(57)【要約】  免疫反応の調節における、羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団、及びそのような細胞を含む組成物を使用する方法が、本明細書において提供される。様々な実施態様において、免疫反応は、移植片対宿主病、アレルギー、喘息、又は免疫関連疾患若しくは障害、例えば自己免疫疾患である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊膜由来接着細胞(AMDAC)、又はAMDACによる馴化培養培地の治療有効量を個体に投与することを含む、不適切な又は望ましくない免疫反応に関連した又はこれにより引き起こされた疾患又は障害を有するか又は発症のリスクのある個体を治療する方法であって、ここで該治療有効量が、該疾患、障害又は病態の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量であり、並びに該AMDACが、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-であり、且つ組織培養プラスチックに接着する、前記方法。
【請求項２】
前記疾患又は障害が、Th1又はTh17前炎症反応により引き起こされるか又は媒介される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記投与が、前記Th1又はTh17反応を媒介するT細胞を、前記AMDACと接触させることを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記AMDACが、前記個体におけるTh1細胞成熟を低下する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記AMDACが、前記個体において制御性T細胞表現型をアップレギュレートする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記AMDACが、前記個体においてTh1及び／又はTh17反応を促進する生体分子の樹状細胞(DC)及び／又はマクロファージにおける発現を低下する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記AMDACが、前記T細胞によるリンホトキシン-1α(LT-1α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)及び／又はインターフェロンガンマ(IFNγ)の1以上の生成を検出可能に減少する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記AMDACが、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-、並びにフローサイトメトリーにより検出可能な、CD49f+、CD105+、及びCD200+である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記AMDACが、免疫局在化により検出可能な、VEGFR1/Flt-1(血管内皮増殖因子受容体1)及びVEGFR2/KDR(血管内皮増殖因子受容体2)について陽性である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記AMDACが、フローサイトメトリーにより検出可能な、CD90+及びCD117-であり、且つ、RT-PCRにより決定可能な、HLA-G-である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記AMDACが、RT-PCRにより決定される、OCT-4-及びHLA-G-であり、且つフローサイトメトリーにより検出可能な、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記AMDACが加えて、免疫局在化により検出可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記AMDACが加えて、免疫局在化により検出可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記AMDACが、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-、並びに免疫局在化により決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、CD117-、及びCD200+であり、且つ該AMDACが：
(a)免疫局在化により決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1以上を発現し；
(b)免疫局在化により決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、又はVE-カドヘリンの発現を欠き；
(c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠き；
(d)
【化１】
2014501249.tif 000034
のmRNAを発現し；
(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を生成し；
(f)血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターロイキン-8(IL-8)、単球走化性タンパク質-3(MCP-3)、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1を、AMDACが成長している培養培地へ分泌し；
(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；
(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；
(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を発現し；或いは
(j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8又はVEGFを増加したレベルで発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記AMDACが、RT-PCRにより決定されたOCT-4-、並びに免疫局在化により決定されたCD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ該AMDACが：
(a)免疫局在化により決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)を発現し；
(b)免疫局在化により決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及びVE-カドヘリンの発現を欠き；
(c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠き；
(d)RT-PCRにより決定可能な、
【化２】
2014501249.tif 000035
のmRNAを発現し；
(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型を生成し；
(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及びガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌し；
(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及びmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；
(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；
(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を発現し；或いは
(j)21％O2下でのCD202b、IL-8及び／又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8及び／又はVEGFを増加したレベルで発現する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
加えて、第二の型の幹細胞を前記個体へ投与することを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の型の幹細胞が、胚性幹細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された非-AMDAC幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞、又は体性幹細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患又は障害が、アレルギー、喘息、又は前記個体に対し外因性の抗原に対する反応である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患又は障害が、移植片対宿主病である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は障害が、自己免疫疾患である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫、又は強皮症である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群(原発性又は続発性)、喘息、自己免疫性胃炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性疾患、自己免疫性血小板減少性紫斑病、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡(例えば、粘膜類天疱瘡)、寒冷凝集素疾患、ドゴー病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎(若年性)、本態性混合型クリオグロブリン血症、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎(橋本病；自己免疫性甲状腺炎)、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgA腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合型結合組織病、斑状強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、小児自己免疫性神経精神疾患(PANDA)、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎(例えば、皮膚筋炎を伴う)、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変症、レイノー病(レイノー現象)、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群(メルシュ‐ヴォルトマン症候群)、高安動脈炎、側頭動脈炎(巨細胞性動脈炎)、ブドウ膜炎、血管炎(例えば、紅斑性狼瘡を随伴しない血管炎)、白斑、及び／又はヴェーゲナー肉芽腫症の1以上である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症性腸疾患が、クローン病である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記クローン病が、胃十二指腸クローン病、空回腸炎、回結腸炎、又はクローン結腸炎である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
前記潰瘍性大腸炎が、汎大腸炎、限局性大腸炎、遠位大腸炎、又は直腸炎である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記症状が、消化管の一部の炎症及び膨潤、腹痛、腸管の頻繁な排泄、下痢、直腸出血、貧血、体重減少、関節炎、皮膚の問題、発熱、腸壁の肥厚、個体の腸内の瘢痕組織の形成、個体の腸内のびらん又は潰瘍の形成、個体の腸壁内の1以上瘻孔の出現、個体の肛門の1以上の亀裂の出現、栄養欠乏の出現(例えば、タンパク質、カロリー、ビタミンの1以上の欠乏)、腎臓結石の出現、又は胆石の出現の1以上である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記症状が、腹痛、出血性下痢、発熱、悪心、腹部痙攣、貧血、疲労、体重減少、食欲不振、直腸出血、体液及び栄養喪失、皮膚病変、関節痛、発育不全、骨粗鬆症、目の炎症、又は肝臓疾患の1以上である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患又は障害が、強皮症である、請求項20記載の方法。
【請求項３０】
前記強皮症が、びまん性強皮症、限局性強皮症(CREST症候群)、斑状強皮症、又は線状強皮症である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記症状が、顔面皮膚の硬化、指の皮膚の硬化、レイノー症候群、四肢の不適切な血管収縮、石灰沈着症、毛細血管拡張症、又は食道運動障害の1以上を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患又は障害が、乾癬である、請求項20記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患又は障害が、乾癬性関節炎である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記乾癬の症状が、皮膚の落屑、皮膚の発赤、皮膚の肥厚、プラーク形成、爪板下の変色、爪甲陥凹、爪の横筋、爪の下の皮膚の肥厚、爪甲離床症、膿疱出現、関節又は結合組織の炎症、皮膚の炎症、又は皮膚の剥離の1以上である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患又は障害が、多発性硬化症である、請求項20記載の方法。
【請求項３６】
前記症状が、個体の手足の知覚障害、視神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸管機能障害、性機能障害、運動失調、又は複視の1以上である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患又は障害が、関節リウマチである、請求項20記載の方法。
【請求項３８】
前記関節リウマチが、壊疽性膿皮症、好中球性皮膚症、スイート症候群、ウイルス感染、結節性紅斑、小葉性脂肪組織炎、指の皮膚の萎縮、手掌紅斑、広汎性菲薄化(ライスペーパー皮膚)、皮膚脆弱性、例えば肘上の外面上の皮下小結節、肺線維症(例えば、メトトレキセート療法の結果として)、キャプラン小結節、脈管炎疾患、爪郭梗塞、ニューロパシー、腎症、アミロイド症、筋偽肥大、心内膜炎、左心室不全、脈管炎、強膜軟化症、多発単神経炎、環軸亜脱臼の1以上に関与している、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患又は障害が、紅斑性狼瘡である、請求項20記載の方法。
【請求項４０】
前記紅斑性狼瘡の症状が、頬部発疹、皮膚上の厚みのある鱗屑性紅斑の出現、脱毛症、口腔潰瘍、鼻潰瘍、膣潰瘍、皮膚病変、関節痛、欠乏性貧血、鉄欠乏症、正常値よりも低い血小板及び白血球数、抗リン脂質抗体症候群、血中の抗カルジオリピン抗体の存在、心膜炎、心筋炎、心内膜炎、肺炎症、胸膜炎症、胸膜炎、胸膜滲出、ループス肺炎、肺高血圧症、肺塞栓、肺出血、自己免疫肝炎、黄疸、血中の抗核抗体(ANA)の存在、血中の平滑筋抗体(SMA)の存在、血中の肝臓/腎臓ミクロソーム抗体(LKM-1)の存在、血中の抗-ミトコンドリア抗体(AMA)の存在、血尿症、タンパク尿、ループス腎炎、腎不全、「ワイヤーループ」異常を伴う膜性糸球体腎炎の出現、発作、精神病、脳脊髄液の異常、個体のT細胞におけるCD45ホスファターゼ欠乏及び／又はCD40リガンド発現の増加、ループス腹膜炎、ループス膵炎、ループス膀胱炎、自己免疫性内耳疾患、副交感神経機能不全、レチナール血管炎、全身性血管炎、FcεRIγ発現の増加、T細胞中のカルシウムレベルの増加及び維持、血中イノシトール三リン酸の増加、プロテインキナーゼCリン酸化の減少、Ras-MAP キナーゼシグナル伝達の減少、又はプロテインキナーゼAI活性欠損症の1以上である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患又は障害が、糖尿病である、請求項20記載の方法。
【請求項４２】
前記症状が、異常に高い血糖値、グルコース耐性試験により決定されるインスリン抵抗性の欠如、疲労、又は意識喪失の1以上である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患、障害又は病態が、菌状息肉腫(アルベルト-バザン症候群)である、請求項20記載の方法。
【請求項４４】
前記菌状息肉腫が、斑形成相にある、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記菌状息肉腫が、皮膚腫瘍相にある、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
前記菌状息肉腫が、皮膚発赤(紅皮症)期にある、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
前記菌状息肉腫が、リンパ節期にある、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
前記症状が、痒い扁平な赤斑の出現、隆起し堅い扁平な赤斑(プラーク)の出現、隆起した塊(小結節)の出現、全身に広がる赤く痒い大きい鱗屑性の領域の出現、手掌及び足裏の皮膚のひび割れ、手掌及び足裏の皮膚の肥厚、又はリンパ節の炎症の1以上である、請求項43記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2010年12月17日に出願された米国特許仮出願第61/424,593号の優先権を主張するものであり、該出願の開示はその全体として引用により本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
(1.  分野)
免疫細胞の1以上の型を、AMDACと称される羊膜由来接着細胞の有効量と接触させることを含む、インビボ又はインビトロにおいて、免疫反応を調節、例えば軽減する方法を本明細書において提供する。望ましくない又は不適切な免疫反応、例えば自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー又は喘息を有する個体にAMDACを投与することを含む、そのような個体を治療する方法も、本明細書において提供する。
【背景技術】
【０００３】
(2.  背景)
炎症、並びに自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー及び喘息などの免疫関連疾患状態は、依然として重要な医学的問題である。そのような病態のための改善された療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
(3.  概要)
一態様において、羊膜由来接着細胞(AMDAC)、又はAMDACにより馴化された培養培地の治療有効量を個体へ投与することを含む、不適切な又は望ましくない免疫反応に関連した若しくはそれにより引き起こされた疾患又は障害を有するか、又はその発症のリスクがある個体を治療する方法を、本明細書において提供し、ここで該治療有効量は、該疾患、障害又は病態の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量であり、且つ該AMDACは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により決定可能な、OCT-4-(OCT-4について陰性、POU5F1又はオクタマー結合タンパク質4としても知られている)であり、且つ組織培養プラスチックに接着する。
【０００５】
具体的実施態様において、疾患又は障害は、前炎症反応、例えばTh1反応又はTh17反応により引き起こされるか若しくはそれに関連し、該AMDACを投与することで、該前炎症反応、例えば該Th1反応又はTh17反応を抑制する。具体的実施態様において、本方法は、該Th1又はTh17反応を媒介するT細胞(例えば、CD4+ Tリンパ球又は白血球)を、AMDACと接触させることを含む。具体的実施態様において、該接触は、Th1細胞成熟を検出可能に減少する。本方法の具体的実施態様において、該接触は、該T細胞による(例えば該個体において)、又は抗原提示(antigen-producing)細胞による、リンホトキシン-1α(LT-1α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)及び／又はインターフェロンガンマ(IFNγ)の1種以上の生成を検出可能に減少する。別の本方法の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)表現型を、増強又はアップレギュレートし、並びに／又はTh1及び／若しくはTh17反応を促進する生体分子(例えば、CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)の樹状細胞(DC)及び／若しくはマクロファージにおける発現を低下する。具体的実施態様において、該T細胞はまた、IL-10、例えば外因性IL-10又は該T細胞により生成されないIL-10、例えば組換えIL-10と接触される。
【０００６】
前記治療方法のいずれかの具体的実施態様において、該疾患又は障害は、アレルギー、喘息、又は該個体に対し外来性の抗原に対する反応である。別の前記治療方法のいずれかの具体的実施態様において、該疾患又は障害は、移植片対宿主病である。
【０００７】
別の前記治療方法のいずれかの具体的実施態様において、該疾患又は障害は、自己免疫疾患である。特定の具体的実施態様において、該自己免疫疾患は、炎症性腸疾患(例えば、クローン病若しくは潰瘍性大腸炎)、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫、又は強皮症である。特定の他の具体的実施態様において、該自己免疫疾患は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群(原発性又は続発性)、喘息、自己免疫性胃炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性疾患、自己免疫性血小板減少性紫斑病、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡(例えば、粘膜類天疱瘡)、寒冷凝集素疾患、ドゴー病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎(若年性)、本態性混合型クリオグロブリン血症、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎(橋本病；自己免疫性甲状腺炎)、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgA腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合型結合組織病、斑状強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、小児自己免疫性神経精神疾患(PANDA)、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎(例えば、皮膚筋炎を伴う)、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変症、レイノー病(レイノー現象)、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群(メルシュ‐ヴォルトマン症候群)、高安動脈炎、側頭動脈炎(巨細胞性動脈炎)、ブドウ膜炎、血管炎(例えば、紅斑性狼瘡を随伴しない血管炎)、白斑、及び／又はヴェーゲナー肉芽腫症の1以上である。
【０００８】
自己免疫疾患が炎症性腸疾患である具体的実施態様において、該炎症性腸疾患は、クローン病である。より具体的実施態様において、該クローン病は、胃十二指腸のクローン病、空回腸炎、回結腸炎、又はクローン結腸炎である。別の具体的実施態様において、該炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。特定の具体的実施態様において、該潰瘍性大腸炎は、汎大腸炎、限局性大腸炎、遠位大腸炎、又は直腸炎である。特定の具体的実施態様において、該炎症性腸疾患、例えばクローン病の症状は、胃腸(GI)管の一部の炎症及び膨潤、腹痛、腸管の頻繁な排泄、下痢、直腸出血、貧血、体重減少、関節炎、皮膚の問題、発熱、腸壁の肥厚、個体の腸内の瘢痕組織の形成、個体の腸内のびらん又は潰瘍の形成、個体の腸壁内の1以上瘻孔の出現、個体の肛門の1以上の亀裂の出現、栄養欠乏の出現(例えば、タンパク質、カロリー、ビタミンの1以上の欠乏)、腎臓結石の出現、又は胆石の出現の1以上である。特定の他の具体的実施態様において、該炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎の症状は、腹痛、出血性下痢、発熱、悪心、腹部痙攣、貧血、疲労、体重減少、食欲不振、直腸出血、体液及び栄養喪失、皮膚病変、関節痛、及び発育不全の1以上である。別のより具体的実施態様において、該症状は、骨粗鬆症、目の炎症、又は肝臓疾患である。
【０００９】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患又は障害は、強皮症である。具体的実施態様において、強皮症は、びまん性強皮症、限局性強皮症(CREST症候群)、斑状強皮症、又は線状強皮症である。特定の具体的実施態様において、該強皮症の症状は、顔面皮膚の硬化、指の皮膚の硬化、レイノー症候群、四肢の不適切な血管収縮、石灰沈着症、毛細血管拡張症、又は食道運動障害の1以上を含む。
【００１０】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患又は障害は、乾癬である。特定の具体的実施態様において、該乾癬の症状は、乾癬性関節炎、皮膚の落屑、皮膚の発赤、皮膚の肥厚、プラーク形成、爪板下の変色、爪甲陥凹、爪の横筋、爪の下の皮膚の肥厚、爪甲離床症、膿疱出現、関節又は結合組織の炎症、皮膚の炎症、又は皮膚の剥離の1以上である。
【００１１】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患又は障害は、多発性硬化症である。特定の具体的実施態様において、該多発性硬化症の症状は、個体の手足の知覚障害、視神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸管機能障害、性機能障害、運動失調、又は複視の1以上である。
【００１２】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患又は障害は、関節リウマチである。特定の具体的実施態様において、該関節リウマチは、壊疽性膿皮症、好中球性皮膚症、スイート症候群、ウイルス感染、結節性紅斑、小葉性脂肪組織炎、指の皮膚の萎縮、手掌紅斑、広汎性菲薄化(ライスペーパー皮膚)、皮膚脆弱性、例えば肘上の外面上の皮下小結節、肺線維症(例えば、メトトレキセート療法の結果として)、キャプラン小結節、脈管炎疾患、爪郭梗塞、ニューロパシー、腎症、アミロイド症、筋偽肥大、心内膜炎、左心室不全、脈管炎、強膜軟化症、多発単神経炎、又は環軸亜脱臼の1以上に関与している。
【００１３】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患又は障害は、紅斑性狼瘡である。特定の具体的実施態様において、該紅斑狼瘡の症状は、頬部発疹、皮膚上の厚みのある鱗屑性紅斑の出現、脱毛症、口腔潰瘍、鼻潰瘍、膣潰瘍、皮膚病変、関節痛、欠乏性貧血、鉄欠乏症、正常値よりも低い血小板及び白血球数、抗リン脂質抗体症候群、血中の抗カルジオリピン抗体の存在、心膜炎、心筋炎、心内膜炎、肺炎症、胸膜炎症、胸膜炎、胸膜滲出、ループス肺炎、肺高血圧症、肺塞栓、肺出血、自己免疫肝炎、黄疸、血中の抗核抗体(ANA)の存在、血中の平滑筋抗体(SMA)の存在、血中の肝臓/腎臓ミクロソーム抗体(LKM-1)の存在、血中の抗-ミトコンドリア抗体(AMA)の存在、血尿症、タンパク尿、ループス腎炎、腎不全、「ワイヤーループ」異常を伴う膜性糸球体腎炎の出現、発作、精神病、脳脊髄液の異常、個体のT細胞におけるCD45ホスファターゼ欠乏及び／又はCD40リガンド発現の増加、ループス腹膜炎、ループス膵炎、ループス膀胱炎、自己免疫性内耳疾患、副交感神経機能不全、レチナール血管炎、全身性血管炎、FcεRIγ発現の増加、T細胞中のカルシウムレベルの増加及び維持、血中イノシトール三リン酸の増加、プロテインキナーゼCリン酸化の減少、Ras-MAP キナーゼシグナル伝達の減少、又はプロテインキナーゼAI活性欠損症の1以上である。
【００１４】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患又は障害は、糖尿病である。特定の具体的実施態様において、該症状は、異常に高い血糖値、グルコース耐性試験により決定されるインスリン抵抗性の欠如、疲労、又は意識喪失の1以上である。
【００１５】
本明細書に明らかにされた治療方法の別の実施態様において、該疾患、障害又は病態は、菌状息肉腫(アルベルト-バザン症候群)である。特定の具体的実施態様において、該菌状息肉腫は、斑形成相、皮膚腫瘍相、皮膚発赤(紅皮症)段階、又はリンパ節段階にある。特定の他の具体的実施態様において、該菌状息肉腫の症状は、痒い扁平な赤斑の出現、隆起し堅い扁平な赤斑(プラーク)の出現、隆起した塊(小結節)の出現、全身に広がる赤く痒い大きい鱗屑性の領域の出現、手掌及び足裏の皮膚のひび割れ、手掌及び足裏の皮膚の肥厚、又はリンパ節の炎症の1以上である。
【００１６】
本明細書に明らかにされた治療方法において有用なAMDACは、細胞マーカー及び遺伝子マーカーの異なる組合せにより同定されてよい。具体的実施態様において、例えば、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-である。別の実施態様において、AMDACは、フローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+である。また別の実施態様において、AMDACは、各々、RT-PCR及びフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-及びCD49f+である。更に別の実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、CD105+、及びCD200+である。別の実施態様において、AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、並びに免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1(血管内皮増殖因子受容体1)又はCD309(VEGFR2/KDR(血管内皮増殖因子受容体2)としても公知)について陽性である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、フローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+及びCD117-であり、並びにRT-PCRにより決定可能なHLA-G-である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-及びHLA-G-であり、並びに免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD90+、CD105+、及び／又はCD117-である。別の具体的実施態様において、上記AMDACのいくつかは加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上である。別の具体的実施態様において、上記AMDACのいくつかは加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。
【００１７】
別の具体的実施態様において、AMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能なGFAP+である(例えば、下記6.3.3節参照)。別の具体的実施態様において、AMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能なβ-チューブリンIII(Tuj1)+である(例えば、下記6.3.3節参照)。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、GFAP+、及びβ-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、OCT-4-、CD200+、CD105+、及びCD49f+である。別の具体的実施態様において、AMDACは、CD200+、CD105+、CD90+、及びCD73+である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、CD117-であり、且つCD117に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、AMDACは、CD146-であり、且つCD146に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-であり、且つRT-PCR及び／又は免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能なVEGFによる誘導後、CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、CD117-、及びCD200+である。
【００１８】
別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法において有用なAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定される神経原性である(例えば、下記6.3.3節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法において有用なAMDACは、インビトロ軟骨形成能アッセイにより決定される非軟骨形成性である(例えば、下記6.3.2節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法において有用なAMDACは、骨形成表現型アッセイにより決定される非骨形成性である(例えば、下記6.3.1節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、100nMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロールリン酸、50μM L-アスコルビン酸-2-ホスフェートを補充した、pH7.4のDMEM(高グルコース)において最大6週間(例えば、2週間、4週間、又は6週間)培養された後、非骨形成性であり、ここで骨形成性は、von Kossa染色；アリザリンレッド染色を用いるか；又は、例えばRT-PCRにより、オステオポンチン、オステオカルシン、オステオネクチン、及び／又は骨シアロタンパク質の存在を検出することにより、評価される。
【００１９】
より具体的実施態様において、上記AMDACのいずれかは加えて：(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1以上を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、又はVE-カドヘリンの1以上の発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠き；(d)
【化１】
2014501249.tif 000002
の1以上のmRNAを発現し；(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を生成し；(f)血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターロイキン-8(IL-8)、単球走化性タンパク質-3(MCP-3)、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1の1以上を、AMDACが成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び／又はmiR-16の1以上を発現し；或いは、(j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8又はVEGFの1以上を増加したレベルで発現する。より具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、CD117-、及びCD200+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つここで該AMDACは加えて：(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及びVEGFR2/KDR(CD309)を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及びVE-カドヘリンの発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠き；(d)RT-PCRにより決定可能な、
【化２】
2014501249.tif 000003
のmRNAを発現し；(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型を生成し；(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及びmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を発現し；或いは、(j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8及び／又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8及び／又はVEGFを増加したレベルで発現する。
【００２０】
他の実施態様において、例えば、羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つ例えば胚性癌腫由来幹細胞株(例えば、NTERA-2、例えばATCC寄託番号CRL-1973でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手可能)などの適切な対照細胞株と比べ、30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-である。具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はVEGFR2/KDR+(血管内皮増殖因子受容体2、キナーゼ挿入ドメイン受容体としても公知)である。別の具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+(インテグリン-α6+)である。具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、OCT-4-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。
【００２１】
別の実施態様において、該OCT-4-細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD29+、CD73+、ABC-p+、及びCD38-の1以上である。
【００２２】
別の具体的実施態様において、該OCT-4-羊膜由来接着細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、CXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上である。より具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別のより具体的実施態様において、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり；免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び／又はTie-2-の1以上、又は全てである。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4の、例えば、20サイクルより多く(例えば、20〜30サイクル)のPCR-増幅されたmRNAを、同等数のNTERA-2細胞よりも、少なくとも2log少なく発現する。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-(CD144-)である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD105+及びCD200+について陽性である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば、1〜100ng/mL VEGF(血管内皮増殖因子)へ4〜21日間曝露した後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。
【００２３】
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-及びSOX-2-である。また別の実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、及びCD117-である。具体的実施態様において、OCT-4-、SOX-2-羊膜由来接着細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、HLA-G-又はCD271-である。より具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-及びSOX-2-であり；且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、CD117-、CD271-及びHLA-G-である。
【００２４】
任意の上記AMDACの別の実施態様において、及びこれに加えて、該細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つCD309(VEGFR2/KDR+としても知られている)について陽性である。
【００２５】
本明細書に明らかにされた治療方法において有用な羊膜由来接着細胞は、別の実施態様において、組織培養プラスチックに接着し、例えば、20〜30サイクルなど、20サイクルよりも多いRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-の1以上である。具体的実施態様において、該細胞は、例えば、20〜30サイクルなど、20サイクルよりも多いRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、例えば、1〜100ng/mL VEGFへ4〜21日間曝露した後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。
【００２６】
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-の1以上である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び／又はTie-2+の1以上である。別の具体的実施態様において、該細胞は、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及びTie-2+である。
【００２７】
別の実施態様において、本明細書で明らかにされた羊膜由来接着細胞は、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、
【化３】
2014501249.tif 000004
の1以上のmRNAを発現しない。別の実施態様において、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、フローサイトメトリーにより決定可能なような、インバリアント鎖、HLA-DR-DP-DQ、CD6、又はCD271の1以上を構成的に発現せず、すなわち羊膜由来接着細胞は、一般に通常の非刺激条件下で、これらのマーカーを発現しない。
【００２８】
具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCR及び／又はテロメア反復配列増幅プロトコール(TRAP)アッセイにより測定されるように、テロメラーゼ-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCRにより測定されたように、NANOG-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、NANOGのmRNAを発現しない。具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、(性決定領域Y)-box2(SOX2)-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2のmRNAを発現しない。
【００２９】
羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞の集団が、本明細書において更に提供され、ここで該細胞集団は、本明細書に明らかにされた治療方法において治療効果がある。そのような細胞集団は、本明細書に明らかにされたマーカーの任意の組合せにより説明される、羊膜由来接着細胞のいずれかを含むことができる。具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、そのような羊膜由来接着細胞である。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％又はそれよりも多くは、OCT-4+ではない。
【００３０】
特定の実施態様において、本明細書に提供される治療方法は加えて、第二の幹細胞型を該個体へ投与することを含む。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の単離された集団は加えて、第二の細胞型、例えば、幹細胞又は前駆細胞を含む。具体的実施態様において、本明細書に明らかにされたAMDACは、該集団中の細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％又は少なくとも98％を占める。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞及び第二の細胞型を含む細胞集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％又はそれ以上は、OCT-4+ではない。具体的実施態様において、第二の細胞型は、胎盤血、臍帯血、粗骨髄又は他の組織の中に含まれるか又はそれらから単離されている。より具体的実施態様において、該第二の細胞型は、胚性幹細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞(例えば、臍帯マトリクス又はワルトン膠質由来の幹細胞)、骨髄由来の間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、CD34+細胞、体性幹細胞、脂肪幹細胞、誘導多能性幹細胞などである。別のより具体的実施態様において、該第二の細胞型は、該集団中の細胞の少なくとも 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％を占める。
【００３１】
別の具体的実施態様において、上記AMDACのいずれか、又は第二の細胞型は、培養において増殖するか、又は増殖されている。別の具体的実施態様において、上記細胞のいずれかは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20回又はそれ以上継代されている、そのような細胞の培養物に由来している。別の具体的実施態様において、上記細胞のいずれかは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは少なくとも50回、又はそれ以上倍加されている、そのような細胞の培養物に由来している。
【００３２】
他の実施態様において、本明細書に明らかにされた治療方法は、組成物、例えば医薬組成物中で、罹患した個体へ、AMDACを投与することを含む。具体的実施態様において、該組成物は、マトリクス又はスキャフォールドであり、例えば、例として恒久性若しくは分解性の脱細胞化された組織マトリクス若しくはスキャフォールドなどの天然の組織マトリクス又はスキャフォールド；或いは、合成マトリクス又はスキャフォールドである。より具体的実施態様において、該マトリクス又はスキャフォールドは、ビーズ、チューブの形状又は他の三次元の形状に成形される。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、脱細胞化された組織マトリクスである。別の具体的実施態様において、該組成物は、生理的に許容し得る溶液、例えば食塩水、培養培地などの中に、本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞の1個以上を、又は羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団を含む。
【００３３】
本明細書に提供される治療方法の別の具体的実施態様において、該細胞は、注射により該個体へ投与される。別の具体的実施態様において、該細胞は、静脈内注入により該個体へ投与される。治療方法の別の具体的実施態様において、該細胞は、前述のような羊膜由来接着細胞を含む、マトリクス又はスキャフォールドの該個体への埋め込みにより、該個体へ投与される。
【００３４】
本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞及び細胞集団は、例えば、それらの開示はそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,255,879号又は米国特許出願公開第2007/0275362号に説明された、単離された胎盤幹細胞又は細胞集団ではない。本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞はまた、内皮前駆細胞、羊膜上皮細胞、栄養芽細胞、栄養膜細胞層、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、胚の内部細胞塊から得られる細胞、又は胚の生殖隆起から得られる細胞でもない。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「約」という用語は、例えば、記述された数字又は値の10％以内を意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「幹細胞」という用語は、例えば、最大約40集団倍加まで、大規模に増殖することができるが、しかし必ずしも無限ではなく、且つ複数の細胞型に分化することができる、例えばインビトロにおいて分化することができる、いずれか所定の細胞集団の機能特性を定義している。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「前駆細胞」という用語は、例えば、最大約40集団倍加まで、大規模に増殖することができるが、しかし必ずしも無限ではなく、且つ幹細胞のそれと比べ一般により限定されている、細胞型の限定されたセットに分化することができる、例えば、インビトロにおいて分化することができる、いずれか所定の細胞集団の機能特性を定義している。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「由来した」という用語は、単離されているか、又は別の形で純化されていることを意味する。例えば、羊膜由来接着細胞は、羊膜から単離されている。「由来した」という用語は、組織、例えば、羊膜から直接単離された細胞から培養される細胞、及び初代単離株から培養又は拡大された細胞を包含する。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「免疫局在化」は、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気細胞選別、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えば、抗体又はその断片を用いる、化合物、例えば、細胞マーカーの検出を意味する。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「単離された細胞」という用語は、該細胞が得られるか又は由来する組織、例えば羊膜の他の細胞から実質的に分離されている細胞、例えばAMDACを意味する。該細胞が天然に関連している細胞の少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも約99％が、例えば、該細胞の回収及び／又は培養時に、該細胞から取り除かれる場合、該細胞は「単離され」ている。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「単離された細胞集団」という用語は、該細胞集団が得られるか又は由来する組織、例えば、羊膜又は胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。該細胞集団、又は該細胞集団が由来する細胞が天然に関連している細胞の少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が、例えば、羊膜由来接着細胞の回収及び／又は培養時に、該細胞から取り除かれる場合、該細胞集団は「単離され」ている。
【００４２】
本明細書で使用されるように、細胞又は細胞集団は、例えば、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより；又は、RT-PCRによりなど、特定のマーカーがバックグラウンドを上回り検出可能である場合、特定のマーカーについて「陽性」である。例えば、CD105が、バックグラウンドよりも(例えばアイソタイプ対照と比べて)検出可能に多い量で細胞上、又は細胞集団内で検出可能である場合、該細胞又は細胞集団は、例えばCD105について陽性と説明される。例えば、抗体-媒介性検出の文脈において、特定の細胞表面マーカーが存在することの指標としての「陽性」は、該マーカーが、そのマーカーに対し特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を用い、検出可能であることを意味し；「陽性」はまた、細胞又は細胞集団が、例えば血球計測器、ELISAなどにおいて、バックグラウンドを上回り検出可能であるシグナルを発生する量で、そのマーカーを提示することも意味する。例えば、細胞が、CD105に特異的な抗体により検出可能に標識され、且つ該抗体からのシグナルが対照(例えば、バックグラウンド)よりも検出可能に高い場合に、該細胞は「CD105+」である。対照的に、同じ文脈で「陰性」とは、細胞表面マーカーが、該マーカーに特異的な抗体を用い、バックグラウンドと比べ、検出可能でないことを意味する。例えば、細胞又は細胞集団が、CD34に特異的な抗体で検出可能に標識されない場合、該細胞又は細胞集団は「CD34-」である。本明細書において別に注記しない限りは、分化抗原分類("CD")マーカーは、抗体を用いて検出される。例えば、OCT-4のmRNAが、例えば30サイクルのRT-PCRを用い検出可能である場合に、OCT-4は存在し、且つ細胞はOCT-4+であると決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
(4.  図面の簡単な説明)
【図１】図1は、羊膜由来接着細胞及びNTERA-2細胞による幹細胞関連遺伝子の発現を示す。
【００４４】
【図２】図2は、羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞表面上のTEM-7の発現を示す。
【００４５】
【図３】図3A-3Dは、羊膜由来接着細胞により選択された血管新生タンパク質の分泌を示す。図3A：継代数6のAMDAC(n＝3)による、組織メタロプロテアーゼ阻害物質-1(TIMP-1)、TIMP-2、トロンボポエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、及びVEGF-Dの分泌。図3B：継代数6のAMDAC(n＝3)による、アンギオゲニン、上皮細胞増殖因子(EGF)、上皮性好中球-活性化ペプチド78(ENA-78)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、及び成長-調節する癌遺伝子α(GRO)の分泌。図3C：継代数6のAMDAC(n＝3)による、インターフェロンγ(IFN-γ)、インスリン-様増殖因子-1(IGF-1)、インターロイキン-6(IL-6)、IL-8、及びレプチンの分泌。図3D：継代数6のAMDAC(n＝3)による、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)、血小板由来増殖因子(PDGF)-BB、胎盤増殖因子(PlGF)、ランテス、及びトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)の分泌。
【００４６】
【図４】図4は、インビトロにおいて、T細胞増殖を阻害するAMDACの能力を明らかにしている。NHDF：新生児皮膚線維芽細胞。AMDAC、NHDFの左側のバー：AMDAC又はNHDFが存在しない場合と比較した、CD4+ T細胞抑制。AMDAC、NHDFの右側のバー：AMDAC又はNHDFが存在しない場合と比較した、CD8+ T細胞抑制。Y軸：AMDAC又はNHDFの非存在時のT細胞増殖と比較した、AMDAC又はNHDFが原因の抑制率。
【００４７】
【図５】図5は、AMDACによる馴化培地が、T細胞によるTNF-α生成の抑制を誘導することを明らかにしている。Y軸：AMDAC又はNHDFの非存在時のTNF-α生成と比較した、AMDAC又はNHDF存在下でのバルクT細胞によるTNF-α生成の抑制率。
【００４８】
【図６】図6は、Th1 T細胞のAMDACによる抑制を示す。Pan Tベース：AMDAC非存在下での、Th1 T細胞の割合。100K、75K、50K、25K：各々、AMDACの100,000、75,000、50,000、及び25,000個が存在する場合の、Th1 T細胞の割合。
【００４９】
【図７】図7は、Th17 T細胞のAMDACによる投与量依存的様式での抑制を示す。100K、80K、60K、40K：各々、AMDACの100,000、80,000、60,000、及び40,000個と共培養した後に残存するTh17 T細胞(AMDAC非存在)の割合。
【００５０】
【図８】図8は、AMDACによるFoxP3 Treg細胞の増加を示す。ベースライン：AMDACの非存在下での総T細胞中のFoxP3 Treg細胞の割合。100K、75K、50K、25K：各々、AMDACの100,000、75,000、50,000、及び25,000個の存在下での、FoxP3 Treg細胞の割合。
【００５１】
【図９】図9A-9Cは、CD86及びHLA-DR発現により評価した、DC集団のフローサイトメトリー結果を示す。全て：SSC：側方散乱光。細胞型：樹状細胞(DC)のみ、又はDC＋AMDAC。LPS＋IFN-γ：細菌性リポ多糖体及びインターフェロンγにより刺激した細胞(+)又は刺激していない細胞(-)。図9A：抗-CD86-フィコエリトリン(PE)により標識したDC。図9B：抗-HLA-DR-PerCP Cy5.5により標識したDC。図9C：抗-IL-12-PE(Y-軸)及び抗-CD11c-FITCにより標識したDC。
【００５２】
【図１０】図10は、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)及びインターロイキン-12(細菌性リポ多糖体(LPS)-刺激した樹状細胞(DC)によるIL-12)の生成の抑制を示す。各条件に関して(IL-12又はTNF-α生成)、左列は、LPS及びインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)存在下でのDCによるサイトカイン生成であり、右列は、LPS、IFN-γ、及びAMDACの存在下でのDCによるサイトカイン生成である。「□-」は、DCが、LPS又はIFN-γのいずれによっても刺激されなかった状態を示している。各条件の右側の数値は、各条件においてDCにより産生されたIL-12又はTNF-αのピコグラム数を示している。
【００５３】
【図１１】図11は、ナチュラルキラー(NK)細胞増殖のAMDAC-媒介性抑制を示している。X軸：AMDACを含む(左側バー)又は含まない(右側バー)でのNK細胞前駆体の培養日数。Y軸：示された各培養日数でのNK細胞の数。
【００５４】
【図１２】図12は、NK細胞の細胞傷害性のAMDAC抑制を示す。X軸：標的としてのNK細胞及びK562細胞(ヒト不死化骨髄性白血病細胞株)と共培養した1ウェル当たりのAMDACの数。Y軸：NK細胞傷害率(％)（1−試料中のK562細胞の総数÷NK細胞を含まない対照中のK562細胞の総数）×100として計算した。
【００５５】
【図１３】図13は、マウス多発性硬化症モデルにおいて、処置12〜24日目にわたり、AMDACを受け取るマウス(G9)は、対照ビヒクルを受け取るマウス(G1)に勝る明白な改善を示したこと(13A)、並びにマウス体重は、処置12〜28日目にわたりAMDAC-処置マウスにおいてより高いこと(13B)を示している。
【００５６】
【図１４】図14は、マウス多発性硬化症モデルにおいて、AMDACを受け取るマウス(G9)は、対照ビヒクルのみを受け取るマウス(G1)よりも、症状発現が遅いことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
(5.  詳細な説明)
(5.1  羊膜由来接着細胞を使用する免疫調節)
一態様において、免疫細胞を、本明細書記載の複数の羊膜由来接着細胞(AMDAC)と接触させることにより、1個の免疫細胞又は複数の免疫細胞の活性、例えば増殖を調節する、例えば抑制する方法が、本明細書に提供される。該免疫細胞は、インビトロにおける細胞であることができるか、或いはインビボにおける免疫反応の一部であることができる。特定の実施態様において、免疫反応の一部である複数の個体の免疫細胞を、複数の羊膜由来接着細胞と、該羊膜由来接着細胞が該免疫反応を検出可能に抑制するのに十分な時間接触させることを含む、個体における免疫反応を抑制する方法方法が、本明細書に提供され、ここで該免疫反応は、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病、喘息又はアレルギーであり、ここで例えば、該羊膜由来接着細胞は、例えば混合リンパ球反応(MLR)アッセイ又は退行(regression)アッセイにおいてT細胞増殖を検出可能に抑制する。
【００５８】
免疫反応、又は免疫細胞の活性の調節において有用な羊膜由来接着細胞は、本明細書において別所に記載された羊膜由来接着細胞である(5.4節参照)。免疫抑制に使用される羊膜由来接着細胞は、単独の胎盤の羊膜又は複数の胎盤の羊膜に由来するか又はそれらから入手することができる。免疫抑制に使用される羊膜由来接着細胞はまた、単独の種、例えば意図されたレシピエントの種又はその機能が低下若しくは抑制される免疫細胞の種に由来することができるか、或いは複数の種に由来することができる。
【００５９】
本方法及び本明細書に明らかにされた方法の文脈での「免疫細胞」は、免疫系の任意の細胞、特にT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞を意味する。従って本方法の様々な実施態様において、羊膜由来接着細胞は、複数の免疫細胞と接触され、ここで該複数の免疫細胞は、複数のT細胞(例えば、複数のCD3+ T細胞、CD4+ T細胞及び／若しくはCD8+ T細胞)並びに／又はナチュラルキラー細胞であるか又はこれらを含む。本方法の文脈での「免疫反応」は、免疫細胞により正常に認識される刺激に対する免疫細胞による任意の反応、例えば抗原の存在に対する反応であることができる。様々な実施態様において、免疫反応は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー又は喘息の一部としてのT細胞(例えば、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及び／又はCD8+ T細胞)の増殖であることができる。免疫反応はまた、ナチュラルキラー(NK)細胞の任意の活性、樹状細胞の成熟などであることができる。免疫反応はまた、免疫細胞の1以上のクラスの活性の局所的、組織-若しくは臓器-特異的、又は全身作用であることができ、例えば免疫反応は、炎症、炎症-関連した瘢痕組織の形成などであることができる。
【００６０】
本明細書に提供される方法の文脈において「接触させる」は、羊膜由来接着細胞と免疫細胞を、1つの容器(例えば、培養皿、フラスコ、バイアルなど)又はインビボにおいて、例えば同じ個体(例えば哺乳動物、例えばヒト)において一緒にさせることを包含している。好ましい実施態様において、接触させるのは、免疫細胞の免疫機能の変化が検出可能であるのに十分な時間、及び羊膜由来接着細胞と免疫細胞の十分な数である。より好ましくは様々な実施態様において、該接触させるのは、免疫機能(例えば、抗原に反応したT細胞増殖)を、羊膜由来接着細胞非存在下での免疫機能と比べ、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％又は95％抑制するのに十分である。インビボ状況におけるそのような抑制は、インビトロアッセイ(下記参照)により決定することができ；すなわち、インビトロアッセイにおける抑制の程度は、レシピエント個体内の特定数の羊膜由来接着細胞及び多くの免疫細胞について該個体における抑制の程度に外挿することができる。
【００６１】
特定の実施態様において、インビトロにおける複数の免疫細胞の1以上の型の免疫反応、又は活性を調節するための羊膜由来接着細胞の使用方法が、本明細書に提供される。羊膜由来接着細胞と複数の免疫細胞を接触させることは、複数の羊膜由来接着細胞の少なくとも一部が、複数の免疫細胞の少なくとも一部と相互作用するように、羊膜由来接着細胞と免疫細胞を同じ物理的空間内で一緒にすること；共通培地の入った個別の物理的空間に羊膜由来接着細胞と免疫細胞を維持することを含むか；又は、羊膜由来接着細胞又は免疫細胞の1つ又は培養物由来の培地を、他の細胞型と接触させることを含むことができる(例えば、羊膜由来接着細胞の培養物から培養培地を入手し、且つ該培地中に単離された免疫細胞を再懸濁する)。具体例において、接触は、混合リンパ球反応(MLR)において行われる。別の具体例において、接触は、退行アッセイ又はビート(beat)T-リンパ球反応(BTR)アッセイにおいて行われる。
【００６２】
そのような接触は、例えば、特定の複数の羊膜由来接着細胞が免疫調節性、例えば免疫抑制性である程度を決定するためにデザインされた実験的設定で行うことができる。そのような実験的設定は、例えば混合リンパ球反応(MLR)又は退行アッセイであることができる。MLR及び退行アッセイを行う手順は、当該技術分野において周知である。例えばSchwarzの文献、「混合リンパ球反応：寛容に関するインビトロ試験(The Mixed Lymphocyte Reaction : An In Vitro Test for Tolerance)」、J. Exp. Med. 127(5):879-890 (1968)；Lacerdaらの文献、「異種移植したC.B-17 Scid/Scidマウスにおける自家EBV-誘導したBリンパ球増殖へ優先的に回復し、かつそれへの選択的退行を誘導したヒトエプスタイン・バーウイルス(EBV)-特異的細胞傷害性Tリンパ球(Human Epstain Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17 Scid/Scid Mice)」、J. Exp. Med. 183:1215-1228 (1996)を参照されたい。好ましい実施態様において、多数の羊膜由来接着細胞が複数の免疫細胞(例えばリンパ球、例えばCD3+、CD4+及び／又はCD8+ Tリンパ球)と接触されるMLRが実行される。
【００６３】
MLRを使用し、複数の羊膜由来接着細胞の免疫抑制能力を決定することができる。例えば複数の羊膜由来接着細胞は、CD4+又はCD8+T細胞、樹状細胞(DC)及び羊膜由来接着細胞を、例えば比約10：1：2で一緒にすることを含む、MLRにおいて試験することができ、ここでT細胞は、例えば娘細胞へ分配されるCFSEなどの色素で染色され、且つここでT細胞は約6日間増殖させることができる。羊膜由来接着細胞の存在下での6日目のT細胞増殖が、DC存在下且つ羊膜由来接着細胞非存在下でのT細胞増殖と比べ、検出可能に低下する場合に、複数の羊膜由来接着細胞は、免疫抑制性である。そのようなMLRにおいて、羊膜由来接着細胞は、解凍されるか又は培養物から収集されるかのいずれかである。羊膜由来接着細胞約20,000個を、培地(RPMI1640、1mM HEPES緩衝液、抗生物質、及び5％プールしたヒト血清)100μL中に再懸濁し、且つ2時間ウェルの底へ接着させる。CD4+及び／又はCD8+ T細胞は、全末梢血単核細胞からMiltenyi磁気ビーズを用い単離される。これらの細胞を、CFSE染色し、且つ全部で100,000個のT細胞(CD4+T細胞のみ、CD8+T細胞のみ、又は等量のCD4+及びCD8+T細胞)を、各ウェルに添加する。ウェルの容積は200μLとし、且つMLRを進行させる。
【００６４】
従って一実施態様において、複数の免疫細胞を複数の羊膜由来接着細胞と、該羊膜由来接着細胞が混合リンパ球反応(MLR)アッセイ、ビーズT細胞反応(BTR)アッセイ又は退行アッセイにおいてT細胞増殖を検出可能に抑制するのに十分な時間、接触させることを含む、免疫反応を抑制する方法が、本明細書に提供される。一実施態様において、MLR、BTR又は退行アッセイにおいて使用した該羊膜由来接着細胞は、羊膜由来接着細胞の大きい集団からの羊膜由来接着細胞の試料又はアリコートを表す。
【００６５】
異なる胎盤、又は同じ胎盤内の異なる組織から得られた羊膜由来接着細胞の集団は、免疫細胞の活性を調節するそれらの能力が異なり、例えばT細胞活性若しくは増殖又はNK細胞活性を抑制する能力が異なり得る。従って使用前に、免疫抑制に関する羊膜由来接着細胞の特定の集団の能力を決定することが望ましい。そのような能力は、例えば、MLR又は退行アッセイにおいて羊膜由来接着細胞集団の試料を試験することにより、決定することができる。一実施態様において、試料でMLRが実行され、且つ羊膜由来接着細胞が原因となる該アッセイにおける免疫抑制の程度が決定される。この免疫抑制の程度は次に、試料採取される羊膜由来接着細胞集団に帰することができる。従ってMLRを、特定集団の羊膜由来接着細胞の免疫機能を抑制する絶対能力及び相対能力を決定する方法として使用することができる。MLRのパラメータは、より多くのデータを提供し且つ羊膜由来接着細胞試料の免疫抑制能力を最良に決定するために変動することができる。例えば、羊膜由来接着細胞による免疫抑制は、該アッセイ中に存在する羊膜由来接着細胞の数におおまかに比例して増加するように見えるので、MLRは、一実施態様において2つ以上の羊膜由来接着細胞の数、例えば1反応につき1×103、3×103、1×104及び／又は3×104個の羊膜由来接着細胞で行うことができる。また該アッセイ中のT細胞数に対する羊膜由来接着細胞数は、変動することができる。例えば、比較的多数の羊膜由来接着細胞又はT細胞の使用にも拘わらず、該アッセイ中の羊膜由来接着細胞及びT細胞は、例えば約100：1〜約1：100、好ましくは約1：5の比で存在することができる。
【００６６】
退行アッセイ又はBTRアッセイは、類似の様式で使用することができる。
【００６７】
従って、インビボにおける複数の免疫細胞の1以上の型の免疫反応、又は活性を調節するための羊膜由来接着細胞の使用方法が、本明細書で提供される。羊膜由来接着細胞と免疫細胞は、例えば複数の羊膜由来接着細胞のレシピエントである個体において、接触させられる。接触が個体において行われる場合、一実施態様において、この接触は、外来性羊膜由来接着細胞(すなわち、該個体由来又は該個体に関連した羊膜由来ではない羊膜由来接着細胞；同種細胞)と該個体に対して内因性の複数の免疫細胞の間である。他の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、例えば個体と遺伝的同一性を共有する、個体に対し内因性であり、例えば個体に対し自家である。具体的実施態様において、個体内の免疫細胞は、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及び／又はNK細胞である。
【００６８】
本羊膜由来接着細胞は、個体において公知の又は予想される免疫細胞、例えばT細胞の数に関して、約10：1〜約1：10、好ましくは約1：5の比で、個体へ投与することができる。しかし複数の羊膜由来接着細胞を、非限定的例で約10,000：1、約1,000：1、約100：1、約10：1、約1：1、約1：10、約1：100、約1：1,000又は約1：10,000の比で、個体へ投与することができる。一般に、レシピエント1kg当たり約1×105〜約1×108個の羊膜由来接着細胞、好ましくはレシピエント1kg当たり約1×106〜約1×107個の羊膜由来接着細胞を、免疫抑制をもたらすために投与することができる。様々な実施態様において、個体又は対象へ投与される複数の羊膜由来接着細胞は、少なくとも、約、又はわずかに1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109個の羊膜由来接着細胞、又はそれ以上を含む。
【００６９】
本羊膜由来接着細胞はまた、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,468,276号又は米国特許出願公開第2007/0275362号に説明されているような、1以上の第二の幹細胞型、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞又は胎盤幹細胞と共に投与することができる。そのような第二の幹細胞は、羊膜由来接着細胞と、例えば約1：10〜約10：1の比で、個体へ投与することができる。
【００７０】
インビボにおける羊膜由来接着細胞と免疫細胞の接触又は隣接を促進するために、羊膜由来接着細胞を、羊膜由来接着細胞と免疫細胞を互いに接触させるのに十分な任意の経路により、個体に投与することができる。例えば、羊膜由来接着細胞は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、眼球内、非経口、髄腔内、又は直接臓器、例えば膵臓へにより、個体へ投与することができる。インビボ投与に関して、羊膜由来接着細胞は、下記5.8.1節に説明したように、医薬組成物として製剤することができる。
【００７１】
この免疫抑制方法は加えて、特にインビボ状況において、1以上の免疫抑制薬の添加を含むことができる。一実施態様において、複数の羊膜由来接着細胞を、個体中インビボにおいて複数の免疫細胞と接触させ、且つ免疫抑制薬を含有する組成物を該個体へ投与する。免疫抑制薬は、当該技術分野において周知であり、且つ例えば抗-T細胞受容体抗体(モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又はそれらの抗体断片若しくは誘導体)、抗-IL-2受容体抗体(例えば、バシリキシマブ(SIMULECT(登録商標))又はダクリツマブ(ZENAPAX)(登録商標))、抗T細胞受容体抗体(例えば、Muromonab-CD3)、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤などを含む。具体的実施態様において、免疫抑制薬は、マクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1α又はMIP-1βに対する中和抗体である。好ましくは抗-MIP-1α又はMIP-1β抗体は、該個体におけるMIP-1α及び／又はMIP-1βの量の検出可能な減少を引き起こすのに十分な量で投与される。
【００７２】
羊膜由来接着細胞は、T細胞増殖の抑制に加え、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病、喘息又はアレルギーの治療において有益であり得る、免疫系細胞に対する他の抗炎症作用を有する。例えば、羊膜由来接着細胞は、例えばインビトロ又はインビボ、個体へ投与される場合のように、Th1及び／又はTh17 T細胞サブセットにより媒介された免疫反応を低下する。別の態様において、T細胞(例えば、CD4+ Tリンパ球又は白血球)を羊膜由来接着細胞、すなわち本明細書記載の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて、例えばTh1反応又はTh17反応などの、前炎症反応を阻害する方法が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該接触は、Th1細胞成熟を検出可能に低下する。本方法の具体的実施態様において、該接触は、該T細胞によるか又は抗原提示(antigen-producing)細胞による、リンホトキシン-1α(LT-1α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)及び／又はインターフェロンガンマ(IFNγ)の1以上の生成を検出可能に減少する。本方法の別の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)表現型を強化又はアップレギュレートし、並びに／又はTh1及び／若しくはTh17反応を促進する生体分子(例えば、CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)の樹状細胞(DC)及び／若しくはマクロファージにおける発現を低下する。具体的実施態様において、該T細胞はまた、IL-10、例えば外因性IL-10、又は該T細胞により生成されないIL-10、例えば組換えIL-10と接触される。
【００７３】
別の実施態様において、マクロファージを、有効量の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、マクロファージからの前炎症サイトカインの生成を減少する方法が、本明細書に提供される。別の実施態様において、免疫系細胞を、有効量の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、寛容原性細胞の数を増加し、免疫細胞の寛容原性機能を促進し、及び／又は例えばマクロファージ由来の寛容原性サイトカインをアップレギュレートする方法が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該接触は、活性化されたマクロファージが、該羊膜由来接着細胞と接触せずに活性化されたマクロファージよりも、より多くのIL-10を検出可能に生成することを引き起こす。別の実施態様において、免疫系細胞を、有効量の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、抗炎症性T細胞の数をアップレギュレートするか、又は増加する方法が、本明細書に提供される。
【００７４】
一実施態様において、羊膜由来接着細胞の有効量を個体へ投与することを含む、免疫関連疾患又は病態、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病、喘息又はアレルギーの症状を有するか又は経験している個体において、Th1反応を阻害する方法が、本明細書に提供され、ここで該有効量は、該個体においてTh1反応の検出可能な減少を生じる量である。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の有効量を個体へ投与することを含む、免疫関連疾患又は病態の症状を有するか又は経験している個体において、Th17反応を阻害する方法が、本明細書に提供され、ここで該有効量は、該個体においてTh17反応の検出可能な減少を生じる量である。これらの方法の具体的実施態様において、該投与は、該個体内のT細胞又は抗原提示細胞により、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの1以上の生成を検出可能に減少する。本方法の別の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)表現型を増強若しくはアップレギュレートするか、又はTh1若しくはTh17反応を促進するマーカーの該個体の樹状細胞(DC)及び／若しくはマクロファージにおける生成を調節する。別の具体的実施態様において、本方法は加えて、IL-10を該個体へ投与することを含む。
【００７５】
別の態様において、1以上の抗炎症サイトカインを発現するように遺伝子操作された本明細書に記載の羊膜由来接着細胞が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該抗炎症サイトカインは、IL-10を含む。
【００７６】
(5.2  羊膜由来接着細胞を使用する治療方法)
本明細書記載の羊膜由来接着細胞の治療有効量(すなわち数)を個体に投与することを含む、不適切な又は望ましくない免疫反応により引き起こされた又はこれに関連した疾患又は障害、例えば、免疫抑制により治療することができる疾患、障害又は病態を有する個体を治療する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、治療有効量は、個体における免疫反応を検出可能に抑制するのに十分な量である。そのような免疫反応は、例えば、個体由来のT細胞を使用する、MLR又は退行アッセイにおけるT細胞の増殖であることができる。別の具体的実施態様において、治療有効量は、羊膜由来接着細胞の量であり、その投与は、疾患又は障害の1以上の症状の検出可能な改善、又は進行の縮小を生じる。
【００７７】
不適切な又は望ましくない免疫反応に関連した又はこれにより引き起こされた疾患又は障害を有する個体は、該疾患の進行時いずれかの時点で、複数の羊膜由来接着細胞、及び任意に1種以上の治療薬により治療することができる。特定の実施態様において、個体は、多発性硬化症；炎症性腸疾患、例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎；移植片対宿主病；関節リウマチ；糖尿病；乾癬；菌状息肉腫；又は、本明細書に列挙された他の免疫関連疾患若しくは障害を有するか、又は発症のリスクがある。例えば、個体は、診断の直後、又は診断の1、2、3、4、5、6日以内に、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50週間以内若しくはそれ以降、又は診断後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年若しくはそれ以降に、治療することができる。個体は、単回、又は疾患の臨床過程において複数回治療することができる。個体は、適宜、急性攻撃時、寛解時、又は慢性変性相に治療することができる。
【００７８】
そのような疾患、障害又は病態の治療において有用な羊膜由来接着細胞は、本明細書に明らかにされたAMDACのいずれかであることができる。具体的な非限定的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、CD49f、CD105及びCD200を発現するが、OCT-4を発現しない。様々な実施態様において、個体へ投与されるAMDACは、本明細書記載のタンパク質マーカー又は遺伝子マーカーの任意の組合せにより定義された、又は特徴付けられたAMDACを含むことができる。
【００７９】
一実施態様において、本方法は、羊膜由来接着細胞約3億個の少なくとも1回投与量を、個体へ投与することを含む。しかし特定の用量は、個体の生理的特徴、例えば体重に応じて変動することができ、且つ1回投与量につき100万個〜100億個のAMDACの範囲であることができ、好ましくは1回投与量につき1000万個〜10億個のAMDAC、又は1回投与量につき1億個〜5億個のAMDACの範囲である。投与は、静脈内が好ましいが、生存細胞の投与に関して医学的に許容し得る任意の経路、例えば非経口、皮下、筋肉内、腹腔内、眼球内、腰椎穿刺などであることができる。一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、細胞バンクに由来している。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の投与量は、ボーラス注射又はカテーテルによる投与に適した、血液バッグ又は類似バッグ内に含まれる。
【００８０】
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞により馴化されている培養培地を、個体において免疫反応を検出可能に抑制するのに十分な量で該個体に投与することを含む、不適切な又は望ましくない免疫反応により引き起こされた又はこれに関連した疾患又は障害、例えば免疫抑制により有益に治療され得る疾患又は障害を有する個体を治療する方法が、本明細書において提供される。そのような免疫反応は、例えば、個体由来のT細胞を使用し実行される、MLR、BTR又は退行アッセイにおけるT細胞の増殖であることができる。
【００８１】
羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培地は、単回投与量、又は反復投与量で投与することができる。例えばAMDACが反復投与量で投与される特定の実施態様において、該投与量は、例えば、不適切な又は望ましくない免疫反応により引き起こされた又はこれに関連した疾患又は障害の1以上の急性症状を緩和するように設計された治療レジメンの一部であることができる。例えばAMDACが反復投与量で投与される特定の別の実施態様において、投与量は、そのような疾患又は障害の慢性の経過を予防するか、又は重症度を軽減するように設計された長期治療レジメンの一部であることができる。
【００８２】
(5.2.1  多発性硬化症の治療)
別の態様において、個体に複数の羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培地を、個体における免疫反応を検出可能に調節する、例えば抑制するのに十分な量及び時間で、投与することを含む、多発性硬化症、又は多発性硬化症に関連した症状を有する個体を治療する方法が、本明細書において提供される
【００８３】
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系の慢性の、再発性炎症疾患である。本疾患は、CNS及びPNSの軸索の周りの髄鞘、乏突起膠細胞、及び神経細胞それら自身の損傷を生じる。該疾患は、増殖し、血液-脳関門を超え、且つ細胞接着分子及び前炎症サイトカインの影響下でCNSに進入する、自己反応性のT細胞、特にCD4+ T細胞により媒介される。MSの症状は、手足の知覚障害、視神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸管機能障害、性機能障害、運動失調、及び複視を含む。
【００８４】
MSの4つの異なる型又は臨床経過が、確定されている。第一に、再発寛解型MS(RRMS)は、数日から数週間の経過を辿り急性に症状発現し、それに数ヶ月間の、時には不完全な回復期が続く、神経学的機能障害の自己限定的攻撃により特徴付けられる。第二の型である二次進行型MS(SPMS)は、RRMSとして始まるが、臨床経過は、急性攻撃に関係しない機能の一様の悪化により特徴付けられるように変化する。第三の一次性進行型MS(PPMS)は、急性攻撃を伴わない、発症からの機能の一様な低下により特徴付けられる。第四の型の進行再発型MS(PRMS)もまた、進行性の経過で始まり、場合によっては機能の進行性の低下と重なった攻撃を伴う。
【００８５】
MSを有する患者は一般に、任意にMRIと組合せた、運動技能評価を用い評価される。例えば、1つの運動技能評価である、総合障害度評価尺度(EDSS)は、下記のように、罹患した個体の能力を段階的にスコア化する：
0.0  神経学的検査で正常。
1.0  身体障害なし、FS1の最小の徴候。
1.5  身体障害なし、FS1以上の最小の徴候。
2.0  FS1で最小の身体障害。
2.5  FS1で軽度の身体障害、又はFS2で最小の身体障害。
3.0  FS1で中等度の身体障害、又はFS3若しくは4で軽度身体障害。完全歩行。
3.5  完全歩行するが、FS1で中等度の身体障害及び幾つかの他の最小よりも大きい身体障害を伴う。
4.0  比較的重度の身体障害にも係わらず、介助なしで完全歩行し、自分のことは自分でできる、1日のうち12時間程は床から離れる；介助なし休まずに、500m程歩行可能。
4.5  介助なし完全歩行、1日の大半は床から離れ、終日働くことができ、他方完全な活動には若干の制限があるか、最小の補助が必要；比較的重度の身体障害が特徴；介助なし休まずに、300m程歩行可能。
5.0  介助なし休まずに、約200m歩行；終日の活動(特別な設備を伴わない終日の作業)を損なうのに十分な重度の身体障害。
5.5  介助なし休まずに、約100m歩行；終日の活動を妨げるのに十分な重度の身体障害。
6.0  休まずに、又は休みながらの約100mの歩行に、断続的又は片側の常の補助(杖、松葉杖、装具)が必要。
6.5  休まずに約20mの歩行に、常に両側の補助(杖、松葉杖、装具)が必要。
7.0  介助があったとしても約5mを超える歩行の困難、事実上車椅子に制限；標準の車椅子を自分で操縦及び独りでの乗降；1日のうち12時間程は車椅子で床から離れる。
7.5  2、3歩以上歩けず；車椅子に制限され；乗降に介助が必要なことがある；自分で車輪を動かすが、標準の車椅子では終日続けることはできない；電動車椅子が必要なことがある。
8.0  事実上ベッド又は椅子に制限されるか、又は車椅子で巡回するが、1日の大半はベッド外であることができる；多くのセルフケア機能を保持する；一般に腕を効果的に使用。
8.5  事実上1日のほとんどをベッドに制限される；若干腕を効果的に使用し、若干のセルフケア機能を保持する。
9.0  ベッドに拘束される；依然意思伝達及び飲食はできる。
9.5  全体として体の不自由な寝たきり患者；効果的に意思伝達し又は飲食／嚥下することができず。
10.0  MSによる死亡。
【００８６】
上記スコアリングシステムにおいて、「FS」とは、錐体路、小脳、脳幹、感覚、腸及び膀胱、視覚、大脳、及び他のシステムを含む、測定された8種の機能システムをいう。
【００８７】
スクリプス神経学的レーティングスケール、歩行可能指標、及び多発性硬化症機能的要素検査(MSFC)を含む、他の類似のスコアリングシステムが知られている。MSの進行はまた、発病率の決定により評価される。MSの進行はまた、MSに関連した神経病変(例えば、新規病変、増強している病変、又は独自の活発な病変の組合せ)を検出することができる磁気共鳴画像診断により評価することができる。
【００８８】
従って、一実施態様において、個体における免疫反応を検出可能に抑制するのに十分な複数の羊膜由来接着細胞を、個体へ投与することを含む、MSを有する個体、例えば、MSと診断された個体を治療する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、MSは、再発寛解型MSである。別の具体的実施態様において、MSは、二次進行型MSである。別の具体的実施態様において、MSは、一次性進行型MSである。別の具体的実施態様において、MSは、進行再発型MSである。別の具体的実施態様において、該投与は、個体におけるMSの1以上症状を検出可能に改善する。より具体的実施態様において、該症状は、例えば、手足の知覚障害、視神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸管機能障害、性機能障害、運動失調、及び複視の1以上である。別の具体的実施態様において、該投与は、少なくとも0.5ポイントのEDSSスケールの改善を生じる。別の具体的実施態様において、該投与は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11ヶ月の経過にわたり、少なくとも1つのMSスコア化システムに従い、機能の維持を生じる。別の具体的実施態様において、該投与は、少なくとも1ポイントのEDSSスケールの改善を生じる。別の具体的実施態様において、該投与は、少なくとも2ポイントのEDSSスケールの改善を生じる。他の具体的実施態様において、該投与は、多発性硬化症評価スケール又はMRIにおける検出可能な改善を生じる。個体は、急性攻撃時、寛解時、又は慢性変性相の間、適宜治療することができる。別の実施態様において、AMDACは、寛解状態を維持するか、又は妊娠時に経験した再発の発生を低下するために、分娩後、MSを有する女性に投与される。
【００８９】
同じく、個体における免疫反応を検出可能に抑制するのに十分な複数の羊膜由来接着細胞、及び加えて1以上の第二の治療薬を、個体へ投与することを含む、MSを有する個体、例えば、MSを有すると診断された個体を治療する方法が、本明細書において提供され、ここで該投与は、個体におけるMSの1以上症状を検出可能に改善する。一実施態様において、第二の治療薬は、リツキシマブ、アレムツズマブ(Alenituzumab)、クラドリビン、ダクリツマブ、ナタリズマブ、タイサブリ(Tysabri)、又はモノサイクリン(ミノサイクリン)の1以上である。他の実施態様において、第二の治療薬は、糖質コルチコイドである。具体的実施態様において、糖質コルチコイドは、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、メチルプレドニゾロン、又はデキサメタゾンである。別の実施態様において、第二の治療薬は、免疫調節薬又は免疫抑制薬である。様々な具体的実施態様において、免疫調節薬又は免疫抑制薬は、IFNβ-1a、IFN-1b、グリアトリアマーアセテート、シクロホスファミド、メトトレキセート、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン又はミトキサントロンである。他の実施態様において、該治療薬は、静脈内免疫グロブリン、血漿交換、又はスルファサラジンである。別の実施態様において、該個体には、AMDACに加え、前述の第二の治療薬の任意の組合せが投与される。
【００９０】
(5.2.2  炎症性腸疾患の治療)
別の態様において、羊膜由来接着細胞は、炎症性腸疾患(IBD)、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎を有するか、又は発症するリスクのある個体を治療するために使用される。従って、個体における免疫反応を検出可能に調節する、例えば抑制するのに十分な量及び時間で複数の羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培地を、個体へ投与することを含む、炎症性腸疾患、又は炎症性腸疾患に関連した症状を有する個体を治療する方法が、本明細書において提供される。
【００９１】
(クローン病)  一実施態様において、IBDは、時には、回腸炎又は腸炎と称される、クローン病である。クローン病は、消化管(同じく胃腸管、又はGI管とも称される)の炎症を引き起こす、慢性の障害である。クローン病は、口から肛門までの消化管の任意の部分を冒し得るが、最も一般的には回腸と称される小腸の最後の部分を冒す。5つの型のクローン病が知られている。胃十二指腸クローン病は、胃及び十二指腸(小腸の一番最初の部分)を冒す。空回腸炎は、小腸の最も長い部分である空腸のクローン病である。回腸炎は、小腸の最後の部分である、回腸のクローン病である。回結腸炎は、クローン病の最も一般的な形であり、回腸及び結腸を冒す。最後に、クローン結腸炎(肉芽腫性大腸炎)は、結腸を冒し、且つクローン結腸炎において、罹患した組織領域の間に健常な組織の領域が存在することが多い潰瘍性大腸炎から識別され、且つクローン結腸炎は、結腸にのみ関与し、直腸には無関係である。クローン病は、例えば食品、善玉菌などの、消化管内の抗原に対する、身体の免疫系の不適切な反応から生じ、腸の内層に白血球の蓄積をもたらすと考えられる。クローン病に関連した炎症はまた、サイトカイン腫瘍壊死因子(TNF-α)の活動が原因である。
【００９２】
(潰瘍性大腸炎)  別の実施態様において、IBDは、潰瘍性大腸炎である。潰瘍性大腸炎は、直腸及び／又は結腸の内層に炎症及びびらん(潰瘍)を引き起こす疾患である。潰瘍は、炎症が結腸の内側を通常覆う細胞を殺傷する場所に形成され；潰瘍は典型的には引き続き、出血し膿を生じる。炎症が直腸及び結腸の最後の部分に生じる場合、該疾患は潰瘍性直腸炎と称される。結腸全体が冒された場合、該疾患は汎大腸炎と称される。結腸の左側のみが冒された場合、該疾患は限局性又は遠位大腸炎と称される。潰瘍性大腸炎の症状としては、腹痛、出血性下痢、発熱、悪心、腹部痙攣、貧血、疲労、体重減少、食欲不振、直腸出血、体液及び栄養喪失、皮膚病変、関節痛、及び発育不全(小児において)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。潰瘍性大腸炎は、目の炎症、肝臓疾患及び骨粗鬆症などの合併症も引き起こし得る。
【００９３】
従って、一実施態様において、羊膜由来接着細胞の治療有効量を該個体へ投与することを含む、炎症性腸疾患を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、該炎症性腸疾患(IBD)の少なくとも1つの症状の検出可能な改善を生じる量である。具体的実施態様において、IBDはクローン病である。より具体的実施態様において、該クローン病は、胃十二指腸クローン病、空回腸炎、回腸炎、回結腸炎、又はクローン結腸炎である。別の具体的実施態様において、該クローン病は、瘻管を生じるクローン病である。別のより具体的実施態様において、該症状は、クローン病の症状である。より具体的実施態様において、該クローン病の症状は、消化管の一部の炎症及び膨潤、腹痛、腸管の頻繁な排泄、及び／又は下痢である。別のより具体的実施態様において、該クローン病の症状は、直腸出血、貧血、体重減少、関節炎、皮膚の問題、発熱、腸壁の肥厚、腸内の瘢痕組織の形成、腸内のびらん又は潰瘍の形成、腸壁内の1以上瘻孔の出現、肛門の1以上の亀裂の出現、栄養欠乏の出現(例えば、タンパク質、カロリー、ビタミンの1以上の欠乏)、腎臓結石の出現、胆石の出現、肝系又は胆管系の疾患である。
【００９４】
別のより具体的実施態様において、IBDは潰瘍性大腸炎である。より具体的実施態様において、該潰瘍性大腸炎は、潰瘍性直腸炎、汎大腸炎、限局性大腸炎又は遠位大腸炎である。別のより具体的実施態様において、該症状は、潰瘍性大腸炎の症状である。より具体的実施態様において、該症状は、腹痛、出血性下痢、発熱、悪心、腹部痙攣、貧血、疲労、体重減少、食欲不振、直腸出血、体液及び栄養喪失、皮膚病変、関節痛、及び発育不全である。別のより具体的実施態様において、該症状は、骨粗鬆症、目の炎症、又は肝臓疾患である。
【００９５】
いくつかの実施態様において、羊膜由来接着細胞は、治療的タンパク質の1以上を発現するように遺伝子操作されている。具体的実施態様において、該1以上の治療的タンパク質は、IL-10、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)及び／又は線維芽細胞増殖因子(FGF)である。
【００９６】
別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞が投与される該個体は加えて、1以上の第二の治療薬が投与され、ここで該第二の治療薬は、例えば抗炎症薬、ステロイド、免疫抑制薬、及び／又は抗生物質を含む。例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎の治療において有用な抗炎症薬の例としては、メサラミン、5-ASA(5-アミノサリチル酸)薬(例えば、ASACOL(登録商標)(遅延放出型メサラミン)、DIPENTUM(オサラジン)、PENTASA(登録商標)(制御放出型メサラミン))、スルファサラジン(5-ASAとスルファピリジンの組合せ)、抗炎症性抗体(例えば、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。クローン病又は潰瘍性大腸炎の治療において有用なステロイドの例としては、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレディゾン、メチルプレドニソンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。典型的には、当該技術分野において実践されるように、ステロイドの用量は、最初に比較的大きい投与量で送達し、その後炎症が治まるのでより少量で送達する。クローン病の治療において有用な免疫抑制薬の例としては、シクロスポリンA、6-メルカプトプリン又はアザチオプリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。クローン病の治療において使用することができる抗生物質の例としては、例えば、アンピシリン、スルホンアミド、セファロスポリン、テトラサイクリン、及び／又はメトロニダゾールが挙げられる。別の具体的実施態様において、第二の療法は、ブタ鞭虫、例えばトリクリス・スイス(Trichuris suis)の卵の投与である。他の具体的実施態様において、第二の療法は、TNFα阻害剤(例えば、インフリジマブ（Inflizimab）、アダリムルマブ（Adalimurmab）、セルトリズマブ)、IL-6阻害剤(例えば、アチリズマブ（Atilizumab）)、インテグリンα4に結合する抗体(例えば、ナタリズマブ)、インターフェロンγ阻害剤(例えば、フノリズマブ（Fonolizumab）)、CD4+ T細胞及びTh2 T-ヘルパーサブセットに結合する抗体(例えば、ビシリズマブ)、アリカホルセン(ICAM-1のアンチセンス阻害剤)、抗-IL-12Ab抗体、インテグリンα4β7に結合する抗体(例えば、MLN02、研究室で作製した抗体)、及び／又は組換えGM-CSF(例えば、サルグラモスチム、LEUKINE(登録商標))の1以上である。
【００９７】
特定の実施態様において、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎を有する個体は、IBDの治療に関する他の任意の療法に対し難治性ではない。別の実施態様において、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎を有する個体は、IBDの治療に関する少なくとも1つの療法に対し難治性ではない。具体的実施態様において、IBD、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎の治療に関する少なくとも1つの他の療法に難治性の個体は、ステロイド療法、例えばコルチコステロイド療法に対し難治性である。
【００９８】
特定の実施態様において、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎は、免疫細胞、例えば活性化されたT細胞、リンパ球及び／又はマクロファージの数の検出可能な増加に関連するか、又はこれにより一部引き起こされる。具体的実施態様において、活性化されたリンパ球は、Th17及び／又はTh1 T細胞である。特定の他の実施態様において、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎は、IL-2、IL-12、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの血清中濃度の検出可能な増加に関連するか、又はこれにより一部引き起こされる。従って、(1)該個体における活性化されたT細胞、リンパ球及び／又はマクロファージの数を決定する工程；並びに、(2)該個体に本明細書に記載のように、羊膜由来接着細胞の治療有効量(すなわち、多くの細胞)を投与し、ここで該治療有効量は、該投与前と比較して、該個体における活性化されたT細胞、リンパ球及び／又はマクロファージの数を検出可能に減少する量である工程：を含む、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。別の実施態様において、(1)該個体由来の組織、例えば血液又は血清中のIL-2、IL-12、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの濃度を決定する工程；並びに、(2)該個体に、本明細書に記載のように、羊膜由来接着細胞の治療有効量(すなわち、多くの細胞)を投与し、ここで該治療有効量は、該投与前と比較して、該個体由来の該組織中のIL-2、IL-12、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの濃度を検出可能に減少する量である工程：を含む、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。別の実施態様において、(1)T細胞、リンパ球、抗原提示(producing)細胞、及び／又はマクロファージにより生成されるIL-2、IL-12、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの量を決定する工程；並びに、(2)該個体に本明細書に記載のように、羊膜由来接着細胞の有効量を投与し、ここで該有効量は、該投与前と比較して、該個体においてT細胞、リンパ球、抗原提示細胞、及び／又はマクロファージにより生成されるIL-2、IL-12、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの量を検出可能に減少する量である工程：を含む、炎症性腸疾患、例えばクローン病を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。別の実施態様において、(1)該個体由来の試料中のTh1及び／又はTh17 T細胞の数を決定する工程；並びに、(2)該個体に本明細書に記載のように、羊膜由来接着細胞の有効量を投与し、ここで該有効量は、該投与前の数と比較して、Th1及び／又はTh17細胞の数を検出可能に減少する量である工程：を含む、炎症性腸疾患、例えばクローン病を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。
【００９９】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である特定の他の実施態様において、該疾患は、活性化されたリンパ球及び好中球により主に特徴付けられ、且つ活性化されたT細胞サブセットは、Th17(IL-23)並びにTh2(IL-4、IL-5及びIL-13)である。従って、(1)該個体由来の組織、例えば血清中のIL-4、IL-5、IL-13及び／又はIL-23の濃度を決定する工程；並びに、(2)該個体に本明細書に記載のように、羊膜由来接着細胞の治療有効量を投与し、ここで該治療有効量は、該投与前と比較して、該個体由来の該組織中のIL-23の濃度を検出可能に減少する量である工程：を含む、潰瘍性大腸炎を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。
【０１００】
IBD、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎の治療のためのAMDACの投与は、本明細書に記載の医学的に許容し得る任意の経路によることができる。IBDが瘻管を生じるクローン病である特定の実施態様において、AMDACは、例えば、1つ以上の瘻孔へ直接又はその隣接部に局所的に投与してよい。
【０１０１】
(5.2.3  移植片対宿主拒絶反応の治療)
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞(すなわち、多くの細胞)、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量を個体へ投与することを含む、移植片対宿主病(GVHD)の症状を有するか、又は経験しているか、又は発症するリスクのある、個体、例えば移植レシピエント又は移植を受ける個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、GVHDの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又はGVHDの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量である。
【０１０２】
GVHDは典型的には、完全な-又は部分的-同種組織移植の後、又はその結果として、特に同種造血幹細胞移植後に、発症し、且つ典型的には移植の5〜100日以内に発症する、皮膚炎、腸炎及び肝炎の1以上を含む。GVHDは、急性又は慢性であることができる。急性GVHDは、典型的には移植後5〜47日目の、掻痒性又は有痛の発疹の出現により特徴付けられてよい。超急性GVHDはまた、発熱、全身の紅皮症、及び落屑を随伴することがある。ビリルビン、アラニンアミノ基転移酵素(ALT)、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AST)、及びアルカリホスファターゼ(AP)の上昇(例えば正常値よりも高い)レベルにより証拠づけられるよう、肝臓もまた関与し始める。急性GVHDはまた、結腸が関与し、結果的に下痢、内出血、痙攣、腹痛、及びイレウスを生じる。慢性GVHDは、急性GVHDを経験した移植患者、又はそれまで無症候であった移植患者において起こり得る。慢性GVHDの症状発現は、眼の灼熱感、眼刺激、羞明、及び涙液分泌の減少に起因した眼痛；口腔乾燥、辛い又は酸っぱい食品への過敏、腹痛、嚥下障害(飲み込み困難)、嚥下痛(飲み込み時の疼痛)、体重減少、閉塞性肺疾患、筋力低下、神経因性疼痛、及び／又は筋痙攣を含む。
従って、本方法の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の治療有効量は、急性GVHDの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又は急性GVHDの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量である。より具体的実施態様において、該1以上の症状は、皮膚炎、掻痒性皮膚、発疹、腸炎、肝炎、発熱、紅皮症、落屑、上昇したレベルのALT、上昇したレベルのAST、上昇したレベルのAP；上昇したレベルのビリルビン；腹痛、痙攣、内出血、又はイレウスである。本方法の別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の治療有効量は、慢性GVHDの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又は慢性GVHDの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量であり、ここで該1以上の症状は、眼の灼熱感、眼刺激、涙液生成の減少、羞明、涙液生成の減少に起因した眼痛、口腔乾燥、辛い又は酸っぱい食品への過敏、腹痛、嚥下障害(飲み込み困難)、嚥下痛(飲み込み時の疼痛)、体重減少、閉塞性肺疾患(喘鳴を伴う呼吸困難及び／又は慢性の咳を含む)、筋力低下、神経因性疼痛、及び／又は筋痙攣を含む。本方法の他の具体的実施態様において、急性GVHD及び／又は慢性GVHDの症状は、高ビリルビン血症、黄疸、門脈圧亢進症、肝硬変、出血性結膜炎、偽膜形成、兎眼、慢性角結膜炎、乾燥症、点状角膜症、口腔粘膜の萎縮、紅斑、口腔内又は口唇粘膜の苔癬様病変の出現、閉塞性細気管支炎、膣炎、膣狭窄、自己免疫性血小板減少症、及び／又は貧血である。
本方法は、ドナー又はレシピエントの性質により限定されない。移植は、種系列を超えることができる。好ましい実施態様において、ドナー及びレシピエントは、同種であり、例えば両方共ヒトである。移植レシピエントは、ドナーと完全に-又は部分的に-同種であることができる。移植は、自家であることができる。移植レシピエント又はドナーは、5歳未満、1〜10歳、5〜15歳、10〜20歳、15〜25歳、20〜30歳、25〜35歳、30〜40歳、35〜45歳、40〜50歳、45〜55歳、50〜60歳、55〜65歳、60〜70歳、又は70歳以上であることができる。
GVHDは一般に、症状の重症度により等級化される。例えば一実施態様において、表1及び2に示したように、GVHDの症状は段階化され、並びにGVHDは、皮膚、肝臓、及び／又は小腸の症状に従い、0(無GVHD)からIV(命を脅かすGVHD)まで等級化される。
【表１】
2014501249.tif 000005
【表２】
2014501249.tif 000006
【０１０３】
従って、本方法の別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の治療有効量は、該移植片対宿主病が、少なくとも1段階等級が低下するように、例えば個体において、例として移植を受けた個体(移植レシピエント)において、移植片対宿主病の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。具体的実施態様において、該移植片対宿主病は、等級IVから等級IIIへ；等級IVから等級IIへ；等級IVから等級Iへ；等級IVから等級0へ；等級IIIから等級IIへ；等級IIIから等級Iへ；等級IIIから等級0へ；等級IIから等級Iへ；等級IIから等級0へ；又は、等級Iから等級0へ低下する。本方法の別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の治療有効量は、該個体における移植片対宿主病が、移植後10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100日以内に、等級0、等級I、等級II又は等級IIを過ぎて発達しない量である。
【０１０４】
様々な具体的実施態様において、GVHDを有すか又は発症のリスクのある個体は、同種の造血細胞移植を受け取る個体(例えば、GVHD予防を受けなかった個体；高齢の個体；HLA-不一致造血幹細胞のレシピエント；同種感作された(allosensitized)ドナー由来の移植片のレシピエント；無関係のドナー由来の移植片のレシピエント)；固形臓器移植、特にリンパ系組織を含む臓器の移植、例えば小腸移植を受け取る個体；並びに、非照射血液製品を受け取る個体(例えば、新生児及び胎児、先天性免疫不全症候群を有する個体、免疫抑制化学療法を受け取る個体、部分的にHLA-同一、HLA-相同のドナーから指定された輸血を受ける個体)、複合組織同種移植片(すなわち、2種以上の組織型を有する同種移植片)を受け取る個体；などである。GVHDはまた、自家又は同系造血細胞移植後にも起こり得る。別の具体的実施態様において、個体は、移植を補助するものとして致死量以下又は致死量の放射線を受け取っている(例えば、照射されている)。
【０１０５】
具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、例えば、移植片対宿主病を引き起こすか又は開始する組織の移植の14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1日前以内で、個体へ投与される。別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、移植と同時に投与される。別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、移植の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14日以内に投与される。羊膜由来接着細胞の投与は、複数回、例えば移植の前、同時、若しくは後に複数回、又はそれらの任意の組合せで行うことができる。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、等級II又はそれよりも悪い移植片対宿主病が個体(移植レシピエント)において症状発現された場合、移植後任意の時点で投与される。
【０１０６】
本方法の別の実施態様において、個体、例えば、移植レシピエント又は移植を受ける個体は、羊膜由来接着細胞に加えて、1種以上の第二の治療薬が投与される。具体的実施態様において、該治療薬は、無胸腺細胞(athymocyte)グロブリン、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、キャンパス-1H、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレディゾン、又はメチルプレドニソンである。別の具体的実施態様において、該治療薬は、免疫抑制薬又は免疫調節薬である。GVHDに適用可能な免疫抑制薬及び免疫調節薬は、当該技術分野において公知であり、且つメトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、マクロライド系抗生物質(例えば、FK506(タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン(シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロノニトリルアミド(例えば、レフルノミド)、T細胞受容体モジュレーター、及びサイトカイン受容体モジュレーター、ペプチド模倣薬、及び抗体(例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Fvs、ScFvs、Fab又はF(ab)2断片又はエピトープ結合断片)、核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子及び三本鎖ヘリックス)、小型分子、有機化合物、及び無機化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に、免疫調節薬としては、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、シトキサン、イムラン、シクロスポリンA、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質(例えば、FK506(タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン(シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロノニトリルアミド(例えば、レフルノミド)、T細胞受容体モジュレーター、及びサイトカイン受容体モジュレーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。T細胞受容体モジュレーターの例は、抗-T細胞受容体抗体(例えば、抗-CD4抗体(例えば、cM-T412(Boeringer社)、IDEC-CE9.Is(IDEC社とSKB社)、mAB 4162W94、オルトクローン(登録商標)及びOKTcdr4a(Janssen-Cilag社))、抗-CD3抗体(例えば、NUVION(登録商標)(Product Design Labs社)、OKT3(Johnson & Johnson社)、又はリツキサン(IDEC社))、抗-CD5抗体(例えば、抗-CD5リシン-結合型免疫複合体)、抗-CD7抗体(例えば、CHH-380(Novartis社))、抗-CD8抗体、抗-CD40リガンドモノクローナル抗体(例えば、IDEC-131(IDEC社))、抗-CD52抗体(例えば、CAMPATH(登録商標)1H(Ilex社))、抗-CD2抗体、抗-CD1a抗体(例えば、Xanelim(Genentech社))、及び抗-B7抗体(例えば、IDEC-114)(IDEC社)))、CTLA4-免疫グロブリン、サリドマイド、又は上記5.6.6節の化合物の1つを含むが、これらに限定されるものではない。具体的実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2アンタゴニストである。他の実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2アンタゴニストではない。別の具体的実施態様において、該物質は、抗体MEDI-501(T10B9)である。別の具体的実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2結合分子、好ましくはMEDI-507である。他の実施態様において、T細胞受容体モジュレーターは、CD2結合分子ではない。GVHD又はGVHDの症状の治療に適した前記治療薬の任意の組合せを、投与することができる。そのような治療薬は、羊膜由来接着細胞と任意の組合せで、治療と同時に、又は治療と別のコースで、投与することができる。
【０１０７】
(5.2.4  関節リウマチの治療)
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞(すなわち、多くの細胞)、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量を個体へ投与することを含む、関節リウマチ(RA)を有するか、又はその症状を経験しているか、又はそれを発症するリスクのある個体を、治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、RAの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又はRAの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量である。関節リウマチは、身体の免疫系が、関節を、典型的には身体の他の組織を攻撃する、慢性の、炎症性の自己免疫病態である。
【０１０８】
具体的実施態様において、該投与は、RAの個体において、少なくとも1つの関節で、RAの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分であるか、又はRAの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分である。別の具体的実施態様において、該投与は、RAの個体において、少なくとも1つの非関節組織で、RAの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分であるか、又はRAの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分である。RAにより冒され得る非関節組織の例は、皮膚(真皮)、肺、自己免疫系又は血液、腎性組織、心臓血管系組織、眼球組織、又は神経組織を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
具体的実施態様において、RAの症状は、非限定的に、朝のこわばり(例えば、持続期間1時間以上)、1以上の関節又は関節群の軟組織膨潤、関節痛、皮下小結節、95パーセンタイル値を超えて存在するリウマチ因子、又は関節侵食を示唆する放射線学的変化である。
【０１１０】
具体的実施態様において、該投与は、RAに付属する1以上の病態の検出可能な改善を引き起こすのに十分であるか、又はRAに付属する1以上の病態の発症を検出可能に軽減するのに十分である。そのような病態の例としては、壊疽性膿皮症、好中球性皮膚症、スイート症候群、ウイルス感染、結節性紅斑、小葉性脂肪組織炎、指の皮膚の萎縮、手掌紅斑、広汎性菲薄化(ライスペーパー皮膚)、皮膚脆弱性、例えば肘上の外面上の皮下小結節、肺線維症(例えば、メトトレキセート療法の結果として)、キャプラン小結節、脈管炎疾患、爪郭梗塞、ニューロパシー、腎症、アミロイド症、筋偽肥大、心内膜炎、左心室不全、脈管炎、強膜軟化症、多発単神経炎、環軸亜脱臼などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本方法の別の実施態様において、RAを有する個体は、羊膜由来接着細胞及び加えて少なくとも1種の他の治療薬が投与される。具体的実施態様において、該治療薬は、例えば、鎮痛薬又は抗炎症薬である。別の具体的実施態様において、該治療薬は、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)である。より具体的実施態様において、DMARDは、生体異物(xenobiotic)(例えば、アザチオプリン、シクロスポリンA、D-ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキセート、ミノサイクリン若しくはスルファサラジン)、又は生物学的製剤(例えば、腫瘍壊死因子α(TNF-α)遮断薬、例えばエタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))など、又は上記5.6.8節に明らかにされた化合物の1つ；インターロイキン-1遮断薬；抗-B細胞(CD20)抗体(例えば、リツキシマブ又はRITUXAN(登録商標))；或いは、T細胞活性化遮断薬(例えば、アバタセプト又はORENCIA(登録商標))の1以上である。別のより具体的実施態様において、鎮痛薬又は抗炎症薬は、糖質コルチコイド、非ステロイド系抗炎症薬、アセトアミノフェン、イブプロフェン、アスピリン、アヘン製剤、又はリドカイン(局所用)である。GVHD又はGVHDの症状の治療に適した上記治療薬の任意の組合せを、投与することができる。そのような治療薬は、同時に又は個別の治療コースとして、羊膜由来接着細胞との任意の組合せで投与することができる。
【０１１２】
具体的実施態様において、RAを有する個体に投与される複数の羊膜由来接着細胞は、RAに関するポリペプチド治療薬を発現するように遺伝子操作されている。より具体的実施態様において、RAのポリペプチド治療薬は、IL-1Ra(インターロイキン-1受容体アンタゴニスト)である。別のより具体的実施態様において、RAのポリペプチド治療薬は、IL-1Ra及びDHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)を含む、融合タンパク質である。より具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、IL-1Ra-DHFR融合タンパク質をコードしている核酸により形質転換され、ここで融合タンパク質の発現は、葉酸代謝拮抗薬、例えばメトトレキセートにより増強される。別の具体的実施態様において、複数の第二の型の幹細胞が、RAを有する個体へ加えて投与され、ここで該第二の型の幹細胞、又は少なくとも複数の第二の型の幹細胞は、RAのポリペプチド治療薬、例えば先に明らかにされた任意のポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている。更により具体的実施態様において、核酸は、IL-1Ra-DHFR-IRES-Lucをコードし、ここでIRESは、配列内リボソーム進入部位であり、且つLucはルシフェラーゼである。別の具体的実施態様において、該核酸は、IL-1Ra又はIL-1Ra-DHFR融合ポリペプチドの発現の制御を可能にするヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
RAを治療するために使用される、遺伝子操作された羊膜由来接着細胞、又は別の種類の幹細胞は、遺伝子改変されていないような幹細胞と任意の組合せで、RAを有する個体に投与することができる。
【０１１４】
(5.2.5  強皮症の治療)
別の実施態様において、治療有効量の羊膜由来接着細胞(すなわち、多数の細胞)、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地を、個体へ投与することを含む、強皮症を有する、又はその症状を経験している、又はそれを発症するリスクのある個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、強皮症の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又は強皮症の1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量である。
【０１１５】
強皮症は、皮膚又は他の臓器におけるコラーゲンの過剰な沈着を特徴とする慢性疾患である。強皮症は、局所性又は全身性であることができる。本疾患の局所性形態は、身体障害を起こすが、致命的な傾向はない。びまん型強皮症又は全身性硬化症として症状発現する、本疾患の全身性形態は、心臓、腎臓、肺又は腸の損傷の結果として致命的であり得る。強皮症の3つの型は、全身性であるびまん型強皮症及び限局型強皮症(CREST症候群)、並びに、皮膚に限定される、斑状強皮症/線状強皮症である。びまん型強皮症は、最も重篤な形態であり、患者は、急激な発症、広汎な皮膚硬化、並びに著しい内臓障害、特に肺及び胃腸管への障害を経験する。
【０１１６】
強皮症の限局型は、はるかに穏やかであり、比較的ゆるやかな発症及び進行を示す。皮膚硬化は通常、手及び顔に限定されており、内臓の関与はびまん型よりも重症度が低い。典型的には、レイノー現象が、強皮症に数年先行することがある。レイノー現象は、寒冷中に露出された末梢、特に指趾の小動脈の血管収縮に起因し、且つ古典的には最初に白色、次に青色、最後に再度温まるにつれて赤色の三相性の色の変化を特徴とする。限局型は、CREST症候群と称されることが多く、ここで「CREST」とは、石灰沈着症(軟組織、例えば皮膚のカルシウム沈着)、レイノー症候群、食道運動障害、手指硬化症(指の強皮症)、及び毛細血管拡張症(くも状静脈)の5つの主な特徴の頭文字である。
【０１１７】
強皮症の発症は、自己抗体、特に抗-セントロメア抗体及び抗-scl70/抗-トポイソメラーゼ抗体の存在と相関している。罹患した個体の最大90％は、検出可能な抗-核抗体を有する。抗-セントロメア抗体は、全身型(10％)よりも限局型(80〜90％)でより一般的であり、且つ抗-scl70は、びまん型(30〜40％)において、及びアフリカ系アメリカ人患者においてより一般的である。
【０１１８】
従って、本明細書に提供される治療方法において、羊膜由来接着細胞の投与は、強皮症の1以上の症状の出現を阻害するか、その重症度を軽減するか、又はその進行を縮小する。一実施態様において、強皮症は、限局型強皮症である。別の実施態様において、強皮症は、びまん型強皮症である。別の実施態様において、強皮症は、斑状強皮症である。別の具体的実施態様において、その症状は、顔面皮膚の硬化、指の皮膚の硬化、レイノー症候群、四肢の不適切な血管収縮、石灰沈着症、毛細血管拡張症、又は食道運動障害の1以上である。別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の投与は、抗-核抗体、例えば抗-セントロメア抗体又は抗-トポイソメラーゼ抗体の1以上の、個体由来の血液1mL中の量又は濃度を検出可能に減少する。
【０１１９】
別の実施態様において、本明細書に提供される治療方法は、第二の治療薬の投与を含み、ここで該第二の治療薬は、抗炎症薬、例えばステロイド系抗炎症薬、又は非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、アセチルサリチル酸などである。NSAIDが投与されるより具体的実施態様において、プロトンポンプ阻害薬(PPI)、例えばオメプラゾールも投与してよい。別の実施態様において、第二の治療薬は、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド又はメトトレキセートなどの、免疫抑制化合物である。別の実施態様において、罹患した個体が、指の潰瘍及び肺高血圧症を有する場合、プロスタサイクリン(イロプロスト)などの血管拡張薬を投与してよい。
【０１２０】
別の実施態様において、第二の治療薬は、第二の型の細胞である。いくつかの実施態様において、該第二の型の細胞は、例えば、約105個細胞/kg〜約109個細胞/kgの1つ以上の投与量の、造血幹細胞、例えばCD34+造血幹細胞である。別の具体的実施態様において、該第二の型の幹細胞は、間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞である。別の具体的実施態様において、第二の型の幹細胞は、脂肪由来幹細胞である。第二の型の幹細胞、例えば造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞などは、羊膜由来接着細胞と共に、例えば約 100：1、75：1、50：1、25：1、20：1、15：1、10：1、5：1、1：1、1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：50、1：75若しくは1：100の比で投与することができる。骨髄由来間葉系幹細胞又は脂肪由来幹細胞などの幹細胞は、商業的に入手するか、又は例えば、骨髄、骨髄穿刺液、脂肪組織などの独自の給源から入手することができる。
【０１２１】
強皮症又は強皮症の症状の治療に適した上記治療薬の任意の組合せを、投与することができる。そのような治療薬は、同時に又は個別の治療経過として、羊膜由来接着細胞との任意の組合せで投与することができる。
【０１２２】
本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、医薬組成物、例えば、例として静脈内、筋肉内若しくは腹腔内注射に適した医薬組成物の形態で、強皮症を罹患した個体に投与することができる。
【０１２３】
(5.2.6  乾癬の治療)
別の実施態様において、治療有効量の羊膜由来接着細胞(すなわち、多数の細胞)、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地を、個体へ投与することを含む、乾癬を有する、又はその症状を経験している、又はそれを発症するリスクのある個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、乾癬の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、乾癬の1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又は乾癬の進行を縮小するのに十分な量である。
【０１２４】
乾癬は、皮膚及び関節を冒す疾患であり、これは通常、プラーク乾癬と称される鱗片状紅斑の皮膚上の出現を引き起こす。乾癬性紅斑は、炎症及び過度の皮膚形成の領域である。皮膚は、これらの部位で急速に蓄積し、銀白色の外観を呈する。プラークは、肘及び膝の皮膚上に生じることが多いが、頭皮及び生殖器を含む任意の領域を罹患し得る。乾癬は、免疫媒介性であるという仮説がある。
【０１２５】
いくつかの異なる型の乾癬が特定されている。プラーク乾癬(尋常性乾癬)は、最も一般的な乾癬の形であり、典型的にはプラークと称される、銀白色の鱗片状の皮膚により覆われた炎症を起こした皮膚の隆起領域が出現する。間擦疹型乾癬(逆型乾癬)は、例えば、生殖器の周り(大腿部と鼠径部の間)、腋窩、肥満胃の下、及び乳房下など皮膚のひだに生じる、皮膚の滑らかな炎症斑として出現する。滴状乾癬は、胴、手足、及び頭皮など、身体の広い部分に現れる、多数の小さい卵円形(涙型)の斑点として症状発現する。滴状乾癬は、連鎖球菌性咽喉感染症に付随する。膿疱性乾癬は、非感染性膿(膿疱)で満たされた隆起(raised bump)として現れる。膿疱性乾癬は、通常手足に限定されるか(掌蹠膿疱症)、又は身体の任意の部位に無作為に起こる広汎な斑点を伴う全身性である。爪乾癬は、爪板下の変色、爪甲陥凹、爪の横筋、爪の下の皮膚の肥厚、爪の緩み(爪甲離床症)及び剥脱を含む、手足の指の爪に現れる様々な変化を生じる。乾癬性関節炎は、例えば手指及び足指の関節における、関節及び結合組織の炎症が関与しており、これは指炎として知られる手指及び足指のソーセージ型膨潤を生じ得る。乾癬性関節炎はまた、股関節部、膝及び脊椎(脊椎炎)を冒し得る。紅皮症性乾癬は、体表のほとんどに及ぶ広汎な炎症及び皮膚の落屑として症状発現する。これは、重度の掻痒、膨潤及び疼痛を随伴することがある。これは多くは、特に全身治療の突然の離脱後の、不安定なプラーク乾癬の増悪の結果である。この乾癬型は、極度の炎症及び落屑は、体温を調節し且つ皮膚の障壁機能を発揮する身体能力を破壊するので、致命的であり得る。
【０１２６】
従って一実施態様において、本発明は、個体に対する治療有効量の羊膜由来接着細胞を個体へ投与することを含む上記乾癬型の1つである、乾癬を有する個体の治療方法を提供し、ここで該治療有効量は、上記乾癬の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な、その重症度を軽減するのに十分な、又はその進行を縮小するのに十分な、羊膜由来接着細胞の量(すなわち、多数の細胞)である。
【０１２７】
乾癬の重症度は、例えば、乾癬の面積及び重症度指標(PASI)により評価することができる。PASIは、病変の重症度の評価と罹患した面積とを、0(疾患なし)から72(最高疾患)までの範囲の1つのスコアに組合せている。
【０１２８】
PASIを算出するために、身体を4つの区画に分ける：足、体(胴体領域(胃、胸、背中など)；腕；及び、手。これらの領域は各々、患者自身によりスコア化され、次に4つのスコアを一緒にし、最終PASIとする。各区画に関して、乾癬に罹患した皮膚面積の割合を概算し、その後下記のように等級0〜6に変換する。
【表３】
2014501249.tif 000007
【０１２９】
この重症度は、掻痒、紅斑(発赤)、落屑及び肥厚の4つの異なるパラメータにより概算され、0〜4に等級化される。次に4つの重症度パラメータ全ての合計を、各皮膚区画に関して計算し、その面積に関する面積スコアを積算し、且つ各区画の重量を積算する(頭部0.1、腕0.2、胴体0.3、及び足0.4)。例：（Ibody＋Ebody＋Sbody＋Tbody）×Abody×0.3＝Totalbody。最後に、総PASIを、4つの皮膚区画全てのPASIの合計として計算する。
【０１３０】
重症度の程度はまた、乾癬に罹患した個体を写真撮影し、乾癬病変に覆われた体面積の割合をコンピュータにより計算することにより評価することもできる。
【０１３１】
従って、本明細書に提供される治療方法の具体的実施態様において、乾癬は、プラーク乾癬(尋常性乾癬)、間擦疹型乾癬(逆位乾癬)、滴状乾癬、膿疱性乾癬、爪乾癬、乾癬性関節炎、又は紅皮症性乾癬である。本方法の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量は、乾癬の1以上の症状の改善を引き起こすか、その発症を遅延するか、又はその進行を遅らせるのに十分な量であり、ここで該1以上の症状は、皮膚の落屑、皮膚の発赤、皮膚の肥厚、プラーク形成、爪板下の変色、爪甲陥凹、爪の横筋、爪の下の皮膚の肥厚、爪甲離床症、膿疱出現、関節又は結合組織の炎症、皮膚の炎症、又は皮膚の剥離である。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量は、乾癬の面積及び重症度指標の5、10、15、20、25、30、35、40ポイント又はそれ以上の低下を引き起こすのに十分な量である。
【０１３２】
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量は、第二療法と一緒に投与される。該第二療法は、コルチコステロイド(例えば、デスオキシメタシン)、ビタミンD3アナログ(例えば、カルシポトリオール)、アントラリン、アルガン油、レチノイド、又はコールタールの1以上を含有する、局所的、例えばクリーム又は軟膏である。別の具体的実施態様において、該第二療法は、例えば、紫外線への、例として波長約280nm〜約315nmの、特に約311nm〜約312nmのUVBへの約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18又は20分間の1回以上の曝露を含む。別の具体的実施態様において、該第二療法は、UVA光への曝露と組合せた、ソラレンの局所性投与を含む。別の具体的実施態様において、該第二療法は、例えば、メトトレキセート、シクロスポリン、レチノイド、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、スルファサラジン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、経口タクロリムス及び／又はフマル酸エステルの1以上の全身性投与を含む。 
【０１３３】
(5.2.7  紅斑性狼瘡の治療)
別の実施態様において、治療有効量の羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地を、個体へ投与することを含む、紅斑性狼瘡(LE)を有する、又はその症状を経験している、又はそれを発症するリスクのある個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、LEの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又はLEの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又はLEの進行を縮小するのに十分な量である。
【０１３４】
LEの症状は多く、且つ本疾患は、異なる個体において異なるように進行することがある。症状は、皮膚科的症状発現(例えば、頬部発疹(蝶型発疹とも称される)、円板状狼瘡(皮膚上の厚い、赤色鱗片状斑)、脱毛症、口、鼻、及び膣の潰瘍、並びに／又は皮膚上の病変)；骨格筋の症状発現(例えば、関節痛)；血液学的症状発現(例えば、貧血及び鉄欠乏症、正常値よりも低い血小板数及び白血球数、抗リン脂質抗体症候群(リン脂質に対する自己抗体が患者の血清中に存在する血栓疾患)、及び／又は血液中の抗カルジオリピン抗体の存在)；心臓の症状発現(例えば、心膜炎、心筋炎、及び／又は心内膜炎)；肺の症状発現(例えば、肺及び／若しくは胸膜の炎症、胸膜炎、胸膜滲出、ループス肺炎、慢性広汎性間質性肺炎、肺高血圧症、肺塞栓、並びに／又は肺出血)；肝臓の症状発現(例えば、自己免疫性肝炎；黄疸；血流中の抗核抗体(ANA)、平滑筋抗体(SMA)、肝／腎ミクロソーム抗体(LKM-1)、及び／又は抗-ミトコンドリア抗体(AMA)の存在)；腎臓の症状発現(例えば、無痛の血尿症又はタンパク尿、ループス腎炎、腎不全、及び／又は「ワイヤーループ」異常を伴う膜性糸球体腎炎の出現)；神経学的症状発現(例えば、発作、精神病、脳脊髄液の異常)；T細胞異常(例えば、CD45ホスファターゼ欠乏及び／又はCD40リガンド発現の増加)；並びに／又は、非特異的症状発現(例えば、ループス腹膜炎、ループス膵炎、ループス膀胱炎、自己免疫性内耳疾患、副交感神経機能不全、レチナール血管炎、全身性血管炎、FcεRIγ発現の増加、T細胞中のカルシウムレベルの増加及び維持、血中イノシトール三リン酸の増加、プロテインキナーゼCリン酸化の減少、Ras-MAP キナーゼシグナル伝達の減少、及び／又はプロテインキナーゼAI活性欠損症を含むことができる。
【０１３５】
従って、具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量は、LEの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、LEの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又はLEの1以上の症状の増悪を軽減するのに十分な量であり、ここで該1以上の症状は、LEの皮膚科的、血液学的、骨格筋の、神経学的、腎臓の、肝臓の、又はT細胞の症状発現の1以上を含む。別の具体的実施態様において、該治療有効量は、LEの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、LEの1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又はLEの1以上の症状の増悪を軽減するのに十分な量であり、ここで該1以上の症状は、頬部発疹、蝶型発疹、円板状狼瘡、脱毛症、口、鼻、及び膣の潰瘍、皮膚上の病変、関節痛、貧血及び／若しくは鉄欠乏症、正常値よりも低い血小板数及び白血球数、抗リン脂質抗体症候群、血液中の抗カルジオリピン抗体の存在、心膜炎、心筋炎、心内膜炎、肺及び／若しくは胸膜の炎症、胸膜炎、胸膜滲出、ループス肺炎、慢性広汎性間質性肺炎、肺高血圧症、肺塞栓、肺出血、自己免疫性肝炎；黄疸；血流中の抗核抗体(ANA)、平滑筋抗体(SMA)、肝／腎ミクロソーム抗体(LKM-1)、及び／又は抗-ミトコンドリア抗体(AMA)の存在、無痛の血尿症又はタンパク尿、ループス腎炎、腎不全、及び／又は「ワイヤーループ」異常を伴う膜性糸球体腎炎の出現)；神経学的症状発現(例えば、発作、精神病、脳脊髄液の異常)；T細胞異常(例えば、CD45ホスファターゼ欠乏及び／又はCD40リガンド発現の増加)；並びに／又は、非特異的症状発現(例えば、ループス腹膜炎、ループス膵炎、ループス膀胱炎、自己免疫性内耳疾患、副交感神経機能不全、レチナール血管炎、全身性血管炎、FcεRIγ発現の増加、T細胞中のカルシウムレベルの増加及び維持、血中イノシトール三リン酸の増加、プロテインキナーゼCリン酸化の減少、Ras-MAPキナーゼシグナル伝達の減少、及び／又はプロテインキナーゼAI活性欠損症を含む。
【０１３６】
羊膜由来接着細胞は、医薬組成物、例えば、例として静脈内、筋肉内若しくは腹腔内注射に適した医薬組成物の形態で、強皮症を罹患した個体に投与することができる。
【０１３７】
(5.2.8  菌状息肉腫の治療)
別の実施態様において、治療有効量の羊膜由来接着細胞(すなわち、多数の細胞)、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地を、個体へ投与することを含む、菌状息肉腫を有する、又はその症状を経験している、又はそれを発症するリスクのある個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、菌状息肉腫の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、菌状息肉腫の1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又は菌状息肉腫の進行を縮小するのに十分な量である。
【０１３８】
菌状息肉腫は、皮膚において増殖する稀な癌の群である、最も一般的な皮膚T細胞性リンパ腫である。セザリー症候群は、T細胞が末梢血に加え皮膚を冒すより稀な形態であり、これは菌状息肉腫の全症例の約5％で起こる。菌状息肉腫は一般に、下記の皮膚症状により定義された病期で進行する：(1)皮膚が、扁平な赤斑、又は非常に痒い、皮膚が暗色の個体における非常に明るい若しくは非常に暗い斑を有し、且つ隆起し堅い(プラーク)ことがある、斑形成相；(2)赤紫色の隆起した塊(小結節)が出現し、これはドーム型(マッシュルーム様)であるか又は潰瘍となることがある、皮膚腫瘍相；(3)個体の皮膚が、非常に痒く且つ鱗片状の大きい赤い領域を生じ、且つ手掌及び足裏の皮膚が、肥厚しひび割れることがある、皮膚発赤(紅皮症)期；並びに、(4)菌状息肉腫が、リンパ節を介して身体の他の部位に移動し始め、これが浸潤し、時には癌性であり、且つ肝臓、肺、若しくは骨髄へ広がり得る、リンパ節期。
【０１３９】
従って具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量は、菌状息肉腫の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、菌状息肉腫の1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又はLEの1以上の症状の増悪を軽減するのに十分な量であり、ここで該1以上の症状は、菌状息肉腫の皮膚科的、血液学的、骨格筋の、神経学的、腎臓の、肝臓の、又はT細胞の症状発現の1以上を含む。別の具体的実施態様において、該治療有効量は、菌状息肉腫の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、又は菌状息肉腫の1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又は菌状息肉腫の1以上の症状の増悪を軽減するのに十分な量であり、ここで該1以上の症状は、痒みを伴う皮膚上の明斑又は暗斑、皮膚プラーク、皮膚腫瘍の出現、皮膚上の隆起、鱗片状で掻痒性の赤い皮膚領域の出現、手掌及び足裏の皮膚の肥厚、手掌及び足裏の皮膚のひび割れ、又はリンパ節の炎症の1以上を含む。
【０１４０】
別の実施態様において、該羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量は、第二の療法又は第二の治療薬と一緒に投与される。より具体的実施態様において、第二の療法又は治療薬は、太陽光又は紫外線への該個体の患部の曝露、局所的ステロイド、局所的表面的な放射線治療、全皮膚電子線照射、有機ハチミツ(Manuka)の紅皮症に罹患した皮膚への塗布、又は生物学的療法の1以上である。より具体的実施態様において、該生物学的療法は、インターフェロン、レチノイド、レキシノイド、ボリノスタット(例えば、ZOLINZA(登録商標))の1以上の個体への投与を含む。
【０１４１】
(5.2.9  糖尿病の治療)
別の実施態様において、治療有効量の羊膜由来接着細胞(すなわち、多数の細胞)、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地を、個体へ投与することを含む、糖尿病を有する、又はその症状を経験している、又はそれを発症するリスクのある個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、糖尿病の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量、糖尿病の1以上の症状の発症を検出可能に軽減するのに十分な量、又は糖尿病の進行を縮小するのに十分な量である。具体的実施態様において、該糖尿病は、タイプ1糖尿病、1型糖尿病、T1D、又はインスリン依存性糖尿病(IDDM)としても知られている、1型真性糖尿病である。
【０１４２】
該羊膜由来接着細胞は、該疾患の経過時に1回以上投与することができる。該幹細胞は、最初の診断の1、2、3、4、5、若しくは6日、又は1週間以内に投与されることが好ましい。一実施態様において、該羊膜由来接着細胞の治療有効量は、異常に高い血糖値、グルコース耐性試験により決定されるインスリン抵抗性の欠如、疲労、又は意識喪失を含む、1型真性糖尿病の症状を逆行するか、その重症度を軽減するか、又はそうでなければ症状を改善するのに十分な量である。
【０１４３】
羊膜由来接着細胞は、第二の療法、例えば、移植された膵組織及び／又は島細胞；自家若しくは同種の幹細胞療法などと一緒に投与することができる。
【０１４４】
(5.2.10  他の免疫関連疾患又は障害の治療)
AMDACを使用し、他の免疫関連疾患又は病態を治療する方法が、本明細書に更に提供される。他の実施態様において、例えば、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を個体に投与することを含む、例えば免疫抑制により有益に治療することができる、疾患、障害又は病態などの、不適切な又は望ましくない免疫反応により引き起こされるか又はそれに関連する疾患又は障害を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。様々な具体的実施態様において、該免疫関連疾患は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群(原発性又は続発性)、喘息、自己免疫性胃炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性疾患、自己免疫性血小板減少性紫斑病、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡(例えば、粘膜類天疱瘡)、寒冷凝集素疾患、ドゴー病、疱疹状皮膚炎、本態性混合型クリオグロブリン血症、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎(橋本病；自己免疫性甲状腺炎)、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgA腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合型結合組織病、斑状強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、小児自己免疫性神経精神疾患(PANDA)、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変症、レイノー病(レイノー現象)、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群(メルシュ‐ヴォルトマン症候群)、高安動脈炎、側頭動脈炎(巨細胞性動脈炎)、ブドウ膜炎、血管炎(例えば、紅斑性狼瘡に関連しない血管炎)、白斑、及び／又はヴェーゲナー肉芽腫症の1以上である。
【０１４５】
様々な他の具体的実施態様において、該自己免疫疾患は、炎症性筋炎、皮膚筋炎、皮膚筋炎(若年性)、若年性筋炎、封入体筋炎、及び／又は多発性筋炎(例えば、皮膚筋炎を伴う)の1以上である。
【０１４６】
(5.2.11  第二の治療的組成物及び第二の療法)
前記治療方法のいずれかにおいて、該方法は、第二の治療的組成物又は第二の療法の投与を含むことができる。上記の特定の疾患を治療する方法における具体的第二の治療的化合物又は第二の療法の列挙は、排除されることを意図するものではない。例えば、本明細書において考察した疾患、障害又は病態のいずれかは、本明細書記載の抗炎症化合物又は免疫抑制化合物のいずれかにより治療することができる。羊膜由来接着細胞が第二の治療薬又は第二の型の幹細胞と一緒に投与される実施態様において、羊膜由来接着細胞並びに第二の治療薬及び／又は第二の型の幹細胞は、同時に又は異なる時点で投与することができ、例えば、該投与は、互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、若しくは50分間以内に、又は互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、若しくは22時間以内に、又は互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10日以内若しくはそれ以降に実行される。
【０１４７】
具体的実施態様において、不適切な、悪化した又は有害な免疫反応に関連したか又はそれにより引き起こされる疾患、障害又は病態の治療は、羊膜由来接着細胞に加え、第二の型の幹細胞、又は第二の型の幹細胞の集団の投与を含む。具体的実施態様において、該第二の型の幹細胞は、間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞である。別の実施態様において、第二の型の幹細胞は、脂肪由来幹細胞である。他の実施態様において、第二の型の幹細胞は、分化多能性幹細胞、分化万能性幹細胞、前駆細胞、造血幹細胞、例えばCD34+造血幹細胞、成体幹細胞、胚性幹細胞又は胚性生殖細胞である。第二の型の幹細胞、例えば間葉系幹細胞又は脂肪由来幹細胞は、羊膜由来接着細胞と、任意の比で、例えば、約100：1、75：1、50：1、25：1、20：1、15：1、10：1、5：1、1：1、1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：50、1：75又は1:100の比で、投与することができる。間葉系幹細胞は、商業的に入手するか、又は独自の給源、例えば、骨髄、骨髄穿刺液、脂肪組織などから入手することができる。
【０１４８】
別の具体的実施態様において、該第二の療法は、免疫調節化合物を含み、ここで該免疫調節化合物は、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオン；3-(4'アミノイソリンドリン-1'-オン(onw))-1-ピペリジン-2,6-ジオン；4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン；又は、α-(3-アミノフタルイミド)グルタルイミドである。より具体的実施態様において、該免疫調節化合物は、下記構造を有する化合物、或いはそれらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、又は立体異性体の混合物である：
【化４】
2014501249.tif 000008
(式中、
X及びYの一方は、C=Oであり、X及びYの他方は、C=O又はCH2であり、且つR2は、水素又は低級アルキルである。)。別のより具体的実施態様において、該免疫調節化合物は、下記構造を有する化合物、或いはそれらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、又は立体異性体の混合物である：
【化５】
2014501249.tif 000009
(式中、
X及びYの一方は、C=Oであり、且つ他方は、CH2又はC=Oであり；
R1は、H、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'、又は(C1-C8)アルキル-O(CO)R5であり；
R2は、H、F、ベンジル、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、又は(C2-C8)アルキニルであり；
R3及びR3'は、独立して、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)OR5であり；
R4は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、(C1-C4)アルキル-OR5、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、又は(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリールであり；
R5は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、又は(C2-C5)ヘテロアリールであり；
R6の各出現は、独立して、H、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C2-C5)ヘテロアリール、又は(C0-C8)アルキル-C(O)O-R5であるか、或いは、R6基は結合して、ヘテロシクロアルキル基を形成することができ；
nは、0又は1であり；且つ
*は、キラル炭素中心を表す。)。別のより具体的実施態様において、該免疫調節化合物は、下記構造を有する化合物、或いはそれらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、又は立体異性体の混合物である：
【化６】
2014501249.tif 000010
(式中：
X及びYの一方は、C=Oであり、且つ他方は、CH2又はC=Oであり；
Rは、H又はCH2OCOR'であり；
(i)R1、R2、R3、又はR4の各々は、他から独立して、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、若しくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、若しくはR4の1つは、ニトロ若しくは-NHR5であり、R1、R2、R3、若しくはR4の残りは、水素であり；
R5は、水素又は炭素1〜8個のアルキルであり；
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、若しくはフルオロであり；
R'は、R7-CHR10-N(R8R9)であり；
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-(式中、nは0〜4の値を有する)であり；
R8及びR9の各々は、互いに独立して、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか、或いはR8とR9は一緒に、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、若しくは-CH2CH2X1CH2CH2-(式中、X1は、-O-、-S-、若しくは-NH-である)であり；
R10は、水素、炭素原子8個までのアルキル、又はフェニルであり；且つ
*は、キラル炭素中心を表す。)。
【０１４９】
上記治療薬の任意の組合せを、投与することができる。そのような治療薬は、羊膜由来接着細胞との任意の組合せで、同時に又は個別の治療経過として、投与することができる。
【０１５０】
羊膜由来接着細胞は、医薬組成物、例えば静脈内、筋肉内若しくは腹腔内注射に適した医薬組成物の形状で、免疫関連疾患に罹っている個体に投与することができる。羊膜由来接着細胞は、単回投与量、又は反復投与量で投与することができる。羊膜由来接着細胞が、反復投与量で投与される場合、該投与量は、免疫関連疾患又は障害、例えば、IBD、例としてクローン病の1種以上の急性症状を緩和するためにデザインされた治療レジメンの一部であることができ、例えば該疾患の慢性の経過を予防するか、又は重症度を軽減するようにデザインされた長期治療レジメンの一部であることができる。羊膜由来接着細胞が第二の治療薬又は第二の型の幹細胞と一緒に投与される実施態様において、羊膜由来接着細胞並びに第二の治療薬及び／又は第二の型の幹細胞は、同時に又は異なる時点で投与することができ、例えば、投与は、互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9 10、20、30、40、若しくは50分間以内に、又は互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、若しくは22時間以内に、又は互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10日以内若しくはそれ以降に実行される。
【０１５１】
(5.3  羊膜由来接着細胞)
本明細書に提供される方法は、「羊膜由来接着細胞」又はAMDACと本明細書において称される、組織培養プラスチック接着性の羊膜由来細胞、及びそのような細胞の集団を使用する。一般に、羊膜由来接着細胞は、外見が線維芽細胞又は間葉系細胞に一見似ており、全般的に線維芽細胞様の形状を有する。そのような細胞は、細胞培養表面、例えば組織培養プラスチックに接着する。本明細書に開示されたAMDACのいずれか特定の実施態様において、該細胞はヒト細胞である。
【０１５２】
本明細書に提供されるAMDACは、それらを他の羊膜由来の細胞、又は胎盤由来の細胞から識別する細胞マーカーを示す。本明細書記載のAMDACの実施態様の各々の特定の実施態様において、AMDACは単離されている。
【０１５３】
一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-(オクタマー結合タンパク質4)である。別の具体的実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、RT-PCRにより決定可能なHLA-G-である。別の具体的実施態様において、OCT-4-細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はVEGFR2/KDR+(血管内皮増殖因子受容体2)である。具体的実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は、OCT-4について、例えば20サイクルで、PCR-増幅されたmRNAを、同等数のNTERA-2細胞及びRNA増幅サイクルよりも、少なくとも2log少なく発現する。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ加えて例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、OCT-4-細胞は、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。従って具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
【０１５４】
具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能なGFAP+である(例えば、下記6.3.3節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な、β-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、OCT-4-、GFAP+、及びβ-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、OCT-4-、CD200+、CD105+、及びCD49f+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、CD200+、CD105+、CD90+、及びCD73+である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、CD117-であり、且つCD117に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、CD146-であり、且つCD146に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCR及び／又は免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ例えばRT-PCR及び／又は免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFによる誘導後、CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法において使用されるAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な神経原性である(例えば、下記6.3.3節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法において使用されるAMDACは、インビトロ軟骨形成能アッセイにより決定可能な非軟骨形成性である(例えば、下記6.3.2節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法において使用されるAMDACは、骨形成表現型アッセイにより決定可能な非骨形成性である(例えば、下記6.3.1節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、100nMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロールリン酸、50μM L-アスコルビン酸-2-ホスフェートを補充した、pH7.4のDMEM(高グルコース)において最大6週間(例えば、2週間、4週間、又は6週間)培養された後、非骨形成性であり、ここで骨形成性は、von Kossa染色；アリザリンレッド染色を用いるか；又は、例えばRT-PCRにより、オステオポンチン、オステオカルシン、オステオネクチン、及び／又は骨シアロタンパク質の存在を検出することにより、評価される。
【０１５５】
別の実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD29+、CD73+、ABC-p+、及びCD38-の1以上である。
【０１５６】
別の具体的実施態様において、例えば、OCT-4- AMDACは加えて、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上であるか、又はRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-である。より具体的実施態様において、該細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-であり、且つRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-である。別の実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、及び／又はCD133-の1以上である。具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり；免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；且つ、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、及び／又はCD133-の1以上又は全てである。
【０１５７】
別の具体的実施態様において、該AMDACは加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、単独で又は他のマーカーと組合せてのいずれかで、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD105+及びCD200+に陽性である。別の具体的実施態様において、該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD34を発現しない。より具体的実施態様において、該細胞は、25〜75ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、又は50ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。更により具体的実施態様において、該細胞は、1、2.5、5、10、25、50、75又は100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。またより具体的実施態様において、該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに7〜14日間、例えば7日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。
【０１５８】
具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、及び／又はCD200+の1以上である。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様において、該細胞は、例えば1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝した後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。
【０１５９】
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-の1以上である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別の具体的実施態様において、該細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；並びに、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び／又はTie-2-の1以上である。別の具体的実施態様において、該細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及びTie-2-である。
【０１６０】
別の実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び／又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1以上、又は全てであるか；或いは、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上であるか、若しくはRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
【０１６１】
特定の実施態様において、単離された組織培養プラスチック-接着性羊膜由来接着細胞は、CD49f+である。具体的実施態様において、該CD49f+細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び／又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1以上であるか；或いは、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、OCT-4-、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上又は全てであるか、又はRT-PCRにより決定可能なSOX2-である。
【０１６２】
特定の他の実施態様において、単離された組織培養プラスチック-接着性羊膜由来接着細胞は、HLA-G-、CD90+、及びCD117-である。具体的実施態様において、該HLA-G-、CD90+、及びCD117-細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び／又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1以上又は全てであるか；或いは、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、OCT-4-、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上又は全てであるか、又はRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
【０１６３】
別の実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞は、例えば、標準培養条件下、30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、アンジオポエチン4(ANGPT4)、アンジオポエチン-様3(ANGPTL3)、カドヘリン5タイプ2(CDH5)、骨γ-カルボキシグルタミン酸(gla)タンパク質(BGLAP)、CD31、CD34、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド10(CXCL10)、ディスタル-レス(distal-less)ホメオボックス5(DLX5)、フィブリノゲンα鎖(FGA)、線維芽細胞増殖因子4(FGF4)、FMS-様チロシンキナーゼ3(FLT3)、HLA-G、インターフェロンγ(IFNG)、白血球細胞由来ケモタキシン1(LECT1)、レプチン(LEP)、マトリクスメタロプロテアーゼ13(MMP-13)、NANOG、ネスチン、プラスミノーゲン(PLG)、POU5F1(OCT-4)、プロラクチン(PRL)、プロキネチシン1(PROK1)、(性決定領域Y)-box2(SOX2)、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、テノモジュリン(TNMD)、及び／又は細胞外リンクドメイン含有1(XLKD1)のmRNAを構成的に発現しない。
【０１６４】
他の実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞又は羊膜由来接着細胞の集団は、(ARNT2)、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュートロフィン-3(NT-3)、NT-5、低酸素-誘導因子1α(HIF1A)、低酸素-誘導タンパク質2(HIG2)、ヘムオキシゲナーゼ(脱環化)1(HMOX1)、細胞外スーパオキシドジスムターゼ[Cu-Zn](SOD3)、カタラーゼ(CAT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、トランスフォーミング増殖因子β1受容体(TGFB1R)、及び肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c-met)のmRNAを発現する。
【０１６５】
別の態様において、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を含む、単離された細胞の集団、例えば、羊膜細胞又は胎盤細胞の単離された集団、或いはAMDACの実質的に単離された集団が、提供される。該細胞の集団は、均質な集団であり、例えば、少なくとも約90％、95％、98％又は99％が羊膜由来接着細胞である細胞集団であることができる。該細胞集団は、不均質であり、例えば、その集団の細胞の多くとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％又は80％が羊膜由来接着細胞である細胞集団である。しかし単離された細胞の集団は、組織、すなわち羊膜ではない。
【０１６６】
一実施態様において、AMDACを含む単離された細胞集団、例えば、AMDACについて実質的に均質である細胞集団、又はAMDACに関して不均質である細胞集団が、本明細書において提供され、ここで該AMDACは、組織培養プラスチックに接着し、且つ該AMDACは、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-である。具体的実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリー又はRT-PCRにより決定可能な、CD49f+又はHLA-G-である。別の具体的実施態様において、該細胞集団中の該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり、ここで該単離された細胞集団は、羊膜又は羊膜の膜又は他の組織ではない。より具体的実施態様において、該細胞集団中のAMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-、及び／又はHLA-G-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、該AMDACは、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。更により具体的実施態様において、該集団は、AMDACを含み、ここで該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
【０１６７】
別の具体的実施態様において、該細胞集団中の該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、例えばRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞集団中のAMDACは、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。従ってより具体的実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。更により具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ加えてCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。
【０１６８】
別の実施態様において、該細胞集団中の羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり、且つ加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、若しくはCXCR4-の1以上であるか、又はRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-であり、ここで該単離された細胞集団は、羊膜ではない。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む、単離された細胞集団が、本明細書において提供され、ここで該細胞は、組織培養プラスチックに接着し、ここで該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり、ここで該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現せず、且つここで該単離された細胞集団は、羊膜ではない。
【０１６９】
上記実施態様のいずれかの具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、先に説明された細胞マーカーの任意の組合せにより説明される又は特徴付けられる該羊膜由来接着細胞である。
【０１７０】
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞集団のいずれも、例えばI型及びIV型コラーゲンなどの、細胞外マトリクスタンパク質、又は、例えば血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)若しくは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの、血管新生因子の存在下で、例えば胎盤コラーゲン、又は例えばMATRIGEL(商標)などの基材中又は上において、少なくとも4日間及び最大14日間培養した場合、新芽又は管様構造を形成する。
【０１７１】
特定の実施態様において、下記のものを発現する細胞、又は細胞集団が本明細書に提供され、ここで該単離された細胞集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％又は98％は、下記のものの1以上又は全てを発現する羊膜由来接着細胞である：ACTA2(アクチン、α2、平滑筋、大動脈)、ACTC1(アクチン、α心筋1)、ADAMTS1(トロンボスポンジン1型モチーフを持つADAM型メタロペプチダーゼ、1)、AMOT(アンジオモチン)、ANG(アンギオゲニン)、ANGPT1(アンジオポエチン1)、ANGPT2、ANGPTL1(アンジオポエチン-様1)、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1(脳-特異的血管新生阻害因子1)、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1(癌胎児性抗原-関連細胞接着分子1)、CHGA(クロモグラニンA)、COL15A1(コラーゲン、XV型、α1)、COL18A1(コラーゲン、XVIII型、α1)、COL4A1(コラーゲン、IV型、α1)、COL4A2(コラーゲン、IV型、α2)、COL4A3(コラーゲン、IV型、α3)、コネキシン-43、CSF3(コロニー刺激因子3(顆粒球)、CTGF(結合組織増殖因子)、CXCL12(ケモカイン(CXCモチーフ)リガンド12(間質細胞由来因子1))、CXCL2、DNMT3B(DNA(シトシン-5-)-メチル基転移酵素3β)、ECGF1(チミジンホスホリラーゼ)、EDG1(内皮細胞分化遺伝子1)、EDIL3(EGF-様反復配列及びジスコイジンI-様ドメイン3)、ENPP2(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ2)、EPHB2(EPH受容体B2)、FBLN5(FIBULIN 5)、F2(凝固因子II(トロンビン))、FGF1(酸性線維芽細胞増殖因子)、FGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子)、FIGF(c-fos誘導した増殖因子(血管内皮増殖因子D))、FLT4(fms-関連チロシンキナーゼ4)、FN1(フィブロネクチン1)、FST(フォリスタチン)、FOXC2(フォークヘッドボックスC2(MFH-1、間葉系フォークヘッド1))、フォリスタチン、ガレクチン-1、GRN(グラニュリン)、HGF(肝細胞増殖因子)、HEY1(YRPWモチーフ1が関係したヘアリー／エンハンサー-オブ-スプリット)、HSPG2(ヘパラン硫酸プロテオグリカン2)、IFNB1(インターフェロン、β1、線維芽細胞)、IL8(インターロイキン8)、IL12A、ITGA4(インテグリン、α4；CD49d)、ITGAV(インテグリン、αV)、ITGB3(インテグリン、β3)、KLF4(クルッペル-様因子4)、MDK(ミッドカイン)、MMP2(マトリクスメタロプロテアーゼ2)、MYOZ2(ミオゼニン2)、NRP2(ニューロピリン2)、PDGFB(血小板由来増殖因子β)、PF4(血小板因子4)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ1)、PROX1(プロスペロホメオボックス1)、PTN(プレイオトロフィン)、SEMA3F(セモフォリン3F)、セルピンB5(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレイドB(オボアルブミン)、メンバー5)、セルピンC1、セルピンF1、TIMP2(組織メタロプロテアーゼ阻害物質2)、TIMP3、TGFA(トランスフォーミング増殖因子、α)、TGFB1、THBS1(トロンボスポンジン1)、THBS2、TIE1(免疫グロブリン-様及びEGF-様ドメインを持つチロシンキナーゼ1)、TNF(腫瘍壊死因子)、TNNC1(トロポニンC、1型)、TNNT2、TNFSF15(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー15)、VASH1(バソヒビン1)、VEGF(血管内皮増殖因子)、VEGFB、VEGFC、及び／又はVEGFR1/FLT1(血管内皮増殖因子受容体1)。
【０１７２】
ヒト細胞が使用される場合、全体を通した遺伝子の称号は、ヒト配列をいい、当業者に周知であるように、代表的配列は、文献又はGenBankにおいて認めることができる。これらの配列に対するプローブは、公共で入手可能な配列、又は、例えば特異的TAQMAN(登録商標)プローブ若しくはTAQMAN(登録商標)血管新生アレイ(Applied Biosystems社、パーツ番号4378710)など、商業的供給業者を通じて入手可能な配列により決定することができる。
【０１７３】
特定の実施態様において、免疫局在化により検出可能な、CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17前駆体(Aジスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン17)(TNF-α変換酵素)(TNF-αコンベルターゼ)、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA(α-フィラミン)(フィラミン1)(内皮アクチン-結合タンパク質)(ABP-280)(非筋型フィラミン)、α-アクチニン1(α-アクチニン細胞骨格アイソフォーム)(非筋型α-アクチニン1)(F-アクチン架橋型タンパク質)、低密度リポタンパク受容体-関連タンパク質2前駆体(メガリン)(糖タンパク質330)(gp330)、マクロファージ捕捉受容体I型及びII型(マクロファージアセチル化LDL受容体I型及びII型)、IIB型アクチビン受容体前駆体(ACTR-IIB)、Wnt-9タンパク質、グリア細胞線維性酸性タンパク質、星状膠細胞(GFAP)、ミオシン-結合タンパク質C、心筋型(心筋MyBP-C)(C-タンパク質、心筋アイソフォーム)、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型(細胞性ミオシン重鎖、A型)(非筋型ミオシン重鎖-A)(NMMHC-A)を発現する細胞、又は細胞集団が本明細書に提供され、ここで該単離された細胞集団の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％は、これらを発現する羊膜由来接着細胞である。
【０１７４】
特定の実施態様において、羊膜由来接着細胞、又は例えば該単離された集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％又は98％が羊膜由来接着細胞である、羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、ガレクチン-1の1以上又は全てを、例えば、そこで1個又は複数の細胞が成長している培養培地へ、分泌する。
【０１７５】
別の実施態様において、細胞集団、例えば羊膜由来接着細胞の集団、又は該単離された細胞集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％が、マイクロRNA(miRNA)を骨髄由来間葉系幹細胞よりも高いレベルで発現する羊膜由来接着細胞である細胞集団が、本明細書に提供され、ここで該miRNAは、miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及び／又はmiR-296の1以上又は全てを含む。別の実施態様において、細胞集団、例えば羊膜由来接着細胞の集団、又は該単離された細胞集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％が、マイクロRNA(miRNA)の1つ以上若しくは全てを骨髄由来間葉系幹細胞よりも低いレベルで発現する羊膜由来接着細胞である細胞集団が、本明細書に提供され、ここで該miRNAは、miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及び／又はmiR-16の1以上又は全てを含む。特定の実施態様において、AMDAC、又はAMDACの集団は、血管新生miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び／又はmiR-16の1以上又は全てを発現する。
【０１７６】
一実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞が、本明細書において提供され、ここで該細胞は、組織培養プラスチックに接着性であり、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つここで該細胞は：(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1以上を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、又はVE-カドヘリンの発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠き；(d)
【化７】
2014501249.tif 000011
のmRNAを発現し；(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を発現し；(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を発現し；並びに／又は、(j)21％O2下のCD202b、IL-8又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8又はVEGFを増加したレベルで発現する。具体的実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及びVEGFR2/KDR(CD309)を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なような、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及びVE-カドヘリンの発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能なような、SOX2の発現を欠き；(d)
【化８】
2014501249.tif 000012
のmRNAを発現し；(e)CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を発現し；(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及び／又はガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を発現し；並びに／又は、(i)該細胞が21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8及び／又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8及び／又はVEGFを増加したレベルで発現する。先に列記した特徴の1以上を有する、AMDACを含む細胞の集団、例えばAMDACの集団が更に、本明細書において提供される。
【０１７７】
他の具体的実施態様において、羊膜由来血管新生細胞を含む細胞集団は、1以上の血管新生因子を分泌し、且つこれによりインビトロ創傷治癒アッセイにおいてヒト内皮細胞の移動を誘導する。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞又は筋芽細胞の成熟、分化又は増殖を誘導する。
【０１７８】
別の実施態様において、前記羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団のいずれかは、例えば胎盤コラーゲン若しくはMATRIGEL(商標)などの基材上で、細胞外マトリクスタンパク質、例えばI型若しくはIV型コラーゲン及び／又は、1以上の血管新生因子、例えばVEGF、EGF、PDGF、若しくはbFGFの存在下で培養した場合、アセチル化された低密度リポタンパク(LDL)を取り込む。
【０１７９】
別の実施態様において、AMDACは、細胞集団内に含まれる。そのような実施態様の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である。具体的実施態様において、該細胞集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である、羊膜由来細胞である。別の具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である、羊膜由来細胞である。別の具体的実施態様において、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、該細胞はまたVE-カドヘリン-である。
【０１８０】
具体的実施態様において、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である該羊膜由来細胞は、該細胞集団を血管内皮増殖因子(VEGF)の存在下で培養した場合、新芽又は管様構造を形成する。
【０１８１】
本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、初代培養下、又は幹細胞の培養に適した培地での増殖時に、上記特徴、例えば細胞表面マーカー及び／又は遺伝子発現プロファイルの組合せを示す。そのような培地は、例えば、1〜100％DMEM-LG(Gibco社)、1〜100％MCDB-201(Sigma社)、1〜10％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、0.1〜5×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS、Sigma社)、0.1〜5×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA、Sigma社)、10-5〜10-15Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-2〜10-10Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、1〜50ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)(R&D Systems社)、1〜50ng/mL血小板由来増殖因子(PDGF-BB)(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含有する培地を含む。具体的実施態様において、該培地は、60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、上皮細胞増殖因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来増殖因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含有する。他の好適な培地は、以下に説明する。
【０１８２】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の単離された集団は、例えば容器内に、約、少なくとも約、又はわずかに約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多い羊膜由来接着細胞を含むことができる。様々な実施態様において、本明細書に提供された単離された細胞集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％は、羊膜由来接着細胞である。すなわち、単離された羊膜由来接着細胞の集団は、例えば、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％もの非AMDAC細胞を含むことができる。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％またはそれよりも多くは、OCT-4+ではない。
【０１８３】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、基材上で培養することができる。様々な実施態様において、該基材は、羊膜由来接着細胞の培養及び／又は選択を達成することができる任意の表面であることができる。典型的には、該基材は、プラスチック、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、例えば、CELLSTART(商標)、MESENCULT(商標)ACF-基材、オルニチン、若しくはポリリジンなどの、生体分子又は合成模倣物質、又は例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの、細胞外マトリクスタンパク質により処理、コーティング、又はインプリンティングすることができる。
【０１８４】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団は、1以上の胎盤から単離することができる。単離された羊膜由来細胞は、培養及び拡大し、そのような細胞の集団を作製することができる。羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団も、培養及び拡大し、羊膜由来接着細胞の集団を作製することができる。
【０１８５】
特定の実施態様において、上記マーカー及び／又は遺伝子発現特徴のいずれかを示すAMDACは、少なくとも 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20回、又はそれよりも多く継代したものである。特定の他の実施態様において、上記マーカー及び／又は遺伝子発現特徴のいずれかを示すAMDACは、培養において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49回又は少なくとも50回、又はそれよりも多く倍加される。
【０１８６】
具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCR及び／又はTRAPアッセイにより測定されるように、テロメラーゼについて陰性である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCRにより測定されるように、NANOG-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、NANOGのmRNAを発現しない。具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、(性決定領域Y)-box2(SOX2)について陰性である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、骨形成表現型アッセイにより測定されるように、骨形成性ではない(例えば、下記6.3.1節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、軟骨形成能アッセイにより測定されるように、軟骨形成性ではない(例えば、下記6.3.2節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、骨形成表現型アッセイにより測定されるように、骨形成性ではなく(例えば、下記6.3.1節参照)、且つ軟骨形成能アッセイにより測定されるように、軟骨形成性ではない(例えば、下記6.3.1節参照)。
【０１８７】
AMDACは、表3に明らかにするように、RT-PCRにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
【表４】
2014501249.tif 000013
2014501249.tif 000014
2014501249.tif 000015
2014501249.tif 000016
【０１８８】
AMDACは、表4に明らかにするように、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
【表５】
2014501249.tif 000017
2014501249.tif 000018
【０１８９】
AMDACは、表5に明らかにするように、免疫局在化、例えば免疫蛍光測定及び／又は免疫組織化学により決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
【０１９０】
【表６】
2014501249.tif 000019
【０１９１】
AMDACは、表6に明らかにするように、免疫局在化、例えば膜プロテオミクスにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
【表７】
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【０１９２】
AMDACは、表7に明らかにするように、セクレトーム解析、例えばELISAにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
【表８】
2014501249.tif 000021
【０１９３】
(5.4  他の細胞型を含む羊膜由来接着細胞の集団)
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、例えば羊膜由来接着細胞ではない胎盤細胞、又は、例えば胎盤細胞ではない細胞などの第二の細胞型を含むことができる。例えば、羊膜由来接着細胞の単離された集団は、第二の細胞型の集団を含むことができ、例えば該集団と組合せることができ、ここで、該第二の細胞型は、例えば、胚性幹細胞、血液細胞(例えば、胎盤血、胎盤血細胞、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血、末梢血細胞、胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の有核細胞など)、血液から単離された幹細胞(例えば、胎盤血、臍帯血又は末梢血から単離された幹細胞)、胎盤幹細胞(例えば、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,468,276号、及び米国特許出願公開第2007/0275362号に記載の、胎盤幹細胞)、胎盤灌流液由来の有核細胞、例えば胎盤灌流液からの全有核細胞、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,638,141号に説明され特許請求された細胞、臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来の間葉系間質細胞、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨髄由来の造血幹細胞、粗骨髄、成体(体性)幹細胞、組織に含まれる幹細胞の集団、培養細胞、例えば培養幹細胞、完全に分化した細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心筋細胞など)、周皮細胞などを含む。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、胎盤幹細胞又は臍帯からの幹細胞を含む。第二の細胞型が血液又は血液細胞である特定の実施態様において、赤血球は、この細胞の集団から除去される。
【０１９４】
具体的実施態様において、第二の細胞型は造血幹細胞である。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血又は末梢血内；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの全有核細胞内；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの単離されたCD34+細胞の集団内；未処理の骨髄内；骨髄からの全有核細胞内；骨髄から単離されたCD34+細胞の集団内などに含まれることができる。
【０１９５】
別の実施態様において、第二の細胞型は、胚性幹細胞に関連した多分化能マーカー及び機能マーカーを発現するために、培養において操作された非胚細胞型である。
【０１９６】
前記羊膜由来接着細胞の単離された集団の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞及び第二の細胞型のいずれか又は両方は、該細胞の意図されたにレシピエント対し、自家であるか、又は同種である。
【０１９７】
羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞以外の複数の幹細胞を含有する組成物が、本明細書において更に提供される。具体的実施態様において、該組成物は、胎盤から得られる幹細胞、すなわち胎盤幹細胞、例えばそれらの各開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,045,148号；第7,255,879号；及び、第7,311,905号、並びに米国特許出願公開第2007/0275362号に記載された胎盤幹細胞を含有する。具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+及びCD105+である。より具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+及びCD200+である。より具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD45-、CD10+、CD90+、CD105+及びCD200+である。より具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD45-、CD80-、CD86-、CD10+、CD90+、CD105+及びCD200+である。他の具体的実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD200+及びHLA-G+であり；CD73+、CD105+、及びCD200+であり；CD200+及びOCT-4+であり；CD73+、CD105+及びHLA-G+であり；CD73+及びCD105+であり、並びに該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、該集団中の1以上の胚様体の形成を促進するか；又は、OCT-4+であり、並びに該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、該集団中の1以上の胚様体の形成を促進するか；又は、それらの任意の組合せである。より具体的実施態様において、該CD200+、HLA-G+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別のより具体的実施態様において、該CD73+、CD105+、及びCD200+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。別のより具体的実施態様において、該CD200+、OCT-4+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別のより具体的実施態様において、該CD73+、CD105+及びHLA-G+幹細胞は、CD34-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である。別のより具体的実施態様において、該CD73+及びCD105+幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD38-及びCD45-である。別のより具体的実施態様において、該OCT-4+幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別のより具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、母親起源である(すなわち、母親遺伝子型を有する)。別のより具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、胎児起源である(すなわち、胎児遺伝子型を有する)。
【０１９８】
別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞、及び胚性幹細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞及び間葉系間質細胞若しくは幹細胞、例えば骨髄由来の間葉系間質細胞若しくは幹細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、骨髄由来の造血幹細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞及び造血前駆細胞、例えば骨髄、胎児血液、臍帯血、胎盤血、及び／又は末梢血からの造血前駆細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞及び体性幹細胞を含有する。より具体的実施態様において、該体性幹細胞は、神経幹細胞、肝性幹細胞、膵性幹細胞、内皮幹細胞、心筋幹細胞、又は筋幹細胞である。
【０１９９】
別の具体的実施態様において、第二の細胞型は、該集団中の細胞の約、少なくとも、又はわずかに10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％を構成する。他の具体的実施態様において、該組成物中のAMDACは、該組成物中の細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％又は90％を構成する。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、該集団中の細胞の約、少なくとも、又はわずかに10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、又は45％を構成する。他の具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％又はそれよりも多くは、OCT-4+ではない。
【０２００】
羊膜由来接着細胞の単離された集団中の細胞は、別の型の複数の細胞と、例えば、幹細胞の集団と、各々の集団内の全有核細胞の数と比べて、約100,000,000：1、50,000,000：1、20,000,000：1、10,000,000：1、5,000,000：1、2,000,000：1、1,000,000：1、500,000：1、200,000：1、100,000：1、50,000：1、20,000：1、10,000：1、5,000：1、2,000：1、1,000：1、500：1、200：1、100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1；1：2；1：5；1：10；1：100；1：200；1：500；1：1,000；1：2,000；1：5,000；1：10,000；1：20,000；1：50,000；1：100,000；1：500,000；1：1,000,000；1：2,000,000；1：5,000,000；1：10,000,000；1：20,000,000；1：50,000,000；又は約1：100,000,000の比で、一緒にすることができる。単離された羊膜由来接着細胞集団内の細胞を、更に複数の細胞型の複数の細胞と組合せることもできる。
【０２０１】
(5.5  培養下の成長)
任意の哺乳動物細胞に関して、本明細書記載の羊膜由来接着細胞の成長は、成長用に選択される特定の培地に一部左右される。最適な条件下では、羊膜由来接着細胞は、典型的にはおよそ24時間で数が2倍になる。培養中、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、培養液中の基材、例えば組織培養容器(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコーティングしたプラスチックなど)の表面に接着し、単層を形成する。典型的には、該細胞は、羊膜の消化後、2〜7日以内に培養物中に樹立する。これらは、1日辺りおよそ0.4〜1.2倍の集団倍加で増殖し、且つ少なくとも30〜50回集団倍加させることができる。これらの細胞は、コンフルエンス以下で且つ拡大する間に、間葉系細胞/線維芽細胞-様表現型を示し、コンフルエンス時には、立方体/丸石-様外観を示し、且つ培養液中の増殖は、強力に接触阻害される。羊膜由来接着細胞の集団は、培養液中の拡大時に胚様体を形成することができる。羊膜由来接着細胞は、正常酸素圧又は低酸素圧の条件下、例えば、約0.1％O2〜約21％O2、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21％O2で成長させることができる。
【０２０２】
(5.6  羊膜由来接着細胞を得る方法)
羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、他の細胞又は細胞集団から、例えば、羊膜組織の特定の消化方法を介し単離し、任意にそれに続けて得られた細胞又は細胞集団を、羊膜由来接着細胞の特徴的マーカー、又はマーカー組合せの存在又は非存在下で評価するか、或いは羊膜細胞を入手し、且つ羊膜由来接着細胞の特徴的なマーカーを基に選択することにより、作製することができる。
【０２０３】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、例えば、羊膜組織の消化、それに続く接着細胞の選択により作製することができる。一実施態様において、例えば、単離された羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、(1)羊膜組織を、第一の酵素で消化し、細胞を、羊膜の間葉系層の細胞からの羊膜上皮層から解離する工程；(2)引き続き、羊膜の間葉系層を、第二の酵素で消化し、単-細胞懸濁液を形成する工程；(3)該単-細胞懸濁液中の細胞を、組織培養表面、例えば組織培養プラスチック上で培養する工程；並びに、(4)培地の交換後、該表面に接着する細胞を選択し、これにより羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団を作製する工程：により作製することができる。具体的実施態様において、該第一の酵素はトリプシンである。より具体的実施態様において、該トリプシンは、消化されるべき羊膜組織1gにつき溶液5〜20ml、例えば10ml中濃度0.25％トリプシン(w/v)で使用される。別のより具体的実施態様において、該トリプシンによる消化は、37℃で約15分間進行され、且つ最大3回繰り返される。別の具体的実施態様において、該第二の酵素はコラゲナーゼである。より具体的実施態様において、該コラゲナーゼは、消化されるべき羊膜組織1gにつき溶液5ml中濃度50〜500U/Lで使用される。別のより具体的実施態様において、該コラゲナーゼによる消化は、37℃で約45〜60分間進行される。別の具体的実施態様において、コラゲナーゼによる消化後形成された単-細胞懸濁液は、工程(2)と工程(3)の間で、75μM〜150μMフィルターを通して濾過される。別の具体的実施態様において、該第一の酵素はトリプシンであり、且つ該第二の酵素はコラゲナーゼである。
【０２０４】
羊膜由来接着細胞を含有する単離された細胞集団は、別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の1以上の特徴を示す、羊膜からの細胞、例えば、本明細書別所記載の羊膜組織の消化により得られた細胞を選択することにより得ることができる。一実施態様において、例えば、細胞集団は、(a)RT-PCRにより決定可能な、OCT-4について陰性、及び(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定又は選択可能なように、VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200の1以上について陽性である、細胞を同定し選択する工程；並びに、該細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程を含む方法により、作製される。具体的実施態様において、該羊膜細胞は加えて、VE-カドヘリン-である。具体的実施態様において、細胞集団は、(a)RT-PCRにより決定可能な、OCT-4について陰性、及び、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリンについて陰性であり、並びに(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200の各々について陽性である、胎盤細胞を選択する工程；並びに、該細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程により、作製される。特定の実施態様において、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーによる選択は、RT-PCRによる選択の前に実行される。別の具体的実施態様において、該選択は、1〜100ng/mL VEGFの存在下で、4〜21日間の培養後に、細胞マーカーCD34を発現していない細胞を選択する工程を含む。
【０２０５】
別の実施態様において、例えば、細胞集団は、組織培養プラスチックに接着し、並びにRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及びVEGFR2/KDR+である羊膜細胞を選択する工程、並びに該細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程を含む方法により、作製される。具体的実施態様において、細胞集団は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、及びHLA-G-である羊膜細胞を選択する工程を含む方法により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞集団は、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及び／又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上、又は全てである羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をこれらの特徴の1以上を示さない細胞から単離する工程により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞集団は、加えて免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-である羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をVE-カドヘリン+である細胞から単離する工程により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞集団は、加えて免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD105+及びCD200+である羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をCD105-又はCD200-である細胞から単離する工程により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞は、1〜100ng/mL VEGFに、4〜21日間曝した後に、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。
【０２０６】
細胞の選択において、羊膜由来接着細胞に特異的な特徴について、細胞の全集団を試験する必要はない。代わりに、細胞集団の1以上の細胞アリコート(例えば約0.5％〜2％)を、そのような特徴について試験すればよく、それらの結果を、その細胞集団の残りの細胞に帰することができる。
【０２０７】
選択された細胞は、細胞試料(例えば約104〜約105個細胞)を、基材、例えばMATRIGEL(商標)上で、4〜14日間、例えば7日間、VEGF(例えば約50ng/mL)の存在下で培養し、且つ新芽及び／又は細胞ネットワークの外観について細胞を目視により検証することにより、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞であることを確認することができる。
【０２０８】
羊膜由来接着細胞を、細胞選択の技術分野で公知の任意の方法によって、上記マーカーにより選択することができる。例えば、該接着細胞を、例えば免疫局在化、例としてフローサイトメトリー又はFACSにおいて、1つ以上の細胞表面マーカーに対する1つ又は複数の抗体を用いて選択することができる。抗体の磁気ビーズとの複合体を用いて、選択を達成することができる。特定のマーカーに特異的である抗体は当該技術分野で公知であり、且つ、例えばCD9に対する抗体(Abcam社)；CD54に対する抗体(Abcam社)；CD105に対する抗体(Abcam社；BioDesign International社、サコ、MEなど)；CD200に対する抗体(Abcam社)、サイトケラチンに対する抗体(SigmaAldrich社)などが商業的に入手可能である。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38、及びCD45に対する抗体が、例えば、StemCell Technologies社又はBioDesign International社から入手可能である。RT-PCRに適したOCT-4配列に対するプライマーは、例えば、Millipore社若しくはInvitrogen社から、商業的に入手するか、又はGenBank寄託番号DQ486513のヒト配列から容易に誘導することができる。
【０２０９】
羊膜由来接着細胞を得るために、胎盤及び胎盤由来の羊膜組織を入手し、且つそのような組織を処理する詳細な方法は、以下に提示される。
【０２１０】
(5.6.1  細胞回収組成物)
一般に、細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば細胞回収組成物を使用し、哺乳動物胎盤、例えばヒト胎盤由来の羊膜から得ることができる。特定の実施態様において、該細胞回収組成物は、アポトーシスを防止又は抑制し、細胞死、溶解、分解などを防止又は抑制する。細胞回収組成物は、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、関連の米国特許出願公開第2007/0190042号、表題「胎盤幹細胞回収及び組織保存のための改善された培地(Improved Medium for Collecting Placental Stem Cell and Preserving Organs)」に説明されている。
【０２１１】
細胞回収組成物は、緩衝成分、例えば4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を添加又は無添加の、例えば、食塩水(例えばリン酸-緩衝食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)などの、羊膜由来接着細胞の回収及び／又は培養に適した任意の生理的に許容し得る溶液を含有することができる。
【０２１２】
細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、細胞、例えば羊膜由来接着細胞を保存する、すなわち、該細胞の死を防止するか、又は該細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞集団内の細胞の数を減少させるなどの傾向がある1種以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤若しくはJNK阻害剤)；血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン若しくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など)；壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、若しくはクロナゼパム)；TNF-α阻害剤；及び／又は、酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど)であることができる。
【０２１３】
細胞回収組成物は、1種以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼなど)；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE(商標)、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。組織消化酵素を含有する細胞回収組成物の使用は、以下により詳細に考察する。
【０２１４】
細胞回収組成物は、殺菌有効量又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。特定の非限定的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム、若しくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、若しくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などに対して活性がある。
【０２１５】
細胞回収組成物は、以下の化合物のうちの1以上を含むこともできる：アデノシン(約1mM〜約50mM)；D-グルコース(約20mM〜約100mM)；マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM)；一実施態様において、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の高分子(例えば、合成若しくは天然のコロイド、約25g/l〜約100g/l、若しくは約40g/l〜約60g/lで存在するデキストラン若しくはポリエチレングリコールなどの多糖)；酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、若しくはビタミンE)；還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン)；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル)；ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L)；一実施態様において、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,000ユニット/lの濃度で存在するヘパリン若しくはヒルジン)；又はアミロライド含有化合物(例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、若しくはイソブチルアミロライド)。
【０２１６】
本明細書記載の羊膜由来接着細胞はまた、例えば、以下に記載のように消化時及び消化後に、単純な生理的に許容し得る緩衝液、例えばリン酸-緩衝食塩水、0.9％NaCl溶液、細胞培養培地などに、回収することもできる。
【０２１７】
(5.6.2  胎盤の回収及び取り扱い)
一般に、ヒトの胎盤を、出産後その娩出後すぐに、又は例えば帝王切開後に、回収する。好ましい実施態様において、インフォームドコンセント後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用いて、胎盤又はそれから採取される細胞の後続的使用を調整することができる。例えば、ヒト羊膜由来接着細胞は、その病歴を考慮して、該胎盤と関連する幼児のための、若しくは近親者のための、又はその幼児の親、兄弟姉妹、若しくは他の血縁者のための個人医療に用いることができる。
【０２１８】
羊膜由来接着細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。特定の実施態様において、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。典型的には、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号；Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照されたい)。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、LifeBank USA社(シダーノールズ、NJ)、ViaCord、Cord Blood Registry and Cryocellにより行なわれてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
【０２１９】
典型的には、臍帯血の回収、及び例えば、組織解離による細胞の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様において、米国特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。特定の実施態様において、臍帯血の回収前に、盤状胎盤(placental disc)への挿入部から好ましくは4〜5cm(センチメートル)以内のところで、近位臍帯をクランプする。他の実施態様において、臍帯血の回収後、しかし、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。
【０２２０】
胎盤は、細胞回収前に、滅菌条件下、且つ4〜25℃(摂氏)の温度、例えば室温で保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤は、例えば0〜24時間の期間、最長48時間、又は48時間よりも長い時間、保存してもよい。一実施態様において、胎盤は、盤出後約0時間〜約2時間に回収される。胎盤は、例えば4〜25℃(摂氏)の温度で、抗凝血剤溶液に入れて保存することができる。好適な抗凝血剤溶液は当該技術分野で周知である。例えば、クエン酸ナトリウム、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を用いることができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中で1％w/w)を含む。放血された胎盤は、細胞を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。
【０２２１】
胎盤の回収及び取り扱いに関する追加情報に関しては、例えば、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,638,141号を参照されたい。
【０２２２】
(5.6.3  羊膜組織の物理的破壊及び酵素的消化)
一実施態様において、羊膜は、例えば指を使用するなどし、例えば大まかに解体することにより、胎盤の残りから分離する。羊膜を、例えば部分又は組織切片に解体し、その後酵素的に消化し、且つ接着細胞を回収する。羊膜由来接着細胞は、全羊膜から、又は羊膜の小切片から、例えば面積約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000平方ミリメートルである羊膜の切片から、得ることができる。
【０２２３】
羊膜由来接着細胞は、一般に、盤出後最初の約3日間以内の任意の時点で、胎盤の羊膜又はそれらの一部から回収することができるが、好ましくは盤出後約0時間〜48時間、又は盤出後約8時間〜約18時間である。
【０２２４】
AMDACは、例えば、トリプシンで消化し、引き続きコラゲナーゼで消化することを含む、特異的2工程単離法を用い、単離することができる。例えば、トリプシンにより、羊膜の膜又はその一部を消化し、その結果上皮細胞を該羊膜の膜から放す工程；羊膜の膜又はその一部を該上皮細胞から除去する工程；更に、羊膜の膜又はその一部をコラゲナーゼにより消化する工程を含む、羊膜由来接着細胞を単離する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、羊膜の膜又はその一部のトリプシンによる消化は、少なくとも1回繰り返される。別の具体的実施態様において、羊膜の膜又はその一部のコラゲナーゼによる消化は、少なくとも1回繰り返される。別の具体的実施態様において、トリプシンは、約0.1％〜1.0％(最終濃度)である。より具体的実施態様において、トリプシンは、約0.25％(最終濃度)である。別の具体的実施態様において、コラゲナーゼは、約50U/mL〜約1000U/mL(最終濃度)である。より具体的実施態様において、コラゲナーゼは、約125U/mL(最終濃度)である。
【０２２５】
一実施態様において、例えば、羊膜由来接着細胞は、下記のように得ることができる。羊膜の膜は、例えば切開により、胎盤から単離され、次にサイズがおよそ0.1インチ×0.1インチ（0.25cm×0.25cm）〜約5インチ×5インチ（12.7cm×12.7cm）、例えば2インチ×2インチ（5.08cm×5.08cm）の切片に切断される。上皮単層は、トリプシン処理により、例えば下記の三重トリプシン処理により、羊膜の膜の胎児側から取り除かれる。羊膜の膜の切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)トリプシン-EDTA溶液(0.25％)の入った容器に配置する。トリプシン溶液の容量は、約5mL/g羊膜の膜〜約50mL/g羊膜の膜の範囲であることができる。容器は、温度を一定に保ちながら、約5分間〜約30分間、例えば15分間攪拌する。その後、羊膜切片を手作業で除去するか、又は濾過によるなど、任意の適切な方法によりトリプシン溶液から、羊膜の膜切片を分離する。トリプシン処理工程は、少なくとも1回以上繰り返すことができる。一実施態様において、トリプシン処理工程は、2回(三重トリプシン処理について)又は3回(四重トリプシン処理について)繰り返される。
【０２２６】
一実施態様において、最終トリプシン処理の完了時に、羊膜の膜切片を、リン酸塩-緩衝食塩水(PBS)/10％ウシ胎仔血清(FBS)、PBS/5％FBS又はPBS/3％FBSなどの、温めた(例えば約20℃〜約37℃)トリプシン中和溶液(例えば、容量約5mL/g羊膜の膜〜約50mL/g羊膜の膜)に配置する。容器を、約5秒〜約30分間、例えば、5、10、又は15分間攪拌する。その後羊膜切片を手作業で除去するか、又は濾過によるなど、任意の好適な方法により、羊膜の膜切片をトリプシン中和溶液から分離する。その後羊膜の膜切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)PBS(pH7.2)溶液(例えば、容量約5mL/g羊膜の膜〜約50mL/g羊膜の膜)で満たされた容器に配置する。容器を、約5秒〜約30分間、例えば、5、10、又は15分間攪拌する。次に羊膜の膜切片を、上記のようにPBSから分離する。
【０２２７】
その後羊膜の膜切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)消化溶液に配置する。消化溶液の容量は、約5mL/g羊膜〜約50mL/g羊膜の範囲であることができる。消化溶液は、DMEMなどの好適な培養培地中に、消化酵素を含む。典型的消化溶液は、I型コラゲナーゼ(約50U/mL〜約500U/mL)を含む。本プロセスのこの工程の消化溶液は、一般にトリプシンを含まない。一般に、羊膜消化が実質的に完了するまで、例えば、羊膜の膜の溶解が完了したことが示され、均質な懸濁液を生じるまで(およそ10分間〜約90分間)、37℃で攪拌する。その後温かいPBS/5％FBSを、約1mL/g羊膜組織〜約50mL/g羊膜組織の比で添加し、約2分間〜約5分間攪拌する。次に細胞懸濁液を、例えば40μm〜100μmフィルターを用い濾過し、あらゆる未消化の組織を除去する。細胞を、温PBS(約1mL〜約500mL)中に懸濁させ、次に200×g〜約400×gで約5分間〜約30分間、例えば300×gで約15分間、20℃で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を、好適な培養培地中に再懸濁させる。この細胞懸濁液を濾過し(40μm〜70μmフィルター)、あらゆる残存している未消化の組織を除去し、単細胞懸濁液を生じる。この実施態様において、残存する未消化の羊膜は廃棄することができる。
【０２２８】
この実施態様において、懸濁液中の細胞を、本明細書別所記載のように収集及び培養し、単離された羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団を作製する。例えば一実施態様において、懸濁液中の細胞を培養し、羊膜由来接着細胞を、該培養液中の非接着細胞から分離し、羊膜由来接着細胞の濃縮された集団を作製することができる。より具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞の濃縮された集団中の細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％又は99％は、該羊膜由来接着細胞である。
【０２２９】
本明細書の任意の消化プロトコールにおいて、消化により得られた細胞懸濁液は、例えば、約50μm〜約150μm、例えば約75μm〜約125μmの有孔フィルターを通して濾過することができる。より具体的実施態様において、細胞懸濁液は、2個以上のフィルター、例えば125μmフィルターと75μmフィルターを通して濾過することができる。
【０２３０】
本明細書記載の任意の方法と組合せて、AMDACは、上記5.3節に記載のように、AMDACの1以上の特徴を発現する細胞を選択することにより、消化時に放出された細胞から単離することができる。
【０２３１】
一実施態様において、AMDACは、第一の酵素及び第二の酵素を順に用いて単離することができ、ここで本方法において使用される第一の酵素はコラゲナーゼではなく、且つ本方法において使用される第二の酵素はトリプシンではない。別の実施態様において、AMDACを単離するために使用する消化工程は、コラゲナーゼ、ジスパーゼ又はヒアルロニダーゼのいずれか2種以上の組合せを使用しない。別の実施態様において、AMDACは、細胞が移植片からの成長、複製、又は移動により検出され得るように、移植片培養を介しては、単離されない。
【０２３２】
別の実施態様において、デオキシリボヌクレアーゼ(DNアーゼ)は、AMDACの単離時は使用されない。例えば、いくつかの実施態様において、DNアーゼは、本単離のコラゲナーゼ消化工程後には使用されない。
【０２３３】
(5.6.4  羊膜由来接着細胞の単離、選別、及び特徴付け)
細胞ペレットを、上記の新鮮な細胞回収組成物、又は細胞維持に適した培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)；イスコフの改変ダルベッコ培地(IMDM)、例えば2U/mLヘパリン及び2mM EDTAを含有するIMDM無血清培地(GibcoBRL社、NY)；緩衝液(例えばPBS、HBSS)のFBS(例えば2％v/v)との混合液；などの中に再懸濁させる。
【０２３４】
フィブロネクチンなどの、追加の細胞外マトリクスコーティングを含む又は含まない、例えば組織培養プラスチックなどの、表面上で培養された羊膜由来接着細胞を、継代するか、又は示差接着により単離することができる。例えば、上記5.6.3節に記載のように得られた細胞懸濁液を、例えば3〜7日間、組織培養プラスチック上の培養培地中で培養することができる。培養時に、懸濁液中の複数の細胞は、培養表面に接着し、且つ非接着細胞は、培地の交換時に除去される。
【０２３５】
羊膜から回収された細胞の数と種類を、免疫局在化、例えばフローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的抗体若しくは細胞マーカー特異的抗体による染色)、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気活性化細胞選別(MACS)などの標準的な細胞検出技術を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学顕微鏡若しくは共焦点顕微鏡法を用いて細胞の形態を調べることにより、並びに／又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野で周知の技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングすることができる。これらの技術を、同様に、1種以上の特定のマーカーが陽性である細胞を同定するためにも用いることができる。例えば、1以上のCD34に対する抗体を用いて、上記の技術を用い、細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを決定することができ；もしそうであるならば、細胞はCD34+である。
【０２３６】
羊膜由来接着細胞は、フィコール分離、例えばフィコール勾配遠心分離により単離することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度などに関して、標準プロトコールに従うことができる。一実施態様において、例えば、羊膜の消化後に回収された細胞は、5000×gで15分間、室温での遠心分離により、フィコール勾配を用い分離され、且つ関心対象の細胞層は更なる処理のために回収される。
【０２３７】
羊膜由来の細胞、例えば、フィコール分離、示差的接着、又は両方の組合せによって単離された細胞を、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いて選別することができる。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である(例えば、Kamarchの文献(1987, Methods Enzymol, 151：150-165)参照)。個々の粒子中の蛍光部分のレーザーによる励起によって、わずかな電荷が生じ、混合物からの陽性粒子及び陰性粒子の電磁分離が可能になる。一実施態様において、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを個別の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターに通して処理し、使用された抗体に結合するそれらの能力に基づく細胞の分離を可能にする。FACSで選別された粒子を96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェルに直接に堆積させて、分離及びクローニングをしやすくすることができる。
【０２３８】
1つの選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば羊膜由来接着細胞を、マーカーCD49f、VEGFR2/KDR、及び／又はFlt-1/VEGFR1の発現に基づいて選別することができる。好ましくは、該細胞は、例えば細胞試料中のRT-PCRによるOCT-4の発現の決定により、OCT-4-であると同定され、ここで該試料中の細胞が30サイクル後にOCT-4のmRNAの検出可能な生成を示すことができない場合に、該細胞はOCT-4-である。例えば、VEGFR2/KDR+及びVEGFR1/Flt-1+である羊膜由来の細胞は、VEGFR2/KDR-、及びVEGFR1/Flt-1+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上である細胞から選別することができる。具体的実施態様において、CD49f+、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上である羊膜由来の組織培養プラスチック-接着細胞、又はVEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である細胞は、そのようなマーカーの1以上を発現しない細胞から選別され、且つ選択される。別の具体的実施態様において、加えてCD31+、CD34+、CD45+、CD133-、及び／又はTie-2+の1以上、又は全てである、CD49f+、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+細胞は、そのような特徴の1以上、又はいずれも示さない細胞から選別される。別の具体的実施態様において、加えてCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及び／又はCXCR4-の1以上、又は全てである、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+細胞は、そのような特徴の1以上、又はいずれも示さない細胞から選別される。
【０２３９】
羊膜由来接着細胞の選択は、例えば、遠心分離又はフローサイトメトリーを使用する分離により、消化から生じた細胞懸濁液について、又は消化液から回収された単離された細胞について実行することができる。発現されたマーカーによる選択は、単独で、或いは例えば培養液中のそれらの接着特性を基に細胞を選択する手順と結びつけて、遂行することができる。例えば、接着選択は、マーカー発現を基に選別する前又は後に遂行することができる。
【０２４０】
羊膜細胞の抗体-媒介した検出及び選別に関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出及び選別(例えば蛍光活性化細胞選別)に適した発蛍光団又は他の標識と組合せて使用することができる。特異的マーカーへの抗体/発蛍光団組合せは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に複合されたCD105に対するモノクローナル抗体(R&D Systems社、ミネアポリス、MNから入手可能)；フィコエリトリン(PE)に複合されたCD200に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen社)；VEGFR2/KDR-ビオチン(CD309、Abcam社)などを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書に明らかにされた任意のマーカーに対する抗体は、抗体の検出を容易にする抗体の任意の標準標識により標識することができ、これは例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン/ビオチン、アビジン/ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン(PE)、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、並びに好適な放射性物質の例は、125I、131I、35S、又は3Hを含む。
【０２４１】
羊膜由来接着細胞は、単独のマーカーに対する抗体により標識し、且つ単独マーカーを基に検出及び／又は選別することができるか、或いは複数の異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識し、且つ複数のマーカーを基に選別することができる。
【０２４２】
別の実施態様において、磁気ビーズを用いて細胞を分離する、例えば、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を他の羊膜細胞から分離することができる。磁気ビーズ(直径0.5〜100μm)に結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別(MACS)技術を用いて、該細胞を選別してもよい。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を磁気ミクロスフェアに対して行なうことができる。その後、該ビーズを細胞と混合し、結合させておく。その後、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様において、その後、これらの細胞を単離し、更なる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。該細胞を再び磁場に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、別々の皿、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れることができる。
【０２４３】
羊膜由来接着細胞を、(生存を評価するための)トリパンブルー排出アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ；及び、(増殖を評価するための)チミジン取込みアッセイ、又はMTT細胞増殖アッセイなどの、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができる。寿命は、延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することなどの、当該技術分野で周知の方法によって測定してもよい。
【０２４４】
羊膜由来接着細胞はまた、当該技術分野において公知の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長(陽性選択)、望ましくない細胞の選択的破壊(陰性選択)；例えば大豆凝集素による、混合集団における示差的細胞凝集能(agglutinability)を基にした分離；凍結-解凍手法；濾過；通常の及びゾーン遠心分離；遠心溶出(対向流遠心分離)；単位重力分離；向流分配；電気泳動；などを用い、他の胎盤細胞又は羊膜細胞から分離することもできる。
【０２４５】
(5.7  羊膜由来接着細胞の培養)
(5.7.1  培養培地)
単離された羊膜由来接着細胞、そのような細胞の集団を用いて、細胞培養物をイニシエートするか、又はそれを播種することができる。一般に、細胞を、コーティングされていないか、或いはラミニン、コラーゲン(例えば、非変性若しくは変性)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL（商標）(BD DiscoveryLabware社、ベッドフォード、MA))などの細胞外マトリクス若しくは生体分子でコーティングされているかのいずれかの滅菌組織培養容器に移す。
【０２４６】
AMDACは、例えば、幹細胞の培養に適している培地において樹立することができる。樹立培地は、例えば、EGM-2培地(Lonza社)、DMEM＋10％FBS、又は60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclene Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×リノール酸-ウシ-血清-アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、上皮細胞増殖因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来増殖因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含む培地(本明細書において「標準培地」と称す)を含む。
【０２４７】
羊膜由来接着細胞は、細胞、例えば接着性胎盤幹細胞の培養に許容し得るものとして当該技術分野で認識されている任意の培地中及び任意の条件下で培養することができる。該培養培地は血清を含むことが好ましい。様々な実施態様において、AMDACの培養又は継代培養のための培地としては、STEMPRO(登録商標)(Invitrogen社)、MSCM-sf(ScienCell社、カールスバッド、CA)、MESENCULT(登録商標)-ACF培地(StemCll Technologies社、バンクーバー、カナダ)、標準培地、EGF非含有標準培地、PDGF非含有標準培地、DMEM＋10％FBS、EGM-2(Lonza社)、EGM-2MV(Lonza社)、2％、10％及び20％ES培地、ES-SSR培地、又はα-MEM-20％FBSを含む。羊膜由来接着細胞の培養に許容し得る培地は、例えば、DMEM、IMDM、DMEM(高グルコース又は低グルコース)、イーグルの基本培地、ハムのF10培地(F10)、ハムのF-12培地(F12)、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地(MSCGM、Lonza社)、ADVANCESTEM(商標)培地(Hyclone社)、KNOCKOUT(商標)DMEM(Invitrogen社)、ライボヴィッツのL-15培地、MCDB、DMIEM／F12、RPMI1640、改良DMEM(Gibco社)、DMEM／MCDB201(Sigma社)、及びCELL-GROFREEなどが挙げられる。様々な実施態様において、例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン-セレン)、LA＋BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG(ダルベッコの改変必須培地、低グルコース)／MCDB 201(ニワトリ線維芽細胞基本培地)；約2〜約20％、例えば約10％ウシ胎仔血清(FBS；例えば、限定ウシ胎仔血清、Hyclone社、ローガン、UT)を含むDMEM-HG(高グルコース)；約2〜約20％、例えば約15％FBSを含むDMEM-HG；約2〜約20％、例えば約10％FBS、約2〜約20％、例えば約10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(イスコフの改変ダルベッコ培地)；約2〜約20％、例えば約10％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199；約2〜約20％、例えば約10％FBS、GlutaMax(商標)、及びゲンタマイシンを含むα-MEM(最小必須培地)；10％FBS、GlutaMax(商標)、及びゲンタマイシンを含むDMEM；約2〜約20％、例えば約15％(v/v)ウシ胎仔血清(例えば、限定ウシ胎仔血清、Hyclone社、ローガン、UT)、抗生物質／抗真菌剤(例えばペニシリン約100ユニット/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、及び／又はアンホテリシンBの0.25μg/mL(Invitrogen社、カールスバッド、CA))、及び0.001％(v/v)β-メルカプトエタノール(Sigma社、セントルイス、MO)を含有するDMEM-LG； 2〜20％FBS、非必須アミノ酸(Invitrogen社)、β-メルカプトエタノールを補充した、KNOCKOUT(商標)-DMEM基本培地；KNOCKOUT(商標)血清代替品を補充した、KNOCKOUT(商標)基本培地；2〜20％FBSを含有するα-MEM；EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-1、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、アスコルビン酸、FBS、ゲンタマイシンを補充したEBM2(商標)基本培地などが挙げられる。
【０２４８】
培養培地には、例えば、血清(例えば、FCS又はFBS、例えば約2〜20％(v/v)；ウマ科(ウマ)血清(ES)；ヒト血清(HS))；β-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは、約0.001％(v/v)；1種以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリン様増殖因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、及びエリスロポエチン(EPO)；L-バリンを含むアミノ酸；並びに例えば、単独の又は組合せた、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための1種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を含む1種以上の成分を補充することができる。
【０２４９】
羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートにおいて、標準の組織培養条件で培養することができる。細胞はまた、ハンギングドロップ法を用いて、培養することができる。この方法において、細胞は、培地約5mL中に、約1×104個細胞/mLで懸濁され、且つ該培地の1滴以上が、組織培養容器、例えば100mLのペトリ皿の蓋の内側に垂らされる。この液滴は、例えば、単独の液滴、又は例えばマルチチャネルピペットからの複数の液滴であることができる。蓋を慎重に裏返し、且つ例えば、皿の大気中の含水量を維持するのに十分な量の滅菌PBSなどの液体量を含む皿の底面上に配置し、且つ細胞を培養する。AMDACはまた、T-フラスコ、Corning社HYPETFLASK(登録商標)、Cell Factories(Nunc)、1-、2-、4-、10-又は40-トレー細胞スタックなどの、標準又はハイボリューム又はハイスループット培養システムにおいても培養することができる。
【０２５０】
一実施態様において、羊膜由来細胞は、該細胞の未分化表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養される。具体的実施態様において、該化合物は、置換3,4-ジヒドロピリジモル[4,5-d]ピリミジンである。より具体的な実施態様において、該化合物は下記化学構造を有する化合物である。
【化９】
2014501249.tif 000022
本化合物は、羊膜由来接着細胞、又はそのような細胞の集団と、例えば、約1μM〜約10μMの濃度で、接触させることができる。
【０２５１】
(5.7.2  羊膜由来接着細胞の拡大及び増殖)
一旦単離された羊膜由来接着細胞、又は単離されたそのような細胞の集団(例えば、該細胞又は細胞集団が通常インビボで関連している羊膜細胞の少なくとも50％から分離されている、羊膜由来接着細胞又はそのような細胞の集団)、該細胞は、インビトロで増殖させ、拡大することができる。例えば、接着細胞又は羊膜由来接着細胞の集団を、組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、40〜70％コンフルエンスになるまで、すなわち、該細胞及びその子孫が、組織培養容器の培養表面積の40〜70％を占めるまで、該細胞が増殖するのに十分な時間、培養することができる。
【０２５２】
羊膜由来接着細胞は、細胞成長を可能にする密度で培養容器中に播種することができる。例えば、該細胞を、低密度(例えば約400〜約6,000個細胞/cm2)から高密度(例えば約20,000個細胞/cm2以上)で播種してもよい。好ましい実施態様において、該細胞を、大気中、約0％〜約5容積％のCO2の存在下で培養する。いくつかの好ましい実施態様において、該細胞を、大気中約0.1％〜約25％のO2、好ましくは、大気中約5％〜約20％のO2で培養する。該細胞を、約25℃〜約40℃、好ましくは37℃で培養することが好ましい。
【０２５３】
該細胞をインキュベーター内で培養することが好ましい。培養時に、培養培地は、静止状態とするか、又は例えば、バイオリアクターを用いて培養時に撹拌することができる。羊膜由来接着細胞を(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステインなどの添加により)低酸化ストレス下で成長させることが好ましい。
【０２５４】
羊膜由来接着細胞はコンフルエンスまで成長することができるが、細胞はコンフルエンスまで成長しないことが好ましい。例えば、一旦40％〜70％のコンフルエンスが得られたならば、細胞を継代してもよい。例えば、該細胞を、当該技術分野で周知の技術を用いて酵素的に処理し、例えばトリプシン処理し、それらを組織培養表面から分離することができる。該細胞をピペッティングで取り除き、該細胞を計数した後、約20,000〜100,000個の細胞、好ましくは約50,000個の細胞、又は約400〜約6,000個細胞/cm2の細胞を、新鮮な培養培地を含む新しい培養容器に継代することができる。典型的には、新しい培地は、該細胞が取り除かれた培地と同じ種類である。羊膜由来接着細胞は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20回、又はそれよりも多く継代することができる。AMDACは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49若しくは少なくとも50回、又はそれよりも多く、培養物において倍加することができる。
【０２５５】
(5.8  羊膜接着細胞を含有する組成物)
(5.8.1  羊膜接着細胞を含有する医薬組成物)
特定の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、医薬組成物内に含まれるか、又は医薬組成物の成分である。該細胞は、個体に容易に投与することができる形態、例えば医療用途に好適な容器中に含まれる羊膜由来接着細胞で調製することができる。そのような容器は、例えば、注射器、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、バイアル、瓶、又は羊膜由来接着細胞集団を容易に分注することができる他の容器であることができる。例えば、該容器は、血液バッグ又はレシピエントへの液体の静脈内投与に好適な他のプラスチック製の医療用に許容し得るバッグであることができる。容器は、特定の実施態様において、該細胞を凍結保存することができるものである。本明細書で提供される該組成物、例えば医薬組成物中の細胞は、単一のドナー、又は複数のドナーに由来する羊膜由来接着細胞を含むことができる。該細胞は、意図されるレシピエントと完全にHLAが一致するものであることができるか、又は一部若しくは完全にHLAが一致しないものであることができる。
【０２５６】
従って、一実施態様において、本明細書に提供される組成物中の羊膜由来接着細胞は、容器中に羊膜由来接着細胞を含む組成物の形態で、それを必要とする個体に投与される。別の具体的実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ、バイアル、又は瓶である。より具体的実施態様において、該バッグは、滅菌プラスチックバッグである。より具体的実施態様において、該バッグは、該接着細胞の静脈内投与、例えば静脈内注入、ボーラス注射などに好適であるか、これを可能にするか、又はこれを容易にする。該バッグは、投与の前又は投与の間に、該細胞と1種以上の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能にするために相互連結されている複数の管腔又は区画を含むことができる。別の具体的実施態様において、凍結保存前に、羊膜由来接着細胞を含む溶液は、該細胞の凍結保存を容易にする1種以上の化合物を含む。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、生理的に許容し得る水溶液に含まれている。より具体的実施態様において、該生理的に許容し得る水溶液は、0.9％NaCl溶液である。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、該細胞のレシピエントとHLAが一致する細胞を含む。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、該細胞のレシピエントと少なくとも一部HLAが一致しない細胞を含む。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、複数のドナーに由来する。様々な具体的実施態様において、該容器は、約、少なくとも、又は多くとも1×106個の該細胞、5×106個の該細胞、1×107個の該幹細胞、5×107個の該細胞、1×108個の該細胞、5×108個の該細胞、1×109個の該細胞、5×109個の該細胞、1×1010個、又は1×1011個の該細胞を含む。前述の凍結保存された集団のいずれか他の具体的実施態様において、該細胞は、約、少なくとも、又はわずかに5回、わずかに10回、わずかに15回、又はわずかに20回継代される。前述の凍結保存された細胞のいずれか別の具体的実施態様において、該細胞は、該容器内で拡大される。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の単一の単位投与量は、様々な実施態様において、約、少なくとも、又はわずかに1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多い羊膜由来接着細胞を含むことができる。
【０２５７】
特定の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、50％以上の生存細胞を含む羊膜由来接着細胞の集団を含むことができる(すなわち、該集団内の細胞の少なくとも50％は機能的であるか、又は生存している)。好ましくは、該集団内の細胞の少なくとも60％が生存している。より好ましくは、該医薬組成物中の該集団内の細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％が生存している。
【０２５８】
(5.8.2  羊膜由来接着細胞を含むマトリクス)
マトリクス、ヒドロゲル、スキャフォールドなどを含む組成物が本明細書で更に提供される。そのような組成物は、液体懸濁液中のそのような細胞の代わりに、又は細胞に加えて使用することができる。
【０２５９】
該マトリクスは、例えば、恒久的又は分解性の脱細胞性組織、例えば脱細胞化された羊膜の膜、又は合成マトリクスであることができる。該マトリクスは、三次元スキャフォールドであることができる。より具体的実施態様において、該マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、又はビトロネクチンを含む。別のより具体的実施態様において、マトリクスは、羊膜の膜又は羊膜の膜由来の生体材料である。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、合成化合物を含む。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、生体活性化合物を含む。別のより具体的実施態様において、該生体活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、又は5,000ダルトン未満の有機分子である。
【０２６０】
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を、天然マトリクス、例えば、羊膜の膜材料などの胎盤生体材料に播種することができる。そのような羊膜の膜材料は、例えば、哺乳動物の胎盤から直接解剖された羊膜の膜；固定又は熱処理された羊膜の膜、実質的に乾燥している(すなわち、＜20％H2Oの)羊膜の膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊膜と絨毛膜などであることができる。その上に本明細書に提供される羊膜由来接着細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、Haririの米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている。
【０２６１】
別の具体的実施態様において、該マトリクスは、細胞外マトリクスを含む組成物である。より具体的実施態様において、該組成物は、MATRIGEL(商標)(BD Biosciences社)である。
【０２６２】
本明細書記載の単離された羊膜由来接着細胞を、例えば注射に好適なヒドロゲル溶液中に懸濁することができる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合により架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造を作製する有機ポリマー(天然物又は合成物)である。そのような組成物のための好適なヒドロゲルは、RAD16などの自己集合ペプチドを含む。一実施態様において、該細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する埋め込み用のマトリクスを形成することができる。そのようなマトリクス中の羊膜由来接着細胞を培養し、該細胞を埋め込み前に有糸分裂で拡大させることもできる。ヒドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、アルギネート及びその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又はそれぞれ温度又はpHによって架橋される、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーが挙げられる。一部の実施態様において、ヒドロゲル又はマトリクスは生体分解性である。
【０２６３】
特定の実施態様において、本明細書に提供される細胞を含有する組成物は、インサイチュで重合可能なゲルを含む(例えば、米国特許出願公開第2002/0022676号；Ansethらの文献(J. Control Release, 78(1-3): 199-209(2002))；Wangらの文献(Biomaterials, 24(22): 3969-80(2003))を参照されたい)。いくつかの実施態様において、該ポリマーは、荷電側基、又はその一価イオン塩を有する水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも一部溶ける。カチオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はビニルエーテルポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを用いることもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ素化)アルコール基、フェノール性OH基、及び酸性OH基である。
【０２６４】
具体的実施態様において、マトリクスは、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料で製造されたマルチフィラメント糸で構成されるフェルトである。この糸は、クリッピング、カッティング、カーディング及びニードリングからなる、標準の織物処理技術を用いフェルトにされる。別の好ましい実施態様において、本発明の細胞は、複合構造であることができる、発泡体スキャフォールド上に播種される。加えて、3次元フレームワークを、修復、交換又は増強すべき体内の特定の構造物などの、有用な形状に成形することができる。他の使用することができるスキャフォールドの例としては、不織マット、多孔性発泡体、又は自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー(例えば、PGA／PLA)(VICRYL、Ethicon社、ソマービル、NJ)から構成される繊維を用いて形成することができる。フリーズドライ、又は凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ(ε-カプロラクトン)／ポリ(グリコール酸)(PCL／PGA)コポリマーから構成される発泡体(例えば、米国特許第6,355,699号参照)をスキャフォールドとして用いることもできる。
【０２６５】
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を、3次元フレームワーク又はスキャフォールドに播種し、インビボにおいて埋め込むことができる。そのようなフレームワークを、例えば組織形成、例えば骨形成又は脈管形成などを刺激する、増殖因子、細胞、薬物又は他の成分の任意の1種以上と組合せて埋め込むことができる。
【０２６６】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、別の実施態様において、複合構造物であってよい発泡体スキャフォールドに播種することができる。そのような発泡体スキャフォールドを、有用な形状、例えば、修復、交換又は増強すべき体内の特定の構造物の一部の形状に成形することができる。いくつかの実施態様において、フレームワークを、細胞接着を強化するために、例えば、0.1M酢酸で処理し、その後細胞の接種前に、ポリリジン、PBS、及び／又はコラーゲン中でインキュベートする。例えば、マトリクスのプラズマ-コーティングによるか、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など)、細胞マトリクス、並びに／又は限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどのような他の材料の添加によって、マトリクスの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
【０２６７】
いくつかの実施態様において、マトリクスは、それを非血栓形成性とする材料を含むか、又は該材料で処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞外マトリクス沈着を促進し、且つ持続させることもできる。これらの材料及び処理の例としては、天然材料、例えばラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えばEPTFE、並びにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばPURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、バークレー、CA)が挙げられるが、これらに限定されない。マトリクスは、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき；本明細書に提供される接着細胞の播種の前に、スキャフォールドを、表面電荷を変化させるように処理する(例えば、プラズマでコーティングする)こともできる。
【０２６８】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の接種前に、細胞接着を増強するために、フレームワークを処理することができる。例えば、本発明の細胞の接種前に、ナイロンマトリクスを、0.1モル酢酸で処理し、ポリリジン、PBS、及び／又はコラーゲン中でインキュベーションし、ナイロンをコーティングする。ポリスチレンは、硫酸を用い、同様に処理することができる。
【０２６９】
加えて、例えば、フレームワークのプラズマ-コーティングによるか、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸)、細胞マトリクス、並びに／又は限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、又は植物ゴムなどのような他の材料の添加によって、三次元フレームワークの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
【０２７０】
いくつかの実施態様において、マトリクスは、マトリクスを非血栓形成性にする材料、例えば、天然材料、例えばラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えばePTFE又はセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばPURSPAN(The Polymer Technology Group社、バークレー、CA)などを含むか、又は該材料で処理される。そのような材料には、スキャフォールドを非血栓形成性にするために例えばヘパリンにより、並びにプラズマでコーティングなど、材料の表面電荷を変化させる処理を更に施すことができる。
【０２７１】
羊膜由来接着細胞を含有する治療用細胞組成物はまた、マトリクス-細胞複合体の形状で提供することができる。マトリクスは、生体吸収性であるかどうかにかかわらず、生体適合性スキャフォールド、格子、自己集合構造などの、液体、ゲル又は固形物を含むことができる。そのようなマトリクスは、治療用細胞処理、外科的修復、組織工学、及び創傷治癒の分野において公知である。特定の実施態様において、該細胞は、マトリクスに接着する。他の実施態様において、該細胞は、マトリクス空間内に捕捉されるか又は含まれる。その中で細胞がマトリクスと密接に関連して成長し、且つ治療に使用される場合、レシピエントの細胞の内方成長を刺激し且つ支援するそのようなマトリクス-細胞複合体が、最も好ましい。該マトリクス-細胞組成物は、限定するものではないが、埋め込み、注射、外科的接着、他の組織との移植、注入などを含む、当該技術分野において公知のいずれかの方法により、個体の体内に導入することができる。いくつかの実施態様において、マトリクスは、インビボ、又はインサイチュにおいて形成される。例えば、インサイチュで重合可能なゲルを、本発明に従い使用することができる。そのようなゲルの例は、当該技術分野において公知である。
【０２７２】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される細胞は、スキャフォールドなどの三次元マトリクス上に播種され、且つインビボで埋め込まれ、そこで播種された細胞は、フレームワーク上若しくは中で増殖するか、又は他の細胞と共同して若しくは共同せずにインビボにおいて組織の交換を確立することを補助する。三次元フレームワーク上での羊膜由来接着細胞又はそれらの共培養物の成長は、インビボにおいて、例えば、損傷した若しくは罹患した組織の修復のために、利用することができる、三次元組織又はそれらの基礎の形成を生じることが好ましい。例としては、三次元スキャフォールドは、例えば血管修復において使用するために；又は、循環系若しくは冠血管構造の態様で、管状構造を形成するために使用することができる。本発明の一態様に従い、羊膜由来接着細胞又はその共培養物を、接種するか、或いは、スキャフォールド、発泡体又はヒドロゲルなどの、三次元フレームワーク又はマトリクス上に播種する。フレームワークは、概して平たい、一般に円筒状又は管状などの様々な形状に形作ることができるか、又は考慮される補正構造(corrective structure)のために必要であるか若しくは望ましいような完全に自由な形状であることができる。いくつかの実施態様において、羊膜由来接着細胞は、三次元構造上で成長するのに対し、他の実施態様においては、該細胞は、単に生存するか、又は死滅さえするが、レシピエントにおける新たな組織の内方成長又は血管形成を刺激若しくは促進する。
【０２７３】
本発明の細胞は、培養時は自由に成長させ、培養物から除去し、且つ三次元フレームワーク上に接種することができる。三次元フレームワークの、例えば約106〜5×107個細胞/mLの濃度の細胞による接種は、好ましくは比較的短い期間での、三次元支持体の樹立を生じる。更にいくつかの適用において、望ましい結果に応じて、より多い又はより少ない数の細胞を使用することが好ましい。
【０２７４】
具体的実施態様において、マトリクスは、その幅が、それが最終的に挿入される管状臓器の内周とほぼ等しい小片(例えば、長方形の形状)に切断することができる。羊膜由来接着細胞は、スキャフォールド上に接種され、且つ液体培地中で浮遊又は懸濁することによりインキュベーションされる。適切なコンフルエンス段階で、該スキャフォールドを、長端を一緒に合わせることにより、チューブに巻き上げる。その後継ぎ目を、適当な直径の好適な材料の糸を用い、2つの端を一緒に縫合することにより閉鎖することができる。細胞が管腔を閉塞しないように、該管状フレームワークの開放端の一方に、ノズルを取り付けることができる。液体培地を、インキュベーションチャンバーに連結された供給チャンバーからノズルを通して強制的に流し、管状フレームワークの内部を通る流れを作り出すことができる。他方の開放端を、回収チャンバーに繋がる流出口に取り付け、回収チャンバーから供給チャンバーを通って培地を再循環させることができる。インキュベーションが完了したら、チューブを、ノズル及び流出口から取り外す。例えば、国際出願WO 94/25584を参照されたい。
【０２７５】
一般に、下記の方法のいずれかを用い、本発明のチューブへと、2つの三次元フレームワークを一緒にすることができる。2つ以上の平らなフレームワークを、他方の表面に乗せ、且つ一緒に縫合する。得られる2層シートを次に巻き上げ、且つ前述のように一緒に合わせ、縫合する。特定の実施態様において、内側層として働く1つの管状スキャフォールドに、羊膜由来接着細胞を接種し、インキュベーションすることができる。第二のスキャフォールドを、該管状フレームワークの外周よりもわずかに大きい幅を持つ平坦な小片として成長させることができる。適切な成長に到達した後、該平坦なフレームワークで管状スキャフォールドの外側を包み、引き続き平坦なフレームワークの2つの端の継ぎ目を閉鎖し、平坦なフレームワークを内側チューブに縫合する。別の実施態様において、わずかに異なる直径の2つ以上の管状メッシュを、個別に成長させる。より小さい直径を持つフレームワークを、より大きいものの内側に挿入し、縫合する。これらの各方法について、この二重層のチューブに該方法を再度適用することにより、より多くの層を追加することができる。該スキャフォールドは、羊膜由来接着細胞の任意の成長段階で一緒にすることができ、且つ一緒にしたスキャフォールドのインキュベーションを、望ましい場合は継続することができる。
【０２７６】
上記と組合せて、本明細書に提供される細胞及び治療用組成物は、埋め込み可能な装置と組合せて使用することができる。例えば羊膜由来接着細胞は、例えば、ステント、人工弁、心室補助装置、Guglielmi取り外し可能なコイルなどと同時投与することができる。これらの装置はそのような治療を必要とする個体に提供される主要な治療を構成しているので、該細胞などは、埋め込まれた装置の領域での適切な治癒を補助するか、刺激するか、又は促進する支持療法又は二次的治療として使用することができる。本発明の細胞及び治療組成物を使用し、特定の埋め込み可能な装置をインビボにおいて使用した際の問題点を最小化するために、該装置を前処理することができる。コーティングされた装置を含む、そのような前処理された装置は、それらを受け取る患者による忍容性がより優れ、局所又は全身の感染症、又は例えば血管の再狭窄若しくは更なる閉塞のリスクを減らす。
【０２７７】
(5.8.3  羊膜由来接着細胞により馴化された培地)
羊膜由来接着細胞により馴化されている培地、すなわち、接着細胞により分泌又は排出された1以上の生体分子を含有する培地が、更に本明細書において提供される。様々な実施態様において、馴化培地は、その中で該細胞が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日間若しくはそれ以上成長している培地、又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20の集団倍加又はそれ以上の培地を含む。他の実施態様において、馴化培地は、その中で羊膜由来接着細胞が少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％コンフルエンス、又は最大100％コンフルエンスまで成長している培地を含む。そのような馴化培地を使用し、例えば幹細胞、例えば胎盤幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体幹細胞などの細胞の集団の培養を支援することができる。別の実施態様において、馴化培地は、その中で羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞でない細胞が一緒に培養されている培地を含む。
【０２７８】
馴化培地は、本明細書に提供された接着細胞を含むことができる。従って、羊膜由来接着細胞を含む細胞培養物が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、馴化培地は、複数の羊膜由来接着細胞、例えば羊膜由来接着細胞の集団を含む。
【０２７９】
馴化培地は、当該技術分野において公知の方法を使用し細胞培養物から回収し、且つ濾過及び／又は滅菌することができ、例えば馴化培地は、小さい細孔のフィルター(例えば0.22μMフィルター)を通り濾過される可能性のある夾雑物の活性を中和し、夾雑物を除去するよう、滅菌することができる。いくつかの実施態様において、馴化培地は、本明細書に提供される治療方法において、回収及び滅菌／濾過後直ちに使用することができる。他の実施態様において、馴化培地は、本明細書に提供される治療方法において、凍結し、及び後続の使用のために貯蔵することができる。
【０２８０】
(5.9  羊膜由来接着細胞の保存)
羊膜由来接着細胞を、例えば、回収時若しくは本明細書記載の組成物の製造前に、例えば、本明細書記載の方法を用い、保存することができ、すなわち、長期貯蔵を可能にする条件下、又は例えば、アポトーシス若しくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【０２８１】
羊膜由来接着細胞を、例えば、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2007/0190042号に記載されている、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び／又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を用いて保存することができる。一実施態様において、そのような細胞、又はそのような細胞の集団を保存する方法は、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と、該細胞又は細胞集団を接触させることを含み、ここで、該アポトーシス阻害剤は、該アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較したとき、該細胞集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的実施態様において、該アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的実施態様において、該アポトーシス阻害剤はJNK阻害剤である。より具体的実施態様において、該JNK阻害剤は、羊膜由来接着細胞の分化又は増殖を調節しない。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、分離相中に該アポトーシス阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシス阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、細胞回収組成物は加えて、乳化剤、例えば、レシチンを含む。別の実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞との接触時に、約0℃〜約25℃である。別のより具体的実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞との接触時に、約2℃〜10℃、又は約2℃〜約5℃である。別のより具体的実施態様において、該接触させることは、該細胞集団の輸送の間に行なわれる。別のより具体的実施態様において、該接触させることは、該細胞集団の凍結及び解凍の間に行なわれる。
【０２８２】
羊膜由来接着細胞の集団を、該細胞の集団をアポトーシス阻害剤及び臓器保存化合物と接触させることを含む方法によって保存することができ、ここで、該アポトーシス阻害剤は、該アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較したとき、該細胞集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的実施態様において、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載されており；ViaSpanとしても知られているもの；Southardらの文献(Transplantation, 49(2)：251-257(1990))も参照されたい)、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液である。別の実施態様において、該臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はそれらの組合せである。別の実施態様において、細胞回収組成物は加えて、2相状態にあるか又はエマルジョンとしてかのいずれかの酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。
【０２８３】
本方法の別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を、組織破壊プロセスの間に、例えば、羊膜組織の酵素的消化の間に、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はそれらの組合せを含む細胞回収組成物と接触させる。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を、組織破壊、例えば、羊膜組織の酵素的消化による回収の後に、該細胞回収化合物と接触させる。
【０２８４】
典型的には、羊膜由来接着細胞の回収、濃縮、及び単離時に、低酸素ストレス及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態様において、それゆえ、羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、回収、濃縮、又は単離時に、該保存時に6時間未満の間、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、例えば、通常の大気酸素濃度を下回る；正常な血中酸素濃度を下回る；などの酸素濃度である。より具体的実施態様において、該細胞又は該細胞の集団は、該保存時に2時間未満の間、該低酸素状態に曝される。別のより具体的実施態様において、該細胞又は該細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、1時間未満、若しくは30分未満の間、該低酸素状態に曝されるか、又は低酸素状態に曝されない。別の具体的実施態様において、該細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、剪断ストレスに曝されない。
【０２８５】
羊膜由来接着細胞を、一般に、又は本明細書に明らかにされた具体的方法により、例えば、小型の容器、例えばアンプル中の凍結保存培地に入れて凍結保存することができる。好適な凍結保存培地としては、例えば、成長培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、SigmaAldrich社カタログ番号C2695、C2639(細胞凍結培地-無血清1×、DMSO非含有)、若しくはC6039(細胞凍結培地-グリセロール1×含有最小必須培地、グリセロール、ウシ胎仔血清及びウシ血清)により確定される細胞凍結培地、Lonza ProFreeze(商標)2×培地、メチルセルロース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、ウシ(bovine)胎仔血清、ウシ(calf)胎仔血清、又はPlasmalyteをはじめとする培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。凍結保存培地は、任意にウシ胎仔血清又はヒト血清を含む、例えば約1％〜約20％、例えば約5％〜10％(v/v)の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)又はグリセロールを含むことが好ましい。凍結保存培地は、例えば、グリセロールを含むか又は含まずに、メチルセルロースなどの追加の物質を含んでいてもよい。単離された羊膜由来接着細胞を、凍結保存時に、約1℃／分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存された細胞を液体窒素の蒸気相に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様において、例えば、一旦アンプルが約-80℃に達したら、それを液体窒素保存領域に移す。凍結保存は、制御された速度のフリーザーを用いて行うこともできる。凍結保存された細胞は、約25℃〜約40℃、好ましくは約37℃の温度で解凍することが好ましい。
【０２８６】
(5.10  改変された羊膜由来接着細胞)
(5.10.1  遺伝子改変された羊膜由来接着細胞)
別の態様において、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、例えば関心対象の核酸若しくはポリペプチドを生成するように、又は例えば、関心対象の核酸若しくはポリペプチドを生成する骨形成原細胞、筋原細胞、周皮細胞、若しくは血管新生細胞などの分化された細胞を生成するように、遺伝子改変されることができる。遺伝子改変は、例えば、限定するものではないが、例えば、パピローマウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクターなどの非組込み複製ベクター；例えば、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどの組込みウイルスベクター；又は、複製欠損ウイルスベクターを含む、ウイルス-ベースのベクターを用い、達成することができる。DNAを細胞へ導入する他の方法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、粒子銃、直接DNA注入などを含む。
【０２８７】
本明細書に提供される接着細胞は、例えば、プロモーター配列若しくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、配列内リボソーム進入部位などの、1以上の好適な発現制御エレメントにより制御された又はそれとの機能的に関連して制御されたDNAにより形質転換又はトランスフェクトされ得る。そのようなDNAは、選択マーカーを組込んでいることが好ましい。外来DNAの導入後、操作された接着細胞を、例えば、強化培地において成長させ、その後選択培地に交換することができる。一実施態様において、羊膜由来接着細胞を操作するために使用したDNAは、例えば、サイトカイン、増殖因子、分化物質、又は治療的ポリペプチドなどの、関心対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
【０２８８】
接着細胞を操作するために使用するDNAは、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞におけるヌクレオチド配列の発現を駆動するために、当該技術分野において公知の任意のプロモーターを含むことができる。例えばプロモーターとしては、CMVプロモーター/エンハンサー、SV40プロモーター、パピローマウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルスプロモーター、エラスチン遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的実施態様において、該プロモーターは、該ヌクレオチド配列が、望ましい時のみに発現されるように、調節可能である。プロモーターは、誘導性(例えば、メタロチオネイン及びヒートショックタンパク質に関連したもの)又は構成性のいずれかであることができる。
【０２８９】
別の具体的実施態様において、プロモーターは、組織-特異的であるか、又は組織特異性を示す。そのようなプロモーターの例としては、ミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Shaniの文献、1985、Nature, 314:283)(骨格筋)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２９０】
本明細書に明らかにした羊膜由来接着細胞は、そのような細胞の1種以上の遺伝子を「ノックアウト」又は「ノックダウン」発現するように操作するか、又はそうでなければ選択してよい。細胞に本来備わる遺伝子の発現は、例えば、相同組換えなどによる完全な遺伝子の失活による、発現の阻害により、低下することができる。一実施態様において、例えば、タンパク質の重要な領域をコードしているエキソン、又はその領域に対するエキソン5'は、例えば、正常なmRNAの標的遺伝子からの生成を妨害し且つ該遺伝子の失活を生じるneoなどの、陽性選択マーカーにより妨害される。遺伝子はまた、遺伝子の一部欠失を作製することによるか、又は全遺伝子を欠失することにより、失活することもできる。該ゲノム内で遠く離れた標的遺伝子と相同な2つの領域を伴う構築体を用いることにより、これら2つの領域に介在する配列を欠失することができる(Mombaertsらの文献、1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084)。標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、モルホリノ、DNAzyme、低分子干渉RNA、ショートヘアピンRNA、及びリボザイム分子もまた、該接着細胞における標的遺伝子活性のレベルを低下するために使用することができる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害するアンチセンスRNA分子は、免疫反応に関して最も汎用性がある(versatile)ことが示されている。3本鎖分子を、標的遺伝子活性のレベルの低下に利用することができる。例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、L. G. Davisら編集の文献「分子生物学における基本的方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)」、第2版、1994年、Appleton & Lange社、ノーウォーク、CNを参照されたい。
【０２９１】
具体的実施態様において、本明細書に明らかにされた羊膜由来接着細胞は、関心対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子により遺伝子改変することができ、ここで関心対象のポリペプチドの発現は、外因性因子、例えば、ポリペプチド、小型有機分子などにより制御可能である。関心対象のポリペプチドは、治療用ポリペプチドであることができる。より具体的実施態様において、関心対象のポリペプチドは、IL-12又はインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)である。別のより具体的実施態様において、関心対象のポリペプチドは、インターロイキン-1受容体アンタゴニストとジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の融合物であり、且つ該外因性因子は、葉酸代謝拮抗物質、例えばメトトレキセートである。そのような構築体は、メトトレキセートとの接触時に、IL-1Ra、又はIL-1RaとDHFRの融合物を発現する羊膜由来接着細胞の操作において有用である。そのような構築体は、例えば、関節リウマチの治療において使用することができる。この実施態様において、IL-1RaとDHFRの融合物は、メトトレキセートなどの葉酸代謝拮抗物質への曝露時に、翻訳によりアップレギュレートされる。従って別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を遺伝子操作するために使用される核酸は、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことができ、ここで該第一及び第二のポリペプチドは、外因性因子の存在下で翻訳によりアップレギュレートされる融合タンパク質として発現される。該ポリペプチドは、一時的に又は長期に(例えば、数週間又は数ヶ月にわたり)発現されることができる。そのような核酸分子は更に、操作された細胞の陽性選択を可能にするか、又は操作された細胞の可視化を可能にするポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。別のより具体的実施態様において、該ヌクレオチド配列は、例えば適切な可視化条件下で蛍光を発するポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ(Luc)をコードしている。より具体的実施態様において、そのような核酸分子は、IL-1Ra-DHFR-IRES-Lucを含むことができ、ここでIL-1Raはインターロイキン-1受容体アンタゴニストであり、IRESは配列内リボソーム進入部位であり、及びDHFRはジヒドロ葉酸レダクターゼである。
【０２９２】
(5.10.2  不死化羊膜由来接着細胞株)
成長促進タンパク質の産生及び／又は活性が外部因子によって調節可能であるように、哺乳動物の羊膜由来接着細胞を、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、トランスフェクトされた細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の好適なベクターによるトランスフェクションによって、条件的に不死化することができる。好ましい実施態様において、成長促進遺伝子は、限定するものではないが、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスのE7タンパク質などのオンコジーンである。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、Narushima、M.らによりヒト膵β-細胞株について例示されたようなcre-lox組換え(Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274-1282))を用い不死化することができる。
【０２９３】
成長促進タンパク質の外部調節は、外部調節可能なプロモーター、例えば、その活性を、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は該細胞と接触する培地の組成を変更することによって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を配置することによって達成することができる。一実施態様において、テトラサイクリン(tet)制御遺伝子発現系を利用することができる(Gossenらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547-5551, 1992)；Hoshimaruらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：1518-1523, 1996)を参照されたい)。tetの非存在下で、このベクター内のtet制御性トランス活性化因子(tTA)は、tetオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphCMV*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌のトランスポゾン-10由来のtet耐性オペロンのリプレッサー(tetR)と単純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインの融合タンパク質である。tetの低い、非毒性濃度(例えば、0.01〜1.0μg/mL)は、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。
【０２９４】
一実施態様において、ベクターは、選択マーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を更に含む。細菌のネオマイシン耐性遺伝子(neoR)は、本方法において利用し得るそのようなマーカーの1つである。neoRを有する細胞は、成長培地への、例えば、100〜200μg/mLのG418の添加などの、当業者に公知の手段によって選択することができる。
【０２９５】
トランスフェクションは、限定するものではないが、レトロウイルス感染を含む、当業者に公知の種々の手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養物を、ベクターのプロデューサー細胞株から回収される馴化培地とN2補給剤含有DMEM／F12の混合物とのインキュベーションによってトランスフェクトすることができる。例えば、上記のように調製された胎盤細胞培養物を、例えば、5日後にインビトロで、1容量の馴化培地と2容量のN2補充剤含有DMEM／F12中での約20時間のインキュベーションによって感染させることができる。その後、選択マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を、上記のように選択することができる。
【０２９６】
トランスフェクション後、培養物を、増殖を可能にする、例えば、24時間の間に細胞の少なくとも約30％を倍加させる表面上で継代する。好ましくは、該基材は、ポリオルニチン(10μg/mL)及び／若しくはラミニン(10μg/mL)でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基材、ポリリジン／ラミニン基材、又はフィブロネクチンで処理された表面である。その後、培養物に、3〜4日ごとに成長培地を供給し、この成長培地には、1種以上の増殖増強因子が補充されていてもよいし、補充されていなくてもよい。増殖増強因子は、培養物が50％未満のコンフルエントである場合に、成長培地に添加してもよい。
【０２９７】
80〜95％コンフルエントになったとき、条件的に不死化された羊膜由来接着細胞株を、標準的な技術を用いて、トリプシン処理などによって継代することができる。約20回目の継代までは、いくつかの実施態様において、選択(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞の場合、G418の添加による)を維持することが有益である。細胞は、長期保存のために液体窒素中で凍結することもできる。
【０２９８】
クローン細胞株を、上記のように調製された条件的に不死化された接着細胞株から単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞株を、標準的な技術を用いて、例えば、限定希釈によるか、又はクローニングリングを用いて単離し、拡大することができる。一般に、クローン細胞株に、上記のように栄養を与え、それを継代することができる。
【０２９９】
クローンであってもよいが、その必要はない、条件的に不死化されたヒト羊膜由来接着細胞株は、一般に、分化を促進する培養条件下で成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を抑制することによって、分化するように誘導することができる。例えば、成長促進タンパク質をコードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば培地の温度又は組成を変更して、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。上で論じられているテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、成長促進遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって、分化を達成することができる。一般に、分化を開始するのに、4〜5日間の1μg/mLのテトラサイクリンで十分である。更なる分化を促進するために、追加の薬剤を成長培地に含めてもよい。
【０３００】
(5.11  投与量及び投与経路)
羊膜由来接着細胞(AMDAC)を必要とする個体へのAMDACの投与は、治療される免疫関連疾患又は病態に関連した任意の医学的に許容し得る経路によることができる。前述の治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACはボーラス注射により投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、静脈内に、例えば静脈内注入により投与される。具体的実施態様において、該静脈内注入は、約1〜約8時間にわたる静脈内注入である。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、局所的に、例えば免疫関連疾患又は病態に罹患した個体の体の特定の部位に投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは頭蓋内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは筋肉内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは腹腔内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、動脈内投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、筋肉内、皮内、又は皮下投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは静脈内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは心室内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは胸骨内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは滑液嚢内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは眼球内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは硝子体内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは大脳内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは脳室内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは髄腔内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは骨内注入される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは膀胱内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは経真皮投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは嚢内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは表皮投与される。
【０３０１】
前述の治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、該個体へ一度に投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、該個体へ2回以上に分けて投与される。別の具体的実施態様において、該投与は、例えば該個体1kgにつきAMDACを、約1×104〜1×105個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×105〜1×106個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×106〜1×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×107〜1×108個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×108〜1×109個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×109〜1×1010個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×1010〜1×1011個の単離されたAMDACを投与することを含む。
【０３０２】
他の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×106〜約2×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約2×106〜約3×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約3×106〜約4×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約4×106〜約5×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約5×106〜約6×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約6×106〜約7×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約7×106〜約8×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約8×106〜約9×106個の単離されたAMDAC；又は、該個体1kgにつき、約9×106〜約1×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、該個体1kgにつき、約1×107〜約2×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、該個体1kgにつき、約1.3×107〜約1.5×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、該個体1kgにつき、約3×107個までの単離されたAMDACを投与することを含む。具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、約5×106〜約2×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、溶液約20mL中、約150×106個の単離されたAMDACを投与することを含む。
【０３０３】
前述の治療方法の別の具体的実施態様において、単離されたAMDACは、単回単位投与量で、個体へ投与される。具体的実施態様において、AMDACの単回単位投与量は、様々な実施態様において、約、少なくとも、又はわずかに1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多いAMDACを含むことができる。
【０３０４】
具体的実施態様において、該投与は、該個体への約5×106〜約2×107個の単離されたAMDACの投与を含み、ここで該細胞は、10％デキストラン、例えばデキストラン-40、5％ヒト血清アルブミン、及び任意に免疫抑制薬を含有する溶液中に含まれる。別の具体的実施態様において、該投与は、約5×107〜3×109個の単離されたAMDACを静脈内投与することを含む。より具体的実施態様において、該投与は、約9×108個の単離されたAMDAC又は約1.8×109個の単離されたAMDACを静脈内に投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、約5×107〜1×108個の単離されたAMDACを頭蓋内投与することを含む。より具体的実施態様において、該投与は、約9×107個の単離されたAMDACを頭蓋内投与することを含む。
【０３０５】
AMDACにより馴化された培地を必要とする個体への該培地の投与は、限定するものではないが、ボーラス注射、静脈内(例えば静脈内注入による)、局所的(例えばCNS損傷に随伴する疾患、障害又は病態に罹患した個体の体の特定の部位へ)、頭蓋内、筋肉内、腹腔内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、心室内、滑液嚢内、眼球内、硝子体内、大脳内、脳室内、髄腔内、骨内注入により、膀胱内、経真皮、嚢内、又は表皮を含む、治療されるCNS損傷に随伴する疾患、障害又は病態に関連した任意の医学的に許容し得る経路によることができる。具体的実施態様において、AMDACにより馴化された培地は、連続注入により投与される。別の具体的実施態様において、AMDACにより馴化された培地は、単回投与量として投与される。
【０３０６】
いくつかの実施態様において、AMDACにより馴化された培地を必要とする個体への該培地の投与は、体重100gにつき約0.01〜約0.02mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.05mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.1mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.15mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.2mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.25mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.3mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.35mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.4mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.45mlのAMDACにより馴化された培地、又は体重100gにつき約0.01〜約0.5mlのAMDACにより馴化された培地の投与を含む。
【０３０７】
(5.12  羊膜由来接着細胞の分化)
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、分化することができる。一実施態様において、例えば、該細胞を血管内皮増殖因子(VEGF)と接触することによるか、又は下記5.11.2節、6.3.3節、若しくは6.3.4節に記されたように、該細胞が、内皮細胞、筋原細胞、又は周皮細胞の少なくとも1つの特徴を示すのに十分であるように、該細胞は分化される。より具体的実施態様において、該内皮細胞、筋原細胞又は周皮細胞の特徴は、OCT-4-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である羊膜細胞と比べ増大している、CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神経/グリア細胞抗原2)又はα平滑筋アクチンの1以上の発現である。他のより具体的実施態様において、該内皮細胞、筋原細胞又は周皮細胞の特徴は、OCT-4-、VEGFR2/KDR+、及びVEGFR1/Flt-1+である羊膜細胞と比べ増大している、CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神経/グリア細胞抗原2)又はα平滑筋アクチンの1以上の発現である。
【０３０８】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の筋原(心筋原)分化は、例えば、心筋細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に細胞を配置することにより、達成することができる。好ましい心筋原性培地は、レチノイン酸1μM；塩基性線維芽細胞増殖因子10ng/mL；及び、トランスフォーミング増殖因子β-1、2mg/mL；及び上皮細胞増殖因子、100mg/mLを補充したDMEM/20％CBSを含む。ノックアウト代替血清(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を、CBSの代わりに使用することができる。或いは、羊膜由来接着細胞は、1〜100、例えば50ng/mLのカルジオトロピン-1を補充したDMEM/20％CBSにおいて、24時間培養することができる。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、タンパク質-非含有培地において10〜14日間培養し、5〜7日間、その後例えば1％臍帯血血清を補充した1％HEPES緩衝液中でヒト心筋層を均質化することにより作製したヒト心筋層抽出物で刺激することができる。
【０３０９】
分化は、例えばRT/PCRによるか、又は目視できる細胞の拍動により、心臓アクチン遺伝子発現を明らかにすることにより確認することができる。接着細胞が、これらの特徴の1以上を示す場合、該細胞は、心臓細胞へ分化していると考えられる。
【０３１０】
(5.12.1  神経原性細胞への分化)
羊膜由来の血管新生細胞は、神経原性条件下で培養する場合、神経の形態及び神経のマーカーを示す細胞へと分化する。例えば、AMDACは、例えば15％v/v FBSを含有するDMEM/F12培地において、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の例えば約20ng/ml、上皮細胞増殖因子(EGF)の例えば約20ng/mlと一緒に、例えば4日間拡大され、引き続き200mMブチル化ヒドロキシアニソール、10nM塩化カリウム、5mg/mLインスリン、10nMフォルスコリン、4nMバルプロ酸、及び2nMヒドロコルチゾンを含む、無血清DMEM/F12を含有する誘導培地において4日間培養された。これらの条件下で、抗体染色により評価される、AMDACは、ヒトネスチン、Tuj1及びGFAPの発現を示す。
【０３１１】
(5.12.2  骨形成原細胞への非分化)
羊膜由来接着細胞は、骨形成に関する標準アッセイにおいて、骨形成分化を示さない。例えば一実施態様において、AMDACによる骨形成分化の欠落が、例えば骨形成性条件下でのAMDACのvon Kossa染色の欠如により示されるような、カルシウム沈着の欠如により示すことができる。例えば、AMDAC、例えば新たに調製した又は凍結保存したAMDACを、例えば成長培地中の24-ウェルプレート及び6-ウェルプレート内に約5000個細胞/cm2で、成長培地中に懸濁し、且つ一晩インキュベーションし、その後骨形成性培地において14〜35日間、例えば28日間培養する。特定の実施態様において、骨形成性培地は、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)を例えば1〜100ng/mL、例えば20ng/mL及びヒト組換え骨形成タンパク質-2(BMP-2)を例えば1〜100ng/mL、例えば40ng/mL補充した、DMEM-低グルコース、10％v/vウシ胎仔血清(FBS)、10mMβグリセロリン酸、100nMデキサメタゾン、及び100μMアスコルビン酸ホスフェートを含む。その後細胞は、標準のプロトコールを使用するvon Kossa染色を用い、染色し；黒銀色の沈着物の出現は、石灰化の存在を示している。AMDACの場合、培養物は、例えば骨髄-間葉系幹細胞と比べると、実質的に、例えば完全に、沈着物を含まず、このことは、AMDACはカルシウム沈着物を生じず、従って骨形成経路へと分化しないことを示している。
【０３１２】
(5.12.3  軟骨形成原細胞への非分化)
羊膜由来接着細胞は同様に、軟骨形成に関する標準アッセイにおいて軟骨形成性の分化を示さない。例えば一実施態様において、例えば、細胞の軟骨形成原細胞がペレット化する軟骨形成アッセイにおける細胞ペレットのAMDACによる出現の欠如により、AMDACによる軟骨形成性の分化の欠如を示すことができる。例えばAMDAC、例えば新たに調製するか又は凍結保存した、例えば2.5×105個の細胞を、15mLコニカルチューブ内に配置し、200×gで5分間、室温で遠心分離し、球状細胞ペレットを形成する。その後回収された細胞を、軟骨形成誘導培地、例えばTGFβ-3(例えば約10ng/mL)、組換えヒト成長/分化因子-5(rhGDF-5)(例えば約500ng/mL)、又はTGFβ-3(10ng/mL)とrhGDF-5(例えば約500ng/mL)の組合せを含有するLonza軟骨細胞培地において、3週間培養する。3週間経過した時点で、細胞を、アリシアンブルーで染色し、これは軟骨形成原細胞により生成されるムコ多糖及びグリコサミノグリカンを染める。典型的には、BM-MSC又は軟骨細胞は、これらの条件下で培養した場合、アリシアンブルーで陽性染色する細胞ペレットを出現させるが、AMDACはペレットを形成せず、アリシアンブルーによっても染まらない。
【実施例】
【０３１３】
(6.  実施例)
(6.1  実施例1：羊膜の膜からの接着細胞の単離及び拡大)
本実施例は、羊膜由来接着細胞の単離及び拡大を明らかにする。
【０３１４】
(6.1.1  単離)
羊膜由来接着細胞は、以下のように羊膜の膜から単離した。羊膜/絨毛膜を胎盤から切除し、羊膜を手作業で絨毛膜から分離した。羊膜を、滅菌PBSによりすすぎ、残留血液、血塊及び他の物質を取り除いた。滅菌ガーゼを使用し、すすぎにより取り除くことができなかった更なる血液、血塊又は他の物質を除去し、且つ羊膜を再度PBSによりすすいだ。過剰なPBSを、膜から除去し、且つ羊膜を、外科用メスにより、2インチ×2インチ（5.08cm×5.08cm）の切片に切断した。上皮細胞放出のために、処理容器を、滅菌ジャケット付きガラス処理容器を、37℃の循環水浴に、チューブとコネクターを用いて接続することにより設定し、且つ攪拌プレート上に設置した。トリプシン(0.25％、300mL)を、処理容器中37℃に温め；羊膜切片を追加し、且つ羊膜/トリプシン懸濁液を、例えば、100RPM〜150RPMで、37℃で15分間攪拌した。処理容器に隣接する無菌野上に無菌レセプタクルを配置し、且つレセプタクルに滅菌75μm〜125μmスクリーン(Millipore社、ビレリカ、MA)を挿入することにより、無菌スクリーニングシステムを集成した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物を、スクリーンに移し、且つ羊膜切片を、例えば滅菌ピンセットを用いて、処理容器へ戻し；上皮細胞を含有するトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を、前述のように、再度トリプシン溶液(0.25％)300mLと一緒に攪拌した。スクリーンを、およそ100〜150mLのPBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。その後羊膜切片を、処理容器に戻し；上皮細胞を含むトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を再度、前述のように、トリプシン溶液(0.25％)300mLと攪拌した。スクリーンを、およそ100〜150mLのPBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。その後羊膜切片を、処理容器に戻し、上皮細胞を含むトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を、PBS/5％FBS(羊膜のPBS/5％FBS溶液に対する容積比1:1)中で37℃でおよそ2〜5分間、攪拌し、トリプシンを中和した。新鮮な無菌スクリーンシステムを集成した。トリプシンの中和後、処理容器の内容物を、新たなスクリーンに移し、羊膜切片を処理容器に戻した。室温で滅菌PBS(400mL)を処理容器に添加し、処理容器の内容物をおよそ2〜5分間攪拌した。スクリーンをおよそ100〜150mLのPBSですすいだ。攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移し；処理フラスコを、PBSですすぎ、且つこのPBS溶液を廃棄した。その後処理容器を、300mLの予め温めたDMEMで満たし、且つ羊膜切片をDMEM溶液に移した。
【０３１５】
羊膜由来接着細胞の放出のために、処理した羊膜の膜を、更に以下のようにコラゲナーゼで処理した。適量のコラゲナーゼ粉末(供給業者から受け取ったコラゲナーゼロットの活性によって変動)をDMEM中に溶解することにより、滅菌コラゲナーゼストック液(500U/mL)を調製した。この溶液を、0.22μmフィルターを通して濾過し、個別の滅菌容器に分注した。CaCl2溶液(0.5mL、600mM)を、各100mL投与量に添加し、且つこれらの投与量を凍結した。コラゲナーゼ(100mL)を、処理容器中の羊膜切片に添加し、且つこの処理容器を、30〜50分間、又は羊膜消化が目視検査により完了するまで、攪拌した。羊膜消化が完了した後、予め温めた滅菌PBS/5％FBSの100mLを処理容器に添加し、処理容器を更に2〜3分間攪拌した。攪拌した後、フラスコの内容物を、無菌60μmスクリーンに移し、液体を真空濾過により回収した。処理容器を、400mLのPBSですすぎ、且つPBS溶液を滅菌濾過した。濾過した細胞懸濁液をその後、300×gで15分間、20℃で遠心分離し、細胞ペレットを、予め温めたPBS/2％FBS(合計およそ10mL)に再懸濁した。
【０３１６】
(6.1.2  樹立)
新たに単離された血管新生羊膜細胞を、60％DMEM-LG(Gibco社)；40％MCBD-201(Sigma社)；2％FBS(Hyclone Labs)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)；10ng/mLリノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)；1n-デキサメタゾン(Sigma社)；100μMアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)；10ng/mL上皮細胞増殖因子(R & D Systems社)；及び、10ng/mL血小板由来増殖因子(PDGF-BB)(R & D Systems社)を含有する成長培地に添加し、且つT-Flask内に、播種密度10,000個細胞/cm2でプレーティングした。その後培養装置を、37℃で、5％CO2、湿度＞90％でインキュベーションした。細胞の接着、成長及び形態を、毎日モニタリングした。非接着細胞及びデブリを、培地交換により除去した。培地交換は、1週間に2回行った。典型的線維芽細胞様/紡錘体形の形態を持つ接着細胞が、最初のプレーティング後数日で出現した。コンフルエンスが40％〜70％に達した時点で(最初のプレーティング後4〜11日目)、これらの細胞を、5分間、室温で(37℃)でのトリプシン処理(0.25％トリプシン-EDTA)により収集した。PBS-5％FBSによる中和後、細胞を200〜400gで、5〜15分間、室温で遠心分離し、その後成長培地中に再懸濁した。この時点で、AMDAC株は、初代継代時にうまく樹立されたとみなした。初代継代した羊膜由来接着細胞を、場合によっては、凍結保存又は拡大した(例えば細胞数が増えるよう培地内で成長)。
【０３１７】
(6.1.3  培養手順)
羊膜由来接着細胞を、前述の成長培地において培養し、且つ適切な組織培養物を処理する培養装置中で、密度2000〜4000個/cm2で播種した。次に培養装置を、37℃、5％CO2、湿度＞90％でインキュベーションした。培養時に、AMDACは、接着し且つ増殖した。細胞の成長、形態、及びコンフルエンスは、毎日モニタリングした。培養が5日目以上に延びた場合は、培地交換は、新鮮な栄養素を補給するために、週2回行った。コンフルエンスが40％〜70％に達した時点で(播種後3〜7日目)、これらの細胞を、5分間、室温で(37℃)でのトリプシン処理(0.05％〜0.25％トリプシン-EDTA)により収集した。PBS-5％FBSによる中和後、細胞を200〜400gで、5〜15分間、室温で遠心分離し、その後成長培地中に再懸濁した。
【０３１８】
この様式で、単離され且つ培養されたAMDACは、典型的にはプレーティングした1×106個細胞から、33530±15090個コロニー-形成単位(線維芽細胞)(CFU-F)を生成した。
【０３１９】
(6.2  実施例2：羊膜由来接着細胞の表現型特徴)
(6.2.1  遺伝子及びタンパク質発現プロファイル)
本実施例は、特徴的細胞表面マーカー、mRNA、及びプロテオミクス発現を含む、羊膜由来接着細胞の表現型の特徴を説明する。
【０３２０】
(試料調製)：羊膜由来接着細胞を、実施例1記載のように得た。継代数6の細胞を、およそ70％コンフルエンスまで、上記の実施例1に説明したような成長培地において、成長させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄した。NTERA-2細胞(アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、ATCC番号CRL-1973)を、4.5g/Lグルコース、2mMグルタミン及び10％FBSを含有するDMEMにおいて成長させた。有核細胞のカウントを行い、最低2×106〜1×107個の細胞を得た。次に細胞を、QIAshredderを利用する、Qiagen RNeasyキット(Qiagen社、バレンシア、CA)を用いて溶解し、溶解液を得た。次にRNA単離を、Qiagen RNeasyキットを用いて行った。RNA量及び品質を、Nanodrop ND1000分光光度計を用いて、RNA/反応物25ng/μLと決定した。Applied Biosystems社(フォスターシティ、CA)のHigh Capacity cDNAアーカイブキットを用い、cDNA反応物を調製した。リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystems社のTAQMAN(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックスを用い実行した。反応は、Applied Biosystems社7300リアルタイムPCRシステムにおいて、40サイクル、標準モードで試行した。
【０３２１】
(試料の分析及び結果)：リアルタイムPCR法及び特異的TAQMAN(登録商標)遺伝子発現プローブ及び／又はTAQMAN(登録商標)ヒト血管新生アレイ(Applied Biosystems社)を用い、細胞を、幹細胞関連マーカー、血管新生マーカー及び心筋原性マーカーの発現について特徴付けた。結果は、関連細胞対照と比較した関心対象の遺伝子の相対発現、又は遍在性に発現されたハウスキーピング遺伝子(例えばGAPDH、18S、又はGUSB)と比較した関心対象の遺伝子の相対発現(デルタCt)のいずれかとして表した。
【０３２２】
羊膜由来接着細胞は、様々な幹細胞関連遺伝子、血管新生遺伝子及び心筋原性遺伝子を発現し、且つNTERA-2細胞と比べ、OCT-4の発現が相対的に存在しないことを示した。表8は、選択された血管新生遺伝子、心筋原性遺伝子、及び幹細胞遺伝子の発現をまとめて、且つ図1は、幹細胞関連遺伝子POU5F1(OCT-4)、NANOG、SOX2、NES、DNMT3B、及びTERTのAMDACにおける発現の欠如を明らかにしている。
【表９】
2014501249.tif 000023
2014501249.tif 000024
2014501249.tif 000025
【０３２３】
別の実験において、AMDACは加えて、アリール炭化水素受容体核移行因子2(ARNT2)、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュートロフィン-3(NT-3)、NT-5、低酸素-誘導因子1α(HIF1A)、低酸素-誘導タンパク質2(HIG2)、ヘムオキシゲナーゼ(脱環化)1(HMOX1)、細胞外スーパオキシドジスムターゼ[Cu-Zn](SOD3)、カタラーゼ(CAT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、トランスフォーミング増殖因子β1受容体(TGFB1R)、及び肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c-met)の遺伝子を発現することがわかった。
【０３２４】
(6.2.2  羊膜由来接着細胞の評価のためのフローサイトメトリー)
フローサイトメトリーを、羊膜由来接着細胞の表現型マーカーを定量する方法として使用し、該細胞の同一性を画定した。細胞試料を、凍結ストックから得た。解凍する前及び試薬調製時には、細胞バイアルをドライアイス上に維持した。引き続き、試料を、37℃水浴を用いて急速に解凍した。予め凍結した細胞のカウントを、初回解凍後の細胞数に左右される希釈の計算に用いた。簡単に述べると、クリオバイアルを、およそ30秒間穏やかに攪拌して37℃の水浴中で解凍した。解凍直後に、冷(2〜8℃)解凍溶液(2.5％アルブミン及び5％Gentran 40を含むPBS)およそ100〜200μLを、クリオバイアルに添加し、且つ混合した。穏やかに混合した後、クリオバイアル中の総容量を等容量の冷(2〜8℃)解凍溶液が入った15mLコニカルチューブに移した。細胞をコニカルチューブ内で、400gで5分間、室温で遠心分離し、その後上清を取り除いた。残存する容積を、ピペットにより測定し(概算)；残存容積及び細胞ペレットを、PBS中1％FBSの中に、室温で再懸濁し、細胞濃度250×103個細胞/100μL緩衝液を達成した。例えば1×106個細胞を、1％FBSの400μL中に再懸濁した。細胞懸濁液を、予めラベルを付けた5mL FACSチューブ(Becton Dickinson(BD)社、フランクリンレーク、NJ)に配置した。各一次抗体アイソタイプに関して、細胞懸濁液100μLを、1個のアイソタイプ対照チューブに入れアリコートとした。表現型分析の前に、全ての抗体の濃度を、良好なシグナル対ノイズ比、及び可能な4log動作範囲にわたるCD抗原の適正な検出を実現するように最適化した。各試料を染色するために使用した各アイソタイプ及び試料抗体の容積を決定した。アイソタイプチューブ及び試料チューブ中の抗体の量(μg)を標準化するために、各抗体の濃度を、下記式で計算した：（1／実際の抗体濃度(μg/μL)）×（2.5×105個細胞についての所望の最終的抗体量(μg)）＝添加した抗体数(μL)。アイソタイプ及び試料の両方の抗体のマスター混合物は、各チューブに適量の抗体を添加して作製した。細胞を、室温、暗所で、15〜20分間染色した。染色後、各試料中の未結合の抗体を、遠心分離(400g×5分間)により除去し、引き続き1％FBS/PBS(室温)2mLを用いて洗浄し、その後、室温で1％FBS/PBSの150μL中に再懸濁した。次に試料を、製造業者の指示に従い使用のために調製したBecton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI、又はBD FACSCantoIIフローサイトメーターにおいて分析した。多重-パラメーターのフローサイトメトリーデータセット(側方散乱光(SSC)、前方散乱光(FSC)及び積分された蛍光プロファイル(FL))を、実行時(on-the-fly)計器補正パラメータを設定することなく獲得した。補正パラメータは、FACSDivaソフトウェアを製造業者の指示に従い用い取得した後、決定した。これらの計器設定を、各試料に適用した。これらの試験に使用したフルオロフォア複合体は、アロフィコシアニン(APC)、AlexaFluor 647(AF647)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、及びペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)であり、これらは全てBD Biosciences社から入手した。表9に、血管新生マーカーを含む、選択された細胞-表面マーカーの発現をまとめている。
【表１０】
2014501249.tif 000026
【０３２５】
別の実験において、AMDAC細胞を、抗-ヒトCD49f(クローンGoH3、フィコエリトリン-複合型；BD Pharmingen社、パーツ番号555736)により標識し、且つフローサイトメトリーにより分析した。AMDACのおよそ96％が、抗-CD49fで標識された(すなわち、CD49f+であった)。
【０３２６】
別の実験において更に、AMDACは、免疫局在化によりCD49a、CD106、CD119、CD130、c-met(肝細胞増殖因子受容体；HGFR)、CXCケモカイン受容体1(CXCR1)、PDGFRA、及びPDGFRBを発現することが、免疫局在化により認められた。AMDACはまた、免疫局在化により、CD49e、CD62E、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR3)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー12A(TNFRSF12A)、インスリン-様増殖因子1受容体(IGF-1R)、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、ケモカイン受容体1(CCR1)、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、上皮細胞増殖因子受容体(EGF-R)、インスリン受容体(CD220)、インターロイキン受容体4(IL4-R；CD124)、IL6-R(CD126)、TNF-R1a及び1b(CD120a、b)、並びにerbB2/Her2の発現を欠くことが認められた。
【０３２７】
(6.2.3  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための免疫組織化学(IHC)/免疫蛍光化学(IFC))
継代数6の羊膜由来接着細胞を、4-ウェルチャンバースライド上でおよそ70％コンフルエンスまで成長させ、各々4％ホルマリン溶液で30分間固定した。固定後、スライドをPBSで2回、5分間すすいだ。その後スライドを、PBS中の二次抗体としての同じ宿主由来の10％正常血清、2×カゼイン、及び0.3％ Triton X100と一緒に、加湿チャンバーにおいて、室温で、20分間インキュベーションした。過剰な血清を、吸い取って除き、スライドを、加湿チャンバー内で一次抗体(ヤギポリクローナルIgG(Santa Cruz社；サンタクルーズ、CA)と一緒にインキュベーションした。インキュベーションの時間及び温度は、使用した抗体に関する最適条件を選択することにより決定した。概して、インキュベーション時間は、37℃で1〜2時間、又は4℃で一晩であった。その後スライドを、PBSで3回、各5分間すすぎ、一次抗体の宿主に対する蛍光-複合した抗-免疫グロブリン二次抗体(ウサギ抗-ヤギ抗体(Santa Cruz社))と一緒に、加湿チャンバー内、室温で、20〜30分間インキュベーションした。その後、スライドをPBSで3回、各5分間すすぎ、核の対比染色のために、DAPI Vectashield(登録商標)(Vector Labs社)マウンティング溶液を利用し、カバースリップを据え付けた。細胞染色は、Nikon蛍光顕微鏡を利用し、視覚化した。全ての画像を、対応するアイソタイプ(ヤギIgG(Santa Cruz社))のバックグラウンドに対し規準化された、等しい露光時間で撮影した。表10は、羊膜由来接着細胞による血管新生タンパク質の発現の結果をまとめている。
【表１１】
2014501249.tif 000027
【０３２８】
羊膜由来接着細胞は、表10に示されたタンパク質の一つのマーカーである腫瘍内皮マーカー7(TEM-7)を発現した。図2参照。
【０３２９】
(6.2.4  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための膜プロテオミクス)
(膜タンパク質精製)：継代数6の細胞を、成長培地において、およそ70％コンフルエンスまで成長させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄した。その後細胞を、細胞溶解する前に、プロテアーゼインヒビターカクテル(P8340、Sigma Aldrich社、セントルイス、MO)を含有する溶液と一緒に15分間インキュベーションした。次に細胞を、10mM HCl溶液の添加により溶解し(従って界面活性剤の使用は回避)、400gで10分間遠心分離し、ペレットとし、核を除去した。核除去後(post-nuclear)の上清を、超遠心分離チューブに移し、T-1270ローター(Thermo Fisher Scientific社、アッシュビル、NC)を装備したWX80超遠心分離機を用い、100,000gで150分間遠心分離し、膜タンパク質ペレットを作製した。
【０３３０】
(プロテオリポソームの生成、固定化及び消化)：膜タンパク質ペレットを、Nanoxis緩衝液(10mMトリス、300mM NaCl、pH8)を用い、数回洗浄した。膜タンパク質ペレットをNanoxis緩衝液1.5mL中に懸濁し、その後Vibra-CELL(商標)VC505超音波処理装置(Sonics & Materials社、ニュータウン、CT)を用い、氷上で20分間、チップ超音波処理した(tip-sonicated)。プロテオリポソームのサイズを、FM1-43色素(Invitrogen社、カールスバッド、CA)による染色、及び蛍光顕微鏡による目視により、決定した。プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃度を、BCAアッセイ(Thermo Scientific社)により決定した。次にプロテオリポソームを、標準ピペットチップを使用し、LPI(商標)Flow CELL(Nanoxis AB社、ゴーゼンバーグ、スウェーデン)上に注入し、1時間固定させた。固定化後、連続洗浄工程を実行し、トリプシン5μg/mL(Princeton Separations社、アデルフィ、NJ)を、LPI(商標)Flow Cell上に直接注入した。このチップを、37℃で一晩インキュベーションし、トリプシン性ペプチドを、LPI(商標)チップから溶出し、その後、Sep-Pakカートリッジ(Waters社、ミルフォード、MA)を用い脱塩した。
【０３３１】
(LTQ線形イオントラップLC/MS/MS分析)：各トリプシン性消化物試料を、軸方向脱溶媒(axial desolvation)真空支援ナノキャピラリーエレクトロスプレーイオン化(ADVANCE)源(Michrom Bioresources社)に直接インターフェイス接続された、0.2mm×150mm、3μm、200 ÅMAGIC C18カラム(Michrom Bioresources社、アーバン、CA)上で、180分勾配(緩衝液A：水、0.1％ギ酸；緩衝液B：アセトニトリル、0.1％ギ酸)を使用し、分離した。ADVANCE源は、従来型nanoESIと同等の感度を達成する一方、かなり高い流量3μL/分で操作される。溶出されたペプチドを、各々のフルスキャン質量スペクトルに従い10データ-依存式MS/MSスキャンを利用したLTQ線形イオントラップ質量分析計(Thermo Fisher Scientific社、サンノゼ、CA)において分析した。各生物学的試料について、7回の反復分析のデータセットを収集した。
【０３３２】
(バイオインフォマティクス)：各細胞株について収集した7回の反復分析のデータセットに対応する7つの生ファイルを、Sorcerer Solo(商標)ワークステーション(Sage-N Research社、サンノゼ、CA)上でSEQUESTアルゴリズムを実行することにより、IPIヒトデーターベースに対する1項目検索として、検索した。ペプチド質量許容差1.2 amuを特定し、メチオニン酸化を示差的修飾として特定し、且つカルバミドメチル化を静的修飾として特定した。Trans-Proteomic Pipeline(TPP)のスキャフォールドソフトウェアを実行し、膜プロテオミクスデータを検索し且つ解析した。タンパク質が、ペプチド確率95％、タンパク質確率95％及び1つの独自ペプチドを持つと確定された場合に、該タンパク質は分析物とみなした。膜プロテオミクスデータセット間の比較は、研究室で開発したカスタムPerlスクリプトを用いて、実行した。
【０３３３】
(結果)：表11に示したように、羊膜由来接着細胞は、様々な血管新生マーカー及び心筋原性マーカーを発現した。
【表１２】
2014501249.tif 000028
【０３３４】
(6.2.5  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのセクレトームプロファイリング)
(タンパク質アレイ)：継代数6の羊膜由来接着細胞を、成長培地において同じ細胞数でプレーティングし、且つ4日後に馴化培地を回収した。細胞-馴化培地において多数の血管新生サイトカイン/増殖因子の同時定性分析を、RayBiotech社血管新生タンパク質アレイ(ノルクロス、GA)を用い実行した。簡単に述べると、タンパク質アレイを、1×ブロッキング緩衝液(Ray Biotech社)2mL中、室温で30分間インキュベーションし、膜をブロックした。引き続きブロッキング緩衝液をデカンテーションし、膜を、試料1mL(各細胞により4日間馴化した成長培地)と一緒に、室温で1〜2時間インキュベーションした。次に試料をデカンテーションし、膜を、1×洗浄緩衝液I(Ray Biotech社)2mLにより、室温で、振盪しながら、5分間3回洗浄した。その後膜を、1×洗浄緩衝液II(Ray Biotech社)2mLにより、室温で、振盪しながら、5分間2回洗浄した。その後希釈したビオチン-複合抗体(Ray Biotech社)1mLを、各膜に添加し、室温で1〜2時間インキュベーションし、且つ洗浄緩衝液により前述のように洗浄した。次に希釈したHRP-複合ストレプトアビジン(2mL)を、各膜に添加し、これらの膜を室温で2時間インキュベーションした。最後に、膜を再度洗浄し、ECL(商標)検出キット(Amersham社)により仕様に従いインキュベーションし、結果を、Kodak Gel Logic 2200 Imaging Systemを用いて視覚化し分析した。AMDACによる様々な血管新生タンパク質の分泌を、図3に示す。
【０３３５】
(ELISA)：細胞-馴化培地における単独の血管新生サイトカイン／増殖因子の定量分析を、R&D Systems社(ミネアポリス、MN)から市販されているキットを用いて行った。簡単に述べると、ELISAアッセイを、製造業者の指示に従い行い、馴化培地中の各血管新生増殖因子の量を、1×106個細胞に規準化した。羊膜由来接着細胞(n＝6)は、細胞100万個につきVEGFおよそ4500pg、及び細胞100万個につきIL-8およそ17,200pgを示した。
【表１３】
2014501249.tif 000029
【０３３６】
別の実験において、AMDACはまた、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮細胞接着分子)、ラミニン、フィブロネクチンも分泌することを確認した。他の実験は、AMDACは加えて、マトリクスメタロタンパク質(MMP)1、MMP7、MMP9、及びMMP10を分泌することを確認した。
【０３３７】
(6.2.6  AMDACマイクロRNA発現)
本実施例は、AMDACは、特定のマイクロ-RNA(miRNA)を比較的高レベルで、及び特定の他のmiRNAを比較的低レベルで発現し、それらの各々は、骨髄由来間葉系幹細胞よりも、血管新生機能に相関することを明らかにしている。
【０３３８】
前血管新生miR-296は、増殖因子受容体のレベルを調節することにより、血管新生機能を調節することは、知られている。例えば、内皮細胞中のmiR-296は、肝細胞増殖因子-調節性チロシンキナーゼ基質(HGS)mRNAを直接標的化することにより、血管新生に著しく寄与し、これはHGSレベルの減少、それによる増殖因子受容体VEGFR2及びPDGFRbのHGS-媒介性分解の低下に繋がる。Wurdingerらの文献、Cancer Cell, 14:382-393 (2008)を参照されたい。加えて、miR-15b及びmiR-16は、血管新生に関与した重要な前血管新生因子であるVEGFの発現を制御し、且つmiR-15b及びmiR-16の低酸素-誘導性減少は、前血管新生サイトカインであるVEGFの増加に寄与することが示されている。Kuelbacherらの文献、Trends in Pharmacological Sciences、29(1):12-15 (2007)を参照されたい。
【０３３９】
AMDACは、上記実施例1に記載のように調製した。AMDAC及びBM-MSC細胞(比較対照として使用)に、MIRVANA(商標)miRNA単離キット(Ambion社、カタログ番号1560)を使用し、マイクロRNA(miRNA)調製を施した。細胞0.5×106〜1.5×106個を、変性溶解緩衝液中で破壊した。次に、試料に、酸性-フェノール＋クロロホルム抽出を施し、小型RNA種に関して高度に濃縮されたRNAを単離した。100％エタノールを添加し、この試料を25％エタノールとした。この溶解液／エタノール混合物が、ガラスファイバーフィルターを通過する際に、大型RNAは固定され、且つ小型RNA種は、濾液に回収された。その後濾液のエタノール濃度を55％まで増加し、この混合物を第二のガラスファイバーフィルターを通過させ、そこで小型RNAを固定させた。このRNAを洗浄し、低イオン強度溶液で溶出した。回収された小型RNAの濃度及び純度を、260nm及び280nmでその吸光度を測定することにより決定した。
【０３４０】
AMDACは、以下の血管新生miRNAを発現することが認められた：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。AMDACはまた、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)と比べ、比較的高レベルの以下の血管新生miRNAを発現することがわかった：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-296。これらの結果は、AMDACは、VEGFR2/KDRを高レベルで発現するという知見とよく相関している(上記参照)。対照的に、AMDACは、BM-MSCと比べた場合に、下記血管新生miRNAを低レベルで発現することが認められた：miR-20a、miR-20b、(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。miR-15b及びmiR-16の低下した発現は、AMDACにおいて認められたVEGFの比較的高レベルの発現と相関した。
【０３４１】
(6.3  実施例3：羊膜由来接着細胞の分化)
(6.3.1  実施例3.1：羊膜由来接着細胞の骨形成性非分化)
本実施例は、羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、例えば石灰化、例えば細胞により沈着したカルシウムを染色するvon Kossa染色により立証されたように、骨形成原細胞には分化しないことを明らかにする。
【０３４２】
前記実施例1に記載のように入手した凍結保存したOCT-4- AMDACを、解凍し、洗浄し、ジメチルスルホキシド(DMSO)を除去し、成長培地中に再懸濁した。細胞を、成長培地中に24-ウェルプレート及び6-ウェルプレートに5000個細胞/cm2で播種し、一晩インキュベーションした。引き続き、培地を取り除き、DMEM-低グルコース、10％v/vウシ胎仔血清(FBS)、10mMβグリセロリン酸(Sigma社)、100nMデキサメタゾン(Sigma社)、100μMアスコルビン酸ホスフェート(Sigma社)、Fungizone(Gibco社)、50ユニット/mlペニシリン、及び50μg/mlストレプトマイシン(Gibco社)を含有する骨形成性培地と交換した。この骨形成性培地に、20ng/mlトランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)(Sigma社)、及び40ng/mlヒト組換え骨形成タンパク質-2(BMP-2)(Sigma社)を補充した。骨形成性培地におけるAMDACの培養を、培地を3〜4日毎に交換しながら、合計28日間継続した。培養期間の最後に、細胞を回収し、洗浄し、石灰化、インジケーター又は骨形成分化の評価のために以下に詳述するように染色した。顕微鏡下で観察した場合、細胞層は線維芽細胞形態(例えば立方状の外観はなし)で完全にコンフルエントであり、小結節は認められなかった。
【０３４３】
対照として、皮膚線維芽細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)を、更に骨形成性培地において培養した。成人の正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Lonza社(ウォーカービル、MD、米国)から入手し、新生児NHDFはATCC(マナサス、VA、米国)から得た。以下の起源の異なる3つのBM-MSC株を評価し：一つ目はScienCell Laboratories社(カールスバッド、CA、米国)から、二つ目はLonza社(ウォーカービル、MD、米国)、及び三つ目は、AllCells社(エメリービル、CA、米国)から入手した、新鮮な全正常骨髄穿刺液から単離された。
【０３４４】
細胞は、10％(v/v)中和緩衝メタノールにより固定した。固定後、細胞を脱イオン水で洗浄し、5％硝酸銀(Aldrich社)で1時間、間接UV光下でインキュベーションした。その後細胞を、脱イオン水で洗浄し、5％(w/v)チオ硫酸ナトリウム中で5分間インキュベーションした。その後細胞を再度蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡により試験した。
【０３４５】
骨形成分化に関連した遺伝子骨シアロタンパク質(IBSP)及びオステオカルシン(BGLAP)の示差的発現レベルを、誘導の前及び後で、RT-PCRにより評価した。具体的には、AMDACを、骨形成分化アッセイの終了時に受け取り、その後RLT溶解緩衝液(Qiagen社)を用いて溶解した。細胞溶解液を、-80℃で貯蔵した。AMDAC細胞溶解液を解凍し、DNAse処理により、RNEasyキット(Qiagen社)を製造業者の指示に従い用い、RNAを単離した。その後RNAを、DEPC処理水で溶出し、且つRNA量を、Nanodrop ND1000分光光度計を用いて決定した。Applied Biosystems社の逆転写試薬を用い、RNAからcDNAを作製した。リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystems社からのTaqman Universal PCRマスターミックスを用いて行った。使用したTaqman遺伝子発現アッセイは、Hs00173720骨シアロタンパク質、Hs00609452オステオカルシン、及びGAPDHであった。リアルタイムPCR反応を、ABI 7300システムにおいて、以下に示すように試行した：
【表１４】
2014501249.tif 000030
閾値サイクル(Ct)値の解釈：
平均Ct  1-10  非常に高い発現
平均Ct  10-20  高い発現
平均Ct  20-30  中レベルの発現
平均Ct  30-35  低い発現
平均Ct  35-40  非常に低い発現
【０３４６】
各遺伝子の発現値(Ct)は、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの値に対し規準化した。次に各試料の規準化された発現値(dCt)を、誘導前と誘導後で比較した。倍数(fold)変化に換算して相対差を、「RQ」として報告した。ハウスキーピング遺伝子のdCtにおける特有の変動のため、3未満の誘導倍数の差は、有意であるとみなさなかった。
【０３４７】
(結果)：Von Kossa染色の結果は、AMDACでは、von Kossa染色は検出されなかったので、AMDACは明らかに非骨形成性であることを明らかにした。対照の線維芽細胞は、最小の石灰化を示したのに対し、BM-MSCは様々な程度の石灰化を示した。
【表１５】
2014501249.tif 000031
【０３４８】
遺伝子発現に関して、試験した全ての細胞は、オステオカルシンの中等度の基本的発現を示した(Ct 27.5〜30.9)。AMDACは、オステオカルシン発現のわずかな(＜2倍)誘導を明らかにし、これは線維芽細胞又はBM-MSCについて観察されたオステオカルシン発現の誘導と比べ、有意であるとは考えられなかった。従って、AMDACによるオステオカルシン発現の誘導は、骨形成能の指標ではなかった。対照的に、3つのBM-MSC株のうち2つは、誘導時に実質的アップレギュレーションを示した。骨シアロタンパク質の誘導に関するBM-MSCの変動は、恐らくドナー変動によるであろう。
【表１６】
2014501249.tif 000032
ND-検出されず
NA-非誘導条件は検出しなかったので、計算できず(すなわち、Ct値は決定されず)
【０３４９】
表14に示された3倍以下の誘導値は、比較対照として使用したハウスキーピング遺伝子の多様性のために、有意であるとは考えられない。従って、前記結果を基に、AMDACは骨形成能を示さないことが結論付けられた。
【０３５０】
(6.3.2  実施例3.2：羊膜由来接着細胞の軟骨形成性非分化)
本実施例は、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、軟骨形成経路に沿って分化しないことを明らかにする。
【０３５１】
本明細書別所記載のOCT-4- AMDACを、対照としての皮膚線維芽細胞及びBM-MSCと一緒に、軟骨形成アッセイにおいて使用した。各試験試料について、細胞0.25×106個を、15mLコニカルチューブに入れ、200×gで室温、5分間遠心分離し、球状ペレットを形成した。ペレットを、TGFβ-3(10ng/mL)、組換えヒト成長/分化因子-5(rhGDF-5)(500ng/mL)、又はTGFβ-3(10ng/mL)とrhGDF-5(500ng/mL))の組合せを含む、軟骨形成性誘導培地(Lonza社軟骨細胞培地(Lonza PT-3003))、又は成長培地(DMEM-低グルコース(Gibco社)＋FBS(2％v/v)(Hyclone社)＋ペニシリン及びストレプトマイシン)のいずれかにおいて、3週間培養した。培養時に、培地の完全な交換は1週間に2回行った。
【０３５２】
培養期間の最後に、細胞ペレットを、10％ホルマリン中で24時間固定した。その後全ての試料を、段階的(graded)アルコールにより脱水し、且つパラフィンに包埋した。切片を厚さ5μmとなるよう切り出し、その後下記のプロトコールに従い染色した。組織学的切片を、光学顕微鏡を用いて試験した。
【０３５３】
(アルシアンブルー染色)：3％酢酸溶液(pH2.5)中で使用した場合、アルシアンブルーは、硫酸基及びカルボキシル基を有する酸性ムコ多糖並びに硫酸基及び／又はカルボキシル基を有するシアロムチンを染色する。3％酢酸中の1％アルシアンブルー(Sigma-Aldrich社、#23655-1)を使用し、引き続き0.1％核ファストレッド(Sigma-Aldrich社、#22911-3)で対比染色した。簡単に述べると、切片を、脱パラフィン化し、且つ段階的アルコールにより蒸留水まで水和し、アルシアンブルーで30分間染色し、流れる水道水で2分間洗浄し、蒸留水ですすぎ、次に核ファストレッド溶液中で5分間対比染色し、流れる水道水で1分間洗浄し、段階的アルコールにより脱水し、キシレン中で透明にし、且つ最終的に残存するマウンティング培地と一緒に据え付けた。
【０３５４】
(II型コラーゲン染色)：軟骨形成分化条件の前及び後の細胞培養試料中のII型コラーゲンの存在を、以下に概説するように免疫組織化学により評価した。これらの細胞によるII型コラーゲンの生成は、II型コラーゲンに対し高度に特異的であり、且つI、III、IV、V、VI、IX、X、又はXI型コラーゲンとの交差反応を示さず、ペプシン-消化型II型コラーゲンとも交差反応を示さない、マウスモノクローナルである、抗体5B2.5(Abcam社、カタログ番号ab3092)を用い評価した。アッセイは、二次抗体としてヤギ抗-マウスAF 594(Invitrogen社、IgG2a、カタログ番号A21135)を使用した。細胞ペレットを、10％ホルマリン中で最低4時間から一晩固定し、パラフィン中に浸潤させた。
【０３５５】
全ての細胞試料を、PBSで洗浄し、PBS、4％ヤギ血清及び0.3％Triton-100Xを含有するタンパク質ブロック溶液に、室温で30分間曝した。次にブロック溶液中に希釈した一次抗体(1：50及び1：100)を、4℃で一晩適用した。翌朝、試料をPBSで洗浄し、且つブロック溶液中に希釈した二次抗体(ヤギ-抗-マウスAF594)(1：500)を、室温で1時間適用した。その後細胞を、PBSで洗浄し、600nM DAPI溶液を室温で10分間適用し、核を可視化した。
【０３５６】
BM-MSC及び線維芽細胞は、軟骨形成誘導培地中に細胞ペレットを形成した。軟骨細胞は、尖端又は中心に明らかに異なる細胞集団を伴わない、巨大な細胞ペレットを形成した。対照的に、AMDACは、培養期間中に、細胞ペレットを形成することができなかった。AMDACは細胞ペレットを形成することができなかったので、AMDACに関して、II型コラーゲン又はアリシンブルーのいずれについても、染色結果は得られなかった。従って、AMDACは非軟骨形成性であることが結論付けられた。
【０３５７】
(6.3.3  実施例3.3：羊膜由来接着細胞の神経分化)
本実施例は、羊膜由来接着細胞は、神経細胞の特徴を持つ細胞へ分化することができることを明らかにしている。AMDACの神経分化は、正常ヒト神経前駆細胞(Lonza社)、皮膚線維芽細胞、新生児正常(ドナー3)、骨髄MSC(ドナー5及び6)と比べた。
【０３５８】
第一の短期神経分化手順において、AMDAC及び他の細胞を解凍し、約5000個/cm2で播種した後、コンフルエントを下回るようになるまで、それらの各成長培地において拡大した。細胞をトリプシン処理し、組織培養液でコーティングされたプレート中に、1ウェルにつき6000個細胞で播種した。全ての細胞を最初に4日間、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)20ng/ml、上皮細胞増殖因子(EGF)20ng/ml(Peprotech社)及びペニシリン/ストレプトマイシン(PenStrep、Invitrogen社)と共に、15％v/vFBS(Hyclone社)を含有するDMEM/F12培地(Invitrogen社)において拡大した。4日後、これらの細胞をPBS(Invitrogen社)においてすすいだ。その後細胞を、20％v/vFBS、PenStrepを含むDMEM/F12中で約24時間培養した。24時間後、細胞をPBS(Invitrogen社)ですすぎ、200mMブチル化ヒドロキシアニソール、10nM塩化カリウム、5mg/mLインスリン、10nMフォルスコリン、4nMバルプロ酸、及び2nMヒドロコルチゾン(Sigma社)を含有する、DMEM/F12、無血清からなる誘導培地において培養した。引き続き細胞を、100％メタノールにより、-20℃で固定した。その後固定した試料を、核のDAPIによる対比染色を行い、抗-ネスチン抗体(Alexa-Fluor 594(Red)複合体)を使用し、ヒトネスチンの発現に関して免疫組織化学(IHC)により評価した。
【０３５９】
第二の短期神経分化プロトコールにおいて、全ての細胞を、塩基性FGFの20ng/ml、EGFの20ng/ml及びPenStrep(Invitrogen社)と共に、15％FBS(Hyclone社)を含有するDMEM/F12培地(Invitrogen社)において、最初に4日間拡大した。4日後、これらの細胞をPBS(Invitrogen社)においてすすぎ、20％v/vFBS、PenStrepを含むDMEM/F12中で培養した。24時間後、細胞をPBSですすいだ。その後培地を、神経前駆細胞拡大培地(NPE)に交換し、これはB27(Gibco社)、4mM L-グルタミン、1μMレチノイン酸(Sigma社)、及びPenStrepと共に、NEUROBASAL(商標)-A基本培地(Gibco社)で構成された。4日後、各ウェルから培地を取り除き、細胞を、氷冷した4％w/vパラホルムアルデヒドにより10分間、室温で固定した。その後、固定した試料を、星状膠細胞表現型に関してGFAP(グリア線維性酸性タンパク質)の発現についてIHCにより、及びニューロン表現型に関してTuJ1(ニューロン-特異性クラスIIIチューブリン)により、各々、評価した。
【０３６０】
第一の分化プロトコールにおいて、全ての細胞型は、双極性形態(bipolar morphology)を伴う細胞型に形質転換され、且つネスチンにより陽性に染まった。神経前駆細胞は構成的に、予想されたようにネスチンを発現した。第二の分化プロトコールにおいて、ニューロン-関連(Tuj1)マーカー及び星状膠細胞-関連(GFAP)マーカーの発現を評価した。誘導時に、AMDAC、及びBM-MSCは、Tuj1を低レベルで発現した。線維芽細胞上の発現は、バックグラウンドのために、ぎりぎり陽性であることがわかった。AMDAC、及び1つのBM-MSC細胞株は、GFAPの低レベル発現を示した。陽性対照細胞株(神経前駆細胞)は、予想されたようにTuj1及びGFAPの両方を構成的に発現した。
【０３６１】
従って、AMDACは、神経誘導条件下で、神経分化と一致する形態学的及び生化学的変化を示すことができる。
【０３６２】
(6.4  実施例4：羊膜由来接着細胞を使用する免疫調節)
本実施例は、AMDACは、ビーズ-刺激したT細胞を利用するアッセイにおいて、インビトロにおいて免疫抑制機能を示すことを明らかにしている。
【０３６３】
(6.4.1  T細胞増殖のAMDAC-媒介性抑制)
AMDACは、前記実施例1に説明したように入手した。CD4+及びCD8+ T細胞は、ヒト末梢血から入手した。
【０３６４】
T細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)により標識し、且つ抗-CD3抗-CD28-コートされたDynabeadsと混合し、引き続きAMDACの非存在下で培養するか、或いはビーズT-リンパ球反応(BTR)としても公知の、細胞と細胞が接触することができるようにAMDACと共培養した。AMDACとの共培養は、96-ウェルプレートのウェル内で、20,000個のAMDAC細胞の存在又は非存在下で、100,000個のT-リンパ球を、抗-CD3及び抗-CD28コートされたDynaBeads(Invitrogen社)と、ビーズ：T-リンパ球の比1:3で混合することにより、実行した。混合した(共培養)及び混合していない細胞培養物を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、5日間インキュベートした。正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、実質的にT細胞阻害活性を有さないが、これを陰性対照として使用し、AMDACと同じ条件に供した。
【０３６５】
5日後、CD4+及びCD8+ T細胞上のCFSE蛍光を、フローサイトメトリーを用いて検出し、T細胞増殖の抑制率を、AMDAC又はNHDFと共培養しなかったCFSE-標識したT細胞の培養物と比較した、増殖していない(CFSE高)T細胞の増加した画分を基に計算した。図4に明らかにしたように、AMDACは、インビトロでのCD4+及びCD8+ T細胞の増殖を阻害し、これはAMDACは免疫調節性であることを示している。
【０３６６】
(6.4.2  T細胞によるTNF-α分泌を阻害するAMDACにより馴化された培地)
AMDACは、前記実施例1に説明したように入手した。T細胞は、ヒト末梢血から入手した。
【０３６７】
AMDACを、組織培養プレート上に播種し、一晩インキュベーションし、接着単層を形成した。翌日、AMDAC培養物を、AMDAC由来抗炎症因子の強力なインデューサーであることが先に示されているIL-1βにより刺激した。IL-1β刺激の16時間後、AMDACにより馴化された培地を回収し、抗-CD3 抗-CD28-コートされたDynabeadsによりコートされたヒト末梢血T細胞と、容積比9：1で混合した。抗-CD3 抗-CD28-コートされたDynabeadsによりコートされたヒト末梢血T細胞の別の集団を、対照として維持した。T細胞を、AMDAC-馴化培地と混合し、且つT細胞の混合していない集団を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、72時間インキュベーションした。正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)により馴化された培地は、実質的にTNF-α阻害活性を有さないが、これを陰性対照として使用し、AMDACと同じ条件に供した。
【０３６８】
72時間培養後、T-細胞由来のTNF-αの濃度を、サイトメトリックビーズ-ベースのELISA法を用い、T細胞培養上清において測定した。TNF-α分泌の抑制率を、AMDAC-馴化培地と混合しなかった対照T細胞培地と比較した、AMDAC-馴化培地の存在下でのTNF-α濃度の減少を基に計算した。図5に明らかにしたように、AMDAC-馴化培地の存在下でのT細胞の培養は、T細胞由来のTNF-αの生成の抑制を誘導した。
【０３６９】
(6.5  実施例5：T細胞コンパートメントを調節するAMDAC)
本実施例は、実施例1に説明したように入手した羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、Th1、Th17及びFoxP3 Tregサブセットをスキューするよう影響を及ぼすことができることを明らかにしている。
【０３７０】
(6.5.1  方法)
(Tリンパ球増殖アッセイ)
【０３７１】
混合リンパ球反応(MLR)を、先に実施例1に説明したように単離した20,000個のAMDAC細胞の存在又は非存在下で、FALCON平底96ウェル組織培養プレート(Fisher Scientific社、ピッツバーグ、PA)の各ウェルにおいて、100,000個のHLA-がマッチしないカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)-標識したTリンパ球を、10,000個の成熟樹状細胞(mDC)と混合することにより実行した。混合した細胞培養物を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、6日間培養した。6日目に、全ての細胞を回収し、抗-CD4-PE及び抗-CD8-APC(R&D systems社、ミネアポリス、MN)により染色した。
【０３７２】
ビーズTリンパ球反応(BTR)を、96-ウェルプレートのウェル中で、100,000個のTリンパ球を、抗-CD3及び抗-CD28コートされたDynaBeads(Invitrogen社)と、ビーズ：Tリンパ球比1：3で混合することにより実行した。BTR反応は、20,000個のAMDAC細胞の存在又は非存在下で行った。混合した細胞培養物を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、6日間培養した。6日目に、全ての細胞を回収し、抗-CD4-PE及び抗-CD8-APC(R&D systems社、ミネアポリス、MN)により染色した。
【０３７３】
Tリンパ球増殖は、FACS Canto II機器(BD社、フランクリンレーク、NJ)により、CD4及びCD8の単独の陽性細胞上の、CFSE蛍光強度の分析により測定した。本試験における全てのFACSデータは、flowjo 8.7.1ソフトウェア(Tree Star社、アッシュランド、OR)を用い分析した。
【０３７４】
(T細胞スキュー(分極))
【０３７５】
Th1スキューを、IL-2(200 IU/ml)、IL-12(2ng/ml)及び抗-IL-4(0.4μg/ml)を含有するサイトカインカクテルをスキューする追加のTh1によるBTR反応を用いて実行した。
【０３７６】
Th17スキューに関して、5×105個の総Tリンパ球を、5×105個選別されたCD14+単球、50ng/mL抗-CD3抗体(BD BioScienences社)及び100ng/mL LPS(Sigma Aldrich社)により、50,000個のAMDACの存在下又は非存在下のいずれかで6日間刺激した。Th17細胞集団は、CD4陽性集団上のIL-17を染色する、細胞内サイトカイン染色(ICCS)により分析した。
【０３７７】
(細胞内サイトカイン及びFoxp3染色)
【０３７８】
Th1細胞サブセットを、以下に列挙した。BTR反応からのT細胞を、50ng/mL酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)及び750ng/mLイオノマイシン(PI)(Sigma Aldrich社)により5時間再活性化した。最後の3時間の間に、GOLGISTOP(商標)(Becton Dickinson社；タンパク質輸送阻害剤)を、添加した。次に細胞を、PE標識した抗-CD4抗体により、引き続きCytofix/Cytopermキット(Becton Dickinson社)を製造業者の指示に従い用い、APC複合した抗-IFN-γ抗体により、表面染色した。
【０３７９】
Th17細胞サブセットを列挙するために、Th17スキュー活性化反応からのT細胞を、50ng/mL PMA及び750ng/mLイオノマイシン(Sigma Aldrich社)により5時間再活性化し、最後の3時間は、GOLGISTOP(商標)(Becton Dickinson社)が共に存在した。その後細胞を、PE標識した抗-CD4抗体により染色し、引き続きCytofix/Cytopermキット(Becton Dickinson社)を製造業者の指示に従い用い、APC複合した抗-IL-17抗体により染色した。
【０３８０】
Treg細胞サブセットを列挙するために、BTR反応からのT細胞を、PE標識した抗-CD4抗体により表面染色し、引き続きFoxp3染色キット(eBioscience社、サンディエゴ、CA)を製造業者の指示に従い用い、APC複合した抗-Foxp3抗体により表面染色した。
【０３８１】
(樹状細胞分化及び刺激)
【０３８２】
未熟DC(iDC)を、マイトジェン-指向した分化により、磁気選別されたCD14+単球集団から作製した。簡単に述べると、iDCを、GM-CSF(20ng/ml)及びIL-4(40ng/ml)と1×106/mlで4日間培養した単球から得た。その後iDC(1×105個細胞)を、FALCON 24ウェル組織培養プレート(Fisher Scientific社、ピッツバーグ、PA)の各ウェルにおいて、1×105個AMDACの存在下又は非存在下のいずれかで、1μg/ml LPSにより24時間刺激した。培養上清を回収し、サイトカインプロファイルを、サイトメトリックビーズアレイ(CBA)により分析した。
【０３８３】
(サイトメトリックビーズアレイ(CBA)分析)
【０３８４】
培養上清中のサイトカイン濃度を、複数の可溶性被検体の同時定量的検出のためのサイトメトリックビーズアレイシステム(CBA；Becton Dickinson社)を製造業者の指示に従い用いて測定した。簡単に述べると、活性化されたT細胞により生成された下記サイトカインの特異的検出のために、BTR培養上清中の試料を、捕捉ビーズの混合物とインキュベーションした：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF、リンホトキシン-α(LT-α)及びIFN-γ。引き続き、ビーズに結合したサイトカインを、蛍光標識した検出試薬と結合させ、且つFACSCanto IIフローサイトメトリーを製造業者のプロトコールに従い用いて検出した。データを獲得し、FACS-DIVA 6.0 ソフトウェア(Becton Dickinson社)を用いて解析し、その後FCAP Array 1.0プログラム(Becton Dickinson社)を用いサイトカイン濃度を計算した。
【０３８５】
(IL-21 ELISA)
【０３８６】
可溶性IL-21を、eBioscience社からのIL-21 ELSAIキット(88-7216)を製造業者のプロトコールに従い用い、Th17スキュー培養から得られた上清中で測定した。
【０３８７】
(NK増殖アッセイ及びNK細胞傷害アッセイ)
【０３８８】
ヒトNK細胞を、NK細胞単離キット(Miltenyi Biotech社、オーバーン、CA)を製造業者の指示に従い用い、PBMCから単離した。NK細胞増殖を、35μg/mlトランスフェリン、5μg/mlインスリン、20Mエタノールアミン、1μg/mlオレイン酸、1μg/mlリノール酸、0.2μg/mlパルミチン酸、2.5μg/ml BSA、0.1μg/ml PHA(Sigma-Aldrich社)及び200IU/mlヒトIL-2(R&D社)を補充した10％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone社)を含有する1ml IMDM中において、2.5×105個NK細胞を、マイトマイシンC処理した(16g/ml)フィーダー細胞(1×106個ヒト同種PBMC又は1×105個K562細胞のいずれか)と一緒に、培養することにより決定した。細胞を、等量のIMDM(10％FBS、2％ヒト血清及び400IU/ml IL-2)を3日毎に添加しながら、37℃、5％CO2でインキュベーションした。NK細胞数を、以下のように7日毎に、FACSにより決定した。簡単に述べると、総NK細胞を、組織培養ウェルから回収した。PBSで洗浄した後、細胞を2uM TO-PRO3で染色した。最後に、10μlカウンティングビーズ(Spherotech社、カタログ番号ACBP-50-10)を各試料に添加し、これは総細胞数の校正のための内部標準として働いた。相対NK数は、回収されたカウンティングビーズ1000個当たりの総生存NK細胞数を基に計算した。
【０３８９】
NK細胞傷害アッセイを、NK細胞を、異なるエフェクター／標的(E/T)比で、標的細胞と混合することにより実行した。一晩培養した後、標的細胞数を、上記のカウンティングビーズ法と標的細胞からNK細胞を分化するための細胞表面マーカーを用い、決定した。K562細胞のNK細胞傷害性に関して、K562細胞はHLA-ABC陰性であるので、FITC複合した抗-HLA-ABC抗体を、NK細胞マーカーとして使用した。AMDAC細胞に関して、CD90-PEを、AMDACをNK細胞及びK562細胞から識別するために使用した。細胞傷害率は、下記式のように計算した：（1−試料中の総標的数÷NK細胞を含まない対照中の総標的細胞）×100。
【０３９０】
(6.5.2  T細胞コンパートメントのAMDACスキュー)
T細胞コンパートメントにおけるスキューに影響を及ぼすAMDACの能力を、T細胞及びAMDAC共培養を使用するTh1及びTh17スキューアッセイにおいてT細胞を生成するサイトカインを測定することにより試験した。簡単に述べると、Th1スキューアッセイにおいて、AMDACを予めプレーティングした。翌日、1×106個/ml T細胞、Dynabeads 6×105個/ml、IL-2(200IU/ml)、IL-12(2ng/ml)、及び抗-IL-4(0.4μg/ml)を添加し、AMDACと混合した。4日後、Th1細胞の割合を、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)細胞内染色により分析した。図6に示すように、AMDACは、投与量依存的様式で、Th1の割合を大きく低下した。同様に、Th17スキューアッセイにおいて、AMDACを一晩予めプレーティングした。その後T細胞(1×106/ml)、CD14+細胞(1×106/ml)、抗-CD3(50ng/ml)及び細菌リポ多糖体(LPS)(100ng/ml)の混合物をAMDACを含むプレートに添加した。6日間培養した後、Th17の割合を、IL-17細胞内染色により試験した。図7に示すように、AMDACは、投与量依存的様式で、Th17の割合を大きく低下した。AMDACのFoxP3陽性T細胞集団に対する作用を調べるために、1×106個PBMCを、AMDACと6日間共培養した。FoxP3陽性集団を、FoxP3細胞内染色について分析した。図8に示したように、AMDACは、FoxP3陽性T細胞集団をわずかに増加した。
【０３９１】
(6.5.3  DC成熟及び機能のAMDAC媒介性調節)
本実験は、AMDACは、未熟樹状細胞(DC)の成熟及び分化を調節することを明らかにしている。
【０３９２】
DCの成熟及び機能のAMDAC-媒介性調節を調べるために、単球由来の未熟DCを、AMDACの存在下又は非存在下で、LPS単独又はLPSとIFN-γの組合せで処理し、DC成熟プロセスを更に駆動した。DC成熟は、DC成熟マーカーCD86及びHLA-DRのFACS染色により分析した。DC機能評価は、IL-12の細胞内染色により、及びCBAによる可溶性サイトカイン生成の測定により、決定した。図9A及び9Bに示すように、DC上のCD86(図9A)、HLA DR(図9B)発現のダウンモジュレーションにより、AMDACは、LPS-誘導した及びLPS＋IFN-γ-誘導したDC成熟を強力に抑制した。更に、図9Cに示したように、AMDACは、LPS＋IFN-γ-刺激したIL-12-生成DC集団の形成を〜70％、有意に抑制した。AMDACは更に、LPS-刺激したDCによるTNF-α及びIL-12の生成を抑制することができることがわかった。図10参照。
【０３９３】
(6.5.4  Th17スキュー培養物中のIL-21生成を抑制するAMDAC)
IL-21は、Th17集団の維持に必要な重要なサイトカインである。AMDACは、IL-21生成を調節することができるかどうかを調べるために、「方法」の項に説明したように、AMDACをTh17スキュー培養物に導入した。AMDACは、AMDAC細胞を含まないTh17スキュー培養物と比べ、AMDAC-Th17共培養において、IL-21生成を72.35％抑制した。AMDACはまた、AMDAC非存在下での培養物と比べ、Th17 T細胞集団を72.65％抑制した。
【０３９４】
(6.5.5  NK細胞の細胞傷害性及び増殖を調節するAMDAC)
NK細胞は、先天性免疫系の主要成分を構成する細胞傷害性リンパ球である。NK細胞は、ウイルス感染された腫瘍及び細胞の拒絶反応に加え、同種細胞及び組織の拒絶反応において大きい役割を果たす。AMDACのNK細胞に対する免疫調節作用を調べるために、NK細胞増殖及び細胞傷害アッセイを確立した。図11に示したように、AMDACは、AMDAC細胞を有さない対照と比べ、ヒトNK細胞増殖を抑制した。
【０３９５】
加えて、NK細胞の細胞傷害性に対するAMDACの作用を調べた。このアッセイにおいては、AMDACを、先の「方法」の項に説明したように、NK細胞傷害アッセイへ導入した。簡単に述べると、予め播種したAMDAC(1×105個細胞)の2倍滴定を行いながら、1×106個NK細胞を、1×105個K562細胞(E/T比10：1)と混合した。NK細胞及びK562細胞を一晩共培養し、且つNK細胞の細胞傷害性を、先の「方法」の項に説明した、プロトコールに従い決定した。図12に示したように、AMDAC細胞は、ヒトNK細胞の細胞傷害性を投与量依存的様式で抑制した。
【０３９６】
(6.6  実施例6：羊膜由来接着細胞を使用する治療方法)
(6.6.1：AMDACを使用する炎症性腸疾患の治療)
個人は、腹部痙攣及び出血性下痢を呈している。これらの症状は、過去1年間にわたり、断続的であり、次第に増悪している。結腸癌を除外した後、潰瘍性大腸炎の診断がなされる。個人に、0.9％NaCl溶液中の1〜5×108個OCT-4-羊膜由来接着細胞(AMDAC)を静脈内投与する。個人を引き続き2週間にわたってモニタリングし、1種以上の該症状の軽減、例えば糞便中の血液量の減少を評価する。加えて個人を、続く1年間にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻った場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
【０３９７】
(6.6.2：AMDACを使用するクローン病の治療)
個人は、クローン病の一形態である回結腸炎を呈し、腹痛、出血性下痢、及び発熱を経験している。個人に、0.9％NaCl溶液中の1〜5×108個OCT-4-羊膜由来接着細胞(AMDAC)を静脈内投与する。個人を引き続き2週間にわたってモニタリングし、1種以上の該症状の軽減を評価する。加えて個人を、続く1年間にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻った場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
【０３９８】
(6.6.3：AMDACを使用する関節リウマチの治療)
個人は、3つ以上の関節に関節リウマチを呈している。個人に、OCT-4- AMDAC、並びにIL-1Ra及びDHFRを含む融合ポリペプチドを生成するように改変されたOCT-4- AMDACの組合せを投与し、ここで該2つの型の幹細胞は、比1：1で投与する。操作された細胞及び操作されない細胞は、0.9％NaCl溶液中の1〜5×108個OCT-4- AMDACである。個人には、メトトレキセートを標準量で与えられ、且つ関節の炎症の軽減をモニタリングする。加えて個人を、続く1年間にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻った場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
【０３９９】
(6.6.4：AMDACを使用する糖尿病の治療)
個人は、先の2ヶ月にわたり発症している、かすみ目、頻尿、増加した喉の渇き、及び増大した空腹感を呈する。血液検査により、血糖値上昇(ブドウ糖7.0mmol/L以上又はブドウ糖126mg/dL以上)を確認する。I型真性糖尿病の診断がなされる。個人に、0.9％NaCl溶液中OCT-4-羊膜由来接着細胞(AMDAC)を静脈内投与し、個人の血糖値を、その後6ヶ月間モニタリングする。個人の血糖値が、ブドウ糖7.0mmol/L未満、又はブドウ糖126mg/dL未満に下落した場合、この投与は成功したと、みなされる。更なる経過観察時に、個人の血糖値が再度ブドウ糖7.0mmol/L又はブドウ糖126mg/dLを超えたことが認められた場合は、投与を繰り返す。
【０４００】
(6.6.5：AMDACを使用する移植片対宿主病の併用治療)
同種骨髄移植を待っている個人に、0.9％NaCl溶液中のOCT-4-羊膜由来接着細胞(AMDAC)を、骨髄移植前24時間以内に、静脈内投与する。この幹細胞の投与は、骨髄移植後24時間以内に、繰り返される。個人を、その後100日間にわたってモニタリングし、且つGVHDが発症し、かつグレードIを超えて進行した場合は、追加投与量5〜10×108個OCT-4-AMDACを投与する。
【０４０１】
(6.7  実施例7：中等度から重度のクローン病を有する成人を治療するためのAMDACの使用)
少なくとも1つの先行する療法に反応しない活動期の中等度から重度のクローン病患者12名に、OCT4- AMDACを1週間空けて2回注入する。その後患者を、更に4週間にわたり毎週モニタリングし、注入後6ヶ月目に再評価する。最初の患者6名は、2×108個細胞(低投与量)の2回注入を受け、次の6名は、8×108個細胞(高投与量)の2回注入を受ける。本試験を通じ、併用投薬は維持される。疾患の活動性を、クローン病活動性指数(CDAI)を用いて測定する。また対象は、炎症性腸疾患の質問票(IBDQ)を完成させる。患者の平均年齢は、35〜40歳である。全ての患者を、例えば4週間目と6ヶ月目に、少なくとも2回の連続来院時に行うCDAIにより、クローン病の改善についてモニタリングし、且つ少なくとも2回の連続来院について(CDAI＜150)が維持される寛解についてモニタリングする。
【０４０２】
(6.8  実施例8：多発性硬化症モデルにおけるAMDACの有効性)
本実施例は、慢性多発性硬化症のマウス実験的自己免疫性脳炎(EAE)モデルにおける生存時間を改善し、且つ症状を軽減する、OCT-4-、CD49f+ AMDACの能力を明らかにしている。EAE症状は、フロイント完全アジュバント(CFA)エマルジョン中のミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG33-55)、及び百日咳毒素(PTx)の組合せにより誘導した。
【０４０３】
実験用の雌のC57BL/6マウス(Taconic社)、30日齢を、4群に分けた：(1)AMDACのOCT4-、CD49f+集団1.5×106個細胞；(2)ビヒクル対照；(3)疾患対照群(CFA/PTx、MOG35-55処置なし)；及び、(4)MOG35-55/CFA/PTxを受け取るが、AMDACを受け取らない、未処置マウス。第1〜3群及び第5群は、各々マウス10匹からなり、第4群は、マウス5匹からなった。第1〜4群の各マウスには、各々、MOG35-55/CFA/PTx及びAMDAC、ビヒクル、CFA/PTx、又はMOG35-55/CFA/PTxを400μL投与した。多発性硬化症の症状は、PTxと組合わせたMOG35-55/CFAの投与により、第1、2及び4群のマウスにおいて誘発された。AMDACの有無に拘わらず、MOG35-55は0日目に投与し、且つPTxを1日目に投与した。第4群は、CFA及びPTXを受け取ったが、MOG35-55は受け取らなかった。動物の体重を、投与後2〜3日毎に測定し、投与後32日間にわたり症状の出現を評価し、下記スケールを使用し、投与後毎日スコア化した。
【表１７】
2014501249.tif 000033
スコアは、実験者の裁量で、0.5刻み(half value)で与えられる。症状の発症は、典型的には、10日目前後に起こった。
【０４０４】
AMDACを受け取るマウス(G9)の臨床スコアは、12〜24日目において、ビヒクルを受け取るマウス(G1)よりも、明白な改善を示し(図13A)、並びにマウス体重は、12〜28日目において、AMDACを受け取るマウスは、ビヒクルを受け取るマウスよりも、明確により高かった(図13B)。更に、AMDACを受け取るマウスは、ビヒクルのみを受け取るマウスよりも、投与後の日数の有意に遅い中央値で、症状を発症した(p＝0.0275；図14)。処置を受け取らないマウスは、予想されたように症状を発現し、及びMOG33-55を受け取らないマウスは、本実験過程にわたり有意な症状を発症しなかった。
【０４０５】
従って、AMDACの投与は、症候性マウスにおいて認められる症状の程度を改善し、且つ体重減少を軽減するのみではなく、症状の発症を遅延させた。このことは、AMDACが、多発性硬化症の治療において治療的利益があることを示している。
【０４０６】
(等価物)：
本発明は、本明細書に記載の具体的実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０４０７】
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書で引用されており、それらの開示は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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