(57)【要約】本発明は、ポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとの間で形成される免疫原性複合体に関する。免疫反応の誘導および免疫化一般を含めた適用における免疫原性複合体の使用について記載する。また、免疫原性複合体を形成および製造する方法についても記載する。本発明はまた、低粘性のポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとを含む免疫原性組成物にも関する。免疫反応の誘導および免疫化一般を含めた適用におけるこのような免疫原性組成物の使用について記載する。また、このような免疫原性組成物の製造法についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアニオン性カルボマーポリマーとの複合体でのＥｎｖポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
低粘性のポリアニオン性カルボマーポリマーと共にＥｎｖポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ポリアニオン性カルボマーポリマーがベンゼンを含まない、請求項１または請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ポリアニオン性カルボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記ポリアニオン性カーボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ポリアニオン性カーボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４Ｐ  ＮＦ（商標）、またはこれらの組合せを含む、請求項１および３から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記Ｅｎｖポリペプチドが三量体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、１種または複数の変異を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、グリコシル化部位における変異、Ｖ１領域の欠失、Ｖ２領域の欠失、ならびに前出の組合せから選択される、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、ならびにＶ２領域の欠失を含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、配列番号２２または２３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記Ｅｎｖポリペプチドと異なるＨＩＶ亜型から選択される第２のＥｎｖポリペプチドをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記Ｅｎｖポリペプチドと同じＨＩＶ亜型の異なる株から選択される第２のＥｎｖポリペプチドをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記第２のＥｎｖポリペプチドおよび前記Ｅｎｖポリペプチドが、前記ポリアニオン性カルボマーポリマーとの混合複合体中にある、請求項１７または請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記第２のＥｎｖポリペプチドが、第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとの別個の複合体中にある、請求項１７または請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記ポリアニオン性カルボマーポリマーと前記第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとが、同じ種類のポリマーである、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記Ｅｎｖポリペプチドおよび前記第２のＥｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ亜型Ｂ株およびＨＩＶ亜型Ｃ株に由来するかまたはこの逆である、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドをさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、Ｇａｇポリペプチド、Ｎｅｆポリペプチド、Ｐｒｏｔポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、Ｒｅｖポリペプチド、Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチドを含む群から選択される、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、前記さらなるＨＩＶポリペプチドの、免疫反応を発生させる能力に悪影響を及ぼさずに、前記ポリペプチドの活性を低減または消失させる変異を含む、請求項２３または請求項２４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
アジュバントをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記アジュバントが、水中油エマルジョンである、請求項２６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記水中油エマルジョンが、スクアレンを含むサブミクロン処方物である、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
請求項１および３から２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を生成させる方法であって、
（ａ）前記ポリアニオン性カルボマーポリマーを前記Ｅｎｖポリペプチドと、ｐＨが溶液中の前記ＥｎｖポリペプチドのｐＩを下回る条件下で接触させるステップと、
（ｂ）前記ポリアニオン性カルボマーポリマーを前記Ｅｎｖポリペプチドと共にインキュベートして、前記Ｅｎｖポリペプチドに、前記ポリアニオン性カルボマーポリマーとの複合体を形成させるステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記ｐＨが、３〜６の間である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｐＨが、３〜５の間である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｐＨが、３〜４の間である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
接触させるステップ（ａ）の後における前記ポリアニオン性カルボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）の間である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
接触させるステップ（ａ）の後における前記ポリアニオン性カーボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）の間である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
接触させるステップ（ａ）の後における前記ポリアニオン性カーボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の間である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリアニオン性カーボマーポリマーがベンゼンを含まない、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４Ｐ  ＮＦ（商標）、またはこれらの組合せを含む、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を含む、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｅｎｖポリペプチドが三量体である、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、１種または複数の変異を含む、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、グリコシル化部位における変異、Ｖ１領域の欠失、Ｖ２領域の欠失、ならびに前出の組合せから選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、ならびにＶ２領域の欠失を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｅｎｖポリペプチドが、配列番号２２または２３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｅｎｖポリペプチドと異なるＨＩＶ亜型から選択される第２のＥｎｖポリペプチドを前記溶液に添加するステップをさらに含む、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のＥｎｖポリペプチドを、前記Ｅｎｖポリペプチドを伴う前記ポリアニオン性カルボマーポリマーと共にインキュベートして、前記Ｅｎｖポリペプチドと前記第２のＥｎｖポリペプチドとが、前記ポリアニオン性カルボマーポリマーとの複合体を同時に形成することを可能とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２のＥｎｖポリペプチドが、第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとの別個の複合体中にある、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリアニオン性カーボマーポリマーと前記第２のポリアニオン性カーボマーポリマーとが、同じ種類のポリマーである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｅｎｖポリペプチドおよび前記第２のＥｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ亜型Ｂ株およびＨＩＶ亜型Ｃ株に由来するかまたはこの逆である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを添加するステップをさらに含む、請求項２９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、Ｇａｇポリペプチド、Ｎｅｆポリペプチド、Ｐｒｏｔポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、Ｒｅｖポリペプチド、Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチドを含む群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、前記さらなるＨＩＶポリペプチドの、免疫反応を発生させる能力に悪影響を及ぼさずに、前記ポリペプチドの活性を低減または消失させる変異を含む、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
アジュバントを前記溶液に添加するステップをさらに含む、請求項２９から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記アジュバントが、水中油エマルジョンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記水中油エマルジョンが、スクアレンを含むサブミクロン処方物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
被験体において免疫反応を発生させる方法であって、前記被験体に、請求項１から２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項２９から５７のいずれか一項に記載の方法により作製される免疫原性組成物を投与し、これにより、前記Ｅｎｖポリペプチドに対する前記免疫反応を発生させるステップを含む、方法。
【請求項５９】
前記免疫原性組成物が、筋内投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、経口投与、または静脈内投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫反応が、体液性免疫反応を含む、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫反応が、細胞性免疫反応を含む、請求項５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
被験体において増強された免疫反応を発生させる方法であって、
（ａ）前記被験体の細胞に、Ｅｎｖポリペプチドの発現を可能とする条件下において、前記Ｅｎｖポリペプチドを発現させるための遺伝子送達ベクターをトランスフェクトし、これにより、前記Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させるステップと、
（ｂ）前記被験体に、請求項１から２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項２９から５７のいずれか一項に記載の方法により作製される免疫原性組成物を投与し、これにより、前記Ｅｎｖポリペプチドに対する前記免疫反応を増強するステップと
を含む、方法。
【請求項６５】
被験体において増強された免疫反応を発生させる方法であって、前記被験体は、Ｅｎｖポリペプチドを発現させるための遺伝子送達ベクターが、前記Ｅｎｖポリペプチドの発現を可能とする条件下において、前記被験体の細胞に既にトランスフェクトされ、これにより、前記Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させており、前記方法は、前記被験体に、請求項１から２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項２９から５７のいずれか一項に記載の方法により作製される免疫原性組成物を投与し、これにより、前記Ｅｎｖポリペプチドに対する前記免疫反応を増強するステップを含む、方法。
【請求項６６】
前記免疫原性組成物が、筋内投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、経口投与、または静脈内投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記免疫反応が、体液性免疫反応を含む、請求項６５から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記免疫反応が、細胞性免疫反応を含む、請求項６５から６９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１１年１１月１４日に出願された米国仮出願第６１／５５９，５１２号への優先権の利益を主張する。上記出願の開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府の支援
この発明は、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨによって付与されたＨＩＶＲＡＤ助成金５Ｐ０１  ＡＩ０６６２８７の下、米国政府の支援を一部受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
ポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとの複合体を含む免疫原性組成物について記載し、これらの免疫原性組成物の使用ならびにこのような複合体を形成および製造する方法についても記載する。低粘性のポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとを含む免疫原性組成物について記載し、これらの免疫原性組成物の使用ならびにこのような組成物を形成および製造する方法についても記載する。
【背景技術】
【０００４】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、今日の医療に直面する健康に対する最大の脅威のうちの１つとして認識されている。この疾患の治癒はいまだに認められない。
【０００５】
１９８３〜１９８４年に、３つのグループが、ＡＩＤＳのものと疑われる病原因子を独立に同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２０巻：８６８〜８７１頁；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ、Ｅｓｓｅｘ、およびＧｒｏｓｓ編、１９８４年）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４年）、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、１巻：７５３頁；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻：４９７〜５００頁；Ｌｅｖｙら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２５巻：８４０〜８４２頁を参照されたい。これらの分離株は、リンパ節症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＩＩＩ型Ｔ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と様々に呼ばれた。これらの分離株の全ては、同じウイルスの株であり、後にまとめてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と命名された。類縁のＡＩＤＳ原因ウイルスが単離されたことから、元来ＨＩＶと呼ばれていた株を今日ではＨＩＶ−１と称し、類縁のウイルスをＨＩＶ−２と呼ぶ。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２６巻：６６２〜６６９頁；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻：３４３〜３４６頁；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻：６９１〜６９５頁を参照されたい。
【０００６】
ＨＩＶウイルスについては多くの情報が生み出されているが、現在のところ、有効なワクチンは同定されていない。ＨＩＶによりコードされるＥｎｖ遺伝子産物およびＧａｇ遺伝子産物を含め、ワクチン開発のためのいくつかの標的が検討されている。Ｇａｇ遺伝子産物は、ＧａｇポリメラーゼおよびＧａｇプロテアーゼを含むがこれらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝子産物は、単量体のｇｐ１２０ポリペプチド、オリゴマーのｇｐ１４０ポリペプチド、およびｇｐ１６０ポリペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０００７】
ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドの免疫原性組成物における使用については記載されている（例えば、各々が異なるＨＩＶ  Ｅｎｖ変異体を発現させる少なくとも４つの異なる組換えウイルスの混合物を含む免疫原性組成物について記載する、Ｈｕｒｗｉｔｚらによる特許文献１；およびＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチドについて記載する、Ｖａｈｌｎｅらによる特許文献２を参照されたい）。加えて、Ｓｉａらによる特許文献３は、配列ＧＰＧＲを含有するＨＩＶ−１分離株のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列に直接に連結された、ＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含む、ＨＩＶに対する候補ワクチンについて記載している。しかし、これらのＥｎｖポリペプチドベースの組成物のうちのいずれも、効果的なワクチンに有用である十分な防御的免疫反応をもたらすことが示されていない。近年、Ｇ．Ｋｒａｓｈｉａｓら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２８巻：２４８２〜２４８９頁、２０１０年）は、ｇｐ１４０およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）を含むワクチンについて記載している。Ｇ．Ｋｒａｓｈｉａｓらは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）が、アジュバントとしてのミョウバンに勝る免疫反応の改善をもたらすことを見出した。しかし、Ｇ．Ｋｒａｓｈｉａｓらは、ｇｐ１４０とＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）との間に検出可能な結合を見出さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，８４６，５４６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８４０，３１３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８７６，７３１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、適切な条件下では、ポリアニオン性カルボマーが、Ｅｎｖポリペプチドとの複合体を形成しうることを見出した。複合体は、既存のアジュバント処理されたＨＩＶ候補ワクチンに勝る免疫原性の改善を示す。
【００１０】
本明細書では、ポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとの新規の複合体について記載する。本開示の一態様は、ポリアニオン性カルボマーポリマーとの複合体でのＥｎｖポリペプチドを含む免疫原性組成物を含む。一実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ  ＥｎｖポリペプチドなおまたはＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドである。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性カルボマーポリマーがベンゼンを含まない。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性カルボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）の間、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）の間、または約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の間である。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４Ｐ  ＮＦ（商標）、もしくはこれらの組合せ、または好ましくはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を含む。前出の実施形態と組み合わせうるさらに別の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、三量体である。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、１種または複数の変異を含む。１種または複数の変異を伴う前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、グリコシル化部位における変異、Ｖ１領域の欠失、Ｖ２領域の欠失、ならびに前出の組合せから選択される。好ましくは、１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、ならびにＶ２領域の欠失を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド；ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド；またはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、配列番号２２または２３に対する少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を伴うアミノ酸配列を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫原性組成物が、Ｅｎｖポリペプチドと異なるＨＩＶ亜型から選択される第２のＥｎｖポリペプチドをさらに含む。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、第２のＥｎｖポリペプチドおよびＥｎｖポリペプチドが、ポリアニオン性カルボマーポリマーとの混合複合体中にある。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、第２のＥｎｖ��リペプチドが、第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとの別個の複合体中にあるか、またはポリアニオン性カルボマーポリマーと第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとが同じ種類のポリマーである。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドおよび第２のＥｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ亜型Ｂ株およびＨＩＶ亜型Ｃ株に由来するかまたはこの逆である。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫原性組成物が、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドをさらに含む。１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、Ｇａｇポリペプチド、Ｎｅｆポリペプチド、Ｐｒｏｔポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、Ｒｅｖポリペプチド、Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチドを含む群から選択される。１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、さらなるＨＩＶポリペプチドの、免疫反応を発生させる能力に悪影響を及ぼさずに、ポリペプチドの活性を低減または消失させる変異を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫原性複合体は、アジュバントをさらに含む。アジュバントを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、アジュバントが、ＭＦ５９である。
【００１１】
本開示の別の態様は、（ａ）ポリアニオン性カルボマーポリマーをＥｎｖポリペプチドと、ｐＨが溶液中のＥｎｖポリペプチドのｐＩを下回る条件下で接触させ、（ｂ）ポリアニオン性カルボマーポリマーをＥｎｖポリペプチドと共にインキュベートして、Ｅｎｖポリペプチドがポリアニオン性カルボマーポリマーとの複合体を形成することを可能とすることにより、上記の免疫原性組成物を生成させる方法を含む。一実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ  ＥｎｖポリペプチドなおまたはＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドである。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、ｐＨが、３〜６の間、３〜５の間、または３〜４の間である。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性カルボマーポリマーがベンゼンを含まない。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、接触させるステップ（ａ）の後におけるポリアニオン性カルボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）の間、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）の間、または約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の間である。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４Ｐ  ＮＦ（商標）、もしくはこれらの組合せ、または好ましくはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を含む。前出の実施形態と組み合わせうるさらに別の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、三量体である。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、１種または複数の変異を含む。１種または複数の変異を含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、グリコシル化部位における変異、Ｖ１領域の欠失、Ｖ２領域の欠失、ならびに前出の組合せから選択される。好ましくは、１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、ならびにＶ２領域の欠失を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド；ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド；またはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、配列番号２２または２３に対する少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドとは異なるＨＩＶ亜型か��選択される第２のＥｎｖポリペプチドが溶液に添加される。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、第２のＥｎｖポリペプチドを、Ｅｎｖポリペプチドを伴うポリアニオン性カルボマーポリマーと共にインキュベートして、Ｅｎｖポリペプチドと第２のＥｎｖポリペプチドとが、ポリアニオン性カルボマーポリマーとの複合体を同時に形成することを可能とする。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、第２のＥｎｖポリペプチドが、第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとの別個の複合体中にある。第２のポリアニオン性カルボマーポリマーを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、ポリアニオン性カルボマーポリマーと第２のポリアニオン性カルボマーポリマーとが同じ種類のポリマーである。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドおよび第２のＥｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ亜型Ｂ株およびＨＩＶ亜型Ｃ株に由来するかまたはこの逆である。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、方法が、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを添加するステップをさらに含む。１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、Ｇａｇポリペプチド、Ｎｅｆポリペプチド、Ｐｒｏｔポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、Ｒｅｖポリペプチド、Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチドを含む群から選択される。１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、さらなるＨＩＶポリペプチドの、免疫反応を発生させる能力に悪影響を及ぼさずに、ポリペプチドの活性を低減または消失させる変異を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、方法が、アジュバントを溶液に添加するステップをさらに含む。アジュバントを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、アジュバントが、ＭＦ５９である。
【００１２】
本開示のさらに別の態様は、被験体において免疫反応を発生させる方法であって、前記被験体に、前出の組成物態様に記載の免疫原性組成物、または前出の方法態様に記載の方法により生成させる免疫原性組成物を投与し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させるステップを含む方法を含む。一実施形態では、免疫原性組成物が、筋内投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、経口投与、または静脈内投与される。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、被験体が、哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物が、ヒトである。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応が、体液性免疫反応を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応が、細胞性免疫反応を含む。
【００１３】
本開示のなお別の態様は、（ａ）被験体の細胞に、Ｅｎｖポリペプチドの発現を可能とする条件下において、Ｅｎｖポリペプチドを発現させるための遺伝子送達ベクターをトランスフェクトし、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させ、（ｂ）前記被験体に、前出の組成物態様に記載の免疫原性組成物、または前出の方法態様に記載の方法により生成させる免疫原性組成物を投与し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を増強することにより、前記被験体において増強された免疫反応を発生させる方法を含む。
【００１４】
本開示の別の態様は、Ｅｎｖポリペプチドを発現させるための遺伝子送達ベクターが、Ｅｎｖポリペプチドの発現を可能とする条件下において、その細胞に既にトランスフェクトされ、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させている被験体において、増強された免疫反応を発生させる方法であって、前記被験体に、前出の組成物態様に記載の免疫原性組成物、または前出の方法態様に記載の方法により生成させる免疫原性組成物を投与し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を増強するステップを含む方法を含む。一実施形態では、免疫原性組成物が、筋内投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、経口投与、または静脈内投与される。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、被験体が、哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物が、ヒトである。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応は、体液性免疫反応を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応は、細胞性免疫反応を含む。
【００１５】
本明細書では、低粘性のポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとを含む新規の組成物について記載する。本開示の一態様は、低粘性のポリアニオン性カルボマーポリマーを伴うＥｎｖポリペプチドを含む免疫原性組成物を含む。一実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ  ＥｎｖポリペプチドなおまたはＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドである。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性カーボマーポリマーがベンゼンを含まない。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、ポリアニオン性カーボマーポリマーの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）の間、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）の間、または約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の間である。前出の実施形態と組み合わせうる別の実施形態では、低粘性のポリアニオン性ポリマーが、平均粘性が２５，０００ｃＰ未満（２５℃、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶＴ、２０ｒｐｍ、ｐＨ７．３〜７．８へと中性化された０．５重量％の漿剤、スピンドル＃６）、２０，０００ｃＰ未満、１５，０００ｃＰ未満のポリアニオン性ポリマーを含むか、または低粘性のポリアニオン性ポリマーが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）である。前出の実施形態と組み合わせうるさらに別の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、三量体である。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、１種または複数の変異を含む。１種または複数の変異を有する前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、グリコシル化部位における変異、Ｖ１領域の欠失、Ｖ２領域の欠失、ならびに前出の組合せから選択される。好ましくは、１種または複数の変異が、切断部位における、ｇｐ１４０ポリペプチドの、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を防止する変異、ならびにＶ２領域の欠失を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド；ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド；またはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドもしくはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドが、配列番号２２または２３に対する少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫原性組成物が、Ｅｎｖポリペプチドと異なるＨＩＶ亜型から選択される第２のＥｎｖポリペプチドをさらに含む。第２のＥｎｖポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、Ｅｎｖポリペプチドおよび第２��Ｅｎｖポリペプチドが、ＨＩＶ亜型Ｂ株およびＨＩＶ亜型Ｃ株に由来するかまたはこの逆である。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫原性組成物が、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドをさらに含む。１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、Ｇａｇポリペプチド、Ｎｅｆポリペプチド、Ｐｒｏｔポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、Ｒｅｖポリペプチド、Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチドを含む群から選択される。１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、１種または複数のさらなるＨＩＶポリペプチドが、さらなるＨＩＶポリペプチドの、免疫反応を発生させる能力に悪影響を及ぼさずに、ポリペプチドの活性を低減または消失させる変異を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫原性組成物が、アジュバントをさらに含む。アジュバントを含む前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、アジュバントが、ＭＦ５９である。
【００１６】
本開示のさらに別の態様は、被験体において免疫反応を発生させる方法であって、前記被験体に、前出の組成物態様に記載の免疫原性組成物を投与し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させるステップを含む方法を含む。一実施形態では、免疫原性組成物が、筋内投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、経口投与、または静脈内投与される。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、被験体が、哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物が、ヒトである。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応が、体液性免疫反応を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応が、細胞性免疫反応を含む。
【００１７】
本開示のなお別の態様は、（ａ）被験体の細胞に、Ｅｎｖポリペプチドの発現を可能とする条件下において、Ｅｎｖポリペプチドを発現させるための遺伝子送達ベクターをトランスフェクトし、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させ、（ｂ）前記被験体に、前出の組成物態様に記載の免疫原性組成物を投与し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を増強することにより、前記被験体において増強された免疫反応を発生させる方法を包含する。
【００１８】
本開示の別の態様は、Ｅｎｖポリペプチドを発現させるための遺伝子送達ベクターが、Ｅｎｖポリペプチドの発現を可能とする条件下において、その細胞に既にトランスフェクトされ、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を発生させている被験体において、増強された免疫反応を発生させる方法であって、前記被験体に、前出の組成物態様に記載の免疫原性組成物を投与し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドに対する免疫反応を増強するステップを含む方法を包含する。一実施形態では、免疫原性組成物が、筋内投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、経口投与、または静脈内投与される。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、被験体が、哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物が、ヒトである。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応が、体液性免疫反応を含む。前出の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態では、免疫反応が、細胞性免疫反応を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、様々な時間にわたるインキュベーション後における、Ｅｎｖポリペプチド−ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）複合体についての免疫ブロットである。パネル（Ａ）は、左から右へ、（１）分子量マーカー、（２）Ｅｎｖポリペプチド複合体：０時間、（３）Ｅｎｖポリペプチド複合体：４℃で１時間、（４）Ｅｎｖポリペプチド複合体：４℃で２時間、（５）Ｅｎｖポリペプチド複合体：４℃で３時間、および（６）Ｅｎｖポリペプチド複合体：４℃で４時間を示す図である。パネル（Ｂ）は、左から右へ、（１）分子量マーカー、（２）Ｅｎｖポリペプチド複合体：４℃で１時間、（３）Ｅｎｖポリペプチド複合体：２０℃で１時間、（４）ＰＢＳ中のＥｎｖポリペプチド：室温（２５℃）で１時間、（５）分子量マーカー、（６）Ｅｎｖポリペプチド複合体：３０℃で１時間、（７）Ｅｎｖポリペプチド複合体：３７℃で１時間、および（８）ＰＢＳ中のＥｎｖポリペプチド：３７℃で１時間を示す図である。ゲル中のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の最終濃度は、約０．１％であった。
【図２】図２は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）単独（左）またはＥｎｖ（ｇｐ１４０）ポリペプチドとの複合体でのＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）についての動的光散乱解析（１０回にわたる測定を平均する）を示す図である。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）単独は、約６８ｎｍの流体力学半径を提示した。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）＋ｇｐ１４０は、約８６ｎｍの半径を示したことから、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）とｇｐ１４０とが、より高次の複合体で相互作用していたことが示される。ゲル中のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の最終濃度は、約０．１％であった。
【図３Ａ】図３は、０．５％のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）と共に、１：１（ｖ／ｖ）（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の最終濃度を０．２５％とする）、室温（２５℃）で、１時間（濃いグレーの白抜きボックス）または３時間（明るいグレーの白抜きボックス）にわたりインキュベートされたＥｎｖポリペプチドの結合について調べるＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）を伴わないＥｎｖポリペプチド（対照としての）も同様にインキュベートした（黒塗りボックス）。ｙ軸は、ＯＤ４５０ｎｍを示し、ｘ軸は、ｇｐ１２０の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。（Ａ）は、ｇｐ１２０試料の、ＣＤ４−ＩｇＧ２（受容体ＣＤ４の代替物）との結合を示す図である。（Ｂ）は、ｇｐ１２０試料の、ｂ１２（ＣＤ４結合部位の中和モノクローナル抗体、ｍＡｂ）との結合を示す図である。（Ｃ）は、可溶性ＣＤ４であるｓＣＤ４の存在下または非存在下における、１７ｂ  ｍＡｂ（ＣＤ４誘導性モノクローナル抗体）との結合を示す図である。ＣＤ４  ＩｇＧ２とｂ１２  ｍＡｂとの結合は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）とのインキュベーションにもかかわらず、コンフォメーション性の受容体結合部位が抗原的に無傷であることを示す。１７ｂ  ｍＡｂの結合により、タンパク質が、機能的Ｅｎｖポリペプチドの鍵となる側面である、ＣＤ４誘導性のコンフォメーション変化を経る可能性があることが確認された。
【図３Ｂ】図３は、０．５％のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）と共に、１：１（ｖ／ｖ）（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の最終濃度を０．２５％とする）、室温（２５℃）で、１時間（濃いグレーの白抜きボックス）または３時間（明るいグレーの白抜きボックス）にわたりインキュベートされたＥｎｖポリペプチドの結合について調べるＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）を伴わないＥｎｖポリペプチド（対照としての）も同様にインキュベートした（黒塗りボックス）。ｙ軸は、ＯＤ４５０ｎｍを示し、ｘ軸は、ｇｐ１２０の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。（Ａ）は、ｇｐ１２０試料の、ＣＤ４−ＩｇＧ２（受容体ＣＤ４の代替物）との結合を示す図である。（Ｂ）は、ｇｐ１２０試料の、ｂ１２（ＣＤ４結合部位の中和モノクローナル抗体、ｍＡｂ）との結合を示す図である。（Ｃ）は、可溶性ＣＤ４であるｓＣＤ４の存在下または非存在下における、１７ｂ  ｍＡｂ（ＣＤ４誘導性モノクローナル抗体）との結合を示す図である。ＣＤ４  ＩｇＧ２とｂ１２  ｍＡｂとの結合は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）とのインキュベーションにもかかわらず、コンフォメーション性の受容体結合部位が抗原的に無傷であることを示す。１７ｂ  ｍＡｂの結合により、タンパク質が、機能的Ｅｎｖポリペプチドの鍵となる側面である、ＣＤ４誘導性のコンフォメーション変化を経る可能性があることが確認された。
【図３Ｃ】図３は、０．５％のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）と共に、１：１（ｖ／ｖ）（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の最終濃度を０．２５％とする）、室温（２５℃）で、１時間（濃いグレーの白抜きボックス）または３時間（明るいグレーの白抜きボックス）にわたりインキュベートされたＥｎｖポリペプチドの結合について調べるＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）を伴わないＥｎｖポリペプチド（対照としての）も同様にインキュベートした（黒塗りボックス）。ｙ軸は、ＯＤ４５０ｎｍを示し、ｘ軸は、ｇｐ１２０の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。（Ａ）は、ｇｐ１２０試料の、ＣＤ４−ＩｇＧ２（受容体ＣＤ４の代替物）との結合を示す図である。（Ｂ）は、ｇｐ１２０試料の、ｂ１２（ＣＤ４結合部位の中和モノクローナル抗体、ｍＡｂ）との結合を示す図である。（Ｃ）は、可溶性ＣＤ４であるｓＣＤ４の存在下または非存在下における、１７ｂ  ｍＡｂ（ＣＤ４誘導性モノクローナル抗体）との結合を示す図である。ＣＤ４  ＩｇＧ２とｂ１２  ｍＡｂとの結合は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）とのインキュベーションにもかかわらず、コンフォメーション性の受容体結合部位が抗原的に無傷であることを示す。１７ｂ  ｍＡｂの結合により、タンパク質が、機能的Ｅｎｖポリペプチドの鍵となる側面である、ＣＤ４誘導性のコンフォメーション変化を経る可能性があることが確認された。
【図４】図４は、表面プラズモン共鳴を介して、Ｅｎｖポリペプチド単独またはポリアニオン性カルボマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標））との複合体でのＥｎｖポリペプチドについて測定される応答単位（ＲＵ：ｙ軸）についてのチャートを示す。センサーチップに結合させた可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）との結合を、左側に白色バーで示す。センサーチップに結合させたグリカン依存性のモノクローナル抗体（２Ｇ１２）との結合を、右側に網掛けしたグレーのバーで示す。
【図５】図５は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）またはＭＦ５９（商標）またはＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）＋ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチド（ＳＦ１６２  ｇｐ１４０）を比較するウサギ研究に由来する、ｇｐ１２０結合ＥＬＩＳＡ（幾何平均力価：ｙ軸）により測定される、血清中の抗体についてのチャートである。２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）における幾何平均力価を、白色バーで示す。３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）における幾何平均力価を、明るいグレーのバーで示す。４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）における幾何平均力価を、黒色バーで示す。
【図６】図６は、チオシアン酸アンモニアＥＬＩＳＡを用いて評価される、血清中のｇｐ１２０特異的抗体のアビディティーについてのチャートである（アビディティー指数：ｙ軸）。血清は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）またはＭＦ５９（商標）またはＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）＋ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチド（ＳＦ１６２  ｇｐ１４０）を比較するウサギ研究に由来する。２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）におけるアビディティー指数を、白色バーで示す。３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）におけるアビディティー指数を、明るいグレーのバーで示す。４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）におけるアビディティー指数を、黒色バーで示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｂは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）またはＭＦ５９（商標）またはＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）＋ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチド（ＳＦ１６２  ｇｐ１４０）を比較するウサギ研究における免疫化レジメンによりもたらされたＥｎｖ特異的抗体の中和能についての結果を示す。各グラフは、（ａ）ＭＦ５９（商標）を伴うＥｎｖポリペプチドによる免疫化、（ｂ）Ｅｎｖポリペプチド−ポリアニオン性カルボマー複合体による免疫化、および（ｃ）ＭＦ５９（商標）を伴うＥｎｖポリペプチド−ポリアニオン性カルボマー複合体による免疫化について、３回目の免疫化の後（ｐ３）、および４回目の免疫化の後（ｐ４）における抗体のＩＤ５０力価を示す。図７Ａは、階層１ａの分離株および階層１ｂの分離株に対する中和能を示す図である。図７Ｂは、階層２の分離株および対照に対する中和能を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）またはＭＦ５９（商標）またはＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）＋ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチド（ＳＦ１６２  ｇｐ１４０）を比較するウサギ研究における免疫化レジメンによりもたらされたＥｎｖ特異的抗体の中和能についての結果を示す。各グラフは、（ａ）ＭＦ５９（商標）を伴うＥｎｖポリペプチドによる免疫化、（ｂ）Ｅｎｖポリペプチド−ポリアニオン性カルボマー複合体による免疫化、および（ｃ）ＭＦ５９（商標）を伴うＥｎｖポリペプチド−ポリアニオン性カルボマー複合体による免疫化について、３回目の免疫化の後（ｐ３）、および４回目の免疫化の後（ｐ４）における抗体のＩＤ５０力価を示す。図７Ａは、階層１ａの分離株および階層１ｂの分離株に対する中和能を示す図である。図７Ｂは、階層２の分離株および対照に対する中和能を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂは、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。各群内５匹ずつのウサギの各々からの結果を示す。黒色の試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。図８Ａは、階層１ａの分離株および階層１ｂの分離株に対する幅および効力を示す。図８Ｂは、階層２の分離株に対する幅および効力を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂは、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。各群内５匹ずつのウサギの各々からの結果を示す。黒色の試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。図８Ａは、階層１ａの分離株および階層１ｂの分離株に対する幅および効力を示す。図８Ｂは、階層２の分離株に対する幅および効力を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｅは、様々な分離株に対する中和ＩＤ５０力価を示す図である。図９Ａは、階層１ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｂは、階層１ａの別の分離株：ＭＮ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｃは、階層１ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｃ）およびＴＶ１．２１（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）およびＤｕ１５６．１２（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｅは、階層２の別の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｅは、様々な分離株に対する中和ＩＤ５０力価を示す図である。図９Ａは、階層１ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｂは、階層１ａの別の分離株：ＭＮ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｃは、階層１ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｃ）およびＴＶ１．２１（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）およびＤｕ１５６．１２（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｅは、階層２の別の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｅは、様々な分離株に対する中和ＩＤ５０力価を示す図である。図９Ａは、階層１ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｂは、階層１ａの別の分離株：ＭＮ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｃは、階層１ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｃ）およびＴＶ１．２１（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）およびＤｕ１５６．１２（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｅは、階層２の別の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｅは、様々な分離株に対する中和ＩＤ５０力価を示す図である。図９Ａは、階層１ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｂは、階層１ａの別の分離株：ＭＮ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｃは、階層１ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｃ）およびＴＶ１．２１（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）およびＤｕ１５６．１２（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｅは、階層２の別の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｅは、様々な分離株に対する中和ＩＤ５０力価を示す図である。図９Ａは、階層１ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｂは、階層１ａの別の分離株：ＭＮ（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｃは、階層１ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｃ）およびＴＶ１．２１（亜型Ｂ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）およびＤｕ１５６．１２（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。図９Ｅは、階層２の別の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）を示す図である。
【図１０】図１０は、ｇｐ１２０結合ＥＬＩＳＡにより測定される、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対する全抗体結合力価を示す図である。また、事前採血（対照としての）についてのバックグラウンドの力価も含まれる。抗体力価は、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドをコートタンパク質として用いるＥＬＩＳＡにより決定した。示されるデータ値は、１群当たり３連で個別にアッセイされた５匹のウサギの幾何平均力価（ＧＭＴ）を表す。
【図１１】図１１は、実施例６の全１０群のウサギであって、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した一価または多価のＥｎｖポリペプチド（および、１つの例では、ＭＦ５９（商標）およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）でアジュバント処理した一価または多価のＥｎｖポリペプチド）により免疫化されたウサギから採取された血清の抗体アビディティーを示す図である。群は、左から右へ、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１４０、ＣＡＰ４５  ｇｐ１４０、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０、ＨＩＶ−２５７１１−２（ＥＦ１１７２７２）ｇｐ１４０、ＣＡＰ２５５（ＥＦ２０３９８２）ｇｐ１４０、ＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１４０、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０＋ＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１４０＋Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０（ＭＦ５９（商標）だけを伴う）、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０＋ＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１４０＋Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０（ＭＦ５９（商標）およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）を伴う）、およびＴＶ１  ｇｐ１４０である。各群についてのアビディティーを、事前採血、２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）、および５回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ５）について、（左から右へ）グレーの網掛けを濃くして示す。アビディティーは、Ｉ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００２年）により記載される通り、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドをコート抗原として用いるＮＨ４ＳＣＮ置換ＥＬＩＳＡにより決定した。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｂは、３回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。黒色の試料は、１０，０００倍を超える血清希釈率で５０％の中和を裏付け、白色の番号を伴う濃いグレーの試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｂは、３回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。黒色の試料は、１０，０００倍を超える血清希釈率で５０％の中和を裏付け、白色の番号を伴う濃いグレーの試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｃは、株の拡大パネルについての４回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。黒色の試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｃは、株の拡大パネルについての４回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。黒色の試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｃは、株の拡大パネルについての４回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。黒色の試料は、１，０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、濃いグレーの試料は、１００〜９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、２０〜９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｅは、ＨＩＶ−１シュードウイルスアッセイを用いて決定される、３回目の免疫化の２週間後（ｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（ｐ４）に得られた血清のＩＤ５０による中和力価を示す図である。図１４Ａは、階層１Ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）（左）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｂは、階層１Ａの第３の分離株：ＭＮ．２（亜型Ｂ）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｃは、階層１Ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｂ）（左）およびＴＶ１．２１（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）（左）およびＤｕ１６５．１２（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｅは、階層２の第３の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和力価を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｅは、ＨＩＶ−１シュードウイルスアッセイを用いて決定される、３回目の免疫化の２週間後（ｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（ｐ４）に得られた血清のＩＤ５０による中和力価を示す図である。図１４Ａは、階層１Ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）（左）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｂは、階層１Ａの第３の分離株：ＭＮ．２（亜型Ｂ）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｃは、階層１Ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｂ）（左）およびＴＶ１．２１（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）（左）およびＤｕ１６５．１２（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｅは、階層２の第３の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和力価を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜Ｅは、ＨＩＶ−１シュードウイルスアッセイを用いて決定される、３回目の免疫化の２週間後（ｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（ｐ４）に得られた血清のＩＤ５０による中和力価を示す図である。図１４Ａは、階層１Ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）（左）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｂは、階層１Ａの第３の分離株：ＭＮ．２（亜型Ｂ）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｃは、階層１Ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｂ）（左）およびＴＶ１．２１（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）（左）およびＤｕ１６５．１２（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｅは、階層２の第３の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和力価を示す図である。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜Ｅは、ＨＩＶ−１シュードウイルスアッセイを用いて決定される、３回目の免疫化の２週間後（ｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（ｐ４）に得られた血清のＩＤ５０による中和力価を示す図である。図１４Ａは、階層１Ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）（左）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｂは、階層１Ａの第３の分離株：ＭＮ．２（亜型Ｂ）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｃは、階層１Ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｂ）（左）およびＴＶ１．２１（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）（左）およびＤｕ１６５．１２（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｅは、階層２の第３の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和力価を示す図である。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜Ｅは、ＨＩＶ−１シュードウイルスアッセイを用いて決定される、３回目の免疫化の２週間後（ｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（ｐ４）に得られた血清のＩＤ５０による中和力価を示す図である。図１４Ａは、階層１Ａの２つの分離株：ＭＷ９６５．２６（亜型Ｃ）（左）およびＳＦ１６２．ＬＳ（亜型Ｂ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｂは、階層１Ａの第３の分離株：ＭＮ．２（亜型Ｂ）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｃは、階層１Ｂの２つの分離株：Ｂａｌ．２６（亜型Ｂ）（左）およびＴＶ１．２１（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｄは、階層２の２つの分離株：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１（亜型Ｃ）（左）およびＤｕ１６５．１２（亜型Ｃ）（右）に対する中和力価を示す図である。図１４Ｅは、階層２の第３の分離株：Ｄｕ４２２．１（亜型Ｃ）に対する中和力価を示す図である。
【図１５】図１５は、ｇｐ１２０結合ＥＬＩＳＡにより測定される、全９群から採取されたウサギ血清についての結合抗体力価を示す図である（幾何平均力価：ｙ軸）。群は、左から右へ、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１４０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０、ＴＶ１  ｇｐ１４０、ＴＶ１  ｇｐ１４０ΔＶ２、ＳＦ１６２  ｇｐ１４０ΔＶ２、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０＋ＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０＋Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０＋ＴＶ１  ｇｐ１４０（群８、多価投与）、およびＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０／Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０／ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０／ＴＶ１  ｇｐ１４０（群９、逐次投与）である。各群についての幾何平均力価を、事前採血、２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）、および最終採血について、（左から右へ）グレーの網掛けを濃くして示す。
【図１６】図１６は、全９群から採取されたウサギ血清の抗体アビディティーを示す図である。群は、左から右へ、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１４０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０、ＴＶ１  ｇｐ１４０、ＴＶ１  ｇｐ１４０ΔＶ２、ＳＦ１６２  ｇｐ１４０ΔＶ２、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１＋ＣＡＰ２３９＋Ｄｕ４２２．１＋ＴＶ１  ｇｐ１４０（群８）、およびＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０／Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０／ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０／ＴＶ１  ｇｐ１４０（群９）である。各群のアビディティー指数は、（左から右へ）２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）、および最終採血を示す。アビディティーは、Ｉ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００２年）により記載される通りに、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドをコート抗原として用いるＮＨ４ＳＣＮ置換ＥＬＩＳＡにより決定した。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｆは、１０のｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドの各々による免疫化および逐次的免疫化実験により誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図１７Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｆは、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１２０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１２０、ＺＭ２４９．ＰＬ１  ｇｐ１２０、およびＴＶ１  ｇｐ１２０による逐次的免疫化（左）、ならびに単一のチャートにおいて被験群の全て（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｆは、１０のｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドの各々による免疫化および逐次的免疫化実験により誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図１７Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｆは、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１２０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１２０、ＺＭ２４９．ＰＬ１  ｇｐ１２０、およびＴＶ１  ｇｐ１２０による逐次的免疫化（左）、ならびに単一のチャートにおいて被験群の全て（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜Ｆは、１０のｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドの各々による免疫化および逐次的免疫化実験により誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図１７Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｆは、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１２０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１２０、ＺＭ２４９．ＰＬ１  ｇｐ１２０、およびＴＶ１  ｇｐ１２０による逐次的免疫化（左）、ならびに単一のチャートにおいて被験群の全て（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜Ｆは、１０のｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドの各々による免疫化および逐次的免疫化実験により誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図１７Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｆは、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１２０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１２０、ＺＭ２４９．ＰＬ１  ｇｐ１２０、およびＴＶ１  ｇｐ１２０による逐次的免疫化（左）、ならびに単一のチャートにおいて被験群の全て（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。
【図１７Ｅ】図１７Ａ〜Ｆは、１０のｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドの各々による免疫化および逐次的免疫化実験により誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図１７Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｆは、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１２０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１２０、ＺＭ２４９．ＰＬ１  ｇｐ１２０、およびＴＶ１  ｇｐ１２０による逐次的免疫化（左）、ならびに単一のチャートにおいて被験群の全て（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。
【図１７Ｆ】図１７Ａ〜Ｆは、１０のｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドの各々による免疫化および逐次的免疫化実験により誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図１７Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図１７Ｆは、ＣＡＰ２３９  ｇｐ１２０、Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１２０、ＺＭ２４９．ＰＬ１  ｇｐ１２０、およびＴＶ１  ｇｐ１２０による逐次的免疫化（左）、ならびに単一のチャートにおいて被験群の全て（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜Ｂは、３回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。濃いグレーの試料は、＞１００００倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、１０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜Ｂは、３回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価）を示すヒートマップである。濃いグレーの試料は、＞１００００倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、１０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図１９】図１９は、免疫化時に誘発される抗Ｅｎｖ抗体のエピトープ特異性をマップするために、固定化ＴＶ１ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対して行った、亜型Ｃのｇｐ１２０による４回目の免疫化の２週間後（２２週目）に採取されたプールウサギ血清（希釈率を１：１００とする）との、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。被験Ｅｎｖポリペプチド単離物を上方に示す。競合アッセイにおいて用いられるエピトープおよびｍＡｂを左側に示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｆは、１０の構築物の各々でモルモットを免疫化することにより誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図２０Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能を示す図である。図２０Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｄは、被験群全ての中和能を単一のチャートに示す図である。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｆは、１０の構築物の各々でモルモットを免疫化することにより誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図２０Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能を示す図である。図２０Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｄは、被験群全ての中和能を単一のチャートに示す図である。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜Ｆは、１０の構築物の各々でモルモットを免疫化することにより誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図２０Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能を示す図である。図２０Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｄは、被験群全ての中和能を単一のチャートに示す図である。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜Ｆは、１０の構築物の各々でモルモットを免疫化することにより誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図２０Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能を示す図である。図２０Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｄは、被験群全ての中和能を単一のチャートに示す図である。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜Ｆは、１０の構築物の各々でモルモットを免疫化することにより誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図２０Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能を示す図である。図２０Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｄは、被験群全ての中和能を単一のチャートに示す図である。
【図２０Ｆ】図２０Ａ〜Ｆは、１０の構築物の各々でモルモットを免疫化することにより誘導された抗体の、ウイルス分離株のパネル（ｘ軸）に対する中和能（ＩＤ５０力価、ｙ軸）を示す図である。図２０Ａは、Ｄｕ１５６．１２  ｇｐ１２０（左）およびＤｕ４２２．１  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｂは、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ４５（ＥＦ２０３９６０）ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｃは、ＣＡＰ８４（ＥＦ２０３９６３）ｇｐ１２０（左）およびＣＡＰ２３９（ＥＦ２０３９８３）ｇｐ１２０（右）の中和能を示す図である。図２０Ｄは、ＴＶ１  ｇｐ１２０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｅは、ＴＶ１  ｇｐ１４０（左）およびＳＦ１６２  ｇｐ１４０（右）の中和能（ＩＤ５０力価での）を示す図である。図２０Ｄは、被験群全ての中和能を単一のチャートに示す図である。
【図２１】図２１は、３回目の免疫化の２週間後に採取された血清を用いる、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価での）を示すヒートマップである。濃いグレーの試料は、＞１００００倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付け、明るいグレーで網掛けした試料は、１０００〜９，９９９倍の血清希釈率で５０％の中和を裏付けた。
【図２２】図２２は、免疫化時に誘発される抗Ｅｎｖ抗体のエピトープ特異性をマップするために、固定化ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対して行った、実施例１０のモルモット研究から３回目の免疫化の２週間後（１４週目）に採取されたプール血清（希釈率を１：５００とする）を用いた、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。被験Ｅｎｖポリペプチド単離物を上方に示す。競合アッセイにおいて用いられるエピトープおよびｍＡｂを左側に示す。
【図２３】図２３は、免疫化時に誘発される抗Ｅｎｖ抗体のエピトープ特異性をマップするために、固定化ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対して行った、実施例１０のモルモット研究から４回目の免疫化の２週間後（２６週目）に採取されたプール血清（希釈率を１：５００とする）を用いた、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。被験Ｅｎｖポリペプチド単離物を上方に示す。競合アッセイにおいて用いられるエピトープおよびｍＡｂを左側に示す。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｄ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｅ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｆ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｇ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｈ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｉ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｊ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【図２４Ｋ】図２４Ａ〜Ｋは、ＭＦ５９（商標）＋ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）でアジュバント処理したｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した５５匹のウサギの、免疫化を開始した後の様々な時点（ｘ軸）における体重（ｙ軸）を示す図である。図２４Ａは、ウサギ１〜５を示す図である。図２４Ｂは、ウサギ６〜１０を示す図である。図２４Ｃは、ウサギ１１〜１５を示す図である。図２４Ｄは、ウサギ１６〜２０を示す図である。図２４Ｅは、ウサギ２１〜２５を示す図である。図２４Ｆは、ウサギ２６〜３０を示す図である。図２４Ｇは、ウサギ３１〜３５を示す図である。図２４Ｈは、ウサギ３６〜４０を示す図である。図２４Ｉは、ウサギ４１〜４５を示す図である。図２４Ｊは、ウサギ４６〜５０を示す図である。図２４Ｋは、ウサギ５１〜５５を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
好ましい実施形態の詳細な説明
ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）は、体液性免疫反応に対して曝露される主要なウイルス性タンパク質なので、ワクチン開発のための重要な標的である。Ｅｎｖを用いる強力な抗ＨＩＶ−１中和抗体の誘発は、様々な因子により複雑化している。鍵となる因子は、Ｅｎｖの抗原変異および構造上の複雑性である。組換えＥｎｖ糖タンパク質は、アジュバントの非存在下で準最適の免疫原性を示している。したがって、Ｅｎｖ免疫原デザインの最適化に加えて、新規のアジュバントおよび／または送達系の同定が、ＨＩＶに対してワクチンを媒介する防御的免疫反応を発生させるのに重要である。
【００２１】
Ｅｎｖは、特に不安定でコンフォメーション依存性の中和エピトープなので、抗原性構造を変性させたり有害に改変したりすることのないアジュバントが好ましい。以下の例は、Ｅｎｖポリペプチドとの複合体で用いると、架橋ポリアクリル酸ポリマー（ポリアニオン性カルボマーまたはＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標））が、頑健な免疫反応を誘発することを裏付ける。ポリアクリル酸ポリマーは、とりわけ、ＭＦ５９（商標）など、他のアジュバントと組み合わせて、免疫反応をさらになお改善しうる点で有利である。重要なことは、例により、ポリアニオン性カルボマーを、ＭＦ５９（商標）と共に用いると、中和抗体の幅および効力全体の改善が示されることである。全体として、例により、ポリアニオン性カルボマーが、ポリペプチドの抗原性構造または安定性を変化させずに、Ｅｎｖとの複合体を形成することが可能であり、複合体が、単独で、またはＭＦ５９（商標）など、他のアジュバントと組み合わせてワクチン接種されると、より良好な免疫反応を誘発することが確認される。理論に拘束されずに述べるなら、免疫反応の改善は、ポリアニオン性カルボマーが、Ｅｎｖポリペプチドを、免疫系内の特定の細胞に方向付けるかもしくは提示すること、ならびに／またはポリアニオン性カルボマーが、保存時およびワクチン接種後において、Ｅｎｖポリペプチドを安定化させることに起因しうるであろう。加えて、Ｅｎｖポリペプチドは、平均粘性が２５，０００ｃＰ未満（２５℃、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶＴ、２０ｒｐｍ、ｐＨ７．３〜７．８へと中性化された０．５重量％の漿剤、スピンドル＃６）、２０，０００ｃＰ未満、１５，０００ｃＰ未満である、低粘性のポリアニオン性ポリマーでアジュバント処理することもできる。このような低粘性のポリアニオン性ポリマーの好ましい例は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）である。
【００２２】
別段に示されない限り、開示される組成物および方法の実施は、当該分野の技量の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法しか必要としない。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２版、１９８９年）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ、（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ  編、１９９７年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を参照されたい。
【００２３】
ポリアニオン性カルボマーポリマー
本明細書で開示される組成物および方法において用いられるポリアニオン性カルボマーポリマーは、アクリル酸ポリマーである。これらのアクリル酸ポリマーは、ホモポリマーの場合もあり、コポリマーの場合もある。ポリアニオン性カルボマーポリマーは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）という商標名で市販されている。アクリル酸ポリマーは、例えば、米国特許第２，９０９，４６２号および同第３，７９０，６６５号において記載されている。
【００２４】
免疫原性が改善された複合体を形成する多くのポリアニオン性カルボマーポリマーが選び出されるが、好ましいポリアニオン性カルボマーポリマーは、交差結合が少なく、残留ベンゼン（潜在的に毒性の高い有機化合物）を回避するように、ベンゼンの存在下では形成されないポリアニオン性カルボマーポリマーである。ベンゼンではなく、残留酢酸エチル溶媒（ＩＣＨガイドラインに従うクラスＩＩＩの溶媒）を有するので、好ましい特徴に基づき、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）ポリマーを選択した。本発明者らはまた、化学的に類似し、それが安全であることを示す毒性データおよび他の裏付けデータも多いので、９７４Ｐ  ＮＦも検討したが、それが分子量が極めて大きな架橋ポリアクリル酸であるので、本発明者らは、９７１Ｐ  ＮＦを選択することに決めた。なぜなら、９７１Ｐ  ＮＦは、比較的架橋が少ないポリマーであり、溶媒和を支援しうるからである。９７４Ｐ  ＮＦについては規制に関する情報および毒性情報が入手可能であり、それらは、９７１Ｐ  ＮＦに対しても適用可能である可能性が高いので、本発明者らは、本発明者らの研究において、後者を選び出すことで満足した。
【００２５】
ポリマーに依存するこれらのポリマーの分子量範囲は、７４０，０００から４〜５００万ダルトンであると推定される。この種類の架橋（すなわち、三次元）ポリマーの実際の分子量を測定する方法は利用可能でないので、サイズは、動的光散乱など、他の手段により推定しなければならない。ホモポリマーの骨格は同じである、すなわち、重合化したアクリル酸である。主な差違は、用いられる架橋剤ではなく、架橋密度および推定される分子量に関する。架橋剤密度の極めて微細な調整により、全体的な分子構造は類似するが、適用特性、例えば、粘性は変化する多数のポリアニオン性カルボマーポリマーを作製することができる。架橋密度は、アクリル骨格上の架橋剤の位置の微小なシフトにより変化させることができる。実際の架橋剤自体は、存在しても、特定のアクリル酸ポリマーの生物学的特性に対してほとんど影響を及ぼさないため、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ、Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＴＦＡ）は、ファミリーモノグラフである「カルボマー」を、これらのポリマーに適合させた。
【００２６】
ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）、ＰＥＭＵＬＥＮ（商標）、およびＮＯＶＥＯＮ（商標）などのポリアニオン性カルボマーポリマーは、本発明の範囲内のポリマーである。これらの特定のポリアニオン性カルボマーポリマーは、ポリアルケニルエーテルまたはジビニルグリコールで架橋されている。
【００２７】
ポリアニオン性カルボマーポリマーは、平均直径約０．２ミクロンの粒子の凝集粉末である。各粒子は、架橋により相互接続されたポリマー鎖の網目構造としてみなすことができる。架橋を伴わなければ、一次粒子は、絡み合ってはいるが化学的に結合していない直鎖状ポリマー鎖の収集物となるだろう。これらの直鎖状ポリマーは、水などの極性溶媒中で可溶性である。ポリアニオン性カルボマーポリマーは、水中において４〜６を上回るｐＨ環境に曝露されると、それらの元の容量の最大で１０００倍に膨潤（かつ、それらの元の直径の１０倍に膨潤）して、ゲルを形成する。これらのポリマーのｐＫａは、６±０．５であるので、ポリマー骨格上のカルボン酸基がイオン化する結果として、負の粒子間に斥力がもたらされ、これらはポリマーの膨潤を増す。架橋ポリマーは、水中で溶解しない。
【００２８】
特定の種類のポリアニオン性カルボマーポリマーの特徴：ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９３４  Ｐ（商標）は、アリルスクロースで架橋され、溶媒であるベンゼン中で重合化している。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）（７１Ｇ、９７４  Ｐ）は、アリルペンタエリトリトールで架橋され、酢酸エチル中で重合化している。ポリカルボフィルは、ジビニルグリコールでの架橋ポリマーであり、溶媒であるベンゼン中で重合化している。酢酸エチル中で作製された全てのポリマーは、１〜３％の水酸化カリウムにより中性化される。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）とＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４  Ｐ（商標）とは、同様の条件下で、同じ工程により製造されるが、それらの差違は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）の架橋結合剤のレベルが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４  Ｐ（商標）よりわずかに低いことである。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ７１  Ｇ（商標）は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の顆粒状の形態である。
【００２９】
構造と特性との関係は、産学両方で関心の対象となっている。異なるグレードのポリアニオン性カルボマーポリマーは、粒子サイズ、架橋間分子量（Ｍｃ）、Ｍｃの分布、および全ユニット中で末端、すなわち、遊離鎖端として生じる割合の反映である、異なるレオロジー特性を呈示する。隣接する架橋間の分子量（Ｍｃ）は、架橋剤密度とほぼ反比例する。これらは、鎖端を無視できると仮定すると、架橋結合単量体の官能性、架橋結合単量体に対するアクリル酸の相対比率、および架橋結合反応の効率から計算することができる。代替的に、分子量を、膨潤したゲルのレオロジー特性および／または平衡膨潤比と定性的に比較することもできる。簡単に言えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）など、低粘性、低剛性のポリマーは、Ｍｃが大きい。逆に、低粘性、低剛性のポリマーは、架橋剤密度が小さい。架橋剤レベルが高いほど、平衡膨潤比は低くなる。弾性の網目理論では、弾性係数Ｇが、架橋間分子量（Ｍｃ）と反比例する。
【００３０】
ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）は、使用レベルが低ければ、極めて低い粘性および優れた降伏値をもたらす。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）により形成される懸濁液は、レオロジーが緩やかとなるであろう。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ７１  Ｇ（商標）ポリマーも、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１  Ｐ（商標）と同じ粘性およびレオロジーをもたらすであろうが、その顆粒状の性質のために、取り扱いがより容易であり、分散させやすい。
【００３１】
毒性の詳細：ポリアニオン性カルボマーポリマーは、他の高分子量ポリマーと同様に、それらの物理的特性および化学的特性に基づき、毒性可能性および刺激可能性の低さを裏付ける。したがって、このような架橋された高分子量アクリル酸ポリマーは、多種多様な化粧品、洗浄剤、および医薬品に関与する適切な規制機関および非規制機関により、このような製品において用いるのに安全であることが見出されている。
【００３２】
カルボマーとは、ＵＳＰ−ＮＦ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ａｄｏｐｔｅｄ  Ｎａｍｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＵＳＡＮ）、およびＣＴＦＡにより採用された、様々なＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）ポリマーの一般名（すなわち、非専売名）である。Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗ（ＣＩＲ）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌは、化粧品成分用のカルボマーの安全性についての評価において、カルボマーの毒性を、以下の通りにまとめた：ラット、モルモット、マウス、およびイヌによる急性経口研究は、カルボマー９１０、カルボマー９３４、カルボマー９４０、およびカルボマー９４１が、摂取されても低毒性であることを示した。アルビノラットにおけるカルボマー９１０の吸入によるＬＣ５０は、１．７１ｍｇ／ｌであった。カルボマー９１０に対して曝露されたラットの皮膚ＬＣ５０は、３．０ｇ／ｋｇを超えた。水溶液中に１％、２％、または３％のカルボマー９３４を、用量５ｍｌ／ｋｇで静脈内注射されたウサギにおいて死亡は生じなかった。ウサギは、１００％のカルボマー９１０またはカルボマー９３４で調べたところ、最小限の皮膚刺激を示し、０．２０〜１００％の濃度のカルボマー９１０、カルボマー９３４、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４０、カルボマー９４１、および／またはそれらの様々な塩で調べたところ、眼刺激が見られない〜中等度の眼刺激を示した。ラットに最大用量５．０ｇ／ｋｇ／日のカルボマー９３４を亜慢性的に給餌すること（４９日間）、ならびにラットおよびイヌの食餌中に最大５．０％のカルボマー９３４Ｐ（２１および／または９０日間）を亜慢性的に給餌することは、正常未満の体重を結果としてもたらした。食餌中５．０％のレベルのカルボマー９３４Ｐを９０日間にわたり施されたラットでは、肝臓の絶対重量ならびに肝臓対体重比および肝臓対脳重量比が低減されたが、病理学的変化は観察されなかった。本明細書で開示される組成物および方法では、どのポリアニオン性カルボマーポリマーを用いるのかについて選択する場合、当業者は、このような問題を容易に考慮に入れることができる。
【００３３】
カルボマー９３４（ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９３４（商標））およびその様々な塩による臨床研究は、０．５％、５．０％、１０．０％、および１００％の濃度において、これらのポリマーの皮膚刺激および皮膚感作の可能性が低いことを示した。ヒトについて１．０％の濃度で調べたところ、カルボマー９４０、カルボマー９４１、およびそれらの様々な塩もまた、皮膚刺激および皮膚感作の可能性が低いことを裏付けた。さらに、最大０．２５％のカルボマー９３４を含有する処方物も、ヒトにおける皮膚刺激、感作、光毒性、および光接触アレルゲン性の可能性が低いことを裏付けた。カルボマー９４０およびカルボマー９４１の皮膚刺激および皮膚感作の可能性を評価するための臨床データは、１．０％の濃度のみを調べる研究に限定された。光毒性および光接触アレルゲン性を評価するための臨床データは、０．２５％のカルボマー９３４の濃度のみを調べる処方物研究に限定された。
【００３４】
ＣＩＲ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌは、カルボマー中の不純物としてのベンゼンの存在に注意を喚起し、ベンゼンを可能な最低レベルまで低減するよう努めることを推奨した。この目標を追求する中で、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．は、代替的な重合化用溶媒系（例えば、酢酸エチル、シクロヘキサンなど）を用いる新たなＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）ポリマーを開発した。したがって、ベンゼンの存在下で形成されていないＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）などのポリアニオン性カルボマーポリマーを用いることが好ましい。これらのポリアニオン性カルボマーポリマーは、ベンゼンにより重合化させたポリアニオン性カルボマーポリマーと化学的に同一であり、したがって、Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ’ｓ  ＴＳＣＡ目録では、アクリル酸ポリマーまたはアクリル酸コポリマーとして列挙されている。
【００３５】
酢酸エチルにより重合化させたポリマーについての予備毒性試験の結果は、既製品と本質的に同様である。ヒト反復パッチ試験において、酢酸エチルにより重合化させたポリマーは、一次刺激原でも感作物質でもない。皮膚ＬＤ５０は、ウサギの体重１ｋｇ当たり２０００ｍｇを超えた。同様に、酢酸エチルにより重合化させたポリマーは、ウサギの眼に対する刺激性も最小限であった。十分なポリマーの挿管が可能ではなかったので、急性経口ＬＤ５０は得ることができなかった。酢酸エチル中で作製されたポリアニオン性カルボマーポリマーについての結果は、これらのポリマーについて予測される結果と符合した。すなわち、酢酸エチル中で作製されたポリアニオン性カルボマーポリマーは、ウサギの皮膚に対する刺激原ではなく、希釈されないポリマーは、ウサギの眼に対する軽度〜中等度の刺激原であったが、１％溶液（中和溶液および非中和溶液）は、眼に対する刺激原ではなく、ヒト皮膚に対する適用は、いかなる皮膚刺激も皮膚感作も引き起こさなかった。ラットにおけるＬＤ５０は、５，０００ｍｇ／ｋｇを超え、ウサギにおける皮膚ＬＤ５０は、２，０００ｍｇ／ｋｇを超える。
【００３６】
ポリアニオン性カルボマーポリマーの物理的特性および構造の類似性を踏まえると、当業者は、任意のポリアニオン性カルボマーポリマーにより、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）と同様の結果がもたらされることを認識するであろう。したがって、当業者は、任意の数の入手可能なポリアニオン性カルボマーポリマーから容易に選択して、前出に基づき本明細書で得られる驚くべき結果をもたらすことができるであろう。
【００３７】
低粘性のポリアニオン性ポリマーを選択する場合、平均粘性は、２５，０００ｃＰ未満（２５℃、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶＴ、２０ｒｐｍ、ｐＨ７．３〜７．８に中性化された０．５重量％の漿剤、スピンドル＃６）、２０，０００ｃＰ未満、または１５，０００ｃＰ未満となろう。低粘性のポリアニオン性ポリマーの好ましい例は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）である。
【００３８】
Ｅｎｖポリペプチド
Ｅｎｖポリペプチドは、エンベロープタンパク質に由来する、好ましくは、ＨＩＶ  Ｅｎｖに由来する分子を含む。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、約１６０ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ１６０）である。宿主細胞のウイルス感染時において、ｇｐ１６０は、宿主細胞のプロテアーゼにより切断されて、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質であるｇｐ４１を形成する。ｇｐ４１部分が、ビリオンの膜二重層にアンカリングされる（かつ、これを貫通する）のに対し、ｇｐ１２０セグメントは、周囲環境に突出する。ｇｐ１２０とｇｐ４１との間では共有結合的付着がなされないので、遊離ｇｐ１２０は、ビリオンおよび感染細胞の表面から放出される。Ｅｎｖポリペプチドはまた、ｇｐ１４０ポリペプチドも含みうる。Ｅｎｖポリペプチドは、単量体として存在する場合もあり、三量体として存在する場合もある。
【００３９】
Ｅｎｖポリペプチドは、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域に由来する分子を含む。ｇｐ１２０の一次アミノ酸配列は、約５１１アミノ酸であり、約６０，０００ダルトンのポリペプチドコアを伴う。このポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化により広範に修飾されて、この分子の見かけの分子量を１２０，０００ダルトンに増大させる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列（したがって、ならびにｇｐ１４０およびｇｐ１６０のアミノ酸配列）は、５つの超可変ドメインを散在させた５つの比較的保存されたドメインを含有する。ＨＩＶ−１ＨＸＢ−２株のｇｐ１２０の一次配列中の１８のシステイン残基の位置、およびｇｐ１２０の配列中の約２４のＮ結合型グリコシル化部位のうちの１３の位置は、全てではないにせよ大半のｇｐ１２０の配列に共通である。超可変ドメインは、広範なアミノ酸の置換、挿入、および欠失を含有する。この変異にもかかわらず、全てではないにせよ、大半のｇｐ１２０の配列は、ウイルス受容体ＣＤ４に結合するウイルスの能力を保持する。
【００４０】
Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、およびｇｐ１６０）は、βシートを形成する４つのアンチパラレルのβ鎖（β２、β３、β２０、およびβ２１）からなる「架橋シート」を含む。β鎖の１つの対（β２およびβ３）からは、２つのループであるＶ１およびＶ２が突出している。ＳＦ−１６２に関して述べると、β２シートが、アミノ酸残基１１３（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１１７（Ｔｈｒ）近傍で生じるのに対し、β３は、アミノ酸残基１９２（Ｓｅｒ）〜アミノ酸残基１９４（Ｉｌｅ）近傍で生じる。ＳＦ−１６２に関して述べると、「Ｖ１／Ｖ２領域」は、アミノ酸１２０位（Ｃｙｓ）〜残基１８９（Ｃｙｓ）近傍で生じる（例えば、Ｗｙａｔｔら（１９９５年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６９巻：５７２３〜５７３３頁；Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら（１９９８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：７８４０〜７８４５頁を参照されたい）。β鎖の第２の対（β２０およびβ２１）からは、本明細書ではまた「架橋シートの小型ループ」とも称する「小型ループ」構造が突出している。ＨＸＢ−２に関して述べると、本明細書およびＷＯ００／３９３０３における教示に従い、小型ループまたは架橋シートの小型ループの両方の位置を決定することができる。表１は、ＳＦ１６２株に基づく代表的なＥｎｖポリペプチドをコードする合成遺伝子および対応する配列番号のリストを提示する。
【００４１】
【表１】
2014533290.tif 000002
【００４２】
さらに、Ｅｎｖポリペプチドは、本明細書で記載される正確な配列のうちの１つを有するポリペプチドに限定されない。実際、ＨＩＶゲノムは、定常的なフラックス状態にあり、分離株の間で比較的高度な変動性を呈示するいくつかの可変ドメインを含有する。Ｅｎｖポリペプチドという用語が、同定されたＨＩＶ分離株のほか、新たに同定される分離株およびこれらの分離株の亜型のうちのいずれかに由来するＥｎｖ（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、およびｇｐ１２０）ポリペプチドを包含することは、容易に明らかである。本明細書では、ＳＦ１６２に関する構造的特色についての記載が示される。本開示および当技術分野の教示を考慮して当業者は、他のＨＩＶ変異体（例えば、分離株であるＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４）、多様な亜型（例えば、亜型Ａ〜ＧおよびＯ）に由来する他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および多様な亜型（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）における対応する領域を決定することができる。（例えば、配列比較プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴプログラムおよび本明細書で記載される他のプログラム）または構造的特色の同定およびアライメント（例えば、Ｐシート領域を同定しうる本明細書で記載される「ＡＬＢ」プログラムなどのプログラム）を使用する、これらの類縁のウイルスおよび他の類縁のウイルスの記載については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版（Ｗ．  Ｋ．  Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８年）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２版（Ｂ．  Ｎ．  ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．  Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ編、１９９１年）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版（Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ  Ｎ、Ｄ  Ｍ  Ｋｎｉｐｅ、Ｐ  Ｍ  Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．を参照されたい）。Ｅｎｖポリペプチドの実際のアミノ酸配列は、任意のＨＩＶ変異体に基づきうる。
【００４３】
加えて、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、およびｇｐ１２０）という用語は、さらなる内部の欠失、付加、および置換など、天然配列へのさらなる修飾を含むタンパク質も包含する。これらの修飾は、部位指向変異誘発を介するなど、意図的な場合もあり、自然発生の変異事象を介するなど、偶発的な場合もある。しかし、修飾は、免疫活性（すなわち、ＨＩＶにおいて見出されるＥｎｖポリペプチドに対する抗体応答を誘発する能力）が失われないような修飾でなければならない。
【００４４】
Ｅｎｖポリペプチドに対する修飾および変異の例は、架橋シート部分、場合によって、可変領域Ｖ１およびＶ２の全部または一部の欠失または置き換えを含む。一般に、修飾Ｅｎｖポリペプチドでは、ＣＤ４結合部位を露出させるのに十分な架橋シートが除去されるが、正しいフォールディング（例えば、正しい形状）を可能とするのに十分な構造は残される。したがって、β２０領域およびβ２１領域への修飾（ＨＸＢ−２に関して述べると、アミノ酸残基４２０とアミノ酸残基４３５との間の近傍）が好ましい。加えてまた、β２領域およびβ３領域への修飾（アミノ酸残基１１９（Ｃｙｓ）とアミノ酸残基２０１（Ｉｌｅ）の間の近傍）、ならびにＶ１ループ領域およびＶ２ループ領域への修飾（例えば、欠失）も施すことができる。他の例示的な変異は、Ｅｎｖ内の切断部位を無効にして、オリゴマーであるｇｐ１４０の、ｇｐ１２０単量体への酵素的切断を防止しうる（例えば、Ｅａｒｌら（１９９０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：６４８〜６５２頁；Ｅａｒｌら（１９９１年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：３１〜４１頁を参照されたい）。さらに他の実施形態では、Ｎ−グリコシル化部位を除去することができる。Ｅｎｖポリペプチドに対するさらなる修飾および変異は、ＷＯ００／３９３０３、ＷＯ００／３９３０２、ＷＯ００／３９３０４、およびＷＯ０２／０４４９３において見出すことができる。Ｅｎｖポリペプチドのさらなる例は、米国特許第５，７９２，４５９号において見出すことができる（ＨＩＶＳＦ２Ｅｎｖポリペプチドの記載について）。
【００４５】
免疫原性Ｅｎｖポリペプチドとは、診断での文脈で、タンパク質が投与される個体において免疫反応を誘発することが可能となるように、または、問題となるＨＩＶに対する抗体と反応することが可能となるように、少なくとも１つのエピトープを含む分子である。
【００４６】
さらなるＨＩＶポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆなど）の野生型のＨＩＶコード配列は、任意の公知のＨＩＶ分離株から選択することができる。野生型のコード領域は、以下で論じられる様式のうちの１種または複数を含めた任意の様式で修飾することができる。上記で論じた通り、異なる変異を、異なる遺伝子のコード配列に導入することができる。
【００４７】
ＨＩＶゲノムおよび様々なポリペプチドコード領域を、表２に示す。８−５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（Ｃ型ＨＩＶの分離株）に関して、ヌクレオチド位置も示す。しかし、本開示の教示を考慮すると当業者には、他のＨＩＶ株または変異体（例えば、分離株であるＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４）、多様な亜型（例えば、亜型Ａ〜ＧおよびＯ）に由来する他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および多様な亜型（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）における対応する領域をどのようにして決定するのかが容易に明らかとなるであろう。（例えば、配列比較プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴプログラムおよび本明細書で記載される他のプログラム）または構造的特色の同定およびアライメント（例えば、様々な領域を同定しうる本明細書で記載される「ＡＬＢ」プログラムなどのプログラム）を使用する、これらの類縁のウイルスおよび他の類縁のウイルスの記載については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版（Ｗ．  Ｋ．  Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８年）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２版（Ｂ．  Ｎ．  ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．  Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ編、１９９１年）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版（Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ  Ｎ、Ｄ  Ｍ  Ｋｎｉｐｅ、Ｐ  Ｍ  Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．を参照されたい）。
【００４８】
【表２−１】
2014533290.tif 000003
【００４９】
【表２−２】
2014533290.tif 000004
【００５０】
Ｇａｇポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチドは、Ｇａｇポリペプチドを含みうる。エピトープの数を増やすために、Ｇａｇポリペプチドには、全長Ｇａｇポリメラーゼ配列が含まれうる。このような全長ポリペプチドは、潜在的に有害な機能的酵素である逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）を含む（構造タンパク質およびプロテアーゼに加えて）ため、ＲＴ機能およびＩＮＴ機能を不活化することが重要である。ＲＴのリーディングフレーム内およびＩＮＴのリーディングフレーム内に、いくつかのインフレームの欠失を施して、それらのＲＴ活性およびＩＮＴ活性に関して非機能的な触媒性酵素を得ることができる（例えば、Ｊａｙ．  Ａ．  Ｌｅｖｙ（編）（１９９５年）、Ｔｈｅ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５０３３ｘ、２１５〜２０頁；Ｇｒｉｍｉｓｏｎ，  Ｂ．およびＬａｕｒｅｎｃｅ，  Ｊ．（１９９５年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、９巻（１号）：５８〜６８頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ｋ．ら（１９９２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６６巻（１１号）：６８０６〜６８１２頁；Ｅｓｎｏｕｆ，  Ｒ．ら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（４号）：３０３〜３０８頁；Ｍａｉｇｎａｎ，  Ｓ．ら（１９９８年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８２巻（２号）：３５９〜３６８頁；Ｋａｔｚ，  Ｒ．  Ａ．およびＳｋａｌｋａ，  Ａ．  Ｍ．（１９９４年）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７３巻；Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ，  Ａ．ら（１９９３年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、９０巻（１３号）：６３２０〜６３２４頁；Ｈｉｃｋｍａｎ，  Ａ．  Ｂ．ら（１９９４年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９巻（４６号）：２９２７９〜２９２８７頁；Ｇｏｌｄｇｕｒ，  Ｙ．ら（１９９８年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、９５巻（１６号）：９１５０〜９１５４頁；Ｇｏｅｔｔｅ，  Ｍ．ら（１９９８年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７３巻（１７号）：１０１３９〜１０１４６頁；Ｇｏｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｌ．ら（１９９８年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２巻（６号）：５０４６〜５０５５頁；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，  Ａ．ら（１９９７年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１巻（５号）：３５０７〜３５１４頁；Ｄｙｄａ，  Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６巻（５１９３号）：１９８１〜１９８６頁；Ｄａｖｉｅｓ，  Ｊ．  Ｆ．ら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻（５００２号）：８８〜９５頁；Ｂｕｊａｃｚ，  Ｇ．ら（１９９６年）、Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３９８巻（２−３号）：１７５〜１７８頁；Ｂｅａｒｄ，  Ｗ．  Ａ．ら（１９９６年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１巻（２１号）：１２２１３〜１２２２０頁；Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ，  Ｌ．  Ａ．ら（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻（５０６５号）：１７８３〜１７９０頁；；Ｋｒｕｇ，  Ｍ．  Ｓ．およびＢｅｒｇｅｒ，  Ｓ．  Ｌ．（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻（４４号）：１０６１４〜１０６２３頁；Ｍａｚｕｍｄｅｒ，  Ａ．ら（１９９６年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４９巻（４号）：６２１〜６２８頁；Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ，  Ｃ．ら（１９９７年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２巻（１７号）：１１１５７〜１１１６４頁；Ｒｏｄｇｅｒｓ，  Ｄ．  Ｗ．ら（１９９５年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、９２巻（４号）：１２２２〜１２２６頁；Ｓｈｅｎｇ，  Ｎ．およびＤｅｎｎｉｓ，  Ｄ．（１９９３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２巻（１８号）：４９３８〜４９４２頁；Ｓｐｅｎｃｅ，  Ｒ．  Ａ．ら（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７巻（５２００号）：９８８〜９９３頁を参照されたい）。
【００５１】
さらに、選択されたＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープを、Ｇａｇポリメラーゼポリペプチドの、ＲＴコード配列およびＩＮＴコード配列の欠失内に付加して、ＲＴおよびＩＮＴの機能的修飾によって欠失させた任意のエピトープを置き換え、かつ増強することができる。代替的に、ＲＴおよびＩＮＴから選択されたＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープを含めた）が、他のさらなるＨＩＶポリペプチド内に含まれうる。（公知のＨＩＶ  Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの記載については、ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＴＬ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ、１９８７〜１９９７年；インターネットアドレスｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖのディレクトリｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ下を参照されたい）。
【００５２】
プロテアーゼに対する代表的な変異は、プロテアーゼ活性の減衰（Ｔｈｒ２６Ｓｅｒ）およびプロテアーゼの不活化（Ａｓｐ２５Ａｌａ）を含む（例えば、Ｋｏｎｖａｌｉｎｋａら、１９９５年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６９巻：７１８０〜８６頁）。逆転写酵素に対する代表的な変異は、触媒中心の欠失（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５年、３４巻、５３５１頁、Ｐａｔｅｌら）、およびプライマーのグリップ領域の欠失（例えば、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７２巻、１７号、１１１５７頁、Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら、１９９７年）を含む。インテグラーゼに対する代表的な変異は、ＨＨＣＣドメインの変異（Ｃｙｓ４０Ａｌａ）、触媒中心の不活化（Ａｓｐ６４Ａｌａ、Ａｓｐ１１６Ａｌａ、Ｇｌｕ１５２Ａｌａ）（例えば、Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、１９９５年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６９巻：３７６頁）、および最小ＤＮＡ結合ドメイン（ＭＤＢＤ）（ｍｉｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）の不活化（Ｔｒｐ２３５の欠失）（例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａら、１９９９年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３巻：４４７５頁）を含む。
【００５３】
Ｐｏｌポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチドは、Ｐｏｌポリペプチドを含みうる。Ｐｏｌポリペプチドは、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、および／またはインテグラーゼ含有配列を含むタンパク質コード領域を含むがこれらに限定されない（Ｗａｎら（１９９６年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、３１６巻：５６９〜５７３頁；Ｋｏｈｌら（１９８８年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻：４６８６〜４６９０頁；Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈら（１９８８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６２巻：４３９３〜４３９７頁；Ｃｏｆｆｉｎ、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３７〜１５００頁（Ｒａｖｅｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０年）；Ｐａｔｅｌら（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻：５３５１〜５３６３頁）。したがって、本明細書におけるＰｏｌポリペプチドは、これらの領域のうちの１つまたは複数、および結果として得られるアミノ酸配列に対する１種または複数の変化を含むことができる。
【００５４】
特定の実施形態では、ＲＴの触媒中心および／またはプライマーのグリップ領域を、上記の通りに修飾する。ＲＴの触媒中心およびプライマーのグリップ領域は、例えば、Ｐａｔｅｌら（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４巻：５３５１頁；およびＰａｌａｎｉａｐｐａｎら（１９９７年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻（１７号）：１１１５７頁において記載されている。例えば、ＡＦ１１０９７５に関して番号付けされたｐ６６  ＲＴの１８３〜１８５位におけるアミノ酸ＹＭＤＤをコードする野生型の配列を、アミノ酸「ＡＰ」をコードする配列で置き換えることができる。さらに、プライマーのグリップ領域（ＡＦ１１０９７５に関して番号付けされたｐ６６ＲＴの残基２２９〜２３２であるアミノ酸ＷＭＧＹ）を、アミノ酸「ＰＩ」をコードする配列で置き換えることもできる。
【００５５】
Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチドは、Ｖｉｆポリペプチド、Ｖｐｒポリペプチド、およびＶｐｕポリペプチドを含みうる。関連する遺伝子産物の機能の低減または消失は、当技術分野で利用可能な日常的な方法を使用して達成することができる。例として述べると、Ｓｉｍｏｎら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７３巻：２６７５〜８１頁、１９９９年）は、Ｖｉｆの変異について教示している。Ｓｉｍｏｎら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０６５０〜５７頁、２０００年）は、Ｖｐｒの変異について教示している。Ｔｉｇａｎｏｓら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５１巻：９６〜１０７頁、１９９８年）は、Ｖｐｕの変異について教示している。
【００５６】
Ｔａｔポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチドは、Ｔａｔポリペプチドを含み得る。Ｔａｔポリペプチドは、当技術分野で教示される日常的な方法を用いて修飾することができる（例えば、２２位におけるシステイン残基を、グリシンで置き換えるか、または３７位におけるシステインを、セリンで置き換える；Ｃａｐｕｔｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３巻：２３５頁、１９９６年）。
【００５７】
Ｒｅｖポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチドは、Ｒｅｖポリペプチドを含み得る。Ｒｅｖポリペプチドは、当技術分野で教示される日常的な方法を用いて修飾することができる（例えば、Ｒｅｖドメインにおける変異（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、１９９８年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：２９３５〜４４頁）、ＲＮＡ結合核局在化における変異（ＡｒｇＡｒｇ３８，３９ＡｓｐＬｅｕ＝Ｍ５）、および活性化ドメインにおける変異（ＬｅｕＧｌｕ７８，７９ＡｓｐＬｅｕ＝Ｍ１０））。
【００５８】
Ｎｅｆポリペプチド
さらなるＨＩＶポリペプチドは、Ｎｅｆポリペプチドを含みうる。Ｎｅｆポリペプチドは、当技術分野で教示される日常的な方法を用いて修飾することができる（例えば、ミリストイル化シグナルの変異およびオリゴマー化ドメインにおける変異：ミリストイル化シグナルに対する点変異（Ｇｌｙ−ｔｏ−Ａｌａ＝−Ｍｙｒ）、Ｎ末端の最初の１８アミノ酸（亜型Ｂ、例えば、ＳＦ１６２）またはＮ末端の最初の１９アミノ酸（亜型Ｃ、例えば、南アフリカクローン）の欠失：−Ｍｙｒ１８または−Ｍｙｒ１９（それぞれ）（例えば、ＰｅｎｇおよびＲｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、２００１年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７８巻：１９５〜２００頁）、オリゴマー化ドメインに対する単一の点変異（Ａｓｐ１２５Ｇｌｙ（亜型Ｂ；ＳＦ１６２）またはＡｓｐ１２４Ｇｌｙ（亜型Ｃ；南アフリカクローン））（例えば、Ｌｉｕら、２０００年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４巻：５３１０〜１９頁）、ならびに（１）ＨＩＶ−ビリオンの感染性（複製）、および／または（２）ＣＤ４の下方制御に影響を及ぼす変異（例えば、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら（２００２年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７６巻（９号）：４６２５〜３３頁））。
【００５９】
ＥｎｖポリペプチドおよびさらなるＨＩＶポリペプチドを作製する方法
本明細書で開示されるポリペプチドは、当技術分野で周知のあらゆる様式で作製することができる。
【００６０】
一実施形態では、ポリペプチドを、当技術分野で周知の組換え法を用いて生成させる。この点では、Ｅｎｖおよび他のＨＩＶポリペプチドの公知の配列に基づき、オリゴヌクレオチドプローブを考案し、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを、Ｅｎｖ遺伝子および他のＨＩＶ遺伝子についてプローブするのに用いることができる。次いで、標準的な技法、例えば、全長配列の所望の部分で遺伝子を切断するのに使用される制限酵素を用いて、遺伝子をさらに単離することができる。同様に、Ｅｎｖ遺伝子および他のＨＩＶ遺伝子は、細胞および細胞を含有する組織から、フェノール抽出など、公知の技法を用いて直接単離し、配列をさらに操作して、所望の切断を作製することもできる。ＤＮＡを得る技法およびＤＮＡを単離する技法の記載については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照されたい。
【００６１】
修飾された（例えば、切断され、かつ／または置換された）ポリペプチドをコードする遺伝子は、公知の配列に基づき、合成により作製することができる。ヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列に適するコドンによりデザインすることができる。完全な配列は一般に、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ  （１９８１年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９２巻：７５６頁；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３巻：１２９９頁；Ｊａｙら（１９８４年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５９巻：６３１１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５年）、Ｇｅｎｅ、１６４巻：４９〜５３頁を参照されたい。
【００６２】
組換え法を用いて、Ｅｎｖをコードする遺伝子および他のＨＩＶポリペプチド遺伝子をクローニングすることは容易であり、次いで、これを、適切な塩基対（複数可）の置き換えによりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて変異誘発させて、所望のアミノ酸のコドンを結果としてもたらすことができる。このような変化は、単一のアミノ酸において変化を及ぼす１つの塩基対というわずかな変化を含む場合もあり、いくつかの塩基対変化が包含される場合もある。代替的に、変異は、ミスマッチしたプライマーであって、ミスマッチした二重鎖の融解温度を下回る温度で親ヌクレオチド配列（一般に、ＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列）にハイブリダイズするプライマーを用いて施すこともできる。プライマーは、プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い限界内に保持し、変異体の塩基が中央に配置されるように保持することにより、特異的とすることができる。例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）、ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３年）、１００巻：４６８頁を参照されたい。プライマーの伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて施され、クローニングされた産物および変異させたＤＮＡを含有するクローンを、プライマー伸長鎖の分離により導き出し、選択する。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとしての変異体のプライマーを用いて達成することができる。技法はまた、複数の点変異を生成させるためにも適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８２年）、７９巻：６４０９頁を参照されたい。
【００６３】
所望のタンパク質のコード配列が単離または合成されたら、それらを発現のための任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローニングすることができる。本明細書における教示から明らかとなる通り、それらの中に欠失または変異を有するＥｎｖおよび他のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、様々な組合せで作動可能に連結する発現構築物を創出することにより、修飾ポリペプチドをコードする多種多様なベクターを生成させることができる。したがって、Ｅｎｖポリペプチドを発現させるために、例えば、ＥｎｖポリペプチドのＶ１／Ｖ２領域を欠失させた特定の部分をコードするポリヌクレオチドを、小型ループ領域内に欠失または置き換えを有するＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結し、構築物を宿主細胞に導入することができる。
【００６４】
当業者には多数のクローニングベクターが公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、選び出しの問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそれらにより形質転換されうる宿主細胞の例は、バクテリオファージラムダ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（Ｅ．ｃｏｌｉ以外のグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、およびウシパピローマウイルス（哺乳動物細胞）を含む。一般に、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩおよびＩＩ巻、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、前出を参照されたい。
【００６５】
また、バキュロウイルス系などの昆虫細胞発現系も用いることができ、当業者に公知であり、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１５５５号（１９８７年）において記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．から、キット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販されている。
【００６６】
また、植物発現系も、Ｅｎｖおよび他のＨＩＶポリペプチドを作製するのに用いることができる。一般に、このような系では、植物細胞に異種遺伝子をトランスフェクトするのに、ウイルスベースのベクターが用いられる。このような系の記載については、例えば、Ｐｏｒｔａら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６年）、５巻：２０９〜２２１頁；およびＨａｃｋｌａｎｄら、Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９４年）、１３９巻：１〜２２頁を参照されたい。
【００６７】
また、Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、（１９９３年）、６７巻：４０１７〜４０２６頁およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）、７４巻：１１０３〜１１１３頁において記載されるワクシニアベースの感染／トランスフェクション系などのウイルス系も、本発明により用いられるであろう。この系ではまず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞に、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスをトランスフェクトする。このポリメラーゼは、それが、Ｔ７プロモーターを保有する鋳型だけを転写する点で、精密な特異性を提示する。感染させた後、細胞に、Ｔ７プロモーターにより駆動される目的のＤＮＡをトランスフェクトする。細胞質中で組換えワクシニアウイルスから発現したポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いで、これが、宿主の翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。方法は、細胞質における高レベルで一過性の、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物（複数可）の産生をもたらす。
【００６８】
この発現構築物を含有するベクターにより形質転換された宿主細胞内で、所望のＥｎｖまたは他のＨＩＶポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるように、遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌による発現の場合）、および、場合によって、オペレーター（本明細書では、まとめて「制御」エレメントと称する）の制御下に置くことができる。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含有する場合もあり、含有しない場合もある。天然に存在するシグナルペプチドおよび異種配列の両方を用いることができる。宿主は、翻訳後プロセシングにおいて、リーダー配列を除去しうる。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照されたい。このような配列は、ＴＰＡリーダーのほか、ミツバチメリチンシグナル配列を含むがこれらに限定されない。
【００６９】
宿主細胞の成長に関するタンパク質配列の発現の調節を可能とする他の調節配列もまた所望されうる。このような調節配列は、当業者に公知であり、例は、調節化合物の存在を含めた化学的刺激または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節配列を含む。ベクター内にはまた、他の種類の制御エレメント、例えば、エンハンサー配列も存在する。
【００７０】
制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に、コード配列にライゲーションすることができる。代替的に、コード配列を、制御配列および適切な制限部位を既に含有する発現ベクターに直接にクローニングすることもできる。
【００７１】
場合によっては、適切な方向を伴って、すなわち、適正なリーディングフレームを維持するために制御配列に付着されうるように、コード配列を修飾することが必要でありうる。変異体または類似体は、タンパク質をコードする配列の一部の欠失により調製することもでき、配列の挿入により調製することもでき、かつ／または配列内の１つもしくは複数のヌクレオチドの置換により調製することもできる。当業者には、部位指向変異誘発など、ヌクレオチド配列を修飾するための技法が周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩおよびＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照されたい。
【００７２】
次いで、発現ベクターを用いて、適切な宿主細胞を形質転換する。当技術分野では、多数の哺乳動物細胞系が公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系であって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｖｅｒｏ２９３細胞のほか、その他の細胞などであるがこれらに限定されない不死化細胞系を含む。Ｅｎｖポリペプチドの場合、適正なグリコシル化を確保するため、哺乳動物細胞内の発現が好ましい。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種などの細菌宿主も、本発現構築物と共に用いられるであろう。本発明において有用な酵母宿主は、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。バキュロウイルス発現ベクターと共に用いられる昆虫細胞は、とりわけ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉを含む。
【００７３】
選択された発現系および宿主に応じて、上記の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、目的のタンパク質が発現する条件下で成長させることにより、本発明のタンパク質を作製する。適切な成長条件の選択は、当該分野の技量の範囲内にある。
【００７４】
一実施形態では、形質転換された細胞が、ポリペプチド産物を、周囲の培地に分泌する。例えば、公知の分泌性タンパク質に由来する組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）のリーダー配列、γ−インターフェロンのシグナル配列、または他のシグナルペプチド配列を用いてある特定の調節配列をベクター内に含めて、タンパク質産物の分泌を増強することができる。次いで、本明細書で記載される様々な技法により、例えば、ヒドロキシアパタイト樹脂、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着法、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などであるがこれらに限定されない標準的な精製法を用いて、分泌されるポリペプチド産物を単離することができる。
【００７５】
代替的に、形質転換された細胞を、細胞を溶解させるが、Ｅｎｖまたは他のＨＩＶポリペプチドを実質的に無傷のまま保持する、化学的手段、物理的手段、または機械的手段を用いて破壊する。細胞内タンパク質はまた、例えば、Ｅｎｖまたは他のＨＩＶポリペプチドの漏出が生じるように、洗浄剤または有機溶媒を用いることにより細胞壁または細胞膜から成分を除去することによっても得ることができる。当業者には、このような方法が公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、（Ｅ．  Ｌ．  Ｖ．  ＨａｒｒｉｓおよびＳ．  Ａｎｇａｌ編、１９９０年）においても記載されている。
【００７６】
例えば、本発明による使用のために細胞を破壊する方法は、音波破砕または超音波処理；撹拌；液体または固体による射出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）；熱処理；凍結−融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧ショック；トリプシン、ノイラミニダーゼ、およびリゾチームなどのプロテアーゼを含めた溶解性酵素による処理；アルカリによる処理；ならびに胆汁酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０、およびＣＨＡＰＳなどの洗浄剤および溶媒の使用を含むがこれらに限定されない。細胞を破壊するのに用いられる特定の技法は、多くの場合、選び出しの問題であり、ポリペプチドを発現させる細胞型、培養条件、および用いられる任意の前処理に依存する。
【００７７】
細胞を破壊した後、細胞破砕物を、一般には遠心分離により除去し、細胞内で産生されたＥｎｖおよび他のＨＩＶポリペプチドは、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着法、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などであるがこれらに限定されない標準的な精製法を用いてさらに精製する。
【００７８】
例えば、本発明の細胞内Ｅｎｖポリペプチドを得るための一方法は、抗Ｅｎｖ特異的抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるアフィニティー精製、またはレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるアフィニティー精製などのアフィニティー精製を伴う。特に好ましいレクチン樹脂は、マンノース部分を認識するレクチン樹脂であって、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓアグルチニン（ＧＮＡ）、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン（ＬＣＡまたはレンズマメレクチン）、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍアグルチニン（ＰＳＡまたはエンドウレクチン）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓアグルチニン（ＮＰＡ）、およびＡｌｌｉｕｍ  ｕｒｓｉｎｕｍアグルチニン（ＡＵＡ）に由来する樹脂などであるがこれらに限定されないレクチン樹脂である。適切なアフィニティー樹脂の選び出しは、当該分野の技量の範囲内にある。アフィニティー精製の後、上記の技法のうちのいずれかによるなど、当技術分野で周知の従来の技法を用いてＥｎｖおよび他のＨＩＶポリペプチドをさらに精製することができる。
【００７９】
比較的小型のポリペプチド、すなわち、長さが最大で約５０アミノ酸のポリペプチドは、例えば、ペプチド技術分野の当業者に公知であるいくつかの技法のうちのいずれかにより簡便に化学合成することができる。一般に、これらの方法は、成長させるペプチド鎖への１つまたは複数のアミノ酸の逐次的な付加を使用する。通常、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基を、適切な保護基により保護する。次いで、保護されるかまたは誘導体化されたアミノ酸を、アミド連結の形成を可能とする条件下で、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列内で続くアミノ酸を付加することにより、不活性の固体支持体に付着させることもでき、溶液中で使用することもできる。次いで、新たに付加されたアミノ酸残基から保護基を除去し、次いで、続くアミノ酸（適切に保護された）を付加するなどを行う。所望のアミノ酸が適正な配列で連結された後で、任意の残存する保護基（および、固相合成法を用いる場合は、任意の固体支持体）を逐次的または共時的に除去し、最終的なポリペプチドとする。この一般的な手順の簡単な改変により、１つより多いアミノ酸を、例えば、保護されたトリペプチドを、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）適正に保護されたジペプチドとカップリングして、脱保護化の後、ペンタペプチドを形成することにより、成長させる鎖に一度に付加することが可能である。例えば、Ｊ．  Ｍ．  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、１９８４年）；ならびにＧ．  ＢａｒａｎｙおよびＲ．  Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ．  ＧｒｏｓｓおよびＪ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、２巻、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０年）、３〜２５４頁（固相ペプチド合成法について）；ならびにＭ．  Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  １９８４年）；ならびにＥ．  ＧｒｏｓｓおよびＪ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻（古典的な溶液合成について）を参照されたい。
【００８０】
典型的な保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｘ）；２，４−ジニトロフェニル；ベンジル（Ｂｚｌ）；  ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニルなどを含む。
【００８１】
典型的な固体支持体は、架橋ポリマー性支持体である。これらは、ジビニルベンゼン架橋されたスチレンベースのポリマー、例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレンコポリマー、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレンコポリマー、およびジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレンコポリマーを含みうる。
【００８２】
本発明のポリペプチド類似体はまた、同時多重ペプチド合成法によるなど、他の方法により化学的に調製することもできる。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８５年）、８２巻：５１３１〜５１３５頁；米国特許第４，６３１，２１１号を参照されたい。
【００８３】
ワクチン
ポリアニオン性カルボマーに複合体化させたＥｎｖポリペプチドおよびこのような複合体（「Ｅｎｖポリペプチド複合体」）を含む免疫原性組成物、ならびに低粘性のポリアニオン性ポリマーを伴うＥｎｖポリペプチド（Ｅｎｖポリペプチド複合体および低粘性のポリアニオン性カルボマー−Ｅｎｖポリペプチド組成物を、まとめて「Ｅｎｖ組成物」とする）は、様々なワクチン組成物において、個別にまたは組み合わせて、例えば、予防用（すなわち、感染を防止するためのワクチン）中または治療用ワクチン（感染後のＨＩＶを処置するためのワクチン）中で用いることができる。ワクチンは、１つより多いウイルス分離株に由来するＥｎｖポリペプチドなど、１種または複数のＥｎｖポリペプチドの混合物を含みうる。ワクチンはまた、他の抗原および免疫調節剤、例えば、ＩＬ−２、修飾ＩＬ−２（Ｃｙｓ１２５→Ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、およびＲＡＮＴＥＳを含むがこれらに限定されない免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカインと共に投与することもできる。ワクチンはまた、タンパク質と核酸との混合物も含むことも可能であり、これらを、同じビヒクルまたは異なるビヒクルを用いて送達することができる。Ｅｎｖ組成物のワクチンは、１回より多く（例えば、「プライム」投与後における、１回または複数回の「ブースト」）施して、所望の効果を達成することができる。プライムと１回または複数回のブーストとは同じ組成物を投与することができる。代替的に、プライミングとブースティングとに異なる組成物を用いることもできる。
【００８４】
例として述べると、Ｅｎｖ組成物のワクチンのいずれも、ＨＩＶ抗原を伴う他のＤＮＡ送達系および／またはタンパク質送達系と組み合わせて用いることができる。非限定的な例は、例えば、１つまたは複数の分子が「プライミング」ステップにおいて送達され、その後、１つまたは複数の分子が「ブースティング」ステップにおいて送達されるプライム−ブースト法におけるこれらの分子の共投与を含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸含有組成物の送達の後、Ｅｎｖ組成物のワクチンの送達を行う。他の実施形態では、複数回の核酸による「プライム」（同じ核酸分子または異なる核酸分子による）の後、複数回のＥｎｖ組成物による「ブースト」（同じＥｎｖポリペプチドおよびさらなるＨＩＶポリペプチドまたは異なるＥｎｖポリペプチドおよびさらなるＨＩＶポリペプチドによる）を行う。
【００８５】
ワクチンは一般に、水、食塩水、グリセロール、エタノールなど、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルを含む。加えて、このようなビヒクルには、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質も存在させることができる。
【００８６】
場合によっては、担体も存在させる。担体とは、組成物を施される個体に有害な抗体の産生を、単独では誘導しない分子である。適切な担体は典型的に、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（油滴またはリポソームなどの）、および不活性のウイルス粒子など、大型でゆっくりと代謝される高分子である。当業者には、このような担体が周知である。さらに、Ｅｎｖ組成物中のＥｎｖポリペプチドは、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来するトキソイドなどの細菌性トキソイドに結合体化することができる。
【００８７】
また、アジュバントを用いて、ワクチンの有効性を増強することもできる。このようなアジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）例えば、（ａ）５％のスクアレン、０．５％のＴＷＥＥＮ８０（商標）、および０．５％のＳＰＡＮ８５（商標）を含有する（必須ではないが、場合によって、様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照されたい）を含有する）ＭＦ５９（商標）（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号）であって、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）などのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いてサブミクロン粒子に処方されたＭＦ５９、（ｂ）１０％のスクアレン、０．４％のＴＷＥＥＮ８０（商標）、５％のＰｌｕｒｏｎｉｃブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照されたい）を含有するＳＡＦであって、サブミクロンエマルジョンに微小流動化されるか、または粒子サイズの大きなエマルジョンを生成させるようにボルテックス処理されたＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のＴＷＥＥＮ８０（商標）、ならびにモノホスホリル脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群に由来する１種または複数の細菌性の細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）などの水中油エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（下記を参照されたい）または細菌性の細胞壁成分など、他の特定の免疫刺激剤を伴うかまたは伴わない）；（３）ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）などのサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）など、サポニンアジュバントから生成させた粒子を用いることができる；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここでは、６３位における野生型のアミノ酸をリシンで置換する）、ＬＴ−Ｒ７２（ここでは、７２位における野生型のアミノ酸をアルギニンで置換する）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでは、１０９位における野生型のアミノ酸をセリンで置換する）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでは、９位における野生型のアミノ酸をリシンで置換し、１２９位における野生型のアミノ酸をグリシンで置換する）（例えば、国際公開第ＷＯ９３／１３２０２号および同第ＷＯ９２／１９２６５号を参照されたい）など、細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の解毒変異体；ならびに（７）免疫刺激剤として作用して、組成物の有効性を増強する他の物質を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
典型的には、ワクチン組成物を、液体溶液または懸濁液としての注射剤として調製するが、また、注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁させるのに適する固体形態も調製することができる。調製物はまた、上記で論じたアジュバント効果を増強するために、乳化させることもでき、リポソーム中に被包することもできる。
【００８９】
ワクチンは、必要に応じて、治療有効量のＥｎｖ組成物および上述の成分のうちの他のいずれかを含むであろう。治療有効量とは、それが投与される非感染個体、感染個体、または非曝露個体において、防御的免疫応答を誘導するＥｎｖ組成物の量であろう。このような応答は一般に、被験体における、ワクチンに対する、分泌性、細胞性、および／または抗体媒介性免疫反応の発生を結果としてもたらすであろう。通例、このような応答は、以下の効果：免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、またはＭなど、免疫クラスのうちのいずれかに由来する抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化シグナル、成長シグナル、および分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の増大のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。
【００９０】
好ましくは、有効量が、疾患症状の処置または防止をもたらすのに十分である。正確な必要量は、他の因子の中でも、処置される被験体；処置される個体の年齢および全体的な状態；個体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される防御の程度；処置される状態の重症度；選択された特定のＥｎｖポリペプチドおよびその投与方式に応じて変化するであろう。当業者は、適切な有効量を容易に決定することができる。治療有効量は、日常的な試験を介して決定しうる比較的広い範囲内に収まる。
【００９１】
Ｅｎｖ組成物のワクチンは、皮下投与、表皮投与、皮内投与、鼻腔内投与、直腸内投与、および膣内投与などの粘膜内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または筋内投与することができる。他の投与方式は、経口投与および肺内投与、坐剤、無針注射、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓおよびｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールの場合もあり、複数用量スケジュールの場合もある。
【００９２】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のほか、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」も包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなる場合もあり、さらなる何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含む場合もある。
【００９３】
「実質的に」という語は、「完全に」を排除しない、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合がある。必要な場合は、「実質的に」という語を、本発明の定義から省くことができる。数値ｘに対する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００９４】
特段に言明されない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む工程は、いかなる特定の混合順序も必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いと組み合わせ、次いで、この組合せを、第３の成分と組み合わせうるなどである。
【００９５】
細胞の培養に動物材料を用いる場合（および、特に、ウシ材料を用いる場合）は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない供給源からそれらを得るべきであり、特に、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源からそれらを得るべきである。全体的に、細胞は、動物由来材料の完全な非存在下で培養することが好ましい。
【００９６】
細胞基材を、再集合手順または逆遺伝学手順に用いる場合は、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒの総論章５．２．３などにおいて、ヒトワクチンの作製における使用について承認された細胞基材であることが好ましい。
【００９７】
ポリペプチド配列間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実装されている、パラメータをギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１とするアフィンギャップ検索を用いる、スミス−ウォーターマンの相同性検索アルゴリズムにより決定することが好ましい。
【００９８】
本明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に指示されることが文脈により明らかでない限り、複数形の指示を含む。したがって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」に対する言及は、２つ以上のこのような作用物質の混合物を含む。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
ポリアニオン性カルボマー＋Ｅｎｖ複合体の生成
ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）は、滅菌条件下で秤量した。最終容量の半分である０．２μを濾過し、蒸留されたＨ２ＯをＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）粉末に添加し、回転混合のために、５〜１０分間にわたり回転攪拌機にかけた。次いで、残存容量の水を添加し、回転混合のために、１６〜１８時間にわたり回転攪拌機にかけて、均一の懸濁液を形成させた。これらの方法を用いて、１〜２％のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）による均質の懸濁液を容易に作製することができる。より高濃度のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）が均質の懸濁を確保するためには、より長い時間にわたる持続的混合が必要とされた。解析またはゲル解析の目的で取り扱うには、４％を上回る懸濁液は、形成に長時間を要し、Ｅｎｖ複合体の形成後の粘性が高すぎた。最終溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ３．０〜４．０の範囲にあると見出されることが典型的であった。粘性の高さのために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるいかなる適用においても、２％を超えるＣＡＲＢＯＰＯＬの懸濁液を調べることはなかった。
【０１００】
複合体を形成するためには、ｐＨが重要であった。Ｅｎｖポリペプチドを添加する前に、３ＭのＮａＯＨ／１ＭのＫＯＨを添加することにより、ｐＨを７．０に調整したところ、動的光散乱（ＤＬＳ）解析は、ＥｎｖポリペプチドとＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）との間に相互作用を示さなかった。これに対して、Ｅｎｖポリペプチドを低ｐＨ（３．０〜４．０）の酸性ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）に添加したところ、ＥｎｖポリペプチドとＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）とは、主に静電相互作用を媒介して、複合体を形成した。ｐＨ３．０〜４．０では、Ｅｎｖポリペプチドが正に荷電するのに対し、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）などのポリアニオン性カルボマーは、負に荷電する（これは、荷電Ｅｎｖポリペプチドと荷電ポリアニオン性分子または荷電ポリアニオン性ポリマーとの間の相互作用を可能とし、複合体の形成を容易にする）。初めからＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）または類似のポリアニオン性カルボマーをｐＨ約７に調整しても、Ｅｎｖポリペプチドとの（または他の正に荷電したタンパク質との）直接的な相互作用は生じず、よって、複合体化も生じないであろう。正しいｐＨでは、複合体が比較的迅速に形成され、１時間以内のインキュベーションしか必要としない。電荷間相互作用は瞬時かつ急速なものであるので、複合体は、容易に、おそらく１時間よりはるかに早く形成される。
【０１０１】
（実施例２）
アニオン性カルボマーと複合体化したＥｎｖポリペプチドの安定性
可溶性の組換えＥｎｖポリペプチドを、ワクチン接種用に安定化させ、ＭＦ５９（商標）などのアジュバントによりもたらされるアジュバント作用（ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ）を増大させようと試みる中で、ポリアニオン性カルボマーであるＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を調べた。ポリアニオン性カルボマーと複合体化されたＥｎｖポリペプチドの安定性を評価するため、ＣＨＯ細胞から産生され、０．５％のＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）と複合体化させた精製オリゴマーであるＳＦ１６２  ｇｐ１４０ΔＶ２  Ｅｎｖポリペプチドを、４℃で時間を変化させてインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｇｐ１２０ウサギポリクローナル血清を用いる免疫ブロット法により解析した。図１（Ａ）において示される通り、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）は、Ｅｎｖに対して有害な影響を及ぼさなかった。Ｅｎｖポリペプチドは、試験された最長の時間（４時間）にわたり、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）−Ｅｎｖポリペプチド複合体内で安定であった。
【０１０２】
Ｅｎｖポリペプチド複合体の安定性はまた、温度を変化させて：４℃、室温（ＲＴ、２０℃）、３０℃、および３７℃の各々で１時間にわたって調べた。また、対照として、ＰＢＳ中のＥｎｖポリペプチドも、ＲＴおよび３７℃でインキュベートした。図１（Ｂ）において示される通り、Ｅｎｖポリペプチド複合体は、全ての被験温度（４℃、室温、３０℃、および３７℃）で１時間にわたり安定であった。図１（Ｂ）のレーン４では、約７０ｋＤａにおいて、かすかなバンドを見ることができる。このバンドは、Ｖ３ループの酵素的切断により生成したｇｐ１４０の公知の切断産物に対応するが、この断片は、ＣＡＲＢＯＭＥＲ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）と関連しない。本発明者らは、高温ではこれを観察したが、低温では観察しなかった。これは、切断を引き起こすエンドプロテアーゼが活性となるのがこれらの温度（室温〜３７℃）においてであるためであると予測された。したがって、Ｅｎｖポリペプチド単独では、２つの被験温度のうちの１つにおいてある程度の分解を既に示していた（これによってもまた、ここで観察された酵素的切断は、好適な温度（ＲＴ〜３７℃）における酵素的活性に起因したものであり、ＣＡＲＢＯＭＥＲ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）の存在に特異的なものではないことが確認される）。これに対し、ポリアニオン性カルボマー（ＣＡＲＢＯＭＥＲ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標））との複合体でのＥｎｖポリペプチドは、いかなる被験温度でも分解を示さなかったことからもまたおそらく、この複合体内では、タンパク質が酵素的切断から部分的に保護される可能性があり、保護は、低ｐＨ（活性にとって好適でない）、酵素を妨害するポリアニオン性カルボマーにより引き起こされる立体障害、またはこれらの両方に起因しうることが示される。したがって、複合体を形成することにより、Ｅｎｖポリペプチドが安定化する。
【０１０３】
（実施例３）
動的光散乱（ＤＬＳ）を用いるＥｎｖポリペプチドとポリアニオン性カルボマーとの相互作用
Ｅｎｖポリペプチドが、直接的な相互作用を介してポリアニオン性カルボマーとの複合体を形成し、これにより、Ｅｎｖポリペプチドを安定化させ、かつ／または制御放出もしくは抗原の提示を支援していることを裏付けるため、溶液中の粒子の流体力学半径を測定する動的光散乱（ＤＬＳ）により、複合体を解析した。図２に示す通り、０．５％のＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）単独の流体力学半径は、約６８ｎｍであった。これに対して、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋Ｅｎｖポリペプチド複合体の流体力学半径は、約８６ｎｍであった。この複合体のサイズの増大は、Ｅｎｖポリペプチドが、電荷間相互作用を介してカルボマー表面に直接吸着されることを示した。Ｅｎｖポリペプチドそれ自体の流体力学半径は＞１０ｎｍであり、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）は、Ｅｎｖポリペプチドとの複合体を形成していることが明らかであった。
【０１０４】
（実施例４）
ポリアニオン性カルボマーと複合体化させたＥｎｖポリペプチドの抗原としての完全性
ポリアニオン性カルボマーが、Ｅｎｖポリペプチド内の重要なコンフォメーションエピトープまたは中和エピトープを妨げたり、これを破壊したりしないことを検証するため、Ｅｎｖポリペプチド−ポリアニオン性カルボマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標））複合体を、受容体（ＣＤ４）およびモノクローナル抗体（２Ｇ１２、グリカン依存性）に結合するそれらの能力について調べた。可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）またはｍＡｂである２Ｇ１２を、アミンカップリングにより、ＣＭ５センサーチップに共有結合的に固定化した。複合体については、Ｅｎｖポリペプチドタンパク質と、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）（最終：０．５％）とを、４℃で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、２０倍過剰量のＨＢＳ緩衝液を添加および注入して、固定化されたリガンドとの結合について解析した。単独のＥｎｖポリペプチド（ｇｐ１４０ΔＶ２）１００ｎＭまたはポリアニオン性カルボマーとの複合体でのＥｎｖポリペプチド（ｇｐ１４０ΔＶ２）１００ｎＭを、１０μｌ／分で注入した。図４に示す通り、Ｅｎｖポリペプチド単独は、ｓＣＤ４と約５０の平均ＲＵ（応答単位）で結合した。Ｅｎｖポリペプチド複合体は、ｓＣＤ４と約３倍のＲＵで結合した。同様に、Ｅｎｖポリペプチド単独が、ｍＡｂである２Ｇ１２と、約１５０のＲＵで結合するのに対し、Ｅｎｖポリペプチド複合体は、約３倍のＲＵで結合した。単独のＥｎｖポリペプチドおよびポリアニオン性カルボマーと複合体化させたＥｎｖポリペプチドのいずれもが、両方のリガンドと結合したことから、Ｅｎｖの抗原としての完全性が、複合体により影響されなかったことが示される。単独のＥｎｖポリペプチドと複合体のＥｎｖポリペプチドとにおけるＲＵの差が常に３倍であることの大部分は、サイズ（複合体が、Ｅｎｖポリペプチド単独と比較して大型であること）に起因した可能性が最も高い。
【０１０５】
ポリアニオン性カルボマーが、Ｅｎｖポリペプチド内の重要なコンフォメーションエピトープまたは中和エピトープを妨げたり、これを破壊したりしないことをさらに検証するため、キャプチャーＥＬＩＳＡを用いて、Ｅｎｖポリペプチド−ポリアニオン性カルボマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標））複合体を、受容体（ＣＤ４、ここでは、ＣＤ４−ＩｇＧ２を代替物として用いる）およびモノクローナル抗体（２Ｇ１２、グリカン依存性）に結合するそれらの能力について調べた。キャプチャーＥＬＩＳＡは、４℃で一晩にわたり、ＭＡＸＩＳＯＲＢ（商標）プレートを、２μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）（ウェル１つ当たり１００μｌ）のＤ３７２４  ｍＡｂでコーティングすることにより実施した。翌日、表面を、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで、３７℃で１時間にわたりインキュベートすることによりブロッキングした。次いで、プレートを３回にわたり洗浄し（ＰＢＳ＋０．０１％のＴＷＥＥＮ２０（商標））、０．１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）（希釈緩衝液）中にＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴うかまたは伴わずにプレインキュベートされた１μｇ／ｍｌのｇｐ１２０を、プレートに添加した。プレートは、室温（ＲＴ、２５℃）で２時間にわたりインキュベートした。プレートを３回にわたり洗浄し、抗ＣＤ４  ＩｇＧ２であるｂ１２または１７ｂを、１μｇ／ｍｌで始める系列希釈により添加し、次いでその後、２倍に希釈した（希釈緩衝液中）。１７ｂ  ｍＡｂを用いるＣＤ４ｉの誘導が所望される例では、等モル量の可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）を、ｇｐ１２０に添加した。次いで、プレートを、ＲＴで１時間にわたりインキュベートし、３回にわたり洗浄した。次いで、抗ヒトＨＲＰ結合体化抗体を、反応物に、１：１０，０００（希釈緩衝液中）で添加した。ＲＴでの１時間にわたるインキュベーション後、プレートを３回にわたり洗浄し、ＫＰＬ製のＴＭＢ基質を用いて発色させた。全ての試料を３連で評価した。キャプチャー抗体は含有するがｇｐ１２０は含有しない表面（しかし、一次抗体、二次抗体、および基質は、表面に添加される）を、各特定のリガンドについての対照として用いた。光学濃度（ＯＤ）は、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を、４５０ｎｍで用いて決定した。結果を、図３（Ａ）〜（Ｃ）に示す。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴うＥｎｖタンパク質およびＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴わないＥｎｖタンパク質は、それぞれのリガンドに、いかなる著明な結合アフィニティーの差違も伴わずに結合したことから、ワクチン評価のための投与前に複合体を形成するのに十分な時間である最長３時間にわたる、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴うインキュベーションの際に、Ｅｎｖポリペプチドが変性したり抗原としての変化を被ったりしないことが示される。まとめると、これらのデータは、ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）の存在下で安定であり、受容体と共受容体との結合に関与する極めて重要な保存的なエピトープを温存することを示す。
【０１０６】
（実施例５）
ＤＮＡプライム−タンパク質ブースト（筋内）レジメンによる、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）（Ｅｎｖとの複合体での）またはＭＦ５９（商標）またはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）（Ｅｎｖとの複合体での）＋ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＨＩＶ−１亜型Ｂ  Ｅｎｖ単独（一価）の免疫原性
このウサギ研究は、単一の（亜型ＢのＳＦ１６２）ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを免疫原として用いて、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）（複合体の）  対  ＭＦ５９（商標）  対  ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）（複合体の）＋ＭＦ５９（商標）を比較するものである。免疫原性を確認するため、ウサギを、複合体中の亜型ＢのＳＦ１６２  Ｅｎｖポリペプチドで免疫化した。１群当たり５匹ずつのニュージーランドシロウサギを、２回にわたるＤＮＡプライム（各回１ｍｇずつによる免疫化）で免疫化した後、ＭＦ５９（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）、またはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）を伴う２５μｇのＳＦ１６２  ｇｐ１４０ΔＶ２（Ｅｎｖ）のタンパク質ブーストを施した。この研究は、亜型ＢのＳＦ１６２  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを（一価の）免疫原として用いて、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）のアジュバント作用を、ＭＦ５９（商標）およびＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）と比較するために実施した。０、４、１２、および２４週目に、殿筋において、４回にわたり筋内免疫化を行った。各回の免疫化における全タンパク質投与量は、２５μｇであった。１回目の免疫化の前（事前採血）および各回の免疫化後の様々な時点（２ｗｐ２、２ｗｐ３、２ｗｐ４、４ｗｐ４、および１５ｗｐ４での出血）において血清試料を採取し、結合および中和について解析した。
【０１０７】
ｇｐ１２０結合ＥＬＩＳＡを用いて測定される通り、ＭＦ５９（商標）と共に投与されたＥｎｖポリペプチドは、２回目の２週間後（２ｗｐ２）において、＞１０５の（幾何平均）力価をもたらし、２ｗｐ３において、１０６の最高の力価をもたらした。ＭＦ５９（商標）と共に投与されたＥｎｖポリペプチドに対する応答は、４回目の免疫化後でも改善されなかった。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させたＥｎｖポリペプチドは、２ｗｐ３において、＞１０６の最高の力価をもたらした。最も著明なことは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチドは、全てのうちで最高の力価をもたらしたことであった（２ｗｐ３において約１０７：図５を参照されたい）。
【０１０８】
免疫反応をさらに評価するため、チオシアン酸アンモニウムＥＬＩＳＡを用いて、ワクチン接種プロトコールによりもたらされるｇｐ１４０特異的な血清中抗体のアビディティーを評価した（図６を参照されたい）。アビディティー指数は、作製された抗体の成熟度の指標を提示する。
【０１０９】
各回の免疫化の２週間後に血清を評価したところ、ＭＦ５９（商標）中のＥｎｖまたはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させたＥｎｖによる３または４回にわたる免疫化後における抗体アビディティーは同様であった。これに対し、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチドの投与後である２ｗｐ３および２ｗｐ４においては、他の２つのレジメンと比較して抗体アビディティーが倍加された。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖポリペプチドを用いて高度なＥｎｖ特異的結合抗体を誘発することを含めた、抗体アビディティーの改善におけるこの著明な差違は、注目に値する結果であり、この例で観察される通り、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）−Ｅｎｖポリペプチド複合体とＭＦ５９（商標）とが作用して、結合抗体の応答をさらに強化することを示す。これは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）が、抗原の送達または制御放出および部分的なアジュバント作用において作用する一方で、ＭＦ５９（商標）は、より強力な免疫強化に向けて作用する相乗作用的効果に起因しうるであろう。
【０１１０】
次いで、生成させたＥｎｖ特異的抗体が、階層化による類別に基づくＨＩＶ−１  Ｅｎｖシュードウイルスの多様なパネル（図７ＡおよびＢを参照されたい）を中和する能力について調べた。シュードウイルス中和の大半について、２ｗｐ４（ｐ４）の血清は、２ｗｐ３（ｐ３）に由来する血清より強力であった。ＭＦ５９（商標）と共に投与したＥｎｖまたはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）のみと複合体化させたＥｎｖと比較すると、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）と複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖが、最も強力であった。しかし、免疫反応の幅では、改善が観察されず、２ｗｐ３／２ｗｐ４のワクチン血清により中和することができたのは、全ての比較群のうちで、階層１Ａおよび１Ｂのウイルスだけであった（図７Ａ）。対照としては、ＭＬＶの中和を実施した（図７Ｂ）。
【０１１１】
免疫化後において誘発される体液性免疫反応の「質」をさらに評価するため、Ｙ  Ｌｉら（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、８３巻（２号）：１０４５〜５９頁、２００９年）により記載されている「血清マッピング」法を用いて、ウサギ血清中で誘発される抗体の特異性について解析した。Ｅｎｖ特異的抗体の示差的吸着のためにｇｐ１２０変異体（ｇｐ１２０ΔＶ１Ｖ２、ｇｐ１２０ΔＶ３、ｇｐ１２０Ｄ３６８Ｒ（ＣＤ４ＢＳ変異体）、ｇｐ１２０Ｉ４２０Ｒ（ＣＤ４ｉ変異体））を用いて、本発明者らは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させるか、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理するか、またはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したｇｐ１４０ΔＶ２免疫原を用いて誘発される抗体の大半が、Ｖ３特異的であることを見出した。ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＥｎｖにより免疫化された群内の１匹のウサギは、ＣＤ４ＢＳ抗体を誘発した。この単一の動物以外では、誘発されたＥｎｖ特異的抗体の大半が、ｇｐ１２０サブユニットを主に指向し、より詳しく述べると、糖タンパク質のＶ３領域を指向した。
【０１１２】
さらなる免疫原性実験において、本発明者らは、ＤＮＡプライム−タンパク質ブーストレジメンおよびタンパク質だけのレジメンのいずれを用いても、ＣＡＲＢＯＰＯＬ：Ｅｎｖ複合体にＭＦ５９（商標）を加えて、一価（ｇｐ１２０／ｇｐ１４０）Ｅｎｖポリペプチドまたは多価（ｇｐ１２０／ｇｐ１４０）Ｅｎｖポリペプチドと共に用いたところ、ワクチン（ウサギ）血清の中和の幅および効力が改善されることを観察した。したがって、免疫原性の改善は、Ｅｎｖポリペプチドの状態（単量体状態またはオリゴマー状態）にも価数（一価または多価）にも依存しない。
【０１１３】
（実施例６）
ＤＮＡプライム−タンパク質ブースト（筋内）レジメンによる、単独（一価）の異なる分離株またはＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）と組み合わされて（多価）処方された異なる分離株に由来するＨＩＶ−１亜型Ｃ  Ｅｎｖの免疫原性
このプライム−ブースト研究は、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した一価のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した多価のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドと比較するものである。この研究はまた、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した多価のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）に複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した多価のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドとも対比する。異なる分離株に由来するＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１４０のＥｎｖの免疫原性を、ＤＮＡプライム−タンパク質ブーストレジメンにおいて評価した。ブースト免疫化のためのＥｎｖポリペプチドは、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した一価組成物（群１〜７、および１０）または多価組成物（群８および９）として投与した。群８の動物は、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した三価のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した。比較では、群９の動物を、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）と複合体化させ、かつ、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理した三価のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドにより免疫化した（このため、これは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）＋ＭＦ５９（商標）群である）。多価／三価群には、５０μｇ（各Ｅｎｖポリペプチド８．３＋８．３＋８．３μｇずつ）の全Ｅｎｖポリペプチドを投与した。
【０１１４】
【表３】
2014533290.tif 000005
【０１１５】
４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）において採取された血清を用いて、ウサギにおける、ＭＦ５９（商標）だけにより、すなわち、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴わずに（群９を除く）処方されたＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドによるワクチン接種後における、階層１ａ、および階層１ｂのウイルスのほか、階層２（シュード）のウイルスについての中和の幅を、図８ＡおよびＢに示す。特に、図８は、結果を、ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力（ＩＤ５０力価での）を示すヒートマップとして示す。ＨＩＶ−１シュードウイルスに対する血清中和の幅および効力は、以下の通りに評価した。血清は、４回目の免疫化の２週間後に解析した。群内の各ウサギに由来する血清を、単一サイクルのＴＺＭ−ｂｌシュードウイルスアッセイにおいて、ＳＦ１６２、ＭＮ．３、Ｂａｌ．２６、Ｄｕ１５６．１２、Ｄｕ４２２．１、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１、ＭＷ９６５．２６、ＴＶ１ｃ２１、およびＣＡＰ２３９の階層化された（階層１ａ、階層１ｂ、および階層２）ウイルスパネルに対して調べた。中和は、分子的にクローニングされたシュードウイルスおよびＴＺＭ−ｂｌ細胞内のルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて評価した。略述すると、ウェル１つ当たり合計２００個のＴＣＩＤ５０シュードウイルスを、希釈された血清試料に添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ウェル１つ当たりのＤＥＡＥ−デキストラン含有培地中に細胞１０，０００個を添加し、３７℃で４８時間にわたりインキュベートした。ＤＥＡＥ−デキストランの最終濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。単一ラウンドの感染のために、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、Ｅｎｖ欠損ＨＩＶ−１骨格ベクター（ｐＳＧ３ΔＥｎｖ）と共に、全長ｇｐ１６０  Ｅｎｖ遺伝子を含有する、エンベロープ発現プラスミドによる２９３Ｔ細胞の共トランスフェクションを介して、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖシュードウイルスを調製した。４８時間後、シュードウイルスを含有する細胞培養物上清を、０．４５μｍのフィルターを介して濾過した。中和活性は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の低減として測定した。相対発光単位（ＲＬＵ）の低減パーセントは、免疫化前血清の存在下におけるＲＬＵと比較して計算した。ＳＦ１６２株に対する中和抗体力価は、３倍に段階希釈された血清試料を用いて決定した。血清中の中和抗体の幅は、血清希釈率を１：２０として評価した。中和パーセントは、対照ウイルスとしてのＭＬＶについて既に記載される式を用いて、非特異的な阻害について補正した。
【０１１６】
亜型Ｃ階層１ａのＭＷ９６５．２６シュードウイルスに対する強力な中和、亜型Ｂ階層１ａシュードウイルスに対する相当程度の中和、および階層１ｂシュードウイルスに対する乏しい中和が観察された。多価／三価アーム（群８）は、中和ＩＤ５０力価において、単一のエンベロープ抗原に勝る顕著な利点を示さなかったが、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）アジュバントアーム（群９）は、効力の増強を示した。
【０１１７】
階層１分離株の中和ＩＤ５０力価（２ｗｐ３（ｐ３）、２ｗｐ４（ｐ４）、および２ｗｐ５（ｐ５）における）：５回目の免疫化は、図９Ａ、Ｂ（階層１ａ）、およびＣ（階層１ｂ）に示す大半の例において、または階層２のいずれの例（図９ＤおよびＥ）においても力価を改善しなかった。
【０１１８】
図１０は、ｇｐ１２０結合ＥＬＩＳＡにより測定される、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対する全抗体結合力価を示す。また、事前採血（対照としての）についてのバックグラウンドの力価も含まれた。抗体力価は、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドをコートタンパク質として用いるＥＬＩＳＡにより決定した。示されるデータ値は、１群当たり３連で個別にアッセイされた５匹のウサギの幾何平均力価（ＧＭＴ）を表す。全ての抗原は、抗体の頑健な幾何平均力価（ＧＭＴ）を誘発し、全ての抗原についてのピークＧＭＴが１０６を超えた。
【０１１９】
全ての群から採取された血清について抗体アビディティーを評価した（図１１）。アビディティーは、Ｉ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００２年）により記載される通り、ＴＶ１ｃ８．２  ｒｇｐ１４０−ｏをコート抗原として用いるＮＨ４ＳＣＮ置換ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１２０】
（実施例７）
ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）の免疫原性：タンパク質だけ（筋内）のレジメンによる、ウサギにおけるｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチド複合体
本研究は、実施例５および６における研究とは対照的に、タンパク質だけによる研究である。実施例５および６は、ＤＮＡプライム−タンパク質ブーストレジメンによる、一価および多価のいずれのＥｎｖポリペプチドによる免疫化においても、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）がより有効であることを示す。この研究は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）が、タンパク質だけのレジメンにおいても同等に有効であり、共投与しても、逐次的に与えても、多価免疫化には差違が見られないことを裏付ける。
【０１２１】
ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）と共に処方されたＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドによるウサギの免疫化（表４を参照されたい）。表４に列挙される分離株（群８を除く全ての群）に由来する、ウサギ１匹当たり２５μｇずつの各個別のｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを投与した。群８には、各株に由来する６．２５μｇずつのｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを組み合わせて、最終用量２５μｇのｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを与えた。この免疫原性研究の各群には、５匹ずつのニュージーランドシロウサギを用いた。Ｅｎｖポリペプチドは、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理されたＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）との複合体で投与した。血清試料は、１回目の免疫化の前（事前採血）および各回の免疫化の２週間後に採取した。
【０１２２】
【表４】
2014533290.tif 000006
【０１２３】
中和の幅（ＩＤ５０力価での）は、血清が２ｗｐ３において採取された全ての群について、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）と共に処方されたＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１４０のＥｎｖによるワクチン接種後において決定した（図１２ＡおよびＢを参照されたい）。血清は、上記の通り、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイにおけるＨＩＶ−１亜型Ｃ階層１ａ、ｂ、および階層２のシュードウイルスパネルに対して調べた。図１２に示す通り、２ｗｐ３の血清は、階層１ａのウイルスを容易に中和したが、大半が階層１ｂまたは階層２のウイルスを中和できなかった。ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドの多価免疫化または逐次的免疫化は、全体的な免疫反応を改善しなかった。
【０１２４】
中和の幅（ＩＤ５０力価での）は、血清が２ｗｐ４において採取された全ての群について、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）と共に処方されたＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１４０のＥｎｖポリペプチドによるワクチン接種後において決定した（図１３Ａ、Ｂ、およびＣを参照されたい）。血清は、上記の通り、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイにおける拡大ＨＩＶ−１亜型ＢおよびＣのウイルスパネルに対して調べた。観察される通り、２ｗｐ４における血清はより強力であり、階層１ａウイルスおよび階層２ａウイルスの大半を中和した（ＩＤ５０力価は低いが）。階層２のウイルスに対してはまた、いくらか低度の中和も観察された。全体として、２ｗｐ４の血清が、２ｗｐ３の血清より良好な中和をもたらした（図１２と図１３とを比較されたい）ことからタンパク質による二次ブーストに対する必要が強調される。
【０１２５】
３回目および４回目の免疫化後における階層１の分離株に対する強力な中和（階層１ａ：図１４Ａ〜Ｂ；階層１ｂ：図１４Ｃ）。４回目の免疫化は、階層１ｂのＴＶ１．２１ウイルスに対する力価を増大させた。上記の通り、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイにおける階層２：図１４Ｄ〜Ｅ。
【０１２６】
全抗体力価についての評価は、Ｉ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００２年）により記載される通り、ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドをコート抗原として用いるＥＬＩＳＡにより実施した（図１５：群８（多価）：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１＋ＣＡＰ２３９＋Ｄｕ４２２．１＋ＴＶ１  ｇｐ１４０；群９（逐次）：ＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０／Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０／ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０／ＴＶ１  ｇｐ１４０）。
【０１２７】
抗体のアビディティーは、上記の通りに決定した。（図１６：群８（多価）：ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１＋ＣＡＰ２３９＋Ｄｕ４２２．１＋ＴＶ１  ｇｐ１４０；群９（逐次）：ＣＡＰ２３９  ｇｐ１４０／Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１４０／ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１  ｇｐ１４０／ＴＶ１  ｇｐ１４０）。
【０１２８】
（実施例８）
ＤＮＡプライム−タンパク質ブーストの効果を、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）：Ｅｎｖ複合体を使用するタンパク質のみでの免疫化と対比して評価する
免疫原性の改善が、ＤＮＡプライムを必要としたのかどうかを確認するため、２回にわたるＤＮＡ−プライムの後、３回にわたるタンパク質ブースト（表３を参照されたい）または４回にわたるタンパク質ブースト（表４を参照されたい）の、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）：Ｅｎｖ複合体による免疫化を用いる免疫化実験からの、既に示されたデータをさらに解析した。亜型Ｃの分離株から生成させた多数の異なるｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドについて調べた。試験した全てのｇｐ１４０分離株は、免疫原性の改善を示した（表５を参照されたい；２ｗｐ２：２回目のタンパク質ブーストの２週間後および２回にわたるＤＮＡプライムの後；２ｗｐ４：４回目のタンパク質ブーストの２週間後であるが、ＤＮＡプライムは行われない）。動物のうちの≧６０％が、亜型ＣシュードウイルスであるＭＷ９６５．１に対して＞９０％の中和効力を呈示した。ＤＮＡまたは他のベクターを介するプライミングは、Ｔ細胞応答（ここでは測定されない）などの鍵となる免疫反応を誘発するのに有益でありうる。しかし、抗体応答だけからみる限り、中和改善の効果は、ＤＮＡプライミングに依存しない。さらに、免疫原性の改善は、ＳＦ１６２分離株なおまたは亜型Ｂの分離株に限定されない。
【０１２９】
重要なことは、シュードウイルスに対する平均ウイルス阻害を、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）を伴わないＭＦ５９（商標）とＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴うＭＦ５９（商標）の間で比較したところ、各例において、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）を伴うＭＦ５９（商標）が、ＭＦ５９（商標）のみの群より良好な機能的応答を発生させることが観察されたことである。
【０１３０】
【表５】
2014533290.tif 000007
【０１３１】
（実施例９）
ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）：Ｅｎｖ  ｇｐ１２０ポリペプチド複合体のウサギにおける免疫原性
ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドを主に用いた上記の他の研究とは対照的に、本発明者らはここで、ｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドを用いて、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）を用いる場合の応答の改善が、オリゴマー化状態、サイズなどにかかわらず、全てのＥｎｖ構築物に対して広く適用可能であるのかどうかを評価する。ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）およびＭＦ５９（商標）と共に処方されたＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドによるウサギの免疫化（表６を参照されたい）。免疫原性研究において、表６に示す各群には、５匹ずつのニュージーランドシロウサギを用いた。ウサギは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）およびＭＦ５９中で処方された２５μｇのｇｐ１２０タンパク質により免疫化した。最終群である群１１には、４つの異なる株に由来するｇｐ１２０タンパク質６．２５μｇずつを組み合わせて、１用量当たり合計で２５μｇのｇｐ１２０タンパク質とした。タンパク質のみでのワクチン接種は、０、４、１２、および２４週目に投与した。免疫化前（事前採血）ならびに２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）に血清試料を採取した。最終血清は、最終免疫化の４週間後（４ｗｐ４）に採取した。
【０１３２】
【表６】
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【０１３３】
ウサギにおけるＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）：亜型ＣのＥｎｖ  ｇｐ１２０複合体による免疫化。中和の幅（ＩＤ５０力価）は、上記の通りに、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイの２ｗｐ３において採取された血清について決定した（図１７Ａ〜Ｆ）。
【０１３４】
ウサギにおけるＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）：亜型ＣのＥｎｖ  ｇｐ１２０複合体による免疫化。中和（ＩＤ５０力価）は、上記の通りに、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイの２ｗｐ３において、階層１ａおよび階層２のＨＩＶ−１亜型Ｃシュードウイルスパネルに対して採取された血清について決定した（図１８Ａ〜Ｂ）。
【０１３５】
上記の通りに、固定化ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対して、亜型Ｃのｇｐ１２０による４回目の免疫化の２週間後（２２週目）に採取されたプール血清（希釈率を１：１００とする）を用いたｍＡｂ競合ＥＬＩＳＡを行って（図１９）、Ｅｎｖに対する抗体特異性を精査した。
【０１３６】
（実施例１０）
モルモットのタンパク質のみ（筋内）による研究における、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）：Ｅｎｖ  ｇｐ１２０ポリペプチド複合体の免疫原性
ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）＋ＭＦ５９（商標）と共に処方されたＨＩＶ−１亜型Ｃ  ｇｐ１２０のＥｎｖポリペプチドによるモルモットの免疫化（表７を参照されたい）：モルモットは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）およびＭＦ５９（商標）中で処方された２５μｇのｇｐ１２０タンパク質により免疫化した。タンパク質のみでのワクチン接種は、０、４、１２、および２４週目に行った。免疫化前（事前採血）ならびに２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、および４回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ４）に血清試料を採取した。最終血清は、最終免疫化の４週間後（４ｗｐ４）に採取した。
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
中和幅（ＩＤ５０力価）は、上記の通りに、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイの２ｗｐ３において採取された血清について決定した（図２０Ａ〜Ｆ）。中和（ＩＤ５０力価）は、上記の通りに、単一サイクルのＴＭＺ−ｂ１シュードウイルスアッセイの２ｗｐ３において、階層１ａおよび階層２のＨＩＶ−１亜型Ｃウイルスパネルに対して採取された血清を用いて決定した（図２１）。
【０１３９】
上記の通りに、固定化ＴＶ１  ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに対して、亜型Ｃのｇｐ１２０による３回目の免疫化の２週間後（図２２；１４週目）または４回目の免疫化の２週間後（図２３；２６週目）に採取されたプール血清（希釈率を１：５００とする）を用いたｍＡｂ競合ＥＬＩＳＡを行って、Ｅｎｖに対する抗体特異性を評価した。
【０１４０】
（実施例１１）
ウサギにおける注射後のＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）：Ｅｎｖ複合体による有害反応を評価する
ウサギを、免疫化後のＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）に対する全体的な反応原性および任意の明白な健康問題について観察した（表８を参照されたい）。ＭＦ５９（商標）は、ヒトを含めた複数の種において使用され、安全であることが見出されている。したがって、目標は、ＭＦ５９（商標）と組み合わせたＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）が、任意の有害反応性を引き起こすのかどうかを決定することであった。ＭＦ５９（商標）は、このような反応性を引き起こさないので、何らかの反応原性が観察されれば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐ  ＮＦ（商標）に起因する可能性が高いであろう。しかし、注射部位における注射直後の局所的な反応原性は観察されなかった。各回の注射後１〜２時間以内に、小型の浮腫および紅斑の発生が検出されたが、これらは、２４時間後に消失した。図２４Ａ〜Ｋに示す通り、１回目のワクチン接種直後に著明な体重の減少が生じることはなく、図２４Ａ〜Ｋに示される３つの群に由来する全ての動物は、研究期間の１４０日間超にわたり、体重を増大させ続けた。ウサギは、免疫化の１日前、ワクチン接種の２４、４８、および７２時間後において、体重についてモニタリングした（図２４を参照されたい）。ワクチン接種の２４、４８、および７２時間後において、局所的反応性および明白な健康問題についてモニタリングした。全ての観察は、観察日誌に記録した。全体として、ＭＦ５９（商標）でアジュバント処理したＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）：Ｅｎｖポリペプチドによりワクチン接種されたウサギにおいて、明白な健康問題は観察されず（ＮＯＨＰ）、また、免疫化後における著明な体重の減少も観察されなかった。このことは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１（商標）の投与が、本研究の状況下にあるウサギにおいて安全であったことを示す。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
【化１】
2014533290.tif 000011
【０１４３】
【化２】
2014533290.tif 000012
【０１４４】
【化３】
2014533290.tif 000013
【０１４５】
【化４】
2014533290.tif 000014
【０１４６】
【化５】
2014533290.tif 000015
【０１４７】
【化６】
2014533290.tif 000016
【０１４８】
【化７】
2014533290.tif 000017
【０１４９】
【化８】
2014533290.tif 000018
【０１５０】
【化９】
2014533290.tif 000019
【０１５１】
【化１０】
2014533290.tif 000020
【０１５２】
【化１１】
2014533290.tif 000021
【０１５３】
【化１２】
2014533290.tif 000022
【０１５４】
【化１３】
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【０１５５】
【化１４】
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【０１５６】
【化１５】
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【０１５７】
【化１６】
2014533290.tif 000026
【０１５８】
【化１７】
2014533290.tif 000027
【図４】
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【図１】
2014533290.tif 000029
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図５】
2014533290.tif 000034
【図６】
2014533290.tif 000035
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2014533290.tif 000038
【図８Ｂ】
2014533290.tif 000039
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2014533290.tif 000041
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2014533290.tif 000043
【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
2014533290.tif 000046
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
2014533290.tif 000049
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
2014533290.tif 000051
【図１４Ａ】
2014533290.tif 000052
【図１４Ｂ】
2014533290.tif 000053
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
2014533290.tif 000058
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
2014533290.tif 000063
【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
2014533290.tif 000069
【図２０Ｃ】
2014533290.tif 000070
【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１】
2014533290.tif 000074
【図２２】
2014533290.tif 000075
【図２３】
2014533290.tif 000076
【図２４Ａ】
2014533290.tif 000077
【図２４Ｂ】
2014533290.tif 000078
【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２４Ｊ】
2014533290.tif 000086
【図２４Ｋ】
2014533290.tif 000087
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月23日(2014.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2014533290.tif 000088
2014533290.tif 000089
2014533290.tif 000090