの上または下にそれぞれ青色の線および青色の領域で指示する。
【図４−１】（ａ）ＧＩ、（ｂ）ＡＦＩＰ分類および（ｃ）ＡＦＩＰ中間症例のサブグループにおけるＧＩによる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。
【図４−２】（ａ）ＧＩ、（ｂ）ＡＦＩＰ分類および（ｃ）ＡＦＩＰ中間症例のサブグループにおけるＧＩによる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。
【図４−３】（ａ）ＧＩ、（ｂ）ＡＦＩＰ分類および（ｃ）ＡＦＩＰ中間症例のサブグループにおけるＧＩによる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。
【図４−４】（ａ）ＧＩ、（ｂ）ＡＦＩＰ分類および（ｃ）ＡＦＩＰ中間症例のサブグループにおけるＧＩによる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。
【図４−５】（ａ）ＧＩ、（ｂ）ＡＦＩＰ分類および（ｃ）ＡＦＩＰ中間症例のサブグループにおけるＧＩによる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。
【図４−６】（ａ）ＧＩ、（ｂ）ＡＦＩＰ分類および（ｃ）ＡＦＩＰ中間症例のサブグループにおけるＧＩによる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。
【図５−１】ＧＩおよびＡＵＲＫＡ発現の両方による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。Ｃ１は、１０より下のＧＩおよび平均より下のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。Ｃ２は、１０を超えるＧＩおよび平均より上のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。
【図５−２】ＧＩおよびＡＵＲＫＡ発現の両方による転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。Ｃ１は、１０より下のＧＩおよび平均より下のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。Ｃ２は、１０を超えるＧＩおよび平均より上のＡＵＲＫＡ発現を有する腫瘍に対応する。
【図６】転移を有するＧＩＳＴまたは転移を有さないＧＩＳＴの発現プロフィールを比較するｔ検定のボルケーノプロット表示。下部のヴェン図は、ＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーと重複する遺伝子の数を指示する。
【図７】ゲノム指数（ＧＩ、Ｙ軸）とＡＵＲＫＡ発現（ｌｏｇ２、Ｘ軸）との間の関連性を示す散布図。水平および垂直の赤い線は、それぞれ１０のＧＩ閾値およびＡＵＲＫＡの平均発現に対応する。ｒ＝ピアソン相関係数。赤い円は転移症例を指示する。
【図８−１】転移（Ｍ）症例において４０００のより頻繁に欠失されたプローブセット（青色）を示すヒストグラム。非転移（ＮＭ）症例についての対応する頻度は赤色である。Ｙ軸は欠失頻度を示す。下部のパネルは、Ｍ症例とＮＭ症例との間で最も高い差を有するプローブセットの詳細な表示である。
【図８−２】転移（Ｍ）症例において４０００のより頻繁に欠失されたプローブセット（青色）を示すヒストグラム。非転移（ＮＭ）症例についての対応する頻度は赤色である。Ｙ軸は欠失頻度を示す。下部のパネルは、Ｍ症例とＮＭ症例との間で最も高い差を有するプローブセットの詳細な表示である。
【図８−３】転移（Ｍ）症例において４０００のより頻繁に欠失されたプローブセット（青色）を示すヒストグラム。非転移（ＮＭ）症例についての対応する頻度は赤色である。Ｙ軸は欠失頻度を示す。下部のパネルは、Ｍ症例とＮＭ症例との間で最も高い差を有するプローブセットの詳細な表示である。
【図９】１８の転移性ＧＩＳＴの９番染色体ゲノムプロフィール（上のパネル）。欠失および獲得をそれぞれ緑色と赤色で指示する；色の強度はコピー数の変化に比例する。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座（暗緑色）を標的するホモ接合９ｐ２１欠失を示す６症例について詳細な表示を提示する（下のパネル）。
【図１０】ＡＵＲＫＡ遺伝子のタンパク質発現の予後的価値。ＡＵＲＫＡ発現による転移なし（ＭＦＳ）生存率のカプラン−マイヤー分析。ＡＵＲＫＡタンパク質を特異的に認識する抗体との特異的ハイブリダイゼーション後にＡＵＲＫＡタンパク質の発現を測定した。次に抗体のハイブリダイゼーションを発色工程によって明らかにした。
【実施例１】
【００４１】
試験材料および方法
腫瘍試料
６７の新鮮凍結ＧＩＳＴ腫瘍を欧州ＧＩＳＴデータベースＣＯＮＴＩＣＡＧＩＳＴ（ｗｗｗ．ｃｏｎｔｉｃａｇｉｓｔ．ｏｒｇ）から選択し、前記データベースは、患者、原発性腫瘍、治療、フォローアップおよび腫瘍試料の入手可能性についての情報を包含する、ＧＩＳＴ組織からのデータを含む。選択したＧＩＳＴはすべて未処置の原発性腫瘍であった。それらの特徴を補足の表１に示す。大部分のＧＩＳＴ（５９／６７）は、ＣＧＨアレイおよび遺伝子発現プロファイリングの両方によって検討された（ＣＧＨアレイによる６６と遺伝子発現プロファイリングによる６０の組合せ）。
【００４２】
ＤＮＡの単離およびアレイＣＧＨ
標準的なフェノール−クロロホルム法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。参照ＤＮＡ（女性）を血液試料から抽出した。ＤＮＡの濃度と品質を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計およびゲル電気泳動を用いて測定した。腫瘍ＤＮＡおよび対照ＤＮＡを８×６０Ｋの全ゲノムＡｇｉｌｅｎｔアレイ（Ｇ４４５０Ａ）にハイブリダイズした。簡単に述べると、各々の試料について、ＤＮＡ  ３５０ｎｇを二重酵素消化（ＡｌｕＩ＋ＲｓａＩ）によって断片化し、標識化およびハイブリダイゼーションの前にＬａｂＯｎＣｈｉｐ（２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検査した。腫瘍および対照ＤＮＡをそれぞれＣＹ５−ｄＵＴＰおよびＣＹ３−ｄＵＴＰでのランダムプライミングによって標識化し、６５℃で２４時間、２０ｒｐｍで回転させながらハイブリダイズした。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５８５ＣＡ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてアレイをスキャンし、Ｆｅａｔｕｒｅ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ１０．１．１．１ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて画像解析を行った。Ｆｅａｔｕｒｅ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ１０．１．１．１ソフトウエアにおいて利用可能なランキングモード法を用いて、任意のパラメータについてのデフォルト値で正規化を行った。生コピー数比データをＣＧＨ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ｖ４．０．７６ソフトウエアに移した。ＣＧＨ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ｖ４．０．７６ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ）のＡＤＭ−２アルゴリズムを使用して、プローブレベルでＤＮＡコピー数の異常を同定した。低レベルのコピー数獲得をｌｏｇ２比＞０．２５と定義し、コピー数喪失をｌｏｇ２比＜−０．２５と定義した。高レベルの獲得または増幅は、ｌｏｇ２比＞１．５と定義し、比率が−１より下である場合はホモ接合欠失が疑われる。予後についての判定基準を確立するため、１００プローブ超を含む変化を、異常フィルターを用いて自動的にコンピュータ処理した。
【００４３】
リアルタイムゲノム定量的ＰＣＲおよびシークエンシング
ｐ１６、ｐ１５およびｐ１４のコピー数状態を測定するため、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてゲノムＤＮＡに関してリアルタイムＰＣＲを実施した。結果を正規化するために、３つの参照遺伝子：ＧＡＰＤＨ、ＡＬＢおよびＲＰＬＰ０を使用し、これは、各々の腫瘍について、これらの参照遺伝子の少なくとも２つを正常コピー数で得るためであった（アレイＣＧＨ）。ＲＰＬＰ０のために使用したプライマーおよびプローブは以下のとおりである：（正プライマー）５’−ＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＡ−３’（配列番号：３）；（逆プライマー）５’−ＣＣＡＧＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴ−３’（配列番号：４）；（プローブ）５’−ＡＧＧＴＧＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＡＴＴＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡ−３’（配列番号：５）。使用した他のプライマーおよびプローブは以前に述べられている（５２）。腫瘍データを、正常ＤＮＡについて得られたデータに対して正規化した。次に結果を以前に述べられているように計算した（５２）。正常状態は０．８≦比≦１．２に対応し、０．１＜比＜０．８はヘミ接合欠失とみなされる。比率が０．１より下である場合、欠失はホモ接合とみなされる。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座を先に述べられているように（［５２］）シークエンシングに供し、Ｈｏｕｄａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ（５３）に従ってゲノムＤＮＡを用いてまたは以下のプライマーでｃＤＮＡを用いてＲＢ１遺伝子を配列決定した：（正プライマー１）５’−ＴＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：６）、（逆プライマー１）５’−ＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＡＣＣ−３’（配列番号：７）；（正プライマー２）５’−ＡＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号：８）、（逆プライマー２）５’−ＣＴＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＣＧＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：９）；（正プライマー３）５’−ＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＴＴＡＧＧ−３’（配列番号：１０）、（逆プライマー３）５’−ＴＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：１１）；（正プライマー４）５’−ＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：１２）、（逆プライマー４）５’−ＴＣＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号：１３）；（正プライマー５）５’−ＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：１４）、（逆プライマー５）５’−ＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号：１５）。
【００４４】
ＲＮＡの単離および１色アッセイによる遺伝子発現プロファイリング
全ＲＮＡをトリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で凍結腫瘍試料から抽出し、製造者の手順に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎ  Ｅｌｕｔｅ  ＴＭ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡの品質をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検査した。ＲＮＡ完全性番号（ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）（ＲＩＮ）＞６．５を有するＲＮＡをマイクロアレイのために使用した。
【００４５】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ４４Ｋ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ａｒｒａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて遺伝子発現分析を実施した。この特異的アレイは４１０００を上回るヒト遺伝子および転写産物を示し、そのすべてがパブリックドメインアノテーションを有する。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を、Ｔ７オリゴ−ｄＴプロモータープライマーを組み込むことによってｃＲＮＡに逆転写した後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて蛍光ｃＲＮＡを作製した。標識したｃＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００装置を用いて定量化した。これらの実験では、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＣｙ３標識（試料）ｃＲＮＡをアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション物を、６５℃に設定した、１０ｒｐｍで回転するＨｙｂ  ＯｖｅｎにおいてＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＨｙｂチャンバーで１７時間インキュベートした。マイクロアレイのスライドガラスを製造者の指示に従って洗浄し、その後Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＢＡ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンして、Ｆｅａｔｕｒｅ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ１０．１．１．１ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて画像解析を行った。
【００４６】
すべてのマイクロアレイデータを、Ｑｕａｎｔｉｌｅアルゴリズムを使用して同時に正規化した。Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｔ検定を実施し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を用いてＰ値を調整した。Ｐ値および遺伝子選択のための倍数変化カットオフ値はそれぞれ０．００１および３であった。Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＧＯ用語の統計的集積を確立するために遺伝子オントロジー解析を実施した。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲ
逆転写およびリアルタイムＰＣＲを以前に述べられているように実施した（５２）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した：ＡＵＲＫＡについてはＨｓ０１５８２０７２＿ｍ１；ＲＢ１についてはＨｓ０１０７８０６６＿ｍ１；ＧＡＰＤＨについてはＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１；ＡＣＴＢについてはＨｓ９９９９９９０３＿ｍ１およびＲＰＬＰ０についてはＨｓ９９９９９９０２＿ｍ１。ｐ１４およびｐ１６発現レベルを以前に述べられているように評価した（５２）。結果を正規化するため、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢおよびＲＰＬＰ０遺伝子を参照遺伝子として使用した。各々の遺伝子につき各々の試料に関して三重に実施した。各試料についての参照ＣＴ（閾値サイクル数）は、３つの参照遺伝子の測定されたＣＴの平均値と定義された。試料中のＡＵＲＫＡの相対的ｍＲＮＡレベルは、ΔＣＴ＝ＣＴ（関心対象の遺伝子）−ＣＴ（３つの参照遺伝子の平均値）と定義された。
【００４８】
統計解析
予後を判定するため、最短重心法を適用した。重心は、各患者の転帰（転移および非転移）についてのシグネチャー遺伝子の発現の中心平均（ｃｅｎｔｅｒｅｄ  ｍｅａｎ）である。したがって、重心をコホート１の試料（１７）から計算し、次に本発明者らのシリーズの各試料（したがってバリデーションセットとみなされる）を、最も高いスピアマン相関を有する予後クラス（重心）に割り当てた。
【００４９】
転移なしおよび疾患なし生存率を、転移の診断を受けた患者に関して最初の診断の日から１回目の転移、再発、最後のフォローアップまたは死亡の日までカプラン−マイヤー法によって計算した。生存率曲線をログランク検定と比較した。ハザード比を、コックス比例ハザードモデルを用いて実施した。すべての統計解析は、Ｒソフトウエアバージョン２．１１．１１および「生存率」パッケージを用いて実施した。
【実施例２】
【００５０】
結果
ＣＩＮＳＡＲＣはＧＩＳＴにおける重要な予後因子である
本発明者らが以前に公表したシグネチャーがＧＩＳＴにおいて予後的価値を有し得るかどうかという問題を評価するため、６７ＧＩＳＴのシリーズにおいて発現プロファイリングを実施した（表１）。
【００５１】
【表１】
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これらの中で、６０症例（８９．５％）について十分なｍＲＮＡ品質を得た。公表されているシリーズ（１７）を、重心を再トレーニングするためのトレーニングセットとし、本シリーズをバリデーションセットとして使用して、ＣＩＮＳＡＲＣ最短重心シグネチャー（１８）をＧＩＳＴに適用した。カプラン−マイヤー分析（図１）は、両方のシリーズにおいてＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーが、腫瘍を大きく異なる転移なし（ＭＦＳ）および疾患なし（ＤＦＳ）生存率を有する２つの群に分けることを明らかにした（バリデーションセット：ＭＦＳ：ＨＲ＝１８．３、９５％ＣＩ＝［２．４〜１４０］、Ｐ＝０．００５およびＤＦＳ：ＨＲ＝１９．６、９５％ＣＩ＝［２．６〜１４９．５］、Ｐ＝０．００４）。
【００５２】
転移の転帰に関連する遺伝子発現の変化
上記に提示した結果は、有糸分裂制御および染色体の完全性（ＣＩＮＳＡＲＣ）に関与する遺伝子の発現がＧＩＳＴにおける生存転帰に関連することを指示する。そこで本発明者らは、逆の現象も当てはまるかどうか、すなわち転移症例と非転移症例との間の区別的発現がそのような遺伝子を同定することができるかどうかを検討した。この問題を評価するため、転帰によって層別化した腫瘍発現プロフィールを比較する目的変数ありｔ検定（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を実施した。２９７の区別的に発現された遺伝子（３３８プローブセット）（表２）の中で、７０（８６プローブセット）は転移症例において下方調節されており、２２７（２５２プローブセット）は転移症例において上方調節されていた（ＦＣ＞３およびＰ＜０．００１）。
【００５３】
【表２】
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７０の下方調節された遺伝子に関して、有意の濃縮経路は同定されなかった。これに対し、２２７の上方調節された遺伝子のうち４５がＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーに属することを認めた（図６）。さらに、遺伝子オントロジー解析は、この遺伝子選択（２２７の転移で上方調節された遺伝子）での濃縮経路がＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーにおける濃縮経路とほとんど同じであることを明らかにした。実際に、７７の濃縮経路のうち６３（８２％）がＣＩＮＳＡＲＣ遺伝子と共通した（表３）。
【００５４】
【表３】
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さらに、ＣＩＮＳＡＲＣには含まれなかった１８２遺伝子の遺伝子濃縮解析は、この遺伝子セットもＣＩＮＳＡＲＣ遺伝子と同じ経路、すなわち有糸分裂の制御と染色体の完全性に関与する遺伝子によって濃縮されていることを示した（表４）。
【００５５】
【表４】
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ＡＵＲＫＡは転移転帰の重要なマーカーである
本発明者らは、ＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーを低減する可能性を調べるため、目的変数ありの分析結果を利用した。目的変数ありｔ検定において上位に分類された重要な遺伝子の中で、ＡＵＲＫＡ（以前はＳＴＫ６またはＳＴＫ１５と称された、オーロラキナーゼＡ）はＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーにも同時に属する最も上位にランクされた遺伝子であった（表１）。そこで本発明者らは、ＡＵＲＫＡ単独でＣＩＮＳＡＲＣと同じように転帰を予測できるかどうかを試験し、試料をそれらのＡＵＲＫＡ発現に従って層別化した（９．１３の平均発現をカットオフ値とした、表５）。
【００５６】
【表５】
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この目的のために、本６７ＧＩＳＴシリーズをトレーニングセットとみなし、Ｙａｍａｇｕｃｈｉのシリーズをバリデーションセットとみなした。次に発現データをｑＲＴ−ＰＣＲによって検証し、両技法の間に高い相関を認めた（ピアソン相関係数＝０．９４；Ｐ＜１×１０−１５）。生存率解析は、得られた２つの群が、トレーニングセット（本シリーズ、ＭＦＳ：Ｐ＝５．３１×ｌ０−１１およびＤＦＳ：Ｐ＝３．６１×ｌ０−１２、図２ａ）およびバリデーションセット（Ｙａｍａｇｕｃｈｉのシリーズ、ＭＦＳ：Ｐ＝９．５×ｌ０−４、図２ｂ）の両方において非常に異なる転帰を有することを明らかにした。
【００５７】
染色体の複雑度はＧＩＳＴの重要な予後因子である
本発明者らは以前に、ＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーがゲノムの複雑度に関連することを示しており（１８）、そのため、ＧＩＳＴゲノムの変化レベルがＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーおよび転移転帰と相関するかどうかという疑問が生じる。６０，０００オリゴヌクレオチドを含むアレイによるゲノムプロファイリング（試験材料および方法参照）を、十分なＤＮＡ品質を有する６６ＧＩＳＴに関して実施した。単純な、すなわち検出可能な変化を有さないものから、数的および部分的な獲得と喪失を有する複雑なものまで、種々のプロフィールが得られた（図３）。５ｐ増幅を有する１例（ＧＩＳＴ１７）を除き、６６プロフィールにわたって高レベルの増幅は検出されなかった。変化の大部分は、染色体腕全体または再配列を有さない染色体を含んだ。実際に、少数の変化だけが検出された場合（８未満）、これらは常に腕全体または染色体に影響を及ぼし、一方プロ−フィルが１０超の変化から成る場合は、染色体内の獲得または喪失を認めることができた。これらの基準、すなわち変化の数と種類を考慮に入れた数値的方法を定義するため、ゲノム指数（ＧＩ）を各々のプロフィールについて以下のように計算した：ＧＩ＝Ａ２×Ｃ（Ａ＝変化の数およびＣ＝関与染色体の数）。次に、腫瘍を、それらのＧＩが１０より下であるかまたは１０より大きいかに依存して、それぞれＧＩ１またはＧＩ２の２つの群に割り当てた（表５）。カプラン−マイヤーの転移なしおよび疾患なし生存率分析は、この層別化が腫瘍を、大きく異なる転帰を有する２つの群に分けることを明らかにした（図４ａ）。さらに、このゲノム層別化は、ＡＦＩＰ分類の中間危険度群において異なる転移転帰を有するＧＩＳＴを同定することができる（９）（図４ｂおよびｃ）。
【００５８】
統合的解析は危険性のない患者群の同定を可能にする
これらの結果を全体として考慮して、本発明者らはＧＩおよびＡＵＲＫＡ発現に基づく判定アルゴリズムを構築する。より詳細には、ＧＩとＡＵＲＫＡ発現の間には正の相関が存在する（ピアソン相関、ｒ＝０．６５、図７）。本発明者らは、平均より下のＡＵＲＫＡ発現および１０未満のＧＩを有する腫瘍は決して転移または再発を発症しないことを認めた（図７、表５）。これと一致して、カプラン−マイヤーのＭＦＳおよびＤＦＳ分析は、良好な予後因子（ＡＧ１：ＡＵＲＫＡ発現＜平均およびＧＩ＜１０）を有する腫瘍は１００％の５年間ＭＦＳを有し、一方不良予後因子（ＡＧ２：ＡＵＲＫＡ発現＞平均またはＧＩ＞１０）を有する腫瘍は２３％の５年間ＭＦＳを有することを明らかにした（Ｐ＝２．６１×１０−８、図５）。したがって、このアルゴリズムは危険性のない患者群の個別化を導く（ＡＧ１：ＡＵＲＫＡ発現＜９．１３およびＧＩ＜１０）。
【００５９】
Ｐ１６／ＲＢ１経路は転移転帰に関連する
これらの所見の結果として、本発明者らは、何らかの特定の変化が患者の転帰に関連するかどうかを調べるためにＣＧＨアレイデータを再検討した。転移転帰を有するＧＩＳＴと転移転帰を有さないＧＩＳＴの間で各プローブセットの変化の頻度を比較した（図８）。これら２つの群間で獲得の頻度には有意差を認めなかった（データは示していない）。しかし、転移症例において上位にランクされた欠失頻度の中で、転移症例と非転移症例のそれぞれ７８．９％および９．６％において欠失した８プローブセットについて最も高い差が認められた（図８）。すべてのプローブセットは９ｐ２１に局在し、ＣＤＫＮ２Ａ（３プローブセット）、ＣＤＫＮ２Ｂ（３プローブセット）またはＭＴＡＰ（２プローブセット）遺伝子座のいずれかを標的する。９ｐ２１欠失は１８例で認められ（１８／６６＝２７％）、これらの腫瘍の中で１３例が転移を発症した（１３／１８＝７２％）。これらの欠失はどちらも、９ｐ腕全体を含むかまたはＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ遺伝子座だけに限定され、非常に低いＣＧＨ比によって指示されるように７例（６／７が転移転帰を有する）についてホモ接合であると推測された（図９）。最も頻度の高い欠失領域は３つの遺伝子座（ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２ＢおよびＭＴＡＰ）を含むと思われたが、ホモ接合欠失を有する２つの腫瘍はＭＴＡＰを除外したので（ＧＩＳＴ  Ｎｏ．５およびＮｏ．１７）、ホモ接合欠失によって関心対象の遺伝子をより正確に同定することが可能になった。したがって、ゲノムｑＰＣＲによってＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂのコピー数状態を調べ、すべてのＣＧＨ結果を完全に確認した。特に、疑わしいホモ接合欠失が確認され、洗練されて、ＧＩＳＴ  Ｎｏ．５におけるホモ接合欠失はＣＤＫＮ２Ａだけを含み、ＣＤＫＮ２Ｂ（その１コピーは保持された）は含まないことを認めた（表５）。その後、ホモ接合欠失を有さない、ＤＮＡが入手可能であったすべてのＧＩＳＴ（５８症例）をＣＤＫＮ２Ａ配列決定に供した。突然変異は全く検出されず（データは示していない）、３つのＳＮＰ（ＲＳ３７３１２４９、ＲＳ１１５１５および１つの非参照（ｕｎｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）サイレントＳＮＰ：ｃ．＊５６Ｇ＞Ａ）だけがそれぞれ４、１４および２０例において同定された。ｐ１４およびｐ１６発現（どちらのｍＲＮＡも同じＡｇｉｌｅｎｔプローブセットにハイブリダイズした）を正確に定量化するため、ｐ１４およびｐ１６  ＲＴ−ｑＰＣＲのための特異的プローブを使用して発現を定量化した（表５）。ｐ１６のコピーを有さないすべての腫瘍（７例）および１コピーだけを有する３つの腫瘍において、ｐ１６  ｍＲＮＡはほとんど存在しなかった；そしてホモ接合欠失を有する２例と組織学的ブロックが入手可能であったヘミ接合欠失を有する３例において、ＩＨＣによりタンパク質は検出されなかった（データは示していない）。ｐ１６  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の欠如は、それゆえ、１０例において証明され、そのうち９例は転移群（１８例）に属していた。
【００６０】
そこで本発明者らは、別のゲノム変化が、ｐ１６ホモ接合欠失を有さない症例においてｐ１６経路の不活性化を導き得ると仮定した。ＲＢ１遺伝子座の１例のホモ接合欠失および１３例のヘミ接合欠失を認めた（表６）。
【００６１】
【表６】
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ＲＢ１欠失を保有する１１例の腫瘍はＡＧ２に分類され、８例が転移を発症した。興味深いことに、ｐ１６ホモ接合欠失を有する腫瘍はＲＢ１欠失を有さないが、それらは高度に再配列されている。ＲＮＡおよびＤＮＡが入手可能であったすべての患者（６６症例）においてＲＢ１を配列決定し、ＧＩＳＴ  Ｎｏ．６１において保持されるコピー中に１つの突然変異（ｃ．ｌ９５９＿１９６０ｄｅｌ／ｐ．Ｌｙｓ６５３ＡｓｎｆｓＸ１４）を同定した。ｑＰＣＲ分析は、欠失腫瘍がＲＢ１の有意に下方調節された発現を有することを確認した（表６）。
【００６２】
結論：
本発明者らは、ＣＩＮＳＡＲＣが転移転帰を予測するための非常に強力なシグネチャーであることを明らかにした。ＣＩＮＳＡＲＣは、そのすべてが染色体の完全性および有糸分裂制御経路に関与する６７遺伝子から成り、本発明者らが最近肉腫において明らかにしたように（１８）、そのような機構がこの腫瘍型における転移の発症を駆動すると思われることを指示する。これは逆のアプローチからの結果と一致し、逆のアプローチとは、転移転帰を有するＧＩＳＴまたは転移転帰を有さないＧＩＳＴの間で区別的に発現される遺伝子の同定である。実際に、１８の転移腫瘍における２２７の上方調節された遺伝子の中で、４５はＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーと共通し、活性化経路はほとんど同じであった。これらの結果は、ゲノムの完全性および有糸分裂制御が転移の発症の根底にある有効な抑制機構であること、およびさらに、これらの機構が十分であるまたは少なくとも最強であると思われることを指示する。これと一致して、本発明者らは、両方のアプローチにおいて上位にランクされた遺伝子、ＡＵＲＫＡの発現が、両シリーズのＧＩＳＴにおいて転移転帰を予測するためにＣＩＮＳＡＲＣと同程度に有効であることを示す。
【００６３】
ゲノム完全性の制御の中心的役割を実証する本発明者らの結果に従って、そのような機構の欠陥は染色体不均衡を導くはずであり、そして生じるゲノムの複雑度もＧＩＳＴにおける転帰を予測するはずであると仮定した。変化の数および変化した染色体の数を統合するＣＧＨゲノム指数（ＧＩ）による腫瘍の層別化は、明らかに異なる転帰の２つの群を形成するので、これはまさに本明細書で本発明者らが示すことである。全染色体の喪失はＧＩＳＴにおいて認められる最も頻度の高い変化であり、これらは、ＡＵＲＫＡ過剰発現などの有糸分裂チェックポイントの欠陥によって誘発される染色体分離欠損から生じると推測されるので、これは明らかにＡＵＲＫＡ発現結果と一致する（３４）。
【００６４】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉらの結果と異なり、本発明者らの試験は、ＣＩＮＳＡＲＣ、ＡＵＲＫＡ発現またはＣＧＨの予後的価値が腫瘍の位置とは無関係であることを明らかにする。さらに、上述したように、ＣＩＮＳＡＲＣの生物学的意味およびゲノム変化とのその関連性は、ＣＩＮＳＡＲＣ遺伝子が悪性進行に関与しており、単なるプロセスの帰結ではないことを強く指示する。この仮説は、ＣＤＫＮ２Ａ欠失（転移転帰を有する１８例の中で６例ではホモ接合欠失および９例ではヘミ接合欠失、これに対し４８の非転移患者では５例のヘミ接合欠失）、ＣＩＮＳＡＲＣ予後群および転移発生の間での、本発明者らが本明細書で認める関連性によって裏付けられる。以前の試験で、ＣＤＫＮ２Ａ変化またはｐ１６ＩＮＫ４ａの発現の腫瘍進行との潜在的な結びつきが既に指摘されている（１１〜１６、４３）。それにもかかわらず、主として９ｐ２１遺伝子座における標的遺伝子についての明確な説明がないため、データは依然として議論の余地がある。ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２ＢまたはＭＴＡＰのいずれの遺伝子が予後不良への結びつきを駆動するのかはまだ不明である。ゲノムレベルでは、ＣＤＫＮ２Ａおよび２Ｂは体系的に共欠失されると思われるとしても（３７、４４、４５）、２つの試験は、９ｐ２１欠失がＭＴＡＰ遺伝子を標的する可能性が高く、ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂに限定されないことを指示する（３５、４６）。本明細書において、ＣＧＨおよびゲノムｑＰＣＲ分析は、ホモ接合欠失がＣＤＫＮ２Ａを特異的に標的することおよび欠失の共通領域はＣＤＫＮ２ＢおよびＭＴＡＰを除外することを明らかにした。驚くべきことに、試験したいずれのＧＩＳＴ症例においても有害なＣＤＫＮ２Ａ突然変異を認めなかった。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ−Ｓｔｏｃｋら（１４）は、４３ＧＩＳＴのシリーズにおいて９例のいわゆる突然変異を報告した。しかしそれらのうちの２つは同一であり、腫瘍およびその再発において検出されており、１つは現在ＳＮＰとして参照され、２つはサイレント突然変異であり、１例では解釈可能な配列が得られなかった。これをすべて考慮すると、著者らは、４つのＣＤＫＮ２Ａ突然変異だけを証明した（４／４３＝９％）。これらのデータによれば、本発明者らの試験ではおよそ５の突然変異が予想され、本発明者らは、これまで言及されていない３つの変化、すなわち２つのＳＮＰと１つのサイレント変化を同定した。この不一致についての１つの説明は標本抽出バイアスであり得るが、本発明者らが、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｓｔｏｃｋらの試験で報告されたよりも２倍多いホモ接合ＣＤＫＮ２Ａ欠失を検出した（７／６３対２／４３）ことは注目に値する。別の排他的な変化がｐ１６不活性化を伴わない攻撃性腫瘍（ＣＩＮＳＡＲＣ  Ｃ２、ＡＧ２）を説明し得るという発想に従って、本発明者らはＲＢ１の機能性コピーを有さない２つの腫瘍および１つのＲＢ１コピーの喪失に起因する有意に下方調節された１２の腫瘍を同定した（ｐ値）。これらの腫瘍においてトランケーション突然変異は検出されなかったが、本発明者らは、アレイの低い分解能のために同定されなかった微小欠失が、肉腫におけるように（４７）、この第二の不活性化を説明し得ると仮定する。ｐ１６���よびＲＢ１変化の排他的な発生は、ＣＤＫＮ２Ａホモ接合欠失を有する腫瘍はいずれもＲＢ１欠失を保有せず、これらの欠失の１つを有する２９ＧＩＳＴの中で、３例だけが両方の欠失を保有するという所見によって強く裏付けられる（表１）。全体では、ｐｌ６／ＲＢ１経路は、転移転帰を有する患者と転移転帰を有さない患者のそれぞれ１４／１８（７８％）および３／４８（６％）において不活性化または下方調節され、これは、ｐｌ６／ＲＢ１経路の不活性化が転移の発症に結びつくことを明確に意味する。
【００６５】
ＣＤＫＮ２Ａは、細胞周期Ｇ１およびＧ２／Ｍ移行の調節に関与する、２つの鍵となる腫瘍サプレッサータンパク質、ｐｌ６ＩＮＫ４ａおよびｐｌ４ＡＲＦをコードする。合わせて考慮すると、これらのタンパク質は２つの重要な細胞周期チェックポイント、ｐ１４およびｐｌ６ＩＮＫ４ａについてのｐ５３およびＲＢ１経路をそれぞれ調節する。これらの遺伝子の喪失は複製老化、細胞不死化および腫瘍増殖を導き得る（４８〜５１）。ＣＩＮＳＡＲＣ遺伝子の大部分はＥ２Ｆの転写制御下にあり、Ｅ２ＦはＲＢ１相互作用によって厳密に調節される。実際に、ＲＢ１はＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）によるＲＢ１のリン酸化後に送達されるＥ２Ｆを隔離し、ｐｌ６ＩＮＫ４ａはＣＤＫ４を阻害する。それゆえ本発明者らの結果から、主として欠失による、ＧＩＳＴにおけるｐｌ６／ＲＢ１経路の不活性化は、有糸分裂の制御に関与する遺伝子の過剰発現を導く原因となる変化である可能性が高いと仮定することができる。この脱制御は細胞ゲノムの再配列を開始させ、再配列は、組合せが自然に選択され、固定されるまで続く。したがって、生じるゲノムの複雑度およびその関連発現は、腫瘍細胞の攻撃性と転移能を付与する。この仮説は細胞およびマウスモデルにおいて実験的に立証されねばならないが、機能性ｐｌ６／ＲＢ１経路を有するまたは有さないＧＩＳＴの発現分析によって裏付けられ、前記分析は、機能性ｐｌ６／ＲＢ１経路を有さないＧＩＳＴにおいて上方調節される４２／２２５（１９％）遺伝子がＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーと共通することを示す。さらに、これら２２５遺伝子はＣＩＮＳＡＲＣおよび転移シグネチャーにおいて濃縮されるものと同じ経路に関与する（補足の表３）。
【００６６】
イマチニブメシル酸塩は、ＧＩＳＴ細胞における増殖と生存を阻害するＫＩＴ異常シグナル伝達を標的することが証明されている。２００９年まで、イマチニブ療法は診断の時点で播種性または進行した疾患に限定された。それ以降、アジュバント治療が承認され、そのような管理から恩恵を受ける可能性が高い患者を同定する選択基準を適用する必要性が浮上してきた。ＦＤＡ（食品医薬品局）によって、およびより低い度合でＥＭＡ（欧州医薬品庁）によって予測された患者選択は、基本的に組織学的危険度評価に基づく。ＡＦＩＰ（９）およびＮＩＨ（８）の両方の組織学に基づく病期判定システムが、腫瘍の転移危険度を決定するうえでの、およびＧＩＳＴ患者がイマチニブによるアジュバント療法に適格であるか否かを判定するための「ゴールドスタンダード」として広く受け入れられている。本明細書において本発明者らは、ＣＩＮＳＡＲＣシグネチャーおよびＡＵＲＫＡ発現が、特にＣＧＨゲノム指数に関連づけた場合、ＡＦＩＰ分類（ＡＦＩＰ分類による生存率分析を図４に提示する）をしのぐことを示す。特に興味深い点として、ゲノム指数は、これらの組織病理学的システムによって中間危険度と分類されたＧＩＳＴ（診断の約２５％を占める）において予後良好な患者と予後不良の患者を識別することができる。より詳細には、１６のＡＦＩＰ中間危険度症例の中で、４例が転移を発症した。これらの症例はＧＩによって予後不良と分類された（図４および表５）。ＣＧＨは、増加しつつある数の病理学科によって日常の診療で既に使用されている技術であり、ホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に適用できるので、この試験で確立されたＧＩは、それゆえ、治療から恩恵を受ける可能性がより高いＧＩＳＴ患者を管理するための非常に強力なツールである。ＧＩの臨床適用を検証するため、本発明者らは、ＦＦＰＥブロックからのＤＮＡに関してＣＧＨを実施するためにより大きなコホートのＦＦＰＥ  ＧＩＳＴ試料を収集している。
【００６７】
本発明者らは、したがって、ＡＦＩＰまたはＮＩＨ等級付けシステムを強化するまたはこれらの組織病理学的方法に取って代わる２つの可能な判定方法を提案する。第一に、ＡＦＩＰまたはＮＩＨ分類を使用する場合、中間危険度症例は治療の管理のために問題があり、本発明者らの結果は、ＣＧＨプロファイリングの使用がそのような問題を容易かつ速やかに解決できることを明らかにする。第二に、本発明者らの結果は、ＧＩとＡＵＲＫＡ発現の併用が、ＡＦＩＰ分類よりもイマチニブ療法のための患者のより良好な選択を提供することを示唆する。どちらの方法も転移危険度を有する患者のための効率的な治療を等しく提供するが、完全に試験者非依存性である、ＣＩＮＳＡＲＣ／ＡＵＲＫＡに基づく選択は、誤ってイマチニブ療法に適格であると指定される、転移の危険性のない患者の数を一貫して低減する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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