(57)【要約】  本発明は細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセスを提供するが、そのプロセスは以下のステップ、すなわち：a) 発酵培地中でグラム陰性宿主細胞培養物を増殖させるステップであって、この宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、そのポリヌクレオチドが細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしているステップ；またはグラム陰性宿主細胞を提供するステップであって、この宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換され、そのポリヌクレオチドが細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしており、このグラム陰性宿主細胞がペリプラズムで発現される細菌トキソイドを含有するステップ；a(i)) 細菌トキソイドの発現を誘導するステップ；b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、その成熟ステップが：I) 宿主細胞をpHショックにさらすこと；II) 宿主細胞を供給添加なしでインキュベートすること；および/またはIII) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらすこと、を含んでなるステップ；ならびにc) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程が浸透圧ショックを含むステップ、を含んでなるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ、
a) 発酵培地中でグラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させるステップであって、該宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、該ポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしている、前記ステップ；
a(i)) 細菌トキソイドの発現を誘導するステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、その成熟ステップが：
I) 宿主細胞をpHショックにさらすこと；
II) 宿主細胞を供給添加なしでインキュベートすること；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらすこと、
を含んでなる、前記ステップ；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程が浸透圧ショックを含んでいる、前記ステップ、
を含んでなる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセス。
【請求項２】
以下のステップ、
a) グラム陰性宿主細胞を用意するステップであって、該宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、該ポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしており、該グラム陰性宿主細胞はペリプラズムで発現される細菌トキソイドを含有している、前記ステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、その成熟ステップが：
I) 宿主細胞をpHショックにさらすこと；
II) 宿主細胞を供給添加なしでインキュベートすること；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらすこと、
を含んでなる、前記ステップ；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程が浸透圧ショックを含んでいる、前記ステップ、
を含んでなる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセス。
【請求項３】
pHショックが、発酵培地のpHを0.2pH単位より大きな幅で、または0.5pH単位より大きな幅で、または0.1から2.0までの間のpH単位だけ、または0.2から1.0までの間のpH単位だけ、上昇または低下させることを含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
インキュベーションステップが、10分から1年、10分から6月、10分から12時間、10分から6時間、または10分から2時間までの間の期間、必要に応じて20℃から40℃の間の温度、たとえば約23℃の温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、請求項１〜３のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項５】
ステップb)が、宿主細胞を-20℃、-40℃、-60℃、-70℃、または-80℃より低い温度に、少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または5日間さらすことを含む、請求項１〜４のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項６】
ステップb)が、宿主細胞を凍結したのち解凍することを含む、請求項１〜５のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項７】
ステップb)が、
- 宿主細胞をpHショックにさらした後、供給添加なしで宿主細胞をインキュベートすること；
- 供給添加なしで宿主細胞をインキュベートした後、宿主細胞をpHショックにさらすこと；
- 供給添加なしで宿主細胞をインキュベートした後、宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと；
- 宿主細胞をpHショックにさらした後、宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと；
- 宿主細胞をpHショックにさらした後、供給添加なしで宿主細胞をインキュベートし、次いで宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと；または
- 供給添加なしで宿主細胞をインキュベートした後、宿主細胞をpHショックにさらし、次いで宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと
を含む、請求項１〜６のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項８】
グラム陰性宿主細胞が大腸菌（E. coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびモラクセラ属（Moraxella）からなる一群から選択される、請求項１〜７のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項９】
グラム陰性宿主細胞がステップb)のあいだ生きている、請求項１〜８のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項１０】
細菌トキソイドが、CRM197などのジフテリアトキソイドである、請求項１〜９のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項１１】
ペリプラズムシグナル配列が、
a) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つである；
b) 1つ、2つ、もしくは3つの点突然変異、挿入もしくは欠失を含有する、配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の変異体である；または
c) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の、少なくとも10アミノ酸からなる断片である、
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項１２】
細菌トキソイドを精製するステップd)をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項１３】
細菌トキソイドを糖類とコンジュゲートするステップe)をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか1つに記載のプロセスであって、該糖類は、肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、髄膜炎菌（N.meningitidis）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、E.フェカリス（E.faecalis）、E.フェシウム（E.faecium）、サルモネラ属（Salmonella）、もしくは表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）に由来する細菌の糖類、たとえば、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる一群から選択される肺炎レンサ球菌莢膜糖類、またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b（Hib）の多糖もしくはオリゴ糖である、前記プロセス。
【請求項１４】
発酵槽の中で行われる、請求項１〜１３のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項１５】
細菌トキソイドを他の抗原と混合するステップf)をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか1つに記載のプロセス。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか1つに記載のプロセスによって、得ることが可能な、または得られた、細菌トキソイド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の細菌トキソイド、および製薬上許容される添加剤、および/またはアジュバントを含有する、免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の免疫原性組成物を含有するワクチン。
【請求項１９】
疾病の予防もしくは治療に使用するための、請求項１７に記載の免疫原性組成物、または請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
疾病の予防もしくは治療用の薬剤の製造における、請求項１７に記載の免疫原性組成物、または請求項１８に記載のワクチンの使用。
【請求項２１】
請求項１７に記載の免疫原性組成物、または請求項1８に記載のワクチンを患者に投与することを含んでなる、疾病を予防もしくは治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質を製造するためのプロセス（方法）、特に、組換えタンパク質を発現する宿主細胞の増殖、ならびに宿主細胞を成熟させるステップを含む、組換えタンパク質を製造するためのプロセスに関する。本発明はまた、本発明のプロセスによって得られる組換えタンパク質、およびその組換えタンパク質を含有する免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の毒素、たとえばジフテリア毒素、の発現は困難であることが知られている。DTは、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）培養物から毒素を精製したのち化学的に無毒化することによって製造することができるが、組み換え型の、言い換えると遺伝的に無毒化された、毒素のアナログ（たとえば、US4,709,107、US5.846.711、US5,601,827、およびUS5,917,017に記載のCRM197、もしくは他の変異体）を精製することによって、製造することもできる。
【０００３】
ワクチンに使用するためにCRM197などのジフテリア毒素を大量に製造することは、タンパク質存在量が少ないために妨げられてきた。CRM197を大腸菌（E.coli）で発現させることによって、この問題への取り組みがすでになされ（Bishai et al J. Bacteriol. 169:5140-5151）、Bishaiらはジフテリア毒素を含有する組換え融合タンパク質（toxシグナル配列を含む）の発現を記載しているが、これは分解されたタンパク質の生成をもたらした。
【０００４】
toxシグナル配列を含有するジフテリア断片のクローニング、およびこれらの配列の大腸菌（Escherichia coli）における発現には、ある種の困難が伴う。発現されたタンパク質はペリプラズム空間に分泌されるが、この分泌は宿主細胞の生存率の低下（O'Keefe et al Proc. Natl, Acad. Sci. 86:343-346）、ならびに組換えタンパク質のタンパク質分解の増加（Bishai et al J Bacteriol. 169:5140-5151）を伴う。こうした理由で、発現がもはやペリプラズム性とならないようtoxシグナル配列の除去が提案されており、これはジフテリアトキソイドの発現を増加させることができる（Bishaiら）。
【０００５】
PCT/EP2010/065047 (WO 2011/042516)は、はじめて、CRM197のペリプラズム発現の成功を明らかにしている。これはCRM197の産生を増加させるが、ここでも、抽出プロセスの改善によって、収率を増加させることができる。Rathoreは、大腸菌（E. coli）で発現されるタンパク質産物の単離のための、浸透圧ショック法の最適化を開示している（Rathore et al Biotechnol.Prog. 2003, 19, 1541-1546）。Bochnerらはまた、宿主細胞からペリプラズムタンパク質を回収するための方法を記載している（US4680262）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第4,709,107号
【特許文献２】米国特許第5.846.711号
【特許文献３】米国特許第5,601,827号
【特許文献４】米国特許第5,917,017号
【特許文献５】国際公開第2011/042516号
【特許文献６】米国特許第4680262号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bishai et al J. Bacteriol. 169:5140-5151
【非特許文献２】O'Keefe et al Proc. Natl, Acad. Sci. 86:343-346
【非特許文献３】Rathore et al Biotechnol.Prog. 2003, 19, 1541-1546
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は、宿主細胞を成熟させるステップを含んでなる、組換えポリペプチドの生産のための改善されたプロセスを提供するものであって、このステップは下記のうちいずれか1つもしくは2つ以上を含むことができる：
(1) 宿主細胞をpHショックにさらす；
(2) 宿主細胞をインキュベートする；または
(3) 宿主細胞を凍結する。
【０００９】
この宿主細胞を成熟させるステップは、タンパク質抽出の効率を大幅に増加させるという驚くべき結果を生じる。
【００１０】
概要
第1の実施形態において、以下のステップを含んでなる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセス（方法）を提供する：
a) 発酵培地中でグラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させるステップであって、この宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、このポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしている；
a(i)) 細菌トキソイドの発現を誘導するステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、この成熟ステップは下記を含んでなる：
I) 宿主細胞をpHショックにさらす；
II) 宿主細胞を、供給添加なしでインキュベートする；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらす；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程は浸透圧ショックを含む。
【００１１】
第2の実施形態において、以下のステップを含んでなる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセスを提供する：
a) ペリプラズムで発現される細菌トキソイドを含有するグラム陰性宿主細胞を用意するステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、この成熟ステップは下記を含んでなる：
I) 宿主細胞をpHショックにさらす；
II) 宿主細胞を、供給添加なしでインキュベートする；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらす；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程は浸透圧ショックを含む。
【００１２】
第3の実施形態において、本発明のプロセスによって、得ることが可能な、または得られた、細菌トキソイドを提供する。
【００１３】
第4の実施形態において、本発明の細菌トキソイドおよび製薬上許容される添加剤を含有する、免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
第5の実施形態において、本発明の免疫原性組成物を含有するワクチンを提供する。
【００１５】
第6の実施形態において、疾病の予防もしくは治療用の薬剤の製造における、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用を提供する。
【００１６】
第7の実施形態において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを患者に投与することを含む、疾病を予防もしくは治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】20リットルスケールのフェドバッチ発酵中にモニターされたプロセスパラメーターによる発酵プロファイル図。ライン1は基質添加量（グラム）を表し、ライン2はpH、ライン3は撹拌速度（rpm）、ライン4はpO2（％）、ライン5は温度（℃）、そしてライン6は塩基添加量（グラム）を表す。
【図２】pH6.8で行われた増殖について供給速度およびpHの関数としてペリプラズムおよび細胞結合画分中のCRM197生産を表す図。左図はペリプラズムのCRM生産を示す。右図は細胞結合型CRM生産を表す。
【図３】20リットルスケールのフェドバッチ発酵および成熟の間にモニターされたプロセスパラメーターによる発酵プロファイル図。ライン1は基質添加量（グラム）を表し、ライン2はpH、ライン3は撹拌速度（rpm）、ライン4はpO2（％）、ライン5は温度（℃）、そしてライン6は塩基添加量（グラム）を表す。矢印は成熟ステップの開始を示す。成熟ステップは右の図で拡大されている。
【図４−１】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列一覧である。
【図４−２】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列一覧である。
【図４−３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列一覧である。
【図４−４】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列一覧である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、以下のステップを含んでなる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセス（方法）を提供する：
a) 発酵培地中でグラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させるステップであって、この宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、このポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしている；
a(i)) 細菌トキソイドの発現を誘導するステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、この成熟ステップは下記を含んでなる：
I) 宿主細胞をpHショックにさらす；
II) 宿主細胞を、供給添加なしでインキュベートする；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらす；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程は浸透圧ショックを含む。
【００１９】
他の実施形態において、以下のステップを含んでなる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセスが提供される：
a) ペリプラズムで発現される細菌トキソイドを含有するグラム陰性宿主細胞を用意するステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、この成熟ステップは下記を含んでなる：
I) 宿主細胞をpHショックにさらす；
II) 宿主細胞を、供給添加なしでインキュベートする；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらす；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程は浸透圧ショックを含む。
【００２０】
ペリプラズムは、グラム陰性細菌の細胞膜と外膜の間の空間である。「ペリプラズム発現」という用語は、宿主細胞内でのタンパク質（細菌トキソイドなど）の発現/生産、ならびに宿主細胞のペリプラズム空間内へのその分泌を意味する。ペリプラズム発現は、当然のことながら、発現されたタンパク質をペリプラズムに移動させることができるシグナル配列を用いることによって達成される。典型的には、ペリプラズムシグナル配列とともにグラム陰性細菌内で発現させた場合、当該ポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100％がペリプラズムに移動させられる。
【００２１】
「組換え」核酸は、天然に存在しない配列を有する核酸、または2つの分離された配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作製された配列を有する核酸である。この人工的な組み合わせは、化学合成によって達成することができるが、より一般的には、単離された核酸セグメントの人工的な操作、たとえば、遺伝子工学の技術によって達成することができる。「組換え」タンパク質は、異種（たとえば、組換え）核酸によってコードされたタンパク質であって、この核酸は、たとえば細菌もしくは真核細胞などの宿主細胞内に導入される。核酸は、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現させることができるシグナルを有する発現ベクターにのせて、導入することができるが、宿主細胞染色体に組み込むこともできる。
【００２２】
「宿主細胞を成熟させる」という表現は、ステップc)の前に行われ、細菌トキソイドなどの組換えポリペプチドが宿主細胞もしくはペリプラズムから放出される効率を高めるプロセスを意味する。ペリプラズムからの組換えポリペプチドの放出の効率は、多くの方法で測定することができる。たとえば、浸透圧ショック後にペリプラズムから放出される組換えポリペプチドの量、ならびにこの浸透圧ショック後に細胞に結合したままの組換えポリペプチドの量を測定することで、これを用いて、生産された当該ポリペプチド（細胞質およびペリプラズム）の総量を計算することができる。浸透圧ショック後に依然として細胞に結合しているポリペプチドの量は、フレンチプレスを用いた細胞破砕後のタンパク質レベルを測定することにより決定することができる。組換えポリペプチドがペリプラズムから放出される効率が高まったどうかを判断するために、成熟ステップあり、およびなしで、プロセスを実施した後に、ペリプラズムから放出される当該ポリペプチドのパーセンテージを測定して、そのパーセンテージを比較することができる。
【００２３】
宿主を成熟させることができるステップの例が提供されるが、それは下記を含む：
(1) 宿主細胞をpHショックにさらす
(2) 場合によっては供給添加なしで、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より上、10℃より上、20℃より上、または30℃より上の温度で、宿主細胞をインキュベートする
(3) 少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または5日間、宿主細胞を0℃より低い温度にさらす。
【００２４】
細菌トキソイドのペリプラズム発現のためのプロセスの、ステップb)は、上記のステップのうちいずれか1つ、または上記ステップの2つもしくは3つを組み合わせて含んでいてもよい。
【００２５】
「宿主細胞から組換えタンパク質を抽出する」という表現は、宿主細胞から組換えタンパク質（細菌トキソイドなど）、典型的にはペリプラズム中に存在する組換えタンパク質を放出させることができる、任意のプロセスを意味する。「宿主細胞から細菌トキソイドを抽出する」という表現は、宿主細胞から細菌トキソイド、典型的にはペリプラズム中に存在する細菌トキソイドを放出させることができる任意のプロセスを意味する。こうした技術は当業者によく知られており、たとえば、浸透圧ショックまたは酵素法がある。必要に応じて、酵素法は、リゾチーム、ザイモリアーゼ、またはリゾスタフィン消化の使用を含む。
【００２６】
「ペリプラズムシグナル配列」という表現は、発現されたタンパク質（細菌トキソイドなど）をペリプラズムに向かわせることができるシグナル配列を意味しており、これは翻訳時（翻訳時シグナル配列）、または翻訳後（翻訳後シグナル配列）に起こりうる。シグナル配列は、グラム陰性細菌においてポリペプチドの翻訳時または翻訳後に、それが当該ポリペプチドに結合したならば、発現されたタンパク質をペリプラズムに向けて移動させる能力を有し、シグナル配列のない場合より多くの前記ポリペプチドが、グラム陰性細菌のペリプラズム中に見いだされる。ある実施形態において、大腸菌（E. coli）などのグラム陰性菌で発現されると、当該ポリペプチドの少なくとも50、60、70、80、90、もしくは100％がペリプラズムに移動させられる。シグナル配列がペリプラズム発現を指示することができるかどうかをテストするためのアッセイは、レポータータンパク質を用いて実施することができる。たとえば、ペリプラズムシグナル配列を、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子の上流に挿入し、このタンパク質を本発明の宿主細胞で発現させることができる。顕微鏡を用いて、細胞質およびペリプラズムでの緑色蛍光タンパク質の相対的なレベルを判断することができる。ある実施形態において、組換えタンパク質は分泌されてもよい。
【００２７】
ポリヌクレオチドは、組換えタンパク質（細菌トキソイドなど）をコードする配列に機能しうるように連結されたペリプラズムシグナル配列をコードする。
【００２８】
ある実施形態において、プロセスはさらに、組換えタンパク質（細菌トキソイドなど）の発現を誘導する、ステップa(i))を含んでなる。「タンパク質の発現を誘導する」という表現は、IPTG（イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）などの誘導物質を培養に添加するプロセス、または培養温度を変更して加速度的にポリペプチドの発現を引き起こすプロセスを意味する。「タンパク質の発現を誘導する」という用語はさらに、培養物を適当な条件下でインキュベートして、プロセスの次ステップの前の一定期間の間に、発現を生じさせることを含む。（誘導物質の添加または温度の変更によって）発現を開始させ、発現を行わせるため（適当な条件下でのインキュベーション）にかかる時間の全期間を、本明細書では「誘導期」と称する。本発明のある実施形態によれば、誘導期は、5分から72時間まで、30分から48時間まで、1時間から36時間まで、6時間から26時間まで、または12時間から24時間まで、たとえば、約6、12、18、24、26、36、48、または72時間、持続してもよい。本発明のある態様によれば、組換えタンパク質の発現を誘導するステップa(i))は、ステップa)の後でステップb)の前に行われ、以下ステップa(i))と称される。
【００２９】
ある実施形態において、ステップb)は、宿主細胞をpHショックにさらすことを含んでいる。本発明に関して、「宿主細胞をpHショックにさらす」という表現は、発酵培地のpHを上げるか、または下げることを意味する。pHショックは、発酵槽の中で宿主細胞に対して行うことができるが、その他に、たとえば遠心分離によって濃縮された宿主細胞に対して行うこともできる。pHショックは、宿主細胞を懸濁した溶液に酸または塩基を添加することによって行うことができる。
【００３０】
ある実施形態において、pHショックは、発酵培地のpHを、pH単位で0.2より大きな幅で変化させること、pH単位で0.3より大きな幅で、0.4より大きな幅で、0.5より大きな幅で、または0.6より大きな幅で、変化させることを含む。総じて、「発酵培地のpHを変化させる」ことは、発酵培地のpHを上げるかまたは下げることを含み、これは、発酵培地に成分を添加すること、たとえば発酵培地に酸または塩基を添加することによって、行うことができる。
【００３１】
ある実施形態において、pHショックは、発酵培地のpHを、pH単位で0.2より大きな幅で上昇させること、pH単位で0.3より大きな幅で、0.4より大きな幅で、0.5より大きな幅で、または0.6より大きな幅で上昇させることを含む。これは、たとえば、塩基などのアルカリ化剤を発酵培地に添加することによって行うことができる。
【００３２】
ある実施形態において、pHショックは、発酵培地のpHを、pH単位で0.2より大きな幅で低下させること、pH単位で0.3より大きな幅で、0.4より大きな幅で、0.5より大きな幅で、または0.6より大きな幅で低下させることを含む。これは、たとえば、酸などの酸性化剤を発酵培地に添加することによって行うことができる。
【００３３】
他の実施形態において、pHショックは、発酵培地のpHを、0.1から2.0の間のpH単位だけ変化させること、0.1から2.0の間のpH単位、0.1から1.5の間のpH単位、0.2から2.0の間のpH単位、0.2から1.5の間のpH単位、0.2から1.0の間のpH単位、0.5から2.0の間のpH単位、0.5から1.5の間のpH単位、0.5から2.0の間のpH単位、または0.7から1.5の間のpH単位だけ変化させることを含む。
【００３４】
他の実施形態において、pHショックは、発酵培地のpHを、0.1から2.0の間のpH単位だけ上昇させること、0.1から2.0の間のpH単位、0.1から1.5の間のpH単位、0.2から2.0の間のpH単位、0.2から1.5の間のpH単位、0.2から1.0の間のpH単位、0.5から2.0の間のpH単位、0.5から1.5の間のpH単位、0.5から2.0の間のpH単位、または0.7から1.5の間のpH単位だけ上昇させることを含む。
【００３５】
他の実施形態において、pHショックは、発酵培地のpHを、0.1から2.0の間のpH単位だけ低下させること、0.1から2.0の間のpH単位、0.1から1.5の間のpH単位、0.2から2.0の間のpH単位、0.2から1.5の間のpH単位、0.2から1.0の間のpH単位、0.5から2.0の間のpH単位、0.5から1.5の間のpH単位、0.5から2.0の間のpH単位、または0.7から1.5の間のpH単位だけ低下させることを含む。
【００３６】
ある実施形態において、pHショックは塩基の添加によって達成される。ある実施形態にいて、塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および炭酸水素ナトリウムからなる一群から選択される。他の実施形態において、塩基は水酸化アンモニウム（NH4OH）または水酸化ナトリウム（NaOH）である。もう1つの実施形態において、塩基は水酸化アンモニウムである。また他の実施形態において、塩基は水酸化ナトリウムである。
【００３７】
ある実施形態において、pHショックは酸の添加によって達成される。ある実施形態において、酸は、塩酸、硫酸、炭酸、リン酸、酢酸、および乳酸からなる一群から選択される。ある実施形態において、酸はリン酸（H3PO4）である。
【００３８】
ある実施形態において、ステップb) はインキュベーションステップを含んでおり、このインキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い温度、5℃より高い温度、10℃より高い温度、15℃より高い温度，20℃より高い温度、または23℃より高い温度で、インキュベートすることを含む。ある実施形態において、インキュベーションステップは、宿主細胞を、10℃-50℃、15℃-45℃、20℃-40℃、22℃-38℃、15℃-50℃、15℃-40℃、20℃-38℃、20℃-50℃、22℃-50℃、22℃-45℃、22℃-40℃、23℃-50℃、23℃-45℃、23℃-40℃、23℃-38℃、23℃-30℃、25℃-50℃、25℃-45℃、25℃-40℃、25℃-38℃、25℃-30℃の間の温度でインキュベートすることを含んでいる。
【００３９】
ある実施形態において、インキュベーションステップは、宿主細胞を約23℃または約37℃の温度でインキュベートすることを含む。
【００４０】
ある実施形態において、インキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分間、少なくとも7分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、少なくとも90分間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも5時間、少なくとも24時間、または少なくとも2日間、インキュベートすることを含んでいる。もう1つの実施形態において、インキュベーションステップは、宿主細胞を、5分から2年、5分から1年、5分から6月、5分から3月、5分から1月、5分から2週間、5分から1週間、5分から24時間、5分から12時間、5分から6時間、5分から3時間、5分から2時間、5分から1時間、5分から30分、5分から15分、10分から1年、10分から6月、10分から3月、10分から1月、10分から2週間、10分から1週間、10分から24時間、10分から12時間、10分から6時間、10分から3時間、10分から2時間、10分から1時間、10分から30分、10分から15分、30分から1年、30分から6月、30分から3月、30分から1月、30分から2週間、30分から1週間、30分から24時間、30分から12時間、30分から6時間、30分から3時間、30分から2時間、30分から1時間、1時間から1年、1時間から6月、1時間から3月、1時間から1月、1時間から2週間、1時間から1週間、1時間から24時間、1時間から12時間、1時間から6時間、1時間から3時間、または1時間から2時間までの間の期間、インキュベートすることを含んでいる。
【００４１】
ある実施形態において、インキュベーションステップの間の供給速度は、ステップa)の間の供給速度より低い。供給速度（もしくは基質供給速度）は、基質添加速度（ml/分）であって、この基質は、培養される宿主細胞の食物源を含む。ある実施形態において、インキュベーションステップ中の供給速度は、ステップa)で使用される供給速度の75％、50％、35％、25％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、または1％より低い。他の実施形態において、インキュベーションステップ中に供給添加はないが、一般にこれは、インキュベーションステップ中に基質を添加しないことを意味する。
【００４２】
ある実施形態において、培地のpHは、インキュベーションステップの間に変動してもよい。ある実施形態において、pHは約0.1単位で変動する。他の実施形態では、インキュベーションステップ中にpHの制御は行われない。これは、一定のpHを維持するために酸もしくは塩基がそれ以上添加されないことを意味する。
【００４３】
他の実施形態において、ステップb) は、宿主細胞を0℃より低い温度に、少なくとも30分、1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、3日、4日、5日、15日、1月、6月、12月、1年、または2年間さらすことを含んでいる。ある実施形態において、宿主細胞は、0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-60℃、-70℃、または-80℃より低い温度にさらされる。他の実施形態において、宿主細胞は、0から-100℃、0から-80℃、0から-20℃、0から-18℃、-5から-80℃、-10から-80℃、-20から-80℃、または-25から-80℃までの温度、たとえば約0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-18℃、-22℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、または-80℃の温度にさらされる。ある実施形態において、宿主細胞は、0℃より低い温度に、5分から10年、15分から10年、40分から10年、1時間から10年、15分から5年、30分から5年、1時間から5年、15分から3年、30分から3年、1時間から3年、15分から2年、30分から2年、1時間から2年、15分から1年、30分から1年、1時間から1年、1時間から15日、2時間から10日、12時間から7日、または2から5日までの間の期間、たとえば、約30分、1時間、2時間、5時間、12時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、15日、1月、6月、または12月間、さらされる。
【００４４】
他の実施形態において、ステップb) は、宿主細胞を少なくとも30分、1時間、2時間、3時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、5日、15日、1月、3月、6月、1年、2年、5年、または10年の間、凍結することを含む。他の実施形態において、ステップb) は、宿主細胞を、5 分から10年、5分から5年、5分から2年、30分から10年、30分から5年、30分から2年、1時間から10年、1時間から5年、1時間から2年までの間の期間、凍結することを含んでいる。「凍結する」という用語は、宿主細胞を0℃より低い温度に曝すことを意味する。他の実施形態において、ステップc) は、宿主細胞を、0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-70℃、または-80℃より低い温度で凍結することを含んでいる。宿主細胞を凍結することは、結果として、氷の結晶の生成をもたらす可能性があるが、氷の結晶の生成をもたらすことなしに宿主細胞の温度を0℃より下に下げることも、「宿主細胞を凍結する」と見なされる。
【００４５】
ある実施形態において、ステップb) はさらに、細胞を解凍することを含む。「細胞を解凍する」という表現は、宿主細胞の温度を、0℃、10℃、または20℃より高く上げることを意味する。一般に、「細胞を解凍する」ことは、細胞が凍結された後であるがステップc)より前に生じるものである。
【００４６】
ある実施形態において、ステップb) は、宿主細胞をpHショックにさらした後にインキュベーションステップを含んでおり、このインキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より上、10℃より上、または20℃より上の温度でインキュベートすることを含む。
【００４７】
他の実施形態において、ステップb) は、インキュベーションステップに続いて宿主細胞をpHショックにさらすことを含んでおり、このインキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より上、10℃より上、または20℃より上の温度でインキュベートすることを含む。
【００４８】
他の実施形態において、ステップb) は、インキュベーションステップの後に宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または4日間凍結することを含んでおり、このインキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より上、10℃より上、または20℃より上の温度でインキュベートすることを含む。
【００４９】
他の実施形態において、ステップb) は、宿主細胞をpHショックにさらした後、宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または4日間凍結することを含んでいる。
【００５０】
他の実施形態において、ステップb) は、宿主細胞をpHショックにさらした後にインキュベーションステップを行い、続いて宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または4日間凍結することを含んでいるが、このインキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より上、10℃より上、または20℃より上の温度でインキュベートすることを含む。
【００５１】
他の実施形態において、ステップb) は、インキュベーションステップに続いて、宿主細胞をpHショックにさらした後、宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または4日間凍結することを含んでいるが、このインキュベーションステップは、宿主細胞を、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より上、10℃より上、または20℃より上の温度でインキュベートすることを含む。
【００５２】
ステップb) は、全培養液（ステップa） および/またはステップa)(i)の産物）中の細胞に対して直接行うことができるが、別法として、ステップb) の前に細胞を発酵槽から取り出してもよく、さらに他の実施形態では、細胞はステップb) の前に発酵槽から取り出して、たとえば遠心分離によって濃縮される。
【００５３】
ある実施形態において、宿主細胞はグラム陰性宿主細胞、たとえばグラム陰性細菌である。他の実施形態において、グラム陰性宿主細胞は、大腸菌（E.coli）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ラン藻（Cyanobacteria）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、ヘモフィルス属（Hemophilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジオネラ属（Legionella）、モラクセラ属（Moraxella）、ナイセリア属（Neisseria）、パスツレラ属（Pasteurella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、赤痢菌属（Shigella）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、およびエルシニア属（Yersinia）からなる一群から選択される。さらに他の実施形態において、グラム陰性宿主細胞は、大腸菌（E.coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびモラクセラ属（Moraxella）からなる一群から選択される。他の実施形態において、グラム陰性宿主細胞は大腸菌（E. coli）である。
【００５４】
ある実施形態において、ステップc) は浸透圧ショックを含む。
【００５５】
ある実施形態において、細胞はステップb)の前に死滅させない。他の実施形態において、ステップb)は、生きた宿主細胞に対して行われる。宿主細胞は、宿主細胞培養物中の細胞の大部分が複製可能であるならば「生きている」と見なされる。細胞を「死滅させる」ことが判明しているプロセスの例としては、宿主細胞のアルコールへの暴露、または高温への暴露がある。ある実施形態において、宿主細胞は、ステップb)より前に40℃より上、50℃より上、または60℃より上の温度にさらされない。他の実施形態において、ステップb)より前に、宿主細胞の培養物にアルコールは添加されない。「ステップb)の間、生きている」という表現は、宿主細胞の培養物中の細胞の大部分が、成熟ステップb)の全期間のあいだ、またはその大部分のあいだ、生きていることを意味する。
【００５６】
ある実施形態において、組換えタンパク質は、細菌、ウイルス、またはがんの抗原である。ある実施形態において、組換えタンパク質は、原核生物のタンパク質である。ある実施形態において、組換えタンパク質は、成長ホルモンではない。ある実施形態において、組換えタンパク質は、ヒト成長ホルモンではない。ある実施形態において、組換えタンパク質はCRM197ではない。ある実施形態において、組換えタンパク質はCRM197でなく、ペリプラズムシグナル配列はflgIではない。ある実施形態において、組換えタンパク質は可溶性タンパク質である。他の実施形態において、組換えタンパク質は表面結合タンパク質である。他の実施形態において、組換えタンパク質はトキソイド、たとえば細菌トキソイドである。他の実施形態において、組換えタンパク質は、ジフテリア菌（C.diphtheriae）、肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、モラクセラ属（Moraxella）、髄膜炎菌（N.meningitidis）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、E.フェカリス（E.faecalis）、E.フェシウム（E. faecium）、サルモネラ属（Salmonella）、C.トラコマチス（C. trachomatis）、または表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）に由来するタンパク質である。他の実施形態において、組換えタンパク質はCRM197である。
【００５７】
ある実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は異種シグナル配列である。
【００５８】
「異種の」という用語は、2つの異なる起源に由来する2つの成分、たとえばポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列を意味する。たとえば、異種タンパク質は、異なる起源から得られるポリヌクレオチドもしくは核酸配列の人工的な組み合わせを含む、異なる起源に由来するポリヌクレオチドもしくは核酸によってコードされるタンパク質であるか、または、それが発現される細胞型に本来そなわっていないタンパク質である。たとえば、これは、組換えタンパク質と通常結び付けられないシグナル配列、たとえば、天然の状態では異なるタンパク質をペリプラズムに方向付けるシグナル配列を指す。たとえば、flgIは天然の状態ではflhIタンパク質をペリプラズムに方向付けるので、flgI以外のタンパク質をペリプラズムに方向付けるならば異種シグナル配列と見なされることになる。
【００５９】
ある実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、下記を含む：
a) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ；
b) 1、2、もしくは3つの点突然変異、挿入、もしくは欠失を含有する配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の変異体；または
c) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の少なくとも10アミノ酸の断片。
【００６０】
必要に応じてペリプラズムシグナル配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号24、または配列番号2、4、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、10、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、10、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、22、もしくは24、または配列番号12、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号16、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号16、20、もしくは24、または配列番号16、22、もしくは24、または配列番号18、20、もしくは24、または配列番号18、22、もしくは24のいずれか1つを含む。
【００６１】
他の実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号24、または配列番号2、4、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、10、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、10、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、22、もしくは24、または配列番号12、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号16、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号16、20、もしくは24、または配列番号16、22、もしくは24、または配列番号18、20、もしくは24、または配列番号18、22、もしくは24のいずれか1つの、1、2、もしくは3つの点変異、挿入、もしくは欠失（を含有する変異体）を含んでいる。
【００６２】
他の実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つ、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号24、または配列番号2、4、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、10、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号2、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、10、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号4、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、12、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号10、22、もしくは24、または配列番号12、14、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号12、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、16、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、20、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号14、22、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号16、18、もしくは24のいずれか1つ、または配列番号16、20、もしくは24、または配列番号16、22、もしくは24、または配列番号18、20、もしくは24、または配列番号18、22、もしくは24のいずれか1つの、少なくとも10、12、15、18、もしくは20アミノ酸の断片であって、タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を指示する能力を有する前記断片を含有する。
【００６３】
他の実施形態において、シグナル配列は配列番号24を含む。
【００６４】
ある実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、もしくは23のいずれか1つによってコードされる。他の実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、配列番号23によってコードされる。
【００６５】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、誘導可能なプロモーターを含有する。
【００６６】
ある実施形態において、ステップb)は、宿主細胞を遠心分離によって濃縮するステップを含んでいる。これには、適宜、5000xgから8000xgの間、6000xgから7000xgの間、または約6500xgで遠心することが必要である。必要に応じて、細胞は30分から2時間までの間、遠心分離され、場合によっては約1時間遠心分離される。
【００６７】
ある実施形態において、ステップa)は、4.5から8.5の間、5.0から8.0の間、5.5から7．5の間、5.0から7．0の間、4.5から6．5の間、6.0から7．0の間のpH、または約pH6.0で行われる。
【００６８】
ある実施形態において、ステップa)は、20℃から40℃の間、25℃から35℃の間、27℃から32℃の間、または約28℃の温度で行われる。
【００６９】
ある実施形態において、ステップa)の大部分の、培養物中の溶存酸素レベルは、5％から40％の間、10％から30％の間、15％から25％の間、または約20％である。
【００７０】
ある実施形態において、ステップa)は10から1000 h-1のKLaで行われる。KLaは、酸素が培養物中に入る速度の指標である。KLaが高いほど、酸素を培養物中に取り込む速度が大きい。
【００７１】
KLaは次のように測定することができる。その方法は、KLaが測定されるべき培地容量、温度、圧力、撹拌、および通気の条件で、発酵槽を設定すること、空気を窒素ガスで置き換えることによって脱気すること、通気を回復させることによって空気を中に供給すること、ならびにpO2がその定常状態レベルに戻る速度を測定することを含む。
【００７２】
ln (100-pO2) = -KLa. T + C
ln (100-pO2)を時間に対してプロットすることで、その直線の傾き（すなわち角度係数）が-KLaである。pO2はブロス中の溶存酸素％であり、Tは時間、そしてCは定数である。
【００７３】
発酵ステップのKLaは、培養の撹拌量および培養の通気速度などのいくつかの要因によって影響される。たとえば、培養の撹拌を低下させて通気速度を高めるか、または逆にしながら、一定のKLaを維持することができる。しかしながら、ある実施形態において、培養の撹拌と通気速度はいずれも、発酵ステップのあいだ一定である。
【００７４】
ステップa)および/またはステップa(i))は、たとえば、10-1000h-1、10-200h-1、10 - 150 h-1、10 - 100 h-1、10-80 h-1、10-50 h-1、10-40h-1、10-30 h-1、20-150 h-1、20-100 h-1、20-50 h-1、20-60 h-1、20-80 h-1、20-30 h-1、20-40 h-1、30-60 h-1、60-80 h-1、60-150 h-1または60-200 h-1の間のKLaで行われる。
【００７５】
ある実施形態において、発酵培地は、CY、SOC、または類似培地からなる一群から選択される培地を含む。ある実施形態において、培地はCYまたはSOCである。
【００７６】
ある実施形態において、ステップa(i))は、誘導物質の添加を含む。誘導物質は、培養に添加される化合物であって、その誘導物質を添加するとタンパク質発現率が高まる。ある実施形態において，誘導物質はIPTGである。
【００７７】
ある実施形態において、プロセスは、組換えタンパク質（たとえば細菌トキソイド）を精製するという追加のステップd)を含んでいる。ある実施形態において、ステップd)は、クロマトグラフィーを用いた細胞精製を必要とする。ある実施形態において、クロマトグラフィー技術は、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）またはイオン交換クロマトグラフィーである。必要に応じて、アフィニティクロマトグラフィーは、アフィニティタグ精製カラム、抗体精製カラム、レクチンアフィニティカラム、プロスタグランジン精製カラム、またはストレプトアビジンカラムを使用してもよい。HPLCは、適宜、イオン交換カラム、逆相カラム、またはサイズ排除カラムを使用することができる。必要に応じて、イオン交換カラムは陰イオン交換カラムでも陽イオン交換カラムでもよい。
【００７８】
ある実施形態において、プロセスはさらに、（細菌トキソイドなどの）組換えタンパク質を糖類にコンジュゲートするステップe)を含んでいる。
【００７９】
ある実施形態において、糖類は細菌の糖類である。細菌の糖類は、たとえば、肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、E. フェカリス（E.faecalis）、E. フェシウム（E.faecium）、サルモネラ属（Salmonella）または表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）由来の莢膜の糖類である。本明細書で定義される場合、「糖類」は、オリゴ糖であっても多糖であってもよい。
【００８０】
ある実施形態において、細菌の糖類は、肺炎レンサ球菌の莢膜の糖類であって、これは1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fからなる一群から選択される。ある実施形態において、細菌の糖類はインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b（Hib）の多糖もしくはオリゴ糖である。
【００８１】
コンジュゲーションはよく知られた結合技術によって行うことができる。コンジュゲーションの方法は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート（CDAP）を用いて糖を活性化することによるものであって、シアン酸エステルを形成することができる。したがって活性化された糖は、直接、またはスペーサー（リンカー）基を介して、キャリアータンパク質のアミノ基に結合することができる。たとえば、スペーサーがシスタミンもしくはシステアミンであれば、チオエーテル結合を介してキャリアーに結合しうるチオール化された多糖が与えられるが、このチオエーテル結合は、（たとえばGMBSを用いて）マレイミド活性化されたキャリアータンパク質、または（たとえばヨードアセトイミド[たとえばエチルヨードアセトイミドHCl]またはブロモ酢酸N-スクシンイミジル、またはSIAB、またはSIA、またはSBAPを用いて）ハロアセチル化されたキャリアータンパク質との反応後に得られるものである。好ましくは、シアン酸エステル（適宜CDAPの化学によって作製される）をヘキサンジアミンまたはADHと結合し、アミノ誘導体化された糖を、カルボジイミド（たとえばEDACまたはEDC）の化学構造によって、タンパク質キャリアー上のカルボキシル基を介してキャリアータンパク質と結合させる。このようなコンジュゲートは公開されたPCT出願WO 93/15760 ユニフォームドサービスユニバーシティおよびWO 95/08348およびWO 96/29094に記載されている。
【００８２】
他の適当な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUを使用する。多くのものはWO 98/42721に記載されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシ基とCDIとの反応（Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18）と、その後の、カルバメート結合を形成するタンパク質との反応によって形成されるカルボニルリンカーを含んでいてもよい。これは、アノマー末端の1級ヒドロキシ基への還元を含んでいてもよく、必要に応じて、CDIカルバメート中間体を形成する1級ヒドロキシ基とCDIとの1級ヒドロキシル基反応の保護/脱保護、ならびにCDIカルバメート中間体とタンパク質のアミノ基との結合を含むことができる。コンジュゲートは、US 4365170  Jennings)およびUS 4673574 (Anderson)に記載の直接的な還元的アミノ化によっても調製することができる。他の方法がEP-0-161-188、EP-208375、およびEP-0-477508に記載されている。他の方法は、アジピン酸ジヒドラジド（ADH）で誘導体化された糖であって臭化シアン（またはCDAP）で活性化された前記の糖を、たとえばEDACを用いたカルボジイミド縮合（Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256）によってタンパク質キャリアーと結合させることに関する。
【００８３】
ある実施形態において、糖のヒドロキシ基（好ましくは、活性化されたヒドロキシ基、たとえば、活性化されてシアン酸エステルを作るヒドロキシ基[たとえばCDAPによる]）は、タンパク質のアミノ基またはカルボキシル基に、直接または間接的に（リンカーを介して）連結される。リンカーが存在する場合、糖のヒドロキシ基は、好ましくは、たとえばCDAPコンジュゲーションによってリンカーのアミノ基に結合している。リンカー、たとえばADH、のさらに他のアミノ基が、たとえば、カルボジイミドの化学的性質を利用することによって、たとえばEDACを使用することで、タンパク質のカルボン酸基にコンジュゲートしていてもよい。ある実施形態において、肺炎レンサ球菌莢膜糖類は、リンカーがキャリアータンパク質とコンジュゲートする前にまず、リンカーにコンジュゲートしている。あるいは、リンカーは、糖類にコンジュゲートする前にキャリアーとコンジュゲートしていてもよい。
【００８４】
概して、タンパク質キャリアーの下記のタイプの化学基を結合/コンジュゲーションに使用することができる：
A) カルボキシル（たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸による）。ある実施形態において、この基は、糖類のアミノ基に直接、またはリンカー上のアミノ基に、カルボジイミドの化学的性質によって、たとえばEDACを用いて、連結される。
【００８５】
B)アミノ基（たとえばリジンによる）。ある実施形態において、この基は、糖類のカルボキシル基に直接、またはリンカーのカルボキシル基に、カルボジイミドの化学的性質によって、たとえばEDACを用いて連結される。別の実施形態において、この基は、CDAPもしくはCNBrで活性化された、糖類のヒドロキシ基に直接、またはリンカー上の同様の基に；アルデヒド基を有する糖類もしくはリンカーに；スクシンイミドエステル基を有する糖類もしくはリンカーに、連結される。
【００８６】
C) スルフヒドリル（たとえばシステインによる）。ある実施形態において、この基は、ブロモもしくはクロロアセチル化された糖類もしくはリンカーに、マレイミドの化学的性質によって連結される。ある実施形態においてこの基はビスジアゾベンジジンによって活性化/修飾される。
【００８７】
D) ヒドロキシ基（たとえばチロシンによる）。ある実施形態においてこの基はビスジアゾベンジジンによって活性化/修飾される。
【００８８】
E) イミダゾリル基（たとえばヒスチジンによる）。ある実施形態においてこの基はビスジアゾベンジジンによって活性化/修飾される。
【００８９】
F) グアニジル基（たとえばアルギニンによる）。
【００９０】
G) インドリル基（たとえばトリプトファンによる）。
【００９１】
糖類について、一般に、下記の基を結合のために使用することができる：OH、COOH、またはNH2。たとえば、過ヨウ素酸、酸加水分解、過酸化水素などの当技術分野で知られているさまざまな処理の後で、アルデヒド基を生成することができる。
【００９２】
直接結合アプローチ：
糖-OH + CNBr または CDAP -----> シアン酸エステル + NH2-Prot ----> コンジュゲート
糖-アルデヒド + NH2-Prot ----> シッフ塩基 + NaCNBH3 ----> コンジュゲート
糖-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> コンジュゲート
糖-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> コンジュゲート
スペーサー（リンカー）を介した間接結合アプローチ：
糖-OH + CNBr または CDAP ---> シアン酸エステル + NH2----NH2 ----> 糖--- -NH2 + COOH-Prot + EDAC -----> コンジュゲート
糖-OH + CNBr または CDAP ----> シアン酸エステル + NH2-----SH -----> 糖-- --SH + SH-Prot (露出したシステインを有する天然タンパク質、またはタンパク質のアミノ基をたとえばSPDPで修飾して得られる) -----> 糖- S-S-Prot
糖-OH + CNBr または CDAP ---> シアン酸エステル + NH2----SH -------> 糖----SH + マレイミド-Prot (アミノ基の修飾) ----> コンジュゲート
糖-OH + CNBr または CDAP ---> シアン酸エステル + NH2-----SH ---> 糖- SH + ハロアセチル化-Prot ----> コンジュゲート
糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 糖------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> コンジュゲート
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 糖----SH + SH-Prot (露出したシステインを有する天然タンパク質、またはタンパク質のアミノ基をたとえばSPDPで処理して得られる) -----> 糖-S-S-Prot
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 糖----SH + マレイミド-Prot (アミノ基の修飾) ----> コンジュゲート
糖-COOH + EDAC + NH2----SH ---> 糖-SH + ハロアセチル化-Prot -- --> コンジュゲート
糖-アルデヒド + NH2-----NH2 ----> 糖---NH2 + EDAC + COOH-Prot - ---> コンジュゲート
注記：上記EDACに代わり、任意の適当なカルボジイミドを使用することができる。
【００９３】
要するに、糖との結合のために一般に使用することができるタンパク質キャリアーの化学基のタイプは、（たとえばリジン残基の）アミノ基、（たとえばアスパラギン酸およびグルタミン酸残基の）COOH基、および（もし利用可能ならば）（たとえばシステイン残基の）SH基である。
【００９４】
ある実施形態において、ステップa)のpHは、ステップa(i))のpHより低い。ある実施形態において、ステップa)の温度は、ステップa(i))の温度より高い。ある実施形態において、ステップa)の基質供給速度は、ステップa(i))の基質供給速度より高い。
【００９５】
他の実施形態において、ステップa)のpHは、5.0-7.0、5.0-6.0、6.0-7.0、または6.5-7.0の範囲である。
【００９６】
ある実施形態において、ステップa(i))のpHは維持される。ある実施形態において、pHは、pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0より高く維持されるか、または、6.5から10.0、6.5から9.5、6.5から9.0、6.5から8.5、6.5から7.5、6.5から7.0、7.0から10.0、7.0から9.5、7.0から9.0、7.0から8.5、7.0から8.0、7.0から7.5、7.5から10.0、7.5から9.5、7.5から9.0、7.5から8.5、7.5から8.0、8.0から10.0、8.0から9.5、8.0から9.0、8.0から8.5、8.5から10.0、8.5から9.5、8.0から9.0、8.0から8.5、8.5から10.0、8.5から9.5、8.5から9.0、9.0から10.0、9.0から9.5、または9.5から10.0の間に維持される。他の実施形態において、pHは、リン酸バッファー、Trisバッファー、およびヒスチジンバッファーからなる一群からのバッファーを用いて維持される。バッファーの濃度は、必要に応じて、10-200mM、50-100mM、100-200mM、10-50mM、または50-150mMとする。場合によって、バッファーは、80-120mM、80-100mM、または100mMのリン酸バッファーとすることができる。
【００９７】
ある実施形態において、ステップa(i))のpHは、ステップa)のpHより、少なくとも、pH単位として、厳密にまたはおおよそ2.0、1.5、1.0、0.5、0.3、0.2または0.1高い。
【００９８】
このpHの上昇は、適宜、たとえば水酸化ナトリウムもしくはアンモニアなどの塩基の添加によって行われる。
【００９９】
ある実施形態において、ステップa)の温度はステップa(i))の温度より高い。ある実施形態において、本発明のプロセスのステップa)は、20-40℃の温度で行われる。本発明のプロセスのステップa(i))は、20-28℃、21-27℃、22-26℃、23-24℃、21-24℃、または22-23℃の温度で実施される。
【０１００】
ある実施形態において、ステップa(i))の基質供給速度は、ステップa)の間維持された基質供給速度の5％から90％、20％から80％、または20％から30％までの間に維持される。
【０１０１】
ある実施形態において、本発明のプロセスは発酵槽の中で実施される。ある実施形態において、ステップa)および/またはステップa(i))では消泡剤が添加される。他の実施形態において、ステップa)および/またはステップa(i))では泡プローブまたは機械的破泡装置を使用する。他の実施形態において、ステップa)および/またはステップa(i))では、消泡剤、ならびに泡プローブもしくは機械的破泡装置が使用される。
【０１０２】
ある実施形態において、発酵槽には10-5000リットルの培養物が入る。他の実施形態において、発酵槽には、少なくとも500リットルの培養物が入り、また他の実施形態では、発酵槽に1000リットルの培養物が入る。他の実施形態において、発酵槽には、50-1000、100-500、または100-200リットルの培養物が入る。他の実施形態において、発酵槽には約150リットルの培養物が入る。
【０１０３】
他の実施形態において、本発明のプロセスは、さらに、組換えタンパク質（たとえば細菌トキソイド）を他の抗原と混合物するステップf)を含んでなる。ある実施形態において、追加の抗原は、がん、ウイルス、もしくは細菌抗原である。ある実施形態において、ワクチンもしくは免疫原性組成物は、肺炎レンサ球菌（S. pneumoniae）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、髄膜炎菌（N. meningitidis）、大腸菌（E.coli）、C.トラコマチス（C.trachomatis）、M.カタラーリス（M.cattarhalis）、破傷風、ジフテリア、百日咳、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、腸球菌、または黄色ブドウ球菌（S. aureus）由来の抗原を含んでいてもよい。
【０１０４】
ある実施形態において、本発明の組換えタンパク質（たとえば、本発明の細菌トキソイド）は、製薬上許容される添加剤と混合される。他の実施形態において、組換えタンパク質（たとえば本発明の細菌トキソイド）は、アジュバントと混合される。細菌毒素、もしくは本発明のプロセスによって作製されたコンジュゲートと混合するのに適したアジュバントの選択は、当業者の知識の範囲内にある。適当なアジュバントには、アルミニウム塩、たとえば水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、もしくはリン酸アルミニウム、またはミョウバンがあるが、他の金属塩、たとえば、カルシウム、マグネシウム、鉄、もしくは亜鉛の塩であってもよく、アセチル化チロシンの不溶性懸濁液、またはアセチル化された糖類、カチオンもしくはアニオン誘導体化された糖類、またはポリホスファゼンであってもよい。
【０１０５】
本発明の他の態様において、本発明のプロセスによって得ることが可能な組換えタンパク質（たとえば本発明の細菌トキソイド）が与えられる。本発明の他の態様において、本発明のプロセスによって得られる組換えタンパク質（たとえば本発明の細菌トキソイド）が与えられる。
【０１０６】
本発明の他の態様において、本発明の組換えタンパク質（たとえば本発明の細菌トキソイド）、および製薬上許容される添加剤を含んでなる、免疫原性組成物が与えられる。ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、追加の抗原を含んでなる。これらの追加抗原は、必要に応じて、肺炎レンサ球菌（S. pneumoniae）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、髄膜炎菌（N. meningitidis）、大腸菌（E.coli）、C.トラコマチス（C.trachomatis）、M.カタラーリス（M.cattarhalis）、破傷風、ジフテリア、百日咳、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、腸球菌、または黄色ブドウ球菌（S. aureus）由来の抗原である。
【０１０７】
ある実施形態において、疾病の予防または治療に使用するための本発明の免疫原性組成物が与えられる。他の実施形態において、細菌性、ウイルス性、またはがん疾患の予防もしくは治療に使用するための本発明の免疫原性組成物が与えられる。
【０１０８】
本発明の他の態様において、本発明の免疫原性組成物を含んでなるワクチンが与えられる。
【０１０９】
本発明の免疫原性組成物を含有するワクチン製剤を用いて、全身経路または粘膜経路で前記ワクチンを投与することにより、感染症を起こしやすい哺乳動物を防御または治療することができる。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路による注射；または口道/消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与を含めることができる。肺炎もしくは中耳炎の治療用ワクチンの鼻内投与は好ましい（肺炎レンサ球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に予防することができるので、そのもっとも初期の段階で感染症を弱めることができる）。本発明のワクチンは、単回投与で投与することができるが、その成分を同時に、または別々の時期に併用投与してもよい（たとえば、肺炎レンサ球菌糖類コンジュゲートは、相互の免疫応答の最適な協調のために、別々に、同時に、またはワクチンの細菌タンパク質成分の投与の1-2週間後に投与することができる）。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。たとえば、糖類もしくは糖コンジュゲートはIM（またはID）投与してもよく、細菌タンパク質はIN（またはID）投与することができる。それに加えて、本発明のワクチンは、初回投与ではIM投与し、追加投与ではIN投与してもよい。
【０１１０】
ワクチンの毒素の含量は、典型的には、1-100μg、好ましくは5-50μg、もっとも典型的には5-25μgの範囲内となる。初回ワクチン接種後、被験体は1回または複数回の追加免疫を、適切に間隔をおいて受けることができる。ワクチン製剤は、一般的に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内への封入は、Fullerton, 米国特許第4,235,877号に記載されている。
【０１１１】
他の態様では、疾病の予防もしくは治療における、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの使用が与えられる。ある実施形態では、がん、ウイルス性および細菌性疾患からなる一群から選択される疾病の予防における、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの使用が与えられる。
【０１１２】
他の態様において、疾病の予防もしくは治療用の薬剤の製造における、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの使用が与えられる。他の実施形態では、がん、ウイルス性および細菌性疾患からなる一群から選択される疾病の予防もしくは治療用の薬剤の製造における、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの使用が与えられる。
【０１１３】
他の態様において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを患者に投与することを含む、疾病を予防もしくは治療する方法が与えられる。他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを患者に投与することを含んでなる、がん、ウイルス性および細菌性疾患からなる一群から選択される疾病を予防もしくは治療する方法が与えられる。
【０１１４】
「含んでなる」（“comprising”、“comprise”、および“comprises”）という用語は、本明細書では、いかなる場合も「からなる」（それぞれ“consisting of”、“consist of”、および“consists of”）という用語と置き換えてもよいこととする。
【０１１５】
別途に説明しない限り、本明細書で使用される科学技術用語はすべて、本明細書の属する技術分野の当業者によって共通に理解される、同じ意味を有する。分子生物学の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press刊, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら(編), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.刊, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.刊, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。
【０１１６】
単数形の用語 “a”、“an”、および“the” は、文脈上明確に他の意味を示す場合を除き、複数の指示対象を含んでいる。同様に、「または」という単語は、文脈上明確に他の意味を示す場合を除いて、「および」を含むものとする。「複数」という用語は、2つ以上を意味する。さらに、当然のことながら、核酸またはポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズもしくはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量もしくは分子質量値は概算であり、説明のために与えられる。さらに、抗原などの基質の濃度もしくはレベルに関して与えられる数値限定は概算であるものとする。したがって、濃度が少なくとも（たとえば）200 pgであると示される場合、その濃度は少なくとも約（言い換えると「おおよそ」、または「〜」）200 pgであると理解されるべきであるものとする。
【０１１７】
本発明の実施形態はさらに、以下の番号付きの条項で説明される。
【０１１８】
1．  下記を含んでなる、組換えタンパク質を作製するためのプロセス：
a)  発酵培地中で宿主細胞を培養することであって、この宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、このポリヌクレオチドは、組換えタンパク質およびペリプラズムシグナル配列をコードする；
b)  宿主細胞を成熟させること；および
c)  宿主細胞から組換えタンパク質を抽出すること。
【０１１９】
2．  下記を含んでなる、組換えタンパク質を作製するためのプロセス：
a)  宿主細胞を作製することであって、この宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、このポリヌクレオチドは組換えタンパク質およびペリプラズムシグナル配列をコードしており、この宿主細胞はペリプラズムで発現される組換えタンパク質を含有する；
b)  宿主細胞を成熟させること；および
c)  宿主細胞から組換えタンパク質を抽出すること。
【０１２０】
3．  組換えタンパク質の発現を誘導するステップa(i))をさらに含んでなる、第1もしくは第2項のプロセス。
【０１２１】
4．  ステップb)が宿主細胞をpHショックにさらすことを含む、第1-3項のいずれか1つのプロセス。
【０１２２】
5．  pHショックが、発酵培地のpHを0.2pH単位より大きな幅で、または0.5pH単位より大きな幅で変化させることを含む、第4項のプロセス。
【０１２３】
6．  pHショックが、発酵培地のpHを0.2pH単位より大きな幅で、または0.5pH単位より大きな幅で上昇させることを含む、第5項のプロセス。
【０１２４】
7．  pHショックが、発酵培地のpHを0.2pH単位より大きな幅で、または0.5pH単位より大きな幅で低下させることを含む、第5項のプロセス。
【０１２５】
8．  pHショックが、発酵培地のpHを0.1から2.0までの間のpH単位だけ、または0.2から1.0までの間のpH単位だけ変化させることを含む、前記のいずれかの項のプロセス。
【０１２６】
9．  pHショックが、発酵培地のpHを0.1から2.0までの間のpH単位だけ、または0.2から1.0までの間のpH単位だけ上昇させることを含む、第5、6、または8項のいずれか1つのプロセス。
【０１２７】
10．  pHショックが、発酵培地のpHを0.1から2.0までの間のpH単位だけ、または0.2から1.0までの間のpH単位だけ低下させることを含む、第5、7、または8項のいずれか1つのプロセス。
【０１２８】
11．  pHショックが塩基の添加によって行われる、第5、6、8、また9項のいずれか１つのプロセス。
【０１２９】
12．  塩基が水酸化アンモニウム（NH4OH）または水酸化ナトリウム（NaOH）である、第11項のプロセス。
【０１３０】
13．  pHショックが酸の添加によって行われる、第5、7、8、または10項のいずれか１つのプロセス。
【０１３１】
14．  酸がリン酸（H3PO4）である、第13項のプロセス。
【０１３２】
15．  ステップb)が、インキュベーションステップを含んでおり、そのインキュベーションステップは、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い、10℃より高い、20℃より高い、または23℃より高い温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記のいずれかの項のプロセス。
【０１３３】
16．  インキュベーションステップが、10分から1年、10分から6月、10分から12時間、10分から6時間、または10分から2時間までの間の期間、宿主細胞をインキュベートすることを含む、第15項のプロセス。
【０１３４】
17．  インキュベーションステップが、宿主細胞を20℃-40℃の間の温度でインキュベートすることを含む、第15または16項のプロセス。
【０１３５】
18．  インキュベーションステップが、約23℃の温度で行われる、第15-17項のいずれか１つのプロセス。
【０１３６】
19．  ステップa)が第１の供給速度を有し、ステップb)が第２の供給速度を有するが、第２の供給速度が第１の供給速度より低い、第15-18項のいずれか１つのプロセス。
【０１３７】
20．  インキュベーションステップの期間中、供給添加を行わない、第15-19項のいずれか１つのプロセス。
【０１３８】
21．  インキュベーションステップの期間中、pHコントロールを行わない、第15-20項のいずれか１つのプロセス。
【０１３９】
22．  ステップb)が、宿主細胞を、0℃より低い温度に、少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または5日間さらすことを含む、前記のいずれかの項のプロセス。
【０１４０】
23．  ステップb)が、宿主細胞を、少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または5日間凍結することを含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１４１】
24．  ステップb)が、宿主細胞を-10℃、-20℃、または-70℃より低い温度で凍結することを含む、第22もしくは23項のプロセス。
【０１４２】
25．  ステップb)がさらに、細胞を解凍することを含む、第22-24項のいずれか１つのプロセス。
【０１４３】
26．  ステップb)が、宿主細胞をpHショックにさらした後インキュベーションステップを行うことを含んでおり、このインキュベーションステップが、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い、10℃より高い、20℃より高い、または23℃より高い温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１４４】
27．  ステップb)が、インキュベーションステップの後、宿主細胞をpHショックにさらすことを含んでおり、このインキュベーションステップが、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い、10℃より高い、20℃より高い、または23℃より高い温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、第1-26項のいずれか１つのプロセス。
【０１４５】
28．  ステップb)が、インキュベーションステップの後に宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、もしくは4日間凍結することを含んでおり、このインキュベーションステップが、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い、10℃より高い、20℃より高い、または23℃より高い温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１４６】
29．  ステップb)が、宿主細胞をpHショックにさらした後に、宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、もしくは4日間凍結することを含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１４７】
30．  ステップb)が、宿主細胞をpHショックにさらした後インキュベーションステップを行い、その後、宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、もしくは4日間凍結することを含んでおり、このインキュベーションステップが、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い、10℃より高い、または20℃より高い温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、第1-26項または第28-29項のいずれか１つのプロセス。
【０１４８】
31．  ステップb)が、インキュベーションステップの後、宿主細胞をpHショックにさらし、その後、宿主細胞を少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、もしくは4日間凍結することを含んでおり、このインキュベーションステップが、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも1時間、または少なくとも2時間のあいだ、0℃より高い、10℃より高い、または20℃より高い温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、第1-25項または第27-29項のいずれか１つのプロセス。
【０１４９】
32．  宿主細胞がグラム陰性宿主細胞である、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５０】
33．  グラム陰性宿主細胞が、大腸菌（E.coli）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ラン藻（Cyanobacteria）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、ヘモフィルス属（Hemophilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジオネラ属（Legionella）、モラクセラ属（Moraxella）、ナイセリア属（Neisseria）、パスツレラ属（Pasteurella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、赤痢菌属（Shigella）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、およびエルシニア属（Yersinia）からなる一群から選択される、第32項のプロセス。
【０１５１】
34．  グラム陰性宿主細胞が大腸菌（E. coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびモラクセラ属（Moraxella）からなる一群から選択される、第32または33項のプロセス。
【０１５２】
35．  グラム陰性宿主細胞が大腸菌（E.coli）である、第32-34項のいずれか１つのプロセス。
【０１５３】
36．  ステップc)が浸透圧ショックを含んでいる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５４】
37．  宿主細胞がステップb)の間生きている、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５５】
38．  組換えタンパク質が、細菌抗原、ウイルス抗原、もしくはがん抗原を含んでなる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５６】
39．  組換えタンパク質が原核生物タンパク質である、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５７】
40．  組換えタンパク質が可溶性タンパク質である、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５８】
41．  組換えタンパク質が表面結合タンパク質である、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１５９】
42．  組換えタンパク質がトキソイドである、第1-49項のいずれか１つのプロセス。
【０１６０】
43．  組換えタンパク質が、ジフテリア菌（C.diphtheriae）、肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、モラクセラ属（Moraxella）、髄膜炎菌（N.meningitidis）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、E.フェカリス（E.faecalis）、E.フェシウム（E. faecium）、サルモネラ属（Salmonella）、C.トラコマチス（C. trachomatis）、または表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）に由来する、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１６１】
44．  組換えタンパク質がジフテリアトキソイドである、第42もしくは43項のプロセス。
【０１６２】
45．  組換えタンパク質がCRM197である、第42もしくは43項のプロセス。
【０１６３】
46．  ペリプラズムシグナル配列が、異種シグナル配列である、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１６４】
47．  ペリプラズムシグナル配列が、
a) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つである；
b) 1つ、2つ、もしくは3つの点変異、挿入もしくは欠失を含有する、配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の変異体である；または
c) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の、少なくとも10アミノ酸からなる断片である、
前記のいずれか1項のプロセス。
【０１６５】
48．  ペリプラズムシグナル配列が、
a) 配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つである；
b) 1つ、2つ、もしくは3つの点変異、挿入もしくは欠失を含有する、配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26の変異体である；または
c) 配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26の、少なくとも10アミノ酸からなる断片である、
第47項のプロセス。
【０１６６】
49．  ペリプラズムシグナル配列が、
a) 配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24のいずれか1つである；
b) 1つ、2つ、もしくは3つの点変異、挿入もしくは欠失を含有する、配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24の変異体である；または
c) 配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24の、少なくとも10アミノ酸からなる断片である、
第47項のプロセス。
【０１６７】
50．  ペリプラズムシグナル配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、もしくは23のいずれか1つによってコードされている、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１６８】
51．  ペリプラズムシグナル配列が、配列番号1、3、9、11、13、15、17、19、21、23、もしくは25のいずれか1つによってコードされている、第50項のプロセス。
【０１６９】
52．  ペリプラズムシグナル配列が、配列番号1、3、9、11、13、15、17、19、21、もしくは23のいずれか1つによってコードされている、第50項のプロセス。
【０１７０】
53．  ポリヌクレオチドが誘導可能なプロモーターを含んでいる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７１】
54．  ステップb)が、宿主細胞を遠心分離によって濃縮するステップを含んでいる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７２】
55．  ステップa)が、pH5.0から8.0の間、または6.0から7.0の間のpHで行われる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７３】
56．  ステップa)が、20℃から40℃の間の温度で行われる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７４】
57．  ステップa)のほとんどの間、培養物内部の溶存酸素レベルが、10％から30％の間である、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７５】
58．  ステップa)が、10-1000 h-1の間のKlaで行われる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７６】
59．  発酵培地が、CY、SOC、もしくは類似の培地からなる一群から選択される培地を含有する、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１７７】
60．  ステップa(i))が、誘導物質の添加、および/または発酵培地の温度を変更することを含む、第3項のプロセス。
【０１７８】
61．  誘導物質がIPTGである、第60項のプロセス。
【０１７９】
62．  ステップa(i))が、発酵培地の温度を、2℃より大きく、5℃より大きく、10℃より大きく、または15℃より大きく変更することを含む、第61項のプロセス。
【０１８０】
63．  組換えタンパク質を精製するステップd)をさらに含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１８１】
64．  組換えタンパク質を糖類とコンジュゲートするステップe)をさらに含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１８２】
65．  糖類が、肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、髄膜炎菌（N.meningitidis）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、E.フェカリス（E.faecalis）、E.フェシウム（E.faecium）、サルモネラ属（Salmonella）、もしくは表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）に由来する細菌の糖類である、第64項のプロセス。
【０１８３】
66．  細菌の糖類が、1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23Fおよび33Fからなる一群から選択される、肺炎レンサ球菌莢膜糖類である、第65項のプロセス。
【０１８４】
67．  細菌の糖類が、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b（Hib）の多糖もしくはオリゴ糖である、第66項のプロセス。
【０１８５】
68．  ステップa)のpHがステップa(i))のpHより低い、第2項のプロセス。
【０１８６】
69．  ステップa)の温度がステップa(i))の温度より高い、第2項のプロセス。
【０１８７】
70．  ステップa)の基質供給速度が、ステップa(i))の基質供給速度より高い、第2項のプロセス。
【０１８８】
71．  プロセスが発酵槽の中で行われる、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１８９】
72．  ステップa)および/またはステップa(i))において消泡剤が添加される、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１９０】
73．  ステップa)および/またはステップa(i))において、泡プローブもしくは機械的破泡装置が使用される、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１９１】
74．  発酵槽に10-5000リットルの培養物が入る、第71項のプロセス。
【０１９２】
75．  発酵槽に100-200リットルの培養物、または約150リットルの培養物が入る、第74項のプロセス。
【０１９３】
76．  組換えタンパク質を他の抗原と混合するステップf)をさらに含む、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１９４】
77．  組換えタンパク質が、製薬上許容される添加剤と混合されている、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１９５】
78．  組換えタンパク質がアジュバントと混合されている、前記のいずれか1項のプロセス。
【０１９６】
79．  前記のいずれか1項のプロセスによって得ることが可能な組換えタンパク質。
【０１９７】
80．  第1-78項のいずれか１つのプロセスによって得られた組換えタンパク質。
【０１９８】
81．  第79もしくは80項の組換えタンパク質、および製薬上許容される添加剤を含んでなる、免疫原性組成物。
【０１９９】
82．  追加の抗原を含んでなる、第81項の免疫原性組成物。
【０２００】
83．  疾病の予防もしくは治療用の、第81もしくは82項の免疫原性組成物。
【０２０１】
84．  第81-83項の免疫原性組成物を含んでなるワクチン。
【０２０２】
85．  疾病の予防もしくは治療における、第81-83項の免疫原性組成物、または第84項のワクチンの使用。
【０２０３】
86．  疾病の予防もしくは治療用の薬剤の製造における、第81-83項の免疫原性組成物、または第84項のワクチンの使用。
【０２０４】
87．  第81-83項の免疫原性組成物、または第84項のワクチンを、患者に投与することを含む、疾病を予防もしくは治療する方法。
【０２０５】
（実施例）
【実施例１】
【０２０６】
大腸菌（Escherichia coli）B2355前培養
凍結した大腸菌株B2355の種培養を用いて、前培養を調製した。この菌株は、大腸菌由来のFlgIのシグナルペプチド（配列番号23）とCRM197（配列番号27）との融合タンパク質をコードする配列を含有する、pET26b誘導体で形質転換された、B834（DE3）株である。種培養可能割合は、mlあたり約1x1010コロニー形成単位と測定された。
【０２０７】
種培養を解凍して室温とし、400μlを用いて、400 ml前培養培地を入れた2リットル三角フラスコに接種した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))より改変）。
【０２０８】
接種したフラスコを次に、37℃（±1℃）にて200rpmでインキュベートした。培養によって650nmで0.5から1.5の間の光学濃度が得られたら（約5時間のインキュベーション）、前培養期を終わらせた。培養を終了したらただちに、その前培養を用いて、発酵槽内の培地に接種した。
【実施例２】
【０２０９】
20Lスケールのフェドバッチ発酵
20リットル発酵槽（Biolafitte）を使用した。9リットルのバッチ培地を無菌的に発酵槽に移した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)より改変）。培地のpHは、塩基の添加により6.8に調整した。放射線照射した消泡剤（SAG 471）の原液3mlも発酵槽に添加した。その後、接種の前に、温度（28℃）、上部圧力（0.5 bar）、通気速度（1分あたり20リットル注入空気）、および初発の撹拌速度（300rpm）を設定した。これらの条件での溶存酸素レベルは100％であった。上部圧力および通気速度は発酵中、一定のレベルに維持された。
【０２１０】
約20 mlの前培養（実施例1に記載のように調製）を添加することで接種を行った。
【０２１１】
バッチ期（0-15時間）のあいだ、温度は28℃に維持した。溶存酸素レベルは20％に設定した。溶存酸素（DO）レベルは、DOが20％を下回ったら撹拌を増やすことによって調節した。グルコースを使い尽くすと、DOは増加し、同時に撹拌は減少した。
【０２１２】
15時間発酵後、追加の基質を、以下の供給添加プロファイルにしたがって、添加した：
【表１】
2014512185.tif 000002
2014512185.tif 000003
【０２１３】
フェドバッチ期（15-46時間）のあいだ、pHは塩基の添加により6.8に維持し、温度は28℃に調節し、DOレベルは、撹拌速度をコントロールすることで20％に維持した。
【０２１４】
46時間時点でIPTGを終濃度1mMとなるように添加し、細菌を誘導した。それに加えて、46時間後に塩基の添加によりpHを上昇させ、温度は23℃に低下させた（これらの変化は、高レベルのペリプラズム発現をもたらすことができる）。このpHおよび温度は、誘導期（46-72時間）の全期間中、維持された。DOレベルは、撹拌速度をコントロールすることにより20％に維持された。
【０２１５】
誘導期の終了時に（72時間）、遠心分離（6,500xg、4℃にて1時間）によって細胞ペーストを収集し、-20℃で保存した。
【０２１６】
Chenら（Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004)相違点を下記の表２に記載）から改変された手順を用いて、浸透圧ショックによってペリプラズム抽出を行った。ペリプラズムおよび細胞質画分のCRM197含量をELISAでアッセイした。
【表２】
2014512185.tif 000004
【０２１７】
図1は、20Lスケールフェドバッチ培養の間、プロセスパラメーターをモニターした、典型的な発酵プロファイルを示す。
【０２１８】
発酵終了時に、ペリプラズムCRM197の生産性をELISAでアッセイした：
【表３】
2014512185.tif 000005
【０２１９】
この技術は、発現レベルおよび分泌効率の向上を示した。
【実施例３】
【０２２０】
誘導期に使用される最適な供給速度およびpHの決定
この実験では、組換えタンパク質のペリプラズム生産を最大にするために、応答局面法（J.ind. Microbiol. Biotechnol. 37:195-204 (2010)）を用いて、3つのパラメーターの最適値を決定した。検討する3つの発酵パラメーターは、増殖期のpH、誘導中のpH、および誘導中の供給速度である。これら3つのパラメーターの値は、Doehlert uniform shell design（Doehlert (Applied Statistics 19:231-239 (1970))）にしたがって選択された。表5に記載の値を用いて15回の発酵を実施した。
【０２２１】
発酵はB2284株を用いて行ったが、これは、大腸菌由来のFlgIのシグナルペプチド（配列番号23）とCRM197の成熟部分（配列番号27）の融合タンパク質をコードする配列を含有するpET26b誘導体で形質転換されたBLR（DE3）細胞の一菌株である。
【０２２２】
各発酵について、種培養を解凍して室温とし、500μlを用いて、前培養培地400 mlを入れた2リットル三角フラスコに接種した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))より改変）。
【０２２３】
植菌したフラスコをその後37℃（±1℃）にて200 rpmでインキュベートした。650 nmの光学濃度（OD650nm）が約2.5に達したら（約6時間インキュベーション）、前培養を止めた。培養を止めたらただちに、その前培養を用いて、発酵槽内の培地に接種した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)より改変）。
【０２２４】
20リットル発酵槽（Biolafitte）を使用した。バッチ期の培地9リットルを発酵槽に無菌的に移した。塩基の添加により培地のpHを目標値（表5）に調整した。放射線照射した消泡剤（SAG 471）の原液3mlも発酵槽に添加した。その後、接種の前に、温度（28℃）、上部圧力（0.5 bar）、通気速度（1分あたり20リットル注入空気）、および初発の撹拌速度（300rpm）を設定した。これらの条件で溶存酸素レベルは100％であった。上部圧力および通気速度は発酵中、一定のレベルに維持された。
【０２２５】
バッチ期（0-15時間）の間、温度は28℃に維持された。溶存酸素レベルは20％に設定し、DOが20％を下回ったら撹拌を増やして調節した。
【０２２６】
フェドバッチ期（15-46時間）の間、pHは、表5に記載の条件のうち1つにしたがって、塩基の添加により維持された。温度は28℃に調節した。撹拌速度は、一定の設定値（最大800 rpm）に維持され、DOレベルは、DOが20％を上回ったら、高濃度のフィード溶液を自動的に添加することによって、20％に維持された（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))より改変）。
【０２２７】
培養がOD650nm約90に到達したら、pHの設定値を、表5に記載の条件のうち1つにしたがって、塩基もしくは酸の添加により変更し、温度は23℃に低下させた。これらの条件が達成された時点で、IPTGを添加して終濃度1mMとした。pHおよび温度は、誘導期の期間中（24時間）ずっと維持された。誘導期の全期間中、表4に記載の条件の1つにしたがって、一定の基質供給速度が使用された。DOレベルは撹拌速度を調節することによって20％に維持された。
【０２２８】
誘導期の終了時に、細胞ペーストを遠心分離（典型的には6,500xg、4℃、1時間）によって集め、-20℃で保存した。
【０２２９】
Chenら(Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004) 相違点は表２に記載)から改変された手順を用いて、浸透圧ショックによりペリプラズム抽出を行った。ペリプラズムおよび細胞質画分のCRM197含量はELISAによってアッセイした。
【表４】
2014512185.tif 000006
【表５】
2014512185.tif 000007
【０２３０】
15回の発酵から得られた結果をもとに、NEMROD-W ソフトウェア(LPRAI, Marseille, France)を用いて、ペリプラズムおよび細胞質画分中のCRM197の生産をモデル化した。
【０２３１】
図２に示すように、誘導中、低い供給速度で、ペリプラズムのCRM197生産は高くなった（図2a）が、細胞内部のCRM197の蓄積は、供給速度が高いほど高かった（図2b）。ペリプラズムCRM197または細胞結合型CRM197の生産に対する最適供給速度の相違は、ペリプラズムCRM197の生産を選択的に向上させる条件を限定することを可能にする。誘導時のpH上昇も、より高レベルのペリプラズムCRM197の生産をもたらす（図2a）。
【実施例４】
【０２３２】
浸透圧ショックによるペリプラズム放出効率に及ぼす細胞ペースト凍結の影響
flgI CRM197構築物を発現する大腸菌B834（DE3）の細胞を、フェドバッチ培養で増殖させ（20Lスケール）、組換えタンパク質の発現およびペリプラズム空間への分泌の誘導は、ペリプラズム発現を用いた他のいかなる発酵法も適しているであろうが、上記（実施例1-3）に記載のように行った。
【０２３３】
IPTG添加の26時間後、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）により細胞を集めた。ペリプラズムのタンパク質の抽出は、10 mlの発酵ブロスに相当する新鮮細胞ペレットに対して、Chenら（Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004) 相違点を表6にまとめる）から改変した方法を用いて、浸透圧ショックにより、ただちに行った。並行して、10 mlブロスに相当する細胞ペレットを−20℃にて4日間保存し、室温で解凍してから、浸透圧ショックにさらした。
【表６】
2014512185.tif 000008
【０２３４】
CRM197含量は、凍結細胞もしくは新鮮細胞への浸透圧ショック後に、上清および細胞結合画分においてELISAによって測定した（検出はウサギ抗CRM抗体（Pims20010665）および抗ウサギIgG（Jackson 111-035-003）を用いて行った）。総タンパク質含量は、同画分においてローリー（Lowry）法で測定した（表7）。
【表７】
2014512185.tif 000009
【０２３５】
* 100 x CRM197上清/(CRM197上清 + CRM197細胞結合型)として算出。
【０２３６】
全CRM197のうちわずかに19％だけが新鮮細胞から放出されたのに対して、凍結細胞からは92％が回収されたが、これは浸透圧ショックで放出されるCRM197の総量の、5倍を超える改善を示す。この改善は、総タンパク質放出の増加（2.8倍）、ならびにELISA：総タンパク質比の増加（2倍）によって達成された。
【実施例５】
【０２３７】
新鮮細胞からのペリプラズム放出効率に及ぼす浸透圧ショック前のpHショックの影響
大腸菌由来FlgIのシグナルペプチド（19aa）(配列番号24)とCRM197の成熟部分（595aa）（配列番号28）との融合タンパク質を発現する大腸菌B834（DE3）の細胞を、フェドバッチ培養で増殖させ（20Lスケール）、組換えタンパク質の発現およびペリプラズム空間への分泌の誘導は、ペリプラズム発現を用いた他のいかなる発酵法も適しているであろうが、上記のように行った。
【０２３８】
IPTG添加の24時間後、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）により細胞を集めた。ペリプラズムのタンパク質の抽出は、10 mlの発酵ブロスに相当する新鮮細胞ペレットに対して、Chenら（Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004) 相違点を上記表6に記載する）から改変した方法を用いて、浸透圧ショックにより、ただちに行った。対照として、10 mlブロスに相当する細胞ペレットを−20℃にて7日間保存し、室温で解凍してから、浸透圧ショックにさらした。
【０２３９】
並行して、発酵物から分け取った100mlを、さらに、600μl NH4OH 25％もしくは60μl H3PO4 85％を添加した、または添加しない、500ml振盪フラスコ内でインキュベートした（23℃、200rpm）。2時間インキュベートした後、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）により細胞を集め、ただちに浸透圧ショックにさらした。
【０２４０】
CRM197含量は、浸透圧ショック後に、上清画分においてELISAによって測定した（検出はウサギ抗CRM抗体（Pims20010665）および抗ウサギIgG（Jackson 111-035-003）を用いて行った）（表８）。
【表８】
2014512185.tif 000010
【０２４１】
*N/A、該当なし
何も処理しない場合、新鮮細胞のペリプラズム抽出は、凍結細胞から抽出された量の30％を抽出できるのみであった。細胞を23℃で2時間追加してインキュベートすると、結果として改善がもたらされた（未処理の新鮮細胞に対して1.2倍）。わずかなpH上昇（600μl NH4OH 25％の添加）後に同じ処理を適用すると、1.4倍の改善が見られた。最後に、2時間のインキュベーション期間の前にpHを約7.1に低下させると、未処理の新鮮細胞と比べて、1.7倍の改善が観察された。
【０２４２】
したがって、pH低下に続いて、供給添加もpH制御もない2時間のインキュベーション期間という成熟ステップを加えることによって、新鮮細胞からのペリプラズム放出の効率は1.7倍に増加した。CRM197の総量については、この条件は凍結細胞から抽出される量の51％を放出した。重要なことは、2時間の処理の間変わらないOD650nmで示されるように、これが細胞溶解によるのではないということである。
【実施例６】
【０２４３】
新鮮細胞からのペリプラズム放出効率に及ぼす浸透圧ショック前のpH低下幅の影響
大腸菌由来FlgIのシグナルペプチド（19aa）(配列番号24)とCRM197の成熟部分（595aa）（配列番号28）との融合タンパク質を発現する大腸菌B834（DE3）の細胞を、フェドバッチ培養で増殖させ（150Lスケール）、組換えタンパク質の発現およびペリプラズム空間への分泌の誘導は、ペリプラズム発現を用いた他のいかなる発酵法も適しているであろうが、上記のように行った。
【０２４４】
IPTG添加の24時間後、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）により細胞を集めた。ペリプラズムのタンパク質の抽出は、10 mlの発酵ブロスに相当する新鮮細胞ペレットに対して、Chenら（Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004) 相違点を上記表6に記載する）から改変した方法を用いて、浸透圧ショックにより、ただちに行った。対照として、10 mlブロスに相当する細胞ペレットをやはり−20℃にて30日間保存し、室温で解凍してから、浸透圧ショックにさらした。
【０２４５】
並行して、発酵物から分け取った100mlを、さらに、500ml振盪フラスコ内でインキュベートした（23℃、200rpm）が、これには、H3PO4 85％を増量して添加した（0、60、120、180、または240μl）。2時間インキュベートした後、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）により細胞を集め、ただちに浸透圧ショックにさらした。
【０２４６】
CRM197含量は、浸透圧ショック後に、上清画分においてELISAによって測定した（検出はウサギ抗CRM抗体（Pims20010665）および抗ウサギIgG（Jackson 111-035-003）を用いて行った）（表9）。
【表９】
2014512185.tif 000011
【０２４７】
* N/A、該当なし
** 100 x CRM197上清/(CRM197上清 + CRM197細胞結合型)として算出
*** CRM197分解が認められた
何も処理しない場合、新鮮細胞のペリプラズム抽出は、凍結細胞での88％と比べて、利用可能な全CRM197のうちわずかに26％が抽出されたのみであった（4.7倍低い効率）。23℃にてさらに2時間インキュベートした結果、新鮮細胞から放出されるCRM197の量は2倍に改善された。このプラスの効果は、2時間のインキュベーション期間の前にpHを低下させることによって強められた。放出されるCRM197の量は低pHで増加した。pHの約6.9への低下を行うと、新鮮細胞から、利用可能な全CRM197の61％が放出された（未処理の新鮮細胞に対して2.7倍の改善）。約6.9より低いpH値では、放出されるCRM197の量の増加は見られず、CRM197タンパク質は不安定であることが判明した。
【０２４８】
したがって、6.9へのpH低下と、それに続く、供給添加もpHコントロールもしない2時間インキュベーション期間という成熟ステップを加えることによって、新鮮細胞からのペリプラズム放出効率を、未処理凍結細胞から放出されるCRM197の量の21％から72％に増加させることができた（100 x CRM197新鮮細胞から放出/CRM197凍結細胞から放出として算出）。
【実施例７】
【０２４９】
20Lスケールで新鮮細胞からのペリプラズム放出効率に及ぼすpH低下の影響
大腸菌由来FlgIのシグナルペプチド（19aa）(配列番号24)とCRM197の成熟部分（595aa）（配列番号28）との融合タンパク質を発現する大腸菌B834（DE3）の細胞を、フェドバッチ培養で増殖させ（20Lスケール）、組換えタンパク質の発現およびペリプラズム空間への分泌の誘導は、ペリプラズム発現による他のいかなる発酵法も適しているであろうが、上記のように行った。
【０２５０】
IPTG添加の26時間後、10 mlを分取して、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）し、新鮮細胞（ただちに実施）または凍結細胞（-20℃にて4日間保存した細胞ペレット）に対して、Chenら（Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004) 相違点を上記表6に記載する）から改変した方法を用いて、浸透圧ショックによるペリプラズムタンパク質の抽出を行った。
【０２５１】
並行して、pHを7.5から6.8に低下させるために、34 g H3PO4 85％を発酵ブロスに添加し、供給添加を止めた。他のすべてのパラメーターは前記の設定値のままとした。発酵はその後2時間pH6.8で続行した。この成熟期間中、300 rpmで最低限の撹拌速度を維持したが、その結果、溶存酸素レベルは増加した（供給添加なしを受けて低い酸素要求量の結果）。pH 6.8での2時間インキュベーションの期間中の発酵プロファイルを図3に示す。
【０２５２】
2時間の成熟期の後、10 mlを分取して、遠心分離（14,000xg、10分、＋4℃）し、新鮮細胞（ただちに実施）または凍結細胞（-20℃にて4日間保存した細胞ペレット）に対して、浸透圧ショックによるペリプラズムタンパク質の抽出を行った。
【０２５３】
CRM197含量は、凍結細胞もしくは新鮮細胞への浸透圧ショック後に、上清および細胞結合画分においてELISAによって測定した（検出はウサギ抗CRM抗体（Pims20010665）および抗ウサギIgG（Jackson 111-035-003）を用いて行った）。総タンパク質含量は、同画分においてローリー（Lowry）法で測定した（表10）。
【表１０】
2014512185.tif 000012
【０２５４】
*100 x CRM197上清/(CRM197上清 + CRM197細胞結合型)として算出
酸性処理なしでは、浸透圧ショックによるCRM197放出は、凍結細胞と比べて新鮮細胞では5.7倍（フォールド）少なかった。2時間酸性処理によって、新鮮細胞への浸透圧ショックの効率が改善された；成熟ステップ後、全CRM197の49％が新鮮細胞から抽出されたが、これに対して成熟なしではわずかに19％であった。この改善は総タンパク質のより高い放出、およびELISA：総タンパク質比の増加によって達成された。
【０２５５】
したがって、pHの6.8への低下と、それに続く供給添加なしの2時間インキュベーション期間という成熟ステップを加えることによって、新鮮細胞からのペリプラズム放出効率を、未処理凍結細胞から放出されるCRM197の量の18％から50％に高めることができた（100 x CRM197新鮮細胞から放出/CRM197凍結細胞から放出として算出）。
【図１】
2014512185.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【配列表】
2014512185000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月12日(2013.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ、
a) 発酵培地中でグラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させるステップであって、該宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、該ポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしている、前記ステップ；
a(i)) 細菌トキソイドの発現を誘導するステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、その成熟ステップが：
I) 宿主細胞をpHショックにさらすこと；
II) 宿主細胞を供給添加なしでインキュベートすること；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらすこと、
を含んでなる、前記ステップ；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程が浸透圧ショックを含んでいる、前記ステップ、
を含んでなり、
ここで該グラム陰性宿主細胞は大腸菌（E. coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびモラクセラ属（Moraxella）からなる一群から選択され、該宿主細胞はステップb)のあいだ生きており、10-5000リットルの培養物が入る発酵槽の中で行われる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のための方法。
【請求項２】
以下のステップ、
a) グラム陰性宿主細胞を用意するステップであって、該宿主細胞はポリヌクレオチドで形質転換されており、該ポリヌクレオチドは細菌トキソイドおよびペリプラズムシグナル配列をコードしており、該グラム陰性宿主細胞はペリプラズムで発現される細菌トキソイドを含有している、前記ステップ；
b) 宿主細胞を成熟させるステップであって、その成熟ステップが：
I) 宿主細胞をpHショックにさらすこと；
II) 宿主細胞を供給添加なしでインキュベートすること；および/または
III) 宿主細胞を−20℃より低い温度にさらすこと、
を含んでなる、前記ステップ；ならびに
c) 宿主細胞から細菌トキソイドを抽出するステップであって、この抽出工程が浸透圧ショックを含んでいる、前記ステップ、
を含んでなり、ここで該グラム陰性宿主細胞は大腸菌（E. coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびモラクセラ属（Moraxella）からなる一群から選択され、該宿主細胞はステップb)のあいだ生きており、10-5000リットルの培養物が入る発酵槽の中で行われる、細菌トキソイドのペリプラズム発現のための方法。
【請求項３】
pHショックが、発酵培地のpHを0.2pH単位より大きな幅で、または0.5pH単位より大きな幅で、または0.1から2.0までの間のpH単位だけ、または0.2から1.0までの間のpH単位だけ、上昇または低下させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
インキュベーションステップが、10分から1年、10分から6月、10分から12時間、10分から6時間、または10分から2時間までの間の期間、必要に応じて20℃から40℃の間の温度、たとえば約23℃の温度で、宿主細胞をインキュベートすることを含む、請求項１〜３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５】
ステップb)が、宿主細胞を-20℃、-40℃、-60℃、-70℃、または-80℃より低い温度に、少なくとも1時間、2時間、5時間、12時間、24時間、1日、2日、または5日間さらすことを含む、請求項１〜４のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
ステップb)が、宿主細胞を凍結したのち解凍することを含む、請求項１〜５のいずれか1つに記載の方法。
【請求項７】
ステップb)が、
- 宿主細胞をpHショックにさらした後、供給添加なしで宿主細胞をインキュベートすること；
- 供給添加なしで宿主細胞をインキュベートした後、宿主細胞をpHショックにさらすこと；
- 供給添加なしで宿主細胞をインキュベートした後、宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと；
- 宿主細胞をpHショックにさらした後、宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと；
- 宿主細胞をpHショックにさらした後、供給添加なしで宿主細胞をインキュベートし、次いで宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと；または
- 供給添加なしで宿主細胞をインキュベートした後、宿主細胞をpHショックにさらし、次いで宿主細胞を-20℃より低い温度にさらすこと
を含む、請求項１〜６のいずれか1つに記載の方法。
【請求項８】
グラム陰性宿主細胞がステップb)のあいだ生きている、請求項１〜７のいずれか1つに記載の方法。
【請求項９】
細菌トキソイドが、CRM197などのジフテリアトキソイドである、請求項１〜８のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
ペリプラズムシグナル配列が、
a) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26のいずれか1つである；
b) 1つ、2つ、もしくは3つの点突然変異、挿入もしくは欠失を含有する、配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の変異体である；または
c) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、もしくは26の、少なくとも10アミノ酸からなる断片である、
請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
細菌トキソイドを精製するステップd)をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１２】
細菌トキソイドを糖類とコンジュゲートするステップe)をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか1つに記載の方法であって、該糖類は、肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、髄膜炎菌（N.meningitidis）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、E.フェカリス（E.faecalis）、E.フェシウム（E.faecium）、サルモネラ属（Salmonella）、もしくは表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）に由来する細菌の糖類、たとえば、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる一群から選択される肺炎レンサ球菌莢膜糖類、またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b（Hib）の多糖もしくはオリゴ糖である、前記方法。
【請求項１３】
発酵槽の中で行われる、請求項１〜１２のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１４】
細菌トキソイドを他の抗原と混合するステップf)をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか1つに記載の方法。
【国際調査報告】
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