(57)【要約】  本発明は、新規のバレンセンシンターゼ、このようなバレンセンシンターゼをコードする核酸、前記コード核酸配列を含む宿主細胞、および本発明によるバレンセンシンターゼの存在下でファルネシル二リン酸をバレンセンに変換することを含む、バレンセンを調製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレンセンシンターゼであって、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼと比較して、（１時間当たりに形成されるバレンセンのモル量として表される）バレンセンへのファルネシル二リン酸の変換に対する向上した生産性を有し、または配列番号３において「Ｘ」印が付いた少なくとも１つの位置が、配列番号２における対応する位置とは異なるという条件で、配列番号３により表されるアミノ酸配列を含む、バレンセンシンターゼ。
【請求項２】
配列番号２により表されるバレンセンシンターゼと比較して、宿主細胞における向上した特異的生産性、向上した安定性、向上した生成物特異性（ゲルマクレンＡへのファルネシル二リン酸の変換と比べて）または増加した発現を有する、請求項１に記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項３】
ファルネシル二リン酸から形成されるゲルマクレンＡに対するファルネシル二リン酸から形成されるバレンセンのモル比（試験条件下で）として表される生成物特異性が、１０以上、好ましくは１３から３０、特に１５から２５である、請求項２に記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項４】
バレンセンシンターゼの量当たり１時間当たりに形成されるバレンセンのモル量として表されるバレンセンシンターゼの特異的生産性が、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼの特異的生産性の少なくとも１．５倍、好ましくは２．０から１０倍、特に２．５から５倍である、請求項１から３のいずれかに記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項５】
配列番号２により表されるバレンセンシンターゼと比較して、バレンセンシンターゼの第２のシェルにおける少なくとも１つの修飾、特に少なくとも１つの置換、またはバレンセンシンターゼの第１のシェルにおける少なくとも１つの修飾、特に少なくとも１つの置換を有する、請求項１から４のいずれかに記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項６】
配列番号２においてシステインを有する位置と対応する位置に異なるアミノ酸が存在する、請求項１から５のいずれかに記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項７】
配列番号２の１６、１２８、１７１、１８７、２２５、２４４、３００、３０２、３０７、３１９、３２３、３２７、３３１、３３４、３９８、４０５、４０９、４１０、４１２、４３６、４３８、４３９、４４４、４４８、４４９、４５０、４６３、４８８、４９０、４９２、５０２、５０３、５０７、５２７、５５６、５５９、５６０、５６６、５６８、５６９および５７０の群から選択される位置と対応するアミノ酸位置に、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼと比較して１つ以上の修飾、特に１つ以上の置換を有する、請求項１から６のいずれかに記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項８】
１つ以上の修飾が、１６Ａ、１６Ｔ、１６Ｓ、１２８Ｌ、１７１Ｒ、１８７Ｋ、２２５Ｓ、２４４Ｓ、２４４Ｔ、３００Ｙ、３０２Ｄ、３０７Ｔ、３０７Ａ、３１９Ｑ、３２３Ａ、３２７Ｌ、３３１Ｇ、３３４Ｌ、３９８Ｉ、３９８Ｍ、３９８Ｔ、４０５Ｔ、４０５Ｖ、４０９Ｆ、４１０Ｆ、４１０Ｖ、４１０Ｌ、４１２Ｇ、４３６Ｌ、４３６Ｋ、４３６Ｔ、４３６Ｗ、４３８Ｔ、４３９Ｇ、４３９Ａ、４４４Ｉ、４４４Ｖ、４４８Ｓ、４４９Ｆ、４４９Ｉ、４４９Ｙ、４５０Ｌ、４５０Ｍ、４５０Ｖ、４６３Ｅ、４６３Ｓ、４６３Ｇ、４６３Ｗ、４８８Ｙ、４８８Ｈ、４８８Ｓ、４９０Ｎ、４９０Ａ、４９０Ｔ、４９０Ｆ、４９２Ａ、４９２Ｋ、５０２Ｑ、５０３Ｓ、５０７Ｅ、５０７Ｑ、５２７Ｔ、５２７Ｓ、５２７Ａ、５５６Ｔ、５５９Ｈ、５５９Ｌ、５５９Ｖ、５６０Ｌ、５６６Ｓ、５６６Ａ、５６６Ｇ、５６８Ｓ、５６９Ｉ、５６９Ｖ、５７０Ｔ、５７０Ｇ、５７０Ａおよび５７０Ｐの群から選択される、請求項６または７に記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項９】
配列番号２と少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれかに記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項１０】
第１のポリペプチドセグメントおよび第２のポリペプチドセグメントを含み、第１のセグメントがタグペプチドを含み、ならびに第２のセグメントがバレンセンシンターゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項１から９のいずれかに記載のバレンセンシンターゼ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のバレンセンシンターゼをコードする核酸配列、この相補的配列を含む、またはストリンジェントな条件下で、請求項１から１０のいずれかに記載のバレンセンシンターゼをコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載のバレンセンシンターゼに対する特異的結合活性を有する抗体、または前記抗体の抗原結合部分に対する特異的結合親和性を有するタンパク質。
【請求項１４】
生物それ自体または多細胞生物の部分であり得る宿主細胞であって、請求項１２に記載の発現ベクターを含み、好ましくは細菌細胞、真菌細胞および植物細胞の群から選択され、より好ましくは、
ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）またはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）などのグラム陰性細菌の群から選択される細菌細胞；
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）（キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の群から選択される真菌細胞；
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞を含む培養物、ここで宿主細胞は、タバコ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ）、ナス属種（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、チコルム・インティバス（Ｃｉｃｈｏｒｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ハッカ属種（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｐ）、アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、塊茎形成植物、油料作物および樹木から選択されるトランスジェニック植物の細胞である；または
トランスジェニックキノコまたはトランスジェニックキノコ細胞を含む培養物、ここで、宿主細胞は、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）およびプレウロティシ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓｉ）から選択される、
である、宿主細胞。
【請求項１５】
バレンセンを調製するための方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載のバレンセンシンターゼの存在下で、ファルネシル二リン酸をバレンセンに変換することを含み、好ましくはバレンセンが、請求項１４に記載の宿主細胞を用いて調製される、方法。
【請求項１６】
ノートカトンを調製するための方法であって、請求項１５に記載の方法において調製されたバレンセンがノートカトンに変換され、前記変換は、バレンセンの位置特異的水酸化と、これに続く酸化を含み得、これによりノートカトンを形成する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バレンセンシンターゼ、前記バレンセンシンターゼをコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む宿主細胞、バレンセンの調製方法およびノートカトンの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物は、多様なテルペンおよびテルペノイドを生産する能力を有する。テルペンは、分子式Ｃ５Ｈ８を有するイソプレンの単位と通常は呼ばれる、２−メチルブタン残基から実際にまたは概念的に構築される。イソプレン単位は、天然の共通する構成単位の１つとみなすことができる。テルペンの基本的な分子式は、この式の倍数、すなわち（Ｃ５Ｈ８）ｎであり、ｎは連結されたイソプレン単位の数である。これは、イソプレン則と呼ばれ、この結果、テルペンはイソプレノイドとも称される。イソプレン単位は、直鎖を形成するように「頭尾」結合されてもよく、または環を形成するように配列されてもよい。テルペンの生合成では、テルペンは、一般的な５炭素前駆体、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびこの異性体、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）から形成される。したがって、テルペン炭素骨格は、５炭素原子の倍数を一般に含む。最も多いのは５、１０、１５、２０、３０および４０炭素テルペンであり、それぞれヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペンおよびテトラテルペンと呼ばれている。「頭尾」結合の他に、トリテルペンおよびテトラテルペンは、中心に１個の「尾尾」結合も含有する。テルペンは、アルコールおよびこの配糖体、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸およびカルボン酸エステルのようなさらなる官能基を含むことができる。これらの官能化されたテルペンは、本明細書ではテルペノイドと呼ばれる。テルペンと同様に、テルペノイドは、５炭素原子の倍数を有する炭素骨格を一般に有する。テルペノイドにおける炭素の総数は、５の倍数である必要はなく、例えば官能基は、任意の数の炭素原子を有するアルキル基を含むエステル基であってもよいことに留意されるべきである。
【０００３】
上述の定義は別として、用語「テルペン」、「テルペノイド」および「イソプレノイド」は、公開文献および特許文献においてしばしば互換的に使用されることに留意することが重要である。
【０００４】
バレンセンは、さまざまな柑橘類などの特定の植物で生産される天然に存在するテルペンである。これらの植物においてファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、バレンセンシンターゼの存在下でバレンセンに酵素的に変換される。
【０００５】
バレンセンは、例えば、香気または風味として産業上利用可能である。バレンセンは、柑橘類から得られた柑橘類精油からの蒸留により得ることができるが、これらの果実における低いバレンセン濃度（０．２から０．６重量％）のため、これらの油からの単離は厄介である。
【０００６】
バレンセンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の取り込みにより遺伝的に修飾された微生物を利用し、バレンセンを微生物学的に調製することが提案されている。このように生産されたバレンセンシンターゼは、ＦＰＰからのバレンセンの調製に使用することができ、この変換は、単独の反応として（インビトロ）、または糖からのバレンセンの生産を最終的にもたらすより長い代謝経路の一部として（インビボ）実行され得る。
【０００７】
柑橘類由来のいくつかのバレンセンシンターゼが知られている。例えば、ＵＳ７，２７３，７３５およびＵＳ７，４４２，７８５には、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるシトラス・エックス・パラディシ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）由来のバレンセンシンターゼの発現が記載されている。さらに、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のバレンセンシンターゼが、Ｌｕｃｋｅｒら（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）６５：２６４９−２６５９頁）により記載されている。宿主生物におけるこれらのバレンセンシンターゼの発現が記載されているが、実際の酵素活性はインビトロ条件下で示されているのみである。
【０００８】
多くの論文が、インビボでのバレンセンシンターゼの活性も記載している。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００７）９７：１７−１８１頁）は、特にノックアウト変異を通じたＥＲＧ９遺伝子の不活化により主要な中間体ＦＰＰのレベルの増強のために最適化されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における、シトラス・エックス・パラディシバレンセンシンターゼ遺伝子（アクセッション番号ＡＦ４１１１２０）の発現を報告している。ＥＲＧ９変異を２１６時間補完するエルゴステロールを含有する合成最少培地における最良株の培養は、２０ｍｇ／Ｌバレンセンの生産をもたらした。Ａｓａｄｏｌｌａｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）９９：６６６−６７７頁）は、サッカロミセス・セレビシエ株におけるシトラス・エックス・パラディシバレンセンシンターゼ遺伝子（アクセッション番号ＣＱ８１３５０８；ＡＦ４１１１２０と比較して５４８個のアミノ酸のうち３個が異なる）の発現に基づく、どちらかと言えば類似したバレンセン生産系を記載している。該生産系においてＥＲＧ９遺伝子の発現は、制御可能なＭＥＴ３プロモーターとの天然ＥＲＧ９プロモーターの置換により下方制御された。有機溶媒としてのドデカンを用いる２つの液相発酵を適用する最少培地でのこの株の培養は、６０時間で３ｍｇ／Ｌバレンセンの形成をもたらした。
【０００９】
現在知られているバレンセンシンターゼは、バレンセンがＦＰＰから調製される産業的バレンセン生産プロセスに該シンターゼが適用される場合（例えば単離されたバレンセンシンターゼもしくは（透過処理された）全細胞を用いる隔絶された反応（インビトロ）において、またはさもなければ、例えば、糖からのバレンセンの生産を最終的にもたらすより長い代謝経路の一部である発酵プロセス（インビボ）のどちらかにおいて）、特に望ましくないいくつかの明白な欠点を有する。例えば、本発明者らによる内部調査は、活性型での異なる微生物（エシェリキア・コリ、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サッカロミセス・セレビシエ）におけるシトラス・エックス・パラディシ（ＣＱ８１３５０８）またはシトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（ＡＦ４４１１２４）由来のバレンセンシンターゼの過剰発現は面倒であり、バレンセンの生産率の重度の低下をもたらすことを明らかにした。同様に、Ａｓａｄｏｌｌａｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）９９：６６６−６７７頁）は、組換えサッカロミセス・セレビシエ株における低いバレンセン合成は、シトラス・エックス・パラディシバレンセンシンターゼ遺伝子の不十分な異種発現に起因することを見出した。
【００１０】
さらに、シトラス・シネンシス由来の酵素とほぼ同一であるシトラス・エックス・パラディシバレンセンシンターゼは、中性または弱アルカリ性ｐＨでＦＰＰのバレンセンへの変換を触媒するだけでなく、かなりの量のゲルマクレンＡへの変換も触媒することが見出されている（米国特許第７，４４２，７８５  Ｂ２号明細書）。
【００１１】
例えば、ｐＨ７．５でのＦＰＰとのこの酵素のインキュベーションは、形成された合計反応生成物の９５％以上を占める２つの化合物の形成をもたらし、このうち３０％がベータエレメン（ゲルマクレンＡの熱再配列生成物）であり、このうち６５％がバレンセンであった。本発明者らはさらに、インビボ条件下でも、かなりの量のゲルマクレンＡ副生成物がこの酵素により形成されることを見出した；イソプレノイド生産およびシトラス・エックス・パラディシバレンセンシンターゼ遺伝子（アクセッション番号ＣＱ８１３５０８）の保有のために最適化されたロドバクター・スフェロイデス株の培養は、形成されたセスキテルペンの総量のそれぞれ４８％および２５％においてバレンセンおよびゲルマクレンＡ（ベータエレメンとしてＧＣにより分析）の形成をもたらした。
【００１２】
ブドウ、ヴィティス・ヴィニフェラ（アクセッション番号ＡＡＳ６６３５８）由来のバレンセンシンターゼは、特異性の類似の欠如を示す。エシェリキア・コリにおける発現とこれに続くインビトロ酵素アッセイは、このシンターゼがＦＰＰを５つの微量生成物と共に（＋）−バレンセン（合計生成物の４９．５％）および（−）−７−エピ−α−セリネン（合計生成物の３５．５％）に変換することを示した（Ｌｕｃｋｅｒら  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）６５：２６４９−２６５９頁）。
【００１３】
生化学的に証明されたバレンセンシンターゼ活性を有する上記の酵素の他に、ＧｅｎＢａｎｋ核酸配列データベースは、バレンセンシンターゼとして注釈を付けられたさらに別のエントリー、すなわちペリラ・フルテスケンス変種フルテスケンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）バレンセンシンターゼ遺伝子（アクセッション番号ＡＹ９１７１９５）を含有する。しかし、文献において、この特定の推定バレンセンシンターゼについて報告されたものはないため、この活性および特異性に関する生化学的証拠は欠如している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，２７３，７３５号明細書
【特許文献２】米国特許第７，４４２，７８５号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｕｃｋｅｒら（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）６５：２６４９−２６５９頁）
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００７）９７：１７−１８１頁）
【非特許文献３】Ａｓａｄｏｌｌａｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）９９：６６６−６７７頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
故に、バレンセンの調製において使用することができる代替のバレンセンシンターゼが必要である。特に、少なくとも選択された宿主細胞において改善された発現を示す代替のバレンセンシンターゼ；少なくとも特定の条件下（中性またはアルカリ性ｐＨおよび／または代替のバレンセンシンターゼが生産されている細胞の細胞内などの）で高い酵素活性を有する代替のバレンセンシンターゼ；および／または高度に特異的である代替のバレンセンシンターゼ、特に、少なくとも特定の条件下（ほぼ中性またはアルカリ性ｐＨおよび／または代替のバレンセンシンターゼが生産されている細胞の細胞内などの）でバレンセンへのＦＰＰの変換を触媒することに関して、シトラス・エックス・パラディシ由来のバレンセンシンターゼと比較して改善された特異性を有する代替のバレンセンシンターゼが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これまで知られていなかった特定のポリペプチドがバレンセンシンターゼ活性を有すること、およびこのポリペプチドは、既知のバレンセンシンターゼの代替として機能を果たし得る触媒として使用することができることが見出された。特に、このような酵素は、バレンセンへのＦＰＰの変換を触媒することに関して、シトラス・エックス・パラディシ由来のバレンセンシンターゼと比較して改善された特異性および／または生産性を有する。
【００１８】
したがって、一態様において本発明は、配列番号２に示されたアミノ酸配列を含むバレンセンシンターゼ、またはこの機能的相同体に関し、前記機能的相同体は、配列番号２と少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバレンセンシンターゼである。前記相同体は、特に、配列番号２と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバレンセンシンターゼであり得る。
【００１９】
本発明者らは、配列番号２のアミノ酸配列を有するバレンセンシンターゼと比較して、バレンセンへのファルネシル二リン酸の変換に対する生産性が改善されたバレンセンシンターゼを提供することができることをさらに見出した。
【００２０】
したがって、本発明は特に、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼと比較して、（試験条件下で１時間当たりに形成されるバレンセンのモル量として表される）バレンセンへのファルネシル二リン酸の変換に対する向上した生産性を有するバレンセンシンターゼに関する。
【００２１】
さらに、本発明は特に、配列番号３において「Ｘ」印が付いた少なくとも１つの位置が、配列番号２における対応する位置とは異なるという条件で、配列番号３により表されるアミノ酸配列を含むバレンセンシンターゼに関する。好ましい実施形態において、前記バレンセンシンターゼは、この配列が、配列番号２と比較して、アミノ酸配列における少なくとも１つの違いを含むという条件で、配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む。
【００２２】
さらに、本発明は、本発明によるバレンセンシンターゼに対する特異的結合親和性を有する抗体に関する。本発明による抗体は、故に、本発明によるバレンセンシンターゼに特異的に結合する。
【００２３】
さらに、本発明は、本発明のバレンセンシンターゼの断片に対して惹起される抗体と免疫学的交差反応性を示すタンパク質、特にバレンセンシンターゼ活性を有するようなタンパク質に関する。
【００２４】
免疫学的交差反応性は、バレンセンシンターゼ活性を有する本発明による単離されたポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに対して惹起される抗体、または該エピトープと反応する抗体を用いてアッセイすることができる。モノクローナルまたはポリクローナルのどちらであってもよい抗体は、例えばＨｕｄｓｏｎら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版（１９８９）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓに記載されているような、当技術分野で知られた方法により生産することができる。免疫化学的交差反応性は、当技術分野で知られたアッセイを用いて判定することができ、この例は、例えばＨｕｄｓｏｎら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版（１９８９）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓに記載されているようなウェスタンブロッティングである。
【００２５】
本発明は、さらに、本発明によるバレンセンシンターゼをコードする核酸配列を含む核酸、特に、配列番号２、３もしくは４に示されたアミノ酸配列を含むバレンセンシンターゼをコードする核酸配列またはこの機能的相同体を含む核酸、または前記コード配列に対して相補的な核酸配列を含む核酸に関する。特に、核酸は、配列番号１に示された核酸配列、および配列番号１に示された核酸配列と少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、本発明によるバレンセンシンターゼをコードする他の核酸配列、または配列番号３もしくは４に示された配列を含むバレンセンシンターゼをコードする核酸配列を含む核酸、それぞれこれらに相補的な核酸から選択され得る。本発明によるバレンセンシンターゼをコードする前記他の核酸配列は、以下、機能的類似体と呼ばれ得る。
【００２６】
本発明はまた、低ストリンジェンシー条件下、好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは高ストリンジェンシー条件下および最も好ましくは極めて高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１に示された核酸配列とハイブリダイズする、本発明によるバレンセンシンターゼをコードする核酸配列、または配列番号３もしくは４に示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸、それぞれこれらに相補的な核酸にも関する。
【００２７】
ハイブリダイゼーション実験は、当業者に十分に利用可能であるさまざまな方法により行うことができる。これらのさまざまな方法の中から選択するための一般的なガイドラインは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、（２００１）に見出すことができる。
【００２８】
ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーで意味されるのは、実際のハイブリダイゼーションステップおよび洗浄ステップから成るハイブリダイゼーションが行われる条件である。洗浄ステップは、例えばニトロセルロースフィルターに固定化された標的核酸とハイブリダイズしない核酸を洗い流すのに使用される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、例えば洗浄溶液の塩分濃度を変えること、および／または洗浄ステップが行われる温度（洗浄温度）を変えることにより変えることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄溶液中の塩分濃度を低下させること、または洗浄温度を上昇させることにより高まる。本出願の目的のため、低、中、高および極めて高いストリンジェンシー条件は、特に次の条件およびこの同等物である：ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣストック溶液は、水中３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸三ナトリウムである）、５×デンハルト試薬（１００×デンハルト試薬は、水中２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ画分Ｖ、２０％（ｗ／ｖ）フィコール４００および２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンである）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬ変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む水溶液中で、約４５℃で約１２時間行われる。室温で２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、２回の連続５分の洗浄ステップによる非結合核酸プローブの除去後、室温で０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、２回の連続５分の洗浄ステップの施行が低ストリンジェンシーの例であり、４２℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、２回の連続１５分の洗浄ステップの施行が中ストリンジェンシーの例であり、５５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、２回の連続１５分の洗浄ステップの施行が高ストリンジェンシーの例であり、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、２回の連続３０分の洗浄ステップが極めて高いストリンジェンシーの例である。
【００２９】
本発明によるバレンセンシンターゼまたは核酸は、天然の化合物または天然の供給源から単離された化合物の断片であってもよく、化学的もしくは酵素的に合成された化合物または化合物の断片、または組換え細胞（化合物もしくは化合物の断片が存在し得、または化合物もしくは化合物の断片が単離され得る）において生産された化合物もしくは化合物の断片であってもよい。
【００３０】
本発明は、さらに、本発明による核酸を含む発現ベクターに関する。
【００３１】
本発明は、さらに、本発明による発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３２】
本発明は、さらに、本発明によるバレンセンシンターゼの存在下でＦＰＰをバレンセンに変換することを含む、バレンセンを調製するための方法に関する。ＦＰＰの４つの異なる幾何異性体、すなわち２Ｅ，６Ｅ−ＦＰＰ、２Ｚ，６Ｅ−ＦＰＰ、２Ｅ，６Ｚ−ＦＰＰおよび２Ｚ，６Ｚ−ＦＰＰが存在し得る。良好な結果は２Ｅ，６Ｅ−ＦＰＰで得られているが、原則としてＦＰＰの任意の他の異性体が、本発明による酵素に適切な基質となり得る。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明による方法において調製されたバレンセンがノートカトンに変換される、ノートカトンを調製するための方法に関する。
【００３４】
本発明は、さらに、バレンセンシンターゼの生産をもたらす条件下で、本発明による宿主細胞を培養すること、および宿主細胞からバレンセンシンターゼを回収することを含む、本発明によるバレンセンシンターゼを生産するための方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明に従って、異なる生物において良好な収量でバレンセンシンターゼを発現させることができることが見出された。バレンセンシンターゼ（配列番号２により表される）は、エシェリキア・コリおよびサッカロミセス・セレビシエ（パン酵母）において十分に発現されることが見出された。また、本発明によるバレンセンシンターゼがイソプレノイド生産宿主生物（ロドバクター・スフェロイデス）において発現される本発明による方法では、バレンセン生産は、柑橘類バレンセンシンターゼが発現される比較方法より高いことも見出された。
【００３６】
配列番号２によるバレンセンシンターゼについて、該バレンセンシンターゼは、特に、インビトロアッセイにおいて、または本発明によるバレンセンシンターゼおよび柑橘類バレンセンシンターゼをそれぞれ生産するように遺伝的に修飾された宿主細胞の細胞内でバレンセンが合成される方法において、中性ｐＨまたはおよそ中性のｐＨで、バレンセン合成に対して柑橘類由来のバレンセンシンターゼより特異的であることが見出された。初期結果は、同一条件下で、本発明の新規の酵素で形成された主な副生成物（ゲルマクレンＡ）の量は、著しくより低いこと（すなわち柑橘類バレンセンシンターゼでの２：１と比較して４：１のモル比バレンセン：ゲルマクレンＡ）を示している。さまざまな宿主細胞は、７．０−８．５のｐＨなどの中性またはわずかにアルカリ性の細胞内ｐＨを有すると考えられるため、理論に縛られることなく、中性または弱アルカリ性ｐＨでのバレンセン合成の触媒に対する高い特異性は、バレンセンが細胞内で調製される方法に特に望ましいとみなされることが考えられる（細菌の細胞内ｐＨ値については、例えば、Ｂｏｏｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９８５）４９：３５９−３７８頁を参照のこと）。例えば、エシェリキア・コリ細胞が５．５から８．０の範囲のｐＨ値に曝露された場合、細胞内ｐＨは７．１から７．９の間であった（Ｏｌｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２）６８：４１４５−４１４７頁）。これは、細胞内でも、本発明によるバレンセンシンターゼのバレンセンの合成に対する改善された特異性を説明し得る。
【００３７】
本発明によるバレンセンシンターゼの生産性は、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼの生産性の少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍または少なくとも２．５倍であり得る。生産性は、最大１００倍、またはさらにより高くなり得る。特定の実施形態において、生産性は最大１０倍高く、特に最大５倍高く、より特に最大４倍高くなり得る。
【００３８】
配列番号２によるバレンセンシンターゼと比較して生産性が改善された本発明によるバレンセンシンターゼは、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼと比較して、宿主細胞における向上した特異的生産性、向上した安定性（酵素の失活速度の低下）、向上した生成物特異性（ゲルマクレンＡへのファルネシル二リン酸の変換と比べて）または増加した発現を特に有することができる。
【００３９】
配列番号２によるバレンセンシンターゼと比較して向上した生産性を有するバレンセンシンターゼの特異的生産性は、酵素の量当たり１時間当たりに形成されたバレンセンのモル量として表される配列番号２によるバレンセンシンターゼの特異的生産性と通常はほぼ同じであり、またはより高い。好ましくは特異的生産性は、配列番号２によるバレンセンシンターゼの特異的生産性の少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、特に少なくとも２．０倍、より特に少なくとも２．５倍である。上限は重要ではない。向上した生産性を有するバレンセンシンターゼの特異的生産性は、配列番号２のバレンセンシンターゼの特異的生産性の最大１００倍であり得、より高くなり得る。特定の実施形態において、特異的生産性は、配列番号２により表されるバレンセンシンターゼの最大１０倍であり、特に５倍以下であり、より特に４倍以下である。
【００４０】
（本明細書に規定された試験条件下で）ファルネシル二リン酸から形成されるゲルマクレンＡに対するファルネシル二リン酸から形成されるバレンセンのモル比として表される生成物特異性は、通常は６以上であり、より好ましくは１０以上であり、より好ましくは少なくとも１３であり、特に少なくとも１５である。生成物特異性は、最大１０００であり得、１０００より高くなり得る。特定の実施形態において、生成物特異性は１００以下であり、特に３０以下であり、より特に２５以下でありまたは２２以下である。
【００４１】
本明細書で使用されるとき「生産性」は、単位時間当たり、より詳細には１時間当たりに基質（より詳細にはファルネシル二リン酸）から形成される反応生成物（より詳細にはバレンセン）のモル量として定義される。本発明によるバレンセンシンターゼの「生産性」は、標準的な制御可能な条件下で、好ましくは実施例２に記載されたインビトロアッセイにおいて判定される。この目的のため、本発明によるバレンセンシンターゼは、３０℃で余剰のファルネシル二リン酸とインキュベートされ、ｐＨ７．０−７．５で２時間緩衝され、この後、反応は酢酸エチルによる抽出により停止された。バレンセンシンターゼは、清澄化溶解物の形態でアッセイされるため、リン酸塩化を阻害し故にファルネシル二リン酸の望まれない加水分解を防ぐためにオルトバナジン酸Ｎａが添加された。実施例２に示された反応条件（清澄化溶解物の量、ファルネシル二リン酸の量および反応時間を含む）は、形成された生成物の量が溶解物の量に依然として線形に依存するように選択された。
【００４２】
本明細書で使用されるときバレンセン生産に関する「特異的生産性」は、バレンセンシンターゼの量当たりの単位時間（１時間）当たりに基質ファルネシル二リン酸から形成されるバレンセンのモル量として定義される。特異的生産性は故に、バレンセンシンターゼの量当たりの上記に定義された「生産性」であり、故に、「生産性」を判定するのに使用される酵素調製物中のバレンセンシンターゼの種々の量の存在を補うことが意味される。純粋バレンセンシンターゼ調製物がアッセイされる場合、標準的な総タンパク質定量化法（例えばＢｒａｄｆｏｒｄ法［Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｍ．Ｍ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６、７２：２４８−２５４頁］）が、バレンセンシンターゼの量を定量化するのに使用され得る。非純粋バレンセンシンターゼ調製物がバレンセン生産性判定に使用される場合、バレンセンシンターゼと調製物中に存在する他のタンパク質を区別する方法が適用されなければならない。実施例２は、蛍光色素によるタンパク質バンドの染色を介した定量化とこれに続くイメージングと組み合わされた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質の分離に基づくこのような方法を記載する。
【００４３】
本明細書で使用されるとき「安定性」は、基質ファルネシル二リン酸を反応生成物バレンセンに変換するのに適用される条件下でのバレンセンシンターゼの安定性を意味する、「動作安定性」として定義される。２時間の反応時間が、実施例２に記載された「生産性」判定法において使用されるため、この方法はまた、適用されたインビトロ条件下での本発明によるバレンセンシンターゼの動作安定性も本質的に判定する。この理由は、不安定な酵素は、より安定な酵素より急速に作用するのをやめ、故により少ない生成物形成をもたらし、故に生産性の低下をもたらすためである。
【００４４】
本明細書で使用されるとき「生成物特異性」は、実施例２に記載された標準的生産性アッセイにおいて、ファルネシル二リン酸から形成されるバレンセン対ゲルマクレンＡのモル比として定義される。本発明によるバレンセンシンターゼがかなりの量の他のセスキテルペン様副生成物を生産する場合、生成物特異性は、実施例２に記載された標準的生産性アッセイにおいて、ファルネシル二リン酸から形成されるバレンセン対他のセスキテルペンの合計のモル比として定義される。
【００４５】
本明細書で使用されるとき「宿主細胞における発現」は、特定の宿主細胞において形成されたタンパク質の総量と比べた、この宿主細胞において形成された本発明によるバレンセンシンターゼの量として定義される。特定のタンパク質の発現レベルの判定に典型的に使用される方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける（例えば清澄化溶解物中に）存在する全てのタンパク質の分離と、これに続くタンパク質の染色、およびこの後の定量化に基づく。発現レベル（％での）は、次いで、１００％を乗じた、ゲル上の全てのバンドの強度の合計と比較した目的とするタンパク質に属するバンドの相対強度として定義される。
【００４６】
本発明によるバレンセンシンターゼは、清澄化溶解物として分析されたという事実のため、「特異的生産性」および「宿主細胞における発現」は両方とも、標準タンパク質、すなわち配列番号２のバレンセンシンターゼと比べて判定された。
【００４７】
用語「または」は本明細書で使用されるとき、他に特に規定のない限り「および／または」として定義される。
【００４８】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は本明細書で使用されるとき、他に特に規定のない限り「少なくとも１つ」として定義される。
【００４９】
単数形での名詞（例えば化合物、添加物等）に言及する場合、複数が含まれることが意味される。
【００５０】
本明細書で互換的に使用されている用語ファルネシル二リン酸およびファルネシルピロリン酸（両方ともＦＰＰとして略される）は、化合物３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−ドデカトリエン−１−イルピロホスフェートを指し、この化合物の全ての既知の異性体を含む。
【００５１】
本明細書で使用されるとき組換え細胞、ベクター、核酸等との関連において用語「組換え」は、細胞、ベクター、核酸等に自然発生しない核酸、および／またはこの同じ位置に自然発生しない核酸を含有する、この細胞、ベクター、核酸等を指す。一般に、前記核酸は、組換えＤＮＡ法を用いてこの株（細胞）に導入されている。
【００５２】
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質に関して使用される場合、用語「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、核酸またはタンパク質が存在する生物、細胞、ゲノムもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部として自然発生しない核酸またはタンパク質、または、核酸またはタンパク質が天然には見出される細胞またはゲノム配列もしくはＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列中の位置（複数可）とは異なる、細胞またはゲノム配列もしくはＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列中の位置（複数可）に見出される核酸またはタンパク質を指す。異種核酸またはタンパク質は、これらが導入される細胞に内因性ではないが、別の細胞から得られている、または合成的もしくは組換え的に生産されている。必ずしもではないが、一般にこのような核酸は、ＤＮＡが発現される細胞により通常は生産されないタンパク質をコードする。
【００５３】
特定の宿主細胞に内因性ではないが、この天然の形態から例えばＤＮＡシャッフリングの使用を通じて修飾された遺伝子もまた、異種と呼ばれる。用語「異種」は、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含む。故に、用語「異種」は、細胞に対して外来もしくは異種であるＤＮＡセグメントを指してもよく、または細胞に同種であるが、該セグメントが通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置および／もしくは数にあるＤＮＡセグメントを指してもよい。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを生じるように発現される。「相同」ＤＮＡ配列は、これが導入される宿主細胞と天然に関連したＤＮＡ配列である。
【００５４】
発現される細胞に対し異種または外来として当業者が認識する任意の核酸またはタンパク質は、用語異種核酸または異種タンパク質により本明細書に包含される。
【００５５】
別のタンパク質またはペプチドと比較した（特に配列番号２に示される配列におけるアミノ酸から成るポリペプチドと比較した）タンパク質またはポリペプチドに関する用語「修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」、「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「変異した（ｍｕｔａｔｅｄ）」、「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」または「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」は、本明細書で使用されるとき、修飾タンパク質またはポリペプチドが、比較されるタンパク質またはポリペプチド、例えば野生型タンパク質／ポリペプチドと比較して、アミノ酸配列に少なくとも１つの違いを有することを示すために使用される。該用語は、修飾／変異タンパク質が、これらのアミノ酸をコードする核酸の変異誘発により、または別の方法での（例えば人工遺伝子合成方法論を用いた）ポリペプチド／タンパク質の修飾により実際に得られたかどうかに関わりなく使用される。変異誘発は、当技術分野でよく知られた方法であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（２００１）に記載された、ＰＣＲによるまたはオリゴヌクレオチド媒介変異誘発を介した、例えば部位特異的変異誘発を含む。遺伝子に関する用語「修飾された」、「修飾」、「変異した」、「変異」または「バリアント」は、本明細書で使用されるとき、この遺伝子のヌクレオチド配列またはこの制御配列における少なくとも１つのヌクレオチドが、比較されるヌクレオチド配列、例えば野生型ヌクレオチド配列（配列番号１などの）とは異なることを示すのに使用される。該用語は、修飾／変異ヌクレオチド配列が、変異誘発により実際に得られたかどうかに関わりなく使用される。
【００５６】
修飾／変異は、特定の場合に、異なるヌクレオチドによるアミノ酸それぞれのヌクレオチドの置換、アミノ酸それぞれのヌクレオチドの欠失またはアミノ酸それぞれのヌクレオチドの挿入であってもよい。
【００５７】
用語「オープンリーディングフレーム」および「ＯＲＦ」は、コード配列翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間にコードされたアミノ酸配列を指す。用語「開始コドン」および「終結コドン」は、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞれ開始および鎖終結を規定する、コード配列における３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）を指す。
【００５８】
用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連した核酸の任意のセグメントを指すのに広く使用される。故に、遺伝子は、コード配列および／またはこの発現に必要とされる制御配列を含む。例えば、遺伝子は、ｍＲＮＡもしくは機能的ＲＮＡを発現し、または特定のタンパク質をコードし、および制御配列を含む核酸断片を指す。遺伝子はまた、例えば他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含む。遺伝子は、目的とする供給源からのクローニングまたは既知のもしくは予測される配列情報からの合成を含むさまざまな供給源から得ることができ、および所望のパラメーターを有するように設計された配列を含んでもよい。
【００５９】
用語「キメラ遺伝子」は、１）天然には一緒に見出されない制御配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列、または２）天然には隣接しないタンパク質の部分をコードする配列、または３）天然には隣接しないプロモーターの部分を含有する任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列を含んでもよく、または同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる形に配列された制御配列およびコード配列を含んでもよい。
【００６０】
本明細書で使用されるときトランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物に対する用語「トランスジェニック」は、生物または細胞に自然発生しない核酸を含有し、および組換えＤＮＡ法を用いて核酸がこの生物または細胞に導入された（すなわち生物または細胞自体、または生物の先祖もしくは細胞が単離された生物の先祖生物に導入された）、この生物または細胞（細胞が生物それ自体であり得、または細胞が単離された多細胞生物の細胞であり得る）を指す。
【００６１】
「トランス遺伝子」は、形質転換によりゲノムに導入された、好ましくは安定に維持される遺伝子を指す。トランス遺伝子には、例えば、形質転換される特定の植物の遺伝子に対し異種または相同のどちらかである遺伝子が含まれ得る。さらに、トランス遺伝子は、非天然生物に挿入される天然遺伝子、すなわちキメラ遺伝子を含み得る。用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置における天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物において通常は見出されないが遺伝子導入により導入される遺伝子を指す。
【００６２】
「形質転換」および「形質転換すること」は、本明細書で使用されるとき、挿入に使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、コンジュゲーション、ｆ接合（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）またはエレクトロポレーションに関わりなく、宿主細胞への異種ヌクレオチド配列の導入を指す。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えばプラスミドとして維持され得、あるいは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【００６３】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードし、および非コード配列を除外するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。コード配列は、「連続したコード配列」（すなわちｃＤＮＡにおけるようなイントロンを欠く）を構成し得、またはコード配列は、適切なスプライス部位により結合された１つ以上のイントロンを含み得る。「イントロン」は、一次転写産物に含有されるＲＮＡであるが、細胞内でのＲＮＡの切断および再ライゲーションを通じて除去されて、タンパク質に翻訳され得る成熟ｍＲＮＡを作るＲＮＡの配列である。
【００６４】
「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、および関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列には、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化シグナル配列が含まれる。制御配列には、天然配列および合成配列、ならびに合成配列および天然配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。上述の通り、用語「適切な制御配列」は、プロモーターに限定されない。
【００６５】
制御配列の例には、プロモーター（転写プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーターなどの）、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写ならびに翻訳開始および翻訳終結を制御する適切な配列が含まれる。制御配列が本発明のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列に機能的に関連する場合、核酸配列は「作動可能に連結」される。
【００６６】
各制御配列は、異種および相同制御配列から独立に選択されてもよい。
【００６７】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび適正な転写に必要とされる他の因子に対する認識を提供してコード配列の発現を制御する、このコード配列の通常は上流（５’）のヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」には、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始の部位を規定するのに役立つ他の配列を含む短いＤＮＡ配列であり、調節エレメントが発現の制御のために付加される最小プロモーターが含まれる。「プロモーター」はまた、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができる、最小プロモータープラス調節エレメントを含むヌクレオチド配列も指す。このタイプのプロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントから成り、後者のエレメントは多くの場合、エンハンサーと呼ばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができる、およびプロモーターの生来のエレメントであってもよく、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであってもよいＤＮＡ配列である。エンハンサーは、両方の配向（正常または反転）で作動することができ、プロモーターから上流または下流のどちらかに動かされた場合でさえ機能することができる。エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントは両方とも、この効果を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を結合する。プロモーターは、この全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。プロモーターはまた、生理的または発生条件に応じて転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列も含有してもよい。
【００６８】
用語「核酸」は本明細書で使用されるとき、一本鎖型または二本鎖型のどちらかでのデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマー、すなわちポリヌクレオチドへの言及を含み、他に特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）に類似した形で一本鎖核酸にハイブリダイズするという点で、天然ヌクレオチドの本質的性質を有する既知の類似体を包含する。ポリヌクレオチドは、天然または異種の構造遺伝子または調節遺伝子の完全長またはサブ配列であってもよい。他に特に示されない限り、該用語は、規定された配列およびこの相補的配列への言及を含む。故に、安定性のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書で意図されるとき、「ポリヌクレオチド」である。さらに、ほんの２例を挙げると、イノシンなどの稀な塩基またはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、該用語が本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」である。当業者に知られた多くの有用な目的に適う非常にさまざまな修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われていることが理解される。用語「ポリヌクレオチド」は、これが本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびに、とりわけ単純および複雑細胞を含む、ウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学形態を包含する。
【００６９】
ポリペプチドをコードする本発明のあらゆる核酸配列は、遺伝コードへの言及により、核酸のあらゆる可能性のあるサイレントバリエーションを記述する。用語「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、用語「保存的に修飾されたバリアント」は、遺伝コードの縮重のため、同一のアミノ酸配列またはアミノ酸配列の保存的に修飾されたバリアントをコードするような核酸を指す。用語「遺伝コードの縮重」は、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードするという事実を指す。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。故に、アラニンがコドンにより規定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載された対応するコドンのいずれにも変えられ得る。このような核酸バリエーションは「サイレントバリエーション」であり、保存的に修飾されたバリエーションの一種を表す。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用されてアミノ酸残基のポリマーを指す。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。天然に存在するアミノ酸のこのような類似体の本質的性質は、タンパク質に組み込まれた場合、同じタンパク質であるが天然に存在するアミノ酸から完全に成る抗体に対し、このタンパク質が特異的に反応することである。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はまた、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化を含む修飾も含むが、これらに限定されない。
【００７０】
本出願の文脈内では、オリゴマー（オリゴヌクレオチド、オリゴペプチドなどの）は、ポリマーの群の一種とみなされる。オリゴマーは、比較的低い数の単量体単位、一般に２−１００、特に６−１００を有する。
【００７１】
「発現カセット」は本明細書で使用されるとき、終結シグナルに作動可能に連結された目的とするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ配列を意味する。発現カセットはまた、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要とされる配列も典型的に含む。コード領域は通常、目的とするタンパク質をコードするが、センスまたはアンチセンス方向で目的とする機能的ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡもコードすることができる。目的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットは、この成分の少なくとも１つが他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する、キメラであってもよい。発現カセットはまた、自然発生ではあるが異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、または宿主細胞が多少の特定の外部刺激に曝露された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織または器官または発生段階に特異的であることもできる。
【００７２】
用語「ベクター」は本明細書で使用されるとき、標的化細胞の形質転換を指示するように設計された遺伝物質を含む構築物を指す。ベクターは、核酸カセット中の核酸が転写され得、および必要な場合、形質転換細胞に翻訳され得るように位置的および連続的に配向された、すなわち、他の必要なエレメントと作動的に連結された複数の遺伝的エレメントを含有する。
【００７３】
特に、ベクターは、ウイルスベクター、（バクテリオ）ファージ、コスミドまたはプラスミドの群から選択することができる。ベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはアグロバクテリウムバイナリーベクターであってもよい。ベクターは、二本鎖または一本鎖の線形または環状形態であってもよく、自己伝播性（ｓｅｌｆ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ）または可動性であってもなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込みまたは染色体外に存在すること（例えば複製起点を有する自己複製プラスミド）により、原核または真核宿主生物を形質転換することができる。詳細には、含まれるのはシャトルベクターであり、これは、放線菌および関連種、細菌ならびに真核生物（例えば高等植物、哺乳動物、酵母または真菌）細胞から選択することができる２つの異なる宿主生物において、天然にはまたは設計により複製することができるＤＮＡビヒクルを意味する。好ましくはベクター中の核酸は、微生物（例えば細菌）細胞もしくは植物細胞などの宿主細胞における転写のための適切なプロモーター、または他の調節エレメントの制御下にあり、およびこれらに作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであってもよい。ゲノムＤＮＡの場合には、これは、自身のプロモーターまたは他の調節エレメントを含有してもよく、およびｃＤＮＡの場合には、これは、宿主細胞での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあってもよい。
【００７４】
本発明による核酸を含有するベクターは、当技術分野でそれ自体知られた方法論に基づいて調製することができる。例えば、転写または翻訳制御核酸配列などの適切な調節エレメントに作動可能に連結された本発明によるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列が使用されてもよい。
【００７５】
用語「ベクター」は本明細書で使用されるとき、標準的クローニング作業のためのベクター（「クローニングベクター」）、ならびに（常染色体）発現ベクターおよび宿主細胞の染色体への組み込みに使用されるクローニングベクター（「組み込みベクター」）のような、より特化されたタイプのベクターへの言及を含む。
【００７６】
「クローニングベクター」は、外来ＤＮＡ配列が、ベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく、判別可能な方法で挿入され得る１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適したマーカー遺伝子を典型的には含有する。
【００７７】
用語「発現ベクター」は、目的とするポリペプチドの転写を提供する追加の核酸セグメントの制御下で（すなわち該セグメントに作動可能に連結された）目的とするポリペプチドをコードするセグメントを含む、ＤＮＡ分子（線形または環状）を指す。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含んでもよく、場合によって、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含んでもよい。発現ベクターは、一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し、または両方のエレメントを含有してもよい。特に発現ベクターは、５’から３’方向におよび作動可能に連結された、（ａ）宿主生物により認識される転写および翻訳開始領域、（ｂ）目的とするポリペプチドのコード配列、ならびに（ｃ）宿主生物により認識される転写および翻訳終結領域を含むヌクレオチド配列を含む。「プラスミド」は、微生物のゲノムに組み込まれない、天然には通常、環状である自己複製染色体外ＤＮＡを指す。
【００７８】
「組み込みベクター」は、微生物のゲノムに組み込むことができる、および目的とするポリペプチドをコードする遺伝子の安定な継承を提供するＤＮＡ分子（線形または環状）を指す。組み込みベクターは、目的とするポリペプチドの転写を提供する追加の核酸セグメントの制御下で（すなわち、該セグメントに作動可能に連結された）目的とするポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、１つ以上のセグメントを一般に含む。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含んでもよく、ならびに通常は相同的組換えのプロセスにより、標的細胞のゲノムへの目的とする遺伝子の取り込みを駆動する１つ以上のセグメントを含んでもよい。典型的には、組み込みベクターは、標的細胞に移入され得るものであるが、この生物において非機能性であるレプリコンを有するものである。目的とする遺伝子を含むセグメントの組み込みは、適切なマーカーがこのセグメント内に含まれる場合に選択することができる。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、このように記載された成分が意図された形で機能することを可能にする関係にある並置を指す。別の制御配列および／またはコード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の転写および／または発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲートされる。一般に、作動可能に連結されたは、連結されている核酸配列が隣接しており、ならびに、２つのタンパク質コード領域を連結するために必要な場合、隣接しおよび同じリーディングフレームにあることを意味する。
【００８０】
用語「バレンセンシンターゼ」は、ファルネシル二リン酸からのバレンセンの形成において触媒活性を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドを含む他の部分に関して本明細書で使用される。このような他の部分の例には、１つ以上の他のポリペプチドを有する前記ポリペプチドの複合体、前記ポリペプチドの他の複合体（例えばメタロタンパク質複合体）、前記ポリペプチドおよび別の有機部分を含む巨大分子化合物、担体物質等に結合された前記ポリペプチドが含まれる。バレンセンシンターゼは、この天然の環境において、すなわちこれが生産された細胞内で、またはこれを生産する細胞によりこれが排出された培地において提供することができる。バレンセンシンターゼはまた、該ポリペプチドを生産した供給源から分離して提供されてもよく、標識部分で標識された担体等への付着により操作されてもよい。
【００８１】
用語、配列の「機能的相同体」、または手短に「相同体」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上のアミノ酸が、置換、欠失、付加および／または挿入されているという条件で、前記特定の配列を含むポリペプチド、ならびに基質変換に対する同じ酵素機能性を（質的に）有するポリペプチド、すなわち、ファルネシル二リン酸からのバレンセンの形成において触媒活性を有する配列番号２を有する配列の相同体を指す。実施例２において、ポリペプチドまたはポリペプチドを含む部分が、ファルネシル二リン酸からのバレンセンの形成において触媒活性を有するかどうかを検証するのに適切である試験が記載される（「バレンセンシンターゼ変異体の（特異的）生産性および生成物特異性の判定」）。さらに、当業者は、本発明により包含される同等のヌクレオチド配列はまた、低条件、中程度の条件および／またはストリンジェントな条件下で、この特許請求の範囲の文字通りの範囲内にあるヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力により定義することもできることを認識する。
【００８２】
好ましい本発明によるバレンセンシンターゼは、「バレンセンシンターゼ変異体の（特異的）生産性および生成物特異性の判定」−下記の実施例２で本明細書に記載された試験（本発明によるバレンセンシンターゼを含有する清澄化溶解物を用いる；しかし、同じ試験設定は、精製ポリペプチドを用いて適用することもできる）を用いて、ｐＨ７で判定された場合に、少なくとも３：１、特に少なくとも４：１のモル比バレンセン対ゲルマクレンＡ（既知のバレンセンシンターゼ触媒反応において形成された既知の副生成物）として表される、バレンセン形成の触媒に対する特異性を有する。前記比は、無限（１：０、すなわち検出可能な量の形成されたゲルマクレンＡがない）、または最大１００：１、または最大１０：１または最大５：１であり得る。
【００８３】
配列同一性、相同性または類似性は、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上の核酸配列間の関係（これらの配列を比較して判定された）として本明細書では定義される。通常、配列同一性または類似性は、配列の全長にわたって比較されるが、しかし、互いに整列された配列の一部についてのみ比較することもできる。当技術分野において、「同一性」または「類似性」は、ポリペプチド配列間または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する（このような配列間の一致により判定される場合であり得るとき）。配列同一性は本明細書で使用されるとき、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアライメントアルゴリズム「Ｎｅｅｄｌｅ」により判定された値である。特に、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが、「最長同一性」を計算するＮＯＢＲＩＥＦオプション（ＮＯに対する「Ｂｒｉｅｆ同一性および類似性」）を用いて使用され得る（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ−Ｒｉｃｅ，Ｐ．ら  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）１６：２７６−２７７頁；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。
【００８４】
２つの整列された配列間の同一性、相同性または類似性は、以下のように計算される：アライメント中のギャップの合計数を減算後、両方の配列における同一アミノ酸を示すアライメント中の対応する位置の数をアライメントの全長で除す。アミノ酸配列のアライメントについて、初期設定パラメーターは：マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；オープンギャップペナルティー＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。核酸配列のアライメントについて、初期設定パラメーターは：マトリックス＝ＤＮＡｆｕｌｌ；オープンギャップペナルティー＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。手元の配列番号２によるバレンセンシンターゼまたは配列番号１による核酸と、前記バレンセンシンターゼの機能的相同体の間の相違は、例えば分子進化または合理的設計などの当業者に知られた生物学的技法により、または当技術分野で知られた変異誘発法（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定向進化、遺伝子組換え等）を用いて、例えばバレンセンシンターゼまたは核酸の特性を改善するために（例えば発現の改善）、行われた修飾の特に結果である可能性がある。バレンセンシンターゼのまたは核酸の配列は、１つ以上の天然に存在するバリエーションの結果として、それぞれ配列番号２および配列番号１の配列と比較して変更され得る。このような天然の修飾／バリエーションの例は、グリコシル化（「翻訳後修飾」としてより広く定義された）における違い、選択的スプライシングによる違い、および単一核酸多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）である。核酸は、配列番号２のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸が異なるポリペプチドをコードするように修飾することができ、その結果、核酸は、配列番号２と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含むポリペプチド（バレンセンシンターゼ活性を依然として有する）をコードする。さらに、人工遺伝子合成（合成ＤＮＡ）が使用されてもよい。さらに、例えばＷＯ  ２００８／０００６３２に記載された方法、またはＤＮＡ２．０、ＧｅｎｅａｒｔおよびＧｅｎＳｃｒｉｐｔのような商業的ＤＮＡ合成企業により提供された方法に基づき、コドン最適化またはコドン対最適化が使用されてもよい。
【００８５】
本発明のポリペプチドと天然には関連しない適切なシグナルペプチドをコードする１つ以上の核酸配列が、（発現）ベクターに取り込まれてもよい。例えば、シグナルペプチドリーダーのＤＮＡ配列は、本発明のポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻訳されるように、本発明の核酸配列にインフレームで融合することができる。シグナルペプチドの性質に応じて、発現されたポリペプチドは種々に標的化される。意図された宿主細胞において機能性である分泌シグナルペプチドは、例えば、発現されたポリペプチドの細胞外分泌を増強する。他のシグナルペプチドは、発現されたポリペプチドを、葉緑体、ミトコンドリアおよびペルオキシソームのような特定のオルガネラに導く。シグナルペプチドは、意図されたオルガネラへのまたは細胞からの輸送時に、ポリペプチドから切断することができる。配列番号２によるポリペプチドまたはこの相同体のアミノまたはカルボキシル末端で、追加のペプチド配列の融合を提供することができる。
【００８６】
本発明者らは、配列番号２によるバレンセンシンターゼとは異なる、および向上した生産性を有する、本発明によるさまざまなバレンセンシンターゼを見出した。本発明によるバレンセンシンターゼは、１つのアミノ酸位置での修飾のみを含有するという点で、または２つ以上の修飾を含有するという点で、異なり得る。１つ以上の修飾は、特に１つ以上の置換であってもよい。１つ以上のアミノ酸がないこともあり得る。例えば、配列番号２の１−１５位または１−１６位の１つ以上のアミノ酸がない場合がある（ポリペプチドのＮＨ２末端から開始する残基番号付け）。
【００８７】
配列番号２のバレンセンシンターゼと比較して、生産性が改善されたバレンセンシンターゼ、特に配列番号２のバレンセンシンターゼの機能的相同体は、バレンセンシンターゼのさまざまな位置に修飾を含むことができる。修飾は、バレンセンシンターゼの第１のシェル位置、もしくはバレンセンシンターゼの第２のシェル位置、またはバレンセンシンターゼのより遠くの部分（基質結合部位から相対的に）に存在してもよい。用語「第１のシェルおよび第２のシェル」位置は、当技術分野で一般に知られている。
【００８８】
特に、アミノ酸が、バレンセンシンターゼの第１のシェル、第２のシェルまたはより遠くの部分の一部を形成するかどうかは、配列番号２のモデル構造を用いて判定することができる。このようなモデル構造は、分子モデリングパッケージＹＡＳＡＲＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン１１．２．１８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ（「ＹＡＳＡＲＡモデル」）における日常的に利用可能な相同性モデリングにおいて調製された。モデリングに使用されたテンプレートは、Ｎｏｅｌ  Ｊ．Ｐ．ら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）５：３７７−３９２頁により公表されているような、（２−シス、６−トランス）−２−フルオロファルネシル二リン酸（２Ｆ−ＦＰＰ）と複合体化されたニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の５−エピ−アリストロチェンシンターゼの構造であった（座標：ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｍ０２）。ＹＡＳＡＲＡプログラムへのこのテンプレートのロード後、プログラムのモデリングスピードを「スロー」に設定し、ならびに最大テンプレートおよび１テンプレート当たりの最大アライメントを１に設定して、相同性モデリングランが実行された。他の設定は、プログラムの初期設定で維持された。
【００８９】
第１のシェル位置は、モデル構造において結合された２Ｆ−ＦＰＰの原子の７．５オングストローム以内に少なくとも１つの非水素側鎖または骨格原子を有するアミノ酸残基として定義される。配列番号２と比較して、第１のシェルにおける修飾は、好ましくは可変の第１のシェル位置に存在する。これらは、配列番号２の３０１、３０３、３０７、３１０、３３１−３３７、３４１、４０９、４１３、４１６、４２０、４３５、４３７−４４１、４４４、４７６、４７９、４８１−４８４、４８６、４８７、４９１、５５２、５５３、５５６、５５７、５６０、５６９および５７４位（と整列する）位置である。
【００９０】
第２のシェル位置は、モデル構造において結合された２Ｆ−ＦＰＰの原子の７．５から１５オングストロームの間に少なくとも１つの非水素側鎖または骨格原子を有するが、モデル構造において結合された２Ｆ−ＦＰＰの原子の７．５オングストローム以内に側鎖または骨格原子がないアミノ酸残基として定義される。配列番号２と比較して、第２のシェルにおける修飾は、好ましくは可変位置に存在する。可変の第２のシェル位置は、配列番号２の２５、２７−３２、３４、２２５−２２８、２３０、２９７−３００、３０２、３０４−３０６、３０８、３０９、３１１−３１５、３２５−３２８、３３０、３４０、３４３−３４６、３５０、３５３、３５４、３５７、３７５、３７８、３７９、３８２、３８３、４０２−４０８、４１０−４１２、４１４、４１５、４１７、４１８、４２１、４２２、４２４、４２７−４３４、４３６、４４２、４４３、４４５−４４８、４６４、４７２−４７５、４７７、４７８、４８５、４８８−４９０、４９２−５０３、５１６、５１７、５１９−５２１、５２３、５２４、５２７、５４８−５５１、５５４、５５５、５５８、５５９、５６１−５６４、５６６−５６８、５７０、５７１、５７３、５７５、５７６、５７８および５７９位（と整列する）位置である。
【００９１】
第２のシェルまたは第１のシェルにおける修飾は、生産性が改善されたバレンセンシンターゼを得るために、より特に特異的生産性が改善されたバレンセンシンターゼを得るために有利であることが見出された。
【００９２】
有利な実施形態において、バレンセンシンターゼは、配列番号２におけるシステイン位置と対応する位置に少なくとも１つの修飾を有する。これらのシステイン位置は、配列番号２の１６、２２５、２４４、３２３、３２７、４０５、５０３および５２７位（と整列する）位置である。
【００９３】
理論に拘束されることなく、このようなバレンセンシンターゼにおける改善された生産性は、部分的にまたは完全に、向上した酵素安定性、より正確には向上した動作安定性（経時的に触媒活性を喪失する傾向がより低い）の結果となり得ることが企図される。配列番号２におけるシステイン位置は、配列番号２におけるバレンセンシンターゼのＹＡＳＡＲＡモデルにおいて、遊離システインとしてまたはジスルフィド架橋中に生じる位置であってもよい。これらのシステイン位置は、配列番号２の１６、２２５、２４４、３２３、３２７、４０５、５０３および５２７位（と整列する）位置である。
【００９４】
好ましい実施形態におて、本発明によるバレンセンシンターゼは、配列番号３に示されたアミノ酸配列またはこの機能的相同体を含む。本明細書では、「Ｘ」印が付いた位置は、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸残基が、配列番号２における対応するアミノ酸残基とは異なるという条件で、任意のアミノ酸残基を原則として含有することができる。特に好ましい実施形態において、本発明によるバレンセンシンターゼは、配列番号４に示されたアミノ酸配列またはこの機能的相同体を含む。本明細書では、特に好ましいアミノ酸残基は、配列番号３において「Ｘ」印が付いた位置に対する丸括弧の間に与えられる。好ましくはこれらの位置の少なくとも１つは、配列番号２における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。
【００９５】
特定の実施形態において、生産性が改善されたバレンセンシンターゼ、特に配列番号２のバレンセンシンターゼの機能的相同体は、配列番号２の８７、９３、１２８、１７１、１７８、１８７、２２６、３０２、３１２、３１９、３２３、３９８、４３６、４４８、４４９、４５０、４６３、４８８、４９２、５０２、５０７、５３０または５５９位と整列する位置の１つ以上において修飾を含む。
【００９６】
好ましい実施形態において、生産性が改善されたバレンセンシンターゼ、特に配列番号２のバレンセンシンターゼの機能的相同体は、配列番号２の１６、１２８、１７１、１８７、２２５、２４４、３００、３０２、３０７、３１９、３２３、３２７、３３１、３３４、３９８、４０５、４０９、４１０、４１２、４３６、４３８、４３９、４４４、４４８、４４９、４５０、４６３、４８８、４９０、４９２、５０２、５０３、５０７、５２７、５５６、５５９、５６０、５６６、５６８、５６９および５７０の群から選択される位置と対応するアミノ酸位置に、配列番号２により表されたバレンス（ｖａｌｅｎｃｅ）シンターゼと比較して１つ以上の修飾、特に１つ以上の置換を有する。より好ましくは、生産性が改善されたバレンセンシンターゼは、配列番号２の１６、２２５，２４４、３００、３０２、３０７、３２３、３２７、３３１、３３４、４０５、４０９、４１０、４１２、４３６、４３８、４３９、４４４、４４８、４４９、４５０、４６３、４８８、４９０、４９２、５０２、５０３、５０７、５２７、５５６、５５９、５６０、５６６、５６８、５６９および５７０の群から選択される１つ以上の位置と対応する（整列する）位置に１つ以上の修飾を含む。
【００９７】
特に好ましい実施形態において、バレンセンシンターゼは、１６Ａ、１６Ｔ、１６Ｓ、１２８Ｌ、１７１Ｒ、１８７Ｋ、２２５Ｓ、２４４Ｓ、２４４Ｔ、３００Ｙ、３０２Ｄ、３０７Ｔ、３０７Ａ、３１９Ｑ、３２３Ａ、３２７Ｌ、３３１Ｇ、３３４Ｌ、３９８Ｉ、３９８Ｍ、３９８Ｔ、４０５Ｔ、４０５Ｖ、４０９Ｆ、４１０Ｆ、４１０Ｖ、４１０Ｌ、４１２Ｇ、４３６Ｌ、４３６Ｋ、４３６Ｔ、４３６Ｗ、４３８Ｔ、４３９Ｇ、４３９Ａ、４４４Ｉ、４４４Ｖ、４４８Ｓ、４４９Ｆ、４４９Ｉ、４４９Ｙ、４５０Ｌ、４５０Ｍ、４５０Ｖ、４６３Ｅ、４６３Ｓ、４６３Ｇ、４６３Ｗ、４８８Ｙ、４８８Ｈ、４８８Ｓ、４９０Ｎ、４９０Ａ、４９０Ｔ、４９０Ｆ、４９２Ａ、４９２Ｋ、５０２Ｑ、５０３Ｓ、５０７Ｅ、５０７Ｑ、５２７Ｔ、５２７Ｓ、５２７Ａ、５５６Ｔ、５５９Ｈ、５５９Ｌ、５５９Ｖ、５６０Ｌ、５６６Ｓ、５６６Ａ、５６６Ｇ、５６８Ｓ、５６９Ｉ、５６９Ｖ、５７０Ｔ、５７０Ｇ、５７０Ａおよび５７０Ｐの群から選択される１つ以上の修飾を有する。
【００９８】
特に、良好な結果は、１６Ａ、１６Ｔ、１６Ｓ、２４４Ｓ、２４４Ｔ、３００Ｙ、３０７Ｔ、３０７Ａ、３２３Ａ、３２７Ｌ、３３１Ｇ、３３４Ｌ、４０５Ｔ、４０５Ｖ、４０９Ｆ、４１０Ｆ、４１０Ｖ、４１０Ｌ、４１２Ｇ、４３６Ｌ、４３６Ｋ、４３６Ｔ、４３８Ｔ、４３９Ｇ、４３９Ａ、４４４Ｉ、４４８Ｓ、４４９Ｆ、４５０Ｍ、４５０Ｌ、４５０Ｖ、４６３Ｅ、４６３Ｓ、４６３Ｇ、４６３Ｗ、４８８Ｙ、４８８Ｓ、４８８Ｈ、４９０Ｎ、４９０Ａ、４９０Ｔ、４９０Ｆ、４９２Ａ、４９２Ｋ、５０２Ｑ、５０３Ｓ、５０７Ｅ、５０７Ｑ、５２７Ｔ、５２７Ｓ、５２７Ａ、５５６Ｔ、５５９Ｈ、５５９Ｌ、５５９Ｖ、５６０Ｌ、５６６Ｓ、５６６Ａ、５６６Ｇ、５６８Ｓ、５６９Ｉ、５６９Ｖ、５７０Ｔ、５７０Ｇおよび５７０Ｐの群から選択される１つ以上の修飾を有するバレンセンシンターゼにより達成された。
【００９９】
特に高い生産性は、１６Ａ、２４４Ｓ、３００Ｙ、３０７Ｔ、３０７Ａ、３２３Ａ、３２７Ｌ、３３１Ｇ、３３４Ｌ、４０５Ｔ、４０９Ｆ、４１０Ｆ、４１０Ｖ、４１０Ｌ、４１２Ｇ、４３６Ｌ、４３６Ｋ、４３６Ｔ、４３８Ｔ、４３９Ｇ、４３９Ａ、４４９Ｆ、４５０Ｌ、４５０Ｖ、４８８Ｙ、４８８Ｈ、４８８Ｓ、４９０Ｎ、４９０Ａ、４９０Ｔ、４９２Ａ、４９２Ｋ、５０２Ｑ、５０３Ｓ、５０７Ｅ、５０７Ｑ、５２７Ｔ、５５６Ｔ、５５９Ｈ、５５９Ｌ、５６０Ｌ、５６６Ｓ、５６６Ａ、５６８Ｓ、５６９Ｉ、５６９Ｖ、５７０Ｔおよび５７０Ｇの群から選択される少なくとも１つの修飾を有するバレンセンシンターゼについて観察された。
【０１００】
配列番号２と比較して少なくとも２つの修飾を含むバレンセンシンターゼの好ましい例は、少なくとも２つの修飾が、１２８Ｌ、１８７Ｋ、３０２Ｄ、３９８Ｉ、３９８Ｍ、３９８Ｔ、４３６Ｌ、４３６Ｋ、４３６Ｗ、４４９Ｆ、４４９Ｉ、４４９Ｙ、４５０Ｌ、４５０Ｆ、４５０Ｖ、４６３Ｅ、４６３Ｓ、４６３Ｇ、４６３Ｗ、４８８Ｓ、４８８Ｙおよび４８８Ｈから選択されるものである。特に良好な結果は、少なくとも２つの修飾が、４６３、４８８、４３６、４５０と対応する少なくとも２つの位置での修飾から選択される、好ましくは４６３および４８８、または４３６および４５０と対応する位置での変異である、配列番号２と比較して少なくとも２つの修飾を含むバレンセンシンターゼにより達成された。修飾は、好ましいとき、上記の本明細書に示された置換から特に選択されてもよい。
【０１０１】
良好な結果は、配列番号２と比較して、１つまたは２つの変異（置換）のみを有するバレンセンシンターゼにより得られたが、本発明によるバレンス（ｖａｌｅｎｃｅ）シンターゼは、より多くの修飾、特に３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つ以上の修飾を含むことができる。酵素がバレンセンシンターゼとしての十分な触媒特性を保持するという条件で、原則として修飾の数に制限はない。しかし、少なくともバレンセンシンターゼの機能的相同体について、配列番号２の第１および第２のシェルにおける厳密に保存された残基と整列する位置は、配列番号２と同じアミノ酸残基を含むことが一般に好ましい。バレンセンシンターゼの有利な生産性特性を達成するためには、これらは特に、配列番号２の３２４、３２９、３３８、３３９、３４２、３５９、３６０、３６９、４１９、４２６、４８０、５３２、５５５および５６５位である。
【０１０２】
配列番号２のバレンセンシンターゼと比較して向上した生産性を有するバレンセンシンターゼは、好ましくは、配列番号２のバレンセンシンターゼの機能的相同体である。配列番号２のバレンセンシンターゼと比較して向上した生産性を有するバレンセンシンターゼは、バレンセンシンターゼが配列番号２と比較して少なくとも１つの修飾を含有するという条件で、配列番号２と少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を好ましくは含む。バレンセンシンターゼは、配列番号２とこのような配列同一性を有するポリペプチドから成ってもよい。しかし、バレンセンシンターゼが、このような配列同一性を有する少なくとも１つのセグメント、およびタグペプチドなどの少なくとも１つのさらなるペプチドセグメントを含むこともあり得る。
【０１０３】
故に、特定の実施形態において、本発明は、第１のポリペプチドセグメントおよび第２のポリペプチドセグメントを含み、第１のセグメントがタグペプチドを含み、第２のセグメントがバレンセンシンターゼ活性を有する本発明によるポリペプチドを含む、バレンセンシンターゼに関する。
【０１０４】
タグペプチドは、好ましくは、窒素利用タンパク質（ＮｕｓＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の群から選択される。Ｚｈａｎｇ、Ｙ−Ｂら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００４）３６：２０７−２１６頁により記載されている、さらに大きい実効負電荷を有する小ペプチドがタグペプチドとして使用されてもよい。特に適切なのは、エシェリキア・コリ由来のマルトース結合タンパク質である。タグは、活性型でのバレンセンシンターゼの発現を増加して、酵素の生産性を特に改善することができる。好ましくは、タグペプチドセグメントを有する本発明によるバレンセンシンターゼは、特にタグペプチドが、窒素利用タンパク質（ＮｕｓＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の群から選択される場合、配列番号２により表されたバレンセンシンターゼと比較して、向上した特異的生産性、向上した安定性または向上した生成物特異性（ゲルマクレンＡへのファルネシル二リン酸の変換と比べて）を有する。
【０１０５】
タグ付けされたバレンセンシンターゼの改善された可溶性（タグがないバレンセンシンターゼと比較して）について、該酵素の第１のセグメントは、第２のセグメントのＣ末端からＮ末端で好ましくは結合される。あるいは、タグ付けされた酵素の第１のセグメントは、第２のセグメントのＮ末端からＣ末端で結合される。
【０１０６】
本発明は、さらに、本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。「宿主細胞」により、ベクターを含有し、ベクターの複製および／または発現を支持する細胞が意味される。
【０１０７】
宿主細胞においてバレンセンシンターゼをコードする核酸は、一般に、宿主細胞に対し異種である。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞または古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）のメンバー由来の細胞であってもよい。宿主細胞は、任意の生物、特に任意のヒト以外の生物由来であってもよい。特に宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌、原生生物、植物細胞（藻類を含む）、動物に由来する細胞（特に前記動物から単離された）から選択することができる。宿主細胞は、ヒト以外または酵素が天然に由来する生物以外の多細胞生物の部分を形成してもよい。特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、多細胞生物に由来し、さらにそこから単離された細胞の培養物である。
【０１０８】
一般に、宿主細胞は、普遍的なイソプレノイド構成単位であるＣ５プレニル二リン酸イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の生産を可能にする、メバロン酸経路または別の代謝経路（デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路などの）の反応ステップを触媒する酵素を発現する遺伝子を含む生物である。知られている限り、特異的遺伝子がノックアウトされている場合を除き、全ての既知の生物はこのような経路を含む。真核生物は、一般に、天然にメバロン酸経路を介してＩＰＰを調製することができる。このＩＰＰは、次いで酵素イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｉｄｉ）の作用によりＤＭＡＰＰに異性化される。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを５：１比で提供しているＤＸＰ経路は原核生物に共通しているが、いくつかの原核生物は、天然にメバロン酸経路を介してＩＰＰを調製することができる。これらの経路は、当技術分野で知られており、例えば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）７３：９８０−９９０頁においてＷｉｔｈｅｒｓおよびＫｅａｓｌｉｎｇにより記載されている（これらの経路の記載、ならびに特に図１および前記経路の１つまたは両方で役割を果たす前記刊行物で言及された酵素に関する内容は、参照により包含される）。これらの経路の遺伝子は、該細胞に対し各々独立に相同または異種であってもよい。
【０１０９】
宿主細胞は、さらに、より長いプレニル二リン酸を生産するＣ５プレニル二リン酸の頭尾縮合を触媒するプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を発現する１つ以上の遺伝子を、内因性にまたは異種の供給源から含む。例えば、普遍的なセスキテルペン前駆体ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、ＤＭＡＰＰの１分子へのＩＰＰの２分子の連続頭尾付加によるこれらの酵素の作用により形成される。
【０１１０】
一実施形態において、宿主細胞は細菌である。細菌は、グラム陽性またはグラム陰性であってもよい。グラム陽性細菌は、バチルス属およびラクトバチルス属、特にバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種およびラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）種から選択することができる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、細菌は、グラム陰性細菌の群、特にロドバクター属、パラコッカス属およびエシェリキア属の群、より特にロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス、パラコッカス・カロティニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）およびエシェリキア・コリの群から選択される。ロドバクター・スフェロイデスは、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの細胞内生産を可能にする、ＤＸＰ経路でのさまざまな反応ステップを触媒する酵素を発現するのに必要とされる全ての遺伝子を天然に含有する生物の例である。
【０１１２】
一実施形態において、宿主細胞は、真菌細胞、特にアスペルギルス属、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）（キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅ））、ピキア属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅ）、サッカロミセスおよびヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の群、より特にアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ））、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエおよびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の群から選択される真菌細胞である。
【０１１３】
植物細胞および動物細胞（昆虫細胞、またはマウス、ラットもしくはヒト由来の細胞などの）などの高等真核生物に由来する細胞において、本発明の核酸を発現することも可能である。前記細胞は、細胞または組織培養において維持することができ、バレンセンシンターゼのインビトロ生産に使用することができる。
【０１１４】
本発明による宿主細胞を含む多細胞生物は、多細胞植物およびキノコ（担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ））の群から特に選択することができる。
【０１１５】
故に、特定の実施形態において、本発明は、トランスジェニック植物または植物細胞またはトランスジェニック植物細胞を含む組織培養物であって、本発明による植物宿主細胞を含む前記植物または培養物に関する。トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞の培養物は、タバコ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）、ナス属種（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、チコルム・インティバス（Ｃｉｃｈｏｒｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ハッカ属種（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｐ．）、アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、ヘリアンサス・ツベロスス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、キャッサバおよびベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）などの塊茎形成植物（ｔｕｂｅｒ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｌａｎｔ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）、アブラヤシ属種（Ｅｌａｅｉｓ  ｓｐｐ．）（アブラヤシの木）、ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）およびアラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）などの油料作物、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）アオウキクサ属種（Ｌｅｍｎａ  ｓｐｐ．）、タバコＢＹ２細胞およびフィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）などの液体培養植物、マツおよびポプラなどの樹木、それぞれ前記植物のいずれかの細胞培養物または組織培養物から特に選択することができる。特定の実施形態において、組織培養物は毛状根培養物である。
【０１１６】
さらなる特定の実施形態において本発明は、トランスジェニックキノコまたはトランスジェニックキノコ細胞を含む培養物に関する。トランスジェニックキノコまたはトランスジェニック宿主細胞を含む培養物は、特に、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）およびヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、より特にシゾフィラム・コムーネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、ツクリタケ（アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ））、ヒラタケ（プレウロタス・オストレオタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅｏｔｕｓ）およびプレウロタス・サピダス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ））の群（それぞれ、いずれかの前記キノコの細胞を含む培養物）から選択することができる。バレンセンシンターゼを発現するのにキノコを使用する１つの追加の利点は、少なくともいくつかのキノコは、バレンセンをノートカトンに変換することができることである（Ｆｒａａｔｚ、Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍ．（２００９）６１：２０２−２０７頁）。
【０１１７】
バレンセンそれ自体の生産に次いで、本発明によるバレンセンシンターゼの発現および植物またはキノコにおけるバレンセンの生産は、これらの生物における耐性も提供する。まず第一に、バレンセンは防虫剤として作用することが知られており、蚊、ゴキブリ、ダニ、ノミ、シロアリおよびドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫に対して活性である。さらに、バレンセンは、真菌フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、特にフィトフトラ・ラモルム（Ｐ．ｒａｍｏｒｕｍ）（サドンオークデス病原体）（Ｍａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｋ．ら、Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００６）３６：２９７−３０８頁）などの病原体に対して植物を耐性にすることが知られている。
【０１１８】
本発明による宿主細胞は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）；ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）、および後のこの補遺に記載された、当技術分野で一般に知られている標準的な遺伝学的および分子生物学的技法に基づいて生産することができる。
【０１１９】
担子菌類を形質転換する方法は、例えば、Ａｌｖｅｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）７０：６３７９−６３８４頁）、Ｇｏｄｉｏら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（２００４）４６：２８７−２９４頁）、Ｓｃｈｕｕｒｓら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１４７：５８９−５９６頁）、およびＷＯ  ０６／０９６０５０から知られている。担子菌類における適切なバレンセンシンターゼ遺伝子の発現を達成するために、この完全なオープンリーディングフレームが、担子菌類の形質転換に適切な発現ベクターに典型的にはクローン化される。発現ベクターは、転写開始および終結を制御する核酸配列も好ましくは含む。形質転換体の選択を可能にする少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を取り込むこともまた好ましい。バレンセンシンターゼの発現は、担子菌類プロモーター、例えば構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを用いて達成することができる。強力な構成的プロモーターの例は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモーターである。このプロモーターは、組換えＤＮＡ材料が担子菌類宿主において発現される場合の構成的発現に好ましい。他の例は、担子菌類のホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ）プロモーター、ＴＰＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）プロモーター、ＡＰＣ合成酵素サブユニットｇ（ｏｌｉＣ）プロモーター、ｓｃ３プロモーターおよびアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）プロモーターである（ＷＯ  ９６／４１８８２）。
【０１２０】
必要であれば、バレンセンシンターゼ遺伝子の一次ヌクレオチド配列を、担子菌類宿主のコドン使用頻度に適合させることができる。
【０１２１】
さらに、発現は、特に（一核性）菌糸または（二核性）子実体を対象とすることができる。後者の場合では、プレウロティス（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ）のＦｂｈ１プロモーターが特に有用である（Ｐｅｎａｓ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ（２００４）９６：７５−８２頁）。
【０１２２】
植物形質転換コンストラクトの構築のための方法論は、当技術分野で記載されている。過剰発現は、選択された遺伝子の１つまたは２つ以上の過剰コピーの挿入により達成することができる。ヌクレオチド配列の１つまたは２つ以上の過剰コピーで最初は形質転換された植物またはこの子孫が、過剰発現を示すことは知られていないわけではない。
【０１２３】
適切な植物組織において十分なレベルのトランスジェニック発現を得ることは、遺伝子改変作物の生産における重要な側面である。異種ＤＮＡ配列の発現は、植物宿主内で機能性である作動可能に連結されたプロモーターの存在に左右される。プロモーター配列の選択は、いつ、および生物内のどこで異種ＤＮＡ配列が発現されるかを決定する。双子葉植物由来の多くのプロモーターは、単子葉植物において作動性であり、この逆も同様であることが示されているが、理想的には、双子葉植物プロモーターは、双子葉植物での発現に対して選択され、単子葉植物プロモーターは単子葉植物での発現に対して選択される。しかし、選択されるプロモーターの起源に制限はなく、所望の細胞または組織でのヌクレオチド配列の発現の駆動において作動性であることが十分である。いくつかの場合では、複数の組織での発現が望ましく、３５Ｓプロモーターシリーズなどの構成的プロモーターがこの点で使用され得る。しかし、本発明の実施形態のいくつかにおいて、トランスジェニック植物での発現は葉特異的であることが好ましく、より好ましくは、遺伝子の発現は葉プラスチドで生じる。ポプルス・アルバ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）由来のイソプレンシンターゼ遺伝子（ＰａＩｓｐＳ）（Ｓａｓａｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５）５７９：２５１４−２５１８頁）のプロモーターは、プラスチド特異的発現を駆動するようである。したがって、このプロモーターは、本発明の発現ベクターにおける使用に極めて適切なプロモーターである。
【０１２４】
他の適切な葉特異的プロモーターは、ｒｂｃＳ（ルビスコ）プロモーター（例えばコーヒー由来、ＷＯ  ０２／０９２８２２参照）；アブラナ属種由来、ＵＳ  ７，１１５，７３３；大豆由来、Ｄｈａｎｋｅｒ，Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０：１１４０−１１４５頁参照）、ｃｙ−ＦＢＰａｓｅプロモーター（ＵＳ  ６，２２９，０６７参照）、アブラヤシ由来の集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター配列（ＵＳ  ２００６／０２８８４０９参照）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＳＴＰ３プロモーター（Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎ．（２００１）２３：１７５−１８４頁参照）、マメＰＡＬ２遺伝子のプロモーター（Ｓａｂｌｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：６９０１−６９０５頁参照）、ジャガイモＳＴ−ＬＳ１プロモーターのエンハンサー配列（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８４：７９４３−７９４７頁参照）、小麦ＣＡＢ１プロモーター（Ｇｏｔｏｒ，Ｃ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９３）３：５０９−５１８頁参照）、ジャガイモＡＤＰ−グルコース−ホスホリラーゼ遺伝子由来の気孔特異的プロモーター（ＵＳ  ５，５３８，８７９参照）、コメのＰ（Ｄ５４０）遺伝子由来のＬＰＳＥ１エレメント（ＣＮ  ２００７／１００５１４４３参照）、およびアラビドプシス・タリアナ由来の気孔特異的プロモーター、ｐＧＣ１（Ａｔ１ｇ２２６９０）（Ｙａｎｇ，Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ方法ｓ（２００８）４：６頁参照）である。
【０１２５】
植物種は、当技術分野でよく知られた手順に従って、例えば、植物細胞プロトプラストのＤＮＡ媒介形質転換、およびこの後の形質転換プロトプラストからの植物の再生により形質転換されてもよい。
【０１２６】
植物細胞を形質転換する方法のさらなる例には、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：１７９−１８５頁）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ，ＣＤ．およびＢａｔｅｓ，Ｇ．Ｗ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）、８３：５６０２−５６０６頁）、アグロバクテリウム媒介形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９８８）６：９１５−９２２頁）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８４）３：２７１７−２７２２頁）およびＡｇｒａｃｅｔｕｓ、Ｉｎｃ．（マジソン、ウィスコンシン）およびＢｉｏＲａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア）から入手可能な装置を用いた弾道粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号明細書および欧州特許出願第ＥＰ  ０  ３３２  ５８１号明細書参照）が含まれる。
【０１２７】
トウモロコシにはプロトプラスト形質転換方法を使用することもできる（欧州特許出願第ＥＰ  ０  ２９２  ４３５号明細書、米国特許第５，３５０，６８９号明細書）。
【０１２８】
アグロバクテリウム属種のＴｉおよびＲｉプラスミドのバイナリー型ベクターを使用することが特に好ましい。Ｔｉ由来ベクターは、大豆、綿、セイヨウアブラナ、タバコおよびコメ（Ｐａｃｃｉｏｔｔｉら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９８５）３：２４１頁；Ｂｙｒｎｅ  Ｍ．Ｃ．ら、  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）８：３−１５頁；Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ，Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）８：２０９−２１７頁；Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９４）６：２７１−２８２頁）などの単子葉および双子葉植物を含む、多種多様な高等植物を形質転換する。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は広範囲に研究されており、十分に記載されている（例えばＥＰ−Ａ  １２０  ５１６）。植物への導入のため、本発明のキメラ遺伝子は、例に記載されたバイナリーベクターに挿入されてもよい。
【０１２９】
外来ＤＮＡコンストラクトの直接取り込み（ＥＰ−Ａ  ２９５  ９５９参照）、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）、３１９：７９１−７９３頁）または核酸コンストラクトで被覆された金属粒子による高速弾道衝撃（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（例えばＵＳ  ４，９４５，０５０）などの他の形質転換方法が、当業者に利用可能である。ひとたび形質転換されれば、細胞は当業者により再生され得る。特に関連するのは、菜種（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８９）９１：６９４−７０１頁）、ヒマワリ（Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｎ．Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５：１２０１−１２０４頁）、大豆（ＥＰ−Ａ  ３０１  ７４９）、コメ（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９４）６：２７１−２８２頁）およびトウモロコシ（Ｆｒｏｍｍら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９頁）などの商業的に重要な作物に外来遺伝子を形質転換する方法である。
【０１３０】
当業者は、方法の選択が植物のタイプ、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に依存し得ることを理解する。
【０１３１】
別の実施形態において、本明細書に記載されたベクターは、プラスチドゲノムに直接形質転換されてもよい。プラスチド形質転換技術は、例えば、ＵＳ  ５，４５１，５１３、ＵＳ  ５，５４５，８１７、ＵＳ  ５，５４５，８１８およびＷＯ  ９５／１６７８３に広く記載されている。葉緑体形質転換のための基本技法は、目的とする遺伝子と一緒に選択可能なマーカーを隣接するクローン化プラスチドＤＮＡの領域を、例えば微粒子銃またはプロトプラスト形質転換（例えば塩化カルシウムまたはＰＥＧ媒介形質転換）を用いて、適切な標的組織に導入することを含む。
【０１３２】
本発明によるベクター（ベクターがＴｉプラスミドを含む）を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞は、形質転換植物を作製する方法において有用である。植物細胞は、上記のアグロバクテリウム・ツメファシエンスに感染されて形質転換植物細胞を生産し、次いで植物が形質転換植物細胞から再生される。本発明を実施する上で有用な多数のアグロバクテリウムベクター系が知られている。これらは、典型的には少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を保有し、およびｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）１２：８７１１−８７２０頁）などのベクターを含む。
【０１３３】
直接遺伝子導入またはアグロバクテリウム媒介移入の形態のどちらかを用いる方法は、必ずしもではないが通常は、抗生物質（例えばカナマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート）または除草剤（例えばホスフィノトリシン）に対する耐性を提供する可能性がある選択可能なマーカーを用いて行われる。しかし、植物形質転換のための選択可能なマーカーの選択は、本発明にとって重要ではない。
【０１３４】
植物組織を培養する一般的な方法は、Ｍａｋｉ，Ｋ．Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９３）１５：４７３−４９７頁；およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．Ｉ．ら  Ｉｎ：Ｓｐｒａｇｕｅ  ＧＦ、Ｄｕｄｌｅｙ  ＪＷ編  Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．第３版、Ｍａｄｉｓｏｎ（１９８８）３４５−３８７頁による例が提供されている。
【０１３５】
形質転換後、トランスジェニック植物細胞は、トランスジェニック細胞の選択に適切な選択培地に置かれ、次いでカルスに増殖される。芽をカルスから成長させ、発根培地での成長により小植物が芽から発生される。使用される特定のマーカーは、導入されたＤＮＡを欠く細胞と比較して形質転換細胞の選択を可能にする。
【０１３６】
トランスジェニック細胞および植物におけるトランス遺伝子の存在を確かめるために、さまざまなアッセイが行われ得る。このようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲなどの核酸ベースの増幅方法などの当業者によく知られた「分子生物学的」アッセイ、ならびに例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）または酵素機能による、タンパク質生成物の存在の検出などの「生化学」アッセイが含まれる。酵素的に活性なバレンセンシンターゼの存在は、植物の揮発性生成物（バレンセン）の化学的分析により確立することができる。
【０１３７】
本発明によるバレンセンシンターゼは、バレンセンの工業生産に使用することができ、バレンセンは、例えば食品における風味もしくは香気として、または例えば家庭用品における芳香としてそれ自体使用されてもよく、または別のイソプレノイド、例えばノートカトンを生産するための中間体として使用され得る。
【０１３８】
本発明によるバレンセンを生産するための方法は、バレンセンシンターゼの存在下でバレンセンを調製することを含む。原則としてこのような方法は、目的とする化合物の調製において酵素を使用する任意の技法に基づくことができる。
【０１３９】
方法は、ＦＰＰまたは任意のこの前駆体（ファルネソール、ＩＰＰ、イソペンテニルリン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、３−メチルブタ−３−エン−１−オールおよびさらにメバロン酸などの）が、バレンセンシンターゼを含む細胞に基質として与えられる方法であってもよい。あるいは、方法は、適切な炭素供給源からＦＰＰを形成し、故にバレンセンへの十分な発酵経路を確立することができる酵素系を含む生体が使用されてもよい。用語「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ）」は、適切な原料（例えば炭水化物、アミノ酸供給源、脂肪酸供給源）から化合物を合成するために生物の培養物が使用されるプロセスに対して、広い意味で本明細書では使用されることが留意されるべきである。故に、本明細書で意味される発酵プロセスは、嫌気条件に限定されず、好気条件下のプロセスまで拡大される。適切な原料は、一般に（微）生物の個々の種に対して知られている。
【０１４０】
また、例えば基質（ＦＰＰ）およびバレンセンシンターゼが適切な条件（ｐＨ、溶媒、温度）下で接触される反応系において、バレンセンが生産された細胞から単離されたバレンセンシンターゼが使用されてもよく、該条件は、本明細書で参照された先行技術および本開示に基づくことができる（場合によっていくつかの日常的試験との併用で）。バレンセンシンターゼは、例えば同様にＦＰＰが存在する水性培地で可溶化されてもよく、またはバレンセンシンターゼは、当技術分野で知られた方法で担体物質に固定化され、次いでＦＰＰを含む液体と接触されてもよい。該酵素は、ＦＰＰからバレンセンへの触媒に対して高い活性および／または選択性を有することから、本発明はまた、酸性条件下だけでなく、ｐＨがほぼ中性またはアルカリ性の場合にも、このようなインビトロ方法に有利である。適切な条件は、例えば、本明細書で参照された文献、本明細書に開示された情報、共通の一般知識および場合によっていくつかの日常的実験において参照される、既知のバレンセンシンターゼに関する既知の方法論に基づくことができる。
【０１４１】
本発明の特に有利な方法において、バレンセンは発酵調製される（すなわちバレンセンシンターゼを発現する細胞を培養培地で培養して）。バレンセンシンターゼにより触媒される実際の反応は、細胞内で起こり得、または−バレンセンシンターゼが培養培地に排出される場合−培養培地において細胞外に起こり得る。
【０１４２】
本発明によるバレンセンを調製するための方法で使用される細胞は、特に、本発明による宿主細胞であってもよい。所望であれば、これらの宿主細胞は、バレンセンシンターゼにＦＰＰを増加量で供給するように改変することができる。これは、例えば、ＦＰＰに対する炭素フラックスの増強（これ自体、種々の方法で実現され得る）により行うことができる。内因性ＤＸＰ経路を有する宿主細胞（エシェリキア・コリおよびロドバクター・スフェロイデスのような）において、これらの経路の酵素の発現の調節解除は、イソプレノイド形成に対する明らかなプラス効果を有し得る。ＤＸＰ経路の第１の酵素および故に代謝工学の主要な標的の１つ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＰシンターゼ）をコードするｄｘｓの過剰発現は、いくつかのイソプレノイドの生合成の増加をもたらした（例えば、ＭａｔｔｈｅｗｓおよびＷｕｒｔｚｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）５３：３９６−４００頁；Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００１）９：２２３７−２２４２頁；ＨａｒｋｅｒおよびＢｒａｍｌｅｙ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９９）４４８：１１５−１１９頁；Ｊｏｎｅｓら  Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２０００）２：３２８−３３８頁；およびＹｕａｎら  Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００６）８：７９−９０頁）。また、ＤＸＰ経路における第２の関与段階を触媒する酵素、ＤＸＰイソメロレダクターゼ（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼとしても知られる）をコードするｄｘｒの過剰発現は、イソプレノイド生産の増加をもたらすことができ（Ａｌｂｒｅｃｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）２１：７９１−７９５頁）、この効果は、同時にｄｘｓを共過剰発現することによりさらに増加され得る（ＫｉｍおよびＫｅａｓｌｉｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ（２００１）７２：４０８−４１５頁）。イソプレノイド生合成に対するプラス効果は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）へのＩＰＰの相互変換を触媒する酵素、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＰイソメラーゼ、Ｉｄｉ）（例えば、Ｋａｊｉｗａｒａら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９７）３２４：４２１−４２６頁）；ＭｉｓａｗａおよびＳｈｉｍａｄａ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）５９：１６９−１８１頁；ならびにＹｕａｎら  Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００６）８：７９−９０頁）、ならびにエシェリキア・コリにおいて１つのオペロンｉｓｐＤＦとして転写される、酵素ＭＥＰシチジリルトランスフェラーゼ（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、ＩｓｐＤとしても知られる）および２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）（Ｙｕａｎら  Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００６）８：７９−９０頁）の過剰発現によりさらに得られた。
【０１４３】
イソプレノイドの高レベル生産のために、内因性ＤＸＰ経路で株を改変するための代替のより効率的なアプローチが、異種メバロン酸経路の導入である。合成アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ遺伝子とのサッカロミセス・セレビシエメバロン酸経路のエシェリキア・コリにおける共発現は、組換えエシェリキア・コリ株がＬＢ＋グリセロール培地で培養された場合、１１０ｍｇ／Ｌを超える力価でセスキテルペンアモルファジエンの形成をもたらした（Ｍａｒｔｉｎら  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１：７９６−８０２頁）。このエシェリキア・コリ株は、この後、酵母酵素３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼのＣ末端触媒ドメインをコードする遺伝子ｔＨＭＧ１の過剰コピーの導入により改善された。この酵素の形成および故に活性を増加させることにより、毒性メバロン酸経路中間体ＨＭＧ−ＣｏＡの細胞内レベルが低減され、これにより成長阻害を克服し、メバロン酸の生産の増加をもたらした（Ｐｉｔｅｒａら  Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００７）９：１９３−２０７頁）。異種メバロン酸経路を通じたフラックスのさらなる改善は、２倍強力なｌａｃＵＶ５プロモーターによる野生型ｌａｃプロモーターの置換との組み合わせで、この経路の最初の３つの遺伝子のコドン最適化により得られた（Ａｎｔｈｏｎｙら  Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．（２００９）１１：１３−１９頁）。アモルファジエンの生産は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの酵母遺伝子をグラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の同等の遺伝子と置換してさらに増加させることができた。最適化発酵プロトコルとの組み合わせで、この新規の改変エシェリキア・コリ株の培養は、２７．４ｇ／Ｌのアモルファジエン力価をもたらした（Ｔｓｕｒｕｔａら  ＰｌｏＳ  ＯＮＥ（２００９）４（２）：ｅ４４８９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００４４８９）。同様に、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のメバロン酸経路で改変されたエシェリキア・コリ株は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスデカプレニル二リン酸シンターゼ（ｄｄｓＡ）遺伝子との組み合わせで、２４００μｇ／ｇを超える細胞乾燥重量でコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）を生産した（Ｚａｈｉｒｉら  Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．（２００６）８：４０６−４１６頁。ＣｏＱ１０の増加した生産は、天然でのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（ＷＯ  ２００５／００５６５０）および変異型でのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（ＷＯ  ２００６／０１８２１１）由来のメバロン酸経路によるロドバクター・スフェロイデス株の改変によっても得られた。
【０１４４】
また、内因性ＭＥＶ経路を有する宿主細胞（サッカロミセス・セレビシエのような）も、イソプレノイド高生産性株を得るための複数の改変研究の主題となっている。柑橘類バレンセンシンターゼをコードする遺伝子と組み合わせた、異種エシェリキア・コリ由来ＤＸＰ経路のサッカロミセス・セレビシエへの導入は、バレンセンシンターゼのみを発現する株と比較して、約１０倍多いバレンセンを蓄積する株をもたらした（ＷＯ  ２００７／０９３９６２）。しかし、工業的に重要な酵母カンジダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエにおけるほとんどの改善は、相同ＭＥＶ経路の改変に重点を置いている。特に、ＤＸＰ経路における主要な調節酵素と考えられる酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの過剰発現（この完全長または切断バージョンでの）は、イソプレノイドの生産を増加させる効率的な方法であるように思われている。Ｎ末端切断ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの過剰発現のこの刺激効果は、例えば、カンジダ・ユーティリスにおけるリコペン生産（Ｓｈｉｍａｄａら  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）６４：２６７６−２６８０頁）およびサッカロミセス・セレビシエにおけるエピ−セドロール（ｅｐｉ−ｃｅｄｒｏｌ）生産（Ｊａｃｋｓｏｎら  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００３）５：１６２９−  １６３２頁）の場合に観察されている。後者の場合では、このセスキテルペンの生産は、ステロール生合成への代謝フラックスの増加を誘発するアレル、ｕｐｃ２−１の導入によりさらに増強することができた。ＭＥＶ経路を通じてフラックスを増加させるための別の方法は、ＦＰＰおよび他のイソプレノイド前駆体によるフィードバック阻害に対して感受性が低いメバロン酸キナーゼバリアントの使用である。例えば、ＷＯ  ２００６／０６３７５２は、サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ変異体Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍおよびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ  ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子の導入後、内因性ＭＥＶ経路を有する細菌、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４が、野生型サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼを発現する対応するパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス株より、著しく多いコエンザイムＱ１０を生産することを示している。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４によるＣｏＱ１０生産に関する類似の陽性結果は、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスメバロン酸キナーゼのフィードバック耐性バリアントＫ９３Ｅでも得られている（ＷＯ  ２００４／１１１２１４）。
【０１４５】
ＦＰＰ量の増加に対する第２のアプローチは、ＦＰＰに対する酵素副活性の低減または排除に基づく。酵母において遺伝子ＥＲＧ９は、２つのファルネシル二リン酸部分の縮合を触媒してスクアレンを形成する酵素ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ（スクアレンシンターゼ）をコードする。これは、ステロール生合成におけるＦＰＰ後の最初のステップであり、故にステロール経路へのイソプレン単位のフラックスを調節することから、ＥＲＧ９は、セスキテルペンおよびカルテノイド生産の増加のための酵母代謝工学における高頻度の標的である。酵母カンジダ・ユーティリスにおけるｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの過剰発現と組み合わせたＥＲＧ９の破壊は、リコペンの生産の増加をもたらした（Ｓｈｉｍａｄａら  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）６４：２６７６−２６８０頁）。ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの過剰発現およびメチオニン抑制性プロモーターを用いたＥＲＧ９の下方制御の類似の組み合わせは、アモルファジエンシンターゼ遺伝子のみを発現する酵母株と比較して、酵母におけるセスキテルペンアモルファジエンの生産を約１０倍増加させた（Ｒｏら  Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４０：９４０−９４３頁；Ｌｅｎｉｈａｎら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００８）２４：１０２６−１０３２頁）。エルゴステロールは酵母の成長に不可欠であり、酵母細胞は、外部から与えられたエルゴステロールを好気性成長中に取り込むことたができないため、ＥＲＧ９の下方制御／ノックアウトは、酵母株が培養培地からのエルゴステロールの効率的な好気的取り込みをできるようにする変異としばしば組み合わされる。例は、ｓｕｅアレル（Ｔａｋａｈｉｓｈｉら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００７）９７：１７０−１８１頁）およびｕｐｃ２−１アレル（Ｊａｃｋｓｏｎら  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００３）５：１６２９−１６３２頁）である。Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００７）９７：１７０−１８１頁）は、酵母においてホスファターゼ遺伝子ｄｐｐ１をノックアウトして内因性ホスファターゼ活性を制限する効果も調査した。このノックアウトは、はるかに少ないファルネソール蓄積により反映されたＦＰＰの脱リン酸化を明らかに制限したが、適用された成長条件下での複合ｅｒｇ９／ｓｕｅ変異を超えてセスキテルペン生産を改善しなかった。
【０１４６】
バレンセンを発酵調製するための反応条件は、使用される宿主細胞の種類（例えばロドバクター・カプスラータ、ロドバクター・スフェロイデス、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス、エシェリキア・コリ、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、サッカロミセス・セレビシエ、ヤロウイア・リポリティカ、ペニシリウム・クリソゲナム、ファフィア・ロドジマおよびピキア・パストリス）、本明細書に開示された情報、共通の一般知識および場合によっていくつかの日常的実験に関する既知の条件に応じて選択することができる。
【０１４７】
原則として、本発明による方法において使用される反応培地（培養培地）のｐＨは、バレンセンシンターゼ（宿主細胞中の）がｐＨ条件下で活性であり、および望まれる特異性を示す限り、幅広い限度内で選択することができる。バレンセンシンターゼを発現するために、方法が細胞の使用を含む場合では、ｐＨは、細胞が意図された機能（複数可）を果たすことができるように選択される。ｐＨは、２５℃の本質的に水溶液系の場合では、中性ｐＨより下の４つのｐＨ単位および中性ｐＨより上の２つのｐＨ単位、すなわちｐＨ３からｐＨ９の間の範囲内で特に選択することができる。良好な結果は、例えば、６．８から７．５の範囲内にｐＨを有する水性反応培地において達成された。
【０１４８】
水が唯一の溶媒または主たる溶媒（合計液体に対して＞５０重量％、特に＞９０重量％）である場合、系は水性とみなされ、例えば微量のアルコールまたは別の溶媒（合計液体に対して＜５０重量％、特に＜１０重量％）が、存在する微生物が活性のままであるような濃度で溶解され得る（例えば完全発酵アプローチの場合の炭素供給源として）。
【０１４９】
特に酵母および／または真菌が使用される場合は、酸性条件が好ましい場合があり、特にｐＨは、２５℃の本質的に水性系に対しｐＨ３からｐＨ８の範囲であり得る。所望であれば、ｐＨは、酸および／もしくは塩基を用いて調製されてもよく、または酸および塩基の適切な組み合わせにより緩衝されてもよい。
【０１５０】
嫌気条件は、本明細書では、いかなる酸素もない、または実質的に酸素が培養細胞（特に微生物）により消費されない条件として定義され、通常は、５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満の酸素消費量、好ましくは２．５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満の酸素消費量、もしくはより好ましくは１ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満に相当する。好気条件は、非制限的成長に十分なレベルの酸素が培地に溶解されており、少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈを超える、さらにより好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈを超える、および最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ．ｈを超える酸素消費速度を支持することができる条件である。
【０１５１】
酸素制限条件は、酸素消費が気体から液体への酸素移動により制限される条件として定義される。酸素制限条件の下限は、嫌気条件の上限、すなわち通常は少なくとも１ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ、特に少なくとも２．５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈまたは少なくとも５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈの上限により決定される。酸素制限条件の上限は、好気条件の下限、すなわち１００ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、５０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、２０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満または１０ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満により決定される。
【０１５２】
条件が好気性、嫌気性または酸素制限的であるかどうかは、方法が実施される条件、特に流入する気体流の量および組成、使用される機器の実際の混合／物質移動特性、使用される微生物の種類および微生物密度に依存する。
【０１５３】
バレンセンシンターゼ（細胞中の）が実質的な活性を示す限り、原則として、使用される温度は重要ではない。一般に、温度は、少なくとも０℃、特に少なくとも１５℃、より特に少なくとも２０℃であってもよい。所望の最高温度は、バレンセンシンターゼを発現するために細胞が使用される方法の場合、バレンセンシンターゼおよび細胞に依存する。温度は、７０℃以下、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下、特に３５℃以下である。
【０１５４】
発酵プロセスの場合、インキュベーション条件は、細胞が十分な活性および／または成長を示す限り、幅広い限度内で選択することができる。これには、好気条件、酸素制限条件および嫌気条件が含まれる。
【０１５５】
特に、バレンセンが形成される触媒反応が宿主細胞外で実施される場合、有機溶媒を含む反応培地は、使用されるバレンセンシンターゼがこのような培地において十分な活性および特異性を保持する場合に、高濃度で使用することができる（例えば、合計液体に対して５０％を超える、または９０重量％を超える）。
【０１５６】
所望であれば、本発明による方法において生産されるバレンセン、または調製後にバレンセンが変換されたさらなる化合物（ノートカトンなどの）は、これが作製された反応培地から回収される。適切な方法は、反応培地と混合できない抽出液体による液液抽出である。
【０１５７】
（水性反応培地からの抽出に）特に適切なのは、液体炭化水素などの液体有機溶媒による抽出である。初期結果から、この方法は、バレンセン（またはさらなる生成物）の回収のために細胞を溶解させる必要なしに、バレンセンの生産のために使用された本発明による細胞を含む反応培地から、バレンセン（またはさらなる生成物）を抽出するのにも適切であることは明白である。特に、有機溶媒は、液体アルカン、液体長鎖アルコール（少なくとも１２個の炭素原子を有するアルコール）および長鎖脂肪酸（少なくとも１２個の炭素原子を有する酸）の液体エステルから選択することができる。特に適切な液体アルカンには、ヘキサン、オクタン、デカン、ドデカン、イソドデカンおよびヘキサデカンなどのＣ６−Ｃ１６アルカンが含まれる。特に適切な長鎖脂肪族アルコールには、オレイルアルコールおよびパルミトレイルアルコールのようなＣ１２−Ｃ１８脂肪族アルコールが含まれる。特に長鎖脂肪酸の適切なエステルには、ミリスチン酸イソプロピルおよびオレイン酸エチルのような、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸のＣ１−Ｃ４アルコールのエステルが含まれる。
【０１５８】
有利な実施形態において、バレンセン（またはさらなる生成物）は、第１液相（反応相）であって、バレンセン（またはさらなる生成物）を生産する本発明による細胞を含有する前記第１液相、および第２液相（接触した時に第１相と本質的に分相したままである有機相）であって、形成された生成物がより高い親和性を有する抽出相である前記第２液相を含む反応器において生産される。この方法は、これがインサイチュ生成物回収を可能にする点で有利である。また、第２相の存在により、反応相中のバレンセン（またはさらなる生成物）濃度が、プロセス全体を通して比較的低く保たれ得るため、この方法は、細胞に対するバレンセン（またはさらなる生成物）の潜在的な毒性作用の阻止、または少なくとも低減にも寄与する。最後に、抽出相は、反応相からのバレンセン（またはさらなる生成物）の抽出に寄与するという好材料がある。
【０１５９】
本発明の好ましい方法において、抽出相は、反応相の上に層を形成し、または反応相と混合されて抽出相における反応相の分散、もしくは反応相における抽出相の分散を形成する。故に、抽出相は、反応相から生成物を抽出するだけでなく、バレンセンが（水性）反応相において生産される場合、または（水性）反応相に排出される場合に生じ得るオフガスを通じた、反応器からの形成された生成物の喪失を低減すること、または完全に回避することにも役立つ。バレンセンは水に難溶性であり、したがって水から容易に揮発する。有機相に溶媒和されたバレンセン（層または分散として）は、少なくとも実質的に揮発を妨げられることが企図される。
【０１６０】
抽出相としての使用に適切な液体は、良好な生体適合性を有する（生細胞の生存能力を障害しない）反応相よりも低い密度、低揮発性、および水性反応相との絶対に近い非混和性を兼ね備える。この適用に適切な液体の例は、デカン、ドデカン、イソドデカン、テトラデカンおよびヘキサデカンのような液体アルカン、またはオレイルアルコールおよびパルミトレイルアルコールのような長鎖脂肪族アルコール、またはミリスチン酸イソプロピルおよびオレイン酸エチルのような長鎖脂肪酸のエステル（例えばＡｓａｄｏｌｌａｈｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）９９：６６６−６７７頁）、Ｎｅｗｍａｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００６）９５：６８４−６９１頁）およびＷＯ  ２００９／０４２０７０参照）である。
【０１６１】
本発明に従って生産されるバレンセンは、例えば風味もしくは芳香として、もしくは防虫剤としての使用などに使用することができ、または別の化合物、特に別の風味もしくは芳香の出発物質として使用することができる。特に、バレンセンは、ノートカトンに変換することができる。ノートカトンへのバレンセンの変換は、細胞内または細胞外で実施することができる。この調製が細胞内部で実施される場合、ノートカトンは、通常、この生産後に宿主細胞から単離される。
【０１６２】
バレンセンをノートカトンに変換する適切な方法は、例えば、内容が参照により組み込まれているＦｒａａｔｚら  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００９）８３：３５−４１頁、またはここに引用された参照文献に記載されているように、当技術分野で知られている。
【０１６３】
一般に、バレンセンからノートカトンを調製するための適切な方法は、ｉ．純化学的方法、ｉｉ．生体触媒方法（例えばメディエーターとの併用でラッカーゼを用いるもの）、ｉｉｉ．生物変換（すなわち生細胞全体を適用する方法）およびｉｖ．完全発酵に分類することができる。方法ｉ−ｉｉｉにおいて、外部から与えられたバレンセンが変換されるのに対し、方法ｉｖにおいてバレンセンはインサイチュで生産される。
【０１６４】
特定の実施形態において、変換は、アルファ−および／またはベータ−ノートカトルへの２位でのバレンセンの位置特異的水酸化と、これに続くノートカトンを形成するこの酸化を含む。
【０１６５】
さらなる実施形態において、バレンセンは、バレンセンのヒドロペルオキシドに変換され、この後ノートカトンに変換される。米国特許第５，８４７，２２６号明細書は、不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドの存在下、酸素含有雰囲気でのノートカトンへの（＋）−バレンセンの化学変換を記載している。この脂肪酸ヒドロペルオキシドは、例えば自動酸化、光酸化またはリポオキシゲナーゼを用いた酵素的酸化によりインサイチュで生成され、この後このヒドロペルオキシドは、バレンセンの自動酸化を触媒する。
【０１６６】
（＋）−バレンセンは、緑藻クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）または真菌ボトリオスファエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ）（Ｆｕｒｕｓａｗａら  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（２００５）５３：１５１３−１５１４頁、およびＪＰ  ２００３−０７０４９２）のさまざまな種により、ノートカトンに高収量で変換することができる。
【０１６７】
ＥＰ−Ａ  １  ０８３  ２３３は、バレンセンヒドロペルオキシドへのバレンセンのラッカーゼ触媒変換（バレンセンヒドロペルオキシドは、この後、分解されてノートカトンを形成する）に基づく無細胞（生体触媒）系を適用するノートカトンの調製を記載している。場合によって、ラッカーゼ活性を維持する濃度でのメディエーターおよび／または溶媒が含まれ得る。
【０１６８】
ＷＯ  ２００６／０７９０２０は、特に新規の植物由来シトクロムＰ４５０酵素、ヒヨスチアムス・ムティカス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）由来のプレムナスピロジエン・オキシゲナーゼ（Ｐｒｅｍｎａｓｐｉｒｏｄｉｅｎｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（ＨＰＯ）（主にベータ−ノートカトルへの（＋）−バレンセンのモノ水酸化を触媒する）を記載している。ノートカトン形成は、極めて高濃度のノートカトル（＞３０μΜ）でのみ、ただし、極めて低い反応速度でのみ観察された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：３１７４４−３１７５４頁）。同じ論文において、Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、全体の反応生成物プロフィールを著しく変えることなく、ノートカトル生合成の触媒効率が５倍改善したＨＰＯ変異体について報告している。このノートカトルは、同じ宿主細胞でのアルコールデヒドロゲナーゼ酵素の共発現により、ノートカトンにさらに酸化され得る。
【０１６９】
別の適切な植物由来シトクロムＰ４５０酵素が、チコリ（チコリウム・インティバスＬ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ  Ｌ．））において最近同定された。酵母におけるバレンセンシンターゼとのこの新規のＰ４５０酵素の共発現は、トランス−ノートカトル、シス−ノートカトルおよび（＋）−ノートカトンの形成をもたらした（Ｃａｎｋａｒ，Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０１１）５８５：１７８−１８２頁）。
【０１７０】
植物由来シトクロムＰ４５０酵素の他に、細菌シトクロム４５０モノオキシゲナーゼＰ４５０ｃａｍおよびＰ４５０ＢＭ−３ならびにこれらの変異体もまた、（＋）−バレンセンを酸化させることが報告されている（Ｓｏｗｄｅｎら  Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）３：５７−６４頁）。野生型Ｐ４５０ｃａｍがこの酸化反応を触媒しなかったのに対し、変異体は、形成された生成物の＞８５％を構成する（＋）−バレンセン、（＋）−トランス−ノートカトルおよび（＋）−ノートカトンにおける所望のＣ２位に対する比較的高い位置選択性を示した。これらの変異体の活性は、依然としてやや低かった。一方、Ｐ４５０ＢＭ−３変異体はより高い活性を示したが、活性部位での（＋）−バレンセンの複数の結合配向のため、非選択的であった。最近、はるかにより選択的なＢＭ−３変異体が報告されており、この最良のものは９５％のＣ２位置選択性を有する（Ｓｅｉｆｅｒｔら  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２００９）１０：８５３−８６１頁）。
【０１７１】
ノートカトンへのバレンセンの変換を触媒するための一酵素または複数の酵素をコードする１つ以上の遺伝子が、本発明による宿主細胞に組み込まれてもよいことが企図される。このような酵素は、上記の本明細書に言及されたクロレラもしくはボトリオスファエリアの酵素、またはヒヨスチアムス・ムティカス由来のプレムナスピロジエン・オキシゲナーゼ、またはＰ４５０ｃａｍもしくはＰ４５０ＢＭ−３変異体から例えば選択することができる。
【０１７２】
上記に示されたように、本発明は、本発明によるバレンセンシンターゼに対する特異的結合親和性を有する抗体に関する。用語「抗体」は、抗体の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２）への言及を含む。用語「抗体」は、分析物（抗原）を特異的に結合および認識する免疫グロブリン遺伝子（複数可）またはこの断片により実質的にコードされたポリペプチドを指すことが多い。しかし、さまざまな抗体断片は、インタクトな抗体の消化に関して定義することができるが、当業者は、このような断片が化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を利用してデノボ合成され得ることを理解する。故に、用語抗体には、本明細書で使用されるとき、一本鎖Ｆｖ、キメラ抗体（すなわち、異なる種由来の定常および可変領域を含む）、ヒト化抗体（すなわち、ヒト以外の供給源由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの抗体断片も含まれる。
【０１７３】
抗体またはこの断片は、抗体の合成のための当技術分野で知られた任意の方法により、特に、化学的合成または好ましくは組換え発現法により生産することができる。
【０１７４】
バレンセンシンターゼに対するポリクローナル抗体は、当技術分野でよく知られたさまざまな手順により生産することができる。例えば、異種バレンセンシンターゼは、バレンセンシンターゼに特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導するように、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されないさまざまな宿主動物に投与することができる。さまざまなアジュバントは、宿主種に応じて免疫学的応答を高めるのに使用することができ、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質ならびにＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントも、当技術分野でよく知られている。
【０１７５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で知られた多種多様な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られおよび、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版  １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）に教示されているものを含むハイブリドーマ法を用いて生産することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、ハイブリドーマ技術を通じて生産される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、これが生産される方法を指さない。
【０１７６】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生産しスクリーニングする方法は、日常的であり、当技術分野でよく知られている。簡単には、マウスがバレンセンシンターゼで免疫され、およびひとたび免疫応答が検出され（例えば、バレンセンシンターゼに特異的な抗体がマウス血清において検出され）れば、マウス脾臓が回収され、脾細胞が単離される。脾細胞は、次いで、任意の適切な骨髄腫細胞、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０由来の細胞に、よく知られた技法により融合される。ハイブリドーマは、限定希釈により選択され、クローン化される。ハイブリドーマクローンは、次いで、本発明のポリペプチドを結合できる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で知られた方法によりアッセイされる。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫して生成することができる。
【０１７７】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体を生成する方法は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含み、好ましくは、ハイブリドーマは、バレンセンシンターゼで免疫されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合すること、次いで、バレンセンシンターゼを結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合から得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより生成される。本発明による抗体は、例えばクロマトグラフィー担体物質に固定化された抗体を用いて、本発明に従って生産されたバレンセンシンターゼを単離するための方法において例えば使用することができる。
【０１７８】
さらに、本開示は、バレンセンまたはノートカトンを調製するための方法であって、本発明によるバレンセンシンターゼの存在下で、ポリプレニル二リン酸基質をバレンセンまたはノートカトンに変換することを含む方法に関する。このような方法は、本発明によるバレンセンシンターゼが使用されるという条件で、当技術分野で知られた方法論（例えば引用された先行技術に記載されているような）に基づくことができる。バレンセンまたはノートカトンは、細胞内で、または単離された酵素を用いて作製することができる。バレンセンまたはノートカトンは、これが形成される培地から単離することができる。これは、それ自体既知の方法において達成することができる。
【０１７９】
ノートカトンへのバレンセンの変換の反応ステップを触媒する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞においてノートカトンを調製することも可能であり、宿主細胞は好ましくはバレンセンシンターゼも含む。
【０１８０】
本発明は、これより、次の例により例示される。
【実施例】
【０１８１】
［実施例１］  活性試験のためのバレンセンシンターゼ変異体の調製
本発明によるバレンセンシンターゼ変異体（ＶａｌＣ＿変異体）をコードする遺伝子、およびバレンセンシンターゼ野生型（ＶａｌＣ＿ｗｔ、配列番号２）をコードする遺伝子を有する合成ＤＮＡ断片は、発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ，ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）においてＤＮＡ２．０（メンロパーク、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。バレンセンシンターゼ遺伝子は、ロドバクター属における改善された発現のためにＤＮＡ２．０によりコドン最適化されていた。プラスミドは、指定されたｐＡＣＹＣＤｕｅｔ：ＶａｌＣ＿変異体またはｐＡＣＹＣＤｕｅｔ：ＶａｌＣ＿ｗｔであった。ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ：ＶａｌＣ＿ｗｔのヌクレオチド配列を、配列番号５に示す。ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ：ＶａｌＣ＿変異体プラスミドのヌクレオチド配列は、バレンセンシンターゼ変異体の形成に必要とされるヌクレオチド置換を除いて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ：ＶａｌＣ＿ｗｔのものと同一である。
【０１８２】
エシェリキア・コリにおけるこれらのｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベースの組換えベクターの発現は、次のｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１由来Ｎ末端伸長：ＮＨ２−ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＱＤＰＨ−ＣＯＯＨを有するバレンセンシンターゼ（このＮ末端メチオニン残基を含む）の形成をもたらした。
【０１８３】
ＤＮＡ２．０から得た凍結乾燥ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１ベースのベクターを、各５０μＬ滅菌水に再溶解させ、３７℃で１．５時間インキュベートした。この後、９６ウェルフォーマットでの市販の化学的コンピテントなエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、供給者のプロトコル（Ｎｏｖａｇｅｎ；プロトコルＴＢ  ３１３  Ｒｅｖ．Ｂ０３０４）を適用して、１ウェル当たり１μＬ再溶解プラスミド溶液で形質転換した。各形質転換混合物（５０μＬプラスプレートにわたる液体の均一な分布を促進するための５０μＬＳＯＣ培地）を選択プレート（１％（ｗ／ｖ）グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地）に播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。全ての選択プレートはコロニーを含有したが、得られた形質転換体の数は、１プレート当たり１コロニーから５０を超えるまで大きく異なった。プレートをさらなる使用まで４℃で貯蔵した。
【０１８４】
個々の形質転換体の単一コロニーを、１％（ｗ／ｖ）グルコースおよび５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩成長させた。これらの一晩培養物を用いてグリセロールストックを調製し、−７０℃で貯蔵した。さらに、２００μＬの各一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２０ｍＬ  ２×ＹＴ培地を含む１００ｍＬ三角フラスコに移した。フラスコをＲｏｔｉｌａｂｏ（登録商標）培養栓（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ、カールスルーエ、ドイツ）で塞ぎ、ＯＤ６００ｎｍが０．６−０．８となるまで２５０ｒｐｍおよび３７℃でインキュベートした。次いで、２０μＬの１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を添加し、インキュベーションを２５０ｒｐｍおよび１８℃で一晩継続した。翌日、培養物を３，４００ｒｐｍで１５分間、５０ｍＬ管での遠心分離により回収し、この後、培養培地を除去した。この後、細胞ペレットを−２０℃で凍結貯蔵した。参照として、野生型バレンセンシンターゼ（配列番号２）をコードする遺伝子を含有するｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１で形質転換したエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を、これに応じて処理した。
【０１８５】
清澄化溶解物の調製のために、細胞ペレットを氷上で解凍し、１ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に再懸濁した。次いで、約０．２ｇのジルコニア／シリカビーズ０．１ｍｍ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｐｅｃ．ｃｏｍ／）を添加し、速度６．５のＢｉｏ１０１／Ｓａｖａｎｔ  ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ  １２０マシン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＬＬＣ、イルキルヒ、フランス）における１０秒間の振盪と、これに続く２分間の氷への管の移行、およびさらに１回の速度６．５での１０秒間の振盪により、溶解を達成した。この後、溶解物を１３，０００×ｇおよび４℃で１０分間遠心分離し、上清（＝清澄化溶解物）を酵素アッセイに直ちに使用した。
【０１８６】
試験するバレンセンシンターゼバリアントの数が、１日当たりに生産できる清澄化溶解物の数より大きかったため、毎日、清澄化溶解物も、参照としての野生型バレンセンシンターゼを発現する細胞から調製した。
【０１８７】
［実施例２］  バレンセンシンターゼ変異体の（特異的）生産性および生成物特異性の判定
変異体バレンセンシンターゼのバレンセン生産性の判定のために、次のアッセイを使用した。
ガラス管において以下を混合した：
−６５μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；
−８００μＬのアッセイ緩衝液（１５ｍＭ  ＭＯＰＳＯ（３−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）ｐＨ＝７．０；１２．５％（ｖ／ｖ）グリセロール；１ｍＭアスコルビン酸；０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭジチオスレイトール［使用直前に添加］；ＮａＯＨによる７．０までのｐＨ）；
−２０μＬの２５０ｍＭ  オルトバナジン酸Ｎａ；
−および５μＬの１０ｍＭファルネシル二リン酸（蒸発乾固させ、０．２Ｍカルバミン酸アンモニウムおよび５０％エタノールに溶解したＦＰＰ、Ｓｉｇｍａ）。
【０１８８】
反応は、３５μＬの清澄化溶解物の添加により開始した。混合後、ガラス管を３０℃で穏やかに撹拌しながら２時間インキュベートした。反応混合物を次いで２ｍＬ酢酸エチルで抽出し、１０秒間ボルテックスした。１，２００×ｇで１０分間遠心分離後、酢酸エチル層を回収し、硫酸ナトリウムカラムで脱水し、ＧＣ−ＭＳ分析に使用した。この目的のため、１μＬの酢酸エチル層からの分析物を、１ｍＬ／分の流速でキャリアガスとしてヘリウムを用いて、３０ｍ×０．２５ｍｍ、０．２５ｍｍ膜厚カラム（ＺＢ−５、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えた７８９０Ａ  ＧＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのガスクロマトグラフィーを用いて分離した。注入器（７６８３Ｂシリーズ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、注入口温度を２５０°Ｃに設定したスプリットモードで使用した。５５℃の初期オーブン温度は１５℃／分の速度で１分間後に３００℃まで上昇させ、３００℃で５分間保持した。ＧＣを質量選択検出器（モデル５９７５Ｃ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。化合物を同定し、バレンセンの真正標準のものと比較して、この質量スペクトル、保持時間およびＭＳクロマトグラムの表面積により定量化した。ゲルマクレンＡは、このコープ反応生成物β−エレメンの発生により同定し、バレンセンのものとの総イオンカウント表面積の比較により定量化した。
【０１８９】
このアッセイにおける清澄化溶解物の量（３５μＬ）および反応時間（２時間）は、形成されたバレンセンの量が、溶解物の量に直線的に依存する範囲で選択した。このアプローチは、生産性が改善されたバレンセンシンターゼ変異体が、このアッセイにより同定可能であることを確保する。
【０１９０】
発現レベルの違いに対して種々のバレンセンシンターゼ変異体のバレンセン生産性を補償するために、各清澄化溶解物中のバレンセンシンターゼタンパク質の相対量を定量化した。各清澄化溶解物から、６０μＬを２０μＬの４×試料緩衝液（以下の組成）に添加し、１００℃で２分間インキュベートし、凍結貯蔵した。分析のため、このストック溶液を、この後、１×試料緩衝液に１：５０希釈し、１００℃で２分間インキュベートし、短時間遠心分離した。１０μＬを、次いで、１２ウェルＲｕｎＢｌｕｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、ハーストン、ケンブリッジシャー、ＵＫ）に添加した。各ゲルに、陰性対照（空ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターを含有するエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の清澄化溶解物）および陽性対照（野生型バレンセンシンターゼをコードする遺伝子を有するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１を含有するエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の清澄化溶解物）も添加した。ゲルを２５ｍＡ／ゲルで３０分間、これに続いて５０ｍＡ／ゲルで６０分間、冷却条件下でランニング緩衝液（以下の組成）に流した。ゲルはＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ブレダ、オランダ）を用いて染色した。染色手順には、４０％（ｖ／ｖ）エタノール＋１０％（ｖ／ｖ）酢酸溶液での３０分間の固定、脱塩水での単回洗浄ステップ、これに続く暗所で非希釈ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色剤中での４時間のインキュベーションが含まれた。この後、ゲルを１０％（ｖ／ｖ）エタノール＋７％（ｖ／ｖ）酢酸溶液で１時間洗浄し、次いで脱塩水で短時間洗浄した。この染色手順は、線形応答曲線をもたらした。
【０１９１】
タンパク質バンドは、Ｐｏｓｔｓｔａｉｎモード、１００μｍピクセル、マトリックスタイプ：ゲル、およびＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ  １チャネル（励起フィルター４８０／３０ｎｍ、発光フィルター５９５／２５ｎｍ、ｅｘｐ０．２）を用いたＥｔｔａｎ  ＤＩＧＥ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ディーゲム、ベルギー）でゲルをスキャンして定量化した。バンドは、マニュアルレーン作成、ローリングボール（ｒｏｌｌｉｎｇ−ｂａｌｌ）バックグラウンド削除およびマニュアルピーク検出を用いたＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェアパッケージ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ディーゲム、ベルギー）により検出した。
【０１９２】
陽性対照を含むレーンは、分子量マーカーを含むレーン中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ）バンドよりもわずかに速く流れるエキストラバンドを常に示した。このエキストラバンドは、陰性対照には一貫して非存在であり、本発明による変異体バレンセンシンターゼを発現するエシェリキア・コリクローン由来の清澄化溶解物を添加したレーンに存在したため、バレンセンシンターゼ（Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグを含む）の計算された分子量は７０，９６７Ｄａであるが、このバンドはバレンセンシンターゼを表すと結論された。バレンセンシンターゼバンドの定量化は、次いで、陰性対照を含むレーン中のバックグラウンド強度を差し引き、陽性対照を含むレーン中の対応するバンドの強度に対して相対的に行った。
【０１９３】
試料緩衝液（１×）の組成は、以下であった：
−１０％（ｖ／ｖ）グリセロール
−１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
−０．２Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．６
−１％（ｗ／ｖ）フィコール４００  
−０．００６％（ｗ／ｖ）フェノールレッド
−０．００６％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＧ２５０
−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
【０１９４】
ランニング緩衝液の組成は、以下であった：
−０．０４Ｍトリシン
−０．０６Ｍトリス
−０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
−２．５ｍＭ亜硫酸水素ナトリウム
−ｐＨ＝８．２
【０１９５】
単一アミノ酸修飾を有するバレンセンシンターゼ変異体に関するこれらのインビトロ試験の結果を、表１に示す。
【０１９６】
【表１】
2014519841.tif 000002
2014519841.tif 000003
2014519841.tif 000004
2014519841.tif 000005
【０１９７】
表１の結果は、本発明による単一点変異を有するバレンセンシンターゼ変異体が、明らかに改善されたインビトロバレンセン生産性を示すことを示している。この試験系において野生型バレンセンシンターゼで得られたものと比べたこれらの変異体のバレンセン生産性は、１０３．６％（ＶａｌＣ：Ｅ３１９Ｑ）から３９７．８％（ＶａｌＣ：Ｉ４１０Ｆ）にわたる。試験したバレンセンシンターゼ変異体の多くに関して、この改善されたバレンセン生産性は、改善された特異的バレンセン生産性に伴うものであり、改善されたバレンセン生産性は、主として、エシェリキア・コリにおけるこれらの変異体の増加した発現の結果ではないという事実を指している。陽性対照と比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのバレンセンシンターゼバンドの強度が、野生型バレンセンシンターゼに属するバンドのものよりはるかに高いことから、本発明による他のバレンセンシンターゼ変異体は、明らかな発現変異体である。最後に、野生型バレンセンシンターゼとしてのバレンセンと比較して、はるかに少ないゲルマクレンＡを生産するバレンセンシンターゼ変異体が得られた。
【０１９８】
表２のデータは、本発明による少なくとも２つの点変異を含有するバレンセンシンターゼ変異体も、野生型バレンセンシンターゼと比較して、１００．６％（ＶａｌＣ：Ｖ４３６Ｗ、Ｌ４４９Ｙ）から２６６．７％（ＶａｌＣ：Ｑ４６３Ｓ、Ｆ４８８Ｓ）にわたる明らかに改善されたインビトロバレンセン生産性を示すことを証明している。
【０１９９】
【表２】
2014519841.tif 000006
【０２００】
［実施例３］  改善されたバレンセンシンターゼ変異体を発現するロドバクター・スフェロイデス株の構築
プラスミドｐＪ２４１−５９４４０−ｍｅｖ  Ａ２４１５  Ｔ４０８８  ｍｏｄ１における新規の合成メバロン酸オペロンの説明
パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス由来のメバロン酸オペロン（ＷＯ  ０６／０１８２１１およびＨｕｍｂｅｌｉｎ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ（２００２）２９７：１２９−１３９頁に記載された［アクセッションＡＪ４３１６９６］）の修飾バージョンを含有する合成ＤＮＡ断片をＤＮＡ２．０から購入し、ｐＪ２４１（ＤＮＡ２．０からの専売プラスミド）に挿入した。プラスミドをｐＪ２４１−５９４４０−ｍｅｖ＿Ａ２４１５＿Ｔ４０８８＿ｍｏｄ１と命名し、このヌクレオチド配列を配列番号６に示す。野生型ヌクレオチド配列と比較して、さらなるクローニングステップを促進することを意味しおよびサイレント変異により達成された修飾は、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅｌに対する認識部位の除去、ならびにメバロン酸オペロンインサート内（配列番号６における１２４０位から７８７５位）への、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩに対する固有の認識部位の導入を含んだ。
【０２０１】
プラスミドｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘをもたらす、ｐＢＢＲベースのプラスミドへの新規の合成メバロン酸オペロンのサブクローニング
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ｖａｌＦｐｏＲ−ｒｅｖ（特許出願、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８４８号および欧州特許出願第ＥＰ０９１７４９９９．０号に記載された）を、ＡｓｅＩで消化し、より大きい断片を単離し、自己ライゲートし、プラスミドｐ−ｍ−４８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘを得た。新たなプラスミドをＺｒａＩで切断し、６，６３６ｂｐ断片を単離した。プラスミドｐＪ２４１−５９４４０−ｍｅｖ＿Ａ２４１５＿Ｔ４０８８＿ｍｏｄ１もＺｒａＩで切断し、５，５６９ｂｐ断片を単離し、ｐ−ｍ−４８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘに由来する６，６３６ｂｐ断片とライゲートした。新たなコンストラクトを、正しい配向での挿入について確認し、ｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘと命名した。
【０２０２】
プラスミドｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘへの、本発明によるバレンセンシンターゼ変異体および野生型バレンセンシンターゼをコードする遺伝子の挿入による、プラスミドｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ変異体およびｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ  ｗｔの構築
本発明によるバレンセンシンターゼ変異体（ＶａｌＣ＿変異体）をコードする遺伝子、およびバレンセンシンターゼ野生型（ＶａｌＣ＿ｗｔ、配列番号２）をコードする遺伝子を有する合成ＤＮＡ断片は、一般的なクローニングベクターｐＪ２０１（専売ベクター  ＤＮＡ２．０）においてＤＮＡ２．０（メンロパーク、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。バレンセンシンターゼ遺伝子は、ロドバクターにおける改善された発現のためにＤＮＡ２．０によりコドン最適化されていた。プラスミドを、ｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿変異体またはｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿ｗｔと命名した。ｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿ｗｔのヌクレオチド配列を、配列番号７に示す。ｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿変異体プラスミドのヌクレオチド配列は、本発明によるバレンセンシンターゼ変異体の形成に必要とされるヌクレオチド置換を除いて、ｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿ｗｔのものと同一である。
【０２０３】
プラスミドｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘをＡｓｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、１２，１３６ｂｐ断片を単離した。プラスミドｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿変異体（表３、列２参照）およびプラスミドｐＪ２０１：ＶａｌＣ＿ｗｔは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、１，７７７ｂｐ断片を単離し、ｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ由来の１２，１３６ｂｐ断片とライゲートし、表３、列３に列挙した１８のｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ＿変異体プラスミドおよびｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ＿ｗｔを得た。
【０２０４】
プラスミドｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ変異体における合成メバロン酸オペロンｍｅｖ  Ａ２４１５  Ｔ４０８８  ｍｏｄ１のメバロン酸オペロンｍｅｖ−ｏｐ−４−８９との置換による、プラスミドｐ−ｍ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ変異体の構築
プラスミドｐ−ｍ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ−ｏｐｔは、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ｖａｌＦｐｏＲ−ｒｅｖ由来のｖａｌＦコード領域が、ｖａｌＣ−ｏｐｔコード領域（ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８４８およびＥＰ０９１７４９９９における配列番号１８、該配列は、参照により本明細書に組み込まれている）により置換されたという事実を除いて、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ｖａｌＦｐｏＲ−ｒｅｖと本質的に同じプラスミドである。
【０２０５】
プラスミドｐ−ｍ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ｖａｌＣ−ｏｐｔは、ＺｒａＩ、ＢｌｐＩおよびＳａｃＩで切断し、６，７３９ｂｐ  ＺｒａＩ−ＢｌｐＩ断片を単離した。ｐ−ｍｅｖＡＴ−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ＿変異体プラスミド（表３、列３）は、ＺｒａＩ、ＢｌｐＩおよびＡｓｉＳＩで切断し、７，２３４ｂｐ  ＺｒａＩ−ＢｌｐＩ断片を単離した。これらの断片を、この後、ｐ−ｍ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ｖａｌＣ−ｏｐｔ由来の６，７３９ｂｐ断片とライゲートし、プラスミドｐ−ｍ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｔｒｘ−ＶａｌＣ＿変異体を得た（表４、列３）。
【０２０６】
メバロン酸経路および本発明による変異体バレンセンシンターゼを発現するロドバクター・スフェロイデスＲｓ２６５−９ｃ株の構築
エシェリキア・コリＳ１７−１を表４、列３に示したプラスミドで形質転換し、得られた株は、ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８４８およびＥＰ０９１７４９９９に記載されたコンジュゲーションにより、プラスミドをロドバクター・スフェロイデスＲｓ２６５−９ｃに転移するのに使用した。
【０２０７】
【表３】
2014519841.tif 000007
【０２０８】
【表４】
2014519841.tif 000008
【０２０９】
［実施例４］  標準振盪フラスコ条件下でのロドバクター・スフェロイデス株の培養およびバレンセン生産の評価
凍結細胞ストックの調製
ロドバクター・スフェロイデス株の凍結細胞ストックは、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（プラスミド維持に妥当であれば）を含有する２ｍＬ  ＲＳ１０２培地にループフル（ｌｏｏｐ  ｆｕｌｌ）の凍結細胞を導入して調製した。前培養物を２４時間、２２０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で増殖させた。前培養物の２５０μＬアリコートを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する２５ｍＬのＲＳ１０２培地に移して増殖を開始した（ｔ＝０）。２５ｍＬ主要培養物を、２５０ｍＬバッフル付き三角フラスコ中で約２４時間、２２０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で増殖させた。細菌細胞培養物を、２５％の最終グリセロール含量および１２の６６０ナノメートル（ΟＤ６６０）での最終光学密度に達するように、滅菌無水グリセロールおよび滅菌水と混合した。得られた細胞懸濁液は、２ｍＬクライオバイアルに１．２ｍＬアリコートで無菌的に分配し、次いで使用まで−８０℃で凍結させた。
【０２１０】
振盪フラスコ手順
ロドバクター・スフェロイデス株の種菌は、２５０μＬの解凍しホモジナイズした凍結細胞ストックを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（プラスミド維持に妥当であれば）を含有する２５ｍＬのＲＳ１０２培地に導入して開始した。前培養物は、２５０ｍＬバッフル付き三角フラスコ中で２２０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃、２４−２８時間増殖させた。前培養物の適切なアリコートを、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（プラスミド維持に妥当であれば）を含有する２２．５ｍＬのＲＳ１０２培地に移して、０．１６の６６０ｎｍ（ΟＤ６６０）での初期光学密度で振盪フラスコ実験を開始した（ｔ＝０）。主要培養物を、２５０ｍＬバッフル付き三角フラスコ中で２２０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で増殖させた。８時間培養後、２．５ｍＬのｎ−ドデカンを細菌培養物に添加した。振盪フラスコ培養は、植菌から７２時間、２２０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で継続した。各々の種培養は、培養培地およびインサイチュ生成物回収のためのｎ−ドデカンで構成される２５ｍＬ全ブロスの最終容量を、２つの複製振盪フラスコに植菌するのに役立った。二相培養ブロスの試料（０．５ｍＬ）を２４時間間隔で除去し、増殖（ΟＤ６６０）、ｐＨおよび上清中のグルコースについて分析した。実験の最後に（ｔ＝７２時間）、二相培養ブロスをバレンセンの存在について分析した（以下の分析方法参照）。実験の最後に、１０μＬの培養ブロスを一般的な培養カウント寒天プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）に無菌的に播種し、３７℃で２４時間インキュベートしてコンタミネーションを試験した。
【０２１１】
分析方法
全ブロス中のイソプレノイド含量を分析するための試料調製
典型的な手順において、４００μＬ全ブロス試料をディスポーザブル滅菌１５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブに移し、４ｍＬアセトンで処理し、ＩＫＡ  Ｖｉｂｒａｘオービタルシェーカーで１，５００ｒｐｍで２０分間強く振盪し、次いで周囲温度で３０分間、卓上超音波槽中でインキュベートした。最後に試料を最大速度で遠心分離し、上清をガスクロマトグラフィーによる分析（以下参照）のためアンバークロマトグラフィーバイアルに移した。生成物収量は、次のように調製した真正バレンセンの標準溶液を用いて確立した校正曲線に基づき判定する：０．５ｍＬの真正バレンセンを１０ｍＬ容量フラスコに添加し、分析用ｎ−ドデカンで溶解する。バレンセン標準溶液のアリコート（２０、４０および８０μｌ）をディスポーザブル滅菌１５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブに移し、脱イオン化滅菌水（それぞれ、３８０、３６０および３２０μＬ）および４ｍＬアセトンで処理する。各混合物は、ボルテックスシェーカーで強くホモジナイズし、次いでガスクロマトグラフィーによる分析のためアンバークロマトグラフィーバイアルに移し、ここから校正曲線を得る。
【０２１２】
ガスクロマトグラフィー
ガスクロマトグラフィーは、Ｒｅｓｔｅｋ  Ｒｔｘ−５Ｓｉｌ  ＭＳキャピラリーカラム（３０．０ｍ×０．２８ｍｍ×０．５μｍ）を備えたヒューレットパッカードＧＣ  ６８９０機器で行う。注入器およびＦＩＤ検出器温度を、それぞれ３００℃および２５０℃に設定する。カラムを通過する気体流を１．５ｍＬ／分に設定する。オーブン初期温度を７０℃で０．５分間維持し、２０℃／分の速度で１５０℃まで上昇させ、次いで５℃／分の速度で２０５℃まで上昇させ、４０℃／分の速度で３００℃までさらに上昇させ、次いで６０℃に冷却し、次の注入までこの温度で３分間維持する。注入試料容量は、４：１スプリット比で１μＬである。生成物収量は、真正試料用に確立した校正曲線に基づき判定する。ゲルマクレンＡをβ−エレメンとして検出し、バレンセン用に決定した応答係数で定量化する。有機相中のバレンセンおよびβ−エレメンの含量は、全ブロス分析から推定した。全ブロス中のバレンセンおよびβ−エレメンの測定濃度は、ｎ−ドデカンについて見出された測定濃度との関係で決定する。
【０２１３】
［実施例５］  酵母におけるカマエシパリス・ノートカテンシス（Ｃ．ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）バレンセンシンターゼのインビボ発現
カマエシパリス・ノートカテンシスバレンセンシンターゼ（ＶａｌＣ、配列番号２）をコードする完全長オープンリーディングフレームは、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８４８号の実施例９（参照によりその実施例は本明細書に組み込まれている）に記載された方法において、プライマー６５−３ＡＴＧＤｕｅｔＦｗ
５’−ｔａｔａｔｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣ−３’
（下線を付されたΒａｍＨＩ認識部位）、およびＤｕｅｔＡＳ１  ５’−ＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＡ−３’でプラスミドｐＡＣ−６５−３から増幅した。配列番号３または４に示された配列を含むバレンセンシンターゼなどのこのバレンセンシンターゼのバリアントは、共通の一般知識および本明細書に開示された情報を用いて、類似の方法で酵母において発現させることができる。
【０２１４】
［実施例６］  植物におけるＶａｌＣの発現
配列番号２による配列を含むバレンセンシンターゼは、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８４８号の実施例１０（参照によりその実施例は本明細書に組み込まれている）に記載された方法で植物において発現させた。配列番号３または４に示された配列を含むバレンセンシンターゼなどのこのバレンセンシンターゼのバリアントは、共通の一般知識および本明細書に開示された情報を用いて、類似の方法で植物において発現させることができる。
【０２１５】
配列
【０２１６】
【化１】
2014519841.tif 000009
【０２１７】
【化２】
2014519841.tif 000010
【０２１８】
【化３】
2014519841.tif 000011
【０２１９】
【化４】
2014519841.tif 000012
【０２２０】
【化５】
2014519841.tif 000013
2014519841.tif 000014
【０２２１】
【化６】
2014519841.tif 000015
2014519841.tif 000016
2014519841.tif 000017
【０２２２】
【化７】
2014519841.tif 000018
2014519841.tif 000019
2014519841.tif 000020
【配列表】
2014519841000001.app
【国際調査報告】
2014519841.tif 000021
2014519841.tif 000022
2014519841.tif 000023
2014519841.tif 000024