(57)【要約】【課題】生体サンプルからの核酸検体溶液の抽出方法、および前記方法によって得られた核酸検体の検出方法を提供する。【解決手段】前記核酸検体溶液の抽出方法は、生体サンプルを加熱室に入れるステップ；任意に、前記生体サンプルに溶媒を加えるステップ；前記生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ；任意に、前記生体サンプルを遠心分離するステップ；および前記核酸検体を得るステップを含んでなる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルからの核酸検体溶液の抽出方法で、前記方法は、生体サンプルを加熱室に入れるステップ；任意に、前記生体サンプルに溶媒を加えるステップ；前記生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ；任意に、前記生体サンプルを遠心分離するステップ；および前記核酸検体を得るステップを含んでなる。
【請求項２】
前記高圧が、１１０〜３２０ｋＰａ、特に１１５〜２５０ｋＰａ、好ましくは１２０〜２００ｋＰａの如き
１０５〜３５０ｋＰａである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記高圧加熱の継続時間が、１０〜９０分、特に２０〜６０分の如き５〜２１０分である、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項４】
前記生体サンプルが、生検サンプル、細胞サンプル、腫瘍サンプル、および生体液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項５】
前記生体液サンプルが、血液、血清、組織液、尿、糞、痰、脳脊髄液、唾液、涙、および乳頭吸引液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項６】
前記生体サンプルがパラフィン埋め込み組織である、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項７】
前記溶媒が、水、ＤＥＰＣ処理水、生理食塩水、アルカリ溶液、および緩衝液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項８】
以下のステップ：
任意に、遠心分離管の栓に穿孔するステップ；
パラフィン埋め込み組織区画を遠心分離管に入れ、サンプルが液体に浸漬するように、純水またはアルカリ溶液を加えるステップ；
前記サンプルを１４０〜２００ｋＰａの圧力下、２５〜４５分加熱するステップ；および
前記サンプルを遠心分離機に掛けて、上澄み液を得るステップ
を含んでなる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項９】
生体サンプル中の核酸検体を検出する方法で、以下からなる：
請求項１〜８の何れか１項の方法によって前記核酸検体の溶液を得、および
核酸検体を検出する。
【請求項１０】
前記検出が、ポリメラーゼ連鎖反応によって行なわれる、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項９または１０の方法。
【請求項１２】
更に前記核酸検体の溶液濃縮することを含む、請求項９〜１１の何れか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の抽出および検出に関し、特に、本発明は、高圧加熱を用いた核酸の生体サンプルからの液相分離方法、およびその検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検出は、近年の臨床医学において増大する重要な役割を担っている。遺伝子検出の第一段階は、固定または非固定生体サンプルから核酸を抽出することである。
従来の化学的方法によれば、細胞または組織は、通常先ず酵素によって消化され、その後有機溶媒で抽出される。単離された核酸は、エタノールまたはイソプロパノールによって沈殿され、捕獲され水中に濃縮される。全工程で２、３日間要する。殊に、パラフィン埋め込み組織には、キシレン中の多数回の脱ろう、高濃度のプロテアーゼ等で長時間消化され、短時間効率のより著しい不利をもたらす。
近年、種々の液相核酸抽出キットが自国または外国において開発されている。それらキットの殆どは、核酸を分離し、ある粒子の表面に核酸を吸着し、そのあとで沈殿または溶出するという溶解細胞原理に基づく。これらの方法は、核酸抽出時間を比較的短縮させるが、低コスト、高効率、単純な目標プロセスには未だ程遠い。
遺伝子検出の増大する重要性と共に、核酸抽出技術は、遺伝子検出の新規方法および技術の緊急性に比べて、同時に進行すべき改革及び躍進を伴なっていない。限定された核酸の入手性は、核酸検出、特にパラフィン埋め込み組織に大いに依存する、特に遺伝子型決定または診断の為の遺伝子検出の成功の鍵となって来た。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、生体サンプルから核酸検体溶液を抽出するための方法を提供し、当該方法は、生体サンプルを加熱室へ入れるステップ；任意に、生体サンプルに溶媒を添加するステップ；生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ；任意に、生体サンプルを遠心分離するステップ；および前記核酸検体を含む液体を回収するステップからなる方法である。
【０００４】
本発明の方法は、特にホルマリン固定パラフィン埋め込み組織からの核酸抽出に適する。本方法において、パラフィン埋め込み組織の脱ろう、組織細胞の溶解、および解架橋が、単一高圧加熱ステップを介して、液相核酸が分離されるまでに同時に完了する。
【０００５】
本発明は、さらに生体サンプルの核酸検体の検出方法を提供し、それは本発明の方法による前記核酸検体の溶液作成、および好ましくは重合酵素（ポリメラーゼ）連鎖反応（ＰＣＲ）による、核酸検体の検出からなる。
【０００６】
本発明の方法は、単純で（例えば、最も汎用の核酸抽出キットは２０ステップ以上を要する）、時間節減、低コスト、および特別の装置や試薬を要しない。当該簡便法は、実施が容易で、核酸溶液の調製および検出の効率を大きく改善する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】Ｋ−ラス  エクソン２，５’→３’のコドン１２（Ｇ１２Ｓ）における点突然変異を示す。
【図１Ｂ】同じ試料の逆シークエンシング（３'→５’）を示す。図中の矢印は、突然変異点を示す。
【図２】ヒト結腸癌Ｋ−ラス  エクソン２のコドン１２，１３の通常シークエンスを示す。
【図３】カンジダ・アルビカンスに対する蛍光ＰＣＲの結果を示し、縦軸は蛍光量を、横軸はＰＣＲサイクル数を表す。２つの曲線は陽性の結果を表す。
【図４】ヒト血清ＨＢＶヴィールスの５７５，２４１，および１９２  ｂｐ  ＨＢＶ特定フラグメント・シークエンスの電気泳動の結果を示す。
【図５】［１］ヒト消化管間質腫瘍のパラフィン埋め込み組織、［２］ヒト結腸癌のパラフィン埋め込み組織、［３］１００ｂｐマーカー、［４］ヒト甲状腺癌の新鮮な組織、［５］培養細胞の各電気泳動分析図を示す。
【図６】飽和蒸気の温度と圧力の関係を示す比較表
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、一つには生体サンプルから核酸検体溶液を抽出する方法を提供し、その方法は、加熱容器に生体サンプルを入れるステップ；任意に、生体サンプルに溶解媒体（溶媒とも言う）を添加するステップ；生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ；任意に、生体サンプルを遠心分離するステップ；および前記核酸検体を含む液体を得るステップからなる。一般的に、核酸検体溶液は、ＰＣＲ等の引き続く検出に直接用いられ得る。これは、核酸抽出ステップを著しく簡便化する。
【０００９】
ここに用いられるように、「核酸検体」とは、ＤＮＡやＲＮＡを含む被分析目標核酸分子を意味する。サンプルの被分析核酸がハウスキーピング遺伝子である場合、こうして得られた溶液は、核酸の大コピー数の故に、高い核酸含有率を有し、引き続くＰＣＲ検出を促進する。被分析核酸のコピー数が少ない場合、核酸溶液は本発明の方法を用いて得られたあとで更に濃縮され得、それは核酸濃度を改善するようにクロマトグラフ・カラムによる濃縮が如き方法である。
【００１０】
ここで用いられるように、「任意に」とは、「選択される」、または「非必須の」を意味する。「任意にサンプルを遠心分離する」とは、遠心分離をするかしないかは、環境にしたがって当業者によって選択し得ることを意味する。
【００１１】
ここで用いられるように、「高圧」とは、標準環境圧力より高い圧力を表す。例えば、標準大気圧状態下の海面レベルの空気圧は、１気圧を表し、概ね１０１．３ｋＰａと等しい。
本発明の高圧は、圧力釜、オートクレーブなどの当業界において通常用いられる高圧装置によって達成され得る。
【００１２】
最も一般的に用いられる高圧装置は、蒸気加熱装置である。高圧加熱中の温度は通常、常圧加熱中の温度よりも高いことは当業界においてよく知られている。圧力と温度の高圧加熱中の関係を推定するための幾つかの方法がある（例えば、図６に示した「飽和蒸気の温度と圧力の関係を示す比較表」参照）。これらの方法によれば、高圧加熱中の概略の温度を推定できる。例えば、蒸気圧力釜が２５０ｋＰａのとき、温度は約１２７℃である。
【００１３】
本発明の「高圧」は、一般的に１０５ｋＰａ、例えば１１０ｋＰａ、１１５ｋＰａである。蒸気釜に通常用いられる圧力は、約３５０ｋＰａである。
【００１４】
本発明の方法に用いられる「高圧」は、１０５〜３５０ｋＰａ、例えば１１０〜３２０ｋＰａ、特に１１５〜２５０ｋＰａ、好ましくは１２０〜２００ｋＰａである。
【００１５】
異なる生体サンプルは、温度および圧力に対する許容範囲に関して相互に変化する。当業者は、被験サンプルの性質にしたがって、ルーティンの実験によって最適化高圧−温度および時間を見出し得る。例えば、サンプルが可溶性のとき（例えば、腫瘍やヴィールスサンプル）、加熱圧力および時間は減少する；生体サンプルが難溶性の場合（例えばカンジダ・アルビカンス）、加熱圧力および時間は増加する。
【００１６】
加熱時間は、異なるサンプル、および異なる圧力の観点から５〜２１０分間の範囲、例えば、１０〜９０分間で変動する。特に、一般に用いられる加熱時間は、２０〜６０分間である。加熱圧が低く、しかもサンプルの核酸が分離し難い上に、長時間の加熱、例えば４時間を要すときは、当業者は本発明の方法を評価する。
【００１７】
例えば、パラフィン埋め込み組織区画サンプルが加工されるとき、一般的な加熱条件は、１４０〜１７０ｋＰａの圧力下で、２５〜４５分間保持することである。カンジダ・アルビカンス  サンプルが加工されるときは、一般的加熱条件は、１４０〜１７０ｋＰａの圧力下で、４５〜６０分間保持することである。
【００１８】
ここで用いられるように、「生体サンプル」は、動物、植物、微生物、または人体からの生体サンプルを含む被験核酸を含有するものを意味する。生体サンプルは、種々の新鮮な、凍結した、または固定されたサンプルで、例えば、組織生検サンプル、腫瘍サンプル、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織サンプルや、同様にバクテリア、菌類、ヴィールス、マイコプラズマなどのような微生物サンプルであり得る。通常の新鮮な生体サンプルは、血液、血清、組織液、尿、糞、痰、脳脊髄液、唾液、涙、乳頭吸引液、および培養細胞の如き生体液サンプル、患部から取り出した疾病組織の如き腫瘍サンプルなどである。一般的固定生体サンプルは、１０％ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織である。本発明の方法は特に、長期パラフィン塊および保管部位を含むパラフィン埋め込み組織サンプルに適する。
【００１９】
生体サンプルの加熱中に、サンプルは加熱容器に入れられる。一般的に用いられる加熱容器は、遠心分離機用チューブ（または管）、例えば、栓付きの１．５ｍＬまたは１０ｍＬ遠心分離機用チューブが含まれる。好ましくは、チューブの栓は、高圧加熱中のガスの膨張による栓外れを防ぐように穿孔される。サンプルは、金網でシールしたエルレンマイヤー・フラスコまたはフラスコ、或いはその他の加熱用ガス透過性の容器に入れられる。
【００２０】
高圧加熱する前に、必要であれば生体サンプルに溶媒を加えてもよい。例えば、パラフィン埋め込み組織区分（または区画）を加熱する前に、０．１Ｍ苛性ソーダ溶液、例えば、２００μｌまたは１ｍｌをサンプルが完全に液に漬かるように添加する。一般的に用いられる溶媒には、水、ＤＥＰＣ処理水、生理食塩水、アルカリ溶液、緩衝液などがある。一般的に用いられる緩衝液は、トリス塩酸緩衝液、酢酸−酢酸ソーダ緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、リン酸水素二ナトリウム−クエン酸ソーダ緩衝液等である。当業者は、生体サンプルそれ自体で既に大量の液体、例えば髄液を含み、追加の溶媒添加を要しないので、好んで使用する。
【００２１】
高圧加熱ステップの後に、サンプルは任意に遠心分離機に掛けられ、上澄みを収集する。核酸は通常上澄み液に溶解され、続くＰＣＲの如き操作に直接用いられる。遠心分離ステップが不可欠でないのが当業者に好ましい。核酸溶液の遠心分離の省略が引き続く実験（ＰＣＲ等）に影響しなければ、遠心分離操作は不要である。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、以下のステップが含まれる：任意に遠心分離チューブのキャップに穿孔するステップ；パラフィン埋め込み組織区分（例えば、１−２区分）を、遠心分離チューブに入れるステップ、およびサンプルが液に漬かるように純水またはアルカリ溶液（苛性ソーダ水溶液等）を添加するステップ；前記サンプルを１４０〜２００ｋＰａで２５〜４５分間加熱するステップ；およびサンプルを遠心分離して上澄みを得るステップ。上澄み液は、引き続くＰＣＲ反応に直接用いられる。
【００２３】
本発明の別の観点は、生体サンプル中の核酸検体を検出する方法の提供に関し、その方法は、上述のような方法によって、核酸検体の溶液を得、核酸検体を検出することからなる。特に好ましい態様において、検出はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なわれる。
【００２４】
本発明は、さらに以下の実施例を参照して例示される。これら実施例は、本願発明の理解を促進するべく提供されるが、本願発明の実施を限定するように解されてはならない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１］  ヒト結腸癌Ｋラス  エクソン２の遺伝子検出
１．遠心分離チューブの調製：１．５ｍｌ遠心分離チューブのキャップは、アルコールバーナーを用いて加熱された細い針によって細かな穴を開け、高圧下でガスの膨張による栓外れを防ぐ。
２．サンプリング：ヒト結腸癌パラフィン埋め込み組織区分（５〜１０μｍ）を１から２切れ、１．５ｍｌの遠心分離用チューブに入れた。５００μｌの０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）を加え、サンプルを液に完全に浸漬させた。
３．高圧：高圧加熱は、３０〜４５分間実施（リレン製電気圧力釜、モデル  ＤＹＧ−５Ｂ、操作圧力１４０−１７０ｋＰａ、圧力限界２００ｋＰａ）
４．ＰＣＲ：高圧プロセスが完了した後で、冷却なしで直ちに遠心分離ステップ（１３，０００ｒｐｍ，５分間）に付された。１−２μｌの上澄み液（または１：１０の上澄み液の希釈を１−２μｌ）が指示書にしたがってＰＣＲ分析に用いられた。
５．電気泳動法：ＰＣＲ製品が電気泳動法によって検出された。もし製品の量が少な過ぎれば、ネステッドＰＣＲで実施できる。
６．ＰＣＲ品の配列決定結果：図１Ａおよび図１Ｂ
結果は、高圧加熱法を通してパラフィン埋め込み組織サンプルから得られた核酸サンプルは、ＰＣＲ品の直接配列決定の要求に適合していることを示した。
【００２６】
［実施例２］  ヒト結腸癌（レーザー顕微解剖された腫瘍細胞）のＫ−ラス  エクソン２の遺伝子検出
ある量のパラフィン区分のレーザー顕微解剖された腫瘍細胞が、実施例１の方法にしたがって加工された（もし細胞の量が少なければ、溶液量を少なくした）。ＰＣＲに上澄み液が用いられた。ＰＣＲ品の配列決定結果が図２に示された。
上述の結果は、本発明の高圧加熱法は、遺伝子型分析や診断に用いられ得る信頼できる量の核酸を得るために少量の細胞に適用し得る。少量の細胞または組織の遺伝子型分析および診断（微細針吸収腫瘍組織の如き）の成功率は増加し、それは治療の薬剤選択をするために外科手術の機会を逸していた癌患者に極めて重要である。
【００２７】
［実施例３］  パラフィン埋め込み組織中の結核菌の核酸増幅検出
結核菌によって感染の疑いのあるパラフィン埋め込み組織区分、１〜２切れが実施例１と本質的に同じ方法によって加工され、加熱時間は２０−３０分であった。上澄み液がリアルタイムＰＣＲ（蛍光プローブがＰＣＲプレミックス（予備混合物）に添加された）に用いられた。
結果は、許容量のバクテリアＤＮＡが、高圧加熱法によってパラフィン埋め込み組織から得られ、臨床的同定および結核菌の診断を援助することを示した。
【００２８】
［実施例４］  カンジダ・アルビカンスの遺伝子検出
カンジダ・アルビカンスの疑いのあるヒト病変部のスワッブ（綿棒に分泌物を付けたもの）を０．１Ｍの苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）２００μｌで洗浄し、実施例１と本質的に同じ方法で処理し、加熱時間は３５−５０分であった。上澄み液が蛍光ＰＣＲ（蛍光プローブがＰＣＲプレミックスに入れられた）に用いられ、結果が図３に示された。
【００２９】
カンジダ・アルビカンスは菌類に属し、バクテリアの数倍〜数十倍大きい。極めて肉厚の細胞は実験中に一般的アプローチでは分裂させるのが困難で、ＰＣＲの感度に影響する。近年、菌類の感染が著しく増加し、それは抗菌剤の濫用、誤用から起こる細菌分解異常、およびホルモンや抗がん剤の投与から起こる免疫不全に関係する。病原性菌類は多くのタイプがあり、その薬剤許容度は互いに異なる。遺伝子配列決定と異なるタイプの菌類間の区別が、最近は益々精密になっている。
【００３０】
前記の結果は、肉厚でしっかりした細胞壁を有する菌類にとって、高圧加熱法は、遺伝子配列を区別し、菌類のタイプを直接同定するのに信頼できる量の核酸を容易に得られるから、極めて有利である。
【００３１】
［実施例５］  ＨＢＶヴィールスヒト血清の検出
ＨＢＶ罹患者から採取した血清、５μｌを０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）、２００μｌと混ぜ、本質的に実施例１と同じ方法によって処理し、加熱時間は２５−４０分であった。上澄み液をＰＣＲに用いた。電気泳動の結果を図４に示した。
前記結果から、高圧加熱法が臨床試験のための血清のトレース量から信頼できる量でヴィールス性核酸を得るのに用い得ることが示された。
【００３２】
［実施例６］  新鮮な組織、パラフィン埋め込み組織および培養細胞におけるｍＲＮＡ検出
１．サンプリング
ａ．ヒト胃腸基質腫瘍のパラフィン区分（５−１０μｍ）、１−２切れ
ｂ．ヒト結腸癌のパラフィン埋め込み組織（５−１０μｍ）、１−２切れ
ｃ．ヒト甲状腺癌の新鮮な組織（１／２粒子サイズ）、みじん切り
ｄ．培養細胞
サンプルは、１．５ｍｌ遠心分離用チューブに入れ、適当量の０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）をサンプルが溶液に完全に漬かるように加えた。得られた溶液は、徹底的に混ぜた。
２．高圧：加熱時間は３０−４５分間（操作圧力；１４０−１７０ｋＰａ、圧力上限；２００ｋＰａ）
３．逆転写：（ＲＮＡ抽出中に、タイムリーに高圧処理が必要で、逆転写プレミックスが予め作られる。）高圧プロセスが完了したときに、遠心分離用チューブが即時遠心分離のあとで、２−５μｌの上澄み液がＲＮＡの急速な崩壊を防ぐように逆転写のために急いで用いられた。
逆転写プレ−ミックス：逆転写緩衝剤、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２μｇのランダムプライマー（または０．２μＭの特定のプライマー）、５０ＵＭ−ｍＬＶの逆転写、０．０１Ｍ  ＤＴＴ、ＤＥＰＣ水を最終容量２０μｌとなるように加えた。
４２℃で６０分間、９５℃で５分間。
４．ＰＣＲ：逆転写が完了後（即時遠心分離が実施された）、１−５μｌの上澄み液をＰＣＲプレミックスに添加した（１ＸＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．４−０．５μＭの特定のプライマー、水を加えて最終２５−５０μｌとした）。ＰＣＲ：９４℃で１分３０秒間（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２０秒、３０−３５サイクル）７２℃で２分間。
５．ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ（電気泳動図−２２６ｂｐ）：図５参照
前記結果によれば、高圧加熱法は信頼できる量でＤＮＡおよびＲＮＡを同時に得るために用い得、特定の遺伝子配列フラグメント（ＤＮＡ）および生体マーカー（ｍＲＮＡ）の検出のために用い得る。
【００３３】
［実施例７］  生体サンプルの核酸分離への異なる温度および高圧の効果
１．実施例１と同じ方法にしたがって遠心分離用チューブが調製された。
２．サンプリング
（１）ＨＢＶ罹患々者からの血清５μｌを０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）１００μｌに添加混合された。
（２）ＨＳＶ罹患々者から採取したスワーブを０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）１００μｌで洗浄
（３）腫瘍患者から採取した７μＭのパラフィン埋め込み組織区分を２切れ０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）、５００μｌに入れた。
３．圧力釜のタイプ
（１）リレンブランドの電気圧力釜、モデルＤＹＧ−５Ｂ
（２）台湾製ＣＩＲＲＵＳ  ＣＲ−３５６０ＣＧ−Ｍオートクレーブ
４．方法
前記３個の生体サンプルがリレンブランドの電気圧力釜（モデルＤＹＧ−５Ｂ）および台湾製ＣＩＲＲＵＳ  ＣＲ−３５６０ＣＧ−Ｍオートクレーブをそれぞれ用いて、異なる温度で異なる時間、高圧処理に付された。
５．結果
表１に結果を示した。実験結果から、異なる生体サンプルは、高圧処理の時間および圧力の許容範囲において変化することが分かった。
【００３４】
【表１】
2014512190.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、第一には生体サンプルから核酸検体溶液を抽出する方法、第二に前記抽出方法によって得た生体サンプルを検出する方法を提供し、核酸抽出ステップを著しく簡便化する。本発明の方法は、単純で、時間節減、低コスト、および特別の装置や試薬を要せず、当該簡便法は、実施が容易で、核酸溶液の調製および検出の効率を大きく改善し、産業上の利用可能性をもたらす。
【図１Ａ】
2014512190.tif 000003
【図１Ｂ】
2014512190.tif 000004
【図２】
2014512190.tif 000005
【図３】
2014512190.tif 000006
【図４】
2014512190.tif 000007
【図５】
2014512190.tif 000008
【図６】
2014512190.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月27日(2012.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルからの核酸検体溶液の抽出方法で、前記方法は、生体サンプルを加熱室に入れるステップ；任意に、前記生体サンプルに溶媒を加えるステップ；前記生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ；任意に、前記生体サンプルを遠心分離するステップ；および前記核酸検体を得るステップを含んでなる。ここで、前記高圧は、１１０〜３２０ｋＰａ、特に１１５〜２５０ｋＰａ、好ましくは１２０〜２００ｋＰａの如き、１０５〜３５０ｋＰａである。
【請求項２】
前記高圧加熱の継続時間が、１０〜９０分、特に２０〜６０分の如き５〜２１０分である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが、生検サンプル、細胞サンプル、腫瘍サンプル、および生体液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項４】
前記生体液サンプルが、血液、血清、組織液、尿、糞、痰、脳脊髄液、唾液、涙、および乳頭吸引液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項５】
前記生体サンプルがパラフィン埋め込み組織である、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項６】
前記溶媒が、水、ＤＥＰＣ処理水、生理食塩水、アルカリ溶液、および緩衝液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項７】
以下のステップ：
任意に、遠心分離管の栓に穿孔するステップ；
パラフィン埋め込み組織区画を遠心分離管に入れ、サンプルが液体に浸漬するように、純水またはアルカリ溶液を加えるステップ；
前記サンプルを１４０〜２００ｋＰａの圧力下、２５〜４５分加熱するステップ；および
前記サンプルを遠心分離機に掛けて、上澄み液を得るステップ
を含んでなる、先行する請求項の何れかの方法。
【請求項８】
生体サンプル中の核酸検体を検出する方法で、以下からなる：
先行する請求項の何れかの方法によって前記核酸検体の溶液を得、および
核酸検体を検出する。
【請求項９】
前記検出が、ポリメラーゼ連鎖反応によって行なわれる、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項８または９の方法。
【請求項１１】
更に前記核酸検体の溶液濃縮することを含む、請求項８〜１０の何れか１項の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
［実施例１］  ヒト結腸癌Ｋラス  エクソン２の遺伝子検出
１．遠心分離チューブの調製：１．５ｍｌ遠心分離チューブのキャップは、アルコールバーナーを用いて加熱された細い針によって細かな穴を開け、高圧下でガスの膨張による栓外れを防ぐ。
２．サンプリング：ヒト結腸癌パラフィン埋め込み組織区分（５〜１０μｍ）を１から２切れ、１．５ｍｌの遠心分離用チューブに入れた。５００μｌの０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）を加え、サンプルを液に完全に浸漬させた。
３．高圧：高圧加熱は、３０〜４５分間実施（リレン製電気圧力釜、モデル  ＤＹＧ−５Ｂ、圧力１４０−１７０ｋＰａ、圧力限界２００ｋＰａ）
４．ＰＣＲ：高圧プロセスが完了した後で、冷却なしで直ちに遠心分離ステップ（１３，０００ｒｐｍ，５分間）に付された。１−２μｌの上澄み液（または１：１０の上澄み液の希釈を１−２μｌ）が指示書にしたがってＰＣＲ分析に用いられた。
５．電気泳動法：ＰＣＲ製品が電気泳動法によって検出された。もし製品の量が少な過ぎれば、ネステッドＰＣＲで実施できる。
６．ＰＣＲ品の配列決定結果：図１Ａおよび図１Ｂ
結果は、高圧加熱法を通してパラフィン埋め込み組織サンプルから得られた核酸サンプルは、ＰＣＲ品の直接配列決定の要求に適合していることを示した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
［実施例６］  新鮮な組織、パラフィン埋め込み組織および培養細胞におけるｍＲＮＡ検出
１．サンプリング
ａ．ヒト胃腸基質腫瘍のパラフィン区分（５−１０μｍ）、１−２切れ
ｂ．ヒト結腸癌のパラフィン埋め込み組織（５−１０μｍ）、１−２切れ
ｃ．ヒト甲状腺癌の新鮮な組織（１／２粒子サイズ）、みじん切り
ｄ．培養細胞
サンプルは、１．５ｍｌ遠心分離用チューブに入れ、適当量の０．１Ｍ苛性ソーダ水溶液（ｐＨ１１）をサンプルが溶液に完全に漬かるように加えた。得られた溶液は、徹底的に混ぜた。
２．高圧：加熱時間は３０−４５分間（圧力；１４０−１７０ｋＰａ、圧力上限；２００ｋＰａ）
３．逆転写：（ＲＮＡ抽出中に、タイムリーに高圧処理が必要で、逆転写プレミックスが予め作られる。）高圧プロセスが完了したときに、遠心分離用チューブが即席遠心分離のあとで、２−５μｌの上澄み液がＲＮＡの急速な崩壊を防ぐように逆転写のために急いで用いられた。
逆転写プレ−ミックス：逆転写緩衝剤、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２μｇのランダムプライマー（または０．２μＭの特定のプライマー）、５０ＵＭ−ｍＬＶの逆転写、０．０１Ｍ  ＤＴＴ、ＤＥＰＣ水が最終容量２０μｌとなるように加えた。
４２℃で６０分間、９５℃で５分間。
４．ＰＣＲ：逆転写が完了後（即席遠心分離が実施された）、１−５μｌの上澄み液をＰＣＲプレミックスに添加した（１ＸＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．４−０．５μＭの特定のプライマー、水を加えて最終２５−５０μｌとした）。ＰＣＲ：９４℃で１分３０秒間（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２０秒、３０−３５サイクル）７２℃で２分間。
５．ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ（電気泳動図−２２６ｂｐ）：図５参照
前記結果によれば、高圧加熱法は信頼できる量でＤＮＡおよびＲＮＡを同時に得るために用い得、特定の遺伝子配列フラグメント（ＤＮＡ）および生体マーカー（ｍＲＮＡ）の検出のために用い得る。
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月6日(2014.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルからの核酸検体溶液の抽出方法で、前記方法は、生体サンプルを加熱室に入れるステップ；任意に、前記生体サンプルに溶媒を加えるステップ；前記生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ；任意に、前記生体サンプルを遠心分離するステップ；および前記核酸検体を得るステップを含んでなる。 ここで、前記高圧は、１１０〜３２０ｋＰａ、特に１１５〜２５０ｋＰａ、好ましくは１２０〜２００ｋＰａの如き、１０５〜３５０ｋＰａである。
【請求項２】
前記高圧加熱の継続時間が、１０〜９０分、特に２０〜６０分の如き５〜２１０分である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが、生検サンプル、細胞サンプル、腫瘍サンプル、および生体液からなる群から選ばれる、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記生体液サンプルが、血液、血清、組織液、尿、糞、痰、脳脊髄液、唾液、涙、および乳頭吸引液からなる群から選ばれる、請求項1〜３の何れかの方法。
【請求項５】
前記生体サンプルがパラフィン埋め込み組織である、請求項１〜４の何れかの方法。
【請求項６】
前記溶媒が、水、ＤＥＰＣ処理水、生理食塩水、アルカリ溶液、および緩衝液からなる群から選ばれる、請求項１〜５の何れかの方法。
【請求項７】
以下のステップ：
任意に、遠心分離管の栓に穿孔するステップ；
パラフィン埋め込み組織区画を遠心分離管に入れ、サンプルが液体に浸漬するように、純水またはアルカリ溶液を加えるステップ；
前記サンプルを１４０〜２００ｋＰａの圧力下、２５〜４５分加熱するステップ；および
前記サンプルを遠心分離機に掛けて、上澄み液を得るステップ
を含んでなる、請求項１〜６の何れかの方法。
【請求項８】
生体サンプル中の核酸検体を検出する方法で、以下からなる：
請求項１〜７の何れかの方法によって前記核酸検体の溶液を得、および
核酸検体を検出する。
【請求項９】
前記検出が、ポリメラーゼ連鎖反応によって行なわれる、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項８または９の方法。
【請求項１１】
更に前記核酸検体の溶液濃縮することを含む、請求項８〜１０の何れか１項の方法。
【国際調査報告】
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