(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を評価するための診断法、およびＥＭＴ遺伝子シグネチャーインデックススコアを利用して、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤で癌患者を治療する有効性を予測するための診断法を提供する。本発明は、これらの方法を取り込む、癌患者を治療するための方法をさらに提供する。【選択図】図４５
2014519813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；
共相関（ｃｏ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
ヒト腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項４】
腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物での治療から利益を受けうる癌患者を同定する方法であって：
患者から腫瘍細胞サンプルを得て、
該サンプルにおける、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２のＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベルを測定し；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し； 
前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そして
ＥＭＴインデックススコアが間葉表現型の細胞により似ている場合、患者を、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物での治療から利益を受けうる患者であると同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項５】
ＥＭＴＧＳインデックススコアを引き出すために用いるアルゴリズムが、アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１である、請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
腫瘍細胞が、癌患者由来の腫瘍由来である、請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項７】
発現レベルを測定する工程の前に、患者腫瘍細胞サンプルを得るさらなる工程を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
腫瘍細胞サンプルを腫瘍生検から得る、請求項６の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞サンプルを、循環腫瘍細胞を含有する血液細胞から得る、請求項６の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞がＮＳＣＬ癌、乳癌、結腸直腸癌、または膵臓癌腫瘍細胞である、請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項１１】
癌患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって：
請求項１の方法を用いて、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ているかどうかを評価することによって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性を診断し、そして
患者の腫瘍細胞がＥＭＴを経ておらず、そしてしたがってＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に反応性である可能性が高い場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
癌患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって：
請求項１の方法を用いて、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ているかどうかを評価することによって、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性を診断し、そして
患者の腫瘍細胞がＥＭＴを経ておらず、そしてしたがってＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤による阻害に反応性である可能性が高い場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
癌患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって：
請求項４の方法を用いて、ＥＭＴの阻害剤での治療から利益を受けうる患者であると同定し、そして
前記患者に、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物の療法的有効量を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
癌患者を治療する方法であって：
請求項２の方法を用いて、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いかどうかを決定し、そして
患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
癌患者を治療する方法であって：
請求項２の方法を用いて、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤がエルロチニブを含む、請求項１１、１４または１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
癌患者を治療する方法であって：
請求項３の方法を用いて、患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いかどうかを決定し、そして
患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
癌患者を治療する方法であって：
請求項３の方法を用いて、患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤がＯＳＩ−９０６を含む、請求項１２、１７または１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
以下の遺伝子：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、およびＺＥＢ２の各々に対するプライマー対からなるＰＣＲプライマーセット。
【請求項２１】
固相表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットが、以下の遺伝子：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、およびＺＥＢ２の各々に特異的なプローブからなる、前記ＤＮＡマイクロアレイチップ。
【請求項２２】
複数の腫瘍細胞サンプル各々における、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：
腫瘍細胞サンプル各々において、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、各腫瘍細胞試料に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
腫瘍細胞サンプル各々に関して、前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、各腫瘍細胞サンプルのＥＭＴ状態を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
腫瘍増殖が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されるかどうかを予測する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害される参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されない参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、腫瘍増殖がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されるかどうかを予測する
工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し；ここでＥＭＴＧＳは、ＥＭＴ中に協調して制御されると決定されている遺伝子群からなる；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し；ここでＥＭＴＧＳは、（ａ）ＥＭＴの多数の腫瘍細胞モデルにおいて協調して制御される遺伝子の最初の群の選択；および（ｂ）多数のヒト腫瘍データセットにおいて発現が共相関される遺伝子の数を最大にするような、遺伝子の反復付加または前記群からの遺伝子の反復除去の工程を含むプロセスによって、ＥＭＴ中に協調して制御されると決定されている遺伝子群からなる；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を同定する方法であって、スクリーニングしようとする試験化合物と、上皮腫瘍細胞株の細胞サンプルを接触させ、腫瘍細胞において上皮間葉転換を誘導する剤とサンプルを接触させ、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を、試験化合物と接触させていない腫瘍細胞の同一サンプルにおけるＥＭＴ状態と比較することによって、サンプル中の腫瘍細胞が上皮間葉転換を経るのを阻害するかどうかを決定し、ここで腫瘍細胞のＥＭＴ状態を請求項１の方法によって決定する、そしてしたがって、試験化合物が、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物であるかどうかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２７】
試験化合物が、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、オーロラＡ、ＴＮＫ２、ＳＲＣ、ＴＡＫ１、ＭＥＴ；ヒストンデアセチラーゼ；ＬＰＡ受容体、ＳＨＨシグナル伝達経路、ＷＮＴシグナル伝達経路、ＴＧＦ−ベータ受容体；ＴＮＦ−アルファ受容体；またはＯＳＭ受容体の阻害剤である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
阻害剤化合物での治療に対するヒト腫瘍の反応性を監視して、阻害剤が腫瘍細胞におけるＥＭＴを阻害するのに有効かどうかを決定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、前記治療の前および後の両方で、特定の生物学的機構を通じて作用するＥＭＴ阻害剤化合物によってＥＭＴが阻害された際に協調して制御されると決定されており、そしてその機構を通じた阻害に特徴的である遺伝子群からなる、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、治療の前および後の両方で、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
参照上皮腫瘍細胞および参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに比較した、前記治療の前および後の両方の、ＥＭＴＧＳインデックススコアにおける相違の度合いから、阻害剤化合物での治療が腫瘍細胞中のＥＭＴを阻害するのに有効であるかどうかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２９】
阻害剤化合物が、ＭＥＴキナーゼ阻害剤であり、そしてＥＭＴＧＳが以下の遺伝子：ＣＹＰ４Ｘ１、ＦＯＳＢ、ＭＭＰ９、ＶＩＭ、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＨＯＰＸ、ＭＭＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、およびＶＷＦから本質的になる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
阻害剤化合物が、ＦＡＫキナーゼ阻害剤であり、そしてＥＭＴＧＳが以下の遺伝子：ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＭＰＺＬ２、ＭＡＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、およびＴＭＥＭ４５Ｂから本質的になる、請求項２８の方法。
【請求項３１】
阻害剤化合物が、ＴＡＫ１キナーゼ阻害剤であり、そしてＥＭＴＧＳが以下の遺伝子：ＦＯＳＢ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＭＭＰ９、ＭＳＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ２、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、およびＸＢＰ１から本質的になる、請求項２８の方法。
【請求項３２】
ＥＭＴＧＳインデックススコアを引き出すために用いるアルゴリズムが、アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１である、請求項２８〜３１のいずれかの方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞が癌患者由来の腫瘍由来である、請求項２８〜３１のいずれかの方法。
【請求項３４】
腫瘍細胞サンプルを腫瘍生検から得る、請求項２８〜３１のいずれかの方法。
【請求項３５】
腫瘍細胞サンプルを、循環腫瘍細胞を含有する血液サンプルから得る、請求項２８〜３１のいずれかの方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞がＮＳＣＬ癌、乳癌、結腸直腸癌、または膵臓癌腫瘍細胞である、請求項２８〜３１のいずれかの方法。
【請求項３７】
ヒト腫瘍を、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性であるかまたは非反応性である可能性が高いと同定する方法であって：
腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、
ここでＥＭＴＧＳは、以下の遺伝子：ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＯＸＣ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＯＰＸ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＰＺＬ２、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＺＢＴＢ１０から本質的になるか、
またはＥＭＴＧＳは、以下の遺伝子：ＡＧＲ２、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ４、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＩＫＢＩＰ、ＯＣＬＮ、ＳＨ３ＹＬ１から本質的になるか；
またはＥＭＴＧＳは、以下の遺伝子：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２の少なくとも５４を含むか；
またはＥＭＴＧＳは、以下の遺伝子：ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＯＸＣ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＯＰＸ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＰＺＬ２、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＺＢＴＢ１０の少なくとも２４を含む；
共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして
該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項３８】
ＥＭＴＧＳインデックススコアを引き出すために用いるアルゴリズムが、アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
腫瘍細胞が癌患者由来の腫瘍由来である、請求項３７の方法。
【請求項４０】
発現レベルを測定する工程の前に、患者腫瘍細胞サンプルを得るさらなる工程を含む、請求項３９の方法。
【請求項４１】
腫瘍細胞サンプルを腫瘍生検から得る、請求項３９の方法。
【請求項４２】
腫瘍細胞サンプルを、循環腫瘍細胞を含有する血液細胞から得る、請求項３９の方法。
【請求項４３】
腫瘍細胞がＮＳＣＬ癌、乳癌、結腸直腸癌、または膵臓癌腫瘍細胞である、請求項３７の方法。
【請求項４４】
癌患者を治療する方法であって：
請求項３７の方法を用いて、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いかどうかを決定し、そして
患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４５】
癌患者を治療する方法であって：
請求項３７の方法を用いて、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤がエルロチニブを含む、請求項１４または１５の方法。
【請求項４７】
癌患者を治療する方法であって：
請求項３７の方法を用いて、患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いかどうかを決定し、そして
患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４８】
癌患者を治療する方法であって：
請求項３７の方法を用いて、患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４９】
ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤がＯＳＩ−９０６を含む、請求項４７または４８のいずれかの方法。
【請求項４７】
遺伝子リスト（Ａ）およびデータセット（Ｂ）に関するインデックススコアを計算するために適用するアルゴリズムが、以下の工程を行う、請求項１〜４、２２〜２５、２８、または３７のいずれかの方法：
１）Ｂにおいて、Ａに関する相関に基づくアンカー遺伝子（ＡＧ）を：
ａ）Ｂにおけるすべてのサンプルに渡って、Ａにおけるすべての遺伝子−遺伝子対に関する遺伝子発現のピアソンまたはスピアマン相関を計算し；そして
ｂ）ＡＢに関するＡＧは、以下：
【化１】
2014519813.tif 000041
式中、ＡＧＡＢはデータセットＢにおける遺伝子リストＡに関するアンカー遺伝子であり、Ｎｘは遺伝子ｘを含むすべての遺伝子−遺伝子対のセットであり、ｎはＮｘ中の遺伝子−遺伝子対の数であり、そして｜Ｒ｜は、Ｂにおけるすべてのサンプルに渡る各遺伝子−遺伝子対に関するピアソンまたはスピアマン相関係数の絶対値である
を最大にする遺伝子ｘである
によって定義し；
２）遺伝子リスト（ＡＡＧ）から：
ａ）ＡＧに対する相関のＰ値に基づいて、すべての遺伝子を順位付けし；そして
ｂ）ＡＡＧを、Ｂに渡ってＡＧと相関するＡにおける遺伝子サブセットと定義し、ここでＰ値≦ｃであり、式中、ｃは、ユーザーが規定する有意性カットオフである
によって、ＡＧと有意に相関する遺伝子サブセットを選択し；そして
３）Ｂにおける各サンプルｓに関して：
ａ）ＩＡＢｓを：
【化２】
2014519813.tif 000042
式中、ＡＡＧは、アンカー遺伝子ＡＧと有意に相関するＡにおける遺伝子サブセットであり、ｍは、ＡＡＧにおける遺伝子の数であり、そしてｅｓｘ’は、以下のように、データセットＢのサンプルｓにおける遺伝子ｘ（サブセットＡＡＧ由来）の発現と定義される：
【化３】
2014519813.tif 000043
｛式中、ｅｓｘは、サンプルｓにおける遺伝子ｘの発現であり、μＢｘはデータセットＢにおける遺伝子ｘの平均発現であり、そしてＲｘは、アンカー遺伝子ＡＧと遺伝子ｘの相関係数である｝
と定義する
によって、遺伝子リストＡに関する相関に基づく発現インデックススコア（Ｉ）を計算する。
【請求項４８】
遺伝子リスト（Ａ）およびデータセット（Ｂ）に関するインデックススコアを計算するために適用するアルゴリズムが、以下の工程を行う、請求項１〜４、２２〜２５、２８、または３７のいずれかの方法：
１）Ｂにおいて、Ａに関する相関に基づくアンカー遺伝子（ＡＧ）を：
ａ）Ｂにおけるすべてのサンプルに渡って、Ａにおけるすべての遺伝子−遺伝子対に関する遺伝子発現のピアソンまたはスピアマン相関を計算し；そして
ｂ）ＡＢに関するＡＧは、以下：
【化４】
2014519813.tif 000044
式中、ＡＧＡＢはデータセットＢにおける遺伝子リストＡに関するアンカー遺伝子であり、Ｎｘは遺伝子ｘを含むすべての遺伝子−遺伝子対のセットであり、ｎはＮｘ中の遺伝子−遺伝子対の数であり、そして｜Ｒ｜は、Ｂにおけるすべてのサンプルに渡る各遺伝子−遺伝子対に関するピアソンまたはスピアマン相関係数の絶対値である
を最大にする遺伝子ｘである
によって定義し；
２）遺伝子リスト（ＡＡＧ）から：
ａ）ＡＧに対する相関のＰ値に基づいて、すべての遺伝子を順位付けし；そして
ｂ）ＡＡＧを、Ｂに渡ってＡＧと相関するＡにおける遺伝子サブセットと定義し、ここでＰ値≦ｃであり、式中、ｃは、ユーザーが規定する有意性カットオフである
によって、ＡＧと有意に相関する遺伝子サブセットを選択し；そして
３）Ｂにおける各サンプルｓに関して：
ａ）ＩＡＢｓを：
【化５】
2014519813.tif 000045
式中、ＡＡＧは、アンカー遺伝子ＡＧと有意に相関するＡにおける遺伝子サブセットであり、ｍは、ＡＡＧにおける遺伝子の数であり、そしてｅｓｘ’は、以下のように、データセットＢのサンプルｓにおける遺伝子ｘ（サブセットＡＡＧ由来）の発現と定義される：
【化６】
2014519813.tif 000046
｛式中、ｅｓｘは、サンプルｓにおける遺伝子ｘの発現であり、μＢｘはデータセットＢにおける遺伝子ｘの平均発現であり、そしてＲｘは、アンカー遺伝子ＡＧと遺伝子ｘの相関係数である｝
と定義する
によって、遺伝子リストＡに関する相関に基づく発現インデックススコア（Ｉ）を計算する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
[1]癌は、制御されない増殖、分化の欠如、および局所組織に浸潤し、そして遠隔部位に転移する潜在能力によって特徴付けられる、広範囲の細胞性機能不全および制御不全の総称である。これらの新生物悪性疾患は、多様な度合いの出現率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）で、体のすべての組織および臓器に影響を及ぼしうる。本発明は、癌患者を診断し、そして治療するための方法に関する。特に、本発明は、プロテインキナーゼの阻害剤、例えば上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ）、またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤（例えばＯＳＩ−９０６）である抗癌剤での治療からどの患者が最も利益を受けるかを決定するための方法、および新規抗癌剤を同定し、そして特徴付けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[2]プロテインキナーゼの阻害剤は、哺乳動物癌細胞増殖の選択的阻害剤として有用であると認識されてきている。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子産物のキナーゼ活性を阻害する２−フェニルピリミジンチロシンキナーゼ阻害剤であるグリーベックＴＭ（メシル酸イマチニブとしても知られる）は、ＣＭＬの治療に関して、米国食品医薬品局によって認可されてきている。４−アニリノキナゾリン化合物タルセバＴＭ（エルロチニブＨＣｌ）もまた、ＦＤＡによって認可されてきており、そして高い有効性でＥＧＦ受容体キナーゼを選択的に阻害する。ＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ活性を直接阻害する化合物、ならびにＩＧＦ−１Ｒ活性化を遮断することによってＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性を減少させる抗体、またはＩＧＦ−１Ｒ発現を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを抗腫瘍剤として使用するための開発は、集中的に研究努力がなされてきた分野である（例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｏ．ら（２００５）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９２：２０９７−２１０１；  Ｉｂｒａｈｉｍ，  Ｙ．Ｈ．およびＹｅｅ，  Ｄ．（２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：９４４ｓ−９５０ｓ；  Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，  Ｃ．Ｓ．ら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０；  Ｃａｍｉｒａｎｄ，  Ａ．ら（２００５）  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：Ｒ５７０−Ｒ５７９  （ＤＯＩ  １０．１１８６／ｂｃｒ１０２８）；  Ｃａｍｉｒａｎｄ，  Ａ．およびＰｏｌｌａｋ，  Ｍ．（２００４）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１８２５−１８２９；  Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，  Ｃ．ら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９；  Ｓａｃｈｄｅｖ  ＤおよびＹｅｅ  Ｄ．，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００７  Ｊａｎ；６（１）：１−１２；  Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｆ．およびＧａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ｃ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００５  １０：１０４１−７を参照されたい）。ＩＧＦ−１Ｒ経路を阻害する剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方の多数のヒト癌モデルにおいて、特に、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫の小児モデルにおいて、抗腫瘍有効性を示してきている（Ｍａｎａｒａ  ＭＣら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５  ２７：１６０５−１６）。肉腫患者において、初期に有効性の兆しがあったにもかかわらず、初期の臨床試験における今日までのＩＧＦ−１Ｒ阻害剤の結果は印象的ではなく、このアプローチを前進させるには、患者選択戦略および合理的な組み合わせが必要でありうることが示されている（Ｔｏｌｃｈｅｒ  Ａ．Ｗ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２００７  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｖｏｌ  ２５，  Ｎｏ．  １８Ｓ（６月２０日補遺），  ２００７：  ３００２）。これまでに得られたデータは、ＩＧＦ−１Ｒ経路のメンバーの活性化、過剰発現、または増幅が、反応性を予測するとは示していない。
【０００３】
[3]上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、分化および増殖などの細胞性反応に関与する、４つの緊密に関連する受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）を含む。ＥＧＦＲキナーゼ、またはそのリガンド、トランスフォーミング増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）の過剰発現は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、および星状細胞腫を含む、多くの癌に頻繁に関連づけられ、そしてこれらの腫瘍の悪性増殖に寄与すると考えられる。ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ）における特異的欠失突然変異は、細胞腫瘍原性を増加させることもまた見出されてきている。ＥＧＦＲが刺激するシグナル伝達経路の活性化は、潜在的に癌促進性である多くのプロセス、例えば増殖、血管新生、細胞運動性および浸潤、アポトーシス（プログラム細胞死）減少、ならびに薬剤耐性誘導を促進する。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現増加は、疾患進行、転移および劣った予後と頻繁に関連づけられる。例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および胃癌において、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現増加は、高い転移率、劣った腫瘍分化および腫瘍増殖増加と相関することが示されてきている。
【０００４】
[4]ＥＧＦ受容体の生得的なプロテインチロシンキナーゼ活性を活性化し、そして／または下流シグナル伝達を増加させる突然変異が、ＮＳＣＬＣおよび神経膠芽腫において観察されてきている。しかし、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えばエルロチニブ（タルセバ（登録商標））またはゲフィチニブ（イレッサＴＭ）に対する感受性を与える原理機構としての突然変異の役割には、議論の余地があり続けている。近年、全長ＥＧＦＲの突然変異型が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブに対する反応性を予測することが報告されてきている（Ｐａｅｚ，  Ｊ．  Ｇ．ら（２００４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−１５００；  Ｌｙｎｃｈ，  Ｔ．  Ｊ．ら（２００４）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０：２１２９−２１３９）。細胞培養研究によって、ＥＧＦＲの突然変異型を発現する細胞株（すなわちＨ３２５５）は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブによる増殖阻害により感受性であり、そして野生型ＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞株を阻害するにははるかにより高濃度のゲフィチニブが必要であることが示されてきている。これらの観察によって、ＥＧＦＲの特定の突然変異型は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対するより高い感受性を反映する可能性もあるが、完全に非反応性の表現型を同定しないことが示唆される。
【０００５】
[5]ＥＧＦＲのキナーゼ活性を直接阻害する化合物、ならびにＥＧＦＲ活性化を遮断することによってＥＧＦＲキナーゼ活性を減少させる抗体を抗腫瘍剤として使用するための開発は、集中的に研究努力がなされてきた分野である（ｄｅ  Ｂｏｎｏ  Ｊ．Ｓ．およびＲｏｗｉｎｓｋｙ，  Ｅ．Ｋ．（２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：Ｓ１９−Ｓ２６；  Ｄａｎｃｅｙ，  Ｊ．およびＳａｕｓｖｉｌｌｅ，  Ｅ．Ａ．（２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３）。エルロチニブ（例えばエルロチニブＨＣｌ、またタルセバ（登録商標）またはＯＳＩ−７７４としても知られる）は、経口的に利用可能なＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エルロチニブは、結腸直腸癌および乳癌を含む、多くのヒト腫瘍細胞株において、ＥＧＦＲキナーゼに対する実質的な阻害活性を示してきており（Ｍｏｙｅｒ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：４８３８）、そして前臨床評価によって、多くのＥＧＦＲ発現ヒト腫瘍異種移植片に対する活性が立証されてきている（Ｐｏｌｌａｃｋ，  Ｖ．Ａ．ら（１９９９）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２９１：７３９）。より最近は、エルロチニブは、頭頸部癌（Ｓｏｕｌｉｅｒｅｓ，  Ｄ．ら（２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：７７）、ＮＳＣＬＣ（Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ  Ｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０：３１０ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  １２３５）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）（Ｏｚａ，  Ｍ．ら（２００３）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：１９６ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ７８５）および転移性乳癌（ＭＢＣ）（Ｗｉｎｅｒ  Ｅ．ら（２００２）  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ７６：５１１５ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ４４５）を含む多くの適応症において、第Ｉ期および第ＩＩ期臨床試験における有望な活性を示してきている。第ＩＩＩ期臨床試験において、エルロチニブ単一療法は、進行した治療不応性ＮＳＣＬＣ患者において、有意に生存を延長させ、疾患進行を延長させ、そして肺癌関連症状の悪化を遅延させた（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，  Ｆ．ら（２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２２：１４Ｓ（７月１５日補遺），  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ７０２２）。エルロチニブに関する臨床試験データの大部分は、ＮＳＣＬＣにおける使用に関連するが、第Ｉ／ＩＩ期研究からの予備的結果は、ＣＲＣ（Ｏｚａ，  Ｍ．ら（２００３）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：１９６ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ７８５）およびＭＢＣ（Ｊｏｎｅｓ，  Ｒ．Ｊ．ら（２００３）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：４５ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  １８０）を含む、広範囲のヒト固形腫瘍型を患う患者において、エルロチニブおよびカペシタビン／エルロチニブ併用療法に関する有望な活性を立証してきている。２００４年１１月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、少なくとも１回の先の化学療法措置に失敗した後の局所進行性または転移性ＮＳＣＬＣの患者の治療に関して、タルセ��（登録商標）を認可した。タルセバ（登録商標）は、第ＩＩＩ期臨床試験において、進行性ＮＳＣＬＣ患者の生存の増加を示した、ＥＧＦＲクラスの唯一の薬剤である。
【０００６】
[6]ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体ファミリーに属し、このファミリーには、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦ−１Ｒ（ホモ二量体）、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ（ハイブリッド受容体）、およびＩＧＦ−２Ｒ（マンノース６リン酸受容体）が含まれる。ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲハイブリッドはホモ二量体として働き、ＩＧＦと優先的に結合し、そしてシグナル伝達する。ＩＲは２つのアイソフォームで存在する：ＩＲ−Ｂ（伝統的なインスリン受容体）およびＩＲ−Ａ（選択された腫瘍中で再発現され、そしてＩＧＦ−ＩＩに優先的に結合する致死型）。ＩＧＦ−２Ｒは、ＩＧＦ−ＩＩの「シンク」として作用する非シグナル伝達受容体である(Ｐｏｌｌａｋ  Ｍ．Ｎ．ら  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４  ４：５０５−１８）。６つのよく性質決定されたインスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜−６）はＩＧＦリガンドと会合してＩＧＦを安定化し、そしてＩＧＦがＩＧＦ−ＩＲに結合する能力を調節する。
【０００７】
[7]ＩＧＦ−１Ｒは、ＩＧＦ−１に主に結合するが、より低いアフィニティでＩＧＦ−ＩＩおよびインスリンにも結合する、膜貫通ＲＴＫである。受容体へのＩＧＦ−１の結合は、チロシンキナーゼ活性の活性化、分子間受容体自己リン酸化、ならびにＩＲＳ１およびＳｈｃを含む細胞基質のリン酸化を生じ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を導く（Ａｄａｍｓ  Ｔ．Ｅ．ら  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０００  ５７：１０５０−９３；  Ｐｏｌｌａｋ  Ｍ．Ｎ．ら  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４  ４：５０５−１８；  Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９９９  ２５３：１−６）。リガンド活性化ＩＧＦ−１Ｒは、正常細胞において分裂促進活性を誘導し、そして異常な増殖において重要な役割を果たす。ＩＧＦ−１系の主な生理学的役割は、正常な増殖および再生の促進である。過剰発現されたＩＧＦ−１Ｒ（１型インスリン様増殖因子受容体）は、有糸分裂誘発を開始し、そしてリガンド依存性新生物性形質転換を促進しうる。さらに、ＩＧＦ−１Ｒは、悪性表現型の確立および維持において重要な役割を果たす。上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体とは異なり、ＩＧＦ−１Ｒの突然変異発癌型は同定されてきていない。しかし、いくつかの癌遺伝子がＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒ発現に影響を及ぼすことが立証されてきている。ＩＧＦ−１Ｒ発現の減少および形質転換に対する耐性の間の相関が見られてきている。ＩＧＦ−１Ｒ  ＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡに細胞を曝露すると、いくつかのヒト腫瘍細胞株の軟寒天増殖が防止される。ＩＧＦ−１Ｒは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、アポトーシスへの進行を抑止する。野生型レベルより低いＩＧＦ−１Ｒレベルに減少すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞のアポトーシスが引き起こされることもまた示されてきている。ＩＧＦ−１Ｒ破壊がアポトーシスを引き起こす能力は、正常の非腫瘍原性細胞において低下しているようである。
【０００８】
[8]ＩＧＦ−１経路は、ヒト腫瘍発展において重要な役割を有する。ＩＧＦ−１Ｒ過剰発現は、多様な腫瘍（乳房、結腸、肺、肉腫）において頻繁に見出され、そしてしばしば高悪性度の表現型と関連する。高い循環ＩＧＦ１濃度は、前立腺癌、肺癌および乳癌リスクと強く相関する。さらに、ＩＧＦ−１Ｒは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの形質転換表現型の確立および維持に必要である（Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．，  １９９９，  ２５３，  １−６）。ＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ活性は、いくつかの癌遺伝子：ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＳＶ４０  Ｔ抗原、活性化Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびｖ−Ｓｒｃの形質転換活性に必須である。正常線維芽細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現は、新生物表現型を誘導し、これは次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を形成しうる。ＩＧＦ−１Ｒ発現は、係留非依存性増殖において重要な役割を果たす。ＩＧＦ−１Ｒはまた、化学療法、放射線、およびサイトカインが誘導するアポトーシスから細胞を防御することも示されてきている。逆に、三重らせん形成またはアンチセンス発現ベクターであるドミナントネガティブＩＧＦ−１Ｒによる内因性ＩＧＦ−１Ｒの阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換活性を、そして動物モデルにおいて腫瘍増殖を抑制することが示されてきている。結腸直腸癌（ＣＲＣ）における受容体およびリガンドの過剰発現、より悪性の表現型との関連、化学療法耐性、ならびに劣った予後との相関を示すデータに基づいて、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路はまた、ＣＲＣにおいて頑強なターゲットであるようである（Ｓａｌｔｚ，  Ｌ．Ｂ．ら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；２５（３０）：  ４７９３−４７９９；  Ｔｒｉｐｋｏｖｉｃ  Ｉ．ら  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｊｕｌ；３８（５）：５１９−２５．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｐｒ  ２６；  Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ．ら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５  Ｍａｙ  １；１１（９）：３４９４−５０２；  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ．ら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｄｅｃ  １５；１０（２４）：８４３４−４１；  Ｇｒｏｔｈｅｙ  Ａら  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９９；１２５（３−４）：１６６−７３）。
【０００９】
[9]新生物および他の増殖性障害のためのより効果的な治療に関する必要性、そしてまたどの腫瘍がどの治療に反応するかを決定するためのより有効な手段に関する必要性がある。いくつかのグループが、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤に対する患者の反応を予測するための潜在的なバイオマーカーを調べるかまたは開示してきている（例えば、ＰＣＴ公報：ＷＯ  ２００４／０６３７０９、ＷＯ  ２００５／０１７４９３、ＷＯ  ２００４／１１１２７３、ＷＯ  ２００８／１０８９８６、ＷＯ  ２００７／００１８６８、ＷＯ  ２００４／０７１５７２、ＷＯ  ２００３／０７８６６２、ＷＯ  ２００７／０６７５００、ＷＯ  ２００５／０７００２０、ＷＯ  ２００９／０１５２３３、ＷＯ  ２００９／０２３１７２、ＷＯ  ２００４／０４６３８６、ＷＯ  ２００８／０７０４６０、およびＷＯ  ２０１０／０２２２６８；米国公開特許出願：  ＵＳ  ２００５／００１９７８５、ＵＳ  ２００７／００６５８５８、ＵＳ  ２００５／０１６４２１８、ＵＳ  ２００９／００９２５９６、ＵＳ  ２００９／００９３４８８、ＵＳ  ２００９／００９３４８８、ＵＳ  ２００６／０１４０９６０、ＵＳ  ２００９／０１１８１７５、ＵＳ  ２００４／０１３２０９７、ＵＳ  ２００３／０１６５９５４、ＵＳ  ２００７／０２１８５１２、ＵＳ  ２００７／０２６５１８５、ＵＳ  ２００７／０２７０５０５、ＵＳ  ２００７／０１２８６３６、ＵＳ  ２００９／００９２５９６、ＵＳ  ２００７／０２１２７３８、ＵＳ  ２００７／０２３７７７０、ＵＳ  ２００９／００２９３５４、ＵＳ  ２００９／００９２５２６、ＵＳ  ２００６／０２６３７７５、ＵＳ  ２００４／００１８５２８、ＵＳ  ２００６／０１２１５３９、ＵＳ  ２００８／０１３１８８５、ＵＳ  ２００５／００１９７８５、ＵＳ  ２００６／０２６３８０６、ＵＳ  ２００７／０１７２８５７、ＵＳ  ２００４／００４８２５４、ＵＳ  ２００９／００６１４５４、ＵＳ  ２００９／０１２３３７４、ＵＳ  ２００７／０１９６３５２、ＵＳ  ２００６／００７８９４１、ＵＳ  ２００８／０２３４１３８、ＵＳ  ２００５／０１７０３８６、ＵＳ  ２００２／０１６９５６２、ＵＳ  ２００３／００５３９９５、ＵＳ  ２００７／００７７５７７、ＵＳ  ２００８／０１８７９３０、ＵＳ  ２００６／０００３３６５、ＵＳ  ２００５／０２６０６６４、ＵＳ  ２００８／０１１２８８８、ＵＳ  ２００８／００１９９６１、ＵＳ  ２００８／０１６７５３２、ＵＳ  ２００６／０２３４２５９、ＵＳ  ２００４／００６３１２０、ＵＳ  ２００７／００９２８８１、ＵＳ  ２００８／００２６４８１、ＵＳ  ２００９／００９２９８３、ＵＳ  ２００４／０２１４２０３、ＵＳ  ２００９／０１３６９４５、ＵＳ  ２００７／０１５４９１５、ＵＳ  ２００９／０１５５７８６、ＵＳ  ２００８／００１５１６０、ＵＳ  ２００８／０３１２０９３、ＵＳ  ２００８／０１７６２２９、ＵＳ  ２００４／０１５７２５５、ＵＳ  ２００７／００３１８７１、ＵＳ  ２００９／００６１４２２、ＵＳ  ２００８／０１１３８７４、ＵＳ  ２００６／００１９２６８、ＵＳ  ２００７／００６５８５８、ＵＳ  ２００７／０２３１８２２、およびＵＳ  ２００９／００２３１４９、ならびに米国特許  ＵＳ  ５，３６７，０６４、ＵＳ  ７，３６８，５５１、ＵＳ  ６，１７１，７７９、ＵＳ  ７，３４２，１０８、ＵＳ  ６，４１３，７３０、ＵＳ  ７，５２６，３８７、ＵＳ  ６，２７１，３６３、ＵＳ  ６，２５１，６２８、およびＵＳ  ７，５６９，３４９を参照されたい）。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する反応を予測するために、いくつかのバイオマーカーが提唱されてきており、これには、結腸直腸癌における非反応性の予測因子としての突然変異体ＫＲＡＳが含まれる（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｒ，  Ｗ．ら（２００９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：１５ｓ，  （補遺；  ａｂｓｔｒ  ８０２０）；  Ｓｉｅｎａ，  Ｓら（２００９）  ＪＮＣＩ  １０１（１９）：１３０８−１３２４；  ＲｉｅｌｙおよびＬａｄａｎｙｉ（２００８）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １０（６）：４９３；  Ｊｉｍｅｎｏ，  Ａ．ら（２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  １５（２）：１１０−１３）。さらに、突然変異体ＫＲＡＳを含むいくつかのバイオマーカーは、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者の反応を予測する際に潜在的能力を有することが開示されてきている（例えば、Ｒｏｄｏｎ，  Ｊ．ら（２００８）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ７：２５７５−２５８８；  Ｔ．  Ｐｉｔｔｓら（２００９）  ＥＯＲＴＣ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃２１４１；  Ｈｕａｎｇ，  Ｆ．ら（２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９（１）：１６１−１７０；  Ｒｏｄｏｎ，  Ｊ．ら（２００８）  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ７：２５７５−２５８８を参照されたい）。しかし、大部分の場合、こうした阻害剤での患者の治療において、主治医を有効に導きうる、または標準的化学療法剤とこうした阻害剤の組み合わせに、どの腫瘍が最も好ましく反応するかを医師に示しうる、ＦＤＡ認可の診断試験はまだ出現してきていない。
【００１０】
[10]大部分の癌転移の間、腫瘍細胞において、上皮間葉転換（ＥＭＴ）として知られる重要な変化が起こる（Ｔｈｉｅｒｙ，  Ｊ．Ｐ．（２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４；  Ｓａｖａｇｎｅｒ，  Ｐ．（２００１）  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３；  Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（２００４）  Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９；  Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，  Ｓ．ら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８；  Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．ら（２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７；  Ｌｕ  Ｚ．ら（２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ４（６）：４９９−５１５）。ＥＭＴは通常、胚形成中を除いて健康な細胞においては起きないが、上皮組織の再構成を補助するため、上皮創傷治癒において、一過性のＥＭＴ状態が誘導される。緊密にともに結合し、そして極性を示す上皮細胞は、より間葉細胞表現型に変化し、ここで、これらの間葉細胞はより緩やかにともに保持され、極性喪失を示し、そして組織内で移動する能力を有する。これらの間葉様細胞は元来の腫瘍を取り巻く組織内に拡散し、それと同時に腫瘍から分離され、血管およびリンパ管に浸潤し、そして新たな位置に移動して、ここで分裂し、そしてさらなる腫瘍を形成しうる。最近の研究は、上皮細胞が、ＥＧＦＲおよびインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）キナーゼ阻害剤によく反応するが、ＥＭＴ後に生じる間葉様腫瘍細胞は、こうした阻害剤に対して、はるかにより感受性でないことが示されてきている（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｓ．ら（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（２０）：９４５５−９４６２；米国特許出願６０／９９７，５１４）。したがって、腫瘍細胞ＥＭＴ事象を防止するかまたは逆転させる（例えば間葉上皮転換（ＭＥＴ）を刺激する）か、あるいはＥＭＴから生じる間葉様腫瘍細胞の増殖を阻害することが可能な抗癌剤に対する緊急の必要性がある。こうした剤は、他の抗癌薬剤、例えばＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いた際、特に有用であるはずである。本発明は、ＥＭＴを調節する化合物の同定および性質決定のための新規方法を提供する。
【００１１】
[11]ヒトの癌が、より浸潤性の転移状態に進行するにつれて、細胞および組織背景に応じて、細胞生存および遊走を制御する多数のシグナル伝達プログラムが観察される（Ｇｕｐｔａ，  Ｇ．  Ｐ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（２００６）  Ｃｅｌｌ  １２７，  ６７９−６９５）。最近のデータは、上皮癌細胞がより間葉様状態に分化転換することを強調し、これは、上皮間葉転換（ＥＭＴ；  （Ｏｆｔ，  Ｍ．ら（１９９６）．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０，  ２４６２−２４７７；  Ｐｅｒｌ，  Ａ．  Ｋ．ら（１９９８）．  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，  １９０−１９３）と似たプロセスであって、細胞浸潤および転移を促進する（Ｂｒａｂｌｅｔｚ，  Ｔ．ら（２００５）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，  ７４４−７４９；  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，  Ｇ．（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，  ４４４−４５０）。ＥＭＴ様転換を通じて、間葉様腫瘍細胞は、増殖潜在能力を代償として、遊走能を得ると考えられる。間葉上皮転換（ＭＥＴ）は、より増殖性の状態を再生し、そして離れた部位で原発性腫瘍が形成されるのに似たマクロ転移を可能にすると仮定されてきている（Ｔｈｉｅｒｙ，  Ｊ．  Ｐ．（２００２）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，  ４４２−４５４）。腫瘍細胞におけるＥＭＴ様転換は、かなりの期間（数週から数ヶ月）に渡る転写再プログラミングから生じ、ジンクフィンガー、フォークヘッド、ｂＨＬＨおよびＨＭＧボックスドメインを宿する転写因子を介する（Ｍａｎｉ，  Ｓ．  Ａ．ら（２００７）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，  １００６９−１００７４；  Ｐｅｉｎａｄｏ，  Ｈ．ら（２００７）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ７，  ４１５−４２８）。Ｅ−カドヘリンの喪失、およびビメンチンまたはフィブロネクチンなどの間葉タンパク質の発現増加を伴う、より間葉様状態への転換は、癌の進行において、大きな役割を果たすようであり（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，  Ｔ．ら（２００１）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７，  ５９４−５９９；  Ｙｏｓｈｉｕｒａ，  Ｋ．ら（１９９５）．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９２，  ７４１６−７４１９）、そして間葉表現型の獲得は、劣った予後と相関づけられてきている（Ｂａｕｍｇａｒｔ，  Ｅ．ら（２００７）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，  １６８５−１６９４；  Ｋｏｋｋｉｎｏｓ，  Ｍ．  Ｉ．ら（２００７）  Ｃｅｌｌｓ，  ｔｉｓｓｕｅｓ，  ｏｒｇａｎｓ  １８５，  １９１−２０３；  Ｗｉｌｌｉｐｉｎｓｋｉ−Ｓｔａｐｅｌｆｅｌｄｔ，  Ｂ．ら（２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ８００６−８０１４．）。腫瘍由来および／または腫瘍関連間質細胞をターゲティングすることは、ＥＭＴ様転換を遮断し、そして浸潤細胞の生存を阻害するユニークな機構を提供する。
【００１２】
[12]ＥＭＴ様転換と関連する細胞変化は、生存のためのＥＧＦＲシグナル伝達ネットワークに対する癌細胞の依存性を改変する。ＥＭＴ様転換は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤エルロチニブに対する細胞の非感受性と関連することが観察されてきており（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｓ．ら（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，  ９４５５−９４６２；  Ｗｉｔｔａ，  Ｓ．  Ｅら（２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，  ９４４−９５０；  Ｙａｕｃｈ，  Ｒ．  Ｌ．ら（２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ８６８６−８６９８）、これは部分的に、ＰＩ３キナーゼまたはＭｅｋ−Ｅｒｋ経路のいずれかまたは両方のＥＧＦＲ非依存性活性化から生じる（Ｂｕｃｋ，  Ｅ．ら（２００７）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  ５３２−５４１）。ＥＭＴ状態をＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する感受性と相関させる類似のデータは、膵臓、ＣＲＣ（Ｂｕｃｋ，  Ｅ．ら（２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  ５３２−５４１）、膀胱（Ｓｈｒａｄｅｒ，  Ｍ．ら（２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  ２７７−２８５）およびＨＮＳＣＣ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋら（２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  １６８３−１６９１）細胞株、異種移植片および患者（Ｙａｕｃｈ，  Ｒ．  Ｌ．ら（２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ８６８６−８６９８）において報告されてきている。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する細胞感受性をバイパスしうるＰＩ３キナーゼおよびＥｒｋ経路の活性化の別の経路に対する分子決定因子が活発に調べられてきている（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，  Ａ．ら（２００２）  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，  ２００−２０７；  Ｅｎｇｅｌｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．ら（２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１０３９−１０４３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ  ２００４／０６３７０９
【特許文献２】ＷＯ  ２００５／０１７４９３
【特許文献３】ＷＯ  ２００４／１１１２７３
【特許文献４】ＷＯ  ２００８／１０８９８６
【特許文献５】ＷＯ  ２００７／００１８６８
【特許文献６】ＷＯ  ２００４／０７１５７２
【特許文献７】ＷＯ  ２００３／０７８６６２
【特許文献８】ＷＯ  ２００７／０６７５００
【特許文献９】ＷＯ  ２００５／０７００２０
【特許文献１０】ＷＯ  ２００９／０１５２３３
【特許文献１１】ＷＯ  ２００９／０２３１７２
【特許文献１２】ＷＯ  ２００４／０４６３８６
【特許文献１３】ＷＯ  ２００８／０７０４６０
【特許文献１４】ＷＯ  ２０１０／０２２２６８
【特許文献１５】ＵＳ  ２００５／００１９７８５
【特許文献１６】ＵＳ  ２００７／００６５８５８
【特許文献１７】ＵＳ  ２００５／０１６４２１８
【特許文献１８】ＵＳ  ２００９／００９２５９６
【特許文献１９】ＵＳ  ２００９／００９３４８８
【特許文献２０】ＵＳ  ２００９／００９３４８８
【特許文献２１】ＵＳ  ２００６／０１４０９６０
【特許文献２２】ＵＳ  ２００９／０１１８１７５
【特許文献２３】ＵＳ  ２００４／０１３２０９７
【特許文献２４】ＵＳ  ２００３／０１６５９５４
【特許文献２５】ＵＳ  ２００７／０２１８５１２
【特許文献２６】ＵＳ  ２００７／０２６５１８５
【特許文献２７】ＵＳ  ２００７／０２７０５０５
【特許文献２８】ＵＳ  ２００７／０１２８６３６
【特許文献２９】ＵＳ  ２００９／００９２５９６
【特許文献３０】ＵＳ  ２００７／０２１２７３８
【特許文献３１】ＵＳ  ２００７／０２３７７７０
【特許文献３２】ＵＳ  ２００９／００２９３５４
【特許文献３３】ＵＳ  ２００９／００９２５２６
【特許文献３４】ＵＳ  ２００６／０２６３７７５
【特許文献３５】ＵＳ  ２００４／００１８５２８
【特許文献３６】ＵＳ  ２００６／０１２１５３９
【特許文献３７】ＵＳ  ２００８／０１３１８８５
【特許文献３８】ＵＳ  ２００５／００１９７８５
【特許文献３９】ＵＳ  ２００６／０２６３８０６
【特許文献４０】ＵＳ  ２００７／０１７２８５７
【特許文献４１】ＵＳ  ２００４／００４８２５４
【特許文献４２】ＵＳ  ２００９／００６１４５４
【特許文献４３】ＵＳ  ２００９／０１２３３７４
【特許文献４４】ＵＳ  ２００７／０１９６３５２
【特許文献４５】ＵＳ  ２００６／００７８９４１
【特許文献４６】ＵＳ  ２００８／０２３４１３８
【特許文献４７】ＵＳ  ２００５／０１７０３８６
【特許文献４８】ＵＳ  ２００２／０１６９５６２
【特許文献４９】ＵＳ  ２００３／００５３９９５
【特許文献５０】ＵＳ  ２００７／００７７５７７
【特許文献５１】ＵＳ  ２００８／０１８７９３０
【特許文献５２】ＵＳ  ２００６／０００３３６５
【特許文献５３】ＵＳ  ２００５／０２６０６６４
【特許文献５４】ＵＳ  ２００８／０１１２８８８
【特許文献５５】ＵＳ  ２００８／００１９９６１
【特許文献５６】ＵＳ  ２００８／０１６７５３２
【特許文献５７】ＵＳ  ２００６／０２３４２５９
【特許文献５８】ＵＳ  ２００４／００６３１２０
【特許文献５９】ＵＳ  ２００７／００９２８８１
【特許文献６０】ＵＳ  ２００８／００２６４８１
【特許文献６１】ＵＳ  ２００９／００９２９８３
【特許文献６２】ＵＳ  ２００４／０２１４２０３
【特許文献６３】ＵＳ  ２００９／０１３６９４５
【特許文献６４】ＵＳ  ２００７／０１５４９１５
【特許文献６５】ＵＳ  ２００９／０１５５７８６
【特許文献６６】ＵＳ  ２００８／００１５１６０
【特許文献６７】ＵＳ  ２００８／０３１２０９３
【特許文献６８】ＵＳ  ２００８／０１７６２２９
【特許文献６９】ＵＳ  ２００４／０１５７２５５
【特許文献７０】ＵＳ  ２００７／００３１８７１
【特許文献７１】ＵＳ  ２００９／００６１４２２
【特許文献７２】ＵＳ  ２００８／０１１３８７４
【特許文献７３】ＵＳ  ２００６／００１９２６８
【特許文献７４】ＵＳ  ２００７／００６５８５８
【特許文献７５】ＵＳ  ２００７／０２３１８２２
【特許文献７６】ＵＳ  ２００９／００２３１４９
【特許文献７７】ＵＳ  ５，３６７，０６４
【特許文献７８】ＵＳ  ７，３６８，５５１
【特許文献７９】ＵＳ  ６，１７１，７７９
【特許文献８０】ＵＳ  ７，３４２，１０８
【特許文献８１】ＵＳ  ６，４１３，７３０
【特許文献８２】ＵＳ  ７，５２６，３８７
【特許文献８３】ＵＳ  ６，２７１，３６３
【特許文献８４】ＵＳ  ６，２５１，６２８
【特許文献８５】ＵＳ  ７，５６９，３４９
【特許文献８６】国特許出願６０／９９７，５１４
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｏ．ら（２００５）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９２：２０９７−２１０１
【非特許文献２】Ｉｂｒａｈｉｍ，  Ｙ．Ｈ．およびＹｅｅ，  Ｄ．（２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：９４４ｓ−９５０ｓ
【非特許文献３】Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，  Ｃ．Ｓ．ら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０
【非特許文献４】Ｃａｍｉｒａｎｄ，  Ａ．ら（２００５）  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：Ｒ５７０−Ｒ５７９  （ＤＯＩ  １０．１１８６／ｂｃｒ１０２８）
【非特許文献５】Ｃａｍｉｒａｎｄ，  Ａ．およびＰｏｌｌａｋ，  Ｍ．（２００４）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１８２５−１８２９
【非特許文献６】Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，  Ｃ．ら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９
【非特許文献７】Ｓａｃｈｄｅｖ  ＤおよびＹｅｅ  Ｄ．，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００７  Ｊａｎ；６（１）：１−１２
【非特許文献８】Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｆ．およびＧａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ｃ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００５  １０：１０４１−７
【非特許文献９】Ｍａｎａｒａ  ＭＣら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５  ２７：１６０５−１６
【非特許文献１０】Ｔｏｌｃｈｅｒ  Ａ．Ｗ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２００７  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｖｏｌ  ２５，  Ｎｏ．  １８Ｓ（６月２０日補遺），  ２００７：  ３００２
【非特許文献１１】Ｐａｅｚ，  Ｊ．  Ｇ．ら（２００４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−１５００
【非特許文献１２】Ｌｙｎｃｈ，  Ｔ．  Ｊ．ら（２００４）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０：２１２９−２１３９
【非特許文献１３】ｄｅ  Ｂｏｎｏ  Ｊ．Ｓ．およびＲｏｗｉｎｓｋｙ，  Ｅ．Ｋ．（２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：Ｓ１９−Ｓ２６
【非特許文献１４】Ｄａｎｃｅｙ，  Ｊ．およびＳａｕｓｖｉｌｌｅ，  Ｅ．Ａ．（２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３
【非特許文献１５】Ｍｏｙｅｒ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：４８３８
【非特許文献１６】Ｐｏｌｌａｃｋ，  Ｖ．Ａ．ら（１９９９）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２９１：７３９
【非特許文献１７】Ｓｏｕｌｉｅｒｅｓ，  Ｄ．ら（２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：７７
【非特許文献１８】Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ  Ｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０：３１０ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  １２３５
【非特許文献１９】Ｏｚａ，  Ｍ．ら（２００３）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：１９６ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ７８５
【非特許文献２０】Ｗｉｎｅｒ  Ｅ．ら（２００２）  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ７６：５１１５ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ４４５
【非特許文献２１】Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，  Ｆ．ら（２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２２：１４Ｓ（７月１５日補遺），  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ７０２２
【非特許文献２２】Ｊｏｎｅｓ，  Ｒ．Ｊ．ら（２００３）  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２２：４５ａ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  １８０
【非特許文献２３】Ｐｏｌｌａｋ  Ｍ．Ｎ．ら  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４  ４：５０５−１８
【非特許文献２４】Ａｄａｍｓ  Ｔ．Ｅ．ら  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０００  ５７：１０５０−９３
【非特許文献２５】Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９９９  ２５３：１−６
【非特許文献２６】Ｓａｌｔｚ，  Ｌ．Ｂ．ら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；２５（３０）：  ４７９３−４７９９
【非特許文献２７】Ｔｒｉｐｋｏｖｉｃ  Ｉ．ら  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｊｕｌ；３８（５）：５１９−２５．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｐｒ  ２６
【非特許文献２８】Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ．ら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５  Ｍａｙ  １；１１（９）：３４９４−５０２
【非特許文献２９】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ．ら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｄｅｃ  １５；１０（２４）：８４３４−４１
【非特許文献３０】Ｇｒｏｔｈｅｙ  Ａら  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９９；１２５（３−４）：１６６−７３
【非特許文献３１】Ｂｒｕｇｇｅｒ，  Ｗ．ら（２００９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：１５ｓ，  （補遺；  ａｂｓｔｒ  ８０２０）
【非特許文献３２】Ｓｉｅｎａ，  Ｓら（２００９）  ＪＮＣＩ  １０１（１９）：１３０８−１３２４
【非特許文献３３】ＲｉｅｌｙおよびＬａｄａｎｙｉ（２００８）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １０（６）：４９３
【非特許文献３４】Ｊｉｍｅｎｏ，  Ａ．ら（２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  １５（２）：１１０−１３
【非特許文献３５】Ｒｏｄｏｎ，  Ｊ．ら（２００８）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ７：２５７５−２５８８
【非特許文献３６】Ｔ．  Ｐｉｔｔｓら（２００９）  ＥＯＲＴＣ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，  ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃２１４１
【非特許文献３７】Ｈｕａｎｇ，  Ｆ．ら（２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９（１）：１６１−１７０
【非特許文献３８】Ｔｈｉｅｒｙ，  Ｊ．Ｐ．（２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４
【非特許文献３９】Ｓａｖａｇｎｅｒ，  Ｐ．（２００１）  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３
【非特許文献４０】Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（２００４）  Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９
【非特許文献４１】Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，  Ｓ．ら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８
【非特許文献４２】Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．ら（２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７
【非特許文献４３】Ｌｕ  Ｚ．ら（２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ４（６）：４９９−５１５）
【非特許文献４４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｓ．ら（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（２０）：９４５５−９４６２
【非特許文献４５】Ｇｕｐｔａ，  Ｇ．  Ｐ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（２００６）  Ｃｅｌｌ  １２７，  ６７９−６９５
【非特許文献４６】Ｏｆｔ，  Ｍ．ら（１９９６）．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０，  ２４６２−２４７７
【非特許文献４７】Ｐｅｒｌ，  Ａ．  Ｋ．ら（１９９８）．  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，  １９０−１９３
【非特許文献４８】Ｂｒａｂｌｅｔｚ，  Ｔ．ら（２００５）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，  ７４４−７４９
【非特許文献４９】Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，  Ｇ．（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，  ４４４−４５０
【非特許文献５０】Ｍａｎｉ，  Ｓ．  Ａ．ら（２００７）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，  １００６９−１００７４
【非特許文献５１】Ｐｅｉｎａｄｏ，  Ｈ．ら（２００７）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ７，  ４１５−４２８
【非特許文献５２】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，  Ｔ．ら（２００１）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７，  ５９４−５９９
【非特許文献５３】Ｙｏｓｈｉｕｒａ，  Ｋ．ら（１９９５）．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９２，  ７４１６−７４１９
【非特許文献５４】Ｂａｕｍｇａｒｔ，  Ｅ．ら（２００７）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，  １６８５−１６９４
【非特許文献５５】Ｋｏｋｋｉｎｏｓ，  Ｍ．  Ｉ．ら（２００７）  Ｃｅｌｌｓ，  ｔｉｓｓｕｅｓ，  ｏｒｇａｎｓ  １８５，  １９１−２０３
【非特許文献５６】Ｗｉｌｌｉｐｉｎｓｋｉ−Ｓｔａｐｅｌｆｅｌｄｔ，  Ｂ．ら（２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ８００６−８０１４
【非特許文献５７】Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｓ．ら（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，  ９４５５−９４６２
【非特許文献５８】Ｗｉｔｔａ，  Ｓ．  Ｅら（２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，  ９４４−９５０
【非特許文献５９】Ｙａｕｃｈ，  Ｒ．  Ｌ．ら（２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ８６８６−８６９８
【非特許文献６０】Ｂｕｃｋ，  Ｅ．ら（２００７）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  ５３２−５４１
【非特許文献６１】Ｓｈｒａｄｅｒ，  Ｍ．ら（２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  ２７７−２８５
【非特許文献６２】Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋら（２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，  １６８３−１６９１
【非特許文献６３】Ｙａｕｃｈ，  Ｒ．  Ｌ．ら（２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ８６８６−８６９８
【非特許文献６４】Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，  Ａ．ら（２００２）  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，  ２００−２０７
【非特許文献６５】Ｅｎｇｅｌｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．ら（２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１０３９−１０４３
【発明の概要】
【００１５】
[13]ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞感受性に影響を及ぼす因子の解明において、近年、かなりの進歩がなされてきているが、任意の所定の癌患者のための最適な様式の治療を決定するための改善された方法、およびこうした阻害剤が単一剤として、または他の抗癌剤と組み合わせて用いられるかいずれであっても、こうした決定を癌患者のためにより有効な治療措置に取り込むための改善された方法に対する、決定的な必要性が依然としてある。本発明は、どの腫瘍がこうした阻害剤での治療に最も有効に反応するかを決定するための新規方法を提供する。
【００１６】
発明の概要
[14]本発明は、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し；ここでＥＭＴＧＳは、ＥＭＴ中に協調して制御されると決定されている遺伝子群からなる；共相関（ｃｏ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズム（例えば、本明細書に記載するようなアルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１）を、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する工程を含む、前記方法を提供する。この方法を、ＥＭＴを阻害するか、またはＥＭＴの特定の期において最適に機能する、新規抗癌化合物を同定するいくつかの方法の一部として利用してもよい。
【００１７】
[15]本発明はまた、（ａ）ＥＭＴの多数の腫瘍細胞モデルにおいて協調して制御される遺伝子の最初の群の選択；および（ｂ）多数のヒト腫瘍データセットにおいて発現が共相関される遺伝子の数を最大にするような、遺伝子の反復付加または前記群からの遺伝子の反復除去の工程を含むプロセスによって、遺伝子群がＥＭＴ中に協調して制御されるかどうかを決定する方法も提供する。
【００１８】
[16]本発明は、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズム（例えば、アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１）を、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００１９】
[17]本発明は、ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズム（例えば、アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１）を、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００２０】
[18]本発明は、ヒト腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズム（例えば、アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１）を、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００２１】
[19]本発明は、これらの診断法を取り込む癌患者治療のための方法をさらに提供する。
【００２２】
[20]本発明は、上述の８８遺伝子ＥＭＴＧＳを、このシグネチャーの遺伝子のサブセットによって、または別のシグネチャーによって置換する、さらなる関連法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】[21]Ｈ３５８  ＥＭＴ細胞モデルの４方向ベン解析。１］二重リガンドＨＧＦ＋ＯＳＭ、２］ＴＧＦβ、３］ｓｎａｉｌの発現を誘導するドキシサイクリン、または４］ｚｅｂ１の発現を誘導するドキシサイクリンで処理したＨ３５８腫瘍細胞において上方制御されるかまたは下方制御された、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析によって同定された有意な遺伝子を、４方向ベン図ジェネレータ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｎｇｌｏｓｓｏｍ／ｓｅｉｄｌ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｖｅｎｎ４．ｃｇｉ）を用いたベン解析によって比較した。上皮間葉転換を経るように誘導されたすべての４細胞モデルに共通である１０１遺伝子を同定した。
【図２】[22]８８遺伝子ＥＭＴ遺伝子シグネチャーの生成のためのプロセス。
【図３】[23]乳房ＨＥＲ２アーカイブサンプルにおける遺伝子相関。Ｈ３５８細胞において上皮間葉転換分析から同定された９１遺伝子を、アルゴリズムＡを実行する私有カスタムソフトウェアを用いて、共相関に関して解析した。［Ａ］アンカー遺伝子としてＥｒｂＢ３を用いた相関マップ。黄色い線より上の遺伝子は、アンカー遺伝子に対する相関に関して、Ｐ値カットオフに合格したものである。［Ｂ］９１遺伝子の相関に関する遺伝子インデックス値のウォーターフォールプロット。
【図４】[24]乳房ＨＥＲ２アーカイブデータセットとの８８ＥＭＴ遺伝子シグネチャー遺伝子の相関。ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（表１）をアルゴリズムＡを実行する私有カスタムソフトウェアを用いた共相関解析に用いた。［Ａ］アンカー遺伝子としてＥＲＢＢ３を用いた乳房ＨＥＲ２アーカイブマイクロアレイデータセット共相関マップ。［Ｂ］乳房ＨＥＲ２アーカイブデータセットにおける遺伝子インデックス値のウォーターフォールプロット。
【図５−１】[25]ヒト腫瘍データセット（Ｇｅｎｅｌｏｇｉｃ）との８８ＥＭＴ遺伝子シグネチャー遺伝子の相関は、８８遺伝子ＥＭＴＧＳの広い適用可能性を立証する。８８遺伝子ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（表１）を、ＡＶＥＯソフトウェアとともにアルゴリズムＡを用いる共相関解析に用いた。Ａ．アンカー遺伝子としてビメンチンを用いたＧｅｎｅＬｏｇｉｃデータセット（乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、膵臓、前立腺および胃／食道腫瘍；Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０プラットフォーム）と組み合わせた、ヒト固形腫瘍における８８遺伝子ＥＭＴＧＳの共相関マップ。Ｂ．Ｇｅｎｅｌｏｇｉｃ固形腫瘍データベースにおけるＥＭＴインデックススコアのウォーターフォールプロット（腫瘍は左から右に、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、膵臓、前立腺および胃である）。Ｃ．インデックススコアによって配置した、腫瘍各々における８８遺伝子の発現値のヒートマップ。
【図５−２】図５続き。Ｄ．独立に実行した６つのＧｅｎｅＬｏｇｉｃ腫瘍データベース（乳房、結腸、腎臓、肺、膵臓、および胃／食道）各々における、８８遺伝子ＥＭＴＧＳの共相関プロット。
【図６】[26]８８遺伝子ＥＭＴ遺伝子シグネチャーを用いたＥＭＴモデルおよび復帰の分子性質決定。Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｈ３５８、ＣＦＰＡＣ１、Ｈ１６５０、およびＨ２９２腫瘍細胞における、示すリガンドでのＥＭＴの誘導。Ｂ）Ｈ３５８腫瘍細胞モデルにおけるＺｅｂ１、Ｓｎａｉｌまたは活性化ＴＧＦ−ベータ（ａＴＧＦβ）タンパク質のドキシサイクリン誘導によるＥＭＴの誘導。Ｎ．Ｂ．緑＝下方制御遺伝子；赤＝上方制御遺伝子。
【図７】[27]ＯＳＩ  ＥＭＴ遺伝子シグネチャーおよびＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＥＭＴアレイの比較。３つの駆動因子、ａＴＧＦβ、Ｓｎａｉｌ、およびＺｅｂ１の異所性発現で、ＥＭＴを経るようにＨ３５８細胞を刺激した。７日後、ＲＮＡのために細胞を採取し、このＲＮＡをｃＤＮＡにプロセシングして、そして２つの個々のｑＰＣＲプレート上で実行した。未処理細胞に比較して、各遺伝子に関する倍変化を計算した。
【図８】[28]ＥＭＴ形態変化、マーカー変化および表現型変化の要約、ならびにエルロチニブ感受性およびＥＭＴインデックススコアに対する対応する変化。（Ａ）Ｈ３５８リガンド駆動モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導された変化。細胞を、示すリガンドとともに７日間インキュベーションした。免疫蛍光のため、細胞を固定し、そしてＥ−カドヘリン（緑）、ビメンチン（赤）に関する免疫反応性に関して染色し、そしてＴＯＰＲＯ−３で対比染色して、核を視覚化した。また、別個の実験において、よく性質決定されたＥＭＴマーカーに関するウェスタンブロットによって、タンパク質存在量に関しても、そして８８遺伝子ＥＭＴＧＳに対する変化のｑＰＣＲ定量化に関しても細胞を評価した。最後に、表現型変化の指標として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖能および浸潤能に関しても細胞を調べた。すべての実験の定性的結果を以下のように示す：穏やかな変化（＋）、中程度の変化（＋＋）および頑強な変化（＋＋＋）。（Ｂ）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）によって駆動されるＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１のＨ３５８操作モデルにおいて誘導された変化。
【図９】[29]ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ肺Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０データセットにおける８８遺伝子ＥＭＴＧＳ（表５）の進行するバージョンの共相関マップ。
【図１０】[30]ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ膵臓Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０データセットにおける８８遺伝子ＥＭＴＧＳ（表５）の進行するバージョンの共相関マップ。
【図１１】[31]ＥＭＴインデックススコアに対する個々の遺伝子および遺伝子セットの影響。ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ肺ＡＢデータセットにおけるインデックススコアのウォーターフォールプロット。プロットは、全８８遺伝子シグネチャー、ＩＴＧＡ５またはＣＤＨ１を除く８８遺伝子シグネチャー、Ｃｈｏｉ  ＥＭＴシグネチャーおよびＢｕｎｎゲフィチニブ耐性シグネチャーと共通に見られる８遺伝子を除く８８遺伝子シグネチャー（８０遺伝子インデックス）、ならびに最後に８８遺伝子ＥＭＴＧＳの４４上皮遺伝子のみ（Ｅのみのインデックス）に関する同じ腫瘍のインデックススコアのものである。
【図１２】[32]ＥＭＴインデックススコアに対する個々の遺伝子および遺伝子セットの影響。各腫瘍に関して、図１１に記載するような２つのリストからのインデックススコアを互いに対してプロットして、シグネチャーから遺伝子を減じる影響を評価した。
【図１３】[33]（Ａ）ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ膵臓Ｐｌｕｓ  ２．０データセットにおける全８８遺伝子シグネチャーおよび上皮のみのシグネチャーに関するＥＭＴインデックススコアのウォーターフォールプロット。（Ｂ）各腫瘍に関して、８８遺伝子シグネチャーおよび上皮のみのシグネチャー由来のインデックススコアを互いに対してプロットした。
【図１４】[34]エルロチニブ感受性および非感受性細胞株由来のｑＰＣＲデータから計算したＥＭＴインデックススコアの比較。左の２つのカラムにおけるインデックススコアは、全８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来である。右の２つのカラムにおけるインデックススコアは、上皮のみの遺伝子シグネチャー由来である。肺、膵臓、結腸および乳房腫瘍由来の細胞株を一緒に評価し（すべての腫瘍）、そして膵臓腫瘍および肺腫瘍由来の細胞株に別個に比較した。
【図１５】[35]細胞株におけるエルロチニブ感受性に関する上皮および間葉遺伝子の予測値。ＥＭＴシグネチャーにおける４４の上皮遺伝子または４４の間葉遺伝子を用いて、インデックススコアを計算し、そして各細胞株に関してプロットし、エルロチニブ感受性にしたがって配置した（アルゴリズムＡで計算）。
【図１６】[36]全８８遺伝子ＥＭＴＧＳおよび上皮のみの遺伝子シグネチャーから計算したＧｅｎｅＬｏｇｉｃ肺ＡＢデータセットにおけるインデックススコアの比較。８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアにしたがって腫瘍を配置し、そして腫瘍サブタイプによって分類する。各サンプルにおけるボックスプロットは、各々、シグネチャーと同じサイズを有する、ランダム遺伝子リストに基づく１０００インデックススコアの分布を示す。赤および青のバーは、各サンプルにおけるランダム遺伝子リスト由来の１０００インデックススコアの分布に基づいて、それぞれ、有意に低いおよび高い（Ｐ＝０．０５）サンプルのシグネチャーインデックススコアを示す。有意に低くもまたは高くもないインデックススコアを持つサンプルに関しては、そのインデックススコアを黄色で示す。
【図１７】[37]ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ固形腫瘍データセットにおけるＥ−カドヘリンインデックススコア（マイクロアレイシグナル強度）と８８ＥＭＴＧＳインデックススコアの比較。各サンプルにおけるボックスプロットは、各々、シグネチャーと同じサイズを有する、ランダム遺伝子リストに基づく１０００インデックススコアの分布を示す。赤および青のバーは、各サンプルにおけるランダム遺伝子リスト由来の１０００インデックススコアの分布に基づいて、それぞれ、有意に低いおよび高い（Ｐ＝０．０５）サンプルのシグネチャーインデックススコアを示す。有意に低くもまたは高くもないインデックススコアを持つサンプルに関しては、そのインデックススコアを黄色で示す。
【図１８】[38]ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ固形腫瘍データセットにおけるＥＭＴ遺伝子シグネチャーの３つの進行するバージョン由来のインデックススコアの比較。各サンプルにおけるボックスプロットは、各々、シグネチャーと同じサイズを有する、ランダム遺伝子リストに基づく１０００インデックススコアの分布を示す。赤および青のバーは、各サンプルにおけるランダム遺伝子リスト由来の１０００インデックススコアの分布に基づいて、それぞれ、有意に低いおよび高い（Ｐ＝０．０５）サンプルのシグネチャーインデックススコアを示す。有意に低くもまたは高くもないインデックススコアを持つサンプルに関しては、そのインデックススコアを黄色で示す。
【図１９】[39]ＥＭＴインデックススコアは、Ｅ−カドヘリン状態およびエルロチニブに対する感受性と相関する。上部パネルにおいて、乳房、結腸、膵臓、および肺腫瘍由来の細胞株を、Ｅ−カドヘリン状態に関してスコア付けし、そしてエルロチニブによる最大増殖阻害％にしたがって整理した。下部パネルにおいて、８８遺伝子ＥＭＴＧＳを用いて同じ細胞株に関するインデックススコアを計算し（アルゴリズムＡで計算）、そして同じ順序でプロットした。
【図２０】[40]Ｈ３５８およびＨ１６５０  ＥＭＴモデルに関して８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し、そして既知の参照上皮細胞（ＮＣＩ−Ｈ４４１）および間葉（ＮＣＩ−Ｈ１７０３）細胞株由来のインデックススコアとともにプロットした（すべてアルゴリズムＡで計算）。Ｈ−３５８Ｔ−Ｚｅｂ１、ＳｎａｉｌおよびａＴＧＦｂモデルにおける１４日間の導入遺伝子の誘導は、ＥＭＴインデックススコアにおける増加（すなわちより間葉）を誘導し、これはドキシサイクリン休薬の２１日後、部分的にまたは完全に逆転した。Ｈ３５８リガンド駆動モデルにおいては、７日間のリガンド処理後のインデックススコアに対する変化は、より間葉状態を反映し、これは、先に特徴付けられた形態学的および表現型的変化と相関した。Ｈ１６５０モデルにおいて、インデックススコアは、リガンドとのインキュベーション後、変化しないが、すべての状態におけるエルロチニブに対する非感受性を正しく示した。
【図２１】[41]ＥＭＴのＨ３５８操作モデルにおけるａＴＧＦｂ、ＳｎａｉｌまたはＺｅｂの誘導は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥ−カドヘリンの下方制御およびビメンチンの上方制御を生じた。腫瘍を、皮下または同所性セッティングのいずれかにおいて、移植後７日間、増殖させた。マウスに移植１４日後〜２１日後、ドキシサイクリンを投与して、導入遺伝子発現を誘導した。腫瘍を採取し、ＩＨＣによって、Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ１、Ｅ−カドヘリンまたはビメンチンの誘導に関して評価した（弱拡大）。
【図２２】[42]ＥＭＴのＨ３５８ＴモデルにおけるＳｎａｉｌ誘導後の構築上の変化および組織学的変化の評価。図２１に示すＩＨＣ切片のより高い拡大によって、Ｓｎａｉｌの発現後、腫瘍に構築上の変化は示されない。Ｅ−カドヘリンは穏やかに下方制御され、そしてビメンチンは頑強に上方制御される。
【図２３】[43]ＥＭＴのＨ３５８ＴモデルにおけるＺｅｂ１誘導後の構築上の変化および組織学的変化の評価。図２１に示すＩＨＣ切片のより高い拡大によって、Ｚｅｂ１の発現後、腫瘍に構築上の変化は示されない。Ｅ−カドヘリンは強く下方制御され、そしてビメンチンは穏やかに上方制御される。
【図２４】[44]ＥＭＴのＨ３５８ＴモデルにおけるａＴＧＦｂ誘導後の構築上の変化および組織学的変化の評価。（Ａ）図２１に示すＩＨＣ切片のより高い拡大によって、ａＴＧＦｂの誘導後、増加した間質浸潤が示される（Ｈ＆Ｅ染色）。Ｅ−カドヘリンは下方制御され、そしてビメンチンは頑強に上方制御される。矢印は、間質中の細胞を示し、これらの細胞は、マウス間質細胞ではなく、ヒト腫瘍細胞と一致する核サイズを有する。（Ｂ）ＥＭＴ状態に関する浸潤細胞の評価。ａＴＧＦｂ  ＩＨＣを行って、腫瘍の上皮ネスト中の導入遺伝子の発現を検証した。連続切片上、ＩＨＣによって、多数のマーカーに関して細胞を評価した。浸潤細胞は、高レベルのサイトケラチン、低レベルのＥ−カドヘリンおよび高レベルのビメンチンを発現した。
【図２５】[45]導入遺伝子誘導後のＨ３５８Ｔ−ａＴＧＦｂ、ＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１異種移植片の増殖。ドキシサイクリンを伴わずに、腫瘍を移植後１週間増殖させた。第２週および第３週、ネズミを２つの群に分けた：一方にはドキシサイクリンを投与し、対照群には投与しなかった。腫瘍を第２週および第３週に測定し、増殖速度の変化を評価した。
【図２６】[46]ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＨ３５８Ｔ  ａＴＧＦｂ、ＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１モデルにおける８８遺伝子ＥＭＴＧＳの比較。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：細胞をドキシサイクリンとともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間増殖させ、そして未処理細胞に比較して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳに対する変化に関して、ｑＰＣＲによってプロファイリングした。ｉｎ  ｖｉｖｏ：異種移植片を誘導して、導入遺伝子を２週間発現させ、そしてＲＮＡを採取して、これをドキシサイクリンで処置されなかった腫瘍に比較して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳに対する変化をプロファイリングするために用いた。複製マウス由来の腫瘍由来のプロファイルを示す。（Ｂ）エルロチニブＥＣ５０値に対する変化、およびＥＭＴインデックススコアに対する対応する変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの非誘導および誘導モデルに関して示す（アルゴリズムＡで計算）。
【図２７】[47]３Ｄ培養におけるＥＭＴの誘導は、Ｈ３５８操作モデルに対する増殖変化を生じる。Ｈ３５８Ｔ−ａＴＧＦｂ、ＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１細胞を、ドキシサイクリンを伴いまたは伴わずにマトリゲル中で１４日間増殖させ、そして増殖およびコロニーの構築における変化に関して評価した。
【図２８】[48]ＣＦＰＡＣ１膵臓腫瘍モデルにおいて、ＨＧＦおよびＯＳＭによって誘導されるＥＭＴ変化。形態変化（Ａ）を、散在の増加およびより線維芽細胞様の形態の獲得によって例示する。マーカー変化（Ｂ）を、ウェスタンブロットおよび８８遺伝子ＥＭＴＧＳに対する変化のヒートマップによって示す。表現型評価（Ｃ）を、リガンドとの７日間のインキュベーション後、細胞遊走および浸潤能の増加によって示す。
【図２９】[49]Ｈ１６５０  ＮＳＣＬＣ腫瘍モデルにおけるＨＧＦ、ＯＳＭ、およびＴＧＦｂ１によって誘導されるＥＭＴ変化。示すリガンドで７日間誘導した細胞に対する、形態変化（Ａ）およびバイオマーカー変化（Ｂ）。
【図３０】[50]Ｈ２９２  ＮＳＣＬＣ腫瘍モデルにおけるＨＧＦ、ＯＳＭおよびＴＧＦｂ１によって誘導されるＥＭＴ変化。示すリガンドで７日間誘導した細胞に対する、形態変化（Ａ）、マーカー変化（Ｂ）、および表現型変化（Ｃ）。
【図３１】[51]Ｈ３５８操作モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで制御される、８８遺伝子ＥＭＴＧＳにおける遺伝子の比較。
【図３２】[52]ＯＳＩ−９０６感受性と、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアの相関。ＯＳＩ−９０６感受性および非感受性細胞株に関して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算した。各細胞株に関するＥＣ５０値を下部パネルに示し、そして上部パネルにおいて、ＥＭＴインデックススコアを示す（アルゴリズムＡで計算）。
【図３３】[53]ＯＳＩ９０６−エルロチニブ相乗作用と、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアの相関。細胞株に関して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し、そして上部パネルにおいて、増加する順にプロットした（アルゴリズムＡで計算）。下部パネルにおいて、ＯＳＩ−９０６およびエルロチニブの間の相乗作用を、実験ＢＬＩＳＳ値に対する最大阻害の比率として定量化した。
【図３４】[54]Ｅ−カドヘリン発現値と８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアの相関。マウス乳房腫瘍アーカイブにおいて、腫瘍に関して、８８ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算した。比較のため、Ｅ−カドヘリン発現値（対数マイクロアレイシグナル強度）を、ＥＭＴインデックススコア上に重ねた。
【図３５】[55]コア８  ＥＭＴＧＳインデックススコアは、エルロチニブ感受性と相関する。８８遺伝子ＥＭＴＧＳ、Ｃｈｏｉ  ＥＭＴＧＳおよびＢｕｎｎゲフィチニブ感受性ＧＳに共通な８遺伝子（すなわち、ＡＧＲ２、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ４、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＩＫＩＰ、ＯＣＬＮ、ＳＨ３ＹＬ１）を用いて、エルロチニブ感受性が知られる２４の細胞株に関するマイクロアレイデータから、インデックススコアを計算した。細胞株を、エルロチニブ感受性が減少する順に配置した。
【図３６】[56]８８遺伝子ＥＭＴＧＳにおける４４の間葉遺伝子のアノテーション。
【図３７】[57]８８遺伝子ＥＭＴＧＳにおける４４の上皮遺伝子のアノテーション。
【図３８】[58]８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアおよびエルロチニブ感受性値の相関（アルゴリズムＡで計算）。
【図３９】[59]選択した遺伝子を除いた８８遺伝子ＥＭＴＧＳに関する多数の腫瘍細胞株におけるインデックススコア（アルゴリズムＡで計算）。
【図４０】[60]図３９におけるインデックススコアを生成するために用いた共相関遺伝子。
【図４１】[61]乳房腫瘍ＢＨアーカイブ細胞において、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックス（上部パネル）と、ＡＸＬ遺伝子発現（下部パネル）を比較すると、ＡＸＬは、より上皮性である腫瘍において低い発現を有し、そしてより間葉様である腫瘍において、より高い発現を示し、ＡＸＬが潜在的に間葉腫瘍に重要な遺伝子であることが示唆される。
【図４２】[62]８８ＥＭＴ遺伝子シグネチャーを用いたＴａｑ−ｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ分析は、新規ターゲット同定および発見に有益である。（Ａ）Ａ５４９細胞をＴＮＦおよび対照またはＴＡＫ１  ｓｉＲＮＡで処理した。８８ＥＭＴＧＳに対する変化を、ｑＰＣＲによって相対倍変化として定量化した。ＴＮＦ＋対照ｓｉＲＮＡによって誘導される変化を、リガンドなし＋対照ｓｉＲＮＡに比較する。ＴＮＦ＋ＴＡＫ１  ｓｉＲＮＡによって誘導される変化は、ＴＮＦ＋対照ｓｉＲＮＡに対する比較である。（Ｂ）ｃ−ＭＥＴ阻害剤化合物Ｍを伴いまたは伴わずに、ＨＧＦ＋ＯＳＭで、Ｈ３５８細胞を７日間処理した。ＨＧＦ＋ＯＳＭサンプルに関する倍変化は、未処理細胞に対する比較である。ＨＧＦ＋ＯＳＭ＋化合物Ｍに関する倍変化は、ＨＧＦ＋ＯＳＭに対する比較である。生物学的複製物を対のカラムに示す。（Ｃ）ＦＡＫ阻害剤化合物Ｆを伴いまたは伴わずに、Ｈ３５８Ｔ−ａＴＧＦｂ細胞をドキシサイクリンで７日間処理して、ＴＧＦｂ発現を誘導した。ドキシサイクリン処理細胞に関する倍変化は、未処理細胞に対する比較である。ドキシサイクリン＋化合物Ｆに関する倍変化は、ドキシサイクリン単独に対する比較である。
【図４３】[63]公表された遺伝子シグネチャーからのインデックススコアの派生。５つのシグネチャー（８８遺伝子ＥＭＴＧＳ、Ｃｈｏｉ、ＳＡｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｙａｕｃｈ、およびＢｕｎｎ）に関するインデックススコアを、エルロチニブ感受性が知られる細胞株由来のマイクロアレイデータから計算し、そして感受性が減少する順にプロットした。
【図４４】[64]腫瘍細胞集団を分析するためのインデックススコアの使用。８８遺伝子ＥＭＴＧＳ、ＳＡｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＥＭＴＧＳ、Ｃｈｏｉ  ＥＭＴＧＳ、およびＹａｕｃｈエルロチニブ感受性シグネチャーを用いて、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ肺Ｕ１３３ＡＢデータセットに関してインデックススコアを計算した。腫瘍を８８ＥＭＴＧＳの順に配置して、４つのシグネチャー由来のインデックススコアを比較した。各サンプルにおけるボックスプロットは、各々、シグネチャーと同じサイズを有する、ランダム遺伝子リストに基づく１０００インデックススコアの分布を示す。赤および青のバーは、各サンプルにおけるランダム遺伝子リスト由来の１０００インデックススコアの分布に基づいて、それぞれ、有意に低いおよび高い（Ｐ＝０．０５）サンプルのシグネチャーインデックススコアを示す。有意に低くもまたは高くもないインデックススコアを持つサンプルに関しては、そのインデックススコアを黄色で示す。
【図４５】[65]ＥＭＴインデックススコアは、Ｅ−カドヘリン状態およびエルロチニブに対する感受性と相関する。上部パネルにおいて、乳房、結腸、膵臓、および肺腫瘍由来の細胞株をＥ−カドヘリン状態に関してスコア付けし、そしてエルロチニブによる最大増殖阻害％にしたがって整理した。下部パネルにおいて、８８遺伝子ＥＭＴＧＳを用いて同じ細胞株に関するインデックススコアを計算し（アルゴリズムＡ１で計算）、そして同じ順序でプロットした。
【図４６】[66]ＯＳＩ−９０６感受性と、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアの相関。ＯＳＩ−９０６感受性および非感受性細胞株に関して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算した。下部パネルにおいて、各細胞株に関するＥＣ５０値を示し、そして上部パネルにおいて、ＥＭＴインデックススコアを示す（アルゴリズムＡ１で計算）。
【図４７】[67]細胞株におけるエルロチニブ感受性に関する上皮および間葉遺伝子の予測値。ＥＭＴシグネチャーにおける４４の上皮遺伝子または４４の間葉遺伝子を用いて、インデックススコアを計算し、そしてエルロチニブ感受性にしたがって配置した各細胞株に関してプロットした（アルゴリズムＡ１で計算）。
【図４８】[68]Ｈ３５８およびＨ１６５０  ＥＭＴモデルに関して８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し、そして既知の参照上皮細胞（ＮＣＩ−Ｈ４４１）および間葉（ＮＣＩ−Ｈ１７０３）細胞株由来のインデックススコアとともにプロットした（すべてアルゴリズムＡ１で計算）。Ｈ−３５８Ｔ−Ｚｅｂ１、Ｓｎａｉｌ  およびａＴＧＦｂモデルにおける１４日間の導入遺伝子の誘導は、ＥＭＴインデックススコアにおける増加（すなわちより間葉）を誘導し、これはドキシサイクリン休薬の２１日後、部分的にまたは完全に逆転した。Ｈ３５８リガンド駆動モデルにおいては、７日間のリガンド処理後のインデックススコアに対する変化は、より間葉状態を反映し、これは、先に特徴付けられた形態学的および表現型的変化と相関した。Ｈ１６５０モデルにおいて、インデックススコアは、リガンドとのインキュベーション後、変化しないが、すべての状態におけるエルロチニブに対する非感受性を正しく示した。
【図４９】[69]ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＨ３５８Ｔ  ａＴＧＦｂ、ＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１モデルにおける８８遺伝子ＥＭＴＧＳの比較。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：細胞をドキシサイクリンとともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間増殖させ、そして未処理細胞に比較して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳに対する変化に対して、ｑＰＣＲによってプロファイリングした。ｉｎ  ｖｉｖｏ：異種移植片を誘導して、導入遺伝子を２週間発現させ、そしてＲＮＡを採取して、これを、ドキシサイクリンで処置されなかった腫瘍に比較して、８８遺伝子ＥＭＴＧＳに対する変化をプロファイリングするために用いた。複製マウス由来の腫瘍由来のプロファイルを示す。（Ｂ）エルロチニブＥＣ５０値に対する変化、およびＥＭＴインデックススコアに対する対応する変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの非誘導および誘導モデルに関して示す（アルゴリズムＡ１で計算）。
【図５０】[70]ＯＳＩ９０６−エルロチニブ相乗作用と、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアの相関。細胞株に関して８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し、そして上部パネルにおいては、増加する順序でプロットした（アルゴリズムＡ１で計算）。下部パネルにおいては、ＯＳＩ−９０６およびエルロチニブの間の相乗作用を、実験ＢＬＩＳＳ値に対する最大阻害の比率として定量化した。
【図５１】[71]８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアおよびエルロチニブ感受性値の相関（アルゴリズムＡ１で計算）。
【図５２】[72]選択した遺伝子を除いた８８遺伝子ＥＭＴＧＳに関する多数の腫瘍細胞株におけるインデックススコア（アルゴリズムＡ１で計算）。
【図５３】[73]ＧｅｎｅＬｏｇｉｃレーザー捕捉顕微解剖腫瘍データセットにおける８８遺伝子ＥＭＴＧＳに関する発現ヒートマップ。（Ａ）マッチした間質、腫瘍、および非解剖患者サンプルに関するＥＭＴＧＳ中の８８遺伝子各々の平均を中心とした発現レベルを赤−青色スケール上に示す。（Ｂ）ＦＤＲ補正ｐ値＜０．０１の、対応のあるＴ検定によって、マッチした腫瘍および間質患者サンプルの間で統計的に示差的に発現されたＥＭＴＧＳ由来の２７遺伝子のサブセットの平均を中心とした発現レベル。
【図５４】[74]ＧｅｎｅＬｏｇｉｃレーザー捕捉顕微解剖腫瘍データセットにおける解剖腫瘍および浸潤間質組織を含むマッチした腫瘍由来の８８遺伝子（Ａ）および４４上皮遺伝子（Ｂ）ＥＭＴＧＳインデックススコアの比較。各パネルに関して、間質が加わった腫瘍のセットと直接比較するため、腫瘍のみのセットのインデックススコアの増加によって、マッチしたサンプルを整理する。各サンプルにおけるボックスプロットは、各々、シグネチャーと同じサイズを有する、ランダム遺伝子リストに基づく１０００インデックススコアの分布を示す。赤および青のバーは、各サンプルにおけるランダム遺伝子リスト由来の１０００インデックススコアの分布に基づいて、それぞれ、有意に低いおよび高い（Ｐ＝０．０５）サンプルのシグネチャーインデックススコアを示す。有意に低くもまたは高くもないインデックススコアを持つサンプルに関しては、そのインデックススコアを黄色で示す。腫瘍のみおよび間質を加えた腫瘍のマッチしたサンプルの間のスピアマン順位相関を、８８遺伝子および４４上皮遺伝子ＥＭＴＧＳインデックススコアに関して示す。（Ａ）において、腫瘍のみのサンプルに関するソフトウェアプラットフォームによってアンカー遺伝子としてＥ遺伝子が選択されたため、強い反相関があるが、間質を加えた腫瘍サンプルに関しては、アンカー遺伝子としてＭ遺伝子を選択したことに注目されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
[75]用語、個体における「癌」は、癌を引き起こす細胞に典型的な特性、例えば制御されない増殖、不死性、転移潜在能力、迅速な成長および増殖速度、ならびに特定の特徴的な形態学的特徴を所持する細胞の存在を指す。しばしば、癌細胞は、腫瘍の形であるが、こうした細胞は、個体内に単独で存在していてもよいし、または独立の細胞、例えば白血病細胞として血流中を循環していてもよい。
【００２５】
[76]本明細書において、例えば「腫瘍細胞増殖」の文脈における「細胞増殖」は、別に示さない限り、腫瘍学において一般的に用いられるように用いられ、該用語は、原則的に、細胞数の増加と関連づけられ、これは細胞再生（すなわち増殖）速度が細胞死の率（例えばアポトーシスまたは壊死によるもの）よりも大きい場合に、細胞再生によって起こり、細胞集団サイズの増加を生じるが、増殖の小さい構成要素は、特定の状況においてはまた、個々の細胞の細胞サイズまたは細胞質体積の増加による可能性もある。細胞増殖を阻害する剤は、したがって、増殖を阻害するかまたは細胞死を刺激するかのいずれかによって、これらの２つの相対するプロセス間のバランスが改変されるようにして、細胞増殖を阻害しうる。
【００２６】
[77]「腫瘍増殖」または「腫瘍転移増殖」は、本明細書において、別に示さない限り、腫瘍学において一般的に用いられるように用いられ、該用語は、原則的に、主に腫瘍細胞増殖の結果としての、腫瘍または腫瘍転移の質量または体積の増加と関連づけられる。
【００２７】
[78]「異常な細胞増殖」は、本明細書において、別に示さない限り、正常に制御された機構に依存しない細胞増殖を指す（例えば接触阻害の喪失）。これには：（１）突然変異チロシンキナーゼの発現または受容体チロシンキナーゼの過剰発現によって増殖する腫瘍細胞（腫瘍）；（２）異常なチロシンキナーゼ活性化が生じる、他の増殖性疾患の良性および悪性細胞；（４）受容体チロシンキナーゼによって増殖する任意の腫瘍；（５）異常なセリン／スレオニンキナーゼ活性化によって増殖する任意の腫瘍；ならびに（６）異常なセリン／スレオニンキナーゼ活性化が生じる、他の増殖性疾患の良性および悪性細胞の異常増殖が含まれる。
【００２８】
[79]用語「治療する」は、本明細書において、別に示さない限り、疾患または状態を相殺する医学的補助を与えることを意味する。句「治療する方法」またはその同等物は、癌に適用した際、患者における癌細胞の数を減少させるかまたは癌細胞を排除するか、あるいは癌の症状を軽減するように設計された処置または一連の行動を指す。癌または別の増殖性障害を「治療する方法」は、癌細胞または他の障害が、事実上排除されるか、細胞数または障害が事実上減少するか、あるいは癌または他の障害の症状が事実上軽減されることを、必ずしも意味しない。しばしば、癌を治療する方法は、成功可能性が低いものであっても行われるが、これらは、病歴および概算される患者の生存期待度を考慮すると、それにもかかわらず、全体的に有益な一連の行動に見える。
【００２９】
[80]用語「療法的に有効な剤」は、研究者、獣医、医師または他の臨床家が探究している組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を誘発するであろう組成物を意味する。
【００３０】
[81]用語「療法的有効量」または「有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床家が探究している組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を誘発するであろう対象化合物または組み合わせの量を意味する。
【００３１】
[82]用語「反応性の」または「反応性」は、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与に対する患者の反応を指す際に用いる場合、患者が利益を受ける可能性が高い、陽性または有効な反応を指す。治療される腫瘍に関しては、反応性は、例えば：（ａ）増殖遅延、（ｂ）増殖休止、または（ｃ）退行を示す腫瘍によって示されうる。
【００３２】
[83]例えば「腫瘍データセット」におけるような用語「データセット」は、本明細書に記載するような遺伝子インデックスの決定に使用可能である遺伝子セットまたは遺伝子シグネチャーに関する遺伝子発現データを得るために用いられる腫瘍または腫瘍細胞株のコレクションまたは複数の腫瘍または腫瘍細胞株を意味する。
【００３３】
[84]本発明は、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤での治療にどの腫瘍が最も有効に反応するであろうか決定するための方法を提供する研究から得られ（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｓ．ら（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（２０）：９４５５−９４６２；  米国特許出願６０／９９７，５１４）、これは、腫瘍細胞が上皮間葉転換（「ＥＭＴ」；  Ｔｈｉｅｒｙ，  Ｊ．Ｐ．（２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４；  Ｓａｖａｇｎｅｒ，  Ｐ．（２００１）  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３；  Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（２００４）  Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９；  Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，  Ｓ．ら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８；  Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．ら（２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７；  Ｌｕ  Ｚ．ら（２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ４（６）：４９９−５１５）を経ているかどうかに基づく。この研究は、上皮癌細胞が、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤によく反応するが、ＥＭＴ後、生じた間葉様細胞は、こうした阻害剤にはるかにより感受性でないことを立証した。バイオマーカーを用いて、どの腫瘍細胞がＥＭＴを経ているかを決定することも可能である（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｓ．ら（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（２０）：９４５５−９４６２）。こうした研究の結果、腫瘍の浸潤性および転移性特性における重要な要素と考えられる、こうした間葉様細胞の形成、増殖および／または機能を阻害可能な剤を見出す、新規療法アプローチが必要であることが明らかとなってきている。
【００３４】
[85]腫瘍ＥＭＴ事象の制御に関与する生化学的経路の解明、および生じる間葉様腫瘍細胞の性質決定を開始しようとする、かなり多くの研究が行われてきている。例えば、間葉様腫瘍細胞によって産生される多様なタンパク質産物の発現の特異的ｓｉＲＮＡ阻害剤を用いた実験によって、特定の遺伝子の産物の発現減少は、間葉様腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害可能であることが立証されてきている。したがって、これらの遺伝子にコードされるタンパク質産物の発現もまた特異的に阻害するか、または発現されたタンパク質の生物学的活性（例えばホスホトランスフェラーゼ活性）を特異的に阻害する、薬理学的剤、例えば細胞外ドメインを所持する発現されたタンパク質に対する特異的抗体、アンチセンス分子、リボザイム、または低分子酵素阻害剤（例えばプロテインキナーゼ阻害剤）は、同様に、やはり間葉様腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害するであろう剤であると予期される。ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤と、こうした剤の組み合わせの抗腫瘍効果は、これらのキナーゼ阻害剤自体の抗腫瘍効果よりも優れているはずであり、それはこうした組み合わせが、上皮および間葉様腫瘍細胞の両方を有効に阻害するはずであるためであり、そしてしたがって、こうした剤とＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の同時投与は、ＮＳＣＬ癌、膵臓癌、結腸癌または乳癌などの進行した癌の患者の治療に有効であるはずである。
【００３５】
[86]したがって、間葉様腫瘍細胞の増殖、またはＥＭＴプロセスを阻害するであろう剤の発見および開発のための重要なターゲットの同定がされたことを前提として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法によって同定された剤を評価して、薬剤開発中の動物モデル系および薬剤有効性を評価する際のヒト患者の両方において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、これらの剤が間葉様腫瘍細胞の形成、増殖および／または遊走を阻害する予測される効果を有するかどうかを決定するための、定量的で信頼性があり、そして普遍的に適用可能な方法に関する緊急の必要性がある。また、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤による阻害に対して感受性である可能性が高いかまたはそうでないか、そしてしたがって、こうした治療の優れた候補であるか、そしてまたＥＭＴまたは生じる間葉様腫瘍細胞を阻害するさらなる剤から利益を受ける可能性が高いかを予測するために、患者腫瘍中の細胞のＥＭＴ状態を決定するための信頼可能な診断法に関する必要性もまたある。
【００３６】
[87]ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、腫瘍細胞におけるＥＭＴ状態を決定するための現在の方法には、潜在的な欠点がいくつかある。これらには、例えば以下が含まれる：（１）ＥＭＴ状態を決定する個々のバイオマーカー法は、ＥＭＴ状態の常に信頼可能な予測因子ではなく、そしてしたがって、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する感受性の常に信頼可能な予測因子ではない。例えば、上皮状態に関するバイオマーカーとしてのＥ−カドヘリン発現は、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞感受性を常に信頼可能には予測しない（例えばＥ−カドヘリンが突然変異している場合）。同様に、間葉状態に関するバイオマーカーとしてのビメンチン発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞感受性を常に信頼可能には予測しない（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｆ．ら（２００９）    Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，  １３ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｊｕｌｙ  ３１  −  Ａｕｇｕｓｔ  ４，  ２００９，  ｅ−Ｐｏｓｔｅｒ：  ＰＤ７．２．５．  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ：  ＷＣＬＣ  ２００９；  ２９ページ）；（２）腫瘍サンプルに間質組織が混入すると、腫瘍細胞バイオマーカー発現の混乱した分析が複雑になりうる；（３）腫瘍細胞バイオマーカー発現の定量化およびＥＭＴ状態との相関は信頼不能でありうる；（４）古典的なＥＭＴバイオマーカー分析を用いて、ＥＭＴ中の異なる中間状態を差別化するのは困難である；（５）ＥＭＴに反応して発現が調節される（例えば誘導されるかまたは阻害される）広範囲の遺伝子には、腫瘍間で大きな多様性があり、これは部分的に、異なるＥＭＴ誘導因子の異なる影響により、そして部分的に、異なる組織特異的反応のためであるが、これによって、広い範囲の腫瘍に渡って、ＥＭＴ状態を信頼可能に予測するバイオマーカーの選択が困難になっている；（６）薬剤発見および開発に用いられる細胞培養モデルにおいて、ＥＭＴに反応して発現が調節される遺伝子の範囲が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養からｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植片増殖では多様であり、細胞モデルのいかなる所定の適用においてもＥＭＴ状態を信頼可能に予測するであろう個々のバイオマーカーを選択することが困難になっている。
【００３７】
[88]本明細書の以下の実施例に提示するデータは、個々の発現レベルを集合的に用いて、ＥＭＴＧＳインデックススコアを組立てることが可能な遺伝子で構成されるＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）を得ることが可能であることを立証しており、該インデックススコアは腫瘍細胞が経た上皮間葉転換（ＥＭＴ）の度合いを正確に定量化し（すなわちＥＭＴ状態を評価し）、そしてまた特定の抗癌薬剤、例えばＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の反応性を有効に予測することも可能である。これらの観察は、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の患者の転帰に対する影響を予測するための価値ある新規診断法の基礎であり、腫瘍学者らが患者のために最も適切な治療措置を選択するのを補助するさらなるツールを与える。これらはまた、ＥＭＴまたは生じる間葉様細胞を特異的に阻害する薬剤；あるいはその作用がＥＭＴによって影響を受ける抗癌薬剤の薬剤発見および開発において、研究者らを補助する強力な新規ツールを研究者に提供する。
【００３８】
[89]本発明はしたがって、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し；ここでＥＭＴＧＳは、ＥＭＴ中に協調して制御されると決定されている遺伝子群からなる；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３９】
[90]本発明はさらに、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し；ここでＥＭＴＧＳは、（ａ）ＥＭＴの多数の腫瘍細胞モデルにおいて協調して制御される遺伝子の最初の群の選択；および（ｂ）多数のヒト腫瘍データセットにおいて発現が共相関される遺伝子の数を最大にするような、遺伝子の反復付加または前記群からの遺伝子の反復除去の工程を含むプロセスによって、ＥＭＴ中に協調して制御されると決定されている遺伝子群からなる；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４０】
[91]本発明はまた、（ａ）ＥＭＴの多数の腫瘍細胞モデルにおいて協調して制御される遺伝子の最初の群の選択；および（ｂ）多数のヒト腫瘍データセットにおいて発現が共相関される遺伝子の数を最大にするような、遺伝子の反復付加または前記群からの遺伝子の反復除去の工程を含むプロセスによって、遺伝子群がＥＭＴ中に協調して制御されるかどうかを決定する方法も提供する。
【００４１】
[92]本発明は、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００４２】
[93]本明細書において、「共相関」は、遺伝子セットに適用した場合、セットのメンバーの発現レベルが、所定のタイプの組織、例えば腫瘍組織内で、同時に増加するかまたは減少する、統計的に有意な傾向を示すことを意味する。理論によって束縛されることは意図しないが、共相関は、共相関遺伝子が、１またはそれより多い生物学的機能において、共通の関与を共有することを示す可能性が高い。
【００４３】
[94]本明細書に開示する方法いずれかの態様において、測定される発現レベル値に適用される共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムは、本明細書の以下に定義するような、アルゴリズムＡ１である（実験詳細セクションもまた参照されたい）。
【００４４】
[95]アルゴリズムＡ１は、２つの主要構成要素からなる：１）発現相関に基づく遺伝子選択構成要素および２）選択した遺伝子の平均発現に基づくインデックススコア計算構成要素。特に、遺伝子リストＡ（例えば８８遺伝子ＥＭＴＧＳ）およびデータセットＢを与えられると、アルゴリズムＡ１は、以下の工程を行う：
１）Ｂにおいて、Ａに関する相関に基づくアンカー遺伝子（ＡＧ）を定義する：
ａ）Ｂにおけるすべてのサンプルに渡って、Ａにおけるすべての遺伝子−遺伝子対に関する遺伝子発現のピアソンまたはスピアマン相関（ユーザーが選択）を計算する。
【００４５】
ｂ）ＡＢに関するＡＧは、以下を最大にする遺伝子ｘである：
【００４６】
【化１】
2014519813.tif 000003
【００４７】
式中、ＡＧＡＢはデータセットＢにおける遺伝子リストＡに関するアンカー遺伝子であり、Ｎｘは遺伝子ｘを含むすべての遺伝子−遺伝子対のセットであり、ｎはＮｘ中の遺伝子−遺伝子対の数であり、そして｜Ｒ｜は、Ｂにおけるすべてのサンプルに渡る各遺伝子−遺伝子対に関するピアソン（またはスピアマン）相関係数の絶対値である。
【００４８】
２）遺伝子リスト（ＡＡＧ）から、ＡＧと有意に相関する遺伝子サブセットを選択する：
ａ）ＡＧに対する相関のＰ値に基づいて、すべての遺伝子を順位付けする。
【００４９】
ｂ）ＡＡＧを、Ｂに渡ってＡＧと相関するＡにおける遺伝子サブセットと定義し、ここでＰ値≦ｃであり、式中、ｃは、ユーザーが規定する有意性カットオフである（典型的には０．０１）。
【００５０】
３）Ｂにおける各サンプルｓに関して、遺伝子リストＡに関する相関に基づく発現インデックススコア（Ｉ）を計算する：
ａ）ＩＡＢｓを以下のように定義する：
【００５１】
【化２】
2014519813.tif 000004
【００５２】
式中、ＡＡＧは、アンカー遺伝子ＡＧと有意に相関するＡにおける遺伝子サブセットであり、ｍは、ＡＡＧにおける遺伝子の数であり、そしてｅｓｘ’は、以下のように、データセットＢのサンプルｓにおける遺伝子ｘ（サブセットＡＡＧ由来）の発現と定義される：
【００５３】
【化３】
2014519813.tif 000005
【００５４】
式中、ｅｓｘは、サンプルｓにおける遺伝子ｘの発現であり、μＢｘはデータセットＢにおける遺伝子ｘの平均発現であり、そしてＲｘは、アンカー遺伝子ＡＧと遺伝子ｘの相関係数である。
【００５５】
[96]本明細書に開示する方法いずれかの別の態様において、測定される発現レベル値に適用される共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムは、本明細書の以下に定義するような、アルゴリズムＡである（実験詳細セクションもまた参照されたい）。
【００５６】
[97]アルゴリズムＡは、２つの主要構成要素からなる：１）発現相関に基づく遺伝子選択構成要素および２）選択した遺伝子の平均発現に基づくインデックススコア計算構成要素。特に、遺伝子リストＡおよびデータセットＢを与えられると、アルゴリズムＡは、以下の工程を行う：
１）Ｂにおいて、Ａに関する相関に基づくアンカー遺伝子（ＡＧ）を定義する：
ａ）Ｂにおけるすべてのサンプルに渡って、Ａにおけるすべての遺伝子−遺伝子対に関する遺伝子発現のピアソンまたはスピアマン相関（ユーザーが選択）を計算する。
【００５７】
ｂ）ＡＢに関するＡＧは、以下を最大にする遺伝子ｘである：
【００５８】
【化４】
2014519813.tif 000006
【００５９】
式中、ＡＧＡＢはデータセットＢにおける遺伝子リストＡに関するアンカー遺伝子であり、Ｎｘは遺伝子ｘを含むすべての遺伝子−遺伝子対のセットであり、ｎはＮｘ中の遺伝子−遺伝子対の数であり、そして｜Ｒ｜は、Ｂにおけるすべてのサンプルに渡る各遺伝子−遺伝子対に関するピアソン（またはスピアマン）相関係数の絶対値である。
【００６０】
２）遺伝子リスト（ＡＡＧ）から、ＡＧと有意に相関する遺伝子サブセットを選択する：
ａ）ＡＧに対する相関のＰ値に基づいて、すべての遺伝子を順位付けする。
【００６１】
ｂ）ＡＡＧを、Ｂに渡ってＡＧと相関するＡにおける遺伝子サブセットと定義し、ここでＰ値≦ｃであり、式中、ｃは、ユーザーが規定する有意性カットオフである。
【００６２】
３）Ｂにおける各サンプルｓに関して、遺伝子リストＡに関する相関に基づく発現インデックススコア（Ｉ）を計算する：
ａ）ＩＡＢｓを以下のように定義する：
【００６３】
【化５】
2014519813.tif 000007
【００６４】
式中、ＡＡＧは、アンカー遺伝子ＡＧと有意に相関するＡにおける遺伝子サブセットであり、ｍは、ＡＡＧにおける遺伝子の数であり、そしてｅｓｘ’は、以下のように、データセットＢのサンプルｓにおける遺伝子ｘ（サブセットＡＡＧ由来）の発現と定義される：
【００６５】
【化６】
2014519813.tif 000008
【００６６】
式中、ｅｓｘは、サンプルｓにおける遺伝子ｘの発現であり、μＢｘはデータセットＢにおける遺伝子ｘの平均発現であり、そしてＲｘは、アンカー遺伝子ＡＧと遺伝子ｘの相関係数である。
【００６７】
[98]共相関解析において、統計的有意性を達成するためには、群またはデータセットの一部として、ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算しなければならない。サンプルの数は、相関係数が統計的有意性を達成しうる値を変化させる。サンプルの数が増加するにつれて、有意性を達成する係数が減少する。したがって、約２５〜３０のサンプルまたはそれより多いサンプルの群の一部として、インデックス化アルゴリズムを通じて、サンプルをプロセシングしなければならない。臨床適用のためには、単一の患者サンプルを、例えば相対インデックスが患者反応と相関している臨床試験から採用されるサンプル対照群とともに解析してもよい。
【００６８】
[99]０．０１のユーザー明記有意性カットオフ（ｃ）が典型的には選択される、本明細書記載の任意の方法に対する代替法として、インデックススコアを計算するために、遺伝子シグネチャーにおいてすべての遺伝子の寄与を用いることを確実にしたいと望む場合、１．０のユーザー明記有意性カットオフ（ｃ）を選択してもよい。したがって、例えばサンプルの数が非常に小さい場合には、シグネチャー中の関心対象でありうるすべての遺伝子由来のデータを用いて、異なるサンプルの比較を行ってもよい。
【００６９】
[100]ＥＭＴＧＳが８８遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、およびＺＥＢ２からなる、または本質的にこれらからなる、８８遺伝子のＥＭＴＧＳを伴う、本明細書に開示する任意の方法に対する代替法として、本発明はまた、８８遺伝子ＥＭＴＧＳではなく、ＥＭＴＧＳが、本明細書において以下に記載する遺伝子シグネチャーから選択される、これらの８８遺伝子のサブセット（すなわちサブセットＡ〜Ｑ；Ｒ１〜Ｒ１７；８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来の８７遺伝子（すなわち表１におけるようなものであるが、ＭＴＡ３は含まない）由来の任意の５４またはそれより多い遺伝子サブセット；および８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来の８７遺伝子の４３上皮遺伝子由来の任意の２４またはそれより多い遺伝子サブセット）からなるか、または本質的にこれらのサブセットからなってもよい、任意のこれらの方法もまた提供する。本発明は、８８遺伝子のこれらのサブセットの各々に関して、サブセットの遺伝子各々に関するプライマー対からなるＰＣＲプライマーセットをさらに提供する。本発明は、８８遺伝子のこれらのサブセット各々に関して、固体表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットがサブセット遺伝子の各々に特異的なプローブからなる前記ＤＮＡマイクロアレイチップをさらに提供する。
【００７０】
[101]ＥＭＴＧＳサブセットＡ（すなわちＩＴＧＡ５を含まない）：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２。
【００７１】
[102]ＥＭＴＧＳサブセットＢ（すなわちＶＩＭを含まない）：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２。
【００７２】
[103]ＥＭＴＧＳサブセットＣ（すなわちＣＤＨ１を含まない）：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２。
【００７３】
[104]ＥＭＴＧＳサブセットＤ（すなわちＥＲＢＢ３を含まない）：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２。
【００７４】
[105]ＥＭＴＧＳサブセットＥ（すなわちＥのみ（上皮遺伝子のみ））：ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＯＸＣ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＯＰＸ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＰＺＬ２、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＺＢＴＢ１０。
【００７５】
[106]ＥＭＴＧＳサブセットＦ（すなわち、Ｅ−ＣＤＨ１、ＣＤＨ１を含まない上皮遺伝子）：ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＯＸＣ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＯＰＸ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＰＺＬ２、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＺＢＴＢ１０。
【００７６】
[107]ＥＭＴＧＳサブセットＧ（すなわちＥ−ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ３を含まない上皮遺伝子）：ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＴＶ５、ＦＯＸＣ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＯＰＸ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＰＺＬ２、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＺＢＴＢ１０。
【００７７】
[108]ＥＭＴＧＳサブセットＨ（８０遺伝子）：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ５、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２。
【００７８】
[109]ＥＭＴＧＳサブセットＩ（８遺伝子）：ＡＧＲ２、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ４、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＩＫＢＩＰ、ＯＣＬＮ、ＳＨ３ＹＬ１。
【００７９】
[110]ＥＭＴＧＳサブセットＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＱは、図４０に列挙する遺伝子の８つのサブセットであり、アルゴリズムＡを実行してＥＭＴＧＳインデックススコアを生成する相関解析ソフトウェアによってこれらを用いる（すなわち、各群に関して、１つのアンカー遺伝子に加えて、アンカー遺伝子の下に列挙する遺伝子）。
【００８０】
[111]ＥＭＴＧＳサブセットＲ１〜Ｒ１７は、本明細書の表６に列挙する遺伝子の１７群であり、これらは共相関カットオフに合格し、そしてアルゴリズムＡを実行して、示すヒト腫瘍データセットに関するＥＭＴＧＳインデックススコアを生成する相関解析ソフトウェアによってこれらを用いる。
【００８１】
[112]５４遺伝子ＥＭＴＧＳ：８８遺伝子ＥＭＴＧＳより選択される８７遺伝子由来の任意の５４またはそれより多い遺伝子のサブセットであって、８７遺伝子がＭＴＡ−３を含まない８８遺伝子である、前記サブセット。８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来の８７遺伝子（すなわちＭＴＡ−３を含まない）は、したがって：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２である。したがって、例えば、ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかどうかを決定するための本発明の方法において、これらの８７遺伝子由来の任意の５４またはそれより多い遺伝子を含むシグネチャーを用いてもよい。
【００８２】
[113]２４遺伝子ＥＭＴＧＳ：８８遺伝子ＥＭＴＧＳより選択される８７遺伝子（すなわちＭＴＡ−３を含まない）の４３上皮遺伝子由来の任意の２４またはそれより多い遺伝子のサブセット。４３上皮遺伝子は、したがって、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＯＸＣ１、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＯＰＸ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＰＺＬ２、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＺＢＴＢ１０である。したがって、例えば、ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかどうかを決定するための本発明の方法において、これらの４３遺伝子由来の任意の２４またはそれより多い遺伝子を含むシグネチャーを用いてもよい。
【００８３】
[114]８８遺伝子ＥＭＴＧＳのこれらのサブセット各々由来のインデックスはすべて、ＥＭＴ状態、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞感受性、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に対して反応性または非反応性である可能性が高い患者におけるヒト腫瘍を評価するための予測値を有する。しかし、これらの各々は、所定の領域に特定の利点を有しうる。例えば、上皮遺伝子のみに由来するインデックスは、高含量の間質組織を有する腫瘍細胞で用いた際に、特定の値を有しうる。Ｒ１〜Ｒ１７シグネチャー由来のインデックスは、表６に示すように、これらが関連する腫瘍タイプで最も有用であろう。
【００８４】
[115]さらに、８８遺伝子のＥＭＴＧＳを伴う、本明細書開示の方法いずれかの代替物として、本発明はまた、遺伝子シグネチャーが、８８遺伝子ＥＭＴＧＳよりむしろ、本明細書に以下に記載するような（表１０〜１３を参照されたい）Ｃｈｏｉシグネチャー、Ｂｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャー、Ｙａｕｃｈシグネチャー、またはＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓシグネチャーでありうるこれらの方法のいずれかも提供する。本発明は、これらのシグネチャー各々に関して、シグネチャーの遺伝子各々に関するプライマー対からなるＰＣＲプライマーセットをさらに提供する。本発明は、これらのシグネチャー各々に関して、固体表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットがシグネチャーの遺伝子の各々に特異的なプローブからなる前記ＤＮＡマイクロアレイチップをさらに提供する。これらのシグネチャー各々に由来するインデックスは、ＥＭＴ状態、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞感受性、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に対して反応性または非反応性である可能性が高い患者におけるヒト腫瘍を評価するための予測値を有する。しかし、８８遺伝子ＥＭＴＧＳまたはそのサブセットに由来するインデックスに比較して、その使用には限界がある。例えば、これらのシグネチャーはいずれも、多数のヒト腫瘍データセットを用いては得られておらず、そしてしたがって、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト腫瘍において、８８遺伝子ＥＭＴＧＳの予測力を欠くであろう。Ｃｈｏｉシグネチャーは、乳房腫瘍細胞に関する予測結果の値を有するに過ぎない。ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓシグネチャーは、いくつかの腫瘍細胞ＥＭＴモデルにおいて、８８遺伝子ＥＭＴＧＳよりも、ＥＭＴ誘導に対してはるかにより少ない遺伝子変化を示し、そしてしたがって、特定の腫瘍タイプにおけるように、遺伝子の少ないサブセットしかＥＭＴまたはその阻害に関与していないか、あるいはＥＭＴを防止するために特定のＥＭＴ阻害剤化合物を用いる場合には、ＥＭＴを監視するためのツールとしてより劣っているであろう。Ｂｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャーは、ＥＭＴ状態指標としてではなく、ＮＳＣＬＣ腫瘍のゲフィチニブ感受性シグネチャーとして開発されており、そしてしたがって、この領域において、特にシグネチャーが開発された肺以外の腫瘍組織に関しては、限界を有する可能性が高い。最後に、Ｙａｕｃｈシグネチャーは、ヒト肺腫瘍の異なるタイプ（例えば腺癌および扁平上皮癌）を、８８遺伝子ＥＭＴＧＳと同程度に有効に差別化することが不可能であるようであり、これは、ヒト腫瘍データセットがその生成において利用されていないという事実のためである可能性が高い。
【００８５】
[116]本発明は、腫瘍細胞が癌患者の腫瘍由来である、本明細書開示の任意の方法をさらに提供する。本発明はまた、遺伝子発現レベルを測定する工程の前に、患者腫瘍細胞サンプルを得るさらなる工程を含む、本明細書開示の任意の方法も提供する。本発明はまた、腫瘍細胞が腫瘍生検由来である、本明細書開示の任意の方法も提供する。本発明はまた、腫瘍細胞が循環腫瘍細胞を含有する血液サンプル由来である、本明細書開示の任意の方法も提供する。本発明はまた、腫瘍細胞が、ＮＳＣＬ癌、乳癌、結腸直腸癌、または膵臓癌腫瘍細胞である、本明細書開示の任意の方法も提供する。
【００８６】
[117]本発明はさらに、ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００８７】
[118]本発明はさらに、ヒト腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして該ＥＭＴＧＳインデックススコアが、腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して非反応性である可能性が高いかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００８８】
[119]１つの態様において、定義された閾値より上のＥＭＴＧＳインデックススコアは、腫瘍がＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に反応性である可能性が高いことを示し、そして定義された閾値より下のＥＭＴＧＳスコアは、腫瘍がＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に非反応性である可能性が高いことを示す。例えば、本明細書に記載するようにＲＯＣ曲線解析を用いて、または任意の匹敵する統計法によって、閾値を決定してもよい。
【００８９】
[120]したがって、閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアに対してＥＭＴＧＳインデックススコアを解釈するため、本発明の１つの態様において、ＥＭＴＧＳ測定のため、ｑＰＣＲを用いて、閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアより高いＥＭＴＧＳインデックススコアは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤治療に対して非反応性（耐性）である可能性が高い腫瘍を示すと解釈されるであろう。閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアより低いＥＭＴＧＳインデックススコアは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤治療に対して反応性（感受性）である可能性が高い腫瘍を示すと解釈されるであろう。所定の閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアは、腫瘍タイプに応じて多様であろうと予期される。本発明の背景において、用語「腫瘍タイプ」は、（ａ）種（ヒト、マウス、イヌ等）；および（ｂ）起源の臓器または組織を考慮に入れる。場合によって、腫瘍タイプはさらに、遺伝子発現特性に基づく腫瘍分類を考慮に入れ、例えばＨＥＲ２陽性乳房腫瘍、または特定のＥＧＦＲ突然変異を発現する非小細胞肺腫瘍がある。
【００９０】
[121]任意の所定の腫瘍タイプに関して、最適な閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアは、閾値決定解析を実行することによって、経験的に決定可能である（または少なくとも近似可能である）。多くの有効な方法において、閾値決定解析には、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析が含まれる。
【００９１】
[122]本明細書記載の「閾値決定解析」は、その特定の腫瘍タイプに関する閾値ＥＭＴＧＳインデックススコア、例えば最適閾値ＥＭＴＧＳスコアを決定するための、所定の腫瘍タイプ（例えばヒトＮＳＣＬＣ）を代表するデータセットの解析を意味する。閾値決定解析の背景において、所定の腫瘍タイプを代表するデータセットには、（ａ）実際の反応データ（反応または非反応）、および（ｂ）腫瘍所持マウスまたはヒトの群に由来する各腫瘍に関するＥＭＴＧＳスコアが含まれる。本明細書において「最適閾値ＰＧＳスコア」は、分類器が偽陰性コールおよび偽陽性コールのコストの間の最も望ましいバランスを生じる閾値ＰＧＳスコアを意味する。
【００９２】
[123]ＲＯＣ曲線解析は、確立された統計技術であり、その適用は、当該技術分野の一般の技術範囲内である。ＲＯＣ曲線解析の考察に関しては、一般的に、Ｚｗｅｉｇら，  １９９３，  “Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  （ＲＯＣ）  ｐｌｏｔｓ：  ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３９：５６１−５７７；およびＰｅｐｅ，  ２００３，  Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００９３】
[124]本明細書において、「受信者動作特性」（ＲＯＣ）曲線は、二項分類系に関する偽陽性率（感受性）対真の陽性率（特異性）のグラフプロットを意味する。ＲＯＣ曲線を構築する際、以下の定義を適用する：偽陰性率：ＦＮＲ＝１−ＴＰＲ。
真の陽性率：ＴＰＲ＝陽性／（真の陽性＋偽陰性）。
偽陽性率：ＦＰＲ＝偽陽性／（偽陽性＋真の陰性）
[125]ＥＭＴＧＳインデックススコアおよび最適閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアは、腫瘍タイプ間で多様でありうる。したがって、閾値決定解析を、好ましくは、本発明を用いて試験しようとする任意の所定の腫瘍タイプを代表する１またはそれより多いデータセットに対して行う。閾値決定解析のために用いるデータセットには：（ａ）実際の反応データ（反応または非反応）、および（ｂ）ヒト腫瘍または動物腫瘍の群由来の各腫瘍サンプルに関するＥＭＴＧＳインデックススコアが含まれる。所定の腫瘍タイプに関して、ＥＭＴＧＳインデックススコア閾値がひとたび決定されたら、その閾値を適用して、その腫瘍タイプの腫瘍由来のＥＭＴＧＳインデックススコアを解釈してもよい。
【００９４】
[126]ＲＯＣ曲線解析を、本質的に以下のように実行する。閾値より大きいＥＭＴＧＳインデックススコアを持つ任意のサンプルを非応答者と同定する。閾値未満のまたは閾値と等しいＥＭＴＧＳインデックススコアを持つ任意のサンプルを応答者と同定する。サンプルの試験したセット由来のすべてのＥＭＴＧＳインデックススコアに関して、「応答者」および「非応答者」（仮定コール）は、ＥＭＴＧＳインデックススコアを用いて、閾値と分類される。このプロセスは、各潜在的閾値に関して、データセットに関する実際の反応データに対して仮定コールを比較することを通じて、ＴＰＲ（ｙベクトル）およびＦＰＲ（ｘベクトル）の計算を可能にする。次いで、ドットプロットを作製し、ＴＰＲベクトルおよびＦＰＲベクトルを用いることによって、ＲＯＣ曲線を構築する。ＲＯＣ曲線が、（０，０）点から（１．０，０．５）点の対角線より上である場合、ＥＭＴＧＳ試験結果は、ランダム．ＥＤＩＴより優れた試験であることが示される。
【００９５】
[127]ＲＯＣ曲線を用いて、最適な動作点を同定することも可能である。最適な動作点は、偽陰性のコストに対する偽陽性のコストの間の最適なバランスを生じるものである。これらのコストは等しい必要はない。ＲＯＣ空間における点ｘ、ｙでは、分類の平均期待コストは、式、Ｃ＝（１−ｐ）アルファ＊ｘ＋ｐ＊ベータ（１−ｙ）によって示され、式中：アルファ＝偽陽性のコスト、ベータ＝陽性を失うコスト（偽陰性）、およびｐ＝陽性症例の比率である。
【００９６】
[128]アルファおよびベータに関して異なる値を割り当てることによって、偽陽性および偽陰性に異なって加重することも可能である。例えば、非反応者である、より多くの患者を治療するコストを払って、反応者群により多くの患者を含めると決めた場合、アルファにより加重することも可能である。この場合、偽陽性および偽陰性のコストは同じであると仮定される（アルファがベータに等しい）。したがって、ＲＯＣ空間における点ｘ、ｙでの分類の平均期待コストは：Ｃ’＝（１−ｐ）＊ｘ＋ｐ＊（１−ｙ）である。偽陽性および偽陰性のすべての対（ｘ，ｙ）を用いた後、最小のＣ’を計算することも可能である。最適ＥＭＴＧＳインデックススコア閾値は、Ｃ’での（ｘ，ｙ）のＥＭＴＧＳインデックススコアとして計算される。
【００９７】
[129]腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に反応性であるかまたは耐性であるかを予測するのに加えて、ＥＭＴＧＳインデックススコアは、腫瘍が反応性であるかまたは非反応性である可能性がどのくらいかに関して、およそであるが有用な指標を提供する。一般的に、ＥＭＴＧＳ測定のためにｑＰＣＲを用いる際、ＥＭＴＧＳインデックススコアが低ければ低いほど、腫瘍はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に反応性であるはずであり、そしてＥＭＴＧＳインデックススコアが高ければ高いほど、腫瘍はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に耐性であるはずである。
【００９８】
[130]本発明は、癌患者を治療する方法であって：ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療に対して反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定するための本明細書開示の任意の方法を用いて、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いかどうかを決定し、そして患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤はエルロチニブを含む。
【００９９】
[131]本発明は、癌患者を治療する方法であって：ヒト腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療に対して反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定するための本明細書開示の任意の方法を用いて、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤はエルロチニブを含む。
【０１００】
[132]本発明は、癌患者を治療する方法であって：ヒト腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に対して反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定するための本明細書開示の任意の方法を用いて、患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性である可能性が高いかどうかを決定し、そして患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤はＯＳＩ−９０６を含む。
【０１０１】
[133]本発明は、癌患者を治療する方法であって：ヒト腫瘍がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に対して反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いかを同定するための本明細書開示の任意の方法を用いて、患者がＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対して反応性であると予測される場合、前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤はＯＳＩ−９０６を含む。
【０１０２】
[134]本発明は、腫瘍細胞増殖、または腫瘍増殖が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されるかどうかを予測する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害される参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されない参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、腫瘍増殖がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されるかどうかを予測する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤はエルロチニブを含み、そしてＩＧＲ−１Ｒキナーゼ阻害剤はＯＳＩ−９０６を含む。
【０１０３】
[135]本発明は、腫瘍増殖が、患者において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されるかどうかを予測する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害される可能性が高いことを示すと定義された閾値より上であるか、または前記閾値より下であり、そしてしたがって、腫瘍増殖がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせによって相乗的に阻害されるかどうかを予測する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤はエルロチニブを含み、そしてＩＧＲ−１Ｒキナーゼ阻害剤はＯＳＩ−９０６を含む。この方法は、癌患者が、単に単一の剤としての阻害剤よりも、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の組み合わせでの治療から利益を受ける可能性があり、そして単一剤に対する耐性の度合いが発展している場合には、特に有用でありうるかどうかを、医師が決定するのを補助する。
【０１０４】
[136]本発明は、腫瘍増殖阻害特性が腫瘍細胞のＥＭＴ状態に依存する化合物による阻害に対する、腫瘍細胞増殖の感受性を予測する方法であって：本明細書開示の任意の方法によって腫瘍細胞のＥＭＴ状態を同定し；そして阻害剤化合物による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測する、ここで腫瘍細胞ＥＭＴ状態が上皮である場合、阻害剤化合物による阻害に対する高い感受性が予測され、そして腫瘍細胞ＥＭＴ状態が間葉である場合、阻害剤化合物による阻害に対する低い感受性が予測される、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、腫瘍増殖阻害特性が腫瘍細胞のＥＭＴ状態に依存する化合物は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。本方法の別の態様において、腫瘍増殖阻害特性が腫瘍細胞のＥＭＴ状態に依存する化合物は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。
【０１０５】
[137]本発明は、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を同定する方法であって、スクリーニングしようとする試験化合物と、上皮腫瘍細胞株の細胞サンプルを接触させ、腫瘍細胞において上皮間葉転換を誘導する剤とサンプルを接触させ、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を、試験化合物と接触させていない腫瘍細胞の同一サンプルにおけるＥＭＴ状態に比較することによって、サンプル中の腫瘍細胞が上皮間葉転換を経るのを阻害するかどうかを決定し、ここで腫瘍細胞のＥＭＴ状態を、その目的のための本明細書開示の任意の方法によって決定する、そしてしたがって、試験化合物が、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物であるかどうかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１０６】
[138]本発明の方法において、腫瘍細胞において、上皮間葉転換を誘導する剤は、特定の腫瘍細胞タイプにおいてＥＭＴを誘導することが知られるいかなる剤であってもよい。腫瘍細胞のこうした剤に対する感受性は多様である。こうしたＥＭＴ誘導剤の例には、ＨＧＦ、ＷＮＴ経路アゴニスト、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路の活性化剤、ＴＧＦ−ベータ（例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、ＴＮＦ−アルファ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）、およびＩＬＥＩが含まれる。
【０１０７】
[139]本発明の方法において、上皮腫瘍細胞を、腫瘍細胞における上皮間葉転換を阻害する際の活性に関してスクリーニングしようとする試験化合物と接触させる際、化合物は、例えば、本明細書に上述するものなど、その活性化がＥＭＴを誘導することが知られる生物学的経路の１つに関与するタンパク質（または腫瘍細胞において該タンパク質をコードする遺伝子の発現）に対する阻害活性を有するものであってもよい。こうしたタンパク質の例には、プロテインキナーゼＰＡＫ１（ＧｅｎｅＩＤ：５０５８）、ＰＡＫ２（ＧｅｎｅＩＤ：５０６２）、オーロラＡ（ＧｅｎｅＩＤ：６７９０）、ＡＣＫ１（別称ＴＮＫ２；ＧｅｎｅＩＤ：１０１８８）、ＳＲＣ（ＧｅｎｅＩＤ：６７１４）、ＴＡＫ１（ＧｅｎｅＩＤ：７１８２）およびＭＥＴ（ＧｅｎｅＩＤ：４２３３）；ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ；例えばＨＤＡＣ１〜１０のいずれか）；ＬＰＡ受容体；ＳＨＨ（ソニックヘッジホッグ）シグナル伝達経路を刺激する際の活性を有するタンパク質、ＷＮＴシグナル伝達経路を刺激する際の活性を有するタンパク質、ＳＨＨ経路受容体Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ；ＧｅｎｅＩＤ：６６０８）、ＳＨＨ経路受容体Ｐａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣＨ１；ＧｅｎｅＩＤ：５７２７）；ＷＮＴ経路受容体（例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体１〜１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６）；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ共受容体；ＴＧＦ−ベータ受容体；ＴＮＦ−アルファ受容体；およびＯＳＭ受容体が含まれる。これらのタンパク質の活性を阻害する多くの化合物または抗体が、すでに知られており、そしてハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）を含む、生化学的アッセイまたはスクリーンにおいて、さらなる化合物が容易に同定される。
【０１０８】
[140]腫瘍細胞が上皮間葉転換を経るのを阻害する化合物を同定するための本明細書開示の方法はまた、ＥＭＴ転換から部分的に生じる線維性障害の治療のための剤を同定する際にも有用であり、こうした障害には、限定されるわけではないが、腎線維症、肝線維症、肺線維症、および中皮腫が含まれる。これらの疾患において、正常に機能している肺、腎臓および肝臓細胞が、筋線維芽細胞に転換されうる。したがって、腫瘍細胞に関して本明細書に記載する任意の方法はまた、ＥＭＴを経る線維性疾患に関与する他の細胞タイプにも適用可能であろう。同様に、抗癌剤の同定に有用であると本明細書に記載する任意の発明はまた、線維症を伴う疾患を治療するための抗線維症剤の同定にも有用であろう。
【０１０９】
[141]本発明は、間葉様腫瘍細胞を刺激して、間葉上皮転換を経るようにする化合物を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株の細胞サンプルを、腫瘍細胞において上皮間葉転換を誘導する剤と接触させ、スクリーニングしようとする試験剤と細胞サンプルを接触させ、サンプル腫瘍細胞のＥＭＴ状態を、試験化合物と接触させていない腫瘍細胞の同一サンプルにおけるＥＭＴ状態と比較することによって、サンプル中の間葉様腫瘍細胞が間葉上皮転換を経るのを試験化合物が刺激するかどうかを決定し、ここで腫瘍細胞のＥＭＴ状態をその目的のための本明細書開示の任意の方法によって決定する、そしてしたがって、試験化合物が、腫瘍細胞が間葉上皮転換を経ることを刺激する化合物であるかどうかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１１０】
[142]本発明は、上皮間葉転換を経た腫瘍細胞を阻害する剤を同定する方法であって、腫瘍細胞において上皮間葉転換を誘導する剤と、上皮腫瘍細胞株の細胞サンプルを接触させ、ここで間葉様表現型は、その目的のための本明細書開示の任意の方法によって決定され、スクリーニングしようとする試験剤を細胞サンプルと接触させ、試験剤が間葉様腫瘍細胞増殖を阻害するかどうかを決定し、そしてしたがって上皮間葉転換を経た腫瘍細胞の増殖を阻害する剤であるかどうかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。この方法の１つの態様は、試験剤が、上皮間葉転換を経た腫瘍細胞の増殖を阻害するかどうかを決定する工程の後に、間葉様腫瘍細胞増殖を阻害する剤がまた、上皮腫瘍細胞増殖も阻害するかどうかを決定し、そしてしたがって該剤が、上皮間葉転換を経た腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害する剤であるかどうかを決定するさらなる工程を含む。本方法のさらなる態様において、試験剤が間葉様腫瘍細胞増殖を阻害するかどうかを決定する工程のため、試験剤が、前記腫瘍細胞のアポトーシスを刺激することによって、阻害を行うことを決定する。本方法のさらなる態様において、試験剤が間葉様腫瘍細胞増殖を阻害するかどうかを決定する工程のため、試験剤が、前記腫瘍細胞の増殖を阻害することによって、阻害を行うことを決定する。
【０１１１】
[143]本発明は、本明細書開示の剤を同定する任意の方法であって、上皮腫瘍細胞株の細胞サンプルが動物（例えばヌードマウス）において成長する異種移植片である、前記方法をさらに提供する。
【０１１２】
[144]本発明は、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物での治療から利益を受けうる癌患者を同定する方法であって；患者から腫瘍細胞サンプルを得て、該サンプルにおける、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、およびＺＥＢ２のＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベルを測定し；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてＥＭＴインデックススコアが間葉表現型の細胞により似ている場合、患者を、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物での治療から利益を受けうる患者であると同定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本方法の１つの態様において、上皮間葉転換を経ることから腫瘍細胞を阻害する化合物を含む薬学的組成物はさらに、ＥＧＦＲキナーゼの阻害剤を含む。本方法の別の態様において、上皮間葉転換を経ることから腫瘍細胞を阻害する化合物を含む薬学的組成物はさらに、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼの阻害剤を含む。
【０１１３】
[145]本発明は、腫瘍細胞が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を経ることを阻害する化合物で治療されている癌患者を監視して、阻害剤が腫瘍細胞のＥＭＴを阻害するのに有効かどうかを決定する方法であって：（ａ）患者から腫瘍細胞サンプルを得て、（ｂ）該サンプルにおける、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２のＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベルを測定し；（ｃ）共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；（ｄ）前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてＥＭＴインデックススコアが間葉表現型の細胞により似ている場合、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物での治療から、利益を受けうる患者であると同定し；（ｅ）腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物の療法的有効量を、治療から利益を受けうる前記患者に投与し；そして（ｆ）患者から腫瘍細胞の別のサンプルを得て、そしてＥＭＴ阻害剤の投与が、工程（ｃ）で測定したものよりも、ＥＭＴインデックススコアを増加させて、上皮表現型の細胞のものとより似たものにしているかどうかを決定し、そしてしたがって、化合物が、腫瘍細胞のＥＭＴを阻害するのに有効であるかどうかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１１４】
[146]本発明は、癌患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって：その目的のための本明細書開示の任意の方法を用いて、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ているかどうかを評価することによって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性を診断し、そして前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１１５】
[147]本発明は、癌患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって：その目的のための本明細書開示の任意の方法を用いて、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ているかどうかを評価することによって、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性を診断し、そして前記患者に、療法的有効量のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１１６】
[148]本発明は、癌患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって：その目的のための本明細書記載の任意の方法を用いて、ＥＭＴの阻害剤での治療から利益を受けうる患者であると同定し、そして前記患者に、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。この方法の１つの態様において、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物は、さらに、ＥＧＦＲキナーゼの阻害剤を含む。本方法の別の態様において、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物は、さらに、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼの阻害剤を含む。
【０１１７】
[149]本発明の方法で使用可能なＥＭＴ阻害剤化合物の例には、ＥＭＴ誘導剤のアンタゴニスト、ＴＧＦ−ベータ・アンタゴニストまたはＴＧＦ−ベータ受容体アンタゴニスト（例えば：抗ＴＧＦ−ベータおよび抗ＴＧＦ−ベータ受容体抗体、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ  ２０３５８０）；４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）；および同様の活性またはより活性であるこうした化合物の類似体または相同体）、ＭＥＴ、ＦＡＫ、ＴＡＫ１、ＩＬＫ、ＳＲＣ、ＦＹＮまたはＹＥＳプロテインキナーゼの阻害剤、およびカルパイン阻害剤が含まれる。こうした化合物のさらなる例には、米国特許出願１２／７９１，０４７、米国公開特許出願ＵＳ２００９／１９７８６２におけるもの、ダサチニブ（Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−［［６−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−メチル−４−ピリミジニル］アミノ］−５−チアゾールカルボキサミド一水和物）、ＡＺＤ０５３０、ＰＦ５７３２２８（３，４−ジヒドロ−６−［［４−［［［３−（メチルスルホニル）フェニル］メチル］アミノ］−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリミジニル］アミノ］−２（１Ｈ）−キノリノン）、ＮＶＰ−ＴＡＥ２２６、ＮＶＰ−ＴＡＣ５４４、ＡＲＱ  １９７（Ａｒｑｕｌｅ）、ＰＮＤ−１１８６、ＰＦ２３６２３７６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−５６２，２７１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−２，３４１，０６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＥ−３５５６２１抗ｃ−ＭＥＴ抗体、ＰＨＡ６６５７５２（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＰＦ−３，８１４，７３５（Ｐｆｉｚｅｒ）が含まれる。
【０１１８】
[150]本発明はさらに、複数の腫瘍細胞サンプル各々における、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を決定する方法であって：腫瘍細胞サンプル各々において、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを測定し、ここでＥＭＴＧＳは、本質的に以下の遺伝子からなる：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、各腫瘍サンプルに関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして腫瘍細胞サンプル各々に関して、前記ＥＭＴＧＳインデックススコアが、参照上皮腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、または参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに、より似ているかを決定し、そしてしたがって、各腫瘍細胞サンプルのＥＭＴ状態を決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。この方法を、例えば、患者集団における上皮および間葉様腫瘍の相対数を決定し、そしてしたがって、有効性が腫瘍細胞のＥＭＴ状態に依存する抗癌剤（例えばＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、例えばエルロチニブまたはＯＳＩ−９０６）によって、この群の患者が有効に治療される可能性を予測するために用いることも可能である。本方法の特定の態様において、複数の腫瘍細胞サンプルは、例えば１〜１０、１０〜２０、２０〜３０；３０〜４０；４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１０００、または１０００〜１００００の範囲中の任意の数であってもよい。
【０１１９】
[151]本発明は、以下の遺伝子：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、およびＺＥＢ２の各々に対するプライマー対からなるＰＣＲプライマーセットをさらに提供する。
【０１２０】
[152]本発明は、固相表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットが、以下の遺伝子：ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＣＴＮ１、ＡＧＲ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＣＡＭ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＸＬ、ＢＳＰＲＹ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＥＰ１７０、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＮＮ３、ＣＹＰ４Ｘ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＳＧ３、ＤＳＰ、ＥＦＮＢ２、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＬＦ５、ＥＲＢＢ３、ＥＴＶ５、ＦＬＲＴ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＣ１、ＦＸＹＤ５、ＧＰＤ１Ｌ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＯＰＸ、ＩＦＩ１６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＨＨ、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１８、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＣＮ２、ＭＡＰ７、ＭＢ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＰＺＬ２、ＭＳＬＮ、ＭＴＡ３、ＭＴＳＳ１、ＯＣＬＮ、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮＢ１、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＲＡＳＳＦ８、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＦＲＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＢＸ２、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＸＢＰ１、ＹＢＸ１、ＺＢＴＢ１０、ＺＥＢ１、およびＺＥＢ２の各々に特異的なプローブからなる、前記ＤＮＡマイクロアレイチップをさらに提供する。
【０１２１】
[153]本発明の方法において、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物は、ＥＭＴを阻害しても、またはＭＥＴの逆プロセスを刺激してもよい。「上皮間葉転換の阻害」は、特定の機構を暗示せず、単に、こうした化合物によって、細胞の上皮表現型が維持されるか、または再確立される。
【０１２２】
[154]本発明の方法において、「腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する化合物を含む薬学的組成物」は、腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることを阻害する１つまたは多数の化合物を含んでもよい。多数の化合物は、異なるＥＭＴ遺伝子セットを調節することによって、互いに補完してもよい。例えば、１つの化合物がＥＭＴに関与する遺伝子のサブセットを調節し、一方、第二の化合物が他のセットを調節して、合わせた効果が腫瘍細胞が上皮間葉転換を経ることのより有効な阻害であってもよい。本明細書に開示する８８ＥＭＴＧＳおよび他のＥＭＴＧＳを用いて、ＥＭＴＧＳ内のどの遺伝子の発現が、任意の所定のＥＭＴ誘導因子によって調節され、そしてしたがってまた、どの遺伝子の発現がＥＭＴ阻害剤化合物によって影響を受けるのかを決定してもよい。したがって、その発現の調節がＥＭＴ阻害剤の作用に非常に重要であるＥＭＴＧＳ遺伝子サブセットを同定することが可能である。この遺伝子サブセットの発現評価を用いて、腫瘍細胞に対する、例えば腫瘍生検における化合物の影響を監視して、そして腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳからインデックススコアを得ることによって、定量化してもよい。
【０１２３】
[155]したがって、本発明は、阻害剤化合物での治療に対するヒト腫瘍の反応を監視して、阻害剤が腫瘍細胞におけるＥＭＴを阻害するのに有効かどうかを決定する方法であって：腫瘍細胞サンプルにおいて、特定の生物学的機構を通じて作用するＥＭＴ阻害剤化合物によってＥＭＴが阻害された際に協調して制御されると決定されている遺伝子群からなり、そしてその機構を通じた阻害に特徴的である、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー（ＥＭＴＧＳ）の各遺伝子の相対発現レベルを、前記治療の前および後の両方で測定し；共相関遺伝子の寄与を取り込むアルゴリズムを、測定された発現レベル値に適用することによって、前記治療の前および後の両方由来の前記腫瘍細胞に関するＥＭＴＧＳインデックススコアを計算し；そして参照上皮腫瘍細胞および参照間葉様腫瘍細胞由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに比較した、前記治療の前および後の両方由来の該ＥＭＴＧＳインデックススコアの相違の度合いから、阻害剤化合物での治療が腫瘍細胞中のＥＭＴを阻害するのに有効であるかどうかを決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。この方法の１つの態様において、阻害剤化合物は、ＭＥＴキナーゼ阻害剤であり、そしてＥＭＴＧＳは以下の遺伝子：ＣＹＰ４Ｘ１、ＦＯＳＢ、ＭＭＰ９、ＶＩＭ、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＨＯＰＸ、ＭＭＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、およびＶＷＦから本質的になる。この方法の別の態様において、阻害剤化合物は、ＦＡＫキナーゼ阻害剤であり、そしてＥＭＴＧＳは以下の遺伝子：ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＭＰＺＬ２、ＭＡＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、およびＴＭＥＭ４５Ｂから本質的になる。この方法のさらなる態様において、阻害剤化合物は、ＴＡＫ１キナーゼ阻害剤であり、そしてＥＭＴＧＳが以下の遺伝子：ＦＯＳＢ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＭＭＰ９、ＭＳＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ２、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、およびＸＢＰ１から本質的になる。これらの方法のいずれにおいても、ＥＭＴＧＳインデックススコアを引き出すために用いるアルゴリズムは、本明細書の以下に定義するようなアルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１であってもよい。
【０１２４】
[156]本発明はさらに、以下の遺伝子：ＣＹＰ４Ｘ１、ＦＯＳＢ、ＭＭＰ９、ＶＩＭ、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＨＯＰＸ、ＭＭＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、およびＶＷＦの各々に関するプライマー対からなるＰＣＲプライマーをさらに提供する。
【０１２５】
[157]本発明は、固相表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットが、以下の遺伝子：ＣＹＰ４Ｘ１、ＦＯＳＢ、ＭＭＰ９、ＶＩＭ、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＨＯＰＸ、ＭＭＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＬＸＮＢ１、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、ＴＭＥＭ４５Ｂ、およびＶＷＦの各々に特異的なプローブからなる、前記ＤＮＡマイクロアレイチップをさらに提供する。
【０１２６】
[158]本発明はさらに、以下の遺伝子：ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＭＰＺＬ２、ＭＡＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、およびＴＭＥＭ４５Ｂの各々に関するプライマー対からなるＰＣＲプライマーをさらに提供する。
【０１２７】
[159]本発明は、固相表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットが、以下の遺伝子：ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＭＰＺＬ２、ＭＡＰ７、ＯＣＬＮ、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＰＤＥＦ、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ１２５、およびＴＭＥＭ４５Ｂの各々に特異的なプローブからなる、前記ＤＮＡマイクロアレイチップをさらに提供する。
【０１２８】
[160]本発明はさらに、以下の遺伝子：ＦＯＳＢ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＭＭＰ９、ＭＳＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ２、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、およびＸＢＰ１の各々に関するプライマー対からなるＰＣＲプライマーセットをさらに提供する。
【０１２９】
[161]本発明は、固相表面およびプローブセットからなるＤＮＡマイクロアレイチップであって、前記プローブセットが、以下の遺伝子：ＦＯＳＢ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＭＭＰ９、ＭＳＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ２、ＰＰＬ、ＰＰＰ１Ｒ９Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＪＰ３、およびＸＢＰ１の各々に特異的なプローブからなる、前記ＤＮＡマイクロアレイチップをさらに提供する。
【０１３０】
[162]阻害剤化合物での治療に対するヒト腫瘍の反応性を監視して、阻害剤が腫瘍細胞におけるＥＭＴを阻害するのに有効かどうかを決定する任意の方法の態様において、腫瘍細胞は、癌患者由来の腫瘍由来であってもよい。これらの任意の方法の１つの態様において、腫瘍細胞サンプルは、腫瘍生検由来であるか、または循環腫瘍細胞を含有する血液サンプル由来である。腫瘍細胞は、例えば、ＮＳＣＬ癌、乳癌、結腸直腸癌、または膵臓癌腫瘍細胞であってもよい。
【０１３１】
[163]例えば、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療に反応性である可能性が高いかまたは非反応性である可能性が高いヒト腫瘍の同定に関与する、本明細書記載の本発明の特定の態様において、ＥＭＴＧＳは、ＨＵＧＯ遺伝子記号によって表１に列挙される８８遺伝子からなるか、これらから本質的になるか、またはこれらで構成される。これらの遺伝子を図３６および３７により詳細に記載する。
【０１３２】
[164]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤から最も利益を得る患者集団のみが治療される必要があり、そして特に、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療から利益を得ないと予測される患者は治療される必要がない点で、治療措置の一部として、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での癌患者の治療の有効性を予測する、本明細書記載の任意の診断法を包含することは、こうした診断工程を含まない治療措置に勝る利点を提供する。
【０１３３】
[165]本発明は、癌患者を治療するための方法であって：ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の有効性を予測するための本明細書記載の本発明の任意の方法によって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性を診断する工程；および該患者に、療法的有効用量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１３４】
[166]本明細書記載の患者を治療する任意の方法の１つの態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の療法的有効用量を患者に投与する工程は、治療がより有効であることを示す、先のバイオマーカー診断工程を条件とする。本明細書記載の患者を治療する任意の方法の別の態様において、先のバイオマーカー診断工程が、治療が特に有効である可能性が高くないと予測する場合であっても、患者にＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の療法的有効用量を投与する。例えば医師の判断において、何らかの利益がなお、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の投与によって達成される可能性があり、そして／または患者に対する他のオプションが限定されているかまたは存在しない場合には、後者の態様を追求してもよい。
【０１３５】
[167]本明細書記載のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療法のため、好ましいＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の例は、薬理学的に許容されうる塩またはその多形を含む、エルロチニブである。個々の患者に属する任意のさらなる環境と組み合わせて、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性が予測されるならば、投与する医師によって適切であると判断されるように、１またはそれより多いさらなる抗癌剤または治療もまた、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤とともに、同時にまたは連続して共投与してもよい。
【０１３６】
[168]本明細書記載のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療法のため、好ましいＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の例は、薬理学的に許容されうる塩またはその多形を含む、ＯＳＩ−９０６である。個々の患者に属する任意のさらなる環境と組み合わせて、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性が予測されるならば、投与する医師によって適切であると判断されるように、１またはそれより多いさらなる抗癌剤または治療もまた、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤とともに、同時にまたは連続して共投与してもよい。
【０１３７】
[169]したがって、医学業の当業者には、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性の診断の後に、前記患者に、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を投与する正確な投与方式は、主治医の裁量によることが認識されるであろう。投与様式は、投薬量、他の抗癌剤との組み合わせ、投与のタイミングおよび頻度等を含め、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者のありうる反応性の診断、ならびに患者の状態および病歴によって、影響を受ける可能性もある。したがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤によく反応しないと診断された患者であってもなお、特に、他の抗癌剤、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する患者の反応を改変しうる剤と組み合わせた場合には、こうした阻害剤での治療から利益を受ける可能性もある。
【０１３８】
[170]本明細書記載の本発明の任意の方法において、「患者の腫瘍細胞によって発現される遺伝子（例えばＥ−カドヘリン、ビメンチン）の発現レベルを評価する」工程は、さらなる工程、例えば以下の工程の１またはそれより多くを含んでもよい：１．癌患者から腫瘍サンプルを得て；２．腫瘍サンプル、またはそこから精製されたサンプルを、抗バイオマーカー抗体、バイオマーカープローブ、またはＰＣＲプライマーと接触させ；そして３．検出法（例えば色素原；蛍光）を使用して、腫瘍サンプルにおける抗体またはプローブ結合部位を位置決定し、そして定量化する。
【０１３９】
[171]本発明の任意の方法における、上皮または間葉様腫瘍細胞のＥＭＴＧＳインデックススコアにより類似であるとする患者腫瘍細胞のＥＭＴＧＳインデックススコアの評価は、参照または対照腫瘍細胞サンプルのインデックススコアの値に対する比較によって、決定可能であり、ここでこの対照腫瘍細胞スコアは、上皮または間葉様表現型と先に相関づけられている。あるいは、ある範囲のインデックススコアに相当する、そしてしたがってある範囲の表現型、例えば１００％上皮から１００％間葉の範囲の、こうした参照腫瘍細胞サンプルのパネルを用いて、試験腫瘍細胞サンプルのインデックススコアから表現型が予測可能であるような、標準曲線を構築することも可能である。
【０１４０】
[172]本明細書において、用語「より似ている」は、通常の意味を有する。患者由来の腫瘍細胞は、例えば１００％上皮である腫瘍細胞から、１００％間葉である腫瘍細胞まで、細胞の表現型を反映するインデックススコアの範囲を有するであろう。こうした範囲の端由来の腫瘍細胞は、ＥＭＴ状態に関して性質決定する必要がある腫瘍細胞サンプルに比較するための、参照腫瘍細胞として利用可能である。したがって、腫瘍細胞は、インデックススコアが上皮または間葉細胞に関する値にはるかに近い（例えば、参照細胞インデックススコアに、２つの参照細胞インデックススコアの間の相違の度合いの１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満の任意の値を加えるかまたは減じたもの）場合、これらの２つの表現型の一方または他方により類似であろうし、そしてインデックススコアが範囲の中央にある場合、中間の表現型と見なされるであろう。こうした中間の表現型は、例えば、転移可能腫瘍細胞型、あるいは上皮から間葉に、またはその逆に活発に転換している腫瘍細胞に関して予期されるであろう。本発明の方法において、参照細胞として使用可能な上皮または間葉様腫瘍細胞の例には、上皮または間葉として特徴付けられている腫瘍細胞（例えば形態学的、バイオマーカー、および／または表現型状態によって、判断されるように）、あるいは本明細書記載のものの多くを含めて、同様に性質決定されている腫瘍細胞株が含まれる。例えば、本明細書記載の腫瘍細胞ＥＭＴモデルの１つ（例えばＨ３５８  ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞；別名、ＮＣＩ−Ｈ３５８ＴＭまたはＣＲＬ−５８０７）を用いて参照細胞を提供してもよく、ここで上皮参照細胞は未刺激腫瘍細胞であり、そして間葉様参照細胞は外因性リガンドによって、またはＥＭＴ誘導剤（例えば活性化ＴＧＦ−ベータ、転写因子ｓｎａｉｌ）をコードするトランスフェクション遺伝子の誘導によって、ＥＭＴ誘導された後の腫瘍細胞である。参照腫瘍細胞は、好ましくは、分析されているサンプル腫瘍細胞と同じかまたは類似の組織タイプである。さらなる適切な参照腫瘍細胞には、例えば、上皮である肺腫瘍細胞Ｈ４４１、Ｈ３２２、およびＨ２９２、ならびにどちらも間葉様であるＨ１７０３およびＨ４６０；どちらも上皮である乳房腫瘍細胞ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ、ならびにどちらも間葉様であるＢＴ−５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１；すべて上皮である膵臓腫瘍細胞ＣＦＰＡＣ１、ＨＰＡＣ、およびＢｘＰＣ３、ならびにどちらも間葉様であるＡ１１６５およびＰＡＮＣ１；ならびにすべて上皮であるＣＲＣ腫瘍細胞ＨＣＴ−１５、ＳＷ４８０、ＨＣＴ８、ならびに間葉様であるＳＷ６２０が含まれる。サンプル腫瘍細胞のインデックススコアが、感受性および耐性参照細胞の間の範囲の外に属する場合、明らかに、サンプルスコアの範囲外にある範囲の側の参照細胞により類似であろう。
【０１４１】
[173]当業者には、参照腫瘍細胞サンプル（例えば上皮または間葉）は、すべてのアッセイに関して、アッセイを行う間に確立する必要はなく、むしろ、上皮および間葉腫瘍細胞（または患者反応者および非反応者）の間を区別する、先に決定された単数のインデックススコア（または複数のスコア）に関する貯蔵された情報の一種を参照することによって、ベースラインまたは参照を確立することも可能である。こうした貯蔵された情報の一種には、限定されるわけではないが、感受性および耐性腫瘍または患者に関する集団または個々のデータの参照チャート、リストまたは電子ファイル、あるいは評価しようとする患者または腫瘍細胞に有用である、腫瘍細胞感受性または耐性に関するＥＭＴインデックス値のカットオフレベルに関するデータの任意の他の供給源が含まれることも可能である。
【０１４２】
[174]本発明はさらに、癌患者を治療するための方法であって：患者腫瘍サンプルを得て、サンプルの腫瘍細胞がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤に対する感受性を予測するＥＭＴＧＳインデックス値を有するかどうかを決定することによって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療から利益を受ける可能性が最も高い癌患者を同定し、そしてＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の療法的有効用量を患者に投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０１４３】
[175]本明細書（例えば図３６および３７中）に列挙するＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ番号は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベース記録由来のヒト遺伝子のユニークな同定因子である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ），  Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４；インターネット・アドレス  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。本明細書において、これらを用いて、名称および／または頭字語によってアプリケーションにおいて参照される遺伝子を明白に同定する。こうして同定される遺伝子によって発現される遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ、タンパク質）は、本発明の方法において使用可能である産物に相当し、そしてＮＣＢＩデータベース（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標））記録中に開示されるようなこれらの産物の配列は、異なるアイソフォームを含めて、本明細書に援用される。同様に、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ＧｅｎｅＩＤ番号（例えば図３６および３７中）は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩおよびＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ共同研究によって用いられるヒト遺伝子のユニークな同定因子である。
【０１４４】
[176]本発明の方法において、癌患者の腫瘍細胞は、好ましくは、ＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼを発現することが知られるかまたは期待されるタイプのものであり、上皮細胞系譜由来の固形腫瘍由来の大部分の腫瘍細胞が当てはまる。こうした腫瘍細胞には、例えば、肺癌腫瘍（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、または本明細書において、以下に記載するような多様な他の癌いずれか由来の腫瘍細胞が含まれる。これらの腫瘍細胞のＥＧＦＲキナーゼは、野生型または突然変異型であってもよい。
【０１４５】
[177]本発明の方法において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、以下に記載するような、任意のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であってもよい。１つの態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、薬理学的に許容されうる塩または多形を含む、６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４、またはタルセバ（登録商標）（すなわちエルロチニブＨＣｌ））である。
【０１４６】
[178]本発明の方法において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、以下に記載するような、任意のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤であってもよい。１つの態様において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、薬理学的に許容されうる塩または多形を含む、シス−３−［８−アミノ−１−（２−フェニル−キノリン−７−イル）−イミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−３−イル］−１−メチル−シクロブタノール（ＯＳＩ−９０６としても知られる）である。
【０１４７】
[179]本発明の方法において、好ましくは腫瘍生検をアッセイすることによって腫瘍細胞遺伝子の発現レベルを評価する。しかし、別の態様において、腫瘍から生じる腫瘍細胞の検出可能なレベルを含有する体液または排出物において、腫瘍細胞遺伝子の発現レベルを評価してもよい。本発明で有用な体液または排出物には、血液、尿、唾液、糞便、胸水、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、あるいは任意の他の体性分泌物または派生物が含まれる。血液によって、全血、血漿、血清または任意の血液派生物が含まれると意味される。こうした体液または排出物における腫瘍細胞遺伝子の評価は、ときに、侵襲性サンプル採取法が不適切であるかまたは不都合である状況において好ましい可能性もある。腫瘍細胞遺伝子発現の評価のため、腫瘍細胞を含有する患者サンプル、あるいはこれらの腫瘍細胞によって産生されるタンパク質または核酸を、本発明の方法において用いてもよい。もちろん、サンプルにおける遺伝子発現を評価する前に、細胞サンプルを多様な周知の収集後調製技術および貯蔵技術に供してもよい（例えば核酸および／またはタンパク質抽出、固定、貯蔵、凍結、限外ろ過、濃縮、蒸発、遠心分離等）。同様に、腫瘍生検もまた、収集後調製技術および貯蔵技術、例えば固定に供してもよい。
【０１４８】
[180]本発明の方法において、遺伝子発現レベルを決定するための当該技術分野に知られる標準的バイオアッセイ法のいずれを用いることによって、腫瘍細胞における遺伝子発現を評価してもよく、例えばバイオアッセイ法には、以下により詳細に記載するような、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、イムノブロッティング、免疫蛍光顕微鏡、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡマイクロアレイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写等が含まれる。
【０１４９】
[181]本明細書に記載するような診断アッセイの一般的な原理は、発現された遺伝子産物を含有しうるサンプルまたは反応混合物、およびプローブを、適切な条件下で、そして産物およびプローブが相互作用してそして結合するのに十分な時間、調製し、こうして反応混合物またはサンプルにおいて除去し、そして／または検出することが可能な複合体を形成する工程を含む。これらのアッセイは多様な方式で実行可能である。例えば、こうしたアッセイを実行する１つの方法は、基盤とも称される固相支持体上に、発現された産物またはプローブを係留し、そして反応終了時に、固相上に係留されたターゲット産物／プローブ複合体を検出する工程を伴うであろう。こうした方法の１つの態様において、遺伝子産物の存在および／または濃度に関してアッセイしようとする被験体由来のサンプルを、キャリアーまたは固相支持体上に係留してもよい。別の態様において、逆の状況が可能であり、この場合、プローブを固相に係留し、そして被験体由来のサンプルをアッセイの係留されない構成要素として反応させてもよい。
【０１５０】
[182]固相にアッセイ構成要素を係留するための多くの確立された方法がある。これらには、限定されるわけではないが、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲート化を通じて固定されるバイオマーカーまたはプローブ分子が含まれる。当該技術分野に知られる技術（例えばビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォード）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、こうしたビオチン化アッセイ構成要素を調製し、そしてストレプトアビジン・コーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定してもよい。特定の態様において、固定されたアッセイ構成要素を持つ表面をあらかじめ調製し、そして貯蔵してもよい。
【０１５１】
[183]こうしたアッセイのための他の適切なキャリアーまたは固相支持体には、バイオマーカーまたはプローブが属する分子クラスに結合可能な任意の物質が含まれる。周知の支持体またはキャリアーには、限定されるわけではないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含まれる。
【０１５２】
[184]上述のアプローチでアッセイを行うため、固相上に非固定構成要素を添加し、それに際して、第二の構成要素が係留される。反応が完了したら、形成されたいかなる複合体も、固相上に固定されたままであるような条件下で、複合体化していない構成要素を除去してもよい（例えば洗浄によって）。固相に係留された、発現された産物／プローブ複合体の検出を、本明細書に概略する多くの方法において達成してもよい。
【０１５３】
[185]１つの態様において、プローブが係留されないアッセイ構成要素である場合、アッセイの検出および読み取りのために、本明細書に論じ、そして当業者に周知の検出可能標識で、直接または間接的にプローブを標識してもよい。
【０１５４】
[186]例えば、蛍光エネルギー移動（すなわち、ＦＥＴ、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；  Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）を利用することによって、どちらの構成要素（バイオマーカーまたはプローブ）のさらなる操作または標識も伴わずに、産物／プローブ複合体形成を直接検出することもまた可能である。適切な波長の入射光で励起した際に、放出された蛍光エネルギーが、第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、これが次に吸収されたエネルギーによって、蛍光を生じることが可能であるように、第一の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識を選択する。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、単に、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプター」分子標識が、「ドナー」のものと区別可能であるように、異なる波長の光を放出する、標識を選択する。標識間のエネルギー移動の効率は、分子を分ける距離に関連するため、分子の間の空間的関係を評価することも可能である。分子間で結合が起こる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光放出は最大であるはずである。当該技術分野に周知の標準的蛍光分析検出手段（例えば蛍光光度計を用いて）、ＦＥＴ結合事象を好適に測定することも可能である。
【０１５５】
[187]別の態様において、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えばＳｊｏｌａｎｄｅｒ，  Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，  Ｃ．，  １９９１，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３：２３３８−２３４５、ならびにＳｚａｂｏら，  １９９５，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５：６９９−７０５を参照されたい）などの技術を利用することによって、いずれのアッセイ構成要素（プローブまたはバイオマーカー）も標識することなく、プローブがバイオマーカーを認識する能力の決定を達成してもよい。本明細書において、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、反応体のいずれも標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面での質量の変化（結合事象の指標）は、表面近くでの光の屈折率の改変を生じ（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用可能な検出可能シグナルを生じる。
【０１５６】
[188]特定の態様において、当該技術分野に知られる方法を用いて、生物学的サンプルにおいて、ｉｎ  ｓｉｔｕによって、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ形式によっての両方で、ｍＲＮＡのレベルを決定してもよい。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された、組織、細胞、生物学的液体およびその単離物、ならびに被験体内に存在する、組織、細胞および液体を含むように意図される。多くの発現検出法は、単離ＲＮＡを用いる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法のため、腫瘍細胞からのＲＮＡ精製のために、ｍＲＮＡの単離に反するように選択しない任意のＲＮＡ単離技術を利用してもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９を参照されたい）。さらに、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの一工程ＲＮＡ単離プロセス（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）などの、当業者に周知の技術を用いて、多数の組織サンプルを容易にプロセシングすることも可能である。
【０１５７】
[189]単離されたｍＲＮＡを、限定されるわけではないが、ノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて用いてもよい。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断法は、検出しようとする遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸分子（プローブ）と単離ｍＲＮＡを接触させることを伴う。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはその一部、例えば長さ少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドであり、そして本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明の診断アッセイにおいて使用するための他の適切なプローブを本明細書に記載する。プローブとｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、問題のバイオマーカーが発現されていることを示す。
【０１５８】
[190]１つの形式において、例えばアガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動し、そしてニトロセルロースなどの膜にゲルからｍＲＮＡをトランスファーすることによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定し、そしてプローブと接触させる。別の形式において、例えばＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブ（単数または複数）を固体表面に固定し、そしてｍＲＮＡをプローブ（単数または複数）に接触させる。当業者は、本発明のバイオマーカーにコードされるｍＲＮＡのレベルを検出する際に使用するため、既知のｍＲＮＡ検出法を容易に適応させることも可能である。
【０１５９】
[191]サンプル中のｍＲＮＡレベルを決定するための別の方法は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に示される実験態様）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：１８９−１９３）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータ・レプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら，  １９８８，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法の後、当業者に周知の技術を用いて、増幅分子を検出することによる、核酸増幅プロセスを伴う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数しか存在しない場合に、こうした分子を検出するのに特に有用である。本明細書において、増幅プライマーを、遺伝子（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）の５’または３’領域にアニーリング可能であり、そしてその間に短い領域を含有する、核酸分子対と定義する。一般的に、増幅プライマーは、長さ約１０〜３０ヌクレオチドであり、そして長さ約５０〜２００ヌクレオチドの領域に隣接する。適切な条件下で、そして適切な試薬とともに、こうしたプライマーは、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０１６０】
[192]ｉｎ  ｓｉｔｕ法に関しては、ｍＲＮＡは、検出前に腫瘍細胞から単離される必要はない。こうした方法において、既知の組織学的方法を用いて、細胞または組織サンプルを調製し／プロセシングする。次いで、サンプルを支持体、典型的にはガラススライド上に固定し、そして次いでバイオマーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なプローブと接触させる。
【０１６１】
[193]サンプル中のＥＭＴシグネチャー遺伝子発現レベルを本発明にしたがって決定可能であるように、ヒト患者または動物モデルにおける腫瘍由来の組織サンプルをＲＮＡ供給源として用いてもよい。一般的に、腫瘍は癌腫であろう。慣用的な腫瘍生検装置および方法を用いることによって、組織サンプルを得てもよい。内視鏡生検、切除生検、切開生検、細針生検または吸引（ＦＮＡ）、コア生検、パンチ生検、薄片生検および皮膚生検が、本発明を実施する際に使用するための腫瘍サンプルを得るために、当業者によって使用可能な認識される医学的方法の例である。腫瘍組織サンプルは、個々の遺伝子発現レベルを測定するのに十分なＲＮＡを提供するために十分に大きくなければならない。
【０１６２】
[194]巨視的解剖および／または顕微解剖法（例えばレーザー顕微解剖および圧カタパルティング（ＬＭＰＣ））を用いて、腫瘍から組織サンプルを得てもよい。例えばＰＡＬＭ（登録商標）マイクロビーム顕微鏡（Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ．  Ｍｉｃｒｏｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ、ドイツ・ベルンリート）；またはＳＬ−Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  ＵＶレーザー顕微解剖系（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、スイス・グラットブルック））を用いて、正常組織細胞または間質細胞を除去することによって、腫瘍サンプルの腫瘍細胞集団を濃縮してもよい（例えばｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ＥＣ．ら  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００５  Ｏｃｔ  １４；６：１４２；  Ｄｈａｌ，  Ｅ．ら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｕｌｙ  ２００６  １２；  ３９５０；  Ｆｕｎｅｌ，  Ｎ．ら  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  （２００８）  ８８，  ７７３−７８４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．２００８．４０，  オンライン公開２００８年５月１９日））。また、純粋な腫瘍細胞集団を生じるため、サンプルから初代腫瘍細胞培養を調製してもよい。
【０１６３】
[195]腫瘍組織サンプルは、遺伝子発現分析、例えばＲＮＡ抽出および定量化を可能にする、いかなる形態であってもよい。したがって、組織サンプルは、新鮮であるか、適切な低温貯蔵技術を通じて保存されるか、または非低温貯蔵技術を通じて保存されてもよい。臨床生検サンプルを取り扱うための標準的なプロセスは、ホルマリン中で組織サンプルを固定し、そして次いで、パラフィン中に包埋することである。この形のサンプルは、一般的に、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として知られる。続くＲＮＡ抽出のための組織調製および組織保存の適切な技術が当業者に周知である。
【０１６４】
[196]ＥＭＴ遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関する個々の遺伝子発現レベルが、ＥＭＴインデックス値を計算するために用いられる入力値である。組織サンプルを得たら、ＥＭＴ遺伝子シグネチャーにおける個々の遺伝子の発現レベルを決定する、すなわち測定する必要がある。任意の適切な方法によって、遺伝子発現レベルを決定してもよい。個々の発現を測定するための２つの例示的な方法が、以下に論じるＤＮＡマイクロアレイ分析およびｑＲＴ−ＰＣＲである。これらの代替法のいずれに関しても必要条件はＲＮＡ単離である。
【０１６５】
[197]真核ｍＲＮＡ、すなわちポリ（ａ）ＲＮＡを組織サンプルまたは培養細胞から迅速にそして効率的に抽出するための方法が、よく確立されており、そして当業者に知られる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照されたい。組織サンプルは、新鮮、凍結または固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）臨床研究腫瘍サンプルであってもよい。一般的に、新鮮または凍結組織サンプルから単離されたＲＮＡは、ＦＦＰＥサンプル由来のＲＮＡよりもより断片化されていない傾向がある。しかし、腫瘍材料のＦＦＰＥサンプルは、より容易に入手可能であり、そしてＦＦＰＥサンプルは、本発明の方法で使用するためのＲＮＡの適切な供給源である。ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングのためのＲＮＡ供給源としてのＦＦＰＥサンプルの考察に関しては、例えば、Ｃｌａｒｋ−Ｌａｎｇｏｎｅら，  ２００７，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：２７９を参照されたい。また、Ｄｅ  Ａｎｄｒｅｓら，  １９９５，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４；およびＢａｋｅｒら、米国特許出願公報第２００５／００９５６３４号も参照されたい。ＲＮＡ抽出および調製のための、業者の使用説明を含む、商業的に入手可能なキットの使用が広まっており、そして一般的である。多様なＲＮＡ単離製品および完全キットの商業的ベンダーには、Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）およびＥｘｉｑｏｎ（マサチューセッツ州ウォバーン）が含まれる。
【０１６６】
[198]一般的に、ＲＮＡ単離は、組織／細胞破壊で始まる。組織／細胞破壊中、ＲＮアーゼによってＲＮＡ分解を最小限にすることが望ましい。ＲＮＡ単離プロセス中のＲＮアーゼ活性を制限する１つのアプローチは、細胞が破壊されたら直ちに、変性剤が細胞内容物と接触するのを確実にすることである。別の一般的な実施は、ＲＮＡ単離プロセス中に１またはそれより多いプロテアーゼを含めることである。場合によって、新鮮な組織サンプルを収集したら直ちに、室温でＲＮＡ安定化溶液に浸す。安定化溶液は、細胞に迅速に浸透し、続く単離のため、４℃での貯蔵のためにＲＮＡを安定化する。１つのこうした安定化溶液は、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）として商業的に入手可能である。
【０１６７】
[199]いくつかのプロトコルにおいて、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって、破壊された腫瘍材料から総ＲＮＡを単離する。一般的に、ｍＲＮＡは、総細胞ＲＮＡのおよそ１％〜５％を構成する。固定オリゴ（ｄＴ）、例えばオリゴ（ｄＴ）セルロースは、一般的に、リボソームＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡからｍＲＮＡを分離するために用いられる。単離後に貯蔵する場合、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ不含状態で貯蔵されなければならない。単離ＲＮＡの安定した貯蔵のための方法が当該技術分野に知られる。ＲＮＡの安定した貯蔵のための多様な商業的製品が入手可能である。
【０１６８】
[200]慣用的なＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング技術を用いて、多数の遺伝子に関するｍＲＮＡ発現レベルを測定してもよい。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス、プラスチックまたはシリコンなどの固体表面または支持体に固定された、特定のＤＮＡセグメントまたはプローブのコレクションであり、各々の特定のＤＮＡセグメントは、アレイにおいて、既知の位置を占める。通常はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、標識ＲＮＡサンプルとのハイブリダイゼーションによって、アレイ中の各プローブに対応するＲＮＡ分子の検出および定量化が可能になる。非特異的に結合したサンプル材料を除去するストリンジェントな洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡または他の適切な検出法によって、マイクロアレイをスキャンする。しばしば、ＤＮＡチップとして知られる現代的な商業的ＤＮＡマイクロアレイは、典型的には、数万のプローブを含有し、そしてしたがって、数万の遺伝子の発現を同時に測定可能である。こうしたマイクロアレイを本発明の実施に用いてもよい。あるいは、ＥＭＴ遺伝子シグネチャーの遺伝子の発現を測定するのに必要である程度に少ないプローブに加えて、必要な対照または標準（データ規準化等のため）を含有するカスタムチップを、本発明の実施において用いてもよい。
【０１６９】
[201]データ規準化を容易にするため、二色マイクロアレイ読み取り装置を用いてもよい。二色（二チャネル）系において、第一の波長で発光する第一のフルオロフォアでサンプルを標識し、一方、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ標準を、異なる波長で発光する第二のフルオロフォアで標識する。例えばＣｙ３（５７０ｎｍ）およびＣｙ５（６７０ｎｍ）は、二色マイクロアレイ系でしばしばともに使用される。
【０１７０】
[202]ＤＮＡマイクロアレイ技術は、十分に開発され、商業的に入手可能であり、そして広く使用されている。したがって、本発明の方法を実行する際に、一般の当業者は、マイクロアレイ技術を使用して、過度な実験を行うことなく、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の遺伝子の発現レベルを測定することが可能である。ＤＮＡマイクロアレイチップ、試薬（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液のためのもの）、装置（例えばマイクロアレイ読み取り装置）およびプロトコルが、当該技術分野に周知であり、そして多様な商業的供給源から入手可能である。マイクロアレイ系の商業的業者には、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンタクララ）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州サンタクララ）が含まれるが、他の系も使用可能である。
【０１７１】
[203]慣用的な定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）技術を用いて、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の個々の遺伝子に相当するｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。ｑＲＴ−ＰＣＲの利点には、感度、柔軟性、定量的正確さ、および緊密に関連するｍＲＮＡの間を区別する能力が含まれる。定量的ＰＣＲのための組織サンプルプロセシングに関する指針は、ｑＲＴ−ＰＣＲの商業的製品の製造者および業者（例えばＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）およびＡｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン））を含む、多様な供給源から入手可能である。ｑＲＴ−ＰＣＲの自動化実行のための装置系が商業的に入手可能であり、そして多くの実験室でルーチンに用いられる。周知の商業的系の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ迅速リアルタイムＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）である。
【０１７２】
[204]単離ｍＲＮＡを入手したら、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第一の工程は、ｍＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写することであり、次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応において、指数関数的に増幅する。２つの一般的に用いられる逆転写酵素は、トリ（ａｖｉｌｏ）骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニー・ネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写反応は、典型的には、特異的プライマー、ランダム六量体、またはオリゴ（ｄＴ）プライマーによってプライミングされる。適切なプライマーが商業的に入手可能であり、例えばＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）がある。生じたｃＤＮＡ産物を、続くポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして用いてもよい。
【０１７３】
[205]熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ工程を実行する。ＰＣＲ系において最も一般的に用いられるポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼである。ＰＣＲの選択性は、増幅のためにターゲティングされるＤＮＡ領域、すなわちＥＭＴ遺伝子シグネチャーの遺伝子から逆転写されたｃＤＮＡの領域に相補的なプライマーの使用から生じる。したがって、ｑＲＴ−ＰＣＲを本発明で使用する場合、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の各遺伝子に特異的なプライマーは、遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づく。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）などの商業的技術を、業者の使用説明にしたがって用いてもよい。ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子のレベルを比較することによって、サンプル間の装填の相違に関して、メッセンジャーＲＮＡレベルを規準化してもよい。ｍＲＮＡ発現レベルを、正常非腫瘍組織または細胞由来のｍＲＮＡなどの任意の単一の対照サンプルに比較して、表してもよい。あるいは、腫瘍細胞プール、腫瘍細胞株由来のｍＲＮＡ、あるいは商業的に入手可能な対照ｍＲＮＡセット由来のｍＲＮＡと比較して、表してもよい。
【０１７４】
[206]過度な実験を伴わずに、当業者は、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の遺伝子の発現レベルのＰＣＲ分析に適したプライマーセットを設計し、そして合成することも可能である。あるいは、本明細書において、表１および図３６〜３７に示すように、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の遺伝子の同一性に基づいて、商業的供給源、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから、本発明を実施するための完全ＰＣＲプライマーセットを購入してもよい。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、長さ約１７〜２５ヌクレオチドである。融点（Ｔｍ）概算のための慣用的なアルゴリズムを用いて、特定のＴｍを有するプライマーを設計することも可能である。プライマー設計およびＴｍ概算のためのソフトウェアは、商業的に入手可能であり、例えばＰｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）があり、そしてまた、インターネット上でも入手可能であり、例えばＰｒｉｍｅｒ３（マサチューセッツ工科大学）がある。ＰＣＲプライマー設計の確立された原理を適用することによって、多数の異なるプライマーを用いて、任意の所定の遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。したがって、本発明は、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の任意の所定の遺伝子に関して、特定のプライマーを用いることに関して限定されない。
【０１７５】
[207]本発明の別の態様において、発現されたタンパク質を検出する。本発明において発現されたタンパク質を検出するための好ましい剤は、こうしたタンパク質またはその断片に結合可能な抗体、好ましくは検出可能標識を伴う抗体である。抗体は、ポリクローナルであってもよく、またはより好ましくはモノクローナルであってもよい。損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体、あるいはその断片または誘導体（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用いてもよい。用語「標識」は、プローブまたは抗体に関して、検出可能物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性による、プローブまたは抗体の間接的標識を含むよう意図される。間接的標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、ならびに蛍光標識ストレプトアビジンで検出可能であるような、ビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が含まれる。
【０１７６】
[208]当業者に周知の技術を用いて、腫瘍細胞由来のタンパク質を単離してもよい。使用するタンパク質単離法は、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅに記載されるものなどであってもよい（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。
【０１７７】
[209]多様な形式を使用して、サンプルが所定の抗体に結合するタンパク質を含有するかどうかを決定してもよい。こうした形式の例には、限定されるわけではないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析および酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。当業者は、腫瘍細胞が本発明のバイオマーカーを発現するかどうかを決定する際に使用するため、既知のタンパク質／抗体検出法を容易に適応させることが可能である。
【０１７８】
[210]１つの形式において、抗体、あるいは抗体断片または誘導体を、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術などの方法において用いて、発現されたタンパク質を検出してもよい。こうした使用において、一般的に、抗体またはタンパク質のいずれかを固体支持体上に固定することが好ましい。適切な固相支持体またはキャリアーには、抗原または抗体が結合することが可能な任意の支持体が含まれる。周知の支持体またはキャリアーには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含まれる。
【０１７９】
[211]当業者は、抗体または抗原を結合させるのに適した多くの他の適切なキャリアーを知っているであろうし、そして本発明で使用するために、こうした支持体を適応させることが可能であろう。例えば、腫瘍細胞から単離したタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で泳動して、そしてニトロセルロースなどの固相支持体上に固定してもよい。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識した抗体で処理してもよい。次いで、固相支持体を緩衝液で二度目に洗浄して、未結合抗体を除去してもよい。次いで、慣用的な手段によって、固体支持体上に結合した標識の量を検出してもよい。
【０１８０】
[212]ＥＬＩＳＡアッセイのため、特異的結合対は、免疫または非免疫型であってもよい。免疫特異的結合対は、抗原−抗体系またはハプテン／抗ハプテン系によって例示される。言及したフルオレセイン／抗フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、ビオチン／抗ビオチン、ペプチド／抗ペプチド等がありうる。当業者によく知られる慣例法によって、特異的結合対の抗体メンバーを産生してもよい。こうした方法は、動物を特異的結合対の抗原メンバーで免疫する工程を伴う。特異的結合対の抗原メンバーが免疫原性でない場合、例えばハプテンである場合、該メンバーをキャリアータンパク質に共有カップリングさせて免疫原性にしてもよい。非免疫結合対には、２つの構成要素が互いに天然アフィニティを共有するが抗体ではない系が含まれる。例示的な非免疫対は、ビオチン−ストレプトアビジン、内因子−ビタミンＢ１２、葉酸−葉酸結合タンパク質等である。
【０１８１】
[213]特異的結合対のメンバーで抗体を共有標識する多様な方法が利用可能である。特異的結合対のメンバーの性質、望ましい連結のタイプ、および多様なコンジュゲート化化学反応に対する抗体の耐性に基づいて方法を選択する。商業的に入手可能な活性誘導体を利用することによって、ビオチンを抗体に共有カップリングさせてもよい。これらのいくつかは、タンパク質上のアミン基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；カルボジイミドカップリングを通じて炭水化物部分、アルデヒドおよびカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド；ならびにスルフィドリル基に結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである。イソチオシアン酸フルオレセインを用いて、タンパク質アミン基にフルオレセインをカップリングさせてもよい。硫酸２，４−ジニトロベンゼンまたは２，４−ジニトロフルオロベンゼンを用いて、ジニトロフェニル基をタンパク質アミン基にカップリングさせてもよい。ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、ホモ官能性架橋、およびヘテロ二官能性架橋を含む、コンジュゲート化の他の標準的な方法を使用して、モノクローナル抗体を特異的結合対メンバーにカップリングさせてもよい。カルボジイミドカップリングは、１つの物質上のカルボキシル基を別の基質上のアミン基にカップリングするのに有効な方法である。カルボジイミドカップリングは、商業的に入手可能な試薬１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いることによって促進される。
【０１８２】
[214]二官能性イミドエステルおよび二官能性Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを含むホモ二官能性架橋剤が商業的に入手可能であり、そして一方の物質上のアミン基を別の基質上のアミン基にカップリングするために使用される。ヘテロ二官能性架橋剤は、異なる官能基を所持する試薬である。最も一般的な商業的に入手可能なヘテロ二官能性架橋剤は、一方の官能基として、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、そして第二の官能基としてスルフィドリル反応基を有する。最も一般的なスルフィドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジスルフィドおよび活性ハロゲンである。官能基の１つは光反応性アリールニトレンであってもよく、該物質は、照射されると多様な基と反応する。
【０１８３】
[215]放射性同位体、酵素、蛍光発生物質、化学発光物質または電気化学物質であってもよいレポーターにカップリングすることによって、検出可能に標識された抗体または特異的結合対の検出可能に標識されたメンバーを調製する。２つの一般的に用いられる放射性同位体は、１２５Ｉおよび３Ｈである。標準的放射性同位体標識法には、１２５Ｉに関するクロラミンＴ、ラクトペルオキシダーゼおよびＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ法、ならびに３Ｈに関する還元性メチル化が含まれる。用語「検出可能に標識された」は、標識の生得的酵素活性によって、またはそれ自体が容易に検出可能な別の構成要素の標識に結合させることによって容易に検出可能であるような方式で標識された分子を指す。
【０１８４】
[216]本発明で使用するのに適した酵素には、限定されるわけではないが、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）およびウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）を含むルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、ウレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびリゾチームが含まれる。酵素標識は、特異的結合対のメンバーと抗体とのカップリングに関して上述したような、ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、ホモ二官能性架橋剤、およびヘテロ二官能性架橋剤を用いることによって促進される。
【０１８５】
[217]選択される標識法は、酵素および標識しようとする物質上で利用可能な官能基、ならびにコンジュゲート化条件に対する両方の耐性に応じる。本発明で用いる標識法は、限定されるわけではないが、ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅａｒｌｍａｎｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，  ８７１（１９７１）、ＡｖｒａｍｅａｓおよびＴｅｒｎｙｎｃｋ，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，  １１７５（１９７５）、Ｉｓｈｉｋａｗａら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ４（３）：２０９−３２７（１９８３）、ならびにＪａｂｌｏｎｓｋｉ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４８：１９９（１９８５）に記載されるものを含む、任意の慣用的方法の１つであってもよい。
【０１８６】
[218]スペーサーまたは特異的結合対の他のメンバーを用いるなど、間接的な方法によって、標識を達成してもよい。この例は、非標識ストレプトアビジンおよびビオチン化酵素を用いたビオチン化抗体の検出であり、ストレプトアビジンおよびビオチン化酵素を連続してまたは同時にのいずれかで添加する。したがって、本発明にしたがって、検出のために用いる抗体を、レポーターで直接、または特異的結合対の第一のメンバーで間接的に、検出可能に標識することも可能である。抗体を特異的結合対の第一のメンバーにカップリングした場合、特異的結合複合体の抗体−第一のメンバーを、上述のように標識されたまたは標識されない結合対の第二のメンバーと反応させることによって、検出を達成する。
【０１８７】
[219]さらに、非標識抗体を、非標識抗体に特異的な標識抗体と反応させることによって、非標識検出剤抗体を検出してもよい。この例において、上に用いるような「検出可能に標識された」は、非標識抗体に特異的な抗体が結合可能であるエピトープを含有することを意味すると解釈される。上に論じるアプローチのいずれを用いて、こうした抗−抗体を直接または間接的に標識してもよい。例えば、抗−抗体をビオチンにカップリングしてもよく、上に論じるようなストレプトアビジン−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ系と反応させることによって、ビオチンを検出する。
【０１８８】
[220]本発明の１つの態様において、ビオチンを利用する。ビオチン化抗体を次に、ストレプトアビジン−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ複合体と反応させる。オルトフェニレンジアミン、４−クロロ−ナフトール、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳ、ＢＴＳまたはＡＳＡを用いて、色素原検出を達成してもよい。
【０１８９】
[221]本発明を実施するための１つのイムノアッセイ形式において、慣用的技術を用いて、支持体表面上に捕捉試薬を固定しておく、順方向サンドイッチアッセイを用いる。アッセイに用いる適切な支持体には、合成ポリマー支持体、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、置換ポリスチレン、例えばアミン化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリビニルクロリド、ガラスビーズ、アガロース、またはニトロセルロースが含まれる。
【０１９０】
[222]本発明はまた、生物学的試薬中のＥＭＴＧＳの遺伝子発現を検出するためのキットも含む。こうしたキットを用いて、被験体がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤による阻害により感受性でない腫瘍を患うか、またはこうした腫瘍を発展させるリスクが増加しているかどうかを決定してもよい。例えば、キットは、生物学的サンプル中の多数のＥＭＴＧＳタンパク質または核酸を検出可能な標識化合物または剤、あるいはＰＣＲ増幅に使用するためのプライマー、およびサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡの量を決定するための手段（例えばタンパク質またはその断片に結合する抗体、あるいはｍＲＮＡまたは派生ｃＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含んでもよい。キットにはまた、キットを用いて得た結果を解釈するための説明書も含まれてもよい。
【０１９１】
[223]オリゴヌクレオチドに基づくキットに関して、キットは、例えば、各ＥＭＴＧＳ遺伝子に関して：（１）オリゴヌクレオチド、例えばＥＭＴＧＳ遺伝子をコードする核酸配列にハイブリダイズする、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）ＥＭＴＧＳ核酸分子を増幅するのに有用なプライマー対を含んでもよい。キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤も含んでもよい。キットはさらに、検出可能標識を検出するのに必要な構成要素（例えば酵素または基質）を含んでもよい。キットはまた、アッセイし、そして試験サンプルに比較することが可能な、対照サンプルまたは一連の対照サンプルも含有してもよい。キットの各構成要素を個々の容器内に封入し、そしてキットを用いて実行したアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、多様な容器のすべてを単一パッケージ内に入れてもよい。キットはまた、ＥＭＴＧＳの遺伝子各々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含むＤＮＡマイクロアレイチップも含んでもよい。
【０１９２】
[224]本発明はさらに、癌患者において、癌、あるいは腫瘍または腫瘍転移を治療するための本明細書に開示する任意の方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多い他の細胞傷害剤、化学療法剤または抗癌剤、あるいはこうした剤の効果を増進させる化合物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。本発明の背景において、他の抗癌剤には、例えば、他の細胞傷害剤、化学療法剤、または抗癌剤、あるいはこうした剤の効果を増進させる化合物、抗ホルモン剤、血管形成阻害剤、ＥＭＴを阻害するかまたは逆転させる剤（例えばＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤）、腫瘍細胞アポトーシス促進性またはアポトーシス刺激性剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ヒストンデメチラーゼ阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、抗増殖剤、抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））またはその免疫療法活性断片、抗増殖剤、ＣＯＸＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤、および抗腫瘍免疫反応を増進可能な剤が含まれる。
【０１９３】
[225]本発明の背景において、さらなる他の細胞傷害剤、化学療法剤または抗癌剤、あるいはこうした剤の効果を増進させる化合物には、例えば：アルキル化剤またはアルキル化作用を持つ剤、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；例えばシトキサン（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ；例えばロイケラン（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ；例えばプラチノール（登録商標））、ブスルファン（例えばミレラン（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ等；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；例えばベペシド（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えばキセロダ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；例えばアドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン等；アルカロイド、例えばビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチン等；ならびに他の抗腫瘍剤、例えばパクリタキセル（例えばタキソール（登録商標））およびパクリタキセル誘導体、細胞分裂阻害剤、グルココルチコイド、例えばデキサメタゾン（ＤＥＸ；例えばデカドロン（登録商標））およびコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、ヌクレオシド酵素阻害剤、例えばヒドロキシ尿素、アミノ酸枯渇酵素、例えばアスパラギナーゼ、ロイコボリン、ペメトレキセドおよび他の葉酸誘導体、ならびに類似の多様な抗腫瘍剤が含まれる。以下の剤もまた、さらなる剤として使用可能である：アルニフォスチン（ａｒｎｉｆｏｓｔｉｎｅ）（例えばエチヨル（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン・リポ（例えばドキシル（登録商標））、ゲムシタビン（例えばジェムザール（登録商標））、ダウノルビシン・リポ（例えばダウノキソーム（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えばタキソテール（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロン・ベータ、インターフェロン・アルファ、ミトキサントロン、トポテカン、リュープロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルが含まれる。
【０１９４】
[226]本発明はさらに、患者において、腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多い抗ホルモン剤を投与する工程を含む、前記方法を提供する。本明細書において、用語「抗ホルモン剤」には、腫瘍に対するホルモン作用を制御するかまたは阻害するように作用する、天然または合成有機またはペプチド化合物が含まれる。
【０１９５】
[227]抗ホルモン剤には、例えば：ステロイド受容体アンタゴニスト、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、他のアロマターゼ阻害剤、４２−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（例えばフェアストン（登録商標））；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリン；ならびに上記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸または誘導体；糖タンパク質ホルモンのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ならびに黄体形成ホルモン（ＬＨ）およびＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）；ゾラデックス（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）として商業的に入手可能なＬＨＲＨアゴニスト、酢酸ゴセレリン；ＬＨＲＨアンタゴニスト、Ｄ−アラニンアミドＮ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−アラニル−４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニル−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−（アラニル）−Ｌ−セリル−Ｎ６−（３−ピリジニルカルボニル）−Ｌ−リジル−Ｎ６−（３−ピリジニルカルボニル）−Ｄ−リジル−Ｌ−ロイシル−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−リジル−Ｌ−プロリン（例えばアンチド（登録商標）、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）；ＬＨＲＨアンタゴニスト、酢酸ガニレリクス；メゲース（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）として商業的に入手可能なステロイド性抗アンドロゲン、酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）および酢酸メゲストロール；エウレキシン（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）として商業的に入手可能な非ステロイド抗アンドロゲン、フルタミド（２−メチル−Ｎ−［４，２０−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルプロパンアミド］）；非ステロイド抗アンドロゲン、ニルタミド、（５，５−ジメチル−３−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル−４’−ニトロフェニル）−４，４−ジメチル−イミダゾリジン−ジオン］）；ならびに他の非許容性受容体のアンタゴニスト、例えばＲＡＲ、ＲＸＲ、ＴＲ、ＶＤＲ等のアンタゴニストが含まれる。
【０１９６】
[228]化学療法措置において上述する細胞傷害剤および他の抗癌剤の使用は、一般的に、癌療法業によく性質決定され、そして本明細書において、その使用は、耐性および有効性を監視するための、そして何らかの調節で投与経路および投薬量を調節するための同じ考慮の元に属する。例えば、細胞傷害剤の実際の投薬量は、組織培養法を用いることによって決定される、患者の培養細胞反応に応じて多様でありうる。一般的に、さらなる他の剤の非存在下で用いる量に比較して、投薬量は減少するであろう。
【０１９７】
[229]有効な細胞傷害剤の典型的な投薬量は、製造者によって推奨される範囲内であることが可能であり、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応または動物モデルにおける反応によって示される場合、濃度または量の大きさの最大約一桁減少させることも可能である。したがって、実際の投薬量は、医師の判断、患者の状態、および初代培養悪性腫瘍または組織培養組織サンプルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応性、あるいは適切な動物モデルにおいて観察される反応に基づく療法の有効性に応じるであろう。
【０１９８】
[230]本発明はさらに、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多い血管形成阻害剤を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１９９】
[231]抗血管形成剤には、例えば：ＶＥＧＦＲ阻害剤、例えばＳＵ−５４１６およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）、または例えば国際出願第ＷＯ  ９９／２４４４０号、第ＷＯ  ９９／６２８９０号、第ＷＯ  ９５／２１６１３号、第ＷＯ  ９９／６１４２２号、第ＷＯ  ９８／５０３５６号、第ＷＯ  ９９／１０３４９号、第ＷＯ  ９７／３２８５６号、第ＷＯ  ９７／２２５９６号、第ＷＯ  ９８／５４０９３号、第ＷＯ  ９８／０２４３８号、第ＷＯ  ９９／１６７５５号、および第ＷＯ  ９８／０２４３７号、ならびに米国特許第５，８８３，１１３号、第５，８８６，０２０号、第５，７９２，７８３号、第５，８３４，５０４号および第６，２３５，７６４号に記載されるようなもの；ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＩＭ８６２（Ｃｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．、米国ワシントン州カークランド）；スニチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（コロラド州ボールダー）およびＣｈｉｒｏｎ（カリフォルニア州エメリービル）の合成リボザイムであるアンジオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）；およびＶＥＧＦに対する抗体、例えばベバシズマブ（例えばアバスチンＴＭ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）、ＶＥＧＦに対する組換えヒト化抗体；αｖβ３、αｖβ５およびαｖβ６インテグリンに対するものなどのインテグリン受容体アンタゴニストおよびインテグリンアンタゴニスト、ならびにそのサブタイプ、例えばシレンジチド（ＥＭＤ  １２１９７４）、または抗インテグリン抗体、例えばαｖβ３特異的ヒト化抗体（例えばビタキシン（登録商標））；ＩＦＮ−アルファ（米国特許第４１５３０，９０１号、第４，５０３，０３５号、および第５，２３１，１７６号）などの因子；アンジオスタチンおよびプラスミノーゲン断片（例えば、クリングル１−４、クリングル５、クリングル１−３（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｍ．Ｓ．ら（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−３２８；  Ｃａｏら（１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２９４６１−２９４６７；  Ｃａｏら（１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２２９２４−２２９２８）；エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｍ．Ｓ．ら（１９９７）  Ｃｅｌｌ  ８８：２７７；および国際特許公報第ＷＯ  ９７／１５６６６号）；トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１；  Ｆｒａｚｉｅｒ（１９９１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：７９２）；血小板因子４（ＰＦ４）；プラスミノーゲン活性化因子／ウロキナーゼ阻害剤；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；へパリナーゼ；フマギリン類似体、例えばＴＮＰ−４７０１；スラミンおよびスラミン類似体；血管新生抑制ステロイド；ｂＦＧＦアンタゴニスト；ｆｌｋ−１およびｆｌｔ−１アンタゴニスト；抗血管新生剤、例えば、ＭＭＰ−２（マトリックス−メタロプロテイナーゼ２）阻害剤およびＭＭＰ−９（マトリックス−メタロプロテイナーゼ９）阻害剤が含まれる。有用なマトリックス・メタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、国際特許公報第ＷＯ  ９６／３３１７２号、第ＷＯ  ９６／２７５８３号、第ＷＯ  ９８／０７６９７号、第ＷＯ  ９８／０３５１６号、第ＷＯ  ９８／３４９１８号、���ＷＯ  ９８／３４９１５号、第ＷＯ  ９８／３３７６８号、第ＷＯ  ９８／３０５６６号、第ＷＯ  ９０／０５７１９号、第ＷＯ  ９９／５２９１０号、第ＷＯ  ９９／５２８８９号、第ＷＯ  ９９／２９６６７号、および第ＷＯ  ９９／０７６７５号、欧州特許公報第８１８，４４２号、第７８０，３８６号、第１，００４，５７８号、第６０６，０４６号、および第９３１，７８８号；英国特許公報第９９１２９６１号、ならびに米国特許第５，８６３，９４９号および第５，８６１，５１０号に記載される。好ましいＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９阻害剤は、ＭＭＰ−１を阻害する活性がほとんどまたはまったくないものである。より好ましいものは、他のマトリックス−メタロプロテイナーゼ（すなわち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）に比較して、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。
【０２００】
[232]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多い腫瘍細胞アポトーシス親和性またはアポトーシス刺激性剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２０１】
[233]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多いヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２０２】
[234]ＨＤＡＣ阻害剤には、例えば：ＳＢ９３９、ＣＨＲ−３９９６、ＣＲＡ−０２４７８１、ＩＴＦ２３５７、ＪＮＪ−２６８５４１６５、ＪＮＪ−２６４８１５８５（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ボリノスタット（スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＳＡＨＡ；  Ｍｅｒｃｋ）、ＦＫ−２２８（デプシペプチド／ＦＲ−９０１２２８、藤沢、日本・大阪）、フェニルブチレート（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ダブリン）、ＬＡＱ８２４およびＬＢＨ５８９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＸＤ１０１（ＴｏｐｏＴａｒｇｅｔ、コペンハーゲン）、ＭＳ−２７５（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）、ピロキサミド（Ａｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａ、ニューヨーク州タリータウン）、ＭＧＣＤ０１０３（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、モントリオール）、ＮＢＭ−ＨＤ−１（ＮａｔｕｒｅＷｉｓｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌｓ社）、ＣＩ−９９４（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ）、ピバネクス（Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）、ロミデプシン（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ならびにエンチノスタット（ＳＮＤＸ−２７５；  Ｓｙｎｄａｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が含まれる。
【０２０３】
[235]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多いヒストンデメチラーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２０４】
[236]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多いＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤には、例えば：Ｓ−１１０（Ｓｕｐｅｒｇｅｎ、カリフォルニア州ダブリン）、ゼブラリン、プロカイン、（−）エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、およびプサンマプリンが含まれる。
【０２０５】
[237]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多いシグナル伝達阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２０６】
[238]シグナル伝達阻害剤には、例えば：ｅｒｂＢ２受容体阻害剤、例えば有機分子、またはｅｒｂＢ２受容体に結合する抗体、例えばトラスツズマブ（例えばハーセプチン（登録商標））；他のプロテインチロシンキナーゼの阻害剤、例えばイミチニブ（例えばグリーベック（登録商標））；ｒａｓ阻害剤；ｒａｆ阻害剤；ＭＥＫ阻害剤；ＰＡＫ１およびＰＡＫ２キナーゼ阻害剤；ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２キナーゼの両方に結合し、そしてこれらを直接阻害するｍＴＯＲ阻害剤（例えばＯＳＩ−０２７、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンおよびその類似体（例えばＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１およびＡＰ２３５７３）；二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤であるｍＴＯＲ阻害剤、例えばＦａｎ，  Ｑ−Ｗら（２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９：３４１−３４９およびＫｎｉｇｈｔ，  Ｚ．Ａ．ら（２００６）  Ｃｅｌｌ  １２５：７３３−７４７に記載されるような化合物ＰＩ−１０３；ｍＴＯＲキナーゼおよび１またはそれより多い他のＰＩＫＫ（またはＰＩＫ関連）キナーゼファミリーメンバーの二重阻害剤であるｍＴＯＲ阻害剤が含まれる。こうしたメンバーには、ＭＥＣ１、ＴＥＬ１、ＲＡＤ３、ＭＥＩ−４１；ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＴＲＲＡＰ、ＰＩ３Ｋ、およびＰＩ４Ｋキナーゼ；サイクリン依存性キナーゼ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；ＰＩ−３キナーゼ阻害剤；およびＰＤＫ−１阻害剤が含まれる（こうした阻害剤のいくつかの例、および癌治療のための臨床試験における使用の説明に関しては、Ｄａｎｃｅｙ，  Ｊ．およびＳａｕｓｖｉｌｌｅ，  Ｅ．Ａ．（２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３を参照されたい）。
【０２０７】
[239]ＥｒｂＢ２受容体阻害剤には、例えば：ＥｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばラパチニブまたはＧＷ−２８２９７４（どちらもＧｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ｐｌｃ）、モノクローナル抗体、例えばＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．  米国テキサス州ザ・ウッドランズ）および２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ）、ならびにｅｒｂＢ２阻害剤、例えば国際公報第ＷＯ  ９８／０２４３４号、第ＷＯ  ９９／３５１４６号、第ＷＯ  ９９／３５１３２号、第ＷＯ  ９８／０２４３７号、第ＷＯ  ９７／１３７６０号、および第ＷＯ  ９５／１９９７０号、ならびに米国特許第５，５８７，４５８号、第５，８７７，３０５号、第６，４６５，４４９号および第６，５４１，４８１号に記載されるものが含まれる。
【０２０８】
[240]本明細書において、ｍＴＯＲ阻害剤には、当該技術分野に現在知られるいかなるｍＴＯＲ阻害剤も含まれ、そして患者に投与した際に、患者においてｍＴＯＲの阻害を生じるいかなる化学実体も含まれる。ｍＴＯＲ阻害剤は、いかなる生化学的機構によって、ｍＴＯＲを阻害してもよく、これには、ＡＴＰ結合部位での競合、ｍＴＯＲキナーゼの触媒部位の別の箇所での競合、非競合阻害、不可逆的阻害（例えば共有タンパク質修飾）、あるいはｍＴＯＲキナーゼ活性の阻害を生じる方式でのｍＴＯＲキナーゼと他のタンパク質サブユニットまたは結合タンパク質の相互作用の調節（例えばｍＴＯＲとＦＫＢＰ１２、ＧβＬ（ｍＬＳＴ８）、ＲＡＰＴＯＲ（ｍＫＯＧ１）、またはＲＩＣＴＯＲ（ｍＡＶＯ３）の相互作用の調節）が含まれる。ｍＴＯＲ阻害剤の特定の例には：ラパマイシン；他のラパマイシンマクロリド、あるいはラパマイシン類似体、誘導体またはプロドラッグ；ＲＡＤ００１（エベロリムスとしても知られる、ＲＡＤ００１は、米国特許第５，６６５，７７２号に開示されるアルキル化ラパマイシン（４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン）；Ｎｏｖａｒｔｉｓである）；ＣＣＩ−７７９（テムシロリムスとしても知られる、ＣＣＩ−７７９は米国特許第５，３６２，７１８に開示されるラパマイシンのエステル（３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−２−メチルプロピオン酸との４２−エステル）；Ｗｙｅｔｈである）；ＡＰ２３５７３またはＡＰ２３８４１（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＢＴ−５７８（４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン；  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ＫＵ−００５９４７５（Ｋｕｄｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；およびＴＡＦＡ−９３（ラパマイシンプロドラッグ；Ｉｓｏｔｅｃｈｎｉｋａ）。当該技術分野に知られるラパマイシン類似体および誘導体の例には、米国特許第６，３２９，３８６号；第６，２００，９８５号；第６，１１７，８６３号；第６，０１５，８１５号；第６，０１５，８０９号；第６，００４，９７３号；第５，９８５，８９０号；第５，９５５，４５７号；第５，９２２，７３０号；第５，９１２，２５３号；第５，７８０，４６２号；第５，６６５，７７２号；第５，６３７，５９０号；第５，５６７，７０９号；第５，５６３，１４５号；第５，５５９，１２２号；第５，５５９，１２０号；第５，５５９，１１９号；第５，５５９，１１２号；第５，５５０，１３３号；第５，５４１，１９２号；第５，５４１，１９１号；第５，５３２，３５５号；第５，５３０，１２１号；第５，５３０，００７号；第５，５２５，６１０号；第５，５２１，１９４号；第５，５１９，０３１号；第５，５１６，７８０号；第５，５０８，３９９号；第５，５０８，２９０号；第５，５０８，２８６号；第５，５０８，２８５号；第５，５０４，２９１号；第５，５０４，２０４号；第５，４９１，２３１号；第５，４８９，６８０号；第５，４８９，５９５号；第５，４８８，０５４号；第５，４８６，５２４号；第５，４８６，５２３号；第５，４８６，５２２号；第５，４８４，７９１号；第５，４８４，７９０号；第５，４８０，９８９号；第５，４８０，９８８号；第５，４６３，０４８号；第５，４４６，０４８号；第５，４３４，２６０号；第５，４１１，９６７号；第５，３９１，７３０号；第５，３８９，６３９号；第５，３８５，９１０号；第５，３８５，９０９号；第５，３８５，９０８号；第５，３７８，８３６号；第５，３７８，６９６号；第５，３７３，０１４号；第５，３６２，７１８号；第５，３５８，９４４号；第５，３４６，８９３号；第５，３４４，８３３号；第５，３０２，５８４号；第５，２６２，４２４号；第５，２６２，４２３号；第５，２６０，３００号；第５，２６０，２９９号；第５，２３３，０３６号；第５，２２１，７４０号；第５，２２１，６７０号；第５，２０２，３３２号；第５，１９４，４４７号；第５，１７７，２０３号；第５，１６９，８５１号；第５，１６４，３９９号；第５，１６２，３３３；５，１５１，４１３号；第５，１３８，０５１号；第５，１３０，３０７号；第５，１２０，８４２号；第５，１２０，７２７号；第５，１２０，７２６号；第５，１２０，７２５号；第５，１１８，６７８号；第５，１１８，６７７号；第５，１００，８８３号；第５，０２３，２６４号；第５，０２３，２６３号；および第５，０２３，２６２号に記載される化合物が含まれ；該特許はすべて、本明細書に援用される。ラパマイシン誘導体もまた、例えば本明細書に援用される、ＷＯ  ９４／０９０１０、ＷＯ  ９５／１６６９１、ＷＯ  ９６／４１８０７、またはＷＯ  ９９／１５５３０に開示される。こうした類似体および誘導体には、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２（ＳまたはＲ）−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２（ＳまたはＲ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、４０−０−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、３２−デオキソラパマイシンおよび１６−ペント−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−ラパマイシンが含まれる。ラパマイシン誘導体にはまた、例えばＷＯ  ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７に開示されるような、いわゆるラパログ（例えば、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１）も含まれてもよい。ラパマイシン誘導体のさらなる例には、名称、ビオリムス−７またはビオリムス−９（ＢＩＯＬＩＭＵＳ  Ａ９ＴＭ）（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、シンガポール）の下で開示されるものが含まれる。上記ラパマイシン類似体または誘導体のいずれも、上記参考文献に記載されるような方法によって容易に調製可能である。
【０２０９】
[241]本明細書において、用語「ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２キナーゼの両方に結合し、そしてこれらを直接阻害するｍＴＯＲ阻害剤」は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２キナーゼの両方に結合し、そしてこれらを直接阻害するいかなるｍＴＯＲ阻害剤も指し、そしてこれには、患者に投与した際に、患者においてｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２キナーゼの両方に結合し、そしてこれらの直接阻害を生じるいかなる化学実体も含まれる。本明細書記載の本発明で有用なｍＴＯＲ阻害剤の例には、２００６年１１月１５日出願の米国特許出願第１１／５９９，６６３号に開示され、そして請求される、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２キナーゼの両方に結合し、そしてこれらを直接阻害することによって、ｍＴＯＲを阻害する一連の化合物が含まれる。
【０２１０】
[242]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））またはその免疫療法的活性断片を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２１１】
[243]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、１またはそれより多いさらなる抗増殖剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２１２】
[244]さらなる抗増殖剤の例には、例えば：米国特許第６，０８０，７６９号、第６，１９４，４３８号、第６，２５８，８２４号、第６，５８６，４４７号、第６，０７１，９３５号、第６，４９５，５６４号、第６，１５０，３７７号、第６，５９６，７３５号、および第６，４７９，５１３号、ならびに国際特許公報ＷＯ  ０１／４０２１７に開示され、そして請求される化合物を含む、酵素ファルネシルプロテイントランスフェラーゼの阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）キナーゼ阻害剤が含まれる。抗増殖剤にはまた、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤および線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）キナーゼ阻害剤が含まれる。
【０２１３】
[245]本明細書において、用語「ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤」には、当該技術分野に現在知られるいかなるＰＤＧＦＲ阻害剤も含まれ、そして患者に投与した際に、そうでなければ天然リガンドのＰＤＧＦＲへの結合から生じる下流生物学的効果のいずれも含む、患者におけるＰＤＧＦＲの活性化に関連する生物学的活性の阻害を生じるいかなる化学実体も含まれる。こうしたＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤には、患者における癌治療に関連するＰＤＧＦＲ活性化またはＰＤＧＦＲ活性化の下流生物学的効果のいずれかを遮断しうるいかなる剤も含まれる。こうした阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そしてそのキナーゼ活性を阻害することによって作用してもよい。あるいは、こうした阻害剤は、ＰＤＧＦＲのリガンド結合部位またはその一部を占めることにより、正常な生物学的活性が防止されるかまたは減少するように、受容体を天然リガンドにアクセス不能にすることによって、作用することも可能である。あるいは、こうした阻害剤は、ＰＤＧＦＲポリペプチドの二量体化、またはＰＤＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質の相互作用を調節することによって、あるいはＰＤＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシス分解を増進することによって作用することも可能である。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、低分子阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（すなわちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムが含まれる。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤には、抗ＰＤＧＦ（抗血小板由来増殖因子）または抗ＰＤＧＦＲアプタマー、抗ＰＤＧＦまたは抗ＰＤＧＦＲ抗体、あるいは同族受容体へのＰＤＧＦの結合を防止する可溶性ＰＤＧＦ受容体デコイが含まれる。好ましい態様において、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＰＤＧＦＲに特異的に結合する小有機分子または抗体である。化合物または剤が、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤として作用する能力は、当該技術分野に知られ、そしてさらに例えばＤａｉら（２００１）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １５：  １９１３−２５；  Ｚｉｐｐｅｌら（１９８９）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５０（２）：４２８−３４；およびＺｗｉｌｌｅｒら（１９９１）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：  ２１９−２１に示されるような方法にしたがって決定可能である。
【０２１４】
[246]本発明には、当該技術分野に知られるＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤、ならびに以下に支持するもの、および生成する際に通常の技術範囲内である、あらゆる同等物が含まれる。例えば、ＰＤＧＦに対して向けられる阻害抗体が当該技術分野に知られ、例えばその内容の全体が本明細書に援用される、米国特許第５，９７６，５３４号、第５，８３３，９８６号、第５，８１７，３１０号、第５，８８２，６４４号、第５，６６２，９０４号、第５，６２０，６８７号、第５，４６８，４６８号、ならびに第ＰＣＴ  ＷＯ  ２００３／０２５０１９号に記載されるものである。さらに、本発明には、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤であるＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体が含まれ、例えば、本明細書にその全体が援用される、米国特許第５，５２１，１８４号、ならびにＷＯ２００３／０１３５４１、ＷＯ２００３／０７８４０４、ＷＯ２００３／０９９７７１、ＷＯ２００３／０１５２８２、およびＷＯ２００４／０５２８２に開示されるものが含まれる。
【０２１５】
[247]ＰＤＧＦの作用を遮断する低分子が当該技術分野に知られ、例えば米国特許または公開出願第６，５２８，５２６号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，５２４，３４７号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，４８２，８３４号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，４７２，３９１号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，９４９，５６３号、第６，６９６，４３４号、第６，３３１，５５５号、第６，２５１，９０５号、第６，２４５，７６０号、第６，２０７，６６７号、第５，９９０，１４１号、第５，７００，８２２号、第５，６１８，８３７号、第５，７３１，３２６号、および第２００５／０１５４０１４号、ならびに国際公開出願第ＷＯ  ２００５／０２１５３１号、第ＷＯ  ２００５／０２１５４４号、および第ＷＯ  ２００５／０２１５３７号に記載されるものがあり、これらの特許および出願の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【０２１６】
[248]ＰＤＧＦの作用を遮断するタンパク質およびポリペプチドが当該技術分野に知られ、例えば、その内容の全体が本明細書に援用される、米国特許第６，３５０，７３１号（ＰＤＧＦペプチド類似体）、第５，９５２，３０４号に記載されるものがある。
【０２１７】
[249]ＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害するビス・モノおよび二環アリールおよびヘテロアリール化合物が当該技術分野に知られ、例えば、その内容の全体が本明細書に援用される、米国特許第５，４７６，８５１号、第５，４８０，８８３号、第５，６５６，６４３号、第５，７９５，８８９号、および第６，０５７，３２０号に記載されるものがある。
【０２１８】
[250]ＰＤＧＦを阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドが当該技術分野に知られ、例えば、各々、その内容の全体が本明細書に援用される、米国特許第５，８６９，４６２号、および第５，８２１，２３４号に記載されるものがある。
【０２１９】
[251]ＰＤＧＦを阻害するためのアプタマー（核酸リガンドとしても知られる）が当該技術分野に知られ、例えば、各々、その内容の全体が本明細書に援用される、米国特許第６，５８２，９１８号、第６，２２９，００２号、第６，２０７，８１６号、第５，６６８，２６４号、第５，６７４，６８５号、および第５，７２３，５９４号に記載されるものがある。
【０２２０】
[252]ＰＤＧＦを阻害するための他の化合物には、各々、その内容の全体が本明細書に援用される、米国特許第５，２３８，９５０号、第５，４１８，１３５号、第５，６７４，８９２号、第５，６９３，６１０号、第５，７００，８２２号、第５，７００，８２３号、第５，７２８，７２６号、第５，７９５，９１０号、第５，８１７，３１０号、第５，８７２，２１８号、第５，９３２，５８０号、第５，９３２，６０２号、第５，９５８，９５９号、第５，９９０，１４１号、第６，３５８，９５４号、第６，５３７，９８８号および第６，６７３，７９８号に記載されるものが含まれる。
【０２２１】
[253]ＰＤＧＦＲなどのチロシンキナーゼ受容体酵素に選択的な、いくつかのタイプのチロシンキナーゼ阻害剤が知られる（例えば、ＳｐａｄａおよびＭｙｅｒｓ（（１９９５）  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  ５：  ８０５）ならびにＢｒｉｄｇｅｓ（（１９９５）  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  ５：  １２４５を参照されたい）。さらに、ＬａｗおよびＬｙｄｏｎは、チロシンキナーゼ阻害剤の抗癌潜在能力を要約してきている（（１９９６）  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ：  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ  Ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，  ２４１−２６０）。例えば、米国特許第６，５２８，５２６号は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）チロシンキナーゼ活性を選択的に阻害する置換キノキサリン化合物を記載する。ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ活性の既知の阻害剤には、Ｍａｇｕｉｒｅら（（１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ３７：  ２１２９）によって、そしてＤｏｌｌｅら（（１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ３７：  ２６２７）によって報告されるキノリンに基づく阻害剤が含まれる。フェニルアミノ−ピリミジンに基づく阻害剤クラスが、最近、ＴｒａｘｌｅｒらによってＥＰ  ５６４４０９に、そしてＺｉｍｍｅｒｍａｎら（（１９９６）  Ｂｉｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  ６：  １２２１−１２２６）によって、そしてＢｕｃｈｄｕｎｇｅｒら（（１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ９２：  ２５５８）によって報告された。ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を阻害する際に有用なキナゾリン誘導体には、ビスモノ−および二環アリール化合物およびヘテロアリール化合物（例えば、ＷＯ  ９２／２０６４２を参照されたい）、キノキサリン誘導体（（１９９４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５４：６１０６−６１１４を参照されたい）、ピリミジン誘導体（日本公開特許出願第８７８３４／９４号）およびジメトキシキノリン誘導体（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １１６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  （Ｋａｎａｚａｗａ），  （１９９６），  ２，  ｐ．２７５，  ２９（Ｃ２）１５−２を参照されたい）が含まれる。
【０２２２】
[254]本発明にしたがって使用可能な低分子ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の特定の好ましい例には、イマチニブ（グリーベック（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＳＵ−１２２４８（リンゴ酸スニチニブ、スーテント（登録商標）；Ｐｆｉｚｅｒ）；ダサチニブ（スプリセル（登録商標）；ＢＭＳ；ＢＭＳ−３５４８２５としても知られる）；ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標）；Ｂａｙｅｒ；Ｂａｙ−４３−９００６としても知られる）；ＡＧ−１３７３６（アキシチニブ；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＲＰＲ１２７９６３（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＣＰ−８６８５９６（Ｐｆｉｚｅｒ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＭＬＮ−５１８（タンジュチニブ；Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＭＧ−７０６（モテサニブ；Ａｍｇｅｎ）；アラバ（登録商標）（レフルノミド；Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；ＳＵ１０１としても知られる）、およびＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が含まれる；本発明にしたがって使用可能な、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤でもある低分子ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる好ましい例には、ＸＬ−９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＳＵ６６６８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＨＩＲ−２５８／ＴＫＩ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＲＯ４３８３５９６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）およびＢＩＢＦ−１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が含まれる。
【０２２３】
[255]本明細書において、用語「ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤」には、当該技術分野に現在知られるいかなるＦＧＦＲキナーゼ阻害剤も含まれ、そして患者に投与した際に、そうでなければ天然リガンドのＦＧＦＲへの結合から生じる下流生物学的効果のいずれも含む、患者におけるＦＧＦＲの活性化に関連する生物学的活性の阻害を生じるいかなる化学実体も含まれる。こうしたＦＧＦＲキナーゼ阻害剤には、患者における癌治療に関連するＦＧＦＲ活性化またはＦＧＦＲ活性化の下流生物学的効果のいずれかを遮断しうるいかなる剤も含まれる。こうした阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そしてそのキナーゼ活性を阻害することによって作用してもよい。あるいは、こうした阻害剤は、ＦＧＦ受容体のリガンド結合部位またはその一部を占めることにより、正常な生物学的活性が防止されるかまたは減少するように、受容体を天然リガンドにアクセス不能にすることによって、作用することも可能である。あるいは、こうした阻害剤は、ＦＧＦＲポリペプチドの二量体化、またはＦＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質の相互作用を調節することによって、あるいはＦＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシス分解を増進することによって作用することも可能である。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、低分子阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（すなわちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムが含まれる。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤には、抗ＦＧＦ（抗線維芽細胞増殖因子）または抗ＦＧＦＲアプタマー、抗ＦＧＦまたは抗ＦＧＦＲ抗体、あるいは同族受容体へのＦＧＦＲの結合を防止する可溶性ＦＧＦ受容体デコイが含まれる。好ましい態様において、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＦＧＦＲに特異的に結合する小有機分子または抗体である。抗ＦＧＦＲ抗体には、ＦＲ１−Ｈ７（ＦＧＦＲ−１）およびＦＲ３−Ｄ１１（ＦＧＦＲ−３）（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）が含まれる。
【０２２４】
[256]ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤にはまた、ヘパラン硫酸プロテオグリカンがＦＧＦＲ活性を調節する能力に影響を及ぼすことによって、ＦＧＦＲシグナル伝達を阻害する化合物も含まれる。細胞外マトリックス中のヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＦＧＦの作用、例えばタンパク質分解からの保護、局在化、貯蔵、および増殖因子の内在化を仲介することも可能であり（Ｆａｈａｍ，  Ｓ．ら（１９９８）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：５７８−５８６）、そして同族ＦＧＦＲにＦＧＦを提示し、そして／または受容体オリゴマー化を促進するよう作用する、低アフィニティＦＧＦ受容体として働きうる（Ｇａｌｚｉｅ，  Ｚ．ら（１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７５：６６９−６８５）。
【０２２５】
[257]本発明には、当該技術分野に知られるＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（例えばＰＤ１７３０７４）、ならびに以下に支持するもの、および生成する際に通常の技術範囲内である、あらゆる同等物が含まれる。
【０２２６】
[258]線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）作用に拮抗可能であり、そしてしたがって本明細書記載の方法においてＦＧＦＲキナーゼ阻害剤として使用可能である化学薬品の例には、スラミン、スラミンの構造的類似体、ポリ硫酸ペントサン、スコポラミン、アンジオスタチン、スプローティ（ｓｐｒｏｕｔｙ）、エストラジオール、カルボキシメチルベンジルアミンデキストラン（ＣＭＤＢ７）、スラジスタ、インスリン様増殖因子結合タンパク質３、エタノール、ヘパリン（例えば６−Ｏ−脱硫酸ヘパリン）、低分子ヘパリン、硫酸プロタミン、シクロスポリンＡ、またはｂＦＧＦのＲＮＡリガンドが含まれる。
【０２２７】
[259]当該技術分野に知られるＦＧＦＲキナーゼを阻害するための他の剤または化合物には、米国特許第７，１５１，１７６号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社；ピロロトリアジン化合物）；第７，１０２，００２号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社；ピロロトリアジン化合物）；第５，１３２，４０８号（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ペプチドＦＧＦアンタゴニスト）；および５，９４５，４２２号（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ社；２−アミノ置換ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン）；米国公開特許出願第２００５／０２５６１５４号（４−アミノ−チエノ［３，２−ｃ］ピリジン−７−カルボン酸アミド化合物）；および第２００４／０２０４４２７号（ピリミジノ化合物）；ならびに公開国際特許出願ＷＯ−２００７０１９８８４（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ−（３−ピラゾリル）−Ｎ’−４−（４−ピリジニルオキシ）フェニル）尿素化合物）；ＷＯ−２００７００９７７３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ；ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体）；ＷＯ−２００７０１４１２３（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．；ＦＧＦＲ融合タンパク質）；ＷＯ−２００６１３４９８９（協和発酵工業社；窒素性複素環化合物）；ＷＯ−２００６１１２４７９（協和発酵工業社；アザ複素環）；ＷＯ−２００６１０８４８２（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；９−（４−ウレイドフェニル）プリン化合物）；ＷＯ−２００６１０５８４４（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ−（３−ピラゾリル）−Ｎ’−４−（４−ピリジニルオキシ）フェニル）尿素化合物）；ＷＯ−２００６０９４６００（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；テトラヒドロピロロキノリン誘導体）；ＷＯ−２００６０５０８００（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ，Ｎ’−ジアリール尿素誘導体）；ＷＯ−２００６０５０７７９（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ，Ｎ’−ジアリール尿素誘導体）；ＷＯ−２００６０４２５９９（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；フェニル尿素誘導体）；ＷＯ−２００５０６６２１１（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．；抗ＦＧＦＲ抗体）；ＷＯ−２００５０５４２４６（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；ヘテロシクリルアミン）；ＷＯ−２００５０２８４４８（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；２−アミノ−１−ベンジル−置換ベンズイミダゾール誘導体）；ＷＯ−２００５０１１５９７（Ｉｒｍ  Ｌｌｃ；置換複素環誘導体）；ＷＯ−２００４０９３８１２（Ｉｒｍ  Ｌｌｃ／Ｓｃｒｉｐｐｓ；６−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体）；ＷＯ−２００４０４６１５２（Ｆ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ；ピリミド［４，５−ｅ］オキサジアジン誘導体）；ＷＯ−２００４０４１８２２（Ｆ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ；ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体）；ＷＯ−２００４０１８４７２（Ｆ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ；ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体）；ＷＯ−２００４０１３１４５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社；ピロロトリアジン誘導体）；Ｗ��−２００４００９７８４（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社；ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル化合物）；ＷＯ−２００４００９６０１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社；アザインドール化合物）；ＷＯ−２００４００１０５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社；複素環誘導体）；ＷＯ−０２１０２９７２ （Ｐｒｏｃｈｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．／Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ；抗ＦＧＦＲ抗体）；ＷＯ−０２１０２９７３（Ｐｒｏｃｈｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．；抗ＦＧＦＲ抗体）；ＷＯ−００２１２２３８（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ社；２−（ピリジン−４−イルアミノ）−６−ジアルコキシフェニル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン誘導体）；ＷＯ−００１７０９７７（Ａｍｇｅｎ，  Ｉｎｃ．；ＦＧＦＲ−Ｌおよび誘導体）；ＷＯ−００１３２６５３（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，  Ｉｎｃ．；ピラゾロン誘導体）；ＷＯ−０００４６３８０（Ｃｈｉｒｏｎ社；ＦＧＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質）；およびＷＯ−０００１５７８１（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ；ＳＰＲＯＵＴＹ−１タンパク質に関連するポリペプチド）が含まれる。
【０２２８】
[260]本発明にしたがって使用可能な低分子ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の特に好ましい例には、ＲＯ−４３９６６８６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）；ＣＨＩＲ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ；ＴＫＩ−２５８としても知られる）；ＰＤ  １７３０７４（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＰＤ  １６６８６６（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＮＫ−８３４およびＥＮＫ−８３５（どちらもＥｎｋａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ａ／Ｓ）；ならびにＳＵ５４０２（Ｐｆｉｚｅｒ）が含まれる。本発明にしたがって使用可能な、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤でもある低分子ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる好ましい例には、ＸＬ−９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＳＵ６６６８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＨＩＲ−２５８／ＴＫＩ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＲＯ４３８３５９６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）およびＢＩＢＦ−１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が含まれる。
【０２２９】
[261]本明細書において、用語「ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤」には、当該技術分野に現在知られるいかなるＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤も含まれ、そして患者に投与した際に、そうでなければ天然リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合から生じる下流生物学的効果のいずれも含む、患者におけるＩＧＦ−１受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害を生じるいかなる化学実体も含まれる。こうしたＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、患者における癌治療に関連するＩＧＦ−１Ｒ活性化またはＩＧＦ−１Ｒ活性化の下流生物学的効果のいずれかを遮断しうるいかなる剤も含まれる。こうした阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そしてそのキナーゼ活性を阻害することによって作用してもよい。あるいは、こうした阻害剤は、ＩＧＦ−１受容体のリガンド結合部位またはその一部を占めることにより、正常な生物学的活性が防止されるかまたは減少するように、受容体を天然リガンドにアクセス不能にすることによって、作用することも可能である。あるいは、こうした阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの二量体化、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチドと他のタンパク質の相互作用を調節することによって、あるいはＩＧＦ−１Ｒのユビキチン化およびエンドサイトーシス分解を増進することによって作用することも可能である。ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤はまた、例えばＩＧＦ−１のその受容体への結合に拮抗することにより、ＩＧＦ−１レベルを減少させることにより、またはＩＧＦ−１Ｒ以外のタンパク質、例えばＩＧＦ結合タンパク質（例えばＩＧＦＢＰ３）とＩＧＦ−１の会合を促進することにより、ＩＧＦ−１Ｒを活性化するために利用可能なＩＧＦ−１の量を減少させることによってもまた、作用しうる。ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、低分子量阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（すなわちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムが含まれる。好ましい態様において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する小有機分子または抗体である。
【０２３０】
[262]ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、例えばイミダゾピラジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、アザ二環アミン阻害剤、キナゾリンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピリドピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピリミドピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピロロピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピラゾロピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、フェニルアミノピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、オキシンドールＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、インドールカルバゾールＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、フタラジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、イソフラボンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、キナロンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびチロホスチンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ならびにこうしたＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤のすべての薬学的に許容されうる塩および溶媒和物が含まれる。
【０２３１】
[263]ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の例には、アザ二環アミン誘導体を記載する国際特許公報第ＷＯ  ０５／０９７８００号、イミダゾピラジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を記載する国際特許公報第ＷＯ  ０５／０３７８３６号、ＩＧＦ−１Ｒ関連障害を治療するためのピリミジンを記載する国際特許公報第ＷＯ  ０３／０１８０２１号および第ＷＯ  ０３／０１８０２２号、シクロリグナンおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤としてのシクロリグナンを記載する国際特許公報第ＷＯ  ０２／１０２８０４号および第ＷＯ  ０２／１０２８０５号、ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼの阻害に反応する疾患の治療のためのピロロピリミジンを記載する国際特許公報第ＷＯ  ０２／０９２５９９号、チロシンキナーゼ阻害剤としてのピロロピリミジンを記載する国際特許公報第ＷＯ  ０１／７２７５１号、ならびにキナーゼのピロロトリアジン阻害剤を記載する国際特許公報第ＷＯ  ００／７１１２９号、ならびにピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンおよびチロシンキナーゼ阻害剤としてのその使用を記載する国際特許公報第ＷＯ  ９７／２８１６１号、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのＩＧＦ−１Ｒ阻害活性を持つチロホスチンを記載するＰａｒｒｉｚａｓら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３８：１４２７−１４３３（１９９７））、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤としてのヘテロアリール−アリール尿素を記載する国際特許公報第ＷＯ  ００／３５４５５号、ＩＧＦ−１Ｒの調節剤としてのピリミジン誘導体を記載する国際特許公報第ＷＯ  ０３／０４８１３３号、キナーゼタンパク質に対する阻害効果を持つ化学的化合物を記載する、国際特許公報第ＷＯ  ０３／０２４９６７号、第ＷＯ  ０３／０３５６１４号、第ＷＯ  ０３／０３５６１５号、第ＷＯ  ０３／０３５６１６号、および第ＷＯ  ０３／０３５６１９号、過剰増殖状態を治療するための方法および組成物を記載する国際特許公報第ＷＯ  ０３／０６８２６５号、プロテインキナーゼ阻害剤としてのピロロピリミジンを記載する、国際特許公報第ＷＯ  ００／１７２０３号、セフェム化合物、その産生および抗微生物組成物を記載する日本特許公報第ＪＰ  ０７／１３３２８０号、プテリジン研究および４位で未置換のプテリジンを記載するＡｌｂｅｒｔ，  Ａ．ら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １１：  １５４０−１５４７（１９７０）、ならびに３−４−ジヒドロプテリジンを介した、ピラジンからのプテリジン（４位で未置換）の合成を記載する、Ａ．  Ａｌｂｅｒｔら，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．，  ４ｔｈ，  ４：  １−５（１９６９）が含まれる。
【０２３２】
[264]さらに、本発明にしたがって使用可能なＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の特定の例には、ｈ７Ｃ１０（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）、ＩＧＦ−１アンタゴニスト；ＥＭ−１６４（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．）、ＩＧＦ−１Ｒ調節剤；ＣＰ−７５１８７１（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＩＧＦ−１アンタゴニスト；ランレオチド（Ｉｐｓｅｎ）、ＩＧＦ−１アンタゴニスト；ＩＧＦ−１Ｒオリゴヌクレオチド（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）；ＩＧＦ−１オリゴヌクレオチド（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発中のＩＧＦ−１Ｒプロテインチロシンキナーゼ阻害剤（例えばＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，  Ｃ．ら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９；またはＮＶＰ−ＡＤＷ７４２、Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，  Ｃ．Ｓ．ら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０）；ＩＧＦ−１Ｒプロテインチロシンキナーゼ阻害剤（Ｏｎｔｏｇｅｎ社）；ＯＳＩ−９０６（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＧ−１０２４（Ｃａｍｉｒａｎｄ，  Ａ．ら（２００５）  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：Ｒ５７０−Ｒ５７９（ＤＯＩ  １０．１１８６／ｂｃｒ１０２８）；Ｃａｍｉｒａｎｄ，  Ａ．およびＰｏｌｌａｋ，  Ｍ．（２００４）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１８２５−１８２９；Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＩＧＦ−１アンタゴニスト；チロホスチンＡＧ−５３８およびＩ−ＯＭｅ−ＡＧ  ５３８；ＢＭＳ−５３６９２４、ＩＧＦ−１Ｒの低分子阻害剤；ＰＮＵ−１４５１５６Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  ＳｐＡ）、ＩＧＦ−１アンタゴニスト；ＢＭＳ  ５３６９２４、二重ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲキナーゼ阻害剤（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＡＥＷ５４１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＳＫ６２１６５９Ａ（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ）；ＩＮＳＭ−１８（Ｉｎｓｍｅｄ）；およびＸＬ−２２８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）が含まれる。
【０２３３】
[265]抗体に基づくＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、天然リガンドによるＩＧＦ−１Ｒ活性化を部分的にまたは完全に遮断可能ないかなる抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗体断片も含まれる。抗体に基づくＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤にはまた、部分的にまたは完全にＩＧＦ−１Ｒ活性化を遮断可能ないかなる抗ＩＧＦ−１抗体または抗体断片も含まれる。抗体に基づくＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の限定されない例には、Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｏ．ら（２００５）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９２：２０９７−２１０１ならびにＩｂｒａｈｉｍ，  Ｙ．Ｈ．およびＹｅｅ，  Ｄ．（２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：９４４ｓ−９５０ｓに記載されるもの；あるいはＩｍｃｌｏｎｅによって開発中のもの（例えばＩＭＣ−Ａ１２）、またはＡＭＧ−４７９、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ａｍｇｅｎ）；Ｒ１５０７、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｇｅｎｍａｂ／Ｒｏｃｈｅ）；ＡＶＥ−１６４２、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ／Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＭＫ  ０６４６またはｈ７Ｃ１０、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｍｅｒｃｋ）；あるいはＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって開発中の抗体（例えばＳＣＨ  ７１７４５４または１９Ｄ１２；あるいは米国特許出願公報第ＵＳ  ２００５／０１３６０６３  Ａ１号および第ＵＳ  ２００４／００１８１９１  Ａ１号に記載されるようなもの）が含まれる。ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体、あるいは抗体またはその結合特異性を有する抗体断片であってもよい。
【０２３４】
[266]本明細書記載の任意の方法の別の態様において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、政府規制当局（例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）；欧州医薬品庁；日本厚生労働省；英国医薬品庁（ＭＨＲＡ））によって認可されたＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤であってもよい（例えばそのように認可されている、本明細書開示の任意のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤）。同様に、本明細書記載の任意の方法の別の態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、政府規制当局によって認可されたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であってもよい（例えばそのように認可されている、本明細書開示の任意のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤）。さらに、本明細書記載の任意の方法の別の態様において、ＥＭＴ阻害剤は、政府規制当局によって認可されたＥＭＴ阻害剤であってもよい（例えばそのように認可されている、本明細書開示の任意のＥＭＴ阻害剤）。
【０２３５】
[267]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、ＣＯＸ  ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例には、アレコキシブ（例えばセレブレックスＴＭ）、バルデコキシブおよびロフェコキシブが含まれる。
【０２３６】
[268]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、放射線または放射線医薬品での治療を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２３７】
[269]放射線供給源は、治療中の患者に対して外部または内部のいずれであってもよい。供給源が患者外部である場合、療法は、外照射療法（ＥＢＲＴ）と称される。放射線供給源が患者内部である場合、治療は小線源療法（ＢＴ）と称される。本発明の背景で使用するための放射性原子は、限定されるわけではないが、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨード−１２３、ヨード−１３１、およびインジウム−１１１からなる群より選択可能である。本発明にしたがったＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤が抗体である場合、抗体をこうした放射性同位体で標識することもまた可能である。
【０２３８】
[270]放射線療法は、切除不能または手術不能腫瘍および／または腫瘍転移を調節するための標準的治療である。放射線療法を化学療法と組み合わせた際、改善された結果が見られている。放射線療法は、ターゲット領域に送達される高線量放射線が、腫瘍および正常組織の両方の再生可能細胞の死を生じる原理に基づく。放射線投薬措置は、一般的に、放射線吸収線量（Ｇｙ）、時間および分割に関して定義され、そして腫瘍学者によって注意深く定義されなければならない。患者が受ける放射線の量は、多様な考慮に応じるが、２つの最も重要な点は、体の他の非常に重要な構造または臓器に対する腫瘍の位置、および腫瘍が広がっている度合いである。放射線療法を受ける患者のための典型的な治療経過は、１〜６週間の期間の治療スケジュールであり、患者には、約１．８〜２．０Ｇｙの一日分割で、週５日、１０〜８０Ｇｙの間の総線量が投与される。本発明の好ましい態様において、ヒト患者における腫瘍を本発明の治療および放射線の組み合わせで治療する場合、相乗作用がある。言い換えると、本発明の組み合わせを含む剤による腫瘍増殖阻害は、場合によってさらなる化学療法剤または抗癌剤とともに、放射線と組み合わせた際に増進される。アジュバント放射線療法のパラメータは、例えば国際特許公報ＷＯ  ９９／６００２３に含有される。
【０２３９】
[271]本発明は、患者において腫瘍または腫瘍転移を治療するための先行する方法であって、療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびさらに同時にまたは連続して、抗腫瘍免疫反応を増進させることが可能な１またはそれより多い剤での治療を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【０２４０】
[272]抗腫瘍免疫反応を増進させることが可能な剤には、例えば：ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体（例えばＭＤＸ−ＣＴＬＡ４、イピリムマブ、ＭＤＸ−０１０）、およびＣＴＬＡ４を遮断可能な他の剤が含まれる。本発明で使用可能な特定のＣＴＬＡ４抗体には、米国特許第６，６８２，７３６号記載のものが含まれる。
【０２４１】
[273]本発明の背景において、剤または療法の「有効量」は、上に定義する通りである。剤または療法の「療法量未満の量」は、剤または療法に有効な量より少ない量であるが、別の剤または療法の有効量または療法量以下の量と組み合わせると、例えば生じる有効性効果の相乗作用、または副作用減少によって、医師が望む結果を生じうる。
【０２４２】
[274]本明細書において、用語「患者」は、好ましくは、癌のため、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療が必要なヒトを指す。しかし、用語「患者」はまた、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療が必要な非ヒト動物も指してもよく、好ましくは哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびとりわけ非ヒト霊長類である。
【０２４３】
[275]好ましい態様において、患者は癌治療が必要なヒトである。患者の癌は、好ましくは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の投与によって、部分的にまたは完全にのいずれかで治療可能な任意の癌である。癌は、例えば、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ、ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、結腸直腸癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌（例えば副腎皮質癌）、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫であってもよく、任意の上記の癌の不応性型、あるいは１またはそれより多い上記癌の組み合わせが含まれる。
【０２４４】
[276]本発明の目的のため、さらなる抗癌剤とＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤（両方の構成要素を、以後、「２つの活性剤」と称する）の「同時投与」およびこれらを「同時投与すること」は、２つの活性剤を別個にまたは一緒に投与することのいずれも指し、この場合、２つの活性剤は、併用療法の利点を得るように設計された適切な投薬措置の一部として投与される。したがって、同じ薬学的組成物の一部として、または別個の薬学的組成物においてのいずれかで、２つの活性剤を投与してもよい。さらなる剤を、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤投与の前に、該投与と同時に、または該投与に続いて、あるいはそのいくつかの組み合わせで、投与してもよい。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤が、例えば標準的治療経過中に反復間隔で患者に投与される場合、さらなる剤を、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の各投与の前に、該投与と同時に、または該投与に続いて、あるいはそのいくつかの組み合わせで、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤治療とは異なる間隔で、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での治療経過の前に、その間の任意の時点で、またはそれに続いて、単回用量で投与してもよい。
【０２４５】
[277]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、典型的には、当該技術分野に知られるように、そして例えば国際特許公報第ＷＯ  ０１／３４５７４号に開示されるように、患者を治療しようとする癌の最も有効な治療（有効性および安全性両方の観点から）を提供する投薬措置で、患者に投与されるであろう。本発明の治療法を実行する際、治療する癌のタイプ、用いるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤のタイプ（例えば低分子、抗体、ＲＮＡｉ、リボザイムまたはアンチセンス構築物）および例えば公表される臨床研究の結果に基づくような主治医の医学的判断に応じて、阻害剤を、当該技術分野に知られる任意の有効な方式で、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、皮下、鼻内、眼内、膣、直腸、または経皮経路によって、投与することも可能である。
【０２４６】
[278]投与するＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の量および阻害剤投与のタイミングは、治療中の患者のタイプ（種、性別、年齢、体重等）および状態、治療中の疾患または状態の重症度、ならびに投与経路に応じるであろう。例えば、低分子ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、１回または分割用量で１日あたりまたは１週あたり、あるいは連続注入によって、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与可能である（例えば国際特許公報第ＷＯ  ０１／３４５７４号を参照されたい）。特に、エルロチニブＨＣｌは、１回または分割用量で、１日あたり５〜２００ｍｇ、または１週あたり１００〜１６００ｍｇの範囲の用量で、あるいは連続注入によって、投与可能である。好ましい用量は１５０ｍｇ／日である。抗体に基づくＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、あるいはアンチセンス、ＲＮＡｉまたはリボザイム構築物を、１回または分割用量で１日あたりまたは１週あたり、あるいは連続注入によって、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与してもよい。いくつかの例において、前述の範囲の下限より下の投薬量レベルでも十分である可能性もあり、一方、他の場合において、さらにより多い用量をまず、１日を通じた投与のため、いくつかの小さい用量に最初に分割するならば、さらにより大きい用量が、いかなる有害な副作用も引き起こさずに使用されることも可能である。
【０２４７】
[279]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤および他のさらなる剤を、同じまたは異なる経路によって、別個にまたは一緒にのいずれかで、そして非常に多様な異なる投薬型で、投与してもよい。例えば、阻害剤は好ましくは経口または非経口投与される。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤がエルロチニブＨＣｌ（タルセバ（登録商標））である場合、経口投与が好ましい。ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤がＯＳＩ−９０６である場合、経口投与が好ましい。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤および他のさらなる剤の両方を単回用量または多数回用量で投与してもよい。
【０２４８】
[280]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハードキャンディ、粉末、スプレー、クリーム、軟膏、座薬、ジェリー、ゲル、ペースト、ローション、軟膏、エリキシル剤、シロップ等の形で、多様な薬学的に許容されうる不活性キャリアーとともに投与してもよい。単回用量または多数回用量で、こうした投薬型の投与を実行してもよい。キャリアーには、固形希釈剤または充填剤、無菌水性媒体および多様な非毒性有機溶媒等が含まれる。経口薬学的組成物に適切に甘味および／またはフレーバーを付けてもよい。
【０２４９】
[281]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を、スプレー、クリーム、軟膏、座薬、ジェリー、ゲル、ペースト、ローション、軟膏等の形で、多様な薬学的に許容されうる不活性キャリアーと一緒に合わせてもよい。単回用量または多数回用量で、こうした投薬型の投与を実行してもよい。キャリアーには、固形希釈剤または充填剤、無菌水性媒体および多様な非毒性有機溶媒等が含まれる。タンパク質性ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を含むすべての配合物は、阻害剤の変性および／または分解、ならびに生物学的活性の喪失を回避するように、選択すべきである。
【０２５０】
[282]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む薬学的組成物を調製する方法が当該技術分野に知られ、そして例えば国際特許公報第ＷＯ  ０１／３４５７４号に記載される。本発明の解説を考慮して、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を含む薬学的組成物を調製する方法は、上に引用する刊行物から、そして他の既知の参考文献、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ペンシルバニア州イーストン，  第１８版（１９９０）から明らかであろう。
【０２５１】
[283]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の経口投与のため、１または両方の活性剤を含有する錠剤は、任意の多様な賦形剤、例えば微結晶性セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウムおよびグリシンなどと、多様な崩壊剤、例えばデンプン（そして好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、アルギン酸および特定の複合シリケートとともに、顆粒化結合剤、例えばポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチンおよびアラビアゴムと一緒に、組み合わせられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの潤滑剤が、錠剤化目的のために、しばしば非常に有用である。類似のタイプの固形組成物をゼラチンカプセル中の充填剤として使用してもよく；これに関連して好ましい材料にはまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールも含まれる。水性懸濁物および／またはエリキシル剤が経口投与のために望ましい場合、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を多様な甘味剤またはフレーバー剤、着色物質または色素と組み合わせてもよく、そして望ましい場合、乳化剤および／または懸濁剤とも、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび多様な同様の組み合わせと一緒に組み合わせてもよい。
【０２５２】
[284]活性剤のいずれかまたは両方の非経口投与のため、ゴマ油またはピーナツ油、あるいは水性プロピレングリコールのいずれか中の溶液を使用してもよく、活性剤または対応するその水溶性の塩を含む無菌水溶液を使用してもよい。こうした無菌水溶液は、好ましくは、適切に緩衝され、そしてまた、例えば十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされている。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋内、皮下および腹腔内注射目的に、特に適している。油性溶液は、動脈内、筋内および皮下注射目的に適している。これらの溶液すべての無菌条件下での調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。タンパク質性ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の投与に関して選択される任意の非経口配合物は、阻害剤の変性および生物学的活性の喪失を回避するように選択すべきである。
【０２５３】
[285]さらに、活性剤のいずれかまたは両方を、例えばクリーム、ローション、ジェリー、ゲル、ペースト、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ、ｓａｌｖｅ）等によって、標準的な薬学的実施にしたがって、局所投与することも可能である。例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の濃度のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を含む局所配合物を調製してもよい。
【０２５４】
[286]獣医学的目的のため、任意の型を用いて、そして上述の経路のいずれかによって、活性剤を別個にまたは一緒に動物に投与してもよい。好ましい態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を、カプセル、ボーラス、錠剤、液体水薬（ｄｒｅｎｃｈ）の形で、注射によって、または移植物として投与する。代替物として、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を、動物の飼料とともに投与してもよく、そしてこの目的のため、濃縮飼料添加物またはプレミックスを通常の動物飼料のために調製してもよい。こうした配合物を標準的獣医学的実施にしたがって、慣用的方式で調製する。
【０２５５】
[287]本明細書において、用語「ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤」には、当該技術分野に現在知られるいかなるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤も含まれ、そして患者に投与した際に、そうでなければ天然リガンドのＥＧＦＲへの結合から生じる下流生物学的効果のいずれも含む、患者におけるＥＧＦＲの活性化に関連する生物学的活性の阻害を生じるいかなる化学実体も含まれる。こうしたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、患者における癌治療に関連するＥＧＦＲ活性化またはＥＧＦＲ活性化の下流生物学的効果のいずれかを遮断可能ないかなる剤も含まれる。こうした阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そしてそのキナーゼ活性を阻害することによって作用してもよい。あるいは、こうした阻害剤は、ＥＧＦＲのリガンド結合部位またはその一部を占めることにより、正常な生物学的活性が防止されるかまたは減少するように、受容体を天然リガンドにアクセス不能にすることによって、作用することも可能である。あるいは、こうした阻害剤は、ＥＧＦＲポリペプチドの二量体化、またはＥＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質の相互作用を調節することによって、あるいはＥＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシス分解を増進することによって作用することも可能である。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、低分子量阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（すなわちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムが含まれる。好ましい態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する小有機分子または抗体である。
【０２５６】
[288]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、例えばキナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリミドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピロロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピラゾロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フェニルアミノピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、オキシンドールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、およびチロホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えば以下の特許刊行物に記載されるもの、ならびに前記ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のすべての薬学的に許容されうる塩および溶媒和物が含まれる：国際特許刊行物第ＷＯ  ９６／３３９８０号、第ＷＯ  ９６／３０３４７号、第ＷＯ  ９７／３００３４号、第ＷＯ  ９７／３００４４号、第ＷＯ  ９７／３８９９４号、第ＷＯ  ９７／４９６８８号、第ＷＯ  ９８／０２４３４号、第ＷＯ  ９７／３８９８３号、第ＷＯ  ９５／１９７７４号、第ＷＯ  ９５／１９９７０号、第ＷＯ  ９７／１３７７１号、第ＷＯ  ９８／０２４３７号、第ＷＯ  ９８／０２４３８号、第ＷＯ  ９７／３２８８１号、第ＷＯ  ９８／３３７９８号、第ＷＯ  ９７／３２８８０号、第ＷＯ  ９７／３２８８号、第ＷＯ  ９７／０２２６６号、第ＷＯ  ９７／２７１９９号、第ＷＯ  ９８／０７７２６号、第ＷＯ  ９７／３４８９５号、第ＷＯ  ９６／３１５１０号、第ＷＯ  ９８／１４４４９号、第ＷＯ  ９８／１４４５０号、第ＷＯ  ９８／１４４５１号、第ＷＯ  ９５／０９８４７号、第ＷＯ  ９７／１９０６５号、第ＷＯ  ９８／１７６６２号、第ＷＯ  ９９／３５１４６号、第ＷＯ  ９９／３５１３２号、第ＷＯ  ９９／０７７０１号、および第ＷＯ  ９２／２０６４２号；欧州特許出願第ＥＰ  ５２０７２２号、第ＥＰ  ５６６２２６号、第ＥＰ  ７８７７７２号、第ＥＰ  ８３７０６３号、および第ＥＰ  ６８２０２７号；米国特許第５，７４７，４９８号、第５，７８９，４２７号、第５，６５０，４１５号、および第５，６５６，６４３号；ならびにドイツ特許出願第ＤＥ  １９６２９６５２号。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる限定されない例には、Ｔｒａｘｌｅｒ，  Ｐ．，  １９９８，  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ  ８（１２）：１５９９−１６２５に記載されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のいずれかが含まれる。
【０２５７】
[289]本発明にしたがって使用可能な低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の特定の好ましい例には、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ−７７４、エルロチニブ、またはタルセバ（登録商標）（エルロチニブＨＣｌ）としても知られる；ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第５，７４７，４９８号；国際特許公報第ＷＯ  ０１／３４５７４号、およびＭｏｙｅｒ，  Ｊ．Ｄ．ら（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：４８３８−４８４８）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３としても知られ、以前、ＰＤ１８３８０５として知られた；Ｐｆｉｚｅｒ）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，  １９９９，  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４０：７２３）；ＰＤ−１５８７８０（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ−１４７８（カリフォルニア大学）；ＣＧＰ−５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６またはジトシル酸ラパチニブとしても知られる；ＧＳＫ）；バンデタニブ（ＺＤ６４７４；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、ＰＦ００２９９８０４（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびゲフィチニブ（ＺＤ１８３９またはイレッサＴＭとしても知られる；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）（Ｗｏｏｄｂｕｒｎら，  １９９７，  Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３８：６３３）が含まれる。本発明にしたがって使用可能な特に好ましい低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（すなわちエルロチニブ）、その塩酸塩（すなわちエルロチニブＨＣｌ、タルセバ（登録商標））または他の塩型（例えばメシル酸エルロチニブ）である。
【０２５８】
[290]抗体に基づくＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、天然リガンドによるＥＧＦＲ活性化を部分的にまたは完全に遮断可能な任意の抗ＥＧＦＲ抗体または抗体断片が含まれる。抗体に基づくＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の限定されない例には、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，  Ｈ．，ら，  １９９３，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２４７−２５３；  Ｔｅｒａｍｏｔｏ，  Ｔ．，ら，  １９９６，  Ｃａｎｃｅｒ  ７７：６３９−６４５；  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，  １９９５，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １：１３１１−１３１８；  Ｈｕａｎｇ，  Ｓ．  Ｍ．，ら，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５：５９（８）：１９３５−４０；およびＹａｎｇ，  Ｘ．，ら，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：１２３６−１２４３が含まれる。したがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体Ｍａｂ  Ｅ７．６．３（Ｙａｎｇ，  Ｘ．Ｄ．ら（１９９９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：１２３６−４３）またはＭａｂ  Ｃ２２５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８５０８）、あるいはその結合特異性を有する抗体または抗体断片であってもよい。適切なモノクローナル抗体ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブまたはエルビタックスＴＭとしても知られる；Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦとしても知られる；Ａｂｇｅｎｉｘ）、マツズマブ（ＥＭＤ  ７２０００としても知られる；Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、ダルムシュタット）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−４４７（メダレックス／  Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、ニモツズマブ（ｈ−Ｒ３）、ザルツムマブ、およびｃｈ８０６（突然変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩをターゲティングする）が含まれる。
【０２５９】
[291]抗体に基づくさらなるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、適切な抗原またはエピトープを、例えばとりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスから選択される宿主動物に投与することによって、既知の方法にしたがって作製することも可能である。当該技術分野に知られる多様なアジュバントを用いて、抗体産生を増進させることも可能である。
【０２６０】
[292]本発明を実施する際に有用な抗体は、ポリクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。培養中の連続細胞株によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体を調製し、そして単離してもよい。産生および単離のための技術には、限定されるわけではないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，  １９７５，  ２５６：４９５−４９７）によって元来記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅら，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６）．が含まれる。
【０２６１】
[293]あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（例えば米国特許第４，９４６，７７８号）を適応させて、抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体を産生してもよい。本発明を実施する際に有用な、抗体に基づくＥＧＦＲキナーゼ阻害剤にはまた、限定されるわけではないが、損なわれていない抗体分子のペプシン消化によって生成可能なＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片を含む抗ＥＧＦＲ抗体断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築して（例えば、Ｈｕｓｅら，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照されたい）、ＥＧＦＲに対する望ましい特異性を有する断片を迅速に同定することを可能にしてもよい。
【０２６２】
[294]モノクローナル抗体および抗体断片の産生および単離のための技術は、当該技術分野に周知であり、そしてこうした技術は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに、そしてＪ．  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  １９８６，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎに記載される。ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体および抗体断片もまた、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｔ．  Ｊ．ら，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６：５３５−５３９および該文献に引用される参考文献に記載されるものなどの既知の技術にしたがって調製可能であり、そしてこうした抗体またはその断片もまた、本発明を実施する際に有用である。
【０２６３】
[295]本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づいてもよい。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞中で、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡに結合することによって、その翻訳を直接遮断し、そしてしたがってタンパク質翻訳を防止するか、またはｍＲＮＡ分解を増加させ、したがってＥＧＦＲキナーゼタンパク質のレベル、そしてしたがって活性を減少させるように働くであろう。例えば、少なくとも約１５塩基であり、そしてＥＧＦＲをコードするｍＲＮＡ転写物配列のユニークな領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば慣用的なホスホジエステル技術によって合成し、そして例えば静脈内注射または注入によって投与してもよい。配列が知られる遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するため、アンチセンス技術を用いるための方法が、当該技術分野に周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；および第５，９８１，７３２号を参照されたい）。
【０２６４】
[296]低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）もまた、本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として機能しうる。ＥＧＦＲ発現が特異的に阻害されるように、腫瘍、被験体または細胞と、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、あるいは低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターまたは構築物を接触させることによって、ＥＧＦＲ遺伝子発現を減少させることも可能である（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。その配列が知られる遺伝子に関して、適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法が当該技術分野に周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｉ，  Ｔ．ら（１９９９）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３（２４）：３１９１−３１９７；  Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８；  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−２５１；  ＭｃＭａｎｕｓ，  Ｍ．Ｔ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．  Ａ．（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：７３７−７４７；  Ｂｒｅｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｔ．Ｒ．ら（２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；米国特許第６，５７３，０９９号、および第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公報第ＷＯ  ０１／３６６４６号、第ＷＯ  ９９／３２６１９号、および第ＷＯ  ０１／６８８３６号を参照されたい）。
【０２６５】
[297]リボザイムもまた、本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として機能しうる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒可能な、酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的ターゲットＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション後、ヌクレオチド鎖切断を伴う。ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的に、そして効率的に触媒する操作ヘパリンまたはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、したがって、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的なＲＮＡターゲット内での特異的リボザイム切断部位は、リボザイム切断部位に関してターゲット分子をスキャンすることによって最初に同定され、こうした部位には、典型的には、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣが含まれる。ひとたび同定されたら、切断部位を含有するターゲット遺伝子領域に対応する、約１５〜約２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、予測される構造特徴、例えばオリゴヌクレオチド配列を不適切にしうる二次構造に関して評価してもよい。候補ターゲットの適切性はまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するアクセス可能性を試験することによってもまた評価可能である。
【０２６６】
[298]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムはどちらも、既知の方法によって調製可能である。これらには、化学的合成法に関する技術、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成によるものが含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって、アンチセンスＲＮＡ分子を生成してもよい。Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む非常に多様なベクター内に、こうしたＤＮＡ配列を取り込んでもよい。細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに多様な修飾を導入してもよい。ありうる修飾には、限定されるわけではないが、分子の５’および／または３’端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド主鎖内でのホスホジエステラーゼ連結ではないホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用が含まれる。
【０２６７】
[299]本発明の治療法の背景において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、薬学的に許容されうるキャリアーおよび非毒性療法的有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤化合物（その薬学的に許容されうる塩を含む）で構成される組成物として用いられる。
【０２６８】
[300]用語「薬学的に許容されうる塩」は、薬学的に許容されうる非毒性塩基または酸から調製される塩を指す。本発明の化合物が酸性である場合、対応する塩は、好適に、無機塩基および有機塩基を含む、薬学的に許容されうる非毒性塩基から調製されうる。こうした無機塩基に由来する塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅（銅二価および銅一価）、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン（第二マンガンおよび第一マンガン）、カリウム、ナトリウム、亜鉛および同様の塩が含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。薬学的に許容されうる有機非毒性塩基由来の塩には、一級、二級、および三級アミン、ならびに環状アミンおよび置換アミン、例えば天然存在および合成置換アミンが含まれる。塩を形成可能な他の薬学的に許容されうる有機非毒性塩基には、イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等が含まれる。
【０２６９】
[301]本発明で用いる化合物が塩基性である場合、対応する塩は、好適に、無機酸および有機酸を含む、薬学的に許容されうる非毒性酸から調製されうる。こうした酸には、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。特に好ましいのは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸および酒石酸である。
【０２７０】
[302]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物（その薬学的に許容されうる塩を含む）を活性成分として含む、本発明で使用する薬学的組成物には、薬学的に許容されうるキャリアー、および場合によって他の療法成分またはアジュバントが含まれてもよい。他の療法剤には、上に列挙するような、細胞傷害剤、化学療法剤または抗癌剤、あるいはこうした剤の効果を増進させる剤が含まれてもよい。組成物には、経口、直腸、局所、および非経口（皮下、筋内、および静脈内を含む）投与に適した組成物が含まれるが、任意の所定の症例における最も適切な経路は、特定の宿主、ならびに活性成分を投与しようとする状態の性質および重症度に依存するであろう。薬学的組成物を、好適に、単位投薬型で提示し、そして薬学業に周知の任意の方法によって調製してもよい。
【０２７１】
[303]実施において、本発明のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物（その薬学的に許容されうる塩を含む）を、慣用的な薬学的化合技術にしたがって、薬学的キャリアーと緊密に混合した活性成分として組み合わせてもよい。キャリアーは、投与、例えば経口または非経口（静脈内を含む）投与に望ましい調製型に応じて、非常に多様な型を取りうる。したがって、本発明の薬学的組成物は、各々、あらかじめ決定された量の活性成分を含有するカプセル、カシェーまたは錠剤などの経口投与に適した別個の単位として提示されてもよい。さらに、組成物は、粉末として、顆粒として、溶液として、水性液体中の懸濁物として、非水性液体として、水中油エマルジョンとして、または油中水液体エマルジョンとして、提示されてもよい。上に示す一般的な投薬型に加えて、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物（各構成要素の薬学的に許容されうる塩を含む）はまた、徐放手段および／または送達デバイスによって投与されてもよい。薬学業の方法のいずれによって、組成物の組み合わせを調製してもよい。一般的に、こうした方法には、活性成分と、１またはそれより多い必要な成分を構成するキャリアーを会合させる工程が含まれる。一般的に、組成物は、均一にそして念入りに、活性成分と、液体キャリアーまたは細分割された固体キャリアーを、あるいはその両方を混ぜ合わせることによって調製される。次いで、産物が望ましい提示になるように、好適に成形してもよい。
【０２７２】
[304]本発明で用いるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物（その薬学的に許容されうる塩を含む）はまた、１またはそれより多い療法的活性化合物と組み合わせて、薬学的組成物中に含まれてもよい。他の療法活性化合物には、上に列挙するような、細胞傷害剤、化学療法剤または抗癌剤、あるいはこうした剤の効果を増進させる剤が含まれてもよい。
【０２７３】
[305]したがって、本発明の１つの態様において、薬学的組成物は、抗癌剤と組み合わされたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物を含んでもよく、ここで前記抗癌剤は、アルキル化薬剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、および抗血管形成剤からなる群より選択されるメンバーである。
【０２７４】
[306]使用する薬学的キャリアーは、例えば、固体、液体、または気体であってもよい。固体キャリアーの例には、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が含まれる。液体キャリアーの例は、シュガーシロップ、ピーナツ油、オリーブ油、および水である。気体キャリアーの例には、二酸化炭素および窒素が含まれる。
【０２７５】
[307]経口投薬型の組成物を調製する際には、任意の好適な薬学的媒体を使用してもよい。例えば、水、グリコール、油、アルコール、フレーバー剤、保存剤、着色剤等を用いて、経口液体調製物、例えば懸濁剤、エリキシル剤および溶液を形成してもよく；一方、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等を用いて、経口固体調製物、例えば粉末、カプセルおよび錠剤を形成してもよい。投与を容易にするため、固形薬学的キャリアーを使用する錠剤およびカプセルが好ましい経口投薬単位である。場合によって、標準的水性または非水性技術によって、錠剤をコーティングしてもよい。
【０２７６】
[308]圧縮またはモールディングによって、場合によって１またはそれより多い付属成分またはアジュバントとともに、本発明で用いる組成物を含有する錠剤を調製してもよい。適切な装置中で、粉末または顆粒などの自由流動型の活性成分を、場合によって結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤または分散剤と混合して、圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。適切な装置中で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物をモールディングすることによって、モールディング錠剤を作製してもよい。各錠剤は、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約５ｇの活性成分を含有し、そして各カシェーまたはカプセルは、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約５ｇの活性成分を含有する。
【０２７７】
[309]例えば、ヒトへの経口投与に意図される配合物は、総組成物の約５〜約９５パーセントで多様であることも可能である、適切でそして好適な量のキャリアー成分と混合された、約０．５ｍｇ〜約５ｇの活性剤を含有してもよい。単位投薬型は、一般的に、約１ｍｇ〜２ｇの間の活性成分、典型的には、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇを含有するであろう。
【０２７８】
[310]本発明で用いる、非経口投与に適した薬学的組成物を、水中の活性化合物の溶液または懸濁物として調製してもよい。適切な界面活性剤には、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースが含まれてもよい。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中のその混合物中で分散物を調製してもよい。さらに、微生物の有害な増殖を防止するために、保存剤を含めてもよい。
【０２７９】
[311]注射可能使用に適した本発明の薬学的組成物には、無菌水溶液または分散物が含まれる。さらに、組成物は、こうした無菌注射可能溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末の形であってもよい。すべての場合で、最終注射可能型は無菌でなければならず、そして容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）のために有効に流動性でなければならない。薬学的組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならない；したがって、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存されなければならない。キャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、植物油、およびその適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であってもよい。
【０２８０】
[312]本発明の薬学的組成物は、例えば、エアロゾル、クリーム、軟膏、ローション、散布粉末等の局所使用に適した型であってもよい。さらに、組成物は、経皮デバイスにおける使用に適した型であってもよい。慣用的なプロセシング法を通じて、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物（その薬学的に許容されうる塩を含む）を利用して、これらの配合物を調製してもよい。例として、親水性成分および水を、約５重量％〜約１０重量％の化合物と一緒に混合して、望ましいコンシステンシーを有するクリームまたは軟膏を産生することによって、クリームまたは軟膏を調製する。
【０２８１】
[313]本発明の薬学的組成物は、直腸投与に適した型であってもよく、ここでキャリアーは固体である。混合物が単位用量座薬を形成することが好ましい。適切なキャリアーにはココアバターおよび当該技術分野で一般的に用いられる他の材料が含まれる。組成物をまず、軟化または融解キャリアー（単数または複数）と混合し、その後、冷却し、そしてモールド中で成形することによって、座薬を好適に形成してもよい。
【０２８２】
[314]前述のキャリアー成分に加えて、上記薬学的配合物には、適切なように、１またはそれより多いさらなるキャリアー成分、例えば希釈剤、緩衝剤、フレーバー剤、結合剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（酸化防止剤を含む）等が含まれてもよい。さらに、配合物を、意図されるレシピエントの血液と等張にするため、他のアジュバントが含まれてもよい。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤化合物（その薬学的に許容されうる塩を含む）を含有する組成物はまた、粉末または液体濃縮型でも調製可能である。
【０２８３】
[315]本発明を実施するために用いる化合物の投薬量レベルは、本明細書に記載するように、またはこれらの化合物に関して当該技術分野に記載されるように、およそであろう。しかし、任意の特定の患者に特異的な用量レベルは、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬剤組み合わせ、および療法を受けている特定の疾患の重症度に応じるであろう。
【０２８４】
[316]当該技術分野に知られる多くの代替実験法は、本発明の実施において、本明細書に特に記載するものに対して置換可能であり、例えば、本発明に関連する技術分野で入手可能な優れたマニュアルおよび教科書（例えば、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．およびＬａｎｅ，  Ｄ．監修，  １９９９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（例えばＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；  Ｒｏｅ  Ｂ．Ａ．ら  １９９６，  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．（例えばＩＳＢＮ  ０−４７１−９７３２４−０）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ２０００，  Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，  Ｓ．Ｅｍｒ，  Ｊ．Ｔｈｏｒｎｅｒ．監修  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２００１，  第３版，  Ｊｏｓｅｐｈ  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＰｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ監修（以前のＭａｎｉａｔｉｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍａｎｕａｌ）（例えばＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５７７−３）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆｒｅｄ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（例えばＩＳＢＮ  ０−４７１−５０３３８−Ｘ）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（例えばＩＳＢＮ  ０−４７１−１１１８４−８）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  １９９０，  Ｖｏｌ．  １８２，  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍ．Ｐ．監修，  Ａｃｅｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（例えばＩＳＢＮ  ０−１２−２１３５８５−７））の多くに記載される通りであり、または分子生物学における実験法を記載するために充てられる多くの大学および商業的ウェブサイトに記載される通りである。
【０２８５】
[317]本発明は、以下の実験詳細からよりよく理解されるであろう。しかし、当業者は、論じる特定の方法および結果は、この後に続く請求項により完全に記載するような本発明の単なる例示であり、そしていかなる点でもこれに限定されるとは見なされないものとする。
【実施例】
【０２８６】
[318]実験詳細：
[319]材料および方法
[320]化合物：
[321]選択的ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、エルロチニブは、塩酸塩、エルロチニブＨＣｌ（タルセバ（登録商標））として、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、米国ニューヨーク州ファーミングデールによって合成された。
【０２８７】
[322]選択的ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＯＳＩ−９０６は、式、シス−３−［８−アミノ−１−（２−フェニル−キノリン−７−イル）−イミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−３−イル］−１−メチル−シクロブタノールを有する。その調製は、米国公開特許出願ＵＳ  ２００６／０２３５０３１に詳細に記載される。該阻害剤は、以下のような構造を有する：
【０２８８】
【化７】
2014519813.tif 000009
【０２８９】
[323]選択的ＦＡＫキナーゼ阻害剤、化合物Ｆは、方法を用いて、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、米国ニューヨーク州ファーミングデールによって合成された。該化合物は、米国特許出願１２／７９１，０４７中の式１にしたがった化合物に相当し、そして該出願記載の方法によって合成される。
【０２９０】
[324]選択的ＭＥＴキナーゼ阻害剤、化合物Ｍは、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、米国ニューヨーク州ファーミングデールによって合成された。該化合物は、米国公開特許出願ＵＳ２００９／１９７８６２中の式１にしたがった化合物に相当し、そして該出願記載の方法によって合成される。
【０２９１】
[325]一般的な細胞培養条件：本明細書に別に記載しない限り、ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８ＴＭ［別名Ｈ−３５８；Ｈ３５８］、ＮＣＩ−Ｈ１６５０［別名Ｈ１６５０；ＣＲＬ−５８８３ＴＭ］、ＮＣＩ−Ｈ２９２ＴＭ［別名ＣＲＬ−１８４８ＴＭ；Ｈ２９２］、およびＣＦＰＡＣ−１［別名ＣＲＬ−１９１８ＴＭ］は、ＡＴＣＣ推奨の補充培地中で培養された。ＨＧＦ、ＴＧＦβ１、およびオンコスタチンＭを含む増殖因子およびサイトカインを商業的供給源から得た。
【０２９２】
[326]さらに、以下のヒト癌細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）またはさらなる示す供給源から得て、そして記載されるように培地中で培養した。腫瘍タイプもまた示す：Ｈ２９５Ｒ（副腎皮質癌；ＡＴＣＣ）、ＮＣＩ−Ｈ３２２（ＮＳＣＬＣ；ＥＣＡＣＣ）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ＮＳＣＬＣ；ＡＴＣＣ）、ＳＷ１５７３（ＮＳＣＬＣ；ＡＴＣＣ）、Ｈ１７０３（ＮＳＣＬＣ；ＡＴＣＣ）、ＢｘＰＣ３（膵臓；ＡＴＣＣ）、ＯＶＣＡＲ５（卵巣；ＮＣＩ；）、ＭＤＡＨ−２７７４（卵巣；ＡＴＣＣ）、Ｉｇｒｏｖ１（卵巣；ＮＣＩ）、ＧＥＯ（結腸；Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＣＣ））、ＨＴ−２９（結腸；ＡＴＣＣ）、ＲＫＯ（結腸；ＡＴＣＣ）、Ｈ２２６（ＮＳＣＬＣ；ＡＴＣＣ）、８２２６（骨髄腫；ＡＴＣＣ）、Ｈ９２９（骨髄腫；ＡＴＣＣ）、Ｕ２６６（骨髄腫；ＡＴＣＣ）、ＳＫＥＳ１（ユーイング肉腫；ＡＴＣＣ）、ＲＤＥＳ（ユーイング肉腫；ＡＴＣＣ）、ＲＤ（横紋筋肉腫；ＡＴＣＣ）、ＤＵ４４７５（乳房；ＡＴＣＣ）、ＳＫＮＡＳ（神経芽腫；ＡＴＣＣ）、２６５０（鼻ＳＣＣ；ＡＴＣＣ）、ＯＶＣＡＲ４（卵巣；ＮＣＩ）、Ａ６７３（ユーイング肉腫；ＡＴＣＣ）、ＢＴ４７４（乳房；ＡＴＣＣ）、１３８６（口腔ＳＣＣ；ＭＳＫＣＣ、ＮＹ）、１１８６（ＳＣＣＨＮ；ＭＳＫＣＣ、ＮＹ）、Ｃｏｌｏ２０５（結腸；ＡＴＣＣ）、ＨＣＴ−１５（結腸；ＡＴＣＣ）、Ｆａｄｕ（口腔ＳＣＣ；ＡＴＣＣ）、ＳＫＢＲ３（乳房；ＡＴＣＣ）、１４８３（ＨＮＳＣＣ；ＭＳＫＣＣ、ＮＹ）、ＨＳＣ−２（ＨＮＳＣＣ；理研バイオリソースセンター、日本・茨城県つくば市、３０５−００７４、日本）。細胞を、５％  ＣＯ２を含有する大気下、インキュベーター中、３７℃に維持した。マイコプラズマの存在に関して、細胞をルーチンにスクリーニングした（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、メリーランド州ボルチモア）。
【０２９３】
[327]細胞増殖の測定：Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて細胞増殖を決定した。９６ウェルプレート中、ウェルあたり３０００細胞の密度で細胞株を植え付けた。増殖に対する薬剤効果の評価のため、プレーティング２４時間後に、細胞に、単一剤として、または組み合わせてのいずれかで、多様な濃度の薬剤を投薬した。投薬７２時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏに関するシグナルを決定した。
【０２９４】
[328]ＴＥＴ誘導性ターゲット遺伝子細胞株の生成：標準的方法を用いて、Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ１、またはＴＧＦベータ（恒常的活性）（Ｓｎａｉｌ  ｍＲＮＡ配列、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００５９８５、ＧｅｎｅＩＤ：６６１５の産物；  Ｚｅｂ１  ｍＲＮＡ配列、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０３０７５１、ＧｅｎｅＩＤ：６９３５の産物；恒常的に活性なＳｅｒ２２３／Ｓ２２５ヒトＴＧＦ−ベータ−１をコードするＴＧＦベータ配列（すなわち、システイン２２３および２２５がセリンに突然変異している、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿０００６５１（ＧｅｎｅＩＤ：７０４０の産物））をＴｅｔ制御プロモーターの調節下に（ｐＴＲＥ２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）構築した。ＴＥＴ−ＯＮ細胞株をプレーティングし、そして上述のような、ｐＴＲＥ２−Ｓｎａｉｌ、ｐＴＲＥ２−Ｚｅｂ１、またはｐＴＲＥ２−ＴＧＦベータプラスミドでトランスフェクションした。１５０ｍｍのプレートにプレーティングしたら、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、単一細胞を選択した。ピューロマイシン濃度を０．１μｇ／ｍｌの最終濃度に減少させて、３〜４週間の期間に渡ってコロニーを選択した。コロニーフィルターを用いてコロニーを摘み取り、そしてウェスタンブロット分析によって、ターゲット遺伝子のＴＥＴ依存性発現に関してスクリーニングした。いくつかの場合、多数のｃＤＮＡを所定の細胞株に同時トランスフェクションした。これらの方法は、上に列挙するｃＤＮＡに駆動され、テトラサイクリンまたはその類似体に反応して、ＥＭＴを経る細胞株の生成を可能にする。
【０２９５】
[329]ＥＭＴ細胞モデルプロトコル：用いるＥＭＴ細胞モデルは、本質的に本明細書に記載する通りであり、またはより詳細には、米国特許出願１２／３８１，０８２、１２／６６０，４４３、１２／６６０，４４４およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２５１３７に記載される通りである。
【０２９６】
[330]リガンド駆動ＥＭＴモデル：１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１３６０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５６３０）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃２１８７０）中で、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を培養した。リガンド処理のため、細胞を通常の増殖培地に植え付け、そして翌日（第０日）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１００−３９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、２９５−ＯＭ）、２．５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃６１６４５０）または３つの組み合わせで刺激した。培地を交換し、そして新鮮なリガンドを刺激の４日後および６日後に添加し、ＲＮＡ単離前に２４時間、サンプルが新鮮なリガンドで刺激されるようにした。薬剤処理を含有する分析のため、リガンド処理時に、サンプルにＤＭＳＯまたは薬剤を添加した。ＲＮＡ用に、サンプルを第１日、第４日、および第７日に採取した。１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１３６０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５６３０）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃２１８７０）中で、ＮＣＩ−Ｈ１６５０およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を増殖させた。１０％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０）を補ったＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１９６０）中で、ＣＦＰＡＣ１細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１９１８）を培養した。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＭＥＭ中で、Ａ５４９細胞を培養した。細胞をリガンドで７日間処理し、そして別に記載しない限り、［２４９］のＮＣＩ−Ｈ３５８に関して記載するように採取した。
【０２９７】
[331]Ｈ３５８Ｔｅｔ  ＯＮ  Ｓｎａｉｌ、ａＴＧＦβおよびＺｅｂモデルプロトコル：テトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下、Ｓｎａｉｌ、ａＴＧＦβ、Ｚｅｂまたは空ベクターのいずれかを安定に発現するＨ３５８細胞を、１０％テトラサイクリン不含保証ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１３６０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５６３０）、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ）および０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃２１８７０）中で培養した。刺激のため、細胞を正常増殖培地中に植え付け、そして翌日（第０日）、０．５μｇ／ｍｌドキシサイクリンで刺激した。培地を交換し、そして新鮮なドキシサイクリンを第４日に添加した。ＲＮＡまたはタンパク質のために細胞を第７日に採取した。
【０２９８】
[332]３Ｄマトリゲル培養：冷たい増殖因子減少マトリゲル（８０μｌ；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３５４２３０）を、８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂｔｅｋ  ＩＩ、Ｎｕｎｃ  ＃１５４５３４）中にプレーティングし、そして３７℃で凝固させた。２％  マトリゲルを含有する完全培地で細胞を希釈し、３００μｌあたり５０００細胞にした。各ウェル内に３００μｌをプレーティングし、そして３７℃、５％  ＣＯ２で一晩インキュベーションした。培地を吸引し、そして２％  マトリゲルおよびリガンド処理を含有する培地、ウェルあたり１２０μｌを再プレーティングした。細胞を１４日間増殖させ、３〜４日ごとにフィードした。位相差によって細胞を画像化した。
【０２９９】
[333]ＴＡＫ１  ｓｉＲＮＡ：細胞をおよそ５０％集密でプレーティングした。翌日、細胞を２５ｎｇ／ｍｌのＴＡＫ１に対するｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）でトランスフェクションした。トランスフェクション培地を８時間後に除去した。４８時間後、１％ＦＢＳを含むＭＥＭに培地を交換し、そしてリガンドで４時間処理した。ｑＰＣＲ分析のために、２４時間後、ＲＮＡ用に細胞を採取した。
【０３００】
[334]ｑＰＣＲ：第１日（リガンドモデルのみ）、第４日（リガンドモデルのみ）、第７日および第１４日（Ｈ３５８Ｔｅｔ  Ｏｎモデルのみ）、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＲＮＡ水性４−ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ１９１４）を用いて、ＲＮＡを単離した。次いで、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ不含キット（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ１９０７）を用いて、サンプルをＤＮアーゼ処理し、そしてｑＰＣＲ分析のため、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８０−０４４）を用いて逆転写した。ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて、Ｔａｑｍａｎプライマーおよびロック化核酸プローブを設計した。ｍＲＮＡ分析のため、ＡＢＩ  ７９００ＨＴシリーズのＰＣＲ装置を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。熱周期条件は以下の通りであった：５０℃２分間、９５℃１０分間、９５℃１５秒間、５０℃１０秒間、６０℃１分間。４５周期に渡ってデータを収集し、そして次いで、ＧＡＰＤＨに対して規準化し、そしてさらに未処理対照サンプルに対して規準化した。
【０３０１】
[335]ＲＴ−ＰＣＲ分析のための８８遺伝子ＥＭＴＧＳとともに用いる規準化遺伝子：遺伝子ＧＴＦ２Ｂ、ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、およびＡＣＴＢを、ｑＰＣＲ分析における規準化遺伝子として選択した。これらを用いて、特定のサンプルに関するすべての規準化遺伝子の幾何平均を計算した（幾何平均＝（Ｘ１）（Ｘ２）．．．（Ｘｎ）のｎ乗根）。幾何平均は、所定の数のセットの中心傾向を示す。次いで、デルタＣｔを以下のように計算する：
デルタＣｔ＝（遺伝子ＸのＣｔ値）−（すべての規準化遺伝子の幾何平均）
対照サンプルおよび処理サンプルの間の倍変化の計算には：
対照サンプル＝２＾（−デルタＣｔ）
処理サンプル＝２＾（−デルタＣｔ）
倍変化＝処理サンプル／対照サンプル
１未満の値（比）を、−（１／Ｘ）を乗じることによって、倍変化に変換する。
【０３０２】
[336]ウェスタンブロット：細胞をＰＢＳで洗浄し、２００μＭバナジン酸ナトリウム、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｐ２８５０、Ｐ８３４０、Ｐ５７２６）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｒ０２７８）中に掻き取り、そして遠心分離した。標準ウェスタンブロッティングプロトコルにしたがった。一次抗体供給源は以下の通りである：Ｅ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ２１７９１）、ビメンチン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５０５１３）、ＥｒｂＢ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ２８５）、Ｚｅｂ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ２５３８８）、Ｓｎａｉｌ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃４７１９）、ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ２５７７８）。４０００ＭＭまたはＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  ＦｌｕｏｒｃｈｅｍＴＭ  ＳＰを用いて、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｆｅｍｔｏ基質でウェスタンブロットを現像した。
【０３０３】
[337]ザイモグラム：製造者のプロトコルにしたがって、Ｎｏｖｅｘ  Ｚｙｍｏｇｒａｍ  Ｇｅｌａｔｉｎゲル上で細胞溶解物を泳動した。ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅでゲルを染色し、そしてＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  ＦｌｕｏｒｃｈｅｍＴＭ  ＳＰ上で画像化した。
【０３０４】
[338]免疫蛍光／共焦点顕微鏡：記載されるように、細胞をガラスカバースリップ上にプレーティングし、そして処理した。標準免疫蛍光染色プロトコルにしたがった。一次抗体供給源は以下の通りである：Ｅ−カドヘリン：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ２１７９１およびビメンチン：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＃ＡＢ５７３３。Ｌｅｉｃａ共焦点ソフトウェア（ＬＣＳ）を用いて、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＸＥ顕微鏡／ＳＰ２スキャナ上で染色細胞を捕捉した。
【０３０５】
[339]遊走／浸潤：細胞を血清の存在下、リガンドで６日間刺激した。第６日、培地を、リガンドを含む血清不含培地に交換した。第７日、上部チャンバー中に血清不含培地を、そして下部チャンバー中に３ｘリガンド／１０％ＦＢＳを含む修飾ボイデンチャンバー（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｃｕｌｔｒｅｘ  ＃３４５８−０９６−Ｋ）中に細胞をプレーティングした。浸潤アッセイのため、膜をＩＶ型コラーゲン（アッセイキット中に含まれる）でコーティングした。２４時間（遊走）または４８時間（浸潤）後、蛍光プレート読み取り装置（Ｗａｌｌａｃ）上のカルセイン−ＡＭ染色読み取り値を用いて、膜の下側に付着した細胞を定量化した。ｐ＜０．０５のカットオフ値で、対応のないＴ検定によって、有意性を決定した。
【０３０６】
[340]異種移植片：メスＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；７〜８週齢）に、マトリゲルと１：１の比の正常増殖培地（１００μＬ最終体積）中に懸濁された１ｘ  １０７  Ｈ３５８  ＴＥＴ−ＯＮ  ｐＴｒｅ２−ＳＮＡＩＬ、ｐＴＲＥ２−ＺＥＢまたはｐＴＲＥ２−ａＴＧＦｂ細胞を皮下移植した。腫瘍を７日間増殖させた後、導入遺伝子を誘導した。飲料水中、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを２週間投与した。腫瘍体積を、移植７日後、１４日後、および２１日後にＶｅｒｎｉｅｒノギスによって計測した二方向腫瘍測定値から計算した（Ｖ＝［長さｘ（幅）２］／２）。第２１日、ＩＡＣＵＣ指針にしたがって、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。腫瘍を除去し、そして液体窒素中でスナップ凍結するか、または中性緩衝ホルマリン中で一晩固定した。
【０３０７】
[341]免疫組織化学：標準的プロトコルにしたがって、ホルマリン固定腫瘍をパラフィン包埋し、そして社内で切片作製した。Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ、テキサス州ケラー）でスライドを脱パラフィン処理し、そして段階的アルコールを通じて再水和した。スチーマー中、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０中で、熱誘導エピトープ回収（ＨＩＥＲ）を行った。すべての免疫染色に関して、ベクターＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）検出系プロトコルにしたがった。切片をヘマトキシリン（業者）で対比染色し、段階的アルコールおよびＨｅｍｏ−Ｄｅを通じて脱水し、そして次いでマウントした。抗体供給源およびインキュベーションは以下の通りである：Ｅ−カドヘリン（２４Ｅ１０）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃３１１９５、１：５０、１時間；ビメンチン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＃ＡＢ５７３３ニワトリ、１：６４００、３０分間；ＳＮＡＩＬ、ＡＢＣＡＭ  ＃１７７３２ウサギｐＡＢ  １：１６００、１時間；  Ｚｅｂ−１（Ｅ−２０）  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃１０５７２ヤギ、１：４００、１時間；サイトケラチン（広域）Ｄａｋｏ  ＃Ｚ０６２２ウサギｐ−ＡＢ  １：５００、１時間。
【０３０８】
[342]Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ：実験第７日、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ペレットにし、そしてスナップ凍結した。細胞ペレットを、ＲＮＡ単離のため、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓ（テネシー州メンフィス）またはＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ノースカロライナ州ダーハム）に送った。次いで、ｍＲＮＡをｃＤＮＡにプロセシングし、増幅し、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ｍＲＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのため、標識した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、マイクロアレイをスキャンし、そして各プローブセットに関して、データをシグナル強度にプロセシングした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ  ５ソフトウェアを用いて、生データを規準化し、そして私有アルゴリズムに基づいて、各プローブセットに、存在（Ｐ）非存在（Ａ）または境界線（Ｍ）の検出コールを与える。どの遺伝子が未処理および処理細胞の間で示差的に制御されているか決定するため、少なくとも２の倍変化に関して、そしてまた、比較サンプルの少なくとも１つにおけるＰの検出コールに関して、プローブセットをフィルター処理した。
【０３０９】
[343]バイオインフォマティクス：
[344]共相関解析のため、ＡＶＥＯ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたカスタム私有ソフトウェアを用いて、遺伝子インデックスを生成する遺伝子の共相関のための解析を行った。バイオインフォマティクスのためのパラメーター設定は、０．０１に設定されたｐ値を伴うピアソン相関、統計のためのランダム遺伝子選択、中央値中心または非中央値中心法のいずれかを用い、そして自動アンカーされた。ＥＭＴＧＳインデックスの計算のため、全体の遺伝子インデックススコアを計算するために、負に相関した遺伝子をフリップさせた。
【０３１０】
[345]この解析のために用いたソフトウェアは、生物学的経路における遺伝子が一緒に制御され、そして同じ経路中の多くの遺伝子が相関発現を示すという概念に基づく。該ソフトウェアは、生物学的に意味がある経路に相当するリスト中の相関および反相関遺伝子の集積発現に基づくインデックススコアを計算する。
【０３１１】
[346]ソフトウェアアルゴリズム（本明細書において、アルゴリズムＡ１と称する）は、２つの主要構成要素からなる：１）発現相関に基づく遺伝子選択構成要素および２）選択した遺伝子の平均発現に基づくインデックススコア計算構成要素。特に、遺伝子リストＡおよびデータセットＢを与えられると、アルゴリズムは、以下のように機能する：
１）Ｂにおいて、Ａに関する相関に基づくアンカー遺伝子（ＡＧ）を定義する：
ａ）Ｂにおけるすべてのサンプルに渡って、Ａにおけるすべての遺伝子−遺伝子対に関する遺伝子発現のピアソンまたはスピアマン相関（ユーザーが選択）を計算する。
【０３１２】
ｂ）ＡＢに関するＡＧは、以下を最大にする遺伝子ｘである：
【０３１３】
【化８】
2014519813.tif 000010
【０３１４】
式中、ＡＧＡＢはデータセットＢにおける遺伝子リストＡに関するアンカー遺伝子であり、Ｎｘは遺伝子ｘを含むすべての遺伝子−遺伝子対のセットであり、ｎはＮｘ中の遺伝子−遺伝子対の数であり、そして｜Ｒ｜は、Ｂにおけるすべてのサンプルに渡る各遺伝子−遺伝子対に関するピアソン（またはスピアマン）相関係数の絶対値である。
【０３１５】
２）遺伝子リスト（ＡＡＧ）から、ＡＧと有意に相関する遺伝子サブセットを選択する：
ａ）ＡＧに対する相関のＰ値に基づいて、すべての遺伝子を順位付けする。
【０３１６】
ｂ）ＡＡＧを、Ｂに渡ってＡＧと相関するＡにおける遺伝子サブセットと定義し、ここでＰ値≦ｃであり、式中、ｃは、ユーザーが規定する有意性カットオフである（典型的には０．０１）。
【０３１７】
３）Ｂにおける各サンプルｓに関して、遺伝子リストＡに関する相関に基づく発現インデックススコア（Ｉ）を計算する：
ａ）ＩＡＢｓを以下のように定義する：
【０３１８】
【化９】
2014519813.tif 000011
【０３１９】
式中、ＡＡＧは、アンカー遺伝子ＡＧと有意に相関するＡにおける遺伝子サブセットであり、ｍは、ＡＡＧにおける遺伝子の数であり、そしてｅｓｘ’は、以下のように、データセットＢのサンプルｓにおける遺伝子ｘ（サブセットＡＡＧ由来）の発現と定義される：
【０３２０】
【化１０】
2014519813.tif 000012
【０３２１】
式中、ｅｓｘは、サンプルｓにおける遺伝子ｘの発現であり、μＢｘはデータセットＢにおける遺伝子ｘの平均発現であり、そしてＲｘは、アンカー遺伝子ＡＧと遺伝子ｘの相関係数である。
【０３２２】
[347]アルゴリズムＡ１を用いて、図４５〜５１のインデックススコアを計算した。Ｒｘ＜０ならばｅｓｘ’＝μＢｘ−ｅｓｘであることを除いて、本明細書記載のアルゴリズムＡ１と同一であるアルゴリズムＡを用いて、すべての他のデータに関するインデックススコアを計算した。
【０３２３】
[348]インデックス化プラットフォームは、評価しているすべてのサンプルに関して、遺伝子リスト上の遺伝子各対に関する相関係数（−１から１のＲ値）を計算する。各遺伝子に関して、すべての相関および反相関の絶対値に渡って、平均Ｒ値を計算する。アンカー遺伝子は、最高の平均Ｒ値を持つ遺伝子と定義される。アンカーへの相関に基づいて、各遺伝子対に関して相関ヒートマップをプロットする。アンカー遺伝子への相関に関して、ユーザーが特定するｐ値カットオフに合格した遺伝子を、インデックススコアの計算に用いる。インデックススコアは、遺伝子がアンカー遺伝子に正に相関している際に、ｐ値カットオフに合格した遺伝子の平均発現値である。反相関遺伝子に関して、発現値をその遺伝子に関する平均発現値から減じ、そして次いで、正に相関した遺伝子との平均の一部として計算する。次いで、すべてのサンプルに関するインデックススコアを、増加する順にウォーターフォールプロット中にプロットする。
【０３２４】
[349]所定の遺伝子リストに関するインデックススコアがランダム遺伝子リストに関するスコアと有意に異なるかどうかを決定するため、１０００のランダム遺伝子リスト由来の平均インデックススコアに、計算したインデックススコアを比較する方法を開発した（ランダム化リサンプリングを通じた有意性評価または「ブートストラッピング法」）。各サンプルに関して、箱髭プロットとしてウォーターフォールプロット上にランダムインデックス統計を示し、最小、最大、平均、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを示す。インデックス値を箱髭上に重ね、そして上部または下部５パーセンタイル中のいかなるインデックスも、ランダムとは有意に異なると見なした。
【０３２５】
[350]シグネチャーインデックススコアの有意性を決定するためのブートストラッピング法
[351]ブートストラッピング法を発展させて、各サンプル由来のＥＭＴＧＳインデックススコアに関する統計的有意性を決定した。各サンプルに関して、以下の３工程法でＮ−遺伝子シグネチャーに基づくインデックススコアを計算する。まず、サンプル中のシグネチャーにおける他の遺伝子に対する最高の平均ピアソン相関を有する、シグネチャー中のアンカー遺伝子を同定する。続いて、各遺伝子の発現値を調整する。アンカーと負に相関するシグネチャー中の遺伝子に関して、その発現値を、サンプル間の平均発現値を回って反転させる。アンカーと正に相関する遺伝子に関して、サンプルに渡る平均発現値を発現値から差し引く。最後に、シグネチャー中のすべての遺伝子由来の調整した発現値の平均を計算し、そしてこの平均はそのサンプルに関するインデックススコアを構成する。
【０３２６】
[352]各サンプル中のインデックススコアの有意性を評価するため、各サンプルにおいて、ランダムＮ−遺伝子リストを選択し、そしてこのランダム遺伝子リストに基づくインデックススコアを同じ上述の方法にしたがって計算する。このプロセスを１０００回反復し、そしてランダムＮ−遺伝子リストから１０００のインデックススコアを生成する。サンプルが、ランダム遺伝子リストに基づくこれらの１０００インデックススコアの最低Ｐ（ユーザーによって定義される有意性レベル）分位に属するシグネチャーに基づくインデックススコアを有する場合、このサンプルは、Ｐの有意性レベルで、有意に低いインデックススコアを有すると決定される。逆に、サンプルが上位Ｐ分位に属するシグネチャーインデックススコアを有する場合、Ｐの有意性レベルで有意に高いインデックススコアを有すると決定される。各サンプル全体でこのブートストラッピング法を反復して、インデックススコアが有意に低いかまたは高いかを決定する。インデックススコア有意性決定のためのこのブートストラッピング法の利点は、２倍である。まず、該方法は、シグネチャーに関する発現レベルのサンプル間変動を考慮に入れる。この方法によって割り当てられる有意性レベルは、例えばサンプルに渡るシグネチャーインデックススコアを比較するのではなく、シグネチャーからの発現インデックスが、各サンプル内で偶然期待される（バックグラウンド）ものとどのくらい異なるかを測定する。第二に、シグネチャーにおけるものと正確に同じ数の遺伝子を含め、そしてシグネチャーに関するようなランダム遺伝子リストと同じ方法でインデックススコアを計算することによって、シグネチャーに基づくインデックススコアの有意性レベルを評価するため、インデックススコアの不偏分布が確立される。したがって、このブートストラッピング法は、各サンプルにおけるシグネチャーインデックススコアの統計的有意性を測定する客観的な方法を提供し、そしてヒト腫瘍における特定のＥＭＴＧＳインデックススコアの出現率の評価を促進する。
【０３２７】
[353]レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）マイクロアレイデータ：
[354]１０人の患者由来（７つの卵巣腫瘍および３つの乳房腫瘍）のマッチしたレーザー捕捉顕微解剖腫瘍、間質、および非顕微解剖物に関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３−ＡＢチップ発現データを、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃより購入した。ＣＥＬファイルは、ともにＲＭＡ規準化され、そしてインデックス有意性スコアリングのため、ブートストラッピング・アルゴリズムを用いる前に、平均中心化された。
【０３２８】
[355]結果／考察
[356]１］腫瘍モデル、２］ＥＭＴ細胞モデルおよび３］公的に入手可能なヒト腫瘍患者マイクロアレイデータセットへのバイオインフォマティクス比較を通じて精密化した４つのＨ３５８  ＥＭＴ細胞モデルから最初に得られた遺伝子セットを用いて、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーを得た。解析によって、この新規ＥＭＴ遺伝子シグネチャーは、例えば特定の抗癌薬剤での治療に対する患者の感受性を診断し、そして／または監視し、薬剤発見のため、関心対象の新規ターゲットを同定し、そして化合物処理に際して多様なＥＭＴモデルにおけるＥＭＴプロセスに対する変化を監視することを含む、多くの潜在的な使用を有することが示される。さらに、このＥＭＴシグネチャーから得られるＥＭＴインデックスは、より上皮性またはより間葉性としての腫瘍細胞の状態に関して、腫瘍細胞の定性的および定量的性質決定を可能にする。これは、分子レベルでＥＭＴを広く調べる手段として研究および臨床の両方において、貴重なツールであろう。
【０３２９】
[357]本明細書記載の８８遺伝子ＥＭＴシグネチャー（表１を参照されたい）は、上皮腫瘍細胞で発現される４４遺伝子および間葉様腫瘍細胞で発現される４４遺伝子からなる（遺伝子の説明に関しては、図３６〜３７を参照されたい）。例えばｑＰＣＲまたはｍＲＮＡマイクロアレイによって測定されるような遺伝子の発現パターンは、上皮から間葉への状態の範囲に沿って、腫瘍細胞または腫瘍組織切片を性質決定する。アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１を実行するＡＶＥＯソフトウェアを用いて、シグネチャー中の最適に共相関する遺伝子の発現値を変換して、解析する各サンプルに関する数値ＥＭＴインデックスを計算する。ＥＭＴインデックスは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤エルロチニブおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤ＯＳＩ−９０６に対する腫瘍細胞感度と相関し、そしてこれを用いて、臨床におけるこれらの化合物に対する患者反応を予測することも可能である。
【０３３０】
[358]表１：８８遺伝子ＥＭＴ遺伝子シグネチャー中の遺伝子
【０３３１】
【表１】
2014519813.tif 000013
【０３３２】
[359]異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ＥＭＴ中に同時制御される遺伝子、ならびに多数のヒト腫瘍マイクロアレイデータベース中のこれらの遺伝子と優れた共相関を示す遺伝子を用いて、本明細書に開示する８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーを開発したため（材料および方法セクションを参照されたい）、これは、異なる腫瘍タイプに広く適用可能であり、細胞培養モデルのみではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏサンプルまたは臨床生検に由来する腫瘍組織を性質決定する力を有する、遺伝子シグネチャー、および対応する遺伝子インデックスを生じている。
【０３３３】
[360]ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる際の遺伝子発現を示すため、遺伝子シグネチャーを開発する際に、ヒト腫瘍データベースを用いた。他の公的に入手可能なＥＭＴシグネチャーでは、腫瘍データを用いて、遺伝子リストを洗練させたものはない。細胞株は、遺伝子シグネチャーを開発する、よりきれいな系であるが、これらはまた、腫瘍および間質相互作用が遺伝子発現に影響を及ぼすｉｎ  ｖｉｖｏ、および臨床状況において、適切であろうシグネチャーを発展させるにはやはり不完全である。
【０３３４】
[361]８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーおよびインデックスの誘導
[362]４方向ベン図ジェネレータを用いたベン解析によって、１］二重リガンドＨＧＦ＋ＯＳＭ、２］ＴＧＦβ、３］ベクターにコードされるｓｎａｉｌ発現を誘導するドキシサイクリン、または４］ベクターにコードされるｚｅｂ１の発現を誘導するドキシサイクリンで処理したＨ３５８腫瘍細胞ＥＭＴモデルにおいて、上方制御されるかまたは下方制御されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析によって同定された有意な遺伝子を比較した（図１）。上皮間葉転換を経るように誘導された４つの細胞モデルすべてに共通する、１０１の遺伝子を同定した（表２を参照されたい）。表２の１０１遺伝子のうち、イタリックで示した１０は、８８ＥＭＴ遺伝子シグネチャーの最終的な生成のため、最初のバイオインフォマティクス解析からは省かれた。これらの遺伝子のうち８つは、未知の遺伝子であったため省かれた。他のＥＭＴモデルにおいて検証されなかった際、ＣＧＢ５および７を除去した。
【０３３５】
[363]表２：４つのＨ３５８  ＥＭＴ細胞モデルにおいて上方または下方制御される１０１遺伝子
【０３３６】
【表２−１】
2014519813.tif 000014
【０３３７】
【表２−２】
2014519813.tif 000015
【０３３８】
【表２−３】
2014519813.tif 000016
【０３３９】
[364]Ｈ３５８  ＥＭＴモデル系は、可逆性ＥＭＴの頑強なモデルである。転写因子ＳｎａｉｌまたはＺｅｂ１のリガンドまたは安定発現のいずれかで７日間処理した後、細胞は、ＥＭＴと一致する形態変化、マーカー変化、および表現型的変化を経る（図８）。さらに、Ｈ３５８細胞におけるリガンド誘導およびｓｎａｉｌ誘導ＥＭＴは、エルロチニブに対する感受性の減少を生じる。この系に関連する遺伝子変化のいくつかを取り込むＥＭＴシグネチャーはエルロチニブ感受性を予測すると仮定された。
【０３４０】
[365]４つのＨ３５８  ＥＭＴ細胞モデルから得た、続く９１遺伝子セットを、１］ＡＶＥＯ腫瘍モデル（表３）；２］さらなるＥＭＴ細胞モデル（表４）；および３］公的に入手可能なヒト腫瘍患者マイクロアレイデータセット（表３）に対する反復バイオインフォマティクス比較（表２）を通じて洗練して、最終８８遺伝子ＥＭＴシグネチャー（表１）を生じた。図３および図４は、得た最終８８遺伝子シグネチャーに対して最初の遺伝子シグネチャーを比較することによって、この反復プロセスによって達成され、乳房腫瘍アーカイブに対する遺伝子シグネチャーの相関インデックスの増加を例示する。この解析は、同じ経路における遺伝子の同時発現は、該経路が活性であることを意味すると仮定する。
【０３４１】
[366]表３：ＥＭＴＧＳ開発に用いた腫瘍マイクロアレイデータセット
【０３４２】
【表３】
2014519813.tif 000017
【０３４３】
[367]表４：ＥＭＴＧＳ開発に用いたさらなる腫瘍細胞ＥＭＴモデル
【０３４４】
【表４】
2014519813.tif 000018
【０３４５】
[368]シグネチャーを洗練するための全体の戦略は、腫瘍データセットおよびＥＭＴモデル両方におけるその振る舞いに基づいて、遺伝子を排除するかまたは含めることであった。ＥＭＴ遺伝子の元来のリストは、Ｈ３５８モデル由来のマイクロアレイデータセットから得られた。これらの遺伝子を、ＣＦＰＡＣ１、Ｈ１６５０およびＨ２９２  ＥＭＴモデルにおける変化に関して評価し、そしてまた、腫瘍データセットにおける共相関に関して評価した。モデルいずれにおいても変化しない遺伝子は排除した。また、いくつかのさらなる供給源（文献、プロテオミクスデータセット、ＡＶＥＯ腫瘍モデル、他のＥＭＴモデル）からシグネチャー内に新規遺伝子を導入し、そして同じ方式で評価した。シグネチャーの洗練は、遺伝子を付加し、評価し、そして次いで変化しない遺伝子を除去する多数周期を伴う反復プロセスであった。このプロセスを例示するため、表５は、ＥＭＴシグネチャーの４つの進行するバージョンを含有し、そして図９〜１０は、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ肺（Ｕ１３３ＡＢ）および膵臓（Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０）データセットにおけるこれらの４つのバージョンを通じた共相関プロットにおける改善を立証する。
【０３４６】
[369]表５：ＥＭＴ遺伝シグネチャーの進行
【０３４７】
【表５−１】
2014519813.tif 000019
【０３４８】
【表５−２】
2014519813.tif 000020
【０３４９】
【表５−３】
2014519813.tif 000021
【０３５０】
[370]表５は、８８ＥＭＴ遺伝子シグネチャー遺伝子に関するヒト腫瘍データセットにおける共相関解析を示す。すべての腫瘍を一緒に規準化し、そして各腫瘍タイプをＥＭＴインデックススコアにしたがって配置したウォーターフォールプロットとして視覚化すると、腫瘍間のＥＭＴインデックス発現における相対相違が明らかになる。例えば、乳房腫瘍は、上皮および間葉インデックススコアの間に均一に分布し、一方、結腸腫瘍は、間葉（高スコア）インデックススコアよりもより上皮（低スコア）インデックススコアを有する傾向がある。これは、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーが、多数のヒト腫瘍タイプにおいて、ＥＭＴを同定可能であることを立証する。
【０３５１】
[371]ＥＭＴシグネチャーにおける遺伝子の発現値から、数値のＥＭＴインデックスへの変換は、ＡＶＥＯソフトウェア実行アルゴリズムＡまたはアルゴリズムＡ１を用いて行われる。簡潔には、シグネチャー中の遺伝子各対に関する共相関係数（Ｒ値）を各サンプルに関して計算し、そして最高平均Ｒ値を持つ遺伝子（アンカー遺伝子）に対する相関強度によってソーティングしたヒートマップ中にプロットする。正の相関を紫で示し、そして負の相関を青で示す。ユーザーが特定するカットオフに合格したｐ値を持つ遺伝子を選択して、インデックスを計算する。アンカー遺伝子と負に相関するすべての遺伝子発現値を、その遺伝子に関する平均を回ってフリップさせる。次いで、相関プロットに関するｐ値カットオフに合格した各遺伝子の平均発現値として、インデックススコアを計算する。
【０３５２】
[372]ＥＭＴ状態が知られている参照腫瘍細胞株を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、インデックス値をＥＭＴ状態に転換するか、または形態およびＥＭＴバイオマーカーから推定してもよい。ＥＭＴＧＳインデックス値を用いて間葉様細胞から上皮様細胞を区別するため、既知の上皮表現型または間葉表現型の参照腫瘍細胞を試験またはサンプル腫瘍細胞に含めた。これらは、好ましくは、試験またはサンプル腫瘍細胞と同じ組織タイプのものである（例えば乳房、ＮＳＣＬＣ、膵臓等）。
【０３５３】
[373]ＥＭＴＧＳインデックススコアを用いて、（例えばエルロチニブ、ＯＳＩ−９０６等に関して）非反応者から、予測される薬剤反応者を区別するため、閾値決定解析（例えば受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析）を行って、どのインデックス値カットポイントが真の陽性および偽陽性の間の最適な分離を生じるかを決定してもよい。エルロチニブ感受性が知られている細胞株のＥＭＴＧＳインデックス値の解析によって、ＥＭＴインデックスおよび薬剤感受性の間に、完全ではないが優れた相関が示されている（図１９）。
【０３５４】
[374]すべてのサンプルに関するＥＭＴＧＳインデックススコアを、ウォーターフォールプロット上に、増加する順序でプロットしてもよく、そしてこれは、ＥＭＴの相対状態を示す（図４Ｂを参照されたい）。上皮遺伝子上にアンカーされたマイクロアレイデータから発現値を計算した際、高いインデックススコアは上皮表現型を反映する。上皮遺伝子上にアンカーされたｑＰＣＲデータから発現値を計算した際、低いインデックススコアは上皮表現型を反映する。マイクロアレイデータは、ｍＲＮＡ存在量を反映し、そしてしたがって、高いスコアは、アンカー遺伝子と共相関する遺伝子のｍＲＮＡがより高い存在量であることを反映するであろう。ｑＰＣＲデルタＣｔデータは、増幅を反映し、そしてしたがって、低いスコアは、ＰＣＲの初期の周期での増幅を反映し、そしてしたがって、アンカー遺伝子と共相関する遺伝子のｍＲＮＡの存在量が増幅前により高いことを反映するであろう。
【０３５５】
[375]共相関プロット中で統計的有意性を達成するために、群の一部として、ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算しなければならない。サンプルの数は、相関係数が統計的有意性を達成可能な値を変化させる。サンプルの数が増加するにつれて、有意性を達成する係数は低下する。さらに、ランダム化リサンプリング（ブートストラッピング）法を通じた、有意性評価は、適切な計算のため、少なくとも２５〜３０サンプルを必要とする。これらの理由のため、３０サンプルまたはそれより多い群の一部として、インデックス化アルゴリズムを通じて、サンプルをプロセシングしなければならない。臨床適用のため、単一の患者サンプルを、相対インデックスが患者反応と相関する、例えば第２期臨床試験から取られたサンプル群とともに解析してもよい。
【０３５６】
[376]以下のリスト（すなわち表６）は、共相関カットオフに合格し、そしてしたがって、示す腫瘍データセットのためのインデックス計算に含まれた遺伝子群である。
【０３５７】
[377]表６：
【０３５８】
【表６−１】
2014519813.tif 000022
【０３５９】
【表６−２】
2014519813.tif 000023
【０３６０】
【表６−３】
2014519813.tif 000024
【０３６１】
【表６−４】
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【０３６２】
【表６−５】
2014519813.tif 000026
【０３６３】
【表６−６】
2014519813.tif 000027
【０３６４】
[378]群の各々に関して、任意の他の群と重複する遺伝子の数は、以下の表７に示すように、２２〜３８で多様である。すべての１５のリストに共通であるのは、ただ１つの遺伝子：ＩＴＧＡ５である。遺伝子インデックスの計算に対する任意の個々の遺伝子の寄与は、シグネチャー中の遺伝子の数に応じて、そして遺伝子がｐ値カットオフに合格するかどうかで多様である。ＩＴＧＡ５は、それ自体、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ肺ＡＢデータセットのインデックス値に有意に影響を及ぼさない（図１１〜１２）。
【０３６５】
[379]表７：
【０３６６】
【表７】
2014519813.tif 000028
【０３６７】
[380]対照的に、４４の上皮遺伝子のみを用いて、同じデータセットにおけるインデックススコアを生成すると、２８遺伝子が０．１のｐ値カットオフに合格する（表６最後の列を参照されたい）。このリストから生成されるインデックススコアは、このデータセットに関してｐ値カットオフに合格する元来の８８遺伝子シグネチャーのうち４９遺伝子から生成されるインデックススコアとはまったく異なる。
【０３６８】
[381]臨床的に、患者腫瘍由来の材料を評価する際、間質細胞が間葉遺伝子に混入する可能性があるため、ＥＭＴインデックスを計算するために上皮遺伝子のみを用いることが望ましい可能性もある。上皮遺伝子のみを用いたインデックスの解析は、間葉遺伝子がインデックスに影響を及ぼすことを示す（図１１〜１３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ肺および膵臓腫瘍モデルにおいて、上皮遺伝子から計算されるインデックススコアは、肺腫瘍細胞株に関して、上皮および間葉遺伝子両方を用いて計算されるインデックススコアに比較して、統計的有意性が劣っていたものの、エルロチニブ非感受性細胞株からエルロチニブ感受性株を区別することが可能であった（図１４）。
【０３６９】
[382]腫瘍材料の入手可能性には限界がある可能性があるため、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を用いた臨床材料に対するＥＭＴ遺伝子シグネチャーの解析を行う。商業的に入手可能なＲＮＡ単離キットを用いて、ｑＰＣＲ分析に適した品質であるＲＮＡをＦＦＰＥ組織から抽出することも可能である。本発明者らは、腫瘍切片から増幅したＲＮＡを用いたｑＰＣＲによって、ＥＭＴシグネチャー中の８８遺伝子を分析可能であることを決定した。
【０３７０】
[383]ＥＭＴインデックスの開発中に、ＥＭＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて、最終遺伝子リストを評価し、そして洗練した。リガンドで誘導し、そして操作したＨ３５８モデルは、どちらも転移可能モデルであり、ここで、ＥＭＴ駆動因子によって誘導されるＥＭＴ特性は、駆動因子を取り除くと逆転する。Ｈ３５８モデルがＥＭＴを経るにつれて、エルロチニブに対する感受性が減少する。図８は、転移可能Ｈ３５８  ＥＭＴモデルの形態変化、マーカー変化、および表現型的変化を要約する。表に含めるのは、エルロチニブに関する、ＥＭＴ誘導後の各モデルに関する増殖に対するＥＣ５０値、ならびにｑＰＣＲデータから計算するＥＭＴインデックス値である。大部分のモデルに関して、ＥＭＴは、エルロチニブ感受性の減少およびインデックスの増加と相関する。２つの例外はＨＧＦおよびＺｅｂ１モデルである。ＨＧＦ処理したＨ３５８細胞の低いＥＭＴＧＳインデックススコアを考慮すると、ＨＧＦは、エルロチニブ阻害から細胞を防御するとは期待されないが、防御する。この防御は、ＥＭＴ誘導というよりも、ＨＧＦ−ｃＭｅｔ経路を通じた生存シグナル伝達のためである可能性が最も高い。逆に、誘導されたＺｅｂ１発現によって駆動されるＥＭＴは、エルロチニブから細胞を防御するように予測されるが、防御せず、Ｚｅｂ１によって影響を受けないＥＭＴの側面が、この例ではエルロチニブ防御に必要でありうることを示唆する。
【０３７１】
[384]バイオインフォマティクスの反復周期を通じて、本発明者らは、１つの腫瘍タイプ内の遺伝子の関連を強化し、そしてまた、多数の腫瘍タイプに対するシグネチャーの適用を広める意図を持って、ＥＭＴシグネチャーを洗練した。これは、マウスＢＨ腫瘍アーカイブ（図３〜４）における初期のバージョン、および洗練後に遺伝子の共相関が改善されるＥＭＴシグネチャーの最終バージョンの共相関プロットにおいて例示される。図１８は、文献において、ＥＭＴを制御すると報告される遺伝子（表５、バージョン１）で構成される初期のＥＭＴシグネチャー、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｈ３５８  ＥＭＴモデル由来の遺伝子を含む中間シグネチャー（バージョン２）、および最終８８遺伝子ＥＭＴシグネチャー（バージョン４）の、本発明者らのＧｅｎｅＬｏｇｉｃデータベース中のすべての固形腫瘍に渡るウォーターフォールプロットを示す。シグネチャー各々に関するよりＭ様およびよりＥ様とスコア付けされる腫瘍の割合に相違があることに注目されたい。
【０３７２】
[385]ＥＭＴ状態指標としての８８遺伝子ＥＭＴＧＳおよびインデックスの検証。
【０３７３】
[386]図１９は、相対エルロチニブ感受性に対してプロットした腫瘍細胞株に関するＥカドヘリン状態（上部パネル）およびＥＭＴインデックス（下部パネル）を示す。水平軸に沿って中程の垂直線は、感受性および非感受性細胞株の間の分割を示し、ここで、感受性に関するカットオフは、１０μＭエルロチニブで増殖の５０％阻害であった。高いＥ−カドヘリン発現と、低い（上皮）インデックススコアの相関、そして逆に低いまたは非機能性Ｅ−カドヘリン発現と、高い（間葉）インデックススコアの相関に注目されたい。
【０３７４】
[387]ドキシサイクリン処理に際して、活性化されたＴＧＦベータ、ＳｎａｉｌまたはＺｅｂ１を誘導性に発現するように操作されたＨ３５８細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＭＴを経る。ＴＧＦベータモデルに関する免疫組織化学および組織学を図２４に示す。ＴＧＦベータの誘導は、Ｅ−カドヘリン発現減少、ビメンチン発現増加、ならびに間質浸潤および浸潤腫瘍細胞によって特徴付けられる全体の構築変化を生じる。ｉｎ  ｖｉｖｏのＥＭＴ遺伝子の変化のｑＰＣＲ分析は、ヒートマップに例示されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されるものと定性的に類似の変化を示す（図２６）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの導入遺伝子ａＴＧＦｂ、ＳｎａｉｌまたはＺｅｂ１の誘導に際してのＥＭＴインデックスの変化を図２６の表に報告する。ドキシサイクリンおよびエルロチニブの組み合わせで処理すると毒性があるため、ｉｎ  ｖｉｖｏ操作モデルにおいて、エルロチニブに関するＥＣ５０値を決定することは不可能であった。
【０３７５】
[388]２．５倍カットオフを用いて、３つの操作モデルに関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで生じるＥＭＴシグネチャーにおける遺伝子変化を比較した（以下の表８）。本発明者らは、３つのモデルすべてにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで、より多くの遺伝子変化を同定した。各モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で制御される遺伝子を以下の表９に列挙する。
【０３７６】
[389]表８
【０３７７】
【表８−１】
2014519813.tif 000029
【０３７８】
【表８−２】
2014519813.tif 000030
【０３７９】
[390]表９
【０３８０】
【表９】
2014519813.tif 000031
【０３８１】
[391]８８遺伝子ＥＭＴＧＳを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＭＴモデルの分子性質決定
[392]８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーの遺伝子に対する変化を、４つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＭＴ細胞モデルにおいてプロファイリングして、ＥＭＴ中に細胞が経る分子変化を理解する際のシグネチャーの有用性を評価した。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、またはその組み合わせで細胞を７日間刺激して、ＥＭＴを誘導した。ｑＰＣＲによる遺伝子変化を分析するため、ＲＮＡを採取し、そしてｃＤＮＡに変換した。生Ｃｔ値をＧＡＰＤＨに対して規準化して、そして次いで、未処理細胞に対する倍変化値に変換した。３の倍変化カットオフを用いて、ＥＭＴ中に示差的に発現される遺伝子を同定した。結果を、図６に示すようなヒートマップに要約し、ここで、４４の間葉遺伝子を初めに列挙し、そして次に４４の上皮遺伝子を列挙する。Ｈ３５８モデルにおいて、ＨＧＦおよびＯＳＭは、各々、部分的ＥＭＴを引き起こし、そしてＨＧＦ＋ＯＳＭ、ＴＧＦβおよびＴＧＦβ＋ＯＳＭは、形態変化、バイオマーカー変化および表現型変化によって特徴付けられるような、より進行したＥＭＴを刺激する。これは、ＨＧＦおよびＯＳＭが、７日間に渡ってＥＭＴ関連遺伝子にほとんど変化を引き起こさないヒートマップに反映される（図６Ａ）。ＨＧＦ＋ＯＳＭ、ＴＧＦβおよびＴＧＦβ＋ＯＳＭは、対照的に、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーの遺伝子に顕著な変化を引き起こした。したがって、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーは、このＮＳＣＬ腫瘍ＥＭＴモデルにおいて、ＥＭＴ状態を正確に評価した。
【０３８２】
[393]８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、個々のＥＭＴバイオマーカーより広い適用を有する。単一の上皮または間葉バイオマーカーのいずれも、すべての細胞モデル、そしてひいてはすべての腫瘍と関連する表現型変化を反映することは不可能である。特に、間葉バイオマーカーは有意に多様である。ＥＭＴ状態を性質決定する多数の遺伝子を用いることによって、本発明者らは、細胞および腫瘍のＥＭＴ状態をより正確に性質決定することが可能である。
【０３８３】
[394]７日間のリガンド刺激後、ＣＦＰＡＣ１、Ｈ１６５０およびＨ２９２腫瘍細胞ＥＭＴモデルにおける変化もまたプロファイリングした（図６Ａ）。Ｈ３５８モデルにおいて観察されたものと同様、すべて、用いた刺激に応じて、シグネチャーに対する多様な変化を示した。細胞株間および細胞株内でのプロファイルの相違は、ＥＭＴ状態の範囲を例示し、腫瘍において観察されるものと一致する。ＣＦＰＡＣ１膵臓ＥＭＴモデルは、肺モデルよりもより少ない遺伝子変化を経た。Ｈ１６５０細胞は、間葉プロファイルよりも、より頑強に上皮プロファイルを制御し、そしてＨ２９２細胞に関してはその逆であった。ここでもやはり、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーは、これらのＮＳＣＬＣおよび膵臓腫瘍ＥＭＴモデルにおいて、ＥＭＴ状態の変化を正確に反映する。
【０３８４】
[395]各モデルに関する形態変化、マーカー変化および表現型変化を図２８〜３０に例示する。リガンド刺激に際して、ＥＭＴと一致した変化が、各モデルで生じるが、各モデルは、より間葉状態にシフトする能力が異なる。ＣＦＰＡＣ１細胞は、単一リガンド刺激で容易にＥＭＴを経るが、Ｈ１６５０細胞およびＨ２９２細胞は、より微かな変化を経て、そして２つのリガンドでの刺激を必要とする。
【０３８５】
[396]８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの特性に別の次元を加える。本発明者らが観察した場合、ＣＦＰＡＣ１モデルは、最小の刺激でＥＭＴを経て、８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、他のモデルよりもより少ない遺伝子変化を示した。これは、他のモデルに比較して、これらの細胞がＥＭＴを経るには、より少ない遺伝子変化しか必要でないと解釈可能であった。Ｈ１６５０モデルは、より微かな形態変化を示した。８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、上皮遺伝子の明らかな下方制御およびより穏やかな間葉遺伝子増加を示した。これは、形態変化が、より進行していない間葉表現型を示すことを示唆する。これは、遊走および浸潤アッセイにおける一貫した変化の欠如によって裏付けられる。Ｈ２９２細胞は、遊走アッセイによって例示されるような、説得力のある形態学的および表現型的変化を経た。間葉バイオマーカー発現を徹底的に調べると、ＥＭＴ中に上方制御されると同定されたものはわずかであった。ＭＭＰ９が最も顕著であった。８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、しかし、間葉遺伝子の強い制御を示し、より間葉である状態への転写シフトがあることが示唆された。こうしたデータは、これらのモデルを性質決定するために、単に慣用的なＥＭＴバイオマーカーにのみ頼っていたのでは、そのＥＭＴ状態の理解が不完全になることを示す。
【０３８６】
[397]８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの間葉上皮（ＭＥＴ）反転の度合いも性質決定する。活性化ＴＧＦβ（ａＴＧＦβ）、ＳｎａｉｌまたはＺｅｂ１を誘導性に発現するよう操作されたＨ３５８細胞を用いて、本発明者らは、導入遺伝子発現１４日後に観察される遺伝子変化を同定した。次いで、ドキシサイクリンを休薬して、導入遺伝子の発現を除去し、そしてＥＭＴの逆転を誘導するため、細胞を２１日間培養した。図６Ｂは、各々未処理細胞に対する１４日間の刺激および２１日間の復帰の後のプロファイルを示す。Ｚｅｂ１トランスジェニック細胞は、未処理細胞と一致するプロファイルに復帰可能であり、一方、ＳｎａｉｌおよびａＴＧＦβを発現するよう誘導された細胞は、部分的にしか復帰しなかった。
【０３８７】
[398]８８遺伝子ＥＭＴＧＳを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＭＴモデルが復帰する度合いを性質決定し、したがって、モデルが順安定性（可逆性）であるかまたは後成的に固定されているかを定義することも可能である。モデルの可逆性を知ることによって、転移におけるＥＭＴおよびＭＥＴの役割を調べるモデルとしての有用性が決定され、ここで、転移した腫瘍細胞は、増殖し、そして粘着性腫瘍を形成するためには、より上皮状態に復帰しなければならない。
【０３８８】
[399]上述のように、皮下および同所セッティングにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＨ３５８操作ＥＭＴモデルの増殖は、ＮＳＣＬＣ腫瘍におけるＥＭＴのモデルとして働く。各場合で、導入遺伝子の誘導は、Ｅ−カドヘリンの喪失、ビメンチン発現増加および腫瘍増殖遅延を生じる（図２１〜２５を参照されたい）。ＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１は、浸潤性腫瘍表現型を持たないが、ＴＧＦｂは、腫瘍細胞の間質への明らかな浸潤を示した。
【０３８９】
[400]図２６に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏセッティングにおいて、８８遺伝子ＥＭＴＧＳのヒートマップによって判断されるように、モデルの定性的一致がある。ＴＧＦベータおよびＳｎａｉｌは、同様の数の遺伝子変化を示し、一方、Ｚｅｂ１は、８８遺伝子ＥＭＴＧＳにより少ない影響を有する。３Ｄマトリックスにおけるモデルの増殖は、異種移植片の増殖率および攻撃性を予測する。図２７は、コロニーサイズによって決定されるように、すべてのモデルの増殖減少を示し、Ｓｎａｉｌコロニーは、導入遺伝子誘導後、ほぼ増殖停止する。ＳｎａｉｌまたはＺｅｂ１コロニーはいずれも、マトリックス内に浸潤しないが、ａＴＧＦｂはコロニーからマトリックスへの突起を示した。これらの表現型は、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長率および浸潤性の両方で再現された。
【０３９０】
[401]表８および９に示すように、各モデルに関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏセッティングの間の遺伝子変化には多様な共有性がある（図３１を参照されたい）。ａＴＧＦｂは、最適な重複を示し、そしてＺｅｂ１は最小である。２つのセッティングの間に相違があることが予期され、これは、増殖環境が、シグナル伝達に寄与し、そしてしたがって細胞における転写プロファイルに寄与するためである。これには、細胞外マトリックスおよび間質細胞からのインプットが含まれる。
【０３９１】
[402]８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、「古典的」ＥＭＴマーカーを発現しないが、より一般的でないマーカーによって分類可能な細胞／腫瘍を捕捉する。ＥＭＴＧＳインデックススコアは、いかなる１つのマーカーによっても支配されず、そしてしたがって、古典的マーカーが発現されない可能性もあるモデルにおいてもなお有用である。本発明者らはまた、特定の腫瘍タイプにおいてしかよく働かない他のＥＭＴシグネチャー（例えばＣｈｏｉ  ＥＭＴシグネチャー；本明細書の以下を参照されたい）とは異なり、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャー／インデックスが、多数の固形腫瘍タイプに渡って適用可能であることも示した。これらの特徴は、古典的ＥＭＴバイオマーカー分析に対する８８遺伝子ＥＭＴＧＳおよびインデックスの利点を例示する。
【０３９２】
[403]ＥＭＴＧＳインデックス値は、図２０に示すようなＥＭＴの相対的状態に相当する。ＥＭＴ、Ｚｅｂ１、Ｓｎａｉｌ、およびａＴＧＦｂのＨ３５８操作モデルはすべて、導入遺伝子の誘導に際して、インデックススコアの変化を示す。誘導２週後のインデックススコアの相対値は、形態状態、マーカー状態および表現型状態によって判断した際、ＥＭＴ状態として観察したものを反映する。導入遺伝子がオフになると、インデックススコアは低下し、より上皮状態に相当するようになる。最終スコアは、細胞で観察される逆転の度合いと相関する：Ｚｅｂ１は完全に復帰し、Ｓｎａｉｌはより完全でなく、そしてＴＧＦｂは部分的でしかない。Ｈ３５８リガンド駆動モデルにおけるインデックススコアもまた、ＥＭＴの相対状態を反映する。ＯＳＭまたはＨＧＦ刺激は、部分的ＥＭＴ状態しか生じず、一方、ＴＧＦｂ、ＨＧＦ＋ＯＳＭおよびＴＧＦｂ＋ＯＳＭはすべて、上昇したインデックススコアに反映されるように、より完全なＥＭＴ変化を駆動する。したがって、ＥＭＴインデックススコアは、１００％上皮から１００％間葉までの全範囲に渡る、同じ細胞株内のＥＭＴ状態の相違を区別可能である。図１９は、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックスが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで関連しない細胞株に渡るＥＭＴ状態を区別可能であることを示す。
【０３９３】
[404]８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーの他のＥＭＴ遺伝子シグネチャーへの比較
[405]科学文献において、ＥＭＴに関する多くの結論は、問題の細胞が上皮様または間葉様のいずれであるかを性質決定する際に、わずかな確立されたマーカー（例えばＥ−カドヘリン、ビメンチン）に頼っている。上皮様細胞および間葉様細胞の表現型が複雑であるため、これは、明らかに、細胞集団の誤った性質決定につながっている。この方法から離れて、そして８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーおよびインデックスの開発に向かうことで、ＥＭＴ状態の分子分類を改善し、そしてしたがって、ヒト腫瘍において観察されるＥＭＴ状態の範囲を定性的および定量的に研究する能力を改善することも可能である。クリニックにおいて、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーおよびＥＭＴインデックスを使用すると、どの腫瘍がエルロチニブに反応するかを有効に予測し、よりあつらえられた癌療法を可能にすることによって、患者ケアを改善することも可能である。
【０３９４】
[406]いくつかのＥＭＴ遺伝子シグネチャーが公表されてきており、そして１つは、研究ツールとして販売されている。本明細書に開示する８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーを、１つはＲａｓ形質転換ＥｐＨ４細胞において開発されたもの（Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ，  ２００３；５４遺伝子）であり、そして１つは非形質転換ＭＤＣＫ細胞におけるもの（Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｕｅｎｏ，  ２００６；１８９遺伝子）である、２つの公表されたＥＭＴシグネチャー、ならびにＥＭＴに関与する遺伝子が濃縮されていることが示されたＨＮＳＣＣ腫瘍組織から開発された疾患再発シグネチャー（Ｃｈｕｎｇ，  ２００６；４２遺伝子）に比較した。本明細書開示の８８遺伝子ＥＭＴシグネチャー、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルからまたは腫瘍生検から実験的に得られたこれらの３つのＥＭＴに基づくシグネチャーの間には、ほとんど重複が見られなかった（遺伝子重複：Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ、５遺伝子；Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｕｅｎｏ、５遺伝子；Ｃｈｕｎｇ、１遺伝子）。
【０３９５】
[407]エルロチニブ感受性を予測するためのＯＳＩ  ＥＭＴシグネチャーを評価する際に、４つのさらなるシグネチャーを比較した。これらは、Ｃｈｏｉ  ＥＭＴシグネチャー、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＥＭＴシグネチャー、Ｙａｕｃｈエルロチニブ・シグネチャーおよびＢｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャーおよび（Ｃｈｏｉ，  ２０１０；Ｃｏｌｄｅｒｅｎ，  ２００６；Ｙａｕｃｈ，  ２００５、表１０〜１２）であった。Ｃｈｏｉ  ＥＭＴシグネチャー（表１０）は、３つの細胞タイプ：上皮乳房腫瘍細胞、間葉乳房腫瘍細胞および線維芽細胞の間の発現パターンを比較することによって、実験的に発展された。間葉腫瘍細胞および線維芽細胞に比較して、上皮腫瘍細胞において、少なくとも２倍高い発現を示す上位１００遺伝子を、上皮遺伝子と称した。上皮腫瘍細胞および線維芽細胞に比較して、間葉腫瘍細胞において、少なくとも２倍高い発現を示す上位１００遺伝子を、間葉遺伝子と称した。遺伝子を以下に列挙する。ＯＳＩ  ＥＭＴ遺伝子シグネチャーおよびＣｈｏｉ  ＥＭＴ遺伝子シグネチャーに共通である、１１遺伝子がある（すなわちＡＧＲ２、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＩＫＢＩＰ、ＯＣＬＮ、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＰＤＥＦ）。
【０３９６】
[408]表１０：Ｃｈｏｉ  ＥＭＴシグネチャー遺伝子
【０３９７】
【表１０】
2014519813.tif 000032
【０３９８】
[409]本明細書開示の８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーは、エルロチニブ感受性を予測する能力に関して、評価されたため、このＥＭＴシグネチャー、ならびにＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、エルロチニブ（Ｙａｕｃｈ，  ２００５、表ｘｘ）およびゲフィチニブ（Ｃｏｌｄｒｅｎ，  ２００６、表１１）に対する感受性の予測のために細胞株において開発された２つの遺伝子シグネチャーの間の共通性を決定した。ここでもまた、本発明者らは、８８ＥＭＴＧＳの遺伝子およびエルロチニブ感受性（５遺伝子重複）ゲフィチニブ感受性（１５遺伝子重複）シグネチャーの遺伝子の重複が限定されていることを観察した。
【０３９９】
[410]Ｙａｕｃｈエルロチニブ感受性シグネチャーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでエルロチニブに感受性であるかまたは非感受性であると性質決定された肺腫瘍株の間で示差的に発現される遺伝子から開発された。既知のエルロチニブ感受性の４２のＮＳＣＬＣ細胞株のパネルをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイによってプロファイリングし、そして感受性株および非感受性株の間で最も変化して発現されるプローブセット１９，５９２を同定した。感受性細胞株において、最高の発現を示す５０のプローブセットおよび間葉細胞株で最高の発現を示す５０のプローブセットを合わせて、シグネチャーを作製した。このシグネチャー（表１１）の６２の既知の遺伝子のうち、５つが８８ＥＭＴＧＳと重複した（ＡＰ１Ｍ２、ＣＤＨ１、ＭＡＰ７、ＶＩＭおよびＺＥＢ１）。
【０４００】
[411]表１１：Ｙａｕｃｈエルロチニブ感受性シグネチャー：
【０４０１】
【表１１】
2014519813.tif 000033
【０４０２】
[412]Ｂｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャー（表１２）もまた、ＥＭＴ状態指標としてよりも、ゲフィチニブに対する感受性を予測するために、実験的に開発された。５つのゲフィチニブ感受性および６つの非感受性細胞株をｍＲＮＡマイクロアレイによって比較した。０．００１のｐ値カットオフの２サンプルｔ検定によって決定されるように、示差的に発現されるすべての遺伝子がシグネチャーに含まれた（４１５プローブセット、３３３遺伝子）。Ｂｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャーおよび８８遺伝子ＥＭＴ遺伝子シグネチャーに共通な１５遺伝子がある（すなわちＡＧＲ２、ＡＰ１Ｍ２、ＢＳＰＲＹ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＬＤＮ４、ＥＨＦ、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＩＫＢＩＰ、ＯＣＬＮ、ＰＰＬ、ＳＨ３ＹＬ１、ＴＪＰ３、ＴＭＥＭ４５Ｂ）。
【０４０３】
[413]表１２：Ｂｕｎｎゲフィチニブ感受性シグネチャー：
【０４０４】
【表１２−１】
2014519813.tif 000034
【０４０５】
【表１２−２】
2014519813.tif 000035
【０４０６】
[414]本明細書に開示する８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーをまた、商業的に入手可能な（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；表１３）ＥＭＴ  ｑＰＣＲアレイ中の８４遺伝子に比較した。このシグネチャーがどのように開発されたかは知られていない。両リストに共通であることが見出されたのは１５遺伝子のみであった（すなわちＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＤＳＰ、ＥＲＢＢ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ９、ＯＣＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＮＡＩ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２）。８８ＥＭＴＧＳまたはＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＥＭＴアレイのいずれかを用いて、ＥＭＴ細胞モデル由来のサンプルを比較した際、どちらも、ＥＭＴと一致する遺伝子変化を示したが、８８ＥＭＴＧＳは、各細胞モデルで、およそ２倍多い遺伝子変化を示し（図７）、８８ＥＭＴＧＳを用いたＥＭＴのより包括的な分子分類が例示された。
【０４０７】
[415]表１３：ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＥＭＴ遺伝子リスト：
【０４０８】
【表１３】
2014519813.tif 000036
【０４０９】
[416]異なるＥＭＴシグネチャーを用いた、インデックススコア出現率のウォーターフォールプロットによって、異なる肺腫瘍に渡る異なるプロファイルが示された（図４４）。ＯＳＩ  ＥＭＴシグネチャーおよびＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓシグネチャーは、ＣｈｏｉまたはＹａｕｃｈエルロチニブ・シグネチャーよりも似ていた。Ｃｈｏｉシグネチャーは、乳房腫瘍細胞株から開発されたため、乳房腫瘍に対して偏向している可能性もある。興味深いことに、Ｙａｕｃｈシグネチャーは、肺腫瘍株マイクロアレイデータから開発されているが、腺癌および扁平上皮癌を、ヒト腫瘍データセットにおいて洗練された８８ＥＭＴＧＳほどよくは区別しなかった。
【０４１０】
[417]多様な腫瘍細胞株において、８８遺伝子ＥＭＴＧＳ、Ｃｈｏｉシグネチャー、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓシグネチャー、Ｙａｕｃｈエルロチニブ・シグネチャーおよびＢｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャーを用いてインデックススコアを得ると（図４３）、これらの遺伝子シグネチャーいずれか由来のインデックススコアも、エルロチニブ感受性およびエルロチニブ耐性腫瘍細胞株において有意に異なり、そしてしたがって、エルロチニブ感受性の予測因子として使用可能であることが示される。
【０４１１】
[418]８８遺伝子ＥＭＴＧＳ、Ｃｈｏｉシグネチャー、およびＢｕｎｎゲフィチニブ・シグネチャーに共通な８つの遺伝子がある（すなわちＡＧＲ２、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ４、ＥＬＦ３、ＥＲＢＢ３、ＩＫＩＰ、ＯＣＬＮ、およびＳＨ３ＹＬ１）。多様な腫瘍細胞株において、これらの８つの遺伝子を用いてインデックススコアを得ると（図３５）、この８つの遺伝子シグネチャーから得たインデックススコアが、エルロチニブ感受性およびエルロチニブ耐性腫瘍細胞株で有意に異なり、そしてしたがって、エルロチニブ感受性の予測因子として使用可能であることが示される。
【０４１２】
[419]８８遺伝子ＥＭＴＧＳのサブセット解析：１０，０００の異なる５４遺伝子サブセット
[420]８８遺伝子ＰＧＳは、全体で、細胞株において、エルロチニブまたはＯＳＩ−９０６に対する感受性を予測する。８８ＰＧＳのサブセットもまた予測するかどうかを決定するため、８８ＰＧＳのサブセットをランダムに生成し、そして次いで、エルロチニブまたはＯＳＩ−９０６感受性が知られる４０細胞株由来のｑＰＣＲデータから生成される、生じた遺伝子インデックスの予測力に関して試験した。ｑＰＣＲデータセットは、遺伝子の１つ、ＭＴＡ３が細胞株のいずれにおいても検出レベルより高くならなかったため、８８遺伝子のうち８７に限定された。８７遺伝子リストから、まず６０遺伝子をランダムに１０，０００回抜き取り、そして反応予測試験を用いて、各リストが正確に予測することを決定した。さらにより小さい遺伝子サブセットを生成し、そして次いで反応予測試験を適用する反復プロセスを通じて、ＰＧＳ中の元来の８７遺伝子のうち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感受性を予測するには、少なくとも５４が必要であると決定された。１０，０００の異なるスコア各々の最適な閾値を実験的に決定した。１０，０００サブセット各々に関して別個に計算された最適な閾値を適用した。偽陽性率および偽陰性率を決定して、各サブセットが、ＰＧＳとして使用する際に満足できる試験正確性を生じるかどうかを評価した。フィッシャーの直接検定を用いて、濃縮のｐ値を概算した。すべての１０，０００のフィッシャーの直接検定のうち最大のｐ値は０．００６９であった。これは、試験したこうした５４遺伝子サブセット１０，０００のうち最悪の性能の５４遺伝子サブセットにおいて、偶然のみによって観察された結果が得られる可能性が０．００６９であることを意味し、これは、統計的有意性に関する慣用的なカットオフ、すなわちｐ＝０．０５よりもおよそ３．６倍優れている。この分析は、ＭＴＡ３を除いて表１に列挙する８８遺伝子（すなわち８７遺伝子）のいずれから選択される、少なくとも５４遺伝子のサブセットが、いずれも本発明の実施に使用可能であることを示唆する。
【０４１３】
[421]反応予測試験のための同じデータセットを用いて、上皮遺伝子のみが、エルロチニブ感受性を予測するのに十分であるかどうかもまた試験した。全体として、４３の上皮遺伝子リスト（すなわちＭＴＡ３を除く）は、８７遺伝子のリスト全体と同様に予測可能である。反復サブセット解析によって、上皮遺伝子のいずれの２４も、予測に十分であることが示された。
【０４１４】
[422]以下に記載するコンピュータプログラムを書き、そして１０，０００の異なる５４遺伝子サブセットの試験を自動化するのに用いた。
【０４１５】
[423]＃この関数は、インプットとしてマトリックスを採用し、そしてコールされる応答者群における応答者数の濃縮に関して、フィッシャーの直接検定ｐ値を計算する。
【０４１６】
【化１１】
2014519813.tif 000037
【０４１７】
[441]＃１０，０００順列検定を行うスクリプト。経路スコア関数はここには含まれず、入力データファイル「Ｔａｒｃｅｖａ．ｃｅｌｌ．ｔｅｘｔ」も含まれない。
【０４１８】
【化１２】
2014519813.tif 000038
【０４１９】
[474]新規薬剤ターゲットを同定し、そして薬剤効果を予測するかまたは監視するための、８８遺伝子ＥＭＴ遺伝子シグネチャーおよびインデックスの使用
[475]ＥＭＴインデックスがエルロチニブに対する感受性を予測可能であるかどうかを決定するため、本発明者らは、肺、結腸、膵臓および乳房腫瘍由来の３９腫瘍細胞株のＥＭＴインデックススコアを計算し、そして各細胞株に関して、エルロチニブ感受性に対してこれらをプロットした（図１９）。低いＥＭＴインデックススコア（より上皮状態）はエルロチニブに対する感受性と相関し、そして高いインデックススコア（より間葉状態）はエルロチニブ非感受性と相関した。培養細胞における感受性を予測するＥＭＴインデックスの能力は、Ｅ−カドヘリン状態に匹敵した（図１９；Ｅ−カドヘリン状態のＮ．Ｂ．分類は、ウェスタンブロット上の相対発現に基づく）。さらに、４４上皮遺伝子にのみ基づくインデックスは、本発明者らが試験したモデルにおいて、すべての８８遺伝子に基づくインデックスと同様、感受性を予測した（図１４）。図６で用いたサンプル由来のＥＭＴインデックススコアもまた、より高いインデックス値およびエルロチニブ非感受性の間の強い相関を示した（図２０を参照されたい；Ｎ．Ｂ．感受性は、本明細書において、１０μＭエルロチニブの濃度で、増殖の５０％最大阻害より多くを有すると定義される）。
【０４２０】
[476]興味深いことに、Ｈ１６５０モデルにおいて、ＥＭＴと一致する遺伝子変化がヒートマップ中に反映される（図２８）が、エルロチニブ感受性は、インデックスによってしか予測されず（すなわちＨ１６５０細胞は、ＥＭＴ誘導前後で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでエルロチニブに対して感受性でない）、したがって、インデックスおよびシグネチャーの異なる適用を例示する。Ｈ１６５０モデルは、古典的なＥＭＴバイオマーカーがＥＭＴ誘導前にエルロチニブに反応すると示唆する腫瘍細胞株の例として働くが、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックスは、該細胞が反応しないことを正確に予測する。
【０４２１】
[477]ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤エルロチニブに加えて、８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来のインデックススコアは、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤ＯＳＩ−９０６に対する感受性と相関する。図３２は、ＥＭＴインデックススコアおよび対応するＯＳＩ−９０６  ＥＣ５０値とともに細胞株を示す。低（上皮）インデックススコアおよびＯＳＩ−９０６に対する感受性の間には、優れた相関がある。ＥＭＴインデックスが感受性を予測しない細胞株のうち、大部分はＥＲ陽性であり、これらがエストロゲン受容体からの生存シグナル伝達によって、ＯＳＩ−９０６から防御されることが示唆される。ＥＭＴインデックススコアはまた、２つの化合物ＯＳＩ−９０６およびエルロチニブの間の相乗作用も予測する。図３３は、ＥＭＴインデックススコア、ならびに実験ＢＬＩＳＳ値に対する最大阻害率として表される、ＯＳＩ−９０６およびエルロチニブの間の対応する相乗作用を示す。より低いＥＭＴインデックススコアを持つ細胞株に関しては、相乗作用はより高く、そして逆に、より高いインデックス値を持つ細胞株は、ほとんどまたはまったく相乗作用を示さない。このデータは、エルロチニブに関してだけでなく、他の化合物に関しても、感受性を予測する際に、８８遺伝子ＥＭＴシグネチャーが有用であることを立証する。
【０４２２】
[478]ＥＭＴインデックススコアは、図１９の細胞株データにおいて示すように、Ｅ−カドヘリン状態とともに推移する（ｔｒａｃｋ  ｗｉｔｈ）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、本発明者らは、ＥＭＴインデックススコアおよびＥ−カドヘリンスコアの間の一致に関して、ＡＶＥＯ  ＢＨ乳房腫瘍アーカイブにおける腫瘍を調べた。図３４は、優れた一致を示すが、強い間葉インデックスを示す腫瘍はほとんどなかった。ヒト腫瘍データセットにおいて、ＥＭＴインデックスに比較してＥ−カドヘリン  ｍＲＮＡレベルを調べると、大部分の腫瘍タイプが優れた一致を示すが、完全な一致ではないことが注目された（図１７）。しかし、いくつかの場合、Ｅ−カドヘリンレベルは、間葉腫瘍から上皮腫瘍を区別することが不可能であった（例えば乳房）。ＥＭＴインデックスは、上皮表現型または間葉表現型のための明らかな優先性を示す薬剤に対する反応を予測する指標において、特に役立つであろう。
【０４２３】
[479]図９に示すように、ＥＭＴインデックスは、単一遺伝子の非存在によって、有意には影響を受けない。本発明者らは、これが、異なる腫瘍タイプに渡る頑強さに寄与すると考えている。図３８〜３９は、示す個々の遺伝子（すなわちＩＴＧＡ５、ＶＩＭ、ＣＤＨ１、およびＥＲＢＢ３）を除去した際のインデックススコアの変化が、エルロチニブ感受性を有効に予測する能力に有意に影響しないことを示し、８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックス、およびそこから得られる４４遺伝子上皮サブセットの重要な特徴をさらに立証する。図４０は、図３９のインデックススコア計算に寄与した遺伝子を列挙する。これらの遺伝子群、およびそこから得られるインデックスを、ＥＭＴ状態、あるいはＥＧＦＲまたはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ＯＳＩ−９０６）に対する感受性の予測のために、これらが得られた完全８８または４４遺伝子ＥＭＴＧＳの代わりに使用可能である。
【０４２４】
[480]間葉遺伝子は、上皮遺伝子とは対照的に、エルロチニブ感受性に関して、それ自体は予測上の価値を提供しない（図１５）。しかし、インデックススコアに含めると、これらは、非感受性肺腫瘍細胞株から感受性のものを区別する際に、ｐ値を改善する（図１４）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは臨床診断状況において、間葉遺伝子を含めると、図１７の乳癌で示されるように、インデックススコアが、典型的には、上皮マーカーを失う腫瘍を分類する能力が改善されるようである。しかし、間葉遺伝子を含めると、腫瘍生検の間質混入のため、いくつかの分類は混乱するであろうし、そしてしたがって、４４上皮遺伝子ＥＭＴＧＳインデックスは、こうした状況においては価値がないと証明される可能性が高い。
【０４２５】
[481]ヒト腫瘍集団における高いまたは低い８８ＥＭＴインデックス値を持つ腫瘍の出現率
[482]ヒト固形腫瘍マイクロアレイデータセットを、ランダム遺伝子リスト由来のインデックスに比較して、高いまたは低いインデックス値を持つ腫瘍の出現率に関して調べた（図１８、下部パネル）。各腫瘍タイプに関して、本発明者らは、上皮および間葉インデックススコアを示す腫瘍を同定することが可能であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータによって、より上皮であるインデックススコアを持つ患者が、エルロチニブ療法によりよく反応しうることが示唆される。これは、ＥＭＴＧＳインデックススコアが、療法のために患者を選択する価値ある臨床ツールでありうることを示唆する。
【０４２６】
[483]図１６（下部パネル）は、異なる肺腫瘍サブタイプにおけるＥＭＴＧＳインデックススコアに関する出現率データを示す。腺癌は、インデックススコアによって決定した際、扁平上皮癌よりも上皮様腫瘍のより高い集団を示す。この性質決定は、臨床反応率に反映され、腺癌患者は、扁平上皮癌患者よりもエルロチニブによりよく反応する。
【０４２７】
[484]８８ＥＭＴＧＳはまた、ＥＭＴを制御する新規薬剤ターゲットを同定するために用いられる。Ａ５４９細胞の８８ＥＭＴＧＳ  ｑＰＣＲ分析によって、ＴＮＦａ刺激が、未処理細胞に比較して、上皮遺伝子の下方制御および間葉遺伝子の上方制御を引き起こすことが示された（図４２Ａ）。ＴＡＫ１をＴＮＦａ処理細胞でノックダウンすると、ＴＮＦａ処理細胞に比較して、間葉遺伝子は下方制御され、そして上皮遺伝子は上方制御され、ＴＮＦ誘導性ＥＭＴ遺伝子転写の逆転が示される。Ｈ３５８  ＨＧＦ＋ＯＳＭモデルにおいて、化合物ＭによるＨＧＦ−ｃＭＥＴシグナル伝達の阻害は、上皮遺伝子の下方制御および間葉遺伝子に対する影響のいくつかを逆転させた（図４２Ｂ）。Ｈ３５８Ｔ−ａＴＧＦｂドキシサイクリン誘導性モデルにおいて、ＴＧＦｂ仲介ＥＭＴの下流シグナル伝達構成要素であるＦＡＫを、選択的ＦＡＫ阻害剤、化合物Ｆで阻害すると、上皮遺伝子の転写下方制御が逆転した（図４２Ｃ）。しかし、ＦＡＫの阻害は、間葉遺伝子の上方制御には影響を及ぼさなかった。これらの実験によって、ＥＭＴプロセスの重要な制御因子でありうる新規薬剤ターゲットを同定する際の、そしてまた、任意の所定のＥＭＴ誘導因子のための重要なバイオマーカーでありうる個々の上皮または間葉遺伝子を同定する際の、８８遺伝子ＥＭＴＧＳの価値が立証される。
【０４２８】
[485]ＥＭＴ誘導性リガンドによって調節され、そして次いでＦＡＫまたはＭＥＴ阻害剤化合物、またはＴＡＫ１  ｓｉＲＮＡ後に（２．５倍より多く）逆転する遺伝子を表１４に列挙する。これらの遺伝子リストは各々、腫瘍細胞におけるＥＭＴのＦＡＫ、ＭＥＴ、またはＴＡＫ１阻害に特異的なＥＭＴＧＳに相当し、そしてこれを用いて、これらのタンパク質（すなわちＦＡＫ、ＭＥＴ、ＴＡＫ１）を通じてＥＭＴを阻害する化合物での処理を監視することも可能である。さらに、８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来のインデックススコアを生成するために用いたアルゴリズムを本明細書において同様に用いて、これらのシグネチャーに対する影響を定量化し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで阻害効果の度合いをより容易に監視することも可能である。
【０４２９】
[486]８８遺伝子ＥＭＴＧＳインデックスを用いた分析はまた、８８遺伝子ＥＭＴインデックスに対する関心対象の遺伝子の発現パターンを比較することによって、関心対象の潜在的な薬剤ターゲットを同定することも可能である。例えば、ＢＨ３乳房腫瘍アーカイブ細胞において、ＡＫＬは、より上皮である腫瘍においては低い発現を有し、そしてより間葉様である腫瘍においては、より高く発現され、ＡＸＬが、間葉腫瘍に重要な潜在的な遺伝子と示唆される（図４１）。
【０４３０】
[487]表１４．  ＦＡＫ、ＭＥＴ、またはＴＡＫ１阻害に特異的なＥＭＴＧＳ
【０４３１】
【表１４】
2014519813.tif 000039
【０４３２】
[488]クリニックにおける薬剤反応の予測。
【０４３３】
[489]以下の予言的な例は、本発明を用いて、ｑＰＣＲ（例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標））データを用い、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ）またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤（例えばＯＳＩ−９０６）に対するヒト反応をどのように予測可能であるかを詳細に例示する。
【０４３４】
[490]患者をＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤で治療する前に、所定の腫瘍タイプ（例えばＮＳＣＬＣ、ＡＣＣ、肝細胞癌）に関して、腫瘍サンプル（アーカイブＦＦＰＥブロック、新鮮サンプルまたは凍結サンプル）をヒト患者から得る（病院または臨床実験室を通じて、間接的に）。標準的組織学処置にしたがって、新鮮または凍結腫瘍サンプルを１０％中性緩衝ホルマリンに５〜１０時間入れた後、アルコール脱水し、そしてパラフィンに包埋する。
【０４３５】
[491]１０μｍ  ＦＦＰＥ切片からＲＮＡを抽出する。キシレン抽出によってパラフィンを除去した後、エタノール洗浄する。商業的ＲＮＡ調製キットを用いて、ＲＮＡを単離する。適切な商業的キット、例えばＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）を用いてＲＮＡを定量化する。慣用法によって、ＲＮＡサイズを分析する。
【０４３６】
[492]ｑＲＴ−ＰＣＲのためのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  第一鎖合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写を行う。総ＲＮＡおよびプールした遺伝子特異的プライマーは、それぞれ、１０〜５０ｎｇ／μｌおよび１００ｎＭ（各々）で存在する。
【０４３７】
[493]適切な商業的ソフトウェア、例えばＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、ＥＭＴＧＳ中の各遺伝子に関して、ｑＲＴ−ＰＣＲプライマーを設計する。装置製造者または業者によって推奨されるように、商業的合成装置および適切な試薬を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを合成する。適切な商業的標識キットを用いて、プローブを標識する。
【０４３８】
[494]製造者の指示にしたがって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ装置を用いて、３８４ウェルプレート中でＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応を行う。反応ウェルあたり１ｎｇの総ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて、複製５μｌ反応中で、ＥＭＴＧＳ中の各遺伝子の発現を測定する。最終プライマーおよびプローブ濃度は、それぞれ、０．９μＭ（各プライマー）および０．２μＭである。標準操作法にしたがって、ＰＣＲサイクリングを行う。ｑＲＴ−ＰＣＲシグナルが、混入ＤＮＡではなくＲＮＡによるものであることを検証するため、試験した各遺伝子に関して、ＲＴを伴わない対照を平行して実行する。ｑＲＴ  ＰＣＲ中の所定の増幅曲線に関する閾値周期は、プローブからの蛍光シグナルが、特定する蛍光閾値セッティングを超えて伸びる時点である。最初のテンプレートがより多ければ、試験サンプルは、より早い増幅周期で、閾値を超える。
【０４３９】
[495]すべてのサンプルに渡って、遺伝子発現レベルを比較するため、５つの参照遺伝子（その発現レベルが、すべてのサンプルに渡って同様であると仮定されるハウスキーピング遺伝子）に基づく規準化を用いて、各アッセイウェルにおいて、ＲＮＡ品質、およびＲＮＡの総量の変動から生じる相違に関して補正する。各サンプルに関する、参照ＣＴ（閾値周期）を参照遺伝子の平均測定ＣＴと定義する。試験遺伝子の規準化ｍＲＮＡレベルをΔＣＴ＋１０と定義し、ここで、ΔＣＴ＝参照遺伝子ＣＴマイナス試験遺伝子ＣＴである。
【０４４０】
[496]上に示すようなアルゴリズムにしたがって、各腫瘍サンプルに関するＥＭＴＧＳインデックススコアを遺伝子発現レベルから計算する。腫瘍サンプルを供給する病院または臨床実験室から、試験した腫瘍サンプルと関連する実際の反応データを得る。典型的には、適切な画像化技術、例えばＣＴスキャンによって決定されるような腫瘍縮小、例えば３０％縮小に関して臨床反応を定義する。いくつかの場合、時間、例えば無増悪生存期間に関して、ヒト臨床反応を定義する。所定の腫瘍タイプに関する最適閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアを上述のように計算する。続いて、この最適閾値ＥＭＴＧＳインデックススコアを用いて、同じタイプの新規に試験するヒト腫瘍が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤での処理に反応性であるかまたは非反応性であるかを予測する。
【０４４１】
[497]患者腫瘍サンプルにおけるＥＭＴＧＳの有効な使用。
【０４４２】
[498]間葉遺伝子を発現する浸潤間質組織が腫瘍における８８遺伝子ＥＭＴＧＳのインデックススコアに影響を及ぼす度合いを決定するため、本発明者らは、１０のレーザー捕捉顕微解剖患者サンプルのマッチしたセット由来のマイクロアレイ発現データを利用した。各患者サンプルに関して、マッチする腫瘍、間質、および非解剖細胞における８８遺伝子ＥＭＴＧＳの発現を比較した（図５３）。患者サンプルに渡って、マッチした腫瘍組織に比較した際、間質組織で見られる全体により高いレベルのＭ遺伝子発現があった。逆に、間質組織に比較して、腫瘍組織においては、より高いレベルのＥ遺伝子発現があった。非解剖患者サンプルは、８８遺伝子ＥＭＴＧＳに渡って、中間の遺伝子発現パターンを示した。さらに、８８遺伝子ＥＭＴＧＳ由来の２７遺伝子のサブセットは、マッチした腫瘍および間質の間で統計的に示差的な発現を有することが見出された（図５３；ＦＤＲ補正Ｔ検定＜０．０１）。
【０４４３】
[499]ＥＭＴＧＳに渡るＥおよびＭ遺伝子発現の全体のパターンが、腫瘍および間質で、それぞれ有意な上昇を示すが、本発明者らは、ＥＭＴＧＳインデックススコアがサンプルを順位付けする能力に対する、これらの発現パターンの影響を決定しようと試みた。Ｅｘｐｒｅｓｓｏインデックス化プラットフォームによって生成されたインデックススコアの有意性を決定するため、ブートストラッピング・アルゴリズムを用いて、本発明者らは、マッチした、腫瘍のみの、および腫瘍に間質が加わった、ＬＣＭ患者サンプルに関して、ＥＭＴＧＳインデックススコアを計算した（図５４Ａ）。８８遺伝子ＥＭＴＧＳは、腫瘍のみおよび腫瘍に間質が加わったマッチしたサンプルセットにおいて、インデックススコアによる患者の非常に類似の順位を生じ（スピアマン順位相関の絶対値、｜Ｒ｜＝０．８０６）、ＥＭＴＧＳインデックススコア化に対する浸潤間質細胞の影響は最小限であることが示された。
【０４４４】
[500]ＥＭＴＧＳにおけるＭ遺伝子の存在が、混合腫瘍および間質細胞を伴うサンプルにおけるシグネチャーの機能を大きくは改変しないようである事実にもかかわらず、本発明者らは、Ｅのみのシグネチャーが、間質浸潤によって、さらにより影響を受けないかどうかを決定することを試みた。４４のＥ遺伝子のＥＭＴＧＳを用いて、本発明者らは、腫瘍のみの、および腫瘍に間質が加わった、ＬＣＭサンプルのマッチしたセットに関して、インデックススコア順位を比較した（図５４Ｂ）。４４のＥ遺伝子のＥＭＴＧＳもまた、サンプルの非常に類似の順位を生じ（スピアマン順位相関の絶対値、｜Ｒ｜＝０．６７３）、腫瘍のみの、および腫瘍に間質が加わったサンプルの間の順位相関には増加がなく、８８遺伝子ＥＭＴＧＳにおけるＭ遺伝子の存在は、浸潤間質を伴う腫瘍細胞において、インデックススコア計算を混乱させる影響を生じないことが示された。
【０４４５】
[501]参考文献
【０４４６】
【化１３】
2014519813.tif 000040
【０４４７】
[511]略語
ＥＭＴＧＳ、ＥＭＴ遺伝子シグネチャー；ＨＲ、ハザード比；ＰＦＳ、無増悪生存；ＯＳ、全体生存；ＣＩ、信頼区間；Ｅ、エルロチニブ；Ｐ、プラセボ；Ｈ、高；Ｌ、低；ＥＧＦ、上皮増殖因子；ＥＭＴ、上皮間葉転換；ＭＥＴ、間葉上皮転換；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌；ＨＮＳＣＣ、頭頸部扁平上皮癌；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＭＢＣ、転移性乳癌；ＥＧＦＲ、上皮増殖因子受容体；ＥｒｂＢ３、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子相同体３」、ＨＥＲ−３としても知られる；ｐＨＥＲ３、リン酸化ＨＥＲ３；ＬＣ、液体クロマトグラフィー；ＩＨＣ、免疫組織化学；ＭＳ、質量分析；ＩＧＦ−１、インスリン様増殖因子−１；ＩＧＦ−２、インスリン様増殖因子−２；ＩＧＦ−１ＲまたはＩＧＦＲ、インスリン様増殖因子−１受容体；ＲＴＫ、受容体チロシンキナーゼ；ＭＥＴ、ｍｅｔ癌原遺伝子（肝細胞増殖因子受容体としても知られる）；ＦＡＫ、ＰＴＫ２プロテインキナーゼ２；ＴＡＫ１、ＴＧＦ−ベータ活性化キナーゼ１（ＭＡＰ３Ｋ７またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ７）；ＬＰＡ、リゾホスファチジン酸；ＴＧＦα、トランスフォーミグ増殖因子アルファ；ＨＢ−ＥＧＦ、ヘパリン結合性上皮増殖因子；ＴＧＦβまたはＴＧＦベータまたはＴＧＦｂ、トランスフォーミング増殖因子ベータ；ａＴＧＦβまたはａＴＧＦｂベータまたはａＴＧＦｂ、活性化トランスフォーミング増殖因子ベータ；ＯＳＭ、オンコスタチンＭ；ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；ＩＣ５０、最大半量阻害濃度；ＥＣ５０、最大半量有効濃度；ｐＹ、ホスホチロシン；ｗｔ、野生型；ＰＩ３Ｋ、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＵＧＯ、ヒトゲノム機構；ＰＭＩＤ、ＰｕｂＭｅｄユニーク同定因子；ＮＣＢＩ、米国バイオテクノロジー情報センター；ＮＣＩ、米国癌研究所；ＭＳＫＣＣ、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター；ＥＣＡＣＣ、欧州細胞培養コレクション；ＡＴＣＣ、アメリカンタイプカルチャーコレクション；ＬＣＭ、レーザー捕捉顕微解剖；ＦＤＲ、偽発見率；ＦＰＲ、偽陽性率；ＴＰＲ、真の陽性率；ＦＮＲ、偽陰性率；ＲＯＣ、受信者動作特性。
【０４４８】
[512]援用
[513]本明細書に開示するすべての特許、公開特許出願および他の参考文献は、明確に、本明細書に援用される。
【０４４９】
[514]同等物
当業者は、ルーチンの実験より多くを用いずに、本明細書に特に記載する、本発明の特定の態様の多くの同等物を認識するかまたは確認することが可能であろう。こうした同等物は、以下の請求項の範囲内に含まれると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
2014519813.tif 000052
【図６】
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【図７】
2014519813.tif 000054
【図８】
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【図９】
2014519813.tif 000056
【図１０】
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【図１１】
2014519813.tif 000058
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2014519813.tif 000077
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2014519813.tif 000082
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【国際調査報告】
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