(57)【要約】  ＦＧＦ２１ポリペプチドを使用して代謝疾患および障害を治療する方法が提供される。様々な実施形態において、代謝疾患または障害は、１型糖尿病、肥満、脂質異常症、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、糖尿病性ネフロパシー、神経障害、網膜症、虚血性心疾患、末梢血管疾患および脳血管疾患である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上効果的な量の、（ａ）単離ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド、または（ｂ）ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項２】
代謝障害が、１型糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
代謝障害が、脂質異常症である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
代謝障害が、肥満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
代謝障害が、糖尿病性ネフロパシーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
代謝障害が、対象が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物が、人間である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドが、配列番号４および８の１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドが、配列番号３および７の１つによりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＧＦ２１変異体が、表１〜１３に示される突然変異から選択される、配列番号４または配列番号８の成熟ＦＧＦ２１配列における１つ以上の突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＧＦ２１ポリペプチドが、薬学的に許容される担体と混合された前記ＦＧＦ２１ポリペプチドを含む薬学的組成物の形態で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
投与の後の時点で対象の血糖値を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
投与の後の時点で対象の血清インスリン値を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはヒトＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが、
（ａ）１つ以上のＰＥＧ分子、および
（ｂ）Ｆｃポリペプチド
の１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
代謝障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上効果的な量の、配列番号４および８の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１７】
代謝障害が、１型糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
代謝障害が、脂質異常症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
代謝障害が、肥満である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
代謝障害が、糖尿病性ネフロパシーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
代謝障害が、対象が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、哺乳動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物が、人間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドが、薬学的に許容される担体と混合された前記ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを含む薬学的組成物の形態で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
投与の後の時点で対象の血糖値を決定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
投与の後の時点で対象の血清インスリン値を決定するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＧＦ２１ポリペプチドが、表１〜１３に示される突然変異から選択される、配列番号４または８の成熟ＦＧＦ２１配列における１つ以上の突然変異を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＧＦ２１ポリペプチドが、
（ａ）１つ以上のＰＥＧ分子、および
（ｂ）Ｆｃポリペプチド
の１つ以上をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
単離ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが、配列番号１０および１２の１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
単離ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが、配列番号３９および４１の１つを含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、それぞれ全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年８月３１日出願の米国仮特許出願第６１／５２９，６４１号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
開示される発明は、それを必要とする対象に、治療上効果的な量のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を投与することによる、１型糖尿病の治療または改善に関する。
【背景技術】
【０００３】
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３を含む、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌ポリペプチドである（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０：５６３−６９）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン依存性であり、グルコース、脂質、およびエネルギー代謝の調節においてホルモンとして機能するという点で、非定型ＦＧＦである。
【０００４】
ＦＧＦ２１は、肝臓および膵臓において高度に発現し、肝臓で主に発現する唯一のＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦ２１を過剰発現する形質転換マウスは、遅い成長速度、低い血漿グルコースおよびトリグリセリド値の代謝表現型を示し、加齢に伴う２型糖尿病、膵島過形成、および肥満を有さない。罹患げっ歯類および霊長類モデルにおける組み換えＦＧＦ２１タンパク質の薬理学的投与は、血漿グルコース値の正常化、トリグリセリドおよびコレステロール値の低減、ならびに耐糖能およびインスリン感受性の改善をもたらす。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体的活動、および代謝速度を増加させることにより、体重および体脂肪を低減する。実験的研究は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、および人間における他の代謝状態または障害の治療のための、ＦＧＦ２１の薬理学的投与への支援を提供する。
【０００５】
２つの主要な種類の糖尿病、１型および２型が定義されている。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる１型糖尿病において、膵臓は、不十分なインスリン値を生成する。１型糖尿病に罹患した患者は、生存するためにインスリンの投与に頼らなければならない。非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）とも呼ばれる２型糖尿病に罹患した患者は、まだインスリンを生成することができるが、比較的不十分である。多くの場合において、膵臓は、通常よりも多量のインスリンを生成する。２型糖尿病の際立った特徴は、体の細胞（特に脂肪および筋肉細胞）によるインスリンに対する感受性の喪失である。
【０００６】
増加したインスリン耐性の問題に加えて、２型糖尿病に罹患した患者においては、膵臓によるインスリンの放出もまた不良であり、最適以下となり得る。実際に、２型糖尿病においては、グルコース制御の悪化に寄与する、インスリンのベータ細胞産生の一定の低下が見られることが知られているが、これは、最終的にインスリン治療を必要とする２型糖尿病の多くの患者の主要因子である。さらに、２型糖尿病患者の肝臓は、血糖値が上昇しているにもかかわらず、グルコース新生によりグルコースを産生し続ける。したがって、２型糖尿病患者において、グルコース新生の制御が悪化する可能性がある。
【０００７】
１型糖尿病に罹患した患者は、生存するためにインスリンを必要とする（例えば、Ｆａｌｏｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔ．  ９：２５−４６を参照されたい）。インスリンは、１型および２型糖尿病の両方の治療に使用され得るが、２型糖尿病の治療に使用されている現在の他の市販の化合物は、１型糖尿病の治療に使用できない（Ｒａｓｌｏｖａ，  （２０１０）  Ｖａｓｃ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇ．  ６：３９９−４１０）。確立されたインスリン治療とは対照的に、本開示は、ＦＧＦ２１を使用して１型糖尿病を治療する方法を提供し、したがって、１型糖尿病患者を治療する医療専門家に代替的治療法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０：５６３−６９
【非特許文献２】Ｆａｌｏｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔ．  ９：２５−４６
【非特許文献３】Ｒａｓｌｏｖａ，  （２０１０）  Ｖａｓｃ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇ．  ６：３９９−４１０
【発明の概要】
【０００９】
一態様において、代謝障害を治療する方法が提供される。一実施形態において、方法は、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の（ａ）ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド、または（ｂ）ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを投与することを含む。さらなる実施形態において、代謝障害は、１型糖尿病である。さらなる実施形態において、代謝障害は、脂質異常症である。さらなる実施形態において、代謝障害は、肥満である。さらなる実施形態において、代謝障害は、糖尿病性ネフロパシーである。さらなる実施形態において、代謝障害は、対象が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む。一実施形態において、方法が実行される対象は、哺乳動物であり、別の実施形態において、哺乳動物は人間である。特定の実施形態において、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドは、配列番号４および８の１つを含み、別の実施形態において、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドは、配列番号３および７の１つによりコードされる。さらなる実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、表１〜１３に示される突然変異から選択される、配列番号４および８の１つの成熟ＦＧＦ２１配列における１つ以上の突然変異を含む。別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドは、薬学的に許容される担体と混合されたＦＧＦ２１ポリペプチドを含む薬学的組成物の形態で投与される。さらなる実施形態において、開示される方法は、投与の後の時点で対象の血糖値を決定するステップをさらに含む。別の実施形態において、方法は、投与の後の時点で対象の血清インスリン値を決定するステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはヒトＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、（ａ）１つ以上のＰＥＧ分子、および（ｂ）Ｆｃポリペプチドの１つ以上をさらに含む。具体的実施形態において、単離ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、配列番号１０および１２の１つを含み、別の実施形態において、単離ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、配列番号３９および４１の１つを含む。
【００１０】
また、代謝障害を治療する別の方法が本明細書において提供される。一実施形態において、方法は、それを必要とする対象に、配列番号４および８の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、治療上効果的な量のヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを投与することを含む。さらなる実施形態において、代謝障害は、１型糖尿病である。さらなる実施形態において、代謝障害は、脂質異常症である。さらなる実施形態において、代謝障害は、肥満である。さらなる実施形態において、代謝障害は、糖尿病性ネフロパシーである。さらなる実施形態において、代謝障害は、対象が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む。一実施形態において、方法が実行される対象は、哺乳動物であり、別の実施形態において、哺乳動物は人間である。特定の実施形態において、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドは、配列番号４および８の１つを含み、別の実施形態において、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドは、配列番号３および７の１つによりコードされる。さらなる実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、表１〜１３に示される突然変異から選択される、配列番号４または配列番号８の成熟ＦＧＦ２１配列における１つ以上の突然変異を含む。別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドは、薬学的に許容される担体と混合されたＦＧＦ２１ポリペプチドを含む薬学的組成物の形態で投与される。さらなる実施形態において、開示される方法は、投与の後の時点で対象の血糖値を決定するステップをさらに含む。別の実施形態において、方法は、投与の後の時点で対象の血清インスリン値を決定するステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはヒトＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、（ａ）１つ以上のＰＥＧ分子、および（ｂ）Ｆｃポリペプチドの１つ以上をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおける血漿グルコース値を示すプロットであり、血糖値は、処置開始後３日目の朝の注射から１時間および４時間後、ならびに５日目の朝の注射から１時間後に測定された。
【図２】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、血漿グルコース値の臨床化学分析を示す棒グラフであり、血液試料からの血漿は、処置前（０日目）および朝の注射（５日目）の約２時間後に回収され、試験された。
【図３】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、血漿トリグリセリド値の臨床化学分析を示す棒グラフであり、処置前（０日目）および朝の注射（５日目）の約２時間後に回収された血液試料からの血漿が試験された。
【図４】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、血漿全コレステロール値の臨床化学分析を示す棒グラフであり、血液試料からの血漿は、処置前（０日目）および朝の注射（５日目）の約２時間後に回収され、試験された。
【図５】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、血漿遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）値の臨床化学分析を示す棒グラフであり、血液試料からの血漿は、処置前（０日目）および朝の注射（５日目）の約２時間後に回収され、試験された。
【図６】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定されたインスリン値を示す棒グラフであり、血液試料からの血漿は、処置前（０日目）および朝の注射（５日目）の約２時間後に回収され、試験された。
【図７】ビヒクル、インスリン（５ＩＵ／ｋｇ）、ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）およびヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ治療薬を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定されたグルカゴン値を示す棒グラフであり、血液試料からの血漿は、処置前（０日目）および朝の注射（５日目）の約２時間後に回収され、試験された。
【図８】ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された血漿グルコース値を示すプロットであり、血糖値は、０日目の注射前ならびに１、３、５、および７日目に測定された。
【図９】ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された血漿グルコース値を示すプロットであり、血糖値は、０日目の注射前ならびに２、６、１０、１４、１８および２２日目に測定された。
【図１０】０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および２７日目（二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から７日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、血漿グルコース値を示す棒グラフである。
【図１１】０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および２７日目（二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から７日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、トリグリセリド値を示す棒グラフである。
【図１２】０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および２７日目（二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から７日後）の、ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、コレステロール値を示す棒グラフである。
【図１３】０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および２７日目（二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から７日後）の、ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、ＨＤＬ値を示す棒グラフである。
【図１４】０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および２７日目（二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から７日後）の、ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、ＮＥＦＡ値を示す棒グラフである。
【図１５】０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および２７日目（二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から７日後）の、ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、インスリン値を示す棒グラフである。
【図１６】ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与された、ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された体重の変化を示すプロットであり、測定値は、０日目（５回目のＳＴＺ注射から７２時間後）ならびに２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２日目に得られた。
【図１７】ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与された、複数低用量（ＭＬＤ）ストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された血漿グルコース値を示すプロットであり、血糖値は、−２日目の注射前ならびに２、６、１０および１４日目に測定された。
【図１８】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、インスリン値を示す棒グラフである。
【図１９】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、トリグリセリド値を示す棒グラフである。
【図２０】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、コレステロール値を示す棒グラフである。
【図２１】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、ＨＤＬ値を示す棒グラフである。
【図２２】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、ＮＥＦＡ値を示す棒グラフである。
【図２３】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、インスリン値を示す棒グラフである。
【図２４】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重２０ｋｄ  ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、ＡＳＴ値を示す棒グラフである。
【図２５】−２０日目（５回目のＳＴＺ注射後）および１８日目（１８日目の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の最後の注射から２日後）の、ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された、ＡＬＴ値を示す棒グラフである。
【図２６】ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を投与された、ＭＬＤストレプトゾトシン誘導１型糖尿病マウスにおいて測定された体重の変化を示すプロットであり、測定値は、０日目（５回目のＳＴＺ注射から２３日後）ならびに２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８日目に得られた。
【図２７】ストレプトゾトシン処置マウスからの膵島におけるインスリン免疫反応性を示す写真であり、上部パネルは、ビヒクル処置マウス（Ａ３）からの膵島であり、下部パネルはＦＧＦ２１処置マウス（Ｂ３）からの膵島である。元の倍率は約２５倍であった。
【図２８】各ビヒクルおよびＰＥＧ−ＦＧＦ２１処置マウスからのインスリン免疫反応性および形態学的所見を要約した表であり、ビヒクル処置マウスはＡ１からＡ５で指定され、一方ＰＥＧ−ＦＧＦ２１処置マウスはＢ１からＢ５で指定されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、それを必要とする対象に、治療上効果的な量の単離ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを投与することにより、１型糖尿病を治療する方法を提供する。投与および送達の方法もまた提供される。
【００１３】
実施例に記載のものを含む、本明細書において使用される組み換えポリペプチドおよび核酸の方法は、一般に、共にあらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記載される方法である。
【００１４】
Ｉ．一般的定義
「１つ（ａおよびａｎ）」という規定は、本明細書において使用される場合、別段に具体的に指定されない限り、「１つ以上」を意味する。
【００１５】
本明細書において使用される場合、「アミノ酸」および「残基」という用語は、同義的であり、ペプチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、自然発生的および合成アミノ酸の両方、ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣薬、および自然発生的アミノ酸に化学的に類似した非自然発生的アミノ酸を指す。
【００１６】
「自然発生的アミノ酸」は、遺伝子コードによりコードされたアミノ酸、および合成後に修飾された、遺伝子コードによりコードされたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、自然発生的アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有し得るが、自然発生的アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
【００１７】
「アミノ酸模倣薬」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、自然発生的アミノ酸と類似した様式で機能する化学化合物である。例は、アミドのメタクリロイルまたはアクリロイル誘導体、β−、γ−、δ−イミノ酸（例えば、ピペリジン−４−カルボン酸）等を含む。
【００１８】
本開示において同義的に使用され得る用語である「非自然発生的アミノ酸」または「非自然コード化アミノ酸」は、自然発生的アミノ酸と同じ基本化学構造を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳複合体により成長ポリペプチド鎖に組み込まれない化合物である。「非自然発生的アミノ酸」はまた、これに限定されないが、自然コード化アミノ酸（これに限定されないが、２０の一般アミノ酸を含む）の修飾（例えば、翻訳後修飾）により生じるが、それ自体は翻訳複合体により成長ポリペプチド鎖に自然に組み込まれないアミノ酸を含む。ポリペプチド配列に挿入され得る、またはポリペプチド配列中の野生型残基と置換され得る非自然発生的アミノ酸の例の限定されないリストは、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化側鎖を有するアミノ酸を含む。例は（Ｌ型またはＤ型、括弧内のように省略される）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリシン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリシン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−アミノ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリシン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と省略される）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはアミノ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ−���ラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ν，Ν，Ν−トリメチルリシン、ε−Ν−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、および他の同様のアミノ酸、ならびに具体的に列挙されたもののいずれかの誘導体化形態を含む。
【００１９】
「単離核酸分子」という用語は、全核酸が源の細胞から単離された場合に核酸と共に自然に見られる、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチドまたは他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離された、５’から３’末端から読み出されるデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基（例えば、本明細書に記載の天然もしくは変異体ＦＧＦ２１核酸配列）の一本鎖もしくは二本鎖ポリマー、またはその類似体を指す。好ましくは、単離核酸分子は、ポリペプチド産生における使用、またはその治療的、診断的、予防的もしくは研究上の使用に干渉する、核酸の自然環境中に見られる任意の他の汚染核酸分子またはその他の分子を実質的に含まない。
【００２０】
「単離ポリペプチド」という用語は、源細胞から単離された場合にポリペプチドと共に自然に見られる、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチドまたは他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されたポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体ＦＧＦ２１ポリペプチド）を指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、その治療的、診断的、予防的または研究上の使用に干渉する、その自然環境中に見られる任意の他の汚染ポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【００２１】
「コード」という用語は、１つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、開始または停止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列により提供される６つの異なるリーディングフレームのいずれか１つにコードされ得る。
【００２２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する「同一」およびパーセント「同一性」という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチドの間の同一の残基のパーセントを意味し、比較されている分子のうち最小の分子のサイズに基づき計算される。これらの計算のために、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により、アラインメントのギャップ（該当する場合）が考慮され得る。アラインされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．），  （１９８８）  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  （Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．），  １９９３，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．），  １９９４，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  （１９８７）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．），  １９９１，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８：１０７３に記載のものを含む。
【００２３】
パーセント同一性の計算において、比較されている配列は、配列間の最大の一致を与えるように整列される。パーセント同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、パーセント配列同一性が決定されるべき２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインさせるために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドが最適に一致するようにアラインされる（アルゴリズムにより決定される「一致したスパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算され、「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の平均であり、「対角」は、特定の比較行列により各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２等の比較行列が、アルゴリズムと併せて使用される。ある特定の実施形態において、標準比較行列（ＰＡＭ  ２５０比較行列に関しては、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２を、ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列に関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）もまたアルゴリズムにより使用される。
【００２４】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための推奨されるパラメータは、以下の通りである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３；
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２（上記参照）からのＢＬＯＳＵＭ  ６２；
ギャップペナルティ：１２（但し末端ギャップに対してはペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性閾値：０
【００２５】
２つのアミノ酸配列をアラインさせるためのある特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらし得るが、この小さいアラインされた領域は、２つの全長配列間に有意な関係がない場合であっても、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されるアラインメント方法（例えば、ＧＡＰプログラム）は、所望により、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続アミノ酸にわたるアラインメントをもたらすように調節され得る。
【００２６】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」および「ＦＧＦ２１タンパク質」という用語は、同義的に使用され、人間またはマウス等の哺乳動物において発現する自然発生的野生型ポリペプチドを意味する。本開示の目的において、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」は、２０９個のアミノ酸残基からなり、ヌクレオチド配列の配列番号１および３によりコードされる任意の全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば配列番号２および４、ならびに１８１個のアミノ酸残基からなり、ヌクレオチド配列の配列番号３および５によりコードされるポリペプチドの成熟形態を含む任意の形態、例えば、配列番号４および８を指すように同義的に使用され得、全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端における２８個のアミノ酸残基（すなわち、シグナルペプチドを構成する）が除去されている。ＦＧＦ２１ポリペプチドは、操作により、または細菌発現プロセスの結果導入され得るアミノ末端メチオニンを含んでもよいが、必須ではない。
【００２７】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」はまた、自然発生的ＦＧＦ２１ポリペプチド配列（例えば、配列番号２、４、６および８）が修飾され、したがって「ＦＧＦ２１変異体」を生成しているＦＧＦ２１ポリペプチドを包含する。そのような修飾は、非自然発生的アミノ酸、非自然発生的アミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣薬との置換を含む１つ以上のアミノ酸置換、ならびに切断を含むが、これらに限定されない。例えば、ヒトＦＧＦ２１は、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８残基によりＮ末端で、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３残基によりＣ末端で切断された場合、活性を維持することが知られている（それぞれ受容体およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合部位を含むと推定される；例えば、ＷＯ２００９／１４９１７１を参照されたい）。したがって、配列番号２または４の１８１残基配列の切断変異体を、本発明において使用することができる。「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチドに導入され得る点突然変異、例えば表１〜１３に示されるものを包含する。さらに、ヒトＦＧＦ２１は、天然では少なくとも２つのアイソフォームとして存在することが知られており、１つのアイソフォームは、全長タンパク質の１７４位にプロリン残基を含み（配列番号２）（タンパク質の成熟形態の１４６位（配列番号４））、もう１つはこの位置にロイシン残基を含む（配列番号６および８に示され、それぞれ全長および成熟形態である）。これらのアイソフォームのいずれも、開示される組成物および方法において使用することができ、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」、「ＦＧＦ２１タンパク質」および「ＦＧＦ２１変異体」という用語に包含される。
【００２８】
様々な実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、自然発生的ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６および８）と少なくとも約８５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドは、自然発生的ＦＧＦ２１ポリペプチドアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６および８）と少なくとも約９０パーセントまたは約９５、９６、９７、９８もしくは９９パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。そのようなＦＧＦ２１ポリペプチドは、好ましくは、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性、例えば血糖、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロール値を低下させる能力、体重を低減する能力、または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善する能力を有するが、必須ではない。また、本発明は、そのようなＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体配列をコードする核酸分子を包含する。
【００２９】
上述のように、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、シグナル配列（配列番号２もしくは６の残基１〜２８）を含んでもよく、または、シグナル配列が除去されていてもよい（配列番号４もしくは８の１８１残基配列を提供する）が、これはｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＧＦ２１の活性形態である。いくつかの場合において、対象における代謝障害を治療または改善するために使用され得るＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、対象と同じ種から得られるＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の成熟形態である。
【００３０】
ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、好ましくは、生物学的に活性である。様々なそれぞれの実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、全長ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体配列のＮ末端からシグナルペプチドが除去されている、自然発生的形態の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の生物学的活性と等しい、それより高い、またはそれより低い生物学的活性を有する。生物学的活性の例は、血糖、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロール値を低下させる能力、体重を低減する能力、または耐糖能、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力、尿中グルコースおよびタンパク質排泄を低下する能力を含む。
【００３１】
「治療上効果的な用量」および「治療上効果的な量」という用語は、本明細書において使用される場合、治療されている疾患または障害の症状の軽減または改善を含む、研究者、医者または他の臨床医学者により求められている組織系、動物、または人間における生物学的または医薬的反応を惹起する、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の量、すなわち、観察され得るレベルの１つ以上の所望の生物学的または医薬的反応、例えば血糖、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロール値の低下、体重の低減、または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の、当業者に知られている標準的アッセイを使用して決定される所望の（例えば、人間にとって生理学的に正常な）レベルへの改善を補助する、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の量を意味する。決定する上で好適なアッセイの例は、本明細書に記載され、市販の機器、例えばＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ；Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）またはＨｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｋｉｔ（ＨＥＮＤＯ−７５Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、自動化された様式で行うことができる。
【００３２】
ＩＩ．開示される方法において使用され得るＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体および核酸
本明細書において提供される様々な方法は、本開示により説明される任意のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用することができる。これらのＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、操作されてもよく、および／または標準的な分子生物学的方法を使用して生成されてもよい。様々な例において、配列番号１、３、５および７の全てまたは一部を含んでもよいＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体をコードする核酸配列は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから単離および／または増幅され得る。プライマーは、標準的（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅技術に従い、本明細書に記載の核酸およびアミノ酸配列に基づいて設計され得る。増幅されたＦＧＦ２１核酸は、次いで、好適なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列分析により特性決定され得る。
【００３３】
本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の全てまたは一部の単離または増幅におけるプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ分析装置を使用して設計および生成されてもよく、または、より長い配列のＤＮＡから単離されてもよい。
【００３４】
ＩＩ．Ａ．自然発生的および変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＦＧＦ２１は、シグナル配列を含む連続アミノ酸配列として発現する。
全長ヒトＦＧＦ２１（Ｐｒｏ  １７４／１４６形態）の２０９アミノ酸配列は、
【００３５】
【化１】
2014526441.tif 000003
であり、以下のＤＮＡ配列
【００３６】
【化２】
2014526441.tif 000004
【００３７】
２８残基シグナル配列の切断後のヒトＦＧＦ２１のアミノ酸配列は、
【００３８】
【化３】
2014526441.tif 000005
であり、以下のＤＮＡ配列
【００３９】
【化４】
2014526441.tif 000006
【００４０】
本明細書に記載のように、ヒトＦＧＦ２１はまた、配列番号２の位置１７４（配列番号４の位置１４６）のプロリンがロイシンで置き換えられた自然発生的アイソフォームとして存在し得る。この形態のＦＧＦ２１と関連したアミノ酸および核酸配列は、本明細書において、配列番号５〜８として記載される。
【００４１】
本明細書に記載のように、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトアミノ酸配列の配列番号２、４、６および８を含むＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。しかしながら、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、配列が配列番号２、４、６および８と少なくとも８５％同一であるように、自然発生的ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ酸配列、例えば配列番号２、４、６および８と１つ以上のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含し、そのようなポリペプチドは、本開示において一般に「ＦＧＦ２１変異体」と呼ばれ、本明細書においてさらに説明される。ＦＧＦ２１ポリペプチドは、保存的または非保存的な１つ以上のアミノ酸置換を導入し、ＦＧＦ２１ポリペプチドの特定位置において自然発生的または非自然発生的アミノ酸を使用することにより生成され得る。ＦＧＦ２１ポリペプチドに導入され得る置換の例は、表１〜１３に示され、本明細書において説明される。
【００４２】
「保存的アミノ酸置換」は、天然アミノ酸残基（ずなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所与の位置において見られる残基）の、非天然残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所与の位置に見られない残基）による、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響しないような置換を含み得る。保存的アミノ酸置換はまた、生体系内での合成によるのではなく、化学的ペプチド合成により典型的に組み込まれる非自然発生的アミノ酸残基を包含する。これらは、ペプチド模倣薬、およびアミノ酸部分の他の反対または反転形態を含む。
【００４３】
自然発生的残基は、表１に示されるような一般的側鎖特性に基づくクラスに分けることができる。
【００４４】
【表１】
2014526441.tif 000007
【００４５】
また、アミノ酸の追加的な群は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４）  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ  （２ｄ  Ｅｄ．  １９９３），  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載の原理を使用して調製され得る。いくつかの場合において、そのような特徴の２つ以上に基づいて置換をさらに特性決定することが有用となり得る（例えば、Ｔｈｒ残基等の「小極性」残基での置換は、適切な状況において極めて保存的な置換となり得る）。
【００４６】
保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの、同じクラスの別のメンバーとの交換を含み得る。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの、別のクラスからのメンバーとの交換を含み得る。
【００４７】
上述の群のものと同様の既知の物理化学的特性を有する、合成、希少、または修飾アミノ酸残基は、配列内の特定のアミノ酸残基の「保存的」代替として使用され得る。例えば、Ｄ−Ａｒｇ残基は、典型的なＬ−Ａｒｇ残基の代替として機能し得る。また、特定の置換は、上述のクラスの２つ以上に関して説明され得る場合も考えられる（例えば、小さい疎水性残基での置換は、当該技術分野において、両方の定義に適合するそのような残基と同様の物理化学的特性を有することが知られている上述のクラスまたは他の合成、希少、もしくは修飾残基の両方において見られる残基（複数を含む）での１つのアミノ酸の置換を意味する）。
【００４８】
配列番号１、３、５および７に縮重するもの、ならびに配列番号１、３、５および７のポリペプチド変異体をコードするもの、例えば表１〜１３の突然変異を含むものを含む、本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする核酸配列は、本開示の他の態様を形成する。
【００４９】
ＩＩ．Ｂ．ＦＧＦ２１ベクター
本明細書に記載のＦＧＦ２１核酸配列を発現させ、それにより開示される方法における使用のためのＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を生成するために、適切なコード配列、例えば配列番号１、３、５および７、または表１〜１３の１つ以上の突然変異をコードする配列は、標準的なクローニングおよび発現技術に従い、好適なベクターにクローニングすることができ、好適な宿主への導入後に配列が発現してコードされたポリペプチドを生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載されている）。また、本開示は、本明細書に記載の核酸配列（例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体をコードする配列）を含むそのようなベクターに関する。
【００５０】
「ベクター」は、（ａ）ポリペプチドコード核酸配列の発現を促進し、（ｂ）それからのポリペプチドの産生を促進し、（ｃ）それによる標的細胞のトランスフェクション／形質転換を促進し、（ｄ）核酸配列の複製を促進し、（ｅ）核酸の安定性を促進し、（ｆ）核酸および／もしくは形質転換／トランスフェクトされた細胞の検出を促進し、ならびに／または（ｇ）ポリペプチドコード核酸に有利な生物学的および／もしくは物理化学的機能を別様に付与する、送達ビヒクルを指す。ベクターは、染色体、非染色体および合成核酸ベクター（好適な組の発現制御要素を含む核酸配列）を含む、任意の好適なベクターであってもよい。そのようなベクターの例は、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから得られるベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターを含む。
【００５１】
組み換え発現ベクターは、原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用した昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）におけるＦＧＦ２１タンパク質の発現のために設計され得る。代表的な宿主細胞は、大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ′、ＴＯＰ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３、２９３−ＥＢＮＡ  ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  ５５０３−５５０９  （１９８９））；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を含む、クローニングおよび発現のために典型的に使用される宿主を含む。代替的に、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。好ましくは、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するクローニング部位の上流側のプロモーターを含有する。オンおよびオフが切り替えられ得るプロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーターおよびｔｒｐプロモーターを含む。
【００５２】
したがって、本明細書において、開示される方法において使用され得る組み換えＦＧＦ２１ポリペプチドの発現を促進する、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。様々な実施形態において、ベクターは、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体の発現を調節する作用可能に結合したヌクレオチド配列を含む。ベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進要素を含んでもよく、またはそれらと関連してもよい。そのような要素の例は、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、もしくはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター）、効果的なポリ（Ａ）停止配列、大腸菌におけるプラスミド生成物の複製の源、選択可能マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。また、ベクターは、ＣＭＶ  ＩＥ等の構成的プロモーターとは対照的に、誘導可能なプロモーターを含んでもよい。一態様において、代謝関連組織、例えば肝臓または膵臓組織における配列の発現を促進する組織特異的プロモーターに作用可能に結合したＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体をコードする配列を含む核酸が提供される。
【００５３】
ＩＩ．Ｃ．宿主細胞
本開示の別の態様において、本明細書に開示されるＦＧＦ２１核酸およびベクターを含む宿主細胞が提供される。様々な実施形態において、ベクターまたは核酸は、宿主細胞ゲノムに統合され、他の実施形態において、ベクターまたは核酸は染色体外である。
【００５４】
そのような核酸、ベクター、またはそれらのいずれかもしくは両方の組み合わせを含む、酵母、細菌（例えば、大腸菌）、哺乳動物細胞（例えば、不死化哺乳動物細胞）等の組み換え細胞が提供される。様々な実施形態において、開示される方法における使用のためのＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体の発現のための配列コードを含む、非統合化核酸、例えばプラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素を含む細胞が提供される。
【００５５】
本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体をコードする核酸配列を含むベクターは、形質転換により、またはトランスフェクションにより宿主細胞に導入され得る。細胞を発現ベクターで形質転換する方法は周知である。
【００５６】
ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体コード核酸は、ウイルスベクターにより宿主細胞または宿主動物に位置付けられ、および／またはそれに送達され得る。この機能において、任意の好適なウイルスベクターが使用され得る。ウイルスベクターは、単独で、または所望の宿主細胞における本発明の核酸の送達、複製および／もしくは発現を促進する１つ以上のウイルスタンパク質と組み合わせて、任意の数のウイルスポリヌクレオチドを含んでもよい。ウイルスベクターは、ウイルス核酸およびＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体コード核酸を含む、ウイルスゲノム、ウイルスタンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、または無傷ウイルス粒子の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドであってもよい。ウイルス粒子ウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子または修飾ウイルス粒子を含んでもよい。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター単位複製配列等、複製および／または発現のために別のベクターまたは野生型ウイルスの存在を必要とするベクターであってもよい（例えば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存性ウイルスであってもよい）。典型的には、そのようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子、または、導入遺伝子機能を増加させ、核酸のトランスフェクションおよび／もしくは発現を補助するようにそのタンパク質および／もしくは核酸含有量が変更されたウイルス粒子からなる（そのようなベクターの例は、ヘルペスウイルス／ＡＡＶ単位複製配列を含む）。典型的には、ウイルスベクターは、通常人間に感染するウイルスと同様であり、および／またはそれから得られる。この点において好適なウイルスベクター粒子は、例えば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科の任意のウイルス、またはそのウイルスから得られる任意のウイルスを含む）、アデノ関連ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）または他のパルボウイルスおよびパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターを含む。
【００５７】
ＩＩ．Ｄ．ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の単離
本明細書に記載のように発現されるＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離され得る。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体は、それが自然に発現する細胞から単離されてもよく、または、ＦＧＦ２１ポリペプチドもしくはＦＧＦ２１変異体を発現するように操作されている細胞、例えば、自然ではいかなる形態のＦＧＦ２１ポリペプチドも発現しない細胞から単離されてもよい。
【００５８】
ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を単離するために使用され得るタンパク質精製方法、ならびに関連する材料および試薬は、当該技術分野において知られている。ＦＧＦ２１ポリペプチドを精製する例示的方法は、本明細書に示される実施例ならびにＷＯ２００９／１４９１７１およびＷＯ２０１０／１２９５０３に記載される。
【００５９】
ＩＩＩ．特異的ＦＧＦ２１変異体
本明細書に記載のように、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトＦＧＦ２１の様々な突然変異形態を包含する。開示される突然変異は、ＦＧＦ２１ポリペプチドに様々な特性を付与することができる。例えば、開示される突然変異のいくつかは、ＦＧＦ２１ポリペプチドの半減期を向上させ、それによりその治療的特性を向上させることができる。そのような向上は、開示される方法を行う際に望ましくなり得る。
【００６０】
一実施形態において、Ａ１８０Ｅ突然変異が成熟ヒトＦＧＦ２１（配列番号４または８）のＣ末端分解を最小限化することが特定されている。したがって、Ａ１８０Ｅ突然変異は、本明細書において開示されるように、単一の突然変異または他の突然変異との組み合わせとして、変異体ＦＧＦ２１配列の要素を形成し得る。
【００６１】
別の実施形態において、Ｌ９８Ｒ突然変異が凝集を最小限化し、成熟ヒトＦＧＦ２１（配列番号４または８）の溶解度を向上させることが特定されている。したがって、Ｌ９８Ｒ突然変異は、本明細書において開示されるように、単一の突然変異または他の突然変異との組み合わせとして、変異体ＦＧＦ２１配列の要素を形成し得る。
【００６２】
別の実施形態において、Ｐ１７１Ｇ突然変異が成熟ヒトＦＧＦ２１（配列番号４または８）のタンパク質分解的切断を最小限化することが特定されている。したがって、Ｐ１７１Ｇ突然変異は、本明細書において開示されるように、単一の突然変異または他の突然変異との組み合わせとして、変異体ＦＧＦ２１配列の要素を形成し得る。
【００６３】
本明細書に開示される突然変異は、配列番号４または８を含むＦＧＦ２１ポリペプチドに様々な特性を付与することができ、例として、例えばＦＧＦ２１が製剤中に入れられると、開示される突然変異のいくつかは、ジスルフィド結合の形成のための部位を提供することによりＦＧＦ２１の安定性を向上させ、したがって向上したタンパク質分解安定性を提供することができる。さらに他の開示される突然変異は、ＦＧＦ２１が酵母中で発現されると、増加または減少したレベルのＯ−グリコシル化を提供することができる。さらに他の突然変異は、ＦＧＦ２１のＣ末端を含む、プロテアーゼまたは他の化学攻撃がＦＧＦ２１に作用してそれを分解し得る点を破壊することができる。他の突然変異は、減少したアミド分解を付与し得る。さらに他の突然変異は、ＦＧＦ２１の凝集レベルを低減し、結果としてその溶解度を向上させることができる。突然変異はまた、本明細書に記載のように、半減期延長部分、例えばヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＩｇＧ定常領域の結合点として機能するために導入され得る。様々な様式で、これらの突然変異は、ＦＧＦ２１のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、天然ＦＧＦ２１以上に改善することができる。本明細書に記載のように、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の向上した治療プロファイルを提供する特性を含む、所望の特性の累積的な向上を提供するために、１つ以上の所望の特性を付与する１つ以上の突然変異がＦＧＦ２１配列に導入されてもよい。そのような向上は、所与のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を、開示される方法における使用により好ましいものとすることができる。
【００６４】
一例において、ジスルフィド結合形成の形成を促進するために、単一または対のシステイン残基が、成熟ヒトＦＧＦ２１配列（配列番号４または８）内の様々な点に導入され得る。導入されたシステイン残基はまた、ＰＥＧ化のための部位として機能し得る。Ｃ７５とＣ９３との間の自然発生的ジスルフィド結合は、無傷に維持されてもよく、または破壊されて、Ｃ７５またはＣ９３と導入されたシステイン残基との間に新たなジスルフィド結合が形成されてもよい。システインが野生型残基と置換され得る位置の例を、表２に要約する。
【００６５】
【表２】
2014526441.tif 000008
2014526441.tif 000009
2014526441.tif 000010
【００６６】
導入されたシステイン残基は、操作されたジスルフィド結合の形成を促進し得る。そのようなジスルフィド結合は、治療製剤中等の濃縮条件下での分子の安定性を含む、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の安定性を向上させることができる。操作ジスルフィド結合対の例は、表３に示されるものを含む（位置は、配列番号４または８の成熟ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。
【００６７】
【表３】
2014526441.tif 000011
2014526441.tif 000012
2014526441.tif 000013
【００６８】
野生型ＦＧＦ２１においては見られないジスルフィド結合を操作することを目標とした、システイン残基に対する突然変異の残基の１つ以上の対の選択は、ＦＧＦ２１の三次元モデルの分析に基づくことができる。例えば、回転タンパク質操作手法を使用して、突然変異のためのＦＧＦ２１における好適な残基を特定することができる。これは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（「ＰＤＢ」；例えば、構造１ＰＷＡ）から得られるＦＧＦ１９の高分解能（１．３Å）Ｘ線結晶構造の検査により達成され得るが、これは、次いで、例えばＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを使用して、ＦＧＦ２１の３Ｄ相同性モデルを形成するために使用され得る。ＰＤＢに蓄積されたタンパク質の中でも、ＦＧＦ１９は、アミノ酸配列相同性に関してＦＧＦ２１に密接に関連したタンパク質であるため、ＦＧＦ１９は有用なテンプレートである。
【００６９】
別の態様において、高濃縮溶液、またはフェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、レゾルシノールおよびベンジルアルコール等の一般的製剤成分の条件下でＦＧＦ２１の安定性を向上させるために、成熟ＦＧＦ２１配列に追加的突然変異を導入することができる。向上した安定性の特性を提供し得る突然変異の例は、表４に示されるものを含む（位置は、配列番号４または８の成熟ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。
【００７０】
【表４】
2014526441.tif 000014
例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１４９１７１およびＷＯ２０１０／１２９５０３を参照されたい。
【００７１】
安定性向上突然変異に対する突然変異の残基の１つ以上の対の選択は、ＦＧＦ２１の三次元モデルの分析に基づくことができる。例えば、回転タンパク質操作手法を使用して、突然変異のためのＦＧＦ２１における好適な残基を特定することができる。これは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から得られるＦＧＦ１９（１ＰＷＡ）の高分解能（１．３Å）Ｘ線結晶構造の検査により達成され得るが、これは、次いで、例えばＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを使用して、ＦＧＦ２１の３Ｄ相同性モデルを形成するために使用され得る。ＰＤＢに蓄積されたタンパク質の中でも、ＦＧＦ１９は、アミノ酸配列相同性に関してＦＧＦ２１に関連したタンパク質であるため、ＦＧＦ１９は有用なテンプレートである。
【００７２】
別の態様において、いくつかの条件下でのＦＧＦ２１ポリペプチドのタンパク質分解的切断の程度を低減するために、ＦＧＦ２１配列に追加的突然変異を導入することができる。タンパク質分解的切断に対する耐性の特性を提供し得る突然変異の例は、表５に示されるものを含む（位置は、配列番号４または８の成熟ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。
【００７３】
【表５】
2014526441.tif 000015
例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１４９１７１およびＷＯ２０１０／１２９５０３を参照されたい。
【００７４】
さらなる態様において、高濃度等のいくつかの条件下でＦＧＦ２１ポリペプチドの凝集を阻害するために、成熟ＦＧＦ２１配列に追加的突然変異を導入することができる。ＦＧＦ２１の凝集を阻害する特性を提供し得る突然変異の例は、表６に示されるものを含む（位置は、配列番号４または８の成熟ヒトＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。
【００７５】
【表６】
2014526441.tif 000016
例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１４９１７１およびＷＯ２０１０／１２９５０３を参照されたい。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列を野生型タンパク質のアミノ酸配列以上に延長する、ポリペプチドのＣ末端への別の１つ以上の残基の付加によりキャッピングされた１つ以上の非自然発生的ポリマー結合部位を含む、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに関する。さらに別の実施形態において、本開示は、１つ以上のＣ末端突然変異をさらに含む１つ以上の非自然発生的ポリマー結合部位を含む、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに関する。そのようなキャッピングされたＣ末端突然変異ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドは、化学的に修飾されていてもよいが、必須ではない。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「キャッピングされたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド」は、ＦＧＦ２１ポリペプチドもしくはＦＧＦ２１変異体、または、化学的に修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドもしくはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを指し、１つ以上のアミノ酸残基が、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドまたは化学的に修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＣ末端に付加されている。１つ以上のプロリン残基および１つ以上のグリシン残基を含む、任意の自然発生的または非自然発生的アミノ酸を使用して、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドをキャッピングすることができる。野生型成熟ＦＧＦ２１配列は、１８１残基の長さ（配列番号４または８）であるが、キャッピングされたＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、ポリペプチドの長さを、それぞれの付加されたキャッピング残基につき１つの残基分延長し、本開示の付番スキームに従い、キャップ残基は１８２から開始して番号付けられる。したがって、単一のプロリンキャッピング残基は、Ｐ１８２として示される。より長いキャップが可能であり、それに応じて番号付けられる（例えば、Ｘ１８２、Ｙ１８３、Ｚ１８４（Ｘ、ＹおよびＺは、任意の自然発生的または非自然発生的アミノ酸である））。キャッピング残基は、任意の好都合な方法を使用して、例えば化学的に、突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドに付加され得るが、アミノ酸は、化学反応によりポリペプチドのＣ末端に共有結合する。代替的に、標準的な分子生物学的技術を使用して、キャッピング残基をコードするコドンがＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドコード配列に付加されてもよい。本明細書に記載の突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドのいずれも、所望により１つ以上の残基でキャッピングされ得る。
【００７８】
Ｃ末端突然変異は、本発明の別の態様を形成する。本明細書において使用される場合、「Ｃ末端突然変異」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の残基９１〜１８１（またはポリペプチドがキャッピングされている場合はより長い）の領域における１つ以上の変化を指す。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体配列に導入されたＣ末端突然変異は、非自然発生的ポリマー結合部位を導入する１つ以上の突然変異に追加的である。Ｃ末端突然変異は、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体配列の９１〜１８１の領域における任意の点で導入され得るが、Ｃ末端突然変異の例示的位置は、位置１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０および１８１を含む。Ｃ末端突然変異は、本明細書に記載のもの等の標準的な分子生物学的技術を使用して導入され得る。本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体のいずれも、Ｃ末端突然変異を含み得る。
【００７９】
キャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異の位置および識別の例を、表７に示す。
【００８０】
【表７】
2014526441.tif 000017
【００８１】
キャッピングされた、および／またはＣ末端ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の活性、ならびにこれらの突然変異の化学的に修飾された形態は、様々な様式で、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを使用して分析され得る。
【００８２】
本発明のキャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体、ならびに化学的に修飾された後のキャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の活性は、ｏｂ／ｏｂマウス等のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて評価され得る。一般に、これらのポリペプチドの１つ以上のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価するために、ポリペプチドは、試験動物に腹腔内投与され得る。１つ以上の所望の期間後に、血液試料を採取して、血糖値を測定することができる。
【００８３】
本発明の全てのＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体と同様に、キャップされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体、ならびに化学的に修飾された後のキャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、定方向突然変異により、または細菌発現プロセスの結果導入され得るアミノ末端メチオニン残基を随意に含んでもよい。
【００８４】
本発明のキャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、標準的な実験技術を使用して調製され得る。標準的な分子生物学的技術に精通した当業者は、その知識を本開示と組み合わせて使用して、本発明のキャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体を作製および使用することができる。標準的な技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換に使用することができる（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。例えば、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造者の仕様に従って酵素的反応および精製技術を行うことができる。特定の定義が示されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、周知のものであり、当該技術分野において一般的に使用されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化および送達、ならびに患者の治療に使用され得る。
【００８５】
キャッピングされた、および／またはＣ末端突然変異ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの調製後、ポリペプチドは、本明細書に記載のように、ポリマーの結合により化学的に修飾され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０４２７４７を参照されたい。
【００８６】
本発明のさらなる態様において、ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体が調製され得るが、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列（配列番号４または８）における両方のシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成せず、またポリマー結合部位として機能しない残基、例えばアラニンまたはセリンと置き換えられる。その後、チオール含有残基（例えば、システイン残基またはチオール基を有する非自然発生的アミノ酸）、または遊離アミノ基（例えば、リシンもしくはアルギニン残基、または遊離アミノ基を有する非自然発生的アミノ酸）の形態で、非自然発生的ポリマー結合部位を導入する置換が、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド内に形成され得る。次いで、結合のためにチオールまたは遊離アミノ基に依存するポリマー、例えばＰＥＧが、既知の位置でＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド配列に導入されているシステイン、リシンまたはアルギニン残基に標的化され得る。この戦略は、より効率的および制御されたポリマー配置を促進し得る。
【００８７】
１つの手法において、７５位および９３位に位置する野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドにおける２つの自然発生的システイン残基は、非チオール含有残基と置換され得る。その後、システイン残基が既知の場所に導入され得る。ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドはまた、さらに多くのポリマー結合部位（例えば、システイン残基）を導入し得る他の突然変異を含むことができ、またはいくつかの他の所望の特性を達成するように設計され得る。そのようなＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの例は、Ｃ７５Ａ／Ｅ９１Ｃ／Ｃ９３Ａ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＣ７５Ｓ／Ｅ９１Ｃ／Ｃ９３Ｓ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇを含む。これらの例において、７５位および９３位における自然発生的システインはアラニンまたはセリン残基に突然変異しており、ポリマー結合部位は、９１位および１２５位（この場合、ＰＥＧ等のチオール反応性ポリマー）に導入されており、追加的突然変異は、１７１位において形成されており、すなわち、プロリン１７１がグリシン残基と置換されている（列挙される位置は、配列番号４または８に対する）。
【００８８】
本明細書に開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の全てと同様に、野生型成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド配列において見られるシステインを含有しないが、代わりに、導入されたポリマー結合部位、ならびに随意に１つ以上の追加的突然変異およびこれらの突然変異の化学的に修飾された形態を含むポリペプチドの活性は、様々な様式で、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを使用して分析され得る（例えば、開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドおよび本明細書に開示されるＦＧＦ２１変異体のいずれかの活性の分析に好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを開示している、ＷＯ２０１０／０４２７４７を参照されたい）。これらのポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、例えばｏｂ／ｏｂマウスを使用してｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる（同様に、例えば、開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドおよび本明細書に開示されるＦＧＦ２１変異体のいずれかの活性の分析に好適なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを開示している、ＷＯ２０１０／０４２７４７を参照されたい）。
【００８９】
本発明のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の全てと同様に、野生型成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド配列において見られるシステインを含有しないが、代わりに、導入されたポリマー結合部位、ならびに随意に１つ以上の追加的突然変異およびこれらのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの化学的に修飾された形態を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性は、定方向突然変異により、または細菌発現プロセスの結果導入され得るアミノ末端メチオニン残基を随意に含んでもよい。
【００９０】
野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列において見られるシステインを含有しないが、代わりに、導入されたポリマー結合部位、および随意に１つ以上の追加的突然変異を含むＦＧＦ２１変異体は、標準的方法を使用して調製され得る。標準的な分子生物学的技術に精通した当業者は、その知識を本開示と組み合わせて使用して、これらのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製および使用することができる。標準的な技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換に使用することができる（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。例えば、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造者の仕様に従って酵素的反応および精製技術を行うことができる。特定の定義が示されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、周知のものであり、一般的に使用されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化および送達、ならびに患者の治療に使用され得る。
【００９１】
野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列において見られるシステインを含有しないが、代わりに、導入されたポリマー結合部位、および随意に１つ以上の追加的突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の調製後、ポリペプチドは、結合されているポリマーの性質に依存する当業者に知られた標準的方法を使用したポリマーの結合により化学的に修飾され得る。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号および米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。
【００９２】
さらなる態様において、追加的突然変異は、ＧａｌＮＡｃが付加されてＯ−グリコシル化のための点として機能するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ媒介グリコシル化のための部位を提供し得る、成熟ＦＧＦ２１配列に導入され得る。以下の突然変異のリストは、点突然変異、ならびに連続的および非連続的突然変異のシーケンスの両方を含み、ＧａｌＮＡｃは、ＳまたはＴ残基に付加される。ＦＧＦ２１のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ媒介グリコシル化のための部位を提供し得る突然変異の例は、表８に示されるものを含むが、表８中、複数のアミノ酸の配列が示されている場合、点突然変異は、太字で強調され、下線が引かれている（位置は、配列番号４または８の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。
【００９３】
【表８】
2014526441.tif 000018
2014526441.tif 000019
2014526441.tif 000020
2014526441.tif 000021
2014526441.tif 000022
【００９４】
表８とは対照的に、追加的突然変異は、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体が酵母中で発現した場合、野生型ＦＧＦ２１配列に対してＯ−グリコシル化のための低減された能力を提供し得る成熟ＦＧＦ２１に導入され得る。表９中の突然変異のリストは、点突然変異、ならびに連続的および非連続的突然変異のシーケンスの両方を含む（位置は、配列番号４または８の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。ＦＧＦ２１配列が酵母中で発現した場合に、野生型ＦＧＦ２１配列に対して低減されたＯ−グリコシル化を提供し得る突然変異の例は、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｅ、Ｓ１６７Ｄ、Ｓ１６７Ｎ、Ｓ１６７Ｑ、Ｓ１６７Ｇ、Ｓ１６７Ｖ、Ｓ１６７Ｈ、Ｓ１６７ＫおよびＳ１６７Ｙを含む。
【００９５】
【表９】
2014526441.tif 000023
【００９６】
本開示の別の態様において、本明細書に開示されるいくつかのＦＧＦ２１変異体の所望の特性は、向上した薬学的特性を示すＦＧＦ２１変異体を生成するように、相加的または相乗的に組み合わされてもよい。したがって、別の実施形態において、表１〜１３に提供される点突然変異は、変異体ＦＧＦ２１配列の所望のプロファイルを提供するように組み合わされてもよい。
【００９７】
本発明の全てのＦＧＦ２１突然変異と同様に、２つ以上の本発明の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体は、本明細書に記載のように調製され得る。標準的な分子生物学的技術に精通した当業者は、その知識を本開示と組み合わせて使用して、本発明の２つ以上の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体を作製および使用することができる。標準的な技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換に使用することができる（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。例えば、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（上記参照）を参照されたい。当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造者の仕様に従って酵素的反応および精製技術を行うことができる。特定の定義が示されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、周知のものであり、一般的に使用されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化および送達、ならびに患者の治療に使用され得る。
【００９８】
本発明の２つ以上の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体は、２つ以上の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体に追加的な特性を付与することができる別の実体に融合されてもよい。本発明の一実施形態において、２つ以上の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列に融合されてもよい。そのような融合は、既知の分子生物学的方法および／または本明細書に記載の指針を用いて達成され得る。そのような融合ポリペプチド、およびそのような融合ポリペプチドを作製するための方法の利益は、本明細書においてより詳細に議論される。
【００９９】
点突然変異として、または２つ以上の点突然変異の組み合わせとしてＦＧＦ２１配列に導入され得る突然変異の例は、表１〜１３に記載されるが、その具体例が以下の表１０に記載される（位置は、配列番号４または８の成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドを指す）。
【０１００】
【表１０】
2014526441.tif 000024
2014526441.tif 000025
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【０１０１】
具体的実施形態において、変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本明細書において配列番号１０として示される、配列番号４または８を含む成熟ＦＧＦ２１に導入されたＬ９８Ｒ突然変異およびＰ１７１Ｇ突然変異を含む。そのような変異体の１つの具体例は、配列番号３９のＦｃ融合を含み、配列番号１０のＦＧＦ２１配列は、配列番号３３のリンカーを介して配列番号４７のＦｃ配列に結合している。
【０１０２】
別の具体的実施形態において、変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本明細書において配列番号１２として示される、配列番号４または８を含む成熟ＦＧＦ２１に導入されたＬ９８Ｒ突然変異、Ｐ１７１Ｇ突然変異およびＡ１８０Ｅ突然変異を含む。そのような変異体の１つの具体例は、配列番号４１のＦｃ融合を含み、配列番号１２のＦＧＦ２１配列は、配列番号３３のリンカーを介して配列番号４７のＦｃ配列に結合している。
【０１０３】
開示される方法において使用され得るさらなる具体的ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０４２７４７、ＷＯ２００９／１４９１７１、ＷＯ２０１０１２９５０３に記載されている。
【０１０４】
ＩＶ．「連結分子」
本発明のさらに別の態様において、「連結分子」が、開示される方法において使用され得る。そのような「連結分子」は、本明細書に記載のように調製され得る。「連結分子」は、リンカー分子により互いに連結された２つの野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、配列番号４もしくは８またはそれらの組み合わせ）を含む分子である。２つのＦＧＦ２１ポリペプチドまたは２つのＦＧＦ２１変異体または野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体を互いに結合させることにより、連結分子の効果的な半減期および有効性が、単一のＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体の半減期および有効性以上に拡張され得る。
【０１０５】
本発明の連結分子は、リンカーおよび２つの野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドもしくはＦＧＦ２１変異体またはそれらの組み合わせを含み、突然変異が導入されていない２つの自然発生的ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１ポリペプチドに導入されたリンカー結合部位を有する２つのＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド、または１つの自然発生的ＦＧＦ２１ポリペプチドおよび１つのＦＧＦ２１変異体の組み合わせを含み得る。非自然発生的リンカー結合部位を有する少なくとも１つのＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体、および１つ以上の追加的突然変異を含む連結分子もまた企図され、本発明の別の態様を形成する。したがって、そのような連結分子は、リンカー分子の結合のための部位を形成する突然変異、および連結分子に別の所望の特性を付与するための別の突然変異を含み得る。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「リンカー結合部位」という用語は、リンカーが関連し得る官能基を有する自然発生的または非自然発生的アミノ酸を意味する。一例において、リンカー結合部位は、ＰＥＧ分子と関連し得るチオール基を含有する残基である。
【０１０７】
ＩＶ．Ａ．連結分子内のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体
連結分子が２つのＦＧＦ２１変異体を含む場合、ＦＧＦ２１変異体は、配列内に導入された１つ以上の突然変異を含み得るが、突然変異は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのそれぞれにおいて同じアミノ酸位置にある必要はない。例として、連結分子が２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む場合、１つのＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドは、リンカー分子の結合点を形成し得るＨ１２５Ｃ突然変異を含有してもよい。一方で、他のＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドは、２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを互いに連結するリンカーの結合点として機能し得るＨ１２５以外の位置で突然変異を含有し得る。１つまたは２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが使用されたとしても、リンカーは、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＮ末端に結合することができ、導入された結合点は、必ずしも使用される必要はない。
【０１０８】
連結分子が１つまたは２つの自然発生的野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、配列番号４もしくは８またはそれらの組み合わせ）を含む場合、リンカーは、結合化学に適したＦＧＦ２１ポリペプチド内の点で結合され得る。例えば、自然発生的ジスルフィド結合が低減され得、システイン残基がＰＥＧ等のリンカーの結合点として機能し得る。別の実施形態において、リンカーは、Ｎ末端またはリシン側鎖上でＦＧＦ２１ポリペプチドに結合し得る。
【０１０９】
連結分子のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの１つまたは両方は、切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含み得る。本明細書に記載のように、切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端またはＮおよびＣ末端の両方における任意の数の残基を除去することにより調製され得る。
【０１１０】
連結分子はまた、リンカー結合部位としては好ましくない可能性があるが、代わりに連結分子にいくつかの他の所望の特性を付与し得るポリペプチド配列内の突然変異（例えば、表１〜１３中に記載の突然変異）を含む、１つまたは両方のＦＧＦ２１ポリペプチドを含んでもよい。したがって、突然変異が連結分子に所望の特性を付与する１つ以上のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む連結分子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１１１】
連結分子の活性は、様々な様式で、例えば本明細書に記載のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを使用して分析され得る。
【０１１２】
開示される連結分子を含む開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドおよび本明細書において開示されるＦＧＦ２１変異体の全ての活性は、例えばｏｂ／ｏｂマウスにより、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる。一般に、これらのポリペプチドの１つ以上のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価するために、ポリペプチドは、試験動物に腹腔内投与され得る。１つ以上の所望の期間後に、血液試料を採取して、インスリン、コレステロール、脂質または血糖の値等のバイオマーカーを測定することができる。
【０１１３】
本発明の全てのＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の場合と同様に、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはその両方の組み合わせであってもよい連結分子を含むＦＧＦ２１ポリペプチドは、随意に、定方向突然変異により、または細菌発現プロセスの結果導入され得るアミノ末端メチオニン残基を含んでもよい。
【０１１４】
標準的な分子生物学的技術に精通した当業者は、その知識を本開示と組み合わせて使用して、本明細書に記載の連結分子（ならびにＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体）を作製および使用することができる。標準的な技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換に使用することができる（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。例えば、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造者の仕様に従って酵素的反応および精製技術を行うことができる。リンカーをＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体に関連付けるためのプロセスは、リンカーの性質に依存するが、当業者に知られている。リンカー結合化学の例は、本明細書に記載される。
【０１１５】
特定の定義が示されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、周知のものであり、当該技術分野において一般的に使用されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化および送達、ならびに患者の治療に使用され得る。
【０１１６】
ＩＶ．Ｂ．連結分子を形成するのに有用なリンカー
２つのＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを互いに連結させるための連結分子において、任意のリンカーを使用することができる。リンカー分子は、分岐または非分岐であってもよく、本明細書に記載のもの等の様々な既知の化学を使用してＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合され得る。リンカーは主にスペーサとして機能するため、リンカーの化学構造は重要ではない。リンカーは、独立して、連結分子（例えば、３つ以上のＦＧＦ２１変異体またはＦＧＦ２１ポリペプチドを含む連結分子）内に存在し得る任意の他のリンカー（複数を含む）と同じ、または異なってもよい。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸で構成され得る。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者により十分に理解されるように、グリコシル化されてもよい。例えば、シアリル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号４６、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）である。別の実施形態において、リンカー分子は、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａ等の任意のサイズのＰＥＧ分子であってもよい。
【０１１７】
ペプチジルリンカーが存在する（すなわち、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸で構成される）実施形態において、リンカーは、好ましくは１個から約４０個までのアミノ酸残基、より好ましくは１個から約２０個までのアミノ酸残基、最も好ましくは１個から約１０個までのアミノ酸残基の長さで作製される。一実施形態において、リンカー内のアミノ酸残基は、任意の２０の標準アミノ酸から選択される。別の実施形態において、リンカー内のアミノ酸残基は、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および／またはセリンから選択される。さらに別の実施形態において、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合により結合したグリシン、セリン、およびアラニン等の立体障害のないアミノ酸の大部分で構成される。存在する場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環における急速なタンパク質分解代謝回転を回避するペプチジルリンカーが選択されることが望ましいことが多い。したがって、好ましいペプチジルリンカーは、ポリグリシン、特に（Ｇｌｙ）４  （配列番号１３）；（Ｇｌｙ）５（配列番号１４）；ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）；およびポリアラニンを含む。他の好ましいペプチジルリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１６）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）および本明細書に記載の実施例において使用される任意のリンカーを含む。しかしながら、本明細書に記載のリンカーは例示的であり、本発明の範囲内のリンカーは、それよりはるかに長くてもよく、また他の残基を含んでもよい。
【０１１８】
ペプチドリンカー部分を含む連結分子の実施形態において、酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基が、リンカー部分のアミノ酸配列内に配置される。その例は、以下のペプチドリンカー配列を含む。
ＧＧＥＧＧＧ  （配列番号１８）；
ＧＧＥＥＥＧＧＧ  （配列番号１９）；
ＧＥＥＥＧ  （配列番号２０）；
ＧＥＥＥ  （配列番号２１）；
ＧＧＤＧＧＧ  （配列番号２２）；
ＧＧＤＤＤＧＧ  （配列番号２３）；
ＧＤＤＤＧ  （配列番号２４）；
ＧＤＤＤ  （配列番号２５）；
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ  （配列番号２６）；
ＷＥＷＥＷ  （配列番号２７）；
ＦＥＦＥＦ  （配列番号２８）；
ＥＥＥＷＷＷ  （配列番号２９）；
ＥＥＥＦＦＦ  （配列番号３０）；
ＷＷＥＥＥＷＷ  （配列番号３１）；  または
ＦＦＥＥＥＦＦ  （配列番号３２）。
【０１１９】
他の実施形態において、ペプチジルリンカーは、リン酸化部位、例えばＸ１Ｘ２ＹＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号４３）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基である）；Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号４４）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基である）；またはＸ１Ｘ２ＴＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号４５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基である）を構成する。
【０１２０】
また、非ペプチドリンカーが連結分子内に使用されてもよい。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２から２０である）等のアルキルリンカーが使用され得る。これらのアルキルリンカーは、任意の非立体障害基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等によりさらに置換されていてもよい。
【０１２１】
連結分子を形成するために、任意の好適なリンカーが本発明において使用され得る。一例において、本明細書に記載の連結分子を生成するために使用されるリンカーは、一般式：
Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−Ｘ
（式中、Ｘは、マレイミド基である）を有するホモ二官能性ビス−マレイミドＰＥＧ分子であった。他の実施形態において、Ｘは、オルトピリジル−ジスルフィド、ヨードアセトアミド、ビニルスルホン、または、当該技術分野においてチオール基に特異的であることが知られている任意の他の反応性部分であってもよい。さらに別の実施形態において、Ｘは、Ｎ末端または操作されたリシル基を介して２つの突然変異ポリペプチドを連結するために使用される、アミノ特異的反応性部分であってもよい。（例えば、Ｐａｓｕｔ  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  ２００６，  “ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ａｄｖ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．  １９２：９５−１３４を参照されたい。）
【０１２２】
さらに別の実施形態において、リンカーは、一般式：
Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（式中、ＸおよびＹは、上述の基から選択される異なる反応性部分である）を有し得る。そのようなリンカーは、異なる突然変異ポリペプチドの複合化を可能にし、連結されたヘテロ二量体またはヘテロオリゴマーを生成する。
【０１２３】
さらなる実施形態において、リンカーは、１から１００ｋＤａ、好ましくは１０から５０ｋＤａ（例えば、１０、２０、３０または４０ｋＤａ）、より好ましくは２０ｋＤａの分子量を有し得るＰＥＧ分子であってもよい。ペプチドリンカーは、上述と同じ様式で誘導体を形成するように改質され得る。
【０１２４】
有用なリンカーの他の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００６／０４２１５１号に記載のような、アミノエチルオキシエチルオキシ−アセチルリンカーを含む。
【０１２５】
本発明の連結分子を形成する際、リンカーをＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体ＦＧＦ２１ポリペプチに関連付けるために、標準的な化学を使用することができる。関連付けの正確な方法は、結合部位（例えば、アミノ酸側鎖）およびリンカーの性質に依存する。リンカーがＰＥＧ分子である場合、結合は、標準的な化学および遊離スルフヒドリルまたはアミン基、例えばシステイン残基（突然変異によりＦＧＦ２１ポリペプチドもしくはＦＧＦ２１変異体ポリペプチド配列に導入されてもよく、または自然発生的であってもよい）上に、またはリシン（突然変異によりＦＧＦ２１配列に導入されてもよく、または自然発生的であってもよい）上に見られるもの、あるいはＮ末端アミノ基により達成され得る。
【０１２６】
Ｖ．化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異
本明細書に記載のＦＧＦ２１分子の切断された形態を含む、本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の化学的に修飾された形態は、本明細書に記載の開示を考慮して当業者により調製され得る。そのような化学的に修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドおよび変異体は、化学的に修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体が、ＦＧＦ２１変異体に自然に結合した分子の種類または位置において、非修飾ＦＧＦ２１ポリペプチドとは異なるように改質される。化学的に修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、１つ以上の自然に結合した化学基の欠失により形成される分子を含み得る。
【０１２７】
化学修飾に好適となり得る追加的なＦＧＦ２１変異体は、化学修飾のための結合／反応点として機能し得る個々の点突然変異を示す表１１の変異体を含む。示される残基数は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、配列番号４または８）に対するものである。
【０１２８】
【表１１】
2014526441.tif 000030
【０１２９】
表１１は、様々な単一の点突然変異を示しているが、複数の点突然変異がＦＧＦ２１配列に導入されて、表１１に記載のものを含む化学修飾のための複数の部位を生成してもよい。したがって、化学修飾に好適となり得る追加的なＦＧＦ２１変異体は、化学修飾のための結合／反応点として機能し得る点突然変異の組み合わせを示す表１２の変異体を含む。示される残基数は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、配列番号４または８）に対するものである。
【０１３０】
【表１２】
2014526441.tif 000031
【０１３１】
表１１は、様々な単一の点突然変異を示し、複数の点突然変異がＦＧＦ２１配列に導入されて、化学修飾のための複数の部位を生成してもよく、表１２は、化学修飾のための結合／反応点として機能し得る２つの点突然変異の組み合わせを示す。以下に示される表１３は、化学修飾のための結合／反応点として機能し得る３つの点突然変異の組み合わせを示す。示される残基数は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば、配列番号４または８）に対するものである。
【０１３２】
【表１３】
2014526441.tif 000032
2014526441.tif 000033
【０１３３】
一実施形態において、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、１つ以上のポリマーの共有結合により修飾され得る。例えば、選択されるポリマーは、それが結合するタンパク質が生理学的環境等の水性環境において沈殿しないように、典型的には水溶性である。好適なポリマーの範囲内には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終製品調製物の治療的使用のために、ポリマーは、薬学的に許容される。本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体に複合化した非水溶性ポリマーもまた、本開示の一態様を形成する。
【０１３４】
例示的ポリマーは、それぞれ、任意の分子量のポリマーであってもよく、また分岐または非分岐であってもよい。ポリマーは、それぞれ、典型的には約２ｋＤａから約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製において、述べられた分子量より重い分子もあれば、それより軽い分子もあることを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａから約５０ｋＤａの間、より好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａ、最も好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａの間である。
【０１３５】
好適な水溶性ポリマーまたはその混合物は、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、（例えば約６ｋＤの低分子量デキストラン等）、セルロースまたは他の炭水化物系ポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。また、共有結合したＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異多量体を調製するために使用され得る二官能性架橋分子も、本発明に包含される。また、ポリシアル酸に共有結合したＦＧＦ２１突然変異も、本発明に包含される。
【０１３６】
本開示のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含む１種以上の水溶性ポリマーを含むように、共有結合的または化学的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号および米国特許第４，１７９，３３７号、ならびに本明細書に記載の実施例を参照されたい。本発明のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物系ポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、またはそのようなポリマーの混合物を含むがこれらに限定されない、１種以上のポリマーを含む。
【０１３７】
本開示のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、ＰＥＧサブユニットにより共有結合的に修飾されている。いくつかの実施形態において、１種以上の水溶性ポリマーは、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体の１つ以上の特定の位置に（例えばＮ末端に）結合する。いくつかの実施形態において、１種以上の水溶性ポリマーは、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の１つ以上の側鎖に無作為に結合する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の治療能力を改善するために使用され、これは、開示される方法を実践する際に望ましくなり得る。例えば、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１３３，４２６号において、ある特定の方法が議論されている。
【０１３８】
ポリマーがＰＥＧである本開示の実施形態において、ＰＥＧ基は、任意の好都合な分子量のものであってもよく、直鎖または分岐鎖であってもよい。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは、約２ｋＤから約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲、例えば、１０、２０、３０、４０、または５０ｋＤａであってもよい。ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を介した、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのアシル化または還元アルキル化により、ＦＧＦ２１突然変異に結合する。
【０１３９】
本開示のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２３１変異体を含むポリペプチドのＰＥＧ化は、当該技術分野において知られたＰＥＧ化反応のいずれかを使用して特定的に行うことができる。そのような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：  ４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および第０４０１３８４号、ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ＰＥＧ化は、本明細書に記載のように、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）によるアシル化またはアルキル化反応により行うことができる。アシル化反応の場合、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元アルキル化の場合、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。
【０１４０】
本開示のいくつかの実施形態において、ポリペプチドへのＰＥＧ基の結合のための有用な戦略は、溶液中の複合体結合の形成を介して、それぞれが他方に対して相互反応性である特別な官能性を保持する、ペプチドおよびＰＥＧ部分を組み合わせることを含む。ペプチドは、従来の固相合成により容易に調製され得る。ペプチドは、特定の部位において適切な官能基で「事前活性化」されている。前駆体は、ＰＥＧ部分と反応する前に、精製され、完全に特性決定される。ペプチドのＰＥＧとのライゲーションは、通常、水相において生じ、逆相分析ＨＰＬＣにより容易に監視することができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製され、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザ脱離質量分析により特性決定され得る。
【０１４１】
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾に使用され得る別の種類の水溶性ポリマーである。したがって、多糖類ポリマーに融合した本明細書に開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、開示される方法において使用され得るＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の追加の実施形態を形成する。デキストランは、主にアルファ１−６結合により結合したグルコースの個々のサブユニットを含む多糖類ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独の、または別のビヒクル（例えばＦｃ）と組み合わせたビヒクルとしての使用に好適な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号を参照されたい。治療的または診断的免疫グロブリンに複合化したデキストランの使用が報告されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許公開第０３１５４５６号を参照されたい。本発明はまた、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランの使用を包含する。
【０１４２】
一般に、化学修飾は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の好適な条件下で行うことができる。化学的に修飾されたポリペプチドを調製するための方法は、一般に、（ａ）ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体が１つ以上のポリマー分子に結合する件下で、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（例えばポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させるステップと、（ｂ）反応生成物を得るステップとを含む。最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比が大きい程、結合するポリマー分子のパーセンテージが大きい。本発明の一実施形態において、化学的に修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、アミノ末端に単一のポリマー分子部分を有することができる（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照されたい）。
【０１４３】
本発明の別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体は、ビオチンに化学的に結合させることができる。次いで、ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体をアビジンに結合させ、四価アビジン／ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を得る。ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体はまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合させることができ、得られる複合体は抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭにより沈殿し、１０の価数を有する十量体複合体を形成し得る。
【０１４４】
一般に、開示される化学的に修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の投与により軽減または調節され得る状態は、本明細書に記載のもの、例えば１型糖尿病を含み、したがって、開示される方法において使用することができる。しかしながら、本明細書に開示される化学的に修飾されたＦＧＦ２１変異体はまた、非修飾ＦＧＦ２１変異体と比較して、追加的な活性、向上もしくは低減した生物活性、または増加もしくは低減した半減期等の他の特性を有し得る。
【０１４５】
ＶＩ．ＦＧＦ２１様シグナル伝達を示す分子
開示される方法を実行する上で有用となり得るＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体の範囲は、表１〜１３に示されるが、これらの分子は排他的なリストを形成しないことが留意されることが留意される。本明細書において示されるように、ＦＧＦ２１およびその変異体は、１型糖尿病等の様々な代謝状態を治療する際に使用され得ることが確定している。したがって、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を含むいかなる分子も、開示される方法において使用され得る。「ＦＧＦ２１様シグナル伝達」および「ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導する」という用語は、本開示の方法における使用に企図される分子に適用される場合、分子が、（ｉ）β−Ｋｌｏｔｈｏ；（ｉｉ）ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４；または（ｉｉｉ）β−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４の１つを含む錯体の結合により誘導される、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的効果を模倣または調節し、（ｉ）β−Ｋｌｏｔｈｏ；（ｉｉ）ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４；または（ｉｉｉ）β−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４の１つを含む錯体へのｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＧＦ２１結合から別様に得られる生物学的反応を誘導することを意味する。開示される方法における使用のための分子を特定する上で、分子は、反応が、配列番号４または８の成熟形態（すなわち、ヒトＦＧＦ２１配列の成熟形態）を含む野生型ＦＧＦ２１標準の活性の５％以上、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である場合、生物学的反応を誘導するものとみなされ、以下の特性を有する：（１）ＷＯ２０１１／０７１７８３に記載のもの等の組み換えＦＧＦ２１受容体媒介ルシフェラーゼ−レポーター細胞アッセイ；（２）ＷＯ２０１１／０７１７８３に記載のもの等の組み換えＦＧＦ２１受容体媒介細胞アッセイにおけるＥＲＫ−リン酸化、および（３）ＷＯ２０１１／０７１７８３に記載のようなヒト脂肪細胞におけるＥＲＫ−リン酸化において、ＦＧＦ２１標準（例えば、配列番号４および８）の５％以上の有効性レベルおよび１００ｎＭ以下、例えば９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭまたは１０ｎＭのＥＣ５０を示す。候補分子の「有効性」は、以下のアッセイにおいて、１００ｎＭ以下、例えば９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、および好ましくは１０ｎＭ未満の分子のＥＣ５０を示すこととして定義される：（１）ＷＯ２０１１／０７１７８３に記載の組み換えＦＧＦ２１受容体媒介ルシフェラーゼ−レポーター細胞アッセイ；（２）ＷＯ２０１１／０７１７８３に記載の組み換えＦＧＦ２１受容体媒介細胞アッセイにおけるＥＲＫ−リン酸化；および（３）ＷＯ２０１１／０７１７８３に記載のようなヒト脂肪細胞におけるＥＲＫ−リン酸化。
【０１４６】
したがって、開示される方法は、ＦＧＦ２１模倣薬、あるいは、ＦＧＦ２１活性を模倣するが、それ自体はＦＧＦ２１ポリペプチド配列（例えば、配列番号４もしくは８）もしくはＦＧＦ２１変異体配列に対して比較的低い程度の配列相同性を含む、またはいくつかの場合においてはＦＧＦ２１と全く相同性を有さない分子を使用して行うことができる。そのような分子は、ＷＯ２０１１／０７１７８３、ＷＯ２０１１／０６８８９３、ＷＯ２０１１／１３０４１７およびＷＯ２０１０／１４８１４２に記載されている。
【０１４７】
ＶＩＩ．ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を含む薬学的組成物
開示される方法における使用のための、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物が提供される。そのようなＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体薬学的組成物は、投与形態との適合性のために選択される薬学的または生理学的に許容される製剤と混合された、治療上効果的な量のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含み得る。開示される方法における使用に好適な薬学的組成物は、本明細書に開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含み得る。
【０１４８】
「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、本明細書において使用される場合、人間または人間以外の対象へのＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の送達を達成または向上させるために、および本明細書に開示される方法における使用に好適な１種以上の製剤を指す。この用語は、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の１つ以上、およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの場合において、薬学的組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の保存期間または有効性を向上させる、薬学的に許容される物質、例えば湿潤剤または微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤もまた、担体として機能し得る、またはその一成分を形成し得る。許容される薬学的に許容される担体は、好ましくは、使用される用量および濃度において受容者に対し非毒性である。
【０１４９】
本明細書において開示される方法における使用のための薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透性を調節、維持、または保存するための製剤（複数を含む）を含有してもよい。好適な製剤は、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン）、抗菌剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸）、膨張性薬剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０もしくはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０；Ｔｒｉｔｏｎ；トロメタミン；レシチン；コレステロールもしくはチロキサパル）、安定性向上剤（例えば、スクロースもしくはソルビトール）、等張性向上剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムもしくはカリウム−またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤ならびに／あるいは薬学的アジュバント（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：  ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，  第１９版，  （１９９５）；Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ６６６１），  １−１９  （１９７７）を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。追加的な関連する原理、方法、および薬剤は、例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ−ＤＩＳＰＥＲＳＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ  （第２版，  ｖｏｌ．  ３，  １９９８）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＆  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ  （第７版  ２０００）；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，  ＴＨＥ  ＥＸＴＲＡ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＥＩＡ  （第３１版），  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  （第１６〜２０版およびその後の��）；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  Ｅｄｓ．  （第９版−−１９９６）；Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｓｖｏｌｄｓ’  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，  Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｒｅｍｅｒｓ，  Ｅｄｓ．  （第１０版，  １９９８）に記載されており；薬学的に許容される組成物の製剤化の原理は、例えば、Ａｕｌｔｏｎ，  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ：  ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＯＦ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭ  ＤＥＳＩＧＮ，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  （１９８８），  ＥＸＴＥＭＰＯＲＡＮＥＯＵＳ  ＯＲＡＬ  ＬＩＱＵＩＤ  ＤＯＳＡＧＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，  ＣＳＨＰ  （１９９８）にも記載されており、これらの参考文献は全て、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
本明細書に開示される方法における使用のための最適な薬学的組成物は、当業者により、例えば意図される投与経路、送達形態、および所望の用量に基づいて決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（上記参照）を参照されたい）。そのような組成物は、ＦＧＦ２１ポリペプチドの物理状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ  放出の速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏ  クリアランスの速度に影響し得る。
【０１５１】
本明細書に開示される方法における使用のための薬学的組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水性または非水性の性質であってもよい。例えば、注射に好適なビヒクルまたは担体は、非経口投与用の組成物において一般的な他の材料が添加されていてもよい、水、生理食塩溶液、または人工脳脊髄液であってもよい。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的ビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはさらにソルビトールまたは好適な代替物を含んでもよい。本発明の一実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を随意の製剤と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存のために調製され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（上記参照））。さらに、ＦＧＦ２１ポリペプチド生成物は、スクロース等の適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化され得る。
【０１５２】
ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。代替的に、組成物は、吸引または消化管を介した送達、例えば経口的な送達のために選択され得る。
【０１５３】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在し得る。例えば、緩衝剤は、組成物を生理学的ｐＨまたはそれより若干低いｐＨ、典型的には約５から約８のｐＨ範囲内に維持するように使用され得る。
【０１５４】
非経口投与が企図される場合、開示される方法における使用のための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中の所望のＦＧＦ２１ポリペプチドを含むパイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。非経口注射に特に好適なビヒクルは、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体が適切に保存された無菌等張溶液として製剤化された、無菌蒸留水である。さらに別の調製は、所望の分子の、続いて蓄積注射により送達され得る生成物の制御または持続放出を提供する、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（例えばポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤との製剤化を含み得る。ヒアルロン酸が使用されてもよく、これは、循環中の持続期間の促進作用を有し得る。所望の分子の導入のための他の好適な手段は、移植型薬剤送達デバイスを含む。
【０１５５】
一実施形態において、薬学的組成物は、吸引用に製剤化され得る。例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、吸引用の乾燥粉末として製剤化され得る。また、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体吸引溶液が、エアロゾル送達用の噴射剤と共に製剤化され得る。さらに別の実施形態において、溶液は、霧化され得る。国際公開第ＷＯ９４／２００６９号において、経肺投与がさらに記載されている。
【０１５６】
また、本明細書に開示される方法の脈絡の中で、ある特定の製剤が経口投与され得ることが企図される。本方法の一実施形態において、このように投与されるＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体は、錠剤およびカプセル等の固体投薬形態の配合において習慣的に使用される担体あり、またはなしで製剤化され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性分解が最小限化される場合に、胃腸管の点で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の吸収を促進するために、追加的な薬剤が含まれてもよい。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑油、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用され得る。
【０１５７】
代替の薬学的組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物としての、効果的な量のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含んでもよい。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解させることにより、溶液を単位用量形態で調製することができる。好適な賦形剤は、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、またはアカシア；あるいは潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクを含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
本明細書に開示される方法において使用され得る追加的なＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体薬学的組成物は、当業者には明らかであり、持続または制御送達製剤としての、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む製剤を含む。リポソーム担体、生体侵食性マイクロ粒子または多孔質ビーズ、および蓄積注射等の、様々な他の持続または制御送達手段の製剤化のための技術もまた、当業者に知られている（例えば、薬学的組成物の送達のための多孔質ポリマーマイクロ粒子の制御放出を記載している国際公開第ＷＯ９３／１５７２２号、ならびに、ミクロスフェア／マイクロ粒子の調製および使用を議論しているＷｉｓｃｈｋｅ  ＆  Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，  （２００８）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７およびＦｒｅｉｂｅｒｇ  ＆  Ｚｈｕ，  （２００４）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２８２：  １−１８を参照されたい）。本明細書に記載のように、ヒドロゲルは、持続または制御送達製剤の一例である。
【０１５９】
持続放出調製物の追加的な例は、成形物、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第００５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，  （１９８２）  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０１３３９８８号）を含み得る。また、持続放出組成物は、当該技術分野において知られたいくつかの方法のいずれかにより調製され得るリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２：３６８８−９２；ならびに欧州特許第００３６６７６号、欧州特許第００８８０４６号および欧州特許第０１４３９４９号を参照されたい。
【０１６０】
本明細書に開示される方法においてｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物は、典型的には無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜を通した濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液として保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射用溶液バッグ、または皮下注射用針により貫通可能なストッパーを有するバイアル内に入れられる。
【０１６１】
薬学的組成物が製剤化されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル内に保存され得る。そのような製剤は、すぐに使用できる形態、または投与前に再構成を必要とする形態（例えば凍結乾燥形態）で保存され得る。
【０１６２】
具体的実施形態において、本発明は、単回投与単位を生成するためのキットに関する。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。また、単一および複数チャンバの事前に充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含有するキットも開示される。
【０１６３】
本明細書に開示される方法において治療的に使用される、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む効果的な量の薬学的組成物は、例えば、治療状況および目的に依存する。したがって、治療のための適切な用量レベルは、送達される分子、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体が使用されている適応症、投与経路、およびサイズ（体重、対表面、または器官サイズ）、ならびに患者の状態（年齢および全体的な健康）に一部依存して変動することが、当業者に理解される。したがって、臨床医学者は、用量を滴定し、投与経路を修正して、最適な治療効果を得ることができる。典型的な用量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲であってもよい。
【０１６４】
本明細書に開示される方法において使用される投薬頻度は、使用されている製剤中のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の薬物動態学的パラメータに依存する。典型的には、臨床医学者は、所望の効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、長期にわたる２回以上の投与（これは、同じ量の所望の分子を含有しても、もしくは含有しなくてもよい）として、または移植デバイスもしくはカテーテルによる連続的注入として投与され得る。適切な用量のさらなる精密化は、当業者により習慣的になされ、当業者により習慣的に行われる作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量−反応データ、例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体による１型糖尿病を含む代謝障害または状態の治療を含む臨床試験から得られたデータを使用することにより確認され得る。
【０１６５】
薬学的組成物の投与経路は、既知の方法に従い、例えば、経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内もしくは病巣内経路による注射により；持続放出系（これもまた注射されてもよい）により；または移植デバイスにより行われる。所望される場合、組成物は、ボーラス注射により、または注入により連続的に、または移植デバイスにより投与され得る。
【０１６６】
代替的に、または追加的に、組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された膜、スポンジ、または別の適切な材料の移植を介して局所的に投与されてもよい。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官内に移植されてもよく、所望の分子の送達は、拡散、時限放出性ボーラス、または継続投与により行われてもよい。
【０１６７】
薬物、例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を、薬物濃度が所望の治療上効果的なレベルで長期間にわたり維持され得るような所定の速度で送達するために、開示される方法を実践する場合、様々な異なる手法を使用することができる。そのような手法は、本明細書に開示される方法を実践する際に有用となり得る。一例において、ゼラチン（例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチン、もしくは別の源からのゼラチン）等のポリマー、または自然発生的もしくは人工的に生成されたポリマーを含むヒドロゲルが使用され得る。５、１０、１５または２０％等の任意のパーセンテージのポリマー（例えば、ゼラチン）を、ヒドロゲルにおいて使用することができる。適切な濃度の選択は、所望の治療プロファイルおよび治療分子の薬物動態プロファイル等の様々な因子に依存し得る。
【０１６８】
ヒドロゲルに組み込むことができるポリマーの例は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド、コ−ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリジノン）、ポリ（アミノ酸）、デキストラン、ヘパリン、多糖類、ポリーテル等を含む。
【０１６９】
ヒドロゲル製剤を生成する際に考慮され得る別の因子は、ヒドロゲル中の架橋度および架橋剤である。一実施形態において、架橋は、メタクリル酸無水物が関与するメタクリル化反応により達成され得る。いくつかの状況において、高い架橋度が望ましくなり得るが、他の状況では、より低い架橋度が好ましい。いくつかの場合において、より高い架橋度は、より長い持続放出を提供する。より高い架橋度は、より丈夫なヒドロゲル、および薬物が送達されるより長い期間を提供し得る。
【０１７０】
架橋剤（例えば、メタクリル酸無水物）に対するポリマーの任意の比を使用して、所望の特性を有するヒドロゲルを生成することができる。例えば、架橋剤に対するポリマーの比は、例えば、８：１、１６：１、２４：１、または３２：１であってもよい。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンであり、架橋剤がメタクリレートである場合、８：１、１６：１、２４：１、または３２：１のメタクリル酸無水物：ゼラチンの比が使用されてもよい。
【０１７１】
ＶＩＩＩ．開示されるＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体および核酸を使用して代謝状態または障害を治療する方法
ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、本明細書に開示される方法において使用される場合、代謝状態または障害を治療、診断または改善するために使用され得る。一実施形態において、治療される代謝障害は、糖尿病、例えば、１型糖尿病である。別の実施形態において、代謝状態または障害は、肥満である。他の実施形態において、代謝状態または障害は、脂質異常症、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、または糖尿病性ネフロパシーである。ＦＧＦ２１ポリペプチドは、薬学的組成物の形態で対象に提供され得る。
【０１７２】
一例において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、人間対象が１２５ｍｇ／ｄＬ以上、例えば１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００または２００ｍｇ／ｄＬ超の空腹時血糖値を有する状態である。開示される方法の一実施形態において、７０〜１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値の達成、例えば、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値を達成するために、人間患者に十分なＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を投与することが、標的となる目標であってもよい。空腹時血糖値の測定は、様々な周知の方法または装置のいずれかを使用して得ることができる。例えば、一実施形態において、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，  ＰＡ）を使用することができる。
【０１７３】
血糖値は、満腹もしくは空腹状態、または無作為で測定することができる。別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、人間対象が１２０ｍｇ／ｄＬを超える満腹時（食後ではない）血糖値を有する状態である。満腹時（食後ではない）状態において、開示される方法は、人間患者における標的血糖値、例えば８０〜１２０ｍｇ／ｄＬ、例えば、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０ｍｇ／ｄＬを達成するために使用され得る。満腹時（食後ではない）状態における血糖値の測定は、様々な周知の方法または装置のいずれかを使用して得ることができる。例えば、一実施形態において、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，  ＰＡ）を使用することができる。
【０１７４】
別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、人間対象が１５０ｍｇ／ｄＬを超える空腹時トリグリセリド値を有する状態である。１つの例示的な標的空腹時トリグリセリド値は、１５０ｍｇ／ｄＬ未満であり、例示的方法は、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１０ｍｇ／ｄＬの空腹時トリグリセリド値を達成するために、人間患者に十分なＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を投与することを含む。空腹時トリグリセリド値の測定は、様々な周知の方法または装置のいずれかを使用して得ることができる。例えば、一実施形態において、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，  ＰＡ）を使用することができる。
【０１７５】
別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、人間対象が２００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時全コレステロール値を有する状態である。１つの例示的な標的全コレステロール値は、２００ｍｇ／ｄＬ未満であり、例示的方法は、２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１０ｍｇ／ｄＬの空腹時全コレステロール値を達成するために、人間患者に十分なＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を投与することを含む。空腹時全コレステロール値の測定は、様々な周知の方法または装置のいずれかを使用して得ることができる。例えば、一実施形態において、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，  ＰＡ）を使用することができる。
【０１７６】
別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、グルコースの投与から２時間後（すなわち、経口耐糖能試験、「ＯＧＴＴ」）に人間対象が１４０ｍｇ／ｄＬを超える血糖値を有する状態である。ＯＧＴＴにおいて、１つの例示的な標的血漿グルコース値は、１４０ｍｇ／ｄＬ未満であり、例示的方法は、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５または５０ｍｇ／ｄＬの人間患者へのグルコース投与から２時間後の血漿グルコース値を達成するために、人間患者に十分なＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を投与することを含む。血漿グルコース値の測定は、様々な周知の方法または装置のいずれかを使用して得ることができる。例えば、一実施形態において、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，  ＰＡ）を使用することができる。
【０１７７】
別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、人間対象が、熟練した臨床医学者または医師により決定されるように生理学的に妥当であるとみなされないインスリン値を有する状態である。インスリン値は、様々な周知の方法または装置のいずれかを使用して得ることができる。例えば、一実施形態において、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｋｉｔ  （ＨＥＮＤＯ−７５Ｋ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を使用することができる。
【０１７８】
別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、人間対象が２５ｋｇ／ｍ２を超えるボディマス指数（「ＢＭＩ」）を有する状態である。１８．５〜２５ｋｇ／ｍ２の範囲内の１つの例示的ＢＭＩ、および例示的方法は、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５または２５．０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを達成するために、人間患者に十分なＦＧＦ２１ポリペプチドまたは変異体を投与することを含む。ＢＭＩの測定値は、患者の体重および身長を測定することにより得ることができる。
【０１７９】
様々な実施形態において、対象は、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体で治療され得る、１００ｍｇ／ｄＬ以上の血糖値を有する人間である。
【０１８０】
また、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を使用して治療または改善され得る代謝状態または障害は、対象が代謝状態を発症する増加したリスクを有する状態を含み得る。人間対象において、そのような状態は、約１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値を含む。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物を使用して治療され得る状態はまた、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ−２０１１，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｖｏｌ．  ３４，  Ｎｏ．  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，  Ｓ１１−Ｓ６１，  ２０１０に見出すことができる。
【０１８１】
実用においては、代謝障害または状態、例えば１型糖尿病、空腹時血糖値の上昇、インスリン値の上昇、脂質異常症、肥満、満腹時血漿グルコース値の上昇、空腹時トリグリセリド値の上昇、空腹時全コレステロール値の上昇、ＯＧＴＴ後の血漿グルコース値の上昇、および糖尿病の合併症、例えばネフロパシー、神経障害、網膜症、虚血性心疾患、末梢血管疾患および脳血管疾患は、治療上効果的な用量のＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６もしくは８のもの、または本明細書に記載のＦＧＦ２１変異体、例えば表１〜１３に記載の変異体、および本開示に関連する配列表に列挙されるものを、それを必要とする患者に投与することにより治療され得る。投与は、本明細書に記載のように、例えばＩＶ注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下注射、筋肉内注射により、または錠剤もしくは液体製剤の形態で経口的に行うことができる。いくつかの状況において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の治療上効果的または好ましい用量は、臨床医学者により決定され得る。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の治療上効果的な用量は、なかでも、投与スケジュール、投与される薬剤の単位用量、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体が他の治療薬剤と組み合わされて投与されるかどうか、免疫状態、および受容者の健康に依存する。「治療上効果的な用量」という用語は、本明細書において使用される場合、治療されている疾患または障害の症状の軽減または改善を含む、研究者、医者または他の臨床医学者により求められている組織系、動物、または人間における生物学的または医薬的反応を惹起する、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の量、すなわち、観察され得るレベルの１つ以上の所望の生物学的または医薬的反応、例えば血糖、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロール値の低下、体重の低減、または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の改善を補助する、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の量を意味する。
【０１８２】
ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の治療上効果的な用量はまた、所望の結果に伴い変動し得ることが留意される。したがって、例えば、より低い血糖値が示される状況においては、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の用量は、それに対応して、比較的より低い血糖値が望ましい場合の用量より高い。逆に、より高い血糖値が示される状況においては、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体の用量は、それに対応して、比較的より高い血糖値が望ましい場合の用量より低い。
【０１８３】
一実施形態において、本開示の方法は、まず、対象におけるグルコース、インスリン、コレステロール、脂質等の１つ以上の代謝関連化合物のベースライン値を測定することを含む。次いで、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物が、対象に投与される。所望の期間後、対象における１つ以上の代謝関連バイオマーカーまたは化合物の値（例えば、血糖、インスリン、コレステロールおよび／または脂質値）が再び測定される。次いで、対象における代謝関連化合物の相対的変化を決定するために、２つの値が比較され得る。その比較の結論に依存して、１つ以上の代謝関連化合物の所望の値を達成するために、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物の別の用量が投与され得る。再び、関連バイオマーカーまたは化合物の値が評価され、対象の治療計画における次のステップに関して決定がなされ得る（例えば、１回以上のさらなる投与または薬学的組成物、別の形態の治療、薬学的組成物と別の治療分子との組み合わせ等）。
【０１８４】
開示される方法の様々な実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物は、別の化合物と併用投与されてもよいことが留意される。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体と共に併用投与される化合物の識別および特性は、治療または改善される状態の性質に依存する。ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物と組み合わせて投与され得る化合物の例の限定されないリストは、ロシグリチゾン、ピオグリチゾン、レパグリニド、ナテグリチニド、メトホルミン、エキセナチド、スチアグリプチン、プラムリンチド、グリピジド、グリメプリリドアカルボース、およびミグリトールを含む。
【０１８５】
ＩＸ．キット
開示される方法を実践するためのキットもまた提供される。そのようなキットは、無菌容器内に提供されてもよい、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含むベクターおよび細胞、ならびにそのような核酸含有化合物を含む薬学的組成物を含む、本明細書に記載のようなＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体等の薬学的組成物を含んでもよい。随意に、代謝障害の治療において提供される薬学的組成物をどのようにして使用するかに関する説明書もまた含まれるか、または患者もしくは医療サービス提供者に利用可能であってもよい。
【０１８６】
一態様において、キットは、（ａ）治療上効果的な量のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体を含む薬学的組成物と、（ｂ）薬学的組成物を無菌保存するための１つ以上の容器とを含む。そのようなキットはまた、その使用説明書を含んでもよく、説明書は、治療されている正確な代謝障害に合わせて作成され得る。説明書は、キット内に提供される材料の使用および性質を記載してもよい。ある特定の実施形態において、キットは、代謝障害、例えば血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、１型糖尿病、脂質異常症、糖尿病性ネフロパシーおよび糖尿病の合併症、例えばネフロパシー、神経障害、網膜症、虚血性心疾患、末梢血管疾患および脳血管疾患を治療するために患者が投与を行うための説明書を含む。
【０１８７】
説明書は、基板上、例えば紙またはプラスチック等に印刷されてもよく、添付文書としてキット内に存在する、キットまたはその構成要素の容器のラベルに（例えばパッケージに関連して）存在する等であってもよい。他の実施形態において、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書はキット内に存在しないが、例えばインターネット上で遠隔の源から説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができる、および／またはそこから説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。
【０１８８】
多くの場合、キットのいくつかまたは全ての構成要素が、無菌性を維持するために好適なパッケージ内にパッケージされることが望ましい。キットの構成要素は、単一の取り扱いが容易な単位を形成するようにキット封入要素内にパッケージされてもよく、キット封入要素、例えば箱もしくは類似の構造は、例えば、キットの構成要素のいくつかまたは全ての無菌性をさらに保つために、気密性容器であっても、または機密性容器でなくてもよい。
【０１８９】
本開示全体を通して、公開された文献に対する参照が記載されている。本開示において列挙されている全ての文献は、あらゆる目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１９０】
行われた実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明を限定するものとして解釈されない。
【０１９１】
緒論
組み換えＦＧＦ２１を用いた以前の薬理学的試験は、様々な２型糖尿病げっ歯類および霊長類モデルにおいて、その強力なグルコース低下効果を示した。ＦＧＦ２１の代謝作用は、これらのインスリン耐性モデルにおいて十分に確立されており、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のための治療薬としての可能性を強調している。しかしながら、これまで、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる１型糖尿病における、ＦＧＦ２１のグルコースを低下させる可能性を検査するための試験は文書化されていない。以下の実施例は、１型糖尿病げっ歯類モデルに投与した場合の、グルコース低下およびベータ細胞保護効果を含むＦＧＦ２１の様々な治療関連効果を実証する。
【０１９２】
実施例１
高用量ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導１型糖尿病マウスに対するヒトＦＧＦ２１の効果
本試験は、ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスにおける、ヒトＦＧＦ２１（配列番号４）、ヒトインスリンおよびそれらの組み合わせのグルコース低下および他の代謝効果を評価するために行った。
【０１９３】
雄Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したが、７週齢で供給された。到着後、マウスを個別飼育し、１２時間の明（午前６：３０〜午後６：３０）暗サイクル（午後６：３０〜午前６：３０）で制御環境条件に維持した。マウスに標準げっ歯類用餌の食事（２０２０ｘ  Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）を与え、飲み水を自由に与えた。
【０１９４】
１週間の順化後、血漿グルコースおよび／または体重の測定を行った。その後マウスを餌なしで新しいケージに入れることにより、４時間絶食させた。マウスには飲み水を自由に与えた。これらのマウスに、ＳＴＺ（ストレプトゾトシン、Ｓｉｇｍａ  Ｓ−１０３０）の１８０ｍｇ／ｋｇでの単回腹腔内（ＩＰ）注射を行い、膵臓内のインスリン産生ベータ細胞を弱め、インスリン欠乏１型糖尿病様表現型を誘導した。次いで、げっ歯類用餌を再びケージに入れ、急性低血糖症を予防するためにマウスを１０％スクロース水で４８時間維持した。通常の飲み水を４８時間後に与えた。誘導プロセスの間、毎朝の体重を測定した。ＳＴＺ注射（０日目）から７２時間後の時点で、体重および血漿グルコース値を測定し、血液試料を全てのマウスから採取した。１．２ｇから４．３ｇの体重減少および４１０ｍｇ／ｄＬを超える血漿グルコース値を示すマウスを、試験用に選択した。次いで、血漿グルコースおよび体重の値を無作為化基準として使用して、マウスをビヒクルまたは処置群に割り当てた。ビヒクル（１０ｍＭ  ＫＰＯ４、５％ソルビトール、ｐＨ８．０）、インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）、組み換えヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、またはインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）および組み換えヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の両方を、示された容量で１日２回マウスにＩＰ注射した。処置開始後３日目の朝の注射から１時間および４時間後、ならびに５日目の朝の注射から１時間後に、血糖を測定した。５日目の１時間の血糖測定後に、マウスを安楽死させ、末梢血液試料を採取した。試験期間中、体重を毎日測定した。
【０１９５】
ベースラインおよび末端で採取された血液試料から、臨床化学および内分泌性ホルモン分析のために血漿を調製した。血漿グルコース、全コレステロール、トリグリセリド、および非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を含む臨床化学パラメータを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ；Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，  ＰＡ）を使用して測定した。多重マウス内分泌キット（ＭＥＮＤＯ−７５Ｋ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）により、インスリンおよびグルカゴン値を測定した。
【０１９６】
血漿グルコースに対するＦＧＦ２１の効果：
図１に示されるように、ＳＴＺ注射後、全ての群における血糖値は、通常から６０１ｍｇ／ｄＬから６３０ｍｇ／ｄＬの範囲の平均値まで増加した。血糖値は、５日間の処置期間中、ビヒクル中で７００ｍｇ／ｄＬ超まで増加し続けた。組み換えヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）またはインスリン（５ＩＵ／ｋｇ）による処置は、３日目に、血糖値をそれぞれ１６％および４２％低減した。ＦＧＦ２１およびインスリンの組み合わせの群においては、追加的な５４％の血糖値の低減が観察された。全ての化合物の注射から４時間後、血糖値はベースラインに戻った。５日目に、同様の所見が観察された。組み換えヒトＦＧＦ２１、インスリン、および組み合わせ処置の血糖値低減は、ビヒクル群に対して、それぞれ１５％、３１％、および５８％であった。
【０１９７】
ベースライン（０日目）および５日目の朝の注射から約２時間後に採取された血液試料からの血漿を、より正確な血漿グルコース測定のために臨床化学分析機で分析した。結果を図２に示す。図１に示される血糖測定器から得られた血糖測定値に類似して、ヒトＦＧＦ２１、インスリン、および組み合わせ処置は、ビヒクル群に対して、それぞれ２０％、３２％、および６２％の血糖値の低減をもたらした。
【０１９８】
脂質値に対するＦＧＦ２１の効果：
ベースライン（０日目）および５日目の朝の注射から約２時間後に採取された血液試料を、血漿脂質値を測定するために臨床化学分析機で分析した。０日目から５日目まで、ビヒクル処置マウスにおける血漿トリグリセリド、全コレステロール、およびＮＥＦＡ値は、１型糖尿病が徐々に悪化すると共に２〜３倍増加した。ヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）処置のみは、インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）処置動物において観察される値と同様に、血漿トリグリセリド値を低下させた（図３）。組み合わせ処置群においては、さらなる血漿トリグリセリド低下効果が観察された。ビヒクル群に対して、ヒトＦＧＦ２１、インスリン、および組み合わせ処置における血漿トリグリセリド値の低減は、それぞれ５７％、５３％、および７０％であった（図３）。
【０１９９】
また、ＦＧＦ２１による処置は、全コレステロールおよびＮＥＦＡ値を低下させた。ビヒクル群に対して、ヒトＦＧＦ２１、インスリン、および組み合わせ処置における全コレステロール値の低減は、それぞれ５７％、５３％、および７０％であった（図４）。ＮＥＦＡ値は、ビヒクル処置マウスに対して、ヒトＦＧＦ２１、インスリン、および組み合わせ処置マウスにおいてそれぞれ１８％、５０％、および６５％低減された（図５）。
【０２００】
インスリン値に対するＦＧＦ２１の効果：
ビヒクル、組み換えヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）、またはインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）およびＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを１日２回注射されたＳＴＺ処置マウスにおいて、インスリン値を評価した。ＦＧＦ２１のみでの処置は、ＳＴＺ処置マウスにおける血漿インスリン値を修復しなかった（図６）。しかしながら、血漿インスリン値は、インスリン処置のみの群よりも、ＦＧＦ２１およびインスリンの組み合わせ処置群において高かったが、これはＦＧＦ２１のインスリン安定化効果の可能性を示唆している（図６）。
【０２０１】
グルカゴン値に対するＦＧＦ２１の効果：
図７は、ＳＴＺ誘導１型糖尿病げっ歯類モデルにおける血漿グルカゴン値を低下させるＦＧＦ２１の能力を示している。ビヒクル群と比較して、全ての処置群においてより低いグルカゴン値が見られた。組み換えヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）、インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）、またはインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、５ＩＵ／ｋｇ）および組み換えヒトＦＧＦ２１（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせの処置は、ビヒクル処置に対して、それぞれ２７％、４３％、および３０％グルカゴン値を低減した。
【０２０２】
実施例２
高用量ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスに対する、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果
実施例１において、天然ヒトＦＧＦ２１処置は、ＳＴＺ誘導１型糖尿病げっ歯類モデルにおいて、血漿グルコース値を低下させることができることが実証された。しかしながら、血漿グルコース値は注射後４時間以内に戻るため、この効果は短期間である（図１）。長期の時間枠にわたる血漿グルコース低下効果を評価するために、２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子（２０ｋＤ）を３７位および７７位においてヒトＦＧＦ２１変異体に化学的に融合させた（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ；突然変異の位置は、配列番号４に対する）。この二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体は、以前のげっ歯類試験において、おそらくは改善された薬物動態の結果、天然ヒトＦＧＦ２１に対して優れたグルコース低下効果を示すことが実証されている。本試験は、この二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体が、単回投与後のＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスにおいて、持続的なグルコース低下効果を生成し得るかどうかを評価するために行った。
【０２０３】
高用量ＳＴＺ（１８０ｍｇ／ｋｇ）誘導１型糖尿病マウスモデルを、実施例１に記載のように生成した。ＳＴＺ注射（０日目）から７２時間後の時点で、１．２ｇから３．３ｇの体重減少および３６７ｍｇ／ｄＬから６５２ｍｇ／ｄＬの範囲内の血漿グルコース値を示すマウスを、試験用に選択し、ビヒクルまたは各処置群に割り当てた。１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇでのビヒクル（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）または二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の単回ＩＰ注射をマウスに行った。１、３、５、および７日目において、ビヒクルまたは二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の投与後に血糖を測定した。全試験期間中、体重を毎日測定した。
【０２０４】
図８に示されるように、１日目までに、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）における血漿グルコース値は、ビヒクル値に対して、それぞれ２０％および１５％低減された。これらの値は、３日目に両方の用量群に対して維持され、グルコース低減は、ビヒクルに対してそれぞれ２０％および１２％であった。高用量二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（５ｍｇ／ｋｇ）は、５日目および７日目において引き続き有効性を示し、血漿グルコース低減は、ビヒクルに対して約１５％であった。有効性は、より低用量の二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（１ｍｇ／ｋｇ）において、５日目までに消失した。
【０２０５】
実施例３
複数低用量ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスにおける、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果（予防）
複数低用量（ＭＬＤ）ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスモデルを生成した。ＭＬＤ−ＳＴＺモデルは、前の試験において言及された単回高用量ＳＴＺモデルよりも、人間における１型糖尿病を厳密に模倣する。ＭＬＤ法は、各連続的低用量ＳＴＺ注射の際に、膵臓のベータ細胞の漸減をもたらす。これにより、膵臓のベータ細胞に対する初期炎症反応が生じる。２〜３週間にわたり、この先天性免疫反応が増加し、膵臓のインスリン産生ベータ細胞を破壊してＴ１ＤＭをもたらす。一方、単回高用量ＳＴＺ（１８０ｍｇ／ｋｇ）法は、ＳＴＺ注射後の最初の２４時間から４８時間で膵臓におけるベータ細胞を急速に破壊する。これらの方法は共に最終的にはインスリン欠乏１型糖尿病マウスをもたらすが、ＭＬＤ法は、主に免疫反応により機能し、一方単回高用量法は、主にＳＴＺの毒性作用により機能する。本試験において、我々は、ＭＬＤ  ＳＴＺ誘導マウスにおけるＴ１ＤＭの進行に対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果を評価した。
【０２０６】
雄Ｃ５７ＢＬ６マウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したが、７週齢で供給された。到着後、マウスを個別飼育し、制御環境条件に維持した。５日間の順化後、２０ｇ超の体重のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇ／日で、ＳＴＺ（ストレプトゾトシン、Ｓｉｇｍａ  Ｓ−１０３０）の５回の連続した毎日の腹腔内（ＩＰ）注射を行った。それぞれの日にＳＴＺ注射を受ける前にマウスを４時間絶食させた。誘導プロセスの間、毎朝の体重を監視した。５回目のＳＴＺ注射（０日目）から７２時間後の時点で、体重および血漿グルコース測定を行い、血漿を全てのマウスから採取した。次いで、血漿グルコース値が２００ｍｇ／ｄＬを超えるマウスを、分類基準として血漿グルコースおよび体重に基づき、ビヒクルまたは処置群に無作為に割り当てた。
【０２０７】
ビヒクル（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）または二重ＰＥＧ化２０ｋｄヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）−（１ｍｇ／ｋｇ）を、０日目から開始して４日毎にマウスにＩＰ注射した。処置の開始後２、６、１０、１４、１８および２２日目に、血糖を測定した。２７日目、最後の注射から７日後に、マウスを安楽死させ、末梢血液試料を採取した。試験期間中、体重を１日おきに測定した。
【０２０８】
血漿グルコースに対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果：
５回目のＳＴＺ注射（０日目）から７２時間後の時点で、ビヒクルおよび処置群のベースライン平均血糖は、それぞれ２５３ｍｇ／ｄＬおよび２５６ｍｇ／ｄＬであった。ビヒクル群において、試験の間中血漿グルコース値は増加し、一方二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）群においては、ビヒクルに対して、８％（２日目）、２６％（６日目）、４０％（１０日目）、４８％（１４日目）、５８％（１８日目）、および５４％（２２日目）低減した（図９）。
【０２０９】
０日目および２７日目（最後の注射から７日後）に採取された血液試料からの血漿を、より正確な血漿グルコース測定のために臨床化学分析機で分析した。図９に示される血糖の低減と同様に、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）による処置は、血漿グルコースの上昇を予防し、血漿グルコース値を正常血糖値まで低減した（図１０）。ビヒクル群に対して、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）における血漿グルコースの低減は、５１％であった。
【０２１０】
脂質値に対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果：
０日目から２７日目まで、ビヒクル処置マウスにおける血漿トリグリセリド値は安定なままであり、一方二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）マウスで処置されたマウスにおいては、４７％低減した（図１１）。また、ＦＧＦ２１による処置は、それぞれビヒクル群に対して全コレステロールを２５％（図１２）、ＨＤＬ−コレステロールを１８％（図１３）、およびＮＥＦＡ値を３５％（図１４）低下させた。
【０２１１】
インスリンおよびグルカゴン値に対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体の効果：
単回高用量のＳＴＺモデルと比較して、ＭＬＤ  ＳＴＺ法は、重度のインスリン欠乏状態としては生成しないが、高血糖症を生成するのに適切であったことは明らかである（図９、図１０および図１５）。二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）による処置は、ビヒクル処置に対してインスリン値を６０％低減する（図１５）一方で血糖値を正常に維持したが、これは、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の投与がＭＬＤ  ＳＴＺ処置マウスにおいてインスリン感受性を改善したことを示唆している。
【０２１２】
体重に対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果：
二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）による処置は、ＭＤＬ  ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスにおける体重増加の持続的低減をもたらした（図１６）。０日目からの体重の変化がプロットされている。２２日目までに、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスにおける体重は、ビヒクル処置マウスよりも１７％少なかった。
【０２１３】
実施例４
複数低用量ＳＴＺ誘導１型糖尿病マウスにおける、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果（治療）
我々は、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）が、２２日の試験期間にわたり、Ｔ１ＤＭ  疾患進行の間に血糖値の上昇を予防することを実証した（実施例３）。その試験では、５回目の低用量ＳＴＺ注射から３日後に、マウスが１型糖尿病および高血糖症を発症する前に二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）を投与した。本試験では、我々は、ＭＬＤ  ＳＴＺ注射後にマウスが高血糖症となった時点で、ＦＧＦ２１が高血糖症を逆転させることができるかどうかを評価する。二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）を、ＳＴＺ注射の５回目の投薬から２３日後に投与した。
【０２１４】
ＭＬＤ  ＳＴＺマウスモデルを、実施例３に記載のように生成した。簡潔に述べると、７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６マウスに、４０ｍｇ／ｋｇ／日で、ＳＴＺ（ストレプトゾトシン、Ｓｉｇｍａ  Ｓ−１０３０）の５回の連続した毎日の腹腔内（ＩＰ）注射を行った。ＳＴＺの５回目の投薬（処置２日目）後２１日目に、血糖値および体重を測定し、マウスをビヒクルまたは処置群に無作為化した。ビヒクル（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）または二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を、ＳＴＺの５回目の投薬（処置０日目）後２３日目に、マウスにＩＰ注射した。化合物を４日毎に与え、全部で５回のＩＰ注射を施した。処置２、６、１０、１４、および１８日目に血糖値を測定した。疾患誘導段階中は週２〜３回、および試験期間中は１日おきに、体重を測定した。処置１８日目、最後の注射から２日後に、マウスを安楽死させ、末梢血液試料を採取した。
【０２１５】
各群内の５匹のマウスから膵臓を採取した。インスリンおよびグルカゴンに対する組織学評価および免疫組織化学を行った。５μｍの膵臓切片を脱パラフィンし、脱イオンＨ２Ｏ中で水和させた。切片をＣＡＳ  ＢＬＯＣＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＃００−８１２０；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）でブロックし、ウサギポリクローナル抗グルカゴン（ＤＡＫＯ  ＃Ａ０５６５，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）と共にインキュベートした。スライドを３％  Ｈ２Ｏ２で、続いてＲａｂｂｉｔ  ＥｎｖｉｓｉｏｎＨＲＰ（ＤＡＫＯ  ＃Ｋ４００３，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）でクエンチした。ジアミノベンザジン（ＤＡＢ；ＤＡＫＯ  ＃Ｋ３４６８  Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ，  ＣＡ）で反応部位を可視化した。次いで、切片を再びＣＡＳ  ＢＬＯＣＫでブロックし、モルモットモノクローナル抗インスリン（ＤＡＫＯ  ＃Ａ０５６４，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）と共にインキュベートした。スライドをビオチニル化ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＃ＢＡ７０００，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）、続いてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＰ−ＡＢＣ  （Ｖｅｃｔｏｒ  ＃ＡＫ５０００，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）と共にインキュベートした。反応部位をＡＰ−Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＃ＳＫ５１００）で可視化した。次いで、スライドは病理学者により顕微鏡で評価された。
【０２１６】
血漿グルコースに対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果：
本試験において、我々は、ＭＬＤ  ＳＴＺ誘導から２３日後にマウスがＴ１ＤＭとなった後のＦＧＦ２１投与の血漿グルコース低下効果を調査した。ＭＬＤ  ＳＴＺ誘導から２１日後の処置開始の前に、両群のベースライン平均血糖は、４３８ｍｇ／ｄＬから４５５ｍｇ／ｄＬの範囲内であった（処置２日目）。ビヒクルおよび二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）（１ｍｇ／ｋｇ）を、マウスＱ４Ｄに投与した。その後、血漿グルコースを、２、６、１０、１４、および１８日目に、４日毎に測定した。二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）は、血漿グルコースを低下させ、最終的にこの動物モデルにおける高血糖症を逆転させた（図１７）。二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）群における血漿グルコース値は、４６％（２日目）、５６％（６日目）、および６９％（１０日目、１４日目）低減された。試験１０日目までに、血漿グルコース値は正常血糖値に戻った。
【０２１７】
−２０日目および１８日目の最後の注射から２日後に採取された血液試料からの血漿を、より正確な血漿グルコース測定のために臨床化学分析機で分析した。図１７に示される血糖の低減と同様に、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）による処置は、血漿グルコース値を正常血糖値まで低減した。ビヒクル群に対して、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）群における血漿グルコースの低減は、７０％であった（図１８）。
【０２１８】
脂質値に対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果：
−２０日目から１８日目まで、ビヒクル処置マウスにおけるトリグリセリド値は上昇し、一方ＰＥＧ−ＦＧＦ２１処置マウスは、トリグリセリド値の低減を示した。ビヒクル群に対して、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスにおける血漿トリグリセリド値は、５３％低減された（図１９）。また、ＦＧＦ２１による処置は、全コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、およびＮＥＦＡ値を、それぞれ２１％、１４％および４２％低下させた（図２０、２１、および２２）。
【０２１９】
インスリン値に対する二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の効果：
二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）による処置は、ビヒクル処置に対してインスリン値を５５％低減する（図２３）一方で血漿グルコース値を正常化した（図１７および１８）が、これは、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）の投与がこれらのマウスにおいてインスリン感受性を改善したことを示唆している。
【０２２０】
肝酵素値に対する二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体の効果：
１８日目に、ＡＳＴおよびＡＬＴ値の上昇が、ＭＬＤ  ＳＴＺ処置マウスにおいて観察された（図２４および２５）。二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスは、ビヒクル処置マウスよりも４０％低いＡＬＴ値を示した（図２５）。
【０２２１】
体重に対する二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体の効果：
本試験において、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）により、体重が徐々に低減した（図２６）。１８日目までに、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスにおける体重は、ビヒクル処置マウスよりも６％少なかった。
【０２２２】
ベータ細胞保存に対する二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体の効果：
ＳＴＺ誘導Ｔ１ＤＭマウスへのＦＧＦ２１投与の有益な効果をより良く理解するために、我々は、インスリンおよびグルカゴンの免疫組織化学染色、ならびに膵臓の組織形態分析を行った。具体的には、ベータ細胞萎縮／肥大、膵島細胞の変性、単核細胞浸潤、ならびに周囲組織の萎縮および線維症を分析した。ベータ細胞のインスリン免疫反応性を、図２７に示す。上部パネルは、ビヒクル処置マウス（マウスＡ３）からの画像であり、下部パネルは、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウス（マウスＢ３）からの画像である。図示されるように、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスにおいて、インスリン免疫反応性の強度および均一性の増加が見られた。図２８は、各ビヒクルおよび二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスからの、インスリン免疫反応性および形態学的所見を要約している。ビヒクル処置マウスは、Ａ１からＡ５で示され、一方二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたマウスは、Ｂ１からＢ５で示されている。要約すると、ほぼ全てのビヒクル処置マウスが、いくらかの膵島細胞萎縮／肥大および変性を示し、一方で、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置された群内の１〜２匹のマウスが、これらの効果を示した。また、インスリン免疫反応性がビヒクル処置マウスにおいて大きく減少したことは、ビヒクル処置マウスにおいては、二重ＰＥＧ化ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）で処置されたものよりも高いパーセンテージのベータ細胞が破壊されたことを示唆している。全体的に、これらの形態学的結果は、ＦＧＦ２１処置が、グルコースおよび脂質値を低下させるだけでなく、ベータ細胞に対する、さらなる免疫学的破壊およびＴ１ＤＭの進行からのいくらかの保護効果を示すことを裏付けている。
【０２２３】
結論
総合的に、実施例１〜４に示されるデータは、ＦＧＦ２１が１型糖尿病患者に対する新たな治療上の選択肢を提示することを示している。ＦＧＦ２１処置のみでも、高用量および低用量ＳＴＺ誘導１型糖尿病げっ歯類モデルの両方において、血漿グルコースおよび脂質値を低減するのに十分であった。さらに、インスリン処置と併せたＦＧＦ２１処置は、相加的な血漿グルコース低下効果を提供する。ヒトＦＧＦ２１変異体（Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ）のＰＥＧ化は、血漿グルコース低下効果を、単回注射後７日間まで劇的に延長した。この分子の長期投与は、Ｔ１ＤＭマウスにおいて、Ｔ１ＤＭの進行を防止しただけでなく、血漿グルコースおよび脂質値の上昇を逆転させた。我々の形態学的分析から、我々はさらに、ＦＧＦ２１投与が膵島インスリン含量を増加させ、ベータ細胞を破壊から保護することを示した。これは、Ｔ１ＤＭ動物モデルにおいて観察されるＦＧＦ２１の有益な効果の機構的説明を提供し得る。全体的に、我々は、ＦＧＦ２１が１型糖尿病の治療の可能性を有する証拠を提供した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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