(57)【要約】  本発明は、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物などの、バイオマスを加水分解する際に使用することのできる組成物、バイオマス材料を加水分解する方法、並びにβ−グルコシダーゼポリペプチド及び／又は活性を含む組成物の安定性及び糖化効率を向上させる方法に関する。
2014509858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１３５と少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列；又は
ｂ）Ｎ末端配列及びＣ末端配列を有し、前記Ｎ末端配列が、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１のアミノ酸配列を有し、少なくとも２００残基の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のうちの１つ以上又はすべてを含むものであり、前記Ｃ末端配列が、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２のアミノ酸配列を有し、少なくとも５０残基の長さであり、かつ配列番号１７０を含むものであり、前記ポリペプチドが、β−グルコシダーゼ活性を有する、単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１３５と少なくとも約８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１３５と少なくとも約９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記第１のβ−グルコシダーゼに由来するＮ末端配列と、前記第２のβ−グルコシダーゼに由来するＣ末端配列とを有し、前記第１のβ−グルコシダーゼ及び前記第２のβ−グルコシダーゼが互いに異なっている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端配列及び前記Ｃ末端配列が直接連結していないものの、リンカードメインを介し連結している、請求項１又は４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端配列、前記Ｃ末端配列、又は前記リンカードメインが、ループ領域配列を含み、該ループ領域配列が、アミノ酸残基３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでありかつ配列番号１７１又は１７２のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
前記第１のβ−グルコシダーゼ又は前記第２のβ−グルコシダーゼと比較して安定性が向上している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記安定性の向上が、貯蔵条件又は産生条件下でのタンパク質分解耐性の向上である、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｎ末端配列が、同じ長さの配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８又は７９の配列と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記Ｃ末端配列が配列番号１７０の配列モチーフを含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、前記Ｃ末端配列が、同じ長さの配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９の配列と少なくとも９０％配列同一性を有する、請求項４〜８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｎ末端配列が、３つ以上、４つ以上、５つ以上の配列番号１３６〜１４８の配列モチーフの後に続き、前記Ｃ末端配列が、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の配列番号１４９〜１５６の配列モチーフの後に続く、請求項９又は１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む組成物。
【請求項１３】
１種以上のセルラーゼを更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記１種以上のセルラーゼが、エンドグルカナーゼ、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びその他のβ−グルコシダーゼから選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が１種以上のヘミセルラーゼを更に含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記１種以上のヘミセルラーゼが、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼから選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記β−グルコシダーゼが、前記組成物中の総タンパク質量に対して１重量％〜７５重量％の量で存在する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
培養混合物又は発酵ブロスである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
全ブロス製剤である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
単離ポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号８３と少なくとも７０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、又は
ｂ）厳密度の高い条件下で配列番号８３若しくはその相補配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を含む、又は
ｃ）β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号１３５と少なくとも約７０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドをコードしており、又はβ−グルコシダーゼ活性を有し、Ｎ末端配列及びＣ末端配列を含む単離ポリペプチドをコードしており、前記Ｎ末端配列は、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１のアミノ酸配列を含み、少なくとも２００残基の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のうちの１つ以上又はすべてを含むものであり、かつ前記Ｃ末端配列は、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２のアミノ酸配列を含み、少なくとも５０残基の長さのであり、かつ配列番号１７０を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号８３と少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項２０又は２１に記載のポリヌクレオチドを発現するよう遺伝子組換えされた、組み換え宿主細胞。
【請求項２４】
バクテリア又は真菌細胞である、請求項２３に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２５】
バチルス（Bacillus）、又は大腸菌（E. coli）から選択される、請求項２４に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２６】
トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、又は酵母細胞から選択される、請求項２４に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を発酵させることで調製される、発酵ブロス又は培養混合組成物。
【請求項２８】
バイオマス材料を請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２７に記載の発酵ブロス若しくは培養混合組成物と接触させる工程を含む、セルロース系バイオマス材料を加水分解する方法。
【請求項２９】
前記バイオマス材料が、種子、穀類、塊茎、植物性廃棄物又は食品加工若しくは工業加工に関係する副産物、茎、トウモロコシ穂軸、まぐさ、葉、草、多年生の竹（perennial canes）、木材、紙、パルプ及び再生紙、ポテト、マメ科植物大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビーツ、及びシュガーケーンバガスから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオマス材料に前処理を行う、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記前処理が、酸性前処理若しくは塩基性前処理、又は酸性前処理と塩基性前処理の併用を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２７に記載の発酵ブロス若しくは培養混合組成物、又は請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の加水分解方法を、商用の設定又は工業用の設定で適用する方法であって、市販の酵素供給モデル又は現場型の生物精製所モデル戦略に従う、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月１７日に出願された米国仮出願特許第６１／４５３，９１８号の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、一般的に、特定のβ−グルコシダーゼ酵素、及び改変型β−グルコシダーゼ組成物、β−グルコシダーゼ発酵ブロス組成物、並びにこのようなβ−グルコシダーゼを含むその他の組成物、並びに研究、産業、又は商業用途でこれらの組成物を製造する方法、又は使用する方法、例えば、糖化、すなわち、ヘミセルロースと、場合によりセルロースとを含むバイオマス材料を発酵性糖質へと変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
石油危機が発生した１９７０年代から、研究者らは、再生可能なリグノセルロース系バイオマスを発酵性糖質へと生物変換し、続いて発酵させて、液体燃料の代替としてアルコール（例えば、エタノール）を生成する工程に強い関心を持っている（Ｂｕｎｇａｙ，Ｈ．Ｒ．，「Ｅｎｅｒｇｙ：ｔｈｅ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｏｐｔｉｏｎｓ」．ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；１９８１；Ｏｌｓｓｏｎ  Ｌ，Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ  Ｂ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９６，１８：３１２〜３１；Ｚａｌｄｉｖａｒ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１，５６：１７〜３４；Ｇａｌｂｅ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２，５９：６１８〜２８）。ここ数十年程の間、エタノールは、アメリカではガソリンに１０％混合され、あるいはブラジルではそのまま乗り物用の燃料として使用されてきた。バイオエタノール燃料の重要性は、油の価格が上昇し、かつ資源が徐々に枯渇していることに関連して増加している。加えて、発酵性糖質は、プラスチック、ポリマー、及びその他のバイオ系材料の製造時にますます使用されるようになっている。したがって、豊富に得られ、低コストであり、石油系燃料の代わりに使用することができ、発酵性糖質に対する需要が急増している。
【０００４】
再生可能なバイオマス材料の中でも、とりわけ、発酵性糖質へと変換することができるセルロース及びヘミセルロース（キシラン）は有用である。酵素による、これらの多糖類の、可溶性糖質（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、及び／又は他のヘキソース及びペントース）への変換は、多様な酵素の複合作用により生じる。例えば、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＧ）及びエキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）は、不溶性セルロースのセロオリゴ糖への加水分解（例えば、セロビオースが主生成物となる）を触媒するのに対し、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）は、オリゴ糖をグルコースに変換する。キシラナーゼは、その他のアクセサリータンパク質（ヘミセルラーゼ；非限定的な例としては、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、フェルロイル及びアセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、及びβ−キシロシダーゼが挙げられる）とともに、ヘミセルロースの加水分解を触媒する。
【０００５】
植物の細胞壁は、共有結合及び非共有結合的な手段により相互作用する、互いに非常に異なる複合多糖類の混合物からなる。高等植物の細胞壁に含まれる複合多糖類としては、例えば、セルロース（β−１，４グルカン）が挙げられる。一般的に、セルロースは、細胞壁の成分に含まれる炭素原子のうちの３５〜５０％を占める。セルロースポリマーは、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用及び疎水性相互作用により自己集合し、準結晶性セルロースミクロフィブリルを形成する。これらのミクロフィブリルは、一般に非晶質セルロースとして知られる、非結晶性の領域も含有する。セルロースミクロフィブリルは、ヘミセルロース（例えば、キシラン、アラビナン、及びマンナンを含む）、ペクチン（例えば、ガラクツロナン及びガラクタン）、及びその他の各種β−１，３及びβ−１，４グルカンから形成されるマトリックスに埋め込まれている。これらのマトリックスポリマーは、多くの場合、例えば、アラビノース、ガラクトース及び／又はキシロース残基による置換を受け、非常に複雑なアラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトマンナン、及びキシログルカンを形成する。ヘミセルロースマトリックスは、次にポリフェノール化合物のリグニンにより包囲される。
【０００６】
有用な発酵性糖質をバイオマス材料から得るために、一般的には、リグニンを分解し、可溶化させ、かつヘミセルロースを分解させて、セルロース加水分解酵素を接近させる。発酵性糖質を得る前にバイオマス材料の複雑なマトリックスを分解させるには、酵素活性を協調的に機能させる必要がある場合がある。
【０００７】
セルロース系資源の種類とは関係なく、酵素の費用効果及び加水分解効率は、バイオマスの生物化学的変換工程の商業化を制限する主要な要因である。微生物により酵素を産生させる際にかかる産生コストは、酵素産生株の産生性と、発酵ブロスの最終的な活性収率とに密接に関係する。多酵素複合体による加水分解効率は、例えば、個々の酵素の特性、それらの相乗作用、及び多酵素配合物に含まれる酵素の比などの、多数の要因に基づいて決定され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野では、効率が十分なものであり、若しくは向上しており、発酵性糖質の収率が向上しており、及び／又は様々なセルロース性材料又はヘミセルロース性材料に対する作用性能が向上している、植物及び／又はその他のセルロース性材料又はヘミセルロース性材料を発酵性糖質ヘと変換し得る酵素及び／又は酵素組成物を同定することが必要とされている。本明細書に記載の改良された方法及び組成物は、再生可能な資源から低コストで発酵性糖質を生成することのできる酵素組成物を提供する。
【０００９】
本明細書に引用される特許、特許出願、文献、ヌクレオチド／タンパク質配列のデータベースアクセッション番号、並びに論文は、参照により本明細書にその全文が組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書では、変異体（variants）、変異体（mutants）、ハイブリッド／キメラ／融合酵素などの数多くのβ−グルコシダーゼポリペプチド、これらのポリペプチドをコードしている核酸、このようなポリペプチドを含む組成物、並びにこれらの組成物を用いる方法が提供される。本明細書の組成物は、一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物である。この組成物には、ヘミセルラーゼ組成物などの１種以上のヘミセルラーゼを更に含有させることができる。一部の態様では、この組成物を糖化工程に使用して、様々なバイオマス材料を発酵性糖質へと変換することができる。一部の態様では、本明細書の組成物は、糖化活性又は糖化効率を改良し、かつその他の利点を提供する。同様に、本明細書では、細胞、例えば、遺伝子組み換えを行った宿主細胞、これらの細胞に由来する発酵ブロス、並びにこれらの細胞又は発酵ブロスを用いる方法又は工程も提供される。更に、かかるポリペプチド、これらのポリペプチドをコードしている核酸、及びこのようなポリペプチドを含む組成物を用いるビジネス・メソッドを説明し、かつ本発明において企図する。
【００１１】
特定の態様では、本開示は、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ配列に関するβ−グルコシダーゼのキメラポリペプチド（又はハイブリッドポリペプチド、又は融合ポリペプチド。これらの用語は、本明細書において、同一の概念について述べる際に互換的に使用される）を含む、非天然に得られるセルラーゼ組成物を提供する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。この組成物は、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の１つ以上を更に有する。したがって、組成物はヘミセルラーゼ組成物であり得る。非天然に得られるセルラーゼ／ヘミセルラーゼ組成物は、少なくとも２つの異なる資源に由来する成分を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ／ヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを含む。組成物に含まれるβ−グルコシダーゼポリペプチドは、１つ以上のグリコシル化部位を有し得る。一部の態様では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、Ｎ末端配列及びＣ末端配列を含み、Ｎ末端配列又はＣ末端配列はそれぞれ、異なるβ−グルコシダーゼに由来する下位配列を１つ以上含む。特定の態様では、Ｎ末端及びＣ末端配列は、異なる供給源に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端及びＣ末端配列の１つ以上の下位配列のうち少なくとも２つは異なる供給源に由来する。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ末端配列のいずれかは、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ領域配列を更に含む。特定の実施形態では、Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、直接隣接しており、又は直接連結している。他の実施形態では、Ｎ末端及びＣ末端配列は直接隣接しておらず、むしろ、それらはリンカードメインにより機能的に関連付けられている。特定の実施形態では、リンカードメインはキメラポリペプチドの中央に位置する（例えば、Ｎ末端又はＣ末端のいずれにも位置しない）。特定の実施形態では、ハイブリッドポリペプチドのＮ末端配列もＣ末端配列もループ配列を含まない。代わりに、リンカードメインがループ配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、β−グルコシダーゼ又はそれらの変異体の第１アミノ酸配列を、少なくとも約２００残基（例えば、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基）分の長さで含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ末端配列は、β−グルコシダーゼ又はそれらの変異体の第２アミノ酸配列を、少なくともアミノ酸約５０残基（例えば、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００残基）分の長さで含む。一部の態様では、Ｃ末端配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以��のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。一部の態様では、Ｃ末端又はＮ末端配列のいずれかは、アミノ酸残基を約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む、ループ配列を含む。一部の態様では、Ｃ末端もＮ末端配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、Ｃ端末配列及びＮ末端配列は、リンカードメインにより連結され、リンカードメインは、アミノ酸残基を約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号１３５と少なくとも約６５％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド（すなわち、β−グルコシダーゼポリペプチド）は、配列番号８３と少なくとも約６５％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有するヌクレオチド、又は厳密度の高い条件下で配列番号８３又はその相補配列とハイブリッド形成することのできるポリヌクレオチドによりコードされる。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物中に含まれるβ−グルコシダーゼポリペプチドは、キメラポリペプチドの各Ｃ末端及び／又はＮ末端配列に由来する天然の酵素のいずれと比較しても安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度が減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、又は約２０％未満、より好ましくは１５％未満、又は１０％未満である。
【００１２】
本開示のポリペプチドは、「実質的に純粋な」状態で得る及び／又は使用するのに好適である。例えば、本開示のポリペプチドは、所定の組成物に含まれる総タンパク質のうち少なくとも約８０重量％（例えば、少なくとも約８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、又は９９重量％）を構成する。この組成物は、緩衝液又は溶液などのその他の成分も含む。
【００１３】
一部の態様では、本開示は、変異体（variants）、変異体（mutants）、及びハイブリッド／融合／キメラポリペプチドを含むβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸を提供する。例えば、本開示は、β−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている単離核酸を提供し、核酸は、配列番号８３に対して少なくとも約６５％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有し、すなわち、厳密度の高い条件下で配列番号８３又はその相補配列とハイブリッド形成することができる。本開示は、このような核酸分子を含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、本開示は、核酸分子及び宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモーター及びベクターも更に提供する。特定の態様では、本開示は、宿主細胞の発酵により調製された、セルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物を包含する組成物を提供する。本開示では、そのような組成物として発酵ブロス組成物を提供する。
【００１４】
一部の態様では、本開示は、組成物、ポリペプチド、細胞、又は本明細書のポリペプチドをコードしている核酸を用い、バイオマス基質／材料の糖化を行う方法を提供する。特定の実施形態では、バイオマス基質／材料は、適切に前処理されており、又は適切な前処理を実施される。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物、ポリペプチド、細胞、又は核酸と関係のある特定の商業的手法又はビジネス・メソッドも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
以下の図表は、例示を意図したものであり、本明細書の開示又は請求項の範囲及び内容を制限するものではない。
【図１Ａ】多様な酵素及びこれらの特定の酵素をコードしているヌクレオチドに関し、本開示で使用される配列名を要約する表。
【図１Ｂ】多様な酵素及びこれらの特定の酵素をコードしているヌクレオチドに関し、本開示で使用される配列名を要約する表。
【図１Ｃ】多様な酵素及びこれらの特定の酵素をコードしているヌクレオチドに関し、本開示で使用される配列名を要約する表。
【図１Ｄ】多様な酵素及びこれらの特定の酵素をコードしているヌクレオチドに関し、本開示で使用される配列名を要約する表。
【図２】サブサイト−１によりグルコースと複合体を形成したＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）Ｂｇｌ３Ｂ結晶構造に基づき予測された、特定のβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｆｖ３Ｃ）相同体間で保存されている残基についての表（結晶構造のタンパク質データバンク登録番号：ｐｄｂ：２Ｘ４１）。
【図３】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａにより産生される発酵ブロスの酵素組成物。
【図４Ａ】実施例２の各サンプルに個々に加えた酵素（精製又は未精製）、及びこれらの酵素の貯蔵タンパク質濃度（stock protein concentrations）のリスト。
【図４Ｂ】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、図４Ａに記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物を添加することにより糖化した後に放出される、グルコース量。これらの酵素は、実施例２に従いＴ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａに加えた。
【図４Ｃ】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、図４Ａに記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物により糖化した後に放出される、セロビオース量。これらの酵素は、実施例２に従いＴ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａに加えた。
【図４Ｄ】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、図４Ａに記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物により糖化した後に放出される、キシロビオース量。これらの酵素は、実施例２に従いＴ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａに加えた。
【図４Ｅ】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、図４Ａに記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物により糖化した後に放出されるキシロース量。これらの酵素は、実施例２に従いＴ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａに加えた。
【図５Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）、Ｆｖ３Ｃ、Ｆｖ３Ｄ及びＰａ３Ｃといった数多くのβ−グルコシダーゼ相同体のβ−グルコシダーゼ活性のリスト。セロビオース及びＣＮＰＧ基質に対する活性を実施例４に記載の通りに測定した。
【図５Ｂ】実施例５Ａに記載に従う、セロビオース及びＣＮＰＧ基質に対する、その他のβ−グルコシダーゼ相同体群の活性の、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１との比較。
【図６】実施例５Ｂ〜Ｄで試験した酵素混合物／組成物中の酵素の相対重量を示す表。
【図７】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する酵素組成物の効果を比較する表。
【図８Ａ】Ｆｖ３Ａヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図８Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ３Ａアミノ酸配列（配列番号２）。
【図９Ａ】Ｐｆ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図９Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載し、予測糖結合モジュール（「ＣＢＭ」）は大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭ間の予測リンカーはイタリック体で記載した、Ｐｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号４）。
【図１０Ａ】Ｆｖ４３Ｅヌクレオチド配列（配列番号５）。
【図１０Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ４３Ｅアミノ酸配列（配列番号６）。
【図１１Ａ】Ｆｖ３９Ａヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１１Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインをボールド体で記載されている、Ｆｖ３９Ａアミノ酸配列（配列番号８）。
【図１２Ａ】Ｆｖ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図１２Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載され、予測ＣＢＭは大文字で記載され、保存ドメイン及びＣＢＭ間の予測リンカーはイタリック体で記載されている、Ｆｖ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図１３Ａ】Ｆｖ４３Ｂヌクレオチド配列（配列番号１１）。
【図１３Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号１２）。
【図１４Ａ】Ｐａ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号１３）。
【図１４Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインはボールド体で記載され、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、ゲノムＤＮＡのコドンが最適化されている（図２７Ｃを参照）、Ｐａ５１Ａアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１５Ａ】Ｇｚ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号１５）。
【図１５Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｇｚ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１６）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）中の予測シグナル配列は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１のシグナル配列（ＭＹＲＫＬＡＶＩＳＡＦＬＡＴＡＲＡ（配列番号１５９））で置き換えた。
【図１６Ａ】Ｆｏ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号１７）。
【図１６Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｏ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１８）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、予測シグナル配列は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ＭＹＲＫＬＡＶＩＳＡＦＬＡＴＡＲＡ（配列番号１５９））で置き換えた。
【図１７Ａ】Ａｆ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号１９）。
【図１７Ｂ】予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ａｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号２０）。
【図１８Ａ】Ｐｆ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号２１）。
【図１８Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｐｆ５１Ａアミノ酸配列（配列番号２２）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、予測Ｐｆ５１Ａシグナル配列は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ＭＹＲＫＬＡＶＩＳＡＦＬＡＴＡＲＡ（配列番号１５９））で置き換え、かつＴ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際にＰｆ５１Ａヌクレオチド配列のコドンを最適化させた。
【図１９Ａ】ＡｆｕＸｙｎ２ヌクレオチド配列（配列番号２３）。
【図１９Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインＧＨ１１はボールド体で記載されている、ＡｆｕＸｙｎ２アミノ酸配列（配列番号２４）。
【図２０Ａ】ＡｆｕＸｙｎ５ヌクレオチド配列（配列番号２５）。
【図２０Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインＧＨ１１はボールド体で記載されている、ＡｆｕＸｙｎ５アミノ酸配列（配列番号２６）。
【図２１Ａ】Ｆｖ４３Ｄヌクレオチド配列（配列番号２７）。
【図２１Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ４３Ｄアミノ酸配列（配列番号２８）。
【図２２Ａ】Ｐｆ４３Ｂヌクレオチド配列（配列番号２９）。
【図２２Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｐｆ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号３０）。
【図２３Ａ】ヌクレオチド配列（配列番号３１）。
【図２３Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインはボールド体で記載した、Ｆｖ５１Ａアミノ酸配列（配列番号３２）。
【図２４Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ヌクレオチド配列（配列番号４１）。
【図２４Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３アミノ酸配列（配列番号４２）。
【図２５Ａ】シグナル配列には下線を付け、予想される保存ドメイン残基はボールド体で記載している、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２のアミノ酸配列（配列番号４３）。
【図２５Ｂ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２のヌクレオチド配列（配列番号１６２）。コード配列は、Ｔｏｒｒｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：１４６１〜６５に見ることができる。
【図２６Ａ】シグナル配列には下線が付けられ、予測保存ドメインはボールド体で記載された、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１のアミノ酸配列（配列番号４４）。
【図２６Ｂ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１のヌクレオチド配列（配列番号１６３）。コード配列はＭａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６，６２（１０）：３８４０〜４６に見ることができる。
【図２７Ａ】シグナル配列には下線が付けられ、コード配列はＢａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９（６）：５６２〜５６７に見ることができる、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のアミノ酸配列（配列番号４５）。
【図２７Ｂ】Ｐａ５１Ａに推定されるｃＤＮＡ（配列番号４６）。
【図２７Ｃ】Ｐａ５１Ａのコドンを最適化したｃＤＮＡ（配列番号４７）。
【図２７Ｄ】Ｇｚ４３Ａの成熟配列をコードしているゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含むコンストラクトのコード配列（配列番号４８）。
【図２７Ｅ】Ｆｏ４３Ａの成熟配列をコードしているゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含むコンストラクトのコード配列（配列番号４９）。
【図２７Ｆ】Ｐｆ５１Ａをコードしている、コドンを最適化したＤＮＡの上流に、ＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含む、コンストラクトのコード配列（配列番号５０）。
【図２８Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のヌクレオチド配列（配列番号５１）。
【図２８Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載され、予測リンカーはイタリック体で記載する、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のアミノ酸配列（配列番号５２）。
【図２９Ａ】Ｐａ３Ｄのヌクレオチド配列（配列番号５３）。
【図２９Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｐａ３Ｄのアミノ酸配列（配列番号５４）。
【図３０Ａ】Ｆｖ３Ｇのヌクレオチド配列（配列番号５５）。
【図３０Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ３Ｇのアミノ酸配列（配列番号５６）。
【図３１Ａ】Ｆｖ３Ｄのヌクレオチド配列（配列番号５７）。
【図３１Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ３Ｄのアミノ酸配列（配列番号５８）。
【図３２Ａ】Ｆｖ３Ｃのヌクレオチド配列（配列番号５９）。
【図３２Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｖ３Ｃのアミノ酸配列（配列番号６０）。
【図３３Ａ】Ｔｒ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６１）。
【図３３Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｔｒ３Ａのアミノ酸配列（配列番号６２）。
【図３４Ａ】Ｔｒ３Ｂのヌクレオチド配列（配列番号６３）。
【図３４Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｔｒ３Ｂのアミノ酸配列（配列番号６４）。
【図３５Ａ】コドンを最適化したＴｅ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６５）。
【図３５Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｔｅ３Ａのアミノ酸配列（配列番号６６）。
【図３６Ａ】Ａｎ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６７）。
【図３６Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ａｎ３Ａのアミノ酸配列（配列番号６８）。
【図３７Ａ】Ｆｏ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６９）。
【図３７Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｆｏ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７０）。
【図３８Ａ】Ｇｚ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号７１）。
【図３８Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｇｚ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７２）。
【図３９Ａ】Ｎｈ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号７３）。
【図３９Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｎｈ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７４）。
【図４０Ａ】Ｖｄ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号７５）。
【図４０Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｖｄ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７６）。
【図４１Ａ】Ｐａ３Ｇのヌクレオチド配列（配列番号７７）。
【図４１Ｂ】予測シグナル配列には下線が付され、予測保存ドメインはボールド体で記載されている、Ｐａ３Ｇのアミノ酸配列（配列番号７８）。
【図４２】Ｔｎ３Ｂのアミノ酸配列（配列番号７９）。一般的なシグナル予測プログラムＳｉｇｎａｌ  Ｐでは予測シグナル配列は得られなかった。
【図４３Ａ−１】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ａ−２】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ａ−３】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ａ−４】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ａ−５】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ａ−６】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ａ−７】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図４３Ｂ−１】β−グルコシダーゼ相同体のアラインメント。相同体のうち一部のものはタンパク質の分解により切断を受けることが知られているが、他の相同体については不明である。最初に下線を付した領域は、このクラスの酵素のおおよそ中央に位置するループ配列の残基を含有する。第１の下線領域から下流にある第２の下線領域は、最初にタンパク質分解による消化又は切断を高頻度で受ける残基を含有している。
【図４３Ｂ−２】β−グルコシダーゼ相同体のアラインメント。相同体のうち一部のものはタンパク質の分解により切断を受けることが知られているが、他の相同体については不明である。最初に下線を付した領域は、このクラスの酵素のおおよそ中央に位置するループ配列の残基を含有する。第１の下線領域から下流にある第２の下線領域は、最初にタンパク質分解による消化又は切断を高頻度で受ける残基を含有している。
【図４３Ｂ−３】β−グルコシダーゼ相同体のアラインメント。相同体のうち一部のものはタンパク質の分解により切断を受けることが知られているが、他の相同体については不明である。最初に下線を付した領域は、このクラスの酵素のおおよそ中央に位置するループ配列の残基を含有する。第１の下線領域から下流にある第２の下線領域は、最初にタンパク質分解による消化又は切断を高頻度で受ける残基を含有している。
【図４４】Ｆｖ３Ｃ翻訳領域を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター。
【図４５Ａ】ｐＴｒｅｘ６ｇベクター。
【図４５Ｂ】発現コンストラクト（pExpression construct）ｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ｃる。
【図４６Ａ】Ｆｖ３ＣゲノムＤＮＡ配列の予測コード領域。
【図４６Ｂ】矢印は推定シグナルペプチド切断部位を示す、成熟タンパク質の開始部位には下線が付されている、Ｆｖ３ＣのＮ末端アミノ酸配列。
【図４６Ｃ】（１）下線を付した開始コドン及び（２）可能性のある開始コドンに由来するＦｖ３Ｃを発現しているＴ．リーゼイ（T. reesei）形質転換体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図４７】リン酸膨潤セルロースの５０℃での糖化における数多くの全セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物の性能の比較。本実験では、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してリン酸膨潤セルロース（０．７％セルロース、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で２時間実施した。サンプルは三つ組で試験した。この試験は実施例５Ａに従う。
【図４８】酸で前処理したトウモロコシ葉茎（ＰＣＳ）の５０℃での糖化における数多くの全セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物の性能の比較。本実験では、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してＰＣＳ（固形分１３％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。サンプルは三つ組で試験した。実験の詳細は実施例５Ｂに記載する。
【図４９】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の５０℃での糖化における数多くの全セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物の性能の比較。本実験では、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼを８ｍｇのヘミセルラーゼ及び５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用して、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ＋８ｍｇ／ｇヘミセルロース混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。サンプルは三つ組で試験した。実験の詳細は実施例５Ｃに記載する。
【図５０】水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で前処理したトウモロコシ穂軸の５０℃での糖化における全セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物の性能の比較。本実験では、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用して、ＮａＯＨで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分１７％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。各サンプルは四つ組で実施した。この試験は実施例５Ｄに従う。
【図５１】希アンモニアで前処理したスイッチグラスの５０℃での糖化における全セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物の性能の比較。本実験では、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してスイッチグラス（固形分１７％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。各サンプルは四つ組で実施した。実験の詳細は実施例５Ｅに記載する。
【図５２】ＡＦＥＸトウモロコシ葉茎の５０℃での糖化における全セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ混合物の性能の比較。本実験では、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してＡＦＥＸトウモロコシ葉茎（固形分１４％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。各サンプルは四つ組で実施した。実験の詳細は実施例５Ｆに記載する。
【図５３Ａ】β−グルコシダーゼ対全セルラーゼの比を０〜５０％で変化させた場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％）から得られるグルカン変換率。各実験間で酵素投与量は一定に維持し、図５３Ａ  Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１で実施した実験。
【図５３Ｂ】β−グルコシダーゼ対全セルラーゼの比を０〜５０％で変化させた場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％）から得られるグルカン変換率。各実験間で酵素投与量は一定に維持し、Ｆｖ３Ｃで実施した実験。
【図５３Ｃ】β−グルコシダーゼ対全セルラーゼの比を０〜５０％で変化させた場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％）から得られるグルカン変換率。各実験間で酵素投与量は一定に維持し、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）で実施した実験。
【図５４】実施例７に従って、３種の異なる酵素組成物をグルカン１ｇ当たり２．５〜４０ｍｇの投与量で投与した場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％）から得られるグルカン変換率。△は、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  １５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔキシラナーゼについて観察されるグルカン変換率を示し、◇は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａ由来の全セルラーゼについて観察されるグルカン変換率を示し、◆は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａ由来の７５重量％の全セルラーゼに加え、２５重量％のＦｖ３Ｃを含む酵素組成物について観察されるグルカン変換率を示す。
【図５５Ａ】Ａ．ニガー（A. niger）において発現させる際に使用したｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃ発現プラスミドのプラスミドマップ。
【図５５Ｂ】ｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１−９４３／９４２プラスミドマップ。
【図５５Ｃ】ｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２発現ベクター。
【図５５Ｄ】ｐＥＮＴＲ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３プラスミド。
【図５５Ｅ】ｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３発現ベクター。
【図５５Ｆ】ｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａプラスミドを記載。
【図５５Ｇ】ｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａ発現ベクター。
【図５５Ｈ】ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄプラスミド。
【図５５Ｉ】ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａプラスミド。
【図５６】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−キシロシダーゼＢｘｌ１及びＦｖ３Ａ間のアミノ酸アラインメント。
【図５７Ａ】ファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線が付され、ボールド体で記載されている、特定のＧＨ４３ファミリー加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５７Ｂ】ファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線が付され、ボールド体で記載されている、特定のＧＨ４３ファミリー加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５８】ファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線が付され、ボールド体で記載されている、特定のＧＨ５１ファミリー酵素のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５９Ａ】数多くのＧＨ１０のアミノ酸配列のアラインメント。ボールド体で記載し下線を付した残基は、触媒性求核残基である（アラインメント上部に「Ｎ」と示す）、ＧＨ１０ファミリーキシラナーゼのアラインメント。
【図５９Ｂ】数多くのＧＨ１１ファミリーエンドキシラナーゼのアミノ酸配列のアラインメント。ボールド体で記載し下線を付した残基は、触媒性求核残基であり、一般的な酸塩基残基である（それぞれアラインメント上部に「Ｎ」及び「Ａ」と示す）、ＧＨ１１ファミリーキシラナーゼのアラインメント。
【図６０Ａ】Ｆｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（「ＦＢ」）キメラ／融合ポリペプチドをコードしている遺伝子の略図。
【図６０Ｂ−１】融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（「ＦＢ」）をコードしているヌクレオチド配列（配列番号８２）。
【図６０Ｂ−２】融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（「ＦＢ」）をコードしているヌクレオチド配列（配列番号８２）。
【図６０Ｃ】融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３をコードしているアミノ酸配列（配列番号１５９）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３由来の配列をボールド体で記載する。
【図６１】ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合プラスミドマップ。
【図６２】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化について、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色菱型）及びＡ．ニガー（A. niger）で産生させたＦｖ３Ｃ（白色菱型）の比較。本実験では、１０ｍｇ／ｇの一定濃度でＨ３Ａ−５を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１及びＦｖ３Ｃをセルロース１ｇ当たり０〜１０ｍｇ充填し、これらの混合物を使用して、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（５％セルロース、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で２日間実施した。各サンプルは５つ組で実施した。実験の詳細は実施例１３に示す。
【図６３】５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）を用い、９０℃／ｒスキャン速度（２５℃〜１１０℃）で回収した、β−グルコシダーゼＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌｕ１（Ｔｒ３Ａ）、Ｆｖ３Ｃ、及びＦｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３（「ＦＡＢ」）キメラポリペプチドのＤＳＣプロファイル。
【図６４Ａ】全セルラーゼの性能：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物による５０℃でのリン酸膨潤セルロースの糖化。
【図６４Ｂ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物による３７℃でのリン酸膨潤セルロースの糖化。
【図６４Ｃ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物による５０℃での酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化。
【図６４Ｄ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物による３７℃での酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化。
【図６５Ａ】リン酸膨潤セルロースの糖化におけるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色菱型）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（白色菱型）の比較。
【図６５Ｂ】リン酸膨潤セルロースの糖化時にＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（左側のパネル）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（右側のパネル）により産生されるセロビオース（黒色バー）及びグルコース（白色バー）の比較。
【図６６Ａ】数多くのプライマーのヌクレオチド配列。
【図６６Ｂ】数多くのプライマーのヌクレオチド配列。
【図６７Ａ】Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（「ＦＡＢ」）の全長アミノ酸配列（配列番号１３５）（Ｔｅ３Ａはイタリック体のボールド体で示し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３は大文字に下線を付して示す）。
【図６７Ｂ】Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（「ＦＡＢ」）キメラをコードしている核酸配列（配列番号８３）。
【図６８Ａ】特定のキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ−及びＣ−端末ドメインに存在している構造モチーフを掲載している表。
【図６８Ｂ】本発明の好適なβ−グルコシダーゼのハイブリッド／キメラポリペプチドを設計するのに使用した具体的なアミノ酸配列モチーフを掲載している表。
【図６８Ｃ】ＧＨ６１／エンドグルカナーゼのアミノ酸配列モチーフの一覧。
【図６９Ａ】Ｐａ３Ｃのヌクレオチド及びタンパク質配列（それぞれ配列番号８０及び８１）。
【図６９Ｂ】Ｐａ３Ｃのヌクレオチド及びタンパク質配列（それぞれ配列番号８０及び８１）。
【図７０Ａ】第１の角度から見て、Ｆｖ３Ｃ及びＴｅ３Ａ、並びにＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の構造を３Ｄで重ねあわせ、「挿入１」の構造が見えるようレンダリングした図。
【図７０Ｂ】同様に第２の角度から見て構造を重ねあわせ、「挿入２」の構造が見えるようレンダリングした図。
【図７０Ｃ】同様に第３の角度から見て構造を重ねあわせ、「挿入３」の構造が見えるようレンダリングした図。
【図７０Ｄ】同様に第４の角度から見て構造を重ねあわせ、「挿入４」の構造が見えるようレンダリングした図。
【図７０Ｅ−１】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｑ１２７１５＿ＴＲＩ）、Ｔｅ３Ａ（ＡＢＧ２＿Ｔ＿ｅｍｅ）、及びＦｖ３Ｃ（ＦＶ３Ｃ）の配列アラインメント。挿入１〜４は、すべてループ様構造。
【図７０Ｅ−２】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｑ１２７１５＿ＴＲＩ）、Ｔｅ３Ａ（ＡＢＧ２＿Ｔ＿ｅｍｅ）、及びＦｖ３Ｃ（ＦＶ３Ｃ）の配列アラインメント。挿入１〜４は、すべてループ様構造。
【図７０Ｆ】Ｆｖ３Ｃ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の一部の構造を重ねあわせた図。各残基Ｗ５９／Ｗ３３及びＷ３５５／Ｗ３２５（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）間で保存されている相互作用を示す。
【図７０Ｇ】Ｆｖ３Ｃ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の一部の構造を重ねあわせた図。第１残基対：Ｓ５７／３１及びＮ２９１／２６１（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）；並びに第２残基群：Ｙ５５／２９、Ｐ７７５／７２９及びＡ７７８／７３２（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）間で保存されている相互作用を示す。
【図７０Ｈ】Ｆｖ３Ｃ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の一部の構造を重ねあわせた図。Ｆｖ３ＣのＫ１６２と「挿入２」中の骨格酸素原子Ｖ４０９との水素結合相互作用は、Ｔｅ３Ａでは保存されているものの、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１では観察されなかった。
【図７０Ｉ（ａ）】Ｆｖ３Ｃ、Ｔｅ３Ａ及び配列番号１３５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ間で共有されており、配列番号１６８で保存されているグリコシル化部位。（ａ）には、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）を重ねあわせて同様の領域を示す。黒色の矢印によりＴｅ３Ａ中の「挿入３」のループ構造を示す（配列番号１３５のハイブリッドβ−グルコシダーゼ中にも存在する）。このループ構造はグリコシル化グリカンを包埋しているよう。
【図７０Ｉ（ｂ）】Ｆｖ３Ｃ、Ｔｅ３Ａ及び配列番号１３５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ間で共有されており、配列番号１６８で保存されているグリコシル化部位。（ｂ）には、配列番号１３５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）を重ねあわせて同様の領域を記載する。黒色の矢印によりＴｅ３Ａ中の「挿入３」のループ構造を示す（配列番号１３５のハイブリッドβ−グルコシダーゼ中にも存在する）。このループ構造はグリコシル化グリカンを包埋しているよう。
【図７０Ｊ】Ｆｖ３Ｃ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の構造を一部重ねあわせた図。残基Ｗ３８６／３５５と、Ｆｖ３Ｃ及びＴｅ３Ａの「挿入２」の残基Ｗ９５／６８（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）との相互作用において保存されている相互作用を示す。相互作用はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１には存在していない。
【図７１Ａ】実施例１３に従って５０℃で４４時間インキュベートした後に可溶性画分（上清）中に測定された未結合のタンパク質の量。
【図７１Ｂ】実施例１３に従って５０℃で４４時間インキュベートした後のスラリー中の総タンパク質量（結合型及び未結合型型）。
【図７１Ｃ】実施例１３に従って緩衝液中で更に３０分インキュベートした後のスラリー中の未結合のタンパク質についての記載。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従来、酵素は、基質特異性及び反応産物により分類されてきた。プレゲノム時代では、酵素を比較する際、機能は最も適した（かつおそらく最も有用な）基準であると見なされ、各種酵素活性についてのアッセイが長年にわたって広く開発され、お馴染みのＥＣ分類スキームが誕生した。２つの糖残基間（又は、ニトロフェノール−グリコシド誘導体に生じるものなどのように、糖及び非糖残基間）のグリコシド結合に対し作用する、セルラーゼ及びその他のグリコシルヒドロラーゼは、この分類スキーム下ではＥＣ  ３．２．１．−として命名され、名前の最後に記される数字により、切断させる結合の正確な種類が示される。例えば、このスキームに従うと、エンド型セルラーゼ（１，４−β−エンドグルカナーゼ）は、ＥＣ  ３．２．１．４と表記される。
【００１７】
多様なゲノム配列決定プロジェクトの出現に伴い、配列決定データをもとに、関係する遺伝子とタンパク質とを解析及び比較することが容易になってきている。更に、糖残基に作用し得る酵素（すなわち、カルボヒドラーぜ）が数多く結晶化され、その３次元構造が明らかにされている。このような解析から、関係する配列を有しており、アミノ酸配列に基づき予測することのできる３次元構造が保存されている、各（discreet）酵素のファミリーが同定されている。更に、同様の又は類似する３次元構造を有する酵素は、異なる反応を触媒する場合であってさえも、加水分解の際に同様の又は類似の立体特異性を示すことが明らかになっている（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９８，４２５（２）：３５２〜４；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，１９９９，Ｔ．Ｋｉｍｕｒａ．Ｔｏｋｙｏ，Ｕｎｉ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｃｏ：１５〜２３．）。
【００１８】
これらの発見がもととなって、配列に基づくカルボヒドラーゼモジュールの分類がなされており、この分類は、インターネットデータベースの形態（「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅ  ｓｅｒｖｅｒ（ＣＡＺｙ）」（ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ））で利用することができる（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）：ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３３〜３８を参照されたい）。
【００１９】
ＣＡＺｙは、触媒される反応の種類に基づきカルボヒドラーゼを識別することのできる、４つの主要な分類：グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ’ｓ）、糖転移酵素（ＧＴ’ｓ）、多糖除去付加酵素（ＰＬ’ｓ）、及び糖エステラーゼ（ＣＥ’ｓ）を定義している。本開示の酵素は、グリコシルヒドロラーゼである。ＧＨ’ｓは、２つ以上の糖間の、又は糖と非糖残基との間のグリコシド結合を加水分解する酵素群である。配列類似性によりグリコシルヒドロラーゼをグループ分けする分類系では、１２０を超える異なるファミリーが定義されている。この分類はＣＡＺｙウェブサイトで利用できる。本発明の酵素は、グリコシルヒドロラーゼファミリー３（ＧＨ３）に属している。
【００２０】
ＧＨ３酵素としては、例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；及びβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２３）が挙げられる。例えば、ＧＨ３酵素は、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ、グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ、セロデキストリナーゼ、エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ、及び／又はβ−ガラクトシダーゼの活性を有する酵素であってよい。一般的に、ＧＨ３酵素は球状タンパク質であり、２つ以上のサブドメインからなる。β−グルコシダーゼでは、第３ペプチドのＮ末端に位置するアスパラギン酸残基が触媒残基として同定されており、この残基はアミノ酸フラグメントＳＤＷ内部に位置している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：８３５〜８４０）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）由来のＢｇｌ１に相当する配列は、Ｔ２６６Ｄ２６７Ｗ２６８（開始位置のメチオニンから計数）であり、触媒残基のアスパラギン酸残基としてはＤ２６７を備える。試験されたＧＨ３  β−キシロシダーゼでは、ヒドロキシル／アスパルテート配列も保存されている。例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１で相当する配列はＳ３１０Ｄ３１１であり、かつＦｖ３Ａで相当する配列はＳ２９０Ｄ２９１である。
【００２１】
本発明のポリペプチド
セルラーゼ
本開示の組成物には、１種以上のセルラーゼを含ませることができる。セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、及びセロオリゴ糖等を生成する酵素である。セルラーゼは、従来的に、３つの主要なクラス：エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及びβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）に分類されてきた（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５（９）：２５５〜２６１；Ｓｈｕｌｅｉｎ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：２３４〜２４２）。
【００２２】
本開示の方法及び組成物に従って使用する際のセルラーゼは、限定するものではないが、次の生物のうちの１種以上から得ることができ、又はこれらの生物の組み換えにより産生することができる：クロストリジウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、クリニペリス・スカペラ（Crinipellis scapella）、マクロフォミア・ファセオリナ（Macrophomina phaseolina）、ミセリオフィソーラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ソルダリア・フィミコラ（Sordaria fimicola）、ボルテラ・セロトリコイド（Volutella colletotrichoides）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、アクレモニウム菌種（Acremonium sp.）、エキシジア・グランデュロサ（Exidia glandulosa）、フォムス・フォメンタリウス（Fomes fomentarius）、スポンジペリス菌種（Spongipellis sp.）、リゾフィリクティス・ロセア（Rhizophlyctis rosea）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、フィコマイセス・ニテウス（Phycomyces niteus）、カエトスチラム・フレセニィ（Chaetostylum fresenii）、ディプロディア・ゴシピナ（Diplodia gossypina）、ウロスポラ・ビルグラミイ（Ulospora bilgramii）、サッコボラス・ジルテラス（Saccobolus dilutellus）、ペニシリウム・ベルクロサム（Penicillium verruculosum）、アオカビ（Penicillium chrysogenum）、サーモマイセス・ベルコサス（Thermomyces verrucosus）、ジアポルテ・シンゲネシア（Diaporthe syngenesia）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、ニグロスポラ菌種（Nigrospora sp.）、キシラリア・ヒポキシロン（Xylaria hypoxylon）、ネクトリア・ピネア（Nectria pinea）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、カエトミウム・モロラム（Chaetomium mororum）、カエトミウム・バーセンス（Chaetomium virscens）、カエトミウム・ブラシリエンシス（Chaetomium brasiliensis）、カエトミウム・クニコロラム（Chaetomium cunicolorum）、シスパストスポラ・ボニネンシス（Syspastospora boninensis）、クラドリナム・フォエカンヂシマム（Cladorrhinum foecundissimum）、スキタリジウム・サーモフィラ（Scytalidium thermophila）、グリオクラジウム・カテヌラタム（Gliocladium catenulatum）、フザリウム・オキシスポラム菌種・リコペルシキ（Fusarium oxysporum ssp. lycopersici）、フザリウム・オキシスポラム菌種パッシフローラ（Fusarium oxysporum ssp. passiflora）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・アングイオイド（Fusarium anguioides）、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）、ヒュミコラ・ニグレッセンス（Humicola nigrescens）、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）、パナエオラス・レチルギス（Panaeolus retirugis）、トラメテス・サングイネア（Trametes sanguinea）、シゾフィラム・コミューン（Schizophyllum commune）、トリコテキウム・ロゼウム（Trichothecium roseum）、ミクロスファロシス菌種（Microsphaeropsis sp.）、アクソボロス・スチクトイデウス（Acsobolus stictoideus spej.）、ポロニア・パンクタタ（Poronia punctata）、ノデュリスポラム菌種（Nodulisporum sp.）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei））、及びシリンドロカルポン菌種（Cylindrocarpon sp.）。セルラーゼは、バクテリアから得ることも、又はバクテリアに遺伝子組み換えにより産生させることもでき、あるいは酵母に遺伝子組み換えにより産生させることもできる。
【００２３】
例えば、本開示の方法及び／又は組成物に使用するセルラーゼは全セルラーゼであり、及び／又はカルコフローアッセイにより測定した場合に少なくとも０．１（例えば、０．１〜０．４）画分を得ることのできるものである。
【００２４】
β−グルコシダーゼ
β−グルコシダーゼ（又は本明細書においては互換的に「β−グルコシダーゼポリペプチド」）は、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒し、グルコースを放出させる。β−グルコシダーゼポリペプチドとしては、β−グルコシダーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なβ−グルコシダーゼポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に得られるポリペプチド（例えば、変異体（variant）など）及び核酸、並びにβ−グルコシダーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源に由来する変異体（mutant）ポリペプチド及び変異体（mutant）核酸が挙げられる。
【００２５】
本開示の組成物には、１種以上のβ−グルコシダーゼポリペプチドを含ませることができる。本明細書で使用するとき、用語「β−グルコシダーゼ」は、ＥＣ  ３．２．１．２１として分類されるβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、及び／又はセロビオースの加水分解を触媒してβ−Ｄ−グルコースを放出させるＧＨファミリー３メンバーを意味する。本発明のＧＨ３  β−グルコシダーゼとしては、限定するものではないが、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ（「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１」又は「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌｕ１」とも呼ばれる）、Ｔｒ３Ｂ（「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３」とも呼ばれる）、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ（「Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ」とも呼ばれる）、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、又はＴｎ３Ｂポリペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書のＧＨ３  β−グルコシダーゼポリペプチドは、β−グルコシダーゼポリペプチドに関係する活性を少なくとも１つ有する。
【００２６】
好適なβ−グルコシダーゼポリペプチドは、遺伝子組み換え法により数多くの微生物から得ることができ、あるいは供給業者から購入することができる。微生物由来のβ−グルコシダーゼの例としては、限定するものではないが、バクテリア及び真菌に由来するものが挙げられる。例えば、本開示のβ−グルコシダーゼは、適宜、糸状菌から得られる。
【００２７】
β−グルコシダーゼポリペプチドは、とりわけ、Ａ．アキュレタス（A. aculeatus）（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９９６，１７３：２８７〜２８８）、カワチコウジカビ（A. kawachi）（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９，６５：５５４６〜５５５３）、ニホンコウジカビ（A. oryzae）（国際公開第２００２／０９５０１４号）、Ｃ．ビアゾテア（C. biazotea）（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，１９９８，２０７：７９〜８６）、Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）（国際公開第２００４／０７８９１９号）、Ｓ．フィブリゲラ（S. fibuligera）（Ｍａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８，５４：３１４７〜３１５５）、Ｓ．ポンベ（S. pombe）（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１５：８７１〜８８０）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（例えば、β−グルコシダーゼ１（米国特許第６，０２２，７２５号）、β−グルコシダーゼ３（米国特許第６，９８２，１５９号）、β−グルコシダーゼ４（米国特許第７，０４５，３３２号）、β−グルコシダーゼ５（米国特許第７，００５，２８９号）、β−グルコシダーゼ６（米国特許第２００６０２５８５５４号）、β−グルコシダーゼ７（米国特許第２００６０２５８５５４号））、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（例えば、Ｐａ３Ｄ）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）（例えば、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、又はＦｖ３Ｃ）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（例えば、Ｔｒ３Ａ又はＴｒ３Ｂ）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（例えば、Ｔｅ３Ａ）、Ａ．ニガー（A. niger）（例えば、Ａｎ３Ａ）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（例えば、Ｆｏ３Ａ）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（例えば、Ｇｚ３Ａ）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（例えば、Ｎｈ３Ａ）、Ｖ．ダヒラエ（V. dahliae）（例えば、Ｖｄ３Ａ）、Ｐ．アンセリネ（P. anserine）（例えば、Ｐａ３Ｇ）、又はＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（例えば、Ｔｎ３Ｂ）から得ることができ、又は遺伝子組み換えにより産生することができる。
【００２８】
β−グルコシダーゼポリペプチドは、β−グルコシダーゼ、変異体（variant）、ハイブリッド／キメラ／融合体、又は変異体（mutant）をコードしている内在性／外来性の遺伝子を発現させることで産生できる。例えば、β−グルコシダーゼポリペプチドは、例えば、バチルス（Bacillus）若しくはアクチノマイッセート（Actinomycetes）などのグラム陽性細菌により、又は真菌などの真核宿主（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、アスペルギルス（Aspergillus）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））などにより細胞外空間に分泌させることができる。β−グルコシダーゼポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母に発現させてもよい。β−グルコシダーゼポリペプチドは、過剰発現又は低発現させることができる。
【００２９】
β−グルコシダーゼポリペプチドは、供給業者から入手することもできる。本開示に使用するのに好適なβ−グルコシダーゼ調製物の市販例としては、例えば、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）に含まれるＴ．リーゼイ（T. reesei）のβ−グルコシダーゼ；ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（Ａ．ニガー（A. niger）由来のβ−グルコシダーゼ）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．，Ｉｒｅｌａｎｄ．）の、アグロバクテリウム菌種（Agrobacterium sp.）のβ−グルコシダーゼ、及びＴ．マリティマ（T. maritima）のβ−グルコシダーゼが挙げられる。
【００３０】
更に、β−グルコシダーゼポリペプチドは、セルラーゼ組成物、全細胞セルラーゼ組成物、セルラーゼ発酵ブロス、又は全ブロス配合セルラーゼ組成物の成分とすることができる。
【００３１】
β−グルコシダーゼ活性は、当該技術分野において既知の、限定するものではないが、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９９２，１２１：５４〜６０に記載のアッセイ（ここで、１  ｐＮＰＧは、５０℃及びｐＨ  ４．８にて１０分間に４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドから１μｍｏＬのニトロフェノールが遊離することを意味する）などの、数多くの適した手法により決定することができる。
【００３２】
β−グルコシダーゼポリペプチドは、好適には、本発明のセルラーゼ組成物に含まれる酵素の総重量の約０重量％〜約７５重量％を構成する。任意に組み合わせた酵素の互いに対する比は、本開示に基づき容易に算出することができる。本明細書で開示される重量％から導かれる任意の重量比で酵素を含むセルラーゼ組成物が企図される。β−グルコシダーゼ含量は、下限が、セルラーゼ組成物に含まれる酵素の総重量の約０重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、１７％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％であり、かつ上限が、セルラーゼ組成物に含まれる酵素の総重量の約１０重量％、１２重量％、１５重量％、１７重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％である範囲であってよい。例えば、β−グルコシダーゼは、好適には、セルラーゼ組成物に含まれる酵素の総重量の約０．１重量％〜約４０重量％、約１重量％〜約３５重量％、約２重量％〜約３０重量％；約５重量％〜約２５重量％、約７重量％〜約２０重量％、約９重量％〜約１７重量％、約１０重量％〜約２０重量％；又は約５重量％〜約１０重量％を示す。
【００３３】
β−グルコシダーゼポリペプチド変異体（mutant）：本開示は、β−グルコシダーゼポリペプチド変異体（mutant）を提供する。β−グルコシダーゼポリペプチド変異体（mutant）としては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換されているものの、β−グルコシダーゼ活性（すなわち、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端の残基の加水分解を触媒してグルコースを放出させる能力）を保持している変異体（mutant）が挙げられる。このようなβ−グルコシダーゼポリペプチド変異体（mutant）は、本明細書で定義される用語の通りの、特定の種類の「β−グルコシダーゼポリペプチド」を構成する。β−グルコシダーゼポリペプチド変異体（mutant）は、ポリペプチドのネイティブな又は野生型アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を置換することで作成できる。一部の態様では、本発明は、酵素前駆体のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が変更されているポリペプチドを包含し、酵素変異体（mutant）は、酵素前駆体がもつセルロース分解特性を保持しつつ、例えば、酵素前駆体と比較して、至適ｐＨの上昇又は下降、酸化安定性の増大又は低下；熱安定性の増大又は低下、及び１種以上の基質に対する非活性の増大及び減少を示すなど、一部の特定の点で特性が変更されていてよい。生物活性に影響を及ぼさずに、置換、挿入又は欠失させるアミノ酸残基を決定する際の指針は、当該技術分野において既知のコンピュータ・プログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見つけることができる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。アミノ酸置換は、ポリペプチドの糖質結合モジュール（ＣＢＭｓ）、ポリペプチドの触媒ドメイン（ＣＤ）、並びに／又はＣＢＭ及びＣＤのいずれもに局在させることができる。標準的な２０個のアミノ酸「記号」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分類した。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「アミノ酸の保存的置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「アミノ酸の非保存的置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【００３４】
キメラポリペプチド：本開示は、典型的には、本開示のタンパク質にとって異種性のものである（すなわち、本開示のタンパク質とは異なる供給源に由来する）１つ以上の融合断片に取り付けた本開示のタンパク質ドメインを含む、ハイブリッド／融合／キメラタンパク質も提供する。これらのハイブリッド／融合／キメラ酵素も、野生型参照β−グルコシダーゼと配列が異なっているものの（very）、β−グルコシダーゼ活性は保持しており、ネイティブな又は野生型参照β−グルコシダーゼとはその他の特性が異なっている、β−グルコシダーゼ変異体（mutant）の一種として見なすことができる。好適なキメラ断片としては、限定するものではないが、タンパク質の安定性を高める、その他の望ましい生物活性を提供する又は望ましい生物活性を高める、及び／又はタンパク質の精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製）を容易にすることのできる断片が挙げられる。好適なキメラ断片は所望の機能（例えば、安定性、溶解度特性、作用又は生物活性を向上させる；及び／又はタンパク質の精製を簡略化させるなど）を有する任意の大きさのドメインであってよい。本発明のキメラタンパク質は、２つ以上のキメラ断片から構成することができ、各断片又は少なくとも２つの断片は異なる供給源又は微生物に由来する。本開示のタンパク質のドメインのアミノ及び／又はカルボキシ末端に、キメラ断片を組み合わせることもできる。キメラ断片を切断されやすいものにすることもできる。キメラ断片を切断されやすいものにすることで、例えば、対象とするタンパク質を簡単に回収できるようになる。キメラタンパク質は、好ましくは、タンパク質のカルボキシ又はアミノ末端のいずれかに取り付けたキメラ断片、あるいはタンパク質のカルボキシ及びアミノ末端の両方に取り付けたキメラ断片、あるいはこれらのドメインを包含するタンパク質をコードしているキメラ核酸を形質移入させた、組み換え細胞を培養することで産生される。
【００３５】
したがって、本開示のβ−グルコシダーゼポリペプチドには、融合遺伝子（例えば、過剰発現させた、可溶性の、活性型組み換えタンパク質）、変異導入遺伝子（例えば、転写及び翻訳が高められるようコドンに変更が加えられた遺伝子）、及びトランケート型遺伝子（例えば、シグナル配列が除去されている、又は異種シグナル配列により置換されている遺伝子）の発現産物も包含する。
【００３６】
多くの場合、不溶性の基質を利用するグリコシルヒドロラーゼはモジュラー酵素である。これらは通常、１つ以上の非触媒性糖質結合モジュール（ＣＢＭ）が付加された触媒モジュールからなる。従来、ＣＢＭは、グリコシルヒドロラーゼと、その標的基質の多糖類との相互作用を促進するものであると考えられている。したがって、本開示は、例えば、異種ＣＢＭをスプライシング時に転写させた結果として複数の基質をもつなどして、基質特異性に変更が加えられたキメラ酵素を提供する。本開示のキメラ酵素の異種ＣＢＭは、同様に、グリコシルヒドロラーゼと異種又は同種であってよい触媒モジュール又は触媒ドメイン（「ＣＤ」、例えば、活性部位）に取り付けられるようなモジュラーとして設計することもできる。
【００３７】
したがって、本開示は、ＣＢＭ／ＣＤモジュールからなる、又はこのモジュールを含む、ペプチド及びポリペプチドを提供し、本モジュールは、相同的に対を形成するか、又は結合してキメラ（異種）ＣＢＭ／ＣＤ対を形成する。したがって、これらのキメラポリペプチド／ペプチドを使用して、対象とする酵素の性能を向上又は変更することができる。したがって、一部の態様では、本開示は、例えば、利用可能な場合、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９の酵素のうちの少なくとも１つのＣＢＭを含む、キメラ酵素を提供する。例えば、本開示のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９のポリペプチド配列のＣＤ及び／又はＣＢＭを含むアミノ酸配列を含む。したがって、本開示のポリペプチドは、２種以上の異なるタンパク質に由来する機能ドメインを含む（例えば、あるタンパク質に由来するＣＢＭが、他のタンパク質に由来するＣＤと連結されている）適切な融合タンパク質であってよい。
【００３８】
本開示は、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のキメラ体であるβ−グルコシダーゼポリペプチドを含む、非天然に得られるセルラーゼ組成物も提供する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。この組成物は、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を１つ以上更に有する。したがって、組成物はヘミセルラーゼ組成物である。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ／ヘミセルラーゼ組成物は、少なくとも２種の異なる供給源に由来する酵素成分又はポリペプチドを含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ／ヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを含む。
【００３９】
一部の態様では、組成物に含まれるβ−グルコシダーゼポリペプチドは、更に１つ以上のグリコシル化部位を含む。一部の態様では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、Ｎ末端配列及びＣ端末配列を含み、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、それぞれ、異なるβ−グルコシダーゼに由来する下位配列を１つ以上含み得る。特定の態様では、Ｎ末端及びＣ末端配列は、異なる供給源に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端及びＣ末端配列の１つ以上の下位配列のうち少なくとも２つは異なる供給源に由来する。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列のいずれかは、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ領域の配列を更に有する。特定の実施形態では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は直接隣接しており、又は直接連結している。他の実施形態では、Ｎ末端及びＣ末端配列は直接隣接しておらず、むしろ、それらはリンカードメインにより機能的に関連付けられている。リンカードメインはキメラポリペプチドの中央に位置してもよい（例えば、Ｎ末端又はＣ末端のいずれにも位置しない）。特定の実施形態では、ハイブリッドポリペプチドのＮ末端配列もＣ端末配列もループ配列を含まない。代わりに、リンカードメインがループ配列を有する。一部の態様では、Ｎ末端配列は、β−グルコシダーゼ又はそれらの変異体の第１アミノ酸配列を、少なくとも約２００残基（例えば、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基）分の長さで含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼ又はそれらの変異体の第２アミノ酸配列を、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００残基）の長さで含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。一部の態様では、Ｃ末端又はＮ末端配列のいずれかは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基を約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）配列、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）配列を含む。一部の態様では、Ｃ末端もＮ末端配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、Ｃ端末配列及びＮ末端配列は、リンカードメインにより連結され、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセ���ラーゼ組成物中に含まれるβ−グルコシダーゼポリペプチドは、キメラポリペプチドの各Ｃ末端及び／又はＮ末端配列が由来するネイティブな酵素のいずれと比較しても安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、又は約２０％未満、より好ましくは１５％未満、又は１０％未満である。
【００４０】
本開示のポリペプチドは、「実質的に純粋な」状態で得る及び／又は使用するのに好適である。例えば、本開示のポリペプチドは、所定の組成物に含まれる総タンパク質のうち少なくとも約８０重量％（例えば、少なくとも約８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、又は９９重量％）を構成する。この組成物は、緩衝剤又は溶液などのその他の成分も含む。
【００４１】
発酵ブロス：同様に、本開示のポリペプチドは、適宜得ることができ、及び／又は発酵ブロス（例えば、糸状菌培養ブロス）に使用することができる。発酵ブロスは、遺伝子組み換え型酵素組成物であってもよく、例えば、発酵ブロスは、対象とする異種ポリペプチドを発現するよう遺伝子組換えされた宿主細胞により、又は同種ポリペプチドの発現レベルをより増大させて又は抑制させて（例えば、同種ポリペプチドの発現レベルの約１、２、３、４、又は５倍以上の量で、あるいは１、１／２、１／３、１／４、又は１／５倍未満の量で）本開示の同種ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞により産生させることができる。本発明の発酵ブロスは、本開示の複数のポリペプチドを所望の比で発現するよう遺伝子操作を行った、特定の「遺伝子組み換え型」宿主細胞株により産生させることもできる。例えば、対象とするポリペプチドをコードしている遺伝子のうちの１つ以上又はすべてを、宿主細胞株の遺伝物質に組み込むこともできる。
【００４２】
Ｆｖ３Ｃ
Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）のアミノ酸配列を図３２Ｂ及び４３に示す。配列番号６０は、未成熟なＦｖ３Ｃ配列である。Ｆｖ３Ｃは、配列番号６０の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６０の位置２０〜８９９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３２Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｖ３Ｃ残基のＥ５３６及びＤ３０７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ３Ｃポリペプチド」は、一部の態様では、配列番号６０の残基２０〜８９９間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ｃと比較して、残基Ｅ５３６及びＤ３０７において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、図３２Ｂに示すネイティブなＦｖ３Ｃの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＦｖ３Ｃポリペプチドは、図３２Ｂに示すＦｖ３Ｃの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＦｖ３Ｃポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００４３】
したがって、本発明のＦｖ３Ｃポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列、又は配列番号６０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２２〜６００、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜８９９、又は（ｖ）４２８〜６６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００４４】
一部の態様では、本発明の「Ｆｖ３Ｃポリペプチド」は、Ｆｖ３Ｃポリペプチド変異体（mutant）を指す。Ｆｖ３Ｃポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、β−グルコシダーゼ活性、及び／又は分子の安定性を向上させることもできる。例えば、Ｆｖ３Ｃポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＦｖ３Ｃの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、ポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｆｖ３Ｃポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｖ３Ｃポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｖ３ＣポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。あるいは、Ｆｖ３ＣポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある場合もある。一部の態様では、Ｆｖ３Ｃポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５３６及び／又はＤ３０７で行われ得る。一部の態様では、Ｆｖ３Ｃポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１１９、Ｒ１２５、Ｌ１６８、Ｒ１８３、Ｋ２１６、Ｈ２１７、Ｒ２２７、Ｍ２７２、Ｙ２７５、Ｄ３０７、Ｗ３０８、Ｓ４７７、及び／又はＥ５３６のうちの１つ以上又はすべてで行われ得る。Ｆｖ３Ｃポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００４５】
一部の態様では、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、キメラ／融合／ハイブリッド体、又は２つのβ−グルコシダーゼ配列のキメラコンストラクトを含み、この場合、第１の配列は、第１のβ−グルコシダーゼに由来し、アミノ酸残基少なくとも約２００個分の長さであり、Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の同一性を有し、第２の配列は、第２のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の同一性を有し、又は配列番号１７０のアミノ酸配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６０の連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基からなるＮ末端配列を含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基からなるＣ末端配列を含み、配列番号１７０のアミノ酸配列モチーフを含む。
【００４６】
特定の態様では、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／ハイブリッド／融合体、又はキメラコンストラクトであってよく、第１の配列は、第１のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の同一性を有し、又は配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２の配列は第２のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９の連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基からなるＮ末端配列を含み、又は配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６０の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基からなるＣ末端配列を含む。
【００４７】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、第１、第２、又はいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、更に１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｆｖ３Ｃポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体、又はこれらのハイブリッド／キメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列、Ｎ末端配列、又はこれらのいずれもに局在させることができる。
【００４８】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＦｖ３Ｃなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵、発現、又は産生工程時のタンパク質分解耐性における向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失率又は損失の程度の減少とは、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３の配列に操作可能に連結されたＦｖ３Ｃポリペプチドの配列を含むキメラ又は融合酵素である。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃポリペプチドに由来するＮ末端配列と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３ポリペプチドに由来するＣ端末配列とを含む。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に含み得る。
【００４９】
Ｐａ３Ｄ：
Ｐａ３Ｄ（配列番号５４）のアミノ酸配列を図２９Ｂ及び４３に示す。配列番号５４は、未成熟なＰａ３Ｄ配列である。Ｐａ３Ｄは、配列番号２の残基１〜１７（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号５４の残基１８〜７３３に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。本開示のこの及びその他のポリペプチドに対するシグナル配列予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズム（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）により行った。図２９Ｂにおいて、予測保存ドメインはボールド体で示す。本開示のこの及びその他のポリペプチドに対するドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースを基に行った。Ｐａ３Ｄ残基Ｅ４６３及びＤ２６２は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する数多くのＧＨ３  βグルコシダーゼファミリーの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｐａ３Ｄポリペプチド」は、配列番号５４の残基１８〜７３３間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、ネイティブなＰａ３Ｄと比較して、残基Ｅ４６３及びＤ２６２において変更はなされていない。好ましくは、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｐａ３Ｄポリペプチドは、図２９Ｂに示すネイティブなＰａ３Ｄの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＰａ３Ｄポリペプチドは、図２９Ｂに示すＰａ３Ｄの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＰａ３Ｄポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００５０】
したがって、本発明のＰａ３Ｄポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列、又は配列番号５４の残基（ｉ）１８〜２８２、（ｉｉ）１８〜６０１、（ｉｉｉ）１８〜７３３、（ｉｖ）３５６〜６０１、又は（ｖ）３５６〜７３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００５１】
本発明の「Ｐａ３Ｄポリペプチド」は、Ｐａ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）も指す。Ｐａ３Ｄポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、β−グルコシダーゼ活性、及び／又は他の特性を向上させることもできる。例えば、Ｐａ３Ｄポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＰａ３Ｄの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を導入することができる。一部の態様では、Ｐａ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。Ｐａ３Ｄポリペプチド変異体は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｐａ３ＤポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。あるいは、Ｐａ３ＤポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある場合もある。一部の態様では、Ｐａ３Ｄポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ４６３及び／又はＤ２６２で行われ得る。Ｐａ３Ｄポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ８７、Ｒ９３、Ｌ１３６、Ｒ１５１、Ｋ１８４、Ｈ１８５、Ｒ１９５、Ｍ２２７、Ｙ２３０、Ｄ２６２、Ｗ２６３、Ｓ４０６、及び／又はＥ４６３のうちの１つ以上又はすべてで行われ得る。Ｐａ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００５２】
一部の態様では、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列のキメラ／融合／ハイブリッド体であってよく、第１の配列は第１のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、Ｐａ３Ｄ（配列番号５４）の相当する長さの配列と約６０％（例えば、約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％）以上の同一性を有し、第２の配列は、第２のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号約５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、７０％、７５％又は８０％以上の同一性を有し、又は配列番号１７０のアミノ酸配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４の連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基からなるＮ末端配列を含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基からなるＣ末端配列を含み、配列番号１７０のアミノ酸配列モチーフを含む。
【００５３】
一部の態様では、本発明のＰａ３Ｄポリペプチドは、β−グルコシダーゼ配列のキメラ／ハイブリッド／融合体、又はキメラコンストラクトを含み、第１の配列は第１のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％）以上の同一性を有し、又は配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２の配列は第２のβ−グルコシダーゼに由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｐａ３Ｄ（配列番号５４）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。例えば、第１のβ−グルコシダーゼ配列は配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９のＮ末端配列の連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４のＣ末端配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００５４】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｐａ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００５５】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＰａ３Ｄなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に有する。
【００５６】
Ｆｖ３Ｇ
Ｆｖ３Ｇ（配列番号５６）のアミノ酸配列を図３０Ｂ及び４３に示す。配列番号５６は、未成熟なＦｖ３Ｇ配列である。Ｆｖ３Ｇは、配列番号５６の位置１〜２１（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号５６の位置２２〜７８０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。上記のように、シグナル配列の予測は、本開示のその他のポリペプチドに対して行った通り、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）を用い行った。予測保存ドメインを、図３０Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、本明細書においてその他のポリペプチドに対して行ったように、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｖ３Ｇ残基のＥ５０９及びＤ２７２は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｆｖ３Ｇポリペプチド」は、配列番号５６の残基２０〜７８０間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ｇと比較して、残基Ｅ５０９及びＤ２７２において変更はなされていない好ましくは、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、図３０Ｂに示すネイティブなＦｖ３Ｇの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＦｖ３Ｇポリペプチドは、図３０Ｂに示すＦｖ３Ｇの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＦｖ３Ｇポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００５７】
したがって、本発明のＦｖ３Ｇポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸配列、又は配列番号５６の残基（ｉ）２２〜２９２、（ｉｉ）２２〜６２９、（ｉｉｉ）２２〜７８０、（ｉｖ）３７３〜６２９、又は（ｖ）３７３〜７８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００５８】
一部の態様では、本発明の「Ｆｖ３Ｇポリペプチド」は、Ｆｖ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｆｖ３Ｇポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｆｖ３Ｇポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＦｖ３Ｇの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｆｖ３Ｇポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｆｖ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｖ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｖ３ＧポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｆｖ３ＧポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｆｖ３Ｇポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５０９及び／又はＤ２７２に行うことができる。一部の態様では、Ｆｖ３Ｇポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１０１、Ｒ１０７、Ｌ１５０、Ｒ１６５、Ｋ１９８、Ｈ１９９、Ｒ２０９、Ｍ２３７、Ｙ２４０、Ｄ２７２、Ｗ２７３、Ｓ４５５、及び／又はＥ５０９のうちの１つ以上に行うことができる。Ｆｖ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００５９】
一部の態様では、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＦｖ３Ｇ（配列番号５６）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、又は配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５６のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列のＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、又は配列番号１７０のモチーフを含む。
【００６０】
特定の態様では、本発明のＦｖ３Ｇポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、又は配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、一方で第２のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｆｖ３Ｇ（配列番号５６）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５６のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００６１】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｆｖ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９のうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含む。β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラには、１つ以上のグリコシル化部位を更に含有させてもよい。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００６２】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＦｖ３Ｇなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に有する。
【００６３】
Ｆｖ３Ｄ
Ｆｖ３Ｄ（配列番号５８）のアミノ酸配列を図３１Ｂ及び４３に示す。配列番号５８は、未成熟なＦｖ３Ｄ配列である。Ｆｖ３Ｄは、配列番号５８の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号５８の位置２０〜８１１に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３１Ｂにボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｖ３Ｄ残基のＥ５３４及びＤ３０１は、それぞれ、例えば、Ｐ．（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｆｖ３Ｄポリペプチド」は、配列番号５８の残基２０〜８１１間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ｄと比較して、残基Ｅ５３４及びＤ３０１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、図３１Ｂに示すネイティブなＦｖ３Ｄの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＦｖ３Ｄポリペプチドは、図３１Ｂに示すＦｖ３Ｄの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＦｖ３Ｄポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００６４】
したがって、本発明のＦｖ３Ｄポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列、又は配列番号５８の残基（ｉ）２０〜３２１、（ｉｉ）２０〜６５１、（ｉｉｉ）２０〜８１１、（ｉｖ）４２３〜６５１、又は（ｖ）４２３〜８１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００６５】
一部の態様では、本発明の「Ｆｖ３Ｄポリペプチド」は、Ｆｖ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｆｖ３Ｄポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｆｖ３Ｄポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＦｖ３Ｄの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｆｖ３Ｄポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｆｖ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｖ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｖ３ＧポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｆｖ３ＤポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｆｖ３Ｄポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５３４及び／又はＤ３０１に行うことができる。一部の態様では、Ｆｖ３Ｄポリペプチドアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１１１、Ｒ１１７、Ｌ１６０、Ｒ１７５、Ｋ２０８、Ｈ２０９、Ｒ２１９、Ｍ２６６、Ｙ２６９、Ｄ３０１、Ｗ３０２、Ｓ４７２、及び／又はＥ５３４のうちの１つ以上に行うことができる。Ｆｖ３Ｄポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００６６】
一部の態様では、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、Ｆｖ３Ｄ（配列番号５８）の相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５８のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列のＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００６７】
特定の態様では、本発明のＦｖ３Ｄポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列に関する、ハイブリッド／融合／キメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｆｖ３Ｄ（配列番号５８）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５８のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００６８】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインはループ領域を含み、ループ領域は約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｆｖ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０のモチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００６９】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＦｖ３Ｄなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に有する。
【００７０】
Ｔｒ３Ａ
Ｔｒ３Ａ（配列番号６２）のアミノ酸配列を図３３Ｂ及び４３に示す。Ｔｒ３ＡはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１としても知られる。配列番号６２は、未成熟なＴｒ３Ａ配列である。Ｔｒ３Ａは、配列番号６２の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６２の位置２０〜７４４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３３Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｔｒ３Ａ残基のＥ４７２及びＤ２６７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｔｒ３Ａポリペプチド」は、配列番号６２の残基２０〜７４４間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｔｒ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＴｒ３Ａと比較して、残基Ｅ４７２及びＤ２６７において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｒ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｒ３Ａポリペプチドは、図３３Ｂに示すネイティブなＴｒ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＴｒ３Ａポリペプチドは、図３３Ｂに示すＴｒ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＴｒ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００７１】
したがって、本発明のＴｒ３Ａポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列、又は配列番号６２の残基（ｉ）２０〜２８７、（ｉｉ）２２〜６１１、（ｉｉｉ）２０〜７４４、（ｉｖ）３６２〜６１１、又は（ｖ）３６２〜７４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００７２】
一部の態様では、本発明の「Ｔｒ３Ａポリペプチド」は、Ｔｒ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｔｒ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｔｒ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＴｒ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｔｒ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｔｒ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｒ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｒ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｒ３ＡポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｒ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ４７２及び／又はＤ２６７に行うことができる。一部の態様では、Ｔｒ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ９２、Ｒ９８、Ｌ１４１、Ｒ１５６、Ｋ１８９、Ｈ１９０、Ｒ２００、Ｍ２３２、Ｙ２３５、Ｄ２６７、Ｗ２６８、Ｓ４１５、及び／又はＥ４７２のうちの１つ以上に行うことができる。Ｔｒ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００７３】
一部の態様では、Ｔｒ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／融合／ハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ相当する長さのＴｒ３Ａ（配列番号６２）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６２のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【００７４】
特定の態様では、本発明のＴｒ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつＴｒ３Ａ（配列番号６２）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６２のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００７５】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｔｒ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００７６】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＴｒ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に含み得る。
【００７７】
Ｔｒ３Ｂ
Ｔｒ３Ｂ（配列番号６４）のアミノ酸配列を図３４Ｂ及び４３に示す。Ｔｒ３Ｂは、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３」又は「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｃｅｌ３Ｂ」としても知られる。配列番号６４は、未成熟なＴｒ３Ｂ配列である。Ｔｒ３Ｂは、配列番号６４の位置１〜１８（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６４の位置１９〜８７４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３４Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｔｒ３Ｂ残基Ｅ５１６及びＤ２８７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｔｒ３Ｂポリペプチド」は、配列番号６４の残基１９〜８７４間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＴｒ３Ｂと比較して、残基Ｅ５１６及びＤ２８７において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、図３４Ｂに示すネイティブなＴｒ３Ｂの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＴｒ３Ａポリペプチドは、図３４Ｂに示すＴｒ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＴｒ３Ｂポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００７８】
したがって、本発明のＴｒ３Ｂポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列、又は配列番号６４の残基（ｉ）１９〜３０７、（ｉｉ）１９〜６４０、（ｉｉｉ）１９〜８７４、（ｉｖ）４０７〜６４０、又は（ｖ）４０７〜８７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００７９】
一部の態様では、本発明の「Ｔｒ３Ｂポリペプチド」は、Ｔｒ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｔｒ３Ｂポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｔｒ３Ｂポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＴｒ３Ｂの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｔｒ３Ｂポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｔｒ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｒ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｒ３ＢポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｒ３ＢポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｒ３Ｂポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５１６及び／又はＤ２８７に行うことができる。一部の態様では、Ｔｒ３Ｂポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ９９、Ｒ１０５、Ｌ１４８、Ｒ１６３、Ｋ１９６、Ｈ１９７、Ｒ２０７、Ｍ２５２、Ｙ２５５、Ｄ２８７、Ｗ２８８、Ｓ４５７、及び／又はＥ５１６のうちの１つ以上に行うことができる。Ｔｒ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００８０】
一部の態様では、Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／ハイブリッド／融合体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＴｒ３Ｂ（配列番号６４）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６４のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【００８１】
特定の態様では、本発明のＴｒ３Ｂポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフを１つ以上含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｔｒ３Ｂ（配列番号６４）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、あるいは、配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６４のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００８２】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｔｒ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００８３】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＴｒ３Ｂなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に有する。
【００８４】
Ｔｅ３Ａ
Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）のアミノ酸配列を図３５Ｂ及び４３に示す。Ｔｅ３Ａは「Ａｂｇ２」としても知られる。配列番号６６は、未成熟なＴｅ３Ａ配列である。Ｔｅ３Ａは、配列番号６６の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６６の位置２０〜８５７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３５Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｔｅ３Ａ残基Ｅ５０５及びＤ２７７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｔｅ３Ａポリペプチド」は、配列番号６６の残基２０〜８５７間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｔｅ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＴｅ３Ａと比較して、残基Ｅ５０５及びＤ２７７において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｅ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｅ３Ａポリペプチドは、図３５Ｂに示すネイティブなＴｅ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＴｅ３Ａポリペプチドは、図３５Ｂに示すＴｅ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＴｅ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００８５】
したがって、本発明のＴｅ３Ａポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、又は配列番号６６の残基（ｉ）２０〜２９７、（ｉｉ）２０〜６２９、（ｉｉｉ）２０〜８５７、（ｉｖ）３９６〜６２９、又は（ｖ）３９６〜８５７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００８６】
一部の態様では、本発明の「Ｔｅ３Ａポリペプチド」は、Ｔｅ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｔｅ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｔｅ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＴｅ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｔｅ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｔｅ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｅ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｅ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｅ３ＡポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｅ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５０５及び／又はＤ２７７に行うことができる。一部の態様では、Ｔｅ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ９２、Ｒ９８、Ｌ１４１、Ｒ１５６、Ｋ１８９、Ｈ１９０、Ｒ２００、Ｍ２４２、Ｙ２４５、Ｄ２７７、Ｗ２７８、Ｓ４４７、及び／又はＥ５０５のうちの１つ以上に行うことができる。Ｔｅ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００８７】
一部の態様では、Ｔｅ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／融合／ハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＴｅ３Ａ（配列番号６６）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６６のＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは、配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【００８８】
特定の態様では、本発明のＴｅ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体／ハイブリッド／融合体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６６のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００８９】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｔｅ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０のモチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００９０】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＴｅ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００９１】
Ａｎ３Ａ
Ａｎ３Ａ（配列番号６８）のアミノ酸配列を図３６Ｂ及び４３に示す。Ａｎ３Ａは、「Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ」としても知られる。配列番号６８は、未熟なＡｎ３Ａ配列である。Ａｎ３Ａは、配列番号６８の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６８の位置２０〜８６０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３６Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ａｎ３Ａ残基のＥ５０９及びＤ２７７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ａｎ３Ａポリペプチド」は、配列番号６８の残基２０〜８６０間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくはＡｎ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＡｎ３Ａと比較して、残基Ｅ５０９及びＤ２７７において変更はなされていない。好ましくは、Ａｎ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ａｎ３Ａポリペプチドは、図３６Ｂに示すネイティブなＡｎ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＡｎ３Ａポリペプチドは、図３６Ｂに示すＡｎ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＡｎ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００９２】
したがって、本発明のＡｎ３Ａポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列、又は配列番号６８の残基（ｉ）２０〜３００、（ｉｉ）２０〜６３４、（ｉｉｉ）２０〜８６０、（ｉｖ）４００〜６３４、又は（ｖ）４００〜８６０を少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【００９３】
一部の態様では、本発明の「Ａｎ３Ａポリペプチド」は、Ａｎ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ａｎ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ａｎ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＡｎ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ａｎ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ａｎ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ａｎ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ａｎ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ａｎ３ＡポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ａｎ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５０９及び／又はＤ２７７に行うことができる。一部の態様では、Ａｎ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ９２、Ｒ９８、Ｌ１４１、Ｒ１５６、Ｋ１８９、Ｈ１９０、Ｒ２００、Ｍ２４５、Ｙ２４８、Ｄ２７７、Ｗ２７８、Ｓ４５１、及び／又はＥ５０９のうちの１つ以上に行うことができる。Ａｎ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【００９４】
一部の態様では、Ａｎ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／ハイブリッド／融合体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、Ａｎ３Ａ（配列番号６８）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６８のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【００９５】
特定の態様では、本発明のＡｎ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％％超の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ａｎ３Ａ（配列番号６８）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号６８のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００９６】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、更に、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ａｎ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、好ましくは配列番号１７０のモチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【００９７】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＡｎ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００９８】
Ｆｏ３Ａ
Ｆｏ３Ａ（配列番号７０）のアミノ酸配列を図３７Ｂ及び４３に示す。配列番号７０は、未成熟なＦｏ３Ａ配列である。Ｆｏ３Ａは、配列番号７０の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号７０の位置２０〜８９９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３７Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｏ３Ａ残基Ｅ５３６及びＤ３０７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｆｏ３Ａポリペプチド」は、配列番号７０の残基２０〜８９９間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｆｏ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｏ３Ａと比較して、残基Ｅ５３６及びＤ３０７において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｏ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｏ３Ａポリペプチドは、図３７Ｂに示すネイティブなＦｏ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＦｏ３Ａポリペプチドは、図３７Ｂに示すＦｏ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＦｏ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００９９】
したがって、本発明のＦｏ３Ａポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列、又は配列番号７０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜６６０、又は（ｖ）４２８〜８９９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１００】
一部の態様では、本発明の「Ｆｏ３Ａポリペプチド」は、Ｆｏ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｆｏ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｆｏ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＦｏ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｆｏ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｆｏ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｏ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｆｏ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｆｏ３ＡポリペプチドのＣＢＭに存在する。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｆｏ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５３６及び／又はＤ３０７に行うことができる。一部の態様では、Ｆｏ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１１９、Ｒ１２５、Ｌ１６８、Ｒ１８３、Ｋ２１６、Ｈ２１７、Ｒ２２７、Ｍ２７２、Ｙ２７５、Ｄ３０７、Ｗ３０８、Ｓ４７７、及び／又はＥ５３６のうちの１つ以上に行うことができる。Ｆｏ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【０１０１】
一部の態様では、Ｆｏ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／ハイブリッド／融合体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＦｏ３Ａ（配列番号７０）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７０のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【０１０２】
特定の態様では、本発明のＦｏ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％超配列同一性を有し、配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｆｏ３Ａ（配列番号７０）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７０のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１０３】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、更に、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｆｏ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、好ましくは配列番号１７０のモチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【０１０４】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＦｏ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０１０５】
Ｇｚ３Ａ
Ｇｚ３Ａ（配列番号７２）のアミノ酸配列を図３８Ｂ及び４３に示す。配列番号７２は、未成熟なＧｚ３Ａ配列である。Ｇｚ３Ａは、配列番号７２の位置１〜１８（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号７２の位置１９〜８８６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３８Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｇｚ３Ａ残基Ｅ５２３及びＤ２９４は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｇｚ３Ａポリペプチド」は、配列番号７２の残基１９〜８８６間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｇｚ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＧｚ３Ａと比較して、残基Ｅ５３６及びＤ３０７において変更はなされていない。好ましくは、Ｇｚ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｇｚ３Ａポリペプチドは、図３８Ｂに示すネイティブなＧｚ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＧｚ３Ａポリペプチドは、図３８Ｂに示すＧｚ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＧｚ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１０６】
したがって、本発明のＧｚ３Ａポリペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列、又は配列番号７２の残基（ｉ）１９〜３１４、（ｉｉ）１９〜６４７、（ｉｉｉ）１９〜８８６、（ｉｖ）４１５〜６４７、又は（ｖ）４１５〜８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１０７】
一部の態様では、本発明の「Ｇｚ３Ａポリペプチド」は、Ｇｚ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｇｚ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｇｚ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＧｚ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｇｚ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｇｚ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｇｚ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｇｚ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｇｚ３ＡポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｇｚ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５３６及び／又はＤ３０７に行うことができる。一部の態様では、Ｇｚ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１０６、Ｒ１１２、Ｌ１５５、Ｒ１７０、Ｋ２０３、Ｈ２０４、Ｒ２１４、Ｍ２５９、Ｙ２６２、Ｄ２９４、Ｗ２９５、Ｓ４６４、及び／又はＥ５２３のうちの１つ以上に行うことができる。Ｇｚ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【０１０８】
一部の態様では、Ｇｚ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／融合／ハイブリッドを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＧｚ３Ａ（配列番号７２）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７２のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【０１０９】
特定の態様では、本発明のＧｚ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｇｚ３Ａ（配列番号７２）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７２のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１１０】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｇｚ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、好ましくは配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【０１１１】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＧｚ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を更に有する。
【０１１２】
Ｎｈ３Ａ
Ｎｈ３Ａ（配列番号７４）のアミノ酸配列を、図３９Ｂ及び４３に示す。配列番号７４は、未成熟なＮｈ３Ａ配列である。Ｎｈ３Ａは、配列番号７４の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号７４の位置２０〜８８０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図３９Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｎｈ３Ａ残基Ｅ５２３及びＤ２９４は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では「Ｎｈ３Ａポリペプチド」は、配列番号７４の残基２０〜８８０間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｎｈ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＮｈ３Ａと比較して、残基Ｅ５２３及びＤ２９４において変更はなされていない。好ましくは、Ｎｈ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｎｈ３Ａポリペプチドは、図３９Ｂに示すネイティブなＮｈ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＮｈ３Ａポリペプチドは、図３９Ｂに示すＮｈ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＮｈ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１１３】
したがって、本発明のＮｈ３Ａポリペプチドは、配列番号７４のアミノ酸配列、又は配列番号７４の残基（ｉ）２０〜２９５、（ｉｉ）２０〜６４７、（ｉｉｉ）２０〜８８０、（ｉｖ）４１４〜６４７、又は（ｖ）４１４〜８８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１１４】
一部の態様では、本発明の「Ｎｈ３Ａポリペプチド」は、Ｎｈ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｎｈ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｎｈ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＮｈ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｎｈ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｎｈ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｎｈ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｎｈ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｎｈ３ＡポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｎｈ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５２３及び／又はＤ２９４に行うことができる。一部の態様では、Ｎｈ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１０６、Ｒ１１２、Ｌ１５５、Ｒ１７０、Ｋ２０３、Ｈ２０４、Ｒ２１４、Ｍ２５９、Ｙ２６２、Ｄ２９４、Ｗ２９５、Ｓ４６４、及び／又はＥ５２３のうちの１つ以上に行うことができる。Ｎｈ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【０１１５】
一部の態様では、Ｎｈ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／融合／ハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＮｈ３Ａ（配列番号７４）と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７４のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【０１１６】
特定の態様では、本発明のＮｈ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｎｈ３Ａ（配列番号７４）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７４のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１１７】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｎｈ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、好ましくは配列番号１６４〜１６９の配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフの、１つ以上又は全てを含み、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【０１１８】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＮｈ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０１１９】
Ｖｄ３Ａ
Ｖｄ３Ａ（配列番号７６）のアミノ酸配列を図４０Ｂ及び４３に示す。配列番号７６は、未成熟なＶｄ３Ａ配列である。Ｖｄ３Ａは、配列番号７６の位置１〜１８（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号７６の位置１９〜８９０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４０Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｖｄ３Ａは、例えば、ｃＮＰＧ及びセロビオースを用いる酵素アッセイにおいて、並びに希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として加水分解する際に、β−グルコシダーゼ活性を有することが示された。Ｖｄ３Ａ残基Ｅ５２４及びＤ２９５は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｖｄ３Ａポリペプチド」は、配列番号７６の残基１９〜８９０間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｖｄ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＶｄ３Ａと比較して、残基Ｅ５２４及びＤ２９５において変更はなされていない。好ましくは、Ｖｄ３Ａポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｖｄ３Ａポリペプチドは、図４０Ｂに示すネイティブなＶｄ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＮｈ３Ａポリペプチドは、図４０Ｂに示すＮｈ３Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＶｄ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１２０】
したがって、本発明のＶｄ３Ａポリペプチドは、配列番号７６のアミノ酸配列、又は配列番号７６の残基（ｉ）１９〜２９６、（ｉｉ）１９〜６４９、（ｉｉｉ）１９〜８９０、（ｉｖ）４１５〜６４９、又は（ｖ）４１５〜８９０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１２１】
一部の態様では、本発明の「Ｖｄ３Ａポリペプチド」は、Ｖｄ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｖｄ３Ａポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｖｄ３Ａポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＶｄ３Ａの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｖｄ３Ａポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｖｄ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｖｄ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｖｄ３ＡポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｖｄ３ＡポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｖｄ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５２４及び／又はＤ２９５に行うことができる。一部の態様では、Ｖｄ３Ａポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１０７、Ｒ１１３、Ｌ１５６、Ｒ１７１、Ｋ２０４、Ｈ２０５、Ｒ２１５、Ｍ２６０、Ｙ２６３、Ｄ２９５、Ｗ２９６、Ｓ４６５、及び／又はＥ５２４のうちの１つ以上に行うことができる。Ｖｄ３Ａポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【０１２２】
一部の態様では、Ｖｄ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／ハイブリッド／融合体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＶｄ３Ａ（配列番号７６）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７６のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、及び７９いずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【０１２３】
特定の態様では、本発明のＶｄ３Ａポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と、約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｖｄ３Ａ（配列番号７６）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７６のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１２４】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、更に、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｖｄ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【０１２５】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＶｄ３Ａなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０１２６】
Ｐａ３Ｇ
Ｐａ３Ｇ（配列番号７８）のアミノ酸配列を図４１Ｂ及び４３に示す。配列番号７８は、未成熟なＰａ３Ｇ配列である。Ｐａ３Ｇは、配列番号７８の位置１〜１９（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号７８の位置２０〜８０５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４１Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｐａ３Ｇ残基Ｅ５１７及びＤ２８９は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｐａ３Ｇポリペプチド」は、配列番号７８の残基２０〜８０５間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｐａ３Ｇポリペプチドは、ネイティブなＰａ３Ｇと比較して、残基Ｅ５１７及びＤ２８９において変更はなされていない。好ましくは、Ｐａ３Ｇポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が加えられている。Ｐａ３Ｇポリペプチドは、図４１Ｂに示すネイティブなＰａ３Ｇの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＰａ３Ｇポリペプチドは、図４１Ｂに示すＰａ３Ｇの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＰａ３Ｇポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１２７】
したがって、本発明のＰａ３Ｇポリペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列、又は配列番号７８の残基（ｉ）２０〜３５４、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８０５、（ｉｖ）４４９〜６６０、又は（ｖ）４４９〜８０５と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１２８】
一部の態様では、本発明の「Ｐａ３Ｇポリペプチド」は、Ｖｄ３Ａポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｐａ３Ｇポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｐａ３Ｇポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＰａ３Ｇの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、ポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｐａ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｐａ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｐａ３ＧポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｐａ３ＧポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｐａ３Ｇポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ５１７及び／又はＤ２８９に行うことができる。一部の態様では、Ｐａ３Ｇポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ１０１、Ｒ１０７、Ｌ１５０、Ｒ１６５、Ｋ１９９、Ｈ２０９、Ｒ２１５、Ｍ２５４、Ｙ２５７、Ｄ２８９、Ｗ２９０、Ｓ４５８、及び／又はＥ５１７のうちの１つ以上に行うことができる。Ｐａ３Ｇポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【０１２９】
一部の態様では、Ｐａ３Ｇポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／融合／ハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＰａ３Ｇ（配列番号７８）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７８のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７９のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【０１３０】
特定の態様では、本発明のＰａ３Ｇポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｐａ３Ｇ（配列番号７８）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７９のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７８のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１３１】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、更に、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインはループ領域を含み、ループ領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｐａ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０のモチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【０１３２】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＰａ３Ｇなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０１３３】
Ｔｎ３Ｂ
アミノ酸配列Ｔｎ３Ｂ（配列番号７９）を図４２及び４３に示す。配列番号７９は、未成熟なＴｎ３Ｂ配列である。ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）では予測シグナル配列は得られなかった。Ｔｎ３Ｂ残基のＥ４５８及びＤ２４２は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリナ（P. anserina）（登録番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（登録番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（登録番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（登録番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（登録番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（登録番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（登録番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（登録番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図４３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、一部の態様では、「Ｔｎ３Ｂポリペプチド」は、配列番号７９の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を意味する。好ましくは、Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＴｎ３Ｂと比較して、残基Ｅ４５８及びＤ２４２において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、図４３のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、図４３に示すネイティブなＴｎ３Ｂの予測保存ドメイン全長を適切に含む。代表的なＴｎ３Ｂポリペプチドは、図４２に示すＴｎ３Ｂの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＴｎ３Ｂポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１３４】
したがって、本発明のＴｎ３Ｂポリペプチドは、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１３５】
一部の態様では、本発明の「Ｔｎ３Ｂポリペプチド」は、Ｔｎ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）も指し得る。Ｔｎ３Ｂポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子のβ−グルコシダーゼ活性を向上させることもできる。例えば、Ｔｎ３Ｂポリペプチドの、基質に対する結合親和性を向上させるアミノ酸置換、又はＴｎ３Ｂの、β−Ｄ−グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒する能力を向上させるアミノ酸置換を、Ｔｎ３Ｂポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、Ｔｎ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｎ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）は、１つ以上のアミノ酸の非保存的置換を含む。一部の態様では、Ｔｎ３ＢポリペプチドのＣＤには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｎ３ＢポリペプチドのＣＢＭには、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、ＣＤ及びＣＢＭの両方に、１つ以上のアミノ酸置換がある。一部の態様では、Ｔｎ３Ｂポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｅ４５８及び／又はＤ２４２に行うことができる。一部の態様では、Ｔｎ３Ｂポリペプチドのアミノ酸置換は、アミノ酸Ｄ５８、Ｒ６４、Ｌ１１６、Ｒ１３０、Ｋ１６３、Ｈ１６４、Ｒ１７４、Ｍ２０７、Ｙ２１０、Ｄ２４２、Ｗ２４３、Ｓ３７０、及び／又はＥ４５８のうちの１つ以上に行うことができる。Ｔｎ３Ｂポリペプチド変異体（mutant）は、β−グルコシダーゼ活性を適切に有する。
【０１３６】
一部の態様では、Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／融合／ハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さのＴｎ３Ｂ（配列番号７９）配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７８のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７９のＮ末端配列のアミノ酸残基を少なくとも２００個含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７８のいずれか１つのＣ端末配列の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基を含み、あるいは配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。
【０１３７】
特定の態様では、本発明のＴｎ３Ｂポリペプチドは、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体、又はキメラコンストラクトを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７８のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有し、あるいは配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、Ｔｎ３Ｂ（配列番号７９）の相当する長さの配列と約６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以上の配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、及び７８のいずれか１つのＮ末端配列の少なくとも２００個のアミノ酸残基を含み、又は配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、配列番号７９のＣ端末配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１３８】
一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１、第２、又はこれらのいずれものβ−グルコシダーゼ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、互いに直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はループ領域を含み、あるいはループ様の構造を示す配列を含み、ループ領域あるいはループ様の構造は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まない。一部の実施形態では、リンカードメインはループ領域を含み、ループ領域は約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカードメインは、中央に位置する（すなわち、キメラポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しない）。一部の態様では、キメラβ−グルコシダーゼのＮ末端配列は、Ｔｎ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００残基の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｎ末端配列は、配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９のモチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、β−グルコシダーゼポリペプチド又はこれらの変異体（variant）に由来する、少なくともアミノ酸残基５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分の長さの配列を含む。一部の態様では、Ｃ端末配列は、配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、又は好ましくは配列番号１７０のモチーフを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラは、１つ以上のグリコシル化部位を更に含む。１つ以上のグリコシル化部位は、Ｃ端末配列又はＮ末端配列のいずれか、あるいはこれら両方の配列内に局在させることができる。
【０１３９】
一部の態様では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物は、１つ以上の天然に得られるヘミセルラーゼを更に含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、キメラβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端配列のいずれかが由来するＴｎ３Ｂなどのネイティブな酵素よりも安定性が向上している。一部の態様では、安定性の向上には、貯蔵時、発現時、又は産生工程時のタンパク質分解耐性の向上を含む。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵時又は産生条件下で酵素活性の損失率又は損失の程度がそれにともなって減少することを含み、この場合の酵素活性の損失は、好ましくは約５０％未満、約４０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、又は更により好ましくは約１０％未満である。一部の態様では、Ｎ末端配列又はＣ端末配列は、ループ配列を含んでよく、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。Ｎ末端及びＣ末端配列は、直接隣接させることも、又は互いに直接連結することもできる。他の態様では、Ｎ末端配列及びＣ端末配列は、リンカードメインを介して連結されてよい。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する。一部の態様では、非天然に得られるセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０１４０】
核酸
β−グルコシダーゼの代表的な核酸としては、β−グルコシダーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチド、をコードしている核酸が挙げられる。β−グルコシダーゼの代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に得られるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。代表的なβ−グルコシダーゼ核酸としては、例えば、限定するものではないが、次の生物のうちの１種以上から単離されるβ−グルコシダーゼのものが挙げられる：クリニペリス・スカペラ（Crinipellis scapella）、マクロフォミナ・ファゼオリナ（Macrophomina phaseolina）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ソルダリア・フィミコラ（Sordaria fimicola）、ボルテラ・コッレトトリコイド（Volutella colletotrichoides）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、アクレモニウム菌種（Acremonium sp.）、エキシジア・グランデュロサ（Exidia glandulosa）、フォムス・フォメンタリウス（Fomes fomentarius）、スポンジペリス菌種（Spongipellis sp.）、リゾフィリクティス・ロセア（Rhizophlyctis rosea）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、フィコマイセス・ニテウス（Phycomyces niteus）、カエトスチラム・フレセニィ（Chaetostylum fresenii）、ディプロディア・ゴシピナ（Diplodia gossypina）、ウロスポラ・ビルグラミイ（Ulospora bilgramii）、サッコボラス・ジルテラス（Saccobolus dilutellus）、ペニシリウム・ベルクロサム（Penicillium verruculosum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、サーモマイセス・ベルコサス（Thermomyces verrucosus）、ジアポルテ・シンゲネシア（Diaporthe syngenesia）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、ニグロスポラ菌種（Nigrospora sp.）、キシラリア・ヒポキシロン（Xylaria hypoxylon）、ネクトリア・ピネア（Nectria pinea）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、カエトミウム・モロラム（Chaetomium mororum）、カエトミウム・バーセンス（Chaetomium virscens）、カエトミウム・ブラシリエンシス（Chaetomium brasiliensis）、カエトミウム・クニコロラム（Chaetomium cunicolorum）、シスパストスポラ・ボニネンシス（Syspastospora boninensis）、クラドリナム・フォエカンヂシマム（Cladorrhinum foecundissimum）、スキタリジウム・サーモフィラ（Scytalidium thermophila）、グリオクラジウム・カテヌラタム（Gliocladium catenulatum）、フザリウム・オキシスポラム菌種・リコペルシキ（Fusarium oxysporum ssp. lycopersici）、フザリウム・オキシスポラム菌種パッシフローラ（Fusarium oxysporum ssp.passiflora）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・アングイオイド（Fusarium anguioides）、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）、ヒュミコラ・ニグレッセンス（Humicola nigrescens）、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）、パナエオラス・レチルギス（Panaeolus retirugis）、トラメテス・サングイネア（Trametes sanguinea）、シゾフィラム・コミューン（Schizophyllum commune）、トリコテキウム・ロゼウム（Trichothecium roseum）、ミクロスファロシス菌種（Microsphaeropsis sp.）、アクソボロス・スチクトイデウス（Acsobolus stictoideus spej.）、ポロ��ア・パンクタタ（Poronia punctata）、ノデュリスポラム菌種（Nodulisporum sp.）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei））、及びシリンドロカルポン菌種（Cylindrocarpon sp.）。
【０１４１】
本開示は、少なくともヌクレオチド約１０個分、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、又は２０００個分の領域にわたって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、又は７７の核酸と、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％；８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％）配列同一性を有する核酸配列を含む、単離、合成、又は組み換え核酸を提供する。本開示は、ヘミセルロース分解活性（例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性）を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードしている核酸も提供する。更に、本開示は、セルロース分解活性（例えば、β−グルコシダーゼ活性、又はエンドグルカナーゼ活性）を有するポリペプチドをコードしている核酸も提供する。
【０１４２】
本開示の核酸としては、酵素、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９の配列を含む酵素の成熟部分、あるいは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ酵素、あるいはポリペプチド配列モチーフ：（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号：８６；（４）配列番号：８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１を含む酵素の成熟部分、並びにこれらのサブ配列（例えば、保存ドメイン、又は糖質結合ドメイン（「ＣＢＭ」））、並びにこれらの変異体、をコードしている、単離、合成、又は組み換え核酸も挙げられる。
【０１４３】
本開示は、具体的には、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｆｖ３Ｃ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、又はＴｎ３Ｂポリペプチド、変異体（variant）、変異体（mutant）、又はこれらのハイブリッド若しくはキメラポリペプチドをコードしている核酸を提供する。一部の態様では、本開示は、例えば、第１のβ−グルコシダーゼ配列と、第２のβ−グルコシダーゼ配列とを含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列が異なる生物種に由来する、キメラ又は融合酵素をコードしている核酸を提供する。特定の観点では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド又はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端であり、第２のβ−グルコシダーゼはハイブリッド又はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドのＣ末端である。特定の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列、又はより詳細には、第１のβ−グルコシダーゼ配列のＣ末端は、第２のβ−グルコシダーゼ配列と直接隣接するか又は連結され、より詳細には、第２のβ−グルコシダーゼ配列のＮ末端と直接隣接するか又は連結される。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼは、直接隣接せず、又は連結されず、むしろ第１のβ−グルコシダーゼ配列はリンカー配列又はドメインを介し、第２のβ−グルコシダーゼ配列に操作可能に連結され、又は連結される。一部の実施例では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１３６〜１４８により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１４９〜１５６により表されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列と第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接連結され、又は互いに直接隣接している。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、第２のβ−グルコシダーゼ配列と直接連結されず、又は直接隣接せず、むしろ、第１及び第２のβ−グルコシダーゼはリンカー配列を介して連結される。特定の実施形態では、リンカー配列は中央領域に局在する。具体例では、第１のβ���グルコシダーゼ配列は配列を含み、例えば、Ｆｖ３Ｃポリペプチドの、少なくともアミノ酸残基２００個分の長さのＮ末端配列を含む。一部の実施形態では、第２のβ−グルコシダーゼ配列は配列を含み、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３ポリペプチドの、少なくともアミノ酸残基５０個分の長さのＣ端末配列を含む。特定の例では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、ハイブリッド若しくはキメラＦｖ３Ｃポリペプチド、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）ポリペプチドであり、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む。他の例では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、ハイブリッド若しくはキメラＦｖ３Ｃポリペプチド、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３ポリペプチドであり、場合により、第３のβ−グルコシダーゼポリペプチド配列に由来するリンカー配列を含み、β−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、キメラ又は融合酵素は、適宜リンカー配列も含み、したがって、本開示は、Ｎ末端配列、Ｃ端末配列、又はこれらのサブ配列のいずれかに由来するβ−グルコシダーゼポリペプチドであると見なすことのできるキメラ酵素をコードしている核酸を提供する。例えば、ハイブリッド型のＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃポリペプチド、これらの変異体（variant）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３ポリペプチド、これらの変異体（variant）、又はキメラ型Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３ポリペプチド、又はこれらの変異体（variant）と見なすことができる。他の例では、ハイブリッド型Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃポリペプチド又はこれらの変異体（variant）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３ポリペプチド又はこれらの変異体（variant）、Ｔｅ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体（variant）、あるいはキメラ型Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３／ポリペプチド又はこれらの変異体（variant）と見なすことができる。
【０１４４】
ポリヌクレオチド配列についての文脈で使用する際、用語「変異体（variant）」は、遺伝子又はこれらのコード配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、又は「多型」変異体も包含される。スプライス変異体（variant）は、参照ポリヌクレオチドと非常に高い同一性を有するものの、一般的に、ｍＲＮＡのプロセシング時のエキソンの選択的スプライシングに起因し、残基数が多くなっているか、又は少なくなっている。対応するポリペプチドは、更なる機能ドメインを保有していたり、あるいはドメインを欠損していたりする。種変異体（variant）は、ポリヌクレオチド配列が種によって異なる変異体である。得られるポリペプチドは、更に詳細に記載するとおり、一般的に、互いに非常に高いアミノ酸同一性を有する。多型変異体（variant）は、所与のそれぞれの種間で、ポリヌクレオチド配列の特定の遺伝子において生じる、偏差である。
【０１４５】
例えば、本開示は、単離核酸分子を提供し、本核酸分子は、
（１）配列番号５４のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５４の残基（ｉ）１８〜２８２、（ｉｉ）１８〜６０１、（ｉｉｉ）１８〜７３３、（ｉｖ）３５６〜６０１、若しくは（ｖ）３５６〜７３３に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（２）配列番号５６のアミノ酸配列、又は配列番号５６の残基（ｉ）２２〜２９２、（ｉｉ）２２〜６２９、（ｉｉｉ）２２〜７８０、（ｉｖ）３７３〜６２９、若しくは（ｖ）３７３〜７８０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（３）配列番号５８のアミノ酸配列、又は配列番号５８の残基（ｉ）２０〜３２１、（ｉｉ）２０〜６５１、（ｉｉｉ）２０〜８１１、（ｉｖ）４２３〜６５１、若しくは（ｖ）４２３〜８１１に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（４）配列番号６０のアミノ酸配列、又は配列番号６０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２２〜６００、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜８９９、若しくは（ｖ）４２８〜６６０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（５）配列番号６２のアミノ酸配列、又は配列番号６２の残基（ｉ）２０〜２８７、（ｉｉ）２２〜６１１、（ｉｉｉ）２０〜７４４、（ｉｖ）３６２〜６１１、若しくは（ｖ）３６２〜７４４に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（６）配列番号６４のアミノ酸配列、又は配列番号６４の残基（ｉ）１９〜３０７、（ｉｉ）１９〜６４０、（ｉｉｉ）１９〜８７４、（ｉｖ）４０７〜６４０、若しくは（ｖ）４０７〜８７４に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（７）配列番号６６のアミノ酸配列、又は配列番号６６の残基（ｉ）２０〜２９７、（ｉｉ）２０〜６２９、（ｉｉｉ）２０〜８５７、（ｉｖ）３９６〜６２９、若しくは（ｖ）３９６〜８５７に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（８）配列番号６８のアミノ酸配列、又は配列番号６８の残基（ｉ）２０〜３００、（ｉｉ）２０〜６３４、（ｉｉｉ）２０〜８６０、（ｉｖ）４００〜６３４、若しくは（ｖ）４００〜８６０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（９）配列番号７０のアミノ酸配列、又は配列番号７０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜６６０、若しくは（ｖ）４２８〜８９９に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（１０）配列番号７２のアミノ酸配列、又は配列番号７２の残基（ｉ）１９〜３１４、（ｉｉ）１９〜６４７、（ｉｉｉ）１９〜８８６、（ｉｖ）４１５〜６４７、若しくは（ｖ）４１５〜８８６に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（１１）配列番号７４のアミノ酸配列、又は配列番号７４の残基（ｉ）２０〜２９５、（ｉｉ）２０〜６４７、（ｉｉｉ）２０〜８８０、（ｉｖ）４１４〜６４７、若しくは（ｖ）４１４〜８８０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（１２１）配列番号７６のアミノ酸配列、又は配列番号７６の残基（ｉ）１９〜２９６、（ｉｉ）１９〜６４９、（ｉｉｉ）１９〜８９０、（ｉｖ）４１５〜６４９、若しくは（ｖ）４１５〜８９０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（１３）配列番号７８のアミノ酸配列、又は配列番号７８の残基（ｉ）２０〜３５４、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８０５、（ｉｖ）４４９〜６６０、若しくは（ｖ）４４９〜８０５に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；あるいは
（１４）配列番号７９のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、をコードする。
【０１４６】
本開示は、
（１）配列番号５３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号５３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（２）配列番号５５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号５５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（３）配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号５７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（４）配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号５９又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（５）配列番号６１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号６１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（６）配列番号６３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号６３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（７）配列番号６５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号６５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（８）配列番号６７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号６７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（９）配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号６９又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸あるいは
（１０）配列番号７１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番７１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（１１）配列番号７３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号７３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（１２）配列番号７５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号７５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸；あるいは
（１３）配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号７７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することができる核酸、も提供する。
【０１４７】
本明細書で使用するとき、用語「厳密度の低い条件下、中程度に厳密な条件下、厳密度の高い条件下、又は非常に厳密度の高い条件下」は、ハイブリッド形成及び洗浄についての条件を示す。ハイブリッド形成を実施する際の指針は、現行のプロトコル「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６）」に見出すことができる。文献には、水を使用する方法及び使用しない方法が記載されており、これらのいずれをも使用することができる。本明細書で参照される具体的なハイブリッド形成条件は次のとおりである：１）厳密度の低いハイブリッド形成条件：約４５℃下で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次に０．２Ｘ  ＳＳＣで２回洗浄、少なくとも５０℃下で０．１％  ＳＤＳ（厳密度の低い条件については、洗浄温度は５５℃まで上昇させることができる）；２）中程度に厳密な条件：約４５℃下で６Ｘ  ＳＳＣ、次に０．２Ｘ  ＳＳＣで１回以上洗浄、６０℃下で０．１％  ＳＤＳ；３）厳密度の高い条件：約４５℃下で６Ｘ  ＳＳＣ、次に０．２Ｘ  ＳＳＣで１回以上洗浄、６５℃下で０．１％  ＳＤＳ；並びに好ましくは４）非常に厳密度の高い条件：６５℃下で、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳ、次に０．２Ｘ  ＳＳＣで１回以上洗浄、６５℃下で１％  ＳＤＳ。（４）非常に厳密度の高い条件は、別途記載のない限り、好ましい条件である。
【０１４８】
核酸の単離法の例
β−グルコシダーゼ及び本開示のその他の核酸は標準法により単離できる。対象とする生物資源（例えばバクテリアのゲノムなど）から所望の核酸を得る方法は、一般的なものであり、分子生物学の分野では周知である。既知の配列のＰＣＲによる増幅、核酸の合成、ゲノムライブラリの選択、コスミドライブラリの選択などの、核酸単離の標準法は、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号、及び米国特許出願第第１２／３３５，０７１号に記載される。
【０１４９】
宿主細胞例
本開示は、本開示の１つ以上の酵素を発現するよう遺伝子操作された宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、任意の微生物（例えば、バクテリア細胞、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）、又はその他の微生物）が挙げられ、好ましくは宿主細胞はバクテリア細胞、酵母細胞、又は糸状菌細胞である。
【０１５０】
好適な細菌属宿主細胞としては、限定するものではないが、大腸菌（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、及びストレプトマイセス（Streptomyces）が挙げられる。好適なバクテリア種細胞としては、限定するものではないが、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）が挙げられる。
【０１５１】
酵母属の好適な宿主細胞としては、限定するものではないが、サッカロマイセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、ピキア（Pichia）、クリヴェロミセス（Kluyveromyces）、及びファフィナ（Phaffia）細胞が挙げられる。好適な酵母種細胞としては、限定するものではないがサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキアパストリス（Pichia pastoris）、Ｐ．カナデンシス（P. canadensis）、クリヴェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）及びファフィア・ロードザイマ（Phaffia rhodozyma）細胞が挙げられる。
【０１５２】
好適な糸状菌宿主細胞としては、エウミコチニア（Eumycotina）亜門の全ての糸状菌が挙げられる。好適な糸状菌属の細胞としては、限定するものではないが、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシディウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスカス（Corynascus）、ケトミウム（Chaertomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ヒュミコラ、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ、ムコール（Mucor）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリカム（Sporotrichum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、及びトリコデルマ（Trichoderma）細胞が挙げられる。
【０１５３】
好適な糸状菌種細胞としては、限定するものではないが、アワモリコウジカビ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、こうじ菌（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイドス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トルコテキオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジャカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオシス・カレジエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオシス・ギルベッセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオシス・パンノキンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオシス・サブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・キネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ハースタス（Coriolus hirsutus）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネッセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソルタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、白色腐朽菌（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラブス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa）、カワラタケ（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、及びトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞が挙げられる。
【０１５４】
本開示は更に、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｆｖ３Ｃ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ又はＴｎ３Ｂポリペプチド、あるいはこれらの変異体（variant）のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。
【０１５５】
特定の実施形態では、２つ以上のセルラーゼ配列及び／又はヘミセルラーゼ配列に由来するハイブリッド若しくはキメラ酵素を発現している組み換え宿主細胞が企図される。一部の態様では、ハイブリッド若しくはキメラ酵素は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１３６〜１４８のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１４９〜１５６から選択されるポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドのＮ末端であり、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列はＣ末端である。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接しているか、又は互いに連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接していない又は直接連結されていないものの、リンカードメインを介して連結されている。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する。特定の態様では、第１の又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はいずれも、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含み、この改変により、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドは、未改変の対応するポリペプチド又はハイブリッド若しくはキメラポリペプチドのキメラ部分が由来するポリペプチドと比較して安定性が向上する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まず、むしろリンカードメインがループ配列を含む。一部の実施形態では、ループ配列を改変することにより、例えば、配列を短縮、延長、欠失、交換、置換あるいは修飾することにより、ループ配列中の残基が分解されにくくなる。他の実施形態では、ループ配列の改変により、ループ配列の外側の残基が切断されにくくなる。
【０１５６】
特定の実施形態では、２つ以上のセルラーゼ配列及び／又はヘミセルラーゼ配列に由来するハイブリッド若しくはキメラ酵素を発現している組み換え宿主細胞が企図される。一部の態様では、ハイブリッド若しくはキメラ酵素は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む。一部の実施形態では、第１の配列と第２の配列を含み、第１の配列は、連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基分の長さを有し、かつ配列番号６０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有し、第２の配列は、連続する少なくとも約５０個のアミノ酸残基分の長さを有し、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有する、ハイブリッド若しくはキメラ酵素を発現している、組み換え宿主細胞が企図される。代替的な実施形態では、第１の配列と第２の配列を含み、第１の配列は、連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基分の長さを有し、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有し、第２の配列は、連続する少なくとも約５０個のアミノ酸残基分の長さを有し、配列番号６０の配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有する、ハイブリッド若しくはキメラ酵素を発現している、組み換え宿主細胞が企図される。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドのＮ末端であり、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列はＣ末端である。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接していない又は直接連結されていないものの、リンカードメインを介して連結されている。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する。特定の態様では、第１の又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はいずれも、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含み、この改変により、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドは、未改変の対応するポリペプチド又はハイブリッド若しくはキメラポリペプチドのキメラ部分が由来するポリペプチドと比較して安定性が向上する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列も第２のβ−グルコシダーゼ配列もループ配列を含まず、むしろリンカードメインがループ配列を含む。特定の実施形態では��例えば、配列の短縮、延長、欠失、交換、置換又はあるいは改変などによりループ配列が改変されると、ループ配列中の残基の切断が低減される。他の実施形態では、ループ配列の改変により、ループ配列の外側の残基の切断が低減される。
【０１５７】
一部の態様では、組み換え宿主細胞は、１つ以上のキメラ酵素、例えば、Ｆｖ３Ｃ融合酵素、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３融合酵素、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合酵素、Ｔｅ３Ａ融合酵素、又はＦｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３融合酵素を発現する。本開示では、用語「ＸＸ融合酵素」、「ＸＸキメラ酵素」及び「ＸＸハイブリッド酵素」は、ＸＸ酵素に由来する少なくとも１つのキメラ部分を有する酵素について言及する際に、互換的に使用される。例えば、Ｆｖ３Ｃ融合又はキメラ酵素は、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３ハイブリッド酵素（Ｂｇｌ３キメラ酵素でもある）、又はＦｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３ハイブリッド酵素（Ｔｅ３Ａ又はＢｇｌ３キメラ酵素でもある）として言及することもできる。
【０１５８】
組み換え宿主細胞は、例えば、組み換えＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞である。特定の実施例では、本開示は、Ｆｖ３Ａ，Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｆｖ３Ｃ、Ｆｖ３Ｃ融合／キメラ酵素、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３、Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３融合／キメラ酵素、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、又はＴｎ３Ｂポリペプチド、又はこれらの変異体（variant）若しくは変異体（mutane）、例えばこれらのハイブリッド若しくはキメラポリペプチド、のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上を発現するよう遺伝子操作された組み換えＴ．リーゼイ（T. reesei）などの組み換え真菌を提供する。
【０１５９】
本開示は、宿主細胞、例えば、遺伝子組み換えにより少なくとも１つのキシラナーゼ、少なくとも１つのβ−キシロシダーゼ、及び１つのＬ−α−アラビノフラノシダーゼを発現するよう遺伝子操作された組み換え真菌宿主細胞又は組み換え糸状菌を提供する。本開示は、組み換え宿主細胞、例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｆｖ３Ｃ、Ｆｖ３Ｃ融合酵素、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３融合酵素、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合酵素、Ｔｒ３Ａ、Ｔｅ３Ａ、Ｔｅ３Ａ融合酵素、Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３融合酵素、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、又はＴｎ３Ｂポリペプチドのうちの１、２、３、４、又は５以上に加えて、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、又はこれらの変異体（variant）のうちの１つ以上を発現するよう遺伝子操作された組み換えＴ．リーゼイ（T. reesei）などの、組み換え真菌宿主細胞又は組み換え糸状菌も提供する。組み換え宿主細胞は、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞である。
【０１６０】
本開示は、例えば、組み換え真菌宿主細胞、又は組み換え生物などの組み換え宿主細胞も提供し、例えば、このような宿主細胞としては、遺伝子組み換えによりＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３融合酵素、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、及びＦｖ５１Ａポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された組み換えＴ．リーゼイ（T. reesei）などの糸状菌が挙げられる。例えば、組み換え宿主細胞は好適にはＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞である。組み換え真菌は、好適には組み換えＴ．リーゼイ（T. reesei）である。本開示は、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３融合酵素、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、及びＦｖ５１Ａポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞を提供する。
【０１６１】
プロモーター及びベクター例
本開示は、上記の核酸を含む、発現カセット及び／又はベクターも提供する。好適には、本開示の酵素をコードしている核酸は、操作可能にプロモーターに連結される。プロモーターは当該技術分野において周知である。β−グルコシダーゼ及び／又は本開示の任意のその他の核酸を発現させる際、宿主細胞において機能する任意のプロモーターを使用することができる。多様な宿主細胞において本開示のβ−グルコシダーゼ核酸及び／又は任意のその他の核酸の発現を駆動させるのに有用な調節領域又はプロモーターの転写を開始する手法は多数あり、かつ当業者には馴染み深いものである（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び当該特許に引用される参照文献を参照されたい）。これらの核酸を駆動させることのできる、事実上あらゆるプロモーターを使用することができる。
【０１６２】
特に、糸状菌宿主に組み換え体を発現させることが望ましい場合、プロモーターは糸状菌のプロモーターであってよい。例えば、核酸は、異種プロモーターの調節下のものであってよい。核酸は、常時発現型又は誘導型プロモーターの調節下で発現させることもできる。使用することができるプロモーターの例としては、限定するものではないが、セルラーゼのプロモーター、キシラナーゼのプロモーター、１８１８プロモーター（これまでに、ＥＳＴマッピングしたトリコデルマ（Trichoderma）により高発現されるタンパク質として同定されている）が挙げられる。例えば、プロモーターは、好適にはセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターであってよい。特に好適なプロモーターは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターである場合がある。例えば、プロモーターは、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）プロモーターである。プロモーターの非限定例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。その他のプロモーターの非限定例としては、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。
【０１６３】
本明細書で使用するとき、用語「操作可能に連結された」は、選択されたＤＮＡの発現をプロモーターにより制御するために、選択したヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードしている）をプロモーターに近接させていることを意味する。加えて、プロモーターは、転写及び翻訳の方向の観点から、選択されたヌクレオチド配列の上流に位置する。「操作可能に連結された」は、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が制御配列に結合した際に、遺伝子発現が可能になるような様式で、ヌクレオチド配列及び制御配列が連結されていることを意味する。
【０１６４】
任意のβ−グルコシダーゼ及び／又は本明細書に記載のその他の核酸を、１つ以上のベクターに含有させることができる。したがって、本明細書には、任意のβ−グルコシダーゼ及び／又は本開示のその他の核酸をコードしている核酸を１つ以上含むベクターも記載される。一部の態様では、ベクターは、発現制御配列の制御下の核酸を含有する。一部の態様では、発現制御配列はネイティブな発現制御配列である。一部の態様では、発現制御配列は非ネイティブな発現制御配列である。一部の態様では、ベクターは選択マーカー（selective marker又はselectable marker）を含有する。一部の態様では、１つ以上のβ−グルコシダーゼを、選択マーカーと組み合わせずに細胞染色体に組み込む。
【０１６５】
好適なベクターは、選択された宿主細胞と適合性があるものである。好適なベクターは、例えばバクテリア、ウィルス（バクテリオファージＴ７又はＭ−１３から誘導されたファージなど）、コスミド、酵母又は植物に由来するものである場合がある。好適なベクターは、培地中にはコピーナンバー数を少なく維持することができ、又は宿主細胞中でコピー数が大きくなるよう維持することができる。このようなベクターを得るための及び使用するためのプロトコルは、当業者には既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照されたい）。
【０１６６】
一部の態様では、発現ベクターには転写終結配列も包含される。転写終結制御領域は、宿主細胞にとってネイティブな様々な遺伝子に由来するものであり得る。一部の態様では、転写終結配列及びプロモーター配列は同じ供給源に由来する。
【０１６７】
β−グルコシダーゼの核酸は、標準法により、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）。
【０１６８】
一部の態様では、１つ以上のβ−グルコシダーゼ、及び／又は本開示の１つ以上の任意の他の核酸を、現在天然に発生する細胞で観察されるよりもはるかに高濃度で過剰発現させることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ及び／又は本開示で記載される１つ以上の任意の他の核酸を、現在天然に発生する細胞で観察されるよりもはるかに低濃度で低発現させる（例えば、変異、不活性化、又は欠失により）ことが望ましい場合もある。
【０１６９】
形質転換方法例
β−グルコシダーゼの核酸又はこれを含むベクターは、宿主細胞内にＤＮＡコンストラクト又はベクターを導入するための、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、遺伝子導入（例えばリポフェクション法による若しくはＤＥＡＥ−デキストラン法による遺伝子導入、又は組換えファージウイルスを使用したトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法とインキュベーションの併用、ＤＮＡコーティングした微粒子を用いる高速微粒子銃、及びプロトプラスト融合などの、標準的な技術を使用して、宿主細胞（例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）に挿入することができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入した核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選択することができる。
【０１７０】
細胞培養培地例
概して、微生物は、本明細書に記載のポリペプチドを産生させるのに好適な細胞培養培地で培養する。培養は、当該技術分野において既知の手順及び変法を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行なわれる。増殖及びセルラーゼ生成に好適な培地、温度範囲及び他の条件が当該技術分野において既知である。非限定例として、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）によりセルラーゼを産生させる際に一般的な温度範囲は２４℃〜２８℃である。
【０１７１】
細胞培養条件例
細菌培養の維持及び増殖に適した材料及び方法は、当該技術分野では周知のものである。代表的な手法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）ｏｒ  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）に見出すことができる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞内に挿入した核酸によってコードされている１つ以上のβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させることのできる条件下で培地中で培養される。細胞を培養する際には、標準的な細胞培養条件を使用することができる。一部の態様では、適切な温度、気体組成、及びｐＨ下で細胞を増殖させ、維持する。一部の態様では、適切な細胞培地中で細胞を増殖させる。
【０１７２】
本発明の組成物
本開示は、遺伝子組み換え酵素組成物（例えば、セルラーゼ組成物）、又は上記の１つ以上のポリペプチドが濃縮された発酵ブロスを提供する。一部の態様では、組成物はセルラーゼ組成物である。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）セルラーゼ組成物などの、糸状菌セルラーゼ組成物であってよい。一部の態様では、組成物は、１つ以上のセルラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を含む細胞である。一部の態様では、組成物は、セルラーゼ活性を有する発酵ブロスであり、ブロスは、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約５０％超を糖へと変換し得る。本明細書で使用するとき、用語「発酵ブロス」は、発酵により産生され、発酵後に全く又はほとんど回収及び／又は精製されない酵素調製物を指す。発酵ブロスは、糸状菌の発酵ブロスであってよく、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、ケファロスポリウム（Cephalosporium）、アキラ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボラス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）の発酵ブロスであってよい。特に、発酵ブロスは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）などのトリコデルマ菌種（Trichoderma spp）、又はＰ．フニクロサム（P. funiculosum）などのペニシリウム菌種（Penicillium spp.）のものであってよい。発酵ブロスは、好適には無細胞発酵ブロスであってもよい。一態様では、本発明の任意のセルラーゼ、細胞、又は発酵ブロス組成物には、更に１つ以上のヘミセルラーゼを含有させてもよい。一態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。特定の実施形態では、発酵ブロスは、全ブロス製剤に使用されるとされる、例えば、精製、限外ろ過、ろ過又は殺細胞工程などの限定的な産生後加工法（limited post-production processing）に使用することができる。一部の態様では、全セルラーゼ組成物はＴ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる。一部の態様では、全セルラーゼ組成物は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａで発現させる。一部の態様では、全セルラーゼ組成物は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａで発現させた組成物であり、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａで発現された１つ以上のポリペプチド成分が除去してある。一部の態様では、全セルラーゼ組成物は、Ａ．ニガー（A. niger）又はその遺伝子組み換え株で発現させる。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、カルコフローアッセイにより測定した場合に少なくとも０．１〜０．４画分を得ることができる。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、組成物の総酵素重量の０．１〜２５重量％を構成する。一部の態様では、セルラーゼ組成物は更に、１つ以上のヘミセルラーゼを含む。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、バイオマス中に存在するセルロースの約７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０％重量超を糖へと変換し得る。一部の態様では、セルラーゼ組成物はポリペプチドを含み、バイオマスサンプル中のセルロースを糖に変換する割合（重量％）は、ポリペプチドを含まないセルラーゼ組成物と比較��て増大している。
【０１７３】
一部の態様では、組成物は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するポリペプチドを含む、セルラーゼ組成物である。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するポリペプチドを含み、セルラーゼ組成物は、バイオマス基質中に存在するセルロースの約３０重量％超、例えば、約４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％超を糖へと変換し得る。特定の実施形態では、典型的には、バイオマス基質に本明細書に記載のものなどの何らかの好適な前処理加工を行った結果、バイオマス基質は、固体、ゲル、半固体、又は液体形態の混合物である。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するポリペプチドを含み、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約３０重量％超（例えば、約４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％超）を糖へと変換することのできるセルラーゼ組成物は、全細胞組成物である。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれも１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するポリペプチドを含み、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約３０重量％超、例えば、約４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％超を糖へと変換することができるセルラーゼ組成物は、発酵ブロスである。一部の態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。一部の態様では、発酵ブロスは無細胞発酵ブロスである。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａで発現させる。一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａで発現したポリペプチドの１つ以上の成分を除外させる。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物を、Ａ．ニガー（A. niger）又はその組み換え株で発現させる。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物は、カルコフローアッセイにより測定した場合に少なくとも０．１〜０．４画分を得ることのできるものである。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物は、組成物の０．１〜２５重量％（例えば、０．５〜２２重量％、１〜２０重量％、５〜１９重量％、７〜１８重量％、９〜１７重量％、１０〜１５重量％）で総タンパク質を含む。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列の少なくとも１つとを有する少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物は、更に、１つ以上のヘミセルラーゼを含む。一部の態様では、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）配列同一性を有するポリペプチドを含むセルラーゼ組成物は、バイオマス中に存在するセルロースの約５０％超（例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％超）を糖へと変換することができる。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６���％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）配列同一性を有するポリペプチドを含み、バイオマスサンプル中のセルロースを糖に変換する割合（重量％）は、ポリペプチドを含まないセルラーゼ組成物と比較して増大している。
【０１７４】
一部の態様では、セルラーゼ組成物は非天然に得られるセルラーゼ組成物であり、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ／ハイブリッド／融合体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さ（第１のβ−グルコシダーゼ配列に相当）の連続的なＦｖ３Ｃ配列（配列番号６０）と約６０％（例えば、約６５％、７０％、７５％、８０％）以上の配列同一性を有し、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、相当する長さ（第２のβ−グルコシダーゼ配列に相当）の配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの連続的な配列と少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％）配列同一性を有し、又は配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の態様では、セルラーゼ組成物は全細胞組成物である。一部の態様では、セルラーゼ組成物は発酵ブロスである。一部の態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。一部の態様では、発酵ブロスは無細胞発酵ブロスである。
【０１７５】
一部の態様では、セルラーゼ組成物は非天然に得られるセルラーゼ組成物であり、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さ（第１のβ−グルコシダーゼ配列に相当）の配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの連続的な配列と約６０％（例えば、約６５％、７０％、７５％、８０％）以上の配列同一性を有し、配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、相当する長さ（第２のβ−グルコシダーゼ配列に相当）の連続的なＦｖ３Ｃ配列（配列番号６０）と少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％）配列同一性を有する。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の態様では、セルラーゼ組成物は発酵ブロスである。一部の態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。一部の態様では、発酵ブロスは無細胞発酵ブロスである。
【０１７６】
特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接し、又は連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接せず、リンカードメインを介して連結される。特定の実施形態では、リンカードメインは、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドの中央領域（すなわち、Ｎ末端又はＣ末端のいずれでもない）に位置する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列のいずれかは、あるいはこれらの配列の両方共が、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ配列を含み、ループ配列は、例えばアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は、第１の及び第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカー配列を提供する。一部の態様では、セルラーゼ組成物は全細胞組成物である。一部の態様では、セルラーゼ組成物は発酵ブロスである。一部の態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。一部の態様では、発酵ブロスは無細胞発酵ブロスである。
【０１７７】
一部の態様では、セルラーゼ組成物は非天然に得られるセルラーゼ組成物であり、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さ（第１のβ−グルコシダーゼ配列に相当）の連続的なＦｖ３Ｃ配列（配列番号６０）と約６０％（例えば、約６５％、７０％、７５％、８０％）以上の配列同一性を有し、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、相当する長さ（第２のβ−グルコシダーゼ配列に相当）の配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの連続的な配列と少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％）配列同一性を有し、又は配列番号１７０のポリペプチド配列モチーフを含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接し、又は連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接せず、リンカードメインを介して連結される。特定の実施形態では、リンカードメインは、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドの中央領域（すなわち、Ｎ末端又はＣ末端のいずれでもない）に局在する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列のいずれかは、あるいはこれらの配列の両方共が、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ配列を含み、ループ配列は、例えばアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は、第１の及び第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカー配列を提供する。一部の態様では、セルラーゼ組成物は全細胞組成物である。一部の態様では、セルラーゼ組成物は発酵ブロスである。一部の態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。
【０１７８】
一部の態様では、発酵ブロスは無細胞発酵ブロスである。一部の態様では、セルラーゼ組成物は非天然に得られるセルラーゼ組成物であり、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、連続する少なくとも約２００個のアミノ酸残基分（例えば、少なくとも約２５０、３００、３５０、４００、又は４５０個分）の長さであり、かつ配列番号１３６〜１４８のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、連続する少なくとも約５０個のアミノ酸残基分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、又は２５０個分）の長さであり、かつ配列番号１４９〜１５６の１つ以上又は全てのアミノ酸配列モチーフを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、キメラポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はキメラポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接し、又は連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接せず、リンカードメインを介して連結される。特定の実施形態では、リンカードメインは、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドの中央領域（すなわち、Ｎ末端又はＣ末端のいずれでもない）に位置する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列のいずれかは、あるいはこれらの配列の両方共が、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ配列を含み、ループ配列は、例えばアミノ酸残基、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は、第１の及び第２のβ−グルコシダーゼ配列を連結するリンカー配列を提供する。一部の態様では、セルラーゼ組成物は全細胞組成物である。一部の態様では、セルラーゼ組成物は発酵ブロスである。一部の態様では、発酵ブロスは全セルラーゼを含む。一部の態様では、発酵ブロスは無細胞発酵ブロスである。
【０１７９】
ヘミセルラーゼ組成物
一部の態様では、本発明の任意のセルラーゼ組成物は、更に、１種以上のヘミセルラーゼを含む。この場合、ひいては、セルラーゼ組成物もヘミセルラーゼ組成物である。一部の態様では、本発明のヘミセルラーゼ組成物は、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、及びこれらの組み合わせから選択されるヘミセルラーゼを含む。一部の態様では、本発明のヘミセルラーゼ組成物は、少なくとも１種のキシラナーゼを含む。一部の態様では、少なくとも１種のキシラナーゼは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＡｆｕＸｙｎ５からなる群から選択される。一部の態様では、本発明のヘミセルラーゼ組成物は、少なくとも１種のβ−キシロシダーゼを含む。一部の態様では、β−キシロシダーゼは、例えば、Ｆｖ３Ａ及びＦｖ４３Ａなどのβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ１群を含む。一部の態様では、β−キシロシダーゼは、例えば、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１などのβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ２群を含む。一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、第１群又は第２群のいずれかのβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼを単独で含む。一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、２種のβ−キシロシダーゼを含み、１種のβ−キシロシダーゼは第１群から選択され、他方は第２群から選択される。一部の態様では、本発明のヘミセルラーゼ組成物は、少なくとも１種のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含む。一部の態様では、少なくとも１種のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及びＦｖ５１Ａからなる群から選択される。
【０１８０】
キシラナーゼ：一部の態様では、セルラーゼ組成物は、少なくとも１種の好適なキシラナーゼを含むヘミセルラーゼ組成物を含む。一部の態様では、少なくとも１種のキシラナーゼは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＡｆｕＸｙｎ５からなる群から選択される。
【０１８１】
任意のキシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）を１種以上のキシラナーゼとして使用することができる。好適なキシラナーゼとしては、例えば、カルドセラム・サッカロリティカム（Caldocellum saccharolyticum）・キシラナーゼ（Ｌｕｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（９）：２６７７〜２６８３）、サーマトガ・マリティマ（Thermatoga maritima）キシラナーゼ（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ  ＆  Ｌｉｅｂｅｌ，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（５）：１８１０〜１８１５）、サーマトガ菌種（Thermatoga Sp.）ＦＪＳＳ−Ｂ．１株キシラナーゼ（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７，４１３〜４１７）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）・キシラナーゼ（ＢｃＸ）（米国特許第５，４０５，７６９号）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）キシラナーゼ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７９（５）：４２２〜４２８）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）・キシラナーゼ（Ｓｈａｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｇｅｎｅ  １０７：７５〜８２；Ｍｏｒｏｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９：５８７〜５９２；Ｋｌｕｅｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７：４５〜５０）、枯草菌（Bacillus subtilis）キシラナーゼ（Ｂｅｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｇｅｎｅ  ２６（１）：５９〜６５）、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）・キシラナーゼ（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３９：２７〜３５）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）・キシラナーゼ（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３４：３２３９〜３２４７）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）・キシラナーゼ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：５６９〜５７６）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）・キシラナーゼ（Ｎｕｙｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００１，５６：４３１〜４３４；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（１４Ｂ）：７１８７）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）Ｐ２６２・キシラナーゼ（Ｚａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（８）：２１７９）、又はトリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）キシラナーゼ（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４（４）：７５５〜７５６）が挙げられる。
【０１８２】
Ｘｙｎ２：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、更にＸｙｎ２を含む。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２（配列番号４３）のアミノ酸配列を、図２５及び５９Ｂに示す。配列番号４３は、未成熟なトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２は、配列番号４３の残基１〜３３（図２５中下線部）に相当する予測プレプロペプチド配列を有する。残基１６及び１７間の予測シグナル配列が切断することで、プロペプチドが生成されるものと予想され、このプロペプチドはケキシン様プロテアーゼにより残基３２及び３３間にプロセシングを受け、配列番号４３の残基３３〜２２２に相当する配列を有する成熟タンパク質を生成する。予測保存ドメインを、図２５中にボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で作用させた場合に、キシロースモノマーの産生を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた酸性残基としては、Ｅ１１８、Ｅ１２３、及びＥ２０９が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチド」は、配列番号４３の残基３３〜２２２間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、又は１７５個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドの残基Ｅ１１８、Ｅ１２３、及びＥ２０９は、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２のものから改変されていない。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、図５９Ｂのアラインメントに示すとおり、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＡｆｕＸｙｎ５間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、図２５に示す、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２の予測保存ドメインの全長を適切に含む。代表的なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、図２５に示すＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２の成熟配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１８３】
Ｘｙｎ３：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は更にＸｙｎ３を含む。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３（配列番号４２）のアミノ酸配列を図２４Ｂに示す。配列番号４２は、未成熟なトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３は、配列番号４２の残基１〜１６（図２４Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４２の残基１７〜３４７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図２４Ｂ中にボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で作用させた場合に、キシロースモノマーの産生を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた触媒残基としては、ＧＨ１０ファミリーの別の酵素、すなわちストレプトミセス・ハルステディ（Streptomyces halstedii）由来のＸｙｓ１  δ（Ｃａｎａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｃｔ  Ｃｒｙｓｔａｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．５９：１４４７〜５３）（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３とは３３％の配列同一性を有する）とのアラインメントにより示される通り、Ｅ９１、Ｅ１７６、Ｅ１８０、Ｅ１９５、及びＥ２８２が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチド」は、配列番号４２の残基１７〜３４７間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドの残基Ｅ９１、Ｅ１７６、Ｅ１８０、Ｅ１９５、及びＥ２８２は、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３のものから改変されていない。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３及びＸｙｓ１  δ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、図２４Ｂに示す、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の予測保存ドメインの全長を適切に含む。代表的なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、図２４Ｂに示すＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の成熟配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１８４】
ＡｆｕＸｙｎ２：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、更にＡｆｕＸｙｎ２を含む。ＡｆｕＸｙｎ２（配列番号２４）のアミノ酸配列を図１９Ｂ及び５９Ｂに示す。配列番号２４は、未成熟なＡｆｕＸｙｎ２配列である。ＡｆｕＸｙｎ２は、配列番号２４の残基１〜１８（図１９Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２４の残基１９〜２２８に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインＧＨ１１を、図１９Ｂ中にボールド体で示す。ＡｆｕＸｙｎ２は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で作用させた場合に、キシロースモノマーの産生を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた触媒残基としては、Ｅ１２４、Ｅ１２９、及びＥ２１５が挙げられる。本明細書で使用するとき、「ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチド」は、一部の態様では、配列番号２４の残基１９〜２２８間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、ネイティブなＡｆｕＸｙｎ２と比較して、残基Ｅ１２４、Ｅ１２９、及びＥ２１５において変更はなされていない。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、図５９Ｂのアラインメントに示すとおり、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、図１９Ｂに示す、ネイティブなＡｆｕＸｙｎ２の予測保存ドメインの全長を適切に含む。代表的なＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、図１９Ｂに示すＡｆｕＸｙｎ２の成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１８５】
ＡｆｕＸｙｎ５：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、更にＡｆｕＸｙｎ５を含む。ＡｆｕＸｙｎ５（配列番号２６）のアミノ酸配列を図２０Ｂ及び５９Ｂに示す。配列番号２６は、未成熟なＡｆｕＸｙｎ５配列である。ＡｆｕＸｙｎ５は、配列番号２６の残基１〜１９（図２０Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２６の残基２０〜３１３に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインＧＨ１１を、図２０Ｂ中にボールド体で示す。ＡｆｕＸｙｎ５は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で作用させた場合に、キシロースモノマーの産生を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた触媒残基としては、Ｅ１１９、Ｅ１２４、及びＥ２１０が挙げられる。予測ＣＢＭは、セリン、スレオニンに富むアミノ酸長鎖に続いてＣ末端付近に存在し、多数の疎水性残基が存在することを特徴とする。図５９Ｂ中に下線を付してこの領域を示す。本明細書で使用するとき、「ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド」は、配列番号２６の残基２０〜３１３間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は２７５個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、ネイティブなＡｆｕＸｙｎ５と比較して、残基Ｅ１１９、Ｅ１２０、及びＥ２１０において変更はなされていない。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、図５９Ｂのアラインメントに示すとおり、ＡｆｕＸｙｎ５、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、図２０Ｂに示すネイティブなＡｆｕＸｙｎ５の予測ＣＢＭの全長、及び／又はネイティブなＡｆｕＸｙｎ５の予測保存ドメインの全長（下線部）を適切に含む。代表的なＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、図２０Ｂに示すＡｆｕＸｙｎ５の成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１８６】
キシラナーゼは、本開示のセルラーゼ組成物の約０．０５重量％〜約５０重量％を適宜構成する。重量％は、所定の組成物中の全ての酵素の合計重量に対する、キシラナーゼの合計重量を意味する。キシラナーゼは、０．０５重量％、１重量％、１．５重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、又は４５重量％を下限とし、５重量％、１０重量％，１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、又は５０重量％を上限とする範囲で存在させることができる。好適には、本発明の酵素組成物中の１種以上のキシラナーゼの合計重量は、例えば、酵素組成物中の全ての酵素の合計重量の約０．０５重量％〜約５０重量％（例えば、０．０５重量％、１重量％、２重量％、３重量％〜５０重量％、３重量％〜４０重量％、３重量％〜３０重量％、３重量％〜２０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜３０重量％、１５重量％〜３５重量％、２０重量％〜４０重量％、２０重量％〜５０重量％など）を占める。
【０１８７】
キシラナーゼは、キシラナーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで産生できる。キシラナーゼは、一定の条件下で過剰発現又は低発現させることができる。
【０１８８】
β−キシロシダーゼ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、少なくとも１種のβ−キシロシダーゼを含む。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、例えば、Ｆｖ３Ａ及びＦｖ４３Ａからなる群から選択されるβ−キシロシダーゼ１群を少なくとも１つ含む。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、例えば、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１からなる群から選択されるβ−キシロシダーゼ２群を少なくとも１つ含む。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、第１群又は第２群のいずれかから選択されるβ−キシロシダーゼを単独で含む。一部の態様では、セルラーゼ組成物は、２種のβ−キシロシダーゼを含み、１種のβ−キシロシダーゼは第１群から選択され、他方は第２群から選択される。
【０１８９】
任意のβ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）を好適なβ−キシロシダーゼとして使用することができる。好適なβ−キシロシダーゼとしては、例えば、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）Ｂｘｌ１（Ｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０５（３）：５７９〜８５）、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）β−キシロシダーゼ（Ｓｈａｌｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：３８７〜３９７）、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）β−キシロシダーゼ（Ｚａｎｏｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１７０〜１７６）、Ｔ．リグノラム（T. lignorum）β−キシロシダーゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：６６２〜６７１）、アワモリコウジカビ（A. awamori）β−キシロシダーゼ（Ｋｕｒａｋａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７２６：２７２〜２７９）、Ａ．バーシカラー（A. versicolor）β−キシロシダーゼ（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１９３１〜１９３８）、ストレプトマイセス菌種（Streptomyces sp.）β−キシロシダーゼ（Ｐｉｎｐｈａｎｉｃｈａｋａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７２７〜７３３）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）β−キシロシダーゼ（Ｘｕｅ  ａｎｄ  Ｓｈａｏ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６：１５１１〜１５１５）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）ＳＹ  β−キシロシダーゼ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６４３〜６４５）、Ａ．ニガー（A. niger）β−キシロシダーゼ（Ｏｇｕｎｔｉｍｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｌｌｙ，１９８０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２２：１１４３〜１１５４）、又はＰ．ウォルトマニ（P. wortmanni）β−キシロシダーゼ（Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：２３６７〜２３７９）が挙げられる。好適なβ−キシロシダーゼは、宿主生物により内因的に産生させることができ、あるいは遺伝子組み換えを用い宿主細胞にクローン化及び／又は発現させることができる。更に、セルラーゼ組成物には、好適なβ−キシロシダーゼを精製又は単離形態で加える事ができる。
【０１９０】
Ｆｖ３Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｆｖ３Ａポリペプチドを含む。Ｆｖ３Ａ（配列番号２）のアミノ酸配列を図８Ｂ及び５６に示す。配列番号２は、未成熟なＦｖ３Ａ配列である。Ｆｖ３Ａは、配列番号２の残基１〜２３（下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２の残基２４〜７６６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図８Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、ヘミセルロース由来の分岐アラビノキシランオリゴマー、又は希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基がＤ２９１であったのに対し、フランキング残基Ｓ２９０及びＣ２９２は基質結合に関与するものと予測された。Ｅ１７５及びＥ２１３は他の酵素ＧＨ３及びＧＨ３９間で保存されており、触媒機能を有するものと予測される。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３Ａポリペプチド」は、配列番号２の残基２４〜７６６間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＦｖ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ａと比較したときに、残基Ｄ２９１、Ｓ２９０、Ｃ２９２、Ｅ１７５、及びＥ２１３において変更が存在しない。好ましくは、Ｆｖ３Ａポリペプチドは、図５６のアラインメントに示すとおり、Ｆｖ３Ａ、及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｘｌ１間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ａポリペプチドは、好適には、図８Ｂに示すようなネイティブなＦｖ３Ａの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明の例示的なＦｖ３Ａポリペプチドは、図８Ｂに示すような成熟Ｆｖ３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９１】
したがって、本発明のＦｖ３Ａポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２の残基（ｉ）２４〜７６６、（ｉｉ）７３〜３２１、（ｉｉｉ）７３〜３９４、（ｉｖ）３９５〜６２２、（ｖ）２４〜６２２、又は（ｖｉ）７３〜６２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９２】
Ｆｖ４３Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物はＦｖ４３Ａポリペプチドを含む。Ｆｖ４３Ａ（配列番号１０）のアミノ酸配列を図１２Ｂ及び５７に示す。配列番号１０は、未成熟なＦｖ４３Ａ配列である。Ｆｖ４３Ａは、配列番号１０の残基１〜２２（図１２Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１０の残基２３〜４４９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図１２Ｂ中、予測保存ドメインをボールド体で記載し、予測ＣＢＭを大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭを分離する予測リンカーをイタリック体で記載する。Ｆｖ４３Ａは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、ヘミセルロース由来の分岐アラビノキシランオリゴマー、及び／又は直鎖キシロオリゴマーを用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３４又はＤ６２のいずれか、Ｄ１４８、及びＥ２０９が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１０の残基２３〜４４９間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ａと比較して、残基Ｄ３４又はＤ６２、Ｄ１４８、及びＥ２０９において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、Ｆｖ４３Ａ酵素ファミリー間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、図１２Ｂに示すネイティブなＦｖ４３Ａの予測ＣＢＭの全長、及び／又はネイティブなＦｖ４３Ａの予測保存ドメインの全長、及び／又はＦｖ４３Ａのリンカーを適切に含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ａポリペプチドは、図１２Ｂに示すような成熟Ｆｖ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ４３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９３】
したがって、本発明のＦｖ４３Ａポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、又は配列番号１０の残基（ｉ）２３〜４４９、（ｉｉ）２３〜３０２、（ｉｉｉ）２３〜３２０、（ｉｖ）２３〜４４８、（ｖ）３０３〜４４８、（ｖｉ）３０３〜４４９、（ｖｉｉ）３２１〜４４８、又は（ｖｉｉｉ）３２１〜４４９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９４】
Ｐｆ４３Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｐｆ４３Ａポリペプチドを含む。Ｐｆ４３Ａ（配列番号４）のアミノ酸配列を図９Ｂ及び５７に示す。配列番号４は、未成熟なＰｆ４３Ａ配列である。Ｐｆ４３Ａは、配列番号４の残基１〜２０（図９Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４の残基２１〜４４５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図９Ｂ中、予測保存ドメインをボールド体で記載し、予測ＣＢＭを大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭを分離する予測リンカーをイタリック体で記載する。Ｐｆ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、又は希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３２又はＤ６０のいずれか、Ｄ１４５、及びＥ２０６が挙げられる。図５７において、Ｃ末端中で下線を付して示される領域が予測ＣＢＭである。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号４の残基２１〜４４５間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＰｆ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＰｆ４３Ａと比較したときに残基Ｄ３２又はＤ６０、Ｄ１４５、及びＥ２０６において変更はなされていない。好ましくは、Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、Ｐｆ４３Ａファミリーのタンパク質間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、又は８種全てのアミノ酸配列間で保存されていることが判明しているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、次のドメイン：図９Ｂに示すとおりの（１）予測ＣＢＭ、（２）予測保存ドメイン、及び（３）Ｐｆ４３Ａのリンカーのうちの２種以上又は全てを含む。本発明の例示的なＰｆ４３Ａポリペプチドは、図９Ｂに示すような成熟Ｐｆ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９５】
したがって、本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４の残基（ｉ）２１〜４４５、（ｉｉ）２１〜３０１、（ｉｉｉ）２１〜３２３、（ｉｖ）２１〜４４４、（ｖ）３０２〜４４４、（ｖｉ）３０２〜４４５、（ｖｉｉ）３２４〜４４４、又は（ｖｉｉｉ）３２４〜４４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９６】
Ｆｖ４３Ｄ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドを更に含む。Ｆｖ４３Ｄ（配列番号２８）のアミノ酸配列を図２１Ｂ及び５７に示す。配列番号２８は、未成熟なＦｖ４３Ｄ配列である。Ｆｖ４３Ｄは、配列番号２８の残基１〜２０（図２１Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２８の残基２１〜３５０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図２１Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｄは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３７又はＤ７２のいずれか、Ｄ１５９、及びＥ２５１が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ｄポリペプチド」は、配列番号２８の残基２１〜３５０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、又は３２０個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ｄと比較して、残基Ｄ３７又はＤ７２、Ｄ１５９、及びＥ２５１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｄ酵素ファミリー間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、図２１Ｂに示す、ネイティブなＦｖ４３Ｄの予測ＣＤの全長を適切に含む。代表的なＦｖ４３Ｄポリペプチドは、図２１Ｂに示すＦｖ４３Ｄの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。本発明のＦｖ４３Ｄポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９７】
したがって、本発明のＦｖ４３Ｄポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列、又は配列番号２８の残基（ｉ）２０〜３４１、（ｉｉ）２１〜３５０、（ｉｉｉ）１０７〜３４１、又は（ｉｖ）１０７〜３５０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９８】
Ｆｖ３９Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｆｖ３９Ａポリペプチドを含む。Ｆｖ３９Ａ（配列番号８）のアミノ酸配列を図１１Ｂに示す。配列番号８は、未成熟なＦｖ３９Ａ配列である。Ｆｖ３９Ａは、配列番号８の残基１〜１９（図１１Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号８の残基２０〜４３９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１１Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ３９Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。Ｆｖ３９Ａの残基Ｅ１６８及びＥ２７２は、それぞれ、Ｆｖ３９Ａを有するサーモアナエロバクテリウム・サッカロリエィカム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ３６９０６）及びゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ９ＺＦＭ２）に由来する、上記ＧＨ３９キシロシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ３９Ａポリペプチド」は、配列番号８の残基２０〜４３９間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましいＦｖ３９Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３９Ａと比較したときに、残基Ｅ１６８及びＥ２７２において変更は存在しない。好ましくは、Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、Ｆｖ３９Ａ、並びにサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）及びゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）由来のキシロシダーゼ（上記を参照のこと）のファミリー又は酵素間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、好適には、図１１Ｂに示すようなネイティブなＦｖ３９Ａの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明の例示的なＦｖ３９Ａポリペプチドは、図１１Ｂに示すような成熟Ｆｖ３９Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ３９Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１９９】
したがって、本発明のＦｖ３９Ａポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号８の残基（ｉ）２０〜４３９、（ｉｉ）２０〜２９１、（ｉｉｉ）１４５〜２９１、又は（ｉｖ）１４５〜４３９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０２００】
Ｆｖ４３Ｅ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｆｖ４３Ｅポリペプチドを含む。Ｆｖ４３Ｅ（配列番号６）のアミノ酸配列を図１０Ｂ及び５７に示す。配列番号６は、未成熟なＦｖ４３Ｅ配列である。Ｆｖ４３Ｅは、配列番号６の残基１〜１８（図１０Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６の残基１９〜５３０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１０Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｅは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、又は希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基と、Ｄ４０又はＤ７１のいずれか、Ｄ１５５、及びＥ２４１が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ｅポリペプチド」は、配列番号６の残基１９〜５３０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましいＦｖ４３Ｅポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ｅと比較したときに残基Ｄ４０又はＤ７１、Ｄ１５５、及びＥ２４１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｅ酵素ファミリー間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、又は８種全てのアミノ酸配列間で保存されていることが判明しているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、好適には、図１０Ｂに示すようなネイティブなＦｖ４３Ｅの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ｅポリペプチドは、図１０Ｂに示すような成熟Ｆｖ４３Ｅ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ４３Ｅポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０２０１】
したがって、本発明のＦｖ４３Ｅポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６の残基（ｉ）１９〜５３０、（ｉｉ）２９〜５３０、（ｉｉｉ）１９〜３００、又は（ｉｖ）２９〜３００と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０２０２】
Ｆｖ４３Ｂ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドを含む。Ｆｖ４３Ｂ（配列番号１２）のアミノ酸配列を図１３Ｂ及び５７に示す。配列番号１２は、未成熟なＦｖ４３Ｂ配列である。Ｆｖ４３Ｂは、配列番号１２の残基１〜１６（図１３Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１２の残基１７〜５７４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１３Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｂは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド及びｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる第１酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示された。Ｆｖ４３Ｂは、第２酵素アッセイにおいては、分枝アラビノキシロオリゴマーからのアラビノースの放出を触媒し、かつ他のキシロシダーゼ酵素の存在下では、オリゴマー混合物からキシロースをより多量に放出させるよう触媒することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３８又はＤ６８のいずれか、Ｄ１５１、及びＥ２３６が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ｂポリペプチド」は、配列番号１２の残基１７〜５７４間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ｂと比較して、残基Ｄ３８又はＤ６８、Ｄ１５１、及びＥ２３６において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ酵素ファミリー間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、好適には、図１３Ｂ及び５７に示すようなネイティブなＦｖ４３Ｂの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ｂポリペプチドは、図１３Ｂに示すような成熟Ｆｖ４３Ｂ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。好ましくは、本発明のＦｖ４３Ｂポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又はβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有する。
【０２０３】
したがって、本発明のＦｖ４３Ｂポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列、又は配列番号１２の残基（ｉ）１７〜５７４、（ｉｉ）２７〜５７４、（ｉｉｉ）１７〜３０３、又は（ｉｖ）２７〜３０３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好ましくは、ポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又はβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有する。
【０２０４】
Ｐａ５１Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物はＰａ５１Ａポリペプチドを含む。Ｐａ５１Ａ（配列番号１４）のアミノ酸配列を図１４Ｂ及び５８に示す。配列番号１４は、未成熟なＰａ５１Ａ配列である。Ｐａ５１Ａは、配列番号１４の残基１〜２０（図１４Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１４の残基２１〜６７６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図１４Ｂでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｐａ５１Ａは、例えば、人工基質のｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド及びｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示された。Ｐａ５１Ａは、分枝アラビノキシロオリゴマーからのアラビノースの放出を触媒し、かつ他のキシロシダーゼ酵素の存在下では、オリゴマー混合物からキシロースをより多量に放出させるよう触媒することが示された。保存されている酸性残基としては、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２５７、Ｅ２９６、Ｅ３４０、Ｅ３７０、Ｅ４８５、及びＥ４９３が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐａ５１Ａポリペプチド」は、配列番号１４の残基２１〜６７６間の、少なくとも５０個、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又は６５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐａ５１Ａポリペプチドは、ネイティブなＰａ５１Ａと比較して、残基Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２５７、Ｅ２９６、Ｅ３４０、Ｅ３７０、Ｅ４８５及びＥ４９３において変更はなされていない。好ましくは、Ｐａ５１Ａポリペプチドは、Ｐａ５１Ａ酵素ファミリー間、及び図５８のアラインメント中に示すとおり、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＰｆ５１Ａなどの酵素群間で保存されているアミノ酸残基の、少なくと７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｐａ５１Ａポリペプチドは、図１４Ｂに示すとおりの、ネイティブなＰａ５１Ａの予測保存ドメインを適切に含む。本発明の例示的なＰａ５１Ａポリペプチドは、図１４Ｂに示すような成熟Ｐａ５１Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。好ましくは、本発明のＰａ５１Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又はβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有する。
【０２０５】
したがって、本発明のＰａ５１Ａポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列、又は配列番号１４の残基（ｉ）２１〜６７６、（ｉｉ）２１〜６５２、（ｉｉｉ）４６９〜６５２、又は（ｉｖ）４６９〜６７６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好ましくは、ポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又はβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有する。
【０２０６】
Ｇｚ４３Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物はＧｚ４３Ａポリペプチドを含む。Ｇｚ４３Ａ（配列番号１６）のアミノ酸配列を図１５Ｂ及び５７に示す。配列番号１６は、未成熟なＧｚ４３Ａ配列である。Ｇｚ４３Ａは、配列番号１６の残基１〜１８（図１５Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１６の残基１９〜３４０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１５Ｂ中にボールド体で示す。Ｇｚ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合及び／若しくは直鎖キシロオリゴマーを用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３３又はＤ６８のいずれか、Ｄ１５４、及びＥ２４３が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｇｚ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１６の残基１９〜３４０間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＧｚ４３Ａと比較して、残基Ｄ３３又はＤ６８、Ｄ１５４、及びＥ２４３において変更はなされていない。好ましくは、Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、Ｇｚ４３Ａ酵素ファミリー間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、図１５Ｂに示すとおりの、ネイティブなＧｚ４３Ａの予測保存ドメインを適切に含む。本発明の例示的なＧｚ４３Ａポリペプチドは、図１５Ｂに示すような成熟Ｇｚ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＧｚ４３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【０２０７】
したがって、本発明のＧｚ４３Ａポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列、又は配列番号１６の残基（ｉ）１９〜３４０、（ｉｉ）５３〜３４０、（ｉｉｉ）１９〜３８３、又は（ｉｖ）５３〜３８３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０２０８】
β−キシロシダーゼは、好適には、本発明のセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物中の酵素の総重量の約０重量％〜約７５重量％（例えば、約０．１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約４０重量％、約２重量％〜約３５重量％、約５重量％〜約３０重量％、約１０重量％〜約２５重量％）を構成する。任意に組み合わせたタンパク質の、互いに対する比は、本開示に基づき容易に算出することができる。本明細書で開示される重量％から導かれる任意の重量比で酵素を含む組成物が企図される。β−グルコシダーゼ含量は、下限が、配合物／組成物に含まれる酵素の総重量の約０重量％、０．０５重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％  ７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％であり、かつ上限が、組成物に含まれる酵素の総重量の約１０重量％、１５重量％２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％である範囲であってよい。例えば、好適には、β−キシロシダーゼは、組成物中の酵素の総重量の約２重量％〜約３０重量％；約１０重量％〜約２０重量％；約３重量％〜約１０重量％、又は約５重量％〜約９重量％を占める。
【０２０９】
β−キシロシダーゼは、β−キシロシダーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで産生できる。β−キシロシダーゼは、一定の条件下で、過剰発現又は低発現させることができる。別の方法としては、β−キシロシダーゼは宿主生物にとって異種性のものであってよく、宿主生物により遺伝子組み換え的に発現される。更に、本発明のセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物には、β−キシロシダーゼを精製又は単離形態で加える事ができる。
【０２１０】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、少なくとも１種のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含む。一部の態様では、少なくとも１種のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及びＦｖ５１Ａからなる群から選択される。一部の態様では、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ４３Ａは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼ活性をいずれも有する。
【０２１１】
任意の好適な生物由来のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）を１種以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼとして使用することができる。好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼとしては、例えば、ニホンコウジカビ（A. oryzae）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、ショウユコウジカビ（A. sojae）（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．２００５，５２：２６１〜２６５）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，１４：４７４〜４８２）、Ｂ．ブレビ（B. breve）（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，６９：７１１６〜７１２３）、Ｂ．ロンガム（B. longum）（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，６９：５０９６〜５１０３）、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００６，３９５：３１〜３７）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（Ｐａｎａｇｉｏｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４９：６３９〜６４４）、Ｆ．オキシスポラムｆ．菌種ジアンチ（F. oxysporum f. sp. dianthi）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）Ｔ−６（Ｓｈａｌｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：４３６６７〜４３６７３）、大麦（H. vulgare）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：５３７７〜５３８７）、アオカビ（P. chrysogenum）（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００３，１６２１：２０４〜２１０）、ペニシリウム菌種（Penicillium sp.）（Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４９：５８〜６４）、Ｐセルローサ（P. cellulosa）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｒ．プシラス（R. pusillus）（Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００３，３３８：１４６９〜１４７６）、Ｓ．シャトリューシス（S. chartreusis）、Ｓ．サーモビオラカム（S. thermoviolacus）、Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）、Ｔ／キシラニリティカス（T/xylanilyticus）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｔ．フスカ（T. fusca）（Ｔｕｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，（Ｐｒａｈａ）４８：１６８〜１７２）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ２００５，９：３９９〜４０６）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）ＳＹ（Ｊｕｎｇ  ��ｔ  ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，４８：７〜１０）、カワチコウジカビ（A. kawachii）（Ｋｏｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００６，１７６０：１４５８〜１４６４）、Ｆ．オキシスポラムｆ．菌種ジアンチ（F. oxysporum f. sp. dianthi）（Ｃｈａｃｏｎ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．２００４，６４：２０１〜２０８）、Ｔ．キシラニリティカス（T. xylanilyticus）（Ｄｅｂｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２００２，１５：２１〜２８）、Ｈ．インソレンス（H. insolens）、Ｍ．ギガンテウス（M. giganteus）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００７，２３：１００〜１０７）、又はＲ．サチバス（R. sativus）（Ｋｏｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．２００６，５７：２３５３〜２３６２）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼが挙げられる。好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、宿主生物により内因的に産生させることができ、あるいは遺伝子組み換えを用い宿主細胞にクローン化及び／又は発現させることができる。更に、セルラーゼ組成物には、好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼを精製又は単離形態で加える事ができる。
【０２１２】
Ａｆ４３Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ａｆ４３Ａポリペプチドを含む。Ａｆ４３Ａ（配列番号２０）のアミノ酸配列を図１７Ｂ及び５７に示す。配列番号２０は、未成熟なＡｆ４３Ａ配列である。予測保存ドメインを、図１７Ｂ中にボールド体で示す。Ａｆ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる酵素機能アッセイにおいて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。Ａｆ４３Ａは、エンドキシラナーゼの作用を介してヘミセルロースから放出される一連のオリゴマーからアラビノースを放出させるよう触媒することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ２６又はＤ５８のいずれか、Ｄ１３９、及びＥ２２７が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ａｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号２０の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個のアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体（variant）を指す。好ましくは、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＡｆ４３Ａと比較して、残基Ｄ２６又はＤ５８、Ｄ１３９、及びＥ２２７において変更はなされていない。好ましくは、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、Ａｆ４３Ａの酵素群間、及び図５７のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、図１７Ｂに示すとおりの、ネイティブなＡｆ４３Ａの予測保存ドメインを適切に含む。代表的なＡｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号２０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、本発明のＡｆ４３Ａポリペプチドは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０２１３】
したがって、本発明のＡｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列、又は配列番号２０の残基（ｉ）１５〜５５８、又は（ｉｉ）１５〜２９５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適には、ポリペプチドは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０２１４】
Ｐｆ５１Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物はＰｆ５１Ａポリペプチドを含む。Ｐｆ５１Ａ（配列番号２２）のアミノ酸配列を図１８Ｂ及び５８に示す。配列番号２２は、未成熟なＰｆ５１Ａ配列である。Ｐｆ５１Ａは、配列番号２２の残基１〜２０（図１８Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２２の残基２１〜６４２に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図１８Ｂでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｐｆ５１Ａは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる酵素機能アッセイにおいて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。Ｐｆ５１Ａは、エンドキシラナーゼの作用を介してヘミセルロースから放出される一連のオリゴマーからアラビノースを放出させるよう触媒することが示された。予測される、保存されている酸性残基としては、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２４８、Ｅ２８７、Ｅ３３１、Ｅ３６０、Ｅ４７２、及びＥ４８０が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐｆ５１Ａポリペプチド」は、配列番号２２の残基２１〜６４２間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、ネイティブなＰｆ５１Ａと比較して、残基Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２４８、Ｅ２８７、Ｅ３３１、Ｅ３６０、Ｅ４７２、及びＥ４８０において変更はなされていない。好ましくは、Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、図５８のアラインメントに示すとおり、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及びＦｖ５１Ａ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、図１８Ｂに示すとおりの、ネイティブなＰｆ５１Ａの予測保存ドメインを適切に含む。代表的なＰｆ５１Ａポリペプチドは、図１８Ｂに示すＰｆ５１Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。好ましくは、本発明のＰｆ５１Ａポリペプチドは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０２１５】
したがって、本発明のＰｆ５１Ａポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列、又は配列番号２２の残基（ｉ）２１〜６３２、（ｉｉ）４６１〜６３２、（ｉｉｉ）２１〜６４２、又は（ｉｖ）４６１〜６４２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適には、ポリペプチドは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０２１６】
Ｆｖ５１Ａ：一部の態様では、本発明のセルラーゼ組成物は、Ｆｖ５１Ａポリペプチドを含む。Ｆｖ５１Ａ（配列番号３２）のアミノ酸配列を図２３Ｂ及び５８に示す。配列番号３２は、未成熟なＦｖ５１Ａ配列である。Ｆｖ５１Ａは、配列番号３２の残基１〜１９（図２３Ｂ中下線部）に相当する予測シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号３２の残基２０〜６６０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図２３Ｂでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｆｖ５１Ａは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる酵素機能アッセイにおいて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。Ｆｖ５１Ａは、エンドキシラナーゼの作用を介してヘミセルロースから放出される一連のオリゴマーからアラビノースを放出させるよう触媒することが示された。保存残基としては、Ｅ４２、Ｄ４９、Ｅ２４７、Ｅ２８６、Ｅ３３０、Ｅ３５９、Ｅ４７９、及びＥ４８７が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ５１Ａポリペプチド」は、配列番号３２の残基２０〜６６０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又は６２５個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ５１Ａと比較して、残基Ｅ４２、Ｄ４９、Ｅ２４７、Ｅ２８６、Ｅ３３０、Ｅ３５９、Ｅ４７９、及びＥ４８７において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、図５８のアラインメントに示すとおり、Ｆｖ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及びＰｆ５１Ａ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、図２３Ｂに示すとおりの、ネイティブなＦｖ５１Ａの予測保存ドメインを適切に含む。代表的なＦｖ５１Ａポリペプチドは、図２３Ｂに示すＦｖ５１Ａの成熟配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する。好ましくは、本発明のＦｖ５１Ａポリペプチドは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０２１７】
したがって、本発明のＦｖ５１Ａポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列、又は配列番号３２の残基（ｉ）２１〜６６０、（ｉｉ）２１〜６４５、（ｉｉｉ）４５０〜６４５、又は（ｉｖ）４５０〜６６０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を適宜含む。好適には、ポリペプチドは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【０２１８】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、本開示のセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物の酵素の総重量の約０．０５％重量％〜約３０重量％（例えば、約０．１重量％〜約２５重量％、約０．５重量％〜約２０重量％、約１重量％〜約１０重量％）を適宜構成する。ここで、重量％は、所定の組成物中の全ての酵素の合計重量に対する、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの合計重量を意味する。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、０．０５重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、又は２８重量％を下限とし、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、又は３０重量％を上限とする範囲で存在させることができる。例えば、１つ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、本発明のセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物中の酵素の総重量の約２重量％〜約３０重量％（例えば、約２重量％〜約３０重量％、約５重量％〜約３０重量％、約５重量％〜約１０重量％、約１０重量％〜約３０重量％、約２０重量％〜約３０重量％、約２５重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約１０重量％、約５重量％〜約１５重量％、約１０重量％〜約２５重量％、約２０重量％〜約３０重量％など）を適宜構成する。
【０２１９】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで産生できる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、一定の条件下で過剰発現又は低発現させることができる。別の方法としては、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは宿主生物にとって異種性のものであってよく、宿主生物により遺伝子組み換え的に発現される。更に、本発明のセルラーゼ又はヘミセルラーゼ組成物には、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼを精製又は単離形態で加える事ができる。
【０２２０】
細胞組成物
一部の態様では、本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞も企図する。一部の態様では、細胞はＴ．リーゼイ（T. reesei）細胞である。一部の態様では、細胞はＡ．ニガー（A. niger）細胞である。一部の態様では、細胞としては、任意の微生物（例えば、バクテリア細胞、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）、又はその他の微生物）が挙げられ、好ましくは宿主細胞はバクテリア細胞、酵母細胞、又は糸状菌細胞である。微生物属の好適な宿主細胞としては、限定するものではないが、エシェリキア（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（LactoBacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、及びストレプトマイセス（Streptomyces）の細胞が挙げられる。好適なバクテリア種細胞としては、限定するものではないが、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）が挙げられる。酵母属の好適な宿主細胞としては、限定するものではないが、サッカロマイセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、ピキア（Pichia）、クリヴェロミセス（Kluyveromyces）、及びファフィナ（Phaffia）細胞が挙げられる。好適な酵母種細胞としては、限定するものではないがサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキアパストリス（Pichia pastoris）、Ｐ．カナデンシス（P. canadensis）、クリヴェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）及びファフィア・ロードザイマ（Phaffia rhodozyma）細胞が挙げられる。好適な糸状菌宿主細胞としては、エウミコチニア（Eumycotina）亜門の全ての糸状菌が挙げられる。好適な糸状菌属の細胞としては、限定するものではないが、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシディウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスカス（Corynascus）、ケトミウム（Chaertomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ヒュミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ムコール（Mucor）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリカム（Sporotrichum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、及びトリコデルマ（Trichoderma）細胞が挙げられる。好適な糸状菌細胞としては、限定するものではないが、アワ��リコウジカビ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、こうじ菌（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイドス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トルコテキオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジャカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオシス・カレジエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオシス・ギルベッセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオシス・パンノキンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオシス・サブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・キネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ハースタス（Coriolus hirsutus）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネッセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソルタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、白色腐朽菌（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラブス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa）、カワラタケ（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、及びトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞が挙げられる。一部の態様では、細胞はＴ．リーゼイ（T. reesei）細胞である。一部の態様では、細胞はＡ．ニガー（A. niger）細胞である。一部の態様では、細胞は更に、１種以上のヘミセル���ーゼをコードしている１つ以上の核酸を含む。一部の態様では、細胞は、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼのキメラ体であるβ−グルコシダーゼ酵素を含む、非天然に得られるセルラーゼ組成物を含む。
【０２２１】
一部の態様では、本発明は、配列番号６０、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列に対し、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０重量％、７５％、８０重量％、８５％、９０％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％）配列同一性を有するポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を企図する。一部の態様では、細胞は更に、例えば、β−キシロシダーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、又はキシラナーゼ活性などの、ヘミセルラーゼ活性を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードしている核酸を含む。一部の態様では、本発明は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体を含む細胞も企図する。第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、連続して伸びる相当する長さの配列番号６０の配列と約６０％（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％）以上の配列同一性を有し、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９から選択される、連続して伸びる相当する長さのアミノ酸配列と約６０％（例えば、約６５％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％）以上の配列同一性を有する。特定の態様では、本発明は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含む細胞を企図する。第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９から選択される、連続して伸びる相当する長さのアミノ酸配列と約６０％（例えば、約６５％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％）以上の配列同一性を有し、配列番号１６４〜１６９のポリペプチド配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、連続して伸びる相当する長さの配列番号６０と約６０％（例えば、約６５％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％）以上の配列同一性を有する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列、第２のβ−グルコシダーゼ配列、又は第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列の両方は、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ領域又はループ様の構造をコードしている配列を含み、ループ領域又はループ様の構造をコードしている配列は、アミノ酸残基、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接し、又は連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接せず、むしろリンカードメイン��介して連結される。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する（すなわち、キメラ分子のＮ末端付近又はＣ末端付近には位置しない）。
【０２２２】
特定の態様では、本発明は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含む細胞を企図する。第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり（例えば、アミノ酸残基約２５０、３００、３５０又は４００個分の長さ）であり、配列番号１３６〜１４８のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、その一方で第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり（例えば、アミノ酸残基約１２０、１５０、１７０、２００、又は２２０個分の長さ）、配列番号１４９〜１５６のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸５０残基分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列、第２のβ−グルコシダーゼ配列、又は第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列の両方は、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ領域又はループ様の構造をコードしている配列を含み、ループ領域又はループ様の構造をコードしている配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接し、又は連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接せず、むしろリンカードメインを介して連結される。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する（すなわち、キメラ分子のＮ末端付近又はＣ末端付近には位置しない）。
【０２２３】
発酵ブロス組成物
一部の態様では、本発明は、１種以上のセルラーゼ活性を含む発酵ブロスを企図する。ブロスは、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約５０重量％超を、発酵性糖質へと変換することができる。一部の態様では、発酵ブロスは、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約５５重量％超（例えば、約６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％超）を発酵性糖質へと変換することができる。一部の態様では、発酵ブロスは更に、１種以上のヘミセルラーゼ活性を有し得る。特定の態様では、本発明は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９の配列のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％  ９２％、８３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）配列同一性を有する少なくとも１種のβ−グルコシダーゼポリペプチドを含む、発酵ブロスを企図する。特定の態様では、本発明は、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼを含む発酵ブロスを企図し、このβ−グルコシダーゼは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体である。
【０２２４】
一部の態様では、本発明は、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ活性を含む発酵ブロスを企図する。発酵ブロスは、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約５０重量％超（例えば、約５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％）を発酵性糖質へと変換することができる。特定の実施形態では、発酵ブロスは、Ｆｖ３Ｃセルラーゼ活性、Ｐａ３Ｄセルラーゼ活性、Ｆｖ３Ｇ活性、Ｆｖ３Ｄ活性、Ｔｒ３Ａ活性、Ｔｒ３Ｂ活性、Ｔｅ３Ａ活性、Ａｎ３Ａ活性、Ｆｏ３Ａ活性、Ｇｚ３Ａ活性、Ｎｈ３Ａ活性、Ｖｄ３Ａ活性、Ｐａ３Ｇ活性、及び／又はＴｎ３Ｂ活性を含み、ブロスは、バイオマスサンプル中に存在するセルロースの約５０重量％超（例えば、約５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は更には８０重量％超）を糖へと変換することができる。
【０２２５】
一部の態様では、本発明は、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含む発酵ブロスも企図する。第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さの配列番号６０の配列と約６０％（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％）以上の配列同一性を有し、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９から選択される、相当する長さの配列と約６０％（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％）以上の配列同一性を有する。一部の態様では、本発明は、２つのβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含む発酵ブロスも企図する。第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、連続して伸びる相当する長さの配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９の配列と約６０％（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％）以上の配列同一性を有し、かつ第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％）以上の配列同一性を有する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列、第２のβ−グルコシダーゼ配列、又は第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列の両方は、１つ以上のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ領域又はループ様の構造をコードしている配列を含み、ループ領域又はループ様の構造をコードしている配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接し、又は連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接せず、むしろリンカードメインを介して連結される。特定の実施形態では、リンカードメインは、ループ領域を含み、ループ領域は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に局在する（すなわち、キメラ分子のＮ末端又はＣ末端には局在しない）。
【０２２６】
本発明の方法
一部の態様では、本明細書では、安定性を向上させるために、キメラ酵素の骨格（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどのセルラーゼ、並びにキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、β−キシロシダーゼなどのヘミセルラーゼ）を生成する方法が提供される。一部の態様では、安定性の向上とは、酵素が、酵素にとって適した条件下で、又は酵素が典型的に使用される一定の標準条件下で切断を受けにくくなるという点で、酵素のタンパク質分解耐性が向上することを意味する。一部の態様では、タンパク質分解耐性は、貯蔵時の安定性に関するものであるのに対し、他の態様では、タンパク質分解耐性は、発現及び産生時の安定性に関するものであり、これにより酵素がより効果的に産生される。よって、安定性の向上は、キメラ酵素のもととなる未改変の酵素（すなわち、その配列が、又はその変異体（variant）の配列がキメラ酵素の一部を構成する酵素）と比較して、標準的な貯蔵条件下、あるいは標準的な発現又は産生条件下での分解の程度を軽減する。一部の態様では、安定性の向上は、貯蔵安定性の向上、並びに発現及び産生時のタンパク質分解耐性の向上の両方において反映される。安定性の向上により、貯蔵時並びに発現及び産生時の標準条件下での切断の程度が軽減される。
【０２２７】
一部の態様では、本明細書では、バイオマスを糖へと変換する方法が提供され、方法には、バイオマスを発酵性糖質へと変換させるのに有効な、任意の量の本開示の組成物と、バイオマスとを接触させる工程が包含される。一部の態様では、本明細書では、バイオマスをポリペプチドで処理する工程を含む、糖化工程が提供され、ポリペプチドはセルラーゼ活性を有し、工程により、少なくとも約５０重量％（例えば、少なくとも約５５重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約６５重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約７５重量％、又は少なくとも約８０重量％）のバイオマスが発酵性糖質に変換される。一部の態様では、本明細書では、本明細書に記載の任意の組成物を販売する方法が提供され、組成物は、エタノール精製所又は他のバイオケミカル若しくはバイオマテリアル製造所に供給され、場合により、組成物は、エタノール精製所又はその他のバイオケミカル若しくはバイオマテリアル製造所の周辺に位置する製造施設で製造される。
【０２２８】
キメラ骨格の生成方法
一部の態様では、本発明は、特定のβ−グルコシダーゼポリペプチドの安定性を向上させることに関する。特定の態様では、安定性の向上は、タンパク質分解耐性の向上を意味し、例えば、β−グルコシダーゼポリペプチドが典型的に使用される標準条件下での、β−グルコシダーゼポリペプチドの分解又は切断の程度の減少という点で反映される。一部の態様では、タンパク質分解耐性の向上は、貯蔵、発現及び／又は産生時の安定性の向上を意味する。タンパク質分解耐性の向上は、β−グルコシダーゼポリペプチドが典型的に使用され又は適用される標準的な貯蔵、発現及び／又は産生条件下で、β−グルコシダーゼポリペプチドが切断される程度の減少という点で反映される（例えば、活性が損失する程度又は度合いの減少という点で反映される）。
【０２２９】
その他の異種発現タンパク質と同様、ある種のβ−グルコシダーゼは、異種（exogenase）プロテアーゼの産生及び貯蔵時に、宿主バクテリア又は真菌細胞により発現されるプロテアーゼにより、あるいは産生及び貯蔵工程で他の外的な要因により、切断を受ける傾向がある。慣習的に、このような分解は、タンパク質の一次アミノ酸配列において、切断を受ける既知の共通配列又は切断部位を同定し、これらのアミノ酸に変異を導入し、タンパク質がもはやこの部位で切断されないようにすることで、減少させることができる。この手法は、ポリペプチドが１種以上のプロテアーゼによる切断を受ける可能性がある場合、あるいは切断が酵素により引き起こされるものではない場合には不都合なものである。同様に、複数の部位で切断が生じ、切断に優先順位がある場合にもこの手法は十分なものではない。例えば、元のタンパク質、例えば、対象とするβ−グルコシダーゼポリペプチドが、タンパク質切断機序により、最初に特定の部位で切断を受ける可能性がある場合、一度最初の切断部位が同定され、改変され又は変異導入されれば、もはや同様のタンパク質切断機序による影響を受けることはない。しかしながらこの酵素は、次に、同様の又は幾分異なるタンパク質切断機序により、最初の切断部位とは異なる部位が切断されることが判明している。勿論、２番めの部位も同定し、改変し、又は変異導入して、もはやタンパク質切断を受けることのないようにすることもできるが、それでも引き続き酵素の更に別の部位が上記の通り同様の又は異なる機序により切断を受ける可能性がある。
【０２３０】
出願者らは、ポリペプチドの異種発現時の切断部位は、進化的に関係のある酵素の二次構造の比較に基づき同定できることを発見した。異種発現、産生、及び／又は貯蔵時に切断を受けない関連する酵素のアミノ酸配列及び予測二次構造を比較することにより、タンパク質の二次構造において存在するループ配列を同定することができる。しかしながら、ループ配列が、切断が生じる場所である可能性もあれば、そうでない可能性もある。一部の実施形態では、ループ配列の上流又は下流で実際に切断が発生する。本発明は、従来的な手法により個々のアミノ酸に変異を導入するというよりも、及び／又は個々のアミノ酸残基若しくは切断部位付近の残基に変異を導入するというよりも、ループドメインを改変して、例えば、ループドメインを置き換えて、あるいはループドメインの長さ及び／又は配列を改変して、発現、産生、及び／又は貯蔵時の安定性が優れているポリペプチドを得るというものである。特定の実施形態では、改変としては、例えば、ループドメインの、除去、延長、短縮、又は進化的に関係する酵素に同定されている切断を受けにくいドメインとの交換が挙げられる。更に、複数の異種発現ポリペプチドにこの方法を用い、次に、切断される傾向のある二次構造を除去するという変更を加えていないキメラポリペプチドと比較して全般的に優れたタンパク質分解耐性を保有している単一のキメラ骨格に対し融合させることもできる。特定のアミノ酸配列モチーフ、例えば、図６８Ａに掲載するモチーフは、完全な活性を有し、高性能であるβ−グルコシダーゼハイブリッド／キメラ／融合分子の構築に重要なものである可能性があることを突き止めた。
【０２３１】
出願者らは、更に、切り抜きを受けやすい、及び切り抜きに耐性のある、既知の特定のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼの３次元構造を、例えば、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．（２０１０）Ｄ６６，４８６〜５０１に記載される通りのモデリング法「Ｃｏｏｔ」などの、一般的な三次元酵素構造解析ツールを用い比較した。例えば、Ｆｖ３Ｃ及びＴｅ３Ａはいずれも、数多くのセルロース基質に対し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１よりも優れたβ−グルコシダーゼ活性及び性能を有することが判明した。Ｆｖ３Ｃが、標準的な貯蔵又は産生条件下でタンパク質切断を受け、活性が低下すること、あるいは市販の又は工業用組成物の成分として含有させるのに望ましくなくなることも判明した。Ｃｏｏｔなどのモデリング法を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較した場合にＴｅ３Ａ、Ｆｖ３Ｃが共有する特徴を調査したところ、図７０Ｅに示すとおり、四箇所に挿入が発見された。これらの挿入から、保存されている相互作用を識別する際に残基及びアミノ酸モチーフが更に発見された（例えば、図７０Ｆ〜Ｊに示すとおり、Ｆｖ３Ｃ及びＴｅ３Ａには存在するが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１には存在しない水素結合を行うグリコシル部位）。したがって、所定の、天然に得られるβ−グルコシダーゼ、若しくはこれらの変異体、又はこれらのハイブリッド／キメラ／融合分子の、性能／活性並びに安定性が向上されるのか決定するにあたって、図６８Ｂに掲載するものなどの、特定のアミノ酸配列モチーフが重要な役割を果たすことが判明した。
【０２３２】
理論に束縛されるものではないが、タンパク質の安定性が向上することで、酵素活性が低下する場合がある。酵素活性の低下は、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、及び更により好ましくは１０％未満である。したがって、本明細書では、酵素中の、例えば、セルラーゼ又はヘミセルラーゼ中のループ配列を改変することにより、これらの酵素の安定性を向上させる方法が提供される。特定の実施形態では、ループ配列は、切断を受けやすい。他の実施形態では、ループ配列は切断を受けやすいものではないものの、ループ配列を改変させることで、酵素中のループ配列の上流部又は下流部の切断に作用し得る。
【０２３３】
特定の実施形態では、ループ配列は、各々が異なるβ−グルコシダーゼに由来する２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む、ハイブリッド若しくはキメラ酵素、例えば、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼ中に存在する。例えば、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼは、２つのβ−グルコシダーゼ配列を含んでよく、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基２００個分の長さであり、相当する長さの配列番号６０の配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼは、少なくともアミノ酸残基５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する。他の例では、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼは、２つのβ−グルコシダーゼ配列を含んでよく、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼは、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する。一部の実施形態では少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さの第１のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド酵素のＮ末端に存在するのに対し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さの第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド酵素のＣ末端に存在する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端又はＣ末端は、ループ配列を含む。一部の実施形態では、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端及びＣ末端は、直接隣接しており、又は互いに直接連結している他の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端及びＣ末端は互いに直接隣接しておらず、むしろリンカー配列を介して連結されている。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する。一部の実施形態では、リンカードメインはループ配列を含む。特定の実施形態では、例えば、ループ配列の延長、短縮、変異、欠失（全体又は一部の欠失）、又は交換などによ���ループ配列が改変されると、得られるハイブリッド若しくはキメラ酵素はタンパク質分解による切断を受けにくくなる。結果として、得られるポリペプチド又はキメラポリペプチドは、ネイティブなポリペプチド（例えば、キメラポリペプチドの場合、ネイティブなポリペプチドとは、各キメラ部位の由来したネイティブな酵素について指す）と比較して、安定性が望ましく向上する。安定性の向上は、一般的な貯蔵、発現、産生、又は使用条件下での分解の減少又は低減に反映される。
【０２３４】
異種発現させたポリペプチド及びキメラポリペプチドの安定性の向上は、貯蔵、発現又はその他の産生過程、並びにかかるポリペプチドが使用される過程でのタンパク質分解耐性の向上について試験することにより判断することができる。
【０２３５】
特定の実施形態では、ループ配列は、各々が異なるβ−グルコシダーゼに由来する２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む、ハイブリッド若しくはキメラ酵素、例えば、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼ中に存在する。例えば、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼには、２つのβ−グルコシダーゼ配列を含ませてよく、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基２００個分の長さであり、かつ配列番号１３６〜１４８のアミノ酸配列うちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼは、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１４９〜１５６のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。一部の実施形態では少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さの第１のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド酵素のＮ末端に存在するのに対し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さの第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド酵素のＣ末端に存在する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端又はＣ末端は、ループ配列を含む。一部の実施形態では、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端及びＣ末端は、直接隣接しており、又は互いに直接連結している他の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端及びＣ末端は互いに直接隣接しておらず、むしろリンカー配列を介して連結されている。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する。一部の実施形態では、リンカードメインはループ配列を含む。特定の実施形態では、例えば、ループ配列の延長、短縮、変異、欠失（全体又は一部の欠失）、又は交換などによりループ配列が改変されると、得られるハイブリッド若しくはキメラ酵素はタンパク質分解による切断を受けにくくなる。結果として、得られるポリペプチド又はキメラポリペプチドは、ネイティブなポリペプチド（例えば、キメラポリペプチドの場合、ネイティブなポリペプチドとは、各キメラ部位の由来したネイティブな酵素について指す）と比較して、安定性が望ましく向上する。安定性の向上は、一般的な貯蔵、発現、産生、又は使用条件下での分解の減少又は低減に反映される。
【０２３６】
一部の態様では、２つ以上の酵素配列を含み、少なくとも１つの配列がβ−グルコシダーゼ配列のものである一方で、他方の配列は他の酵素の配列ではなくかつβ−グルコシダーゼの配列ではない、ハイブリッド若しくはキメラ酵素中、例えば、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼ中にループ配列が存在する。例えば、キメラ酵素の少なくとも１つのキメラ部が由来する、非β−グルコシダーゼ配列は、その他のヘミセルラーゼ又はセルラーゼ、例えば、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、キシロシダーゼ、及びアラビノフラノシダーゼなどから選択することができる。キメラポリペプチドのＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインは、互いに直接隣接させることができる。あるいは、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインは互いに隣接又は連結しておらず、むしろリンカー配列を介して連結される。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ配列のＮ末端又はＣ末端は、ループ配列を含む。一部の実施形態では、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。特定の実施形態では、リンカードメインは中央領域に位置する。一部の実施形態では、リンカードメインはループ配列を含む。特定の実施形態では、例えば、ループ配列の延長、短縮、変異、欠失（全体又は一部の欠失）、又は交換などによりループ配列が改変されると、得られるハイブリッド若しくはキメラ酵素はタンパク質分解による切断を受けにくくなる。結果として、得られるポリペプチド又はキメラポリペプチドは、ネイティブなポリペプチド（例えば、キメラポリペプチドの場合、ネイティブなポリペプチドとは、各キメラ部位の由来したネイティブな酵素について指す）と比較して、安定性が望ましく向上する。安定性の向上は、一般的な貯蔵、発現、産生、又は使用条件下での分解の減少又は低減に反映される。特定の実施形態では、キメラ又はハイブリッドポリペプチドには、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ活性を２重に保有させることができる。例えば、本発明のキメラ又はハイブリッドポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性及びキシラナーゼ活性を両方有し得る。一部の実施形態では、キメラ又はハイブリッドポリペプチドは、キメラ部位のネイティブなポリペプチドと比較して、安定性を向上させることができる。例えば、改変ループ配列を含んでいるキメラβ−グルコシダーゼ−キシラナーゼポリペプチドは安定性を向上させることができ、例えば、キメラポリペプチドのβ−グルコシダーゼ配列及びキシラナーゼ配列が由来するβ−グルコシダーゼ及びキシラナーゼと比較して、標準的な貯蔵、発現、産生、又は使用条件下でのタンパク質分解耐性を向上させることができる。
【０２３７】
一部の態様では、本発明は、セルラーゼ又はヘミセルラーゼ酵素の安定性を向上させる方法に関し、安定性は、標準的な貯蔵、発現、産生、又は使用条件下で、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、又は更には３０％以上向上している。安定性の向上は、特定の標準貯蔵、発現、産生、又は使用条件下にて、特定の時間経過後に切断される酵素の量を決定することにより測定できる。例えば、安定性の向上は、標準的な貯蔵条件下、例えば、使用時温度、又は約４０℃、４５℃、５０℃、若しくは更なる高温下での、例えば、約１（例えば、約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２４）時間以上経過後の切断産物量を基に、測定することができる。特定の実施形態では、安定性の向上は、例えば、標準的な産生条件下で、例えば、５０℃以上（例えば、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、又は更には６５℃以上）の温度にて、例えば約１（例えば、約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２４）時間以上経過後に残存しているインタクトな産物の量を検出及び決定することで測定できる。
【０２３８】
バイオマスを糖へと変換する方法
一部の態様では、本明細書では、バイオマスを糖へと変換する方法が提供され、方法には、バイオマスを発酵性糖質へと変換させるのに有効な、任意の量の本開示の組成物と、バイオマスとを接触させる工程が包含される。一部の態様では、方法は更に、バイオマスを酸及び／又は塩基により前処理する工程を含む。一部の態様では、酸はリン酸を含む。一部の態様では、塩基は水酸化ナトリウム又はアンモニアを含む。
【０２３９】
バイオマス：本開示は、本開示のセルラーゼ又は非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物を用い、バイオマスを糖化する方法及び工程を提供する。本明細書で使用するとき、用語「バイオマス」は、セルロース及び／又はヘミセルロースを含む（場合により、リグノセルロース系バイオマス材料中のリグニンも含む）任意の組成物を指す。本明細書で使用するとき、バイオマスとしては、限定するものではないが、種子、穀類、塊茎、植物性廃棄物、すなわち食品加工又は工業加工に関係する副産物（例えば、茎など）、トウモロコシ（例えば、穂軸、及びまぐさなど）、草本類（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアン・グラス、又は例えば、キビ（Panicum）種などパニクム・バーガタム（Panicum virgatum）といったスイッチグラス）、多年生植物のケーン類（例えば、暖竹）、木材（例えば、木片、加工廃棄物など）、紙、パルプ、及び再生紙（例えば、新聞紙、及び印刷紙など）が挙げられる。他のバイオマス材料としては、限定するものではないが、ジャガイモ、マメ科植物（例えば、菜種）、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビーツ、及びサトウキビバガスが挙げられる。
【０２４０】
本開示は、バイオマス材料、例えば、キシラン、ヘミセルロース、セルロース、及び／又は発酵性糖質を含む材料を、本開示のポリペプチド、又は本開示の核酸によりコードされるポリペプチド、又はセルラーゼ若しくは非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物のうちのいずれか１つ又は本開示の製造産物を含む組成物と接触させる工程を含む、糖化方法を提供する。
【０２４１】
糖化させたバイオマス（例えば、本開示の酵素により加工したリグノセルロース系材料）に、例えば、微生物による発酵及び／又は化学合成などの加工を行うことで、数多くのバイオ系製品を製造することができる。本明細書で使用するとき、「微生物による発酵」は、好適な条件下で発酵微生物を増殖及び回収するプロセスを指す。発酵微生物は、バイオ系産物を産生するための所望の発酵プロセスで使用するのに好適な任意の微生物であり得る。好適な発酵微生物としては、限定するものではないが、糸状菌、酵母、及びバクテリアが挙げられる。糖化させたバイオマスを、発酵及び／又は化学合成により燃料（例えば、バイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料、又は同様物などのバイオ燃料）にすることができる。糖化させたバイオマスを、発酵により及び／又は化学合成により、汎用化学物質（例えば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、タンパク質及び酵素にすることができる。
【０２４２】
前処理：糖化前に、好ましくは、バイオマス（例えば、リグノセルロース系材料）には、キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び／又はリグニン材料を、酵素がより接近しやすく又は作用しやすい状態にするために、ひいては、本開示の酵素及び／又はセルラーゼ又は非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物により加水分解されやすい状態にするために、１つ以上の前処理工程を行う。
【０２４３】
例示的な実施形態では、前処理は、反応器内で、バイオマス材料を、強酸及び金属塩の希釈溶液からなる触媒に曝露することを伴う。バイオマス材料は、例えば、原材料又は乾燥させた材料であってよい。この前処理により、セルロースの加水分解にまつわる活性化エネルギー、又は温度を低くすることができ、最終的にはより多量の発酵性糖質を生成できるようになる。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照されたい。
【０２４４】
他の例示的な前処理法は、大部分のセルロースをグルコースへと脱重合させずに、ヘミセルロースの一次脱重合を実施するために選択される温度及び圧力レベルにて、バイオマス材料に対し、水性媒質中での第１の加水分解工程を実施することで、バイオマスを加水分解する工程を伴う。この工程により、スラリーには、ヘミセルロースの脱重合から得られる単糖が溶解している液体水相並びにセルロース及びリグニンを含有する固相が生じる。次に、セルロースの大部分を脱重合させすることのできる条件下で、スラリーに第２の加水分解工程を行い、セルロースが溶解している／セルロースの可溶性脱重合産物を含有している液体水相を生成する。例えば、米国特許第５，５３６，３２５号を参照のこと。
【０２４５】
他の例示的な方法は、約０．４％〜２％の強酸を用い、希酸による１段階以上の加水分解を行うことでバイオマス材料を加工する工程、並びに酸加水分解させた固形リグノセルロース形成分の未反応材料に、アルカリ系脱リグニン化処理を行う工程、を包含する。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照のこと。
【０２４６】
他の例示的な前処理方法は、前加水分解反応容器中で、バイオマス（例えば、リグノセルロース系材料）を予め加水分解する工程、酸性の液体をリグノセルロース系固形材料に添加して、混合物を作製する工程、混合物を反応温度に加熱する工程、リグノセルロース系材料を、リグノセルロース系材料由来のリグニンを少なくとも約２０％含有している可溶性画分及びセルロースを含有している固体画分へと分画するのに十分な時間にわたり、反応温度を維持する工程、固体画分から可溶性画分を分離させ、可溶性画分を反応温度にて、又は反応温度付近にて取り出す工程、並びに、可溶性タンパク質を回収する工程、を含む。固体画分中のセルロースを、酵素による消化を受けやすい状態にする。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照のこと。
【０２４７】
その他の前処理方法は、過酸化水素Ｈ２Ｏ２の使用を伴うものである。Ｇｏｕｌｄ，１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｒ．２６：４６〜５２を参照されたい。
【０２４８】
前処理は、バイオマス材料を、非常に低濃度の化学量論の水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムと接触させる工程も含む。Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７〜７９：１９〜３４を参照されたい。
【０２４９】
前処理には、リグノセルロースを、温和な温度、圧力及びｐＨで、例えばｐＨ約９〜約１４の化学物質（例えば、炭酸ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基）と接触させる工程を含有させることもできる。国際公開第２００４／０８１１８５号を参照されたい。
【０２５０】
例えば、好ましい前処理方法ではアンモニアを使用する。例えば、前処理方法は、固形分濃度の高い条件下で、低濃度のアンモニアにバイオマスを晒すことを含む。例えば、米国特許第２００７００３１９１８号、及び国際公開第０６１１０９０１号を参照されたい。
【０２５１】
糖化工程
一部の態様では、本明細書では、バイオマスをポリペプチドで処理する工程を含む、糖化工程が提供され、ポリペプチドはセルラーゼ活性を有し、工程により、少なくとも約５０重量％（例えば、少なくとも約５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％）のバイオマスが発酵性糖質に変換される。一部の態様では、バイオマスはリグニンを含む。一部の態様では、バイオマスはセルロースを含む。一部の態様では、バイオマスはヘミセルロースを含む。一部の態様では、セルロースを含むバイオマスは、更に１種以上のキシラン、ガラクタン、又はアラビナンを含む。一部の態様では、バイオマスは、限定するものではないが、種子、穀類、塊茎、植物性廃棄物又は食品加工若しくは工業加工に関係する副産物（例えば、茎）、トウモロコシ（例えば、穂軸、及び葉茎など）、草類（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアン・グラス）；又は例えば、パニクム・バーガタム（Panicum virgatum）などのパニクム（Panicum）種などのスイッチグラス）、多年生の竹（perennial canes）（例えば、暖竹（giant reeds））、木材（例えば、木片、加工廃棄物）、紙、パルプ、及び再生紙（例えば、新聞紙、及びプリンター用紙など）、ポテト、豆類（例えば、ナタネ）、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビーツ、及びシュガーケーンバガスからなる。一部の態様では、バイオマスを含む材料は、ポリペプチドによる処理前に、酸及び／又は塩基により処理する。一部の態様では、酸はリン酸である。一部の態様では、塩基は、アンモニア又は水酸化ナトリウムである。一部の態様では、糖化工程は、バイオマスをセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼにより処理する工程を更に含む。一部の態様では、バイオマスは全セルラーゼにより処理する。一部の態様では、糖化工程により、少なくとも約５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％のバイオマスが糖に変換される。一部の態様では、セルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物はポリペプチドを含み、このポリペプチドは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ体である、ハイブリッド若しくはキメラβ−グルコシダーゼ酵素である。
【０２５２】
一部の態様では、ポリペプチドを含む組成物によりバイオマスを処理する工程を含む、糖化プロセスを提供し、ポリペプチドは、配列番号６０、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列に対し、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）配列同一性を有し、かつプロセスにより、バイオマスの少なくとも約５０重量％（例えば、少なくとも約５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％）が発酵性糖質へと変換される。一部の態様では、ポリペプチドによりバイオマスを処理する工程を含む、糖化プロセスを提供し、ポリペプチドは、配列番号６０、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列に対し、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）配列同一性を有し、かつプロセスにより、バイオマスの少なくとも約６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％が発酵性糖質へと変換される。一部の態様では、バイオマスを含む材料を、配列番号６０、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のいずれか１つの配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチドにより処理する前に、酸及び／又は塩基で処理する。一部の態様では、酸はリン酸である。
【０２５３】
一部の態様では、バイオマスを、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体であるβ−グルコシダーゼを含む、非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物により処理する工程を含む、糖化工程が提供される。
【０２５４】
一部の態様では、糖化プロセスは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラを含む、非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物により、バイオマスを処理する工程を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）の相当する長さのアミノ酸配列と約６０％（例えば、約６５％、７０％、７５％、又は８０％）以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、６８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つの相当する長さの配列に対し、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、又は８０％）以上の配列同一性を有する。一部の態様では、糖化プロセスは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラを含む非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物によりバイオマスを処理する工程を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、６８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、又は７９から選択されるいずれか１つの相当する長さのアミノ酸配列と約６０％（例えば、約６５％、７０％、７５％、又は８０％）以上の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、又は８０％）配列同一性を有する。一部の態様では、糖化プロセスは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラを含む非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物によりバイオマスを処理する工程を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１３６〜１４８のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１４９〜１５６のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又はすべてを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１６４〜１６９のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又はすべて）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１７０を含む。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドのＮ末端に存在し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドのＣ末端に存在する。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接しているか、又は互いに直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。特定の態様では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列は、ループ配列を含み、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、ハイブリッド若しくはキメラ酵素のループ配列中の部位が又はループ配列の外側の残基が切断を受けにくくなるように、ループ配列を改変する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼも第２のβ−グルコシダーゼもループ配列を含まず、むしろリンカードメインがループ配列を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドの中央に位置する。一部の態様では、バイオマスを含む材料は、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼからなるキメラを含む非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物により処理する前に、酸及び／又は塩基により処理する。一部の態様では、酸はリン酸である。一部の態様では、塩基は、アンモニア又は水酸化ナトリウムである。一部の態様では、糖化工程は更に、バイオマスをヘミセルラーゼにより処理する工程を含む。一部の態様では、バイオマスは全セルラーゼにより処理する。一部の態様では、糖化プロセスは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ又はハイブリッド体を含む非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物によりバイオマスを処理する工程を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、相当する長さの配列番号６０の配列に対し約６０％超（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％）の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、又は８０％）の配列同一性を有し、これらの結果として、バイオマスの少なくとも約５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％が糖へと変換される。一部の態様では、糖化プロセスは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ若しくはハイブリッド体を含む非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物によりバイオマスを処理する工程を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つの相当する長さの配列と約６０％以上（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％）の配列同一性を有し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列に対し少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、又は８０％超）の配列同一性を有し、これらの結果として、バイオマスの少なくとも約５０重���％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％が糖へと変換される。一部の態様では、糖化プロセスは、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列からなるキメラ若しくはハイブリッド体を含む非天然に得られるセルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物によりバイオマスを処理する工程を含み、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号１３６〜１４８のアミノ酸配列モチーフの１つ以上若しくは全て、又は好ましくは配列番号１６４〜１６９の１つ以上若しくは全てモチーフを含み、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１４９〜１５６のアミノ酸配列モチーフの１つ以上若しくは全て、又は好ましくは配列番号１７０の配列モチーフを含み、これらの結果として、バイオマスの少なくとも約５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％が糖へと変換される。一部の態様では、第１のβ−グルコシダーゼ配列はキメラ若しくはハイブリッド型β−グルコシダーゼポリペプチドのＮ末端に位置し、第２のβ−グルコシダーゼ配列はＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接しているか、又は直接連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接していないものの、リンカードメインを介して連結されている。一部の態様では、第１の又は第２のβ−グルコシダーゼ配列のいずれかはループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含み、ループ配列の改変により安定性が向上され、この向上は、ハイブリッド若しくはキメラポリペプチドの切断又は分解の程度の減少に反映され得る。特定の実施形態では、安定性の向上は、ループ配列残基の切断の減少又は消失に反映される。特定の実施形態では、安定性の向上は、ループ領域の外側の残基の切断の減少又は消失に反映される。特定の実施形態では、第１又は第２のβ−グルコシダーゼ配列はいずれもループ領域を含まず、その一方で、リンカードメインがループ配列を含み、ループ配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基を含み、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号１７１）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号１７２）の配列を含む。一部の実施形態では、糖化プロセスにより、バイオマスの少なくとも約５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、又は９０重量％が糖へと変換される。
【０２５５】
ビジネス方法
本開示のセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、更に、工業的及び／又は商業的環境に使用できる。したがって、方法、すなわちインスタント式セルラーゼ及び非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物の製造、販売、あるいは市販方法も企図される。
【０２５６】
具体的な実施例では、本発明のセルラーゼ及び非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物は、特定のエタノール（バイオエタノール）精製所又はその他の生化学又はバイオマテリアル製造所に供給又は販売することができる。第１の例では、非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、工業規模での酵素の製造に特化した酵素製造施設で製造することができる。次に、非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は包装することができ、又は酵素製造業に関係する顧客に販売することができる。本明細書では、この運用戦略を「商用酵素供給モデル」と呼ぶ。
【０２５７】
他の運用戦略では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、バイオエタノール精製所又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造所（「現場型」）に又はその周辺に位置する施設で酵素製造業者により構築される酵素産生系に関係する形態で産生することができる。一部の実施形態では、酵素の供給契約は、酵素製造業者と、バイオエタノール精製業者又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造業者とにより締結される。酵素製造業者は、本明細書に記載される通りの、現場で宿主細胞を用いる酵素産生系、発現方法、及び産生方法を設計し、制御し、操作して、非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物を産生する。特定の実施形態では、好適なバイオマスに対し好ましくは本明細書に記載の通りに適切に前処理を行い、バイオエタノール精製所又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造施設にて、又はその付近で、糖化方法並びに本明細書の酵素及び／又は酵素組成物を用いて加水分解することができる。次に、得られる発酵性糖質を用い、同じ施設で、又は近隣の施設で発酵を行うことができる。この運用戦略を、本明細書では「現場型生物精製モデル」と呼ぶ。
【０２５８】
現場型生物精製モデルは、例えば、酵素供給業者から購入する必要のある酵素を最小限に抑える自給自足型運用法を提供するなど、酵素の商用供給モデルに対し一定の利点を提供する。その他に、このモデルにより、バイオエタノール精製所又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造施設は、リアルタイムでの又はほぼリアルタイムでの要求に応じ酵素の供給をより良好に調節しやすくなる。特定の実施形態では、互いに近接している２箇所以上のバイオエタノール精製所及び／又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造所間で共有することのできる、現場型酵素産生設備が企図され、この様な設備により、酵素の輸送及び貯蔵費用が削減される。更に、このモデルでは、現場型酵素産生設備を改良した、より近接した「差し込み（drop-in）」法が可能になり、この手法では、酵素組成物を改良してから、発酵性糖質、究極的にはバイオエタノール又はバイオケミカルをより高収率で産生するまでのタイムラグが減少する。
【０２５９】
現場型生物精製モデルは、本開示のセルラーゼ及び非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物だけでなく、デンプン（例えば、トウモロコシ）をより効率的にかつ有効に加工してバイオエタノール又はバイオケミカルへと直接変換させることのできるこれらの酵素及び酵素組成物も、製造、供給、及び産生に使用することのできる、バイオエタノール及びバイオケミカルの工業産生及び商業化においてより一般的な適用法を有する。特定の実施形態では、デンプン加工酵素は、現場型生物精製所で製造した後、バイオエタノールを製造する目的で迅速にかつ容易にバイオエタノール精製所又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造施設に組み入れることができる。
【０２６０】
したがって、特定の態様では、本発明は、特定のバイオエタノール、バイオ燃料、バイオケミカル、又はその他のバイオマテリアルの製造及び販売に、本明細書に記載の酵素（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ）、細胞、組成物及びプロセスを利用するビジネス方法にも関する。一部の実施形態では、本発明は、現場型生物精製モデルでのこのような酵素、細胞、組成物及びプロセスの利用に関する。他の実施形態では、本発明は、商用酵素供給モデルでのこのような酵素、細胞、組成物及びプロセスの利用に関する。
【０２６１】
関連して、本開示は、商業的環境での本発明の酵素及び／又は酵素組成物の使用を提供する。例えば、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、酵素及び／又は組成物の典型的な又は好ましい使用方法についての指示書と組み合わせて適切な市場で販売することができる。したがって、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、商用酵素供給モデルにより使用又は市販することができる。このモデルでは、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、バイオエタノール製造業者、燃料精製業者、又は燃料若しくはバイオ製品を製造する事業を行っているバイオケミカル製造業者若しくはバイオマテリアル製造業者に販売される。一部の態様では、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、現場型生物精製モデルを用い市販又は商品化され、酵素及び／又は酵素組成物は、燃料精製施設又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造施設又は施設の付近にて製造又は調製され、本発明の酵素及び／又は酵素組成物は、燃料精製施設又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造業者の具体的な要求に合わせてリアルタイムで調整される。更に、本開示は、所望のバイオプロダクト（例えば、バイオ燃料、バイオケミカル、バイオ材料など）を製造し、市販することのできる酵素及び／又は酵素組成物の使用時に、これらの製造業者に技術的な支援及び／又は指示を提供する工程に関する。
【０２６２】
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
【実施例】
【０２６３】
実施例１：アッセイ／方法
以下のアッセイ／方法を、概して、以降に記載の実施例において使用した。以下に提供するプロトコルに由来する任意の変法を、具体例に示す。
【０２６４】
Ａ．バイオマス基質の前処理
酵素により加水分解する前に、国際公開第０６１１０９０１（Ａ）号に記載の方法及び加工条件により、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、及びスイッチグラスを前処理した（別途記載がない限りこの手法による）。前処理についてのこれらの参照は、米国特許第２００７−００３１９１８（Ａ１）号、同第２００７−００３１９１９（Ａ１）号、同第２００７−００３１９５３（Ａ１）号、及び／又は同第２００７−００３７２５９（Ａ１）号の開示にも包含される。
【０２６５】
アンモニア繊維爆砕した（ＡＦＥＸ）トウモロコシ茎葉を、国際ミシガン・バイオテクノロジー協会（Michigan Biotechnology Institute International（ＭＢＩ））から得た。トウモロコシ茎葉の組成は、国際再生可能エネルギー機関（National Renewable Energy Laboratory）（ＮＲＥＬ）の手法（ＮＲＥＬ  ＬＡＰ−００２）を用い、ＭＢＩ（Ｔｅｙｍｏｕｒｉ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１１３：９５１〜９６３）により測定した。ＮＲＥＬの手順は：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌにて利用できる。
【０２６６】
Ｂ．バイオマスの組成解析
「バイオマス中の糖及びリグニンの構造決定」［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ  ２００８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｄｆｓ／４２６１８．ｐｄｆ）］に記載の２段階酸加水分解法を使用し、バイオマス基質の組成を測定した。変換率（％）を基質の初期セルロース及びキシラン含量を元にした理論収量と比較して、上記手法を用いた酵素加水分解の結果を本明細書に報告する。
【０２６７】
Ｃ．総タンパク質の解析
ＢＣＡタンパク質アッセイは、タンパク質濃度を分光光度計により測定する比色分析法である。製造元の指示に従って、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）を用い、試験チューブに酵素希釈物を調製した。希釈した酵素液を、１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１ｍＬを入れた２ｍＬエッペンドルフチューブに別個に（各０．１ｍＬ）加えた。チューブをボルテックスにかけ、１０分間アイスバスに置いた。チューブを１４，０００ｒｐｍで６分遠心分離した。上清を廃棄し、各ペレットを０．１ＮのＮａＯＨ  １ｍＬに再懸濁し、ペレットが溶解するまでチューブを再度ボルテックスにかけた。２ｍｇ／ｍＬ原液からＢＳＡ標準液を調製した。ＢＣＡタンパク質アッセイキットの試薬Ｂ  ０．５ｍＬと試薬Ａ  ２５ｍＬを混合し、ＢＣＡ希釈標準液を調製した。再懸濁した酵素試料を、各０．１ｍＬずつ３本のエッペンドルフチューブに加えた。各試料及びＢＳＡ標準のチューブに、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ希釈標準液２ｍＬを加えた。チューブを３７℃のウォーターバスで３０分インキュベートした。試料を室温に冷却し（１５分）、各サンプルの５６２ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２６８】
各標準に関し、タンパク質吸光度の平均値を算出した。吸光度をｘ軸にとり、濃度（ｍｇ／ｍＬ）をｙ軸にとって、タンパク質標準の平均値をプロットした。各点は等式：ｙ＝ｍｘ＋ｂと一致した。未希釈濃度の酵素サンプルに関しては、ｘ軸の吸光度を減算して算出した。総タンパク濃度は、希釈係数を乗じて算出した。
【０２６９】
精製試料に含まれる総タンパク質量は、Ａ２８０により測定した（Ｐａｃｅ，ＣＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４：２４１１〜２４２３）。
【０２７０】
発酵産物中の総タンパク含量は、場合により、ケルダール法（ｒｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又はＤＵＭＡＳ法（ＴｒｕＳｐｅｃ  ＣＮ）（Ｓａｄｅｒ，Ａ．Ｐ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９（２）：７３〜７９）のいずれかを用い、燃焼、並びに放出窒素の捕捉及び測定により総窒素量として測定した。例えば、発酵ブロスなどの複雑なサンプルについては、平均Ｎ含量は１６％、窒素からタンパク質への平均係数は６．２５として計算に使用した。場合によっては、非タンパク質系窒素の干渉を考慮に入れ、総沈殿タンパク質を測定した。これらの場合、測定には１２．５％濃度のＴＣＡを使用し、タンパク質を含有しているＴＣＡペレットを０．１ＭのＮａＯＨに再懸濁した。
【０２７１】
場合によっては、製造元の推奨に従って、ベターブラッドフォードアッセイ（Better Bradford Assay）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）としても知られるクーマシープラスを使用した。他の場合では、総タンパク質は、ヴァイクセルバウム（Weichselbaum）及びゴルナール（Gornall）により改変されたビウレット法により、ウシ血清アルブミンを標準物質として用い測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，Ｔ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１９６０，１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４９，１７７：７５２）。
【０２７２】
Ｄ．ＡＢＴＳを用いるグルコース測定
グルコース測定用の、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチレンチアゾリン−６）−スルホン酸）アッセイは、グルコース酸化酵素が、Ｏ２の存在下では、グルコースの酸化を触媒しつつ化学量論量の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成するという原理に基づくものであった。この反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によりＡＢＴＳの酸化を触媒する。この反応はＨ２Ｏ２の濃度に直接相関する。酸化ＡＢＴＳの発生は、緑色の発色により示される。この発色をＯＤ  ４０５ｎｍで定量する。暗所で、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）に２．７４ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ粉末（Ｓｉｇｍａ）と０．１Ｕ／ｍＬのＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）と１Ｕ／ｍＬのグルコース酸化酵素（ＯｘｙＧＯ（登録商標）ＨＰ  Ｌ５０００，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ）とを混合した混合液を調製し、保管した。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を用い、グルコース標準（０、２、４、６、８、１０ｎｍｏｌ）を調製した。各９６ウェル平底マイクロタイタープレートに、１０μＬの標準を３ウェルずつ加えた。段階希釈したサンプル１０μＬもプレートに加えた。各ウェルに１００μＬのＡＢＴＳ基質溶液を加え、プレートを分光光度式プレートリーダーに配置した。ＡＢＴＳの酸化を４０５ｎｍで５分読み取りした。
【０２７３】
あるいは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）及び２％  ＳＤＳを含有している停止液を用い反応を停止させた後、１５〜３０分インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２７４】
Ｅ．ＨＰＬＣによる糖分析
０．２２μｍナイロンＳｐｉｎ−Ｘ遠心チューブフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）による遠心ろ過を用い不溶性の成分を除去し、蒸留水を用い可溶性糖類を所望の濃度に希釈して、トウモロコシ穂軸の糖化加水分解物からサンプルを調製した。６×５０ｍｍ  ＳＨ−１０１１Ｐガードカラム（ｗｗｗ．ｓｈｏｄｅｘ．ｎｅｔ）を取り付けたＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ−Ｇ  ＳＨ１０１１，８×３００ｍｍで単糖類を測定した。０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を溶媒として使用し、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを実施した。カラム温度は５０℃に維持し、屈折率を基に検出を行った。あるいは、糖の量は、Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを取り付けたＷａｔｅｒｓ  ２４１０屈折率検出器を用い分析した。分析時間は約２０分であり、注入体積は２０μＬであり、移動相には、０．２μｍフィルタによりろ過し脱気した０．０１Ｎの硫酸を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで用い、カラム温度は６０℃に維持した。グルコース、キシロース、及びアラビノースの外部標準を各サンプルセットに関し溶出させた。
【０２７５】
分子ふるいクロマトグラフィーを用い糖を分離し、オリゴ糖を同定した。Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  Ｇ２０００ＰＷカラム（７．５ｍｍ×６０ｃｍ）を使用した。蒸留水を使用して糖を溶出させた。流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとし、室温のカラムで実施した。六炭糖の標準は、スタキオース、ラフィノース、セロビオース、及びブドウ糖を含有し；五炭糖の標準はキシロヘキソース、キシロペントース、キシロテトロース、キシロトリオースキシロビオース及びキシロースを含有した。キシロオリゴマー標準は購入した（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）。屈折率を基に検出を行った。結果の記録には、ピーク面積単位又は相対的なピーク面積のいずれかを使用した。
【０２７６】
遠心分離及びろ過清澄（上記の通り）したサンプルを加水分解し、可溶性糖類の総量を測定した。清澄化させた試料は、０．８ＮのＨ２ＳＯ４により１：１希釈した。得られた溶液をバイアル瓶に入れ、蓋をし、１２１℃で１時間オートクレーブ処理した。加水分解時の単糖類の損失について補正を行わずに結果を報告する。
【０２７７】
Ｆ．穂軸からのオリゴマーの調製及び酵素アッセイ
希アンモニアで前処理した乾燥重量２５０ｇのトウモロコシ穂軸と、８ｍｇのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３と、１ｇのグルカン＋キシランと、を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）に加え、インキュベートして、トウモロコシ穂軸をＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３により加水分解させ、オリゴマーを調製した。１８０ｒｐｍで回転振とうさせながら、４８℃で７２時間反応を進行させた。上清を９，０００×Ｇで濃縮させ、次に０．２２μｍ  Ｎａｌｇｅｎｅフィルタによりろ過し、可溶性糖類を回収した。
【０２７８】
Ｇ．バイオマス糖化アッセイ
特定の変法を示す特定の実施例を除き、本明細書における典型例では、以降の手順に従って、マイクロタイタープレート形式でトウモロコシ穂軸の糖化アッセイを実施した。バイオマス基質、例えば、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を水に希釈し、硫酸によりｐＨ  ５に調整して７％セルローススラリーを調製し、更なる加工は行わずに本アッセイに使用した。トウモロコシ穂軸中のセルロース１ｇ当たり、又はキシラン１ｇ当たり、又はセルロースとキシランを合わせて１ｇ当たりの総タンパク質量（ｍｇ）を基に、酵素サンプルを充填した（上掲の従来の組成解析法を用い測定した）。５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）により酵素を希釈し、所望の充填濃度を得た。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸７０ｍｇ（各ウェル７％セルロース）に、４０μＬの酵素溶液を加えた（各ウェルのセルロースの最終濃度は４．５％相当になる）。次に、アッセイプレートをアルミニウム製プレートシーラーで覆い、室温で混合し、５０℃、２００ｒｐｍで３日間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、各ウェルに１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０．０）を１００μＬ加え、糖化反応を停止させ、プレートを３，０００ｒｐｍで５分遠心分離した。９６ウェルＨＰＬＣプレート中で、１０μＬの上清に２００μＬのミリＱ水を添加し、可溶性糖類をＨＰＬＣにより測定した。
【０２７９】
Ｈ．マイクロタイタープレートを用いる糖化アッセイ
基質に含まれるセルロース１ｇごとの総タンパク質量（ｍｇ）に基づき、精製セルラーゼ及び全セルラーゼの無細胞産物を糖化アッセイに組み入れた。基質のキシラン含量に基づき、精製ヘミセルラーゼを充填した。バイオマス基質としては、例えば、希酸で前処理したトウモロコシ葉茎（ＰＣＳ）、アンモニア繊維膨潤（ＡＦＥＸ）トウモロコシ葉茎、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で前処理したトウモロコシ穂軸、及び希アンモニアで前処理したスイッチグラスを記載の固形分濃度（％）で混合し、混合物のｐＨを５．０に調節した。プレートをアルミニウム製プレートシーラーで覆い、５０℃のインキュベータに配置した。振とうしながら２日間インキュベートした。各ウェルに１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを加え、反応を停止させた。十分混合した後、プレートを遠心分離し、１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）を１００μＬ含有させたＨＰＬＣプレートで上清を１０倍希釈した。生成された可溶性糖類の濃度を、セロビオース加水分解アッセイ（下記）について記載される通りにＨＰＬＣを用い測定した。グルカン変換率（％）は、［グルコース（ｍｇ）＋（セロビオース（ｍｇ）×１．０５６＋セロトリオース（ｍｇ）×１．０５６）］／［基質中セルロース（ｍｇ）×１．１１１］として定義し、キシラン変換率（％）は、［キシロース（ｍｇ）＋（キシロビオース（ｍｇ）×１．０６）］／［基質中キシラン（ｍｇ）×１．１３６］として定義する。
【０２８０】
Ｉ．セロビオース加水分解アッセイ
Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，５９（２），２５７〜２６８の手法を用い、セロビアーゼ活性を測定した。セロビオース単位（Ｇｈｏｓｅが記載の通りに誘導）は、アッセイ条件下で０．１ｍｇグルコースを放出させるのに必要な酵素量により除算し、０．８１５として定義した。
【０２８１】
Ｊ．クロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）加水分解アッセイ
マイクロタイタープレートの各ウェルに、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）２００μＬを加えた。プレートを覆い、エッペンドルフ・サーモミキサーにおいて３７℃で１５分平衡化させた。個々のウェルに、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）で希釈した５μＬの酵素も加えた。プレートを再度覆い、３７℃で５分間平衡化させた。ミリポア水を用い、２ｍＭの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＮＰＧ，Ｒｏｓｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，ＣＡ）２０μＬを調製し、各ウェルに加え、プレートを手早く分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に移した。ＯＤ  ４０５ｎｍで１５分間動態を読み取り、データをＶｍａｘとして記録した。ＣＮＰの吸光係数を用い、Ｖｍａｘの単位をＯＤ／秒からμＭ  ＣＮＰ／秒へと変換した。μＭ  ＣＮＰ／秒を、本アッセイで使用した酵素量（ｍｇ）で除算し、比活性（μＭ  ＣＮＰ／秒／タンパク質（ｍｇ））を割り出した。
【０２８２】
Ｋ．カルコフローアッセイ
すべての化合物は分析等級のものを使用した。ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）からＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１を購入した。セロビオース及びカルコフローホワイトは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から購入した。Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２のプロトコルに変更を加え、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１によりリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。簡潔に述べると、Ａｖｉｃｅｌを濃リン酸で可溶化させ、次に冷脱イオン水により沈殿させた。セルロースを回収し、多量の水で洗浄してｐＨを中和させた後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）で固形分１％に希釈した。
【０２８３】
全ての酵素希釈液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を用い調製した。ＧＣ２２０セルラーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を２．５、５、１０、及び１５ｍｇのタンパク質／Ｇ  ＰＡＳＣへと希釈し、線形の較正曲線を作成した。試験する試料は、較正曲線の範囲内に収まるよう（すなわち、０．１〜０．４フラクション生成物に相当するよう）希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中で、２０μＬの酵素溶液に１５０μＬの１％冷ＰＡＳＣを加えた。プレートを覆い、Ｉｎｎｏｖａインキュベータ／振とう器において、５０℃、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。５０μｇ／ｍＬカルコフロー／１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを用い反応を停止させた。励起波長Ｅｘ＝３６５ｎｍ、放出波長Ｅｍ＝４３５ｎｍにて、蛍光マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））で、蛍光を読み取りした。この結果を、等式：
ＦＰ＝１−（Ｆｌサンプル−Ｆｌ緩衝液重量／セロビオース）／（Ｆｌ酵素不含有−Ｆｌ緩衝液重量／セロビオース）
（式中、ＦＰはフラクション生成物であり、Ｆｌ＝蛍光単位である）に従うフラクション生成物として表現する。
【０２８４】
実施例２：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）の組み込み型発現株の構築
５種の遺伝子：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ３Ａ、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ４３Ｄ、及びＦ．バーティシリオイド（F. verticillioides）α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａを共発現させて、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）の組み込み型発現株を構築した。
【０２８５】
これらの異なる遺伝子の発現カセットの構築、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）株の形質転換を以下に記載する。
【０２８６】
Ａ．β−グルコシダーゼ発現ベクターの構築
ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１のＮ末端領域のコドンを最適化させた（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この合成領域は、この酵素をコードしている最初の４４７塩基からなる。次に、プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４１（下記）を用い、この断片をＰＣＲ法により増幅させた。プライマーＳＫ９４０及びＳＫ９４２（下記）を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、ネイティブなｂｇｌ１遺伝子の残りの領域をＰＣＲ法により増幅させた。プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４２を用い、ｂｇｌ１遺伝子のこれらの２つのＰＣＲ産物を、融合ＰＣＲ反応により融合させた。
【０２８７】
順方向プライマーＳＫ９４３：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号９２）
逆方向プライマーＳＫ９４１：（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’）（配列番号９３）
順方向プライマー（ＳＫ９４０）：（５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号９４）
逆方向プライマー（ＳＫ９４２）：（５’−ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号９５）
得られる融合ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、中間ベクターｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）（図５５Ｂ）を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｂｇｌ１配列を有するｐＥＮＴＲ−９４３／９４２ベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み替えた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるプロトコル概要を参照されたい）。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２を得た（マップを参照されたい、図５５Ｃ）。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ７４５及びＳＫ７７１（下記）により発現カセットをＰＣＲ増幅させて、形質転換用の配列を生成した。
【０２８８】
順方向プライマーＳＫ７７１：（５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号９６）
逆方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号９７）
１）エンドキシラナーゼ発現カセットの構築
プライマーｘｙｎ３Ｆ−２及びｘｙｎ３Ｒ−２を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルからネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３をＰＣＲ増幅させた。
【０２８９】
順方向プライマーｘｙｎ３Ｆ−２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧ−３’）（配列番号９８）
逆方向プライマーｘｙｎ３Ｒ−２：（５’−ＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＴＧＣＣＧ  ＧＣＴＴＧＧＧＧ−３’）（配列番号９９）
得られるＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセルを形質転換させ、図５５Ｄに示すとおりのベクターを得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｘｙｎ３配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３ベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み替えた。ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、最終的な発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｘｙｎ３を得た（図５５Ｅを参照されたい）。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ７４５及びＳＫ８２２（下記）により発現カセットをＰＣＲ増幅させて、形質転換用の配列を生成した。
【０２９０】
順方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１００）
逆方向プライマーＳＫ８２２：（５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣ−３’）（配列番号１０１）
２）β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現ベクターの構築
プライマーＭＨ１２４及びＭＨ１２５を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからＦ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼｆｖ３Ａの遺伝子を増幅させた。
【０２９１】
順方向プライマーＭＨ１２４：（５’−ＣＡＣＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＴＣＴＴＣＡＧ−３’）（配列番号１０２）
逆方向プライマーＭＨ１２５：（５’−ＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧ−３’）（配列番号１０３）
ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、中間ベクターｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａ（図５５Ｆを参照されたい）を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｆｖ３Ａ配列を有するｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｐＴｒｅｘ６ｇで組み替えた。ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、最終的な発現ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａを得た（図５５Ｇを参照されたい）。ベクターには、国際公開第２００８／０３９３７０（Ａ１）号に記載の方法に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換についての選択マーカーとして、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）アセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）遺伝子、ａｌｓＲの、クロリムロンエチル耐性の変異も、そのネイティブなプロモーター及びターミネーターと共に含有させた。プライマーＳＫ１３３４、ＳＫ１３３５、及びＳＫ１２９９（下記）により発現カセットをＰＣＲ増幅させて、形質転換用の配列を生成した。
【０２９２】
順方向プライマーＳＫ１３３４：（５’−ＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧ−３’）（配列番号１０４）
順方向プライマーＳＫ１３３５：（５’−ＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣ−３’）（配列番号１０５）
逆方向プライマーＳＫ１２９９：（５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’）（配列番号１０６）
３）β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットの構築
Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットを構築するため、プライマーＳＫ１３２２及びＳＫ１２９７（下記）を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからｆｖ４３Ｄ遺伝子産物を増幅させた。ＲＬ−Ｐ３７株から抽出したＴ．リーゼイ（T. reesei）ゲノムＤＮＡサンプルのエンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーター領域を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１３２１（下記）を用いＰＣＲ増幅させた。続いて、これらのＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７（下記）を用い融合ＰＣＲ反応により融合させた。得られる融合ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄを作成した（図５５Ｈを参照されたい）。次に、このプラスミドを用い、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。いくつかの大腸菌（E. coli）クローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素による消化によりそれらの配列を確認した。
【０２９３】
順方向プライマーＳＫ１３２２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号１０７）
逆方向プライマーＳＫ１２９７：（５’−ＧＧＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧ−３’）（配列番号１０８）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１０９）
逆方向プライマーＳＫ１３２１：（５’−ＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号１１０）
プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７（上記）を用い、ＰＣＲによりＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄから発現カセットを増幅させて、形質転換用の配列を生成した。
【０２９４】
４）α−アラビノフラノシダーゼ発現カセットの構築
Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａ発現カセットの構築の際、プライマーＳＫ１１５９及びＳＫ１２８９（下記）を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからｆｖ５１Ａ遺伝子産物を増幅させた。ＲＬ−Ｐ３７株（上掲）から抽出したＴ．リーゼイ（T. reesei）ゲノムＤＮＡサンプルのエンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーター領域を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２６２（下記）を用いＰＣＲ増幅させた。続いて、ＰＣＲ増幅させたＤＮＡ断片を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２８９（下記）を用い融合ＰＣＲ反応により融合させた。得られる融合ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａ（図５５Ｉを参照されたい）を作成し、このプラスミドを用い、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。
【０２９５】
順方向プライマーＳＫ１１５９：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＴＡＧ−３’）（配列番号１１１）
逆方向プライマーＳＫ１２８９：（５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）（配列番号１１２）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１１３）
逆方向プライマーＳＫ１２６２：（５’−ＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣ−３’）（配列番号１１４）
プライマーＳＫ１２９８及びＳＫ１２８９（上記）を用い、発現カセットをＰＣＲ増幅させて、形質転換用の配列を生成した。
【０２９６】
順方向プライマーＳＫ１２９８：（５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号１１５）
逆方向プライマーＳＫ１２８９：（５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）（配列番号１１２）
５）β−グルコシダーゼ及びエンドキシラナーゼ発現カセットによるＴ．リーゼイ（T. reesei）の同時形質転換
ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３．）に由来し、かつ高セルラーゼ産生であるものとして選択したトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）変異株を、ＰＥＧによる形質転換方法（Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９８７，６１（２）：１５５〜６４を参照されたい）を用い、β−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、及びａｍｄＳマーカー）、及びエンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、及びｃｂｈ１ターミネーター）を利用して同時形質転換させた。多数の形質転換体を単離し、β−グルコシダーゼ生成及びエンドキシラナーゼ生成について試験した。他の発現カセットによる形質転換に際し、形質転換体のＴ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９を選択した。
【０２９７】
６）２種のβ−キシロシダーゼ及びα−アラビノフラノシダーゼ発現カセットによるＴ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９の同時形質転換
例えば、国際公開第２００８１５３７１２（Ａ２）号に記載の電気穿孔法を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９を、β−キシロシダーゼｆｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、ｆｖ３Ａ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、及びａｌｓＲマーカー）、β−キシロシダーゼｆｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、ｆｖ４３Ｄ遺伝子、ネイティブ型ｆｖ４３Ｄターミネーター）、及びｆｖ５１Ａ  α−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、ｆｖ５１Ａ遺伝子、ｆｖ５１Ａネイティブ型ターミネーター）により同時形質転換させた。形質転換体は、クロリムロンエチル（８０ｐｐｍ）を含有しているＶｏｇｅｌｓ寒天プレートで選択した。
【０２９８】
【表１】
2014509858.tif 000003
【０２９９】
多数の形質転換体を単離し、β−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ生成について試験した。実施例１に記載の通りの穂軸糖化アッセイに従って、バイオマスの変換率についても形質転換体を選択した。本明細書に記載のＴ．リーゼイ（T. reesei）の組み込み発現株の例は、β−グルコシダーゼ１、Ｘｙｎ３をコードしているＴ．リーゼイ（T. reesei）遺伝子、並びにＦｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄをコードしているフザリウム（Fusarium）遺伝子を、異なる比で発現するＨ３Ａ、３９Ａ、Ａ１０Ａ、１１Ａ、及びＧ９Ａから選択される。特に、その他のＨ３Ａ株と比較して、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１を低発現していたＨ３Ａ株＃５（「Ｈ３Ａ−５」）を、本明細書において以降に記載する実験に使用した。実施例５に記載の実験には、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１を低発現しているその他のＨ３Ａ株を使用した。特に、１種のＴ．リーゼイ（T. reesei）株では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の過剰発現が欠損しており、その他の株ではＦｖ５１Ａが欠損しており、２種ではＦｖ３Ａが欠損していることが、ウェスタン・ブロットにより確認された。
【０３００】
７）Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａの組成
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａの発酵、及び組成の決定により、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄの遺伝子産物が本明細書の図３に示す比で存在していることが確認された。
【０３０１】
８）ＨＰＬＣによるタンパク質アッセイ
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及びマススペクトロスコピー（ＭＳ）を実施して、発酵ブロスに含まれている酵素を分離し、定量した。始めに、Ｓ．プリカタス（S. plicatus）（例えば、ＮＥＢ  Ｐ０７０２Ｌ）から遺伝子組換えにより発現させたエンドＨグリコシダーゼにより酵素サンプルを処理した。エンドＨは、サンプル中の総タンパク質１μｇ当たり０．０１〜０．０３μｇ量になるよう使用した。ＨＰＬＣ解析に先立ち、混合物を、３７℃、ｐＨ  ４．５〜６．０で３時間インキュベートし、Ｎ−結合糖鎖を酵素により除去させた。次に、ＨＩＣ−フェニルカラム、及び高濃度−低濃度という塩濃度勾配を用い、約５０μｇのタンパク質に対し３５分間かけて疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ）を行った。高塩濃度の緩衝液Ａ：４Ｍの硫酸アンモニウム／２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．７５）と、低塩濃度の緩衝液Ｂ：２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．７５）とを用い、勾配を作成した。ＵＶ  ２２２ｎｍでピークを検出した。画分を回収し、マススペクトロスコピーにより解析した。サンプルの総積分面積に対する各ピーク面積の割合（％）としてタンパク質比を記載する。
【０３０２】
９）Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａの発酵ブロスに精製タンパク質を添加することにより希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対し生じる効果
本実験により、前処理したバイオマスの糖化に対し各種酵素（ほとんどが精製されているものの、未精製の酵素もある）により付与される効果を評価した。数種の精製タンパク質及び１種の未精製タンパク質を原液から段階希釈し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株Ｈ３Ａの発酵ブロスを添加した。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、固形分２０重量％（ｐＨ  ５）で９６ウェルマイクロタイタープレートに充填した（ウェル当たり約５ｍｇのセルロース）。２０ｍｇタンパク質／セルロース（ｇ）となるよう各ウェルにＨ３Ａ発酵ブロスを添加した。各希釈タンパク質（図４Ａ）を体積１０、５、２、及び１μＬで各ウェルに添加し、各ウェルの総量が１０μＬとなるよう水も添加した。参照ウェルには水１０μＬ、又はその他のＨ３Ａ希釈物のいずれかを添加した。マイクロタイタープレートにアルミホイルで蓋をし、Ｉｎｎｏｖａ恒温振とう機にて、２００ｒｐｍ、５０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬによりサンプルの反応を停止した。次に、プレートをプラスチックシールで覆い、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心分離した。反応を停止させた混合物の５μＬのアリコートを、１００μＬの水により希釈した。反応で生じたグルコースの濃度をＨＰＬＣにより測定した。２０ｍｇ／ｇになるよう加えたＨ３Ａのタンパク質濃度を基に、グルコース収率を測定した。結果を図４Ｂ〜４Ｅに示す。
【０３０３】
実施例３：ＦＶ３Ｃのクローニング、発現及び精製
Ａ．Ｆｖ３Ｃクローニング及び発現
Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）のフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）ゲノムに対しＧＨ３のβ−グルコシダーゼ相同体について検索を行い、Ｆｖ３Ｃ配列（配列番号６０）を得た。テンプレートとしてフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）由来の精製ゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＦｖ３Ｃ翻訳領域を増幅させた。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＣＲサーモサイクラーとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＤＮＡポリメラーゼとして使用した。翻訳領域を増幅させるために使用したプライマーは次のとおりである：
順方向プライマーＭＨ２３４（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣ−３’）（配列番号１１６）
逆方向プライマーＭＨ２３５（５’−ＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’）（配列番号１１７）
順方向プライマーには、４つの追加のヌクレオチド（配列−ＣＡＣＣ）を５’末端に含有させて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）への定方向クローニングを促進させた。翻訳領域を増幅させるためのＰＣＲ条件は、次のとおりであった：工程１：９４℃で２分。工程２：９４℃で３０秒。工程３：５７℃で３０秒。工程４：７２℃で６０秒。工程２、３及び４を更に２９サイクル繰り返した。工程５：７２℃で２分。Ｆｖ３Ｃ翻訳領域のＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。精製したＰＣＲ産物を、最初にｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、５０ｐｐｍのカナマイシンを含有させたＬＡプレートに播種した。ＱＩＡｓｐｉｎプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、大腸菌（E. coli）形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入されたＤＮＡの配列を、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマーと、次のその他の配列プライマーとを用い確認した：
ＭＨ２５５（５’−ＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号１１８）
ＭＨ２５６（５’−ＴＡＴＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号１１９）
ＭＨ２５７（５’−ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＴ−３’）（配列番号１２０）
ＭＨ２５８（５’−ＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号１２１）
Ｆｖ３Ｃ翻訳領域（図４４）の正しいＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｐＴｒｅｘ６ｇ（図４５Ａ）デスティネーションベクターに組み込んだ。
【０３０４】
続いて、ＬＲクロナーゼ（登録商標）の反応産物により、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、次に、５０ｐｐｍカルベニシリンを含有させたＬＡプレートに播種した。Ｆｖ３Ｃ翻訳領域と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）変異型アセト乳酸合成酵素選択マーカー（ａｌｓ）とを含有しているｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ｃ（図４５Ｂ）を発現コンストラクト（pExpression construct）として得た。Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用い、Ｆｖ３Ｃ翻訳領域を含有している発現コンストラクト（pExpression construct）のＤＮＡを単離し、遺伝子銃によるＴ．リーゼイ（T. reesei）芽胞の形質転換に使用した。
【０３０５】
遺伝子銃を用い、適切なＦｖ３Ｃ翻訳領域を含有しているｐＴｒｅｘ６ｇ発現ベクターにより、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換を行った。特に、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１、ｅｇ２、ｅｇ３、及びｂｇｌ１の欠失していた（すなわち、６遺伝子欠失株、国際公開第０５／００１０３６号を参照されたい）Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株を、製造元の指示に従ってＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）ＰＤＳ−１０００／ｈｅ粒子デリバリーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いヘリウムイオンビームにより形質転換させた（米国特許第２００６／０００３４０８号を参照されたい）。形質転換体を、新しいクロリムロンエチル選択培地に移植した。２００μＬ／ウェルのグリシン最少培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ（ｐＨ  ５．５））を滅菌後、約２％グルコース／ソホロース混合物（炭素供給源として）、１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２  １０ｍＬ／Ｌ、２．５ｍＬ／Ｌの４００ＸＴ．リーゼイ（T. reesei）微量元素溶液（１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３）ｍＬ／Ｌを添加し、フィルタマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、適切な形質転換体をこの培地に播種した。２８℃のインキュベータ中で、高酸素濃度にしたチャンバ内で、液体培地中で５日間、形質転換体を増殖させた。真空マニホールドで、フィルタマイクロタイタープレートから上清サンプルを回収した。上清サンプルを４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲルで電気泳動させ、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。
【０３０６】
Ｂ．Ｆｖ３Ｃの精製
振とうフラスコ濃縮物から、２５ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．８）にＦｖ３Ｃを透析した。透析した酵素溶液を、分取用ＳＥＣ  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００架橋アガロース及びデキストランカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速１ｍＬ／ｍｉｎで充填した。カラムは前もって２５ｍＭのＴＥＳ／０．１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ  ６．８）で平衡化させておいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、ＳＥＣ分離により得られた画分にＦｖ３Ｃが存在していることを同定及び確認した。Ｆｖ３Ｃを含有している画分をプールし、濃縮した。ＳＥＣ精製も用い、低分子量及び高分子量の夾雑物からＦｖ３Ｃを分離した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルをクーマシーブルー染色し、酵素調製物の純度を確認した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥでは、単一の主要なバンドが９７ｋＤａに検出された。
【０３０７】
Ｃ．Ｆｖ３Ｃの選択的翻訳
Ｆｖ３Ｃ遺伝子を発現させる際、フザリウム（Fusarium）データベースにおいて注釈される通りにＯＲＦを含有しているゲノム配列を使用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ｆｕｓａｒｉｕｍ＿ｇｒｏｕｐ／ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。予測コード領域はイントロンを３つ含有し、最初のイントロンはシグナルペプチド配列中に介在している（図４６Ａ）。
【０３０８】
しかしながら、３’部位では、最初のイントロンは、同様にシグナルペプチド用のコードとして予測される成熟配列のフレーム中に選択的ＯＲＦを含有していた（図４６Ｂ）。Ｎ末端配列解析により決定される通り、いずれの翻訳においても、成熟タンパク質（図４６Ｂ下線部）の開始部位は、どちらも推定シグナルペプチド切断部位（矢印により示す）の下流から開始していた。すなわち、翻訳推定開始コドンとしていずれかのＡＴＧを用い、Ｆｖ３Ｃを効果的に発現させることができることが示された（図４６Ｃ）。
【０３０９】
実施例４：セロビオース及びＣＮＰＧに対するβ−グルコシダーゼ活性
本実験では、セロビオース及びＣＮＰＧに対する、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）、Ｆｖ３Ｄ（配列番号５８）、及びＰａ３Ｃ（配列番号８０）のβ−グルコシダーゼの活性を試験した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（「Ａｎ３Ａ」）、Ｆｖ３Ｃ、Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３（ＦＡＢ）キメラ、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３（ＦＢ）キメラ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３、及びＴｅ３Ａは精製タンパク質である。Ｆｖ３Ｄ及びＰａ３Ｃは未精製タンパク質である。これらのタンパク質はＴ．リーゼイ（T. reesei）６遺伝子欠失株（上記に定義されるとおり）で発現させたが、バックグラウンドにタンパク質活性が幾分存在していた。図５Ａに示すとおり、セロビオースに対しては、Ｆｖ３ＣはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して約２倍の活性を有すること、それに対しＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して約１２倍もの活性を有することが判明した。
【０３１０】
ＣＮＰＧ基質に対しては、Ｆｖ３Ｃ活性はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のものと概ね等しかったが、Ａ．ニガー（A. niger）ＢｇｌｕではＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の活性の約１４％であった（図５Ａ）。Ｆｖ３Ｃと同様に発現させた、その他のフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）β−グルコシダーゼのＦｖ３Ｄの場合、セロビアーゼ活性は検出されなかったものの、ＣＮＰＧに対する活性はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の約５倍であった。更に、同様に生成したＰ．アンセリナ（P. anserina）β−グルコシダーゼ相同体のＰａ３Ｃの場合、セロビオース又はＣＮＰＧ基質に対する活性は測定されなかった。これらの試験により、セロビオース及びＣＮＰＧに対するＦｖ３Ｃの活性は分子自体によるものであり、夾雑タンパク質の活性によるものではないことが示された。
【０３１１】
実施例５：Ｆｖ３Ｃによる各種バイオマス基質の糖化
Ａ．ＰＡＳＣに対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、ＰＡＳＣに対する、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び数種のＦｖ３Ｃ相同体の糖化性能を試験する。９６ウェルＨＰＬＣプレートに、セルロース１ｇ当たりタンパク質量が５ｍｇ〜１０ｍｇになるよう各β−グルコシダーゼ２０μＬを加え、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｂｇｌ１抑制株由来の全セルラーゼを充填した。固形分０．７％のＰＡＳＣスラリー１５０μＬを各ウェルに加え、プレートをアルニウム製プレートシーラーで覆い、５０℃に設定したインキュベータに設置し、２時間振とうした。１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）１００μＬを各ウェルに加え、反応を停止させた。十分に混合した後、プレートを遠心分離し、上清を、各ウェルに１０ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを含有させた他のＨＰＬＣプレートで１０倍希釈した。生成された可溶性糖類の濃度を、ＨＰＬＣを用い測定した（図４７）。
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１を含有させた混合物と比較して、Ｆｖ３Ｃを含有させた混合物の方が、グルコースの収率が高いことが示された。これにより、Ｆｖ３Ｃの有するセロビアーゼ活性はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のものよりも高いことが示される（同様に図５Ｂを参照されたい）。Ｆｖ３Ｇ、Ｐａ３Ｄ及びＰａ３ＧはＰＡＳＣ加水分解に対し何ら効果を示さなかったことから、ＰＡＳＣ加水分解に対し、６遺伝子を欠失させたというバックグラウンド（各種Ｆｖ３Ｃ相同体をクローン化し発現させた）による影響はなかったことが示された。
【０３１２】
Ｂ．希酸で前処理したトウモロコシ葉茎（ＰＣＳ）に対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、固形分１３％のＰＣＳの糖化の向上に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び数種のＦｖ３Ｃ相同体の性能を、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）を用い試験した。
【０３１３】
各酵素を試験する際、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのβ−グルコシダーゼに、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）−Ｂｇｌ１欠損株に由来する１０ｍｇの全セルラーゼを添加した。
。
【０３１４】
具体的には、セルロース１ｇ当たり５ｍｇの各β−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び相同体）に、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１欠損株に由来する、１０ｍｇの全セルラーゼ、又は８ｍｇの精製ヘミセルラーゼ混合物（成分を図６に示す）を添加した。酵素混合物と基質とを５０℃で２日間インキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。
【０３１５】
結果を図４８に示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して、Ｆｖ３Ｃが、グルカン変換率（％）に対して明らかに効果を示すことも観察された。更に、Ｆｖ３Ｃも、グルコース及び糖の合計収率がＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１よりも高かった。
【０３１６】
この結果により、宿主細胞由来の夾雑タンパク質の影響は、あったとしてもわずかなものであることが示された。
【０３１７】
Ｃ．希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する、Ｆｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、アンモニアで前処理した固形分２０％のトウモロコシ穂軸の糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に従って試験した。具体的には、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸基質に、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び相同体）と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１欠損株に由来する１０ｍｇの全セルラーゼとを添加した。更に、Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ及びＦｖ５１Ａを含有している精製ヘミセルラーゼミックス（図６）も、セルロース１ｇ当たり８ｍｇとなるよう混合物に添加した。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。
【０３１８】
結果を図４９に示す。Ｆｖ３Ｃの性能が、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）などのその他のβ−グルコシダーゼと比較して明らかに良好であることも観察された。Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）を、セルロース１ｇ当たり２．５ｍｇを上回る量で酵素混合物に加えた場合、糖化が阻害されることも観察された。
【０３１９】
Ｄ．水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で前処理したトウモロコシ穂軸に対するＦｖ３Ｃの糖化性能
各種基質の前処理方法が、Ｆｖ３Ｃ性能に対し示す影響を試験するために、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａとも呼ぶ）、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、ＮａＯＨで前処理した固形分１２％のトウモロコシ穂軸の糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に記載の方法に従って測定した。水酸化ナトリウムによるトウモロコシ穂軸の前処理は、次の通りに行った：１，０００ｇのトウモロコシ穂軸を約２ｍｍ大に挽き、次に５％水酸化ナトリウム水溶液４Ｌに懸濁し、１１０℃で１６時間加熱した。実験室において、高熱真空下で暗褐色の液体をろ過した。溶出液に呈色が観察されなくなるまで、フィルタ上の固体残渣を水で洗浄した。固体を、実験室において真空下で２４時間乾燥させた。１００ｇのサンプルを７００ｍＬの水に懸濁し、撹拌した。溶液のｐＨを測定したところ、１１．２であった。クエン酸水溶液（１０％）を添加してｐＨを５．０に下げ、この懸濁液を３０分撹拌した。次に固形分をろ過し、水で洗浄し、室温にて真空下で２４時間乾燥させた。乾燥後、多糖類に富む８６．２ｇのバイオマスを得た。このバイオマスの湿分含量は約７．３重量％であった。糖解析用のＮＲＥＬ法により、水酸化ナトリウム処理の前後に、グルカン、キシラン、リグニン、及び総糖含量を測定した。前処理によりバイオマスを脱リグニン化させつつ、グルカン／キシランの重量比を未処理のバイオマスの１５％以内に維持した。
【０３２０】
ＮａＯＨで前処理した基質に、セルロース１ｇ当たり約５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（Ｆｖ３Ｃ及び相同体）を加え、更に、特にＢｇｌ１を低発現している株について選択した遺伝子組換え型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株Ｈ３Ａ（「Ｈ３Ａ−５株」）に由来する全セルラーゼを８．７ｍｇ添加した。本実験では、全セルラーゼ組成物には、その他の精製ヘミセルラーゼ（例えば、図６の混合物）を添加しなかった。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。
【０３２１】
結果を図５０に示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ａｎ３Ａ、及びＴｅ３Ａなどのその他のβ−グルコシダーゼと比較して、Ｆｖ３Ｃはある程度良好な性能を有するようであることが観察された。セルロース１ｇ当たり４ｍｇ以上のＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）を加えた場合、変換率が低くなることも観察された。
【０３２２】
Ｅ．希アンモニアで前処理したスイッチグラスに対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、希アンモニアで前処理した固形分１７％のスイッチグラスの糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に従って試験した。希アンモニアで前処理したスイッチグラスをＤｕＰｏｎｔから得た。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）の手法（ＮＲＥＬ  ＬＡＰ−００２）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌで利用可能）により、組成を測定した。
【０３２３】
乾燥重量に基づき、組成は、グルカン（３６．８２％）、キシラン（２６．０９％）、アラビナン（３．５１％）、酸不溶性リグニン（２４．７％）、及びアセチル（２．９８％）であった。１ｍｍスクリーンを通過させ、この原材料をナイフで細断した。細断した材料を、６重量％（乾燥固形分）アンモニアの存在下で、約１６０℃で９０分前処理した。初期固形充填量は、乾物約５０％であった。処理したバイオマスを、使用時まで４℃で保管した。
【０３２４】
この実験では、希アンモニアで前処理したスイッチグラスに、β−グルコシダーゼを低発現しているものの中から選択した組み換え型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株（Ｈ３Ａ）に由来する、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼの存在下で、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び相同体）を添加した。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。結果を図５１に示す。
【０３２５】
Ｆｖ３Ｃは、明らかにＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕよりも良好に機能した。
【０３２６】
Ｆ．ＡＦＥＸトウモロコシ葉茎に対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕが、固形分１４％のＡＦＥＸトウモロコシ葉茎の糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に従って試験した。ＡＦＥＸで前処理したトウモロコシ茎葉は、ミシガン・バイオテクノロジー・国際研究所（Michigan Biotechnology Institute International）（ＭＢＩ）より得た。トウモロコシ茎葉の組成は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）の手法ＬＡＰ−００２により測定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌで利用可能）。
【０３２７】
乾燥重量に基づき、組成は、グルカン（３１．７％）、キシラン（１９．１％）、ガラクタン（１．８３％）、及びアラビナン（３．４％）であった。１８．９リットル（５ガロン）圧力反応器（Ｐａｒｒ）において、９０℃、湿分含量６０％、バイオマス量対アンモニア充填量１：１で、この原材料を３０分ＡＦＥＸ処理した。処理したバイオマスを反応器から取り出し、ドラフト内に置き、残存しているアンモニアを蒸発させた。処理したバイオマスを、使用時まで４℃で保管した。
【０３２８】
本実験では、前処理した基質に、β−グルコシダーゼを発現している組み換え型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株に由来する、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇの全セルラーゼの存在下で、セルロース１ｇ当たり約５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（Ｆｖ３Ｃ及び相同体）を加えた（図３を参照されたい）。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。結果を図５２に示す。
【０３２９】
グルカンの変換において、Ｆｖ３Ｃが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１よりも良好に機能することが示された。上記条件下で、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇのＦｖ３Ｃと、セルロース１ｇ当たり１０ｍｇのＨ３Ａ全セルラーゼにより、完全に又は一見したところ完全にグルカンが変換されたことにも留意した。セルロース１ｇ当たり１ｍｇ未満の濃度では、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）は、見たところ、Ｆｖ３Ｃ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較してグルコース変換率及び総グルカン変換率が高いものの、セルロース１ｇ当たり２．５ｍｇ超の濃度になると、Ｆｖ３Ｃ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の方が、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕよりもグルコース変換率及び総グルカン変換率が高くなることが示された。
【０３３０】
実施例６：希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を糖化する際のＦＶ３Ｃ対全セルラーゼ比の最適化
本実験では、Ｆｖ３Ｃ対全セルラーゼ比を変えて、ヘミセルラーゼ組成物におけるＦｖ３Ｃ対全セルラーゼの最適比を決定した。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として使用した。β−グルコシダーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ）対Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）由来の全セルラーゼ比を、ヘミセルラーゼ組成物において０〜５０％で変化させた。アンモニアで前処理した固形分２０％のトウモロコシ穂軸に、タンパク質濃度がセルロース１ｇ当たり２０ｍｇとなるよう混合物を添加し、加水分解させた。結果を図５３Ａ〜５３Ｃに示す。
【０３３１】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１対全セルラーゼの最適比には幅があり、中央値が約１０％であり、混合物濃度が５０％になると、全セルラーゼを単独で充填した場合と同様の結果が得られる。対照的に、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕは約５％で最適になり、ピークはよりシャープであった。ピーク／最適濃度では、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌｕを含有している最適な混合物よりも変換率が高かった。
【０３３２】
Ｆｖ３Ｃ対全セルラーゼの最適比は約２５％であることが判明した。この場合、セルロース１ｇ当たり総タンパク質２０ｍｇの混合物により、９６％超のグルカンが変換されることになる。したがって、全セルラーゼ中の酵素のうち２５％を、単独の酵素Ｆｖ３Ｃで置き換えることで、糖化性能を向上させることができる。
【０３３３】
実施例７：アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の異なる酵素配合物による糖化
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）由来の２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼ混合物を、用量反応実験において、その他の高性能なセルラーゼ混合物と比較した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）単独に由来する全セルラーゼ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）混合物に由来する２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼ、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼを、希アンモニアで前処理した固形分２０％のトウモロコシ穂軸に対する糖化性能に関し比較した。反応時には、セルロース１ｇ当たり２．５〜４０ｍｇとなるよう酵素配合物を投与した。結果を図５４に示す。
【０３３４】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）混合物由来の２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼは、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ配合物と比較して劇的に良好であり、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）由来の全セルラーゼと比較して大幅な向上を示した。７０、８０、又は９０％のグルカンを変換させるのに必要とされる投与量を図７に掲載する。グルカン変換率７０％では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）混合物由来の２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼは、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ配合物と比較して投与量が３．２倍削減される。７０、８０、又は９０％のグルカン変換率では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）混合物由来の２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み換え株（Ｈ３Ａ）単独に由来する全セルラーゼと比較して、必要とされる酵素が約１．８倍削減される。
【０３３５】
実施例８：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株におけるＦＶ３Ｃの発現
Ａ．ニガー（A. niger）においてＦｖ３Ｃを発現させるために、米国特許第７４５９２９９号に記載の通りにＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、デスティネーションベクターｐＲＡＸｄｅｓｔ２によりｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ｃプラスミドを組み換えた。発現プラスミドには、Ａ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼのプロモーター及びターミネーターの調節下のＦｖ３Ｃゲノム配列、選択マーカー用のＡ．ニデュランス（A. nidulans）ｐｙｒＧ遺伝子、真菌細胞での自律複製用のＡ．ニデュランス（A. nidulans）ａｍａ１配列を含有させた。生成された組み換え産物によりＥ．ｃｏｌｉ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、発現コンストラクトｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃ（図５５Ａ）を含有しているクローンを２ｘＹＴ寒天プレート（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／Ｌのバクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有）で選択した。
【０３３６】
約５０〜１００ｍｇの発現プラスミドによりＡ．ニガー（A. niger）変異体アワモリ（awamori）株を形質転換させた（米国特許第７４５９２９９号を参照されたい）。内在性グルコアミラーゼｇｌａＡ遺伝子をこの株から欠失させ、かつウリジン要求性の形質転換体を選択するためにｐｙｒＧ遺伝子に変異を生じさせた。Ａ．ニガー（A. niger）形質転換体を、ＭＭ培地（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換の際に最小培地として使用したものと同様の培地。但し、窒素供給源として、アセトアミドの代わりに１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを使用した）で３７℃で４〜５日間増殖させ、異なる形質転換プレート由来の芽胞集団を合わせて（total population）（約１０６芽胞／ｍＬ）、産生培地を含有させた振とうフラスコに播種した。産生培地の組成は（１Ｌ当たり）：トリプトン１２ｇ；ソイトン８ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４  １５ｇ；ＮａＨ２ＰＯ４ｘＨ２Ｏ  １２．１ｇ；Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ  ２．１９ｇ；ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ  １ｇ；Ｔｗｅｅｎ  ８０  １ｍＬ；マルトース１５０ｇ；ｐＨ  ５．８。２００ｒｐｍで振とうさせながら３０℃で３日間発酵させた後、形質転換体におけるＦｖ３Ｃの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０３３７】
実施例９：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）の性能
Ａ．全セルラーゼ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３配合物によるＰＡＳＣ及びＰＣＳの糖化
ＲＬ−Ｐ３７由来の、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）変異株（mutant）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）からの全セルラーゼ発酵ブロスを清澄化し、セルラーゼ高産生のブロスについて選択し、これらの実験のバックグラウンドに使用した。糖化アッセイでは、基質中セルラーゼ１ｇ当たり総タンパク質量１ｍｇとなるよう、全セルラーゼ及び精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）を充填した。精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３を、濃度０〜１００％で全セルラーゼと配合した。混合物をセルロース１ｇ当たりタンパク質量２０ｍｇとなるよう充填した。各サンプルを三つ組で試験した。
【０３３８】
Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２のプロトコルに変更を加え、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１によりリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。簡潔に述べると、２５のＡｖｉｃｅｌを濃縮リン酸に溶解させた後、冷脱イオン水を用い沈殿させた。セルロースを回収し、多めの水で洗浄してｐＨを中和し、固形分１％となるよう５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）に希釈した。平底マイクロタイタープレートの各ウェルに２０μＬの希釈酵素混合物を加えた。リピーターピペットを用い、ウェル当たり１５０μＬの基質を加え、プレートを２枚のアルミニウム製プレートシーラーで覆った。
【０３３９】
希酸で前処理したトウモロコシ茎葉（上掲）を、７％セルロースとなるよう５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）緩衝液に希釈し、混合物のｐＨを５．０に調節した。リピーターピペットを用い、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに１５０μＬの基質を加えた。各ウェルに２０μＬの希釈酵素混合物を加え、プレートを２枚のアルミニウム製プレートシーラーで覆った。
【０３４０】
これらのプレートを、７００ｒｐｍで混合しながら３７℃又は５０℃でインキュベートした。ＰＡＳＣを２時間、及びＰＣＳを４８時間インキュベートした。１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）１００μＬを各ウェルに加え、反応を停止させた。十分に混合した後、プレートの内容物をろ過し、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを含有させたＨＰＬＣプレートで上清を６倍希釈した。次に、産生された可溶性糖質の濃度を、８５℃に維持したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ、脱灰化／ガードカラム（Ｂｉｏｒａｄ  ＃１２５〜０１１８）を使用）及びＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐ糖分析カラムにより測定した。流速０．６ｍＬ／ｍｉｎの水を移動相とした。ここでは、グルカン変換率（％）は、１００×［グルコース（ｍｇ）＋（セロビオース（ｍｇ）×１．０５６）］／［基質中セルロース（ｍｇ）×１．１１１］として定義する。したがって、変換率（％）は、加水分解に関係する水について補正される。得られた全セルラーゼ：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物の、５０℃でのＰＡＳＣ糖化時の性能を図６４Ａに示す。得られた全セルラーゼ：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物の、３７℃でのＰＡＳＣ糖化時の性能を図６４Ｂに示す。全セルラーゼ：酸で再処理したトウモロコシ葉茎を５０℃で糖化した際のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物を図６４Ｃに示す。全セルラーゼ：酸で再処理したトウモロコシ葉茎を３７℃で糖化した際の、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３混合物を図６４Ｄに示す。
【０３４１】
Ｂ．ＰＡＳＣにおけるＢｇｌ３と全セルラーゼバックグラウンドの用量反応
ＲＬ−Ｐ３７由来の、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）変異株（mutant）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）由来の全セルラーゼ発酵ブロスを清澄化し、セルラーゼ高産生のブロスについて選択し、これらの実験のバックグラウンドに使用した。
【０３４２】
糖化アッセイでは、基質中セルラーゼ１ｇ当たり総タンパク質量１ｍｇとなるよう、全セルラーゼ及び精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３を充填した。セルロース１ｇ当たりタンパク質量が０〜１０ｍｇとなるよう、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３を充填した。各サンプルには、セルロース１ｇ当たり全セルラーゼタンパク質量が１０ｍｇの一定濃度となるようタンパク質を充填した。各サンプルを三つ組で試験した。
【０３４３】
リン酸膨潤セルロース基質を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）緩衝液で１％セルロースに希釈し、ｐＨを５．０に調節した。平底マイクロタイタープレートの各ウェルに２０μＬの希釈酵素混合物を加えた。リピーターピペットを用い、各ウェルに１５０μＬの基質を加え、プレートを２枚のアルミニウム製プレートシーラーで覆った。次に７００ｒｐｍで混合しながらプレートを５０℃で１時間インキュベートした。
【０３４４】
１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）１００μＬを各ウェルに加え、反応を停止させた。十分に混合した後、プレートの内容物をろ過し、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを含有させたＨＰＬＣプレートで上清を６倍希釈した。次に、産生された可溶性糖質の濃度を、８５℃に維持したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ、脱灰化／ガードカラム（Ｂｉｏｒａｄ  ＃１２５−０１１８）を使用）及びＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐ糖分析カラムにより測定した。流速０．６ｍＬ／ｍｉｎの水を移動相とした。
【０３４５】
ここでは、グルカン変換率（％）は、１００×［グルコース（ｍｇ）＋（セロビオース（ｍｇ）×１．０５６）］／［基質中セルロース（ｍｇ）×１．１１１］として定義する。したがって、変換率（％）は、加水分解に関係する水について補正される。リン酸膨潤セルロースの糖化時の、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３の用量反応の比較を図６５Ａに示す。リン酸膨潤セルロースの糖化時に、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３により産生されるセロビオース及びグルコースの比較を図６５Ｂに示す。
【０３４６】
実施例１０：キメラβ−グルコシダーゼ
Ａ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）における発現
野生型Ｆｖ３ＣのＣ末端配列の一部を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼのＢｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ）由来のＣ末端配列により置き換えた。詳細には、Ｆｖ３Ｃの連続的に延びる残基１〜６９１を、Ｂｇｌ３の連続的に延びる残基６６８〜８７４と融合させた。Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラ／融合ポリペプチドをコードしている遺伝子の概略を図６０Ａに示す。融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３をコードしているアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を図６０Ｂ及び６０Ｃに示す。
【０３４７】
融合ＰＣＲによりキメラ／融合分子を構築した。Ｆｖ３Ｃ及びＢｇｌ３をコードしているゲノム配列のｐＥＮＴＲクローンを、ＰＣＲテンプレートとして用いた。いずれのエントリークローンもｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に構築した。２段階で融合産物を組み立てた。第一段階では、ｐＥＮＴＲ  Ｆｖ３Ｃクローンをテンプレートとして用い、かつ次のオリゴヌクレオチドプライマー
ｐＤｏｎｏｒ順方向：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号１２２）
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３逆方向：５’−ＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡ  ＣＣＧＡＡＣ  ＴＣＧＴＡＧ  ３’（配列番号１２３）、を用い、ＰＣＲ反応によりＦｖ３Ｃキメラ部を増幅させた。
【０３４８】
次のオリゴヌクレオチドプライマー：
ｐＤｏｎｏｒ逆方向：５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１２４）
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３順方向：５’−ＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１２５）、を用い、ｐＥＮＴＲ  Ｂｇｌ３ベクターからＢｇｌ３キメラ部を増幅させた。
【０３４９】
第二段階では、融合ＰＣＲ反応を行い、次の：
Ａｔｔ  Ｌ１順方向：５’ＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴ  ３’（配列番号１２６）
ＡｔｔＬ２逆方向：５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡ  ３’（配列番号１２７）を入れ子プライマーとして用い、等モルのＰＣＲ産物（初期ＰＣＲ反応産物を各約１μＬ及び０．２μＬ）をテンプレートとして加えた。
【０３５０】
高性能Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ）を用い、ＰＣＲ反応を実施した。得られる融合ＰＣＲ産物は、インタクトなＧａｔｅｗａｙ特異的ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２組み換え部位を末端に含有しており、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により最終的なデスティネーションベクターに直接クローニングすることができた。
【０３５１】
０．８％アガロースゲルでＤＮＡ断片を分離した後、断片をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）で精製し、ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３デスティネーションベクター及びＬＲクロナーゼ（商標）ＩＩ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、各１００ｎｇの断片を組換えた。得られた組み換え産物によりＥ．ｃｏｌｉ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、キメラβ−グルコシダーゼを収容している発現コンストラクトｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合体（図６１）を含有しているクローンを、２ｘＹＴ寒天プレートで選択した。２ｘＹＴ寒天プレートは、１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／Ｌのバクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを用い調製した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有させた２ｘＹＴ培地でバクテリアを増殖させた。その後、プラスミドを単離し、ＢｇｌＩ又はＥｃｏＲＶのいずれかの制限酵素により消化した。得られたＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３領域の配列をＡＢＩ３１００シークエンスアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により確認した。制限酵素によるプラスミドの消化パターンを確認し、正しい配列をテンプレートとして用い、かつ高性能Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ）と、次のプライマー：
Ｃｂｈ１順方向：５’ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧ  ３’（配列番号１２８）
ＡｍｄＳ逆方向：５’ＣＣＴＧＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴＡＡＣＣＧ  ３’（配列番号１２９）、を用い、更にＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を生成した。
【０３５２】
得られた断片は、ｃｂｈ１プロモーター及びターミネーターの調節下にＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３コード領域を包含していた。この断片を０．５〜１μｇ用い、下記の通り若干の変更を加えたプロトプラスト−ＰＥＧ法により、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）６遺伝子欠失株（上記を参照されたい）を特異的に形質転換させた。プロトプラストの調製に際し、１５０ｒｐｍで振とうさせながらトリコデルマ（Trichoderma）最少培地ＭＭ（組成：２０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ４．５）、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、１ｍＬの１０００ｘ  Ｔ．リーゼイ（T. reesei）微量元素溶液（組成：５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４ｘＨ２Ｏ、３．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ））により、２４℃で１６〜２４時間芽胞を増殖させた。出芽した芽胞を遠心分離により回収し、５０ｍｇ／ｍＬのＧｌｕｃａｎｅｘ  Ｇ２００（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＡＧ）溶液により処理し、真菌細胞壁を溶解させた。更に、Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ６１（１９８７）１５５〜１６４に記載の方法に従って、プロトプラストを調製した。
【０３５３】
形質転換混合物（総量２００μＬ中に約１μｇのＤＮＡ及び１〜５×１０７プロトプラストを含有）を、各々２５％  ＰＥＧ溶液２ｍＬで処理し、２倍量の１．２Ｍのソルビトール／１０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭのＣａＣｌ２で希釈し、３％  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｏｐ  ａｇａｒｏｓｅ  ＭＭ（５ｍＭのウリジン及び２０ｍＭのアセトアミド含有）と混合した。得られた混合物を、ウリジン及びアセトアミドを含有させた２％  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｒｏｓｅプレートに接種した。プレートを２８℃で更に７〜１０日間インキュベートした後、１つの形質転換体をウリジン及びアセトアミドを含有させた新しいＭＭプレートに再度接種した。別個のクローン由来の芽胞を９６ウェルマイクロタイタープレート又は振とうフラスコのいずれかの発酵培地に接種した。
【０３５４】
２５０μＬのグリシン系産生培地（組成：４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌの１，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸（ｐＨ  ５．５）、６．０ｇ／Ｌのグリシン、５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、２．５ｍＬ／Ｌの４００ｘ  Ｔ．リーゼイ（T. reesei）微量元素溶液、２０ｇ／Ｌのグルコース、及び６．５ｇ／Ｌのソホロース）を含有させた９６ウェルフィルタプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３ハイブリッド体を発現しているＴ．リーゼイ（T. reesei）形質転換体の芽胞懸濁物を接種した（芽胞数はウェル当たり１０４個超）。２８℃及び約８０％湿度でプレートを６〜８日間インキュベートした。真空ろ過により培養上清を回収し、ハイブリッド体の性能及びその発現レベルについて試験した。全ブロスサンプルのタンパク質プロファイルは、ＰＡＧＥ電気泳動により決定した。２０μＬの培養上清を、還元剤を不含有の４ｘサンプル緩衝液８μＬと混合した。ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、サンプルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  １０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにより分離させた。
【０３５５】
この結果、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３（ＦＢ）キメラβ−グルコシダーゼをＴ．リーゼイ（T. reesei）で発現させた場合又は貯蔵時のプロテアーゼ分解への感受性が低下した。マイクロタイタープレートでの発酵８日後、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３（ＦＢ）キメラで発現させたβ−グルコシダーゼの分解は、同等の条件下でのＦｖ３Ｃ  β−グルコシダーゼの分解と比較して有意に低下したことがに観察された。
【０３５６】
Ｂ．クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）宿主細胞におけるＦｖ３Ｃ及びＦＡＢの発現
発現カセットの構築
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（ｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３ｃ、実施例３、図４５Ｂ）及びＡ．ニガー（A. niger）（ｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃ、実施例８、図５５Ａ）について記載したＦｖ３Ｃ発現ベクターを用い、Ｆｖ３Ｃ又はＦＡＢをクリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）で発現させる。ネイティブなＦｖ３Ｃシグナル配列を使用する。ベクターｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃは、Ａ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼのプロモーター及びターミネーター配列の調節下のｆｖ３Ｃ遺伝子配列、選択マーカー用のＡ．ニデュランス（A. nidulans）ｐｙｒＧ遺伝子、真菌細胞での自律複製用のＡ．ニデュランス（A. nidulans）ａｍａ１配列を含有する。ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３ｃは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーターの調節下のＦｖ３Ｃ翻訳領域、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）変異型（mutated）アセト乳酸合成酵素選択マーカー（ａｌｓ）とそのネイティブなプロモーター及びターミネーターを含有する。あるいは、フレオマイシン又はハイグロマイシン耐性の選択マーカー、又は栄養要求性（ａｍｄＳ）選択マーカーのアセトアミダーゼも使用できる。
【０３５７】
Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense）の形質転換
Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ６１（１９８７）１５５〜１６４に記載の手法に、例えば米国特許第６，５７３，０８６号などの当該技術分野で知られる修正を行って、プロトプラスト融合法を用い、ｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３ＣによりＣ．ラックノウエンス（C. lucknowense）宿主細胞を形質転換させる。次に、新しいクロリムロンエチルプレートで耐性形質転換体を選択することができる。あるいは、プロトプラスト融合法を用い、ｐｙｒＧ−（ウリジン要求性）Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense）宿主細胞を、ｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃにより形質転換させ、上掲実施例８に記載の通りにウリジン要求性について選択することができる。
【０３５８】
タンパク質産生の際のＣ．ラックノウエンス（C. lucknowense）形質転換体の培養
例えば、国際公開第９８／１５６３３号に記載の培地を使用し、ＣＢＨＩプロモーターの誘導にセルロース若しくはラクトースを用い、又はグルコアミラーゼプロモーターの誘導にマルトース、マルトリン、又はデンプンを用い、振とうさせながら、Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense）形質転換体を２７〜４０℃、ｐＨ  ５〜１０で約５日間培養し、Ｆｖ３Ｃ及びＦＡＢを産生させる。
【０３５９】
実施例１１：キメラ型β−グルコシダーゼ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びペプチドマッピング解析により、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラ体は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で産生させた場合に２種の断片に切断されることが明らかになった。Ｎ末端配列を決定した所、Ｆｖ３Ｃの全長の残基６７４及び６８３の間に切断領域が示された。
【０３６０】
Ｆｖ３Ｃに由来するＮ末端配列、タラロマイセス・エマーソニィ（Talaromyces emersonii）Ｔｅ３Ａ由来の第２のβ−グルコシダーゼの配列のループ領域、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（又はＴｒ３Ｂ）に由来する一部のＣ末端配列からなる、第２のキメラ型β−グルコシダーゼを構築した。この構築は、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラ体のループ領域を置き換えて実施した（上掲実施例１０を参照されたい）。Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラ（ＲＲＳＰＳＴＤＧＫＳＳＰＮＮ  ＴＡＡＰＬ（配列番号１５７）の配列を有する）のＦｖ３Ｃ残基６６５〜６８３を、Ｔｅ３Ａ残基６３４〜６４０（ＫＹＮＩＴＰＩ（配列番号１５８））で特異的に置換した。上掲の実施例１０に記載の通りに融合ＰＣＲ法を用い、このハイブリッド分子を構築した。
【０３６１】
２つのＮ−グリコシル化部位、すなわちＳ７２５Ｎ及びＳ７５１ＮをＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３骨格に組み込んだ。テンプレートとしてｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合核外遺伝子（図６１）を選択し、上記の通りに融合ＰＣＲ増幅法を用い、これらのグリコシル化変異（mutations）をＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３骨格に組み込み、初期ＰＣＲ産物を生成した。別個のＰＣＲ反応に次のプライマー対を加えた：
Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向：５’ＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣ  ３’（配列番号１３０）及び
７２５／７５１逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＣＣＴＴＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧ  ３’（配列番号１３１）
７２５／７５１順方向：５’−ＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣ  ３’（配列番号１３２）、及び
Ｔｅｒ  ＣｂｈＩ逆方向：５’ＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＧ  ３’（配列番号１３３）。
【０３６２】
次に、Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向及びＴｅｒ  ＣｂｈＩプライマーを用い、ＰＣＲ産物を融合させた。得られた融合産物は、所望のグリコシル化部位だけでなく、インタクトなａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２領域も含有していたことから、Ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｐＤｏｎｏｒ２２１ベクターに組み込むことができた。これにより、次にｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３／Ｓ７２５Ｎ  Ｓ７５１Ｎクローンを骨格として使用し、３重ハイブリッド分子Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３を構築した。
【０３６３】
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３ハイブリッド体の残基６６５〜６８３を、Ｔｅ３Ａ由来のループ配列で置き換えるために、次のプライマーセット：
セット１：ｐＤｏｎｏｒ順方向：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ  ３’（配列番号１２２）及び
Ｔｅ３Ａ逆方向：５’−ＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣ  ３’（配列番号１６０）；
セット２：Ｔｅ３Ａ２順方向：５’−ＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＧＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号１６１）；及び
ｐＤｏｎｏｒ逆方向：５’ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ  ３’（配列番号１２４）、を用い、一次ＰＣＲ反応を実施した。
【０３６４】
一次ＰＣＲ反応により得られた断片を、次に次のプライマー：
Ａｔｔ  Ｌ１順方向：５’ＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴ  ３’（配列番号１２６）及び
ＡｔｔＬ２逆方向：５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡ  ３’（配列番号１２７）、を用い融合させる。
【０３６５】
得られる融合ＰＣＲ産物は、インタクトなＧａｔｅｗａｙ特異的ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２組み換え部位を末端に含有しており、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により最終的なデスティネーションベクターに直接クローニングすることができた。
【０３６６】
Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３をコードしている遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号８３］として掲載する。Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３（ＦＡＢ）ハイブリッド体のアミノ酸配列は配列番号１３５として掲載する。Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ体をコードしている遺伝子配列をｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３ベクターにクローン化し、上掲実施例１０に記載の通りに、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）レシピエント株で発現させた。
【０３６７】
実施例１２：キメラβ−グルコシダーゼの安定性の向上
本実験では、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を用い、各種β−グルコシダーゼの熱変性温度を決定した。精製酵素Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ体、Ｆｖ３Ｃ、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１について、特異的に熱遷移温度を測定した。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）で、酵素を５００ｐｐｍに希釈した。ＤＳＣ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭｉｃｒｏＣａｌ）に、各酵素希釈サンプルを５００μＬずつ充填した。水及び緩衝液のブランクも充填した。ＤＳＣ（Ａｕｔｏ  ＶＰ−ＤＳＣ，ＭｉｃｒｏＣａｌ）パラメータを、スキャン速度９０℃／ｈ；開始温度２５℃、最終温度１１０℃に設定した。サーモグラムを図６３に示す。Ｆｖ３Ｃ及びＦｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ体のＴｍは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のものと類似しているようであり、かつＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して若干低いようであった。
【０３６８】
実施例１３：希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化におけるＡ．ニガー（A. niger）で発現させたＦＶ３Ｃの活性
基質中セルロース１ｇ当たり総タンパク質量１ｍｇとして、組み換え株Ｈ３Ａ−５（β−グルコシダーゼ低産生株）、Ａ．ニガー（A. niger）で産生させたＦｖ３Ｃ（実施例８を参照されたい）、及び精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（本明細書において、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌｕ１」又は「Ｔｒ３Ａ」とも呼ばれる）を糖化アッセイに用いた。セルロース１ｇ当たり０〜１０ｍｇのβ−グルコシダーゼを充填した。各サンプルに１０ｍｇ／ｇの一定濃度でＨ３Ａ−５を加えた。各サンプルを５つ組で実施した。
【０３６９】
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸基質を５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）緩衝液で７％セルロース濃度に希釈し、ｐＨを５．０に調節した。基質を９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた（ウェル当たり６５ｍｇ）。適切に希釈した酵素混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに３０μＬずつ入れた。酵素混合物を加えた後、基質は５％セルロースを含有するものと計算した。２枚のアルミニウム製プレートシーラーでプレートを覆った。次に５０℃に設定したインキュベータにすべてのプレートを入れ、２００ｒｐｍで４８時間振とうさせた。
【０３７０】
各ウェルに１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）を１００μＬ入れて反応を停止させた。十分に混合した後、プレートの内容物を遠心分離し、上清を、１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）１００μＬを含有させたＨＰＬＣプレートで１１倍希釈した。次に、生成された可溶性糖質の濃度をＨＰＬＣにより測定した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ装置に脱灰化／ガードカラム（Ｂｉｏｒａｄ  ＃１２５−０１１８）と、Ａｍｉｎｅｘ糖分析カラム（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐ）を取り付け、８５℃に維持した。流速０．６ｍＬ／ｍｉｎの水を移動相とした。
【０３７１】
グルカン変換率は、１００×［グルコース（ｍｇ）＋（セロビオース（ｍｇ）×１．０５６）］／［基質中セルロース（ｍｇ）×１．１１１］として定義する。この方法では、加水分解に関係する水について補正した変換率（％）を図６２に示す。
【０３７２】
実施例１３：ＦＶ３Ｃ、ＦＡＢ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）ＢＧＬ１の基質結合性の比較
本実験では、特定の典型的なバイオマス基質に対する、Ｆｖ３Ｃ、β−グルコシダーゼのキメラ分子ＦＡＢ、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の各々の結合性を比較する。
【０３７３】
フェニルプロパノイド系の複雑な生体高分子であるリグニンは、木材の主要な非糖系成分であり、セルロース繊維に結合して、植物の細胞壁を堅固で強靭なものにする。リグニンは他の細胞壁成分を互いに架橋するため、セルロース分解酵素は、リグニンによりセルロース及びヘミセルロースへの接近性が阻害されることになる。したがって、概してリグニンはすべての植物性バイオマスの易消化性を低下させるよう機能する。特に、セルラーゼがリグニンに結合することで、セルラーゼによるセルロースの分解は減少することになる。リグニンは疎水性であり、負に帯電しているものと考えられる。ＦＡＢ、Ｂｇｌ１、及びＦｖ３Ｃ間では、Ｆｖ３Ｃが最も低いｐＩを有し、かつ最も負に帯電しているのに対し、Ｂｇｌｕ１は最も高いｐＩを有し、かつ最も正に帯電していた。リグノセルロース系基質に対するこれらの結合を調査した。
【０３７４】
リグニンを除去し、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（ＤＡＣＣ）若しくはトウモロコシ茎葉（ＤＡＣＳ）、又は酸で前処理したトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ又はｗｈＰＣＳ）を、セルロース１ｇ当たり１００ｍｇのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅと８ｍｇのマルチフェクトキシラナーゼとを含有させた糖化混合物を用い広範に糖化した。糖化後、非特異的なセリンプロテアーゼを添加し、セルラーゼの加水分解を行った。混合物に０．１ＮのＨＣｌを加え、プロテアーゼを不活性化し、酢酸緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５））で数回洗浄し、サンプルのｐＨを５に戻す。
【０３７５】
１００μＬのＤＡＣＳ（約５％グルカン）、ＤＡＣＣ（約５％グルカン）、ｗｈＰＣＳ（約５％グルカン）、ＤＡＣＣから調製したリグニン（５％グルカンとして）、ＰＣＳから調製したリグニン（５％グルカンとして）、又は対照として５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）緩衝液を、マイクロタイタープレートで、１００μＬの、１５０μｇ／ｍＬのＦＡＢ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、又はＦｖ３Ｃと組み合わせ、次にシールし、５０℃で４４時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを高速で遠心分離して、不溶性画分と可溶性画分とを分離した。可溶性画分に含まれる酵素活性を測定した。簡潔に述べると、上清を５倍希釈し、次に上清のうち２０ｕＬを２ｍＭの２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＮＰＧ）８０ｕＬに加え、室温で６分インキュベートした。５００ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ  ９．５）１００ｕＬを加えて反応を停止させた。ＯＤ４０５を読み取った。可溶性画分中の活性なβ−グルコシダーゼのＯＤ４０５を、リグニン及びバイオマス基質は含有させずに同様の方法でインキュベートした対照サンプルのＯＤ４０５で除算して、未結合のβ−グルコシダーゼの割合を算出した。
【０３７６】
結合型及び未結合型のβ−グルコシダーゼの総活性を測定した。マイクロタイタープレートを再混合し、各２０ｕＬのアリコートを８０ｕＬの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）に加え、２０ｕＬの希釈混合物を８０ｕＬの２ｍＭの２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＮＰＧ）に加え室温で６分インキュベートし、１００ｕＬの５００ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ  ９．５）を加え反応を停止させた。反応混合物をスピンダウンし、新しいマイクロタイタープレートに１００ｕＬの上清を入れた。ＯＤ４０５を読み取った。総混合物のＯＤ４０５を、リグニン及びバイオマス基質は含有させずに同様の方法でインキュベートした対照サンプルのＯＤ４０５で除算して、バイオマス又はリグニンの存在下での相対的な総β−グルコシダーゼ活性を算出した。
【０３７７】
結合したβ−グルコシダーゼが測定時間内に解離していなかったことを確認するために、再混合したマイクロタイタープレートから２０ｕＬのアリコートを分取して、新しいマイクロタイタープレート中の８０ｕＬの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）に入れ、プレートを振盪させながら室温で３０分インキュベートし、バイオマス又はリグニンからβ−グルコシダーゼを解離させた。次に、プレートを遠心分離し、上記の通りに上清中のβ−グルコシダーゼ活性を測定した。再度、未結合のβ−グルコシダーゼを算出した。
【０３７８】
Ｆｖ３Ｃはバイオマス基質又はリグニンへの結合が最も少なかったのに対し、ＦＡＢ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）１はいずれも大部分がバイオマス基質及びリグニンに結合していたことが示された（図７１Ａ）。これら３種のβ−グルコシダーゼのうちの何れもがＤＡＣＣに結合しなかったものの、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）及びＦＡＢは、ＤＡＣＣを完全糖化し調製したリグニンに結合した。驚くべきことに、結合型のＦＡＢ又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１は、遊離型のＦＡＢ又はＢｇｌ１と比較して約５０〜８０％の活性を保持していた（図７１Ｂ）。結合型のＦＡＢはバイオマス又はリグニンから解離していなかったものの、３０分のインキュベーション時間中に約２０％のＢｇｌ１が解離して結合状態から非結合状態になっていたことも判明した（図７１Ｃ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2014509858.tif 000010
【図４Ｂ】
2014509858.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３Ａ−１】
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【図４３Ａ−２】
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【図４３Ａ−３】
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【図４３Ａ−４】
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【図４３Ａ−５】
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【図４３Ａ−６】
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【図４３Ａ−７】
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【図４３Ｂ−１】
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【図４３Ｂ−２】
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【図４３Ｂ−３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７】
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【図４８】
2014509858.tif 000109
【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
2014509858.tif 000120
【図５５Ｄ】
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【図５５Ｅ】
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【図５５Ｆ】
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【図５５Ｇ】
2014509858.tif 000124
【図５５Ｈ】
2014509858.tif 000125
【図５５Ｉ】
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【図５６】
2014509858.tif 000127
【図５７Ａ】
2014509858.tif 000128
【図５７Ｂ】
2014509858.tif 000129
【図５８】
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【図５９Ａ】
2014509858.tif 000131
【図５９Ｂ】
2014509858.tif 000132
【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ−１】
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【図６０Ｂ−２】
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【図６０Ｃ】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６４Ｄ】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７０Ｄ】
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【図７０Ｅ−１】
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【図７０Ｅ−２】
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【図７０Ｆ】
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【図７０Ｇ】
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【図７０Ｈ】
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【図７０Ｉａ】
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【図７０Ｉｂ】
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【図７０Ｊ】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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