(57)【要約】本発明は、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の応答を予測するインビトロの方法であって、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置されている場合に、工程ｉ）患者の試料中の補体因子Ｈファミリーの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーまたはそれらの混合物もしくは組合せのタンパク質濃度を決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定されたタンパク質濃度を精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者における補体因子Ｈファミリーの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーのタンパク質濃度を代表する値に比較すること、ｉｉｉ）ここで、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の試料中における補体因子Ｈファミリーからの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーのより高いタンパク質濃度は、前記処置から臨床的有用性が得られるであろう患者のための指標であり、およびｉｖ）精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者のために前記処置を選択することを含む方法に関する。
2014527175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の応答を予測するインビトロの方法であって、次の工程：
ｉ）患者の試料中の補体因子Ｈファミリーの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバー、またはそれらの混合物もしくは組合せのタンパク質濃度を決定すること、
ｉｉ）精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者における補体因子Ｈファミリーの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーのタンパク質濃度を代表する値に、工程ｉ）で決定されたタンパク質濃度を比較すること
ｉｉｉ）ここで、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の試料中の補体因子Ｈファミリーからの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーのより高いタンパク質濃度が、当該処置からの臨床的有用性が得られる患者の指標であり、そして
ｉｖ）精神発達、神経、または神経精神障害をもつ患者のために当該処置を選択すること、を含む方法。
【請求項２】
グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の応答を予測するインビトロの方法であって、次の工程：
ｉ）患者の試料中の補体因子Ｈファミリーの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーまたはそれらの混合物もしくは組合せのタンパク質濃度を決定すること
ｉｉ）精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者における補体因子Ｈファミリーの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーのタンパク質濃度を代表する値に、工程ｉ）で決定されたタンパク質濃度を比較すること
ｉｉｉ）ここで、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の試料中の補体因子Ｈファミリーからの１個，２個，３個，４個，５個または６個のメンバーのより高いタンパク質濃度が、ＧＲＩ処置からの臨床的有用性が得られる患者の指標であり、そして
ｉｖ）精神発達、神経、または神経精神障害をもつ患者のためにＧＲＩ処置を選択すること、を含む方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ａ（ＣＦＨＲ４Ａ）、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ｂ（ＣＦＨＲ４Ｂ）、および補体因子Ｈ関連タンパク質５（ＣＦＨＲ５）を含む補体因子Ｈファミリーの個々のメンバーまたはそれらの混合物もしくは組合せである、方法。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈおよび補体因子Ｈ関連タンパク質１の混合物である、方法。
【請求項５】
請求項１、２または３のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈおよび補体因子Ｈ関連タンパク質１の組合せである、方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈ関連タンパク質１である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、精神発達、神経または神経精神障害は、統合失調症、双極性障害、物質依存症、自閉症および強迫性障害の陰性または陽性症状を含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーの個々のメンバーまたはそれらの混合物もしくは組合せのタンパク質濃度は、ＥＬＩＳＡに基づく技術によって測定される、方法。
【請求項９】
グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の応答を予測するインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーの個々のメンバーまたはそれらの混合物もしくは組合せのタンパク質濃度は補体因子Ｈファミリーメンバーの遺伝子変異体を測定することによって決定される、方法。
【請求項１０】
グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置される場合に、請求項９に記載の、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の応答を予測するインビトロの方法であって、ここで、補体因子Ｈファミリーの個々のメンバーまたはそれらの混合物もしくは組合せのタンパク質濃度は補体因子Ｈファミリーメンバーの遺伝子変異体を測定することによって決定される、方法。
【請求項１１】
請求項９および１０のいずれか一項に記載の、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の応答を予測するインビトロの方法であって、ここで、ＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、ＣＦＨＲ１のコピー数多型の測定によるか、または欠失の代わりとしてのＳＮＰの測定によるかのいずれかによってＣＦＨＲ１の遺伝子変異体を測定することにより決定される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜９に記載の方法において補体因子Ｈファミリーのタンパク質に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、患者は統合失調感情障害に冒されている、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のインビトロの方法であって、ここで、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物は、ＧＲＩ［４−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イル）−ピペラジン−１−イル］−［５−メタンスルホニル−２−［［（２Ｓ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イル］オキシ］フェニル］メタノンである、方法。
【請求項１５】
グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置される患者のための予測マーカーとしての使用のための補体因子Ｈファミリーメンバー。
【請求項１６】
グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置される患者の予測マーカーとしての使用のための、請求項１５に記載の補体因子Ｈファミリーメンバー。
【請求項１７】
グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置される患者のための臨床的有用性の予測マーカーとしての補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質の使用。
【請求項１８】
グリシン再取り込み阻害剤で処置される請求項１７に記載の患者の臨床的有用性の予測マーカーとしての補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質の使用。
【請求項１９】
グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の臨床的有用性の予測マーカーとしての、補体因子Ｈファミリーメンバー。
【請求項２０】
グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害をもつ患者の臨床的有用性の予測マーカーとしての、請求項１９に記載の補体因子Ｈファミリーメンバー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経発達、神経または神経精神障害をもつ患者を、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置するための臨床的有用性を予測する方法に関する。
【０００２】
神経発達障害は、脳または中枢神経系の成長と発達の障害である。その用語の狭義の使用は感情、学習能力および感情、ならびに社会的能力、スキルおよび行動に影響を与え、そして個体が成長するにつれて展開する脳機能の障害を指す。起源において神経発達であり、またはそれらが幼年および子供時代に発生した時に神経発達影響をもたらすと考えらえる障害は、アスペルガー症候群のような自閉症および自閉症スペクトラム障害、外傷性脳損傷（脳性麻痺、通信、音声および言語障害を引き起こすような先天性障害を含む）、脆弱−Ｘ症候群およびダウン症候群のような遺伝性疾患を含む。精神発達障害は、個人、家族、および社会全般に広く様々な程度の精神的、感情的、物理的、および経済的負担と関連する。
【０００３】
神経障害は身体の神経系の障害である。脳、脊髄、またはそれらからまたはそれらへと導く神経における構造的、生化学的または電気的異常が麻痺、筋肉低下、調節不足、感覚の喪失、けいれん、混乱、痛み、無関心、および意識の変性状態のような症状を引き起こしうる。多くの認識された神経障害、いくらか比較的一般的しかし多くは稀である。２００６年に、世界保健機構は、神経障害およびその後遺症は世界中１０億人程の多くに影響を与えると推定し、関連した障害および苦しみを与える主な因子として健康の不平等と社会的不名誉／差別を認めた。
【０００４】
神経精神医学は神経系の疾患に起因する精神障害を処置する医学の部門であり、それはまた、心理学および行動神経学の分野に密接に関連しており、それは脳障害または脳疾患に起因する認知および／または行動の臨床的問題に対処する神経学の細分化専門部門である。
【０００５】
神経発達、神経または神経精神障害は、統合失調症、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症および強迫性障害（ОＣＤ）を含み、それらは本発明に関して最も好ましい適応症である。
【０００６】
本発明は、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で（例えば、グリシン再取り込み阻害剤で）処置される患者の臨床的有用性のための予測マーカーとしての補体因子Ｈファミリーのタンパク質の使用を開示する。さらに、それはインビトロにおける前記試料における補体因子Ｈファミリーのタンパク質を測定することにより、個体から得られた試料から薬物の応答を予測するための方法に特に関連する。
【０００７】
補体因子Ｈファミリーは、それがＣＦＨ、ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４Ａ、ＣＦＨＲ４ＢおよびＣＦＨＲ５を含む個々のＣＦＨタンパク質またはそれらの混合物で有り得ることを意味する。
【０００８】
ＧｌｙＴ１を標的とするグリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）は、グリシンの細胞外濃度を上昇してＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡ−Ｒ）媒介伝達を高めると考えられている新規クラスの化合物である。健康な個体、精神病患者および動物における研究および遺伝子分析からの証拠は、精神発達、神経または神経精神障害の病態生理学において、ＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡ−Ｒ）機能低下の関与について過去１５年にわって蓄積されてきた。
【０００９】
ＣＮＳにおいて、グリシンは感覚と高次脳機能を支配する二つの主要な役割を持つ：それはグリシン作動性ニューロンにおける抑制性神経伝達物質であり、そしてＮＭＤＡ受容体のグルタミン酸作動性伝達のグルタミン酸と共同アゴニストとしての興奮性神経伝達物質である。
【００１０】
グルタミン酸は、脳における主な興奮性神経伝達物質であり、ＮＭＤＡおよび非−ＮＭＤＡ受容体（リガンド開口型イオンチャンネル、すなわちＡＭＰＡ、カイニン酸および代謝型受容体、すなわちｍＧｌｕＲ１−８）を活性化する。ＮＭＤＡ受容体は異ったニューロン（例えば、グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）に位置する。従って、ＮＭＤＡ受容体はグルタミン酸、ＧＡＢＡおよびドーパミンに直接作用できる。
【００１１】
ＮＭＤＡ受容体は、それらが活性化のためにグルタミン酸およびグリシンの両方の結合を必要とすることを意味するリガンド開口型イオンチャンネルである。グリシンはグルタミン酸の調節因子として作用する：それはグルタミン酸の効力を増加し、従って受容体を活性化する効果を高める。発達途上の脳においておよび、成熟脳においてはより少ない程度で、ＮＭＤＡ受容体は、シナプト形成に、ならびにシナプスメンテナンスおよび安定化（増加したシナプス可塑性によって）を促進することにおいて重要な役割を果たす。従って、ＮＭＤＡ受容体は、成熟および発達途上脳の両方においていくつかの脳機能に関与している。
【００１２】
グルタミン酸作動性神経伝達物質における機能障害は、気分障害および統合失調症の病態生理に関与している。従って、ＮＭＤＡ受容体グリシン−調節部位は、統合失調症における認識を改善しそして陰性症状を減少させるための治療標的であると考えられる。
【００１３】
グリシンはＮＭＤＡ−Ｒ複合体における必須の共アゴニストであるので、ＮＭＤＡ−Ｒ媒介神経伝達を高めるための戦略は、ＮＭＤＡ受容体の局所のミクロ環境におけるグリシンの細胞外濃度を高めることである。グリシン上昇はＧＲＩの阻害によって達成でき、それはシナプス間隙からのグリシン除去による。既存の神経および神経精神病の治療上の可能な有用性は、良好な効率をもつグリシン再取り込み阻害剤の効果、ならびに統合失調症、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症および強迫性障害（ОＣＤ）における陰性および正の症状の処置のための改善された認容性プロファイルを含む。
【００１４】
ＧｌｙＴ１は、神経伝達物質輸送体のスーパーファミリー（ＳＥＲＴ、ＮＥＴまたはＤＡＴのような）に属する。ＧｌｙＴ１は、前脳においてグルタミン酸作動性シナプスを囲んでいる。それはＮＭＤＡ受容体のＮＲ１部位上の結合部位で、シナプスにおける細胞外グリシン濃度を飽和レベル以下で維持する。尾側脳領域および脊髄において、ＧｌｙＴ１はグルタミン酸作動性（ＮＭＤＡ受容体を介して）およびグリシン作動性伝達の両方を支配する。
【００１５】
グリシン再取り込み阻害剤は、精神発達、神経または神経精神障害（例えば、統合失調症）の処置のために使用されうることが知られている。
【００１６】
本発明の内容に使用されている適切なグリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）は、［４−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イル）−ピペラジン−１−イル］−［５−メタンスルホニル−２−（（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−エトキシ）−フェニル］−メタノンである。
【００１７】
統合失調症は、莫大な社会的および経済的影響をもつ成人人口の約１％の世界的有病率を伴う思春期後期または成人期早期に典型的に現れる重篤な精神障害である。統合失調症診断のためのヨーロッパ精神科医協会（ＩＣＤ）および米国精神科医協会（ＤＳＭ）の基準は、二つ以上の特徴的な症状が存在する：妄想、幻覚、まとまりのない会話、ひどくまとまりのないまたは緊張病性行動または陰性症状（失語、情緒平坦化、意欲の欠如、無快感症）、および情緒障害を除くような他の要件、および機能障害の存在が存在することを要求する。集団として、統合失調症を持つ人々は子ども時代に始まり成人期を通して継続する機能的障害をもち、そしてほとんどの患者に正常の職業に就くことまたはそうでなければ正常の社会機能をもつことを不可能にする［２、３］。また、彼らは一般集団に比べて短い寿命を持ち、統合失調症処置に先だって重い、物質依存症、強迫症状および異常な不随意運動を含む、多種多様な他の神経精神病症候群の有病数の増加に苦しんでいる。統合失調症はまた、精神病症状が十分に制御されている場合でも、広い範囲の認知障害、機能を制限する重篤性と関連している。
【００１８】
グルタミン酸作動性伝達と関連した他の適応症は、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症および強迫性障害（ОＣＤ）である。
【００１９】
ＣＮＳ疾患（例えば、統合失調症、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症および強迫性障害（ОＣＤ））の処置を個体別化する方法を開発する必要があることは長い間認識されてきた。
【００２０】
標的とされた疾患処置の進展とともに、標的の分子プロファイルを提供できる方法（すなわち、臨床有用性を予測すること）に特別な関心が存在する。
【００２１】
従って、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物に対して臨床的有用性を予測するためのインビトロの方法を提供すること、例えば、統合失調症、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症および強迫性障害（ОＣＤ））である、グルタミン酸作動性経路に関連した疾患を標的とする化合物で処置するための臨床的有用性が得られる個体を同定することが、本発明の目的である。
【００２２】
この目的のために、体液（例えば、血液、血清または血漿）中に検出できる循環中に存在する予測マーカーが見つけられなければならない。
【００２３】
臨床的に有用であるためには、予測マーカーは、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物による処置から臨床的効果が得られない個体から、臨床的効果が得られる個体を識別できるべきである。予測感度または試験の特異性は受信者操作特性（ＲＯＣ）によって最もよく評価される。
【００２４】
全血、血清または血漿は、臨床ルーチンにおいてもっとも広く使用されるサンプル源である。統合失調症および他の疾患におけるグルタミン酸作動性経路を標的とする化合物による処置に応答する個体の同定に役立つ予測マーカーの同定は、これらの疾患の処置および管理に大きな助けになる方法につながる。従って、グルタミン酸作動性経路を標的とする疾患（例えば、ＧＲＩ関連疾患）の処置を改善するために緊急の臨床的必要性が存在する。
【００２５】
さらに本発明の目的は、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物（例えば、ＧＲＩ）に対する応答を予測することに使用されうる生化学的マーカーが体液試料中インビトロで同定できるかどうかを研究することである。
【００２６】
驚くべきことには、試料中のタンパク質ＣＦＨファミリーの濃度のインビトロ決定は精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者のためのＧＲＩでの処置から臨床的有用性の予測を可能にすることが見いだされた。
【００２７】
本文脈において、血液、血清または血漿試料中の補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度を決定することは、特定の処置から臨床的有用性が得られる患者のための指標である。この目的のために、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度が、治療から臨床的有用性が得られない患者集団の補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度を代表する値と比較され、ここで患者の血液、血清または血漿試料中の補体因子Ｈファミリーメンバーのより高いタンパク質濃度が、当該処置から臨床的有用性が得られる患者のための指標である。
【００２８】
精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の応答性を予測する新しいインビトロの方法が提供され、ここではそのような患者はグルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で（例えば、ＧＲＩ）で処置され、その方法は以下：
−  患者の血液、血清または血漿試料中の補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度を測定すること
−  補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度を、治療から臨床的有用性を得られない患者集団の補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度を代表する値に比較すること、ここで、患者の血液、血清または血漿試料中の補体因子Ｈファミリーメンバーのより高いタンパク質濃度が当該処置から臨床的有用性が得られる患者のための指標である
を含む。
【００２９】
さらなる実施態様において、本発明は、ある種のＣＮＳ疾患（例えば、統合失調症）のインビトロ評価における試料中のタンパク質補体因子Ｈファミリーメンバーの使用に関するものであり、ここでは、上記のリファレンス濃度であるタンパク質補体因子Ｈファミリーメンバーの濃度が前記疾患の薬物処置による臨床的有用性のための指標である。
【００３０】
補体因子Ｈは、１８９個のタンパク質のパネルから選択された（Rules Based Medicine, Human Discovery Map v 1.0）。ＧＲＩで処置された統合失調症患者からのベースラインおよび処置血清試料は、Luminex based multiplex ELISA Human DiscoveryMap(登録商標) v 1.0で分析された。
【００３１】
DiscoveryMAP(登録商標)は、１８９個のタンパク質分析を含む総合的な定量的イムノアッセイ試験である。それは、サイトカイン、ケモカイン、代謝マーカー、ホルモン、成長因子、組織リモデリングタンパク質、血管形成マーカー、急性期応答物質、腫瘍マーカー、腎毒性マーカー、ＣＮＳバイオマーカーおよび他の重要な血清タンパク質のためのアッセイ開発の１０年間の集大成を表す。
【００３２】
補体因子Ｈは、以下のような有用性：
−  補体因子Ｈは処置グループにおいて応答者および非応答者の間で強力な区別を表す
−  補体因子Ｈはプラセボグループにおいて予後効果を表さない
−  補体因子Ｈ血清濃度は、８週間内でＧＲＩによる処置によって影響を受けない
−  補体因子Ｈ血清濃度は経時的に安定である
を考慮して他の１８９個のタンパク質分析物に勝っていることが分かった。
【００３３】
補体因子Ｈ（因子Ｈとしてまた知られている）は、微生物の防御、免疫複合体プロセシング、プログラム細胞死および加齢黄斑変性に関与している補体媒介性免疫系の調節に必須の役割を果たすシアル酸含有糖タンパク質である。補体因子Ｈは、補体因子Ｈタンパク質ファミリーの最もよく特徴づけられたメンバーである。補体因子Ｈファミリーは、以下のメンバーから成る：補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）、アイソフォーム４Ａおよび４Ｂをもつ補体因子Ｈ関連タンパク質４（ＣＦＨＲ４ＡおよびＣＦＨＲ４Ｂ）、補体因子Ｈ関連タンパク質５（ＣＦＨＲ５）。補体因子Ｈ関連タンパク質は、補体因子Ｈ遺伝子の下流にコードされ、補体因子Ｈのサブドメインと高い濃度のホモロジーを共有している。補体因子Ｈ関連タンパク質は、また機能的類似性を共有している［４］。
【００３４】
補体系は、体液中または細胞および組織表面に存在し、３つの主要経路によりカスケード状に活性化される約４０個のタンパク質から成る［１］。代替経路は中央構成成分Ｃ３の自発的加水分解によって低速度で連続的に活性化され、レクチン経路は微生物糖鎖を認識するマンノース結合レクチンまたはフィコリンをによって開始され、そして古典的経路はＣ１ｑが抗原結合イムノグロブリンに結合することにより活性化される。酵素的工程では、補体構成成分の活性型フラグメントを生成し、さらなる増幅を引きだす。三つの経路はＣ３の濃度で合流し、活性化されてＣ３ａおよびＣ３ｂに解裂する。
【００３５】
補体因子Ｈは制御されていない補体活性化から生じる障害から宿主細胞を保護する。補体因子ＨはファクターＩ媒介Ｃ３ｂ解裂のための両方の補因子活性を有することによって自身の細胞上の補体活性化を調節し、および代替経路Ｃ３転換酵素、Ｃ３ｂＢｂに対する加速活性を低下させる。
【００３６】
補体因子Ｈは、補体活性化から自身の細胞を保護するが、細菌／ウイルスを保護しない。補体因子Ｈが補体の調節に果たす中心的役割によって、異常なＣＦＨ活性から起る多くの臨床的影響がある。補体因子Ｈ遺伝子における変異は、稀な腎障害、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）および膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）（デンスデポジット糸球体腎炎（ＤＤＤ）とも呼ばれる）、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型またはデンスデポジット疾患、ならびに頻度の高い網膜疾患加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む重篤および多様な疾患と関連している。補体調節活性に加えて、補体因子Ｈは複数の生理活性を持ち、および１）細胞外マトリクッス成分として働く、２）インテグリン型の細胞受容体に結合する、および３）広い選択のリガンド（例えば、Ｃ−反応性タンパク質、スロンボスポンジン、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、およびヘパリン）と相互作用する。
【００３７】
補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）は４３kDaであり、糖タンパク質の因子Ｈファミリーの分泌型メンバーである。それは、肝臓によって作られ、二つの異ったグリコシル化アイソフォーム（３７kDaおよび４３kDa）として循環している。成熟ヒトＣＦＨＲ１は長さにおいて３１２ａａである。それは、基本的に全分子を構成している５つの約６０ａａＳＣＲｓ（短いコンセンサスリピート／ＣＣＰｓ／ＳＵＳＨＩ繰り返し）を含んでいる。ＣＦＨＲ１は、ＬＰＳを好中球に結合するリポタンパク質複合体中で役割を果たす。ＣＦＨＲ１に対する齧歯類の対応物は報告されていない。ＣＦＨＲ１前駆体のａａ１９１４３にわたり、ヒトＣＦＨＲ２およびＣＦＨＲ５は、それぞれ９８％および８６％ａａ同一性を表す。
【００３８】
本明細書において
用語「バイオマーカーまたはマーカー」は、治療相互作用に対する、生物学的状態、すなわち生物学的プロセスまたは薬理学的反応の指標として使用される物質を意味する。バイオマーカーまたはマーカーは、疾患の危険性または進展と、または与えられた処置に対する疾患の感受性と関係するタンパク質の発現または状態における変化を示す。
【００３９】
用語「遺伝子」は宿主有機体におけるＤＮＡの断片を意味する。
【００４０】
遺伝子発現は、遺伝子からの情報は機能性の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の合成に用いられる過程である。用語「発現濃度」は特定の遺伝子が細胞、組織または有機体内で発現される濃度を意味する。タンパク質との文脈において用語「発現濃度」はある時点で細胞内に存在する特定のタンパク質の量を反映する。
【００４１】
用語「タンパク質」は遺伝子から合成される機能性の遺伝子産物を意味する。
【００４２】
用語「処置から臨床的有用性が得られない患者集団の補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度を代表する値」は、当該処置から臨床的有用性が得られない患者集団の平均発現濃度の推定値を指す。臨床的有用性とは、８週以上後にプラセボに比較して測定可能な応答性を持つこととして定義された。
【００４３】
本明細書で使用された用語「試料」または「試験試料」はインビトロ評価の目的のための個体から得られた生物試料を指す。本発明の方法において、試料または患者試料は本発明の実施態様において任意の体液を含む。好ましい試料は体液（例えば、血液、血清または血漿）であり、最も好ましいのは血清または血漿である。
【００４４】
用語「混合物」は、一つのタンパク質アッセイ（例えば、サンドイッチアッセイ）によって同時に検出される二つ以上のタンパク質によって構成されるタンパク質混合物を指す。同時の検出はサンドイッチアッセイに使用された抗体によって検出されるタンパク質上に存在する類似のエピトープによりなされうる。
【００４５】
用語「組合せ」は、順序は問題でない、タンパク質のより大きなグループから測定された二つ以上のタンパク質分析物の独立した測定に関する。独立した測定結果は数学的に（例えば、二つの測定結果の比を計算することによって）組合される。
【００４６】
補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度、特に可溶型の補体因子Ｈファミリーメンバー（ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４Ａ、ＣＦＨＲ４Ｂ、ＣＦＨＲ５またはそれらの混合物）のタンパク質濃度は、適切な試料中でインビトロ測定される。好ましくは、試料はヒト被験者（例えば、統合失調症患者または統合失調症の危険性のあるヒトまたは統合失調症をもつと疑われる人）から得られる。補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度は血液、血清または血漿試料で測定される。
【００４７】
本発明は、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置された場合に、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の応答を予測する方法を含み、次の工程：
ｉ）患者の試料中の補体因子Ｈファミリーの１個、２個、３個、４個、５個または６個のメンバーまたはそれらの混合物または組合せのタンパク質濃度を決定すること
ｉｉ）工程ｉ）で測定されたタンパク質濃度を、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者における補体因子Ｈファミリーからの１個、２個、３個、４個、５個または６個のメンバーのタンパク質濃度を代表する値に比較すること
ｉｉｉ）精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の試料における補体因子Ｈファミリーからの１個、２個、３個、４個、５個または６個のメンバーのより高いタンパク質濃度は本処置からの臨床的有用性が得られる患者の指標である、および
ｉｖ）精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者のために本処置を選択すること
を含む。
【００４８】
さらに具体的には、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置された場合に、本発明は患者の応答を予測するためのインビトロの方法を包含し、次の工程：
ｉ）患者試料中の補体因子Ｈファミリーの１個、２個、３個、４個、５個または６個のメンバーまたはそれらの混合物または組合せのタンパク質濃度を決定すること
ｉｉ）工程ｉ）で決定されたタンパク質濃度を、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者における補体因子Ｈファミリーの１個、２個、３個、４個、５個または６個のメンバーのタンパク質濃度を代表する値に比較すること
ｉｉｉ）ここで、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者における補体因子Ｈファミリーからの１個、２個、３個、４個、５個または６個のメンバーのより高いタンパク質濃度はＧＲＩでの処置からの臨床的有用性が得られる患者の指標である、および
ｉｖ）精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者のためにＧＲＩ処置を選択すること
を包含する。
【００４９】
補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ａ（ＣＦＨＲ４Ａ）、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ｂ（ＣＦＨＲ４Ｂ）、および補体因子Ｈ関連タンパク質５（ＣＦＨＲ５）を含む。
【００５０】
本発明の一実施態様は、上記の補体因子Ｈファミリーメンバーまたはそれらの混合物または組合せである。
【００５１】
本発明の一実施態様は、補体因子Ｈファミリーメンバーは補体因子Ｈ関連タンパク質１であり、または補体因子Ｈ関連タンパク質１と補体因子Ｈの混合物であることである。
【００５２】
本発明のさらなる一実施態様は、インビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは補体因子Ｈ関連タンパク質１である。
【００５３】
本発明のさらなる一実施態様は、インビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは補体因子Ｈ関連タンパク質１および補体因子Ｈの組合せである。
【００５４】
本発明の特に好ましい一実施態様は、インビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは補体因子Ｈ関連タンパク質１と補体因子Ｈの比率である。
【００５５】
本発明の一実施態様は、さらにインビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは補体因子Ｈ関連タンパク質３および補体因子Ｈの組合せである。
【００５６】
本発明の一実施態様は、さらにインビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは補体因子Ｈ関連タンパク質３および補体因子Ｈの比率である。
【００５７】
本発明の一実施態様は、さらにインビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈ関連タンパク質３または補体因子Ｈ関連タンパク質１のいずれかと次の補体因子：補体因子Ｈ関連タンパク質２、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ａ、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ｂ、補体因子Ｈ関連タンパク質５および補体因子Ｈの一つとの組合せである。
【００５８】
本発明の一実施態様は、さらにインビトロの方法であり、ここでは補体因子Ｈファミリーメンバーは、補体因子Ｈ関連タンパク質３または補体因子Ｈ関連タンパク質１のいずれかと次の補体因子：補体因子Ｈ関連タンパク質２、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ａ、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ｂ、補体因子Ｈ関連タンパク質５および補体因子Ｈの一つとの比率である。
【００５９】
精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の応答を予測するための方法は、統合失調症、双極性障害、物質依存症、自閉症および強迫性障害（ОＣＤ））の陰性または陽性の症状を含む。
【００６０】
本発明の一実施態様は、患者が統合失調感情性障害を患っている場合の方法である。
【００６１】
本発明のさらなる一実施態様は、補体因子Ｈファミリーの個々のメンバーまたはそれらの混合物または組合せのタンパク質濃度がＥＬＩＳＡに基づく技術によって決定されることである。
【００６２】
本発明はさらに、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）であるグルタミン酸作動性経路を標的とする化合物で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の応答を予測するインビトロの方法を含み、ここでは補体因子Ｈファミリーの個々のメンバーまたはそれらの混合物または組合せのタンパク質濃度は、補体因子Ｈファミリーメンバーの遺伝子変異体を測定することによって決定される。
【００６３】
本発明はさらに、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の応答を予測するインビトロの方法を含み、ここではＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、ＣＦＨＲ１のコピー数変動の測定または欠失の代わりとしてのＳＮＰの測定によるかのいずれかによって、ＣＦＨＲ１の遺伝子変異体を測定することによって決定される。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様は、補体因子Ｈファミリーのタンパク質に特異的に結合する抗体の使用である。
【００６５】
インビトロの方法はＧＲＩ、すなわち［４−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イル）−ピペラジン−１−イル］−［５−メタンスルホニル−２−［［（２Ｓ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イル］オキシ］フェニル］メタノンの使用を含む。
【００６６】
本発明のさらなる実施態様は、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物（例えば、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ））で処置される患者のための予測マーカーとしての使用のための補体因子Ｈファミリーメンバーである。
【００６７】
本発明のさらなる実施態様は、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物（例えば、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ））で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の臨床的有用性の予測マーカーとしての補体因子Ｈファミリーメンバーの使用である。
【００６８】
本発明のさらなる実施態様は、グルタミン酸作動性経路を標的とする化合物（例えば、グリシン再取り込み阻害剤（ＧＲＩ））で処置される場合に、精神発達、神経または神経精神障害を持つ患者の臨床的有用性の予測マーカーとしての補体因子Ｈファミリーメンバーである。
【００６９】
本明細書で使用される用語「リファレンス試料」は、インビトロで評価の目的のために、処置から臨床的有用性が得られない、リファレンスグループの患者から提供される生物試料を指す。本明細書で使用される用語「リファレンス濃度」は、処置から臨床的有用性が得られない、リファレンスグループの患者で確立された値を指す。
【００７０】
本発明の方法に従った工程（ｉ）の測定結果がリファレンス濃度に比較されることは当業者において周知のことである。そのようなリファレンス濃度は、陰性リファレンス試料、陽性リファレンス試料、またはこれらのタイプのコントロールの一つ以上を含む混合リファレンス試料を用いて決定できる。
【００７１】
表現「リファレンス濃度に決定された濃度を比較する」は、当業者に自明であることをさらに説明するために単に使用される。リファレンス濃度はコントロール試料で確立される。コントロール試料は内部または外部コントロール試料であリ得る。一実施態様では、内部コントロール試料が使用される、すなわち前記のマーカーの濃度に変化がある場合に、マーカー濃度は試験試料および決定するために同じ被験体から採取された一つまたはそれ以上の試料において評価される。別の実施態様では、外部コントロール試料が使用される。外部コントロール試料のためには、個体から得られた試料中のマーカーの存在または量は、与えられた状況から苦しむことが知られている、あるいは危険性のあることが知られている個体；または与えられた状況がないと知られている個体、すなわち、“健常人”におけるその存在または量に比較される。例えば、患者試料におけるマーカー濃度は精神発達、神経または神経精神障害の特異過程と関連していると知られた濃度に比較できる。
【００７２】
通常、試料のマーカー濃度は直接的または間接的に診断に関連しており、マーカー濃度は例えば、個体が精神発達、神経または神経精神障害の危険性があるどうかを決定するために使用される。
【００７３】
代わりに、試料のマーカー濃度は例えば、統合失調症患者における治療に対する応答性、統合失調症の診断、統合失調症に対する適切な薬物の選択のためのガイダンス、疾患の進行の危険性の判断、または統合失調症患者のフォローアップに関連していると知られるマーカー濃度に比較されることができる。意図された診断使用によって、適切なコントロール試料が選ばれ、そしてマーカーのためのコントロールまたはリファレンス値がそこで確立される。一実施態様によるそのようなコントロール試料は、同年齢のおよび交絡する疾患を持たないリファレンス集団から得られることは当業者に理解されるであろう。当業者に明らかなように、コントロール試料中に確立された絶対マーカー値は使用されるアッセイに依存するであろう。好ましくは、適切なリファレンス集団からの１００の良く特徴づけられた個体からの試料はリファレンス値を確立するために使われる。同様に好ましくは、リファレンス集団は２０．３０，５０，２００，５００，または１０００の個体から成るように選ばれることができる。ＧＲＩ処置から臨床的有用性が得られない統合失調症患者はリファレンス値を確立するための好ましいリファレンス集団を表す。
【００７４】
ＧＲＩ処置から臨床的有用性が得られない統合失調症患者は、処置後彼らの症状において改善を示さないまたは軽度の改善のみを示す患者として定義できる。一実施態様において、症状において無改善または軽度の改善は、陽性および陰性症状スケール（Positive and Negative Symptom Scale）（ＰＡＮＳＳ）において２０％以下の変化として定義される。別の実施態様において、症状において無または軽度改善は、臨床全般印象スケール（ＣＧＩ）により、悪化症状、不変または軽度改善症状として定義される。
【００７５】
ＣＦＨファミリー遺伝子の特異遺伝子型を持つ統合失調症患者は、コントロール値を確立するための別の好ましいリファレンス集団を示す。一実施態様において、ＣＦＨＲ１およびＣＦＨＲ３のホモ接合欠失をもつ統合失調症患者は、リファレンス値を確立するための好ましいリファレンス集団を示す。別の実施態様において、ＣＦＨＲ１およびＣＦＨＲ３のホモ接合またはヘテロ接合欠失をもつ統合失調症患者は、リファレンス値を確立するための好ましいリファレンス集団を示す。
【００７６】
用語「測定」、「測定すること」または「決定すること」は、好ましくは、定性的、半定量的または定量的測定を含む。本発明において、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質またはそれらの混合物は体液試料中で測定される。好ましい実施態様では、測定は半定量的測定であり、すなわち補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質またはそれらの混合物の濃度がカットオフ値以上または以下であるかどうかが決定される。
【００７７】
コントロールグループまたはコントロール集団において決定されたように補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質またはそれらの混合物のための値は、例えば、カットオフ値またはリファレンス範囲を確立するために使用される。そのようなカットオフ値以上の値は、精神発達、神経または神経精神障害の処置における臨床的有用性の予測のための指標として考えられる。
【００７８】
一実施態様では、固定されたカットオフ値が確立される。そのようなカットオフ値は目的の診断上の疑問に適合するように選択される。
【００７９】
一実施態様では、カットオフ値は９０％の特異性を得るように設定され、また、好ましいカットオフ値は９５％の特異性を得るように設定され、または同様に好ましいカットオフ値は９８％の特異性を得るように設定される。
【００８０】
一実施態様では、カットオフ値は９０％の感度を得るように設定され、また、好ましいカットオフ値は９５％の感度を得るように設定され、または同様に好ましいカットオフ値は９８％の感度を得るように設定される。
【００８１】
一実施態様では、コントロールグループまたはコントロール集団において決定された補体因子Ｈファミリーのタンパク質の値は、リファレンス範囲を確立するために使用される。好ましい実施態様では、補体因子Ｈファミリーのタンパク質の濃度は、もし決定された値がリファレンス範囲の９０％百分位数以上であれば、上昇していると考えられる。さらに好ましい実施態様では、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質の濃度は、もし決定された値がリファレンス範囲の９５％百分位数、９６％百分位数、９７％百分位数または９７．５％百分位数以上であれば、増加していると考えられる。
【００８２】
カットオフ値以上の値は、例えば、精神発達、神経または神経精神障害の処置における増加した臨床的有用性のための指標であることができる。
【００８３】
さらに好ましい実施態様では、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質の測定は定量的測定である。さらなる実施態様では、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質の濃度は、精神発達、神経または神経精神障害の処置における上昇した臨床的有用性に相関する。
【００８４】
当業者が理解するように、任意のそのような評価はインビトロで行われる。試料（試験試料）はその後廃棄される。試料は本発明のインビトロ診断法のためにのみ使用され、試料の物質は患者の身体に戻されない。典型的には、試料は体液試料であり、例えば、血清、血漿、または全血である。本発明による方法は、個体から得られる液体または体液試料に、およびそのような試料中の補体因子Ｈファミリーメンバーまたはその混合物のタンパク質濃度のインビトロ決定に基づいている。本明細書で使用される“個体”は単一のヒトを指す。
【００８５】
好ましくは、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度は、特異結合剤の使用によって液体試料からインビトロで特異的に決定される。
【００８６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、当該発明が属する分野の通常の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００８７】
【表１】
2014527175.tif 000003
【００８８】
上記は、本出願で使用された用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する。
【００８９】
本発明によって記載されるそれぞれの遺伝子のタンパク質発現の検出のための技術は、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含むが、限定されるものではない。
【００９０】
本発明の実行は、特に示されない限り、分子生物学（リコンビナント技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術（それらは当業者に周知である）を使用する。そのような技術は下記の文献に十分に説明されている。
【００９１】
【表２】
2014527175.tif 000004
【００９２】
本発明による方法は、個体から得られる液体または体液試料に、および補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度のインビトロ決定に基づいている。本明細書で使用される“個体”は単一のヒトを指す。
【００９３】
本発明による好ましい実施態様において、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度が決定される。一実施態様において、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度は、特異結合剤の使用によって試料からインビトロで特異的に決定される。
【００９４】
特異結合剤は、例えば、補体因子Ｈファミリーメンバーの受容体、補体因子Ｈファミリーメンバーに結合するレクチン、補体因子Ｈファミリーメンバーに対する抗体、補体因子Ｈファミリーメンバーに対するペプチドボディ、二種特異性二重結合体または二種特異性抗体フォーマットである。特異結合剤は、対応する標的分子のために少なくとも１０７ｌ／モルの親和性をもつ。その特異結合剤は、その標的分子のために好ましくは１０８ｌ／モルの親和性または同様に１０９ｌ／モルの親和性が好まれる。
【００９５】
当業者が理解するように、用語「特異な」は、試料中に存在する他の生物分子は配列番号１の補体因子Ｈタンパク質配列または配列番号２〜７の補体因子Ｈ関連タンパク質１〜５のために特異的な結合剤に有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子より他の生物分子に結合する濃度は、それぞれ、標的分子に親和性の最大１０％のみもしくはそれ以下、５％のみもしくはそれ以下、２％のみもしくはそれ以下または１％のみもしくはそれ以下である結合親和性を生じる。好ましい特異結合剤は、親和性および特異性の両方について上記の最少基準を満たす。
【００９６】
特異結合剤の例は、ペプチド、ペプチド類似体、アプタマー、シュピーゲルマー、ダルピン（darpins）、アンキリンリピートタンパク質（ankyrin repeat proteins）、Ｋｕｎｉｔｚタイプドメイン（Kunitz type domains）、抗体、単一ドメイン抗体［６］および抗体の一価のフラグメントである。
【００９７】
ある好ましい実施態様では、特異結合剤はポリペプチドである。
【００９８】
ある好ましい実施態様では、特異結合剤は抗体または一価の抗体フラグメント、好ましくはモノクロナール抗体由来の一価のフラグメントである。
【００９９】
本明細書記載の用語「抗体」は最も広い意味で使用され、そして具体的にはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二種特異性抗体）、およびそれらが望ましい生物活性を表す限りにおいて抗体フラグメントを包含する。ある好ましい実施態様において、特異結合剤は抗体または一価の抗体フラグメント、好ましくはモノクロナール抗体由来の一価のフラグメントである。
【０１００】
好ましくは、特異結合剤は、補体因子Ｈファミリーのメンバーまたはそれらの組合せ、（例えば、補体因子Ｈ（配列番号１）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（配列番号２）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（配列番号３）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（配列番号４）、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ａ（配列番号５）、補体因子Ｈ関連タンパク質４Ｂ（配列番号６）、補体因子Ｈ関連タンパク質５（配列番号７）、直鎖状エピトープまたは立体エピトープのいずれか）と反応する抗体または抗体のセットである。
【０１０１】
今や、当業者が理解できるように、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度は、精神発達、神経または神経精神障害の処置の臨床的有用性の評価に有用であるマーカーとして同定された。
【０１０２】
補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質濃度の測定のために、個体から得られた試料は、結合剤と補体因子Ｈファミリーメンバーの間の複合体の形成のために適切な条件下で、補体因子Ｈファミリーメンバーのための特異結合剤とインビトロでインキュベートされる。当業者はそのような適切なインキュベーション条件をいかなる発明的努力もなしに容易に同定することができるので、そのような条件は具体化される必要はない。結合剤と補体因子Ｈファミリーメンバーの間の複合体の量は、例えば、上記のような酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で決定される［７］。
【０１０３】
イムノアッセイは当業者に周知である。そのようなアッセイを実施するための方法、ならびに実際の適用および操作法は関連の教科書に要約されている。関連教科書の例は
【表３】
2014527175.tif 000005
である。
【０１０４】
このアッセイフォーマットを用いて、患者からの試料は、処置によって患者のための臨床的有用性を評価するために使用できる。結果は、この出願の実施例の部分に表される。
【０１０５】
実施例
本発明は下記の実施例にさらに記載され、それは説明としてのみ示され、発明の範囲を制限するものでない。
【０１０６】
第２相のＧＲＩ統合失調症試験の患者および試験計画
第ＩＩ相試験は、顕著な陰性症状を伴う統合失調症の成人で実施された。個体は臨床的に安定でおよび第二世代の抗精神病薬で安定した処置を受けていた。試験は、優良臨床実施基準（Good Clinical Practice）(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00616798)のためのＩＣＨガイドラインに従ってブラジル、フランス、ドイツ、ハンガリー、日本、メキシコ、ポーランド、ロシアおよび米国における複数の場所で実施された。試験のプロトコールは、それぞれの国の医療当局および各地のそれぞれの倫理委員会によって認可された。３２３人の患者すべてがその試験に参加するための書面による同意書を提出し、そして２２４人の患者は診査のバイオマーカー分析のための血清試料の採集と使用に同意した。スクリーニングおよび４週導入期間の後、患者は８週の継続期間、一日一回投与されるプラセボ、ＧＲＩの１０mg、３０mg、または６０mgで無作為に二重盲検で付加処置され、４週の追求期間が続いた。
【０１０７】
第２相ＧＲＩ統合失調症試験の評価基準
患者は、週−２、ベースライン、週１，２，４，６，８，１０および１２のスクリーニングで評価された。評価は、ＰＡＮＳＳ、臨床全般印象（Clinical Global Impression）−病気の重症度（ＣＧＩ−Ｓ）および全般精神病理学５６のための臨床全般印象−グローバル改善（Global Improvement）(ＣＧＩ−Ｉ)、陰性症状５７のみの評価のための 陰性症状のＣＧＩ−ＳおよびＣＧＩ−Ｉ(ＣＧＩ−Ｓ−Ｎ、ＣＧＩ−Ｉ−Ｎ)、ならびに錐体外路症状の標準試験（BAS58, SAS59, AIMS60）を含んだ。陰性症状における効果を評価する主要有効変数は、ＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコア６４におけるベースラインからの変化であった。副次的有効変数はｉ）ＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアにおけるベースラインからの≧ ２０％変化として定義された陰性症状における、臨床応答を示す患者の割合およびｉｉ）ＣＧＩ−Ｉ−Ｎであった。追加の分析は、ＰＡＮＳＳ全スコア、残るＰＡＮＳＳ因子スコア６４ＣＧＩ−ＳおよびＣＧＩ−Ｉにおける変化を含んた。
【０１０８】
血清試料の調製
血清試料は、診査のバイオマーカー分析のための血清試料の採集と使用に書面同意を提出した患者からベースラインでおよび処置後８週で採取された。試料は、ＥＤＴＡなしのプレインチューブに採取され、約３０分間あるいは室温で凝固するまで静置した。血液採取の６０分以内に試料は遠心器に移し、４℃で（または冷蔵遠心分離器が使用できない場合は室温で）１０分間１５００ｇで遠心分離した。遠心分離後直ちに、上清（すなわち血清）を新しく予めラベルされたチューブに移し、−７０度で保存した。
【０１０９】
第２相ＧＲＩ統合失調症試験からの患者のＣＦＨ濃度の決定と結果
ベースラインの血清試料は、Rules Based Medicine (Austin Texas)によって提供されたLuminex based multiplex ELISA Human Discovery Map(登録商標) v 1.0 で分析された。第ＩＩ相試験からの凍結血清試料は無作為に、盲検下で、そして１８９個のタンパク質分析物の分析のためにRules Based Medicineにドライアイス上で輸送された。タンパク質バイオマーカー測定は一つのバッチで実施され、結果は測定単位（例えば、ng／mL）で報告された。
【０１１０】
測定値は、それらが標準検量線内にあれば、報告された。検量曲線外の値は、検量限界を用いて表された。１８９個の測定されたタンパク質分析物の内、２６個が患者試料の７０％以上で最も低い目盛りより低い測定値を報告した。これらの分析物は分析から取り除いた。２個の関連分析物（プローインスリンおよびインスリン）の測定は、それらは高度に関連した測定値を示したので平均してまとめた。前もってのプロセシングの後、１６２個のタンパク質分析物が分析データセットに残った。
【０１１１】
バイオマーカーサブグループの人口統計、ベースラインの精神病理および機能  対  第２相ＧＲＩ統合失調症試験の総合試験コホート
第２相のＧＲＩ統合失調症試験の３２３人の患者の内２２４人は、バイオマーカーの探索分析のための血清試料の採集と使用に同意した。バイオマーカーのサブグループは全試験コホートを代表する。
【０１１２】
応答予測のためのバイオマーカー候補の同定
全体として臨床試験において、主要評価項目はＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアにおけるベースラインからの変化であった［８］。この分析の応答変数は、ベースラインと週８との間のＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアにおける変化であった。応答予測のためのバイオマーカーの同定のために、ＲＢＭにより測定されるようなタンパク質分析物は次のように分析された：この分析のための唯一の説明変数は個々のタンパク質のベースラインの測定であり、その分析はＰＰ（プロトコール当り）集団を使ってプールされた１０mgおよび３０mgのバイオマーカー集団で実施された。各タンパク質マーカー候補のために、ＰＡＮＳＳにおける変化がタンパク質測定に無関連であるという帰無仮説が、試験統計としてロバスト線形型のＲ^２を用いて試験された。帰無仮説は、複数試験のための修正と平行して、すべての分析されたタンパク質マーカーのために試験された。表１は、もっとも良い実施マーカーとしてランク付けされる“補体因子Ｈ”と呼ばれる分析物を表すが、しかし、複数試験による調整の後には、それは統計学的有意性を与えなかった。
【０１１３】
臨床試験における副次評価項目として、ベースラインと週８の評価の間の陰性症状の臨床全体印象（ＣＧＩ）改善が用いられた。この評価項目は２値変数として取り扱われた。正のグループは、“著明改善”および“中程度改善”スコアからなり、負のグループは、“軽度改善”、“不変”“軽度悪化”、“中程度悪化”および“著明悪化”からなった。分析は、パープロトコル（ＰＰ）集団を用いて、組合されたプラセボ、１０mgおよび３０mgのバイオマーカー集団で実施された。この分析の説明変数は、すべての測定されたタンパク質のベースライン測定、処置（プラセボ、またはプールされた１０mg／３０mg処置）および処置−タンパク質相互作用である。ロジスティック回帰モデルが予測因子として使用された。
【０１１４】
この分析に基づいて、マーカーは、１０mg／３０mg処置群でＣＧＩにおける改善なしの患者から改善ありの患者を区別するためにそれらの能力によって階級化された。
【０１１５】
ＲＢＭパネル内の“補体因子Ｈ”と呼ばれる分析物は、０．００６の調整ｐ値で複数試験のための補正後、統計的有意性に到達する唯一のマーカーとして同定された（表１を参照）。
【０１１６】
臨床的効果を予測する血清“補体因子Ｈ”ベースラインレベルの能力は、人口統計学的および臨床的共変数（ベースラインＰＡＮＳＳを含む）とは独立しており、異った処置群の間で“補体因子Ｈ”ベースライン血清濃度における有意差はなかった。“補体因子Ｈ”はプラセボグループにおける応答（ＰＡＮＳＳまたはＣＧＩ−Ｉ）と相関を示さなかった。
【０１１７】
ＲＢＭアッセイにおいて使用される抗体のさらなる特徴付けは、キャプチャー抗体と検出抗体の両方がＣＦＨの少なくとも３つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲｓ）内で結合することを明らかにした。この領域は補体因子Ｈ関連タンパク質１に高度に相同性をもつ（ＣＦＨＲ１：ＳＣＲ１８、ＳＣＲ１９およびＳＣＲ２０は、ＣＦＨＲ１のＳＣＲ３、ＳＣＲ４、およびＳＣＲ５と、それぞれ１００％、１００％および９７％の同一性を共有する）［４］。
【０１１８】
ヒトのＣＦＨおよびＣＦＨＲ１タンパク質は血清から単離されて精製された。ＲＢＭアッセイにおける両方のタンパク質の特徴付けは、ＣＦＨＲ１はＣＦＨよりＣＦＨＲ１にとって10倍の優先度で認識されることを表した。
【０１１９】
ＣＦＨＲ１−特異アッセイのために使用された抗体
ＣＦＨＲ１−特異アッセイの開発のために次のモノクロナール抗体が使用された：ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３（供給者：Thermo Scientific, カタログ番号: GAU 020-03-02）およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７（供給者: R&D-systems, カタログ番号: MAB4247）。
【０１２０】
モノクロナールＬ２０／３  Ｆａｂ−フラグメントのビオチン化、化学量論１：１．３
モノクロナールマウスＩｇＧ（クローン：Ｌ２０／３；供給者：Thermo Scientific, , カタログ番号: GAU 020-03-02）は、Ｆａｂ−フラグメントを作るためにパパイン（３mU／mgＩｇＧ）を使って消化された。消化されたＦｃ−フラグメントはＤＡＥ−セファロースによるクロマトグラフィーによって取り除かれた。残りのＦｃのＦｃγ−吸着によるＦａｂの精製はセファデックス２００分子篩によって続いた。
【０１２１】
１００mM  ＫＰО４、ｐＨ８．５中に１０mg／mLのＬ２０／３−Ｆａｂフラグメントの溶液に、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＤＭＳО中３．６mg／mL）の５０μLをmL当り加えた。室温で４５分の後、試料は１００mM  ＫＰО４、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して透析し、凍結した。
【０１２２】
モノクロナール４４２１２７ＩｇＧのルテニル化、化学量論１：３
１００mM  ＫＰО４、ｐＨ８．５中に５mg／mLのモノクロナールマウスＩｇＧ（クローン４４２１２７、供給者: R&D-systems, カタログ番号:ＭＡＢ４２４７）の溶液に１２５μgのルテニュウム−（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣО−Оｓｕを加えた。室温で７５分後、ルテニル化は１０mM  リシンを添加して停止した。凝集物の分離のために、試料の適切な分画はセファデックス２００分子篩クロマトグラフィーから回収された。
【０１２３】
ヒト血清からＣＦＨＲ１の精製
検量物質としての使用のために、天然のＣＦＨＲ１はＣＦＨおよびＣＦＨＲ１に特異的なモノクロナール抗体Ｌ２０／３を用いる免疫吸着によって、ヒト血清から次の操作法によって精製された：ＭＡＢ  Ｌ２０／３＜ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１＞Ｍ−ＩｇＧ−スフェロシル樹脂がヒト血清からのＣＦＨＲ１の精製のために用いられる。前もって希釈された（５０mM  トリスＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に１：４）血清はSartoclean CA (０．８μm)およびSartobran P (０．２μm)フィルターキャップを通過させた。カラムに充填された前処置された血清は、洗浄され（１０mMトリスＨＣｌ、５００mMＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５で）、Ｑ−セファロースに展開緩衝液によって続けられ、分析物と吸着剤の分解を避けるために穏和な溶出緩衝液（Thermo Scientific）で溶出された。共結合したＣＦＨＲ１およびＣＦＨの分離のために、免疫吸着剤からの溶出液はサイズ依存の溶出のためにモノＱカラムを通した。ＣＦＨＲ１を含む溶出液ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で異った高さに泳動する共精製されたタンパク質は、さらにモノＳカラムにおける等電性のために分離されて、純粋なＣＦＨＲ１の分画が得られる。純粋なＣＦＨＲ１は、血清ＣＦＨＲ１値のためのElecsys-ECLIA試験におけるＣＦＨＲ１の決定のための検量物質として適用される。
【０１２４】
ＥＣＬＩＡ  イムノアッセイを用いてヒト血清または血漿試料におけるＣＦＨＲ１の測定
ＣＦＨＲ１のためのＥＣＬＩＡ  イムノアッセイは、Elecsys(登録商標)アナライザーを用いて、ヒト血清または血漿試料におけるＣＦＨＲ１の特異測定のために開発された。
【０１２５】
Elecsys(登録商標)アナライザーを用いるＣＦＨＲ１の測定のためアッセイ手順を次に記述する。
【０１２６】
ElecsysＣＦＨＲ１イムノアッセイは、サンドイッチ原理を経て機能する電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）である。そのアッセイに含まれる二つの抗体がある−モノクロナール抗体Ｌ２０／３−Ｂｉ（キャプチャー抗体）のビオチン化Ｆａｂ−フラグメントおよびルテニル化モノクロナール抗−ＣＦＨＲ１抗体４４２１２７−Ｒｕ（検出抗体）、それらは試料中のＣＦＨＲ１とサンドイッチイムノアッセイ複合体を形成する。次にその複合体は固体相のストレプトアビジンコートのミクロ粒子に結合する。ミクロ粒子は電極の表面に磁気によって捕えられ、そして電極への電圧印加が化学発光放射を誘発し、それが読み取りのための光電子増倍管によって測定される。結果は計器特異検量曲線によって決定される。
【０１２７】
試料は、希釈剤（Roche Diluent MultiAssay for Elecsys Ref. No. 03609987-190）に１：４００で自動的に希釈される。アッセイプロトコール３が適用され、希釈試料の１０μLを反応緩衝液（Ｈｅｐｅｓ５０mM、ＮａＣｌ１５０mM；Thesit/Polidocanol０．１％；ＥＤＴＡ１mM；牛血清アルブミン０．５％）中に０．５μg／mLのルテニル化＜ＣＦＨＲ１＞−４４２１２７の８０μLと９分間予めインキュベーションの後、３０μLのミクロ粒子と反応緩衝液中に１．５μg／mLのビオチン化＜ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１＞−Ｌ２０／３の８０μLが加えられ、そしてさらに９分間インキュベーションされた。インキュベーションの間、ミクロ粒子に結合された抗体−分析物−抗体のサンドイッチが形成される。最終的に、ミクロ粒子はシグナル発生と読み取りのためにElecsysシステムの検出チャンバーに移される。検量のために、精製ＣＦＨＲ１の１：２希釈系列（１２５ng／mL、６２．５ng／mL、３１．２５ng／mL、１５．６３ng／mL、７．８１ng／mL、３．９ng／mL、１．９５ng／mL、０ng／mL）がMultiAssay Diluent中に調製される。検量曲線の式は、非線形最少二乗法カーブフィッティング（RCM-Rodbard）によって算出され、そしてシグナル読み取りを対応する濃度値に変換するために使用された。結果は各試料そのものの濃度を得るために前希釈ファクターで掛け算される。
【０１２８】
適用された抗体サンドイッチの交差反応性は、潜在的に交差反応する血清成分ＣＦＨ、ＣＦＨＬ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４およびＣＦＨＲ５の別個の濃度を測定することによって決定された。適用された抗体サンドイッチでは、ＣＦＨＬ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４およびＣＦＨＲ５のための交差反応性は決定されず、４．４％のＣＦＨのわずかな認識のみが決定された。
【０１２９】
第２相ＧＲＩ統合失調症試験からの血清試料の測定はＣＨＦＲ１内の自然のカットオフを同定する
ＣＦＨＲ１  ＥＣＬＩＡイムノアッセイで測定されたＣＦＨＲ１濃度は、ＣＦＨＲ１遺伝子の検出状況と相関するマルチモードの分布を表した。
【０１３０】
図１は、第ＩＩ相の血清試料中のＣＦＨＲ１濃度の分布を表す。
【０１３１】
三つのグループが同定された：
・８μg／mL以下のＣＦＨＲ１濃度を持ち、ＣＦＨＲ１のホモ接合欠失を伴うグループと相関し、したがってＣＦＨＲ１を発現していないグループ。測定されたシグナルは、ＣＦＨとＣＦＨＲ１  ＥＣＬＩＡイムノアッセイの残存する交差反応による。
【０１３２】
・８μg／mL以上および２８μg／mL以下のＣＦＨＲ１濃度を持つグループ。このグループはＣＦＨＲ１のためのヘテロ接合欠失を伴う。
【０１３３】
・２８μg／mL以上のＣＦＨＲ１値を持つグループ。このグループはＣＦＨＲ１のための欠失を伴わない。
【０１３４】
ＣＦＨＲ１は集団の約５〜１７％で欠損し、民族起源依存性である［５、９］。白色人種では、集団の約５％がホモ接合欠失を持ち、そして約４０％がヘテロ接合欠失を持つ。
【０１３５】
ＣＦＨＲ１自然カットオフを用いる患者階級化
図１に表された三つのグループのそれぞれのＣＦＨＲ１タンパク質濃度は、治療応答との相関について分析された。ホモ接合欠失を持つ患者においてＣＦＨＲ１は検出できない；残存するシグナルはＣＦＨとのアッセイの交差応答による。ＣＦＨＲ１のヘテロ接合欠失をもつ患者では、治療応答とＣＦＨＲ１タンパク質濃度の関連はなかった。ＣＦＨＲ１の欠損をもたない患者グループでは、より高いＣＦＨＲ１濃度がより高い治療応答と相関するという傾向があった。これは、ＧＲＩに対してより低い応答性と翻訳されるＣＦＨＲ１のヘテロ接合またはホモ接合欠失を伴って、応答率はＣＦＨＲ１の遺伝的状況によって実際に主に予測されることを示す。
【０１３６】
結果として、患者階級化のために、ＣＦＨＲ１に特異的なＥＣＬＩＡイムノアッセイを用いて２８μg／mLで同定されるＣＦＨＲ１ベースライン血清濃度の自然カットオフ（図１）が選択された。２８μg／mLに等しいまたはそれ以下のＣＦＨＲ１血清値をもつ患者は、“ＣＦＨＲ１−低”として階級化され、一方２８μg／mL以上のＣＦＨＲ１血清値をもつ患者は、“ＣＦＨＲ１−高”として階級化された。表２は、異った投与量グループ内での“ＣＦＨＲ１−高”および“ＣＦＨＲ１−低”患者の分布を表す。
【０１３７】
ＣＦＨＲ１−高（Ｎ＝７５）およびＣＦＨＲ１−低（Ｎ＝７５）のサブグループは主要評価項目で、および第ＩＩ相検査の選択された副次的評価項目で分析され、非階級化ＣＦＨＲ１血清試料ＰＰサブグループ（Ｎ＝１５０）に比較された。
【０１３８】
図２は、ベースラインを越えた時間からＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコア（ＰＡＮＳＳ  ＮＦＳ）における変化の分析を表す。すべての患者コホートのための結果は上段パネルに、中段パネルにＣＦＨＲ１−低患者のための結果、下段パネルにＣＦＨＲ１−高の患者のための結果が表されている。１０mg群では、ＣＦＨＲ１−高のグループにおける効果サイズは非階級化グループにおける−０．４２に比べて、−１．０１であり、３０mg群では、ＣＦＨＲ１−高のグループにおける効果サイズは非階級化グループにおける−０．４７に比べて、−０．７６であった。
【０１３９】
図３は、ＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコア応答者率における分析を表し、それは副次的臨床評価項目であった：処置の８週間後ＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアにおけるベースラインからの少なくとも２０％の減少をもつ患者は応答者と定義された：全血清サブグループにおけるすべての四つの処置群のための応答率は白色縞の背景バーで示され、ＣＦＨＲ１−高およびＣＦＨＲ１−低サブグループのためには灰色バーで示された。１０mg群では、ＣＦＨＲ１−高のグループにおける応答率は８８％で非階級グループにおける６９％に比較され、そして３０mg群では、ＣＦＨＲ１−高のグループにおける応答率は７８％で非階級グループにおける６６％に比較された。
【０１４０】
図４は、他の副次的臨床評価項目における分析、陰性症状応答者率の臨床全般印象（ＣＧＩ）を表す：ＣＧＩ応答者率の分析のために、“改善”または“著明改善”であった患者は応答者と定義された：全血清サブクラスにおけるすべての四つの処置群のための応答率は、白色縞の背景バーで示され、ＣＦＨＲ１−高およびＣＦＨＲ１−低サブグループのためには灰色バーで示されている。１０mg群では、ＣＦＨＲ１−高グループにおける応答率は６９％で、非階級化グループにおける３９％と比較され、そして３０mg群では、ＣＦＨＲ１−高のグループにおける応答率は６７％で非階級化グループにおける４５％に比較された。
【０１４１】
ＣＦＨ特異アッセイに使用された抗体
ＣＦＨＲ１−特異アッセイの開発のために次のモノクロナール抗体が用いられた：ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３（供給者；Thermo Scientific, カタログ番号: GAU 020-03-02）およびＭＡＢ＜ＣＦＨ＞ОＸ−２４ (供給者: Thermo Scientific, カタログ番号: MA1-70057)。
【０１４２】
ОＸ２４  ＩｇＧのルテニル化、化学量論１：３
１００mM  ＫＰО４、ｐＨ８．５中に５mg／mLのモノクロナールマウスＩｇＧ（クローンОＸ−２４、Thermo Scientific, カタログ番号: MA1-70057）の溶液に、１２５μgのルテニュウム−（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣО−Оｓｕが、そのＩｇＧ溶液に加えられた。室温で７５分後、ルテニル化は１０mM  リシンを添加して停止した。凝集物の分離のために、試料の適切な分画は、セファデックス２００分子篩クロマトグラフィーから回収された。
【０１４３】
ヒト血清からのＣＦＨの精製
リファレンス検量物質としての使用のために、天然のＣＦＨはＣＦＨおよびＣＦＨＲ１に特異的なモノクロナール抗体Ｌ２０／３を用いる免疫吸着によって、ヒト血清から次の操作法によって精製された：ＭＡＢ  Ｌ２０／３＜ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１＞Ｍ−ＩｇＧ−スフェロシル樹脂が精製のために用いられる。前もって希釈された（５０mMトリスＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に１：４）血清はSartoclean CA (０．８μm) およびSartobran P (０．２μm)フィルターキャップを通過させる。カラムに充填された前処置された血清は洗浄され（１０mMトリスＨＣｌ、５００mMＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５で）、Ｑ−セファロース展開緩衝液に続き、そして分析物と吸着剤の分解を避けるために穏和な溶出緩衝液（Thermo Scientific）で溶出された。共結合したＣＦＨＲ１の分離のために、免疫吸着剤からの溶出液はサイズ依存の溶出のためにモノＱカラムを通した。純粋なＣＦＨは、血清ＣＦＨ値のためのElecsys-ECLIAテストにおけるＣＦＨの決定のためのリファレンス検量物質として適用される。
【０１４４】
ＥＣＬＩＡイムノアッセイを用いてヒト血清または血漿試料におけるＣＦＨの測定
ＣＦＨのためのＥＣＬＩＡイムノアッセイは、ヒト血清または血漿試料におけるＣＦＨの特異測定のためにElecsys(登録商標)アナライザーを用いて開発されている。
【０１４５】
Elecsys(登録商標)アナライザーを用いるＣＦＨの測定のためアッセイ手順を次に記述する。
【０１４６】
ElecsysＣＦＨイムノアッセイは、サンドイッチ原理によって機能する電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）である。そのアッセイに含まれる二つの抗体がある−モノクロナール抗−ＣＦＨ抗体Ｌ２０／３−Ｂｉ（キャプチャー抗体）のビオチン化Ｆａｂ−フラグメントおよびルテニル化モノクロナール抗−ＣＦＨ抗体ОＸ−２４−Ｂｉ  Ｒｕ（検出抗体）、それらは試料中のＣＦＨとサンドイッチイムノアッセイ複合体を形成する。次にその複合体は固体相のストレプトアビジンコートのミクロ粒子に結合する。ミクロ粒子は電極の表面に磁気によって捕えられ、そして電極への電圧印加が化学発光放射を誘発し、それが読み取りのための光電子増倍管によって測定される。結果は２点補正および試薬のバーコードカーブ（barcodecurve）により与えられたマスター曲線によって作り出される計器特異検量曲線によって決定される。アッセイを実施するのに必要とされる合計時間は１８分である。
【０１４７】
試料は、Elecsysのためのマルチアッセイ希釈剤 （Roche 03609987-190）で１：４００に自動的に希釈される。適用されたアッセイプロトコール２に従って、反応緩衝液（Ｈｅｐｅｓ５０mM、ＮａＣｌ  １５０mM；Thesit/Polidocanol．０．１％；ＥＤＴＡ  １mM；牛血清アルブミン０．５％）中に、両方共に１．５μg／mLで、ビオチン化＜ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１＞−Ｌ２０／３の８０μLおよびルテニル化＜ＣＦＨ＞−ОＸ２４の８０μLが、試料の１０μLとインキュベーションされた。インキュベーションの間、ミクロ粒子に結合された抗体−分析物−抗体のサンドイッチが形成される。最終的に、そのミクロ粒子はシグナル発生と読み取りのためにElecsysシステムの検出チャンバーに移される。検量のために、精製されたＣＦＨの１：４希釈系列（１．２５μg／mL、３１２．５ng／mL、７８．１ng／mL、１９．５ng／mL、０ng／mL）（５００μg／mL、１２５μg／mL、３１．２５μg／mL、７．８１μg／mL、０μg／mL）がマルチアッセイ希釈剤中に調製される。検量線の方程式は、非線形最少二乗法カーブフィッティング（RCM-Rodbard）によって算出され、そしてシグナル読み取りを対応する濃度値に変換するために使用された。結果は各試料そのものの濃度を得るために前希釈ファクターで掛け算される。
【０１４８】
適用された抗体サンドイッチの交差応答性は、潜在的に交差応答する血清成分の別個の濃度を測定することによって決定された。適用された抗体サンドイッチでは２．９％の交差応答性がＣＦＨＲ１のために決定された。
【０１４９】
第ＩＩ相ＧＲＩ統合失調症試験からの血清試料中で測定されたＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比の測定は自然のカットオフを確認する
ＣＦＨＲ１濃度およびＣＦＨ濃度は、ＣＦＨＲ１およびＣＦＨ  ＥＣＬＩＡイムノアッセイで独立して測定され、ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比が計算された。図１で表されるように、ＣＦＨＲ１濃度単独と同様に、ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比は、ＣＦＨＲ１遺伝子の欠失状況と相関するマルチモードの分布を表した。
【０１５０】
図５は、第ＩＩ相の血清試料中のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比の分布を表す。三つのグループが同定された：
・０．０１以下のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比をもち、ＣＦＨＲ１のホモ接合欠失を伴うグループと相関し、したがってＣＦＨＲ１を発現していないグループ。測定された残りのシグナルは、ＣＦＨＲ１  ＥＣＬＩＡイムノアッセイのＣＦＨとの低交差応答による。
・０．０１以上および０．０８以上のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比を持つグループ。このグループはＣＦＨＲ１のためのヘテロ接合欠失を伴う。
・０．０８以上のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比を持つグループ。このグループはＣＦＨＲ１のための欠失を伴わない。
【０１５１】
ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比を用いる患者階級化
図５で表されるように、三つのグループのそれぞれ内のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比は処置応答性と関連して分析された。この目的のために、０．０１以下のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比は低（“Ｌ”）と呼ばれ、ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比が０．０１以上で０．０８以下は中間（“Ｍ”）と呼ばれ、ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比が０．０８以上を高（“Ｈ”）と呼ばれた。
【０１５２】
図６は、陰性症状応答者率の臨床全般印象（ＣＧＩ）における分析を表す：ＣＧＩ応答者率の分析のために“改善”または“著明改善”は応答者と定義された。全血清サブグループにおけるすべての四つの処置群のための応答率は白色縞の背景バーで示され、そしてＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比のためにサブグループＬ、ＭおよびＨを灰色バーで示した。Ｌグループのためには、応答率はプラセボ群並びに１０mgおよび３０mg群では０％であり、一方６０mg群では応答は１００％であった。Ｌグループは、小試料サイズからなり、従って結果は注意して解釈される必要がある。Ｍサブループについては、プラセボ群においては２４％であり、６０mg群では２５％である応答率は、非階級化グループ（網かけバー）（プラセボ群においては２０％であり、６０mg群では３４％）に匹敵した。しかしながら、１０mg群および３０mg群においてＭサブグループは１９％（１０mgについては）および２８％（３０mgについては）であり、非階級化グループの３９％（１０mgについては）および４５％（３０mgについては）の応答率に比べてより低い応答率を示した。Ｈサブグループはプラセボ群については２０％および６０mg群では３３％を表し、それらは、非階級化グループにおける比率（プラセボ群については２０％および６０mg群では３４％である）に匹敵する。両処置群において、１０mg群および３０mg群において、Ｈサブグループは増加した処置応答率：１０mg群での非階級化グループにおける３９％に比べて、Ｈサブグループでは６９％の応答率、および３０mg群での非階級化グループにおける４５％に比べて、Ｈサブグループでは６７％の応答率を表した。
【０１５３】
ＤＮＡ試料の調製
ＤＮＡ試料は、バイオマーカー探索分析のためのＤＮＡ試料の採取および使用に書面同意を与えた患者から集められた（３２０人の患者のうちの１７０人）。ＤＮＡ試料は全血として採取され、９mLＥＤＴＡチューブに採取され、そして−２０℃で保存された。ＤＮＡ試料は二重符合化および匿名化された。５０〜２００μL全血の試料から、ゲノムＤＮＡがRoche MagNA Pure 96 LC DNA Isolation System を用いて抽出された。ＤＮＡ単離の原理は磁気ビーズ技術に基づく。簡単に説明すると、最初に、試料をカオトロピック塩およびプロテイナーゼＫを含む緩衝液とインキュベーションして溶解する。次に、磁気ガラス粒子（ＭＧＰ）を加え、ＤＮＡはそれらの表面に結合する。非結合物質は数回の洗浄工程で取り除かれ、精製されたＤＮＡが溶出される。得られたＤＮＡは比色定量により５ng／μLの濃度に標準化された。
【０１５４】
ＣＦＨＲ１コピー数の決定のためのアッセイ
定量リアルタイムＰＣＲアッセイが染色体１：１９６７９６２５７−１９６７９６３８１（Genome Build 37, Assembly GRCh37による座標）における遺伝子位置におけるコピー数を決定するためにセットアップされた。オリゴヌクレオチド配列は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０で与えられている。蛍光プローブは５’末端に５’フルオレセインで修飾され、および３’末端に３’末端BlackHoleTM Dark Quencher-1で修飾された。
【０１５５】
ＣＦＨＲ１コピー数アッセイは、二倍体ゲノムで２コピーで存在することが知られている配列を検出する分離蛍光リポーターで標識されたアッセイを参考にして設定された。リファレンスアッセイとして、RNase P H1 RNAおよび hTERT 遺伝子のためにはTaqMan Copy Number Reference Assays (Life Technologies, Carlsbad, California)がそれぞれ用いられた。結果は、もしＲＮａｓｅＰおよびｈＴＥＲＴリファレンスアッセイのどちらかを用いて独立した二重セットアップから生じたＣＦＨＲ１コピー数が一致すれば、有効であると考えられた。
【０１５６】
ＰＣＲ反応は、０．９μMの最終濃度でＰＣＲオリゴヌクレオチドおよび０．２５μMの最終濃度でプローブオリゴヌクレオチドを含んだ。リアルタイムＰＣＲは、LightCyclerR 480 II real-time PCR システムおよび次のサイクルパラメーターを用いて行われた：１０分９５℃、４０ｘ［１５秒９５℃、１分６０℃］、１分４０℃。“絶対定量／第二デリバティブマックス（Absolute Quantitation/2nd Derivative Max）”計器設定を採用し、閾値サイクル（ＣＴ）値が計算された。比較相対定量分析△△ＣＴ［１０］を用いてＣＦＨＲ１標的配列のコピー数が算出された。
【０１５７】
ＣＦＨＲ１のコピー数のための外部リファレンスとして、細胞株ＮＡ０７０００（Coriell Institute for Medical Research, Camden, New Jersey）からのＤＮＡが用いられ、それはＣＦＨＲ３−１欠損内の位置で２コピーを保有することが記載されている［１１］。アッセイは、ＣＦＨＲ３−ＣＦＨＲ１遺伝子座で１または０コピーを保有するように記載されている複数の細胞株で試験され［１１］、そしてアッセイの特異性が確認された。
【０１５８】
ｒｓ７５４２２３５の測定のためのアッセイ
ＤＮＡ試料は、製造手順に従って、ヒト１Ｍ−デュオビーズチップ（ｖ．３）（Illuminaから）を用いて遺伝子型を同定した。次に試料はＳＮＰｒｓ７５４２２３５のために分析された。
【０１５９】
一塩基多型ｒｓ７５４２２３５に対するＣＦＨＲ１コピー数の相関
遺伝子座Ｃｈｒ１：１９６８２３６１３（Genome Build 37, Assembly GRCh37）に位置した一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ７５４２２３５、は共通のＣＦＨＲ１−ＣＦＨＲ３欠失の代わりとして記載されている［１２］。この関連はヨーロッパ系民族の個体にとって非常に高く（ｒ２＝１．００）、しかし他の民族群にとってはそれほど密接ではないことが示されている［５９］。
【０１６０】
表３は、ＳＮＰｒｓ７５４２２３５対立遺伝子とカスタマイズドコピー数多型アッセイの相関を表す：文献と一致して、主なＡ／Ａ対立遺伝子は二つのＣＦＨＲ１コピーをタグし（ＣＦＨＲ１＋／＋を示す）、対立遺伝子Ａ／Ｇは一つＣＦＨＲ１コピーをタグし（ＣＦＨＲ１＋／−を示す）、そしてマイナーな対立遺伝子Ｇ／Ｇは０のＣＦＨＲ１コピーをタグする（ＣＦＨＲ１−／−を示す）。
【０１６１】
注目すべきは、ＣＦＨＲ１−／−およびｒｓ７５４２２３５Ａ／Ａ対立遺伝子をもつ両試料はブラック、非ヒスパニック民族の出であり、およびＣＦＨＲ１＋／−およびｒｓ７５４２２３５Ａ／Ａ対立遺伝子をもつ患者の５人のうち４人は非ヨーロッパ系民族の出である。
【０１６２】
ＣＦＨＲ１タンパク質濃度とＣＦＨＲ１コピー数の相関
図７は、遺伝的ＣＦＨＲ１状況に対するＲＢＭアッセイを用いて測定されたタンパク質濃度のボックスプロット（主にＣＦＨＲ１を検出）を表す：ＣＦＨＲ１＋／＋遺伝的状況は高いＣＦＨＲ１血清濃度と相関し、ＣＦＨＲ１＋／−遺伝的状況はより低いＣＦＨＲ１血清濃度と相関し、ＣＦＨＲ１−／−遺伝的状況は最も低いタンパク質シグナル（アッセイのＣＦＨとの交差反応により生じた）と相関する。
【０１６３】
ＣＦＨＲ１タンパク質濃度に対するＳＮＰｒｓ７５４２２３５の相関
図８は、ＮＰｒｓ７５４２２３５の対立遺伝子状況に対するＲＢＭアッセイを用いて測定されたタンパク質濃度（主にＣＦＨＲ１を検出）のボックスプロットを表す：ｒｓ７５４２２３５対立遺伝子Ａ／Ａは高いＣＦＨＲ１血清濃度と相関し、ｒｓ７５４２２３５対立遺伝子Ａ／Ｇはより低いＣＦＨＲ１血清濃度と相関し、ｒｓ７５４２２３５対立遺伝子Ａ／Ａは最も低いタンパク質シグナル（アッセイのＣＦＨとの交差反応により生じた）と相関する。
【０１６４】
ＣＦＨＲ１遺伝子分析を用いた患者階級化
図９は、陰性応答者率の臨床全体インプレッション（ＣＧＩ）における分析を表す：ＣＧＩ応答者率の分析のために“改善”または“著明改善”であった患者は応答者として定義された：ＤＮＡ試料のために同意した患者のための応答率は白色縞の背景バーとして表され、ＣＦＨＲ１遺伝的状況は灰色バーで表されている。１０mg群のためには、ＣＦＨＲ１＋／＋グループは５７％であり非階級化グループにおける３９％と比較され、３０mg群のためには、ＣＦＨＲ１＋／＋グループは６７％であり非階級化グループにおける４６％と比較された。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】第ＩＩ相血清ベースライン試料におけるＣＦＨＲ１濃度のヒストグラム。三つの曲線はクラスターアルゴリズム（混合正規分布）からの確率密度推量を表す。クラスター分析はＣＦＨＲ１発現の遺伝的状況に基づいた三つの異った濃度グループを想定した。二つの自然カットオフはＣＦＨＲ１  ＥＣＬＩＡイムノアッセイを用いて同定できる：８μg／mLおよび２８μg／mLにおいて。２８μg／mLカットオフ（矢印で印された）は、ＣＦＨＲ１ヘテロ接合またはホモ接合欠失を伴う患者を、欠失を伴わない患者から分離して、患者階級化のために用いた。
【図２Ａ】ＣＦＨＲ１のための自然カットオフを用いて、すべての患者（上段パネル）におけるベースラインからのＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアの変化。血清濃度≦２８μg／mLをもつ患者はＣＦＨＲ１−低として、および血清濃度＞２８μg／mLをもつ患者はＣＦＨＲ１−高として分類された。ＭＭＲＭ分析からの期待された応答および標準偏差バーの評価。鎖線および丸印はプラセボ；実線および四角印は１０mgＧＲＩ；実線および上向き三角印は３０mgＧＲＩ；点線および菱形印は６０mgＧＲＩ。
【図２Ｂ】ＣＦＨＲ１のための自然カットオフを用いて、ＣＦＨＲ１−低患者（中段パネル）におけるベースラインからのＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアの変化。血清濃度≦２８μg／mLをもつ患者はＣＦＨＲ１−低として、および血清濃度＞２８μg／mLをもつ患者はＣＦＨＲ１−高として分類された。ＭＭＲＭ分析からの期待された応答および標準偏差バーの評価。鎖線および丸印はプラセボ；実線および四角印は１０mgＧＲＩ；実線および上向き三角印は３０mgＧＲＩ；点線および菱形印は６０mgＧＲＩ。
【図２Ｃ】ＣＦＨＲ１のための自然カットオフを用いて、ＣＦＨＲ１−高患者（下段パネル）におけるベースラインからのＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアの変化。血清濃度≦２８μg／mLをもつ患者はＣＦＨＲ１−低として、および血清濃度＞２８μg／mLをもつ患者はＣＦＨＲ１−高として分類された。ＭＭＲＭ分析からの期待された応答および標準偏差バーの評価。鎖線および丸印はプラセボ；実線および四角印は１０mgＧＲＩ；実線および上向き三角印は３０mgＧＲＩ；点線および菱形印は６０mgＧＲＩ。
【図３】週８における二分ＰＡＮＳＳ陰性症状因子スコアの応答率（ベースラインから≧２０％減少として定義された応答）。網かけ背景バーは、プロトコール人口当り全体における応答率である。実線灰色バーは、ＣＦＨＲ１のための自然カットオフを用いたＣＦＨＲ１階級化サブ人口における応答率である。
【図４】週８における二分ＣＧＩ−Ｉ陰性症状率スコア（“中程度改善”または“著明改善”と定義された応答）の応答率。網かけ背景バーはプロトコール人口当りの全体における応答率である。実線灰色バーは、ＣＦＨＲ１のための自然カットオフを用いたＣＦＨＲ１階級化サブ人口における応答率である。
【図５】第ＩＩ相血清ベースライン試料におけるＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比の分布のヒストグラム。三つの曲線はクラスターアルゴリズムからの確率密度推量（混合正規分布）を表す。クラスター分析は、ＣＦＨＲ１発現の遺伝的状況に基づいた三つの異った濃度のグループを想定した。二つの自然カットオフ：０．０１および０．０８は、ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比（ＥＣＬＩＡアッセイにより測定）を用いて同定できる。０．０１以下のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比をもつ試料は、ＣＦＨＲ１ホモ接合欠失の指標であり、０．０１以上および０．０８以下のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比をもつ試料は、ＣＦＨＲ１ヘテロ接合欠損の指標として、および０．０８以上のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比をもつ試料はＣＦＨＲ１欠損をもたない指標である。
【図６】週８における二分ＣＧＩ−Ｉ陰性症状率スコア（“中程度改善”または“著明改善”と定義された応答）の応答率。網かけ背景バーはプロトコール人口当りの全体における応答率である。実線灰色バーは、ＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比（０．０１以下のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比に相当するＬ（低）、０．０１以上０．０８以下のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比に相当するＭ（中）、０．０８以上のＣＦＨＲ１／ＣＦＨ比に相当するＨ（高）による）を用いたＣＦＨＲ１階級化サブ人口における応答率である。
【図７】ＲＢＭアッセイ（比率１０：１でＣＦＨＲ１:ＣＦＨを認識する）を用いたＣＦＨＲ１タンパク質濃度に対するＣＦＨＲ１遺伝子のための遺伝的状況。
【図８】ＲＢＭアッセイ（比率１０：１でＣＦＨＲ１:ＣＦＨを認識する）を用いたＣＦＨＲ１タンパク質濃度に対するＳＮＰｒｓ７５４２２３５の対立遺伝子状況。
【図９】週８における二分ＣＧＩ−Ｉ陰性症状率スコア（“中程度改善”または“著明改善”と定義された応答）の応答率。網かけ背景バーは、ＤＮＡ試料に同意したヒトからのプロトコール人口当りの全体における応答率である。実線灰色バーは、ＣＦＨＲ１対立遺伝子の遺伝的状況を用いたＣＦＨＲ１階級化サブ人口における応答率である。
【０１６６】
配列の説明（配列番号）：
配列番号１：  ヒト補体因子Ｈのタンパク質配列を表す。
配列番号２：  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質ＣＦＨＲ１のタンパク質配列を表す。
配列番号３：  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質ＣＦＨＲ２のタンパク質配列を表す。
配列番号４：  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質ＣＦＨＲ３のタンパク質配列を表す。
配列番号５：  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質ＣＦＨＲ４Ａのタンパク質配列を表す。
配列番号６：  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質ＣＦＨＲ４Ｂのタンパク質配列を表す。
配列番号７：  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質ＣＦＨＲ５のタンパク質配列を表す。
配列番号８：  カスタマイズドＣＦＨＲ１コピー数アッセイにおいて用いられた順方向プライマーのオリゴヌクレオチド配列を表す。
配列番号９：  カスタマイズドＣＦＨＲ１コピー数アッセイにおいて用いられた逆方向プライマーのオリゴヌクレオチド配列を表す。
配列番号１０：  カスタマイズドＣＦＨＲ１コピー数アッセイにおいて用いられたプローブのオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０１６７】
【表４】
2014527175.tif 000006
【０１６８】
【表５】
2014527175.tif 000007
ＣＦＨＲ１−低はベースラインのＣＦＨＲ１血清濃度≦２８μg／mgをもつ患者であり、
ＣＦＨＲ１−高グループはベースラインのＣＦＨＲ１血清濃度＞２８μg／mgをもつ患者である。
ＣＦＨＲ１はＥＣＬＩＡ  ＣＦＨＲ１アッセイを用いて決定された。
【０１６９】
【表６】
2014527175.tif 000008
【０１７０】
【表７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2014527175.tif 000012
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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