(57)【要約】クロストリジウム・ディフィシル疾患は、軽症の〜自己限定的な下痢から生命を危うくする偽膜性大腸炎および巨大結腸症までに及ぶ、ある範囲の臨床像を含む。Ｃ．ディフィシルの症例は、疾患の重症度に応じて異なる方法で処置される。軽症および中程度の症例はメトロニダゾールを用いて処置することができ、一方で中程度〜重症の、および再燃性の症例はしばしばバンコマイシンまたはフィダキソマイシンで処置される。Ｃ．ディフィシル疾患の存在は、Ｃ．ディフィシル抗原（ＧＤＨ）、毒素ＡおよびＢ、ならびに糞便中ラクトフェリンが含まれるバイオマーカーの一団を用いて検出される。Ｃ．ディフィシル疾患が疑われる患者において、ＧＤＨが検出された場合、それはＣ．ディフィシルの存在を示しており、次いで毒素産生性Ｃ．ディフィシルを示すために、およびＣ．ディフィシル関連疾患の診断を支持するために毒素Ａおよび／またはＢが検出され、腸炎症の量を示すことによりその疾患の重症度を決定するために糞便中ラクトフェリン濃度が測定される。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法が中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を、重症の腸炎症を示す糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルに関して検査結果が陽性であった患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルが定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の使用により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラクトフェリンの高められたレベルが糞便試料中で１００μｇ／ｍＬ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
療法上有効な処置がグリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
療法的処置が天然細菌叢移植である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法が中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を、中程度の腸炎症を示す糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルに関して検査結果が陽性であった患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルが定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の使用により決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ラクトフェリンの高められたレベルが糞便試料中で７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
療法上有効な処置が１種類以上のニトロイミダゾール系抗生物質である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
療法上有効な処置が天然細菌叢移植である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
クロストリジウム・ディフィシル疾患の重症度により患者を診断する方法であって、該方法がＣ．ディフィシル疾患を有すると診断されている人から糞便試料を得て；該糞便試料中にラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルが存在するかどうかを決定し；そして該糞便試料中にラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルが存在することが決定されたら、該糞便試料中に存在するラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルに基づいて該Ｃ．ディフィシル疾患の重症度を同定することを含む、前記方法。
【請求項１２】
糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルが定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の使用により決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ラクトフェリンの高められたレベルが糞便試料中で１００μｇ／ｍＬ以上であり、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度が中程度〜重症であると考えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
療法上有効な処置がグリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
療法上有効な処置が天然細菌叢移植である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ラクトフェリンの高められたレベルが糞便試料中で７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬであり、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度が中程度であると考えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
療法上有効な処置が１種類以上のニトロイミダゾール系抗生物質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ラクトフェリンの高められたレベルが糞便試料中で７．２５μｇ／ｍＬ未満であり、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度が軽症であると考えられ、療法上有効な処置が無処置である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法であって、Ｃ．ディフィシルを有すると診断された患者において疾患の重症度を決定するために用いられるラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルが以下：１日あたりの形を成さない便の数、発熱の存在、腹痛、および嘔吐の１種類以上を含む臨床症状、ならびにＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、およびクレアチニンの１種類以上を含む実験室パラメーターの１種類以上と組み合わせられる、前記方法。
【請求項２０】
Ｃ．ディフィシルの診断が毒素産生性Ｃ．ディフィシルの存在を示すバイオマーカーの存在に基づいて結論付けられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を監視する方法であって、該方法が第１の時点において患者から第１の糞便試料を得て；第１の時点よりも後の第２の時点において同じ患者から第２の糞便試料を得て；第１の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第１の量を第２の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第２の量と比較して第１の時点および第２の時点の間のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化を同定し；ラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化に基づいて、患者のＣ．ディフィシル疾患の重症度における変化を同定し；そして患者のＣ．ディフィシル疾患の重症度における変化の同定に基づいて、Ｃ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を該患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
療法上有効量の処置が、ラクトフェリンのレベルが患者の第２の糞便試料に関して７．２５μｇ／ｍＬ未満に低下していた場合、処置を停止することである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
療法上有効量の処置が、ラクトフェリンのレベルが患者の第２の糞便試料に関して７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬである場合、中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置がニトロイミダゾール系抗生物質の１種類以上を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
療法上有効量の処置が、ラクトフェリンのレベルが患者の第２の糞便試料に関して１００μｇ／ｍＬ以上である場合、中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することであり、１００μｇ／ｍＬ以上のラクトフェリンのレベルが重症の腸炎症を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置がグリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上を用いた処置を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置が天然細菌叢移植を用いた処置を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を監視する方法であって、該方法が第１の時点において患者から第１の糞便試料を得て；第１の時点よりも後の第２の時点において同じ患者から第２の糞便試料を得て；第１の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第１の量を第２の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第２の量と比較して第１の時点および第２の時点の間のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化を同定し；ラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化に基づいて、患者のＣ．ディフィシル疾患の重症度における変化を同定し；そしてＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を、第２の糞便試料を得た後に該患者に投与することを含み、該患者が第１の時点においてＣ．ディフィシルの軽症の症例を、第２の時点において増大した量のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上を有し、第１の試料における第１の量および第２の試料における第２の量の比較が増大した腸炎症およびＣ．ディフィシル疾患の悪化を示す、前記方法。
【請求項２９】
療法上有効量の処置が、ラクトフェリンのレベルが患者の第２の糞便試料に関して７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬである場合、中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置がニトロイミダゾール系抗生物質の１種類以上を用いた処置を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
療法上有効量の処置が、ラクトフェリンのレベルが患者の第２の糞便試料に関して１００μｇ／ｍＬ以上である場合、中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置がグリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上を用いた処置を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置が天然細菌叢移植を用いた処置を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｃ．ディフィシル疾患の存在およびＣ．ディフィシル疾患の重症度を決定する診断法であって、該方法が患者から糞便試料を得て；同じ患者の糞便試料から第１のバイオマーカーの存在を決定し、第１のバイオマーカーの存在がＣ．ディフィシル疾患の存在を示し；そして同じ患者の糞便試料から第２のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、第２のバイオマーカーのレベルがＣ．ディフィシル疾患の重症度を示す、前記方法。
【請求項３５】
第１のバイオマーカーがＣ．ディフィシルのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１のバイオマーカーがＣ．ディフィシルの毒素Ａを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
第１のバイオマーカーがＣ．ディフィシルの毒素Ｂを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
第１のバイオマーカーがＣ．ディフィシルの毒素Ａ遺伝子（ｔｃｄＡ）またはＣ．ディフィシルの毒素Ｂ遺伝子（ｔｃｄＢ）の１以上を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
第２のバイオマーカーが患者の糞便試料中のラクトフェリンのレベルを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
第２のバイオマーカーが患者の糞便試料中のカルプロテクチンのレベルを含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１２年４月２６に出願された米国特許出願一連番号13/457,064および２０１２年４月２６に出願された米国特許出願一連番号13/457,049に対する優先権を主張し、その両方が２０１１年４月２９日に出願された米国仮出願一連番号61/480,616に対する優先権を主張し、その全てを明確に本明細書にそのまま援用する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症（ＣＤＩ）は、軽症の〜自己限定的な（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）下痢から生命を危うくする偽膜性大腸炎および巨大結腸症までが含まれる、ある範囲の臨床像を含む。多くの健康な人（例えば乳児）がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）を保菌しており、多くの患者が病院への入院後に無症候性保菌者になる。ほとんどの症例は、臨床評価、抗生物質使用の履歴、ならびに便中のその生物および／または毒素ＡおよびＢ（すなわちそれぞれＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ）の存在に基づいて診断される。酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）試験は、便標本中の毒素を測定するための最も頻繁に用いられる試験形式であり、特異的な中和と組み合わせられた組織培養は便中の毒素を検出するための至適基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）である。最近、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験がＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢ遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）の存在を決定するために利用可能であり、これらは独立した試験として、およびＣ．ディフィシル陰性の患者を除外するためにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の検出との組み合わせで用いられる。これらのアッセイの全てが診断の助けとしてＣ．ディフィシルの存在を検出するのに適しているが、疾患の重症度に関する情報は提供しない。
【０００３】
その疾患の重症度は、適切な一連の処置を勧めるための重要な要因である。一般に、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者はしばしば発熱を示し、わずかに上昇した白血球（白血球増加）を有し、そして軽症の腹痛を経験する。軽症の症例は刺激している（ｉｎｃｉｔｉｎｇ）抗生物質の中断によく応答するが、中程度および／または中程度〜重症のＣ．ディフィシル疾患の症例はしばしば抗生物質介入を必要とする。現在、医学的および／または外科的処置を最適化するためにＣＤＡＤの重症度に基づいて患者を層別化するためにルーチン的に用いられている単一の実験室パラメーターはない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本発明の説明的な態様を、添付された図面への参照により下記で詳細に記述し、ここで：
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の態様に従うＣ．ディフィシル疾患を有すると診断された患者に関する患者の特徴を示し；
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の態様に従う重症度により層別化された臨床的に定義されたＣ．ディフィシル疾患の症例を有する患者に関する平均ラクトフェリンレベル（μｇ／ｍＬ±標準誤差）を示し；
【図２】図２は、本発明の態様に従うＡＲＬ０２７対他のリボタイプのＣ．ディフィシル感染症により層別化された患者に関する平均ラクトフェリンレベル（μｇ／ｍＬ±標準誤差）を示し；
【図３】図３は、本発明の態様に従うＣ．ディフィシル疾患を有する患者における抗生物質処置の間および後のラクトフェリンレベルの毎日の監視を示し；
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の態様に従う臨床的治癒（最初の処置の間および／または後に症状がなく、且つＣ．ディフィシルがいない）を有する患者に関するバイオマーカーの結果の要約を示し；
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の態様に従う細菌の再感染（最初の処置の間および／または後の、症状の非存在下でのＣ．ディフィシルの再出現（ｒｅｔｕｒｎ））を有する患者に関するバイオマーカーの結果の要約を示し；そして
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の態様に従う臨床的再発または非治癒（最初の処置の間および／または後の、症状およびＣ．ディフィシルの再出現）を有する患者に関するバイオマーカーの結果の要約を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度に基づく患者の層別化を助けるための試験法に向けられている。バイオマーカーの一団（ｐａｎｅｌ）を用いた疾患を有する患者の重症度に基づく層別化は、発生率の増大および頻繁な重症の症状および抗生物質の使い過ぎのため、決定的に必要とされている新規の概念である。より多くの毒素および芽胞を産生する大流行株リボタイプＡＲＬ  ０２７の出現は、より重症のＣ．ディフィシル疾患およびより大きな再燃の機会と結びついてきた。加えて、抗生物質フィダキソマイシン（ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）（Ｄｉｆｉｃｉｄ）のようなより新しい薬物療法がＣ．ディフィシル疾患に関する追加の処置選択肢を与える。L. Kyneらにより１９９９年に公開された研究において、著者はアイルランド、ダブリンにおけるＣＤＡＤの大流行に関する疾患状態の詳細な特性付けを実施した。この特定の大流行には、便中細胞毒素陽性であるが無症候性である１４人の患者が含まれていた。症候性の患者の内で、２５％は抗生物質処置なしの軽症の自己限定的疾患を有し、３５％は抗生物質処置に応答する中程度に重症のＣ．ディフィシル疾患を有し、そして４０％は１１〜３６日間続く長期化した症状を有する重症の疾患を発現した。Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者の合計８％が、偽膜および中毒性巨大結腸症を伴う重症の大腸炎へと進行した。著者は、医師はＣ．ディフィシル疾患の症例に関する罹患率および死亡率を低下させるために疾患重症度の早期の指標に気を付けるべきであると特筆した。
【０００６】
臨床像および様々な実験室パラメーターの組み合わせが、患者を疾患活動性（例えば軽症、中程度、および中程度〜重症）により層別化するために評価されてきた。白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミンレベル（腸中への漏出の指標）、および腎不全を監視するためのクレアチニンレベルが、Ｃ．ディフィシルに関する疾患活動性に関する最も一般的に用いられる実験室指標である。Ｃ．ディフィシルの軽症〜中程度の症例は、通常は１５，０００／μＬ以下のＷＢＣ、正常な血清クレアチニン（２．０ｍｇ／ｄＬ未満）およびアルブミンレベル（２．５ｇ／ｄＬ以上）を示す。症状には、１日あたり血液を含まない１０未満の水様便を有すること、および平均４日までの間続く軽症の痙攣が含まれる。軽症〜中程度のＣ．ディフィシル疾患の初期のエピソードを有する患者に関する一般的な処置は、ニトロイミダゾールクラスの抗生物質のメンバーを用いた処置である。例えば、軽症〜中程度のＣ．ディフィシル疾患は、５００ｍｇメトロニダゾールで１日３回１０日間処置することができる。ほとんどの症例はさらなる合併症なしで消散する（ｒｅｓｏｌｖｅ）が、これらの症例の２５％に至るまでが複数回再燃して第２ラウンドの抗生物質を必要とする可能性があり、それには歴史的にバンコマイシンのようなグリコペプチドクラスの抗生物質のメンバーを用いた処置が含まれてきた。しかし、今日ではそのような第２ラウンドの抗生物質にはフィダキソマイシン（Ｄｉｆｉｃｉｄ）のような大環状クラスの抗生物質のメンバーが含まれる。
【０００７】
６５歳を超える多数の共存症を有する患者はＣ．ディフィシル疾患に関するより高い危険にさらされており、多数回の再燃につながるより重症の疾患を患う頻度がより高い。重症の劇症型Ｃ．ディフィシル疾患は、１０日より長い間の１日あたり１１以上の液状便を有することを特徴とする。便標本はしばしば粘膜を含有し、血性である可能性がある。劇症型Ｃ．ディフィシル大腸炎に関する定義された実験室パラメーターは、１５，０００／μＬ以上のＷＢＣ、乏しい腎機能を示す上昇している血清クレアチニン（５０％の増大および２．０ｍｇ／ｄＬ以上のレベル）、および血清の腸中への滲出のためのタンパク質の喪失を示す２．５ｇ／ｄＬ未満に低下したアルブミンレベルである。臨床像には、内視鏡検査の際の偽膜、重症の腹痛および痙攣、ならびにＣＴスキャンにより観察される大腸の肥厚が含まれる可能性がある。腸閉塞に由来する中毒性巨大結腸症が起こる可能性があり、それは吐き気、嘔吐、重症の脱水、およ極度の嗜眠を引き起こす。Ｃ．ディフィシル疾患の重症および再燃性の症例に関する処置には、通常１０日間の１日あたり４回の１２５ｍｇバンコマイシンが含まれる。
【０００８】
Ｃ．ディフィシル感染症を有する患者に関する疾患活動性の同定は、適切な処置ならびに罹患率および死亡率が低下したよりよい転帰に必須である。本発明の１態様は、糞便中ラクトフェリンを測定し、その糞便中ラクトフェリンの測定値をＣ．ディフィシルにより引き起こされる腸炎症に関する指標として用いることにより、Ｃ．ディフィシル疾患における重症度を評価するための診断パラメーターを提供する。
【０００９】
Ｃ．ディフィシル疾患は、活性化された好中球の粘膜を越える管腔中への浸潤を含む炎症性疾患であり、それは大腸炎を、そして重症の症例では偽膜の形成を引き起こす。ヒトラクトフェリンはほとんどの粘膜分泌中に存在する糖タンパク質であり、活性化された好中球の顆粒の主な構成要素である。Ｃ．ディフィシルからの腸炎症の発症の間、活性化された好中球が腸管腔に浸潤し、糞便中ラクトフェリンの増大を引き起こす。
【００１０】
糞便標本はＣ．ディフィシル検査（抗原および毒素）に関してルーチン的に収集される。従って、疾患の重症度の指標としての腸炎症の量を決定するために、糞便中ラクトフェリンのレベルを測定するための追加の検査を行うことができる。加えて、抗原の存在ならびに毒素ＡおよびＢのレベルを糞便中ラクトフェリン濃度と組み合わせることは、最適な医学的処置のための患者が真の軽症〜重症の感染症を有する患者からの保菌者であるかどうかの決定において医師を助けることができる。
【００１１】
本発明の１態様において、糞便中ラクトフェリンレベルを用いてＣ．ディフィシル疾患を有する患者において疾患の重症度を評価するための方法が提供される。毒素Ａは、ＩＬ−８の放出および活性化された好中球の腸粘膜中への浸潤を引き起こす、走化性の強いタンパク質である。実際、毒素Ｂの濃度の１００倍未満の毒素Ａ濃度がＩＬ−８の放出を刺激することが示されている。毒素Ａは、Ｉｌ−１βおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）が含まれる他の炎症促進性サイトカイン類も刺激する。毒素Ｂは組織損傷および炎症を引き起こす細胞毒素であり、体液の蓄積を引き起こす毒素Ａと共に疾患に寄与する。腸毒性および走化性の毒素Ａならびに毒素Ｂの細胞毒性作用の複合作用は、疾患の重症度に強く寄与する。Kuehneらによる研究において、ノックアウト変異体は、Ａ＋Ｂ−およびＡ−Ｂ＋変異体の両方がハムスターモデルにおいて細胞毒性であり、疾患を引き起こすことを示した。ｔｃｄＢが挿入により不活性化された場合、結果としてもたらされるＡ＋Ｂ−変異体は細胞培養において増大した毒素Ａの細胞毒性を示したことは、興味深い発見であった。その増大した細胞毒性は、抗毒素Ａ特異的抗体により完全には中和されなかった。ｔｃｄＢの不活性化後の細胞毒性の増大に関する理由は決定されなかったが、増大した発現によるものであると考えられた。二重ノックアウト変異体Ａ−Ｂ−はハムスターにおいて疾患を引き起こさなかった。これらの結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方が、組み合わせで、および独立して疾患を引き起こすことを確証した。別の研究において、Ａ−Ｂ＋分離株の分析は、マウスにおいて通常の毒素Ｂよりも有意に致死性である変異体毒素Ｂを示した。これらの研究は、その疾患における両方の毒素の役割を支持する。便中の毒素の存在との組み合わせでの腸炎症の存在を決定するための方法は、Ｃ．ディフィシル感染症を有する患者に関する疾患状態に関する追加の情報を与えることができる。
【００１２】
本発明の１態様は、例としてＣ．ディフィシル抗原（ＧＤＨ）、毒素Ａ（ｔｃｄＡまたはＴｃｄＡ）およびＢ（ｔｃｄＢまたはＴｃｄＢ）が含まれる毒素産生性Ｃ．ディフィシルの存在を決定するためのバイオマーカーの一団を用いるＣ．ディフィシル疾患の存在の決定を提供する。理解されるであろうように、本発明のさらなる態様は、Ｃ．ディフィシル感染に関する追加のバイオマーカーを利用する。Ｃ．ディフィシル疾患の診断が結論付けられた場合、糞便中ラクトフェリン濃度を用いて疾患の重症度を決定することができる。Ｃ．ディフィシルによる感染が疑われる患者において、ＧＤＨが存在する場合、それはＣ．ディフィシルの存在を示しており、毒素Ａおよび／またはＢ（遺伝子および／またはタンパク質）を検出して毒素産生性Ｃ．ディフィシルの存在を示し、続いて腸炎症の指標としての糞便中ラクトフェリンレベルを測定する。毒素産生性Ｃ．ディフィシルが存在するかどうかをラクトフェリン濃度との組み合わせで知ることは、処置を最適化するために疾患重症度を決定するのを助けるであろう。
【００１３】
複数の態様において、一連のＣ．ディフィシル感染に関するバイオマーカーの測定が利用される。例えば、ラクトフェリン、ＧＤＨ、毒素Ａ、および／または毒素Ｂレベルを分析および／または処置の間に規則的な間隔で監視することができる。複数の態様において、１種類以上のバイオマーカー（例えばＧＤＨ、毒素Ａおよび／またはＢ）の存在の一連の分析はその細菌の指標を提供し、それを患者の処置への応答を決定するために用いることができる。
【００１４】
複数の態様において、糞便試料中のラクトフェリンのレベルはＣ．ディフィシルの重症度の指標を提供する。例えば、“軽症の”Ｃ．ディフィシル疾患は、７．２５μｇ／ｍＬ未満のラクトフェリンを含む試料で示され得る。複数の態様において、軽症のＣ．ディフィシル疾患の診断は、その軽症の疾患を定義するための臨床指標と組み合わせられた、７．２５μｇ／ｍＬ未満のラクトフェリンを含む試料で示される。例えば、１日あたりの形を成さない便の数、発熱の存在、腹痛、および嘔吐のような臨床指標を軽症のＣ．ディフィシル疾患の診断を示すものとして特性付ける、および／または決定することができ、それを７．２５μｇ／ｍＬ未満のラクトフェリンの測定値と一緒に分析して疾患の重症度を決定することができる。複数の態様において、軽症のＣ．ディフィシルの診断のための臨床指標には、１日あたり３〜５の便を有することおよび１５，０００／ｍｍ３以下の白血球数が含まれる。さらなる態様において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、および／またはクレアチニンのような実験室パラメーターをラクトフェリンのレベル、カルプロテクチンのレベル、および／または臨床指標（単数または複数）と組み合わせて、軽症のＣ．ディフィシルを有すると診断された患者における疾患の重症度を決定することができる。
【００１５】
別の例において、“中程度の”Ｃ．ディフィシル疾患は、７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬのラクトフェリンを含む試料で示され得る。一部の態様において、中程度のＣ．ディフィシル疾患の診断は、その中程度の疾患を定義するための臨床指標と組み合わせられた、７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬのラクトフェリンを含む試料で示される。例えば、１日あたりの形を成さない便の数、発熱の存在、腹痛、および嘔吐のような臨床指標を中程度のＣ．ディフィシル疾患の診断を示すものとして特性付ける、および／または決定することができ、それを７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬのラクトフェリンの測定値と一緒に分析して疾患の重症度を決定することができる。複数の態様において、中程度のＣ．ディフィシルの診断のための臨床指標には、１日あたり６〜９の便を有すること、１５，００１／ｍｍ３から２０，０００／ｍｍ３までの白血球数、および中程度の腹痛が含まれる。さらなる態様において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、および／またはクレアチニンのような実験室パラメーターをラクトフェリンのレベル、カルプロテクチンのレベル、および／または臨床指標（単数または複数）と組み合わせて、中程度のＣ．ディフィシルを有すると診断された患者における疾患の重症度を決定することができる。
【００１６】
さらなる例において、“中程度〜重症の”Ｃ．ディフィシル疾患は、１００μｇ／ｍＬ以上のラクトフェリンを含む試料で示され得る。一部の態様において、中程度〜重症のＣ．ディフィシル疾患の診断は、その中程度〜重症の疾患を定義するための臨床指標と組み合わせられた、１００μｇ／ｍＬ以上のラクトフェリンを含む試料で示される。例えば、１日あたりの形を成さない便の数、発熱の存在、腹痛、および嘔吐のような臨床指標を中程度〜重症のＣ．ディフィシル疾患の診断を示すものとして特性付ける、および／または決定することができ、それを１００μｇ／ｍＬ以上のラクトフェリンの測定値と一緒に分析して疾患の重症度を決定することができる。複数の態様において、中程度〜重症のＣ．ディフィシルの診断のための臨床指標には、１日あたり１０以上の便を有すること、２０，００１／ｍｍ３以上の白血球数、および重症の腹痛が含まれる。さらなる態様において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、および／またはクレアチニンのような実験室パラメーターをラクトフェリンのレベル、カルプロテクチンのレベル、および／または臨床指標（単数または複数）と組み合わせて、中程度〜重症のＣ．ディフィシルを有すると診断された患者における疾患の重症度を決定することができる。
【００１７】
Ｃ．ディフィシルＧＤＨバイオマーカーの存在に関する検査の１つの典型的な方法はＣ．ＤＩＦＦ  ＣＨＥＫ（商標）−６０検査を用いることであり、それはＣ．ディフィシルＧＤＨに特異的な抗体を用いる。Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ  ＰｌａｔｅはＧＤＨ抗原に対する固定されたポリクローナル抗体を含有し、一方でＣｏｎｊｕｇａｔｅはホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた高度に特異的なモノクローナル抗体からなる。ＧＤＨ抗原が標本中に存在する場合、そのアッセイにおいて形成される酵素−抗体−抗原複合体により、呈色が検出される。
【００１８】
毒素Ａおよび毒素Ｂの存在に関する検査の１つの典型的な方法はＣ  ＤＩＦＦＩＣＩＬＥ  ＴＯＸ  Ａ／Ｂ  ＩＩ（商標）検査を用いることであり、それはＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する抗体を用いる。その検査は毒素ＡおよびＢに対する固定された親和性精製されたポリクローナル抗体を利用し、検出抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた毒素Ａモノクローナル抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた毒素Ｂポリクローナル抗体の混合物からなる。毒素ＡおよびＢが標本中に存在する場合、そのアッセイにおいて形成される酵素−抗体−抗原複合体により、呈色が検出される。
【００１９】
ＧＤＨ、毒素Ａおよび毒素Ｂの存在に関する検査の１つの典型的な方法はＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）検査を用いることであり、それはＣ．ディフィシルのＧＤＨおよび毒素ＡおよびＢに特異的な抗体を用いる。その装置は固定された抗体の３本の縦線を含有し、抗原検査の線はＣ．ディフィシルのＧＤＨに対する抗体を含有し、対照の線は抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体を含有する点線である。毒素ＡおよびＢ検査の線はＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する抗体を含有し、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅはホースラディッシュペルオキシダーゼに連結されたＧＤＨに対する抗体ならびに毒素ＡおよびＢに対する抗体からなる。ＧＤＨ反応は縦の青い線の出現に関して視覚的に調べられ、それは陽性の検査を示し、一方で青い線は毒素ＡおよびＢに関する陽性の検査も示す。
【００２０】
Ｃ．ディフィシル毒素の存在に関する検査の１つの典型的な方法はＣ．ＤＩＦＦＩＣＩＬＥ  ＴＯＸ−Ｂ  ＴＥＳＴ（商標）であり、それは組織培養形式を用いて糞便標本中の細胞毒性活性の存在を検出し、特異的抗毒素を用いるＣ．ディフィシル毒素の同定を確証する。その試験は、その細胞毒性活性を特異的な抗毒素である試薬を用いて中和することによりＣ．ディフィシル毒素の存在を確証する。そのアッセイにおいて、Ｃ．ディフィシル毒素が存在する場合、ＰＢＳを有するウェル中の細胞は丸くなり、それは細胞毒性活性の存在を実証し、一方でＣ．ディフィシル毒素の存在は抗毒素を含有するウェルにおいてその細胞毒性活性が中和された場合に確証される。
【００２１】
Ｃ．ディフィシルを処置する１つの典型的な方法は、天然細菌叢移植による。糞便（または糞便（Ｆａｅｃａｌ））微生物叢移植（ＦＭＴ）とも呼ばれるこのプロセスは、健康なヒトの提供者から得られた健康な細菌叢を例えば浣腸による便の注入により導入することによる大腸内細菌叢の修復である。天然細菌叢移植は、その患者が飲む液体として投与することもできる。
【００２２】
本発明の１観点は、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を処置する方法に向けられている。その方法は、中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を、重症の腸炎症を示す糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルに関して検査結果が陽性であった患者に投与することを含む。糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルは、定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の使用により決定される。ラクトフェリンの高められたレベルは、糞便試料中で１００ｕｇ／ｍＬ以上であってよい。この場合、その療法上有効な処置は、グリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上であってよい。その療法上有効な処置は天然細菌叢移植であってもよい。
【００２３】
本発明の別の観点は、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を処置する方法に向けられている。その方法は、中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を、中程度の腸炎症を示す糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルに関して検査結果が陽性であった患者に投与することを含む。糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルは、定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の使用により決定されてよい。ラクトフェリンの高められたレベルは、糞便試料中で７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬであってよい。この場合における療法上有効な処置は、１種類以上のニトロイミダゾール系抗生物質であってよい。加えて、その療法上有効な処置は天然細菌叢移植であってよい。
【００２４】
本発明の別の観点は、クロストリジウム・ディフィシル疾患の重症度により患者を診断する方法に向けられている。その方法は、Ｃ．ディフィシル疾患を有すると診断されている人から糞便試料を得て；その糞便試料中にラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルが存在するかどうかを決定し；そしてその糞便試料中にラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の高められたレベルが存在することが決定されたら、その糞便試料中に存在するラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルに基づいてそのＣ．ディフィシル疾患の重症度を同定することを含む。糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルは、定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の使用により決定されてよい。ラクトフェリンの高められたレベルがその糞便試料中で１００μｇ／ｍＬ以上である場合、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度は中程度〜重症であると考えてよい。この場合、その療法上有効な処置は、グリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上であってよい。その療法上有効な処置は天然細菌叢移植であってよい。ラクトフェリンの高められたレベルがその糞便試料中で７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬである場合、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度は中程度であると考えられる。この場合、その療法上有効な処置は１種類以上のニトロイミダゾール系抗生物質であってよい。ラクトフェリンの高められたレベルがその糞便試料中で７．２５μｇ／ｍＬ未満である場合、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度は軽症であると考えられ、その療法上有効な処置は無処置であってよい。Ｃ．ディフィシル疾患を有すると診断された患者において疾患の重症度を決定するために用いられるラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルは、以下の１種類以上と組み合わせることができる：１日あたりの形を成さない便の数、発熱の存在、腹痛、および嘔吐の１種類以上を含む臨床症状、ならびにＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、およびクレアチニンの１種類以上を含む実験室パラメーター。Ｃ．ディフィシルの診断は、毒素産生性Ｃ．ディフィシルの存在を示すバイオマーカーの存在に基づいて結論付けることができる。
【００２５】
本発明のさらに別の観点は、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を監視する方法に向けられている。その方法は、第１の時点において患者から第１の糞便試料を得て；第１の時点よりも後の第２の時点において同じ患者から第２の糞便試料を得て；第１の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第１の量を第２の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第２の量と比較して第１の時点および第２の時点の間のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化を同定し；ラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化に基づいて、患者のＣ．ディフィシル疾患の重症度における変化を同定し；そして患者のＣ．ディフィシル疾患の重症度における変化の同定に基づいて、Ｃ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置をその患者に投与することを含む。療法上有効量の処置は、ラクトフェリンのレベルがその患者の第２の糞便試料に関して７．２５μｇ／ｍＬ未満に低下していた場合、処置の停止であってよい。療法上有効量の処置は、ラクトフェリンのレベルがその患者の第２の糞便試料に関して７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬである場合、中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することであってよい。この場合、その中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置は、ニトロイミダゾール系抗生物質の１種類以上を含む。療法上有効量の処置は、ラクトフェリンのレベルがその患者の第２の糞便試料に関して１００μｇ／ｍＬ以上である場合、中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することであってよく、ここで１００μｇ／ｍＬ以上のラクトフェリンのレベルは重症の腸炎症を示す。中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置は、グリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上を用いた処置を含む。中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された別の処置は、天然細菌叢移植を用いた処置を含む。
【００２６】
本発明のさらに別の観点は、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を監視する方法に向けられている。その方法は、第１の時点において患者から第１の糞便試料を得て；第１の時点よりも後の第２の時点において同じ患者から第２の糞便試料を得て；第１の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第１の量を第２の糞便試料中のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上の第２の量と比較して第１の時点および第２の時点の間のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化を同定し；ラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上のレベルにおける変化に基づいて、患者のＣ．ディフィシル疾患の重症度における変化を同定し；そしてＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を、第２の糞便試料を得た後にその患者に投与することを含み、ここでその患者は第１の時点においてＣ．ディフィシルの軽症の症例を、第２の時点において増大した量のラクトフェリンまたはカルプロテクチンの１種類以上を有し、ここで第１の試料における第１の量および第２の試料における第２の量の比較は増大した腸炎症およびＣ．ディフィシル疾患の悪化を示す。療法上有効量の処置は、ラクトフェリンのレベルがその患者の第２の糞便試料に関して７．２５μｇ／ｍＬ〜９９．９９μｇ／ｍＬである場合、中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することであってよい。中程度のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置は、ニトロイミダゾール系抗生物質の１種類以上を用いた処置を含む。療法上有効量の処置は、ラクトフェリンのレベルがその患者の第２の糞便試料に関して１００μｇ／ｍＬ以上である場合、中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された療法上有効量の処置を投与することであってよい。中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置は、グリコペプチド系抗生物質または大環状抗生物質の１種類以上を用いた処置を含む。中程度〜重症のＣ．ディフィシルの処置において有効であることが示された処置は、天然細菌叢移植を用いた処置を含む。
【００２７】
本発明の別の観点は、Ｃ．ディフィシル疾患の存在およびＣ．ディフィシル疾患の重症度を決定する診断法に向けられている。その方法は、患者から糞便試料を得て；同じ患者の糞便試料から第１のバイオマーカーの存在を決定し、ここでその第１のバイオマーカーの存在はＣ．ディフィシル疾患の存在を示し；そして同じ患者の糞便試料から第２のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、ここでその第２のバイオマーカーのレベルはＣ．ディフィシル疾患の重症度を示す。第１のバイオマーカーは、Ｃ．ディフィシルのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む。別の第１のバイオマーカーは、Ｃ．ディフィシルの毒素Ａを含む。別の第１のバイオマーカーは、Ｃ．ディフィシルの毒素Ｂを含む。第１のバイオマーカーは、Ｃ．ディフィシルの毒素Ａ遺伝子（ｔｃｄＡ）またはＣ．ディフィシルの毒素Ｂ遺伝子（ｔｃｄＢ）の１つ以上を含んでいてよい。第２のバイオマーカーは、その患者の糞便試料中のラクトフェリンのレベルを含む。第２のバイオマーカーは、その患者の糞便試料中のカルプロテクチンのレベルも含んでいてよい。
【００２８】
以下は本発明に従って好ましいアッセイを確立するために利用されてきた手順の実施例である。以下の実施例は単に典型的なものであり、限定として与えられているわけではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１
糞便中ラクトフェリンレベルを、軽症から中程度〜重症の疾患までの範囲の臨床的に定義されたＣ．ディフィシル疾患を有する患者において評価した。簡潔には、ある範囲の重症度を示す臨床的に確証されたＣ．ディフィシル疾患を有する患者を、腸の病気を有しないと定められた１４人の年齢性別を合わせた健康な対象と共に募集した。疾患活動性は、医師の評価により、ならびに症状、血清アルブミン、ＷＢＣ数および共存症に基づいて定められた。糞便中ラクトフェリンを定量的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を用いて測定した。便中のＣ．ディフィシルのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）ならびに毒素ＡおよびＢを、膜に基づくＥＩＡを用いて検出した。毒素産生培養を芽胞濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて行い、分離株および便標本の両方を組織培養アッセイにより細胞毒性に関して試験した。
【００３０】
結果
３９件の臨床的に確証されたＣ．ディフィシル疾患の症例（１５件は中程度〜重症、２１件は中程度、および３件は軽症）を、６ヶ月の期間の間検査した。年齢は３２から８９歳までの範囲に及び、５０パーセントが女性であった。主な共存症は、糖尿病（３１％）、癌（２３％）および腎不全（２３％）であった。全ての患者がＧＤＨ陽性であり、４人を除く全ての患者から毒素産生性Ｃ．ディフィシルが分離された。平均ラクトフェリンレベル（μｇ／ｍＬ±標準誤差）は、中程度〜重症の対象に関して１１９８±４０４、中程度の対象に関して１３２±５０、軽症の対象に関して１２±５、そして健康な対象に関して２±０．３であった。便中の毒素は、組織培養により、中程度〜重症の疾患の８７％（１３／１５）、中程度の疾患の７１％（１５／２１）、そして軽症の疾患に関して３３％（１／３）で検出された。最も低いラクトフェリンレベル（８μｇ／ｍＬ以下）を有する中程度〜重症の患者の２人および４人の最も低いラクトフェリンレベル（１２μｇ／ｍＬ以下）を有する中程度の患者の３人も、組織培養陰性であった。これらの患者の内で、重症の患者および４人の中程度の患者の２人は陰性の糞便培養を有していた。これらの患者の全てがその臨床評価に寄与する共存症を有していた。我々の結論は、臨床設定において、共存症はＣ．ディフィシル感染に関する臨床評価を複雑にし得ることである。我々の結果は、糞便中ラクトフェリンがＣ．ディフィシル感染症を有する患者において疾患の重症度を示すために有用であることを示している。
【００３１】
従って、図１Ａは、臨床的に確証されたＣ．ディフィシル疾患の症例に関する患者の特徴を詳述する。ほとんどの患者は６４歳より高い年齢であり、痛みを経験し、液状便を有し、糖尿病、癌、腎不全および肺炎が含まれる共存症を患っていた。図１Ｂは、Ｃ．ディフィシル疾患の軽症、中程度、および中程度〜重症の症例の間でラクトフェリンレベルが有意により高く、中程度〜重症の群に関してより高い傾向があったことを示している。
【００３２】
図２は、リボタイプにより分類された臨床的に確証されたＣ．ディフィシル疾患を有する患者に関する平均ラクトフェリンレベルを示す。ＡＲＬ  ０２７に感染した患者は、他のリボタイプに感染した患者よりも有意に高いラクトフェリンのレベルを有していた。研究は、ＡＲＬ  ０２７に感染した患者は便中毒素を有し、より重症の疾患を示す傾向があることを示してきた。
【００３３】
実施例２
糞便中Ｃ．ディフィシルＧＤＨ、毒素ＡおよびＢ、ならびにヒトラクトフェリンレベルを、Ｃ．ディフィシル疾患を有する数人の対象において抗生物質処置の間に測定した。臨床的に確証されたＣ．ディフィシル疾患を有する両方の対象を、ＧＤＨ、毒素ＡおよびＢ、ならびに糞便中ラクトフェリンの存在に関して、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）により監視した。標本の収集は抗生物質処置の開始時に開始され、可能である場合は毎日〜毎週継続された。症状の記録はそれぞれの患者により保たれ、試験期間の間全ての処置が記録された。両方の患者が抗生物質処置に対して急速な応答を示し、糞便中ＧＤＨ、毒素ＡおよびＢ、ならびに糞便中ラクトフェリンは２４時間以内にベースラインに達した。抗原、毒素、および糞便中ラクトフェリンは、抗生物質療法の間陰性のままであった。処置の後、両方の患者が臨床的再燃を経験し、全てのパラメーターに関して急速な増大を示した。抗生物質の第２過程の後、全てのパラメーターがベースラインに戻った。抗生物質の第２過程の完了時に、全てのパラメーターが臨床症状の非存在下で急速に増大した。ＧＤＨおよび毒素は両方とも３〜４週間存在したままであったが、糞便中ラクトフェリンは迅速にベースラインに戻った。臨床症状が存在せず、患者は健康なままであったため、抗生物質は投与されなかった。
【００３４】
結果
この評価において、Ｃ．ディフィシルＧＤＨ、毒素、および糞便中ラクトフェリンレベルは、ベースライン（陰性）に戻ることにより抗生物質療法に迅速に応答した。より興味深いことに、ＧＤＨおよび毒素の両方が、臨床症状を伴わずに、且つベースラインのラクトフェリンにより決定されるように腸炎症を伴わずに存在していた。これらの結果は、どのＣ．ディフィシル疾患の症例が抗生物質によるそれ以上の処置を必要としない可能性があるかの決定に関する、抗原および毒素の測定との組み合わせでの糞便中ラクトフェリンの役割を示している。加えて、我々の発明は、Ｃ．ディフィシル疾患の監視における糞便中ラクトフェリンの役割を提供する。Ｃ．ディフィシル疾患の患者において臨床評価と共にラクトフェリンを用いて腸炎症の量を決定することにより、患者の疾患の重症度に関する同定は、処置を最適化し、よりよい患者の転帰をもたらすために有用であることが判明する可能性がある。
【００３５】
処置は、様々な重症度のレベルが異なる処置の推奨を必要とするため、Ｃ．ディフィシル疾患に関して最適化されてよい。例えば、Ｃ．ディフィシル疾患の軽症の症例はしばしば抗生物質処置を受けない。対照的に、中程度の重症度の症例はメトロニダゾールのような抗生物質を必要とする可能性があり、一方でＣ．ディフィシル疾患の中程度〜重症の症例は、バンコマイシンおよびフィダキソマイシン（Ｄｉｆｉｃｉｄ）のような抗生物質を用いて処置される可能性がある。
【００３６】
図３は、Ｃ．ディフィシル感染の初期のエピソードからの、抗生物質処置の間および後の日々のラクトフェリンレベルを図説する。ラクトフェリンは初期のエピソードの間および両方の再燃の期間の間高められた（７．２５μｇ／ｍＬ以上）。レベルは一度処置が開始されると急速に低下し、症状が戻るにつれて増大した。
【００３７】
実施例３
下痢および陽性便中毒素（ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ）および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を有する患者（ｐｔｓ）を募集して、インフォームドコンセントを得た。便標本を、入院時（Ｔ＝０）に開始して経過観察（Ｔ＝Ｆ）まで収集した。ＧＤＨ、毒素、およびラクトフェリン（ＬＦ：中央値μｇ／ｇ）を便標本中で免疫アッセイにより測定した。細菌培養および計数（中央値ＣＦＵ＃／ｇ）をエタノール濃縮を用いて行い、分離株のリボタイプを決定した。合計１８人の入院患者を募集し、Ｔ＝０からＴ＝Ｆまで２１日の期間（中央値）の間追跡した。年齢の中央値は７５歳であり、男性：女性比率は１：３．５であった。Ｐｔｓを以下の３つの群に層別化した：（ｉ）処置され、再発を示さなかったｐｔｓ（Ｎ＝９）、（ｉｉ）処置され、症状が完全に消散したが、ＣＤＩを有していたｐｔｓ（Ｎ＝５）、および（ｉｉｉ）最初は処置に応答したが再燃したｐｔｓ（Ｎ＝４）。
【００３８】
結果
群（ｉ）中の患者は、Ｔ＝０においてＧＤＨ、毒素に関して強い陽性および１０４の芽胞計数からＴ＝Ｆにおいて全てのバイオマーカーに関して陰性まで至った。ＬＦはこの期間の間４０６から４までの範囲に入った（表１ａ）。群（ｉｉ）中の５人のｐｔｓの４人は、Ｔ＝０においてＧＤＨ、毒素に関して陽性であり、１０４の芽胞計数を有していた。Ｔ＝Ｆにおいて、その５人のｐｔｓの３人は毒素陰性であり、３人のｐｔｓはＧＤＨ陽性のままであり、全てのｐｔｓは芽胞を有していた（１０３）。これらのｐｔｓに関するＬＦは、症状の消散と関係して８５から２まで低下した（表１ｂ）。群（ｉｉｉ）に関して、４人のｐｔｓは全て症候性のままであり、ＧＤＨ、毒素に関して強い陽性のままであり、１０４の芽胞計数を有していた。この群に関するＬＦレベルはＴ＝０およびＴ＝Ｆの両方において類似していた（それぞれ３６２および３１５）（表１ｃ）。合計５人（２８％）のｐｔｓはＴ＝０において０２７  ＣＤＩを有していた。群（ｉｉ）において、５人のｐｔｓの３人は０２７に保菌者として再感染していた。群（ｉｉｉ）において、１人の患者が０２７に転換された（ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）。＊＊０２７分離株の全てがフルオロキノロン耐性であった。我々の研究において、Ｔ＝Ｆにおいて、ｐｔｓの５０％がＣＤＩを有さず、２８％が保菌者になり、２２％が病気のままであった。ＧＤＨ、毒素およびＬＦレベルは全て臨床疾患の存在と相関していた。Ｃ．ディフィシルは複雑な感染症であり続け、疾患の正確な診断はその生物に関する、および炎症に関するバイオマーカーと合わせて用いられる病歴に頼っている。
【００３９】
図４Ａは、Ｃ．ディフィシル疾患に関する抗生物質処置の前および後のＣＤＩバイオマーカーの結果を示す。この群中の患者の全てが、最初の抗生物質処置の間および後に、無症状およびＣ．ディフィシルが検出されないことを意味する臨床的治癒を有していた。
【００４０】
図４Ｂは、Ｃ．ディフィシル疾患に関する抗生物質処置の前および後のＣＤＩバイオマーカーの結果を示す。この群中の全ての患者が、最初の抗生物質処置の間および／または後に、症状の非存在下でＣ．ディフィシル生物が検出されることを意味するＣ．ディフィシルの再感染を有していた。
【００４１】
図４Ｃは、Ｃ．ディフィシル疾患に関する抗生物質処置の前および後のＣＤＩバイオマーカーの結果を示す。この群中の全ての患者が、最初の抗生物質処置の間および／または後に、症状およびＣ．ディフィシル生物が維持されている、または戻ったことを意味する臨床的再発または非治癒を有していた。
【００４２】
代わりの態様において、糞便中ラクトフェリンではなく、またはそれに加えて、糞便中カルプロテクチンを腸炎症を測定するための非侵襲的マーカーとして利用することができる。例えば、Ｃ．ディフィシル疾患を有すると診断された人において、糞便中カルプロテクチンの定量的レベルを測定することができ、その定量的レベルを軽症、中程度、および中程度〜重症が含まれる疾患の重症度と関係付けることができる。さらに、糞便中カルプロテクチンを処置に続いて測定して医学的処置に対する人の応答またはその疾患の活動性レベルを監視することができる。
【００４３】
要約すると、本発明は、Ｃ．ディフィシル疾患を有すると診断された人におけるＣ．ディフィシル疾患の重症度をラクトフェリンを用いて同定するための非侵襲的方法に向けられている。同定された疾患の重症度を、その人に関する好ましい一連の処置を勧めるために用いることができる。本発明はさらに、ラクトフェリンレベルにおける変化を利用して人の疾患活動性および／または処置に対する応答を監視することに向けられている。
【００４４】
本発明の免疫アッセイは、腸炎症の指標の役目を果たす安定なタンパク質であるラクトフェリンを検出し、疾患重症度をＣ．ディフィシル疾患に関係付けるための、および疾患活動性を監視するための定量的な糞便中ラクトフェリンレベルを提供する。本発明を特定の態様に関して記述してきたが、それは全ての点で限定的ではなく説明的であることを意図している。代わりの態様が本発明が属する技術分野の当業者にその範囲から逸脱することなく明らかになるであろう。
【００４５】
前記のことから、この発明は本明細書において上記で明らかでありその方法に本来備わっている他の利点と一緒に述べた全ての目標および目的を達成するために十分に適合されたものであることが分かるであろう。特定の特徴および部分的組合せは有用なものであり、他の特徴および部分的組合せと関係なく用いることができることは理解されるであろう。これは特許請求の範囲により意図されており、特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2014519018.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際調査報告】
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