(57)【要約】本発明は、肝臓での脂質蓄積と関連した疾患を治療または予防するための治療化合物として有用な、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、ルイスx抗原を含む化合物（例えば、LNFPIII）、非ルイスx抗原を含む化合物（例えば、LNnT、LDN、およびLDN誘導体）、またはルイスx抗原と非ルイスx抗原の混合物を含む化合物（例えば、SEA））を含む化合物を提供する。本発明の化合物は、脂肪肝疾患を有するかまたは該疾患を発症するリスクを有する対象における該疾患の発症を治療または予防するのに、および肝細胞における脂質生成を阻害するのに有用である。本発明はまた、脂肪肝疾患を有する対象に蠕虫由来グリカンおよび／もしくはその複合糖質を含む化合物を投与すること、または蠕虫由来グリカンおよび／もしくはその複合糖質を含む化合物と肝細胞を接触させることにより、Erk-c-fos/AP-1-FXRαシグナル伝達経路を調節する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を予防する方法であって、該疾患を発症するリスクを有する哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の予防的有効量を投与する段階を含む、方法。
【請求項３】
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
化合物が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
化合物がLNFPIIIを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
化合物がSEAを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
疾患が脂肪肝疾患である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
疾患が非アルコール性脂肪肝疾患である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
疾患が肝臓脂肪症（hepatic steatosis）である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
疾患が非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
疾患がアルコール性脂肪肝疾患である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
疾患が肝臓脂肪症である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
疾患が脂肪性肝炎である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
疾患がメタボリックシンドロームである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子に架橋されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、請求項18〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、請求項19〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
担体が糖質ポリマーである、請求項18〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
糖質ポリマーがデキストランである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
担体がタンパク質である、請求項18〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
担体がポリアクリルアミドである、請求項18〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
化合物が非経口投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が腹腔内投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が静脈内投与される、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が経口投与される、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝臓におけるトリグリセリドレベルを低下させる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝臓における脂質生成を抑制する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝細胞におけるFXRαの産生を増加させる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝細胞におけるSREBP-1cの産生を減少させる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が、肝細胞におけるFXRαの産生を増加させることにより、該肝細胞における脂質生成を抑制する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
肝細胞における脂質生成を減少させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の十分量と該肝細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項４１】
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
化合物が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項40〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、請求項40〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、請求項40〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
化合物がSEAを含む、請求項40〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
化合物がLNFPIIIを含む、請求項40〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
肝細胞においてSREBP-1cの産生が阻害される、請求項40〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
肝細胞においてFXRαの産生が増加する、請求項40〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
それを必要とする対象に、肝臓の脂質生成が阻害されるように化合物が投与される、請求項40〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
対象が脂肪肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
対象が非アルコール性脂肪肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
対象が肝臓脂肪症を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
対象が脂肪性肝炎を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
対象がアルコール性脂肪肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
対象がメタボリックシンドロームを有するかまたはそれを発症するリスクを有する、請求項50記載の方法。
【請求項５７】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子に架橋されている、請求項40〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、請求項57〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
担体が糖質ポリマーである、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
糖質ポリマーがデキストランである、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
担体がタンパク質である、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
担体がポリアクリルアミドである、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が非経口投与される、請求項40〜69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が腹腔内投与される、請求項40〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が静脈内投与される、請求項40〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が経口投与される、請求項40〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
細胞におけるFXRαの産生を増加させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と該細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項７５】
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
化合物が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項74〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、請求項74〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、請求項74〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
化合物がSEAを含む、請求項74〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
化合物がLNFPIIIを含む、請求項74〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項74〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、請求項82〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、請求項82〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質抗原がデキストランに架橋されている、請求項82〜89のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
FXRαがFXRα3/α4である、請求項74〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
FXRαがFXRα1/α2である、請求項74〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
FXRαによって転写的に誘導される遺伝子産物の産生を増加させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と肝細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項９４】
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される、請求項93〜95のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、請求項93〜96のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、請求項93〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
化合物がSEAを含む、請求項93〜98のいずれか一項記載の方法。
【請求項１００】
化合物がLNFPIIIを含む、請求項93〜98のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項93〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、請求項93〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、請求項93〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
ルイス抗原がデキストランに架橋されている、請求項93〜107のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
遺伝子産物が、SHP、OATP1、PLTP、およびBSEPからなる群より選択される、請求項93〜109のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
肝細胞におけるErk-c-fos/AP1-FXRα経路の活性化を上昇させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と該肝細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項１１２】
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される、請求項111〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、請求項111〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスxを含む、請求項115記載の方法。
【請求項１１７】
化合物がLNFPIIIを含む、請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
化合物がSEAを含む、請求項116記載の方法。
【請求項１１９】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項111〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２０】
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項119記載の方法。
【請求項１２１】
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、請求項119〜121のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、請求項119〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
LNFPIIIがデキストランに架橋されている、請求項119〜126のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
Erk-c-fos/AP1-FXRα経路の活性化が脂質生成の減少を伴う、請求項111〜127のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を治療するのに十分な量の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2011年9月23日に出願された、「Methods of Treating Fatty Liver Disease with Helminth-Derived Glycan-Containing Compounds」という表題の米国仮特許出願第61/538629号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝臓での脂肪蓄積を特徴とする疾患は、主に不健康な食習慣および肥満が原因で、先進国の成人および小児に徐々に蔓延しつつある。慢性的で過度なアルコール摂取によって起こるアルコール性脂肪肝疾患 (AFLD) は、本質的に、脂肪症、脂肪性肝炎 (ASH)、炎症、硬変、および場合により肝細胞癌を伴う病理学的過程をたどる。最もよく見られる肝疾患であると考えられている非アルコール性脂肪肝疾患 (NAFLD) とは、重症度が肝臓脂肪症（hepatic steatosis）（肝臓での脂肪の蓄積）、硬変から肝細胞癌にまで及ぶ、AFLDの肝臓病態と類似した一連の肝臓病態を包含する用語である。したがって、NAFLDは、アルコール乱用歴のない患者においてAFLDの組織学的特徴を示す。AFLDおよびNAFLDの全段階で、共通して肝細胞に脂肪が蓄積している (Reddy et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006;290:G852-8（非特許文献1）)。
【０００３】
米国の人口の推定3分の1がNAFLDに罹患している (Grattagliano et al., Can Fam Physician 2007; 53:857-863（非特許文献2）)。NAFLDの発症は性別で偏っているようであり、男性は女性と比べて、かつより早い年齢で本疾患を発症する可能性が高い (Browning et al. Hepatology 2004;40:1387-95（非特許文献3）)。NAFLDは、肝臓脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) にまで徐々に悪化し得、NASHは、肝細胞傷害、炎症細胞の浸潤、または線維症によって明らかな肝傷害の発症を特徴とする。NASHは次には肝硬変に進行し得、肝硬変は、瘢痕組織による肝細胞の置き換え、およびより進行した段階では肝細胞癌と関連している。NAFLDは、硬変および肝不全の重要でかつ一般的な原因と認識されている (Wanless et al, Hepatology, 1990;12:1106-10（非特許文献4）)。NAFLDは、メタボリックシンドローム (MetS) の一部と見なされている。MetSを有する人と同様に、NAFLDを有する個体の>80%が過体重であり、およそ30%が肥満である (Grattagliano et al., 2007)。さらに、NAFLDを有する人はまた、同時に高脂血症、2型糖尿病 (T2DM) を有し、高血圧である場合が多い。
【０００４】
肝臓脂肪症は、主な供給源として食事が挙げられるトリグリセリドの肝臓蓄積、デノボの脂肪酸合成、および脂肪組織の増加を特徴とする (Cohen et al., Science 2011;332:1519-23（非特許文献5）)。このようなトリグリセリドの蓄積は、次にインスリン抵抗性を引き起こし得る (Macias-Rodriguez et al., Rev Invest Clin 2009;61:161-72（非特許文献6）)。複数ヒット仮説によると、肝臓脂肪症からNASHへの移行は複数のヒットを必要とする (Day et al., Gastroenterology 1998;114:842-5（非特許文献7）)。インスリン感受性障害による肝臓の遊離脂肪酸レベルの上昇が第1ヒットとして働き、インスリン抵抗性、脂肪症、脂質過酸化、ならびに炎症細胞の蓄積および活性化の上昇をもたらし得る (Schuppan et al., Liver International 2010;30:795-808（非特許文献8）)。これは次に、脂肪毒性および肝細胞増殖停止またはアポトーシスを引き起こし得る（同上；Feldstein et al. Gastroenterology 2003;125:437-43（非特許文献9））。1a型糖原病、シトリン欠損症、および先天性全身性リポジストロフィーなどのいくつかの遺伝性障害は、肝臓脂肪症と関連している（Hooper et al., J Lipid Res 2011;52:593-617（非特許文献10）；Bandsma et al., Pediatr Res 2008;63:702-7（非特許文献11）；Komatsu et al., J Hepatol 2008;49:810-20（非特許文献12））。さらに、トリグリセリドの恒常性において機能する遺伝子の変異もまた、肝臓脂肪症の発症において役割を果たす（Cohen et al.、前記）。
【０００５】
現在のところNAFLDの確立された治療法はなく、大部分の治療法は、肥満、糖尿病、および高脂血症などの関連状態を管理することに依存している (Angulo et al., Sem Liver Dis. 2001;21(1):81-8（非特許文献13）)。NAFLDの他の治療法は、運動および食事などの生活習慣を主に標的としている。体重減少およびインスリン抵抗性を標的とすることを目的とした薬理学的介入は、有効性が限られている (Mishra et al. Curr Drug Discov Technol 2007; 4:133-40（非特許文献14）)。しかしながら、いくつかの研究は、体重減少後に脂肪症が回復するという徴候を示しており、この状態が可逆的である可能性を示唆し、疾患進行を食い止めるために、NAFLD発病に関与する経路を標的とする治療法を開発する希望を提供している（Eriksson et al., Acta Med Scand. 1986;220:83-88（非特許文献15）；Sheth et al., Ann Intern Med 1997; 126(2):137-45（非特許文献16））。AFLDの主な治療法は、アルコールからの離脱を含む (Scaglioni et al., Dig Dis 2011;29:202-10（非特許文献17）)。
【０００６】
世界的に肥満およびインスリン抵抗性の有病率が将来増加すると推定されることと併せて、肝臓での脂肪蓄積の増加と関連した一連の障害に対する有効な治療法が現在不足していることを考えると、これらの疾患を予防および治療する新たな方法を開発することが急務である。この問題をさらに悪化させているのは、これらの疾患の発病に関与する機構の明確な理解が不足していることである。例えば、肝臓の脂質生成、またはAFLDおよびNAFLDの発症に関与する分子経路のより良い理解は、標的薬物ベースの治療法を開発するための手段を提供するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Reddy et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006;290:G852-8
【非特許文献２】Grattagliano et al., Can Fam Physician 2007; 53:857-863
【非特許文献３】Browning et al. Hepatology 2004;40:1387-95
【非特許文献４】Wanless et al, Hepatology, 1990;12:1106-10
【非特許文献５】Cohen et al., Science 2011;332:1519-23
【非特許文献６】Macias-Rodriguez et al., Rev Invest Clin 2009;61:161-72
【非特許文献７】Day et al., Gastroenterology 1998;114:842-5
【非特許文献８】Schuppan et al., Liver International 2010;30:795-808
【非特許文献９】Feldstein et al. Gastroenterology 2003;125:437-43
【非特許文献１０】Hooper et al., J Lipid Res 2011;52:593-617
【非特許文献１１】Bandsma et al., Pediatr Res 2008;63:702-7
【非特許文献１２】Komatsu et al., J Hepatol 2008;49:810-20
【非特許文献１３】Angulo et al., Sem Liver Dis. 2001;21(1):81-8
【非特許文献１４】Mishra et al. Curr Drug Discov Technol 2007; 4:133-40
【非特許文献１５】Eriksson et al., Acta Med Scand. 1986;220:83-88
【非特許文献１６】Sheth et al., Ann Intern Med 1997; 126(2):137-45
【非特許文献１７】Scaglioni et al., Dig Dis 2011;29:202-10
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、少なくとも一部は、蠕虫由来グリカン、例えばLNFPIIIを含む化合物が、肝臓の炎症を軽減し、肝細胞および肝臓での脂肪蓄積を阻害するという発見に基づいている。
【０００９】
1つの局面において、本発明は、肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、方法を提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を予防する方法であって、該疾患を発症するリスクを有する哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の予防的有効量を投与する段階を含む、方法を提供する。
【００１１】
特定の態様において、本発明の方法に従って治療または予防される疾患は、FLD、NAFLD、またはAFLDである。特定の好ましい態様において、疾患は、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎、またはアルコール性脂肪性肝炎である。さらなる別の態様において、疾患はメタボリックシンドロームである。
【００１２】
特定の態様において、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明の方法で用いられる化合物は、哺乳動物におけるトリグリセリドレベルを低下させる。関連態様において、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物は、哺乳動物の肝臓における脂質生成を抑制または阻害する。他の関連態様において、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物は、肝細胞におけるFXRαの産生を増加させる、および／またはSREBP-1cの産生を減少させる。
【００１３】
本発明の方法の特定の態様において、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有する化合物は、非経口的に、好ましくは腹腔内にまたは静脈内に投与される。別の態様において、化合物は経口投与される。
【００１４】
別の局面において、本発明は、肝細胞における脂質生成を減少させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の十分量と該肝細胞を接触させる段階を含む、方法を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、細胞（例えば、肝細胞）におけるFXRαの産生を増加させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と該細胞を接触させる段階を含む、方法を提供する。好ましい態様において、FXRαはFXRα3/α4である。別の好ましい態様において、FXRαはFXRα1/α2である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、FXRαによって転写的に誘導される遺伝子産物の産生を増加させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と肝細胞を接触させる段階を含む、方法を提供する。好ましい態様において、遺伝子産物はSHP、OATP1、PLTP、および／またはBSEPである。
【００１７】
別の局面において、本発明は、肝細胞におけるErk-c-fos/AP1-FXRα経路の活性化を上昇させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と該肝細胞を接触させる段階を含む、方法を提供する。好ましい態様において、Erk-c-fos/AP1-FXRα経路の活性化は脂質生成の減少を伴う。
【００１８】
特定の態様において、本発明の方法で用いられる化合物は、少なくとも1つまたは少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む。特定の態様において、蠕虫由来グリカンはルイスx抗原、非ルイスx抗原、またはそれらの組み合わせを含む。特定の好ましい態様において、本発明の方法で用いられる化合物は、LNFPIII、LNnT、LDN、LDNF、SEA、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１９】
他の態様において、本発明の方法で用いられる蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質は担体分子に架橋されている。特定の好ましい態様では、2つまたはそれ以上の蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている。好ましい態様において、架橋された蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質と担体分子の分子量は、好ましくは約5,000〜100,000ダルトンであり、より好ましくは約10,000〜40,000ダルトンである。さらなる他の好ましい態様において、架橋された複合物は、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有し、より好ましくは、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有し、さらにより好ましくは、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する。特定の好ましい態様において、担体は糖質ポリマー（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、HSA）、またはポリアクリルアミドである。
【００２０】
関連局面において、本発明はまた、肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患または障害を治療するのに十分な量の、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質の1つまたは複数を含む薬学的組成物に注目する。本発明には、本発明の組成物を含むキットもまた含まれる。
【００２１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】媒体、LNFPIII、またはSEAで処置したマウスからの肝臓切片の顕微鏡写真を示す。実験期間中、8〜10週齢の雄のC57BL/6Jマウスに高脂肪、高炭水化物食を課した。この食餌を6週間与えた後、マウスに、表示のように25μgデキストラン（媒体）、25μg LNFPIII‐デキストラン (LNFPIII)、または25μg SEA（0.9% NaCl中）を週に2回注射した。SEA実験の媒体は0.9% NaClであった。組織採取および組織学的検査のために、処置の6週目にマウスを屠殺した。
【図１Ｂ】媒体もしくはLNFPIIIで処置したマウス（左パネル）またはSEA（0.9% NaCl中25μg）で処置したマウス（右パネル）からの肝臓におけるトリグリセリドのレベルを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図１Ｃ】リアルタイムq-PCRで評価した、媒体またはLNFPIIIで処置したマウス（n＝5匹／群）の肝臓における、炎症、脂質生成、およびβ酸化に関与する遺伝子の相対的mRNA発現を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図１Ｄ】媒体またはLNFPIII処置マウスの循環中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) およびアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) のレベルを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図１Ｅ】媒体またはSEA処置マウスの循環中のASTおよびALTのレベルを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図２Ａ】媒体 (20μg/ml) またはLNFPIII (20μg/ml) でインビトロにおいて24時間処理した初代肝細胞における脂質生成（左パネル）またはβ酸化（右パネル）の程度を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図２Ｂ】媒体またはLNFPIIIで24時間処理した初代肝細胞における表示の遺伝子のmRNA発現レベルを示す棒グラフである。LNFPIIIはFXRαおよびSHPの発現を増加させるが、脂質生成遺伝子を下方制御する。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図２Ｃ】ヒトFXRα1/α2（プロモーター1）およびFXRα3/α4（プロモーター2）の発現を駆動するための選択的プロモーター使用を示すFXRαプロモーターのゲノム構造の模式図である。
【図２Ｄ】リアルタイムq-PCRで評価した、媒体もしくはLNFPIIIで処置したマウス（n＝5匹／群）の肝臓における、FXRαシグナル伝達経路で機能する遺伝子のmRNA発現レベルを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図２Ｅ】リアルタイムq-PCRで評価した、媒体 (0.9% NaCl) およびSEA（0.9% NaCl中の25μg）で処置したマウス（n＝5匹／群）の肝臓における、FXRαシグナル伝達経路で機能する遺伝子のmRNA発現レベルを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図２Ｆ】リアルタイムq-PCRで評価した、媒体またはLNFPIIIで処置したFXR-/-マウス（n＝6匹／群）の肝臓における、脂質生成およびβ酸化に関与する遺伝子の相対的mRNA発現を示す棒グラフである。
【図２Ｇ】媒体、LNFPIII、またはSEAで処理した、野生型マウスまたはFXR-/-マウスから単離された初代肝細胞における脂質生成およびβ酸化を示す棒グラフである。細胞は24時間処理した。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。LNFPIIIおよびSEAが肝細胞における脂質合成を阻害する、およびβ酸化を増強する能力は、FXRαに依存する。
【図２Ｈ】LNFPIII処置をしたまたはしていない野生型マウスおよびFXR-/-マウス（n＝6匹／遺伝子型）における肝臓トリグリセリド含量を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05（LNFPIII 対 媒体対照）。
【図２Ｉ】LNFPIII処置をしたまたはしていない野生型マウスおよびFXR-/-マウス（n＝6匹／遺伝子型）における血清AST濃度およびALT濃度を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05（LNFPIII 対 媒体対照）。
【図３Ａ】ヒト、ラット、およびマウスFXRα下流プロモーター（プロモーター2）の5'近位調節領域の配列のアライメントである。C/EBPの推定結合部位（部位1）およびAP-1の推定結合部位（部位2および部位3）、ならびにレポーターアッセイのための変異配列を示してある。
【図３Ｂ】LNFPIII (20μg/ml) またはSEA (2μg/ml) で処理をした場合またはしなかった場合の、2 kb断片のヒトFXRαプロモーター1または0.13 kb断片のヒトFXRαプロモーター2によって駆動されるルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトしたHepG2細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図３Ｃ】LNFPIII (20μg/ml) またはSEA (2μg/ml) を用いてまたは用いずに処理した初代肝細胞における、内因性のFXRα1/α2遺伝子およびFXRα3/α4遺伝子のmRNAレベルを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図３Ｄ】図3D（上パネル）は、FXRαプロモーター2 (p2-0.13 kb) 構築物または変異体 (p2-0.13 kb-M) 構築物を示す模式図である。転写開始部位を1と指定した。2つの重複AP1結合部位および導入された変異の配列を示す。図3D（下パネル）は、Erk阻害剤PD98059 (10μM) の存在下または非存在下で媒体またはLNFPIIIを用いてまたは用いずに処理したHepG2細胞における、表示の構築物を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを示す棒グラフである。細胞は、PD98059であらかじめ1時間処理してから、LNFPIIIで一晩処理した。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図３Ｅ】媒体またはSEAで処理したHepG2細胞における、部位1変異体、部位2変異体、または部位3変異体ルシフェラーゼレポーター構築物を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを示す棒グラフである。部位は図3Aで定義されている。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。FXRαプロモーター2の誘導は、部位3におけるAP1結合配列によって媒介される。部位1および部位2における変異は影響を及ぼさなかった。LNFPIIIでも同様の結果が得られた（データは表示せず）。
【図３Ｆ】図3F（上パネル）は、媒体またはLNFPIII処置マウスから調製された肝臓溶解物におけるホスホ‐ERK (p-Erk) および全Erk (t-Erk) のレベルに関する免疫ブロットである（n=5、代表的な3つの試料／処置を示す）。アクチンレベルを負荷対照とした。図3F（下パネル）は、図3F（上パネル）からの免疫ブロットのデンシメトリー解析を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図３Ｇ】図3G（左パネル）は、媒体、LNFPIII、PD90859、またはLNFPIII + PD98059で処理した初代肝細胞におけるホスホ‐Erk (p-Erk) および全Erk (t-Erk) のレベルに関する免疫ブロットである。細胞は、PD98059であらかじめ1時間処理してから、LNFPIIIで一晩処理した。アクチンレベルを負荷対照とした。図3G（右パネル）は、図3G（左パネル）からの免疫ブロットのデンシメトリー解析を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。
【図３Ｈ】媒体、SEA、またはSEA + PD98059で処理した初代肝細胞におけるp-Erkおよびt-Erkのレベルに関する免疫ブロットである。細胞は、PD98059であらかじめ1時間処理してから、SEAで一晩処理した。アクチンレベルを負荷対照とした。
【図３Ｉ】図3I（左パネル）は、媒体、LNFPIII、PD98059、またはLNFPIII + PD98059で処理したWT肝細胞およびFXRα-/-肝細胞における脂質生成活性を示す棒グラフである。細胞は、PD98059であらかじめ1時間処理してから、LNFPIIIで一晩処理した。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。LNFPIIIが肝細胞における脂質生成を抑制する能力は、Erk活性およびFXRαに依存した。図3I（右パネル）は、媒体、LNFPIII、PD98059、またはLNFPIII + PD98059で処理したWT肝細胞およびFXRα-/-肝細胞におけるβ酸化を示す棒グラフである。細胞は、脂質生成アッセイと同様に処理した。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。LNFPIIIが肝細胞におけるβ酸化を増加させる能力は、Erk活性およびFXRαに依存した。
【図３Ｊ】媒体、SEA、またはSEA + PD98059で処理した肝細胞の脂質生成活性を示す棒グラフである。細胞は、PD98059であらかじめ1時間処理してから、SEAで一晩処理した。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。SEAが肝細胞における脂質生成を抑制する能力は、Erk活性に依存した。
【図４】図4Aは、媒体（第1レーン）、5μg LNnT（第2レーン）、または20μg LNnT（第3レーン）で処理した肝細胞の脂質生成活性を示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。図4B（上パネル）は、ヒトFXRα1/α2およびFXRα3/α4の発現を駆動するための選択的プロモーター使用を示すFXRαプロモーターのゲノム構造を表す略図である。図4B（下パネル）は、LNnTありまたはなしでの、ヒトFXRα1/α2プロモーターおよびFXRα3/α4プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトしたHepG2細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイを示す棒グラフである。結果は、平均値±SEMとして示してある。*p<0.05。
【図５】Erk-c-fos/AP1-FXRα軸シグナル伝達経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の前に、ルイス抗原を含む化合物（例えば、LNFPIII）が、自己免疫障害、癌、および感染症などの多くの疾患状態の発症および進行にとって重要であることが知られている、Th1応答またはTh2応答の発生を歪めるサイトカイン（例えば、IL-10、IL-4、およびIL-5）の免疫細胞による産生を調節し得ることが知られていた。例えば、刺激型のルイス抗原化合物は、抗原特異的免疫応答（IgG応答）を誘発することが示されているのに対して、阻害型はアレルギー応答（IgE応答）を阻害することが示されている（例えば、米国特許第6,540,999号、第6,841,543号、および第7,799,755号を参照されたい）。しかしながら、他の臨床状況におけるルイス抗原含有化合物（例えば、LNFPIII）の役割、およびこれらの化合物によって標的化されるシグナル伝達経路は、本質的に不明である。
【００２４】
これに応じて、本発明は、少なくとも一部は、蠕虫由来グリカンまたはその複合糖質（例えば、ルイスx抗原を含む化合物（例えば、LNFPIII）、非ルイスx抗原を含む化合物（例えば、LNnT、LDN、その誘導体）、またはルイスx抗原と非ルイスx抗原の混合物を含む化合物（例えば、SEA））を含む化合物が、Erkを活性化することができ、その後AP-1転写複合体の活性化、FXRαおよびFXRα標的遺伝子の発現の誘導、ならびにFXRαによって媒介される肝細胞における脂質生成の阻害が起こるという予期せぬ知見に基づいている。脂質生成遺伝子発現の減少は、トリグリセリドレベルの低下、ならびに肝細胞および肝臓における脂肪酸β酸化の増加を伴う。
【００２５】
したがって、本発明は、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物による、肝臓における炎症および脂肪蓄積の増加を特徴とする疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明の方法は、脂肪肝疾患 (FLD) を有するかまたはそれを発症するリスクを有する対象における該疾患の発症を治療または予防するのに、および肝細胞における脂質生成を阻害するのに有用である。本発明はまた、脂肪肝疾患を有する対象に蠕虫由来グリカンおよび／もしくはその複合糖質を含む化合物を投与すること、または蠕虫由来グリカンおよび／もしくはその複合糖質を含む化合物と肝細胞を接触させることにより、Erk-c-fos/AP-1-FXRαシグナル伝達経路を調節する方法を提供する。
【００２６】
Erkはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) のサブファミリーに属し、連続的なリン酸化によるその活性化は、細胞表面上のそれらの受容体に対する細胞外刺激物質の結合による二次的なものである。Erkは活性化されると、様々な細胞質タンパク質または核タンパク質をリン酸化して活性化し、細胞の増殖および分化を制御する生物学的応答を含む複数の生物学的応答を媒介する。本発明との関連では、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物で肝細胞または対象を処置すると、Erk活性が上昇する。
【００２７】
AP-1複合体は、bZIP型転写因子であるc-fosとc-junの二量体化により形成される。AP-1複合体は、細胞外シグナルに応答してMAPKシグナル伝達カスケードによって活性化される。本発明との関連では、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物で肝細胞または対象を処置すると、AP-1活性が上昇する。
【００２８】
FXRまたは胆汁酸受容体は、肝臓および腸において高度に発現される核内受容体である。FXRは、胆汁酸恒常性の調節を担う重要な転写因子の1つである (Forman et al., Cell 1995;81:687-93)。FXRは活性化されると、細胞核へ移行し、結合パートナーと二量体化し、DNA上のホルモン応答エレメントに結合する。FXRの標的遺伝子は、直接的であっても間接的であってもよい。標的遺伝子の直接的調節は、DNA上のホルモン応答エレメントの直接的結合によって起こり得る。転写標的の間接的調節は、中間体を介して起こり得る。例えば、FXRは小型ヘテロ二量体パートナー (SHP) タンパク質の発現を誘導することができ、SHPタンパク質は次に標的遺伝子の転写を阻害し得る。機構的に、FXRによるSHPの誘導は、主要な脂質生成調節因子SREBP-1cの発現を減少させることが示されている (Watanabe et al., J Clin Invest 2004;113:1408-18)。FXRα標的遺伝子のいくつかの例には、SHP、有機アニオン輸送タンパク質1 (OATP1)、リン脂質輸送タンパク質 (PLTP)、および胆汁酸塩排出ポンプ (BSEP) が含まれる。本発明との関連では、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質、例えばLNFPIIIおよびSEAを含む化合物で肝細胞または対象を処置すると、FXRα産生、具体的にはFXRα3/α4産生が増加する。SEAで肝細胞または対象を処置すると、FXRα1/α2産生およびFXRα3/α4産生の両方が増加する。
【００２９】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物による処置に応答して下方制御される脂質生成遺伝子には、SREBP-1cおよびその下流の転写標的遺伝子［例えば、脂肪酸合成酵素 (FAS)、アセチルCoAカルボキシラーゼ1 (ACC1)、アセチルCoAカルボキシラーゼ2 (ACC2)、ステアロイルCoA不飽和化酵素1 (SCD1)］が含まれる。SREBP-1cは、bHLH-Zipファミリーに属する転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質 (SREBP) のメンバーである (Yokoyama et al., Cell 1993;75:187-97)。これらの転写因子は、コレステロールまたは脂肪酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子中に存在するステロール調節エレメント (SRE) に結合する (Rawson et al., MCB 2003;4:631-40)。
【００３０】
本発明の様々な組成物および方法を以下に詳細に記載する。本明細書において特定の組成物および方法が例証されるが、多くの代替的な組成物および方法のいずれもが、本発明の実施における使用に適用可能でありかつ適していることが理解される。
【００３１】
定義
別段の指示がない限り、本明細書で用いられる用語はすべて、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えDNA技術の従来技法を使用する。本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内にあるウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技法の従来法を使用する。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition)；DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)；Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijssen, ed.)；Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.) を参照されたい。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「ルイス抗原」という用語は、1つまたは複数のフコシル残基で置換されたラクトI型構造｛Gal(β1-3)GlcNac｝またはラクトII型構造｛Gal(β1-4)GlcNac｝のいずれかをコア配列として有する糖質を含むことが意図される。ルイス抗原は、単一の置換コア配列または反復する一連の置換コア配列を含み得る。さらに、コア配列は、より大きな糖の中に存在してもよい。したがって、ルイス抗原含有オリゴ糖は、例えば、三糖、四糖、五糖等であってよい。ルイス抗原の種類には、ルイスx、ルイスy、ルイスa、およびルイスbオリゴ糖、ならびにそれらの誘導体が含まれる。本明細書に記載される免疫調節能を保持するこれらの糖質の合成構造相同体もまた、「ルイス抗原」という用語に包含されることが意図される。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「ルイスxオリゴ糖」という用語は、構造：｛Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]GlcNac｝を含むラクトII型糖質を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「ルイスyオリゴ糖」という用語は、構造：｛Fuc(α1-2)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]GlcNac｝を含むラクトII型糖質を指す。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「ルイスaオリゴ糖」という用語は、構造：｛Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNac｝を含むラクトI型糖質を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「ルイスbオリゴ糖」という用語は、構造：｛Fuc(α1-2)Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNac｝を含むラクトI型糖質を指す。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、ルイスオリゴ糖の「誘導体」とは、1つまたは複数の付加的な置換基を有するルイスオリゴ糖を指す。誘導体の例には、末端シアル酸化型のルイスオリゴ糖（例えば、シアリルルイスx、シアリルルイスy、シアリルルイスa、シアリルルイスb）、硫酸化型のルイスオリゴ糖、およびスルホシアル酸化型のルイスオリゴ糖が含まれる。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「SEA」という用語は、ルイスx抗原および非ルイスx抗原を含む住血吸虫卵抗原または可溶性卵抗原を指す。「SEA由来グリカン」とは、SEA中に存在する様々な異なるグリカン種を指し、例えばLNFPIII、LNnT、LND、およびLDNFなどであるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、「LN」という用語は、構造：｛Gal(β1-4)GlcNAc｝を有する糖を指す。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、「LNFPIII」という用語は、構造：｛Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc｝を有し、かつルイスx抗原を含む化合物を指す。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、「LNnT（ラクト-N-ネオテトラオース）」という用語は、コア構造：｛Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc｝を有するポリラクトサミン糖を指す。LNnTは、LNFPIIIの非フコシル化相同体である。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「LDN」 (LacdiNAc) という用語は、構造：｛GalNAc(β1-4)GlcNAc｝を有する糖を指す。本明細書において「LDNF」と称されるフコシル化LDNは、構造：｛GalNac(β1-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ1｝を有する。LDNの他のフコシル化誘導体には、これらに限定されないが、LDN-DF｛GalNAc(β1-4)[Fuc(α1-2)Fuc(α1-3)]GlcNAcβ1｝、F-LDN｛Fuc(α1-3)GalNAc(β1-4)GlcNAcβ1｝、F-LDN-F｛Fuc(α1-3)GalNAc(β1-4)[Fuc(α1-3)]GlcNAcβ1｝、およびDF-LDN-DF｛Fuc(α1-2)Fuc(α1-3)GalNAc(β1-4)[Fuc(α1-2)Fuc(α1-3)]GlcNAcβ1｝が含まれる（Peterson et al., Int J Parasitology 2009;39:1331-44；Hokke et al., Exp Parasitology 2007;117:275-83）。LDNおよびそのフコシル化誘導体はいずれも、本発明の範囲内であると見なされる。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「蠕虫由来グリカン」という用語は、Jonhston et al., Parasitology 2009;136:125-47、およびDie and Cummings, Glycobiology 2010;20:2-12において概説されているような、蠕虫として分類される真核生物寄生虫（例えば、これらに限定されないが、シストソーマ (Schistosoma) 属の虫、例えばマンソン住血吸虫 (S. mansoni) など；ファスキオラ (Fasciola) 属の虫、例えば肝蛭 (Fasciola hepatica) など；エキノコックス (Echinococcus) 属の虫、例えば多包条虫 (Echinococcus multilocularis) など）に存在するグリカン種を指す。このようなグリカンには、ルイスx抗原を含む化合物（例えば、LNFPIII）、非ルイスx抗原を含む化合物（例えば、LNnTおよびLDN（およびLDN誘導体））、またはルイスx抗原と非ルイスx抗原の混合物を含む化合物（例えば、SEA）が含まれる。本明細書で用いられる「複合糖質」とは、担体分子にコンジュゲートされたグリカン分子、例えば、例えば脂質（例えば、糖脂質、リン脂質）、タンパク質にコンジュゲートされた蠕虫由来グリカンを指す。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「多価の蠕虫由来グリカンまたはその複合糖質」という用語は、複数のLNFPIII含有オリゴ糖が1つの担体分子にコンジュゲートされた形態などの、複数コピーの1つまたは複数の蠕虫由来グリカン含有オリゴ糖を含む合成構築物を指すことが意図される。「多価の蠕虫由来グリカンまたはその複合糖質」とはまた、複数の異なる蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質種が1つの担体分子にコンジュゲートされた形態を指し得る。非限定的な例において、担体分子は、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFのうちの2つまたはそれ以上とコンジュゲートされ得る。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「脂肪肝疾患」(FLD) という用語は、アルコール性脂肪肝疾患 (AFLD) および非アルコール性脂肪肝疾患 (NAFLD) を包含することが意図される。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、「アルコール性脂肪肝疾患」という用語は、アルコール性肝臓脂肪症 (ASH) およびアルコール性脂肪性肝炎を包含することが意図される。AFLDは、アルコール消費歴によって生じる肝臓細胞への脂肪蓄積によって起こる（Reddy et al.、前記）。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「非アルコール性脂肪肝疾患」という用語は、過度のアルコール消費歴のない個体における肝臓細胞への脂肪の蓄積によって生じる一連の障害を指す。最も軽度な形態において、NAFLDは肝臓脂肪症を指す。NAFLDという用語はまた、より重度で進行した形態である非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH)、硬変、肝細胞癌、およびウイルス誘発性（例えば、HIV、肝炎）脂肪肝疾患を包含することが意図される。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、「対象」または「個体」または「患者」という用語は、FLDを有するかまたはそれを発症するリスクを有するヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。本発明の「哺乳動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、齧歯類、およびトランスジェニック非ヒト動物を含む。「対象」、「個体」、および「哺乳動物」という用語は、互換的であることが意図される。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、「接触させる」（すなわち、化合物と細胞を接触させる）という用語は、化合物と細胞をインビトロで共にインキュベートすること（例えば、化合物を培養中の細胞に添加すること）、および化合物と対象の細胞がインビボで接触するように化合物を対象に投与することを含むと意図される。
【００５０】
本明細書において用いられる「治療する」という用語は、FLDの進行を軽減する、緩和する、阻害するか、またはFLDの1つもしくは複数の状態もしくは症状を部分的もしくは完全に取り除くための、蠕虫由来グリカン、蠕虫由来グリカン含有複合糖質、またはそれらの組み合わせを含む組成物の対象への適用または投与（治療法）を指す。本明細書において用いられる「治療」という用語は、治療する行為を指す。
【００５１】
本明細書において用いられる「予防」または「予防する」という用語は、疾患の発症または進行を阻害する、回避する、または未然に防ぐための、蠕虫由来グリカン、蠕虫由来グリカン含有複合糖質、またはそれらの組み合わせを含む組成物の対象への適用または投与（予防法）を指す。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、「十分量」または「有効量」という用語は互換的に用いられて、所望の結果を達成するために必要な量を指す。例えば、蠕虫由来グリカン、複合糖質含有化合物（例えば、SEA、LNFPIII、LnNT、LDN、またはLDFN）、またはそれらの組み合わせの十分量または有効量は、以下のうちの1つまたは複数をもたらす：媒体または対照と比較した、インビトロの肝細胞またはインビボの肝臓における脂質生成に関与する1つもしくは複数の遺伝子の発現の減少、Erkリン酸化の増加、c-fos/AP1転写活性の増加、FXRα遺伝子の転写の増加、および／またはFXRα遺伝子の転写標的の産生の増加。蠕虫由来グリカン、複合糖質含有化合物（例えば、SEA、LNFPIII、LnNT、LDN、またはLDFN）、またはそれらの組み合わせの有効量または十分量とはまた、単独で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて、FLDと関連した1つまたは複数の症状または状態を治療または予防するのに有効な量を指す。これらの効果は、当技術分野で公知の日常的な診断技法を用いて確認することができ、対象の生存期間の延長、対象の経験する症状の軽減、または対象における症状の発症の予防として現れ得る。
【００５３】
同様に、「治療的有効量」という用語は、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を誘発するベクターの能力に応じて異なり得る。治療的有効量とはまた、治療上有益な効果がいかなる毒性または有害効果も上回るものでもある。例えば、治療的有効量とは、必要な投与量および期間で、肝臓脂肪含量の減少を達成し、それによって特定の疾患状態の治療経過に影響を及ぼすのに有効な量である。本明細書で用いられる場合、「予防的有効量」という用語は、必要な投与量および期間で、例えば予防目的で肝臓での脂肪の蓄積を軽減または阻害するといった所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、予防的用量は対象において疾患の初期段階の前または初期段階で用いられるため、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００５４】
本発明の様々な局面を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。
【００５５】
I. FLDを治療または予防するための化合物
本発明の方法で使用され得る化合物は、肝細胞における脂質生成を抑制すること、および／または肝臓脂肪症から肝臓を保護することにより、肝臓での脂肪の蓄積を阻害する。
【００５６】
1つの態様において、本発明の方法で用いられる化合物は、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質、例えばルイス抗原を含む化合物を含む。ルイス抗原は、例えば、ルイスx、ルイスy、ルイスa、もしくはルイスbオリゴ糖、またはそれらの誘導体であってよい。肝細胞の治療に関する特定の態様において、ルイス抗原は好ましくはルイスxである。ルイス抗原はまた、より大きな糖質構造中に存在してもよい。例えば、化合物の糖質部分は、構造：｛Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc｝を有し、かつルイスxオリゴ糖を含むラクト-N-フコペンタオースIII (LNFPIII) であってよい。
【００５７】
非ルイスグリカンには、構造：｛GalNAc(β1-4)GlcNAc｝を有するLacdiNAc (LDN)；および構造：｛GalNac(β1-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ1｝を有するフコシル化LacdiNAc (LDNF) が含まれるが、これらに限定されない。別の態様において、化合物はSEA由来グリカンを含み得る。別の態様において、蠕虫由来グリカンは、コア構造：｛Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc｝を有するラクト-N-ネオテトラオース (LNnT) である。
【００５８】
本発明の化合物として使用するのに適しているルイス抗原または非ルイス抗原を含む他の関連糖質は、当業者には明白である。好ましい態様において、蠕虫由来グリカンはLNFPIIIである。別の態様において、本発明の方法で用いられる化合物は、同時にまたは別々に組み合わせて投与することができる。
【００５９】
特定の態様において、本発明の方法で典型的に用いられる蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物は、糖質構造が多価の架橋された形態で存在するものである。好ましい態様において、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物は、担体分子と、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を示す複数の糖質分子の複合物である。例えば、ヒト血清アルブミン (HSA) とルイスxオリゴ糖の複合物（本明細書ではHSA‐ルイスxと称される）のように、糖質分子をタンパク質担体にコンジュゲートさせることができる。糖‐担体タンパク質複合物が対象に投与される場合、担体タンパク質は、担体タンパク質に対する免疫学的反応が対象において促進されないように選択されるべきである（例えば、ヒト担体タンパク質がヒト対象と共に用いられるべきである、等）。
【００６０】
ルイス抗原または非ルイス抗原を示す糖質分子を、担体タンパク質の代わりに他の担体分子、例えば、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体にコンジュゲートさせることができ、この例として、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製する方法は、当業者には明白である。材料はまた、例えばAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス性抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的としたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００６１】
他の好ましい担体には、糖質または多糖ポリマーなどのポリマーが含まれる。好ましい糖質ポリマーはデキストランである。典型的には、担体分子として有用である糖質または多糖は、約5,000〜100,000ダルトン、好ましくは約8,000〜80,000ダルトン、より好ましくは約10,000〜50,000ダルトンまたは約10,000〜40,000ダルトンの分子量を有する。
【００６２】
担体にコンジュゲートされた糖の密度に関して、糖分子は好ましくは複合物の少なくとも10重量％、より好ましくは複合物の少なくとも15重量％、さらにより好ましくは複合物の少なくとも20重量％、およびさらにより好ましくは複合物の少なくとも25重量％、およびさらにより好ましくは複合物の少なくとも25重量％、または複合物の少なくとも30重量％、または複合物の少なくとも35重量％、または複合物の少なくとも40重量％、または複合物の少なくとも45重量％を構成する。特定の態様において、糖分子は複合物の約10〜25重量％、複合物の約15〜25重量％、または複合物の約20〜25重量％、または約30〜35重量％、または約35〜40重量％、または約40〜45重量％を構成する。いくつかの態様において、複合物は、10〜11個、12〜13個、14〜15個、6〜17個、18〜19個、または20個もしくはそれ以上の糖／複合物を含む。さらにより好ましくは、ルイス抗原を示す糖質を含む化合物は、25個、30個、25個、40個、45個、50個、またはそれ以上の糖／複合物を含む複合物である。好ましい態様において、ルイス抗原を示す糖質を含む化合物は、ルイス抗原を示す複数の糖質分子と担体ポリアクリルアミドの複合物である。より好ましくは、ポリアクリルアミド複合物は25〜30個（またはそれ以上）の糖／複合物を含み、複合物の平均分子量はおよそ30 kDである。あるいは、またはルイス抗原と組み合わせて、化合物は非ルイス抗原を示す糖質を含み得る。
【００６３】
上記のルイス抗原および／または非ルイス抗原含有糖を含む複合物に加えて、ルイス抗原および／または非ルイス抗原を含む他の化合物には、脂質生成を抑制し、FLDを予防または治療するのに適した形態でルイス抗原および／または非ルイス抗原を天然で含む単離されたタンパク質が含まれる。このようなタンパク質の一例は住血吸虫卵抗原 (SEA) であり、これはルイスxオリゴ糖および非ルイスxオリゴ糖の両方を示す。SEAは様々な種から単離され得る。シストソーマ属は、様々な生活環を有する21種の虫を含む。これらのうち3つの主な種が、ヒトにおいて住血吸虫症を引き起こすと考えられている‐マンソン住血吸虫、日本住血吸虫 (S. japonicum)、およびビルハルツ住血吸虫 (S. haematobium)。3つのすべての種の卵が、ヒトにおいてTh2表現型を誘導することが示されている。3つのすべての種に由来する抗原が、宿主グリカンを模倣するグリカンを含む。これらには、例えば、ルイスX、偽ルイスY、LDN、LDNF、高マンノース型、およびLNグリカンが含まれる。大部分の住血吸虫種の卵で、類似の構造的グリカンが認められる。マンソン住血吸虫および日本住血吸虫は肝臓の寄生虫であり、それらが肝臓および肝循環において産卵することが示唆される。ルイス抗原を示すことが報告されている他のタンパク質には、腫瘍関連抗原（例えば、Pauli et al., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 1992;4:405-14；Hakomori, Adv Cancer Res 1989;52:257-331を参照されたい）、およびHIV gpl20 (Adachi et al., J Exp Med 1988;167:323-31) が含まれる。
【００６４】
本発明の方法に用いるための化合物は、商業的に購入するか、または標準的方法によって精製もしくは合成することができる。例えば、ルイス抗原含有糖と担体タンパク質（例えば、HSA）の複合物は、Accurate Chemicals、Westbury, N.Y.から入手可能である。ルイス抗原含有糖とポリアクリルアミドの複合物は、GlycoTech、Rockville, MDから入手可能である。LNFPIIIは、Sigma-Aldrich (USA) から入手可能である。住血吸虫卵抗原 (SEA) は、Harn et al. (1984) J. Exp. Med. 159:1371-1387に記載されているように、マンソン住血吸虫卵から精製することができる。ルイス抗原含有糖またはそれらの誘導体は、標準的方法によって、例えば化学架橋剤を用いて、担体分子にコンジュゲートさせることができる。多種多様な、ホモおよびヘテロ官能性双方の二官能性または多官能性架橋試薬が、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、Pierce Chemical Co.、Rockford, Ill.）。2種以上の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を単一の担体にコンジュゲートさせることができる。1つの非限定的な例において、LNFPIII、LnNT、LDN、およびLDNFのうちの1つまたは複数を、同じ担体分子にコンジュゲートさせることができる。このような複合物は、単一の蠕虫由来グリカンではなく、蠕虫由来グリカンの混合物を担体分子にコンジュゲートさせることによって行うことができる。
【００６５】
多価形態の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質は、標準的方法を用いて作製することができる。例えば、オリゴ糖の2つ以上の個々の分子が多価担体に共有結合した複合物を生じるように、当技術分野で公知の技法を用いて、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質のオリゴ糖部分を多価担体に結合させる。多価担体は、2〜1,000分子（すなわち、p＝2〜1,000の整数）、好ましくは2〜200分子、好ましくは2〜100分子、より好ましくは10〜100分子、より好ましくは2〜50分子、より好ましくは10〜50分子、さらにより好ましくは20〜50分子のオリゴ糖部分を多価担体に結合させたままにした多価分子を提供するのに十分大きい。特定の好ましい態様において、13個、25個、35個、45個、50個、100個、または200個の、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有する分子、例えばLNFPIIIが、多価担体に結合している。
【００６６】
適切な多価担体には、還元末端糖に結合し得る末端連結基と結合を形成し得る複数の結合部位を有する化合物、またはグルコースもしくはN-アセチルグルコサミン残基のC1グリコシド酸素と結合を形成し得る複数の結合部位を有する化合物が含まれる。例には、ポリオール、多糖、ポリリジン、アビジン、ポリアクリルアミド、糖質（例えば、デキストラン）、脂質、脂質乳剤、リポソーム、デンドリマー、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン (HSA)、ウシ血清アルブミン (BSA)）、またはシクロデキストリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
多価分子を作出するため、およびオリゴ糖を多価担体に連結するために必要な化学は、連結化学の分野において周知である。本発明に従った連結化学の非限定的な例には、米国特許第5,736,533号、Stowell et al. (Stowell et al. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 1980;37:225)、およびSmith et al. (Smith et al. (1978) Complex Carbohydrates part C, Methods in Enzymology, volume L, Ed. by V. Ginsburg, pg. 169) に記載されているものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
例えば、還元末端糖と担体分子との間の結合は、還元末端糖のC1におけるアルデヒドもしくはカルボン酸、または酸化により還元末端糖上に導入された任意のアルデヒド基もしくはカルボン酸基を担体分子と反応させて、--NH--、--N(R')_（R'はC1-20アルキルである）、ヒドロキシアルキルアミン、アミド、エステル、チオエステル、チオアミドなどの適切な結合を形成させることによって、形成させることができる。還元末端糖と担体分子との間の結合はまた、ピラノース型におけるC1ヒドロキシル基をアシル化剤および分子ハロゲン化物と反応させてから求核剤と反応させて、--NH--、--N(R')--（R'はC1-20アルキルである）などの適切な結合を形成させることによって、形成させることもできる（Stowell et al.、前記に記載されている）。オリゴ糖部分は、還元末端糖のフリーのアノマー炭素を介して多価担体に結合させることができる。あるいは、還元末端糖は、Smith et al.、前記に記載されているように、フェネチルアミン‐イソチオシアネート誘導体を介して結合させることができる。多価複合物を形成するために用いることができる多種多様な他の二官能性および多官能性架橋剤が、当技術分野で公知であり、容易に入手可能である（例えば、Pierce Chemical Co.、Rockford, Ill.）。
【００６９】
II. アッセイ法
本発明の方法における任意のルイス抗原および／または非ルイス抗原含有化合物の有効性は、脂質生成の1つまたは複数の特徴を測定する、当技術分野で公知の方法によって容易に決定することができる。
【００７０】
例えば、肝細胞をルイス抗原および／または非ルイス抗原を含む化合物と接触させた後、その化合物が脂質生成を阻害するかどうかを判定するために試験するインビトロアッセイ法を用いることができる。脂質生成の阻害とは、本明細書で用いられる場合、媒体もしくは対照で処置した試料もしくは動物、または処置前の対照と比較した、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物または組成物を投与した際のトリグリセリドの濃度の減少、ならびに／または脂質生成遺伝子の発現および活性の減少を指す。
【００７１】
特定の態様において、本発明の方法において有用である蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有する化合物は、1つまたは複数の脂肪酸、好ましくはトリグリセリドのレベルの低下をもたらす。好ましい態様において、トリグリセリドのレベルは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれ以上低下する。トリグリセリドレベルは、例えばSigma-Aldrich (USA) から市販されているキットを用いて、製造業者の説明書に従って、酵素的にアッセイすることができる。トリグリセリドレベルの解析のための肝組織の調製は、例えばHong et al. (Hepatology 204;40:933-941) に開示されている通りに行うことができる。循環ASTレベルおよびALTレベルは、市販のキット（例えば、Sigma、USA；Bayer Diagnostics、USA）を用いて、製造業者の説明書に従って決定することができる。培養肝細胞または肝組織への脂質蓄積のレベルは、当技術分野で認識されている方法、例えばオイルレッドO染色を用いて決定することができる（例えば、Rector et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294:G619-G626）。
【００７２】
特定の態様において、本発明の方法において有用である蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有する化合物は、本発明の方法に従ってルイス抗原含有化合物で処置した際に、1つまたは複数の脂質生成遺伝子（例えば、SREBP-1c、FAS、ACC1、ACC2、SCD1）の発現を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上減少させる。mRNAまたは発現されたタンパク質のレベルを決定する方法は、例えば、ウェスタンブロット、ELISA、ドットブロット、放射免疫測定法、およびフローサイトメトリー、ノーザンブロット解析、RT-PCR、およびリアルタイムqPCRを含むがこれらに限定されない当技術分野で認識されている方法を用いて行うことができる。
【００７３】
1つの態様において、Erk-c-fos/AP1-FXRαシグナル伝達軸の調節における、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の有効性は、例えば実施例に記載されているように、当技術分野で公知の方法によって容易に決定することができる。例えば、培養肝細胞を媒体または蠕虫由来グリカンおよび／もしくは複合糖質を含有する化合物で一晩処理し、溶解し、抽出物を免疫ブロットおよび／またはリアルタイム定量的PCR解析のために処理することができる。経路の活性化は、Erk活性の増加（ホスホ‐ERK抗体を用いて評価される）、FXRα mRNAおよび下流のFXRα標的遺伝子の発現の増加（例えばリアルタイムqPCRを用いて評価される）、SREBP1cおよび他の脂質生成遺伝子のmRNA発現の減少（例えばリアルタイムqPCRを用いて評価される）、脂質生成の減少（例えば14C-酢酸から、クロロホルム／メタノール (2:1) 溶液で抽出可能な14C-脂質への変換によって決定される）、ならびにβ酸化の増加（Reilly et al, Cell Metab 2010;12:643-53によって記載される）によって証明される。AP-1活性は、実施例に記載されているように、適切な市販のレポーター（例えば、QIAGEN、USAによる）またはFXRα3/α4プロモーターを使用するレポーターアッセイ法（例えば、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法）を用いて決定することができる。AP-1活性はまた、ゲルシフトアッセイ法または免疫沈降法によって決定することもできる。
【００７４】
本発明の方法における蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有する化合物の有効性はまた、例えばNAFLD、AFLD、およびNASHの動物モデルにおいて試験することもできる。化合物（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を試験動物に投与し、試験動物における疾患の経過を、使用する特定のモデルにとって標準的な方法（例えば、組織学的検査、トリグリセリドレベル、バイオマーカーレベル）によってモニターすることができる。化合物の有効性は、未処置の動物（または対照化合物もしくは媒体で処置した動物）と比較した、化合物で処置した動物における疾患状態の寛解または改善、組織像、バイオマーカーレベル（例えば、肝細胞傷害時に全身循環に漏出する肝臓酵素であるASTおよびALT）、またはトリグリセリドの改善によって証明される。
【００７５】
NAFLDおよびNASHの非限定的な動物モデルには、実施例に記載される高脂肪食誘導性肥満モデル；CMF食（Oriental Yeast Co., Ltd、Japan）を与えたKK-Ayマウス (CLEA Japan, Inc.) (U.S. 2011/0003757.)；Long-Evans Tokushima脂肪ラット (Ota et al., Gastroenterology 2007;32:282-93)、SREBP-1cトランスジェニックマウス (Nakayama et al., Metabolism 2007;56:470-75)、L-SACC1（CEA関連CAM）ノックアウトマウス (Lee et al., Gastroenterology 2008;135:2084-95)、LDL-Rノックアウト＋FXRノックアウトマウス (Kong et al., J Pharmacol Exp Ther 2009;328:116-22)、および脂肪細胞11β-HSD1トランスジェニックマウス (Morton et al., Front Horm Res 2008;36:146-64) が含まれるが、これらに限定されない。食餌に基づく齧歯類NASHモデルには、アテローム生成食に課したマウス (Matsuzawa et al., Hepatology 2007;46:1392-403)、胃内高多価不飽和脂肪酸で処置したラット (Baumgardner et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294:G27-38)、メチオニンおよびコリン欠乏 (MCD) 食＋高脂肪食 (HFD) に課したマウス、MCD＋トランス脂肪＋ジエチルニトロソアミンに課したラット (de Lima et al., J Hepatol 2008;49:1055-56)、ならびにコリン欠乏Lアミノ酸置換食（CDAA食）に課したラット (Hebbard et al., Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 2011;8:35-44) が含まれる。別のNASHモデルは、脂肪性肝炎、ならびに過食症、高インスリン血症、および高脂血症を示す自発的遺伝的肥満モデルである肥満Zuckerラット (OZR) (Kitade et al., Hepatology 2006;44:983-91) である。
【００７６】
AFLDの動物モデルの非限定的な例もまた、例えば、Gyamfi et al. (Exp Biol and Med 2010;235:547-60)；ならびにLieber-DeCarli液体飼料モデルおよびTsukamoto-French胃内管給餌モデル（French. J Biomed Sci 2001;8:20-7；Lieber et al., Hepatology 1989;10:501-10）に記載されている。
【００７７】
MetSにおける肝臓脂肪蓄積の非限定的な動物モデルは、例えば、Panchal et al. (J Biomed Biotechnol 2011;2011:351982) に記載されているMetSの動物モデルなどのMetSの動物モデル；高脂肪食給餌ラット (Buettner et al., J Mol Endocrinol 2006;36:485-501)；高フルクトース、高脂肪誘導性ラット (Wada et al., Endocrinology 2010;151:2040-9)；高スクロース、高脂肪誘導性ラット (Sato et al., Diabetes 2010;59:2495-504)；およびナイルグラスネズミ (Nile Grass rat) (Noda et al., FASEB Journal 2010;24:2443-53) において試験することができる。
【００７８】
加えて、本発明の方法に用いるための蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有する化合物の毒性および治療効果は、例えばLD50（集団の50%に対して致死的な用量）およびED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を軽減するために、罹患組織の部位にこのような化合物を標的化する送達系を設計するよう注意が払われるべきである。
【００７９】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を規定する上で使用することができる。このような化合物の投与量は、毒性のほとんどないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法で用いられる任意の化合物に関して、治療的有効用量は最初に培養細胞アッセイから推定することができる。用量は、培養細胞で決定されたEC50（すなわち、最大半量の応答を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで規定することができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００８０】
III. 薬学的組成物
肝臓または肝細胞への脂肪蓄積と関連した疾患を治療するための本発明の方法において用いるための薬学的組成物は、典型的には、1つまたは複数の蠕虫由来グリカン、複合糖質、またはそれらの組み合わせ、好ましくはLNFPIIIおよびSEAなどのルイスx抗原を含む化合物を含む化合物、ならびに薬学的に許容される担体を含む。
【００８１】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。担体の種類は、意図される投与経路に基づいて選択することができる。様々な態様において、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経皮、または経口投与に適している。好ましい態様において、組成物は、静脈内投与に適するように製剤化される。本発明の薬学的組成物は、特定の投与経路に適するように製剤化することができる。例えば、様々な態様において、本発明の薬学的組成物は、注射、吸入、もしくは吹送（口または鼻のいずれかから）、または鼻腔内、粘膜、経口、頬側、非経口、直腸内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下送達に適していてよい。
【００８２】
薬学的に許容される担体には、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒質または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物を組成物中に組み入れることもできる。
【００８３】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適したその他の規則構造体として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。さらに、調節因子は、持続放出製剤中で、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中で投与することができる。活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー (PLG) などの生分解性生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許権を有するか、または一般的に当業者に公知である。
【００８４】
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記の成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み入れ、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基礎分散媒および上記の成分からの必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ濾過滅菌された活性成分＋任意の付加的な所望の成分の溶液から、それらの粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【００８５】
投与経路に応じて、化合物は、酵素、酸、および化合物を不活性化し得るその他の自然条件の作用からこれを保護するための材料で被覆することができる。例えば、化合物は、酵素阻害剤と同時投与される適切な担体もしくは希釈剤中で、またはリポソームなどの適切な担体中で対象に投与することができる。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および緩衝水溶液が含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシン阻害剤、フルオロリン酸ジイソプロピル (DEP)、およびトラジロールが含まれる。リポソームには、水中油中水型乳剤および従来のリポソームが含まれる (Strejan et al., J. Neuroimmunol 1984;7:27)。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるための防腐剤を含み得る。
【００８６】
組成物中の活性化合物は、好ましくは治療的有効量で組成物中に製剤化される。最適な治療反応を提供するように、投薬計画を調整することができる。治療的有効量とはまた、治療上有益な効果が化合物のいかなる毒性または有害効果も上回るものでもある。
【００８７】
別の態様において、活性化合物は予防的有効量で組成物中に製剤化される。典型的には、予防的用量は対象において疾患の初期段階の前または初期段階で用いられるため、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００８８】
本発明の化合物の治療的有効量または予防的有効量の非限定的な範囲は、0.01nM〜20 mM、好ましくは0.1nM〜10 mM、およびより好ましくは1μM〜1 mMである。あるいは、化合物は、1μg〜100 mg/kg体重、好ましくは10μg〜200 mg/kg体重、より好ましくは20μg〜10 mg/kg体重、およびさらにより好ましくは100μg〜10 mg/kg体重の量で、インビボにおいて週に2回使用され得る。化合物は、0.01μg/mL〜100μg/mL、より好ましくは0.1μg/mL〜50μg/mL、およびさらにより好ましくは2μg/mL〜20μg/mLの量で、インビトロにおいて使用され得る。投与量の値が、緩和されるべき状態の重症度によって、ならびに対象の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子に応じて異なり得ることに注意すべきである。
【００８９】
任意の特定の対象について、特定の投薬計画が、個体の必要性、および組成物を投与する人または組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って、最適な治療反応を提供するように経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載される投与量範囲が例示にすぎず、特許請求される組成物の範囲または実施を制限することを意図していないことが、さらに理解されるべきである。
【００９０】
例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割用量を時間をかけて投与してもよいし、または治療状況の要件によって示される通りに用量を比例的に増減してもよい。投与の簡便性および投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる単位剤形とは、治療される哺乳動物対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、(a) 活性化合物の独自の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに (b) 個体における過敏症の治療のためにこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。
【００９１】
本発明の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物は、この化合物がその中で唯一の活性化合物である薬学的組成物中に製剤化することができる。あるいは、薬学的組成物は付加的な活性化合物を含み得る。例えば、2つ以上の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIII、LNnT、LDN、またはLDNF）を併用することができる。さらに、本発明の2つ以上の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を、FLDの治療に用いられる1つまたは複数の他の薬剤、例えば、ビグアナイド薬（例えば、メトホルミン）、チアゾリジン誘導体（例えば、ピオグリタゾン塩酸塩）、αグルコシダーゼ阻害薬（例えば、ボグリボース）、インスリン分泌促進剤（例えば、ナテグリニド）、ビタミン、エイコサペンタエン酸 (EPA)、ベタイン、N-アセチルシステイン (NaC)、フィブラート系薬物（例えば、ベザフィブラート）、HMG-CoA還元酵素阻害薬（例えば、アトルバスタチン）、プロブコール、ウルソデオキシコール酸 (UDCA)、タウリン、強力ネオミノファーゲンシー、ポリエンホスファチジルコリン、アンジオテンシンII受容体拮抗薬（例えば、ロサルタン）、または防風通聖散（漢方薬）等と組み合わせることができる。併用する場合、薬物は、同時に、または連続してもしくは望ましい時間間隔で別々に投与することができる。同時投与のための製剤は、混合形態であっても別個の形態であってもよい。
【００９２】
特定の態様において、本発明の薬学的組成物は、特定の目的のため、例えば、免疫応答を調節するため、補助剤として使用するため、アレルギー反応を調節するため、または自己免疫疾患を調節するためにこの薬学的組成物を使用するための説明書と共に包装することができる。
【００９３】
IV. 治療方法
本発明の方法をインビボで実施するには、肝細胞における脂質生成の減少、肝臓での脂肪蓄積の減少、および／または肝臓トリグリセリドのレベルの低下などの所望の効果を達成するのに有効な量で、化合物を薬学的に許容される担体（前記）中で対象に投与する。所望の効果を達成するのに適した任意の投与経路が、本発明によって企図される。化合物の1つの好ましい投与経路は非経口である。別の好ましい投与経路は経口である。さらに別の好ましい投与経路は静脈内である。疾患状態の治療への本発明の方法の適用は、長期もしくは短期のいずれかでの、状態に付随する症状の種類および数の減少（すなわち、状態の寛解）、または単純に対象への一過性の有益な効果をもたらし得る。
【００９４】
関連局面において、本発明は、対象における疾患または障害を予防的または治療的に予防または治療する方法を提供する。化合物（すなわち、本発明の化合物）の予防的な投与は、望ましくない疾患または障害の症状が現れる前に、疾患または障害が予防されるか、またはその代わりにその進行が遅延するように行われ得る。本発明の予防的方法は、本明細書に記載される治療法と同様の様式で行うことができる。
【００９５】
治療の治療有効性は、ルイス抗原を含む化合物により治療された対象の肝臓組織像（例えば、肝生検による）、脂肪酸（例えば、トリグリセリド）のレベル、および／またはバイオマーカーのレベル（例えば、ASTおよびALTの循環レベル）の改善によって実証され得る。肝臓組織像および／または脂肪酸のレベルおよび／またはバイオマーカーのレベルの変化は、介入の前後で、または未治療の対象と比較して決定することができる。これらのアッセイを実施する方法は前記されている。
【００９６】
本明細書に記載される表示された治療のそれぞれに関して、試験対象は、治療前のレベル、またはプラセボ処置した対象もしくは他の適切な対照対象と比較して、例えばNAFLD、AFLD、およびMetSによって生じるかまたはそれらに付随する1つまたは複数の症状またはバイオマーカーレベルの5%、10%、20%、30%、50%、またはそれ以上の減少、75〜90%または95%もしくはそれ以上までの減少を示す。具体的な態様において、1つまたは複数の肝臓酵素、好ましくはALTまたはASTのレベルは、本発明の治療が施行された対象において、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%低下する。別の態様において、肝細胞または肝組織における1つまたは複数の脂肪酸、好ましくはトリグリセリドのレベルは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%低下する。
【００９７】
肝臓での脂肪の蓄積と関連した多くの疾患状態が同定されており、これらは、この疾患状態に罹患しているかまたはこの疾患状態を発症するリスクを有する個体において本発明の化合物を投与することによって恩恵を受け得る。このような疾患への本発明の化合物の適用を、以下にさらに詳細に記載する。例えば、本発明の方法から恩恵を受け得る脂肪酸肝障害は、肝炎、ウイルス性または非ウイルス性感染病原体によって誘導される脂肪症、薬物誘導性脂肪症（例えば、タモキシフェン、脱共役タンパク質阻害剤、イソニアジド、リファンピシン、フィブラート、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体作動薬）、代謝原因（例えば、肥満、多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS)、糖尿病、インスリン抵抗性、および代謝障害）、アルコールに基づく原因（例えば、アルコール性脂肪肝疾患およびアルコール性脂肪性肝炎）、先天性代謝異常または遺伝子変化（例えば、シトリン欠損症、ヘモクロマトーシス、高フェリチン血症）、遺伝性障害（例えば、1a型糖原病、シトリン欠損症、および先天性全身性リポジストロフィー）、毒素誘導性の脂肪症または脂肪性肝炎、セリアック病、リポジストロフィー、肥満外科手術、および肝移植を含むがこれらに限定されない種々の因子によって起こり得る。
【００９８】
A. NAFLD
本発明の方法は、肝臓での脂肪の蓄積を治療的または予防的に治療または予防するために用いることができる。具体的には、本方法は、肝臓脂肪症およびNASHを包含する用語であるNAFLDの治療または予防を対象とする。その必要のある対象においてNAFLDを治療または予防するための、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む好ましい化合物は、ルイスx抗原を含む化合物、例えばLNFPIII、ならびに非ルイスx抗原を含む化合物、例えばLNnTおよびSEAである。
【００９９】
いくつかのバイオマーカーが、NAFLDを予測する、診断する、または病期分類するのに有用であることが知られている。肝臓脂肪症は、痩せた健常個体の第95パーセンタイルを超える肝臓TGレベル（すなわち、>55 mg/g肝臓）、または肝細胞の5%超における細胞質TG液滴の存在と定義される（Cohen et al、前記）。NAFLDを有し、肝臓脂肪症からNASHに進行するリスクを有する人は、ASTレベル、ALTレベル、またはその両方の上限の>2.5倍への原因不明の上昇、過体重、T2DM、および原因不明の肝腫大に基づいて同定され得る。他のマーカーには、アルカリホスファターゼの増加、フェリチンレベルの上昇、ASTレベルを超えるALT濃度、ならびに過体重および肥満個体における血清アミノトランスフェラーゼレベルの原因不明の上昇が含まれる (Grattagliano et al., Can Fam Physician 2007;53:857-86)。トリグリセリド、AST、およびALTのレベルは、以下に記載される方法を用いるか、または市販のキットを用いて容易に決定することができる。NASHに関して用いることができる別の予測因子は血清サイトケラチン18であり、このレベルはNASH活性と相関する (Wieckowska et al, Hepatology 2006;44:27-33)。NASHを発症するリスクを有する対象から血清を採取することにより、市販のELISAキット（例えば、Axxora LLC (San Diego, CA) から入手可能）を用いて、NASHを発症するリスクを有する対象の血清中のサイトケラチン18のレベル。
【０１００】
バイオマーカーレベルの決定のみを用いて、NAFLDを発症するリスクを有する人を予測すること、またはNAFLDを有する人を診断することができるが、これらのマーカーアッセイに組織学的評価（例えば、肝生検）または非侵襲的画像診断法を追加することもできる。NAFLDを評価するための当技術分野で公知の非侵襲的画像診断法には、磁気共鳴画像法 (MRI)、拡散強調MRI (Naganawa et al., Magn Reson Med Sci 2005;4:175-86)、および超音波エラストグラフィーまたはMRIエラストグラフィー（Friedrich-Rust et al., Gastroenterology 2008;134:960-74；Talwalkar et al., Hepatology 2008;47:332-42）が含まれるが、これらに限定されない。このような非侵襲的画像診断法は、NAFLDの存在を判定するため、およびNAFLDの進行を病期分類するための有用でかつ無痛の代替手段を提供する。
【０１０１】
NAFLDのリスクを有する哺乳動物を判定するため、および／または哺乳動物が軽症型のNAFLDを有するかもしくは重症型のNAFLDを有するかを判定するための他の非侵襲的方法は、例えば米国特許出願公開第2009/0220986号（「'986公開」）に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。例えば、'986公開は、DHEA関連化合物の血漿レベルが低い（例えば、mL血液当たり<0.45μgのDHEA、または硫酸化型のDEHAであるDHEA-S）ヒトが、肝線維症がより進行した重度のNASHなどの重症型のNAFLDを有するリスクが高いと分類され得ることを開示している。DHEA関連化合物の血漿レベルが高い（例えば、mL血液当たり>0.45μgのDHEA-S）患者は、重度のNASHを有する可能性が非常に低い。試料中のDHEA関連化合物のレベルは、商業的な放射免疫アッセイ法および商業的なELISAキット（Diagnostic Systems Lab、Webster, Tex.）を含む、当技術分野で公知の方法を用いて容易に決定することができる。非限定的に、血液、組織（例えば、肝臓）、または血清を含み得る試料は、当技術分野における任意の公知の方法によって単離することができる。例えば、血液は針またはカテーテルを用いて採取することができ、組織試料は生検によって得ることができる。
【０１０２】
1a型糖原病、シトリン欠損症、先天性全身性リポジストロフィーなどの多くの遺伝性障害は、重度の肝臓脂肪症と関連している。全範囲のNAFLDと関連した多くの遺伝子配列変種が同定されており、本疾患を発症するリスクを有する人を判定するためにこのような変種を用いることができる（Cohen et al.、前記）。このような変種には、ATGL、比較遺伝子同定-58 (CGI-58)、ヒドロキシアシルCoAトランスフェラーゼ、VLDL、ミクロソームTG輸送タンパク質、APOB、およびPNPLA3などの遺伝子における変異または配列変種が含まれる（Romeo et al., Nat Genet 2008;40:1461；Tanoli et al., J Lipid Res 2004;45:941-7）。1つの態様において、NAFLDを発症するリスクを有する人は、PNPLA3遺伝子の変異（例えば、Ile148→Met148）の存在に基づいて同定することができる。個体におけるこのような変異は、DNA配列決定によって容易に同定することができる。肝臓脂肪症と関連した、他に同定されたゲノム遺伝子座には、PPP1R3B、NCAN、GCKR、LYPLAL1、およびAPOC3をコードするものが含まれる（Speliotes et al., PLoS Genetics 2011;7:1-14；Cohen et al、前記）。したがって、当技術分野で公知の日常的な技法（すなわち、DNA配列決定、RFLP解析、遺伝子連鎖試験）を用いて、NAFLDを発症するリスクを有する対象を同定することができ、ひいては本発明の化合物で予防的に処置することができる。
【０１０３】
NAFLDを発症する別のリスク因子には肝移植が含まれる。NASHまたは特発性肝硬変のために肝移植を受ける人の70%までが、移植された肝臓にNALFDを発症する (Yalamanchili et al., Liver Transpl 2010;16:431-9)。したがって、肝移植を受ける個体は、NAFLDを発症するリスクを有する集団を構成する。
【０１０４】
B. アルコール性脂肪肝疾患 (AFLD)
アルコール性脂肪肝疾患は、NAFLDを有する個体と違ってAFLDを有する人がアルコール乱用歴を有すること以外は、NAFLDで認められる病理学的特徴と同じ特徴を共有する。AFLDの主な治療法の1つはアルコール消費からの離脱を含むが、これは達成することが難しいと考えられる。その必要のある対象においてNAFLDを治療または予防するための、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む好ましい化合物は、ルイスx抗原を含む化合物、例えばLNFPIII、ならびに非ルイスx抗原を含む化合物、例えばLNnTおよびSEAである。
【０１０５】
ALDに対する感受性を判定するために、アルコール摂取のパターン、性別、年齢、および遺伝子多型などの多くの因子を評価することができる（Becker et al., Hepatology 1996;23:1025-9；Crabb et al., Proc Nutr Soc 2004;63:49-63；Konishi et al., Exp Mol Pathol 2003;74:183-9；Konishi et al., Alcohol Clin Exp Res 2004;28:1145-52；Grove et al., Hepatology 1997;26;143-6；Ladero et al., Scand J Gastroenterol 2005;40:348-53；Savolainen et al., Alcohol Clin Exp Res 1996;20:1340-5). Wan et al., Genet Test 1998;2:79-83）。AFLDを有する人は、例えばTannapfel et al. (Virchows Arch 2011;458:511-23) に記載されている組織学的方法を用いて診断することができる。
【０１０６】
したがって、1つの態様において、AFLDを発症するリスクを有する人は、AFLDの発症と関連していることが公知である遺伝子多型の存在を評価することによって、容易に判定することができる。AFLDと関連した遺伝子多型の非限定的な例には、例えば、PPARγ2 (Rey et al., World J Gastroenterol 2010;16:5830-7)、mtDNA4997欠失 (Zhuang et al., CME, 2011 IEEE/ICME Intl Conference June 16, 2011, pp. 127-31)、およびCYP2E1 (Maezawa et al., Am J Gastroenterol 1994;89:561-5) で同定されたものが含まれる。
【０１０７】
AFLDを有する個体は、例えば、好中球、血清ビリルビン、および肝トランスアミナーゼのレベルの上昇を含む様々なマーカーに基づいて、Stickel et al. (Best Pract Res Clin Gastroenterol 2010;24:683-93) に概説されているように同定することができる。個体がAFLDを有するかどうかを判定するために用いることができる他の因子は、過度のアルコール消費歴、および他の類似した病因の排除である。さらなる他の因子は、肝臓脂肪貯蔵の増加、クッパー細胞の活性化を誘発する腸由来エンドトキシンの肝取り込みの増加、およびエタノールによる高ホモシステイン血症である。
【０１０８】
C. メタボリックシンドローム
メタボリックシンドロームは、5,000万人を超えるアメリカ人が罹患していると推定されるリスク因子の集積である。現在のところ、メタボリックシンドロームを診断するための十分に受け入れられている診断基準はないが、罹患している人は、腹部肥満、アテローム生成脂質異常症、血圧上昇、インスリン抵抗性または耐糖能障害、血栓形成促進状態、および炎症促進状態を示す。メタボリックシンドロームを有する個体は、脂肪肝疾患、末梢血管疾患、2型糖尿病、および加速性アテローム性動脈硬化症に及ぶ疾患を発症するリスクを有する。
【０１０９】
本発明のいくつかの態様において、NAFLDを発症するリスクを有するかまたはNAFLDを有する患者は、メタボリックシンドロームに罹患している。本発明の方法によるルイス抗原および／または非ルイス抗原を含む化合物を用いた治療に適応される、メタボリックシンドロームを有する患者は、いくつかの確立された診断基準によって同定することができる。ここ何年かにわたり、何がMet Sを構成するのかに関して多くの定義が示されてきた。Met Sを診断するために現在用いられている主な診断基準は、4つのグループによって示されている：世界保健機関（1999年に確立された診断基準）(World Health Organization (WHO). Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Report of a WHO consultation, 1999)、成人治療パネルIIIレポート2001 (Adult Treatment Panel III Report 2001) (Expert panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults. JAMA. 2001;285:2486-97)、欧州IR研究会 (European Group for the Study of IR) (EGIR) 1999 (Balkau B et al., Diabet Med 1999;16:442-3)、およびMet Sに関する国際糖尿病連合 (IDF) の合意。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質（例えば、LNFPIIIおよびSEAなどの、ルイス抗原を含む化合物）を含む化合物の予防的有効量または治療的有効量を投与することによる、肝臓での脂肪蓄積を特徴とする疾患の治療または予防に関する。好ましい態様において、このような治療を必要とする哺乳動物は、MetSを有するかまたはそれを発症するリスクを有する。
【０１１１】
Gupta et al. (Bioscience Trends 2010;4:204-11) において概説されているように、MetSのリスク因子には、(a) 高レベルのトリグリセリド (≧150 mg/dL)、(b) 低レベルの高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロール（女性では<50 mg/dLおよび男性では<40 mg/dL）、(c) 高血圧 (≧130/85 mmHg)、(d) 高レベルの空腹時血糖 (>100 mg/dL)、および (e) 大きな腹囲（女性では≧35インチおよびおよび男性では≧40インチ）が含まれる。各パラメータの実際の値は限定と見なされるべきではない。というのも、前記の4つの主な診断基準はそれぞれ、これらの値のわずかな変化形に依存するからである。したがって、上記の各パラメータの具体的な値は、依存する特定の診断基準に記載されている値に従うべきである。これに応じて、MetSを発症するリスクを有する対象は、上記のリスク因子のいずれかまたは組み合わせの存在に基づいて容易に同定することができる。
【０１１２】
WHO、EGIR、NCEP-ATP III、およびIDFによって記載されている診断基準はそれぞれ、MetSを有する個体を診断するための指示のもととして役立ち得る。例えば、MetSのWHO診断基準は、個体が、糖尿病、耐糖能異常、空腹時血糖異常、またはインスリン抵抗性、および上記のリスク因子のうちの少なくとも2つを有することを必要とする。したがって、MetSを有する個体は、例えば上記の4つの診断基準のうちの1つに依存することにより、容易に同定することができる。
【０１１３】
本明細書で引用される出版物、特許、および特許出願は、前記のものも下記のものもすべて、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
上記の開示は本発明の開示を一般的に説明しており、これを以下の実施例によってさらに例証する。これらの特定の実施例は単に説明の目的で記載されるものであり、本開示の範囲を限定することは意図されない。本明細書において特定の対象、用語、および値が用いられているが、このような対象、用語、および値も同様に、例示であり、本開示の範囲を限定するものではないことが理解されよう。
【実施例】
【０１１５】
実施例で用いられる材料および方法
動物
雄のC57BL/6Jマウス（8〜10週齢）は、The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) から購入した。FXR α-/-マウス（いずれもC57BL/6Jバックグラウンド）も、The Jackson Laboratoryから入手した。動物試験はすべて、Harvard Medical Area Standing Committee on Animalsによって承認された。
【０１１６】
治療計画
実験期間中、雄のC57BL/6Jマウス（8〜10週齢）に高脂肪、高炭水化物食（F3282、Bio-Serv）を課した。特殊な食餌を6週間与えた後、マウスにデキストラン（媒体）25μg、またはデキストランとコンジュゲートされたLNFPIII (LNFPIII-dex) 25μgを週に2回腹腔内注射した。第2コホートは、0.9% NaClまたは0.9% NaCl中に溶解したSEAで処置した（25μg/マウス/週2回）。LNFPIII処置またはSEA処置の4週間後に代謝試験を開始し、これは6時間の絶食後に行った。血清および組織を採取するために、処置の6週目に動物を屠殺した。大部分の実験は2つのコホート（n＝4〜7匹/処置）で繰り返した。体重および食物摂取量は毎週モニターした。
【０１１７】
測定
全般的肝機能のマーカーであるALTおよびASTの循環レベルは、Liu et al. (JBC 2011;286:1237-47) に記載されている通りに、商業的キットを用いて測定した。
【０１１８】
組織学的検査
Dana Farber/Harvard Cancer Center Research Pathology Coresが、すべての組織学的検査サービスおよび病理学者による予備的評価を提供した。簡潔に説明すると、動物から組織を採取し、10%ホルマリン中で48時間固定した（肝臓）。固定した試料をPBSでリンスし、組織学的検査コアに送り、そこで標準的な手順に従ってパラフィン包埋、切片作製、ならびにヘマトキシリンおよびエオシンによる染色がなされた。スタッフ病理学者が、炎症、脂肪肝、線維症、および肝臓と関連した他の病態の徴候について試料を解析した。
【０１１９】
初代細胞、細胞培養、および機能アッセイ法
初代肝細胞は、以前に記載された通りに単離した（Liu et al.、前記；Reilly et al., Cell Metab 2010;12:643-53）。簡潔に説明すると、マウスに麻酔をし、EDTA緩衝液50 mL、およびコラゲナーゼ（Liberase(商標)、Roche）を含む灌流緩衝液50 mLで門脈から灌流した。灌流後、肝細胞を単離し、percoll勾配によって分離した。細胞をカウントし、William's E、5% FBS中で一晩接着させ、その後24時間処理した。デノボ脂質生成については、細胞を14C-酢酸で標識し、6時間後に14C-脂質をクロロホルム：メタノール (v/v 2:1) で抽出した。試料を遠心分離し、脂質含有層を単離して乾燥させた。次に放射能のレベルを測定した。β酸化アッセイは、以前に記載された通りに行った（Reilly et al.、前記）。簡潔に説明すると、細胞を3H-パルミチン酸で2時間または4時間処理した。上清中の、脂質異化作用の副産物である3H2Oのレベルを測定した。
【０１２０】
ATCCから入手したHepG2細胞 (#HB-8065) は、非必須アミノ酸、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、10%ウシ胎仔血清、および抗生物質を補充したイーグル最小必須培地で培養した。
【０１２１】
遺伝子発現解析
転写物の相対発現レベルは、SYBRグリーンに基づくリアルタイム定量的PCR (q-PCR) 反応によって決定した。36B4レベルを正規化に使用した。qPCRは、StepOneリアルタイムPCRシステム (Applied Biosystems) で行った。プライマー配列を表1に示す。
【０１２２】
【表１】
2014527985.tif 000002
【０１２３】
ウェスタンブロット解析のために、組織および細胞溶解物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下において、溶解緩衝液（20 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1 mM EDTA、NP-40、グリセロール、PMSF、およびDTT）中で調製した。4つのFXRα (NR1H4) アイソフォームは以前の報告書に基づき、これらは元はFXRα1/α2およびFXRβ1/β2と命名された（Huber et al., Gene 2002;290:35-43；Zhang et al., JBC 2003;278:104-10）。後者は、齧歯類FXRβ (NR1H5) との混同を避けるために、FXRα3/α4と新たに命名された (Lefebvre et al., Physiol Rev 2009;89:147-91)。
【０１２４】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ法
ルシフェラーゼシステム (Promega) を用いて、ヒトFXRα遺伝子の上流プロモーター1領域および下流プロモーター2領域をpGL3基礎ルシフェラーゼレポーター構築物にクローニングし、96ウェル形式のHepG2細胞または24ウェル形式の初代肝細胞にトランスフェクトした。βガラクトシダーゼレポーター構築物をトランスフェクション対照として使用した。ヒトFXRα遺伝子のプロモーター1および2はPCR増幅し、pGL3基礎ルシフェラーゼレポーター (Promega) にクローニングした。部位特異的突然変異誘発キット (Stratagene) を用いて、点変異を導入した。特定の変異を作製するためのプライマーを表1に記載する。
【０１２５】
統計解析
統計解析はスチューデントt検定（両側）を用いて行った。値は平均値±SEMとして示した。P<0.05を有意と見なした。
【０１２６】
実施例1
LNFPIIIによる高脂肪食誘導性脂肪症の治療および肝機能の維持
本実施例では、LNFPIIIまたはSEAが高脂肪食誘導性脂肪症を防ぎ、肝機能を維持する能力を調べた。方法セクションに記載された通りに、マウスに媒体（デキストラン、25μg）、デキストランにコンジュゲートされたLNFPIII (25μg)、またはSEAのいずれかを週に2回注射した（各群についてn＝5匹）。組織学的評価により、媒体処置マウスと比較してLNFPIIIまたはSEA処置マウスの肝臓では、高脂肪食誘導性の肝臓脂質蓄積が少ないことが明らかになった（図1a）。さらに、媒体処置マウスと比較してLNFPまたはSEA処置マウスの肝臓では、有意により低いレベルのトリグリセリドが存在した（*p<0.05；図1b）。例えばウイルス誘導性FLD（例えば、HIVまたは肝炎ウイルス誘導性）を含むFLDの他の動物モデルでも、同様の結果が予測される。
【０１２７】
肝臓における脂質蓄積の減少およびトリグリセリドレベルの低下が炎症、脂質生成遺伝子発現、またはβ酸化の違いに起因し得るのかどうかを判定するために、肝組織を採取し、mRNAを抽出し、リアルタイムq-PCR用に処理した。LNFPIIIで処置したマウスは、媒体処置マウスとして、肝組織において有意により低いレベルのF4/80マーカーおよびIL-6を示したが、有意により高いレベルのM2マーカー（Arg1およびMgl1）を示した（*p<0.05；図1c）。IL-1βのレベルは変化しなかった。これらの結果から、LNFPIIIが、M2マクロファージの数を増加させつつ、炎症誘発性マクロファージの肝組織への浸潤を減少させたことが示唆される。驚くべきことに、媒体処置マウスと比較してLNFPIII処置マウスの肝臓では、脂肪酸合成酵素 (FAS)、アセチルCoAカルボキシラーゼ1/2 (ACCl/2)、ステアロイルCoA不飽和化酵素1 (SCD1)、およびステロール調節エレメント結合タンパク質1c (SREBP-1c) を含む脂質生成遺伝子の発現が有意に減少した（*p<0.05；図1c）。これらの結果は、LNFPIIIが肝臓において炎症および脂肪蓄積を減少させるという考えと一致する。
【０１２８】
全般的肝機能がLNFPIII処置の影響を受けるかどうかを判定するために、ASTおよびALTの循環レベルもまた調べた。高脂肪食に課した媒体処置マウスと比較して、LNFPIII処置マウスはASTおよびALTの有意に低下したレベルを示した（*p<0.05；図1d）。SEAも同様の保護効果を示した（*p<0.05；図1e）。
【０１２９】
複数の異なる蠕虫由来グリカン種（例えば、LNFPIII、LnNT、LDN、およびLDNF）の個々の投与を含む併用療法でも同様の結果が予測され得、またはその代わりに、複数の異なる蠕虫由来グリカンおよび／もしくは複合糖質種を同じ担体分子にコンジュゲートさせることもできる。
【０１３０】
まとめるとこれらの結果から、LNFPIIIが、肝臓脂肪蓄積を伴う肝臓の炎症を抑制し、肝臓での異所性脂肪蓄積を防ぐことが示される。
【０１３１】
実施例2
肝臓におけるFXRα活性化を介したLNFP IIIによる脂質生成の抑制
肝臓で認められた脂質生成遺伝子発現減少プロファイル（実施例1を参照されたい）に基づいて、LNFP IIIが脂質生成を抑制する能力を評価した。このために、初代マウス肝細胞を単離し、LNFP III (20μg/ml) または媒体（デキストラン）で処理してデノボ脂質生成アッセイに供した。LNFPIIIは、媒体処理細胞と比較して、肝細胞において脂質生成を有意に抑制し、脂肪酸β酸化を有意に増加させた（*p<0.05；図2a）。LNFP III処理がβ酸化遺伝子発現に影響を及ぼさなかったことを考えると（図1cおよび2b）、脂質燃焼の増加は、脂肪酸合成の減少の二次的なものである可能性が高い。
【０１３２】
どのようにしてLNFPIIIが脂質生成を抑制するかについての機構的洞察を得るために、主要な脂質生成転写因子としてのその役割、およびLNFPIIIで処置したマウスの肝組織におけるその下方制御（図1c）を考慮して、SREBP-1cに注目した。SREBP-1cの発現および転写活性は、核内受容体シグナル伝達経路のネットワーク、特に正の調節因子LXRα (NR1H3)（Joseph et al., JBC 2002;277:11019-25；Repa et al., Genes Dev 2000;14:2819-30）、ならびに負の調節因子FXRα (NR1H4) およびその標的SHP (NR0B2) (Watanabe et al., Ｊ Clin Invest 2004;113:1408-18) によって制御される。FXRαは2つの主要な5'調節領域からなり、上流プロモーターおよび下流プロモーターはそれぞれFXRα1/α2アイソフォームおよびFXRα3/α4アイソフォームの発現を駆動する (Lefebvre et al., Physiol Rev 2009;89:147-91)（図2c）。FXRα1/α2（またはFXRα3/α4）の間の唯一の違いは、FXRα1（またはFXRα3）における4アミノ酸挿入である。
【０１３３】
リアルタイムq-PCRによると、FXRα3/α4アイソフォーム、ならびにSHP、有機アニオン輸送タンパク質 (OATP)、リン脂質輸送タンパク質 (PLTP)、および胆汁酸塩排出ポンプ (BSEP) を含むいくつかの公知のFXR標的遺伝子の転写物は、媒体処理した肝細胞と比較して、LNFPIIIで24時間処理した初代肝細胞において有意に上方制御された（*p<0.05；図2d）；しかしながら、FXRα1/α2およびLXRαのmRNA発現は変化しないままであった。さらに、初代肝細胞のLNFPIII処理は、FXRα3/α4およびSHPのmRNA発現を有意に増加させるのに、ならびにSREBP-1cおよびACC1のレベルを有意に抑制するのに十分であった（*p<0.05；図2b）。SEAがFXRα1/α2およびFXRα3/α4の両方を有意に上方制御するようであったことを除いて、SEA処理でも同様の効果が得られた（*p<0.05；図2e）。
【０１３４】
FXRαが脂質生成に関与する遺伝子の下方制御を媒介することと一致して、LNFPIII処置は、FXRα-/-マウスにおいてFas、Acc1、Acc2、Scd1、およびSrebpのmRNA発現を減少させなかった（図2f）。さらに、FXRαが、脂質生成および脂肪酸酸化に及ぼすLNFPIIIの効果を媒介するかどうかを判定するために、野生型マウスまたはFXRα-/-マウスから初代肝細胞を単離し、培養し、デノボ脂質生成および脂肪酸酸化について試験した。FXRαがLNFPIIIの効果を媒介することと一致して、FXRα-/-肝細胞では、LNFPIIIおよびSEAは脂質生成を阻害することができず、脂肪酸酸化を増強することができなかった（*p<0.05；図2g）。図2hおよび2i（*p<0.05）に示されるように、LNFPIII処置による肝臓トリグリセリド含量ならびに血清AST濃度およびALT濃度の減少もまた。FXRα発現を必要とした。これらのデータから、LNFPIIIがFXRαを直接標的化して、肝臓脂質代謝を調節することが示唆される。
【０１３５】
実施例3
LNFPIIIとFXRαを関連づけるシグナル伝達経路
ヒトおよびマウスのFXRαはいずれも、2つの主要なプロモーターを含む（図2c）。図2cは、ヒトFXRα1/α2（プロモーター1）およびFXRα3/α4（プロモーター2）の発現を駆動するための選択的プロモーター使用を示すゲノム構造を示す。配列比較から、マウス、ラット、およびヒトのFXRα遺伝子間での5'調節領域における高い保存が明らかになる（図3a）。LNFPIIIがFXRα活性を調節するシグナル伝達経路を調べるために、HepG2細胞（ヒト肝細胞癌細胞）において、上流（プロモーター1）または下流（プロモーター2）の調節領域によって駆動されるルシフェラーゼレポーターの活性を調べた。2 kb断片のヒトFXRαプロモーター1または0.13 kb断片のヒトFXRαプロモーター2によって駆動されるレポーターを、HepG2細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をLNFPIII (20μg/ml) またはSEA (2μg/ml) を用いてまたは用いずにさらに24時間処理した。HepG2細胞にプロモーター1‐ルシフェラーゼレポーター構築物またはプロモーター2‐ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトしたところ、LNFPIII処理に応答してプロモーター2のみが有意に活性化されたのに対し、SEAにより両プロモーターが有意に活性化された（*p<0.05；図3b）。これと一致して、初代肝細胞において、LNFPIII処理 (20μg/ml) によりFXRα3/α4発現のみが有意に増加したのに対し、SEA (2μg/ml) によりFXRα1/α2およびFXRα3/α4の両方が誘導された（*p<0.05；図3c）。
【０１３６】
プロモーターの活性化に関与するプロモーター2の領域についての洞察を得るために、一連のプロモーター欠失変異体によって、最小LNFPIII応答領域を決定した。最小LNFPIII応答領域は、ヒト、ラット、およびマウスの間で高度に保存されており、転写開始部位のおよそ130 bp上流にマッピングされ、C/EBPおよびAP1のコンセンサス結合部位を含んでいた（図3a）。AP-1部位に関して、3つの潜在的結合部位が存在した；1つの独立した部位（すなわち、部位2）、および2つの重複したAP-1部位を有する別の部位（すなわち、部位3）（図3a）。部位特異的突然変異誘発により、2つの重複AP-1部位が、LNFPIIIによるFXRαプロモーターの活性化に必要であることが実証された（図3d）。SEAでも同様の結果が得られた（図3e）。
【０１３７】
以前の研究から、樹状細胞において、LNFPIIIがErkを介してシグナルを出して、c-junと二量体化してAP1を形成するc-fosの活性化を誘導することが実証された（Harn et al., Immunol Rev 2009;230:247-57；Dillon et al., J Immunol 2004;172:4733-43）。このこと、およびAP-1結合部位が、LNFPIIIによるFXRαプロモーターの活性化に必要であるという知見と一致して、LNFPIIIで処置した肝臓（図3f）およびSEAで処理した初代肝細胞（図3h）において、Erkリン酸化が増加した。実際に、化学的MEK阻害剤であるPD98059（LNFPIIIで一晩処理する前に10μMで1時間）を用いてErk活性化を阻止すると、これにより、HepG2細胞におけるLNFPIIIに対するFXRαプロモーター2の応答性（図3d）、LNFPIIIに応答したErkの活性化（図3g）、ならびにLNFPIIIが初代肝細胞における脂質合成を抑制する、およびβ酸化を増加させる能力（図3i）が消失した。著しくは、FXRα-/-肝細胞において脂質生成を抑制すること、またはβ酸化を増加させることができないことから明らかなように、LNFPIIIによる脂質生成の抑制およびβ酸化の増加はFXRαを必要とする。SEAでも同様の結果が得られた（*p<0.05；図3hおよび3j）。これらの知見をまとめると、LNFPIIIが、Erk-c-fos/AP-1-FXRα軸を介した肝臓脂質生成の直接的なエフェクターであることが示唆される。
【０１３８】
実施例4
肝臓の脂質生成およびFXRα活性化に及ぼすLNnTの効果
肝臓の脂質生成に及ぼすLNFPIIIおよびSEAの阻害効果と一致して、LNnT（非ルイス抗原）は、用量依存的様式で培養初代肝細胞における脂質生成を阻止した（図4a；*p<0.05）。さらに、LNnTは、実施例3に記載された通りに実施したルシフェラーゼアッセイにおいて、FXRα1/α2プロモーターの活性を有意に増加させた（図4b；*p<0.05）。これらの知見から、LNFPIII以外のグリカンも、FXRα活性化を介して肝臓の脂質生成を抑制し得ることが示される。
【０１３９】
実施例5
脂肪肝疾患の予防的かつ長期的治療
FLDの予防的治療のために、動物に1つまたは複数の蠕虫由来グリカンまたは複合糖質（例えば、LNFPIII、SEA、LnNT、LDN、LDNF、またはグリカンの組み合わせ）を注射してから、マウスに高脂肪食を与える。実施例1〜3に記載されたアッセイ法を用いて、肝臓脂肪症の予防に及ぼすこれらグリカンの効果を判定する。様々なグリカンを注射したマウスが、肝臓脂肪症も脂肪肝疾患も発症しないことが予測される。
【０１４０】
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が血清遊離脂肪酸レベルおよびトリグリセリドレベルに及ぼす長期的効果、ならびに他の組織に及ぼす効果を評価するために、動物を12〜16週間またはそれ以上の期間にわたって2回／週で処置し、前記のアッセイに供する。蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質の投与による、血清遊離脂肪酸およびトリグリセリドのレベルの低下、ならびに末梢組織の脂質蓄積の減少が予測される。血清トリグリセリドレベルを定期的にモニターして、FLDの発症または治療を追跡することもできる。
【０１４１】
本開示をその様々な態様のそれぞれにおいて説明してきたが、前述の説明に記載されるような、および添付の特許請求の範囲でさらに具体化されるような本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく、本開示に対する特定の修正が当業者によって実施および達成され得ることが予想される。本開示は、本明細書に記載される特定の態様によって範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本開示の様々な修正が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。値はすべて概算値であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するか、またはこれを確認し得るであろう。このような同等物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2014527985.tif 000003
【図１Ｂ】
2014527985.tif 000004
【図１Ｃ】
2014527985.tif 000005
【図１Ｄ】
2014527985.tif 000006
【図１Ｅ】
2014527985.tif 000007
【図２Ａ】
2014527985.tif 000008
【図２Ｂ】
2014527985.tif 000009
【図２Ｃ】
2014527985.tif 000010
【図２Ｄ】
2014527985.tif 000011
【図２Ｅ】
2014527985.tif 000012
【図２Ｆ】
2014527985.tif 000013
【図２Ｇ】
2014527985.tif 000014
【図２Ｈ】
2014527985.tif 000015
【図２Ｉ】
2014527985.tif 000016
【図３Ａ】
2014527985.tif 000017
【図３Ｂ】
2014527985.tif 000018
【図３Ｃ】
2014527985.tif 000019
【図３Ｄ】
2014527985.tif 000020
【図３Ｅ】
2014527985.tif 000021
【図３Ｆ】
2014527985.tif 000022
【図３Ｇ】
2014527985.tif 000023
【図３Ｈ】
2014527985.tif 000024
【図３Ｉ】
2014527985.tif 000025
【図３Ｊ】
2014527985.tif 000026
【図４】
2014527985.tif 000027
【図５】
2014527985.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月24日(2014.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ａ】
2014527985.tif 000029
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｄ】
2014527985.tif 000030
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
[本発明1001]
肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1002]
肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を予防する方法であって、該疾患を発症するリスクを有する哺乳動物に、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の予防的有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1003]
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
化合物が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
化合物がLNFPIIIを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
化合物がSEAを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
疾患が脂肪肝疾患である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
疾患が非アルコール性脂肪肝疾患である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
疾患が肝臓脂肪症（hepatic steatosis）である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
疾患が非アルコール性脂肪性肝炎である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
疾患がアルコール性脂肪肝疾患である、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1015]
疾患が肝臓脂肪症である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
疾患が脂肪性肝炎である、本発明1014の方法。
[本発明1017]
疾患がメタボリックシンドロームである、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1018]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子に架橋されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1018の方法。
[本発明1020]
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1019の方法。
[本発明1021]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、本発明1018〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、本発明1019〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
担体が糖質ポリマーである、本発明1018〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
糖質ポリマーがデキストランである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
担体がタンパク質である、本発明1018〜1025のいずれかの方法。
[本発明1029]
タンパク質がヒト血清アルブミンである、本発明1028の方法。
[本発明1030]
担体がポリアクリルアミドである、本発明1018〜1025のいずれかの方法。
[本発明1031]
化合物が非経口投与される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1032]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が腹腔内投与される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1033]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が静脈内投与される、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1034]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が経口投与される、本発明1001〜1030のいずれかの方法。
[本発明1035]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝臓におけるトリグリセリドレベルを低下させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1036]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝臓における脂質生成を抑制する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝細胞におけるFXRαの産生を増加させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1038]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が肝細胞におけるSREBP-1cの産生を減少させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物が、肝細胞におけるFXRαの産生を増加させることにより、該肝細胞における脂質生成を抑制する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1040]
肝細胞における脂質生成を減少させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物の十分量と該肝細胞を接触させる段階を含む、方法。
[本発明1041]
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
化合物が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1040〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、本発明1040〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、本発明1040〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
化合物がSEAを含む、本発明1040〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
化合物がLNFPIIIを含む、本発明1040〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
肝細胞においてSREBP-1cの産生が阻害される、本発明1040〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
肝細胞においてFXRαの産生が増加する、本発明1040〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
それを必要とする対象に、肝臓の脂質生成が阻害されるように化合物が投与される、本発明1040〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
対象が脂肪肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、本発明1050の方法。
[本発明1052]
対象が非アルコール性脂肪肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、本発明1051の方法。
[本発明1053]
対象が肝臓脂肪症を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
対象が脂肪性肝炎を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、本発明1053の方法。
[本発明1055]
対象がアルコール性脂肪肝疾患を有するかまたはそれを発症するリスクを有する、本発明1052の方法。
[本発明1056]
対象がメタボリックシンドロームを有するかまたはそれを発症するリスクを有する、本発明1050の方法。
[本発明1057]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子に架橋されている、本発明1040〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1057の方法。
[本発明1059]
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1058の方法。
[本発明1060]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、本発明1057〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、本発明1060の方法。
[本発明1062]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、本発明1057〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、本発明1062の方法。
[本発明1064]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、本発明1063の方法。
[本発明1065]
担体が糖質ポリマーである、本発明1057〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
糖質ポリマーがデキストランである、本発明1065の方法。
[本発明1067]
担体がタンパク質である、本発明1057〜1064のいずれかの方法。
[本発明1068]
タンパク質がヒト血清アルブミンである、本発明1067の方法。
[本発明1069]
担体がポリアクリルアミドである、本発明1057〜1064のいずれかの方法。
[本発明1070]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が非経口投与される、本発明1040〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が腹腔内投与される、本発明1040〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が静脈内投与される、本発明1040〜1070のいずれかの方法。
[本発明1073]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が経口投与される、本発明1040〜1070のいずれかの方法。
[本発明1074]
細胞におけるFXRαの産生を増加させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と該細胞を接触させる段階を含む、方法。
[本発明1075]
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1074の方法。
[本発明1076]
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む、本発明1075の方法。
[本発明1077]
化合物が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1074〜1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、本発明1074〜1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、本発明1074〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
化合物がSEAを含む、本発明1074〜1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
化合物がLNFPIIIを含む、本発明1074〜1079のいずれかの方法。
[本発明1082]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1074〜1080のいずれかの方法。
[本発明1083]
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1082の方法。
[本発明1084]
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1083の方法。
[本発明1085]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、本発明1082〜1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、本発明1085の方法。
[本発明1087]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、本発明1082〜1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、本発明1087の方法。
[本発明1089]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、本発明1088の方法。
[本発明1090]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質抗原がデキストランに架橋されている、本発明1082〜1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
FXRαがFXRα3/α4である、本発明1074〜1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
FXRαがFXRα1/α2である、本発明1074〜1090のいずれかの方法。
[本発明1093]
FXRαによって転写的に誘導される遺伝子産物の産生を増加させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と肝細胞を接触させる段階を含む、方法。
[本発明1094]
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1093の方法。
[本発明1095]
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される、本発明1093〜1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、本発明1093〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスx抗原を含む、本発明1093〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
化合物がSEAを含む、本発明1093〜1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
化合物がLNFPIIIを含む、本発明1093〜1098のいずれかの方法。
[本発明1101]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1093〜1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1101の方法。
[本発明1103]
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1102の方法。
[本発明1104]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、本発明1093〜1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、本発明1104の方法。
[本発明1106]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、本発明1093〜1105のいずれかの方法。
[本発明1107]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、本発明1106の方法。
[本発明1108]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、本発明1107の方法。
[本発明1109]
ルイス抗原がデキストランに架橋されている、本発明1093〜1107のいずれかの方法。
[本発明1110]
遺伝子産物が、SHP、OATP1、PLTP、およびBSEPからなる群より選択される、本発明1093〜1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
肝細胞におけるErk-c-fos/AP1-FXRα経路の活性化を上昇させる方法であって、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む化合物と該肝細胞を接触させる段階を含む、方法。
[本発明1112]
化合物が少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、本発明1111の方法。
[本発明1113]
化合物が少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質を含む、本発明1112の方法。
[本発明1114]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が、LNFPIII、LNnT、LDN、およびLDNFからなる群より選択される、本発明1111〜1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイス抗原を含む、本発明1111〜1114のいずれかの方法。
[本発明1116]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質がルイスxを含む、本発明1115の方法。
[本発明1117]
化合物がLNFPIIIを含む、本発明1116の方法。
[本発明1118]
化合物がSEAを含む、本発明1116の方法。
[本発明1119]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1111〜1118のいずれかの方法。
[本発明1120]
少なくとも1つの蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1119の方法。
[本発明1121]
少なくとも2つの蠕虫由来グリカンおよび／または複合糖質が担体分子にコンジュゲートされている、本発明1120の方法。
[本発明1122]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約5,000〜100,000ダルトンである、本発明1119〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質と担体分子との複合物の分子量が約10,000〜40,000ダルトンである、本発明1122の方法。
[本発明1124]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり2〜200個有する、本発明1119〜1123のいずれかの方法。
[本発明1125]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり10〜100個有する、本発明1124の方法。
[本発明1126]
複合物が、蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含有するオリゴ糖分子を担体分子当たり20〜50個有する、本発明1125の方法。
[本発明1127]
LNFPIIIがデキストランに架橋されている、本発明1119〜1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
Erk-c-fos/AP1-FXRα経路の活性化が脂質生成の減少を伴う、本発明1111〜1127のいずれかの方法。
[本発明1129]
肝臓での脂肪蓄積と関連した疾患を治療するのに十分な量の蠕虫由来グリカンおよび／またはその複合糖質を含む、薬学的組成物。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
【表１】
2014527985.tif 000031
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014527985000001.app
【国際調査報告】
2014527985.tif 000032
2014527985.tif 000033
2014527985.tif 000034
2014527985.tif 000035