(57)【要約】本発明は、細胞中でベータ-カテニンmRNAを標的としてベータ-カテニンの発現低下を引き起こすオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。ベータ-カテニンの発現を低減させることは、広範な医学的障害、例えば過剰増殖性障害、例えば癌に有益である。本発明は、オリゴマーを含有する治療組成物、および該オリゴマーを用いてベータ-カテニンの発現を調節する方法（癌（例えば多発性骨髄腫）を含む過剰増殖性障害の治療法を含む）を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における骨髄腫を治療または予防する方法であって、該哺乳動物に有効量の：
【化１】
2014533280.tif 000019
式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表し、そしてMeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す
から成る群から選択されるオリゴマーまたは該オリゴマーのコンジュゲートを投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
該骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
【化２】
2014533280.tif 000020
式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表し、そしてMeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す
から成る群から選択されるオリゴマーまたは該オリゴマーのコンジュゲートの、哺乳動物における骨髄腫を治療または予防するための薬剤の調製における使用。
【請求項６】
該骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
該哺乳動物がヒトである、請求項５または６に記載される使用。
【請求項８】
哺乳動物における骨髄腫の治療または予防のための医薬組成物であって、
【化３】
2014533280.tif 000021
式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表し、そしてMeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す
から成る群から選択されるオリゴマーまたは該オリゴマーのコンジュゲートを含有する、上記組成物。
【請求項９】
該骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬的に許容される賦形剤を更に含有する、請求項８または９に記載される医薬組成物。
【請求項１１】
該哺乳動物がヒトである、請求項８から１０のいずれか一項に記載される医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願第61/558,870号（2011年11月1日出願）に基づく優先権を主張するものであり、該出願は米国特許出願第13/232,123号（2011年9月14日出願）に関連し、該出願は米国特許出願第12/874,668号（2010年9月2日出願。現在米国特許第8,039,446号）の分割出願であり、該出願は米国特許出願第12/356,923号（2009年1月21日出願。現在米国特許第7,915,401号）の分割出願であり、該出願は米国特許出願第12/113,031号（2008年4月30日出願。現在放棄）の継続出願であり、該出願は同様に米国特許仮出願第61/023,244号（2008年1月24日出願）および第60/915,371号（2007年5月1日出願）に基づく優先権を主張するものである。上記の各出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の属する分野
本発明は、細胞中でベータ-カテニンmRNAを標的としてベータ-カテニンの発現低下を引き起こすオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。ベータ-カテニン発現を低減させることは、広範な医学的障害、例えば過剰増殖性疾患（癌を含む）に有益である。本発明は、オリゴマーを含有する治療組成物、および該オリゴマーを用いてベータ-カテニンの発現を調節する方法（治療法を含む）を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ベータ-カテニン（別名、カドヘリン結合タンパク質およびβ-カテニン）は細胞質タンパク質であるカテニンファミリーのメンバーであり、複数の発生過程のメディエーターであるWntタンパク質によって開始されるシグナリング経路において、中心的役割を果たしている。ベータ-カテニンは増殖因子の刺激を受けるとリン酸化され、細胞の接着性低下を引き起こす。
【０００４】
癌の発生におけるベータ-カテニンの役割は、APC（結腸腺腫性ポリポーシス）遺伝子の発現産物によって調節されることが明らかになっている。APC腫瘍抑制タンパク質はベータ-カテニンに結合し、一方、ベータ-カテニンはTcfおよびLef転写因子と相互作用することが明らかにされた。Morinら（Morinら, Science, 1997, 275, 1787-1790）は、APCタンパク質が、結腸癌においてベータ-カテニンおよびTcf-4が介在する転写活性化を抑制的に調節することを報告している。Morinらの結果は、ベータ-カテニンの調節がAPCの腫瘍抑制効果にきわめて重要であること、および、この調節がAPCまたはベータ-カテニンのいずれかの変異によって回避できることを示している。
【０００５】
Morinらは、リン酸化部位に影響を及ぼすベータ-カテニンの変異によって、細胞がAPCが介在するベータ-カテニンの抑制的調節に非感受性となり、この機序の破綻が結腸直腸の腫瘍発生にきわめて重要であることを明らかにした（Morinら, Science, 1997, 275, 1787-1790）。
【０００６】
種々の癌細胞株におけるベータ-カテニンの変異検出に関して複数の報告がなされており、メラノーマ細胞株において異常に高い量のベータ-カテニンが確認されている。
【０００７】
米国特許第6,066,500号（Bennettら）は、ベータ-カテニンの発現を調節するためのアンチセンス化合物、組成物、および方法について記載している。
【０００８】
癌の発生におけるベータ-カテニンの関与を考慮すると、ベータ-カテニンの機能を有効に阻害する能力を有する物質が今なお必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、10-50個の連続するモノマーのオリゴマーであって、該オリゴマーの配列が哺乳動物ベータ-カテニンをコードする核酸の標的領域の逆相補配列と少なくとも80％の同一性を有する、上記オリゴマーを提供する。
【００１０】
本発明は、第１の領域を含有する10-50個の連続するモノマーのオリゴマーであって、該第１の領域の配列がSEQ ID NO:173の標的領域の逆相補配列またはSEQ ID NO:1-132、SEQ ID NO:174-192、およびSEQ ID NO:193から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する、上記オリゴマーを提供する。
【００１１】
本発明は更に、本発明にかかるオリゴマーを含有するコンジュゲートであって、該コンジュゲートが、それ自体は核酸またはモノマーではない１またはそれ以上の部分（「コンジュゲート部分」）に共有結合している、上記コンジュゲートを提供する。ある態様では、コンジュゲート部分はステロール基（例えばコレステロール）もしくは細胞内への侵入を促進する他の部分から成るか、またはそれらを含有する。
【００１２】
本発明は、本発明にかかるオリゴマーを含有するコンジュゲートを提供し、該コンジュゲートは正電荷を有する基を含有するポリマーコンジュゲート部分（例えばポリエチレングリコール（PEG））に共有結合している、すなわち、本発明にかかるオリゴマーは、任意にPEG化されていてもよい。
【００１３】
本発明は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲート、および医薬的に許容される希釈剤、キャリア、塩、またはアジュバントを含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は更に、医学的用途のための本発明にかかるオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００１５】
本発明は更に、１またはそれ以上の本明細書に記載する疾病（例えば過剰増殖性疾患（例えば癌））の治療のための薬剤を製造するための、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【００１６】
本発明は更に、本明細書に記載する１またはそれ以上の疾病（例えば癌）の治療に使用するための、本発明にかかるオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００１７】
また、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを含有する医薬組成物または他の組成物も提供する。更に、細胞または組織においてベータ-カテニンの発現を抑制的に調節する方法も提供し、該方法は、インビトロまたはインビボで該細胞または組織を有効量の１またはそれ以上の本発明のオリゴマー、コンジュゲート、または組成物と接触させることを含む。
【００１８】
また、ベータ-カテニンの発現または過剰発現に関係する疾病または症状を有する疑いがあるか、またはその傾向を有する疑いがある動物（例えば哺乳動物（例えばヒト））を治療する方法を開示し、該方法は、該動物またはヒトに治療的または予防的有効量の１またはそれ以上の本発明のオリゴマー、コンジュゲート、または組成物を投与することによる。
【００１９】
更に、ベータ-カテニンの発現の阻害、およびベータ-カテニンの活性に関係する疾病の治療のための、オリゴマーの使用法も提供する。
【００２０】
本発明のある態様は、哺乳動物（例えばヒト）において形質細胞性腫瘍（例えば骨髄腫（例えば多発性骨髄腫））を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、ベータ-カテニンの発現を低減させるのに有効な本明細書に記載するオリゴマーまたはそのコンジュゲート、例えば以下：
【００２１】
【化１】
2014533280.tif 000002
（式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表し、そして、MeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す）
から成る群から選択されるオリゴマーまたはそのコンジュゲートの有効量を該哺乳動物に投与することを含む。
【００２２】
本発明の関連する態様では、ベータ-カテニンの発現を低減させるのに有効な本明細書に記載するオリゴマーまたはそのコンジュゲート、例えば以下：
【００２３】
【化２】
2014533280.tif 000003
（式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表し、そして、MeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す）
から成る群から選択されるオリゴマーまたはそのコンジュゲートの、哺乳動物（例えばヒト）において細胞質性腫瘍（例えば骨髄腫（例えば多発性骨髄腫））を治療または予防するための薬剤の調製における使用法を提供する。
【００２４】
更なる関連する態様では、哺乳動物（例えばヒト）において形質細胞性腫瘍（例えば骨髄腫（例えば多発性骨髄腫））を治療または予防するための医薬組成物を提供し、該組成物は、ベータ-カテニンの発現を低減させるのに有効な本明細書に記載するオリゴマーまたはそのコンジュゲート、例えば以下：
【００２５】
【化３】
2014533280.tif 000004
（式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表し、そして、「MeC」は5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す）
から成る群から選択されるオリゴマーまたはそのコンジュゲートを含有する。医薬組成物は、任意に、１またはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を更に含有してもよい。
【００２６】
本発明は、細胞または組織においてベータ-カテニンの発現を阻害または低減する方法を提供し、該方法は、該細胞または組織を有効量の本発明のオリゴマー、コンジュゲート、または医薬組成物と接触させてベータ-カテニンの発現を阻害または低減する段階を含む。
【００２７】
本発明は、細胞（例えば癌細胞）においてアポトーシスを惹起する方法を提供し、該方法は、該細胞または組織を有効量の本発明のオリゴマー、コンジュゲート、または医薬組成物と接触させることによりベータ-カテニンの発現を阻害もしくは低減する、および／またはアポトーシスを惹起する段階を含む。
【００２８】
本発明は更に、連続する共有結合したモノマーを含有するか、またはそれらから成るオリゴマーであって、該オリゴマーが第１の領域を含有し、該第１の領域の配列がSEQ ID NO:1-132またはSEQ ID NO:174-193の領域の配列と少なくとも80％の同一性を有する、上記オリゴマーを提供する。ある態様では、配列はSEQ ID NO:189、192、58、および103から成る群から選択される。
【００２９】
本発明は更に、第１の領域を含有するか、またはそれから成るオリゴマーであって、該第１の領域の配列がSEQ ID NO:174-193の領域、例えばSEQ ID NO:189または192の領域と同一である、上記オリゴマーを提供する。
【００３０】
本発明は更に、SEQ ID NO:133-174にも同様に存在する（例えばSEQ ID NO:168または171にも同様に存在する）配列を含有するか、またはそれから成るオリゴマーを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１−１】SEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、および118の配列を有するオリゴマーがそれぞれ標的とするベータ-カテニン配列（太字および下線で示す）と、ベータ-カテニン転写物（GenBankアクセッション番号NM＿001904；SEQ ID NO:173）中のそれらの位置を示す。
【図１−２】SEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、および118の配列を有するオリゴマーがそれぞれ標的とするベータ-カテニン配列（太字および下線で示す）と、ベータ-カテニン転写物（GenBankアクセッション番号NM＿001904；SEQ ID NO:173）中のそれらの位置を示す。
【図２−１】SW480細胞のトランスフェクション24時間後におけるGAPDHに対して標準化したベータ-カテニン発現。
【図２−２】SW480細胞のトランスフェクション24時間後におけるGAPDHに対して標準化したベータ-カテニン発現。
【図３】ウェスタンブロットで測定した1および5nMの濃度のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたSW480細胞中のベータ-カテニンタンパク質含量。チューブリン染色をローディングコントロールとして使用し、SEQ ID NO:194をスクランブルコントロールオリゴヌクレオチドとして使用した。
【図４−１】25nMの濃度のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたHCT116細胞において、MTSアッセイを用い、トランスフェクション後の種々の時点でOD490を測定して細胞増殖性を測定した。擬似トランスフェクト細胞およびSEQ ID NO:194（スクランブルコントロール）でトランスフェクトした細胞をコントロールとして使用した。
【図４−２】25nMの濃度のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたHCT116細胞において、MTSアッセイを用い、トランスフェクション後の種々の時点でOD490を測定して細胞増殖性を測定した。擬似トランスフェクト細胞およびSEQ ID NO:194（スクランブルコントロール）でトランスフェクトした細胞をコントロールとして使用した。
【図４−３】25nMの濃度のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたHCT116細胞において、MTSアッセイを用い、トランスフェクション後の種々の時点でOD490を測定して細胞増殖性を測定した。擬似トランスフェクト細胞およびSEQ ID NO:194（スクランブルコントロール）でトランスフェクトした細胞をコントロールとして使用した。
【図５】3ｘ25mg/kgのオリゴヌクレオチドのi.v.処理を行った後、QPCRでマウス肝臓における、生理食塩水処理コントロールに対するベータ-カテニンmRNA発現を測定した。ベータ-カテニン発現をGAPDHに対して標準化し、結果を生理食塩水処理コントロールに対してプロットした。
【図６−１】アクセッション番号NM＿001904.3 (SEQ ID NO:195）のヒト・ベータ-カテニンmRNAのヌクレオチド配列。
【図６−２】アクセッション番号NM＿001904.3 (SEQ ID NO:195）のヒト・ベータ-カテニンmRNAのヌクレオチド配列。
【図７】一部の多発性骨髄腫（MM）細胞株は、トランスフェクションを行わずに（裸で（ジムノチックに））使用した場合、ベータ-カテニンアンチセンスLNAオリゴマーであるEZN-3892に対して感受性である。
【図８−１】EZN-3892は、多くの多発性骨髄腫細胞株においてベータ-カテニンのmRNAおよびタンパク質レベルを抑制的に調節する。
【図８−２】EZN-3892は、多くの多発性骨髄腫細胞株においてベータ-カテニンのmRNAおよびタンパク質レベルを抑制的に調節する。
【図９−１】EZN-3892はインビボにおいてOPM-2多発性骨髄腫異種移植片の増殖を強く阻害する。
【図９−２】EZN-3892はインビボにおいてOPM-2多発性骨髄腫異種移植片の増殖を強く阻害する。
【図９−３】EZN-3892はインビボにおいてOPM-2多発性骨髄腫異種移植片の増殖を強く阻害する。
【図９−４】EZN-3892はインビボにおいてOPM-2多発性骨髄腫異種移植片の増殖を強く阻害する。
【図１０】ベータ-カテニンmRNAの抑制的調節が、EZN-3892を投与したマウスから回収した肝臓、腫瘍、および腫瘍間質において明らかである。
【図１１】OPM-2腫瘍のH&E評価により、EZN-3892で処理したOPM-2腫瘍において顕著な腫瘍細胞死が明らかである。
【図１２】2-D増殖アッセイにおいてEZN-3892に感受性でない多発性骨髄腫細胞株は、インビボにおいて抗腫瘍作用を示さない。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
オリゴマー
第１の観点では、（例えば、哺乳動物のベータ-カテニンをコードする核酸分子（例えばSEQ ID NO:173のベータ-カテニン核酸）および天然に存在するそれらの哺乳動物ベータ-カテニンをコードする核酸分子の対立遺伝子多型の機能の調節に）有用なオリゴマー化合物（本明細書ではオリゴマーと記載する）を提供する。本発明のオリゴマーは、共有結合したモノマーから構成される。
【００３３】
「モノマー」という用語には、核酸中に天然に存在し、修飾された糖または修飾された核酸塩基をいずれも含有しないヌクレオシドおよびデオキシヌクレオシド（「ヌクレオシド」と総称される）、すなわち、リボース糖またはデオキシリボース糖が天然に存在する未修飾の核酸塩基（塩基）部分（すなわちプリンおよびピリミジン複素環であるアデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に共有結合した化合物、および、「ヌクレオシド類似体」、すなわち、核酸中に天然に存在するか、または核酸中に天然に存在しないヌクレオシドであって、糖部分がリボースもしくはデオキシリボース糖以外のものであるか（例えば二環式糖または2'修飾された糖（例えば2'置換された糖））、または塩基部分が修飾されているか（例えば5-メチルシトシン）、またはその両方であるヌクレオシドが、両方とも含まれる。
【００３４】
「RNAモノマー」は、リボース糖および未修飾の核酸塩基を含有するヌクレオシドである。
【００３５】
「DNAモノマー」は、デオキシリボース糖および未修飾の核酸塩基を含有するヌクレオシドである。
【００３６】
「ロックト核酸（Locked Nucleic Acid）モノマー」、「ロックトモノマー」、または「LNAモノマー」は、本明細書で更に後述する二環式糖を有するヌクレオシド類似体である。
【００３７】
「対応するヌクレオシド類似体」および「対応するヌクレオシド」という用語は、ヌクレオシド類似体中の塩基部分およびヌクレオシド中の塩基部分が同一であることを示す。例えば、「ヌクレオシド」がアデニンに結合した2-デオキシリボース糖を含有する場合、「対応するヌクレオシド類似体」は、例えばアデニン塩基部分に結合した修飾された糖を含有する。
【００３８】
「オリゴマー」、「オリゴマー化合物」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明との関係においては同義に使用し、例えばリン酸基（ヌクレオシド間にホスホジエステル結合を形成する）またはホルホロチオエート基（ヌクレオシド間にホスホロチオエステル結合を形成する）による、２またはそれ以上の連続するモノマーの共有結合によって形成される分子をいう。オリゴマーは10-50個のモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００３９】
ある態様では、オリゴマーは、本明細書に記載するように、ヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体、またはそれらの混合物を含有する。「LNAオリゴマー」または「LNAオリゴヌクレオチド」は、１またはそれ以上のLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドをいう。
【００４０】
オリゴマー中に任意に含有されてもよいヌクレオシド類似体は、対応するヌクレオシドと同様に機能してもよいし、または特定の改善された機能を有してもよい。モノマーの一部または全部がヌクレオシド類似体であるオリゴマーは、多くの場合、それらのオリゴマーが有する複数の好適な特性（例えば細胞膜への侵入能、細胞外および／または細胞内ヌクレアーゼに対する良好な耐性、および、核酸標的に対する高い親和性および特異性）により、天然型より優れている。LNAモノマーは、例えば複数の上記特性を得られるために、特に好適である。
【００４１】
種々の態様では、オリゴマー中に存在する１またはそれ以上のヌクレオシド類似体は、対応する天然型ヌクレオシドに対して機能的に「サイレント」または「同等」である、すなわち、該オリゴマーが標的遺伝子の発現を阻害する様式に機能的に影響を与えない。それでもなお、それらの「同等な」ヌクレオシド類似体は、例えば製造がより簡易もしくは安価であるか、または保存もしくは製造条件下でより安定であるか、またはタグもしくは標識の導入が可能な場合、有用である。しかしながら、一般に類似体は、例えば標的核酸の標的領域に対する結合親和性を増加させる、そして／または、細胞内ヌクレアーゼに対する耐性を増加させる、および／または、細胞内への輸送をより容易にすることによって、オリゴマーが発現阻害するように機能する様式に機能的影響を与える。
【００４２】
従って、種々の態様では、本発明のオリゴマーは、ヌクレオシドモノマーおよび少なくとも1つのヌクレオシド類似体モノマー（例えばLNAモノマーまたは他のヌクレオシド類似体モノマー）の両方を含有する。
【００４３】
「少なくとも１つの」という用語は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などのように、１または１より大きい整数を含む。例えば本発明の化合物の核酸またはタンパク質標的に関して記載する場合のように、種々の態様では、「少なくとも１つの」という用語は、「少なくとも２つの」および「少なくとも３つの」および「少なくとも４つの」という用語を含み、同様に、「少なくとも２つの」という用語は、「少なくとも３つの」および「少なくとも４つの」という用語を含んでもよい。
【００４４】
種々の態様では、オリゴマーは10-50個のモノマー、好ましくは10-25個のモノマー、より好ましくは10-16個のモノマー、そして更に好ましくは12-16個のモノマーから成る。
【００４５】
種々の態様では、本発明のオリゴマーはRNAモノマーを含有しない。
【００４６】
「領域」という用語は、本発明のオリゴマーに関して使用する場合、該オリゴマー中の多数の連続したモノマーを意味し、該「領域」中のモノマーの数は、オリゴマー中のモノマーの総数より少ない。
【００４７】
好ましくは、本発明のオリゴマーは直鎖分子であるか、または合成時に直鎖である。それらの態様では、オリゴマーは１本鎖分子であり、一般には、同じオリゴマー内の別の領域と相補的であってオリゴマーが分子内２本鎖を形成するような（例えば少なくとも３、４、または５個の連続するモノマーの）短鎖領域を含有しない。種々の態様では、オリゴマーは実質的に２本鎖ではない、すなわち、siRNAではない。
【００４８】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、一続きの連続するモノマーから成り、その配列は本明細書に開示するSEQ ID NO:で識別される（例えば表１−４参照）。他の態様では、オリゴマーは第１の領域を含有し、該領域は一続きの連続するモノマー、および少なくとも１つの更なるモノマーから成る１またはそれ以上の更なる領域から成る。ある態様では、第１の領域の配列は、本明細書に開示するSEQ ID NO:で識別される。
【００４９】
標的核酸
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義に使用し、上記のように２またはそれ以上の共有結合によって形成された分子と定義する。２またはそれ以上のモノマーを含め、「核酸」は任意の長さであってもよく、この用語には、本明細書に記載する長さを有する「オリゴマー」も包含される。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖、２本鎖、部分的２本鎖、および環状の分子を含む。
【００５０】
本明細書で使用する「標的核酸」という用語は、哺乳動物ベータ-カテニンポリペプチド、例えばヒト・ベータ-カテニンタンパク質（例えばアクセッション番号X89579、X89593、X89592、X89591、X89588、X89585、X89584、およびX89578のヒト遺伝子エクソン）、または哺乳動物ベータ-カテニンmRNA（例えばSEQ ID NO:173）をコードする核酸（例えばDNA）をいう。他の哺乳動物ベータ-カテニンmRNAの例として、それらに限定されるわけではないが、アクセッション番号NM＿001098203、NM＿0010987210（ヒト・ベータ-カテニンmRNA）；NM＿007614（マウス・ベータ-カテニンmRNA）；NM＿053357（ラット・ベータ-カテニンmRNA）；NM＿001122762、DQ267491（ウマ・ベータ-カテニンmRNA）；NM＿214367（ブタ・ベータ-カテニンmRNA）；BC119949、BT030683（ウシ・ベータ-カテニンmRNA）が挙げられる。また「標的核酸」には、ベータ-カテニンをコードする核酸または天然に存在するその変異体、および、それらから誘導されるRNA核酸、好ましくはmRNA（例えばmRNA前駆体でもよいが、好ましくは成熟mRNAである）も含まれる。種々の態様では、例えば研究または診断に使用する場合、「標的核酸」は、上記のDNAまたはRNA核酸標的に由来するcDNAまたは合成オリゴヌクレオチドであってもよい。本発明のオリゴマーは、好ましくは標的核酸にハイブリダイズする能力を有する。
【００５１】
「天然に存在するその変異体」という用語は、所定の分類群（例えば哺乳動物、例えばマウス、サル、および好ましくはヒト）中に天然に存在するベータ-カテニンポリペプチドまたは核酸配列の変異体をいう。一般に、ポリヌクレオチドの「天然に存在する変異体」に関して使用する場合、この用語は、染色体転座または重複により染色体Chr 3: 41.22-41.26 Mbに見られるベータ-カテニンをコードするゲノムDNAの対立遺伝子多型およびRNA（例えばそれから誘導されたmRNA）を包含しうる。特定のポリペプチド配列に関して使用する場合、例えば、この用語には天然存在型のタンパク質も包含され、従ってこのタンパク質が、例えば翻訳時または翻訳後修飾（例えばシグナルペプチド切断、タンパク質切断、グリコシル化など）によって加工されてもよい。
【００５２】
本発明のオリゴマーは、オリゴマーのモノマーと標的核酸のモノマーとの間のワトソン-クリック塩基対形成、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合のいずれかによって、標的核酸の領域（「標的領域」）に結合する。特に記載しない限り、結合は相補的塩基のワトソンクリック塩基対形成によるものであり、オリゴマーは、該オリゴマーの配列が標的領域の逆相補的配列と同一であるか、または部分的に同一であるために、標的に結合する；本明細書の目的では、オリゴマーは標的領域に「相補的」または「部分的に相補的」であると称され、オリゴマー配列と標的領域配列の「相補性」のパーセンテージは、標的領域配列の逆相補的配列との「同一性」のパーセンテージである。
【００５３】
文脈において特に明記しない限り、本明細書における「標的領域」は、後述するアラインメントプログラムおよびパラメータを用いて特定のオリゴマー（またはその領域）の逆相補的配列と最適なアラインメントを示す配列を有する、標的の領域である。
【００５４】
本発明のオリゴマー（またはその領域）および哺乳動物ベータ-カテニンをコードする核酸の標的領域（例えば本明細書に開示するもの）間の「相補性」の度合いの測定では、「相補性」の度合い（「相同性」とも称する）は、オリゴマー（またはその領域）の配列およびそれと最適なアラインメントを示す標的領域の逆相補的配列間の同一性パーセンテージとして表される。パーセンテージは、２つの配列間で同一である塩基の数を、オリゴマー中の連続するモノマーの総数で除し、これを100倍して算出される。それらの比較においてギャップが存在する場合、それらのギャップは、ギャップ内のモノマー数が本発明のオリゴマーおよび標的領域間で異なるよりは、単なるミスマッチであるほうが好ましい。
【００５５】
アミノ酸およびポリヌクレオチドのアラインメント、配列同一性パーセンテージ、および相補性の度合いは、本発明の目的では、ClustalWアルゴリズムを用い、標準的な設定で測定してもよい。方法：EMBOSS::water（local）：Gap Open＝10.0、Gap extend＝0.5、Blosum 62（タンパク質）（または、ヌクレオチド／核酸塩基配列の場合はDNAfull）を使用。
【００５６】
理解されるように、文脈によっては、「ミスマッチ」は（例えばオリゴマーの核酸塩基配列およびそれに結合する標的領域の逆相補的配列間の；例えば２つのアラインされたベータ-カテニンをコードする核酸の塩基配列間の）配列の非同一性、または（例えばオリゴマーおよびそれに結合する標的領域間の）配列の非相補性を示す。
【００５７】
状況に応じて、オリゴマー（または更に後述するコンジュゲート）は、ベータ-カテニン遺伝子の発現を（例えば抑制的調節によって）阻害する能力を有する。
【００５８】
種々の態様では、本発明のオリゴマーは、ベータ-カテニンのmRNA発現を標準的な発現レベルに比較して少なくとも10%、標準的な発現レベルに比較して少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%阻害する。種々の態様では、本発明のオリゴマーは、ベータ-カテニンのタンパク質発現を標準的な発現レベルに比較して少なくとも10%、標準的な発現レベルに比較して少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%阻害する。ある態様では、それらの阻害は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを1nMで使用する際に観察される。種々の態様では、それらの阻害はオリゴマーまたはコンジュゲートを25nMで使用する際に観察される。
【００５９】
種々の態様では、mRNA発現の阻害は100%未満であり（すなわち、発現の完全な阻害ではなく）、例えば98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば70％未満の阻害である。種々の態様では、タンパク質発現の阻害は100%未満であり（すなわち、発現の完全な阻害ではなく）、例えば98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば70％未満の阻害である。
【００６０】
発現レベルの調節（すなわち阻害または増加）は、タンパク質レベルの測定によって、例えばSDS-PAGEを行った後に、標的タンパク質に対して産生させた好適な抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことによって測定してもよい。あるいはまた、発現レベルの調節は、mRNAレベルの測定によって、例えばノザンブロッティングまたは定量RT-PCRによって測定することができる。mRNAレベルによって測定する場合、好適な用量（例えば1および25nM）を用いる場合の阻害のレベルは、一般に本発明の化合物の非存在下での標準的なレベルの10-20％までである。
【００６１】
従って本発明は、ベータ-カテニンのタンパク質および／またはmRNAを発現する細胞においてベータ-カテニンのタンパク質および／またはmRNAの発現を（例えば抑制的調節によって）阻害する方法を提供し、該方法は、細胞を、該細胞においてベータ-カテニンのタンパク質および／またはmRNAの発現を（例えば抑制的調節によって）阻害するのに有効な一定量の本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートと接触させることを含む。状況に応じて、細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。接触は、ある態様では、インビトロで行ってもよい。他の態様では、接触は、本発明の化合物またはコンジュゲートを哺乳動物に投与することによって、インビボで行ってもよい。
【００６２】
本発明のオリゴマーは、一般にヒト・ベータ-カテニンmRNAの標的領域に結合し、従って、（例えばSEQ ID NO:173の標的領域の）塩基配列に相補的であるか、または部分的に相補的である塩基配列を有する領域を含有するか、またはそれから成る。本発明のオリゴマーの配列は、最適なアラインメントを行ったSEQ ID NO:173の標的領域の配列と比較して、1、2、3、4、またはそれ以上の塩基ミスマッチを任意に含有してもよい。
【００６３】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、以下の表1に示すSEQ ID NO:1-132から成る群から選択される配列と同一の配列を有する。他の態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:1-132から成る群から選択される配列と比較して、1、2、または3個の塩基が異なっている配列を有する。ある態様では、オリゴマーは10-16個の連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。16個の連続するモノマーから成るオリゴマーの例として、SEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、および118が挙げられる。より短い配列をそれらから誘導することができ、例えばそれらの短鎖オリゴマー（shorter oligomer）の配列は、SEQ ID NO:1-132の領域にも同様に存在していてもよい。長鎖オリゴマー（longer oligomer）は、SEQ ID NO:1-132にも同様に存在する少なくとも10個の連続するモノマーの配列を有する領域を含有してもよい。
【００６４】
【表１】
2014533280.tif 000005
【００６５】
【表２】
2014533280.tif 000006
【００６６】
【表３】
2014533280.tif 000007
【００６７】
【表４】
2014533280.tif 000008
【００６８】
【表５】
2014533280.tif 000009
【００６９】
更に、SEQ ID NO:1-132のオリゴマーの１またはそれ以上に相補的であるか、または部分的に相補的である標的領域を含有する標的核酸（すなわちベータ-カテニンをコードするDNAまたはmRNA）であって、該オリゴマーがベータ-カテニンのタンパク質またはmRNAの発現を（例えば抑制的調節によって）阻害する能力を有する、上記標的核酸を提供する。例えば、SEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、および118の配列を有するアンチセンスオリゴマーに相補的なヒト・ベータ-カテニンmRNAの標的領域を図１に示す（太線および下線；対応するオリゴマーのSEQ ID NOを上部に示す）。
【００７０】
本発明のオリゴマーは、状況に応じて、本発明の短鎖オリゴマーにも同様に存在する特定の配列を有する領域を含有してもよい（例えばSEQ ID NO:174-193から選択されるオリゴマー）。好ましくは、該領域は10-16個のモノマーを含有する。例えば、SEQ ID NO:174-193はそれぞれ、ある領域を含有してもよく、該領域の配列はそれぞれSEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、および118の短鎖オリゴマーにも同様に存在する。ある態様では、16個未満、例えば10、11、12、13、14、または15個のモノマーを有するオリゴマーは、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または15個の連続するモノマーの領域を有し、該領域の配列は、SEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、または118にも同様に存在する。従って、種々の態様では、短鎖オリゴマーは長鎖オリゴマーから誘導される。ある態様では、長鎖オリゴマーは、例示するSEQ ID NOからの、全ての、または少なくとも10個の連続するモノマーを含有する。一般に、本発明のオリゴマーがSEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、または118にも同様に存在する配列を有する第１の領域を含有し、該オリゴマーが第１の領域より長い場合、該オリゴマーの他の領域は、好ましくはSEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、または118にも同様に存在する第１の領域に隣接しており、該オリゴマーの隣接する領域は、標的核酸の標的領域に隣接する配列と相補的な配列を有する。そのような２つのオリゴマーはSEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:103である。
【００７１】
また、本発明のオリゴマーの具体的な設計も開示するが、それらは例えばSEQ ID NO:133-152に示すもの、特にSEQ ID NO:133、l34、135、136、138、141、148、149、150、151、および152である。LNAオリゴヌクレオチドの具体的な設計は、例えばSEQ ID NO:153-172に示すもの、特にSEQ ID NO:153、154、155、156、158、161、168、169、170、171、および172である。好ましい態様では、本発明のオリゴマーはベータ-カテニンのmRNAおよびタンパク質発現の強力な阻害剤である。
【００７２】
種々の態様では、オリゴマーは、哺乳動物ベータ-カテニンをコードする標的核酸の標的領域に全く相補的な（完全に相補的な）モノマー配列を含有するか、またはそれから成る。
【００７３】
しかしながら、ある態様では、オリゴマーの配列は、最適にアラインした標的領域と比較して1、2、3、または4個（またはそれ以上）のミスマッチを含有し、なおかつ、標的領域に十分に結合してベータ-カテニンのmRNAまたはタンパク質発現の阻害効果を有する。ワトソン-クリック水素結合した２本鎖上のミスマッチによる不安定化効果は、例えばオリゴマーの延長および／またはオリゴマー中に存在するヌクレオシド類似体（例えばLNAモノマー）数の増加によって、補填してもよい。
【００７４】
種々の態様では、オリゴマー塩基配列は、最適にアラインされた（例えば哺乳動物ベータ-カテニンをコードする核酸の）標的領域の塩基配列と比較して、3個以下、例えば2個以下のミスマッチを含有する。種々の態様では、オリゴマー塩基配列は、最適にアラインされた（例えば哺乳動物ベータ-カテニンをコードする核酸の）標的領域の塩基配列と比較して、1個以下のミスマッチを含有する。
【００７５】
本発明のオリゴマーの、またはその領域の塩基配列は、SEQ ID NO:1-132から成る群から選択される配列と、好ましくは少なくとも80%の同一性、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91 %、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、更には100%の同一性を有する。
【００７６】
本発明のオリゴマーの、またはその領域の塩基配列は、SEQ ID NO:173中に存在する標的領域の配列と、好ましくは少なくとも80%の相補性、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91 %、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、更には100%の相補性を有する。
【００７７】
種々の態様では、オリゴマー（またはその第１の領域）の配列は、SEQ ID NO:1-132もしくはSEQ ID NO:174-193から成る群から選択されるか、またはSEQ ID NO:1-132もしくはSEQ ID NO:174-193の少なくとも10個の連続するモノマーから成る群から選択される。別の態様では、本発明のオリゴマーまたはその第１の領域の配列は、該選択された配列またはその領域と最適にアラインした場合、SEQ ID NO:1-132もしくはSEQ ID NO:174-193の配列またはその少なくとも10個の連続するモノマーと異なる塩基部分を1、2、または3個、任意に含有する。
【００７８】
ある態様では、モノマー領域は11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29個の連続するモノマー、例えば10-15、12-25、12-22、例えば12-18個のモノマーから成る。状況に応じて、種々の態様では、該領域は本発明のオリゴマーと同じ長さである。
【００７９】
ある態様では、オリゴマーは、5'または3'末端に標的領域の配列と非相補的である更なるモノマーを（例えばオリゴマーの5'末端および／または3'末端に独立して1、2、3、4、または5個の更なるモノマーを）含有する。種々の態様では、本発明のオリゴマーは、5'および／または3'に更なるモノマーが隣接した、標的に相補的な領域を含有する。種々の態様では、領域の3'末端に1、2、または3個のDNAまたはRNAモノマーが隣接している。3'DNAモノマーは、オリゴマーの固相合成の際にしばしば使用される。種々の態様では、オリゴマーの5'末端に1、2、または3個のDNAまたはRNAモノマーが隣接しており、それらは同一であるか、または異なっていてもよい。ある態様では、更なる5'または3'モノマーはヌクレオシド、例えばDNAまたはRNAモノマーである。種々の態様では、更なる5'または3'モノマーは、本明細書においてギャップマーオリゴマーに関して記載する領域Dであってもよい。
【００８０】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:1またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８１】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:16またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８２】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:17またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８３】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:18またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８４】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:33またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８５】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:34またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８６】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:49またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８７】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:50またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８８】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:51またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００８９】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:52またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９０】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:53またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９１】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:54またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９２】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:55またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９３】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:56またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９４】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:57またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９５】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:58またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９６】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:73またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９７】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:88またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９８】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:103またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【００９９】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO:118またはその領域にかかる核酸塩基配列を有する連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【０１００】
配列アラインメントを使用して、ヒトおよび1またはそれ以上の異なる哺乳動物種（例えばサル、マウス、および／またはラット）由来のベータ-カテニンをコードする核酸の領域であって、それらの種間で十分な核酸同一性が見られるものを同定することができ、それによって、ヒト・ベータ-カテニン標的核酸、および異なる哺乳動物種に存在する対応する核酸の両方を標的とする（すなわち、その両方の発現を阻害するのに十分な特異性をもって結合する）オリゴヌクレオチドの設計を行うことが可能となる。
【０１０１】
ある態様では、それらのオリゴマーは、ヒト由来のベータ-カテニンをコードする核酸、および異なる哺乳動物種由来のベータ-カテニンをコードする核酸（単数または複数）の両方の標的領域の配列と100％の相補性を示す、少なくとも10個、例えば少なくとも12個、例えば少なくとも14個、例えば少なくとも16個、例えば少なくとも18個、例えば11、12、13、14、15、16、17、または18個の連続するモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【０１０２】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、ヒト・ベータ-カテニンをコードする核酸、および異なる哺乳動物種由来のベータ-カテニンをコードする核酸（単数または複数）（例えばベータ-カテニンをコードするマウス核酸）の両方の標的領域の配列と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも98%、または100%相補的な配列を有する連続するモノマーの領域を含有するか、またはそれから成る。好ましくは、オリゴマーの連続する核酸塩基配列は、ヒト・ベータ-カテニンmRNAの標的領域と100%の相補性を有する。
【０１０３】
長さ
オリゴマーは、10-50個の連続するモノマー、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の連続するモノマーを含有するか、またはそれらから成る。
【０１０４】
種々の態様では、オリゴマーは10-25個の連続するモノマー、例えば12-25または10-22個の連続するモノマー、例えば12-18個の連続するモノマー、例えば13-17または12-16個の連続するモノマー、例えば13、14、15、16個の連続するモノマーを含有するか、またはそれらから成る。
【０１０５】
種々の態様では、オリゴマーは10、11、12、13、または14個の連続するモノマーを含有するか、またはそれらから成る。
【０１０６】
種々の態様では、本発明にかかるオリゴマーは、22個以下の連続するモノマー、例えば20個以下の連続するモノマー、例えば18個以下の連続するモノマー、例えば15、16、または17個の連続するモノマーから成る。ある態様では、本発明のオリゴマーは、20個未満の連続するモノマーを含有する。
【０１０７】
ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体
種々の態様では、オリゴマー中に存在するモノマーの少なくとも1つは、修飾された塩基、例えば5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリン、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンから成る群から選択される塩基を含有するヌクレオシド類似体である。
【０１０８】
種々の態様では、オリゴマー中に存在するモノマーの少なくとも1つは、修飾された糖を含有するヌクレオシド類似体である。
【０１０９】
ある態様では、オリゴマーの少なくとも２つの連続するモノマー間の結合は、ホスホジエステル結合以外の結合である。
【０１１０】
ある態様では、オリゴマーは、修飾された塩基を有するモノマーを少なくとも１つ、修飾された糖を有するモノマーを少なくとも１つ（同じモノマーであってもよい）、および天然に存在しないモノマー間結合を少なくとも１つ含有する。
【０１１１】
本明細書に記載するオリゴマーに有用なヌクレオシド類似体の具体的な例は、例えばFreier & Altmann; Nuc1. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、そしてスキーム１（いくつかのヌクレオシド類似体をヌクレオチドとして示している）に記載されている。
【０１１２】
スキーム１
従って、オリゴマーは、ヌクレオシドの単純な配列（好ましくはDNAモノマーであるが、RNAモノマーであってもよい）、またはヌクレオシドおよび1もしくはそれ以上のヌクレオシド類似体の組み合わせを含有するか、またはそれから成ってもよい。ある態様では、それらのヌクレオシド類似体は、標的核酸の標的領域に対するオリゴマーの親和性を好適に向上する。
【０１１３】
好適かつ好ましいヌクレオシド類似体の例は、WO2007/031091（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはその参考文献に報告されている。
【０１１４】
ある態様では、ヌクレオシド類似体は、2'置換基を施与するように修飾された糖部分（例えば2'-O-アルキル-リボース糖、2'-アミノ-デオキシリボース糖、および2'-フルオロ-デオキシリボース糖）を含有する。
【０１１５】
ある態様では、ヌクレオシド類似体は、２環式糖（LNA）を成す架橋化構造が存在する糖を含有し、これによって結合親和性が向上され、また、ヌクレアーゼ耐性も向上されうる。種々の態様では、LNAモノマーはオキシ-LNA（例えばβ-D-オキシ-LNAおよびα-L-オキシ-LNA）、および／またはアミノ-LNA（例えばβ-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNA）、および／またはチオ-LNA（例えばβ-D-チオ-LNAおよびα-L-チオ-LNA）、および／またはENA（例えばβ-D-ENAおよびα-L-ENA）から選択される。ある態様では、LNAモノマーはβ-D-オキシ-LNAである。LNAモノマーについては以下に更に記載する。
【０１１６】
オリゴマー中に親和性を向上するヌクレオシド類似体（例えばLNAモノマーまたは2'-置換型糖を含有するモノマー）を導入することにより、オリゴマーのサイズを低減することが可能となり、また、非特異的または異常な結合が起こる前に、オリゴマーのサイズの上限を低減することも可能となりうる。
【０１１７】
ある態様では、オリゴマーは少なくとも2個のヌクレオシド類似体を含有する。ある態様では、オリゴマーは3-8個のヌクレオシド類似体、例えば6または7個のヌクレオシド類似体を含有する。好ましい態様では、少なくとも1個のヌクレオシド類似体はロックト核酸（LNA）モノマーである；例えば少なくとも3個もしくは少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または8個のヌクレオシド類似体がLNAモノマーである。ある態様では、全てのヌクレオシド類似体がLNAモノマーである。
【０１１８】
認識されるように、好ましいオリゴマー塩基配列に関して記載する場合、ある態様では、オリゴマーは、対応するヌクレオシド類似体で、例えば対応するLNAモノマーまたは他の対応するヌクレオシド類似体で、オリゴマー／標的領域２本鎖の安定性（Tm）を向上するもの（すなわち親和性向上ヌクレオシド類似体）を含有する。
【０１１９】
種々の好ましい態様では、オリゴマーの塩基配列および標的領域の塩基配列間のミスマッチ（すなわち非相補性）が存在する場合、それらは親和性向上ヌクレオシド類似体を含有するオリゴマー領域（例えば領域AまたはC）以外の場所、例えば後述の領域B内、および／または後述の領域D内、および／またはヌクレオシドのみを含有するオリゴマー領域内、および／または標的領域に相補的なオリゴマー領域に対して5'もしくは3'側に存在する領域内に位置する。
【０１２０】
ある態様では、本発明のオリゴマー中に（例えば本明細書に記載する領域AおよびC中に）存在するヌクレオシド類似体は、例えば以下から独立して選択される：2'-O-アルキル-リボース糖を含有するモノマー、2'-アミノデオキシリボース糖を含有するモノマー、2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含有するモノマー、LNAモノマー、アラビノース糖を含有するモノマー（「ANAモノマー」）、2'-フルオロ−ANA糖を含有するモノマー、d-アラビノ-ヘキシトール糖を含有するモノマー（「HNAモノマー」）、Christensen, Nucl. Acids. Res. 30: 4918-4925 (2002)（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるインターカレート（intercalating）モノマー、および2'MOE糖を含有するモノマー。ある態様では、上記のタイプのヌクレオシド類似体のうちの1つだけが、本発明のオリゴマーまたはその領域中に存在する。
【０１２１】
ある態様では、ヌクレオシド類似体は2'-O-メトキシエチルリボース糖（2'MOE）または2'-フルオロ-デオキシリボース糖またはLNA糖を含有し、従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、これら3つのタイプの類似体から独立して選択されるヌクレオシド類似体を含有するか、または3つのタイプから選択される1つのタイプの類似体のみを含有してもよい。ヌクレオシド類似体を含有するオリゴマーのある態様では、ヌクレオシド類似体の少なくとも1つが2'-MOEリボース糖を含有し、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のヌクレオシド類似体が2'-MOEリボース糖を含有する。ある態様では、ヌクレオシド類似体の少なくとも１つは2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含有し、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のヌクレオシド類似体が2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含有する。
【０１２２】
種々の態様では、本発明のオリゴマーは、少なくとも1個のロックト核酸（LNA）モノマー、例えば1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個のLNAモノマー、例えば3-7個もしくは4-8個のLNAモノマー、または3、4、5、6、もしくは7個のLNAモノマーを含有する。種々の態様では、全てのヌクレオシド類似体がLNAモノマーである。ある態様では、オリゴマーはβ-D-オキシ-LNAモノマーおよび1またはそれ以上の以下のLNAユニットの両方を含有する：チオ-LNAモノマー、アミノ-LNAモノマー、オキシ-LNAモノマー、および／またはENAモノマーであって、立体配置がβ-Dもしくはα-Lであるか、またはそれらを組み合わせたものであるモノマー。ある態様では、オリゴマー中の全てのLNAモノマーのシトシン塩基部分が5-メチルシトシンである。本発明のある態様では、オリゴマーはLNAおよびDNAモノマーの両方を含有する。一般的に、LNAおよびDNAモノマーの合計数は10-25、好ましくは10-20、更に好ましくは12-16である。本発明のある態様では、オリゴマーまたはその領域は少なくとも1個のLNAモノマーから成り、それ以外のモノマーはDNAモノマーである。ある態様では、オリゴマーはLNAモノマーおよびヌクレオシド（例えばRNAまたはDNAモノマー、最も好ましくはDNAモノマー）のみを含有し、それらは任意に修飾型結合基（例えばホスホロチオエート）で結合されていてもよい。
【０１２３】
種々の態様では、オリゴマー中に存在するヌクレオシド類似体の少なくとも１つは、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンから成る群から選択される修飾型塩基を有する。
【０１２４】
LNA
「LNAモノマー」という用語は、二環式糖（「LNA糖」）を含有するヌクレオシド類似体をいう。「LNAオリゴヌクレオチド」および「LNAオリゴマー」という用語は、１またはそれ以上のLNAモノマーを含有するオリゴマーをいう。
【０１２５】
本発明のオリゴマーに使用するLNAモノマーは、好ましくは一般式I：
【０１２６】
【化４】
2014533280.tif 000010
式中、Xは-0-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され；
【０１２７】
Bは水素、任意に置換されていてもよいC1-4アルコキシ、任意に置換されていてもよいC1-4アルキル、任意に置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、核酸塩基、DNAインターカレータ、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基（chelating groups）、レポーター基、およびリガンドから選択され；
【０１２８】
Pは、それに続くモノマーとのヌクレオシド間結合または5'末端基のためのラジカル位置を表し、それらのヌクレオシド間結合または5'末端基は任意に置換基R5または同等に適用可能な置換基R5*を含有してもよく；
【０１２９】
P*は、前に位置するモノマーへのヌクレオシド間結合または3'末端基を表し；
【０１３０】
R4*およびR2*は合わさって、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N、O、-Si(Ra)2-、S-、-So2-、-N(Ra)-、および>C=Zから選択される1-4個の基／原子からなるビラジカルを表し、式中、Zは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、RaおよびRbはそれぞれ独立して水素、任意に置換されていてもよいC1-12アルキル、任意に置換されていてもよいC2-12アルケニル、任意に置換されていてもよいC2-12アルキニル、ヒドロキシ、C1-12アルコキシ、C2-12アルコキシアルキル、C2-12アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12アルコキシカルボニル、C1-12アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)-アミノカルボニル、アミノ-C1-6アルキルアミノカルボニル、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキルアミノカルボニル、C1-6アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Cl-6アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレータ、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、そして、２つのジェミナルな置換基であるRaおよびRbは合わさって、任意に置換されていてもよいメチレン（=CH2）を表し、存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6、およびR6*はそれぞれ独立して水素、任意に置換されていてもよいCl-12アルキル、任意に置換されていてもよいC2-12アルケニル、任意に置換されていてもよいC2-12アルキニル、ヒドロキシ、C1-12アルコキシ、C2-12アルコキシアルキル、C2-12アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12アルコキシカルボニル、C1-12アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ-(Cl-6アルキル)-アミノカルボニル、アミノ-C1-6アルキルアミノカルボニル、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキルアミノカルボニル、C1-6アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Cl-6アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレータ、光学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、そして、２つのジェミナルな置換基は合わさって、オキソ、チオキソ、イミノ、もしくは任意に置換されていてもよいメチレンを表すか、または合わさって、O、S、および-(NRN)-から選択される1またはそれ以上のヘテロ原子／基によって任意に遮断および／または終結されてもよいC1-5アルキレン鎖から成るスピロビラジカルを成してもよく、式中、RNは水素およびCl-4アルキルから選択され、２つの隣接する（ジェミナルでない）置換基は二重結合を生じる更���る結合を表してもよく；そして、RN*は（存在するがビラジカルに関与しない場合）水素およびC1-4アルキルから選択される；
並びにその塩基性塩および酸付加塩；
の構造を有する。
【０１３１】
ある態様では、R5*はH、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3、およびCH=CH2から選択される。
【０１３２】
種々の態様では、R4*およびR2*は合わさって、C(RaRb)-O、-C(RaRb)-C(RcRd)-O、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、C(RaRb)-O-C(RcRd)-O、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-1、-C(Ra)=C(Rb)C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O、および-C(RaRb)-S、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-から選択されるビラジカルを表し、ここでRa、Rb、Rc、Rd、Re、およびRfはそれぞれ独立して水素、任意に置換されていてもよいC1-12アルキル、任意に置換されていてもよいC2-12アルケニル、任意に置換されていてもよいC2-12アルキニル、ヒドロキシ、Cl-12アルコキシ、C2-12アルコキシアルキル、C2-12アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12アルコキシカルボニル、C1-12アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)-アミノカルボニル、アミノ-C1-6アルキルアミノカルボニル、モノ-およびジ-(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキルアミノカルボニル、C1-6アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Cl-6アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレータ、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、そして、２つのジェミナルな置換基であるRaおよびRbは合わさって、任意に置換されていてもよいメチレン（=CH2）を表してもよい。
【０１３３】
更なる態様では、R4*およびR2*は合わさって、CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-0-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、CH(CH2-O-CH3)-O-から選択されるビラジカルを表す。
【０１３４】
全てのキラル中心について、不斉置換基はRまたはS配置のいずれであってもよい。
【０１３５】
好ましくは、本発明のオリゴマーに使用されるLNAモノマーは、式：
【０１３６】
【化５】
2014533280.tif 000011
のいずれかのLNAモノマーを少なくとも1個含有し、
【０１３７】
式中、Yは-O-、-O-CH2-、-S-、-NH-、またはN(RH)であり；ZおよびZ*は独立してヌクレオシド間結合、末端基、または保護基から選択され；Bは核酸中に天然に存在するか、または核酸中に天然に存在しない、修飾されていない塩基部分または修飾された塩基部分であり、そして、RHは水素およびC1-4アルキルから選択される。
【０１３８】
特に好ましいLNAモノマーをスキーム2に示す：
【０１３９】
【化６】
2014533280.tif 000012
【０１４０】
スキーム２
「チオ-LNA」という用語は、上記の一般式中のYがSまたは-CH2-S-から選択されるLNAモノマーである。チオ-LNAは、β-Dまたはα-L配置のいずれであることもできる。
【０１４１】
「アミノ-LNA」という用語は、上記の一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、および-CH2-N(R)-から選択され、Rが水素およびC1-4アルキルから選択されるLNAモノマーである。アミノ-LNAは、β-Dまたはα-L配置のいずれであることもできる。
【０１４２】
「オキシ-LNA」という用語は、上記の一般式中のYが-O-または-CH2-O-であるLNAモノマーである。オキシ-LNAは、β-Dまたはα-L配置のいずれであることもできる。
【０１４３】
「ENA」という用語は、上記の一般式中のYが-CH2-O-（-CH2-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'-位に結合している）であるLNAモノマーをいう。
【０１４４】
好ましい態様では、LNAモノマーは、β-D-オキシ-LNAモノマー、α-L-オキシ-LNAモノマー、β-D-アミノ-LNAモノマー、およびβ-D-チオ-LNAモノマー、特にβ-D-オキシLNAモノマーから選択される。
【０１４５】
本明細書において、「C1-4アルキル」という用語は、1から4個の炭素原子を有する直鎖型または分枝型の飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、およびtert-ブチルを意味する。
【０１４６】
RNase Hの動員
認識されるように、オリゴマーは、標的mRNAのRNase非依存的分解、例えば翻訳の立体障害、または他の機序を介して機能してもよい；しかしながら、好ましい本発明のオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（RNase）（例えばRNase H）を動員する能力を有する。
【０１４７】
一般に、オリゴマーは、標的RNAの標的領域と２本鎖を形成した時にRNaseを動員する能力を有する、少なくとも6個、例えば少なくとも7個の連続するモノマー、例えば少なくとも8個または少なくとも9個の連続するモノマー（7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個の連続するモノマーなど）の領域を含有する。RNaseの動員が可能なオリゴマーの領域は、以下でギャップマーに関して記載する、領域Bであってもよい。ある態様では、RNase動員可能オリゴマーの領域（例えば領域B）は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のモノマーから成る。
【０１４８】
欧州特許第1222309号はインビトロにおけるRNase H活性の測定法について記載しており、これを用いて、本発明のオリゴマーのRNase Hを動員する能力を測定してもよい。オリゴマーは、RNA標的の相補的な標的領域と接触させた場合に、欧州特許第1222309号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例91-95に記載される方法を用いて測定した初速度（pmol/l/分）が、同じ塩基配列を有するがDNAモノマーしか含有せず、2'置換を有さず、全てのモノマー間にホスホロチオエート結合基を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも1%、例えば少なくとも5%、例えば少なくとも10%または20%未満である場合に、RNase Hを動員する能力を有すると見なされる。
【０１４９】
種々の態様では、オリゴマーは、RNA標的の相補的な標的領域およびRNase Hと接触させた場合に、欧州特許第1222309号の実施例91-95に記載される方法を用いて測定したRNaseHの初速度（pmol/l/分）が、同じ塩基配列を有するがDNAモノマーしか含有せず、2'置換を有さず、全てのモノマー間にホスホロチオエート結合基を有するオリゴヌクレオチドを用いて測定した初速度の1％未満、例えば5%未満、例えば10%未満または20%未満である場合に、本質的にRNase Hを動員する能力を有さないと見なされる。
【０１５０】
他の態様では、オリゴマーは、RNA標的の相補的な標的領域およびRNase Hと接触させた場合に、欧州特許第1222309号の実施例91-95に記載される方法を用いて測定したRNaseHの初速度（pmol/l/分）が、同じ塩基配列を有するがDNAモノマーしか含有せず、2'置換を有さず、全てのモノマー間にホスホロチオエート結合基を有するオリゴヌクレオチドを用いて測定した初速度の少なくとも20%、例えば少なくとも40%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも80%である場合に、RNase Hを動員する能力を有すると見なされる。
【０１５１】
一般に、標的RNAの相補的な標的領域と２本鎖を形成してRNaseを動員する能力を有するオリゴマーの領域は、DNAモノマーおよびLNAモノマーを含有してもよく、標的領域とDNA/RNAの様な２本鎖を形成してもよい。好ましくはLNAモノマーはα-L配置であり、特にα-L-オキシLNAであるのが好ましい。
【０１５２】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の両方を含有してもよく、ギャップマー、ヘッドマー（headmer）、ミクスマー（mixmer）の形態であってもよい。
【０１５３】
「ヘッドマー」は、第１の領域およびそれに続く第２の領域を含有するオリゴマーであって、第２の領域の5'最末端モノマーが第１の領域の3'最末端モノマーに結合している、上記オリゴマーと定義される。第１の領域は一続きの連続する非RNase動員ヌクレオシド類似体を含有し、第2の領域はRNaseによる認識および開裂が可能な一続きの連続する（例えば少なくとも7個の連続する）DNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーを含有する。
【０１５４】
「テイルマー」は、第１の領域およびそれに続く第２の領域を含有するオリゴマーであって、第2の領域の5'最末端モノマーが第１の領域の3'最末端モノマーに結合している、上記オリゴマーと定義される。第１の領域はRNaseによる認識および開裂が可能な一続きの連続する（例えば少なくとも7個の連続する）DNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーを含有し、第2の領域は一続きの連続する非RNase動員ヌクレオシド類似体モノマーを含有する。
【０１５５】
他の「キメラ」オリゴマーは「ミクスマー」と称され、（i）RNaseによる認識および開裂が可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマー、および（ii）非RNase動員ヌクレオシド類似体モノマーを交互に配した組成から成る。
【０１５６】
ある態様では、標的領域に対するオリゴマーの親和性の向上に加え、いくつかのヌクレオシド類似体は、RNase（例えばRNase H）の結合および開裂にも介在する。α-L-LNA-モノマーはRNase活性をある程度まで動員するので、ある態様では、α-L-LNAモノマーを含有するオリゴマーのギャップ領域（例えば本明細書で後述する領域B）は、より少ない数のRNaseによる認識および開裂が可能なモノマーから成り、そして、ミクスマー構築物のフレキシビリティーはより高くなっている。
【０１５７】
ギャップマーの設計
好ましくは、本発明のオリゴマーはギャップマーである。
【０１５８】
「ギャップマー」は、一続きの連続するRNase（例えばRNase H）動員可能モノマー（例えば少なくとも6個または7個のDNAモノマーの領域）（本明細書では領域Bと称する）を含有するオリゴマーであり、ここで領域Bは、その5'および3'末端の両方に、それぞれ領域AおよびCと称される領域が隣接しており、領域AおよびCはそれぞれ、ヌクレオシド類似体、例えば親和性向上ヌクレオシド類似体、例えば1-6個のヌクレオシド類似体を含有するか、またはそれらから成る。
【０１５９】
好ましくは、ギャップマーは5'から3'へ、A-B-C、または任意にA-B-C-DもしくはD-A-B-Cである領域を含有し、ここで領域Aは少なくとも1個のヌクレオシド類似体、例えば少なくとも1個のLNAモノマー、例えば1-6個のヌクレオシド類似体、例えばLNAモノマーから成るか、またはそれらを含有し；そして、領域Bは少なくとも5個の連続する（標的RNA分子、例えばmRNA標的の相補的な標的領域と２本鎖を形成した時に）RNaseを動員する能力を有するモノマー（例えばDNAモノマー）から成るか、またはそれらを含有し；そして、領域Cは少なくとも１個のヌクレオシド類似体、例えば少なくとも１個のLNAモノマー、例えば１-６個のヌクレオシド類似体、例えばLNAモノマーから成るか、またはそれらを含有し；そして、領域Dは、存在する場合、1、2、または3個のモノマー、例えばDNAモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【０１６０】
種々の態様では、領域Aは1、2、3、4、5、または6個のヌクレオシド類似体、例えばLNAモノマー、例えば2-5個のヌクレオシド類似体、例えば2-5個のLNAモノマー、例えば3または4個のヌクレオシド類似体、例えば3または4個のLNAモノマーから成り；そして／または、領域Cは1、2、3、4、5、または6個のヌクレオシド類似体、例えばLNAモノマー、例えば2-5個のヌクレオシド類似体、例えば2-5個のLNAモノマー、例えば3または4個のヌクレオシド類似体、例えば3または4個のLNAモノマーから成る。
【０１６１】
ある態様では、領域Bは5、6、7、8、9、10、11、または12個の連続するRNase動員可能モノマー、または6-10個、または7-9個、例えば8個の連続するRNase動員可能モノマーから成るか、またはそれらを含有する。ある態様では、領域Bは少なくとも1個のDNAモノマー、例えば1-12個のDNAモノマー、好ましくは4-12個のDNAモノマー、より好ましくは6-10個のDNAモノマー、例えば7-10個のDNAモノマー、最も好ましくは8、9、または10個のDNAモノマーから成るか、またはそれらを含有する。
【０１６２】
ある態様では、領域Aは3または4個のヌクレオシド類似体、例えばLNAモノマーからなり、領域Bは7、8、9、または10個のDNAモノマーから成り、そして領域Cは3または4個のヌクレオシド類似体、例えばLNAモノマーから成る。それらの設計は(A-B-C) 3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3を含有し、1または2個のモノマー、例えばDNAモノマーを含有してもよい領域Dを更に含有してもよい。
【０１６３】
ギャップマーの更なる設計は、WO 2004/046160（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１６４】
米国特許仮出願第60/977,409号（参照により本明細書に組み込まれる）は「ショートマー」ギャップマーオリゴマーについて記載しており、それらは、ある態様では、本発明のギャップマーオリゴマーであってもよい。
【０１６５】
ある態様では、オリゴマーは10、11、12、13、または14個の連続するモノマーから成り、ここでオリゴマーの領域はパターン(5'-3')、A-B-C、または任意にA-B-C-DもしくはD-A-B-Cを有し、ここで；領域Aは1、2、または3個のヌクレオシド類似体モノマー、例えばLNAモノマーから成り；領域Bは、7、8、または9個の連続する、相補的なRNA分子（例えばmRNA標的）と２本鎖を形成した時にRNaseを動員する能力を有するモノマーから成り；そして、領域Cは1、2、または3個のヌクレオシド類似体モノマー、例えばLNAモノマーから成る。領域Dは、存在する場合、１個のDNAモノマーから成る。
【０１６６】
ある態様では、領域Aは１個のLNAモノマーから成る。ある態様では、領域Aは2個のLNAモノマーから成る。ある態様では、領域Aは3個のLNAモノマーから成る。ある態様では、領域Cは１個のLNAモノマーから成る。ある態様では、領域Cは2個のLNAモノマーから成る。ある態様では、領域Cは3個のLNAモノマーから成る。ある態様では、領域Bは7個のヌクレオシドモノマーから成る。ある態様では、領域Bは8個のヌクレオシドモノマーから成る。ある態様では、領域Bは9個のヌクレオシドモノマーから成る。ある態様では、領域Bは1-9個のDNAモノマー、例えば2、3、4、5、6、7、または8個のDNAモノマーを含有する。ある態様では、領域BはDNAモノマーから成る。ある態様では、領域Bは少なくとも1個のα-L-配置であるLNAモノマー、例えば2、3、4、5、6、7、8、または9個のα-L-配置であるLNAモノマーを含有する。ある態様では、領域Bは少なくとも1個のα-L-オキシLNAモノマーを含有するか、または、全てのα-L配置のLNAモノマーがα-L-オキシLNAモノマーである。ある態様では、オリゴマーのA-B-C領域中に存在するモノマーの数は、（ヌクレオチド類似体モノマー-領域B-ヌクレオシド類似体モノマー）：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4または；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4または；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、および3-10-1から成る群から選択される。ある態様では、本発明のオリゴマーのA-B-C領域中に存在するモノマーの数は、2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群から選択される。ある態様では、領域AおよびCはそれぞれ2個のLNAモノマーから成り、領域Bは8または9個のヌクレオシドモノマー、好ましくはDNAモノマーから成る。
【０１６７】
他のギャップマー設計には、領域Aおよび／またはCが3、4、5、または6個のヌクレオシド類似体、例えば2'-O-メトキシエチル-リボース糖（2'MOE）を含有するモノマーおよび2'-フルオロ-デオキシリボース糖から成り、領域Bが8、9、10、11、または12個のヌクレオシド、例えばDNAモノマーから成り、そして、領域A-B-Cが5-10-5または4-12-4個のモノマーを有するものが挙げられる。更なるギャップマーの設計は、WO 2007/146511A2（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１６８】
結合基
本発明のオリゴマーのモノマーは、結合基を介して互いに連結されている。状況に応じて、各モノマーは3'側に隣接するモノマーに結合基を介して結合している。
【０１６９】
「結合基」または「ヌクレオシド間結合」という用語は、2個の連続するモノマーを共有結合させる能力を有する基を意味する。具体的かつ好ましい例として、リン酸基（隣接するヌクレオシドモノマー間にホスホジエステル結合を形成する）およびホスホロチオエート基（隣接するヌクレオシドモノマー間にホスホチオエステルを形成する）が挙げられる。
【０１７０】
好適な結合基として、WO 2007/031091（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、例えばWO 2007/031091、34ページの第１段落に記載される結合基が挙げられる。
【０１７１】
種々の態様では、結合基は、その標準的なホスホジエステルから、ヌクレアーゼによる攻撃に対してより耐性が高いもの、例えばホスホロチオエートまたはボラノホスフェート（これら２つは、RNase Hによる開裂が可能であり、それによって標的遺伝子の発現のRNase介在型アンチセンス阻害が可能となる）に改変するのが好ましい。
【０１７２】
本明細書に記載する硫黄（S）含有結合基は好ましい。ホスホロチオエート結合基も（特にギャップマーのギャップ領域（B）に）好ましい。また、ホスホロチオエート結合を隣接する領域に（必要に応じて、AおよびC、AもしくはCからDへの結合、そして、領域D内に）使用してもよい。
【０１７３】
しかしながら、領域A、B、およびCは、特に、例えばヌクレオシド類似体の使用によって領域AおよびC内の結合基をエンドヌクレアーゼ分解から保護する場合（例えば領域AおよびCがLNAモノマーを含有する場合）、ホスホロチオエート以外の結合基、例えばホスホジエステル結合を含有してもよい。
【０１７４】
オリゴマーの結合基は、RNase Hによる標的RNAの開裂が起こるように、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはボラノホスフェートであってもよい。改善されたヌクレアーゼ耐性および他の理由（例えば製造の簡易性）から、ホスホロチオエートは好ましい。
【０１７５】
種々の態様では、オリゴマーの隣接するモノマーは、ホスホロチオエート基によって互いに結合している。
【０１７６】
認識されるように、（一般に領域Aおよび／またはCにおいて）ホスホロチオエート・バックボーンを有する（特に、ヌクレオシド類似体モノマー間またはヌクレオシド類似体モノマーに隣接する位置にホスホロチオエート結合基を有する）オリゴマーにホスホジエステル結合（例えば1または2個の結合）を包含させることにより、オリゴマーの生物学的利用能および／または生物学的分布を改変することができる（WO 2008/053314（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
【０１７７】
ある態様では（例えば上記の態様で、適宜であって具体的に記載していない場合は）、全ての残りの結合基は、ホスホジエステルもしくはホスホロチオエートのいずれか、またはそれらの混合である。
【０１７８】
ある態様では、全てのヌクレオシド間結合基はホスホロチオエートである。
【０１７９】
例えば本明細書に記載する特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に関して記載する場合、理解されるように、種々の態様において、結合がホスホロチオエート結合である場合、特にヌクレオシド類似体（例えばLNAモノマー）間の結合には、それに代わる結合（例えば本明細書に開示するもの）を使用してもよく、例えばリン酸（ホスホジエステル）結合を使用してもよい。同様に、例えば本明細書に記載する特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に関して記載する場合、1またはそれ以上のシトシン塩基が5-メチルシトシンであると記載する場合は、オリゴマー中の他のシトシン塩基は未修飾であってもよい。
【０１８０】
オリゴマー
ある態様では、本発明のオリゴマーは、表２に示すSEQ ID NO:133-152から成る群から選択される。
【０１８１】
表２において、大文字はヌクレオシド類似体モノマーを表し、下付の「s」はホスホロチオエート結合を表す。小文字はヌクレオシド（DNA）モノマーを表す。「s」が無い場合は、ホスホジエステル結合を示す。
【０１８２】
【表６】
2014533280.tif 000013
【０１８３】
コンジュゲート
本開示において、「コンジュゲート」という用語は、本明細書に記載するオリゴマーが、それ自体は核酸またはモノマーではない１またはそれ以上の部分（「コンジュゲート部分」）に共有結合することによって形成された化合物（「コンジュゲート」）を示す。そのようなコンジュゲート部分の例として、高分子化合物、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらを組み合わせたものが挙げられる。一般に、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であってもよい。一般的なポリマーは、ポリエチレングリコールであってもよい。WO 2007/031091には好適な部分およびコンジュゲートが記載されている（それらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８４】
従って、本発明は、本明細書に記載するオリゴマー、および該オリゴマーに共有結合した、核酸またはモノマーではない少なくとも１つのコンジュゲート部分を含有するコンジュゲートを提供する。従って、ある態様では、本発明のオリゴマーが本明細書に開示する特定の塩基配列を有する連続するモノマーから成る場合、コンジュゲートは、該オリゴマーに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含有してもよい。
【０１８５】
ある態様では、オリゴマーはオリゴマー化合物の細胞への取り込みを向上する部分にコンジュゲートしていてもよい。
【０１８６】
コンジュゲートによって、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布、または細胞取り込みが向上されてもよい。それらの部分として、限定されるわけではないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミトイル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分が挙げられる。
【０１８７】
本発明のオリゴマーは、活性原薬、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、または抗生物質にコンジュゲートしていてもよい。
【０１８８】
ある態様では、コンジュゲート部分はステロール、例えばコレステロールである。
【０１８９】
種々の態様では、コンジュゲート部分は、正電荷を有するポリマー、例えば1-50、例えば2-20、例えば3-10アミノ酸長の、正電荷を有するペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコールを含有するか、またはそれらから成る（WO 2008/034123（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。状況に応じて、正電荷を有するポリマー、例えばポリアルキレンオキシドが、WO 2008/034123に記載される遊離可能なリンカー（releasable inker）を介して本発明のオリゴマーに結合していてもよい。
【０１９０】
活性型オリゴマー
本明細書で使用する「活性型オリゴマー」という用語は、1またはそれ以上のコンジュゲート部分（すなわちそれ自体が核酸またはモノマーでない部分）へのオリゴマーの共有結合を可能とする、少なくとも１つの官能性部分に共有結合して（すなわち官能化して）本明細書に記載するコンジュゲートを形成した本発明のオリゴマーをいう。一般に、官能性部分は、（例えば3'-ヒドロキシ基またはアデニン塩基の環外NH2基を介して）オリゴマーに共有結合できる化学基、ある態様では親水性であるスペーサ、およびコンジュゲート部分に結合できる末端基（例えばアミノ基、スルフヒドリル基、またはヒドロキシル基）を含有する。ある態様では、末端基は保護されておらず、例えばNH2基である。他の態様では、末端基は、例えば任意の好適な保護基（例えば“Protective Groups in Organic Synthesis”, Theodora W GreeneおよびPeter G M Wut, 第3版(John Wiley& Sons、1999)に記載されるもの）で保護されている。好適なヒドロキシル保護基の例として、エステル、例えば酢酸エステル、アラルキル基、例えばベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチル、およびテトラヒドロピラニル（tetrahydropyrallYl）が挙げられる。好適なアミノ保護基の例として、ベンジル、α-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えばトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルが挙げられる。
【０１９１】
ある態様では、官能性部分は自己開裂する。他の態様では、官能性部分は生分解性である。例えば米国特許第7,087,229号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照。
【０１９２】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、オリゴマーの5'末端へのコンジュゲート部分の共有結合が可能となるように、5'末端が官能化されている。他の態様では、本発明のオリゴマーは、3'末端を官能化することができる。更なる態様では、本発明のオリゴマーは、バックボーンに沿って、または複素環塩基部分を官能化することができる。更に別の態様では、本発明のオリゴマーは、5'末端、3'末端、バックボーン、および塩基から独立して選択される1つより多い位置を官能化することができる。
【０１９３】
ある態様では、本発明の活性型オリゴマーは、合成の際に官能性部分に共有結合した1またはそれ以上のモノマーを導入することによって合成される。他の態様では、本発明の活性型オリゴマーを官能化されていないモノマーで合成し、合成が完了した時点でオリゴマーを官能化する。
【０１９４】
ある態様では、オリゴマーの官能化は、アミノアルキル・リンカーを含有するヒンダードエステルを用いて行われ、ここで、アルキル部分は式(CH2)wであり、式中、wは1から10の範囲の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であることができ、官能基はエステル基（-O-C(O)-(CH2)wNH）を介してオリゴマーに結合している。
【０１９５】
他の態様では、オリゴマーの官能化は、(CH2)w-スルフヒドリル（SH）リンカーを含有するヒンダードエステルを用いて行われ、ここで、wは1から10の範囲の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であることができ、官能基はエステル基（-O-C(O)-(CH2)wSH）を介してオリゴマーに結合している。ある態様では、スルフヒドリルで活性化されたオリゴヌクレオチドを、ポリマー部分（例えばポリエチレングリコール）またはペプチドと（ジスルフィド結合の形成を介して）コンジュゲートさせる。
【０１９６】
少なくとも1つの官能性部分に共有結合した活性型オリゴマーは、任意の当該分野で公知の方法、特に、米国特許公開第2004/0235773号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Zhaoら（(2007) J. Controlled Release 119: 143-152）、およびZhaoら（(2005) Bioconjugate Chem. 16:758-766）に開示される方法によって合成してもよい。
【０１９７】
更に他の態様では、本発明のオリゴマーの官能化は、実質的に米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載される官能化試薬（すなわち、一方の末端にホスホルアミダイトを有し、これが、保護された、または保護されていないスルフヒドリル、アミノ、またはヒドロキシル基を含有する他方の末端に親水性スペーサ基を介して結合した、実質的に直鎖の試薬）を用いてスルフヒドリル、アミノ、またはヒドロキシル基をオリゴマーに導入することによって行われる。それらの試薬は、主としてオリゴマーのヒドロキシル基と反応する。ある態様では、それらの活性型オリゴマーは、オリゴマーの5'-ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。他の態様では、活性型オリゴマーは、3'-ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。別の態様では、本発明の活性型オリゴマーは、オリゴマーのバックボーン上のヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。更に別の態様では、本発明のオリゴマーの官能化は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される1より多くの官能化試薬を用いて行われる。それらの官能化試薬の合成法およびモノマーまたはオリゴマーへの導入法は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に開示されている。
【０１９８】
ある態様では、固相に結合したオリゴマーの5'-末端をジエニルホスホルアミダイト誘導体で官能化した後、例えばディールズ-アルダー環化付加反応によってアミノ酸またはペプチドを保護されていないオリゴマーにコンジュゲートさせる。
【０１９９】
種々の態様では、2'-糖修飾（例えば2'-カルバメート置換糖または2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)デオキシリボース糖）を含有するモノマーをオリゴマーに導入することによって、オリゴマーの糖へのコンジュゲート部分の共有結合が促進される。他の態様では、1またはそれ以上のモノマーの2'-位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーを、例えば5'ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'-N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホルアミダイトのような試薬を用いて調製する。例えばManoharanら, Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171参照。
【０２００】
更に別の態様では、本発明のオリゴマーは、核酸塩基上（例えばプリンのN6アミノ基上、グアニンの環外N2、またはシトシンのN4もしくは5位上）に、アミンを含有する官能性部分を有する。ある態様では、それらの官能化は、既に官能化されている市販の試薬をオリゴマー合成において使用することによって行ってもよい。
【０２０１】
いくつかの官能性部分が市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性リンカー部分がPierce社（イリノイ州ロックフォード）から販売されている。他の市販のリンカー基は5'-Amino-Modifier C6および3'-Amino-Modifier試薬であり、共にGlen Research社（バージニア州スターリング）から販売されている。5'-Amino-Modifier C6はABI（Applied Biosystems社。カリフォルニア州フォスターシティ）からも、Aminolink-2として販売されており、また、3'-Amino-ModifierはClontech Laboratories社（カリフォルニア州パロアルト）からも販売されている。
【０２０２】
組成物
本発明のオリゴマーを医薬製剤および組成物に使用してもよい。状況に応じて、それらの組成物は医薬的に許容される希釈剤、キャリア、塩、またはアジュバントを含有する。好適かつ好ましい、医薬的に許容される希釈剤、キャリア、およびアジュバントは、WO 2007/031091に記載されている（それらは参照により本明細書に組み込まれる）。好適な用量、処方、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤については、WO 2007/031091にも記載されている（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２０３】
本明細書で使用する「医薬的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載する化合物の所望の生体活性を保持し、所望しない毒性が許容されるレベルである塩を表す。非制限的な例として、それらの塩は、有機アミノ酸と共に形成される塩、および、金属カチオン（例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなど）またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレンジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、もしくはエチレンジアミンから生成されるカチオンと共に形成される塩基付加塩；または、(c)(a)および(b)を組み合わせたもの；（例えばタンニン酸亜鉛塩など）であることが可能である。
【０２０４】
適用
本明細書で使用する「治療」という用語は、既存の疾病（例えば本明細書で後述する疾病または障害）の治療、または、疾病の防止、すなわち予防の両方を指す。従って、認識されるように、ある態様では「治療」は予防を包含する。
【０２０５】
本発明のオリゴマーを、例えば診断、治療、および予防のための、研究用試薬として利用してもよい。
【０２０６】
研究においては、細胞および実験動物において（一般的には、ベータ-カテニンmRNAの分解または阻害によってタンパク質生成を阻止することによって）ベータ-カテニンタンパク質の発現を特異的に阻害し、それによって、標的の機能性解析、または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にするために、それらのオリゴマーを使用してもよい。
【０２０７】
診断においては、ノザンブロッティング、インサイツ（in situ）・ハイブリダイゼーション、またはそれに類する技術によって、細胞および組織におけるベータ-カテニン発現を検出および定量するために、それらのオリゴマーを使用してもよい。
【０２０８】
治療においては、ベータ-カテニン発現の調節によって治療することができる疾病または障害を有する疑いのある非ヒト動物またはヒトを、有効量の本発明のオリゴマー（またはそのコンジュゲート）を投与することによって治療する。更に、治療的または予防的有効量の1またはそれ以上の本発明のオリゴマーまたは組成物を投与することによって、ベータ-カテニンの発現に関係する疾病または障害を有する疑いがある、またはその傾向を有する疑いがある哺乳動物を治療する（例えばヒトを治療する）方法を提供する。
【０２０９】
本発明はまた、本明細書に記載する障害の治療のための薬剤の製造、または本明細書に記載する障害の治療法への、本発明の化合物またはコンジュゲートの使用法を提供する。
【０２１０】
本発明はまた、薬剤として使用するための、本明細書に記載するオリゴマー、組成物、またはコンジュゲートに関する。
【０２１１】
本発明はまた、本明細書に記載する障害の治療法を提供し、該方法は、有効量の本明細書に記載する本発明の化合物、および／または有効量の本発明のコンジュゲート、および／または本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０２１２】
種々の態様では、オリゴマーまたはそのコンジュゲートは、例えば標的核酸への水素結合によって、ヒトにおいて望ましい治療効果を誘導する。オリゴマーは、標的のmRNAへの水素結合（ハイブリダイゼーション）を介して標的の発現の減少（阻害）を引き起こし、それによって遺伝子発現が低下する。また、想定されるように、本明細書に開示するオリゴマーおよびコンジュゲートは、非治療的適用、例えば診断的適用を有してもよい。
【０２１３】
非常に好ましくは、本発明の化合物は、ワトソン-クリック塩基対形成によって標的核酸（例えばベータ-カテニンmRNA）にハイブリダイズする能力を有する。
【０２１４】
医学的適応
ある治療の態様では、治療すべき障害は、過剰増殖性障害、例えば癌（例えば骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、悪性黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、造血系癌（例えば、限定されるわけではないが形質細胞腫）、子宮頸癌、CNS腫瘍、骨癌、胆道癌、および副腎癌）から成る群から選択される。
【０２１５】
ある態様では、障害は結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、および悪性黒色腫から成る群から選択される。
【０２１６】
ある態様では、障害は肝臓癌および腎臓癌から成る群から選択される。ある態様では、障害は形質細胞腫瘍、例えば骨髄腫、例えば多発性骨髄腫である。
【０２１７】
ある態様では、疾病または障害は、ベータ-カテニン遺伝子、または、そのタンパク質産物がベータ-カテニンと関係もしくは相互作用する遺伝子（例えばAPC遺伝子）における変異に関係する。従って、種々の態様では、標的mRNAは変異型のベータ-カテニン配列であり、例えば1またはそれ以上の単一点変異、例えば癌に関係するSNPを含有してもよい。
【０２１８】
ベータ-カテニンまたはAPC遺伝子における変異によって異常レベルのベータ-カテニン活性が引き起こされる疾病の例として：(1)結腸直腸癌（全体の70％を超える症例でAPCおよびベータ-カテニンの両方に変異が見られる（Powellら, Nature, 1992；Morinら, Science, 1997；Sparksら, Cancer Res, 1998））；(2)肝細胞癌（全体の25％を超える症例でベータ-カテニンに変異が見られる（de La Coste A, PNAS, 1998））；(3)子宮内膜癌（>10%でベータ-カテニンに変異が見られる）；および、(4)悪性黒色腫（>10%でベータ-カテニンに変異が見られる（Rubinfeldら, Science, 1997））が挙げられる。
【０２１９】
それらの疾病の更なる例として、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、造血系癌（例えば、限定されるわけではないが形質細胞腫）、子宮頸癌、CNS腫瘍、骨癌、胆道癌、および副腎癌が挙げられる。既に記載したように、ベータ-カテニンまたはAPC遺伝子における変異は、これらの疾病に関係している（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer（サンガー研究所（英国）から入手可））。
【０２２０】
ある態様では、疾病または障害は、異常レベルの変異型ベータ-カテニンに関係する。ある態様では、疾病または障害は、異常レベルの野生型ベータ-カテニンに関係する。本発明のある観点は、異常レベルのベータ-カテニンに関係する症状に罹患した、またはその疑いがある哺乳動物を治療する方法に関し、該方法は、ベータ-カテニンを標的とする本発明のオリゴマーまたはその種々の組成物もしくはコンジュゲートを、治療的有効量で哺乳動物に投与することを含む。ある態様では、オリゴマーは1またはそれ以上のLNAモノマーを含有する。
【０２２１】
好適な用量、処方、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤については、WO 2007/031091にも記載されている（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。また、本発明は、本明細書に記載する化合物もしくはコンジュゲートまたはコンジュゲート、および医薬的に許容される希釈剤、キャリア、またはアジュバントを含有する医薬組成物も提供する。好適かつ好ましい、医薬的に許容される希釈剤、キャリア、およびアジュバントは、WO 2007/031091に記載されている（それらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２２２】
更にまた、本明細書に記載する本発明は、疾病の予防または治療の方法を包含し、該方法は、治療的有効量のベータ-カテニン調節オリゴマーを、それらの治療を必要とするヒトに投与することを含む。本発明は更に、ベータ-カテニン調節オリゴヌクレオチド化合物（オリゴマーまたはコンジュゲート）の短期投与の使用法を包含する。
【０２２３】
種々の態様では、本発明は、(i)有効量の本発明のコンジュゲートまたはその組成物、および、(ii)有効量の第2の物質を投与することを含む、異常レベルのベータ-カテニンを治療する方法に関する。ある態様では、コンジュゲートおよび第2の物質の投与は同時に行われる。他の態様では、コンジュゲートおよび第2の物質の投与は連続的に行われる。一般的に、第2の物質はオリゴマーに共有結合してコンジュゲートを形成している。
【０２２４】
更なる態様
以下は更なる態様であり、それらを上記の態様、および添付の特許請求の範囲に記載する態様と組み合わせてもよい：
【０２２５】
１．SEQ ID NO:173のベータ-カテニン遺伝子またはその対立遺伝子の標的配列に結合してベータ-カテニンの発現を抑制的に調節する能力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばオリゴマー）であって、標的配列に対応する10-50個の核酸塩基の配列を含有する、上記オリゴヌクレオチド。
２．標的配列がSEQ ID NO:1-132に示すベータ-カテニン遺伝子またはその対立遺伝子多型の領域から選択される、態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３．SEQ ID NO:1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103、および118に示す10-16個の核酸塩基の配列またはその対立遺伝子多型を含有する、態様１または２に記載されるオリゴヌクレオチド。
４．SEQ ID NO:1-132に示す配列を含有する、態様１−３のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
５．SEQ ID NO:133-172に示す、態様１−４のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
６．該核酸塩基配列が独立してホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびボラノホスフェートから選択される核酸塩基間結合を含有する、態様１−５のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
７．該核酸塩基の少なくとも2個がヌクレオチド類似体である、態様１−６のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
８．該核酸塩基の配列が5'から3'の方向に、(i)領域A：一続きの2-4個のヌクレオチド類似体、それに続く(ii)領域B：領域Aのものとは異なる一続きの6-11個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、それに続く(iii)領域C：一続きの2-4ヌクレオチド類似体、そして任意にそれに続いてもよい(iv)領域D：1または2個のヌクレオチドを含有する、態様５記載のオリゴヌクレオチド。
９．該領域Aが2個のヌクレオチド類似体ユニット間および／またはヌクレオチド類似体ユニットおよび領域Bの核酸塩基ユニット間に少なくとも1個のホスホジエステル結合を有する、態様８のオリゴヌクレオチド。
１０．該領域Cが2個のヌクレオチド類似体ユニット間および／またはヌクレオチド類似体ユニットおよび領域Bの核酸塩基ユニット間に少なくとも1個のホスホジエステル結合を有する、態様８または態様９に記載されるオリゴヌクレオチド。
１１．全ての核酸塩基間結合がホスホロチオエートである、態様１から６のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
１２．該ヌクレオチド類似体ユニットが独立して2'-O-アルキル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、ロックト核酸(LNA)、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANA、RNA、INA、および2'-MOEから選択される、態様７から１１のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
１３．ヌクレオチド類似体が独立して2'-MOE-RNA、2'-フルオロ-DNA、およびLNAから選択される、態様１２記載のオリゴヌクレオチド。
１４．該ヌクレオチド類似体の少なくとも1つがロックト核酸（LNA）である、態様１３記載のオリゴヌクレオチド。
１５．全てのヌクレオチド類似体がLNAである、態様１４記載のオリゴヌクレオチド。
１６．LNAがβ-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNA、およびβ-D-チオ-LNAから選択される、態様１２から１５のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチド。
１７．態様１から１６のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含有するコンジュゲート。
１８．該非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分がステロール基、例えばコレステロールから成るか、またはそれを含有する、態様１７記載のコンジュゲート。
１９．態様１から１６のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドまたは態様１７もしくは態様１８に記載されるコンジュゲート、および医薬的に許容される希釈剤、キャリア、またはアジュバントを含有する医薬組成物。
２０．薬剤として使用するための態様１から１８のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート。
２１．異常レベルのβカテニン、またはβカテニン発現の抑制的調節が必要とされる疾病もしくは障害を治療するための薬剤を製造するための、態様１から１８のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートの使用。
２２．該疾病または障害が癌である、態様２１記載の使用。
２３．癌に罹患した被験体を治療する方法であって、態様１から１９のいずれかに記載される医薬組成物、オリゴヌクレオチド、またはコンジュゲートを、それを必要としている被験体に投与する段階を含む、上記方法。
２４．癌が形質細胞腫、骨髄腫（例えば限定されるわけではないが多発性骨髄腫）、結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、悪性黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、造血系癌、子宮頸癌、CNS腫瘍、骨癌、胆道癌、および副腎癌から成る群から選択される、態様２１-２３のいずれかに記載される使用または方法。
２５．ベータ-カテニン遺伝子中の標的配列であって、該標的配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドがベータ-カテニンの発現を抑制的に調節する能力を有する、上記標的配列。
２６．標的配列がSEQ ID NO:1-132に相補的なベータ-カテニン遺伝子またはその対立遺伝子多型の領域から選択される、態様２５記載の標的配列。
２７．細胞、例えば限定されるわけではないが哺乳動物（例えばヒト）の形質細胞腫細胞、骨髄腫細胞、または多発性骨髄腫細胞においてベータ-カテニンの発現を抑制的に調節する方法であって、該細胞を態様１−１６のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、上記方法。
【実施例】
【０２２６】
７．実施例
実施例１：モノマー合成
LNAモノマー構築ブロックおよび誘導体を、報告されている方法および引用される参考文献に従って調製した（WO 07/031081および引用文献参照）。
【０２２７】
実施例２：オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドはWO 07/031081に記載されている方法に従って合成した。表１に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドモチーフの例を示す。
【０２２８】
実施例３：オリゴヌクレオチドの設計
本発明によれば、一連のオリゴヌクレオチドを、公表されている配列であるGenBankアクセッション番号NM＿001904（本明細書ではSEQ ID NO:173と記載）を用いて、ヒト・ベータ-カテニンmRNAの種々の領域を標的とするように設計した。
【０２２９】
表２に、本発明のオリゴマーの設計を示す。表３に、24mer配列モチーフを示すが、これらから本発明のオリゴマーを設計してもよい（太字は、長鎖オリゴマーに導入される、表1の16mer配列モチーフを示す）。
【０２３０】
【表７】
2014533280.tif 000014
【０２３１】
実施例４：インビトロ・モデル：細胞培養
アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸発現に対する影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、種々のタイプの細胞で試験することができる。標的核酸は、内因性の発現であるか、または一過性もしくは安定トランスフェクションによって発現させることができる。標的核酸の発現レベルは、例えばノザンブロッティング分析、リアルタイムPCR、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、ごく普通に（routinely）測定することができる。下記のタイプの細胞は例証の目的で提供するものであるが、標的が選択されるタイプの細胞中で発現されることを条件に、他のタイプの細胞をごく普通に使用することもできる。
【０２３２】
下記の好適な培地中で細胞を培養し、37℃、湿度95-98%、および5% C02に保持した。細胞は週2-3回、定期的に継代した。
【０２３３】
SW480：ヒト結腸直腸癌細胞株SW480は、L-15培地（Leibovitz）＋10%ウシ胎仔血清（FBS）＋Glutamax I＋pen/strep中で培養した。
【０２３４】
HCT116：ヒト結腸直腸癌細胞株HCT116は、マッコイ5A改変培地（Sigma社）＋10%ウシ胎仔血清（FBS）＋Glutamax I＋pen/strep中で培養した。
【０２３５】
IM-9、OPM2、U266、AMO1、KMS-12-BM、およびRPMI8226：多発性骨髄腫細胞株IM-9、OPM2、U266、AMO1、KMS-12-BM、およびRPMI8226は、10％ウシ胎仔血清を含有するRPMI1640培地中で培養した。
【０２３６】
LP1およびEJM：多発性骨髄腫細胞株LP1およびEJMは、10％ウシ胎仔血清を含有するイスコフMDM培地中で培養した。
【０２３７】
実施例５：インビトロ・モデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理
カチオン性リポソーム試薬LipofectAMINE 2000（Gibco社）をトランスフェクションベヒクルとして使用して、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。細胞を６ウェルプレート（NUNC社）に播種し、75-90％の集密度になった時点で処理した。使用したオリゴヌクレオチド濃度は、最終濃度1nMから25nMの範囲である。オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成は、本質的に製造者の指示に従い、血清未含有OptiMEM（Gibco社）および最終脂質濃度10μg/mLのLipofectAMINE 2000を用いて行った。細胞を37℃で4時間インキュベートし、オリゴヌクレオチドを含有する培地を除去して処理を停止した。細胞を洗浄し、血清含有培地を添加した。オリゴヌクレオチド処理の後、細胞を20時間回復させ、その後、RNA分析のために回収した。
【０２３８】
実施例６：インビトロ・モデル：RNAの抽出およびcDNAの合成
細胞株からのRNAの単離には、RNeasy mini kit（Qiagen社、カタログ番号74104）を製造者のプロトコルに従って使用した。
【０２３９】
第１の鎖の合成は、Ambion社のReverse Transcriptase試薬を製造者の取扱説明書に従って使用した。
【０２４０】
各サンプルについて、0.5μgの総RNAを、RNase未含有H2Oを用いて10.8μlに調整し、2μlのランダム・デカマー（50μM）および4μlのdNTP mix（各dNTPが2.5mM）と混合し、70℃で3分間加熱した後、サンプルを氷上で速やかに冷却した。サンプルを氷上で冷却した後、2μlの10x Buffer RT、1μlのMMLV Reverse Transcriptase（100 U/μl）、および0.25μlのRNase阻害剤（10 U/μl)を各サンプルに添加し、その後、42℃で60分間インキュベートし、95℃で10分間の酵素の熱不活化を行い、そしてサンプルを4℃まで冷却した。
【０２４１】
実施例７：インビトロ・モデル：リアルタイムPCRによるオリゴヌクレオチドのベータ-カテニン発現阻害の分析
ベータ-カテニン発現のアンチセンス調節は、当該分野で公知の種々の方法でアッセイできる。例えば、ベータ-カテニンmRNAレベルは、例えばノザンブロッティング、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、またはリアルタイムPCRによって定量できる。リアルタイム定量PCRは、現在のところ好ましい。RNA分析は、総細胞RNAまたはmRNAで行うことができる。RNAの単離およびRNAの分析（例えばノザンブロット分析）の方法は当該分野でごく普通のものであり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（John WileyおよびSons）に記載されている。
【０２４２】
リアルタイム定量（PCR）は、市販のMulti-Color Real Time PCR Detection System（Applied Biosystem社から入手可）を用いて便宜に実施することができる。
【０２４３】
ベータ-カテニンmRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
サンプルのヒト・ベータ-カテニンmRNA含量を、ヒト・ベータ-カテニンABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent（Applied Biosystems社、カタログ番号Hs00170025 ＿ml）を用い、製造者の説明書に従って定量した。
【０２４４】
グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAの量を内因性コントロールとして使用し、サンプル調製におけるばらつきを標準化した。
【０２４５】
サンプルのヒトGAPDH mRNA含量は、ヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent（Applied Biosystems社、カタログ番号4310884E）を用い、製造者の説明書に従って定量した。
【０２４６】
リアルタイム定量PCRは当該分野で公知の技術であり、例えばHeidら, Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994に記載されている。
【０２４７】
リアルタイムPCR
実施例８に記載するように実施した第１鎖合成からのcDNAを2-20倍に希釈し、Taqman 7500 FAST（Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイム定量PCRで分析した。プライマーおよびプローブを2x Taqman Fast Universal PCR master mix (2x)（Applied Biosystems社、カタログ番号4364103）と混合し、4/μlのcDNAに添加して最終容量10/μlとした。各サンプルの分析は３重測定で行った。目的のRNAを発現する細胞株から精製した物質で調製したcDNAの２倍希釈液のアッセイによって、アッセイの標準曲線を作成した。テンプレート未含有コントロールには、cDNAの代わりに滅菌H2Oを使用した。PCRプログラム：95℃で30秒間、次いで、95℃で3秒間、60℃で30秒間を40サイクル。Applied Biosystems社のFast System SDS Software Version 1.3.1.21を用いて算出された閾値サイクルから、標的mRNA配列の相対量を測定した。
【０２４８】
実施例８：インビトロ分析：オリゴヌクレオチドによるヒト・ベータ-カテニン発現のアンチセンス阻害
表２のオリゴヌクレオチドを、SW480細胞において、1、5、および25nMの濃度でのベータ-カテニンmRNAをノックダウンする能力について評価した（図２参照）。結果を表４に示す。データは、5nMで擬似トランスフェクトした細胞と比較した場合の、ベータ-カテニンmRNAの抑制的調節のパーセンテージとして示す。小文字はDNAモノマーを表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す。全てのLNAモノマーのシトシン塩基は5'メチルシトシンである。下付の「s」はホスホロチオエート結合を表す。
【０２４９】
【表８】
2014533280.tif 000015
表４に示すように、SEQ ID NO:153、154、155、156、158、161、168、169、170、171、および172のオリゴヌクレオチドは、これらの実験で、5nMで約74%またはそれ以上のベータ-カテニンmRNA発現阻害を示し、従って好ましい。
【０２５０】
また、例証するアンチセンスオリゴマー配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、例えば長さ（より短く、またはより長く）および／またはモノマー含量(例えばヌクレオシド類似体モノマーのタイプおよび／または割合）を変化させたもので、良好なベータ-カテニン発現阻害を示すものも好ましい。
【０２５１】
実施例９：インビトロ分析：ベータ-カテニンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
トランスフェクトした細胞におけるベータ-カテニンタンパク質レベルに対するオリゴマー化合物のインビトロでの影響を、ウェスタンブロッティングによって測定した。SW480細胞（200,000細胞／ウェル）を実施例５に記載するオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche社）を添加したRIPA溶解バッファー（50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1% TritonX-100、0.1% SDS、1% デオキシコール酸ナトリウム）で溶解した。総タンパク質濃度を、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce社）を用いて測定した。製造者の説明書（Invitrogen社）に従って、50μgの総タンパク質を3-8% Tris Acetateゲル上で泳動し、PVDFメンブレンに転写した。ブロッキングバッファー（5%脱脂粉乳を添加したPBS-T）中で一晩インキュベートした後、メンブレンを抗ベータ-カテニン抗体（BD Transduction laboratories社）と共に一晩インキュベートした。ローディングコントロールとして、Neomaker社のモノクローナル抗体を用いてチューブリンを検出した。その後、メンブレンを２次抗体と共にインキュベートし、化学発光ECL+検出キット（Amersham社）を用いてベータ-カテニンまたはチューブリンを可視化した。図３参照。
【０２５２】
実施例１０：増殖性生細胞の測定（MTSアッセイ）
トランスフェクションの前日に、HCT116結腸直腸癌細胞を６ウェルプレートに、マッコイ5a改変培地（Sigma社、M8403）＋2mM Glutamax I（Gibco社、35050-038）＋10% FBS（Brochrom社、#193575010）＋25μg/μlゲンタマイシン（Sigma社、G1397、50mg/ml）中、200,000細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、培地を除去した後、7.5μg/mlのLipofectamine 2000（Invitrogen社）を含有する1.2mlのOptiMEMを添加した。細胞を７分間インキュベートした後、OptiMEMで希釈したオリゴヌクレオチド0.3mlを添加した。オリゴヌクレオチドの最終濃度は25nMであった。4時間処理した後、培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、透明の96ウェルプレート（Scientific Orange社、No.1472030100）に、100μlマッコイ5a改変培地（Sigma社、M8403）＋2mM Glutamax I（Gibco社、35050-038）＋10% FBS（Brochrom社、#193575010）＋25μg/μlゲンタマイシン（Sigma社、G1397、50mg/ml）中、5000細胞／ウェルの密度で播種した。指示された時点で10μlのテトラゾリウム化合物[3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、内塩；MTS]および電子カップリング試薬（フェナジンエトスルファート；PES）（CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega社）を添加して、生細胞を測定した。Powerwave（Biotek Instruments社）を用い、490nmで生細胞を測定した。OD 490nmを時間（時間）に対してプロットした（図４参照）。
【０２５３】
実施例１１：マウス肝臓におけるベータ-カテニンmRNAの阻害
NMRIマウスに、3日間連続で25mg/kgのオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:156、158、168、169、171）を静脈内投与した（各群5検体のマウス）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを0.9％生理食塩水（NaCl）に溶解した。最終投与の24時間後に動物を屠殺し、肝臓組織をサンプリングし、RNA抽出およびQPCR分析まで、RNA later中に保存した。総RNAを抽出し、肝臓サンプル中のベータ-カテニンmRNA発現の測定を、実施例7に記載するようにマウスベータ-カテニンQPCRアッセイ（カタログ番号Mm00483033＿m1、Applied Biosystems社）を用いてQPCRアッセイ分析によって行った。結果をマウスGAPDH（カタログ番号4352339E、Applied Biosystems社）に対して標準化し、生理食塩水処理コントロールに対してプロットした（図５参照）。
【０２５４】
実施例１２：SEQ ID NO:161とポリエチレングリコールとのコンジュゲートの調製
SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:168、およびSEQ ID NO:171のオリゴマーの5'末端の官能化を、ごく普通のホスホロアミダイト化学を用いて保護基（例えばFmoc）で保護したヘキサン-1-アミンのようなアミノアルキル基をオリゴマーの5'リン酸基に結合させ、得られた化合物を酸化し、脱保護し、そして精製することによって行い、それぞれ式（IA）、（IB）、および（IC）の官能化オリゴマーを得る：
【０２５５】
【化７】
2014533280.tif 000016
式中、SEQ ID NO:161、168、および171中の太字の大文字および下付の「s」は上記と同じ意味を有し、MeCは5-メチルシトシンを表す。
【０２５６】
式（II）に示すような活性化PEG：
【０２５７】
【化８】
2014533280.tif 000017
（式中、PEG部分の平均分子量は12,000である）、並びに式（IA）、（IB）、および（C）の化合物のそれぞれをPBSバッファーに混合した溶液を、個別の容器中、室温で12時間撹拌する。反応溶液を塩化メチレンで3回抽出し、合一した有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥、濾過し、減圧下で溶媒をエバポレートした。得られた残渣を再蒸留水に溶解し、アニオン交換カラムに負荷する。未反応のPEGリンカーを水で溶出し、産物をNH4HCO3溶液で溶出する。精製産物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、それぞれ式（IIIA）、（IIIB）、および（IIIC）に示すようなコンジュゲートSEQ ID NO:161、168、および171を得る：
【０２５８】
【化９】
2014533280.tif 000018
（式中、SEQ ID NO:161、168、および171のオリゴマーはそれぞれ、リンカーを介して平均分子量12,000のPEGポリマーに結合している）。
【０２５９】
実施例１３：ベータ-カテニンを標的とするアンチセンスLNAオリゴマーの多発性骨髄腫に対する抗増殖作用
本発明のベータ-カテニンを標的とするアンチセンスLNAオリゴマーの有益な抗増殖作用について、下記の図７−１１に示す実験データおよびそれに伴う考察で例証する。
【０２６０】
図７：一部の多発性骨髄腫（MM）細胞株は、トランスフェクションを行わずに（裸で（ジムノチックに；gymnotically））使用した場合、ベータ-カテニンアンチセンスLNAオリゴマーであるEZN-3892に対して感受性である。固形腫瘍細胞株に関する従前の研究で、全ての細胞株がLNAオリゴマーを取り込めるわけではないことが報告されている。多発性骨髄腫細胞株を、種々の用量のEZN-3892を細胞培養液に単純に添加することによって、5日間処理した（最大10の多発性骨髄腫）。この方法はトランスフェクションを用いないため、より正確にインビボ条件を反映する。MTSアッセイによる分析の結果から、2/8の細胞株が、EZN-3892の存在下で増殖阻害を示すことが明らかであった。OPM-2およびU266細胞は、他の物よりEZN-3892に対する感受性が高かった（EC50〜8-10多発性骨髄腫）。EZN-3892に対する感受性は、特定の細胞株の、EZN-3892を細胞に侵入させてベータ-カテニンmRNAとハイブリダイズさせる能力と相関関係を有する可能性がある。
【０２６１】
図８：EZN-3892は、多くの多発性骨髄腫細胞株においてベータ-カテニンのmRNAおよびタンパク質レベルを抑制的に調節する。2/8の細胞株しかEZN-3892への暴露後に抗増殖作用を示さないとすれば、EZN-3892はほとんどの細胞株でベータ-カテニンmRNAの抑制的調節を起こさないと予想される。実際は、これは真実ではなかった。多発性骨髄腫細胞株をジムノチックな条件でEZN-3892で72時間処理すると、全ての多発性骨髄腫細胞株でEZN-3892によるベータ-カテニンmRNAの抑制的調節が見られる（A）。EZN-3892の存在下および非存在下でのベータ-カテニンタンパク質レベルの分析から、多発性骨髄腫細胞株は種々のレベルのベータ-カテニンタンパク質を有し、6/8の細胞株はEZN-3892での処理後に低下する（B）。
【０２６２】
図９：EZN-3892はインビボにおいてOPM-2多発性骨髄腫異種移植片の増殖を強力に阻害する。多発性骨髄腫細胞株のEZN-3892に対する感受性を試験するために、OPM-2腫瘍異種移植片を保有するマウスに、生理食塩水、コントロールLNA、またはEZN-3892を100および50mg/kgの用量で静脈内投与した。顕著な腫瘍増殖阻害（85および78%）がこのOPM-2腫瘍モデルで測定された（それぞれAおよびB）。興味深いことに、EZN-3892の最も有効な用量は50mg/kgであり、更に用量を増加しても有効性は上昇しなかった（A）。EZN-3892は、マウスにおいて50mg/kgで十分な耐容性を示したが、より高い用量の100mg/kgでは13.7%の体重減少を引き起こした（CおよびD）。マウスは、試験の期間を通して健常かつ覚醒であった。
【０２６３】
図１０：ベータ-カテニンmRNAの抑制的調節が、EZN-3892を投与したマウスから回収した肝臓、腫瘍、および腫瘍間質において明らかである。OPM-2腫瘍異種移植片を保有するマウスに、生理食塩水、コントロールLNA、またはEZN-3892のいずれかを100および50mg/kgで（図３Aと同様）複数回投与し、6回目の投与の24時間後に肝臓組織を回収した。組織から抽出した総RNAについて、RT-qPCRを実施した。予想通り、EZN-3892はマウス肝臓におけるベータ-カテニンmRNAを強力に減少させる。ヒトOPM-2腫瘍異種移植片におけるベータ-カテニンmRNAの阻害は、100mg/kgでわずかに見られ、50mg/kgでは検出困難であった。マウスの腫瘍間質におけるベータ-カテニンmRNAレベルの分析により、ベータ-カテニンmRNAの顕著な（〜50%）低下が明らかである。
【０２６４】
実施例１１：OPM-2腫瘍のH&E評価により、EZN-3892で処理したOPM-2腫瘍において顕著な腫瘍細胞死が明らかである。腫瘍を10%中性緩衝ホルマリン中に回収し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。下記の顕微鏡写真は、生理食塩水で処理したOPM-2腫瘍が高度に好塩基性の小型細胞の均質な腫瘍マトリクスを示すことを表している（A）。これに対し、50および100mg/kgのEZN-3892で処理したものは、より無秩序な組織構造と、多くの除核された死細胞を示している（CおよびD）。
【０２６５】
具体的な態様、参考文献の引用
本発明は、本明細書に記載する特定の態様の範囲に限定されるものではない。実際に、本明細書に記載するものに加えて、種々の本発明の改変が、前述の記載および添付の図面から当業者に明白である。それらの改変は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【０２６６】
特許出願、特許、および科学文献を含む種々の参考文献を本明細書で引用する；それら参考文献のそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図４−１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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