(57)【要約】  本明細書には、過酸ベースの有益剤で毛髪を処理するための組成物および方法が開示されている。過酸有益剤は、毛髪漂白、毛髪弱化、毛髪除去、ヘアウェービング（ｈａｉｒ  ｗａｉｖｉｎｇ）、ヘアストレートニング（ｈａｉｒ  ｓｔｒａｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）またはこれらの任意の組み合わせのために使用することができる。過酸は、過酸素源の存在下で、過加水分解活性を有する酵素（ペルヒドロラーゼ）を用いてカルボン酸エステル基質から酵素的に発生され得る。毛髪結合ドメインに直接または任意選択的なリンカーを介して結合されたペルヒドロラーゼを含む融合タンパク質を使用して、過加水分解活性を毛髪表面に標的化することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸ベース有益剤を、皮膚ではなく毛髪に優先的に提供するための方法であって、
ａ）ペルヒドロリシス活性を有し、毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つの結合ドメインを有する酵素の集団を含む組成物を備え付けるステップと、
ｂ）毛髪および皮膚を含む体表面をステップａ）の組成物と接触させるステップで、それにより酵素集団の第１の画分が毛髪に永続的に結合し、酵素集団の第２の画分が毛髪に永続的に結合しない、該ステップと、
ｃ）体表面をリンスして、毛髪に耐久的に結合されなかった酵素の第２の画分を除去するステップと、
ｄ）場合により、リンスした体表面を乾燥させるステップと、
ｅ）毛髪に永続的に結合された酵素を、過酸化水素および少なくとも１つのカルボン酸エステル基質を含む水溶液と接触させるステップで、それにより過酸有益剤が発生し、過酸に基づく利益を皮膚ではなく毛髪に優先的に提供する、該ステップと、
ｆ）場合により、ステップ（ａ）〜（ｅ）を繰り返すステップと
を含む、上記方法。
【請求項２】
過酸に基づく利益が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベース有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非過酸ベース有益剤が、脱毛剤、染毛剤、ヘアコンディショニング剤またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
有効量の過酸が、接触ステップ（ｅ）実行の６０分以内に発生し、該有効量が０．００１質量％〜４質量％の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素的に生成される過酸が過酢酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アリールエステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、炭水化物エステラーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アリールエステラーゼが、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
炭水化物エステラーゼがＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、それぞれが、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、該シグネチャーモチーフが、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
カルボン酸エステル基質が、
ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここでＲ６は、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７について、場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステルと、
ｂ）構造
【化１】
2014501760.tif 000068
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、
Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリドと、
ｃ）式
【化２】
2014501760.tif 000069
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたはそれより多いエステルと、
ｄ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類と、
ｅ）これらの混合物と
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１のステップ（ａ）のペルヒドロリシス活性を有する酵素集団を含む組成物が、少なくとも１つの界面活性剤を含むボディウォッシュの形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１の接触ステップ（ｅ）の過酸化水素および少なくとも１つのカルボン酸エステル基質を含む水溶液が、経皮的に許容可能な成分を含むモイスチャークリームまたはローションの形態である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｅ）のモイスチャークリームまたはローションが、１０秒〜２４時間の間、体表面と接触される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）〜（ｅ）が繰り返され、それにより、永続的に結合されるペルヒドロリシス活性を有する酵素の量が、処理の繰り返しと共に増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
接触ステップ（ｂ）が５秒〜５分間行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
過酸有益剤を毛髪に提供するための方法であって、
ａ）１）ペルヒドロリシス活性を有する少なくとも１つの酵素と、
２）過酸素源と、
３）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７について、場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化３】
2014501760.tif 000070
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化４】
2014501760.tif 000071
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたはそれより多いエステル、
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類、ならびに
ｖ）これらの混合物
からなる群から選択される基質と
を含む反応成分のセットを備え付けるステップと、
ｂ）毛髪を含む体表面を、反応成分のセットを組み合わせることによって得られる有効量の酵素的に発生した過酸と接触させ、それにより過酸ベースの利益が毛髪を含む体表面に提供されるステップと、
ｃ）体表面をすすぐステップと、
ｄ）場合により、すすいだ体表面を乾燥させるステップと、
ｅ）場合により、ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップと
を含む、上記方法。
【請求項１７】
過酸ベースの利益が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベース有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非過酸ベース有益剤が、脱毛剤、染毛剤、ヘアコンディショニング剤、およびこれらの組み合わせである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
過酸の有効量が０．００１質量％〜４質量％の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
過酸が過酢酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
反応成分のセットが体表面上で組み合わせられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
反応成分のセットが体表面と接触される前に組み合わせられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＨＳＢＤ
または
ＨＳＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
（式中、ＰＡＨは、ペルヒドロリシス活性を有する酵素であり、
ＨＳＢＤは、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分であり、
Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意選択的なペプチドリンカーであり、
ｙは０または１である）
を有する融合タンパク質である、請求項１、６、７、８、９および１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
毛髪に対する親和性を有するペプチド成分が、抗体、Ｆａｂ抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、ラクダ科抗体、スカフォールドディスプレイタンパク質または免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドが、毛髪に対して１０−５Ｍ以下のＫＤ値またはＭＢ５０値を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドが２〜５０の毛髪結合ペプチドを含み、毛髪結合ペプチドが、独立して、そして場合により、１〜１００の範囲のアミノ酸長さのポリペプチドスペーサーによって分離されていてもよい、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
毛髪に対する親和性を有するペプチド成分が正味の正電荷を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
過酸が、過酸発生反応成分を組み合わせてから６０分以内に０．００１％〜４％の濃度で生成される、請求項１または１６に記載の方法。
【請求項２９】
過酸を１時間未満の間毛髪と接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒と、
ｂ）１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７について、場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
２）構造
【化５】
2014501760.tif 000072
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
３）式
【化６】
2014501760.tif 000073
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたはそれより多いエステル、ならびに
３）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）ヘアケア製品において使用するのに適した経皮的に許容可能なキャリア媒体と
を含むヘアケア製品。
【請求項３１】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、
ａ）ペルヒドロリシス活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｂ）ヒト毛髪に対する親和性を有するペプチド成分を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質の形態である、請求項３０に記載のヘアケア製品。
【請求項３２】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、およびこれらの組み合わせの群から選択される、請求項３０または３１に記載のヘアケア製品。
【請求項３３】
アリールエステラーゼが、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のヘアケア製品。
【請求項３４】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のヘアケア製品。
【請求項３５】
炭水化物エステラーゼがＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、それぞれが、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、該シグネチャーモチーフが、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
を含む、請求項３２に記載のヘアケア製品。
【請求項３６】
ヒト毛髪に対する親和性を有するペプチド成分を有する第２の部分が、少なくとも１つの毛髪結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである、請求項３１に記載のヘアケア製品。
【請求項３７】
毛髪結合ペプチドが５〜６０の範囲のアミノ酸長さである、請求項３６に記載のヘアケア製品。
【請求項３８】
ヘアケア製品が、粉末剤、ペースト剤、ゲル剤、液剤、油剤、軟膏剤、スプレー剤、フォーム剤、錠剤、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナーリンスまたはこれらの任意の組み合わせの形態である、請求項３０または３１に記載のヘアケア製品。
【請求項３９】
ヘアケア製品が使用される前は、酵素触媒が、カルボン酸エステル基質、過酸素源、またはカルボン酸エステル基質および過酸素源の両方から分離されたままである、請求項３０に記載のヘアケア製品。
【請求項４０】
ａ）１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
２）構造
【化７】
2014501760.tif 000074
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
３）式
【化８】
2014501760.tif 000075
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたはそれより多いエステル、ならびに
４）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される、０．１〜５０質量％の少なくとも１つの基質と、
ｂ）０．１〜１５質量％の過酸化水素源と、
ｃ）ペルヒドロリシス活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７炭水化物エステラーゼを含む、０．００１〜１質量％の酵素触媒と、
ｄ）経皮的に許容可能なキャリア媒体を含む、９８質量％までのヘアケア組成物の残りの成分と
を含む反応成分のセットを含み、それにより、反応成分を混合したときに過酸が生成される、毛髪を除去または弱化するためのヘアケア製品。
【請求項４１】
ヘアケア製品がさらに、２５質量％までの膨潤剤を含む、請求項４０に記載のヘアケア製品。
【請求項４２】
膨潤剤が尿素を含む、請求項４１に記載のヘアケア製品。
【請求項４３】
さらに、２５質量％までの還元剤を含む、請求項４０に記載のヘアケア製品。
【請求項４４】
還元剤がチオグリコレートである、請求項４３に記載のヘアケア製品。
【請求項４５】
ａ）０．００１〜４質量％の過酢酸を含む組成物を備え付けるステップと、
ｂ）毛髪を含む体表面を適切な条件下で過酢酸と接触させて、過酸処理された毛髪を形成するステップと、
ｃ）場合により、過酢酸処理された毛髪を水溶液ですすぐステップと、
ｄ）場合により、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）の後に、毛髪を乾燥させるステップと、
ｅ）毛髪が体表面から除去されるまで、ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップとを含む、毛髪の除去方法。
【請求項４６】
ａ）０．００１〜４質量％の過酢酸を含む組成物を備え付けるステップと、
ｂ）初期引張強さによって特徴付けられる毛髪を含む体表面を、過酢酸を含む組成物と適切な条件下で接触させて、過酢酸処理された毛髪を形成するステップと、
ｃ）場合により、過酢酸処理された毛髪を水溶液ですすぐステップと、
ｄ）場合により、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）の後に、毛髪を乾燥させるステップと、
ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返し、それにより、毛髪の初期引張強さが低減されるステップと
を含む、毛髪の引張強さを低減する方法。
【請求項４７】
過酢酸処理された毛髪を、毛髪除去または毛髪弱化を増強するために少なくとも１つの還元剤と接触させる、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
還元剤が少なくとも１つのチオグリコレートである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
０．００１〜４質量％の過酢酸を含む組成物が、過酸化水素源および適切なカルボン酸エステル基質を反応させて過酢酸を生成することによって非酵素的に生成される、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項５０】
０．００１〜４質量％の過酢酸を含む組成物が、体表面と接触させる前にペルヒドロリシス酵素、過酸素源、およびカルボン酸エステル基質を組み合わせることによって酵素的に生産される、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項５１】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、およびこれらの組み合わせの群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
アリールエステラーゼが、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
炭水化物エステラーゼがＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、それぞれが、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、該シグネチャーモチーフが、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの毛髪結合ドメインに結合されたペルヒドロリシス酵素を含む融合タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子構築物を含む組換え微生物宿主細胞を備え付けるステップの、該融合タンパク質が、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分に結合されたペルヒドロリシス活性を有する酵素を含む、該ステップと、
ｂ）組換え微生物宿主細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより融合タンパク質が産生されるステップと、
ｃ）場合により、融合タンパク質を回収するステップと
を含む、上記方法。
【請求項５６】
組換え微生物宿主細胞が、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
毛髪の除去、毛髪の弱化、他の脱毛製品を増強するための毛髪の前処理、毛髪の漂白、染料を適用する前の毛髪の前処理、毛髪のカーリング、および毛髪のコンディショニングのために有効濃度の少なくとも１つの過酸を生成するための、ペルヒドロリシス活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼのヘアケア製品における使用。
【請求項５８】
毛髪の除去、毛髪の弱化、他の脱毛製品を増強するための毛髪の前処理、毛髪の漂白、染料を適用する前の毛髪の前処理、毛髪のカーリング、および毛髪のコンディショニングのために有効濃度の少なくとも１つの過酸を生成するための、ペルヒドロリシス活性を有するアリールエステラーゼのヘアケア製品における使用であって、該アリールエステラーゼが、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書中に援用される２０１０年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２４，８４７号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヘアケアの有益剤（ｂｅｎｅｆｉｔ  ａｇｅｎｔ）として少なくとも１つの過酸を含むパーソナルケア製品の分野に関する。過酸は、少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質および過酸素源の存在下で酵素的に生成され得る。具体的には、ヘアケア製品で使用するための過酸有益剤を生成するために、過加水分解活性を有する酵素を含む少なくとも１つの酵素触媒が使用される。過加水分解酵素は、毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を含有するように操作された融合タンパク質の形態であり得る。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシカルボン酸（「過酸」）は有効な抗菌剤である。望ましくない微生物の増殖に対して硬い表面、食品、生きた植物組織、および医療デバイスを清浄化、消毒、および／または衛生化するための方法が記載されている（例えば、特許文献１〜５）。また過酸は、洗濯洗剤用途のための漂白組成物の調製においても有用であることが報告されている（例えば、特許文献６〜８）。
【０００４】
また過酸は、毛髪、皮膚および爪などのケラチン材料を酸化し得ることも報告されている。例えば、特許文献９（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｐ．ら）には、１００℃よりも低い温度において４個以下の炭素原子を有する飽和過脂肪酸（ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｐｅｒａｌｉｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ）の水溶液を用いて、ケラチン材料のジスルフィド結合をスルフィドリルまたはスルホン酸に酸化して、酸化された材料が容易に希アルカリ中に溶解するようにする方法が記載されている。Ｌｉｌｌｉｅら（非特許文献１）は、ケラチン構造の酸化誘発性の好塩基球増加症を開示している。特許文献１０（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅら）は、毛髪などのケラチン含有源から水溶性ペプチドを得るための方法を開示しており、水溶性ペプチドを形成するために水溶液中のケラチン含有材料を酸化することを含む。酸化剤は、過酢酸を含み得る。
【０００５】
過酸の使用が記載されているヘアケア組成物および方法が報告されている。特許文献１１（Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．）は、過酢酸およびカタラーゼで毛髪を処理した後、プロテアーゼで毛髪を処理する方法を開示している。特許文献１２〜１５、および特許文献１６（Ｄｉａｓら）には、ペルオキシ酸酸化剤および酸化ヘアカラーリング剤を含むヘアカラーリング組成物が記載されている。特許文献１７（Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．）には、ペルオキシ化合物および反応染料によるヒト毛髪の染色が記載されている。特許文献１８（Ｃｌａｒｋら）には、有機過酸成分と、有機界面活性剤およびＣ１０〜Ｃ２１脂肪酸アミドを含有する水性発泡性溶液とを含む毛髪処理のための組成物が記載されている。特許文献１９（Ｔｉｌｌら）には、モノ過フタル酸マグネシウムを含むヒト毛髪の酸化処理のための薬剤が開示されている。
【０００６】
非特許文献２は、過酢酸、Ｎａ２Ｏ２、およびＣＡＲＯＡＴ（登録商標）またはＣｌＯ２で毛髪ケラチンを酸化した後、酸化された毛髪をアルカリで溶解させることによる脱毛方法を開示している。特許文献２０（Ｈａｈｎら）には、皮膚（子ウシ皮、ヤギ皮、ヒツジ皮）および牛革の過酸による処理（０．５〜５重量％の過酢酸、ｐＨ２〜５．５で３時間の処理）の後、中性塩または弱もしくは強アルカリ性作用塩または塩基で処理することによる脱毛方法が開示されている。パーソナルケア用脱毛製品で使用するのに適した製剤における過酸の使用は記載されていない。
【０００７】
過酸を含むスキンホワイトニング組成物も開示されている。特許文献２１（Ｇｕｐｔａ，Ｓ．）には、過酢酸などの活性酸素供与剤に結合されたアニオン性ゼオライトケージ錯体を含むスキンホワイトニング組成物が開示されている。特許文献２２（Ｋｌａｖｅｎｅｓｓら）には、２〜６重量％の過酸化物漂白剤を含む、皮膚漂白のための過酸化物組成物が開示されている。記載される過酸化物漂白剤には、有機過酸およびその塩が含まれた。
【０００８】
過加水分解活性を有する特定の変異体スブチリシンカールスバーグプロテアーゼをボディケア製品に包含させることは、特許文献２３（Ｗｉｅｌａｎｄら）に開示されている。特定の変異体プロテアーゼ以外の過加水分解酵素は記載されておらず、パーソナルケア有益剤としての過酸の酵素的生成を実証する実施例も存在しない。
【０００９】
特許文献２４〜２６、および特許文献２７（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）には、カルボン酸エステル基質を（過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下で）消毒剤および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度のペルオキシカルボン酸に転換するために、有意な過加水分解活性を特徴とする炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのメンバーとして構造的に分類される酵素（すなわち、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）が開示されている。炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのいくつかのメンバーは、アルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルから、反応成分を混合してから１分以内に４０００〜５０００ｐｐｍ、そして５分〜３０分の間に９０００ｐｐｍまでの過酢酸を生成するのに十分な過加水分解活性を有することが実証されている（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、特許文献２８）。特許文献２９には、改善された過加水分解活性を有する変異体ＣＥ−７酵素が記載されている。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは例外的な過加水分解活性を有するが、化粧用パーソナルケア製品におけるその使用は開示されていない。従って、解決すべき問題は、過酸有益剤の生成のために少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼの使用を含むパーソナルケア組成物および方法を提供することである。
【００１０】
過酸は強酸化剤であり、所望の利益の標的ではない材料を含む様々な材料に対して反応性であり得る。従って、特定のパーソナルケア用途は、過酸の生成を所望の標的体表面またはその付近に局在化させることによって、過酸有益剤を所望の体表面に標的化する／焦点を合わせる能力から利益を得ることができる。酵素的な過酸の生成は、ペルヒドロラーゼを体表面に標的化することによって利益を得ることができる。
【００１１】
ペプチド親和性材料としての抗体、抗体断片（Ｆａｂ）、単鎖融合可変領域抗体（ｓｃＦｃ）、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）抗体、および大型スキャフォールドディスプレイタンパク質の使用は、そのサイズおよびコストのために、いくつかのパーソナルケア用途に対しては適切でないことがある。従って、特定の低コスト化粧品用途では、有益剤の標的化送達のためにより短くより安価なペプチド親和性材料を使用することの必要性が残されている。
【００１２】
化粧用有益剤を体表面に標的化するためにより短いバイオパニングされた（ｂｉｏｐａｎｎｅｄ）ペプチドを使用することが記載されている（特許文献３０〜３２、および特許文献３３〜４２、および特許文献４３、ならびに公開されたＰＣＴ出願の特許文献４４、特許文献４５、および特許文献４６）。過酸有益剤の生成のために活性過加水分解酵素（すなわち、「標的化ペルヒドロラーゼ」）に結合するための、毛髪に対する親和性を有するペプチド材料の使用は記載されていない。
【００１３】
従って、解決すべきさらなる問題は、酵素的な過酸の生成を毛髪に対して標的化するのに適した組成物および方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３−００２６８４６Ａ１号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献９】英国公開特許明細書のＧＢ６９２，４７８（Ａ）号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，２７０，７９１号明細書
【特許文献１１】中国特許出願公開第ＣＮ１０１４４０５７５Ａ号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００２−００５３１１０Ａ１号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，０２２，３８１号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，００４，３５５号明細書
【特許文献１５】国際公開第９７／２４１０６号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第９７／２４１０８号パンフレット
【特許文献１７】米国特許第３，６７９，３４７号明細書
【特許文献１８】英国特許のＧＢ１５６０３９９Ａ号明細書
【特許文献１９】独国特許出願公開第ＤＥ１９７３３８４１Ａ１号明細書
【特許文献２０】米国特許第３，４７９，１２７号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００７−１０６６３３９Ａ１号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２００６−０１６１１２１Ａ１号明細書
【特許文献２３】米国特許第７，５１０，８５９号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２００８−０１７６７８３Ａ１号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９Ａ１号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２００９−０００５５９０Ａ１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１０−００４１７５２Ａ１号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００９−０００５５９０Ａ１号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９Ａ１号明細書
【特許文献３０】米国特許第７，２２０，４０５号明細書
【特許文献３１】同第７，３０９，４８２号明細書
【特許文献３２】同第７，２８５，２６４号明細書
【特許文献３３】同第７，８０７，１４１号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９Ａ１号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２００７−０１９６３０５Ａ１号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２００６−０１９９２０６Ａ１号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２００７−００６５３８７Ａ１号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第２００８−０１０７６１４Ａ１号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２００７−０１１０６８６Ａ１号明細書
【特許文献４０】米国特許出願公開第２００６−００７３１１１Ａ１号明細書
【特許文献４１】米国特許出願公開第２０１０−０１５８８４６号明細書
【特許文献４２】米国特許出願公開第２０１０−０１５８８４７号明細書
【特許文献４３】米国特許出願公開第２０１０−０２４７５８９号明細書
【特許文献４４】国際公開第２００８／０５４７４６号パンフレット
【特許文献４５】国際公開第２００４／０４８３９９号パンフレット
【特許文献４６】国際公開第２００８／０７３３６８号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，（１９５４）９５−１０２
【非特許文献２】Ｈａｈｎ，Ｆ．ら（Ｌｅｄｅｒ（１９６７）１８（８）：１８４−１９２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
毛髪除去（脱毛剤）、毛髪の引張強さの低減、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）を増強するために使用される毛髪の前処理、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニングなどの用途において使用され得る過酸有益剤を酵素的に生成するための組成物および方法が提供される。
【００１７】
一実施形態では、過酸ベースの有益剤を、皮膚ではなく毛髪に優先的に提供するための方法が提供されており、本方法は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素集団を含む組成物を提供するステップであって、前記酵素が、毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つの結合ドメインを有するステップと、
ｂ）毛髪および皮膚を含む体表面をステップａ）の組成物と接触させ、それにより酵素集団の第１の画分が毛髪に永続的に結合し、酵素集団の第２の画分が毛髪に永続的に結合しないステップと、
ｃ）体表面をすすいで、毛髪に永続的に結合されない酵素の第２の画分を除去するステップと、
ｄ）場合により、すすいだ体表面を乾燥させるステップと、
ｅ）毛髪に永続的に結合された前記酵素を、過酸化水素および少なくとも１つのカルボン酸エステル基質を含む水溶液と接触させ、それにより過酸有益剤が発生され、過酸に基づく利益が皮膚ではなく毛髪に優先的に提供されるステップと、
ｆ）場合により、ステップ（ａ）〜（ｅ）を繰り返すステップと
を含む。
【００１８】
別の実施形態では、過酸に基づく利益は、毛髪除去、毛髪弱化（ｈａｉｒ  ｗｅａｋｅｎｉｎｇ）、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベースの有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい態様では、過酸ベースの利益は、毛髪除去または毛髪弱化である。
【００１９】
過酸有益剤を毛髪と結合および接触させる単一段階方法も提供される。一実施形態では、過酸有益剤を毛髪に提供するための方法が提供されており、本方法は、
ａ）１）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素と、
２）過酸素源と、
３）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１】
2014501760.tif 000002
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化２】
2014501760.tif 000003
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類、ならびに
ｖ）これらの混合物
からなる群から選択される基質と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
ｂ）毛髪を含む体表面を、反応成分のセットを混ぜ合わせることによって得られる有効量の酵素的に発生された過酸と接触させ、それにより過酸ベースの有益剤が毛髪を含む体表面に提供されるステップと、
ｃ）体表面をすすぐステップと、
ｄ）場合により、すすいだ体表面を乾燥させるステップと、
ｅ）場合により、ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップと
を含む。
【００２０】
過加水分解酵素は、任意的なペプチドスペーサーを介して毛髪に対する親和性を有するペプチド成分に結合された過加水分解酵素を含む融合タンパク質を使用することによって、毛髪に標的化され得る。好ましい態様では、過加水分解活性を有する酵素は、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＨＳＢＤ
または
ＨＳＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
を有する融合タンパク質であり、式中、
ＰＡＨは、過加水分解活性を有する酵素であり、
ＨＳＢＤは、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分であり、
Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意選択的なペプチドリンカーであり、
ｙは０または１である。
【００２１】
さらなる実施形態では、
ａ）過加水分解活性を有する酵素触媒と、
ｂ）１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
２）構造
【化３】
2014501760.tif 000004
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
３）式
【化４】
2014501760.tif 000005
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
３）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）ヘアケア製品において使用するのに適した経皮的に許容可能なキャリア媒体と
を含むヘアケア製品が提供される。
【００２２】
０．００１重量％〜４重量％の過酢酸を含む組成物を用いて毛髪の引張強さを除去または弱化する方法も提供されており、本方法は、
ａ）０．００１〜４重量％の過酢酸を含む組成物を提供するステップと、
ｂ）過酸処理された毛髪を形成するために適切な条件下で、毛髪を含む体表面を前記過酢酸と接触させるステップと、
ｃ）場合により、過酢酸処理された毛髪を水溶液ですすぐステップと、
ｄ）場合により、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）の後に、毛髪を乾燥させるステップと、
ｅ）毛髪が体表面から除去されるまで、ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップとを含む。
【００２３】
好ましい態様では、体表面に適用される上記過酢酸組成物は水性組成物である。ただし、さらに好ましい態様では、体表面に適用される過酢酸組成物は、実質的に非水性組成物を含まない（すなわち、１つまたは複数の有機溶媒を本質的に含む）。
【００２４】
毛髪に利益を提供する過酸を酵素的に生成するために、過加水分解活性を有する加水分解酵素が使用される。一実施形態では、過加水分解酵素は、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、およびこれらの組み合わせの群から選択される。好ましい態様では、過加水分解アリールエステラーゼは、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
別の好ましい態様では、過加水分解酵素は、構造的に炭水化物エステラーゼに分類される。好ましい態様では、炭水化物エステラーゼはＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、それぞれが、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆ）を有し、前記シグネチャーモチーフは、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
別の実施形態では、
ａ）１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
２）構造
【化５】
2014501760.tif 000006
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
３）式
【化６】
2014501760.tif 000007
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
４）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される、０．１〜５０重量％の少なくとも１つの基質と、
ｂ）０．１〜１５重量％の過酸化水素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素を含む、０．００１〜１重量％の〜酵素触媒と、
ｄ）経皮的に許容可能なキャリア媒体を含む、９８重量％までのヘアケア組成物の残りの成分と
を含む反応成分のセットを有し、それにより、反応成分を混合したときに過酸が生成される、ヘアケア製品が提供される。
【００２８】
上記の方法の好ましい態様では、過加水分解活性を有する酵素は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ、アリールエステラーゼ、またはこれらの組み合わせである。
【００２９】
別の実施形態では、少なくとも１つの毛髪結合ドメインに結合された過加水分解酵素を
含む融合タンパク質の産生のための方法が提供されており、本方法は、
ａ）融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子構築物を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、前記融合タンパク質が、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分に結合された過加水分解活性を有する酵素を含むステップと、
ｂ）組換え微生物宿主細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより融合タンパク質が産生されるステップと、
ｃ）場合により、融合タンパク質を回収するステップと
を含む。
【００３０】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）、ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則の２０８項および付録Ｃの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【００３１】
配列番号１は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００３２】
配列番号２は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号３は、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００３４】
配列番号４は、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号５は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００３６】
配列番号６は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの酸配列である。
【００３７】
配列番号７は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００３８】
配列番号８は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号９は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４０】
配列番号１０は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１１は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４２】
配列番号１２は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１３は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４４】
配列番号１４は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１５は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号１６は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１７は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４８】
配列番号１８は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号１９は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの核酸配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４において報告されるようなバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列は、他のセファロスポリンＣデアセチラーゼとの配列アライメントと、他のＣＡＨ酵素の観察される長さ（通常は、３１８〜３２５のアミノ酸長さ、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−００８７５２８−Ａ１号明細書を参照）に対する報告される長さ（３４０のアミノ酸）の比較とに基づいて恐らく誤りである、１５アミノ酸Ｎ−末端付加をコードすると思われることに注意すべきである。従って、本明細書で報告される核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４で報告されるＮ−末端１５アミノ酸を含まないバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼ配列をコードする。
【００５０】
配列番号２０は、配列番号１９の核酸配列によってコードされるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２１は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００５２】
配列番号２２は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２３は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００５４】
配列番号２４は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２５は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）をコードする核酸配列である。
【００５６】
配列番号２６は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推定アミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号２７は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書（参照によってその全体が本明細書中に援用される）からのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５８】
配列番号２８は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５９】
配列番号２９は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００６０】
配列番号３０は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００６１】
配列番号３１は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からの「ＲＱ２（ａ）」に由来するサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００６２】
配列番号３２は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からの「ＲＱ２（ｂ）」に由来するサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７８のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００６３】
配列番号３３は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３４は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号３５は、本明細書において「ＲＱ２（ａ）」と記載されるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２からの第１のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号３６は、本明細書において「ＲＱ２（ｂ）」と記載されるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２からの第２のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号３７は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼをコードするコドン最適化核酸配列である。
【００６８】
配列番号３８は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号３９は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＥＵ２５５９１０）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７０】
配列番号４０は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＢＸ７５６３４．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号４１は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＣ＿００２６７８．２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７２】
配列番号４２は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＢ５３１７９．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＦ０３８５４７．２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７４】
配列番号４４は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＦ７０２０２．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号４５は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｆ２４Ｉ／Ｓ３５Ｔ／Ｑ１７９Ｌ／Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ／Ｓ３０８Ｇ／Ｆ３１７Ｓ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ（ａ．ｋ．ａ．変異体「Ａ３」）をコードする核酸配列である。
【００７６】
配列番号４６は、「Ａ３」変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号４７は、Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７８】
配列番号４８は、Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号４９は、Ｃ２７７Ｓ／Ｆ３１７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００８０】
配列番号５０は、Ｃ２７７Ｓ／Ｆ３１７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号５１は、Ｓ３５Ｔ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００８２】
配列番号５２は、Ｓ３５Ｔ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号５３は、Ｑ１７９Ｌ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００８４】
配列番号５４は、Ｑ１７９Ｌ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号５５は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｌ８Ｒ／Ｌ１２５Ｑ／Ｑ１７６Ｌ／Ｖ１８３Ｄ／Ｆ２４７Ｉ／Ｃ２７７Ｓ／Ｐ２９２Ｌ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｈ９をコードする核酸配列である。
【００８６】
配列番号５６は、８４３Ｈ９変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８７】
配列番号５７は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｋ７７Ｅ／Ａ２６６Ｅ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｆ１２をコードする核酸配列である。
【００８８】
配列番号５８は、８４３Ｆ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８９】
配列番号５９は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｆ２７Ｙ／Ｉ１４９Ｖ／Ａ２６６Ｖ／Ｃ２７７Ｓ／Ｉ２９５Ｔ／Ｎ３０２Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｃ１２をコードする核酸配列である。
【００９０】
配列番号６０は、８４３Ｃ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号６１は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｌ１９５Ｑ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４２Ｈ３をコードする核酸配列である。
【００９２】
配列番号６２は、８４２Ｈ３変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００９３】
配列番号６３は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｙ１１０Ｆ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４１Ａ７をコードする核酸配列である。
【００９４】
配列番号６４は、８４１Ａ７変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００９５】
配列番号６５〜２２１、２７１、２９０、および２９１は、毛髪に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列の非限定的なリストである。
【００９６】
配列番号２１７〜２６９は、皮膚に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
【００９７】
配列番号２７０〜２７１は、爪に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号２７２−２８５は、ペプチドリンカー／スペーサーのアミノ酸配列である。
【００９９】
配列番号２８６は、融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３をコードする核酸配列である。
【０１００】
配列番号２８７は、融合構築物Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０をコードする核酸配列である。
【０１０１】
配列番号２８８は、融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３のアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号２８９は、融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０のアミノ酸配列である。
【０１０３】
配列番号２９０は、毛髪結合ドメインＨＣ２６３のアミノ酸である。
【０１０４】
配列番号２９１は、毛髪結合ドメインＨＣ１０１０のアミノ酸配列である。
【０１０５】
配列番号２９２は、発現プラスミドｐＬＤ００１の核酸配列である。
【０１０６】
配列番号２９３は、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｓのアミノ酸配列である。
【０１０７】
配列番号２９４は、Ｄ１２８Ｇ置換をさらに含む融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（「ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３」）のアミノ酸配列である。
【０１０８】
配列番号２９５は、Ｄ１２８Ｇ置換をさらに含む融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０（「ＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０」）のアミノ酸配列である。
【０１０９】
配列番号２９６は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｆ２６８Ｓ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ａ１０（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書、参照によって本明細書に援用される）をコードする核酸配列である。
【０１１０】
配列番号２９７は、００６Ａ１０変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１１】
配列番号２９８は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｒ２１８Ｃ／Ｃ２７７Ｔ／Ｆ３１７Ｌ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｅ１０（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１２】
配列番号２９９は、００６Ｅ１０変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１３】
配列番号３００は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｈ２２７Ｌ／Ｔ２３３Ａ／Ｃ２７７Ｔ／Ａ２９０Ｖ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｅ１２（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１４】
配列番号３０１は、００６Ｅ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１５】
配列番号３０２は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｄ２５４Ｇ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｇ１１（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１６】
配列番号３０３は、００６Ｇ１１変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１７】
配列番号３０４は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｒ２６１Ｓ／Ｉ２６４Ｆ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｆ１２（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１８】
配列番号３０５は、００６Ｆ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１９】
配列番号３０６は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｗ２８Ｃ／Ｆ１０４Ｓ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｂ１２（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１２０】
配列番号３０７は、００６Ｂ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１２１】
配列番号３０８は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ａ２６６Ｐ／Ｃ２７７Ｓ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８７４Ｂ４（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書、参照によって本明細書に援用される）をコードする核酸配列である。
【０１２２】
配列番号３０９は、８７３Ｂ４変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号３１０は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｗ２８Ｃ／Ｌ３２Ｐ／Ｄ１５１Ｅ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｄ１０（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書、参照によって本明細書に援用される）をコードする核酸配列である。
【０１２４】
配列番号３１１は、００６Ｄ１０変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１２５】
配列番号３１２は、毛髪結合ドメイン「ＨＣ２６３ＫｔｏＲ」のアミノ酸配列であり、１０リジン残基が１０アルギニン残基によって置置換された毛髪結合ドメイン「ＨＣ２６３」（配列番号２９０）の変異体である。
【０１２６】
配列番号３１３は、荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈ６のアミノ酸配列である。
【０１２７】
配列番号３１４は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１２８】
配列番号３１５は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１２９】
配列番号３１６は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３０】
配列番号３１７は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号３１８は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３２】
配列番号３１９は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号３２０は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３４】
配列番号３２１は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号３２２は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３６】
配列番号３２３は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号３２４は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３８】
配列番号３２５は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号３２６は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０（配列番号２９１）に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４０】
配列番号３２７は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号３２８は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４２】
配列番号３２９は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−
Ｈｉｓ６に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号３３０は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４４】
配列番号３３１は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４５】
配列番号３３２は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４６】
配列番号３３３は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＦｔｏＲに融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４７】
配列番号３３４は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０（配列番号２９１）に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４８】
配列番号３３５は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４９】
配列番号３３６は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１５０】
配列番号３３７は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１５１】
配列番号３３８は、野生型マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１５２】
配列番号３３９は、野生型シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１５３】
配列番号３４０は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１５４】
配列番号３４１は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＦｔｏＲに融合された、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ変異体のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
本開示において、いくつかの用語および略語が使用される。他に具体的に記載されない限り、以下の定義が適用される。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非限定的であることが意図される。従って、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及される規定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、使用される材料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または使用溶液を製造するために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物を製造するためまたは方法を実行するために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって、および同類のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。
【０１５９】
存在する場合、全ての範囲は包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が列挙される場合、列挙される範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈されるべきである。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「接触させる」は、所望の結果（標的表面の結合、過酸ベースの効果など）を達成するのに十分な時間、組成物を標的体表面と接触した状態に置くことを指す。一実施形態では、「接触させる」は、所望の結果を達成するのに十分な時間、有効濃度の過酸を含む（または生成することができる）組成物を標的体表面と接触した状態に置くことを指すことができる。別の実施形態では、「接触させる」は、酵素的な過加水分解のために使用される反応成分の１つまたは複数などのパーソナルケア組成物の少なくとも１つの成分を、標的体表面と接触した状態に置くことを指すこともできる。接触には、噴霧、処理、浸漬、フラッシング、注入（上または中に）、混合、混ぜ合わせ、ペインティング、コーティング、適用、付着が含まれ、あるいは、有効濃度の過酸を含む過酸溶液もしくは組成物、有効濃度の過酸を形成する溶液もしくは組成物、または有効濃度の過酸を形成する組成物の成分を体表面と連通させることも含まれる。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「基質」、「適切な基質」、および「カルボン酸エステル基質」という用語は、具体的には：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘは式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または環状５員ヘテロ芳香族もしくは６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステルもしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｂ）構造
【化７】
2014501760.tif 000008
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、あるいは
（ｃ）式
【化８】
2014501760.tif 000009
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類、あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
を交換可能に指す。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「過酸」という用語は、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸およびペルオキソ酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）と同義である。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「過酢酸」という用語は「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０の全ての他の同義語と同義である。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同義である。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセテート、グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセテート、グリセロールトリアセテート、グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセテート、およびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全ての他の同義語と同義である。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、およびグリセリルモノブチレートと同義である。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチレートおよびグリセリルジブチレートと同義である。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチレート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全ての他の同義語と同義である。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、およびグリセリルモノプロピオネートと同義である。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオネートおよびグリセリルジプロピオネートと同義である。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアセチル基を含む単糖類、二糖類および多糖類を指す。例としては、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、もしくは三重結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子により置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子により置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置である。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールおよびこれらの混合物の「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏの少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を指し、式中、ＲはＣ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分である。一実施形態では、カルボン酸エステル基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＤＧＡ）、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「プロピレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシプロパン、プロピレンジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号６２３−８４−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「エチレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシエタン、エチレンジアセテート、グリコールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号１１１−５５−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「適切な酵素反応混合物」、「その場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）過酸の発生に適した成分」、「適切な反応成分」、「適切な水性反応混合物」、「反応混合物」、および「過酸発生成分」という用語は、反応物および過加水分解酵素触媒が接触される材料および水を指す。一実施形態では、過酸発生成分は、好ましくは毛髪などの体表面に対する親和性を有する結合ドメインを含む融合タンパク質の形態の、少なくとも１つのペルヒドロラーゼと、少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質と、過酸素源と、水（例えば、過酸化水素などの過酸素源を含む水溶液）とを含むであろう。好ましい態様では、ペルヒドロラーゼはＣＥ−７ペルヒドロラーゼであり、好ましくは、髪などの体表面に標的化された融合タンパク質の形態である。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、「過加水分解」という用語は、過酸を形成するための、選択された基質と過酸化物との反応であると定義される。通常、無機過酸化物が触媒の存在下で選択された基質と反応されて、ペルオキシカルボン酸を生成する。本明細書で使用される場合、「化学的な過加水分解」という用語は、基質（ペルオキシカルボン酸前駆体）が過酸化水素源と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、ペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。本明細書で使用される場合、「酵素的な過加水分解」という用語は、カルボン酸エステル基質（過酸前駆体）が過酸化水素源および水と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、酵素触媒が過酸の形成を触媒する。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの触媒活性を指す。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度で１分あたり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量であると定義される。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態であり得る。また酵素触媒は化学修飾されていてもよい（ペグ化、あるいは架橋試薬との反応などによる）。またペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られている方法を用いて可溶性または不溶性の担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７が参照される。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、ＡＸＥ）を指す。本明細書において説明されるように、有意な過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼとして分類されるいくつかの酵素が提供される。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を指す（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（６）：２２２４−２２２９）。有意な過加水分解活性を有するいくつかのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列が本明細書において提供される。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）」という用語は、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）を有する、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された細菌細胞を指す。本明細書に記載されるように、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からの有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号２として提供される（米国特許出願公開２０１０−００４１７５２号明細書を参照）。単離酵素のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＡ０１７２９．１によって提供されるセファロスポリンＣデアセチラーゼに対して１００％のアミノ酸同一性を有する（上記のＭｉｔｓｕｓｈｉｍａら）。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１、米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書を参照）。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１６として提供される。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」、および「単離核酸断片」は交換可能に使用され、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指すであろう。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。
【０１８８】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。
【０１８９】
【表１】
2014501760.tif 000010
【０１９０】
例えば、所与の部位で化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野においてよく知られている。本発明の目的のために、置換は、以下の５つの群：
１．  小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．  極性の負帯電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３．  極性の正帯電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．  大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、ならびに
５．  大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ
のうちの１つの中での交換であると定義される。
【０１９１】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、別のあまり疎水性でない残基（グリシン残基）またはより疎水性の残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負帯電残基による別の残基（アスパラギン酸によるグルタミン酸など）の置換、あるいは１つの正帯電残基による別の残基（リジンによるアルギニンなど）の置換をもたらす変化も、機能的に等価な産物を生じることが予想され得る。多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の改変をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性を変更しないと予想されるであろう。提唱される修飾のそれぞれは、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当該技術分野において十分にルーチン的な技能の範囲内である。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、「シグネチャーモチーフ」および「診断モチーフ」という用語は、定義される活性を有する酵素のファミリーの間で共有される保存構造を指す。シグネチャーモチーフは、定義される基質ファミリーに対して同様の酵素活性を有する構造的に関連する酵素ファミリーを定義および／または同定するために使用することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続アミノ酸配列であっても、あるいは一緒にシグネチャーモチーフを形成する不連続の保存モチーフの集まりであってもよい。通常、保存モチーフはアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、過加水分解酵素はＣＥ−７炭水化物エステラーゼシグネチャーモチーフを含む。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域に言及する場合の「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を指す。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらの構成要素は連結およびアニールされて遺伝子セグメントを形成し、これは次に酵素的に組み立てられて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡ配列に関する場合の「化学的に合成される」は、ヌクレオチド成分がインビトロで組み立てられたことを意味する。十分に確立された手順を用いて手作業によるＤＮＡの化学合成が達成されてもよいし、あるいはいくつかの市販の機械の１つを用いて自動化学合成が実施されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を作り、宿主細胞のコドンバイアスを反映することができる。当業者は、コドン使用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合に、遺伝子発現が成功する可能性を認識している。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能な宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸分子を指し、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の制御配列が含まれる。「天然遺伝子」は、その独自の制御配列を有して天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。「内在性遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、通常は宿主生物中に見出されないが遺伝子導入によって宿主生物中に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム内に導入された遺伝子である。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流側（５’非コード配列）、内部、または下流側（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５を組み込んだＦＡＳＴＡプログラムが含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた、ソフトウェア製造業者により設定された任意の値またはパラメータのセットを意味するであろう。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、「体表面」という用語は、過酸有益剤などの有益剤の標的としての役割を果たすことができる人体の任意の表面を指す。典型的な体表面としては、毛髪、皮膚、爪、歯、および歯肉が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法および組成物は、ヘアケア用途およびパーソナルケア製品に関する。従って、体表面は毛髪を含む。一実施形態では、体表面はヒト毛髪である。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「ボディウォッシュ」という用語は、皮膚を清浄化するように設計され、清浄化作用および発泡を提供するために１つまたは複数の界面活性剤を含む水性組成物を指す。さらに、ボディウォッシュ製剤は、増粘剤、湿潤剤、皮膚軟化剤、緩衝液、香料、グリセロール、染料、防腐剤、タンパク質および安定剤などの様々な種類の他の成分を含有してもよい。
【０２００】
保湿剤、ローションまたはボディローションという用語は、皮膚を水和させるためまたはその水分損失を低減するためのスキンケア用途において主要な利益を有する、低〜中程度の粘度の油および水のエマルション（ほとんどの場合は水中油であるが、油中水もあり得る）を指す。ほとんど全ての保湿剤は、皮膚軟化剤、閉塞剤（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ）、および湿潤剤の組み合わせを含有する。主として脂質および油である皮膚軟化剤は皮膚を水和させ、皮膚の外観を改善する。ペトロラタム、ラノリンおよび蜜ろうなどの閉塞剤は、皮膚の上に疎水性バリアを形成すことによって、経皮的な水分損失を低減する。グリセロールおよび尿素などの湿潤剤は、外部環境から水を引き付け、真皮から表皮内への吸水を増強することができる。さらに、保湿剤製剤は、エマルションの安定性を保持するために乳化剤を含有してもよく、所望の粘度および皮膚感触を達成するために増粘剤を使用してもよい。消費者に好まれる他の特質のために、香料、染料、防腐剤、治療薬、タンパク質および安定剤などの様々な種類の他の成分が一般的に添加される。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」は、この用語が説明する薬物、薬剤および／または不活性成分が、合理的な損益比に見合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー応答などを伴わずにヒトおよび他の動物の組織と接触して使用するのに適していることを意味する。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「パーソナルケア製品」は、毛髪、皮膚、頭皮、および歯の清浄化、漂白および／または消毒において使用される製品を意味し、シャンプー、ボディローション、シャワージェル、局所保湿剤、歯磨き粉、歯磨きジェル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、および／または他の局所クレンザーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの特定の好ましい実施形態では、これらの製品はヒトにおいて用いられるが、他の実施形態では、これらの製品の非ヒト動物による用途を見出す（例えば、獣医学用途において）。好ましい実施形態では、「パーソナルケア製品」という用語はヘアケア製品を指す。一実施形態では、ヘアケア製品は、粉末、ペースト、ジェル、液体、オイル、軟膏、スプレー、フォーム、錠剤、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナーリンスまたはこれらの任意の組み合わせの形態である。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「生物学的汚染物質」という用語は、１つまたは複数の不要なおよび／または病原性の生物学的実体を指し、微生物、胞子、ウィルス、プリオン、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、生物学的汚染物質の存在を低減および／または排除するために有用な有効濃度の少なくとも１つの過酸を酵素的に生成するための方法が提供される。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、「消毒する」という用語は、生物学的汚染物質を破壊する、または生物学的汚染物質の増殖を予防するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「消毒剤」という用語は、生物学的汚染物質の破壊、中和、または増殖の阻害によって消毒する薬剤を指す。通常、消毒剤は無生物または表面を処理するために使用される。本明細書で使用される場合、「消毒」という用語は、消毒の作用またはプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「防腐剤」という用語は、疾患を保有する微生物の増殖を阻害する化学物質を指す。１つの態様では、生物学的汚染物質は病原微生物である。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「衛生」という用語は、通常、健康に有害であり得る作用物質を除去、防止または調節することによる、健康の回復または保持を意味する、またはこれらに関する。本明細書で使用される場合、「衛生化する」という用語は、衛生的にすることを意味する。本明細書で使用される場合、「衛生化剤（ｓａｎｉｔｉｚｅｒ）」という用語は、衛生化する薬剤を指す。本明細書で使用される場合、「衛生化」という用語は、衛生化の作用またはプロセスを指す。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）」という用語は、微生物を不活性化または破壊する化学物質（通常は広範囲）を指す。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学物質は、「殺生物（ｂｉｏｃｉｄａｌ）」活性を有すると説明される。過酸は、殺生物活性を有することができる。当該技術分野で既知の典型的な代替の殺生物剤としては、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール、銅塩、有機硫黄化合物、および第４級アンモニウム塩を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「最小殺生物濃度」という語句は、特定の接触時間に、標的微生物の生存可能な集団において所望の致死的で不可逆的な低減を生じ得る殺生物剤の最小濃度を指す。有効性は、処理後の生存可能な微生物の減少のｌｏｇ１０によって測定することができる。１つの態様では、標的化される生存可能な微生物の処理後の減少は、少なくとも３−Ｌｏｇ１０の減少、より好ましくは少なくとも４−Ｌｏｇ１０の減少、最も好ましくは少なくとも５−Ｌｏｇ１０の減少である。別の態様では、最小殺生物濃度は、生存可能な微生物細胞の少なくとも６−Ｌｏｇ１０の減少である。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中にある場合に約１ｍＭ以上の濃度の過酸化水素を提供することができる化合物を指し、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において記載されるように、水性反応製剤中の過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を混ぜ合わせたときに最初は少なくとも０．１ｍＭ以上である。一実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも０．５ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、１０００ｍＭ以上である。水性反応製剤中の酵素基質、例えばトリグリセリドに対する過酸化水素のモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は約０．００２〜２０でよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５でよい。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合によって連結された２個から少なくとも２４個の間の単糖単位を含有する化合物を指す。「単糖」という用語は、実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎの化合物を指し、ここで、ｎ≧３であり、炭素骨格は分枝しておらず、各炭素原子は１つを除いてヒドロキシル基を含有し、残りの炭素原子は炭素原子２におけるアルデヒドまたはケトンである。また「単糖」という用語は、細胞内環状ヘミケタール型またはヘミケタール型も指す。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、製剤中の活性成分のキャリアとして使用される不活性物質を指す。賦形剤は、活性成分の貯蔵安定性など、製剤中の活性成分を安定化するために使用されてもよい、また賦形剤は、活性成分を含有する製剤を増量するために使用されることもある。本明細書において記載されるように、「活性成分」は、過加水分解活性を有する酵素、適切な反応条件下で過加水分解酵素により生成される過酸、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２１１】
「実質的に水を含まない」という用語は、カルボン酸エステル中に存在する場合に酵素または酵素粉末の貯蔵安定性に悪影響を与えない、製剤中の水の濃度を指すであろう。カルボン酸エステルは非常に低濃度の水を含有し得る。例えば、トリアセチンは、通常、１８０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍの水を有する。一実施形態では、過加水分解酵素は、実質的に水を含まないカルボン酸エステル基質中で貯蔵される。さらなる実施形態では、「実質的に水を含まない」は、酵素（または酵素粉末）およびカルボン酸エステルを含む製剤中の、２０００ｐｐｍ未満、好ましくは１０００ｐｐｍ未満、より好ましくは５００ｐｐｍ未満、さらにより好ましくは２５０ｐｐｍ未満の水を意味し得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、酵素が水溶液中で安定であるように発生系が設計されれば、水溶液中で貯蔵され得る（例えば、貯蔵中に酵素により加水分解されることが可能な有意な濃度のカルボン酸エステル基質を含有しない溶液）。一実施形態では、過加水分解酵素は、実質的に水を含まないカルボン酸エステル基質と、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）とを含む混合物中で貯蔵され得る。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を得るために標的材料にさらされる所与の条件および／または組成物（例えば、毛髪の除去または引張強さの変更のために毛髪を過酸にさらす）の量を指すであろう。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「酵素集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ）」という用語は複数の過加水分解酵素を指し、この集団は、異なる過加水分解酵素で構成され得る。一実施形態では、酵素集団は、毛髪などの標的材料に対する親和性を有するペプチド成分に結合された過加水分解酵素を含む融合タンパク質で構成され得る。酵素集団は、過加水分解酵素に結合される少なくとも１つの結合ドメインを含むことにより、毛髪などの標的表面に永続的に結合することができる亜集団または画分を含むことができる。洗浄またはすすぎなどの処理は、標的材料に永続的に結合する亜集団と、標的材料に永続的に結合しない亜集団とを区別するために使用され得る。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「毛髪に永続的に結合する」という用語は、（毛髪に接触および結合された後）続いて洗浄／すすぎにさらされた後でも毛髪に結合したままである過加水分解酵素（通常は融合タンパク質の形態である）を指すであろう。毛髪に永続的に結合されない過加水分解酵素の亜集団を除去するために使用される洗浄またはすすぎステップは、通常、毛髪をシャワーですすぐ場合に通常使用される水道水などの水で構成されるであろう。一実施形態では、毛髪に永続的に結合する過加水分解酵素は、以下の：１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いる２５℃での４回のすすぎと、その後の５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いる２５℃での２回のすすぎとを用いて、毛髪を洗浄／すすいだ後に、毛髪に結合したままでいることが可能な酵素（通常、標的化ペルヒドロラーゼ）によって定義することができる。すすぎステップと組み合わせて標的化ペルヒドロラーゼを設計する場合に、毛髪に対する強力な親和性を有するペプチド成分の使用は、皮膚ではなく毛髪において、過酸ベースの有益剤の優先的な生成を容易にする。
【０２１５】
過加水分解活性を有する酵素
過加水分解活性を有する酵素は、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼと分類されるいくつかの酵素、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（スブチリシンカールスバーグ変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解アリールエステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、配列番号３１５［Ｌ２９Ｐ変異体］および配列番号３３９［野生型］、米国特許第７，３８４，７８７号明細書）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からの過加水分解アリールエステラーゼ（配列番号３１４［Ｓ５４Ｖ変異体］および配列番号３３８［野生型］、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書）、および過加水分解炭水化物エステラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい態様では、過加水分解炭水化物エステラーゼはＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。
【０２１６】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、本明細書において報告されるような過加水分解活性を有する酵素をコードするアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０２１７】
別の実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０２１８】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０２１９】
別の実施形態では、実質的に類似の過加水分解酵素は、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の最終洗浄）下で、本発明の過加水分解酵素のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列によってコードされるものを含むことができる。
【０２２０】
好ましい実施形態では、ペルヒドロラーゼは、少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を有する融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼ（融合タンパク質）が、本明細書において記載されるペルヒドロラーゼのいずれかと実質的に類似の配列を含むかどうかを決定するために使用される全てのアライメントは、体表面に対する親和性を有するペプチド成分を持たない過加水分解酵素のアミノ酸配列に基づく。
【０２２１】
ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ
好ましい実施形態では、本発明のパーソナルケア組成物および方法は、構造的に酵素の炭水化物ファミリーエステラーゼファミリー７（ＣＥ−７ファミリー）のメンバーであると分類される過加水分解活性を有する酵素を含む（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ｉｎ「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ａｎｄ  Ｂ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｄｓ．，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．３−１２を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーは、過酸素源と混ぜ合わせられたときに様々なカルボン酸エステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するために特に有効であることが実証されている（国際公開第２００７／０７０６０９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書、同第２００８−１７６７８３号明細書、同第２００９−０００５５９０号明細書、同第２０１０−００４１７５２号明細書、および同第２０１０−００８７５２９号明細書、ならびに米国特許出願第１２／５７１７０２号明細書および米国仮特許出願第６１／３１８０１６号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）、それぞれ参照によって本明細書中に援用される）。
【０２２２】
ＣＥ−７ファミリーのメンバーには、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が含まれる。ＣＥ−７エステラーゼファミリーのメンバーは、保存されたシグネチャーモチーフを共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３））。ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むペルヒドロラーゼ（「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」）および／または実質的に類似の構造は、本明細書に記載される組成物および方法において使用するのに適している。実質的に類似の生物分子を同定するための手段は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、配列アライメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、および／または保存シグネチャーモチーフの存在）。１つの態様では、ペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、本明細書において提供される配列の１つに対する少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４２％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素が含まれる。
【０２２３】
本明細書で使用される場合、「酵素は構造的にＣＥ−７酵素と分類される」、「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」または「構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７酵素と分類される」という語句は、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類される過加水分解活性を有する酵素を指すために使用されるであろう。この酵素ファミリーは、シグネチャーモチーフの存在によって定義することができる（上記のＶｉｎｃｅｎｔら）。ＣＥ−７エステラーゼのためのシグネチャーモチーフは、３つの保存モチーフ：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０と、
ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３と、
ｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９と
を含む（残基位置の番号付けは、参照配列の配列番号２（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ）に対する）。
【０２２４】
通常、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒トライアドに属する３つのアミノ酸残基のうちの２つは太字である。一実施形態では、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびスレオニンからなる群から選択される。
【０２２５】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存モチーフのさらなる分析は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼをさらに定義するために使用され得る付加的な保存モチーフ（配列番号２のアミノ酸位置２６７〜２６９のＬＸＤ）の存在を示す。さらなる実施形態では、上記で定義されたシグネチャーモチーフは、
Ｌｅｕ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９
と定義される付加的な（第４の）保存モチーフを含むことができる。
【０２２６】
アミノ酸残基位置２６８のＸａａは、通常、イソロイシン、バリン、またはメチオニンである。第４のモチーフは、触媒トライアド（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）に属するアスパラギン酸残基（太字）を含む。
【０２２７】
ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を有する融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼ（融合タンパク質）がＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むかどうかを決定するために使用される全てのアライメントは、体表面に対する親和性を有するペプチド成分を持たない過加水分解酵素のアミノ酸配列に基づくであろう。
【０２２８】
いくつかのよく知られているグローバルアライメントアルゴリズム（すなわち、配列分析ソフトウェア）を用いて、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を表す２つ以上のアミノ酸配列をアラインさせ、酵素が本発明のシグネチャーモチーフで構成されているかどうかを決定することができる。アラインされた配列は参照配列（配列番号２）と比較され、シグネチャーモチーフの存在が決定される。一実施形態では、参照アミノ酸配列（本明細書で使用される場合、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのペルヒドロラーゼ配列（配列番号２））を用いるＣＬＵＳＴＡＬアライメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷなど）を使用して、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定する。保存アミノ酸残基の相対的な番号付けは、アラインされた配列内の小さい挿入または欠失（例えば、通常は５アミノ酸以下）を考慮に入れるために、参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基づく。
【０２２９】
本発明のシグネチャーモチーフを含む配列を同定する（参照配列と比較したときに）ために使用され得る他の適切なアルゴリズムの例としては、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３（１９７０）、グローバルアライメントツール）、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１）、ローカルアライメントツール）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントは、デフォルトパラメータを用いて実行される。適切なデフォルトパラメータの例としては、ＧＡＰオープンペナルティ＝１０およびＧＡＰ伸長ペナルティー＝０．５と共にＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用が挙げられる。
【０２３０】
ペルヒドロラーゼ間での全体的な同一性パーセントの比較により、配列番号２に対してわずか３３％のアミノ酸同一性を有する酵素（シグネチャーモチーフを保持しながら）が有意なペルヒドロラーゼ活性を示し、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類されることが示される。一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、配列番号２に対する少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素が含まれる。
【０２３１】
過加水分解活性を有する適切なＣＥ−７炭水化物エステラーゼの例としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１などのアミノ酸配列を有する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、酵素は、１４、１６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ（配列番号１８）に由来する。
【０２３２】
本明細書で使用される場合、「ＣＥ−７変異体」、「変異体ペルヒドロラーゼ」または「変異体」という用語は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび関連の過加水分解活性が保持される限り、変異体が由来する対応する酵素（通常、野生型酵素）と比較したときに少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換をもたらす遺伝子改変を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼを指すであろう。ＣＥ−７変異体ペルヒドロラーゼも本発明の組成物および方法において使用することができる。ＣＥ−７変異体の例は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１として提供される。一実施形態では、変異体は、配列番号２７、２８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６４を含み得る。
【０２３３】
当業者は、本発明の組成物および方法において、実質的に類似のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ配列（シグネチャーモチーフを保持する）が使用され得ることを認識する。一実施形態では、実質的に類似の配列は、高ストリンジェント条件下で、本明細書において例示される配列に関連する核酸分子とハイブリッド形成するその能力によって定義される。別の実施形態では、配列アライメントアルゴリズムを用い、本明細書において提供されるＤＮＡまたはアミノ酸配列に対する同一性パーセントに基づいて、実質的に類似の酵素を定義することができる。
【０２３４】
本明細書で使用される場合、核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で第１の分子の一本鎖が他の分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）において例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した分子（遠縁の生物からの相同配列など）から、高度に類似した分子（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、通常、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間の洗浄から始まり、次に、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、そして次に、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましい条件セットはより高温を用い、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける最後の２回の３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。別の好ましい高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件セットは０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃であり、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより洗浄された後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の最終洗浄が行われる。
【０２３５】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）。１つの態様では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【０２３６】
本明細書で使用される場合、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）、「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、ならびに「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）において記載される方法を含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．７．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）：２７６−２７７（２０００））を用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３など）（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）、およびＣｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３））Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介してＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）を、デフォルトパラメータと共に用いて実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントのための適切なパラメータには、ＧＡＰ  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、���ｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントがデフォルト設定と共に使用されるが、遅いアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）を用いるパラメータを修正して、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５も使用することができる。
【０２３７】
１つの態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、ただし、ポリペプチドはＣＥ−７シグネチャーモチーフを保持することを条件とする。適切な核酸分子は上記の相同性を有するだけでなく、通常、約２１０〜３４０のアミノ酸長さ、約３００〜約３４０のアミノ酸長さ、好ましくは約３１０〜約３３０のアミノ酸長さ、最も好ましくは約３１８〜約３２５のアミノ酸長さを有するポリペプチドもコードし、各ポリペプチドは、過加水分解活性を有すると特徴付けられる。
【０２３８】
標的化ペルヒドロラーゼ
本明細書で使用される場合、「標的化ペルヒドロラーゼ」および「過加水分解活性を有する標的化酵素」という用語は、標的表面、好ましくは標的化体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分に融合／結合された少なくとも１つの過加水分解酵素（野生型またはその変異体）を含む融合タンパク質を指すであろう。標的化ペルヒドロラーゼ内の過加水分解酵素は任意の過加水分解酵素でよく、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、配列番号３１５［Ｌ２９Ｐ変異体］および配列番号３３９［野生型］）、過加水分解アリールエステラーゼ（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号３１４［Ｓ５４Ｖ変異体］および３３８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、「毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つの結合ドメイン」、「体表面に対する親和性を有するペプチド成分」、「毛髪に対する親和性を有するペプチド成分」、および「ＨＳＢＤ」という用語は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の少なくとも１つのポリマーを含む、過加水分解酵素の一部ではない融合タンパク質のペプチド成分を指し、この成分は、毛髪、好ましくはヒト毛髪に対する親和性を有するであろう。
【０２４０】
一実施形態では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、抗体、Ｆａｂ抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、ラクダ科抗体（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）７４：２７７−３０２）、非抗体スキャフォールドディスプレイタンパク質（種々のスキャフォールド補助によるアプローチの概説については、Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．（２００６）１５（１）：１４−２７およびＢｉｎｚ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３、１２５７−１２６８）、または免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドであり得る。別の態様では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチド（すなわち、毛髪に対する親和性を有する体表面結合ペプチドまたは少なくとも１つの体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメイン）である。好ましい実施形態では、ペプチド成分は、毛髪に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
【０２４１】
毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は、任意的なペプチドリンカーによって過加水分解酵素から分離され得る。特定のペプチドリンカー／スペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
【０２４２】
一実施形態では、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は１つまたは複数の毛髪結合ペプチドを含むことができ、それぞれは、場合によりそして独立して、１〜１００のアミノ酸長さのペプチドスペーサーによって分離される。毛髪結合ペプチドおよび／または毛髪結合ペプチドを含む毛髪結合ドメインの例としては、配列番号６５〜２２１、２７１、２９０、２９１、３１２、および３１３を挙げることができるが、これらに限定されない。ペプチドリンカー／スペーサーの例としては、配列番号２７２〜２８５を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２４３】
１つの体表面に対する親和性を有することが既に確認されたペプチドは、毛髪に対しても親和性を有し得る。従って、融合ペプチドは、皮膚（配列番号２１７〜２６９）または爪（配列番号２７０〜２７１）などの別の体表面に対する親和性を有することが既に報告されている少なくとも１つのペプチドを含むことができる。別の実施形態では、融合ペプチドは、標的体表面に対する静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
【０２４４】
標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ
好ましい実施形態では、「標的化ペルヒドロラーゼ」は、過加水分解活性を有する標的化ＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。本明細書で使用される場合、「標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」および「標的化ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ」という用語は、標的表面、好ましくは毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分に融合／結合された少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（野生型または変異体ペルヒドロラーゼ）を含む融合タンパク質を指すであろう。体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、上記で記載されたもののいずれであってもよい。好ましい態様では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ中のペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチド（すなわち、毛髪に対する親和性を有する体表面結合ペプチドまたは少なくとも１つの体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメイン）である。好ましい実施形態では、ペプチド成分は、毛髪に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
【０２４５】
毛髪／毛髪表面に対する親和性を有するペプチド成分は、任意的なペプチドリンカーによってＣＥ−７ペルヒドロラーゼから分離され得る。特定のペプチドリンカー／スペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
【０２４６】
従って標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例としては、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分に結合された配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼの例としては、毛髪に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドに（場合により、ペプチドスペーサーを介して）結合された配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２４７】
別の実施形態では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、１つの体表面に対する親和性を有することが既に確認されており、口腔ケア表面に対しても親和性を有し得るペプチドを含むことができる。従って、融合ペプチドは、皮膚（配列番号２１７〜２６９）または爪（配列番号２７０〜２７１）などの別の体表面に対する親和性を有することが既に報告されている少なくとも１つのペプチドを含むことができる。一実施形態では、ＣＥ−７融合ペプチドは、配列番号６５−２２１、２７１、２９０、および２９１を含む群からの少なくとも１つの毛髪結合ペプチドを含む。別の実施形態では、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合ペプチドは、標的体表面に対する静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
【０２４８】
別の実施形態では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例としては、配列番号２８８、２８９、２９４、２９５、３１７、３１９、および３２１を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２４９】
体表面に対する親和性を有するペプチド
少なくとも１つの体表面に結合することができる免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチドは「体表面結合ペプチド」（ＢＳＢＰ）と呼ばれ、例えば、毛髪、皮膚、または爪に結合するペプチドを含むことができる。少なくともヒト毛髪に結合することが確認されたペプチドは、「毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）」とも呼ばれる。少なくともヒト皮膚に結合することが確認されたペプチドは、「皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）」とも呼ばれる。少なくともヒト爪に結合することが確認されたペプチドは、「爪結合ペプチド（ＮＢＰ）」とも呼ばれる。短い単鎖体表面結合ペプチドは実験的に生成されてもよいし（例えば、負帯電表面に標的化された正帯電ポリペプチド）、あるいは標的体表面に対するバイオパニングを用いて生成されてもよい。
【０２５０】
種々の体表面に対して強い親和性を有する短いペプチドが報告されている（米国特許第７，２２０，４０５号明細書、同第７，３０９，４８２号明細書、同第７，２８５，２６４号明細書、および同第７，８０７，１４１号明細書、米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９号明細書、同第２００７−０１９６３０５号明細書、同第２００６−０１９９２０６号明細書、同第２００７−００６５３８７号明細書、同第２００８−０１０７６１４号明細書、同第２００７−０１１０６８６号明細書、同第２００６−００７３１１１号明細書、同第２０１０−０１５８８４６号明細書、および同第２０１０−０１５８８４７号明細書、ならびに公開されたＰＣＴ出願の国際公開第２００８／０５４７４６号パンフレット、国際公開第２００４／０４８３９９号パンフレット、および国際公開第２００８／０７３３６８号パンフレット）。体表面結合ペプチドは、有益剤を標的体表面に結合することができるペプチドベースの試薬を構築するために使用されている。しかしながら、これらのペプチドを使用して、過酸有益剤の生成のために活性ペルヒドロラーゼを標的体表面に結合させる（すなわち、「標的化ペルヒドロラーゼ」）ことは記載されていない。
【０２５１】
少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する体表面結合ペプチドの非限定的なリストは本明細書において提供されており、毛髪に対する親和性を有するもの（配列番号６５〜２２１、２７１、２９０、および２９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する毛髪結合ペプチド）、皮膚に対する親和性を有するもの（皮膚結合ペプチドは配列番号２１７〜２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）、および爪に対する親和性を有するもの（爪結合ペプチドは配列番号２７０〜２７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）が含まれる。いくつかの実施形態では、体表面結合ドメインは、約６０までのアミノ酸長さである体表面結合ペプチドで構成される。一実施形態では、体表面結合ペプチドは、５〜６０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、体表面結合ペプチドは、７〜５０のアミノ酸長さ、または７〜３０のアミノ酸長さである。さらに他の実施形態では、７〜２７のアミノ酸長さである体表面結合ペプチドである。
【０２５２】
単一の毛髪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、爪結合ペプチドを含む体表面結合ペプチドを含む融合ペプチドは本発明の特定の実施形態であるが、本発明の他の実施形態では、複数の体表面結合ペプチドを使用することが有利であり得る。複数、すなわち２つ以上の体表面結合ペプチドを包含すると、例えば、単一の体表面結合を含む結合要素よりもさらにより耐久性であるペプチド成分を提供することができる。いくつかの実施形態では、体表面結合ドメインは、２〜約５０または２〜約２５の体表面結合ペプチドを含む。他の実施形態は、２〜約１０または２〜５の体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメインを含む。
【０２５３】
複数の結合要素（すなわち、体表面結合ペプチドまたは体表面結合ドメイン）は、直接結合されていてもよいし、あるいはペプチドスペーサーを用いて結合されていてもよい。特定のペプチドスペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
【０２５４】
体表面結合ドメイン、およびこれらを構成するより短い体表面結合ペプチドは、例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびこれらの組み合わせなどの任意の既知のバイオパニング技術を含む、当業者に既知のいくつもの方法を用いて同定することができる。通常、ランダムまたは実質的にランダムな（バイアスが存在する場合）ペプチドライブラリーが標的体表面に対してバイオパニングされ、標的体表面に対する親和性を有するライブラリー内のペプチドが同定される。
【０２５５】
ペプチドのランダムライブラリーの生成は周知であり、細菌ディスプレイ（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（７）：４５２０−４５２４（１９８１）、およびＨｅｌｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０（１）：３１−３５，（１９８３））、酵母ディスプレイ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８（２１）：９５７８−８２（１９９１））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、およびファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）、リボソームディスプレイ（米国特許第５，６４３，７６８号明細書、米国特許第５，６５８，７５４号明細書、および米国特許第７，０７４，５５７号明細書）、およびｍＲＮＡディスプレイ技術（ＰＲＯＦＵＳＩＯＮ（商標）、米国特許第６，２５８，５５８号明細書、同第６，５１８，０１８号明細書、同第６，２８１，３４４号明細書、同第６，２１４，５５３号明細書、同第６，２６１，８０４号明細書、同第６，２０７，４４６号明細書、同第６，８４６，６５５号明細書、同第６，３１２，９２７号明細書、同第６，６０２，６８５号明細書、同第６，４１６，９５０号明細書、同第６，４２９，３００号明細書、同第７，０７８，１９７号明細書、および同第６，４３６，６６５号明細書を参照）を含む様々な技術によって達成することができる。
【０２５６】
結合親和性
体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、ヒト毛髪、皮膚、または爪に対する結合親和性、あるいは１０−５モル濃度（Ｍ）以下の結合親和性を含む。特定の実施形態では、ペプチド成分は、１０−５モル濃度（Ｍ）以下のヒト毛髪、皮膚、または爪に対する
結合親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドおよび／または結合ドメインである。いくつかの実施形態では、結合ペプチドまたはドメインは、少なくとも約５０〜５００ｍＭの塩の存在下で１０−５Ｍ以下の結合親和性値を有するであろう。「結合親和性」という用語は、結合ペプチドと、そのそれぞれの基質、この場合はヒト毛髪、皮膚、または爪との相互作用の強度を指す。結合親和性は、結合ペプチドの解離定数（「ＫＤ」）、または「ＭＢ５０」に関して定義または判断することができる。
【０２５７】
「ＫＤ」は、標的上の結合部位の半分が占有される、すなわち、ペプチド結合を有する標的（結合標的材料）の濃度がペプチド結合を有さない標的の濃度と等しい場合のペプチドの濃度に相当する。解離定数が小さいほど、ペプチドはより堅く結合される。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）の解離定数を有するペプチドは、マイクロモル濃度（μＭ）の解離定数を有するペプチドよりも堅く結合する。本発明の特定の実施形態は１０−５以下のＫＤ値を有するであろう。
【０２５８】
「ＭＢ５０」は、ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイにおいて得られる最大シグナルの５０％であるシグナルを与える結合ペプチドの濃度を指す。例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２２６８３号明細書の実施例３を参照されたい。ＭＢ５０は、複合体の成分の結合相互作用または親和性の強度の表示を提供する。ＭＢ５０の値が低いほど、ペプチドとその対応する基質との相互作用はより強い、すなわち「より良い」。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）のＭＢ５０を有するペプチドは、マイクロモル濃度（μＭ）のＭＢ５０を有するペプチドよりも堅く結合する。本発明の特定の実施形態は、１０−５Ｍ以下のＭＢ５０値を有するであろう。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、ＫＤまたはＭＢ５０値により測定される場合に、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下、または約１０−１０Ｍ以下の結合親和性を有することができる。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、体表面結合ペプチドおよび／または体表面結合ドメインは、ＫＤまたはＭＢ５０値により測定される場合に、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下の結合親和性を有することができる。
【０２６１】
本明細書で使用される場合、「強い親和性」という用語は、約１０−５Ｍ以下、好ましくは約１０−６Ｍ以下、より好ましくは約１０−７Ｍ以下、より好ましくは約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、または最も好ましくは約１０−１０Ｍ以下のＫＤまたはＭＢ５０値を有する結合親和性を指すであろう。
【０２６２】
多成分ペルオキシカルボン酸発生系
複数の活性成分を分離および結合するための系および手段の設計は当該技術分野において知られており、通常、個々の反応成分の物理的な形態に依存し得る。例えば、複数の活性流体（液体−液体）系は、通常、反応性流体を混合したときに所望の漂白剤が生成されるいくつかの漂白用途において見出されるような、マルチチャンバディスペンサーボトルまたは２相系を使用する（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第５，６２４，６３４号明細書、米国特許第６，３９１，８４０号明細書、欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書、およびＰＣＴ公報の国際公開第００／６１７１３号パンフレット）。ペルオキシカルボン酸を発生させるために使用される多成分系の他の形態には、粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、多数のコンパートメントを有する水溶性パケット（例えば、米国特許第６，９９５，１２５号明細書）および水が添加されると反応する固体凝集体（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２６３】
別の実施形態では、第１の成分中のカルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、第１の成分中のカルボン酸エステルは、アセチル化糖類である。別の実施形態では、第１の成分中の酵素触媒は、微粒子固体であり得る。別の実施形態では、第１の反応成分は、固体錠剤または粉末であり得る。
【０２６４】
ペルオキシカルボン酸は非常に反応性であり、通常、時間が経つと濃度が低下する。これは特に、長期安定性を欠いていることが多い市販の予備成形されたペルオキシカルボン酸組成物に当てはまる。予備成形されたペルオキシカルボン酸の水溶液は、特に、大型容器および／または高度に濃縮されたペルオキシカルボン酸溶液をより長距離にわたって輸送する場合に、取扱いおよび／または輸送の難点も示し得る。さらに、予備成形されたペルオキシカルボン酸溶液は、特定の標的用途に対して所望の濃度のペルオキシカルボン酸を提供することができないことがある。従って、特に液体製剤の場合に、種々の反応成分を分離して保持することが非常に望ましい。
【０２６５】
所望のペルオキシカルボン酸を生成するために混ぜ合わせられる２つ以上の成分を含む多成分ペルオキシカルボン酸発生系の使用は報告されている。個々の成分は取扱いが安全で、長期間安定（すなわち、混合したときに生成されるペルオキシカルボン酸の濃度により測定される場合に）でなければならない。一実施形態では、多成分酵素ペルオキシカルボン酸発生系の貯蔵安定性は、酵素触媒の安定性に関して評価することができる。
【０２６６】
所望のペルオキシカルボン酸濃度を有する水性過酸溶液を急速に生成するために酵素触媒を使用する多成分ペルオキシカルボン酸発生製剤を含むパーソナルケア製品が本明細書において提供される。混合は使用の直前に、そして／あるいは適用部位において（その場で）起こり得る。一実施形態では、パーソナルケア製品製剤は、使用されるまで分離して保持される少なくとも２つの成分で構成され得る。成分の混合は、水性過酸溶液を急速に形成する。各成分は、得られる水性過酸溶液が、意図される最終用途（例えば、過酸に基づいた脱毛、過酸に基づいた毛髪引張強さの低下、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）と共に使用するための過酸で増強される毛髪除去、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、スキンホワイトニング、皮膚漂白、スキンコンディショニング、皮膚のしわの出現の低減、皮膚の若返り、真皮の接着の低減、体臭の低減もしくは除去、爪の漂白、または爪の消毒）に適した効果的な過酸濃度を含むように設計される。個々の成分の組成は、（１）長期の貯蔵安定性を提供するように、そして／あるいは（２）ペルオキシカルボン酸で構成される適切な水性反応製剤の形成を高める能力を提供するように設計されなければならない。
【０２６７】
多成分製剤は、少なくとも２つの実質的に液体の成分で構成され得る。一実施形態では、多成分製剤は、第１の液体成分および第２の液体成分を含む２成分製剤であり得る。「第１」または「第２」の液体成分という用語の使用は相対的であるが、ただし、特定の材料を含む２つの異なる液体成分は使用されるまで分離して保持されるものとする。最低でも、多成分ペルオキシカルボン酸製剤は、（１）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素触媒と、（２）カルボン酸エステル基質と、（３）過酸素源および水とを含み、成分が混ぜ合わせられたときに製剤は所望の過酸を酵素的に生成する。
【０２６８】
２成分製剤において使用される種々の原料のタイプおよび量は、（１）各成分、特に酵素触媒の過加水分解活性の貯蔵安定性と、（２）溶解度および／または所望の水性ペルオキシカルボン酸溶液を効果的に形成する能力を増強する物理特性とを提供するように慎重に選択され、バランスがとられるべきである（例えば、水性反応混合物中のエステル基質の溶解度を増強する原料、および／または液体成分［すなわち、酵素的な過加水分解活性に著しい悪影響を与えない少なくとも１つの共溶媒］の少なくとも１つの粘度および／濃度を変更する原料）。
【０２６９】
酵素的な過酸発生系の性能および／または触媒安定性を改善するために種々の方法が開示されている。米国特許出願公開第２０１０−００４８４４８Ａ１号明細書には、特定のエステル基質の溶解度および／または混合特性を増強するために少なくとも１つの共溶媒の使用が記載されている。本発明のパーソナルケア組成物および方法も、共溶媒を使用することができる。一実施形態では、カルボン酸エステル基質およびペルヒドロラーゼ触媒を含む成分は、約２未満のＬｏｇ  Ｐ値を有する有機溶媒を含む。ここで、Ｌｏｇ  Ｐは、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水で表される、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義される。酵素活性に著しい悪影響を与えない、２以下のＬｏｇ  Ｐ値を有するいくつかの共溶媒が記載されている。別の実施形態では、共溶媒は、カルボン酸エステル基質および酵素を含む反応成分内の約２０重量％〜約７０重量％である。カルボン酸エステル基質および酵素を含む反応成分は、場合により、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）を含んでいてもよい。
【０２７０】
米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４Ａ１号明細書には２成分系の使用が記載されており、第１の成分は、液体カルボン酸エステルおよび固体酵素粉末の製剤を含み、前記酵素粉末は、（ａ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７エステラーゼ、および（ｂ）少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤の製剤を含み、第２の成分は、過酸素源および過酸化水素安定剤を有する水を含む。本発明のパーソナルケア組成物および方法は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４Ａ１号明細書に記載される系と同様の２成分製剤を使用することができる。従って、オリゴ糖賦形剤は、酵素活性の安定化を促進するために使用され得る。一実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有し得る。別の実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有し得る。別の実施形態では、オリゴ糖はマルトデキストリンである。
【０２７１】
米国特許出願公開第２０１０−００８６５３５−Ａ１号明細書にも２成分系が記載されており、第１の成分は、液体カルボン酸エステルおよび固体酵素粉末の製剤を含み、前記製剤は、（ａ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７エステラーゼおよび少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤および少なくとも１つの界面活性剤を含む酵素粉末と、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液（好ましい実施形態では、緩衝液は別箇の（すなわち、酵素粉末から分離されている）不溶性成分としてカルボン酸エステル基質に添加される）とを含み、第２の成分は、過酸素源および過酸化水素安定剤を有する水を含む。本発明のパーソナルケア組成物および方法は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３５Ａ１号明細書に記載される系と同様の２成分製剤を使用することができる。一実施形態では、賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有するオリゴ糖賦形剤であり得る。別の実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有し得る。別の実施形態では、オリゴ糖はマルトデキストリンである。さらなる実施形態では、任意的なｐＨ緩衝液は重炭酸緩衝液である。またさらなる実施形態では、過酸化水素安定剤はＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬである。
【０２７２】
酵素粉末
いくつかの実施形態では、パーソナルケア組成物は、安定化酵素粉末の形態の酵素触媒を使用し得る。酵素粉末を含む製剤を製造および安定化するための方法は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４号明細書および同第２０１０−００８６５３５号明細書に記載されている。
【０２７３】
一実施形態では、酵素は、酵素粉末の乾燥重量を基準として約５重量パーセント（重量％）〜約７５重量％の範囲の量で酵素粉末中に存在し得る。酵素粉末／噴霧乾燥混合物中の酵素の好ましい重量パーセント範囲は約１０重量％〜５０重量％であり、酵素粉末／噴霧乾燥混合物中の酵素のより好ましい重量パーセント範囲は、約２０重量％〜３３重量％である。
【０２７４】
一実施形態では、酵素粉末は、さらに、賦形剤を含むことができる。１つの態様では、賦形剤は、酵素粉末の乾燥重量を基準として、約９５重量％〜約２５重量％の範囲の量で提供される。酵素粉末中の賦形剤の好ましい重量％範囲は約９０重量％〜５０重量％であり、酵素粉末中の賦形剤のより好ましい重量％範囲は、約８０重量％〜６７重量％である。
【０２７５】
一実施形態では、酵素粉末を調製するために使用される賦形剤は、オリゴ糖賦形剤であり得る。一実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有する。特定のオリゴ糖としては、マルトデキストリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン、キトサン、ラフィノース、スタキオース、ペクチン、インスリン、レバン、グラミナン、アミロペクチン、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、およびこれらの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、オリゴ糖賦形剤はマルトデキストリンである。またオリゴ糖ベースの賦形剤としては、ヒドロキシメチル−セルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにこれらの混合物などの水溶性の非イオン性セルロースエーテルも挙げることができるが、これらに限定されない。またさらなる実施形態では、賦形剤は、以下の化合物：トレハロース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、セロビオース、α−シクロデキストリン、およびカルボキシメチルセルロースのうちの１つまたは複数から選択することができるが、これらに限定されない。
【０２７６】
製剤は少なくとも１つの任意選択的な界面活性剤を含んでいてもよく、少なくとも１つの界面活性剤の存在が好ましい。界面活性剤には、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、モノグリセリドまたはそのエトキシ化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、ナトリウムドクサート、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、レシチン、リン脂質、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのブロックコポリマー、ならびに非イオン性有機ケイ素（ｏｒｇａｎｏｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）などのイオン性および非イオン性の界面活性剤または湿潤剤が含まれ得るが、これらに限定されない。好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート８０がより好ましい。
【０２７７】
一実施形態では、適切な非イオン性界面活性剤は、セトマクロゴール１０００（ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ココ−ベタイン、コカミドＤＥＡ、コカミドＭＥＡ、ココグリセリド、ココ−グルコシド、デシルグルコシド、ラウリン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、狭い範囲のエトキシレート、ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール、ＮＰ−４０、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポロキサマー、ポロキサマー４０７、ポリリシノール酸ポリグリセリロール、ラウリン酸ポリグリセリル−１０、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ココ−硫酸ナトリウム、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、ステアリルアルコール、ラウリン酸スクロース、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含むことができる。
【０２７８】
製剤が酵素粉末を含む場合、粉末を調製するために使用される界面活性剤は、酵素粉末中に存在するタンパク質の重量を基準として約５重量％〜０．１重量％の範囲、好ましくは、酵素粉末中に存在するタンパク質の重量を基準として約２重量％〜０．５重量％の範囲の量で存在し得る。
【０２７９】
酵素粉末はさらに、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）と、酵素安定剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸、（１−ヒドロキシエチリデン）ビスホスホン酸））とを含んでいてもよい。
【０２８０】
酵素粉末を形成するための製剤の噴霧乾燥は、例えば、「Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｋ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）、およびＰＣＴ特許公報の国際公開第９７／４１８３３号パンフレットおよび国際公開第９６／３２１４９号パンフレット（Ｐｌａｔｚ，Ｒ．ら）において概略的に記載されるように行われる。
【０２８１】
一般に、噴霧乾燥は、高度に分散された液体と、十分な体積の温風とを結びつけて、液滴の蒸発および乾燥を生じることからなる。通常、原料は暖かいろ過空気の流れの中に噴霧され、溶媒が蒸発されて、乾燥された生成物がコレクターに搬送される。次に、使用済みの空気は溶媒と共に排出される。当業者は、所望の生成物を提供するためにいくつかの異なるタイプの装置が使用され得ることを認識するであろう。例えば、Ｂｕｃｈｉ  Ｌｔｄ．（Ｐｏｓｔｆａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって製造される市販の噴霧乾燥器は、所望のサイズの粒子を効果的に生成するであろう。さらに、これらの噴霧乾燥器、特にそのアトマイザーは、ダブルノズル技術を用いて、２つの溶液の同時噴霧などの特殊な用途のために変更またはカスタマイズされ得ることが認識されるであろう。より具体的には、油中水エマルションを１つのノズルから微粒化し、マンニトールなどの抗接着剤を含有する溶液を第２のノズルから同時に微粒化することができる。他の場合には、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）ポンプを用いて特注設計のノズルから原料溶液を押出すのが望ましいこともある。正しいモルホロジーおよび／または組成を含む微細構造が生成されるとすれば、装置の選択は重要ではなく、本明細書における教示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【０２８２】
噴霧される材料を乾燥するために使用されるガスの入口および出口の温度はいずれも、噴霧される材料中の酵素の分解を引き起こさないような温度である。このような温度は通常実験的に決定されるが、一般に、入口温度は約５０℃〜約２２５℃の範囲であり、出口温度は約３０℃〜約１５０℃の範囲であろう。好ましいパラメータには、約２０〜１５０ｐｓｉ（０．１４ＭＰａ〜１．０３ＭＰａ）の範囲、好ましくは約３０〜４０から１００ｐｓｉ（０．２１〜０．２８ＭＰａから０．６９ＭＰａ）の範囲の微粒化圧力が含まれる。通常、使用される微粒化圧力は、以下の（ＭＰａ）０．１４、０．２１、０．２８、０．３４、０．４１、０．４８、０．５５、０．６２、０．６９、０．７６、０．８３またはそれ以上のうちの１つであろう。
【０２８３】
酵素粉末を使用する場合、酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の製剤は、周囲温度で貯蔵される際に実質的にその酵素活性を長期間保持することが要求され得る。酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の製剤は、実質的に、その酵素活性を高温で短期間保持する。一実施形態では、「実質的にその酵素活性を保持する」は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤において、周囲温度で長い貯蔵期間の後、および／または高温（周囲温度よりも高い）で短い貯蔵期間の後、酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の製剤が、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期酵素活性と比較して、酵素粉末または酵素粉末の製剤中の酵素の酵素活性の少なくとも約７５パーセントを保持することを意味する。長い貯蔵期間は、周囲温度で約１年〜約２年の期間である。一実施形態では、高温における短い貯蔵期間は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤が４０℃で生成されたときから４０℃で約８週間までの期間である。別の実施形態では、高温は、約３０℃〜約５２℃の範囲である。好ましい実施形態では、高温は、約３０℃〜約４０℃の範囲である。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤において４０℃で８週間の貯蔵の後、酵素粉末は、４０℃でカルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期酵素活性と比較して、酵素活性の少なくとも７５パーセントを保持する。他の実施形態では、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤において４０℃で８週間の貯蔵の後、酵素粉末は、４０℃でカルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期酵素活性と比較して、少なくとも１つの酵素の酵素活性の少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントを保持する。好ましくは、過加水分解活性は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５１０号明細書の実施例８〜１３に記載されるように測定されるが、過加水分解活性の任意の測定方法が使用され得る。
【０２８５】
規定される期間にわたる酵素活性のさらなる改善は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４号明細書に記載されるように、カルボン酸エステルおよび噴霧乾燥された酵素粉末で構成される製剤に、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲において緩衝能力を有する緩衝液を添加することによって達成することができる。適切な緩衝液としては、重炭酸、ピロリン酸、リン酸、メチルホスホン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸またはコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、またはナトリウムもしくはカリウム塩の混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。カルボン酸エステルおよび噴霧乾燥酵素粉末で構成される製剤において使用するために好ましい緩衝液には、重炭酸、ピロリン酸、リン酸、メチルホスホン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸塩、マレイン酸またはコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、またはナトリウムもしくカリウム塩の混合物が含まれる。好ましい実施形態では、緩衝液は、重炭酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩を含む。
【０２８６】
カルボン酸エステルおよび酵素粉末製剤中に緩衝液が存在し得る実施形態では、緩衝液は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤中のカルボン酸エステルの重量を基準として、約０．０１重量％〜約５０重量％の範囲の量で存在することができる。緩衝液は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤中のカルボン酸エステルの重量を基準として、約０．１０％〜約１０％のより好ましい範囲で存在し得る。さらに、これらの実施形態では、酵素の過加水分解活性間の比較は、カルボン酸エステル、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝液、および酵素粉末で構成される製剤において４０℃で８週間の貯蔵の後、カルボン酸エステル、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝液、および酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期過加水分解活性と比較して、少なくとも１つの酵素の過加水分解活性の少なくとも７５パーセントを保持する酵素粉末の間で決定される。
【０２８７】
乾燥酵素粉末は、トリアセチンなどの少なくとも１つの酵素のための基質である有機化合物中の製剤として貯蔵されることが意図される。添加される過酸化水素の非存在下で、、トリアセチンは、通常、水溶液中で過加水分解酵素により加水分解されて、ジアセチンおよび酢酸を生成し、酢酸の生成は、反応混合物のｐＨの低下を引き起こす。トリアセチン中の酵素の長期間の貯蔵安定性の１つの要件は、トリアセチンと、トリアセチン中に存在し得る任意の水との有意の反応が存在しないことであり、１つの市販のトリアセチン（Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ  Ｇｒｏｕｐ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍにより供給される）中の含水量についての仕様は、０．０３重量％の水（３００ｐｐｍ）である。トリアセチン中での酵素の貯蔵中に生じるトリアセチンの任意の加水分解は、ペルヒドロラーゼの活性の低下または不活性化を引き起こし得る酢酸を生成し得る。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、通常、５．０以下のｐＨで不活性化される（米国特許出願公開第２００９−０００５５９０号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏ，Ｒ．らを参照）。本出願において使用するために選択される賦形剤は、製剤中の低濃度の水のために酢酸が発生され得る条件下で、酵素のための有機基質中における酵素の安定性を提供しなければならない。製剤が賦形剤および１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）をさらに含む場合、乾燥酵素粉末は、少なくとも１つの酵素のための基質である有機化合物中の製剤として貯蔵することができる。
【０２８８】
カルボン酸エステルおよび過酸化水素から過酸を酵素触媒により調製するための適切な反応条件
本発明のパーソナルケア組成物および方法では、過加水分解活性を有する１つまたは複数の酵素を使用して、有効濃度の所望の過酸を発生させることができる。所望のペルオキシカルボン酸は、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルと、過酸素源（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウムを含むがこれらに限定されない）とを反応させることによって調製され得る。
【０２８９】
標的化ペルヒドロラーゼ内の過加水分解酵素は任意の過加水分解酵素でよく、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、配列番号３１５［Ｌ２９Ｐ変異体］および配列番号３３９［野生型］）、過加水分解アリールエステラーゼ（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号３１４［Ｓ５４Ｖ変異体］および３３８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２９０】
一実施形態では、酵素触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を含み、前記酵素は、構造的にいくつかのＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー（ＣＥ−７、上記のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．を参照）に分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にセファロスポリンＣデアセチラーゼに分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にアセチルキシランエステラーゼに分類される。
【０２９１】
一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、過加水分解活性と、
ａ）配列番号２のアミノ酸残基１１８〜１２０とアラインするＲＧＱモチーフ、
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１７９〜１８３とアラインするＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２９８〜２９９とアラインするＨＥモチーフ
を含むＣＥ−７シグネチャーモチーフとを有する酵素を含む。
【０２９２】
好ましい実施形態では、参照配列番号２に対するアライメントはＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて実施される。
【０２９３】
さらなる実施形態では、ＣＥ−７シグネチャーモチーフはさらに、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２にアラインされたときに、アミノ酸残基２６７〜２６９においてＬＸＤモチーフと定義される付加的な（すなわち、第４の）モチーフを含むことができる。
【０２９４】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含み、前記酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０２９５】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含み、前記酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、シグネチャーモチーフが保存され、ペルヒドロラーゼ活性が保持される限り、前記酵素は１つまたは複数の付加、欠失、または置換を有していてもよい。
【０２９６】
上記のように、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、ペルヒドロラーゼが所望の体表面に「標的化される」ように、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼを含む第１の部分と、標的体表面に対する親和性を有するペプチド成分を含む第２の部分とを有する融合タンパク質であり得る。一実施形態では、任意のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（ＣＥ−７シグネチャーモチーフの存在によって定義される）は、酵素を体表面に標的化することができる任意のペプチド成分／結合要素に融合され得る。１つの態様では、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は、抗体、抗体断片（Ｆａｂ）、ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖ、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合物）、単一ドメインラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体、スキャフォールドディスプレイタンパク質、および免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖親和性ペプチドを含むことができる。抗体、抗体断片および他の免疫グロブリン由来の結合要素、ならびに大型スキャフォールドディスプレイタンパク質を含む組成物は、多くの場合、経済的に実行可能ではない。従って、好ましい態様では、ペプチド成分／結合要素は、免疫グロブリンの折り畳みおよび／または免疫グロブリンドメインを欠いた単鎖親和性ペプチドである。短い単鎖体表面結合ペプチドは実験的に生成されてもよいし（例えば、負帯電表面に標的化された正帯電ポリペプチド）、あるいは標的体表面に対するバイオパニングを用いて生成されてもよい。いくつものディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡディスプレイ）を用いて親和性ペプチドを同定する／得るための方法は、当該技術分野においてよく知られている。個々の毛髪結合ペプチドは、より大きい結合「ドメイン」（本明細書では、結合「ハンド」とも呼ばれる）を形成して過加水分解酵素の毛髪への付着／局在化を高めるために、任意的なスペーサー／リンカーを介して結合されてもよい。
【０２９７】
融合タンパク質は、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ酵素と毛髪結合ドメインとを分離し、そして／あるいは異なる毛髪結合ペプチド間を分離する（例えば、より大きい標的毛髪結合ドメインを形成するために複数の毛髪結合ペプチドが結合されている場合）、１つまたは複数のペプチドリンカー／スペーサーを含むこともできる。例示的なペプチドスペーサーの非限定的なリストは、配列番号２９０、２９１、３１２、および３１３のアミノ酸配列によって提供される。
【０２９８】
毛髪に対する親和性を有する適切なペプチドは、本明細書において上記で記載されている。上記の「ディスプレイ」技術のいずれかを用いて追加の毛髪結合ペプチドを同定するための方法はよく知られており、追加の毛髪結合ペプチドを同定するために使用することができる。
【０２９９】
適切なカルボン酸エステル基質は、以下の式を有するエステルを含むことができる：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｂ）構造
【化９】
2014501760.tif 000011
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、あるいは
（ｃ）式
【化１０】
2014501760.tif 000012
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類、あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ。
【０３００】
適切な基質は、アシル化単糖類、二糖類、および多糖類からなる群から選択される１つまたは複数のアシル化糖類を含むこともできる。別の実施形態では、アシル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース（キシローステトラアセテートなど）、アセチル化グルコース（α−Ｄ−グルコースペンタアセテート、β−Ｄ−グルコースペンタアセテート、１−チオ−β−Ｄ−グルコース−２，３，４，６−テトラアセテートなど）、β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，４−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、β−Ｄ−キシロフラノーステトラアセテート、α−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテート、β−Ｄ−グルコピラノース−１，２，３，４−テトラアセテート、β−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４、６−テトラアセテート、２−アセトアミド−２−デオキシ−１，３，４，６−テトルアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、２−アセトアミド−２−デオキシ−３，４，６−トリアセチル−１−クロリド−α−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−マンノピラノースペンタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、スクロースオクタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。
【０３０１】
別の実施形態では、付加的な適切な基質は、５−アセトキシメチル−２−フルアルデヒド、３，４−ジアセトキシ−１−ブテン、４−アセトキシ安息香酸（ａｃｅｔｏｘｙｂｅｎｅｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、酢酸バニリン、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、および２−アセチルクエン酸トリエチルも含むことができる。
【０３０２】
別の実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、これらの混合物からなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、１つまたは複数のエステル基を含むＣ１〜Ｃ６ポリオールである。好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ６ポリオールのヒドロキシル基の１つまたは複数は、１つまたは複数のアセトキシ基によって置換されている（１，３−プロパンジオールジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、１，４−ブタンジオールジアセテート、１，５−ペンタンジオールジアセテートなど）。さらなる実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＧＤＡ）、またはこれらの混合物である。
【０３０３】
さらなる実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、およびトリブチリンからなる群から選択される。さらに別の態様では、基質は、ジアセチンおよびトリアセチンからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、適切な基質はトリアセチンを含む。
【０３０４】
好ましい実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの組み合わせ（すなわち、混合物）からなる群から選択される液体基質である。カルボン酸エステルは、酵素に触媒される過加水分解の際に所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに十分な濃度で、反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルは反応製剤中に完全に溶解性である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒によってエステルが対応するペルオキシカルボン酸に転換できるようにするために十分な溶解度を有する。カルボン酸エステルは、反応製剤の０．０５重量％〜４０重量％の濃度、好ましくは反応製剤の０．１重量％〜２０重量％の濃度、より好ましくは反応製剤の０．５重量％〜１０重量％の濃度で反応製剤中に存在する。
【０３０５】
過酸素源としては、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））過ホウ酸塩および過炭酸塩を挙げることができるが、これらに限定されない。反応製剤中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％の範囲、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％の範囲、より好ましくは０．１重量％〜約３０重量％の範囲であり得る。
【０３０６】
過酸素源（すなわち、過酸化水素）は、有効量の過酸化水素を生成することができる酵素を用いて、酵素的に発生されてもよい。例えば、グルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、エチレングリコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、およびアミノ酸オキシダーゼを含むがこれらに限定されない種々のオキシダーゼを本発明の組成物および方法において使用して、有効量の過酸化水素を生成することができる。
【０３０７】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過処理された全細胞、および部分精製全細胞抽出物）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ  １．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素から酸素および水への転換を触媒する。１つの態様では、過加水分解触媒にはカタラーゼ活性がない。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が反応製剤に添加され得る。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調整することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜約１Ｍの範囲であり、好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。
【０３０８】
別の実施形態では、酵素触媒は有意なカタラーゼ活性を持たないか、あるいはカタラーゼ活性を低減または除去するように操作され得る。宿主細胞におけるカタラーゼ活性は、トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含むがこれらに限定されないよく知られた技術を用いて、カタラーゼ活性の原因である遺伝子の発現を破壊することによって下方制御または除去することができる。好ましい実施形態では、内在性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、下方制御または破壊（すなわち、ノックアウト）される。本明細書で使用される場合、「破壊された」遺伝子は、修飾された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および／または機能がもう存在しないものである。遺伝子を破壊するための手段は当該技術分野においてよく知られており、対応するタンパク質の活性および／または機能が存在しなくなる限り、遺伝子への挿入、欠失、または突然変異を含むことができるが、これらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生宿主である（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書を参照）。別の実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および／または破壊を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。
【０３０９】
水性反応製剤中の触媒の濃度は触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒の重量は、通常、全反応体積の０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７が参照される。固定化触媒の使用により、その後の反応における触媒の回収および再利用が可能になる。酵素触媒は、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製または精製酵素、およびこれらの混合物の形態であり得る。
【０３１０】
１つの態様では、カルボン酸エステルの化学的な過加水分解および酵素的な過加水分解の組み合わせによって発生されるペルオキシカルボン酸の濃度は、選択されるパーソナルケア用途のために有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分である。別の態様では、本発明の方法は、所望の有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するための酵素および酵素基質の組み合わせを提供しており、添加される酵素が存在しないと、著しくより低い濃度のペルオキシカルボン酸が生成される。場合によっては、無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応によって酵素基質の実質的に化学的な過加水分解が起こり得るが、所望の用途において有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するために十分な濃度のペルオキシカルボン酸は発生されないことがあり、全ペルオキシカルボン酸濃度の著しい増大は、適切なペルヒドロラーゼ触媒の反応製剤への添加によって達成される。
【０３１１】
少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生されるペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の濃度は、過加水分解反応の開始から１０分以内、好ましくは５分以内に、少なくとも約０．１ｐｐｍであり、好ましくは少なくとも０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、３００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、７００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍ、５０００ｐｐｍまたは１０，０００ｐｐｍの過酸である。ペルオキシカルボン酸を含む製品製剤は、場合により、標的用途に基づいて所望されるより低い濃度のペルオキシカルボン酸を含む製剤を生成するために、水、または主に水で構成される溶液で希釈されてもよい。明らかに、当業者は、選択されるパーソナルケア製品に対する所望の過酸濃度を達成するために反応成分および／または希釈量を調整することができる。
【０３１２】
１つの態様では、所望の濃度の過酸を生成するために必用とされる反応時間は、約２時間以内、好ましくは約３０分以内、より好ましくは約１０分以内、最も好ましくは約５分以内である。他の態様では、毛髪を含む表面は、反応成分を混ぜ合わせてから５分以内の間、本明細書に記載される方法に従って形成されるペルオキシカルボン酸と接触される。一実施形態では、標的体表面は、前記反応成分を混ぜ合わせてから約５分間〜約１６８時間以内の間、または前記反応成分を混ぜ合わせてから約５分間〜約４８時間以内、または約５分間〜２時間以内の間、またはその中の任意の時間間隔で、本明細書に記載される方法で生成されるペルオキシカルボン酸と接触される。
【０３１３】
本明細書に記載される方法に従って形成される過酸はパーソナルケア製品／用途において使用され、過酸は標的体表面と接触されて、毛髪除去（過酸脱毛剤）、毛髪の引張強さの低減、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）を増強するために使用される毛髪の前処理、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、スキンホワイトニング、皮膚漂白、スキンコンディショニング、皮膚のしわの出現の低減、皮膚の若返り、真皮の接着の低減、体臭の低減もしくは除去、爪の漂白、または爪の消毒などの過酸ベースの利益を提供する。一実施形態では、標的体表面に対して過酸を生成するための方法はその場で実行される。
【０３１４】
反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を調節するように選択され得る。特定のパーソナルケア用途では明らかに、標的体表面の温度が反応の温度であり得る。反応の温度は、反応製剤の氷点（約０℃）のすぐ上の温度から約９５℃までの範囲であり得るが、好ましい範囲は５℃〜約７５℃であり、さらに好ましい反応温度範囲は、約５℃〜約５５℃である。
【０３１５】
ペルオキシカルボン酸を含有する最終反応製剤のｐＨは約２〜約９であり、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約５〜約８、さらにより好ましくは約５．５〜約８であり、またさらにより好ましくは約６．０〜約７．５である。反応、そして最終反応製剤のｐＨは、場合により、リン酸、ピロリン酸、重炭酸、酢酸、またはクエン酸を含むがこれらに限定されない適切な緩衝液の添加により調節され得る。緩衝液の濃度は、使用される場合には、通常０．１ｍＭ〜１．０Ｍであり、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭであり、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【０３１６】
別の態様では、酵素的な過加水分解反応製剤は、反応製剤中のカルボン酸エステルの溶解速度を高めるために、分散剤としての役割を果たす有機溶媒を含有していてもよい。このような溶媒としては、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１７】
単一段階適用方法と多段階適用方法との対比
通常、過酸有益剤を酵素的に生成するための最低限の反応成分のセットは、（１）ＣＥ−７ペルヒドロラーゼなどの、本明細書に記載されるような過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素（場合により、標的化された融合タンパク質の形態である）と、（２）少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質と、（３）過酸素源とを含むであろう。
【０３１８】
パーソナルケア組成物の過酸発生反応成分は、使用されるまで分離して保持され得る。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから標的体表面と接触され、それにより、得られる過酸ベースの有益剤は、体表面に利益を提供する。成分は混ぜ合わせられてから標的体表面と接触されてもよいし、あるいは標的化体表面上で混ぜ合わせられてもよい。一実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。
【０３１９】
多段階の適用が用いられてもよい。過酸発生系（すなわち、これらの基本的な反応成分の少なくとも１つを体表面に順次適用する）組成物の個々の成分のうちの１つまたは２つは、酵素的な過酸の生成に必要とされる残りの成分を適用する前に毛髪と接触され得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、毛髪がカルボン酸エステル基質および／または過酸素源と接触される前に、毛髪と接触される（すなわち、「２段階適用」）。
【０３２０】
一実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分と混ゼ合わせる前に毛髪に適用される標的化ペルヒドロラーゼである。一実施形態では、毛髪を含む体表面を標的化ペルヒドロラーゼと接触させるステップは１時間以上続かず、好ましくは３０分間以上続かず、最も好ましくは、５秒〜５分間持続する。一実施形態では、酵素は、少なくとも１つの界面活性剤を含むボディウォッシュの形で毛髪に適用される。好ましい実施形態では、使用される界面活性剤は非イオン性である。毛髪に永続的に結合しない標的化ペルヒドロラーゼは、永続的に結合された標的化ペルヒドロラーゼ（毛髪に結合した）を残りの反応成分（過酸化水素源およびエステル基質）と接触させる前に、水溶液（例えば、シャワーや入浴における水道水）による洗浄／すすぎによって、そして場合により、次に毛髪を乾燥させることによってによって除去することができる。毛髪に永続的に結合しなかった酵素の亜集団を除去するために使用される洗浄／すすぎステップの条件は、毛髪が、有効量の永続的に結合された標的化過加水分解酵素を受け取ることができるように調整され得る。毛髪は、場合により、永続的に結合しない標的化ペルヒドロラーゼを洗い流した後に乾燥されてもよい。一実施形態では、残りの反応成分（過酸化水素源およびカルボン酸エステル基質）は、１０秒〜２４時間の期間、永続的に結合した標的化ペルヒドロラーゼと接触される。さらなる態様では、過酸化水素源およびエステル基質は、経皮的に許容可能な成分を含む毛髪／皮膚用保湿剤またはボディローション（すなわち、水または油中水混合物）の形態である。
【０３２１】
好ましい実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分と混ぜ合わせる前に毛髪に適用される「標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」（すなわち、ＣＥ−７融合タンパク質）である（すなわち、２段階適用方法）。標的化ペルヒドロラーゼは、融合タンパク質の毛髪表面への非共有結合を促進するのに適切な条件下で毛髪と接触される。任意的なすすぎステップを使用して、残りの反応成分を混ぜ合わせる前に、過剰および／または非結合の融合タンパク質を除去することができる。
【０３２２】
さらなる実施形態では、過加水分解酵素（場合により、毛髪表面に標的化された融合タンパク質の形態である）およびカルボン酸エステルは、過酸素源を添加する前に毛髪に適用される。
【０３２３】
さらなる実施形態では、過加水分解酵素（場合により、毛髪に標的化された融合タンパク質の形態である）および過酸素源（例えば、過酸化水素を含む水溶液）は、カルボン酸エステル基質を添加する前に毛髪に適用される。
【０３２４】
さらなる実施形態では、カルボン酸エステル基質および過酸素源（例えば、過酸化水素を含む水溶液）は、過加水分解酵素（場合により、毛髪に標的化された融合タンパク質の形態である）を添加する前に毛髪に適用される。
【０３２５】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかを、本発明を実行するためのキットに組み込むことができる。キットは、過酸の酵素的な生成を促進するための材料および試薬を含むことができる。例示的なキットは、基質、過酸素源、および過加水分解活性を有する酵素触媒を含み、ここで、酵素触媒は、場合により、毛髪または毛髪を含む体表面に標的化され得る。その他のキット成分は、以下の：サンプル管、固体担体、教材（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、および過酸を酵素的に生成する際に有用な許容可能な成分またはキャリアなどの他の溶液または他の化学試薬のうちの１つまたは複数を含むことができるがこれらに限定されない。
【０３２６】
皮膚科学的に許容可能な成分／キャリア／媒体
本明細書に記載される組成物および方法はさらに、ヘアケア、スキンケア、ネイルケアまたは他のパーソナルケア製品において使用するために既知であるか、あるいは有効である１つまたは複数の皮膚科学的または美容的に許容可能な成分を含むことができるが、ただし、任意的な成分は、本明細書に記載される不可欠な成分と物理的および化学的に適合性であるか、あるいは、製品の安定性、美観、または性能を過度に損なわないことを条件とする。このような任意的な成分の非限定的な例は、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２、およびＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４に開示されている。
【０３２７】
一実施形態では、皮膚科学的に許容可能なキャリアは、約１０重量％〜約９９．９重量％、あるいは約５０重量％〜約９５重量％、あるいは約７５重量％〜約９５重量％の皮膚科学的に許容可能なキャリアを含むことができる。組成物と共に使用するのに適したキャリアは、例えば、ヘアスプレー、ムース、トニック、ジェル、皮膚の保湿剤、ローション、およびリーブオン（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）コンディショナーの製剤において使用されるものを含むことができる。キャリアは、水と、有機油と、揮発性シリコーン、アミノまたは非アミノシリコーンガムまたは油、およびこれらの混合物などのシリコーンと、鉱油と、オリーブ油、ヒマシ油、菜種油、ココナッツ油、小麦胚芽油、スィートアーモンド油、アボカド油、マカダミア油、アプリコット油、ベニバナ油、キャンドルナッツ油、亜麻仁油（ｆａｌｓｅ  ｆｌａｘ  ｏｉｌ）、タマヌ油、レモン油およびこれらの混合物などの植物油と、ワックスと、Ｃ２〜Ｃ１０アルカン、アセトン、メチルエチルケトン、揮発性有機Ｃ１〜Ｃ１２アルコール、Ｃ１〜Ｃ２０酸およびＣ１〜Ｃ８アルコールのエステル（エステルの選択は、ペルヒドロラーゼに対するカルボン酸エステル基質としての役割を果たし得るかどうかに依存し得るという理解の下で）（酢酸メチル、酢酸ブチル、酢酸エチル、およびミリスチン酸イソプロピルなど）、ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルコール（ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびベヘニルアルコールなど）、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪酸（ラウリン酸およびステアリン酸など）、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アミド（ラウリン酸ジエタノールアミドなど）、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルキルエステル（Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルキル安息香酸エステルなど）、ヒドロキシプロピルセルロース、およびこれらの混合物などの有機化合物とを含むことができる。一実施形態では、キャリアは、水、脂肪アルコール、揮発性有機アルコール、およびこれらの混合物を含む。
【０３２８】
本発明の組成物はさらに、約０．１％〜約１０％、あるいは約０．２％〜約５．０％のゲル化剤を含み、組成物に所望される粘度を提供するのに役立つことができる。適切な任意的なゲル化剤の非限定的な例には、架橋カルボン酸ポリマー；中和されていない架橋カルボン酸ポリマー；中和されていない変性架橋カルボン酸ポリマー；架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー；中和されていない架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー（例えば、Ｍｏｎｓａｎｔｏから市販されているＥＭＡ８１）；中和されていない架橋アルキルエーテル／アクリレートコポリマー（例えば、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販されているＳＡＬＣＡＲＥ（商標）ＳＣ９０）；ポリアクリル酸ナトリウム、鉱油、およびＰＥＧ−１  ｔｒｉｄｅｃｅｔｈ−６の中和されていない架橋コポリマー（例えば、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販されているＳＡＬＣＡＲＥ（商標）ＳＣ９１）；メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸の中和されていない架橋コポリマー（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されているＳＴＡＢＩＬＥＺＥ（商標）ＱＭ―ＰＶＭ／ＭＡコポリマー）；疎水的に変性された非イオン性セルロースポリマー；疎水的に変性されたエトキシレートウレタンポリマー（例えば、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅから市販されているアルカリ膨潤性ポリマーのＵＣＡＲＥ（商標）Ｐｏｌｙｐｈｏｂｅ  Ｓｅｒｉｅｓ）；およびこれらの組み合わせが含まれる。これに関連して、「中和されていない」という用語は、任意的なポリマーおよびコポリマーゲル化剤材料が、中和されていない酸モノマーを含有することを意味する。好ましいゲル化剤には、中和されていない水溶性架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー、中和されていない水溶性架橋カルボン酸ポリマー、疎水的に変性された水溶性の非イオン性セルロースポリマー、および界面活性剤／脂肪アルコールゲルネットワーク、例えば、ヘアコンディショニング製品において使用するのに適したものなどが含まれる。
【０３２９】
ヘアケア組成物
過酸発生成分は、ヘアケア組成物および製品に取り込まれて、有効濃度の少なくとも１つの過酸を発生させることができる。所望の量の過酸を発生させるために使用されるペルヒドロラーゼは融合タンパク質の形態で使用することができ、ここで、融合タンパク質の第１の部分はペルヒドロラーゼを含み、第２の部分は毛髪に対する親和性を有する。
【０３３０】
生成される過酸は毛髪に利益を提供する（すなわち、「過酸ベースの有益剤」）。過酸は、脱毛剤、毛髪の引張強さを低下させるための毛髪処理剤、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）の性能を高めるために使用される毛髪前処理剤、毛髪漂白剤、染毛の前処理剤（酸化染毛剤）、ヘアカーリング／スタイリング剤として、そしてヘアコンディショニング製品中の成分として使用され得る。
【０３３１】
過酸ベースの有益剤に加えて、ヘアケア製品および製剤は、ヘアケア製品において通常見出されるいくつもの付加的な成分を含むこともできる。付加的な成分は、毛髪の外観、感触、色、および光沢を改善すると共に、毛髪のボリュームまたは柔軟性を増大するのに役立つことができる。
【０３３２】
ヘアコンディショニング剤は当該技術分野においてよく知られており、例えば、参照によって本明細書中に援用されるＧｒｅｅら（国際公開第０１０７００９号パンフレット）が参照され、種々の供給元から市販されている。ヘアコンディショニング剤の適切な例としては、カチオン性ポリマー（カチオン化グァーガム、ジアリル第４級アンモニウム塩／アクリルアミドコポリマー、４級化ポリビニルピロリドンおよびその誘導体、ならびに種々のポリクオタニウム化合物など）、カチオン性界面活性剤（塩化ステアラルコニウム、塩化セントリモニウム、およびサパミン塩酸塩など）、脂肪アルコール（ベヘニルアルコールなど）、脂肪アミン（ステアリルアミンなど）、ワックス、エステル、非イオン性ポリマー（ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコールなど）、シリコーン、シロキサン（デカメチルシクロペンタシロキサンなど）、ポリマーエマルション（アモジメチコンなど）、ならびにナノ粒子（シリカナノ粒子およびポリマーナノ粒子など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３３】
ヘアケア製品は、美容的に許容可能な媒体中に通常見出される付加的な成分を含むこともできる。このような成分の非限定的な例は、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２、およびＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４に記載されている。またヘアケアのための美容的に許容可能な媒体中に含まれることが多い成分の非限定的なリストは、Ｐｈｉｌｉｐｐｅらにより米国特許第６，２８０，７４７号明細書において、そしてＯｍｕｒａらにより米国特許第６，１３９，８５１号明細書において、そしてＣａｎｎｅｌｌらにより米国特許第６，０１３，２５０号明細書において記載されている（これらは全て、参照によって本明細書中に援用される）。例えば、ヘアケア組成物は水性、アルコール性または水−アルコール性の溶液でよく、水−アルコール性溶液の場合、好ましくは、アルコールは全重量に対して約１〜約７５重量％の割合のエタノールまたはイソプロパノールである。さらに、ヘアケア組成物は、酸化防止剤、保存剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢ日焼け止め、香料、増粘剤、ゲル化剤、湿潤剤およびアニオン性、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または顔料を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の従来の化粧品または皮膚科用添加剤または補助剤を含有し得る。
【０３３４】
ヘアケア組成物および方法は、毛髪、皮膚、または爪の色を変化させるために使用することができる任意の染料、レーキ（ｌａｋｅ）、顔料などの少なくとも１つのカラーリング剤を含むこともできる。ヘアカラーリング剤は当該技術分野においてよく知られており（例えば、Ｇｒｅｅｎら（上記）、ＣＦＴＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｏｒ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２）およびＣｏｓｍｅｔｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ／ＩＡＳ  Ｂｏｏｋｌｅｔ（１９９２）を参照）、種々の供給元（例えば、Ｂａｙｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ、ＩＣＩ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ、Ｓａｎｄｏｚ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ、ＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ、およびＨｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。適切なヘアカラーリング剤には、４−ヒドロキシプロピルアミノ−３−ニトロフェノール、４−アミノ−３−ニトロフェノール、２−アミノ−６−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、Ｈｅｎｎａ、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  ２、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ４、ＨＣ  Ｒｅｄ  ３、ＨＣ  Ｒｅｄ  ５、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌａｃｋ  ９、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  ７、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １２、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ８、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  １２、ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ  ２、Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  １、Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ３、Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌｕｅ  ３、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｖｉｏｌｅｔ  １、エオシン誘導体（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１など）、およびハロゲン化フルオレセイン誘導体（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．５と、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１０と組み合わせなど）などの染料と、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３６およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏｓ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．１２のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．１３のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．５、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１、およびＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛、酸化バリウム、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、ならびにカーボンブラック粒子などの顔料とが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ヘアカラーリング剤は、Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  １および３、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６および８、Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １、ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ  ２、ＨＣ  Ｒｅｄ  ５、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、ならびにカーボンブラックである。金属および半導体ナノ粒子も、その強力な発光のためにヘアカラーリング剤として使用され得る（米国特許出願公開第２００４−００１０８６４号明細書（Ｖｉｃら））。
【０３３５】
ヘアケア組成物には、シャンプー、コンディショナー、ローション、エアロゾル、ジェル、ムース、および染毛剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３３６】
一実施形態では、
ａ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む、酵素触媒と、
ｂ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１１】
2014501760.tif 000013
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化１２】
2014501760.tif 000014
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）経皮的に許容可能なキャリア媒体と
を含むヘアケア組成物が提供されており、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が混ぜ合わせられたときに、組成物は過酸を含む。
【０３３７】
別の実施形態では、ヘアケア組成物において使用される過加水分解酵素は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｂ）毛髪に対する親和性を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質である。
【０３３８】
一実施形態では、ヘアケア組成物中で形成される過酸は過酢酸である。
【０３３９】
ヘアケア組成物の成分は、使用されるまで分離して保持され得る。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから毛髪表面と接触され、それにより得られる過酸ベースの有益剤は、毛髪除去、毛髪弱化（毛髪の引張強さの低減により評価される）、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニングからなる群から選択される利益を提供する（すなわち、１段階適用方法）。別の実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。ヘアケア組成物中の原料の相対的な量は、所望の効果に応じて変化され得る。
【０３４０】
一実施形態では、
１）ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１３】
2014501760.tif 000015
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化１４】
2014501760.tif 000016
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む酵素触媒と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
２）（１）の反応成分を混ぜ合わせ、それにより少なくとも１つの過酸が生成されるステップと、
３）毛髪を前記過酸と接触させ、それにより、得られる過酸ベースの有益剤が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、染毛の前処理、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニングからなる群から選択される利益を提供するステップと、
を含む単一段階毛髪処理方法が提供されており、美容的に許容可能な媒体の１つまたは複数の成分が存在していてもよい。
【０３４１】
過酸発生系（すなわち、毛髪表面における順次適用）組成物の個々の成分のうちの１つまたは２つは、酵素的な過酸の生成に必要とされる残りの成分を適用する前に毛髪表面と接触され得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、基質および過酸素源よりも前に毛髪と接触される（すなわち、「２段階適用」）。好ましい実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分よりも前に毛髪表面に適用される標的化ペルヒドロラーゼ（すなわち、融合タンパク質）である（すなわち、２段階適用方法）。
【０３４２】
別の実施形態では、
１）毛髪を、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分であって、前記酵素が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む第１の部分と、
ｂ）毛髪に対する親和性を有するペプチド成分を含む第２の部分と
を含む融合タンパク質と接触させ、それにより融合ペプチドが毛髪に結合するステップと
、
２）場合により、毛髪を水溶液ですすぎ、非結合融合ペプチドを除去するステップと、
３）結合した融合ペプチドを含む毛髪を、
ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１５】
2014501760.tif 000017
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化１６】
2014501760.tif 000018
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と
に接触させ、それにより、融合ペプチドが基質および過酸素源と混ぜ合わせられると、過酸が生成され、それにより得られる過酸が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、染毛の前処理、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニンからなる群から選択される利益を提供するステップと
を含む方法が提供される。
【０３４３】
好ましい実施形態では、上記の過酸ベースのヘアケア方法は、毛髪を除去し、そして／あるいは毛髪の引張強さを弱めるために使用される。毛髪の除去または引張強さの低下を対象とするヘアケア方法は、除去の標的となる毛髪を含む表面からの毛髪の弱化および／または除去を増強するために、場合により、チオグリコレートなどの還元剤（システインの対を連結するジスルフィド結合を低減するため）を含んでいてもよい。
【０３４４】
さらなる実施形態では、上記の脱毛方法は、チオグリコレートベースの毛髪除去製品などの少なくとも１つの還元剤を含む市販の毛髪除去製品を後で適用するための前処理として使用されてもよい。従って、上記の方法は、過酸処理された毛髪を還元剤と接触させるステップを含むことができる。好ましくは、還元剤は、チオグリコール酸ナトリウムまたはチオグリコール酸カリウムなどのチオグリコレートである（例えば、ＮＡＩＲ（登録商標）などの毛髪除去製品において使用されることが多い活性成分）。
【０３４５】
日用製品を用いる毛髪の除去
一実施形態では、低濃度の過酸を含むパーソナルケア製品は、毛髪の引張強さを除去または弱化するために使用され得る。過酸の濃度は、過酸組成物の度重なる適用によって他の体表面（すなわち、皮膚）が悪影響を受けないよう調節され得る。この特定の実施形態（すなわち、多数回適用、低濃度の過酸を含む日用製品）で使用される過酸は、酵素的に発生された過酸、化学的に発生された過酸、予備成形された過酸、またはこれらの任意の組み合わせでよい。
【０３４６】
一実施形態では、パーソナルケアの日用製品は、少なくとも１つの酵素的に発生された過酸、好ましくはＣＥ−７ペルヒドロラーゼを用いて発生された過酸を含む。過酸の濃度は、毛髪除去が製品の多数回適用を必要とするように調節される。好ましくは、製品は、１か月に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に１回を以上、または毎日適用され得る。
【０３４７】
一実施形態では、毛髪を除去するための方法が提供されており、
ａ）０．００１〜４重量％の過酸を含む組成物を提供するステップと、
ｂ）過酸処理された毛髪を形成するために適切な条件下で、毛髪を含む体表面を前記過酸と接触させるステップと、
ｃ）場合により、過酸処理された毛髪を水溶液ですすぐステップと、
ｄ）場合により、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）の後に、毛髪を乾燥させるステップと、
ｅ）毛髪が体表面から除去されるまで、ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップとが含まれる。
【０３４８】
一実施形態では、毛髪を過酸と接触させる前、毛髪を含む体表面は場合により、湿っていてもよいし、ボディウォッシュで清浄化されていてもよいし、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。
【０３４９】
さらに別の実施形態では、２段階適用方法を使用することができ、この場合、標的化ペルヒドロラーゼは、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分の前に適用される。
【０３５０】
別の実施形態では、毛髪の引張強さを低減するための方法が提供されており、
ａ）０．０１〜４重量％の過酸を含む組成物を提供するステップと、
ｂ）過酸処理された毛髪を形成するために適切な条件下で、初期引張強さを特徴とする毛髪を含む体表面を、過酸を含む組成物と接触させるステップと、
ｃ）場合により、過酸処理された毛髪を水溶液ですすぐステップと、
ｄ）場合により、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）の後に、毛髪を乾燥させるステップと、
ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返し、それにより、毛髪の初期引張強さが低減されるステップと
が含まれる。
【０３５１】
別の実施形態では、上記の毛髪の除去／引張強さの低減方法は、場合により、ステップ（ｂ）の前、間、または後に、毛髪を、２５重量％までの尿素などの膨潤剤（すなわち、毛髪繊維を膨潤させるまたは一時的に開く（ｏｐｅｎ  ｕｐ）ために使用される化学薬品）と接触させるステップを含むことができる。
【０３５２】
別の実施形態では、上記の方法はさらに、過酸処理された毛髪を少なくとも１つの還元剤と接触させるステップを含むことができる。還元剤は、毛髪内のジスルフィド結合を低減することができる任意の還元剤を含むことができる。
【０３５３】
還元剤は、チオグリコレート、サルファイト、バイサルファイト、システイン、グリセリルモノチオグリコレート、システアミン、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。好ましい実施形態では、還元剤は、毛髪の除去または弱化を増強するために適切な量で、少なくとも１つのチオグリコレート（例えば、チオグリコール酸カリウム、チオグリコール酸カルシウムなど）を含む。好ましくは、還元剤は、２５重量％未満の濃度で適用される。
【０３５４】
別の実施形態では、上記の毛髪除去／弱化方法はどれも、所望の効果（毛髪の除去／引張強さの低減）を達成する前に最大３０回繰り返される。好ましくは、過酸濃度および適用条件は、毛髪除去／弱化製品が、少なくとも１か月に１回、好ましくは少なくとも１週間に１回、より好ましくは１日おきに、最も好ましくは少なくとも１日１回、安全に適用され得るように選択される。別の実施形態では、毛髪除去／弱化方法は、１日２回、最大３０日間繰り返される。
【０３５５】
上記方法において、毛髪を除去／弱化するために使用される過酸は、予備成形されてもよいし、化学的な過加水分解によって生成されてもよいし、そして／あるいは過加水分解酵素を用いて酵素的に生成されてもよい。好ましくは、過加水分解酵素は、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。
【０３５６】
一実施形態では、０．００１〜４重量％の過酢酸を含む組成物は、過酢酸を生成するために過酸化水素源および適切なカルボン酸エステル基質を化学的に反応させることによって、非酵素的に生成される。１つの態様では、過酢酸を化学的に発生させるために使用される過酸前駆体は、過酢酸を化学的に生成する前に、親和性を有するペプチド成分を介して毛髪に結合される。別の実施形態では、過酸前駆体はＴＡＥＤ（テトラアセチルエチレンジアミン）であるか、あるいは本明細書で記載される適切なカルボン酸エステル基質である。
【０３５７】
別の実施形態では、０．００１〜４重量％の過酢酸を含む組成物は、体表面との接触の前に、過加水分解酵素、過酸素源、およびカルボン酸エステル基質を混ぜ合わせることによって酵素的に生成される。
【０３５８】
一実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、およびこれらの組み合わせの群から選択される。
【０３５９】
別の実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、配列番号配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３６０】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０３６１】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３６２】
さらなる実施形態では、ペルヒドロラーゼは、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、各酵素は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、前記シグネチャーモチーフは、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む。
【０３６３】
ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１７】
2014501760.tif 000019
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化１８】
2014501760.tif 000020
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される、０．１〜５０重量％の少なくとも１つの基質と、
ｂ）０．１〜１５重量％の過酸化水素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７炭水化物エステラーゼを含む、０．００１〜１重量％の酵素触媒と、
ｄ）経皮的に許容可能なキャリア媒体を含む、９８重量％までのパーソナルケア組成物の残りの成分と
を含み、それにより、反応成分を混合したときに過酸が生成される、毛髪除去および／または毛髪弱化のためのヘアケア製品も提供される。一実施形態では、ヘアケア製品は、２５重量％までの毛髪膨潤剤を含むことができる。さらなる実施形態では、毛髪膨潤剤は尿素を含む。
【０３６４】
上記のヘアケア製品はさらに、毛髪ケラチン内のジスルフィド結合を還元することができる、２５重量％までの還元剤を含むことができる。好ましい実施形態では、還元剤は、少なくとも１つのチオグリコレートを含む。還元剤は、過酸処理された毛髪と接触される別箇の成分として供給され得る。
【０３６５】
スキンケア組成物
ＣＥ−７過酸発生成分は、スキンケア製剤および製品に取り込まれて、有効濃度の少なくとも１つの過酸を発生させることができる。所望の量の過酸を発生させるために使用されるＣＥ−７ペルヒドロラーゼは融合タンパク質の形態で使用することができ、ここで、融合タンパク質の第１の部分はＣＥ−７ペルヒドロラーゼを含み、第２の部分は皮膚に対する親和性を有する。
【０３６６】
既に同定された皮膚結合ペプチドの例は、本明細書において提供される。皮膚に対する親和性を有する追加のペプチドを同定するための方法は当該技術分野においてよく知られており、いくつか例を挙げると、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡ−ディスプレイなどのいくつものペプチドディスプレイ技術が含まれ得る。さらに、皮膚結合ペプチドは、皮膚に対する静電引力を有するように実験的に調製することができる。
【０３６７】
生成される過酸は皮膚に利益を提供する。過酸は、スキンホワイトニング、皮膚漂白、スキンコンディショニング、皮膚のしわの出現の低減、皮膚の若返り、真皮の接着の低減、および体臭の低減または除去のために使用され得る。本発明のスキンケア製品は、非過酸ベースのスキンケア製品の前処理として使用されてもよい。
【０３６８】
スキンケア製品において一般に使用されるいくつもの皮膚科学的に許容可能な材料も、スキンコンディショニング剤および皮膚着色剤などの本発明のスキンケア組成物中に取り込まれ得る。
【０３６９】
本明細書において定義されるスキンコンディショニング剤には、皮膚を引き締める収斂剤と、死んだ皮膚細胞を除去する角質除去剤（ｅｘｆｏｌｉａｎｔ）と、滑らかで柔らかく柔軟な外観の保持を助けるする皮膚軟化剤と、皮膚の上層の含水量を増大させる湿潤剤と、皮膚表面からの水の蒸発を遅らせる閉塞剤と、乾燥または損傷した皮膚の外観を向上するか、あるいは剥離を低減して柔軟性を回復させる種々雑多な化合物とが含まれるが、これらに限定されない。スキンコンディショニング剤は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｇｒｅｅｎら（国際公開第０１／０７００９号パンフレット）が参照され、種々の供給元から市販されている。スキンコンディショニング剤の適切な例としては、α−ヒドロキシ酸、β−ヒドロキシ酸、ポリオール、ヒアルロン酸、Ｄ，Ｌ−パンテノール、ポリサリチレート、パルミチン酸ビタミンＡ、酢酸ビタミンＥ、グリセリン、ソルビトール、シリコーン、シリコーン誘導体、ラノリン、天然油およびトリグリセリドエステルが挙げられるが、これらに限定されない。スキンコンディショニング剤は、ポリサリチレート、プロピレングリコール（ＣＡＳ  Ｎｏ．５７−５５−６、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、グリセリン（ＣＡＳ  Ｎｏ．５６−８１−５、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）、グリコール酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．７９−１４−１、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、乳酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．５０−２１−５、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）、リンゴ酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．６１７−４８−１、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、クエン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．７７−９２−９、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、酒石酸（ＣＡＳ  ＮＯ．１３３−３７−９、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、グルカル酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．８７−７３−０）、ガラクタル酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．５２６−９９−８）、３−ヒドロキシ吉草酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０２３７−７７−１）、サリチル酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．６９−７２−７、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、および１，３プロパンジオール（ＣＡＳ  Ｎｏ．５０４−６３−２、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を含むことができる。ポリサリチレートは、参照によって本明細書中に援用される米国特許第４，８５５，４８３号明細書においてＷｈｉｔｅらにより記載される方法によって調製され得る。グルカル酸は、Ｍｅｒｂｏｕｈら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３６：７５−７８（２００１）により記載される方法を用いて合成され得る。３−ヒドロキシ吉草酸は、公開された国際特許出願の国際公開第０２／０１２５３０号パンフレットにおいてＢｒａｍｕｃｃｉにより記載されるように調製され得る。
【０３７０】
美容的に許容可能な媒体は、組成物の全重量に対して一般に約１０〜約９０重量％の割合の脂肪性物質を含有することができ、脂肪相は、少なくとも１つの液体、固体または半固体の脂肪性物質を含有する。脂肪性物質には、油、ワックス、ガム、およびいわゆるペースト状の脂肪性物質が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、油中水または水中油エマルションなどの形態であり得る。さらに、組成物は、酸化防止剤、保存剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢ日焼け止め、香料、増粘剤、湿潤剤およびアニオン性、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または顔料（着色剤）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の従来の化粧品または皮膚科用添加剤または補助剤を含有し得る。
【０３７１】
皮膚のカラーリング剤は、以下の染料：エオシン誘導体（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１など）およびハロゲン化フルオレセイン誘導体（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．５と、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１０と組み合わせ）と、顔料：二酸化チタン、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３６およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏｓ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．１２のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．１３のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．５、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１、ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、ウルトラマリンブルー、ならびにカーボンブラックとを含むことができる。カラーリング剤は、日光を浴びることなく日焼けした皮膚の外観を生じる、ジヒドロキシアセトンなどのサンレスタンニング剤であってもよい。
【０３７２】
一実施形態では、
ａ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む酵素触媒と、
ｂ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１９】
2014501760.tif 000021
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化２０】
2014501760.tif 000022
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）皮膚のための経皮的に許容可能なキャリア媒体と
を含むスキンケア組成物が提供されており、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が混ぜ合わせられたときに、組成物は過酸を含む。
【０３７３】
別の実施形態では、スキンケア組成物において使用される過加水分解酵素は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｂ）皮膚に対する親和性を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質である。
【０３７４】
一実施形態では、スキンケア製品において使用するために形成される過酸は過酢酸である。スキンケア組成物中の原料の相対的な量は、所望の効果に応じて変化され得る。
【０３７５】
スキンケア組成物の成分は、使用されるまで分離して保持され得る。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから皮膚表面と接触され、それにより、過酸ベースの有益剤は、皮膚に有益な効果を提供する（すなわち、１段階適用方法）。別の実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。
【０３７６】
一実施形態では、
１）ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化２１】
2014501760.tif 000023
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む酵素触媒と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
２）（１）の反応成分を混ぜ合わせ、それにより少なくとも１つの過酸が生成されるステップと、
３）皮膚を前記過酸と接触させ、それにより、過酸処理が、スキンホワイトニング、皮膚漂白、スキンコンディショニング、皮膚のしわの出現の低減、皮膚の若返り、真皮の接着の低減、および体臭の低減または除去からなる群から選択される利益を提供するステップとを含む単一段階方法が提供されており、美容的に許容可能な媒体の１つまたは複数の成分が存在していてもよい。
【０３７７】
過酸発生系（すなわち、皮膚表面における順次適用）組成物の個々の成分のうちの１つまたは２つは、酵素的な過酸の生成に必要とされる残りの成分を適用する前に皮膚表面と接触され得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、基質および過酸素源よりも前に皮膚と接触される（すなわち、「２段階適用」）。好ましい実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分よりも前に皮膚表面に適用される標的化ペルヒドロラーゼ（すなわち、融合タンパク質）である（すなわち、２段階適用方法）。
【０３７８】
別の実施形態では、
１）皮膚を、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分であって、前記酵素が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ  
を含む第１の部分と、
ｂ）皮膚に対する親和性を有するペプチド成分を含む第２の部分と
を含む融合タンパク質と接触させ、それにより融合ペプチドが皮膚に結合するステップと、
２）場合により、皮膚を水溶液ですすぎ、非結合融合ペプチドを除去するステップと、
３）結合した融合ペプチドを含む皮膚を、
ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化２２】
2014501760.tif 000024
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と
に接触させ、それにより、融合ペプチドが基質および過酸素源と混ぜ合わせられると過酸が生成され、それにより、皮膚が、スキンホワイトニング、皮膚漂白、スキンコンディショニング、皮膚のしわの出現の低減、皮膚の若返り、真皮の接着の低減、および体臭の低減または除去からなる群から選択される利益を受けるステップと
を含む方法が提供される。
【０３７９】
ネイルケア組成物
ＣＥ−７過酸発生成分は、ネイルケア製剤および製品に取り込まれて、有効濃度の少なくとも１つの過酸を発生させることができる。所望の量の過酸を発生させるために使用されるＣＥ−７ペルヒドロラーゼは融合タンパク質の形態で使用することができ、ここで、融合タンパク質の第１の部分はＣＥ−７ペルヒドロラーゼを含み、第２の部分は爪に対する親和性を有する。
【０３８０】
ここでは、爪に対する親和性を有するペプチドが提供される。爪に対する親和性を有する追加のペプチドを同定するための方法は当該技術分野においてよく知られており、いくつか例を挙げると、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡ−ディスプレイなどのいくつものペプチドディスプレイ技術が含まれ得る。さらに、爪結合ペプチドは、爪に対する静電引力を有するように実験的に調製することもできる。
【０３８１】
生成される過酸は爪に利益を提供する。過酸は、爪の漂白、爪の消毒、爪のリサーフェシングのために、あるいはマニキュア液などの他のネイルケア製品の前処理として使用され得る。
【０３８２】
ネイルケア製品において一般に使用されるいくつもの皮膚科学的に許容可能な材料も、爪コンディショニング剤および爪着色剤などの本発明のネイルケア組成物中に取り込まれ得る。
【０３８３】
爪着色剤は、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏｓ．８、１０、３０および３６、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏｓ．６、９および１２のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏｓ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３０およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１７およびＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．６のストロンチウムレーキを含むことができる。
【０３８４】
爪着色剤は、指の爪および足指の爪を着色するためのマニキュア液組成物において使用され得る。マニキュア液組成物は、美容的に許容可能な媒体中に有効量の少なくとも１つの爪着色剤を含む、爪の処理および着色のための組成物である。マニキュア液のための美容的に許容可能な媒体の成分は、Ｐｈｉｌｉｐｐｅら（上記）によって記載されている。マニキュア液組成物は、通常、溶媒と、セルロース誘導体、ポリビニル誘導体、アクリルポリマーまたはコポリマー、ビニルコポリマーおよびポリエステルポリマーなどの塗膜形成物質とを含有する。さらに、マニキュア液は、リン酸トリクレジル、安息香酸ベンジル、リン酸トリブチル、アセチルリシノール酸ブチル、クエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、フタル酸ジブチルまたはカンファーなどの可塑剤を含有してもよい。
【０３８５】
一実施形態では、
ａ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む酵素触媒と、
ｂ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化２３】
2014501760.tif 000025
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）爪のための美容的に許容可能なキャリア媒体と
を含むネイルケア組成物が提供されており、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が混ぜ合わせられたときに、組成物は過酸を含む。
【０３８６】
別の実施形態では、ネイルケア組成物中で使用される過加水分解酵素は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｂ）爪に対する親和性を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質である。
【０３８７】
一実施形態では、ネイルケア組成物のために形成される過酸は過酢酸である。ネイルケア組成物中の原料の相対的な量は、所望の効果に応じて変化され得る。
【０３８８】
ネイルケア組成物の成分は、使用されるまで分離して保持され得る。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから爪表面と接触され、それにより、過酸ベースの有益剤は、爪に有益な効果を提供する（すなわち、１段階適用方法）。別の実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。
【０３８９】
一実施形態では、
１）ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化２４】
2014501760.tif 000026
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、
ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
である酵素触媒と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
２）（１）の反応成分を混ぜ合わせ、それにより少なくとも１つの過酸が生成されるステップと、
３）爪を前記過酸と接触させ、それにより、過酸処理が、爪の漂白、爪のリサーフェシング、および爪の消毒からなる群から選択される利益を提供するステップと
を含む、爪を処理するための単一段階方法が提供される。
【０３９０】
過酸発生系（すなわち、爪表面における順次適用）組成物の個々の成分のうちの１つまたは２つは、酵素的な過酸の生成に必要とされる残りの成分を適用する前に爪表面と接触され得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、基質および過酸素源よりも前に爪と接触される（すなわち、「２段階適用」）。好ましい実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分よりも前に爪表面に適用される標的化ペルヒドロラーゼ（すなわち、融合タンパク質）である（すなわち、２段階適用方法）。
【０３９１】
別の実施形態では、
１）爪を、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分であって、前記酵素が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む第１の部分と、
ｂ）爪に対する親和性を有するペプチド成分を含む第２の部分と、
を含む融合タンパク質と接触させ、それにより融合ペプチドが爪に結合するステップと、
２）場合により、爪を水溶液ですすぎ、非結合融合ペプチドを除去するステップと、
３）結合した融合ペプチドを含む爪を、
ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化２５】
2014501760.tif 000027
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と
に接触させ、それにより、融合ペプチドが基質および過酸素源と混ぜ合わせられると過酸が生成され、それにより、爪が、爪の漂白、爪のリサーフェシング、および爪の消毒からなる群から選択される利益を受けるステップと
を含む方法が提供される。
【０３９２】
ペルオキシカルボン酸および過酸化水素の濃度を決定するためのＨＰＬＣ検定方法
反応物および生成物を分析するために、滴定、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、Ｕ．Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７））によって記載される分析手順、ならびに本発明の実施例において記載されるような２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾタゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）検定（Ｕ．Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌ  ｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ，１２２：５６７−５７１（１９９７）およびＤｉｎｕ  ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０：３９２−３９８（２０１０））を含むがこれらに限定されない様々な分析方法を、本発明の方法において使用することができる。
【０３９３】
ペルオキシカルボン酸の最小殺生物濃度の決定
特定のパーソナルケア用途は、いくつか例を挙げると体臭および真菌感染に関連するものなど、不要な微生物の除去と関連し得る。従って、標的パーソナルケア用途のための最小殺生物濃度を測定することが望まれるかもしれない。Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：６３−７３（２００２））によって記載される方法は、ペルオキシカルボン酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度（ＭＢＣ）を決定するために使用することができる。検定法は、ＸＴＴの還元阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学濃度（ＯＤ）の変化による微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な様々なその他の方法が存在し、生存可能なプレートのカウント、直接的な顕微鏡のカウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、およびバイオルミネセンスなどが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．，「Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ、ＵＳＡ；２００１を参照）。
【０３９４】
組換え微生物の発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞において、特に微生物宿主の細胞において産生され得る。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーにおいて見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌はどれも適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせにおいて発現され得るが、ここで、細胞外発現によって、発酵産物からの所望のタンパク質の回収は、細胞内発現により産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞原料に対して不変なままであり、それにもかかわらず機能遺伝子は発現されるであろう。宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピキア属、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、クルイベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ヤロウィア属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ザイモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、ディノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パンテア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス属、メチロサイナス属、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、シネココッカス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミキソコッカス属などの細菌、真菌または酵母種が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属、バチルス属、クルイベロミセス属、およびシュードモナス属が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０３９５】
大規模の微生物の増殖および機能遺伝子の発現は、様々な単純または複合糖質、有機酸、およびアルコール、またはメタンなどの飽和炭化水素、または二酸化炭素（光合成または化学独立栄養宿主の場合）、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または任意の微量栄養素（小さい無機イオンを含む）の形態および量を使用し得る。増殖速度の制御は、特定の制御分子を培養に添加するか否かによって影響され得るが、これらは通常、栄養分またはエネルギー源とは考えられない。
【０３９６】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは当該技術分野でよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、関連の遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の調節を包含する遺伝子の５’領域と、転写の終結を調節するＤＮＡ断片の３’領域とを含む。両方の調節領域が形質転換宿主細胞に相同および／または産生宿主に天然の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、このような調節領域はそのような由来でなくてもよい。
【０３９７】
所望の宿主細胞における本発明のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の発現を駆動するために有用な開始調節領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるあらゆるプロモーターが本発明に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピキア属における発現に有用）、ならびにｌａｃ、ａｒａＢ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、そしてバチルス属における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび種々のファージプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９８】
終結調節領域も、好ましい宿主細胞に天然の種々の遺伝子に由来し得る。一実施形態では、終結調節領域の包含は任意的である。別の実施形態では、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞に由来する終結調節領域を含む。
【０３９９】
工業的な産生
ペルヒドロラーゼ触媒を産生するために様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模産生は、バッチ培養、流加培養、および連続培養法によって行うことができる。バッチおよび流加培養法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−２３４（１９９２）において見出すことができる。
【０４００】
所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的な産生は、連続培養を用いて達成することもできる。連続培養は開放系であり、定義される培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に、等量の条件培地が処理のために除去される。一般に、連続培養は、細胞が主に対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は固定化細胞を用いて実施することもでき、ここで、炭素および栄養分は連続的に添加され、価値のある産物、副産物または老廃物は細胞塊から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される様々な固体担体を用いて実施することができる。
【０４０１】
バッチ発酵、流加発酵、または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に知られている方法のいずれかによって達成され得る。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストは遠心分離または膜ろ過によって培地から分離され、場合により水または所望のｐＨの水性緩衝液で洗浄され、次に、所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペーストの懸濁液は均質化されて、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生じる。細胞抽出物は、場合により、セライトまたはシリカなどの適切なろ過助剤を通してろ過され、酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させるための加熱処理ステップの前に細胞片が除去されてもよい。次に、所望の酵素触媒を含有する溶液は、膜ろ過または遠心分離によって、沈殿した細胞片およびタンパク質から分離されてもよく、得られた部分精製酵素触媒溶液は、付加的な膜ろ過によって濃縮され、次に場合により、適切なキャリア（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合物）と混合され、噴霧乾燥されて所望の酵素触媒を含む固体粉末を生じ得る。
【０４０２】
量、濃度、またはその他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の一覧のいずれかで与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲の上限または好ましい値と、任意の範囲の下限または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が列挙される場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲を定義する場合、本発明の範囲は、列挙される特定の値に限定されることは意図されない。
【０４０３】
一般的な方法
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するための技術に従い、従って、その実施のために好ましいモードを構成すると考えられることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変化が成され、そしてそれでもなお本発明で開示される方法および実施例の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができると認識すべきである。
【０４０４】
全ての試薬および材料は、他に指定されない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ｉｎ）またはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０４０５】
本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、技術、特性、または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ｇｆ」は最大グラム重量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｇｒａｍｓ  ｆｏｒｃｅ）を意味し、「ｄｅｎ」はデニールを意味し、「Ｎ」はニュートンを意味し、「ｔｅｘ」はヤードの質量における基本的なテックス単位／長さ１０００メートル当たりの繊維のグラム数を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄＨ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は１分間の回転数を意味し、「Ｔｇ」はガラス転移温度を意味し、「Ｔｅｎ．」は靭性を意味し、「ＴＳ」は引張強さを意味し、そして「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
【０４０６】
単一の繊維の引張強さ試験
試験のための毛髪サンプルの選択
毛髪サンプルの量および直径は様々なので、引張強さ試験において合理的な標準偏差を達成するために、毛髪サンプルの予備選択が使用される。目に見える欠陥があるか、あるいは大部分の繊維よりも著しく細いまたは太い毛髪繊維はどれも手で除去した。汚染を防止するために、毛髪繊維サンプルを取り扱う間、手袋を用いた。
【０４０７】
毛髪サンプルの調製
プラスチック製ホールピペット管は、球状端部を切り取ることにより２７／８インチ（約７．３ｃｍ）に切断した。一端をテープで留めることにより毛髪繊維をひとまとめにしながら、７〜２０本の毛髪ストランドを有する毛髪束を慎重に管に挿入し、ホールピペットの幅広端部の外側上部に取り付けた。これは、ストランドを管中の正しい位置に一度で保持するのにも役立った。
【０４０８】
適用手順
溶液／クリーム（２００μＬ）を２．０ｍＬの微量遠心管に添加した。毛髪を先端から突出させてホールピペットの小さい方の端部を管の内部に挿入することによって、毛髪ストランドがＵ型を形成し、ストランドの自由端部が微量遠心管の外側にゆるく垂れ下がるように毛髪サンプルを管の中に入れた。
【０４０９】
特定の適用の後、毛髪サンプルを乾燥させ、引張強さ試験の前に、温度および湿度制御室において少なくとも１２時間、好ましくは２４時間平衡化した。
【０４１０】
毛髪繊維の引張強さ試験手順
毛髪サンプルを長さ４インチの片に切断した。各毛髪繊維のデニール数（線質量密度（ｌｉｎｅｒ  ｍａｓｓ  ｄｅｎｓｉｔｙ））は、Ｔｅｘｔｅｃｈｎｏ  Ｖｉｂｒｏｍａｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｅｘｔｅｃｈｎｏ  Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｓｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。毛髪繊維は、ＡＳＴＭ  Ｄ  ３８２２−０１（「Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｆｉｂｅｒｓ」、ＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｅｓｔ  Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎ，ＰＡ，２００１）に従って、Ｉｎｓｔｒｏｎ試験システム（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  １１２２  Ｔｅｓｔｅｒ、Ｉｎｓｔｒｏｎ，ＭＡ）において約７０°Ｆ（約２１℃）および６５％相対湿度で試験した。毛髪サンプルの試験領域をゲージの中央に置き、両端部を試験ヘッド上に把持した。取扱いおよび試験ヘッド上の把持を容易にするために繊維の両端部をそれぞれテープ片に取り付けた。試験は、２インチ（５．１ｃｍ）のゲージ長、５００ｍｇのロードセル、および１．２インチ／分（３ｃｍ／分）の引張速度を用いた。試験中、繊維の力−ひずみ曲線を記録した。最大力（ｇｆ）をデニール数（ｄｅｎ）で除することによって最大靭性（ｇｆ／ｄｅｎ）を計算した。（ｇｆ／ｄｅｎ）／１１．３３＝ニュートン／テックス（Ｎ／ｔｅｘ）に注意されたい。
【０４１１】
ＨＰＬＣ過酢酸検定
反応混合物中の過酢酸（ＰＡＡ）濃度の決定は、Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６９（１７）：３６２３−３６２７によって記載される方法に従って実施した。反応混合物のアリコート（０．０４０ｍＬ）を所定時間に取り出して、０．９６０ｍＬの５ｍＭのリン酸水と混合した。希釈サンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整することにより反応を直ちに終了させた。得られた溶液は、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルタユニット（３０，０００公称分画分子量（Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ、ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔ＃  ＵＦＣ３ＬＫＴ００）を用いてろ過した。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬのスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、＃５１８２−０７１５）に移し、次に、アセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−スルフィド）０．１００ｍＬを添加し、バイアルにフタをし、内容物を軽く混合してから、光のない状態で、約２５℃において１０分間のインキュベーションを行った。次に、各バイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリルおよび０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液を添加し、バイアルに再度フタをし、得られた溶液を混合し、光のない状態で約２５℃で３０分間インキュベートした。次に、各バイアルに、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−Ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ、ＨＰＬＣ外部標準）を添加し、得られた溶液をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）により分析した。
【０４１２】
ＨＰＬＣ方法
Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（ｃａｔ．＃５６９４２２−Ｕ）ｗ／プレカラムＳｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ＃５９５９０−Ｕ）、１０マイクロリットルの注入体積、１．０ｍＬ／分および周囲温度におけるＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃２７０７１７）および脱イオン水による勾配法：
【０４１３】
【表２】
2014501760.tif 000028
【０４１４】
発現ベクターｐＬＤ００１
プラスミドｐＬＤ００１（配列番号２９２）はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための適切な発現ベクターであることが既に報告されている（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１０−０１５８８２３Ａ１号明細書（Ｗａｎｇら）を参照）。ベクターｐＬＤ００１は、市販のベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に由来した。これは、市販のベクターｐＥＴ３１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）由来の配列を含み、酵素ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）の断片をコードする。
【０４１５】
標準組換えＤＮＡ法を用いて、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位によって結合された種々のヒドロラーゼ／ペルヒドロラーゼに対するコード配列は、ｐＬＤ００１のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に連結され、ＫＳＩ断片を置換し得る。同様に、ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩ部位により結合された結合ドメインのコード配列は、ｐＬＤ００１のＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩ部位の間に連結され得る。
【実施例】
【０４１６】
実施例１
市販の脱毛製品を用いた毛髪弱化効力の目標レベルの設定
この実施例の目的は、市販の脱毛製品を用いて毛髪弱化効力の目標レベルを確立することである。
【０４１７】
各毛髪サンプルの最大靭性（引張強さ）を使用して、毛髪サンプルの完全性を比較した。最大靭性の値が低いことは、弱化効力の改善を示す。市販の脱毛剤クリームのＮＡＩＲ（登録商標）（Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｗｉｇｈｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙからのアルカリ／チオグリコール酸カリウムベースの毛髪除去製品）を用いて、毛髪弱化の目標レベルを設定した。ＮＡＩＲ（登録商標）製品の使用説明書に基づいて、推奨される処理時間は３分〜１０分間である。従って、ＮＡＩＲ（登録商標）で３分〜１０分間処理された毛髪サンプルの最大靭性を用いて目標レベルを決定した。毛髪処理の間、約２００μＬのＮＡＩＲ（登録商標）クリームを２ｍＬ微量遠心管に添加し、毛髪サンプルをクリーム中に３、５および１０分間浸漬した。次に、毛髪サンプルを水道水ですすいで全てのクリームを除去してから、Ｎ２の流れの中で乾燥させた。表２は、ＮＡＩＲ（登録商標）で３分〜１０分間処理した毛髪ストランドの平均引張強さが、約１．３ｇｆ／ｄｅｎ〜０．８ｇｆ／ｄｅｎの範囲であったことを示す。従って、毛髪弱化効力の所望のレベルは、類似の試験条件下で０．８ｇｆ／ｄｅｎ〜１．３ｇｆ／ｄｅｎの範囲を標的とした。
【０４１８】
【表３】
2014501760.tif 000029
【０４１９】
実施例２
目標レベルを達成する単一適用における過酢酸の最低濃度の確認
この実施例の目的は、毛髪弱化効力の目標レベルを単一適用で達成する過酢酸（ＰＡＡ）の最低濃度を確認することである。
【０４２０】
５０ｍＭのリン酸緩衝液中に過酢酸を添加して、ｐＨ６およびｐＨ８において異なるＰＡＡ濃度を有する溶液を調製した。ＰＡＡ溶液（２００μＬ）を２ｍＬ微量遠心管に添加し、毛髪サンプルを２時間挿入した。次に、毛髪サンプルを脱イオン水ですすぎ、Ｎ２下で乾燥させた。表３は、試験条件下で目標の毛髪弱化レベルを達成するために、ＰＡＡ濃度は０．６重量％よりも高い必要があることを示す。
【０４２１】
【表４】
2014501760.tif 000030
【０４２２】
ＰＡＡの濃度を低くするために、より長い浸漬時間および尿素（毛髪膨潤剤）の包含を用いた。表４は、より長い浸漬時間および２０％の尿素の使用が、有効なＰＡＡ濃度を約０．６重量％まで低下させることに役立ったことを示す。より長い浸漬時間および尿素の効果は、ＰＡＡ濃度が０．６重量％未満の場合には有意でなかった。
【０４２３】
【表５】
2014501760.tif 000031
【０４２４】
実施例３
過酸の多数回処理
この実施例の目的は、単回の過酸処理に対して、同じ暴露時間で、過酸の多数の繰り返し処理の利点を示すことである。
【０４２５】
２０重量％の尿素を含有する５０ｍＭのリン酸（ｐＨ８）中で種々の濃度のＰＡＡの溶液を調製した。毛髪サンプルを溶液中に３０分間浸漬してから、上記のようにすすいで乾燥させた。処理を７回または１５回（すなわち、それぞれ４時間および８時間の全暴露時間）繰り返した。結果は、表５で提供される。
【０４２６】
【表６】
2014501760.tif 000032
【０４２７】
表４を表５と比較すると、２０重量％の尿素溶液を含有する０．６重量％のＰＡＡの場合、繰り返しの処理は、毛髪弱化効力を効果的に改善する。表５のデータは、目標の毛髪弱化レベルを達成するために有効なＰＡＡ濃度は、１６回までの多数回の処理を用いて０．２重量％まで低下され得ることを示す。
【０４２８】
実施例４
他の毛髪漂白剤の毛髪弱化効力
この実施例の目的は、他の毛髪漂白剤の毛髪弱化効力を比較することである。
【０４２９】
２つの市販の過酸化水素ベースの漂白クリーム（ＳＡＬＬＹ  ＨＡＮＳＥＮ（登録商標）顔用漂白クリームおよびＳＡＬＬＹ  ＨＡＮＳＥＮ（登録商標）顔＆ボディ用超強力漂白クリーム、Ｄｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎｄａｌｅ，ＮＹ）と、同様のｐＨ８の２０％の尿素のリン酸溶液中の６重量％の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とにより、実施例３と同じ多数回処理を適用した。２つの漂白クリームで処理した毛髪サンプルの色は、最初の処理の後に著しく明るくなった。しかしながら、処理した毛髪ストランドの最大靭性値は、未処理の毛髪ストランドと比較してあまり低下しなかった。６重量％のＨ２Ｏ２溶液で処理した毛髪ストランドの色および靭性値における変化は観察されなかった（表６）．
【０４３０】
【表７】
2014501760.tif 000033
【０４３１】
実施例５
より低濃度の過酢酸および尿素を用いた毛髪弱化効力
この実施例の目的は、実施例３で示されたよりも低いＰＡＡ濃度および少ない量の尿素で、同様の毛髪弱化効力が達成され得ることを実証することである。
【０４３２】
別の実験では、異なる量のＰＡＡおよび尿素を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）中に混合して、異なる濃度のＰＡＡを有する１０重量％の尿素溶液を作った。毛髪サンプルを溶液中に２０分間浸漬してから、上記のようにすすいで乾燥させた。処理を１５回繰り返した。表７は、０．１重量％のＰＡＡおよび１０重量％の尿素を含有するｐＨ８溶液を使用すると、試験条件下で、毛髪弱化効力の目標レベルを達成可能であることを示す。言い換えると、０．１重量％のＰＡＡおよび１０重量％の尿素の溶液（ｐＨ８）により、１回の適用当たり２０分間で１６回、毛髪繊維を処理すると、ＮＡＩＲ（登録商標）で５分間処理した毛髪サンプルよりも優れた毛髪弱化効力が達成され得る。
【０４３３】
【表８】
2014501760.tif 000034
【０４３４】
実施例６
羊毛除去に対する過酢酸溶液の効果
この実施例の目的は、生皮サンプルからの羊毛の除去に対するＰＡＡ溶液の効果を研究することである。
【０４３５】
ヒツジ生皮サンプルからの羊毛の除去に対するＰＡＡ溶液の効力を評価するために、以下の実験を行った。生皮ストリップ（０．５ｃｍ×３ｃｍ）を切断し、羊毛繊維を０．２ｃｍの長さに整えた。各溶液（５０μＬ）を、分離された生皮ストリップ上に適用した（長さの半分を処理し、長さの半分は未処理）。生皮ストリップサンプルを室温（約２０℃）で１０分間放置させた。過剰な液体をブロッティングにより除去し、さらなる処理のためにサンプルを３０分間プラスチック管内部に入れ、次に、５０μＬの２％のラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）溶液で洗浄し、水道水ですすぎ（過剰な液体をブロッティングにより除去した）、次にＮ２下で乾燥させた。処理された領域の羊毛繊維が全て除去されるまで処理を繰り返した。このプロトコルを用いて、ａ）ｐＨ８の５０ｍＭのリン酸緩衝液中、０．６重量％のＰＡＡ、１５重量％の尿素、および０．５重量％のＳＬＥＳと、ｂ）ｐＨ８の５０ｍＭのリン酸緩衝液中、０．６重量％のＰＡＡおよび１５重量％の尿素と、ｃ）ｐＨ８の５０ｍＭのリン酸緩衝液中、０．２重量％のＰＡＡ、１５重量％の尿素、および０．５重量％のＳＬＥＳとの３つの異なる溶液を試験した。溶液（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で処理したサンプル羊毛繊維はそれぞれ、１９回目、２３回目、２４回目の適用で完全に除去された。０．５重量％のＳＬＥＳの添加は、羊毛除去プロセスを加速するようである。
【０４３６】
実施例７
還元溶液と組み合わせて順次適用される過酢酸溶液
この実施例の目的は、毛髪サンプルをＰＡＡ溶液および還元溶液で順次処理した場合の毛髪弱化効力を実証することである。
【０４３７】
現在の毛髪除去製品は、通常、活性成分としてチオグリコール酸カリウムなどの還元剤（化学還元剤）を使用する。必要な毛髪除去効力を得るために、高ｐＨおよび高濃度のこれらの還元剤が通常必要とされる。例えば、１５重量％のチオグリコール酸カリウムおよびｐＨ１２が使用される。しかしながら、これらの条件は皮膚刺激を引き起こし得る。この例は、どのようにして、過酢酸（ＰＡＡ）溶液および還元溶液を順次用いることにより、有効な毛髪除去に必要とされる活性成分のｐＨおよび濃度を低くできるかを示す。この実験では、異なる量のＰＡＡおよび尿素を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に添加して、異なる濃度のＰＡＡを有する１０重量％の尿素溶液を作った。５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に５重量％のチオグリコール酸カリウム、１０重量％の尿素を含む還元溶液を調製した。毛髪サンプルをＰＡＡ溶液に２０分間浸漬してから、上記のようにすすいで乾燥させた。次に、毛髪サンプルを上記の還元溶液中に２０分間浸漬してから、すすいで乾燥させた。ＰＡＡ溶液および還元溶液の両方による処理全体を１５回繰り返した。表８において、ＰＡＡ溶液で処理しなかったサンプル１は毛髪弱化効力の目標レベルを達成しなかった。０．０５重量％のＰＡＡ溶液を前記還元溶液と組み合わせると、処理は毛髪弱化効力を著しく改善する。表８を表７と比較すると、ＰＡＡ溶液と穏やかな還元溶液との組み合わせは、ＰＡＡ溶液を単独で使用した場合よりも優れた毛髪弱化効力を示した。
【０４３８】
【表９】
2014501760.tif 000035
【０４３９】
実施例８
毛髪標的化ペルヒドロラーゼ融合物の構築
以下の実施例は、毛髪結合配列により毛髪に標的化されたペルヒドロラーゼの産生のための発現系の設計を記載する。
【０４４０】
毛髪結合ドメイン（配列番号２９０および配列番号２９１）に対する過加水分解活性を有する酵素（「ペルヒドロラーゼ」）の融合物をコードする遺伝子（配列番号２８６および配列番号２８７）は、可動性リンカー（それ自体はさらに、毛髪結合ドメインＨＣ２６３またはＨＣ１０１０（それぞれ、配列番号２９０および配列番号２９１）に融合される）をコードするヌクレオチド配列に対して３’端部で融合したサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ変異体（配列番号２９３）のポリヌクレオチド配列を有するように設計した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために遺伝子をコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により合成した。ＮｄｅＩおよびＡｓｃＩ制限部位間で発現ベクターｐＬＤ００１（配列番号２９２）において遺伝子をＴ７プロモーターの後ろでクローン化し、それぞれプラスミドｐＬＲ１０２１およびｐＬＲ１０２２を生じた。融合タンパク質を発現するために、プラスミドをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に移し、株ＬＲ３３１１（ＨＣ２６３に対するペルヒドロラーゼ融合物、配列番号２８８）およびＬＲ３３１２（ＨＣ１０１０に対するペルヒドロラーゼ融合物、配列番号２８９）を生じた。
【０４４１】
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの非標的化Ｃ２７７Ｓ変異体を同様にクローン化した。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異体の調製および組換え発現は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書においてＤｉＣｏｓｉｍｏらにより既に報告されている。
【０４４２】
実施例９
融合タンパク質の産生
以下の実施例は、毛髪結合ドメインにより毛髪に標的化されたペルヒドロラーゼの発現および精製を記載する。
【０４４３】
株ＬＲ３３１１および株ＬＲ３３１２は、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する１リットルの自己誘導培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７５％のグリセロール、０．０７５％のグルコースおよび０．０５％のアラビノース）において、２００ｒｐｍの攪拌下、３７℃で２０時間増殖させた。非標的化ペルヒドロラーゼの産生は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）において既に報告されている。
【０４４４】
細胞を４℃で８０００ｒｐｍの遠心分離によって収集し、組織ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒモデルＰＣＵ１１、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を３５００ｒｐｍで用いた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、４℃）を用いて、３００ｍＬの氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に細胞ペレットを再懸濁させることにより洗浄した。組織ホモジナイザーを用いて７５ｍｇのニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を含有する冷却した溶解緩衝液中に再懸濁させることによって細胞を溶解させた。細胞懸濁液を３時間氷の上に置き、組織ホモジナイザーにより定期的に均質化ながら、リゾチームによる細胞壁の消化を可能にした。この段階では、抽出物の発泡を回避するように気を付けた。抽出物を分割して（５００ｍＬのボトル当たり１５０ｍＬ）、−２０℃で凍結させた。凍結細胞抽出物を室温（約２２℃）で解凍し、組織ホモジナイザーで均質化し、５ｍｍのプローブを備えたソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ、Ｓｏｎｉｆｉｅｒモデル４５０）を２０％の最大出力、２パルス／秒で１分間用いて超音波処理により破壊した。溶解細胞抽出物を４×５０ｍＬの円錐ポリプロピレン遠心管に移してから、４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞片および破壊されていない細胞を含有するペレットを凍結した。ライセートのアリコートを１５ｍＬの円錐ポリプロピレン管（１２×５ｍＬ）に移し、８０℃で１５分間加熱し、氷上で冷却し、４×５０ｍＬの円錐ポリプロピレン遠心管内に注いだ。熱安定性酵素および沈殿したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を含有する可溶性画分を、４℃における１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により分離した。超音波処理ステップの後に細胞破壊が不完全であれば、凍結ペレットを再度解凍し、超音波処理、遠心分離および加熱処理の第２ラウンドを受けさせた。この精製プロトコルの出力は、通常、２〜４ｍｇ／ｍＬのタンパク質を生じ、融合ペルヒドロラーゼの純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析で評価される場合に、９０％〜７５％のタンパク質であった。ウシ血清アルブミンの溶液を標準として使用するビシンコニン酸（ＢＣＡ）検定（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって、全タンパク質を定量化した。
【０４４５】
実施例１０
酵素ヒドロラーゼ活性の定量化
以下の実施例には、非特異的エステラーゼ基質を用いてそのヒドロラーゼ活性によりペルヒドロラーゼを検出および定量化するための方法が記載される。
【０４４６】
ペルヒドロラーゼ融合物のヒドロラーゼ活性は、ｐＮＰＡ（ｐ−ニトロフェニルアセチルエステル）を用いて決定した。通常、酵素をヒドロラーゼ検定緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．２）中、１〜０．０１μｇ／ｍＬ濃度まで希釈した。２５℃または３０℃でｐＮＰＡを３ｍＭの最終濃度（３０μＬ／ｍＬの１００ｍＭのｐＮＰＡ（アセトニトリル中に溶解））まで添加することにより、反応を開始させた。選択された時間に、４００ｎｍにおける吸収を記録した。ｐＮＰＡの非酵素的加水分解のバックグラウンドレベルのために、分析には非酵素対照を含ませた。活性は、Δ４００／分（サンプル）−Δ４００／分（非酵素対照）として測定し、加水分解されたｐＮＰＡのμｍｏｌ／タンパク質のｍｇ×分（ｐＮＰＡのモル吸収：１０９０９Ｍ−１）に変換した。融合タンパク質の比活性は、通常、１０〜３０μｍｏｌ／ｍｇ×分であった。
【０４４７】
実施例１１
毛髪標的化ペルヒドロラーゼ融合物の毛髪への結合
以下の実施例は、毛髪結合配列のペルヒドロラーゼ（ＰＡＨ）への融合に依存する形で、ペルヒドロラーゼの毛髪への結合を記載する。
【０４４８】
毛髪結合実験のために、茶色の毛髪房（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｌｅｎｓｄａｌｅ  ＮＹ）を使用した。毛髪を２％のＳＬＥＳで洗浄し、脱イオン水で徹底的にすすぎ、風乾した。
【０４４９】
約２０ｍｇの１ｃｍの茶色の毛髪断片を１．８ｍＬの微量遠心管中に添加した。ヒドロラーゼ検定緩衝液（１．２ｍＬ）を毛髪に添加した後、ペルヒドロラーゼ酵素を溶液に添加した。Ａｄａｍｓ  Ｎｕｔａｔｏｒ（モデル１１０５、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において、穏やかに攪拌（２４ｒｐｍ）しながら３０分間、酵素を毛髪に結合させた。ｐＮＰＡヒドロラーゼ試薬の非酵素的加水分解を説明するために、無酵素の対照（毛髪を含むものと含まないもの）を結合実験に含ませた。結合ステップの後、結合緩衝液の１．０ｍＬのアリコートを新しい管に移し、非結合酵素の量を定量化した。付加的な結合緩衝液を除去し、毛髪断片を１ｍＬのヒドロラーゼ緩衝液中の１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で４回洗浄した後、１ｍＬ（それぞれ）のヒドロラーゼ緩衝液中で２回洗浄した。次に、毛髪断片を１ｍＬのヒドロラーゼ検定緩衝液中に再懸濁させ、毛髪に結合したままのヒドロラーゼ活性を測定した。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ（「ＰＡＨ」）変異体（配列番号２９３）は、非標的化ペルヒドロラーゼのための対照として使用した。結果は表９で提供される。
【０４５０】
【表１０】
2014501760.tif 000036
【０４５１】
表９のデータは、１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０中での徹底的な洗浄の後に、毛髪標的化ペルヒドロラーゼ融合物は毛髪上に保持されていたが、非標的化ペルヒドロラーゼは保持されなかったことを実証する。
【０４５２】
実施例１２
毛髪における融合ペルヒドロラーゼの結合特異性
以下の実施例は、毛髪結合配列に依存する形で、皮膚よりも主に毛髪における毛髪標的化ペルヒドロラーゼの結合を記載する。
【０４５３】
皮膚よりも毛髪に対してある程度の結合特異性を提供するペルヒドロラーゼの毛髪への標的化を査定するために、一般的なエステラーゼ組織学的染色キット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：９１Ａ−１  ＫＴ）を用いて、ペルヒドロラーゼのヒドロラーゼ活性の視覚的検出を実施した。このキットは、加水分解されると不溶性の茶色い沈殿物を形成する生成物をもたらす無色の基質を提供し、従って、ヒドロラーゼ活性の存在の視覚的評価を可能にする。
【０４５４】
毛髪および皮膚細胞を、以下のように、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ  Ｄ−１００粘着テープストリップ（ＣｕＤｅｒｍ  Ｃｏｒｐ  Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）に付着させた。数本の天然の白い毛髪ストランド（０．５ｃｍ〜１ｃｍ長さ）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｌｅｎｓｄａｌｅ  ＮＹ）をテープストリップの粘着面に置き、ストリップを予め剃った腕の内側の皮膚に対して１０秒間押し付けた。ペルヒドロラーゼの近くの茶色の染料の付着の視覚化を最大限にするように白い毛髪を選択した。ストリップは除去したらすぐに、皮膚細胞および白髪で被覆した。毛髪および皮膚細胞を有する各ストリップを、低速で（＜４０ｒｐｍ）穏やかに攪拌しながら、％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含有する２ｍＬのヒドロラーゼ検定緩衝液中で洗浄し、６マルチウェル細胞培養ポリスチレンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウェル内で毛髪／皮膚細胞を１〜２分間洗浄した。緩衝液を除去し、２ｍＬの５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）（ヒドロラーゼ検定緩衝液）と、１０μＬのＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（１．４μｇ／ｍＬ）、７．０μＬのＣ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０（２．０μｇ／ｍＬ）または１．７μＬの非標的化酵素とで置き換えた。穏やかに攪拌しながら室温（約２２℃）で３０分間、結合を可能にし、その後、それぞれの酵素溶液を除去し、１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含有するヒドロラーゼ検定緩衝液に交換した。この洗浄ステップを３回繰り返した後、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含まないヒドロラーゼ検定緩衝液中で２回洗浄した。次に、各テープストリップを新しいウェルに移した。１ミリリットルのα−ナフチルアセテート試薬（製造者により記載されるように新しく調製）を添加し、１５分間発色させた。染色されたテープストリップをヒドロラーゼ検定緩衝液で３回洗浄した。毛髪および皮膚細胞の染色の視覚的な観察は表１０に記録される。
【０４５５】
【表１１】
2014501760.tif 000037
【０４５６】
この実験は、標的化ペルヒドロラーゼ融合物について、皮膚ではなく毛髪におけるペルヒドロラーゼの保持を実証する。
【０４５７】
実施例１３
１段階適用において過加水分解酵素用いる毛髪弱化効力
この実施例の目的は、１段階適用において酵素的に生成される場合のＰＡＡの毛髪弱化効力を示すことである。
【０４５８】
少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ酵素を含むその場での酵素的な過酢酸発生系を用いて、毛髪除去／毛髪弱化のための２つの方法を開発した。
【０４５９】
第１の方法（本明細書では、「１段階アプローチ」と呼ばれる）は、異なる量の少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼを、トリアセチン（適切なエステル基質の一例）および過酸化水素と混ぜ合わせて、過酢酸を発生させることを含む。酵素溶液をトリアセチン溶液（最終濃度は約１００ｍＭであった）およびＨ２Ｏ２溶液（最終濃度は約２５０ｍＭ）と混合したら直ちに、毛髪束を「１段階アプローチ」溶液に１５分間挿入した。毛髪サンプルを水ですすいで乾燥させた。この方法をさらに１５回繰り返した（適用は全部で１６回であった）。１つの実験では、２つのペルヒドロラーゼ酵素、すなわち、非標的化Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｓ（「Ｃ２７７Ｓ」、ＰＡＨ」、配列番号２９３）および「Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３」（配列番号２８８）を使用した。１５分後の溶液中の過酢酸の濃度をＨＰＬＣにより評価した。結果は表１１で提供される。
【０４６０】
【表１２】
2014501760.tif 000038
【０４６１】
表１１において、酵素により発生されるＰＡＡの量は溶液中の酵素の量と共に増大したが、酵素濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬに達した後は横ばいになった。融合タンパク質Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３の調製物は、試験条件下および同じ重量基準で、Ｃ２７７Ｓよりも約２〜３倍低いペルヒドロラーゼ活性を示した。０．０５ｍｇ／ｍＬのＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３は、約０．２重量％のＰＡＡを発生させることができ、他のすべての条件は、より多くのＰＡＡを発生させた。表１１は、各処理の後の毛髪ストランドの引張強さも示す。０．２５ｍｇ／ｍＬの酵素を含有する溶液で処理した毛髪サンプルは最低の引張強さを示し、適用中に破壊しなかったのは、７本の毛髪ストランドのうちの２本だけであった。他のサンプルでは、少なくとも５本のストランドが引張強さ試験に対して残された。ペルヒドロラーゼの非標的化バージョン（Ｃ２７７Ｓ）は、より多くのＰＡＡを発生したので、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（標的化融合構築物）よりも優れた効力を示した。尿素または０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＡＨおよび１０％の尿素を用いることなく０．２５ｍｇ／ｍＬのＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３を使用すると、１０分間のＮＡＩＲ（登録商標）処理よりも優れた効力が達成され得る。
【０４６２】
実施例１４
２段階適用において過加水分解酵素を用いる毛髪弱化効力
この実施例の目的は、２段階適用においてペルヒドロラーゼ系の毛髪弱化効力を決定することである。
【０４６３】
２段階適用では、毛髪ストランドはまずペルヒドロラーゼ溶液で処理され、酵素が毛髪に結合できるようにする。次に、毛髪ストランドは乾燥されるか、あるいは緩衝液ですすがれて乾燥される。すすぎステップは、過剰の非結合酵素を毛髪から除去することが意図される。毛髪ストランドはトリアセチンおよびＨ２Ｏ２溶液中に浸漬される。適用は複数回繰り返される。
【０４６４】
１つの実験は、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３および非標的化Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｓにより、以下のプロトコルを用いて実行した：
１．  ５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）中に０．５ｍｇ／ｍＬ酵素を含む酵素溶液を、１０重量％の尿素と共に、または１０重量％の尿素を用いずに作った。
２．  七（７）本の毛髪ストランドを０．２ｍＬの酵素溶液中に１０分間浸漬してから、前もってすすぐことなく、Ｎ２下で乾燥させた。
３．  次に、毛髪ストランドを、１００ｍＭのトリアセチンおよび２５０ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する０．２ｍＬのｐＨ８溶液中に１５分間浸漬し、乾燥さてから、ＤＩ水ですすぎ、その後再度乾燥させた。
４．  ステップ２〜３を最高１５回繰り返した。
【０４６５】
引張強さ結果は表１２に示される。すすぎステップがない場合、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３および非標的化Ｃ２７７Ｓはいずれも十分に毛髪上に保持され、毛髪弱化の目標レベルを達成した。１０重量％の尿素を添加すると、非標的化Ｃ２７７Ｓ溶液が毛髪をより速く漂白する能力が高められるようであったが、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３系の毛髪弱化効力は低下した。
【０４６６】
【表１３】
2014501760.tif 000039
【０４６７】
別の実験は、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（配列番号２８８）、ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３（配列番号２９４）、ＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０（配列番号２９５）および非標的化Ｃ２７７Ｓにより、以下のプロトコルを用いて実行した：
１．  ５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６）中に１．０ｍｇ／ｍＬの酵素を含む酵素溶液を調製した。２つの酵素を含有する溶液については、各酵素の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬであった。
２．  七（７）本の毛髪ストランドを０．２ｍＬの酵素溶液中に１０分間浸漬し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６）ですすいでから、Ｎ２下で乾燥させた。
３．  次に、乾燥した毛髪ストランドを、１００ｍＭのトリアセチンおよび２５０ｍＭのＨ２Ｏ２を含む０．２ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ８）中に１５分間浸漬し、乾燥してから、ＤＩ水ですすぎ、その後再度乾燥させた。
４．  いくつかのサンプルが明白なモルホロジー変化を示したので、ステップ２〜３を最高１３回繰り返した。
【０４６８】
引張強さ結果は表１３で提供される。
【０４６９】
【表１４】
2014501760.tif 000040
【０４７０】
ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３（配列番号２９４）を単独で含むペルヒドロラーゼ溶液は、最良の毛髪弱化効力を示した。ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３（配列番号２９４）および非標的化Ｃ２７７Ｓ（配列番号２９３）の両方を含有するペルヒドロラーゼ溶液は、２番目に優れた性能を有した。ＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０を含有するペルヒドロラーゼ溶液は、毛髪弱化の目標レベルも達成した。しかしながら、非標的化Ｃ２７７Ｓ、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３またはＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３：Ｃ２７７Ｓ（１：１の質量比）を用いる溶液は、有意な毛髪弱化効果を示さなかった。ペルヒドロラーゼ活性におけるＨＰＬＣ分析は、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３のこの調製物は、他の３つのペルヒドロラーゼ酵素よりも著しく低い過加水分解活性を有することを示した。従って、Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３のより低い毛髪弱化効力が、より低いペルヒドロラーゼ活性またはすすぎステップによるＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３の損失のいずれに起因するものであるかを見分けるのは困難であった。非標的化Ｃ２７７Ｓ酵素は、ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３およびＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０（配列番号２９５）と比較して、類似のペルヒドロラーゼ活性を有する。従って、毛髪弱化効力の違いは、恐らく、ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３およびＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０が、緩衝液すすぎステップの後に非標的化Ｃ２７７Ｓよりも多く毛髪上に保持されるという事実によるものである。この実験は、標的化ペルヒドロラーゼが、適切なすすぎの課題を有する２段階アプローチを用いて、非標的化ペルヒドロラーゼよりも優れた毛髪弱化効力を達成できることを実証した。
【０４７１】
実施例１５
過加水分解活性に対するいくつかの添加剤の影響
この実施例の目的は、いくつかのペルヒドロラーゼ系のペルヒドロラーゼ活性に対する添加剤の影響を評価することである。
【０４７２】
７５〜４００ｐｐｍの検出範囲を有する過酢酸インジケーターストリップを用いて、ペルヒドロラーゼのペルヒドロラーゼ活性に対する添加剤の影響を研究した。ＰＡＡ濃度が少なくとも０．２重量％である場合、インジケーターストリップ上に発生する暗色は、時間が経つと元の白色に戻るであろう。
【０４７３】
第１の溶液（「溶液Ａ」）は、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）および１０重量％の以下の添加剤のうちの１つを用いて調製した：それぞれ、グリセリン、エタノール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール。
【０４７４】
第２の溶液（「溶液Ｂ」）は、３０％のＨ２Ｏ２および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）を混合することにより調製し、ここで、Ｈ２Ｏ２の最終濃度は５００ｍＭであった。
【０４７５】
ＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０（配列番号２９５）（０．２ｍｇ／ｍＬ）、トリアセチン（２００ｍＭ）、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）、および溶液Ａ（５重量％の添加剤）で構成される第３の溶液（「溶液Ｃ」）を調製した。直ちに、溶液Ｂを１：１の体積比で添加した。１〜５分後に、得られた溶液の３０μＬのサンプルを除去し、直ちにＰＡＡインジケーターストリップ上に置いた。
【０４７６】
上記に挙げられた添加剤のそれぞれについてこのプロセスを繰り返した。試験条件下で、上記の添加剤はどれも、２０００ｐｐｍ未満のＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０（配列番号２９５）のペルヒドロラーゼ活性をあまり低下させなかった。
【０４７７】
実施例１６
ペルヒドロラーゼ酵素の過加水分解活性に対する市販の保湿剤ローションの適合性
この実施例の目的は、ペルヒドロラーゼ酵素と市販の保湿剤ローションとの適合性を評価することである。
【０４７８】
ローション「Ａ」は、オーバーヘッドミキサーを用いて２００ｒｐｍで約３分間、２ｍＬの微細遠心管中で０．７６６７ｇのＳＵＡＶＥ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒ（Ｌｏｔ＃  １２１４８ＪＵ４１、Ｕｎｉｌｅｖｅｒ，ＣＴ）を、４０μＬのペルヒドロラーゼ融合物Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合することにより調製した。Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（配列番号２８８）の濃度は、ローションＡ中、約０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【０４７９】
ＳＵＡＶＥ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒは、以下の原料を含む市販のスキンケアローションである：Ｈ２Ｏ、グリセリン、ステアリン酸、ステアリン酸グリコール、パルミチン酸レチニル、酢酸トコフェニル、ステアリン酸グリセリル、セチルアルコール、ペトロラタム、香料、ジメチコン、マグネシウムアルミニウムシリケート、パルミチン酸イソプロピル、トリエタノールアミン、カルボマー、ＤＭＤＭヒダントイン、メチルパラベン、ヨードプロピニルブチルカルバメート、および二酸化チタン。
【０４８０】
２つの対照サンプル、すなわち、Ａ−対照およびＡ−対照２は、ペルヒドロラーゼ（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）を同じ体積のＤＩ水および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）でそれぞれ置き換えることによって調製した。
【０４８１】
４４μＬのトリアセチン、８９９μＬの５０ｍＭのｐＨ８のリン酸緩衝液、および５７μＬのＨ２Ｏ２（３０重量％）を混ぜ合わせることによって、溶液「Ｂ」を作った。溶液Ｂは、ＰＡＡインジケーターストリップ試験を行う直前に毎回新しく作った。
【０４８２】
所定時間の後、５０μＬのローション「Ａ」および５０μＬの溶液「Ｂ」を穏やかに約１分間混合した。ＰＡＡインジケーターストリップを使用して、実施例１０に記載されるように、混合物中のＰＡＡの存在について試験した。結果は、ペルヒドロラーゼＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（配列番号２８８）が、ＳＵＡＶＥ（登録商標）保湿剤中、室温（約２１℃）で少なくとも３０日間、特定のペルヒドロラーゼ活性を保持したことを示す。
【０４８３】
実施例１７
トリアセチンおよび過酸化水素の混合物の毛髪弱化効力
この実施例の目的は、多数回適用を用いて毛髪に適用されたトリアセチンおよび過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の濃縮混合物を用いて、毛髪弱化効力を示すことである。
【０４８４】
この実験では、毛髪ストランドはまず５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）で１０分間処理され、次に、Ｎ２下で乾燥される。次に、毛髪ストランドを、２０重量％の尿素と共に、あるいは尿素を用いずに、９００ｍＭのトリアセチンおよび５００ｍＭのＨ２Ｏ２を含む溶液中に１５分間浸漬した。毛髪ストランドを窒素パージにより乾燥させ、脱イオン水ですすぎ、再度Ｎ２で乾燥させた。適用をさらに１５回繰り返した。結果は表１４で提供される。
【０４８５】
【表１５】
2014501760.tif 000041
【０４８６】
表１４は、実施例１３〜１５で使用される条件よりも比較的高い濃度のトリアセチンおよびＨ２Ｏ２を用いることにより、標的化された毛髪弱化効力が達成され得る。適用において２０％の尿素を使用すると、毛髪弱化効果が促進されるようであることを示す。
【０４８７】
実施例１８（予測的）
皮膚標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの構築および産生
皮膚に対する親和性を有する標的化ペルヒドロラーゼは、皮膚のための過酸有益剤を生成するように調製することができる。皮膚に対する親和性を有するペプチドの例は、配列番号２１７〜２６９のアミノ酸配列によって提供される。付加的な皮膚結合ペプチドは、ファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイを用いて同定され得る。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６４のアミノ酸配列によって提供される。
【０４８８】
簡単に言うと、少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼを有する第１の部分と、皮膚に対する親和性を有する第２の部分とを含む融合タンパク質は、皮膚に対する親和性を有するペプチドを代用することにより、あるいは皮膚に対する親和性を有する実験的に生成されたペプチドを用いることによって、実施例８〜１１に記載される毛髪標的化融合ペプチドを作るために使用されるものと同様の方法を用いて構築し、産生し、そして検定することができる。融合ペプチドは、実施例８に記載される一般的な方法を用いて構築することができる。融合タンパク質の産生は、実施例９に記載される一般的な方法に従うことができる。実施例１０は活性な融合タンパク質の量を定量化するために使用され、実施例１１の方法は、表面特異性について試験するために使用され得る。
【０４８９】
皮膚標的化ペルヒドロラーゼは、スキンケアのための過酸有益剤を生成するためにスキ
ンケア製品において使用することができる。適用方法は、本出願において記載される１段階または２段階適用方法に従うことができる。
【０４９０】
実施例１９（予測的）
爪標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの構築および産生
爪（例えば、ヒトの指の爪、足指の爪）に対する親和性を有する標的化ペルヒドロラーゼは、爪のための過酸有益剤を生成するために調製することができる。爪に対する親和性を有するペプチドの例は、配列番号２７０〜２７１のアミノ酸配列によって提供される。付加的な爪結合ペプチドは、ファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイを用いて同定され得る。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６４のアミノ酸配列によって提供される。
【０４９１】
簡単に言うと、少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼを有する第１の部分と、爪に対する親和性を有する第２の部分とを含む融合タンパク質は、爪に対する親和性を有するペプチドを代用することにより、あるいは爪に対する親和性を有する実験的に生成されたペプチドを用いることによって、実施例８〜１１に記載される毛髪標的化融合ペプチドを作るために使用されるものと同様の方法を用いて構築し、産生し、そして検定することができる。融合ペプチドは、実施例８に記載される一般的な方法を用いて構築することができる。融合タンパク質の産生は、実施例９に記載される一般的な方法に従うことができる。実施例１０は活性な融合タンパク質の量を定量化するために使用され、実施例１１の方法は、表面特異性について試験するために使用され得る。
【０４９２】
爪標的化ペルヒドロラーゼは、ネイルケアのための過酸有益剤を生成するためにネイルケア製品において使用することができる。適用方法は、本出願において記載される１段階または２段階適用方法に従うことができる。
【０４９３】
実施例２０
界面活性剤の存在下で毛髪に対する毛髪標的化ペルヒドロラーゼの結合
以下の実施例は、界面活性剤の存在下で、毛髪における毛髪標的化ペルヒドロラーゼの付着を実証する。
【０４９４】
５％の試験界面活性剤を含有する５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中に、毛髪結合ペプチドＨＣ２６３（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８、本明細書では、「ＨＣ１１２１」とも呼ばれる）により毛髪に標的化された５０μｇ／ｍＬのサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを含有する２ｍＬの結合溶液中に、１０ｍｇのヒト毛髪を浸漬した。試験界面活性剤は、２つの非イオン性界面活性剤：ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ，ＳＴ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、およびＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ１００（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と、２つのイオン性界面活性剤：ＣＨＥＭＢＥＴＡＩＮＥ（商標）ＣＡＤ（コカミドプロピルベタイン、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ，Ｗｉｃｋｌｉｆｆｅ，ＯＨ）およびＲＨＯＤＡＰＥＸ（登録商標）ＥＳ−２Ｋ（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、Ｒｈｏｄｉａ  Ｎｏｖｅｃａｒｅ，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）とであった。
【０４９５】
結合溶液中で穏やかに攪拌しながら室温（約２２℃）で３０分間、毛髪をインキュベートし、この時点で、溶液を吸引により除去し、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で毛髪をすすいだ。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥（ｂｌｏｔｔｅｄ  ｄｒｙ）し、新しい管のセットに移した。毛髪を５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で１回すすいいでから、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で３回すすいだ。毛髪に結合されたままであるペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により決定した。
【０４９６】
ＡＢＴＳ検定は、以下のように実施した。上記のように処理した毛髪サンプルを新しい２ｍＬの微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）に移した。各管に、４８０μＬのＰＡＨ緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．２）、１４μＬの３９％の過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  ３４１０）、および６μＬのトリアセチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｗ２００７００）を添加した。ペルヒドロラーゼ反応を室温（約２２〜２５℃）で１０分間進行させた。１０ｍＭのリン酸でアリコートを１０×、１００×および１０００×に希釈することによって反応を停止させた。検出のために、５０μＬの１Ｍの酢酸、５０μＬの４０ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム、および５０μＬの４ｍＭのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、５０μＬの上記の希釈物に添加した。１０分間発色させ、分光光度計において４０５ｎｍで読み取った。無酵素対照からの値を差し引いて、酵素活性のみに起因する値を得た。ＯＤ４０５ｎｍ対ＰＡＡ濃度（ｐｐｍ）の標準曲線により８．７５の変換係数が得られたので、１．０のＯＤ４０５ｎｍは約８．７５ｐｐｍのＰＡＡに相当する。次に、この値に適切な希釈を乗じて、ペルヒドロラーゼ反応におけるＰＡＡ濃度に到達する。
【０４９７】
界面活性剤の存在下で毛髪における標的化ペルヒドロラーゼの付着の結果は表１５に与えられる。非イオン性界面活性剤に対して得られた値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０については２．４３であり、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ１００については１．７６であった。イオン性界面活性剤の値は、ＣＨＥＭＢＥＴＡＩＮＥ（商標）ＣＡＤについては０．５２であり、ＲＨＯＤＡＰＥＸ（登録商標）ＥＳ−２Ｋについては０．３６であった。結果は、非イオン性界面活性剤の存在下で結合した酵素の活性のほうが実質的により高いことを示した。
【０４９８】
【表１６】
2014501760.tif 000042
【０４９９】
この実施例は、毛髪標的化ペルヒドロラーゼが界面活性剤の存在下で付着することができ、付着は特に非イオン性界面活性剤の存在下で有効であることを実証する。
【０５００】
実施例２１
ｐＨの関数としての付着の最適化
以下の実施例は、標的化ペルヒドロラーゼを含む製剤のｐＨが、その毛髪への付着を最適化するために使用可能であることを実証する。
【０５０１】
毛髪結合ペプチドＨＣ２６３（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）により毛髪に標的化されたサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを、ｐＨ４．９、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、またはｐＨ７．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪を２ｍＬの上記製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で５分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルを各ｐＨでインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の２ｍＬの１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で毛髪を洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥し、新しい管のセットに移した。毛髪を、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で１回すすいでから、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で３回すすいだ。毛髪に結合したままであるペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により決定した。結果は、１０分間で生成されたｐｐｍＰＡＡで与えられる（無酵素対照値を差し引いた後）。結果は表１６に報告され、試験した値の範囲内で、ｐＨ５．５が最良の結合条件を提供することが示される。
【０５０２】
【表１７】
2014501760.tif 000043
【０５０３】
結果に基づいて、製剤のｐＨを用いて、毛髪標的化サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）ペルヒドロラーゼの量、より一般的には、他の毛髪標的化ペルヒドロラーゼの量を調節することができる。
【０５０４】
実施例２２
界面活性剤溶液からの毛髪の急速結合
以下の実施例は、毛髪標的化ペルヒドロラーゼの付着が急速であり、スキンケアレジメンと適合性であり得ることを実証する。
【０５０５】
毛髪結合ペプチドＨＣ２６３（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）により毛髪に標的化されたサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪を２ｍＬの上記製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温（約２２℃）で３０秒、１分間、２分間および５分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルもインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、毛髪を２ｍＬの５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥し、新しい管のセットに移した。毛髪を５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液でもう１回すすいだ。毛髪に結合したままであるペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により決定した。結果は、１０分におけるＯＤ４０５ｎｍで与えられる（無酵素対照値を差し引いた後）。表１７に提示される結果は、その後の結合が、毛髪と酵素との接触の３０秒以内に起こったことを示す。
【０５０６】
【表１８】
2014501760.tif 000044
【０５０７】
この実施例は、標的化酵素の有意な付着が３０秒という短い結合時間で生じることを実証する。
【０５０８】
実施例２３
毛髪房の引張強さ試験手順
以下の実施例は、引張強さ測定を用いて脱毛製品による毛髪の弱化を査定するための定量試験を実証する。
【０５０９】
ＡＳＴＭ  Ｄ  ３８２２−０１（「Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｆｉｂｅｒｓ」，ＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｅｓｔ  Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎ，ＰＡ，２００１）に従う繊維試験プロトコルは、単一の繊維の引張強さを決定するためのより正確な方法である。本発明のシステムで使用するためのこの試験プロトコルの欠点は、温度および湿度条件の調節の厳密さ、ならびに最終的に最終結果に達するために必要とされる時間の長さである。さらなる欠点は、意味のあるデータを得るために試験されるべき反復サンプルの数である。処理の後にサンプルを迅速に比較するために、平均効果のために多数の毛髪繊維を含有するサンプルを使用した。さらに、１００％の湿度条件をシミュレートするために、サンプルを湿った状態で試験した。４ｃｍ長さの約３０〜７０ｍｇの毛髪の毛髪束からなるサンプルを、厚さ１ｍｍ、幅２ｍｍおよび長さ５ｍｍの接着剤ストリップで結合させた。速乾性の接着剤（例えば、ＤＵＣＯ（登録商標）ＣＥＭＥＮＴ（登録商標）、ニトロセルロース家庭用接合剤）を用いてこの束の５ｍｍの自由端部をさらに接着した。接着剤を乾燥させた後、緩んだ毛髪ストランドはどれも切り落とし、サンプルを秤量した。
【０５１０】
引張試験のために、１００ポンド（約４５．４ｋｇ）のロードセルが取り付けられたＣＯＭ−ＴＥＮ（登録商標）Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｔｅｓｔｅｒ  ９５−ＶＤ（Ｃｏｍ−Ｔｅｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｐｉｎｅｌｌａｓ  Ｐａｒｋ，ＦＬ）を使用した。サンプルの滑りを低減するために、工業グレードのＶＥＬＣＲＯ（登録商標）（Ｖｅｌｃｒｏ  ＵＳＡ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）の幅５ｍｍのストリップをクランプのエッジの内側に取り付けた。試験の前に、ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮを「オフ」に設定し、ＦＯＲＣＥ  ＵＮＩＴＳを「グラム」に設定し、クランプ間の距離を３ｃｍに調整した。試験サンプルを水中に３０秒間浸漬した。ペーパータオルで優しく吸収することにより過剰な水分を除去し、１００％の湿度レベルであるとみなすために毛髪に十分な水分を残した。ＶＥＬＣＲＯ（登録商標）ストリップが毛髪を接着剤の真下に保持するような形で、試験サンプルの接着した端部を上部および下部クランプの両方で固定した。コントロールノブの速度を調整することにより試験速度を約２．５インチに設定した。ＲＵＮモードのＦｏｒｃｅメーターを用いて、開始ＰＥＡＫ  ＦＯＲＣＥを０に設定するためにＴＡＲＥをＺＥＲＯに設定した。試験を開始するために、ＤＩＲＥＣＴＩＯＮトグルスイッチをＵＰ位置に押した。試験の最後には、サンプルが失敗したときに、ＤＩＲＥＣＴＩＯＮスイッチをＳＴＯＰに動かし、ピーク力を記録した。下側および上側クランプの両方で毛髪をクランプのエッジに沿って切り落とした。クランプを開き、切れ端（ｓｔｕｂ）を除去し、空気中で乾燥させ、秤量した。元のサンプル重量と、切れ端の合わせた重量との差異が、引張伸びを受けている毛髪の重量であり、この量を用いて引張強さを計算した。
【０５１１】
引張強さの計算
処理後のサンプルを比較するために、引張強さを以下のように定義した：
引張強さ（Ｎ／ｍｇ毛髪）＝ピーク力（ニュートン）／（初期サンプル重量−切れ端の重量）
【０５１２】
引張検定のベンチマーキング
この実施例の目的は、市販の脱毛製品を用いて、毛髪弱化効力の目標レベルを規定することである。
【０５１３】
検定のベンチマーキングは、ココアバターを有する市販の脱毛製品のＮＡＩＲ（登録商標）ローション（Ｃｈｕｒｃｈ  ＆  Ｄｗｉｇｈｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）による処理の後、毛髪房の引張強さ（毛髪の弱化）を測定することによって達成した。ＮＡＩＲ（登録商標）製品の使用説明書に基づいて、推奨される処理時間は５〜１０分間である。従って、ＮＡＩＲ（登録商標）で５分〜１０分間処理された毛髪サンプルの引張強さを用いて、目標レベルを決定した。長さ４ｃｍの約５０ｍｇの毛髪の毛髪束からなる試験毛髪サンプルを、厚さ１ｍｍ、幅２ｍｍおよび長さ５ｍｍの接着剤ストリップで結合させた。試験サンプルをガラスプレート上に置いた。手袋をはめた指で、約１ｍＬのＮＡＩＲ（登録商標）ローションを房に適用した。ローションを房の上に優しく延ばし、押し付けて、毛髪繊維全体を被覆した。室温で所望の処理時間の後、房を水道水で十分にすすいで、ローションの痕跡をすべて除去した。サンプルを風乾し、その引張強さを試験した。
【０５１４】
これらの処理時間に対して、房（湿った房、１００％の湿度）の引張強さは、１０分では約０．２Ｎ／ｍｇ毛髪までの間であり、５分では０．７〜１．４Ｎ／ｍｇ毛髪の間であることが分かった。データは表１８で提供される。引張強さの変動を考えると、所望の毛髪弱化効力のレベルは、同様の試験条件下で１．０Ｎ／ｍｇＨ〜１．６Ｎ／ｍｇＨの範囲を標的とされた。
【０５１５】
【表１９】
2014501760.tif 000045
【０５１６】
実施例２４
ローションからの基質の送達の計算−基質製剤を製造するための一般的な処方
以下の実施例は、保湿溶液から、ペルヒドロラーゼのための基質、トリアセチンおよびＨ２Ｏ２を送達するための原型的な調製を実証する。
【０５１７】
ほとんどの実施例について、基質は保湿製剤から送達した。製剤の正確な割合は各サンプルに対して別々に指定される。一般的な例として、１０ｍＬの最終製剤が、２０％のローション中ｍ０．７５モル濃度（Ｍ）過酸化水素および１．０Ｍのトリアセチンを必要とする場合、以下の処方が使用され得る。
（ａ）５ｍＬの１．５ＭのＨ２Ｏ２製剤は以下を含有する：
０．９ｍＬの８．８ＭのストックＨ２Ｏ２（１７ｖ／ｖ％）、
１ｍＬの保湿ローション（２ｖ／ｖ％）および
３．１ｍＬの緩衝液（６３ｖ／ｖ％）。
（ｂ）５ｍＬの２．０Ｍのトリアセチン製剤は以下を含有する：
１．９ｍＬのストックトリアセチン（３７．５ｖ／ｖ％）、
１ｍＬの保湿ローション（２ｖ／ｖ％）および
２．１ｍＬの緩衝液（４２．５ｖ／ｖ％）。
【０５１８】
等しい体積のＨ２Ｏ２およびトリアセチンの製剤が毛髪に適用される場合、０．７５ＭのＨ２Ｏ２および１．０Ｍのトリアセチンである最終濃度が試験表面で達成される。
【０５１９】
実施例２５
２段階における毛髪弱化の実証−２段階処理プロトコルのための一般的な手順
以下の実施例は、２段階製品のためのプロトコルを実証する：第１のステップは、毛髪における標的化ペルヒドロラーゼの付着であり（過剰の酵素は洗い流される）、第２のステップは、毛髪に付着したペルヒドロラーゼへの残りの反応成分（エステル基質、過酸化水素源）の送達であり、ここで、残りの反応成分は、保湿溶液から送達される。
【０５２０】
これらの実施例では中程度の茶色の毛髪を使用した。ストック毛髪見本は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＮＹ）により特注した。各見本は、厚さ１ｍｍおよび幅２ｃｍの接着剤により中央で優しく接着された、１５００ｍｇの５０％反転された毛髪を有した。
【０５２１】
房の調製：長さ４ｃｍの約５０ｍｇの毛髪の毛髪束からなる試験毛髪サンプルを、厚さ１ｍｍ、幅２ｍｍおよび長さ５ｍｍの接着剤ストリップで結合させた。ＢＹＴＡＣ（登録商標）（ＴＹＰＥ  ＶＦ−８１、Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）のシートをポリスチレンカバープレートに取り付け、毛髪の取り付けおよび処理のためのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）被覆された試験表面を提供した。両面スコッチテープのストリップを、試験表面の上端に近づけて、ＢＹＴＡＣ（登録商標）表面に貼り付けた。試験毛髪サンプルの接着側をテープの露出面に押し付け、非接着毛髪ストランドが完全にテープから離れていることを確かめた。房の接着部分および露出した両面テープ表面を透明な片面テープのストリップで被覆した。この方法は単一の試験毛髪房について記載されるが、各試験条件に対しては４房を用い、処理全体を通して、隣り合わせに並べて置いた。
【０５２２】
酵素の付着：試験房を水道水で濡らし、過剰の水をペーパータオルで吸収した。計算された体積の酵素製剤を適用し、手袋をはめた指で約３０秒間、優しくそして均一に毛髪ストランドに染み込ませ、特定の付着時間の間、製剤を浸漬させた。次に、房を水道水ですすぎ、ぜん動ポンプにより２０秒間攪拌して、界面活性剤を完全に除去した。
【０５２３】
基質の適用：ペーパータオル上での吸収により、前述のステップからの房から過剰な水を湿った除去した。必要な体積の基質（Ｈ２Ｏ２およびトリアセチン（ＴＡ））を試験房に適用した。手袋をはめた指で約１分間、混合物を毛髪ストランドにしっかりと均一に擦り込んだ。特定の処理時間中、房を半分被覆して放置した。
【０５２４】
前処理（酵素付着の前）としても使用される最終洗浄：界面活性剤を泡立てるのに十分な力で１分間毛髪に擦り込んで、房の調製中または前のサイクルからに生じる油および残渣の痕跡を全て除去することによって、試験毛髪を希釈界面活性剤溶液で洗浄した。毛髪を水道水で十分にすすぎ、手袋をはめた指で房を優しく広げながら、ぜん動ポンプにより３５秒間攪拌して、全ての接着物（界面活性剤または保湿剤）が除去されたことを確認する。ペーパータオルで房の上を抑えることにより過剰な水分を吸収した。これは、１サイクルの最後を示すであろう。酵素の付着ステップから始まる処理サイクルを、所望のサイクル数に達するまで繰り返した。
【０５２５】
４サイクル終了する毎に、房を空気中で乾燥させ、４ｍｍポートのＸ−ＲＩＴＥ（登録商標）ＳＰ６４分光光度計（Ｘ−Ｒｉｔｅ，Ｇｒａｎｄｖｉｌｌｅ，ＭＩ）を用いて色測定を行った。色数は、反射率からＤ６５／１０°においてＣＩＥＬＡＢ７６に従って測定した。毛髪房（４回の反復全て）を、孔を開けたカードペーパーの下に置き、バックグラウンドが見えないことを確認した。分光光度計のポートホールを孔の中心に置き、下側の毛髪サンプルをスキャンした。房−束をひっくり返し、カードの下に置き、さらなる測定を行った。平均Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊（ＣＩＥＬＡＢ７６に従う色）値を記録した。
【０５２６】
色抜けのΔＥは、以下の式に従って計算した：
【数１】
2014501760.tif 000046
式中、
Ｌ１＊、Ａ１＊およびｂ１＊は、処理後のサンプル房のＬ＊、ａ＊およびｂ＊値である。
Ｌ０＊、ａ０＊およびｂ０＊は、未処理毛髪のＬ＊、ａ＊およびｂ＊値である。
【０５２７】
各実験からの２つのサンプルに、実施例２３に記載されるような引張検定を受けさせ、毛髪弱化の程度を決定した。
【０５２８】
実施例２６
日常的な２段階適用−１サイクル当たり２４時間処理の１６サイクル（日）
以下の実施例は、２段階処理における毛髪の構造的な弱化を実証する。
【０５２９】
以下の実験は、実施例２５に開示される一般的な処理方法に従った。溶液は、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中の５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０界面活性剤中で作った。約０．８ｍＬの酵素溶液を約２００ｍｇの毛髪サンプル（４つの試験房）に１０分間適用した。Ｈ２Ｏ２およびトリアセチン、製剤は、実施例２４に従って、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中、２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローション中で作った。試薬を適用した後、日常的な適用と同様に、処理を２４時間継続させた。ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中５％）を最終界面活性剤洗浄のために使用した。処理はさらに１５サイクル、全部で１６日間繰り返した。結果は表１９で提供される。
【０５３０】
これらの条件下で、全てのサンプルは、基準の毛髪弱化効力を示すか、あるいはこれを上回った。データは、２段階製品の製剤は、過酸化水素およびトリアセチンから過酢酸を生成して、１６回の２４時間サイクルで毛髪を著しく弱化するために、各サイクルで十分にペルヒドロラーゼに付着可能であることを実証する。
【０５３１】
【表２０】
2014501760.tif 000047
【０５３２】
実施例２７
日常的な２段階適用−加速試験
以下の実施例は、毛髪弱化に対する処理の効果を決定するための加速試験法を実証する。
【０５３３】
以下の実験は、試薬を適用した後、処理を、２４時間／サイクルよりも短い回数／サイクルの間継続させたことを除いて、実施例２６に開示される一般的な処理方法に従った。
処理条件および１６サイクルの処理の後の引張強さ結果は、表２０に示される。
【０５３４】
これらの結果と、実施例２６の表１９からの２４時間／サイクル処理の結果との比較によって、２４時間／サイクル処理（ＴＳ−２４ｈｒ）の引張強さは、以下の式に値を代入することによって、２０分／サイクル処理（ＴＳ−２０ｍ）の引張強さから予測可能であることが実証される。：
（ＴＳ−２４ｈｒ）＝１．３４×（ＴＳ−２０ｍ）−２．３４
【０５３５】
１６サイクルの２０分／サイクル処理の場合の１．８Ｎ／ｍｇＨ以下の引張強さ値は、毛髪が、１６サイクルの２４時間／サイクル処理では完全に崩壊し得ることを示す。２．５〜２．９Ｎ／ｍｇＨの間で得られる値は、１日１回の１６サイクルで、基準値（すなわち、１．０〜１．５Ｎ／ｍｇＨ）と同様の毛髪弱化効力を予測し得る。
【０５３６】
【表２１】
2014501760.tif 000048
【０５３７】
実施例２８
酵素負荷の範囲
以下の実施例は、引張強さおよび色抜けに対する酵素負荷の効果を実証する。この実施例は、実施例２５に開示される一般的な処理方法に従った。
【０５３８】
酵素溶液は、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中の０．５％または５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０界面活性剤中で作った。約０．８ｍＬの酵素溶液を約２００ｍｇの毛髪サンプル（４つの試験房）に１０分間適用した。Ｈ２Ｏ２およびトリアセチン、製剤は、実施例２４に従って、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中、２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローション（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）中で作った。４００μＬの試薬のそれぞれを適用した後、処理を２０〜４０分間継続させた。８００μＬの基質混合物中のＨ２Ｏ２およびＴＡの最終濃度は表２１に示される。ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中５％）を最終の界面活性剤洗浄のために使用した。サンプルの引張強さ結果はこのようにして処理され、１６サイクルの２４時間／サイクル処理レジメンに対応する予測値は表２１に示される。
【０５３９】
この実施例で使用される最低の酵素濃度の７５０μｇ／ｍＬにおいてでさえ、１６サイクルの２４時間／サイクル処理レジメンに対して予測される引張強さは、基準値と同様である（あるいはそれよりも良い）約１Ｎ／ｍｇＨになるであろう。これらの条件下で、毛髪は引張強さの低下に比例して漂白もされ、これは、処理効力の初期徴候として使用され得る。
【０５４０】
【表２２】
2014501760.tif 000049
【０５４１】
実施例２９
サイクル数の増大に従う毛髪損傷の拡大および酵素結合の増大の実証
以下の実施例は、それぞれの繰り返しサイクルにおいて産生される過酢酸の量がサイクル数の増大と共にどのように増大するかを実証する。実験は、実施例２５に開示される一
般的な処理方法に従った。
【０５４２】
以下の実施例において使用される酵素は、ＨＣ１１２１（Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）であり、使用した濃度は２５００μｇ／ｍＬ（Ｅ／Ｈ＝１０＊）であった。酵素溶液は、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中の５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０界面活性剤中で作った。約０．８ｍＬの酵素溶液を約２００ｍｇの毛髪サンプル（４つの試験房）に１０分間適用した。Ｈ２Ｏ２およびトリアセチン、製剤は、実施例２４に従って、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中、２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローション中で作った。４００μＬの試薬のそれぞれを適用した後、処理を２０分間継続させ、その後、毛髪を水道水ですすぎ、乾燥させた。次のサイクルを進める前に、サンプルをｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０による界面活性剤洗浄にさらし、水道水ですすいだ。
【０５４３】
毛髪の弱化、毛髪の漂白および酵素活性（その過酢酸、ＰＡＡを生成する性質）を定量化するために、引張強さ測定、色測定および結合ペルヒドロラーゼ酵素活の検定などの試験を実施した。
【０５４４】
結合ペルヒドロラーゼ酵素活性の検定：規定のサイクル数の処理の後、各房から１０ｍｇの毛髪を切断し、２ｍＬ微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）に入れた。各管に、４８０μＬのＰＡＨ緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．２）、１４μＬの３０％の過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  ３４１０）、および６μＬのトリアセチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｗ２００７００）を添加した。ペルヒドロラーゼ反応を２５℃で１０分間進行させた。１０ｍＭのリン酸でアリコートを１０×、１００×および１０００×に希釈することによって反応を停止させた。検出のために、５０μＬの１Ｍの酢酸、５０μＬの４０ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム、および５０μＬの４ｍＭのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、５０μＬの希釈物に添加した。１０分間発色させ、分光光度計において４０５ｎｍで読み取った。無酵素対照からの値を差し引いて、酵素活性のみに起因する値を得た。ＯＤ４０５ｎｍ対ＰＡＡ濃度（ｐｐｍ）の標準曲線により８．７５の変換係数が得られたので、１．０のＯＤ４０５ｎｍは約８．７５ｐｐｍのＰＡＡに相当する。次に、この値に適切な希釈を乗じて、ペルヒドロラーゼ反応におけるＰＡＡ濃度に到達する。
【０５４５】
結果は表２２に示される。処理サイクル数が増大するに従って、毛髪漂白の範囲の増大および引張強さの低下が観察された。また処理サイクル数が増大すると、毛髪はより大量の酵素結合の影響を受けやすくなり、その結果、検定中に添加される同じ濃度の基質に対して、より大量の過酢酸が生成された。
【０５４６】
【表２３】
2014501760.tif 000050
【０５４７】
この実施例は、２段階プロセスのサイクルが追加されると、より多くの過酢酸が生成され、より大きい毛髪の弱化が生じることを実証する。この観察は、ペルヒドロラーゼの付着および過酢酸の生成の繰り返されるサイクルを組み込んだ脱毛レジメンの効力の増大に対する支持をもたらす。
【０５４８】
実施例３０
２段階プロセスにおいて毛髪を弱化するための毛髪標的化ドメインの役割
以下の実施例は、ペルヒドロラーゼ融合物上の毛髪結合ドメインが、毛髪房検定（ｔｒｅｓｓ  ａｓｓａｙ）において、毛髪の弱化における効力を改善することを実証する。
【０５４９】
以下の実施例は、実施例２５に開示される一般的な処理方法に従った。以下の実施例で使用される酵素は、毛髪結合ペプチドＨＣ２６３（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）により毛髪に標的化されたサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼおよび非標的化ペルヒドロラーゼ（Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ、配列番号２９３）であった。酵素の濃度は１５００μｇ／ｍＬ（Ｅ／Ｈ＝６＊）であった。酵素溶液は、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中、５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０界面活性剤中で作った。約０．８ｍＬの酵素溶液を、約２００ｍｇの毛髪サンプル（４つの試験房）に５分間適用した。Ｈ２Ｏ２およびトリアセチン、製剤は、実施例２４に従って、ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中、２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローション中で作った。４００μＬの試薬のそれぞれを適用した後、処理を２時間継続させた。次のサイクルを始める前に、サンプルをｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０による界面活性剤洗浄にさらし、水道水ですすいだ。処理条件および引張強さ結果は表２３に要約される。
【０５５０】
引張強さ（ＴＳ）結果は、標的化ペルヒドロラーゼ酵素処理が非標的化よりも低い引張強さを示したことを示す。これにより、標的化は、日常的な２段階適用脱毛製品においてより大きい毛髪弱化効力を提供することが示される。この実施例は、２段階プロトコルでは、毛髪の構造の弱化における効力のために酵素の毛髪への標的化が必要であることを実証する。
【０５５１】
【表２４】
2014501760.tif 000051
【０５５２】
実施例３１
他のペルヒドロラーゼの構築および産生
毛髪への標的化
以下の実施例は、毛髪に標的化される付加的なペルヒドロラーゼの産生のための発現系の設計を実証する。構築物の要約は表２４で提供される。
【０５５３】
簡単に言うと、ポリヌクレオチド配列（配列番号９、３９、および４１）は、１８アミノ酸可動性リンカー（ＧＰＧＳＧＧＡＧＳＰＧＳＡＧＧＰＧＳ、配列番号２８５）（それ自体は毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）に融合される）に対するバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのキシランエステラーゼ（配列番号１０、４０、および４２）の融合物をコードするように設計した。これらの酵素は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのように、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに属する。
【０５５４】
ポリヌクレオチド配列（配列番号３２２、３２４、３２６および３２８）は、１８アミノ酸可動性リンカー（配列番号２８５）（それ自体は毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）に融合される）に対するマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（配列番号３１４）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体の融合物をコードするように設計した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼとは異なる加水分解酵素の種類に属する。ポリヌクレオチド配列（配列番号３３０、３３２、３３４、および３３６）は、１８アミノ酸可動性リンカー（配列番号２８５）（それ自体は毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）に融合される）に対するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（配列番号３１５）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体の融合物をコードするように設計した。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのエステラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼまたはマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）とは異なる加水分解酵素の種類種に属する。
【０５５５】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために遺伝子をコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により合成した。実施例８に記載されるものと同様の方法で、コード配列をＴ７プロモーターまたはｐＢＡＤプロモーターの後ろでプラスミドにおいてクローン化した。Ｔ７プロモーター下での構築のために、あるいはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５のＡｒａＢＡＤ誘導体ではｐＢＡＤプロモーター下での構築のために、プラスミドを適切な発現宿主：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に移した。
【０５５６】
【表２５】
2014501760.tif 000052
【０５５７】
実施例３２
代替的なエステラーゼ／ペルヒドロラーゼおよび毛髪結合ドメインを含む融合タンパク質の産生
以下の実施例は、実施例３１に記載されるように毛髪に標的化された種々の代替的なエステラーゼ／ペルヒドロラーゼの発現および精製を実証する。
【０５５８】
実施例３１の表２４中のペルヒドロラーゼに対する融合物をコードする遺伝子を発現する株は、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する１Ｌの自己誘導培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７５％のグリセロール、０．０７５％のグルコースおよび０．０５％のアラビノース）において、２００ｒｐｍの攪拌下、３７℃で２０時間増殖させた。全てのタンパク質融合物は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で十分に発現した。細胞を４℃で８０００ｒｐｍの遠心分離によって収集し、組織ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒモデルＰＣＵ１１）を３５００ｒｐｍで用いた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、４℃）を用いて、３００ｍＬの氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に細胞ペレットを再懸濁させることにより洗浄した。１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２ＭＰａ）でＦｒｅｎｃｈ圧力セルを２回通過させることにより細胞を破壊した。溶解細胞抽出物を４×５０ｍＬの円錐ポリプロピレン遠心管に移し、４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。酵素を含有する上澄みを新しい管に移し、クーマシー染色されたＰＡＧＥゲル上のウシ血清アルブミン標準のバンドに対する比較により各抽出物中のおよその量の融合タンパク質を評価した。
【０５５９】
ペルヒドロラーゼ融合物は好熱性ではないので、これらは、Ｃｏ−ＮＴＡアガロース（ＨｉｓＰｕｒ  Ｃｏｂａｌｔ  Ｒｅｓｉｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる金属キレート化クロマトグラフィにより、そのＣ−末端Ｈｉｓ６を用いて精製した。通常、４体積の平衡緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、１ｍＭのイミダゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ）を備えたＣｏ−ＮＴＡアガロースの５〜１０ｍＬカラムに細胞抽出物を負荷した。カラムに負荷される各抽出物の量は、Ｃｏ−ＮＴＡアガロースビーズ１ｍＬ当たり５〜１０ｍｇのペルヒドロラーゼ融合物を含有するように調整した。樹脂を２ベッド体積の平衡緩衝液で洗浄し、２体積の溶離緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、１５０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）で溶出させた。画分を収集し、精製タンパク質の存在をＰＡＧＥにより検出した。溶出したタンパク質をＰＡＧＥにより分析した。これらの全てのタンパク質は、親和性クロマトグラフィにより精製することができた。その事実は、融合タンパク質が全長型で産生されたことを示す。
【０５６０】
この実施例は、融合ヒドロラーゼ／ペルヒドロラーゼを、毛髪に対する親和性を有する様々な結合ドメインを有する異なるファミリーから産生することの実行可能性を実証する。
【０５６１】
実施例３３
毛髪結合ドメインに融合された代替のペルヒドロラーゼのペルヒドロラーゼ活性
以下の実施例は、毛髪に標的化された代替のペルヒドロラーゼの活性を実証する。
【０５６２】
実施例３２に記載されるように産生された様々な標的ドメインを有する毛髪に標的化された酵素のペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により測定した。結果は表２５に報告され、ＣＥ−７（炭水化物エステラーゼファミリー７）も非ＣＥ−７ヒドロラーゼも過加水分解活性を有することが示される。
【０５６３】
【表２６】
2014501760.tif 000053
【０５６４】
この実施例は、ＣＥ−７ファミリーまたはその他のファミリーからのヒドロラーゼ酵素の他の毛髪標的融合物が過加水分解活性を示し、毛髪用途において直接または酵素発生の後に使用され得ることを実証する。
【０５６５】
実施例３４
毛髪に標的化された他のペルヒドロラーゼの毛髪結合
以下の実施例は、種々の標的化ペルヒドロラーゼ（ＣＥ−７サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ以外）が毛髪に結合できることを実証する。
【０５６６】
標的化ペルヒドロラーゼＨＣ１１２１（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）、ＨＣ１１６９（ＡｒＥ−ＨＣ２６３、配列番号３２３）、およびＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ペルヒドロラーゼの変異体（配列番号３３１）を、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪を２ｍＬの上記製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で５分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルもインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の２ｍＬの１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で毛髪を洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥し、新しい管のセットに移した。毛髪を、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で２回すすいでから、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で３回すすいだ。毛髪に結合したままである酵素の量は、毛髪を２〜３ｍｍ断片に切断することによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定した。断片を５００μＬポリプロピレン微量遠心管に入れ、８０μＬのゲル負荷緩衝液（２０μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７）、８μＬの５００ｍＭのＤＴＴ、および５２μＬ５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム）で被覆した。毛髪サンプルを９０℃で１０分間加熱してから、４度まで冷却した。
【０５６７】
上澄み（２５μＬ）をＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０３２２）上に負荷し、１５０ｖで４０分間実行した。ゲルを水で３回洗浄し、１５ｍＬのＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ（商標）Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、ＬＣ６０６０）中で１時間染色し、３回すすいでから、水中で３時間脱染した。結果はゲルに結合した酵素の相対強度として報告され、表２６で提供される。
【０５６８】
【表２７】
2014501760.tif 000054
【０５６９】
データによって、異なるヒドロラーゼファミリーからの様々なペルヒドロラーゼを毛髪に標的化させることができ、毛髪結合配列は、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）ペルヒドロラーゼ以外のペルヒドロラーゼに対する融合物の場合において機能的であることが示される。
【０５７０】
実施例３５
毛髪結合ドメインＨＣ２６３におけるＫからＲへの置換を有する標的化ペルヒドロラーゼの毛髪結合
以下の実施例は、毛髪標的化ペルヒドロラーゼの毛髪結合ドメインの変化形も毛髪に結合することを実証する。
【０５７１】
ＨＣ２６３毛髪結合ドメインの１０リジン残基がアルギニン残基で置換された突然変異結合配列の結合能力を試験するために、いくつかの変異酵素をそれぞれ、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪を２ｍＬの上記製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で１０分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルもインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の２ｍＬの１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で毛髪を洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥し、新しい管のセットに移した。毛髪を、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で１回すすいでから、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で３回すすいだ。毛髪に結合したままであるペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により決定した。結果は、表２７において１０分間のｐｐｍＰＡＡで与えられる（無酵素対照値を差し引いた後）。
【０５７２】
【表２８】
2014501760.tif 000055
【０５７３】
実施例３６
毛髪におけるマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの結合の毛髪標的配列の依存性
以下の実施例は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ由来のペルヒドロラーゼ以外の毛髪標的化ペルヒドロラーゼが毛髪に結合し、毛髪への結合のために毛髪結合ドメインが必要とされることを実証する。
【０５７４】
毛髪に標的化されたマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体（配列番号３２３）およびその非標的化同等物（配列番号３１４）を、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪を２ｍＬの上記製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温（約２２℃）で１分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルもインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の２ｍＬの１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で毛髪を洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥してから、新しい管のセットに移した。毛髪を、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液でもう１回すすいでから、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で２回すすいだ。毛髪に結合したままであるペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により決定した。結果は、ＯＤ４０５ｎｍおよび１０分間のｐｐｍＰＡＡとして表２８で提供される（無酵素対照値を差し引いた後）。これらは、本質的に、非標的化アリールエステラーゼが毛髪に結合しなかったことを示す。
【０５７５】
【表２９】
2014501760.tif 000056
【０５７６】
この実施例は、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ペルヒドロラーゼを毛髪に結合するための毛髪標的配列の必要性と、融合タンパク質の場合における毛髪標的配列の機能性とを実証する。より一般的には、これは、異なるヒドロラーゼファミリーからの様々なペルヒドロラーゼを毛髪に標的化させることが可能であることを例示する。
【０５７７】
実施例３７
ＰＡＡにより予め損傷を受けた毛髪に対する標的化ペルヒドロラーゼの改善された結合
以下の実施例は、毛髪が過酢酸（ＰＡＡ）により損傷を受けると毛髪標的化ペルヒドロラーゼの毛髪への結合が増大されることを実証する。
【０５７８】
毛髪へのＰＡＡ損傷が酵素結合に与える効果を評価するために、ｐＨ６．５に調整された０．２％のＰＡＡ中に毛髪の房を室温（約２２℃）で１時間浸漬することによって、ＰＡＡ損傷されたヒト毛髪を調製した。浸漬の後、毛髪を水で３回、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で１回すすいだ。いくつかの房を記載されるように２回処理した。標的化アリールエステラーゼＨＣ１１６９（ＡｒＥ−ＨＣ２６３、配列番号３２３）を、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪（未処理、ＰＡＡ１回処理、ＰＡＡ２回処理）をそれぞれ２ｍＬの上記の製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で１分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルもインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、毛髪を２ｍＬの５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥し、新しい管のセットに移した。毛髪を５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で１回すすいだ。毛髪に結合したままであるペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により決定した。結果は、１０分間のｐｐｍＰＡＡとして表２９に報告される（無酵素対照値を差し引いた後）、結果は明らかに、ＰＡＡ損傷の増大と共に増大される量に対応して、毛髪上の保持されたペルヒドロラーゼ活性の増大を示す。
【０５７９】
【表３０】
2014501760.tif 000057
【０５８０】
この実施例は、過酢酸によって毛髪がより多く損傷を受けると、より多くのペルヒドロラーゼが結合することを実証する。この観察は、ペルヒドロラーゼの付着および過酢酸の生成の繰り返されるサイクルを組み込んだ脱毛レジメンの効力の増大に対する支持をもたらす。
【０５８１】
実施例３８
マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのペルヒドロラーゼを用いる２段階プロセスにおける毛髪の弱化
以下の実施例は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ由来のペルヒドロラーゼ以外のペルヒドロラーゼが、毛髪を弱化するための２段階プロセスで使用可能であることを実証する。
【０５８２】
以下の実験は、実施例２５に開示された一般的な処理方法に従った。この実施例で使用した酵素は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）から得られ、標的毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）を有する非ＣＥ−７酵素（アリールエステラーゼＳ５４Ｖ変異体、配列番号３１４）であった。酵素の濃度は、１５００μｇ／ｍＬ（Ｅ／Ｈ＝６＊）であった。試薬の濃度および試験条件は実施例３０と同じであった。処理条件および引張強さ結果は表３０に要約され、酵素を含まない対照についてのこれまでの結果と比較した。
【０５８３】
引張強さ（ＴＳ）結果は、これらの適用条件下で、毛髪標的化マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼＳ５４Ｖ変異体（ＡｒＥ−ＨＣ２６３、配列番号３２３）酵素が対照よりも低い引張強さを示し、従って、日常的な２段階適用の脱毛製品において毛髪弱化効力を提供することを示した。
【０５８４】
【表３１】
2014501760.tif 000058
【０５８５】
実施例３９
過酢酸を発生させるための異なるペルヒドロラーゼおよび異なる基質の使用
以下の実施例は、異なる基質と共に異なるペルヒドロラーゼを用いて、脱毛用途に適した有効量のＰＡＡが発生され得ることを実証する。
【０５８６】
ＨＣ１１２１は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのＣＥ−７クラスの炭水化物エステラーゼ（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）であり、ＨＣ１１６９は、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼ（ＡｒＥ−ＨＣ２６３、配列番号３２３）である。両方の酵素をその過加水分解活性について試験した。酵素、基質および緩衝液の濃度、ならびに反応時間は表３１に記載される。いくつかの反応条件に対して酵素を含まない反応を行い、過酢酸の非酵素的な発生も決定した。反応の最後に、１００ｍＭのＨ３ＰＯ４による１０または２５倍の酸性化によって反応を停止させた。反応停止されたサンプルを、ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＭＦ遠心装置（３０Ｋの分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔｏｆｆ、ＭＷＣＯ）、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，Ｐ／Ｎ  ＯＤ０３０Ｃ３５）を用いて、１２，０００ｒｐｍで６分間の遠心分離によりろ過した。ろ液をＨＰＬＣ  Ｋａｒｓｔ検定によりデュプリケートで検定して、これらの反応条件で発生した過酢酸（ＰＡＡ）の量を決定した。
【０５８７】
第１の試験群（異なる緩衝液中、１００ｍＭのトリアセチンおよび２００ｍＭのＨ２Ｏ２を使用した）では、酵素がなくても、トリアセチンおよび過酸化水素は５分以内に非常に少量のＰＡＡ（１１０ｐｐｍ以下のＰＡＡ）を発生させたが、５０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１を添加すると、ｐＨに応じて５分以内に約２７７ｐｐｍ〜４８３２ｐｐｍのＰＡＡが発生された。ｐＨが高いほど、より多くのＰＡＡが発生された。
【０５８８】
第２の試験群（１００ｍＭ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中、２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローション中の２５０ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を使用した）では、酵素がなくても、トリアセチンおよび過酸化水素は６０以内に３３２ｐｐｍのＰＡＡを発生させたが、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９を添加すると、６０分以内に３４３３ｐｐｍのＰＡＡが発生され、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１を添加すると６０分以内に４４５１ｐｐｍのＰＡＡが発生された。
【０５８９】
第３の試験群（異なる緩衝液中、２５０ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を使用した）では、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は、３０以内に３６８０ｐｐｍ〜４８１２ｐｐｍのＰＡＡを発生させ、ｐＨへの依存性はほとんど示されなかった。
【０５９０】
第４の試験群（異なる緩衝液中、２５０ｍＭのＰＧＤＡおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を使用した）では、１０μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は、３０分以内に４１４０ｐｐｍ〜４７２６ｐｐｍのＰＡＡを発生させ、この場合もｐＨへの依存性はほとんど示されなかった。さらに、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は既に提供された基質との反応を飽和させており、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は、ＰＡＡの発生における付加的な利益を示さなかった。
【０５９１】
【表３２】
2014501760.tif 000059
【０５９２】
【表３３】
2014501760.tif 000060
【０５９３】
この実施例は、異なるペルヒドロラーゼを種々のｐＨ濃度および緩衝溶液、ならびに保湿剤製剤中で用いて、有意なレベルの過酢酸がＨ２Ｏ２およびトリアセチンまたはプロピレングリコールジアセテートから発生され得ることを実証する。
【０５９４】
実施例４０
１段階手順でペルヒドロラーゼを用いた毛髪弱化効力：酵素濃度およびＰＨの効果
以下の実施例は、酵素および基質が低濃度において１段階で混ぜ合わせられる場合に、毛髪が１段階手順で弱化され得ることを実証する。酵素濃度およびｐＨの効果を調査した。
【０５９５】
これらの実施例における毛髪房は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＮＹ）によって特注されたストック培地茶髪見本（ｓｔｏｃｋ  ｍｅｄｉｕｍ  ｂｒｏｗｎ  ｈａｉｒ  ｓｗａｔｃｈｅｓ）から切断した。各毛髪房を一端で接着し、５ｍｍ幅および４ｃｍ長さ（接着した部分を除いて）、１００＋／−２０ｍｇの正味の毛髪重量で切断した。各試験条件について、トリプリケートの毛髪房を使用した。１段階手順において、各毛髪房を透明なプラスチック秤量トレイ（ＶＷＲ、Ｃａｔ．＃１２５７７−０５３）に入れてから、緩衝液中の１ｍＬのペルヒドロラーゼＨＣ１１２１溶液を毛髪房に適用し、アプリケータを用いて毛髪房に擦り込んだ。次に、計算された量のトリアセチンおよび３０％のＨ２Ｏ２を各毛髪房に適用し、毛髪房に擦り込み、２００ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２が得られた。毛髪房をこの反応混合物中に３０分間入れた後、水道水で十分に洗浄し、その後ペーパータオルで乾燥させた。これにより３０分の処理サイクルは完了された。処理サイクルを１６回繰り返した。毛髪房はより明るい色になり、処理中に弱化した。最終のすすぎおよび風乾の後、実施例２５に記載されるように各毛髪房において引張強さ試験を実行し、毛髪の弱化を定量化した。さらに、各毛髪サンプルに対してＬ＊、ａ＊、ｂ＊色測定を行い、毛髪の色抜けを定量化した。Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊色測定は、ΔＥ色差計算の参照として、未処理毛髪についても行った。ΔＥは、ΔＥ＝（（Ｌ＊−Ｌ＊ｒｅｆ）２＋（ａ＊−ａ＊ｒｅｆ）２＋（ｂ＊−ｂ＊ｒｅｆ）２）０．５として標準的な方法で計算した。処理条件は表３２で提供される。表３３に示される引張強さ試験結果は、より高い酵素濃度では毛髪がより弱化されることを示した。ｐＨ６において、０．３μｇ／ｍｇ毛髪のＥ／Ｈ比を与える３０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１が使用される場合、処理された毛髪房の引張強さは１．９Ｎ／ｍｇ毛髪に低下し、１．５Ｎ／ｍｇ毛髪（ＮＡＩＲ（登録商標）クリームで５分間処理した毛髪の基準強度である）に近づいた。ｐＨ７において、３０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１が使用される場合、処理された毛髪房の引張強さは０．３Ｎ／ｍｇ毛髪であり、１．５Ｎ／ｍｇ毛髪の基準よりもはるかに低かった。従って、適切なｐＨにおける適切な濃度の酵素は、毛髪を効果的に弱化し得る。処理した毛髪房について測定した毛髪の色抜けは毛髪の弱化と良く相関した：毛髪弱化が大きいほど毛髪の色抜けも大きい。
【０５９６】
【表３４】
2014501760.tif 000061
【０５９７】
【表３５】
2014501760.tif 000062
【０５９８】
この実施例は、１段階手順において低濃度の酵素および基質で毛髪弱化が達成され得ることを実証する。
【０５９９】
実施例４１
１段階手順でペルヒドロラーゼを用いた毛髪弱化効力：緩衝液濃度および処理時間の効果
以下の実施例は、より高い緩衝液濃度およびより長い処理サイクル時間を用いる場合に毛髪が１段階手順において効果的に弱化され得ることを実証する。
【０６００】
実生活の日常的なシャワーを模倣するために、ＳＬＥＳ（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、一般的なセッケン成分）洗浄ステップ（１ｍＬの１％のＳＬＥＳ（Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙによる「ＲＨＯＤＡＰＥＸ  ＥＳ  ２Ｋ」）が毛髪房に移され、毛髪房が手袋をはめた手のひらで３０秒間擦られる）を各サイクルの水道水すすぎステップの前に追加したことを除いて、実施例４０に記載されるものと同じ手順を用いて毛髪房を処理した。この実施例の処理パラメータ（酵素濃度、ｐＨおよび緩衝液濃度、ならびに処理サイクル時間）は、表３４に示した。２４時間の処理サイクルの場合、毛髪房を混合物中に１時間入れた後、乾燥皿に取り出した。毛髪房を２３時間乾燥させた後、１ｍＬの１％のＳＬＥＳで洗浄した後、水道水ですすぎ、ペーパータオルで乾燥させた。３０分間の処理サイクルの場合、処理サイクルを１６回繰り返した。２４時間の処理サイクルの場合、２４時間サイクルで処理した毛髪房は、視覚的に、１６サイクルの３０分間処理で処理した毛髪房と同じ程度の損傷を示したので、サイクル７が完了したら処理を停止した。最後の各毛髪房のすすぎおよび風乾の後、実施例４０に記載されるように各毛髪房において引張強さ試験および色測定を実行して、毛髪弱化および毛髪の色抜けを定量化した。表３５に示される引張強さ結果は、ｐＨ６．６において、３０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１、２００ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を用いると、１６サイクルの３０分間処理または７サイクルの２４時間処理のいずれでも毛髪房は著しく弱化されることを示した。毛髪の引張強さは０．３〜０．８Ｎ／ｍｇ毛髪の範囲であり、１．５Ｎ／ｍｇ毛髪の引張強さの基準よりもはるかに低かった。より高い緩衝液濃度およびより長い処理時間では、より強力な毛髪弱化が生じた。毛髪の色抜けについても同じ傾向が観察された：毛髪弱化が大きいほど毛髪の色抜けも大きい。従って、さらにより低い酵素濃度を使用して、わずかにより高いｐＨ（実施例４０のｐＨ６と比較してｐＨ６．６）、より高い緩衝液濃度およびより長い処理時間において基準の毛髪弱化に到達し得ることが予想された。
【０６０１】
【表３６】
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【０６０２】
【表３７】
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【０６０３】
実施例４２
１段階手順でペルヒドロラーゼを用いた毛髪弱化効力：基質濃度の範囲
以下の実施例は、毛髪が１段階手順で弱化され得る基質濃度の範囲を実証する。
【０６０４】
ｐＨ６．６の１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１および種々の濃度の基質を使用し、実施例４１に記載されるものと同じ２４時間処理サイクルのための手順を用いて毛髪房を処理した。この実施例の処理パラメータ（酵素濃度、ｐＨおよび緩衝液濃度、基質濃度ならびに処理サイクル時間）は、表３６に示した。全ての毛髪房に対して８サイクルの２４時間処理サイクルを繰り返した。各毛髪房に対する最後のすすぎおよび風乾の後、実施例４０に記載されるように毛髪房において引張強さ試験および色測定を実施し、毛髪弱化および毛髪の色抜けを定量化した。表３７に示される引張強さ結果は、ｐＨ６．６において、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１、２００〜５００ｍＭのトリアセチンおよび１００〜５００ｍＭのＨ２Ｏ２を用いると、８サイクルの２４時間処理で毛髪房は著しく弱化されることを示した。より高い基質濃度を使用するほど、より大きい毛髪弱化および毛髪の色抜けが得られた。試験した最低基質濃度（２００ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２）では、毛髪引張強さは１．２Ｎ／ｍｇ毛髪まで低下し、実質的に１．５Ｎ／ｍｇ毛髪の基準よりも低かった。Ｈ２Ｏ２濃度が３００ｍＭを超えたらすぐ、毛髪引張強さは約０．５Ｎ／ｍｇ毛髪まで低下し、横ばいになった。従って、適切なｐＨおよび処理時間を用いると、０．１μｇ／ｍｇ毛髪という低いＥ／Ｈ比、および２００ｍＭのトリアセチンという低い基質濃度、および１００ｍＭのＨ２Ｏ２を用いて、毛髪は弱化され得る。
【０６０５】
【表３８】
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【０６０６】
【表３９】
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【０６０７】
実施例４３
過酢酸を生成するために過酸化水素および適切なカルボン酸エステル基質を有する非酵素的脱毛製品
酵素破壊ステップが存在しなかったことを除いて、実施例２５に開示される一般的な処理方法に従った。Ｈ２Ｏ２およびトリアセチン、製剤は、実施例２４に従って、Ｈ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中、２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローション中で作った。２００マイクロリットルの各試薬を約２００ｍｇの毛髪サンプル（４つの試験房）に適用した。試薬を適用した後、日常的な適用と同様に、処理を２４時間継続させた。ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（ｐＨ６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中５％）を最終界面活性剤洗浄のために使用した。処理はさらに１５サイクル、全部で１６日間繰り返した。結果は表３８で提供される。
【０６０８】
この実施例は、穏やかな保湿培地中でＨ２Ｏ２およびトリアセチンの濃度を調整することによって、日常的な適用レジメンに従うことにより約１５〜１６日で、所望の量の毛髪弱化を達成できることを説明する。製品は、脱毛剤およびヘアライトニング（ｈａｉｒ−ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）用途において潜在的な有用性を有する。
【０６０９】
【表４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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