(57)【要約】  ここに記載の主題事項は、オートファジーの阻害剤である薬剤と組合せて、キナーゼ阻害剤であり、オートファジー誘導剤でもある薬剤を用いて、腫瘍を治療する薬剤及び方法に関する。
2014507129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腫瘍を治療する方法であって、(ｉ)オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤と(ｉｉ)オートファジー阻害剤との組み合わせを該腫瘍の治療に有効な量、投与することを含む方法。
【請求項２】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤と前記オートファジー阻害剤が相乗的な有効量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オートファジー阻害剤がｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オートファジー阻害剤が、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ１、又はオートファジー(Ａｔｇ)遺伝子の発現又は機能を阻害する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａｔｇ遺伝子が、Ａｔｇ１、Ａｔｇ４、Ａｔｇ８、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７又はＡｔｇ１２である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オートファジー阻害剤がオートファジーの誘導、隔離、融合又は分解相の阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オートファジー阻害剤がオートファジーの誘導相の阻害剤である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オートファジー阻害剤が３-メチルアデニンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オートファジー阻害剤が、オートファジーの分解又は融合相の阻害剤である請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記オートファジーの分解相の阻害剤がリソソーム作用剤である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リソソーム作用剤が抗寄生虫剤である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗寄生虫剤がクロロキン、ヒドロキシヒドロキノン又はスラミンである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リソソーム作用剤が液胞型プロトンＡＴＰアーゼ阻害剤である請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記液胞型プロトンＡＴＰアーゼ阻害剤がバフィロマイシンＡ１である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リソソーム作用剤が循環系に作用する薬剤である請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤がアミオダロン又はペルヘキシレンである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リソソーム作用剤が細胞傷害剤である請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞傷害剤がビンブラスチンである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リソソーム作用剤が、脂質代謝に影響を与える薬剤、抗生物質又はホルモンである請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記ホルモンがグルカゴン又はエストラジオールである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗生物質がモネンシンである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リソソーム作用剤が、塩化アンモニウム、ｃＡＭＰ又はメチルアミンである請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤が、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１及びｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤が、Ａｋｔ又はＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤がＡｋｔキナーゼ阻害剤である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記オートファジー阻害剤がオートファジーの分解又は融合相の阻害剤である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記オートファジーの分解又は融合相の阻害剤がリソソーム作用剤である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ａｋｔキナーゼ阻害剤がパンＡｋｔ阻害剤である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ａｋｔキナーゼ阻害剤が、Ａｋｔ-１、Ａｋｔ-２又はＡｋｔ-３選択的阻害剤である請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ａｋｔキナーゼ阻害剤が、Ａｋｔ-１及びＡｋｔ-２の阻害剤である請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ａｋｔキナーゼ阻害剤がアロステリックＡｋｔ阻害剤である請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ａｋｔキナーゼ阻害剤が、次の式Ｉ：
2014507129.tif 000063
[上式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ及びＣＦ３であり；
Ｒ２は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｒ５は、Ｈ又はＭｅであり；
Ａは
2014507129.tif 000064
であり、
Ｇは、ハロゲンで置換されていてもよい５−６員のヘテロアリール、又は１ないし４のＲ９基で置換されていてもよいフェニルであり；
Ｒ６及びＲ７は独立して、Ｈ、ＯＣＨ３、(Ｃ３-Ｃ６シクロアルキル)-(ＣＨ２)、(Ｃ３-Ｃ６シクロアルキル)-(ＣＨ２ＣＨ２)、Ｖが５−６員のヘテロアリールであるＶ-(ＣＨ２)０-１、ＷがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、ＣＦ３又はＭｅで置換されていてもよいフェニルであるＷ-(ＣＨ２)１-２、Ｃ１-Ｃ３アルキル又はＯ(Ｃ１-Ｃ３アルキル)で置換されていてもよいＣ３-Ｃ６-シクロアルキル、ヒドロキシ-(Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル)、フルオロ-(Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル)、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＨ)フェニル、Ｆ、ＯＨ、Ｃ１-Ｃ３アルキル、シクロプロピルメチル又はＣ(＝Ｏ)(Ｃ１-Ｃ３アルキル)で置換されていてもよい４-６員の複素環、又はＯＨ、オキソ、Ｏ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＮ、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｎ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２、シクロプロピル、フェニル、イミダゾリル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、オキセタニル又はテトラヒドロピラニルから独立して選択される一又は複数の基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６-アルキルであり、又はＲ６及びＲ７はそれらが結合している窒素と共同して、ＯＨ、ハロゲン、オキソ、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｏ(Ｃ１-Ｃ３アルキル)、Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ(Ｍｅ)２、Ｓ(Ｏ)２ＣＨ３、シクロプロピルメチル及びＣ１-Ｃ３アルキルから独立して選択される一又は複数の基で置換されていてもよい４-７員の複素環式環を形成し；
Ｒａ及びＲｂはＨであり、
又はＲａはＨであり、Ｒｂ及びＲ６はそれらが結合している原子と共同して、１又は２の環窒素原子を有する５−６員の複素環式環を形成し；
Ｒｃ及びＲｄはＨ又はＭｅであり、
又はＲｃ及びＲｄはそれらが結合している原子と共同してシクロプロピル環を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｍｅ、Ｆ又はＯＨであり、
又はＲ８及びＲ６はそれらが結合している原子と共同して、１又は２の環窒素原子を有する５−６員の複素環式環を形成し；
各Ｒ９は独立して、ハロゲン、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル、Ｏ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｓ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＮ、ＯＣＨ２-フェニル、ＣＨ２Ｏ-フェニル、ＮＨ２、ＮＨ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｎ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２、ピペリジン、ピロリジン、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＯＣＨ２Ｆ、ＯＣＨＦ２、ＯＨ、ＳＯ２(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ２、Ｃ(Ｏ)ＮＨ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、及びＣ(Ｏ)Ｎ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２であり；
Ｒ１０はＨ又はＭｅであり；
ｍ、ｎ及びｐは独立して０又は１である]
の化合物、その互変変異体、分離したエナンチオマー、分離したジアステレオマー、溶媒和物、及び塩である請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍が肉腫である請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍が癌腫である請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍が扁平上皮癌である請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍が腺腫又は腺癌である請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、陰茎癌、泌尿生殖器癌、セミノーマ、食道癌、咽頭癌、胃癌、胃腸癌、皮膚癌、ケラトアカントーマ、濾胞性癌、メラノーマ、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、肺腺癌、肺の扁平上皮細胞癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳頭癌、膀胱癌、肝臓癌、胆汁道癌、腎臓癌、骨癌、骨髄性疾患、リンパ性疾患、ヘアリー細胞癌、頬側口腔癌及び咽頭(経口)癌、口唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、小腸癌、結腸癌、肛門癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、中枢神経系癌、腹膜癌、肝細胞癌、頭部癌、頸部癌、ホジキン病及び白血病からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ａｋｔキナーゼ阻害剤が、次の式ＩＩ：
2014507129.tif 000065
[上式中、
Ｒ１及びＲ２は独立して、水素、Ｃ１-Ｃ５アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１-５アルコキシ又はアミンであり；
ｐは１〜６の整数であり；
Ａは、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、フェニル、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、５-１４炭素の環式、二環式又は三環式の芳香族又は芳香族複素環であり；
Ｂは、次の式:
2014507129.tif 000066
を有する芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環であり；
ここでＱ、Ｔ、Ｘ及びＹは独立して、-ＣＨ、ＣＨ２、Ｎ又はＯからなる群から選択され；
Ｚは、-ＣＨ、-ＣＨ２、Ｎ、Ｏ又は-Ｃ=Ｃ-であり；
Ｒ６及びＲ７は独立して、水素、ハロゲン、及びカルボニルからなる群から選択され、又はＲ６及びＲ７は共同して、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい５又は６員の芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環を形成する]
の化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が、解糖系依存性癌以外のものである請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤が、一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減させる一又は複数のＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)コンストラクトを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記一又は複数のＡｋｔタンパク質が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、及びその組合せからなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、Ａｋｔ遺伝子内の配列に実質的に対応する一又は複数のＤＮＡ配列を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、配列番号：１−１８からなる群から選択される配列に実質的に対応する一又は複数のＤＮＡ配列を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、センスＲＮＡストランド及び実質的に相補的なＲＮＡストランドを含み、ここで該アンチセンスストランドは、配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８から選択される配列に実質的に対応する一又は複数の配列を含み、該センス及びアンチセンスストランドがＲＮＡ二本鎖としてアニールされる請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記センスストランドが、配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７からなる群から選択される配列に実質的に対応する一又は複数の配列を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記一又は複数のセンスストランドと前記一又は複数のアンチセンスストランドが、次の配列対：配列番号：１９：２０、２１：２２、２３：２４、２５：２６、２７：２８、２９：３０、３１：３２、３３：３４、３５：３６、及び３７：３８及び対の組合せとしてアニールされる請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、配列番号：１−１８から選択される配列に実質的に対応する核酸配列を含むＲＮＡｉコンストラクトから転写される請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減させるＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５０】
一又は複数のＡｋｔ遺伝子内の配列に実質的に対応する一又は複数のＤＮＡ配列を含む、請求項４９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５１】
前記一又は複数のＤＮＡ配列が、配列番号：３９-４８からなる群から選択される、請求項５０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５２】
配列番号：１−１８からなる群から選択される配列に実質的に対応する一又は複数のＤＮＡ配列を含む請求項４９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５３】
前記コンストラクトがｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである請求項４９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５４】
センスＲＮＡストランドと、実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡストランドを含み、該アンチセンスストランドが、配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８から選択される配列に実質的に対応する一又は複数の配列を含み、該センス及びアンチセンスストランドがＲＮＡ二本鎖としてアニールされる請求項５３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５５】
前記センスストランドが、配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７からなる群から選択される配列に実質的に対応する一又は複数の配列を含む請求項５４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５６】
前記一又は複数のセンスストランドと前記一又は複数のアンチセンスストランドが、次の配列対：配列番号：１９：２０、２１：２２、２３：２４、２５：２６、２７：２８、２９：３０、３１：３２、３３：３４、３５：３６、及び３７：３８及び対の組合せとしてアニールされる請求項５５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５７】
前記センスストランドと前記アンチセンスストランドが、単鎖ヘアピンにより共有的に結合している請求項５６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５８】
配列番号：３２に実質的に対応するヌクレオチド配列と配列番号：２２、２６及び３６からなる群から選択される配列に実質的に対応する配列を含む請求項４９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５９】
配列番号：３１に実質的に対応するヌクレオチド配列と、配列番号：２１、２５及び３５からなる群から選択される配列に実質的に対応する配列を含む請求項４９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項６０】
配列番号：１−１８からなる群から選択される配列に実質的に対応するＤＮＡ配列で、ＲＮＡ配列に転写されるものを含む一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減可能なＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項６１】
配列番号：１９−３８からなる群から選択される配列に実質的に対応するＲＮＡ配列及びその組合せを含む一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減可能なＲＮＡｉコンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ここに開示のＲＮＡｉコンストラクト及び併用療法は腫瘍の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラスＩホスファチジルイノシトール３-キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)／Ａｋｔ経路の異常な活性化は様々な癌に幅広く関与している。これは、種々の上流増殖因子及びそれらのレセプターの異常な活性化の結果としてばかりでなく、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔアイソフォームの直接的変化を介しており、より頻繁には、ＰＩ３Ｋの活性化を否定するリン脂質ホスファターゼである腫瘍サプレッサーホスファターゼ・テンシンホモログ(ＰＴＥＮ)の不活性化を介している。３つのＡｋｔアイソフォームは魅力ある癌治療標的である(Samuels, Y., 及び K. Ericson, (2006), Oncogenic PI3K and its role in cancer. Curr Opin Oncol. 18:77-82; Stambolic, V., 及び J.R. Woodgett, (2006), Functional distinctions of protein kinase B/Akt isoforms defined by their influence on cell migration. Trends Cell Biol.)。マウスにおける３つのＡｋｔ遺伝子の遺伝子破壊は、正常な生理機能における各アイソフォームの別々の機能と重複する機能の双方を明らかにした(Chen, W.S., P.Z. Xu, K. Gottlob, M.L. Chen, K. Sokol, T. Shiyanova, I. Roninson, W. Weng, R. Suzuki, K. Tobe, T. Kadowaki, 及び N. Hay, (2001), Growth retardation and increased apoptosis in mice with homozygous disruption of the Akt1 gene. Genes Dev. 15:2203-8; Cho, H., J. Mu, J.K. Kim, J.L. Thorvaldsen, Q. Chu, E.B. Crenshaw, 3rd, K.H. Kaestner, M.S. Bartolomei, G.I. Shulman, and M.J. Birnbaum, (2001), Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science. 292:1728-31; Cho, H., J.L. Thorvaldsen, Q. Chu, F. Feng, and M.J. Birnbaum, (2001), Akt1/PKBalpha is required for normal growth but dispensable for maintenance of glucose homeostasis in mice. J Biol Chem. 276:38349-52. Epub 2001 Aug 31; Easton, R.M., H. Cho, K. Roovers, D.W. Shineman, M. Mizrahi, M.S. Forman, V.M. Lee, M. Szabolcs, R. de Jong, T. Oltersdorf, T. Ludwig, A. Efstratiadis, and M.J. Birnbaum, (2005), Role for Akt3/protein kinase Bgamma in attainment of normal brain size. Mol Cell Biol. 25:1869-78; Peng, X.D., P.Z. Xu, M.L. Chen, A. Hahn-Windgassen, J. Skeen, J. Jacobs, D. Sundararajan, W.S. Chen, S.E. Crawford, K.G. Coleman, and N. Hay, (2003), Dwarfism, impaired skin development, skeletal muscle atrophy, delayed bone development, and impeded adipogenesis in mice lacking Akt1 and Akt2. Genes Dev. 17:1352-65; Tschopp, O., Z.Z. Yang, D. Brodbeck, B.A. Dummler, M. Hemmings-Mieszczak, T. Watanabe, T. Michaelis, J. Frahm, and B.A. Hemmings, (2005), Essential role of protein kinase B gamma (PKB gamma/Akt3) in postnatal brain development but not in glucose homeostasis. Development. 132:2943-54. Epub 2005 Jun 1; Yang, Z.Z., O. Tschopp, N. Di-Poi, E. Bruder, A. Baudry, B. Dummler, W. Wahli, and B.A. Hemmings, (2005), Dosage-dependent effects of Akt1/protein kinase Balpha (PKBalpha) and Akt3/PKBgamma on thymus, skin, and cardiovascular and nervous system development in mice. Mol Cell Biol. 25:10407-18) 及び tumor initiation (Chen, M.L., P.Z. Xu, X.D. Peng, W.S. Chen, G. Guzman, X. Yang, A. Di Cristofano, P.P. Pandolfi, and N. Hay, (2006), The deficiency of Akt1 is sufficient to suppress tumor development in Pten+/- mice. Genes Dev. 20:1569-74; Ju, X., S. Katiyar, C. Wang, M. Liu, X. Jiao, S. Li, J. Zhou, J. Turner, M.P. Lisanti, R.G. Russell, S.C. Mueller, J. Ojeifo, W.S. Chen, N. Hay, and R.G. Pestell, (2007), Akt1 governs breast cancer progression in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:7438-43; Maroulakou, I.G., W. Oemler, S.P. Naber, and P.N. Tsichlis, (2007), Akt1 ablation inhibits, whereas Akt2 ablation accelerates, the development of mammary adenocarcinomas in mouse mammary tumor virus (MMTV)-ErbB2/neu and MMTV-polyoma middle T transgenic mice. Cancer Res. 67:167-77; Skeen, J.E., P.T. Bhaskar, C.C. Chen, W.S. Chen, X.D. Peng, V. Nogueira, A. Hahn-Windgassen, H. Kiyokawa, and N. Hay, (2006), Akt deficiency impairs normal cell proliferation and suppresses oncogenesis in a p53-independent and mTORC1-dependent manner. Cancer Cell. 10:269-80)。しかしながら、ヒト腫瘍増殖の維持における３つのＡｋｔアイソフォームの相対的寄与は分からないままである。
【０００３】
ヒトの癌は、通常、２つ又は３つ全てのＡｋｔアイソフォームを同時発現しており、各アイソフォームの増幅又は過剰発現が、異なるタイプの癌において文献化されている(Altomare, D.A., 及び J.R. Testa, (2005), Perturbations of the AKT signaling pathway in human cancer. Oncogene. 24:7455-64; Stahl, J.M., A. Sharma, M. Cheung, M. Zimmerman, J.Q. Cheng, M.W. Bosenberg, M. Kester, L. Sandirasegarane, and G.P. Robertson, (2004), Deregulated Akt3 activity promotes development of malignant melanoma. Cancer Res. 64:7002-10)。増加している証拠は、Ａｋｔアイソフォームが、研究された外部刺激及び組織に応じて差次的に調節され得、細胞及び組織特異的な形で細胞プロセスの特徴的な側面を調節しうることが示唆される(Dufour, G., M.J. Demers, D. Gagne, A.B. Dydensborg, I.C. Teller, V. Bouchard, I. Degongre, J.F. Beaulieu, J.Q. Cheng, N. Fujita, T. Tsuruo, K. Vallee, and P.H. Vachon, (2004), Human intestinal epithelial cell survival and anoikis. Differentiation state-distinct regulation and roles of protein kinase B/Akt isoforms. J Biol Chem. 279:44113-22. Epub 2004 Aug 6; Irie, H.Y., R.V. Pearline, D. Grueneberg, M. Hsia, P. Ravichandran, N. Kothari, S. Natesan, and J.S. Brugge, (2005), Distinct roles of Akt1 and Akt2 in regulating cell migration and epithelial-mesenchymal transition. J Cell Biol. 171:1023-34; Kim, D., S. Kim, H. Koh, S.O. Yoon, A.S. Chung, K.S. Cho, and J. Chung, (2001), Akt/PKB promotes cancer cell invasion via increased motility and metalloproteinase production. FASEB J. 15:1953-62; Samuels, Y., L.A. Diaz, Jr., O. Schmidt-Kittler, J.M. Cummins, L. Delong, I. Cheong, C. Rago, D.L. Huso, C. Lengauer, K.W. Kinzler, B. Vogelstein, and V.E. Velculescu. 2005. Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell. 7:561-73; Tanno, S., S. Tanno, Y. Mitsuuchi, D.A. Altomare, G.H. Xiao, and J.R. Testa, (2001), AKT activation up-regulates insulin-like growth factor I receptor expression and promotes invasiveness of human pancreatic cancer cells. Cancer Res. 61:589-93; Yoeli-Lerner, M., G.K. Yiu, I. Rabinovitz, P. Erhardt, S. Jauliac, and A. Toker, (2005), Akt blocks breast cancer cell motility and invasion through the transcription factor NFAT. Mol Cell. 20:539-50)。
【０００４】
Ａｋｔは、その抗アポトーシス活性についてよく知られており、生存キナーゼとしてのその描写に至る(Amaravadi, R., and C.B. Thompson, (2005), The survival kinases Akt and Pim as potential pharmacological targets. J Clin Invest. 115:2618-24)。しかしながら、しばしばＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の成分の阻害は、さらなるアポトーシス誘導刺激がないと実質的なアポトーシスを誘導しない。これは最近の研究で例証されており、そこでは、Ａｋｔのリン酸化を効率的に阻害した二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が、アポトーシスの誘導なしにグリオーマ異種移植片の増殖を阻止した(Fan, Q.W., Z.A. Knight, D.D. Goldenberg, W. Yu, K.E. Mostov, D. Stokoe, K.M. Shokat, and W.A. Weiss, (2006), A dual PI3 kinase/mTOR inhibitor reveals emergent efficacy in glioma. Cancer Cell. 9:341-9)。
【０００５】
最近の研究では、アルキル化剤が、クロロキンと組合せて投与された。クロロキンとのキナーゼ阻害剤の併用については何の結果も提示されなかった。
【発明の概要】
【０００６】
ここに開示の主題事項は、オートファジー阻害剤である薬剤と組合せて、キナーゼ阻害剤でありオートファジー誘導剤でもある薬剤を用いて腫瘍を治療する薬剤及び方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】異種移植腫瘍増殖に対するＡｋｔアイソフォームの誘導性(ノックダウン)ＫＤ及びそれらの効果を示す。(Ａ)誘導性ｓｈＲＮＡコンストラクトを発現する安定ＰＣ３クローンにおけるＡｋｔアイソフォーム及び種々の下流タンパク質の免疫ブロット分析。各クローンを、７日間、１０％のＦＢＳ下で増殖させ、１μｍ／ｍｌのＤｏｘを用い、それぞれのｓｈＲＮＡ(類)の発現を誘導した。二重矢印は、全及びホスホ-Ａｋｔ抗体により検出された３つのＡｋｔアイソフォームの移動性と、ＩＲＳ１の移動性シフトにおける、わずかな差異を示している。図１Ｂは、異種移植増殖に対するＡｋｔ ＫＤの効果を示す。代表的な実験は、ビヒクルコントロール（−Ｄｏｘ、黒丸）又は（＋Ｄｏｘ、白丸）で処理された種々のｓｈＲＮＡを含むＰＣ３異種移植腫瘍の増殖を示している(表３の詳細を参照)。エラーバーはＳＥＭを表す。*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．００５。
【図２】Ａｋｔ ＫＤが細胞周期の遅延を生じ、実質的なアポトーシスなしにオートファジーを増加させたことを示している。(Ａ)標記の５、１５、又は２１日間、Ｄｏｘ又はビヒクルコントロールで処理されたＰＣ３-ｓｈＡｋｔ１２３腫瘍の組織学的分析。腫瘍組織を、Ｋｉ-６７に特異的な抗体を使用するＩＨＣによって、又はＴＵＮＥＬアッセイによって分析した。各サンプルについてのシグナル強度の病理学者のスコアリングを括弧で示す。バー、１００μｍ。(Ｂ及びＣ)。血清饑餓(ｓｓ)下での細胞周期進行に対する三重Ａｋｔ ＫＤの効果を１０％ＦＢＳ下で増殖した細胞と比較した。ＥＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡ又は３つ全てのＡｋｔアイソフォームを含む細胞を、１０％のＦＢＳを含む培地において、Ｄｏｘを用いて又は用いず、２日間前処理し、０％(Ｂ)又は０．５％(Ｃ)のＦＢＳに変化させた。細胞周期プロファイルは、血清引き抜き後、示された時点で分析した。エラーバーはＳＥＭ(＝３)を表す。また、Ｄｏｘ有対Ｄｏｘ無での各細胞周期相における変化の割合が示される。
【図３】Ａｋｔ ＫＤによるＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞に誘導されたオートファジーを示す。(Ａ)５日間、Ｄｏｘ誘導Ａｋｔ１２３ＫＤの不在(ａ及びｆ)、又は存在(ｂ-ｅ及びｇ)下で増殖させたＰＣ３(ａｄ)及びＵ８７ＭＧ(ｅ-ｇ)細胞のＥＭ画像。矢印、分解性オートリソソーム。二重矢印、初期ＡＶ。矢印、ファーゴホア(phagophore)単離膜。Ｍ、ＡＶにおけるミトコンドリア。星印、グリコーゲン粒子クラスター。バー：(ａ、ｂ、ｆ、及びｇ)０．５μｍ：(ｃ及びｄ)２００ｎｍ；(ｅ)１μｍ。(Ｂ)Ｄｏｘ誘導ｓｈＡｋｔ １２３発現を伴うか又は伴わないＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞の無作為にサンプリングされた細胞質面積(ｎ＝５ ＞２００μｍ２ の面積)におけるＡＶにより占有される細胞質面積の割合及び４．５μｍ２(ｎ＞６４)の細胞質面積当たりのＡＶの数の定量。エラーバーはＳＥＭを表す。(ｅ)ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ腫瘍における変性に起因するＤｏｘ誘導Ａｋｔサイレンシング。(Ｃ)(ａ)１５日間のＤｏｘ処理後のコントロールＥＧＦＰ ｓｈＲＮＡを発現するＰＣ３腫瘍。腫瘍細胞は大きな核と核小体、いくつかの脂質液滴(星印)を含み、細胞間結合により結合している(矢印)。(ｂ-ｄ)１５日間(ｂ及びｃ)又は１０日間(ｄ)のＤｏｘ処理後のｓｈＡｋｔ １２３を発現するＰＣ３腫瘍。(ｂ)これらの腫瘍における細胞及び核小体はしばしば縮んだように見える。矢印、ＡＶ。Ｅ，好酸球。(ｃ)変性した腫瘍細胞において拡張ＲＥＲ槽に見出された２のＡＶ(矢印)。(ｄ)ヒトＬＡＭＰｌのイムノゴールド標識を有する超薄凍結切片。標識はリソソーム(矢印)及びＡＶ(上挿入図)上に生じる。腫瘍細胞のいくつかはまたマイクロオートファジーの形状記憶を伴うヒトＬＡＭＰｌポジティブ濃密体を含む(下挿入図；de Waal, E.J., H. Vreeling-Sindelarova, J.P. Schellens, J.M. Houtkooper, 及び J. James, (1986), Quantitative changes in the lysosomal vacuolar system of rat hepatocytes during short-term starvation. A morphometric analysis with special reference to macro- and microautophagy. Cell Tissue Res. 243:641-8)。腫瘍細胞は広くなった核エンベロープとＥＲ槽(星印)を有しており、小細胞質島(矢印)を含む。(ｅ)５日間のビヒクル処理後のＵ８７ＭＧ腫瘍。(ｆ-ｈ)５日間のＤｏｘ処理後のＵ８７ＭＧ-ｓｈＡｋｔ １２３腫瘍。矢印、ＡＶ。(ｈ)いくつかの腫瘍サンプルにおいて、グリコーゲンクラスターを有する細胞（星印）、及びグリコーゲン含有ＡＶが生じる。バー：(ａ-ｃ)２μｍ：(ｅ及びｆ)１μｍ：(ｇ)０．５μｍ：(ｄ及びｈ)２００ｎｍ。
【図４】Ａｋｔ ＫＤとの組合せで細胞死を促進させるリソソーム作用剤を示す。(Ａ)ＣＱ処理は、Ｄｏｘ-処理ＰＣ３-ｓｈＡｋｔ １２３細胞においてＧＦＰ-ＬＣ３ドットの蓄積を引き起こした。ＧＦＰ-ＬＣ３を安定して発現するＰＣ３-ｓｈＡｋｔ １２３細胞は、６日間、１μｇ／ｍｌのＤｏｘを用いて又は用いずに前処理され、１０μＭのＣＱを用いて又は用いずに処理された。ＧＦＰ蛍光をＣＱ治療の１日後に撮像した。矢印は代表的なＧＦＰドット又は凝集塊を指し示す。バー、１０μｍ。(Ｂ)Ｄｏｘ又はＣＱを用いて又は用いずに処理されたＰＣ３-ｓｈＡｋｔ １２３細胞におけるＬＣ３プロセシング、ＰＡＲＰ切断、及び全Ａｋｔに対する１０μＭのＣＱ及びｓｈＡｋｔ１２３の効果。ＬＣ３-１に対するＬＣ３-１１及び全長(ＦＬ)ＰＡＲＰに対する切断体(Ｃｌ)の比率を、ＣＱ処理の１又は２日目に作製された細胞可溶化液の免疫ブロットから定量した。２日目のサンプルの免疫ブロットを示す。分子量を、各タンパク質の隣に括弧を付してキロダルトンで示す。データは３回の独立した実験の代表値である。(Ｃ)ＣＱはＰＣ３細胞における細胞死を促進してｓｈＡｋｔ１２３の発現を誘導したが、３-ＭＡ前処理はこの効果を遅延させた。ＰＣ３-ｓｈＡｋｔ１２３を１μｇ／ｍｌのＤｏｘで３日間プレインキュベートし、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した後、Ｄｏｘを用いて又は用いずに、２．５ｎＭのＢａ又は１０μＭのＣＱを含む新鮮な培地に細胞を播種した。前処理中と前処理後の双方において、１ｍＭの３-ＭＡをＤｏｘと共に添加した。細胞生存率を、０．５％(ｅ)又は０％(Ｄ)ＦＢＳ下、２、３及び４日目に決定した(０％のＦＢＳの下、Ｂａ単独で処理された細胞を、２及び３日のみ追跡)。０．５％のＦＢＳ下、アネキシンＶ-ポジティブ ＰＩ-ネガティブの個体群の割合を、２、３及び４日目に決定した。カスパーゼ−３／７活性を、０％のＦＢＳ下、２及び３日目に決定し、同数の細胞に対して規準化された相対的蛍光単位(ＲＦＵ、千単位)として表した。エラーバーは３回の独立した実験のＳＤを表す。
【図５】ＩＩＩ-５との組合せにおけるＣＱ促進細胞死を示す。(Ａ)ＰＣ３細胞を、０．５％のＦＢＳ下、１０μＭのＣＱの存在又は不存在下、０．５μＭのＩＩＩ-５又はＤＭＳＯを用いて処理した。細胞生存率をＰＩ排除により、２、３、及び５日目に決定した。アネキシンＶ染色を２及び３日目に分析し、ＰＩ＋又はＰＩ-集団に分けた。(Ｂ)１０μＭのＣＱ又は３ｍＭの３-ＭＡを用いて又は用いずに、０．５(ＩＩＩ-５-０．５)又は２０μＭ(ＩＩＩ-５-２０)のＩＩＩ-５で処理されたＰＣ３細胞における細胞生存率の時間経過。１％のＦＢＳ下で２４時間、ＩＩＩ-５を用いて前処理されたＰＣ３細胞を、ＣＱの存在又は不在下で、０．５％のＦＢＳを含む培地中に分割した。３-ＭＡを、ＣＱ添加の２４時間前、ＩＩＩ-５の直前に添加した。細胞生存率を、ＣＱ添加後の示した時点で、ＰＩ排除により測定した。エラーバーはＳＥＭ(ｎ＝３)を表す。ＬＣ３-１に対するＬＣ３-１１の比率を、免疫ブロットの定量から決定した。(Ｃ)ＣＱは、ＩＩＩ-５で処理されたＰＣ３細胞におけるＭＤＣ＋液胞の大きさ及び数を、劇的に増加させたが、３-ＭＡはこの効果を抑制した。０．５％のＦＢＳを含む培地で細胞を培養し、示されたように、ＤＭＳＯ、０．５μＭのＩＩＩ-５、１０μＭのＣＱ、及び５ｍＭの３-ＭＡを単独で又は組合せて処理した。４８時間後のＭＤＣ染色を示す。バー、１０μｍ。
【図６】ＩＩ-４との組合せにおけるＣＱ促進細胞死を示す。(Ａ)ＰＣ３細胞を、０．５％のＦＢＳ下、１０μＭのＣＱの存在又は不在下、４μＭのＩＩ-４又はＤＭＳＯを用いて処理した。細胞生存率を、ＰＩ排除により、１０日にわたって測定した。エラーバーはＳＥＭを表す。３回の独立した実験の一つからの代表データを示す。(Ｂ)Ａに示された実験からの示された時点で収集された細胞可溶化液の免疫ブロット分析。矢印は、ＬＣ３-１及び-ＩＩ、ＣａｔｈＤ ４３、及びＣａｔｈＤ ２８についての位置を示す。示されたマーカーの定量をＣに示す。ＣａｔｈＤ４３は、カテプシンＤ前駆体の４３−５０ｋＤ型。ＣａｔｈＤ ２８は２８ｋＤカテプシンＤ重鎖。
【図７Ａ】図７は細胞膜破裂に先行し、この実施例では化合物ＩＩ-４のＡｋｔ阻害剤(「Ａｋｔｉ」)とＣＱでの処理でのアポトーシス及び無核化細胞の出現と相関させたＡＶＯｓの蓄積を示す。(Ａ)５％のＦＢＳ下、ＤＭＳＯ、１０μＭのＩＩ-４、１０μＭのＣＱ、又は双方で処理されたＰＣ３細胞を、タイムラプス顕微鏡を使用し、３日間追跡した。示された時点の細胞の代表的画像を示す。白色矢印は、双方の薬剤で処理された細胞における細胞質膜破裂前の２の隣接する細胞間の融合を示す。バー、１０μｍ。
【図７Ｂ】(Ｂ)示された薬剤で処理されたＰＣ３細胞をＡＯで染色し、多重スペクトル画像フローサイトメトリーにより分析した。各処理を受けた３の代表的細胞の(左)明視野(ＢＦ)、核(緑)、液胞(赤)、及び緑／赤複合画像を示す。バー、１０μｍ。(中央)ＡＯのグリーン強度対ＡＯのグリーン輝度の詳細な面積のプロットにより、３の異なる集団：Ｒ２無核化細胞、Ｒ３アポトーシス細胞、及びＲ４生存細胞が明らかになった。(右)Ｒ４のＡＯの赤強度を、最も明るいＡＯの赤強度を有する事象を含むように描かれた任意ゲート(Ｒ５)を有するヒストグラムにプロットした。Ｒ２、Ｒ３及びＲ４ヒストグラムを、Ａｋｔｉ(ＩＩ-４)＋ＣＱプロットのみに重ねる。
【図７Ｃ】(Ｃ)Ｂに示す各集団の統計。*、全単一細胞の割合；**、Ｒ４生存細胞の平均蛍光強度；***、Ｒ４生存細胞の割合。
【図８Ａ−Ｂ】図８は、Ａｋｔ阻害が、ミトコンドリアスーパーオキシド及び細胞ＲＯＳ生成を誘導し、これがＣＱにより増加することを示す。(Ａ)０．５％のＦＢＳにおいて培養されたＰＣ３細胞を、ＤＭＳＯ、３μＭのＩＩ-４、１０μＭのＣＱ、又は双方で処理し、ＭｉｔｏＳＯＸレッド染料で染色し、蛍光顕微鏡で調べた。２４時間での画像を示す。バー、１０μｍ。(Ｂ)Ａのように処理されたＰＣ３細胞を、Ｉｍａｇｅ-ｉＴ ＬＩＶＥグリーンＲＯＳ検出キットで染色し、２４時間で蛍光顕微鏡によって調べた。細胞の明視野(ＢＦ)画像も示す。バー、１０μｍ。
【図８Ｃ】(Ｃ)２４時間でのフローサイトメトリーによるＭｉｔｏＳＯＸレッド、及びＲＯＳグリーンの蛍光強度の定量。細胞をＡ及びＢのようにして処理した。エラーバーはＳＥＭ(ｎ＝３)を表す。
【図９Ａ】図９は、ＣＱがインビトロでＡｋｔｉ処理ＰＴＥＮ-ヌル細胞における細胞死を選択的に加速し、インビボでＡｋｔ ＫＤの抗腫瘍効果を高めたことを示す。(Ａ)ＰＴＥＮ−／−(−／−)ＭＥＦは、ＩＩ-４及びＣＱでの組合せ処理に対する同質遺伝子的ＰＴＥＮ＋／＋(＋／＋)カウンターパートよりも感受性であった。ＭＥＦを、１％のＦＢＳ下、ＣＱ及びＩＩ-４の各々５μＭで処理し、細胞生存率をＰＩ排除により０、２及び３日目に決定した。エラーバーはＳＥＭ(ｎ＝３)を表す。
【図９Ｂ−Ｄ】(Ｂ)ビヒクル(Ｖｅｈ)、Ｄｏｘのみ、ＣＱのみ、又はＤｏｘ及びＣＱの双方で、２８日にわたって毎日処理されたＰＣ３異種移植腫瘍の平均腫瘍体積。腫瘍量から重量減少のため、処理の１８日前まで、ビヒクル及びビヒクル＋ＣＱのグループを追跡した。エラーバーはＳＥＭ(各コホートにおいて、ｎ＝１０の腫瘍)。(Ｃ)２８日目における、Ｄｏｘのみ、及びＤｏｘ＋ＣＱグループの腫瘍体積の散布図(Ｐ＝０．０５)。水平バーは平均腫瘍体積を示す。完全に寛解した腫瘍の数(ＣＲ、破線)を、各グループについて示す。(Ｄ)Ａに示すように、Ｄｏｘのみ、及びＤｏｘ＋ＣＱコホートについて、０日目に比較した腫瘍体積変化の割合としてプロットした個々の腫瘍増殖。鎖線は、出発腫瘍体積から−１００％変化、すなわち完全な腫瘍寛解を示す。２８日目に、出発腫瘍体積より小さい(≪０％変化)又は大きい(＞０％変化)腫瘍の数を示す。
【図１０】Ａｋｔｌ２３ ＫＤ及びＣＱの組合せ処理されたＰＣ３におけるＡＶ蓄積及びアポトーシスの増加を示す。(Ａ)(ａ)５日間、ＣＱのみを用いて処理されたＰＣ３-ｓｈＡｋｔ１２３腫瘍のＥＭ画像。矢印、濃密ＡＶ及びリソソーム；Ｎ、核小体。(ｂ)Ｄｏｘのみ。矢印、ａにおいてよりもあまり濃密でない外観を有するＡＶ。(ｃ及びｄ)Ｄｏｘ及びＣＱの双方。(ｃ)多くの濃密で拡大したＡＶ(矢印)が腫瘍細胞に蓄積している。アポトーシス細胞(Ａｐ)は部分的にマクロファージ(Ｍ)に包囲されている。Ｔ、腫瘍細胞。(ｄ)ＡＶ-充填された(矢印)腫瘍細胞の中のアポトーシス核(Ａｐ)。挿入図、核腫瘍におけるＡＶ(ａ-ｃ)と異常なミトコンドリア(＊)の拡大画像。バー；(ａ-ｃ)２μｍ：(ｄ)１μｍ。(Ｂ)無作為にサンプリングされた細胞質面積において、ＡＶにより占有される細胞質面積の割合の定量(ｎ＝６ ＞８０μｍ２の面積)(Ｃ)無作為にサンプリングされた腫瘍細胞核の中のアポトーシス核のパーセンテージ(１００の腫瘍細胞核のｎ＝３-４セット)。(Ｂ及びＣ)エラーバーはＳＥＭを表す；*、他の３グループと比較して、Ｐ＜０．０００５。
【図１１】ｓｈＲＮＡによるＡｋｔノックダウンがオートファジー遺伝子発現を誘導することを示す。ＰＣ３細胞を、ドキシサイクリンにより７２時間、示されたＡｋｔアイソフォームにｓｈＲＮＡを発現するように誘導させ、ＲＮＡを、Ｄｏｘ処理(Ｄｏｘ＋)又は未処理のコントロール(Ｄｏｘ−)細胞の双方から抽出した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを使用してマイクロアレイ分析を実施した。Ｄｏｘ＋及びＤｏｘ−サンプルからの各オートファジー遺伝子の発現レベルの比率を示す。データは３回の独立した実験の平均値である。
【図１２】オートファジー遺伝子発現を誘導するＡｋｔ阻害剤を示す。ＰＣ３細胞を、ＤＭＳＯビヒクルコントロール、又は１-(１-(４-(５-ヒドロキシ-６-メチル-３-フェニルピラジン-２-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-１)、１-(１-(４-(６-ヒドロキシ-５-イソブチル-３-フェニルピラジン-２-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-２)、１-(１-(４-(７-フェニル-１Ｈ-イミダゾ[４,５-ｇ]キノキサリン-６-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-４)、(Ｓ)-２-(４-クロロフェニル)-１-(４-((５Ｒ,７Ｒ)-７-ヒドロキシ-５-メチル-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-シクロペンタ[ｄ]ピリミジン-４-イル)ピペラジン-１-イル)-３-(イソプロピルアミノ)プロパン-１-オン  (ＩＩＩ-４)、及び(Ｓ)-１-(３-(Ｎ-(４-(３-フェニルイソオキサゾール-５-イル)チアゾール-２-イル)チオフェン-２-カルボキシアミド)プロピル)ピペリジン-２-カルボキシアミド(ＩＶ-１)を含む種々のＡｋｔ阻害剤を用い、１又は５□Ｍで６〜２４時間処理した。ＲＮＡを細胞から抽出した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを使用し、マイクロアレイ分析を実施した。各オートファジー遺伝子の発現レベルを、ＤＭＳＯコントロールに対して規準化する。データは３回の独立した実験の平均値である。
【図１３】種々のｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔ阻害剤が単独で、フローサイトメーターで側方散乱(ＳＳＣ)により測定される、オートファジー液胞蓄積の増加を誘導することを示す。阻害剤には、３-フェニル-２-(４-((４-(５-(ピリジン-２-イル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル)メチル)フェニル)-１,６-ナフチリジン-５(６Ｈ)-オン(ＩＩ-３)、２-(４-(３-エチルウレイド)フェニル)-４-(１,４-オキサゼパン-４-イル)-５Ｈ-ピロロ[３,４-ｄ]ピリミジン-６(７Ｈ)-カルボン酸ベンジル(ＩＩＩ-１)；１-エチル-３-(４-(４-モルホリノ-７-(ピリミジン-２-イル)-５,６,７,８-テトラヒドロピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-２-イル)フェニル)ウレア(ＩＩＩ-２)、(Ｒ)-１-(４-((２-(２-アミノピリミジン-５-イル)-７-メチル-４-モルホリノチエノ[３,２-ｄ]ピリミジン-６-イル)メチル)ピペラジン-１-イル)-２-ヒドロキシプロパン-１-オン(ＩＩＩ-３)、４-(２-(１Ｈ-インダゾール-４-イル)-６-((４-(メチルスルホニル)ピペラジン-１-イル)メチル)チエノ[３,２-ｄ]ピリミジン-４-イル)モルホリン(ＩＩＩ-６)、(Ｓ)-Ｎ-(４-(ベンゾ[ｄ][１,３]ジオキソール-５-イル)チアゾール-２-イル)-Ｎ-(３-(２-ホルミルピペリジン-１-イル)プロピル)チオフェン-２-カルボキシアミド(ＩＶ-２)及びラパマイシンが含まれる。
【図１４】ＣＱ(１０μＭ)が、種々のｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、及びＡｋｔ阻害剤と組合せた場合、オートファジー液胞の数及び大きさを増加させることを示す。
【図１５】アクリジンオレンジ染色後、グリーンに対するレッドの蛍光比率を測定した場合に、種々のｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔ阻害剤が、単独でオートファジー液胞蓄積の増加を誘導することを示す。
【図１６】アクリジンオレンジ染色後、グリーンに対するレッドの蛍光比率を測定した場合に、ＣＱが、種々のｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔ阻害剤と組合されて、オートファジー液胞蓄積を増加させることを示す。
【図１７】Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ-４及びＰＩ３Ｋ阻害剤ＩＩＩ-６が双方ともＣＱと相乗効果を有し、細胞死を促進させることを示す。
【図１８】Ｕ８７ＭＧ細胞及び異種移植腫瘍におけるＡｋｔアイソフォームの誘導性ノックダウンと、癌細胞株におけるＡｋｔアイソフォームの相対レベルを示す。(Ａ)腫瘍細胞株における各Ａｋｔアイソフォームの相対的発現レベル。各細胞株からの全細胞可溶化液におけるＡｋｔタンパク質を、アイソフォーム特異的抗体を使用し、ウエスタンブロット分析により分析し、標準と同じゲルが充填された各アイソフォームの組換えタンパク質を使用して定量した。データは２回の独立した実験の代表である。(Ｂ)誘導性ｓｈＲＮＡコンストラクトを発現するＵ８７ＭＧ細胞におけるＡｋｔ ＫＤのウエスタンブロット確認。それぞれのＡｋｔアイソフォームを標的とする示されたコンストラクトを含むＵ８７ＭＧ細胞の安定したプールを、３日間、１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを用いてｓｈＲＮＡを発現するように誘導させた。全細胞可溶化液を、示された抗体を使用して分析した。ＧＡＰＤＨレベルを負荷コントロールとして測定した。分子量は各タンパク質の隣の括弧内にキロダルトンで示す。(Ｃ-Ｆ)示されたｓｈＲＮＡを含むＵ８７ ＭＧ異種移植腫瘍を、ビヒクルコントロール又はＤｏｘで処理した。各コホートは１０匹のマウスから構成された。(Ｇ)Ｄｏｘは、野生型ＰＣ３細胞の増殖に何の効果も持たない。(Ｈ)第２のｓｈＡｋｔ１コンストラクトにより誘導されるＰＣ３腫瘍増殖遅延。エラーバーはＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．００５。
【図１９】細胞周期進行、アポトーシス、及びオートファジーに対するｓｈＧＦＰ及びＡｋｔアイソフォームＫＤの効果を示す。(Ａ)Ｄｏｘ処理された(１μｇ／ｍｌで９６時間)又はされていない、示されたｓｈＲＮＡを含む安定ＰＣ３クローンの定常状態細胞周期プロファイル。エラーバーは２回の独立した実験の標準偏差を表す。(Ｂ)Ｄｏｘ処理されない同じクローンと比較して、Ｄｏｘ処理された各相における変化の割合として表される(Ａ)の細胞周期プロファイル。データは、各条件に対して分析された少なくとも０．５×１０６細胞を用いた少なくとも２回の独立した実験の代表である。(Ｃ)ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞の細胞質面積４．５μｍ２(ｎ＝１３０)単位あたりのＡＶ数のＥＭ定量で、Ｄｏｘ誘導ｓｈＧＦＰ発現を有する又は有さないＡＶ数に有意差は示されない。エラーバーはＳＥＭを表す。(Ｄ)未処理コントロールと比較した、Ｄｏｘ誘導ｓｈＡｋｔｌ２３発現の５日後のＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞において増加した点状ＬＣ３免疫蛍光染色。Ｂａｒ、１０μｎ。(Ｅ)示された処理下でのＧＦＰ-ＬＣ３ドットを有するＰＣ３-ｓｈＡｋｔｌ２３細胞の割合。安定してＧＦＰ-ＬＣ３を発現するＰＣ３-ｓｈＡｋｔｌ２３細胞を、図４に示すようにして前処理し、可視の＞５点状ＧＦＰドットを有する細胞の割合を測定した。ＣＱ処理単独では、細胞において、核周囲ＧＦＰ-ＬＣ３凝集体を引き起こしたが、これらは、Ｄｏｘ処理細胞における広汎な細胞質ＧＦＰ-ＬＣ３塊とは形態学的に異なっていることが留意される。エラーバーは、それぞれ少なくとも１５の細胞の２回の無作為領域からの標準偏差を表す。(Ｆ)ＣＱ処理により、ｓｈＡｋｔｌ２３を発現するＤｏｘ処理されたＰＣ３細胞におけるＭＤＣ標識液胞の蓄積が引き起こされる。ＰＣ３-ｓｈＡｋｔ１２３細胞を、５日間、１０μＭのＣＱと共に又はそうではなく、１μｇ／ｍｌのＤｏｘ存在又は不在下でインキュベートし、ＭＤＣで標識した。スケールバー：１０μｍ。(Ｇ)１μｇ／ｍｌのＤｏｘ、１０μＭのＣＱ又は双方で処理され、アクリジンオレンジ染色されたＰＣ３-ｓｈＡｋｔｌ２３細胞のフローサイトメトリー分析。ＦＬ１-Ｈは、核のグリーン蛍光の強度を示す。ＦＬ３-ＨはＡＶＯのレッド蛍光の強度を示す。高レベルのＡＶＯを有する細胞に特徴的な(Paglinら, 2001)高いＦＬ３-Ｈ／ＦＬｌ-Ｈ比率を有する細胞の割合がヒストグラムに示されている。示されたデータは３回の独立した実験の代表である。
【図２０Ａ−Ｂ】図２０は、ＰＩ-１０３又はＡｋｔＩ-１／２と組合せての、ＰＣ３細胞生存率に対する、ＬＡＭＰ２、Ａｔｇ７、プロテアーゼ阻害剤、カテプシンＤ ｓｉＲＮＡ及びペプスタチンＡの効果。(Ａ)非標的コントロールオリゴ(ｓｉＣｔｒｌ)と比較したｓｉＲＮＡオリゴａ-ｄ及びそれらのプールによる、ＬＡＭＰ２のＫＤを示す免疫ブロット。(Ｂ)ＰＣ３細胞生存率に対するＬＡＭＰ２ ｓｉＲＮＡオリゴの効果。ＰＣ３細胞を、０．５％のＦＢＳ下、８０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて形質移入し、形質移入の２日後にＰＩ-１０３(０．５μＭ)又はＤＭＳＯを添加し、ＰＩ-１０３添加の４日後に、細胞生存率(ＰＩ排除)を分析した。
【図２０Ｃ−Ｄ】(Ｃ)非標的コントロールオリゴ又はＡｔｇ７ ｓｉＲＮＡプール(Santa Cruz)で形質移入されたＰＣ３細胞のＡｔｇ７免疫ブロット。(Ｄ)種々の処理下での、ＰＣ３細胞生存率に対するＡｔｇ７ ｓｉＲＮＡオリゴの効果。０．５％のＦＢＳ下、ＰＣ３細胞を２０ｎＭのｓｉＲＮＡで形質移入し、形質移入の２日後、ＣＱ(１０μＭ)と共に又はそうではなく、Ａｋｔｉ-１Ｉ２(５μＭ)又はＤＭＳＯを添加し、化合物添加の２又は３日後に、細胞生存率(ＰＩ排除)を分析した。*、２つの条件の間でＰ＜０．０５。
【図２０Ｅ−Ｈ】(Ｅ)ＤＭＳＯと共に、１０μＭのＣＱ、３μＭのＡｋｔｉ-１／２、Ａｋｔｉ-１／２とＣＱの双方が添加された、示された濃度のｚＶＡＤ.ｆｍｋで処理されたＰＣ３細胞。ＰＩ排除により、３日目に、細胞生存率を測定した。*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．００１、２つの条件の間。(Ｆ)ＤＭＳＯと共に、１０μＭのＣＱ、３μＭのＡｋｔｉ-１／２、又はＡｋｔｉ-１／２とＣＱの双方が添加された、示された濃度のｚＦＡ.ｆｍｋで処理されたＰＣ３細胞。ＰＩ排除により、３日目に、細胞生存率を測定した。*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．００１、２つの条件の間。(Ｆ)ＤＭＳＯと共に、１０μＭのＣＱ、３μＭのＡｋｔｉ-１／２、又はＡｋｔｉ-１／２とＣＱの双方が添加された、示された濃度のｚＦＡ.ｆｍｋで処理されたＰＣ３細胞。ＰＩ排除により、３日目に、細胞生存率を測定した。*、Ｐ＜０．０５、ＡｋｔＩ-１／２単独、又はｚＦＡ.ｆｍｋ単独のいずれかで処理された細胞と比較。(Ｇ-Ｈ)ＤＭＳＯ、１０μＭのＣＱ、３μＭのＡｋｔＩ-１／２、又はＡｋｔＩ-１／２及びＣＱの添加の２時間前に、示された濃度のＣＡ-０７４-Ｍｅ(Ｇ)又はＡＬＬＮ(Ｈ)で前処理されたＰＣ３細胞。ＰＩ排除により、３日目に、細胞生存率を測定した。*、Ｐ＜０．０５、ＡｋｔＩ-１／２単独、又はプロテアーゼ阻害剤単独のいずれかで処理された細胞と比較。
【図２０Ｉ−Ｊ】(Ｉ)種々の処理下での、ＰＣ３細胞生存率に対するカテプシンＤ ｓｉＲＮＡオリゴの効果。０．５％のＦＢＳ下、ＰＣ３細胞を、１０ｎＭのカテプシンＤ ｓｉＲＮＡプール(Santa Cruz)又は非標的コントロールで形質移入し、形質移入の２日後、ＣＱ(１０μＭ)と共に又はそうではなく、Ａｋｔｉ-１／２(５μＭ)又はＤＭＳＯを添加し、化合物添加の２日後に、細胞生存率(ＰＩ排除)を分析した。カテプシンＤノックダウンを、上部右の角に示す免疫ブロット分析で確認した。(Ｊ)種々の処理下での、ＰＣ３細胞生存率に対するペプスタチンＡの効果。０．５％のＦＢＳ下、ＰＣ３細胞を、２００μＭのペプスタチンＡと共に又はそうではなく、ＤＭＳＯ、５μＭのＡｋｔｉ-１／２、１０μＭのＣＱ、又は双方を用いて処理した。細胞生存率(ＰＩ排除)を、化合物添加の２日後に分析した。*、Ｐ＜０．０５、２つの条件の間。(Ｂ、Ｄ-Ｊ)エラーバーはＳＥＭ(ｎ＝３)を表す。Ａ、Ｃ及びＩにおける免疫ブロットについて、分子量を、各タンパク質の隣の括弧内にｋＤａで示す。
【図２１】ＣＱが、Ａｋｔｉ-１／２と組合せて、ミトコンドリア膜脱分極及び細胞ＲＯＳ蓄積を促進することを示す。(Ａ)ＣＱによるＡｋｔｉ-１／２-誘導性ミトコンドリア脱分極の向上。０．５％のＦＢＳにおいて培養されたＰＣ３細胞を、ＤＭＳＯ、３μＭのＡｋｔｉ-１／２、１０μＭのＣＱ、又は双方で処理し、種々の時点で、ＭｉｔｏＰＴ染料(Immunochemistry Technologies, LLC)で染色した。４８時間目の画像を示す。健康なミトコンドリアは、ＪＣ-１凝集体の点状赤色染色を示し(ＭｉｔｏＰＴ-Ｒ)、脱分極したミトコンドリアを有する細胞は、ＪＣ-１モノマーの散在性グリーン染色を示す(ＭｉｔｏＰＴ-Ｇ)。また、レッドとグリーンのチャンネルの間の混合画像も示す(ＭｉｔｏＰＴ-Ｍ)。スケールバー：２０μｍ。(Ｂ)(Ａ)において記載された処理からの、赤色点状染色とグリーン散在性染色を示す細胞のパーセンテージ。各処理の蛍光画像の２の無作為領域からの＞８６細胞を計測した。エラーバーは２つの領域の間の標準偏差を表す。(Ｃ)ＣＱ、Ａｋｔｉ及びＡｋｔｉ＋ＣＱにより生成した３-ＭＡ低減ＲＯＳシグナル。０．５％のＦＢＳにおいて培養されたＰＣ３細胞を、３-ＭＡで一晩前処理し、ついで、４８時間、ＤＭＳＯ、５μＭのＡｋｔｉ-１／２、１０μＭのＣＱ、又は双方で処理し、Image-iT LIVE green ROS検出キットで染色した。全ての細胞からの全蛍光強度を、Isocyte (Blueshift Biotechnologies)、レーザースキャンイメージャーを使用して収集した。グリーン蛍光強度を、４８８ｎｍレーザーと、５１０-５４０ｎｍハンドパスフィルターを使用して収集し、４０５ｎｍレーザーと、４３０-４８０ｎｍハンドパスフィルターを使用するヘキスト染色により測定した細胞数に対して規準化した。エラーバー、２の独立した実験の間の標準偏差。(Ｄ）Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００倒立顕微鏡下での、グリーンＲＯＳシグナルと明視野(ＢＦ)の代表的画像。Ａｋｔｉ-１／２は単独で、まず、ＲＯＳレベルにおける均一増加を誘導したが、４８時間までに、蛍光はかなり低減し、オートリソソームに類似した細胞質液胞及び核周囲に局在化した。ＣＱは単独で、ＲＯＳレベルにあまり効果がないが、Ａｋｔｉ-１／２と組合せると、液胞蛍光が長時間増加し、また持続性な均一蛍光を伴った細胞集団が増加し、その多くは４８時間以内にアポトーシスの形態学的徴候を示した。矢印は、液胞蛍光を示す代表的細胞を指し示す。星印は均一なグリーン蛍光を有する代表的細胞を示し、さらにアポトーシス形態を示す。スケールバー：２０μｍ。
【図２２Ａ−Ｃ】図２２は、ＮＡＣが、Ａｋｔｉ＋ＣＱにより誘導される細胞死を救出することを示す。(Ａ)ＮＡＣによる、種々の処理で誘導されたＭｉｔｏＳＯＸレッドシグナルの低減。ＰＣ３細胞を、１日間、５ｍＭのＮＡＣで前処理し、ついで洗浄(ＮＡＣｐｒ)し、提示した薬剤で処理するか、又は１時間、５ｍＭのＮＡＣで前処理し、提示した薬剤と共に、ＮＡＣ(ＮＡＣ)の存在下でインキュベートした。ＭｉｔｏＳＯＸシグナルを、Ａｋｔｉ-１／２添加の２４時間後に、フローサイトメトリーで測定した。５μＭのＡｋｔｉ-１／２と１０μＭのＣＱを使用した。この時点で、ＭｉｔｏＳＯＸレッドシグナルの低減に、連続したＮＡＣ処理が必要である。(Ｂ)(Ａ)のようにして処理された細胞の生存率(ＰＩ排除)を、Ａｋｔｉ-１／２添加の４日後に、フローサイトメトリーで測定した。ＮＡＣ前処理では、Ａｋｔｉ＋ＣＱグループにおける細胞死に、小さな、有意ではない低減を示し、ＮＡＣ連続処理を用いることで、かなりの救出がみられる。(Ａ及びＢ)エラーバーはＳＥＭ(ｎ＝３)を表す。(Ｃ)ＧＦＰ-ＬＣ３を安定して発現するＰＣ３細胞を(Ａ)のようにして処理し、Ａｋｔｉ-１／２添加の４８時間後に、免疫ブロットにより分析した。充填コントロールとして、β-アクチンとＧＡＰＤＨを使用した。ＧＡＰＤＨに対して規準化されたｐ６２と切断ＧＦＰの定量、及びＬＣ３-Ｉに対するＬＣ３-ＩＩの比率を右に示す。Ａｋｔｉは、ｐ６２レベルの低減、ＬＣ３-Ｉ代謝回転の増加(内在性及びＧＦＰ-ＬＣ３-Ｉ)、同時のＬＣ３-ＩＩ及び切断ＧＦＰの蓄積を引き起こした。ＣＱは、オートリソソームにおけるｐ６２分解のブロッキングと一致して、Ａｋｔｉと共に又はそうではなく、ｐ６２のレベルを増加させた。また、ＣＱは、オートリソソームにおけるそれらの分解のブロッキングのために、ＬＣ３-ＩＩ及び切断ＧＦＰの蓄積を誘導した。ＮＡＣ処理は、ＣＱと共に又はそうではなく、Ａｋｔｉにより誘導されるこれらの全ての効果に対抗するが、ｐＡｋｔ又はｐＳ６を阻害するＡｋｔｉの能力に影響は与えなかった。ＮＡＣｐｒはある程度示したが、ＮＡＣの連続処理よりは弱い効果であった。
【図２２Ｄ】(Ｄ)Ａｋｔｉ-１／２添加の２、１１及び２３時間後、５ｍＭのＮＡＣ(Ａｋｔ-１／２の１時間前に添加)の存在又は不在下で、ＤＭＳＯ、３μＭのＡｋｔｉ-１／２で処理されたＧＦＰ-ＬＣ３を安定に発現するＰＣ３細胞のタイムラプス蛍光画像。矢印は可視化ＧＦＰ-ＬＣ３ドットを有する代表的細胞を指し示す。スケールバー：５０μｍ。
【図２３】Ａｋｔアイソフォームを特異的に標的とするｓｈＲＮＡを作製するために使用されるｐＨＵＳＨベクターシステムを示す。ｐＨＵＳＨベクターシステムは、ｓｈＲＮＡ発現シャトルプラスミド(ｐＳｈｕｔｔｌｅ-Ｈ１)、及びウイルスベクター骨格(ｐＨＵＳＨ-ＧＷ；ＧＷ＝Ｇａｔｅｗａｙ)で、Ｔｅｔ-調節ｓｈＲＮＡ発現を可能にするＴｅｔＲ-ＩＲＥＳ-Ｐｕｒｏカセットを含むものを含有する。Ａｋｔ ｓｈＲＮＡベクターを、(１)ｐＳｈｕｔｔｌｅ-Ｈ１において、ｓｈＲＮＡ配列を設計し、クローンし、(２)Ｇａｔｅｗａｙ  (Invitrogen)組換え反応により、ｐＨＵＳＨ-ＧＷにＨ１-ｓｈＲＮＡカセットを移し、(３)レトロウイルスとして、完成したＨ１-ｐＨＵＳＨプラスミドを包装することにより構築した。各ｓｈＲＮＡについて、Ａｋｔ遺伝子(類)のコード化配列に対し、適切なアルゴリズムを使用し、１９ｂｐのｓｉＲＮＡ配列を設計した。ｓｈＲＮＡ配列をｓｈＲＮＡヘアピン配列に転換させ、ついで、対応する二重鎖ＤＮＡオリゴを合成し、示すように、ｐＳｈｕｔｔｌｅ-にクローンした。ｐＳｈｕｔｔｌｅ-Ｈ１ベクターにおける、各ｓｈＲＮＡの有効性を、細胞における一時的形質移入により検証し、各Ａｋｔアイソフォームのノックダウンの程度を、ウエスタンブロットにより調べた。ついで、有効なＨ１-ｓｈＲＮＡカセットをｐＨＵＳＨ-ＧＷベクターに移し、レトロウイルスとして包装した(表１は使用した有効配列の概要である)。各ｓｈＲＮＡを安定して発現する細胞を、ｓｈＲＮＡ-含有ウイルスを単独で又は組合せて用い、レトロウイルス感染により生成させた。Ａｋｔアイソフォームノックダウンについて、各Ａｋｔアイソフォームを単独で標的とするｓｈＲＮＡコンストラクトをコードする、１のレトロウイルスベクターで感染させ(Ａｋｔ１についてコンストラクト２５２及び２５３、Ａｋｔ２について２５４及び２５５、Ａｋｔ３について２５９及び２６０)、安定したクローンを、５ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを使用して選択した。二重Ａｋｔ１及びＡｋｔ２ノックダウンについて、Ａｋｔ１及び２の双方を同時に標的する単一のｓｈＲＮＡ(コンストラクト２５６及び２５７)を使用した。二重Ａｋｔ２及び３(コンストラクト２５５及び２６１)、又は三重Ａｋｔ１、２及び３(コンストラクト２５７及び２６１)ノックダウンを、それぞれ単一のｓｈＲＮＡをコードする種々の抗生物質選択マーカー(ピューロマイシン及びハイグロマイシン)を含有する２のレトロウイルスウイルスを用い、細胞を同時感染させることにより成し遂げ、安定したクローンを、５ｍｇ／ｍｌのピューロマイシン及び３００ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを使用して選択した。二重Ａｋｔ１及び３ノックダウンについて、Ａｋｔ１及び３(コンストラクト２５８)の双方を標的とする単一のｓｈＲＮＡのいずれか、又は２のｓｈＲＮＡベクター(コンストラクト２５３及び２６１)を用いた同時感染を使用した(表２)。表２に示す全てのｓｈＲＮＡは、培養細胞において有効であった。異種移植モデルにおいて有効なｓｈＲＮＡの有効性及び腫瘍阻害効果を表３にまとめる。
【図２４】Ａｋｔ阻害剤とクロロキンとの組合せにより誘導される細胞死のメカニズムのモデルを示す。Ａｋｔ阻害剤単独(ｓｈＲＮＡ、特異的Ａｋｔ阻害剤又はクラスＩＰＩ３Ｋ阻害剤による)は、ＡｋｔのｍＴＯＲＣ１活性下流の低減(Corradetti MN, Guan KL. Upstream of the mammalian target of rapamycin: do all roads pass through mTOR Oncogene (2006); 25:6347-60)、ＦｏｘＯタンパク質の活性の増加(Zhao J, Brault JJ, Schild A, Goldberg AL. Coordinate activation of autophagy and the proteasome pathway by foxO transcription factor, Autophagy (2008); 4:378-80)、及びグルコース及びエネルギー代謝の低減を含む、複数のメカニズムを介して、オートファジーを活性化することができる。また我々は、Ａｋｔノックダウン及び阻害を有する細胞において、異常なミトコンドリアの蓄積及びＥＲストレスの徴候(未発表データ)を観察しており、双方がオートファジーを誘導可能である。(Yorimitsu T, Klionsky DJ. Endoplasmic reticulum stress: a new pathway to induce autophagy. Autophagy (2007); 3:160-2)。異常なミトコンドリアはＲＯＳシグナルを生成可能で、ダメージを受けたミトコンドリアのオートファジー的除去性の上昇、及び酸化ストレスの減衰に至る。３-メチルアデニン(３-ＭＡ)、及びクラスＩＩＩのＰＩ３Ｋを阻害する他の非選択的パン-ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばワートマニン又はＬＹ２９４００２は、アオートファジーの誘導をブロックする。ＣＱに起因する損傷を受けたオートリソソーム分解(又はリソソーム酵素分解の他の阻害剤)により、ＲＯＳダメージをさらに増幅させる有害なＲＯＳジェネレーターの凝集が生じうる。複数の下流事象が、アポトーシス様及び非アポトーシス様細胞死に至らしめる可能性がある。Ａｋｔ阻害単独により誘導されるオートファジー反応により、いくつかの細胞は、最終的に細胞死に直接至る、又は付加的な発作が必要される可能性がある。
【図２５】図２５Ａ−Ｅは、Ａｋｔ阻害剤、ＣＱ及びそれらの組合せで処理されたＰＣ３細胞におけるＡＶ蓄積を示す。(パネルＡ-Ｃ)：０．５％のＦＢＳ下で増殖したＰＣ３細胞を、(Ａ)ＤＭＳＯコントロール、(Ｂ)１０μＭのＣＱ、及び(Ｃ)５μＭのＡｋｔｉ-１／２で１日処理した。ＣＱ及びＡｋｔｉ-１／２は単独でＡＶの蓄積を誘導した(矢印)。(パネルＤ-Ｅ)：Ａｋｔｉ１,２及びＣＱの併用処理により、より大きなＡＶの蓄積、及びアポトーシス核の出現に至る。(Ｄ)処理の１日後、多くの細胞は、非常に大きなＡＶ(矢印)、膨張したＥＲ槽(矢印)、及び見かけ大きく液胞化したもの(小さい矢印)を含む。(Ｅ)処理の２日後、アポトーシスはかなりの割合の細胞に現れた(星印)。スケールバー、２μｍ。
【図２６Ａ】図２６Ａ−Ｂは、複数の細胞株において、ＣＱ単独、ＡＫＴｉ ＩＩＩ-４単独、及びそれらの組合せについて測定されたＥＤ５０を示す。図２６Ａは、ＣＱ及びＡＫＴｉについての化合物比率のワークテーブルを示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、１０％血清での処理の４日目、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより得られたデータについての棒グラフを使用することによるＣＩ(組合せ指標)を示す。Ｘ軸は細胞株を示し、Ｙ軸はμＭでの濃度を示す。ＣＱとＡＫＴｉの組合せは、ＡＫＴｉとＣＱの双方について、ＥＤ５０を低下させた。
【図２７Ａ】図２７Ａ−Ｂは、ＰＣ３(ＰＴＥＮ-、ｐ５３-及びＡｌ)細胞株についてのデータを示す。図２７Ａは、ＡＫＴｉ ＩＩＩ-４及びＣＱが様々な組合せられた場合の、ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０でのＣＩ値を示す。データは、それぞれ最も低いＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０値を有する、５：１〜１：８００の範囲でのＩＩＩ-４：ＣＱの組合せ比率を示し、それぞれ約１：１．５〜約１：２００の比率、約１：３〜約１：５０の範囲の代替比率、さらに約１：１２〜約１：５０の代替比率、特に約１：２５の比率である。
【図２７Ｂ】２７Ｂは、ＡＫＴｉ ＩＩ-４単独、ＣＱ単独、及びＡＫＴｉとＣＱとの組合せを、１：２５の比率で投与した増殖阻害曲線を示す(おおよそＥＣ５０比率)。Ｘ軸はμＭでのＩＩＩ-４濃度を示し、Ｙ軸はコントロール％を示す。データは、組合せで、ＩＩＩ-４単独又はＣＱ単独のいずれかよりも、より低いＩＩＩ-４濃度で、細胞株での増殖を阻害することを示す。
【図２８Ａ】図２８Ａ−Ｂは、ＭＤＡ-３６１．１(ＰＩ２-Ｋ ｍｕｔ (Ｅ５４５Ｋ)、Ｈｅｒ２＋、ＨＲ＋及びＬｕｍｉｎａｌ)細胞株についてのデータを示す。図２８Ａは、ＡＫＴｉ ＩＩＩ-４及びＣＱが様々な組合せられた場合の、ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０でのＣＩ値を示す。データは、それぞれ最も低いＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０値を有する、５：１〜１：８００の範囲でのＩＩＩ-４：ＣＱの組合せ比率を示し、それぞれ約１：１．５〜約１：２００の比率、約１：３〜約１：２５の範囲の代替比率、特に約１：１２．５の比率である。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ＡＫＴｉ ＩＩ-４単独、ＣＱ単独、及びＡＫＴｉとＣＱとの組合せを、１：１２．５の比率で投与した増殖阻害曲線を示す(おおよそＥＣ５０比率)。Ｘ軸はμＭでのＩＩＩ-４濃度を示し、Ｙ軸はコントロール％を示す。データは、組合せで、ＩＩＩ-４単独又はＣＱ単独のいずれかよりも、より低いＩＩＩ-４濃度で、細胞株での増殖を阻害することを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａ−Ｂは、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１(Ｋｒａｓ、Ｂｒａｆ、ｐ５３ ｍｕｔ、Ｔｒｉｐｌｅ-及びＢａｓａｌ)細胞株についてのデータを示す。図２９Ａは、ＡＫＴｉ ＩＩＩ-４及びＣＱが様々な組合せられた場合の、ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０でのＣＩ値を示す。データは、それぞれ最も低いＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０値を有する、５：１〜１：８００の範囲でのＩＩＩ-４：ＣＱの組合せ比率を示し、それぞれ約２．５：１〜約１：１：３の比率、特に約１．２５：１の比率である。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ＡＫＴｉ ＩＩ-４単独、ＣＱ単独、及びＡＫＴｉとＣＱとの組合せを、１．２５：１の比率で投与した増殖阻害曲線を示す(おおよそＥＣ５０比率)。Ｘ軸はμＭでのＩＩＩ-４濃度を示し、Ｙ軸はコントロール％を示す。データは、組合せで、ＩＩＩ-４単独又はＣＱ単独のいずれかよりも、より低いＩＩＩ-４濃度で、細胞株での増殖を阻害することを示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ−Ｂは、Ｕ８７ＭＧ(ＰＴＥＮ-、ＰＩ３Ｋ ｍｕｔ(Ｉ３９１Ｍ))細胞株についてのデータを示す。図３０Ａは、ＡＫＴｉ ＩＩＩ-４及びＣＱが様々な組合せられた場合の、ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０でのＣＩ値を示す。データは、それぞれ最も低いＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０値を有する、５：１〜１：８００の範囲でのＩＩＩ-４：ＣＱの組合せ比率を示し、それぞれ約２．５：１〜約１：２５の比率、約１．２５：１〜約１：３の範囲の代替比率、特に約１：１．５の比率である。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＡＫＴｉ ＩＩ-４単独、ＣＱ単独、及びＡＫＴｉとＣＱとの組合せを、１：１．５の比率で投与した増殖阻害曲線を示す(最小ＣＩを有するおおよそＥＣ５０比率)。Ｘ軸はμＭでのＩＩＩ-４濃度を示し、Ｙ軸はコントロール％を示す。データは、組合せで、ＩＩＩ-４単独又はＣＱ単独のいずれかよりも、より低いＩＩＩ-４濃度で、細胞株での増殖を阻害することを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａ−Ｃは、Ｐａｎｃ-１(Ａｋｔ２ ａｍｐ、Ｋｒａｓ ｍｕｔ、ｐ５３ ｍｕｔ)細胞株についてのデータを示す。図３１Ａは、ＡＫＴｉ ＩＩＩ-４及びＣＱが様々な組合せられた場合の、ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０でのＣＩ値を示す。データは、それぞれ最も低いＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０値を有する、５：１〜１：８００の範囲でのＩＩＩ-４：ＣＱの組合せ比率を示し、それぞれ約２．５：１〜約１：１．３の比率、特に約１．２５：１の比率である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＡＫＴｉ ＩＩ-４単独、ＣＱ単独、及びＡＫＴｉとＣＱとの組合せを、１．２８：１の比率で投与した増殖阻害曲線を示す(最小ＣＩを有するおおよそＥＣ５０比率)。Ｘ軸はμＭでのＩＩＩ-４濃度を示し、Ｙ軸はコントロール％を示す。データは、組合せで、ＩＩＩ-４単独又はＣＱ単独のいずれかよりも、より低いＩＩＩ-４濃度で、細胞株での増殖を阻害することを示す。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＡＫＴｉ ＩＩ-４単独、ＣＱ単独、及びＡＫＴｉとＣＱとの組合せを、１：１．５６の比率で投与した増殖阻害曲線を示す(最小ＣＩを有するおおよそＥＣ１０比率)。Ｘ軸はμＭでのＩＩＩ-４濃度を示し、Ｙ軸はコントロール％を示す。データは、組合せで、ＩＩＩ-４単独又はＣＱ単独のいずれかよりも、より低いＩＩＩ-４濃度で、細胞株での増殖を阻害することを示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、５３７ＭＥＬメラノーマ細胞株及びＳＫＢＲ３乳癌細胞株のアクリジンオレンジ染色により測定された、付与化合物での処理の２４時間後の、各化合物をＣＱと組合せた場合の、オートファジー誘導とアポトーシス誘導との間の相関関係を表すデータを示す。コントロールはＤＭＳＯである。テストされた化合物は、１-(１-(４-(７-フェニル-１Ｈ-イミダゾ[４,５-ｇ]キノキサリン-６-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-４)、３-フェニル-２-(４-((４-(５-(ピリジン-２-イル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル)メチル)フェニル)-１,６-ナフチリジン-５(６Ｈ)-オン(ＩＩ-３)、(Ｓ)-２-(４-クロロフェニル)-１-(４-((５Ｒ,７Ｒ)-７-ヒドロキシ-５-メチル-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-シクロペンタ[ｄ]ピリミジン-４-イル)ピペラジン-１-イル)-３-(イソプロピルアミノ)プロパン-１-オン(ＩＩＩ-４)、４-(２-(１Ｈ-インダゾール-４-イル)-６-((４-(メチルスルホニル)ピペラジン-１-イル)メチル)チエノ[３,２-ｄ]ピリミジン-４-イル)モルホリン(ＩＩＩ-６)、(Ｒ)-Ｎ-(２,３-ジヒドロキシプロポキシ)-３,４-示フルオロ-２-(２-フルオロ-４-ヨードフェニルアミノ)ベンズアミド(ＶＩＩ)、(Ｓ)-１-エチル-３-(４-(４-(３-メチルモルホリノ)-７-(ピリミジン-２-イル)-５,６,７,８-テトラヒドロピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-２-イル)フェニル)ウレア(ＩＩＩ-２ａ)及びラパマイシンである。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、５３７ＭＥＬメラノーマ細胞株及びＳＫＢＲ３乳癌細胞株のアクリジンオレンジ染色により測定された、付与化合物での処理の２４時間後の、各化合物をＣＱと組合せた場合の、オートファジー誘導とアポトーシス誘導との間の相関関係を表すデータを示す。コントロールはＤＭＳＯである。テストされた化合物は、１-(１-(４-(７-フェニル-１Ｈ-イミダゾ[４,５-ｇ]キノキサリン-６-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-４)、３-フェニル-２-(４-((４-(５-(ピリジン-２-イル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル)メチル)フェニル)-１,６-ナフチリジン-５(６Ｈ)-オン(ＩＩ-３)、(Ｓ)-２-(４-クロロフェニル)-１-(４-((５Ｒ,７Ｒ)-７-ヒドロキシ-５-メチル-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-シクロペンタ[ｄ]ピリミジン-４-イル)ピペラジン-１-イル)-３-(イソプロピルアミノ)プロパン-１-オン(ＩＩＩ-４)、４-(２-(１Ｈ-インダゾール-４-イル)-６-((４-(メチルスルホニル)ピペラジン-１-イル)メチル)チエノ[３,２-ｄ]ピリミジン-４-イル)モルホリン(ＩＩＩ-６)、(Ｒ)-Ｎ-(２,３-ジヒドロキシプロポキシ)-３,４-示フルオロ-２-(２-フルオロ-４-ヨードフェニルアミノ)ベンズアミド(ＶＩＩ)、(Ｓ)-１-エチル-３-(４-(４-(３-メチルモルホリノ)-７-(ピリミジン-２-イル)-５,６,７,８-テトラヒドロピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-２-イル)フェニル)ウレア(ＩＩＩ-２ａ)及びラパマイシンである。
【図３３Ａ−Ｄ】図３３Ａ−Ｄは、提示した化合物単独で、又は１０μＭのＣＱと組合せて処理し、Ａｎｎｅｚｉｎ Ｖ(ＡｎｎＶ)及びヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色により測定された、５３７ＭＥＬメラノーマ及びＳＫＢＲ３乳癌細胞における、アポトーシス誘導の用量反応曲線を示す。
【図３３Ｅ−Ｇ】図３３Ｅ−Ｇは、提示した化合物単独で、又は１０μＭのＣＱと組合せて処理し、Ａｎｎｅｚｉｎ Ｖ(ＡｎｎＶ)及びヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色により測定された、５３７ＭＥＬメラノーマ及びＳＫＢＲ３乳癌細胞における、アポトーシス誘導の用量反応曲線を示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、５３７ＭＥＬメラノーマ細胞株及びＳＫＢＲ３乳癌細胞株のアクリジンオレンジ染色により測定された、付与化合物での処理の２４時間後の、各化合物をＣＱと組合せた場合の、オートファジー誘導とアポトーシス誘導との間の相関関係を表すデータを示す。コントロールはＤＭＳＯである。テストされた化合物は、１-(１-(４-(７-フェニル-１Ｈ-イミダゾ[４,５-ｇ]キノキサリン-６-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-４)、３-フェニル-２-(４-((４-(５-(ピリジン-２-イル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル)メチル)フェニル)-１,６-ナフチリジン-５(６Ｈ)-オン(ＩＩ-３)、(Ｓ)-２-(４-クロロフェニル)-１-(４-((５Ｒ,７Ｒ)-７-ヒドロキシ-５-メチル-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-シクロペンタ[ｄ]ピリミジン-４-イル)ピペラジン-１-イル)-３-(イソプロピルアミノ)プロパン-１-オン(ＩＩＩ-４)、４-(２-(１Ｈ-インダゾール-４-イル)-６-((４-(メチルスルホニル)ピペラジン-１-イル)メチル)チエノ[３,２-ｄ]ピリミジン-４-イル)モルホリン(ＩＩＩ-６)、(Ｒ)-Ｎ-(２,３-ジヒドロキシプロポキシ)-３,４-示フルオロ-２-(２-フルオロ-４-ヨードフェニルアミノ)ベンズアミド(ＶＩＩ)、(Ｓ)-１-エチル-３-(４-(４-(３-メチルモルホリノ)-７-(ピリミジン-２-イル)-５,６,７,８-テトラヒドロピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-２-イル)フェニル)ウレア(ＩＩＩ-２ａ)及びラパマイシンである。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、５３７ＭＥＬメラノーマ細胞株及びＳＫＢＲ３乳癌細胞株のアクリジンオレンジ染色により測定された、付与化合物での処理の２４時間後の、各化合物をＣＱと組合せた場合の、オートファジー誘導とアポトーシス誘導との間の相関関係を表すデータを示す。コントロールはＤＭＳＯである。テストされた化合物は、１-(１-(４-(７-フェニル-１Ｈ-イミダゾ[４,５-ｇ]キノキサリン-６-イル)ベンジル)ピペリジン-４-イル)-１Ｈ-ベンゾ[ｄ]イミダゾール-２(３Ｈ)-オン(ＩＩ-４)、３-フェニル-２-(４-((４-(５-(ピリジン-２-イル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル)メチル)フェニル)-１,６-ナフチリジン-５(６Ｈ)-オン(ＩＩ-３)、(Ｓ)-２-(４-クロロフェニル)-１-(４-((５Ｒ,７Ｒ)-７-ヒドロキシ-５-メチル-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-シクロペンタ[ｄ]ピリミジン-４-イル)ピペラジン-１-イル)-３-(イソプロピルアミノ)プロパン-１-オン(ＩＩＩ-４)、４-(２-(１Ｈ-インダゾール-４-イル)-６-((４-(メチルスルホニル)ピペラジン-１-イル)メチル)チエノ[３,２-ｄ]ピリミジン-４-イル)モルホリン(ＩＩＩ-６)、(Ｒ)-Ｎ-(２,３-ジヒドロキシプロポキシ)-３,４-示フルオロ-２-(２-フルオロ-４-ヨードフェニルアミノ)ベンズアミド(ＶＩＩ)、(Ｓ)-１-エチル-３-(４-(４-(３-メチルモルホリノ)-７-(ピリミジン-２-イル)-５,６,７,８-テトラヒドロピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-２-イル)フェニル)ウレア(ＩＩＩ-２ａ)及びラパマイシンである。
【図３５Ａ−Ｄ】図３５Ａ−Ｄは、提示した化合物単独で、又は１０μＭのＣＱと組合せて処理し、Ａｎｎｅｚｉｎ Ｖ(ＡｎｎＶ)及びヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色により測定された、５３７ＭＥＬメラノーマ及びＳＫＢＲ３乳癌細胞における、アポトーシス誘導の用量反応曲線を示す。
【図３５Ｅ−Ｇ】図３５Ｅ−Ｇは、提示した化合物単独で、又は１０μＭのＣＱと組合せて処理し、Ａｎｎｅｚｉｎ Ｖ(ＡｎｎＶ)及びヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色により測定された、５３７ＭＥＬメラノーマ及びＳＫＢＲ３乳癌細胞における、アポトーシス誘導の用量反応曲線を示す。
【０００８】
上述した図において、化合物とＣＱとを組合せた場合に、オートファジー誘導とアポトーシス誘導との間に、正の相関が示される。オートファジーを誘導しない化合物(ＶＩＩ)のケースにおいて、ＣＱと組合せた場合に、相乗的アポトーシス誘導は示されなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
「腫瘍」なる用語は、「癌」及び「癌性」を含み、典型的には調節されない細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか又は記載する。「腫瘍」は一又は複数の癌細胞を含む。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、骨髄腫、及び白血病又はリンパ性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定な例には、扁平上皮細胞癌(例えば上皮扁平細胞癌)、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌(「ＮＳＣＬＣ」)、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric又はstomach)、例えば胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌(kidney又はrenal)、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌が含まれる。一実施態様において、腫瘍は解糖系依存性癌以外のものである。他の実施態様において、腫瘍は前立腺癌、乳癌、グリオーマ、又は膵臓癌である。他の実施態様において、腫瘍はＰＴＥＮ又はＰＩ３Ｋ変異を含む。他の実施態様において、腫瘍はＡｋｔキナーゼ経路の阻害剤に対して耐性がある。
【００１０】
ここで使用される「アルキル」なる用語は、１ないし１２の炭素原子の飽和直鎖状又は分枝鎖の一価炭化水素基を称し、ここでアルキル基は、以下に記載する一又は複数の置換基で、独立して置換されていてもよい。アルキル基の例には、限定されないが、メチル(Ｍｅ，-ＣＨ３)、エチル(Ｅｔ，-ＣＨ２ＣＨ３)、１-プロピル(ｎ-Ｐｒ，ｎ-プロピル，-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２-プロピル(ｉ-Ｐｒ，ｉ-プロピル，-ＣＨ(ＣＨ３)２)、１-ブチル(ｎ-Ｂｕ，ｎ-ブチル，-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２-メチル-１-プロピル(ｉ-Ｂｕ，ｉ-ブチル，-ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２)、２-ブチル(ｓ-Ｂｕ，ｓ-ブチル，-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３)、２-メチル-２-プロピル(ｔ-Ｂｕ，ｔ-ブチル，-Ｃ(ＣＨ３)３)、１-ペンチル(ｎ-ペンチル，-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２-ペンチル(-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、３-ペンチル(-ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)２)、２-メチル-２-ブチル(-Ｃ(ＣＨ３)２ＣＨ２ＣＨ３)、３-メチル-２-ブチル(-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＣＨ３)２)、３-メチル-１-ブチル(-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２)、２-メチル-１-ブチル(-ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３)、１-ヘキシル(-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２-ヘキシル(-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、３-ヘキシル(-ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)(ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３))、２-メチル-２-ペンチル(-Ｃ(ＣＨ３)２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、３-メチル-２-ペンチル(-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３)、４-メチル-２-ペンチル(-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２)、３-メチル-３-ペンチル(-Ｃ(ＣＨ３)(ＣＨ２ＣＨ３)２)、２-メチル-３-ペンチル(-ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)ＣＨ(ＣＨ３)２)、２,３-ジメチル-２-ブチル(-Ｃ(ＣＨ３)２ＣＨ(ＣＨ３)２)、３,３-ジメチル-２-ブチル(-ＣＨ(ＣＨ３)Ｃ(ＣＨ３)３、１-ヘプチル、１-オクチル等々が含まれる。
【００１１】
「アルケニル」なる用語は、少なくとも一の不飽和部位、つまり炭素−炭素、ｓｐ２二重結合を有する２ないし１２の炭素原子の直鎖状又は分枝鎖状の一価炭化水素基を称し、ここで、アルケニル基は、ここに記載の一又は複数の置換基で、独立して置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、又は「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基を含む。例には、限定されないが、エチレニル又はビニル(-ＣＨ=ＣＨ２)、アリル(-ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２)等々が含まれる。
【００１２】
「アルキニル」なる用語は、少なくとも一の不飽和部位、つまり炭素−炭素、ｓｐ三重結合を有する２ないし１２の炭素原子(Ｃ２-Ｃ８)の直鎖状又は分枝鎖状の一価炭化水素基を称し、ここで、アルキニル基は、ここに記載の一又は複数の置換基で、独立して置換されていてもよい。例には、限定されないが、エチニル(-Ｃ≡ＣＨ)、プロピニル(プロパルギル，-ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ)等々が含まれる。
【００１３】
「炭素環」、「カルボシクリル」、「環状炭素」及び「シクロアルキル」という用語は、単環として３ないし１２の炭素原子、又は二環として７ないし１２の炭素原子を有する一価の非芳香族の飽和又は部分的に不飽和の環を指す。７ないし１２の原子を有する二環式炭素環は、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]又は[６,６]系として配置され得、９又は１０の環原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ[５,６]又は[６,６]系として、又はビシクロ[２.２.１]ヘプタン、ビシクロ[２.２.２]オクタン及びビシクロ[３.２.２]ノナンのような架橋系として配置され得る。単環式炭素環の例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１-シクロペンタ-１-エニル、１-シクロペンタ-２-エニル、１-シクロペンタ-３-エニル、シクロヘキシル、１-シクロヘキサ-１-エニル、１-シクロヘキサ-２-エニル、１-シクロヘキサ-３-エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシル等々が含まれる。
【００１４】
「アリール」又は「芳香族」は、親芳香族環系の単一炭素原子から一つの水素原子を取り除くことによって誘導される６-２０の炭素原子の一価芳香族炭化水素基を意味する。幾つかのアリール基は「Ａｒ」として例示構造において表される。アリールは飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環又は複素環に縮合した芳香族環を含む二環式基を含む。典型的なアリール基には、限定されないが、ベンゼン(フェニル)、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、インデニル、インダニル、１,２-ジヒドロナフタレン、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル等々が含まれる。アリール基は、ここに記載の一又は複数の置換基で、独立して置換されていてもよい。
【００１５】
「複素環」、「ヘテロシクリル」及び「複素環式環」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、少なくとも一の環原子が、窒素、酸素、及び硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子がＣであり、一又は複数の環原子は以下に記載の一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい、３ないし２０の環原子の飽和、部分的不飽和(つまり、環内に一又は複数の二重及び／又は三重結合を有する)又は芳香族炭素環式基を指す。複素環は、３から７の環員(２から６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１から４のヘテロ原子)を有する単環、又は７から１０の環員(４から９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１から６のヘテロ原子)を有する二環、例えば、ビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]、又は[６,６]系でありうる。複素環は、Paquette, Leo A.;「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に１、３、４、６、７、及び９章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」(John Wiley & Sons,New York, 1950 to present)、特に１３、１４、１６、１９、及び２８巻；及びJ. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載されている。「複素環」なる用語はヘテロシクロアルコキシを含む。「ヘテロシクリル」はまた、複素環基が、飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環又は複素環式環と縮合した基を含む。複素環式環の例には、限定されないが、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２-ピロリニル、３-ピロリニル、インドリニル、２Ｈ-ピラニル、４Ｈ-ピラニル、ジオキサニル、１,３-ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、３-アザビシクロ[３.１.０]ヘキサニル、３-アザビシクロ[４.１.０]ヘプタニル、アザビシクロ[２.２.２]ヘキサニル、３Ｈ-インドリルキノリジニル及びＮ-ピリジルウレアが含まれる。スピロ部分がまたこの定義の範囲内に含まれる。２の環原子がオキソ(=Ｏ)部分で置換されている複素環基の例はピリミジノニル及び１,１-ジオキソチオモルホリニルである。ここで複素環基は、ここに記載の一又は複数の置換基で、独立して置換されていてもよい。
【００１６】
「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」なる用語は、５-、６-又は７員の環の一価芳香族基を称し、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される一又は複数のヘテロ原子を含む５-２０原子の縮合環系(少なくとも一が芳香族)を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル(例えば２-ヒドロキシピリジニルを含む)、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル(例えば４-ヒドロキシピリミジニルを含む)、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。ヘテロアリール基は、ここに記載の一又は複数の置換基で、独立して置換されていてもよい。
【００１７】
複素環又はヘテロアリール基は、それが可能な場合、炭素(炭素連結)、窒素(窒素連結)又は酸素(酸素連結)結合でありうる。例を挙げると、限定ではないが、炭素結合複素環又はヘテロアリールはピリジンの２、３、４、５、又は６位、ピリダジンの３、４、５、又は６位、ピリミジンの２、４、５、又は６位、ピラジンの２、３、５、又は６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、又はテトラヒドロチオピロールの２、３、４、又は５位、オキサゾール、イミダゾール又はチアゾールの２、４、又は５位、イソオキサゾール、ピラゾール、又はイソチアゾールの３、４、又は５位、アジリジンの２又は３位、アゼチジンの２、３、又は４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、又は８位、又はイソキノリンの１、３、４、５、６、７、又は８位で結合する。
【００１８】
「治療する」及び「治療」なる用語は、治癒的治療と、所望しない生理学的変化又は疾患、例えば癌の成長、発症又は広がりを防止し又は遅延させる(少なくする)ことである予防的又は防止的手段の双方を指す。一実施態様において、「治療する」及び「治療」なる用語は、所望しない生理学的変化又は疾患、例えば癌の成長、発症又は広がりを防止し又は遅延させる(少なくする)ことである治癒的治療を指す。この発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果は、限定するものではないが、検出可能であれ検出不可能であれ、徴候の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化(つまり悪化しない)状態、又は疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解(部分的又は完全)を含む。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して生存を延長することを意味しうる。治療を必要とするものは、既に症状又は疾患を持つ者並びに症状又は疾患になりやすい者又は症状又は疾患が防止される者を含む。
【００１９】
ここで使用される場合「解糖系依存性癌」とは、オートファジーにより得られうるエネルギーを除く本質的にその全てのエネルギーをグルコース代謝に依存している癌細胞により特徴付けられる癌のことを意味する。解糖系依存性癌の癌細胞は、ある程度のレベルの非解糖系代謝は可能であるが、このようなレベルでは、グルコースエネルギー源の不在下で、癌細胞のアポトーシス又はオートファジーによる細胞死を防止しない。癌が解糖系に依存するかどうかを決定する様々な方法が存在する。腫瘍サンプルを切除し、細胞が解糖系に依存しているかどうかを決定する、いくつかのよく知られたアッセイの任意の一つにより、インビトロで検査することができる。このような方法は、細胞が好気性又は嫌気性の解糖系を利用するか決定することができる。検出のためのマーカーとして、ＦＤＧ-ＰＥＴスキャン技術は、高レベルのグルコース取込を使用する。検出可能なグルコース誘導体１８-フルオロ-２-デオキシグルコースを取り込む癌細胞は、患者の解剖所見のコンピュータ画像に位置させることができる。ＦＤＧ-ＰＥＴスキャン技術で検出可能なそれらの癌は、解糖系に高度に依存しているように思われる。
【００２０】
「治療的有効量」なる語句は、(ｉ)特定の疾病、症状、又は疾患を治療する、(ｉｉ)特定の疾病、症状、又は疾患の一又は複数の徴候を減弱にし、寛解させ、又は除く、又は(ｉｉｉ)ここに記載された特定の疾病、症状、又は疾患の一又は複数の徴候の発症を予防し又は遅延させる、本発明の化合物の量を意味する。癌の場合、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し(つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ)；腫瘍転移を阻害し(つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ)；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は癌に伴う徴候の一又は複数をある程度軽減しうる。薬剤が増殖を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させうる程度まで、それは細胞分裂阻害性及び／又は細胞毒性でありうる。癌治療では、効能は、例えば無増悪期間(ＴＴＰ)を評価し、及び／又は奏功率(ＲＲ)を決定することにより測定することができる。
【００２１】
「哺乳動物」なる用語は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、及びヒツジ、及び家禽を含む。
【００２２】
ここで使用される「製薬的に許容可能な塩」なる語句は、本発明の化合物の製薬的に許容可能な有機又は無機塩を指す。例示的な塩には、限定されるものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸ホスフェート、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸シトレート、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩(つまり、１,１'-メチレン-ビス-(２-ヒドロキシ-３-ナフトエート))塩が含まれる。製薬的に許容可能な塩は、アセテートイオン、スクシネートイオン又は他の対イオンのような他の分子を含みうる。対イオンは親化合物上の電荷を安定化する任意の有機又は無機部分でありうる。さらに、製薬的に許容可能な塩は、その構造中に一を越える荷電原子を有しうる。複数の荷電原子が製薬的に許容可能な塩の一部である場合は、複数の対イオンを有しうる。よって、製薬的に許容可能な塩は一又は複数の荷電原子及び／又は一又は複数の対イオンを有しうる。
【００２３】
本発明の化合物が塩基である場合、所望の製薬的に許容可能な塩は、当該分野で利用できる任意の適切な方法、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸等のような無機酸で、又は例えば酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸、例えばグルクロン酸又はガラクツロン酸、αヒドロキシ酸、例えばクエン酸又は酒石酸、アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸、芳香族酸、例えば安息香酸又はケイ皮酸、スルホン酸、例えばｐ-トルエンスルホン酸又はエタンスルホン酸等のような有機酸での遊離塩基の処理によって調製することができる。塩基性の薬学的化合物から、製薬的に有用な又は許容可能な塩を形成させるのに適切であると一般的に考えられている酸は、例えば、P. Stahlら, Camille G. (eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH; S. Bergeら, Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1 19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201 217; Andersonら, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, (1995) Mack Publishing Co., Easton PA; and in The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. on their website)により論議されている。これらの開示は、参照としてここに導入される。
【００２４】
本発明の化合物が酸である場合、所望の製薬的に許容可能な塩は、任意の適切な方法、例えば無機又は有機塩基、例えばアミン(第１級、第２級又は第３級)、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物等での遊離酸の処理によって調製することができる。適切な塩を例証する例には、限定されないが、アミノ酸、例えばグリシン及びアルギニン、アンモニア、第１級、第２級、及び第３級アミン、及び環状アミン、例えばピペリジン、モルホリン及びピペラジンから誘導される有機塩、及びナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム及びリチウムから誘導される無機塩が含まれる。
【００２５】
「製薬的に許容可能な」なる語句は、物質又は組成物が、製剤に含有される他の成分、及び／又はそれで治療されている哺乳動物と、化学的に及び／又は毒物学的に適合性があることを示している。
【００２６】
「実質的に相当」なる語句は、配列が、公知又は標的の配列と重要ではない程度の変動を有することを意味する。一例において、配列は、公知又は標的の配列と、約８０％の相同性を有する。他の例において、配列は８５％の相同性を有する。他の例において、配列は、９０、１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又はそれ以上の％相同性を有する。方法は、％相同性を決定するために、当該技術で公知である。
【００２７】
「溶媒和物」は一又は複数の溶媒分子と本発明の化合物の物理的結合体又は複合体を指す。本発明の化合物は、溶媒和していない、又は溶媒和した形態で存在してよい。溶媒和物を形成する溶媒の例には、限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが含まれる。「水和物」なる用語は、溶媒分子が水である複合体を指す。この物理的結合には、水素結合を含む、イオン結合及び共有結合が、種々の程度で含まれる。ある例において、溶媒和物は、結晶性固体の結晶格子に、一又は複数の溶媒分子が組み込まれた場合に単離可能である。溶媒和物の調製は、一般的に、例えば、M. Cairaら, J. Pharmaceutical Sci., 93(3), 601 611 (2004)において公知である。溶媒和物、半溶媒和物、水和物等の同様の調製は、E. C. van Tonderら, AAPS PharmSciTech., 5(1), article 12 (2004); 及び A. L. Binghamら, Chem. Commun., 603 604 (2001)に記載されている。典型的には、非限定的プロセスは、所望の量の所望の溶媒(有機物又は水又はその混合物)に、本発明の化合物を周囲温度よりも高い温度で溶解させる、結晶を形成させるのに十分な速度で溶液を冷却し、ついで、標準的な方法で単離することを含む。分析技術、例えばＩ.Ｒ.分光法は、溶媒和物(又は水和物)として、結晶における溶媒(又は水)の存在を示す。
【００２８】
ここで使用される場合、「相乗」なる用語は、２又はそれ以上の単一薬剤の付加的効果よりも、さあに効果的である治療の組合せを指す。オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤と、オートファジーの一又は複数の阻害剤との間の相乗作用は、ここに記載のアッセイから得られた結果に基づいている。相乗効果は、活性成分が：（１）同時処方され、併用された単位投薬製剤として同時に投与又は送達され；（２）別個の製剤として交互に又は平行して送達される場合；又は（３）ある種の他のレジメンによって、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別個にシリンジにおいて、異なった注射によって逐次的に投与され又は送達されるときに達成できる。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効用量が逐次的、つまり連続的に投与される一方、併用療法では２又はそれ以上の活性成分の有効用量が併せて投与される。ここで提供される組合せは評価され、データは、相乗性、及び拮抗性を定量する、標準的プログラムを利用して分析可能である。相乗性を算出するのに使用されるプログラムの例は、Chou 及び Talalay, in 「New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy」, Academic Press, 1987, 第2章に記載されている。
【００２９】
ここで使用される場合、「オートファジー阻害剤」とは、その不在下で、オートファジーを被る細胞におけるオートファジーレベルと比較して、その存在下でオートファジーを被る細胞におけるうオートファジーレベルを低減させる組成物を指すことを意味する。オートファジーはバルクリソソーム分解の異化プロセスであり、細胞質におけるオートファジー液胞の出現に特徴付けられる、細胞質物質と細胞質小器官の再循環、リソソーム区画の細胞質小器官と他の成分の自己消化に至る。オートファジーはその限界に到達可能な場合、最終的に細胞殺傷を可能にすると同時に、オートファジーはストレス条件下で、細胞にとって一時的な生存メカニズムを提供可能であるが、特定の環境下、いくつかの形態の細胞死に対して、細胞を脆弱にさせる可能性がある。オートファジーの阻害により、使用する薬剤及び条件に依存して、細胞死を促進又は阻害することができる(Amaravadi, R.K., D. Yu, J.J. Lum, T. Bui, M.A. Christophorou, G.I. Evan, A. Thomas-Tikhonenko, and C.B. Thompson, (2007), Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma. J Clin Invest. 117:326-336; Kroemer, G., and M. Jaattela. 2005. Lysosomes and autophagy in cell death control. Nat Rev Cancer. 5:886-97; Levine, B., and J. Yuan, (2005), Autophagy in cell death: an innocent convict. J Clin Invest. 115:2679-2688; Lockshin, R.A., and Z. Zakeri, (2004), Apoptosis, autophagy, and more. Int J Biochem Cell Biol. 36:2405-19)。オートファジーは明確な相を有する異化プロセスである。これらには、誘導、隔離、融合、及び分解相が含まれる。オートファジー阻害剤は、一又は複数の相を阻害可能である。一実施態様において、オートファジー阻害剤は、オートファジーの後期段階を阻害する。一例において、オートファジー阻害剤は、オートファジーの隔離、融合、及び分解相を阻害する。一例において、オートファジー阻害剤は、オートファジーの融合及び分解相を阻害する。一例において、オートファジー阻害剤はオートファジーの分解相を阻害する。オートファジーの有用な阻害剤にはｓｉＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ１、又はオートファジー(Ａｔｇ)遺伝子(例えば、Ａｔｇ１、Ａｔｇ４、Ａｔｇ８、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７又はＡｔｇ１２)の発現又は機能を阻害する薬剤；３-メチルアデニン；抗寄生虫剤ともできるリソソーム作用剤、例えばクロロキン、ヒドロキシクロロキン又はスラミン、液胞型プロトンＡＴＰアーゼ阻害剤、例えばバフィロマイシンＡ１、循環系に作用する薬剤、例えばアミオダロン又はペルヘキシレン、細胞傷害剤、例えばビンブラスチン、脂質代謝に影響を与える薬剤、抗生物質、例えばモネンシン、又はホルモン、例えばグルカゴン又はエストラジオール、リソソーム作用剤、例えば塩化アンモニウム、ｃＡＭＰ又はメチルアミン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リソソームプロテアーゼ阻害剤、例えばカテプシン阻害剤及びカテプシンノックダウン、並びにＬＡＭＰノックダウン、例えばＬＡＭＰ１及びＬＡＭＰ２が含まれる。他の実施態様において、リソソーム活性のモジュレーターは、オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤と組合せられて、腫瘍の併用療法を提供可能である。リソソームは消化酵素(酸ヒドロラーゼ)を含有する細胞小器官である。このような酵素には、脂質を消化す���リパーゼ、炭水化物(例えば糖類)を分解するカルボヒドラーゼ、タンパク質を消化するプロテアーゼ、核酸リン酸モノエステルを消化するヌクレアーゼが含まれる。一例において、モジュレーターは、リソソーム活性を阻害するように作用する。一実施態様において、組合せは相乗効果を提供する。
【００３０】
キナーゼ阻害剤
数百のキナーゼが存在するが、全てのキナーゼ阻害剤がオートファジーを誘導するわけではない。例えば、ｂＲａｆ及びＭＥＫキナーゼ阻害剤は、オートファジーを誘導しない。一例において、ＭＥＫ阻害剤 (Ｒ)-Ｎ-(２,３-ジヒドロキシプロポキシ)-３,４-ジフルオロ-２-(２-フルオロ-４-ヨードフェニルアミノベンズアミド(ＶＩＩ)は、オートファジーにおける増加性を誘導しない。他の例において、ＣＱは、化合物ＶＩＩと比較して、癌細胞(例えば、メラノーマ及び乳癌)において、アポトーシスを誘導しない。ここには、キナーゼ阻害剤がオートファジーを誘導するかどうかを測定するアッセイを記載した。オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤には、Ａｋｔ(例えば、Ａｋｔ-１、Ａｋｔ-２及びＡｋｔ-３)、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１及びｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤が含まれる。Ａｋｔキナーゼ阻害剤は、パン-Ａｋｔ阻害剤、アロステリックＡｋｔ阻害剤、又はＡｋｔ-１、Ａｋｔ-２又はＡｋｔ-３の選択的阻害剤であってよい。
【００３１】
一実施態様において、Ａｋｔキナーゼ阻害剤は、次の式Ｉ：
2014507129.tif 000003
[上式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ及びＣＦ３であり；
Ｒ２は、Ｈ又はＭｅであり；Ｒ５は、Ｈ又はＭｅであり；
Ａは
2014507129.tif 000004
であり、ここでＧは、ハロゲンで置換されていてもよい５−６員のヘテロアリール、又は１ないし４のＲ９基で置換されていてもよいフェニルであり；
Ｒ６及びＲ７は独立して、Ｈ、ＯＣＨ３、(Ｃ３-Ｃ６シクロアルキル)-(ＣＨ２)、(Ｃ３-Ｃ６シクロアルキル)-(ＣＨ２ＣＨ２)、Ｖが５−６員のヘテロアリールであるＶ-(ＣＨ２)０-１、ＷがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、ＣＦ３又はＭｅで置換されていてもよいフェニルであるＷ-(ＣＨ２)１-２、Ｃ１-Ｃ３アルキル又はＯ(Ｃ１-Ｃ３アルキル)で置換されていてもよいＣ３-Ｃ６-シクロアルキル、ヒドロキシ-(Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル)、フルオロ-(Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル)、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＨ)フェニル、Ｆ、ＯＨ、Ｃ１-Ｃ３アルキル、シクロプロピルメチル又はＣ(＝Ｏ)(Ｃ１-Ｃ３アルキル)で置換されていてもよい４-６員の複素環、又はＯＨ、オキソ、Ｏ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＮ、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｎ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２、シクロプロピル、フェニル、イミダゾリル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、オキセタニル又はテトラヒドロピラニルから独立して選択される一又は複数の基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６-アルキルであり、又はＲ６及びＲ７はそれらが結合している窒素原子と共同して、ＯＨ、ハロゲン、オキソ、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｏ(Ｃ１-Ｃ３アルキル)、Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ(Ｍｅ)２、Ｓ(Ｏ)２ＣＨ３、シクロプロピルメチル及びＣ１-Ｃ３アルキルから独立して選択される一又は複数の基で置換されていてもよい４-７員の複素環式環を形成し；
Ｒａ及びＲｂはＨであり、又はＲａはＨであり、Ｒｂ及びＲ６はそれらが結合している原子と共同して、１又は２の窒素原子を有する５−６員の複素環式環を形成し；
Ｒｃ及びＲｄはＨ又はＭｅであり、又はＲｃ及びＲｄはそれらが結合している原子と共同してシクロプロピル環を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｍｅ、Ｆ又はＯＨであり、又はＲ８及びＲ６はそれらが結合している原子と共同して、１又は２の窒素環原子を有する５−６員の複素環式環を形成し；
各Ｒ９は独立して、ハロゲン、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル、Ｏ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｓ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＮ、ＯＣＨ２-フェニル、ＣＨ２Ｏ-フェニル、ＮＨ２、ＮＨ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｎ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２、ピペリジン、ピロリジン、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＯＣＨ２Ｆ、ＯＣＨＦ２、ＯＨ、ＳＯ２(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ２、Ｃ(Ｏ)ＮＨ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、及びＣ(Ｏ)Ｎ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２であり；
Ｒ１０はＨ又はＭｅであり；
ｍ、ｎ及びｐは独立して０又は１である]
の化合物、その互変変異体、分離したエナンチオマー、分離したジアステレオマー、溶媒和物、及び塩である。
【００３２】
他の実施態様には、Ｒ１がメチルであり；Ｒ２、Ｒ５及びＲ１０がＨであり；Ｇが１-３のＲ９で置換されていてもよいフェニルであり；Ｒ９がハロゲン、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＮＣ、ＣＦ３、ＯＣＦ３ ＯＣＨ３又はＯＣＨ２フェニルであり；Ｒｃ及びＲｄがＨ又はメチルであり；ｍ、ｎ及びｐが０又は１であり；Ｒ８がＨ又はメチルである、式ＩのＡｋｔ阻害剤が含まれる。
【００３３】
他の実施態様には、次の化合物：
2014507129.tif 000005
2014507129.tif 000006
を含む、式ＩのＡｋｔ阻害剤が含まれる。
【００３４】
式Ｉの化合物の調製
式Ｉの化合物は、全ての目的について、ここに出典明示により援用される「Hydroxylated and Methoxylated Pyrimidyl Cyclopentanes as AKT Protein Kinase Inhibitors」と題され、2007年7月5日に出願された米国特許出願第11/773949号に記載の方法に従い調製されうる。
【００３５】
式Ｉの化合物は、単一、少なくとも２、例えば５〜１０００の化合物、又は１０〜１００の化合物を含有する、単一又は化合物ライブラリとして調製されてよい。式Ｉの化合物のライブラリは、コンビナトリアル「スプリット及びミックス」アプローチにより、又は液相又は固相化学を使用する、複数の平行合成により調製されてよい。
【００３６】
例示的目的のために、スキーム１-４は、式Ｉの化合物、並びに重要な中間体を調製するための一般的方法を示す。当業者であれば、他の合成経路も使用可能であることは理解しているであろう。特定の出発物質及び試薬は、スキームに示し、以下で論ずるが、他の出発物質及び試薬に置き換えて、種々の誘導体及び／又は反応条件を提供することもできる。さらに、以下に記載の方法で調製された多くの化合物は、当業者によく知られている、従来からの化学を使用し、この開示を考慮してさらに修正することもできる。
【００３７】
2014507129.tif 000007
スキーム１は、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ５がＨである、式Ｉの化合物１０を調製する方法を示す。ピリミジン２の形成は、エタノール等の適切な溶媒において、ＫＯＨ等の塩基の存在下、チオ尿素をケトエステル１とを反応させることにより実施することができる。標準的な還元条件(例えばラネーＮｉ及びＮＨ４ＯＨ)下、化合物２のメルカプト基を還元し、化合物３を提供した後、標準的な条件(ＤＩＥＡ／ＤＣＥにおけるＰＯＣｌ３)下、ヒドロキシピリミジン３を塩素化することで、化合物４を提供することができる。ついで、化合物４を標準的な条件(例えば、ＣＨＣｌ３等の適切な溶媒におけるＭＣＰＢＡ)下で酸化し、ピリミジン-オキシド５を得る。無水酢酸でピリミジン-オキシドを処理し、転位生成物６を得る。標準的なＳＮＡｒ反応条件下、適切に置換されたピペリジンと化合物６とを反応させ、化合物７を得る。化合物７を加水分解することで、化合物８が提供され、ついで脱保護して、中間体９が生じる。ＨＢＴＵ等のカップリング剤の存在下、適切なアミノ酸を用いてピペラジニルシクロペンタ[ｄ]ピリミジン９をアシル化し、必要であれば、その後脱保護して、式Ｉの化合物１０を得る。
【００３８】
2014507129.tif 000008
スキーム２は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５がメチルである、式Ｉの化合物２２、２５及び２７を調製する方法を示す。スキーム２に従い、臭素を用いて(＋)-プレゴン１１を臭素化し、ジブロミド１２を得る。ナトリウムエトキシド等の塩基を用い、ジブロミド１２を処理することで、プレゲナート１３が提供される。プレゲナート１３のオゾン分解によりケトエステル１４が得られる。エタノールにおいて、ＫＯＨ等の塩基の存在下、チオ尿素でケトエステル１４を処理し、標準的な還元条件(例えばアンモニアにおけるラネーＮｉ)下、メルカプト基を還元することで、ヒドロキシピリミジン１６が提供される。標準的な条件(例えばＰＯＣｌ３)下、ヒドロキシピリミジン１６を塩素化することで、４-クロロピリミジン１７が提供される。過酸化水素又はＭＣＰＢＡ等の酸化剤を用いて、４-クロロピリミジン１７を酸化することで、Ｎ-オキシド１８が提供される。無水酢酸でＮ-オキシド１８を転位させることで、中間体１９が生じる。スキーム１に記載の手順に従い、所望のピペラジンと化合物１９とを反応させることで、Ｒ５がＨ及び２３であり、Ｒ５がＭｅである、化合物２０が提供される。キラル固定を用いるＨＰＬＣを使用して、化合物２０及び２３をキラル分離にかけ、ついで、水酸化リチウム等の塩基で処理して加水分解することで、それぞれ化合物２１及び２４が提供される。脱保護後、化合物２１及び２４を適切なアミノ酸と反応させることで、それぞれ化合物２２及び２５が提供される。
【００３９】
また、化合物２４の７-ヒドロキシ基を、ＮａＨ又はＫＯＨ等の塩基の存在下、アルキルハロゲン化物等のアルキル化試薬でアルキル化することで、Ｒ２がＭｅである、化合物２６が提供されてもよい。脱保護後、ついで、化合物２６を適切なアミノ酸と反応させることで、化合物２７が提供される。
【００４０】
2014507129.tif 000009
スキーム３は、化合物７３及び７４を調製するための代替法を示す。スキーム３に従い、アンモニアシントンを使用し、１４をアミノ化することで６３が得られる。例えば、５０℃-２５０℃及び／又は高圧にて、ホルムアミドの存在下、ギ酸アンモニウムを使用してピリミジン形成させることで、二環式ユニット６４が得られる。例えば、ＰＯＣｌ３又はＳＯＣｌ２を使用し、６４を活性化すると、活性化ピリミジン６５が得られる。０℃〜１５０℃で、適切に保護／置換されたピペリジンを使用し、この離脱基を置き換えると、ピペリジン６６が得られる。例えば、−２０℃〜５０℃で、ｍ-クロロペルオキシ安息香酸(「」ＭＣＰＢＡ」又は「ｍ-ＣＰＢＡ」)又はオキソン(登録商標)を使用して酸化させることで、Ｎ-オキシド６７が得られる。アシル化剤(例えば無水酢酸)で処理し、加熱し(４０℃〜２００℃)、転位することで、６８が得られる。０℃〜５０℃で、ＬｉＯＨ又はＮａＯＨを使用して加水分解することで、アルコール６９が得られる。例えば、スワーン条件、ＭｎＯ４又はピリジン-ＳＯ３錯体を適切な温度で使用する酸化により、ケトン７０が得られる。キラルリガンドの存在下、水素化ホウ素還元剤又はＣＢＳ触媒、水素の存在下、触媒性キラル触媒を使用して不斉還元することにより、アルコール７１又は７２で、(Ｒ)又は(Ｓ)立体化学のいずれかが生じる。また、シクロペンタン単位上のメチル基が面選択性、最終的にはジアステレオ選択性を提供する非キラル還元剤を使用することもできる(例えば、Ｈ２、Ｐｄ／Ｃ)。還元により、より低い選択性が得られるならば、ジアステレオマーを(例えば)クロマトグラフィー、結晶化又は誘導体化により分離することもできる。最終的に、例えば０℃〜５０℃で酸を使用し、Ｂｏｃ基を脱保護し、適切に官能化されたアミノ酸を使用してアシル化させ、このアミノ酸のアミンを官能化(例えば、任意の保護基の除去、アルキル化、還元アミノ化、又はアシル化して新規の置換基を導入)させることで、最終的な化合物７３及び７４が生じる。
【００４１】
2014507129.tif 000010
標準的なアシル化手順による化合物(１)へのキラル補助(例えばエバンスオキサゾリジノン等)の導入で、コンジュゲート(２)が得られる。例えば、−２０℃〜１００℃で、アミン塩基の存在下、混合無水物形成(例えば、２,２-ジメチルプロパノイルクロリド)、又は活性化剤(例えばＣＯＣｌ２)を用いて酸を処理し、適切なキラル補助(Ｘ)で処理することで、化合物(２)が得られる。キラル補助の選択及び立体化学により、ジアステレオ選択性及び新たに生成したキラル中心の立体化学が決定される。アミン塩基(例えばヒュニグ(Hunig)塩基)及び低温(例えば、−２０℃〜−１００℃)にて、ルイス酸(例えばＴｉＣｌ４)を用いて化合物(２)を処理し、ついで、低温で適切に置換されたイミニウムイオン前駆体(３)を使用することで、化合物(４)が生じる。温度、ルイス酸、及びキラル補助は、全て、さらなる付加体のジアステレオ選択性に影響を与えることが予測されている。最終的に、温和な条件下(例えば、−１０℃〜３０℃でＬｉＯＨ／Ｈ２Ｏ)でのケン化により、所望の酸(５)が生じる。
【００４２】
他の実施態様において、キナーゼ阻害剤は、次の式：
2014507129.tif 000011
[上式中、
Ｇは、ハロゲンで置換されていてもよい５−６員のヘテロアリール、又はＲａ基の１ないし３で置換されていてもよいフェニルであり；
Ｒ１及びＲ１ａは独立して、Ｈ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＣＨＦ２又はＣＨ２Ｆから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、又は-ＯＨであり；
Ｒ２ａはＨであり；
Ｒ３はＨであり；
Ｒ４は、Ｆ、-ＯＨ又は-Ｏ(Ｃ１-Ｃ３アルキル)で置換されていてもよいＣ１-Ｃ４アルキル、又はＨであり；
Ｒ５及びＲ５ａは独立して、Ｈ、及びＣ１-Ｃ４アルキルから選択され、又はＲ５及びＲ５ａはそれらが結合している原子と共同して、５−６員のシクロアルキル又は５−６員の複素環を形成し、ここで複素環は酸素ヘテロ原子を有し；
各Ｒａは独立して、ハロゲン、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、Ｃ３-Ｃ６-シクロアルキル、-Ｏ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＦ３、-ＯＣＦ３、Ｓ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、ＣＮ、-ＯＣＨ２-フェニル、ＮＨ２、-ＮＯ２、-ＮＨ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、-Ｎ-(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２、ピペリジン、ピロリジン、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、-ＯＣＨ２Ｆ、-ＯＣＨＦ２、-ＯＨ、-ＳＯ２(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ２、Ｃ(Ｏ)ＮＨ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)、及びＣ(Ｏ)Ｎ(Ｃ１-Ｃ６-アルキル)２であり；及び
ｊは、１又は２である]
のＡｋｔ阻害剤、その立体異性体、互変変異体、又は製薬的に許容可能な塩である。
【００４３】
他の実施態様には、
2014507129.tif 000012
を含む、Ａｋｔ阻害剤が含まれる。
【００４４】
一実施態様において、キナーゼ阻害剤は、次の式ＩＩ：
2014507129.tif 000013
[上式中、
Ｒ１及びＲ２は独立して、水素、Ｃ１-Ｃ５アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１-５アルコキシ又はアミンであり；ｐは１〜６の整数であり；Ａは、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、フェニル、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、５-１４炭素の、環式、二環式又は三環式の芳香族又は芳香族複素環であり；一実施態様において、Ａは次の構造：
2014507129.tif 000014
の一つを有しており；
ここでＤ及びＥは独立して、-ＣＨ又はＮであり；
Ｒ３及びＲ４は独立して、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲン、水素であり；
Ｒ５は、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、５又は６員の芳香族又は芳香族複素環であり；一実施態様において、Ｒ５はフェニルであり；
Ｂは、次の式：
2014507129.tif 000015
を有する芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環であり；
ここでＱ、Ｔ、Ｘ及びＹは独立して、-ＣＨ、-ＣＨ２、Ｃ=Ｏ、Ｎ又はＯからなる群から選択され；
Ｚは、-ＣＨ、-ＣＨ２、Ｃ=Ｏ、Ｎ、Ｏ又は-Ｃ=Ｃ-であり；
Ｒ６及びＲ７は独立して、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい５又は６員の芳香族又は芳香族複素環、及びカルボニル、ハロゲン、水素からなる群から選択され；一実施態様において、Ｒ６又はＲ７はピリジニルであり、又はＲ６及びＲ７は共同して、シクロプロピルメチル、Ｃ１-Ｃ３アルキル、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノ、ＯＨ、ハロゲンで置換されていてもよい５又は６員の芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環を形成し；一実施態様において、Ｂは、次の構造：
2014507129.tif 000016
の一つを有し；
ここでＸ、Ｙ、Ｑ、Ｒ６及びＲ７は上述したものであり、Ｘ’、Ｑ’及びＴ’は-ＣＨ又はＮである]
のＡｋｔ阻害剤化合物である。
【００４５】
他の実施態様において、ＡＫＴ阻害剤は、次の式：
2014507129.tif 000017
[上式中：ａは０又は１であり；ｂは０又は１であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、０、１又は２であり；ｐは、０、１又は２であり；ｒは０又は１であり；ｓは０又は１であり；
Ｑは：−−ＮＲ７Ｒ８、
2014507129.tif 000018
から選択され、
Ｒ１は独立して、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂＣ１-Ｃ６アルキル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂアリール、Ｃ２-Ｃ６アルケニル、Ｃ２-Ｃ６アルキニル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂヘテロシクリル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂＣ３-Ｃ６シクロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＯｂＣ１-Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｏａ(Ｃ=Ｏ)ｂＮＲ７Ｒ８、ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＮＲ７Ｒ８、Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、Ｓ(Ｏ)２ＮＲ７Ｒ８、ＮＲｃＳ(Ｏ)ｍＲａ、オキソ、ＣＨＯ、ＮＯ２、ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＲａ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ６アルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ６シクロアルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、及びＯ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂ-複素環から選択され、ここで該アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ２は独立して、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＯＨ及びＳ(Ｏ)２ＮＲ７Ｒ８から選択され、ここで該アルキル、アリール及びヘテロシクリルは、Ｒｚから選択される１、２又は３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８は独立して、Ｈ、(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ１０アルキル、(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ８シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、(Ｃ=Ｏ)Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１-Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２-Ｃ１０アルケニル、Ｃ２-Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３-Ｃ８シクロアルキル、ＳＯ２Ｒａ及び(Ｃ=Ｏ)ＮＲｂ２から選択され、ここで該アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８はそれらが結合している窒素と共同して、５-７員で、各環に、場合によっては窒素に加えて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１又は２の付加的なヘテロ原子を有する、単環式又は二環式複素環を形成し、該単環式又は二環式複素環は、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒｚは：(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ１-Ｃ１０)アルキル、Ｏｒ(Ｃ１-Ｃ３)ペルフルオロアルキル、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、オキソ、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ２-Ｃ１０)アルケニル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ２-Ｃ１０)アルキニル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-アリール、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ヘテロシクリル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-Ｎ(Ｒｂ)２、Ｃ(Ｏ)Ｒａ、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ＣＯ２Ｒａ、Ｃ(Ｏ)Ｈ、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ＣＯ２Ｈ、Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒｂ)２、Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、及びＳ(Ｏ)２Ｎ(Ｒｂ)２ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＲａ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ１０アルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ８シクロアルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、及びＯ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂ-複素環から選択され、ここで該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、及びヘテロシクリルは、Ｒｂ、ＯＨ、(Ｃ１-Ｃ６)アルコキシ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｃ１-Ｃ６アルキル、オキソ、及びＮ(Ｒｂ)２から選択される３までの置換基で置換されていてもよく；
Ｒａは、(Ｃ１-Ｃ６)アルキル、(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルであり；及び
Ｒｂは、Ｈ、(Ｃ１-Ｃ６)アルキル、アリール、ヘテロシクリル、(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)ＯＣ１-Ｃ６アルキル、(Ｃ=Ｏ)Ｃ１-Ｃ６アルキル又はＳ(Ｏ)２Ｒａであり；
Ｒｃは：Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アリール、Ｃ２-Ｃ６アルケニル、Ｃ２-Ｃ６アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３-Ｃ８シクロアルキル及びＣ１-Ｃ６ペルフルオロアルキルから選択され、ここで該アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアルキニルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい]
を有する化合物、又はその製薬的に許容可能な塩又は立体異性体を含む。
【００４６】
他の実施態様において、ＡＫＴ阻害剤は：
2014507129.tif 000019
[上式中：ａは０又は１であり；ｂは０又は１であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、０、１、２又は３であり；ｐは、０、１又は２であり；ｒは０又は１であり；ｓは０又は１であり；ｕ、ｖ、ｗ及びｘは独立して：ＣＨ及びＮから選択され、但しｕ、ｖ、ｗ及びｘの一つのみがＮであってよく；
Ｑは、−−ＮＲ５Ｒ６、
2014507129.tif 000020
から選択され、
Ｒ１は独立して、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂＣ１-Ｃ６アルキル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂアリール、Ｃ２-Ｃ６アルケニル、Ｃ２-Ｃ６アルキニル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂヘテロシクリル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂＣ３-Ｃ６シクロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＯｂＣ１-Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｏａ(Ｃ=Ｏ)ｂＮＲ７Ｒ８、ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＮＲ７Ｒ８、Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、Ｓ(Ｏ)２ＮＲ７Ｒ８、ＮＲｃＳ(Ｏ)ｍＲａ、オキソ、ＣＨＯ、ＮＯ２、ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＲａ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ６アルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ６シクロアルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、及びＯ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂ-複素環から選択され、ここで該アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ２は独立して、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＯＨ及びＳ(Ｏ)２ＮＲ７Ｒ８から選択され、ここで該アルキル、アリール及びヘテロシクリルは、Ｒｚから選択される１、２又は３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８は独立して、Ｈ、(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ１０アルキル、(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ８シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、(Ｃ=Ｏ)Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１-Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２-Ｃ１０アルケニル、Ｃ２-Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３-Ｃ８シクロアルキル、ＳＯ２Ｒａ及び(Ｃ=Ｏ)ＮＲｂ２から選択され、ここで該アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアルキニルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；又は
Ｒ７及びＲ８はそれらが結合している窒素と共同して、５-７員で、各環に、場合によっては窒素に加えて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１又は２の付加的なヘテロ原子を有する、単環式又は二環式複素環を形成し、該単環式又は二環式複素環は、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒｚは：(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ１-Ｃ１０)アルキル、Ｏｒ(Ｃ１-Ｃ３)ペルフルオロアルキル、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、オキソ、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ２-Ｃ１０)アルケニル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ２-Ｃ１０)アルキニル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-アリール、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ヘテロシクリル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-Ｎ(Ｒｂ)２、Ｃ(Ｏ)Ｒａ、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ＣＯ２Ｒａ、Ｃ(Ｏ)Ｈ、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ＣＯ２Ｈ、Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒｂ)２、Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、及びＳ(Ｏ)２Ｎ(Ｒｂ)２ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＲａ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ１０アルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ８シクロアルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、及びＯ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂ-複素環から選択され、ここで該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、及びヘテロシクリルは、Ｒｂ、ＯＨ、(Ｃ１-Ｃ６)アルコキシ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｃ１-Ｃ６アルキル、オキソ、及びＮ(Ｒｂ)２から選択される３までの置換基で置換されていてもよく；
Ｒａは、(Ｃ１-Ｃ６)アルキル、(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルであり；及び
Ｒｂは、Ｈ、(Ｃ１-Ｃ６)アルキル、アリール、ヘテロシクリル、(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)ＯＣ１-Ｃ６アルキル、(Ｃ=Ｏ)Ｃ１-Ｃ６アルキル又はＳ(Ｏ)２Ｒａであり；
Ｒｃは：Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アリール、Ｃ２-Ｃ６アルケニル、Ｃ２-Ｃ６アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３-Ｃ８シクロアルキル及びＣ１-Ｃ６ペルフルオロアルキルから選択され、ここで該アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアルキニルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい]
を有する化合物、又はその製薬的に許容可能な塩又は立体異性体を含む。
【００４７】
他の実施態様において、ＡＫＴ阻害剤は：
2014507129.tif 000021
[上式中：ａは０又は１であり；ｂは０又は１であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、０、１、２又は３であり；ｐは、０、１又は２であり；ｒは０又は１であり；ｓは０又は１であり；ｕ、ｖ、及びｘは独立して：ＣＨ及びＮから選択され；Ｗは、結合、ＣＨ又はＮであり；
Ｑは、−−ＮＲ５Ｒ６、
2014507129.tif 000022
から選択され、
Ｒ１は独立して、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂＣ１-Ｃ６アルキル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂアリール、Ｃ２-Ｃ６アルケニル、Ｃ２-Ｃ６アルキニル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂヘテロシクリル、(Ｃ=Ｏ)ａＯｂＣ３-Ｃ６シクロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＯｂＣ１-Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｏａ(Ｃ=Ｏ)ｂＮＲ７Ｒ８、ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＮＲ７Ｒ８、Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、Ｓ(Ｏ)２ＮＲ７Ｒ８、ＮＲｃＳ(Ｏ)ｍＲａ、オキソ、ＣＨＯ、ＮＯ２、ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＲａ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ６アルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ６シクロアルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、及びＯ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂ-複素環から選択され、ここで該アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ２は独立して、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＯＨ及びＳ(Ｏ)２ＮＲ７Ｒ８から選択され、ここで該アルキル、アリール及びヘテロシクリルは、Ｒｚから選択される１、２又は３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８は独立して、Ｈ、(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ１０アルキル、(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ８シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、(Ｃ=Ｏ)Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１-Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２-Ｃ１０アルケニル、Ｃ２-Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３-Ｃ８シクロアルキル、ＳＯ２Ｒａ及び(Ｃ=Ｏ)ＮＲｂ２から選択され、ここで該アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアルキニルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；又は
Ｒ７及びＲ８はそれらが結合している窒素と共同して、５-７員で、各環に、場合によっては窒素に加えて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１又は２の付加的なヘテロ原子を有する、単環式又は二環式複素環を形成し、該単環式又は二環式複素環は、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
Ｒｚは：(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ１-Ｃ１０)アルキル、Ｏｒ(Ｃ１-Ｃ３)ペルフルオロアルキル、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、オキソ、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ２-Ｃ１０)アルケニル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ２-Ｃ１０)アルキニル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-アリール、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ヘテロシクリル、(Ｃ=Ｏ)ｒＯｓ(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-Ｎ(Ｒｂ)２、Ｃ(Ｏ)Ｒａ、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ＣＯ２Ｒａ、Ｃ(Ｏ)Ｈ、(Ｃ０-Ｃ６)アルキレン-ＣＯ２Ｈ、Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒｂ)２、Ｓ(Ｏ)ｍＲａ、及びＳ(Ｏ)２Ｎ(Ｒｂ)２ＮＲｃ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＲａ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ１-Ｃ１０アルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)ＯｂＣ３-Ｃ８シクロアルキル、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂアリール、及びＯ(Ｃ=Ｏ)Ｏｂ-複素環から選択され、ここで該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、及びヘテロシクリルは、Ｒｂ、ＯＨ、(Ｃ１-Ｃ６)アルコキシ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、Ｏ(Ｃ=Ｏ)Ｃ１-Ｃ６アルキル、オキソ、及びＮ(Ｒｂ)２から選択される３までの置換基で置換されていてもよく；
Ｒａは、(Ｃ１-Ｃ６)アルキル、(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルであり；及び
Ｒｂは、Ｈ、(Ｃ１-Ｃ６)アルキル、アリール、ヘテロシクリル、(Ｃ３-Ｃ６)シクロアルキル、(Ｃ=Ｏ)ＯＣ１-Ｃ６アルキル、(Ｃ=Ｏ)Ｃ１-Ｃ６アルキル又はＳ(Ｏ)２Ｒａであり；
Ｒｃは：Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アリール、Ｃ２-Ｃ６アルケニル、Ｃ２-Ｃ６アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３-Ｃ８シクロアルキル及びＣ１-Ｃ６ペルフルオロアルキルから選択され、ここで該アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアルキニルは、Ｒｚから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい]
を有する化合物、又はその製薬的に許容可能な塩又は立体異性体を含む。
【００４８】
例示的ＡＫＴ阻害剤は、
2014507129.tif 000023
を含む。
【００４９】
一実施態様において、キナーゼ阻害剤はＡｋｔ-１選択性阻害剤であり、次の式ＩＶ：
2014507129.tif 000024
[上式中、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは独立して、Ｓ、-ＣＨ、Ｏ又はＮであり、式ＩＶに示される環は、芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環であり；
ｐは１〜６の整数であり；
Ｒ１５及びＲ１６は独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノ及びＣ１-Ｃ６-アルキルからなる群から選択され；
Ｑは５−６員の芳香族又は芳香族複素環であり；一実施態様において、Ｑは次の構造：
2014507129.tif 000025
のものであり、ここでＧ及びＧ’は独立して、Ｎ、Ｓ又は-Ｃ=Ｃ-であり；
Ｒ’及びＲ”はそれが結合しているＮと共同して、ハロゲン、ＯＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノ、Ｃ１-Ｃ６-アルキルで置換されていてもよい５、６又は７員の複素環式環を形成し、例えば、Ｇ’に依存して、上述にて列挙した置換基をさらに有していてもよい芳香族複素環又は複素環であってよい次の構造：
2014507129.tif 000026
を有し、
ここでＧ’は上述したものであり；
Ｊは、未置換又は置換されたアミドであり；
Ｒ１７は、置換されていてもよい５-１４員の芳香族又は芳香族複素環系であり；一実施態様において、Ｒ１７は次の構造：
2014507129.tif 000027
の一つを有し、ここでＸ及びＹは独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ又は-ＣＨであり；
Ｒ１８、Ｒ１９及びＲ２０は独立して、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１-Ｃ３アルキル又はシクロプロピルメチルで置換されていてもよい、ハロゲン、ＯＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノ、Ｃ１-Ｃ６-アルキル又はフェニルからなる群から選択され；又はＲ１８及びＲ１９は共同して、芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環を形成する]
の化合物である。
【００５０】
式ＩＶの化合物は、
2014507129.tif 000028
を含む。
【００５１】
他の実施態様は、次の式：
2014507129.tif 000029
を有するペリフォシン等のＡＫＴ阻害剤を含む。
【００５２】
他の実施態様は、ＡＫＴ阻害剤、例えば配列：５’ｃｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃａｇｔｃｃａｃｔ３’、５’ｃｇｃｃａａｇｇａｇａｔｃａｔｇｃａｇｃ３’、５’ｇｃｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｃｔｔｇｇｃｇ３’、５’ａｇａｔａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｇａｃａｇ３’、５’ｃｇｔｇｇａｇａｇａｔｃａｔｃｔｇａｇｇ３’、５’ｔｃｇａａａａｇｇｔｃａａｇｔｇｃｔａｃ３’、５’ｔｇｇｔｇｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｇ３’、及び５’ｇｇｃｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｇｃｃｔａｇｃ３’を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００５３】
一実施態様において、キナーゼ阻害剤は式ＩＩＩの化合物である。一例において、式ＩＩＩの化合物はＰＩ３-ｋ阻害剤を含む。他の例において、式ＩＩＩの化合物はｍＴＯＲ阻害剤を含む。式ＩＩＩの化合物は、次の式：
2014507129.tif 000030
[上式中、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは独立して、-ＣＨ又はＮであり；
Ｒ８はＲ９は共同して、置換されていてもよい芳香族、芳香族複素環、環式又は複素環式環を形成し、例えばＲ８及びＲ９はそれらが結合している式ＩＩＩの炭素原子と共同して、９-１０員の二環式環系を形成し；二環式環系の実施態様は、次の構造：
2014507129.tif 000031
を含み、ここで
2014507129.tif 000032
は結合を示し；
Ｒ１１及びＲ１２は独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノ、Ｃ１-Ｃ６-アルキル、-Ｃ(=Ｏ)Ｏ−(ＣＲｙＲｚ)ｎ-Ｗ又はフェニルで、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１-Ｃ３アルキル又はシクロプロピルメチルで置換されていてもよいからなる群から選択され、ＷはＣ５-１２アリール又はヘテロアリールであり、Ｒｙ及びＲｚは独立して、水素、ハロゲン、-ＯＨ又はＣ１-６アルキルであり；又はＲ１１及びＲ１２は共同して、５-１４員の芳香族又は芳香族複素環を形成し、例えばＲ１１及びＲ１２はそれらが結合している炭素、及び式ＩＩＩの環と共同して、１２-１４員の三環式環系を形成し、一実施態様において、次の構造：
2014507129.tif 000033
を有し；
Ｒ’及びＲ”はそれらが結合しているＮと共同して、ハロゲン、ＯＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノ、Ｃ１-Ｃ６-アルキルで置換されていてもよい、５、６又は７員の複素環式環を形成し、上述にて列挙した置換基をさらに有していてもよい、次の構造：
2014507129.tif 000034
の一つを有し；
ここでＧ及びＧ’は独立して、Ｃ、Ｏ又はＮであり；
Ｒ１０は、次の構造：
2014507129.tif 000035
を有する芳香族又は芳香族複素環であり；
ここでＸ、Ｙ、Ｚ及びＺ’は独立して、-ＣＨ又はＮであり；
Ｒ１３は、水素、ハロゲン、ＯＨ、アミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノ、Ｃ１-Ｃ６-アルキル又は-Ｎ-(Ｃ=Ｏ)-Ｎ-Ｒ１４であり、Ｒ１４はＣ１-Ｃ６-アルキルであり、Ｒ１０の例は、
2014507129.tif 000036
であり、ここでＪは-Ｎ-(Ｃ=Ｏ)-Ｎ-であり、Ｒ１４はＣ１-Ｃ６-アルキルである]
を有する。
【００５４】
式ＩＩＩの一例の化合物は、ＰＩ３-ｋ阻害剤：
2014507129.tif 000037
を含む。
【００５５】
他の実施態様は、次の構造：
2014507129.tif 000038
[Ａは、モルホリン-４-イル、３,４-ジヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル、３,６-ジヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル、テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル、１,４-オキサゼパン-４-イル、ピペリジン-１-イルからなる群から選択され、-Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＲｂ、-ＯＲａ、-ＳＲａ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｃ、-Ｓ(Ｏ)Ｒｃ、-Ｒｃ、ハロゲン、-ＮＯ２、-ＣＮ及び-Ｎ３からなる群から選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく、ここでＲａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル及びＣ３-６シクロアルキルから選択され、又はＲａ及びＲｂはそれぞれが結合している窒素原子と共同して、３-ないし６-員環を形成し、Ｒｃは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ３-６シクロアルキルから選択され；
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合している原子と組合せられて、置換されていてもよいピロリジン、ピペリジン又はホモピペリジン環を形成し、ここで該ピロリジン、ピペリジン又はホモピペリジン環の窒素原子は、基：
2014507129.tif 000039
により置換されており；
ここでＥは、水素、Ｃ６-１０アリール、Ｃ５-１０ヘテロアリール、Ｃ３-１０シクロアルキル、Ｃ３-１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１-６アルキル又はＣ１-６ヘテロアルキルであり；またＥは、ハロゲン、Ｃ１-６アルキル、-ＮＲｄＲｅ、-ＳＲｄ、-ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(=ＮＯＲｄ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＣ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｒｆ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(=ＮＯＲｄ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＯ２、-(ＣＨ２)１-４-Ｎ３又は-(ＣＨ２)１-４-ＣＮから選択される、１ないし５の置換基で置換されていてもよく；ここでＲｄ及びＲｅはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され、又はＲｄ及びＲｅは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて、３-ないし６-員環を形成し；Ｒｆは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；
Ｆは、Ｃ１-６アルキレン、Ｃ２-６アルケニニレン、Ｃ２-６アルキニレンル及びＣ１-６ヘテロアルキレンからなる群から選択されるメンバーであり；ここでＦは独立して、ハロゲン、-ＮＲｇＲｈ、-ＳＲｇ、-ＯＲｇ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｇ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-ＮＲｇＣ(Ｏ)Ｒｉ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｉ、-ＮＲｇＣ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、ＮＲｇＳ(Ｏ)２ＮＲｇＲｈ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｇ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｇＲｈ、-Ｒｉ、-ＮＯ２、Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｇＲｈ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｇ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｇ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｇ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)Ｒｇ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｇＣ(Ｏ)Ｒｈ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)Ｒｉ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｇＣ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｇＳ(Ｏ)２ＮＲｇＲｈ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２Ｒｇ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｇＲｈ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＯ２、-(ＣＨ２)１-４-Ｎ３及び-(ＣＨ２)１-４-ＣＮからなる群から選択される０ないし３の置換基で置換されており；ここでＲｇ及びＲｈはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され、場合によっては、Ｒｇ及びＲｈは、同じ窒素原子に結合している場合、３-ないし６-員環を形成し；Ｒｉは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；
Ｇは、-Ｃ(Ｏ)-、-ＯＣ(Ｏ)-、-ＮＨＣ(Ｏ)-、-ＮＨＣ(=ＮＯＨ)-、-Ｓ(Ｏ)２-及び-ＮＨＳ(Ｏ)２-からなる群から選択されるメンバーであり；
ｍ及びｐはそれぞれ独立して、０ないし１から選択される整数であり、ｍ及びｐが双方とも０であるならば、ＥはＣ１-６アルキル又はＣ１-６ヘテロアルキルではなく；
ここでＲ１及びＲ２を組合せることにより形成されるピロリジン、ピペリジン又はホモピペリジン環は、ハロゲン、-ＮＲｊＲｋ、-ＳＲｊ、-ＯＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｊＲｋ、-ＮＨＣ(Ｏ)Ｒｊ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｊ、-Ｒｍ、-ＣＮ及び=Ｏからなる群から選択される０ないし５の置換基でさらに置換されており、ここでＲｊはＲｋはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-５シクロアルキル及びＣ３-５ヘテロシクロアルキルから選択され、及びＲｊ及びＲｋは、同じ窒素原子に結合している場合、任意に組合せられて、３-ないし６-員環を形成し；及びＲｍは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-５シクロアルキル及びＣ３-５ヘテロシクロアルキルから選択され；
Ｂは、フェニレン、ピリジレン、ピリミジレン、ピリダジニレン及びピラジニリンからなる群から選択され、ハロゲン、-ＣＮ、-Ｎ３、-ＮＯ２、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｎ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｎＲｏ、-ＮＲｎＣ(Ｏ)Ｒｏ、-ＮＲｎＣ(Ｏ)ＮＲｎＲｏ、-ＯＲｎ、-ＮＲｎＲｏ及びＲｐから選択される０ないし４の置換基で置換されており；ここでＲｎ及びＲｏは独立して、水素及びＣ１-４アルキル、Ｃ１-４ハロアルキル、Ｃ１-４ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル及びＣ３-７ヘテロシクロアルキルから選択されるか、又は同じ窒素原子に結合している場合、Ｒｎ及びＲｏは任意に組合せられて、３-ないし６-員環を形成し；Ｒｐは、Ｃ１-４アルキル、Ｃ１-４ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル及びＣ３-７ヘテロシクロアルキルであり、ここでＤ基を含まず、Ｂの隣接する原子に位置する、任意の２の置換基は任意に組合せられて、５-ないし６-員の炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール環を形成し；及び
Ｄは、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ４Ｒ５、-Ｃ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＯＣ(Ｏ)ＯＲ４、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＯＲ４)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＮＲ４)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)Ｒ４、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)ＯＲ４、-ＮＲ３Ｓ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５及び-ＮＲ３Ｓ(Ｏ)２Ｒ４からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ３は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル及びＣ２-６アルケニルからなる群から選択され；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-１０シクロアルキル、Ｃ３-１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ５-１０ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ４及びＲ５は、同じ窒素原子に結合している場合、任意に組合せられて、５-ないし７-員の複素環又はヘテロアリールを形成し；及びＲ３、Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン、-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＮＲｑＲｒ、-ＯＲｑ、-ＳＲｑ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｑ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｑＲｒ、-ＮＲｑＣ(Ｏ)Ｒｒ、-ＮＲｑＣ(Ｏ)ＯＲｓ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｑＲｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｑ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｑ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｑ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｑＲｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｑＣ(Ｏ)Ｒｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｑＣ(Ｏ)ＯＲｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＯ２、-Ｓ(Ｏ)Ｒｒ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｒ、=Ｏ、及び-Ｒｓからなる群から独立して選択される０ないし３の置換基でさらに置換されており；Ｒｑ及びＲｒは、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール、Ｃ５-１０ヘテロアリールから選択され；Ｒｓは、それぞれの場合において、独立して、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ５-１０ヘテロアリールから選択され；Ｄ基及びＢの隣接する原子に位置する置換基は、任意に組合せられて、５-ないし６-員の複素環又はヘテロアリール環を形成する]
を有するｍＴＯＲ阻害剤、その立体異性体、互変変異体又は製薬的に許容可能な塩を含む。
【００５６】
ある実施態様において：
Ａは、モルホリン-４-イル、３,４-ジヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル、３,６-ジヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル、テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル、１,４-オキサゼパン-４-イル、ピペリジン-１-イルで、Ｃ１-６アルキルで置換されていてもよいものからなる群から選択される環であり；
Ｂは、フェニレン及びピリミジレンからなる群から選択され；
Ｄは、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ４Ｒ５、-Ｃ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＯＣ(Ｏ)ＯＲ４、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＯＲ４)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＮＲ４)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)Ｒ４、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)ＯＲ４、-ＮＲ３Ｓ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５又は-ＮＲ３Ｓ(Ｏ)２Ｒ４であり、ここでＲ３は、水素又はＣ１-６アルキルであり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル又はＣ３-１０シクロアルキルであり、又はＲ４及びＲ５は組合せられて、５-ないし７-員の複素環を形成し；
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合している原子と組合せられて、置換されていてもよいピロリジン、ピペリジン又はホモピペリジン環を形成し、ここで該環の窒素原子は、基：
2014507129.tif 000040
により置換されており；
ここでＥは、水素、Ｃ６アリール、Ｃ５-６ヘテロアリール、Ｃ１-６アルキル、又はＣ５-６ヘテロシクロアルキルであり；Ｅは、ハロゲン、Ｃ１-６アルキル、-ＮＲｄＲｅ、-ＳＲｄ、-ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(=ＮＯＲｄ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＣ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｒｆ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(=ＮＯＲｄ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＯ２、-(ＣＨ２)１-４-Ｎ３又は-(ＣＨ２)１-４-ＣＮから選択される、１ないし５の置換基で置換されていてもよく；ここでＲｄ及びＲｅはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され、又はＲｄ及びＲｅは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて３-ないし６-員環を形成し；Ｒｆは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；
Ｆは、Ｃ１-６アルキレンであり；
Ｇは、-Ｃ(Ｏ)-、-ＯＣ(Ｏ)-、-ＮＨＣ(Ｏ)-、-ＮＨＣ(=ＮＯＨ)-、-Ｓ(Ｏ)２-又は-ＮＨＳ(Ｏ)２-であり；
ｍ及びｐは独立して、０又は１である。
【００５７】
他の実施態様は、
2014507129.tif 000041
[上式中、Ａは、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１ないし３のヘテロ原子を有し、０ないし２の二重結合を有する、５-ないし８-員の複素環式環であり；ここでＡ環は、Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＲｂ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｃ、-ＯＲａ、-ＳＲａ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｃ、-Ｓ(Ｏ)Ｒｃ、-Ｒｃ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲａＲｂ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲａＣ(Ｏ)Ｒｃ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲａ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲａ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２Ｒｃ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)Ｒｃ、ハロゲン、-ＮＯ２、-ＣＮ及び-Ｎ３からなる群から選択される０ないし５のＲＡ置換基でさらに置換されており、ここでＲａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-６シクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４(フェニル)から選択され、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ結合している窒素原子と共同して、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし７-員の複素環式環を形成し；Ｒｃは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-６シクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４(フェニル)から選択され；５-ないし８-員の複素環式環の同じ原子に結合した任意の２の置換基は、任意に組合せられて、３-ないし５-員の炭素環又は３ないし５-員の複素環を形成し；Ｒ１及びＲ２は、それらが結合している原子と組合せられて、環頂点の一つとして、-Ｏ-を有する、５-ないし８-員の単環式又は架橋した二環式複素環を形成し；ここでＲ１及びＲ２を組合せることによって形成された５-ないし８-員の単環式又は架橋した二環式複素環は、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１の付加的なヘテロ原子をさらに有していてもよく、ハロゲン、-ＮＲｊＲｋ、-ＳＲｊ、-ＯＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｊＲｋ、-ＮＨＣ(Ｏ)Ｒｊ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｊ、-Ｒｍ、-ＣＮ、=Ｏ、=Ｓ、=Ｎ-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｊ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｊＲｋ、-Ｃ１-４アルキレン-ＯＲｊ、-Ｃ１-４アルキレン-Ｒｍ、-Ｃ２-４アルケニレン-Ｒｍ、-Ｃ２-４アルキニレン-Ｒｍ、-Ｃ１-４アルキレン-Ｃ１-９ヘテロアリール、Ｃ２-４アルケニレン-Ｃ１-９ヘテロアリール、Ｃ２-４アルキニレン-Ｃ１-９ヘテロアリール、Ｃ１-４アルキレン-Ｃ６-１０アリール、Ｃ２-４アルキニレン-Ｃ６-１０アリール及びＣ２-４アルキニレン-Ｃ６-１０アリールからなる群から選択される０ないし５のＲＡ置換基で置換されており、ここでＲｊ及びＲｋはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシクロアルキル、フェニル、ピリジル及び-(ＣＨ２)１-４-(Ｐｈ)から選択され、及びＲｊ及びＲｋは、同じ窒素原子に結合している場合、任意に組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する３-ないし６-員の複素環式環を形成し；及びＲｍは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシク��アルキル及び-(ＣＨ２)１-４-(Ｐｈ)から選択され、ここでＲＲ置換基のＣ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシクロアルキル、Ｃ１-９ヘテロアリール又はＣ６-１０アリール部分は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＨ(Ｃ１-４アルキル)、-Ｎ(ジＣ１-４アルキル)、Ｏ(Ｃ１-４アルキル)、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、-Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ１-４アルキル)、-Ｃ(Ｏ)ＮＨ(Ｃ１-４アルキル)、-Ｃ(Ｏ)Ｎ(ジＣ１-４アルキル)、-ＮＯ２、-ＣＮからなる群から選択される０ないし３の置換基で置換されており；ここでＲ１及びＲ２が組合せられて、単環式の５-ないし８-員の複素環式環を形成している場合、該５-ないし８-員の複素環式環の同じ原子又は隣接する炭素原子に結合している任意の２のＲＲ置換基は、任意に組合せられて、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし７-員のヘテロシクロアルキル環、又は３-ないし７-員のシクロアルキル環を形成し；Ｂは、フェニレン及び５-ないし６-員のヘテロアリーレンからなる群から選択されるメンバーであり、ハロゲン、-ＣＮ、-Ｎ３、-ＮＯ２、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｎ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｎＲｏ、-ＮＲｎＣ(Ｏ)Ｒｏ、-ＮＲｎＣ(Ｏ)ＮＲｎＲｏ、-ＯＲｎ、-ＮＲｎＲｏ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｎ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｎＲｏ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｎ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｎＲｏ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｐ及びＲｐから選択される、０ないし４のＲＢ置換基で置換されており；ここでＲｎ及びＲｏは独立して、水素及びＣ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-(フェニル)から選択されるか、又は同じ窒素原子に結合している場合、Ｒｎ及びＲｏは任意に組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する３-ないし６-員の複素環式環を形成し；Ｒｐは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-(フェニル)であり、ここでＤ基を含まず、Ｂの隣接する原子に位置する、任意の２の置換基は任意に組合せられて、５-ないし６-員の炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール環を形成し；Ｄは、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ４Ｒ５、-Ｃ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＯＣ(Ｏ)ＯＲ４、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＯＲ４)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(=Ｎ-ＮＲ４)ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)Ｒ４、-ＮＲ３Ｃ(Ｏ)ＯＲ４、-ＮＲ３Ｓ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５、-ＮＲ３Ｓ(Ｏ)２Ｒ４、-ＮＲ３Ｃ(=Ｓ)ＮＲ４Ｒ５及び-Ｓ(Ｏ)２Ｒ４Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ３は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル及びＣ２-６アルケニルからなる群から選択され；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６アルキルアミノ-Ｃ(=Ｏ)-、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-１０シクロアルキル、Ｃ２-９ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ１-９ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ４及びＲ５は、同じ窒素原子に結合している場合、���意に組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし３のヘテロ原子を有する、５-ないし６-員のヘテロアリール環、又は５-ないし７-員の複素環式環を形成し；ここでＲ３、Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン、-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＮＲｑＲｒ、-ＯＲｑ、-ＳＲｑ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｑ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｑＲｒ、-ＮＲｑＣ(Ｏ)Ｒｒ、-ＮＲｑＣ(Ｏ)ＯＲｓ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｑＲｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｑ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｑ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｑ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｑＲｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｑＣ(Ｏ)Ｒｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｑＣ(Ｏ)ＯＲｒ、-(ＣＨ２)１-４-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＯ２、-Ｓ(Ｏ)Ｒｒ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｒ、-(ＣＨ２)１-４Ｒｓ、=Ｏ、及び-Ｒｓからなる群から独立して選択される０ないし３のＲＤ置換基でさらに置換されており；ここでＲｑ及びＲｒは、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール、Ｃ１-９ヘテロアリールから選択され；Ｒｓは、それぞれの場合において、独立して、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-６ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ１-９ヘテロアリールから選択
され；Ｄ基及びＢの隣接する原子に位置する置換基は、任意に組合せられて、１ないし２のＲＤ置換基で置換されていてもよい、５-ないし６-員の複素環又はヘテロアリール環を形成する]
を含むｍＴＯＲ阻害剤化合物、その立体異性体、互変異性体、及び製薬的に許容可能な塩を含む。
【００５８】
他の実施態様は、
2014507129.tif 000042
[上式中、Ｒ１は、６-ないし１０−員のアリール、５-ないし９-員のヘテロアリール、３-ないし１２-員のヘテロシクロアルキル、３-ないし１２-員のシクロアルキルからなる群から選択され、ここでＲ１は、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＲａＲｂ、-ＳＲａ、-ＯＲａ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｃ(Ｏ)Ｒａ、-ＮＲａＣ(Ｏ)Ｒｂ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｃ、-ＮＲａＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＳ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒａ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｒｃ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、Ｒｃ１、-Ｘ１-ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＳＲａ、-Ｘ１-ＯＲａ、-Ｘ１-Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、-Ｘ１-Ｃ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-Ｃ(Ｏ)Ｒａ、-Ｘ１-ＮＲａＣ(Ｏ)Ｒｂ、-Ｘ１-ＯＣ(Ｏ)Ｒａ、-Ｘ１-ＮＲａＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＯＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＮＲａＳ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-Ｓ(Ｏ)２Ｒａ、-Ｘ１-Ｓ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＮＯ２、-Ｘ１-Ｎ３、-Ｘ１-ＣＮ、及びＸ１-Ｒｃ１からなる群から選択される０ないし５のＲＲ１置換基で置換されており；ここでＲａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４フェニルから選択され、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし６-員の複素環式環を形成し；Ｒｃは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；Ｘ１は、Ｃ１-４アルキレン、Ｃ２-４アルケニレン及びＣ２-４アルキニレンからなる群から選択され；及びＲｃ１は、フェニル、２-ピリジル、３-ピリジル、４-ピリジル、２-イミダゾリル、２-インドリル、１-ナフチル、２-ナフチル、２-チエニル、３-チエニル、２-ピロリル、２-フラニル及び３-フラニルからなる群から選択され、及びＲｃ１は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＲａＲｂ、-ＳＲａ、-ＯＲａ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒａ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、ピリジル、Ｃ１-６アルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル及びＣ１-６ヘテロアルキルから選択される０ないし３の置換基で置換されていてもよく；Ｒ２は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、６-ないし１０員のアリール、５-ないし１０−員のヘテロアリール、３-ないし１２-員のヘテロシクロアルキル、３-ないし１２員のシクロアルキル、-Ｌ-Ｃ６-１０アリール、-Ｌ-Ｃ１-９ヘテロアリール、-Ｌ-Ｃ３-１２シクロアルキル及び−Ｌ-Ｃ２-１２ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、ここでＬは、Ｃ１-６アルキレン、Ｃ２-６アルケニレン、Ｃ２-６アルキニレン及びＣ１-６ヘテロアルキレンから選択され、ここでＲ２は、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＲｄＲｅ、-ＳＲｄ、-ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄ���ｅ、-Ｒｆ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、-Ｘ２-ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＳＲｄ、-Ｘ２-ＯＲｄ、-Ｘ２-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｘ２-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-Ｘ２-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-Ｘ２-ＯＣ(Ｏ)Ｒｄ、-Ｘ２-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｘ２-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＮＯ２、-Ｘ２-Ｎ３及び−Ｘ２-ＣＮからなる群から選択される０ないし５のＲＲ２置換基で置換されており；ここでＲｄ及びＲｅはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され、場合によってはＲｄ及びＲｅは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし６-員の複素環式環を形成し；Ｒｆは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；及びＸ２は、Ｃ１-４アルキレン、Ｃ２-４アルケニレン及びＣ２-４アルキニレンからなる群から選択され；Ｒ３は、５-ないし１２-員の単環式又は架橋したヘテロシクロアルキル環であり、ここでＲ３基は、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｇ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-ＮＲｇＲｈ、-ＯＲｇ、-ＳＲｇ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｉ、-Ｓ(Ｏ)Ｒｉ、-Ｒｉ、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＯ２、-ＣＮ及び-Ｎ３からなる群から選択される０ないし３のＲＲ３置換基で置換されており、ここでＲｇ及びＲｈはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル及びＣ３-６シクロアルキルから選択され、場合によってはＲｇ及びＲｈは、それぞれが結合している窒素原子と共同して、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし６-員の複素環式環を形成し、及びＲｉは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ３-６シクロアルキルから選択され；Ｒ３が単環式ヘテロシクロアルキル環である場合、Ｒ３の同じ原子に結合している任意の２のＲＲ３基は、任意に組合せられて、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２の原子を有する、３-ないし７-員の複素環式環又は３-ないし７-員の炭素環を形成し；Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｃ(ＲＡ)又はＣ(Ｈ)から選択されるメンバーであり、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４の少なくとも３は、それぞれ独立してＣ(Ｈ)又はＣ(ＲＡ)であり、ＲＡはそれぞれの場合において、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＯ２、-ＣＮ、Ｃ１-４アルキル、Ｃ２-４アルケニル、Ｃ２-４アルキニルからなる群から選択され、又は隣接する原子に結合している任意の２のＲＡ基は、任意に組合せられて、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有するＣ２-６複素環式環、Ｃ３-７シクロアルキル環、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし４のヘテロ原子を有するＣ１-５ヘテロアリール環、又はフェニル環を形成し；及びＤは、-��Ｒ４Ｃ(Ｏ)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ５Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)ＮＲ５Ｒ６、-ＯＣ(Ｏ)ＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(=Ｎ-ＯＲ５)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(=Ｎ-ＮＲ５)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(Ｏ)Ｒ５、-ＮＲ４Ｃ(Ｏ)ＯＲ５、-ＮＲ４Ｓ(Ｏ)２ＮＲ５Ｒ６及び-ＮＲ４Ｓ(Ｏ)２Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ４は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル及びＣ２-６アルケニルからなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-１０シクロアルキル、Ｃ２-１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ１-９ヘテロアリールからなる群から選択され、及びＲ５及びＲ６は、同じ窒素原子に結合している場合、任意に組合せられて、０-３のＲＤ置換基で置換されており、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし３のヘテロ原子を有する５-ないし９-員のヘテロアリール環又は５-ないし７-員の複素環式環を形成し；及びＲ４、Ｒ５及びＲ６は、０-３のＲＤ置換基でさらに置換
されており、ＲＤは独立して、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＮＲｊＲｋ、-ＯＲｊ、-ＳＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｊＲｋ、-ＮＲｊＣ(Ｏ)Ｒｋ、-ＮＲｊＣ(Ｏ)ＯＲｍ、-Ｘ３-ＮＲｊＲｋ、-Ｘ３-ＯＲｊ、-Ｘ３-ＳＲｊ、-Ｘ３-Ｃ(Ｏ)ＯＲｊ、-Ｘ３-Ｃ(Ｏ)ＮＲｊＲｋ、-Ｘ３-ＮＲｊＣ(Ｏ)Ｒｋ、-Ｘ３-ＮＲｊＣ(Ｏ)ＯＲｋ、-Ｘ３-ＣＮ、-Ｘ３-ＮＯ２、-Ｓ(Ｏ)Ｒｍ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｍ、=Ｏ、及び-Ｒｍからなる群から選択され；ここでＲｊ及びＲｋは、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール、Ｃ１-９ヘテロアリールから選択され；及びＲｍは、それぞれの場合において、独立して、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ１-９ヘテロアリールから選択され；Ｘ３は、Ｃ１-４アルキレン、Ｃ２-４アルケニレン及びＣ２-４アルキニレンからなる群から選択され；ここでＤ、及びＤが結合している原子に隣接した原子に結合しているＲＡ置換基は、任意に組合せられて、０ないし４のＲＤで置換された、置換されていてもよい５-ないし６-員の複素環式環又はヘテロアリール環を形成する]
を含むｍＴＯＲ阻害剤化合物、その立体異性体、互変異性体、及び製薬的に許容可能な塩を含む。
【００５９】
他の実施態様は、
2014507129.tif 000043
[上式中、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して、Ｎ又はＣ(Ｒ１)であるが、Ｙ１及びＹ２は双方ともＮではなく、又は双方ともＣ(Ｒ１)ではなく、ここでＲ１は、Ｒ１は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、６-ないし１０-員のアリール、５-ないし９-員のヘテロアリール、３-ないし１２-員のヘテロシクロアルキル、３-ないし１２-員のシクロアルキルからなる群から選択され、ここでＲ１は、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＲａＲｂ、-ＳＲａ、-ＯＲａ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｃ(Ｏ)Ｒａ、-ＮＲａＣ(Ｏ)Ｒｂ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｃ、-ＮＲａＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＳ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒａ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｒｃ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、Ｒｃ１、-Ｘ１-ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＳＲａ、-Ｘ１-ＯＲａ、-Ｘ１-Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、-Ｘ１-Ｃ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-Ｃ(Ｏ)Ｒａ、-Ｘ１-ＮＲａＣ(Ｏ)Ｒｂ、-Ｘ１-ＯＣ(Ｏ)Ｒａ、-Ｘ１-ＮＲａＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＯＣ(Ｏ)ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＮＲａＳ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-Ｓ(Ｏ)２Ｒａ、-Ｘ１-Ｓ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-Ｘ１-ＮＯ２、-Ｘ１-Ｎ３、-Ｘ１-ＣＮ、及びＸ１-Ｒｃ１からなる群から選択される０ないし５のＲＲ１置換基で置換されており；ここでＲａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４フェニルから選択され、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし６-員の複素環式環を形成し；Ｒｃは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；Ｘ１は、Ｃ１-４アルキレン、Ｃ２-４アルケニレン及びＣ２-４アルキニレンからなる群から選択され；及びＲｃ１は、フェニル、２-ピリジル、３-ピリジル、４-ピリジル、２-イミダゾリル、２-インドリル、１-ナフチル、２-ナフチル、２-チエニル、３-チエニル、２-ピロリル、２-フラニル及び３-フラニルからなる群から選択され、及びここでＲｃ１は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＲａＲｂ、-ＳＲａ、-ＯＲａ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒａ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲａＲｂ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、ピリジル、Ｃ１-６アルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル及びＣ１-６ヘテロアルキルから選択される０ないし３の置換基で置換されており；Ｒ２は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、-Ｌ-Ｃ６-１０アリール、-Ｌ-Ｃ１-９ヘテロアリール、-Ｌ-Ｃ３-１２シクロアルキル及び−Ｌ-Ｃ２-１２ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、ここでＬは、Ｃ１-６アルキレン、Ｃ２-６アルケニレン、Ｃ２-６アルキニレン及びＣ１-６ヘテロアルキレンから選択され、ここでＲ２は、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＲｄＲｅ、-ＳＲｄ、-ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｒｆ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、-Ｘ２-ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＳＲｄ、-Ｘ２-ＯＲｄ、-Ｘ２-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｘ２-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-Ｘ２-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-Ｘ２-ＯＣ(Ｏ)Ｒｄ、-Ｘ２-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｘ２-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｘ２-ＮＯ２、-Ｘ２-Ｎ３及び−Ｘ２-ＣＮからなる群から選択される０ないし５のＲＲ２置換基で置換されており；ここでＲｄ及びＲｅはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され、場合によってはＲｄ及びＲｅは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし６-員の複素環式環を形成し；Ｒｆは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；及びＸ２は、Ｃ１-４アルキレン、Ｃ２-４アルケニレン及びＣ２-４アルキニレンからなる群から選択され；Ｒ３は、５-ないし１２-員の単環式又は架橋したヘテロシクロアルキル環であり、ここでＲ３基は、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｇ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｇＲｈ、-ＮＲｇＲｈ、-ＯＲｇ、-ＳＲｇ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｉ、-Ｓ(Ｏ)Ｒｉ、-Ｒｉ、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＯ２、-ＣＮ及び-Ｎ３からなる群から選択される０ないし３のＲＲ３置換基で置換されており、ここでＲｇ及びＲｈはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ２-６アルケニル及びＣ３-６シクロアルキルから選択され、場合によってはＲｇ及びＲｈは、それぞれが結合している窒素原子と共同して、組合せられて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有する、３-ないし６-員の複素環式環を形成し、及びＲｉは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ３-６シクロアルキルから選択され；Ｒ３が単環式ヘテロシクロアルキル環である場合、Ｒ３の同じ原子に結合している任意の２のＲＲ３基は、任意に組合せられて、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２の原子を有する、３-ないし７-員の複素環式環又は３-ないし７-員の炭素環を形成し；Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｃ(ＲＡ)又はＣ(Ｈ)から選択されるメンバーであり、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４の少なくとも３は、それぞれ独立してＣ(Ｈ)又はＣ(ＲＡ)であり、ＲＡはそれぞれの場合において、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＯ２、-ＣＮ、Ｃ１-４アルキル、Ｃ２-４アルケニル、Ｃ２-４アルキニルからなる群から選択され、又は隣接する原子に結合している任意の２のＲＡ基は、任意に組合せられて、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし２のヘテロ原子を有するＣ２-６複素環式環、Ｃ３-７シクロアルキル環、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１ないし４のヘテロ原子を有するＣ１-５ヘテロアリール環、又はフェニル環を形成し；及びＤは、-ＮＲ４Ｃ(Ｏ)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ５Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)ＮＲ５Ｒ６、-ＯＣ(Ｏ)ＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(=Ｎ-ＯＲ５)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(=Ｎ-ＮＲ５)ＮＲ５Ｒ６、-ＮＲ４Ｃ(Ｏ)Ｒ５、-ＮＲ４Ｃ(Ｏ)ＯＲ５、-ＮＲ４Ｓ(Ｏ)２ＮＲ５Ｒ６及び-ＮＲ４Ｓ(Ｏ)２Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、ここでＲ４は、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル及びＣ２-６アルケニルからなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-１０シクロアルキル、Ｃ２-１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ１-９ヘテロアリールからなる群から選択され、及びＲ５及びＲ６は、同じ窒素原子に結合している場合、任意に組合せられて、０-３のＲＤ置換基で置換されており、環頂点として、Ｎ、Ｏ及びＳから選択され
る１ないし３のヘテロ原子を有する５-ないし９-員のヘテロアリール環又は５-ないし７-員の複素環式環を形成し；及びＲ４、Ｒ５及びＲ６は、０-３のＲＤ置換基でさらに置換されており、ＲＤは独立して、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＮＲｊＲｋ、-ＯＲｊ、-ＳＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｊ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｊＲｋ、-ＮＲｊＣ(Ｏ)Ｒｋ、-ＮＲｊＣ(Ｏ)ＯＲｍ、-Ｘ３-ＮＲｊＲｋ、-Ｘ３-ＯＲｊ、-Ｘ３-ＳＲｊ、-Ｘ３-Ｃ(Ｏ)ＯＲｊ、-Ｘ３-Ｃ(Ｏ)ＮＲｊＲｋ、-Ｘ３-ＮＲｊＣ(Ｏ)Ｒｋ、-Ｘ３-ＮＲｊＣ(Ｏ)ＯＲｋ、-Ｘ３-ＣＮ、-Ｘ３-ＮＯ２、-Ｓ(Ｏ)Ｒｍ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｍ、=Ｏ、及び-Ｒｍからなる群から選択され；ここでＲｊ及びＲｋは、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ１-６ヘテロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール、Ｃ１-９ヘテロアリールから選択され；及びＲｍは、それぞれの場合において、独立して、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６-１０アリール及びＣ１-９ヘテロアリールから選択され；Ｘ３は、Ｃ１-４アルキレン、Ｃ２-４アルケニレン及びＣ２-４アルキニレンからなる群から選択され；ここでＤ、及びＤが結合している原子に隣接した原子に結合しているＲＡ置換基は、任意に組合せられて、０ないし４のＲＤで置換された、置換されていてもよい５-ないし６-員の複素環式環又はヘテロアリール環を形成する]
を含むｍＴＯＲ阻害剤化合物、その立体異性体、互変異性体、及び製薬的に許容可能な塩を含む。
【００６０】
他の実施態様は、
2014507129.tif 000044
2014507129.tif 000045
を含むｍＴＯＲ阻害剤化合物を含む。
【００６１】
他の実施態様は、ｍＴＯＲ阻害剤、ラパマイシン：
2014507129.tif 000046
を含む。
【００６２】
他の実施態様は、次の式：
2014507129.tif 000047
[Ｒ１及びＲ２は独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１-６アルキル、-ＮＲｄＲｅ、-ＳＲｄ、-ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-Ｃ(=ＮＯＲｄ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＣ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲｄＲｅ、-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-Ｒｆ、-ＮＯ２、-Ｎ３、=Ｏ、-ＣＮ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＳＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＯＲｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(Ｏ)Ｒｄ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(Ｏ)Ｒｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)Ｒｆ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＯＣ(Ｏ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｃ(=ＮＯＲｄ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＣ(=Ｎ-ＣＮ)ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＲｄＳ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２Ｒｄ、-(ＣＨ２)１-４-Ｓ(Ｏ)２ＮＲｄＲｅ、-(ＣＨ２)１-４-ＮＯ２、-(ＣＨ２)１-４-Ｎ３又は-(ＣＨ２)１-４-ＣＮから選択され；ここでＲｄ及びＲｅはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ２-６アルケニル、Ｃ２-６アルキニル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され、又はＲｄ及びＲｅは、同じ窒素原子に結合している場合、組合せられて、３-ないし６-員環を形成し；Ｒｆは、Ｃ１-６アルキル、Ｃ１-６ハロアルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ３-７ヘテロシクロアルキル、フェニル及び-(ＣＨ２)１-４-フェニルから選択され；又は
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合している原子と共同して、オキソ、ハロゲン、Ｃ１-Ｃ３アルキル又はＣＦ３により置換されていてもよい、縮合した５-又は６-員のヘテロシクリル又はヘテロアリール環を形成する]
のＰＩ３-ｋ阻害剤化合物、又はその製薬的に許容可能な塩を含む。
【００６３】
例示的なＰＩ３-ｋ阻害剤は、次のもの：
2014507129.tif 000048
を含む。
【００６４】
一実施態様において、キナーゼ阻害剤は次の式Ｖ及びＶＩ：
2014507129.tif 000049
[Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｍＮＲ１０Ｒ１１、-Ｃ(Ｒ１４Ｒ１５)ｎＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)Ｒ１０、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｎＮＲ１２Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｍＯＲ１０、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｎＳ(Ｏ)２Ｒ１０、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｎＳ(Ｏ)２ＮＲ１０Ｒ１１、-Ｃ(ＯＲ１０)Ｒ１１Ｒ１４、-Ｃ(=Ｙ)Ｒ１０、-Ｃ(=Ｙ)ＯＲ１０、-Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１２ＯＲ１０、-Ｃ(=Ｏ)ＮＲ１２Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-Ｃ(=Ｏ)ＮＲ１２(ＣＲ１４Ｒ１５)ｍＮＲ１０Ｒ１１、-ＮＯ２、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)Ｒ１１、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)ＯＲ１１、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-ＮＲ１２Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-ＮＲ１２ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１、-ＳＲ１０、-Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲ１０Ｒ１１、-ＳＣ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＳＣ(=Ｙ)ＯＲ１０、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ３-Ｃ１２カルボシクリル、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ１-Ｃ２０ヘテロアリールから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＦ３、-ＮＯ２、-Ｃ(=Ｙ)Ｒ１０、-Ｃ(=Ｙ)ＯＲ１０、-Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｍＮＲ１０Ｒ１１、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｎＯＲ１０、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｔ-ＮＲ１２Ｃ(=Ｏ)(ＣＲ１４Ｒ１５)ＮＲ１０Ｒ１１、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)ＯＲ１０、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-ＮＲ１２ＳＯ２Ｒ１０、ＯＲ１０、-ＯＣ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＯＣ(=Ｙ)ＯＲ１０、-ＯＣ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＳ(Ｏ)２(ＯＲ１０)、-ＯＰ(=Ｙ)(ＯＲ１０)(ＯＲ１１)、-ＯＰ(ＯＲ１０)(ＯＲ１１)、ＳＲ１０、-Ｓ(Ｏ)Ｒ１０、-Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲ１０Ｒ１１、-Ｓ(Ｏ)(ＯＲ１０)、-Ｓ(Ｏ)２(ＯＲ１０)、-ＳＣ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＳＣ(=Ｙ)ＯＲ１０、-ＳＣ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ３-Ｃ１２カルボシクリル、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ１-Ｃ２０ヘテロアリールから選択され；
Ｒ３は、炭素結合単環式ヘテロアリール、炭素結合縮合二環式Ｃ３-Ｃ２０ヘテロシクリル、又は炭素結合縮合二環式Ｃ１-Ｃ２０ヘテロアリールであり、ここで単環式ヘテロアリール、縮合二環式Ｃ３-Ｃ２０ヘテロシクリル、及び縮合二環式Ｃ１-Ｃ２０ヘテロアリールは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、-ＣＮ、-ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＲ１０、-Ｃ(Ｏ)Ｒ１０、-ＮＲ１０Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、-Ｎ(Ｃ(Ｏ)Ｒ１１)２、-ＮＲ１０Ｃ(Ｏ)ＮＲ１０Ｒ１１、-ＮＲ１２Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-Ｃ(=Ｏ)ＯＲ１０、-Ｃ(=Ｏ)ＮＲ１０Ｒ１１、Ｃ１-Ｃ１２アルキル及び(Ｃ１-Ｃ１２アルキル)-ＯＲ１０から選択される一又は複数の基で置換されていてもよい；
Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ３-Ｃ１２カルボシクリル、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、又はＣ１-Ｃ２０ヘテロアリールであり、
又はＲ１０及びＲ１１はそれらが結合している窒素原子と共同して、オキソ、(ＣＨ２)ｍＯＲ１２、ＮＲ１２Ｒ１２、ＣＦ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２Ｒ１２、Ｃ(=Ｏ)Ｒ１２、ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)Ｒ１２、ＮＲ１２Ｓ(Ｏ)２Ｒ１２、Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１２Ｒ１２、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ３-Ｃ１２カルボシクリル、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール及びＣ１-Ｃ２０ヘテロアリールから独立して選択される一又は複数の基で置換されていてもよい、Ｃ２-Ｃ２０複素環式環を形成し；
Ｒ１４及びＲ１５は独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、又は-(ＣＨ２)Ｎ-アリールから選択され、
又はＲ１４及びＲ１５はそれらが結合している原子と共同して、飽和又は部分的に不飽和のＣ３-Ｃ１２炭素環を形成し；ここで該アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＦ３、-ＮＯ２、オキソ、Ｒ１０、-Ｃ(=Ｙ)Ｒ１０、-Ｃ(=Ｙ)ＯＲ１０、-Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｎＮＲ１０Ｒ１１、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｎＯＲ１０、-ＮＲ１０Ｒ１１、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)ＯＲ１１、-ＮＲ１２Ｃ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-(ＣＲ１４Ｒ１５)ｍＮＲ１２ＳＯ２Ｒ１０、=ＮＲ１２、ＯＲ１０、-ＯＣ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＯＣ(=Ｙ)ＯＲ１０、-ＯＣ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＳ(Ｏ)２(ＯＲ１０)、-ＯＰ(=Ｙ)(ＯＲ１０)(ＯＲ１１)、-ＯＰ(ＯＲ１０)(ＯＲ１１)、-ＳＲ１０、-Ｓ(Ｏ)Ｒ１０、-Ｓ(Ｏ)２Ｒ１０、-Ｓ(Ｏ)２ＮＲ１０Ｒ１１、-Ｓ(Ｏ)(ＯＲ１０)、-Ｓ(Ｏ)２(ＯＲ１０)、-ＳＣ(=Ｙ)Ｒ１０、-ＳＣ(=Ｙ)ＯＲ１０、-ＳＣ(=Ｙ)ＮＲ１０Ｒ１１、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ３-Ｃ１２カルボシクリル、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ１-Ｃ２０ヘテロアリールから独立して選択される一又は複数の基で置換されていてもよく；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ１２であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり；及び
ｎは、１、２、３、４、５又は６である]
のＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤、又はその立体異性体、幾何異性体、互変変異体、又は製薬的に許容可能な塩を含む。
【００６５】
例示的なＰＩ３-ｋ阻害剤は、次のもの：
2014507129.tif 000050
を含む。
【００６６】
式Ｖ及びＶＩの化合物の調製
式Ｖ及びＶＩの化合物は、全ての目的について、その全体が参照としてここに導入される、国際特許第2006/046031号を含む、化学分野でよく知られているものに類似したプロセスを含む合成経路により、合成されうる。出発物質は、Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI)等の商業的供給源から一般的に入手可能であるか、又は当業者によく知られている方法を使用して容易に調製される(例えば、Louis F. Fieser 及び Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, N.Y. (1967-1999編)、又は補足を含む、Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin,に記載された一般的方法により調製(また、Beilsteinオンラインデータベースを介して入手可能)。
【００６７】
式Ｖ及びＶＩの化合物は、他のチオフェン類、フラン類、ピリミジン類(米国特許第6608053号;米国特許第6492383号;米国特許第6232320号;米国特許第6187777号;米国特許第3763156号;米国特許第3661908号;米国特許第3475429号;米国特許第5075305号;米国特許第2003/220365号;英国特許第1393161号;国際特許第93/13664号)；及びComprehensive Heterocyclic Chemistry, Editors Katritzky  and Rees, Pergamon Press, 1984に記載の、他の複素環を調製するための手順を使用し、調製することができる。
【００６８】
式Ｖ及びＶＩ化合物は、製薬的に許容可能な塩に転換されてもよく、塩は、従来からの方法により、遊離の化合物に転換されてよい。製薬的に許容可能な塩の例には、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸及びリン酸；及び有機酸、例えばメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸及びグルタミン酸との塩が含まれる。塩は、メシル酸塩、塩酸塩、リン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、又は硫酸塩であってよい。塩は、単塩又は二塩であってよい。例えばメシル酸塩は、一メシル酸塩又は二メシル酸塩であってよい。
【００６９】
式Ｖ及びＶＩの化合物及び塩は、水和物又は溶媒和物として存在していてよい。
【００７０】
中間体の官能基(例えば、第１級又は第２級アミン)の保護が、式Ｖ及びＶＩの化合物の調製において必要な場合もある。このような保護の必要性は、調製方法の条件、遠隔官能性の性質に応じて変化するであろう。適切なアミノ保護基には、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ-ブトキシカルボニル(ＢＯＣ)、ベンジルオキシカルボニル(ＣＢｚ)、及び９-フルオレニルメチレンオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)が含まれる。このような保護の必要性は、当業者により容易に決定される。保護基及びそれらの使用についての一般的記載は、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1999を参照。
【００７１】
例示的目的のために、スキーム５-１１は、本発明の化合物、並びに重要な中間体を調製するための一般的方法を示す。個々の反応工程の詳細は、以下の実施例を参照のこと。当業者であれば、本発明の化合物を調製するために、他の合成経路も使用可能であることは理解しているであろう。特定の出発物質及び試薬は、スキームに示し、以下で論ずるが、他の出発物質及び試薬に置き換えて、種々の誘導体及び／又は反応条件を提供することもできる。さらに、以下に記載の方法で調製された多くの化合物は、当業者によく知られている、従来からの化学を使用し、この開示を考慮してさらに修正することもできる。
【００７２】
2014507129.tif 000051
スキーム５は、２-カルボキシエステル、３-アミノチオフェン、及び２-アミノ、３-カルボキシエステルチオフェン試薬から、それぞれチエノピリミジン中間体５５及び５６を調製するための一般的方法を示し、ここでＨａｌはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり；及びＲ１、Ｒ２、及びＲ１０は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである。
【００７３】
2014507129.tif 000052
スキーム６は、有機溶媒において、塩基性条件下、モルホリンを用い、ビス-ハロチエノピリミジン中間体５７及び５８から４-ハロゲン化物を選択的に置き換え、それぞれ２-ハロ、４-モルホリノチエノピリミジン化合物５９及び６０を調製するための一般的方法を示し、ここでＨａｌはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり；及びＲ１及びＲ２は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである。
【００７４】
2014507129.tif 000053
スキーム７は、Ｒ１がＨである、２-ハロ、４-モルホリノ、６-水素チエノピリミジン化合物６１及び６２の６位を誘導体化させる一般的方法を示す。リチウム化試薬を用いて６１及び６２を処理し、６位のプロトンを除去し、ハロゲン化物、ＮＨＳエステル、カルボキシラート、又はジアルキルアミノ等、Ｚが離脱基である、アシル化試薬Ｒ１０Ｃ(Ｏ)Ｚを添加したところ、２-ハロ、４-モルホリノ、６-アシルチエノピリミジン化合物６３及び６４が得られ、ここでＨａｌはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり；及びＲ２及びＲ１０は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである。６-ホルミル化合物(Ｒ１０=Ｈ)を調製するためのＲ１０Ｃ(Ｏ)Ｚの例は、Ｎ,Ｎ'-ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)である。
【００７５】
2014507129.tif 000054
スキーム８は、式Ｖ及びＶＩの２置換された(Ｈｙ)、４-モルホリノチエノピリミジン化合物(６８及び６９)を調製するために、単環式ヘテロアリール、縮合二環式ヘテロシクリル、又は縮合二環式ヘテロアリールボロナートの酸(Ｒ１５=Ｈ)又はエステル(Ｒ１５=アルキル)試薬６７を用い、２-ハロピリミジン中間体(６５及び６６)をスズキ型カップリングする一般的方法を示し、ここでＨａｌはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり；及びＲ１及びＲ２は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである。スズキ反応にいついては、Miyauraら(1995) Chem. Rev. 95:2457-2483; Suzuki, A. (1999) J. Organomet. Chem. 576:147-168; Suzuki, A. Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions, Diederich, F., Stang, P.J., Eds., VCH, Weinheim, DE (1998), pp 49-97を参照。パラジウム触媒は、スズキ型架橋カップリングに典型的に使用される任意のもの、例えばＰｄＣｌ２(ＰＰｈ３)２、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４、Ｐｄ(ＯＡｃ)２、ＰｄＣｌ２(ｄｐｐｆ)-ＤＣＭ、Ｐｄ２(ｄｂａ)３／Ｐｔ-Ｂｕ)３であってよい(Owensら (2003) Bioorganic & Med. Chem. Letters 13:4143-4145; Molanderら (2002) Organic Letters 4(11):1867-1870; 米国特許第6448433号)。
【００７６】
2014507129.tif 000055
スキーム９は、化合物７２及び７３のアルキニル化誘導体を調製するために使用可能な、アルキン７１を合成するための一般的方法を示す。プロパルギルアミン７１は、臭化プロパルギル７０と式Ｒ１０Ｒ１１ＮＨのアミン(ここでＲ１０及びＲ１１は独立して、Ｈ、アルキル、アリール及びヘテロアリールから選択されるか、又はＲ１０及びＲ１１はそれが結合している窒素と共同して複素環式環を形成)とを、適切な塩基(Ｃｓ２ＣＯ３等)において反応させることにより調製されてよい。アルキニルアミン類及び関連する合成については、Booker-Milburn, K.I.、Comprehensive Organic Functional Group Transformations (1995), 2:1039-1074;及びViehe, H.G., (1967) Angew. Chem., Int. Ed. Eng., 6(9):767-778を参照。アルキン７１は、続いて、中間体７２(Ｘ２=ブロモ又はヨード)又は７３(ソノガシラカップリングを介する)と反応させて、それぞれ化合物７４及び７５が提供されてもよい(ここで、Ｒ２及びＲ３は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである)。
【００７７】
2014507129.tif 000056
スキーム１０は、化合物７２及び７３のアルキニル化誘導体を調製するために使用可能な、アルキン７７を合成するための一般的方法を示す。ジェム-ジアルキルプロパルギルアミン７７は、Zaragozaら (2004) J. Med. Chem., 47:2833に記載された方法を使用して調製されてよい。スキーム６に従い、ジェム-ジアルキルクロリド７６(Ｒ１及びＲ１５は独立して、メチル、エチル又は他のアルキル基である)を、ＣｕＣｌ及び適切な塩基(例えばＴＥＡ等)の存在下、式Ｒ１０Ｒ１１ＮＨのアミン(ここでＲ１０及びＲ１１は独立して、Ｈ、アルキル、アリール及びヘテロアリールから選択されるか、又はＲ１０及びＲ１１はそれが結合している窒素と共同して複素環式環を形成)と反応させることで、アルキン７７が提供される。アルキン７７を中間体７２又は７３(ソノガシラカップリングを介する)と反応させることで、それぞれ化合物７８及び７９が提供され、ここで、Ｒ２及びＲ３は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである。
【００７８】
2014507129.tif 000057
スキーム１１は、化合物７２及び７３のアルキニル化誘導体を調製するために使用可能な、アルキン８１を合成するための一般的方法を示す。ブト-３-イン-１アミン８１(ここでＲ１４及びＲ１５は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールであり、又はＲ１４及びＲ１５はそれが結合している炭素原子と共同して炭素環又は複素環式環を形成)は、Olomucki M.ら (1960) Ann. Chim. 5:845に記載のプロトコルを使用し、式Ｒ１０Ｒ１１ＮＨのアミン(ここでＲ１０及びＲ１１は独立して、Ｈ、アルキル、アリール及びヘテロアリールから選択されるか、又はＲ１０及びＲ１１はそれが結合している窒素と共同して複素環式環を形成)とアルキン８０(ＬＧ=トシラート又は他の離脱基)とを反応させることにより調製できる。続いて、アルキン８０を、スキーム５及び６に提供される記載に従い、中間体７１又は７３(ソノガシラカップリングを介する)と反応させることで、それぞれ化合物８２及び８３が提供され、ここで、Ｒ２及びＲ３は、式Ｖ及びＶＩの化合物、又は前駆体又はプロドラッグについて定められたものである。
【００７９】
式ＩないしＶＩのチエノピリミジン化合物の製薬的に許容可能な塩は、従来からの技術を使用して調製されてよい。典型的には、本プロセスは、適切な溶媒において、適切な酸を用い、上述した式Ｉのチエノピリミジンを処理することを含む。
【００８０】
上述した本発明のプロセスにおいて、アミノ化工程とＰｄ媒介性架橋カップリング工程の双方は、従来からの条件化で実施される。パラジウム触媒は、スズキ型架橋カップリングに典型的に使用される任意のもの、例えばＰｄＣｌ２(ＰＰｈ３)２であってよい。還元剤は、典型的にはホウ化水素、例えばＮａＢＨ(ＯＡｃ)３、ＮａＢＨ４又はＮａＣＮＢＨ４である。
【００８１】
腫瘍の治療方法
一実施態様は、(ｉ)キナーゼ阻害剤で、オートファジーを誘導するもの、及び(ｉｉ)腫瘍を治療するのに有効な量のオートファジー阻害剤を組合せて投与することを含む、哺乳動物の腫瘍を治療する方法を含む。キナーゼ阻害剤及びオートファジー阻害剤は、同時に又は異なる時点で、一緒に又は別々に投与することができる。一実施態様において、オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤、及びオートファジー阻害剤は、相乗的な有効量で存在する。
【００８２】
他の実施態様において、(ｉ)キナーゼ阻害剤で、オートファジーを誘導するもの、及び(ｉｉ)腫瘍を治療するのに有効な量のオートファジー阻害剤を組合せて投与することを含む、哺乳動物の腫瘍を治療する方法が、プロテアーゼ阻害剤の投与をさらに含む。プロテアーゼ阻害剤は当該技術でよく知られている。一実施態様において、プロテアーゼ阻害剤はリソソームシステインプロテアーゼ活性又はアスパラギンプロテアーゼ、例えばペプスタチンＡを阻害する。キナーゼ阻害剤、オートファジー阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤は、一回で、又は、同時に又は異なる時点で一緒に又は別々に任意の組合せで投与することができる。
【００８３】
腫瘍増殖の再発、又は癌細胞成長の再発を低減又はブロックする方法も提供される。本発明のある種の実施態様において、被験者は、同時に癌治療を受けた又は受ける。ここに記載の併用療法の投与により、腫瘍増殖の再発、又は癌細胞成長の再発がブロック又は低減する。
【００８４】
他の実施態様は、(ｉ)キナーゼ阻害剤で、オートファジーを誘導するもの、及び(ｉｉ)アポトーシスと誘導するのに有効な量のオートファジー阻害剤を細胞に投与することを含む、癌細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。一例において、前記キナーゼ阻害剤及び／又はオートファジー阻害剤の有効量は、相乗的なアポトーシス誘導効果を生じさせる量である。他の例において、該キナーゼ及び／又はオートファジー阻害剤の有効量は、、キナーゼ阻害剤又はオートファジー阻害剤単独のＥＤ５０、ＥＤ７５又はＥＤ９０より低い、ＥＤ５０、ＥＤ７５又はＥＤ９０を有する。一例において、キナーゼ阻害剤及びオートファジー阻害剤は、約２：１〜約１：５０、又は約１．２５：１〜約１：１２、又は約１：１〜約１：５の範囲の比率で付与される。一例において、ＩＩＩ-４は、約１：２５、１：１２．５、１：１．５、又は１．３：１の比率で、ＣＱと組合せて投与される。
【００８５】
任意の成分、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩにおいて、１回より多くの変化が生じる場合、各発生におけるその定義は、他の発生毎でのその定義に依存しない。また、置換基及び／又は変数の組合せは、このような組合せが許容可能な価数である場合にのみ容認される。
【００８６】
ここに記載の腫瘍を治療する方法は、オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤を投与することを含み、ここで、阻害剤はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)コンストラクトと、オートファジー阻害剤との組合せである.図２３は、このようなＲＮＡｉコンストラクトが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡに転写されるＤＮＡを含有できる。好ましくは、オートファジー阻害剤と組合せて、本方法においてＲＮＡｉコンストラクトを使用することで、腫瘍における相乗的殺傷及び阻害効果に帰する。
【００８７】
ＲＮＡコンストラクト
他の実施態様において、ここに開示の主題事項は、ここに記載のＲＮＡｉコンストラクトに関する。ＲＮＡｉコンストラクトはＡｋｔの有用な阻害剤である。
【００８８】
ここで使用される場合、ＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを指向するＤＮＡ、並びにＤＮＡそれ自体、ＤＮＡオリゴ、及びここに記載のベクターを含む。ある種の実施態様において、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、一又は複数のＡｋｔ遺伝子の標的配列に実質的に対応する核酸配列を含有するＲＮＡｉコンストラクトから転写される。好ましくは、配列は配列番号：３９-４８、及びその組合せから選択される。細胞に導入された場合、これらのＲＮＡｉコンストラクトは、一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減可能である。タンパク質の発現を低減とは、ＲＮＡｉコンストラクトが導入されない場合よりも、細胞における発現が低減していることを意味する。発現レベルを検出する方法は、ここに記載されているか、又は当該技術で公知である。ＲＮＡｉコンストラクトは,」Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３及びその組合せを含む、ＡＫＴアイソフォームの発現を低減させる。
【００８９】
ＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号：１-１８からなる群から選択される配列に、実質的に対応する一又は複数のＤＮＡ配列を含有可能である。ＤＮＡ配列は合成可能であり、ここに記載したように、シャトルにおいてクローン可能である。他の実施態様において、一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減可能なＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号：１９-３８からなる群から選択される配列、及びその組合せに、実質的に対応するＲＮＡ配列を含有可能である。他の実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトはセンスＲＮＡストランド及び実質的に相補的なＲＮＡストランドを含有可能であり、ここでアンチセンスストランドは、配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８から選択される配列に実質的に対応する一又は複数の配列を含有し、センス及びアンチセンスストランドは、ＲＮＡ二本鎖としてアニールされる。二本鎖は、配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７からなる群から選択される配列に実質的に対応する一又は複数の配列を含有するセンスストランドを含有可能である。センス及びアンチセンスストランドはアニール化されて、次の配列番号：１９：２０、２１：２２、２３：２４、２５：２６、２７：２８、２９：３０、３１：３２、３３：３４、３５：３６、及び３７：３８の１以上の対を含む組合せを含む対組合せにおいて、二本鎖を形成する。ＲＮＡｉコンストラクトは、センスストランド及びアンチセンスストランドに共有的に結合するヘアピンを含有可能である。
【００９０】
他の実施態様において、一又は複数のＡｋｔタンパク質の発現を低減可能なＲＮＡｉコンストラクトが、ここに記載されている。このようなＲＮＡｉコンストラクトの非限定的例は、配列番号：３２に実質的に対応するヌクレオチド配列を有する、及び配列番号：２２、２６及び３６からなる群から選択される配列に実質的に対応する配列を付加的に有するコンストラクトを含む。他の非限定的例は、配列番号：３１に実質的に対応するヌクレオチド配列、及び及び配列番号：２１、２５及び３５からなる群から選択される配列に実質的に対応する配列を付加的に含む。Ａｋｔアイソフォームの発現を低下させる他の組合せは、本開示により、容易に得ることができる。
【００９１】
他の実施態様は、Ａｋｔ遺伝子の発現を低減可能なＲＮＡｉコンストラクトを指向し、ここでコンストラクトはダイサーの基質である。さらなる他の実施態様は、ここに記載の、単離されたヌクレオチド又は核酸配列を指向する。ここに記載のＲＮＡｉコンストラクトは、任意の公知の方法で調製可能である。(McIntyre, GJ,及びFanning GC, BMC Biotechnology (2006), 6:1)。
【００９２】
薬学的製剤
本発明の薬学的組成物又は製剤は、式ＩないしＶＩの化合物、及びここに記載の他の化合物、オートファジー阻害剤、一又は複数の製薬的に許容可能な担体、滑剤、希釈剤、又は賦形剤の組合せを含む。
【００９３】
式ＩないしＶＩの化合物、及びここに記載の他の化合物、及び本発明のオートファジー阻害剤は、水、エタノール等の、製薬的に許容可能な溶媒と溶媒和した、及び溶媒和しない形態で存在していてよく、本発明は、溶媒和した及び溶媒和していない形態の双方を包含することを意図している。
【００９４】
式ＩないしＶＩの化合物、及びここに記載の他の化合物、及び本発明のオートファジー阻害剤は、種々の互変変異体で存在してよく、全てのこのような形態は本発明の範疇に入る。「互変異性体」又は「互変異性形態」なる用語は、低エネルギー障壁を介して相互転換可能な異なったエネルギーの構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体(プロトトロピー互変異性体としても知られる)は、ケト-エノール及びイミン-エナミン異性化のようなプロトンの移動を介する相互変換を含む。原子価互変異性体は結合電子の幾らかの再構築による相互変換を含む。
【００９５】
薬学的組成物は、任意の製薬的に不活性な賦形剤、希釈剤、担体又は滑剤と共に、ここに記載の付加的な薬剤の列挙から選択されるオートファジー阻害剤、及び式ＩないしＶＩの化合物を含む製薬的に活性な薬剤を１以上(例えば２)を含有する、バルク組成物及び個々の投与単位を含む。バルク組成物及び個々の投与単位は、固定量の上述した製薬的に活性な薬剤を含有可能である。バルク組成物は、個々の投与単位を形成していない物質である。例示的な投与単位は経口投与単位、例えば錠剤、丸薬、カプセル等である。同様に、本発明の薬学的組成物を投与することにより患者を治療する上述した方法は、バルク組成物及び個々の投与単位の投与を含むことを意図する。
【００９６】
また薬学的組成物は、ここに列挙されたものと同一であるが、一又は複数の原子が、通常自然に見出される原子質量及び質量数とは異なる原子質量及び質量数を有する原子と置き換えられている、本発明のアイソトープ標識された化合物も含む。特定されるように、任意の特定の原子又は元素の全てのアイソトープは、本発明の化合物及びそれらの使用の範疇に入ると考えられる。本発明の化合物に導入可能な例示的なアイソトープには、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素及びヨウ素のアイソトープ、例えば２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、１２３Ｉ及び１２５Ｉが含まれる。本発明のあるアイソトープ標識された化合物(例えば、３Ｈ又は１４Ｃで標識されたもの)は、化合物及び／又は基質の組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化(３Ｈ)及び炭素-１４(１４Ｃ)アイソトープは、調製及び検出の容易性において有用である。さらに、より重いアイソトープ、例えば重水素(すなわち、２Ｈ)を有する置換イオンは、より大きな代謝安定性に起因するある種の治療的利点(例えば、インビボ半減期の増加又は必要用量の低減)を提供可能であり、よって、ある環境では好ましい。アイソトープが放射する陽電子、例えば１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ、及び１８Ｆは、基質レセプター占有率を検査するためのポジトロン放出断層撮影(ＰＥＴ)研究に有用である。本発明のアイソトープ標識された化合物は、以下のスキーム及び／又は実施例に開示されたものに類似した手順に従い、アイソトープ標識されていない試薬をアイソトープ標識された試薬に置き換えることにより、一般的に調製可能である。
【００９７】
式ＩないしＶＩの化合物、及びここに記載の他の化合物、オートファジー阻害剤は、ヒトを含む哺乳類の過剰増殖性疾患の治療的治療(予防的治療を含む)のための併用療法の使用について、標準的な薬務に従い処方される。本発明は、一又は複数の製薬的に許容可能な担体、滑剤、希釈剤、又は賦形剤に、式ＩないしＶＩの化合物を含有せしめた薬学的組成物を提供する。
【００９８】
適切な担体、希釈剤及び賦形剤は、当業者によく知られており、炭水化物、ロウ、水溶性及び／又は膨張性のポリマー、親水性又は疎水性の物質、ゼラチン、油、溶媒、水等を含む。使用される特定の担体、希釈剤又は賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段及び目的に依存するであろう。溶媒は、一般的には、哺乳類に投与した際に安全(ＧＲＡＳ)であるように、当業者に認識されている溶媒に基づき選択される。一般的に、安全な溶媒は無毒の水性溶媒、例えば水、及び水に溶解又は混和する無毒の他の溶媒である。適切な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール(例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００)等、及びその混合物が含まれる。また製剤は、一又は複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、滑剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味料、香料、フレーバー、及び薬剤(すなわち、本発明の化合物又はその薬学的組成物)を見栄え良く提供するための、又は薬学的製品(すなわち、医薬品)の製造を補助する他の公知の添加剤を含有してもよい。
【００９９】
製剤は、従来からの溶解及び混合手順を使用して調製することができる。例えば、バルク薬剤物質(すなわち、本発明の化合物、又は本化合物の安定化形態、例えばシクロデキストリン誘導体又は他の公知の錯化剤との複合体)を、上述した一又は複数の賦形剤の存在下、適切な溶媒に溶解させる。本発明の化合物は、典型的には製薬投与される形態に処方されることで、薬剤の投与量の制御、及び処方レジメンを用いた患者の薬剤服用順守が容易になる。
【０１００】
適用される薬学的組成物(又は製剤)は、薬剤の投与に使用される方法に応じて、多様な方法で包装することができる。一般的に、分配用の物品は、適切な形態の薬学的製剤をそこに付与する容器を含む。適切な容器は当業者によく知られており、ボトル(プラスチック又はガラス)、小袋、アンプル、プラスチック袋、金属製シリンダー等の物質が含まれる。また容器には、包装の内容物への軽率な接近を防止するための、不正開封防止が施されたアセンブリも含まれる。さらに、容器には、容器の内容物を記載したラベルが、そこに付与されている。また標識は、適切な警告を含むこともできる。
【０１０１】
本発明の化合物の薬学的製剤は、種々の投与経路及びタイプについて調製することができる。例えば、所望の純度を有する式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の他の化合物は、凍結乾燥された製剤、粉砕パウダー、又は水溶液において、場合によっては、製薬的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤と共に混合可能である(Remington's Pharmaceutical Sciences (1995) 18th edition, Mack Publ. Co., Easton, PA)。周囲温度、適切なｐＨ、及び所望の純度にて、生理的に許容可能な担体、すなわち使用される用量及び濃度でレシピエントに無毒な担体と混合することにより、処方することができる。製剤のｐＨは、主として、化合物の特定の使用及び濃度に依存するが、約３〜約８の範囲とすることができる。
【０１０２】
薬学的組成物は、好ましくは滅菌されている。特に、インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。このような滅菌は、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１０３】
通常、薬学的製剤は、固体状組成物、凍結乾燥製剤又は水溶液として保管することができる。
【０１０４】
本発明の薬学的製剤は、良好な医療行為と一致した様式にて、すなわち、量、濃度、スケジュール、課程、ビヒクル及び投与経路にて、処方、服用及び投与されるであろう。こここで考慮される要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医者に公知の他の要因が含まれる。投与される化合物の「治療的有効量」は、このような考慮により決定され、凝固因子媒介性疾患を予防、寛解、又は治療するのに必要な最小量である。このような量は、好ましくは、宿主、又はかなり出血しやすい宿主に対して毒性のある量以下である。
【０１０５】
一般的な割合として、一回当たりに経口的又は非経口投与される、式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の他の化合物の当初の製薬的有効量は、一日当たり患者の体重に対して約０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ、すなわち約０．１−２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される化合物の典型的な当初の範囲は、０．３−１５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１０６】
許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、ホスファート、シタラート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール等)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。また、本発明の活性な薬学的成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 18版,(1995) Mack Publ. Co., Easton, PAに開示されている。
【０１０７】
式ＩないしＶＩの化合物、及びここに記載の他の化合物の徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、式Ｉの化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド類(米国特許第3773919号)、Ｌグルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセタート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１０８】
薬学的製剤は、ここに詳述される投与経路に適したものを含む。製剤は、便宜的に、単位投与形態で提供されてよく、薬学の分野でよく知られている任意の方法により調製可能である。一般的な技術及び処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences 18版 (1995) Mack Publishing. Co., Easton, PAに見出される。このような方法は、一又は複数の副成分を構成する担体と、活性成分とを併せる工程を含む。一般的に、製剤は、液状担体又は微細に分割された固体状担体又は双方と、活性成分とを、均質にまた密接に併せることにより調製され、ついで、必要であるならば、製品に成形する。
【０１０９】
経口投与に適した、式ＩないしＶＩの化合物、及びここに記載の他の化合物、及びオートファジー阻害剤の製剤は、それぞれ所定量の式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の他の化合物、及びオートファジー阻害剤を含有する個別単位、例えば丸薬、硬質又は軟質の例えばゼラチンカプセル、カシェー、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性の懸濁剤、分散パウダー又は顆粒、エマルション、シロップ又はエリキシル剤を経口用途のために調製することができる。このような製剤は、薬学的組成物の製造のために当該分野で知られている任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、口に合う調製物を提供するために、甘味料、香味料、着色剤及び保存剤を含む一又は複数の薬剤を含みうる。圧縮錠剤は、適切な機械において、流動形態、例えばパウダー又は顆粒を、場合によってはバインダー、滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、又は分散剤と混合して圧縮することにより調製可能である。成形錠剤は不活性な液体希釈剤で湿潤させた粉末化活性成分の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は場合によっては被覆し又は切り込み線を入れ、場合によっては活性成分の遅延又は制御放出をもたらすように製剤化される。
【０１１０】
本発明の薬学的製剤の錠剤用賦形剤には、錠剤を作製するパウダー状薬剤のかさ容量を増加させるフィラー(又は希釈剤)；それが摂取され、、薬剤の急速な分解及び吸収が促進される場合に、錠剤を小さな断片、理想的には個々の薬剤粒子に、錠剤を破壊する崩壊剤；顆粒及び錠剤が、圧縮後に、必要な機械的強度と錠剤性を保持し、包装、輸送及び常套的な操作中に、成分パウダー状への破壊を防止するように形成可能とするバインダー；製造中、錠剤を作製するパウダーの流動性を改善する滑剤；製造中、錠剤用パウダーが錠剤の圧縮に使用される機器に付着しないようにする潤滑剤が含まれる。それらは、圧縮中のパウダー混合物の流動性を改善し、最終的な錠剤が機器から排出される場合の摩擦及び破壊を最小にする。製造中、錠剤の形状を打ち出すのに使用される機械と、錠剤を作製するパウダーとの間の付着性を低減する、滑剤に類似した機能を有する抗接着剤；さらに好ましい味覚を付与し、又は好ましくないものをマスクするために錠剤に導入される香味料；及び患者の薬剤服用順守を補助する着色剤も含まれる。
【０１１１】
錠剤の製造に適した非毒性の製薬的に許容可能な賦形剤と混合せしめられて活性成分を含む錠剤が許容可能である。これらの賦形剤は、例えば不活性な希釈剤、例えば炭酸カルシウム又はナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はナトリウム；顆粒化及び崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア；及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクでありうる。錠剤は非被覆でも、又は胃腸管中での崩壊と吸着を遅延させるマイクロカプセル化を含む既知の方法によって被覆してもよく、それによって長時間にわたる持続作用をもたらす。例えば、時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを単独で又はロウと共に用いることができる。
【０１１２】
眼又は他の外部組織、例えば口及び皮膚の治療に対しては、製剤は、例えば０．０７５から２０％ｗ／ｗの量で活性成分(類)を含む局所用軟膏又はクリームとして適用されることが好ましい。軟膏に処方される場合、活性成分はパラフィン系又は水混和性軟膏基剤と共に用いることができる。あるいは、活性成分は水中油型クリーム基剤を用いクリームに処方することができる。
【０１１３】
所望される場合、クリーム基剤の水性相は多価アルコール、すなわち、例えばプロピレングリコール、ブタン１,３-ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００を含む）及びその混合物のような２又はそれ以上のヒドロキシル基を有するアルコールを含みうる。局所用製剤は、好ましくは、皮膚又は他の患部領域を通しての活性成分の吸収又は浸透を向上させる化合物を含みうる。そのような皮膚浸透向上剤の例はジメチルスルホキシド及び関連アナログを含む。
【０１１４】
この発明のエマルションの油性相は公知の方法で既知の成分から構成することができ、脂肪又は油、又は脂肪と油との双方と、少なくとも１の乳化剤との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤が、安定剤として作用する脂質親和性乳化剤と共に含有せしめられる。併せて、安定剤と共に又は安定剤を伴わない乳化剤(類)はいわゆる乳化ロウを構成し、油及び脂肪と共にロウはクリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を含む。本発明の製剤に使用するのに適した乳化剤及び乳化安定剤には、トゥイーン(登録商標)６０、スパン(Span(登録商標))８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、モノ-ステアリン酸グリセリル及びラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。
【０１１５】
本発明の薬学的製剤の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合せしめられて活性物質を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメローゼ、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガム、及び分散又は湿潤剤、例えば天然に生じるホスファチド（例えばレシチン）、脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンステアラート）、長鎖脂肪族アルコール（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）とエチレンオキシドとの縮合生成物、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。水性懸濁液はまた一又は複数の保存料、例えばエチル又はｎ-プロピルｐ-ヒドロキシ-ベンゾアート、一又は複数の着色剤、一又は複数の香味剤及び一又は複数の甘味料、例えばスクロース又はサッカリンを含みうる。
【０１１６】
薬学的組成物は滅菌された注射用調製物の形態、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液であってもよい。この懸濁液は上に述べた好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知技術に従って処方することができる。滅菌された注射用調製物はまた１,３-ブタンジオール溶液又は凍結乾燥粉末として調製したもののように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の溶液又は懸濁液であってもよい。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒は水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌固定化油を溶媒又は懸濁媒質として便宜的に用いることができる。この目的に対して、合成のモノ-又はジグリセリドを含む任意のブランドの固定化油を用いることができる。また、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。
【０１１７】
単位投薬形態をつくるために担体物質と組合せられる活性成分の量は、治療される宿主と特定の投与形式に応じて変わる。例えば、ヒトへの経口投与のための時間放出製剤は、全組成物の約５から約９５％（重量：重量）と変わりうる適切で簡便な量の担体物質と共に配合されておよそ１から１０００ｍｇの活性物質を含みうる。薬学的組成物は投与のために容易に測定可能な量をもたらすように調製することができる。例えば、静脈点滴のための水溶液は、約３０ｍＬ／ｈｒの割合で適した体積の点滴が生じうるようにするために、溶液１ミリリットル当たり約３から５００μｇの活性成分を含みうる。
【０１１８】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び意図したレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含みうる水性及び非水性滅菌注射用溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。
【０１１９】
眼への局所投与に適した製剤には、好適な担体、特に活性成分のための水性溶媒に活性成分が溶解又は懸濁させられた点眼液がまた含まれる。活性成分はそのような製剤中に、好ましくは約０．５から２０％ｗ／ｗ、約０．５から１０％ｗ／ｗ、又は約１．５％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【０１２０】
口への局所投与に適した製剤には、香味基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアのような不活性基剤に活性成分を含むパスティユ；及び適切な液体担体に活性成分を含むうがい薬が含まれる。
【０１２１】
直腸投与のための製剤は、例えばココアバター又はサリチラートを含む好適な基剤を用いて座薬として調製されてよい。
【０１２２】
肺内又は経鼻投与に適した製剤は、例えば０．１から５００ミクロン（例えば０．５、１、３０ミクロン、３５ミクロン等々のような増分ミクロンで０．１から５００ミクロンの範囲の粒子径を含む）の範囲の粒子径を有し、これが鼻経路を通る迅速な吸入又は肺胞嚢に達するように口からの吸入によって投与される。好適な製剤には、活性成分の水性又は油性溶液が含まれる。エアゾール又は乾燥粉末投与に適した製剤は常法によって調製することができ、以下に記載されるような疾患の治療又は予防に使用されている化合物のような他の治療剤と共に送達されてよい。
【０１２３】
膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、当該分野で適切であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤として提供することができる。
【０１２４】
さらに、本発明の薬剤(例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、キナーゼ阻害剤、化学療法剤又は抗癌剤)は、遺伝子治療により被験者に導入可能であると考えられる。遺伝子治療は、被験者に核酸を投与することにより実施される治療を指す。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために、細胞に遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 (1986))。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾することができる。遺伝子治療の方法の一般的レビューは、例えば、Goldspielら. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu及びWu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); 及びMay TIBTECH 11:155-215 (1993)を参照。使用可能な、組換えＤＮＡ技術の当該技術で一般的に知られている方法は、Ausubelら編. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; 及びKriegler (1990) Gene Transfer 及びExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【０１２５】
一実施態様において、本発明のＲＮＡコンストラクトを形成するためのＲＮＡｉコンストラクト又はＤＮＡは、処理により細胞(類)に送達され、オートファジー阻害剤と組合せられて送達されてもよい。患者の細胞にＤＮＡ／ＲＮＡ(ベクターに包含される場合)を至らしめるには、主として２つのアプローチ：インビボ及びエクスビボが存在する。インビボ送達用として、ＤＮＡ／ＲＮＡは、通常、患者のＤＮＡ／ＲＮＡが必要とされている部位に、直接注入される。エクスビボ治療用としては、患者の細胞が取り出され、ＤＮＡ／ＲＮＡをこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は患者に移植される多孔質膜に包含させて投与する(例えば、米国特許第4,892,538号及び5,283,187号を参照)。生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。技術は、オリゴヌクレオチドが培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。オリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。遺伝子のエクスビボ送達に一般的に使用されているベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０１２６】
インビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質ベースの系(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)での形質移入を含む。現在公知の遺伝子作製及び遺伝子治療のプロトコルのレビューは、例えばAndersonら, Science 256:808-813 (1992)を参照。また、国際特許第93/25673号及びここで引用した参考文献も参照。遺伝子治療に使用されているウイルスベクターの例は、Clowesら. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiemら. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons 及び Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman 及び Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993); Boutら. Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Rosenfeldら. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeldら. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeliら. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993);及びWalshら. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)に見出すことができる。
【０１２７】
いくつかの状況では、核酸供給源を、標的細胞を標的とする薬剤、例えば標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンド等とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)；及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルのレビューは、Andersonら, Science, 256, 808-813 (1992)を参照。
【０１２８】
製剤は、単位投薬又は複数投薬容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに包装することができ、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時混合注射溶液及び懸濁液は既に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。好適な単位投薬製剤は、活性成分の、上に記載されたような毎日の投薬又は毎日の部分用量単位、又はその適切な画分を含むものである。
【０１２９】
本発明はさらに獣医学的担体と共に上述の少なくとも一の活性成分を含む獣医学的組成物を提供する。獣医学的担体は組成物を投与する目的に有用な物質であり、不活性な又は獣医学分野で許容され、活性成分と相容性がある固形、液体又は気体物質でありうる。これらの獣医学的組成物は非経口的、経口的又は任意の他の所望の経路によって投与することができる。
【０１３０】
併用療法
併用療法は同時又は逐次のレジメンとして投与されうる。逐次的に投与される場合、組合せは二回以上の投与で投与することができる。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する同時投与、何れかの順での逐次投与が含まれ、その場合、好ましくは時間があり、両方の（又は全ての）活性剤が同時にその生物学的活性を作用させる。
【０１３１】
上記の同時投与薬剤の任意のものに適した投薬量は現在使用されているものであり、新たに同定された薬剤と他のオートファジー阻害剤又は治療の併用作用（相乗作用）のために低下させることができる。
【０１３２】
抗癌治療の特定の実施態様において、式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の他の化合物、又はその立体異性体、幾何異性体、互変異性体、溶媒和物、代謝物、又は製薬的に許容可能な塩は、オートファジー阻害剤、さらに外科治療及び放射線治療と組合せられる。よって、式ＩないしＶＩの化合物(類)、又はここに記載の他の化合物、及びオートファジー阻害剤(類)の量、及び投与の相対的タイミングは、所望する併用療法の効果を達成するように選択されるであろう。一実施態様において、治療効果は相乗効果である。
【０１３３】
本発明の化合物は治療される症状に適した任意の経路によって投与されうる。好適な経路には、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、吸入、皮内、くも膜下腔内、硬膜外及び注入技術を含む）、経皮、直腸、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、膣、腹腔内、肺内、鼻腔内が含まれる。局所的投与は、経皮投与、例えば経皮パッチ又はイオン泳動装置の使用を含むことができる。薬剤の処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton, PAにて論議されている。薬剤製剤の他の例は、Liberman, H. A.及びLachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Vol 3, 2nd Ed., New York, NYに見出すことができる。局所用免疫抑制治療用としては、化合物は、移植前に、移植片と阻害剤とをかん流又は接触させることを含む、病巣内投与により投与することができる。好ましい経路は例えばレシピエントの状態に応じて変わりうることは理解される。本化合物が経口投与される場合、化合物は、丸薬、カプセル、錠剤等として、製薬的に許容可能な担体、滑剤又は賦形剤と共に処方することができる。本化合物が非経口的に投与される場合、化合物は、以下に詳述されるように、製薬的に許容可能な非経口ビヒクルと共に単位投薬注射可能形態に処方することができる。
【０１３４】
ヒト患者を治療するための用量は、式ＩないしＶＩの化合物で、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲とすることができる。典型的な用量は、約１００ｍｇ〜約３００ｍｇの化合物とすることができる。特定の化合物の吸収、分布、代謝及び排出を含む、薬物動態的(ＰＫ)及び薬力学的(ＰＤ)特性に応じて、１日に１度(ＱＩＤ)、１日に２度(ＢＩＤ)、又はより頻繁に投与することができる。さらに毒性要因は、用量及び投与レジメンに影響を与えるおそれがある。経口的に投与される場合、毎日、又は特定の期間でより少ない頻度で、丸薬、カプセル又は錠剤を摂取可能である。レジメンは多くの治療サイクルで、繰り返すことができる。
【０１３５】
オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤とオートファジー阻害剤を組合せたキットも提供される。ある実施態様において、キットは、オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤、及びオートファジー阻害剤、製薬的に許容可能な担体、ビヒクル、又は希釈剤、及び容器を含む。使用のための使用説明書も含まれる。
【０１３６】
本発明の他の実施態様では、上述の疾患又は障害の治療に有用な式ＩないしＶＩの化合物を含む製造品、又は「キット」が提供される。一実施態様において、キットは、式Ｉの化合物、又はその立体異性体、幾何異性体、互変変異体、溶媒和物、代謝物、又は製薬的に許容可能な塩を収容する容器を具備する。キットは、容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物をさらに含んでなる。「パッケージ挿入物」なる用語は、このような治療用製品に関する指示、使用法、用量、投与、禁忌、及び／又は警告についての情報を含む、治療用製品の市販パッケージに常套的に含まれる指示書を指すために使用される。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、式ＩないしＶＩの化合物、又は病状を治療するのに有用なその製剤を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の化合物である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療のために使用されることを示している。一実施態様において、標識又はパッケージ挿入物は、標識又はパッケージ挿入物は、式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の化合物を含有する組成物が、異常な細胞増殖が原因である疾患を治療に使用可能であることを示している。また、ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が他の疾患の治療に使用可能であることも示している。代替的に、又は付加的に、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備していてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０１３７】
キットは、式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の化合物、及び存在するならば第２の薬学的製剤を投与するための指示をさらに含んでよい。例えば、キットは、式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の化合物を含有する第１の組成物、及び第２の薬学的組成物を含んでいる場合、キットは、第１及び第２の薬学的組成物を、それを必要とする患者に、同時、逐次又は別々に投与することについての指示をさらに含んでよい。
【０１３８】
他の実施態様において、キットは、経口用固体状形態の式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の化合物、例えば錠剤又はカプセルの送達に適している。このようなキットは、多くの単位投薬を好ましくは含む。このようなキットは、それらの意図する使用の順番に置かれた投薬を有するカードを含んでいてよい。このようなキットの例は「ブリスター包装」である。ブリスター包装は包装業界でよく知られており、薬学的単位投与形態に包装するために、幅広く使用されている。所望するならば、投薬が投与される治療スケジュールにおいて、日付を記したカレンダー挿入物を用い、又は数字、文字又は他のマーキングの形態で、記憶補助を提供することもできる。
【０１３９】
一実施態様において、キットは（ａ）そこに式ＩないしＶＩの化合物、又はここに記載の化合物を収容する第一の容器と；場合によっては（ｂ）抗過剰増殖活性を有する第２の化合物を含有する第２の薬学的製剤を収容する第２の容器とを具備しうる。代替的に、又は付加的に、キットは、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第三の容器をさらに具備していてもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１４０】
キットが式ＩないしＶＩの組成物、又はここに記載の化合物、及び第２の治療剤、例えばオートファジー阻害剤を含んでいる場合、キットは、別々の組成物を収容する容器、例えば分割ボトル又は分割ホイルパックを具備していてもよいが、別々の組成物は、単一の未分割容器に収容されていてもよい。典型的には、キットは、別々の成分を投与するための指示を含む。別々の成分が異なる投与形態(例えば経口及び非経口)で好ましくは投与され、異なる投与間隔で投与される場合、又は組合せの個々の成分の滴定が、処方医に所望されている場合、キット形態は特に有利である。
【０１４１】
オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤
ここに提示したデータは、Ａｋｔ阻害剤、及び同様に他のある種のキナーゼ阻害剤が、明確なアポトーシス反応を常に誘導するとは限らないことを示す。オートファジーは、パン-Ａｋｔノックダウン又は阻害、Ａｋｔ-アイソフォーム選択性ノックダウン又は阻害、又は、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１又はｐ７０Ｓ６Ｋ経路の小分子阻害剤に対して、容易に検出可能な程度に反応する。キナーゼ-阻害-誘導性オートファジーは、このリソソーム分解経路を標的とする薬剤に対して、腫瘍細胞を敏感にさせる。実際、リソソーム分解機能をブロック薬剤は、オートファジーを誘導し、前臨床モデルにおける完全な腫瘍寛解を促進させるキナーゼ阻害剤と組合せられた場合、細胞死を引き起こす。オートファジー応答を阻害、遅延又はブロックすることは、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１及びｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤等、オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤の治療効果を増加させるための、有望な方法でありうる。
【０１４２】
オートファジーは、例えば、癌細胞株におけるアポトーシスよりも、Ａｋｔ阻害剤に対して敏感に応答する。多くの報告には、種々の癌におけるホスファチジルイノシトール ３-キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)／Ａｋｔ経路の調節不全により、制御できない成長及び増殖ばかりでなく、種々の細胞死刺激に対する耐性に至ることが記されている(Manning BD、Cantley LC. AKT/PKB signaling: navigating downstream. Cell 2007; 129:1261-74; Samuels Y, Ericson K. Oncogenic PI3K and its role in cancer. Curr Opin Oncol 2006; 18:77-82)。よって、例えばこの経路の中枢結節で、Ａｋｔ、セリン／スレオニンキナーゼ、又は阻害によりオートファジーが誘導される他のキナーゼを標的とすることで、悪性細胞の成長及び生存の双方が阻害されうる。
【０１４３】
Ａｋｔは、種々のアポトーシス促進性発作後のプログラムされた細胞死から、細胞を保護することにおいて、重要な役割を担っていると考えられる(Manning BDら;Downward J. Mechanisms and consequences of activation of protein kinase B/Akt. Curr Opin Cell Biol 1998; 10:262-7)が、アポトーシスがＡｋｔ活性単独の阻害に対する一般的な応答であるかどうかは決定されるべきまま残っている。３のＡｋｔアイソフォーム、並びに特異的阻害剤それそれに特異的にヌクレオチドさせるＲＮＡ干渉技術により、３つ全てのＡｋｔアイソフォームがかなり低減した場合でさえ、試験されたかなりの割合の癌細胞株は、容易にアポトーシスを受容しないということに至る。(Koseoglu S, Lu Z, Kumar C, Kirschmeier P, Zou J. AKT1, AKT2 and AKT3-dependent cell survival is cell line-Specific and knockdown of all three isoforms selectively induces apoptosis in 20 human tumor cell lines. Cancer Biol Ther 2007; 6:755-62)。このことは、全Ａｋｔ活性の少しの部分が、マウスの胚性線維芽(ＭＥＦ)細胞におけるアポトーシス阻害に必要であるという報告に一致する(Liu X, Shi Y, Birnbaum MJ, Ye K, De Jong R, Oltersdorf T, Giranda VL, Luo Y. Quantitative analysis of antI-apoptotic function of Akt in Akt1 and Akt2 double knock-Out mouse embryonic fibroblast Cell under normal and stressed conditions. J Biol Chem 2006; 281:31380-8)。Ａｋｔ阻害における、アポトーシス誘導に対する癌細胞の感度は、遺伝的背景及び周囲条件の双方に依存すると思われる。例えば、より高いレベルに活性化したＡｋｔは、この経路における腫瘍細胞の相対的信用度を示唆し、Ａｋｔ阻害に対するアポトーシス応答性に対して、わずかに良好な予測因子であるが、アポトーシスに対する耐性も、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性を負に調節する腫瘍サプレッサー、ホスファターゼ及びテンシンホモログ(ＰＴＥＮ)の損失を伴うものを含む、Ａｋｔ活性を有する細胞において観察される(Koseoglu Sら)。アポトーシスは、厳しい選択圧を介したそれらの進化の結果として、進行した癌細胞における多くのメカニズムにより抑制可能であると考えられている。
【０１４４】
これに対し、ＰＴＥＮ-Ｎｕｌｌ細胞株及びＰＣ３及びＵ８７ＭＧの双方は、３つ全てのアイソフォームの誘導性ｓｈＲＮＡ(ｓｈＡｋｔ１２３)ノックダウンに応答したアポトーシスに耐性があるが、データには、双方の細胞株において、かなり高いオートファジーを示す。これらの細胞にアポトーシスが誘導されてもされなくても、オートファジーは、種々の細胞株の経路の、特異的ｓｈＲＮＡノックダウン又は選択的阻害剤のいずれかに起因する、低減したＡｋｔ活性に対してより敏感に応答するように思われる(Degtyarev及びLin, この研究及び未公開データ)。
【０１４５】
Ａｋｔ阻害剤と組合せて、オートファジー分解をブロックすると、細胞死が促進された。オートファジーは、環境及び細胞状況に応じて、、細胞死のメカニズムとして、また細胞保護プロセスとして、双方に関与している(Scarlatti F, Granata R, Meijer AJ、Codogno P. Does autophagy have a license to kill mammalian Cell 2008)。しかしながら、ｓｈＡｋｔ１２３を発現するＰＣ３細胞は、減少した血清条件下でさえ、有意な生存能の損失なしに、長時間生存可能である。異種移植腫瘍として成長した場合、ｓｈＡｋｔ１２３の連続発現により、最初は、腫瘍増殖を効果的に阻害可能であるが、多くの腫瘍は、阻害の完全で最終的な克服を退行させるのに失敗し、２-３週間以内にリバウンドした。これらにより、Ａｋｔを単独で阻害することにより誘導されるオートファジーは、これらの条件下にある癌細胞を、効果的に除去しないことが示唆される。
【０１４６】
オートファジーは、Ａｋｔノックダウン又は小分子阻害剤に対して、より敏感に応答するため、オートファジーを効果的にブロックするＴ、Ａｋｔ阻害剤と組合せて、細胞死を促進させることができる。リソソーム作用剤クロロキン(ＣＱ)は、いずれかのｓｈＡｋｔ１２３を発現する、又は経路の比較的特異的な小分子阻害剤、ＰＩ-１０３(ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤では、クラスＩＩＩ ＰＩ３ＫよりもクラスＩにおいて、１０００ｘ強力である)(Knight ZA, Gonzalez B, Feldman ME, Zunder ER, Goldenberg DD, Williams O, Loewith R, Stokoe D, Balla A, Toth B, Balla T, Weiss WA, Williams RL, Shokat KM. A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling. Cell 2006; 125:733-47)、及びＡｋｔ-１／２(選択的二重Ａｋｔ１,２阻害剤)(Barnett SF, Defeo-Jones D, Fu S, Hancock PJ, Haskell KM, Jones RE, Kahana JA, Kral AM, Leander K, Lee LL, Malinowski J, McAvoy EM, Nahas DD, Robinson RG, Huber HE. Identification and characterization of pleckstriN-homology-domaiN-dependent and isoenzyme-Specific Akt inhibitors. Biochem J 2005; 385:399-408)で処理された細胞において、死亡率をかなり促進させ、その双方が、明らかにオートファジーを誘導した。類似の結果が、バフィロマイシンＡ１、リソソーム酸性化を損なわせる、液胞プロトンポンプ阻害剤(Ｖ−Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ)を用いて得られた(Yamamoto A, Tagawa Y, Yoshimori T, Moriyama Y, Masaki R, Tashiro Y. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cell. Cell Struct Funct 1998; 23:33-42)。また、ＣＱ及びＡｋｔ阻害剤の相乗的阻害効果も、癌細胞株の拡張パネルで観察される。
【０１４７】
ＣＱ及びＡｋｔ経路阻害剤の双方で処理された細胞における細胞死の開始は、拡大したオートリソソーム様液胞の蓄積により先行する。Ａｋ阻害剤及びＣＱ単独の双方は、オートファジー液胞(ＡＶ)の蓄積を誘導するが(図２５Ａ-Ｃ)、さらなる分析により、Ａｋｔ阻害剤は単独で、カテプシンＤ及びリソソーム活性の生成及び成熟を増加させることが明らかになり、これに対して、ＣＱはカテプシンＤの成熟をブロックし、Ａｋｔ阻害により、非常に大きく、おそらく、細胞内の分解欠陥液胞の蓄積に至らしめる。このことは、カスパーゼ３の活性化、及びアポトーシス核における劇的な増加と一致した(図２５Ｄ，Ｅ)。Ａｋｔ阻害剤単独で処理された細胞において、ミトコンドリア脱分極及び反応性酸素種(ＲＯＳ)の生成が増加した。細胞質ＲＯＳの生成は、Ａｋｔ阻害剤単独では４８時間以内に弱化したが、ＣＱ同時処理では、細胞質及び液胞の双方で、ＲＯＳ蓄積の延長を引き起こした。リソソーム膜浸透性(ＬＭＰ)及び後続する細胞質ＲＯＳスカベンジャーチオレドキシンの分解のための、カテプシンＤの細胞質転位は、他のアオートファジー誘導剤と組合せて、ＣＱにより誘導される細胞死、及びＲＯＳ蓄積のメカニズムとして提案された(Carew JS, Nawrocki ST, Kahue CN, Zhang H, Yang C、CHung L, Houghton JA, Huang P, Giles FJ、Cleveland JL. Targeting autophagy augments the anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drug resistance. Blood 2007; 110:313-22)。ＬＭＰは、細胞死の一因となる可能な下流事象であるが、我々のシステムにおける細胞死の開始前に、チオレドキシンの分解において有意な増加はない(Degtyarev及びLin、未公開データ)ことが観察された。 これに対して、カテプシンＤノックダウン又はリソソームプロテアーゼ活性の阻害は、ＣＱ／Ａｋｔｉ-１／２-誘導性細胞死から細胞を保護することはできず、むしろ、Ａｋｔｉ-１と組合せられた場合に、細胞死の促進における、ＣＱの効果に類似していた。このことは、カテプシンＤ成熟において、ＣＯとＡｋｔｉ-１／２の逆効果と一致し、(上昇した)リソソーム分解活性が、Ａｋｔ阻害により誘導される上昇したオートファジー活性の存在下、細胞生存率にとって重要であることが示唆される。これらの発見の組合せは、Ａｋｔ阻害により引き起こされる、制限されたミトコンドリア脱分極が、オートファジーを促進させるＲＯＳシグナルを増加させ(Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E, Shorer H, Gil L, Elazar Z. Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. Embo J 2007; 26:1749-60)、損傷を受けたミトコンドリアを除去し、酸化ストレスを軽減するモデルを支持する。ＣＱにより引き起こされるオートリソソーム消化の機能障害により、有害な酸化生成物が凝集し、さらに、ＲＯＳダメージを増幅させることができた(Moore MN, Viarengo A, Donkin P, Hawkins AJ. Autophagic and lysosomal reactions to stress in the hepatopancreas of blue mussels. Aquat Toxicol 2007; 84:80-91)。カスパーゼ活性化及び場合によってはＬＭＰを含む、複数の下流事象により、アポトーシス様及び非アポトーシス様細胞死に至らしめることができる(図２４)。理論に縛られるものではないが、図２４は、オートファジー阻害剤(クロロキン)と組合せて、Ａｋｔ阻害剤による細胞死のメカニズムのモデルを示す。
【０１４８】
パン-Ａｋｔ阻害剤の投与により、インスリンシグナル伝達が阻害されて、副作用、最も顕著な代謝効果が制限されたように思われるであろう(Amaravadiら, 2005)。我々のデータは、ＰＴＥＮ-Ｎｕｌｌ ＰＣ３異種移植腫瘍のような癌モデルにおいて少なくとも、腫瘍細胞の完全な除去は、連続したパン-Ａｋｔノックダウンを伴い、達成されない可能性がある。しかしながら、ＣＱとの併用処理により、異種移植モデルにおいて、完全な腫瘍寛解のインシデントが増加するが、ＣＱ単独では、有意な効果はなかった。このことは、Ａｋｔ阻害を介したオートファジー誘導が、他の指示に対して、臨床的に承認されている比較的無毒の薬剤に対して、腫瘍を敏感にさせることができる。
【０１４９】
オートファジーの不適切な阻害により、その腫瘍の抑制機能の損失に至り、又は他の永存経路のアップレギュレーションが引き起こされる可能性がある。(Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007; 446:745-7; Wang Y, Singh R, Massey AC, Kane SS, Kaushik S, Grant T, Xiang Y, Cuervo AM, Czaja MJ. Loss of macroautophagy promotes or prevents fibroblast apoptosis depending on the death stimulus. J Biol Chem 2008; 283:4766-77)。ここでデータは、欠損したオートリソソームの蓄積が、ＣＱ効果に必要であることを示唆している。分解をブロックし、同時に発生に対してオートファジー隔離を可能にすることの潜在的利点は、これにより、リポスフチンなどの、欠損したオートリソソームにおいて、さらに毒性のあるＲＯＳジェネレーターの形成に至り(Terman A, Gustafsson B, Brunk UT. The lysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging and cell death. Chem Biol Interact 2006; 163:29-37; Moore MN, Viarengo A, Donkin P, Hawkins AJ. Autophagic and lysosomal reactions to stress in the hepatopancreas of blue mussels. Aquat Toxicol 2007; 84:80-91)、よって、さらに急速な細胞死誘導に至る可能性があることである。さらに、細胞は、それらがオートファジー応答にすでに関与した後での、容易なエスケープを見出さない。
【０１５０】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路は、ヒトの癌の他の経路よりも頻繁にゲノム異常により標的とされる複数の成分を伴う細胞増殖及び生存の多くの側面に対して重要であり、それを癌治療の魅力的な標的としている。Ａｋｔ阻害剤の臨床的結果の基底にある重要な問題は、３つのアイソフォーム間の選択性の程度、及びこれらのキナーゼ阻害から予期される、腫瘍細胞成長及び生存における効果である。近年記載されている、Ａｋｔ１及びＡｋｔ２に対して前例のない選択的を有するアロステリックＡｋｔ阻害剤は、これらの問題に取り組み始めるための価値のあるツールである(Barnett, S.F., M.T. Bilodeau,及びC.W. Lindsley, (2005), The Akt/PKB family of protein kinase: a review of small molecule inhibitors and progress towards target validation. Curr Top Med Chem. 5:109-25)。しかしながら、今まで、小分子阻害剤は、達成可能な特異性の程度において制限されており、報告されている化合物のインビボ有効性は、薬理学的特性が乏しいために評価されなかった。さらにＡｋｔ３選択性化合物は報告されていなかった。
【０１５１】
ＲＮＡ干渉は、遺伝子発現を抑制させるための、強力な方法である。Ｄｏｘ誘導ｓｈＲＮＡアプローチを使用し、インビボ腫瘍増殖の維持における、各アイソフォームの必要性を評価するために、個々に、また全ての可能な組合せの双方において、各Ａｋｔアイソフォームの特異的ＫＤを達成することができた。ここで提供されるデータには、双方のＰｔｅｎ-アンドロゲン-独立性前立腺癌モデルＰＣ３、及びグリオブラストーマモデルＵ８７ＭＧにおいて、Ａｋｔ１は、腫瘍増殖の維持に最も重要なアイソフォームであるという結果が示唆される。このことは、Ａｋｔ１が優勢に発現しているアイソフォーム、及びＡｋｔ１がそうではない双方の組織において、Ａｋｔ１欠損により、Ｐｔｅｎ＋／−マウスにおける腫瘍の発生率が極めて低減可能であるという近年の報告と呼応している(Chenら, 2006)。しかしながら、マウスの遺伝子研究において、Ａｋｔ１はＰｔｅｎ＋／−マウスにおける腫瘍発症の前に除去されるが、これに対し、本研究では、Ａｋｔ ＫＤが誘導される前に、腫瘍を確立させることができる。よって、Ａｋｔ１活性の低減により、腫瘍の発生を防止するばかりでなく、ヒト癌モデルにおける、ＰＴＥＮ欠損を有する確立された腫瘍の成長も阻害される。
【０１５２】
Ａｋｔ２及びＡｋｔ３の付加的なＫＤにより、腫瘍増殖のより一貫して明確な阻害に至った。このことは、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３の活性が、腫瘍増殖の維持において、Ａｋｔ１活性の低減を部分的に代償していることを示唆する。これは、組合せたＡｋｔ ＫＤで観察された下流標的のより効果的な阻害と一致する。Ａｋｔ２の同時ＫＤに対抗可能な、Ａｋｔ１単独の阻害に関連した、侵襲性の増加についての近年の報告と共に、高度に選択的なＡｋｔ１阻害は所望されていない。ここで提供されるデータは、３つ全てのアイソフォームの部分的ＫＤが、腫瘍増殖阻害に、より効果的であることを示唆している。もっともらしいシナリオが、３つ全てのＡｋｔアイソフォームを阻害するであろうが、活性ＫＤは異なる程度であり、よって、それらの正常な生理的機能についての、重要なレベルのアイソフォーム活性が保存され、腫瘍増殖及び進行における阻害効果が最大になる。
【０１５３】
Ａｋｔの最も顕著な機能の一つは、細胞生存を媒介することである。構造的に活性なＡｋｔは、種々のアポトーシス促進性発作後のプログラムされた細胞死から、細胞を保護していると報告されている。しかしながら、アポトーシスがＡｋｔ阻害に対する一次応答であるかどうかは、特にアポトーシスが種々の遺伝的変化のために抑制されている癌細胞では、あまり明確ではない。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の小分子阻害剤を使用する以前の実験では、多くの場合、これらの化合物の予測できる非特異的効果により、はっきりしない、矛盾する結果を生じる。ここで提供されるデータは、正常な細胞培養条件下、任意又は３つ全てのＡｋｔのアイソフォームの特異的ＫＤにより、アポトーシスをあまり促進させることなく、細胞周期を遅延化させることに至らしめることができることを示している。このことは、全Ａｋｔ活性の一部のみが、通常の成長条件下でのアポトーシスの阻害に必要であるという、近年の報告に一致している(Liu, X., Y. Shi, M.J. Birnbaum, K. Ye, R. De Jong, T. Oltersdorf, V.L. Giranda,及びY. Luo, (2006), Quantitative analysis of antI-apoptotic function of Akt in Akt1 and Akt2 double knock-Out mouse embryonic fibroblast Cell under normal and stressed conditions. J Biol Chem. 281:31380-8)。これに対し、かなり増加したオートファジーは、Ａｋｔ ＫＤを有するＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞の双方で観察され、オートファジーがＡｋｔ活性を低減させるために、より敏感に応答することが示唆される。これは、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、及び二重Ａｋｔ１，２阻害剤を含む、経路の比較的特異的な阻害剤を使用することにより、さらに示される。
【０１５４】
Ａｋｔ阻害-誘導性オートファジーの分子メカニズムは、さらに解明されるままであるが、いくつかの可能性が存在している。第１に、Ａｋｔの阻害により、オートファジーの公知の阻害剤であるｍＴＯＲを阻害することができる。興味深いことに、構造的に活性な形態のＡｋｔは、ラパマイシンによるオートファジーの誘導を抑制し(Takeuchi, H., Y. Kondo, K. Fujiwara, T. Kanzawa, H. Aoki, G.B. Mills,及びS. Kondo, (2005), Synergistic augmentation of rapamycin-induced autophagy in malignant glioma cell by phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B inhibitors. Cancer Res. 65:3336-46)、オートファジーにおけるＡｋｔの効果が、Ａｋｔの猛禽類-ｍＴＯＲ活性下流を介して完全に媒介されない、又はラパマイシンの効果が、Ａｋｔの阻害を介して、例えば長時間の処理後、ｍＴＯＲ Ｃ２のアセンブリの阻害を介して、少なくとも部分的に媒介される可能性が生じる(Sarbassov, D.D., S.M. Ali, S. Sengupta, J.H. Sheen, P.P. Hsu, A.F. Bagley, A.L. Markhard,及びD.M. Sabatini, (2006), Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB. Mol Cell. 22:159-68. Epub 2006 Apr 6)。第２に、Ａｋｔの他のシグナル伝達出力、例えばグルコースの取込又は代謝、又は細胞周期の調節が、ｍＴＯＲに独立して、オートファジー調節の一因となっている可能性がある。注目すべきは、Ａｋｔ阻害剤は、増殖因子の中止下、オートファジーを調節することが近年示されているｐ２７ｋｉｐ１を安定化させる(Liang, J., S.H. Shao, Z.X. Xu, B. Hennessy, Z. Ding, M. Larrea, S. Kondo, D.J. Dumont, J.U. Gutterman、C.L. Walker, J.M. Slingerland,及びG.B. Mills, (2007), The energy sensing LKB1-AMPK pathway regulates p27(kip1) phosphorylation mediating the decision to enter autophagy or apoptosis. Nat Cell Biol. 9:218-24)。第３に、ここで提供されたデータは、Ａｋｔ阻害が、ミトコンドリア膜脱分極を誘導し、ＲＯＳの生成を増加させることが示されている。饑餓が、ミトコンドリアにおけるＲＯＳの形成を模倣し、オートファジーを活性化させるシグナルとして供給されることが示されている(Scherz-Shouval, R., E. Shvets, E. Fass, H. Shorer, L. Gil,及びZ. Elazar, (2007), Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. Embo J. 26:1749-60)。Ａｋｔ阻害により、類似したメカニズムを介してオートファジーが誘導され、これらの損傷を受けたミトコンドリアの再循環においてオートファジーを高め、有害なレベルへのＲＯＳの蓄積を防止することができると考えられる。
【０１５５】
過度のオートファジーは、その限界に達したときに、細胞の殺傷に至る可能性があるが、Ａｋｔ単独での阻害は、我々が調べたＰＴＥＮ-Ｎｕｌｌ癌細胞株において、減少した血清条件下でさえ、細胞殺傷においてあまり効果的ではなかった。インビボ腫瘍増殖条件下、オートファジーは、Ａｋｔ阻害が腫瘍増殖を制限することによる潜在的メカニズムであるが、Ａｋｔ阻害により強いられる酸化ストレス及び代謝からの一時的救済を提供し、これが耐性を生じさうる。実際、Ａｋｔ ＫＤ単独で処理されたほとんどの腫瘍が、最初の退行又は停滞後に対抗するようになり、リバウンドした。初期段階でオートファジーを阻害することで、この一時的な保護効果が防止されるが、オートファジーの可能性のある腫瘍阻害効果に対抗する可能性もある。後期段階でオートファジーを完全にブロックすると、この対抗効果を回避できるかもしれない。実際、リソソーム作用剤とＡｋｔ阻害剤との組合せにより、明らかにできない、分解-欠損オートリソソーム様液胞の過度の蓄積に至り、結果として細胞死が促進される。この組合せは、ＲＯＳスカベンジャー及びオートファジーの自己再生機能のみを妨害するわけではなく、欠損オートリソソームの破壊、及びサイトゾルへのリソソーム含有物の放出を促進し、さらに酸化ストレス及びミトコンドリアダメージを増加させ、結果として細胞死に至らしめる。近年、治療に対し、適応した生存応答として誘導されるオートファジーの阻害は、リンパ腫のＭｙｃ-誘導性マウスモデルにおいて、アポトーシスを高めることが報告されている(Amaravadiら, 2007)。ここで報告されているように、Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋにより誘導されるオートファジーは、リソソーム作用剤を使用し、ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌヒト腫瘍異種移植の寛解を促進させるのに利用されている。この効果は、付与される処理に誘導されるオートファジーの程度に、正に相関していることが予期されるため、Ａｋｔ経路の阻害剤等、広範囲にわたってオートファジーを誘導する薬剤とリソソーム作用剤との創造的組合せは、それらの抗癌効果に大きな影響を与える可能性がある。Degenhardtらは、Ａｋｔの過剰発現によるオートファジーの阻害が、腫瘍の中心を壊死に至らしめ、一方、周囲の腫瘍細胞は、Ａｋｔ刺激された増殖、及び壊死誘導性炎症応答の組合せ効果の結果として、成長促進に応答している可能性があることを提案している。しかしながら、Ａｋｔ阻害の存在下、ＣＱ誘導性の後期オートファジー阻害により引き起こされる細胞死の促進は、炎症反応の可能性のために、それらが成長して元の状態に戻る前に、腫瘍細胞を完全に除去する可能性があり、これは腫瘍細胞増殖がかなり低減するからである。ここで提供されるデータは、ＰＴＥＮ欠損を有する細胞が、無傷ＰＴＥＮを有する細胞よりも、この組合せに対して敏感であることが示されており、合理的な治療域が達成されることが示唆される。ＣＱは、いくつかの疾患における治療効果が既に見出されており、良好な耐性がある(Gustafsson, L.L., O. Walker, G. Alvan, B. Beermann, F. Estevez, L. Gleisner, B. Lindstrom, 及びF. Sjoqvist, (1983), Disposition of chloroquine in man after single intravenous and oral doses. Br J Clin Pharmacol. 15:471-9; Hagihara, N., S. Walbridge, A.W. Olson, E.H. Oldfield, 及びR.J. Youle, (2000), Vascular protection by chloroquine during brain tumor therapy with Tf-CRM107. Cancer Res. 60:230-4)。オートファジーを誘導することが報告されている抗癌剤の長期リストを付与し、ＣＱ及び他のリソソーム作用剤は、癌治療に、有望な新たな治療的価値を見出されている。
【実施例】
【０１５６】
材料及び方法
細胞培養及び試薬：ＰＴＥＮ-／−及びＰＴＥＮ＋／＋ＭＥＦを、予め記載されたようにして保持した(Sun, H., R. Lesche, D.M. Li, J. Liliental, H. Zhang, J. Gao, N. Gavrilova, B. Mueller, X. Liu, 及びH. Wu, (1999), PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,-trisphosphate and Akt/protein kinase B signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:6199-204)。ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞を、１０％のテトラサイクリンフリーのウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／ハムＦ-１２(１：１)において、３７℃で５％のＣＯ２にて保持した。ＩＩ-４はCalbiochemからのものである(Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ)(Barnett, S.F., D. Defeo-Jones, S. Fu, P.J. Hancock, K.M. Haskell, R.E. Jones, J.A. Kahana, A.M. Kral, K. Leander, L.L. Lee, J. Malinowski, E.M. McAvoy, D.D. Nahas, R.G. Robinson,及びH.E. Huber, (2005), Identification and characterization of pleckstrin-homology-domaiN-dependent and isoenzyme-Specific Akt inhibitors. Biochem J. 385:399-408)。オートファジーを阻害するため、細胞を、５-１０ｍＭのクロロキン、２．５ｎＭのバフィロマイシンＡ１、又は１ｍＭの３-ＭＡ(全てSigmaから)で処理し、提示した時点で分析した。Image-iT LIVE Green Reactive Oxygen Species Detection KitをMolecularProbesから購入した。MitoPT Mitochondria Permeability Transition Detection KitをImmunochemistry Technologies, LLCから購入した。
【０１５７】
誘導性ｓｈＲＮＡコンストラクト及び誘導性-ｓｈＲＮＡクローンの生成：ｐＨＵＳＨテトラサイクリン-誘導性レトロウイルス遺伝子移動ベクターは、他の場所で記載されている(Gray, D., A.M. Jubb, D. Hogue, P. Dowd, N. Kljavin, S. Yi, W. Bai, G. Frantz, Z. Zhang, H. Koeppen, F.J. de Sauvage, 及びD.P. Davis, (2005), Maternal embryonic leucine zipper kinase/murine protein serine-threonine kinase 38 is a promising therapeutic target for multiple cancers. Cancer Res. 65:9751-61; Hoeflich, K.P., D.C. Gray, M.T. Eby, J.Y. Tien, L. Wong, J. Bower, A. Gogineni, J. Zha, M.J. Cole, H.M. Stern, L.J. Murray, D.P. Davis, 及びS. Seshagiri, (2006), Oncogenic BRAF is required for tumor growth and maintenance in melanoma models. Cancer Res. 66:999-1006; 米国特許第2007/0026002号, その全体は参照によりここに導入される)。相補性二本鎖ｓｈＲＮＡオリゴを、シャトルベクターを使用し、このベクター系に挿入し、続いて先に記載されたようにして、Gateway組換え反応をした(Invitrogen)(Grunwald, V., L. DeGraffenried, D. Russel, W.E. Friedrichs, R.B. Ray, 及びM. Hidalgo, (2002), Inhibitors of mTOR reverse doxorubicin resistance conferred by PTEN status in prostate cancer cell. Cancer Res. 62:6141-5; また、ここで図２３を参照)。この研究で使用したｓｈＲＮＡ配列を、表２に概説する。全てのコンストラクトは配列決定により確認されている。レトロウイルス感染を記載したようにして実施した(Grayら, 2005; Hoeflichら, 2006)。単一のＡｋｔアイソフォームノックダウンについて、各Ａｋｔアイソフォームを標的とするｓｈＲＮＡコンストラクトをコードする一つのレトロウイルスベクターを用いて、細胞を感染させ(Ａｋｔ１に対しては２５２及び２５３、Ａｋｔ２に対しては２５４及び２５５、Ａｋｔ３に対しては２５９及び２６０)、安定したクローンを５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを使用して選択した。二重Ａｋｔ１及びＡｋｔ２ ＫＤについて、Ａｋｔ１及び２の双方を同時に標的とするｓｈＲＮＡ(コンストラクト２５７及び２６１)を使用した。二重Ａｋｔ２及び３(コンストラクト２５５及び２６１)、又は三重Ａｋｔ１、２及び３(コンストラクト２５７及び２６１)ノックダウンを、種々の抗生物質選択マーカー(ピューロマイシン及びハイグロマイシン)を含有する２のレトロウイルスベクターを用いて、細胞の同時感染を達成させ、それぞれは単一のｓｈＲＮＡをコードし、安定したクローンを、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン、及び３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを使用して選択した。二重Ａｋｔ１及び３ ＫＤについて、Ａｋｔ１及び３の双方を標的とする単一のｓｈＲＮＡ(コンストラクト２５８)、又は２のｓｈＲＮＡベクター(コンストラクト２５３及び２６１)を用いた同時感染を使用した。
【０１５８】
ウエスタンブロット分析、免疫蛍光法、ＩＨＣ及びＴＵＮＥＬアッセイ：ウエスタンブロット分析について、全タンパク質可溶化液をＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移した。使用した抗体は：抗-Ａｋｔ１、抗-Ａｋｔ２、抗-Ａｋｔ３、抗-全Ａｋｔ、抗-ｐ-Ａｋｔ(Ｓｅｒ４７３)、抗-ｐ-Ａｋｔ(Ｔｈｒ３０８)、抗-ｐ-Ｓ６(Ｓｅｒ２３５／２３６)、抗-ＰＡＲＰ及び抗-切断カスパーゼ-３(Cell Signaling Technology)；抗-ｐ-ＰＲＡＳ４０(Invitrogen)；抗-ｐ２７Ｋｉｐ１(Santa Cruz Biotechnology)；抗-ＬＣ３(Novus)；抗-ＬＡＭＰ２及び抗-カテプシンＤ(BD Biosciences)；及び抗-ＧＡＰＤＨ(Advanced Immunochemical Inc.)であった。一次抗体を、ＩＲ染料８-コンジュゲート(Rockland)及びＡｌｅｘａ-フルオロ６８０-コンジュゲート(Molecular Probes)した、種選択性二次抗体を使用して検出した。検出及び定量を、製造者のソフトウェアを用い、Odyssey赤外線スキャナ(ＬＩＣＯＲ)を使用して実施した。免疫蛍光法染色について、細胞を３％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳに０．０１％のジキトニンが入ったもので透過処理し、ついで、ウサギポリクローナル抗-ＬＣ３(Abgent)一次抗体を、ｃｙ３-コンジュゲート抗-ウサギ二次抗体(Jackson Immunoresearch)で検出した。ＩＨＣについて、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された試料を収集した。５μｍ厚の、パラフィン包埋された切片を、Dako ARK キット(Dako Corporation)を用い、抗-Ｋｉ-６７(ＭＩＢ-１、DakoCytomation)抗体を使用して染色した。組織をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、搭載した。全てのケースにおいて、抗原回収を、製造者の使用説明書毎に、Dako Target Retrievalキットを用いて実施した。ＴＵＮＥＬアッセイについて、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された切片を、製造者の使用説明書に従い、インサイツ細胞死検出キット(POD; Roche Diagnostic)を使用して染色した。
【０１５９】
異種移植研究：６-ないし８-週齢のメス無胸腺ヌードマウスｎｕ／ｎｕマウスを、Charles River Laboratoriesから購入し、Genentechの従来からの動物用施設で保持した。２００μｌのハンクスバランス塩溶液(Invitrogen)に、５〜７．５ｘ１０６細胞が懸濁したものを、右側腹部に注射した。腫瘍が１００〜３００ｍｍ３の平均容量に達した時に、同様の大きさの腫瘍を有するマウスを、治療コホートにグループ分けした。コントロール及びＫＤコホートそれぞれについて、マウスは、５％のスクロース、又は５％のスクロースと１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘが入った飲用水を受容した。琥珀色の水用ボトルを使用し、週毎に３回変えた。ＣＱを０．９％の生理的食塩水に溶解させ、フィルター滅菌し、腹腔内又は皮下経路で、４５ｍｇ／ｋｇを投与した。腫瘍をノギスで測定し、週に２回、マウスを計量した。腫瘍が２０００ｍｍ３に達した、又は体重の２０％以上を失ったマウスを、安楽死させた。８〜１０の間のマウスを、各治療グループで使用した。統計的有意性をＪＭＰソフトウェアを使用して分析した(SAS Institute, Inc.)。
【０１６０】
電子顕微鏡：細胞をプラスチックフラスコにおいて単層に増殖させ、半強度のKarnovsky固定液(２％のパラホルムアルデヒド、２．５％のグルタルアルデヒド、０．０２５％のＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ及び０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４)；に固定し；腫瘍を小さな立方体(〜１ｍｍ３)に切断し、同じ固定液、又は免疫電子顕微鏡用に使用される固定液に浸漬して固定した。細胞及び組織を、１％のＯｓＯ４及び１％のＫ４Ｒｕ(ＩＩ)(ＣＮ)６又は１．５％のＫ３Ｆｅ(ＣＮ)６でポストフィックスし、エタノールにおいて脱水し、Ｅｐｏｎに包埋した。超薄切片を酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。ＡＶの数を、４．５μｍ３の組織的にサンプリングされた細胞質面積において計測した(Ｎ≧６４状況毎)。パーセントＡＶ面積を、細胞質面積≧８０μｍ２をカバーする各セットを用い、組織的にサンプリングされた顕微鏡写真の≧５セット上の四角のメッシュグリッドの手段により測定した。腫瘍組織におけるアポトーシス核のパーセントを、１００の組織的に計測された腫瘍細胞核の３ないし４セットにおける、アポトーシス核の数から算出した。
【０１６１】
免疫電子顕微鏡：小さな腫瘍ブロックを、２％のパラホルムアルデヒド、０．２％のグルタルアルデヒドが０．１Ｍのリン酸バッファーに入ったもの、ｐＨ７．４に、４℃で５分間浸漬することで固定した。ＰＢＳですすいだ後、ブロックを１２％のゼラチンに包埋し、、２．３Ｍのスクロースを使用して細胞保護し、液体窒素で凍結させた。超薄切片を１−１２０℃で切断し、１％のメチルセルロース、１．２Ｍのスクロースで取り上げ、解凍し、カッパーグリッドに収集した。０．０２のＭグリシンを含有するＰＢＳですすいだ後、切片を、ウサギ抗-ヒトＬＡＭＰ１抗体(M. Fukuda寄贈、(Carlsson, S.R., J. Roth, F. Piller, 及びM. Fukuda. 1988. Isolation and characterization of human lysosomal membrane glycoproteins, H-lamp-1 and H-lamp-2. Major sialoglycoproteins carrying polylactosaminoglycan. J Biol Chem. 263:18911-9)、又はラットモノクローナル抗-マウスＬＡＭＰ-１抗体ＩＤ４Ｂ(T. August, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA)、ついで、ウサギ抗-ラットＩｇＧ抗体(Dako)と共にインキュベートした。ついで、これらをプロテインアがコンジュゲートした、１０ｎｍのコロイド状金粒子で標識し、１．８％のメチルセルロース、０．６％の酢酸ウラニル混合物で対比させた。
【０１６２】
細胞生存率及び細胞周期分析：細胞数及び生存率を、Ｖｉ-細胞分析器(Beckman Coulter)を使用するトリパンブルー排出アッセイで測定するか、又は１μｇ／ｍｌのＰＩ、ＰＢＳ／１％のＢＳＡで標識し、蛍光励起セルソーター(ＦＡＣＳ)(Becton Dickinson)を用いて、細胞蛍光分析した。ＦＩＴＣがコンジュゲートしたアネキシンＶを、ＦＡＣＳ分析により、スファチジルセリン暴露の評価に使用した。カスパーゼ活性をカスパーゼ-Ｇｌｏ３／７アッセイキット(Promega)を使用して分析した。細胞周期分析について、細胞をチルド冷却された７０％のエタノールを滴下して固定し、ＰＢＳで洗浄し、５０μｇ／ｍｌのＰＩ及び６０単位のリボヌクレアーゼＡを含有する染色溶液に再懸濁させた。ＤＮＡ含有量を、FlowJo及びModFitソフトウエアを使用する、フローサイトメトリーにより分析した(Becton Dickinson)。
【０１６３】
多重スペクトル画像フローサイトメトリー：種々の薬剤で処理された細胞をアクリジンオレンジで染色し、IDEAS画像分析プログラムを使用する、ImageStream system (Amnis Corporation, Seattle, WA)で分析した。ＤＮＡのＡＯグリーン画像及び液胞のＡＯレッド画像を、まず、別のチャンネルに補償し、ついでアポトーシス／無核細胞のパーセンテージ(ＡＯ核の形態及び強度に基づく)及び空胞化細胞(ＡＯレッド＋)を定量した。ＡＯのグリーン強度対ＡＯのグリーン輝度の詳細な面積のプロットにより、３の異なる集団：Ｒ２無核化細胞(低いＡＯグリーン標識、散在性細胞質のマスキングのため大きい面積；Ｒ３アポトーシス細胞(中程度から低いＡＯグリーン、小さくて輝きのある濃縮核断片の存在のために、非常に低いＡＯグリーンの詳細な面積)、及びＲ４生存細胞(無傷の輝きのある核)が明らかになった。ＡＯのレッド強度を、最も明るいＡＯのレッド強度を有する事象を含むように描かれた任意ゲート(Ｒ５)を有する第２のヒストグラムにプロットした。
【０１６４】
タイムラプスビデオ顕微鏡：２４ウェルプレートで培養された細胞を、コントロールされた環境下(３７℃、５％のＣＯ２)で３日間、オリンパスＩＸ８１倒立顕微鏡において撮像した。化合物の添加の６時間後、撮像を開始し、１時間の間隔をあけてとった。
【０１６５】
実施例１
Ａｋｔアイソフォームの誘導性ｓｈＲＮＡ ＫＤは用量-及びアイソフォーム依存方式にＰＴＥＮ-ｎｕｌｌヒト腫瘍異種移植の増殖を阻害した
腫瘍増殖の保持における、３つのＡｋｔアイソフォームの相対的寄与性を測定するために、我々は、近年記載されているレトロウイルスシステム、Ｈ１又はＵ６の短いヘアピン用のtet-誘導性プラスミドベクターを使用する、tet-誘導性ｓｈＲＮＡ ＫＤ法を使用した(Grayら, 2005; Hoeflichら, 2006)。我々は、ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３及びグリオーマ細胞株Ｕ８７ＭＧを選択した(Li, J.、C. Yen, D. Liaw, K. Podsypanina, S. Bose, S.I. Wang, J. Puc、C. Miliaresis, L. Rodgers, R. McCombie, S.H. Bigner, B.C. Giovanella, M. Ittmann, B. Tycko, H. Hibshoosh, M.H. Wigler, 及びR. Parsons, (1997), PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science. 275:1943-7)。双方の細胞株は、３つ全てのＡｋｔアイソフォームを発現した(図１８Ａ)；ＰＣ３細胞において、Ａｋｔ１タンパク質は、Ａｋｔ２レベルの約２倍発現し、全Ａｋｔの＜１０％にＡｋｔ３は寄与していたが、Ｕ８７ＭＧ細胞において、３つ全てのＡｋｔタンパク質は、同レベルで発現していた(図１８Ａ)。ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞の安定したクローンを、全ての可能な単一及び組合せたＡｋｔアイソフォームを標的とする、ハーバリング誘導性ｓｈＲＮＡコンストラクトを生成した(表２)。各Ａｋｔを標的とするｓｈＲＮＡ(ｓｈＡｋｔ)は、ドキシサイクリン(Ｄｏｘ)誘導時の対応するＡｋｔｍＲＮＡ及びタンパク質の〜７５-９９％ＫＤを引き起こした(図１Ａ、図１８Ｂ、及び表３)。下流標的ＰＲＡＳ４０及びＳ６の低減した定常状態のリン酸化、ｐ２７Ｋｉｐ１のアップレギュレーション、及び，及びＩＲＳ１のフィードバック安定化が、３つ全てのＡｋｔ ＫＤを有する細胞で観察された最も強い効果で、ＫＤに対して様々な程度で観察された(図１Ａ)。
【０１６６】
次に、我々は、ＰＣ３細胞の、インビボにおいて確立された腫瘍の成長を保持する能力について、Ａｋｔ ＫＤの効果を調べた。Ａｋｔ２(ｓｈＡｋｔ２)又はＡｋｔ３(ｓｈＡｋｔ３)単独での、Ｄｏｘ誘導ＫＤでは、腫瘍増殖において、有意の阻害に至らなかった(図１Ｂ及び表３)。これに対して、Ａｋｔ１(ｓｈＡｋｔ１)を標的とする２の異なるｓｈＲＮＡコンストラクトは双方とも、有意な腫瘍増殖阻害を示し、３つのうちの２つは、独立したクローンである。腫瘍増殖の遅延及び停滞は、典型的にはこれらのクローンで観察された(図１Ｂ、図１８Ｈ、及び表３)。また、Ａｋｔ１,２(ｓｈＡｋｔ１２)又はＡｋｔｌ，３(ｓｈＡｋｔ１３)も腫瘍増殖を阻害し、ここでほとんど全ての腫瘍は成長が停止し、Ｄｏｘ-処理されたマウスのいくつかには、腫瘍退行も観察された。興味あることに、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３(ｓｈＡｋｔ２３)の双方のＫＤは、腫瘍増殖を有意に阻害し、Ｄｏｘ処理２週間で、腫瘍容量の２倍はなく、Ａｋｔ１活性単独で、最適な腫瘍増殖を十分に維持できないことが示唆された。最後に、三重-Ａｋｔ ＫＤ(ｓｈＡｋｔＩ２３)は、最も効果的に腫瘍増殖を阻害し、処理の最初の２週間で、腫瘍の退行が観察されたことに一致した。同様の結果がＵ８７ＭＧ細胞でも観察され、３つのＡｋｔアイソフォームが同レベルで発現していた。３つの単一のＫＤのなかでも、ｓｈＡｋｔ１のみは有意な腫瘍停止を示し、腫瘍退行も、三重-Ａｋｔ ＫＤと共に、再度観察された(図１８、Ｃ−Ｆ)。よって、Ａｋｔ１単独のＫＤは、ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ異種移植の双方において、腫瘍増殖を阻害可能であり、このＡｋｔ１依存性は、単純に、全Ａｋｔ投与効果ではない。しかしながら、より顕著な増殖阻害及び退行が、３つ全てのＡｋｔアイソフォームのＫＤにて、腫瘍内に生じている。
【０１６７】
2014507129.tif 000058
2014507129.tif 000059
【０１６８】
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2014507129.tif 000061
ａ配列の安定した発現を確立するために使用される抗生物質の選択。Ｐｕｒ、ピューロマイシン；Ｈｙｇ、ハイグロマイシン。
ｂ標的におけるセンス配列(全て５’-３’方向)。
ｃこれらの１９ｂｐコア配列を含有する、ｓｉＲＮＡ二本鎖又はｓｈＲＮＡヘアピンは、提示された遺伝子に対して効果的であるべきである(センス及びアンチセンス配列は、双方とも５’-３’方向である)。
【０１６９】
2014507129.tif 000062
ａリアルタイム定量法ＲＴ-ＰＣＲにより測定された未処理のコントロールと比較して、Ｄｏｘ処理の７２時間後のメッセージレベルのパーセンテージ(Taqman)。データは、少なくとも３の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
ｂ各コホートにおいて分析された腫瘍の数。
ｃ処理の出発時における最初の大きさの＞２倍の腫瘍容量で定められる、１４日間進行した腫瘍の数。
ｄ処理の出発時における最初の大きさの＜５０％の腫瘍容量で定められる、１４日間退行した腫瘍の数。
ｅ有意の差異が達せられた場合の、１４日目及び最初の日の腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)のパーセンテージを、
％ＴＧＩ＝％[Ｖｃ(ｄｘ−ｄ０)-Ｖｔ(ｄｘ−ｄ０)]／Ｖｃ(ｄｘ−ｄ０)＊１００
[ここで、Ｖｃ(ｄｘ−ｄ０)は、分析した日(ｄｘ)と処理を開始した日(ｄ０)の間の、コントロールコホート(Ｖｃ)の平均腫瘍容量の差異であり、Ｖｔ(ｄｘ−ｄ０)は、分析した日と処理を開始した日の間の、処理されたコホート(Ｖｔ)の平均腫瘍容量の差異である]として算出した。％ＴＧＩ＞１００は、腫瘍の退行を示す。
ｆＰ＜０．０５は、スチューデントテストにより測定された、スクロースビヒクルで処理されたグループと比較したものである。
【０１７０】
実施例２
Ａｋｔ ＫＤは有意なアポトーシスなしに細胞周期の遅延化を誘導した
Ａｋｔ ＫＤを有するＰＣ３腫瘍の分析により、コントロール腫瘍と比較して、増殖マーカーＫｉ-６７では穏やかに低下し、ＴＵＮＥＬ-ポジティブ細胞ではほとんど増加していないことが明らかになった(図２Ａ)。またアポトーシスの欠損が、インビトロで培養されたＰＣ３細胞で観察された。１０％のＦＢＳ下、Ｇ０／ＧＩにおける穏やかな増加と、Ｓ相における低下が、各ｓｈＡｋｔコンストラクトを発現する細胞において観察された。Ｇ２／Ｍ相における細胞蓄積のわずかな増加が、Ａｋｔ１単独、及び２又は３のＡｋｔアイソフォームの任意の組合せについて、ｓｈＲＮＡを発現する細胞において観察され、これらの細胞においては、ＤＮＡの複製及び有糸分裂の双方で、細胞周期が遅延化することが示唆された。しかしながら、サブ-Ｇ１集団では、任意のＫＤは観察されなかった(図１９、Ａ及びＢ)。また付加的な実験では、ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞の双方において、Ａｋｔ ＫＤに応答する、有意なカスパーゼ活性化の検出に失敗した。インビボ環境における準最適な成長条件を部分的に模倣するために、我々は、培養において、血清細胞を饑餓させ、細胞がＡｋｔ ＫＤに対してより敏感になったかどうかについて疑問をもった。実際、完全な血清饑餓、又は０．５％まで低減させた血清により、Ｇ０／Ｇ１相における細胞の蓄積が、かなり増加する結果になった。しかしながら、０％のＦＢＳで少なくとも２日間、０．５％のＦＢＳで５日間、有意なサブ-Ｇ１ピークは、今だ観察されなかった(図２、Ｂ及びＣ)。
【０１７１】
実施例３
Ａｋｔ ＫＤはＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞においてオートファジーを促進した
Ａｋｔは、オートファジーを阻害することが示されているため(Arico, S., A. Petiot、C. Bauvy, P.F. Dubbelhuis, A.J. Meijer, P. Codogno, 及びE. Ogier-Denis, (2001), The tumor suppressor PTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway. J Biol Chem. 276:35243-6. Epub 2001 Jul 26; Degenhardtら, 2006)、我々は、内在性Ａｋｔの特異的ＫＤが、オートファジーを促進可能であるかどうかに疑問をもった。実際、ＥＭ分析により、ｓｈＡｋｔ１２３を発現することを誘導したＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞の双方において、ＡＶの蓄積がかなり増加したことが明らかになった(図３、Ａ及びＢ；及び図１９Ｃ)。ＡＶ及び酸性小胞細胞小器官(ＡＶＯ)の蓄積が、オートファゴソームマーカーＧＦＰ-ＬＣ３の局在化、抗-ＬＣ３抗体、及び蛍光染料モノダンシルカダベリン(ＭＤＣ)及びアクリジンオレンジを用いた染色でさらに確認された(ＡＯ；図４Ａ、図１９、Ｄ-Ｇ)。
【０１７２】
我々は、ＥＭにより、ｓｈＡｋｔを発現する異種移植腫瘍を調べた。コントロールＧＦＰ-標的ｓｈＲＮＡ-発現ＰＣ３腫瘍は、細胞間結合により結合した健康にみえる細胞からなる(図３Ｃ、ａ)。これに対して、ｓｈＡｋｔ１２３-発現腫瘍の細胞は、Ｄｏｘ処理の１０-１５日後に、細胞間接触の損失及び変性の形態学的徴候を示した(図３Ｃ、ｂ)。ヒトリソソーム関連膜タンパク質(ＬＡＭＰ)１に対してポジティブな後期ＡＶが、変性した腫瘍細胞で見出された(図３Ｃ、ｂ−ｄ)。また、これらの細胞は、多くの場合、かなり組織破壊された拡張型ＲＥＲ、及び肥大したミトコンドリアを含有しており、エネルギー代謝、ＥＲストレス、及びオートファジーの間の関連性を示唆している。典型的なアポトーシスの特徴である、クロマチン凝集及び断片化は、変性した腫瘍細胞ではめったに観察されず；その代わり、いくつかのＡＶ含有細胞は、オートファジー変性を受けた細胞に典型的な穏やかな核濃縮を示す(図３Ｃ、ｂ及びｄ)。
【０１７３】
ＡＶ蓄積が、変性の形態学的徴候の前に、腫瘍細胞において生じているかどうかを決定するために、我々は、Ａｋｔ ＫＤの５日又は３週間のいずれか、Ｕ８７ＭＧ腫瘍を調べた。５日間、ｓｈＡｋｔ １２３を発現する腫瘍において、多くの細胞は、ビヒクル処理コントロールに対して、類似した肉眼形態を示すが、パーセントＡＶ領域においては、約２倍増加していた(コントロール腫瘍で０．７８％から、Ｄｏｘ-処理腫瘍で１．５３％；Ｐ＜０．０５；図３Ｃ、ｅ-ｈ)。Ａｋｔ ＫＤの３週間後、Ｕ８７ＭＧ腫瘍は、１５日間処理されたＰＣ３腫瘍に類似した多くの細胞で、変性の徴候を示した(未公開データ)。
【０１７４】
実施例４
リソソーム作用剤はＡｋｔ ＫＤと共にＰＣ３細胞において細胞死を促進した
オートファジーの上昇レベルと、穏やかな細胞周期の遅延化にかかわらず、ｓｈＡｋｔ１２３を発現するＰＣ３細胞は、細胞死がかなり増加することなく、１０％のＦＢＳの存在下、多くの継代のための培養において生存可能である。低減した血清(０．５％のＦＢＳ)の下でさえ、長時間のうちに、生存率にわずかな低下のみであった(未公開データ)。文献には、細胞生存における初期段階のオートファジー阻害の効果に議論の余地があるとされているが、後期段階でオートファジーをブロックすると、オートファジー誘導条件下で、細胞死の促進を引き起こすことが、一貫して示されている(Kanzawa, T., I.M. Germano, T. Komata, H. Ito, Y. Kondo, 及びS. Kondo, (2004), Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells. Cell Death Differ. 11:448-57; Boya, P., R.A. Gonzalez-Polo, N. Casares, J.L. Perfettini, P. Dessen, N. Larochette, D. Metivier, D. Meley, S. Souquere, T. Yoshimori, G. Pierron, P. Codogno, 及びG. Kroemer, (2005), Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol. 25:1025-40; Gonzalez-Polo, R.A., P. Boya, A.L. Pauleau, A. Jalil, N. Larochette, S. Souquere, E.L. Eskelinen, G. Pierron, P. Saftig, 及びG. Kroemer, (2005), The apoptosis/autophagy paradox: autophagic vacuolization before apoptotic death. J Cell Sci. 118:3091-102. Epub 2005 Jun 28; Kroemer and Jaattela, 2005; Yu, L., F. Wan, S. Dutta, S. Welsh, Z. Liu, E. Freundt, E.H. Baehrecke, 及びM. Lenardo, (2006), Autophagic programmed cell death by selective catalase degradation. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:4952-7)。よって、我々は、細胞生存率における、Ａｋｔ ＫＤにより開始されるオートファジーの完了のブロック効果を調査する。ＧＦＰ-ＬＣ３を安定して発現するＰＣ３-ＳｈＡｋｔｌ２３細胞において、ＡｋｔＫＤは、オートリソソームにおいて急速に代謝回転する、脂質質付加されたオートファゴソーム-局在化ＬＣ３-ＩＩにおけるわずかな増加と、内在性ＬＣ３(ＬＣ３-Ｉ)の非脂質付加された前駆体形態の対応する低減を伴う、点状ＧＦＰシグナル(図４Ａ及び図１９Ｅ)に至らしめる(図４Ｂ；Klionskyら, 2008)。リソソーム作用剤クロロキン(ＣＱ)、分解性オートリソソームへの、オートファゴソームの成熟を阻害するのに幅広く使用されている弱塩基アミン(Boya, P., R.A. Gonzalez-Polo, N. Casares, J.L. Perfettini, P. Dessen, N. Larochette, D. Metivier, D. Meley, S. Souquere, T. Yoshimori, G. Pierron, P. Codogno, 及びG. Kroemer, (2005), Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol. 25:1025-40; Kroemer 及び Jaattela, 2005; Lum, J.J., D.E. Bauer, M. Kong, M.H. Harris、C. Li, T. Lindsten, 及びC.B. Thompson, (2005), Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis. Cell. 120:237-48)は、核周囲領域に、小さなＧＦＰ-ＬＣ３クタスターの出現を引き起こす。ＣＱとＡｋｔ ＫＤとの組合せにより、オートリソソーム分解における欠損と一致して、連続するＬＣ３-Ｉ代謝回転の存在下で、ＬＣ３-ＩＩの増強した蓄積、並びにＧＦＰ-ＬＣ３ドットのより強い蓄積に至る。ＭＤｃ＋液胞の類似した蓄積も観察された(図１９Ｆ)。これは、０．５％、より顕著には０％のＦＢＳの下、ＣＱで処理されたｓｈＡｋｔ１２３-発現細胞における、促進された細胞死に付随する(図４、Ｃ及びＤ)。液胞プロトンポンプを阻害し(ＶＨ＋−ＡＴＰアーゼ)、リソソーム区画の適切な酸性化を防止する第２のリソソーム作用剤、バフィロマイシンＡＩ(Ｂａ)(Yamamoto, A., Y. Tagawa, T. Yoshimori, Y. Moriyama, R. Masaki, 及びY. Tashiro, (1998), Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23:33-42)も、ｓｈＡｋｔ １２３と組合せられて、細胞死を促進させる。増加したアネキシンＶ-ポジティブ集団及びカスパーゼ-３,７活性が、Ａｋｔ ＫＤと組合せてＣＱ又はＢａで処理された細胞で観察され、これらの細胞における、ポリ-ＡＤＰ-リボースポリメラーゼ(ＰＡＲＰ)切断に相関していた(図４Ｂ)。これに対し、１ｍＭの３-ＭＡでの前処理では、オートファゴソーム形成の最も初期段階の阻害剤が、クラスＩＩＩ ＰＩ３Ｋの阻害の原因であると考えられ(Seglen, P.O., 及びP.B. Gordon, (1982), 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79:1889-92; Petiot, A., E. Ogier-Denis, E.F. Blommaart, A.J. Meijer, 及びP. Codogno, (2000), Distinct classes of phosphatidylinositol 3'-kinase are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells. J Biol Chem. 275:992-8)、ｓｈ Ａｋｔ発現細胞における、ＣＱ又はＢａのいずれかの細胞死促進効果を抑制した(図４、Ｃ及びＤ)。このことは、リソソーム向性阻害剤に起因する細胞死の促進が、異常なＡＶの蓄積に依存していることを示唆している。
【０１７５】
実施例５
ＣＱはＰＩ３Ｋ及びＡｋｔ阻害剤との組合せで細胞死を促進した
近年、Ａｋｔ活性を阻害する、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質アナログが、放射線感作効果を有するオートファジーを誘導することが報告されている(Fujiwaraら, 2007)。ホスファチジルイノシトールエーテル脂質アナログは、付加的な細胞標的を有することが知られているため(Gillsら, 2006; Memmottら, 2008)、我々は、ＰＩ３Ｋ-Ａｋｔの他の特異的阻害剤が、オートファジーを誘導し、後期段階のオートファジー阻害に対して、細胞を敏感にできるかどうかに疑問をもった。まず、我々は、ナノモル濃度でクラスＩのＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲを阻害するが、クラスＩＩＩのＰＩ３Ｋにおいては、＞１０００倍強力ではない、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、化合物ＩＩＩ-５(ＰＩ-１０３)を使用した(Knight, Z.A., B. Gonzalez, M.E. Feldman, E.R. Zunder, D.D. Goldenberg, O. Williams, R. Loewith, D. Stokoe, A. Balla, B. Toth, T. Balla, W.A. Weiss, R.L. Williams, 及びK.M. Shokat, (2006), A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling. Cell. 125:733-47)。クラスＩ及びＩＩＩのＰＩ３Ｋの双方を阻害しするのに等価であり、後の活性に起因するオートファジーを阻害する、広域スペクトルＰＩ３Ｋ阻害剤、ワートマニン、又はＬＹ２９４００２(Petiotら, 2000; Knightら, 2006)に対して、ＩＩＩ-５はＡＶの蓄積誘導において強力である(図５、Ｂ及びＣ)。Ａｋｔ ＫＤと同様、ＣＱと組合せて、ＩＩＩ-５で処理された細胞死を促進させた(図５Ａ)。顕著に増加したＬＣ３-１に対するＬＣ３-ＩＩの比率、及びＭＤＣにより明るく染色された肥大液胞の出現が、細胞死の明白な検出の前に観察された(図５、Ｂ及びＣ)。Ａｋｔ ＫＤで観察されたように、３-ＭＡを用いた前処理で、ＬＣ３-１に対するＬＣ３-ＩＩの比率、及びＭＤＣ＋液胞の蓄積の双方が低減し、細胞死の速度が低下した(図５、Ｂ及びＣ)。これに対し、ＣＱの細胞死-促進効果は、オートリソソームにおけるオートファゴソームの成熟に必要なであることが、予め示されているタンパク質であるＬＡＭＰ２のｓｉＲＮＡ ＫＤにより部分的に模倣された(図２０、Ａ及びＢ)；Gonzalez-Poloら, 2005)。
【０１７６】
またＣＱの類似効果が、報告されている最も選択的なＡｋｔ阻害剤の一つ、二重Ａｋｔｌ,２阻害剤化合物ＩＩ-４(Ａｋｔｉ-１／２)を用いて得られた(Barnettら, 2005)。ＩＩ-４単独での処理により、Ｓｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８残基において、Ａｋｔのリン酸化が効果的に阻害され、あまり細胞死に起因しない、下流標的Ｓ６のリン酸化をかなり低減させた(図６、Ａ及びＢ)。ＣＱとの同時治療により細胞生存率が急激に低下し、完全な細胞死が１０日間観察された。免疫ブロット分析により、ＩＩ-４処理の２４時間以内に、ＬＣ３-ＩＩがかなり蓄積されることが明らかになり、ＣＱの同時処理示にさらに高まった(図６、Ｂ及びＣ)。
【０１７７】
細胞死の動力学を追跡評価するために、我々は、タイムラプス顕微鏡を使用し、ＣＱ及びＩＩ-４で処理された生存細胞を撮像した(図７Ａ)。ＣＱ処理により、細胞分裂に穏やかな低減、及び核周囲領域に暗色粒子の漸進的蓄積が引き起こされた。ＡＯ染色により、これらの粒子が、その形成が３-ＭＡにより阻害されるＡＶＯであることが示されている(未公開データ)。ＩＩ-４単独による処理により、明白な細胞死なしに、完全に近い細胞分裂の阻害に至った。これらの細胞は、最終的に細胞質で満たされる、ＡＶＯの蓄積を伴う平らな形態を示す。ＩＩ-４及びＣＱの双方で処理された細胞は、ＡＶＯの類似した蓄積を示すが、細胞の縮み及び細胞質膜の破壊が、４８時間以内に観察された。何度か、２の隣接する細胞が、細胞質膜の破壊の前に、２つの細胞間が完全に融合するように拡大する、膜接合を形成する(図７Ａ、白色矢印)。
【０１７８】
ＡＶＯ蓄積と細胞死との間の類似した相関性が、多重スペクトル画像フローサイトメトリーにより観察された(図７、Ｂ及びＣ)。ＣＱ又はＩＩ-４単独での処理により、生存性をあまり損なうことなくＡＶＯの蓄積が誘導されたが、双方を組合せることで、生存細胞におけるＡＶＯ蓄積のさらなる増加、及び濃縮アポトーシス核を有する細胞における併用性の増加、及び壊死細胞の無核集団の特徴の出現に至った。
【０１７９】
実施例６
オートファジー阻害と分解欠損オートリソソーム蓄積は共にＩＩ-４と組合せてＣＱにより誘導される細胞死の促進に寄与する
自身によるオートファジー阻害が、Ａｋｔ阻害と組合せて、細胞死の促進を誘導するのに十分であるかどうかを研究するために、我々は、ＫＤ Ａｔｇ７、オートファゴソームの形成に関与している遺伝子に、ｓｉＲＮＡを使用した(Ohsumi, Y. 2001. Molecular dissection of autophagy: ２のユビキチン様システム)。Ａｔｇ７単独のＫＤでは、細胞死に有意な効果は示されなかったが、Ａｋｔｉと組合せた場合、３日までに、細胞生存率の小さな低下が誘導された。しかしながら、ＣＱ及びＩＩ-４の双方と組合せた場合、Ａｔｇ７ ＫＤにより、２日目に、細胞死の一過的遅延に至った(図２０、Ｃ及びＤ)。３-ＭＡの上述した効果と共に、これらのデータには、オートファジー阻害及び欠損ＡＶ蓄積は双方とも、Ａｋｔ阻害剤と組合せて、ＣＱにより誘導される細胞死の促進に寄与していることが示唆される。
【０１８０】
オートファジーはリソソーム区画の重要な機能である(Terman, A., B. Gustafsson, 及びU.T. Brunk, (2006), The lysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging and cell death. Chem Biol Interact. 163:29-37)ため、我々は、リソソームマーカーＬＡＭＰＩ及びカテプシンＤ、主要なリソソームアスパラギン酸プロテアーゼを、免疫ブロットにより調べた(図６、Ｂ及びＣ)。化合物ＩＩ-４単独では、リソソーム活性の上昇と一致して、ＬＡＭＰ１レベルの増加が誘導された。カテプシンＤは、同時翻訳的に切断され、グリコシル化されて４６-ｋＤのプロカテプシンを形成し、１５-ｋＤの軽鎖及び２８-ｋＤの重鎖からなる成熟酵素にさらに切断される中間体を生じるリソソームに標的化される、４３-ｋＤのプレプロカテプシンＤとして合成される。カテプシンＤの２８-ｋＤ及び前駆体形態の双方を検出する抗体を使用することで、４３-５０ｋＤでカテプシンＤの成熟前形態のレベルにおける増加が検出され、ＩＩ-４での単独処理後、成熟酵素の２８-ｋＤ重鎖における増加、リソソーム活性の増加を再度示した。ＣＱは、２８-ｋＤ鎖の拡大において、前駆体形態での蓄積を引き起こし、カテプシンＤのプロセシング及び成熟に必要な、リソソームシステインプロテアーゼ活性の阻害に一致する(Liaudet-Coopman, E., M. Beaujouin, D. Derocq, M. Garcia, M. Glondu-Lassis, V. Laurent-Matha、C. Prebois, H. Rochefort, 及びF. Vignon, (2006)、Cathepsin D: newly discovered functions of a long-Standing aspartic protease in cancer and apoptosis. Cancer Lett. 237:167-79)。ＩＩ-４及びＣＱの双方で処理された細胞において、前駆体形態のカテプシンＤは、いずれか単独よりも高いレベルで蓄積されるが、成熟した２８-ｋＤ鎖では、徐々に減少した。また、化合物ＩＩ-４処理により、ｐ６２、オートリソソームにおいて分解されるオートファジー活性の他のマーカーのレベルは低減するが(Klionskyら, 2008)、ＩＩ-４処理された又は処理されない双方では、ＣＱはｐ９２分Ａｋｔ阻害剤をブロックした(図２２Ｃ)。集合的に、これらのデータは、Ａｋｔ阻害が、リソソーム酵素の生成及び成熟を増加させるが、ＣＱ処理により、欠損ＡＶＯの蓄積を引き起こす、最終的なオートリソソーム区画におけるこれらの酵素の成熟が損なわれることが示唆される。後者は、その基質ＰＡＲＰの切断、及びカスパーゼ活性において、相当する増加を伴い、２日以内に、カスパーゼ３の活性形態への切断が増加することを伴う(図６Ｂ)(未公開データ)。ｚＶＡＤ．ｆｍｋ、パンカスパーゼ阻害剤は、テストした全ての濃度で、部分的に細胞死を救出する(図２０Ｅ)。また、ｚＶＡＤ．ｆｍｋは、高濃度で、リソソームシステインプロテアーゼを阻害可能であるが、後者はカスパーゼ依存性細胞死を媒介することが報告されている(Foghsgaardら, 2001)。広域スペクトルシステインプロテアーゼ阻害剤 ｚＦＡ．ｆｍｋ及びＮ-アセチル-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｎｌｅ-ＣＨＯのいずれも、もしくはより特異的なカテプシンＢ阻害剤 ＣＡ-０７４-Ｍｅは、ＩＩ-４及びＣＱにより誘導された細胞死の、有意な救済を示さなかった。代わりに、システインプロテアーゼ阻害剤は、１０-５０μＭ濃度でＡｋｔｉと組合せられて、細胞殺傷を高めるが、それらは、こう濃度で、単独で細胞傷害性を示す(図２０、Ｆ−Ｈ)。これらの結果は、ＩＩ-４及びＣＱにより誘導される細胞死が、少なくとも��分的にカスパーゼ依存しているが、リソソームプロテアーゼ活性は、Ａｋｔ阻害下、細胞の生存のために必要であることを示唆している。
【０１８１】
損傷を受けたリソソーム分解により、Ａｋｔ阻害剤と組合せられて、細胞死を誘導可能であるかどうかをさらに尋ねるために、我々は、ｓｉＲＮＡを使用し、カテプシンＤをノックダウンさせた。実際、ＩＩ-４と組合せることで細胞死はかなり増加し、双方とも、ＩＩ-４と組合せられた場合に、ＣＱの細胞殺傷効果がさらに上昇した(図２０Ｉ)。同様に、ペプスタチンＡ、カテプシンＤを含むアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤も、Ａｋｔｉ-１１２と共に、細胞死を促進させた(図２０Ｊ)。
【０１８２】
実施例７
ＣＱはＡｋｔｉ誘導性ミドコンドリアスーパーオキシド及び細胞反応性酸化種(ＲＯＳ)の蓄積を増強させた
増加する証拠により、プログラムさせた細胞死の実行における、リソソームとミトコンドリアとの間の密接な関連性が示唆される(Bursch, W. (2001), The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 8:569-81). The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 8:569-81; Terman, A., T. Kurz, B. Gustafsson,、及びU.T. Brunk, (2006), Lysosomal labilization. IUBMB Life. 58:531-9)。よって、我々は、ミトコンドリア膜電位における、Ａｋｔ阻害とＣＱの効果を調べた。ミトコンドリア整合性の維持におけるＡｋｔ機能(Parcellier, A., L.A. Tintignac, E. Zhuravleva, 及びB.A. Hemmings, (2007), PKBand the mitochondria: AKTing on apoptosis. Cell Signal. 0:0)と一致して、かなりの数の分極ミトコンドリアが、多くの細胞に存在しているが、Ａｋｔｉ-１１２単独で、ミトコンドリア膜電位の低下を引き起こす。ＣＱ単独では有意な効果はないが、ＣＱ及びＩＩ-４の同時処理により、細胞生存率における急激な低下に先行して、ミトコンドリア電位は、殆ど完全に失われる(図２１、Ａ及びＢ)。
【０１８３】
近年では、ミトコンドリアＲＯＳが、オートファジー誘導に関与していることが報告されている(Scherz-Shouvalら, 2007)。ミトコンドリアはスーパーオキシド(Ｏ２-)発生の、主要な細胞内供給源であるため、我々は、膜電位の機能としてミトコンドリアに蓄積され、酸化時に蛍光を発し、その後ＤＮＡに結合する、ＭｉｔｏＳＯＸレッド、Ｏ２-指示剤を使用し、Ｏ２−の生成を分析した。化合物ＩＩ-４単独で、６時間以内に、ＭｉｔｏＳＯＸ蛍光が増加した(図８、Ａ及びＣ；また図示せず)。多くの蛍光が、核蛍光を示す細胞の亜集団で、ミトコンドリアの局在化パターンを示し、これらの細胞におけるミトコンドリア透過性の増加と一致した。ＣＱ単独では、ＭｉｔｏＳＯＸシグナルの穏やかな増加を引き起こすのみであったが、ＩＩ-４との組合せで、強い核染色パターンを示す多くの細胞で、蛍光強度のかなりの増加に至った。Ｏ２−の生成における増加に続いて、一般的なＲＯＳ-過敏性プローブを使用して測定された場合、２４時間以内に、全体的な細胞ＲＯＳレベルが増加した(図８、Ｂ及びＣ)。興味があることに、ＩＩ-４単独により誘導される細胞質ＲＯＳシグナルは、４８時間以内に減弱するが、ＣＱとの同時処理で、ＲＯＳレベルの長時間にわたる増加が引き起こされた(図２１Ｄ、また図示せず)。これは、Ａｋｔ阻害に起因する制限されたミトコンドリア脱分極が、増加したオートファジーに対して、一過性のＲＯＳシグナルを誘導する、要するに、損傷を受けたミトコンドリアが除去されるという考えに一致する。ＣＱに起因する細胞成分の損傷を受けた消化により、セロイド／リポフスシン等の、有害な酸化生成物のオートリソソーム凝集に至り、ＲＯＳダメージがさらに増幅され(Mooreら, 2(06)、細胞死に至る。３-ＭＡ前処理により、ＩＩ-４により誘導されるＲＯＳレベルが低下し(図２１Ｃ)、饑餓誘導性ＲＯＳ生成に類似した、クラスＩＩＩのＰＩ３Ｋ依存性が示唆される(Scherz-Shouvalら, 2007)。一般的なＲＯＳスカベンジャー Ｎ-アセチルシステイン(ＮＡＣ)を用いた処理により、ＩＩ-４及びＣＱの存在下、細胞生存率が救済される(図２２、Ａ及びＢ)。さらに、ＮＡＣは、Ａｋｔｉ-誘導性のＬＣ３及びＧＦＰ-ＬＣ３脂質化、ｐ６２分解、及びＧＦＰ-ＬＣ３の点状形成を低減させ(図ＳＳ、Ｃ及びＤ)、オートファジー誘導における、ＲＯＳの必須の役割に一致した(Scherz-Shouvalら, 2007)。
【０１８４】
実施例８
ＣＱはインビトロにおけるＡｋｔｉ処理ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌ細胞の細胞死を選択的に促進し、インビボにおけるＡｋｔ ＫＤの抗腫瘍効果を高めた
ＰＣ３細胞はＰＴＥＮ ｎｕｌｌであるため、我々は、同質遺伝子的ＰＴＥＮ＋／＋及びＰＴＥＮ-／−マウスの胚性線維芽細胞(ＭＥＦ)を使用し、ＰＴＥＮ状態が、Ａｋｔ阻害単独で、又はＣＱと組合せられて、細胞の感度に影響を与えるかどうかを探査した。ＰＴＥＮ-／− ＭＥＦは、Ａｋｔ経路活性を上昇させることが以前から示されており、ＰＴＥＮ＋ｔ＋ ＭＥＦよりもｍＴＯＲ阻害の抗増殖効果に対して敏感である(Sunら, 1999)。図９Ａに示すように、ＰＴＥＮ-／−ＭＥＦは、それらのＰＴＥＮ＋／＋カウンターパートよりも、組合せたＣＱ及びＩＩ-４の細胞殺傷効果に対して、かなり敏感であった。これは、ＰＴＥＮ-／−細胞が、Ａｋｔ阻害時の生存に対して、オートファジー分解にさらに依存しており、合理的な治療指標が、この方法を使用し、悪性ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌ腫瘍細胞を選択的にターゲティングすることにより達成される可能性が上昇することを示唆している。
【０１８５】
また、ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌ腫瘍が、インビボでのＡｋｔ阻害時に、オートファジー分解を頼っているかどうかを尋ねるために、我々は、ｓｈＡｋｔ １２３を発現するＰＣ３異種移植腫瘍の生存における、ＣＱの効果を調べた。図９Ｂに示すように、ＣＱ単独の腹腔内注射により、腫瘍増殖速度が、少しではあるが、有意でない程度に低下した。Ａｋｔ ＫＤ単独により、最初の腫瘍状態を有する、かなりの腫瘍増殖阻害に至るが、多くの腫瘍では、完全な退行に失敗しており、２-３週間内に腫瘍の９０％にリバウンドが生じ；完全な退行は達しえなかった。これに対し、完全な退行が、Ｄｏｘ及びＣＧの双方で処理された腫瘍の４０％で観察され、研究中、別の２０％の腫瘍は、停滞状態を維持していた(図９、Ｃ及びＤ)。類似した結果が、ＣＱの皮下腫瘍趣意注射により得られた(未公開データ)。５日目に取り出された腫瘍サンプルのＥＭ試験により、Ｄｏｘ又はＣＱ単独で治療された腫瘍におけるＡＶ領域における穏やかな増加が明らかになったが、＞５０％退行を示す、ＡＶの劇的な蓄積がＤｏｘ及びＣＱの双方で治療された腫瘍で観察された。これらのＡＶは、Ｄｏｘ-又はＣＱ-単独の腫瘍で見出されたものよりも大きく、高密度の未消化物質を含んでいるが、通常、単一膜オートリソソームの外観を伴い、ヒトＬＡＭＰ１に対してポジティブ染色で、オートファゴソーム-リソソーム融合後の分解損傷に一致する。このことは、アポトーシス形態を示す腫瘍核、並びに易感染性の血漿膜整合性及び異常なミトコンドリアを有すＲＡＶ含有細胞屑の数の増加と同時に生じる(図１０)。よって、ＣＱは、インビトロでＡｋｔ阻害と組合せて、細胞死を促進させないが、インビボにおける完全な腫瘍退行の発生率は増加させた。
【０１８６】
Ｄｏｘ誘導ｓｈＲＮＡアプローチを使用し、我々は、各Ａｋｔアイソフォームを、個々にまた全ての可能な組合せでノックダウンさせ、腫瘍増殖の維持におけるそれらの必要性について評価した。我々の結果では、ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌ ＰＣ３及びＵ８７ＭＧ細胞において、Ａｋｔ１は最も重要なアイソフォームであるが、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３の活性は、腫瘍増殖の維持において、低減したＡｋｔ１活性を部分的に補償するものであった。Ａｋｔ２阻害の潜在的代謝副作用と、Ａｋｔ２の同時阻害に対抗可能な、報告されているＡｋｔ１の単独阻害に関連する侵襲性での増加の双方を一緒にすると(Irieら, 2005)、最大腫瘍阻害を達成するために、２つ又は３つ全てのＡｋｔアイソフォームを同時に阻害する必要があるが、重要なレベルのアイソフォーム活性を保存するために、種々の程度に不活性化させ、副作用が低下するようになされる。
【０１８７】
Ａｋｔの最も優れた機能の一つは細胞生存である。構造的に活性なＡｋｔは、種々のアポトーシス促進性発作の後に、プログラムされた細胞死から細胞を保護することが報告されている(Downward, 1998)。しかしながら、アポトーシスが、多くの場合、Ａｋｔ阻害に対する一次応答であるかどうかは、あまりはっきりしておらず、特に種々の遺伝的変化の故に、アポトーシスがしばしば抑制されている癌細胞においてはしかりである。ＰＩ３Ｋ-Ａｋｔ経路の小分子阻害剤を使用する以前の実験では、しばしば、それらの非特異的効果によって不明瞭な、矛盾する結果が生じていた。我々のデータは、Ａｋｔの特異的ＫＤにより、あまりアポトーシスを促進させることなく、細胞周期を遅延化させることができることを示している。このことは、全Ａｋｔ活性の小さな部分のみが、アポトーシス阻害に必要であるという、最近の研究と一致している(Liuら, 2006)。これに対し、我々は、オートファジーが、特異的ｓｈＲＮＡ ＫＤ又は経路の選択的阻害のいずれかにより引き起こされる低減したＡｋｔ活性に対して、より敏感に応答するこを見出した。
【０１８８】
いくつかのメカニズムが、Ａｋｔ阻害によるオートファジー誘導に寄与している。第１に、Ａｋｔを阻害することで、ｍＴＯＲＣ１阻害に至る。ｍＴＯＲはオートファジーの公知の阻害剤である。興味あることに、Ａｋｔの構造的に活性な形態は、ラパマイシンによるオートファジーの誘導を抑制し(Takeuchiら, 2005)、オートファジーにおけるＡｋｔの効果が、ｍＴＯＲ Ｃ２における長時間効果を介して、Ａｋｔ阻害により少なくとも部分的に媒介される可能性が生じる(Sarbassovら, 2006)。第２に、ＦｏｘＯタンパク質等、Ａｋｔの他のシグナル伝達出力(Zhaoら, 2008)又はグルコース代謝が、独立して、ｍＴＯＲのオートファジー調節に寄与している。第３に、我々のデータは、Ａｋｔ阻害により、オートファジーを活性化可能な、細胞ＲＯＳシグナル、及びミトコンドリアスーパーオキシドの増加を誘導することが示されている。
【０１８９】
オートファジーの活性化により、アポトーシス等の、より急速な死亡プログラムに切り替わるか、最終的なオートファジー細胞死のいずれかを介して、付加的な死亡誘導性刺激に対して細胞を過敏にさせるか、又はその限界に達した場合に、最終的に細胞死に至る可能性がある。Ａｋｔ阻害は、オートファジー応答の増強を介して放射性感受性を増加させるが(Fujiwaraら, 2007)、Ａｔｇ５のカルパイン媒介性切断も、オートファジーをアポトーシスに切り替える(Yousefiら, 2006)。ここで、我々は、Ａｋｔ単独阻害が、我々が調べたＰＴＥＮ-ｎｕｌｌ癌細胞における細胞殺傷に不活性であるが、細胞死は、オートリソソーム分解のブロックを介して促進可能であることを示す。オートファジーは、Ａｋｔ阻害が腫瘍増殖を制限することによる潜在的な代謝であり、Ａｋｔ阻害により強いられる酸化ストレス及び代謝からの一時的救済を提供する。初期段階でオートファジーを阻害すると、この一時的な保護効果は防止されるが、腫瘍阻害効果に対抗する可能性があり、一方で、別の生存メカニズムを介して、容易なエスケープが可能になる。しかしながら、腫瘍細胞が、オートファジー分解に関連し、依存した後に、リソソーム機能をブロックすると、有害な酸化凝集体の蓄積を介して、酸化ダメージ及び細胞傷害を増幅させながら、この対抗効果を回避することができる(Seehafer 及び Pearce, 2006)。実際、我々のデータは、適合性のあるリソソーム分解能は、リソソーム作用剤、カテプシンＤ ＫＤ又はリソソームプロテアーゼ阻害剤でのリソソーム活性の阻害が、Ａｋｔ阻害との組合せで、全て細胞死を誘発させることができるように、Ａｋｔ阻害により誘導される上昇したオートファジー活性の存在下での細胞生存に対して重要であることを示唆している。オートファジー、リソソーム変化、酸化ストレスは、抗癌治療の長期化リストに関連しており、リソソーム向性竿は、単独で、又は他の治療剤と組合せて、抗癌活性を示す(Shoemaker 及び Dagher, 1979; Ohtaら, 1998; Ostenfeldら, 2005; Amaravadiら, 2007; Carew, J.S., S.T. Nawrocki、C.N. Kahue, H. Zhang、C. Yang, L. Chung, J.A. Houghton, P. Huang, F.J. Giles, 及びJ.L. Cleveland, (2007), Targeting autophagy augments the anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drug resistance. Blood. 110:313-22; Fujiwaraら, 2007; GrothPedersenら, 2007)。ここで、我々は、Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害により誘導されるオートファジーは、リソソーム作用剤、例えば良好な耐性を示す薬剤ＣＱを使用して、ＰＴＥＮ-ｎｕｌｌヒト腫瘍異種移植の寛解を促進させるように利用可能であることを、最初に報告している。この効果は、付与された治療により誘導されるオートファジーの程度で、正に相関していることが予期されるため、Ａｋｔ経路の阻害剤等、強力なオートファジー誘導剤とこれらの薬剤との創造的組合せが、それらの抗癌効果にかなり影響を及ぼす可能性がある。
【０１９０】
その全体が出典明示によりここに援用される米国仮出願第61/103,198号が特に参照される。またその全体が出典明示によりここに援用される米国仮出願第61/160,169号も参照される。この発明は十分に記載されており、当業者であれば、本発明又は任意の実施態様の範疇に影響を与えない、条件、処方、及び他のパラメーターの幅広く等価な範囲内で、同様に実施可能であると理解される。ここに引用された全ての特許、特許出願、及び文献は、それらの全体が出典明示によりここに完全に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ−Ｄ】
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【図２０Ｅ−Ｈ】
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【図２０Ｉ−Ｊ】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ−Ｄ】
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【図３３Ｅ−Ｇ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ−Ｄ】
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【図３５Ｅ−Ｇ】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月4日(2013.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014507129000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月20日(2013.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腫瘍の予防又は治療のための医薬であって、（ｉ）オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤と（ｉｉ）オートファジー阻害剤との組み合わせを含む医薬。
【請求項２】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤と前記オートファジー阻害剤が相乗的な有効量で存在する請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記オートファジー阻害剤がオートファジーの誘導、隔離、融合又は分解相の阻害剤である請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
前記オートファジーの分解相の阻害剤がリソソーム作用剤である請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
前記リソソーム作用剤が抗寄生虫剤である請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記リソソーム作用剤が液胞型プロトンＡＴＰアーゼ阻害剤である請求項４に記載の医薬。
【請求項７】
前記リソソーム作用剤が循環系に作用する薬剤である請求項４に記載の医薬。
【請求項８】
前記リソソーム作用剤が細胞傷害剤である請求項４に記載の医薬。
【請求項９】
前記リソソーム作用剤が、脂質代謝に影響を与える薬剤、抗生物質又はホルモンである請求項４に記載の医薬。
【請求項１０】
オートファジーを誘導する前記キナーゼ阻害剤が、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１及びｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤から選択される請求項１から９の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
前記腫瘍が肉腫又は癌腫である請求項１から１０の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
前記腫瘍が扁平上皮癌である請求項１から１０の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記腫瘍が腺腫又は腺癌である請求項１から１０の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１４】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、陰茎癌、泌尿生殖器癌、セミノーマ、食道癌、咽頭癌、胃癌、胃腸癌、皮膚癌、ケラトアカントーマ、濾胞性癌、メラノーマ、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺の扁平上皮細胞癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳頭癌、膀胱癌、肝臓癌、胆汁道癌、腎臓癌、骨癌、骨髄性疾患、リンパ性疾患、ヘアリー細胞癌、頬側口腔癌及び咽頭（経口）癌、口唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、小腸癌、結腸癌、肛門癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、中枢神経系癌、腹膜癌、肝細胞癌、頭部癌、頸部癌、ホジキン病及び白血病からなる群から選択される請求項１から１０の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１５】
哺乳動物の腫瘍の予防又は治療のための医薬の製造における、（ｉ）オートファジーを誘導するキナーゼ阻害剤と（ｉｉ）オートファジー阻害剤との組み合わせの使用。
【国際調査報告】
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