(57)【要約】  本発明は、細胞培養アッセイに関する。本発明は、基板と；基板の内部中央に沿って形成され、少なくとも１つ以上が連続的に配置され、内部には、スキャフォルドが流動するスキャフォルドチャネルと；スキャフォルドチャネルの両側または一側にそれぞれ形成され、内部には細胞が流動する微細流体チャネルと；を含み、微細流体チャネル及びスキャフォルドチャネルの境界部の天井面及び底面のうち少なくともいずれか１つには、スキャフォルドが微細流体チャネルに漏出されることを防止するための漏出防止部が形成される。このような本発明によれば、スキャフォルドチャネルと微細流体チャネルの境界部の天井面または底面に漏出防止部が延長するようにすることによって、細胞が他の構造物と先に反応しないようにして、細胞培養の観察及び反応時に正確な定量化が可能であり、細胞の相互作用に対する研究が可能であるという効果がある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と；
前記基板の内部中央に沿って形成され、少なくとも１つ以上が連続的に配置され、内部にはスキャフォルドが流動するスキャフォルドチャネルと；
前記スキャフォルドチャネルの両側または一側にそれぞれ形成され、内部には細胞が流動する微細流体チャネルと；を含み、
前記微細流体チャネル及びスキャフォルドチャネルの境界部の天井面及び底面のうち少なくともいずれか１つには、前記スキャフォルドが微細流体チャネルに漏出されることを防止するための漏出防止部が形成されることを特徴とする、細胞培養アッセイ。
【請求項２】
前記微細流体チャネル及びスキャフォルドチャネルの上部は、半円形よりなり、半円形の上部は、互いに当接し、境界部に前記漏出防止部が形成されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項３】
前記漏出防止部は、先端がとがっていて、両側が曲面形状を有する断面を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項４】
前記漏出防止部は、先端がラウンド状に形成されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項５】
前記漏出防止部は、先端が四角形状の断面を有するように形成されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項６】
前記漏出防止部は、前記スキャフォルドチャネル及び微細流体チャネルの高さの５〜９５％を占めるように形成されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項７】
前記スキャフォルドチャネル及び微細流体チャネルは、互いに交互に繰り返して配置されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項８】
前記微細流体チャネルの両端部は、前記スキャフォルドチャネルから離れる方向に延長することを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項９】
前記スキャフォルドは、流体形態で注入されてゲル化するか、または硬化する物質よりなることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【請求項１０】
前記スキャフォルドは、アルジネート（Ａｌｇｉｎａｔｅ）、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）、フィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）、アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）、ＰＨＥＭＡ（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＶＡ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ）、ＰＥＧ（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））、ＰＥＯ（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅ））、ＰＥＧＤＡ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（ｇｌｙｃｏｌ）  ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ）、ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ＰＬＬＡ（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ））、カルボキシメチルセルロース（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＳＡＰ、ＰＨＥＭＡ−ＭＭＡ、デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）のうちいずれか１つの材質または、これらのうち２つ以上が混合された材質よりなることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養アッセイに関し、より詳細には、量産が容易であり、細胞の培養過程をさらに正確に観察することができる構造を有する細胞培養アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞移動（ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）とは、多様な物理、化学、生物学的刺激によって生物または個々の細胞が移動することを意味し、ＡＩＤＳ、病菌、バクテリアなどの感染、動脈硬化、関節炎、歯周炎、乾癬、癌、多発性硬化症、男性不妊、石綿中毒、オゾン中毒など人体内部の多様な疾病や生物学的現象に深く連関されている。
【０００３】
しかし、従来の細胞移動評価アッセイは、大部分が２次元細胞移動を対象とし、細胞が底に這うことを観察するしかなかった。この場合、実際の細胞は、３次元で存在するので、実際現象とは異なる結果を示す場合が多かった。
【０００４】
３次元細胞移動や、組職形成、形態変化、細胞分化などを分析するアッセイは、海外で開発されたことがあるが、細胞を特定条件に露出させるか、生物内部に起きる実際の３次元移動を模写するには限界が多かったうえ、実験結果を効果的に評価し、数値化することができない問題があった。
【０００５】
ここで、微細流体チャネルの間に細胞外基質（ＥＣＭ）を成すスキャフォルドを導入する場合、微細流体技術の長所をすべて維持しながら細胞移動及び形態変化、組職形成、細胞分化などの評価環境で細胞の反応を３次元で模写することができるという長所がある。
【０００６】
このような長所を反映した従来技術として、特許文献１がある。この従来技術は、微細流体チャネルの間に細胞外基質（ＥＣＭ）のうち１つであるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）スキャフォルドを導入し、血管の新生を３次元で模写することに成功し、血管内皮細胞と癌細胞の反応、肝細胞と血管内皮細胞の反応、神経細胞の反応研究結果を含んでいる。
【０００７】
ここで、微細流体技術は、細胞周辺に微細環境を与えることができ、細胞のリアルタイム観察及び反応の正確な定量化が可能であり、使用される細胞や試料の量を減らすことができ、多様な実験条件を評価することができるという長所がある。
【０００８】
また、スキャフォルドを統合する技術は、細胞を３次元で誘導することができ、スキャフォルドの内部、両側など多様な方向を利用して細胞を培養することができ、多様な細胞を一度に培養が可能であり、これを利用して細胞の相互作用に対する研究が可能であり、細胞とスキャフォルド自体の相互作用の研究が可能であり、医療用物質を開発するのに活用が可能である。さらに、ナノ物質、薬物、タンパク質を含む多様な物質が細胞に及ぶ影響を３次元で評価することができる。
【０００９】
しかし、従来技術による微細流体プラットホームは、スキャフォルドのチャネル間の固定のために数十〜数百μｍサイズの柱アレイが必要であり、柱がない場合、スキャフォルドがチャネルに漏れることができ、活用が不可能である問題点がある。参照として、スキャフォルドは、大部分、液体の形態でチャネル内の特定位置に注入された後、固くなり、このように注入されたスキャフォルドを固くなる前に特定位置に閉じ込めるために柱が必要である。
【００１０】
しかし、前述した微細流体プラットホームは、スキャフォルドの漏出を防止する柱に起因して細胞が反応する面積に制限が生じ、量産に深刻な問題がある。また、観察過程で柱が続いて見えて、定量化を妨害する要因になり、細胞がスキャフォルドよりは柱と優先的に反応する核心的な問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９／１２６５２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、前述したような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、細胞がスキャフォルドと優先的に反応せず、これと同時にスキャフォルドチャネルの間に固定が可能な構造を有する細胞培養アッセイを提供することにある。
【００１３】
本発明が解決しようとする技術的課題は、上記で言及した技術的課題に制限されず、言及されない他の技術的課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解されることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明の態様によれば、本発明は、基板と；前記基板の内部中央に沿って形成され、少なくとも１つ以上が連続的に配置され、内部には、スキャフォルドが流動するスキャフォルドチャネルと；前記スキャフォルドチャネルの両側または一側にそれぞれ形成され、内部には細胞が流動する微細流体チャネルと；を含み、前記微細流体チャネル及びスキャフォルドチャネルの境界部の天井面及び底面のうち少なくともいずれか１つには、前記スキャフォルドが微細流体チャネルに漏出されることを防止するための漏出防止部が形成されることを特徴とする。
【００１５】
前記微細流体チャネル及びスキャフォルドチャネルの上部は、半円形よりなり、半円形の上部は、互いに当接し、境界部に前記漏出防止部が形成されることを特徴とする。
【００１６】
前記漏出防止部は、先端が尖っていて、両側が曲面形状を有する断面を有することを特徴とする。
【００１７】
前記漏出防止部は、先端がラウンド状に形成されることを特徴とする。
【００１８】
前記漏出防止部は、先端が四角形状の断面を有するように形成されることを特徴とする。
【００１９】
前記漏出防止部は、前記スキャフォルドチャネル及び微細流体チャネルの高さの５〜９５％を占めるように形成されることを特徴とする。
【００２０】
前記スキャフォルドチャネル及び微細流体チャネルは、互いに交互に繰り返して配置されることを特徴とする。
【００２１】
前記微細流体チャネルの両端部は、前記スキャフォルドチャネルから離れる方向に延長されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、スキャフォルドチャネルと微細流体チャネルの境界部の天井面または底面に漏出防止部が延長するようにすることによって、細胞が他の構造物と先に反応しないようにして、細胞培養の観察及び反応時に正確な定量化が可能であり、細胞の相互作用に対する研究が可能であるという効果がある。
【００２３】
また、スキャフォルドチャネルと微細流体チャネルを多様な構造で配置することによって、多様な細胞を同時に観察し、実験期間を短縮することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイを示す平面図である。
【図２】図２は、図１の線Ｉ−Ｉに沿う断面図である。
【図３ａ】図３ａは、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイにスキャフォルドが注入されて固くなることを示す例示図である。
【図３ｂ】図３ｂは、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイにスキャフォルドが注入されて固くなることを示す例示図である。
【図４】図４は、本発明による細胞培養アッセイのチャネル形状の他の例を示す断面図である。
【図５】図５は、本発明による細胞培養アッセイのチャネル形状の他の例を示す断面図である。
【図６ａ】図６ａは、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイにスキャフォルドが注入される過程を示す斜視図である。
【図６ｂ】図６ｂは、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイにスキャフォルドが注入される過程を示す斜視図である。
【図６ｃ】図６ｃは、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイにスキャフォルドが注入される過程を示す斜視図である。
【図７ａ】図７ａは、本発明による細胞培養アッセイのチャネル構造の他の例を示す断面斜視図である。
【図７ｂ】図７ｂは、本発明による細胞培養アッセイのチャネル構造の他の例を示す断面斜視図である。
【図８】図８は、従来の細胞培養アッセイにおいての細胞培養状態を示す写真である。
【図９】図９は、本発明による細胞培養アッセイにおいての細胞培養状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下では、本発明による細胞培養アッセイの一実施形態を添付の図面を参照して詳細に説明する。
【００２６】
図１は、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイを示す平面図であり、図２は、図１の線Ｉ−Ｉによる断面図である。
【００２７】
同図に示されたように、略直方体形状の基板１０にスキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０がそれぞれ形成される。基板１０は、或る物質の微小流量の輸送が可能な微細流体構造を具現することができる素材で製造されることができる。
【００２８】
細胞が流入される微細流体チャネル３０は、基板１０において両側に位置し、その間には、スキャフォルドチャネル２０が配置される。以下で説明するが、スキャフォルドチャネル２０は、微細流体チャネル３０の間に多数個が連続して配置されてもよい。
【００２９】
スキャフォルドチャネル２０は、基板１０の中央を横切って一直線に設置される。スキャフォルドチャネル２０の前端（上流）には、スキャフォルド流入口２２が形成され、後端（下流）には、スキャフォルド流出口２４がそれぞれ形成される。また、微細流体チャネル３０の前端及び後端には、それぞれ微細流体流入口３２及び微細流体流出口３４が形成される。
【００３０】
本実施形態において、スキャフォルドチャネル２０には、スキャフォルド５０（図３ａ参照）が流動するようになり、細胞外基質（ＥＣＭ）を成すスキャフォルド５０を通じて微細流体技術の長所をすべて維持しながら、細胞移動評価過程で細胞の３次元反応を模写することができる。このようなスキャフォルド５０は、スキャフォルドチャネル２０の内部で流動しなければならないし、微細流体チャネル３０の側に漏出されてはならない。また、スキャフォルド５０は、液体形態としてスキャフォルドチャネル２０内の特定位置に注入された後に固くなる。
【００３１】
本実施形態において、スキャフォルド５０は、流体形態で注入され、固体化またはゲル（Ｇｅｌ）化するか、硬化するか、粘度が高くなるか、またはパイプ形態になる物質よりなることができる。スキャフォルド５０を固体化するときには、熱を加えるか、化学的に混合するか、一定時間以上保持するか、または光（特に紫外線）を加えるなどの方法がある。そして、固体化またはゲル化するスキャフォルド５０としては、アルジネート（Ａｌｇｉｎａｔｅ）、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）、フィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）、アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）、ＰＥＧなど多様な材質があり、その他、ハイドロゲル、一般ゲル、アガロースゲル、組職、タンパク質、実際のマトリックス材質などを多様に活用することができる。また、スキャフォルド５０は、細胞や、細胞塊、生体組職など生体で直接抽出した物質またはその混合物質よりなることができる。
【００３２】
ここで、従来のように、スキャフォルド５０を柱アレイを通じて特定位置に閉じ込める場合、細胞がスキャフォルド５０より柱アレイと優先的に反応する問題があり、本実施形態では、スキャフォルドチャネル２０と微細流体チャネル３０とが会う境界部に漏出防止部４０を設けることによって、これを解決しようとした。すなわち従来の柱アレイを除去し、スキャフォルドチャネル２０と微細流体チャネル３０との境界部の天井面または底面に所定長さだけ漏出防止部４０が延長するように形成したものである。
【００３３】
このように漏出防止部４０が形成された状態でスキャフォルド５０が注入される過程が図３ａ及び図３ｂに示されている。これを参照すれば、最初にスキャフォルド５０がスキャフォルドチャネル２０に流入されれば、図３ａのように、スキャフォルド５０自体の凝集力に起因して両側が内側に凹設される形状を有することができ、時間が経過すれば、スキャフォルド５０が両側に広がりながら図３ｂのように凸設される形状を有することができる。この形状は、チャネルの表面接触角によって異なり、特定形態で操作が可能である。このような過程でスキャフォルド５０は、漏出防止部４０との表面張力によって微細流体チャネル３０に漏出されることが防止されることができる。
【００３４】
一方、漏出防止部４０は、前述したように、スキャフォルドチャネル２０と微細流体チャネル３０との境界部の天井面または底面に形成されることができ、図２では、天井面に形成されたものと図示した。最も好ましくは、図２のように、漏出防止部４０が先端がとがっていて、両側面が曲面形状である断面を有することが好ましい。これは、スキャフォルドチャネル２０と微細流体チャネル３０の上部を半円形で形成し、互いに当接するように配置すれば、形状具現が可能である。
【００３５】
但し、実際に本基板１０を製造する過程で先端が図２のように尖ったように形成されず、図４のように、ラウンド状に形成されてもよい。また、図５のように、漏出防止部４０は、四角形状の断面を有するように形成されてもよい。
【００３６】
結果的に、以上で説明した漏出防止部４０は、スキャフォルドチャネル２０と微細流体チャネル３０の境界部の天井面または底面から所定長さだけ延長すればよく、その形状には、特別な制限がない。
【００３７】
また、漏出防止部４０は、スキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０の高さの５〜９５％を占めるように形成されることができる。この場合、漏出防止部４０がスキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０の高さの５％未満に形成されれば、毛細管現象（ｃａｐｉｌｌａｒｉｔｙ）が維持されにくいし、９５％超過に形成されれば、薬物／分子の円滑な伝達が難しい問題点があり得る。例えば、漏出防止部４０は、スキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０の高さの２０〜８０％、３０〜７０％、４０〜６０％など多様な範囲下で形成されることができる。
【００３８】
一方、微細流体チャネル３０は、両端部がそれぞれ図１のようにスキャフォルドチャネル２０から離れる方向やその他多様な方法で延長する。このように形成されることによって、実質的にスキャフォルド５０と流体は、上流と下流との間で会う。そして、スキャフォルドチャネル２０の内部、両側など多様な方向を利用して細胞を培養することができ、多様な細胞を一度に培養することができる。また、これを利用して細胞の相互作用に対する研究が可能であり、細胞とスキャフォルド自体の相互作用の研究が可能であり、医療用物質を開発するのに活用が可能である。
【００３９】
一方、図６ａ〜図６ｃには、本発明の一実施形態による細胞培養アッセイにスキャフォルドが注入される過程を示す斜視図が示されている。
【００４０】
同図に示されたように、スキャフォルド５０は、スキャフォルド流入口２２を通じて流入され、スキャフォルドチャネル２０に沿って流動する。そして、スキャフォルド５０は、図６ｃに示されたように流入されても、漏出防止部４０によって微細流体チャネル３０の側に漏出されることなく、スキャフォルドチャネル２０上に固定されることができる。
【００４１】
次に、図７ａ及び図７ｂには、本発明による細胞培養アッセイのチャネル構造の他の例を示す断面斜視図が示されている。
【００４２】
同図に示されたように、細胞培養アッセイのスキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０は、多様な形態で配置されることができる。前述した実施形態において、図２を参照すれば、微細流体チャネル３０が両側に配置され、その間に１つのスキャフォルドチャネル２０が配置されている。
【００４３】
しかし、スキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０の配置は、必ず前述した実施形態に限定されるものではなく、図４のように、多数個のスキャフォルドチャネル２０が連続的に配置されてもよく、図５のように、スキャフォルドチャネル２０及び微細流体チャネル３０は、互いに交互に繰り返して配置されてもよい。このように多様に配置されることによって、多様な種類の細胞培養を同時に確認することができるという長所がある。
【００４４】
以下では、図８及び図９を参照して従来と本発明の細胞培養の実施形態を写真を通じて比較する。
【００４５】
図８は、従来の細胞培養アッセイを通じて血管内皮細胞を培養したことを示す図である。図８で、黄色で表示した部分を見れば、従来、柱アレイ及び壁面に沿って血管内皮細胞が成長することを確認することができる。すなわち、細胞が反応する面積に制限が生じ、観察過程でも柱が見えて、定量化を妨害し、細胞が柱アレイと先に反応する問題がある。また、赤色で表示した部分は、細胞と細胞、細胞とゲル、化学的要因（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ）などとの相互作用を見るために広くなれば良いが、表面張力を維持するには、さらに広くすることが困難である問題がある。
【００４６】
一方、図９を参照すれば、血管内皮細胞が安定的に成長することを確認することができる。したがって、本発明による細胞培養アッセイによれば、細胞と細胞、細胞とゲル、化学的要因による相互作用を観察しやすく、基板の製作が容易であるという長所がある。
【００４７】
また、図８及び図９では、血管内皮細胞を例として挙げて説明したが、本発明による細胞培養アッセイは、血管内皮細胞を含めた多様な細胞に使用することができることは当然である。
【００４８】
なお、以上で説明した細胞培養アッセイは、多様な環境条件での細胞移動評価に使用されることが一般的であるが、新薬開発、癌、アルツハイマーなどの疾病モデル構築、組職及び臓器モデル構築、生物環境模写、毒性評価、薬物評価、汚染物評価、タンパク質及びその他物質評価、生体適合性評価、幹細胞研究など多様な用途に活用が可能である。
【００４９】
本発明の権利範囲は、前述した実施形態に限定されず、請求範囲に記載した内容により定義され、本発明の技術分野における通常の知識を有する者が請求範囲に記載した権利範囲内で多様な変形と改作を行うことができることは自明である。
【符号の説明】
【００５０】
１０  基板
２０  スキャフォルドチャネル
２２  スキャフォルド流入口
２４  スキャフォルド流出口
３０  微細流体チャネル
３２  微細流体流入口
３４  微細流体流出口
４０  漏出防止部
５０  スキャフォルド
【図１】
2014530635.tif 000003
【図２】
2014530635.tif 000004
【図３ａ】
2014530635.tif 000005
【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
2014530635.tif 000009
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
2014530635.tif 000011
【図７ａ】
2014530635.tif 000012
【図７ｂ】
2014530635.tif 000013
【図８】
2014530635.tif 000014
【図９】
2014530635.tif 000015
【国際調査報告】
2014530635.tif 000016
2014530635.tif 000017
2014530635.tif 000018
2014530635.tif 000019