(57)【要約】  本発明は、癌の治療を目的とする方法及び医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、ブレビバクテリウム・オーランチアカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）から単離された、メチオニンガンマ−リアーゼ活性及びホモシステイナーゼ活性を示すポリペプチドに関する。また、本発明は、癌の治療を目的とするこのようなポリペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその機能保存的変異体。
【請求項２】
少なくとも１つのポリエチレングリコール基と共有結合している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
腫瘍ターゲティング剤に共有結合している、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項５】
配列番号：２で記載される配列を含む請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：３で記載される配列を含む請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸及び／又は請求項７に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）前記ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下、請求項８に記載の形質転換宿主細胞を培養すること；及び（ｉｉ）発現したポリペプチドを回収すること、からなるステップを含む方法。
【請求項１０】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸と１種以上の酵素補助因子との組み合わせを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸と１種以上の化学療法剤又は放射線療法剤との組み合わせを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
１種以上の酵素補助因子を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
１種以上の化学療法剤又は放射線療法剤を含む、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオニンガンマ−リアーゼ活性及びホモシステイナーゼ活性を示すブレビバクテリウム・オーランチアカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）から単離されたポリペプチドならびに癌の治療を目的とするそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニン欠乏下で成長した癌細胞の細胞毒性は十分に確立されている。メチオニンの欠乏は癌細胞の死を誘導するが一方、正常細胞ははるかに抵抗性である。この相対的な選択性の理由は不明である。正常細胞も癌細胞も、十分な葉酸、コバラミン、及びホモシステインが供給されればメチオニンを合成することができる。しかし、大多数の腫瘍細胞はそれらが合成することのできる以上の量のメチオニンを必要とし、外因性の供給が欠如すると、増殖抑制を受けるか、又は死滅する。
【０００３】
不可逆的にＬ−メチオニンのα、γ−脱離を触媒して、メタンチオール、α−ケトブチレート、及びアンモニアの生成をもたらすメチオニンガンマリアーゼ（Ｌ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトエタンリアーゼ；ＭＧＬ）の作用により、インビトロ及びインビボのメチオニン欠如を達成することができる。いくつかの微生物からの精製又は種々の細菌種及び原生動物由来の酵素をコードする遺伝子の組換えにより、種々のＭＧＬが製造されている。メチオニン欠如の抗腫瘍作用についての大多数の研究では、潜在的に病原性のシュードモナス菌であるシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のＭＧＬ（Ｐｐ−ＭＧＬ）が使用されている。
【０００４】
Ｐｐ−ＭＧＬにより獲得されたメチオニン欠如は、ヒトの種々のタイプの癌の治療に現在用いられている薬剤であるフルオロピリミジン５−フルオロウラシル（ＦＵｒａ）の細胞毒性作用を増強する（Ｍａｃｈｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｍａｃｈｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。増強は、メチオニン欠如により誘導された葉酸減少の細胞内プール改変によるものであり、また、ことによると、細胞死に対して有利に働く細胞機構の発現における変化（ＤＮＡの脱メチル化に関連し得る）によるものと思われる（Ｍａｃｈｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｍａｃｈｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。また別の研究者は、Ｐｐ−ＭＧＬの同時投与により、腫瘍担持マウスにおけるＦＵｒａ及びシスプラチンの増強を示している。
【０００５】
クリニックでは、組換えＰｐ−ＭＧＬ導入を目的として動物実験が行われている。しかし、このタンパク質により再抗原投与したサルに致死的なアナフィラキシーショック症候群が観察されており、天然組換えＰｐ−ＭＧＬのさらなる開発を妨げている。現在のところ、ペグ化によるタンパク質の免疫原性低下の試みは成功していない。
【０００６】
この前臨床データから、Ｐ．ｐ．ＭＧＬ及び、ことによると、これまでに述べられた他の推定上の十分に特性化されたＭＧＬは全てヒトにとって潜在的な病原体である種々の微生物に由来（すなわち、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ならびに原生動物の膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、及び赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）起源）であって、これらの禁止的な免疫原性により、安全な条件下で血漿中の持続的なメチオニン欠如に必要な酵素を静脈内投与することができなかったと考えられた。
【０００７】
しかし、癌に対する新規薬剤の開発が要望されている。この意味で、腫瘍細胞の増殖を抑制する新規治療ターゲットの特性化がきわめて望ましいことが示唆されてきた。したがって、当技術分野では、食物に豊富に存在する非病原性の微生物由来のメチオニンガンマリアーゼが要望されており、このＭＧＬは経口免疫寛容により利益を得て、癌治療のためにＭＧＬを必要としている対象の血流内へのその投与が可能になると思われる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、癌の治療を目的とする方法及び医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、ブレビバクテリウム・オーランチアカムのメチオニンガンマ−リアーゼ及び癌の治療を目的とするそれらの使用に関する。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ブレビバクテリウム・オーランチアカム（ＡＴＣＣ９１７５；以前は、ブレビバクテリウム・リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ））由来のメチオニンガンマ−リアーゼの開発に関する。
【００１０】
本発明者らは、芳香及び色素産生、ならびに食物病原体の成長を阻害するその性質を特徴とするチーズ熟成微生物であるＢ．オーランチアカム（ＡＴＣＣ９１７５）中の種々の硫黄含有アミノ酸の存在下でのトランスクリプトーム分析により、遺伝子発現を試験した。驚くべきことに、これらの試験により、同じ微生物において以前に記載されたもの（Ａｍａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）とは大きく異なる新規の推定上メチオニンガンマ−リアーゼ（ＭＧＬ）の配列同定が導かれた。
【００１１】
本発明者らは、Ｂ．オーランチアカム由来の推定上ＭＧＬの最適化遺伝子を含有する発現プラスミドにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生株を形質転換した。作製された組換え酵素、ＭＧＬ−ＢＬ９２９は、メチオニンに対して、４．３３  Ｕ／ｍｇ〜７．２１Ｕ／ｍｇ、すなわちＰ．ｐｕｔｉｄａ由来の酵素で見出されたものに近い値の特異的活性を示した。本発明者らは、作製されたＭＧＬ−ＢＬ９２９が、メチオニンガンマ−リアーゼ活性に加えて、ホモシステイナーゼ活性を有することを実証した。また、本発明者らは、ＭＧＬ−ＢＬ９２９が、
−  長期間、腫瘍細胞培養培地由来のメチオニン及びホモシステインを欠如させ、
−  腫瘍細胞培養条件下で、またインビトロのヒト血清中で安定であり、
−  培養物中で増殖している種々のヒト腫瘍細胞に対して、高い細胞毒活性を有し、
−  癌細胞に対しては高い細胞毒性の濃度において、正常細胞の増殖には影響を与えず、
−  細胞増殖抑制剤の細胞毒活性を増強（調節）し、
−  細胞増殖抑制剤に対する前の細胞耐性を無効化すること
を、実証した。
【００１２】
定義
用語「メチオニンガンマ−リアーゼ」又は「ＭＧＬ」は、当技術分野における一般的な意味を有し、Ｌ−メチオニンのα，γ−脱離を不可逆的に触媒し、メタンチオール、α−ケトブチレート、及びアンモニアの生成をもたらす酵素であるＬ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトエタンリアーゼのことである。
【００１３】
用語「ホモシステイナーゼ活性」は、当技術分野における一般的な意味を有し、Ｌ−ホモシステインリアーゼ活性のことである。
【００１４】
用語「ブレビバクテリウム・リネンス」は、他の３つの種、すなわち、Ｇａｖｒｉｓｈら、２００４に記載されている通り、ブレビバクテリウム・オーランチアカム，ブレビバクテリウム・アンチクーム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｔｉｑｕｕｍ）及びブレビバクテリウム・ペルメンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｍｅｎｓｅ）も含む。ＡＴＣＣ９１７５株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＢ．ｌｉｎｅｎｓ  ＡＴＣＣ９１７５として寄託されており、最近、Ｇａｖｒｉｓｈら（２００４）により提案されている通り、Ｂ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ  ＡＴＣＣ９１７５として再命名された。
【００１５】
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、又は酵素などの発現産物を「コードする配列」又は「コード化する」配列は、発現した時に、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、又は酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわち、このヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質又は酵素に関するアミノ酸配列をコードする。タンパク質をコードする配列は、開始コドン（通常はＡＴＧ）及び終止コドンを含み得る。
【００１６】
ポリペプチド（すなわち、本発明のメチオニンガンマ−リアーゼ）又はヌクレオチド配列を言う場合の「精製した」又は「単離した」とは、指示された分子が同じタイプの他の生物学的高分子が実質的に存在しない中で存在していることを意味する。本明細書に用いられる用語の「精製した」とは、好ましくは、同じタイプの生物学的高分子が少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％存在していることを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子が実質的に無い核酸分子のことであるが、しかし該分子は、組成物の基本的な特徴に有害な影響を与えないいくつかの追加の塩基又は部分を含み得る。
【００１７】
用語「ＰＥＧ」は、サイズ又はＰＥＧの末端における修飾に関わらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含し、ｎが２０〜２３００の整数であり、ＸがＨ又は末端修飾、例えばアルキルである式、Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨにより表すことができる。
【００１８】
「ペグ化」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖がポリペプチドに結合される過程を意味する。用語「ペグ化ポリペプチド」は、前記ポリペプチドに共有結合した少なくとも１個のＰＥＧ基を含むポリペプチドを意味する。
【００１９】
本明細書に用いられる用語「対象」は、齧歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などの哺乳類を意味する。本発明による対象はヒトであることが好ましい。
【００２０】
メチオニンガンマ−リアーゼポリペプチド
したがって、本発明は、配列番号：１により記載されたアミノ酸配列を含む単離された、合成又は組換えメチオニンガンマ−リアーゼポリペプチド又はその機能保存的変異体を提供する。
【００２１】
したがって、本発明は、配列番号：１により記載されたメチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドの機能保存的変異体を包含する。機能保存的変異体は、配列番号：１のポリペプチドの構造（及びそれをコードするＤＮＡ配列において）なされる修飾及び変化から得ることができ、さらに、望ましい特徴（ＭＧＬ及びホモシステイナーゼ）を有する機能的分子が得られる。
【００２２】
したがって、「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素における所与のアミノ酸残基を、ポリペプチドの全体のコンホメーション及び機能を変えることなく、非限定的に、アミノ酸を同様の性質（例えば、極性、水素結合能力、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を有するものと置換などをして、変化させたものである。保存されたとして指示されたもの以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なっていてもよく、その結果、同様の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列の類似性パーセントは変化することがあり得、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいたＣｌｕｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄなどのアライメント方式により決定した際に、７０％から９９％であり得る。「機能保存的変異体」は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定した際に、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、さらに一層好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、それらは比較対象の天然タンパク質又は親タンパク質と同じか、又は実質的に同様の性質又は機能を有する。２つのアミノ酸配列は、８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超のアミノ酸が同一である場合に、又は約９０％超、好ましくは９５％超のアミノ酸が類似性（機能的に同一性）である場合に、「実質的に相同性」又は「実質的に類似性」である。類似性又は相同性の配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）パイルアッププログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの任意の配列比較アルゴリズムを用いるアライメントにより同定されることが好ましい。
【００２３】
アミノ酸の変化は、表１によるＤＮＡ配列におけるコドンを変化させることによって達成できる。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
例えば、タンパク質構造において、あるアミノ酸を、メチオニンガンマ−リアーゼの能力又はホモシステイナーゼの能力の相当大きな損失なしに、他のアミノ酸と置換することができる。これは、そのタンパク質の生物学的機能活性を規定するタンパク質の相互作用的能力であり性質であるので、あるアミノ酸置換は、タンパク質配列中で、そして勿論、そのＤＮＡコード化配列中で行うことができ、それでも同様の性質を有するタンパク質が得られる。したがって、本発明のポリペプチド配列、又は前記ポリペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列に、それらの生物学的機能活性の相当大きな損失なしに種々の変更を行い得ることが考慮されている。
【００２６】
前記メチオニンガンマ−リアーゼ活性及びホモシステイナーゼ活性は、本明細書後記の当技術分野で周知の種々の技法によって評価することができる。
【００２７】
ポリペプチドのアミノ配列に変更を行う場合、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮できる。タンパク質への相互作用的な生物学的機能の授与におけるアミノ酸ヒドロパシー指標の重要性は当技術分野で一般的に認識されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性は、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそれが、タンパク質と、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの他の分子との相互作用を規定することが認められている。各アミノ酸は、それらの疎水性及び電荷の特性に基づいてヒドロパシー指標が定められており、これらは：イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。
【００２８】
あるアミノ酸を、同様のヒドロパシーの指標又はスコアを有する他のアミノ酸と置換しても、同様の生物学的活性を有するタンパク質、すなわち、生物学的機能の等価なタンパク質が得られることは、当技術分野で知られている。
【００２９】
したがって、先に概説した通り、アミノ酸の置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。前記の種々の特性を考慮に入れる典型的な置換は当技術分野で周知であり：アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【００３０】
機能保存的変異体のメチオニンガンマ−リアーゼ活性及びホモシステイナーゼ活性は、例えば、即時的適用に関するアッセイなど当技術分野で公知のメチオニンガンマ−リアーゼ活性及びホモシステイナーゼ活性をアッセイする任意の方法に従って評価できる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、単独で、又は組み合わせて、非限定的に、任意の化学的、生物学的、遺伝子的又は酵素的な技法など、それ自体当技術分野で公知の任意の技法により作製できる。
【００３２】
当業者は、所望の配列のアミノ酸配列を知り、ポリペプチドを作製する標準的技法により前記ポリペプチドを容易に作製することができる。例えば、これらは、周知の固相法を用い、好ましくは、市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフルニア州、により製造されたものなど）を用い、製造元の説明書に従って合成することができる。
【００３３】
あるいは、現在当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法により、本発明のポリペプチドを合成することができる。これらの断片は、例えば、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込み、このようなベクターを、所望のポリペプチドを発現する好適な真核生物又は原核生物の宿主内に導入した後、ＤＮＡ発現産物として得て、それらから、後に周知の技法を用いて単離することができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、単離（例えば、精製）形態で用いることもできるし、膜又は脂質小胞（例えば、リポソーム）などとしてベクター内に含有させることもできる。
【００３５】
特定の実施態様において、本発明によるポリペプチドは、それらの治療的有効性を改善するために改変する可能性が考慮されている。治療的化合物のこのような改変は、毒性の低下、循環時間の増加、又は生体内分布の改変のために使用し得る。例えば、潜在的に重要な治療的化合物の毒性を、生体内分布を改変する種々の薬剤担体媒体と組み合わせることによって、有意に低下させることができる。
【００３６】
薬剤のバイアビリティーを高める戦略の１つは、水溶性ポリマーの利用である。種々の水溶性ポリマーが、生体内分布を改変し、細胞取込み様式を改善し、生理学的バリアーの透過性を変化させ；生体からのクリアランス速度を改変することを示している。ターゲティング効果又は徐放効果を達成するために、ポリマー鎖上に末端基として、骨格の一部として、又はペンダント基として、薬剤部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００３７】
例えば、ペグ化は、数多くのポリペプチドを修飾するための十分に確立され、検証された方法である（Ｃｈａｐｍａｎ、２００２）。これらの利点としては、とりわけ：（ａ）ポリマーが分子の見かけの大きさを糸球体濾過限界以上に増加させる結果としての腎クリアランス回避、及び／又は細胞クリアランス機構の回避によるインビボでの循環半減期の著しい改善；（ｂ）ＰＥＧが結合している分子の抗原性及び免疫原性の低下；（ｃ）薬物動態の改善；（ｄ）共役タンパク質の抗タンパク分解性の増強（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ  ｅｔ．ａｌ．、１９９２）；ならびに（ｅ）ＰＥＧ化ポリペプチドの熱安定性及び機械的安定性の改善が挙げられる。
【００３８】
したがって、本発明のポリペプチドが、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基と共有結合できることは有利である。
【００３９】
したがって、本発明の一態様では、修飾が、ポリペプチドに共有結合した単一のポリエチレングリコール基を含む修飾ポリペプチドが提供される。他の態様では、１つ、２つ、３つ又はそれ以上のポリエチレングリコール基に共有結合した修飾ポリペプチドが提供される。１つ以上のＰＥＧは、約１kDaから約１００kDaの範囲の分子量を有し得るが、約１０kDaから約６０kDa、又は約１０kDaから約４０kDaの範囲の分子量を有することが好ましいであろう。当業者は、所望の投与量、循環時間、タンパク分解に対する抵抗性、免疫原性などの異なる要因を考慮することにより、ペグ化ポリペプチドの治療的使用のされ方に基づき、好適なＰＥＧの分子量を選択することができる。
【００４０】
一実施態様において、本発明のＰＥＧの一端は、ヒドロキシ又はメトキシ、すなわち、ＸがＨ、又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）で終わっている。また、このようなＰＥＧは、互いに結合している１つ以上のＰＥＧ側鎖からなり得る。１つ超のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、分枝ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリオール、及びソルビトールなどの種々のポリオールにポリエチレンオキシドを加えることにより調製することができる。例えば、４つ腕の分枝ＰＥＧは、ペンタエリスリオールとエチレンオキシドから調製することができる。ＰＥＧの一形態として、リシンの一級アミノ基を介して結合した２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。
【００４１】
ポリペプチドへのＰＥＧ基の共有結合を達成するために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性化形態で、すなわち、反応性官能基（それらの例としては、一級アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオール、スクシナート（ＳＵＣ）、スクシンイミジルスクシナート（ＳＳ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＣＡ）、スクシンイミジルプロピオナート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾールカルボナート（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボナート（ＮＰＣ）、及びトレシレート（ＴＲＥＳ）が挙げられる）で提供しなければならない。好適な活性化ポリマー分子は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州、米国）から、又はＰｏｌｙＭＡＳＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（英国）から市販されている。あるいは、ポリマー分子は、例えば、国際公開公報第９０／１３５４０号に開示されているような、当技術分野で公知の従来の方法によって活性化することができる。本発明に用いるための直鎖状又は分枝状活性化ポリマー分子の具体的な例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社の１９９７年及び２０００年のカタログ（研究及び薬剤に関する官能基化生体適合性ポリマー、ポリエチレングリコール及び誘導体。参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体的な例としては、以下の直鎖状ＰＥＧ類：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えば、ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ、及びＳＣＭ−ＰＥＧ）、及びＮＯＲ−ＰＥＧ、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、及びＭＡＬ−ＰＥＧならびにＰＥＧ２−ＮＨＳなどの分枝状ＰＥＧ類が挙げられる。
【００４２】
ポリペプチドと活性化ポリマー分子との結合は、従来の任意の方法を用いて行われる。従来の方法は当業者に公知である。使用すべき活性化方法及び／又は結合化学は、ポリペプチドの結合基ならびにＰＥＧ分子の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン又はハロアセテートである）に依存することを、当業者は認識されるであろう。
【００４３】
一実施態様において、ポリペプチドは、アミノ酸Ｄ及びＥ（ＣＯＯＨに対して）、Ｔ、Ｙ及びＳ（ＯＨに対して）、Ｋ（ＮＨ２に対して）、Ｃ（少なくとも１つのシステインが保存される場合はＳＨに対して）又は／ならびにＱ及びＮ（（アミド官能基に対して）において、ＰＥＧ類と結合する。
【００４４】
一実施態様において、ＰＥＧ化の追加部位は、１つ以上のリシン残基導入による特定部位の変異誘発によって導入することができる。例えば、１つ以上のアルギニン残基をリシン残基へと変異させ得る。別の実施態様では、追加のＰＥＧ化部位は、本発明のポリペプチド上のアミノ酸を修飾することによって化学的に導入される。
【００４５】
一実施態様において、ＰＥＧは、リンカーを介してポリペプチドに結合される。好適なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は、シアヌル酸塩化物である（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９７７；米国特許第４，１７９，３３７号）。
【００４６】
本発明のペグ化ポリペプチドを精製するために、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）及びイオン交換クロマトグラフィーなどの技術分野で公知の従来の分離及び精製技法を用いることができる。生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離することもできる。
【００４７】
一実施態様において、本発明により提供されたペグ化ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドよりも、少なくとも５０％、７５％、１００％、１５０％、又は２００％超のインビボ血清半減期を有する。
【００４８】
別の実施態様において、本発明のポリペプチドは、技術分野で周知の腫瘍ターゲティング薬に共有結合される。非限定例としては、フィブロネクチンのＥＤＢドメインに特異的な抗体、血管内皮成長因子受容体２に結合する抗体又は薬剤、線維芽細胞成長因子受容体−１に結合する抗体又は分子、ＣＤ３１と相互作用する抗体又は薬剤、腫瘍リンパ内皮と相互作用する抗体又は薬剤（Ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ、Ｌｙｖｅ−１）、あるいはＲＧＤペプチドなどのαＶβ３インテグリンに結合する抗体又は薬剤、あるいは腫瘍膜結合ターゲット及び細胞内ターゲットと相互作用する抗体又は薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
核酸、ベクター及び組換え宿主細胞
本発明の別の目的は、本発明によるメチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドをコードする単離された、合成又は組換え核酸に関する。特定の一実施態様において、前記核酸は、配列番号：２で記載された配列を含む。別の特定の実施態様において、前記核酸は、配列番号：３で記載された配列を含む。
【００５０】
典型的には、前記核酸は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり、これを、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウィルスベクターなどの任意の好適なベクターに含ませることができる。用語「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、宿主を形質転換して導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するために、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞内に導入することのできるベヒクルを意味する。
【００５１】
したがって、本発明の別の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００５２】
このようなベクターは、対象に投与した際に前記ポリペプチドの発現を生じさせるか指示するために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節要素を含み得る。ベクターは、複製及び／又は選択性マーカーの１つ又はいくつかの起点をさらに含み得る。プロモーター領域は、コード配列に関して、ホモローグであってもヘテロローグであってもよく、インビボ使用を含めて、任意の適切な宿主細胞において、遍在的な、構成的な、調節された及び／又は組織特異的な発現を提供する。プロモーターの例としては、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウィルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）などが挙げられる。
【００５３】
プラスミドの例としては、複製の起点を含む複製プラスミド、又は、例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。ウィルスベクターの例としては、アデノウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス及びＡＡＶのベクターが挙げられる。このような組換えウィルスは、パッケージング細胞のトランスフェクション又はヘルパープラスミドもしくはウィルスによる一時的トランスフェクションによるなど、当技術分野で公知の技法によって作製できる。ウィルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製−欠損組換えウィルスを生成するための詳細なプロトコルは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開広報第９４／１９４７８号に見出すことができる。
【００５４】
本発明の別の目的は、本発明による核酸及び／又はベクターにより、トランスフェクションしたか、感染させたか、又は形質転換させた細胞に関する。用語の「形質転換」は、宿主細胞が導入された遺伝子又は配列を発現させて、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によりコードされたタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け入れて発現した宿主細胞は「形質転換された」ものである。
【００５５】
本発明の核酸は、好適な発現系において本発明の組換えポリペプチドを産生するために使用できる。用語「発現系」は、例えば、ベクターにより運ばれ、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡにコードされたタンパク質発現のための、好適な条件下での宿主細胞及び適合性のベクターを意味する。
【００５６】
一般的な発現系としては、大腸菌宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウィルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、原核細胞（細菌など）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な例としては、大腸菌、クリベロマイセス属又はサッカロミセス属の酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、ならびに初代の、又は確立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽細胞、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生された）が挙げられる。より具体的には、本発明は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）又は前駆体内皮細胞（ＰＥＣ）などの血管細胞もしくは内皮細胞もしくはそれらの派生物を考慮している。
【００５７】
本発明はまた、本発明によるメチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を作製する方法に関するものでもあり、前記方法は、（ｉ）インビトロ又はエクスビボで上記の組換え核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞内に導入すること、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞を、インビトロ又はエクスビボで培養すること、（ｉｉｉ）場合により、前記メチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドを発現及び／又は分泌する細胞を選択することからなるステップを含む。このような組換え宿主細胞を、先に記載したように、本発明によるメチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドを製造するために用いることができる。
【００５８】
本発明はさらに、本発明によるメチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドを製造する方法に関するものであり、この方法は、（ｉ）前記メチオニンガンマ−リアーゼポリペプチドの発現を可能にする好適な条件下で本発明による形質転換宿主細胞を培養すること；及び（ｉｉ）発現したポリペプチドを回収することからなるステップを含む。
【００５９】
治療的な方法及び使用
一実施態様において、本発明は、癌の治療を必要とする対象に本発明のポリペプチド又は核酸の治療的有効量を投与することを含む癌の治療方法を提供する。
【００６０】
本発明に関連して、本明細書に用いられる「治療すること」又は「治療」という用語は、このような用語が適用される障害もしくは病態、又はこのような障害もしくは病態の１つ以上の症状の進行を逆転、緩和、抑制すること、又はそれを予防することを意味する。
【００６１】
本発明によれば、用語「対象」又は「それを必要とする対象」は、癌に罹患した、又は罹患する可能性の高いヒト又は非ヒト哺乳動物が意図されている。
【００６２】
本発明のポリペプチドの「治療的有効量」は、任意の医療処置に適用できる妥当な利益／危険率で、癌を治療するための（例えば、腫瘍の増殖を制限するための、又は腫瘍の転移を遅延化するか、もしくは阻止するための）ポリペプチドの十分な量を意味する。しかし、本発明のポリペプチド及び組成物の１日の使用総量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは理解されるであろう。任意の具体的な対象に対する具体的な治療的有効用量レベルは、治療されている障害及び障害の重症度；使用される具体的ポリペプチドの活性；使用される具体的組成物、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；投与の時間、投与の経路、及び使用される具体的なポリペプチドの排泄速度；治療の継続期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて、又は同時に使用される薬剤；及び医療分野で周知の同様な要因などの種々の要因に依る。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果の達成に必要な用量より低いレベルで開始して、所望の治療効果が達成されるまで、徐々に用量を増加させることは、十分に当技術分野の範囲内にある。
【００６３】
特定の一実施態様において、本発明のポリペプチド又は核酸は、酵素の補助因子など、ポリペプチドの機能に必要な１種以上の薬剤と同時に投与できる。例えば、前記の酵素補助因子は、ピリドキサルリン酸である。
【００６４】
特定の一実施態様において、本発明のポリペプチド又は核酸は、１種以上の化学療法剤又は放射線療法剤と連続して、又は同時に投与できる。
【００６５】
一実施態様において、前記化学療法剤又は放射線療法剤は、抗癌剤として用いられる治療的活性剤である。例えば、前記抗癌剤としては、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア類、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどの白金錯体、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン類、イリノテカン及びトポテカンなどのカンプトテシン類、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル及びロイコボリンと組み合わせた５−フルオロウラシル、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン類、レバミソール、エストラムスチン、ナイトロジェンマスタード、カルムスチン及びロムスチンなどのニトロウレア類、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンなどのビンカアルカロイド類、イマチニブメシレート、ヘキサメチルメラミン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、チルホスフィン類、プロテアーゼ阻害剤、ヘルビマイシンＡ阻害剤、ゲニステイン、エルブスタチンならびにラベンダスチンＡが挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、追加の抗癌剤が、非限定的に、以下のクラスの薬剤：アルキル化剤、植物アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、葉酸代謝拮抗薬、ピリミジン類縁体、プリン類縁体、ＤＮＡ代謝拮抗剤、タキサン類、ポドフィロトキシン類、ホルモン療法剤、レチノイド類、光増感剤又は光線力学的治療剤、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、イソプレニル化阻害剤、細胞分裂阻害剤、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン類、ＭＤＲ阻害剤及びＣａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤の１種又はそれらの組み合わせから選択できる。
【００６６】
追加の抗癌剤が、非限定的に、サイトカイン類、ケモカイン類、成長因子、成長阻害因子、ホルモン類、可溶性受容体、デコイ受容体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、単特異性抗体、二特異性抗体又は多特異性抗体、モノボディ、ポリボディから選択できる。
【００６７】
さらなる治療活性剤は、制吐剤であり得る。好適な制吐剤としては、非限定的に、メトクロプラミド、ドムペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキナミド、ビエタナウチン、ブロモプリド、ブクリジン、クレボプリド、シクリジン、ジメンヒドリネート、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリジン、メタラタール、メトピマジン、ナビロン、ピパマジン、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカンナビノール類、チエチルピラジン、チオプロペラジン及びトロピセトロンが挙げられる。好ましい実施態様において、制吐剤はグラニセトロン又はオンダンセトロンである。
【００６８】
別の実施態様において、さらなる治療活性剤は、造血コロニー刺激因子であり得る。好適な造血コロニー刺激因子としては、非限定的に、フィルグラスチム、サルグラモスチム、モルグラモスチム及びエポイエチンアルファが挙げられる。
【００６９】
さらに別の実施態様において、他の治療活性剤は、オピオイド又は非オピオイド鎮痛剤であり得る。好適なオピオイド鎮痛剤としては、非限定的に、モルフィン、ヘロイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、オキシモルホン、オキシコドン、メトポン、アポモルフィン、ブプレノルフィン、メペリジン、ロペラミド、エトヘプタジン、ベータプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾン、ペマゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドン及びプロポキシフェンが挙げられる。好適な非オピオイド鎮痛剤としては、非限定的に、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカム及びスリンダクが挙げられる。
【００７０】
さらに別の実施態様において、さらなる治療活性剤は、抗不安薬であり得る。好適な抗不安薬としては、非限定的に、ブスピロン、ならびにジアゼパム、ロラゼパム、オキサザパム、クロラゼペート、クロナゼパム、クロルジアゼポキシド及びアルプラゾラムなどのベンゾジアゼピン類が挙げられる。
【００７１】
本明細書で用いられる「放射線療法剤」という用語は、非限定的に、癌の治療又は寛解に有効である当業者に公知の任意の放射線療法剤のことを意味する。例えば、放射線療法剤は、小線源照射療法又は放射線核種療法において投与される放射線療法剤であり得る。このような方法は、場合によっては、非限定的に、化学療法薬、及び／又は別の放射線療法薬などの１つ以上の追加の癌療法薬の投与をさらに含み得る。
【００７２】
医薬組成物
本発明の別の目的は、本発明によるポリペプチド又は核酸及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。
【００７３】
典型的には、本発明によるポリペプチド又は核酸は、薬学的に許容できる賦形剤、及び場合によっては、生体分解性ポリマーなどの徐放マトリクスと組み合わせて、治療組成物を形成することができる。
【００７４】
「薬学的に」又は「薬学的に許容できる」とは、哺乳動物、特にヒトに適切に投与した際に、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応を生じない分子体及び組成物を意味する。薬学的に許容できる担体又は賦形剤とは、任意のタイプの非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤化補助剤のことである。
【００７５】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は経直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独で、又は別の活性成分と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物として、単位投与形態で、動物及びヒトに投与することができる。好適な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤などの経口投与形態、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル剤、インプラント剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経真皮、脊髄内及び鼻孔内投与形態ならびに直腸投与形態を含む。
【００７６】
医薬組成物は、注射できる製剤にとって薬学的に許容できるベヒクルを含有することが好ましい。これらは、特定の等張性の滅菌生理食塩水（リン酸ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、又はそれらの塩の混合物）、又は、場合に依って、滅菌水又は生理食塩水を添加した際に注射用液剤を構成できる乾燥、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【００７７】
注射に使用する好適な医薬形態としては、滅菌水性液剤又は分散剤；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射用液剤又は分散剤の即時調製用の滅菌散剤が挙げられる。全ての場合において、滅菌であり、かつ、容易な注射可能性が存在する程度に流動性の形態でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。
【００７８】
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩として本発明の化合物を含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。また、分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール類、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。貯蔵及び使用の通常条件下、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
【００７９】
メチオニンガンマ−リアーゼは、中性形態又は塩形態で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容できる塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成）が挙げられ、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００８０】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合は必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収持続は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを用いることにより実現することができる。
【００８１】
滅菌注射用液剤は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中、必要ならば、上記で挙げた他のいくつかの成分と共に組み込み、引き続き、滅菌濾過することにより調製される。一般に、分散剤は、滅菌した種々の活性成分を、基本的な分散媒体及び上記で挙げた成分のうちから必要な他の成分を含有する滅菌媒体中へ組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、先の滅菌濾過したその溶液から活性成分と所望の追加成分の粉末を生成する減圧乾燥法及び凍結乾燥法である。
【００８２】
直接注射用のより濃縮された、又は高濃縮された液剤の調製もまた考慮されており、ここでは、小さな腫瘍領域に対する活性剤のきわめて迅速な透過、高濃度送達をもたらすために、溶媒としてＤＭＳＯの使用が予想されている。
【００８３】
製剤化の際、液剤は、投与剤形に適合する様式で、また、治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記の注射用液剤のタイプなど、種々の投与剤形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども使用できる。
【００８４】
例えば水溶液での非経口投与では、溶液は必要ならば好適に緩衝化し、液体希釈剤は先ず、十分な生理食塩水又はブドウ糖により等張性にする。これらの特定水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体を、本開示を考慮して、当業者は認識されるであろう。投与量のいくらかの変動は、治療されている対象の条件に依って、必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に対する適切な投与量を決定することになる。
【００８５】
メチオニンガンマ−リアーゼは、１投与量当たり、約０．０００１から１．０ミリグラム、又は約０．００１から０．１ミリグラム、又は約０．１から１．０ミリグラム、又は約１から１０ミリグラム、又はさらに１０から１００ミリグラムくらいを含むように、治療混合物内に製剤化できる。多投与量を投与することもできる。
【００８６】
静脈内注射又は筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容できる形態としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形剤；リポソーム製剤；徐放カプセル剤；及び現在使用されている他の形態が挙げられる。
【００８７】
本発明の別の目的は、１種以上の酵素補助因子を含む、本発明による医薬組成物に関する。例えば、前記酵素補助因子は、ピリドキサールリン酸である。
【００８８】
本発明の別の目的は、１種以上の化学療法剤又は放射線療法剤を含む、本発明による医薬組成物に関する。
【００８９】
以下の実施例と図面により本発明をさらに説明する。しかし、これらの実施例と図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】酵素に４８時間、及び７２時間曝露したＨＴ２９ヒト大腸癌細胞株における組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９の用量−効果細胞毒性曲線。
【図２】酵素に４８時間、及び７２時間曝露した正常な皮膚線維芽細胞における組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９の用量−効果細胞毒性曲線。
【図３Ａ】種々の濃度のＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露したＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、ジャーカット、及びＲｅｈヒト腫瘍細胞培養物の上澄み液中のＬ−メチオニン濃度（対照のパーセントで表す）。
【図３Ｂ】種々の濃度のＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露したＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、ジャーカット、及びＲｅｈヒト腫瘍細胞培養物の上澄み液中のＬ−メチオニン濃度（対照のパーセントで表す）。
【図４Ａ】種々の濃度のＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露したＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、ジャーカット、及びＲｅｈヒト腫瘍細胞培養物の上澄み液中のＬ−ホモシステイン濃度（対照のパーセントで表す）。
【図４Ｂ】種々の濃度のＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露したＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、ジャーカット、及びＲｅｈヒト腫瘍細胞培養物の上澄み液中のＬ−ホモシステイン濃度（対照のパーセントで表す）。
【実施例】
【００９１】
材料と方法
方法：
ブレビバクテリウム・オーランチアカム（Ｂ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ；ＡＴＣＣ  ９１７５；以前は、Ｂ．ｌｉｎｅｎｓ）由来のメチオニンガンマ−リアーゼ（ＭＧＬ−ＢＬ９２９）の特性化
種々の硫黄含有アミノ酸の非存在下、及び存在下で培養したブレビバクテリウム・オーランチアカム（ＡＴＣＣ  ９１７５）のトランスクリプトーム解析により、代謝及び遺伝子発現の種々の態様を試験した。これらの試験により、Ｂ．オーランチアカムゲノム内に推定上のＭＧＬをコードする遺伝子（ＢＬ９２９）が同定された。
【００９２】
ブレビバクテリウム・オーランチアカムのメチオニンガンマ−リアーゼ（ＭＧＬ−ＢＬ９２９）の製造
細菌株と増殖製造
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、カリフォルニア州）を、再構成Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス：必要ならば５０μg／mLのカナマイシンを添加した純水中に再懸濁した１％トリプトン、５％酵母抽出物（Ｆｌｕｋａ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ミズーリ州）１％ＮａＣｌ中、２００〜２５０rpmで振盪しながら、３０℃で、エルレンマイヤー中、増殖させた。固体培地は、１．５重量／容量％の最終濃度で工業用寒天（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）を添加することにより調製した。
【００９３】
ブレビバクテリウム・オーランチアカムのメチオニンガンマ−リアーゼＭＧＬ−ＢＬ９２９の製造と精製
Ｂ．オーランチアカムコドンの使用を大腸菌の発現系（配列番号：３）に適合させるため、Ｂ．オーランチアカム由来のＭＧＬ−ＢＬ９２９をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を最適化した。最適化遺伝子を合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ標準操作に従って、大腸菌サブクローニングベクター、公称ｐＭＡ−ＢＬ９２９内にサブクローニングした。ＢＬ９２９  ＯＲＦを、ｐＭＡ−ＢＬ９２９由来の制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｂａＩにより消化し、同酵素により先に消化された大腸菌ｐＧＴＰｃ６０８ａ発現ベクター（ＰＴａｃプロモーター、Ｌａｃオペレーター、複数のクローニング部位、ＬａｃＩｑ及びＴ１Ｔ２ターミネーターを保有するｐＥＴ９ｄ誘導体）内にライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ５α株のエレクトロコンピテントセル内に形質転換した。得られたプラスミドｐＧＴＰｃ６０８−ＢＬ９２９を消化及び配列決定により検証した。製造元の推奨に従って、制限酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＡｎｔａｒｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州）、高フィデリティーＰｈｕｓｉｏｎＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、フィンランド国）を用いた。ＤＮＡ精製キットは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Ｄuｒｅｎ、ドイツ国）から購入した。配列決定は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｅｙｌａｎ、フランス国）により実施した。
【００９４】
大腸菌の産生株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、発現プラスミドｐＧＴＰｃ６０８−ＢＬ９２９により形質転換した。ｐＧＴＰｃ６０８−ＢＬ９２９を保有する単一コロニーを、０．０２％ピリドキサル５‘−ホスフェートを添加した３５ＬのＧＹＰ培地（酵母抽出物２４ｇ／Ｌ、大豆ペプトン１２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４４．８ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４２．２ｇ／Ｌ及びグリセロール５ｇ／Ｌ）を含有する７０ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中、３７℃で増殖させた。培養物が２のＯＤ６００ｎｍに達した時、０．１mMのＩＰＴＧにより発現を誘導した。当初のグリセロールが完全に枯渇したら、濃縮供給溶液（３０重量／容量％のグリセロール及び３０重量／容量％の酵母抽出物）を、遠隔制御ポンプにより加えた。ポンプの流速は、ｐＨ設定ポイントに基づいて調節した。培養物のＯＤ６００ｎｍが４０〜５０に達したら、細胞を採集した。
【００９５】
細胞を細胞溶解緩衝液（２０mMのＴｒｉｓ、１mMのＰＭＳＦ、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＤＴＴ、０．１mMのピリドキサル５‘−ホスフェート、ｐＨ７．５）中に懸濁させ、高圧均質化により細胞溶解させた。細胞抽出物を、４℃、１５，９００ｇで３０分の遠心分離により清澄にしてから、０．４５μm低レベルタンパク質結合ディスポーザブルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ国）に通して濾過した。固体硫酸アンモニウム（ＡＳ）を細胞抽出物に加え、０．７５Ｍの最終濃度に到達させ、４℃で１６時間撹拌した。サンプルを、４℃、１５，９００ｇで３０分、遠心分離し、次いで０．４５μm低レベルタンパク質結合ディスポーザブルフィルターにより濾過して、すべての沈殿タンパク質を除去してから、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ）６ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに注入した。カラムは、２０mMのＴｒｉｓ、０．７５ＭのＡＳ、０．１mMのＰＬＰ、ｐＨ７．５により平衡化した。ＡＳ濃度を１００％から０％へ、数段階で低下させることにより、タンパク質を溶出させた。ＭＧＬ−ＢＬ９２９を含有する溶出フラクションをプールし、１０kDaのカットオフを有する限外濾過カセットを用いて５倍に濃縮してから、２０mMのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ、０．１mMのＰＬＰ、ｐＨ６．０（Ｐａｌｌ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ニューヨーク州）の７容量に対して、ダイアフィルトレーションした。
【００９６】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）溶出液を、２０mMのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ、０．１mMのＰＬＰ、ｐＨ６．０で予め平衡化したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）充填カラムに通した。ＮａＣｌ濃度を、０Ｍから１Ｍへ数段階で増加させることにより、タンパク質を溶出させた。ＭＧＬ−ＢＬ９２９を含有する溶出フラクションを回収し、限外濾過カセット（Ｐａｌｌ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ニューヨーク州）を用いて３倍に濃縮してから、４０mMのＮａ*ＰＯ４、２０μMのＰＬＰ、ｐＨ７．５の７容量に対して、ダイアフィルトレーションした。
【００９７】
ＤＥＡＥ溶出液を、０．２μm低レベルタンパク質結合ディスポーザブルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）に通す濾過により清澄にした。エンドトキシンは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅカプセル（Ｐａｌｌ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ニューヨーク州）に通す濾過により除去した。２０mg／mL〜３０mg／mLの最終濃度範囲に到達させるために、１０kDaのカットオフを有する膜を含有する撹拌セルを用いて、ＭＧＬ−ＢＬ９２９の濃縮を達成した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）。精製タンパク質は、−８０℃で貯蔵した。酵素の濃度と純度は、キャピラリー電気泳動法、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、及びＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより判定した。精製酵素のオリゴマー化状態を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１５０ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により調べた。最終産物のエンドトキシン濃度は、Ｌｏｎｚａ（Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ）によりアッセイした。
【００９８】
酵素アッセイ
アミノ酸及び置換アミノ酸に対してα，γ脱離反応を触媒する精製酵素の能力を、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスタチオニン、Ｓ−アデノシルＬ−メチオニン、Ｓ−アデノシルＬ−ホモシステイン、及びＤ−メチオニンで、別個に試験した。１mLの最終容量で、２５mMの基質を有する１００mMのＫ*ＰＯ４、０．０１mMのＰＬＰ、ｐＨ７．５中で酵素をインキュベーションすることにより、活性を測定した。混合物を２５℃で１０分間インキュベーションし、最終濃度５％までトリクロロ酢酸を添加することにより反応を停止させた。上澄み液に形成したα−ケトブチレートは、３２０nmで分光光度計を用い、３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾンにより測定した（Ｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、１９６７）。
【００９９】
細胞毒性試験と細胞株
ＭＧＬ−ＢＬ９２９の細胞効果を判定するために、７つのヒト腫瘍細胞株を用いた。これらは、５つの接着固形腫瘍由来細胞株（結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９、メトトレキサートに対する（ＨＴ２９ＭＴＸ）及びフルオロウラシルに対する（ＨＴ２９ＦＵｒａ）高レベルの耐性に関して選択されたＨＴ２９の２つの安定変異体、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、及び肝芽細胞腫由来細胞株（ＨｅｐＧ２）、ならびに２つの非接着腫瘍細胞株（Ｔ細胞リンパ腫細胞株ジャーカット、及び急性白血病細胞株Ｒｅｈなど）を含む。同様に、癌細胞に対するＭＧＬ−ＢＬ９２９２の選択性を探索するために、ヒト非腫瘍皮膚線維芽細胞（ＣＤＧＩＩ）を種々の濃度のＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露した。
【０１００】
細胞株は無マイコプラズマ凍結貯蔵物から解凍し、汚染に対して管理した。５％ＣＯ２を含有する大気中、３７℃で、１０％ＦＢＳと抗生物質（ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬ、及びペニシリン、５０Ｕ／mL）を添加した細胞培養培地（各細胞株の増殖要件に従って、ＲＰＭＩ  １６４０又はＤＭＥＭ）中で細胞を維持した。１２ウェル細胞プレート中、細胞を０．０５Ｕ／mLから５Ｕ／mLの範囲の濃度の精製組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露し、曝露開始から２４時間、４８時間、７２時間、及び９６時間後に採集した。Ｍａｌａｓｓｅｚチャンバ中、Ｔｒｙｐａｎブルー色素排除試験により、細胞生存度を測定した。
【０１０１】
細胞培養におけるＬ−メチオニン及びＬ−ホモシステインの測定
ｔ０〜種々の濃度のＭＧＬ−ＢＬ９２９に２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間曝露させて、１０％ＦＢＳを添加した細胞培養培地中で指数増殖しているＨＴ２９，ＳＫＯＶ３、ジャーカット、及びＲｅｈの細胞培養物の上澄み液中、Ｌ−メチオニンとＬ−ホモシステインの濃度を測定した。ＨＴ２９はＤＭＥＭ中で、他の３つの細胞株は、ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地中で増殖させた。測定はイオン交換クロマトグラフィーにより行った（Ｎ．Ｂ．、ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地中、及びＤＭＥＭ細胞培養培地中、Ｌ−ホモシステインの濃度はそれぞれ、１０１μｍｏｌ／Ｌと２０１μｍｏｌ／Ｌ）。
【０１０２】
ウェスタンブロットによるタンパク質安定性の試験
種々の濃度の組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露した培養物中のＨＴ２９細胞の上澄み液のフラクションを、変性条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いで、精製酵素に対して作出したポリクローナルウサギ抗ＭＧＬ−ＢＬ９２９血清を用いたウェスタンブロット（ＷＢ）により明らかにした。
【０１０３】
ウェスタンブロット解析は、精製組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９と共に７２時間インキュベーションしたヒト血清においても実施した。
【０１０４】
結果
ブレビバクテリウム・オーランチアカム（Ｂ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ；ＡＴＣＣ９１７５；以前はＢ．ｌｉｎｅｎｓ）由来のメチオニンガンマ−リアーゼ（ＭＧＬ−ＢＬ９２９）の特性化
Ｌ−システイン及びＬ−システインプラスＬ−メチオニンの存在下でのブレビバクテリウム・オーランチアカム（ＡＴＣＣ９１７５）遺伝子発現プロファイルの比較により、メチオニンの存在下、推定上のＭＧＬをコードする遺伝子ＢＬ９２９を含む２つの隣接遺伝子のアップレギュレーションが示された。ＢＬ９２９のアップレギュレーションはメチオニンの分解から生じた大量の揮発性イオウ化合物の生成を伴った（Ｆｏｒｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。
【０１０５】
推定上のＢＬ９２９遺伝子の配列は、Ｂ．ｌｉｎｅｎｓ（ブレビバクテリウム・リネンス  ＢＬ２  ＮＺ＿ＡＡＧＰ０１０００００７、全ゲノムショットガン配列）のゲノム内に同定された。このゲノムは、１１５５３５の塩基対（ｂｐ）を含む。推定上のＭＧＬヌクレオチド配列ＢＬ９２９は、３４４１５位にあり、１１８２ｂｐ（３４４１５から３５５９６）（配列番号：２）からなる。翻訳タンパク質配列のレファレンスは、ＺＰ＿０５９１３００４．１（配列番号：１）である。
【０１０６】
精製
ＭＧＬ−ＢＬ９２９の精製は、５Ｌ規模の細胞ペレットから４段階のクロマトグラフィーステップの後、均質化して達成された（表１）。この精製方式により、きわめて低レベルのエンドトキシンを含有する９４％のタンパク質純度を有する１．２ｇのＭＧＬ−ＢＬ９２９が精製され、２３％の回収率に相当した。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
酵素のサイズ
天然酵素の分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により調べた。精製ＭＧＬ−ＢＬ９２９の流体力学容量は、１７１．５kDaの球状タンパク質に相当する。変性条件下、キャピラリー電気泳動法によって判定したＭＧＬ−ＢＬ９２９の分子量は４６．５kDaであるので、前記結果は、ＭＧＬ−ＢＬ９２９が、単分散ホモ四量体種であることを示唆する。
【０１０９】
基質特異性
種々の基質に対する精製ＭＧＬ−ＢＬ９２９の酵素活性を、産生されたα−ケト酸の測定（Ｓｏｄａｅｔ  ａｌ．，１９６７）により判定した。精製酵素は、Ｌ−メチオニン及びＬ−ホモシステインのα，γ−脱離を触媒した（表２）。この酵素は、Ｌ−システイン、Ｌ−シスタチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びＤ−メチオニンに対しては活性を持たなかった。Ｌ−ホモシステインに対する精製ＭＧＬ−ＢＬ９２９の親和性及び特異的活性は、Ｌ−メチオニンに対して測定されたものよりも、それぞれ７．３倍と４．８倍大きかった。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
培養液中で増殖しているヒト腫瘍細胞株に対して精製ＭＧＬ−ＢＬ９２９は強い細胞毒活性を発揮する。
【０１１２】
大多数の細胞株において、０．５Ｕ／mlのＭＧＬ−ＢＬ９２９を超えるレベルで、ＭＧＬ−ＢＬ９２９の細胞毒性が現れ、酵素濃度の増加につれて増大した。表３に、曝露７２時間での各細胞株のＩＣ５０をまとめてあり、腫瘍細胞と正常細胞において５０％の増殖抑制を達成する組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９の濃度（ユニット／mL）を表している。
種々の腫瘍細胞株におけるＩＣ５０には差があり；リンパ腫及び白血病由来細胞ならびに標準的な結腸癌ＨＴ２９細胞において最低である。他の腫瘍由来細胞において、ＩＣ５０は、１Ｕ／ml〜１．５Ｕ／mlに含まれる。興味深いことに、細胞が、酵素と、細胞が十分に耐性を有するメトトレキサート（ＭＴＸ）１μMとに同時に曝露された場合、ＨＴ２９ＭＴＸにおけるＭＧＬ−ＢＬ９２９のＩＣ５０は低く（０．３Ｕ／ml）、このことは、ＭＧＬ−ＢＬ９２９が細胞増殖抑制剤に対する前の耐性を克服し得ることを示唆している。ＭＧＬ−ＢＬ９２９による５−フルオロウラシル（ＦＵｒａ）の増強を強く示唆している結果が、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９において得られた。これらの結果から、ＭＧＬ−ＢＬ９２９は、細胞増殖抑制剤の細胞毒性を増強することができ、これらの化合物に対する前の耐性を克服できると、発明者らは結論づける。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
ＭＧＬ−ＢＬ９２９に対するヒト非腫瘍線維芽細胞ＣＤＧＩＩの曝露がそれらの増殖に影響を及ぼすのは、癌細胞の細胞毒性に必要な濃度よりきわめて高い濃度レベルにおいてのみである。本発明者らは、４Ｕ／mlまでの濃度では、ＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露した細胞数に測定可能な減少を観察しなかった。図２に示されるように、５Ｕ／mlでは、酵素に対する曝露開始から７２時間で、わずかな増殖抑制が観察された。
【０１１５】
ＭＧＬ−ＢＬ９２９は、ヒト腫瘍細胞培養物の上澄み液中のＬ−メチオニン及びＬ−ホモシステインを長時間枯渇させる。
ＭＧＬ−ＢＬ９２９への曝露は、試験した４つ全ての細胞株の上澄み液中で、メチオニンのレベルを急速に低下させ、この効果は酵素濃度の増加につれて増大した。図３及び４に示すように、所与のＭＧＬ−ＢＬ９２９濃度により達成されたメチオニン枯渇の程度は、全ての実験継続時間中、維持された。
【０１１６】
増殖中の細胞に由来する、メチオニンの内在性前駆体であるＬ−ホモシステインでも図は同様である。Ｌ−メチオニンに関して、細胞培養物の上澄み液中のＬ−ホモシステイン濃度は、ＭＧＬ−ＢＬ９２９への曝露下で、大きく低下し、この効果は酵素濃度の増加につれて増大した。
【０１１７】
組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９は、腫瘍細胞培養条件下で長時間安定である。
ＨＴ２９細胞培養物の上澄み液中で、組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９の安定性を試験した。対照は、新鮮なＤＭＥＭ培地中、１Ｕ／mLの精製組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９である。０時間で１Ｕ／mLのＭＧＬ−ＢＬ９２９に曝露したＨＴ２９細胞の上澄み液を、実験開始から２４時間、４８時間、７２時間、及び９６時間で採集した。
【０１１８】
ポリクローナルウサギ抗精製ＭＧＬ−ＢＬ９２９血清を用いて実施したウェスタンブロット解析では、細胞培養の条件下、４日間に検出可能なタンパク質の変化を示すことはできなかった。酵素に対する単回曝露後、同じ期間中の持続的なＬ−メチオニン枯渇と共に、この所見は、ＭＧＬ−ＢＬ９２９が、これらの条件下、長時間安定であることを示している。
【０１１９】
組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９は、インビトロのヒト血清において、長時間安定である。
インビトロのヒト血清においても、血清を種々の量の酵素と共にインキュベーションすることにより、組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９の安定性を試験した。腫瘍細胞培養物の上澄み液に関するウェスタンブロット解析では、酵素とのインキュベーション開始から７２時間中にタンパク質の変化は示されなかった。
【０１２０】
発明者らは、９４％のタンパク質純度及び低エンドトキシンレベル（３１EU／ml）を有する１．２ｇの組換えＭＧＬ−ＢＬ９２９を１バッチ製造し精製した。製造されたＭＧＬ−ＢＬ９２９は、高レベルのＬ−メチオニンγ−リアーゼとＬ−ホモシステイナーゼの活性を有した。酵素は、（ａ）腫瘍細胞培養培地から長時間、メチオニンとホモシステインを枯渇させ、（ｂ）腫瘍細胞培養条件下、及びインビトロのヒト血清中、安定であり、（ｃ）培養中に増殖する種々のヒト腫瘍細胞に対して高い細胞毒活性を有し、（ｄ）癌細胞に対して高い細胞毒性である濃度において、正常細胞の増殖に悪影響を及ぼさず、（ｄ）細胞増殖抑制剤の細胞毒活性を増強（調節）し、（ｄ）細胞増殖抑制剤に対する前の細胞耐性を無効化する。したがって、メチオニンガンマ−リアーゼとホモシステイナーゼの活性を示すＭＧＬ−ＢＬ９２９の使用は、癌治療において、腫瘍細胞の増殖を低下させ、細胞増殖抑制剤の細胞毒活性を増強し、細胞増殖抑制剤に対する前の細胞耐性を無効化するための選択的独創的な手法である。
【０１２１】
【化１】
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【０１２２】
文献：
本出願を通して、種々の文献に本発明に関する現在の技術状況が記載されている。これらの文献の開示は、本明細書で、参照として本開示に組み込まれている。
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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