(57)【要約】  本発明は、活性抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤として、微生物起源の広域スペクトルタンパク質を含む組成物を提供する。タンパク質は、病原性及び非病原性の両方の細菌を含むが、これらに限定されない微生物によって分泌されるか、又はその表面に結合している。使用されるタンパク質は、マイコバクテリウムスピーシーズ細菌から、詳細にはマイコバクテリウム・ツベルクローシス又はＭ．ボビスＢＣＧから単離される。さらに、タンパク質は、その様々な切断型誘導体、そのようなタンパク質から誘導されるペプチド、合成的に調製されるペプチド、並びにペグ化、アセチル化、及びリン酸化によって修飾されるタンパク質又はペプチドによって置き換えることができる。タンパク質は、それぞれ、配列番号１及び２からなるアミノ酸配列を有する精製タンパク質及び精製ペプチドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのバリアント／切断型誘導体、並びに任意選択で、適した担体及び／又は賦形剤を含む抗ウイルス組成物。
【請求項２】
タンパク質が、微生物から単離された又は合成的に調製された精製タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
タンパク質が、マイコバクテリウムスピーシーズから分泌される又は表面付着し、マイコバクテリウムスピーシーズから単離される、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
使用されるマイコバクテリウムスピーシーズが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス又はＭ．ボビスＢＣＧである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
タンパク質又はそのバリアントが、ペグ化、アセチル化、リン酸化によって修飾されるさらなるペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
タンパク質のバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
活性治療成分としての請求項１に記載の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそのバリアント／切断型誘導体、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物であって、前記活性治療成分が、０．０〜９５重量％である、医薬組成物。
【請求項８】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、はしかウイルス、豚インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、又は日本脳炎ウイルスに対して、静脈内（ｉｖ）、筋肉内、経口、皮下、又は局所適用として有用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ウイルス増殖の阻害、又はｇｐ−１２０エピトープの遮断に有用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ治療薬（biotherapeutic）に関する。本発明は、活性治療成分としてウイルス感染に対抗する（combat）のに有用な抗ウイルス剤を含有する医薬組成物及び適用の方法を特に提供する。
【０００２】
特に、本発明は、微生物起源のタンパク質である広域スペクトル抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤を含有する組成物を提供する。詳細には、当該タンパク質は、病原性及び非病原性の両方の細菌を含むが、これらに限定されない微生物によって分泌されるか、又はその表面に結合している。
【０００３】
さらに、使用されるタンパク質は、マイコバクテリウムスピーシーズ細菌から、詳細にはマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）又はＭ．ボビス（M. bovis）ＢＣＧから単離される。タンパク質はまた、その様々な切断型誘導体、そのようなタンパク質から誘導されるペプチド、合成的に調製されるペプチド、並びにペグ化、アセチル化、及びリン酸化によって修飾されるタンパク質又はペプチドによって置き換えることができる。タンパク質は、精製タンパク質及び精製ペプチドを表す。
【０００４】
本発明の抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤は、有効性が増強しており、毒性が低下している。さらに、抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤として用いられる精製タンパク質及び精製ペプチドは、患者血流における長期の半減期及び免疫原性の低下を有し得る。
【０００５】
本発明はまた、抗ＨＩＶ化合物及び医薬組成物の性質、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療するための治療剤としてのその適用の様式も開示する。医薬組成物は、活性成分、すなわち、そのペグ化、アセチル化、リン酸化形態を含む、単独又は組み合わせたタンパク質、ペプチド、並びに生理学的及び薬学的に許容されるアジュバント又は賦形剤を含む。タンパク質又はペプチドは、他の既知の抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ薬と組み合わせて使用してもよい。タンパク質／ペプチドは、ポリオ、エボラ、Ｂ型又はＣ型肝炎、デング熱、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１、単純ヘルペスなどのような他のウイルスに対してさらなる活性を有していてもよい。
【背景技術】
【０００６】
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ、Human Immunodeficiency Virus）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、Acquired Immunodeficiency Syndrome）を引き起こす、非常に病原性で、回避的で、根絶するのが困難な病原体である。２つのタイプのＨＩＶ、すなわちＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２がある。両方のタイプのＨＩＶは、身体が疾患に打ち勝つ（fight）能力を支援するのに重大であるＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれる特定の血球を破壊することによって人体に損傷を与える。ＵＮＡＩＤＳのとおり、３３．３百万人の人々が、２００９年に、ＨＩＶを患って生きていた（Global Report: UNAIDS Report on The Global AIDS Epidemic, 2010）。１９８０年代初期のこの発見が、抗ウイルス薬発見及び開発における大きな国際的な科学的取り組みを引き起こした。結果として、多くの薬剤が、この状態を管理するのに現在利用可能であり、ＨＡＡＲＴ（highly active antiretroviral therapy、高活性抗レトロウイルス剤療法）として知られている薬剤併用療法の使用を可能にしている。現時点では、５つの一般的なクラスの抗レトロウイルス薬が、ＦＤＡの承認を得ている：ヌクレオシド／ヌクレオチドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ、nucleoside/nucleotide analog reverse transcriptase inhibitor）、非ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ、non-nucleoside analog reverse transcriptase inhibitor）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ、protease inhibitor）、インテグラーゼ阻害剤（ＩＩ、integrase inhibitor）、及び融合阻害剤（fusion inhibitor）。３つ以上の抗レトロウイルス薬を組み合わせて使用する治療パラダイムである、高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）の導入は、ＨＩＶに関連する罹患率及び死亡率の著しい低下をもたらした（Palella F.J. Jr, Delaney K.M., Moorman A.C., Loveless M.O., Fuhrer J., Satten G.A., Aschman D.J. and Holmberg S.D. 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. N. Eng. J. Med. 338: 853-860）。抗ウイルス治療の選択肢は、２つのヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）及び１つのプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）の組み合わせを主に含んでいる。代替の好ましい選択肢は、非ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）と２つのＮＲＴＩの使用を含む。最近、ＮＲＴＩは、効果的なウイルス抑制及び耐用性のためにインテグラーゼ阻害剤と組み合わせられた。
【０００７】
ＡＩＤＳの病因因子としてのＨＩＶの発見後２５年間にわたって、この疾患に効果的なワクチンは利用できないままである。これは、この疾患病原体が抜け目なく、身体において生成される中和抗体に対する抗原性エピトープをそれが素速く変化させる又は隠すからである。実際に、それぞれＨＩＶ特異的抗体及び細胞傷害性Ｔ細胞応答の誘発に基づく、原理証明用のワクチン（proof-of-principle vaccine）の試験を目的とした２つの大規模臨床試験（ＡＩＤＳＶａｘ及びＳＴＥＰ）は、望ましい臨床効果のいずれも示さなかった（Fauci A.S., Johnston M.I., Dieffenbach C.W., Burton D.R., Hammer S.M.,  Hoxie J.A., Martin M., Overbaugh J., Watkins D.I., Mahmoud A. and Greene W.C. 2008. HIV vaccine research: the way forward. Science. 321: 530-532 ）。慢性的に複製するレトロウイルスであるＨＩＶ−１は、いくつかの通常にはない難題をもたらす。ＨＩＶ−１の大規模な遺伝的変異は、世界中の多数の遺伝的サブタイプ及びそれぞれの感染した個人内での複数のウイルスバリアントの進化によって証明される。ほとんどのウイルス病原体は、感染病原体として又はワクチン中で模倣させて、予め曝露させると、ウイルスを中和し疾患から保護する抗体の生成をもたらす（Stamatatos L., Morris L., Burton D.R. and Mascola J.R. 2009. Neutralizing antibodies generated during natural HIV-1 infection: good news for an HIV-1 vaccine? Nat. Med. 15: 866-870）。よって、ＨＩＶ−１研究者らの主な目標は、ウイルスに対する曝露の前に存在するであろう防御抗体をインビボで誘発するワクチンを設計することである（Burton D.R., Desrosiers R.C., Doms R.W., Koff W.C., Kwong P.D., Moore J.P., Nabel G.J., Sodroski J., Wilson I.A. and Wyatt R.T. 2004. HIV vaccine design and the neutralizing antibody problem. Nat. Immunol. 5: 233-236）。１９８３年におけるＨＩＶ−１の単離、及び中和抗体（ＮＡｂ）がおそらくこのレトロウイルスのエンベロープＥｎｖ糖タンパク質を標的とするであろうという認識は、効果的な抗体ベースのワクチンを数年以内に設計することができるであろうという楽観論をもたらした。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、３つの同一のｇｐ１６０分子からなる三量体構造であり、それぞれ、膜貫通ｇｐ４１分子に非共有結合した表面ｇｐ１２０を有し、実際に、組換えｇｐ１６０ワクチン候補及び組換えｇｐ１２０ワクチン候補は、速やかに産生され、第１相臨床試験において試験された。ほとんどの研究者らが驚いたことには、これらの研究は、それらの第１のインビトロ試験に失敗したことを示した。ワクチン誘発性の抗体は、感染した個人の血液に由来する初期のウイルスを中和することができなかったのである（Mascola J.R., Snyder S.W., Weislow O.S., Belay S.M., Belshe R.B., Schwartz D.H., Clements M.L., Dolin R., Graham B.S., Gorse G.J., Keefer M.C., McElrath M.J., Walker M.C., Wagner K.F., McNeil J.G., McCutchan F.E. and Burke D.S. 1996. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Infect. Dis. 173: 340-348）。結局、ｇｐ１２０ワクチンについての第３相試験の結果は、このタイプの抗体ベースのワクチン戦略の有効性の欠如を示した。ワクチンは、ＨＩＶ−１感染を予防せず、ウイルス複製を低下させなかったか、又はＣＤ４＋Ｔ細胞の減少から保護しなかった（Flynn N.M., Forthal D.N., Harro C.D., Judson F.N., Mayer K.H. and Para M.F. 2005. Placebo-controlled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1 infection. J. Infect. Dis. 191: 654-665）。その後の数年間にわたって、改善された抗体ベースのワクチン免疫原を設計するための多数の試みは、限定的な成功を経験した（Stamatatos L., Morris L., Burton D.R. and Mascola J.R. 2009. Neutralizing antibodies generated during natural HIV-1 infection: good news for an HIV-1 vaccine? Nat. Med. 15: 866-870）。
【０００８】
ウイルス複製又は成熟の阻害剤（ＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ、ＰＩ、ＩＩなど）のほか、抗レトロウイルス薬は、これまで、ＣＤ４に対するウイルス接着、細胞共受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４に対するその結合、並びにウイルス及び宿主細胞の膜融合を標的とすることに基づいてきた。ｇｐ１２０共受容体結合を遮断する、最近承認されたＣＣＲ５アンタゴニストであるマラビロックに加えて（Fatkenheuer G., Pozniak A.L., Johnson M.A., Plettenberg A., Staszewski S., Hoepelman A.I., Saag M.S., Goebel F.D., Rockstroh J.K., Dezube B.J., Jenkins T.M., Medhurst C., Sullivan J.F., Ridgway C., Abel S., James I.T., Youle M. and van der Ryst E. 2005. Efficacy of short-term monotherapy with maraviroc, a new CCR5 antagonist, in patients infected with HIV-1. Nat. Med. 11:1170-1172）、エンフビルチドは、臨床上の使用について承認された残りのただひとつの侵入阻害剤である（Matthews T., Salgo M., Greenberg M., Chung J., DeMasi R. and Bolognesi D. 2004. Enfuvirtide: the first therapy to inhibit the entry of HIV-1 into host CD4 lymphocytes. Nat. Rev. Drug Discov. 3: 215-225）。エンフビルチド（Ｔ−２０としても知られている）は、ｇｐ４１の様々な領域に由来する、化学的に合成されたペプチドから選択されるペプチド薬である（Wild C.T., Shugars D.C., Greenwell T.K., McDanal C.B. and Matthews T.J. 1994. Peptides corresponding to a predictive alpha-helical domain of human immunodeficiency virus type 1 gp41 are potent inhibitors of virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 9770-9774）。エンフビルチド（Ｔ２０）は、皮下注射薬として送達される３６アミノ酸合成ペプチドからなる。臨床試験において非常に効果的であることが示されたが、何人かの患者は、有痛性かつ持続性の注射部位反応を示す。エンフビルチドは、ｇｐ４１の７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）１及びＨＲ−２ドメインの間の相互作用を競合的に阻害することによって作用し、したがって、ウイルスと細胞表面が接触して、融合が起こるのを可能にする再配置を予防する（Kilby J.M., Hopkins S., Venetta T.M., DiMassimo B., Cloud G.A., Lee J.Y., Alldredge L., Hunter E., Lambert D., Bolognesi D., Matthews T., Johnson M.R., Nowak M.A., Shaw G.M. and Saag M.S. 1998.  Potent suppression of HIV-1 replication in humans by T-20, a peptide inhibitor of gp41-mediated virus entry.  Nat. Med. 4: 1302-1307及びRice C. and Wilantewicz H. 2006. Fuzeon (enfuvirtide): efficacy, safety, patient acceptance, and strategies for managing injection-site reactions. AIDS Read. 16: 470-474）。エンフビルチドを臨床承認に導いた同じコンソーシアム（Trimeris, Inc.社及びRoche社）は、第二世代の融合阻害剤、Ｔ−１２４９を開発した。それは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス、Simian Immunodeficiency Virus）由来のｇｐ４１のＣＨＲ配列を考慮に入れて設計された３９アミノ酸長のペプチドである（Eron J.J., Gulick R.M., Bartlett J.A., Merigan T., Arduino R., Kilby J.M., Yangco B., Diers A., Drobnes C., DeMasi R., Greenberg M., Melby T., Raskino C., Rusnak P., Zhang Y., Spence R. and Miralles G.D. 2004. Short-term safety and antiretroviral activity of T-1249, a second-generation fusion inhibitor of HIV. J. Infect. Dis. 189:1075-1083）。ヒトにおける抗レトロウイルス活性及び安全性についての好結果の短期評価は、この新しい薬剤の可能性を証明した（Eron J.J., Gulick R.M., Bartlett J.A., Merigan T., Arduino R., Kilby J.M., Yangco B., Diers A., Drobnes C., DeMasi R., Greenberg M., Melby T., Raskino C., Rusnak P., Zhang Y., Spence R. and Miralles G.D. 2004. Short-term safety and antiretroviral activity of T-1249, a second-generation fusion inhibitor of HIV. J. Infect. Dis. 189:1075-1083）が、さらなる臨床開発は延期された（Martin-Carbonero L. 2004. Discontinuation of the clinical development of fusion inhibitor T-1249. AIDS Rev. 6: 61-61）。エンフビルチドの最初の出現以来、ＨＩＶに対するペプチド薬の調査は、成長中の研究分野であり、いくつかの候補は、インビトロで効率的であることが証明された（Naider F. and Anglister J. 2009. Peptides in the treatment of AIDS. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 473-482）。共受容体結合部位に接触する必要があるｇｐ１２０における立体構造変化を予防するモノクローナル抗体、ＴＮＸ−３５５は、毎週の静脈注射薬として与えられる。ＨＩＶ感染の診断及び治療におけるそのような大きな進歩にもかかわらず、２００９年に、２．２百万の新しい症例のＡＩＤＳが、成人において診断され、ＨＩＶを患って生きている人々の中で１．８百万人の死亡が、世界的に報告された（Global Report: UNAIDS Report on The Global AIDS Epidemic, 2010）。
【０００９】
ＡＩＤＳに対する効果的な薬剤又はワクチンが利用可能でない理由は複雑であり、大部分について、レンチウイルスの特異的な特徴及び宿主免疫系とのそれらの相互作用と関係がある。多くのサブタイプをもたらす、ＨＩＶ−１ウイルスの高度な突然変異性を考慮すれば、必要なのは、ＨＩＶ−１を治療するための全く新しいアプローチである。そのようなアプローチは、ウイルス成長の阻害に加えて、粘膜細胞表面からリンパＴ細胞へのＨＩＶ−１輸送及びウイルス侵入にとって重大である宿主機能を遮断するであろう。必要とされるのは、病原性又は非病原性細菌から得ることができる、ＨＩＶ−１などのようなウイルスに対して広範囲の活性を有するタンパク質兵器である。実際に、あるそのようなタンパク質兵器、アズリンは、抗癌活性を有するだけではなく、ＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスであるＨＩＶ−１などのようなウイルス又はマラリア原虫熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）若しくはトキソプラズマ症を引き起こす寄生虫トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）に対する活性もまた有することが示された（Chakrabarty A.M. 2010.  Bioengineered bugs, drugs and contentious issues in patenting.  Bioeng. Bugs. 1: 2-8及びFialho A.M. and Chakrabarty A.M.  2010. Promiscuous anticancer drugs from pathogenic bacteria: rational versus intelligent drug design.  In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools (A. M. Fialho and A. M. Chakrabarty, Eds), John Wiley & Sons, Hoboken,  NJ. 181-198）。他のタンパク質、マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）由来のＡＤＩは、抗癌活性を有するだけではなく（Feun L., Kuo M.T., You M., Wu C.J., Wangpaichitr M. and Savaraj N.  2010.  Arginine deiminase and cancer therapy. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools (A. M. Fialho and A. M. Chakrabarty, Eds). John Wiley & Sons, Hoboken, NJ. 199-217）、ＨＩＶ−１又はｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス活性もまた有することが示された（Kubo M., Nishitsuji H., Kurihara K., Hayashi T., Masuda T. and Kannagi M. 2006.  Suppression of human immunodeficiency virus type 1 replication by arginine deiminase of Mycoplasma arginini.  J. Gen. Virol. 87: 1589-1593及びIzzo F., Montella M., Orlando A.P., Nasti G., Beneduce G., Castello G., Cremona F., Ensor C.M., Holtzberg F.W., Bomalaski J.S., Clark M.A., Curley S.A., Orlando R., Scordino F. and Korba B.E. 2007. Pegylated arginine deiminase lowers hepatitis c viral titers and inhibits nitric oxide synthesis.  J. Gastroenterol. Hepatol. 22: 86-91）。しかしながら、最も重要なことには、アズリンは、３つのクレード、ヨーロッパ、インド、及びアフリカ起源のＨＩＶ−１ウイルスに対して強力な成長阻害効果を示す（Chaudhari A., Fialho A.M., Ratner D., Gupta P., Hong C.S., Kahali S., Yamada T., Haldar K., Murphy S., Cho W., Chauhan V.S., Das Gupta T.K. and Chakrabarty A.M. 2006. Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by azurin. Cell Cyc. 5: 1642-1648）。そのような強力な成長阻害（９０％以上）は、宿主細胞へのＨＩＶ−１の侵入に干渉するアズリンの能力によることが示された（Chaudhari A., Fialho A.M., Ratner D., Gupta P., Hong C.S., Kahali S., Yamada T., Haldar K., Murphy S., Cho W., Chauhan V.S., Das Gupta T.K. and Chakrabarty A.M. 2006. Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by azurin. Cell Cyc. 5: 1642-1648）。Ｌａｚと呼ばれるアズリン様のタンパク質はまた、髄膜炎を引き起こすナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）などのような淋菌／髄膜炎菌のメンバーによっても産生される。１２８アミノ酸のＰ．エルジノーサ（P. aeruginosa）アズリンと同様に、Ｌａｚは、Ｐ．エルジノーサのアズリンに高い相同性を有する１２７アミノ酸成分を有するが、Ｈ−８エピトープと呼ばれるさらなる３９アミノ酸ペプチドをそのＮ末端に有する。Ｌａｚはまた、癌（Hong C.S., Yamada T., Hashimoto W., Fialho A.M., Das Gupta T.K. and Chakrabarty A.M. 2006. Disrupting the entry barrier and attacking brain tumors: the role of the Neisseria H.8 epitope and the Laz protein. Cell Cyc. 5: 1633-1641）及び寄生虫（Chaudhari A., Fialho A.M., Ratner D., Gupta P., Hong C.S., Kahali S., Yamada T., Haldar K., Murphy S., Cho W., Chauhan V.S., Das Gupta T.K. and Chakrabarty A.M. 2006. Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by azurin. Cell Cyc. 5: 1642-1648；Naguleswaran A., Fialho A.M., Chaudhari A., Hong C.S., Chakrabarty A.M. and Sullivan W.J. Jr. 2008. Azurin-like protein blocks invasion of Toxoplasma gondii through potential interactions with parasite surface antigen SAG1. Antimicrob. Agents Chemotherap. 52: 402-408）の成長だけではなく、ＨＩＶ−１ウイルス（Chaudhari A., Fialho A.M., Ratner D., Gupta P., Hong C.S., Kahali S., Yamada T., Haldar K., Murphy S., Cho W., Chauhan V.S., Das Gupta T.K. and Chakrabarty A.M. 2006. Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by azurin. Cell Cyc. 5: 1642-1648）の成長もまた強く阻害することにおいて非常に効率的である。ＣＤ４、ＩＣＡＭ−３、又はＤＣ−ＳＩＧＮなどのような宿主タンパク質及びウイルスタンパク質ｇｐ１２０に強く結合するアズリン又はＬａｚの能力は、ＨＩＶ−１に対する、アズリン及びＬａｚの両方の成長抑制能力を説明する。必須であるウイルス成分のみを阻害する、医薬品産業によって開発されたプロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素、又は侵入阻害剤と異なり、アズリンは、ｇｐ１２０だけではなく、ＨＩＶ−１輸送及びＴ細胞への侵入にとって重要である宿主タンパク質ＣＤ４、ＩＣＡＭ−３、又はＤＣ−ＳＩＧＮにも強く結合する。ウイルスが宿主タンパク質を変化させるように突然変異することができないので、宿主機能の遮断は、おそらく、ＨＩＶ−１が突然変異して薬剤抵抗性になるのを予防するであろう。Ｐ．エルジノーサは、その兵器であるアズリンを非常に巧みに設計したようであり、それは、ＣＤ４又はＩＣＡＭ−３などのようなウイルス侵入のための宿主装置だけではなく、ＤＣ−ＳＩＧＮもまた遮断して、粘膜表面からＴ細胞へのＨＩＶ−１の輸送を遮断し、それによって感染を予防する。
【００１０】
本発明者らは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスによって分泌されるタンパク質ＭＰＴ６３が、抗癌活性及び抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ活性の両方を持つことを最近実証し、抗癌活性を包含する仮特許出願を提出した（Suri, A., Kanojia, D., Salunkhe, P., Surolia, A. and Chakrabarty, A. 2010. Anti Cancer Agent.  Provisional Patent Application submitted to the Indian Patent Office on October 1, 2010）。
【００１１】
継続的な努力を費やしたＲ＆Ｄ研究の後に、発明者は、驚くべきことに、このタンパク質又はそのバリアントの全く予想外のこれまで知られていない、ウイルス感染に対抗するための特性、特にＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、はしかウイルス、豚インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルスに対する、より特異的にはＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する活性を発見した。
【００１２】
ＭＰＴ６３は、培養の２〜３週間後に分泌される、１５９アミノ酸（アミノ酸）の小さな（１６ｋＤａ）タンパク質である。それは、２９アミノ酸のシグナルペプチドが先行する１３０アミノ酸の成熟タンパク質からなる。このタンパク質は、免疫原性の特性を有することが示され、病原性に関係づけられている。ＭＰＴ６３の相同体が、Ｍ．スメグマチス（M. smegmatis）、Ｍ．ボビス（M. bovis）ＢＣＧ、及びＭ．アビウム（M. avium）のようなマイコバクテリウムの種のみにおいて見い出されたように、それは、マイコバクテリアに特異的である。ＭＰＴ６３の偽遺伝子が、Ｍ．ラプレ（M. lapre）のゲノム内で見い出されたが、タンパク質に翻訳されないと考えられる。ＭＰＴ６３のＸ線結晶構造は、ＭＰＴ６３に関する機能的な情報を得る目的で、１．５オングストロームの解像度まで決定された。ＭＰＴ６３の構造は、さらなる小さな逆平行β−シートと、免疫グロブリン様の折り畳み構造に類似した２つの逆平行β−シートからなるβ−サンドイッチである（Goulding, C.W., Parseghian, A., Sawaya, M.R., Cascio, D., Apostol, M.I., Gennaro, M.L. and Eisenberg, D. 2002. Crystal structure of a major secreted protein of Mycobacterium tuberculosis-MPT63 at 1.5-A resolution. Protein Sci. 11:2887-2893）。ＭＰＴ６３の機能は、これまで知られておらず、それが、プロテインデータバンクの構造の約２４％において生じる、非常によくある免疫グロブリン様の折り畳み構造を有するので、その構造的特徴によって予測することができなかった。ＭＰＴ６３が類似しているβ−サンドイッチの折り畳み構造は、種々の機能を有する多くのタンパク質のコアにある（Goulding, C.W., Parseghian, A., Sawaya, M.R., Cascio, D., Apostol, M.I., Gennaro, M.L. and Eisenberg, D. 2002. Crystal structure of a major secreted protein of Mycobacterium tuberculosis-MPT63 at 1.5-A resolution. Protein Sci. 11:2887-2893）。ＭＢ３０と称され、ＭＰＴ６３タンパク質に由来する３０アミノ酸ペプチドもまた、一連のヒト癌に対する強力な抗癌活性を持つ（Suri, A., Kanojia, D., Salunkhe, P., Surolia, A. and Chakrabarty, A. 2010. Anti Cancer Agent.  Provisional Patent Application submitted to the Indian Patent Office on October 1, 2010）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Global Report: UNAIDS Report on The Global AIDS Epidemic, 2010
【非特許文献２】Palella F.J. Jr, Delaney K.M., Moorman A.C., Loveless M.O., Fuhrer J., Satten G.A., Aschman D.J. and Holmberg S.D. 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. N. Eng. J. Med. 338: 853-860
【非特許文献３】Fauci A.S., Johnston M.I., Dieffenbach C.W., Burton D.R., Hammer S.M.,  Hoxie J.A., Martin M., Overbaugh J., Watkins D.I., Mahmoud A. and Greene W.C. 2008. HIV vaccine research: the way forward. Science. 321: 530-532
【非特許文献４】Stamatatos L., Morris L., Burton D.R. and Mascola J.R. 2009. Neutralizing antibodies generated during natural HIV-1 infection: good news for an HIV-1 vaccine? Nat. Med. 15: 866-870
【非特許文献５】Burton D.R., Desrosiers R.C., Doms R.W., Koff W.C., Kwong P.D., Moore J.P., Nabel G.J., Sodroski J., Wilson I.A. and Wyatt R.T. 2004. HIV vaccine design and the neutralizing antibody problem. Nat. Immunol. 5: 233-236
【非特許文献６】Mascola J.R., Snyder S.W., Weislow O.S., Belay S.M., Belshe R.B., Schwartz D.H., Clements M.L., Dolin R., Graham B.S., Gorse G.J., Keefer M.C., McElrath M.J., Walker M.C., Wagner K.F., McNeil J.G., McCutchan F.E. and Burke D.S. 1996. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Infect. Dis. 173: 340-348
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【非特許文献８】Fatkenheuer G., Pozniak A.L., Johnson M.A., Plettenberg A., Staszewski S., Hoepelman A.I., Saag M.S., Goebel F.D., Rockstroh J.K., Dezube B.J., Jenkins T.M., Medhurst C., Sullivan J.F., Ridgway C., Abel S., James I.T., Youle M. and van der Ryst E. 2005. Efficacy of short-term monotherapy with maraviroc, a new CCR5 antagonist, in patients infected with HIV-1. Nat. Med. 11:1170-1172
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
主な目的は、先行技術の限界を突破する抗ウイルス組成物を提供することである。特に、それは、抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤、医薬組成物、及びその適用の方法を提供する。
【００１５】
他の目的は、抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤、特に、微生物起源の広域スペクトル抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤、特に、病原性及び非病原性の両方の細菌を含むが、これらに限定されない微生物によって分泌されるか、又はその表面に結合しているタンパク質を提供することである。
【００１６】
他の目的は、抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤として有用な、細菌から単離された精製タンパク質、詳細には、マイコバクテリウム・ツベルクローシス又はＭ．ボビスＢＣＧから単離されたタンパク質を提供することである。
【００１７】
さらなる他の目的は、抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤として有用な、そのようなタンパク質から誘導されるペプチド、合成的に調製されるペプチド、並びにペグ化、アセチル化、リン酸化などによって修飾されるタンパク質又はペプチドを提供することである。
【００１８】
他の目的はまた、有効性が増強しており、毒性が低下しているタンパク質又はその様々な切断型誘導体を含む抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤を提供することでもある。
【００１９】
さらなる別の目的は、患者血流において、長期の半減期を有し、免疫原性が低下している、抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤としての、精製タンパク質及び精製ペプチドを提供することである。そのようなタンパク質及びペプチドはまた、デング熱、ポリオ、Ｈ１Ｎ１、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎、ヘルペスなどのような他のウイルスに対しても有用であり得る。本発明の目的はまた、抗ＨＩＶ化合物及び医薬組成物の性質、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療するための治療剤としてのその適用の様式を開示することでもある。医薬組成物は、活性成分、すなわち、そのペグ化、アセチル化、リン酸化形態を含む、単独又は組み合わせたタンパク質、ペプチド、並びに生理学的及び薬学的に許容されるアジュバント又は賦形剤を含む。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
したがって、本発明は、配列番号１からなるアミノ酸配列のタンパク質又はそのバリアント／切断型誘導体並びに任意選択で、適した担体及び／又は賦形剤を含む抗ウイルス組成物を提供する。
【００２１】
実施形態のうちの１つによれば、タンパク質は、微生物から単離された又は合成的に調製された精製タンパク質であってもよい。
【００２２】
さらに、タンパク質は、マイコバクテリウムスピーシーズから分泌されるか、又は表面付着し、マイコバクテリウムスピーシーズから単離されたものでもよい。
【００２３】
タンパク質は、好ましくは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス又はＭ．ボビスＢＣＧから得ることができる。
【００２４】
タンパク質又はそのバリアントは、ペグ化、アセチル化、リン酸化によってさらに修飾されてもよく、バリアントが、ペプチドであってもよい。
【００２５】
使用されるペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するものでもよい。
【００２６】
本発明はまた、活性治療成分として配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号２からなるアミノ酸配列を有するそのバリアント／切断型誘導体、並びに０．０〜９５重量％の範囲で薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【００２７】
薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤は、望ましい製剤の調製及び指定されるルートによる活性成分の送達を促進する従来のものであってもよい。そのため、使用される担体及び／又は賦形剤は、医薬の投与と適合性であり、活性成分の必要とされる薬物動態及び薬力学的効果（pharmacodynamics）を達成する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含む。これらの担体及び／又は賦形剤が、望ましい治療効果を達成するために、活性成分と相互依存して又はそれとの相乗効果で作用する必要があることに注意されたい。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、はしかウイルス、豚インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、又は日本脳炎ウイルスに対して、静脈内（ｉｖ、intravenous）、筋肉内、経口、皮下、又は局所適用として有用であり得る。
【００２９】
請求項７に記載の医薬組成物はまた、ウイルス増殖の阻害、又はｇｐ−１２０エピトープの遮断に有用でもある。
配列番号１：
MKLTTMIKTAVAVVAMAAIATFAEPVALAAYPITGKLGSELTMTDTVGQVVLGWKVSDLKSSTAVIPGYPVAGQVWEATATVNAIRGSVTPAVSQFNARTADGINYRVLWQAAGPDTISGATIPQGEQSTGKIYFDVTGPSPTIVAMNNGMQDLLIWEP
配列番号２：GQVWEATATVNAIRGSVTPAVSQFNARTAD（ＭＢ３０）
【００３０】
材料及び方法：
ａ．抗ウイルス活性、好ましくはＨＩＶ／ＡＩＤＳ活性についてのタンパク質の選択
マイコバクテリウム・ボビス又はマイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のＭＰＴ６３タンパク質の完全なアミノ酸配列を下記に示す。以下のＭＰＴ６３配列の最初の２９アミノ酸（下線）は、分泌シグナルペプチド（リーダー）配列を形成する。
MKLTTMIKTAVAVVAMAAIATFAEPVALAAYPITGKLGSELTMTDTVGQVVLGWKVSDLKSSTAVIPGYPVAGQVWEATATVNAIRGSVTPAVSQFNARTADGINYRVLWQAAGPDTISGATIPQGEQSTGKIYFDVTGPSPTIVAMNNGMQDLLIWEP
【００３１】
ｂ．ＭＰＴ６３遺伝子のクローニング及び発現
マイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のＭＰＴ６３をコードする遺伝子を、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによって増幅した。使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーは：5’ - GCCTATCCCATCACCGGAAAA - 3’及び5’ - CTACGGCTCCCAAATCAGCA 3’とした。遺伝子は、６×Ｈｉｓ融合タグも含有するｐＷＨ８４４ベクターにおいてＴ７プロモーターの下流に配置させた。大腸菌（E. coli）ＳＵＲＥ株を、以下の条件で発現のための宿主として使用した：細胞は、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に３７℃でＬＢ培地において一晩インキュベートし、同じ抗生物質濃度を有するＳＢ培地（３．２％トリプトン、２％酵母抽出物、及び０．５％ＮａＣｌ）において０．１の初期ＯＤ６４０で午前中に接種した。ＯＤ６４０  ０．６〜０．７に到達したら、細胞は、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発し、３７℃、２５０ｒｐｍで５〜６時間、成長させた。細胞は、４℃で１０分間８０００ｒｐｍで遠心分離によって収集し、バッファーＩ（１０ｍＭイミダゾール、０．２Ｍ  ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において１回洗浄し、同じバッファー中に再懸濁し、−８０℃で保存した。細胞破壊は、超音波処理によって実行し、タンパク質精製は、ヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーカラム、HisTrap（商標） HP（GE Healthcare社）において実行した。手短かに言えば、破壊した細胞は、１７６００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を、１時間同じ条件で再び遠心分離した。清澄化された抽出物は、その後、ＳＴＡＲＴバッファー（１０ｍＭイミダゾール、リン酸バッファー：０．２Ｍリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化した５ｍｌ  HisTrap HPカラムにロードした。タンパク質溶離は、同じバッファーにおいて連続イミダゾール勾配（２０〜５００ｍＭ）を用いて達成した。精製の後に、タンパク質は直ちに脱塩し、メーカーの指示に従って、ＡＫＴＡ精製装置システムにおいて、HiPrep 26/10脱塩カラム（GE Healthcare社）中で、バッファーをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８.１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、１，７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）、ｐＨ７．４に交換した。最後に、タンパク質は、分子量のカットオフを１０ｋＤａとして、Amicon Ultra Centrifugal Devices（Milipore社）を用いて４℃で遠心分離によって濃縮した。精製タンパク質は、１ｍｌ  Detoxi-Gel（商標）内毒素除去カラム（Thermo Scientific社）を通過させて、大腸菌宿主株から内毒素を除去した。すべてのステップで、タンパク質濃度は、メーカーの指示に従って、BCA（商標）Protein Assay kit（Thermo Scientific社）により評価した。タンパク質の純度は、硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）によって分析した。
【００３２】
ｃ．初代リンパ球におけるＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の感染及び複製におけるＭＰＴ６３タンパク質の役割
ＣＤ４＋Ｔ細胞単離：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、peripheral blood mononuclear cell）は、健康なドナーのアフェレーシスによって得たロイコパック（leukopack）（Stanford Blood Bank社、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のFicoll-Hypaque（Amersham BioSciences社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、ネガティブセレクションによって精製した。細胞純度は、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤ１４細胞に対して向けられる蛍光複合化抗体を用いて細胞を染色することによって決定した。細胞集団は、＞９５％がＣＤ３＋  ＣＤ４＋であることが分かった。
【００３３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激：ＣＤ４＋Ｔ細胞は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、phytohemagglutinin）刺激又はＣＤ３／ＣＤ２８同時刺激によって活性化した。ＰＨＡ刺激については、細胞は、２４、４８、又は７２時間、１μｇのＰＨＡ（Sigma社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）／ｍｌと共に２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。細胞は、その後、洗浄して、ＰＨＡを除去し、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、fetal bovine serum）（Gemini社、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び５０Ｕのインターロイキン−２（ＩＬ−２）（AIDS Research and Reference Reagent Program、Division of AIDS、National Institute of Allergy and Infectious Diseases [NIAID]、National Institutes of Health [NIH]）／ｍｌを添加したRPMI 1640培地（MediaTech社、Ｈｅｒｎｄｏｎ、Ｖａ．）において４８時間培養した。ＣＤ３／ＣＤ２８同時刺激については、組織培養プレートは、ＣＤ３抗体により予めコーティングした。手短かに言えば、ウェルは、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、その後、５０μｇ／ｍｌストック溶液のＣＤ３抗体によりコーティングした。過剰な液体を除去し、プレートは、それらが乾燥するまで３７℃でインキュベートした。細胞は、その後、２４、４８、又は７２時間、１μｇの可溶性ＣＤ２８抗体（Becton Dickinson社）／ｍｌの存在下において２×１０６細胞／ｍｌの濃度でコーティングプレート上で培養した。細胞は、ＣＤ３コーティングプレートから取り出し、洗浄して、可溶性ＣＤ２８を除去し、その後、１５％ＦＢＳ及び５０ＵのＩＬ−２／ｍｌを補足したRPMI 1640培地において培養した。
【００３４】
ウイルスストック：ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３ストックは、ｐＮＬ４−３を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって調製した。Lipofectamine 2000（Invitrogen社）を、メーカーの指示に従ってトランスフェクションに使用した。本質的には、脂質複合体は、Optimem-I還元血清培地（Invitrogen社）中でｐＮＬ４−３及びLipofectamine 2000を混合することによって生成した。ポリ−Ｄ−リシンコーティングプレート（Becton Dickinson社）上のOptimem-I（７０〜９０％コンフルエント）中の２９３Ｔ細胞を、５時間、脂質複合体と共にインキュベートした。培地は、１０％熱失活ＦＢＳを含有するOptimem-Iに交換した。トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス粒子を含有する上清を収集し、１０分間の１０，０００ｘｇでの遠心分離によって細胞デブリを除き、０．２２μｍ細孔径ポリビニリデンジフルオリド膜でろ過した。ウイルス力価は、ＨＩＶ−１  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット（Innotest社）によりｐ２４抗原酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ、enzyme-linked immunosorbent assay）によって決定した。
【００３５】
細胞をＭＰＴ６３により処理し、続いて、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３に感染させた。細胞は、１０％熱失活ＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ、minimal essential medium）ビタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２００μＭ  Ｌ−グルタミン、５．５×１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール、５０μｇのゲンタミシン／ｍｌを添加したRPMI 1640中で培養した。細胞はまた、組換えヒトインターロイキン２（５０Ｕ／ｍｌ；Hoffmann-La Roche社、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．の寛大な寄贈）も添加された。細胞抽出物及び培養上清におけるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡ  ｐ２４抗原によって測定した。
【００３６】
ｄ．ＣＤ４＋リンパ球におけるクレードＧ及びＣのＨＩＶ−１初代分離株の感染及び複製におけるＭＰＴ６３タンパク質の役割
ＣＤ４＋リンパ球（１０６）は、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の追加前に、ハンクス平衡塩類溶液において図２に示されるいくつかの濃度のＭＰＴ６３タンパク質と共に３０分間、二連でプレインキュベートした。処理前実験において、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３を、３０分間、ＭＰＴ６３タンパク質と共にプレインキュベートした。その後、ＭＰＴ６３処理ウイルスを、Ｔ細胞（１０６）に追加した。感染後、ウイルスを１時間後に除去し、細胞を、適切な濃度のＭＰＴ６３の存在下において５日間培養した。陰性対照細胞は、ＭＰＴ６３希釈液と共にインキュベートした。ウイルス量は、市販のｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（Innotest社）を使用して定量化した。
【００３７】
ウイルス調製：クレードＧ及びＣ由来のＨＩＶ−１は、感染患者から単離されたもので、Ｄｒ．Ｊｏｓｅ  Ｍｉｇｕｅｌ  Ｐｅｒｅｉｒａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ  Ｌｉｓｂｏａ）によって親切にも提供された。ウイルスストックは、１０分間、１，０００ｘｇで遠心分離し、細胞デブリを除去し、その後、４５μｍ細孔径フィルターを通過させた。それぞれウイルス調製物の感染力価は、５０％組織培養感染量アッセイによって決定した。手短かに言えば、複数のドナー由来のＰＨＡ刺激ＰＢＭＣをプールし、四連のウェルにおいて段階希釈ウイルスに感染させた。細胞上清を、感染の５日後に収集し、ＨＩＶ  ｐ２４抗原を、ｐ２４酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化した。ｐ２４レベルが５０ｐｇ／ｍｌよりも高かった場合、感染を複製に対して陽性と評点した。５０％組織培養感染量値は、ウェルの５０％が感染について陽性と評点されるウイルス希釈度を示す。
【００３８】
ＨＩＶ感染：ＣＤ４＋Ｔ細胞は、感染の７２時間前にＣＤ３／ＣＤ２８同時刺激によって活性化した。細胞は、上記に記載されるように処理し、洗浄し、３７℃で４時間、０．０１のＭＯＩのウイルスと共にインキュベートした。感染の後に、細胞は、３回洗浄し、あらゆる非結合ビリオンを除去し、その後、１５％ＦＢＳ及び５０ＵのＩＬ−２／ｍｌを添加したRPMI 1640培地において培養した。
【００３９】
ウイルス複製の定量：ウイルス複製は、培養上清中の可溶性ＨＩＶ  ｐ２４抗原の量を測定することによって評価した。上清の一定分量（２００μｌ）を、感染の３、５、７、及び１０日後に、感染細胞培養物から取り出した。上清は、実験の終了まで−８０℃で保存した。ｐ２４の定量は、メーカーのプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ（Innotest社）を使用して決定した。
【００４０】
ｅ．細胞間融合におけるＭＰＴ６３の役割
ＨＩＶ  Ｅｎｖ媒介性の細胞融合。ＨＩＶ−１のＥｎｖ媒介性の細胞融合に対するＭＰＴ６３の効果は、以前に記載される標準レポーター遺伝子活性化アッセイにより分析した（Schwartz O., Alizon M., Heard J.M. and Danos O. 1994. Impairment of T cell receptor-dependent stimulation in CD4+ lymphocytes after contact with membrane-bound HIV-1 envelope glycoprotein. Virology. 198: 360-365）。手短かに言えば、エフェクター細胞は、組換えワクシニアウイルスｖＣＢ−３２（ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ＳＦ１６２をコード）及びｖＰ１１Ｔ７ｇｅｎｅ１（ワクシニアウイルスプロモーターによって駆動されるバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をコード）により浮遊しているＨｅＬａ細胞を感染させることによって調製した。標的細胞は、２つの組換えワクシニアウイルス、ｖＣＢ２１Ｒ−ＬａｃＺ（Ｔ７プロモーターに連結されたｌａｃＺをコード）及びｖＣＢ−３（ヒトＣＤ４をコード）によりＨＥＫ２９３−ＣＣＲ５細胞を感染させることによって調製した。タンパク質発現を可能にするための３７℃での一晩のインキュベーションの後に、エフェクター細胞及び標的細胞は、それぞれ、洗浄し、再懸濁した。エフェクター細胞（１００μｌ、２×１０６細胞／ｍｌ）は、９６ウェルプレートの二連のウェルに追加し、様々な濃度のＭＰＴ６３を含有する１０μｌのＰＢＳと共に室温で１５分間プレインキュベートした。その後、標的細胞（１００μｌ、２×１０６細胞／ｍｌ）をこれらのエフェクター細胞と混合した。エフェクター細胞は、標的細胞と混合する前に、室温で１５分間、ＭＰＴ６３と共に最初にインキュベートした。細胞混合物は、融合を可能にするために３７℃で２．５時間インキュベートした。その後、細胞は、Nonidet P-40により溶解し、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を、クロロフェノール−レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在下において５７０ｎｍで測定した。
【００４１】
ｇｐ４１の７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）１ドメイン及びＨＲ−２ドメインの競合的阻害剤であるエンフビルチド（Ｔ２０）は、上記の実験すべてにおいて陽性対照として使用した。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】大腸菌ＳＵＲＥ細胞において過剰産生されたＭＰＴ６３タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色を示す図である。
【図２】ＭＰＴ６３タンパク質及びエンフビルチド（Ｔ２０）による末梢血リンパ球におけるＨＩＶ−１  ＮＬ４−３複製の阻害についての相対的なデータを示す図である。末梢血リンパ球は、０．０１の感染多重度で、増加性の濃度のＭＰＴ６３タンパク質（ｎＭ）の存在下において、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３に感染させた。ウイルス複製は、７日目に培養上清における可溶性ＨＩＶ  ｐ２４抗原の量を測定することによって評価した。ｐ２４の定量はＥＬＩＳＡを使用して決定し、値は、三連の試料の平均値を示す。複製の阻害は、ＭＰＴ６３の非存在下におけるＨＩＶ−１  ＮＬ４−３に比べたｐ２４濃度のパーセンテージとして決定した。
【図３】ＭＰＴ６３タンパク質による、ＣＤ４＋リンパ球における、ＨＩＶ−１初代分離株クレードＧ及びＣの複製の阻害を示す図である。末梢血リンパ球は、０．０１の感染多重度で、増加性の濃度のＭＰＴ６３タンパク質（ｎＭ）の存在下において、サブタイプＧ及びＣ由来のＨＩＶ−１初代分離株に感染させた。ウイルス複製は、７日目に培養上清における可溶性ＨＩＶ  ｐ２４抗原の量を測定することによって評価した。ｐ２４の定量はＥＬＩＳＡを使用して決定し、値は、三連の試料の平均値を示す。ｇｐ４１の７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）１ドメイン及びＨＲ−２ドメインの競合的阻害剤であるエンフビルチド（Ｔ２０）は、陽性対照として使用した。融合の阻害は、ＭＰＴ６３の非存在下において、ウイルス複製が１００％であることを考慮して、ＭＰＴ６３の存在下及び非存在下におけるｐ２４濃度の比として決定した。
【図４】ＭＰＴ６３タンパク質による細胞間融合の阻害を示す図である。Ｅｎｖ糖タンパク質及びＴａｔを発現するエフェクターＨｅＬａ細胞は、ＣＤ４を発現し、ＬＴＲ−β−Ｇａｌを含む標的ＨＥＫ２９３と共にインキュベートした。エフェクター細胞は、様々な濃度のＭＰＴ６３を含有する標的細胞に追加した。細胞融合の後に、細胞混合物は、界面活性剤中で破壊し、β−Ｇａｌ活性を、クロロフェノール−レッド−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在下において５７０ｎｍで測定した。ｇｐ４１の７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）１ドメイン及びＨＲ−２ドメインの競合的阻害剤であるエンフビルチド（Ｔ２０）は、陽性対照として使用した。融合の阻害は、ＭＰＴ６３の非存在下において細胞融合が１００％であることを考慮して、ＭＰＴ６３の存在下及び非存在下におけるβ−Ｇａｌ活性の比として決定した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
１．すべて抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ活性を示すＭＰＴ６３タンパク質、又はペプチドと呼ばれる、ＭＰＴ６３タンパク質の様々な切断型誘導体からなる群から選択される、１又は２以上の抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ化合物からなる医薬組成物を、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する患者に投与するステップを含む方法。ＭＰＴ６３タンパク質のアミノ酸配列は、材料及び方法に示されている。この化合物はまた、それらの効力を増強するために他の既知の抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ剤と組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
２．ウイルスが、ＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスのすべてのクレードからなる群から選択されるものであり得る、実施形態１に記載の方法。当然ながら、ＭＰＴ６３タンパク質及びそれに由来するペプチドの抗ウイルス活性はまた、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、はしかウイルス、豚インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、並びに他のウイルスなどのような他のウイルスに対して測定することもできる。
【００４５】
３．ウイルス死滅、ウイルス侵入若しくは宿主細胞との融合の阻害、ウイルス増殖の阻害、ｇｐ−１２０エピトープ及び他のウイルスエピトープの遮断、ＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルス輸送において重要な宿主機能の遮断、並びに／又はＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者若しくは他のウイルス感染患者における宿主Ｔ細胞への侵入をもたらす細菌タンパク質又はペプチドにＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスを接触させる、実施形態２に記載の方法。
【００４６】
４．そのようなタンパク質又はペプチドが、実施形態２において記載されるウイルスのいずれかに感染した患者に導入される、方法。
【００４７】
５．ウイルス患者におけるタンパク質／ペプチドの導入の方法は、アジュバント又は賦形剤の存在下又は非存在下における、静脈内（ｉｖ）、筋肉内、経口、皮下、又は局所適用を含み得る。
【００４８】
６．アミノ酸の多くが、抗ウイルス活性の損失を伴うことなく他のアミノ酸と交換することができることはタンパク質化学の一般的な知識から理解される。したがって、タンパク質又はペプチド配列は、活性のいかなる損失も伴うことなく１０〜４０％変異させることができる。
【００４９】
７．患者血流においてタンパク質若しくはペプチドの半減期を伸長する若しくは最適化するため、又は免疫原性を低下させるために、タンパク質又はペプチドの構造が、ペグ化、アセチル化、リン酸化などによって修飾されたものであり得る、実施形態１におけるタンパク質又はペプチド。そのような修飾はまた、ポリオ、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎、デング熱、Ｈ１Ｎ１他などのような、ＨＩＶ−１以外の広範なウイルス標的まで至ってもよい。
【００５０】
ＭＰＴ６３タンパク質は、材料及び方法に記載のプロトコールに従って、９５％を超える純度にまで精製し、さらなる実験に使用した。この調査におけるＭＰＴ６３タンパク質によるＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスの処理は、タンパク質の抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ特性を明らかにした。実験はすべて、三連で実行し、３回繰り返した。
【００５１】
図２において示されるように、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の複製は、エンフビルチド（Ｔ２０）と同様に、ＭＰＴ６３によって競合的に阻害され、ＥＣ５０は１０−２ｎＭであった。ＨＩＶ／ＡＩＤＳの多くの初代分離株におけるＭＰＴ６３の効果をさらに評価する。
【００５２】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスの様々なクレードにおけるＭＰＴ６３タンパク質の効果を確認するために、ＭＰＴ６３タンパク質は、材料及び方法の部において記載される濃度の、クレードＣ及びクレードＧのＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスと共にインキュベートした。図３において示されるように、クレードＣ及びＧの初代分離株の複製は、様々な濃度のＭＰＴ６３によって競合的に阻害された。ＨＩＶ−１のクレードＧは、クレードＣ初代分離株よりもＭＰＴ６３タンパク質に対して抵抗性を示した。両方のクレードのウイルスが有効に阻害され、ＩＣ５０は、０．１ｎＭ〜５０ｎＭの範囲にあり、したがって、試験したＨＩＶクレードに依存する、ＭＰＴ６３タンパク質によるウイルスの複製のかなりの阻害を明らかにした。
【００５３】
ＨＩＶ−１のＥｎｖ媒介性の細胞融合に対するＭＰＴ６３の効果は、材料及び方法の部において記載されるように、レポーター遺伝子活性化アッセイによって分析した。このアッセイにおいて、ｇｐ１２０を発現する細胞は、ＣＤ４を発現する細胞を標的とし、この細胞間融合の阻害が、ＭＰＴ６３タンパク質の存在下においてモニターされる。図４は、陽性対照エンフビルチド（Ｔ２０）と比較した、ＭＰＴ６３タンパク質の存在下における細胞間融合のより多くの阻害を示し、細胞接触によるウイルス伝播が非常に阻害され得ることを示す。
【００５４】
上記の実験はすべて、ＭＰＴ６３タンパク質が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスの複製及び細胞間伝播を有効に阻害することを示した。
【００５５】
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【図２】
2014512353.tif 000002
【図３】
2014512353.tif 000003
【図４】
2014512353.tif 000004
【図１】
2014512353.tif 000005
【配列表】
2014512353000001.app
【国際調査報告】
2014512353.tif 000006
2014512353.tif 000007