(57)【要約】  本発明は、生物学的な抗原を含む抗原製剤に関し、ここで製剤は、主要構成成分としてエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを含有する油を含む。本発明はまた、抗原製剤を製造するための前記の油の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
該製剤が主要構成成分としてエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを含有する油を含むことを特徴とする生物学的な抗原を含む抗原製剤。
【請求項２】
該エステルがエレオステアリン酸のトリグリセリドであることを特徴とする請求項１の製剤。
【請求項３】
該油が６０ないし９０％（ｗ／ｗ）のエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを含むことを特徴とする請求項１〜２のいずれか一項の製剤。
【請求項４】
該油がシナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）の種子油由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項の製剤。
【請求項５】
該油が桐油であることを特徴する請求項４の製剤。
【請求項６】
該製剤が水性液体中の油のエマルジョンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項の製剤。
【請求項７】
該抗原が該水性液体中に存在することを特徴とする請求項６の製剤。
【請求項８】
該抗原がＡＰＸ  ＩＩＩ毒素、ウシＲＳウイルス抗原およびパラインフルエンザ３ウイルス抗原より選択されることを特徴とする請求項７の製剤。
【請求項９】
該製剤がＵＶ照射に暴露されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の製剤。
【請求項１０】
少なくとも１の生物学的な抗原を含む抗原製剤を製造するための、主要構成成分としてエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを含有する油の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１の生物学的な抗原を含む抗原製剤に関する。
【０００２】
生物学的な抗原を含む製剤は、当該分野で既知であり、例えば、診断目的のために、または細菌、ウイルス、リケッチアおよび寄生虫等の（微）生物によって引き起こされる疾病を予防し、鎮静しまたは治療するためのワクチンとして使用され得る。このような製剤は、生物起源の少なくとも１の抗原（即ち、免疫応答の最終産物、即ち抗体および／またはＴ細胞上の表面受容体と特異的に結合する能力を有する物質）を含有する。生物学的な抗原は、例えば、生きた（任意に弱毒化された）微生物、死滅微生物、生物の毒素（任意に不活化された形態、いわゆるトキソイド）、または生物の任意の他の代謝物、例えば、当該生物のサブユニット、例えば生物のＤＮＡ等、若しくは当該生物の表面分子、例えば細胞表層タンパク質、外膜タンパク質、リポポリサッカライド、炭水化物等であり得る。いずれにせよ、用語「生物学的な抗原」には、生きたまたは死滅した微生物、および例えば、細菌、ウイルス、動物、原生動物、糸状菌等の生物に由来する生物学的分子（好ましくはタンパク質またはポリサッカライド）が包含される。用語「由来する」には、生物学的分子自体またはその前駆体が生物によって産生されることが包含される。
【０００３】
抗原製剤に存在する抗原と抗体またはＴ細胞との間の相互作用の量は、それぞれの抗体またはＴ細胞受容体との抗原の固有の結合特性のみならず、製剤中の抗原のエピトープとも呼ばれる関連結合部位の利用可能性にも依存する。この利用可能性は、製剤中の抗原の提示に関するその能力および保存性に依存する。理想的な製剤は、最適な抗原提示を提供し、好ましくは抗原を分解から防御する。当該技術分野において、不活性油、例えば軽質炭化水素油（例えば、Ｍａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））およびスクアラン等を含む製剤が、抗原提示に対して最も多く使用されている。ヒトへの適用については、ビタミンＥアセテートが広く使用されている。
【０００４】
良好な抗原提示を提供する、代わりの製剤に対する要求がまだ存在する。このために、前文に従って抗原製剤が考案されたが、ここで製剤は、主要構成成分として（典型的には油自体の重量に基づいて５０％を超えて）エレオステアリン酸の脂肪酸エステルを含有する油を含む。驚いたことに、本製剤における種々の異なる抗原の型の抗体との結合に対する利用可能性が、先行技術の製剤にまさって改善されること、また提示が製剤を紫外線照射に曝すことによってさらに改善され得ることが見出された。後者は、抗原を含有する製剤をＵＶ照射に曝すときに予期されることと完全に矛盾している。周知の通り、ＵＶ照射は多くの抗原の構成成分にとって、特にタンパク質にとって有害である。見出され改良された抗原提示の理由は不明である。脂肪酸であるエレオステアリン酸を使用する付随する利点は、例えば軽質炭化水素油やスクアラン等の非生分解性の油と比べとときに、油が身体においてより少ない痕跡しか残留し得ないその生分解性にある。本発明はまた、少なくとも１つの生物学的な抗原を含む抗原製剤を製造するための、主要構成成分としてエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを含有する油の使用にも関する。
油は、水相と一体となってエマルジョンを構成するために使用し得ることに留意されたい。周知の通り、エマルジョンは、少なくとも２の非混和性の液相を含有する１の分散系である。常に、２の非混和性相の一方は水性であり、他方は油（単に水非混和性の液体を意味する）である。水相または油相が分散相となるかどうかは、とりわけ存在する２の液相の含量に依存する。油が水相くまなく液滴として分散されているエマルジョンは、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンと呼ばれる。水が分散される相であり油が分散媒（連続媒体とも呼ばれる）であるときは、エマルジョンは油中水型（Ｗ／Ｏ）である。また、特に活性成分の放出を遅らせるために、多様なエマルジョンが開発されてきた。エマルジョンのこれらの種類では、３（またはそれ以上）の相が存在する。このようなエマルジョンは、例えばＷ／Ｏ／ＷまたはＯ／Ｗ／Ｏ型である。生物学的な抗原は、水性製剤中に単に懸濁される代わりに乳化されるときに、より迅速でより良好な免疫応答を引き起こし得ることが知られている。
【０００５】
脂肪酸エステルは、エレオステアリン酸のトリグリセリドであり得て、それは通常エレオステアリン酸の自然起源のエステルである。当該油は、好ましくはエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを６０ないし９０％の間で含有する。本発明において使用し得る典型的な油は、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）の種子油（「桐油」または「シナ桐油」とも呼ばれる）由来である。この種子油は一般に入手可能であり安価である。調整誘導油（特定の要求に合致）が、例えば、実際の種子油から不純物を除去することによって、または粘度調整剤、安定剤、界面活性剤等の成分を添加することによって、この自然起源の油から作成され得る。１の実施形態において、油は実際の桐油、即ちシナアブラギリから得られる油である。桐油は、エレオステアリン酸のエステルを５０％（ｗ／ｗ）以上、典型的には７３ないし８２％（ｗ／ｗ）の間で含有し、それが桐油を本発明の製剤での使用のために理想的に適したものとしている。
【０００６】
１の実施形態において、製剤は水性液体における油のエマルジョンである。好ましくは、抗原は水性液体中に存在する。適した抗原の例には、ＡＰＸ  ＩＩＩ毒素、ウシＲＳウイルスの抗原（例えば、このウイルスのサブユニットまたはウイルス全体）およびパラインフルエンザ３ウイルスの抗原（例えば、このウイルスのサブユニットまたはウイルス全体）がある。
【０００７】
さらに他の実施形態において、製剤はＵＶ照射に曝される。本当に驚くことに、抗原提示は、製剤を紫外線照射に曝すことによってさらに改善し得ることが見出された。
【０００８】
本発明について以下の実施例においてさらに説明する。
【０００９】
実施例１  水中油型エマルジョン中で処方されたＲＴＸ毒素ＡＰＸ  ＩＩＩ
実施例２  水中油型エマルジョン中で処方された不活化ＢＲＳウイルス
実施例３  水中油型エマルジョン中で処方された不活化ＰＩ−３ウイルス
実施例４  別の水中油型エマルジョン中で処方されたＲＴＸ毒素ＡＰＸ  ＩＩＩ
【実施例１】
【００１０】
第一の実施例として、製剤は、ブタの病原菌であるアクチノバチルス・プルロニューモニア（ＡＰＰとも呼ばれる）により産生される細菌のＲＴＸ毒素ＡＰＸ  ＩＩＩにより作成した。この抗原は、市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＡＰＰ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）においてワクチン成分として使用されており、ブタがＡＰＰの血清型２、３、４、６または８型（これらの血清型はＡｘｐ  ＩＩＩを産生する）のいずれかに感染されているかどうかを証明するための診断試験において使用され得る。
【００１１】
０．０１Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ）のＴｗｅｅｎ８０（Ｕｎｉｑｅｍａ  Ｎｅｄｅｒｌｎｄ  ＢＶ，Ｇｏｕｄａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の溶液は、ＰＢＳ緩衝液の１５９．２１グラム（５０℃）においてＴｗｅｅｎ８０の４０．７９グラムを澄明な溶液が得られるまで磁気的に混合することによって作成した。この溶液は約８℃に冷却した。この溶液の５３．０７グラムに約２０℃の温度を有する５０グラムの桐油（Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ  ＢＶ，Ｔｉｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を徐々に添加し、窒素雰囲気下でｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ  ｍｉｘｅｒ（ＩＫＡ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１４Ｎ回転子／固定子を使用して混合した。油の添加は、約１１０００ｒｐｍの混合速度で３分１２秒かけて行った。その後、エマルジョンは、約２２０００ｒｐｍでさらに１０分間撹拌した。この過程の間に、エマルジョンの温度は１６℃から３２℃に上昇した。油滴の８０％が２μｍ未満（顕微鏡で測定）の直径を有するように思われた。
【００１２】
エマルジョンの９．２５グラムにＡＰＸ  ＩＩＩ抗原の水性（０．０１Ｍ  ＰＢＳ）懸濁液の５０．５８グラムを添加し、最終ＡＰＸ  ＩＩＩ製剤を得た。この最終製剤において目指した抗原濃度は２５Ｕ／ｍｌであった。
【００１３】
対照製剤を構成するために、同一のＡＰＸ  ＩＩＩ抗原懸濁液の５０．５８グラムを０．０１Ｍ  ＰＢＳの９．２５ｇに添加した（従って、同様に２５Ｕ／ｍｌのＡＰＸ  ＩＩＩ濃度を目指した）。
【００１４】
製剤の力価は、抗ＡＰＸ  ＩＩＩ抗体を使用する抗原（量）測定用ＥＬＩＳＡによって測定した。製剤が毒素を分解から保護するかどうかを確証するために、製剤が紫外線照射に曝される試験を実施した。この試験において、Ｍｉｒａｓｏｌ  ＰＲＴ  ｓｙｓｔｅｍ（照明器、バージョン５．１、ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡから入手可能）を使用した。曝される試料の約５７ｍｌをＭｉｒａｓｏｌ装置に標準装備するプラスチック製バッグに移した。そのあと、１２０  ｍｌの酸素ガスをなお添加した。その内容物を含むバッグを製造者の指示に従ってＭｉｒａｓｏｌ装置に一列に配置し、（標準）ＵＶ照射プログラムを実施した。総照射時間は１５分であった。ＵＶ照射後、酸素ガスは窒素ガスフラッシングによって除去した。
【００１５】
製剤において測定された力価は表１に示す。力価は、２の測定値の平均値である。
【００１６】
油がＥＬＩＳＡ試験において抗原提示に関し好ましい効果を有することは明らかである。油により力価は、１３単位／ｍｌ増加する。ＡＰＸ  ＩＩＩの関連結合部位の利用可能性が、桐油の存在によって増加されるように思われる。注目に値するのは、ＵＶ照射暴露に起因する４３から６９Ｕ／ｍｌへの力価の増加である。
【００１７】
【表１】
2014512374.tif 000002
【実施例２】
【００１８】
第二の実施例において、製剤は不活化ＢＲＳウイルスにより作成した。この抗原は、市販のワクチンＢｏｖｉｌｉｓ  Ｂｏｖｉｐａｓｔ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）においてワクチン成分として使用されており、畜牛がウシＲＳウイルスに感染されているかどうかを証明するための診断試験において使用し得る。
【００１９】
０．０１Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ）のＴｗｅｅｎ８０（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  Ｄｅｌａｗａｒｅ）の溶液は、ＰＢＳ緩衝液の１５９．２１グラム（５０℃）においてＴｗｅｅｎ８０の４０．７９グラムを澄明な溶液が得られるまで磁気的に混合することによって作成した。この溶液は約２０℃に冷却した。この溶液の５３．０７グラムに約２０℃の温度を有する５０グラムの桐油（Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ  ＢＶ，Ｔｉｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を徐々に添加し、窒素雰囲気下でｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ  ｍｉｘｅｒ（ＩＫＡ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１８Ｎ回転子／固定子を使用して混合した。油の添加は、１７０００ｒｐｍの混合速度で３分１３秒かけて行った。その後、エマルジョンは、２０２００ｒｐｍで５分３０秒、２４０００ｒｐｍでさらに３分３０秒間撹拌した。この過程で、エマルジョンの温度は２２℃から３５℃に上昇した。油滴の約８０〜９０％が、５μｍ未満（顕微鏡で測定）の直径を有するように思われた。
【００２０】
エマルジョンの９．２５グラムに不活化ＢＲＳウイルスの水性（０．０１Ｍ  ＰＢＳ）懸濁液の５０．５８グラムを添加して、最終製剤を得た。この最終製剤において目指した抗原濃度は１２５Ｕ／ｍｌであった。
【００２１】
対照製剤を構成するために、同一のＢＲＳウイルス懸濁液の５０．５８グラムを０．０１Ｍ  ＰＢＳの９．２５ｇに添加した（従って、同様に１２５Ｕ／ｍｌのＢＲＳＶ濃度を目指した）。
【００２２】
製剤の力価は、抗ＢＲＳウイルス抗体を使用する抗原（量）測定用ＥＬＩＳＡによって測定した。また、製剤が紫外線照射に曝される試験も実施した。この試験において、Ｍｉｒａｓｏｌ  ＰＲＴ  ｓｙｓｔｅｍ（照明器、バージョン５．１、ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡから入手可能）を使用した。暴露される試料の約５７ｍｌをＭｉｒａｓｏｌ装置に標準装備するプラスチック製バッグに移した。そのあとで、１２０  ｍｌの酸素ガスをなお添加した。その内容物を含むバッグを、製造者の指示に従ってＭｉｒａｓｏｌ装置に一列に配置し、（標準）ＵＶ照射プログラムを実施した。総照射時間は１５分であった。ＵＶ処理後、酸素ガスは窒素ガスフラッシングによって除去した。
【００２３】
製剤において測定された力価は表２に示す。力価は、各２回測定した２の製剤の平均値である。
【００２４】
【表２】
2014512374.tif 000003
油がＥＬＩＳＡにおいて抗原提示に関し好ましい効果を有することは明らかである。油により力価は、２２単位／ｍｌ増加する。ＢＲＳＶの関連結合部位の利用可能性は、桐油の存在によって増加されるように思われる。また、注目に値するのは、ＵＶ照射暴露に対する明白で完全な保護である。桐油が存在しないと、ＵＶ照射により力価の完全な喪失が生じる。桐油が存在すると、力価は一定のままである。
【実施例３】
【００２５】
第三の実施例において、製剤は不活化パラインフルエンザ３ウイルスにより作成した。この抗原は、市販のワクチンＢｏｖｉｌｉｓ  Ｂｏｖｉｐａｓｔ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）においてワクチン成分として使用されており、畜牛がパラインフルエンザウイルスに感染されているかどうかを証明するための診断試験において使用し得る。
【００２６】
ＢＲＳＶ製剤の調製用に作成したのと同一の油エマルジョンを使用した。エマルジョンの９．２５グラムに不活化ＰＩ−３ウイルスの水性（０．０１Ｍ  ＰＢＳ）懸濁液の５０．５８グラムを添加し最終製剤を得た。この最終製剤において目指した抗原濃度は２５Ｕ／ｍｌであった。
【００２７】
対照製剤を構成するために、同一のＰＩ−３懸濁液の５０．５８グラムを０．０１Ｍ  ＰＢＳの９．２５ｇに添加した（従って、同様に２５Ｕ／ｍｌのＰＩ−３の濃度を目指した）。
【００２８】
製剤の力価は、抗ＰＩ−３ウイルス抗体を使用する抗原（量）測定用ＥＬＩＳＡによって測定した。また、製剤が紫外線照射に曝される試験も実施した。この試験において、Ｍｉｒａｓｏｌ  ＰＲＴ  ｓｙｓｔｅｍ（照明器、バージョン５．１、ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡから入手可能）を使用した。暴露される試料の約５７ｍｌをＭｉｒａｓｏｌ装置に標準装備されるラスチック製のバッグに移した。そのあとに、１２０  ｍｌの酸素ガスをなお添加した。その内容物を含むバッグを、製造者の指示に従ってＭｉｒａｓｏｌ装置に一列に配置し、（標準）ＵＶ照射プログラムを実施した。総照射時間は１５分であった。ＵＶ処理後、酸素ガスは窒素ガスフラッシングによって除去した。
【００２９】
製剤において測定された力価は表３に示す。力価は、各２回測定した２の製剤の平均値である。
【００３０】
【表３】
2014512374.tif 000004
油は、ＥＬＩＳＡにおいて抗原提示に関し好ましい効果を有すると思われる。油により力価は、２単位／ｍｌ増加する（しかし試験１および２の結果に関する標準偏差、即ちそれぞれ０．９および１．１は、統計的にこの増加は関連し得ないようである）。非常に注目に値するのは、ＵＶ照射暴露後の力価の増加である。桐油が存在しないとＵＶ照射は力価の完全な喪失をもたらすのでなおさらである。主要構成成分としてエレオステアリン酸の脂肪酸エステルを有する桐油により、力価は増加する。
【実施例４】
【００３１】
この実施例において、エレオステアリン酸の代わりの脂肪酸エステル、即ちエレオステアリン酸メチルエステルを用いて、実施例１の実験を再度行った。このエステルは、実施例１記載の桐油の代わりに純粋な形態で使用した。
【００３２】
結果として得られた製剤は、前述のＵＶ処理を含む実施例１に記載したのと同じ力価測定に付した。実施例１の記載の５７ｍｌに代わって得られた製剤の２５０μｌをＵＶ処理したこともあって、異なる点は、ＵＶ処理が１分だけ適用されたことである。結果は以下の表４に示す。
【００３３】
【表４】
2014512374.tif 000005
エレオステアリン酸のメチルエステルが、ＥＬＩＳＡ試験において抗原提示に関し好ましい効果を有するのは明らかである。油により力価は、８単位／ｍｌ増加する。ＡＰＸ  ＩＩＩの関連結合部位の利用可能性は油の存在のために増加するように思われる。再度、ＵＶ照射暴露のために注目に値する力価の増加（３２から４２Ｕ／ｍｌ）が提供される。
【国際調査報告】
2014512374.tif 000006
2014512374.tif 000007
2014512374.tif 000008