(57)【要約】  一般構造（Ｉ）の化合物は19S RP DUBsの脱ユビキチン(DUB)活性を無効にすることができる。該化合物は、癌、特に最高水準の化学療法に難治性の癌の治療に使用できる。対応する治療方法及び該化合物を含む薬学的組成物も開示される。2014530852.tif 000013【選択図】図１ａ
2014530852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
19S RP DUBsの脱ユビキチン(DUB)活性を無効にすることができる一般構造Ｓ−１の化合物：
2014530852.tif 000012
式中、
二重結合d1でのR1，R2及び二重結合d2でのR3，R4は、互いに独立して、式S-1の配置とは反対の配置を有することができ、
Xは、CO，CS，CH2，CHC1-6‐アルキル，NH又はNC1-6アルキル;
R1及びR3は、互いに独立して、H又はC1-6‐アルキル；
R2及びR4は、互いに独立して、H；C1-6‐アルキル；C1-5‐アルキルCO；フェニル又は6‐員ヘテロアリールであって、場合によっては1‐3個のC1-6‐アルキル,C1-6‐アルコキシ,CN,‐COOC1-6アルキル,COOH，NO2，F，Cl，Br，I，CF3，NH2，NHC1-6‐アルキル，N(C1-6‐アルキル)2，CONR7R8で置換されている該フェニル又は6‐員ヘテロアリール、但しアルキル及びアルコキシ中のHの１つ又はそれ以上はフルオロで置換されることができる；
R5は、H；C1-6‐アルキル；C2-6‐アルケニル；C1-3‐アルコキシ‐C2-6‐アルキル‐；C1-3‐アルコキシ‐C2-6‐アルケニル‐；アリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロアリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロ環式‐C0-6‐アルキル‐；シクロアルキル‐C0-6‐アルキル‐；‐C1-6‐アルキル‐COOC1-6‐アルキル；‐C2-6‐アルキル‐アリーロキシ；COR6のいずれか；
R6は、C1-6‐アルキル；C2-6‐アルケニル；C1-6‐アルコキシ；C1-3‐アルコキシ‐C1-6‐アルキル‐；C1-3‐アルコキシ‐C1-6‐アルケニル‐；アリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロアリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロ環式‐C0-6‐アルキル‐；シクロアルキル‐C0-6‐アルキル‐；‐C1-6‐アルキル‐COOC1-6‐アルキル；NH2；‐NHC1-6‐アルキル；‐N(C1-6‐アルキル)2；‐C0-6‐アルキル‐アリーロキシのいずれか；
R7, R8は、互いに独立して、H又はC1-3アルキルである。
【請求項２】
Ｘ＝ＣＯである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R1及びR3の両方がHである、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
R2及びR4の両方が互いに独立して、フェニル又は6‐員ヘテロアリール、特にフェニルであって、1‐3個のC1-6‐アルキル，C1-6‐アルコキシ，CN，‐COOC1-6アルキル，COOH，NO2，F，Cl，Br，I，CF3，NH2，NHC1-6‐アルキル，N(C1-6‐アルキル)2，CONR7R8で置換されている、請求項１〜３のいずれか1項記載の化合物。
【請求項５】
フェニルの置換が３，４，５の位置の一つ又はそれ以上である、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
二重結合d1でのR1，R2及び二重結合d2でのR3、R4が式S-1の配置を有し、
XがCO，CS，CH2，CHC1-6−アルキル，NH又はNC1-6アルキルであり、
R1及びR3が、互いに独立して、H又はC1-6−アルキルであり、
R2及びR4が、互いに独立して、H；C1-6アルキル；C1-5−アルキルCO；フェニル又は6員ヘテロアリールであって、1−3個のCN，NO2，F，Cl，Br，I，NH2，NHC1-6アルキル，N(C1-6アルキル)2，COC1-6アルキルで置換されたフェニル又は6員ヘテロアリールであり、
R5が、H；C1-6アルキル；C2-6アルケニル；C1-3アルコキシC1-6アルキル；C1-3アルコキシ−C1-6アルケニル；アリール；ヘテロアリール；ヘテロサイクリル，C1-6アルキル−ヘテロアリール，C1-6アルキル−ヘテロサイクリル、C1-6アルキル-シクロアルキル，C1-6アルキル−アリール，CO−C1-6アルキル，CO−ビニル，CO−アリル，CO−アリール，CO−シクロアルキルである、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
ＸがＣＯである、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
R２とR４が置換フェニルである、請求項６又は７記載の化合物。
【請求項９】
R5がCO-C1-6アルキル，CO-シクロアルキル，CO-ビニル，CO-アリルから選ばれる、請求項６〜８のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１０】
ボルテゾミブ又はボルテゾミブのアポトーシス発生活性を共有する薬剤又はその他の抗癌剤を用いた、治療に難治性の癌腫瘍の人の治療方法であって、薬学的に許容される担体中の請求項１〜９のいずれか1項記載の化合物の薬理学的有効量を投与することを特徴とする治療方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞が、内因性アポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の過剰発現により治療に難治性である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
19S RP DUBsがUCHL5及びUSP14を含む、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
非プロテアソーム性DUBsの脱ユビキチン(DUB)活性が影響されない、請求項１０〜１２のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
上記化合物が液体担体に溶解又は懸濁される、請求項１０〜１３のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
投与が静脈内、筋肉内、腹腔内若しくは皮下の注射若しくは点滴による、請求項１０〜１４のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
投与が経口による、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
担体が錠剤又はカプセルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記薬理学的有効量が、薬剤が全身的に投与するか局部的に投与するかを考慮して、０．０００１ｇ／ｋｇ体重〜０．１ｇ／ｋｇ体重、特に０．００１ｇ／ｋｇ体重〜０．０１ｇ／ｋｇ体重である、請求項１０〜１７のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
“治療に難治性”とは、ボルテゾミブ又はボルテゾミブのアポトーシス発生活性を共有する薬剤又はその他の抗癌剤の１回用量での癌治療が、治療直前に観察された癌の1月当たりの成長速度を実質的に減少させない、例えば、２５パーセントより大きく、又は１０パーセントより大きく、又は５パーセントより大きく減少させないことを意味する、請求項１０〜１８のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
上記癌が、多発性骨髄腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌から選ばれる、請求項１０〜１９のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
治療する人を、ボルテゾミブ又はボルテゾミブの脱ユビキチン活性阻害のメカニズムを共有する有効成分又はその他の抗癌剤の投与前及び投与後の癌の成長速度を決定することにより、選択することを含み、正の成長速度、特に1月当たり５％超又は１０％超又は２５％超が選択マーカーを構成する、請求項１０〜２０のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか1項記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
経口投与用に、錠剤又はカプセル又はその他の単回投与用製剤の形態にある請求項２２記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
注射又は点滴用に、薬学的に許容される液体担体中の溶液又は懸濁液の形態にある請求項２２記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
静脈内、筋肉内、腹腔内若しくは皮下の注射若しくは点滴用の、請求項２１記載の組成物。
【請求項２６】
化学療法に難治性の人の癌治療のための、請求項１〜９のいずれか1項記載の化合物又は請求項２２〜２５のいずれか1項記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱ユビキチン活性を阻害することによる、患者の癌を治療する方法に関する。更に特定的には、本発明は、少なくとも１種の抗ガン剤による治療に耐性であることが証明された患者の癌を治療する方法に関する。最も特定的には、本発明は、該方法に使用するための化合物、及び該化合物を含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）において崩壊に対する高い感度を示し、このことは抗ガン療法の開発に魅力的な標的にする（非特許文献１）。ユビキチン−タグ付けられた基質は２６Ｓプロテアソームにより崩壊することが認められている。２６Ｓプロテアソームは、タンパク質分解性２０Ｓコア（２０Ｓ  ＣＰ）が１９Ｓ制御粒子（１９Ｓ  ＲＰ）で蓋されたものを含む多サブユニット複合体である（非特許文献２、３）。該２０Ｓ  ＣＰは抗ガン剤開発に重要な標的として開発され、骨髄性白血病の治療用のボルテゾミブ（登録商標Ｖｅｌｃａｄｅ）の承認となった（非特許文献４）。
【０００３】
【化１】
2014530852.tif 000003
【０００４】
化合物ｂ−ＡＰ１５（ＮＳＣ６８７８５２）はｐ５３−非依存性且つカテプシン−Ｄ−依存性のアポトーシスを引き起こすことが知られている（非特許文献５、６）。
【０００５】
【化２】
2014530852.tif 000004
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masdehors, P et al., Increased sensitivity of CLL‐derived lymphocytes to apoptotic death activation by the proteasome‐specific inhibitor lactacystin. Br J Haematol 105, 752‐757, doi:bjh1388 [pii] (1999).
【非特許文献２】DeMartino, G N et al., PA700, an ATP‐dependent activator of the 20 S proteasome, is an ATPase containing multiple members of a nucleotide binding protein family. J Biol Chem 69,20878‐20884, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query. fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed & dopt=Citation&list_uids=8063704 (1994) (1994).
【非特許文献３】Rechsteiner, M et al., The multicatalytic and 26 S proteases. J Biol Chem 268, 6065‐6068, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation & list_uids=8454582 (1993).
【非特許文献４】Adams, J & Kauffman, M, Development of the proteasome inhibitor Velcade (Bortezomib).Cancer Invest 22, 304‐311, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? cmd=Retrieve & db =PubMed&dopt=Citation&list_uids=15199612 (2004).
【非特許文献５】Erdal, H et al., Induction of lysosomal membrane permeabilization by compounds that activate p53‐independent apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 192‐197, doi:0408592102 [pii]10.1073/pnas.0408592102 (2005).
【非特許文献６】Berndtsson, M et al., Induction of the lysosomal apoptosis pathway by inhibitors of the ubiquitin‐proteasome system. Int J Cancer 124, 1463‐1469, doi:10.1002/ijc.24004 (2009).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、脱ユビキチン化活性を阻害することにより患者の癌、特に最高水準の化学療法に難治性の癌、を治療する方法に使用する化合物を提供することである。
【０００８】
特に、本発明の目的は、少なくともボルテゾミブ又はボルテゾミブの脱ユビキチン化活性阻害のメカニズムを共有する薬剤を用いた治療に難治性の患者における癌を治療するための化合物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、当業界で知られた機能的に同等の化合物に関して、生理的ｐＨにおいて溶解性が改良された、前述の種類の化合物を提供することである。
【００１０】
本発明の更なる目的は、対応する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、該化合物を含む薬学的組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、本発明の下記の概要、図面に例示された多くの好ましい発明の態様、及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によると、１９Ｓ  ＲＰ  ＤＵＢｓの脱ユビキチン化（ＤＵＢ）活性を無効にすることができる、一般的構造Ｓ：
【００１４】
【化３】
2014530852.tif 000005
【００１５】
の化合物が開示される。本発明の化合物は、プロテアソーム阻害剤（抑制物質、inhibitor）の新規なクラスに関係すると認められる。該プロテアソーム阻害剤の中で、公知の化合物ｂ−ＡＰ１５が代表的である。
【００１６】
特に、本発明によると、本発明の化合物は２種の１９Ｓ  ＲＰ  ＤＵＢｓである、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の活性を阻害するが、非プロテアソームＤＵＢｓに影響を及ぼさない。更に特定的には、本発明の化合物は、本質的にアポトーシス抑制因子(inhibitor)Ｂｃｌ−２の過剰発現により最高水準の化学療法で難治性の癌腫瘍の治療に効果がある。
【００１７】
最も特に、本発明によると、本発明の化合物は、ボルテゾミブ又はボルテゾミブの脱ユビキチン阻害(抑制)のメカニズムを共有する薬剤を用いた治療に難治性の癌の治療に有効である。別の好ましい態様では、該化合物は、当業界で知られた抗ガン剤で難治性の癌の治療に有効である。
【００１８】
本願で、“治療に難治性”とは、抗ガン剤の１回用量での癌治療が、治療直前に観察された癌の成長速度を実質的に減少させない、例えば、１月当たりの成長速度を２５パーセント以下又は１０パーセント以下又は５パーセント以下だけ減少させることを意味する。特に本発明の方法は、標準用量のボルテゾミブ又はボルテゾミブのアポトーシス発生活性を共有する薬剤又は他の抗ガン剤を１回又はそれ以上受け取った後、１回治療の直前又は２回若しくは３回若しくはそれ以上の治療の最後の直前に観察された癌成長速度と比べて、１月当たり２５パーセント以下又は１０パーセント以下又は５パーセント以下だけ減少した癌成長速度、例えば正の成長速度、を示す患者の癌の治療に有効である。腫瘍成長の受容された方法は、非散布癌の体積の変化である。
【００１９】
本発明の方法による治療に適した癌の例は、多発性骨髄腫である。治療に適した癌の他の例には、肺ガン、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、首及び頭癌が含まれる。
【００２０】
一般構造Ｓ−１の本発明の化合物で、
二重結合d1でのR1, R2及び二重結合d2でのR3, R4は、互いに独立して、式S-1の配置とは反対の配置を有することができ、
XはCO，CS，CH2，CHC1-6‐アルキル，NH又NC1-6アルキル;
R1及びR3は、互いに独立して、H又はC1-6‐アルキル；
R2及びR4は、互いに独立して、H；C1-6‐アルキル；C1-5‐アルキルCO；フェニル又は6‐員ヘテロアリールであって、場合によっては1‐3個のC1-6‐アルキル,C1-6‐アルコキシ,CN,‐COOC1-6アルキル,COOH，NO2，F，Cl，Br，I，CF3，NH2，NHC1-6‐アルキル，N(C1-6‐アルキル)2，CONR7R8で置換されている該フェニル又は6‐員ヘテロアリール、但しアルキル及びアルコキシ中のHの１つ又はそれ以上はフルオロで置換されることができる；
R5はH；C1-6‐アルキル；C2-6‐アルケニル；C1-3‐アルコキシ‐C2-6‐アルキル‐；C1-3‐アルコキシ‐C2-6‐アルケニル‐；アリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロアリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロ環式‐C0-6‐アルキル‐；シクロアルキル‐C0-6‐アルキル‐；‐C1-6‐アルキル‐COOC1-6‐アルキル；‐C2-6‐アルキル‐アリーロキシ；COR6；
R6は、下記から選ばれる:C1-6‐アルキル；C2-6‐アルケニル；C1-6‐アルコキシ；C1-3‐アルコキシ‐C1-6‐アルキル‐；C1-3‐アルコキシ‐C1-6‐アルケニル‐；アリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロアリール‐C0-6‐アルキル‐；ヘテロ環式‐C0-6‐アルキル‐；シクロアルキル‐C0-6‐アルキル‐；‐C1-6‐アルキル‐COOC1-6‐アルキル；NH2；‐NHC1-6‐アルキル；‐N(C1-6‐アルキル)2；‐C0-6‐アルキル‐アリーロキシ；
R7, R8は、互いに独立して、H又はC1-3アルキルである。
【００２１】
R1及びR3の両方は、C1-3‐アルキルであるのが好ましい。
【００２２】
R2及びR4の両方は、H；C1-6‐アルキル；C1-5‐アルキルCO；フェニル又は6‐員ヘテロアリールであって、場合によっては1‐3個のC1-6‐アルキル,C1-6‐アルコキシ,CN,‐COOC1-6アルキル,COOH，NO2，F，Cl，Br，I，CF3，NH2，NHC1-6‐アルキル，N(C1-6‐アルキル)2，CONR7R8で置換されている該フェニル又は該6‐員ヘテロアリール、但しアルキル及びアルコキシ中のHの１つ又はそれ以上はフルオロで置換されることができ、そしてフェニルの置換は３，４，５の位置の一つ又はそれ以上であるのが好ましい。
【００２３】
R2及びR4の両方は、フェニルであって、３，４，５の位置で、1‐3個、好ましくは1‐2個のC1-6‐アルキル，C1-6‐アルコキシ,CN，‐COOC1-6アルキル,COOH，NO2，F，Cl，Br，I，CF3，NH2，NHC1-6‐アルキル，N(C1-6‐アルキル)2，CONR7R8で置換されている該フェニルが特に好ましく、但しアルキル及びアルコキシ中のHの１つ又はそれ以上はフルオロで置換されることができる。最も好ましいものは、電子吸引性置換基、特にF，Cl，トリフルオロメチル，NO2，CNである。
【００２４】
R5は、H、メチル、アセチルCOCH=CH2、2-アセトキシエチルから成る群から選ばれるのが好ましい。
【００２５】
本発明の好ましい観点によると、Ｘ＝ＣＯである。本発明の別の好ましい観点によると、R1とR３は両方ともＨである。本発明の第３の好ましい観点によると、R２とR４は、互いに独立して、フェニル又は6‐員ヘテロアリールであって、1‐3個のC1-6‐アルキル,C1-6‐アルコキシ，CN，‐COOC1-6アルキル，COOH，NO2，F，Cl，Br，I，CF3，NH2，NHC1-6‐アルキル，N(C1-6‐アルキル)2，CONR7R8で置換されているものであり、フェニルが好ましく、フェニルの置換は、置換されている場合、３，４，５の位置の一つ又はそれ以上であるのが好ましい。
【００２６】
本発明の好ましい観点によると、二重結合d1でのR1，R2及び二重結合d2でのR3，R4は、式S-1の配置を有し；XはCO，CS，CH2，CHC1-6−アルキル，NH又NC1-6アルキル;R1及びR3は、互いに独立して、H又はC1-6−アルキル；R2及びR4は、互いに独立して、H；C1-6アルキル；C1-5−アルキルCO；フェニル又は6員ヘテロアリールであって、1−3個のCN，NO2，F，Cl，Br，I，NH2，NHC1-6アルキル，N(C1-6アルキル)2，COC1-6アルキルを有するフェニル又は6員ヘテロアリール；R5はH；C1-6アルキル；C2-6アルケニル；C1-3アルコキシC1-6アルキル；C1-3アルコキシC1-6アルケニル；アリール；ヘテロアリール；ヘテロサイクリル，C1-6アルキル−ヘテロアリール，C1-6アルキル−ヘテロサイクリル、C1-6アルキル-シクロアルキル，C1-6アルキル‐アリール，CO‐C1-6アルキル，CO−ビニル，CO−アリル，CO−アリール，CO−シクロアルキルである。互いに独立して、XはCO、R2及びR4は置換フェニル、R5はCOR6、特にCO-C1-6アルキル，CO-シクロアルキル，CO-ビニル，CO-アリルであるのが好ましい。
【００２７】
“アリール”とは、少なくとも１つの芳香環を含む、６−１０の炭素原子の単環又は二環式炭化水素を云う。“アリールオキシ”とは、酸素原子に結合したアリール基を云う。“ヘテロアリール”は、５又は６の環原子を有する単環式環系であって、該環原子の１つ又はそれ以上が、独立して、酸素、窒素、硫黄から選ばれる単環式環系を表す。“アルキル”とは、直鎖又は分岐したアルキルを示す。“アルケニル”は、直鎖又は分岐アルケニルを示す。“アルコキシ”は、直鎖又は分岐したアルコキシを示す。“シクロアルキル”とは、炭素原子数３〜７の飽和単環式炭化水素を云う。
【００２８】
一般構造Ｓ−１の本発明の好ましい化合物を表に開示する。
【００２９】
【表１】
2014530852.tif 000006
2014530852.tif 000007
【００３０】
アミノ基のプロトン化により、Ｒ５がアシル基でない本発明のアゼパノン化合物、及びそれに対応して置換されたピペリジン−４−オンの水性媒体中の溶解性は、ｐＨの低下と共に増加する。しかしながら、重要な観点によると、Ｒ５がアシル基でない（即ち、−ＣＯＲ６でない）本発明のアゼパノン化合物は、対応して置換されたピペリジン−４−オンに比べて、生理的ｐＨにおいて水性媒体中で優れた溶解性を有する。これらのアゼパノン及びピペリジン−４−オンの溶解性は高ｐＨから低ｐＨに行くにつれて増加するが、その増加は、アゼパノンの方が対応するピペリジン−４−オンよりも高いｐＨで始まる。本願で、”生理的ｐＨ”とは、約６から約８、特に７．０〜７．５である。
【００３１】
【表２】
2014530852.tif 000008
2014530852.tif 000009
2014530852.tif 000010
【００３２】
Ｒ５がアシル基である（即ち、−ＣＯＲ６である）本発明の化合物の水性媒体中の溶解性はｐＨに実質的に独立である。
【００３３】
本発明の特に好ましい化合物は、化合物番号1561, 1562, 1567,1570, 1571, 1586, 1591, 1600, 1612, 1618, 1622, 1625, 1643, 1644, 1647, 1648, 1649, 1652,1653, 1656, 1657, 1658, 1662である。本発明の最も好ましい化合物は、化合物番号1570, 1571, 1625, 1662である。
【００３４】
本発明の化合物は1,5‐ジ置換1,4‐ペンテン‐3‐オン部分を含むので、４つのシス／トランス異性体EE, ZE, ES, ZZで存在することができる。本発明の化合物の定義において、この異性は前記の「二重結合d1でのR1，R2及び二重結合d2でのR3，R4は、互いに独立して、式S-1の配置とは反対の配置を有することができる」と定義される。本発明の化合物は、いずれかのかかる異性体を及びかかる異性体の混合物を含む。
【００３５】
【化４】
2014530852.tif 000011
【００３６】
合成で、本発明の化合物は異性体混合物として得られるが、時々、特定の溶媒中に最も低い溶解度を有する異性体の形態でも得られ、該溶媒から該異性体は沈殿又は結晶化する。このように、純粋な異性体を制御した条件下で得ることができるが、該化合物の薬理学的効果は全ての異性体で奏される。この理由は、水又は他のヒドロキシル若しくはスルフヒドリル溶媒若しくは薬剤の存在下でのそれらの平衡化であり、それは酸又は塩基触媒により加速される。
【００３７】
従って、本願で使用される用語“本発明の化合物”は、上記の種類の純粋な異性体、並びにかかる異性体の２種又はそれ以上の混合物を含む。本発明の化合物の水性本体流体中での平衡速度は、１回の治療期間内に実質的な平衡を与えるに充分である。
【００３８】
本発明の化合物はアゼパン部分、好ましくはアゼパン−４−オン部分を含む。本発明の重要な観点によると、本発明の化合物は、ピペリジン部分、例えば４−ピペリジノン部分、を含む構造的に対応する化合物よりも優れた細胞毒性活性を示す。
【００３９】
本発明の別の重要な観点によると、アゼパン部分、特にアゼパン−４−オン部分を含む本発明の化合物は、患者に投与するのに適した液体担体、例えばジメチルスルホキシド、中で、ピペリジン部分、例えば４−ピペリジノン部分、を含む構造的に対応する化合物よりも優れた溶解性を示す。
【００４０】
“１回の治療期間”とは、本発明の化合物の投与と、消費、即ち、本発明の化合物の作用部位、例えば腫瘍、での濃度が９０％又は９５％又は９９％以上低減した時点、との間に経過する期間である。薬学的組成物において、本発明の化合物の異性体又は異性体混合物は、湿気を注意深く排除することにより異性化に対して安定化される。
【００４１】
本発明の方法は、本発明の化合物の薬理学的有効量を、適当な薬学的担体、例えば水性担体、又はジメチルスルホキシド若しくはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む担体に溶解又は懸濁して、必要とする患者に投与することを含む。投与は、いかなる適当な経路、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内若しくは皮下注射若しくは点滴であってもよい。他の投与方法、特に、例えば錠剤又は硬質若しくは軟ゼラチンカプセルの形態での経口投与もまた考えられる。
【００４２】
当業者は、薬理学的有効量の決定の仕方を知っている。かかる用量は、薬剤を全身的に投与するか局部的に投与するかを考慮して、０．０００１ｇ／ｋｇ体重〜０．１ｇ／ｋｇ体重、特に０．００１ｇ／ｋｇ体重〜０．０１ｇ／ｋｇ体重であり得る。
【００４３】
ＤＵＢ阻害と一致して、本発明の化合物を用いた治療は、ボルテゾミブ治療と比べて、より高分子量のポリユビキチン化タンパク質の蓄積を引き起こし、そしてより強い変性タンパク質反応を生じる結果となる。本発明によると、本発明の化合物によるアポトーシスの誘発は、ボルテゾミブによるアポトーシス誘発と、ｐ５３腫瘍サプレッサーの破壊に非感受性でありそしてアポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の過剰発現に対して非感受性である点で相違する。
【００４４】
本発明によると、本発明の化合物を用いた治療は、胸、肺、結腸、頭及び首の癌のヒト及びマウス腫瘍イン  ビボモデルにおける腫瘍の阻害を示し、そして急性骨髄白血病（ＡＭＬ）モデルにおける浸潤を阻害する。その結果、本発明の化合物による１９Ｓ ＲＰのＤＵＢ活性の阻害は、ヒト及び動物における癌の治療の貴重な選択肢であることが開示される。従って、更に詳しくは、最高水準の化学療法で難治性のヒトにおける癌腫瘍を治療する方法であって、薬学的許容担体中の本発明の化合物の薬理学的有効量を投与することを含む方法が開示される。本発明の方法は、細胞が本質的アポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の過剰発現により治療が難治性である腫瘍を有する患者の治療に特に有効である。
【００４５】
本発明の好ましい観点によると、該１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢｓはＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４を含む。本発明の別の好ましい観点によると、非プロテアソームＤＵＢｓの脱ユビキチン（ＤＵＢ）活性は本発明の化合物によっては影響されない。本発明の化合物は液体担体に溶解して又は懸濁して、いかなる適当な経路、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内及び皮下投与により投与することができる。或いは又は追加して、本発明の化合物は経口的に、例えば錠剤又はカプセルの形態で、投与することができる。本発明の化合物の薬理学的有効量は、該化合物を全身的に投与するか局部的に投与するかを考慮して、０．０００１ｇ／ｋｇ体重〜０．１ｇ／ｋｇ体重、特に０．００１ｇ／ｋｇ体重〜０．０１ｇ／ｋｇ体重である。該方法は、ボルテゾミブ又はボルテゾミブの脱ユビキチン活性のメカニズムを共有する活性主成分又は他の抗ガン剤を投与する前に又はこれを投与して、癌の成長速度を決定することにより治療すべき人を選択することを含み、正の成長速度、特に１月当たり５％を越える若しくはそれ以上の成長速度、又は１０％を越える若しくはそれ以上の成長速度、又は２５％を越える若しくはそれ以上の成長速度は選択マーカーを構成する。
【００４６】
本発明の化合物は、細胞プロテアソーム機能を阻止する。これはレポーター細胞系の使用により確認された。該レポーター細胞系は、黄色蛍光タンパク質にタグされたユビキチン（ＵｂＧ７６Ｖ−ＹＦＰ）を発現し、該ユビキチンは構造的にプロテアソーム分解のための標的とされる（１２）。免疫ブロット及びフローサイトメトリーはＵｂ−ＹＦＰレポーターの用量依存性蓄積（ＩＣ５０＝０．８μＭ）を明らかにし、プロテアソーム機能の損傷を示唆した。プロテアソーム機能の阻害はユビキチンターンオーバーにおける欠陥により特徴付けられるので（１３）、結腸癌ＨＣＴ１１６細胞を本発明の化合物で処理し、そしてユビキチン接合のレベルを免疫ブロット法により分析した。該処理は、２０ＳＣＰ阻害剤であるボルテゾミブと比較して、より高分子量のポリユビキチン化タンパク質の急速な時間依存的蓄積を引き起こし、本発明の化合物はＵＰＳの別のブランチを阻害することを示唆する。ポリユビキチンの増加は、ＨＳＰＡ６（Ｈｓｐ  ７０Ｂ’），ＨＳＰＡ１Ｂ及びＤＮＡＪＢ１（Ｈｓｐ４０）の誘発により特徴付けられる強いタンパク毒素反応を伴う。
【００４７】
多くの細胞サイクル制御タンパク質のターンオーバーは、サイクリン依存性キナーゼｐ２１ Ｃｉｐ１，ｐ２７ Ｋｉｐ１の阻害剤及び腫瘍サプレッサーｐ５３を含むＵＰＳにより制御される（４）。本発明の化合物での処理は、ユビキチンに独立したプロテアソーム基質（８）であるオルニチンデカルボキシラーゼ１（ＯＤＣ１）のレベルを変えずに、それらのレベルを用量依存的に増加させる。細胞サイクル調節剤の増加はＧ２／Ｍ相境界に拘束された成長と同時であり、そしてサブＧ１ ＤＮＡ含量を増加させた。観察された細胞サイクル阻止はＤＮＡ損傷マーカー、例えばホスホリル化ｐ５３（Ｓｅｒ１５の位置）又はＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９の位置）、の増加したレベルを伴わず（１０）、ｂ−ＡＰ１５は遺伝毒性剤ではないことを示唆する。
【００４８】
サブＧ１ ＤＮＡ、カスパーゼ−３の活性化、及びポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）及びサイトケラチン−１８の開裂の増加は、ＵＳＰ阻害及びアポトーシスを結ぶポリユビキチンの蓄積を引き起こす薬物濃度で細胞生存率の全体的減少と関連する。ボルテゾミブによるアポトーシス誘発はｐ５３腫瘍サプレッサーの状態及び抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２腫瘍タンパク質の過剰発現に感受性である（１１、１２）。ＨＣＴ１１６結腸癌細胞の同質遺伝子系クローンの使用により、ｂ−ＡＰ１５誘発アポトーシスは、Ｂｃｌ−２の過剰発現及びアポトーシス調節剤ｐ５２，ＢＡＸ又はＰＵＭＡの崩壊に不感受性である。細胞毒性活性の測定は、本発明の化合物が、不死化網膜色素上皮細胞（ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１）及び末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するよりも、結腸癌細胞系ＨＴＣ−１１６に対して一層毒性であることを示す。本発明の化合物は、正常細胞型に対するよりもＨＴＣ−１１６細胞に対して高度の細胞毒性活性を示す。
【００４９】
観察された細胞プロテアソーム活性における減少は、２０Ｓ ＣＰのβサブユニットのタンパク質分解活性の阻害によっては説明できない。活性特異性基質を使用したイン ビトロ実験は、２０Ｓ ＣＰ又は２６Ｓプロテアソームのタンパク質分解活性における阻害、１９Ｓ ＲＰ及び２０Ｓ ＣＰの解離、又は該プロテアソームに結合するポリユビキチンの阻害を示さない。
【００５０】
本発明の化合物は、２つの立体的に接近したβ炭素を有するα−βジエノン実体を含む。構造的に類似した薬理作用団がユビキチンイソペプチダーゼ阻害剤のクラスを含むことが以前記載された（１３）。しかしながら、細胞ＤＵＢ活性を、ユビキチン７−アミド−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）を使用して、本発明の化合物で処理した細胞に対して試験した場合、Ｕｂ−ＡＭＣ開裂における減少は観察されなかった。これは、本発明の化合物は一般的ＤＵＢ阻害剤ではないことを例証する。薬理作用団構造の類似性、及び本発明の化合物が２０Ｓ ＣＰと独立してプロテアソーム活性を阻害することを示すデータは、本発明の化合物が１９Ｓ ＲＰの脱ユビキチン活性を阻止することによりプロテアソームを阻害することを示す。
【００５１】
Ｕｂ−ＡＭＣ及び精製した１９Ｓ ＲＰ又は２６Ｓプロテアソームを使用したイン ビトロアッセーにより、本発明の化合物は１９Ｓ ＲＰ及び２６Ｓプロテアソームの両方の脱ユビキチン活性を阻害することが確認された。組み換えユビキチン−ＧＦＰは１９Ｓ ＲＰ ＤＵＢ活性の基質である（１５）。１９Ｓ ＲＰをｂ−ＡＰ１５で処理するとＵｂ−ＧＦＰ及びユビキチン化ＨＤＭ２の開裂を効果的に阻害した。ポリユビキチン鎖に存在するユビキチン結合のタイプはユビキチン−修飾基質の運命を決定する。
【００５２】
Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖は一般に、結合したタンパク質を分解のための標的とするが（１４）、一方、Ｋ６３結合鎖は、ＤＮＡ修復（１５）及び有糸分裂染色体分離（１６）を含む非タンパク質分解の役割に関係する。ユビキチン鎖分解反応は、本発明の化合物がＫ４８結合ユビキチンテトラマー及びＫ６３結合ユビキチンテトラマーの両方の１９Ｓ ＲＰ処理(processing)を阻害することを明らかにした。観察されたユビキチン鎖分解の阻害は、本発明の化合物で処理した細胞中の高分子量ユビキチン複合体の蓄積を説明し得る。
【００５３】
プロテアソームの脱ユビキチン活性は、３種のＤＵＢｓ、即ち、全て１９Ｓ ＲＰ内に局在するＵＣＨＬ５、ＵＳＰ１４及びＰＯＨ１、の作用に起因する（１７−１９）。ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の両方は、システインプロテアーゼの一般的阻害剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）に感受性であり、一方、ＰＯＨ１はＮＥＭによる阻害に非感受性であるが、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）のような金属キレート化剤に感受性である（２０）。阻害実験は、残留ＤＵＢ活性が１９Ｓ ＲＰのＮＥＭ及び本発明の化合物を用いた同時処理の後でも存在することを示した。この残留ＤＵＢ活性は１９Ｓ ＲＰの本発明の化合物とＴＰＥＮとの同時処理により無効にされたが、本発明の化合物はＮＥＭ感受性シスチンＤＵＢｓの一つ又は両方を主として阻害することを示唆する。本発明の化合物のβ炭素は、ミカエル受容体部位として働き、標的タンパク質中のシスチン残基に共有結合する結果となる。しかしながら、イン ビトロ検定は、本発明の化合物が可逆的阻害剤であり、そしてグルタチオンは本発明の化合物の阻害活性を妨げないことを示した。
【００５４】
本発明の化合物を用いた処理でどのＤＵＢｓが阻害されるか詳しく確認するために、シスチン類のＤＵＢｓと不可逆的に反応する活性部位指向プローブである赤血球凝集素タグ付けされたユビキチンビニルスルホン（ＨＡ−ＵｂＶＳ）を使用して、競合ラベリング実験を行った（１７）。本発明の化合物を用いた１９Ｓ ＲＰ又は２６Ｓプロテアソームの培養は、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４に対応する分子量の２つのＤＵＢｓのＵｂ−ＶＳラベリングを無効にした。同様の結果が、薬物処理細胞から誘導された溶解物に対してＵｂＶｓを使用して得られた。免疫ブロット分析は、活性の損失及び減少したＵｂＶｓラベリングによる、ＵＳＰ１４及びＵＣＨＬ５の両方の分子量の下方シフトを示した。これは、プロテアソームに限られそして細胞溶解物中では明らかでない減少したＤＵＢ活性を示す本発明の化合物で処理された細胞からのアフィニティ精製プロテアソームと一致する。追加のイン ビトロ検定は、組み換え非プロテアソームシスチンＤＵＢｓに対する本発明の化合物の最小阻害を示し、阻害は一般的シスチン反応性によらないという考えと一致する。
【００５５】
本発明の化合物はイン ビボにおいて腫瘍成長を実質的に減少させずそして停止さえしないことは、ヒト腫瘍又はマウス異種移植片のいずれかを有するマウスに本発明の化合物を投与したことで示される。本発明の化合物を、ＦａＤｕ頭及び首の癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに毎日投与した場合、ＦａＤｕ腫瘍成長の著しい阻害が本発明の化合物を用いた毎日の処理後に観察された（処理／対照腫瘍容積、Ｔ／Ｃ＝０．４、ｐ＝＜０．００１）。腫瘍細胞死を、循環する異種移植片誘導サイトケラチン（ＣＫ１８）を測定することにより分析した。サイトケラチン−１８はアポトーシスのための生体指標である（２１、２２）。全ヒトＣＫ１８の血漿レベルの著しい増加が観察された（ｐ＝０．０１）。カスパーゼ開裂ＣＫ１８（ＣＫ１８−Ａｓｐ３９６）のレベルは全レベルと比較して、中程度に増加し、本発明の化合物はイン ビボで腫瘍細胞に対して活性を有することを示唆する。本発明の化合物はまた、ベヒクル処理対照と比べて、腫瘍開始の著しい遅れにより示されるように、ヌードマウス中のＨＴＣ−１１６Ｂｃｌ２＋結腸癌異種移植片の腫瘍開始を阻害することも示された。同様に、本発明の化合物は、低頻度投与スケジュールを用いた共通遺伝子マウスモデルにおいて、腫瘍成長を阻害する。
【００５６】
ユビキチンＣ−末端加水分解酵素（ＵＣＨ）及びユビキチン特異性タンパク質分解酵素（ＵＳＰ）は、ヒトゲノムによりコードされたほぼ１００のＤＵＢｓの主なサブグループである（２３）。１９Ｓ ＲＰにおけるＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４に対する本発明の化合物の特異性のメカニズムは、該１９Ｓ ＲＰ中のこれらの酵素のユニークな配置構造に関係するか、又は１９Ｓ ＲＰ構造の薬物誘発変更によるかもしれない。本願の発見は、ＵＣＨＬ５及びＵＳＰ１４の両方の損失は、いずれか１つの損失とは違って、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積及び細胞タンパク質分解の阻害に導くことを示す当業界の報告（２４）と一致する。
【００５７】
ＤＵＢ阻害は高分子量ユビキチン基質複合体に関係するという観察は、特に関連があるようである。シャベロン遺伝子の強い発現が、本発明の化合物で処理した細胞に観察されたが、タンパク質毒性反応の誘発を示す。本発明の化合物によるＤＵＢ阻害の結果として蓄積する高分子量ユビキチン−基質複合体は、強い細胞毒性を発生するようである。
【００５８】
以下に本発明を、多くの図を含む図面により例示された好ましい態様を参照して、より詳しく記述する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１ａ−１ｏ】本発明の化合物の具体例によりレポーター細胞系ＨＴＣ−１１６に連続して化合物を７２時間暴露した後の用量依存性細胞毒性の誘発、並びに本発明に含まれない構造的に関連する化合物によるかかる誘発の不存在を示す、ＦＭＣＡ（蛍光分析微細培養細胞毒性アッセー）で測定したグラフである。処理細胞は、未処理の対照と比較した（生存インデックス）。
【図２ａ−２ｅ】生理学的ｐＨにおける水性媒体中の本発明の化合物の優れた溶解性を示すグラフである。
【図３ａ−３ｆ】図１ａ−１ｏの方法による、本発明に含まれない構造的に対応するピペリジン−４−オン化合物に対して本発明のアゼパノン化合物の優れた細胞毒性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
方法
イン ビトロプロテアソーム活性アッセーを、黒９６穴マイクロタイタープレート中で、反応バッファ（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０３％ＳＤＳ）中のヒト２０Ｓプロテアソームを使用して、プロテアソーム活性用の基質としてＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ，Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ又はＢｏｃ−ＬＲＲＡＭＣを用いて行う。脱ユビキチナーゼ活性アッセーを、ヒト１９Ｓ  ＲＰ（ボストン  ビオケム）を用いて、基質としてユビキチン−ＡＭＣを用いて行う。ＦａＤｕ異種移植片研究のために、１ｘ１０６細胞を含む１００μｌ細胞懸濁液を、ＳＣＩＤの脇腹に皮下注射する。腫瘍取得後、マウスを対照群又は処理群にランダム化し、そして５ｍｇｋｇ−１の本発明の化合物又はビヒクルを投与する。イン  ビボレベルのアポトーシス及び細胞死を、Ｍ３０  Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）及びＭ６５  ＥＬＩＳＡ（登録商標）アッセー（Ｐｅｖｉｖａ）を用いて、血漿中の開裂したカスパーゼの検出及びサイトケラチン−１８の合計レベルから決定する。該方法を以下に詳細に記載する。
【００６１】
試薬：試薬を下記の源から得た：２０Ｓプロテアソーム（Ｅ−３６０），２６Ｓプロテアソーム（Ｅ−３６５），１９Ｓプロテアソーム（Ｅ−３６６），Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（Ｓ−２８０），Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ（Ｓ−２３０）、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ（Ｓ−３００），ユビキチン−ＡＭＣ（Ｕ−５５０），テトラ−ユビキチンＫ６３（ＵＣ−３１０）、テトラ−ユビキチンＫ４８（ＵＣ−２１０）、脱結合酵素セット（ＫＥ１０）、ＨＡ−ユビキチンビニルスルホン（Ｕ−２１２）（ボストンビオケム）；抗βアクチン（ＡＣ−１５），ＯＤＣ−１（ＨＰＡ００１５３６）（シグマ  アルドリッヒ）；抗−ＬＣ−３（２７７５），抗−ＧＡＰＤＨ（２１１８）、抗−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（４６９５）、抗−ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（９１０１）（細胞シグナル化）；Ｎ−エチルマレイミド（３４１１５）（ＥＭＤケミカルズ）；抗ユビキチンＫ４８（Ａｐｕ２）、抗ユビキチン（ＭＡＢ１５１０）（ミリポア）；抗−ｐ５３（ＤＯ１），抗−ＵＣＨＬ５（Ｈ−１１０），Ｈｄｍ２（ＳＭＰ１４）（サンタ  クルズ）；抗−ＰＡＲＰ（Ｃ２−１０），抗−ｐ２７（Ｇ１７３−５２４），抗−活性カスパーゼ３（Ｃ９２−６０５）（ＢＤ  ビオサイエンシーズ）；抗−ＵＳＰ１４（Ａ３００−９１９Ａ）（ベチル  ラボラトリーズ）；抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）（ロッシュ）。ボルテゾミブを、スエーデン国カロリンスカ病院、腫瘍学部から得た。
【００６２】
細胞培養：ＭＣＦ７細胞を、ＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清中に維持する。ＨＴ−１１６  ｐ５３＋／＋，ｐ５３−／−，Ｂｃｌ−２＋／＋，ＰＵＭＡ−／−，及びＢＡＸ−／−細胞をＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ修飾培地／１０％ウシ胎仔血清中に維持する。該ＨＴ−１１６ ｐ５３＋／＋，ｐ５３−／−，ＰＵＭＡ−／−，及びＢＡＸ−／−が記載されたように生成する（２５）。該ＨＴ−１１６ Ｂｃｌ−２＋／＋細胞系を、親のＨＴ−１１６ｐ５３＋／＋細胞にｐＣＥＰ４ Ｂｃｌ−２（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ１６４６１）をトランスフェクトし（２６）そして高発現クローンを単離することにより生成した。ＦａＤｕ及びＬＬＣ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ピルビン酸Ｎａ塩、Ｈｅｐｅｓ及び非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地中に維持する。４Ｔ１．１２Ｂガン細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地中に維持する。プロテアソームレポーター細胞系Ｍｅ１ＪｕＳｏ  Ｕｂ−ＹＦＰを、記載されたように生成した（１２）。細胞をダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）修飾イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地／１０％ウシ胎仔血清中に維持した。網膜上皮細胞系を記載されたように生成した（１２）。全ての細胞をダルベッコ修飾イーグル培地／１０％ウシ胎仔血清中に維持する。網膜上皮細胞系を記載されたように生成した（２８）。全ての細胞を３７℃で５％ＣＯ２中に維持する。
【００６３】
プロテアソーム及びＤＵＢ阻害アッセー：２０Ｓ ＣＰ（２ｎＭ）（ボストン  ビオケム）を使用したイン  ビトロプロテアソーム活性アッセーを、３７℃で１００μｌ反応バッファ（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０３％ＳＤＳ）中で行う。サンプルを指示した化合物を用いて１０分間培養し、次いで、クロモトリプシン様、カスパーゼ様及びトリプシン様活性の検出のために、それぞれ１０μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ，Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ又はＢｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣを添加する。ＤＵＢ阻害アッセーには、１９Ｓ ＲＰ（５ｎＭ），２６Ｓ（５ｎＭ），ＵＣＨ−Ｌ１（５ｎＭ）、ＵＣＨ−Ｌ３（０．３ｎＭ）、ＵＳＰ２ＣＤ（５ｎＭ）、ＵＳＰ７ＣＤ（５ｎＭ）、ＵＳＰ８ＣＤ（５ｎＭ）及びＢＡＰ１（５ｎＭ）を、本発明の化合物を用いて培養し、ついでユビキチン−ＡＭＣ（１０００ｎＭ）を添加する。蛍光発光を、３６０ｎｍ励起及び４６０ｎｍ発光フィルターを備えたＷａｌｌａｃ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  カウンター又はＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００を用いて監視する。
【００６４】
基質オーバーレイアッセー：自然（ｎａｔｉｖｅ）ゲル電気泳動を記載されたように（２９）行う。要約すると、精製２６Ｓプロテアソーム（ボストン  ビオケム）４μｇを１０μＭ又は５０μＭの本発明の化合物と混合し、そして３７℃で１０分間培養する。サンプルを４％非変性ＰＡＧＥ上で解像する。ゲルをアッセーバッファ（２０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＡＴＰ，０．１ｍＭ Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ）中に潜らせ、そしてプロテアソームをＵＶ照明下で可視化する。
【００６５】
ユビキチン開裂アッセー：組み換えＵｂ−ＧＦＰプラスミドｐｅｔ１９ｂ Ｕｂ−Ｍ−ＧＦＰを記載されたように（３０）して生成する。要約すると、組み換えＵｂ−ＧＦＰをＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から、Ｈｉｓアフィニティ精製により精製する。開裂アッセーに、１９Ｓ ＲＰ（２５ｎＭ）を１０ｍＭのＮＥＭ、２５０μＭのＴＰＥＮ又は５０μＭの本発明の化合物を用いて１０分間培養し、次いで組み換えＵｂ−ＧＦＰ（２００ｎＭ）を添加する。ユビキチン鎖分解反応を、Ｕｂ−ＧＦＰをＫ４８−又はＫ６３−結合ユビキチンテトラマー（５０ｎｇ）に置き換えた以外は本質的に前述のように行う。Ｕｂ−ＧＦＰ開裂又はユビキチン分解のレベルは、抗ユビキチン抗体を用いた免疫ブロット法により決定する。ユビキチン化Ｈｄｍ２基質を、ボストン  ビオケムプロトコル（Ｋ−２００）に従って生成する。開裂アッセーに、１９Ｓ ＲＰ（２５ｎＭ）を５０μＭの本発明の化合物又はＤＭＳＯを用いて１０分間培養し、次いでユビキチン化Ｈｄｍ２基質（１００ｎＭ）を添加する。ユビキチン化Ｈｄｍ２基質及びユビキチン化Ｈｄｍ２の開裂は、抗Ｈｄｍ２抗体を用いた免疫ブロット法により決定する。
【００６６】
プロテアソーム単離：ＨＣＴ−１１６細胞をボルテゾミブ（１００ｎＭ）又は本発明の化合物（１μＭ）で３時間処理する。刺激の後、該細胞を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．０２５％ジギトニン中に溶解する。サンプルを軽く超音波分解し、氷上で１５分間培養する。これらのサンプルからのプロテアソームを、製造者のプロトコルに従って単離する。
【００６７】
ＤＵＢｓのＵｂＶＳラベル付け：細胞溶解物中のＤＵＢｓのラベル付けに、サブコンフルエント細胞をトリプシン化により収穫し、ＰＢＳで３回洗い、そして１５００ＲＰＭで５分間遠心分離する。細胞ペレットをバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ）を用いて氷上で１５分間溶解する。破片を遠心分離により除去し、２５μｇのタンパク質を１μＭのＨＡ−ＵｂＶＳで３７℃にて３０分間ラベル付けする。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、そして指示した抗体を用いて免疫ブロット法により分析する。
【００６８】
細胞アポトーシス及び生存率の決定：アポトーシスの決定のために、親のＨＣＴ−１１６ｐ５３＋／＋細胞を増加する用量の本発明の化合物で２４時間処理する。処理用量は、最大アポトーシスを２４時間の期間にわたって生じる薬物濃度に基づく。ＨＣＴ−１１６細胞を９６穴マイクロタイタープレートに、穴当たり１０，０００細胞で播種し、そして一晩培養する。細胞を指示した薬物で２４時間処理する。培養期間の終わりに、ＮＰ４０を組織培養培地に０．１％となるように加え、各穴の内容物の２５μｌを、Ｍ３０−Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡを使用して前に記載されたようにして（３１）検定した。細胞生存率を、酸ホスファターゼ活性を測定するか、又はＦＭＣＡ法（３２）を用いて決定する。酸ホスファターゼ活性のために、細胞を９６穴培養プレートに、１穴当たり５，０００細胞で播種し、そして３７℃で１２時間培養する。化合物を成長培地内の該細胞に添加し、そして３７℃で７２時間培養する。細胞を２００μｌの温ＰＢＳで洗う。酢酸ＮａバッファｐＨ５（ＮａＡｃ０．１Ｍ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中のパラーニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ，２ｍｇ／ｍｌ）を１穴当たり１００μｌ添加する。細胞を２時間培養し、その後、反応を、１Ｎ  ＮａＯＨの添加により停止した。吸光率を４０５ｎｍで測定する。本発明の化合物の多くの具体例の用量依存性細胞毒性を図１ａ−１ｏに示す。
【００６９】
ＦＭＣＡアッセーのために、細胞を薬物調製された３８４穴プレートに、滴下ロボットＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  ２０００（ビオ−テク  インストルメンツ社（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）、ウィノースキー、ＶＴ）を使用して播種する。該プレートを７２時間培養し、次にＣＯ２培養器（Ｃｙｔｏｍａｔ  ２Ｃ，ケンドロ、ソレンツナ、スエーデン）を有するＯＲＣＡロボット（ベックマン  コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））、ディスペンサーモジュール（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  ３８４，Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、ワッシャーモジュール（ＥＬｘ４０５、ビオ−テク  インストルメンツ社）、脱蓋ステーション、プレートホテル、バーコード読取り器（ベックマン  コールター）、液ハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００、ベックマン  コールター）及び多目的読取り器（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ、ビーエムジー  ラブテク  ゲーエムベーハー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）、オッフェンバーグ、ドイツ）から成る一体型ＨＴＳ  ＳＡＩＧＡＮ  Ｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍに、自動ＦＭＣＡのために移す。生存インデックス（ＳＩ）を、ブランク値を差し引いて、対照に対するテスト穴の蛍光のパーセントと定義する。
【００７０】
細胞サイクル分析：細胞サイクルの決定のために、ＨＣＴ−１１６細胞を本発明の化合物又はＤＭＳＯで処理し、細胞をトリプシン化により収穫し、洗い、そして７０％氷冷EtOH中に12時間固定する。該細胞を、ＰＢＳ中にヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）及びＲＮＡｓｅＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を含む染色溶液に再度懸濁する。サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳｃｌｉｂｕｒ上で操作する。細胞サイクルの各相中の細胞パーセントを、ＭｏｄＦｉｔソフトウェアを用いて決定する。
【００７１】
実施例１.  本発明の化合物の好ましい態様の例示的合成法
一般的情報：使用したすべての溶剤はHPLC等級又はそれ以上である。水性条件が要求される場合は、過剰量の3オングストローム分子篩（モレキュラーシーブ）を溶剤に、使用より少なくとも24時間前に添加して、乾燥を確保する。1H NMR 核磁気共鳴(NMR)をBruker Advance DPX 400分光計上に400.1 MHzで記録した。低解像エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを、Agilent質量分光計を用いて、正のイオン化モードで得た。フラッシュクロマトグラフィーをシリカゲル60 (230‐400メッシュ)上で行った。分析LCMSデータを、Agilent 質量分光計; Agilent 1100システム; A: ACE C8 カラム(50x3.0mm, 5μM);勾配:10‐97%水中のアセトニトリル/0.1 % TFA、3分、1.0 mL/分、又はB: xBridge C18カラム(3.5&micro;M. 50x3.0mm)、勾配 10 % 〜97 %10 mM NH4HCO3(pH 10)中のアセトニトリル、３分、1mL/分)を用いて行った。化学構造の名称を、Marvin Scech 5.2.6, ChemAxonを用いて決定した。
(3E, 5E)‐3,5‐ビス(フェニルメチリデン)アゼパン‐4-オン(No.1516)及び(3E, 5E)‐3,5‐ビス(4‐メトキシフェニルメチリデン)‐アゼパン‐4-オン (No.1517)
【００７２】
ヘキサヒドロ‐4H‐アゼピン‐4-オン(0.45 g, 3.0 mmol)を、ベンズアルデヒド (0.70 g,7.0 mmol)、4‐メトキシベンズアルデヒド(0.90 g, 7.0 mmol)又は4‐クロロベンズアルデヒド(0.92 g,7.0 mmol)のいずれかと共に、酢酸(10 mL)に溶かした。次に硫酸(濃硫酸 1 mL)を滴下し、そして反応物を２４時間室温で攪拌した。水(30 mL)を加え、そして沈殿物を濾過し、そして一晩減圧乾燥した。更なる沈殿は確認されなかった。化合物No.1516が、LCMS (システム10 A) MS ESI+ m/z 290 [M+H]+で決定して99％の純度で得られた。化合物No.1517もまた、LCMS (システム10 A) MS ESI+ m/z 350 [M+H]+で決定して99％の純度で得られた。化合物No.1518は、LCMS (System A). MS ESI+ m/z 358 [M]+, 360 [M+2]+で91%の純度で得られた。
【００７３】
(3E, 5E)‐3,5‐ビス(フェニルメチリデン)‐1‐(プロパ‐2‐エノイル)‐アゼパン‐4-オン (No.1520)
(3E, 5E)‐3,5‐ビックス(フェニルメチリデン)アゼパン‐4-オン(No.1516)(50.0 mg, 0.182 mmol)及びアクリル酸(14.4 mg, 0.20 mmol)、HBTU (58.4 mg, 0.182 mmol)、トリエチルアミン(36.7 mg,0.364 mmol)をDMF(2 mL)中に溶かし、一晩攪拌した。酢酸エチル及び食塩水を加え、生成物を抽出した。合わせた有機層を乾燥しそして蒸発させた。粗製生成物をメタノールで希釈し、そして分離用HPLCで精製した。化合物No.1520が96%純度で得られた。MS‐ESI+ m/z 344 [M+H]+
【００７４】
(2R)‐[(3E, 5E)‐3,5‐ビス(4‐ニトロフェニルメチリデン)‐4‐オキソ‐1‐(ピロリジン‐2‐イル‐カルボニル)‐アゼパントリフルオロアセテート (No.1505)
N−Bocアゼパノン(100 mg, 0.47 mmol)及び4−ニトロベンズアルデヒド(156 mg, 1.03 mmol)を酢酸(10 mL)に溶かした。次に硫酸(濃硫酸1mL)を滴下し、そして反応物を室温で3日間攪拌した。次に更なるアルデヒド及び硫酸を加え、反応物を更に24時間攪拌し、更なる酸を2回、24時間離して加えた。反応物を水の添加で急冷し、沈殿した粗製中間体を濾取し、そして水で洗い、乾燥後、生成物を一晩減圧乾燥後、2 x 35 mg (0.09 mmol)の粗製中間体を２つのフラスコ内に秤量して入れ、DCM/DMF(2 mL, 4:1)中のコハク酸モノエチル(14.8 mg, 0.10 mmol)に溶解した。トリエチルアミン(19.3 μL, 0.14 mmol)を加え、そして混合物を5分間攪拌し、HATU(38.6 mg, 0.10 mmol)を添加した。12時間攪拌を続けた後、更にトリエチルアミン及びHATUを加え、そして攪拌を4時間続けた。該溶剤を蒸発させ、そして残渣を分取HPLCにより精製した。残渣をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(5 mL, 4:1)に溶解させ、40分間攪拌し、そして再度濃縮した。化合物No.1505をLCMS(システムA)により93％の純度で得た。MS ESI+ m/z 477[M+H]+。
【００７５】
実施例２．本発明の化合物の好ましい態様の更なる例示的合成法
(2R)‐2‐{[(3E,5E)‐3,5‐ビス[(4‐ニトロフェニル)メチリデン]‐4‐オキソアゼパン‐1‐カルボニルl}ピロリジニウムトリフルオロアセテート(化合物No.1505)
N‐boc アゼパン‐4-オン(0.10 g, 0.47 mmol)及び4‐ニトロベンズアルデヒド(156 mg, 1.0 mmol)を酢酸(10 mL)に溶解させ、濃H2SO4(1mL)を滴下し、そして反応物を室温で週末攪拌した。更なるアルデヒド(156 mg)及びH2SO4(1mL)を添加し、攪拌を室温で一晩続けた。別のmLの濃H2SO4を添加し、そして添加し、反応物を一晩再び攪拌した。濃H2SO4をもう一度添加し、そして反応物を完全(2週間)になるまで攪拌した。水を添加すると、褐色の沈殿物が形成し、濾取し、水で洗い、そして減圧下で乾燥して、339.5 mgの褐色固体中間体1を得たが、それを更に精製することなく使用した。中間体1(35 mg, 0.09 mmol)及びN‐bocプロリン(22 mg, 0.10 mmol)をDCM/DMF(4:1, 2 mL)に溶解した。TEA(19 &micro;L, 0.14 mmol)を添加し、そして混合物を5分間攪拌し、次にHATU(38.6 mg, 0.10 mmol)を添加し、そして反応物を室温で一晩攪拌した。更なるTEA(19 &micro;L, 0.14 mmol)及びHATU(38.6 mg, 0.10 mmol)を添加し、そして反応物を更に4時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、次に分取LC(0.1% TFA 中40‐70 % ACN)で精製して、生成物を黄色固体として得た。該固体をDCM/TFA(4:1, 5 mL)に溶解し、次に該溶液を室温で40分間攪拌して、boc保護基を除いた。生成物のTFA塩を黄色固体として93%の純度で回収した。LCMS A: Rt 1.94/1.99, m/z [M+H]+ 477.1, B: Rt 2.28。
【００７６】
(3E,5E)‐1‐(4‐エトキシ‐4‐オキソブタノイル)‐3,5‐ビス[(4‐ニトロフェニル)メチリデン]‐4‐オキソアゼパン‐1‐イウムトリフルオロアセテート(化合物No.1507)
中間体1(35 mg, 0.09 mmol)及びN‐bocプロリン(22 mg, 0.10 mmol)をDCM/DMF(4:1, 2 mL)に溶解した。TEA (19 &micro;L, 0.14 mmol)を添加し、そして混合物を5分間攪拌し、次にHATU(38.6 mg, 0.10 mmol)を添加し、そして反応物を室温で一晩攪拌した。更なるTEA(19 &micro;L, 0.14 mmol)及びHATU(38.6 mg, 0.10 mmol)を添加し、そして反応物を更に4時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、次に分取LC(0.1% TFA 中40‐70 % ACN)で精製して、生成物のTFA塩を95％純度の黄色固体として得た。LCMS A: Rt 2.48/2.50 m/z [M+H]+508.1. B: Rt 2.48/2.52。
【００７７】
(3E, 5E)‐3,5‐ビス[(4‐クロロフェニル)メチリデン]アゼパン‐4-オン(化合物No.1518)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(0.45 g, 3.0 mmol)及び4‐クロロベンズアルデヒド(0.92 g, 6.635mmol)を酢酸(10 mL)に溶解し、濃H2SO4(1 mL)を滴下し、反応物を室温で24時間攪拌した。水(30 mL)の添加後、沈殿物が形成し、濾取し、そして減圧下で乾燥して、生成物を91%純度で黄色固体として得た。LCMS A: Rt 2.04 m/z [M]+ 358.1。
【００７８】
(3E,5E)‐3,5‐ビス(フェニルメチリデン)‐1‐(プロパ‐2‐エノイル)アゼパン‐4-オン (化合物No.1520)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(50 mg, 0.182 mmol)、アクリル酸(14 &micro;L, 0.20 mmol)、TBTU(58 mg, 0.182 mmol)及びTEA(37 mg, 0.364 mmol)をDMF(2 mL)中に溶解し、そして室温で一晩攪拌した。塩水及び酢酸エチルを添加し、そして相を分離した。有機相を乾燥し、そして溶剤を濾過後に蒸発させた。粗製生成物を酢酸(2 mL)及びH2SO4(0.2 mL)に溶解した。ベンズアルデヒド(50 &micro;L)を添加し、反応物を24時間攪拌した。メタノール及び水を該混合物に添加し、それを分取LCで精製した。標題の化合物を96%純度で黄色固体として単離した。LCMS A: Rt 2.68 m/z [M+H]+ 344.1。
【００７９】
(3E,5E)‐3,5‐ビス(フェニルメチリデン)‐1‐シクロブタンカルボニルアゼパン‐4-オン(化合物No.1521)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(50 mg, 0.182 mmol)、シクロ酪酸(14 &micro;L, 0.20 mmol)、TBTU(58 mg, 0.182 mmol)及びTEA(37 mg, 0.364 mmol)をDMF(2 mL)に溶解し、 そして室温で一晩攪拌した。塩水及び酢酸エチルを添加し、そして相を分離した。有機相を乾燥し、そして溶剤を濾過後に蒸発させた。粗製生成物を酢酸(2 mL)及びH2SO4(0.2 mL)に溶解した。ベンズアルデヒド(50 &micro;L)を添加し、反応物を24時間攪拌した。メタノール及び水を混合物にそれを分取LCで精製した。標題化合物を96%純度で黄色固体として単離した。LCMS A: Rt 2.68 m/z [M+H]+ 372.1。
【００８０】
(3E,5E)‐1‐(2‐シクロプロピルアセチル)‐3,5‐ビス[(4‐メトキシフェニル)メチリデン]アゼパン‐4-オン(化合物 No.1526)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(0.45 g, 3.0 mmol)及び4‐メトキシベンズアルデヒド(0.90 g, 6.6 mmol)を酢酸(10 mL)に溶解し、濃H2SO4(1mL)を滴下し、そして反応物を室温で24時間攪拌した。水(30 mL)を添加した。沈殿物を濾取し、減圧下で一晩乾燥した。粗製材料(30 mg,0.107 mmol)、シクロプロピル酢酸(12 mg, 0.12 mmol)、TBTU(41 mg, 0.13 mmol)及びTEA(26 mg, 0.26 mmol)をDMF(2 mL)に溶解し、そして室温で一晩攪拌した。メタノール(1.5 mL)及び水(0.5 mL)を添加し、生成物を分取LCで精製して、固体生成物を95%純度で得た。LCMS A: Rt 2.51 m/z [M+H]+ 432.2。
【００８１】
(3E,5E)‐5‐[(3‐ニトロフェニル)メチリデン]‐3‐(フェニルメチリデン)アゼパン‐4-オン(化合物 No.1560)
N‐boc‐アゼパン‐4-オン(0.10 g, 0.47 mmol)および3‐ニトロベンズアルデヒド(156 mg, 1.0 mmol)を酢酸(5 mL)に溶解し、濃H2SO4(0.5mL)を滴下し、そして反応物を室温で4日間攪拌した。次にさらに濃H2SO4(0.5mL)及びアルデヒド(156 mg, 1.0 mmol)を添加し、そして攪拌を室温で3週間続けた。モノ‐及びジ‐縮合生成物の混合物を得た。該混合物をカラムクロマトグラフィー(DCM/メタノール)で精製して、中間体アミンである中間体2を褐色油(19 mg)として得た。中間体2をベンズアルデヒドと共に酢酸(1.5 mL)中に溶解した。濃H2SO4(0.05 mL)を添加し、そして反応物を室温で一晩攪拌した。次に更にH2SO4を添加し、攪拌を1週間続けた。更なるアルデヒド(156 mg, 1.0 mmol)及びH2SO4を添加し、攪拌を更に4日続けた。反応混合物濃縮し、そして分取LCにより精製して、生成物のTFA塩を黄色固体として98%純度で得た。LCMSシステムA: Rt 1.78 m/z [M+H]+335.1, システムB: Rt 2.43/2.28。
【００８２】
(3E,5E)‐1‐メチル‐3,5‐ビス[(4‐ニトロフェニル)メチリデン]アゼパン‐4-オン(化合物 No.1563)
N‐メチルアゼパン‐4-オン&#8729;HCl(50 mg, 0.30 mmol)及び4‐ニトロベンズアルデヒドを酢酸(5 mL)に溶解し、そして10分間攪拌し、次に濃H2SO4(50 &micro;L)をゆっくり添加し、そして混合物を室温で一晩攪拌した。更なる濃H2SO4(100 &micro;L)を添加し、そして攪拌を室温で6時間続けた。追加の500 &micro;Lの濃H2SO4を添加し、反応物を一晩攪拌した。更なる350 &micro;Lの濃H2SO4を添加し、攪拌を室温で追加の5時間続けたが、その期間に更にH2SO4を2つの部分(500 &micro;L及び250 &micro;L)で添加した。次に水( 3 x 反応物容積)を添加し、そして混合物を室温に達するまで攪拌した。反応混合物を酢酸エチル(3 x反応物容積)で抽出した。（複数の）相を分離し、有機相を濃縮して、暗黄色粘性油を得た。粗製生成物を分取HPLC(XBridgeカラム;溶出剤 pH 10 の50 mM炭酸アンモニウムバッファ及びメタノール)で精製して、標題生成物を黄色固体(26.3 mg)として得た。LCMS システム A: Rt 1.87 m/z [M+H]+ 394.1, システム B: Rt 2.57。
【００８３】
(3E,5E)‐3,5‐ビス[(4‐フルオロフェニル)メチリデン]‐1‐プロピルアゼパン‐4-オン(化合物 No.1574)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(0.25 g, 1.68 mmol)及び4‐フルオロベンズアルデヒド(0.416 g, 3.36 mmol)を酢酸(20 mL)に溶解し、そして溶液を10分間攪拌し、次に濃H2SO4 (200 &micro;L)をゆっくり添加し、そして溶液を室温で一晩攪拌した。さらに濃H2SO4 (1 mL)を添加し、そして室温で攪拌を続けた。別のmLの濃H2SO4を6時間後に添加し、そして反応物を再び一晩攪拌した。翌日、更に800 &micro;Lの濃H2SO4を添加し、そして攪拌を5日間続けたが、その間、２つの部分のH2SO4 (1mL 及び0.5 mL)を添加して、反応混合物を得た。次に水(3 x 反応物容積)を添加し、そして混合物を、室温に達するまで攪拌した。反応混合物を酢酸エチル(10 x 反応物容積)で抽出した。有機相を蒸発により濃縮した。残滓に水を添加した。沈殿物が形成し、濾取した。固体を水で洗い、減圧下で乾燥して、中間体3を黄色固体として得た。その一部分(15 mg, 0.05 mmol)をDCE‐プロパナール(4&micro;L, 0.06 mmol)に溶解し、そして混合物を室温で15分間攪拌した。次にNaBH(OAc)3 (15.7mg, 0.07 mmol)及び酢酸(2.6 &micro;L, 0.05 mmol)を添加し、そして反応物を室温で一晩攪拌した。反応物を濃縮し、そして粗製生成物を分取LCで精製して、生成物(7.2 mg)を90% 純度で得た。 LCMS システム A: Rt 2.02 m/z [M+H]+ 368.1,システム B: Rt 3.21。
【００８４】
(3E,5E)‐3‐[(4‐メトキシフェニル)メチリデン]‐5‐[(4‐ニトロフェニル)メチリデン]アゼパン‐4-オン(化合物 No.1575)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(0.25 g, 1.68 mmol)及び4‐ニトロベンズアルデヒド(253 mg, 1.68 mmol)を酢酸(20 mL)に溶解し、10分間攪拌し、次に濃H2SO4 (1 mL)をゆっくり添加し、そして混合物を室温で8日間攪拌した。それらの日々、1日当たり1‐3部分の濃H2SO4を添加した(0.5 mL, 0.75 mL 及び0.5 mL)。水(2 x反応物容積)を添加し、そして混合物を酢酸エチル(2 x 反応物容積)で抽出した。有機相を蒸発により濃縮し、そして乾燥して、粗製中間体4を得た。中間体4の一部分(100 mg, 0.41 mmol)を酢酸(6 mL)に溶解し、10分間攪拌し、次に濃H2SO4(0.6 mL)をゆっくり添加し、そして反応物を室温で6日間攪拌した。水を添加すると、生成物が黄色固体として沈殿した。沈殿物を濾取し、水で洗い、そして減圧乾燥して、標題化合物を黄色固体として98%純度で得た。LCMSシステム A: Rt 1.82 m/z [M+H]+365.1, システム B: Rt 2.41。1H‐NMR (400 MHz, CDCl3) [ppm] = 2.97‐2.99 (m, 2H), 3.41‐3.44 (m, 2H), 3.83 (bs, 3H), 4.28 (s, 2H), 7.06‐7.08 (d, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.59‐7.62 (d, 2H), 7.76 (s,15    1H), 7.78‐7.80 (d, 2H), 8.27‐8.29 (d, 2H)。
【００８５】
(3E,5E)‐5‐[(4‐フルオロフェニル)メチリデン]‐3‐[(4‐メトキシフェニル)メチリデン]‐1‐メチルアゼパン‐4-オン(化合物 No.1577)
N‐メチルアゼパン‐4-オン塩酸塩(75 mg,0.46 mmol)及び4‐フルオロベンズアルデヒドを酢酸(7 mL)に溶解し、そして10分間攪拌し、次に濃H2SO4 (350&micro;L)をゆっくり添加し、混合物を室温で8日間攪拌した。2‐4日の間(それぞれ0.175 mL, 0.35 mL, 0.25 mL)更に濃H2SO4を添加した。水を添加し、そして溶液を酢酸エチル(反応混合物の容積の2倍)で抽出した。有機相を濃縮して、中間体5を得た。この中間体の一部分(35 mg, 0.15 mmol)及び4‐メトキシベンズアルデヒド(17 &micro;L, 0.15 mmol)を酢酸(2.5 mL)に溶解し、そして10分間攪拌し、次に濃H2SO4(0.20 mL)をゆっくり添加し、そして反応物を5日間攪拌した。水(2 x 反応物容積)を添加し、そして反応混合物を酢酸エチル(2 x 反応物容積)で抽出した。有機層を濃縮し、水を添加した。沈殿物が形成され、濾取して標題生成物(11.2 mg)を91%純度で黄色固体として得た。LCMS システムA: Rt 1.86 m/z [M+H]+ 352.1, システム B: Rt 2.79。
【００８６】
(3E,5E)‐1‐アセチル‐5‐[(4‐フルオロフェニル)メチリデン]‐3‐[(4‐エトキシフェニル)メチリデン]アゼパン‐4‐オン(化合物No.1579)
アゼパン‐4-オン塩酸塩(0.25 g, 1.68 mmol)及び4‐フルオロ‐ベンズアルデヒド(179 &micro;L, 1.68 mmol)を酢酸(20 mL)に溶解し、10分間攪拌し、次に濃H2SO4 (1 mL)をゆっくり添加し、そして混合物を室温で8日間攪拌したが、はじめの3日間濃H2SO4を添加した(それぞれ0.5 mL, 0.75 mL及び0.5 mL)。水(2 x 反応物容積)を添加し、そして混合物を酢酸エチル(2 x 混合物容積)で抽出した。有機相を濃縮し、そして乾燥して、粗製中間体6を得た。この中間体(100 mg, 0.46 mmol)の一部分を酢酸(6 mL)に溶解し、そして10分間攪拌し、次に濃H2SO4 (0.6 mL)をゆっくり添加し、そして反応物を室温で7日間攪拌した。水を添加し(1 x 容積)、混合物を飽和水性NaHCO3で中和した。形成した沈殿物を濾取し、水で洗い、減圧乾燥して、中間体7(31.5 mg)を91%純度の黄色固体として得た。LCMS システム A: Rt 1.85 m/z [M+H]+ 338。中間体7(10 mg)をDCM(1 mL)に溶解し、TEA (5.0 &micro;L, 0.04 mmol)を添加した。混合物を10分間攪拌し、次にアセチルクロリド(2.3 &micro;L, 0.03 mmol)を添加し、そして反応物を室温で30分間攪拌した。反応物を水、飽和水性NaHCO3及び塩水で洗った。有機相を濃縮して、標題化合物(6.4 mg)を90%純度の黄色固体として得た。LCMS システムA: Rt 2.35 m/z [M+H]+ 380.1, システムB: Rt 2.37。1H‐NMR (400 MHz, CDCl3): [ppm] = 1.70, 1.90, 1.98 及び1.99 (4 x s, 3H, CH3CO‐, ２つの位置異性体及びそれらの酢酸塩回転異性体からのシグナル), 2.89‐3.01 (m, 2H), 3.68‐3.77 (m, 2H),3.79, 3.79, 3.79, 3.08 (4 x s, 3H, ‐OMe, ２つの位置異性体及びそれらの酢酸塩回転異性体からのシグナル), 4.65‐4.68 (m, 2H), 7.0‐7.04 及び7.098‐7.103 (2 x m, 2H), 7.22‐7.30 (m, 3H), 7.48‐7.62 (m, 5H)。
【００８７】
(3E,5E)‐5‐[(4‐クロロフェニル)メチリデン]‐3‐[(4‐ニトロフェニル)メチリデン]アゼパン‐4-オン(化合物No.1583)
N‐メチルアゼパン‐4-オン 塩酸塩(75 mg, 0.46 mmol)及び4‐クロロベンズアルデヒド(64 mg, 0.46 mmol)を酢酸(7 mL)に溶解し、10分間攪拌し、次に濃H2SO4 (350 &micro;L)をゆっくり添加し、そして混合物を室温で8日間攪拌した。それらに日々の2‐4日間(それぞれ0.175 mL, 0.35 mL, 0.25 mL)、更なる濃H2SO4を添加した。水(2 x 反応物容積)を添加し、溶液を酢酸エチル(2 x 反応物 volume)で抽出した。有機相を濃縮して、中間体8を得た。該中間体の一部分(35 mg, 0.14 mmol)及び4‐ニトロベンズアルデヒド(69.5 mg, 0.46 mmol)を酢酸(2.5 mL)に溶解し、10分間攪拌し、次に濃H2SO4(200&micro;L)をゆっくり添加し、そして混合物を室温で5日間攪拌した。更なる濃H2SO4(0.2 mL)を添加し、そして攪拌を更に5日間続けた。水(2 x 反応物容積)を添加し、そして溶液を酢酸エチル(2 x 反応物容積)で抽出した。有機相を濃縮し、そして残滓を分取LCで精製して、標題化合物(1.8 mg)を94％純度の黄色固体として得た。LCMS システムA: Rt 1.98/2.04 m/z [M+H]+ 383.1, システムB: Rt 2.82/2.98。
【００８８】
略語
Boc      tert‐ブトキシカルボニル
CAN      アセトニトリル
DCM      ジクロロメタン
TFA      トリフルオロ酢酸 
DMF      ジメチルホルムアミド
TEA      トリエチルアミン
Rt        保持時間
TBTU      O‐(ベンゾトリアゾール‐1‐イル)‐N,N,N',N'‐テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート)
rt        室温
LC        液体クロマトグラフィー
EDC       1‐エチル‐3‐[3‐ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド
HATU      2‐(1H‐7‐アザベンゾトリアゾール‐1‐イル)‐1,1,3,3‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;
DCE       1,2‐ジクロロエタン
【００８９】
実施例３. 薬学的組成物A(水性懸濁液)
本発明の化合物(25 mg)を1mlのジメチルスルホキシドに溶解する。該溶液を10 mlの激しく攪拌した塩水に滴下する。1重量%のPVPを添加することにより安定化することができる形成した懸濁液を、筋肉内、静脈内又は皮下投与に使用できる。
【００９０】
実施例４. 薬学的組成物B(錠剤)
経口投与用の錠剤は、本発明化合物(粉末、<10 m&micro;, 90 %)2.0gを、微結晶セルロース(1.30 g)、とうもろこし澱粉(0.50g)、シリカ(0.20 g)、ステアリン酸Mg(0.12mg)とブレンドすることにより生成する。混合物を乾燥圧縮して、400mg錠剤とし、それを糖被覆する。
【００９１】
実施例５. 薬学的組成物C(溶液)
本発明化合物(10 mg)を0.5mlのクレモフォー(Cremophor)EL(BASF社)に溶解し、無水エタノールを添加して1.0mlにする。該透明溶液をガラス小瓶に注射用に入れる。
【００９２】
実施例６. 薬学的組成物D(溶液)
動物研究における腹腔内投与のために、水性原液を、本発明化合物をクレモフォーEL/ポリエチレングリコール400 1:1 (v/v)中に2 mg/mlの濃度になるように室温で又は約80℃まで加熱して、超音波の助力により溶解して調製した。該原液のアリコートを0.9 %の塩水で1:10に希釈し、そして直ちにIP注射に使用した。
【００９３】
実施例７. 薬学的組成物E(溶液)
腹腔内投与用に、25重量%コリフォー（Kolliphor）HS15原液を、コリフォーHS15(Sigma 42966)の容器全体を60℃に温めることにより溶解しそして脱イオン水で25% w/wに希釈して、調製した。10mLのサンプル管中の化合物No.1570(18.0 mg)に、10.0mLの原液を添加し、そして該管をボルテックスし、そして約50℃で約2時間超音波処理し、そして時々約83℃に加熱した。得られた透明溶液を、注射前に0.2 &micro;mセルロース注射器フィルターを通して殺菌濾過した。同じ手順で、化合物No.1546及びNo.1571の溶液を調製した。しかしながら、これらの化合物は完全には溶解しなかった。不溶の残滓を秤量し、そして重量を化合物の出発重量(18 mg)から差し引いた。調製された溶液(10 ml)は化合物No.1546及びNo.1571をそれぞれ8.5 mg及び11.0 mg含むことが見出された。
【００９４】
実施例８. 薬学的組成物F(溶液)
腹腔内投与用に、2‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン(Aldrich 332593)の原液を、脱イオン水中に該シクロデキストリンを30% w/wの濃度に溶解することにより、調製した。10mLのサンプル管中の化合物No.1649(15.0 mg)に、10.0mLの原液を添加した。該管をボルテックスし、そして約50℃で約2時間超音波処理し、そして時々約83℃に加熱した。得られた溶液を、注射前に0.2 &micro;mセルロース注射器フィルターを通して殺菌濾過した。溶解しなかった残留化合物No.1659の重量を決定し、そして濾過した溶液の濃度を意図した濃度82.5 %に補正するために使用した。同じ手順により、化合物No.1546の溶液を調製した。
【００９５】
実施例９. 本発明の化合物はプロテアソーム阻害を誘発する
プロテアソーム阻害により黄色蛍光タンパク質(YFP)を蓄積するように遺伝子操作されているレポーター細胞系MelJuSo Ub‐YFP(12)を化合物評価に使用した。YFPの蓄積は、自動化蛍光発光顕微鏡であるIncuCyte‐FLR システム (Essen Bioscience, Essen, UK)中で48時間測定した。視野当たり正の細胞の数をプロテアソーム阻害の尺度として使用した。
【００９６】
実施例１０. 水性媒体中の本発明化合物の溶解度の決定
図.2a‐2eのグラフで、溶解度はLog S (mmol/ml; ソフトウェアACD/Labs Inc.)として表されている。溶解度を水性バッファ中で、種々のpH値で決定し、そして25℃の純水について予測する。アルゴリズムは一組の6,800を超える化合物を参照用に使用する。該グラフは、本発明のアゼパノンが、pH６〜８、特に7.0〜7.5のような生理的pHの水性媒体中で、対応して置換されたピペリジン‐4‐オンと比べて、実質的に増加した溶解度、例えば2の倍数又はそれ以上、を有することができることを示す。
【００９７】
実施例１１. 本発明のアゼパン/アゼパノンンは、構造的に対応するピペリジン／ピペリジン‐4‐オンと比べて、より高い細胞毒性を示す
図3b, 3d, 3fは、７員環部分を有する本発明の化合物Nos. 1546, 1547及び1570の細胞毒性を、６員環部分を有する本発明に含まれない構造的に対応する化合物と比較して示すグラフである。用量依存性細胞毒性のそれらの誘発を、レポーター細胞系HCT‐116へ連続した化合物暴露72時間の後に決定した。処理細胞を未処理対照と比較した。細胞毒性を、生存インデックス(SI)として、化合物濃度に依存して約90% SIから約0% SIの範囲にわたって可視化する。図面から、本発明の化合物は参照化合物よりも一層細胞毒性であるようである。何故なら、本発明の化合物はより低濃度で同じレベルの細胞毒性を生じるからである。
【００９８】
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【図１ａ−１ｃ】
2014530852.tif 000014
【図１ｄ−１ｆ】
2014530852.tif 000015
【図１ｇ−１ｉ】
2014530852.tif 000016
【図１ｊ−１ｌ】
2014530852.tif 000017
【図１ｍ−１ｏ】
2014530852.tif 000018
【図２ａ】
2014530852.tif 000019
【図２ｂ】
2014530852.tif 000020
【図２ｃ】
2014530852.tif 000021
【図２ｄ】
2014530852.tif 000022
【図２ｅ】
2014530852.tif 000023
【図３ａ−３ｂ】
2014530852.tif 000024
【図３ｃ−３ｄ】
2014530852.tif 000025
【図３ｅ−３ｆ】
2014530852.tif 000026
【国際調査報告】
2014530852.tif 000027
2014530852.tif 000028
2014530852.tif 000029
2014530852.tif 000030
2014530852.tif 000031
2014530852.tif 000032