(57)【要約】  特に高感度およびより繰り返し可能な性能の改善を達成するための、アッセイシステム、例えば、イムノアッセイ用の微小流体マイクロプレート装置および方法が開示される。また、好ましい実施形態において、捕捉抗体用のコーティング緩衝液の範囲の使用および、前記装置および方法の使用において最適な結果を達成するための、非常に狭い範囲内の特定の配合を有するコーティング緩衝液の使用を開示する。
2014503832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された微小流体マイクロプレート上の試料について、イムノアッセイまたはイムノアッセイ群を行うための改善された方法であって、
プライミング緩衝液をイムノアッセイ順序における第1の試薬として使用し、改善は、プライミング緩衝液が水の表面張力より低い表面張力の液体であることを特徴とする該方法。
【請求項２】
前記プライミング緩衝液が、アルコール、高タンパク質含量の水溶液および他の溶媒よりなる群から選択されることを特徴とする請求項1記載の改善された方法。
【請求項３】
前記プライミング緩衝液が、水性緩衝液であることを特徴とする請求項1記載の改善された方法。
【請求項４】
前記微小流体マイクロプレートが、水の表面張力より低い表面張力のプライミング液体を使用して、生体分子で予めコートされていることを特徴とする請求項1記載の改善された方法。
【請求項５】
前記プライミング緩衝液が、リン酸緩衝液（PBS）およびトリス緩衝液（TBS）よりなる群から選択される水性緩衝液であることを特徴とする請求項1記載の改善された方法。
【請求項６】
微小流体マイクロプレートを使用して行われるイムノアッセイの感度を向上させる方法であって、
捕捉抗体および／または検出抗体の濃度と比較して、適切に高濃度の捕捉抗体および／または検出抗体を使用する工程を含み、
前記の捕捉抗体および／または検出抗体の濃度が、従来の96-ウェルマイクロプレートでの同じアッセイに使用される前記の捕捉抗体および／または検出抗体の濃度より大きく、少なくとも20倍まで高いことを特徴とする該方法。
【請求項７】
約5マイクロリットルまでの試料のアリコートを累加し、各アリコートについて約1分間から約20分間インキュベートすることを特徴とする請求項1記載の改善された方法。
【請求項８】
さらに、最適なpHを有するコーティング緩衝液を選択する工程を含み、
前記最適なpHが、所定のアッセイ用の特定の捕捉抗体についてのコート緩衝液用の最適なpHから、プラスマイナス約0.4pH値から約1pH値未満の範囲内であることを特徴とする請求項1記載の改善された方法。
【請求項９】
各アッセイまたはアッセイ群について、異なるコーティング緩衝液を使用し、
さらに、前記コーティング緩衝液の最適なpHの範囲が、各アッセイまたはアッセイ群について異なることを特徴とする請求項8記載の改善された方法。
【請求項１０】
前記アッセイが、捕捉抗体クローン8D4-8を使用するヒトIL-4；捕捉抗体クローン4H450および4H1420を使用するヒトIL17-AF、捕捉抗体クローン6H617を使用するヒトIL-23、捕捉抗体JES6-1A12を使用するマウスIL-2、捕捉抗体クローンTC11-18H10.1を使用するマウスIL-17A、捕捉抗体AN-18を使用するマウスIFN-ガンマ、捕捉抗体クローン8B1.1D3を使用するヒトMIP3-アルファ、捕捉抗体クローン4H152を使用するヒトIL-17A、および捕捉抗体クローンMQ2-13A5を使用するヒトIL-6よりなる群から選択されることを特徴とする請求項8記載の改善された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、イムノアッセイへの適用を有するアッセイ装置および方法に関し、より詳細には、このようなアッセイの実施においてマイクロプレートの性能を改善するための、微小流体技術と、通常使用されるマイクロプレート構造との一体化に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
この出願は、非仮出願であり、一部分において、2011年1月28日に出願された米国仮出願第61/437,046号の優先権を主張し、同出願を参照により本願明細書に取り込む。
【背景技術】
【０００３】
イムノアッセイ技術は、「Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting and Clinical Applications; James Wu; AACC Press; 2000」に記載のように、各種の適用に幅広く使用される。最も一般的なイムノアッセイ技術は、1)  非競合アッセイであり、この一例として、広く知られているサンドイッチイムノアッセイであって、前記サンドイッチイムノアッセイでは、２つの結合剤を検体の検出に使用する。2)  競合アッセイ：1つの結合剤のみを1つの検体の検出に必要とする。
【０００４】
その最も基本的な形態において、前記サンドイッチイムノアッセイ（アッセイ）は、下記のように記載し得る。第1の結合剤として、捕捉抗体を（典型的に）、固相担体にコートする。前記捕捉抗体を、捕捉抗体が検体への特異的親和性を提供し、理想的にいずれの他の検体とも反応しないように選択する。この工程に続いて、標的検体を含む溶液をこの領域に導入し、これにより、前記標的検体が前記捕捉抗体に結合する。過剰な検体を洗浄して除去した後、第2の結合剤として、第2の検出抗体をこの領域に添加する。前記検出抗体も、前記検体への特異的親和性を提供し、理想的にいずれの他の検体とも反応しない。さらに、前記検出抗体は、典型的に、レポーター物質で「標識化」されている。前記レポーター物質は、多くの検出技術、例えば、光学的（蛍光画像法もしくは化学発光画像法または大面積画像法）、電気的、磁気的または他の方法の1つにより、検出できることを目的とする。前記アッセイ順序において、前記検出抗体は、さらに、検体−捕捉抗体複合体に結合する。過剰な検出抗体を除去した後、最後に前記検出抗体上のレポーター物質を、適切な技術手段により調べる。この方式では、前記レポーター物質からのシグナルが、試料中の検体濃度に比例する。いわゆる「競合」アッセイでは、検出抗体と（検出抗体＋検体）複合体との間の競合反応が生じる。検体または検体の類似体を、前記固相に直接コートし、固相検体（または類似体）に結合する検出抗体の量は、検出抗体の相対濃度と溶液中の遊離の検体濃度とに比例する。イムノアッセイ法の利点は、結合剤の使用により提供される標的検体に対する検出の特異性である。
【０００５】
ここで留意すべきは、上記は、従来のアッセイ法、例えば、タンパク質の検出についての最も一般的な形態に適用することである。イムノアッセイ技術を、目的の他の検体、例えば、制限されず、酵素、核酸等の検出にも使用できる。同様の概念を、さらに、「捕捉」抗原および検出検体を使用して、検体抗体を検出する場合を含めた、他の変形にも幅広く使用してきている。
【０００６】
本願明細書においておよび商業的に「マイクロプレート」、「96ウェルプレート」、「96ウェルマイクロプレート」と呼ばれる、96ウェルマイクロタイタープレートは、生化学実験室で役立ってきた。マイクロプレートは、イムノアッセイ（アッセイ）に基づく検出を含めた、幅広い各種の適用に使用されてきた。マイクロプレートの他の適用について、いくつかの例を挙げれば、保存用、細胞分析用、化合物スクリーニング用の媒体としての使用が挙げられる。96ウェルプレートは、現在全ての生化学実験室に遍在しており、かなりの設備、例えば、自動分注システム、自動プレート洗浄システムが開発されている。実際に、Society for Biomolecular Sciences（SBS）および米国規格協会（ANSI）は、マイクロプレートの特定の寸法についてのガイドラインを公表しており、ほとんどのメーカーは、それに従って、これらのプレートを取り扱える計装システムを調和させている。上記の基本的な自動機器に加えて、特定の態様のマイクロプレートの性能を改善するために開発された、特別な計装システムの多くの例がある。例えば、微小粒子用の分注システムを開示し、前記システムがマイクロプレートに微小粒子を充填することを目的とする米国特許第7488451号明細書、および細胞分析用のマイクロプレートにおいて、凝集パターンを分析する方法を開示する米国特許第5234665号明細書を参照されたし。
【０００７】
96ウェルプラットフォームは、非常に十分に確立され、一般的に受け入れられているが、いくつかの目立った欠点に悩まされる。各反応工程において、約50から100マイクロリットルの試薬量を必要とし、各インキュベート工程において、十分な反応を達成するのに、約1から8時間のインキュベート間隔を必要とし；前記インキュベート時間は、通常、特定の工程における試薬の濃度により影響を受ける。プレート当たりの収率を向上し、反応容量（およびその結果としてプレート当たりの操作コスト）を低減するための試みにおいて、研究者は、高密度様式、例えば、384および1536のウェルマイクロプレートを開発してきた。これらは、96ウェルと同じ外形（footprint）を有するが、ウェル密度およびウェル間の間隔が異なる。例えば、典型的な1536ウェルは、アッセイ工程当たり2〜5マイクロリットルの試薬しか必要としない。試薬量の多大な節約を提供するが、前記1536ウェルプレートは、再現性の問題に悩まされ、これは、極少量が容易に蒸発し、それによりアッセイ反応のための正味の濃度が変化してしまうためである。1536ウェルプレートは、通常、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」（HTS）アプローチと呼ばれる、専用のロボットシステムにより処理される。実際に、国際公開第WO05028110B1号パンフレットに開示されるように、研究者が、さらにプレート「密度」（すなわち、所定の面積におけるウェル数）を拡張させている、革新的な例がある。この例では、約6144ウェルのアレイを作製して、ナノリットルサイズの流体量を処理する。当然、これにも、専用の計装システムが必要である。研究者は、新規なデザインを開発するために、ほとんどの場合、前記SBS/ANSIのガイドラインの制限内で、マイクロプレート構造の改変にとてつもなく大きなエネルギーを注ぎ込んできた。この一例が、米国特許第7033819号明細書、米国特許第6699665号明細書および米国特許第6864065号明細書に開示され、前記開示において、ミクロンサイズのウェルの二次アレイが、従来の96ウェルマイクロプレートのウェルの底面に作製される。これらの小型ウェルは、この形式で可能な他の分析の中でも、細胞を捕捉し、細胞の運動パターンを研究するのに使用される。
【０００８】
小型化および自動化における次の段階は、微小流体システムの開発であった。微小流体システムは、米国特許第6429025号明細書、米国特許第6620625号明細書および米国特許第6881312号明細書に開示されるように、アッセイに基づく反応に理想的に適している。アッセイに基づく反応に加えて、微小流体システムは、アッセイの科学を研究するのにも使用されてきた。例えば、米国特許出願公開第20080247907A1号明細書および国際公開第WO2007120515A1号パンフレットには、アッセイ反応の速度反応論を研究するための方法が記載されている。
【０００９】
微小流体システムは、とりわけ米国特許第7534331号明細書、米国特許第7326563号明細書および米国特許第6900021号明細書に記載のように、細胞処理および細胞に基づく分析等の適用にも示されてきた。微小流体システムの重要な利点は、ハイスループットと非常に少ない反応容量の大規模な並行反応を行う能力であった。この例が、米国特許第7143785号明細書、米国特許第7413712号明細書および米国特許第7476363号明細書に開示されている。米国特許第6495369号明細書および米国特許出願公開第20060263241Al号明細書に開示のように、ハイスループット微小流体に特異的な計装システムも、広く研究され、開発されてきた。同時に、未だに完全に解決されていない重要な問題は、微小流体システムについてのworld-to-chipインターフェースの問題である。研究者は、通常、前記適用に依存して、この問題に対して、専用の溶液を開発してきており、その例が、米国特許第6951632号明細書に開示されている。このたった１つの問題が、微小流体の広範な採用へのかなりのボトルネックとなっていた。微小流体の広範な採用についてのもう１つの問題は、標準化されたプラットホームが無いことであった。ほとんどの場合、微小流体装置は、所定の適用に十分適した特定の設計を有するが、異なる位置に配置された液体の注入口および排出口をもたらす。実際に、当該技術分野において一般的に認められている微小流体装置の外形および厚さにおける共通性さえない。
【００１０】
この順序での次の論理的な段階は、当然、微小流体システムと標準化された96、384または1536のウェル設計との一体化である。ほとんどの場合、「微小流体」マイクロプレートが、従来のマイクロプレートと同じ外形を使用してさえいるが、その機能性は、米国特許出願公開第20060029524A1号明細書および米国特許第7476510号明細書における例により開示されるように、細胞分析について非常に特異的である。研究者は、標準的なマイクロプレートの形式をテンプレートとして広く使用して、微小流体装置を構築してきた。この例は、WitekおよびParkらの、「96-Well Polycarbonate-Based Microfluidic Titer Plate for High-Throughput Purification of DNA and RNA」Anal. Chem., 2008, 80(9), pp 3483-3491および、「A titer plate-based polymer microfluidic platform for high throughput nucleic acid purification」Biomedical Microdevices; Volume 10, Number 1 / February, 2008; 21-33および、「A 96-well SPRI reactor in a photo-activated polycarbonate (PPC) microfluidic chip」Micro Electro Mechanical Systems, 2007. MEMS. IEEE 20th International Conference on, 21-25 Jan. 2007 Page(s):433-436の研究、ならびにChoiらの「A 96-well microplate incorporating a replica molded microfluidic network integrated with photonic crystal biosensors for high throughput kinetic ; biomolecular interaction analysis」Lab Chip, 2007, 7, 1-8の研究、さらに、Tolanらの「Merging Microfluidics with Microtitre Technology for More Efficient Drug Discovery」JALA, Volume 13, Issue 5, Pages 275-279(October 2008)の研究、さらにまた、Jooらの「Development of a microplate reader compatible microfluidic device for enzyme assay」Sensors and actuators. B. Chemical; 2005, vol. 107, no2, pp. 980-985の研究により見られるような文献に沢山ある。具体的には、細胞に基づくアッセイについては、マイクロプレートと同じ外形を有する微小流体設計が、Leeらの「Microfluidic System for Automated Cell-Based Assays」Journal of the Association for Laboratory Automation, Volume 12, Issue 6, Pages 363-367により記載されており、CellAsic（http://www.cellasic.com/M2.html）による市販製品としても提供されている。これらの全てが、96（または384）ウェルプレートと同じ外形を基礎とし、プレートの全ての密度を生かしていない、微小流体装置の例である。
【００１１】
米国特許第6742661号明細書および米国特許出願公開第20040229378A1号明細書には、96ウェル構造と微小流体流路網との一体化の代表的な例が開示されている。好ましい実施形態において米国特許第6742661号明細書に記載のように、ウェルのアレイが、貫通孔ポートを介して微小流体回路に連結される。好ましい実施形態において、前記微小流体回路は、H型またはT型拡散装置でもよい。米国特許第6742661号明細書には、この装置内の液体の移動を制御するための手段も記載されている。前記装置は、静水力と毛細管力との組み合わせを使用して、液体の移動を達成する。米国特許第6742661号明細書により詳細に説明されているように、前記静水力は、(a) 付加的なウェル層を積み重ねることによりマイクロプレート構造に追加の厚みを加えること、または(b) 外部ポンプ駆動圧により既存の静水力を補うことのいずれかにより制御され得る。米国特許第6742661号明細書では、主に（上記のいずれかの方法を使用して調節した）静水力を使用し、微小流体回路への異なる注入口間で、前記静水力に差異がある。具体的には、静水圧の差異は、微小流体回路の異なる注入口に連結されるウェルにおける液柱の高さ（または深さ）の差異により生じるものと想定される。米国特許第6742661号明細書に示される前記装置の概念は、層流拡散インターフェース（LFDI）型の微小流体装置と96ウェル構造とを一体化するための、確実に革新的な解決策である。しかしながら、米国特許第6742661号明細書では、前記開示された装置のウェルから生じて、ウェルに終結する自己完結型の流体流れパターンのみが想定されている。さらに、米国特許第6742661号明細書に記載の流量制御技術は、広義のカテゴリーである、前記液柱の静水圧が流れ特性を制御する「圧力駆動」流に入る。米国特許出願公開20030049862A1号明細書は、微小流体と標準的な96ウェル構成とを一体化するための試みにおける、もう1つの例である。米国特許出願公開20030049862A1号明細書では、慣例的に受け入れられるものとわずかに異なる方法において「微小流体」が規定されていることに留意することが非常に重要である。米国特許出願公開第20030049862A1号明細書では、「流体基材またはプレート自身に流体流路を配置する現在の技術と異なり、本発明では、各流体モジュールに流体流路を設置する。」と規定されている。これは、マイクロプレートの名目上一致する円筒状ウェル内に、適切なサイズの円筒状のインサートを挿入することにより達成される。挿入された円筒の上面とウェルの底面との間の一致した間隔を確保することにより、「微小流路」が規定される。さらに、米国特許出願公開第20030049862A1号明細書に開示の前記装置の設計は、例えば、マイクロポンプの使用による自動的手段、または、例えば、ピペットの使用による手動的手段によるかどうかの、外部フロー制御により本質的に決められる。
【００１２】
米国特許出願公開第20030224531A1号明細書には、エレクトロスプレー適用のウェル構造（標準的な設計の96、384、1536のウェルプレートにおけるウェル構造を含む）に連結する微小流路の一例も開示されている。米国特許出願公開20030224531A1号明細書では、ミクロンもしくはサブミクロン寸法の深さの、浅い処理領域のもう1つのアレイに連結される試薬ウェルのアレイを使用する。前記処理領域は、一端で前記試薬ウェルに連結され、他端でエレクトロスプレー放射体チップに連結される。流体移動用の力（米国特許出願公開第20030224531A1号明細書に規定の駆動力）が、好ましくは、流体柱にわたる電位、または、前記流体柱にわたる圧力差により供給され、流体の移動が、純粋に毛細管力によるものである、本発明とは明らかに異なる。前記処理領域への連結は、注入微小流路および排出微小流路を介してもよく、前記微小流路は、更なる機能性（例えば、標識化または精製）を提供するように構成される。
【００１３】
国際公開第WO03089137A1号パンフレットには、96ウェルプレートのスループットを向上するための、さらにもう1つの革新的な方法が開示されている。この開示では、アッセイは、金属酸化物基材、好ましくは、酸化アルミニウム基材内のナノメートルサイズの流路内で行われる。国際公開第WO03089137A1号パンフレットに開示のように、個々の各ウェルは、底面に付着した金属酸化物膜基材を有する。操作中、各ウェルは、個々に密封され、一般的な供給源から真空（または圧力）が適用される。真空（または圧力）により、ウェル内の液体を基材の底面に向けて（または底面から離れるように）力を加える。この方法では、アッセイ試薬を前記膜上の超小型の開口間を行ったり来たりすることにより、アッセイ性能の顕著な改善を達成し得る。国際公開第WO03089137A1号パンフレットに記載の革新は、真空および／または圧力の供給源に依存して、金属酸化物基材内の液体の移動を調節しており、最適な性能を達成するために、正確な圧力制御装置を必要とする。
【００１４】
米国特許出願公開第2009123336A1号明細書には、一連のウェルに連結された微小流路のアレイを使用することが開示され、前記アレイにおいて、前記ウェルは、384ウェルプレートの形式である。米国特許出願公開第2009123336A1号明細書に記載のように、充填ウェルは、384ウェルプレート上の「ウェル」それぞれの位置に配置された、複数の検出チャンバ用の共通の注入口としての役割を果たす。重要なことに、米国特許出願公開第2009123336A1号明細書では、単一の充填ポイントに連結された複数の検出チャンバを使用することに限定している。高密度微小流体網に微小流体を相互に連結させる挑戦は、不可能ではないがきわめて困難なためである。このことは、米国特許出願公開第2009123336A1号明細書の発明についての使用方法を制限させ、連続的に連結された各チャンバにおける特有のアレイを、特別な処理工程を実行するために必要とする。具体的には、米国特許出願公開第2009123336A1号明細書に開示のように、連続的に連結された各チャンバにおける特有のアッセイを実行する唯一の方法は、チャネル表面を密封する前に、チャネル表面上に捕捉抗体を付着させることである。この工程は、本質的に、(a) 所望の液量を、(b) 正確に規定された位置に的確に供給する、高機能の分注システムを必要とし、これが、システムのコスト全体に加わる。この開示の他の実施形態では、共通の溶液が、流路の一端を前記溶液に浸すことにより、連続的に連結されたチャンバのアレイに吸い込まれる。発明者らは、「共通の充填流路が存在する場合、毛細管力または圧力差により、全ての流路に同時に、試薬を充填し得る・・・」ことも特許請求している。理論的には正しいが、複数の分岐流路における流れを単一の供給源により調節することが、現実的には不可能であることは、微小流体の分野においてよく知られている。複数のこのような流路間で行われるアッセイにおける変動を示唆する、少なくとも1つの分岐流路において、常に優先的により高い流速があるであろう。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の下記の記載から、本発明は、ポイント・オブ・ケア検査（POCT）適用に、特に適していることが理解されるであろう。POCT適用について、多くの場合、上記のような適用に広くダイナミックな範囲にわたって検出できる、イムノアッセイに基づく試験アプローチに使用することが望ましい。POC検査に最も一般的な方法は、いわゆる「ラテラルフローアッセイ」（LFA）法の使用によるものである。LFA法の例は、米国特許第5710005号明細書、米国特許第7491551号明細書、米国特許出願公開第20060051237A1号明細書および国際公開第WO2008122796A1号パンフレットに記載されている。LFA用の特に革新的な技術も、国際公開第WO2008049083A2号パンフレットに記載されており、市販の紙を基材として使用し、非浸透性（水性）境界線のフォトリソグラフィーパターニングにより、流路を規定する。LFA技術の進歩は、米国特許出願公開第20060292700A1号明細書等に開示されており、同開示において、拡散パッドが、複合体の均一性を改善するのに使用され、これにより、アッセイ性能の改善を提供する。他の開示、例えば、国際公開第WO9113998A1号パンフレット、国際公開第WO03004160A1号パンフレットおよび米国特許出願公開第20060137424A1号明細書では、いわゆる「微小流体」技術を使用して、より進歩したLFA装置を開発してきた。
【００１６】
微小流体LFA装置は、一般的に、膜（または多孔質パッド）に基づくLFA装置より、良好な再現性を有すると考えられる。微小流路または微小流路＋正確な流れ抵抗パターンの組み立てにおいて、これらの装置で利用できる精度が正確であるためである。一部の場合において、米国特許出願公開第20070042427A1号明細書に開示されたもの等の装置は、微小流体とLFAとの両方の技術分野において、共通して使用される技術を組み合わせる。米国特許出願公開第20070042427A1号明細書に開示のように、蛇腹型ポンプにより流れが開始され、その後、吸収パッドにより保持される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第7488451号明細書
【特許文献２】米国特許第5234665号明細書
【特許文献３】国際公開第WO05028110B1号パンフレット
【特許文献４】米国特許第7033819号明細書
【特許文献５】米国特許第6699665号明細書
【特許文献６】米国特許第6864065号明細書
【特許文献７】米国特許第6429025号明細書
【特許文献８】米国特許第6620625号明細書
【特許文献９】米国特許第6881312号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第20080247907A1号明細書
【特許文献１１】国際公開第WO2007120515A1号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第7534331号明細書
【特許文献１３】米国特許第7326563号明細書
【特許文献１４】米国特許第6900021号明細書
【特許文献１５】米国特許第7143785号明細書
【特許文献１６】米国特許第7413712号明細書
【特許文献１７】米国特許第7476363号明細書
【特許文献１８】米国特許第6495369号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第20060263241Al号明細書
【特許文献２０】米国特許第6951632号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第20060029524A1号明細書
【特許文献２２】米国特許第7476510号明細書
【特許文献２３】米国特許第6742661号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第20040229378A1号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第20030049862A1号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第20030224531A1号明細書
【特許文献２７】国際公開第WO03089137A1号パンフレット
【特許文献２８】米国特許出願公開第2009123336A1号明細書
【特許文献２９】米国特許第5710005号明細書
【特許文献３０】米国特許第7491551号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第20060051237A1号明細書
【特許文献３２】国際公開第WO2008122796A1号パンフレット
【特許文献３３】国際公開第WO2008049083A2号パンフレット
【特許文献３４】米国特許出願公開第20060292700A1号明細書
【特許文献３５】国際公開第WO9113998A1号パンフレット
【特許文献３６】国際公開第WO03004160A1号パンフレット
【特許文献３７】米国特許出願公開第20060137434A1号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第20070042427A1号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting and Clinical Applications; James Wu; AACC Press; 2000
【非特許文献２】96-Well Polycarbonate-Based Microfluidic Titer Plate for High-Throughput Purification of DNA and RNA」Anal. Chem., 2008, 80(9), pp 3483-3491
【非特許文献３】A titer plate-based polymer microfluidic platform for high throughput nucleic acid purification」Biomedical Microdevices; Volume 10, Number 1 / February, 2008; 21-33
【非特許文献４】A 96-well SPRI reactor in a photo-activated polycarbonate (PPC) microfluidic chip」Micro Electro Mechanical Systems, 2007. MEMS. IEEE 20th International Conference on, 21-25 Jan. 2007 Page(s):433-436
【非特許文献５】A 96-well microplate incorporating a replica molded microfluidic network integrated with photonic crystal biosensors for high throughput kinetic ; biomolecular interaction analysis, Lab Chip, 2007, 7, 1-8
【非特許文献６】Merging Microfluidics with Microtitre Technology for More Efficient Drug Discovery, JALA, Volume 13, Issue 5, Pages 275-279(October 2008)
【非特許文献７】Development of a microplate reader compatible microfluidic device for enzyme assay」Sensors and actuators. B. Chemical; 2005, vol. 107, no2, pp. 980-985
【非特許文献８】Microfluidic System for Automated Cell-Based Assays, Journal of the Association for Laboratory Automation, Volume 12, Issue 6, Pages 363-367
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明は、上記技術の欠点に対処することを目的とし、微小流体技術とマイクロプレートプラットホームの標準化されたプラットホームとの利点を一体化する、容易かつ信頼性の高いシステムを提供することを目的とする。本発明に基づく「微小流体マイクロプレート」が、従来のマイクロプレートと同じサイズに設計された、現在利用できる従来の市販の設備全てと、完全に互換性あるという点において、本発明により検討される装置および方法も新規である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本願明細書で説明するように、本発明のこの開示の目的のために、共通してこれにより割り当てられた、公開された国際特許出願番号PCT/US2010/042506の内容を、その全てを参照により、かかる内容の主題のいずれかの部分が、本願明細書に特に記載しない範囲まで本願明細書に取り込む。
【００２１】
一態様において、本発明は、選択された微小流体マイクロプレート上の試料について、イムノアッセイまたはイムノアッセイ群を行うための改善された方法であって、プライミング緩衝液を、イムノアッセイ順序における第1の試薬として使用し、改善は、プライミング緩衝液が水の表面張力より低い表面張力を有する液体であることを特徴とする方法に関する。
【００２２】
もう1つの態様において、本発明は、微小流体マイクロプレートを使用して行われるイムノアッセイの感度を向上させる方法であって、捕捉抗体および／または検出抗体の濃度と比較して、適切に高濃度の捕捉抗体および／または検出抗体を使用する工程を含み、前記の捕捉抗体および／または検出抗体の濃度が、従来の96ウェルマイクロプレートでの同じアッセイに使用される捕捉抗体および／または検出抗体の濃度より大きく、少なくとも２０倍まで高いことを特徴とする方法に関する。
【００２３】
本発明の他の態様、ならびにその目的および利点は、下記の記載から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、96ウェルのアレイが貫通孔を介して、96本の個々の微小流路に連結される本発明の一実施形態の平面図を示す。示されたマイクロプレートアレイは、（一般的に認められたANSI標準により規定される）従来のマイクロプレートの寸法と一致する。ウェルの配置も、ANSI標準と一致する。各ウェルは、基材の反対面の微小流路に連結される。図１には、明確にするために、（微小流路用の）シール層および吸収パッドを示していない。また、正面図の右手下方のコーナーにおける選択されたウェルは、説明を容易にするために、微小流路パターンを示していない。
【図２】図2は、ウェル構造、微小流路構造、シール層および吸収パッドの相対的な位置を説明する、本発明の一実施形態の一部の断面図を示す。各ウェルは、基材の反対面上の微小流路に連結される。微小流路は、開口を有するシール層により順に密封される。シール層上の開口は、他方において、吸収パッドに連結する。液体がウェルに導入された際、前記液体は、毛細管力により微小流路に引き込まれ、前記液体は、前記テープにおける前記開口に到達するまで、前記微小流路に沿って伝わる。その結果、液体の先端が、より強力な毛細管力を発揮し、ウェルが空になるまで液体を引き込む、前記吸収パッドに接触する。ウェル−微小流路界面での界面構成により、前記液体が微小流路からも空になり、または、液柱の後端がウェル−微小流路界面に達した際に、液体の動きが止まるであろう。後者の場合、前記液体は、前記微小流路に満たされたままである。
【図３】図3は、微小流体マイクロプレートおよび関連するホルダーを構成する部分の詳細を含む、本発明の一実施形態の三次元図を示す。図3Aに、微小流体マイクロプレートの基本的な構成：基材層、シール層および吸収パッドを示す。図3Bに、適切なホルダーを有する微小流体マイクロプレートの使用を示す。下部の挿入図に、ウェル、貫通孔および微小流路構造を示す前記基材層の拡大図を示す。
【図４Ａ】図4Aは、ウェルと微小流路とを連結する貫通孔が特定の規則に従う本発明の好ましい実施形態を示す。示された好ましい実施形態では、前記孔の幅（w）は、前記孔の深さ（d）より大きい、および少なくとも等しい。これにより、液体が前記ウェルに導入された際、前記液体の前方メニスカスが、前記シールテープの表面を「浸し」、接触できることが確保される。前記メニスカスは、前記孔の一部に連結された微小流路の四方の「壁」全て（上図の左手側）にも接触する。その後、毛細管力により、前記液体が前記ウェルから引き出され、前記微小流路を満たすであろう。
【図４Ｂ】図4Bは、ウェルと微小流路とを連結する貫通孔が前記ウェル構造と前記微小流路との間の界面のテーパー部分機構を含む本発明の別の態様を示す。好ましくは、前記貫通孔上端の幅（w）は、前記孔の深さ（d）より大きい、および少なくとも等しい。さらに、前記貫通孔も、テーパー状の壁を有する。前記貫通孔壁の（水平に対する）テーパー角は、前記貫通孔直前のウェル構造の基部での壁のテーパー角より大きいか、または少なくとも等しい。これにより、液体がウェルに導入された際、前記液体の前方メニスカスが、前記シールテープの表面を「浸し」、接触できることが確保される。前記メニスカスは、前記孔の一部に連結された微小流路の四方の「壁」全て（上図の左手側）にも接触する。その後、毛細管力により、前記液体が前記ウェルから引き出され、前記微小流路を満たすであろう。
【図５Ａ】図5は、ウェルの底部で貫通孔に連結している、本発明の好ましい実施形態の微小流路部分の別の構成を示す。図5Aにおいて、前記貫通孔の断面積から前記微小流路の断面積への急な移行がある。前記微小流路の断面積が非常に小さいため、前記ウェルを出る液体は、前記界面で止まるであろう。
【図５Ｂ】図5Bにおいて、前記微小流路は、接点孔よりわずかに大きく、さらに、流路の断面は、最終寸法に徐々にテーパーとなる。この場合において、前記液体が前記ウェルを出る場合、前記微小流路が完全に空になるまで、前記液体は、（吸収パッド中に）流れ続けるであろう。
【図６】図6は、通気孔が流路に組み込まれている本発明の一態様を示す。示された前記通気孔機構の三次元模式図は、前記液体が前記ウェルから空になっているが、前記微小流路を未だに塞いでいる場合、流れを「止める」能力を確保することを示す。前記通気孔により、前記吸収パッドの「陰圧」（すなわち、毛細管吸引力）を大気圧と釣り合わせ、前記微小流路における液柱の全域において圧力差が無いことが確保される。従来のシールテープおよびパッドは、明確にするために示していない。この実施形態において、前記通気孔は、排出口（上図において通気口の右に向かう微小流路の端部における排出口）からわずかにずらされている。液体がウェルに充填され、毛細管力により流路に引き込まれ、前記パッドに移動する。前記ウェルが完全に空になった後、前記液柱の前端は、なおも、より多くの液体を引き込み続けるであろう、前記吸収パッドに接触している。次いで、前記液体は、（前端から）前記流路内に引き込まれるであろう。図8に示す実施形態を使用して、前記液体が前記通気孔を横切るまで、液体を常に排出口から引き込むのを確保する。前記液体を（テープ上の）排出口から引き込む時、前記流路が親水性テープにより密封されている2つの角における液体の薄層により、流れが持続する。前記液体が前記通気孔を横切る時、前記パッドの毛細管吸引力は、流れを停止させる前記通気口からの大気圧により釣り合わされる。
【図７】図7Aおよび図7Bは、本発明の好ましい実施形態に基づく装置における微小流路パターンの実施形態を示す。前記流路パターンは、図7Aに示すように、曲がりくねり得る。前記流路パターンは、前記接点孔から前記吸収パッドへの流路において連続的なテーパーがあるように、さらに修飾され得る。前記テーパーにより、前記液柱の前端における毛細管力が向上し、前記流路がテーパーとなっていない場合とは異なる流速をもたらすことが確保される。
【図８】図8Aおよび図8Bは、本発明の好ましい実施形態における流路のさらに他の構成を示す。複合流路形状が、そこに組み込まれて、（蒸発による）液体損失が発生する時、前記液柱が常に前記排出口から引き込まれるであろうこと、前記液柱の注入口位置が前記貫通孔と前記微小流路との界面で保持されなければならないことを確保する。ここで留意すべきは、始端部分および終端部分についての数値は、前記微小流路の残りの部分とは異なることを示すためのものであり、記載の数値に限定されないことである。
【図９】図9は、微小流体マイクロプレートの微小流体流路部分における複合形状の使用を含む、本発明の実施における流速および蒸発速度についてのこれらの実施形態の異なる流路および影響に関する、本発明の他の好ましい実施形態を示す。らせん状の微小流体流路図における種々の色は、試験された種々の寸法を表わす。添付の表に示すように、高流速のために終端部分のサイズを大きくすると、蒸発により最後のループにおける液体損失の時間が顕著に長くなる。ここで留意すべきは、より長い終端部分が使用される場合、注入口で（貫通孔界面で）の毛細管力をより高くすることで、前記液体がインキュベート期間中に注入口端から決して「移動」しないことを確保する。前記表にも示すように、始端部分に関するより小さい寸法を使用することにより、大いに流速を低減させる（流路を流れる際の液体の滞留時間をより長くさせる）。前記より小さい始端部分は、より強い毛細管力も発揮し、液体が、インキュベーション中に注入口端部から移動しないことを確保する。
【図１０】図10は、感度を向上するためにポリマービーズを使用する、本発明の実施形態を示す。図10Aにおいて、前記微小流路は、微小ビーズを詰め込まれる。これにより、さらに、前記微小流路内の体積に対する表面積比を向上する。図10Bにおいて、前記ビーズは、前記貫通孔構造にのみ詰め込まれ、一本の流路が、前記貫通孔の垂直な視線から液体を引き込むのに使用される。図10Bの実施形態において、前記貫通孔内に詰め込まれたビーズのアレイは、反応チャンバとして機能する。（図4に記載の制約がもはや通用しないため）前記貫通孔の寸法を調整して、感度を調節し得る。
【図１１】図11は、微小流体マイクロプレートにおいて細胞を処理するのに適した、本発明の好ましい実施形態を示す。柱配列が、前記流路に組み立てられる。細胞を含む溶液が、前記ウェルに導入されるならば、前記溶液は、前記微小流路に引き込まれ、前記溶液は前記柱配列を通過するが、前記細胞は、前記柱配列で捕捉されるであろう。
【図１２】図12は、本発明の好ましい実施形態における流路のさらにもう1つの実施形態を示す。この実施形態において、前記微小流路は、ウェルのアレイを含む層に由来する分離層上に組み立てられる。前記微小流路は、前記微小流路を含む基材の両面上に伸び、さらに、反対面からの流路は、前記流路基材上の付加的な貫通孔を介して連結される。これにより、流路長が非常に伸び、その結果として、反応についての総表面積および容量が拡大する。
【図１３】図13は、特有の吸収パッドが各微小流路に連結される、本発明の好ましい実施形態を示す。この実施形態において、分離された吸収パッドは、96ウェルのそれぞれに使用される。さらに、前記吸収パッドは、前記マイクロプレートに物理的に貼り付けられず、または、前記吸収パッドは、操作のために配置される前記マイクロプレートを越えて基部層に貼り付けられる。さらに、前記パッドは、前記ウェルおよび前記微小流路と同じ垂直の目線ではない。説明を簡単にするために、マイクロプレート装置全体では、96個の区別されるパッドを含むが、1本の横列の吸収パッドのみを示す。
【図１４】図14Aおよび図14Bは、吸収パッドを圧縮する効果を示す、本発明のさらに好ましい実施形態に基づく装置の断面図を示す。図14Cに、突出構造を使用することにより、前記吸収パッドと前記微小流路との間の確実な接触を確保するための別の実施形態を示す。図14A      は、前記吸収パッドが前記マイクロプレートに（例えば、接着剤を使用することにより）貼り付けられた際、前記シールテープでの界面は、合理的に平坦である。前記吸収パッドが基部層により圧縮された際、前記パッドは、前記シールテープにおいて、前記孔中に出っ張り、図14Bに示すように、囲まれた微小流路断面に密接に近接する（または物理的に接触する）。後者により、前記液体が前記吸収層に容易に接触することが、確保される。前記吸収パッドは、前記基部層上にも載せられ得る。図14Cにおいて、上段の図に、前記微小流体流路の端部における前記突出構造の模式図を示す。下段（一連の6つの画像）に、前記突出構造および前記微小流体流路の端部の、別の実施形態の三次元図を示す。これらの画像では、前記突起は上側に向かっているが、上段の模式図では、前記突起が底面に向かっていることに留意されたし。
【図１５】図15は、吸収パッドが微小流路の横列または縦列に対して共通である吸収パッドの配置を説明する、本発明の好ましい実施形態を示す。この実施形態において、前記吸収パッドは、各縦列（または各横列）に連結されたストリップとして構成される。さらに、前記パッドは、前記ウェルおよび前記微小流路と垂直な視線が同じではない。説明を簡単にするために、マイクロプレート装置全体では、12個の区別される縦列（または8つの区別される横列）を含むが、2本の縦列の吸収パッドのみを示す。
【図１６】図16は、図15に示すものと同様の前記吸収パッド配置についての別の実施形態を示す。前記別の実施形態において、吸収パッドは、微小流路の横列または縦列に対して共通であり、さらに、前記吸収パッドは、微小流路として基材の反対側にある。
【図１７】図17は、前記微小流路の付加的部分が毛細管ポンプおよび、前記吸収パッドを置き代えるための排液容器として使用される、本発明のさらに好ましい実施形態を示す。この実施形態において、前記微小流体マイクロプレートは、前記吸収パッドを置き代えるための前記毛細管ポンプとして、付加的な長さの微小流路を使用する。前記プレートは、2層：（ウェル、貫通孔および微小流路を有する）前記基材および前記シール層のみに低減される。この実施形態におけるウェルあたりに添加され得る液体の全量は、「排出」流路部分の容量に限定される。
【図１８】図18は、微小流体挿入プレートが単一の連続的な基材の代わりに使用される、本発明に基づく前記装置のもう1つの好ましい実施形態を示す。この実施形態において、前記微小流体流路およびウェルは、従来の96ウェルプレートの形状と一致する外枠（enclosure）により組み立てられた、分離された基材上に組み立てられる。前記プレート（ウェル＋微小流路）は、前記外枠によってのみ配置され、前記外枠から取り外し得る。図18Aに示すように、前記ウェルが上を向き、溶液を前記ウェルに添加し得るように、最初に前記プレートの方向を合わせる。図18Bに示すように、全ての溶液を添加した後、前記プレートを前記外枠から取り外し、前記ウェルが下方を向き、前記チャネルが上方を向くように、ひっくり返し、搭載する。これにより、前記流路を検出システムに密接に近接させる。説明を簡単にするために、1つのピペット分注器および1つのフォトダイオードのみを示す。
【図１９】図19は、微小流体挿入プレートが単一の連続的な基材の代わりに使用され、付加的な層が、検出中の光学的なクロストークを最小化するために使用される、本発明のさらにもう1つの好ましい実施形態を示す。この実施形態において、前記微小流体流路およびウェルは、従来の96ウェルプレートの形状と一致する外枠により組み立てられた、分離された基材上に組み立てられる。前記プレート（ウェル＋微小流路）は、前記外枠によってのみ配置され、前記外枠から取り外し得る。前記ウェルが上を向き、溶液を前記ウェルに添加し得るように、最初に前記プレートの方向を合わせる（図示せず）。全ての溶液を添加した後、前記プレートを前記外枠から取り外し、前記ウェルが下方を向き、前記チャネルが上方を向くように、ひっくり返し、搭載する。さらに、前記付加的な層が前記微小流路の外形に一致するウェル構造を有するように、さらにもう1つの層を追加する。前記付加的な構造は、好ましくは、検出中のクロストークを最小化するために、不透明材料で作製されるべきである。説明を簡単にするために、2つのフォトダイオードのみを示す。
【図２０】図20は、複数の微小流体挿入プレートが使用されること以外は、図18のものと同様の、本発明に基づく好ましい実施形態を示す。この構成において、前記微小流体流路およびウェルは、従来の96ウェルプレートの形状と一致する外枠上に配置される、複数の分離された基材上に組み立てられる。図20において、一実施形態では、個々の基材のそれぞれが、ほぼ従来のガラスプレートのサイズ（約25mm×75mm）であることを示す。
【図２１Ａ】図21Aは、複数の微小流体反応チャンバが共通の充填ウェルに連続的に連結される、本発明に基づく一実施形態を示す。この実施形態において、1つの充填ウェルは、反対面の微小流路に連結され、さらに、前記充填ウェルの下部で間接的に、他の微小流路部分に連結される。液体が前記ウェルに充填された際、前記液体は、一連に連結された全ての微小流路部分（4つの部分）を通って流れるであろう。全24個の区別される充填ウェルそれぞれは、全部で4つの反応チャンバに連結する。前記微小流路は、前記流路部分の連続的な連結に適合するように、修飾され得る。
【図２１Ｂ】図21Bは、前記充填ウェルと前記微小流体反応チャンバとは、同じ垂直な視線ではない、本発明に基づく一実施形態を示す。この実施形態において、1つの充填ウェルは、ただ1つの微小流路に連結されるが、前記微小流路および前記充填ウェルは、垂直な視線がずれている。前記微小流体反応チャンバは、従来の96ウェルマイクロプレート配置において規定される、もう1つの「ウェル」のウェル位置を占有する。この構成により、（挿入された三次元図に示すように）in-outのらせん状の微小流体反応チャンバに連結する、簡易化した形状のウェルを使用し得る。
【図２１Ｃ】図21Cは、複数の充填ウェルが「半自動」の微小流体マイクロプレート用の1つの微小流体反応チャンバに連結される、本発明に基づく更なる実施形態を示す。
【図２１Ｄ】図21Dは、複数の充填ウェルが「半自動」の微小流体マイクロプレート用の1つの微小流体反応チャンバに連結される、本発明に基づく更なる実施形態を示す。
【図２２】図22は、長期間の低流速に特に十分に適した、本発明に基づく好ましい実施形態を示す。この実施形態において、前記マイクロプレートは、この実施形態と共に使用するために特別に構成された治具に搭載される。前記治具は、室温または、前記吸収パッドの下側を通過し、前記治具を通して上昇した温度で空気を送り込み得るエアポンプに連結される。低く一定の流速を長期間要求される工程の前に、更なる液体を少しも吸収できないように、高容量の液体を添加して、前記パッドを完全に満たすように、フローシーケンスが構成される。次いで、所望の液体を、ウェルに添加し、蒸発損失を防ぐために、前記ウェルの上面を密封する。さらに、前記パッドからの液体の蒸発損失を引き起こすであろう前記治具中に、エアフローを開始する。前記パッドが液体量を失うのと同時に、付加的な液体量が、前記ウェルから低流速で、長期間引き込まれるであろう。前記吸収パッドは、全てのウェルについて共通のパッドでもよいし、各ウェルについて別々のパッドでもよい。
【図２３】図23は、化学発光に基づく検出アッセイに特に適した、本発明の好ましい実施形態を示す。この実施形態において、各セル（セルは、一本の微小流路に連結する貫通孔を有する1つのウェルを構成する）は、実質的に不透明な基材により、隣接しているセルから物理的に分離される。前記「微小流体基材」は、実際は、物理的に区別できる基材のアレイである。
【図２４】図24は、完全に手動のポイント・オブ・ケア（POC）アッセイ検査用に採用される、本発明の好ましい実施形態を示す。低減され、簡易化したバージョンの本発明の微小流体マイクロプレートを、この実施形態を説明するために示す。左側に、POC装置用の（前記微小流体マイクロプレートセルと実質的に同一である）構成を示す。前記構成において、前記微小流路は、充填ウェルの下に配置される。右側に、別の実施形態を示す。前記別の実施形態において、前記微小流路は、前記充填ウェルとは異なる位置に配置される。
【図２５】図25は、本発明の新規なアッセイの実施に適した、本発明に基づく微小流体マイクロプレートの画像を示す。
【図２６】図26は、本発明の新規なアッセイの実施に適した、本発明に基づくもう1つの微小流体マイクロプレートの画像を示す。下側の画像に、液体操作工程用のホルダーに配置される前記微小流体マイクロプレートを示す。実際の操作において、前記ホルダーは、前記パッドが使い捨ての要素である、本実施形態において前記吸収パッドも収納する。
【図２７】図27は、本発明の新規なアッセイの実施に適した、本発明に基づく微小流体マイクロプレートに分注するための、従来の標準的なピペットチップまたは細い端部のピペットチップを使用する方法を示す。ここで留意すべきは、この図において、前記微小流路を示していないことである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
したがって、この発明は、使用において、微小流体流路が従来のマイクロプレートのウェル構造に一体化され、「μF96」または「μf96」とも呼ばれる、いわゆる「微小流体マイクロプレート」、例えば、「Optimiser（商標）」または「微小流体マイクロプレート」を使用する、アッセイ装置または方法における改善を検討する。本発明は、SBS/ANSIの標準に従ったプラットホーム上のウェルのアレイを有する、一体化している微小流体流路の手段と連動して、特に有用である。したがって、この発明は、例えば、複数の適用に使用して従来のマイクロプレートを置き替え得る、Siloam Biosciences, Inc.、Forest Park、Ohioから市販品を入手できる、Optimiser（商標）プレートと併せて使用するとき、下記の利点を示す。
【００２６】
したがって、本発明の使用におけるいくつかの利点は、制限されず、
1.  μf96（または本願明細書において、「Optimiser（商標）」とも呼ばれる）プレートは、十分確立された96ウェルのプラットホームを有する、微小流体法の速度および多用途性を組み合わせる。
2.  ユーザーが関与する限り、操作は、実際に工程数が減らされた従来の96ウェルプレートと正確に同じである。
3.  μf96（またはOptimiser（商標））プレートは、潜在的に顕著に試薬消費および／または試料要求を低減できる。比較的十分な試料について、（50μmのらせん状流路に関して）0.4μlの少ない試料量で充分であり得る。このことも、より少ない量の試薬、例えば、イムノアッセイ適用での抗体を使用するのに重要である。
4.  μf96（またはOptimiser（商標））プレートは、従来の96ウェルプレートの適用、例えば、イムノアッセイより、顕著に高速であり得る。96アッセイの全セットを、潜在的に、通常の96ウェルプレートで数時間かかるのとは対照的に、5〜30分間で完了し得る。
5.  μf96（またはOptimiser（商標））プレートのコストは、1回の射出成型操作でもあるため、従来のプレートと同等であり得る。(a) 一方の側の微細加工マスターモールド；および、(b) パッド層のために、わずかに増加したコストは、より少ない試薬消費およびより早い分析時間により十分相殺されるであろう。
6.  基本的アプローチは、極めて多用途であり、実験室設置だけでなく、ポイント・オブ・ケア検査装置の各種幅広い適用にそれ自身役立つ。
7.  流れは、形状および材料の影響によってのみ影響を受け、オペレーターのエラーが低減され、より再現性の高い結果をもたらすであろう。
8.  96ウェルプレートと同様に、μf96（またはOptimiser（商標））プレートの操作を、完全に自動化し得る。実際に、μf96（またはOptimiser（商標））は、プレート操作およびロボット試薬分注システムのみを必要とするであろう。(i)プレート操作システム、(ii)ロボット試薬分注システム、(iii)（長時間インキュベーションのための）インキュベーションシステム、および(iv)プレート洗浄システムを必要とする96ウェルプレートと比較して、これにより、完全自動化のために搭載する装置を非常に低減される。
9.  Optimiser（商標）の感度を、所定のアッセイ用の特定の要求に合致するように、容易に「調整」し得る。
10.  実際に、Optimiser（商標）を、エンドユーザーに、イムノアッセイに基づく分析において、けた外れの柔軟性を許容し、速度、感度および試料容量のパラメーターにわたって、アッセイの性能を「最適化」するのに使用し得る。
【００２７】
マイクロプレート全体の寸法およびウェルの配置は、SBS/ANSI標準により規定される96、384または1536ウェルの形式のそれと一致する。前記微小流体マイクロプレートは、基材の一面に規定されたウェルのアレイからなる。各ウェルは、前記ウェルの底面における適切な貫通孔を介して、前記基材の反対面上の微小流体流路に連結される。前記微小流体流路は、前記微小流路の一端に開口（排出口）を有する、付加的なシール層により順に密封される。さらに、前記シール層は、吸収パッドに接触している。
【００２８】
液体が前記ウェルに導入された際、前記液体は、毛細管力により、前記微小流路に引き込まれる。前記液体は、前記吸収パッドに到達するまで、前記微小流路に沿って伝わる。前記吸収パッドは、前記微小流路より強い毛細管力を発揮し、前記液体を前記流路の外へ引き出す。適切な設計により、前記液体が前記ウェルに存在し、前記吸収パッドに流れる時、前記液体の後方端は、前記ウェルと前記微小流路との間の界面で「動かない」ことが確保され得る。この段階で、前記ウェルは、前記液体が完全に空になるが、前記流路は、未だに前記液体で満たされている。第2の液体を、直ちに前記ウェルに添加した場合、第1の液体を保持する毛管バリアが崩壊され、前記パッドの毛細管作用が再開され、前記第2の液体は、前記流路を介して、前記パッドに引き込まれる。この順序を、複数回繰り返して、イムノアッセイ順序を完了し得る。したがって、この発明の装置は、マイクロプレートプラットホームにおける微小流体イムノアッセイ順序を許容する。さらに、前記プレートを使用する方法は、従来のマイクロプレートと正確に同様であり、本発明の装置は、従来のマイクロプレート用に開発された、適切な自動化装置にも適合する。本発明の装置の他の実施形態を、例えば、細胞に基づく分析の適用に使用し得る。
【００２９】
本願明細書で参照され、上記で示されるように、μF96もしくはμf96またはOptimiser（商標）は、各ウェルが少なくとも1本の微小流体流路に連結される96ウェル微小流体マイクロプレートと呼ばれる。特に明示的に記載しない限り、前記微小流体マイクロプレートは、3つの機能層、すなわち、（前記ウェル、貫通孔構造および微小流路を有する）基材層、シールテープ層および吸収パッド層により作製されることを前提とすべきである。前記96ウェル微小流体マイクロプレートにおいて、前記「96」は、96個のウェル配置を意味し、同様に、μf384は、384個のウェル配置などを意味すべきである。本明細書で使用されるとき、用語Optimiser（商標）も本発明を説明するために使用され、同様に、Optimiser（商標）-96は96個のウェル配置を意味し、Optimiser（商標）-384は384個のウェル配置などを意味すべきである。
【００３０】
さらに、本願明細書で使用される「微小流路」および「微小流体流路」および「流路」は、特に断らない限り、全て同じ流体構造を意味する。「接点孔」または「貫通孔」または「ビアホール」の用語は、特に断らない限り、本願明細書において、全て前記ウェル構造と前記微小流路構造とを連結する、同じ構造を意味する。「セル」なる用語は、前記微小流体マイクロプレートの機能単位を記載するのに、本願明細書で使用され、前記微小流体マイクロプレートは、マイクロプレート全体を含むように、複数の基本的に同じ「セル」を含む。
【００３１】
本発明は、添付図面の図を観察することにより、直ちに理解され得る。基本的な概念は、図1および図2および図3を精査することにより理解され得る。図1は、微小流体96ウェルプレートまたは微小流体マイクロプレートの正面図を示す。前記プレートは、（一般的に認められたANSI標準により規定される）従来のマイクロプレートの寸法と一致する。ウェルの配置も、ANSI標準と一致する。各ウェルは、基材の反対面上の微小流路に連結される。図1に示す実施形態において、前記ウェルおよび前記微小流路は、前記同じ基材層上に組み立てられる。本発明の特筆すべき特徴は、図1から理解され、（液体試薬を添加するための）充填位置と検出領域は、同じ垂直平面であり、従来のマイクロプレートと正確に一致する。
【００３２】
図2は、分解図および組立図における、96のうちの1単位を示すマイクロプレートの一部の断面図を示す。図3Aは、分解図におけるマイクロプレート、シール層および吸収パッドの三次元(3D)図を示す。図3Bに、分解図におけるマイクロプレート、シール層、吸収パッドおよびホルダーの三次元図を示す。各ウェルは、基材の反対面上の微小流路に連結される。微小流路は、（前記ウェルの底面における貫通孔に連結される端部上のそれと比較して）前記微小流路の他端に開口を有する、シール層により順に密封される。シール層上の開口は、他方において、吸収パッドと連結する。好ましい実施形態において、前記吸収パッドが、前記充填ウェルおよび前記流路と同じ垂直の視線でないように、吸収パッドのアレイが使用される。または、図3に示すように、前記吸収パッドは、96か所の微小流路排出口全てに連結される、1枚の連続的な部品であり得る。液体がウェルに導入された際、前記液体は、毛細管力により微小流路に引き込まれ、前記液体は、前記テープにおける開口に到達するまで、前記微小流路に沿って伝わる。その結果、液体の先端が、より強力な毛細管力を発揮し、ウェルが空になるまで液体を引き出す、前記吸収パッドに接触する。好ましい実施形態において、前記貫通孔、微小流体構造および吸収パッドは、前記液体が前記ウェルを出るとき、液柱の後方端が、前記貫通孔と前記微小流路との間の界面を越えて移動しないように構成される。その結果として、前記ウェルは、その液体内容物が完全に空になり、前記液体は、前記吸収パッドにより部分的に吸収される。一方、液体の一部は、未だに前記微小流体流路全体を占有する。この構成を、イムノアッセイに基づく分析用のインキュベーション工程として使用し得る。
【００３３】
第2の液体を前記ウェルに添加した際、前記第2の液体は、前記貫通孔と前記微小流路との界面において第1の液体の後方端と接触する。この段階で、前記吸収パッドから前記微小流路および前記貫通孔を介して前記ウェルに伸びる、連続的な液柱が再度存在する。前記ウェルを満たす前記液柱のより低い表面張力が、流れを生じさせて再開させ、前記第1の液体は、前記微小流路の外へ完全に引き出され、前記第2の液体により置換されるであろう。前記第2の液体の後方端が、流れを再度停止するであろう、前記貫通孔と前記微小流路との界面に直ちに到達するまでに、前記第2の液体も、前記流路から完全に引き出されるであろう。この順序を、イムノアッセイに関して要求される全ての工程が完了するまで、継続する。このことは、本発明の特に有利な態様、すなわち、操作手順が液体添加工程のみを伴うという事実を示す。前記液体は、自動的に排出されるために、前記ウェルから前記液体を除去する必要がない。このことは、操作に必要な工程数を大幅に減らし、前記微小流体マイクロプレートの操作を簡易化する。前述のように、好ましい実施形態において、前記パッドが、反応チャンバと同じ垂直の視線でないように、前記吸収パッドが配置される。この配置において、前記パッドは、前記微小流体マイクロプレートに不可欠であり得る。一方、必要に応じて、例えば、図3に示す実施形態の事例において、最後の液体充填工程後に廃棄し得る、取り外し可能な構成要素として、前記パッドを構成し得る。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、前記のウェル、貫通孔および微小流路を含む基材は、透明である。これにより、前記マイクロプレートの上面および底面の前記微小流路からのシグナルの光学的なモニタリングが可能となる。当該分野において使用される幅広い各種マイクロプレートリーダーに共通の特徴である。他の実施形態において、前記微小流路からのシグナルを、前記流路を含む面からのみ読み取り得るように、前記基材は、不透明材料でもよい。例えば、図2に示す実施形態では、前記基材が不透明材料であれば、前記シグナルを、「底面」からのみ読み取り得る。後述するように、さらにもう1つの方法を、挿入層の回転を使用して、不透明基材材料による上面の読み取りも可能となる。
【００３５】
前記微小流体マイクロプレートを、従来の射出成型過程により製造し得る。射出成型に適した共通に使用される全ての熱可塑性プラスチックを、前記微小流体マイクロプレート用の基材材料として使用してもよい。好ましい実施形態において、前記微小流体マイクロプレートは、マイクロプレートに適した材料として当該分野において周知のポリスチレン材料製である。他の好ましい実施形態において、前記微小流体マイクロプレートは、環状オレフィンコポリマー（COC）材料または環状オレフィンポリマー（COP）材料製である。同材料は、より低い自己蛍光およびその結果として、蛍光または吸光に基づく検出適用において、より低いバックグラウンドノイズを示すものとして、当該分野において公知である。
【００３６】
本発明により提供される装置および方法を使用して行われる、サンドイッチイムノアッセイ用のアッセイ順序の一例を、下記に記載する。当該分野において周知の方法を使用することにより、幅広い各種のこのようなアッセイを、前記微小流体マイクロプレート上で行い得る。本願明細書における発明の記載から直ちに明らかであり、当業者により理解されるであろうように、全ての試薬添加工程を、現在のマイクロプレート形式用の液体を操作するために設計された自動化システムにより、実質的に少しも変更することなく行い得る。
【００３７】
本発明の操作において、好ましい実施形態では、下記の順序が存在し得る；
1.  フローシーケンスを発生させるために、第1の液体を、前記ウェルにピペットで取る。
2.  前記ウェルに充填された前記液体の容量は、前記流路の内部容量より、少なくともわずかに多いべきである。
3.  前記液体は、毛細管力により、微小流体流路に引き込まれ、移動し続けるであろう。
4.  前記液体は、前記液体が前記吸収パッドに接触するであろう排出口に到達するまで、前記流路を介して前記ウェルから流れるであろう。
5.  この後、前記吸収パッドは、前記ウェル中の全ての液体が、前記流路、次いで前記パッドに流れて空になるまで、前記液体を引き出し続けるであろう。前記液柱の後方端が、前記ウェルおよび前記流路の基部における前記貫通孔間の界面に到達する際、前記液体の流れは停止するであろう。
6.  この構成での流速は、(a) 液体の種類、(b) ウェルおよび流路ならびに界面口（すなわち、貫通孔）の形状、(c)μf96（またはOptimiser（商標））マイクロプレートの材料特性、特異的な表面特性、および(d)前記パッドの吸収特性により、完全に制御される。
a.  前記流速を、いずれかのパラメーターの1つを変更することにより操作し得る。
b.  最初の「充填」流速は、前記パッドにより決まり、流路特性にのみに基づく。
c.  その後、前記流路は、固定抵抗として機能し（前記液体が空になる、ごく最後の時を除く）、前記パッドは、真空（または毛細管吸引）源として機能する。
d.  必要に応じて、前記アッセイ工程を、アッセイ反応における流速のばらつきにおける最小限の影響を確保するために、静止したインキュベーションとし得る。
7.  この後、第2の液体を添加してもよく、同じ順序を繰り返し得る。
a.  別法として、前記第1の液体が前記ウェルから空になるのと同時に、前記第2の液体を充填し得る。これにより、前記第1の液体と前記第2の液体との間の流れを止めることなく、連続的な液柱とするであろう。
8.  添加されるべき最後の液体が、前記システムを通過した後、必要に応じて、前記パッドを取り除いてもよい。更なる毛細管力を無くすことにより、前記液体の動きの停止を保証するであろう。
9.  前記プレートを、前記ウェルの上面もしくは底面側から読み取り得る。または、前記ウェル構造が光学的シグナルを妨害する場合、μf96（またはOptimiser（商標））を、ひっくり返して、前記流路側から読み取ってもよい。後者が必要な場合、前記プレートがSBS/ANSI  96ウェルプレート用の標準的なホルダーに常に適合するように、前記プレートの構成を修飾すべきである。
【００３８】
得られるアッセイ、例えば：
1.  捕捉抗体を添加して流す−捕捉抗体は、流路表面に非特異的に吸着するであろう。捕捉抗体溶液を繰り返し注入することにより、潜在的に表面における濃度を向上し得る。
2.  前記捕捉抗体溶液が、前記ウェルを通して完全に吸い込まれるまで待つ。前記捕捉抗体溶液は、未だに完全に前記微小流路を満たしている。インキュベートして捕捉抗体を流路表面に結合させる。
3.  ブロッキング緩衝液を添加して流す。インキュベートして、ブロッキング媒体を流路表面の残りに結合させる。
4.  試料を添加して流す。インキュベートして、標的検体を捕捉抗体に結合させる。
a.  所望により、試料の注入を繰り返すことにより、検出感度を向上できる。
5.  （所望により）再度洗い流す。
6.  標識化検出抗体を添加して流す。インキュベートして、検出抗体を捕捉された標的検体に結合させる。
7.  緩衝液で洗い流す。
8.  蛍光に基づくアッセイに関して、前記プレートを、直ちにリーダーに移動し得る。
9.  発光または化学蛍光アッセイに関して、基質を添加して流路を満たし、インキュベートする。
10.  発光または化学蛍光アッセイに関して、前記プレートを、直ちに適切なリーダーに移動し得る。
【００３９】
図2に示す前記ウェルは、直線（円筒形）部分およびテーパー（円錐形）部分を含む。前記テーパーは、円筒形ウェル構造の基部では少量が通るのとは対照的に、ウェルの内容物を完全に流し出させる。幅広い各種の構成が、この基本的な配置について可能であることが、理解されるであろう。例えば、前記貫通孔が前記ウェルの中央になく、一方側にずれている場合、または、前記微小流路パターンが異なる構成である場合、または、前記吸収パッドが異なる位置に配置される場合、または、（SBS/ANSI標準により14.35mmとして設定される）合計プレート厚みに対する前記ウェル構造および微小流路の相対的な深さおよび／もしくは位置が変更される場合である。実際には、標準化が高く求められるが、Optimiser（商標）微小流体マイクロプレートは、ある例において、ANSI/SBSの仕様に承認されていない寸法でも作製され得る。これらのいくつかを、この概念により可能な実施形態の実施例として記載する。本願明細書に記載の実施形態は、この概念の柔軟性を単に示しているにすぎず、本発明を限定する意図はない。
【００４０】
図3の三次元（3D）図に、一実施形態を示す。図3の挿入図に示すように、前記ウェルは、上面において「直線」部分を有さず、テーパー部分のみを有する。これにより、前記ウェルの垂直壁からテーパー壁への移行点でのいずれかの残留物についての可能性を最少化する。図2および図3に示すように、前記基材が前記ウェルを完全に囲んでも、または、周辺の基材が「へり（lip）」構造の形状で作製されてもよいように、前記ウェルを構成してもよい。後者により、前記部分に必要なポリマー材料の量を最少化する。これにより、コストを低減する。前記「へり」構造の使用は、前記部分を射出成型操作にも、より受け入れられる。この構成での材料量がより少ないことにより、成形過程中における収縮がより小さいためである。前記収縮は、前記のウェル、貫通孔および微小流路パターンの歪みを引き起こし得るため、前記収縮が小さいことは、有利である。
【００４１】
図4Aに、本発明のもう1つの態様を示す。好ましくは、図4Aに示すように、前記孔の幅（w）は、前記孔の深さ（d）より大きい、および前記孔の深さ（d）と少なくとも等しいべきである。これにより、液体が前記ウェルに導入された際、前記液体の前方メニスカスが、前記シールテープの表面を「浸し」、接触できることが確保される。前記メニスカスは、前記孔の一部（上記参照図の左手側）に連結された微小流路の四方の「壁」全てにも接触する。その後、毛細管力により、前記液体が前記ウェルから引き出され、前記微小流路を満たすであろう。前記液体が、前記微小流路を満たすのを確保するために、前記微小流路の少なくとも1つの壁は、親水性であるべきである。好ましい実施形態において、前記シール層は、接着剤が親水性の挙動を示す、適切な接着フィルムである。これにより、前記液体が前記ウェルに充填され、前記前方メニスカスが前記シールテープに接触する際、前記液体が、前記テープ上に「広がり」、前記微小流路部分に接触する。これにより、前記流路に引き込まれ続けることが、確保されるであろう。別の実施形態では、前記シール層は、前記ウェルおよび流路構造の組み立てに使用されるものの1つ、および、当該分野において周知の方法、例えば、いくつかの例を挙げると、熱結合、結合を支援する接着フィルム、レーザーまたは超音波結合を使用して組み合わせられた2つと同様の、別のプラスチックでもよい。別の実施形態では、第1の液体を前記流路に通させることにより、前記流路を、「プライミング（prime）」してもよい。合理的な密封を作製するために、これは、前記接点孔に対して、ピペットチップまたは他の適切な液体操作ツールを位置することにより、容易に達成され得る。次いで、液体の注入は、前記流路に注入されている液体の少なくとも一部となり、その後、毛細管力により、前記液体が前記流路を満たし続けることが確保されるであろう。これをさらに拡張して、少し好ましい実施形態では、最初のみならず、全てのアッセイ工程も、前記流路に溶液を直接注入することにより、容易に行い得る。この場合、前記ウェル構造が、ピペットまたは他の流体充填ツール用のガイドとしてのみ使用される。さらにもう1つの実施形態において、前記流路の全ての壁を、当該分野において周知の表面処理の適切な選択により、親水性に処理する。さらにもう1つの実施形態において、全ての微小流路壁を含む前記基材の材料は、当該分野において周知の方法を使用して、親水性が付与されてもよいし、親水性シールテープを使用してもよい。前記表面処理（すなわち、液体に対する前記壁の最終的な表面張力）の選択は、目的のアッセイ適用により決まる。ほとんどの場合、前記表面への生体分子の結合に基づく疎水性の相互作用を許容する、疎水性表面を有することが好ましい。他の場合、前記結合表面での生体分子の親水性の相互作用に関して、親水性表面がより適切であり得る。さらに他の場合、疎水性表面と親水性表面の組み合わせが、両方の種類の生体分子に結合させるために望ましいかもしれない。
【００４２】
本発明のさらにもう1つの実施形態では、第1の「プライミング」液体を使用して、前記流路を満たす。イソプロピルアルコール等の液体は、ほとんどのポリマーに対して極端に小さい接触角を示し、非常に優れたウィッキングフローを示す。このような液体は、前記流路壁が親水性または親水性であるかどうかに関係なく、前記流路を満たすであろう。前記液体が、前記吸収パッドに一旦接触すれば、充填ウェルへの連続的な形成される。その後、添加された液体は、自動的に前記流路に引き込まれるであろう。前記微小流路表面との組み合わせにおいて、前記ウェル表面を修飾して、前記液柱に発揮される毛細管力を向上または低減してもよい。例えば、強力な親水性処理を前記ウェル表面に付与した場合、後方メニスカスは、強力に凹んだ形状を有し、前記メニスカスの膨らみは、前記ウェルの底面方向に向けられる。このメニスカスの形状は、（吸収パッドに接触する前の）前記液柱前端でのメニスカスの形状に匹敵し、ゆっくりの充填が確保されるであろう。一方、前記ウェル表面に強力な疎水性が付与された場合、後方メニスカスは、凸形状となり、前記メニスカスの膨らみは、前記ウェルの上方に向かうであろう。このメニスカスの形状は、前記液柱前端に存在する毛細管力を加え、流速を早くするであろう。
【００４３】
低表面張力の液体は、制限されず、例えば、イソプロピルアルコールを使用する。水に各種濃度で添加されたイソプロピルアルコール、または、高タンパク質濃度の水性液は、前記微小流路の表面をタンパク質吸着工程により修飾する場合に、特に「プライミング」液体であり得る。例えば、多くの場合、アッセイ順序における第1の生体分子、すなわち、捕捉抗体をコートし、次いで、前記表面をブロックして、このように「コートされた」プレートをエンドユーザーに提供することが望まれる。この実施形態において、前記微小流路を、所望の生体分子でコートし、次いで、前記流路を乾燥させる（すなわち、前記液体を完全に蒸発させる）。これにより、最終のエンドユーザーが、所望のイムノアッセイの結果を達成するのに完了しなければならない、工程数を最少化する。しかしながら、前記捕捉抗体および前記ブロッキング緩衝液中の材料の吸着は、エンドユーザーにより添加される第1の試薬の流れを妨げる、親水性状態でないOptimiser（商標）の微小流路の表面を提供し得ると考えられる。低表面張力液体、例えば、上記のものの使用は、第1の「プライミング」液体を、親水性効果が低減された前記微小流路でも、毛細管作用により前記微小流路に引き込ませるであろう。その後、前記プライミング液体は、前記充填ウェルの基部での前記注入口から、前記微小流路の端部に伸びる液柱を形成するであろう。続けて、液体は、前述のメカニズムを使用して、効果的に流れるであろう。
【００４４】
本発明の好ましい方法において、水性緩衝液を、「プライミング」液体として使用する。実験において、一般的な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液（PBS）またはトリス緩衝液（TBS）によるプライミングが、その後に導入された第1の生体分子の結合を向上させることが観察された。これは、同じポリマー基材材料を共同で使用する2つのプラットホームでさえ、従来のマイクロプレートと比較して、著しく異なる挙動である。プライミング液体は、前記表面の湿潤性を向上し得、これにより、第1の生体分子を含む第2の溶液を、前記微小流体マイクロプレートに導入させ、前記表面により均一に接触させ、これにより、前記ポリマー表面への前記生体分子のより高い結合をもたらすと仮定される。前記水性プライミング溶液を、前記微小流路に、または、微小流路の実施形態によるかのいずれかで（圧力をかけてまたは真空を使用して）注入し得る。前記実施形態において、少なくとも1つの壁は、前記プライミング溶液を毛細管充填させる親水性の挙動を示す。さらに、前記水性プライミング液体の効果は、各アッセイについて異なる。さらに本出願に記載のように、特定のアッセイは、PBS緩衝液のプライミングにより、顕著に改善された性能を示す。一方、他のアッセイは、顕著な改善を示さない。後者のアッセイの種類が、Optimiser（商標）における強い反応をすでに示しているという点で、後者のアッセイの種類は、前者と区別される。したがって、全てのアッセイ用の一致したガイドラインとして、プライミング工程を使用することにより、前記性能は、必ず低下することなく、改善し得る。
【００４５】
本発明の実施において利用される前記マイクロプレートでのELISAアッセイに使用される、少なくとも1つの材料のpH、すなわち、コーティング緩衝液のpHの影響において、顕著な差異が観察される。従来のマイクロプレートにおいて、前記ポリマーウェル表面への捕捉抗体の結合におけるpHの影響は、十分実証され、当該分野において周知である。しかしながら、従来のマイクロプレートでは、pHの影響は、pHの大きな変化によってのみ明らかとなる。最も一般的なコート緩衝液のpHは、約pH7または約pH9.3または約pH2.8のいずれかである。上記列記したpH値の1つで十分に機能する、従来のマイクロプレートでのほとんどのアッセイは、他のpH値でも適度に機能する。しかしながら、Optimiser（商標）は、前記コート緩衝液のpH変化に非常に敏感である。本開示の事例研究3において詳細に示すように、前記マイクロプレートは、従来のプレートアッセイでの挙動とは顕著に異なるアッセイシグナルにおいて、目立った変化（10×）を示す。さらに、アッセイ用の最適なpHは、本発明のアッセイについて一定ではなく、異なるアッセイは、最も優れた性能を達成するために、異なるコート緩衝液の使用を必要とする。さらに、所定のアッセイのための理想的なpH値にわたるpH変化の範囲は、アッセイの種類によっても決まる。このことは、予期しない発見であり、最適なコート緩衝液におけるpHの選択が、本発明により検討されるマイクロプレートに基づくアッセイについて、特別重要であることを立証する。
【００４６】
本発明の他の好ましい実施形態において、前記シール層は、前記微小流路基材に可逆的に接触されるように構成される。この構成において、前記シール層を、流体工程の一部、例えば、吸光アッセイにおいて除去し得る。前記シール層をゆっくり除去し、停止溶液を、吸光反応を停止するために添加する。他の実施形態においてさえ、前記シール層は、アッセイ分析の他の方法に適した特別な材料でもよい。例えば、前記シール層は、関連するアッセイからの産物による捕捉免疫沈降に特に十分適するように、選択されてもよい。
【００４７】
図4Bに示すもう1つの実施形態において、前記貫通孔構造自体は、図4Aに示すような直線の側壁を有する円筒形状よりむしろ、テーパー状である。前記テーパー形状は、前記液体を前記ウェルから前記貫通孔を介して少なくとも1つの親水性微小流路壁に引き出す、毛細管作用を支援するであろう。さらに他の実施形態において、図4Aまたは図4Bに示す前記ウェルおよび前記貫通孔の構造は、選択的に処理されて、異なる表面機能性を付与されてもよい。例えば、前記基材層は、ウェルの内部表面のみが実質的に疎水性であり、前記貫通孔が親水性に処理されてもよい。前記基材層は、親水性テープにより順に密封される。したがって、この構成では、前記液体が、気泡が介在することなく、前記微小流路を常に満たすのを確保する、前記ウェルから前記貫通孔へ、前記微小流路（テープ）の基部への連続的な親水性の経路が存在する。
【００４８】
図5に、本発明のもう1つの態様を示す。図5は、前記ウェルと前記微小流路との間の接点孔での微小流路構成の実施形態を示す。図5Aにおいて、前記貫通孔の断面積から前記微小流路の断面積への急な移行がある。前記微小流路の断面積が非常に小さいため、前記ウェルに存在する液体は、前記界面で止まるであろう。図5Bにおいて、前記微小流路は、接点孔よりわずかに大きく、さらに、流路の断面は、最終寸法に徐々にテーパーとなる。この場合において、前記液体が前記ウェルに存在する時、前記微小流路が完全に空になるまで、前記液体は、（吸収パッドに）流れ続けるであろう。または、非常に高い毛細管力を有する吸収パッドを、図5Aの構成を有する前記微小流路が完全に空になるように使用し得る。前者の場合、次の液体が添加されるまで、前記液体は、前記微小流路に残る。この条件を、インキュベーション工程として使用し得る。この場合、アッセイ性能が、純粋にフロースルーアッセイを使用する場合に生じ得る、流速のわずかな変化に比較的依存しないため、この構成を使用するのが有利である。後者の場合、前記液体は、前記流路において決して止まらず、または、連続フローもしくはスルーフローのアッセイと呼ばれる。アッセイ操作は顕著により速い。このことは、一部のポイント・オブ・ケア試験適用の場合のように、精度の制御より、反応時間がより重要である適用において、有利であり得る。フロースルーモードを、検出感度を向上するのに有利に活用してもよい。例えば、第1の結合試薬（捕捉抗体）を、前記微小流路壁にすでにコートし、残りの未結合の結合部位をブロックしている場合、非常により多量の（標的抗原または検体を含む）試料を、前記ウェルに充填し得る。前記液体が前記流路壁をゆっくり流れる際に、前記表面上の捕捉抗体と結合し得る抗原量が向上する。実質的に、前記フロースルーモードは、前記結合部位の大部分が前記抗原と結合するまで、前記結合部位に曝される標的抗原／検体の供給を補充するのに役立つ。次いで、検出抗体または第2の抗体は、前述のように結合した標的に結合される。このスキームにより、所定の試料由来の非常に低濃度の標的を検出できる。マイクロスケールでの急速な反応の反応速度論により、抗原の重要な部分が、前記捕捉抗体に、フロースルーモードにおいて、前記流路内に前記液体が存在する短時間（数秒）に結合し得ることが、確保される。
【００４９】
図6は、インキュベーション工程が望ましい、流れ順序の信頼性のある性能をさらに支援する本発明の特徴を示す。図6に示すように、通気孔が、前記テープ上の前記排出口にごく近接して、前記微小流路の排出口に向かって構成される。この構成により、前記液体が前記ウェルから空になる際に、前記液体の後端が、前記貫通孔と前記微小流路との間の界面で「詰まる」であろう。なお、高毛細管力の吸収パッドは、前記微小流路から前記液体を空にするのを通常引き起こす、毛細管力を発揮し続けてもよい。実質的に、前記吸収パッドは、真空源として作用しており、前記液柱の先端において陰圧を形成している。前記液体が、前記吸収パッドに吸い込まれる際に、前記液柱は、前記微小流路に「後退する」であろう。前記液体流路の先端が前記通気孔を越えて後退する場合、前記パッドの毛細管作用が止まる。（前記パッドからの）前記陰圧が、前記通気孔を介した大気圧により、取り除かれるためである。前記通気孔は、前記シールテープ上の排出口の周辺内部にも配置され得る。前記後者の構成により、（パッドによる連続的な吸収により）前記液体がわずかに後退するとすぐに、前記通気孔が、陰圧を散逸させることを、確保する必要がある。さらに記載するように、前記液体が後退する、すなわち、前記排出口から離れることを、確保する必要がある。前記液体の先端が、（排出口で）動かないままであった場合、または、（貫通孔界面で）前記液柱の後方端が、前記流路に移動する、すなわち、注入口から離れる場合、付加的な液体が前記ウェルに導入された際、気泡が形成されるであろう。前記2種類の異なる液体間に介在する気泡は、更なる操作を停止および妨げる毛細管力を生じるであろう。
【００５０】
本発明の重要な態様は、従来のマイクロプレートにおけるウェル構造とは対照的に、イムノアッセイを行うための微小流体流路の使用である。前記微小流路の高表面積対容積比により、(a) 限定された拡散距離による素早い反応、および(b) 少ない反応容量が許容されることは、当該分野において周知である。幅広い各種の微小流路構成を、本発明に使用してもよい。以下の表に示すように、表面積対容積比は、流路サイズが減少した時に向上する。液体量における付随する減少により、前記流路を完全に満たす必要がある。前記流路の寸法を、流速、表面積および表面積対容積（SAV）比に関する必要性に基づいて決定されるであろう。例えば、500μmの充填ウェルが中央にあり、最も大きいらせん状流路の半径が約3mmであると仮定すると、下記の構成が可能である。全てのこのようなバリエーションは、本発明の範囲内であることを意図され、考慮されるべきである。
【００５１】
【表１】
2014503832.tif 000003
【００５２】
当然、幅広い各種の流路構成も、先の図に示すらせん状に加えて可能である。図7Aに、本発明に同様に十分適した、曲りくねった流路を示す。さらに、前記流路は、前記注入口から前記排出口にかけて、連続的なテーパーを含んでもよい。前記テーパーにより、前記液柱の前端での毛細管力が向上し、前記流路がテーパー状でない場合とは異なる流速をもたらすことが、確保されるであろう。他の実施形態において、注入口から排出口にかけて徐々に広くなるように、前記テーパーを、前記排出口から前記注入口にかけて設計してもよい。これにより、第1のテーパーまたはテーパーが無い場合と比較して、別の流速がもたらされる。流速の違いは、フロースルーアッセイの連続的な流れにおける顕著な影響、または、静止したインキュベーションアッセイについての液体充填挙動を有し、さらに柔軟性を提供するのに有利に使用され得る。さらに他の実施形態において、前記流路は、非対称に、すなわち、幅が間隔と等しくない、深さが間隔と等しくない、または、それらの組み合わせで構成されてもよい。
【００５３】
図8は、前記微小流路についての他の実施形態を示す。図8Aに示すように、前記微小流路は、強調された微小流路の断面寸法が、残りの微小流路の断面寸法と比較して異なる、複合流路形状を有する。前記終端微小流路部分は、前記残りの微小流路についての比較可能な寸法より大きい、少なくとも1つの寸法を有する。例えば、前記終端部分は、幅300μm×深さ200μmでもよい。一方、前記残りの微小流路は、幅200μm×深さ200μmでもよい。これにより、前記終端部分が、先立つ流路より低い流れ抵抗が確保される。このことは、静止したインキュベーションの事例について、最適な流れ性能を確保するのに有用である。図6の説明に関連して先に記載したように、前記吸収パッドの連続的な作用は、前記液体が前記排出口から後退するように、液体を引き出すのが好ましい。図8に示す実施形態は、（排出口近くの）前記液柱の前端についての前記流れ抵抗が、（貫通孔界面での）前記液柱の後方端についての流れ抵抗より低いために、前記液体が、前記排出口から常に「後退する」であろうことを、確保できる。
【００５４】
図8Bは、類似の効果を達成できる、もう1つの実施形態を示す。強調された最初の部分は、残りの微小流路の断面寸法と比較して異なる。前記始端微小流路部分は、前記残りの微小流路についての比較可能な寸法より小さい、少なくとも1つの寸法を有する。例えば、前記始端微小流路部分は、幅100μm×深さ200μmでもよい。一方、前記残りの微小流路は、幅200μm×深さ200μmでもよい。これにより、前記始端部分が、残り部分より高い流れ抵抗を有することが確保される。これにより、前記液体が常に後退する、すなわち、前記流路に後退するよりもむしろ前記排出口から離れる、すなわち、注入口から離れることも確保されるであろう。さらに、前記微小流路の始まりでの高抵抗部分は、連続流モードまたはフロースルーモードについての流れ制御に関して、有利でもある。図9および関連する表に示すように、前記微小流路内の流速は、前記微小流路の寸法に高く依存する。前記フロースルーモードは、(1)繰り返し可能な性能を確保するための流速に対する正確な制御、(2)前記流路壁上のリガンドへの液体中の生体化学物質の最大吸着／結合を確保するために、前記流路の液体フロースルーについての十分な滞留時間を許容する、低流速で流れる能力を必要とする。図9および関連する表に示す種々の寸法に示すように、これらの実施形態の組み合わせを、別の柔軟性のためにも使用してもよい。
【００５５】
図12は、前記ウェル構造および前記微小流路構造が2種類の基材により規定される別の実施形態を示す。この実施形態において、前記微小流路は、1面上の流路が第2面の壁領域に対応し、逆もまた同様であるように、2面の前記基材上に規定される。これにより、前記ウェル底面の水平形状における無駄な空間がなく、より大きなアッセイシグナルを生成し得ることが、確保される。
【００５６】
先に説明したように、従来のスケールの分析チャンバに対する微小流路の利点は、流路内の表面積対容積比が高いことである。このことは、当該分野において周知の各種の方法を使用することにより、さらに拡大し得る。図10Aは、このような方法の1つを示す。前記方法において、前記流路は、ビーズのアレイで詰め込まれる。幅広い各種のビーズを、この適用に使用でき、いくつかの例を挙げると、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリマービーズ、シリカビーズ、ガラスビーズが挙げられる。または、前記流路は、自己組み立てまたは他の適切な組み立て方法を使用して形成された頑丈なポリマー柱を有し得る。これらの全ておよび、当該分野において周知の他の方法により、前記微小流路内部における正味の表面積を顕著に増加でき、微小流路装置より早い反応時間さえも許容し得る。前記ビーズの使用により、さらに本願明細書で追って説明するように、装置操作においてより高い柔軟性が許容される。（ポリマーまたはその他の）ビーズを使用する場合、ウェル底面の適切なサイズの孔に直接注入する。前記流路の寸法を、ビーズが前記孔を通って自由に流れ得るように選択する。次いで、前記ビーズは全て、ビーズの更なる動きを妨げるであろう前記吸収パッドに到達するまで、前記排出口の方向へ流れるであろう。この段階において、前記吸収パッドを、ビーズが懸濁されている溶液の残りを除去するために、必要に応じて取り替えてもよい。更なる工程は、同様のままであろう。または、前記ビーズを、自己組み立て方法またはスラリーパッキング法を使用することにより詰めてもよい。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、前記ビーズは、Ultralink Biosupport（商標）アガロースゲルビーズである。これらのビーズは、前記ビーズの表面積をより大きく拡大する、多孔質の表面積を提供する。さらに、前記ビーズは、生体化学物質、例えば、捕捉抗体との共有結合に十分適している。捕捉抗体が高表面濃度で前記ビーズに結合した後、前記ビーズ表面の残りを、非特異的な吸着を最少化するために、効率的に不動態化し得る。Ultralink Biosupport（商標）ビーズは、一般的に、親和性液体カラムクロマトグラフィー、例えば、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）に使用され、これらを、感度を大きく向上させるために、微小流体流路に使用する。FPLC用途に関して、前記ビーズを、捕捉実体の共有結合により「調製」し、続けて、液体容器、例えば、試験管において不動態化し、次いで、前記FPLCカラムにビーズを詰める。前記微小流体流路に関して、類似の方法を使用し得る。または、これらの過程も、まずビーズを適切に構成された形状にさせ、次いで、結合する化学物質および不動態化の溶液を連続して添加することにより行い得る。これにより、ビーズで予め詰められた「包括的な」マイクロプレートを提供し、エンドユーザーに前記ビーズに所望の化学物質を結合させる、より高い柔軟性が提供される。
【００５８】
図10Aに示す実施形態は、極端に高感度が求められる適用に特に十分適している。図10Bは、マイクロビーズを使用する別の実施形態を示す。図10Bに示すように、前記ビーズは、前記ウェルと前記流路とを連結する前記貫通孔にのみ捕捉される。実際には、前記流路の寸法は、前記流路が捕捉形状として機能し、狭い寸法がビーズを少しも前記流路に流入させないように構成される。この実施形態において、カラムに詰められた小型のビーズが「反応チャンバ」であり、前記微小流体流路がこのビーズカラムの基部から排液口に液体を輸送することのみに役立ち、その結果として、直線部分のみであることに、留意することが重要である。Ultralink Biosupport（商標）ビーズの極端に高結合能により、図10Bに示すように非常に少量の「ビーズカラム」を使用する場合でさえ、イムノアッセイ適用における適切な感度が許容される。この実施形態は、高密度のマイクロプレート、例えば、384-ウェルおよび1536-ウェルの構成について、特に十分適している。
【００５９】
上記のように、ビーズ（例えば、市販のUltralink Biosupport（商標）またはその他）を使用するための1つの方法は、所望の試薬によりビーズをコートし、次いで、前記流路（または貫通孔）にビーズを充填することである。この方法により、コートされた捕捉分子と反応するであろう抗原に対する前記マイクロプレートを制限する。同時に、前記「予めのコーティング」により、前記ビーズ表面に、ビーズが詰められたカラム内に毛細管流動を生じさせる、親水性も付与される。コートされていないビーズを使用する「包括的な」マイクロプレートに関して、毛細管流動が完全には阻害されないとしても、コートされていない／不動態化されていないビーズの疎水性表面が、より大きく低減するであろう。この問題を回避するために、処理済みのビーズおよび未処理のビーズの混合物を、使用し得る。例えば、前記ビーズを、（製造装置内で）充填するために調製する場合、未処理（疎水性）および不動態化（親水性が提供された表面）の適切な割合で、混合でき、前記の流路または貫通孔に充填する。これにより、詰められたビーズカラムが、（不動態化されたビーズ上の）減少した結合部位を犠牲にして、毛細管流動をサポートし得ることが、確保されるであろう。減少にもかかわらず、正味の結合部位数は、前記微小流路の壁のみの結合部位より、未だにかなり多いであろう。
【００６０】
本発明は、アッセイ分析のみに限定されないと理解される。例えば、図11に示す実施形態を、細胞に基づく分析に使用してもよい。細胞が前記ウェルから輸送され、正確に規定された場所で捕捉される際に、前記流路内の柱配列が細胞を捕捉し得る。その後、前記細胞を、種々の化合物に曝して、特定の細胞機能に対するこのような化合物の影響を研究する。特定の場合において、前記反応は、前記細胞から放出される化合物の形式におけるものでもよい。この場合において、アッセイ順序を、前記細胞の溶液が添加された後で、刺激する化合物を添加する前に、前記吸収パッドを新たなパッドに取り替えるように構成し得る。したがって、前記細胞から放出される化合物を、前記吸収パッドに収集し、さらに分析し得る。他の実施形態において、細胞が前記壁に接着し得るのを確保するために、前記微小流路の表面を、適切に処理してもよい。この例では、まず、前記細胞を培養し、前記微小流路内で増殖させ、続いて、試験化合物に曝し得る。
【００６１】
本発明の全ての実施形態において、前記吸収パッドは、全ての流体操作工程において共通でもよいし、各流体操作工程後、または、選択された工程セット後に取り替えられるように、構成されてもよい。さらに、前記吸収パッドを、最後の流体処理工程後に除去してもよいし、前記微小流体マイクロプレートに組み込まれたままでもよい。好ましい実施形態において、前記吸収パッドが、前記微小流路および／またはウェル構造と重ならないように、前記吸収パッドを構成する。これにより、前記吸収パッドを除去することなく、アッセイシグナルの検出のための光学的に透明な経路が確保される。図13に、このような実施形態の1つを示す。前記実施形態において、特有の吸収パッドを、各ウェル＋流路構造に使用する。図13にも示すように、前記吸収パッドを、前記マイクロプレート上に設置してもよいし、分離層上に設置してもよい。後者の場合において、前記微小流体マイクロプレートを、適切な治具を使用して、前記吸収パッドを保持する前記基材に対して配置する。当然、全ての場合において、前記吸収パッドは、前記微小流体マイクロプレートの全ての「ウェル」に共通の連続的なシートでもよい。
【００６２】
完全な輸送構成において、連続的な吸収パッドを使用することの潜在的な問題は、前記パッドが（光学的に活性成分を含めた）全てのアッセイ試薬を吸収するという事実である。次いで、前記微小流路からの光学シグナルと前記パッドに吸収された成分からの光学シグナルとを区別することが不可能なことである。ほとんどの実施形態において、前記シールテープは、透明なライナー上の親水性の接着剤と想定される。前記吸収パッドが連続的なシートである場合において、前記シールテープを、親水性の接着剤を不透明なライナー上に付着するように選択し得る。前記テープを打ち抜いて、前述のものと同様の排出口を形成する。前記微小流路の端部および前記排出口は、前記ウェルの垂直観察窓および前記らせん状の微小流路パターンとは離れて配置される。前記不透明なテープライナーを有するこの実施形態では、前記吸収パッドの連続的なシートを、光学的なクロストーク効果なしに使用可能である。前記パッドに対する「窓」のみが、前記観察窓から離れて順に配置された、前記シールフィルム上の打ち抜き孔であろうためである。前記微小流体マイクロプレートは、「上面読み取り」モードに限定されるが、前記パッドを、前記マイクロプレートの一部として一体化でき、これにより、ホルダーが不要となる。前記実施形態は、適用、例えば、手動での使用により、部分的に影響されるであろう。除去可能なパッドは、オペレーターにとって読み取り前に除去するのに容易である。一方、自動化装置を使用するハイスループットスクリーニングに関して、現在の設備に適合する一体化されたパッドを有することが好ましい。
【００６３】
図5に示すように、前記ウェルの底面での前記貫通孔から前記微小流路への急な移行は、前記液柱の表面張力圧における急な変化を生じさせ、その界面で流れを停止させる。図14Aに示すように、同様の状態は、排出口端部でも発生し得る。前記吸収パッドを圧縮するための付加的な基部層の使用により、図14Bに示すように、比較的柔軟な吸収パッドが、前記シールフィルム上に形成された空洞内に膨らむであろうことが、確保される。さらに、前記膨らみは、前記微小流路が前記排出孔に面する、前記微小流路断面に直接接触する。これにより、前記吸収パッドが、常に既存の前記液体と「接触」することが、確保される。または、図14Cに示すように、突出構造が、前記排出口部分における前記微小流路の端部に組み立てられてもよい。前記突出構造は、前記突出構造の（基材から離れた）平坦面が、（基材から離れた）前記シールテープの表面にほぼ整列するように、構成されてもよい。これにより、前記移行効果を最小化する。図14Cに、前記突出構造の形成に使用し得る形状の範囲を示す。
【００６４】
図15は、前記パッドがストリップとして構成され、さらに、1つのストリップの吸収パッドが、1横列（または縦列）のウェル＋流路構造に対して共通である、もう1つの実施形態を示す。図16は、前記吸収パッドストリップを「上面」すなわち、前記微小流路から反対面から置くさらにもう1つの実施形態を示す。したがって、本発明の精神から逸脱することなく、幅広い各種の構成を、前記吸収パッドを配置するのに使用し得る。
【００６５】
当業者に直ちに明らかなように、前記微小流路により発揮されるより高い毛細管力を発揮できるいずれかの材料が、本発明の装置における吸収パッドとして使用するのに適している。幅広い各種の材料、例えば、ろ紙、無菌室ティッシュ等が、容易に明白な例である。他の奥義の吸収「パッド」は、高密度の配置、例えば、ウェル構造におけるミクロンサイズのシリカビーズを含んでもよい。これらは、極端に高毛細管力を発揮し、全てが本発明内の吸収パッドとして想定されるであろう。
【００６６】
実際に、図17は、前記微小流路自体が、毛細管ポンプおよび排液容器として使用される好ましい実施形態を示す。図17に示すように、前記構造は、より少ないウェルが、96-ウェル配置上で「機能的」であるように修飾される。各ウェルは、貫通孔を介して微小流路に連結される。この実施形態での前記微小流路は、前記「機能性」流路および前記「排出」流路の、2つの領域：「機能性」流路および「排液」流路に分割される。前記排液流路が、複数の工程アッセイ順序中に添加される全ての液体に適合するように、前記排液流路を設計する。第1の液体を添加した際、前記第1の液体は、前記流路の最初の「機能性」部分を通って流れる。前記機能性部分において、前述のアッセイ反応が、流路壁上で発生するであろう。その後、第1の液体は、前記連続的な流路の「排液」部分に到達するであろう。前記親水性テープは、毛細管力を発揮し続け、前記液体を前記ウェルの外に引き出す。前記流路の「排液」部分における大きな断面積を使用して、前記「排液」流路での毛細管力を、前記貫通孔での毛細管力より弱くすることが、確保される。これにより、前記第1の液体が、前記ウェルの外へ流れ出る際に、微小流路界面で流れが停止する。前記第2の液体を、前記ウェルに添加する際に、前記貫通孔の基部での毛細管バリアが取り除かれ、前記第2の液体が、前記ウェルの外へ流れ出るまで、流れが再開されるであろう。この実施形態により、吸収パッドを必要とすることなく、完全に一体化された装置が可能となる。さらに、この実施形態において、前記通気孔も必要ではない。前記流れが、前記「機能性」流路部分と前記「排液」流路部分との間の寸法の差により、自動的に調節されるためである。この実施形態では、使用される部品数を最少化することにより、より大きな信頼性が可能となり得る。さらに別の実施形態では、排液流路は、マイクロプレートを形成する基材層を通って伸びる貫通孔（「上方」に向いている）のみであり得る。合理的な薄さの基材層、さらに薄さが不均一である基材層により、十分な液体を「排液ウェル」に含ませるであろう。別の実施形態により、ウェル数を犠牲にすることなく、前記微小流体毛細管ポンプの概念を使用させ得る。
【００６７】
ここまで、前記微小流体流路および前記ウェルを、96ウェルプレートの外形に適合する外部形状を規定する、同様の構造の一部として記載している（前記ウェルのみが「マイクロプレート」基材の部品である、図12に示す実施形態を除く。）。前記構造は、図18に示された実施形態を使用するのに、実際により有利であり得る。図18に示すように、微小流体挿入プレートを、周囲の外枠と共に使用し、前記外枠は、従来のマイクロプレートの（周囲の長さに沿った）形状および外形を規定し、前記マイクロプレート挿入構造は、前記ウェル構造および前記微小流路構造を含む。前記2つの部品を、前記微小流体挿入プレートを前記外枠から取り外せるように設計する。図18に、これの使用を示す。一方向、具体的には前記ウェルが上面に面する方向において、前記装置をアッセイ流体順序に使用し、もう一方向、具体的には前記微小流体挿入プレートの微小流路部品が上に面する方向において、前記装置を、アッセイ検出順序に使用する。前記微小流路が、光検出器と同じ焦点面に設置されるのを確保することにより、前記微小流路からの最も良好なシグナルを確保するのに最適な高さに、前記微小流体挿入プレートを配置し得るように、前記外枠を設計してもよい。この実施形態は、光の指向性ビームを使用して蛍光を生じさせる、蛍光検出に特に十分適している。化学発光適用に関して、図19に示す一実施形態が、より適切であり得る。この実施形態において、付加的なプレートを、前記挿入された微小流体挿入プレートの上面に配置する。前記付加的なプレートは、前記微小流体挿入プレートの前記微小流が配置される領域において開口を含む。一方、これらの開口を形成する構造の壁は、不透明である。これにより、「光学的クロストーク」の影響をかなり低減し、1つの反応チャンバからのシグナルが複数の光検出器に到達するのが確保され得る。図18の実施形態は、前記流路側が、回転後に「上面」読み取りマイクロプレートリーダーにより読み取られ得るように、不透明な基材と共に使用するのにも適している。もう1つの別の実施形態において、図12の装置を、前記装置の「ウェル」部品を不透明材料で作製するように、組み立ててもよい。図20は、複数の微小流体挿入プレートを使用する、別の実施形態を示す。インサートのアレイを、特定のサイズ、例えば、約25mm×約75mmの標準的なガラススライドの外形を許容するように構成してもよい。例えば、マイクロプレート用に設計された液体操作装置を、うまく組み合わせた方法において、4つのインサートを同時に操作し、スライドリーダーが、前記各微小流体インサートを別々に読み取る。
【００６８】
図21Aは、1つの充填ウェルが、前記基材の他方の面上の1本の微小流路構造に直接連結され、反対面上の前記マイクロプレートの他のウェルが通常存在する箇所に配置される複数の他のチャンバに連結される、一実施形態を示す。例えば、図21Aに示すように、横列4および5における24個のウェルのアレイはそれぞれ、4つの反応チャンバに連結される。1つの適用では、この装置を、従来のマイクロプレートに基づくアッセイにおいて、試料あたり3回またはそれ以上の読み取りによって通常行われるのと同様に、前記4つの反応チャンバのそれぞれから同じシグナルをアッセイ結果の検定に使用する、従来のアッセイに使用してもよい。もう1つの実施形態において、前記ビーズの使用により、前記装置により高い柔軟性を許容し得る。例えば、共通の前記充填ウェルに充填された前記第1の液体は、ビーズ懸濁液1を含み得る。前記ビーズは、特定の捕捉抗体に結合される。前記ビーズを最も下流の反応チャンバの大部分を詰めた（前述のように吸収パッドに詰めた）場合、前記ビーズが、その特定の微小流路構造のみを満たすように、前記溶液1の容量を構成する。次いで、もう1つの抗体に結合しているビーズを含む第2のビーズ溶液2を、添加し得る。次いで、これらを、最も下流の反応チャンバから2番目のチャンバなどに詰める。したがって、各反応チャンバを、アッセイ操作中に、共通の試料源から異なる検体を検出するように構成し得る。または、種々の捕捉抗体のアレイを、共通の検体に対する感度についてスクリーニングし得る。また、他のこのような検査を、この実施形態を使用して行い得る。ただし、前記実施形態は、充填ウェルに連続して連結された各反応チャンバがアッセイ特性における差異を確保するための異なる物理的な構造を有し得るように修飾されてもよいと理解される。
【００６９】
図21Bは、前記充填ウェルと前記微小流体流路とが垂直平面に沿って分断されている、もう1つの実施形態を示す。図21Bに示すように、円筒形構造の形状における非常に簡易化した（および、より高容量の）ウェル構造を、前記微小流体流路の一方側に連結して使用し得る。前記微小流体流路は、標準的な96-ウェル配置における別の「ウェル」の外形に置かれるらせん状（または他の適切な形状）の検出領域に順につながる。したがって、この構成において、「96-ウェル」の構成を、48-ウェルの構成に低減して、非常に簡易化した物理的構造を有する。さらに、これにより、前記らせん状の微小流体流路の上面上の非常に薄い厚みのプラスチック材料が、前記反応チャンバとして機能可能である。貫通孔を有する前記（テーパー状の）充填ウェルが、前記微小流路と同じ垂直な目線である実施形態では、前記微小流路上にかなりの厚みおよび不均一な厚みのプラスチック材料がある。特に蛍光に基づく検出適用においては、プラスチック材料自体からの自己蛍光を増加させる。その理由は、自己蛍光は、部分的にプラスチック材料の薄さとも関連しているためである。図21Bに示す実施形態では、微小流体反応チャンバの上面上に、非常に薄い（約250〜500μm）厚みのプラスチック材料が可能となる。これにより、プラスチック材料自体からの自己蛍光によるバックグラウンドシグナルが非常に最少化される。
【００７０】
図21Cおよび図21Dは、微小流体マイクロプレートの半自動操作に特に十分適した実施形態を示す。図21Cは、簡易化した充填ウェルのアレイが、1つの反応チャンバに連結されるのを示す。前記模式図に、3つの充填ウェルが、1つの反応チャンバに連結される場合を示す。この構成を、より多くの充填ウェルが1つの反応チャンバに繋がるように拡大し得ることは、直ちに明らかである。図21Cの挿入図に示すように、第1の簡易化した充填ウェルの後の簡易化した充填ウェルも、前記連結する微小流体流路用に特化した形状を使用する。前記第1の簡易化した充填流路からつながる連結流路は、滑らかなテーパーで前記充填ウェルに連結する。他の2つのウェル用の連結流路は、前記微小流路の一部が前記充填ウェルに連結するように、前記充填ウェルの基部周囲で輪になっている。この形状により、前記充填ウェルを2種類の目的；すなわち、充填ウェルと通気孔として機能させる。操作中に、全ての3つの充填ウェルを、複数流路ピペットを使用して、液体試薬で同時に満たす。上記で概要を示した全ての変更が等しく効果的に作用するであろうと認識して、疎水性基材および親水性シールテープを仮定すると、3種類の液体を前記ウェルに充填した際、それらは、前記基部（シールテープ）に接触し、親水性力が、前記流路に液体を引き出し始めるであろう。この説明では、前記ウェルは、前記反応チャンバに最も近いウェル1、2番目の上流のウェルなどのウェル2として記載される。ウェル1内部の液体は、前記反応チャンバおよび前記吸収パッドへの下流に向かう、遮るもののない流れ経路を有する。ウェル2への前記液体の逆流は、妨げられる。（前記流路における）介在空気を逃がすための場所がないためである。同様に、ウェル2からの液体は、空気を逃がす経路が無いため、どちらの方向にも流れることができない。したがって、ウェル1以外の全てのウェルにおける液体は、適所に「捕捉」される。前記液体がウェル1から完全に出たと同時に、ウェル2から液体が移動し始め得る。ウェル2からの前記液体前方の空気を、今空であるウェル1から逃がすことができる。前記流路が連続的な部分であり、全ての点が前記親水性表面（テープ）に連結されているため、ウェル2からの液体がウェル1の周囲を横切る場合、前記流れは、ウェル2からの液体が、前記反応チャンバを通過し、空になるまで続くであろう。ここで留意すべきは、これらの全ての場合において、より狭い寸法を前記反応チャンバに使用して、前記ウェルにおいてその内容物が完全に空になることを確保することである。この流れの事象の順序は、連続するウェル（ウェル3、ウェル4・・・）に続き、続いて、試薬が前記反応チャンバに輸送されるであろう。（表面結合反応を完了するのに）十分な容量を確保することにより、全体のアッセイ順序を、たった1回の充填工程を使用して完了し得る。この実施形態は、2つの区別できる利益：(a) アッセイ順序を行うのに必要な作業の顕著な低減、および(b) 流れ順序を「自動的に」調節することにより、非常に再現可能な結果を提供する。ここで留意すべきは、更なる液体を、2種類の方法：(a) 更なるウェルを連続して連結すること（例えば、前記反応チャンバに注入されるべき一連の5つの試薬および試料用の6つの充填ウェルを有��ること）により、(b) 充填順序を繰り返すこと（例えば、まず試薬1、2および試料を注入し、次いで、3つ全てが前記反応チャンバに輸送された後に、次いで試薬3、4、5を同時に充填すること）により、収容できることである。
【００７１】
図21Dは、「半自動」微小流体マイクロプレート用の種々の変形例を示す。この実施形態において、各ウェルから、共通の分岐流路に連結される流路に流れ出る。図21Cに示したものとの重要な違いは、前記分岐流路につながる各流路の長さ（したがって、容量）が、顕著に異なることである。再度、先の例と同様の命名法を使用して、ウェル1は、前記反応チャンバへの非常に短い経路長を有する。一方、ウェル2は、少なくとも10×長い等の経路長を有する。この実施形態において、全ての液体を、それぞれのウェルに同時にピペットで取ったと同時に、流れは、全ての流路で同時に始まるであろう。最初に、（ウェル1からの）液体1が、前記反応チャンバに到達するであろう。そして、前記反応チャンバには、前記液体のみがあるべきである。その後、（ウェル2からの）液体2が、前記分岐流路に到達し、液体1と液体2との混合液が、前記反応チャンバに流れるであろう。各ウェルの容量を、少量の前記混合液が前記反応チャンバを通過した後、ウェルが完全に空になるように構成し得る。その後、（ウェル3からの）液体3が前記分岐流路等に到達するまで、液体2のみが、前記反応チャンバに流れ続けるであろう。この実施形態は、2つの試薬が、前記反応チャンバに充填される前に混合されるべきである場合に、特に有用である。例示としては、制限されず、2成分化学発光基質、競合的イムノアッセイ等用の標識化抗原および試料抗原の混合物が挙げられる。さらに、前記流れ順序を、3つ（またはそれ以上の）試薬の混合物を、所定の間隔で同時に、前記反応チャンバに流すように構成し得る。
【００７２】
図22は、もう1つの実施形態を示す。この構成では、ゆっくりの流速が長い間隔で望まれる適用に特に十分に適している。前記マイクロプレートは、特別な治具に搭載される。前記治具は、室温または、前記吸収パッドの下側を通過する前記治具を通して上昇した温度で空気を送り込み得るエアポンプに連結される。低く一定の流速が長期間要求される工程の前に、更なる液体を少しも吸収できないように、高容量の液体を添加して、前記パッドを完全に満たすように、流れ順序を構成する。次いで、所望の液体を、ウェルに添加し、前記ウェルの上面を密封して、各ウェルのシール上の小さな通気孔により蒸発損失を防ぐ。さらに、前記パッドからの液体の蒸発損失を引き起こすであろう前記治具中に、エアフローを開始する。前記パッドが液体量を失うのと同時に、更なる液量が、低流速で長期間、前記ウェルから引き込まれるであろう。前記吸収パッドは、全てのウェルについて共通のパッドでもよいし、各ウェルについて別々のパッドでもよい。この実施形態は、細胞増殖の研究等の適用に特に十分適している。前記適用において、培養培地の一定の低い流れが細胞の生存を維持するのに必要である。
【００７３】
これまでに検討された「一体」の実施形態は、透明な基材上に作製された場合、光学的に透明なウェルの間での光学的クロストークのために、化学発光に基づく検出には適していない。蛍光に基づく検出に関して、光学シグナルは、蛍光実体を含む前記微小流路が励起され、前記励起源が除去された後、前記光学シグナルが瞬時にほぼセロに低下した場合のみに生成される。化学発光の場合において、基質を前記流路に添加した際、各微小流路単位は、連続的にシグナルを生じるであろう。したがって、検出器が所定のウェル下の前記流路を「読み取る」場合、隣接した流路からの迷光シグナルを拾ってしまい、この「クロストーク」が、測定における容認できないエラーにつながり得る。一部の実施形態に記載のように、不透明な基材を使用した場合、前記実施形態は、化学発光に基づく検出に適しているが、底面読み取りモードにすること、または、前記流路側を表向きにするために前記プレートを回転することのいずれかが必要となる。ほとんどのルミノメーターが上面読み取りモードにされ、回転工程は自動化に適したものでない。
【００７４】
図23は、化学発光に基づく検出適用に特に十分に適した前記微小流体マイクロプレートの一実施形態を示す。図23の実施形態は、ツーピース設計を使用する。前記実施形態では、前記微小流体マイクロプレートのそれぞれのウェル＋貫通孔＋流路「セル」を完全に囲むように、不透明のピースを使用する。各セルは、透明な材料で構成される。この設計により、各セルが、他のものとほぼ完全に分離され、連続的なテープを使用した場合、光学経路は、前記シールテープのみを通ることが確保される。他の実施形態において、各ウェルが個々に密封される場合も、前記セルは、他のセルから完全に分離されるであろう。図23の実施形態により、前記微小流体マイクロプレートセル間の光学的クロストークを大幅に最小化して、信頼性のある化学発光に基づく検出が可能となる。
【００７５】
図24は、ポイント・オブ・ケア検査（POCT）に特に適した一実施形態を示す。これは、前記マイクロプレートの縮小版であり、完全に手動のポイント・オブ・ケア（POC）アッセイシステムとして使用され得る。図24Aは、充填／検出構造の数が縮小されている以外は、前述のものと正確に同様である装置を示す。一方、図24Bは、前記微小流路構造が前記充填ウェルと同じ垂直の視線ではない、別の実施形態を示す。図21Cおよび図21Dに示され、前述された前記「半自動」微小流体マイクロプレートの構成も、半自動のPOCTに十分適している。
【００７６】
図27は、前記微小流体マイクロプレートに分注するための、標準的なピペットチップまたは特別なピペットチップを使用する方法を示す。最も一般的なピペットチップは、幅広い範囲の容積およびチップ寸法に直面する。より一般的に、ピペットチップは、直径500μmから1.5mmの範囲の合理的に（分注端での）小さい先端寸法、または、直径約1.5mm〜4.mmの大きな端部直径のいずれかを有する。前記小さい末端のチップは、典型的に、溶液のみの液体を分注するのに使用される。一方、前記大きい末端直径のチップは、細胞懸濁液を分注するのに好ましい。前述のように、この発明の一実施形態は、前記ウェルから前記親水性シールテープへの、液体用の連続的な親水性経路があるように、前記のウェルおよび貫通孔を選択的に処理することである。このような実施形態において、例えば、ピペットチップのいずれかの種類を、前記液体または懸濁液もしくはエマルジョンを、前記ウェル表面上に分注するのに使用する。前記ピペットが前記貫通孔内に位置するのは好ましくない。硬いピペットチップが前記親水性シールテープを押し下げ、前記テープにより密封されている、前記テープと前記微小流体流路との間の密封を壊し得るためである。ただし、一部の場合では、前記貫通孔内に分注するのが有利な場合もある。より具体的には、前記ピペットチップ端が、前記親水性テープ表面に置かれたままである。この分注スキームにより、液体／懸濁液／エマルジョンを、親水性テープ表面に強く分注可能であり、より重要に、前記ウェルから、その経路上の前記貫通孔を介して、微小流路注入口へと流れ落ちる際に、微小泡が形成される可能性を最小化可能である。前記親水性テープ上に直接分注する適用には、積極的に好ましい。制限されないが、いわゆるゲル充填チップを含む、特別なピペットチップを使用することが極めて好ましいことが、発見された。ゲル充填チップは、（少なくとも数ミリメートルの）顕著な長さを伸ばした、前記分注端において狭い部分を有する。さらに、前記狭い部分の直径は、前記部分の長さのほぼ1/5未満である。この形状により、前記端部部分が機械的に不安定になり、このようなチップが、前記微小流体プレートセルの貫通孔の基部におけるシールテープ上に押された場合、前記端部部分は、前記シールを壊すよりも曲がる。このことは、このスキームを複数流路ピペットによる使用にも拡張し得るため、さらに有利である。複数流路ピペットに関して、全てのピペットチップを、（ピペット本体におけるポートに関して）同じ相対的なX-Y-Z位置に、正確に配列するのは、非常に困難である。機械的に弱いチップにより、このようなチップのアレイを、前記微小流体マイクロプレート上の対応する貫通孔の開口のアレイ内に押し下げることができ、各チップは、前記基部で前記親水性テープに不揃いに接触したまま、変形するであろう。この特別なピペットチップの直観的でない使用は、再現性、泡なし分注の観点から、前記微小流体マイクロプレートについての操作の信頼性を顕著に向上するのに役立ち得る。
【００７７】
図25は、従来の96ウェルプレートの外形およびウェル配置を有し、本発明に有用な、組み立てられたOptimiser（商標）マイクロプレートを示す。図26は、前記微小流体マイクロプレートのもう1つの実施形態を示す。
【００７８】
下記の実施例事例研究に、詳細なアッセイ検証プロトコールおよび方法比較研究を記載して、本願明細書に記載のように本発明の原理および方法を使用するOptimiser（商標）マイクロプレートの性能を、従来の96-ウェルマイクロプレートと比較する。前記実施例には、説明に役立つ実例として、IL-2アッセイを使用する。本願明細書にさらに記載するように、特異的な検証を伴う類似のプロトコールを使用して、種々の検体の範囲を試験し、この開示において、さらに、そのデータを要約する。商品名および商標による言及は、下記実施例において利用される材料および試薬を商業的に利用できることを示す。
【実施例】
【００７９】
事例研究：低容量の試料を使用するIL-2アッセイ
【００８０】
材料および設備
Siloam Biosciences, Inc. Optimiser（商標）マイクロプレートシステム、Cat#96FX-1/1-X
精製抗マウスIL-2抗体、0.5mg/ml、クローンJES6-1A12、ELISA捕捉用
組換えマウスIL-2タンパク質、0.01mg/ml、ELISA標準用校正
ビオチン化抗マウスIL-2抗体、0.5mg/ml、クローンJES6-5H4、ELISA検出用
ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（SAv-HRP）、KPL、0.5mg/ml、Cat#14-30-00
1-Step Ultra TMB-ELISA吸光基質、Pierce、Cat#34028
2N  硫酸；TMB基質用停止液
Siloam Biosciences, Inc. QuantaRed（商標）  増強化学蛍光HRP基質キット、Pierce、Cat#15159
Siloam Biosciences, Inc. OptiPrime（商標）  前湿潤性溶液
Siloam Biosciences, Inc. OptiCoat（商標）  コーティング緩衝液
Siloam Biosciences, Inc. OptiWash（商標）  洗浄緩衝液
Siloam Biosciences, Inc. OptiBlock（商標）  ブロッキング緩衝液
RPMI-1640培地、10×、Sigma、Cat#R1145
ウシ胎児血清、Sigma、Cat#F2442
正常マウスプール血清、Innovative  Research
BioTek FLx800 蛍光発光マイクロプレートリーダー、528/20nm励起フィルタおよび590/35nm発光フィルタを使用、感度設定45
Awareness Technology ChroMate（登録商標）  吸光マイクロプレートリーダー（OD450nm）
NUNC  高タンパク質結合能96-ウェルプレート、PS、MaxiSorp（登録商標）  吸光検出用に平坦で、透明
VWR  真空ろ過システム、500ml、0.2μm  PES膜
96-ウェルポリプロピレン円錐底面プレート
【００８１】
試薬およびプレートの調製
1)  コーティング緩衝液：OptiCoat（商標）  コーティング緩衝液
2)  ブロッキング緩衝液：OptiBlock（商標）  ブロッキング緩衝液
3)  洗浄緩衝液：OptiWash（商標）  洗浄緩衝液
4)  捕捉抗体溶液：精製抗マウスIL-2抗体を、コーティング緩衝液で2μｇ/mlに希釈した。
5)  細胞培養培地：1×RPMI-1640培地中10%FBS、pH7に調節、0.2μmの真空ろ過システムでろ過
6)  マウス血清：正常マウス血清を13,000gで10分間遠心し、上清を取得した。
7)  アッセイ標準：組換えマウスIL-2タンパク質を、適切なマトリックスで1.0ng/mlに希釈した。次いで連続的にマトリックスを有する96-ウェル円錐底面プレート中で（2倍）希釈した。11種類の濃度のIL-2添加標準を、1.0ng/mlから1.0pg/mlの範囲にわたって調製した。非添加のマトリックスを、ゼロ点として使用した。
8)  検出抗体溶液：ビオチン化抗マウスIL-2抗体を、ブロッキング緩衝液で、2μｇ/mlに希釈した。
9)  SAv-HRP：ストレプトアビジンを結合したHRPを、a) Optimiser（商標）用にブロッキング緩衝液で0.125μg/ml（1:4000）に希釈し、b) 従来の96-ウェルマイクロプレート用に0.25μg/ml（1:2000）に希釈した。HRP活性を妨害するアジ化ナトリウムを、全ての緩衝液から除去した。
10)  化学蛍光基質最終（操作）溶液：QuantaRed（商標）基質キットを、室温で少なくとも10分間平衡化する。50部のQuantaRed（商標）増強溶液を、50部のQuantaRed（商標）安定過酸化物および1部のQuantaRed（商標）ADHP濃縮物と混合する。調製後30分以内に使用する。
11)  （従来の96-ウェルアッセイ用）吸光基質：使用前にTMB基質を、室温に平衡化する。
12)  プライミング：吸収パッドおよびホルダーによりOptimiser（商標）マイクロプレートを組み立てる。10μｌの供給されたPBSに基づくプライミング緩衝液を、Optimiser（商標）プレートの各ウェルに充填する。全てのウェルが空になるまで待つ。前記プレートを15分以内に使用する。
捕捉抗体、検出抗体についての操作濃度を、イムノアッセイ開発用のNIHガイダンスに従って最適化した。
【００８２】
アッセイ手順
細胞培養培地およびマウス血清の両方を、このアッセイに使用して、複合生物学的流体における検体を測定するためのOptimiser（商標）の適合性を説明し、従来のELISA形式に対するOptimiser（商標）の性能を実証した。2種類の異なるアッセイプラットホームにおいて、同じIL-2サンドイッチイムノアッセイを行った。
1)  吸光検出（OD450/630）用の透明な従来の高タンパク質結合能96-ウェルプレート
2)  化学蛍光検出（528/590nm）用のOptimiser（商標）微小流体プレート
【００８３】
Optimiser（商標）マイクロプレートアッセイ手順を、ここで記載する。吸光検出アッセイ手順用の前記透明な従来の高タンパク質結合能96-ウェルプレートを、事例研究別表A-2に記載する。Optimiser（商標）プレートを行うためのアッセイ時間の合計は、約１時間である。これは、従来の96-ウェルELISAに必要な時間（約5〜18時間）のほんの1/10である。
【００８４】
アッセイ工程
試薬およびプレートの調製欄の工程12に記載のように、前記アッセイ手順を開始する前に、Optimiser（商標）プライミング手順を完了する。
1)  吸収パッドおよびホルダーによりOptimiser（商標）マイクロプレートを組み立てる。前記アッセイを開始する前に、前記プレートをプライミングする。
2)  10μlの捕捉抗体溶液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
3)  10μlのブロッキング緩衝液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
4)  10μlのアッセイ標準を、3本の横列の適切なウェルにピペットで取り、室温で10分間インキュベートする。
5)  30μlの洗浄緩衝液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。
6)  10μlの検出抗体溶液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
7)  工程5を繰り返す。
8)  10μlのSAv-HRP溶液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
9)  前記吸収パッドを交換する。
10)  工程5を2回繰り返す。
11)  10μlのQuantaRed（商標）操作溶液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。前記プレートを、前記ホルダーから取り外す。キムワイプ（登録商標）を使用して、Optimiser（商標）プレートの底面から、全ての残留物を拭き取る。528nmの蛍光励起波長および590nmの蛍光発光波長（感度設定45）で、マイクロプレートリーダーを設定する。基質添加後15分の時点での、蛍光を測定する。
【００８５】
結果の算出
3回の試料の各セットの平均値を算出する。それぞれからブランク（ゼロ点）の平均値を差し引く。
【００８６】
4つのパラメーターロジスティック（4-PL）曲線適合を生成可能なコンピュータソフトウェアを使用して前記データを減らすことにより、標準曲線を作成する。別の方法として、IL-2濃度をx軸に、シグナル測定値をy軸とするlog-logグラフ上に曲線をプロットする。最適合曲線を、各アッセイ点から描画する。
【００８７】
結果および結論
細胞培養培地
結果から、250pg/mlから2.0pg/mlのダイナミックレンジにわたって、マトリックスとして細胞培養培地を使用することにより、Optimiser（商標）および従来の96-ウェルプレートの両方におけるアッセイについて、線形性が示される。未加工データを、表CS1に示す。算出結果および標準曲線を、図CS1a) および図CS1b) に示す。
【００８８】
表CS1．添加した細胞培養培地試料を使用する、３回でのIL-2サンドイッチアッセイからのシグナル測定値：
a) NUNC  96-ウェルプレート、吸光、450nmでのOD（630nmを差し引く）および、b) Optimiser（商標）プレート、化学蛍光、528/590nmでのRLU、読み取り感度45
【００８９】
【表２】
2014503832.tif 000004
【００９０】
以下のグラフおよび表の形式は、Optimiser（商標）マイクロプレートにおける、添加した細胞培養培地により試験した、IL-2アッセイについての事例研究1のデータ、および従来の96-ウェルプレートにおける同じアッセイについての比較データである。
【００９１】
【表３】
2014503832.tif 000005
添加した細胞培養培地試料を使用するIL-2アッセイの標準曲線を、TMB基質および、（630nmを差し引く）450nmでの吸光の比色検出を使用して、従来の96-ウェルプレートにおいて行う。
【００９２】
【表４】
2014503832.tif 000006
【００９３】
添加した細胞培養培地試料を使用するIL-2アッセイの標準曲線を、Siloam Biosciences Optimiser（商標）マイクロプレートにおいて、化学蛍光検出用のQuantaRed（商標）基質を使用して行う。
【００９４】
マウス血清
結果から、250pg/mlから2.0pg/mlのダイナミックレンジにわたって、マトリックスとしてマウス血清を使用することにより、Optimiser（商標）および従来の96-ウェルプレートの両方におけるアッセイについて、線形性が示される。未加工データを、以下の表に示す。算出結果および標準曲線を、下記表およびグラフに示す。
【００９５】
添加したマウス血清試料を使用する、3回のIL-2サンドイッチアッセイからのシグナル測定値：
a) NUNC  96-ウェルプレート、吸光、450nmでのOD（630nmを差し引く）および、b) Optimiser（商標）プレート、化学蛍光、528/590nmでのRLU、読み取り感度45
【００９６】
【表５】
2014503832.tif 000007
【００９７】
下記に、Optimiser（商標）マイクロプレートにおいてマウス血清により試験した、IL-2アッセイについての事例研究1のデータ、および従来の96-ウェルプレートにおける同じアッセイについての比較データを要約する。
【００９８】
【表６】
2014503832.tif 000008
【００９９】
添加したマウス血清試料を使用するIL-2アッセイの標準曲線を、TMB基質および、（630nmを差し引く）450nmでの吸光の比色検出を使用して、従来の96-ウェルプレートにおいて行う。
【０１００】
【表７】
2014503832.tif 000009
【０１０１】
添加したマウス血清試料を使用するIL-2アッセイの標準曲線を、Siloam Biosciences Optimiser（商標）マイクロプレートにおいて、化学蛍光検出用のQuantaRed（商標）基質を使用して行う。
【０１０２】
性能特性
5つの異なるレベルのIL-2を、各種マトリックスにおけるアッセイの範囲にわたって、5回の試料反復に添加した。下記のように算出を行った。
【０１０３】
各試行の検証試料の濃度を、各校正曲線を使用して算出する。次いで、それらの検証試料の%回収を、下記式を使用して算出する。
%回収＝100×（推定濃度）／真の濃度
【０１０４】
各濃度についての前記検証試料の算出されたデータの平均および標準偏差を算出する。次いで、それらの検証試料の%精度（CV）を、下記式を使用して算出する。
%精度＝100×（標準偏差）／算出濃度
【０１０５】
【表８】
2014503832.tif 000010
【０１０６】
【表９】
2014503832.tif 000011
【０１０７】
【表１０】
2014503832.tif 000012
【０１０８】
【表１１】
2014503832.tif 000013
【０１０９】
本発明に基づくOptimiser（商標）ELISAの利益および特有の効果
このIL-2アッセイの実施例において、Optimiser（商標）マイクロプレートシステムは、従来の高タンパク質結合能96-ウェルプレートと比較して、下記の劇的な利益および効果を明らかに示す。
・高価な実験試料が1/10
・試薬（捕捉抗体、検出抗体、SAv-HRP、基質）を1/10にする、したがって、試薬コストを1/10に低減
・アッセイ時間全体で30-60分（従来の1/10未満）
・部分的なプレートアッセイを使用できて便利
・感度が同等
・ダイナミックレンジが同等
・洗浄およびプレート洗浄機が不要
・従来のプレートの「周辺効果」が起こらない
・イムノアッセイ適用についての最大速度および利便性
・実施時間を劇的に低減
・複合生物学的流体、例えば、血清および血漿を使用しての同等の性能
【０１１０】
【表１２】
2014503832.tif 000014
【０１１１】
【表１３】
2014503832.tif 000015
【０１１２】
事例研究1：OPTIMISTER（商標）プレートを使用したIL-2アッセイの最適化
実験試料によるアッセイを行う前に、全ての抗体に基づくアッセイと同様に、前記試薬を滴定して、Optimiser（商標）プレートでの使用について、最も実用的な濃度を測定すべきである。下記は、イムノアッセイ開発用のNIHガイダンス1に従うことによる、検出抗体およびHRPコンジュゲートの最も実用的な濃度を測定するための実施例の手順である。同じIL-2アッセイの最適化を、2種類の異なるアッセイプラットホームにおいて行った。
1)  吸光検出（OD450/630）用の透明な従来の高タンパク質結合能96-ウェルプレート
2)  化学蛍光検出（528/590nm）用のOptimiser（商標）微小流体プレート
【０１１３】
試薬の調製
1)  コーティング緩衝液：OptiCoat（商標）  コーティング緩衝液
2)  ブロッキング緩衝液：OptiBlock（商標）  ブロッキング緩衝液
3)  洗浄緩衝液：OptiWash（商標）  洗浄緩衝液
4)  捕捉抗体溶液：精製抗マウスIL-2抗体を、コーティング緩衝液で8、4、2および1μｇ/ｍｌに希釈した。
5)  アッセイ標準：組換えマウスIL-2タンパク質を、ブロッキング緩衝液で1000および20pg/mlに希釈した。非添加マトリックスを、ゼロ点として使用した。
6)  検出抗体溶液：ビオチン化抗マウスIL-2抗体を、ブロッキング緩衝液で8、4、2および1μｇ/ｍｌに希釈した。
7)  SAv-HRP：ストレプトアビジンを結合したHRPを、a) Optimiser用にブロッキング緩衝液で0.125μg/ｍｌ（1:4000）に希釈し、b) 従来の96-ウェル用に0.25μg/ｍｌ（1:2000）に希釈した。HRP活性を妨害するアジ化ナトリウムを、試薬に関して使用される全ての緩衝液から除去した。
8)  （Optimiser（商標）アッセイ用）化学蛍光基質最終操作溶液：QuantaRed（商標）基質キットを、室温で少なくとも10分間平衡化する。50部のQuantaRed（商標）増強溶液を、50部のQuantaRed（商標）安定過酸化物および1部のQuantaRed（商標）ADHP濃縮物と混合する。調製後30分以内に使用する。
9)  （従来の96-ウェル用）吸光基質：使用前にTMB基質を、室温に平衡化する。
10)  Optimiser（商標）プライミング：吸収パッドおよびホルダーによりOptimiser（商標）マイクロプレートを組み立てる。10μｌのOptiPrime溶液を、Optimiser（商標）プレートの各ウェルに充填する。全てのウェルが空になるまで待つ。前記プレートを15分以内に使用する。
【０１１４】
実験手順
Optimiser（商標）マイクロプレートアッセイの手順を、ここで記載する。吸光検出アッセイ手順用の前記透明な従来の高タンパク質結合能96-ウェルプレートを、別表A-2に記載する。
【０１１５】
試薬およびプレートの調製欄の工程10に記載のように、Optimiser（商標）プライミング手順を、アッセイ手順を開始する前に完了する。
1)  10μlの捕捉抗体溶液を、適切なウェル（プレート配置を参照のこと）に添加し、室温で5分間インキュベートする。
2)  10μlのブロッキング緩衝液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
3)  10μlの各アッセイ標準を、適切なウェルにピペットで取り、室温で10分間インキュベートする。
4)  30μlの洗浄緩衝液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。
5)  10μlの検出抗体溶液を、適切なウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
6)  工程5を繰り返す。
7)  10μlのSAv-HRP溶液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
8)  前記吸収パッドを交換する。
9)  工程5を2回繰り返す。
10)  10μlのQuantaRed（商標）操作溶液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。前記プレートを、前記ホルダーから取り外す。キムワイプ（登録商標）を使用して、Optimiser（商標）プレートの底面から、全ての残留物を拭き取る。基質添加後15分の時点での、蛍光を測定する。528nmの蛍光励起波長および590nmの蛍光発光波長（感度設定45）についての、蛍光マイクロプレートリーダーを設定する。
【０１１６】
【表１４】
2014503832.tif 000016
【０１１７】
結論
実験結果に基づいて、2μg/mlの捕捉抗体および2μg/mlの検出抗体を、優れたシグナル対ノイズ比および低試薬消費を生じさせる、Optimiser（商標）および従来の96-ウェルマイクロプレートの両方におけるIL-2アッセイを行うための最適な抗体濃度として選択した。
【０１１８】
事例研究1：従来の96-ウェルプレートについてのIL-2アッセイ手順
1)  100μlの捕捉抗体溶液を、各ウェルに添加し、プレートを密封し、37℃で1.5時間インキュベートする。
2)  前記プレートを、PBS（T-20）で2回洗浄し、続けてPBSで3回洗浄する。
3)  300μlのブロッキング緩衝液を、各ウェルに添加し、プレートを密封し、37℃で1.5時間インキュベートする。
4)  工程2を繰り返す。
5)  100μlの調製した各標準、コントロールおよび／または試料を、適切なウェルにピペットで取り、前記プレートをフィルムで密封し、37℃で1.5時間インキュベートする。
6)  工程2を繰り返す。
7)  100μlの検出抗体溶液を、各ウェルに添加し、前記プレートをフィルムで密封し、37℃で1.5時間インキュベートする。
8)  工程2を繰り返す。
9)  100μlのSAv-HRP溶液を、各ウェルに添加し、前記プレートをフィルムで密封し、37℃で1.5時間インキュベートする。
10)  工程2を繰り返す。
11)  ウェルあたりに、100μlのUltra-TMB基質溶液を添加し、プレートを室温で15分間インキュベートし、50μlの2N  硫酸を各ウェルに添加することにより、反応を停止し、各ウェルの吸光度を、450nmおよび630nmで測定し、450nmの値から630nmの値を差し引く。
【０１１９】
本発明に基づくOptimiser（商標）装置および方法が、従来のアッセイ装置および方法との比較により、イムノアッセイに基づく分析方法についての区別できる効果を提案することを、事例研究1に示す。具体的には、事例研究1は、IL-2アッセイについてOptimiser（商標）を使用することにより、顕著な試料容量およびアッセイ時間の節約が可能であることを示す。前述のように、前記事例研究は、単に説明に役立つ実例であり、類似の性能利益（程度は変わる）が、以下の表2に示すように、他のアッセイについて達成され得る。
【０１２０】
表：Optimiser（商標）において、10μlの試料容量のみで使用する場合の、従来の96-ウェルマイクロプレートとの検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）の比較（従来の96-ウェルマイクロプレート実験では、100μlの試料容量を使用した。）
【表１５】
2014503832.tif 000017
【０１２１】
各アッセイは、好ましくは、Optimiser（商標）に最適化されるべきであり、従来の96-ウェルマイクロプレートと比較した場合に、異なるレベルの感度を提案する。一般的に、Optimiser（商標）は、従来のマイクロプレートと同様の感度（LODおよびLOQ）を示す。しかしながら、アッセイの最適化実験中に、アッセイの種類に基づいて変化する、2つの重要なパラメーターを特定した。
・各アッセイについてのインキュベーション間隔は、同じではないこと：一部のアッセイ（例えば、IL-4アッセイ）では、約10分間のインキュベーションサイクルで、飽和反応近くを示す。一方、他のアッセイ、例えば、IL-2では、20分間（またはより長い）インキュベーション工程でのみ、良好な感度を示す。最適なアッセイ時間は、アッセイごとに確立する必要がある。
・本願明細書で前述のように、異なるアッセイは、前記の前湿潤性溶液に対して異なる挙動を示す。上記表2に要約し、さらに、以下の表3に示すように、前湿潤工程をアッセイ順序に組み入れた場合、各アッセイは、顕著に異なる性能改善を示す。理論的に、このことにより、前湿潤性緩衝液（前述のPBSに基づくプライミング緩衝液）の組成により、アッセイごとの基礎におけるアッセイ性能において、実質的な改善がなされるとの推論が導かれる。
【０１２２】
【表１６】
2014503832.tif 000018
【０１２３】
従来の装置および方法との比較により、Optimiser（商標）おけるアッセイ性能を区別するもう1つの要因は、アッセイの結果に対する試料マトリックスの効果である。血清（または血漿）マトリックスにおける、サンドイッチELISAによる検体の測定は、捕捉抗体と検出抗体とを交差結合し、偽陽性と区別させ得る、自然発生妨害因子により取り違えられ得る。このような自然発生妨害活性は、多くの場合、血清（または血漿）試料における、リウマチ因子またはHAMA（ヒト抗マウス抗体）様効果に起因すると考えられる。IgGのFc部を有する反応性の自己抗体である、Rh因子は、多くの場合、関節炎を有することが疑われる患者において特定される。ただし、特にこの活性は、健常な人の5-10%において観察され、偽陽性シグナルを引き起こす。この効果は、96-ウェルELISAに基づく分析について、十分特徴付けられる。ただし、Optimiser（商標）は、同じ血清／プラズマ因子によってさえも、一部のアッセイについて顕著に改善された性能を示す。このことを説明するために、種々のアッセイ用の複数の抗体セットについて、ヒト（血清および血漿）ならびにマウス（血清）のマトリックスの両方で試験した。Optimiser（商標）の性能は、アッセイごとの基礎に幅広く変化し、所定のマトリックスについての特定のアッセイを最適化するための手段として使用し得ることが見出された。
【０１２４】
本発明は、エンドユーザーが所望の要求に対してアッセイを「調整する」ことができる、極めて用途の広いアッセイシステムを提供することが、当業者に理解されるであろう。この一例は、アッセイの感度を向上するために、より多くの試料容量を使用することである。Optimiser（商標）の充填ウェルは、約30μlの液体量を含むように構成される。ピペットからの1回の充填として30μl未満の容量を、いずれかのアッセイ工程についてOptimiser（商標）に添加し得る。30μl超の容量を、繰り返し充填することにより添加し得る。例えば、90μlの試料を、30μlの3回充填として添加し得る。これを、オペレーターがOptimiser（商標）マイクロプレートを行う場合の手動モード、または自動システムのいずれかで行い得る。使用における、手動モードと自動モードとの重要な差異は、多くの繰り返し試料容量の充填と、各工程で充填される容量である。一般的には、オペレーターが非常に低容量（約5μl未満）を操作すること、または、大量の繰り返し充填（＞5回の試料充填）を行うことは、実行不可能である。これらの任務は、自動化された液体ハンドラーが、正確な時間間隔において、必要な試薬を分注する工程を行うであろう、自動化に基づく方法がより適している。低容量操作または多数の繰り返し充填は、オペレーターには確かに不可能であり、アッセイについての液体操作工程における操作に対する注意深く、細部まで行き届いた配慮により達成され得る。表6に、手動モードについて、アッセイ検出限界において試料容量が増加することの影響を示す。これらの実験では、下記を除いて、事例研究1に記載のものと同様の実験プロトコールを使用した。
・10μlの場合：試料容量の1回充填に続いて、10分間のインキュベーションサイクル
・30μlの場合：試料容量の1回充填に続いて、10分間のインキュベーションサイクル
・90μlの場合：試料容量の3回充填（各30μl）に続いて、各充填工程後に10分間のインキュベーションサイクル
【０１２５】
【表１７】
2014503832.tif 000019
【０１２６】
表6に示すように、一般的な傾向として、試料容量を増加することにより、感度が向上される（より低いLODおよび／またはLOQ）。アッセイを区別するという事実は、レベルの改善である。例えば、IL-4アッセイでは、10μlおよび90μlの試料容量データを比較した場合、LODにおいて、約4倍の改善を示し、LOQにおいて、約8倍の改善を示す。一方、IFN-ガンマアッセイでは、LODおよびLOQそれぞれにおいて、約2倍および4倍未満の改善しか示さなかった。このことは、全てではないがほとんどのアッセイが、感度の改善を示しているが、その利益は、事案ごとの基礎における個々のアッセイについて確立されるべきであるという事実を示す。手動モードにおいて、LOQ改善における利益は、オペレーターの能力におけるわずかな変化に起因する、精度（相違）により部分的に限定される。この一例は、反復操作についての各工程のインキュベーション時間のわずかな変化である。
【０１２７】
この影響は、さらに、繰り返し試料容量充填の回数の増加によってさえも、拡張され得る。説明に役立つ実験として、以下に、事例研究2での、270μlの試料容量によるIL-6アッセイについての実験プロトコールおよび結果を要約する。特に断らない限り、事例研究1の形式に従うプロトコールの残り、および、表6において特定するように、同様のクローン＃’を、この実験について使用する。
【０１２８】
事例研究2：IL-6についての10μl（静止）ならびに90μlおよび270μl（フロースルー）の操作に関する、要約されたアッセイプロトコール
【０１２９】
1)  吸収パッドおよびホルダーによりOptimiser（商標）プレートを組み立てる。Optimiser（商標）プレートを、本願明細書に記載のPBSに基づくプライミング緩衝液によりプライミングする。
2)  10μlの捕捉抗体溶液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
3)  10μlのブロッキング緩衝液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
4)  静止モード：0を含む2〜500pg/mlの範囲の濃度で、標準溶液を調製する。10μlの調製された各標準溶液を、適切なウェルにピペットで取り、室温で10分間＊インキュベートする。
フロースルーモード（90μl）：0を含む0.4〜100pg/mlの範囲の濃度で、標準溶液を調製する。30μlの調製された各標準溶液を、適切なウェルにピペットで取り、10分間待ち、3回繰り返し、90μlの合計容量を、各ウェルに充填した。
フロースルーモード（270μl）：0を含む0.1〜25pg/mlの範囲の濃度で、標準溶液を調製する。30μlの調製された各標準溶液を、適切なウェルにピペットで取り、10分間待ち、9回繰り返し、270μlの合計容量を、各ウェルに充填した。
5)  30μlの洗浄緩衝液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。
6)  10μlの検出抗体溶液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
7)  工程5を繰り返す。
8)  10μlのSAv-HRP溶液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
9)  工程5を繰り返し、前記吸収パッドを交換し、再度、工程5を繰り返す。
10)  10μlのQuantaRed操作溶液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。前記プレートを、前記ホルダーから取り外す。キムワイプを使用して、Optimiser（商標）プレートの底面から、全ての残留物を拭き取る。528／590nmの波長および感度設定45により、基質添加後15分での蛍光を測定する。
【０１３０】
静止モード（10μlの試料容量）と、いわゆるフロースルーモード（90μlおよび270μlの試料容量、または、基本的に30μlより多いいずれかの試料容量）とについての比較結果を、以下の表CS3に示し、大きな感度改善を、明確に示す。下記表に、検出感度に対する試料容量の影響を示す、Optimiser（商標）マイクロプレートで試験されたIL-6アッセイに関する事例研究2のデータを示す。
【０１３１】
【表１８】
2014503832.tif 000020
【０１３２】
前述のように、手動モードに関する制限の源は、ヒトのオペレーターの操作手順における逸脱により生じる相違である。このことが、大量の繰り返し充填が、理想的に自動化に基づくシステムに適していることの確かな理由である。上記実験では、Biotek高精度マイクロプレート分注器で繰り返され、性能の改善には驚かされる。前記自動化システムが、低容量（約1〜5μl）を良好な再現性で分注し得るため、前記実験を、1回の充填での30μlの分注に代えて、約5μlの、微小流路を満たすのに必要とされる最少量（わずかに過剰量）を、各充填工程において分注するように、変更した。次いで、各分注サイクルは、正確に指定時刻に作動するインキュベーションサイクルに従った。したがって、以下の表7に示すように、6×充填サイクルおよび20×サイクルについての合計アッセイ時間は、1回で10μlを充填する場合より長くなる。ただし、これにより、Optimiser（商標）のさらにもう1つの「調整」特性、すなわち、アッセイの時間を伸ばすことによっても、それでも従来の96-ウェルマイクロプレートの合計アッセイ時間より顕著に短いうえに、感度の利益には驚かされることを示される。
【０１３３】
本発明の開発における最適化の成果部分として、Optimiser（商標）への分注時の分注チップの位置は、パラメトリックに最適化される。自動化システムは、同じ正確な位置（許容値約100μm）に繰り返し充填できるため、この最適化工程により、向上した精度性能が得られる。具体的には、前記分注チップの位置は、前記分注チップが、常に貫通孔の近隣に密接して充填ウェルの表面に触れるように最適化される。より具体的には、前記貫通孔の端部から水平面上に、半径約250μm（許容値約100μm）の距離を置く。これらの実験は、前述のように試料充填における例外を除いて、事例研究と同様の形式にも従う。その結果を、以下の表7に示す。表7には、自動化システム法の時に、感度における素晴らしい利益があること、すなわち、低容量であるがより多くの繰り返し充填と、試料インキュベーション工程についてのより長い全インキュベーション時間（各工程について10分間）を使用することを、明確に示されている。表7のデータは、興味深い研究成果を明確に示している。すなわち、30μlの1回充填は、複数回充填（5μl×6回充填）より、効果が著しく低い。このことは、流路の内部容量が約5μlのみであるため、論理的に一致しており、繰り返し充填モードにおいて、各「充填量」は、流路壁に予めコートされた前記捕捉抗体に最大限結合するために、大きなインキュベーション間隔（5〜25分の範囲、この場合では10分間）でインキュベートされる。一方、30μl量を1回の工程で充填する場合、微小流体検出チャンバ内における試料のアリコートについての滞留時間は、流路を流れる際の約10秒〜1分間である。このことは、最適なアッセイ性能を確保するための、更なるアッセイ最適化法、例えば、捕捉抗体、ブロッキング緩衝液等の繰り返し充填を許容する顕著な研究成果である。
【０１３４】
【表１９】
2014503832.tif 000021
【０１３５】
事例研究3：Optimiser（商標）アッセイ性能における、コート緩衝液のpHの効果
5.0から10.5の範囲におけるpHでのコーティング緩衝液に関するスクリーニングを評価する。
【０１３６】
従来のプレートにおけるアッセイとは異なり、Optimiser（商標）における捕捉抗体の吸着は、タンパク質吸着の反応割合により影響される。前記反応割合は、コーティング緩衝液の成分に強く影響を受ける。5.0から10.5の範囲におけるpHに関するコーティング緩衝液スクリーニング試験を、種々のアッセイで行ってきた。
【０１３７】
コーティング緩衝液：リン酸クエン酸緩衝液、pH  5.0および5.5；PBS緩衝液、pH  6.0、6.5、7.0、7.5；トリス緩衝液、pH  8.0、8.5、9.0；ならびに、炭酸−重炭酸緩衝液、pH  9.5、10.0、10.5
実験：プライミング工程を行わない以外は、前述の標準的なプロトコールに従う。上記緩衝液で捕捉抗体を希釈する。各抗原についての1種類の濃度を使用する捕捉抗体のインキュベーション後、1回洗浄工程を行う。
【０１３８】
結果：
5.0から10.5の範囲におけるpHでのコーティング緩衝液に関するアッセイ反応プロフィール
【０１３９】
結論：全てのアッセイにおいて、7.0より低い範囲のpHにおいて、より良好な用量反応が示された。
【０１４０】
2.8から7.2の範囲におけるpHでのクエン酸−Na2HPO4コーティング緩衝液に関するスクリーニングを評価する。
コーティング緩衝液：クエン酸−Na2HPO4緩衝液は、2.6〜7.6の範囲のpHで、幅広い緩衝能を有する。24タイプのクエン酸−Na2HPO4緩衝液を、2.6〜7.2のpHで調製した。これは、より広範囲のスクリーニングのために、CS3.1からの試験の拡張である。
実験：プライミング工程を行わない以外は、標準的なプロトコールに従う。上記緩衝液で捕捉抗体を希釈する。各抗原についての1種類の濃度を使用する捕捉抗体のインキュベーション後、1回洗浄工程を行う。
【０１４１】
結果：
【０１４２】
【表２０】
2014503832.tif 000022
【０１４３】
5.0から10.5の範囲におけるpHで、コーティング緩衝液に関するアッセイ反応プロフィール
【０１４４】
【表２１】
2014503832.tif 000023
【０１４５】
結論および考察
・最も強いシグナルを与える各アッセイに関する最適なpHの範囲がある。
・最適なpHの範囲のウィンドウは、事例研究3にさらに記載のように、アッセイにより変化する；別表2
【０１４６】
PBS緩衝液とクエン酸−Na2HPO4緩衝液との比較
コーティング緩衝液：2.6〜6.9の範囲のpHのPBS緩衝液を、HCI溶液によるpH調整により調製した。注記：PBS緩衝液は、6より低いpHでの使用を目的としており、比較研究についてのみ使用される。
【０１４７】
実験：プライミング工程を行わない以外は、標準的なプロトコールに従う。上記緩衝液で捕捉抗体を希釈する。捕捉抗体のインキュベーション後、1回洗浄工程を行う。マウスIL-2アッセイを、（100pg/mLで）試験した。結果を、クエン酸−Na2HPO4緩衝液でのアッセイ結果と比較し、図3に示す。
【０１４８】
【表２２】
2014503832.tif 000024
【０１４９】
2.6から7.2の範囲におけるpHで、PBS緩衝液およびクエン酸−Na2HPO4緩衝液に関するアッセイ反応プロフィール
【０１５０】
結論および考察：
・PBS緩衝液とクエン酸−Na2HPO4緩衝液との間のアッセイ反応プロフィールは、ほとんど同様である。
・このデータにより、pH（およびコート緩衝液の組成ではない）が、アッセイ反応についての主要な要因であることが確立される。
【０１５１】
クエン酸−Na2HPO4緩衝液による、Optimiser（商標）と従来のプレートとの比較を評価する。
コーティング緩衝液： 24タイプのクエン酸−Na2HPO4緩衝液を、2.6〜7.2のpHで調製した。
【０１５２】
実験：
1)  Optimiser（商標）に関して、プライミング工程を行わない以外は、標準的なプロトコールに従う。上記緩衝液で捕捉抗体を希釈する。捕捉抗体のインキュベーション後、1回洗浄工程を行う。100pg/mLのマウスIL-2でのマウスIL-2アッセイのみを試験した。
2)  従来のプレートに関して、NUNC  MaxiSorp（登録商標）高結合ELISAプレートを使用する。標準的なプロトコールに従う。上記緩衝液で捕捉抗体を希釈する。100pg/mLのマウスIL-2でのマウスIL-2アッセイのみを試験した。
【０１５３】
【表２３】
2014503832.tif 000025
【０１５４】
Optimiser（商標）と従来のプレートとの比較研究での、2.6から7.2の範囲におけるpHでの、クエン酸−Na2HPO4緩衝液に関するアッセイ反応プロフィール
【０１５５】
結論および考察：
・Optimiser（商標）に基づくアッセイにおける、コート緩衝液のpHの影響は、従来のプレートアッセイにおけるコート緩衝液のpHの影響より、非常に顕著である。これは、新たな現象であり、近年当該技術分野において知られている、アッセイ性能におけるコート緩衝液のpHの影響とは、著しく異なる。
【０１５６】
クエン酸−Na2HPO4緩衝液によるOptimiser（商標）における感度改善
Optimiser（商標）プレートでの最適なpHでコーティング緩衝液を使用することにより、感度を改善し得る。ほとんどの場合、10μlの試料によるのみでのOptimiser（商標）アッセイにおいて、同じ抗体濃度を使用する従来のアッセイより、良好な感度を得ることができた。
【０１５７】
【表２４】
2014503832.tif 000026
【０１５８】
一例として、以下は、アッセイ手順におけるプライミング工程でのコーティング緩衝液として、PBS、pH7.2を使用するIL-4アッセイと、プライミング工程を使用せずに、pH4.4でのクエン酸−Na2HPO4緩衝液を使用する同じアッセイとの比較である。
【０１５９】
【表２５】
2014503832.tif 000027
【０１６０】
結論および考察：
・最適なコート緩衝液の使用は、プライミング工程の使用より改善されたアッセイ性能のための、より良好な方法である。
【０１６１】
高濃度の捕捉抗体によるOptimiser（商標）における感度の改善：
最適なコーティング緩衝液により、ほとんどのOptimiser（商標）アッセイは、同じ抗体濃度による従来のアッセイと同じか、または、前記従来のアッセイより良好な感度を達成するであろう。さらに、Optimiser（商標）プレートの微小流体流路における、大きな表面積および高表面積対容積比により、従来のプレートと比較して、より多くの捕捉抗体を表面上に吸着させる。以下の表に、高濃度の捕捉抗体および／または検出抗体を使用した場合に、一部のアッセイが、性能の顕著な改善を示す。
【０１６２】
表：向上された捕捉抗体濃度でのOptimiser（商標）アッセイについてのLOD／LOQ比較
【表２６】
2014503832.tif 000028
【０１６３】
・上記5つのアッセイでは、Optimiser（商標）アッセイにおいて4倍濃度の捕捉抗体を使用することにより、ヒトIL-6およびマウスIFN-ガンマのアッセイの感度が、約２倍改善する。
【０１６４】
最適なコーティング緩衝液によるOptimiser（商標）アッセイに関する、10μl操作用の要約されたアッセイプロトコール：
【０１６５】
1)  吸収パッドおよびホルダーによりOptimiser（商標）プレートを組み立てる。
2)  最適なコーティング緩衝液で、捕捉抗体を調製し、10μlの捕捉抗体溶液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
3)  10μlの洗浄緩衝液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。
4)  10μlのブロッキング緩衝液を、各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。
5)  標準溶液および試料溶液を調製する。10μlの調製された各溶液を、適切なウェルにピペットで取り、室温で10分間インキュベートする。
6)  10μlの検出抗体溶液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
7)  工程5を繰り返す。
8)  10μlのSAv-HRP溶液を、各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートする。
9)  工程5を繰り返し、前記吸収パッドを交換し、再度、工程5を繰り返す。
10)  10μlのQuantaRed操作溶液を、各ウェルに添加し、全てのウェルが空になるまで待つ。前記プレートを、前記ホルダーから取り外す。キムワイプを使用して、Optimiser（商標）プレートの底面から、全ての残留物を拭き取る。528／590nmの波長により、基質添加後15分での蛍光を測定する。
【０１６６】
種々のアッセイにおけるコーティング緩衝液の効果：
以下の表に、コーティング緩衝液（OptiBind（商標））の選択は、異なるアッセイについて幅広く異なること、および、複数のアッセイで、理想的なコート緩衝液として、同じOptiBind（商標）の配合を共有した場合でも、代替緩衝液の範囲が異なることを示す。ここで留意すべきは、種々のOptiBind（商標）の配合を、記号AからLにより特定することである。表CS3.4に列記するように、Aは、pH2.8の緩衝液に対応し、Bは、pH3.2の緩衝液に対応し、Cは、pH3.6の緩衝液に対応する等、Lは、pH7.2の緩衝液に対応する。
【０１６７】
【表２７】
2014503832.tif 000029
【０１６８】
【表２８】
2014503832.tif 000030
【０１６９】
【表２９】
2014503832.tif 000031
【０１７０】
本発明は、種々の好ましい実施形態において本願明細書に詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修飾および変更が、前記好ましい実施形態および、本願明細書に記載の各種発明になされてもよいことは、当業者に明らかである。したがって、全てのこのような修飾および変更は、本願明細書に包含され、この発明の範囲内であることを意図し、この発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ規定されることを意図する。
【図１】
2014503832.tif 000032
【図２】
2014503832.tif 000033
【図３】
2014503832.tif 000034
【図４Ａ】
2014503832.tif 000035
【図４Ｂ】
2014503832.tif 000036
【図５Ａ】
2014503832.tif 000037
【図５Ｂ】
2014503832.tif 000038
【図６】
2014503832.tif 000039
【図７】
2014503832.tif 000040
【図８】
2014503832.tif 000041
【図９】
2014503832.tif 000042
【図１０】
2014503832.tif 000043
【図１１】
2014503832.tif 000044
【図１２】
2014503832.tif 000045
【図１３】
2014503832.tif 000046
【図１４】
2014503832.tif 000047
【図１５】
2014503832.tif 000048
【図１６】
2014503832.tif 000049
【図１７】
2014503832.tif 000050
【図１８】
2014503832.tif 000051
【図１９】
2014503832.tif 000052
【図２０】
2014503832.tif 000053
【図２１Ａ】
2014503832.tif 000054
【図２１Ｂ】
2014503832.tif 000055
【図２１Ｃ】
2014503832.tif 000056
【図２１Ｄ】
2014503832.tif 000057
【図２２】
2014503832.tif 000058
【図２３】
2014503832.tif 000059
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2014503832.tif 000065
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