(57)【要約】  核酸などの生体分子を、ミトコンドリアおよび葉緑体などの非核オルガネラに送達するよう作用する、ペプチドを含む、オルガネラターゲッティングナノキャリアが提供される。また、このようなナノキャリアを使用する非核オルガネラを遺伝子形質転換する方法も提供される。
2014522662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の非核オルガネラに核酸を送達する方法であって、細胞を、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に曝露することを含み、前記少なくとも１つの核酸は、前記少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞の細胞膜を通過してトランスロケーションし、非核オルガネラ中に入る、前記方法。
【請求項２】
核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、植物細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、動物細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
非核オルガネラが、ミトコンドリアである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
オルガネラターゲッティングナノキャリアが、約４から約７の電荷比および約０から約−０．５の親水性を有するポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オルガネラターゲッティングナノキャリアが、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）、
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＭＨ（配列番号２）、
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）、
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）、および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）
から選択される配列を有するポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
非核オルガネラが葉緑体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
オルガネラターゲッティングナノキャリアが、約２から約４．２の電荷比および約０から約−０．２の親水性を有するポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
オルガネラターゲッティングナノキャリアが、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＭＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列を有するポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子改変された植物細胞を製造する方法であって、非核オルガネラを含有する植物細胞を、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に対して曝露することを含み、前記少なくとも１つの核酸は、非核オルガネラをトランスフェクトするために、前記少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞の細胞膜を通過してトランスロケーションし、非核オルガネラ中に入る、前記方法。
【請求項１２】
植物細胞が、胚性小胞子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法によって製造された、遺伝子改変された植物細胞。
【請求項１４】
遺伝子改変された植物体を作製する方法であって、請求項１１または１２に記載の方法によって、遺伝子改変された植物細胞を製造することおよび
遺伝子改変された植物細胞から植物体を作製することを含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって作製された、遺伝子改変された植物体。
【請求項１６】
遺伝子改変された動物細胞を製造する方法であって、少なくとも１つのミトコンドリアを含有する動物細胞を、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つのミトコンドリアターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に対して曝露することを含み、前記少なくとも１つの核酸は、前記少なくとも１つのミトコンドリアをトランスフェクトするために、前記少なくとも１つのミトコンドリアターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞の細胞膜を通過してトランスロケーションし、前記少なくとも１つのミトコンドリア中に入る、前記方法。
【請求項１７】
ミトコンドリアターゲッティングペプチド配列を有し、約４から約７の電荷比および約０から約−０．５の親水性を有するポリペプチドである、ミトコンドリアターゲッティングナノキャリア。
【請求項１８】
ポリペプチドが、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）、
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＨ（配列番号２）、
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）、
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）、および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）
から選択される配列を有する、請求項１７に記載のミトコンドリアターゲッティングナノキャリア。
【請求項１９】
葉緑体輸送ペプチド配列を有し、約２から約４．２の電荷比および約０から約−０．２の親水性を有するポリペプチドである、葉緑体ターゲッティングナノキャリア。
【請求項２０】
ポリペプチドが、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列を有する、請求項１９に記載の葉緑体ターゲッティングナノキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、タンパク質および核酸などの生体分子を、非核オルガネラに送達するための組成物および方法を対象とする。より具体的には、本願は、ミトコンドリアおよび葉緑体の遺伝子形質転換のための組成物および方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に重要な食用作物および工芸作物を、これらの再生可能資源に対する世界需要を満たすよう遺伝子操作するための、新たな農業用の分子生物工学技術が必要である。不運なことに、植物は、哺乳類細胞を操作するために開発された遺伝子形質転換方法のほとんどにとって操作困難である。しかし、ペプチドトランスフェクション技術が、実行可能な植物トランスフェクション技術として、現在新たに現れつつある。
【０００３】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、受容体非依存的な方法で細胞膜を通過して核酸などの極性親水性化合物を形質導入できる短いカチオン性ペプチドである（非特許文献１）。このような細胞透過性ペプチドの一例として、ＨＩＶ−１Ｔａｔ４９−５７（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）がある（非特許文献２および非特許文献３）。
【０００４】
Ｔａｔ配列は、Ｔａｔが、細胞の外側の原形質膜を通過して、自身および結合しているカーゴを形質導入するのを可能にする塩基性アミノ酸を含む。Ｔａｔ−カーゴ複合体は、核局在シグナル（ＮＬＳ）と呼ばれるそのペプチド配列内の細胞内局在配列の存在によって、細胞の核内に蓄積する（非特許文献４）。
【０００５】
タンパク質のＮ末端に見られるこのような細胞内局在配列は、タンパク質局在化シグナル配列と総称される。各タンパク質局在化シグナル配列は、サイトゾルにおいて翻訳された新生タンパク質を、細胞内の特定の細胞内位置へターゲッティングする異なるペプチド配列である。タンパク質局在化シグナルは、核を標的とする核局在シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）、葉緑体をターゲッティングする葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）を含む。ｃＴＰ、ｍＴＰおよびＮＬＳは、二重膜を通過して特定のオルガネラ中への、これらの配列を含有する細胞質タンパク質の輸送を促進するトランスロケーション機構によって認識される（非特許文献５）。
【０００６】
効率的な細胞内取り込みおよびミトコンドリア蓄積を促進する特定の構造特性および化学特性は、ミトコンドリア治療薬および抗癌剤の開発に適用されてきた。例えば、非局在化された親油性カチオン（ＤＬＣ）を含む合成ペプチドが調製されている（非特許文献６）。さらに、ミトコンドリア膜内において活性酸素種によって引き起こされる細胞酸化ストレスを低減するために使用される細胞透過性抗酸化ペプチドが開発されている（非特許文献７）。これらのペプチドは、交互に配置された、抗酸化特性を付与する合成芳香族残基および細胞透過特性を付与する塩基性アミノ酸を含む構造モチーフを有する。最近、交互に配置された芳香族および塩基性残基からなるこのすでに同定された構造モチーフに基づいたミトコンドリア膜透過性ペプチド（ＭＰＰ）が開発され、ＤＬＣの特性が、これらのペプチド内の特定の部位中に組み込まれている（非特許文献８）。
【０００７】
ミトコンドリアおよび葉緑体などの特定のオルガネラは、発現されるが、核ゲノムとは異なり通常は一方の親のみから遺伝されるＤＮＡを含有する。ミトコンドリア遺伝子は、通常は母性的に遺伝され、ほとんどの顕花植物では、例えば、葉緑体は、雄の親からは遺伝されない。このため、このようなオルガネラは特に植物では遺伝子形質転換の標的であったが、これは、あらゆる形質転換された遺伝子は、生物学的に封じ込められ、花粉によってばらまかれない可能性が高く、従ってより低い環境リスクしか示さないためである。さらに、ミトコンドリアの機能障害は、ミトコンドリアを直接的な送達先とする遺伝子治療およびその他の治療が有用な治療であり得るような特定の疾患と関連している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Veldhoen, S., Recent Developments in Peptide-Based Nucleic Acid Delivery. International Journal of Molecular Sciences (2008) 9(7): 1276-1320
【非特許文献２】Vives, E., P. Brodin, and B. Lebleu, A Truncated HIV-1 Tat Protein Basic Domain Rapidly transocates through the Plasma Membrane and Accumulates in the Cell Nucleus. J. Biol. Chem. (1997) 272(25): 16010-16017
【非特許文献３】Wender, P.A., et al., The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: Peptoid molecular transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences (2000) 97(24): 13003-13008
【非特許文献４】Nagahara, H., et al., Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nat Med (1998) 4(12): 1449-1452
【非特許文献５】Emanuelsson, O., et al., Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat. Protocols (2007) 2(4): 953-971
【非特許文献６】Fernandez-Carneado, J., et al., Highly Efficient, Nonpeptidic Oligoguanidinium Vectors that Selectively Internalize into Mitochondria, Journal of the American Chemical Society (2004) 127(3): 869-874
【非特許文献７】Zhao, K., et al., Cell-permeable Peptide Antioxidants Targeted to Inner Mitochondrial Membrane inhibit Mitochondrial Swelling, Oxidative Cell Death, and Reperfusion Injury, J. Biol. Chem. (2004) 279(33): 34682-34690
【非特許文献８】Horton, K.L. et al, Mitochondria-Penetrating Peptides, Chemistry & Biology (2008) 15: 375-382
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、遺伝物質をミトコンドリアおよび葉緑体などのオルガネラのゲノム中に選択的に導入することによって、生物を遺伝子形質転換する新規方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、核酸を細胞中の非核オルガネラに送達する方法であって、細胞を少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に曝露することを含む方法を提供する。前記の少なくとも１つの核酸は前記少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞膜を通過してトランスロケーションし、前記非核オルガネラ中に入る。少なくとも１つの実施形態では、前記細胞は植物細胞である。少なくとも１つの実施形態では、前記植物細胞は胚性体細胞、プロトプラストおよび小胞子から選択される。少なくとも１つの実施形態では、前記細胞は動物細胞である。少なくとも１つの実施形態では、前記核酸はＤＮＡである。
【００１１】
少なくとも１つの実施形態では、非核オルガネラは、ミトコンドリアである。このような実施形態によれば、オルガネラターゲッティングナノキャリアは、約４から約７の電荷比および約０から約−０．５の親水性を有するポリペプチドであり得る。あるいは、このような実施形態では、前記オルガネラターゲッティングナノキャリアは、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）、
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＭＨ（配列番号２）、
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）、
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）、および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）
から選択される配列を有するポリペプチドであり得る。
【００１２】
少なくとも１つの実施形態では、非核オルガネラは葉緑体である。このような実施形態によれば、オルガネラターゲッティングナノキャリアは、約２から約４．２の電荷比および約０から約−０．２の親水性を有するポリペプチドであり得る。あるいは、このような実施形態では、前記オルガネラターゲッティングナノキャリアは、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＭＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列を有するポリペプチドであり得る。
【００１３】
本発明の別の態様では、遺伝子改変された植物細胞を製造する方法であって、非核オルガネラを含有する植物細胞を、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に対して曝露することを含む方法が提供される。前記の少なくとも１つの核酸は、前記非核オルガネラをトランスフェクトするために、前記の少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞の細胞膜を通過してトランスロケーションし、前記非核オルガネラ中に入る。少なくとも１つの実施形態では、前記植物細胞は胚性小胞子である。
【００１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載された方法によって製造された遺伝子改変植物細胞を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様では、遺伝子改変された植物体を作製する方法であって、非核オルガネラを含有する植物細胞を、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に対して曝露すること、ここで前記少なくとも１つの核酸は、非核オルガネラをトランスフェクトするために、前記少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞の細胞膜を通過してトランスロケーションし、前記非核オルガネラ中に入る、およびトランスフェクトされた非核オルガネラを含有する植物細胞から植物体を作製することを含む前記方法が提供される。少なくとも１つの実施形態では、前記植物細胞は、胚性小胞子である。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載された方法によって製造された遺伝子改変された植物を提供する。さらに別の態様は、本明細書に記載されるようなトランスフェクトされた非核オルガネラを含有する、このような遺伝子改変植物の種子を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様では、遺伝子改変された動物細胞を製造する方法であって、少なくとも１つのミトコンドリアを含有する動物細胞を、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのミトコンドリアターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に対して曝露することを含む方法が提供される。前記の少なくとも１つの核酸は、前記の少なくとも１つのミトコンドリアターゲッティングナノキャリアの存在下で細胞の細胞膜を通過してトランスロケーションし、少なくとも１つのミトコンドリア中に入り、少なくとも１つのミトコンドリアをトランスフェクトする。少なくとも１つの実施形態では、前記動物細胞は、哺乳類細胞である。少なくとも１つの実施形態では、前記動物細胞は、ヒト細胞である。
【００１８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載された方法によって製造された遺伝子改変動物細胞を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列を有し、約４から約７の電荷比および約０から約−０．５の親水性を有するポリペプチドである、ミトコンドリアターゲッティングナノキャリアを提供する。少なくとも１つの実施形態では、前記ポリペプチドは、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）、
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＭＨ（配列番号２）、
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）、
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）、および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）
から選択される配列を有する。
【００２０】
本発明の別の態様は、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列を有し、約２から約４．２の電荷比および約０から約−０．２の親水性を有するポリペプチドである、葉緑体をターゲッティングするナノキャリアを提供する。少なくとも１つの実施形態では、前記ポリペプチドは、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＭＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列を有する。
【００２１】
本発明のこれらおよびその他の特徴は、以下の記載および特許請求の範囲および添付の図面から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】フルオレセイン標識されたｃＴＰ１（配列番号６）からの蛍光を示すライコムギプロトプラストの断面の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１Ｂ】フルオレセイン標識されたｃＴＰ１（配列番号６）からの蛍光および葉緑体自家蛍光の両方を示すライコムギプロトプラストの断面の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図２Ａ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ３（配列番号３）からの蛍光を示すライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図２Ｂ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図２Ｃ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ３（配列番号３）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光の両方を示すライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図３Ａ】葉緑体自家蛍光を示すタバコプロトプラストの断面の共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図３Ｂ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ３（配列番号３）からの蛍光を示すタバコプロトプラストの断面の共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図３Ｃ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すタバコプロトプラストの断面の共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図３Ｄ】葉緑体自家蛍光、フルオレセイン標識されたｍＴＰ３（配列番号３）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すタバコプロトプラストの断面の共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図４Ａ】葉緑体自家蛍光を示すタバコプロトプラストの深度方向にスタックした共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図４Ｂ】フルオレセイン標識されたｃＴＰ１（配列番号６）からの蛍光を示すタバコプロトプラストの深度方向にスタックした共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図４Ｃ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すタバコプロトプラストの深度方向にスタックした共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図４Ｄ】葉緑体自家蛍光、フルオレセイン標識されたｃＴＰ１（配列番号６）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すタバコプロトプラストの深度方向にスタックした共焦点顕微鏡画像（オリンパス）である。
【図５Ａ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ３（配列番号３）からの蛍光を示す小胞子の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図５Ｂ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ３（配列番号３）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光の両方を示す小胞子の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図６Ａ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ１（配列番号１）からの蛍光を示す小胞子の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図６Ｂ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示す小胞子の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図６Ｃ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ１（配列番号１）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光の両方を示す小胞子の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図７】フルオレセイン標識されたｍＴＰ１（配列番号１）からの蛍光を示すＭＤＣＫ（メイディン・ダービーイヌ腎臓）細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図８Ａ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ１（配列番号１）からの蛍光を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図８Ｂ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図８Ｃ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ１（配列番号１）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光の両方を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図９Ａ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ５（配列番号５）からの蛍光を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図９Ｂ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図９Ｃ】フルオレセイン標識されたｍＴＰ５（配列番号５）からの蛍光およびMitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光の両方を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１０】フルオレセイン標識されたｍＴＰ４（配列番号４）からの蛍光を示すＭＤＣＫ細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１１】リポータープラスミドｐＷＭａａｄＡＧＦＰのマップである。
【図１２】リポータープラスミドｐＷＣａａｄＡＧＦＰのマップである。
【図１３Ａ】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からの蛍光を示す、ｍＴＰ４（配列番号４）の存在下でｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミド、トランスフェクトされたライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１３Ｂ】ＧＦＰおよびMitoTracker（Ｒ） Orange両方からの蛍光を示す、ｍＴＰ４（配列番号４）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１３Ｃ】ＧＦＰおよびMitoTracker（Ｒ） Orange両方からの蛍光ならびに葉緑体自家蛍光を示す、ｍＴＰ４（配列番号４）の存在下でｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミド、トランスフェクトされたライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１４Ａ】ＧＦＰからの蛍光を示す、ｍＴＰ２（配列番号２）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１４Ｂ】MitoTracker（Ｒ） Orangeからの蛍光を示す、ｍＴＰ２（配列番号２）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１４Ｃ】ＧＦＰおよびMitoTracker（Ｒ） Orange両方からの蛍光を示す、ｍＴＰ２（配列番号２）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギプロトプラストの共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１５】ＧＦＰおよびMitoTracker（Ｒ） Orange両方からの蛍光を示す、ｍＴＰ１（配列番号１）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたＣａｃｏ−２細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１６】ＧＦＰおよびMitoTracker（Ｒ） Orange両方からの蛍光を示す、ｍＴＰ１（配列番号１）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたＦ１１１２細胞の共焦点顕微鏡画像（ニコン）である。
【図１７】ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲによって測定された、内部標準の伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）の発現のレベルと比較した（増大比）、ｍＴＰ１（配列番号１）、ｍＴＰ２（配列番号２）、ｍＴＰ３（配列番号３）、ｍＴＰ４（配列番号４）またはｍＴＰ５（配列番号５）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギ小胞子におけるＧＦＰの発現のレベル（増大比、４回の反復の平均）を示すプロットである。
【図１８】ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲによって測定された、内部標準の伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）の発現のレベルと比較した（増大比）、ｃＴＰ１（配列番号６）、ｃＴＰ２（配列番号７）、ｃＴＰ３（配列番号８）、ｃＴＰ４（配列番号９）またはｃＴＰ５（配列番号１０）の存在下、ｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギ小胞子におけるＧＦＰの発現のレベル（増大比、４回の反復の平均）を示すプロットである。
【図１９】ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲによって測定された、内部標準の伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）の発現のレベルと比較した（増大比）、ｍＴＰ１（配列番号１）、ｍＴＰ２（配列番号２）、ｍＴＰ３（配列番号３）、ｍＴＰ４（配列番号４）またはｍＴＰ５（配列番号５）の存在下、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギプロトプラストにおけるＧＦＰの発現のレベル（増大比、４回の反復の平均）を示すプロットである。
【図２０】ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲによって測定された、内部標準の伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）の発現のレベルと比較した（増大比）、ｃＴＰ１（配列番号６）、ｃＴＰ２（配列番号７）、ｃＴＰ３（配列番号８）、ｃＴＰ４（配列番号９）またはｃＴＰ５（配列番号１０）の存在下、ｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたライコムギプロトプラストにおけるＧＦＰの発現のレベル（増大比、４回の反復の平均）を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一態様は、核酸を細胞中の非核オルガネラに送達する方法を提供する。少なくとも１つの実施形態では、細胞は、非限定的に、体細胞、胚性体細胞、葉肉プロトプラストおよび小胞子を含めた植物細胞である。少なくとも１つの実施形態では、細胞は、非限定的に、哺乳類細胞を含めた動物細胞である。少なくとも１つの実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【００２４】
核酸は、細胞中の細胞内非核オルガネラに送達される。望ましい標的非核オルガネラとは、非限定的に、ゲノムＤＮＡを含めた内在性の核酸を含有し、内在性の核酸に由来する１つまたは複数の遺伝子を発現できるものである。少なくとも１つの実施形態では、オルガネラは葉緑体である。少なくとも１つの実施形態では、オルガネラはミトコンドリアである。
【００２５】
細胞は、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つのオルガネラターゲッティングナノキャリアとを含む組成物に曝露される。核酸は、非核オルガネラ中で発現され得るか、または非核オルガネラのゲノムを形質転換し得ることが望ましい。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、天然に存在する核酸であっても、人工核酸であってもよい。本明細書において、用語「人工核酸」は、人工的にまたは合成的に製造されたか、または改変された核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を意味することを意図する。少なくとも１つの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、標的非核オルガネラ中で発現可能な１つまたは複数の遺伝子を含む。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、プラスミド、人工染色体または遺伝子コンストラクトを含む。当業者ならば、適した核酸、ならびにこのような核酸を選択および調製する方法を承知しているであろう。
【００２６】
少なくとも１つの実施形態では、核酸は、マーカー遺伝子をさらに含む。本明細書において、用語「マーカー遺伝子」は、発現された場合に、存在が検出および／または測定され得る遺伝子産物をコードする遺伝子を意味することを意図する。マーカー遺伝子は、当分野で周知であり、限定されずに、存在が化学的または生化学的手段によって検出または測定され得るタンパク質をコードする遺伝子や、その物理的特性によって検出可能および／または測定可能であるタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。存在が化学的または生化学的手段によって検出または測定され得るタンパク質をコードする遺伝子として、限定されずに、酵素などをコードする遺伝子および発現が抗生物質耐性と関連している遺伝子が含まれる。その物理的特性によって検出可能および／または測定可能であるタンパク質をコードする遺伝子として、限定されずに、オワンクラゲ（Aequorea victoria）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などといった、蛍光によって検出可能であるタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。当業者には理解されるであろうが、マーカー遺伝子を用いて、マーカー遺伝子を安定に発現する細胞を選択できる。例えば、マーカー遺伝子が、抗生物質に対する耐性と関連している遺伝子である場合には、マーカー遺伝子を発現する細胞は、マーカー遺伝子の発現の非存在下では細胞にとって致死的である量の抗生物質の存在下で細胞を培養することによって選択され得る。
【００２７】
少なくとも１つの実施形態では、オルガネラターゲッティングナノキャリアは、１つまたは複数の細胞内非核オルガネラをターゲッティングできるポリペプチドである。少なくとも１つの実施形態では、ナノキャリアポリペプチドは、Ｎ末端のタンパク質局在化シグナル配列を含む。少なくとも１つの実施形態では、ナノキャリアポリペプチドは、本明細書に記載されるような細胞内非核オルガネラに特異的であるＮ末端のタンパク質局在化シグナル配列を含む。少なくとも１つの実施形態では、Ｎ末端のタンパク質局在化シグナル配列は、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列である。少なくとも１つの実施形態では、Ｎ末端のタンパク質局在化シグナル配列は、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列である。少なくとも１つの実施形態では、Ｎ末端のタンパク質局在化シグナル配列は、少なくとも１つの植物の少なくとも１つのタンパク質中に天然に見出だされる配列である。
【００２８】
理論に拘束されるものではないが、オルガネラターゲッティングナノキャリアは、核酸が非核オルガネラ内に入るのを容易にするために、非核オルガネラの膜と相互作用すると現在考えられている。オルガネラターゲッティングナノキャリアは、それ自身が非核オルガネラ内に入っても入らなくてもよく、当業者には理解されるであろうが、オルガネラターゲッティングナノキャリア自身が非核オルガネラ内へこのように入ることは、オルガネラターゲッティングナノキャリアの存在下で核酸が非核オルガネラ内に入るための必要条件ではない。
【００２９】
少なくとも１つの実施形態では、オルガネラターゲッティングナノキャリアポリペプチドはまた、細胞透過特性を有する。少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドは、１００個以下のアミノ酸残基を含む。少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドは、３５個以下のアミノ酸残基を含む。少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドは、約５〜約３５個のアミノ酸残基を含む。
【００３０】
本明細書において、ポリペプチドに関する「正味のカチオン電荷」という語は、次式を使用して、ｐＨ７．０で算出されるペプチドの正味電荷Ｚと定義される。
【００３１】
【数１】
2014522662.tif 000003
【００３２】
式中、Ｎｉは、ペプチド中のｉ番目の塩基性基（Ｎ末端アミノ基ならびにアルギニン、リシンおよびヒスチジン残基の側鎖）の数であり、ｐＫａｉは、ｉ番目の塩基性基のｐＫａ値であり、Ｎｊは、ペプチド中のｊ番目の酸性基（Ｃ末端カルボキシル基ならびにアスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基の側鎖）の数であり、ｐＫａｊは、ｊ番目の酸性基のｐＫａ値である。使用されるｐＫａ値は、以下のとおりである（Nelson, David L, Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition）。
【００３３】
【表１】
2014522662.tif 000004
【００３４】
少なくとも１つの実施形態では、オルガネラターゲッティングナノキャリアポリペプチドは、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列を含み、約２以上の正味のカチオン電荷を有する。少なくとも１つの実施形態では、ｃＴＰ配列を含むポリペプチドは、約２〜約６の正味のカチオン電荷を有する。少なくとも１つの実施形態では、ｃＴＰ配列を含むポリペプチドは、約２〜約４．２の正味のカチオン電荷を有する。
【００３５】
少なくとも１つの実施形態では、オルガネラターゲッティングナノキャリアポリペプチドは、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列を含み、約３．５以上の正味のカチオン電荷を有する。少なくとも１つの実施形態では、ｍＴＰ配列を含むポリペプチドは、約３．５〜約９．２の正味のカチオン電荷を有する。少なくとも１つの実施形態では、ｍＴＰ配列を含むポリペプチドは、約４〜約７の正味のカチオン電荷を有する。
【００３６】
本明細書において、ポリペプチドに関する「親水性」という語は、水に対する親和性または水に溶解する、水と混合するもしくは水によって湿潤する傾向と定義される。ポリペプチドの親水性は、以下のようなホップとウッズの親水性スケール（Hopp T.P., Woods K.R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78: 3824-3828）から得られる親水性値を使用して、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の親水性値の合計として算出される。
【表２】
2014522662.tif 000005
【００３７】
少なくとも１つの実施形態では、オルガネラターゲッティングナノキャリアポリペプチドは、０以下の親水性を有する。少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドは、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列を含み、約０〜約−０．６の親水性を有する。少なくとも１つの実施形態では、ｍＴＰ配列を含むポリペプチドは、約０〜約−０．５の親水性を有する。少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドは、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列を含み、約０〜約−０．５の親水性を有する。少なくとも１つの実施形態では、ｃＴＰ配列を含むポリペプチドは、約０〜約−０．２の親水性を有する。
【００３８】
少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドが、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列を含む場合には、ポリペプチドは、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）、
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＭＨ（配列番号２）、
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）、
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）、および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）
から選択される配列に対して、少なくとも約８０％の類似性、少なくとも約９０％の類似性、少なくとも約９５％の類似性または少なくとも約９９％の類似性を有する配列を有する。
【００３９】
少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドが、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列を含む場合には、ポリペプチドは、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）、
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＭＨ（配列番号２）、
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）、
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）、および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）
から選択される配列に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を有する。
【００４０】
少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドが、ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列を含む場合には、ポリペプチドは、
ＭＦＳＹＬＰＲＹＰＬＲＡＡＳＡＲＡＬＶＲＡＴＲＰＳＹＲＳＡＬＬＲＹＱ（配列番号１）；
ＭＡＡＷＭＲＳＬＦＳＰＬＫＫＬＷＩＲＭＨ（配列番号２）；
ＭＫＬＬＷＲＬＩＬＳＲＫＷ（配列番号３）；
ＭＷＷＲＲＳＲＴＮＳＬＲＹＴ（配列番号４）；および
ＭＬＦＲＬＲＲＳＶＲＬＲＧＬＬＡ（配列番号５）；
から選択される配列、またはアミノ酸残基の１つもしくは複数の欠失、付加もしくは保存的置換を含有し、その結果約５〜約３５個のアミノ酸を含むその類似配列を有する。
【００４１】
少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドが、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列を含む場合には、ポリペプチドは、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＭＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列に対して、少なくとも約８０％の類似性、少なくとも約９０％の類似性、少なくとも約９５％の類似性または少なくとも約９９％の類似性を有する配列を有する。
【００４２】
少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドが、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列を含む場合には、ポリペプチドは、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＭＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を有する。
【００４３】
少なくとも１つの実施形態では、ポリペプチドが、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列を含む場合には、ポリペプチドは、
ＭＧＧＣＶＳＴＰＫＳＣＶＧＡＫＬＲ（配列番号６）、
ＭＱＴＬＴＡＳＳＳＶＳＳＩＱＲＨＲＰＨＰＡＧＲＲＳＳＳＶＴＦＳ（配列番号７）、
ＭＫＮＰＰＳＳＦＡＳＧＦＧＩＲ（配列番号８）、
ＭＡＡＬＩＰＡＩＡＳＬＰＲＡＱＶＥＫＰＨＰＭＰＶＳＴＲＰＧＬＶＳ（配列番号９）、および
ＭＳＳＰＰＰＬＦＴＳＣＬＰＡＳＳＰＳＩＲＲＤＳＴＳＧＳＶＴＳＰＬＲ（配列番号１０）
から選択される配列、またはアミノ酸残基の１つもしくは複数の欠失、付加もしくは保存的置換を含有し、その結果約５〜約３５個のアミノ酸を含むその類似配列を有する。
【００４４】
本明細書において、用語「保存的置換」は、ペプチドの物理的および／または化学的特性が置換によって最小にしか変更されないような、ペプチド配列中のアミノ酸残基の、同様の化学的および／または物理的特性を有する異なるアミノ酸残基との置換を意味することを意図する。物理的および化学的特性の例には、限定されずに、極性、電荷、立体的な嵩高さ、ｐＫａおよび芳香族性が含まれる。例えば、グリシン、アラニンまたはバリンから選択される１つの小さい疎水性残基は、その群から選択される別の小さい疎水性残基と置換され得る。フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンから選択される１つの芳香族残基は、その群から選択される別の芳香族残基と置換され得る。アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択される１つの酸性残基は、その群から選択される別の酸性残基と置換され得る。アルギニンまたはリシンから選択されるある塩基性残基は、その群から選択される別の塩基性残基と置換され得る。セリンおよびトレオニンから選択される１つのヒドロキシル化残基は、その群から選択される別のヒドロキシル化残基と置換され得る。当業者ならば、本発明のペプチドの物理的および／または化学的特性を最小にしか変更しないと予測されるその他のアミノ酸置換を十分に承知するであろう。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載された方法および組成物によって製造される、動物細胞、植物細胞ならびに植物体およびその種子を提供する。植物細胞を遺伝子形質転換する方法、本方法によって製造された遺伝子形質転換された植物細胞から植物体を作製する方法およびこのような植物体から種子を作製する方法は、当分野で周知であり、限定されずに、植物細胞の核または葉緑体の微粒子銃による形質転換、抗生物質耐性マーカーを使用した形質転換された植物細胞の選択および形質転換された単離された小胞子カルチャーからの完全なトランスジェニック植物の再生が含まれる（Chugh, A., E. Amundsen, and F. Eudes, Translocation of cell-penetrating peptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Reports (2009) 28(5): 801-810; Lee, S.M., et al., Plastid transformation in the monocotyledonous cereal crop, rice (Oryza sativa) and transmission of transgenes to their progeny. Molecules and Cells (2006) 21(3): 401-410; Cui, C, et al., Stable chloroplast transformation of immature scutella and inflorescences in wheat (Triticum aestivum L). Acta Biochimica et Biophysica Sinica (2011) 43(4): 284-291）。当業者ならばまた、その他のこのような方法についての知識を有するであろう。さらに、動物細胞の核を遺伝的に形質転換する方法は、当分野で周知である。
【実施例】
【００４６】
本明細書に記載される本発明は、以下の具体的な実施例を参照することによってより完全に理解され得る。これらは、単に本発明の特定の実施形態を説明するために示され、その範囲を制限しようとするものではない。当業者ならば、本明細書に記載された方法および手順が改変され得、そしてこのような改変が含まれることが意図されていることを理解するであろう。これらの実施例では特定の用語が使用されているが、このような用語は非制限的であることが意図され、説明的な意味で使用されている。明細書や以下の実施例において参照されるが明確に説明されない方法は、当業者には周知である。
【実施例１】
【００４７】
オルガネラターゲッティングペプチド（ｏＴＰ）配列の同定
コムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））、イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））、トウモロコシ（ゼア・メイズ（Zea mays））およびシロイヌナズナ（アラビドプシス・タリナ（Arabidopsis thaliana））の入手可能なタンパク質配列を、ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター）ＧｅｎＢａｎｋからダウンロードした。タンパク質配列データセット内の配列冗長性を排除するために、コンピュータソフトウェアプログラムCluster Database at High Identity with Tolerance（ＣＤ−ＨＩＴ）を使用して、非冗長性配列のセットを作製した（Huang, Y., et al., CD-HIT Suite: a web server for clustering and comparing biological sequences, Bioinformatics(2010) 26(5): 680-682)。次いで、ＴａｒｇｅｔＰソフトウェアプログラムを使用してタンパク質配列を分析して、Ｎ末端タンパク質局在化シグナル配列を同定し、これらのＮ末端タンパク質局在化シグナル配列の細胞内局在特性を予測した（Emanuelsson, O., et al., Predicting Subcellular Localization of Proteins Based on their N-terminal Amino Acid Sequence, Journal of Molecular Biology (2000) 300(4): 1005-1016）。タンパク質配列データセットから、葉緑体に特異的なＮ末端タンパク質局在化シグナルペプチド配列（葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）配列）およびミトコンドリアに特異的なＮ末端タンパク質局在化シグナルペプチド配列（ミトコンドリアターゲッティングペプチド（ｍＴＰ）配列）を同定した。表１および２に要約される特定の選択基準の逐次適用によって、潜在的な細胞透過特性を有する候補シグナル配列をさらに選抜した。
【００４８】
【表３】
2014522662.tif 000006
【００４９】
【表４】
2014522662.tif 000007
【００５０】
表１および２中の数値データの最初の３つの列は、各生物に由来するＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋから得られた出発タンパク質配列の総数、ＴａｒｇｅｔＰによって予測されたｃＴＰまたはｍＴＰ配列の総数および≧９０％のＴａｒｇｅｔＰ相対信頼度を有するｃＴＰまたはｍＴＰ配列の予測される数をそれぞれ表す。数値データの残りの列は、以下の選抜基準が逐次、累積的に適用される場合に予測される配列の数を表す：３５個以下のアミノ酸の配列長、≧２．０（ｃＴＰについて）または≧３．５（ｍＴＰについて）の正味の正電荷、および≦０の平均親水性。ｍＴＰは比較的に高いアルギニン濃度を有し、従って、比較的に高い正味の負電荷を有するとわかっているので、ｍＴＰ配列の電荷閾値は、ｃＴＰ配列のものより高いものであるよう選択した（Bhushan, S., et al., The role of the N-terminal domain of chloroplast targeting peptides in organellar protein import and miss-sorting, FEBS Letters (2006) 580(16): 3966-3972）。
【実施例２】
【００５１】
ペプチドの細胞透過およびオルガネラターゲッティング特性
ペプチド合成および標識
５４種の候補オルガネラターゲッティングペプチド（ｏＴＰ）の配列（各々、上記で概説されたすべての基準を満たすものから選択された、３１種のｍＴＰ配列および２３種のｃＴＰ配列）を、当分野で周知であるように、固相Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）法を使用して合成した。各ペプチドを、蛍光による視覚的検出を容易にするために、周知の手順を使用してＮ末端でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いて標識した。
【００５２】
ライコムギ葉肉プロトプラストの単離および精製
プロトプラストの単離および精製を、無菌条件下で実施する。ライコムギ（栽培品種ＡＣ  Ａｌｔａ）種子の胚側半分を、４％次亜塩素酸塩を用いて表面滅菌し、基本ＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地、ｐＨ５．８２に播種する（Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tisssue cultures (1962) Physiol. Plant 15(3). 473-497）。６日齢の実生から得た剥皮した葉を、酵素溶液［ＣＰＷ（細胞プロトプラスト洗浄）溶液中の２％セルラーゼおよび２％マセロザイム（Yakult Honsha Co Ltd, Japan）、ｐＨ５．６（Frearson EM, Power JB, Cocking EC (1973) Dev Biol 33: 130-137）］中、２５℃、暗所で４時間インキュベートする。１００ｇ、室温で３分間の遠心分離によってプロトプラストを単離し（エッペンドルフ遠心機５８１０Ｒ、米国）、ＣＰＷ溶液で２回洗浄し、ＣＰＷ溶液中２１％スクロース上に重ねて精製する。界面に形成されるプロトプラストのバンドを注意深く回収し、ＣＰＷ溶液中に懸濁する。ＣＰＷ溶液で２回洗浄した後、プロトプラスト密度を１０６個プロトプラスト／ｍｌに調整する。
【００５３】
タバコプロトプラストの単離および精製
ベンサミアナタバコ（ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana））植物体を、６〜８週間成長させ、すべての実験に先立って２４時間暗所で維持する。プロトプラスト溶解を防ぐために、すべてのピペッティングは、広口径のピペットチップを用いてゆっくりと行う。葉を裏側で多数の浅い薄い切片に切断し、中心葉脈を取り除き、１５ｍｍペトリディッシュ中で、酵素消化溶液［ＣＰＷ（細胞プロトプラスト洗浄）溶液中、２％セルラーゼおよび２％マセロザイム（ヤクルト本社、日本）、ｐＨ５．６（Frearson EM, Power JB, Cocking EC (1973) Dev Biol 33: 130-137）]を用い、裏側を下にして、２８℃で３〜５時間インキュベートする。インキュベーション後、葉を、ピンセットを用いて穏やかに振盪して、残っているプロトプラストを放出させ、１００μΜの篩を通して培地を穏やかに濾過し、５０ｍＬ遠心管中に移す。培地を３００ｇ、４℃で５分間回転させ、懸濁液の頂部からプロトプラストの浮遊バンドを回収し、Ｗ５洗浄溶液（０．１ＭのＫＯＨを用いてｐＨ５．８に調整された、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭグルコース、０．５Ｍマンニトール）中に再懸濁し、３００ｇ、４℃で３分間回転させる。ペレットを、１５ｍＬ遠心管中で、５ｍＬの２０％マルトース上に穏やかに重ね、３００ｇで５分間遠心分離する。溶液の中央の浮遊バンドを注意深く回収し、ＭａＭｇ溶液（ＫＯＨを用いてｐＨ５．６に調整された、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％ＭＥＳ、０．４Ｍマンニトール）を用いて再懸濁し、３００ｇ、４℃で３分間回転させる。プロトプラスト懸濁液を、血球計数器を使用して１００，０００個細胞／ｍｌに希釈する。
【００５４】
小胞子の単離および精製
ユーデスら（Chugh, A., E. Amundsen, and F. Eudes, Translocation of cell-penetrating peptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Reports (2009) 28(5): 801-810）によって記載のように、表面滅菌した葯からの一核期中後期のライコムギ（栽培品種Ａｌｔａ）小胞子の単離を、ＮＰＢ−９９培地、ｐＨ７．０中で実施する。
【００５５】
ＭＤＣＫ細胞培養
５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃で、ＭＤＣＫ細胞を、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養する。１０ｃｍディッシュ上で増殖した細胞を、トリプシンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて剥離し、ＤＭＥＭ／ＦＢＳを用いて洗浄する。顕微鏡法に使用される細胞は、１２ｍｍの直径のTranswellＴＭパーミアブルサポートの先端チャンバー（コースター社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に、１０００００個の細胞を加えることによって調製する。細胞をＤＭＥＭ／ＦＢＳ中で３〜５日間培養する。
【００５６】
Ｃａｃｏ−２およびＦ１１１２細胞培養
Ｃａｃｏ−２およびＦ１１１２細胞は、５％ＣＯ２を含有する９５％加湿大気中、３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養する。FalconＴＭ２５ｃｍ２または７５ｃｍ２細胞培養フラスコ中で細胞を、コンフルエンシーに達するまで増殖させ、次いで、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを用いて剥離し、ＤＭＥＭを用いて洗浄する。
【００５７】
測光細胞イメージングに使用される調製物は、ヌンクカバーグラスチャンバー（２．５ｃｍ２）に１０００個の細胞を添加することによって調製する。細胞を上記のように、３〜７日間培養する。細胞単層を、上皮細胞生理食塩水（ｐＨ７．４）で３回すすぐ。
【００５８】
ＭＧ細胞培養
ＭＧ細胞を、５％ＣＯ２を含有する９５％加湿大気中、３７℃で、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養する。FalconＴＭ２５ｃｍ２または７５ｃｍ２細胞培養フラスコ中で細胞を、コンフルエンシーに達するまで増殖させ、次いで、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを用いて剥離し、ＤＭＥＭを用いて洗浄する。
【００５９】
測光細胞イメージングに使用される調製物は、ヌンクカバーグラスチャンバー（２．５ｃｍ２）に１０００個の細胞を添加することによって調製する。細胞を上記のように、３〜７日間培養する。細胞単層を、上皮細胞生理食塩水（ｐＨ７．４）で３回すすぐ。
【００６０】
蛍光標識したペプチドとライコムギプロトプラストのインキュベーション
葉肉プロトプラスト（５００μｌの１０６／ｍｌ調製物）を、１８０μｌのフルオレセイン標識したｍＴＰまたはｃＴＰ（１００μΜ）とともに、暗所、室温で１時間インキュベートし、続いて、ＣＰＷ溶液を用いて洗浄する。次いで、プロトプラストを、ＣＰＷ溶液中のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、シグマアルドリッチ社）（１：４）を用いて５分間処理し、続いて、ＣＰＷ溶液を用いて洗浄し、最後にＣＰＷ溶液（５００μｌ）に懸濁する。
【００６１】
蛍光標識したペプチドとタバコプロトプラストのインキュベーション
プロトプラスト懸濁液に、滅菌最適水を用いて調製したフルオレセイン標識したｍＴＰまたはｃＴＰのストック溶液（１００μΜ）を２０μΜの終濃度に添加する。各懸濁液を暗所、室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、２５％トリプシンＥＤＴＡを５分間添加し、溶液を１２０ｇで２分間遠心する。ペレットを新鮮なＭａＭｇ培地に再懸濁し、１．５μＬのMitoTracker（Ｒ）Orange CM-H2TMRos（Ｍ７５１１、インビトロジェン社）を１５分間添加し、続いて、１２０ｇで２分間遠心する。共焦点顕微鏡法（オリンパス社、ＸＹ断面およびＸＹＺ奥行きの画像の両方）用に、１％低融点寒天（２：１比の寒天対プロトプラスト懸濁液）中でプロトプラストをスライドに乗せる。
【００６２】
蛍光標識したペプチドと小胞子のインキュベーション
小胞子（５００μｌの１０６／ｍｌ調製物）を、１８０μｌのフルオレセイン標識したｍＴＰまたはｃＴＰ（１００μΜ）とともに、暗所、室温で１時間インキュベートし、続いて、ＮＰＢ−９９溶液を用いて洗浄する。次いで、小胞子をＮＰＢ−９９溶液中のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、シグマアルドリッチ社）（１：４）を用いて５分間処理し、続いて、ＮＰＢ−９９溶液を用いて洗浄し、最後に、ＮＰＢ−９９溶液（５００μｌ）中に懸濁する。
【００６３】
蛍光標識したペプチドとＭＤＣＫ細胞のインキュベーション
１２ｍｍの直径のTranswellＴＭパーミアブルサポートの先端チャンバーで培養されたＭＤＣＫ細胞を、８０μｌのフルオレセイン標識したｍＴＰまたはｃＴＰ（１００μΜ）および３２０μｌのダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに、暗所、室温で１時間インキュベートし、続いて、４００μｌのＤＭＥＭを用いて洗浄する。
【００６４】
蛍光標識したペプチドと、Ｃａｃｏ−２、Ｆ１１１２およびＭＧ細胞のインキュベーション
上皮細胞生理食塩水に種々の濃度のフルオレセイン標識したｍＴＰ（１００μΜ）を添加して、最終的な作業体積（working volume）で４００μｌを得る。上記のＣａｃｏ−２、Ｆ１１１２およびＭＧ細胞単層に添加される終濃度は、１７μΜ、９μΜおよび４μΜである。５％ＣＯ２を含有する９５％加湿大気中、３７℃、暗所で、細胞を、ペプチドとともに１時間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、細胞単層を上皮細胞生理食塩水で３回すすぎ、５００μｌの上皮細胞生理食塩水を加える。
【００６５】
共焦点顕微鏡法
共焦点顕微鏡（ニコンＣ１、ニコンカナダ社またはオリンパスFluoViewＴＭ）を使用して細胞を観察して、フルオレセイン標識したｍＴＰまたはｃＴＰ（励起波長４９０ｎｍ／放出波長５２０ｎｍ）の局在を分析する。葉緑体は、自家蛍光によって同定される。蛍光色素MitoTracker（Ｒ）Orange CM-H2TMRos（Ｍ７５１１、インビトロジェン社）を使用して、ミトコンドリアを染色する（励起波長５５４ｎｍ／放出波長５７６ｎｍ）。蛍光発光は、１０〜１５ｎｍのｚ−共焦点面から集められ、ＥＺ−Ｃ１ソフトウェアバーション３．６（ニコン社）またはオリンパスFluoViewＴＭソフトウェアバージョン２．０ｂ（オリンパス社）を使用して分析される。
【００６６】
測光細胞イメージング
細胞による標識されたペプチドの取り込みは、測光検出器／細胞イメージングシステム（ＰＴＩ）を使用して定量される。励起スキャンを行って、適切な波長におけるピークによって示されるように、取り込みが起こったかどうか、および標識していない細胞と比較して、量が用量依存的に変化するかどうかを調べる。次いで、最適励起および放出波長での時間ベースのスキャンを実施して、約２０個細胞／視野／反復を使用して総取り込みを定量する。蛍光を示す視野中の細胞の割合を計算する。
【００６７】
結果
図１Ａ〜Ｂおよび２Ａ〜Ｃに見られるように、合成され、フルオレセインで標識され、ライコムギプロトプラストとともにインキュベートされた５４種の候補ペプチドのうち、１０種のオルガネラターゲッティングペプチド（ｏＴＰ）が、細胞膜を通過し、且つ葉緑体またはミトコンドリアのいずれかに局在することがわかった。これら１０種のペプチドの配列が表３および４に提供されている。
【００６８】
【表５】
2014522662.tif 000008
【００６９】
【表６】
2014522662.tif 000009
【００７０】
標識されたｏＴＰによる細胞膜の透過および葉緑体またはミトコンドリアいずれかへの局在も、共焦点顕微鏡法（オリンパス社）を使用してタバコプロトプラストにおいて観察された。ペプチドｍＴＰ２（配列番号２）およびｍＴＰ３（配列番号３）がミトコンドリアに局在することが観察され（図３Ａ〜Ｄ）、ペプチドｃＴＰ１（配列番号６）、ｃＴＰ２（配列番号７）、ｃＴＰ４（配列番号９）およびｃＴＰ５（配列番号１０）は、葉緑体に局在することがわかった（図４Ａ〜Ｄ）。
【００７１】
細胞透過特性およびオルガネラターゲッティング特性（ｍＴＰ１〜ｍＴＰ５、表３およびｃＴＰ１〜ｃＴＰ５、表４）の両方を有すると確認された１０種のｏＴＰを、全植物再生を可能にする単離された小胞子カルチャー（葉肉プロトプラストの代替植物細胞培養系）を含めたその他の細胞種についても試験した。胚性小胞子は、多細胞になり、半数体または倍加半数体の植物体に再生する胚を生じる（Jose, M.S.-S. and N. Fernando, How microspores transform into haploid embryos: changes associated with embryogenesis induction and microspore-derived embryogenesis, Physiologia Plantarum (2008) 134(1): 1-12）。トランスジェニック植物は、核細胞透過性ペプチド小胞子トランスフェクションプロトコールを使用してコムギおよびライコムギの単離された小胞子カルチャーから作製され得る（Chugh, A., E. Amundsen, and F. Eudes, Translocation of cell-penetrating peptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Reports (2009) 28(5): 801-810）。
【００７２】
表３および４中に同定される１０種のフルオレセイン標識されたｏＴＰを、ライコムギ小胞子とともにインキュベートし、小胞子を、上記の手順を使用して共焦点顕微鏡法（ニコン社）によって観察した。図５Ａ〜Ｂおよび６Ａ〜Ｃに見られるように、１０種のｏＴＰは、単離された小胞子中に透過し得るということがわかった。
【００７３】
表３中に列挙されたフルオレセイン標識されたｍＴＰはまた、メイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞とともにインキュベートし、細胞を、上記の手順を使用して共焦点顕微鏡法（ニコン社）を使用して観察した。図７、８Ａ〜Ｃ、９Ａ〜Ｃおよび１０に見られるように、試験されたすべてのｍＴＰは、ＭＤＣＫ細胞において細胞透過特性を有する。特定のミトコンドリアをターゲッティングすることが、ｍＴＰ１（配列番号１）、ｍＴＰ３（配列番号３）およびｍＴＰ５（配列番号５）（図７、８Ａ〜Ｃ、９Ａ〜Ｃ）について観察されたが、ｍＴＰ２（配列番号２）およびｍＴＰ４（配列番号４）については、非特異的ミトコンドリア局在が観察された（図１０）。
【００７４】
表３中に列挙されたフルオレセイン標識されたｍＴＰはまた、Ｃａｃｏ−２（ヒト結腸上皮細胞株）、Ｆ１１１２（ウシ結腸細胞株）およびＭＧ（ウシ乳腺）細胞とともにインキュベートした。標識されたペプチドの取り込みは、上記の手順を使用して、測光細胞イメージングによって測定した。正しいシグナルが検出された場合には、視野中で、すべての細胞が蛍光性であった。表５は、細胞が、種々の濃度（４μΜ、９μΜまたは１７μΜ）の標識されたペプチドに曝露される場合の、標識されたペプチドの取り込みの結果を示す。細胞株のバックグラウンド自家蛍光は、約１×１０５カウント／秒である。表６は、１７μΜの濃度の標識されたペプチドに対して曝露された細胞において測定されたペプチドの平均濃度を示す。
【００７５】
【表７】
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【００７６】
【表８】
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【実施例３】
【００７７】
ペプチドのＤＮＡ結合特性
細胞透過特性およびオルガネラターゲッティング特性の両方を有すると確認された１０種の非標識ｏＴＰ配列（表３および４）を、非共有的に核酸と結合するその能力について、ゲル移動度シフトアッセイおよびヌクレアーゼ保護アッセイを使用して試験した。これらのアッセイの結果が、以下の表７に示されている。
【００７８】
ゲル移動度シフトアッセイ
ゲル移動度シフトアッセイを使用して、プラスミドＤＮＡと結合し、電気泳動の間にそれをシフトさせるのに必要な最小ペプチド濃度を決定する。精製された直鎖化されたプラスミドＤＮＡ（１００ｎｇの直鎖状二本鎖ＤＮＡ、６．８ｋｂ）を、電気泳動の際にプラスミドＤＮＡの完全なシフトが観察されるまで、算出された漸増的なペプチド：ＤＮＡ電荷比（１：１、２：１、３：１、４：１、５：１など）に従って、表３および４に列挙される１０種のｏＴＰ各々の漸増濃度と混合する。ＤＮＡを、滅菌水で１００ｎｇ／μｌの終濃度に調製する。各反応は、２５μｌの最終体積を有し、複合体形成のために３０分間インキュベートし、臭化エチジウムを用いて染色された１％アガロースゲルでの電気泳動に付す。
【００７９】
ヌクレアーゼ保護アッセイ
表３および４に列挙された１０種のｏＴＰを、ゲル移動度シフトアッセイについて記載したようにプラスミドＤＮＡと混合した。ヌクレアーゼ保護アッセイのために、混合物体積（５０μｌ）に、５μｌのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅセット、キアゲン社（米国カリフォルニア州バレンシア）を添加する。混合物を、室温で、１５分間インキュベートし、次いで、氷上で５分間インキュベートする。市販のＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット、キアゲン社）を用いて、プラスミド−ペプチド解離およびプラスミド精製を実施する。ＤＮＡを滅菌水で溶出させる。６μｌのアリコートを、１％アガロースゲル電気泳動に付す。
【００８０】
【表９】
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【００８１】
結果
表７に示されるように、５種のｍＴＰペプチドのうち４種が、電気泳動の際にＤＮＡの移動度シフトを引き起こし、これは、ＤＮＡとの結合が起こっていたことを示す。表７中に列挙される残りのｏＴＰは、試験されたペプチド：ＤＮＡ比では移動度シフトを示さなかった。さらに、ヌクレアーゼ保護アッセイの結果は、≧２．９のカチオン電荷を有するオルガネラターゲッティングペプチドは、ＤＮＡをヌクレアーゼ分解から保護したということを示す。このデータは、≧２．９のカチオン電荷を有するｏＴＰがＤＮＡと非共有的に結合する能力を有することを示し、このようなペプチドが、核酸を特定の植物細胞オルガネラに送達するために利用され得るということを示唆する。
【実施例４】
【００８２】
ペプチドのＤＮＡ送達特性
表３および４中に列挙される１０種の非標識ｏＴＰを、ｏＴＰ−ＧＦＰリポーターコンストラクトのトランスフェクションアッセイを使用して、生物学的に活性なＤＮＡを葉緑体またはミトコンドリアに送達するその能力について試験した。ｏＴＰを、オワンクラゲ（エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクトと混合して、複合体を形成する。形成されたプラスミド−ペプチドナノ複合体を、ライコムギ葉肉プロトプラスト、小胞子あるいはＭＤＣＫ、Ｃａｃｏ−２、Ｆ１１１２またはＭＧ細胞とともにインキュベートする。共焦点顕微鏡法および／または測光細胞イメージングによる蛍光シグナルの検出は、ｄｓＤＮＡがオルガネラ中に輸送されたことおよびＧＦＰの一過性の発現が起こったことを示す。さらに、ｇｆｐのｍＲＮＡ量を決定するために、遺伝子発現が、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して測定され得る。
【００８３】
ミトコンドリアにおける発現のためのｄｓＤＮＡコンストラクト
コムギミトコンドリアのａａｄＡ１６ＧＦＰリポータープラスミド（ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰ、図１１）は、４５８７塩基対のコムギ特異的ミトコンドリア形質転換ベクターであり、挿入部分を、コムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））ミトコンドリアゲノム中で３回反復されている、ｔｒｎｆＭおよびｒｒｎ１８遺伝子クラスター間の４番目の反復領域中にターゲッティングする。挿入部位は、コムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））ミトコンドリアゲノム中のヌクレオチド３００８０５〜３００８７８および３００８８０〜３０２８３４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ００８９８２．１）の位置である。マルチクローニングサイトは、ｔｒｎｆＭターゲット挿入配列の後ろに導入される。選択マーカー遺伝子は、オルガネラコドン特異的ａａｄ−ｇｆｐ融合遺伝子であり、これは、ａａｄＡ誘導体によるスペクチノマイシン耐性およびＧＦＰ蛍光による視覚的検出の二重選択方法を容易にする（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＸ３９４８６;Khan and Maliga, Nat Biotechnol. (1999 Sep) 17(9): 910-5）。選択マーカー遺伝子は、コムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））ミトコンドリアａｔｐＡ遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４３８７．１）によって制御される。ａａｄ−ｇｆｐ融合遺伝子は、ヌクレオチド６２８７１〜６２５６５の位置のコムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））ミトコンドリアゲノムに由来するＴｐｓｂＡターミネーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ００８９８２．１）で終結される。
【００８４】
葉緑体における発現のためのｄｓＤＮＡコンストラクト
コムギ葉緑体ａａｄＡ１６ＧＦＰリポータープラスミド（ｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰ、図１２）は、４２１２塩基対のコムギ特異的プラスチド形質転換ベクターであり、挿入部分を、ヌクレオチド９２８５０〜９３７２７および９３７９４〜９４６７１の位置のコムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））プラスチドゲノムのｔｒｎｌ−ｔｒｎＡ逆位反復領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４２２４０．３）中にターゲッティングする。マルチクローニングサイトは、ｔｒｎｌターゲット挿入配列の後ろに導入される。選択マーカー遺伝子は、オルガネラコドン特異的ａａｄ−ｇｆｐ融合遺伝子であり、ａａｄＡ誘導体によるスペクチノマイシン耐性およびＧＦＰ蛍光による視覚的検出の二重選択方法を容易にする（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＸ３９４８６；Khan and Maliga, Nat Biotechnol. (1999 Sep) 17(9): 910-5）。選択マーカー遺伝子は、ヌクレオチド１２８２〜１１５３の位置のコムギ（トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum））プラスチドゲノムプロモーター（ｐｓｂＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４２２４０．３）によって制御される。ａａｄ−ｇｆｐ融合遺伝子は、葉緑体形質転換ベクターｐＶＳＲ３２６ヌクレオチド４０１４〜４３８７に由来するイネｐｓｂＡターミネーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５２７４８５．１）で終結される。
【００８５】
ｇｆｐリポーターを用いるプロトプラスト形質転換
ｄｓＤＮＡコンストラクト（ミトコンドリア発現のためのｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰまたは葉緑体における発現のためのｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰ）を、１００μｌの最終体積のＣＰＷ溶液中で、ｍＴＰ（ミトコンドリア発現のため）またはｃＴＰ（葉緑体における発現のため）と組み合わせる。ｍＴＰ１（配列番号１）、ｍＴＰ２（配列番号２）、ｍＴＰ３（配列番号３）またはｍＴＰ５（配列番号５）を使用する実験のために、ペプチド（１００ｎｇから、ゲル移動度シフトアッセイにおいてＤＮＡシフトを引き起こすのに必要な濃度の４倍にスケールアップされた（表７））を、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰコンストラクト（５μｇ）と組み合わせる。残りのｏＴＰを使用する実験のためには、ペプチド（３０ｇ）を適当なｄｓＤＮＡコンストラクト（１．５ｇ）と組み合わせる。混合物を室温で１０分間インキュベートし、次いで、単離されたライコムギ葉肉プロトプラスト（実施例２に記載の通りに調製された、５００μｌ、１０６個プロトプラスト／ｍｌ）とともに、暗所、室温で１時間インキュベートする。ＣＰＷ溶液（５００μｌ）を添加し、混合物を暗所で２４時間インキュベートする。MitoTracker（Ｒ）Orange染色を使用してミトコンドリアを可視化し、および葉緑素自家蛍光を使用して葉緑体を可視化して、実施例２に記載されるように共焦点顕微鏡法を使用して細胞を撮像する。
【００８６】
ｇｆｐリポーターを用いる小胞子形質転換
１００μｌの最終体積のＮＢＰ−９９溶液中の、上記のプロトプラスト形質転換実験において使用される量で、ｄｓＤＮＡコンストラクト（ミトコンドリア発現のためのｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰまたは葉緑体における発現のためのｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰ）を、ｍＴＰ（ミトコンドリア発現のため）またはｃＴＰ（葉緑体における発現のため）と組み合わせる。混合物を室温で１０分間インキュベートし、次いで、単離されたライコムギ小胞子（実施例２に記載の通りに調製された、５００μｌ、１０６個小胞子／ｍｌ）とともに、暗所、室温で１時間インキュベートする。ＮＢＰ−９９溶液（５００μｌ）を添加し、混合物を暗所で２４時間インキュベートする。MitoTracker（Ｒ）Orange染色を使用してミトコンドリアを可視化し、実施例２に記載されるように共焦点顕微鏡法を使用して細胞を撮像する。
【００８７】
ｇｆｐリポーターを用いるＭＤＣＫ細胞形質転換
１００μｌの最終体積のダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の、上記のプロトプラスト形質転換実験において使用される量で、ｄｓＤＮＡコンストラクト（ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰ）を、ｍＴＰと組み合わせる。混合物を室温で１０分間インキュベートし、次いで、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃で、３００μｌのＤＭＥＭ中でＭＤＣＫ細胞（実施例２に記載の通りに調製された）とともに２４時間インキュベートする。MitoTracker（Ｒ）Orange染色を使用してミトコンドリアを可視化し、実施例２に記載されるように共焦点顕微鏡法を使用して細胞を撮像する。
【００８８】
ｇｆｐリポーターを用いるＣａｃｏ−２、Ｆ１１１２およびＭＧ細胞形質転換
ｄｓＤＮＡコンストラクト（ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰ、１００μｌのストック溶液、５μｇ）を、ｍＴＰ１（配列番号１）またはｍＴＰ４（配列番号４）（１００μｌの非標識ストック、５００μｇ）と組み合わせ、３７℃で１５分間インキュベートする。混合物に、８００μｌのＤＭＥＭのアリコートを添加し、次いで、５００μｌの完全培地を有する各細胞単層（実施例２に記載の通りに調製された）に１００μｌのこの混合物を添加する。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃で２４時間〜７２時間インキュベートする。ＧＦＰリポーターの取り込みおよび発現を、実施例２に記載されるように、測光検出器／細胞イメージングシステム（ＰＴＩ）を使用して４０時間目に測定する。また、MitoTracker（Ｒ）Orange染色を使用してミトコンドリアを可視化し、実施例２に記載されるように共焦点顕微鏡法を使用して細胞を撮像する。
【００８９】
トランスフェクトされた小胞子からのＲＮＡ抽出
組織を解凍しながら、清浄化したセラミックビーズを使用し、激しく振盪して小胞子を破壊する。ＲＬＴバッファー／Ｂ−Ｍｅ（４５０μｌ）を添加し、サンプルをボルテックス処理する。サンプルを５５℃で１分間加熱し、再度ボルテックス処理する。プロトコール中にオンカラムのＤＮａｓｅＩ消化を組み込んでRNeasyＴＭプラントミニキット（キアゲン社）を使用してＲＮＡを抽出する。最終溶出体積は、４０μｌとする。アガロースゲルクロマトグラフィー（ＲＮＡが無傷であることを確認するため）および分光光度測定（定量のため）の両方を使用してＲＮＡを評価する。
【００９０】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡは、ファーストストランド合成キット（インビトロジェン社）を使用して作製する。各サンプルにＲＮＡ（１μｇ）を添加し、反応混合物の体積を、２０μｌから３０μｌに増大する点を除いて合成のための製造業者のプロトコールに従う。すべての試薬を含有するが、ＲＮＡを含有しないｎｅｇＲＴサンプルを、陰性対照としてｃＤＮＡ合成に含める。
【００９１】
リアルタイムＰＣＲ
伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）（内部対照）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（供試）遺伝子の両方について標準曲線を作成する。ＥＦ１ａ曲線は、各ｃＤＮＡサンプル（ｎｅｇＲＴ対照を含まない）の６μｌをプールし、次いで、さらに５回の希釈について０．５の段階希釈を実施することによって作成する。ＧＦＰ標準曲線は、トランスフェクションに使用されるプラスミドＤＮＡを使用して作成する（１３ｎｇ／μｌプラスミド（そのうち３μｌ（４０ｎｇ）がＰＣＲ反応に使用される）、さらに５種のサンプルとして０．５の希釈シリーズ）。
【００９２】
リアルタイムＰＣＲ反応を、２０μｌの反応体積でQuantiTectＴＭSYBRＴＭグリーンＰＣＲマスターミックス（キアゲン社）を使用して実施する。各サンプルは、３反復で反応させ、各反応に３μｌの鋳型を使用する。サイクルは、以下のとおりに実施する。９５℃１５分、（９４℃１５秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒）を４０回。ＰＣＲ反応が完了した後に、解離曲線を実施（run）する。各サンプルについて３つのデータ点を平均し、標準偏差を算出する。標準曲線は、各サンプル中のＤＮＡの量のｌｏｇに対して平均ＣＴ値をプロットすることによって作成し、その結果、各プライマーのＰＣＲ効率が評価され得る。各プライマーセットは同程度の効率で増幅するので、ＣＴ値を直接的に比較できる。
【００９３】
結果
図１３Ａ〜Ｃおよび１４Ａ〜Ｃに見られるように、ｍＴＰ４（配列番号４）およびｍＴＰ２（配列番号２）は、ライコムギ葉肉プロトプラストのミトコンドリアのトランスフェクションを媒介し得る。共焦点顕微鏡法によって、ミトコンドリアは、緑色蛍光を発すると観察され、これは、ｍＴＰトランスフェクトされたプロトプラスト中のミトコンドリアがＧＦＰを発現していたことを示す。ＧＦＰの発現はまた、実施例２に記載されるとおりに実施された測光細胞イメージングによって、ｍＴＰ１（配列番号１）およびｍＴＰ４（配列番号４）の存在下でミトコンドリアｇｆｐリポーターコンストラクトを用いてトランスフェクトされたＣａｃｏ−２、Ｆ１１１２およびＭＧ細胞のミトコンドリアにおいて検出された。しかし、表８に見られるように、ｍＴＰ４（配列番号４）の存在下でのトランスフェクションの際に観察されたシグナル強度は弱く、蛍光は観察されなかった。対照的に、ｍＴＰ１（配列番号１）の存在下でのトランスフェクションの際に観察されたシグナル強度は、ｍＴＰ４（配列番号４）について観察されたものよりも高く、すべての細胞において蛍光が観察された。トランスフェクトされたＣａｃｏ−２およびＦ１１１２細胞の共焦点イメージングによって、ミトコンドリアへのｇｆｐ発現の局在が確認された（図１５および１６）。
【００９４】
【表１０】
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【００９５】
さらに、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析によって、ＧＦＰが、ｍＴＰ１（配列番号１）、ｍＴＰ２（配列番号２）、ｍＴＰ３（配列番号３）、ｍＴＰ４（配列番号４）またはｍＴＰ５（配列番号５）の存在下でｇｆｐリポーターコンストラクトを用いてトランスフェクトされた小胞子およびプロトプラストのミトコンドリアによって発現されることが確認された。トランスフェクトされたミトコンドリアからの正規化されたｇｆｐのｍＲＮＡ量は、内部対照の伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）ｍＲＮＡの量と比較して、小胞子において０．１〜０．７倍の増大（４反復実験の平均）（図１７）およびプロトプラストにおいて３２〜１５９倍の増大（４反復実験の平均）（図１９）を示した。さらに、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析によって、ＧＦＰが、ｃＴＰ１（配列番号６）、ｃＴＰ２（配列番号７）、ｃＴＰ３（配列番号８）、ｃＴＰ４（配列番号９）またはｃＴＰ５（配列番号１０）の存在下でｇｆｐリポーターコンストラクトを用いて各々トランスフェクトされた、小胞子のプロプラスチドおよびプロトプラストの葉緑体によって発現されることが確認された。内部対照の伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）ｍＲＮＡの量と比較して、トランスフェクトされたプロプラスチドからの正規化されたｇｆｐのｍＲＮＡ量は、小胞子において０．１０〜０．３７倍の増大（４反復実験の平均）（図１８）を示し、トランスフェクトされた葉緑体からの正規化されたｇｆｐのｍＲＮＡ量は、プロトプラストにおいて２４〜１２２倍の増大（４反復実験の平均）（図２０）を示した。
【実施例５】
【００９６】
形質転換された小胞子からの植物体の繁殖
ライコムギ栽培品種Ｕｌｔｉｍａから単離された小胞子を、ｍＴＰ１（配列番号１）の存在下でミトコンドリアリポータープラスミドＷＭａａｄＡＧＦＰ（実施例４）を用いてか、またはｃＴＰ１（配列番号６）の存在下で葉緑体リポータープラスミドＷＣａａｄＡＧＦＰ（実施例４）を用いてトランスフェクトした。形質転換された小胞子から植物体を再生させ、スペクチノマイシン選択下で栽培し、定量的ＰＣＲによって特性決定して、トランスフェクトされたミトコンドリアまたは葉緑体における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＤＮＡのコピー数を測定した。ａａｄＡ−ｇｆｐトランスフェクションについて陽性であった植物を、スペクチノマイシン選択圧を含まない土壌で栽培して、野生型への復帰について試験した。生じた植物の特徴が、以下の表９に示されている。
【００９７】
小胞子単離
ラミナーフローフード中で、ライコムギ栽培品種Ｕｌｔｉｍａの芒をハサミで回収する。穂（小胞子単離のための８つの穂および子房を供給するための４つの穂）を、一定に撹拌しながら、１０％漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）を用いて３分間滅菌し、滅菌再蒸留水を用いて１分間４回すすぐ。外側苞穎を除去し、８つの穂から得られた小花を無菌的に解体し、５０ｍｌの４℃の濾過滅菌した抽出溶液（０．４Ｍマンニトール、ＧＥＭ（単子葉胚発芽）マクロソルト（macrosalts）（F. Eudes, S. Acharya, A. Laroche, LB. Selinger & K.-J. Cheng. A novel method to induce direct somatic embryogenesis, secondary embryogenesis and regeneration of fertile green cereal plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (2003) 73: 147-157）、１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および１００ｍＭのＦｅ−ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）液体培地を含有する、滅菌、冷蔵した１１０ｍｌワーリングブレンダーカップ（ＶＷＲインターナショナル社、５８９８３−０９３番）に移す。小花を、低速（１８０００ｒｐｍ）で７秒間、２回ブレンダー処理する。懸濁液を１ｍｍの篩、次いで、１００μｍの滅菌メッシュ（ＶＷＲインターナショナル社、ＣＡ２１００８−９５０番）を通して、２つの５０ｍｌ遠心管（各２５ｍｌ）中に注ぎ入れる。４℃の５０ｍｌの抽出溶液を用いてブレンダーカップをすすぎ、１００μｍメッシュを通して注ぎ、５０ｍｌの試験管中の第１のアリコートに加える。次いで、スイング型ローターを使用して遠心分離（１００×ｇ、５分間、４℃）によって細胞をペレットにする。上清を注ぎ捨て、小胞子ペレットを１つの５０ｍｌ試験管中に合わせ、５０ｍｌの冷抽出溶液に再懸濁する。細胞を、遠心分離（１００×ｇ、５分間、４℃）を用いて再度ペレットにし、上清を注ぎ捨て、ペレットを１５ｍｌの試験管に移す（およそ５ｍｌ）。ペレットを、１５ｍｌの誘導培地（２μΜのグルタチオンおよび１０ｍｇ／ｌのLarcollＴＭ（アラビノガラクタン）を補給したＮＰＢ−９９溶液）に再懸濁し、洗浄し、上記と同一条件下で遠心分離する。上清を注ぎ捨て、ペレットを、５〜６ｍｌの２０％マルトースに再懸濁し、次いで、１ｍＬの誘導培地をマルトースの上に注意深く重ね、試験管を、１００ｇで１３分間遠心分離する（マルトース勾配精製）。界面に小胞子のバンドが形成され、これを新しい１５ｍｌの試験管中に回収する。試験管を誘導培地で満たし、１５０ｇで５分間再度遠心分離する。上清を注ぎ捨て、細胞を１．４ｍｌの総体積に懸濁する。各小胞子抽出および精製について、血球計数器を使用して細胞の濃度を決定する。各小胞子抽出によって、１５〜２０実験単位の作製が可能であった。
【００９８】
ｄｓＤＮＡ−ｏＴＰ複合体の調製
オルガネラトランスフェクションのために、プラスミドｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰおよびｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰ（実施例４）を用いてミディプレップ（midi-prep）を実施する。ＮＥＢ（ニューイングランドバイオラボ社）使用説明書にしたがって、ｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰを、ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用して二重消化し、ｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰを、ＡａｔＩＩおよびＸｍｎＩ制限酵素を使用して二重消化する。遺伝子カセット（ｄｓＤＮＡ）をゲル精製する。
【００９９】
ミトコンドリアトランスフェクションのために、１．５μｇのｐＷＭａａｄＡ１６ＧＦＰのｄｓＤＮＡおよび７．５μｇのｍＴＰ１（配列番号１）を、１．５ｍＬ微量遠心管中で１００μＬ中に一緒に混合する。葉緑体トランスフェクションのために、１．５μｇのｐＷＣａａｄＡ１６ＧＦＰのｄｓＤＮＡおよび３０μｇのｃＴＰ１（配列番号６）を、１．５ｍＬ微量遠心管中で２００μＬ中に一緒に混合する。複合体を、使用前に室温で１５分間インキュベートする。
【０１００】
小胞子のトランスフェクション
小胞子にｄｓＤＮＡ−ｏＴＰ複合体（１００または２００μｌ）を添加し、穏やかに混合し、複合体とともに１５分間インキュベートする。１００μｌの誘導培地（２μΜグルタチオンおよび１０ｍｇ／ｌのLarcollＴＭ（アラビノガラクタン）を補給したＮＰＢ−９９溶液）を添加し、混合物を室温で４５分間インキュベートする。トランスフェクトされた小胞子を、誘導培地を用いて１回洗浄し、遠心分離し、上清を除去する。ＤＮＡおよびナノキャリアを含有しない対照処理を、精製された小胞子の各バッチからの２つの実験単位に適用する。小胞子培養は、F. Eudes and E. Amundsen, Isolated microspore culture of Canadian 6 tritical cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (2005) 82: 233-241に記載のとおりに再開する。
【０１０１】
形質転換された植物体の再生
トランスフェクトされた小胞子を、１０％FicollＴＭを有する３．３ｍｌの誘導培地を各々含有する３５×１０ｍｍペトリディッシュ中にピペットで入れる（０．２ｍｌ）。ライコムギ栽培品種Ｕｌｔｉｍａ植物体から直接とられた滅菌された穂から得られた４つまたは５つの子房を、小胞子を含有する各ディッシュに加える。ディッシュを、ParafilmＴＭで密閉し、滅菌蒸留水を含有する開放した５０ｍｍのペトリディッシュの周りの１５０ｍｍのペトリディッシュ中に入れる。１５０ｍｍのディッシュもParafilmＴＭで密閉し、暗所、２５℃で２０〜３０日間インキュベートする。０．５ｍｍより長い胚をペトリディッシュから回収し、ＧＥＭ培地（１０ｃｍのペトリディッシュ中２０ｍｌ）上に蒔く（F. Eudes, S. Acharya, A. Laroche, L.B. Selinger & K.-J. Cheng. A novel method to induce direct somatic embryogenesis, secondary embryogenesis and regeneration of fertile green cereal plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (2003) 73: 147-157）。ペトリディッシュをParafilmＴＭで再度密閉し、１６℃の室温で、８０μΜ・ｍ−２ｓ−１を送達するシルバニア社Gro-luxＴＭ広域スペクトラム電球（４０ワット）（１６時間明期間）の３０ｃｍ下に置く。胚が緑色になったら、同一条件下で、MagentaＴＭ容器（ＶＷＲインターナショナル社）中の５０ｍｌの発根培地（F. Eudes, S. Acharya, A. Laroche, L.B. Selinger & K -J. Cheng. A novel method to induce direct somatic embryogenesis, secondary embryogenesis and regeneration of fertile green cereal plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (2003) 73: 147-157）上に無菌的に移す。植物体が２〜３葉期に達し十分な根の成長に達したら、土壌（４×８ポッドSpencer-Lemaire RootrainerＴＭ、スペンサー・ルメール社、エドモントン）に移植し、母植物体と同一条件下の栽培キャビネット中に入れる。開花の２週間後、種子セットについて調べることによって倍数性レベルを推定する。
【０１０２】
抗生物質選抜
小胞子カルチャーの選択されたバッチおよび土壌で成長した緑色植物体にスペクチノマイシン選択を適用する。バッチ１では、発生中の胚を、２００μｌのPPMＴＭを補給した液体ＧＥＭ培養培地２００ｍｌを使用して、３週間目にRITAＴＭボックス半自動浸漬培養システムに移し、２００または４００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを添加する。バッチ２では、小胞子を、培養の開始時に、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンの第１の用量に付す。３〜４週間目に、発生中の多細胞構造を、RITAＴＭボックス半自動培養システムに移し、スペクチノマイシン濃度を２００ｍｇ／Ｌに高める。２週間後、培養培地を、２００μｌのPPMＴＭを補給した新鮮な液体ＧＥＭ（２００ｍｌ）と置換し、４００ｍｇ／Ｌでスペクチノマイシンの第３の用量を適用する。高選択圧でさらに２週間後、発芽した（緑色および斑入り）小植物を、RootrainerＴＭに移す。スペクチノマイシン選択圧は、バッチ１および２に由来する植物体の土壌には適用しない。
【０１０３】
その後のバッチでは、小胞子を、培養の開始時に５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンの第１の用量に付す。３〜４週間目に、発生中の多細胞構造を、RITAＴＭボックス半自動培養システムに移し、スペクチノマイシン濃度を１００ｍｇ／Ｌに高める。２週間後、培養培地を、２００μｌのPPMＴＭを補給した新鮮な液体ＧＥＭ（２００ｍｌ）と置換し、スペクチノマイシンの第３の用量を適用する（２００ｍｇ／Ｌ）。さらに２週間後、発芽した（緑色および斑入り）小植物を、RootrainerＴＭに移す。次いで、スペクチノマイシン選択圧を、４００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンの濃度で土壌において適用する。土壌で栽培された植物体に、４００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン溶液を用いて底部から継続的に給水する。
【０１０４】
再生した緑色植物体からのゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ抽出
組織を解凍しながら、清浄化したセラミックビーズと激しい振盪とを用いて葉サンプルを破壊する。ＲＬＴバッファー／Ｂ−Ｍｅ（４５０μｌ）を添加し、サンプルをボルテックス処理する。サンプルを５５℃で１分間加熱し、再度ボルテックス処理する。プロトコール中にオンカラムのＤＮａｓｅＩ消化を加えて、AllPrepＴＭＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（５０）（キアゲン社）を使用してＲＮＡを抽出する。最終溶出体積は、４０μｌとする。アガロースゲルクロマトグラフィー（ＲＮＡが無傷であることを確認するため）および分光光度測定（ＤＮＡおよびＲＮＡの定量化のため）の両方を使用してＲＮＡを評価する。
【０１０５】
コピー数の決定のためのSYBRＴＭグリーンｑＰＣＲアッセイ
SYBRＴＭグリーンリアルタイムＰＣＲアッセイを、実施例４に記載されるように実施する。決定したＣＴ値を、そのプライマーセットの標準曲線にフィッティングし、曲線式を使用して、投入ＤＮＡに対してコピー数を算出する。標準曲線は、１／１０希釈の６サンプルのシリーズにミトコンドリアまたは葉緑体リポータープラスミド（実施例４）を希釈することによって作成する。ミトコンドリアリポータープラスミドの標準曲線中のコピー数は、８８２，３５２／μｌ〜０．８／μｌの範囲であった。葉緑体リポータープラスミドの標準曲線中のコピー数は、２３４，０４２／μｌ〜０．２／μｌの範囲であった。すべてのゲノムＤＮＡサンプルを、分光光度計によって定量し、リアルタイムのためのサンプルは、すべての反応が、２ＸSYBRＴＭグリーンQuantiTectＴＭマスターミックス（キアゲン社）（１２．５μｌ）、Ｇｆｐ４ＬのＦｗｄプライマー（１０μΜ、１μｌ）、Ｇｆｐ４ＲのＲｅｖプライマー（１０μΜ、１μｌ）およびＤＮＡ（２００ｎｇ、１１μｌ）を含有するように調製する。すべての生体サンプルは３反復で実施する。サイクルは、以下のとおりに実施する。９５℃１５分、（９５℃１５秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）を３５回。得られたＣＴ値の平均を取る。各３反復のサンプルの標準偏差を算出し、異常値を破棄する。各サンプル中のＤＮＡ量のｌｏｇに対して平均ＣＴ値をプロットすることによって標準曲線を作成する。平均ＣＴ値を、各プラスミドの回帰曲線によって作成した式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）にフィッティングする。ミトコンドリアリポーター標準曲線について、方程式は、ｙ＝−３．４８４５ｘ＋４３．７４２であり、Ｒ２の値は、０．９９２である。葉緑体標準曲線について、方程式は、ｙ＝−３．２５６ｘ＋４５．４６９であり、Ｒ２の値は、０．９７０５である。次いで、得られたｌｏｇ値を、実際のコピー数に変換し、この値を、各２００ｎｇのサンプル中のバックグラウンドＤＮＡの総コピー数に対して比較する。２００ｎｇ中のコピー数は、次式を使用して算出される。
Ｕｌｔｉｍａのｂｐ数（１９，０００Ｍｂ）×６６０ｇ／モル（ｂｐの重量）×１０９ｎｇ／ｇ。
【０１０６】
コピー数の決定のためのＴａｑＭａｎのｑＰＣＲアッセイ
リアルタイムＰＣＲ反応は、７９００ＨＴ−ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）およびキアゲン化学を使用して９６ウェルプレートで実施する。ｇｆｐ遺伝子のためのＴａｑＭａｎプローブは、FAMＴＭを用いて５’末端で標識し、ｐＫＡＢＡ１遺伝子のプローブは、VICＴＭを用いて５’末端で標識する。両プローブは、クエンチャー分子としてテトラメチルローダミン（TAMRAＴＭ）を用いて３’末端で標識する。各反応について、２μｌのＤＮＡ、１２．５μｌの２ＸＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ））、０．４μΜのｇｆｐおよびＰＫＡＢＡ１プライマーならびに各二重標識プローブの２００ｎＭを添加し、Ｈ２Ｏを用いて、反応を２５μｌの最終体積にする。ＰＣＲを、以下のとおりに実施する。９５℃１０分、９５℃１分と５８℃１分とを４０サイクル。すべての反応は２反復で実施し、２つの生体サンプルでくり返す。コピー数は、式２−ΔΔＣＴを使用して算出する。較正サンプルのΔＣＴ値に対する調整分−１によって、内在性の対照遺伝子（ＰＫＡＢＡ）は、ライコムギに対するコムギゲノムＡおよびＢの寄与分にのみ相当するという事実を反映する。ライゲノムＲは、この遺伝子を含有しない（半数体ゲノムの２／３の染色体セットは、ＰＫＡＢＡ遺伝子を有する）。標準曲線はまた、標的鋳型およびゲノムＤＮＡの段階希釈ならびにゲノムＤＮＡによる標的遺伝子希釈によって作る。マルチプレックス反応における各プライマーセットのＰＣＲ効率、プライマーのダイナミックレンジおよびプライマー競合の有無を求める。各ｑＰＣＲ実施時にはキャリブレーターサンプルも含まれる。
【０１０７】
結果
トランスフェクトされた小胞子から生じた植物体の一覧が、表９に提供されている。緑色、アルビノおよび斑入り植物体が生じた。胚が受精後３週間までスペクチノマイシンに曝露されなかったバッチ１では、再生した植物体のうち斑入り表現型が多く観察された。その後のバッチは主に、アルビノおよび緑色植物体が混在するものを生じた。バッチ１および２に由来する半数体および倍加半数体ライコムギ植物体を、土壌（RootrainerＴＭ）への最初の移植の時点でｑＰＣＲによって特性分析した。バッチ１および２に由来する少数のライコムギ株は、ｑＰＣＲ（SYBRＴＭグリーン法またはＴａｑＭａｎ法のいずれかを使用する）によって、オルガネラゲノム中へのリポーター遺伝子の組込みの陽性指標を有すると確認された。バッチ２に由来する植物体を、スペクチノマイシン選択圧の非存在下で、土壌で栽培したところ、ｑＰＣＲによって測定されるコピー数の減少および細胞質はその時点でヘテロプラストミック（heteroplastomic）のままであったという証拠から、１ヶ月後に野生型へ復帰したとわかった。
【０１０８】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【０１０９】
本明細書に記載された本発明の実施形態は、例示するものであって、限定するものではない。当業者には容易に明らかである種々の改変が含まれることを意図する。特許請求の範囲は、本明細書に記載された実施形態によって制限されるものではなく、全体として明細書と矛盾しない最も広い解釈が与えられなければならない。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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