(57)【要約】  本発明は、ＭＩＦの特別なｏｘＭＩＦ型が、（ＭＩＦ関連）疾患において診断マーカーとして、特に例えば疾患進行をモニタリングするための診断マーカーとして、有用であるという認識に関係する。本発明は、診断キットのそれぞれの使用およびそれぞれの診断アッセイにも関係し、有利なそれぞれの抗体にも関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ０に弁別的に結合するＭＩＦであるｏｘＭＩＦの、（ＭＩＦ関連）疾患のインビトロ診断におけるマーカーとしての使用。
【請求項２】
該（ＭＩＦ関連）疾患の診断が、請求項１において定義したｏｘＭＩＦである診断マーカーに弁別的に結合する化合物の使用をさらに伴う、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物がｏｘＭＩＦに特異的に結合する抗体である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抗体がｏｘＭＩＦには結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しない、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
弁別的結合が、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、さらに好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値で起こるｏｘＭＩＦへの結合、および４００ｎＭを上回るＫＤを特徴とするｒｅｄＭＩＦへの非結合である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＭＩＦ関連疾患が、炎症性疾患および新生物疾患を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項以上に記載の使用。
【請求項７】
ＭＩＦ関連疾患が、大腸がん、前立腺がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、黒色腫、リンパ腫、肝細胞癌、喘息、ＡＲＤＳ、関節リウマチ、敗血症、ＩｇＡネフロパシー、糸球体腎炎、ループス腎炎（ＬＮ）、肝炎、膵炎（＋／−急性肺傷害）、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃潰瘍、アルツハイマー病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、心機能障害、血管形成術、アテローム性動脈硬化、心筋炎、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、アトピー性皮膚炎、乾癬、子宮内膜症、神経障害性痛および／またはぶどう膜炎からなる群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
抗体がｏｘＭＩＦ結合剤（例えば抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ０など）からなる群より選択される、請求項２〜７のいずれか一項以上に記載の使用。
【請求項９】
診断が、（ＭＩＦ関連疾患）の存在の診断、（ＭＩＦ関連疾患）の進行の診断、（ＭＩＦ関連）疾患の状態の診断、および／または処置の有効性のモニタリングである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
診断が対象の体液試料に対して行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
診断が対象の細胞試料に対して行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
対象の体液試料または細胞試料における請求項１において定義したｏｘＭＩＦの検出による（ＭＩＦ関連）疾患のインビトロ診断のための診断アッセイであって、該試料中のｏｘＭＩＦへの化合物の結合をインビトロで決定するステップを含む、診断アッセイ。
【請求項１３】
ｏｘＭＩＦに結合する化合物および（ＭＩＦ関連）疾患が、請求項２〜９のいずれか一項以上において定義したとおりである、請求項１２に記載の診断アッセイ。
【請求項１４】
アッセイが、（ＭＩＦ関連）疾患の進行、寛解および／または処置中に１回または数回繰り返される、請求項１２または１３に記載の診断アッセイ。
【請求項１５】
診断キットがｏｘＭＩＦに結合する化合物を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項以上に記載のアッセイにおける診断キットの使用。
【請求項１６】
キットが、緩衝液、対照（例えば組換え（ｏｘ）ＭＩＦ）、ポリクローナル抗ＭＩＦ抗体、および／またはコンジュゲート検出抗体をさらに含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
以下の群から選択される抗ＭＩＦ抗体：
ａ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１０の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１２の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＢ４抗体、
ｂ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１１の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１３の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＢ９抗体、
ｃ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１４の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１５の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＢ０抗体、
ｄ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６１の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６２の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＭ４抗体、
ｅ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８５９の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６０の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＭ９抗体、および／または
ｆ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６３の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６４の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＭ０抗体。
【請求項１８】
以下の群から選択される抗ＭＩＦ抗体：
ａ）配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と配列番号６の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ４抗体、
ｂ）配列番号１の軽鎖アミノ酸配列と配列番号５の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ９抗体、
ｃ）配列番号３の軽鎖アミノ酸配列と配列番号７の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ０抗体、
ｄ）配列番号４の軽鎖アミノ酸配列と配列番号８の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ２抗体、
ｅ）配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列と配列番号１３の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＭ４抗体、
ｆ）配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列と配列番号１１の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＭ９抗体、および／もしくは
ｇ）配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列と配列番号９の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＭ０抗体、
ｈ）または、上記抗体ａ）〜ｇ）のいずれか１つと同じエピトープへの結合を特徴とする、それらの機能的等価物。
【請求項１９】
（ＭＩＦ関連）疾患の診断における、上記抗体、特に請求項１７または１８において定義したもののいずれか１つの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に体液または細胞もしくは細胞表面において、特定のＭＩＦ型が、ＭＩＦ関連疾患における診断マーカーとして、特に例えば疾患進行をモニタリングするための診断マーカーとして、（ＭＩＦ関連）疾患状態の（二次）マーカーとして、または処置判定を支援するツールとして、有用であるという認識に関係する。本発明は、診断キットのそれぞれの使用およびそれぞれの診断アッセイにも関係している。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、最初は、ツベルクリン過敏性モルモットからの腹腔滲出細胞（マクロファージを含有する）のインビトロでのランダムな遊走を阻害するその能力に基づいて単離されたサイトカインである（Ｂｌｏｏｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６６，  １５３，  ８０−２；Ｄａｖｉｄら，  ＰＮＡＳ  １９６６，  ５６，  ７２−７）。今日、ＭＩＦは、多面発現的な活性スペクトルを発揮する自然免疫応答および後天性免疫応答の決定的な上流制御因子として知られている。
【０００３】
ヒトＭＩＦ  ｃＤＮＡは１９８９年にクローニングされ（Ｗｅｉｓｅｒら，  ＰＮＡＳ  １９８９，  ８６，  ７５２２−６）、そのゲノム位置は２２番染色体にマッピングされている。ヒトＭＩＦ遺伝子の産物は、１１４アミノ酸（Ｎ末端メチオニンの切断後）で見掛けの分子量が約１２．５ｋＤａのタンパク質である。ＭＩＦは他のどのタンパク質とも有意な配列相同性を有さない。このタンパク質は、同一サブユニットの三量体として結晶化する。各単量体は、４本鎖βシートに対してパッキングされた２本の逆平行αヘリックスを含有している。モノマーは、隣接するサブユニットのβシートと相互作用して単量体間の界面を形成するさらに２本のβストランドを有している。３つのサブユニットは、溶媒露出チャネルを含むバレルを形成するように配置され、そのチャネルは分子の３回回転軸に沿ってタンパク質の中心を貫通している（Ｓｕｎら，  ＰＮＡＳ  １９９６，  ９３，  ５１９１−５１９６）。
【０００４】
マクロファージからのＭＩＦ分泌は極めて低濃度のグルココルチコイドで誘発されると報告されている（Ｃａｌａｎｄｒａら，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９５，  ３７７，  ６８−７１）。しかしまた、ＭＩＦはグルココルチコイドの効果を対抗的に制御し、他のサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αおよびインターロイキンＩＬ−１βなどの分泌を刺激する（Ｂａｕｇｈら，  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００２，  ３０，  Ｓ２７−３５）。ＭＩＦは、例えば血管新生促進性、増殖促進性および抗アポトーシス性を示し、よって腫瘍細胞増殖を促進することも示されている（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｒ．Ａ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，  ２００４．  １６（１）：ｐ．１３−１９；Ｌｕｅ，  Ｈ．ら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７．  ２６（３５）：ｐ．５０４６−５９）。また、例えばリンパ腫、黒色腫、および大腸がんの成長とも、直接的に関連付けられている（Ｎｉｓｈｉｈｉｒａら，  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  ２０００，  ２０：７５１−６２）。
【０００５】
ＭＩＦは、多くの病理学的状態のメディエーターであり、したがってさまざまな疾患、例えば限定するわけではないが、とりわけ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、糸球体腎炎、ＩｇＡネフロパシー、心筋梗塞（ＭＩ）、敗血症およびがんなどと関連付けられている。
【０００６】
組換えヒトＭＩＦに対してポリクローナルおよびモノクローナル抗ＭＩＦ抗体が開発されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １９９６；３８１，  １９９−２０２；Ｋａｗａｇｕｃｈｉら，  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９８６，  ３９，  ２２３−２３２、およびＷｅｉｓｅｒら，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８５，  ９０，  １６７-７８）。
【０００７】
抗ＭＩＦ抗体はその治療的使用が提案されている。Ｃａｌａｎｄｒａら（Ｊ．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  （１９９５）；４７，  ３９−５１）は、実験的に誘発されるグラム陰性菌およびグラム陽性菌敗血症性ショックから動物を防御するために、抗ＭＩＦ抗体を使用したと報告している。抗ＭＩＦ抗体は、敗血症性ショックおよび他の炎症性疾患状態におけるサイトカイン生産を調節するための治療手段として提案された。
【０００８】
ＵＳ６，６４５，４９３には、ＭＩＦの生物学的活性を中和する、ハイブリドーマ細胞由来のモノクローナル抗ＭＩＦ抗体が開示されている。これらのマウス由来抗ＭＩＦ抗体がエンドトキシン誘発性ショックの処置において有益な効果を有することは、動物モデルで示すことができた。
【０００９】
ＵＳ２００３１０２３５５８４には、ＭＩＦ遺伝子がホモ接合性にノックアウトされている動物において、ＭＩＦに対する高アフィニティ抗体を調製する方法が開示されている。
【００１０】
グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）は、Ｇａｌａｔらによって記載されたタンパク質である（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １９９４，  ２２４，  ４１７−２１）。現在ではＭＩＦとＧＩＦとは同じものであると認識されている。Ｗａｔａｒａｉら（ＰＮＡＳ  ２０００，  ９７，  １３２５１−６）は、Ｔｓ細胞におけるＧＩＦの翻訳後修飾の生化学的性質を同定するために、異なるＧＩＦエピトープに結合するポリクローナル抗体を記載した。Ｗａｔａｒａｉら（前掲書）は、ＧＩＦがインビトロでは異なるコンフォメーションアイソフォームで存在すると報告している。アイソマーの一タイプは、単一システイン残基の化学修飾によって生じる。この化学修飾がＧＩＦタンパク質内でのコンフォメーション変化につながる。
【００１１】
ＭＩＦが多数の異なる相互作用に関与する分子であることは過去数十年間にわたって示されてきたので、これは、ＭＩＦ関連疾患における疾患状態に関して、適切なマーカーになるかもしれない。ＭＩＦが関連する疾患のうち、いくつかについては、診断マーカーおよび診断方法が存在するが、通常、ある所与の疾患の診断のために２つ以上の方法およびマーカーが存在することが有益であり、さらに重要なことには、実際の疾患状態と相関するマーカーが存在することが有益である。ＭＩＦは人体において多量に検出されうる遍在性タンパク質であり、それゆえに、一般に、ＭＩＦの出現と（ＭＩＦ関連）疾患とを明確に結びつけて考えることはできなかった。それゆえに、当技術分野では、対象における（ＭＩＦ関連）疾患の発生および／または存在を検出するための適切な診断マーカーが必要とされている；特に（ＭＩＦ関連）疾患において、疾患進行のモニタリング、疾患状態の決定、および処置の効力のモニタリングを、特に、試料として体液を使用することによって、または試料として細胞を使用することによって、可能にするであろう信頼できるマーカーが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の目的は本発明によって解決された。特に本発明者らは、（ＭＩＦ関連）疾患の発生後は、例えば体液試料中に、または細胞もしくは細胞表面上に、ｏｘＭＩＦ（すなわち酸化型ＭＩＦ）を検出できること、およびｏｘＭＩＦは疾患状態および／または疾患進行と相関することを示すことができた。ここに提供される知識／技法によれば、ｏｘＭＩＦは健常ドナーからの体液試料、例えば血液、血清および尿などには存在せず、健常ドナーからの細胞試料にも存在しない。ｏｘＭＩＦは疾患状態下で増加する。この増加は、全ＭＩＦの増加より著しい（より特異的である）（実施例も参照されたい）。
【００１３】
この文脈において「存在しない」とは、ｏｘＭＩＦが、後述の抗体ＲＡＢ０で行った場合に、実施例３．４で「材料および方法」の見出しの下に示すＥＬＩＳＡ技法で検出することが可能な量では、体液中に存在しないことを意味するものとする。
【００１４】
例えば血球などの細胞試料に関連して「存在しない」とは、細胞試料において細胞への抗体ＲＡＢ９またはＲＡＢ０またはＲＡＢ４の適用が、実施例３．９に述べるフローサイトメトリー実験で、対照抗体「対照１（Ｃｏｎｔｒｏｌ  １）」による染色と比較して、それより高いシグナルを与えないことを意味する。
【００１５】
それゆえにｏｘＭＩＦはこれらの疾患に関するマーカーとして適切であり、ここで、本発明に関して、「（ＭＩＦ関連）疾患の診断におけるマーカー」という術語は、特に、ＭＩＦがこの（ＭＩＦ関連）疾患に関与する因子であるかどうかの評価の可能性を意味するものとする。この点において、マーカーとしてのｏｘＭＩＦは、疾患状態、その進行に関する情報を供給し、所与の処置の有効性を決定するためのマーカーとして役立つ；加えて、試料、例えば体液試料または細胞試料におけるｏｘＭＩＦ検出は、好ましい抗ＭＩＦ治療に関する指標として役立ちうる。こうして、ｏｘＭＩＦの検出は、所与の疾患または障害における既知の診断技法を改良するのに役立つ。これは、医師が、所与の疾患または障害の処置方法を判定するのを支援し、診断の特異度を改良するのに役立つ。このように、ｏｘＭＩＦは、特異的で適切な二次マーカーである。したがってその検出は、ＭＩＦ関連疾患に冒された患者の管理において、補助試験として役立ちうる。該当する疾患は、好ましい実施形態では、ＭＩＦ関連であることが知られているか、ＭＩＦ関連であると疑われている疾患（以下に詳述する疾患を参照されたい）であるが、今までにＭＩＦ関連であると疑われたことがない疾患であることもできる。
【００１６】
好ましい実施形態において、試料中のｏｘＭＩＦ存在の検出は、医師に、その試料の採取源となった対象が、ＭＩＦに対抗する治療法の恩恵を受けるかもしれないことを示すであろう。そのような治療法は、抗ＭＩＦ分子、例えば抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体、または（ｏｘ）ＭＩＦに対抗する小分子から選択されうる。
【００１７】
さまざまな疾患の発生後、とりわけ、がんの発生後は、ＭＩＦレベルの上昇、すなわちＭＩＦ全般のレベルの上昇が検出される。しかし、ＭＩＦは健常対象でも循環しているので、明確な区別は困難である。これに対して、ｏｘＭＩＦは健常対象には存在せず、それゆえに、ＭＩＦ関連疾患に関するはるかに強力な診断マーカーである。実施例において示すように、ｏｘＭＩＦは疾患状態では増加し、例えば血液、血清および尿のような患者の試料に検出することができる。
【００１８】
ここに提示する発明は、とりわけ、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４およびＲＡＢ０がｏｘＭＩＦに特異的に結合する（かつｒｅｄＭＩＦに結合する能力はない）という発見に基づいている。
【００１９】
本発明者らが行った初期の実験では、システイン媒介酸化、ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）媒介酸化のような酸化的手順、またはＭＩＦとプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）３００もしくはタンパク質架橋剤（例えばＢＭＯＥ）とのインキュベーションが、上述の抗体への結合を引き起こすことを示すことができた。
【００２０】
本発明者らが到達した驚くべき結論は、次のとおりである：
・組換えＭＩＦ（ヒト、マウス、ラット、ＣＨＯ、サル）の酸化還元調節（Ｃｙｓ／Ｇｌｕを介した温和な酸化）またはプロクリン３００またはタンパク質架橋剤による組換えＭＩＦの処理は、バクスターの抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４およびＲＡＢ０の結合につながる；
・ｏｘＭＩＦの還元はＡｂ結合の喪失につながる；
・ｏｘＭＩＦ−アイソフォームに対する特異性は、生物学的Ａｂ効力と相関する（インビトロ／インビボ）；
・ｏｘＭＩＦレベルは疾患状態と相関させることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって本発明は、好ましくは、次のように定義される。
１．抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ０および／またはＲＡＢ４に弁別的に結合するＭＩＦであるｏｘＭＩＦの、（ＭＩＦ関連）疾患のインビトロ診断におけるマーカーとしての使用。
【００２２】
２．該（ＭＩＦ関連疾患）の診断が、項目１において定義したｏｘＭＩＦである診断マーカーに弁別的に結合する化合物の使用をさらに伴う、項目１に記載の使用。
【００２３】
３．化合物がｏｘＭＩＦに弁別的に結合する抗体である、項目２に記載の使用。
【００２４】
４．抗体がｏｘＭＩＦに結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しない、項目３に記載の使用。
【００２５】
５．弁別的結合が、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、さらに好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値で起こるｏｘＭＩＦへの結合、および４００ｎＭを上回るＫＤを特徴とするｒｅｄＭＩＦへの非結合である、項目４に記載の使用。
【００２６】
６．ＭＩＦ関連疾患が、炎症性疾患および新生物疾患（良性、前悪性および／または悪性）を含む群から選択される、項目１〜５のいずれか１つ以上に記載の使用。
【００２７】
７．ＭＩＦ関連疾患が、大腸がん、前立腺がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、黒色腫、リンパ腫、肝細胞癌、喘息、ＡＲＤＳ、関節リウマチ、敗血症、ＩｇＡネフロパシー、糸球体腎炎、ループス腎炎（ＬＮ）、肝炎、膵炎（＋／−急性肺傷害）、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃潰瘍、アルツハイマー病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、心機能障害、血管形成術、アテローム性動脈硬化、心筋炎、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、アトピー性皮膚炎、乾癬、子宮内膜症、神経障害性痛および／またはぶどう膜炎からなる群より選択される、項目６に記載の使用。
【００２８】
８．抗体がｏｘＭＩＦ結合剤（例えば抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０など）からなる群より選択される、項目２〜７のいずれか１つ以上に記載の使用。
【００２９】
９．診断が、（ＭＩＦ関連疾患）の存在の診断、（ＭＩＦ関連疾患）の進行の診断、疾患の状態の診断、および／または処置の有効性のモニタリングである、項目１〜８のいずれか１つに記載の使用。
【００３０】
１０．診断が対象の体液試料に対して行われる、項目１〜９のいずれか１つに記載の使用。
【００３１】
１１．診断が対象の細胞試料に対して行われる、項目１〜９のいずれか１つに記載の使用。
【００３２】
１２．対象の体液試料または細胞試料における項目１において定義したｏｘＭＩＦの検出による（ＭＩＦ関連）疾患のインビトロ診断のための診断アッセイであって、該試料中のｏｘＭＩＦへの化合物の結合をインビトロで決定するステップを含む、診断アッセイ。
【００３３】
１３．ｏｘＭＩＦに結合する化合物および（ＭＩＦ関連）疾患が、項目２〜９のいずれか１つ以上において定義したとおりである、項目１２に記載の診断アッセイ。
【００３４】
１４．アッセイが、（ＭＩＦ関連）疾患の進行、寛解および／または処置中に１回または数回繰り返される、項目１２または１３に記載の診断アッセイ。
【００３５】
１５．診断キットがｏｘＭＩＦに結合する化合物を含む、項目１２〜１４のいずれか１つ以上に記載のアッセイにおける診断キットの使用。
【００３６】
１６．キットが、緩衝液、対照（例えば組換え（ｏｘ）ＭＩＦ）、ポリクローナル抗ＭＩＦ抗体、および／またはコンジュゲート検出抗体をさらに含む、項目１５に記載の使用。
【００３７】
１７．以下の群から選択される抗ＭＩＦ抗体：
ａ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１０の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１２の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＢ４抗体、
ｂ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１１の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１３の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＢ９抗体、
ｃ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１４の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５１１５の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＢ０抗体
ｄ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６１の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６２の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＭ４抗体、
ｅ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８５９の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６０の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＭ９抗体、および／または
ｆ）プラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６３の軽鎖配列とプラスミド寄託として寄託された受託番号ＤＳＭ２５８６４の重鎖配列とを特徴とする、ＲＡＭ０抗体。
【００３８】
１８．以下の群から選択される抗ＭＩＦ抗体：
ａ）配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と配列番号６の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ４抗体、
ｂ）配列番号１の軽鎖アミノ酸配列と配列番号５の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ９抗体、
ｃ）配列番号３の軽鎖アミノ酸配列と配列番号７の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ０抗体、
ｄ）配列番号４の軽鎖アミノ酸配列と配列番号８の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＢ２抗体、
ｅ）配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列と配列番号１３の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＭ４抗体、
ｆ）配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列と配列番号１１の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＭ９抗体、および／もしくは
ｇ）配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列と配列番号９の重鎖アミノ酸配列とを特徴とする、ＲＡＭ０抗体、
ｈ）または、上記抗体ａ）〜ｇ）のいずれか１つと同じエピトープへの結合を特徴とする、それらの機能的等価物。
【００３９】
１９．（ＭＩＦ関連）疾患の診断における、上記抗体（特に項目１７または１８において定義したもの）のいずれか１つの使用。
【００４０】
上述の項目ならびに本願に添付のクレームは全て、以下の好ましい抗体に、等しく関係している：
ＲＡＭ９
ＲＡＭ４
ＲＡＭ０。
【００４１】
これらの抗体は、上記の項目のリストに挙げた抗体と同じ特異性を有し（下記も参照されたい）、これらの抗体を使って類似する結果を達成することができる。
【００４２】
特に本発明では、例えば診断マーカーとして特に好適で有利な、好ましい本発明の抗体が提供される。
【００４３】
これら上述の抗体は、その配列によって特徴づけられ、裏付けられると共に、上述の抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ４およびＲＡＢ９ならびにＲＡＭ０、ＲＡＭ４およびＲＡＭ９のそれぞれの軽鎖または重鎖のいずれかを、それぞれ含む、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）（ＴＧ１株）中のプラスミドとしての寄託物によっても特徴づけられ、裏付けられる。
【００４４】
プラスミドは、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）（ドイツ国ブラウンシュワイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂ）へのブダペスト条約に基づく寄託時に与えられる公式番号である、そのＤＳＭ番号によって特徴づけられる。プラスミドはそれぞれ大腸菌株に入れて寄託された。
【００４５】
番号ＤＳＭ２５１１０のプラスミドは抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４の軽鎖配列を含む。
【００４６】
番号ＤＳＭ２５１１２のプラスミドは抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４の重鎖（ＩｇＧ４）配列を含む。
【００４７】
適切な宿主細胞におけるプラスミドＤＳＭ２５１１０とＤＳＭ２５１１２との同時発現は、好ましい抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４の生産をもたらす。
【００４８】
番号ＤＳＭ２５１１１のプラスミドは抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９の軽鎖配列を含む。
【００４９】
番号ＤＳＭ２５１１３のプラスミドは抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９の重鎖（ＩｇＧ４）配列を含む。
【００５０】
適切な宿主細胞におけるプラスミドＤＳＭ２５１１１とＤＳＭ２５１１３との同時発現は、好ましい抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９の生産をもたらす。
【００５１】
番号ＤＳＭ２５１１４のプラスミドは抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の軽鎖配列を含む。
【００５２】
番号ＤＳＭ２５１１５のプラスミドは抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の重鎖（ＩｇＧ４）配列を含む。
【００５３】
適切な宿主細胞におけるプラスミドＤＳＭ２５１１４とＤＳＭ２５１１５との同時発現は、好ましい抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の生産をもたらす。
【００５４】
抗体ＲＡＭ０、ＲＡＭ９およびＲＡＭ４も寄託されている；いずれも、ブダペスト条約に従い、２０１２年４月１２日に、以下の名称で、ＤＳＺＭ、ブラウンシュワイク、ドイツ国に寄託された：
ＲＡＭ９−重鎖：大腸菌ＧＡ．６６２−０１．ｐＲＡＭ９ｈｃ−ＤＭＳ２５８６０．
ＲＡＭ４−軽鎖：大腸菌ＧＡ．９０６−０４．ｐＲＡＭ４ｌｃ−ＤＭＳ２５８６１．
ＲＡＭ９−軽鎖：大腸菌ＧＡ．６６１−０１．ｐＲＡＭ９ｌｃ−ＤＭＳ２５８５９．
ＲＡＭ４−重鎖：大腸菌ＧＡ．６５７−０２．ｐＲＡＭ４ｈｃ−ＤＭＳ２５８６２．
ＲＡＭ０−軽鎖：大腸菌ＧＡ．９０６−０１．ｐＲＡＭ０ｌｃ−ＤＭＳ２５８６３．
ＲＡＭ０−重鎖：大腸菌ＧＡ．７８４−０１．ｐＲＡＭ０ｈｃ−ＤＭＳ２５８６４．
【００５５】
したがって本発明は、診断方法において使用するための、抗ｏｘＭＩＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む診断アッセイであって、これらの抗体またはその抗原結合性フラグメントが弁別的結合を有する、すなわちｏｘＭＩＦには結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しない、診断アッセイも包含する。現在の知識／技法によれば、健常ドナーからの試料にｏｘＭＩＦを検出することはできない。一実施形態では、ヒト対象からの生物学的試料中のヒトｏｘＭＩＦを検出するために、上記抗ｏｘＭＩＦ抗体またはその抗原結合性部分を使用することができる。
【００５６】
本願に関して、生物学的試料は、好ましくは、診断が下される対象の体液試料である。体液試料は、当業者に知られている体液の任意の試料である。例えば限定するわけではないが、そのような試料として、血液、血漿、血清、唾液、尿、鼻汁（ｎａｓａｌ  ｆｌｕｉｄ）、腹水、眼液（ｏｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、房水、硝子体液、涙液、カウパー液、精液、間質液、リンパ液、母乳、粘液（鼻水および痰を含む）、胸水、膿、月経分泌物、膣潤滑液、皮脂、脳脊髄液および滑液を挙げることができる。本願に関し、さらなる生物学的試料として、（中空）体器官の洗浄液（洗い出し液）（例えば気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液および腸洗浄液）を挙げることもできる。
【００５７】
代替的一態様では、本願に関して、生物学的試料は、診断が下される対象の細胞試料、最も好ましくは循環または患部組織からの細胞試料、より好ましくは単細胞懸濁液試料としての細胞試料である。
【００５８】
特に、上記診断アッセイは、所与の疾患に（ｏｘ）ＭＩＦが関与しているかどうかを決定するために使用することができる。
【００５９】
したがって本発明は、疾患の進行を評価するための方法にも関係する；この文脈において、「疾患の状態」という用語は、「疾患の重症度」という用語と同義であると理解すべきであり、疾患または状態の重篤度、程度または状態（すなわちステージ）を指す。例えば疾患は、軽度、中等度または重度と特徴づけることができる。重症度または程度、すなわち疾患の状態の決定または評価は、当業者にはよく知られている。この評価のために行われる実際の方法は、もちろん、問題の疾患または状態に依存する。例えば、ある疾患を有する対象の生存の可能性または長さを、同じ疾患を有する他の対象における生存の可能性または長さと比較することによって、疾患の状態を決定することができる。
【００６０】
別の実施形態では、ある疾患を有する対象における疾患の症状を、同じ疾患を有する他の対象における症状と比較することによって、疾患の状態を決定することができる。さらにもう一つの実施形態において、疾患の状態およびその進行は、ある期間にわたる同一患者内での症状の変化に反映される。
【００６１】
さらにもう一つの好ましい態様において、本発明は、抗（ｏｘ）ＭＩＦ化合物による処置に適格な対象を選択する方法であって、対象は（ＭＩＦ関連）疾患を有するか、（ＭＩＦ関連）疾患を進展させるリスクがあり、該対象におけるｏｘＭＩＦの存在および／またはレベルおよび／またはレベルの変化を検出することを含む方法に向けることもできる。ｏｘＭＩＦのレベルが上昇している対象を、上に定義した抗（ｏｘ）ＭＩＦ化合物による予防的または治療的処置のために選択することができる。
【００６２】
「予防的」または「治療的」処置という用語は、当技術分野において認識されている用語であり、患者への薬物の投与を指す。望ましくない状態（例えば、ヒトまたは動物などの宿主の疾患または他の望ましくない状態）の臨床症状発現の前に投与される場合、その処置は予防的処置であり、すなわちそれは望ましくない状態の進展から宿主を防御し、他方、投与が望ましくない状態の症状発現後に投与される場合、その処置は治療的処置である（すなわち、既存の望ましくない状態もしくはその副作用を減じ、改善し、または既存の望ましくない状態もしくはその副作用を維持する）。
【００６３】
本明細書にいう抗（ｏｘ）ＭＩＦ化合物とは、（ｏｘ）ＭＩＦの生物学的活性を減弱し、阻害し、対抗し、打ち消し、または減少させる任意の薬剤を指す。抗（ｏｘ）ＭＩＦ化合物は、（ｏｘ）ＭＩＦ活性を阻害または中和する薬剤、例えば抗体、特に好ましくは本明細書に記載する抗体、さらに好ましくは抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０であることができる。
【００６４】
診断アッセイは、例えば患者の体液試料または細胞試料などにおけるｏｘＭＩＦの存在またはレベルを決定するために使用することができる。ｏｘＭＩＦの存在または非存在は、疾患がＭＩＦ関連であるかどうかの識別またはｏｘＭＩＦ処置が合理的であるかどうかの判定に適している。ｏｘＭＩＦレベルは疾患進行または処置効力を示す。
【００６５】
本発明はさらに、本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体またはその抗原結合性部分を含むキットに関する。キットは、抗体に加えて、さらなる診断剤または治療剤、およびその使用を含みうる。キットは、診断方法または治療方法における使用に関する説明書も含むことができる。
【００６６】
添付の図面に本発明をさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】大腸菌負荷マウスの血漿中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ  対照マウス（Ｃ）および大腸菌負荷マウス（Ｅ）から得た血漿をｏｘＭＩＦ（図１Ａ）および全ＭＩＦ（図１Ｂ）ＥＬＩＳＡに付した。
【図２】大腸菌負荷マウスからの顆粒球および単球の表面でのｏｘＭＩＦ検出    対照（Ｆ）または大腸菌負荷マウス（Ｅ）からさまざまな時点で得た血液試料を、白血球集団を区別するための特異的細胞マーカーと、ヒト抗ＭＩＦモノクローナル抗体ＲＡＢ９またはヒト対照ＩｇＧ１で染色し、ＲＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン、発色性マーカー）標識ポリクローナル抗ヒトＩｇＧによって検出した。ヒストグラムは、顆粒球集団（ＧＲ１）または単球集団（ＣＤ１４）における対照抗体（濃い黒線）とＲＡＢ９特異的染色（灰色のプロファイル）とのオーバーレイを示している。
【図３】菌血症患者の血漿における全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ検出  菌血症患者からの血漿（１〜６、黒いカラム）、１人の健常対照からの血漿（７、灰色のカラム）および健常ドナーからの血漿のプール（８、灰色のカラム）中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【図４】乾癬患者の血清試料中のｏｘＭＩＦの検出  患者の循環中のｏｘＭＩＦレベルの減少は、疾患重症度の改善との相関を示す。
【図５】糸球体腎炎を持つラットからの尿中のｏｘＭＩＦのレベル  （Ａ）ｏｘＭＩＦのレベルは、０日目（疾患誘発前）から疾患誘発後８日目まで、疾患の進行と共に増加する。抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９による処置は、８日目のｏｘＭＩＦの尿中レベルを低下させる。（Ｂ）同じ実験において８日目に動物を屠殺した後に決定されたマクロファージ浸潤。ＲＡＢ９処置群におけるマクロファージ浸潤の低減は、ｏｘＭＩＦレベルの低下と相関する。
【図６】ループス腎炎を持つ患者からの尿中のｏｘＭＩＦのレベル  （Ａ）尿中のｏｘＭＩＦレベルは疾患重症度と相関する。各患者群について測定された平均値を示す。（Ｂ）ループス腎炎と新たに診断された１人の患者において測定されたｏｘＭＩＦレベルの時間経過。この患者を非特異的免疫抑制薬で処置した。尿中ｏｘＭＩＦレベルの低下は臨床状況の改善と相関する。（Ｃ）血漿中のｏｘＭＩＦレベルは疾患重症度と相関する。各患者群について測定された平均値を示す。
【図７】糖尿病性網膜症を持つ患者からの眼房水中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ  白内障（ＣＡＴ、ｎ＝５）または糖尿病性網膜症（ＤＲ、ｎ＝５）を持つ患者から得た眼房水中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【図８】前立腺がんの異種移植マウスモデル  動物モデルの終了後に、全ＭＩＦレベル（Ａ）ならびにｏｘＭＩＦレベル（Ｂ）を測定するために、マウスから血漿試料を採取した。腫瘍を切除し、重量を測定した（Ｃ）。図は各群について得られた値の平均を示す。非異種移植マウスからの血漿試料も全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦについて分析した（＝陰性対照）。
【図９】ＰＣ−３前立腺がん細胞株の表面のｏｘＭＩＦ  ＰＣ−３細胞をまず対照ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（灰色に着色したグラフ）およびＲＡＢ９（黒い線）で標識した。細胞表面に結合した抗体の検出はＲＰＥ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧで行った。
【図１０】健常ドナーからの白血球の表面にはｏｘＭＩＦが存在しない  健常ドナーからのヒト血球を対照ＩｇＧ１ヒトモノクローナル抗体（灰色に着色したグラフ）、ＲＡＢ９（黒い線）またはＲＡＢ０（黒い点線）と共にインキュベートした。細胞表面に結合した抗体の検出はＲＰＥ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧで行った。電子的ゲーティングにより、顆粒球、単球、リンパ球Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）およびリンパ球Ｔ細胞＋ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１９ｎｅｇ細胞）を識別することができた。
【図１１】ＢｘＰＣ３膵がん細胞株の表面のｏｘＭＩＦ  ＢｘＰＣ３細胞をまず対照ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（灰色に着色したグラフ）またはＲＡＢ０（黒い線）で標識した。細胞表面に結合した抗体の検出はＲＰＥ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧで行った。
【図１２】Ａ２７８０卵巣がん細胞株の表面のｏｘＭＩＦ  Ａ２７８０細胞をまず、対照ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（灰色に着色したグラフ）、ＲＡＢ９（黒い線）で標識した。細胞表面に結合した抗体の検出はＲＰＥ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧで行った。
【図１３】ヒトリンパ腫細胞株の表面のｏｘＭＩＦ  ヒトリンパ腫細胞株をまず、対照ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（灰色に着色したグラフ）、ＲＡＢ９（Ａ、ＢおよびＤにおける黒い線）、またはＲＡＢ０（Ｃにおける黒い線）で標識した。細胞表面に結合した抗体の検出はＲＰＥ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧで行った。Ａ）ＣＡ４６バーキットリンパ腫；Ｂ）ＭＣ−ＣＡＲ  Ｂリンパ球骨髄腫；Ｃ）ラージ（Ｒａｊｉ）バーキットリンパ腫；Ｄ）Ｕ９３７組織球リンパ腫。
【図１４】前立腺がん患者からの血漿中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベル（Ａ）異なる前立腺がん患者（ｎ＝１４）および健常ボランティア（ｎ＝４９）からの血漿中の全ＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＝０．０１６６、対応のない片側ｔ検定。（Ｂ）異なる前立腺がん患者（ｎ＝１４）および健常ボランティア（ｎ＝４９）からの血漿中のｏｘＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＝０．００１６、対応のない片側ｔ検定。
【図１５】乳がん患者からの血漿中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベル（Ａ）異なる乳がん患者（ｎ＝１５）および健常ボランティア（ｎ＝４９）からの血漿中の全ＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＝０．００７８、対応のない片側ｔ検定。（Ｂ）異なる乳がん患者（ｎ＝１５）および健常ボランティア（ｎ＝４９）からの血漿中のｏｘＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＝０．０４５１、対応のない片側ｔ検定。
【図１６】多発性硬化症を持つ患者からの脳脊髄液中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベル（Ａ）異なる形態の多発性硬化症と診断された患者（ｎ＝４９）および健常ボランティア（ｎ＝３０）の脳脊髄液中の全ＭＩＦレベルを測定した。中央値（太い線）を記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＜０．０００１、対応のない片側ｔ検定。（Ｂ）異なる形態の多発性硬化症と診断された患者（ｎ＝４９）および健常ボランティア（ｎ＝３０）からの脳脊髄液中のｏｘＭＩＦレベルを測定した。中央値（太い線）を記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＜０．０００１、対応のない片側ｔ検定。
【図１７】卵巣がん患者からの血漿中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベル（Ａ）異なる卵巣がん患者（ｎ＝４２）および健常ボランティア（ｎ＝１９）からの血漿中の全ＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＝０．０４３４、対応のない片側ｔ検定。（Ｂ）異なる卵巣がん患者（ｎ＝４２）および健常ボランティア（ｎ＝１９）からの血漿中のｏｘＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。統計：ｐ＝０．０６６３、対応のない片側ｔ検定。（Ｃ）異なる種類の卵巣がん患者（明細胞腺癌ｎ＝７、乳頭状漿液性嚢胞腺癌ｎ＝１４、および漿液性嚢胞腺癌ｎ＝２１）および健常ボランティア（ｎ＝１９）からの血漿中の全ＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。対照群に対して各群についてｔ検定（対応のない片側）を使って統計的有意性を評価した：ａ．対照（ｎ＝１９）対明細胞腺癌（ｎ＝７）：ｐ＝０．３６９６ｂ．対照（ｎ＝１９）対乳頭状漿液性嚢胞腺癌（ｎ＝１４）：ｐ＝０．０７２１ｃ．対照（ｎ＝１９）対漿液性嚢胞腺癌（ｎ＝２１）：ｐ＝０．００４６＊＊（Ｄ）異なる種類の卵巣がん患者（明細胞腺癌ｎ＝７、乳頭状漿液性嚢胞腺癌ｎ＝１４、および漿液性嚢胞腺癌ｎ＝２１）および健常ボランティア（ｎ＝１９）からの血漿中のｏｘＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。対照群に対して各群についてｔ検定（対応のない片側）を使って統計的有意性を評価した：ａ．対照（ｎ＝１９）対明細胞腺癌（ｎ＝７）：ｐ＝０．４５１８ｂ．対照（ｎ＝１９）対乳頭状漿液性嚢胞腺癌（ｎ＝１４）：ｐ＝０．０４３８＊ｃ．対照（ｎ＝１９）対漿液性嚢胞腺癌（ｎ＝２１）：ｐ＝０．０３５７＊ 図１７Ａ：卵巣がん患者からの血漿中の全ＭＩＦのレベル  図１７Ｂ：卵巣がん患者からの血漿中のｏｘＭＩＦのレベル  図１７Ｃ：異なる形態の卵巣がんを持つ患者からの血漿中の全ＭＩＦのレベル  図１７Ｄ：異なる形態の卵巣がんを持つ患者からの血漿中のｏｘＭＩＦのレベル
【図１８】ＵＣ患者およびＣＤ患者からの血漿中の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベル（Ａ）異なるＵＣ患者（ｎ＝１５）およびＣＤ患者（ｎ＝２１）ならびに健常ボランティア（ｎ＝１９）からの血漿中の全ＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。ａ．対照対ＵＣ：ｐ＝０．１２４０、対応のない片側ｔ検定。ｂ．対照対ＣＤ：ｐ＝０．０２０７＊、対応のない片側ｔ検定。（Ｂ）異なるＵＣ患者（ｎ＝１５）およびＣＤ患者（ｎ＝２１）ならびに健常ボランティア（ｎ＝１９）からの血漿中のｏｘＭＩＦレベルを測定した。中央値を太い線で記入した箱ひげ図（５〜９５％パーセンタイル）を示す。ａ．対照対ＵＣ：ｐ＝０．０４１７＊、対応のない片側ｔ検定。ｂ．対照対ＣＤ：ｐ＝０．０１１４＊、対応のない片側ｔ検定。  図１８Ａ：ＵＣおよびＣＤを持つ患者からの血漿中の全ＭＩＦのレベル  図１８Ｂ：ＵＣおよびＣＤを持つ患者からの血漿中のｏｘＭＩＦのレベル
【発明を実施するための形態】
【００６８】
定義および一般技法
本明細書に別段の定義がある場合を除き、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学に関連して使用される術語は、当技術分野において周知のよく使用されるものである。本発明の方法および技法は、別段の表示がある場合を除き、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って、本明細書の全体を通して引用し議論するさまざまな一般文献と、より専門的な文献とに記述されているように行われる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい（これらは引用により本明細書に組み込まれる）。
【００６９】
「ＭＩＦ」または「マクロファージ遊走阻止因子」とは、免疫応答および炎症応答における決定的メディエーターとして知られ、またグルココルチコイドの対抗制御因子として知られているタンパク質を指す。ＭＩＦには、哺乳動物ＭＩＦ、具体的にはヒトＭＩＦ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔプライマリアクセッション番号：Ｐ１４１７４）が含まれ、その単量体型は、１１５アミノ酸タンパク質としてコードされているが、開始メチオニンが切断されるため、１１４アミノ酸タンパク質として生産される。「ＭＩＦ」には、「ＧＩＦ」（グリコシル化阻害因子）や他の形態のＭＩＦ、例えばＭＩＦの融合タンパク質も含まれる。ＭＩＦのアミノ酸のナンバリングはＮ末端メチオニン（アミノ酸１）で始まり、Ｃ末端アラニン（アミノ酸１１５）で終わる。
【００７０】
「酸化型ＭＩＦ」またはｏｘＭＩＦは、本発明では、温和な酸化剤、例えばシスチンによるＭＩＦの処理によって生じるＭＩＦのアイソフォームと定義される。本発明によって示されるとおり、この方法で処理された組換えｏｘＭＩＦは、（例えば）動物に細菌を負荷した後にインビボで生じるｏｘＭＩＦと共通する構造再構成を起こしたＭＩＦのアイソフォームを含む。
【００７１】
ｒｅｄＭＩＦは、本発明では、還元型ＭＩＦと定義され、ＲＡＢ０、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ４に結合しないＭＩＦである。
【００７２】
本発明で述べる抗ｏｘＭＩＦ抗体は、温和な酸化または還元によってそれぞれ生じるｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦとを区別することができ、ｏｘＭＩＦを特異的に検出するのに役立つ。これらのコンフォーマー間の区別は、ＥＬＩＳＡ（例えば実施例３．４で説明するもの）または表面プラズモン共鳴によって評価される。
【００７３】
Ｂｉａｃｏｒｅによる抗体の弁別的結合の評価
抗体ＲＡＢ９およびＲＡＢ０へのｏｘＭＩＦおよびｒｅｄＭＩＦの結合速度論を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００システムを使った表面プラズモン共鳴分析によって調べる。抗体を、ＣＭ５（＝カルボキシメチル化デキストラン）チップ上にコーティングし、０．２％プロクリン３００と共にプレインキュベートした組換えＭＩＦタンパク質を注入した（プロクリン３００は、ｏｘＭＩＦからｒｅｄＭＩＦへの転化を回避することによって、ｏｘＭＩＦ構造を安定化する酸化性イソチアゾロンからなる）。プロクリン３００を添加していないネイティブＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（＝Ｂｉａｃｏｒｅランニング緩衝液）では、組換えＭＩＦタンパク質はいずれもＲＡＢ９、ＲＡＢ０には結合せず、陰性（バックグラウンド）結合対照として使用した参照抗体（無関係なアイソタイプ対照抗体）にも結合しなかった。
【００７４】
好ましい実施形態では、ｏｘＭＩＦが、抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０またはその抗原結合性フラグメントによって弁別的に結合されるＭＩＦであり、これらの抗体がｏｘＭＩＦには結合するが、ｒｅｄＭＩＦはこれらの抗体のいずれとも結合しないことを意味している。
【００７５】
別の実施形態では、抗ｏｘＭＩＦ抗体、例えば上述の抗体、またはその抗原結合性部分が、１００ｎＭ未満のＫＤ、好ましくは５０ｎＭ未満のＫＤ、より好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤで、ｏｘＭＩＦに結合する。特に好ましくは、本発明の抗体は、５ｎＭ未満のＫＤでｏｘＭＩＦに結合する。
【００７６】
（ｏｘＭＩＦまたはｒｅｄＭＩＦへの）抗体、例えばＲＡＢ９、ＲＡＢ４またはＲＡＢ０の（非）結合は、例えば以下の方法のいずれかなど、当業者に広く知られているように決定することができる：組換えＭＩＦによる弁別的結合ＥＬＩＳＡ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ）、または組換えＭＩＦをその還元状態または酸化状態で使用する表面プラズモン共鳴、例えば上述した周知のＢｉａｃｏｒｅアッセイ。
【００７７】
結合を決定するための好ましい方法は、例えば組換え（ｏｘ）ＭＩＦへの抗体の表面プラズモン共鳴であり、ここで「結合」は、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤによって表されるものとし、一方、ｒｅｄＭＩＦへの非結合は、４００ｎＭを上回るＫＤによって特徴づけられる。「結合」および「特異的結合」は、本明細書では、上記を表すために可換的に使用される。本願に関して「弁別的結合」とは、化合物、特に本明細書に記載する抗体が、ｏｘＭＩＦに（例えば上述のＫＤ値で）結合すると共に、それらがｒｅｄＭＩＦには結合しない（非結合とは、ここでも、上に定義したとおりである）ことを意味する。
【００７８】
「抗体」とは、無傷の抗体または（特異的）結合に関して無傷の抗体と競合する抗原結合性部分を指す。一般論については「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第７章（Ｐａｕｌ，  Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９））（引用により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体という用語には、ヒト抗体、哺乳動物抗体、単離抗体および遺伝子操作された形態、例えばキメラ、ラクダ化またはヒト化抗体が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７９】
抗体の「抗原結合性部分」という用語は、抗原（例えば（ｏｘ）ＭＩＦ）に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技法によって生産するか、無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって生産することができる。抗原結合性部分には、例えば−限定するわけではないが−次に挙げるものが含まれる：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、抗体、およびポリペプチド（すなわちｏｘＭＩＦまたはｒｅｄＭＩＦ）への特異的抗原結合を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチド。Ｎ末端からＣ末端に向かって、成熟軽鎖および重鎖可変ドメインはどちらも、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９８７および１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）、またはＣｈｏｔｈｉａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３  （１９８９）の定義に従う。抗体またはその抗原結合性部分は誘導体化するか、もう一つの機能分子（例えばもう一つのペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。例えば抗体またはその抗原結合性部分は、１つ以上の他の分子実体、例えばもう一つの抗体（例えば二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能剤、細胞毒性剤、医薬剤および／または連結分子に、機能的に連結することができる。
【００８０】
「ＫＤ」という用語は、本明細書では、当業者の一般的知識のとおり、特定抗体と各抗原との平衡解離定数を指す。この平衡解離定数は、大きな物体（ここでは複合体ｏｘＭＩＦまたはｒｅｄＭＩＦ／抗体）が、分離する傾向、すなわち、小さな構成要素（ここではｏｘＭＩＦまたはｒｅｄＭＩＦと抗体と）に解離する傾向を測定している。
【００８１】
「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインと定常ドメインとがヒト配列である任意の抗体を指す。この用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を持つが、例えば考えうる免疫原性が減少し、アフィニティが増加し、または望ましくないフォールディングを引き起こすかもしれないシステインが排除されるように配列が改変されている抗体を包含する。この用語は、例えばヒト細胞に特有ではないグリコシル化を付加するかもしれない非ヒト細胞において組換え生産された前述の抗体を包含する。
【００８２】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト配列を含み、かつ非ヒト配列も含有する抗体を指す。
【００８３】
「ラクダ化抗体」という用語は、抗体の構造または配列が、ラクダ抗体とも呼ばれるラクダからの抗体に、より近くなるように改変されている抗体である。ラクダ化抗体を設計し生産するための方法は、当業者の一般的知識の一部である。
【００８４】
「キメラ抗体」という用語は、２つ以上の異なる種からの領域を含む抗体を指す。
【００８５】
「単離抗体」または「その単離抗原結合性部分」とは、ファージディスプレイライブラリーまたはＢ細胞レパートリーなどの抗体源から同定され選択された抗体またはその抗原結合性部分を指す。
【００８６】
本発明の抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の生産には、遺伝子工学により、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅などによって、組換えＤＮＡを生成させ、発現ベクターにクローニングするための任意の方法が含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができるウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、それが導入された宿主細胞内で自立的に複製する能力を有する（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。別の実施形態において、ベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製されうる。さらにまた、一定のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを、本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。
【００８７】
抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体は、とりわけ従来の発現ベクター、例えば細菌ベクター（例えばｐＢＲ３２２およびその誘導体）、または真核ベクターを利用して、生産することができる。抗体をコードするこれらの配列には、複製、発現および／または宿主細胞からの分泌を制御する制御配列を与えることができる。これらの制御配列は、例えばプロモーター（例えばＣＭＶまたはＳＶ４０）およびシグナル配列を含む。発現ベクターは、選択および増幅マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、およびチミジン−キナーゼも含むことができる。使用するベクターの構成要素、例えば選択マーカー、レプリコン、エンハンサーは、市販されているか、または従来の方法を使って調製することができる。さまざまな細胞培養、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、線維芽細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または大腸菌などの細菌において発現させるためのベクターを構築することができる。いくつかの例では、発現されるタンパク質の最適なグリコシル化を可能にする細胞が使用される。
【００８８】
抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体軽鎖遺伝子および抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができ、あるいはこれらの遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的方法によって、例えば抗体遺伝子フラグメントとベクター上の相補的制限部位のライゲーションによって、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーションによって、発現ベクター中に挿入される。
【００８９】
抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントの生産は、トランスフェクションにより、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって、組換えＤＮＡを真核細胞中に導入するための、当技術分野において知られる任意の方法を含みうる。例えば、抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の組換え発現は、１つ以上の制御配列、例えば強力なプロモーターの支配下にある、抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体コードＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを、適切な宿主細胞株中に、適当なトランスフェクション法で導入することで、導入された配列がゲノム中に安定に組み込まれている細胞をもたらすことによって達成することができる。リポフェクション法は、本発明に従って使用しうるトランスフェクション法の一例である。
【００９０】
抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の生産は、該形質転換細胞を例えば連続的にまたはバッチ的に培養し、抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体を構成的にまたは誘導時に発現させるための、当業者に知られている任意の方法も含みうる。抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の生産に関するさらなる文献として、特にＷＯ２００９／０８６９２０が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明に従って生産される抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体が、ｏｘＭＩＦまたはそのエピトープに結合する。特に好ましい本発明の抗体は、抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０ならびにＲＡＭ９、ＲＡＭ４および／またはＲＡＭ０である。
【００９１】
これらの抗体の配列は、部分的に、ＷＯ２００９／０８６９２０にも開示されている；本願の配列表に加えて、以下を参照されたい。
【００９２】
ＲＡＢ９の軽鎖のアミノ酸配列について配列番号１：
【化１】
2014530360.tif 000002
【００９３】
ＲＡＢ４の軽鎖のアミノ酸配列について配列番号２：
【化２】
2014530360.tif 000003
【００９４】
ＲＡＢ０の軽鎖のアミノ酸配列について配列番号３：
【化３】
2014530360.tif 000004
【００９５】
ＲＡＢ２の軽鎖のアミノ酸配列について配列番号４：
【化４】
2014530360.tif 000005
【００９６】
ＲＡＢ９の重鎖のアミノ酸配列について配列番号５：
【化５】
2014530360.tif 000006
【００９７】
ＲＡＢ４の重鎖のアミノ酸配列について配列番号６：
【化６−１】
2014530360.tif 000007
【化６−２】
2014530360.tif 000008
【００９８】
ＲＡＢ０の重鎖のアミノ酸配列について配列番号７：
【化７】
2014530360.tif 000009
【００９９】
ＲＡＢ２の重鎖のアミノ酸配列について配列番号８：
【化８】
2014530360.tif 000010
【０１００】
ＲＡＭ０ｈｃのアミノ酸配列について配列番号９：
【化９−１】
2014530360.tif 000011
【化９−２】
2014530360.tif 000012
【０１０１】
ＲＡＭ０ｌｃのアミノ酸配列について配列番号１０：
【化１０】
2014530360.tif 000013
【０１０２】
ＲＡＭ９ｈｃのアミノ酸配列について配列番号１１：
【化１１】
2014530360.tif 000014
【０１０３】
ＲＡＭ９ｌｃのアミノ酸配列について配列番号１２：
【化１２】
2014530360.tif 000015
【０１０４】
ＲＡＭ４ｈｃのアミノ酸配列について配列番号１３：
【化１３−１】
2014530360.tif 000016
【化１３−２】
2014530360.tif 000017
【０１０５】
ＲＡＭ４ｌｃのアミノ酸配列について配列番号１４：
【化１４】
2014530360.tif 000018
【０１０６】
本発明の抗ＭＩＦ抗体は、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体である。抗ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子であることができる。別の実施形態では、抗ＭＩＦ抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスである。別の実施形態では、抗体がサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかである。別の実施形態では、抗体がサブクラスＩｇＧ４である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４抗体がセリン（Ｋａｂａｔナンバリング方式でセリン２２８）をプロリンに変える単一変異を有する。したがって、ＩｇＧ４のＦｃ領域中のＣＰＳＣ部分配列は、ＩｇＧ１中の部分配列であるＣＰＰＣになる（Ａｎｇａｌら，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３，  ３０，  １０５−１０８）。
【０１０７】
加えて、抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体の生産は、抗体を、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製するための、当技術分野において知られている任意の方法を含みうる。一実施形態では、抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製することができる。
【０１０８】
ＭＩＦの「中央領域」および「Ｃ末端領域」という用語は、ヒトＭＩＦのそれぞれアミノ酸３５〜６８およびａａ８６〜１１５、好ましくはヒトＭＩＦのそれぞれａａ５０〜６８およびａａ８６〜１０２を含む領域を指す。
【０１０９】
特に好ましい本発明の抗体は、ヒトＭＩＦの領域ａａ５０〜６８または領域ａａ８６〜１０２のいずれかに結合する。これは、次のように結合する好ましい抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ４、ＲＡＢ２およびＲＡＢ９ならびにＲＡＭ４、ＲＡＭ９およびＲＡＭ０の結合にも反映される：
ＲＡＢ４およびＲＡＭ４：ａａ８６〜１０２
ＲＡＢ９およびＲＡＭ９：ａａ５０〜６８
ＲＡＢ０およびＲＡＭ０：ａａ８６〜１０２
ＲＡＢ２：ａａ８６〜１０２
【０１１０】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたは抗体フラグメントに特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基が包含される。エピトープ決定基は通常、分子の化学的に活性な表面基、例えば露出したアミノ酸、アミノ糖、または他の糖質側鎖からなり、通常は特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。
【０１１１】
「ベクター」という用語は、それが連結されたもう一つの核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、ベクターがプラスミド、すなわち、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループである。
【０１１２】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターの導入後に組換えタンパク質を生産する能力を有する細胞株を指す。「組換え細胞株」という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞株を指す。「組換え細胞株」は特定の対象細胞株だけでなく、そのような細胞株の子孫も意味することを理解すべきである。変異または環境の影響によって後続の世代では一定の修飾が起こりうるので、上述の子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお、本明細書において使用する用語「組換え細胞株」の範囲に包含される。
【０１１３】
本発明の宿主細胞タイプは、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞であるか、例えばＨＥＫ２９３細胞であるか、または当業者に知られている他の任意の宿主細胞であり、したがって、例えば大腸菌細胞のような細菌細胞も含まれる。一実施形態では、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株、例えばＤＸＢ１１において、選択マーカーとしてＧ４１８を添加して、抗ＭＩＦ抗体を発現させる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターがＣＨＯ宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現または宿主細胞を成長させる培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって生産される。
【０１１４】
抗（ｏｘ）ＭＩＦ抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使って、培養培地から回収することができる。
【０１１５】
この文脈において「ＭＩＦ関連疾患」とは、一般に、感染性疾患、炎症、自己免疫、がん、細胞分化およびアテローム発生を指す。ＭＩＦ関連疾患は、例えばタイプＩおよびＩＩ糖尿病、急性肺傷害、喘息、同種移植片拒絶、移植片対宿主疾患、創傷治癒障害および炎症性腸疾患である。さらに、がんはＭＩＦ関連疾患である。特にＭＩＦ関連がんは、リンパ腫、肉腫、前立腺がんおよび大腸がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、黒色腫、肝細胞癌、卵巣がん、乳がん  および膵がんである。
【０１１６】
さらに、アテローム性動脈硬化はＭＩＦ関連疾患である。
【０１１７】
さらにＭＩＦ関連疾患は、サルコイドーシス、強皮症、乾癬、（潰瘍性）大腸炎、およびアトピー性皮膚炎、ならびに敗血症性ショック、遅延型過敏症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、膵炎および虚血性心傷害である。
【０１１８】
ＭＩＦ関連である免疫障害および炎症性障害は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌敗血症、例えば緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症または敗血症、ＤＴＨ、糸球体腎炎、関節炎、アジュバント関節炎、若年性関節炎、（自己免疫）脳脊髄炎／脳炎、（自己免疫）心筋炎、アレルギー性脳炎、胃炎、大腸炎；（免疫）糸球体腎炎；肺炎、毒素性ショック症候群、ウイルス感染症、結核、Ｂ型肝炎、デング熱、寄生虫および蠕虫ＭＩＦ関連感染症、特にマラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、アメーバ症、住血吸虫症、嚢虫症、旋毛虫症（ｔｒｉｃｈｅｎｅｌｌｏｓｉｓ）およびフィラリア症；腎臓疾患、例えば白血球媒介腎傷害、非増殖性腎疾患、増殖性腎疾患、腎同種移植片拒絶およびフィンランド型の先天性腎炎症候群、腎炎、ネフロパシー、例えば尿酸腎症および高血圧性腎症、尿管閉塞および糖尿病性腎症である。
【０１１９】
神経障害性痛はさらにもう一つのＭＩＦ関連疾患である。
【０１２０】
本発明によって診断されるべき最も好ましい疾患は、糸球体腎炎、敗血症、リンパ腫、ループス腎炎、乾癬、潰瘍性大腸炎および眼科的状態、ならびにバーキットリンパ腫、白血病、前立腺腺癌（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓腺癌、および卵巣癌である。
【０１２１】
本発明の重要な一態様は、対象の試料におけるｏｘＭＩＦの検出に向けられ、ＭＩＦが、問題の対象を冒している疾患または障害の治療上重要な構成要素であるかどうかを、熟練した医師が決定することを可能にするであろう。この決定は、問題の対象にとって（追加の）抗（ｏｘ）ＭＩＦ処置が有益でありうるかどうかについての医師の判定を助けるであろう。
【０１２２】
ｏｘＭＩＦは、所与の対象の全般的な健康状態または疾患状態を決定するためのマーカーとしても有用であり、ｏｘＭＩＦレベルの上昇は、その対象がＭＩＦ関連疾患に冒されていることの発見を可能にするであろう；このように、ｏｘＭＩＦは、例えば、対象の健康／疾患状態に関する（二次）マーカーとして現在広く使用されているＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の決定と同様に、そのような（二次）一般マーカーとして使用することもできる。
【０１２３】
炎症誘発性サイトカインｏｘＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）に対するインビボ防御抗ｏｘＭＩＦ  ｍＡｂのサブセット（例えばＲＡＢ９、ＲＡＢ４およびＲＡＢ０）は、還元状態にある無修飾ＭＩＦ（ｒｅｄＭＩＦと呼ぶ）には結合しない。対照的に、これらのｍＡｂは、酸化還元依存的ＭＩＦアイソフォーム（ｏｘＭＩＦと呼ぶ）に対して高度に選択的であることが示された。ｏｘＭＩＦは健常な対象および動物の血中には存在しないことが示された。ｏｘＭＩＦは健常な対象および動物の細胞表面には存在しないことも示された。本発明によれば、また本明細書に記載する方法では、ｏｘＭＩＦは、疾患の発生後にのみ検出することができる。その後（すなわち疾患の発生後に）、ｏｘＭＩＦは、循環中または細胞の表面に現れることが示された。別の言い方をすると、ＭＩＦ関連疾患に冒されたヒトまたは動物の患者の試料では、循環においてｏｘＭＩＦが明確に増加している（すなわち検出可能である）ことが、本発明者らによって示された。ＭＩＦ関連疾患に冒された細胞の表面ではｏｘＭＩＦが著しく増加している（したがって検出可能である）ことも示された。本発明によれば、患者におけるｏｘＭＩＦの検出は、疾患進行および治療的介入に関する有利な情報を提供する。それゆえに、ｏｘＭＩＦは診断マーカーとして使用することができ、ここに記載する方法は、ＭＩＦ関連疾患時の、例えば対象、例えばヒトが、炎症状態またはがんなどの疾患状態を罹患している時の、ｏｘＭＩＦのモニタリングを可能にすることになる。
【０１２４】
ここに記載する知見に基づいて、本発明は、ＭＩＦ関連疾患の診断におけるマーカーとしてのｏｘＭＩＦの使用に向けられる。ｏｘＭＩＦは好ましくは、抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０に、上に定義した意味で弁別的に結合するＭＩＦである。上で説明し、実験項で、特に実施例の項で示すとおり、本発明者らは、ｏｘＭＩＦが、ＭＩＦ関連疾患の患者試料には見られるが、正常な健常対照には見られない、すなわち上に定義した意味で存在しない、ＭＩＦのアイソフォームであることを初めて示した。したがってｏｘＭＩＦは、ＭＩＦ関連疾患の診断におけるマーカーとして最も適切である。ｏｘＭＩＦ、特にその量は、疾患の状態および／またはその進行とも相関することが本発明によって示されたので、本明細書に関して、「診断」には、疾患の検出、疾患状態の評価、および疾患進行のモニタリングが包含され、これは、治療的処置の効力のモニタリングも可能にする。
【０１２５】
好ましい実施形態では、ｏｘＭＩＦをマーカーとして使用する該ＭＩＦ関連疾患の診断が、ｏｘＭＩＦを検出するために、ｏｘＭＩＦに結合する化合物のさらなる使用を包含するであろう。
【０１２６】
ｏｘＭＩＦに弁別的に結合するこれらの化合物は、ｏｘＭＩＦに弁別的に結合する抗体または小分子であることができる。
【０１２７】
本発明において使用することができる診断アッセイは、当業者に周知の任意の診断アッセイであることができる。特に診断アッセイは、いずれも当技術分野において周知のＦＡＣＳ、免疫蛍光、免疫組織化学、および他のあらゆる適切な方法を使って、例えばＥＬＩＳＡフォーマット、サンドイッチ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットで行うことができる。
【０１２８】
本発明を以下に例示するが、決して以下の例を本発明の限定とみなしてはならない。
【０１２９】
参考例
Ａ）抗体スクリーニングのためのＧＣＯアッセイ
ＴＨＰ１懸濁培養を遠心分離し、細胞を１ｍｌあたり１０６細胞の細胞密度になるように新鮮な完全培地に再懸濁する。この培養を９６穴マイクロプレートのウェルに移し（９０μｌ／ウェル）、潜在的抗ＭＩＦ抗体を、最終濃度が７５μｇ／ｍｌになるように加える。各抗体を三つ一組にして試験する。３７℃で終夜培養した後、濃度が２ｎＭになるようにデキサメタゾンを加え、３７℃で１時間のインキュベーション後に、ＬＰＳを加える（３ｎｇ／ｍｌ最終濃度）。３７℃でさらに６時間のインキュベーション後に、上清を収穫し、ＩＬ−６濃度を市販のＥＬＩＳＡで決定する。三つ一組の試料の結果を平均し、ＩＬ−６分泌のパーセンテージを対照抗体と比較して決定する。７５％未満のＩＬ−６分泌をもたらす抗体を陽性と評価する。
【０１３０】
Ｂ）ＩＣ５０値を決定するためのアッセイ
実験手順は、使用する抗体の量を増やしながら行う（典型的には１〜１２５ｎＭ）点以外は、スクリーニングアッセイについて説明したように行われる。その結果得られる用量応答曲線を、陰性対照抗体との比較で％阻害として表す。この曲線は、抗体の最大阻害効果（％Ｉｎｈ  ｍａｘ）と、最大阻害効果の５０％を示す抗体濃度（ＩＣ５０）の算出に使用される。
【０１３１】
Ｃ）細胞増殖の阻害
血清は静止ＮＩＨ／３Ｔ３におけるＭＩＦの分泌を刺激し、次いでＭＩＦは細胞増殖を刺激する。したがって、この内在性ＭＩＦを阻害する抗体は、静止ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖を減少させる。増殖の低減は３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定される。
【０１３２】
９６穴プレートで１ウェルあたり１０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％血清を含有する培地中、３７℃で、週末を通してインキュベートする。次に、０．５％血清を含有する培地中でインキュベートすることにより、細胞を３７℃で終夜、飢餓状態に置く。その０．５％培地を除去し、１０％血清、７５μｇ／ｍｌ抗体および５μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンを含有する新鮮培地で置き換える。３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１６時間のインキュベーション後に、細胞を各ウェル１５０μｌの冷ＰＢＳで２回洗浄する。マルチチャンネルピペットを使って、１ウェルあたり１５０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液を加え、４℃で３０分間インキュベートする。プレートを１５０μｌのＰＢＳで洗浄する。０．５％ＳＤＳを含む０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を１ウェルあたり７５μｌ加え、混合し、室温で保存する。５ｍｌのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ（Ｐａｃｋａｒｄ）と７５μｌの試料溶液とを混合することにより、試料をβカウンターで測定する。各決定は三つ一組にして行い、その値をｔ検定によって対照抗体の値と比較する。増殖を有意に低減させる抗体（Ｐ＜０．０５）を陽性と評価する。
【０１３３】
Ｄ）結合試験：抗ＭＩＦ抗体のエピトープ決定
各ペプチドを、典型的には１μｇ／ｍｌのペプチド濃度が得られるように、カップリング緩衝液で希釈し、マイクロプレート（ＮＵＮＣ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）アミノプレートＦ９６クリア）に加え、４℃で終夜インキュベートする（１００μｌ／ウェル）。対照として、組換え完全長ＭＩＦおよびＰＢＳを使用する。プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、抗体（ＰＢＳ中、２〜４μｇ／ｍｌ）を加え（１００μｌ／ウェル）、穏やかに浸透しながら室温で２時間インキュベートする。プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体（例えばＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ標識、Ｓｉｇｍａ）を加える（１００μｌ／ウェル）。穏やかに浸透しながら室温で１時間インキュベートした後、プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。各ウェルを１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液（Ｔ−０４４０、Ｓｉｇｍａ）と共に暗所で３０分間インキュベートする。１ウェルにつき１００μｌの１．８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を加えることによって染色反応を停止する。試料を４５０ｎｍで測定する。
【０１３４】
Ｅ）Ｂｉａｃｏｒｅによる抗ＭＩＦ抗体のＦａｂフラグメントのアフィニティ決定
典型的には、ＣＭ５（＝カルボキシメチル化デキストラン）マトリックスを持つセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に、４０ＲＵ単位のヒト組換えＭＩＦを固定化する。Ｆａｂフラグメントを、典型的にはＨＢＳ−ＥＰに希釈した６〜１００ｎＭの濃度範囲で注入する。各サイクル後に５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌでチップを再生する。１：１ラングミュアモデルに従ってアフィニティを算出する。
【０１３５】
実施例
本実施例は、数個の特異的抗体がｏｘＭＩＦだけに結合し、還元状態にある無修飾ＭＩＦには結合しないという発見に関する。これは、モック調製物を使った化学薬品による組換えＭＩＦの温和な酸化後のＥＬＩＳＡによる酸化型ＭＩＦの検出、対照としての還元型ＭＩＦおよび無処理ＭＩＦによって示された。この実験はインビトロで行われ、ｏｘＭＩＦが特異的抗体によって結合されるのに対して、対照ＭＩＦは結合されないことを明確に示した。
【０１３６】
抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９およびＲＡＢ０は、生理学的に妥当な濃度において、還元状態にあるＭＩＦには結合できないことが示された。これに対し、ＭＩＦの（例えばＬ−シスチンによる）温和な酸化は、ＭＩＦ分子を抗体結合性アイソフォームに転化できることが、インビトロで示された。脊椎動物系および細胞株（例えば不死化細胞株、マウスからの血漿、ラットからの尿、ならびにヒトドナーからの血漿および尿）におけるｏｘＭＩＦ型に関する抗体に基づくスクリーニングにより、そのような抗体反応性ＭＩＦアイソフォームの出現は、疾患関連プロセス（例えば炎症および新形成）に連関することが明らかになった。これが、例えば天然疾患関連ｏｘＭＩＦ型の診断的検出および疾患進行のモニタリングのためのツールとして、これらの抗体を使用することができる理由である。
【０１３７】
本発明者らは、ｏｘＭＩＦに関する偽陽性結果が得られる場合があることも初めて示した。ＭＩＦタンパク質は、溶血血液試料中の酸化還元活性な鉄およびヘムによって、ｏｘＭＩＦに転化されうる、またＭＩＦは酸化剤を加えると生体試料中でｏｘＭＩＦに転化されうると考えられる。
【０１３８】
そこで、擬陽性結果を回避するための好ましい実施形態では、例えば酸化剤の転化を避けること、および酸化還元活性な鉄およびヘムを失活させることを提案する。
【０１３９】
例えば、血中を循環するＭＩＦの分析には特別な試料手順が必要である。全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦの分析にはクエン酸血漿が好ましい。擬陽性シグナルを避けるために、好ましい実施形態では、以下のステップによって試料を調製する必要がある：
【０１４０】
新鮮血からのクエン酸血漿（＋４℃で１２時間を超えない保存）を４０ｇで５分間遠心分離する必要がある。上清を新しいチューブに移し、２０００ｇで３分間、再び遠心分離する必要がある。無細胞上清を再び新しいチューブに移し、１６０００ｇで３分間遠心分離する必要がある。３回の遠心分離ステップ後に、無細胞上清は、−８０℃で保存するか、（ｏｘ）ＭＩＦの分析に直接使用することができる。
【０１４１】
血清を（ｏｘ）ＭＩＦに関して分析すべき場合も、好ましくは、凍結保存する前に、またはＭＩＦ  ＥＬＩＳＡを実行する前に、同じ３回の遠心分離ステップによって細胞および不溶性フラグメントを除去する必要がある。
【０１４２】
尿試料の沈渣も、好ましくは、ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡにおける使用に先だって、遠心分離ステップ（１６０００ｇで５分間）によって除去する必要がある。一般に、生物学的液体（例えば涙液、唾液）中に存在する細胞および他の一般的粒子は、遠心分離ステップによって除去してから、（ｏｘ）ＭＩＦの試験用に保存する必要がある。
【０１４３】
さらにまた、本発明者らは、変性したＭＩＦが、ｏｘＭＩＦに特異的に結合する抗体によって認識されることも示すことができた。それゆえに、ｏｘＭＩＦの分析には、ＭＩＦタンパク質を試料調製中（例えば体液の単離および調製中）にそのネイティブコンフォメーションに保つ必要があることが最も重要であり；したがって、ＭＩＦタンパク質をそのネイティブコンフォメーションに維持するために、そして分析中の偽陽性／陰性結果を避けるために、例えば煮沸、固定化（メンブレン、プラスチック（プレート）またはチップ上）および化学処理（例えば還元剤、酸化剤および有機溶媒によるもの）などといった変性条件／ステップは避ける必要がある。
【０１４４】
細胞表面のｏｘＭＩＦの分析には、好ましくは、フローサイトメトリーアッセイを使用する。試料が試料調製中に溶血を起こさないことは特に重要である。それゆえに、本フローサイトメトリー分析用の試料は全て、試料内の細胞の溶血につながりうるステップを一切経ずに調製された。
【実施例１】
【０１４５】
ｏｘＭＩＦ特異的抗体（例えばＲＡＢ０抗体またはＲＡＢ４抗体）の調製：
抗体は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、好ましくはＭＩＦをコードする遺伝子（内在性ＣＨＯ−ＭＩＦ）が遺伝的にノックアウトされているＣＨＯ細胞において生産される。ノックアウト細胞では、内在性ＣＨＯ−ＭＩＦによる抗体の汚染を無くすことができ、それは、アッセイの感度を向上させることができるので望ましいことである。
【０１４６】
典型的には、ｏｘＭＩＦ特異的抗体は、容積２５Ｌまでのディスポーザブルバイオリアクター（ウェーブシステム）を使ったバッチ発酵プロセスで生産された。生産される抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれ内包する安定ＣＨＯ細胞株をＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１４７】
ある例示的生産プロセスでは、ＤＳＭ２５１１４およびＤＳＭ２５１１５として寄託されたプラスミドを含むＣＨＯノックアウト細胞株を使用した。
【０１４８】
培養中は各ヒト抗体が細胞培養培地中に連続的に発現した。培養の終了時（生存率＜５０％）に、細胞を一般的な遠心分離および濾過ステップによって分離した。清澄化した細胞培養上清（ｃｃｓ）を限外濾過によって濃縮し、抗体の精製に使用した。
【０１４９】
ヒト抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、濃縮ｃｃｓから精製した。プロテインＡ材を５カラム体積（ｃｖ）の２０ｍＭリン酸ナトリウムランニング緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した後、アイソタイプ対照の濃縮上清を、アフィニティカラムに完全に適用した。不純物または望ましくないタンパク質をランニング緩衝液で洗い流した。１００ｍＭグリシン（ｐＨ３）を使ったｐＨシフトによって抗体を溶出させ、２５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ５）に対して透析した。
【０１５０】
あるいは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液および０．１％ツイーン８０を含む５ｃｖの２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）で前もって平衡化しておいたプロテインＡカラムに、濃縮細胞培養上清を適用した。２回の洗浄ステップ：１）平衡緩衝液への１Ｍ  ＮａＣｌの添加、および２）０．１％ツイーン８０を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５）によって、不純物を洗い流した。０．１％ツイーン８０を含む１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３）によってＲＡＢ０抗体を溶出させ、次に２５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ５）に対して透析した。
【実施例２】
【０１５１】
ポリクローナルおよびアフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ｈｕＭＩＦ抗体の調製：
１）組換えヒトＭＩＦ（ｈｕＭＩＦ）の生産
ヒトＭＩＦ配列を持つ発現系を含む大腸菌細胞において組換えｈｕＭＩＦを生産した。新鮮融解細胞を、アンピシリンを補足したルリア・ベルターニ培地（ＬＢ／Ａｍｐ）中、＋３７℃で終夜、培養した。翌日、その細菌細胞培養を等体積の新鮮ＬＢ／Ａｍｐ培地で希釈し、ＩＰＴＧ（最終濃度：１．０ｍＭ）の添加により、３０℃で４時間、発現を誘導した。遠心分離によって細菌ペレットを収穫し、≦−１５℃で保存した。
【０１５２】
細胞内ヒトＭＩＦタンパク質のさらなる精製のために、凍結細菌ペレットを２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）に再懸濁し、ガラスビーズによって細胞を機械的に破壊した。細胞デブリを遠心分離と一般的な０．２μｍフィルターを使った濾過とによって除去した。上清をアニオン交換クロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐ  ２６／１６  ＤＥＡＥ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ウォーキショー）に直接適用し、パッシブ（ｐａｓｓｉｖｅ）結合モードでＭＩＦを精製した。素通り画分を２０ｍＭビス／トリス（ｐＨ６．３）で再緩衝化し、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ、ＧＥ）によって、さらに精製した。２０ｍＭビス／トリス緩衝液（ｐＨ６．３）中の５０ｍＭ  ＮａＣｌの塩勾配によって高純度ヒトＭＩＦを溶出させた。最後に、精製ヒトＭＩＦをＰＢＳに対して再緩衝化し、限外濾過によって濃縮し、純度および機能性について特徴づけた。
【０１５３】
２）ニュージーランド白ウサギにおけるポリクローナルウサギ抗ｈｕＭＩＦ抗体の免疫手順
初回免疫のために、１００μｌのＰＢＳに希釈した２５μｇの組換えヒトＭＩＦを、１００μｌのＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）と混合した。その混合物２００μｌ（５０μｌ×４）を各ウサギの異なる身体部分に皮下適用した。初回免疫の２〜３週間後に、２５μｇの組換えヒトＭＩＦ（１００μｌのＰＢＳに懸濁したもの）による第１追加免疫を１００μｌのＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）と混合した。再び、その混合物２００μｌ（５０μｌ×４）を各ウサギの異なる身体部分に皮下適用した。第２追加免疫は第１追加免疫の２〜３週間後に行い、２５μｇの組換えヒトＭＩＦ（１００μｌのＰＢＳに懸濁したもの）を１００μｌのＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）と混合した。再び、その混合物２００μｌ（５０μｌ×４）を各ウサギの異なる身体部分に皮下適用した。この免疫手順は、第２追加免疫の２週間後に終了した。典型的には複数のウサギからの血漿をプールし、抗ＭＩＦ抗体の単離に使用した。
【０１５４】
３）ポリクローナルウサギ抗ｈｕＭＩＦ抗体のプロテインＡ精製およびｈｕＭＩＦアフィニティ精製手順
免疫血漿からのウサギ抗ｈｕＭＩＦ抗体の単離は、典型的には、２段階のアフィニティークロマトグラフィーステップによって行った。まず、血漿をプロテインＡアフィニティカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。そのために、ウサギ血漿を２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）で１：３希釈し、アフィニティカラムに適用した。洗浄ステップ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）で５カラム体積）後、全ウサギＩｇＧの溶出を１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．８）で行った。溶出液をプールし、１Ｍトリス／ＨＣｌを使ってｐＨ７．０に中和した。ｈｕ−ＭＩＦアフィニティ精製のために、全ウサギＩｇＧを再び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）で１：３希釈し、供給者の推奨どおりに２５ｍｇのｒｈｕＭＩＦとカップリングした５ｍｌのＮＨＳアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。洗浄ステップ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）で５カラム体積）後に、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．８）でウサギ抗ｈｕＭＩＦ抗体の溶出を達成した。溶出液をプールし、１Ｍトリス／ＨＣｌを使ってｐＨ７．０に中和した。最後に、ｈｕ−ＭＩＦアフィニティ精製特異的ウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体（以下「抗ヒトＭＩＦアフィニティ精製ポリクローナル抗体」）をＰＢＳに対して透析し、−２０℃で保存した。
【実施例３】
【０１５５】
患者から得た試料または動物疾患モデルから得た試料中のｏｘＭＩＦの検出
Ｉ．敗血症
実施例３．１：大腸菌負荷マウスの血漿中のｏｘＭＩＦ
本発明者らは、２０００ｃｆｕ（コロニー形成単位）のグラム陰性病原性大腸菌株Ｏ１１１：Ｂ４を負荷した腹膜炎マウスの血漿試料中で全身性ｏｘＭＩＦ型を探そうとした。健常マウス（ＰＢＳで処置）および疾患マウスの血液試料を、負荷の２１時間後に採取し、血漿をｏｘＭＩＦについて分析した。
【０１５６】
方法
マイクロタイタープレートを抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０またはＲＡＢ４でコーティングした。アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗マウスＭＩＦ抗体と市販のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧとでＭＩＦを検出した。抗体は実施例２における説明と同様にして得たが、実施例２とは異なり、ウサギ抗ｍｏＭＩＦ抗体は、組換えｍｏＭＩＦによるウサギ免疫によって生産し、プロテインＡおよびＭＩＦに対するアフィニティークロマトグラフィー（実施例２で説明したものと同じ手順）によって精製した。血漿試料からの反応性ＭＩＦを定量するために、無処理組換えｍｏＭＩＦを、０．２％の殺生物剤プロクリン３００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液（＝ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液）と混合することによって、ｏｘＭＩＦ標準を調製する。プロクリン３００は、結合性ｏｘＭＩＦ構造を誘導し／保存する酸化性イソチアゾロンからなる。全てのプレートをＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で呈色させ、３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した後、ＯＤをＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【０１５７】
結果
図１Ａ（図１Ｂ）．
７つの異なる動物実験からの血漿の分析では、全ＭＩＦレベルおよびｏｘＭＩＦレベルのかなりの相違が明らかになった。しかし、ＰＢＳ処置対照マウス（健常対照）の血漿には、ｏｘＭＩＦが決して検出されなかったのに対し、敗血症マウスからの血漿にはほとんど常にｏｘＭＩＦが検出された。７つの異なる実験からの範囲値（ｒａｎｇｅ  ｖａｌｕｅ）を表１に要約した。
［表１］マウスにおいて測定された全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦの範囲（ｎ＝７実験）
【表１】
2014530360.tif 000019
【０１５８】
図１は代表的な１つの実験を示しているが、この実験では、ｏｘＭＩＦが敗血症マウスでのみ検出され、ｏｘＭＩＦレベルにはマウス間でのばらつきがあった（図１Ａ）。この実験では、全ＭＩＦレベルが一匹のマウスの血漿でしか上昇しておらず、このマウスにおける全ＭＩＦのかなりの部分がｏｘＭＩＦであることから（図１Ａおよび１Ｂ、マウスＥ６）、ｏｘＭＩＦは、急性敗血症に関して、全ＭＩＦより良い診断マーカーであることが確認された。
【０１５９】
結論
全ＭＩＦは健常対照マウスと菌血症マウスのどちらにも存在するが、全ＭＩＦのレベルよりｏｘＭＩＦレベルの方が、疾患のステージに良く相関する。
【０１６０】
実施例３．２：大腸菌負荷マウスからの細胞の細胞表面のｏｘＭＩＦ
腹膜炎マウス（またはＰＢＳだけを注射した対照マウス）からの免疫細胞を、フローサイトメトリーにより、ｏｘＭＩＦについて分析した。
【０１６１】
方法
ＰＢＳ負荷マウスまたは大腸菌負荷マウスからの血液を、細胞染色緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中、Ａｌｅｘａ７００標識抗ＣＤ３ε（Ｔ細胞用）およびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識抗Ｌｙ６Ｇ（顆粒球用）またはＡＰＣ標識抗ＣＤ１４（単球用）およびＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ１９（Ｂ細胞用）で、３００ｎＭ  ＲＡＢ９または対照ＩｇＧと並行して染色した。洗浄後に、ヤギＲ−ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を使ってヒト抗体を検出した。洗浄後に、赤血球をＢＤ  ＦＡＣＳ（商標）溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国フランクリン・レイクス）で溶解した。データ取得は、ＦＡＣＳ（商標）Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って、ＤＩＶＡ（商標）ソフトウェア（ソフトウェアバージョン６；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行い、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、米国オレゴン州アシュランド）を使ってデータを分析した。
【０１６２】
結果
腹膜炎マウスからの血球の表面におけるｏｘＭＩＦの存在を分析した。負荷（すなわち、対照群の場合はＰＢＳ、腹膜炎マウスの場合は２０００ＣＦＵの大腸菌）の１、３または２１時間後に、心臓穿刺によって血液を収穫した。ＲＡＢ９による染色は全血で行い、赤血球は分析前に溶解した。図２に、対照ＩｇＧ抗体（黒い線）と比較した、異なる時点における対照マウス（Ｆ）および負荷マウス（Ｅ）についてのヒストグラムを示す。対照マウスでは、顆粒球−単球集団でも、リンパ球でも、ＲＡＢ９で、陽性細胞は有意に検出されなかった。ｏｘＭＩＦはリンパ球の表面には検出されなかったが、顆粒球（ＧＲ１マーカー）と単球（ＣＤ１４マ−カー）のどちらの表面にも、負荷の１時間後には早くも存在し、２１時間後まで存在していた。
【０１６３】
要約および結論
マウスでの腹膜炎モデルにおいて、本発明者らは、感染中に顆粒球および単球の表面にｏｘＭＩＦが存在することを示すことができ、本発明者らは、ＰＢＳ処置動物にはｏｘＭＩＦが見いだされないことを示した。これらの結果は、ｏｘＭＩＦが、感染の過程で現れるが健常個体には存在しないマーカーであることを実証している。
【０１６４】
実施例３．３：菌血症患者の血清におけるｏｘＭＩＦの検出
クエン酸血からの血漿試料を、集中治療室（ＩＣＵ）で処置されている菌血症患者から得て、ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦの含有量について分析した。
【０１６５】
材料および方法
全ＭＩＦとｏｘＭＩＦはどちらも同じＥＬＩＳＡ設定を使って検出した：マイクロタイタープレートをヒト抗ＭＩＦモノクローナル抗体ＲＡＢ０でコーティングし、検出は、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗体抗ヒトＭＩＦで行った。最後に、ヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート（ＢｉｏＲａｄ、カタログ：１７１−６５１６）（ここでは当技術分野において知られている他の任意のヤギ抗ウサギを同様に使用しうる）およびＴＭＢ基質（上に定義した発色性基質；当業者には知られているとおり、他の任意の適切な基質も使用しうる）のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＡの読出しを４５０ｎｍで行った。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン（ＰｒｏＣｌｉｎ）３００の添加によるｒｅｄＭＩＦの酸化ステップによって新たに生産された組換えヒトｏｘＭＩＦで行った。標準を、０．２％プロクリン３００および４％ヒト対照血漿を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。検量線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌである。被験ヒト血清試料は、ｏｘＭＩＦ  ＥＬＩＳＡの場合は０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に、また全ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡについては、血漿中に存在する全ての還元型ＭＩＦ分子をｏｘＭＩＦに転換するために、プロクリン３００の存在下で、１：２５希釈した。
【０１６６】
結果
クエン酸血からの血漿試料を、ＩＣＵで敗血症の処置を受けている患者から得た（ｎ＝６）。性別、年齢、感染病原菌および処置は全て異なる。図３に、患者の血漿中に検出された、ならびに１人の健常ドナーに検出された、または健常ドナーからの５０血漿試料のプールから検出された、全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベルを示す。全ＭＩＦは、全ての試料に存在するが、ｏｘＭＩＦは６人の菌血症患者中の２人にしか検出されない。
【０１６７】
結論
ｏｘＭＩＦは、試験した菌血症患者の一部（６人中２人）の血漿中に検出することができるが、健常ドナーの血漿には検出することができない。ｏｘＭＩＦは、敗血症のマーカーとして使用することができる。
【０１６８】
ＩＩ．乾癬
実施例３．４：乾癬患者の血清におけるｏｘＭＩＦの検出
乾癬患者から収集した血清試料を、そのｏｘＭＩＦ含量について分析した。全身性抗乾癬治療を受けている患者から、異なる時点（開始時、１２週間および２４週間）で、血清を採取した。
【０１６９】
材料および方法
サンドイッチＥＬＩＳＡによる血清中のｏｘＭＩＦの測定：
マイクロタイタープレートをモノクローナル完全ヒト抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０でコーティングした。ヒト血清試料を０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に１：２５希釈した。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００の添加によって新たに生産した組換えヒトｏｘＭＩＦで行った。標準を、０．２％プロクリン３００および４％ヒト対照血漿（すなわち５０人の健常ドナーからの血漿試料のプール）を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。検量線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌとした。プレートの洗浄後に、コーティング抗体によって捕捉されたｏｘＭＩＦを、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体（ｒｅｄＭＩＦとｏｘＭＩＦとを識別しないウサギ抗ｈｕＭＩＦ）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体によって検出した。ＴＭＢを発色性基質として使用し、発色反応をＨ２ＳＯ４で停止して、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで測定した。全ての試料、標準および対照を二つ一組にして行った。
【０１７０】
結果
本発明者らは、乾癬患者の血清中にレベルの増加したｏｘＭＩＦを検出することができた。全身性免疫調節薬による処置中に、ｏｘＭＩＦのレベルは、患者の状態の改善と相関して減少した（図４）。
【０１７１】
結論
乾癬患者の血清試料におけるｏｘＭＩＦレベルを検出した。これは、乾癬のような慢性または急性炎症性皮膚疾患において、ｏｘＭＩＦが極めて高感度であり、その疾患の重症度に関するマーカーとして、また全身性抗乾癬治療中の疾患の進展をモニタリングするために使用することもできることを意味している。
【０１７２】
ＩＩＩ．腎炎
実施例３．５：増殖性糸球体腎炎の確立後のラットの尿中のｏｘＭＩＦ
材料および方法
増殖性糸球体腎炎のラットモデル：
ウサギ抗ラット糸球体基底膜血清（＝腎毒性血清、ＮＴＳ）（Ｔａｍ  ＦＷＫ，  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １９９９，  １６５８−１６６６）の単回静脈内注射の適用によって増殖性糸球体腎炎を誘発した後のウィスター京都（ＷＫＹ）ラットの尿において、ｏｘＭＩＦレベルを分析した。代謝ケージを使って疾患誘発前の尿試料を収集した。疾患誘発の４日後および６日後に、ラットをヒト対照抗体または異なる用量のヒト抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ９で処理した。２回目の尿試料採取は、組織学的評価のために８日目に動物を屠殺する前に行った。尿中に測定されたｏｘＭＩＦレベルは、タンパク尿または腎臓の組織学データ（半月体形成およびマクロファージ浸潤）のような他の疾患パラメータと相関した。
【０１７３】
サンドイッチＥＬＩＳＡによる尿中のｏｘＭＩＦの測定
マイクロタイタープレートをモノクローナル完全ヒト抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０でコーティングした。尿試料を２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ｐＨ７．２）に１：１０希釈した。標準検量線のために、０．２％プロクリン３００を添加することによって組換えｍｏＭＩＦタンパク質を修飾し、０．２％プロクリン３００を含む２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴに標準を希釈した。検出は、アフィニティ精製ポリクローナル抗マウスＭＩＦ抗体（実施例３．１に記載のウサギ抗ｍｏＭＩＦ）およびＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体によって達成した。ＴＭＢを発色性基質として使用し、発色反応をＨ２ＳＯ４で停止して、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで測定した。全ての試料、標準および対照を二つ一組にして行った。
【０１７４】
結果
疾患誘発前は、ｏｘＭＩＦの平均レベルが０を有意に上回ることはなかった。疾患誘発の４日後に、有意なレベルのｏｘＭＩＦが検出可能になった。疾患進行中は、尿中ｏｘＭＩＦレベルが、無処置対照群では、８日目に、最高３３３ｎｇ／日まで増加した（平均１３０ｎｇ／日）。８日目に、抗ＭＩＦ抗体処置群におけるｏｘＭＩＦの平均レベルは、非処置群と比較して約７０％減少した（図５Ａ参照）。処置群におけるｏｘＭＩＦのレベルの低下は、タンパク尿およびマクロファージ浸潤などの疾患パラメータの低下と相関した（図５Ｂ）。
【０１７５】
結論
尿中のｏｘＭＩＦのレベルは、増殖性糸球体腎炎の動物モデルにおける疾患状態と相関する。抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０の投与後は、ｏｘＭＩＦレベルが有意に低下した。それゆえに本発明者らは、ｏｘＭＩＦの測定は、腎炎の疾患進行および処置有効性をモニタリングするための診断マーカーとして適切であると結論する。
【０１７６】
実施例３．６：ループス腎炎患者の尿および血漿中のｏｘＭＩＦ
異なる疾患ステージにあるループス腎炎患者から尿および血液試料を収集した。各試料を−２０℃で凍結保存し、ドライアイスを使って運搬した。
【０１７７】
材料および方法
ｏｘＭＩＦ特異的抗体の調製：
実施例１で述べたものと同じ抗体調製物を使用した。
【０１７８】
サンドイッチＥＬＩＳＡによる尿中のｏｘＭＩＦの測定：
マイクロタイタープレートをモノクローナル完全ヒト抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０でコーティングした。ヒト尿試料を０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に１：１０希釈した。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００の添加によって新たに生産した組換えヒトｏｘＭＩＦで行った。標準を、０．２％プロクリン３００および１０％ヒト対照尿（すなわち＞１０人の健常ドナーからの尿試料のプール）を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。プレートの洗浄後に、コーティング抗体によって捕捉されたｏｘＭＩＦを、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体（ｒｅｄＭＩＦとｏｘＭＩＦとを識別しないウサギ抗ｈｕＭＩＦ）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体によって検出した。ＴＭＢを発色性基質として使用し、発色反応をＨ２ＳＯ４で停止して、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで測定した。全ての試料、標準および対照を二つ一組にして行った。
【０１７９】
サンドイッチＥＬＩＳＡによる血漿中のｏｘＭＩＦの測定：
マイクロタイタープレートをモノクローナル完全ヒト抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０でコーティングした。ヒト血漿試料を０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に１：２０希釈した。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００の添加によって新たに生産した組換えヒトｏｘＭＩＦで行った。標準を、０．２％プロクリン３００および５％ヒト対照血漿（すなわち１５０人の健常ドナーからの血漿試料のプール）を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。検量線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌとした。プレートの洗浄後に、コーティング抗体によって捕捉されたｏｘＭＩＦを、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体（ｒｅｄＭＩＦとｏｘＭＩＦとを識別しないウサギ抗ｈｕＭＩＦ）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体によって検出した。ＴＭＢを発色性基質として使用し、発色反応をＨ２ＳＯ４で停止して、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで測定した。全ての試料、標準および対照を二つ一組にして行った。
【０１８０】
結果
図６Ａに図示するデータは、尿中に検出されるｏｘＭＩＦの量と疾患の状態（ステージ）との間の明確な相関関係を示している。健常対照の尿中で決定されるｏｘＭＩＦの平均レベルが０を有意に上回ることはなかった。しかし、疾患状態が重症になるほど、尿中で決定される平均ｏｘＭＩＦ濃度は高くなった。
【０１８１】
ループス腎炎と診断された急性患者のｏｘＭＩＦレベルを、第１観察日、診断の９日後および３５日後に測定した。ｏｘＭＩＦレベルの一定した低下が、臨床症状の改善と相関した（図６Ｂ）。血漿中のｏｘＭＩＦレベルも測定し、その結果は、尿中レベルに匹敵した。しかし、部分寛解、寛解またはくすぶり型疾患との相関関係は、それほど顕著ではなく、それはおそらく循環中のｏｘＭＩＦが基礎疾患（ＳＬＥ）の活性を総合的に反映しており、腎臓の状況だけを反映しているわけではないからであるだろう（図６Ｃ）。
【０１８２】
結論
ループス腎炎患者の尿中のｏｘＭＩＦの測定は、疾患進行ならびに処置効力をモニタリングするのに適している。循環中のｏｘＭＩＦも疾患重症度と相関するが、その結果は、おそらく、ＳＬＥに関する患者の総合的状況を反映し、腎臓（ＬＮ）における状況だけを反映するのではないだろう。
【０１８３】
ＩＶ．糖尿病性網膜症
実施例３．７
糖尿病性網膜症（ＤＲ）および白内障を持つ患者から採取した眼房水試料を、ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦの存在について、ＥＬＩＳＡでアッセイした。
【０１８４】
材料および方法
全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦを、実施例３．３および３．４で述べたものと同じＥＬＩＳＡ設定で検出した。
【０１８５】
結果
図７に示すように、全ＭＩＦはＤＲ患者または白内障患者からの試料に検出されるが、ｏｘＭＩＦはＤＲ試料にしか検出されない。
【０１８６】
結論
ｏｘＭＩＦは糖尿病性網膜症においてマーカーとして使用することができる。
【０１８７】
Ｖ．前立腺がん
実施例３．８：ヒト前立腺がんの確立後のマウス血漿中のｏｘＭＩＦ
異種移植マウス前立腺がんモデルの終了時に血漿試料を集めた。ｏｘＭＩＦならびに全ＭＩＦレベルを測定し、アイソタイプ対照および抗ＭＩＦ処置マウスにおける腫瘍成長と相関させた。
【０１８８】
材料および方法
前立腺がんの異種移植モデル
指数増殖期の培養物からＰＣ−３細胞を収穫し、成長因子枯渇ＢＤマトリゲルマトリックスと混合した。その懸濁液を、ＭＦ１ヌードマウス（マウス１匹あたり２５０μｌのマトリゲル中に２×１０６細胞、各群１０匹のマウス）の右脇腹に皮下接種した。腫瘍誘発の翌日に、ＲＡＢ０（５および１５ｍｇ／ｋｇ）による抗体処置を開始し、２週間にわたって１日おきに腹腔内注射した。心臓穿刺によって血液を収集し、循環ＭＩＦレベルを測定するために血漿を調製した。非異種移植マウスからの血漿試料も全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦについて分析した（＝陰性対照）。加えて、腫瘍重量を測定した。
【０１８９】
サンドイッチＥＬＩＳＡによる血漿中の全ＭＩＦの測定：
マイクロタイタープレートをアフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗マウスＭＩＦ抗体（実施例２に記載のウサギ抗ｍｏＭＩＦ）でコーティングした。被験血漿試料を０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に１：２５希釈した。このＥＬＩＳＡの較正は組換え完全長マウスＭＩＦタンパク質で行った。４％対照血漿を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに標準を希釈した。捕捉されたＭＩＦの検出は、アフィニティ精製ビオチン化ポリクローナルウサギ抗マウスＭＩＦ抗体（ビオチン化ウサギ抗ｍｏＭＩＦ）によって達成した。全ての試料、標準および対照を二つ一組にして行った。
【０１９０】
サンドイッチＥＬＩＳＡによる血漿中のｏｘＭＩＦの測定：
マイクロタイタープレートをモノクローナル完全ヒト抗ｏｘＭＩＦ抗体ＲＡＢ０でコーティングした。血漿試料を２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ｐＨ７．２）に１：２５希釈した。標準検量線のために、０．２％プロクリン３００を添加することによって組換えｍｏＭＩＦタンパク質を修飾し、０．２％プロクリン３００および４％対照血漿を含む２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴに標準を希釈した。捕捉されたｏｘＭＩＦの検出は、アフィニティ精製ポリクローナル抗マウスＭＩＦ抗体（実施例３．１に記載のウサギ抗ｍｏＭＩＦ）およびＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体によって達成した。ＴＭＢを発色性基質として使用し、発色反応をＨ２ＳＯ４で停止して、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで測定した。全ての試料、標準および対照を二つ一組にして行った。
【０１９１】
結果
アイソタイプ対照処置群における全ＭＩＦの中央値に、抗ＭＩＦ抗体処置動物との有意差はなかった。全ＭＩＦのレベルは、非異種移植マウス（＝図８Ａの陰性対照）と比較して、腫瘍保持動物では増加していることがわかった。しかし、健常動物におけるｏｘＭＩＦレベルは、適用した方法では検出不可能だった（＝図８Ｂの陰性対照；実施例３．８も参照されたい）。しかし図８Ｂに図示するように、腫瘍保持マウスでは、ｏｘＭＩＦレベルが明らかに検出可能であった。加えて、抗ＭＩＦ抗体による処置後はｏｘＭＩＦレベルが有意に低下していた。対照群におけるｏｘＭＩＦレベルの中央値は８．６ｎｇ／ｍＬであることがわかり、２つの処置群では低下していた。ｏｘＭＩＦレベルの用量依存的低下は、腫瘍成長の低減とも、したがって達成される治療効果とも相関した（図８Ｃ）。
【０１９２】
結論
ＰＣ−３前立腺がん異種移植モデルにおいて、全ＭＩＦのレベルは腫瘍保持マウスでは増加していることがわかった。しかし、非異種移植対照マウスではｏｘＭＩＦが検出されず、ｏｘＭＩＦの濃度はＭＦ１ヌードマウスにおける腫瘍成長と相関するが、全ＭＩＦの濃度は腫瘍成長と相関しない。それゆえにｏｘＭＩＦは、疾患進行および治療効果をモニタリングするための診断マーカーとして、全ＭＩＦよりはるかに適切である。
【０１９３】
実施例３．９：前立腺がん細胞株の細胞表面のｏｘＭＩＦ
ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ−３（前立腺腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４３５（商標））を、その表面でのｏｘＭＩＦの発現についてフローサイトメトリーによって試験した。
【０１９４】
方法
細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中、３００ｎＭの抗体ＲＡＢ９またはＲＡＢ０および陰性対照としての「対照１」（無関係なアイソタイプ対照抗体）で染色し、抗体をＲ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。
【０１９５】
「正常」な状況下での白血球の表面でのｏｘＭＩＦの存在を評価するために、健常ドナーからのヒト血液も分析した。抗体がそのＦｃドメインを介して細胞に非特異的に結合するのを阻止するために、ヘパリン添加血をまず抗ヒトＦｃ受容体（抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３２および抗ＣＤ６４）と共にインキュベートした。次に細胞を、対照ＩｇＧ１ヒトモノクローナル抗体、ＲＡＢ９またはＲＡＢ０と共にインキュベートした。細胞表面結合抗体の検出はＲ−ＰＥ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧで行った。異なる白血球亜集団を弁別するために、細胞をＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ標識抗ＣＤ４５（汎白血球マーカー）およびＡＰＣ標識抗ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）でも標識した。取得は赤血球の溶解後に行う。サイズおよび複雑さパラメータならびにＣＤ１９染色を使って、顆粒球、単球、リンパ球Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）およびリンパ球Ｔ細胞＋ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１９ｎｅｇ細胞）を識別することができる。データの取得はＦＡＣＳ（商標）ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０１９６】
結果
ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ−３の表面にｏｘＭＩＦを見いだすことができる（図９）。健常ドナーからの白血球（陰性対照）はその細胞表面にｏｘＭＩＦを一切示さない（図１０）。
【０１９７】
結論
ヒト前立腺がん細胞の表面におけるｏｘＭＩＦの存在は、がん性細胞を検出するためのマーカーとしてｏｘＭＩＦを使用できることを示している。
【０１９８】
ＶＩ．膵がん
実施例３．１０：膵がん細胞株の細胞表面のｏｘＭＩＦ
ヒト膵がん細胞株ＢｘＰＣ−３（ヒト初代膵臓腺癌、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）＃９３１２０８１６）を、その表面でのｏｘＭＩＦの発現についてフローサイトメトリーによって試験した。
【０１９９】
方法
細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中、３００ｎＭの抗体ＲＡＢ９またはＲＡＢ０および陰性対照としての「対照１」（無関係なアイソタイプ対照抗体）で染色し、抗体をＲ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。データの取得はＦＡＣＳ（商標）ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０２００】
結果
ヒト膵がん細胞株ＢｘＰＣ−３の表面にｏｘＭＩＦを見いだすことができる（図１１）。健常ドナーからの白血球（陰性対照）はその細胞表面にｏｘＭＩＦを一切示さない（図１０）。
【０２０１】
結論
ヒト膵がん細胞の表面におけるｏｘＭＩＦの存在は、がん性細胞を検出するためのマーカーとしてｏｘＭＩＦを使用できることを示している。
【０２０２】
ＶＩＩ．卵巣がん
実施例３．１１：卵巣がん細胞株の細胞表面のｏｘＭＩＦ
ヒト卵巣がん細胞株Ａ２７８０（ヒト卵巣癌、ＨＰＡ＃９３１１２５１９）を、その表面でのｏｘＭＩＦの発現についてフローサイトメトリーによって試験した。
【０２０３】
方法
細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中、３００ｎＭの抗体ＲＡＢ９またはＲＡＢ０および陰性対照としての「対照１」（無関係なアイソタイプ対照抗体）で染色し、抗体をＲ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。データの取得はＦＡＣＳ（商標）ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０２０４】
結果
ヒト卵巣がん細胞株Ａ２７８０の表面にはｏｘＭＩＦを見いだすことができるが（図１２）、それは主としてモノクローナル抗体ＲＡＢ０による。健常ドナーからの白血球（陰性対照）はその細胞表面にｏｘＭＩＦを一切示さない（図１０）。
【０２０５】
結論
ヒト卵巣がん細胞の表面におけるｏｘＭＩＦの存在は、がん性細胞を検出するためのマーカーとしてｏｘＭＩＦを使用できることを示している。
【０２０６】
ＶＩＩＩ．リンパ腫
実施例３．１２：リンパ腫がん細胞株の細胞表面のｏｘＭＩＦ
異なる不死化ヒトリンパ腫細胞株（表２）を、その表面でのｏｘＭＩＦの発現についてフローサイトメトリーによって試験した。
［表２］フローサイトメトリーによる活性ＭＩＦに関する試験で陽性であった細胞株
【表２】
2014530360.tif 000020
【０２０７】
方法
細胞を、２５μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび５０μｇ／ｍｌのデキストラン硫酸で、２４時間から７２時間まで刺激した（または刺激しなかった）。細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中、３００ｎＭの抗体ＲＡＢ９またはＲＡＢ０またはＲＡＢ４および陰性対照としての「対照１」（無関係なアイソタイプ対照抗体）で染色し、抗体をＲ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。データの取得はＦＡＣＳ（商標）ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０２０８】
結果
ヒトリンパ腫細胞株の表面にはｏｘＭＩＦを見いだすことができるのに対し（図１３）、健常ドナーからの白血球（陰性対照）はその細胞表面にｏｘＭＩＦを一切示さない（図１０）。
【０２０９】
結論
ヒトリンパ腫細胞の表面におけるｏｘＭＩＦの存在は、がん性細胞を検出するためのマーカーとしてｏｘＭＩＦを使用できることを示している。
【０２１０】
ＩＸ．固形腫瘍：前立腺がんおよび乳がん
実施例３．１３：がん患者からの血漿中のｏｘＭＩＦ
異なる種類の固形腫瘍（前立腺がんおよび乳がん）を有する患者からのＥＤＴＡ血漿試料を供給業者から入手した。それらの全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。
【０２１１】
材料および方法
全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦはどちらも同じＥＬＩＳＡ設定を使って検出した：マイクロタイタープレートをヒト抗ＭＩＦモノクローナル抗体ＲＡＭ０でコーティングし、ＭＩＦの検出は、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体で行った。ＥＬＩＳＡの読出しは、プレートをヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート抗体（ＢｉｏＲａｄ、カタログ：１７１−６５１６）（ここでは他の任意のヤギ抗ウサギを同様に使用しうる）およびＴＭＢ（発色性基質；当業者には知られているとおり、他の任意の適切な発色性基質も使用しうる）と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで行った。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００と共にインキュベートした組換えヒトＭＩＦで行った（プロクリン３００はＭＩＦ内でのｏｘＭＩＦエピトープの形成を誘発する）。標準を、０．２％プロクリン３００および５％ヒト対照血漿を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。検量線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌとした。被験ヒト血清試料は、ｏｘＭＩＦ  ＥＬＩＳＡの場合は０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に、また全ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡについては０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ／０．２％プロクリン３００に、１：２０希釈した。
【０２１２】
結果
前立腺がん（ｎ＝１４）および乳がん（ｎ＝１５）と診断された患者に由来するＥＤＴＡ血漿試料を供給業者から購入した。健常ボランティアからのＥＤＴＡ血漿（ｎ＝４９）を対照として使用した。図１４Ａおよび１４Ｂに、対照試料および前立腺がん試料の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベルを示す。文献に記載されているとおり、ＭＩＦは健常個体からの血漿中に検出され、前立腺がん患者からの血漿では、全ＭＩＦの有意な増加（ｔ検定、ｐ＝０．０１６６）が観察された。しかし、ｏｘＭＩＦは健常ドナーの血漿には検出されず、一方、前立腺がん患者からの血漿試料にはｏｘＭＩＦが検出された（ｔ検定、ｎ＝０．００１６）。類似するパターンが乳がん試料でも観察され（図１５）、乳がん患者由来の血漿試料では健常対照と比較して全ＭＩＦ（ｐ＝０．００７８）およびｏｘＭＩＦ（ｐ＝０．０４５１）の有意な上昇があり、健常対照ではｏｘＭＩＦが検出されなかった。
【０２１３】
結論
前立腺がん患者および乳がん患者の血漿では、全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベルの上昇を検出することができる。しかし、全ＭＩＦが健常ドナー由来の血漿にも存在するのに対し、ｏｘＭＩＦは健常対照には検出することができない。それゆえにｏｘＭＩＦは、全ＭＩＦより特異的な、疾患状態を示すためのバイオマーカーであるとみなすことができる。
【０２１４】
Ｘ．多発性硬化症
実施例３．１４：多発性硬化症患者のＣＳＦ中のｏｘＭＩＦ
異なる形態の多発性硬化症を有する患者に由来する脳脊髄液試料を供給業者から入手した。全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２１５】
材料および方法
全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦはどちらも同じＥＬＩＳＡ設定を使って検出した：マイクロタイタープレートをヒト抗ＭＩＦモノクローナル抗体ＲＡＭ０でコーティングし、ＭＩＦの検出は、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体で行った。ＥＬＩＳＡの読出しは、プレートをヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート抗体（ＢｉｏＲａｄ、カタログ：１７１−６５１６）（ここでは他の任意のヤギ抗ウサギを同様に使用しうる）およびＴＭＢ（上に定義した発色性基質；当業者には知られているとおり、他の任意の適切な発色性基質も使用しうる）と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで行った。
【０２１６】
ＣＳＦ試料の場合、ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００と共にインキュベートした組換えヒトＭＩＦで行った（プロクリン３００はＭＩＦ内でのｏｘＭＩＦエピトープの形成を誘発する）。標準を、０．２％プロクリン３００を含む２０ｍＭトリス／ＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．２）に希釈した。線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌである。被験ヒトＣＳＦ試料を、ｏｘＭＩＦ  ＥＬＩＳＡの場合は２０ｍＭトリス／ＴＢＳＴに、また全ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡ用にはプロクリン３００の存在下で、１：１０希釈した。
【０２１７】
結果
この実施例で使用した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料の場合（図１６Ａおよび１６Ｂ）、健常対照からのＣＳＦにはｏｘＭＩＦを検出することができなかったのに対し、ＭＳ患者のＣＳＦには高レベルに見いだされた（ｐ＜０．０００１）。全ＭＩＦのレベルも、対照（ｎ＝３０）と比較してＭＳ患者からの試料（ｎ＝４９）では強く増加していた（ｐ＜０．０００１）が、全ＭＩＦは、健常対照からの試料にも、一定程度は見いだされた。
【０２１８】
結論
ＭＳ患者のＣＳＦでは全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベルの上昇を検出することができる。しかし全ＭＩＦが健常ドナー由来のＣＳＦにも存在するのに対し、健常対照にｏｘＭＩＦを検出することはできない。それゆえに、ｏｘＭＩＦは、多発性硬化症に関する優れたバイオマーカーであり、全ＭＩＦより特異的なバイオマーカーであるとみなすことができる。
【０２１９】
ＸＩ．卵巣がん
実施例３．１５：卵巣がん患者からの血漿中のｏｘＭＩＦ
異なる種類の卵巣がん（明細胞腺癌、乳頭状漿液性腺癌および漿液性腺癌）を有する患者からのＥＤＴＡ血漿試料を商業的に入手した。その全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ含量をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２２０】
材料および方法
全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦはどちらも同じＥＬＩＳＡ設定を使って検出した：マイクロタイタープレートをヒト抗ＭＩＦモノクローナル抗体ＲＡＭ０でコーティングし、ＭＩＦの検出は、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体で行った。ＥＬＩＳＡの読出しは、プレートをヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート抗体（ＢｉｏＲａｄ、カタログ：１７１−６５１６）（ここでは当技術分野において知られている他の任意のヤギ抗ウサギを同様に使用しうる）およびＴＭＢ（上に定義した発色性基質；当業者には知られているとおり、他の任意の適切な発色性基質も使用しうる）と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで行った。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００（プロクリン３００はＭＩＦをｏｘＭＩＦに転化する）と共にインキュベートした組換えヒトＭＩＦで行った。標準を、０．２％プロクリン３００および５％ヒト対照血漿を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。検量線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌである。被験ヒト血漿試料を、ｏｘＭＩＦ  ＥＬＩＳＡの場合は０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に、また全ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡについてはプロクリン３００の存在下で、１：２０希釈した。
【０２２１】
結果
ＥＤＴＡ血からの血漿試料を卵巣がんと診断された患者（ｎ＝４２）から購入した。健常ボランティアからのＥＤＴＡ血漿（ｎ＝１９）を対照として使用した。図１７Ａおよび１７Ｂに、対照試料および卵巣がん試料の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベルを示す。文献に記載されているとおり、ＭＩＦは健常個体からの血漿中に検出され、卵巣がん患者からの血漿では、全ＭＩＦの有意な増加（ｔ検定、ｐ＝０．０４３４）が観察された。しかし、ｏｘＭＩＦは健常ドナーの血漿には検出されず、一方、卵巣がん患者からの血漿試料にはｏｘＭＩＦが検出された（ｔ検定、ｐ＝０．０６６３）。卵巣がんの特定サブタイプについて統計解析を行うと、漿液性嚢胞腺癌からの血漿では対照と比較してＭＩＦの有意な増加（ｐ＝０．００４６）が、また乳頭状漿液性嚢胞腺癌（ｐ＝０．０４３８）および漿液性嚢胞腺癌（ｐ＝０．０３５７）では対照に対してｏｘＭＩＦの有意な増加が、観察された。
【０２２２】
ＸＩＩ：潰瘍性大腸炎およびクローン病
実施例３．１６：潰瘍性大腸炎およびクローン病を持つ患者からの血漿中のｏｘＭＩＦ
異なる潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）を有する患者からのＥＤＴＡ血漿試料を商業的に入手した。それらの全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。
【０２２３】
材料および方法
全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦはどちらも同じＥＬＩＳＡ設定を使って検出した：マイクロタイタープレートをヒト抗ＭＩＦモノクローナル抗体ＲＡＭ０でコーティングし、ＭＩＦの検出は、アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＭＩＦ抗体で行った。ＥＬＩＳＡの読出しは、プレートをヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート抗体（ＢｉｏＲａｄ、カタログ：１７１−６５１６）（ここでは当技術分野において知られている他の任意のヤギ抗ウサギを同様に使用しうる）およびＴＭＢ（上に定義した発色性基質；当業者には知られているとおり、他の任意の適切な発色性基質も使用しうる）と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで行った。ＥＬＩＳＡの較正は、０．２％プロクリン３００（プロクリン３００はＭＩＦをｏｘＭＩＦに転化する）と共にインキュベートした組換えヒトＭＩＦで行った。標準を、０．２％プロクリン３００および５％ヒト対照血漿を含む０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳに希釈した。検量線の範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５６ｎｇ／ｍｌである。被験ヒト血漿試料を、ｏｘＭＩＦ  ＥＬＩＳＡの場合は０．５％魚類ゼラチン／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に、また全ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡについてはプロクリン３００の存在下で、１：２０希釈した。
【０２２４】
結果
ＥＤＴＡ血からの血漿試料を、ＵＣ（ｎ＝１５）またはＣＤ（ｎ＝２１）と診断された患者から購入した。健常ボランティア（ｎ＝１９）からのＥＤＴＡ血漿を対照として使用した。図１８Ａおよび１８Ｂに、対照試料ならびにＵＣおよびＣＤ試料の全ＭＩＦおよびｏｘＭＩＦのレベルを示す。文献に記載されているとおり、ＭＩＦは健常個体からの血漿中に検出され、ＣＤ患者からの血漿では全ＭＩＦの有意な増加（ｔ検定、ｐ＝０．０２０７）が検出されたが、ＵＣ試料では有意な増加はなかった（ｐ＝０．１２４０）。しかし、ｏｘＭＩＦは健常ドナーの血漿には検出されず、一方、ＵＣ患者とＣＤ患者のどちらからの血漿試料でもｏｘＭＩＦが検出された（ｔ検定、対照と比較した場合、それぞれｐ＝０．０４１７およびｐ＝０．０１１４）。
【０２２５】
結論
潰瘍性大腸炎患者とクローン病患者はどちらの場合も、健常ボランティアと比較して有意に多量のｏｘＭＩＦを血漿中に検出することが可能だった。これらの結果は、ｏｘＭＩＦをこれらの疾患におけるバイオマーカーとして使用できることを示している。
【図１】
2014530360.tif 000021
【図２−１】
2014530360.tif 000022
【図２−２】
2014530360.tif 000023
【図３】
2014530360.tif 000024
【図４】
2014530360.tif 000025
【図５】
2014530360.tif 000026
【図６】
2014530360.tif 000027
【図７】
2014530360.tif 000028
【図８−１】
2014530360.tif 000029
【図８−２】
2014530360.tif 000030
【図９】
2014530360.tif 000031
【図１０】
2014530360.tif 000032
【図１１】
2014530360.tif 000033
【図１２】
2014530360.tif 000034
【図１３】
2014530360.tif 000035
【図１４】
2014530360.tif 000036
【図１５】
2014530360.tif 000037
【図１６】
2014530360.tif 000038
【図１７−１】
2014530360.tif 000039
【図１７−２】
2014530360.tif 000040
【図１８】
2014530360.tif 000041
【配列表】
2014530360000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月3日(2014.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014530360000001.app
【国際調査報告】
2014530360.tif 000042
2014530360.tif 000043
2014530360.tif 000044
2014530360.tif 000045