(57)【要約】  本発明は、増殖疾患または病態、特に前立腺癌の進行、退縮および／またはそれからの生存を検出、スクリーニング、診断または決定するための組成物および方法に関する。本発明はまた、前立腺癌患者または前立腺癌を有する疑いのある患者を病期分類または層別化するための新たなアッセイおよびキットを提供する。
2014519818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌を有する疑いのある対象を二元層別化する方法であって、
ａ．前記対象から得られた試料中のＦＡＳ、ＮＰＹ、ＵＳＰ２ａ、およびＡＭＡＣＲからなる群から選択される１つ以上の予測因子変数のレベルまたはグレードを決定すること；ならびに
ｂ．前記１つ以上の予測因子変数のレベルまたはグレードに基づき少なくとも５年間生存する可能性が高いか否か前記対象を層別化することを含み、前記予測因子変数のグレードは、３未満である方法。
【請求項２】
前記対象は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の上昇について既にスクリーニングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測因子変数は、ＵＳＰ２ａである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記予測因子変数は、ＡＭＡＣＲである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記予測因子変数のグレードは、２未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記予測因子変数は、ＦＡＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記予測因子変数は、ＮＰＹである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＰＳＡの計測値は、総ＰＳＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は、組織生検を受けており、前記生検の評価は、５〜７の組織グリーソンスコアを明らかにした、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の予測因子変数のレベルまたはグレードを決定することは、前記１つ以上の予測因子変数のＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかを計測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質レベルを計測する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質レベルを免疫組織化学アッセイにより計測する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫組織化学アッセイは、１つ以上の予測因子変数特異的抗体を利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の予測因子変数特異的抗体は、検出可能な標識を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象における５年生存の予測についての免疫組織化学キットまたはアッセイであって、１つ以上の予測因子変数特異的抗体を含み、それぞれが、検出可能な標識をそれぞれ含むとともに、ＦＡＳ、ＮＰＹ、ＵＳＰ２ａ、およびＡＭＡＣＲからなる群から選択される免疫組織化学キットまたはアッセイ。
【請求項１６】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）遺伝子またはタンパク質を標的化するプローブをさらに含む、請求項１５に記載の免疫組織化学キットまたはアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖疾患または病態の進行、退縮および／またはそれからの生存を検出、スクリーニング、診断または決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ癌協会によれば、２００９年、米国において前立腺癌の１９００００人を上回る症例が報告され、２７０００人を上回る関連死が存在した。バイオマーカとしてのＰＳＡ（前立腺特異的抗原）の使用を含む検出の進歩および臨床管理の改善にかかわらず、予測、患者層別化、および治療レジメンの最適化といった領域における臨床ツールが長きにわたり切望されたままである。
【０００３】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺疾患を検出するための生物学的マーカまたは腫瘍マーカとして使用されている。ＰＳＡは、前立腺の細胞により産生されるタンパク質である。ＰＳＡ試験は、ＰＳＡの血中レベルを計測するが；ＰＳＡ単独は、前立腺疾患の存在の確実な指標ではない。
【０００４】
男性が血中で低レベルのＰＳＡを有することが通常である。ＰＳＡの参照範囲は、外見上健常な男性のコホートの９９％が４ｎｇ／ｍＬ未満の総ＰＳＡレベルを有することを見出した研究に基づき０から４．０ｎｇ／ｍＬである。正常の上限値は、４ｎｇ／ｍＬよりもかなり低い。ＰＳＡのレベルの増加は、前立腺癌の存在を示唆し得；しかしながら、前立腺癌は、ＰＳＡレベルの上昇の完全な不存在下でも存在し得、この場合において試験結果は偽陰性である。
【０００５】
ＰＳＡレベルが上昇した男性は、典型的には、前立腺癌の潜在的な存在を評価するために生検を受ける。生検後、前立腺組織の組織病理学的格付けをグリーソンスコア付けにより実施し、それは腫瘍をそれらの最も高頻度の構造に基づき１から５（最大分化から最小分化）に分類し、２つの最も一般的なパターンの合計である組み合わせたスコアを割り当てる。患者は、それらの原発性腫瘍の状態によっても診断され、臓器限局から完全侵襲（Ｔ１〜４）、リンパ節転移の有無（Ｎ０または１）、ならびに遠隔転移の存在および程度（Ｍ０および１ａ〜ｃ）である。
【０００６】
前立腺癌が診断される場合、慣用の治療レジメンは、前立腺の外科的切除および放射線照射法を含む。進行癌の症例において、これらのレジメンは、通常、全身腫瘍組織量および／または循環ＰＳＡを低レベルまたは検出不能レベルに最初に低減させるアンドロゲン除去療法に続き、またはその療法により置換されるが、最終的にはほとんどの症例において疾患が再発する。
【０００７】
前立腺癌において、２７０ｋＤａの細胞質タンパク質である脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）が、前立腺上皮内癌（ＰＩＮ）から始まる大多数の腫瘍の自然史全体にわたり過剰発現される。このタンパク質は、ほとんどの正常なヒト組織中で低レベルから検出不能なレベルで発現される。腫瘍細胞におけるＦＡＳ過剰発現についての生化学および代謝基盤は十分理解されていないが、ＦＡＳ過剰発現は、選択的成長の優位性を腫瘍細胞に付与すると考えられている。高ＦＡＳレベルを発現する前立腺腫瘍は侵襲性生物学的挙動を示し、過剰発現は、不良予後と関連している。
【０００８】
男性が加齢するにつれ、良性前立腺病態および前立腺癌の両方がより一般的になり、Ｐ
ＳＡレベルの増加をもたらす。ＰＳＡレベルは、前立腺感染、過敏または良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を含む病態により増加され得る。
【０００９】
しかしながら、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によれば、ＰＳＡレベル単独では、医師に良性前立腺病態と癌とを区別するために十分な情報を与えない。治療は、患者の進行リスクならびに成功の見込みおよび治療のリスクに基づき個別化されることを必要とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】残差（＝観察値−予測値）を示す生存時間方程式の残差五分位数プロットである。
【図２】ＦＡＳ＝０、グリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２を有する患者についての分布プロファイラダイアグラムである。
【図３】ＦＡＳ＝１、グリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２を有する患者についての分布プロファイラダイアグラムである。
【図４】ＦＡＳ＝２、グリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２を有する患者についての分布プロファイラダイアグラムである。
【図５】ＦＡＳ＝３、グリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２を有する患者についての分布プロファイラダイアグラムである。
【図６】６つのＸ変数ＦＡＳ、グリーソン、治療前ＰＳＡ、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲおよびＮＰＹについてのＲＯＣ曲線を示す。
【図７】再燃確率（非生存）を示す一連のプロットである。それぞれのプロットは、Ｘ軸としての生存時間（０から５）およびＹ軸上の再燃確率を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、前立腺癌患者を層別化する方法であって、患者から得られた試料中のＦＡＳ遺伝子の発現のレベルを決定する工程；ＦＡＳ遺伝子の発現のレベルまたはグレードに基づく患者工程を含む方法を提供する。層別化は、ＦＡＳ単独または他の遺伝子との組合せに対するものであり得る。一実施形態は、ＦＡＳおよびＵＳＰ２ａ計測値の組合せを含む。
【００１２】
本発明の方法は、前記前立腺癌患者からの試料中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のレベルを決定することをさらに含み得る。計測されるＰＳＡは、遊離もしくは総量またはその両方であり得る。本発明によれば、層別化は、患者の年生存、癌の早期再発、癌の遅発再発、疾患関連死、癌退縮度、転移、治療に対する応答性、治療の有効性、および／または前立腺癌への進行の見込みを含み得る１つ以上の臨床管理パラメータに沿うものであり得る。
【００１３】
本発明の一実施形態において、前立腺癌と診断された患者の臨床転帰を予測する方法であって、ＦＡＳ遺伝子の発現のレベルを決定することと、１つ以上の臨床管理パラメータをＦＡＳ遺伝子の発現のレベルと相関させることを含み、３のＦＡＳレベルを負の臨床転帰と相関させる方法が提供される。本方法は、ＦＡＳ単独または１つ以上の他の遺伝子との組合せにおけるレベルを決定することにより実施することができる。１つ以上の他の遺伝子は、限定されるものではないが、ＵＳＰ２ａ、ＮＰＹ、ＡＭＡＣＲ、およびｐＡＫＴを含む。発現レベルの計測値は、前記遺伝子のＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルまたはそれらの組合せのものであり得る。
【００１４】
本発明は、本発明を実施するための方法、アッセイおよびキットを提供する。これらは、免疫組織化学技術を含み、検出可能な標識により標識されて得る抗体の使用を含み得るアッセイを含む。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、療法的治療の過程を受けたかまたはその最中である患者における、腫瘍サイズ、腫瘍グレード、またはアンドロゲン受容体状態とは独立して前立腺癌の早期または遅発再発の見込みを予測する方法であって、前記患者から得られた試料中の組織または血清におけるＦＡＳ遺伝子単独または１つ以上のマーカ遺伝子との組合せの発現のレベルを決定することと；前記患者から得られた試料中の組織または血清における決定されたＦＡＳ遺伝子の発現のレベルに基づき患者における癌の再発の見込みを予測することを含む方法を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、療法的治療の過程を受けたかまたはその最中である患者における腫瘍サイズ、腫瘍グレードまたはアンドロゲン受容体状態とは独立して疾患関連死の見込みを予測する方法であって、前記患者から得られた試料中の組織または血清におけるＦＡＳ遺伝子の発現のレベルを決定することと、前記患者から得られた試料中の組織または血清における決定されたＦＡＳ遺伝子の発現のレベルに基づき患者における疾患関連死を予測することを含む方法を提供する。
【００１７】
一実施形態において、前立腺癌を有する疑いのある対象を二元層別化する方法であって、対象からの試料における１つ以上の予測因子変数のレベルまたはグレードを決定することと、次いで前記１つ以上の予測因子変数のレベルまたはグレードに基づき対象を少なくとも５年間生存する可能性が高いと層別化することを含み、予測因子変数のグレードは、３未満である方法が提供される。予測因子変数は、当分野において公知のものおよび本明細書に教示されるもののいずれかから選択することができる。これらは、ＦＡＳ、ＮＰＹ、ＵＳＰ２ａ、およびＡＭＡＣＲからなる群から選択することもできる。対象は、１つ以上の癌マーカ、例えばＰＳＡについて既にスクリーニングされていてよい。対象は、前立腺の１つ以上の生検を既に受けていてもよく、生検は、グリーソンシステムによる癌病期分類について評価されていてよい。
【００１８】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野において当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等な方法および材料を本発明において挙げられた方法の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。
【００１９】
定義
便宜のため、本明細書、実施例、および付属の特許請求の範囲において用いられるある用語および語句の意味を以下に提供する。定義は、限定を意味するものでは全くなく、本発明のある態様のより明確な理解を提供するために機能する。
【００２０】
用語「ゲノム」は、生物の全ＤＮＡ補足物を含み、例として、核ＤＮＡ構成成分、染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡ、および細胞質領域（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）を含むものとする。
【００２１】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御配列および最も多くはコード配列を含む核酸配列を指す。しかしながら、遺伝子は、翻訳されなくてよく、代わりに調節または構造ＲＮＡ分子をコードする。
【００２２】
遺伝子は、当分野において公知の任意の源、例として植物、真菌、動物、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核、核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または化学合成ＤＮＡから全体的または部分的に由来し得る。遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度、または発現制御の様式に影響し得るコードまたは未翻
訳領域のいずれかの１つ以上の改変を含有し得る。そのような改変には、限定されるものではないが、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、および置換が含まれる。遺伝子は、連続コード配列を構成し得、またはそれは適切なスプライスジャンクションにより結合している１つ以上のイントロンを含み得る。
【００２３】
用語「遺伝子発現」は、核酸配列が良好な転写およびほとんどの場合において翻訳を受けてタンパク質またはペプチドを産生するプロセスを指す。明確性のため、「遺伝子発現」の計測値が参照される場合、これは、計測値が転写の核酸産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡのものまたは翻訳のアミノ酸産物、例えばポリペプチドまたはペプチドのものであり得ることを意味すると理解されるべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチドおよびペプチドの量またはレベルを計測する方法は、当分野において周知である。
【００２４】
用語「遺伝子発現プロファイル」または「ＧＥＰ」または「遺伝子シグネチャ」は、遺伝子またはその転写産物の存在が、個々に（単一の遺伝子マーカと同様に）もしくはまとめて、またはそのようなものの差次的発現が、ある病態を示す／予測する、特定の細胞または組織タイプにより発現される一群の遺伝子を指す。
【００２５】
語句「単一遺伝子マーカ（ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｍａｒｋｅｒ）」または「単一遺伝子マーカ（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ  ｍａｒｋｅｒ）」は、遺伝子またはその転写産物の存在が、個々に、そのようなものの差次的発現が、ある病態を示す／予測する、特定の細胞または組織タイプにより発現される単一遺伝子（遺伝子の全てのバリアントを含む）を指す。
【００２６】
本明細書において使用される語句「遺伝子−タンパク質発現プロファイル「ＧＰＥＰ」は、遺伝子およびタンパク質の存在がまとめてまたはそのようなものの差次的発現が、ある病態を示す／予測する、特定の細胞または組織タイプにより発現される一群の遺伝子およびタンパク質を指す。ＧＰＥＰは、ＧＥＰおよびＰＥＰの１つ以上のセットからなる。
【００２７】
本明細書において使用される用語「核酸」は、１つ以上のヌクレオチドからなる分子、すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両方を指す。この用語には、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーが含まれ、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、ポリマーの場合、５’から３’連結を介して一緒に結合している。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドポリマーは、一本鎖または二本鎖であり得る。しかしながら、連結には、当分野において公知の連結のいずれか、例えば５’から３’連結を含む核酸が含まれ得る。ヌクレオチドは、天然に生じたものであり得、または天然に生じた塩基対と塩基対関係を形成し得る合成により生成されたアナログであり得る。塩基対合関係を形成し得る非天然に生じた塩基の例には、限定されるものではないが、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびに他の複素環式塩基アナログが含まれ、ピリミジン環の炭素および窒素原子の１つ以上は、ヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、セレン、リンなどにより置換されている。
【００２８】
核酸に関する用語「相補的」は、それが核酸に関する場合、ヌクレオチドおよび核酸間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合を指し、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間などまたはオリゴヌクレオチドプローブと標的との間は相補的である。
【００２９】
本明細書において使用される「発現産物」は、生物中の遺伝子が発現される場合に産生される生体分子、例えばタンパク質またはｍＲＮＡである。発現産物は、翻訳後修飾を含み得る。遺伝子のポリペプチドは、全長コード配列により、またはコード配列の任意の部分によりコードされ得る。
【００３０】
用語「アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」および「アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」は、全ての天然に生じたＬ−アルファ−アミノ酸を指す。アミノ酸は、１文字または３文字表記のいずれかにより以下のとおり識別され：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、ここではアミノ酸が最初に列記され、挿入的に３文字および１文字コードがそれぞれ続く。
【００３１】
用語「アミノ酸配列バリアント」は、天然配列と比較してアミノ酸配列に一部の差異を有する分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、アミノ酸配列内のある位置において置換、欠失、および／または挿入を保有し得る。通常、バリアントは、天然配列と少なくとも約７０％の相同性を保有し、好ましくは、それらは天然配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％相同である。
【００３２】
「相同性」は、それがアミノ酸配列に適用される場合、配列をアラインし、最大相同性パーセントを達成すべく必要に応じてギャップを導入した後における、第２の配列のアミノ酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基の割合と定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当分野において周知である。相同性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算において導入されるギャップおよびペナルティに起因して値が異なり得ることが理解される。
【００３３】
「ホモログ」は、それがアミノ酸配列に適用される場合、第２の種の第２の配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「アナログ」は、親の（元の）ポリペプチドの特性を依然として維持する１つ以上のアミノ酸変化、例えばアミノ酸残基の置換、付加または欠失により異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
【００３４】
用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義に使用され、参照分子または出発分子に対して任意の手法で改変または変化された分子を指す。
本発明は、アミノ酸ベース、例としてバリアントおよび誘導体である数タイプの組成物、例えば抗体を企図する。これらには、置換、挿入、欠失ならびに共有結合バリアントおよび誘導体が含まれる。したがって、本発明の範囲内には、置換、挿入および／または付加、欠失ならびに共有結合修飾を含有するポリペプチドベースの分子が含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば１つ以上のリジンを本発明のポリペプチド配列（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）に付加することができる。配列タグは、ポリペプチド精製または局在化に使用することができる。リジンは、溶解度を増加させるためまたはビオチン化を可能とするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に局在するアミノ酸残基を場合により欠失させ、トランケート配列を提供することができる。あるアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）を、配列の使用に応じて選択的に欠失させることができる。配列の使用は、例えば、可溶性であるかまたは固体担体に連結しているより大きい配列の一部としての配列の発現としての配列の使用である。
【００３５】
「置換バリアント」は、タンパク質を指す場合、天然または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に同一位置において異なるアミノ酸が挿入された
ものである。置換は、分子中の１つのみのアミノ酸が置換された単一置換であり得、またはそれらは２つ以上のアミノ酸が同一分子中で置換された多置換であり得る。
【００３６】
本明細書において使用される用語「保存アミノ酸置換」は、配列中に通常存在するアミノ酸の、サイズ、電荷、または極性が類似する異なるアミノ酸による置換を指す。保存置換の例には、非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリンおよびロイシンを別の非極性残基に代えて置換することが含まれる。同様に、保存置換の例には、ある極性（親水性）残基を別のものに代えて置換すること、例えばアルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、およびグリシンとセリンとの間の置換が含まれる。さらに、塩基性残基、例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジンを別のものに代えて置換すること、またはある酸性残基、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸を別の酸性残基に代えて置換することは、保存置換の追加の例である。非保存置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンを極性（親水性）残基、例えばシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンに代えて置換することおよび／または極性残基を非極性残基に代えて置換することが含まれる。
【００３７】
「挿入バリアント」は、タンパク質を指す場合、１つ以上のアミノ酸が天然または出発配列中の特定の位置におけるアミノ酸に直接隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「直接隣接」は、アミノ酸のアルファ−カルボキシまたはアルファ−アミノ官能基のいずれかに連結していることを意味する。
【００３８】
「欠失バリアント」は、タンパク質を指す場合、天然または出発アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域中の１つ以上のアミノ酸が欠失している。
【００３９】
「共有結合バリアント」は、タンパク質を指す場合、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤による天然または出発タンパク質の修飾、および翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、慣習的には、タンパク質の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機序を生かすことにより導入される。得られた共有結合誘導体は、生物学的活性に重要な残基の同定に指向されるプログラムにおいて、免疫アッセイに、または組換え糖タンパク質の免疫アフィニティ精製用の抗タンパク質抗体の調製に有用である。そのような修飾は当分野における通常の技能の範囲内であり、過度の実験なしで実施される。
【００４０】
ある翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に翻訳後に脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、軽度に酸性の条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明により使用されるタンパク質中に存在し得る。
【００４１】
他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニルヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）タンパク質：構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン  ＆  ＣＯ．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐ．７９〜８６（１９８３年）)。
【００４２】
共有結合誘導体には、特に、本発明のタンパク質が非タンパク質性ポリマーに共有結合している融合分子が含まれる。非タンパク質ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー、す
なわち、他に天然には見出されないポリマーである。しかしながら、天然に存在し、組換えまたはインビトロ法により生成されるポリマーは、天然から単離されたポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲内に属する。ポリビニルアルキレンエーテル、そのようなポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールが特に有用である。タンパク質は、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；米国特許第４，４９６，６８９号明細書；米国特許第４，３０１，１４４号明細書；米国特許第４，６７０，４１７号明細書；米国特許第４，７９１，１９２号明細書または米国特許第４，１７９，３３７号明細書に記載の様式で連結していてよい。
【００４３】
「特徴部」は、タンパク質を指す場合、分子の独特なアミノ酸配列ベース構成成分と定義される。本発明のタンパク質の特徴部には、表面発現、局所立体構造形状、フォールド、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【００４４】
本明細書において使用される用語「表面発現」は、タンパク質を指す場合、最外表面上に出現するタンパク質のポリペプチドベース構成成分を指す。
本明細書において使用される用語「局所立体構造形状」は、タンパク質を指す場合、タンパク質の限定的空間内に局在するタンパク質のポリペプチドベース構造発現を意味する。
【００４５】
本明細書において使用される用語「フォールド」は、タンパク質を指す場合、エネルギー最小化時にアミノ酸配列の得られた立体構造を意味する。フォールドは、フォールディングプロセスの２次または３次レベルにおいて生じ得る。２次レベルフォールドの例には、ベータシートおよびアルファへリックスが含まれる。３次フォールドの例には、エネルギー力の凝集または分離に起因して形成されるドメインおよび領域が含まれる。このように形成される領域には、疎水性および親水性ポケットなどが含まれる。
【００４６】
本明細書において使用される用語「ターン」は、それがタンパク質立体構造に関する場合、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変え、１、２、３つ以上のアミノ酸残基を含み得る屈曲部を意味する。
【００４７】
本明細書において使用される用語「ループ」は、タンパク質を指す場合、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を反転させ、４つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドの構造特徴を指す。オリバら（Ｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．）は、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを同定した（ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）第２６６巻（４）：ｐ．８１４〜８３０；１９９７年）。
【００４８】
本明細書において使用される用語「ハーフループ」は、タンパク質を指す場合、それが由来するループのアミノ酸残基の少なくとも半数を有すると同定されたループの部分を指す。ループは、同数のアミノ酸残基を常に含有しなくてよいことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有し、または含むと同定される場合、奇数ループのハーフループは、ループの整数部分または次の整数部分（ループのアミノ酸数／２＋／−０．５アミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ループと同定されたループは、３アミノ酸または４アミノ酸のハーフループを生成し得る（７／２＝３．５＋／−０．５は、３または４である）。
【００４９】
本明細書において使用される用語「ドメイン」は、タンパク質を指す場合、１つ以上の同定可能な構造または機能特徴または特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の
ための部位として機能する結合能）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【００５０】
本明細書において使用される用語「ハーフドメイン」は、タンパク質を指す場合、それが由来するドメインのアミノ酸残基の少なくとも半数を有すると同定されたドメインの部分を意味する。ドメインは同数のアミノ酸残基を常に含有しなくてよいことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有し、または同定される場合、奇数ドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分（ドメインのアミノ酸数／２＋／−０．５アミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ドメインと同定されたドメインは、３アミノ酸または４アミノ酸のハーフドメインを生成し得る（７／２＝３．５＋／−０．５は、３または４である）。サブドメインはドメインまたはハーフドメイン内に同定することができ、これらのサブドメインは、それが由来したドメインまたはハーフドメインにおいて同定された構造または機能特性の全て未満を保有することも理解される。本明細書のドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸は、ポリペプチドの骨格に沿って連続である必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸は、構造的にフォールドしてドメイン、ハーフドメインまたはサブドメインを生成し得る）ことも理解される。
【００５１】
本明細書において使用される用語「部位」は、タンパク質を指す場合、それがアミノ酸ベースの実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチドベース分子内で修飾、操作、変化、誘導体化または変動され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【００５２】
本明細書において使用される用語「１つまたは複数の末端」は、タンパク質を指す場合、ペプチドまたはポリペプチドの先端を指す。そのような先端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最終の部位のみに限定されるものではなく、追加のアミノ酸を末端領域中に含み得る。本発明のポリペプチドベース分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸を末端とする）を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、一部の例において、ジスルフィド結合により、または非共有結合力により結び付けられた複数のポリペプチド鎖から構成される（マルチマー、オリゴマー）。こうしたタイプのタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、場合により、ポリペプチドの末端は、それらが非ポリペプチドベースの部分（例えば有機コンジュゲート）で始まるかまたは終わるように、修飾されてもよい。
【００５３】
特徴部のいずれかが本発明の分子の構成成分であると同定または定義されると、これらの特徴部のいくつかの操作および／または改変のいずれかを、移動、交換、反転、欠失、ランダム化または重複により実施することができる。さらに、特徴部の操作は、本発明の分子への改変と同一の結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメインの欠失を含む操作は、全長未満の分子をコードさせるための核酸の改変とまさに同様に分子の長さの変化をもたらす。
【００５４】
修飾および操作は、当分野において公知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発により達成することができる。次いで、得られた修飾分子を、インビトロまたはインビボアッセイ、例えば本明細書に記載のものまたは当分野において公知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを使用して活性について試験することができる。
【００５５】
「タンパク質」は、ペプチド結合により繋ぎ合わされたアミノ酸残基のポリマーを意味する。本明細書において使用されるこの用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。しかしながら、典型的には、タンパク質は、少なくとも５０アミノ酸長である。一部の場合、コードされるタンパク質は、約５０アミノ酸よりも短い。この場合、ポリペプチドはペプチドと称される。タンパク質が短ペ
プチドである場合、それは少なくとも約１０アミノ酸残基長である。タンパク質は、天然に生じたもの、組換えのもの、もしくは合成のもの、またはそれらの任意の組合せであり得る。タンパク質は、天然に生じたタンパク質またはペプチドの断片も含み得る。タンパク質は、単一分子であり得、または多分子複合体であり得る。タンパク質という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じたアミノ酸の人工化学アナログであるアミノ酸ポリマーに適用することもできる。
【００５６】
用語「タンパク質発現」は、検出可能なレベルのアミノ酸配列またはタンパク質が発現されるように核酸配列が翻訳を受けるプロセスを指す。
用語「タンパク質発現プロファイル」または「ＰＥＰ」または「タンパク質発現シグネチャ」は、タンパク質の存在が個々に（単一タンパク質マーカと同様に）もしくはまとめて、またはそのようなタンパク質の差次的発現が、ある病態を示す／予測する、特定の細胞または組織タイプ（例えば、神経細胞、冠動脈内皮、または疾患組織）により発現される一群のタンパク質を指す。
【００５７】
語句「単一タンパク質マーカ（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｒｋｅｒ）」または「単一タンパク質マーカ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｒｋｅｒ）」は、タンパク質または前記タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の存在が、個々に、そのようなものの差次的発現が、ある病態を示す／予測する、特定の細胞または組織タイプにより発現される単一タンパク質（タンパク質の全てのバリアントを含む）を指す。
【００５８】
本明細書において使用される「タンパク質の断片」は、別のタンパク質の部分であるタンパク質を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することにより得られたポリペプチドを含み得る。一実施形態において、タンパク質断片は、少なくとも約６つのアミノ酸を含む。別の実施形態において、断片は、少なくとも約１０個のアミノ酸を含む。さらに別の実施形態において、タンパク質断片は、少なくとも約１６個のアミノ酸を含む。
【００５９】
用語「アレイ」および「マイクロアレイ」は、通常、行および列における物体の任意のタイプの規則的配置を指す。アレイが遺伝子および／またはタンパク質発現の試験に関する場合、アレイは、対象の標的を捕捉またはそれに結合させるために使用される表面に固定されたプローブ（オリゴヌクレオチドまたはタンパク質ベースであることが多い）または捕捉剤の配置を指す。対象の標的は、遺伝子、遺伝子発現の産物などであり得る。アレイ上に提示されるプローブ（核酸またはタンパク質）のタイプは、アレイの使用目的に依存する（例えば、ヒト遺伝子またはタンパク質の発現をモニタリングするため）。所与のアレイ上のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質捕捉剤は、全て、同一のタイプ、カテゴリー、または群の遺伝子もしくはタンパク質に属する。遺伝子またはタンパク質は、それらが一部の共有特徴、例えば起源の種（例えば、ヒト、マウス、ラット）；疾患状態（例えば、癌）；構造または機能（例えば、タンパク質キナーゼ、腫瘍抑制因子）；または同一の生物学的プロセス（例えば、アポトーシス、シグナル伝達、細胞周期調節、増殖、分化）を共有する場合、同一タイプのものとみなすことができる。例えば、あるアレイタイプは、アレイオリゴヌクレオチドまたはタンパク質捕捉剤のそれぞれが、癌に関連する遺伝子またはタンパク質に対応する「癌アレイ」であり得る。「上皮アレイ」は、特有の上皮遺伝子またはタンパク質に対応するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質捕捉剤のアレイであり得る。同様に、「細胞周期アレイ」は、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質捕捉剤が細胞周期に関連する特有の遺伝子またはタンパク質に対応するアレイタイプであり得る。
【００６０】
本発明において使用される用語「免疫組織化学」またはその略称「ＩＨＣ」は、生物試料中の抗原（例えば、タンパク質）を、前記生物試料中の抗原に対する抗体の結合特性を
利用することにより検出するプロセスを指す。
【００６１】
用語「免疫アッセイ」は、抗原への抗体の結合を使用してある物質を同定および計測する試験を指す。免疫アッセイは、疾患を診断するために使用されることが多く、試験結果は、治療（例えば、エストロゲン受容体が前立腺癌において計測される場合）の計画に役立ち得る疾患についての情報を提供し得る。免疫アッセイは、抗体のその抗原への特異的結合を利用する。モノクローナル抗体は、それらが通常、特定の分子の１つの部位にのみ結合するために使用されることが多く、したがってより特異的で正確な試験を提供し、それは他の分子の存在により混同されにくい。使用される抗体は、極めて高い比率の抗原が抗体に結合してアッセイが適切な感度を有することを確保しなければならないため、対象の抗原についての高い親和性を有さなければならない。
【００６２】
本明細書において使用される用語「ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応技術の略称であり、合成か発現かにかかわらず核酸レベルの検出または決定のための技術を指す。
【００６３】
用語「細胞タイプ」は、所与の源（例えば、組織、器官）からの細胞または所与分化の状態の細胞、または所与の病理もしくは遺伝子構造を伴う細胞を指す。
本明細書において使用される用語「活性化」は、シグナリング経路または生物学的応答の任意の変化、例として、例えば、基底レベルを上回る増加、阻害状態からの基底レベルへの回復、および基底レベルを上回る経路の刺激を指す。
【００６４】
用語「差次的発現」は、正常隣接組織に対する疾患組織または細胞における遺伝子またはタンパク質の時間的および組織発現パターンの定量的および定性的差異の両方を指す。例えば、差次的発現される遺伝子は、疾患状態に対して正常状態で活性化または完全に不活性化されたその発現を有し得、または正常状態に対して疾患状態において上方調節（過剰発現）もしくは下方調節（過小発現）され得る。そのような定性的に調節される遺伝子は、対照または疾患状態のいずれかにおいて検出可能であるが、その両方で検出可能でない、所与の組織または細胞タイプ内の発現パターンを示し得る。換言すると、遺伝子またはタンパク質は、遺伝子またはタンパク質の発現が患者の疾患組織または細胞において正常な患者の（無病）組織または細胞および／または対照組織もしくは細胞におけるその発現のレベルよりも高いまたは低いレベルにおいて生じる場合、差次的に発現される。
【００６５】
用語「検出可能」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイ、およびノザン分析の標準的な技術、または当業者に周知の任意の方法を介して検出可能なＲＮＡ発現パターンを指す。同様に、タンパク質発現パターンは、標準的な技術、例えばウエスタンブロットを介して「検出」することができる。
【００６６】
用語「相補的」は、それがアレイに関する場合、プローブ分子およびその標的の相互作用表面のトポロジー適合性または一致を指す。標的およびそのプローブは相補的と記載することができ、さらに接触表面特徴は互いに相補的である。
【００６７】
用語「抗体」は、天然か部分的または全体的に合成により産生されたかにかかわらず免疫グロブリンを意味する。特異的結合能を維持するその全ての誘導体も、この用語に含まれる。この用語は、免疫グロブリン結合ドメインに相同であり、または概ね相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質も包含する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、任意の免疫グロブリンクラスのメンバー、例として、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどのいずれかであり得る。
【００６８】
用語「抗体断片」は、全長未満の抗体の任意の誘導体または部分を指す。一態様において、抗体断片は、全長抗体の特異的結合能の少なくとも実質的な部分を特に結合パートナとして保持する。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、およびＦｄ断片が含まれる。抗体断片は、任意の手段により産生させることができる。例えば、抗体断片は、インタクト抗体の断片化により酵素的または化学的に産生させることができ、またはそれは部分抗体配列をコードする遺伝子から組換えにより産生させることができる。あるいは、抗体断片は、全体的または部分的に合成により産生させることができる。抗体断片は、単鎖抗体断片を含み得る。別の実施形態において、断片は、例えばジスルフィド連結により繋ぎ合わされた複数鎖を含み得る。断片は、多分子複合体も含み得る。機能抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み得、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。
【００６９】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に相同性の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、同一であり、および／または同一のエピトープを結合させ、但し、モノクローナル抗体の産生の間に生じ得る考えられるバリアントは除く。そのようなバリアントは一般に少量で存在する。典型的には異なる抗原決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対して指向される。このタイプの抗体は、単一抗体産生ハイブリドーマの娘細胞により産生される。モノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応する任意のエピトープについての単一の結合親和性を示す。
【００７０】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に相同性の抗体の集団から得られるという抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求するものと解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、１つのタイプの抗原のみを認識する。本明細書のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片が含まれる。抗体の調製は、モノクローナルかポリクローナルかにかかわらず当分野において公知である。抗体の産生の技術は当分野において周知であり、例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９８年、およびハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）「抗体の使用：実験室マニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９９年に記載されている。
【００７１】
モノクローナル抗体は、それぞれが異なるエピトープに免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含有し得る、例えば二重特異的モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。コーラ（Ｋｏｈｌｅｒおよびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５年）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻：ｐ．４９５〜４９７；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８７年、１９９２年）、編、分子生物学における現代のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａ
ｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク；ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８年）、抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；コリガンら（Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９２年、１９９３年）、編、免疫学における現代のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク；アイヤーら（Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、インディアン・ジャーナル・オブ・メディカル・リサーチ（Ｉｎｄ．Ｊ．Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．）、（２０００年）、第１２３巻：ｐ．５６１〜５６４。
【００７２】
「抗体調製物」は、抗体が存在し得る任意の組成物、例えば、血清（抗血清）を包含することを意味する。
抗体は、当業者により検出可能な標識により標識することができる。標識は、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、もしくは酵素補因子、または当分野において公知の任意の他の標識であり得る。一部の態様において、計測が望まれる実体に結合する抗体（一次抗体）は標識されないが、一次抗体に特異的に結合する標識二次抗体の結合により代わりに検出される。
【００７３】
本発明の抗体には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例として、例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、細胞内で作製された抗体（すなわち、イントラボディ）、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。本発明の抗体は、任意の動物起源、例として、鳥類および哺乳動物からのものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ起源のものである。
【００７４】
多重特異的抗体は、本発明のペプチドの複数の異なるエピトープに特異的であり得、または、本発明のペプチド、および異種エピトープ（例えば異種ペプチドまたは固体担体材料）の両方に特異的であり得る。例えば、国際公開第９３／１７７１５号；国際公開第９２／０８８０２号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／０５７９３号；タットら（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１４７巻：ｐ．６０〜６９；米国特許第４，４７４，８９３号明細書；米国特許第４，７１４，６８１号明細書；米国特許第４，９２５，６４８号明細書；米国特許第５，５７３，９２０号明細書；米国特許第５，６０１，８１９号明細書；およびコステルニーら（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１４８巻：ｐ．１５４７〜１５５３参照。例えば、本発明のＦＡＳペプチド配列の反復単位を含有するペプチドに対する抗体を産生させることができ、もしくは本発明の２つ以上のＦＡＳペプチド配列を含有するペプチドに対する抗体を産生させることができ、またはそれらを組み合わせるｓことができる。
【００７５】
さらに、抗体は、本発明のＦＡＳペプチドの任意の領域から調製することもできる。さらに、ポリペプチドが受容体タンパク質である場合、受容体全体または受容体の部分、例えば、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン全体、特異的膜貫通セグメント、細胞内もしくは細胞外ループのいずれか、またはこれらの領域の任意の部分に対する抗体を開発することができる。特異的機能部位、例えば、リガンド結合の部位、または例え
ば、グリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、もしくはアミド化される部位に対する抗体も開発することができる。
【００７６】
「増幅」は、意図される特異的標的核酸配列（ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲなど）の少なくとも一部を含有する標的核酸の複数コピーの産生を意味する。複数コピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称することができる。好ましくは、増幅標的は、完全な標的遺伝子配列（イントロンおよびエキソン）未満または発現される標的遺伝子配列（エキソンおよびフランキング非翻訳配列のスプライシング転写物）を含有する。例えば、ＦＡＳ特異的アンプリコンは、ＦＡＳ標的ポリヌクレオチドの内部位置にハイブリダイズし、それから重合を開始させる増幅プライマーを使用することによりＦＡＳ標的ポリヌクレオチドの部分を増幅させることにより産生させることができる。好ましくは、増幅部分は、種々の周知の方法のいずれかを使用して検出することができる検出可能な標的配列を含有する。
【００７７】
「プライマー」または「増幅プライマー」は、標的核酸またはその相補体の領域に結合し、標的核酸の核酸増幅を促進し得るオリゴヌクレオチドを意味する。ほとんどの場合、プライマーは、核酸ポリメラーゼにより伸長させることができる遊離３’末端を有する。全ての増幅プライマーは、少なくとも１つの標的核酸の鎖との直接の、または標的配列に相補的な鎖との相補的塩基相互作用を介してハイブリダイズし得る塩基配列を含む。増幅プライマーは、より長い核酸産物を産生する酵素活性のための基質として機能する。
【００７８】
増幅プライマーの「標的結合配列」は、標的特異性を決定する部分である。それというのも、その部分は、標的核酸鎖またはその相補鎖にアニールし得るためである。標的結合配列がハイブリダイズする相補的標的配列は、プライマー結合配列と称される。
【００７９】
増幅産物を「検出する」は、増幅核酸の存在を決定する種々の方法のいずれか、例えば、増幅産物の部分に標識プローブをハイブリダイズさせることなどを意味する。標識プローブは、別の配列に特異的に結合し、例えば、蛍光部分、化学発光部分、放射性同位体、ビオチン、アビジン、酵素、酵素基質、または他の反応基であり得る検出可能な基を含有するオリゴヌクレオチドである。
【００８０】
「核酸増幅条件」は、環境条件、例として核酸増幅法を使用して標的核酸またはその相補鎖の複数コピーの産生を可能とするために十分な塩濃度、温度、温度サイクリングの有無、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および補因子の存在を意味する。核酸増幅の多くの周知の方法は、交互に二本鎖核酸を変性させ、プライマーをハイブリダイズさせるための加熱サイクリングを要求する。
【００８１】
本明細書において使用される用語「バイオマーカ」は、生物学的状態を示す物質を指す。本発明によれば、バイオマーカには、ＧＰＥＰ、ＰＥＰ、ＧＥＰまたはそれらの組合せが含まれる。本発明によるバイオマーカには、本明細書に開示のＧＰＥＰ、ＰＥＰ、ＧＥＰまたはそれらの組合せの１つ以上のメンバーの存在を同定または指示するために使用される任意の化合物または組成物も含まれる。例えば、本明細書においてＰＥＰのメンバーとして同定されたタンパク質のいずれかに結合させるために作出される抗体は、バイオマーカとして有用とみなすことができるが、抗体自体は二次指標である。
【００８２】
用語「生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）」または「生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｓａｍｐｌｅ）」は、生物（例えば、ヒト患者）から、または生物の構成成分（例えば、細胞）から、もしくは体液（例えば、血液、血清、唾液、尿など）から得られた試料を指す。試料は、任意の生体組織、器官、器官系または体液のものであり得る。試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であり得る。そのような試料には、限定
されるものではないが、唾液、血液、血液細胞（例えば、白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、および組織またはコア針、細針もしくは穿刺生検試料、尿、腹水、および胸膜液、またはそれらからの細胞が含まれる。生体試料には、組織の切片、例えば組織学的目的のために採取された冷凍切片も含まれ得る。生体試料は、「患者試料」と称することもできる。
【００８３】
用語「病態」は、任意の細胞、器官、器官系または生物の状態を指す。病態は、疾患状態を示すことも、または、単に、実体の生理学的提示もしくは状況を示すこともあり得る。病態は、表現型病態（例えば疾患の巨視的提示）、または遺伝子型病態（例えば病態に関連する基礎遺伝子またはタンパク質発現プロファイル）として特徴付けられ得る。病態は、良性または悪性であり得る。
【００８４】
個体における用語「癌」は、発癌性細胞に典型的な特徴、例えば無制御な増殖、不死性、転移潜在性、急速な成長および増殖速度、ならびにある特有の形態学的特徴を保有する細胞の存在を指す。癌細胞は、腫瘍の形態であることが多いが、そのような細胞は、個体内で単独で存在し得、または血流中で独立細胞、例えば白血病細胞として循環し得る。
【００８５】
用語「前立腺癌」は、前立腺組織の癌を意味する。
用語「細胞成長」は、原則的に細胞数の成長に関連し、それは細胞繁殖の速度が細胞死（例えば、アポトーシスまたは壊死による）の速度を上回る場合に細胞繁殖（すなわち、増殖）により生じて、細胞の集団のサイズの増加を生成するが、その成長の小構成要素はある状況において個々の細胞の細胞サイズまたは細胞質体積の増加にも起因し得る。したがって、細胞成長を阻害する薬剤は、増殖および細胞死の２つの相反するプロセス間の平衡が変化するように、増殖の阻害または細胞死の刺激のいずれか、またはその両方により阻害し得る。
【００８６】
本明細書において使用される用語「腫瘍成長」または「腫瘍転移成長」は、特に記載のない限り、腫瘍学において一般に使用されるとおりに使用され、この用語は、原則的には、主として腫瘍細胞成長の結果としての腫瘍または腫瘍転移の質量または体積の増加に関連する。
【００８７】
用語「転移」は、癌が最初に原発性腫瘍として生じた場所から体内の遠隔位置に癌が拡散するプロセスを意味する。転移も、原発性腫瘍の拡散から生じた癌を指す。例えば、前立腺癌を有する者は、そのリンパ系、肝臓、骨または肺において転移を示し得る。
【００８８】
本明細書において使用される用語「病変」または「病変部位」は、身体部分または組織の任意の異常な、一般に局在化された構造的変化を指す。石灰化または線維嚢胞性は、本発明の病変の例である。
【００８９】
用語「臨床管理パラメータ」は、検出、スクリーニング、診断、患者の病期分類もしくは層別化、または疾患もしくは病態の進行、退縮および／もしくはそれからの生存の決定に重要とみなされる計量値または変数を指す。そのような臨床管理パラメータの例には、限定されるものではないが、年生存、疾患関連死、早期または遅発再発、退縮度、転移、治療への応答性、治療の有効性または前立腺癌への進行の見込みが含まれる。
【００９０】
用語「終点」は、経路もしくは進行に沿った最終段階または発生を意味する。
用語「腫瘍評価終点」は、腫瘍の病期、状態または発生に基づく終点観察または計算を意味する。腫瘍評価に基づく終点の例には、限定されるものではないが、生存、無病生存（ＤＦＳ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）、無増悪期間（ＴＴＰ）、無増悪生存（ＰＦＳ）、および治療成功期間（ＴＴＦ）が含まれる。
【００９１】
本明細書において使用される用語「治療する」は、特に記載のない限り、癌を有する患者における腫瘍の成長、腫瘍転移、または他の発癌性細胞もしくは新生細胞の進行を部分的または完全に逆転、緩和、阻害することまたはそれらを予防することを意味する。本明細書において使用される用語「治療」は、特に記載のない限り、治療の行為を指す。
【００９２】
語句「治療する方法」またはその均等物は、例えば、癌に適用される場合、個体における癌細胞の数を低減、排除もしくは予防するため、または癌の症状を緩和するために設計される行為の手順または過程を指す。癌または別の増殖障害を「治療する方法」は、癌細胞もしくは他の障害が実際に完全に排除されること、細胞もしくは障害の数が実際に低減されること、または癌もしくは他の障害の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。癌を治療する方法は、成功の見込みが低い場合であっても実施されることが多いが、個体の既往歴および推定生存予測値を考慮すると、それにもかかわらず全体的に有益な行為の過程と考えられる。
【００９３】
用語「予測する」は、特定のイベントが将来的に生じるかまたは生じる可能性が極めて高いという記述または主張を意味する。
用語「予後診断する」は、特定の生物学的イベントが将来的に生じるかまたは生じる可能性が高いという記述または主張を意味する。
【００９４】
用語「進行」または「癌進行」は、疾患もしくは病態の、またはそれに向かう増進または悪化を意味する。
用語「退縮」または「退縮度」は、表現型または遺伝子型のいずれかの癌進行の逆転を指す。癌進行の遅延または停止は、退縮とみなすことができる。
【００９５】
用語「層別化する」は、それが患者に関する場合、患者を一連の正の転帰（例えば、無病）から軽度または良好な転帰（例えば、生活の質の改善または生存の増加）、不良な転帰（例えば、終末予後診断または死亡）に沿った予測転帰の群に分けることを意味する。
【００９６】
用語「治療有効薬剤」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床家により求められている組織、器官、系、生物、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する組成物を意味する。
【００９７】
用語「治療有効量」または「有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床家により求められている組織、器官、系、生物、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する主題化合物または組合せの量を意味する。
【００９８】
本明細書において使用される用語「相関する」または「相関」は、２つ以上のランダム変数または観察データ値間の関係を指す。相関は、統計的手段または検定による分析時、関係が使用される統計的検定の有意性の閾値を充足すると見出される場合、総計的であり得る。
【００９９】
臨床管理パラメータ
本発明は、前立腺癌を検出、スクリーニング、または診断するため；前立腺癌患者を病期分類または層別化するため；ならびに前立腺癌の進行、退縮および／またはそれからの生存を決定するための組成物、方法およびアッセイに関する。
【０１００】
その実施において、本発明は、慣習的な診断、予後診断および／または治療パラダイムを増強させるための方法、アルゴリズムおよび他の臨床ツールを提供する。１つ以上の臨床管理パラメータの値の決定における１つ以上のバイオマーカを使用する組合せアプロー
チも想定される。例えば、ＦＡＳおよびＰＳＡバイオマーカの両方を計測する本発明の方法は、本明細書に提示されるデータにより説明されるとおり、これらのバイオマーカの１つを計測するにすぎない診断アッセイよりも優れた結果を提供する可能性がある。この二重または多重バイオマーカアプローチは、画像化技術との組合せにおいて、いっそうさらなる優位性を提供する。したがって、任意の二重、または多重バイオマーカアプローチ（併用画像を用いるまたは用いない）は、治療から利益を得ないと予測される患者の数を低減させ、したがって、治療を受け損なう患者の数を低減させる可能性があり、顕著に延命し得る。
【０１０１】
本発明により対処される臨床管理パラメータには、年生存、疾患関連死、早期または遅発再発、退縮度、転移、治療への応答性、治療の有効性およびグリーソンスコアが含まれる。比較のためのＰＳＡの計測値も含まれる。
【０１０２】
癌を発現する患者を、癌を発現しない患者と区別することが極めて重要である。６０から７０歳代の健常な男性における未治療低リスク、低ＰＳＡ前立腺癌の自然史に関するデータが欠落している。解剖における研究は、４０〜６０歳の男性の３分の１が、前立腺癌を抱えて生活していることを示している。この数は、８５歳を過ぎると７５％に増加する。それにもかかわらず、男性の３％のみがこの疾患により死亡し、確定試験が存在しないままである。
【０１０３】
有利には、本発明の実施は、スクリーニングにより引き起こされる損害（偽陽性をもたらす）および不要な後続の評価および治療（例えば、放射線照射、生検、ホルモンおよび手術）、例として、感染または尿閉または失禁、不要なスクリーニング誘導性生検、勃起不全、直腸および／または尿道損傷、精液中の持続性出血、乳房肥大、顔面紅潮、インポテンスおよび／または全体的な生活の質の低減、の低減をもたらし得る。本発明は、根治治療、例えば放射線照射または手術を受ける患者における偽陽性治療レジメンから生じる損害を低減、回避または排除する方法を提供する。この目的のため、本発明は、スクリーニングされ、上昇ＰＳＡレベルを有することが見出された男性を、放射線照射、生検または手術を受ける前に、本明細書に記載の予測因子変数の１つ以上についてスクリーニングまたは試験することができる機序を提供する。この確認アッセイまたは「Ｓｕｒｖｉｖｅ５」試験は、本明細書において実証されるとおり、現在のＰＳＡ計測値またはグリーソンスコアよりも良好な生存の予測因子を提供する。
【０１０４】
ＦＡＳ発現が前立腺癌を有するまたは有する疑いのある患者を治療する臨床家に重要な臨床管理パラメータの多くの優勢な予測因子であることが見出されたため、本発明は、組織、細胞および／または血清中での迅速で正確なＦＡＳ発現の同定を含む。
【０１０５】
本方法は、一般に、以下の工程：（ａ）生体試料（最適には、細胞または他の細胞もしくは体液を含有する）を癌患者から得る工程；（ｂ）試料をＦＡＳに特異的な検出薬剤と接触させる工程；（ｃ）（ｂ）中のＦＡＳの存在、量またはレベルを検出する工程；および（ｄ）ＦＡＳの存在、量またはレベル（単独または組合せ）を１つ以上の臨床管理パラメータと相関させて前立腺癌の予防、診断または治療を支援する工程を含む。
【０１０６】
生体試料は、細胞または組織であり得、好ましくは、細胞を含有する血清または血漿である。しかしながら、細胞は、組織試料または細胞培養物から、例えばエクスビボまたはインサイチュ法で得ることもできる。
【０１０７】
検出薬剤は、ＦＡＳに特異的な核酸プローブ、または抗ＦＡＳ抗体であり得る。
ＦＡＳプローブ
本発明は、生体試料中のＦＡＳ遺伝子またはタンパク質の検出において有用な新規核酸
ベースプローブを提供する。この目的のため、本発明は、生体試料から調製された核酸中のＦＡＳ特異的配列を検出する方法において使用されるヒトＦＡＳ遺伝子のセグメントに特異的な核酸配列を含む。本発明は、前立腺癌を有する患者からの組織または体液の生体試料から調製された核酸中の有用な癌検出マーカである前立腺関連配列を検出する方法において使用される他の前立腺関連遺伝子マーカ、ヒトＰＳＡ、ＵＳＰ２ａ、ｐＡＫＴ、ＮＰＹ、および／またはＡＭＡＣＲのセグメントに特異的な核酸配列をさらに含む。試料は、前立腺組織または非前立腺組織であり得る。非前立腺組織には、例えば、血液、リンパ節、乳房または乳房嚢胞、腎臓、肝臓、肺、筋、胃または腸組織が含まれ得る。本発明は、ＦＡＳ特異的配列、ＰＳＡ、ＵＳＰ２ａ、ｐＡＫＴ、ＮＰＹ、および／またはＡＭＡＣＲ配列を個々にまたは組合せで増幅および検出するための核酸配列を組み合わせる好ましい方法も含む。検出に使用される本発明の好ましいプローブ、プライマーおよびプロモータ−プライマー
本発明は、ＦＡＳ特異的ＲＮＡ種を検出および定量する方法も含む。本発明の他の実施形態は、ＰＳＡ、ＵＳＰ２ａ、ｐＡＫＴ、ＮＰＹ、および／またはＡＭＡＣＲのＲＮＡ種を、個々にまたは互いにもしくはＦＡＳ配列との組合せにおいて検出する方法を含む。さらに、個々のまたは組合せにおけるこれらのマーカの検出は、臨床的に重要である。それというのも、個々の患者からの癌は１つ以上のマーカを発現し得、その結果、マーカの１つ以上の検出が、１つのみのマーカの存在が試験された場合に他で生じ得る診断の間の偽陰性の潜在性を減少させるためである。
【０１０８】
一実施形態において、市販の抗体を使用して発現を検出することができる。ＵＳＰ２ａについての１つのそのような抗体は、アブジェント（Ａｂｇｅｎｔ）（サンディエゴ、カリフォルニア；カタログ番号ＡＰ２１３１ａ）からのＵＳＰ２抗体（Ｎ末端）である。
【０１０９】
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
本発明は、新規プローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションおよび蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを介して標的核酸を検出する方法を提供する。インサイチュハイブリダイゼーション法は、最初に１９６９年に開発され、以降多くの改善がなされてきた。基本的技術は、水素結合を介するＲＮＡおよび／またはＤＮＡについてのハイブリダイゼーションキネティクスを利用する。十分な長さ（約５０〜３００塩基対）のＤＮＡまたはＲＮＡの配列を標識することにより、選択的プローブを作製してＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列を検出することができる。これらのプローブの組織切片への適用は、ＤＮＡまたはＲＮＡを組織領域および細胞タイプ内に局在化することを可能とする。プローブの設計法は、当業者に公知である。ハイブリダイズされるプローブおよび標的の検出は、当分野において公知のいくつかの手法において実施することができる。最も顕著なものは、プローブに付着する検出標識の使用を介するものである。本発明のプローブは、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物であり得る。これらは、任意の核酸ベース構築物も構成し得る。本発明のプローブのための標識は、放射性または非放射性であり得、そのような標識の設計および使用は当分野において周知である。
【０１１０】
ＦＡＳ抗体
一実施形態において、本発明は抗ＦＡＳ抗体およびＥＬＩＳＡアッセイを利用する。抗ＦＡＳ抗体は、好ましくは、それぞれ２０１０年１０月１４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０５４５号明細書および２０１１年３月１７日に公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６７７３号号明細書に開示のものである。
【０１１１】
ＦＡＳの検出または捕捉のために本発明において使用される抗体は、ヒトＦＡＳに高度に特異的な新規抗ＦＡＳ抗体である。一実施形態において、ＦＡＳ検出用の市販抗体が使
用される。ＩＨＣについて、使用することができる抗体は、ベチル・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（モンゴメリー、テキサス）からのアフィニティ精製ヒト抗ＦＡＳＮ抗体（カタログ番号Ａ３０１−３２４Ａ）であり、ＥＬＩＳＡ試験について、使用することができる抗体には、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）（リトルトン、コロラド）からの脂肪酸シンターゼ抗体ペア（Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐａｉｒ）（カタログ番号Ｈ００００２１９４−ＡＰ１１）が含まれる。このペアは、ウサギアフィニティ精製ポリクローナル抗ＦＡＳＮ（１００ｕｇ）である捕捉抗体およびマウスモノクローナル抗ＦＡＳＮ、ＩｇＧ１カッパ（２０ｕｇ）である検出抗体を含有する。
【０１１２】
一実施形態において、本発明抗体は、配列番号１〜５（テーブル１）から選択されるヒトＦＡＳ配列に特異的なモノクローナル抗体である。別の実施形態において、本発明抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおける捕捉抗体として使用される。
【０１１３】
【表１】
2014519818.tif 000003
ＦＡＳ抗体および検出率
一実施形態において、本明細書に開示のＦＡＳ抗体を、前立腺癌の検出において単独またはＰＳＡの計測との組合せのいずれかで使用することができる。計測は、患者の組織、細胞または血清中で行うことができる。
【０１１４】
グリーソンスコアおよびＦＡＳ
本発明の方法の実施において、ＦＡＳ発現を１つ以上の臨床管理パラメータと組み合わせて、患者の診断、治癒および／または治療における改善を提供することができる。本発明により企図される１つのそのような組合せは、グリーソンスコアとの組合せである。グリーソンスコアまたはグレードは、組織提示の一次または優勢組織パターンおよび二次パターンにより定義される（テーブル２参照）。２つのパターンのそれぞれにスコアを付与し、スコアを最終的なグリーソンスコアのために組み合わせる。
【０１１５】
【表２】
2014519818.tif 000004
一実施形態において、５〜７のグリーソンスコアとの組合せにおけるＦＡＳレベルを使用して前立腺癌を有する患者を層別化または病期分類し、生存または治療への応答性に関する予後診断情報を提供することができる。全てのグリーソンスコア５〜７（両端含む）にわたり、ＦＡＳグレード（またはレベル）０〜３が患者試料の８８％超を集合的に包含することが見出された。実施例１２参照。結果的に、発現レベルについての計測値としてのＦＡＳグレード、および５〜７のグリーソンスコアの両方を用いる本発明の方法は、顕著な数の個体の層別化を可能とし、それにより生存（または再燃）のより正確な予測を提供する。一連の予測スケールのうち、３のＦＡＳレベルおよび５〜７のグリーソンスコアが最も予測的である。７のグリーソンスコアが一方の患者の致死を予測するが、他方の患者の致死を予測しないことは公知である。したがって、ＦＡＳとグリーソンスコアとの組合せは、改善された予測法を提供する。
【０１１６】
遺伝子発現および発現の局在化
本発明の一実施形態において、ＦＡＳ発現は、１つ以上の追加の遺伝子の発現に対しておよび／または１つ以上の異なる生検部位において計測される。癌の辺縁および癌から遠位の部位における発現と比較する癌部位内の遺伝子発現の比較は、試料の状態およびそれが癌性になるかどうかについて結論を説明することを可能とする。次いで、これらの結論は、転移および結果的に生存の予測の改善を可能とする。これらの方法において特に有用な遺伝子の１つのセットには、ＵＳＰ２ａ、ｐＡＫＴおよびＮＰＹの１つ以上と組み合わせたＦＡＳが含まれる。追加の患者パラメータを遺伝子発現データと組み合わせて本方法の予測力を改善することもできる。１つのそのような患者パラメータは年齢である。５０〜７５歳の患者について、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルがより重要である。
【０１１７】
ＦＡＳおよび退縮度
一実施形態において、ＦＡＳ発現レベルは、個々の患者についての不良および優秀な転帰間の層別化を可能とする癌退縮の確率の予測因子として使用される。この方法において、ＦＡＳ発現は退縮度と相関させ、より高いＦＡＳ発現レベルが臨床転帰を予測する。ＦＡＳレベルは不良転帰の優秀な予測因子であることが決定された。
【０１１８】
ＦＡＳおよび臨床生存
本発明は、前立腺癌を有するまたは有する疑いのある患者の生存の見込みを予測する新たな方法を含む。本明細書に提供されるツールの予測力は、前立腺癌の管理において単独でまたは他の臨床因子との組合せで使用することができるＦＡＳ生存モデル（ＦＳＭ）にフィットした。
【０１１９】
ＦＡＳおよびＵＳＰ２ａ差次的発現
一実施形態において、本発明は、従来、有意な集合的指標の組合せとして公知でなかった予測因子の組合せの使用を提供する。これらの組合せは、前立腺癌の臨床管理において有用な方法、アッセイまたはキットの基礎を形成し得る。
【０１２０】
遺伝子／タンパク質発現プロファイル
前立腺癌に関連する治療パラダイムの予後診断、予測および管理において遺伝子およびタンパク質発現プロファイルを用いるための組成物および方法も本明細書に記載される。
【０１２１】
前立腺癌についての正の治療転帰は、早期検出および治療介入に高度に依存する。最も早期の検出は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の計測を含む身体試験またはアッセイの使用により達成される。しかしながら、これらの技術は、完全な予測力を提供しない。偽陽性およびさらに悪いことに偽陰性が、曖昧で複雑な組織生理学および個体にわたるＰＳＡ試験の変動性の結果として生じ得る。結果的に、これらのアプローチは長期転帰尺度、例えば生存の改善に導かなかった。本発明のＧＥＰおよびＰＥＰ（集合的にＧＰＥＰ）は、疾患の管理に良い影響を与え得る有価な情報を提供し得る予後診断ツールを臨床家に提供する。本発明によれば、腫瘍学者は、ＧＰＥＰのメンバーの存在について疑いのある組織をアッセイすることができ、病態が疾患から進行、退縮し、またはより侵襲的になる可能性が高い患者を高精度で同定することができる。この情報は、他の利用可能な臨床情報、例として画像データとまとめると、より有効な疾患の管理を可能とする。
【０１２２】
本発明の一態様において、患者からの前立腺組織試料または血清中の遺伝子またはタンパク質の発現を、アレイまたは免疫組織化学技術を使用してアッセイしてＧＰＥＰの遺伝子タンパク質の発現を同定する。
【０１２３】
本発明のある方法は、（ａ）生体試料（好ましくは、前立腺組織または血清）を得ること（ｂ）試料をＧＰＥＰ、ＰＥＰまたはＧＥＰの１つ以上のメンバーに特異的な核酸プローブまたは抗体と接触させることおよび（ｃ）プロファイルのメンバーの１つ以上が上方調節（過剰発現）されるかどうかを決定することを含む。
【０１２４】
癌進行の見込みを決定するためのＧＰＥＰの予測値は、上方調節されると見出されるメンバーの数に伴い増加する。ＧＰＥＰの遺伝子および／またはタンパク質の、好ましくは、少なくとも約２つ、より好ましくは、少なくとも約４つ、最も好ましくは、約７つが過剰発現される。好ましい実施形態において、正常（未疾患）、辺縁組織（病変部位を包囲する患者の前立腺腫瘍被膜からの組織）の試料および他の対照組織または体液（例として血清）を、原発性病変部位と同一の試薬を使用して同一の条件下で同時にアッセイする。好ましくは、少なくとも１つの参照タンパク質の発現も同時に同一条件下で計測する。
【０１２５】
一実施形態において、本発明は、前立腺癌患者における疾患の再発／転移の見込みを示す遺伝子発現プロファイルおよびタンパク質発現プロファイルを含む。この実施形態において、本発明の方法は、（ａ）前立腺癌を罹患する患者の生体試料（好ましくは、原発性切除腫瘍または血清）を得ること；（ｂ）試料をＰＥＰのタンパク質に対する核酸プローブ（または抗体）と接触させることおよび（ｃ）プロファイルのメンバーの２つ以上が上方調節（過剰発現）されるかどうかを決定することを含む。再発の見込みを決定するための遺伝子プロファイルの予測値は、本発明により上方調節されると見出されるこれらの遺伝子のメンバーの数に伴い増加する。ＧＰＥＰの遺伝子の、好ましくは、少なくとも約２つ、より好ましくは、少なくとも約４つ、最も好ましくは、約７つが差次的に発現される。生体試料は、好ましくは、患者の組織、例えば、原発性切除腫瘍の試料であり；同一患者からの正常（未疾患）組織または血清を対照として使用する。好ましくは、少なくとも１つの参照遺伝子の発現も計測する。目下好ましい参照遺伝子は、陽性対照としてのベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ
ＤＨ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である一方、陰性対照には、大リボソームタンパク質（ＲＰＬＰ０）および／またはトランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）が含まれる。ベータアクチンはＩＨＣのための陽性対照として使用することができる。
【０１２６】
本発明は、患者試料における遺伝子および／またはタンパク質発現プロファイルを決定するためのアッセイ、ならびにそのアッセイを使用するための説明書をさらに含む。アッセイは、核酸（例えば、対象の核酸に特異的な核酸プローブを使用）またはタンパク質もしくはペプチド（例えば、対象のタンパク質／ペプチドに特異的な核酸プローブまたは抗体を使用）の検出に基づくものであり得る。一実施形態において、アッセイは、好ましくは、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）中にアレイされた組織試料を、ＧＰＥＰ中で同定されたタンパク質／ペプチドに特異的な抗体と接触させる免疫組織化学（ＩＨＣ）試験を含み、検出は、検出された遺伝子と、１つ以上の臨床管理パラメータ、例えば年生存、疾患関連死、早期または遅発再発、退縮度、転移または前立腺癌への進行の見込みとの関係を示すものと解釈する。一実施形態において、アッセイは、好ましくは、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）中にアレイされた血清試料を、ＧＰＥＰ中で同定されたタンパク質／ペプチドに特異的な抗体と接触させる免疫組織化学（ＩＨＣ）試験を含み、検出は、検出された遺伝子と１つ以上の臨床管理パラメータ、例えば年生存、疾患関連死、早期または遅発再発、退縮度、転移または前立腺癌への進行の見込みとの関係を示すものと解釈する。
【０１２７】
本明細書に記載のバイオマーカまたは診断方法のいずれかを、治療および／またはモニタリングレジメンの一部として包含して癌への進行または任意の治療法による癌患者の治療の有効性を予測することは、そのようなバイオマーカも診断工程も含まない治療またはモニタリングレジメンと比べて、そのような治療法またはモニタリングを必要とするまたはそれらから最大の利益を得る患者集団のみが治療またはモニタリングを必要とし、特に、いかなる治療法によっても治療を必要としないまたは治療から利益を得ない（進行が予測されない）と予測された患者は、治療する必要がないという利点を提供する。
【０１２８】
本発明は、前立腺癌を有し得る患者を治療する方法において、１つ以上のＧＰＥＰシグネチャを使用して患者の癌への可能性の高い進行を診断して進行を予測する工程；および患者の年齢、または他の治療関連基準を考慮して患者に前立腺癌のための適切な治療レジメンを施す工程を含む方法をさらに提供する。
【０１２９】
遺伝子発現プロファイルの決定
患者の病態が前立腺癌に進行する可能性が高いかどうかを示す遺伝子発現プロファイルを同定するために使用される方法は、本明細書に概ね記載され、本明細書の実施例においてさらに記載される。遺伝子および／またはタンパク質発現プロファイルを同定する他の方法は公知であり；これらの代替法のいずれかを使用することもできる。例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ＮＥＪＭ、第３５６巻（１）：ｐ．１１〜２０（２００７年）；ルーら（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＬＯＳ・メディシン（ＰＬＯＳ  Ｍｅｄ．）、第３巻（１２）：ｅ４６７（２００６年）；ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ）、第２２９９巻）：ｐ．１５６４（２００４年）；ゴルブら（Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２８６巻：ｐ．５３１〜５３７（１９９９年）参照。
【０１３０】
１つの方法の並行試験においては、１つのトラックにおいて、異なる転帰を経験した患者からの正常（非癌性）組織および／または疾患組織と比較して過剰／過小過剰発現される遺伝子を同定し；第２のトラックにおいて、同一の正常および疾患試料と比較して染色体挿入または欠失を含む遺伝子を同定する。これらの２つのトラックの分析は、２つのデータセットを生成する。データを分析し、遺伝子発現プロファイルの遺伝子（すなわち、対象の癌組織中で差次的に発現される遺伝子）を同定するアルゴリズムを使用して相関さ
せる。陽性および陰性対照を用いて結果を正規化することができ、例として同一患者からの正常組織中でも差次的に発現される遺伝子およびタンパク質を排除し、異なる転帰を有する疾患組織であり、遺伝子発現プロファイルが対象の癌に特有であることを確認する。
【０１３１】
初期工程として、石灰化または線維嚢胞性疾患のいずれかを提示する患者からの生体試料が要求される。組織試料は、前立腺癌に進行したと診断された患者からも得られ、例としてそれぞれの患者からの原発性切除腫瘍、転移リンパ節および正常（未疾患）辺縁前立腺組織の試料である。それぞれの試料に関連する臨床情報、例として化学療法薬、手術、放射線照射による治療または他の治療、治療の転帰および疾患の再発または転移をデータベース中に記録する。臨床情報には、年齢、性別、既往歴、治療歴、症状、家族歴、再発（有／無）などのような情報も含まれる。異なるタイプ（例えば、肺、脳、前立腺）の正常（非癌性）組織の試料および非前立腺癌（例えば、黒色腫、乳癌、卵巣癌）の試料を陽性対照として使用することができる。一組の健常個体からの正常未疾患前立腺組織の試料を陽性対照として使用することができ、癌が再発／転移した患者からの前立腺腫瘍試料を陰性対照として使用することができる。
【０１３２】
次いで、遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を生体試料から総ＲＮＡに基づき十分確立された方法に従って作成する。手短に述べると、典型的な方法は、総ＲＮＡを生体試料から単離し、ＲＮＡを増幅し、ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを検出可能な標識により標識し、ｃＤＮＡをゲノムアレイ、例えばアフィメトリクスＵ１３３ジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）とハイブリダイズさせ、アレイに結合している検出可能な標識からのシグナルの強度を計測することによりゲノムアレイとの標識ｃＤＮＡの結合を測定することを含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる前掲のルーら（Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．）、チェンら（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．）およびゴルブら（Ｇｏｌｕｂ，ｅｔ  ａｌ．）に記載の方法、ならびにそれらに引用される参照文献参照。得られた発現データをデータベース中に入力する。
【０１３３】
組織試料中のｍＲＮＡは、市販のまたは特注プローブまたはオリゴヌクレオチドアレイ、例えばｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドアレイを使用して分析する。これらのアレイの使用は、数千の遺伝子の定常状態ｍＲＮＡレベルの同時計測を可能とし、それにより効果、例えば無制御細胞増殖の発症、停止またはモジュレーションを同定するための強力なツールを提供する。アレイ上での細胞からの対象の核酸へのプローブのハイブリダイゼーションおよび／または結合は、標識プローブから受けるシグナルの局在および強度を検出および／または計測することにより測定することができ、またはそれを使用してマイクロアレイ上の既知の局在における核酸配列にハイブリダイズする試料からのＤＮＡ／ＲＮＡ配列を検出することができる。シグナルの強度は、試料組織中に存在するｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの量に比例する。多数のアレイおよび技術が利用可能で有用である。試料組織中の遺伝子および／またはタンパク質発現を測定する方法は、例えば、米国特許第６，２７１，００２号明細書；米国特許第６，２１８，１２２号明細書；米国特許第６，２１８，１１４号明細書；および米国特許第６，００４，７５５号明細書；ならびにワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、第２２巻（９）：ｐ．１５６４〜１６７１（２００４年）；ゴルブら（Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ）、（前掲）；およびシェナら（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻：ｐ．４６７〜４７０（１９９５年）に記載されており；これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
遺伝子分析態様は、遺伝子発現および挿入／欠失データを調査し得る。第１の工程として、ＲＮＡを組織試料から単離し、標識する。並行プロセスを、試料に対して実行して２つのデータセットを展開させる：（１）ｍＲＮＡレベルに基づく遺伝子の過剰／過小発現；および（２）染色体挿入／欠失データ。次いで、これらの２つのデータセットをアルゴ
リズムにより相関させる。それぞれの組織試料中の遺伝子の過剰／過小発現を、正常（非癌性）試料および他の対照試料中の遺伝子発現と比較し、癌組織中で差次的に発現される遺伝子のサブセットを同定する。好ましくは、上方および下方調節のレベルを、ハイブリダイズされるマイクロアレイプローブの強度計測値の変化倍率に基づき区別する。約２．０倍以上の差、または約０．０５未満のｐ値が、そのような区別をなすのに好ましい。すなわち、遺伝子が正常細胞に対して疾患または疾患の疑いのある細胞中で差次的に発現されると考えられる前、疾患細胞は正常細胞よりも少なくとも約２倍多いまたは少ない発現の強度を生じると見出される。一般に、差異倍率が高くなれば（またはｐ値が低くなれば）、診断または予後診断ツールとして使用される遺伝子がより好ましい。本発明の遺伝子シグネチャについて同定された遺伝子は、臨床実験室装置を使用してバックグラウンドを超過する量により正常またはモジュレートされない遺伝子から区別可能なシグナルの発生をもたらす発現レベルを有する。
【０１３５】
統計値を使用して、モジュレートされる遺伝子をモジュレートされない遺伝子およびノイズから完全に区別することができる。統計的検定は、多様な試料群間で最も有意に差次的に発現される遺伝子を同定し得る。スチューデントのｔ検定は、２つの群間で有意差を見出すために使用することができるロバストな統計的検定の一例である。ｐ値が低ければ、遺伝子が異なる群間で差を示す証拠がより説得力を示す。それにもかかわらず、マイクロアレイは２つ以上の遺伝子の同時計測を可能とするため、数万の統計的検定を１回で実行することができる。このため、小さいｐ値を偶然にのみ観察する可能性は低く、シダック補正を使用する調整または類似の工程および無作為化／並べ替え実験を行うことができる。ｔ検定による約０．０５未満のｐ値は、遺伝子の発現レベルが有意に異なる証拠である。より説得力を示す証拠は、シダック補正を因子化した後の約０．０５未満のｐ値である。それぞれの群における大量の試料について、無作為化／並べ替え検定後の約０．０５未満のｐ値は、有意差の最も説得力を示す証拠である。
【０１３６】
モジュレートされない遺伝子またはノイズよりも大きいシグナルを生成する遺伝子を選択するために使用することができる別のパラメータは、絶対シグナル差の計測値である。好ましくは、差次的に発現される遺伝子により生成されるシグナルは、正常またはモジュレートされない遺伝子と少なくとも約２０％だけ異なる（絶対値換算）。そのような遺伝子が正常またはモジュレートされない遺伝子よりも少なくとも約３０％異なる発現パターンを生成することがいっそうより好ましい。評価される遺伝子のより小さいサブセット、例えば３０個未満、約２０個以下または約１０個以下の遺伝子を含有するプロファイルについて、発現パターンは、正常またはモジュレートされない遺伝子よりも少なくとも約４０％または少なくとも約５０％異なり得る。
【０１３７】
差次的発現分析は、市販のアレイ、例えば、アフィメトリクスＵ１３３ジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）アレイ（アフィメトリクス・インコーポレイテッド（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ））を使用して実施することができる。これらのアレイは、チップ上に固定化される全ヒトゲノムについてのプローブのセットを有し、試験試料中の遺伝子の上方および下方調節を測定するために使用することができる。発現産物を検出し得るヒトゲノムＤＮＡまたはプローブが固定される他の基板、例えばアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、アジレント・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）またはイルミナ・インコーポレイテッド（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ）から入手可能なものを、使用することもできる。本発明において使用される目下好ましい遺伝子マイクロアレイには、アフィメトリクスＵ１３３ジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）アレイおよびアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイが含まれる。遺伝子発現分析を実施するための装置および試薬は、市販されている。例えば、アフィメトリクスジ
ーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）システム参照。次いで、分析から得られた発現データをデータベース中に入力する。
【０１３８】
染色体挿入／欠失分析のため、正常組織の試料と比較したそれぞれの試料の遺伝子についてのデータを得る。挿入／欠失分析は、アレイベース比較ゲノムハイブリダイゼーション（「ＣＧＨ」）を使用して作成する。アレイＣＧＨは、複数の遺伝子座におけるコピー数変動を同時に計測し、癌および発達障害を研究するためならびに診断および治療標的を開発するために重要なツールを提供する。アレイＣＧＨを実施するためのマイクロチップは、例えばアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から市販されている。アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）チップは、染色体上の遺伝子の局在を示し、遺伝子シグネチャについての追加のデータを提供する染色体チップである。この試験から１回収集された挿入／欠失データもデータベース中に入力する。
【０１３９】
分析は同一患者からの同一試料について実施して並行データを作成する。同一のチップおよび試料調製物を使用して変動性を低減させる。
「参照遺伝子」「対照遺伝子」または「ハウスキーピング遺伝子」として公知のある遺伝子の発現も、発現プロファイルの正確性を確保する手段として、好ましくは、同時に測定する。参照遺伝子は、多くの組織タイプ、例として癌性および正常組織中で一貫して発現され、したがって遺伝子発現プロファイルを正規化するために有用な遺伝子である。例えば、シルビアら（Ｓｉｌｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．）、ＢＭＣキャンサー（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ）、第６巻：ｐ．２００（２００６年）；リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻（２）：ｐ．２９２〜２９７（２００２年）；チャンら（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ＢＭＣモレキュラー・バイオロジー（ＢＭＣ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第６巻：ｐ．４（２００５年）参照。参照遺伝子の発現を特有の遺伝子発現プロファイル中の遺伝子と並行して測定することにより、遺伝子発現プロファイルの決定に使用される技術が適正に機能しているさらなる保証を提供する。参照遺伝子に関する発現データもデータベース中に入力する。目下好ましい実施形態において、以下の遺伝子を参照遺伝子として使用し：ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を陽性対照とする一方、陰性対照には、大リボソームタンパク質（ＲＰＬＰ０）および／またはトランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）が含まれる。ベータアクチンはＩＨＣについての陽性対照として使用することができる。
【０１４０】
遺伝子発現プロファイルについてのデータ相関
データベース中の差次的発現データおよび挿入／欠失データは、同様のデータベース中のそれぞれの組織試料に関連する臨床転帰情報と、疾患および／または疾患関連提示の進行ならびに再発の決定または予測のための遺伝子発現プロファイルを決定するアルゴリズムにより相関させることができる。データの相関および予測遺伝子シグネチャの同定に有用な種々のアルゴリズムが利用可能である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるスーら（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）、遺伝子調節ネットワーク構築のための円滑な応答表面アルゴリズム（Ａ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  Ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ａ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）、サイシオロジカル・ゲノミクス（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）第１１巻：ｐ．１１〜２０（２００２）に特定されるもののようなアルゴリズムを本明細書に開示の実施形態の実施に使用することができる。
【０１４１】
遺伝子発現プロファイルを同定する別の方法は、最適化アルゴリズム、例えば株式ポートフォリオの確立において広く使用される平均分散アルゴリズムの使用を介する。１つのそのような方法は、特許出願の米国特許出願公開第２００３／０１９４７３４号明細書に詳細に記載されている。本質的に、この方法は、利益の変動性を最小化しながら、使用す
るために受け取る利益(生成されるシグナル)を最適化するインプットセット(強度により
計測される発現)の確立を必要とする。イリザリーら（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．
）、ヌクレイックアシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第３１巻：ｅｌ５（２００３年）に記載のアルゴリズムを使用することもできる。１つの有用なアルゴリズムは、ＪＭＰソフトウエア（ＪＭＰ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）から入手可能なＪＭＰゲノミクスアルゴリズムである。
【０１４２】
遺伝子発現プロファイルを選択する方法は、発見的規則の適用も含み得る。そのような規則は、生物学および臨床結果を生成するために使用される技術の理解に基づき公式化し、次いで最適化法からのアウトプットに適用する。例えば、遺伝子シグネチャ同定の平均分散法を、癌を有する対象において差次的に発現された遺伝子の数についてのマイクロアレイデータに適用することができる。この方法からのアウトプットは、末梢血および疾患組織中で発現される一部の遺伝子を含み得る最適化された遺伝子のセットである。試験法において使用される試料が末梢血から得られ、癌の場合において差次的に発現されるある遺伝子も末梢血中で差次的に発現され得る場合、ポートフォリオが末梢血中で差次的に発現される遺伝子を排除する効率的フロンティアから選択される発見的規則を適用することができる。他の細胞、組織または体液を差次的に発現される遺伝子、タンパク質またはペプチドの評価に使用することもできる。無論、この規則は、例えば、データ事前選択の間に規則を適用することにより効率的フロンティアの形成前に適用することができる。
【０１４３】
当該生物学に必ずしも関連しない他の発見的規則を適用することができる。例えば、特定の遺伝子または遺伝子群によりある割合のポートフォリオのみを表すことができる規則を適用することができる。市販のソフトウェア、例えばワーグナ（Ｗａｇｎｅｒ）ソフトウェアは、これらのタイプの経験則に容易に適合する（ワーグナアソシエーツ平均分散最適化アプリケーション（Ｗａｇｎｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ））。これは、例えば、確度および精度以外の因子が１つ以上の遺伝子を含む望ましさに対して影響を有する場合に有用であり得る。
【０１４４】
一例として、アルゴリズムを種々の遺伝子（またはポートフォリオ）についての遺伝子発現プロファイルの比較に使用して予後診断を決定づけることができる。ポートフォリオを含む遺伝子のそれぞれの発現プロファイル（ＲＮＡかタンパク質レベルかにかかわらず）を媒体、例えばコンピュータ読取可能媒体中に固定する。これは、多数の形態を取り得る。例えば、疾患を示すシグナル（例えば、強度計測値）の範囲が入力される表を確立することができる。次いで、実際の患者データを表中の値と比較して患者試料が正常か疾患かを決定することができる。より洗練された実施形態において、発現シグナル（例えば、蛍光強度）のパターンをデジタルまたはグラフで記録する。次いで、患者試料と同時に使用される遺伝子ポートフォリオからの遺伝子発現パターンを発現パターンと比較する。次いで、パターン比較ソフトウェアを使用して患者試料が疾患の再発を示すパターンを有するかどうかを決定することができる。無論、これらの比較を使用して患者が疾患再発を経験する可能性が高くないかどうかを決定することもできる。次いで、試料の発現プロファイルを対照細胞のプロファイルと比較する。試料発現パターンが癌の再発についての発現パターンと一致する場合、（拮抗する医学的考察の不存在下で）患者は再発患者を治療するのと同様に治療される。試料発現パターンが正常／対照細胞からの発現パターンと一致する場合、患者は、癌について陰性と診断される。
【０１４５】
患者の遺伝子シグネチャを分析して癌の予後診断を決定する方法は、コックスハザード分析プログラムの使用を介する。この分析は、（Ｓ−プラス）Ｓ−Ｐｌｕｓソフトウェア（インサイトフルコーポレーション（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から市販）を使用して実施することができる。そのような方法を使用して、遺伝子発現プ
ロファイルを再発を明確に表すプロファイルと比較する（すなわち、プロファイル中の遺伝子の組合せについての発現レベルは再発を示す）。確立された閾値を有するコックスハザードモデルを使用して２つのプロファイルの類似性を比較し（既知の再発対患者）、次いで患者プロファイルが閾値を超過するかどうかを決定する。超過する場合、患者を再発する患者として分類し、治療、例えばアジュバント療法を施す。患者プロファイルが閾値を超過しない場合、患者を非再発患者として分類する。他の分析ツール、例えば線形判別分析、ロジスティック回帰およびニューラルネットワークアプローチを使用して同一の質問に回答することもできる。例えば、ＪＭＰ統計ソフトウェアから利用可能なソフトウェア参照。
【０１４６】
多数の他の周知のパターン認識の方法が利用可能である。以下の参照文献は、一部の例を提供する：
重みづけ投票：ゴルブ・ＴＲ．（Ｇｏｌｕｂ，Ｔ  Ｒ．）、スロニム・ＤＫ．（Ｓｌｏｎｉｍ，Ｄ  Ｋ．）、タマヤ・Ｐ．（Ｔａｍａｙａ，Ｐ．）、ユアール・Ｃ（Ｈｕａｒｄ，Ｃ）、ガッセンベーク・Ｍ．（Ｇａａｓｅｎｂｅｅｋ，Ｍ．）、メシロフ・ＪＰ．（Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ  Ｐ．）、コラー・Ｈ．（Ｃｏｌｌｅｒ，Ｈ．）、ロー・Ｌ．（Ｌｏｈ，Ｌ．）、ダウニング・ＪＲ．（Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ  Ｒ．）、カリギウリ・ＭＡ．（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，ＭＡ．）、ブルームフィールド・ＣＤ．（Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，ＣＤ．）、ランダー・ＥＳ．（Ｌａｎｄｅｒ，ＥＳ．）癌の分子分類：遺伝子発現モニタリングによるクラス発見およびクラス予測（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｌａｓｓ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）。サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２８６巻：ｐ．５３１〜５３７，１９９９年。
【０１４７】
サポートベクターマシン：スー・ＡＩ．（Ｓｕ，Ａ  Ｉ．）、ウエルシュ・ＪＢ．（Ｗｅｌｓｈ，Ｊ  Ｂ．）、サピノソ・ＬＭ．（Ｓａｐｉｎｏｓｏ，Ｌ  Ｍ．）、ケルン・ＳＧ．（Ｋｅｒｎ，Ｓ  Ｇ．）、ディミトロフ・Ｐ．（Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｐ．）、ラップ・Ｈ．（Ｌａｐｐ，Ｈ．）、シュルツ・ＰＧ．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ  Ｇ．）、パウエル・ＳＭ．（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ  Ｍ．）、モスカルク・ＣＡ．（Ｍｏｓｋａｌｕｋ，Ｃ  Ａ．）、フリエルソン・ＨＦ．Ｊｒ．（Ｆｒｉｅｒｓｏｎ，Ｈ  Ｆ．Ｊｒ．）、ハンプトン・ＧＭ．（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｇ  Ｍ．）、遺伝子シグネチャの使用によるヒト癌の分子分類（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）。キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第６１巻：ｐ．７３８８〜９３、２００１年。ラマスワミー・Ｓ．（Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．）、タマヨ・Ｐ．（Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．）、リフキン・Ｒ．（Ｒｉｆｋｉｎ，Ｒ．）、ムクヘルジェー・Ｓ．（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．）、イエン・ＣＨ．（Ｙｅａｎｇ，Ｃ  Ｈ．）、アンジェロ・Ｍ．（Ａｎｇｅｌｏ，Ｍ．）、ラッド・Ｃ．（Ｌａｄｄ，Ｃ．）、ライヒ・Ｍ．（Ｒｅｉｃｈ，Ｍ．）、ラツリッペ・Ｅ．（Ｌａｔｕｌｉｐｐｅ，Ｅ．）、メシロフ・ＪＰ．（Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ  Ｐ．）、ポッジオ・Ｔ．（Ｐｏｇｇｉｏ，Ｔ．）、ジェラルド・Ｗ．（Ｇｅｒａｌｄ，Ｗ．）、ローダ・Ｍ．（Ｌｏｄａ，Ｍ．）、ランダー・ＥＳ．（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ  Ｓ．）、ゴウルド・ＴＲ．（Ｇｏｕｌｄ，Ｔ  Ｒ．）。腫瘍遺伝子発現シグネチャを使用する多クラス癌診断（Ｍｕｌｔｉｃｌａｓｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）第９８巻：ｐ．１５１４９〜１５１５４、２００１年。
【０１４８】
ｋ近傍法：ラマスワミー・Ｓ．（Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．）、タマヨ・Ｐ．（Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．）、リフキン・Ｒ．（Ｒｉｆｋｉｎ，Ｒ．）、ムクヘルジェー・Ｓ．（Ｍｕ
ｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．）、イエン・ＣＨ．（Ｙｅａｎｇ，Ｃ  Ｈ．）、アンジェロ・Ｍ．（Ａｎｇｅｌｏ，Ｍ．）、ラッド・Ｃ．（Ｌａｄｄ，Ｃ．）、ライヒ・Ｍ．（Ｒｅｉｃｈ，Ｍ．）、ラツリッペ・Ｅ．（Ｌａｔｕｌｉｐｐｅ，Ｅ．）、メシロフ・ＪＰ．（Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ  Ｐ．）、ポッジオ・Ｔ．（Ｐｏｇｇｉｏ，Ｔ．）、ジェラルド・Ｗ．（Ｇｅｒａｌｄ，Ｗ．）、ローダ・Ｍ．（Ｌｏｄａ，Ｍ．）、ランダー・ＥＳ．（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ  Ｓ．）、ゴウルド・ＴＲ（Ｇｏｕｌｄ，Ｔ  Ｒ）。腫瘍遺伝子発現シグネチャを使用する多クラス癌診断（Ｍｕｌｔｉｃｌａｓｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）第９８巻：ｐ．１５１４９〜１５１５４、２００１年。
【０１４９】
相関係数：ファンフェア  ＬＪ（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  Ｌ  Ｊ）、ダイ  Ｈ（Ｄａｉ
Ｈ）、ファンドビジヴェル  ＭＪ（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ  Ｍ  Ｊ）、ヒー  ＹＤ（Ｈｅ  Ｙ  Ｄ）、ハート  Ａ（Ｈａｒｔ  Ａ）、マオ  Ｍ（Ｍａｏ  Ｍ）、ピータース  ＨＬ（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｈ  Ｌ）、ファンデルコーイ  Ｋ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｏｙ
Ｋ）、マートン  ＭＪ（Ｍａｒｔｏｎ  Ｍ  Ｊ）、ウイッテヴェーン  ＡＴ（Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ  Ａ  Ｔ）、シュレイベル  ＧＪ．（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｇ  Ｊ）、ケルクホーフェン  ＲＭ（Ｋｅｒｋｈｏｖｅｎ  Ｒ  Ｍ）、ロバーツ  Ｃ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｃ）、リンズレイ  ＰＳ．（Ｌｉｎｓｌｅｙ  Ｐ  Ｓ）、ベルナルズ  Ｒ（Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ）、フレンド  ＳＨ（Ｆｒｉｅｎｄ  Ｓ  Ｈ）。遺伝子発現プロファイリングは前立腺癌の臨床転帰を予測する（Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２００２年１月３１日；第４１５巻（６８７１）：ｐ．５３０〜６。
【０１５０】
遺伝子発現分析は、癌試料に特有の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）、すなわち、癌細胞により差次的に発現される遺伝子を同定する。次いで、例えば、市販の装置および試薬、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能なものを使用して実施することができるリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用してこのＧＥＰを検証する。
【０１５１】
タンパク質発現プロファイルの決定
細胞により発現される全ての遺伝子がタンパク質に翻訳されるわけではなく、したがって、ＧＥＰが同定されると、ＧＥＰ中の差次的に発現される遺伝子の一部または全部に対応するタンパク質も同一細胞または組織により差次的に発現されるかどうかを確認することも望ましい場合がある。したがって、タンパク質発現プロファイル（ＰＥＰ）を同一の疑いのある組織から作成し、対照組織を使用してＧＥＰを同定する。ＰＥＰも使用して他の個体、例えば前立腺癌患者におけるＧＥＰを検証する。
【０１５２】
本発明によるＰＥＰを作成する好ましい方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析による。この方法において、ＰＥＰ中のタンパク質に特異的な抗体を使用して対象の個体からの組織試料を調査する。ＰＥＰを同定する他の方法は公知であり、例えば、タンパク質特異的核酸プローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）である。例えば、ホーファら（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．）、第１１巻（１６）：ｐ．５７２２（２００５年）；ヴォルムら（Ｖｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ）著、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メタスタシス（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓ．）、第１９巻（５）：ｐ．３８５（２００２年）参照。これらの代替法のいずれかを使用することもできる。
【０１５３】
ＰＥＰを決定するため、疑いのある組織、転移および正常辺縁前立腺組織の試料を患者から得る。これらは、ＧＥＰを同定するために使用される同一の試料である。組織試料ならびに陽性および陰性対照試料を組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上にアレイして同時分析を可能とする。ＴＭＡは、最大約１０００個の別個の組織試料がアレイ様式でアセンブルされて同時組織学分析を可能とする基板、例えばガラススライドからなる。組織試料は、保存生検試料、例えばパラフィン包埋または冷凍組織から得られた組織を含み得る。組織マイクロアレイを作成する技術は、当分野において周知である。例えば、サイモンら（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第３６巻（１）：ｐ．９８〜１０５（２００４年）；カリオニエミら（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ）著、国際公開第９９／４４０６２号；コノネンら（Ｋｏｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ）著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ）、第４巻：ｐ．８４４〜８４７（１９９８年）参照。１つの方法において、中空針を使用してパラフィン包埋組織中の対象の領域から直径０．６ｍｍほどの小さい組織コアを摘出する。「対象の領域」は、組織学者により所望の疾患または正常組織を含有すると同定されたものである。次いで、これらの組織コアをレシピエントパラフィンブロック中に正確に間隔を空けたアレイパターンで挿入する。このブロックからの切片をミクロトームを使用して切断し、顕微鏡スライド上にマウントし、次いで標準的組織学的分析により分析する。それぞれのマイクロアレイブロックを約１００から約５００個の切片に切断することができ、それらを独立試験に供することができる。
【０１５４】
組織試料中のタンパク質は、タンパク質特異的薬剤、例えば抗体または核酸プローブ、例えばオリゴヌクレオチドまたはアプタマーを使用してＴＭＡを調査することにより分析することができる。抗体は、それらの特異性および利用可能性に起因してこの目的のために好ましい。抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、抗体断片、および／または種々のタイプの合成抗体、例としてキメラ抗体、またはそれらの断片であり得る。抗体は、多数の供給源（例えば、アビーム（Ａｂｅａｍ）、セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはサンタ・クルズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））から市販されており、または当業者に周知の技術を使用して生成することができる。抗体は、典型的には、抗体の検出を可能とする検出可能な標識、例えば酵素、クロモゲンまたは量子ドットを備える。抗体は、検出可能な標識と直接に、または他方のメンバーが検出可能な標識を含有する結合ペアの一方のメンバーに間接的にコンジュゲートまたはタグ化されていてよい。使用される検出系は、例えば、ベンタナ・メディカル・システムズ・インコーポレイテッド（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）のウェブサイトに記載されている。量子ドットは、検出可能な標識として特に有用である。量子ドットの使用は、例えば、以下の参照文献に記載されている：ジェイスワルら（Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第２１巻：ｐ．４７〜５１（２００３年）；チャンら（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第１３巻：ｐ．４０〜４６（２００２年）；チャンら（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２８１巻：ｐ．４３５〜１４６（１９９８年）。
【０１５５】
組織の細胞中の対象のタンパク質を同定するための抗体の使用は、免疫組織化学（ＩＨＣ）と称され、十分確立されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるサイモンら（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第３６巻（１）：ｐ．９８（２００４年）；ヘディッケら（Ｈａｅｄｉｃｋｅ  ｅｔ
ａｌ．）著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第３５巻（１）：ｐ．１６４（２００３年）参照。ＩＨＣアッセイは、市販の装置、例えばベンタナ・メディカル・システムズ・インコーポレイテッド（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ）から入手可能なベンチマーク（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）装置を使用して自動化することができる。
【０１５６】
一実施形態において、ＴＭＡは、遺伝子発現試験において、病態が前立腺癌に進行した患者において差次的に発現されると同定された遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体と接触させてそれぞれのタイプの組織中のこれらのタンパク質の発現を測定することができる。ＴＭＡを調査するために使用される抗体は、最大レベルの差次的発現を有する遺伝子に基づき選択される。
【０１５７】
ＧＰＥＰアッセイ
本発明は、患者の病態が癌に進行する可能性が高いかどうかまたは癌を有する患者が不良予後を有するかどうかを決定または予測するための方法およびアッセイをさらに含む。一態様によれば、組織試料がＧＥＰ、ＰＥＰまたはＧＰＥのいずれかを示すかどうかを決定するため、フォーマット化ＩＨＣアッセイを使用することができる。このアッセイは、分析を実施するために必要とされる材料、例として試薬（抗体、検出可能な標識など）の全部または一部および説明書を含むキットに処方することができる。
【０１５８】
本明細書に記載の組成物のいずれかを、キット中に含めることができる。非限定的な例において、ＰＥＰ、ＧＥＰ、またはＧＰＥＰを検出するための試薬がキットに含まれる。一実施形態において、本明細書に開示のＧＰＥＰの遺伝子の発現産物の１つ以上に対する抗体が含まれる。抗体は、約０．１μｇ／ｍＬから約５００μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬまたは約１μｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬまたは記述範囲内のいずれかの値の濃度を提供するように含めることができる。キットは、さらなるプローブ、標識または捕捉薬剤を作出または合成するための試薬または説明書をさらに含み得る。キットは、１つ以上の緩衝液、例えばヌクレアーゼ緩衝液、転写緩衝液、またはハイブリダイゼーション緩衝液、ＤＮＡテンプレート、ｃＤＮＡ、プライマー、プローブまたは標識を調製するための化合物、および前記のもののいずれかを単離するための構成成分も含み得る。本発明の他のキットは、全ての試薬、緩衝液などを含む核酸またはペプチドアレイを作製するための構成成分を含み得、したがって、例えば、固体担体を含み得る。
【０１５９】
キットの構成成分は、水性媒体中または凍結乾燥形態で包装することができる。キットの容器手段は、一般に、構成成分を装入し、好ましくは、好適にアリコート化することができる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段を含む。キット中に２つ以上の構成成分が存在する場合（標識試薬および標識を一緒に包装することができる）、キットは一般に、追加の構成成分を別個に装入することができる第２、第３または他の追加の容器も含有する。しかしながら、構成成分の種々の組合せを、バイアルまたは類似の容器中に含めることができる。本発明のキットは、典型的には、検出試薬、例えば、核酸またはタンパク質または抗体を含有するための手段、および市販のために密封される他の任意の試薬容器も含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注射または吹込成形プラスチック容器を含み得る。
【０１６０】
キットの構成成分が１つ以上の液体溶液中で提供される場合、液体溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの構成成分は、乾燥粉末として提供することができる。試薬および／または構成成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒は、別の容器手段中で提供することもできることが想定される。一部の実施形態において、標識色素は乾燥粉末として提供される。１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００マイクログラムまたは少なくともまたは多くともそれらの量の乾燥色素が本発明のキット中で提供されることが
企図される。次いで、色素は、任意の好適な溶媒、例えばＤＭＳＯ中で再懸濁させることができる。
【０１６１】
キットは、分解から保護する組成物を保存または維持する構成成分も含み得る。そのようなキットは、一般に、好適な手段中で、それぞれの個々の試薬または溶液についての異なる容器を含む。
【０１６２】
本発明のあるアッセイ法は、個体からの組織試料をＧＰＥＰの遺伝子またはタンパク質の一部または全部に特異的な抗体群と接触させ、試料中のこれらの遺伝子またはタンパク質の上方または下方調節の出現を決定することを含む。ＴＭＡの使用は、対照試料を含む多数の試料の同時アッセイを可能とする。
【０１６３】
本方法は、好ましくは、対照または「参照タンパク質」を検出および／または定量することも含む。試料中の参照タンパク質を検出および／または定量することは、結果を正規化し、したがってアッセイが適正に機能しているさらなる保証を提供する。目下好ましい実施形態において、以下の参照タンパク質の１つ以上に特異的な抗体が含まれ：ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を陽性対照する一方、陰性対照には、大リボソームタンパク質（ＲＰＬＰ０）および／またはトランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）が含まれる。ベータアクチンはＩＨＣについての陽性対照として使用することができる。
【０１６４】
一実施形態において、アッセイおよび方法は、ＧＰＥＰ中の過剰発現される遺伝子またはタンパク質のみの発現を測定することを含む。本方法は、組織試料を患者から得、試料の遺伝子および／またはタンパク質発現プロファイルを決定し、遺伝子またはタンパク質発現プロファイルから決定することを含む。
【０１６５】
一実施形態において、アッセイおよび方法は、ＧＰＥＰ中の過剰発現される遺伝子またはタンパク質のみの発現を測定することを含む。本方法は、好ましくは、少なくとも１つの参照タンパク質を含み、それは以下から選択することができ、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳＢ）を陽性対照とする一方、陰性対照には、大リボソームタンパク質（ＲＰＬＰ０）および／またはトランスフェリン受容体（ＴＲＦＣ）が含まれる。ベータアクチンはＩＨＣについての陽性対照として使用することができる。
【０１６６】
本発明は、個体、例えば、患者からの組織試料または細胞のＩＨＣ分析を実施するための試薬、例としてＧＰＥＰ中のタンパク質の少なくとも約２つおよび任意の参照タンパク質に特異的な抗体を含有するキットをさらに含む。抗体は、好ましくは、対象のタンパク質への抗体の結合を検出するための手段、例えば、検出可能な標識によりタグ化されている。好ましい検出可能な標識には、蛍光化合物または量子ドットが含まれ；しかしながら、他のタイプの検出可能な標識を使用することができる。抗体についての検出可能な標識は、例えば、ベンタナ・メディカル・システムズ・インコーポレイテッド（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）から市販されている。
【０１６７】
組織試料中のタンパク質発現を検出および定量する免疫組織化学法は、周知である。いくつかの異なるタンパク質の発現の測定を可能とする任意の方法を使用することができる。例えば、シグノレッティら（Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、「ヒト前立腺癌におけるＨｅｒ−２−ｎｅｕ発現およびアンドロゲン非依存性への進行（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｏｗａｒｄ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ」、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．
Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ．）、第９２巻（２３）：ｐ．１９１８〜２５（２０００年）；グーら（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．）著、「前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）発現は、グリーソンスコアが高くなり、前立腺癌の病期および骨転移が進行につれて増加する（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｅ，ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）」、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、第１９巻：ｐ．１２８８〜９６（２０００年）参照。そのような方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために設計された自動化装置を使用して効率的に実施することができる。そのようなアッセイを迅速に実施するための装置は、例えば、ベンタナ・モレキュラー・ディスカバリー・システムズ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはラボ・ビジョン・インコーポレーション（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から市販されている。そのような装置を使用する本発明による方法は、製造業者の説明書に従って実施することができる。
【０１６８】
そのような方法またはアッセイにおいて使用されるタンパク質特異的抗体は容易に入手可能であり、または十分に確立された技術を使用して調製することができる。本明細書に開示のＧＰＥＰ中のタンパク質に特異的な抗体は、例えば、セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテッド（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、またはアビーム（Ａｂｅａｍ）から得ることができる。
【０１６９】
免疫アッセイ
本発明は、前立腺癌の診断、予後診断および予測ならびに前立腺癌に関連する臨床管理パラメータの説明において有用な新たなアッセイを提供する。本発明の免疫アッセイは、本明細書に記載の抗ＦＡＳポリクローナルまたはモノクローナル抗体が生体試料中のＦＡＳに特異的に結合することを利用する。任意のタイプの免疫アッセイフォーマット、例として、限定されるものではないが、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光免疫アッセイ（ＣＬＩＡ）、計数免疫アッセイ（ＣＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、凝集、比濁法、混濁法またはウエスタンブロットを使用することができる。これらおよび他のタイプの免疫アッセイは周知であり、文献、例えば、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ファン・オス（Ｖａｎ  Ｏｓｓ）およびファン・レフェンモルテル（Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ）（編）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９４年；免疫アッセイハンドブック（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、Ｄ．ワイルド（Ｄ．Ｗｉｌｄ）（編）、エルサビエ・エルティーディ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｔｄ．）、２００５年；ならびに本明細書に開示の参照文献に記載されている。
【０１７０】
本発明に好ましいアッセイフォーマットは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットである。ＥＬＩＳＡは、溶液中の抗原または抗体を検出および計測するための高感度技術であり、溶液を物質に特異的な固定化抗体が付着された表面上に流し、その物質が存在する場合、それは抗体層に結合し、その存在は、検出を可能とするためにタグ化または標識された抗体の適用により確認および可視化される。ＥＬＩＳＡは、抗体の高特異性を酵素アッセイの高感度と、高いターンオーバー数を保有する容易にアッセイされる酵素、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合している抗体または抗原を使用することにより組み合わせ、血清中抗体濃度（抗体力価）の測定および抗原の存在の検出の両方に極めて有用なツールである。
【０１７１】
多くの異なるタイプのＥＬＩＳＡが存在し；最も一般的なタイプには、「直接ＥＬＩＳ
Ａ」、「間接ＥＬＩＳＡ」、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」および細胞ベースＥＬＩＳＡ（Ｃ−ＥＬＩＳＡ）が含まれる。ＥＬＩＳＡの実施は、特定の抗原についての特異性を有する少なくとも１つの抗体を含む。未知量の抗原を有する試料を固体担体（通常、ポリスチレンマイクロタイタープレート）上に、非特異的（表面への吸着を介する）または特異的（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて同一抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介する）に固定化する。抗原を固定化した後、検出抗体を添加し、抗原との複合体を形成させる。検出抗体は酵素に共有結合されていてよく、またはそれ自体、バイオコンジュゲーションを介して酵素に結合している二次抗体により検出することができる。それぞれの工程間で、プレートを典型的には軽度の洗浄剤溶液により洗浄して特異的に結合していないいかなるタンパク質または抗体も除去する。最終洗浄工程後、検出可能な標識によりタグ化された酵素基質を添加することによりプレートを発色させて可視シグナルを生成し、それが試料中の抗原の量を示す。
【０１７２】
典型的なマイクロタイタープレートサンドイッチ免疫アッセイにおいて、抗体（「捕捉抗体」）は、基板、例えばマイクロタイタープレート上に吸着または固定化させる。モノクローナル抗体は、それらのより大きい特異性に起因して捕捉抗体として好ましいが、ポリクローナル抗体を使用することもできる。試験試料をプレートに添加すると、プレート上の抗体は試料からの標的抗原に結合し、それをプレート中で保持する。二次抗体（「検出抗体」）または抗体ペアを次の工程において添加すると、それも標的抗原（既にプレート上のモノクローナル抗体に結合している）に結合し、それにより２つの異なる抗体間で抗原「サンドイッチ」を形成させる。
【０１７３】
次いで、この結合反応を放射免疫アッセイフォーマット（ＲＩＡ）と同様に放射性同位体により；酵素免疫アッセイフォーマット（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）と同様に酵素により；または検出抗体に付着している他の検出可能な標識により計測することができる。標識は、プレートに添加された元の試料中に存在する標的抗原の量に比例する発色シグナルを生成する。免疫アッセイフォーマットに応じて、発色度を裸眼（家庭用妊娠試験と同様）、シンチレーションカウンタ（ＲＩＡについて）により、または分光光度プレートリーダ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡについて）により検出および計測することができる。
【０１７４】
次いで、アッセイを以下の一般工程に従って実施する：
工程１：捕捉抗体をプラスチックマイクロタイタープレートのウェル上に吸着させる（試料は添加しない）；
工程２：試験試料（例えばヒト血清）をプレートのウェルに、既にプレート上に結合している捕捉抗体への標的抗原の結合を可能とするために十分な条件下で添加し、それにより抗原をウェル中で保持させる；
工程３：標的抗原（既にプレート上の捕捉抗体に結合している）に検出抗体または抗体ペア（付着している酵素または他の検出可能な部分を有する）を結合させ、それにより２つの異なる抗体間で抗原「サンドイッチ」を形成させる。検出抗体上の検出可能な標識は、プレートに添加された元の試料中に存在する標的抗原の量に比例する発色シグナルを生成する。
【０１７５】
抗原ダウン（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｏｗｎ）免疫アッセイと称されることも多い代替的な実施形態において、分析物（抗体でない）を基板、例えばマイクロタイタープレート上にコートし、それを使用して試料中に見出される抗体に結合させる。試料を添加すると（例えばヒト血清）、プレート上の抗原が試料からの抗体（例えば、ＩｇＥ）により結合され、それはウェル中で保持される。次に酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識された種特異的抗体（例えば、抗ヒトＩｇＥ抗体）を添加し、それはプレート上の抗原に結合している抗体に結合する。シグナルが大きければ、より多くの抗体が試料中に存在する。
【０１７６】
別の実施形態において、免疫アッセイは、競合阻害フォーマットで構築することができる。競合阻害アッセイは、小さい分析物を計測するために使用されることが多い。それというのも、競合阻害アッセイは、標準的なＥＬＩＳＡフォーマットにおいて使用されるように２つではなく１つの抗体の結合のみを要求するためである。連続競合阻害アッセイにおいては、試料およびコンジュゲートされた分析物をサンドイッチアッセイと同様の工程で添加する一方、古典的競合阻害アッセイにおいては、これらの試薬を同時に一緒にインキュベートする。
【０１７７】
典型的な連続競合阻害アッセイフォーマットにおいて、捕捉抗体を基板、例えばマイクロタイタープレート上にコートする。試料を添加すると、捕捉抗体は試料から遊離分析物を捕捉する。次の工程において、検出可能な標識、例えば酵素または酵素基質により標識された既知量の分析物を添加する。標識分析物も、プレート上に吸着している捕捉抗体に結合しようとするが、標識分析物は試料からの事前に結合している分析物の存在により捕捉抗体への結合が阻害される。このことは、モノクローナルが試料からの未標識分析物に既に結合している場合、標識分析物はプレート上のモノクローナルにより結合されないことを意味する。試料中の未標識分析物の量は、標識分析物により生成されるシグナルに反比例する。シグナルが低ければ、より多くの未標識分析物が試料中に存在する。標準曲線は、未標識分析物スタンダードの段階希釈物を使用して構築することもできる。次いで、サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットにおいて行うのと同様に、後続の試料値を標準曲線から読取ることができる。古典的競合阻害アッセイフォーマットは、標識（コンジュゲートされた分析物）および未標識分析物（試料から）の同時添加を要求する。次いで、標識および未標識分析物の両方が、プレート上のモノクローナル捕捉抗体上の結合部位に同時に競合する。連続競合阻害アッセイフォーマットと同様に、発色シグナルは試料中の未標識標的分析物の濃度に反比例する。標識分析物の検出は、マイクロタイタープレートリーダ上で読み取ることができる。
【０１７８】
マイクロタイタープレートに加え、免疫アッセイは、迅速試験、例えば家庭用妊娠試験として構成することもできる。マイクロタイタープレートアッセイと同様に、迅速試験は、抗原と反応する抗体を使用し、サンドイッチフォーマット、競合阻害フォーマット、および抗原ダウンフォーマットとして開発することができる。迅速試験について、抗体および抗原試薬は、多孔膜に結合させ、それは陽性試料と反応する一方、過剰な体液を膜の非反応部分に導く。迅速免疫アッセイは、一般に２つの構成がある：試料をウェル中に簡易に装入し、結果を直ちに読み取るラテラルフロー試験；および試料をウェル中に装入し、ウェルを洗浄し、次いで最終的に分析物−検出可能な標識のコンジュゲートを添加し、結果を数分後に読み取ることを要求するフロースルー系。１つの試料をストリップまたはカセット毎に試験する。迅速試験は、マイクロタイタープレートアッセイよりも速く、試料処理をほとんど要求せず、より安価であることが多く、装置の使用なしで有／無の回答を生成する。しかしながら、迅速免疫アッセイは、プレートベース免疫アッセイほど感度も良くなく、それらは分析物を正確に定量するために使用することもできない。
【０１７９】
循環細胞中のＦＡＳの量を検出するために本発明において使用される好ましい技術は、高度に特異的なモノクローナル抗体を使用して試料抗原を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡである。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、以下の一般工程を含む：
１．既知量の捕捉抗体が結合している表面を調製し；
２．表面上のいかなる非特異的結合部位も（場合により）遮断し；
３．抗原含有試料を表面にアプライし；
４．未結合抗原が除去されるように表面を洗浄し；
５．結合した抗原に特異的に結合する一次（検出）抗体をアプライし；
６．一次抗体に特異的な酵素結合二次抗体をアプライし；
７．未結合抗体−酵素コンジュゲートが除去されるようにプレートを洗浄し；
８．酵素により検出可能な（例えば、発色または蛍光または電気化学）シグナルに変換される化学物質をアプライし；
９．吸光度または蛍光または電気化学シグナルを計測して抗原の存在および量を決定する。
【０１８０】
代替的実施形態において、一次抗体（工程５）を酵素に結合させ；この実施形態において、酵素にコンジュゲートされた二次抗体の使用（工程６）は、一次抗体が酵素にコンジュゲートしている場合、必須ではない。しかしながら、二次抗体コンジュゲートの使用は、検出が望まれる全ての抗原についての酵素結合抗体を作出する高価なプロセスを回避する。他の抗体のＦｃ領域に結合する酵素結合抗体を使用することにより、この同一の酵素結合抗体を種々の状況において使用することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡの主な利点は、粗製または不純試料を使用し、存在し得るあらゆる抗原に依然として選択的に結合する能力である。「捕捉」抗体の第１の層を用いない場合、試料中のあらゆるタンパク質（例として、血清タンパク質）はプレート表面に競合的に吸着し得、固定化される抗原の量を低下させる。
【０１８１】
本発明の一実施形態において、固相基板、例えばマイクロタイタープレートまたはストリップは、捕捉抗体を基板の表面に固定または固定化するように処理する。固相の材料は、それが免疫アッセイにおいて使用される通常の固相の材料である限り、特に限定されない。そのような材料の例には、ポリマー材料、例えばラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエンコポリマー、塩化ポリビニル、ポリビニルアセテート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレートコポリマー、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレートコポリマー、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、およびシリコーン；アガロース；ゼラチン；赤血球；ならびに無機材料、例えばシリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、および磁気物質が含まれる。これらの材料は、単独でまたはそれらの２つ以上の組合せで使用することができる。
【０１８２】
固相の形態は、固相が免疫アッセイにおいて使用される通常の固相の形態、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、およびナノ粒子の形態である限り、特に限定されない。粒子には、磁気粒子、疎水性粒子、例えばポリスチレンラテックス、粒子の表面上に親水性基、例えばアミノ基およびカルボキシル基を有するコポリマーラテックス粒子、赤血球およびゼラチン粒子が含まれる。固相は、好ましくは、マイクロタイタープレートまたはストリップ、例えばセル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテッド（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）から入手可能なものである。
【０１８３】
捕捉抗体は、好ましくは、配列番号１〜５のペプチド配列の１つ以上の少なくとも一部に特異的に結合する本明細書に記載の１つ以上のモノクローナル抗ＦＡＳ抗体である。マイクロタイタープレートまたはストリップが使用される場合、捕捉抗体は、ウェル内に固定化される。タンパク質を固相基板にコートおよび／または固定化する技術は当分野において公知であり、例えば、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、またはそれらの組合せにより達成することができる。例えば、Ｗ．ルットマンら（Ｗ．Ｌｕｔｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ）著、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第４．３．１章（ｐ．９２〜９４）、エルセビエ・インコーポレイテッド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｉｎｃ．）（２００６年）およびそれに引用される参照文献参照。例えば、結合物質がアビジンまたはストレプトアビジンである場合、ビオチンが結合した固相を使用してアビジンまたはストレプトアビジンを固相に固定することができる。使用されるべき捕捉抗体、検出抗体および固相の量は、好適には、計測されるべき抗原、使用されるべき抗体、および固相のタイプなどに応
じて確立することもできる。マイクロタイタープレートを捕捉抗体によりコートするためのプロトコル、例として捕捉抗体の量を計算するツールおよび方法は、例えば、イムノケミストリー・テクノロジーズ・エルエルシー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）（ブルーミントン、ミネソタ）およびメソ・スケール・ダイアグノスティクス・エルエルシー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）（ゲイザーズバーグ、メリーランド）についてのウェブサイトに記載されている。
【０１８４】
検出抗体は、任意の抗ＦＡＳ抗体であり得る。抗ＦＡＳ抗体は、例えば、セル・シグナリング・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＭＤバイオサイエンスズ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）他から市販されている。検出抗体は、配列番号１〜５の１つ以上に特異的な本明細書に開示の抗ＦＡＳ抗体でもあり得る。一実施形態において、検出抗体は、検出可能な標識、または酵素と直接コンジュゲートされていてよい。検出抗体が検出可能な標識とも酵素ともコンジュゲートされていない場合、検出抗体に特異的に結合する標識二次抗体が含まれる。そのような検出抗体「ペア」は、例えば、セル・シグナリング・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）から市販されている。
【０１８５】
抗体を検出可能な標識により標識する技術は、当分野において十分確立されている。本明細書に使用される用語「検出可能な標識」は、分光光度、光化学、生化学、免疫化学、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、および酵素補因子、または当分野において公知の任意の他の標識からなる群から選択することができる。例えば、ゾラ（Ｚｏｌａ）著、モノクローナル抗体：技術マニュアル（  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、ｐ．１４７〜１５８（ＣＲＣプレス・インコーポレイテッド（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）１９８７年）参照。検出可能な標識は、対象抗体に付着させることができ、アッセイ装置の利用可能性および適合可能な免疫アッセイ手順により定められることが多い種々の方法の使用の要求に合致するように選択される。適切な標識には、限定されるものではないが、放射性核種、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光部分またはタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光部分（例えば、エビデント・テクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、トロイ、ニューヨークにより供給されるエビドット（Ｅｖｉｄｏｔ）（登録商標）量子ドットまたはクアンツム・ドット・コーポレイション（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パロアルト、カリフォルニアにより供給されるＱドット（Ｑｄｏｔ）（商標）ナノ粒子）が含まれる。
【０１８６】
好ましくは、本発明のサンドイッチ免疫アッセイは、固相上の捕捉抗体−抗原−検出抗体複合体の形成後、検出抗体に結合している標識二次抗体を計測する工程を含む。標識物質を計測する方法は、標識物質のタイプに応じて適切に選択することができる。例えば、標識物質が放射性同位体である場合、慣用的に公知の装置、例えばシンチレーションカウンタを使用することにより放射性を計測する方法を使用することができる。標識物質が蛍光物質である場合、慣用的に公知の装置、例えばルミノメータを使用することにより蛍光を計測する方法を使用することができる
標識物質が酵素である場合、酵素基質を酵素と反応させることにより発光または発色を計測する方法を使用することができる。酵素に使用することができる基質には、慣用的に公知の発光基質、比色基質などが含まれる。アルカリホスファターゼが酵素として使用さ
れる場合、その基質には、化学発光基質、例えばＣＤＰ−スター（ＣＤＰ−ｓｔａｒ）（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１．−ｓｕｐ．３．７］デカン）−４−イル）二ナトリウムフェニルホスフェート）およびＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１．ｓｕｐ．３．７］−デカン）−４−イル）二ナトリウムフェニルホスフェート）および比色基質、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ならびにヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）が含まれる。これらの発光または比色基質は、慣用的に公知の分光光度計、ルミノメータなどにより検出することができる。
【０１８７】
一実施形態において、検出可能な標識は、量子ドット（例えば、エビデント・テクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、トロイ、ニューヨークにより供給されるエビドット（Ｅｖｉｄｏｔ）（登録商標）量子ドットまたはクアンツム・ドット・コーポレイション（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パロアルト、カリフォルニアにより供給されるＱドット（Ｑｄｏｔ）（商標）ナノ粒子）を含む。タンパク質、例として抗体を量子ドットにより標識するための技術は、公知である。例えば、ゴールドマンら（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、フィジカ・ステータス・ソリジ（Ｐｈｙｓ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｌ．）、第２２９巻（１）：ｐ．４０７〜１４（２００２年）；ズドルブノワら（Ｚｄｏｂｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）著、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・オプティクス（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ．）、第１４巻（２）：ｐ．０２１００４（２００９年）；ラオら（Ｌａｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＪＡＣＳ、第１２８巻（４６）：ｐ．１４７５６〜１４７５７（２００６年）；マットウシら（Ｍａｔｔｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＪＡＣＳ、第１２２巻（４９）：ｐ．１２１４２〜１２１５０（２０００年）；およびメイソンら（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー：ナノバイオテクノロジー・プロトコルズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＮａｎｏＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）第３０３巻：ｐ．３５〜５０（スプリンガー・プロトコルズ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、２００５年）参照。量子ドット抗体標識キットは、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールズバッド、カリフォルニア）およびミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ビルリカ、マサチューセッツ）から市販されている。
【０１８８】
本発明のサンドイッチ免疫アッセイは、１つ以上の洗浄工程を含み得る。洗浄により、未反応試薬を除去することができる。例えば、固相がマイクロタイターウェルのストリップを含む場合、洗浄物質または緩衝液をそれぞれの工程後にウェルと接触させる。使用することができる洗浄物質の例には、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが含まれる。緩衝液のｐＨは、好ましくは、約ｐＨ６．０から約ｐＨ１０．０である。緩衝液は、洗浄剤または界面活性剤、例えばツイーン２０を含有し得る。
【０１８９】
サンドイッチ免疫アッセイは、免疫アッセイに典型的な条件下で実施することができる。免疫アッセイに典型的な条件は、ｐＨが約６．０から１０．０であり、温度が約３０から４５℃である条件を含む。ｐＨは、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などにより調節することができる。緩衝液は、通常の免疫アッセイにおいて使用される構成成分、例えば、界面活性剤、保存剤および血清タンパク質を含有し得る。各工程のそれぞれにおいて各構成成分を接触させる時間は、好適には、計測されるべき抗原、使用されるべき抗体、および固相のタイプなどに応じて確立することができる。
【０１９０】
キット
本発明の方法において使用される材料は、周知の手順に従って生成されるキットの調製に好適である。したがって、本発明は、予後転帰または治療への応答を予測するために開示遺伝子の発現を定量するための遺伝子特異的または遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーが含まれ得る薬剤を含むキットを提供する。そのようなキットは、腫瘍試料、特に固定パラフィン包埋組織試料からのＲＮＡの抽出のための試薬および／またはＲＮＡ増幅のための試薬を場合により含有し得る。さらに、キットは、試薬を本発明の方法におけるそれらの使用に関する識別記載またはラベルまたは説明書とともに場合により含み得る。キットは、本方法において利用される種々の試薬（典型的には濃縮形態）の１つ以上をそれぞれ有する容器（例として、本方法の自動化実施において使用に好適なマイクロタイタープレート）、例として、例えば、既製マイクロアレイ、緩衝液などを含み得る。
【０１９１】
本発明により提供される方法は、全体または一部を自動化することもできる。本発明は、本発明のＦＡＳ抗体を使用する免疫アッセイを実施するためのキットをさらに提供する。
【０１９２】
本発明の全ての態様は、例えば、高いピアソン相関係数により証明されるとおり、開示遺伝子（例えば、ＧＰＥＰまたはＦＡＳからの１つ以上の遺伝子）と同時発現される限定数の追加の遺伝子が、開示の遺伝子に加え、またはそれに代えて予後診断または予測試験に含まれるように実施することもできる。
【０１９３】
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
（実施例）
実施例１．遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）分析
術後腫瘍コレクションの遺伝子発現プロファイルを、臨床試験（ＮＵ９９００）において２３５１人の前立腺腺癌患者について、および臨床試験（ＮＵ９９０１）において２９１１人の前立腺腺癌患者について作成した。２つの試験からの発現データをロバストマイクロアレイ分析（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＭＡ）により一緒に正規化した。全ての分析について使用される腺癌尺度は、初期疾患検出の１２ヵ月以内の生検の中央判定に基づく前立腺組織における病理学的（癌）（ＰＳ−ｐＣＡ）であった。２つの臨床試験サブセットに関連する計量値をテーブル３に示す。
【０１９４】
【表３】
2014519818.tif 000005
２つの試験からの遺伝子発現データを、生検組織試料を腺癌の患者から得る免疫組織化学法を介して得た。対照試料も得た。次いで、遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を、生体試料から十分確立された方法に従って総ＲＮＡに基づき作成した（アフィメトリクスジーンチップ発現分析技術マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ）、アフィメトリクス・インコーポレイテッド（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）、サンタクララ、カリフォルニア参照）。手短に述べると、総ＲＮＡを生体試料から単離し、増幅し、ｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＤＮＡを検出可能な標識により標識し、アフィメトリクスＵ１３３ジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）ゲノムアレイとハイブリダイズさせ、アレイに結合した検出可能なｃＤＮＡ標識からのシグナルの強度を計測することにより、アレイへのｃＤＮＡの結合を定量した。
【０１９５】
実施例２．単一遺伝子マーカの同定
遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を、リー  ＨＫら（Ｌｅｅ  ＨＫ  ｅｔ  ａｌ．）著、２００５年「遺伝子発現データセットの機能的分析のためのツール（Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ）」、ＢＭＣバイオンフォマティクス（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、第６巻：ｐ．２６９；（遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）「遺伝子オントロジー：生物学の単一化のためのツール（Ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」。ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．）２０００年５月；第２５巻（ｌ）：ｐ．２５〜９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇも参照）により記載のとおり、遺伝子スコア再サンプリングアルゴリズム（Ｇｅｎｅ  Ｓｃｏｒｅ  Ｒｅ−ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により１００００反復で使用した。ジーンゴー（ＧｅｎｅＧｏ）プログラムを使用して遺伝子ネットワークを構築した。初期分析は全ての腺癌の検出を使用した。
【０１９６】
実施例３．複数プローブセット予測モデル
予測ＧＰＥＰ（遺伝子−タンパク質発現プロファイル）を開発するため、（ａ）全ての試料にわたり低発現のプローブセット；および（ｂ）全ての試料にわたり低分散のプロー
ブセットを除去することにより２１４８５個のプローブセットをフィルタリングした。これにより、後続の分析のための１２３８５個のプローブセットをもたらした。正規化ｌｏｇ２（強度）値は、それぞれのプローブセットについての試験特異的平均を差し引くことによりセンタリングされ、それぞれのプローブセットについてプールされた試験内標準偏差により割ることによってリスケーリングされた。
【０１９７】
２段階モデル構築アプローチを使用して最良の予測モデルに到達した。
単一遺伝子マーカ
次元縮小についての単一プローブセット分析を実施した。この分析は、ロジスティック回帰または線形回帰のいずれかによる発現レベルと応答状態との関係において２つの試験間で差を示したプローブセットについての初期探索を含む。この分析は６０９個のプローブセットをもたらした。
【０１９８】
複数遺伝子マーカ
複数プローブセット予測モデルを用いてフィットを試験した。ここで、グリーソングレード５〜７の単一プローブセット分析から事前に選択されたプローブセットを出発点として使用した。次いで、正則化分類のために閾値勾配降下（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｄｅｓｃｅｎｔ）（ＴＧＤ）法を使用してそれぞれの試験に対する初期予測モデルを別個にフィットさせた。再帰特徴部排除（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＦＥ）を適用して予測精度の相当な損失なしでモデルを簡易化することを試みた。
【０１９９】
モデル選択基準は、５０反復の４倍交差検証からのＲＯＣ曲線下平均面積（ＡＵＣ）であった。次いで、それぞれのＲＦＥモデル系列から、ここでは、試験毎に１つで、２つの試験についての選択基準間の最大差を有するモデルを選択した。ＴＧＤ法も使用して２つの個々のプローブセットの発現に基づき予測モデルを構築した。
【０２００】
実施例４．転移の予測因子
ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＦＡＳおよびＦＡＳ／ＰＳＡの組合せの計測値の予測能を評価し、検出率を決定した。この率は、（ａ）全ての前立腺癌患者（グリーソンスコア５〜７）についてのそれぞれの病態について、および（ｂ）ＰＳＡ単独、ＦＡＳ／ＰＳＡ組合せまたはＦＡＳ単独の発現レベルに基づき推定検出確率＞０．５の任意閾値の患者のみについて決定した。分析の結果をテーブル４に示す。データから、疾患バイオマーカとしてのＦＡＳの使用がＰＳＡと組み合わせた場合またはＰＳＡなしの場合に予測力を示すことは明らかである。表から、ＰＳＡ単独は転移検出の不十分な予測因子であることが把握することができる。対照的に、ＦＡＳ単独は転移および早期転移検出の優秀な予測因子であった。
【０２０１】
【表４】
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実施例５．術後前立腺癌の侵襲的変化の予測：単変数および多変数分析
一連の予後診断因子、例として原発性腫瘍サイズ、グリーソングレード５〜７、組織学的グレード、免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＦＡＳ状態およびアンドロゲン状態を、術後前立腺癌（ＰＳ−ｐＣＡ）患者における早期再発（ＥＲｅｃ）、遅発再発（ＬＲｅｃ）および疾患関連死（ＤＲＤ）の予測について試験した。
【０２０２】
試験は、少なくとも１２０ヵ月（１０年）追跡調査される３２６１人の男性（平均年齢６５歳）からのホルマリン固定パラフィン包埋原発性ＰＳ−ｐＣＡ標本の評価を含んだ。回収された標本は、原発性腫瘍サイズ、グリーソングレード５〜７、組織学的グレード、免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＦＡＳ状態およびアンドロゲン状態について評価した。この試験において、市販の抗ＦＡＳ抗体を使用してＩＨＣおよびＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＩＨＣについて、使用される抗体は、ベチル・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（モンゴメリー、テキサス）からのアフィニティ精製ヒト抗ＦＡＳＮ抗体（カタログ番号Ａ３０１−３２４Ａ）であった。ＥＬＩＳＡ試験について、使用される抗体は、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）（リトルトン、コロラド）からの脂肪酸シンターゼ抗体ペア（Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐａｉｒ）（カタログ番号Ｈ００００２１９４−ＡＰ１１）であった。このペアは、ウサギアフィニティ精製ポリクローナル抗ＦＡＳＮである捕捉抗体（１００ｕｇ）およびマウスモノクローナル抗ＦＡＳＮ、ＩｇＧ１カッパである検出抗体（２０ｕｇ）を含有する。患者は、疾患再発の初期症状前にアジュバント治療を受けなかった。
【０２０３】
単変数分析時、ＩＨＣによるＦＡＳ発現レベルは、ＥＲｅｃ（早期再発）（ｐ＜０．０００２）ＬＲｅｃ（遅発再発）（ｐ＜０．０００５）；およびＤＲＤ（疾患関連死）（ｐ＜０．０００３）を独立して予測した。
【０２０４】
これらのデータを（ａ）対照（対照は、ＦＡＳの正常組織発現であり、零点として設定
した）に対して１％未満の発現レベルにより表わされる非発現、（ｂ）正常対照と比べて２５％未満の発現レベルにより表わされる境界発現および（ｃ）正常対照と比べて５０％を上回る発現レベルにより表わされる高発現のＦＡＳ発現レベルに層別化した場合、高発現腫瘍を有する（ｃ）群の患者は、９．４のＥＲｅｃ（４．８〜２２．４の範囲）：６．４のＬＲｅｃ（２．１〜１３．０の範囲）および１９．２のＤＲＤ（５．０〜３３．８の範囲）の相対リスク（補正相対ハザード）を有した。相対リスクまたは補正相対ハザードは、暴露群と非暴露群において生じる事象の確率の比である。
【０２０５】
腫瘍サイズ、組織学的グレード、グリーソングレードおよびアンドロゲン受容体状態は、ＥＲｅｃも、ＬＲｅｃも、ＤＲＤも一貫して予測しなかった。多変数分析時、ＩＨＣによるＦＡＳ発現レベルは、腫瘍サイズ、グレード、およびアンドロゲン受容体状態とは独立してＥＲｅｃ、ＬＲｅｃ、およびＤＲＤを予測した。
【０２０６】
結果的に、データは、この一連のＰＳ−ｐＣＡ患者において、ＩＨＣによるＦＡＳ発現レベルが腫瘍サイズ、グレード、およびアンドロゲン受容体状態とは独立して早期および遅発疾患再発ならびに疾患関連死を有意に予測したことを示す。したがって、基礎ＦＡＳ免疫組織化学（ベンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ））ＥＬＩＳＡベース血清アッセイは、場合により本明細書に開示のアルゴリズムを適用してアッセイを解釈することを含め、正確な予後診断ツールおよび完全な併用診断として機能して追加の画像化関連試験、例えば二次ＰＥＴ、ＣＴ、超音波または前立腺ＭＲＩを正当化することが結論づけられた。
【０２０７】
実施例６：抗ＦＡＳモノクローナル抗体の調製
抗ＦＡＳ抗体およびその抗体を用いる免疫組織化学ＥＬＩＳＡアッセイは、２０１０年、１０月１４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０５４５号明細書、および２０１１年３月１７日に公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６７７３号明細書にそれぞれ開示されている。それぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
手短に述べると、ＳＣＩＤマウスを合成ＦＡＳペプチドにより免疫化し、アイヤーら（Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、インディアン・ジャーナル・オブ・メディカル・リサーチ（Ｉｎｄ．Ｊ．Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．）、（２０００年）、第１２３巻：ｐ．６５１〜５６４（２００６）により記載の一般的手順に従ってハイブリドーマを樹立させることにより、４つのネズミモノクローナル抗体を調製した。それぞれのマウスを配列番号１〜５の１つのペプチドにより免疫化した。
【０２０９】
ヒト化モノクローナル抗体を、カータら（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８９巻：ｐ．４２８５〜８９（１９９２年）により記載のとおりハイブリドーマＡ、Ｂ、ＤおよびＥに由来するモノクローナル抗体から調製した。ヒト化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を以下、ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、ＦＡＳ４（ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−１０８１１）およびＦＡＳ５とそれぞれ称する。
【０２１０】
実施例７：化学発光のためのＥＬＩＳＡプロトコル
黒色ウェルを、適切な緩衝液（ＰＢＳ／ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ツイーン２０））中で希釈した１００μｌ／ウェルのコート抗体によりコートした。次いで、プレートを４℃において一晩インキュベートし、プレートシーラによりカバーした。次いで、プレートを３００ｕｌの５ｘＰＢＳ−Ｔにより、ウェルウオッシュ・ヴェルサ・プレート（Ｗｅｌｌｗａｓｈ  Ｖｅｒｓａ  Ｐｌａｔｅ）洗浄器（テルモ（Ｔｈｅｒｍｏ））上で洗浄した。次いで、プレートを、プレートシーラによりカバーしてインキュベートマイクロプレートシェーカ（ＶＷＲ）中で１００ｒｐｍにおいて振とうさせながらＥＬＩＳＡブロッカーブロ
ッキング溶液（ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（３００μｌ／ウェル）テルモ（Ｔｈｅｒｍｏ））により２３℃において２時間ブロッキングした。その後、プレートを５ｘＰＢＳ−Ｔ（３００μｌ／ウェル）によりプレート洗浄器上で洗浄した。洗浄後、プレートをベンチ上に置かれたキムワイプ（ｋｉｍｗｉｐｅ）（登録商標）上でタッピングして過剰な液体を除去した。
【０２１１】
スタンダードを予め調製し、７点希釈（例えば、５００ｐｇ／ｍｌからのＰＢＳ−Ｔ中の１％ＢＳＡ中）を含んだ。調製後、１００μｌのスタンダードまたは適切な緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ、Ｒ＆Ｄ希釈剤７、１８など）で新たに希釈された試料を、プレートシェーカ上で１００ｒｐｍで撹拌しながら、プレートシーラによりカバーしながら２３℃において２時間ロードした。次いで、プレートを５ｘＰＢＳ−Ｔ（３００ｕｌ／ウェル）によりプレート洗浄器上で洗浄した。
【０２１２】
検出抗体（１００μｌ／ウェル；緩衝液、例えばＰＴＳ／ＰＢＳ−Ｔ中で適切な濃度に希釈）を、プレートシーラによりカバーされ、プレートシェーカ上で１００ｒｐｍで撹拌しながら２３℃において２時間インキュベートする。次いで、プレートを５ｘＰＢＳ−Ｔ（３００ｕｌ／ウェル）によりプレート洗浄器上で洗浄した。
【０２１３】
二次抗体（１００μｌ／ウェルの適切な二次抗体ストレプトアビジン−ＨＲＰ、ＰＢＳ中１：２００希釈）を、プレートシーラによりカバーされ、プレートシェーカ上で１００ｒｐｍで撹拌しながら２３℃において２０分間インキュベートする。あるいは、抗種ＨＲＰ抗体をＰＢＳ中１：１００００においてプレートシェーカ上で１００ｒｐｍで撹拌しながら２３℃において１時間使用した。次いで、プレートを５ｘＰＢＳ−Ｔ（３００ｕｌ／ウェル）によりプレート洗浄器上で洗浄した。
【０２１４】
シグナルは、１００μｌ／ウェルのＲ＆Ｄグロセット基質（Ｒ＆Ｄ  Ｇｌｏｓｅｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を室温においてバイオテック（ＢｉｏＴｅｋ）ＦＬ８００ｘプレートリーダ中で１０分間添加することにより増幅させた。
【０２１５】
前もって新たに調製した基質は、試薬Ａ（発光向上を安定化）を試薬Ｂ（過酸化水素を安定化）と１：２の比で混合することにより作製する。
シグナルは、バイオテック（ＢｉｏＴｅｋ）ＦＬ８００ｘフルオロメータ（０．５秒の読取時間）上で、感度を標準曲線上の最大点に自動調節し、１０００００の読取に設定して計測した。
【０２１６】
本発明において有用なＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイには、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１１年３月１７日に公開されたＰＣＴ国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６７７３号明細書に記載のものが含まれることに留意すべきである。
【０２１７】
実施例８：試料調製およびインサイチュハイブリダイゼーションプロトコル
Ａ．ＦＩＳＨのためのＦＦＰＥ前処理プロトコル
ＦＦＰＥ前処理の目的は、ＣＥＰおよびＬＳＩ  ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブを用いる蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における使用のために、正荷電スライド上に固定されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片を調製することである。手順は、ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブを使用する場合、ＦＩＳＨについて組織浸透性を最大化するように設計した。
【０２１８】
標本
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本を顕微鏡スライド上で調製した。
試薬および装置
調製は、キットにおいて提供される試薬（カタログ番号３２−８０１２１０）の使用を含んだ。キットにおいて：無水エタノール（ＥｔｏＨ）、ヘモディークリーニング剤（Ｈｅｍｏ−Ｄｅ  Ｃｌｅａｒｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）（サイエンティフィック・セイフティー・ソルベンツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）カタログ番号ＨＤ−１５０）、精製水（蒸留または脱イオン）、コプリンジャー（１６枚のスライド／８つの溝の最大キャパシティ）、３７℃および８０℃のウオーターバス（プローブアッセイについて７３℃において１つ）は提供されない。
【０２１９】
パラフィン前処理手順
試料スライド調製：使用される試料をホルマリン中で２４〜４８時間固定する。
１．ミクロトームを使用して４〜５μｍ厚パラフィン切片を切断する。
２．切片を精製（すなわち、三重蒸留）水のウオーターバス上に４０℃において浮かべる。
３．切片を正荷電スライド上にマウントする。
４．スライドを風乾させる。
５．スライドを５６℃においてベークする。
【０２２０】
スライドの脱パラフィン化
１．スライドをヘモディー（Ｈｅｍｏ−Ｄｅ）中に周囲温度において５分間浸漬する。
２．新たなヘモディー（Ｈｅｍｏ−Ｄｅ）を毎回使用して工程１を２回繰り返す。
３．スライドを１００％のＥｔＯＨ中で周囲温度において１分間脱水する。繰り返す。
４．所望により、スライドを２〜５分間風乾させる。
【０２２１】
スライド前処理
１．スライドを前処理溶液中に８０℃において１０分間浸漬する。必要により、２つのスライドをコプリンジャー中のそれぞれの溝中に裏を合わせて配置し、それぞれの端部の溝中には１つのスライドを配置することができる。端部のスライドについて、組織切片を有するスライドの面は、ジャーの中央に面してなければならない。
２．スライドを精製水中に３分間浸漬する。
【０２２２】
プロテアーゼ前処理
１．スライドを精製水のジャーから取り出す。
２．過剰の水を、スライド端をペーパータオル上で拭き取ることにより除去する。
３．スライドをプロテアーゼ溶液中に３７℃において１５分間浸漬する。（緩衝液の温度が３７±１℃であることを確保してから２５０ｍｇ（１つの管）プロテアーゼを添加する。必要により、２つのスライドをコプリンジャー中のそれぞれの溝中に裏面を合わせて配置し、それぞれの端部の溝中には１つのスライドを配置することができる。端部のスライドについて、組織切片を有するスライドの面は、ジャーの中央に面してなければならない。
４．スライドを精製水中に３分間浸漬する。
５．スライドを２〜５分間風乾させる。
【０２２３】
試料の固定（任意選択）
試料の固定は、試料変性の間の組織損失を最小化するために実施する。この手順は、試料を変性バスフォーマット中で処理する場合に高度に推奨されるが、共変性／ハイブリダイゼーションプロトコルを使用してスライドを処理する場合には必須でない。
１．１つのコプリンジャーに５０ｍＬの１０％緩衝ホルマリンを充填する。３つの他のコプリンジャーに５０ｍＬの７０％エタノール、８０％エタノールおよび１００％エタノールをそれぞれ充填する。
２．スライドを１０％緩衝ホルマリン中に周囲温度において１０分間浸漬する。
３．スライドを精製水中に３分間浸漬する。
４．スライドを風乾させる。
５．適切なプローブプロトコルにより進行させる。
Ｂ．ＦＩＳＨ／ＩＳＨ分析のための顕微鏡スライド上の中期染色体伸展物の調製
この手順の目的は、細胞遺伝学的分析のための顕微鏡スライド上のヒト中期染色体伸展物および間期核を調製することおよびＦＩＳＨ／ＩＳＨハイブリダイゼーション手順のための染色体調製物を調製することである。
【０２２４】
標本
３：１のメタノール：氷酢酸固定剤中のＰＨＡ刺激ヒトリンパ球。標本は「染色体分析のための末梢血細胞の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」の下で下記のとおり調製する。
【０２２５】
試薬及び装置
【０２２６】
【表５】
2014519818.tif 000007
調製
固定剤：メタノール：氷酢酸、３：１。それぞれの使用前に調製する。
スライド：それぞれのスーパーフロストプラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ）スライドをそのフロスト加工表面上でそれに従ってラベルし、スライドを、ガラスカバーを有する矩形染色皿中に配置する。皿に蒸留水を充填し、４℃において浸してから使用してスライドを冷蔵する。これは、数日前に行うことができ、スライドを４℃において貯蔵することができる。
【０２２７】
湿度：推奨周囲条件は２５℃および３３％の湿度である。
ＰＨＡ刺激リンパ球細胞ペレット：ＰＨＡ刺激リンパ球細胞ペレットを新たな固定剤中で１５ｍＬのコニカル管中で調製する。ペレットをその回収後に貯蔵した場合、それを２００ｘｇにおいて５分間遠心分離する。上澄みを吸引し、細胞懸濁液にわずかに混濁が見られるために十分な固定剤を添加する。細胞濃度は、症例間で変動し、実験的に決定すべきである。
【０２２８】
エタノール系列：１００％エタノールのｖ／ｖ希釈物を精製Ｈ２Ｏにより調製する。使
用の間、気密的にカバーして周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄する。蒸留水を使用してプラスチックコプリンジャー中で７０％、８５％および１００％のエタノールを調製する。
【０２２９】
２×ＳＳＣ：１００ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を８５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０±０．２に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。２×ＳＳＣをプラスチックコプリンジャー中で調製し、ウオーターバスを使用して３７℃に予熱する。
【０２３０】
手順
細胞懸濁液をスライド上に滴下させる。
１．スーパーフロストプラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ）顕微鏡スライドを含有する染色皿を４℃の貯蔵から取り出し、実験台上に配置する。
２．球状部を有するガラスパスツールピペット（またはＰ−１０００ピペット）を使用し、細胞ペレットを固定剤中で穏やかに再懸濁させ、管ラック中に取っておく。
３．１つの顕微鏡スライドを冷蔵染色ジャーから取り出し、それをフロスト加工端部により保持する。水の薄膜がスライド表面上に残留するように、水をスライドから抜き出す。４．適切なチップを有するＰ−１０００ピペットを使用して細胞ペレットを再懸濁させ、次いで３００ｕｌの細胞懸濁液を抜き出す。
５．スライドをある角度（約４５°）において保持し、細胞懸濁液をスライドの長さ方向下方に流し、フロスト加工端部において出発させる。懸濁液を流すとき、ピペットチップをフロスト加工領域直下のスライドの表面を一端部から他端部に横切って移動させる。
６．スライドの端部を乾燥ペーパータオル上に接触させることにより過剰の細胞懸濁液および固定剤をスライドから抜き出す。
７．スライドを約４５℃の角度において位置させ、細胞試料側が乾燥するまで向け、固定剤を蒸発させる。
８．スライド調製物を位相差顕微鏡により精査する（以下の注１〜４参照）。
９ａ．スライドを意図される分析に必要なほど調製し続ける。
９ｂ．２×ＳＳＣを含有するコプリンジャー中にスライドを３７℃において３０分間配置することによりスライドを熟成させる。スライドをエタノール系列７０％、８５％および１００％にそれぞれ１分間通す。風乾させる。あるいは、スライドを室温においてスライドボックス中で１から４週間熟成させる（以下の注５参照）。
１０．スライドを−２０℃において長期貯蔵用の乾燥容器中で貯蔵する。
１１．残りの標本を貯蔵する。適切数のスライドを作成した場合、残りの固定剤中の細胞懸濁液を含有する１５ｍＬのコニカル管を−２０℃において貯蔵する。
【０２３１】
注
スライド調製物を位相差顕微鏡により調査して細胞密度および中期伸展を評価する。
１．細胞密度が大きすぎる場合（位相差顕微鏡上の１０×視野当たり約１００を上回る核）、数滴の固定剤を細胞懸濁液に１５ｍＬのコニカル中で添加し、細胞を新たなスライド上に滴下する工程を繰り返す。
２．細胞密度が希薄すぎる場合（１０×視野当たり１０未満の核）、細胞を含有する１５ｍＬのコニカル遠心管を２００ｘｇにおいて５分間遠心分離し、過剰の固定剤を吸引し、ペレットを最初に添加したものよりも少ない固定剤中で再懸濁させ、細胞を新たなスライドを用いて滴下する工程を繰り返す。
３．染色体の大多数が区別不能であるような不適切な伸展が存在する場合、空気流を減少させ、湿度を増加させ、または温度を減少させてスライドをよりゆっくりと乾燥させる。細胞境界が区別可能でないような過剰伸展が存在する場合、空気流を増加させ、湿度を減
少させ、または周囲温度を増加させてスライドをより速く乾燥させる。
４．得られた中期細胞は、最小の重複を有するべきであり、可視的な細胞質を有するべきでなく、位相差顕微鏡下で染色体が灰色から暗灰色の媒体として出現する。
５．細胞遺伝学的調製物の熟成によりタンパク質を変性させ、残留水および固定剤を除去し、ガラスへの材料の接着を向上させる。新たな非熟成スライドを熱変性する場合、それらはそれらの材料のほとんどを損失し、またはそれらの染色体は見かけが歪み、膨張する。スライドを広範に熟成させる場合、染色体が堅固すぎるためハイブリダイゼーション効率は減少する。
【０２３２】
Ｃ．染色体分析のための末梢血細胞の調製
このプロトコルの目的は、ヒトリンパ球を培養および回収して構造的および数的染色体異常を決定することならびにＦＩＳＨ／ＩＳＨハイブリダイゼーション手順のための染色体調製物を調製することである。
【０２３３】
標本
３〜５ｍＬのヘパリン添加全血を回収し（グリーン・トップ・バキュテイナー・チューブ（ｇｒｅｅｎ  ｔｏｐ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ））；ヘパリンナトリウムが推奨される抗凝固剤である。
【０２３４】
【表６】
2014519818.tif 000008
調製
ＰＢ−ＭＡＸ核型分析培地（１×）：ＰＢ−ＭＡＸ核型分析培地を４℃から８℃において解凍する。培地を室温に加温し、穏やかに旋回させて混合してから使用する。ＰＢ−ＭＡＸ核型分析培地を解凍し、簡便のためにより小さいアリコートに無菌的に移すことができる。これらのアリコートは冷凍し、使用時に解凍することができるが、複数の冷凍−解凍サイクルは回避すべきである。培養培地製品を使用する場合、光への長期曝露を回避する。
【０２３５】
固定剤：メタノール氷酢酸、３：１。それぞれの使用前に調製する。
カリオマックス（ＫａｒｖｏＭＡＸ）（登録商標）塩化カリウム溶液、０．０７５Ｍ：低張液を３７℃において予備加温してから使用する。
【０２３６】
手順
短期血液培養物から有糸分裂細胞を調製する。
１．１０ｍＬのＰＢ−ＭＡＸ核型分析培地をそれぞれの無菌Ｔ−２５フラスコに添加してアッセイを設定する（注１参照）。
２．０．７５ｍＬのヘパリン添加血液をそれぞれのＴ−２５フラスコに添加する。
３．細胞培養インキュベータ中で３７℃（５％ＣＯ２）において７２時間インキュベートする。フラスコはキャップを緩く閉めて直立させるべきである。
４．７２時間の培養後、１００μｌのカリオマックス（ＫａｒｙｏＭＡＸ）コルセミド溶液（１０ｕｇ／ｍＬ）をそれぞれのフラスコに添加し、十分に混合する。３７℃において３０分間インキュベートする。
５．３０分後、培養物を１５ｍＬの遠心管に写し、１２００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離する。培地を完全に除去し、但し、約０．５ｍＬの上澄みを細胞ペレット上に残存させる。
６．細胞を残留媒体中で穏やかに再懸濁し、約２ｍＬの予備加温（３７℃）カリオマックス（ＫａｒｙｏＭＡＸ）塩化カリウム溶液、０．０７５Ｍを一滴ずつ穏やかに撹拌しながら慎重に添加する。追加の８ｍＬのＫＣｌを合計１０ｍＬで添加し；十分に混合する（注２参照）。
７．ウオーターバス中で３７℃において１５分間インキュベートする。
８．０．５ｍＬの新たに調製した固定剤を添加し、管に再度キャップし、反転させて混合する。
９．細胞を１２００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離し、上澄みを工程５と同様に除去する。
１０．細胞を再懸濁させ、１０ｍＬの固定剤を添加することにより細胞を固定し；最初の２ｍＬは穏やかに撹拌しながら滴加すべきである。
１１．室温において１０分間インキュベートし、細胞を遠心分離し、上澄みを工程５と同様に除去する。
１２．固定手順をさらに２回繰り返す。遠心分離の間に細胞をインキュベートすることは必須でない。
１３．最後の遠心分離後、細胞を５．０ｍＬの固定剤中で再懸濁させる。
１４．細胞ペレットを固定剤中で−２０℃において貯蔵する。
【０２３７】
注
１．末梢血中の白血球細胞は、マイトジェンにより刺激すべきであり、中期細胞の調製についての前提条件として細胞分裂を誘導させる。末梢ヒト血液細胞の調製において、Ｔ−リンパ球はフィトヘマグルチニンにより刺激する。ＰＢ−ＭＡＸ核型分析培地は、標準濃度のＬ−グルタミン、ゲンタマイシン硫酸塩、ウシ胎仔血清およびフィトヘマグルチニンを完全に補給した液体ＲＰＭＩ−１６４０培地から構成される。この配合は、ＰＨＡ刺激末梢血培養において使用されるＡＣＴラボラトリー（ＡＣＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マニュアル（１９９１年）に参照される末梢血培地に基づく。
２．低張処理は、細胞の膨張を引き起こし；処理の最適時間は異なる細胞タイプについて変動し、実験的に決定しなければならない。
【０２３８】
Ｄ．ＣＥＰ（染色体エニュメレーションプローブ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ））ＦＩＳＨプロトコル
標識ＣＥＰ（染色体エニュメレーションプローブ）ＤＮＡプローブを使用してヒト染色体中期伸展物および間期核を蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により同定して例えば正常および腫瘍細胞の異数性を同定し、細胞遺伝学的試験における参照プローブとして機能させ、ハイブリッド細胞系におけるヒト染色体を同定することができる。
【０２３９】
標本
固定された培養または未培養細胞学的標本の中期染色体および／または間期核を顕微鏡スライド上で調製する。
【０２４０】
【表７】
2014519818.tif 000009
調製
注：示される場合、これらの溶液のｐＨを周囲温度において計測する。特に記載のない限り、ガラス電極を有するｐＨメータを使用する。
【０２４１】
２×ＳＳＣ溶液：１００ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を８５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０±０．２に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。２×ＳＳＣをプラスチックコプリンジャー中で調製し、ウオーターバスを使用して３７℃に予熱する。
【０２４２】
変性溶液（７０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ）：４９ｍＬの超高純度ホルムアミド、７ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）および１４ｍＬの精製Ｈ２Ｏをガラスコプリンジャー中で十分に混合する。ｐＨ指示ストリップを使用してｐＨを計測してｐＨが７．０〜８
．０であることを確認する。使用の間、２〜８℃においてカバーして貯蔵する。７日後に廃棄する。ガラスコプリンジャー中で調製し、７３＋／−１℃に加熱する。
【０２４３】
０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０洗浄溶液：２０ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を９５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。３ｍＬのＮＰ−４０を添加する。ＮＰ−４０が完全に溶解されるまで十分に混合する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０〜７．５に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して溶液の最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。ガラスコプリンジャー中で調製し、７３＋／−１℃に加熱する。
【０２４４】
２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０洗浄溶液：１００ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を８５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。１ｍＬのＮＰ−４０を添加する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０±０．２に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。ガラスコプリンジャー中で調製し、７３＋／−１℃に加熱する。
【０２４５】
エタノール溶液（７０％、８５％、１００％）：１００％エタノールのｖ／ｖ希釈物を精製Ｈ２Ｏにより調製する。使用の間、気密的にカバーして周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄する。蒸留水を使用してプラスチックコプリンジャー中で７０％、８５％および１００％のエタノールを調製する。
【０２４６】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション手順
プローブ調製
１．室温において、７μＬのＣＥＰハイブリダイゼーション緩衝液、１μＬのＣＥＰ  ＤＮＡプローブ、および２μＬの精製Ｈ２Ｏを混合する。１〜３秒間遠心分離し、ボルテックスにかけ、次いで再度遠心分離する。
２．７３℃のウオーターバス中で５分間加熱し、次いで４５〜５０℃に設定されたスライドウオーマ上に配置する。
３．ボルテックスにかけて混合する。管を微小遠心機中で短時間（１〜３秒間）回転させて内容物を管の底部に運ぶ。再度穏やかにボルテックスにかけて混合する。
【０２４７】
標本ＤＮＡ（対照スライドまたはＰＨＡ刺激末梢血リンパ球）の変性
１．ハイブリダイゼーションチャンバ（気密容器）を、４２℃のインキュベータ中にそれを配置することにより４２℃に予備加温させてからスライドを調製する。
２．変性溶液をコプリンジャーに添加し、７３±１℃のウオーターバス中に少なくとも３０分間配置する。使用前に溶液温度を確認する。
３．調製スライドを変性溶液中に７３±１℃において５分間浸漬することにより標本ＤＮＡを変性させる。コプリンジャー当たり１回に５つ以上のスライドを変性させない。変性溶液のｐＨが７．０〜８．０であることをそれぞれの使用前に確認する。
４．ピンセットを使用することによりスライドを変性溶液から取り出し、７０％のエタノール洗浄溶液中に室温において直ちに配置する。スライドを撹拌させてホルムアミドを除去する。スライドをエタノール洗浄物中で１分間立たせる。
５．スライドを７０％のエタノールから取り出す。工程４を８５％のエタノール、次いで１００％のエタノールを用いて繰り返す。
６．スライドの底端部を吸取紙に接触させることにより過剰のエタノールをスライドから抜き出し、スライドの下面を乾燥実験室ワイプにより拭き取る。
７．スライドを４５〜５０℃のスライドウオーマ上に２分間以下で配置してからプローブ溶液をアプライする準備が整う。
注：ハイブリダイゼーションのタイミングが、プローブが準備される前に２分を上回ってスライドが準備されるようなものである場合、スライドは１００％のエタノールのジャー中で残留すべきである。スライドは、それをスライドウオーマ上に配置する前に風乾させない。
【０２４８】
ハイブリダイゼーション
１．プローブ溶液の１０μＬのアリコートをスライドの標的領域にアプライする。直ちに、２２ｍｍｘ２２ｍｍガラスカバースリップをプローブ溶液上に配置し、溶液をカバースリップ下で均等に拡散させる。気泡はハイブリダイゼーションを妨げ、回避すべきである。
ａ．注：カバースリップをアプライする前にプローブ溶液を複数の標的領域上にピペッティングしない。
２．スライドを予備加温４２℃ハイブリダイゼーションチャンバ中に配置し、チャンバを気密蓋によりカバーする。
３．スライドを含有するチャンバを４２℃のインキュベータ中に配置し、ハイブリダイゼーションを少なくとも３０分間進行させる。
注：一部の標本において、十分なシグナル強度のためにより長いハイブリダイゼーション時間が要求され得る。インキュベーションは、一晩（１６時間）実施することができる。１時間よりも長いインキュベーションについては、カバースリップは除去可能なシーラント、例えばゴムセメントを使用してシールしなければならず、ハイブリダイゼーションチャンバは加湿しなければならない。手順を以下に記載する。
Ａ．ゴムセメントを５ｍＬシリンジ中に抜き出す。カバースリップおよびスライドと重なるカバースリップ周縁付近の少量のゴムセメントを滲出させ、それによりカバースリップ周囲にシールを形成させる。
Ｂ．スライドを加湿ハイブリダイゼーションチャンバ（容器の側面に貼り付けされた約１インチ×３インチの一片の湿潤吸取紙またはペーパータオルを有する気密容器）中に配置する。
Ｃ．チャンバを気密蓋によりカバーし、所望により１から１６時間インキュベートする。Ｄ．インキュベーション後、ゴムセメントを抜くことによりゴムセメントをカバースリップから除去する。
【０２４９】
ハイブリダイゼーション後洗浄
１．０．４×ＳＳＣ（ｐＨ７．０〜７．５）をコプリンジャーに添加する。コプリンジャーを７３±１℃のウオーターバス中に少なくとも３０分間配置することにより、または溶液温度が７３±１℃に到達するまで０．４×ＳＳＣ溶液を予備加温する。
ａ．注：適正な温度範囲を維持するため、４つのスライドを加熱洗浄溶液中に一度に配置すべきである。４つより少ないスライドをハイブリダイズさせる場合、室温顕微鏡スライド（標本がアプレイされていない）を使用してスライドの数を４つにすることができる。４つより多いスライドをハイブリダイズさせる場合、それらは２つ以上のバッチ中で洗浄しなければならない。洗浄溶液の温度を７３±１℃に戻してからそれぞれのバッチを洗浄しなければならない。
２．カバースリップを第１のスライドの標的領域から除去し、０．４×ＳＳＣを含有する７３±１℃のコプリンジャー中に直ちにスライドを配置する。スライドを１〜３秒間撹拌する。他の３つのスライドについても繰り返し、７３±１℃において２分間インキュベートする。
３．注：スライドのいずれも洗浄バス中に配置する前にカバースリップをいくつかのスライドから除去しない。最後のスライドを洗浄バスに添加したときに２分間のインキュベーションの計時を開始する。
４．それぞれのスライドを洗浄バスから取り出し、２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０のジャー中に室温において５〜６０秒間配置し、スライドをバス中に配置するときに１〜３秒
間撹拌する。
５．スライドを暗所において風乾させる（密封された引き出しまたは密封された戸棚内部の棚が十分である）。
６．１０μＬのＤＡＰＩ  ＩＩ対比染色剤（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）をスライドの標的領域にアプライし、ガラスカバースリップをアプライする。シグナル計数前にスライドを暗所に貯蔵する。
【０２５０】
貯蔵
ハイブリダイズさせたスライド（カバースリップを有する）を−２０℃において暗所で貯蔵する。これらの条件下、スライドを顕著な蛍光シグナル強度の損失なしで最大１２ヵ月貯蔵することができる。長期貯蔵については、カバースリップをシールして乾燥を防止し、スライドを−２０℃において貯蔵する。
【０２５１】
シグナル計数−スライド適合性の評価
以下の基準を使用してスライド適合性を評価する：
Ａ．プローブシグナル強度：シグナルは、明るく、明確で、容易に評価可能であるべきである。シグナルは、明るくコンパクトで卵形状または糸状で拡散性で卵形状のいずれかであるべきである。
Ｂ．バックグラウンド：バックグラウンドは、暗色または黒色を呈し、蛍光粒子もかすみも有さないべきである。
Ｃ．交差ハイブリダイゼーション／標的特異性：プローブは、標的（染色体のセントロメア）のみをハイブリダイズさせ、発光させるべきである。中期伸展物を評価して遺伝子座特異性を確認し、非標的配列へのあらゆる交差ハイブリダイゼーションを同定すべきである。細胞の少なくとも９８％は、許容可能なハイブリダイゼーションのための１つ以上のシグナルを示すべきである。
【０２５２】
シグナル計数−最適視界および評価可能な核の選択
２５×対物レンズを使用してハイブリダイズした領域を検査し、標本分布を試験する。標本が希薄に分布し、間期核がほとんど重複しておらず、いくつかの間期核を視野内で検査することができる領域を選択する。細胞の分布が稠密であり、細胞が重複しており、または個々の核の核境界が識別不能である領域を回避する。細胞の塊を含有する領域を回避する。明確なシグナルを有する細胞のみを計数する。
【０２５３】
シグナル計数−計数検査
４０×または６３×対物レンズを使用して選択領域の左上象限における分析を開始し、左から右に検査し、それぞれの評価可能な間期細胞の核境界内のシグナルの数をカウントする。高細胞密度を有するスライド上の領域は、ランダムにスキップして標的領域全体を検査すべきである。５００個の間期核を計数および分析するまで検査を継続する。
【０２５４】
シグナル計数−間期計数
４０×または６３×対物レンズを使用してそれぞれの評価可能な間期核中の蛍光シグナルを計数する。より高倍率（例えば、６３×または１００×）の対物レンズを使用してシグナルの分割または拡散についての問題を確認または解決すべきである。これらの指針に従う：
Ａ．ごく近接し、ほぼ同一サイズであるが可視的な結合により連結していない２つのシグナルを２つのシグナルとしてカウントする。
Ｂ．シグナルの拡散が連続的であり、許容可能な境界内にある場合、拡散シグナルを１つのシグナルとしてカウントする。
Ｃ．可視的な結合により連結している２つの小さいシグナルを１つのシグナルとしてカウントする。
Ｄ．０、１、２、３、４、または＞４つのシグナルを有する核の数を計数する。視野に存在する少なくとも１つのシグナルを有する他の核が存在する場合にのみ、シグナルを有さない核をカウントする。計数の精度が不確かな場合、スライドの別の領域において計数を繰り返す。
Ｅ．不明確なシグナルを有する核は計数しない。
【０２５５】
Ｅ．  ＬＳＩ（遺伝子座特異的識別子（Ｌｏｃｕｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ））ＦＩＳＨプロトコル
このプロトコルの目的は、細胞遺伝学的標本上でＬＳＩ（遺伝子座特異的識別子（Ｌｏｃｕｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ））プローブを使用してＦＩＳＨを実施することである。標識ＬＳＩ  ＤＮＡプローブを使用してヒト中期染色体伸展物および間期核を、ならびに蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により遺伝子異常を同定する。例えば、ＬＳＩ  ＢＣＲ／ＡＢＬプローブセットは、９ｑ３４上のＡＢＬ遺伝子座および２２ｑ１．２上のＢＣＲ遺伝子座の融合（転座（９；２２）（ｑ３４；ｑｌ１））を検出するために設計されている。
【０２５６】
標本
固定された培養または未培養細胞学的標本の中期染色体および／または間期核を顕微鏡スライド上で調製する。
【０２５７】
【表８】
2014519818.tif 000010
調製
示される場合、これらの溶液のｐＨを周囲温度において計測する。特に記載のない限り、ガラス電極を有するｐＨメータを使用する。
【０２５８】
２×ＳＳＣ溶液：１００ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を８５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０±０．２に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。２ＸＳＳＣをプラスチックコプリンジャー中で調製し、ウオーターバスを使用して３７℃に予熱する。
【０２５９】
変性溶液（７０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ）：４９ｍＬの超高純度ホルムアミド、７ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）および１４ｍＬの精製Ｈ２Ｏをガラスコプリンジャー中で十分に混合する。ｐＨ指示ストリップを使用してｐＨを計測してｐＨが７．０〜８．０であることを確認する。使用の間、２〜８℃においてカバーして貯蔵する。７日後に廃棄する。ガラスコプリンジャー中で調製し、７３＋／−１℃に加熱する。
【０２６０】
０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０洗浄溶液：２０ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を９５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。３ｍＬのＮＰ−４０を添加する。ＮＰ−
４０が完全に溶解されるまで十分に混合する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０〜７．５に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して溶液の最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。ガラスコプリンジャー中で調製し、７３＋／−１℃に加熱する。
【０２６１】
２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０洗浄溶液：１００ｍＬの２０×ＳＳＣ（ｐＨ５．３）を８５０ｍＬの精製Ｈ２Ｏと十分に混合する。１ｍＬのＮＰ−４０を添加する。ｐＨを計測し、ＮａＯＨによりｐＨ７．０±０．２に調整する。精製Ｈ２Ｏを添加して最終容量を１リットルにする。周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄し、または溶液に混濁もしくは汚染が見られた場合は速やかに廃棄する。ガラスコプリンジャー中で調製し、７３＋／−１℃に加熱する。
【０２６２】
エタノール溶液（７０％、８５％、１００％）：１００％エタノールのｖ／ｖ希釈物を精製Ｈ２Ｏにより調製する。使用の間、気密的にカバーして周囲温度において貯蔵する。原液は６ヵ月後に廃棄する。蒸留水を使用してプラスチックコプリンジャー中で７０％、８５％および１００％のエタノールを調製する。
【０２６３】
ＬＳＩプローブ調製
室温において、７ｕＬのＬＳＩハイブリダイゼーション緩衝液、１ｕＬのＬＳＩ  ＤＮＡプローブ、および２ｕＬの精製Ｈ２Ｏを混合する。１〜３秒間遠心分離し、ボルテックスにかけ、次いで再度遠心分離する。使用時まで氷上に配置する。
【０２６４】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション手順
標本ＤＮＡ（対照スライドまたはＰＨＡ刺激末梢血リンパ球）の変性
１．ハイブリダイゼーションチャンバ（気密容器）を、３７℃のインキュベータ中にそれを配置することにより３７℃に予備加温させてからスライドを調製する。
２．変性溶液をコプリンジャーに添加し、７３±１℃のウオーターバス中に少なくとも３０分間配置する。使用前に溶液温度を確認する。
３．調製スライドを変性溶液中に７３±１℃において５分間浸漬することにより標本ＤＮＡを変性させる。コプリンジャー当たり１回に５つ以上のスライドを変性させない。変性溶液のｐＨが７．０〜８．０であることをそれぞれの使用前に確認する。
４．ピンセットを使用することによりスライドを変性溶液から取り出し、７０％のエタノール洗浄溶液中に室温において直ちに配置する。スライドを撹拌させてホルムアミドを除去する。スライドをエタノール洗浄物中で１分間立たせる。
５．スライドを７０％のエタノールから取り出す。工程４を８５％のエタノール、次いで１００％のエタノールを用いて繰り返す。
６．スライドの底端部を吸取紙に接触させることにより過剰のエタノールをスライドから抜き出し、スライドの下面を乾燥実験室ワイプにより拭き取る。
７．スライドを４５〜５０℃のスライドウオーマ上に２分間以下で配置してからプローブ溶液をアプライする準備が整う。
ａ．注：ハイブリダイゼーションのタイミングが、プローブが準備される前に２分を上回ってスライドが準備されるようなものである場合、スライドは１００％のエタノールのジャー中で残留すべきである。スライドは、それをスライドウオーマ上に配置する前に風乾させない。
【０２６５】
プローブ調製
１．調製したプローブを７３℃のウオーターバス中で５分間加熱する。
２．４５〜５０℃に設定したスライドウオーマ上にスライドを配置する。すぐに使用しない場合、管をホイルによりカバーしてそれを光から遮断する。
【０２６６】
ハイブリダイゼーション
１．プローブ溶液の１０μＬのアリコートをスライドの標的領域にアプライする。直ちに、２２ｍｍｘ２２ｍｍガラスカバースリップをプローブ溶液上に配置し、溶液をカバースリップ下で均等に拡散させる。気泡はハイブリダイゼーションを妨げ、回避すべきである。カバースリップをゴムセメントによりシールする。
ａ．注：カバースリップをアプライする前にプローブ溶液を複数の標的領域上にピペッティングしない。
２．スライドを予備加温３７℃ハイブリダイゼーションチャンバ中に配置し、チャンバを気密蓋によりカバーする。
３．スライドを含有するチャンバを３７℃のインキュベータ中に配置し、ハイブリダイゼーションを１２〜１６時間進行させる。
【０２６７】
ハイブリダイゼーション後洗浄
１．０．４×ＳＳＣ（ｐＨ７．０〜７．５）をコプリンジャーに添加する。コプリンジャーを７３±１℃のウオーターバス中に少なくとも３０分間配置することにより、または溶液温度が７３±１℃に到達するまで０．４×ＳＳＣ溶液を予備加温する。
ａ．注：適正な温度範囲を維持するため、４つのスライドを加熱洗浄溶液中に一度に配置しなければならない。４つより少ないスライドをハイブリダイズさせる場合、室温顕微鏡スライド（標本がアプレイされていない）を使用してスライドの数を４つにすることができる。４つより多いスライドをハイブリダイズさせる場合、それらは２つ以上のバッチ中で洗浄しなければならない。洗浄溶液の温度を７３±１℃に戻してからそれぞれのバッチを洗浄しなければならない。
２．カバースリップを第１のスライドの標的領域から除去し、０．４×ＳＳＣを含有する７３±１℃のコプリンジャー中に直ちにスライドを配置する。スライドを１〜３秒間撹拌する。他の３つのスライドについても繰り返し、７３±１℃において２分間インキュベートする。
ａ．注：スライドのいずれも洗浄バス中に配置する前にカバースリップをいくつかのスライドから除去しない。最後のスライドを洗浄バスに添加したときに２分間のインキュベーションの計時を開始する。
３．それぞれのスライドを洗浄バスから取り出し、２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０のジャー中に室温において５〜６０秒間配置し、スライドをバス中に配置するときに１〜３秒間撹拌する。
４．スライドを暗所において風乾させる（密封された引き出しまたは密封された戸棚内部の棚が十分である）。
５．１０μＬのＤＡＰＩ  ＩＩ対比染色剤をスライドの標的領域にアプライし、ガラスカバースリップをアプライする。シグナル計数前にスライドを暗所に貯蔵する。
【０２６８】
貯蔵
ハイブリダイズさせたスライド（カバースリップを有する）を−２０℃において暗所で貯蔵する。これらの条件下、スライドを顕著な蛍光シグナル強度の損失なしで最大１２ヵ月貯蔵することができる。長期貯蔵については、カバースリップをシールして乾燥を防止し、スライドを−２０℃において貯蔵する。
【０２６９】
シグナル分析
スライド適合性の評価
三重バンドパスフィルタＤＡＰＩ／ＦＩＴＣ／テキサスレッドは、３つ全てのフルオロフォアの同時観察に最適である。以下の基準を使用してスライド適合性を評価する：
Ａ．プローブシグナル強度：シグナルは、明るく、明確で、容易に評価可能であるべきである。シグナルは、明るくコンパクトで卵形状または糸状で拡散性で卵形状のいずれかで
あるべきである。
Ｂ．バックグラウンド：バックグラウンドは、暗色または黒色を呈し、蛍光粒子もかすみも有さないべきである。
Ｃ．交差ハイブリダイゼーション／標的特異性：プローブは、標的のみをハイブリダイズさせ、発光させるべきである。中期伸展物を評価して遺伝子座特異性を確認し、非標的配列へのあらゆる交差ハイブリダイゼーションを同定すべきである。
【０２７０】
最適視界および評価可能な核の選択
２５×対物レンズを使用してハイブリダイズした領域を検査し、標本分布を試験する。標本が希薄に分布し、間期核がほとんど重複しておらず、いくつかの間期核を視野内で検査することができる領域を選択する。細胞の分布が稠密であり、細胞が重複しており、または個々の核の核境界が識別不能である領域を回避する。細胞の塊を含有する領域を回避する。明確なシグナルを有する細胞のみを計数する。
【０２７１】
間期計数
６３×または１００×対物レンズを使用してそれぞれの評価可能な間期核中の蛍光シグナルを分析する。正常細胞中で、これらのプローブは明確な赤色（Ｒ）および緑色（Ｇ）スポットとして、それぞれの相同物について１つ出現する（２Ｇ２Ｒ構造をもたらす）。ｔ（９：２２）患者において、正常染色体９および２２の赤色および緑色シグナルに加え、それぞれ１つの黄色、白色、または黄色−白色（Ｙ）融合シグナルが存在すべきである（１Ｒ１Ｇ１Ｙ）。
【０２７２】
実施例９：グリーソンスコアと遺伝子発現との関係
１２人の男性患者から得られた前立腺組織の試験において、遺伝子発現（変動部位における）と、ある予後診断変数との関係を調査した。計測される遺伝子発現変数には、０が発現の未検出を表す、０、微量、１、２または３のグレードスケールでのＦＡＳ（脂肪酸シンターゼ；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００４１０４；配列番号６）、ＵＳＰ２ａ、（ユビキチン特異的ペプチダーゼ２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００４２０５（アイソフォーム１：長いバリアント；配列番号７）、ｐＡＫＴ（ｖ−ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００５１６３バリアント１：長いバージョン；配列番号８）およびＮＰＹ（ニューロペプチドＹ；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００９０５；配列番号９）のレベルが含まれる。零または未発現は、正常組織中の遺伝子のベースライン発現と等価に設定されたことに留意すべきである。したがって、０のグレードまたはレベルは、発現が当該遺伝子の正常組織の発現と等価であったことを意味する。微量は、正常組織発現と比べて０を上回るが１％未満が検出されたことを意味し、１は、正常組織と比べて１〜２５％の発現が検出されたことを意味し、２は、正常組織と比べて２５〜７５％の発現が検出されたことを意味し、３は、対照と比較して７５〜１００％の発現が検出されたことを意味する。正常組織において、微量のＦＡＳ、ＵＳＰ２ａおよびＮＰＹが常に存在する。症例の少なくとも９０％において、ｐＡＫＴが正常組織中に見出される。発現レベルがいかにグリーソンスコア（単独または組合せ）と関連するかも評価した。
【０２７３】
さらに、試験は（ａ）癌性部位（癌）と癌性部位の辺縁からの部位（辺縁）との間で遺伝子発現の有意差が存在するかどうかおよび（ｂ）癌性部位の辺縁からの部位（辺縁）と非癌性部位（正常）からの部位との間で遺伝子発現の有意差が存在するかどうかを調査した。データをテーブル５に示す。
【０２７４】
【表９】
2014519818.tif 000011
2014519818.tif 000012
2014519818.tif 000013
2014519818.tif 000014
表の略語：Ｔ＝腫瘍グレード；Ｎ＝リンパ節；Ｍ＝転移；Ｄｘ＝病理学的診断；「Ａｄ
ｅｎｏＣＡ」は、腺癌を意味し；「ＧＬ」は、グリーソングレードまたはスコアを意味し；Ｃ＝細胞質；Ｎ＝核（染色度を数値列挙）；ＮＧは腺がないことを意味し；ＮＵＬＬは、それが手術に関する場合、手術タイプが不明であったことを意味する。
【０２７５】
統計分析の結果：遺伝子発現
データは２つのタイプの患者からなる。患者ＡからＭは、それぞれ４つの試料を有する。癌性部位からの３つの試料および正常部位からの１つの試料である。患者ＮからＹは、癌性部位からの３つの試料のみを含有する。それらの患者は正常部位からの試料を含有しない。正常部位における発現を３つの癌性部位と直接比較すると、分析は、「対応のあるｔ検定」と類似し、但し、１つおよび３つの観察値からなる対応を除く。したがって、癌性部位における発現は、正常部位よりも高い精度で理解される。ＳＡＳ統計パッケージＪＭＰ、バージョン８；（カリー、ノースカロライナ）を使用する場合、フィットモデルプラットフォームを使用して不等配分に合わせて調整した。このモデルにおいて、調査される４つの別個のＹ変数は、ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ｐＡＫＴおよびＮＰＹ発現であった。Ｘ変数は部位（癌対辺縁）であった。最小二乗法（ＬＳＭｅａｎｓ）は、異なる試料サイズに合わせて調整される平均であり、テーブル６に報告する。
【０２７６】
【表１０】
2014519818.tif 000015
表から、癌性部位は辺縁部位よりも高いＦＡＳレベルを有することが明らかである。差は高度に有意である。ＵＳＰ２ａについては、癌性部位においてより高い発現が存在する一方、差は有意でなかった。ｐＡＫＴについては、ＦＡＳと同様、発現は癌性部位におい
てより高く、差は有意であった。ＮＰＹについては、癌性および辺縁部位においてほぼ等しい発現が存在した。
【０２７７】
グリーソンスコアとの関連
１２人の患者からの４８個の試料の限定データセットに基づくと、ＦＡＳ発現はグリーソンスコアと最も強い関係を有した。この関係は、統計的に有意であり、Ｐ＝０．００６８７であった。他の３つの変数は有意でなかった。
【０２７８】
辺縁および正常部位の発現の評価
癌性組織の辺縁からの正常部位と非癌性部位からの正常部位との間で有意差が存在するかどうかを決定する試みにおいて、１０人の追加の患者からの第３のデータセットを作成し、２つの試料を癌性領域の辺縁近傍もしくは辺縁部位（「辺縁」）または遠隔非癌性部位（「正常」）から得た。この分析は、癌性領域の辺縁から採取された試料および非癌性試料に対して４つの別個の遺伝子発現変数ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ｐＡＫＴおよびＮＰＹ間で差が存在するかどうかを明らかにする意図であった。データをテーブル７に示す。
【０２７９】
【表１１】
2014519818.tif 000016
データは、辺縁における部位について、ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａおよびｐＡＫＴレベルが正
常組織よりも高いことを明らかにした。しかしながら、ＮＰＹレベルは、辺縁および正常非癌性部位の両方においてほぼ同等であった。ＵＳＰ２ａについては、年齢変数は、わずかに有意な寄与をｐ＝０．０８４５で示す。ｐＡＫＴおよびＮＰＹについては、年齢変数は、有意な寄与をそれぞれｐ＝０．０７７４およびｐ＝０．５４４９で示す。有意であることが見出された年齢範囲は、５０〜７５歳であった。
【０２８０】
実施例１０：前立腺癌の予後診断指標としてのＦＡＳ
内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１１年３月１７日に公開されたＰＣＴ国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６７７３号明細書に報告された９０人の患者コホートの予備調査結果を詳述して、退縮および生存時間に基づき予後診断する方法に関する調査結果が本明細書に開示される。ＦＡＳと退縮度および臨床生存との間に予測関係が存在することが発見された。
【０２８１】
前立腺癌（ＰＣａ）と診断された９０人の患者からの生検標本を下記のとおり調製および分析した。全ての患者はアンドロゲン除去により治療されていた。
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０２０６７７７Ａ１号明細書の表題「ＥＧＦＲ−ＴＫ阻害剤の治療効力に関連する遺伝子およびタンパク質発現プロファイル（Ｇｅｎｅ  ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＥＧＦＲ−ＴＫ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」に記載のとおり調製した。９０個の前立腺癌標本に加え、正常前立腺組織、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）および正常（非癌性）組織を含有するＴＭＡを調製および分析した。
【０２８２】
ＦＡＳ発現は、米国特許出願公開第２００８／０２０６７７７Ａ１号明細書に記載の方法による免疫組織化学（ＩＨＣ）により、ＭＡｂＤ（ペプチド４を用いて生成；配列番号４；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０８０１）を検出（一次）抗体として使用して測定した。検出抗体は、米国特許出願公開第２００８／０２０６７７７Ａ１号明細書に記載のとおりビオチン化結合抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して可視化した。９０個の前立腺癌試料についての結果を以下のテーブル８に示す。
【０２８３】
表中、ＦＡＳ（配列番号６）、ＵＳＰ２ａ（配列番号７）、ＮＰＹ（配列番号９）、およびＡＭＡＣＲ（アルファ−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写バリアント１、またはＡＭＡＣＲ  ＩＡ；ＧｅｎＢａｎｋ
ＮＭ＿０１４３２４；配列番号１０）の発現を、０が発現の未検出を表す０、微量、１、２または３のグレードスケールで表す。零または未発現は、正常組織中の遺伝子のベースライン発現と等価に設定したことに留意すべきである。したがって、０のグレードまたはレベルは、発現が当該遺伝子の正常組織の発現と等価であったことを意味する。微量は、正常組織発現と比べて０を上回るが１％未満が検出されたことを意味し、１は、正常組織と比べて１〜２５％の発現が検出されたことを意味し、２は、正常組織と比べて２５〜７５％の発現が検出されたことを意味し、３は、正常組織と比べて７５〜１００％の発現が対照と比較して検出されたことを意味する。ＴＥ−３０アレイおよび正常前立腺／ＢＰＨスクリーニングアレイについての結果は、ＦＡＳ発現について陰性であった。
【０２８４】
【表１２】
2014519818.tif 000017
2014519818.tif 000018
2014519818.tif 000019
表中、「患者」は、患者を意味し、それぞれに任意番号を割り当て、年齢は、それぞれの患者の年齢であり；「Ｇ−スコア」は、それぞれの生検からの分割グリーソンスコアを指し；「治療前ＰＳＡ」は、患者の治療前総ＰＳＡレベルをｎｇ／ｍＬで指し（治療前ＰＳＡグレード０＝０〜５ｎｇ／ｍｌ；１＝６〜６０ｎｇ／ｍｌ；２＝６１〜１００ｎｇ／ｍｌ；および３＝１０１〜１５０ｎｇ／ｍｌ）；「ＦＡＳ」は、遺伝子脂肪酸シンターゼを指し；「ＵＳＰ２ａ」は、遺伝子ユビキチン特異的ペプチダーゼ２を指し；「ＡＭＡＣＲ」は、遺伝子アルファ−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを指し；「ＮＰＹ」は、遺伝子ニューロペプチドＹを指し；「ＭＴ」は、それぞれの患者が治療を受けた月数を指し；「ＤＲ」は、退縮度を指し；ＴＮＭ２００２」は、腫瘍、リンパ節、転移グレードづけシステムとして設定された腫瘍グレードを指し；「Ｓ」は、患者生存（年数）を指し；「ＵＮＫ」は、不明を表す。
【０２８５】
実施例１１：ＦＡＳおよび癌退縮
ＦＡＳと退縮度との関係は基本的に興味深く、したがって、患者生存および退縮データは、ＳＡＳ統計パッケージ、ＪＭＰ、バージョン８（カリー、ノースカロライナ）を使用して分析した。データは、実施例１０のテーブル８に詳述する９０人の観察値からなるものであった。５１人の観察値は、３つのＦＡＳ値、１０人についてＦＡＳ＝２、１９人についてＦＡＳ＝１、９人についてＦＡＳ＝０を有した。１つの生検（患者８７）は、ＦＡＳ値を有さなかった。退縮度は、不良−良好−優秀の３つのグレードスケールに基づき査定し、不良は、患者が１〜２年で死亡したことを意味し、良好は、患者が５年以内に疾患を有して生存していることを意味し、優秀は、５年を上回る生存を意味する。最大頻度は、ＦＡＳ＝３を有する「不良」退縮度を示す。
【０２８６】
【表１３】
2014519818.tif 000020
この状況において、退縮度は、カテゴリー応答変数であり、ＦＡＳは、カテゴリー試料変数である。周辺等質性検定は、応答確率がＦＡＳレベルにわたり同一であることを検定
する。この分析は、独立性についてのカイ二乗（または尤度比）検定と類似する。両方のタイプの検定は、ＦＡＳと退縮度との強い関係を０．０００１未満のｐ値で示す。応答等質性検定をテーブル１０に示す。
【０２８７】
【表１４】
2014519818.tif 000021
これは、より高いＦＡＳ数がより不良の退縮度に関連することを示す。
【０２８８】
ＦＡＳを数値Ｘ変数（退縮度をカテゴリーＹ変数とする）として使用してさらなる分析を実施した。数値Ｘ変数を伴うカテゴリーＹ変数はロジスティック回帰に導くことを理解すべきである。ＦＡＳが数値変数であることを仮定することにより、値ＦＡＳ＝２は、ＦＡＳ＝１よりも約２倍強いと仮定する。この仮定の利点は、対数オッズ結果に基づき、応答カテゴリー間の分離がいかに強いかを決定することができることである。
【０２８９】
分析は、退縮度とＦＡＳとの関係が高度の有意（ｐ値＜０．０００１）であることを明らかにした。このことは、既に等質性の検定により示されている。しかしながら、ロジスティック回帰について、以下に付加的に記述することができる：
・不良と優秀との対数オッズ、ｐ＜０．０００１で有意；
・不良と良好との対数オッズ、ｐ＜０．０００１で有意；
・良好と優秀との対数オッズ、ｐ＝０．０２４３で有意。
【０２９０】
ＦＡＳ値に従う退縮度への分類の推定確率をテーブル１１に示す。
【０２９１】
【表１５】
2014519818.tif 000022
表中のデータは、「不良」退縮度の推定確率がＦＡＳに依存することを示す。「不良」列において、ＦＡＳ＝０の場合、確率は０．０１５であり、；ＦＡＳ＝１の場合、確率は０．１５１であり；ＦＡＳ＝２の場合、確率は０．５８７であり；ＦＡＳ＝３の場合、確率は０．９０５である。実際の退縮度転帰と、ロジスティック回帰により予測された最も可能性の高い転帰とのクロス分類は、ＦＡＳが不良結果を極めて十分に予測することを示す。これらのデータをテーブル１２に示す。
【０２９２】
【表１６】
2014519818.tif 000023
ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線はこれらの数値結果を裏付け、テーブル１３に示す。
【０２９３】
【表１７】
2014519818.tif 000024
理想的な場合、３つ全てのカテゴリーは１の関連する面積を有する。最悪の場合、それらは感度（ｙ軸）対特異度（ｘ軸）のプロットの斜線をカバーする。２つの極端なカテゴリー：優秀および不良は、それぞれ０．９１４９および０．８８８８の面積を有する。不良または優秀のいずれにも誤分類され得る中程度のカテゴリーの良好は、期待されるとおり最低値を有した。
【０２９４】
実施例１２：ＦＡＳおよび臨床生存
９０人の患者のデータ（実施例１０に概説）に基づき、以下の変数を分析した：予測因子変数としてのグリーソン、治療前ＰＳＡ（ｎｇ／ｍｌ）、ＦＡＳ（発現のレベルの０〜３グレードシステム）、治療月数。生存時間（年数）は、予測変数である。５人の患者は５年間生存し、これらは打ち切り変数により同定された。主分析は、最初の４つの変数のパラメトリック回帰モデルをフィットさせて生存時間を５つの打ち切り観察値により説明することを含んだ。
【０２９５】
生存時間の説明において圧倒的に最も有意な変数はＦＡＳである。尤度比効果検定時、この変数のカイ二乗統計値は次に最も有意な変数よりも１２倍大きく上回った。グリーソン（ｐ＝０．０１５７）および治療月数（ｐ＝０．００９７）も、統計的に有意であった。治療前ＰＳＡは、全く有意でなかった（ｐ＝０．６２８１）。他の３つの変数を考慮すると、ＰＳＡは生存（再燃）時間の説明に関して何も提供しなかった。結果的に、データに基づくと、ＦＡＳは生存または再燃までの時間の圧倒的に最も強い指標である一方、治療前ＰＳＡは実質的に価値を示さないことが考えられる。
【０２９６】
パラメトリック生存フィットは、互いにわずかに相関されるにすぎない推定回帰係数を有したことに留意することが重要である。これは、解釈を簡易化し、それぞれの変数につ
いての独立する記述を可能とする。コックス比例ハザードモデルは、本質的に類似の結果をもたらし、但し、グリーソンおよび治療月数はσ＝０．０５において有意でなかった。コックスモデルを用いると、ＦＡＳは唯一有意であり、生存時間を説明するための依然として傑出した変数である。
【０２９７】
４つの予測因子変数の値は、最適アロケーションスキームに従って拡散されなかったことに留意することが重要である（データソースを考慮すると、このことは起こり得ない）。８６人の治療前ＰＳＡ値は３０未満であった。ＰＳＡ値のより大きい拡散（特に、いっそう多くのより大きい値を含むことによる）は、将来結果に対する効果を有し得る。同様に、７８人のグリーソン値は６または７のいずれかであり；２人は４であり；４人は５であり、５人は８である。さらに多くの４、５および８つのスコアを含むことは、グリーソンの有意性を向上させ得る。最後に、９０人の観察値のうち２９人は、グリーソン＝６およびＦＡＳ＝３を有した。しかしまた、５２人のＦＡＳは３であり、この変数は依然として極めて有意である。
【０２９８】
グリーソンスコア分析
最も高頻度のグリーソン値は、４９人の観察値についての６であり、次いで２９人の観察値についての７である。ＦＡＳとグリーソンとのクロス集計は、２９人（約３分の１）の観察値がグリーソン＝６およびＦＡＳ＝３の併合カテゴリーに属することを示す。まとめをテーブル１４に提供する。
【０２９９】
【表１８】
2014519818.tif 000025
表から、データのほとんど（８８％超）がグリーソンスコア５〜７の範囲内に属することを把握することができる。したがって、ＦＡＳグレードを５から７のグリーソンスコアと組み合わせて少なくとも術後に臨床生存の組合せ予測因子として使用することができる。
【０３００】
パラメトリック生存フィット
次いで、生存を予測するための方程式にデータをフィットさせた。方程式は、Ｙ変数としてのＬｏｇ（生存時間）をＸ変数としてのグリーソン、治療前ＰＳＡ、ＦＡＳおよび治療月数とフィットさせる。「打ち切り」変数を使用して５年間生存した患者を同定する。得られる方程式は：
Ｌｏｇ（生存時間（年数））＝
２．５２５０２＋−０．１３５９５＊グリーソン＋−０．００１８０＊治療前ＰＳＡ＋−０．４９４６５＊ＦＡＳ＋０．０３８６９＊治療月数。
【０３０１】
尤度比効果（ＬＲ効果）
別個のｐ値を方程式のそれぞれの項に割り当てるため、尤度比効果を計算した。テーブル１５はその結果を示す。０．０５未満のｐ値は、０とは有意に異なる効果を示すと解釈される。そのような変数は、生存時間に影響するとみなされる。ＬＲ効果検定は、治療前ＰＳＡを除きＰＳＡが有意であることを示す。治療前ＰＳＡはｐ値＝０．６２８１を有し、生存時間に影響しない。３つの有意な変数のうち、ＦＡＳは最大のカイ二乗検定統計値を有する（グリーソンについての５．８４および治療月数についての６．６８に対して８５．２９）。このことは、ＦＡＳが最も有意な変数であるだけでなく、他の変数と比べて圧倒的に有意であることを示唆する。
【０３０２】
【表１９】
2014519818.tif 000026
パラメータ推定値は全て妥当であり、テーブル１６に概説する。ＦＡＳおよびグリーソンは、負係数を有し、このことは値の増加が生存時間を低減させることを示す。治療月数は、正係数を有し、このことはより長い治療が生存時間を増加させることを意味する。ＰＳＡの係数は、それが有意でないため無視される。ＰＳＡの係数についての９５％信頼区間−０．００９１から＋０．００５６は、０を含む。これは、有意でない別の指標である。全ての他の係数の９５％信頼区間は０を含まず、それらが０とは有意に異なるという異なった形で現れる。パラメータσは、スケールパラメータであり、方程式に直接代入する。
【０３０３】
【表２０】
2014519818.tif 000027
残差プロットは仮定が対数正規のモデルにより最良に充足されることを示唆したため、対数正規を選択した。ワイブルおよび対数ロジスティックも試みた。ワイブルがデータに十分にフィットしなかった一方、対数ロジスティックは、それが対数正規と類似するため極めて良好にフィットした。しかしながら、対数正規モデルはより容易に理解される。
【０３０４】
方程式の残差分位点プロット（図１）は、残差（＝観察値−予測値）が正常に機能する
ことを示す。線は完全に直線ではないが、ワイブルおよびさらには対数ロジスティックと同様に一方向にも多方向にも湾曲してなく曲線を描いてもいない。
【０３０５】
分布プロファイラ
データから、ＦＡＳはこの方程式において最も重要な変数であることが明らかである。再燃の確率（１−生存の確率）に対するＦＡＳの効果を可視化する別の手法は、分布プロファイラの異なる設定から把握することができる。
【０３０６】
この実施例において、プロファイラは、再燃確率（ｙ軸）をグリーソン、治療前ＰＳＡ、ＦＡＳ、治療月数および時間（全てｘ軸上）に対してプロットする５つのグラフからなる。４つの分布プロファイラを図２〜５に示す。プロットにおいて、ある値を一定に保持した。これらは：グリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２である。これらの値はそれらの平均に最近傍の丸められた値である。
【０３０７】
それぞれのプロファイラにおいて、本発明者らは異なるＦＡＳ値：ＦＡＳ＝０（図２）、ＦＡＳ＝１（図３）、ＦＡＳ＝２（図４）およびＦＡＳ＝３（図５）を選択した。当業者は、他の変数について異なる値を選択することにより、より多くのプロファイラを構築することができる。
【０３０８】
ＦＡＳ＝０の分布プロファイラ
ＦＡＳ＝０ならびにグリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２の患者についてのプロファイラは、再燃の確率を０．００７２０５（左軸上）として、０．００１０６から０．０３４２４の間の９５％信頼区間で推定する。グリーソン、ＰＳＡ、月数の実線曲線は効果を示さず、このことは、ＦＡＳ＝０について、再燃の確率が主に時間に依存することを意味する。
【０３０９】
ＦＡＳ＝１の分布プロファイラ
ＦＡＳ＝１ならびに上記と同様にグリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２の患者についてのプロファイラは、再燃の確率を０．１０８１５２（左軸上）として、０．０５０９１から０．２０１３８の間の９５％信頼区間で推定する。グリーソンの実線曲線は上方に曲線を描き、このことは目下の設定グリーソン＝７からの増加が再燃確率の増加をもたらすことを示す。ＰＳＡは有意でないが、適正な方向に向いている。治療月数が増加するにつれ、再燃確率は減少する。時間（対再燃確率）の（Ｓ字曲線）の変化は、ＦＡＳ＝０よりもＦＡＳ＝１がより急傾斜である。
【０３１０】
ＦＡＳ＝２の分布プロファイラ
ＦＡＳ＝２ならびに上記と同様にグリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２の患者についてのプロファイラは、再燃の確率を０．４８９６４４（左軸上）として、０．３８４３２から０．５９５７の間の９５％信頼区間で推定する。この設定について、患者のほぼ半数が２年目までに死亡すると推定される。グリーソンの実線曲線は、上方に強く曲線を描き、このことは、目下の設定グリーソン＝７からの増加がＦＡＳ＝１よりもいっそう急傾斜の再燃確率の増加をもたらすことを示す。ＰＳＡは有意でないが、適正な方向に向いている。治療月数が増加するにつれ、再燃確率は減少する。時間（対再燃確率）の（Ｓ字曲線）の変化も、ＦＡＳ＝０または１のいずれよりもＦＡＳ＝２が同様にかなり急傾斜である。
【０３１１】
ＦＡＳ＝３の分布プロファイラ
ＦＡＳ＝３ならびに上記と同様にグリーソン＝７、ＰＳＡ＝１３、治療月数＝３．７、および（再燃の）時間＝２の患者についてのプロファイラは、再燃の確率を０．８８１８９（左軸上）として、０．７９６１３から０．９３８３５の間の９５％信頼区間で推定す
る。この設定について、患者のほぼ９０％が２年目までに死亡すると推定される。グリーソンの実線曲線は、上方に曲線を描き、このことは、目下の設定グリーソン＝７からの増加が再燃確率の増加をもたらすことを示す。ＰＳＡは有意でないが、適正な方向に向いている。治療月数が増加するにつれ、他のＦＡＳ値と同様に再燃確率は減少する。時間（対再燃確率）の（Ｓ字曲線）の変化は、ＦＡＳ＝３が最も急傾斜である。曲線の急傾斜は、ＦＡＳ＝３のほとんどの患者が特に他の措置が取られない限り、極めて急激に死亡することを補強する。この解釈は、目下の混成患者の代表性に基づくことに留意すべきである。
【０３１２】
他のモデル
本発明者らは、比例ハザードモデルをデータに十分にフィットさせた。ＰＰＨモデルは、この分析が確認することができないある仮定を要求するにもかかわらず、結果は類似する。ＦＡＳは、群を抜いて最も強い変数である。グリーソンおよび治療月数は有意でない。ＰＳＡも有意でない。
【０３１３】
実施例１３：他の指標の相対予測力
ＦＡＳ発現を包囲する調査結果を考慮して、有用な指標であり得る他の潜在的な計量値を評価した。これらは、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲおよびＮＰＹ遺伝子の遺伝子発現の計測値を含んだ。任意の他の遺伝子が臨床管理パラメータまたは臨床エンドポイントのマーカまたは指標としてＦＡＳと同程度に有利かどうかを対処することが望ましかった。
【０３１４】
ＳＡＳ統計パッケージＪＭＰ、バージョン８；（カリー、ノースカロライナ）を使用してデータを分析した。生データは、実施例１０のテーブル８に詳述されている９０人の観察値からなるものであった。
【０３１５】
モザイクプロット（種々の応答レベルについての確率がｘレベルの関数であるかどうかの決定に役立つ視覚プロット）の作出は、ＵＳＰ２ａおよびＮＰＹがＦＡＳに密接に関連することを示した。両方のプロットについて、ＦＡＳ＝３の場合のＦＡＳについての最大のカバレッジがＵＳＰ２ａ＝３およびＮＰＹ＝３と一致することが決定された。一部の相違（一部のＦＡＳ＝３はＵＳＰ２ａ＝１または２のものもあり、ＮＰＹ＝２についてのものある）が存在した一方、ほとんどの転帰はこれら３つの変数（ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａおよびＮＰＹ）が類似のグレードをもたらすという結論と一致した。モザイクプロットにより、グリーソンスコアはＦＡＳに関連しなかった。関連するとは、グリーソンスコアを予測因子としてＦＡＳに代えて用いることができない、例えば、それが実質的な単独の予測因子でないことを意味する。
【０３１６】
興味深いことに、遺伝子ＡＭＡＣＲとＦＡＳとの間で反比例関係が同定された。すなわち、ＡＭＡＣＲスコアが低い場合、ＦＡＳスコアが高い。この結果は、ＡＭＡＣＲ発現も等しく有価な指標であり得るが、値はＦＡＳ発現レベルと反比例関係を有することを示唆する。
【０３１７】
任意の２つの遺伝子、例えばＦＡＳとＵＳＰ２ａとの間の一致度を計測するため、カッパ係数を計算した。２つの二元変数が同一物を計測するための２つの個体による試みである場合、コーエンのカッパ（カッパと呼ばれることが多い）を２つの個体間の一致の尺度として使用することができる。カッパは、表の主対角線中のデータ値の割合を計測し、次いでこれらの値を単なる偶然に起因して期待することができる一致の量について調整する。これらをテーブル１７に示す。より高いカッパ係数は、２つの値が密接に関連することを示す。
【０３１８】
【表２１】
2014519818.tif 000028
データから、最大のカッパ係数により示されるとおりＦＡＳおよびＮＰＹが最も密接に関連することを把握することができる。ＦＡＳおよびＵＳＰ２ａも密接に関連する。結果的に、ＵＳＰ２ａまたはＮＰＹのいずれも前立腺癌の予後診断および／または診断指標として使用することができ、それぞれ７３％または４１％のレベルで少なくともＦＡＳと同様に予測または診断的であり得ることを結論づけることができる。
【０３１９】
実施例１４：個々の予測因子による退縮度の偶然性分析
実施例１０のテーブル８に詳述されるデータの分析の別のセットにおいて、ＳＡＳ統計パッケージ、ＪＭＰ、バージョン８（カリー、ノースカロライナ）を使用して退縮度（ＤＯＲ）と個々の予測因子／指標との関係を調査した。結果をテーブル１８に示す。
【０３２０】
【表２２】
2014519818.tif 000029
テーブルから、治療前ＰＳＡ単独もグリーソンスコア単独も癌退縮度と有意に相関しないことが明らかである。しかしながら、遺伝子ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲおよびＮＰＹのそれぞれは、癌退縮度の予測と高度に有意な関係を示した。したがって、個々の遺伝子のいずれも退縮度の予後診断についてのマーカまたはエンドポイントとして機能し得る。
【０３２１】
実施例１５：複数の退縮度の予測因子
退縮度の予測の改善の試みにおいて、予測因子変数の組合せを調査した。ここでも、分析は実施例１０のテーブル８に詳述されるデータを含み、ＳＡＳ統計パッケージ、ＪＭＰ、バージョン８（カリー、ノースカロライナ）を使用した。結果をテーブル１９に示す。
【０３２２】
【表２３】
2014519818.tif 000030
順序ロジスティック回帰からの結果は、ＦＡＳが有意な変数（ｐ＜０．０００１）であったことおよびグリーソンスコアが分析に何も追加しない（ｐ＝０．２３７４）ことを示す。
【０３２３】
ＦＡＳおよびＵＳＰ２ａの組合せの使用は、有意な予測方程式を作出する。しかしながら、個々の変数として、ＦＡＳはアルファ＝０．１０においてのみ有意である。方程式の決定係数は０．６７６であった。方程式への治療月数の追加は、決定係数を０．７３６に増加させるが、それによってもＦＡＳは有意にならない。一方、治療月数の３つの最大値を排除すると、変数はアルファ＝０．１０においてのみ有意になる。
【０３２４】
ＦＡＳおよびＡＭＡＣＲの組合せの使用は、有意な予測方程式を作出する。しかしながら、個々の変数として、ｐ＝０．２９９７について、ＡＭＡＣＲはアルファ＝０．１０において有意でない。方程式の決定係数は０．６７６であった。
【０３２５】
ＦＡＳおよびＮＰＹの組合せは、個々の変数と比べてあまり改善されない方程式をもたらす。両方の変数はかなり類似するため、ＮＰＹが有意であると、ＦＡＳはＮＰＹにより既に説明されなかったものを何も説明することができなかった。
【０３２６】
ＵＳＰ２ａおよび治療月数のみを有するモデルは、高い決定係数（＝０．７２１２）を保持し、全体的に有意である。しかしながら、３つの最大観察値は、治療月数の重要性を増加させる傾向にある。これにもかかわらず、両方の予測因子は高度に有意であった。
【０３２７】
まとめると、ＵＳＰ２ａは退縮度の最も強い予測因子であることならびにＦＡＳおよびＮＰＹは極めて類似する予測因子であることが決定された。最後に、許容可能なパラダイムとは対照的に、ＰＳＡおよびグリーソンは退縮度の有意な予測因子でなかった。
【０３２８】
実施例１６：ＦＡＳおよびＵＳＰ２ａの差次的発現：局所部位対転移部位
ＦＡＳとＵＳＰ２ａとの間の発現データの分析は、局所部位と、癌から遠隔の転移部位との間の差次的発現のパターンを明らかにした。これらのレベルをプロットすると、臨床転帰、特に退縮度を予測する関係が出現することが明らかになった。
【０３２９】
ＵＳＰ２ａおよびＦＡＳは、ある時点において試験される場合、退縮度（ＤＯＲ）に関して癌侵襲性を予測する高度に有意で強力な手段を提供する発現の差次的パターンを示すことが見出されたことが発見された。ＵＳＰ２ａ発現の増加はＦＡＳ発現の増加に導くことが決定された。ＦＡＳ発現増加時、ＵＳＰ２ａレベルはＦＡＳレベルの降下前に降下することも決定された。この発現のパターンは、前立腺癌の侵襲性と関連および相関する。結果的に、発現のパターンは、予後診断を正確に行うことができるウインドウを提供する。一実施形態において、ＵＳＰ２ａ発現を計測し、ＦＡＳ発現と比較する。ＵＳＰ２ａ発
現がＦＡＳ発現を超過するが、続いて降下する場合、侵襲性の強い指標を仮定することができる。この予後診断のウインドウは、他では無視し得た。それというのも、ＦＡＳの低い計測値がより小さい癌の侵襲形態を示唆し得、それにより臨床家によるあらゆるリスク評価を緩和するためである。換言すると、本発明以前に、低いＦＡＳ発現レベルにより臨床家にＵＳＰ２ａレベルを計測しないことを誤導し、臨床診断を誤導し得た。
【０３３０】
実施例１７：転帰予測の特異度：ＦＡＳおよびＵＳＰ２ａ
ＵＳＰ２ａ遺伝子発現により同定された予期せぬ関係を考慮すると、ロジスティックモデルを使用するさらなる分析を実施し、３つのモデルに基づき最も可能性の高い転帰についてデータを作成した。最も可能性の高い退縮度転帰（不良、良好、優秀）は、それぞれのカテゴリーについて最大推定確率に基づき選択した。無論、これはロジスティック回帰の最終結果である。退縮度は、不良−良好−優秀の３グレードスケールに基づき査定し、不良は、患者が１〜２年で死亡したことを意味し、良好は、患者が５年以内に疾患を有して生存していることを意味し、優秀は、疾患を有してまたは有さずに５年を上回る生存を意味する。ここで分析は、実施例１０のテーブル８に詳述されるデータを含み、ＳＡＳ統計パッケージ、ＪＭＰ、バージョン８（カリー、ノースカロライナ）を使用した。目安としての決定係数の結果をテーブル２０に示す。
【０３３１】
【表２４】
2014519818.tif 000031
データは、既にＵＳＰ２ａを含む方程式へのＦＡＳの追加が決定係数を０．６５から０．６８に上昇させることを明らかにする。しかし、既にＦＡＳを含む方程式へのＵＳＰ２ａの追加は、決定係数を０．３９から０．６８に上昇させる。
【０３３２】
次に、実際の転帰と予測転帰とのクロス集計を実施した。完全なモデルは、全ての不良を不良として、全ての良好を良好として、などと分類する。（１）ＦＡＳ単独、（２）ＵＳＰ２ａ単独、および（３）ＦＡＳとＵＳＰ２ａのそれぞれについて最も可能性の高い退縮度を示すデータをテーブル２１〜２３に示す。
【０３３３】
【表２５】
2014519818.tif 000032
列カテゴリーは、実際の転帰を表す。行は、ＦＡＳ単独を使用して予測された転帰を表す。例えば、合計１１人の実際の「優秀」転帰を有する「優秀」列において、ＦＡＳは、それらのうちの６人を良好として、５人を優秀として正確に分類する。合計２３人の実際の「良好」転帰を有する「良好」列において、ＦＡＳは、９人を不良として、１０人を良
好として、４人を優秀として分類する。以下のテーブル２２において、この列は、ＵＳＰ２ａがＦＡＳよりもかなり良好な予測因子であることが示される。合計５６人の実際の「不良」転帰を有する不良の列において、ＦＡＳは、５３人を不良として、３人を良好として分類する。実際の転帰と予測転帰との一致度は、カッパ＝０．５１を有し、これはかなり高い値であるが、ＵＳＰ２ａを使用した場合よりも低い。
【０３３４】
【表２６】
2014519818.tif 000033
上記のとおり、列カテゴリーは、実際の転帰を表す。行は、ＵＳＰ２ａ単独を使用して予測された転帰を表す。ここで、合計１１人の実際の優秀転帰を有する「優秀」列において、ＵＳＰ２ａは、それらのうちの６人を良好として、５人を優秀として正確に分類する（ＦＡＳと同一）。合計２３人の実際の良好転帰を有する「良好」列において、ＵＳＰ２ａは、１人を不良として、２２人を良好として、０人を優秀として分類し、これはＦＡＳ単独よりもかなり良好である。合計５６人の実際の不良転帰を有する「不良」列において、ＵＳＰ２ａは、５２人を不良として、４人を良好として分類する。実際の転帰と予測転帰との一致度は、カッパ＝０．７７を有し、これは極めて高い値であり、ＵＳＰ２ａとＦＡＳを使用した場合よりもわずかに低いにすぎない。
【０３３５】
【表２７】
2014519818.tif 000034
上記のとおり、列カテゴリーは、実際の転帰を表す。行は、ＵＳＰ２ａをＦＡＳとの組合せで使用して予測された転帰を表す。合計１１人の実際の優秀転帰を有する「優秀」列において、ＵＳＰ２ａは、それらのうちの３人を良好として、８人を優秀として正確に分類する。この列において、ＵＳＰ２ａ＋ＦＡＳの組合せは最大の利益を示す。合計２３人の実際の良好転帰を有する「良好」列において、ＵＳＰ２ａ＋ＦＡＳは、１人を不良として、２２人を良好として、０人を優秀として分類し、これはＵＳＰ２ａ単独と同一である。合計５６人の実際の不良転帰を有する「不良」列において、ＵＳＰ２ａ＋ＦＡＳは、５２人を不良として、３人を良好として、１人を優秀として分類する。実際の転帰と予測転帰との一致度は、カッパ＝０．８４を有し、これは極めて高い値であり、３つのモデルのうち最大である。
【０３３６】
まとめると、ＦＡＳ計測値単独は、不良転帰の分類においてＵＳＰ２ａ単独またはＵＳＰ２ａ＋ＦＡＳ組合せと同様に良好である。しかしながら、良好を良好として分類するのに最良であると見出されたのはＵＳＰ２ａ計測値であった。（同一のことは、ＵＳＰ２ａ＋ＦＡＳに当てはまる）。
【０３３７】
さらに、ＦＡＳ＋ＵＳＰ２ａ組合せは、優秀を優秀として分類するのに特筆すべき利点を提供する。結果的に、臨床家は、ＵＳＰ２ａ単独およびそのＦＡＳとの組合せの計測値を癌退縮の予後診断のためのアッセイに取り込むことを十分に助言される。
【０３３８】
例えば、診断および治療レジメンの規定が不可欠である潜在的な前立腺癌の提示時、ＵＳＰ２ａは、ファーストラインアッセイであるべきである。レベルは、不良転帰（１〜２年後に死亡）の予測においてＦＡＳと同様に良好であり、良好転帰（疾患を有して少なくとも５年間の生存）の予測においてＦＡＳよりも良好である。これら２つの最も悲観的な予後診断にわたる層別化は、最も重要であり、これら２つの間で考えられる治療プロトコルを説明する単一アッセイは、非常に有価である。ここで、ＵＳＰ２ａはこの要求を満たすことが示された。二番目のアッセイについて、ＦＡＳの計測値を追加して優秀転帰の予測の精度を改善することができることが決定された。本発明は、そのような方法、アッセイおよびキットを提供する。
【０３３９】
実施例１８：骨転移におけるＦＡＳおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの発現
ＦＡＳおよびＨｅｒ２／ｎｅｕ（公知の癌原遺伝子）の発現の分析は、前立腺患者における発現および不良予後との相関を明らかにした。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２または上皮成長因子受容体２としても公知）は、乳癌における侵襲性を伝達することが見出されたタンパク質である。本試験において、両方の遺伝子の発現は、前立腺癌患者の骨転移において上昇することが見出された。
【０３４０】
実施例１９：ＵＳＰ２ａについてのポリクローナル抗血清の産生および特性決定
ＳＰＦウサギ（メイン・バイオテクノロジー・サービスズ・インコーポレイテッド（Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を使用してポリクローナル抗血清を生成した。４８匹のウサギを使用した。ポリクローナル抗体を以下、ＵＳＰ２ａ−１およびＵＳＰ２ａ−２と称し、ＡＴＣＣに寄託した（ＡＴＣＣ寄託番号は、それぞれ＿および＿である）。
【０３４１】
それぞれのウサギに、テーブル２４に示される本発明のペプチドの１つを注射した。
【０３４２】
【表２８】
2014519818.tif 000035
ウサギを交配させ、次いで得られた抗血清をプールし、ＵＳＰ２ａ（配列番号７）からのペプチドから生じた同一のエピトープを使用してアフィニティ精製した。アフィニティ精製は、以下の手順に従って実施した：
工程１：アフィニティカラム調製
配列番号１１または配列番号１２のペプチドを１ｍｌの活性化セファロースビーズに結合させることにより免疫アフィニティカラムを調製した。
工程２：抗血清のローディング
抗血清を２μｇ／ｍＬの濃度においてペプチド−セファロースカラム上にロードし、３７℃において１時間インキュベートした。
工程３：溶出
カラムを数回洗浄した後、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する溶出緩衝液を使用して結合した抗体の溶出を実施した。抗体を含有するフラクションをプールし、免疫精製抗
体の最終濃度を、紫外線分光光度計を使用して２８０ｎｍにおける光学密度を読み取ることにより測定した。
工程４：免疫精製抗体のＥＬＩＳＡ試験
ブロッキング試薬シーブロック（ＳｅａＢｌｏｃｋ）を無希釈濃度でウェル中にロードし、３７℃において３０分間インキュベートした。インキュベーション後、４つの血清試料（プレブリードＲｂ１、プレブリードＲｂ２、ペプチド１およびペプチド２）をウェル中に６つの異なる濃度において添加した。４つの試料を１：５０、１：２５０、１：１２５０、１：６２５０、１：３１２５０、および１：１５６０００の濃度に．１５ＭのＰＢＳを使用して希釈した。これらの濃度の４つの血清のそれぞれをウェルに添加し、次いで室温において３０分間インキュベートした。最後に、二次抗体の抗ＲｂＨＲＰ（ＨＲＰ−ロット番号８６５６９）を、１：１００００の濃度に０．０５％のツイーン２０を有する．１５ＭのＰＢＳを使用して希釈し、室温において３０分間インキュベートした。試料の最終濃度は、テーブル２５および２６に示すとおり、紫外線分光光度計を使用して４５０ｎｍにおける吸光度を読み取ることにより測定した。
【０３４３】
【表２９】
2014519818.tif 000036
【０３４４】
【表３０】
2014519818.tif 000037
実施例２０：５年生存についての感度および特異度ＲＯＣ曲線
実施例１０からのデータを使用して、９０人の患者コホートの感度および特異度を二元変数により、５年以上であるそれらの生存時間に応じて生存（Ｓｕｒｖｉｖｅ５）および非生存（ＮｏＳｕｒｖ）に分類した。５年生存変数は、４つの異なる予測因子Ｘ変数（ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲ、およびＮＰＹ）ならびにグリーソンスコアおよび治療前ＰＳＡによりモデル化した。得られたモデルを使用して最も可能性の高い転帰を予測した（同様に生存または非生存）。実際の転帰を、異なるモデルに基づき予測転帰と比較した。クロス分類から、それぞれの変数の感度および特異度を推定した。次いで、ＲＯＣ曲線を作成した。
【０３４５】
Ｙ変数としての５年生存
年生存は数値変数であり、０．５から５の範囲である。基礎ヒストグラムプロットは、かなりの比率の患者が２年より前に死亡したことを示した（平均生存＝２．４５年、標準偏差１．６）。
【０３４６】
二分変数「５年生存」を使用し、値「Ｓｕｒｖｉｖｅ５」を５年以上の生存時間（年数）を有する全ての症例に割り当てた。全ての他の症例に「ＮｏＳｕｒｖ」または非生存を割り当てた。合計８９人の全症例のうち、２０人が少なくとも５年間生存した一方、６９人が５年より前に死亡した。したがって、「ＮｏＳｕｒｖ」の確率は０．７７５であった一方、「Ｓｕｒｖｉｖｅ５」の確率は０．２２５であった（実際の転帰に基づく）。
【０３４７】
Ｘ変数
以下の予測因子変数を分析したＦＡＳ（０〜３グレードシステム）；ＵＳＰ２ａ（０〜３グレードシステム）；ＡＭＡＣＲ（０〜３グレードシステム）；ＮＰＹ（０〜３グレード）；グリーソンスコア（５〜７のみ）；および治療前ＰＳＡ（ｎｇ／ｍｌ）。ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲおよびＮＰＹは、ＪＭＰバージョン８による分析において順序データとして処理した。結果を２段階でまとめた。第１に、退縮度と単一の予測因子との関係を分析した。第２に、退縮度と２つ以上の予測因子との関係を分析した。名義ロジスティック回帰分析を実施し、Ｙ変数「Ｓｕｒｖｉｖｅ５」が二分変数であるためそれが要求された。主要性能特性のまとめを以下のテーブル２７に示す。
【０３４８】
【表３１】
2014519818.tif 000038
この表のまとめは、以下の基準を含む：Ｒ２（決定係数）は、全モデルの尺度である。この値は０から１である。より高い値は、モデルがデータにおけるより多くの全体的な変動を説明することを意味し、ｐ値は、統計的有意性の尺度である。典型的には、当分野において、０．０５未満のｐ値が有意なモデルまたは効果として解釈される。ＲＯＣ面積は、ＲＯＣ曲線の１つの特性である。ＲＯＣ曲線は、順位序列にわたり頻度を蓄積するとき真陽性対偽陽性のカウントを含む。ＲＯＣ曲線は、Ｘ軸上の（１−特異度）およびＹ軸上の感度をプロットする。ＲＯＣ面積下で考えられる最大値は１であり、それは真陽性および真陰性の完全な分離を示す。変数を予測的とすべき場合、１に近い値が望まれる。
【０３４９】
診断試験について、感度および特異度は重要な概念である。感度は、所与のＸ値（検定または尺度）が病態の存在を正確に予測する確率である。ここで、Ｘ変数は、上記に詳述され、病態は、二元変数Ｓｕｒｖｉｖｅ５（少なくとも５年間の生存または非生存）である。特異度は、病態が存在しないことを検定が正確に予測する確率である。
【０３５０】
データから、ＦＡＳが２番目に高いＲ２、２番目に大きいＲＯＣ面積および２番目に高
い特異度を有することを決定することができる。それは、ＮＰＹよりもわずかに高い感度を有するが、より低い特異度により相殺される。ＵＳＰ２ａは、３番目に高いＲ２、３番目に大きいＲＯＣ面積および３番目に高い特異度を有する。それは、ＮＰＹよりもわずかに低い感度を有する。ＡＭＡＣＲは、４番目に高いＲ２、４番目に大きいＲＯＣ面積および４番目に高い特異度を有する。それはより高い感度を有するが、より低い特異度によりかなり相殺される。
【０３５１】
興味深いことに、グリーソンおよび治療前ＰＳＡの両方は、５年生存との非有意関係を有する。これらのＲ２は低く、ＲＯＣ面積は約０．５である。これらの感度は１であるが、それは特異度＝０．５と対をなす。結果的に、ロジスティックモデルは、有意な関係が存在しないため、実質的に全ての患者をＮｏＳｕｒｖとして分類する。
【０３５２】
実施例２１：それぞれのＸ変数についての感度および特異度：ＲＯＣ曲線の比較
ＲＯＣ曲線は、感度と特異度（または１−特異度）との関係を可視化する手法である。
理想的なＲＯＣ曲線は、病態を有する全てを陽性として、病態を有さない全てを陰性として正確に分類する。理想的なＲＯＣ曲線下面積は１であり、そのことは、（１−特異度）＝０の場合、感度の１への急傾斜の増加を意味する。６つのＸ変数についてのＲＯＣ曲線を図６に示す。ＦＡＳについての急傾斜のＲＯＣ曲線をグリーソンスコアからの斜線のＲＯＣと比較することにより、グリーソンが生存転帰の予測においてそれほど有用でないことが実証された。同様に、治療前ＰＳＡは、５年生存の予測においてそれほど良好な変数でない。ＰＳＡ  ＲＯＣは、ＰＳＡが他の変数と同様に順序的でなく連続的であるため、異なって見える（むしろ階段関数に近い）ことに留意されたい。考慮中の６つの変数のＲＯＣの比較は、ＦＡＳ、ＮＰＹおよびＵＳＰ２ａが最大の曲線下面積を有することを明確に示す。グリーソンおよびＰＳＡは斜線に近いＲＯＣ曲線を有し、このことは、それらが５年生存率の予測においてそれほど有用でないことを意味する。
【０３５３】
実施例２２：対数正規分布を使用する５年生存確率
４つの予測因子変数ＦＡＳ、ＮＰＹ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２ａを使用して５年生存確率の推定を改善することができるかどうかおよび治療前ＰＳＡまたはグリーソンスコアと比較してそれらがいかに機能するかを調査する試みにおいて、パラメトリック生存分析を実施した。この分析は、対数正規分布を使用して変動性および線形モデルを表して生存時間と予測因子変数およびまたはグリーソン／ＰＳＡとの関係を表す。一部の観察値は、一部の生存データが５年を上回ったため、左側打ち切りである。
【０３５４】
この試験において、それぞれの症例におけるＹ変数は生存時間（年数）である。観察値のほとんどを年数に丸めた。数個の観察値は５年において左側打ち切りである。打ち切り変数を分析に含めた。ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａ、ＡＭＡＣＲ、ＮＰＹは、ＪＭＰによる分析において順序データとして処理した。
【０３５５】
１９００症例（男性対象）についてのデータが利用可能であった。患者は、アンドロゲン除去を伴い、放射線療法を受けない前立腺切除後であった。全てについてのグリーソンスコアは５〜７であった。しかしながら、ある症例は生存時間を欠き、別の症例は一部の尺度（ＡＭＡＣＲおよびＮＰＹ）を欠いた。結果として、１８８８または１８８９の観察値のみが分析に利用可能であった。生存確率は、５、６、および７のグリーソンを有する症例のみを使用して推定した。８つの観察値はこの範囲外であった。このことは、症例数をさらに１８８１または１８８０に減らした。しかしながら、これらの症例（グリーソンスコア４、８、および９を有する）を含めることは、結論を変えることも効果の尺度の推定値を変化させることもなかったことに留意されたい。
【０３５６】
分析は、ＳＡＳインスティテュート（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の製品ＪＭＰ８を
使用して実施した。この試験について、フィット・ライフ・ディストリビューション（Ｆｉｔ  Ｌｉｆｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を使用してどの生存分布がもっとも有用であるかを確認し、フィット・ライフ×Ｘ（Ｆｉｔ  Ｌｉｆｅ  ｂｙ  Ｘ）プラットフォームの位置モデルを使用して生存確率対異なるレベルの予測因子変数のグラフを作成した。フィット・パラメトリック・サバイバル（Ｆｉｔ  Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）を特異的数値結果、例えば、それぞれの項の有意性の検定および５年生存／再燃確率の推定値に使用した。全てのプラットフォームは、それらの結果を汎用され十分に理解されている統計的方法の尤度法により得た。
【０３５７】
生存データをいかなる予測因子も他のＸ変数も参照せずに評価する第１の分析を行った。この分析の目的は、もっとも有用な生存分布を確認することである。６つの異なる共通生存分布の一般的分析は、対数正規分布がデータに最良にフィットすることを示す。対数正規モデル推定値に基づくと、いかなるＸ変数も考慮せず、５年生存確率は０．０９６であった。
【０３５８】
次いで、４つの予測因子変数を分析し、それぞれは、ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａおよびＮＰＹについて最も強い３つの変数として高度に有意であることが示された。テーブル２８は、５〜７のグリーソンスコアを有する症例についての５年生存確率（Ｓｕｒｖ  Ｐｒｏｂ）を予測因子変数グレードスコアにより分類して示す。
【０３５９】
【表３２】
2014519818.tif 000039
生存時間対グリーソンスコアのモデルは有意でなかった（テーブル２９参照）。しかしながら、グリーソン＝５からグリーソン＝６での生存確率の降下があった。このことは、グリーソンが他の予測因子変数に追加される場合に有意であることが見出された。これにもかかわらず、グリーソンスコアモデルは単独および予測因子変数との組合せの両方でかなり弱かった。
【０３６０】
【表３３】
2014519818.tif 000040
同様に、治療前ＰＳＡは有意でなかった（ｐ＝０．７７）。生存確率対ＰＳＡスコアの
関係は反転し、すなわち、ＰＳＡスコアが増加するにつれ、推定生存確率は減少する。
【０３６１】
【表３４】
2014519818.tif 000041
実施例２３．生存に対する予測因子変数の組合せ
実施例２２からのデータを利用して、予測因子変数の組合せを予測モデルの改善について調査した。最初に、単一の予測因子変数をグリーソンスコアおよびＰＳＡと組み合わせ、次いで複数の予測因子変数をグリーソンスコアおよびＰＳＡレベル計測値と組み合わせた。１つの予測因子変数とグリーソンスコアおよびＰＳＡを含有するモデルは、極めて類似の結果を示す。テーブル３１参照。全ての単一の予測因子変数は有意であった。グリーソンおよびＰＳＡは有意でなく、但し、グリーソンをＮＰＹと組み合わせた場合は例外であった。このことは、主にＮＰＹ＝０または１グレードの場合に生じることが決定された。類似の関係がＦＡＳおよびＵＳＰ２ａについて観察されたが、統計的有意性を達成しなかった。
【０３６２】
【表３５】
2014519818.tif 000042
複数の予測因子変数の組合せも調査し、これらの結果をテーブル３２〜３８に示す。
【０３６３】
【表３６】
2014519818.tif 000043
【０３６４】
【表３７】
2014519818.tif 000044
【０３６５】
【表３８】
2014519818.tif 000045
【０３６６】
【表３９】
2014519818.tif 000046
テーブル３６〜３８は、種々の組合せの尤度比効果検定を示す。（＊）は、統計的有意性を示す。
【０３６７】
【表４０】
2014519818.tif 000047
【０３６８】
【表４１】
2014519818.tif 000048
【０３６９】
【表４２】
2014519818.tif 000049
ＦＡＳおよびＮＰＹを含む全ての変数の使用は、この２つ（ＮＰＹおよびＦＡＳ）が極めて類似するためＮＰＹが有意でないこと示す。しかしながら、これらのデータについて、ＦＡＳはより強い変数であると考えられる。
【０３７０】
予測因子変数の３つ（ＦＡＳ、ＵＳＰ２ａおよびＡＭＡＣＲ）をグリーソンおよびＰＳＡと組み合わせた場合、３つ全てが有意であったが、グリーソンスコアはアルファ＝０．０５において有意でなかった。テーブル３９参照。３つ全てが同時に有意であったという事実は、それらが感度と特異度との間の相殺のわずかに異なる態様を説明すること示唆す
る。
【０３７１】
【表４３】
2014519818.tif 000050
実施例２４：再燃確率×予測因子変数
それぞれの予測因子変数に対する生存時間に関するモデルに別個に基づき、変数による再燃時間（非生存）分布の推定値を計算した。これらの分布を使用してそれぞれの予測因子変数の挙動を説明することができる。データを図７に示す。それぞれのプロットは、Ｘ軸としての生存時間（０から５）およびＹ軸上の再燃確率を有する。異なる分布がそれぞれのグラフに標識される。
【０３７２】
第１のプロット図７Ａは、ＦＡＳに対する生存時間に関する。このプロットは、ＦＡＳ＝３およびＦＡＳ＝２についての曲線が極めて近接することを示す。同様に、ＦＡＳ＝１およびＦＡＳ＝０の曲線も近接する。これら２つの群は、５年生存の機会をほとんど有さない症例を５年生存の機会を有する症例から分けた。４つの曲線は、生存に関してＦＡＳ＝０が最良であり、ＦＡＳ＝３が最悪であるという点で一致する。ＦＡＳについての信頼区間推定値は、ＦＡＳ＝１とＦＡＳ＝０との差が統計的に有意でないことを示すが、全ての他の差のペアはアルファ＝０．０５において有意であることを示す。
【０３７３】
第２のプロット図７Ｂは、ＵＳＰ２ａに対する生存時間に関する。このプロットは、ＵＳＰ２ａ＝１およびＵＳＰ２ａ＝２についての曲線が極めて近接することを示す。５年生存の機会を有する唯一の症例は、ＵＳＰ２ａ＝０からのものである。４つの曲線は、生存に関してＵＳＰ２ａ＝０が最良であり、ＵＳＰ２ａ＝３が最悪であるという点で一致する。ＵＳＰ２ａについての信頼区間推定値は、ＵＳＰ２ａ＝１とＵＳＰ２ａ＝０との差およびＵＳＰ２ａおよびＵＳＰ２ａ＝１についての差が統計的に有意でないことを示すが、全ての他の差のペアはアルファ＝０．０５において有意であることを示す。
【０３７４】
第３のプロット図７Ｃは、ＡＭＡＣＲに対する生存時間に関する。このプロットは、ＡＭＡＣＲ＝０、ＡＭＡＣＲ＝１およびＡＭＡＣＲ＝２についての曲線が極めて近接することを示す。５年生存の機会を有する唯一の症例は、ＡＭＡＣＲ＝３からのものである。４つの曲線は、生存に関してＡＭＡＣＲ＝３が最良であり、ＡＭＡＣＲ＝０が最悪であるという点で一致する。ＡＭＡＣＲについての信頼区間推定値は、ＡＭＡＣＲ＝１とＡＭＡＣＲ＝０との差およびＡＭＡＣＲ＝２およびＡＭＡＣＲ＝１についての差が統計的に有意でないことを示すが、ＡＭＡＣＲ＝３との差の全てのペアはアルファ＝０．０５において有意であることを示す。
【０３７５】
第４のプロット図７Ｄは、ＮＰＹに対する生存時間に関する。外見上、このプロットは、ＦＡＳについてのプロットと極めて類似する。このプロットは、ＮＰＹ＝３およびＮＰＹ＝２についての曲線が極めて近接することを示す。同様に、ＮＰＹ＝１およびＮＰＹ＝０の曲線も近接する。これら２つの群は、５年生存の機会をほとんど有さない症例を５年
生存の機会を有する症例から分けた。４つの曲線は、生存に関してＮＰＹ＝０が最良であり、ＮＰＹ＝３が最悪であるという点で一致する。ＮＰＹについての信頼区間推定値は、ＮＰＹ＝３とＮＰＹ＝２との差が統計的に有意でないことを示すが、全ての他の差のペアはアルファ＝０．０５において有意であることを示す。
【０３７６】
第５のプロット図７Ｅは、グリーソンスコアに対する生存時間に関する。このプロットは、グリーソン＝７およびグリーソン＝６についての曲線が極めて近接することを示す。グリーソン＝５についての曲線はそれほど近接しない。３つの曲線は、生存に関してグリーソン＝５が最良であり、グリーソン＝７が最悪であるという点で一致する。しかしながら、グリーソンスコアについての信頼区間推定値は、曲線がアルファ＝０．０５において統計的に有意でないことを示す。
【０３７７】
第６のプロット図７Ｆは、治療前ＰＳＡに対する生存時間に関する。このプロットは、他の変数ともグリーソンとも違って、ＰＳＡが連続変数であるため異なる。プロットはＸ軸としての治療前ＰＳＡおよびＹ軸としての年生存時間を有する。３つの線は、それぞれのＰＳＡレベルについての生存時間の０．１、０．５および０．９の分位点の推定値を表す。得られた線は不一致であることを把握することができる。ＰＳＡレベルが増加するにつれ、生存確率は増加する。そのような不一致結果は、変数が全体的に非有意である場合に生じ得る。このことは、全体のｐレベル＝０．７７であるＰＳＡの症例である。
【０３７８】
実施例２５：尿中のＦＡＳの検出
一連の患者試料における尿中のＦＡＳのレベルを計測し、上皮細胞におけるＦＡＳレベルと比較した。全ての患者は男性であり、それぞれ経尿道切除（ＴＵＲ）を受けていた。リンパ節転移は評価しなかった。データをテーブル４０に示す。Ｎ／Ａは、測定しなかったことを意味する。Ｇ１は、第１のグリーソンスコアである一方、Ｇ２は、第２のグリーソンスコアを指し、Ｇ合計は、Ｇ１およびＧ２の合計を指す。上皮染色は、０〜４のスケールに基づき、０＝０、１＝１〜２５％、２＝２６〜５０％、３＝５１〜７５％および４＝７６〜１００％である。「＋」記号を示す任意の計測値は、数値指標をわずかに上回るレベルを指す。「Ｍ」は、検出された転移を意味し、「Ｎ」は、検出されたリンパ節を意味する。表から、６より大きいグリーソンスコアについて、ＦＡＳが尿中で１〜４のスコアで検出されることが明らかである。しかしながら、６未満のグリーソンスコアは、ＦＡＳレベルは低い傾向にある（スコア１および２）。したがって、ＦＡＳがより高いレベルにおいて尿中に出るグリーソングレード閾値が存在すると考えられる。
【０３７９】
【表４４】
2014519818.tif 000051
2014519818.tif 000052
2014519818.tif 000053
2014519818.tif 000054
2014519818.tif 000055
実施例２６：グリーソン制限を有するおよび有さないフィット「Ｘ×Ｙ変数」（Ｆｉｔ“Ｘ  ｂｙ  Ｙ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ”）
変数ＦＡＳ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２ａと退縮度との関係を、ＳＡＳ統計パッケージＪＭＰバージョン８（カリー、ノースカロライナ）を使用してさらに調査した。データは、実施例１０のテーブル８に詳述される９０人の観察値からなるものであった。これらのデータのうち、Ｘ×Ｙフィットをグリーソンスコアのさらなる制限を有しておよび有さずに評価した。この場合、９０人の観察値のうち、グリーソンスコア５から７を有する８２人の観察値のみを使用した。
【０３８０】
２つの変数を固形腫瘍（臓器限局）についての代理変数として使用した：ＦＡＳ（０、１、２、３）および退縮度。それぞれの変数についてクロス集計を実施し、ＦＡＳの場合、ケンドールのタウおよびスピアマンのローを順序変数間の関連の尺度として使用して多変数順位相関も実施した。ＦＡＳ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２Ａについてのデータを実施例２７および２８に示す。退縮度を含む全ての変数にわたる評価についてのデータを実施例２９に挙げる。
【０３８１】
結果は、最も強い関連は、ＦＡＳとＮＰＹとの間であり、ほとんど同等に強い関連はＦＡＳとＵＳＰ２Ａとの間であることを示した。退縮度に関して、ＦＡＳはＵＳＰ２Ａよりも強かった。しかしながら、ＵＳＰ２Ａについて、カットオフをＵＳＰ２Ａ＝０、１対２、３からＵＳＰ２Ａ＝０、１、２対３に変えた場合、相関が存在した。
【０３８２】
ＡＭＡＣＲに関して、ＦＡＳ＝３の場合、５１人の症例のうち４８人がＡＭＡＣＲ＝１または２を有する。したがって、低いＡＭＡＣＲ値は、高いＦＡＳ値と関連する。しかしながら、関連は、ＦＡＳが低い場合、それほど強くない。
【０３８３】
実施例２７：フィットＸ×Ｙ変数：ＦＡＳ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２Ａ
ＦＡＳ＝０およびＦＡＳ＝１を優秀予後の代用として使用し、固形腫瘍（臓器限局）において優秀予後であると推定して、本発明者らは、ＦＡＳ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２Ａに何か起こるのかを決定することを追求した。２８人の症例がそのカテゴリーに属した。１２人のＵＳＰ２Ａ症例は、０または１のいずれかの値を有した一方、１６人は２および３の値を有する。２つのＵＳＰ２Ａ群間で非有意差が存在した。１９症例はＡＭＡＣＲを０および１の値で有する一方、９人は値を有する。１９人と９人との差は、統計的に有意であり、フィッシャーの正確確率検定がＰ＝０．０４４であり、片側検定を仮定した。両側検定は、カイ二乗ｐ値＝０．０５９を有し、したがって、閾値を逃した。分割表はより全体的な像を提供した。分割表をテーブル４１および４２に示す。
【０３８４】
【表４５】
2014519818.tif 000056
【０３８５】
【表４６】
2014519818.tif 000057
再発または転移した腫瘍において、高い値のＦＡＳ（３または４）とＵＳＰ２ＡおよびＡＭＡＣＲの値との関係も評価した。ＦＡＳ＝２およびＦＡＳ＝３を不良予後の代用として使用して、６１人の症例がそのカテゴリーに属した。２人のＵＳＰ２Ａ症例は０または１のいずれかの値を有した一方、６０人は２および３の値を有した。実質的に全ての高いＦＡＳ値が、高いＵＳＰ２Ａ値と関連した。これは、２つのＵＳＰ２Ａ群間の明確な有意差である。
【０３８６】
４８人の症例は、ＡＭＡＣＲを０および１の値で有した一方、１３人は値を有した。４８人と１３人との差も統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。両側検定はカイ二乗ｐ値＝０．０５９を有し、したがって閾値を逃す。
【０３８７】
実施例２８．フィットＸ×Ｙ変数：ＦＡＳ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２Ａ
「優秀」退縮度を「優秀」予後の代用として使用して、本発明者らは、ＦＡＳ、ＡＭＡＣＲおよびＵＳＰ２Ａに何が起こるのかを決定することを追及した。３４人の症例がそのカテゴリーに属し、２５人のＦＡＳ症例が０または１のいずれかの値を有する一方、９人が２および３の値を有することが見出された。このことは、ｐ＝０．００６で２つのＦＡＳ群間の有意差であるとは見出されなかった。さらに、１３人のＵＳＰ２Ａ症例は０または１のいずれかの値を有した一方、２１人は２および３の値を有した。対照的に、これは、２つのＵＳＰ２Ａ群間の高度な有意差であった。最後に、１９人の症例はＡＭＡＣＲを値０および１で有した一方、１５人は値２および３を有した。差は有意でなかった。データをテーブル４３〜４５に示す。
【０３８８】
【表４７】
2014519818.tif 000058
【０３８９】
【表４８】
2014519818.tif 000059
【０３９０】
【表４９】
2014519818.tif 000060
次に、再発または転移した腫瘍について、同一のパラメータ、例えば、ＦＡＳ、ＵＳＰ２ＡおよびＡＭＡＣＲに何が起こるのかを調査した。不良退縮度を不良予後診断の代用として使用して、５６人の症例がそのカテゴリーに属した。ＦＡＳ結果により、ＦＡＳ＝１を有する３人の症例（ＦＡＳ＝０の症例なし）を、ＦＡＳ＝２およびＦＡＳ＝３を有する５３人の症例と比較した。結果は高度に有意であった。さらに、１人のＵＳＰ２Ａ症例は
０または１のいずれかの値を有した一方、５５人は２および３の値を有した。実質的に全ての高いＦＡＳ値が、高いＵＳＰ２Ａ値と関連した。これは、２つのＵＳＰ２Ａ群間の明確な有意差である。最後に、４８人の症例は、ＡＭＡＣＲを０および１の値で有した一方、７人は２および３の値を有した。４８人と７人との差も統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【０３９１】
変数ＦＡＳ、ＵＳＰ２ＡおよびＡＭＡＣＲ間の関連度
次いで、ケンドールのτおよびスピアマンのρ（順位相関）を、２つの順序スケール間の関連の２つの尺度を使用して調査した。２つの相関表（テーブル４６および４７）は、（ＦＡＳおよびＮＰＹとは別に）最も強い関連がＦＡＳとＵＳＰ２Ａとの間にある、すなわち、ケンドールタウ＝０．７１５２であり、０とは高度に有意に異なることを示す（ｐ＜．０００１）。同様に、スピアマンのロー＝０．７６９７であり、高度に有意であった。
【０３９２】
ＡＭＡＣＲとＦＡＳとＵＳＰ２Ａとの間の関連は有意であるが、関連度は有意により低かった。ＡＭＡＣＲとＦＡＳとの関連は、ケンドールタウ＝−０．２４５２をｐ＝．００９８で有し、それは０とは有意に異なる。同様に、スピアマンのρ＝−０．７６９７であり、ｐ＝０．０２０８で有意であった。ＦＡＳとＮＰＹとの関連は極めて高度であった。
【０３９３】
【表５０】
2014519818.tif 000061
【０３９４】
【表５１】
2014519818.tif 000062
実施例２９：９０人の観察値のフィットＸ×Ｘ群
実施例２６に概説されたプロトコルに従って、フィットＸ×Ｘデータを以下のテーブル４８〜５４に挙げる。データを以下の７つの報告群Ａ〜Ｇに分類する。それぞれの群につ
いて、分割表、検定決定係数値の概説およびカイ二乗統計分析の結果を提供する。細胞の２０％が５未満の期待カウントを有したことに留意されたい。
【０３９５】
Ａ．ＵＳＰ２（０〜３）×ＦＡＳ（０〜３）
【０３９６】
【表５２】
2014519818.tif 000063
【０３９７】
【表５３】
2014519818.tif 000064
【０３９８】
【表５４】
2014519818.tif 000065
Ｂ．ＡＭＡＣＲ（０〜３）×ＦＡＳ（０〜３）
【０３９９】
【表５５】
2014519818.tif 000066
【０４００】
【表５６】
2014519818.tif 000067
【０４０１】
【表５７】
2014519818.tif 000068
Ｃ．ＮＰＹ（０〜３）×ＦＡＳ（０〜３）
【０４０２】
【表５８】
2014519818.tif 000069
【０４０３】
【表５９】
2014519818.tif 000070
【０４０４】
【表６０】
2014519818.tif 000071
Ｄ．ＦＡＳ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４０５】
【表６１】
2014519818.tif 000072
【０４０６】
【表６２】
2014519818.tif 000073
【０４０７】
【表６３】
2014519818.tif 000074
Ｅ．ＵＳＰ２Ａ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４０８】
【表６４】
2014519818.tif 000075
【０４０９】
【表６５】
2014519818.tif 000076
【０４１０】
【表６６】
2014519818.tif 000077
Ｆ．ＡＭＡＣＲ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４１１】
【表６７】
2014519818.tif 000078
【０４１２】
【表６８】
2014519818.tif 000079
【０４１３】
【表６９】
2014519818.tif 000080
Ｇ．ＮＰＹ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４１４】
【表７０】
2014519818.tif 000081
【０４１５】
【表７１】
2014519818.tif 000082
【０４１６】
【表７２】
2014519818.tif 000083
実施例３０：９０人全ての観察値の多変数および単変数分析
それぞれの変数について、ケンドールのタウおよびスピアマンのローを順序変数間の関連の尺度として使用して多変数および単変数順位相関の両方についてクロス集計を実施した。分析値をテーブル５５〜５８に示す。相関はＲＥＭＬ法により推定する。統計値は、それぞれの列について独立して他の列の欠測値を考慮せずに計算したことに留意すべきである。
【０４１７】
【表７３】
2014519818.tif 000084
【０４１８】
【表７４】
2014519818.tif 000085
【０４１９】
【表７５】
2014519818.tif 000086
【０４２０】
【表７６】
2014519818.tif 000087
実施例３１：フィットＹ×Ｘ群；５から７のグリーソンを有する８２人の観察値
実施例２６に概説されたプロトコルに従って、５〜７のグリーソンスコアを示す観察値の下位群について、フィットＸ×Ｘデータを以下のテーブル５９〜６１に挙げる。データを以下の３つの報告群Ａ〜Ｃに分類する。それぞれの群について、分割表、検定決定係数値の概説およびカイ二乗統計分析の結果を提供する。細胞の２０％が５未満の期待カウントを有したことに留意されたい。
【０４２１】
Ａ．ＵＳＰ２Ａ（０〜３）×ＦＡＳ（０〜３）
【０４２２】
【表７７】
2014519818.tif 000088
【０４２３】
【表７８】
2014519818.tif 000089
【０４２４】
【表７９】
2014519818.tif 000090
Ｂ．ＡＭＡＣＲ（０〜３）×ＦＡＳ（０〜３）
【０４２５】
【表８０】
2014519818.tif 000091
【０４２６】
【表８１】
2014519818.tif 000092
【０４２７】
【表８２】
2014519818.tif 000093
Ｃ．ＮＰＹ（０〜３）×ＦＡＳ（０〜３）
【０４２８】
【表８３】
2014519818.tif 000094
【０４２９】
【表８４】
2014519818.tif 000095
【０４３０】
【表８５】
2014519818.tif 000096
実施例３２：退縮度（２グレード）による；グリーソン５から７を有する症例についてのフィットＹ×Ｘ群
実施例２６に概説されたプロトコルに従って、５〜７のグリーソンスコアを示す観察値の下位群について、退縮度により、フィットＸ×Ｘデータを以下のテーブル６２〜６５に挙げる。データを以下の４つの報告群Ａ〜Ｄに分類する。それぞれの群について、分割表、検定決定係数値の概説およびカイ二乗統計分析の結果を提供する。細胞の２０％が５未満の期待カウントを有したことに留意されたい。
【０４３１】
Ａ．ＦＡＳ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４３２】
【表８６】
2014519818.tif 000097
【０４３３】
【表８７】
2014519818.tif 000098
【０４３４】
【表８８】
2014519818.tif 000099
Ｂ．ＵＳＰ２Ａ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４３５】
【表８９】
2014519818.tif 000100
【０４３６】
【表９０】
2014519818.tif 000101
【０４３７】
【表９１】
2014519818.tif 000102
Ｃ．ＡＭＡＣＲ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４３８】
【表９２】
2014519818.tif 000103
【０４３９】
【表９３】
2014519818.tif 000104
【０４４０】
【表９４】
2014519818.tif 000105
Ｄ．ＮＰＹ（０〜３）×退縮度（２グレード）
【０４４１】
【表９５】
2014519818.tif 000106
【０４４２】
【表９６】
2014519818.tif 000107
【０４４３】
【表９７】
2014519818.tif 000108
実施例３３：５から７のグリーソンを有する多変数および単変数観察値
それぞれの変数について、ケンドールのタウおよびスピアマンのローを順序変数間の関連の尺度として使用して多変数および単変数順位相関の両方についてクロス集計を実施した。分析値をテーブル６６〜６９に示す。相関はＲＥＭＬ法により推定する。統計値は、それぞれの列について独立して他の列の欠測値を考慮せずに計算したことに留意すべきである。
【０４４４】
【表９８】
2014519818.tif 000109
【０４４５】
【表９９】
2014519818.tif 000110
【０４４６】
【表１００】
2014519818.tif 000111
【０４４７】
【表１０１】
2014519818.tif 000112
【図１】
2014519818.tif 000113
【図２】
2014519818.tif 000114
【図３】
2014519818.tif 000115
【図４】
2014519818.tif 000116
【図５】
2014519818.tif 000117
【図６】
2014519818.tif 000118
【図７】
2014519818.tif 000119
【配列表】
2014519818000001.app
【国際調査報告】
2014519818.tif 000120