(57)【要約】本発明は、改善された生成特徴、溶解度、全身送達、および組織取り込みを有する新規なＷｎｔポリペプチド、ならびに本発明のＷｎｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のＷｎｔポリペプチドは、例えば、筋肉喪失を予防もしくは処置する方法、ならびに／または筋肥大および増殖を促進する方法において、治療的に使用され得る。Ｎ末端欠失を含む単離されたＷｎｔポリペプチドであって、ここで該Ｎ末端欠失は、１もしくはより多くの脂質付加部位を除去する、単離されたＷｎｔポリペプチド。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端欠失を含む単離されたＷｎｔポリペプチドであって、ここで該Ｎ末端欠失は、１もしくはより多くの脂質付加部位を除去する、単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｎ末端欠失は、３００個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、請求項１の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端欠失は、２５０個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端欠失は、２００個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端欠失は、１５０個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端欠失は、単一の脂質付加部位を除去する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｎ末端欠失は、少なくとも２個の脂質付加部位を除去する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｎ末端欠失は、すべての脂質付加部位を除去する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項９】
前記単離されたＷｎｔポリペプチドは、１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１０】
前記単離されたＷｎｔポリペプチドは、少なくとも１０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１１】
前記単離されたＷｎｔポリペプチドは、少なくとも２０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１２】
前記単離されたＷｎｔポリペプチドは、少なくとも５０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチドを含む、Ｗｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項１９】
Ｆｃドメインを含む、請求項１８に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性も補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性も有さない、請求項１９に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する、請求項１９に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する、請求項１９に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する、請求項１９に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２４】
天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項２４に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである、請求項２５に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２７】
異種プロテアーゼ切断部位を含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記異種プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される、請求項２７に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項２９】
ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のＷｎｔ融合ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＷｎｔポリペプチド、または請求項１８〜２９のいずれか一項に記載のＷｎｔ融合ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項３１】
薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
賦形剤は、前記組成物の前記ＷｎｔポリペプチドもしくはＷｎｔ融合ポリペプチドの半減期を増大させる、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
賦形剤は、前記組成物の前記ＷｎｔポリペプチドもしくはＷｎｔ融合ポリペプチドの安定性を増大させる。請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも２２０個のアミノ酸のＮ末端欠失をさらに含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｅ）配列番号３〜５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に同一な少なくとも７０個連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列、
を含む、単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項３５】
前記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項３４に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項３６】
前記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、少なくとも１０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項３４に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項３７】
前記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、少なくとも２０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む、請求項３４に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドは、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドは、非標準Ｗｎｔ７ａシグナル伝達活性を保持する、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドは、配列番号３〜５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、もしくは１２９個連続したアミノ酸を含む、請求項３４に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４５】
前記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２および配列番号１８〜２３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＷｎｔポリペプチドと比較して、増大した水性溶液中溶解度を有する、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４６】
前記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、細胞表面上のＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターを結合する、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドは、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドは、脂質付加されておらず、かつ非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する、請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項４９】
前記細胞は、骨格筋サテライト幹細胞である、請求項４６に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項５０】
前記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドの、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターへの結合は、該単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドの非存在下でのサテライト幹細胞増殖と比較して、サテライト幹細胞増殖を増大させる、請求項４６に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチド。
【請求項５１】
請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドを含む、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５２】
Ｆｃドメインを含む、請求項５１に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５３】
前記ペプチドは、ＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も有さない、請求項５２に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５４】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５６】
前記ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５７】
天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５８】
前記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項５７に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項５９】
前記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである、請求項５７に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項６０】
異種プロテアーゼ切断部位を含む、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項６１】
前記異種プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される、請求項６０に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項６２】
ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む、請求項５１〜６１のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項６３】
請求項３４〜５０のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａポリペプチドまたは請求項５１〜６２のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項６５】
請求項６４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞もしくは細菌細胞である、請求項６５に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
請求項６６に記載の宿主細胞によって生成される、Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド。
【請求項６８】
請求項３４〜５０のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａポリペプチドもしくは請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド；請求項３４〜５０のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａポリペプチドもしくは請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または請求項３４〜５０のいずれか一項に記載のＷｎｔ７ａポリペプチドもしくは請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、組成物。
【請求項６９】
薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
賦形剤は、前記組成物のうちの前記Ｗｎｔ７ａポリペプチドもしくはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドの半減期を増大させる、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
賦形剤は、前記組成物のうちの前記Ｗｎｔ７ａポリペプチドもしくはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドの安定性を増大させる、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７２】
前記組成物は、水性溶液に可溶性である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７３】
前記組成物は、注射用に製剤化されている、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７４】
前記組成物は、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために製剤化されている、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物は、組織形成、再生、維持もしくは修復を促進する、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７６】
前記組織は、筋肉である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記筋肉は、骨格筋、心筋、もしくは平滑筋である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記組成物は、幹細胞増殖を促進する、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７９】
前記幹細胞は、成体幹細胞である、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記成体幹細胞は、サテライト幹細胞である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記組成物は、筋肥大を促進するか、または筋萎縮を予防する、請求項７６に記載の組成物。
【請求項８２】
筋肉喪失を処置もしくは予防するための方法であって、該方法は、被験体に、請求項６８に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項８３】
前記組成物は、水性溶液に可溶性である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物は、注射用に製剤化されている、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記組成物が、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために製剤化されている、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記被験体が、筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態を有するか、または有するリスクがある、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記疾患が、変性疾患である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記変性疾患が、筋ジストロフィーである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病）および先天性筋ジストロフィーから選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態が、消耗性疾患、筋減衰、筋萎縮、ＩＣＵ誘導性虚弱、長期不使用、手術誘導性虚弱、もしくは筋変性疾患である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記状態が、筋不使用、固定、手術誘導性虚弱、もしくは傷害と関連した筋萎縮である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記組成物を投与する工程が筋委縮を予防する、請求項８２に記載の方法。
【請求項９３】
前記組成物を投与する工程が筋肥大を促進する、請求項８２に記載の方法。
【請求項９４】
前記筋が骨格筋もしくは心筋である、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記組成物を投与する工程が、サテライト幹細胞増殖を促進する、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２０１１年９月１６日に出願された米国仮出願第６１／５３５，９１３号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。米国仮出願第６１／５３５，９１３号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（配列表についての陳述）
本出願に関連付けられている配列表は、紙の写しの代わりに、テキストフォーマットで提供され、それによって、本明細書に参考として援用される。上記配列表を含むテキストファイルの名称は、ＦＡＴＥ＿１０９＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ．である。上記テキストファイルは、７６ＫＢであり、２０１２年９月１０日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
（技術分野）
本発明は、一般に、Ｗｎｔ組成物およびこれを使用する治療法に関する。本発明のＷｎｔポリペプチドおよびその組成物は、例えば、幹細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および筋肥大を促進することによって、筋肉再生を促進するために、治療的に使用され得る。
【０００４】
（関連技術の説明）
遺伝子のＷｎｔファミリーは、標的細胞上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）レセプターに結合することによって作用する、２０個を超えるシステインリッチな、分泌型Ｗｎｔ糖タンパク質をコードする。Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターは、Ｇプロテイン共役レセプタータンパク質のファミリーである。上記Ｆｚｄファミリーの特定のメンバーへの上記Ｗｎｔファミリーの様々なメンバーの結合は、いくつかの異なる経路のうちの１つによるシグナル伝達を開始し得る。「標準経路」において、シグナル伝達分子であるＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄの活性化は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３β）、細胞質セリン−スレオニンキナーゼの不活性化をもたらす。上記ＧＳＫ−３β標的であるβ−カテニンは、それによって安定化し、特異的プロモーターのＴＣＦ（Ｔ細胞因子）依存性転写を活性化する場所である核へ位置を変える（Ｗｏｄａｒｚ，  １９９８，  Ｄｉｅｒｉｃｋ，  １９９９））。「非標準」Ｗｎｔ経路活性化は、それほど十分に規定されていないが、Ｃａ２＋経路シグナル伝達および潜在的には、ＰＩ３Ｋシグナル伝達、Ｒｈｏ経路シグナル伝達、および平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路シグナル伝達を活性化し得るＷｎｔとＦｚｄとの間の相互作用のサブセットを含む。
【０００５】
Ｗｎｔは、いくつかの原始的な細胞タイプにおいて活性なパラクリンもしくはオートクリンシグナルとして機能する分泌型糖タンパク質である。Ｗｎｔタンパク質は、細胞から分泌されるが、それらは、疎水性であることが見いだされ、保存されたシステイン残基および保存されたセリン残基における脂質部分の付加によって翻訳後修飾されると考えられている。これら脂質修飾は、Ｗｎｔタンパク質の生物学的活性および分泌に重要であると広く受け入れられている。しかし、脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）および脂質付加Ｗｎｔの低溶解度は、製剤化の間に界面活性剤が使用されない場合に低い生産収量と関連し、従って、Ｗｎｔの臨床スケール生成にとって特有の難題を示す。従って、Ｗｎｔは、種々の臨床状況において治療剤としての使用に関して素晴らしい潜在能力を有するが、上記Ｗｎｔの治療潜在能力は、Ｗｎｔの不溶性、および精製され、生物学的に活性な治療剤としての対応する不十分な生成に起因して、依然として完全に実現されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、Ｗｎｔ生物学的活性を保持する、可溶性のＷｎｔポリペプチド、臨床スケールで上記Ｗｎｔを生成するための方法、ならびに組織形成、再生、維持および修復を促進するために上記Ｗｎｔを使用する方法が当該分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（簡単な要旨）
本発明は、一般に、幹細胞増殖および筋肥大を促進することによって、筋肉再生を促進するための新規なＷｎｔ組成物および治療法を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、本発明は、一部、Ｎ末端欠失を含む単離されたＷｎｔポリペプチドであって、ここで上記Ｎ末端欠失が、１個以上の脂質付加部位を除去するものを企図する。
【０００９】
特定の実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、３００個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む。
【００１０】
別の特定の実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、２５０個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む。
【００１１】
さらなる特定の実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、２００個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む。
【００１２】
さらに特定の実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、１５０個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む。
【００１３】
１つの実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、単一の脂質付加部位を除去する。
【００１４】
別の実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、少なくとも２個の脂質付加部位を除去する。
【００１５】
なお別の実施形態において、上記Ｎ末端欠失は、全ての脂質付加部位を除去する。
【００１６】
関連する実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００１７】
別の関連する実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、少なくとも１０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００１８】
なお別の関連する実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、少なくとも２０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００１９】
さらになお別の関連する実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、少なくとも５０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００２０】
特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む。
【００２１】
ある特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。
【００２２】
関連する特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する。
【００２３】
さらに特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する。
【００２４】
さらなる特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する。
【００２５】
種々の実施形態において、本発明は、一部、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う単離されたＷｎｔポリペプチドを含むＷｎｔ融合ポリペプチドを提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む。
【００２７】
別の実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性も補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性も有しない。
【００２８】
１つの特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する。
【００２９】
特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する。
【００３０】
ある特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する。
【００３１】
特定のさらなる実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含む。
【００３２】
特定のさらなる実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される異種シグナルペプチドを含む。
【００３３】
別の実施形態において、上記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである。
【００３４】
別の関連する実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、異種プロテアーゼ切断部位を含む。
【００３５】
特定の関連する実施形態において、上記異種プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される。
【００３６】
１つの実施形態において、上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む。
【００３７】
種々の実施形態において、本発明は、一部、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔポリペプチドまたは本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ融合ポリペプチドを含む組成物を企図する。
【００３８】
特定の実施形態において、上記組成物は、薬学的に受容可能な塩、キャリア、または賦形剤を含む。
【００３９】
特定の実施形態において、上記賦形剤は、上記組成物のうちのＷｎｔポリペプチドもしくはＷｎｔ融合ポリペプチドの半減期を増大させる。
【００４０】
さらなる実施形態において、上記賦形剤は、上記組成物のうちのＷｎｔポリペプチドもしくはＷｎｔ融合ポリペプチドの安定性を増大させる。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、一部、配列番号２に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一でかつ配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも２２０個のアミノ酸のＮ末端欠失をさらに含む、アミノ酸配列；配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号４に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号５に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列；または配列番号３〜５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に同一である少なくとも７０個連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列、を含む単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドを企図する。
【００４２】
特定の実施形態において、単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一でありかつ配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも２２０個のアミノ酸のＮ末端欠失をさらに含むアミノ酸配列；配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；配列番号４に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；配列番号５に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；または配列番号３〜５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に同一である少なくとも７０個連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列、を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、少なくとも２２０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを生じるように、配列番号３の配列と最適に整列され得るアミノ酸配列；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、少なくともｅ−７４のｅ値スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを生じるように、配列番号３の配列と最適に整列され得るアミノ酸配列；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、少なくとも２１０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを生じるように、配列番号４の配列と最適に整列され得るアミノ酸配列；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、少なくともｅ−６６のｅ値スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを生じるように、配列番号４の配列と最適に整列され得るアミノ酸配列；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、少なくとも１７０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを生じるように、配列番号５の配列と最適に整列され得るアミノ酸配列；またはＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、少なくともｅ−５２のｅ値スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを生じるように、配列番号５の配列と最適に整列され得るアミノ酸配列、を含む。
【００４４】
特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００４５】
特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、少なくとも１０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００４６】
さらなる実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、少なくとも２０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失をさらに含む。
【００４７】
さらなる実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドを含むか、またはＷｎｔ７ａ生物学的活性を保持する。
【００４８】
１つの実施形態において、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、非標準Ｗｎｔ７ａシグナル伝達活性を保持する。
【００４９】
特定の実施形態において、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する。
【００５０】
特定の実施形態において、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する。
【００５１】
さらなる実施形態において、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する。
【００５２】
１つの実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号３〜５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、もしくは１２９個連続したアミノ酸を含む。
【００５４】
特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２および配列番号１８〜２３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＷｎｔポリペプチドと比較して、水性溶液中で増大した溶解度を有する。
【００５５】
ある特定の実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、細胞表面上のＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターを結合する。
【００５６】
さらに特定の実施形態において、上記細胞は、骨格筋サテライト幹細胞である。
【００５７】
さらなる実施形態において、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドの、上記Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターへの結合は、上記単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドの非存在下でのサテライト幹細胞増殖と比較して、サテライト幹細胞増殖を増大させる。
【００５８】
さらなる実施形態において、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う単離されたＷｎｔ７ａポリペプチドを含む。
【００５９】
１つの実施形態において、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む。
【００６０】
別の実施形態において、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、ＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も有しない。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された生成収量を有する。
【００６２】
特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された分泌特性を有する。
【００６３】
さらなる実施形態において、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された安定性もしくは半減期を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、または天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含む。
【００６５】
１つの実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される異種シグナルペプチドを含む。
【００６６】
特定の実施形態において、上記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである。
【００６７】
さらなる実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、異種プロテアーゼ切断部位を含む。
【００６８】
さらなる特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される異種プロテアーゼ切断部位を含む。
【００６９】
さらに特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む。
【００７０】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００７２】
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７３】
さらなる実施形態において、上記宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、もしくは細菌細胞である。
【００７４】
別の実施形態において、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチドまたはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、上記宿主細胞によって生成される。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明は、一部、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチド、もしくは本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａ融合ポリペプチド；本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチド、もしくは本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａポリペプチドもしくは本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従うＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、を含む組成物を企図する。
【００７６】
特定の実施形態において、上記組成物は、薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含む。
【００７７】
特定の実施形態において、上記組成物は、水性溶液中で可溶性である。
【００７８】
さらなる実施形態において、上記組成物は、注射用に製剤化されている。
【００７９】
さらなる実施形態において、上記組成物は、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために製剤化されている。
【００８０】
種々の実施形態において、上記組成物は、組織形成、再生、維持もしくは修復を促進する。
【００８１】
特定の実施形態において、上記組織は、筋肉である。
【００８２】
関連する実施形態において、上記筋肉は、骨格筋、心筋、もしくは平滑筋である。
【００８３】
特定の実施形態において、上記組成物は、幹細胞増殖を促進する。
【００８４】
さらなる実施形態において、上記幹細胞は、成体幹細胞である。
【００８５】
特定の実施形態において、上記成体幹細胞は、サテライト幹細胞である。
【００８６】
あるさらなる実施形態において、上記組成物は、筋肥大を促進するか、または筋萎縮を予防する。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明は、一部、被験体へ投与する工程を包含する、筋肉喪失を処置もしくは予防するための方法：本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う短縮型Ｗｎｔポリペプチド、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う短縮型Ｗｎｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、または本明細書で開示される実施形態のうちのいずれか１つに従う組成物を企図する。
【００８８】
１つの実施形態において、上記賦形剤は、上記組成物のうちのＷｎｔ７ａポリペプチドもしくはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドの半減期を増大させる。
【００８９】
別の実施形態において、上記賦形剤は、上記組成物のうちのＷｎｔ７ａポリペプチドもしくはＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドの安定性を増大させる。特定の実施形態において、上記組成物は、水性溶液に可溶性である。
【００９０】
さらなる実施形態において、上記組成物は、注射用に製剤化されている。
【００９１】
１つの実施形態において、上記組成物は、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために製剤化されている。
【００９２】
さらなる実施形態において、上記被験体は、筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態を有するかまたは有するリスクがある。
【００９３】
特定の実施形態において、上記疾患は、変性疾患である。
【００９４】
別の特定の実施形態において、上記変性疾患は、筋ジストロフィーである。
【００９５】
ある特定の実施形態において、上記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病）および先天性筋ジストロフィーから選択される。
【００９６】
さらなる特定の実施形態において、上記筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態は、消耗性疾患、筋減衰、筋萎縮症、ＩＣＵ誘導性虚弱、長期不使用、手術誘導性虚弱、もしくは筋変性疾患である。
【００９７】
さらなる特定の実施形態において、上記状態は、筋不使用、固定、手術誘導性虚弱、もしくは傷害と関連した筋萎縮症である。
【００９８】
さらなる実施形態において、上記組成物を投与する工程は、筋萎縮症を予防する。
特定の実施形態において、上記組成物を投与する工程は、筋肥大を促進する。
【００９９】
特定の実施形態において、上記筋肉は、骨格筋もしくは心筋である。
【０１００】
１つの実施形態において、上記組成物を投与する工程は、サテライト幹細胞増殖を促進する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１−１】図１は、ヒトＷｎｔポリペプチドとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａポリペプチドＷｎｔＤとのマルチプルアラインメントを示す。
【図１−２】図１は、ヒトＷｎｔポリペプチドとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａポリペプチドＷｎｔＤとのマルチプルアラインメントを示す。
【図１−３】図１は、ヒトＷｎｔポリペプチドとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａポリペプチドＷｎｔＤとのマルチプルアラインメントを示す。
【図１−４】図１は、ヒトＷｎｔポリペプチドとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａポリペプチドＷｎｔＤとのマルチプルアラインメントを示す。
【図１−５】図１は、ヒトＷｎｔポリペプチドとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａポリペプチドＷｎｔＤとのマルチプルアラインメントを示す。
【図２Ａ】図２は、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ３ａの二次構造推定を示す。Ａ）野生型ヒトＷｎｔ７ａのアミノ酸配列は、番号付け（１０×）とともに示される。ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔ二次構造推定ソフトウェアの結果は、Ｈ＝アルファヘリックス、Ｅ＝シートおよびＬ＝ループもしくはブランクで示され（Ｐｒｏｆ  ｓｅｃ）、ここで確定した構造は決定できなかった。各推定についての相対的信頼スコアが示され（Ｒｅｌ  Ｓｅｃ）、８５％信頼を上回る領域が列挙される（ＳＵＢ  ｓｅｃ）。Ｂ）野生型ヒトＷｎｔ３ａのアミノ酸配列は、番号付け（１０×）とともに示される。ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔ二次構造推定ソフトウェアの結果は、Ｈ＝アルファヘリックス、Ｅ＝シートおよびＬ＝ループもしくはブランクで示され（Ｐｒｏｆ  ｓｅｃ）、ここで確定した構造は決定できなかった。各推定についての相対的信頼スコアが示され（Ｒｅｌ  Ｓｅｃ）、８５％信頼を上回る領域が列挙される（ＳＵＢ  ｓｅｃ）。
【図２Ｂ】図２は、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ３ａの二次構造推定を示す。Ａ）野生型ヒトＷｎｔ７ａのアミノ酸配列は、番号付け（１０×）とともに示される。ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔ二次構造推定ソフトウェアの結果は、Ｈ＝アルファヘリックス、Ｅ＝シートおよびＬ＝ループもしくはブランクで示され（Ｐｒｏｆ  ｓｅｃ）、ここで確定した構造は決定できなかった。各推定についての相対的信頼スコアが示され（Ｒｅｌ  Ｓｅｃ）、８５％信頼を上回る領域が列挙される（ＳＵＢ  ｓｅｃ）。Ｂ）野生型ヒトＷｎｔ３ａのアミノ酸配列は、番号付け（１０×）とともに示される。ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔ二次構造推定ソフトウェアの結果は、Ｈ＝アルファヘリックス、Ｅ＝シートおよびＬ＝ループもしくはブランクで示され（Ｐｒｏｆ  ｓｅｃ）、ここで確定した構造は決定できなかった。各推定についての相対的信頼スコアが示され（Ｒｅｌ  Ｓｅｃ）、８５％信頼を上回る領域が列挙される（ＳＵＢ  ｓｅｃ）。
【図３】図３は、好ましい薬学的特性を有するＷｎｔタンパク質の構築を示す。実施例１に記載されるように設計されかつ構築されたＷｎｔ７ａタンパク質の模式図。シグナルペプチドは、野生型タンパク質（ｗｔＷｎｔ７ａ）以外の全てにおいて外因性として強調される。脂質除去（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ）タンパク質形態を生じるように設計された点変異は、本文中に記載され、模式図で強調される。短縮およびＦＣ融合物は、示されるとおりである。
【図４】図４は、種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態の発現収量を示す。Ｗｎｔ７ａタンパク質形態は、実施例４に記載されるように発現された。上記Ｗｎｔタンパク質改変および哺乳動物細胞培養培地１リットルあたりのＷｎｔタンパク質の収量が示される。
【図５】図５は、種々の精製Ｗｎｔ７ａタンパク質形態のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質を発現し、実施例４に記載されるように精製した。各Ｗｎｔ７ａタンパク質の５００ｎｇを、各レーンに入れた：１）Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓの市販のＷｎｔ７ａ；２）内因性シグナル配列がＩｇＧκ鎖シグナル配列で置換された、発現されかつ分泌された全長Ｗｎｔ７ａ；３）ＩｇＧκシグナル配列が使用された、変異した脂質除去Ｗｎｔ７ａ；４）Ｆｃ融合タンパク質として発現されかつ精製された、脂質除去Ｗｎｔ７ａ；５）Ｆｃ融合タンパク質として発現されかつ精製されたＷｎｔ７ａアミノ酸２６４−３４９；６）ＷｎｔドメインとＦｃドメインとの間にＴＥＶプロテアーゼを有するＦｃ融合タンパク質として発現されかつ精製され、その後、タンパク質分解消化され、クロマトグラフィーによってきれいにされて、精製Ｗｎｔ７ａアミノ酸２６４〜２４９を生成する、Ｗｎｔ７ａアミノ酸２６４−３４９。分子量は、最も左のレーンにあるマーカーで示される。
【図６】図６は、Ｗｎｔ７ａがインビトロで筋線維肥大を誘導することを示す。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を筋線維へと分化させ、実施例５に記載されるようにＷｎｔ７ａタンパク質で処理した。製剤コントロール（１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水）を、ｗｔ  Ｗｎｔ７ａと比較した。
【図７】図７は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態のインビトロでの筋線維肥大データを示す。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を筋線維へと分化させ、実施例５に記載されるようにＷｎｔ７ａタンパク質で処理した。線維直径を定量し、２００回の測定から平均線維直径として示した。製剤コントロール（１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水）を、ｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、ｗｔＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合タンパク質もしくはＷｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質と比較した。全てのＷｎｔタンパク質を、ＣＨＡＰＳ界面活性剤の存在下および非存在下で試験した。
【図８Ａ】図８は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態のインビトロでの筋線維肥大データを示す。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞もしくは初代ヒトジストロフィン異常症筋芽細胞を筋線維へと分化させ、実施例５に記載されるようにＷｎｔ７ａタンパク質で処理した。線維直径を定量し、１００回の測定からの平均線維直径として示した。Ａ）製剤コントロールである１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＣ）を、マウスＣ２Ｃ１２筋線維においてｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、および短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２３５〜３４９と比較した。Ｂ）製剤コントロールである、１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＣ）を、ヒトジストロフィン異常症筋線維においてｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、および短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２３５〜３４９と比較した。Ｃ）上記短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２６４−３４９の用量応答。
【図８Ｂ】図８は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態のインビトロでの筋線維肥大データを示す。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞もしくは初代ヒトジストロフィン異常症筋芽細胞を筋線維へと分化させ、実施例５に記載されるようにＷｎｔ７ａタンパク質で処理した。線維直径を定量し、１００回の測定からの平均線維直径として示した。Ａ）製剤コントロールである１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＣ）を、マウスＣ２Ｃ１２筋線維においてｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、および短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２３５〜３４９と比較した。Ｂ）製剤コントロールである、１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＣ）を、ヒトジストロフィン異常症筋線維においてｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、および短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２３５〜３４９と比較した。Ｃ）上記短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２６４−３４９の用量応答。
【図８Ｃ】図８は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態のインビトロでの筋線維肥大データを示す。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞もしくは初代ヒトジストロフィン異常症筋芽細胞を筋線維へと分化させ、実施例５に記載されるようにＷｎｔ７ａタンパク質で処理した。線維直径を定量し、１００回の測定からの平均線維直径として示した。Ａ）製剤コントロールである１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＣ）を、マウスＣ２Ｃ１２筋線維においてｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、および短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２３５〜３４９と比較した。Ｂ）製剤コントロールである、１％  ＣＨＡＰＳ補充リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＣ）を、ヒトジストロフィン異常症筋線維においてｗｔ  Ｗｎｔ７ａ、および短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２３５〜３４９と比較した。Ｃ）上記短縮型Ｗｎｔ７ａアミノ酸２６４−３４９の用量応答。
【図９Ａ】図９は、種々のＷｎｔ７ａタンパク質のタンパク質安定性加速評価の定量を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態である、（Ａ）ｗｔＷｎｔ７ａ−ＦＣ、（Ｂ）Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−ＦＣ、および（Ｃ）Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９を、等しいタンパク質濃度で、４℃もしくは３７℃のいずれかにおいて、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。３種の異なる賦形剤製剤を評価した：０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ、０．０５％  ポリソルベート８０（ＰＳ８０）もしくはＰＢＳ単独。残りのタンパク質を、ウェスタンブロット分析を使用して評価した。これを、次いで、ピクセルデンシトメトリーを使用して、出発量（時間０）と比較して残っているタンパク質の割合の値へと変換した。
【図９Ｂ】図９は、種々のＷｎｔ７ａタンパク質のタンパク質安定性加速評価の定量を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態である、（Ａ）ｗｔＷｎｔ７ａ−ＦＣ、（Ｂ）Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−ＦＣ、および（Ｃ）Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９を、等しいタンパク質濃度で、４℃もしくは３７℃のいずれかにおいて、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。３種の異なる賦形剤製剤を評価した：０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ、０．０５％  ポリソルベート８０（ＰＳ８０）もしくはＰＢＳ単独。残りのタンパク質を、ウェスタンブロット分析を使用して評価した。これを、次いで、ピクセルデンシトメトリーを使用して、出発量（時間０）と比較して残っているタンパク質の割合の値へと変換した。
【図９Ｃ】図９は、種々のＷｎｔ７ａタンパク質のタンパク質安定性加速評価の定量を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態である、（Ａ）ｗｔＷｎｔ７ａ−ＦＣ、（Ｂ）Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−ＦＣ、および（Ｃ）Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９を、等しいタンパク質濃度で、４℃もしくは３７℃のいずれかにおいて、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。３種の異なる賦形剤製剤を評価した：０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ、０．０５％  ポリソルベート８０（ＰＳ８０）もしくはＰＢＳ単独。残りのタンパク質を、ウェスタンブロット分析を使用して評価した。これを、次いで、ピクセルデンシトメトリーを使用して、出発量（時間０）と比較して残っているタンパク質の割合の値へと変換した。
【図１０Ａ】図１０は、安定性加速試験からのＷｎｔ７ａサンプルの筋線維肥大評価を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を、等しいタンパク質濃度において、４℃もしくは３７℃のいずれかで、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。賦形剤製剤である、０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳを評価した。残りのタンパク質を、実施例５および実施例６に記載されるように、インビトロでの筋線維肥大アッセイにおける活性についてを評価した。陰性製剤コントロールおよび陽性の市販のＷｎｔ７ａタンパク質コントロールを使用した。Ａ）Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物、ならびにＢ）短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を比較した。
【図１０Ｂ】図１０は、安定性加速試験からのＷｎｔ７ａサンプルの筋線維肥大評価を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を、等しいタンパク質濃度において、４℃もしくは３７℃のいずれかで、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。賦形剤製剤である、０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳを評価した。残りのタンパク質を、実施例５および実施例６に記載されるように、インビトロでの筋線維肥大アッセイにおける活性についてを評価した。陰性製剤コントロールおよび陽性の市販のＷｎｔ７ａタンパク質コントロールを使用した。Ａ）Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物、ならびにＢ）短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を比較した。
【図１１Ａ】図１１は、安定性加速試験からのＷｎｔ７ａサンプルの筋線維肥大評価を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を、等しいタンパク質濃度において、４℃もしくは３７℃のいずれかで、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。賦形剤製剤である０．０５％  ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ）／ＰＢＳを評価した。残りのタンパク質を、実施例５および実施例６に記載されるように、インビトロでの筋線維肥大アッセイにおける活性について評価した。陰性製剤コントロールおよび陽性の市販のＷｎｔ７ａタンパク質コントロールを使用した。Ａ）Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物、ならびにＢ）短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を比較した。
【図１１Ｂ】図１１は、安定性加速試験からのＷｎｔ７ａサンプルの筋線維肥大評価を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を、等しいタンパク質濃度において、４℃もしくは３７℃のいずれかで、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたってインキュベートした。賦形剤製剤である０．０５％  ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ）／ＰＢＳを評価した。残りのタンパク質を、実施例５および実施例６に記載されるように、インビトロでの筋線維肥大アッセイにおける活性について評価した。陰性製剤コントロールおよび陽性の市販のＷｎｔ７ａタンパク質コントロールを使用した。Ａ）Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物、ならびにＢ）短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を比較した。
【図１２Ａ】図１２は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態が標準のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化因子ではないことを示す。上記ｐＢＡＲ標準Ｗｎｔレポーターシステムを、異なる組織に由来する４種の細胞株へと導入した。Ａ）Ａ５４９株、Ｂ）ＫＧ−１ａ株、Ｃ）ＮＡＬＭ−６株、およびＤ）ＴＦ−１ａ株の各株を、Ｗｎｔシグナル伝達への応答について試験した。Ｗｎｔ３ａは、試験した全ての株において明らかなルシフェラーゼレポーター応答を生じた。全長Ｗｎｔ７ａ（ＦＴＶ５００）および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合物（ＦＴＶ５２６）は、試験したいかなる濃度においても上記標準Ｗｎｔレポーターを誘導しなかった。
【図１２Ｂ】図１２は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態が標準のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化因子ではないことを示す。上記ｐＢＡＲ標準Ｗｎｔレポーターシステムを、異なる組織に由来する４種の細胞株へと導入した。Ａ）Ａ５４９株、Ｂ）ＫＧ−１ａ株、Ｃ）ＮＡＬＭ−６株、およびＤ）ＴＦ−１ａ株の各株を、Ｗｎｔシグナル伝達への応答について試験した。Ｗｎｔ３ａは、試験した全ての株において明らかなルシフェラーゼレポーター応答を生じた。全長Ｗｎｔ７ａ（ＦＴＶ５００）および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合物（ＦＴＶ５２６）は、試験したいかなる濃度においても上記標準Ｗｎｔレポーターを誘導しなかった。
【図１２Ｃ】図１２は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態が標準のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化因子ではないことを示す。上記ｐＢＡＲ標準Ｗｎｔレポーターシステムを、異なる組織に由来する４種の細胞株へと導入した。Ａ）Ａ５４９株、Ｂ）ＫＧ−１ａ株、Ｃ）ＮＡＬＭ−６株、およびＤ）ＴＦ−１ａ株の各株を、Ｗｎｔシグナル伝達への応答について試験した。Ｗｎｔ３ａは、試験した全ての株において明らかなルシフェラーゼレポーター応答を生じた。全長Ｗｎｔ７ａ（ＦＴＶ５００）および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合物（ＦＴＶ５２６）は、試験したいかなる濃度においても上記標準Ｗｎｔレポーターを誘導しなかった。
【図１２Ｄ】図１２は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態が標準のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化因子ではないことを示す。上記ｐＢＡＲ標準Ｗｎｔレポーターシステムを、異なる組織に由来する４種の細胞株へと導入した。Ａ）Ａ５４９株、Ｂ）ＫＧ−１ａ株、Ｃ）ＮＡＬＭ−６株、およびＤ）ＴＦ−１ａ株の各株を、Ｗｎｔシグナル伝達への応答について試験した。Ｗｎｔ３ａは、試験した全ての株において明らかなルシフェラーゼレポーター応答を生じた。全長Ｗｎｔ７ａ（ＦＴＶ５００）および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合物（ＦＴＶ５２６）は、試験したいかなる濃度においても上記標準Ｗｎｔレポーターを誘導しなかった。
【図１３Ａ】図１３は、Ｗｎｔ７ａがインビボで顕著な肥大を誘導することを示す。全長Ｗｎｔ７ａを、Ｃ５７Ｂｌ６マウス前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において製剤コントロールもしくはＩＧＦ−１と比較した。Ａ）製剤コントロールもしくはＷｎｔ７ａのいずれかで処置した筋肉における線維の断面積を示すラミニンの免疫組織化学染色。Ｂ）メジアン線維フェレ径（Ｍｅｄｉａｎ  ｆｉｂｅｒ  ｆｅｒｅｔｓ）を、１０００個の値／動物および各処置群に関してプロットしたメジアンの動物間平均から計算した：対側（未処理）コントロール、製剤コントロール、ＩＧＦ−ＬもしくはＷｎｔ７ａ。Ｃ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値をプロットする集団分析としてプロットした。Ｄ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１３Ｂ】図１３は、Ｗｎｔ７ａがインビボで顕著な肥大を誘導することを示す。全長Ｗｎｔ７ａを、Ｃ５７Ｂｌ６マウス前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において製剤コントロールもしくはＩＧＦ−１と比較した。Ａ）製剤コントロールもしくはＷｎｔ７ａのいずれかで処置した筋肉における線維の断面積を示すラミニンの免疫組織化学染色。Ｂ）メジアン線維フェレ径（Ｍｅｄｉａｎ  ｆｉｂｅｒ  ｆｅｒｅｔｓ）を、１０００個の値／動物および各処置群に関してプロットしたメジアンの動物間平均から計算した：対側（未処理）コントロール、製剤コントロール、ＩＧＦ−ＬもしくはＷｎｔ７ａ。Ｃ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値をプロットする集団分析としてプロットした。Ｄ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１３Ｃ】図１３は、Ｗｎｔ７ａがインビボで顕著な肥大を誘導することを示す。全長Ｗｎｔ７ａを、Ｃ５７Ｂｌ６マウス前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において製剤コントロールもしくはＩＧＦ−１と比較した。Ａ）製剤コントロールもしくはＷｎｔ７ａのいずれかで処置した筋肉における線維の断面積を示すラミニンの免疫組織化学染色。Ｂ）メジアン線維フェレ径（Ｍｅｄｉａｎ  ｆｉｂｅｒ  ｆｅｒｅｔｓ）を、１０００個の値／動物および各処置群に関してプロットしたメジアンの動物間平均から計算した：対側（未処理）コントロール、製剤コントロール、ＩＧＦ−ＬもしくはＷｎｔ７ａ。Ｃ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値をプロットする集団分析としてプロットした。Ｄ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１３Ｄ】図１３は、Ｗｎｔ７ａがインビボで顕著な肥大を誘導することを示す。全長Ｗｎｔ７ａを、Ｃ５７Ｂｌ６マウス前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において製剤コントロールもしくはＩＧＦ−１と比較した。Ａ）製剤コントロールもしくはＷｎｔ７ａのいずれかで処置した筋肉における線維の断面積を示すラミニンの免疫組織化学染色。Ｂ）メジアン線維フェレ径（Ｍｅｄｉａｎ  ｆｉｂｅｒ  ｆｅｒｅｔｓ）を、１０００個の値／動物および各処置群に関してプロットしたメジアンの動物間平均から計算した：対側（未処理）コントロール、製剤コントロール、ＩＧＦ−ＬもしくはＷｎｔ７ａ。Ｃ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値をプロットする集団分析としてプロットした。Ｄ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１４Ａ】図１４は、Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９が顕著な肥大をインビボで誘導することを示す。Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を、ＭＤＸジストロフィン異常症マウスモデルの前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において、Ｆｃ融合物コントロールと比較した。Ａ）メジアン線維フェレ径を、１０００個の値／動物から計算し、メジアンの動物間平均を、各処置群についてプロットした：対側（未処置）コントロール、Ｆｃ融合物コントロールまたはＣＨＡＰＳ界面活性剤ありもしくはなしで製剤化したＷｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質。Ｂ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値としてプロットする集団分析としてプロットした。Ｃ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９が顕著な肥大をインビボで誘導することを示す。Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を、ＭＤＸジストロフィン異常症マウスモデルの前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において、Ｆｃ融合物コントロールと比較した。Ａ）メジアン線維フェレ径を、１０００個の値／動物から計算し、メジアンの動物間平均を、各処置群についてプロットした：対側（未処置）コントロール、Ｆｃ融合物コントロールまたはＣＨＡＰＳ界面活性剤ありもしくはなしで製剤化したＷｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質。Ｂ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値としてプロットする集団分析としてプロットした。Ｃ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１４Ｃ】図１４は、Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９が顕著な肥大をインビボで誘導することを示す。Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を、ＭＤＸジストロフィン異常症マウスモデルの前脛骨筋への１回の注射の後に、肥大を誘導するその能力において、Ｆｃ融合物コントロールと比較した。Ａ）メジアン線維フェレ径を、１０００個の値／動物から計算し、メジアンの動物間平均を、各処置群についてプロットした：対側（未処置）コントロール、Ｆｃ融合物コントロールまたはＣＨＡＰＳ界面活性剤ありもしくはなしで製剤化したＷｎｔ７ａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質。Ｂ）全ての線維フェレ径／処置群を、メジアンおよび四分位内の値としてプロットする集団分析としてプロットした。Ｃ）メジアン、平均および統計的有意性についての処置群間の値（＊ｐ≦０．０５）。
【図１５Ａ】図１５は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態の薬物動態分析を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて単一静脈内投与ＰＫ研究において評価した。全長Ｗｎｔ７ａ（ＦＴＶ５００）、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物（ＦＴＶ５１２）、Ｗｎｔ７ａ  ａａ  ２６４−３４９フラグメント（ＦＴＶ５２９）、およびＷｎｔ７ａ  ａａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＴＶ５２６）を比較した。Ａ）示した時点で抜き取ったマウス血漿に対するＷｎｔ７ａ特異的ＥＬＩＳＡ。Ｂ）ＦＴＶ５２６を除いたデータセットの拡張を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、Ｗｎｔ７ａタンパク質形態の薬物動態分析を示す。種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて単一静脈内投与ＰＫ研究において評価した。全長Ｗｎｔ７ａ（ＦＴＶ５００）、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物（ＦＴＶ５１２）、Ｗｎｔ７ａ  ａａ  ２６４−３４９フラグメント（ＦＴＶ５２９）、およびＷｎｔ７ａ  ａａ  ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＴＶ５２６）を比較した。Ａ）示した時点で抜き取ったマウス血漿に対するＷｎｔ７ａ特異的ＥＬＩＳＡ。Ｂ）ＦＴＶ５２６を除いたデータセットの拡張を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
（配列識別子の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトＷｎｔ７ａのｃＤＮＡ配列を示す。
【０１０３】
配列番号２は、配列番号１によってコードされるヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
配列番号３は、配列番号２のアミノ酸２２１〜３４９を示す。
【０１０５】
配列番号４は、配列番号２のアミノ酸２３５〜３４９を示す。
【０１０６】
配列番号５は、配列番号２のアミノ酸２６４〜３４９を示す。
【０１０７】
配列番号６〜９は、配列番号３のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
配列番号１０〜１３は、配列番号４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１０９】
配列番号１４〜１７は、配列番号５のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
配列番号１８は、マウスＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
配列番号１９は、ラットＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１２】
配列番号２０は、ニワトリＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
配列番号２１は、ゼブラフィッシュＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１４】
配列番号２２は、ブタＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１５】
配列番号２３は、ウシＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１６】
配列番号２４〜２６は、Ｗｎｔ発現ベクターを構築するために使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【０１１７】
配列番号２７は、ＣＤ３３シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【０１１８】
配列番号２８は、配列番号２７のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１１９】
配列番号２９は、ＩｇＧκシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【０１２０】
配列番号３０は、配列番号２９のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１２１】
配列番号３１〜３２は、配列番号３のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２２】
配列番号３３〜３４は、配列番号４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２３】
配列番号３５〜３６は、配列番号５のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２４】
配列番号３７〜３８は、配列番号４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２５】
配列番号３９〜４０は、配列番号５のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
配列番号４１〜４２は、配列番号４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２７】
配列番号４３〜４４は、配列番号５のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
（詳細な説明）
（Ａ．概説）
【０１２９】
Ｗｎｔｓの翻訳後脂質付加は、生物学的活性およびタンパク質分泌にとって必要とされると考えられているが、本発明は、一部、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠いているＷｎｔの短縮型形態を含む、Ｗｎｔ生物学的活性を有する新規な短縮型Ｗｎｔポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、Ｗｎｔ生物学的活性を保持し、従って、本発明は、改変Ｗｎｔポリペプチドおよび改善された生物学的薬物様特性（例えば、増強された溶解度、生成、製剤化、全身送達、および組織取り込み）を有する上記改変Ｗｎｔポリペプチドを含む組成物、ならびにこのようなＷｎｔポリペプチドの治療的使用を提供する。本発明はさらに、Ｗｎｔポリペプチドの不溶性によって引き起こされる問題に対する新規な解決法を提供し、さらには、臨床スケール生成および治療的使用に適した本発明のＷｎｔポリペプチドを提供する。本発明のＷｎｔポリペプチドの治療的使用としては、例えば、幹細胞増殖、組織形成、ならびに細胞および／もしくは組織の再生、修復もしくは維持を促進することが挙げられる。
【０１３０】
本発明の実施は、具体的にそうでないと示されなければ、当該分野の技術範囲内の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来法を使用する。これらのうちの多くは、例示目的で以下に記載される。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８２）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．  Ｉ  ＆  ＩＩ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５）；  Ａｎａｎｄ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｅｄｓ．，  １９８４）；  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９８）。
【０１３１】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０１３２】
（Ｂ．定義）
【０１３３】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似もしくは等価な任意の方法および材料が本発明の実施もしくは試験において使用され得るものの、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。本発明の目的に関して、以下の用語が、以下に定義される。
【０１３４】
冠詞「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、上記冠詞の文法的対象物の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）に言及するために本明細書で使用される。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つ以上の要素を意味する。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「約」もしくは「およそ」は、参照となる分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％程度変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さに言及する。特定の実施形態において、用語「約」もしくは「およそ」は、数値の前につく場合、上記値±１５％、１０％、５％、もしくは１％の範囲を示す。
【０１３６】
本明細書全体を通しての「１つの実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「ある実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態（ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態（ｃｅｒｔａｉｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「さらなる実施形態（ａｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、もしくは「さらなる実施形態（ａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」またはこれらの組み合わせへの言及は、上記実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造もしくは特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体を通して種々の位置において前述の語句が出現しても、必ずしも全てが同じ実施形態を言及しない。さらに、上記特定の特徴、構造もしくは特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」とは、（１）長期の自己再生、もしくは元の細胞の少なくとも１つの同一のコピーを生成する能力、（２）単一の細胞レベルでの、複数の、およびいくつかの場合には、ただ１つの専門化した細胞（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）タイプへの分化、および（３）組織のインビボ機能再生、の能力がある未分化の細胞である細胞に言及する。幹細胞は、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）として、それらの発生能に従って下位分類される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、用語「成体幹細胞」または「体幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」とは、（しばしば、生物の特定の組織における）発達したかまたは発達している生物において見いだされる幹細胞に言及する。成体幹細胞は、細胞分裂によって分裂し得、多能性または単能性（unipotent）のいずれかであり、かつその後分化して、細胞および／または組織を増加し、置き換えまたは失われた細胞および／または組織を再生し得る。成体幹細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：外胚葉幹細胞、内胚葉幹細胞、中胚葉幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、筋幹細胞、サテライト幹細胞など。筋幹細胞は、伝統的には、単能性であると考えられ、筋細胞のみを生じる幹細胞の例である。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、用語「サテライト幹細胞」とは、筋性系統の細胞（例えば、筋芽細胞および筋細胞）を生じる成体幹細胞のタイプに言及する。１つの実施形態において、サテライト幹細胞は、Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−筋幹細胞である。特定の実施形態において、サテライト幹細胞は、骨格筋幹細胞である。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「前駆細胞」とは、自己再生し、より成熟した細胞へと分化する能力を有するが、ある系統へとコミットした細胞に言及する（例えば、造血前駆細胞は、血液系統へとコミットしている）のに対して、幹細胞は、必ずしもそのように限定されているわけではない。筋芽細胞は、前駆細胞の一例であり、これは、ただ１つの細胞タイプへと分化する能力があるが、それ自体は、完全に成熟してもいないし、完全に分化してもいない。筋芽細胞は、筋細胞へと分化し得る。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、用語「筋細胞」もしくは「筋線維」とは、筋肉において見いだされる分化した細胞のタイプに言及する。各筋細胞は、筋原線維を含み、これは、筋細胞の収縮単位である長いサルコメアの鎖である。筋細胞には、種々の特定された形態がある：当該分野で公知の種々の特性を有する、心筋細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、用語「自己再生」とは、変化していない娘細胞を生成し、専門化した細胞のタイプを生成する特有の能力（潜在能（ｐｏｔｅｎｃｙ））を有する細胞に言及する。自己再生は、少なくとも２つの方法において達成され得る。非対称性細胞分裂は、親細胞に対して同一である１つの娘細胞、および親細胞とは異なり、前駆細胞もしくは分化した細胞である１つの娘細胞を生成する。非対称性細胞分裂は、従って、上記親細胞に対して同一の娘細胞の数を増大させないが、上記親細胞タイプの細胞数を維持する。対称性細胞分裂は、対照的に、上記親細胞に対して各々同一である２つの娘細胞を生成する。対称性細胞分裂は、従って、上記親細胞に対して同一の細胞の数を増大させ、親細胞の集団を増殖させる。特定の実施形態において、対称性細胞分裂は、「細胞増殖」、例えば、幹細胞集団の増殖と交換可能に使用される。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語「分化」とは、細胞が、特定の機能のために専門化される発生プロセスに言及し、例えば、ここで細胞は、１つ以上の、最初の細胞タイプのものとは異なる形態的特徴および／もしくは機能を獲得する。用語「分化」は、系統コミットメント（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）および最終分化プロセスの両方を含む。未分化もしくは分化の状態は、例えば、免疫組織化学もしくは当業者に公知の他の手順を使用して、生体マーカーの存在もしくは非存在を評価もしくはモニターすることによって、評価され得る。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、用語「系統コミットメント」とは、幹細胞が分化した細胞タイプの特定の限定された範囲を形成するようにコミットするプロセスに言及する。系統コミットメントは、例えば、幹細胞が非対称性細胞分裂の間に前駆細胞を生じる場合に、生じる。コミットした前駆細胞は、しばしば、自己再生もしくは細胞分裂の能力がある。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、用語「最終分化」とは、細胞が、成熟した完全に分化した細胞へと最終分化することに言及する。通常、最終分化は、細胞周期からの離脱および増殖の停止と関連する。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、用語「筋肥大」とは、筋肉のサイズにおける増大に言及し、個々の線維体積における増大および／もしくは筋線維の断面積における増大を含み得、また、筋線維あたりの核の数における増大を含み得る。筋肥大はまた、筋肉全体の体積および質量における増大を含み得る；しかし、筋肥大は、筋過形成（これは、新たな筋細胞の形成である）とは異なり得る。１つの実施形態において、筋肥大は、アクチンおよびミオシン収縮タンパク質の数における増大に言及する。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、用語「促進する」、「増強する」、「刺激する」、もしくは「増大する」とは、一般に、本発明のＷｎｔポリペプチドまたは組成物が、ビヒクルもしくはコントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる生理学的応答と比較して、より大きな応答（すなわち、測定可能な下流効果）を生じるかもしくは引き起こす能力に言及する。１つのこのような測定可能な生理学的応答としては、非対称性細胞分裂と比較して、対称性幹細胞分裂における増大（例えば、サテライト幹細胞における増大）、および／または正常な、未処理、もしくはコントロール処理した筋細胞と比較して、筋肥大の増大が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＷｎｔポリペプチドおよび組成物はまた、天然において見いだされるＷｎｔポリペプチドと比較して、「改善された」、「増大した」、「増強された」、もしくは「より大きな」物理的特性および薬物動態的特性を有し得る。例えば、本発明のＷｎｔポリペプチドの上記生理学的応答、物理的特性または薬物動態学的特性は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上増大し得る。別の非限定的例において、本発明のＷｎｔ組成物の本発明のＷｎｔポリペプチドの上記生理学的応答、物理的特性または薬物動態学的特性は、天然のＷｎｔの生理学的応答、物理的特性または薬物動態学的特性と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上増大し得る。「増大した」もしくは「増強した」応答または特性は、代表的には、「統計的に有意」であり、ビヒクル（因子の非存在）もしくはコントロールＷｎｔ組成物によって生成される応答または特性の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍以上（例えば、５００倍、１０００倍）（その間、および１を超える全ての整数および小数を含む（例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など））である増大を含み得る。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、用語「保持」もしくは「維持」とは、一般に、本発明のＷｎｔ組成物が、天然に存在するＷｎｔアミノ酸もしくは核酸配列のＷｎｔ組成物によって引き起こされる応答に類似の性質である生理学的応答（すなわち、測定可能な下流効果）を生成するかもしくは引き起こす能力に言及する。例えば、本発明のＷｎｔ組成物は、Ｗｎｔ生物学的活性を示し、従って、Ｗｎｔ活性を保持する。本発明の組成物はまた、天然に存在するＷｎｔポリペプチドによって引き起こされる応答に類似の性質のものである生理学的応答（例えば、筋肥大）を生じる。類似の生理学的応答を誘発する本発明のＷｎｔ組成物は、天然に存在するＷｎｔアミノ酸もしくは核酸配列を含む組成物によって誘発される生理学的応答のレベルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは約１００％である生理学的応答を誘発し得る。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「低下する」もしくは「低くする」、または「少なくする」、もしくは「低下させる」、または「弱める」とは、一般に、ビヒクルもしくはコントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、本発明のＷｎｔ組成物がより低い生理学的応答（すなわち、下流効果）（例えば、低下したアポトーシス）を生じるかもしくは引き起こす能力に言及する。１つの実施形態において、上記低下は、遺伝子発現における低下、または通常は細胞生存性の低下と関連する細胞シグナル伝達の低下であり得る。「低下」もしくは「低下した」応答は、代表的には、「統計的に有意」な応答であり、ビヒクル（因子の非存在）もしくはコントロール組成物によって生成される応答の１／１．１、１／１．２、１／１．５、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１５、１／２０、１／３０以上（例えば、１／５００、１／１０００）（その間、および１を超える全ての整数および小数を含む（例えば、１／１．５、１／１．６、１／１．７、１／１．８など））である低下を含み得る。
【０１５０】
（Ｃ．Ｗｎｔシグナル伝達経路）
【０１５１】
上記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、発生の間および成体の生命全体を通じて、細胞運命決定、細胞移動、細胞極性、神経パターン形成および器官形成の重要な局面を調節する古代からの進化的に保存された経路である。上記Ｆｚｄレセプターの下流にあるＷｎｔシグナル伝達経路は、同定されており、これは、標準のもしくはＷｎｔ／β−カテニン依存性経路および非標準のもしくはβ−カテニン非依存性経路を含み、これらは、平面内細胞極性、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路などにさらに分けられ得る。
【０１５２】
Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）レセプターファミリーのＮ末端細胞外システインリッチドメインに結合する。ヒトにおいて１０個のＦｚｄレセプターがある。上記Ｆｚｄタンパク質は、Ｇプロテイン共役レセプターに対してトポロジー的に相同性を有する７回膜貫通タンパク質である。さらに、ＷｎｔとＦｚｄとの間の相互作用に対して、さらに、共レセプターが、Ｗｎｔシグナル伝達を媒介するために必要とされる。例えば、低密度リポプロテイン関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）は、上記標準のＷｎｔシグナルを媒介するために必要とされるのに対して、レセプターチロシンキナーゼＲＹＫは、非標準の機能のために必要とされ得る。Ｗｎｔシグナル伝達の調節の別のレベルは、多様な数の分泌型Ｗｎｔアンタゴニストの存在によって、細胞外環境において起こる。Ｗｎｔがレセプター複合体に結合した後、上記シグナルは、細胞質ホスホプロテインＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ／Ｄｖｌ）に伝達される。Ｄｓｈは、Ｆｚｄと直接相互作用し得る。Ｄｓｈのレベルにおいて、上記Ｗｎｔシグナルは、少なくとも３種の主要なカスケード（標準（β−カテニン）、平面内細胞極性およびＷｎｔ／Ｃａ２＋）に枝分かれする。さらに、Ｇプロテイン共役レセプターシグナル伝達はまた、ＰＩ３Ｋのような増殖および生存経路を刺激し得る。
【０１５３】
（１．標準のＷｎｔシグナル伝達経路）
【０１５４】
上記標準のＷｎｔシグナル伝達経路は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける遺伝的スクリーニングから初めて同定され、詳細に示された。そしてハエ、蠕虫、カエル、魚類およびマウスにおける集中的な研究から、基本的な分子シグナル伝達フレームワークの同定がもたらされた。上記標準のＷｎｔ経路の顕著な特徴は、核へのアドへレンジャンクション関連タンパク質（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ）β−カテニンの蓄積および移動である。Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下では、細胞質β−カテニンは、β−カテニン破壊複合体（これは、Ａｘｉｎ、ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）およびカゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）を含む）によって分解される。ＣＫ１αおよびＧＳＫ３βによるこの複合体内でのβ−カテニンのリン酸化は、β−カテニンを、ユビキチン化およびその後のプロテオソーム機構によるタンパク質分解的破壊のための標的とする。Ｗｎｔの、上記Ｆｚｄおよび上記ＬＲＰ５／６から構成されるそのレセプター複合体への結合は、ＣＫ１およびＧＳＫ３−βによるＬＲＰ６の二重リン酸化を誘導し、このことは、Ａｘｉｎを含むタンパク質複合体が、サイトゾルから形質膜へ移動することを可能にする。Ｄｓｈはまた、上記膜へとリクルートされ、Ｆｚｄへ結合し、Ａｘｉｎは、リン酸化ＬＲＰ５／６へ結合する。Ｆｚｄ／ＬＲＰ５／６において上記膜に形成されるこの複合体は、Ａｘｉｎの隔離および／もしくはＡｘｉｎの分解のいずれかを介して、β−カテニンの安定化を誘導する。β−カテニンは、核へと移動し、ここでβ−カテニンは、Ｌｅｆ／Ｔｃｆファミリーメンバーと複合体形成して、標的遺伝子の転写誘導を媒介する。
【０１５５】
標準のＷｎｔシグナル伝達は、前方頭部構造の形成および神経外胚葉パターン形成、後部パターン形成および尾部形成に影響を及ぼし、ならびに心臓、肺、腎臓、皮膚および骨を含む種々の器官系の形成に影響を及ぼす。
【０１５６】
（２．非標準のＷｎｔシグナル伝達経路）
【０１５７】
上記非標準の経路は、しばしば、β−カテニン非依存性経路といわれ、標準経路ほどにはよく規定されていないが、この経路は、少なくとも２つの異なる枝（平面内細胞極性経路（もしくはＰＣＰ経路）およびＷｎｔ／Ｃａ２＋経路）へとさらに別れ得る。そのうち、上記ＰＣＰのみが、本明細書においてさらに詳細に考察される。上記ＰＣＰ経路は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける遺伝的研究から浮かび上がってきた。この研究において、Ｗｎｔシグナル伝達成分（ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄを含む）における変異は、毛小皮（ｃｕｔｉｃｌｅ  ｈａｉｒｓ）および感覚剛毛を含む上皮構造の配向を無作為化することが見いだされた。上皮における細胞は、規定された先端−基底側極性を有することが公知であるが、さらに、上記細胞はまた、上記上皮層の平面に沿って極性化される。この固定した組織化は、毛包、感覚剛毛および眼における単眼の六角配列の配向を含む構造の配向を左右する。脊椎動物において、この組織化は、筋細胞の組織化および配向、内耳の感覚上皮における不動毛、毛包の組織化、および原腸形成を受けている背側の中胚葉細胞の形態および移動性の挙動の根底にあることが示された。
【０１５８】
Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｄｓｈの活性化をもたらすＬＲＰ５／６とは無関係に、Ｆｚｄを介して伝達される。Ｄｓｈは、Ｄａａｍ１を介して、Ｒｈｏの活性化を媒介し、このことは、続いて、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）を活性化する。Ｄａａｍ１はまた、アクチン結合タンパク質であるプロフィリンを介して、アクチン重合を媒介する。Ｄｓｈはまた、Ｒａｃの活性化を媒介し、このことは、続いて、ＪＮＫを活性化する。Ｒｏｃｋ、ＪＮＫおよびプロフィリンからのシグナル伝達は、細胞極性化および原腸形成の間の運動性のための細胞骨格変化のために統合される。
【０１５９】
（３．筋細胞発生におけるＷｎｔシグナル伝達）
【０１６０】
サテライト幹細胞は、筋細胞を生じる成体幹細胞である。成体の骨格筋におけるサテライト細胞は、それらのホスト筋線維の筋細胞膜と基底板との間の小さなくぼみに位置する。損傷（例えば、物理的外傷、反復運動、もしくは疾患における）の際に、サテライト細胞は活性化され、増殖し、筋原性調節因子（ＭＲＦ）であるＭｙｏＤおよびＭｙｆ５を発現する筋原性前駆細胞（筋芽細胞）の集団を生じる。上記再生プロセスの過程において、筋芽細胞は、数回の分裂を経て最終分化へとコミットし、ホスト線維と融合するかまたは新たな筋線維を生成して、損傷した組織を再構築する（Ｃｈａｒｇｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，  ２００４）。骨格筋再生の間に、上記サテライト幹細胞集団は、幹細胞亜集団によって増殖または維持され、従って、組織ホメオスタシスおよび個体の寿命の間の複数回の再生が可能になる（Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。サテライト幹細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−）は、上記成体サテライト細胞プールのうちの約１０％を示し、非対称性の先端−基底細胞分裂を介して娘サテライト筋原性細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋）を生じる。
【０１６１】
Ｗｎｔシグナル伝達は、胚発生を介する発生プログラムを調節すること、および成体組織において幹細胞機能を調節することにおいて重要な役割を果たす（Ｃｌｅｖｅｒｓ，  ２００６）。Ｗｎｔは、沿軸中胚葉における胚性筋原性誘導に必須であり（Ｂｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｔａｊｂａｋｈｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、同様に、筋線維発生の間の分化の制御において必須である（Ａｎａｋｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。近年では、上記Ｗｎｔ平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路は、発生中の筋節における筋細胞増殖の配向を調節することに関わっていた（Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。成体において、Ｗｎｔシグナル伝達は、急性の損傷後の筋組織における成体幹細胞の筋原性へのコミットメントに必須であると考えられる（Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｔｏｒｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。他の研究から、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、予備の筋芽細胞の活性化およびリクルートを介して筋原性分化を調節することが示唆されている（Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。さらに、成体の筋肉内のサテライト細胞における上記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を制限し、従って分化を促進することによって筋原性系統の進行を制御するようである（Ｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【０１６２】
近年になって、上記ＷｎｔレセプターＦｚｄ７は、静止サテライト幹細胞において顕著にアップレギュレートされることが決定された。さらに、さらなる研究から、Ｗｎｔ７ａは、筋再生の間に発現され、そのレセプターＦｚｄ７およびＶａｎｇｌ２（上記平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路の成分）を介して作用して、対称性のサテライト幹細胞増殖を誘導し、筋再生を劇的に増強することが明らかになった。
【０１６３】
上記ＰＣＰ経路におけるレセプターもしくはエフェクター分子（例えば、Ｆｚｄ７もしくはＶａｎｇｌ２）の阻害は、サテライト幹細胞に対するＷｎｔ７ａの効果を排除すると考えられる（Ｌｅ  Ｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。脂質付加されたＷｎｔ７ａポリペプチドの投与、脂質付加によって後で翻訳後修飾されるＷｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与は、インビトロおよびインビボでサテライト幹細胞数を有意に増大させ、インビボで組織形成を促進し、損傷および罹患した筋組織において増強された修復および再生をもたらすことがさらに実証された（Ｌｅ  Ｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０１６４】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、損傷および罹患した筋組織において増強された修復および再生をもたらすＷｎｔ７ａの作用機構は、２つの経路を有すると予期される：Ｗｎｔ７ａは、ＰＣＰ経路を介して筋サテライト（幹）細胞の対称性の増殖を刺激し得、その後に筋芽細胞へと分化し得る、より大きな細胞のプールを生じる；そして第２に、Ｇプロテイン共役レセプター（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）を介するＷｎｔ７ａは、筋芽細胞および筋線維においてシグナル伝達するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）／ラパマイシン哺乳動物標的（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ）経路を刺激し得る。この経路は、肥大を刺激することが示された（Ｂｏｄｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００１；  ｖｏｌ．  ３；  ｐｐ．  １０１４−１０１７；  Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００３；  ｖｏｌ．  ５；  ｐｐ．  ８７−９０；  Ｃｉｃｉｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉａｆｆｉｎｏ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ．  ２０１０；  １６（８）；  ｐｐ．  ９０６−９１４）。Ｗｎｔ７ａは、上記Ｇプロテイン共役レセプターＦｒｉｚｚｌｅｄ  ７を介してシグナル伝達し得、このＷｎｔ／Ｆｒｚ相互作用は、両方の生物学的効果に寄与し得る。
【０１６５】
種々の実施形態において、組成物は、改変されたＷｎｔ、特に、Ｗｎｔ融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物）またはＮ末端アミノ酸および／もしくはＣ末端アミノ酸を欠いている短縮型Ｗｎｔポリペプチドを含む。本発明の短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ生物学的活性、レセプター結合特異性をなお予測外にも保持し、脂質付加Ｗｎｔと比較して、改善された溶解度、生成、全身送達、および組織取り込みを有する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、改変されたＷｎｔ７ａ、特に、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドまたはＮ末端アミノ酸および／もしくはＣ末端アミノ酸を欠いている短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチド、例えば、少なくともＮ末端の２２０個のアミノ酸を欠いているＷｎｔ７ａポリペプチドを含む。上記短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ７ａ生物学的活性、レセプター結合特異性をなお予測外にも保持し、脂質付加Ｗｎｔと比較して、改善された溶解度、生成、全身送達、および組織取り込みを有する。
【０１６６】
筋細胞肥大にとっての上記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の重要性は、記載されてきたものの、筋細胞においてこの経路を特異的に刺激することの治療的な困難性は、損傷および罹患した筋組織において修復および再生を増強することへのかなりの障害を提起している。強力なＰＩ３−キナーゼアクチベーター（例えば、ＩＧＦ−１）での初期の研究は、インビトロで肥大を生じたが、「オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」代謝効果の可能性が存在する（すなわち、ＩＧＦ−１およびＰＩ３Ｋは、ハウスキーピング代謝プロセス、生存プロセスおよび代謝プロセスの重要なレギュレーターである）。従って、筋特異的なＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のＷｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７刺激の可能性は、重要かつ独特な治療的なブレイクスルーを表す。
【０１６７】
以下にさらに詳細に記載されるように、本発明は、一部、この技術的ハードルおよびＷｎｔポリペプチドの治療的使用への他の障害に対する予測外の解決策を提供して、損傷および罹患した筋組織において修復および再生を増強する本発明のＷｎｔポリペプチドを企図する。
【０１６８】
（Ｄ．ポリペプチド）
【０１６９】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞シグナル伝達ネットワークの重要な成分である。上記ヒトＷｎｔ遺伝子ファミリーは、１９のメンバーからなり、２２個もしくは２４個のＣｙｓ残基およびいくつかの保存されたＡｓｎおよびＳｅｒ残基を有する、進化的に保存された糖タンパク質をコードする。例示的なヒトＷｎｔタンパク質としては、以下が挙げられる：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６。
【０１７０】
上記Ｗｎｔは、分泌型糖タンパク質であり、細胞外環境への輸送および放出前に、大いに改変されている。シグナル配列切断および小胞体（ＥＲ）への移動の後に、Ｗｎｔは、細胞内膜系を介して細胞表面へと輸送され、いくつかの改変を受ける。Ｗｎｔは、Ｎ結合型グリコシル化を受ける（Ｂｕｒｒｕｓ  ａｎｄ  ＭｃＭａｈｏｎ  １９９５；  Ｋａｄｏｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｋｏｍｅｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｓｍｏｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。多くのＷｎｔはまた、最初の保存されたシステイン（例えば、Ｗｎｔ１においてはＣ９３、Ｗｎｔ３ａにおいてはＣ７７、およびＷｎｔ５ａにおいてはＣ１０４（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋａｄｏｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｋｏｍｅｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３））においてパルミトイル化される。さらに、Ｗｎｔ３ａは、保存されたセリンであるＳ２０９（これはまた、Ｗｎｔ１（Ｓ２２４）およびＷｎｔ５ａにおいても保存されている）においてパルミトレイン酸で改変される（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。さらに、これら保存されたシステインおよびセリン残基は、多くのＷｎｔ（例えば、とりわけ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ１０ａ、およびＷｎｔ１１）のＮ末端において存在する（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０１７１】
Ｗｎｔアシル化は、分泌型Ｗｎｔのよく知られた疎水性の性質の原因であることは広く受け入れられている（Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。さらに、哺乳動物Ｗｎｔの翻訳後脂質付加は、機能にとって重要であると考えられている。Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、もしくはＷｎｔ５ａの保存されたＮ末端システインを変異させると、細胞培養物においてパルミトイル化が妨げられた。これら変異型Ｗｎｔは分泌されたが、ほとんどもしくは全くシグナル伝達活性を有しないことが示された（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋｏｍｅｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。そして非パルミトイル化Ｗｎｔは、Ｆｚｄレセプターを結合できないと考えられている（Ｋｏｍｅｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。Ｗｎｔ３ａの中心部分における保存されたセリンを変異させると、パルミトレイン酸付加が妨げられ、分泌がブロックされ、従って、活性がブロックされた（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｗｇに対する研究から、アシル化の重要性が確認された（Ｆｒａｎｃｈ−Ｍａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８ａ；  Ｎｕｓｓｅ  ２００３；  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。
【０１７２】
さらに、これらデータは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいてｐｏｒｃｕｐｉｎｅ（ｐｏｒｃ）表現型によって裏付けられ、これは、Ｗｇシグナル伝達の強力な喪失を示す（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。Ｐｏｒｃは、Ｗｇパルミトイル化（Ｚｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）およびＷｇがＥＲを出て行く（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）のに必要とされるＥＲ局在膜内在型Ｏ−アシルトランスフェラーゼである（Ｋａｄｏｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。脊椎動物Ｐｏｒｃはまた、Ｗｎｔ脂質付加を促進し、Ｗｎｔシグナル伝達およびＷｎｔ生物学的活性に必要とされる（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
【０１７３】
これら研究は、パルミトレイン酸改変が、分泌に必要とされ、Ｆｚｄ結合のためにパルミチン化するというモデルを確立する。従って、これらの報告された脂質改変のいずれかもしくは両方についてのＮ末端アミノ酸配列を欠いているＷｎｔポリペプチドは、生物学的活性を欠くと予測される。
【０１７４】
種々の実施形態において、本発明は、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するが、溶解度、生成、全身送達、および組織取り込みに悪影響を与えるＷｎｔのＮ末端における翻訳後修飾部位を除去するように操作された、Ｗｎｔポリペプチド、例えば、短縮型Ｗｎｔ、Ｗｎｔ融合ポリペプチドを一部企図する。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、幹細胞および前駆細胞の増殖および筋肥大を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進する。本明細書で使用される場合、用語「標準の」とは、天然に存在するポリペプチドに存在するアミノ酸もしくはアミノ酸の群に言及する。いくつかの状況において、「標準の」とは、上記天然に存在するポリペプチドに存在するアミノ酸に言及する場合、「天然の」と交換可能に使用される。
【０１７５】
特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは短縮され、例えば、天然ＷｎｔポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端のアミノ酸を欠く。ある特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｎ末端短縮および／もしくはＣ末端短縮を含むが、増大した標準および／もしくは非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するか、もしくは有する。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、そうではないと特定されなければ、従来の意味に従って、すなわち、ペプチド結合もしくは改変ペプチド結合によって連結されるアミノ酸の配列として交換可能に使用される。本発明のポリペプチドは、明細書中の他の箇所に記載されるとおりの、短縮型ポリペプチド、生物学的に活性なポリペプチドフラグメントおよび融合ポリペプチドを包含するがこれらに限定されない。ポリペプチドは、特定の長さに限定されない。例えば、上記ポリペプチドは、全長のタンパク質配列もしくは全長タンパク質のフラグメントを含んでいてもよいし、上記ポリペプチドの翻訳後修飾を含んでいてもよい（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の改変（天然に存在する、および天然に存在しないの両方））。本発明のポリペプチドは、種々の周知の組換えおよび／もしくは合成技術のうちのいずれかを使用して調製され得る。そのうちの例は、以下でさらに考察される。１つの実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、短縮型のＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、もしくはＷｎｔ１６ポリペプチドである。
【０１７７】
別の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、もしくはＷｎｔ１６ポリペプチドの全体、またはこれらの生物学的に活性なフラグメントを含むＦｃ融合ポリペプチドである。
【０１７８】
好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチド、もしくはＷｎｔ７ａ  Ｆｃ融合ポリペプチド、またはこれらの組み合わせである。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、用語「Ｗｎｔ７ａポリペプチド」とは、野生型Ｗｎｔ７ａ配列に対応するポリペプチド配列を有するＷｎｔ７ａタンパク質をいう。いくつかの実施形態において、用語「Ｗｎｔ７ａポリペプチド」とは、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドフラグメント、または参照となるＷｎｔ７ａ配列に対して少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％  ７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは約１００％同一であるＷｎｔ７ａアミノ酸配列を有するＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをいう。同一性は、少なくとも、約１０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、３００個、もしくはこれより多く連続したアミノ酸にわたって評価され得るか、または上記配列の全長にわたって評価され得る。同一性％もしくは相同性％を決定するための方法は、当該分野で公知であり、任意の適した方法が、この目的のために採用され得る。Ｗｎｔ７ａポリペプチドの例示的な例は、配列番号２〜２３に示される。
【０１８０】
しかし、特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、それらがＮ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含むように操作されており、そして特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含み、かつ非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。いくつかの実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含み、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠き、かつ非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含み、かつ非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するＷｎｔ７ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含み、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠き、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、用語「短縮型Ｗｎｔポリペプチド」、もしくは「Ｎ末端および／もしくはＣ末端の短縮もしくは欠失を含むＷｎｔポリペプチド」は、交換可能に使用され、Ｎ末端もしくはＣ末端のアミノ酸残基を欠いているＷｎｔポリペプチド、またはＷｎｔポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントもしくはその改変体、あるいは１もしくはより多くのアミノ酸欠失を含むこれらのホモログ、パラログ、もしくはオルソログをいう。本発明の特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、１もしくはより多くのアミノ酸欠失を含むが、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔポリペプチド活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、用語「Ｎ末端欠失」および「Ｎ末端短縮」は、しばしば交換可能に使用され、ポリペプチドからのＮ末端アミノ酸の欠失をいう。例えば：３４９アミノ酸を含み、２２０アミノ酸のＮ末端欠失を有するポリペプチドは、上記ポリペプチドのうちの１２９個のＣ末端アミノ酸を含むポリペプチドを生じる；３４９アミノ酸を含み、２３４アミノ酸のＮ末端欠失を有するポリペプチドは、上記ポリペプチドのうちの１１５個のＣ末端アミノ酸を含むポリペプチドを生じる；３４９アミノ酸を含み、２６３アミノ酸のＮ末端欠失を有するポリペプチドは、上記ポリペプチドのうちの８６個のＣ末端アミノ酸を含むポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、本発明に従うＷｎｔポリペプチド、例えば、Ｗｎｔ７ａは、少なくとも、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２５１個、２５２個、２５３個、２５４個、２５５個、２５６個、２５７個、２５８個、２５９個、２６０個、２６１個、２６２個、２６３個、２６４個、２６５個、２６６個、２６７個、２６８個、２６９個、２７０個、２７１個、２７２個、２７３個、２７４個、２７５個、２７６個、２７７個、２７８個、２７９個、２８０個、２８１個、２８２個、２８３個、もしくは２８４個のＮ末端アミノ酸のＮ末端欠失もしくはＮ末端短縮を含む。特定の実施形態において、Ｎ末端短縮を含むＷｎｔポリペプチドはまた、１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸の短縮もしくは欠失を含む。
【０１８３】
特定の実施形態において、本発明に従うＷｎｔポリペプチドは、１もしくはより多くのＷｎｔ脂質付加部位を排除するために十分なＮ末端欠失もしくはＮ末端短縮を含む。特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個もしくは３００個のＮ末端アミノ酸のＮ末端欠失を含む。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ末端欠失」および「Ｃ末端短縮」は、しばしば交換可能に使用され、１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸の、ポリペプチドからの欠失をいう。例えば：３４９アミノ酸を含み、１０アミノ酸のＣ末端欠失を有するポリペプチドは、上記ポリペプチドのうちの３３９個のＮ末端アミノ酸を含むポリペプチドを生じる；そして３４９アミノ酸を含み、２０アミノ酸のＣ末端欠失を有するポリペプチドは、上記ポリペプチドのうちの３２９個のＮ末端アミノ酸を含むポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、本発明に従うＷｎｔポリペプチドは、少なくとも、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、もしくは５０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失もしくはＣ末端短縮を含む。特定の実施形態において、Ｃ末端短縮を含むＷｎｔポリペプチドはまた、１もしくはより多くのＮ末端アミノ酸の短縮もしくは欠失を含む。
【０１８５】
特定の実施形態において、本発明に従う短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、本明細書中他の箇所で記載されるとおりの、１もしくはより多くのＮ末端アミノ酸短縮および１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸短縮を含む。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、約１０〜約３００個のＮ末端アミノ酸のＮ末端欠失もしくはＮ末端短縮、および約１〜約５０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失もしくはＣ末端短縮を含む。
【０１８６】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、約２２０〜約２８４個のＮ末端アミノ酸のＮ末端欠失もしくはＮ末端短縮、および約１〜約５０個のＣ末端アミノ酸のＣ末端欠失もしくはＣ末端短縮を含む。
【０１８７】
１つの実施形態において、本発明は、本明細書中他の箇所で記載されるとおりの１もしくはより多くのＮ末端アミノ酸短縮および１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸短縮を含むＷｎｔポリペプチドの最小限の生物学的に活性なフラグメントを含むＷｎｔポリペプチドを企図する。本明細書で使用される場合、用語「最小限の活性なフラグメント」もしくは「最小限の生物学的に活性なフラグメント」とは、天然に存在するＷｎｔポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持するＷｎｔポリペプチドフラグメントをいう。特定の実施形態において、本発明は、Ｗｎｔポリペプチドのうちの６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、もしくは１２９個連続したアミノ酸を含む、最小限の生物学的に活性なＷｎｔフラグメントを企図する。
【０１８８】
特定の実施形態において、天然に存在するＷｎｔポリペプチド活性、またはＷｎｔ生物学的活性は、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性である。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａ生物学的活性は、非標準Ｗｎｔ７ａシグナル伝達活性である。
【０１８９】
別の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列のうちの６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、もしくは１２９個連続したアミノ酸を含む、最小限の生物学的に活性なＷｎｔフラグメントが提供される。
【０１９０】
特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、当該分野で公知であるかまたは本明細書で言及されるかもしくは別の方法で開示される上記Ｗｎｔポリペプチドアミノ酸配列のうちの例えば、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、もしくは１５０個（それらの間にある全ての整数（例えば、１０１個、１０２個、１０３個）および範囲（例えば、５０〜７５個、７５〜１００個、１２５〜１５０個）を含む）連続した、または非連続のアミノ酸である、ポリペプチドフラグメントであり得る。特定の実施形態において、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメントは、天然に存在するＷｎｔポリペプチドの標準の活性関連配列、ドメインもしくはモチーフを含む。特定の実施形態において、本発明に従うＷｎｔポリペプチドは、本明細書中他の箇所で記載されるように、１もしくはより多くのＮ末端アミノ酸短縮および１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸短縮を含む。
【０１９１】
特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ａポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、本明細書で記載されるＷｎｔ７ａポリペプチドのうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの例えば、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、もしくは１２９個（それらの間にある全ての整数（例えば、１０１個、１０２個、１０３個）および範囲（例えば、５０〜７５個、７５〜１００個、１００〜１２９個）を含む）連続したまたは非連続のアミノ酸である、ポリペプチドフラグメントであり得る。特定の実施形態において、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドフラグメントは、天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドの標準の活性関連配列、ドメインもしくはモチーフを含む。特定の実施形態において、本発明に従うＷｎｔ７ａポリペプチドは、本明細書中他の箇所で記載されるとおりの１もしくはより多くのＮ末端アミノ酸短縮および１もしくはより多くのＣ末端アミノ酸短縮を含む。
【０１９２】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチドが天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドの活性を保持する限りにおいて、約２２０〜約２８４個のＮ末端アミノ酸（その間の全ての整数および範囲（例えば、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個）を含む）のＮ末端欠失もしくはＮ末端短縮、および約１〜約５０個のＣ末端アミノ酸（その間の全ての整数および範囲（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）を含む）のＣ末端欠失もしくはＣ末端短縮を含む。代表的には、上記生物学的に活性なフラグメントは、これが由来する天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドの活性（例えば、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性）の約１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、もしくは１００％以上を有する。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチド、例えば、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメントは、１種以上の細胞結合パートナー、例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターに、同じ細胞結合パートナーに対する天然に存在するＷｎｔポリペプチドの結合親和性の少なくとも、約１％、５％、１０％、２０％、３０、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の親和性で結合する。いくつかの実施形態において、選択された細胞結合パートナー、特に、標準の活性に関与する結合パートナーに対する短縮型Ｗｎｔポリペプチドの結合親和性は、天然に存在するＷｎｔポリペプチドの対応する結合親和性よりも、少なくとも約１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×またはそれを超えて（その間の全ての整数を含む）強いものであり得る。
【０１９４】
本発明は、１もしくはそれより多くのアミノ酸の変異、付加、もしくは置換を含むＷｎｔポリペプチド、短縮型Ｗｎｔポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメント、およびＷｎｔ融合ポリペプチドをさらに企図する。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、１もしくはそれより多くのアミノ酸の変異、付加、および／もしくは置換を含むが、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するかもしくはＷｎｔ生物学的活性が増大している。好ましくは、１もしくはそれより多くのアミノ酸変異、付加、および／もしくは置換を含むＷｎｔポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。
【０１９５】
本発明は、１もしくはそれより多くのアミノ酸の変異、付加、もしくは置換を含む、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドフラグメント、およびＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドをさらに企図する。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔ７ａポリペプチドは、１もしくはそれより多くのアミノ酸の変異、付加、および／もしくは置換を含むが、Ｗｎｔ７ａ生物学的活性を保持するかもしくはＷｎｔ７ａ生物学的活性が増大している。好ましくは、１もしくはそれより多くのアミノ酸変異、付加、および／もしくは置換を含むＷｎｔ７ａポリペプチドは、天然に存在するＷｎｔ７ａ活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」とは、天然において見いだされ得るポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列に言及する。例えば、天然に存在するポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列は、ある生物に存在するものであり、その生物から単離され得、それは、実験室において人間によって意図的に改変されていない。用語「野生型」は、しばしば、用語「天然に存在する」と交換可能に使用される。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「天然に存在するＷｎｔ活性」、「天然に存在するＷｎｔ７ａ活性」、「通常のＷｎｔ活性」、もしくは「改変されていないＷｎｔ活性」を保持するＷｎｔポリペプチド、例えば、Ｗｎｔ７ａ、短縮型、その生物学的に活性なフラグメントおよびＷｎｔ融合ポリペプチドとは、その対応する天然に存在するＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ７ａ）の生理学的応答または物理的特性もしくは薬物動態的特性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％である生理学的応答を生じるか、または物理的特性もしくは薬物動態的特性を有する、改変されたＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ７ａ）をいう。いくつかの実施形態において、本発明のＷｎｔ７ａポリペプチドは、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。
【０１９８】
本発明の状況において、短縮型ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、またはそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログ、または融合ポリペプチドは、これが、野生型タンパク質の活性のうちの約１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％、好ましくは、上記野生型タンパク質の活性のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％を示す場合に、上記野生型タンパク質と少なくとも実質的に同じ活性を有するとみなされる。特定の実施形態において、上記短縮型ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、またはそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログ、または融合ポリペプチドは、野生型タンパク質の活性のうちの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは約１００％を示す。特定の実施形態において、野生型活性より大きな活性が達成され得る。
【０１９９】
短縮型Ｗｎｔポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメントもしくは改変体、またはそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログ、またはＷｎｔ融合ポリペプチドの活性は、例えば、野生型Ｗｎｔ生物学的活性を摸倣するその能力を測定し（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激することによって（例えば、対称性の幹細胞増殖もしくは細胞成長を促進することによって））、その能力と、野生型タンパク質の活性とを比較することによって、決定され得る。幹細胞分裂（例えば、サテライト幹細胞分裂）、および細胞増殖（例えば、筋肥大）を測定し特徴付けるための方法は、当該分野で公知である。
【０２００】
本発明の短縮型ポリペプチドは、ポリペプチド改変体を含み得る。用語「改変体」とは、本明細書で使用される場合、本明細書中の他の箇所で考察され、当該分野で公知であるように、少なくとも１個のアミノ酸残基の改変、付加、欠失、もしくは置換によって参照ポリペプチドから区別されるポリペプチドに言及する。特定の実施形態において、ポリペプチド改変体は、１もしくはそれより多くのアミノ酸置換（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、もしくはそれより多くの置換）によって参照ポリペプチドから区別され、それは、保存的であっても非保存的であってもよい。例えば、種々の実施形態において、１もしくはそれより多くの保存的もしくは非保存的な置換は、上記天然に存在するＷｎｔポリペプチドにおいて見出される任意のアミノ酸残基において行われ得る。
【０２０１】
他の特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチド改変体は、天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔ経路シグナル伝達活性を増大させ、そして／または本発明のＷｎｔポリペプチドの安定性、溶解度、全身送達、および／もしくは組織取り込みを増大させるために、１もしくはそれより多くのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換を含む。
【０２０２】
このような改変体を生成するために、当業者は、例えば、表１に従って、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１個もしくはより多くを変化させ得る。
【０２０３】
【表１】
2014527818.tif 000003
【０２０４】
どのアミノ酸残基が，生物学的活性も免疫学的活性も破壊することなく、置換、挿入、もしくは欠失され得るかを決定することにおけるガイダンスは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲＴＭソフトウェア）を使用して見いだされ得る。所望される場合、アミノ酸置換は、ポリペプチドから官能基を変化させ、そして／もしくは除去するように行われ得る。あるいは、本明細書で開示されるタンパク質改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化であり得る（すなわち、同様に荷電したかもしくは荷電していないアミノ酸の置換）。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および荷電していない極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときおり、まとめて芳香族アミノ酸として分類される。表２を参照のこと。
【０２０５】
【表２】
2014527818.tif 000004
【０２０６】
他の置換も許容され、経験的に、または他の公知の保存的（もしくは非保存的）置換に従って決定され得る。
【０２０７】
このような変化を行うにあたって、アミノ酸のヒドロパシーインデックスが考慮され得る。タンパク質に対して相互作用的生物学的機能を付与することにおける上記アミノ酸のヒドロパシーインデックスの重要性は、一般に、当該分野で理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２（本明細書に参考として援用される））。特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシーインデックスもしくはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、類似の生物学的活性を有するタンパク質をなお生じる（すなわち、生物機能的に等価なタンパク質をなお得る）ことは、当該分野で公知である。このような変化を行うにあたって、ヒドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものは特に好ましく、±０．５以内であるものは、さらになお、特に好ましい。類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて、効率的に行われ得ることもまた、当該分野で理解される。
【０２０８】
本発明のポリペプチド改変体としては、グリコシル化形態、他の分子との集合性結合体、および関連しない化学部分との共有結合的結合体（例えば、ｐｅｇ化分子）が挙げられる。共有結合的改変体は、当該分野で公知であるように、官能基を、アミノ酸鎖において、またはＮ末端もしくはＣ末端の残基において見いだされる基に連結することによって、調製され得る。改変体としてはまた、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインが挙げられる。特定の実施形態では、上記タンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の短縮もしくは欠失もまた、改変である。
【０２０９】
機能に必須の、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位指向性変異誘発もしくはアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５，  １９８９））によって同定され得る。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴もしくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４：８９９−９０４，  １９９２およびｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２，  １９９２）によって決定され得る。
【０２１０】
特定の変化は、上記タンパク質の折りたたみにも活性にも大きく影響を及ぼさない。当業者が行うアミノ酸置換の数は、多くの要因（上記に記載されるものが挙げられる）に依存する。概して、任意の所定のポリペプチドあたりの置換の数は、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下もしくは３個以下である。
【０２１１】
さらに、ポリペプチドのｐｅｇ化および／もしくはムテインは、改善された特性（例えば、増大した半減期、溶解度、およびプロテアーゼ耐性）を提供すると予測される。Ｐｅｇ化は、当該分野で周知である。
【０２１２】
配列同一性は、２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の１次構造を比較し、第２の配列に対して第１の配列の１次構造を記載し、そして／または配列関連性（例えば、改変体およびホモログ）を記載するために使用され得る。配列同一性は、最大の対応を求めて整列された場合に同一である２つの配列における残基を測定する。ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列は、この２つの配列におけるアミノ酸の配列が以下に記載されるように、最大の対応となるように整列された場合に同じである場合、「同一」であるといわれる。配列関連性は、コンピューター実行アルゴリズムを使用して分析され得る。２つ以上のポリヌクレオチドもしくは２つ以上のポリペプチドの間の配列関連性は、上記配列の最良のアラインメントを計算し、上記アラインメントにおけるマッチおよびギャップをスコア付けすることによって決定され得、このことから、配列同一性％および配列類似性％が得られる。ポリヌクレオチド関連性はまた、各々がコードするポリペプチドの比較に基づいて記載され得る。配列の比較および分析のための多くのプログラムおよびアルゴリズムが公知である。
【０２１３】
２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウィンドウにわたって上記配列を比較して、配列類似性の局所の領域を同定および比較することによって、行われる。「比較ウィンドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０個（通常は、３０〜約７５個、４０〜約５０個）連続した位置のセグメントであって、このセグメントにおいて、一方の配列が、２つの配列が最適に整列された後に、同数の連続した位置の参照配列に対して比較され得るものをいう。
【０２１４】
２つの配列は、配列のこの対に関して可能な最高のスコアに到達するように、規定のアミノ酸置換マトリクス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップ存在ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーを使用して、類似性スコア付けのために上記２つの配列が整列された場合に、「最適に整列され」る。アミノ酸置換マトリクスおよび２つの配列間での類似性を定量するにあたってのそれらの使用は、当該分野で周知であり、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”  Ｉｎ  “Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．  ５，  Ｓｕｐｐｌ．  ３  （ｅｄ．  Ｍ．  Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ），  ｐｐ．  ３４５−３５２．  Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９において記載される。上記ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（図１０）はしばしば、配列アラインメントプロトコル（例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．０）においてデフォルトのスコア付け置換マトリクスとして使用される。上記ギャップ存在ペナルティーは、整列された配列のうちの１つにおける１アミノ酸ギャップの導入のために課され、上記ギャップ伸長ペナルティーは、既に空いたギャップの中に挿入される各さらなる空のアミノ酸位置のために課される。上記アラインメントは、可能な最高のスコアに到達するように、このアラインメントが始まって終わる各配列のアミノ酸位置によって、必要に応じて、一方もしくは両方の配列における１つのギャップもしくは複数のギャップの挿入によって、規定される。最適なアラインメントおよびスコア付けは、手動で達成され得るものの、上記プロセスは、コンピューター実行アラインメントアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２に記載され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において公に利用可能にされたｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．０）の使用によって容易にされる。最適なアラインメント（マルチプルアラインメントを含む）は、例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを介して利用可能であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２によって記載される）を使用して調製され得る。
【０２１５】
さらに、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ  ２：４８２の極所同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ２４４４の類似性検索法によって、これらアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実行によって、または目視（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって行われ得る。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドは、ＢＬＡＳＴアラインメントツールを使用して評価され得る。局所アラインメントは、配列セグメントの対（上記配列のうちの各々からの一方が比較されている）から単純になる。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもしくはＳｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの改変は、伸長もしくはトリミングによってスコアが改善され得ない全てのセグメント対（高スコア付けセグメント対（ＨＳＰ）と呼ばれる）を見いだす。上記ＢＬＡＳＴアラインメントの結果は、ＢＬＡＳＴスコアが偶然のみから予測され得る確率を示すために統計的尺度を含む。
【０２１６】
生のスコアであるＳは、各整列された配列と関連するギャップおよび置換の数から計算され、ここでより高い類似性スコアは、より意味のあるアラインメントを示す。置換スコアは、ルックアップテーブルによって与えられる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照のこと）。
【０２１７】
ギャップスコアは、代表的には、Ｇ（ギャップ開放ペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）およびＬ（ギャップ伸長ペナルティー）の合計として計算される。長さｎのギャップに関して、ギャップコストは、Ｇ＋Ｌｎである。ギャップコストＧおよびＬの選択は経験的であるが、Ｇの高い値（１０〜１５）、例えば、１１、およびＬの低い値（１〜２）、例えば、１を選択することは、慣例的である。
【０２１８】
ビットスコアであるＳ’は、上記使用されるスコア付けシステムの統計特性が考慮に入れられた生のアラインメントスコアＳから導出される。ビットスコアは、上記スコア付けシステムに関連して正規化され、従って、それらは、種々の検索からのアラインメントスコアを比較するために使用され得る。用語「ビットスコア」および「類似性スコア」は、交換可能に使用される。上記ビットスコアは、アラインメントがどの程度よいか；スコアが高いほど、アラインメントがよい、の指標を与える。
【０２１９】
上記Ｅ値、すなわち期待値は、類似性スコアを有する配列が偶然にデータベースに存在する確率を記載する。それは、データベース検索において偶然起こると予測されるＳ以上のスコアを有する種々のアラインメントの数の推定である。Ｅ値が小さいほど、アラインメントはより意味のあるものになる。例えば、Ｅ値  ｅ−１１７を有するアラインメントは、ある類似性スコアを有する配列が、単に偶然で起こる可能性が非常に小さいことを意味する。さらに、アミノ酸の無作為の対を整列することに関する予測されるスコアは、負である（ｎｅｇａｔｉｖｅ）であることが必要とされ、さもなければ、長いアラインメントが、整列されたセグメントが関連したか否かとは独立して、高いスコアを有する傾向にある。さらに、上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリクス、ヌクレオチドもしくはアミノ酸を使用し、ギャップ挿入アラインメントに関しては、ギャップ作製ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーを使用する。例えば、ポリペプチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントおよび比較は、代表的には、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用して行われる。
【０２２０】
１つの実施形態において、配列類似性スコアは、上記ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用して行われたＢＬＡＳＴ分析から報告される。
【０２２１】
特定の実施形態において、本明細書で提供される配列同一性／類似性スコアは、以下のパラメーターを使用してＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（ＧＣＧ，  Ａｃｃｅｌｒｙｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）を使用して得られる値をいう：ギャップ重み  ５０および長さ重み  ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア付けマトリクスを使用するヌクレオチド配列に関する同一性％および類似性％；ギャップ重み  ８および長さ重み  ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクスを使用するアミノ酸配列に関する同一性％および類似性％（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９９２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）。ＧＡＰは、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にする２つの完全な配列のアラインメントを見いだすために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−４５３のアルゴリズムを使用する。
【０２２２】
１つの詳細な実施形態において、上記短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２５６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、もしくは２７５のＢＬＡＳＴビットスコアもしくは配列類似性スコアを生成するために、配列番号３〜５のいずれか１つのポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２３】
１つの特定の実施形態において、上記短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも、ｅ−５２、ｅ−５３、ｅ−５４、ｅ−５５、ｅ−５６、ｅ−５７、ｅ−５８、ｅ−５９、ｅ−６０、ｅ−６１、ｅ−６２、ｅ−６３、ｅ−６４、ｅ−６５、ｅ−６６、ｅ−６７、ｅ−６８、ｅ−６９、ｅ−７０、ｅ−７１、ｅ−７２、ｅ−７３、ｅ−７４、ｅ−７５、ｅ−７６、ｅ−７７、ｅ−７８、ｅ−７９、もしくはｅ−８０のＢＬＡＳＴ  ｅ値スコアを生成するために、配列番号３〜５のいずれか１つのポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２４】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、類似性スコア  ２２０〜２７５を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、ｅ−７４〜２ｅ−７８のｅ値スコアを生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２５】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、類似性スコア  ２１０〜２４２を生成するために、配列番号４のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、ｅ値スコア  ｅ−６６〜ｅ−６９を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２６】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、類似性スコア  １７１〜１８４を生成するために、配列番号５のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、ｅ値スコア  ｅ−５２〜３ｅ−５２を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２７】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、類似性スコア  少なくとも２２０を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、ｅ値スコア  少なくともｅ−７４を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２８】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、類似性スコア  少なくとも２１０を生成するために、配列番号４のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、ｅ値スコア  少なくともｅ−６６を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２２９】
特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、類似性スコア  少なくとも１７１を生成するために、配列番号５のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。特定の実施形態において、短縮型Ｗｎｔポリペプチドは、ｅ値スコア  少なくともｅ−５２を生成するために、配列番号３のポリペプチド配列と最適に整列され得るアミノ酸配列を含み、ここで上記ＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ存在ペナルティー  １１、およびギャップ伸長ペナルティー  １を使用した。
【０２３０】
別の例示的アプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０個の位置の比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで上記比較ウィンドウにおけるポリペプチド配列の位置は、上記２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、もしくは１０〜１２％の付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。上記パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両配列において存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算される。
【０２３１】
（Ｅ．融合ポリペプチド）
【０２３２】
種々の実施形態において、本発明は、一部、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。１つの実施形態において、上記融合ポリペプチドは、短縮型Ｗｎｔポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメント、および／もしくは本明細書中の他の箇所に記載されるように、１もしくはより多くのアミノ酸変異、置換、および／もしくは付加をさらに含むこのようなポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａである。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含みかつ非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の欠失もしくは短縮を含み、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠き、かつ非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドである。好ましい実施形態において、上記融合ポリペプチドは、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。
【０２３３】
特定の実施形態において、本発明のＷｎｔ融合ポリペプチドは、幹細胞増殖を促進し、細胞および／もしくは組織の形成、再生、維持および修復を促進する。本発明のＷｎｔ融合ポリペプチドは、ヒトの損傷した筋組織および罹患した筋組織における修復および再生を増強する方法における使用のためである。
【０２３４】
融合ポリペプチドは、上記タンパク質のＮ末端においてシグナルペプチド（これは、翻訳と同時にもしくは翻訳後に上記タンパク質、短縮型Ｗｎｔポリペプチド、または生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメントの移動を指示する）を含み得る。融合ポリペプチドはまた、リンカーもしくはスペーサー、Ｆｃドメイン、１個以上のプロテアーゼ切断部位、または１個以上のエピトープタグまたは上記ポリペプチドの合成、精製もしくは生成を容易にするための他の配列を含み得る。
【０２３５】
融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、直接的にもしくはアミノ酸リンカーを介してのいずれかで、１個以上の異種ポリペプチド配列（融合パートナー）に共有結合的に連結された本発明のポリペプチドに言及する。上記融合タンパク質を形成するポリペプチドは、代表的には、Ｃ末端をＮ末端に連結されるが、それらはまた、Ｃ末端をＣ末端に、Ｎ末端をＮ末端に、またはＮ末端をＣ末端に連結され得る。上記融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序にあり得る。
【０２３６】
上記融合パートナーは、本質的に任意の望ましい目的のために設計され含まれ得るが、ただし、それらは、上記ポリペプチドの所望の活性に有害な影響を及ぼさない。例えば、１つの実施形態において、融合パートナーは、上記タンパク質の溶解度を増大させ、Ｗｎｔポリペプチドの生成および／もしくは精製を促進し、そして／またはＷｎｔの全身送達および／もしくは組織取り込みを促進するように、選択され得る。融合ポリペプチドは、化学合成法によって、または上記２つの部分の間の化学的連結によって生成されてもよいし、一般に、他の標準的技術を使用して調製されてもよい。１つの実施形態において、Ｗｎｔ（例えば、Ｗｎｔ７ａ）融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、および短縮型Ｗｎｔポリペプチド、または生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメントを含む。
【０２３７】
特定の実施形態において、Ｗｎｔ（例えば、Ｗｎｔ７ａ）融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、本明細書のどこかで記載されるとおりの短縮型Ｗｎｔポリペプチドもしくは生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメント、プロテアーゼ切断部位およびエピトープタグを含む。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」とは、分泌経路への進入を確実にするリーダー配列に言及する。分泌型タンパク質の産業的生成のために、上記生成されるべきタンパク質は、宿主細胞もしくは宿主生物から効率的に分泌される必要がある。上記シグナルペプチドは、例えば、上記生成されるべきタンパク質の天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドであり得る。多くのシグナルペプチドは、分泌型タンパク質の生成のために使用される。
【０２３９】
本発明の融合ポリペプチドにおいて使用するためのシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ３３シグナルペプチド；免疫グロブリンシグナルペプチド（例えば、ＩｇＧκシグナルペプチドもしくはＩｇＧμシグナルペプチド）；成長ホルモンシグナルペプチド；エリスロポエチンシグナルペプチド；アルブミンシグナルペプチド；分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチド（例えば、ロタウイルス（ｒｏｔｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ７糖タンパク質シグナルペプチド）。
【０２４０】
特定の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、短縮型Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ７ａ）の精製および生成を促進するために、プロテアーゼ切断部位およびエピトープタグを含む。上記プロテアーゼ切断部位の位置は、代表的には、上記Ｗｎｔを細胞もしくは組織へ送達する前の、異種配列の除去を促進するために、上記ＷｎｔポリペプチドのＣ末端と上記エピトープタグとの間にある。
【０２４１】
本発明の融合タンパク質において使用され得る異種プロテアーゼ切断部位の例としては、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４２】
本発明の融合タンパク質において使用され得るエピトープタグの例としては、ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
融合タンパク質は、一般に、標準的技術を使用して調製され得る。例えば、所望の融合物のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々に組み立てられ得、適切な発現ベクターへと連結され得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーありもしくはなしで、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結され、その結果、上記配列のリーディングフレームが、一致している。このことは、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【０２４４】
ペプチドリンカー配列はまた、融合ポリペプチド成分を、所望であれば、その二次構造および三次構造へと各ポリペプチドが折りたたまれることを確実にするために十分な距離だけ、分離するために使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的技術を使用して、上記融合タンパク質へ組み込まれる。特定のペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）それらが可撓性の伸長したコンホメーションを採用できること；（２）それらが、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できないこと；ならびに（３）上記ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性残基もしくは荷電した残基がないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。他の中性に近いアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）はまた、上記リンカー配列において使用され得る。通常リンカーとして使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４０：３９  ４６  （１９８５）；  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８２５８  ８２６２  （１９８６）；米国特許第４，９３５，２３３号および同第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。上記リンカー配列は、一般に、長さが１〜約５０個のアミノ酸であり得る。リンカー配列は、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、上記機能的ドメインを分離し、立体障害を妨げるために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には、必要とされない。上記２つのコード配列は、いかなるリンカーもなしで直接、または１〜３回反復されるペンタマーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒから構成される可撓性ポリリンカーを使用することによって、融合され得る。このようなリンカーは、ＶＨとＶＬとの間に挿入されることによって一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築するにあたって使用されてきた（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：５９７９−５８８３）。上記リンカーは、上記一本鎖抗体の可変領域を形成する２つのβ−シートの間での正しい相互作用を可能にするように設計される。使用され得る他のリンカーとしては、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７：１０６６−１０７０）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）が挙げられる。
【０２４５】
一般に、ポリペプチド、融合ポリペプチド（ならびにそれらをコードするポリヌクレオチド）、および細胞は、単離される。「単離された」ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、その本来の環境から取り出されているものである。例えば、「単離されたペプチド」もしくは「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、ペプチドもしくはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の成分との会合からの、インビトロでの単離および／もしくは精製に言及する（すなわち、それは、インビボでの物質と顕著に会合していない）。同様に、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態において上記ポリヌクレオチドと隣接している配列から精製されたポリヌクレオチドに言及する（例えば、ＤＮＡフラグメントに通常隣接して存在する配列から取り出された上記フラグメント）。ポリヌクレオチドは、例えば、これが天然の環境の一部ではないベクターにクローニングされている場合に、単離されているとみなされる。「単離された細胞」とは、インビボの組織もしくは器官から得られていて、細胞外マトリクスを実質的に含まない細胞に言及する。好ましくは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは細胞は、これらが少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは、少なくとも約９５％純粋、および最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋である場合に単離されている。
【０２４６】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、細胞においてもしくは合成されて融合タンパク質として発現され得、次いで、精製され得る。
【０２４７】
他の実施形態において、１以上のポリペプチドは、それらが細胞においてもしくは合成されて生成された後に、融合され得る。一般に、当該分野で公知であり本明細書で記載される技術によれば、融合物中の個々のポリペプチドが生成された後に融合されたポリペプチドは、共有結合され得るか、または必要に応じて、広く種々の生体適合性ポリマーもしくは関連しない化学部分を介して結合体化され得る。共有結合改変体は、当該分野で公知であるように、アミノ酸鎖において、またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見いだされる基に官能基を連結することによって調製され得る。さらに、非ペプチドポリマー（例えば、少なくとも２つの共有結合した非ペプチド部分）としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、オリゴサッカリド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせが挙げられ、これらは、２つ以上のポリペプチド配列を融合するためにスペーサーもしくはリンカーとして作用し得る。適切な非ペプチドポリマーの例としては、ＰＥＧ、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびポリ−エチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、用語「〜から得られる」とは、サンプル（例えば、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド）が、特定の供給源（例えば、組換え宿主細胞）から単離されているかもしくはこれに由来することを意味する。別の実施形態において、用語「〜から得られる」とは、インビボでの組織もしくは器官のような供給源から単離されているかもしくはこれに由来する細胞をいう。
【０２４９】
種々の実施形態において、短縮型Ｗｎｔタンパク質およびＦｃドメインを含む融合ポリペプチドが提供される。上記Ｆｃドメインは、別のポリペプチド（例えば、リンカーポリペプチドもしくはＷｎｔポリペプチド）のＮ末端もしくはＣ末端に融合され得る。上記Ｆｃ融合物は、分子シャペロン（タンパク質の安定性および溶解度を改善する）として作用し得る。上記Ｆｃ融合物はまた、インビボでの薬物動態的特性に対して大きな影響を有し得る（分子量を増大させ、腎臓濾過を介した排出を妨げることの両方によって、および身体の多くの細胞に存在する新生児型Ｆｃレセプターを介して、上記タンパク質を循環させることによって、上記タンパク質の半減期を延ばす）。治療用の抗体および治療用のＦｃ融合タンパク質は、免疫応答を刺激もしくは阻害することによって作用し得る：エフェクター細胞上のＦｃγレセプターとの相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のような免疫機能を生じる。
【０２５０】
４つのヒトＩｇＧアイソタイプ（１、２、３および４）は、活性化Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂレセプター、および補体第１成分（Ｃ１ｑ）を異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能を生じる。例えば、ＩｇＧ１は、強力なＡＤＣＣおよびＣＤＣ応答を誘導するのに対して、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソフォームは、正に調節するＦｃγレセプターに対して大きく低下した親和性を有する。従って、特定のＩｇＧアイソフォームＦｃドメインは、特定のエフェクター機能が必要とされる場合に使用され得る。免疫応答が治療上望ましくない場合、ＩｇＧ４サブタイプＦｃが使用され得るか、または低下したエフェクター機能を有するように操作された他のサブタイプＦｃドメインが使用され得る。免疫応答をもたらす特定のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの点変異は、当該分野で公知である（Ｃｈａｍｅｓ  ２００９）。
【０２５１】
特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、短縮型ＷｎｔポリペプチドおよびＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔ−Ｆｃドメイン融合ポリペプチドは、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するが、ＡＤＣＣ応答およびＣＤＣ応答を誘導しない。上記Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのうちのいずれかから得られ得る。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、変異したＦｃ領域である。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、Ｎ末端において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個のアミノ酸が（例えば、ヒンジドメインにおいて）短縮されている。
【０２５２】
特定の実施形態において、本発明のＷｎｔ融合ポリペプチドは、本明細書のどこかで記載されるとおりのＮ末端および／もしくはＣ末端での短縮型Ｗｎｔポリペプチドまたは生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメント、ならびにＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔ融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、本明細書のどこかで記載されるとおりのＮ末端および／もしくはＣ末端での短縮型Ｗｎｔポリペプチドまたは生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメント、プロテアーゼ、ならびにＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、これらＷｎｔ融合ポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端での欠失もしくは短縮を含み、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠き、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。好ましい実施形態において、これらＷｎｔ−Ｆｃドメイン融合タンパク質は、検出可能なＡＤＣＣ活性もしくはＣＤＣ活性を有しない。種々の関連する実施形態において、これらＷｎｔ−Ｆｃドメイン融合タンパク質は、Ｗｎｔ生物学的活性を保持し、天然のＷｎｔポリペプチドと比較して、改善された生成、分泌、および／もしくは安定性を有する。
【０２５３】
さらなる実施形態において、本発明のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、本明細書のどこかで記載されるとおりのＮ末端および／もしくはＣ末端での短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたは生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドフラグメント、ならびにＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、本明細書で記載されるとおりのＮ末端および／もしくはＣ末端での短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチドまたは生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチドフラグメント、プロテアーゼ、ならびにＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、これらＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端での欠失もしくは短縮を含み、１もしくはより多くの脂質付加部位を欠き、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持する。好ましい実施形態において、これらＷｎｔ７ａ−Ｆｃドメイン融合タンパク質は、検出可能なＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も有さない。種々の関連する実施形態において、これらＷｎｔ７ａ−Ｆｃドメイン融合タンパク質は、Ｗｎｔ生物学的活性を保持し、天然のＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、改善された生成、分泌、および／もしくは安定性を有する。
【０２５４】
（Ｆ．ポリヌクレオチド）
【０２５５】
本発明はまた、本発明のＷｎｔポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。種々の実施形態において、本発明は、一部、Ｗｎｔ生物学的活性を保持する、およびいくつかの実施形態においては、増大したＷｎｔシグナル伝達活性を有する、ポリペプチド短縮物または生物学的に活性なフラグメントまたはＷｎｔ融合ポリペプチドをコードするＷｎｔポリヌクレオチドを企図する。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリヌクレオチドは、幹細胞増殖を促進し、細胞および／または組織の形成、再生、維持および修復を促進するＷｎｔポリペプチドをコードする。
【０２５６】
本発明のＷｎｔポリヌクレオチドは、Ｗｎｔポリペプチドの臨床スケール生成のために、ならびにヒトにおける損傷および罹患した筋組織において修復および再生を増強するための方法において使用するために、適している。特定の実施形態において、Ｗｎｔポリヌクレオチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加のための天然のアミノ酸のうちの１もしくはより多くを欠いているＷｎｔポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態において、Ｗｎｔポリヌクレオチドは、ＷｎｔポリペプチドもしくはＷｎｔ融合ポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端の１もしくはより多くのアミノ酸欠失もしくは短縮を含む短縮型Ｗｎｔポリペプチドをコードする。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリヌクレオチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１もしくはより多くのアミノ酸の欠失もしくは短縮を含むが、Ｗｎｔ生物学的活性（例えば、標準のおよび非標準のＷｎｔシグナル伝達活性）を保持するかもしくはＷｎｔ生物学的活性が増大している、Ｗｎｔ融合ポリペプチドもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドをコードする。
【０２５７】
核酸は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，  ３−１９；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９９／５４４５９；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３，  ２６７７−２６８４；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．，  ７４，  ５９−６８；  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ６１，  ３３−４５；およびＢｒｅｎｎａｎ，  米国特許第６，００１，３１１号に記載されるように、当該分野で公知のプロトコルを使用して合成され得る。
【０２５８】
「ヌクレオチド」とは、リン酸化糖とＮ−グリコシド結合した複素環式窒素塩基を意味する。ヌクレオチドは、天然の塩基（標準）、および当該分野で周知の改変塩基を含むことが、当該分野で認識されている。このような塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖およびリン酸基を含む。上記ヌクレオチドは、上記糖、リン酸および／もしくは塩基部分において改変されていなくてもよいし、改変されていてもよい（また、ヌクレオチドアナログ、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどと交換可能に言及される（例えば、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，前出；  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／０７０６５；  Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；  Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，前出を参照のこと））。当該分野で公知の改変核酸塩基のいくつかの例は、以下によってまとめられる：Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ２１８３−２１９６）。
【０２５９】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、特定の種の総ゲノムＤＮＡを含まずに単離されたＤＮＡ分子に言及する。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、１種以上のコード配列を含み、上記ＤＮＡセグメントが得られる種の総ゲノムＤＮＡからなお実質的に単離されているか、または総ゲノムＤＮＡを含まずに精製されているＤＮＡセグメントに言及する。用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれるのは、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、さらに、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる）である。
【０２６０】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、ゲノム外配列、およびプラスミドコード配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現するように適合され得るより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、天然に単離されていてもよいし、組換えであってもよいし、人の手によって合成して改変されていてもよい。
【０２６１】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）分子であっても、ＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列もしくは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよいが、存在している必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／もしくは支持物質に連結されていてもよいが、連結されている必要はない。
【０２６２】
ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、本発明のポリペプチドもしくはその一部をコードする内因性の配列）を含んでいてもよいし、改変体、またはこのような配列の生物学的機能の等価物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書中他の箇所で記載されるように、１もしくはより多くの置換、付加、欠失および／もしくは挿入を含んでいてもよく、好ましくは、その結果として上記改変体は、標準の脂質付加部位を欠いているが、生物学的活性（例えば、経路シグナル伝達活性）を保持し、いくつかの実施形態において、該活性の増大を有するポリペプチドをコードする。
【０２６３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、含まれる。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするとは、互いに対して少なくとも６０％同一なヌクレオチド配列がハイブリダイズを保つハイブリダイゼーションプロトコルを記載する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、プローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドをその標的配列にのみハイブリダイズさせ得る条件である。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる。中程度にストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドが、本発明の核酸の全体、フラグメント、誘導体もしくはアナログにハイブリダイズするように、高ストリンジェンシーのためのものよりはストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件を使用する条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  １９８９）。中程度にストリンジェントな条件は、以下に記載される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  １９９０）。低ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドが、本発明の核酸の全体、フラグメント、誘導体もしくはアナログにハイブリダイズするように、中程度のストリンジェンシーのためのものよりはストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件を使用する条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  １９８９）。低ストリンジェンシーの条件（例えば、種交叉ハイブリダイゼーションのための条件）は、以下に記載される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  １９９０；  Ｓｈｉｌｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  １９８１）。
【０２６４】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに同一もしくは相補的な配列の連続する範囲の種々の長さを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも、約６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８または１２９個連続するアミノ酸残基をコードする。遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在する（ヒトおよび／もしくは霊長類のコドン選択のために最適化されているポリヌクレオチドが挙げられる）ことは、当業者によって認識される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子もまた、使用され得る。
【０２６５】
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のうちのいずれかを使用して、同定、調製および／もしくは操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９，および他の類似の参考文献を参照のこと）。
【０２６６】
種々の発現ベクター／宿主系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含み、発現するために利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌）；酵母発現ベクターで形質転換される酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられる昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換される植物細胞系；または哺乳動物細胞系。
【０２６７】
発現ベクターに存在する用語「制御エレメント」もしくは「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う、ベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）である。ベクター成分としては、一般に、以下のうちの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１種以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、宿主生物によって認識されるプロモーター、および転写終結配列。特異的な開始シグナルもまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。
【０２６８】
宿主細胞系統は、これら系統が、挿入される配列の発現を調節するかもしくは発現されるタンパク質を所望の様式においてプロセシングする能力に対して選択され得る。上記ポリペプチドのこのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。上記タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折りたたみ、および／もしくは機能を促進するために使用され得る。例示的哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、マウスＬＳＬ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞、ＹＩ細胞、ＮＳＯおよびＳＰ２／０マウスハイブリドーマ細胞など、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞もしくは他の不死化細胞および／もしくは形質転換された細胞（これらは、このような翻訳後活性に関して特異的な細胞装置および特徴的な機構を有する））は、高い発現および正確な改変、ならびに外来タンパク質のプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０２６９】
ポリヌクレオチドがコードする生成物の発現を、上記生成物に対して特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野で公知である。例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよび他のアッセイは、他の箇所の中でも特に、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９９０）およびＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １５８：１２１１−１２１６  （１９８３）に記載される。
【０２７０】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からの上記タンパク質の発現および回収に適した条件下で培養され得る。組換え細胞によって生成されるタンパク質は、使用される配列および／もしくはベクターに依存して、分泌され得るかもしくは細胞内に含まれ得る。
【０２７１】
組換え生成法に加えて、本発明のポリペプチド、およびそのフラグメントは、固相技術を使用する直接ペプチド合成によって生成され得る（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５４  （１９６３））。タンパク質合成は、手動の技術を使用して、もしくは自動化技術によって、行われ得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別個に化学合成され、全長分子を生成するために化学的方法を使用して組み合わされてもよい。
【０２７２】
（Ｇ．組成物）
【０２７３】
種々の実施形態において、本発明は、一部、Ｗｎｔポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドの新規な組成物を企図する。本明細書中他の箇所で考察されるように、Ｗｎｔの治療的使用への大きな制限もしくは障害のうちの１つは、それらの低い溶解度であり、このことは、臨床スケールで生成することを実行不能にする。本発明者らは、増大した溶解度、安定性、生産、全身送達および組織取り込みを有し、天然に存在するＷｎｔと比較して、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大を有する新規なＷｎｔポリペプチドを操作して作った。特定の実施形態において、本発明は、幹細胞増殖および筋肥大を促進し、細胞および/または組織の形成、再生、維持および修復を促進するために、可溶性Ｗｎｔポリペプチドの水性製剤を提供する。
【０２７４】
本発明の組成物は、本明細書に記載されるように、１種以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、上記を含むベクターなど、ならびに１種以上の薬学的に受容可能な塩、キャリア、希釈剤、賦形剤および／または細胞もしくは動物への生理学的に受容可能な投与用の溶液を、単独で、または１種以上の他の治療の様式と組み合わせてのいずれかで、含み得る。所望であれば、本発明の組成物は、他の薬剤との組み合わせにおいて（例えば、他のタンパク質、ポリペプチド、低分子もしくは種々の薬学的に活性な因子）投与され得ることもまた、理解される。また、上記組成物に含まれ得る他の成分には実質的に限定はないが、ただし、上記さらなる因子は、上記Ｗｎｔ組成物の治療能力（例えば、上記組成物が筋肥大を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進する能力）に有害な影響を及ぼさない。
【０２７５】
「薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤」は、米国食品医薬品局によってヒトもしくは家畜における使用に受容可能であると承認された任意のアジュバント、キャリア、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、フレーバーエンハンサー（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定化剤、等張剤、溶媒、または乳化剤を包含するが、これらに限定されない。
【０２７６】
薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る物質の他の例としては、以下が挙げられる：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤（例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス）；（９）油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、コーン油および大豆油）；（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）；（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）；（１３）アガー；（１４）緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／もしくはポリ無水物；（２２）薬学的に受容可能な細胞培養培地；ならびに（２３）薬学的製剤において使用される他の非毒性の適合性の物質。
【０２７７】
賦形剤は、この点に関して、広く種々の目的（例えば、製剤の物理的、化学的、もしくは生物学的な特性を調節する（例えば、粘度の調節）のために、ならびに／または有効性を改善するために、および／もしくは例えば、製造、輸送、貯蔵、使用前の調製、投与の間に、およびその後に起こるストレスに起因する分解および損傷に対してこのような製剤およびプロセスを安定化させるために、本発明のプロセスを調節するために本発明において使用され得る。
【０２７８】
種々の解説が、この点に関して有用なタンパク質安定化および製剤物質、ならびに方法について（特に、一部、本発明に従う製剤のためのそれらの賦形剤およびプロセスに関係して、特に、タンパク質の薬学的製品ならびに獣医学的および／もしくはヒトの医学的使用のためのプロセスに関して）利用可能である：例えば、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ８（３）：  ２８５−９１  （１９９１）；  Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ」，  ｉｎ：  ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ：  ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，  ｅｄｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １３：  ６１−８４  （２００２）、およびＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：  １５９−７５  （２００２）（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）。
【０２７９】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、シクロデキストリンおよび誘導体、セルロース、リポソーム、ミセル形成薬剤（例えば、胆汁酸）、およびポリマーキャリア（例えば、ポリエステルおよびポリ無水物）からなる群より選択される賦形剤を含む。
【０２８０】
特定の実施形態において、組成物、特に、薬学的タンパク質組成物は、タンパク質および溶媒を含み、１種以上の薬学的に受容可能な界面活性剤、好ましくは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンの他の脂肪酸エステル、ポリエトキシレート、およびポロキサマー１８８のうちの１種以上、特に好ましくは、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０、好ましくは、約０．００１〜０．１％  ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０、非常に好ましくは、約０．００２〜０．０２％  ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０、特に、０．００２〜０．０２％  ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０をさらに含む。多くの他のこのような界面活性剤は、本発明の実施形態において使用され得る。このような他のものの中でも特に含まれるのは、以下である：Ｔｗｅｅｎ  ２０（約０．０００５％〜約０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０が挙げられるが、これらに限定されない）；コール酸ナトリウム（約０．００１％〜約０．０１％  コール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない）；グリココール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｈｏｌａｔｅ）（約０．００１％〜約０．０１％  グリココール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｈｏｌａｔｅ）が挙げられるが、これらに限定されない）；デオキシコール酸ナトリウム（約０．００１％〜０．０１％  デオキシコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない）；グリコデオキシコール酸ナトリウム（約０．００１％〜約０．０１％  グリコデオキシコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない）；ＣＨＡＰＳ（約０．００１％〜約０．０１％  ＣＨＡＰＳが挙げられるが、これらに限定されない）；ＣＨＡＰＳＯ（約０．００１％〜約０．０１％  ＣＨＡＰＳＯが挙げられるが、これらに限定されない）；Ｅｍｐｈｉｇｅｎ  ＢＢ（約０．００１％〜約０．０１％  Ｅｍｐｈｉｇｅｎ  ＢＢが挙げられるが、これらに限定されない）；ＳＤＳ（約０．００１％〜約０．０１％  ＳＤＳが挙げられるが、これらに限定されない）；Ｍｅｇａ−８（約０．００１％〜約０．０１％  Ｍｅｇａ−８が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｇｅｎｅｐｏｌ  Ｃ−１００（約０．００１％〜約０．０１％  Ｇｅｎｅｐｏｌ  Ｃ−１００が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｂｒｉｊ  ３５（約０．００１％〜約０．０１％  Ｂｒｉｊ  ３５が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（約０．００１％〜約０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（約０．００１％〜約０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２（約０．００１％〜約０．０１％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２が挙げられるが、これらに限定されない）；ＰＥＧ−８０００（約０．００１％〜約０．０１％  ＰＥＧ−８０００が挙げられるが、これらに限定されない）；ＰＥＧ−４０００（約０．００１％〜約０．０１％  ＰＥＧ−４０００が挙げられるが、これらに限定されない）；ＨＰＣＤ（約０．００１％〜約０．１％  ＨＰＣＤが挙げら���るが、これらに限定されない）；およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−  １００（約０．００１％〜約０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０２８１】
「薬学的に受容可能な塩」は、酸付加塩および塩基付加塩の両方を包含する。
【０２８２】
「薬学的に受容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にも他の点でも望ましくないものではなく、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられるが、これらに限定されない）および有機酸（例えば、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、カンファー酸、カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸（ｇｆｉｉｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて形成される塩をいう。
【０２８３】
「薬学的に受容可能な塩基付加塩」とは、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にも他の点でも望ましくないものではない塩をいう。これら塩は、上記遊離酸への無機塩基もしくは有機塩基の添加から調製される。無機塩基から得られる塩としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩など。好ましい無機塩は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。有機塩基から得られる塩としては、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などのような、一級、二級、および三級アミン、置換されたアミン（天然に存在する置換されたアミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂が挙げられる）の塩が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。
【０２８４】
「薬学的組成物」とは、本発明の化合物および哺乳動物（例えば、ヒト）への上記生物学的に活性な化合物の送達に関して当該分野で一般に受けいれられている媒体の製剤をいう。このような媒体としては、そのための全ての薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤が挙げられる。
【０２８５】
例えば、ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ６２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｏｒａｄｅｌｌ，  ＮＪ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，  ２００８；  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｅｌｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００５；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２０００；およびＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，  Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＮＪ：  Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ２００６（これらの各々は、関連部分が参考として援用される）に記載されるように、組成物を製剤化するさらなる方法は、当業者に公知である。
【０２８６】
特定の環境において、本明細書で開示される組成物を非経口送達することが、望ましい。本明細書で使用される場合、語句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、経腸的投与および局所投与以外の、通常は、注射による、投与の様式をいい、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および胸骨内の注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（各々は、その全体が本明細書に参考として具体的に援用される）を参照のこと。
【０２８７】
特定の実施形態において、上記組成物は、鼻内スプレー、吸入、および／もしくは他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を、鼻のエアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（各々、その全体において本明細書に参考として具体的に援用される）に記載されている。同様に、鼻内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（その全体において本明細書に参考として具体的に援用される））を使用する薬物の送達もまた、薬学分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリクスの形態における経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体において本明細書に参考として具体的に援用される）に記載されている。
【０２８８】
（Ｈ．送達方法）
【０２８９】
１つの実施形態において、細胞（例えば、サテライト幹細胞のような幹細胞）は、１種以上の本発明のＷｎｔポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物と接触させられる。本発明の細胞は、インビトロ、エキソビボ、もしくはインビボで接触させられ得ることが企図される。他の実施形態において、本発明のＷｎｔ組成物は、被験体に投与される。
【０２９０】
本発明の組成物は、上記被験体に直接投与され得るか（タンパク質／ポリペプチドとして、もしくは遺伝子治療のための発現ベクターの状況において）、またはエキソビボで、上記被験体に由来する細胞に送達され得る（例えば、エキソビボ遺伝子治療におけるように）。上記組成物の直接的なインビボ送達は、一般に、非経口注射によって（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、心筋に、腫瘍内に、腫瘍周囲に、もしくは組織の間質空間に）達成される。他の投与様式としては、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用、ニードル、および遺伝子銃もしくはハイポスプレーが挙げられる。
【０２９１】
本発明の組成物はまた、組織（例えば、筋）への直接注射によって投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の組成物は、上記組成物を、注射した筋における筋喪失を防止するか、または上記注射した筋の再生もしくは修復を促進するために（例えば、上記注射した筋の筋細胞の増殖もしくは肥大を促進することによって）、筋組織へ直接注射することによって、投与され得る。
【０２９２】
一般に、エキソビボおよびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中の上記ポリヌクレオチドの被包、上記ＤＮＡの、核への直接マイクロインジェクション、およびウイルス媒介性（例えば、アデノウイルス（およびアデノ随伴ウイルス）もしくはアルファウイルス）によって達成され得、全て当該分野で周知である。
【０２９３】
特定の実施形態において、１種以上の改変Ｗｎｔを、ウイルスベクターもしくは他のインビボポリヌクレオチド送達技術を使用して送達することは、好ましい。好ましい実施形態において、上記ウイルスベクターは、非組み込みベクターもしくはトランスポゾンベースのベクターである。これは、種々の周知のアプローチのうちのいずれか（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含むベクター）を使用して、または発現構築物として他のウイルスベクター（ワクシニア・ウイルス、ポリオウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、達成され得る。
【０２９４】
非ウイルス法もまた、本発明のポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して細胞に、もしくは注射を介して組織に（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  もしくはＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ＆  Ｒｅｓｈｅｆ  （１９８６）に記載される技術を使用することによって）、直接投与され得る。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、インビボで類似の様式において移入され得、上記遺伝子生成物を発現し得ることは、想定される。
【０２９５】
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞へ移入するための本発明の別の実施形態は、粒子ボンバードメントを伴い得る。この方法は、ＤＮＡコート微粒子を高速へと加速して、細胞膜を貫通し、細胞を死滅させることなく細胞に入れることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞へ投与される。
【０２９６】
（Ｉ．処置方法）
【０２９７】
本発明のＷｎｔポリペプチド（短縮型Ｗｎｔ７ａ歩、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチド、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチドを包含するがこれらに限定されない）および組成物は、種々の治療適用に有用である。例えば、本明細書に記載される組成物および方法は、必要な被験体における組織形成、再生、修復もしくは維持を促進するために有用である。
【０２９８】
本発明のＷｎｔ組成物に関していくつかの関連する治療適用としては、筋肉喪失を防止するか、または失われたもしくは損傷した筋組織を、筋肉のサイズ、体積もしくは強度を増大させることによって再生する必要がある状況が挙げられる。このような状況は、例えば、化学療法もしくは放射線療法の後、筋肉損傷の後、または筋肉に影響を及ぼす疾患および状態の処置もしくは管理において、が挙げられ得る。特定の実施形態において、上記筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態としては、尿失禁、消耗性疾患（例えば、悪液質（これは、がんもしくはＡＩＤＳのような病気と関連し得る））、筋減衰もしくは萎縮症、または筋変性疾患が挙げられ得る。筋減衰および萎縮症は、例えば、サルコペニア（加齢性サルコペニアが挙げられる）、ＩＣＵ誘導性虚弱、筋肉の不使用（例えば、昏睡、麻痺、傷害、もしくは固定に起因する筋肉の不使用）、手術誘導性虚弱（例えば、股関節置換もしくは膝関節置換の後）、または筋変性疾患（例えば、筋ジストロフィー）と関連し得る。この列挙は、網羅的ではない。
【０２９９】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび組成物は、筋肉サテライト細胞の対称性の増殖を刺激し、それによって、筋組織における常在のサテライト細胞、もしくはコミットメントされた前駆細胞の割合を増大させるために、使用され得る。上記ポリペプチドおよび組成物はまた、筋肥大を（例えば、個々の筋線維のサイズを増大させることによって）促進するために使用され得る。本発明のポリペプチドおよび組成物は、従って、筋細胞の数および筋細胞のサイズの両方を増大させ得、結果として、例えば、損傷したもしくは欠損した組織を置換するか、または筋萎縮症もしくは筋質量の喪失を防止するために、特に、筋肉に影響を及ぼす疾患および障害（例えば、筋ジストロフィー、神経筋疾患および神経変性疾患、筋消耗性疾患および状態、萎縮症、心血管疾患、脳卒中、心不全、心筋梗塞、がん、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなど）に関連して、有用であり得る。
【０３００】
さらなる実施形態において、上記組成物および方法は、機能不全の骨格筋（例えば、筋変性疾患を有する被験体において）を修復もしくは再生するために有用である。上記被験体は、骨格筋損傷、変性もしくは萎縮症を有すると疑われる得か、これらを有するリスクがあり得る。上記骨格筋損傷は、疾患に関連してもよいし、疾患に関連していなくてもよい。上記ヒト被験体は、筋変性もしくは筋消耗を有し得るか、またはこれらを有するリスクがあり得る。上記筋変性もしくは筋消耗は、全体として、もしくは一部は、疾患（例えば、ａｉｄｓ、がん、筋変性疾患、もしくはこれらの組み合わせ）によって引き起こされ得る。
【０３０１】
筋ジストロフィーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病としても公知）、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィーおよびエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３１８．１３６３−１３６８  （１９８８）；  Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ，  Ｃ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｅｄ．，  ８：  ５６９−５８２  （１９９６）；  Ｗｏｒｔｏｎ，  Ｒ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７０：  ７５５−７５６  （１９９５）；  Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．  Ｄｉｓｃｏｒｄ．，  ９  （２）：  １０８−１１４  （１９９９）；  Ｌｉｍ，  Ｌ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｃｕｒｅ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １１  （５）：  ４４３−４５２  （１９９８）；  Ｖｏｉｔ，  Ｔ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．，  ２０  （２）：  ６５−７４  （１９９８）；  Ｂｒｏｗｎ，  Ｒ．  Ｈ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．，  ４８：  ４５７−４６６  （１９９７）；  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｕｐａｄｈｙａｙａ，  Ｍ．，  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．  Ｄｉｓｏｒｄ．，  ７  （１）：  ５５−６２  （１９９７）を参照のこと。
【０３０２】
特定の実施形態において、必要な被験体における筋肉の筋形成、維持、修復、もしくは再生を促進するための医薬の製造のための、本明細書に記載される組成物の使用が、提供される。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、必要な被験体における筋肉の筋形成、維持、修復、もしくは再生を促進するための医薬の製造における使用のために提供される。上記Ｗｎｔポリペプチドは、筋萎縮症を（例えば、筋線維のサイズもしくは数を増大させることによって）予防もしくは処置するために使用され得る。
【０３０３】
上記組成物は、有効量（例えば、治療上有効な量）において投与され得る。ヒトおよび非ヒト被験体のインビボ処置のために、上記被験体は、本発明の１種以上の改変Ｗｎｔポリペプチドの有効量を含む組成物を通常投与される。「有効量」とは、所望の治療効果もしくは予防結果を達成するために有効な量（必要な投薬においておよび期間にわたって）に言及する。
【０３０４】
本発明のＷｎｔポリペプチド、もしくは上記を含む組成物の「治療上有効な量」は、上記個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびにＷｎｔポリペプチドが上記個体において所望の応答を誘発する能力のような要因に従って変動し得る。治療上有効な量はまた、Ｗｎｔポリペプチドの任意の毒性効果、有害効果に、治療上有益な効果が勝っている量である。用語「治療上有効な量」とは、哺乳動物（例えば、患者）における疾患もしくは障害を「処置する」ために有効であるＷｎｔポリペプチドもしくはこれを含む組成物の量に言及する。
【０３０５】
「予防上有効な量」とは、所望の予防結果を達成するために有効な量（必要な投薬においておよび期間にわたって）に言及する。代表的には（しかし必ずしもそうとは限らない）、予防的用量は、疾患の前もしくは疾患の初期段階において被験体において使用されるので、上記予防上有効な量は、上記治療上有効な量より少ない。
【０３０６】
種々の実施形態において、本発明は、未処理の幹細胞集団と比較して、成体幹細胞（例えば、サテライト幹細胞）の分裂対称性を増大させるための方法を提供する。本明細書で開示される方法は、さらに、幹細胞分裂の速度を変化させることなく、対称性の幹細胞分裂を促進し得、幹細胞の集団の生存を促進し得る。上記方法は、インビトロ、エキソビボ、もしくはインビボで行われ得る。
【０３０７】
特定の実施形態において、１種以上の改変Ｗｎｔポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、必要な被験体にインビボで投与される。本明細書で使用される場合、用語「被験体」としては、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、オランウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、もしくは他の非ヒト哺乳動物が挙げられる）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物である脊椎動物、例えば、トリ（例えば、ニワトリもしくはアヒル）もしくは魚類、および非哺乳動物である非脊椎動物が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記被験体は、ヒトである。疾患もしくは状態の処置が必要な被験体としては、このような疾患もしくは状態の症状を示す被験体（例えば、疾患もしくは状態を有するもの）、ならびに疾患もしくは状態を有するリスクのあるものが挙げられる。
【０３０８】
特定の実施形態において、サテライト幹細胞の集団をインビボ、エキソビボ、もしくはインビトロで増殖させるための方法は、上記幹細胞と、Ｆｚｄ７に結合し活性化する、短縮型Ｗｎｔ７ａポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔ７ａポリペプチド、Ｗｎｔ７ａ融合ポリペプチド、またはそのオルソログ、パラログ、もしくはホモログ、あるいはこのようなＷｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の有効量とを接触させる工程を包含する。
【０３０９】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、組織中のサテライト細胞の数を増大させることは、上記組織の増強された再生能力を提供することであると考えられる。
【０３１０】
特定の実施形態において、幹細胞は、単離されるかもしくは維持され、エキソビボもしくはインビトロで増殖させられ、その後、必要な被験体に投与される。例えば、幹細胞は、エキソビボもしくはインビトロで培養および増殖させられ得、有効量の本発明のＷｎｔ組成物と接触させられ得、次いで、治療的幹細胞組成物として、当業者に公知の方法に従って、患者に投与され得る。特定の実施形態において、上記増殖させられた幹細胞集団は、治療的Ｗｎｔ組成物と組み合わせて、上記患者に投与される。
【０３１１】
上記幹細胞増殖を促進するための方法は、幹細胞のエキソビボもしくはインビトロでの増殖を刺激し、それによって、必要な被験体への移植もしくは投与に適した細胞集団を提供するために使用され得る。
【０３１２】
尿自制のいくつかの形態において、機能不全の筋肉は、例えば、上記筋への直接タンパク質注射によって、本発明の組成物もしくは方法で処置され得る。従って、１つの実施形態において、上記方法は、尿失禁を処置するために有用である。
【０３１３】
さらなる実施形態において、損傷したかもしくは機能不全の筋組織は、心筋であり得る。例えば、上記損傷した筋組織は、心血管事象（例えば、心筋梗塞、もしくは心不全）によって損傷を受けた心筋であり得る。ここで上記標的幹細胞は、心臓幹細胞である。本発明の別の局面によれば、哺乳動物において心臓幹細胞増殖もしくは心筋肥大を促進するための方法が提供され、上記方法は、本明細書に記載される組成物の有効量を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する。
【０３１４】
さらに、移植物中で幹細胞を使用することに加えて、幹細胞、もしくは幹細胞を含む組成物は、研究ツールとして、および／または診断アッセイもしくはキットの一部として使用され得る。限定されることは望まないが、キットは、筋幹細胞、１種以上の改変Ｗｎｔポリペプチド、細胞培養もしくは増殖培地、細胞低温保存培地、１種以上の薬学的に受容可能な送達媒体、１種以上の改変Ｗｎｔポリヌクレオチド配列もしくは遺伝子構築物、細胞を必要な被験体に移植もしくは送達するための１種以上のデバイス、本明細書に記載されるように、上記細胞を使用、送達、移植、培養、低温保存する、またはこれらの任意の組み合わせのための説明書を含み得る。
【０３１５】
細胞増殖および／もしくは筋肥大のインジケーターは、定性的にもしくは定量的にモニターされ得、上記インジケーターとしては、以下が挙げられる：例えば、肉眼による形態、総細胞数、組織学、組織化学もしくは免疫組織化学、または特定の細胞マーカーの存在、非存在もしくは相対的レベルの変化。細胞マーカーの存在、非存在もしくは相対的レベルは、例えば、組織化学的技術、免疫学的技術、電気泳動、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリーなどによって分析され得る。あるいは、上記細胞マーカータンパク質をコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの存在が、例えば、ＰＣＲ技術、ノーザンブロット分析、適切なオリゴヌクレオチドプローブの使用などを使用して、検出され得る。
【０３１６】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、各個々の刊行物、特許出願もしくは発行された特許が、参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されているかのように、本明細書に参考として援用される。
【０３１７】
前述の発明は、理解の明瞭さを目的として図示および例示によって、いくぶん詳細に記載されてきたものの、本発明の教示に鑑みれば、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることは、当業者に容易に明らかである。以下の実施例は、例示としてのみ提供されるのであり、限定として提供されるのではない。当業者は、本質的に類似の結果を得るために、変更もしくは改変され得る種々の重要でないパラメーターを容易に認識する。
【実施例】
【０３１８】
実施例１：短縮型Ｗｎｔタンパク質の設計
【０３１９】
Ｗｎｔファミリータンパク質は、３００〜４００アミノ酸の長さであり、グリコシル化および脂質付加を含むいくつかの翻訳後修飾を含む。Ｗｎｔタンパク質の脂質付加は、大規模組換え生成、製剤および潜在的な治療的使用に関する難題を提起する。Ｗｎｔの脂質付加が、それらのシグナル伝達活性に必要とされることは、一般に受け入れられてきたが、この分野における大部分の研究は、単一のアイソフォーム（Ｗｎｔ３ａ）を用いて、および単一のＷｎｔシグナル伝達経路（β−カテニン依存性転写活性化の標準の活性化）を使用することによってしか完了していない（Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）  （Ｔａｋａｄａ  ２００６）。図１は、システイン（Ｗｎｔ７ａのＣｙｓ  ７３）およびセリン（Ｗｎｔ７ａのＳｅｒ  ２０６）の潜在的脂質付加部位が、Ｗｎｔファミリーメンバー間で保存されていることを示す。Ｗｎｔ７ａのシグナル伝達活性、特に、非標準のシグナル伝達は、脂質付加の提唱された部位がアラニン残基に対する変異誘発によって除去される場合にすら維持され得る。位置Ｃ７３Ａおよび／もしくはＳ２０６Ａにおける単一もしくは二重のアラニン置換の構築は、哺乳動物細胞組織培養において発現される場合に中程度に改善された生成、およびインビトロおよびインビボでの活性を保持しながらの製剤特性を与えるタンパク質を生じた。Ｗｎｔタンパク質を、活性を保持した活性なドメインへと短縮した。上記短縮型Ｗｎｔは、より高いレベルの生成を可能にし、脂質除去された。このことは、水性溶液中での製剤化および安定性の助けとなる。
【０３２０】
上記Ｗｎｔ７ａアミノ酸配列を、構造モチーフの推定されるモデルを作るために、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔソフトウェアプログラム（これは、二次構造推定および潜在的な溶媒接近可能性を評価する）を使用して分析した。図２Ａは、上記ヒトＷｎｔ７ａ配列の推定を示し、２つの構造ドメイン：α−ヘリックス二次構造の大部分を含むＮ末端ドメインおよびタンパク質シート二次構造の大部分を含むＣ末端ドメイン、を強調する。上記Ｎ末端ドメインから上記Ｃ末端ドメインへの移行は、およそ残基２３５〜残基２６５の間で起こる。
【０３２１】
上記ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔ二次構造推定プログラムを、標準のヒトＷｎｔ３ａタンパク質を特徴付けるためにも使用した。図２Ｂは、Ｗｎｔ３ａの潜在的ドメイン構造（これは、Ｗｎｔ７ａのものに似ている）を、Ｎ末端α−ヘリックス構造およびＣ末端タンパク質シート構造とともに示す。ヒトＷｎｔ３ａにおいて、上記２つのドメインの間の移行は、およそ残基２３７〜２７０において起こる。上記推定されたＣ末端ドメインは、先にマッピングされるように、潜在的脂質付加部位を含まない。これらドメインの発現カセットを構築して、Ｗｎｔシグナル伝達活性が、脂質翻訳後修飾の要件を最小限にしながら、上記Ｗｎｔタンパク質の単一の領域内で保持され得るか否かを評価した。このようなタンパク質は、タンパク質生成、製剤、ならびに最終的な治療的使用および産業的使用のために有利であり得る。
【０３２２】
いくつかの発現構築物を、上記アミノ酸配列を、別個の脂質付加されていないドメインへと短縮しながら、活性なＷｎｔシグナル伝達分子を構築することに関する潜在能力を評価するために設計した。上記種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態を強調する模式図を、図３に示す。潜在的脂質付加部位のアラニン置換を模式的に示す（Ｗｎｔ７ａ  Ｃ７３Ａおよび／もしくはＳ２０６Ａ）。いくつかの短縮型Ｗｎｔ構築物を、以下に記載されるように細菌発現カセットの中に入れた。タンパク質形態の大部分を、哺乳動物発現系における生成のために構築した。これらの形態に関しては、内因性Ｗｎｔ７ａ分泌シグナルペプチドを、外因性のシグナルペプチド（例えば、ＩｇＧκ、ＣＤ３３もしくはＩＬ２のシグナルペプチド）で置き換えた。シグナルペプチドは、哺乳動物発現系からの組換えタンパク質の効率的分泌を潜在的に改善し得る。
【０３２３】
２つの異なるＣ末端ドメインＷｎｔを生じる短縮物を、哺乳動物組織培養物において発現させ、試験した：Ｗｎｔ７ａ  ａａ２３５−３４９およびＷｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９。Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９は、上記推定から評価されるように、偶数のシステイン残基（１２）を保持すると同時に、より規定された構造ドメインを含む。上記Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９タンパク質を、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインへの融合タンパク質として、上記ＷｎｔフラグメントとＦｃドメインとの間のリンカー領域においてタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位の包含ありもしくはなしで発現させた。この系は、上記融合タンパク質の効率的な発現および分泌、続いて、上記Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９タンパク質の特異的ＴＥＶ認識部位でのタンパク質分解性切断を可能にした。アフィニティークロマトグラフィー法を使用して、上記Ｆｃドメインの得られた消化されたタンパク質、プロテアーゼ、および任意の残りの消化されなかった融合タンパク質をきれいにしたところ、低分子量Ｗｎｔ  ２６４−３４９アミノ酸タンパク質フラグメントの精製された調製物を生じた。Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９は、計算分子量１１ｋＤａおよび実測分子量  約１７ｋＤａを有し、その差異は、翻訳後グリコシル化に起因する可能性が最も高い。
【０３２４】
本実施例において、上記Ｗｎｔ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に特異的な以下の点変異を含む：Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６  ＋  Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ。これら変異は、上記構築物に依存して、Ｗｎｔ融合タンパク質の種々の位置に相当する。さらに、これら変異は、Ｆｃγ−レセプターに対するＩｇＧ１  Ｆｃドメインの親和性を低下させ、従って、上記融合タンパク質によるいかなる望ましくない免疫活性化についての潜在的可能性をも制限する。全ての例についての配列説明およびその対応する配列同定を、図３および添付の配列表ファイルに示す。
【０３２５】
実施例２：短縮型Ｗｎｔの構築
【０３２６】
短縮型Ｗｎｔポリペプチドおよびこれを含むベクターを、以下の方法に従って構築した。
【０３２７】
Ｗｎｔの細菌発現のためのベクター構築
Ｗｎｔ７ａＣ末端ドメインを含むｐＥＴ２９ａ（＋）発現ベクターを、ＰＣＲのテンプレートとして野生型ヒトＷｎｔ７ａを使用して構築した。正方向プライマー  ５’−ＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号２４）および逆方向プライマー  ５’−ＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２５）を、Ｗｎｔ７ａのアミノ酸２３５〜３４９をコードするポリヌクレオチド配列を増幅するために使用した。上記ＰＣＲ生成物を、ＮｄｅＩ制限酵素およびＮｏｔ  １制限酵素で消化し、上記ＮｄｅＩ部位とＮｏｔ  １部位との間でｐＥＴ２９ａ（＋）ベクターへと連結した。上記短縮型Ｗｎｔ７ａ構築物を、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ（登録商標）ポリメラーゼを使用して調製した。
【０３２８】
Ｗｎｔ７ａＣ末端ドメインを含むｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクターを、ＰＣＲのテンプレートとして野生型ヒトＷｎｔ７ａを使用して構築した。正方向プライマー  ５’−ＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号２６）および逆方向プライマー  ５’−ＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２５）を、Ｗｎｔ７ａのアミノ酸２３５〜３４９をコードするポリヌクレオチド配列を増幅するために使用した。上記ＰＣＲ生成物を、ＮｃｏＩ制限酵素およびＮｏｔ  １制限酵素で消化し、上記ＮｃｏＩ部位とＮｏｔ  １部位との間でｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターへと連結した。上記短縮型Ｗｎｔ７ａ構築物を、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ（登録商標）ポリメラーゼを使用して調製した。
【０３２９】
実施例３：Ｗｎｔ融合ポリペプチドの構築
【０３３０】
Ｗｎｔ融合ポリペプチドおよびこれを含むベクターを、以下の方法に従って構築した。
【０３３１】
Ｗｎｔの哺乳動物発現のためのベクター構築物
ＴＥＶプロテアーゼ部位および６ＨＩＳタグに融合されたヒトＷｎｔ  ７ａＣ末端ドメインに融合されたＣＤ３３シグナルペプチドを含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターを、構築した。ＣＤ３３のポリヌクレオチド配列（５’−ＡＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴ−３’（配列番号２７））は、アミノ酸配列  ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＭＤ（配列番号２８））をコードする。これを、ヒトＷｎｔ７ａのアミノ酸２３５〜３４９をコードするポリヌクレオチド配列に融合した。得られた構築物を、ＴＥＶプロテアーゼ部位および６ＨＩＳエピトープ配列を含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターへとクローニングした。上記融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１０に示す。
【０３３２】
ＴＥＶプロテアーゼ部位およびＦＬＡＧタグに融合されたＷｎｔ７ａ  Ｃ末端ドメインに融合されたＩｇＧκシグナルペプチドを含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターを構築した。ＩｇＧκのポリヌクレオチド配列（５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号２９））は、アミノ酸配列  ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号３０））をコードする。そして上記ＩｇＧκのポリヌクレオチド配列を、ヒトＷｎｔ７ａのアミノ酸２３５〜３４９をコードするポリヌクレオチド配列に融合させた。得られた構築物を、ＴＥＶプロテアーゼ部位およびＦＬＡＧエピトープ配列を含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターへとクローニングした。上記融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１３に示す。
【０３３３】
以下のＷｎｔ７ａ構築物もまた作製し、哺乳動物細胞発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋））へとクローニングした：  アミノ酸配列  ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＭＤ（配列番号２８））をコードするＣＤ３３分泌シグナルペプチド（５’−ＡＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧ  ＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴ−３’（配列番号２７））またはアミノ酸配列  ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号３０））をコードするＩｇＧκ鎖分泌シグナルペプチド（５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧ  ＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号２９））のいずれかと結合させたヒトＷｎｔ７ａのＷｎｔ７ａ  ａａ３１−３４９、Ｗｎｔ７ａ  ａａ  ２３５−３４９および／もしくはＷｎｔ７ａ  ａａ  ２６４−３４９。これら融合タンパク質を、いずれの他のタグもしくは融合物の非存在下でも構築して、配列番号３３、３４、３５、および３６で明らかにされたポリペプチド配列を作った。さらに、同じ短縮型Ｗｎｔ／シグナルペプチド融合物を、Ｃ末端ＩｇＧ−Ｆｃドメインを付加して構築した。ここで使用した特定のＦＣ融合ドメインは、エフェクター細胞機能を低下させる以下の変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６  ＋  Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを有するヒトＩｇＧ１であった。これら構築物のための短縮型Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、配列番号３７、３８、３９、および４０に示される。
【０３３４】
Ｗｎｔ７ａのさらなる短縮型形態を、Ｆｃ融合物と組み合わせて、ただし、上記ＷｎｔドメインとＦｃドメインとの間にプロテアーゼ認識部位を含めて、ＣＤ３３およびＩｇＧκ鎖の外因性分泌シグナルペプチドを使用して構築した。これら構築物は、Ｆｃ融合タンパク質の改善された発現および精製を利用し、上記Ｆｃドメインを上記Ｗｎｔポリペプチドから最終的に除去する。これら構築物の短縮型Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、配列番号４１、４２、４３、および４４に示される。
【０３３５】
実施例４：Ｗｎｔタンパク質発現および精製
【０３３６】
活性なＷｎｔタンパク質の有効でスケールを変更した生成（ｓｃａｌｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）は、これら脂質付加タンパク質の製剤化の難題と結びついた組換えシステムにおける比較的低いＷｎｔタンパク質発現および分泌の組み合わせによって、妨げられてきた。活性なＷｎｔは、哺乳動物システムにおいて小スケールで効果的に生成され、上記脂質付加Ｗｎｔを活性なコンホメーションに効果的に保持する界面活性剤およびリポソームの存在下で精製されてきた（Ｗｉｌｌｅｒｔ  ２００８）  （Ｍｏｒｒｅｌ  ２００８）。これら研究は、標準のＷｎｔタンパク質に関しては完了し、より低い程度で、非標準のＷｎｔタンパク質に関しても完了している。しかし、リポソーム製剤の使用は、治療的製造に関しては難しく、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）のような界面活性剤の使用は、治療的投与に必ずしも適用可能ではない。外因性シグナルペプチドを含む全長Ｗｎｔタンパク質を、上記外因性シグナルペプチドが分泌効率を改善するという見込みをもって作製した。さらに、外因性シグナルペプチドおよびＦｃドメイン融合物を有する分泌されかつ精製された全長Ｗｎｔを、発現させた。実施例１〜３に記載される、発現されかつ精製されたＷｎｔ短縮物もまた作製し、外因性シグナルペプチドおよびＦｃ融合タンパク質の使用を比較した。
【０３３７】
哺乳動物細胞生成に関して、２９３Ｆ懸濁培養を、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ無血清培地中で１０６  生細胞／ｍｌの細胞密度において調製した。細胞を、ベクターＤＮＡ  １μｇあたり１μｌのＭｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ  Ｐｒｏ試薬を有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地中で、培養物１ｍｌあたり１μｇのＷＮＴ発現ベクターのリポソームトランスフェクションによって一時的にトランスフェクトした。ＤＮＡ：リポソーム複合体を、２９３Ｆ懸濁培養物に添加する前に、２５分間にわたって形成させた。上記トランスフェクトした細胞を、１３０ｒｐｍにおいて７２時間にわたってオービタルシェイカー上で、３７℃、８％  ＣＯ２においてインキュベートした。馴化培地を、２回の遠心分離（１回は３００×ｇおよび１回は３０００×ｇ）、その後の滅菌濾過によって採取した。馴化培地中のＷｎｔタンパク質を、ＷＮＴもしくはヒトＩｇＧのＦｃドメインのいずれかに対する特異的抗体でのウェスタンブロットによって定量した。馴化培地中の通常のＷＮＴ収量は、トランスフェクトされた構築物に依存して、０．９〜１０μｇ／ｍｌの範囲に及んだ。採取した培地を、２．５バールの一定圧において動かした並行Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００デバイスを使用して、接線流濾過によって５倍濃縮した。最終的な培地を、０．２ミクロン  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ  １５０カプセルを通して滅菌し、タンパク質精製手順へと移した。
【０３３８】
Ｆｃ融合物の非存在下で野生型Ｗｎｔ７ａタンパク質および脂質除去Ｗｎｔタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰカラム（５ｍＬ）に入れたきれいにした馴化培地を使用して精製した。カラムを、２５ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，  １％  （ｗ／ｖ）  ＣＨＡＰＳで洗浄し、続いて、２５ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，  １％  （ｗ／ｖ）  ＣＨＡＰＳ，  １．５Ｍ  ＫＣｌで溶離させた。抗Ｗｎｔ７ａウェスタンブロッティングで検出した溶離画分中のＷｎｔ７ａをプールし、抗Ｗｎｔ７ａ抗体と組み合わせた２ｍＬ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでさらに精製した。０．２ｍＬ／ｍｉｎにおいてローディングを行い、続いて、２０ｍＬ  ＰＢＳ，  １％  ＣＨＡＰＳで洗浄した。結合したＷｎｔ７ａを、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ  ２．５，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １％  ＣＨＡＰＳで溶離した。溶離液を、５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ９．０で予め満たした１ｍＬ画分中に集めた。溶離画分中のＷｎｔ７ａの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色で検出した。
【０３３９】
ヒトＦｃに融合したＷｎｔ７ａ改変体を、ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（５ｍＬ）に入れた、きれいにした馴化培地を使用して精製した。カラムを、４０ｍＬ  ＰＢＳ，  １％  ＣＨＡＰＳで洗浄した。結合した融合タンパク質を、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ  ２．５，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １％  ＣＨＡＰＳで溶離した。溶離液を、０．２５ｍＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ９．０で予め満たした５ｍＬ画分中に集めた。溶離画分中のＷｎｔ７ａの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマシー染色で検出した。
【０３４０】
Ｗｎｔ７ａを含む画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して２ｍＬまで濃縮した。濃縮したＷｎｔ７ａを、ＰＢＳ，  １％  ＣＨＡＰＳで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、最終的に緩衝液交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定した。
【０３４１】
このようにして生成したＷｎｔ  Ｆｃ融合タンパク質は、発現培地において、および精製後の生成物としての両方で顕著に改善された収量を明らかに示す（図４）。さらに、最小のＷｎｔフラグメント（Ｗｎｔ７ａ  アミノ酸２６４〜３４９）の生成は実現可能であり、Ｆｃ融合タンパク質として高い収量を生じた。これらＷｎｔタンパク質はまた、クーマシーＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるように、高レベルの純度を示した（図５）。
【０３４２】
実施例５：Ｗｎｔ短縮物は、インビトロでの生物学的活性を保持する
【０３４３】
Ｗｎｔ７ａは、非標準の経路を介して（すなわち、β−カテニンシグナル伝達を介さずに）、最も可能性があるのは、レセプターＦｒｉｚｚｌｅｄ  ７を介して、筋肥大性および幹細胞増殖を誘導することが以前に示された（Ｌｅ  Ｇｒａｎｄ  ２００９）  （Ｖｏｎ  Ｍａｌｔｚａｈｎ  ２０１２）。野生型Ｗｎｔ７ａは、培養物中での筋線維の肥大を誘導した（図６Ａ）。Ｗｎｔ７ａ誘導性筋線維肥大を定量した。これを、図７にグラフで示す。
【０３４４】
インビトロ肥大実験を、以下のように行った：全ての細胞を、３７℃において、５％  ＣＯ２を有する加湿空気を用いて培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２）、ゼラチン被覆組織培養プレート上で、２０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。インビトロ肥大アッセイのために、Ｃ２Ｃ１２細胞を、２，０００細胞／ウェルにおいてゼラチン被覆９６ウェルプレート上にプレートした。ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）をＬｏｎｚａから得、コラーゲン被覆組織培養プレート上で、Ｆ１０、１５％  ＦＢＳ、０．５％  ニワトリ胚抽出物（Ｃｈｉｃｋ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｅｘｔｒａｃｔ）、０．４μｇ／ｍｌ  デキサメタゾンおよび１ｎｇ／ｍＬ  塩基性線維芽細胞増殖因子中で維持した。インビトロ肥大アッセイのために、ＨＳＭＭを、コラーゲン被覆９６ウェルプレート上で、１２，０００細胞／ウェルにおいてプレートした。Ｃ２Ｃ１２細胞およびＨＳＭＭ両方のインビトロ肥大アッセイのために、培地を２４時間後に、２％  ウマ血清を有するＤＭＥＭへと交換した。３日後、Ｗｎｔタンパク質を添加し、さらに２日間にわたって上記細胞とともにインキュベートした。細胞を固定し（４％  パラホルムアルデヒド  ＰＢＳ，  １０分間）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで透過性にし、ＰＢＳ中の１０％  ヤギ血清および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でブロックし、マウス抗ｓｌｏｗ  ＭｙＨＣおよびマウス抗ｆａｓｔ  ＭｙＨＣで染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８で染色した。ＤＡＰＩで核を染色した。画像獲得および線維直径測定を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して行った。最低でも１００直径カウント／ウェルおよび２ウェル／処理条件を使用して、上記種々のＷｎｔタンパク質のインビトロ活性を評価した。
【０３４５】
野生型Ｗｎｔ７ａ（ｗｔＷｎｔ７ａ）およびＦｃ融合物（ｗｔＷｎｔ７ａ−ＦＣ）はともに、肥大を誘導した（図７）。驚くべきことに、Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９もまた、Ｆｃ融合タンパク質としてか（図７）またはＦｃドメインからのタンパク質分解切断後（図８Ｃ）のいずれで使用した場合にも、顕著な肥大を誘導した。より長いＣ末端Ｗｎｔ７ａフラグメント（Ｗｎｔ７ａ  ａａ２３５−３４９）もまた、ヒト初代ジストロフィン異常症筋芽細胞を含め、マウス筋芽細胞およびヒト筋芽細胞の両方において顕著な肥大を誘導した（図８Ａおよび８Ｂ）。これら結果は、Ｗｎｔ活性が上記タンパク質の顕著な短縮（推定脂質付加部位を有しないフラグメントを生じる）後ですら保持されたことを明らかに示す。さらに、試験した全てのＷｎｔ形態は、界面活性剤ＣＨＡＰＳ中に製剤化した場合に活性であった一方で、ｗｔＷｎｔ７ａは、ＣＨＡＰＳの非存在下でのリン酸緩衝化食塩水中で再製剤化した場合に、その生物学的活性の大部分を失った。ｗｔＷｎｔ７ａ−ＦｃおよびＷｎｔ７ａ短縮物は全て、ＣＨＡＰＳを除去した場合に活性を保持した（図７）。この結果は、上記Ｆｃ融合物の一部に対するシャペロン作用（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）活性および脂質部分を欠いた短縮物の増大した水性での安定性を示す。
【０３４６】
実施例６：短縮型Ｗｎｔタンパク質およびＷｎｔ  Ｆｃ融合タンパク質は、改善された安定性を有し、治療上適切な賦形剤中で製剤化され得る
【０３４７】
実施例１および実施例４において設計され、発現されかつ精製された全てのＷｎｔタンパク質は、−２０℃貯蔵後および数回の凍結融解サイクルの後に、筋肥大アッセイにおいて活性を示す。上記改変Ｗｎｔタンパク質はまた、精製されて界面活性剤ＣＨＡＰＳ中で製剤化される場合に活性である。しかし、ＣＨＡＰＳは、現在、治療上の賦形剤のための一般に使用される製剤化成分ではない。長期の安定性および治療的使用により適切な賦形剤中での上記Ｗｎｔタンパク質を再製剤化する可能性を評価するために、筋肉の筋線維肥大活性評価と合わせた加速安定性研究を行った。
【０３４８】
種々のＷｎｔ７ａタンパク質形態のタンパク質安定性を、４℃もしくは３７℃のいずれかにおいて、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたって等しいタンパク質濃度をインキュベートすることによって評価した。３種の異なる賦形剤製剤を評価した：  ０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ、０．０５％  ポリソルベート８０（ＰＳ８０）／ＰＢＳもしくはＰＢＳ単独。残りのタンパク質を、ウェスタンブロット分析を使用して評価した。上記ウェスタンブロットシグナルを、出発タンパク質量（時間０）と比較した、残っているタンパク質の割合を表した値へと、ピクセルデンシトメトリーを使用して変換した。全てのタンパク質形態は、ＣＨＡＰＳもしくはポリソルベート製剤のいずれにおいても４℃においてインキュベートした場合に安定であった（図９）。しかし、界面活性剤の使用なしでは、ＰＢＳ中で４℃での長期間インキュベートした際にかなりのタンパク質が失われた。さらに、Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９は、単独で、もしくはＦｃ融合物としての両方で、ＰＢＳ中において、全長Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物より有意に安定であった。この結果は、Ｗｎｔ短縮物がこれら条件下で有利であることを示した。
【０３４９】
３７℃においては、タンパク質は、ＰＢＳ中に製剤化した３種のタンパク質調製物のすべてから失われた。しかし、Ｗｎｔ７ａの上記短縮型形態は、全長タンパク質Ｆｃ融合物より高い安定性を有した。３７℃において界面活性剤の存在下では、タンパク質分解は、全てのＷｎｔ７ａタンパク質形態において時間が経つにつれて起こったが、上記ＰＢＳ単独の製剤よりゆっくりとした速度で起こった。これらデータは、Ｗｎｔ７ａタンパク質（短縮物を含む）およびその融合物が、治療上適切な賦形剤（例えば、ポリソルベート８０）中に製剤化され得、実質的なタンパク質安定性を保持し得ることを明らかに示す。
【０３５０】
残りのＷｎｔ７ａタンパク質活性を、加速安定性試験の後に評価した。Ｗｎｔ７ａタンパク質の種々の形態を、４℃もしくは３７℃のいずれかにおいて、０日間、１日間、４日間もしくは７日間にわたって、等しいタンパク質濃度においてインキュベートした。賦形剤製剤  ０．２％  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳおよび０．０５％  ポリソルベート８０を評価した。残りのタンパク質を、実施例５および６に記載されるように、インビトロ筋線維肥大アッセイにおいて活性について評価した。陰性製剤コントロールおよび陽性の市販のＷｎｔ７ａタンパク質コントロールを使用した。Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合タンパク質、短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９および短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９−Ｆｃ融合タンパク質を、全て比較した。
【０３５１】
試験した全てのタンパク質形態は、いずれの賦形剤中でも、４℃において最大７日間にわたってインキュベートした場合、それらの元のタンパク質活性のうちの大部分を保持していた（図１０および図１１）。しかし、上記インキュベーション温度が３７℃であった場合、全長Ｗｎｔ７ａは、時間が経過するとともにその活性の大部分を失った。さらに、Ｆｃ融合タンパク質として試験した場合、上記全長Ｗｎｔ７ａは、時間を経てもより大きな活性を保持した。このことは、上記Ｆｃドメインが、タンパク質構造を、従って、活性を安定化させたことを示し、図７および実施例５に示される結果を確認する。上記短縮型Ｗｎｔ７ａフラグメントであるＷｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９は、両方の賦形剤において時間が経過しても筋肥大活性を保持し、上記短縮型の非脂質付加Ｗｎｔ７ａタンパク質形態の活性および治療開発に関するその増強された特性を確認した。従って、治療上関連する賦形剤（例えば、ポリソルベート８０）は、Ｗｎｔタンパク質（短縮型Ｗｎｔタンパク質を含む）の製剤において使用され得る。
【０３５２】
実施例７：Ｗｎｔ７ａタンパク質短縮物および融合タンパク質は、シグナル伝達特異性を保持する
【０３５３】
１９種のヒトＷｎｔタンパク質および１０種のＦｒｉｚｚｌｅｄレセプター、ならびに種々の共レセプター（例えば、ＬＲＰ、ＲＯＲ、ＲＹＫなど）が存在する。Ｗｎｔ７ａは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７レセプターを介してシグナル伝達し、非標準の平面内細胞極性経路を駆動し、Ｇプロテイン活性化事象を介してＰＩ３−キナーゼ経路を活性化することが示された（Ｖｏｎ  Ｍａｌｔｚａｈｎ  ２０１２）。最もよく特徴付けられたＷｎｔシグナル伝達経路は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターおよび共レセプターとのＷｎｔ相互作用がβ−カテニン依存性転写活性化を生じ、細胞の生存、増殖、およびいくつかの場合には細胞の分化を駆動する標準のＷｎｔシグナル伝達経路である。治療薬開発および送達のために操作されたＷｎｔタンパク質は、それらレセプターおよびシグナル伝達経路特異性を保持するように設計されるべきである。前述の実施例において開示された、上記操作して作られた短縮型および非脂質付加Ｗｎｔタンパク質は、望ましい筋肥大活性を保持した。さらなる実験を同じＷｎｔ７ａタンパク質形態で行って、「オフターゲット」効果（例えば、標準の経路を活性化する）を排除した。
【０３５４】
これを評価するために、本発明者らは、極めて感度の高いレポーターシステムである、Ｗｎｔ  ｐＢＡＲレポーターを使用した。このレポーターは、ホタルルシフェラーゼ発現を駆動する最小のプロモーターエレメントに連結されたＴＣＦエンハンサーエレメントのコンカテマ−反復からなる（Ｂｉｅｃｈｅｌｅ  ２００８）。哺乳動物細胞株へとトランスフェクトした場合、このレポーターは、細胞処理に対する標準のＷｎｔ活性を測定するために使用され得る。ｐＢＡＲレポーターを含む、組織特異的な、確立された安定な細胞株の一団を使用して、本発明者らは、組換えＷｎｔ３ａ陽性コントロールもしくは上記Ｗｎｔ７ａ改変体のいずれかのある用量設定（titration）で上記細胞を処理した場合に、標準のＷｎｔシグナル伝達を試験した。図１２に認められ得るように、ｐＢＡＲレポーターを含む４種の細胞株を、組換えＷｎｔ３ａ、全長Ｗｎｔ７ａおよび上記短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ  ２６４−３４９−ＦＣ融合物の標準のＷｎｔシグナル伝達活性を試験するために使用した。Ｗｎｔ３ａは、試験した全細胞株において強いルシフェラーゼレポーター応答を誘導したが、上記Ｗｎｔ７ａタンパク質処理のうちのいずれも、標準の活性を生じなかった。従って、筋肥大の非標準経路において活性を保持するフラグメントを生じるＷｎｔ７ａの短縮、が標準のシグナル伝達活性を獲得しないことは、明らかである。
【０３５５】
実施例８：Ｗｎｔ７ａ短縮物および融合タンパク質は、インビボでの治療活性を保持する。
【０３５６】
Ｗｎｔ７ａは、インビボ発現のためのＷｎｔ発現ベクターまたは精製されたタンパク質調製物のいずれかの注射によって、骨格筋に直接導入された場合、齧歯類システムにおける顕著な骨格筋肥大を誘導することが示された。ヒト使用のためのＷｎｔのインビボ投与は、適切な賦形剤中に、および高濃度において上記Ｗｎｔを製剤化する（注射体積を最小限にする）能力を必要とする。Ｗｎｔ７ａ  Ｆｃ融合物およびＷｎｔ短縮物は、高いタンパク質生成レベルを達成し、より高い安定性を有し、治療上適切な賦形剤中に製剤化され、インビトロ活性を維持した。製剤化されたＷｎｔ組成物もまた、インビボ活性を保持した。
【０３５７】
イソフルラン麻酔下で、Ｗｎｔ７ａタンパク質を、正常の筋機能を有するＣ５７Ｂｌ６マウスの左後肢の露出させた前脛骨（ＴＡ）筋へ、およびジストロフィン異常症の遺伝的モデルであるＣ５７Ｂ／ｓｃｓｎ−ＤｍｄＭｄｘ／Ｊマウス系統に対しても注射した。切開部位を手術用接着剤で閉じ、次いで、動物を、３週間にわたって維持した。３週間の最後に、動物を屠殺し、上記ＴＡ筋を摘出し、計量して、最適切断温度（ＯＣＴ）包埋媒体中に包埋することによって組織学的評価のために調製した。凍結したＴＡ筋を１４μｍの切片にし、無水エタノール中で５分間にわたって固定した。切片を、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００／ＰＢＳ中で２０分間にわたって透過性にした。５０：５０  ＭＯＭブロッキングおよび１０％  ヤギ血清／ＰＢＳで切片をブロックし、次いで、抗Ｐａｘ７抗体および／もしくは抗ラミニン抗体で免疫染色した。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ５５５抗体およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ４８８抗体とともにインキュベートした。最後に、切片を、ＤＡＰＩとともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、フルオロマウント−Ｇでマウントした。画像獲得を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して行い、最小フェレ径測定（最小線維直径測定）のための画像解析を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して完了した。最小で１０００の線維フェレ径値を、各動物について生成し、メジアンを計算した。各処置群についてのメジアンの動物間平均を表し、同様に、各処置群について累積線維集団シフト（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｆｉｂｅｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｈｉｆｔ）も表した。
【０３５８】
２．５μｇのＷｎｔ７ａタンパク質の１回の注射は、製剤コントロール注射および同じ動物からの未処置の反対側筋肉と比較して、Ｃ５７Ｂｌ６マウスＴＡ筋において顕著な筋肥大を誘導した（図１３）。肥大効果は、等量のＩＧＦ−Ｌ（公知の肥大因子）に匹敵した。各処置群の測定された筋線維の集団全体の分析に関して、上記効果がメジアン線維直径における増大に起因した、すなわち、上記筋肉の大部分が影響を受けたことは、明らかであった。
【０３５９】
短縮型Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９もまた、インビボ肥大アッセイにおいて試験した。２．５μｇのＷｎｔ７ａ  Ｆｃ融合タンパク質を、上記ジストロフィン異常症ＭＤＸマウスモデルのＴＡ筋へと注射した。３週間後、顕著な肥大が、Ｆｃ融合物コントロールタンパク質と比較して認められた（図１４）。上記Ｗｎｔフラグメントは、基本的なリン酸緩衝化食塩水製剤中で投与した場合ですら、肥大を誘導した。従って、Ｗｎｔ７ａを成功裏にフラグメント化し、そして／またはＦｃドメインに融合して、生成、製剤、および投与のパラメーターを改善し、インビトロおよびインビボでの活性をなお保持したことは、明らかである。
【０３６０】
実施例９：Ｗｎｔ短縮物およびＦｃ融合タンパク質の改善された薬物動態的特性
【０３６１】
Ｗｎｔは、局所的なパラクリンもしくは勾配シグナル伝達潜在能（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）において作用することにより細胞プロセスならびに組織発生およびリモデリングを駆動する、分泌型タンパク質である。細胞および組織再生プロセスのアゴニスト、または異所性の栄養増殖および新生物増殖のインヒビターのいずれかとして、Ｗｎｔタンパク質の治療的潜在能を十分に活用するために、その対応する天然の非改変Ｗｎｔタンパク質と比較して増強された全身送達潜在能を有するタンパク質形態が必要とされる。
【０３６２】
薬物動態分析を、本発明の短縮型Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ａ  Ｆｃ融合タンパク質の全身送達潜在能を評価するために行った。薬物動態分析を、上記短縮型Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ａ  Ｆｃ融合タンパク質の全身送達潜在能を評価するために行った。上記種々のＷｎｔタンパク質の単回のボーラス静脈内注射を、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて行った。一連の採血を、４８時間の期間にわたって複数の時点で行った。血液をＥＤＴＡ中に集め、処理して血漿にした。上記血漿サンプルを、サンドイッチＥＬＩＳＡ検出を使用してＷｎｔ７ａタンパク質について評価した。Ｗｎｔ７ａの検出のための抗体を、上記タンパク質のＣ末端領域に由来するペプチドに対して惹起し、上記Ｗｎｔ７ａタンパク質の全ての操作されて作られた形態および短縮形態の検出のために予め最適化した。非改変のポリクローナル抗体は、被覆抗体として働き、上記Ｗｎｔ７ａタンパク質の種々の領域を認識するビオチン化ポリクローナル抗体を、検出のために使用した。プレートを、非改変のＷｎｔ７ａ抗体で一晩被覆し、次いで、脱脂粉乳でブロックした。精製Ｗｎｔ７ａタンパク質改変体を、試験サンプルと同じ培地で希釈し、陰性コントロールマウス血漿を添加して、標準的濃度曲線を作った。標準物質および試験サンプルを、上記プレートに添加し、１時間にわたってインキュベートした。各工程の間に洗浄して、ビオチン化Ｗｎｔ７ａ抗体を上記プレートに添加し、続いて、ニュートラビオチン結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼを添加した。ＥＬＩＳＡを、ＴＭＢ試薬を１０分間にわたって添加することによって発色させ、続いて、硫酸を添加した。４５０ｎｍの吸光度を分光光度計で読み取り、データを、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェアを使用して分析した。全身半減期の比較評価を行った。
【０３６３】
５０μｇの全長Ｗｎｔ７ａを投与し（約２ｍｇ／ｋｇ）、上記他のＷｎｔ改変体の等モル量を投与した。予測されるように、上記全長Ｗｎｔ７ａタンパク質（ＦＴＶ５００）のみが、第１の時点（投与の３０分後）に関して全身で検出されたに過ぎず、その後は、それは検出不能であった（図１５）。Ｗｎｔ７ａの半減期は、Ｆｃ融合タンパク質（ＦＴＶ５１２）として投与された場合に顕著に改善した。分子量の顕著な増大および上記Ｆｃドメインが新生児型Ｆｃレセプターを介する保持および循環を促進する潜在的能力は、増大した半減期に寄与する、ありそうな要因である。しかし、上記Ｗｎｔ７ａ−Ｆｃ融合物の半減期は、なお比較的短かった。
【０３６４】
驚くべきことに、アミノ酸２６４−３４９（ＦＴＶ５２９）を含む非常に低分子量（計算では１１ＫＤａ）のＷｎｔ７ａ短縮物は、２時間の時点で明らかに検出されるとともに、上記全長Ｆｃ融合タンパク質と比較して等しく十分に機能した。このことは、上記タンパク質のこの形態が、全身送達に対してより従いやすいことを示す。Ｆｃ融合タンパク質として発現される上記Ｗｎｔ７ａ  ａａ２６４−３４９短縮物は、３０分の時点で６倍大きな検出および８時間の時点においてバックグラウンドを超える明瞭な検出を伴って、全長Ｗｎｔ７ａを超えて最も顕著な全身半減期延長を示した。
【０３６５】
従って、この分析から、操作されたＷｎｔタンパク質は、改善された全身半減期を有すること、および活性なＣ末端フラグメント（アミノ酸２６４−３４９）Ｆｃ融合タンパク質が他より優れていることが明らかに示された。
【０３６６】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲において開示される具体的実施形態に特許請求の範囲を限定するとは解釈されるべきではなく、このような権利が与えられる特許請求の範囲の等価物の全範囲とともに全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、開示によって限定されない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図６】
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【図１３Ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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