(57)【要約】本発明は、核酸の捕獲及び／又は検出、核酸の増幅及び核酸のシークエンシングなどの分子生物学的技術に有用な新規の修飾オリゴヌクレオチドモノマーを提供する。該修飾オリゴヌクレオチドモノマーは、主溝から逆並行二重螺旋に挿入し得るインターカレータを含む。【選択図】図１
2014512175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般化学構造を有する修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡ：
Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｉ
−式中、
−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｌはリンカーであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレータであり、及びリンカーの長さは５〜１５オングストロームである。
【請求項２】
Ｂ〜Ｌ又はＬ〜Ｉの間にコンジュゲータＫをさらに含む請求項１のモノマー：
Ｘ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉ
Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉ
【請求項３】
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
（式中、ｎは５又は６である。）
によって記載される請求項１のＸ−Ｂ−Ｌ−Ｉモノマー。
【請求項４】
Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
（式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である。）
によって記載される請求項２のＸ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉモノマー。
【請求項５】
Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
（式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である。）
によって記載される請求項２のＸ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉモノマー。
【請求項６】
Ｋはエチニルである、請求項２、４及び５のモノマー。
【請求項７】
Ｘ−ＢはＤＮＡ又はＲＮＡ単位である、以前の請求項のいずれかのＳＮＡモノマー。
【請求項８】
オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みに適した請求項１〜７のいずれかのＳＮＡモノマー。
【請求項９】
標準的オリゴヌクレオチド合成を使用したオリゴヌクレオチド中への取り込みに適した請求項１〜７のいずれかのＳＮＡモノマー。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかのＳＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリメラーゼに対する基質として請求項８の酵素的取り込みに適したＳＮＡモノマーの使用。
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマー又は鋳型として、請求項１０のＳＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
以下の工程を含む方法
ａ．鋳型核酸を提供する工程
ｂ．第１のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｃ．ポリメラーゼを提供する工程
ｄ．ヌクレオチド三リン酸塩混合物を提供する工程
ｅ．工程ａ〜ｄの成分を混合し、及び前記プライマーが前記鋳型へアニーリングすることを可能にする条件を提供する工程
ｆ．プライマー伸長を可能にする条件下で、前記鋳型にアニーリングされた前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長する工程
−ただし、前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドはＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、前記鋳型核酸はＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、前記ヌクレオチド三リン酸塩混合物は、オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みに適したＳＮＡモノマーを含む。
【請求項１４】
以下の工程をさらに含む請求項１３の方法
ｇ．工程ｆの第１の伸長産物に相補的である、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｈ．工程ｆの産物を変性する工程
ｉ．プライマー伸長を可能にする条件下で、前記第１の伸張産物にアニーリングされた前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長する工程。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
核酸の検出、増幅及びシークエンシングは、分子生物学、研究及び臨床診断において、極めて重要な方法である。そのような方法のキーとなる試薬は、ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼに対する基質としての役割を果たすヌクレオシド三リン酸塩並びにプライマー及び／又はプローブとしての役割を果たすオリゴヌクレオチドである。
【０００２】
ＰＣＲの鋳型として使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー及びプローブの主な重要性は、相補的な核酸に対するそれらの親和性及びそれらの配列特異性にある。これらの特徴はオリゴヌクレオチドに固有の内因性要因及びオリゴヌクレオチドにとっての外因性要因によって調節することができる。内因性要因は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸配列構成である。さらに、非天然ヌクレオチド又はバックボーン修飾の使用は内因性要因である。しかしながら、利用可能な非天然ヌクレオチド及びバックボーン単位の数は制限されている。したがって、分子生物学的方法において使用することができる新しい修飾を有するオリゴヌクレオチドの必要性がある。
【０００３】
特許出願ＷＯ２００６／１２５４４７（特許文献１）は、式Ｚの三重螺旋形成モノマー単位を記載し、及び二本鎖核酸を有する三重螺旋形成に関して三重螺旋形成モノマー単位を含むオリゴヌクレオチドの好ましい特性を実証した。三重螺旋形成特性に基づいて、前記特許出願の発明者らは、検出、診断及び治療のためのオリゴヌクレオチドを使用することを示唆した。そのような使用についての詳細又はデータは提供されなかった。
【０００４】
フィリチェフら（フィリチェフ  ＶＶ、２００５年；非特許文献１）は、ＷＯ２００６／１２５４４７と同一の三重螺旋形成モノマー単位を記載し、及び三重螺旋形成モノマー単位の取り込みによって並行二重螺旋及び並行三重螺旋の安定性を見出した。さらに、ネイティブのオリゴヌクレオチドと比較して、三重螺旋形成モノマー単位がオリゴヌクレオチドに挿入されたときに、彼らは、ワトソン−クリック型のＲＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＤＮＡ二重螺旋の不安定化を見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／１２５４４７号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＶＶ  フィリチェフ及びＥＢ  ペーザーセン、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，１４８４９−１４８５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
モノマーはポリメラーゼに対する基質として機能することができないので、ＷＯ２００６／１２５４４７に記載された三重螺旋形成モノマーはポリメラーゼを使用した、オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みに適していない可能性がある。さらに、ＷＯ２００６／１２５４４７に記載された三重螺旋形成モノマーは転写又は複製の鋳型として機能することができないことがさらに見出された。つまり、ポリメラーゼが鋳型中の三重螺旋形成モノマーに遭遇する場合、ポリメラーゼはＲＮＡ又はＤＮＡ合成を継続することができない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、以下の一般化学構造を有する修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡ（積層核酸）を提供する：
Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｉ
−式中、
−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり
−Ｌはリンカーであり、及び
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレータである。
【０００９】
好ましい実施態様では、ＳＮＡモノマーは、Ｂ〜Ｌ又はＬ〜Ｉの間にコンジュゲータＫを含む：
Ｘ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉ
Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉ
【発明の効果】
【００１０】
ＳＮＡモノマーは、ＳＮＡモノマーが二重螺旋の鎖のうちの１つの一部である場合、インターカレータＩが主溝（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）からの逆平行二重螺旋中に挿入することを可能にするように構築することができる。このように、ＳＮＡモノマーは逆平行の二重螺旋形成を安定化することができ、及びしたがって、相補的配列への親和性を増加することができる。
【００１１】
ＳＮＡモノマーは、核酸の捕獲及び／又は検出、核酸の増幅及び核酸のシークエンシングなどの分子生物学的技術に有用である。したがって、本発明の他の側面は、本発明のモノマーを含むオリゴヌクレオチド、本発明のモノマー及びオリゴヌクレオチドの取り込み及び使用に適したモノマーに関連がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】インターカレーションした機能性アクリジン部分を含むｐｄｂエントリー３６７ｄの構造。
【図２】インターカレーションしたピレン単位を有するＴＴＡＧＧＧ三量体ＤＮＡ二重螺旋の概観。
【図３】ピレン単位を含むインターカレーション部位上の拡大図。
【図４ａ−ｅ】センス鎖中のチミジンに連結された１〜５個の炭素のリンカーを有する５０ＫのＭＤの１０ｎｓの後に得られた構成の概観。
【図５ａ−ｅ】アンチセンス鎖中のチミジンに連結された、１〜５個の炭素のリンカーを有する５０ＫのＭＤの１０ｎｓの後に得られた構成の概観。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＳＮＡモノマー
第１の態様では、本発明は、以下の一般化学構造を有する修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡ（積層核酸（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））を提供する：
Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｉ
−式中  
−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｌはリンカーであり、及び
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系（ｆｌａｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を含むインターカレータである。
【００１４】
好ましい実施態様では、ＳＮＡモノマーは、Ｂ〜Ｌ又はＬ〜Ｉの間にコンジュゲータ（ｃｏｎｊｕｇａｔｏｒ）Ｋを含む：
Ｘ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉ
Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉ
【００１５】
ＳＮＡモノマーは、ＳＮＡモノマーが二重螺旋の鎖のうちの１つの一部である場合、インターカレータＩが主溝から逆平行二重螺旋中に挿入することを可能にするように構築することができる。このように、ＳＮＡモノマーは逆平行の二重螺旋形成を安定化することができ、及びしたがって、相補的配列への親和性を増加することができる。
【００１６】
本発明の１つの実施態様では、ＳＮＡモノマーの酵素的取り込みを可能にすることが、ＳＮＡモノマーを提供する目的であり、ただし、Ｌは、逆平行二重螺旋の主溝中へ核酸塩基Ｂから達することができる。Ｌの適切な設計によって、Ｌは後ろに曲がることを強いられ、Ｉが逆平行二重螺旋中へ挿入することを可能にする。逆平行二重螺旋中へのＩの配置によって、逆平行二重螺旋は安定させられるが、好ましくはインターカレータ、Ｉ、は、ＳＮＡモノマーが配置されるオリゴヌクレオチドの酵素的認識又はオリゴヌクレオチド中へのＳＮＡモノマーの酵素的取り込みに干渉しない。
【００１７】
リンカーＬ
リンカーＬは、好ましくは、３０オングストローム未満、２５オングストローム未満、２０オングストローム未満、１９オングストローム未満、１８オングストローム未満、１７オングストローム未満、１６オングストローム未満及び１５オングストローム未満、少なくとも３オングストローム、少なくとも４オングストローム、少なくとも５オングストローム、少なくとも６オングストローム、少なくとも７オングストローム、少なくとも８オングストローム、少なくとも９オングストローム及び少なくとも１０オングストロームからなる群から選ばれる長さを有する。
【００１８】
より好ましくは、リンカーは、１〜３０オングストローム、３〜２０オングストローム、及び最も好ましくは５〜１５オングストローム、６〜１５オングストローム、７〜１５オングストローム、８〜１５オングストローム、９〜１５オングストローム及び１０〜１５オングストロームの長さを有する。
【００１９】
これらの長さは、インターカレータＩが二重螺旋の主溝中へ挿入することを可能にする点で特に好ましい。つまり、本発明のＳＮＡモノマーがオリゴヌクレオチドに挿入される場合、相補的核酸へのオリゴヌクレオチドの親和性及び／又は特異性が増加することが好ましい。
【００２０】
ＳＮＡがコンジュゲータを含まず、かつ、Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｉで表わすことができる場合、リンカーＬの好ましい実施態様は次のとおりである：
−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−
−式中、ｎは１〜１０、より好ましくは２〜８、３〜７であり、及び最も好ましくはｎは５または６である。
【００２１】
同様に、リンカーはさらにＳＮＡモノマー、Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｉ、の一部と記載されてもよく、ボールド体のリンカーを有する：
【化１】
2014512175.tif 000003
【００２２】
ＳＮＡモノマーがコンジュゲータを含み、かつ、Ｘ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉで表わすことができる場合、リンカーＬの好ましい実施態様は次のとおりである：
−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−
−式中、ｎは１〜５であり、かつ、ｍは１〜５であり、例えば、ｎは１〜４であり、かつ、ｍは１〜４であり、ｎは１〜３であり、かつ、ｍは１〜３であり、及びより好ましくはｎは１であり、かつ、ｍは２である。
【００２３】
同様に、リンカーは再びＳＮＡモノマーの一部と記載されてもよく、ボールド体のリンカーを有するＸ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉ：
【化２】
2014512175.tif 000004
【００２４】
ＳＮＡモノマーがコンジュゲータを含み、かつ、Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉで表わすことができる場合、リンカーＬの好ましい実施態様は次のとおりである：
−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ
−式中、ｍとｎは、それぞれ、１〜２０、１〜１０又は１〜５である。さらにより好ましくは、ｍは１であり、かつ、ｎは１〜１０、１〜５、及び最も好ましくはｎは３又は４である。
【００２５】
再度、リンカーはＳＮＡモノマーの一部として、
【化３】
2014512175.tif 000005
と記載されてもよく、ボールド体のリンカーを有するＸ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉ：
【００２６】
他のリンカー：
他の関連のあるリンカーは、例えば、アマディアン及びベルグストローム  Ｍ．（アマディアン及びドナルド  Ｅ．ベルグストローム  ２００８、「生化学及び生物工学における５−置換ヌクレオシド。」生化学、生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ）及び医学における修飾ヌクレオシドにおいて、Ｐ．ハーデウィン、エド．ウィリー−ＶＣＨ、ウィヘイム、２００８、ｐｐ２５１−２７６）によって記載されるものであり、該文献はその全体が参照によってここに包含される。
【００２７】
Ｌの位置
Ｂがプリンである場合、リンカーＬはプリンの６位又は７位に連結されることが好ましい。最も好ましいのは、７位への連結である。
【００２８】
同様に、Ｂがピリミジンである場合、リンカーは５位又は６位に連結されることが好ましい。５位に連結されることが最も好ましい。
【００２９】
これらのリンカー位置は特に好ましい。なぜなら、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼはこれらの位置における核酸塩基修飾に特に耐えられるからである。つまり、ポリメラーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡ合成のための基質として前記の位置で修飾されるヌクレオチドをしばしば使用することができる。そのような１つの例は、ピリミジンの５位へコンジュゲートされるビオチン基を有するヌクレオチド三リン酸塩である。同様に、これらの位置において修飾されたＳＮＡ三リン酸塩はポリメラーゼに対する基質である点では好ましい。
【００３０】
コンジュゲータＫ
言及されているように、好ましい実施態様では、本発明のＳＮＡモノマーはコンジュゲータＫを含む。本文脈では、用語コンジュゲータは、Ｋはインターカレータ又は核酸塩基のものと重複するｐ軌道を含むということを意味する。Ｋは、２〜１２個の炭素のアルケニル、２〜２５個の炭素のアルキニル（ａｌｋｙｎｙｌ）、若しくはジアゾ、又はわずか２５個の炭素又は／及び窒素原子の長さを有するそれらの組合せ、並びに単環芳香族環系からなる群から選ばれてもよい。
【００３１】
好ましい実施態様では、Ｋはアセチレン又は繰返しアセチレンである。
【００３２】
最も好ましくは、Ｋはエチニルである。
【００３３】
Ｋ−Ｉの好ましい実施態様
好ましい実施態様では、Ｋ−Ｉはエチニルアリルであり、及び好ましくはエチニルアリルは１−エチニルピレンである。
【００３４】
Ｋ−Ｌの好ましい実施態様
Ｋ−Ｌの好ましい実施態様は次のとおりである：
Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ
−式中、ｎは１〜５であり、かつ、ｍは１〜５であり、例えば、ｎは１〜４であり、かつ、ｍは１〜４であり、ｎは１〜３であり、かつ、ｍは１〜３であり、より好ましくは、ｎは１であり、かつ、ｍは２である。
【００３５】
さらに、Ｋ−Ｌは、ボールド体のＫ−Ｌを有する、ＳＮＡモノマーＸ−Ｂ−Ｋ−Ｌ−Ｉの一部と記載されてもよい：
【化４】
2014512175.tif 000006
【００３６】
Ｌ−Ｋの好ましい実施態様
Ｌ−Ｋの好ましい実施態様は次のとおりである：
（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡Ｃ
−式中、ｍ及びｎは、それぞれ、１〜２０であり、１〜１０又は１〜５である。さらにより好ましくは、ｍは１であり、かつ、ｎは１〜１０、１〜５、及び最も好ましくは、ｎは３又は４である。
【００３７】
また、ボールド体のＬ−Ｋを有する、ＳＮＡモノマーＸ−Ｂ−Ｌ−Ｋ−Ｉの一部と記載される場合：
【化５】
2014512175.tif 000007
【００３８】
Ｂの好ましい実施態様
Ｂは、好ましくは、ＢがＳＮＡモノマーの一部として示される場合、化学構造１〜２０によって例証されるとおりのピリミジン又はプリンである：
【化６】
2014512175.tif 000008
【化７】
2014512175.tif 000009
【化８】
2014512175.tif 000010
−式中、
−Ｙ＝Ｏ又はＳ、及び
−Ｒ１はＬ−Ｉ、Ｋ−Ｌ−Ｉ又はＬ−Ｋ−Ｉである。
【００３９】
Ｌ−Ｉ、Ｋ−Ｌ−Ｉ及びＬ−Ｋ−Ｉの特に好ましい態様は、上記及び下記に記載される。
【００４０】
したがって、Ｂは、好ましくは、化学構造１〜２０に例証されるＢ構造の群から選ばれる。
【００４１】
インターカレータＩ
本発明のＳＮＡモノマーのインターカレータＩは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層すること（ｃｏ−ｓｔａｃｋｉｎｇ）ができる。
【００４２】
好ましい実施態様では、Ｉは、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系及びそれらの複素環式芳香族アナログ及びそれらの置換体の群から選ばれる。
【００４３】
Ｉの特に好ましい実施態様は、ピレン、フェナントロイミダゾール及びナフタルイミドである：  
【化９】
2014512175.tif 000011
【００４４】
本発明のＬ−Ｋ−Ｉ、Ｋ−Ｌ−Ｉ、Ｌ−Ｉの好ましいモノマー
上記の記載から評価されるとおりに、リンカーＬ、任意のコンジュゲータＫ及びインターカレータＩは、本発明の好ましいモノマーを形成する多くの方法で組み合わせることができる。典型的な組合せの合成は実施例の項中で概説される。
【００４５】
第２の態様
本発明の第２の態様は、オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みに適した第１の態様のＳＮＡモノマーである。この態様において、オリゴヌクレオチドモノマーは典型的にはヌクレオチド三リン酸塩になり得る。
【００４６】
第３の態様
本発明の第３の態様は、標準的なオリゴヌクレオチド合成を使用したオリゴヌクレオチド中への取り込みに適した第１の態様のＳＮＡモノマーである。この態様では、オリゴヌクレオチドモノマーは典型的にはヌクレオシドホスホルアミダイトになり得る。
【００４７】
第４の態様
本発明の第４の態様は第１の態様のＳＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドである。好ましくは、該オリゴヌクレオチドの（他の）モノマー、は、ＤＮＡ又はＲＮＡモノマーのいずれかである。オリゴヌクレオチドは、（本発明の第２の態様の）オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みに適したＳＮＡモノマーを酵素的に使用して合成されてもよく、又は該オリゴヌクレオチドは標準的なオリゴヌクレオチド合成を使用して、及び（本発明の第３の態様の）標準的なオリゴヌクレオチド合成を使用したオリゴヌクレオチド中への取り込みに適したＳＮＡモノマーを使用して合成されてもよい。
【００４８】
第５の態様
本発明の第５の態様は、例えば、シークエンシング又はＰＣＲにおけるポリメラーゼの基質として（本発明の第２の態様の）酵素的取り込みに適したＳＮＡモノマーの使用である。
【００４９】
第６の態様
本発明の第６の態様は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマー又は鋳型として、（本発明の第４の態様において述べられるとおりの）ＳＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドの使用である。
【００５０】
第７の態様
本発明の第７の態様は、以下の工程を含む方法である。
ａ．鋳型核酸を提供する工程
ｂ．第１のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｃ．ポリメラーゼを提供する工程
ｄ．ヌクレオチド三リン酸塩混合物を提供する工程
ｅ．工程ａ〜ｄの成分を混合し、及びプライマーが鋳型にアニーリングすることを可能にする条件を提供する工程。
ｆ．プライマー伸長を可能にする条件下で、鋳型にアニーリングされた第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程
−ただし、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、ＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、鋳型核酸は、ＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、ヌクレオチド三リン酸塩混合物は、（本発明の第２の態様に記載されているとおりに）オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みに適したＳＮＡモノマーを含む。
【００５１】
好ましい実施態様では、本方法はさらに以下の工程を含む。
ｇ．工程ｆの第１の伸長産物に相補的である、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｈ．工程ｆの産物を変性する工程
ｉ．プライマー伸張を可能にする条件下で、第１の伸長産物にアニーリングされた第２のオリゴヌクレオチドを伸長する工程
【００５２】
１つの実施態様では、第２のプライマーオリゴヌクレオチドはＳＮＡモノマーを含む。
【実施例】
【００５３】
実施例１：分子モデリングに基づいてコンジュゲーションされたチミン−１−エチニルピレン
結果及び考察：アクリジン及びＤＮＡの間の典型的なインターカレーションの化学構造は、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ（ＩＤ  ３６７Ｄ）（ＡＫ  トッド、Ａ  アダムズ、ＪＨ  ソープ、ＷＡ  デニー、ＬＰＧ  ウェイクリン、及びＣＪ  カルダン、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，５３６−５４０）から得られた。この構造はインターカレーションされたアクリジン断片（図１）を含み、これはピレン部分の位置を決めるために使用された。ピレン単位の取り込みをモデル化するために、三重繰返し構造（ＴＴＡＧＧＧ）３を有するＤＮＡヘキサデカマーは、いわゆるＢ−ＤＮＡ構造を構成した。
【００５４】
これらの２つの構造から、インターカレーションされたピレンを有する新規のＴＴＡＧＧＧ三量体は構築され、及びエネルギーは分子力学を使用して最小限にされた。インターカレーション部位に並ぶ４つのヌクレオチドを、ボールド体（下線）で示しており、上部の鎖は参考として「センス」と指定し、及び下部の鎖は「アンチセンス」として指定した：
５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’  （センス鎖）
３’−ＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣ−５’  （アンチセンス鎖）
【００５５】
得られた構造は、よく知られる、安定した二重螺旋構造のままであり（図２）、及び詳細に調査した場合、すべての水素結合は保持されることが明らかである（図３）。
【００５６】
ピレン単位をＤＮＡ鎖に連結するために、我々はメチル基の代わりにＣＨ２ＯＨを有するチミンの変形体、５−（ヒドロキシメチル）ウラシルを開始点として使用することができるかもしれないと想定する。ピレンはさらにアルキン基を含み、したがって、我々は、アルキン−ピレン単位及び核酸塩基の酸素の間のリンカーに１〜５個の炭素原子を有する新規な構造を構築した）。該構造の固有のキラリティーにより、連結がセンス鎖（図３中の下部のピレン）又はアンチセンス鎖（図３中の上部のピレン）におけるチミジンに構築されるかどうかに依存する長さに違いがある。該構造が構築物の手動構築中に導入された不利な相互作用を回避することを可能にするために、一連の短い分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実施した。シミュレーションを、５０Ｋ、１００Ｋ、１５０Ｋ、２００Ｋ、２５０Ｋ及び３００Ｋに設定した温度にて１０ｐｓで実行した。該構造のすべては、より高温の最初の螺旋形状に由来する顕著な逸脱（ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）を示した。したがって、我々は５０Ｋでのシミュレーション後に得られた構造を使用するために選択した。
【００５７】
図４は、センス鎖中で修飾核酸塩基を有する１〜５個の炭素（図４−ｅ）のスペーサーを使用した、非連結及び連結ピレン単位の間のインターカレーション部位の上覆い（ｏｖｅｒｌａｙ）を示す。我々は、螺旋のより遠い領域の変化の影響を回避するために、該構造の調査中に、インターカレーション部位に最も近い８個のヌクレオチドの重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）を使用することに決めた。
【００５８】
これらの構造から、３個の炭素及び４個の炭素リンカー（ｎ＝３及びｎ＝４、図３）の両方が、非連結及び連結ピレン単位が重ね合わせることができない、非緊張的な配置を達成することができることは明白である。３又は４−メチレンスペーサーは、このようにセンス鎖中のコンジュゲーションしたチミジンのインターカレーションには最適に見える。
【００５９】
同様の方法で、我々は、ピレン単位の「上部の」チミンから連結を作成し（アンチセンス鎖中の修飾核酸塩基を有する）、及び次の化学構造を得た（図５−ｅ）。
【００６０】
ピレン単位の「上部」に配置されたチミン使用する場合、リンカーのどれもが完全に非緊張的配置を達成することができなかった。本研究で使用された最長５個の炭素鎖は、機能化チミンの酸素をアルキニルリンカーに結び付けるために必要な１８０°の回転を調整するのに最も良いように思える。
【００６１】
上記されたモデル化データは、理想的な構成物が、センス鎖中のチミンの場所にオリゴヌクレオチドに取り込まれた、エチニルピレン及び（５−ヒドロキシメチル）ウラシルの間の３−若しくは４−メチレンスペーサーであるだろうということを示唆する（上記参照）。
【００６２】
合成
４個の炭素スペーサーでコンジュゲーションした１−エチニルピレン−ヌクレオチドの可能な合成は、スキーム１で概説される。
市販の５−（ヒドロキシメチル）ウラシルは酸性条件下でヘキサ−５−イン−１−オール（さらに市販）を用いてアルキル化することができ（ＭＳ  モタウィア、ＡＥ−Ｓ  アデル−メギド、ＥＢ  ペーザーセン、ＣＭ  ニールセン及びＰ  イブセン、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９９２，４６，７７−８１；ＡＥ−Ｓ  アデル−メギド、ＥＢ  ペーザーセン及びＣ  ニールセン、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９８，１２９，９９−１０９）、及び１−ブロモピレンを用いたソノガシラカップリング（Ｋ  ソノガシラ、Ｙ  トーダ及びＮ  ハギシャラ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９７５，１６，４４６７−４４７０）は、インターカレータを導入する。ピリミジンジオンのビス−シリル化は、それをＴＭＳＯＴｆで媒介した２−デオキシリボース三酢酸塩のグリコシル化に対して設定する（ＭＳ  モタウィア、ＡＥ−Ｓ  アデル−メギド、ＥＢ  ペーザーセン、ＣＭ  ニールセン及びＰ  イブセン、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９９２，４６，７７−８１；ＡＥ−Ｓ  アデル−メギド、ＥＢ  ペーザーセン及びＣ  ニールセン、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９８，１２９，９９−１０９）。不要なα−アノマーからβ−アノマーを分離した後、２個のアセチル基を除去し、次いでホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）として３’位の活性化及び１級アルコールの保護のためのＤＭＴ基を導入することができる。
【００６３】
提案された合成ルートは全体で７段階であり、それは処理し易い作業であるべきである。
【００６４】
【化１０】
2014512175.tif 000012
【００６５】
スキーム１は、ホスホアミデート  ピレン−チミンコンジュゲーションの合成を提案した。
【００６６】
結論
インターカレーションしたピレンを有する短い（１８ｂｐ）ＤＮＡ二重螺旋に関するモデル化研究は、修飾チミン塩基へコンジュゲーションしたピレン単位を有する二重螺旋の最良の設計がセンス鎖中の１−エチニルピレンに付加された単純な３−又は４−炭素スペーサーであることを示した。さらに、修飾チミン塩基及びピレンの間の４−炭素スペーサーを有するオリゴヌクレオチド中の取り込みのためのホスホアミデートを供給する７段階の合成ルートが概説された。
【００６７】
実施例２
本発明の他の典型的なモノマーの合成
スキーム−１：
【００６８】
【化１１】
2014512175.tif 000013
【００６９】
段階−１：
【化１２】
2014512175.tif 000014
４−オキソ−４（ピレン−１−イル）−酪酸（２）：
【００７０】
ＡｌＣｌ３（２６．６ｇ、１９９．８６ｍｍｏｌ）を、０℃でニトロベンゼン（１０００ｍＬ）中の無水コハク酸（１０ｇ、９９．９３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。次いで、化合物−１（２０．２ｇ、９９．９３ｍｍｏｌ）を同じ温度で加え、次いで反応混合物を１８時間、室温で撹拌した。反応の進行はＴＬＣによってモニターした；ＴＬＣは、出発物質の完全な消失を示す。反応混合物は、６００ｍｌの２５％氷冷塩酸溶液中に注いだ。黄色有色固形化合物をろ過し、完全に乾燥した。生成物をエタノールから結晶化し、黄色有色固形物として、化合物−２（２１．８ｇ、７２％）をもたらした。
【００７１】
段階−２：
【化１３】
2014512175.tif 000015
Ｎ−プロピル−オキソ−ピレン酪酸アミド（４）：
【００７２】
ＤＩＰＥＡ（１８．６ｍＬ、１３２．４８ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で室温にて、乾燥ＤＭＦ（７０ｍｌ）及び１，２−ジクロロエタン（５０ｍＬ）中の化合物−２（１０ｇ、３３．１１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。次いで、該反応混合物を、０℃に冷却し、次いでロット毎（ｌｏｔ  ｗｉｓｅ）に窒素雰囲気下でＥＤＣ．ＨＣｌ（６．３ｇ、３３．１１ｍｍｏｌ）、さらにＨＯＢｔ（５．１ｇ、３３．１１ｍｍｏｌ）を加えた。化合物−３（２．３ｍＬ、３３．１１ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で０℃にて、上記混合物に滴下手段で加えた。次いで、反応混合物を、５時間室温にて撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、出発物質が消失した。次いで、５００ｍｌの水を、反応混合物に加え、生産物を沈殿させた。該沈殿をろ過し、及び固体化合物をヘキサン中で２０％酢酸エチルで洗浄した。黄色有色固体化合物をＰ２Ｏ５によって乾燥し、黄色有色固形物として化合物−４（７．１ｇ、６３％）をもたらした。
【００７３】
段階−３：
【化１４】
2014512175.tif 000016
ピレンオキソアミドｄＵ（６）：
【００７４】
化合物−４（３．９ｇ、１１．４３ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で室温にて、乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）中の化合物−５（５ｇ、７．６２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加え、及びトリエチルアミン（４．３ｍＬ、３０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、該溶液を３０分間窒素ガスでスパージングすることにより脱気し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（５３５ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ）を加え、及び再び１５分間脱気して、最後にＣｕＩ（７２ｍｇ、０．３８１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間室温にて撹拌した。反応混合物をセライトパッドに通過させてろ過し、ろ液を減圧下で蒸発させ、及び化合物をＤＣＭに溶解し、並びに水及び塩水溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４下で乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発させた。粗化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（６０〜１２０メッシュ、ヘキサン中の５０〜６０％  ＥｔＯＡｃ）を使用することにより精製し、黄色有色固体化合物−６（５．５ｇ、８３％）を得た。
【００７５】
段階−４：
【化１５】
2014512175.tif 000017
ピレン−オキソ−５’−ＤＭＴ−アミダイトｄＵ（７）：
【００７６】
化合物−６（１．２ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥トルエンを用いて２度共蒸発させ、及び高真空圧下で乾燥し、２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中で溶解し、及び室温にて窒素雰囲気下で１−Ｈ−テトラゾール（１２６ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）、さらにリン酸化（Ｐｈｏｓ）試薬（０．６ｍＬ、１．７９ｍｍｏｌ）を加えた。該反応物を３時間室温にて撹拌し、次いでＤＣＭ／ヘキサンで２度沈殿した；最終的に、粘着性固体化合物をＤＣＭ中に溶解し、及びロータヴェイパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）下で蒸発させ、高真空下で乾燥して、青白い有色固形物として化合物−７（８５０ｍｇ、６１％）を得た。
【００７７】
スキーム−２：
【化１６】
2014512175.tif 000018
【００７８】
段階−１：
【化１７】
2014512175.tif 000019
５’，３’−ジアセチル−ｄＴ（２）：
【００７９】
化合物−１（１００ｇ、４１２．８３ｍｍｏｌ）の溶液について、乾燥ピリジン（１５００ｍＬ）中に溶解し、及び反応混合物を０℃に冷却した。この撹拌懸濁物に、無水酢酸（１５６ｍＬ、１６５１．３２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で１５〜２０分の期間で滴下手段で加えた。反応混合物を１６時間室温で撹拌し、明瞭な溶液（ｐＨは中性だった）を得た。反応混合物をＴＬＣ（８０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によってモニターした。ＴＬＣは、ほとんどの出発物質が消失することを示す。反応物を０℃まで冷却し、及び２０６ｍＬのメタノールで急冷した。ピリジンの大部分を減圧下で除去し、及び粗化合物を、水（１０００ｍＬ）及び酢酸エチル（１０００ｍＬ）に溶解し、及び有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ×２度）で抽出し、組み合わせた有機層を２Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２５０ｍＬ）、水（２５０ｍＬ×２度）及び塩水（２５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗（粘着性）化合物を、３０％酢酸エチル／ヘキサン（５００ｍＬ×２度）で沈殿し、白色結晶性固形物を得た。化合物をさらなる精製を経ずに次の工程に持ち込んだ。生産物を１ＨＮＭＲ及びＭＳによって特性化した。
収率：１２４ｇ（９２％）。
７６ＳＰＬ０２２１１−０２。
【００８０】
段階−２及び３：
【化１８】
2014512175.tif 000020
５−ヒドロキシメチル−５’，３’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシウリジン（４）：
【００８１】
化合物−２（１９ｇ、５８．２２ｍｍｏｌ）を無水ベンゼン５０ｍＬ）で共蒸発さえ、及び３００ｍＬの乾燥ベンゼンを加えた。次に、反応混合物を、窒素雰囲気下で、１０分間１１０℃までゆっくり加熱した。ＮＢＳ（１２．６ｇ、７１．０３ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（５１３ｍｇ）を上記溶液に加えた。反応の進行をＴＬＣでモニターし、出発物質が消失した。反応混合物を、高温条件中でろ過し、及び減圧下で溶媒を蒸発させ、化合物−３（２３ｇの粘着性（ｇａｍｍｙ）固体化合物）を得た。粗化合物−３（２３ｇ）を１５０ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解し、及び反応混合物を０℃まで冷却した。次いで、ＮａＨＣＯ３（７．６ｇ）を１５０ｍＬの水に溶解し、及び０℃で上記溶液に滴下手段で加えた。該混合物を、１時間、室温にて、撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の４〜５％  ＭｅＯＨ）によって精製し、淡黄色固形物として化合物−４（９ｇ、２工程から４５．２％）を得た。
７４＆７５  ＳＰＬ０２２１１−０２。
【００８２】
段階−４：
【化１９】
2014512175.tif 000021
５−メチルヒドロキシ−ピレン−ヘキサン−５’，３’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシウリジン（５）：
【００８３】
化合物−４（３．０ｇ、８．７７ｍｍｏｌ）及び化合物−１２（２．１ｇ、７．０１ｍｍｏｌ）の溶液について、窒素雰囲気下で室温にて乾燥トルエン中に溶解した。次いで、Ｂ（Ｃ６Ｆ５）３（４４９ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で、反応混合物に加えた。次いで、該混合物を５時間１１０℃で還流した。反応の進行をＴＬＣでモニターし、出発物質は消失した。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、減圧下で蒸発させた。粗化合物を水（５０ｍＬ）及び酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶解し、及び有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×２度）で抽出し、組み合わせた有機層を、水（２０ｍＬ）、塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥し、及び減圧下で蒸発させた。粘着性液性化合物−５（４．０ｇ）を次の工程に対して得られた。該化合物をＬＣＭＳによって特性化した。
４０ＳＰＬ０２２１１−０３。
【００８４】
段階５：
【化２０】
2014512175.tif 000022
５−メチルヒドロキシ−ピレン−ヘキサン−２’−デオキシウリジン（６）：
【００８５】
化合物−５（４．０ｇ）を６０ｍＬのＭｅＯＨ．ＮＨ３溶液中に溶解し、及び１６時間、室温にて撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、及び粗化合物をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、有機層を水（１０ｍＬ）、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、及び減圧下で蒸発させた。粗化合物をシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）カラムクロマトグラフイーによって精製し、ＤＣＭ中の５％  ＭｅＯＨで溶出し、オフホワイト色固形物として化合物−６（４１０ｍｇ、２工程から８％）を得た。
４２ＳＰＬ０２２１１−０３。
【００８６】
段階−６：
【化２１】
2014512175.tif 000023
５−メチルヒドロキシ−ピレン−ヘキサン−５’，３’−Ｏ−レブ  ２’−デオキシウリジン（７）：
【００８７】
化合物−６（２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解し、及び０℃で該溶液を冷却した。次いで、ＤＣＣ（１１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、さらにレブリン酸（０．０１ｍＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えた。最後に、ＤＭＡＰ（触媒量）を加えた。次いで、反応混合物を１６時間室温にて撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、出発物質が消失した。反応物をＤＣＭで希釈し、有機層を水（１０ｍＬ×２度）、塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４によって乾燥し、ろ過し、及び減圧下で溶媒を蒸発させて、オフホワイト色の有色固形物として化合物−７（２６ｍｇ）を得た。
５６ＳＰＬ０２２１１−０３。
【００８８】
段階−９：
【化２２】
2014512175.tif 000024
５−メチルヒドロキシ−ピレン−ヘキサン−５’−Ｏ−レブ  ２’−デオキシウリジン（８）：
【００８９】
１，４−ジオキサン（０．３５ｍＬ）中の化合物−７（０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、０．１５Ｍ  リン酸バッファーｐＨ  ７（１．６５ｍＬ）及びリパーゼ（ＣＡＬ−Ａ又はＰＳＬ−Ｃ；１：１ｗ／ｗ）を加えた。混合物を６〜１０時間振とうし（２５０ｒｐｍ）、反応物をＴＬＣ（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）でモニターする。３’−Ｏ−レブニニル基の選択的加水分解の完了後に、酵素をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。組み合わせたろ液を濃縮し、クロマトグラフィー精製後の残留物は白色固形物として化合物８をもたらす。
【００９０】
参考文献：
ガルシア、Ｊ．；フェルナンデス、Ｓ．；フェレーロ、Ｍ．；サンヴィ  Ｙ．Ｓ．；ゴーター、Ｖ、オリゴヌクレオチドの溶液相合成の構成ブロック：酵素的アプローチを用いた、３’、５’−ジ−Ｏ−レブリニルヌクレオシドの位置選択的な加水分解、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００２）、６７、４５１３−４５１９
【００９１】
段階−１０：
【化２３】
2014512175.tif 000025
５−メチルヒドロキシ−ピレン−ヘキサン−５’−Ｏ−レブ−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−アミダイト（９）：
【００９２】
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）中の化合物−８（１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、リン酸化試薬（１．２ｍｍｏｌ）及び活性化剤（Ｐｙ．ＴＦＡ又はＤＣＩ；１．２ｍｍｏｌ）を加える。混合物を１〜３時間撹拌し、反応物をＴＬＣ（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によってモニターする。リン酸化の完了に際して、溶液を濃縮し、及びクロマトグラフィー精製後の残留物は白色固形物として化合物９を供給する。
【００９３】
参考文献：サンヴィ、Ｙ．Ｓ．、グオ  Ｚ．、ファンドフェラー、Ｈ．Ｍ．及びコンヴェルソ、Ａ．、より安全かつより安価な活性化剤を使用した、ヌクレオシドのホスホルアミダイトの調製のための改善された方法、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４，１７５−１８１（２０００）
【００９４】
段階−７：
【化２４】
2014512175.tif 000026
ピレン−ヘキシン−１−オール（１１）：
【００９５】
化合物−１０（１０ｇ、３５．３１ｍｍｏｌ）の溶液について、ＴＨＦ／Ｅｔ３Ｎ（６００ｍＬ  １：１）に溶解した。該溶液を、３０分間窒素でスパージングすることにより脱気し、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１．２ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（３３６ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加え、及び１５分間窒素でスパージングすることにより脱気し、最後にヘキシン−１−オール（１１．７ｍＬ、１０５．９４ｍｍｏｌ）を加え、及び１０分間窒素でスパージングすることにより脱気し、コンデンサーをフラスコに合わせ、及び反応フラスコを予熱した油浴（８０℃）へ浸漬した。該反応を８時間進行させ、及び溶媒を真空中で除去し、ＥｔｏＡｃ中に溶解した残留物を得て、及び１Ｎ  ＨＣｌ洗浄、３度の水洗浄、最後に塩水洗浄に供した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、及び減圧下で蒸発させた。粗化合物をシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）カラムクロマトグラフイーで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２０〜２５％）で溶出し、淡黄色固形物［化合物−１１］（９．５ｇ、９０％）としてピレン−ヘキシン−１−オールをもたらした。
３３ＳＰＬ０２２１１−０２。
【００９６】
段階−８：
【化２５】
2014512175.tif 000027
ピレン−ヘキサノール（１２）：
【００９７】
ピレン−ヘキシン−１−オール（１０ｇ）をパー瓶（Ｐａｒｒ  ｂｏｔｔｌｅ）に置き、及びＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解し、該容器を１０分間窒素でフラッシングし、１０％  Ｐｄ−Ｃ（１．２ｇ）を加えた。反応容器を、連続的に脱気及び最終的に水素で２度加圧し、次いで１００ｐｓｉの水素圧力を維持し、及び懸濁物を１６時間室温にて暗闇中で振とうした。触媒をセライトによってろ過することによって除去した。ろ液を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル（ヘキサン中の３０％  ＥｔＯＡｃ）についてのカラムクロマトグラフイーにより精製し、オフホワイトの有色固形物として化合物−１２（７．５ｇ、７４％）を産出した。
８８ＳＰＬ０２２１１−０２。
【００９８】
スキーム−３：
【化２６】
2014512175.tif 000028
スキーム−２、化合物−４までの合成プロトコールを参照されたし。
【００９９】
段階４’：
【化２７】
2014512175.tif 000029
５−ヒドロキシメチル−ピレン−パンタン−５’，３’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシウリジン（１３）：
【０１００】
室温にて、乾燥トルエン中の化合物−４（５．０ｇ、１４．６１ｍｍｏｌ）及び化合物−１９（３．４ｇ、１１．６９ｍｍｏｌ）の懸濁物に、次いで、Ｂ（Ｃ６Ｆ５）３（７４８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で反応混合物に加えた。次いで、該混合物を５時間、１１０℃で還流した。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、出発物質が消えた。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、及び減圧下で蒸発させた。粗化合物を水（５０ｍＬ）及び酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶解し、及び有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×２度）で抽出し、組み合わせた有機層を水（２０ｍＬ）、塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥し、及び減圧下で蒸発させた。粘着液性化合物−１３（ｇ）を次の工程のために得た。
４７ＳＰＬ０２２１１−０３。
【０１０１】
段階５’：
【化２８】
2014512175.tif 000030
５−ヒドロキシメチル−ピレン−ペンタン−２’−デオキシウリジン（１４）：
【０１０２】
化合物−１３（２．０ｇ）を３０ｍＬのＭｅＯＨ．ＮＨ３溶液中に溶解し、及び１６時間室温にて撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、及び粗化合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、有機層を水（１５ｍＬ）、塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥し、及び減圧下で蒸発させた。粗化合物をシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）カラムクロマトグラフイーによって精製し、ＤＣＭ中の５％  ＭｅＯＨで抽出（ｅｌａｔｅ）して、オフホワイト色固形化合物の化合物−１４（２００ｍｇ）を得た。
【０１０３】
段階−６’：
【化２９】
2014512175.tif 000031
５−ヒドロキシメチル−ピレン−ペンタン−５’，３’−Ｏ−レブ  ２’−デオキシウリジン（１５）：
【０１０４】
化合物−１４（２５ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＣＭ中に溶解し、及び０℃で撹拌した。次いで、ＤＣＣ（１１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びレブリン酸（０．０１ｍＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を、連続的に加える。最後に、ＤＭＡＰ（触媒（ｃａｔ））を加える。次いで、反応混合物を１６時間室温で撹拌する。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、出発物質は消失する。反応物をＤＣＭで希釈し、及び有機層を水（１０ｍＬ×２度）、塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、及び有機層をＮａ２ＳＯ４により乾燥させ、ろ過し、及び減圧下で溶媒を蒸発させて、オフホワイト有色固形物として化合物−１５（２６ｍｇ）を供給する。
【０１０５】
参考文献：ガルシア、Ｊ．；フェルナンデス、Ｓ．；フェレーロ、Ｍ．；サンヴィ  Ｙ．Ｓ．；ゴーター、Ｖ、オリゴヌクレオチドの溶液相合成の構成ブロック：酵素的アプローチを用いた、３’、５’−ジ−Ｏ−レブリニルヌクレオシドの位置選択的な加水分解、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００２）、６７、４５１３−４５１９。
【０１０６】
段階−７’：
【化３０】
2014512175.tif 000032
ピレン−ペンチン−１−オール（１８）：
【０１０７】
化合物−１０（１０ｇ、３５．３１６ｍｍｏｌ）の溶液について、ＴＨＦ／Ｅｔ３Ｎ（６００ｍＬ  １：１）に溶解し、該溶液を３０分間窒素を有する隔壁（ｓｅｐｔｕｍ）をスパージングすることにより脱気し、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１．２ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（３３６ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加え、及び１５分間窒素を有する隔壁をスパージングすることにより脱気し、最終的にペンチン−１−オール（９．８ｍＬ、１０５．９４ｍｍｏｌ）を加え、及び１０分間窒素でスパージングすることにより脱気し、コンデンサーをフラスコに適用させ、及び反応フラスコを予熱した油浴（８０℃）へ浸漬した。８時間反応を進行させ、及び溶媒を真空中で除去し、ＥｔｏＡｃで溶解した残留物を得て、及び１Ｎ  ＨＣｌ洗浄、３回の水洗浄、最後に塩水洗浄に供した。有機層をＮａ２ＳＯ４により乾燥させ、ろ過し、及び減圧下で蒸発させた。粗化合物をシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）カラムクロマトグラフイーによって精製し、ＥｔｏＡｃ／ヘキサン（２０〜２５％）で溶出して、淡黄色固形物として化合物−１８（９ｇ、９０％）を供給した。
３４ＳＰＬ０２２１１−０２。
【０１０８】
段階−８’：
【化３１】
2014512175.tif 000033
ピレン−ペンタノール（１９）：
【０１０９】
化合物−１８（８．６ｇ）をパー瓶に置き、及びＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）に溶解し、該容器を１０分間窒素でフラッシングし、１０％  Ｐｄ−Ｃ（９００ｍｇ）を加えた。反応容器を、連続的に脱気及び最終的に水素で２度加圧し、次いで１００ｐｓｉの水素圧力を維持し、及び懸濁物を１６時間室温にて暗闇中で振とうした。触媒をセライトを通してろ過することによって除去した。ろ液を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル（ヘキサン中の３０％  ＥｔＯＡｃ）についてのカラムクロマトグラフイーにより精製し、オフホワイトの有色固形化合物として化合物−１９（６ｇ、６９％）を得た。
９０ＳＰＬ０２２１１−０２。
【０１１０】
参考文献
アマディアン及びドナルド  Ｅ．ベルグストローム  ２００８、「生化学及び生物工学における５−置換ヌクレオシド。」生化学、生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ）及び医学における修飾ヌクレオシドにおいて、Ｐ．ハーデウィン、エド．ウィリー−ＶＣＨ、ウィヘイム、２００８、ｐｐ２５１−２７６。
ＡＫ  トッド、Ａ  アダムズ、ＪＨ  ソープ、ＷＡ  デニー、ＬＰＧ  ウェイクリン、及びＣＪ  カルダン、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，５３６−５４０。
ガルシア、Ｊ．；フェルナンデス、Ｓ．；フェレーロ、Ｍ．；サンヴィ  Ｙ．Ｓ．；ゴーター、Ｖ、オリゴヌクレオチドの溶液相合成の構成ブロック：酵素的アプローチを用いた、３’，５’−ジ−Ｏ−レブリニルヌクレオシドの位置選択的な加水分解、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００２）、６７、４５１３−４５１９。
Ｋ  ソノガシラ、Ｙ  トーダ及びＮ  ハギシャラ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９７５，１６，４４６７−４４７０。
ＭＳ  モタウィア、ＡＥ−Ｓ  アデル−メギド、ＥＢ  ペーザーセン、ＣＭ  ニールセン及びＰ  イブセン、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９９２，４６，７７−８１；ＡＥ−Ｓ  アデル−メギド、ＥＢ  ペーザーセン及びＣ  ニールセン、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９８，１２９，９９−１０９。
サンヴィ、Ｙ．Ｓ．、グオ  Ｚ．、ファンドフェラー、Ｈ．Ｍ．及びコンヴェルソ、Ａ．、より安全かつより安価な活性化剤を使用した、ヌクレオシドのホスホルアミダイトの調製のための改善された方法、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４，１７５−１８１（２０００）。
ＶＶ  フィリチェフ及びＥＢ  ペーザーセン、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，１４８４９−１４８５８；ＶＶ  フィリチェフ、ＩＶ  アスタコーヴァ、ＡＤ  マラホフ、ＶＡ  コルシュン及びＥＢ  ペーザーセン、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２００８，５２，３４７−３４８。
【図１】
2014512175.tif 000034
【図２】
2014512175.tif 000035
【図３】
2014512175.tif 000036
【図４ａ−ｅ】
2014512175.tif 000037
【図５ａ−ｅ】
2014512175.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月10日(2013.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼに対する基質としてヌクレオシド三リン酸塩の形態にある修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーの使用であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡが以下からなるリストから選択される一般化学構造を有する、前記使用：
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
−式中、ｎは５又は６である

Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
−式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である；並びに

Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
−式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である

−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｋはコンジュゲータであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層することができるインターカレータである。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマー又は鋳型として、ＳＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドの使用であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡが以下からなるリストから選択される一般化学構造を有する、前記使用：
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
−式中、ｎは５又は６である

Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
−式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である；並びに

Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
−式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である

−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｋはコンジュゲータであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層することができるインターカレータである。
【請求項３】
以下の工程を含む、プライマー伸長のための方法
ａ．鋳型核酸を提供する工程
ｂ．第１のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｃ．ポリメラーゼを提供する工程
ｄ．ヌクレオチド三リン酸塩混合物を提供する工程
ｅ．工程ａ〜ｄの成分を混合し、及び前記プライマーが前記鋳型へアニーリングすることを可能にする条件を提供する工程
ｆ．プライマー伸長を可能にする条件下で、前記鋳型にアニーリングされた前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長する工程
ｇ．工程ｆの第１の伸長産物に相補的である、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｈ．工程ｆの産物を変性する工程
ｉ．プライマー伸長を可能にする条件下で、前記第１の伸張産物にアニーリングされた前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長する工程
−ただし、前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、前記鋳型核酸は修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、前記ヌクレオチド三リン酸塩混合物は、オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みのためのヌクレオシド三リン酸塩の形態にある修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーを含み、
−ただし、前記修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡが以下からなるリストから選択される一般化学構造を有する：
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
−式中、ｎは５又は６である

Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
−式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である；並びに

Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
−式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である

−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｋはコンジュゲータであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層することができるインターカレータである。
【請求項４】
Ｋはエチニルである、以前の請求項のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項５】
Ｘ−ＢはＤＮＡ又はＲＮＡ単位である、以前の請求項のいずれかに記載の使用又は方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月29日(2013.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼに対する基質としてヌクレオシド三リン酸塩の形態にある修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーの使用であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡが以下からなるリストから選択される一般化学構造を有する、前記使用：
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
−式中、ｎは５又は６である
Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
−式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である；並びに
Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
−式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である
−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｋはコンジュゲータであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層することができるインターカレータである。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における、又は核酸を捕獲及び／若しくは検出するためのプライマー又は鋳型として、ＳＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドの使用であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡが以下からなるリストから選択される一般化学構造を有する、前記使用：
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
−式中、ｎは５又は６である
Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
−式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である；並びに
Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
−式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である
−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｋはコンジュゲータであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層することができるインターカレータである。
【請求項３】
以下の工程を含む、プライマー伸長のための方法
ａ．鋳型核酸を提供する工程
ｂ．第１のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｃ．ポリメラーゼを提供する工程
ｄ．ヌクレオチド三リン酸塩混合物を提供する工程
ｅ．工程ａ〜ｄの成分を混合し、及び前記プライマーが前記鋳型へアニーリングすることを可能にする条件を提供する工程
ｆ．プライマー伸長を可能にする条件下で、前記鋳型にアニーリングされた前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長する工程
ｇ．工程ｆの第１の伸長産物に相補的である、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを提供する工程
ｈ．工程ｆの産物を変性する工程
ｉ．プライマー伸長を可能にする条件下で、前記第１の伸張産物にアニーリングされた前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長する工程
−ただし、前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、前記鋳型核酸は修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーを含み、及び／又は
−ただし、前記ヌクレオチド三リン酸塩混合物は、オリゴヌクレオチド中への酵素的取り込みのためのヌクレオシド三リン酸塩の形態にある修飾オリゴヌクレオチドＳＮＡモノマーを含み、
−ただし、前記修飾オリゴヌクレオチドモノマーＳＮＡが以下からなるリストから選択される一般化学構造を有する：
Ｘ−Ｂ−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｉ
−式中、ｎは５又は６である
Ｘ−Ｂ−Ｋ−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯ−Ｉ
−式中、ｎは１〜３であり、及びｍは１〜３である；並びに
Ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ−Ｋ−Ｉ
−式中、ｍは１であり、及びｎは３又は４である
−Ｘは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのバックボーンに取り込むことができるバックボーンモノマー単位であり、
−Ｂは、核酸塩基、ピリミジン若しくはプリンアナログ、又は１つ以上の窒素原子を含む複素環系であり、
−Ｋはコンジュゲータであり、並びに
−Ｉは、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログの核酸塩基と共積層することができるインターカレータである。
【請求項４】
Ｋはエチニルである、以前の請求項のいずれかに記載の使用又は方法。
【請求項５】
Ｘ−ＢはＤＮＡ又はＲＮＡ単位である、以前の請求項のいずれかに記載の使用又は方法。
【国際調査報告】
2014512175.tif 000039
2014512175.tif 000040
2014512175.tif 000041
2014512175.tif 000042