(57)【要約】  本発明は、インターフェロンアルファまたはその高分子中合体結合体を含む抗癌用医薬組成物および、これらを抗癌剤と併用投与して癌を治療する用途に関する。本発明のインターフェロンアルファ結合体は、従来のインターフェロンアルファに比べて増加した生体内の半減期およびより優れた抗癌活性を示し、特に、ゲムシタビンといった抗癌剤との併用投与は癌細胞成長および増殖に対して相乗的な阻害効果を奏し、顕著に優れた抗癌活性を示す。また、前記本発明の抗癌用医薬組成物は、優れた生体内での半減期および抗癌活性を有し、投与頻度を顕著に減少させることができる。抗癌活性に優れたインターフェロンアルファ結合体と抗癌剤の併用投与は抗癌剤の投与用量を減少させ、抗癌剤の副作用を減少させて治療に対する患者の順応性を上昇させることができる。【選択図】図6
2014526460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンアルファを含む癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記インターフェロンアルファは、生体内の受容体に結合して野生型インターフェロンアルファと同一であるかまたは対応する生物学的活性を示す物質であって、野生型インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ誘導体、インターフェロンアルファ変異体またはこれらの断片である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファとポリマーが結合した、ポリマー結合体形態である請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール、抗体、抗体断片、免疫グロブリン不変領域、フィブロネクチン、アルブミンおよびエラスチンからなる群から選択される請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリマー結合体は、インターフェロンアルファと免疫グロブリン不変領域が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸、ボリ乳酸-グリコール酸、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組合わせからなる群から選択される非ペプチド性ポリマーによって互いに結合されて製造されたものである請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、Ras阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤およびMAPK阻害剤からなる群から選択される抗癌剤をさらに含む請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、ゲムシタビンまたはソラフェニブをさらに含む請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、k-ras変異を有する癌の治療用である請求項6または7に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は膵贓癌、黒色腫、腎癌または卵巣癌の治療に用いられる請求項6または7に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリンFc領域である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１１】
前記インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ2aまたはインターフェロンアルファ2bである請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記非ペプチド性ポリマーは、ポリマー結合体でインターフェロンアルファのN末端に結合される請求項5に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非ペプチド性ポリマーは、ポリマー結合体でインターフェロンアルファのN末端のアミン基またはチオール基に結合される請求項5に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン不変領域は、非糖鎖化される請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫グロブリン不変領域は、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される1〜4個のドメインからなる請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリン不変領域は、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される重鎖不変領域および軽鎖不変領域の二量体からなる請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫グロブリン不変領域は、ヒンジ領域を含む請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン不変領域は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMに由来する請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン不変領域のそれぞれのドメインがIgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来した異なる起源を有するドメインハイブリッドである請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫グロブリン不変領域は、同一の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２１】
前記免疫グロブリン不変領域は、IgG4 Fc領域である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫グロブリン不変領域は、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc領域である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２３】
前記非ペプチド性ポリマーは1kDa〜100kDaの範囲の分子量を有する請求項5に記載の組成物。
【請求項２４】
前記非ペプチド性ポリマーの反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される請求項5に記載の組成物。
【請求項２５】
前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルプロピオン酸エステル、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたは炭酸スクシンイミジルである請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
前記非ペプチド性ポリマーは、両末端にアルデヒド反応基を有する請求項5に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項1〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物を、個体に投与する工程を含む、癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンアルファまたはその結合体を含む癌の予防または治療用の医薬組成物、およびそれを抗癌剤と併用投与する癌治療の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインターフェロンはサイトカインの一種であり、生体内免疫反応活性化および癌細胞のアポトーシス活性化によってウイルス、癌細胞などの増殖を阻害するタンパク質である。インターフェロンを生成する細胞の種類に基づいて、インターフェロンはインターフェロンアルファ、インターフェロンベータおよびインターフェロンガンマの3つの下位グループに分けられる。特に、インターフェロンアルファはBリンパ球細胞、ヌル細胞(Null lymphocytes)およびマクロファージにより生成され、抗ウイルスおよび抗癌活性を有し、NK(Natural Killer)細胞を活性化させ、骨髄細胞を阻害する特性を有する。
【０００３】
最近、臨床実験では組換えヒトインターフェロンアルファが、非常に多様な固形腫瘍の治療に対して治療的可能性を有するとの報告がなされており、組換えDNA技術により製造されたインターフェロン2種は商業的に利用可能である(インターフェロンアルファ-2b組換え体(イントロン-A, シェリング・プラウ社);インターフェロンアルファ-2a組換え体(ロフェロン、ホフマン・ラ・ロシュ社))。イントロンAは、悪性黒色腫の治療における手術と併用しての使用、攻撃性濾胞性非ホジキンリンパ腫(aggressive follicular NoN-Hodgkin's Lymphoma)の治療におけるアントラサイクリン化学療法と併用しての使用、尖圭コンジロームや有毛細胞白血病およびAIDS-関連カポジ肉腫の病変内治療に用いることが勧められている。ロフェロン(roferon)は、フィラデルフィア染色体陽性(Philadelphia chromosome positive)の慢性骨髄性白血病(CML)およびAIDS-関連カポジ肉腫の治療に用いられる。それらは、また膀胱癌 (非特許文献１)および腎癌(非特許文献２)に効果があることが知られている。最近では、ポリエチレングリコール(PEG)で修飾したインターフェロンが悪性黒色腫治療の用途としての承認がなされている。しかし、天然型インターフェロンアルファまたはPEG修飾インターフェロンアルファは半減期が短く効能が低いため、抗癌効果が低いことが報告されてきた。
【０００４】
癌は、細胞増殖および細胞死滅における、非調節なバランスへと導く遺伝子発現の様々な変化によって引き起こされる異常な細胞の成長であり、隣接組織に浸透して組織を破壊し、離れた部位に転移して最終的に死に至らしめる。癌細胞は異常に分裂して分化して、身体内のどの組織においても発生し、1つの要因もしくはそれらの組合わせにより誘発されることが知られている。このような要因には、非常に多様な化学物質または放射線のような環境的要因、ウイルス感染のような感染性疾患および遺伝的要因が挙げられる。癌は、その関連組織と癌組織を成している細胞によって数百種類に分類される。
【０００５】
このような癌を治療するために、手術、放射線治療および化学療法が用いられているが、化学療法および放射線治療は吐き気および嘔吐、血球減少症、感染、悪液質、粘膜炎、脱毛などのような深刻な副作用の問題がある。特に、化学療法による副作用は、患者の生命に大きな影響を及ぼすことがあり、患者の治療の順応性(compliance)を急激に低下させることもあり得る。
【０００６】
一方、膵贓癌は5年間の生存率が5％以下と、予後が良くない。その理由としては、膵贓癌が通常、病期が進行してから発見され、患者の20％未満のみが手術を受けることが望ましいからである。癌を切除しても、微小転移およびリンパ節再発が2年以内に患者のほぼ50％に発生する。膵贓癌は、消化器癌全体の中で最も死亡率が高い癌の一つである言われており、癌の死亡原因として西欧では4位を占め、韓国では6位を占める悪性腫瘍である。膵贓癌は全癌患者の僅か2〜3％にしか該当しないが、全ての癌関連の死亡のうちの6％を占める。局所進行性膵贓癌と転移性膵贓癌は化学療法の種類に関係なく、それぞれ8〜12カ月および3〜6カ月の生存期間中央値(median survival)を有する。したがって、膵贓癌は非常に致命的な癌である。
【０００７】
現在、進行性膵贓癌の強力な治療戦略には、ヒト膵贓癌細胞の細胞死滅を誘導し、腫瘍の成長および進行を阻害できる2'-デオキシシチジンヌクレオシド類似体であるゲムシタビン(リリー社)の静脈投与が挙げられる。しかし、ゲムシタビン単独投与は5.7カ月の全生存期間の中央値(median overall survival)程度の低い効率を示す。最近、ゲムシタビンと組み合わせたエルロチニブ(タルセバ)が転移性膵贓癌に対して承認されており、且つゲムシタビンとエルロチニブの併用療法は、ゲムシタビン単独投与と比較して膵贓癌患者の1年間の生存率を18％から24％に増加させた。しかし、化学療法の重要な要素である全生存期間の中央値は僅か0.33ヵ月増加しただけであった。エルロチニブは低分子量であり、表皮成長因子受容体(EGFR)チロシンキナーゼ阻害剤であり、癌細胞と急速に分裂する正常細胞を区分できない。したがって、ゲムシタビン単独投与より高い毒性を示し、長期間暴露した際には抵抗性を生じる。
【０００８】
このような理由により、ゲムシタビンとエルロチニブの組合わせだけでなく、ゲムシタビン/インターフェロンアルファ、ゲムシタビン/シスプラチン、ゲムシタビン/カペシタビン、ゲムシタビン/アバスチンの併用療法も試みられてきた。しかしながら、治療効果は満足できるものでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第10-0360594号
【特許文献２】韓国登録特許第10-0725315号
【特許文献３】国際特許公開第97/34631号
【特許文献４】国際特許公開第96/32478号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Torti, F.M. et al.,J. clin. Onco.,3, 506-512, 1985
【非特許文献２】Vugrin, D. et al., Cancer treat. Rep., 69, 817-820, 1985
【非特許文献３】H.Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press,New York,1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明者はインターフェロンアルファおよび免疫グロブリン不変領域を非ペプチド性ポリマーで結合させて製造したインターフェロンアルファ結合体が、従来のインターフェロンアルファと比較して、長い生体内の半減期とさらに優れた抗癌活性を示すことを見出し、特にゲムシタビンといった抗癌剤との併用投与は、顕著に優れた抗癌活性を示す相乗効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは抗癌剤と優れた抗癌効果を有するインターフェロンアルファ結合体の併用投与が抗癌剤の投与用量を減少させ、それにより抗癌剤の副作用が減少し、患者の治療の順応性を高めることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、インターフェロンアルファまたはそのポリマー結合体を含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、インターフェロンアルファおよび免疫グロブリン不変領域がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(PLA)、ボリ乳酸-グリコール酸(PLGA)、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組合わせからなる群から選択される非ペプチド性ポリマーにより結合されて製造されたインターフェロンアルファ結合体を含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記インターフェロンアルファ結合体とともに、Ras阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤およびMAPK阻害剤から選択される抗癌剤をさらに含む医薬組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記医薬組成物を個体に投与することを含む癌の治療方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のインターフェロンアルファ結合体は、従来のインターフェロンアルファに比べて、長い生体内の半減期とより優れた抗癌活性を示し、特にゲムシタビンといった抗癌剤との併用投与は癌細胞成長と増殖に相乗的な阻害効果を有し、顕著に優れた抗癌活性を示す。本発明の抗癌用医薬組成物は、優れた生体内の半減期および抗癌活性を有し、投与頻度を大幅に減らすことができる。抗癌活性に優れたインターフェロンアルファ結合体を抗癌剤と併用投与することにより、抗癌剤の副作用を減少させ、患者の治療の順応性を上昇させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、ダウディ(Daudi)細胞の癌細胞増殖に対するインターフェロンアルファと、本発明の一実施態様のインターフェロンアルファ結合体のin vitroにおける阻害効果を示すグラフである。
【図２】図2は、ヒト卵巣癌細胞(SK-OV-3)を皮下に移植したヌードマウス(athymic BALB/c nude)に、本発明の一実施態様のインターフェロンアルファ結合体を投与後の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図３】図3は、ヒト膵贓癌細胞(BxPC-3)を皮下に移植したヌードマウスに、本発明の一実施態様のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンを併用投与した後の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図４】図4は、ヒト膵贓癌細胞(Panc-1)を皮下に移植したヌードマウスに、本発明の一実施態様のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンを併用投与した後の腫瘍のサイズの変化を示すグラフである。
【図５】図5は、ヒト膵贓癌細胞(Panc-1)を皮下に移植したヌードマウスに、本発明の一実施態様のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンを併用投与した後、マウスを個別に剖検して腫瘍のサイズを確認した図を示す。
【図６】図6は、ヒト膵贓癌細胞(Miapaca-2)を皮下に移植したヌードマウスに、本発明の一実施態様のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンを併用投与した後の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一つの態様として、本発明は、インターフェロンアルファを含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明のインターフェロンアルファはサイトカインの一種であり、生体内免疫反応および癌細胞のアポトーシスの活性化によってウイルス、癌細胞などの増殖を阻害するタンパク質である。前記インターフェロンアルファは、Bリンパ球細胞、ヌルリンパ球細胞および大食細胞により生成され、抗ウイルスおよび抗癌活性を有し、NK細胞を活性化させ、骨髄細胞に対して阻害特性を有する。前記インターフェロンアルファは、好ましくはインターフェロンアルファ2b、インターフェロンアルファ2aなどであってもよい。
【００２０】
ヒトインターフェロンアルファは17,500から21,000の分子量を有し、タンパク質mg当り2×108IUの非常に高い力価の固有活性を有する。生体内インターフェロンアルファは165個のアミノ酸を含むタンパク質であり、インターフェロンアルファ2a(配列番号:1)とインターフェロンアルファ2b(配列番号:2)は、それぞれ23位にリシンとアルギニンを有する。
【００２１】
本発明において用いられるインターフェロンアルファは、天然型インターフェロンアルファ、アゴニスト、誘導体、断片およびそれらの変異体を含み、前記アゴニストは、インターフェロンアルファの構造とは無関係にインターフェロンアルファの生体内の受容体に結合し、インターフェロンアルファと同一であるかまたは対応する生物学的活性を示す物質を意味し、前記誘導体は、天然型インターフェロンアルファと少なくとも80％以上のアミノ酸配列において相同性を示し、アミノ酸残基の一部のグループが化学的に置換、欠失または修飾されてもよく、インターフェロンアルファ機能を保有しているペプチドを意味する。前記「断片」とは、天然型インターフェロンアルファのN末端またはＣ末端に1つまたはそれ以上のアミノ酸が追加または欠失した形態であり、天然に存在しないアミノ酸(例:D-型アミノ酸)が追加されてもよく、インターフェロンアルファ機能を保有しているペプチドを意味する。前記変異体は、天然型インターフェロンアルファと1つまたはそれ以上のアミノ酸配列が異なり、インターフェロンアルファ機能を保有しているペプチドを意味する。前記アゴニスト、誘導体、断片およびそれらの変異体はインターフェロンアルファの生体内の受容体に結合して天然型インターフェロンアルファと同一であるかまたは対応する生物学的活性を示す。
【００２２】
本発明で用いられるインターフェロンアルファの製造方法は、特許文献１に開示されている。前記明細書全体は、参考資料として本発明に含まれる。ただし、前記インターフェロンアルファは、前記特許文献１に開示されたものに限定されず、当該分野の技術範囲内で容易に製造されるインターフェロンアルファは本発明の範囲に含まれる。したがって、インターフェロンアルファを製造するために必要とされる通常の技術は本発明に適用することができる。
【００２３】
また、本発明は、インターフェロンアルファにポリマーが結合された、ポリマー結合体を含む癌の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００２４】
本発明における用語、「ポリマー結合体」とはインターフェロンアルファにポリマーが結合した形態である。前記結合体に用いられるポリマーは、生体内の半減期および治療効能を高める全てのポリマーを含む。例えば、前記ポリマーはポリエチレングリコールといったポリマーであってもよく、抗体、抗体断片、フィブロネクチン、アルブミン、免疫グロブリン断片またはエラスチンのようなタンパク質であってもよいが、これらに制限されない。
【００２５】
前記ポリマー結合体において前記インターフェロンアルファおよびポリマーは互いに直接結合されるか、またはペプチド性リンカーまたは非ペプチド性ポリマーのような非ペプチド性リンカーによって結合されてもよいが、これらに制限されない。前記タンパク質ポリマー結合体は、遺伝工学技術を用いて細胞から融合タンパク質の形態で生産することができ、またはインターフェロンアルファおよびタンパク質ポリマーはそれぞれ生産した後、化学的技術を用いて細胞外(ex vivo)で互いに結合され得る。インターフェロンアルファにポリマーが結合したインターフェロンアルファ結合体は、特許文献２に記載された方法により製造することができ、前記明細書全体は、参考資料として本発明に含まれる。ただし、前記インターフェロンアルファ結合体の製造方法は、前記特許文献に開示された方法に限定されず、インターフェロンアルファの半減期を延長させるためにポリマーをインターフェロンアルファと結合させる全ての方法を含む。したがって、当該分野の技術範囲内で容易に製作されるインターフェロンアルファ結合体は本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
また、前記ポリマー結合体は、インターフェロンアルファおよび免疫グロブリン不変領域がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組合わせからなる群から選択される非ペプチド性ポリマーによって結合されたインターフェロンアルファ結合体であってもよい。本発明において前記インターフェロンアルファおよび免疫グロブリン不変領域が非ペプチド性ポリマーによって結合されたポリマー結合体は、インターフェロンアルファ結合体と混用され得る。
【００２７】
前記免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いたCH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される1〜4つのドメインを意味し、もしくは軽鎖不変領域1(CL1)および重鎖不変領域1(CH1)を除いた重鎖不変領域2(CH2)および重鎖不変領域3(CH3)を意味する。また、前記免疫グロブリン不変領域は、ヒンジ(hinge)領域および重鎖不変領域にヒンジ領域をさらに含むことができる。また、前記免疫グロブリン不変領域はCH2および/またはCH3のアミノ酸配列の比較的長い部分を欠失させた断片であってもよい。具体的には、本発明の免疫グロブリン不変領域は1)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびCH4ドメイン、2)CH1ドメインおよびCH2ドメイン、3)CH1ドメインおよびCH3ドメイン、4)CH2ドメインおよびCH3ドメイン、5)1つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域(またはヒンジ領域の一部)との組合わせ、6)重鎖不変領域と軽鎖不変領域の各ドメインの二量体であってもよい。
【００２８】
本発明の免疫グロブリン不変領域は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMに由来してもよく、免疫グロブリン不変領域のそれぞれのドメインがIgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来した異なる起源を有するドメインのハイブリッドであってもよい。前記ハイブリッドは、異なる起源の２つ以上の免疫グロブリン不変領域に該当する配列が単鎖免疫グロブリン不変領域に存在することを意味する。本発明では、種々の形態のハイブリッドが可能である。例えば、ドメインハイブリッドはIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのCH1、CH2、CH3およびCH4からなる群から選択される1〜4つのドメインからなることができ、ヒンジ領域を含むことができる。
【００２９】
また、二量体または多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリン不変領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合される。例えば、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEの不変領域断片からなる群から選択される2つ以上の断片を組み合わせて二量体または多量体を製造することができる。
【００３０】
好ましくは、前記免疫グロブリン不変領域はヒトの血液に最も豊富なタンパク質であるIgGまたはIgM由来の免疫グロブリン不変領域であってもよい。本発明の具体的な実施態様ではIgG由来免疫グロブリン不変領域が用いられた。IgGは、またIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のサブクラスに分けることができ、これらの組合わせまたはこれらのハイブリッドが本発明で許容される。好ましくは、IgG2およびIgG4のサブクラスを用いてもよく、本発明の具体的な一実施態様では補体依存性細胞障害(Complement dependent cytotoxicity、CDC)のようなエフェクター機能のないIgG4のFcドメインが用いられた。
【００３１】
したがって、ヒトIgG4の非糖鎖化された(aglycosylated)Fc領域は、最も多く好まれる薬物キャリアである。非ヒト起源のFc領域は体内で抗原として作用し、この抗体の生産を誘導できるため、ヒト起源のFcドメインはこれを越える利点がある。
【００３２】
また、前記免疫グロブリン不変領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が欠失した(deglycosylated)形態であってもよい。このような免疫グロブリン不変領域糖鎖の増減または欠失は、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法のような当該技術分野において通常に知られている方法により達成されうる。ここで、免疫グロブリン不変領域からの糖鎖の欠失は補体(c1q)の結合力を顕著に低下させ、抗体-依存性細胞媒介性細胞障害(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity、ADCC)または補体-依存性細胞障害が減少または欠失する結果をもたらすため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で糖鎖の化学的または酵素学的欠失により製造された非糖鎖化された免疫グロブリン不変領域、または原核生物、好ましくは大腸菌から生産された非糖鎖化された免疫グロブリン不変領域は、薬物のキャリアとして本発明の目的に、より適合しうる。
【００３３】
本発明の免疫グロブリン不変領域は、天然型アミノ酸配列とその配列誘導体(突然変異体)を含む。アミノ酸配列誘導体は、天然アミノ酸配列で1つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせにより天然型アミノ酸配列と異なる配列である。例えば、抗体結合に重要な役割を果たすことで知られているIgG Fcの214位〜238位、297位〜299位、318位〜322位または327位〜331位のアミノ酸残基が修飾のための適切な標的として用いられてもよい。また、ジスフィルド結合を形成できる残基が欠乏したり、天然型FcのいくつかのN末端アミノ酸が欠乏したりまたは天然型FcのN末端に追加のメチオニン残基を有するなどの多様な誘導体が可能である。また、エフェクター機能はC1q結合モチーフのような補体結合モチーフまたはADCCを、モチーフを欠失させることにより取り除くことができる。このような免疫グロブリン不変領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献３、特許文献４に開示されている。
【００３４】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知となっている(非特許文献３)。最も通常的に起こる交換はAla/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/GluおよびAsp/Gly間の交換である。
【００３５】
場合によっては、アミノ酸はリン酸化、硫酸化、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化、アミド化などで修飾されることも可能である。
【００３６】
前述の不変領域誘導体は、本発明の不変領域と同一の生物学的活性を有し、例えば、熱、pHなどに対して増大した構造的安定性を有する。
【００３７】
また、このような免疫グロブリン不変領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットを含む他の動物から得ることができ、好ましくは、ヒトから得ることができる。非ヒト起源の不変領域は生体で抗原として作用し、これらの抗体生産を誘導できるので、非ヒト起源の不変領域に比べてヒト起源の不変領域のほうが利点を有する。
【００３８】
このようなFc領域は、ヒト、および牛、ヤギ、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットを含む他の動物から分離された天然型から得ることもでき、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはこの誘導体であってもよい。ここで、Fc領域はヒトまたは動物個体から免疫グロブリン全体を分離してタンパク質分解酵素を処理し、天然型免疫グロブリンから得ることができる。例えば、パパインは天然型免疫グロブリンをFabおよびFc領域に分解し、ペプシン処理はpF'cおよびF(ab)2断片の生産を生ずる。これらの断片は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを適用し、FcまたはpF'cを分離することができる。
【００３９】
本発明の具体的な実施態様では、微生物から得た組換え免疫グロブリンFc領域であるヒトIgG4由来の非糖鎖化されたFc領域が用いられた。
【００４０】
本発明の非ペプチド性ポリマーは、ペプチド結合を除いた任意の共有結合により互いに結合された、2以上の繰り返し単位を含む生体適合性ポリマーを意味する。
【００４１】
本発明に使用可能な非ペプチド性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸およびボリ乳酸-グリコール酸といった生分解性高分子、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組合わせで構成された群から選択されてもよく、好ましくはポリエチレングリコールであるが、これらに制限されない。また、当該分野において公知となっているこれらの誘導体および当該分野の技術範囲内で容易に製造できるこれらの誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
従来のインフレームフュージョン(inframe fusion)製法により得られた融合タンパク質において用いられたペプチド性リンカーは、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期を延長させる十分な効果が期待される程は得られないという欠点を有する。しかし、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性を有する非ペプチド性ポリマーを用いて活性薬物の血中半減期を維持させることができる。したがって、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性を有するポリマーであれば、如何なる非ペプチド性ポリマーであっても制限なく用いられる。前記非ペプチド性ポリマーは1〜100kDaの範囲、好ましくは1〜20kDaの範囲の分子量を有することができる。また、本発明における非ペプチド性ポリマーは、一種類のポリマーまたは異なる種類のポリマーの組合わせであってもよい。
【００４３】
本発明で用いられる非ペプチド性ポリマーは、両末端に免疫グロブリン不変領域およびインターフェロンアルファと結合できる反応基を有する。前記非ペプチド性ポリマーは両末端に反応基を有してもよく、前記反応基はアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択することができる。スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオン酸エステル、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたは炭酸スクシンイミジルであってもよい。
【００４４】
前記非ペプチド性ポリマーの両末端の反応基は互いに同一でもよく、また異ってもよい。例えば、非ペプチド性ポリマーは一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を有することができる。
【００４５】
特に、前記非ペプチド性ポリマーが両末端にアルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小化するとともに、非ペプチド性ポリマーの両末端でインターフェロンアルファおよび免疫グロブリン不変領域を結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化により生成された最終産物は、アミド結合で結合された時、より一層安定的である。前記アルデヒド反応基は、低いpHでN末端に選択的に結合し、pH9.0といった高いpHでリシン残基に結合して共有結合を形成する。本発明のインターフェロンアルファ結合体は、好ましくはインターフェロンアルファのN末端に特異的に非ペプチド性ポリマーが結合されて製造された結合体であってもよく、インターフェロンアルファのN末端のアミン基またはチオール基に非ペプチド性ポリマーが結合されたものであってもよい。本発明者らは、インターフェロンアルファのN末端に非ペプチド性ポリマーが結合されることにより、インターフェロンアルファの活性を増加させることができることを確認した。N末端特異的結合体の製造はpHの調節により行われ、好ましいpHの範囲は4.5〜7.5である。
【００４６】
両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールが非ペプチド性ポリマーとして用いられる場合には、前記ヒドロキシ基は公知の化学反応により多様な反応基で活性化することができ、または商業的に入手可能な修飾された反応基を有するポリエチレングリコールが用いられてもよい。
【００４７】
本発明のインターフェロンアルファ結合体は、インターフェロンアルファタンパク質および免疫グロブリン不変領域と非ペプチド性ポリマーによって結合されて製造された結合体の形態であり、生体内の持続性および安定性を維持させるのに優れた効果がある。免疫グロブリン不変領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして用いるのに十分に安全である。また、相対的に少ない分子量であることから、前記免疫グロブリン不変領域は結合体の製造、精製および収率の面において免疫グロブリン分子全体に比べて利点を有する。さらに、アミノ酸配列が抗体ごとに大きく異なるFab部分が存在しないため、結合体の同質性が大幅に増加し、抗原性の誘発減少が期待される。
【００４８】
本発明のインターフェロンアルファ結合体は、天然型インターフェロンアルファに比べて延長した生体内の半減期および優れた抗癌活性を有する。投与時に本発明のインターフェロンアルファ結合体は、インターフェロンアルファ受容体に結合して癌細胞のアポトーシスを誘導して腫瘍のサイズの縮小および腫瘍の成長阻害をもたらす。したがって、インターフェロンアルファまたはその結合体を含む医薬組成物は癌の予防または治療に用いることができる。
【００４９】
本発明において用いられる用語「予防」とは、本発明の組成物の投与により癌の発病を阻害または遅延させる全ての行為を意味し、用語「治療」とは、本発明の組成物の投与により癌の症状が好転したり有益に変更される全ての行為を意味する。
【００５０】
本発明の具体的な一実施態様によると、ヒトホジキンリンパ腫細胞であるダウディ細胞において抗増殖in vitro効力試験を行い、その結果、本発明のインターフェロンアルファ結合体は、天然型インターフェロンアルファと比較して癌細胞の増殖において優れた阻害効果を有することが示された(表1、図1)。本発明の具体的な一実施態様によると、ヒト卵巣癌細胞(SK-OV-3)が皮下に移植されたヌードマウスに本発明のインターフェロンアルファ結合体を投与し、その後の腫瘍のサイズの変化を観察した。その結果、陰性対照群、天然型インターフェロンアルファおよびPEG修飾インターフェロンアルファを比較した際に、腫瘍のサイズに変化がないことが示された(表2、図2)。
【００５１】
また、本発明のインターフェロンアルファ結合体はRas阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤およびMAPK阻害剤から選択された抗癌剤、好ましくはゲムシタビンまたはソラフェニブ(Raf阻害剤)と併用投与することにより、優れた抗癌活性を示すことができる。
【００５２】
本発明の「Ras阻害剤」とはRas(H-Ras,K-RasまたはN-Rasを含む)の発癌原性を標的にしたり、低下させたり阻害する化合物を言い、例えば、L-744832、DK8G557またはR115777(ザーネストラ(Zanestra))といったファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がある。
【００５３】
本発明の「Raf阻害剤」とは、細胞分化、増殖およびアポトーシスにおいて細胞外部信号-調節キナーゼとして重要な役割を果たすRafキナーゼを標的にしたり、低下させたり阻害する化合物を意味し、Raf阻害剤の標的はこれらに制限されないが、RAF1を含むことができる。例えば、3-(3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシベンジリデン)-5-ヨード-1,3-ジヒドロキシインドール-2-オン;およびベンズアミド、3-(ジメチルアミノ)-N-[3-[(4-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]-4-メチルフェニル]-(9Cl)を含むことができる。
【００５４】
本発明の「MEK阻害剤」とは、MAPキナーゼであるMEKのキナーゼ活性を標的にしたり、低下させたり阻害する化合物を意味し、MEK阻害剤の標的はこれらに制限されないが、ERKおよびサイクリンD1を含むことができる。MEK阻害剤の例はこれらに制限されないが、ブタンジニトリル、ビス[アミノ[2-アミノフェニル)チオ]メチレン]-(9Cl)を含むことができる。
【００５５】
本発明の「MAPK阻害剤」とはMAPを標的にしたり、低下させたり阻害する化合物を意味する。MAPキナーゼ(MAPK)は多様な細胞外刺激に対する反応により活性化され、細胞の表面から核への信号伝達を媒介するタンパク質であるセリン/トレオニンキナーゼタンパク質の群である。これは、炎症、アポトーシス性細胞の死滅、発癌性形質転換、腫瘍細胞の浸湿および転移を含む種々の生理学的および病理学的細胞現象を調節する。MAPK阻害剤の例は、これらに制限されないが、ベンゼンスルホンアミド、N-[2-[[[3-(4-クロロフェニル)-2-プロペニル]メチル]アミノ]メチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシ-(9Cl)を含むことができる。
【００５６】
本発明のゲムシタビンは2'-デオキシ-2'，2'-ジフルオロシチジンの一般名を有する化合物であり、ビシノールジフルオロライン(vicinol difluorine)置換されたデオキシシチジン類似体であり、この単一塩酸塩およびβ-異性体を含むことができる。ゲムシタビンはRKIP(Rafキナーゼ阻害蛋白)を活性化させてRaf阻害剤として作用する。従来ゲムシタビンは膵贓癌の治療において最も優れた臨床的活性を示す薬物であると思われていた。しかし、ゲムシタビンは癌細胞と急速に分裂する正常細胞間の特異性欠如により引き起こされる毒性を有し、大部分の腫瘍細胞に既に存在する耐性または後天的な耐性を有し、膵贓癌の病状を大幅に増進させることはできなかった。ゲムシタビン/シスプラチン、ゲムシタビン/カペシタビン、ゲムシタビン/アバスチン、ゲムシタビン/インターフェロンアルファの併用療法も試みられたが、治療効果は満足できるものでなかった。
【００５７】
本発明者らは、本発明のインターフェロンアルファ結合体をRas阻害剤、Rafキナーゼ阻害剤、MEK阻害剤およびMAPK阻害剤から選択された抗癌剤(k-ras変異を克服できる抗癌剤)、特に、ゲムシタビンと併用投与する場合、非常に顕著な抗癌活性を示すことを見出した。Ras→Raf→MEK→MAPK信号伝達経路の活性化は、細胞の分化および成長を促進し、また、インターフェロンアルファ経路の1つであるインターフェロンアルファの抗癌活性(アポトーシス)を阻害するSTATを阻害する。Ras阻害剤、Rafキナーゼ阻害剤、MEK阻害剤およびMAPK阻害剤から選択された抗癌剤は、本発明のインターフェロンアルファ結合体と併用投与する場合、顕著な抗癌活性を示し、特に、ゲムシタビンあるいはインターフェロンを単独で投与する場合、反応がなかったk-ras変異を有するPanc1およびMiapaca2膵贓癌細胞株に対して優れた抗癌効果を奏した。さらに、前記顕著な抗癌活性は、前記抗癌剤を天然型インターフェロンアルファまたはPEG修飾インターフェロンアルファと併用投与した場合には、これまで確認できなかった相乗効果によるものであることが分かった。したがって、本発明のインターフェロンアルファ結合体と前記抗癌剤の併用投与は、優れた抗癌活性を示す相乗効果を誘導することが見出された。
【００５８】
本発明の具体的な一実施態様によると、ヒト膵贓癌細胞(BxPC-3)をヌードマウスの皮下に移植し、本発明のインターフェロンアルファ結合体の単独投与、または本発明のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンの併用投与を行い、その後腫瘍のサイズの変化を観察した。その結果、ゲムシタビンまたはPEG修飾インターフェロンアルファの単独投与と比較して陰性対照群よりも腫瘍のサイズが縮小したことを示した(表3、図3)。
【００５９】
本発明の具体的な一実施態様によると、ヒト膵贓癌細胞(Panc-1)をヌードマウスの皮下に移植し、本発明のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンの併用投与を行い、その後腫瘍のサイズの変化を観察した。その結果、陰性対照群と比較して腫瘍のサイズが縮小していたことを確認し、ゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の相乗効果も確認した(表4、図4および図5)。本発明の具体的な一実施態様によると、ヒト膵贓癌細胞(Miapaca-2)をヌードマウスの皮下に移植し、本発明のインターフェロンアルファ結合体とゲムシタビンの併用投与を行い、その後腫瘍のサイズの変化を観察した。その結果、陰性対照群と比較して腫瘍のサイズが縮小したことを確認し、ゲムシタビン/PEG修飾インターフェロンアルファ併用投与の場合と比較することで、ゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の併用投与が相乗効果を示した(表5、図6)。
【００６０】
本発明の抗癌用医薬組成物は、k-ras変異を有する癌の治療に用いることができ、好ましくは膵贓癌、黒色腫、腎臓癌または卵巣癌の治療に用いることができ、より好ましくは膵贓癌の治療に用いることができる。
【００６１】
本発明の抗癌用医薬組成物は、前記インターフェロンアルファ結合体が目的組織に到達できる限り、如何なる一般の経路を通じて投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血管内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与を含む多様な投与形式が考慮できるが、本発明は、このような投与の例示形式に制限されない。しかし、経口投与時にタンパク質は消化されるため、経口投与用組成物の活性成分はコーティングされたり、胃の中での分解から保護されるように剤形化されなければならない。好ましくは、前記組成物は注射剤の形態で投与されてもよい。また、前記医薬組成物は、活性成分が標的細胞に移動できる特定装置により投与されてもよい。
【００６２】
本発明のインターフェロンアルファまたはこの結合体を含む抗癌用医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含むことができる。経口投与の場合、薬学的に許容可能なキャリアは、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素および香料を含むことができる。注射剤の場合、薬学的に許容可能なキャリアは、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤および安定化剤を含むことができる。局所投与用製剤の場合、薬学的に許容可能なキャリアは、基剤、賦形剤、潤滑剤および保存剤を含むことができる。本発明の抗癌用医薬組成物の剤形は前述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて多様な剤形に製造され得る。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたはウエハに剤形化され得る。注射剤の場合には、単一投薬剤形のアンプルまたは多用量容器のような多回投薬剤形に剤形化できる。前記組成物は、また、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセルおよび徐放性製剤に剤形化できる。
【００６３】
一方、製剤化に適したキャリア、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を含む。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料および防腐剤をさらに含むことができる。
【００６４】
本発明の抗癌用医薬組成物の投与量は、抗癌剤の種類だけでなく治療する癌腫、投与経路、患者の年齢、性別、体重および疾患の重篤度を含む種々の関連因子により決定され得る。本発明の抗癌用医薬組成物は優れた生体内の半減期および優れた抗癌活性を有するため、投与回数および用量を顕著に減少させることができる。抗癌剤と併用投与する場合、併用投与される抗癌剤の投与用量を減少させることができ、それにより、抗癌剤の副作用を減少させ、患者の治療の順応性を上昇させることができる。
【００６５】
もう1つの態様として、本発明は、前記インターフェロンアルファまたはこの結合体を含む抗癌用医薬組成物を、個体に投与することを含む癌の治療方法を提供する。
【００６６】
前記インターフェロンアルファ、医薬組成物および癌については前記で説明した通りである。
【００６７】
具体的には、本発明の治療方法は、前記医薬組成物を薬学的有効量で癌の疑いがある個体内に投与する工程を含む。前記個体は犬、牛、馬、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、およびヒトを含む哺乳類の全体を意味するが、本発明の哺乳類は、前記例により限定されるわけではない。前記医薬組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内経路を通じて投与され得る。局部的治療においては、必要であれば、病変内投与を含む適切な方法により投与され得る。非経口の注入には筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましい剤形は静脈注射、皮下注射、血管内注射剤、筋肉注射または点滴注射の剤形である。本発明の前記医薬組成物の好ましい投与量は個体の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間により異なり、当業者により適宜決定され得る。
【実施例】
【００６８】
以下、下記実施例により本発明をより詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明をこれら実施例により限定しようとするものではない。
【００６９】
実施例1.インターフェロンアルファ結合体の製造
下記実験で用いたインターフェロンアルファは特許文献１に記載された方法により製造した。インターフェロンアルファ結合体は、前記製造されたインターフェロンアルファを用いて、特許文献２に記載された方法により製造した。具体的な代表的方法は下記の通りである。
【００７０】
実施例1-1.インターフェロンアルファ(IFNα)-PEG-免疫グロブリンFc断片結合体の製造I
<工程1>免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンFc断片の製造
免疫グロブリンFc断片を、下記のとおり製造した。10mMのリン酸塩緩衝液に溶解した150kDaの免疫グロブリンG(IgG、緑十字社)200mgに、タンパク質加水分解酵素パパイン(Sigma社)2mgを処理して、37℃で2時間ゆっくり攪拌した。酵素反応後、生成された免疫グロブリンFc断片の精製のためにスーパーデクスカラム、タンパク質Aカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを順次用いるクロマトグラフィーに適用した。具体的には、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(PBS,pH7.3)で平衡化させたスーパーデクス200カラム(Superdex200,Pharmacia社)に投入し、同様の緩衝液を用いて流速1mL/分で前記カラムを溶出した。免疫グロブリンFc断片より分子量が相対的に大きい、未反応免疫グロブリン(IgG)とF(ab')2は免疫グロブリンFc断片より先に溶出するという特性を用いて除去した。免疫グロブリンFc断片と分子量が類似のFabは、タンパク質Aカラムクロマトグラフィーで除去した。スーパーデクス200カラムから溶出された免疫グロブリンFc断片含有分画を、20mMのリン酸塩緩衝液(pH7.0)で平衡化させたタンパク質Aカラム(Pharmacia社)に5mL/分の流速で投入した後、同様の緩衝液で洗浄し、カラムに結合していないタンパク質を除去した。そしてタンパク質Aカラムを100mMのクエン酸ナトリウム(pH3.0)緩衝液で溶出させ、高純度の免疫グロブリンFc断片を得た。タンパク質Aカラムから得たFc分画を、陽イオン交換樹脂カラム(polyCAT,PolyLC社)を用いて最終精製したが、前記Fc分画が負荷されたカラムは10mMのアセテート緩衝液(pH4.5)を直線濃度勾配(塩化ナトリウム濃度0.15M→0.4M)で溶出させ、高純度のFc分画を提供した。高純度のFc分画は12％SDS-PAGEで分析した。
【００７１】
<工程2>IFNα-PEG複合体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する3.4kDaのポリエチレングリコールであるALD-PEG-ALD(Shearwater社)をヒトインターフェロンアルファ-2b(hIFNα-2b,MW:20kDa)が5mg/mLの濃度で溶解した100mMのリン酸塩緩衝液にIFNα:PEGのモル比が1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20になるように混合した。前記混合物に還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3,Sigma社)を最終濃度が20mMになるように添加し、4℃でゆっくり攪拌しながら3時間反応させて、PEGがインターフェロンアルファのアミノ末端部位に結合されるようにした。PEGとインターフェロンアルファの１:１複合体を得るために、前記反応混合物をスーパーデクスAL(SuperdexR,Pharmacia社)カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。
【００７２】
溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用いて、前記カラムからIFNα-PEG複合体を溶出させ、PEGと結合していないインターフェロンアルファ、未反応PEGおよび2つのインターフェロンアルファがPEGと結合された二量体の副産物を除去した。精製されたIFNα-PEG複合体は5mg/mLの濃度で濃縮した。この実験から反応性が最もよく、二量体のような副産物が最も少ない量が生産されるIFNα:PEGの最適反応モル比は1:2.5〜1:5であることを確認した。
【００７３】
<工程3>IFNα-PEG-Fc結合体の製造
前記工程2で精製されたIFNα-PEG複合体を免疫グロブリンFc断片のN末端に結合させるために、工程1で製造された免疫グロブリンFc断片(約53kDa)を10mMのリン酸塩緩衝液に溶解した後、IFNα-PEG複合体:Fcのモル比がそれぞれ1:1、1:2、1:4および1:8になるように、IFNα-PEG複合体と混合した。反応液のリン酸塩緩衝液濃度を100mMに合わせた後、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMになるように、反応液に添加して4℃で20時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。この実験から反応性が最もよく、二量体のような副産物が最も少なく生産されるIFNα-PEG複合体:Fcの最適反応モル比は1:2であることを確認した。
【００７４】
<工程4>IFNα-PEG-Fc結合体の分離および精製
前記工程3の反応後、反応混合物をスーパーデクスサイズ排除クロマトグラフィーに適用し、未反応物質および副産物を除去して生成されたIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体を精製した。反応混合物を濃縮し、スーパーデクスカラムに投入した後、10mMのリン酸塩緩衝液(pH7.3)を流速2.5mL/分でカラムに通過させ、結合していないFcおよび未反応物質を除去し、カラム溶出によってIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体の分画を収集した。収集されたIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体の分画には、少量の不純物として未反応Fcおよびインターフェロンアルファ二量体を含んでいるため、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行って前記不純物を除去した。IFNα-PEG-Fcタンパク質結合体の分画を10mMの酢酸ナトリウム(pH4.5)で平衡化させたPolyCAT LPカラム(PolyLC社)に投入し、1Mの塩化ナトリウム(NaCl)を用いて10mMの酢酸ナトリウム(pH4.5)の緩衝液を用いて直線濃度勾配(塩化ナトリウム濃度0M→0.5M)でカラムから溶出させた。最後に、陰イオン交換カラムを用いてIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体を精製した。10mMのTris-HCl(pH7.5)緩衝液で平衡化させたPolyWAX LPカラム(PolyLC社)に、前記IFNα-PEG-Fcタンパク質結合体の分画を投入し、1Mの塩化ナトリウムを用いて10mM Tris-HCl(pH7.5)緩衝液で直線濃度勾配(塩化ナトリウム濃度0M→0.3M)を用いてカラムで溶出させ、高純度形態のIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体を分離した。
【００７５】
実施例1-2.IFNα-PEG-Fc結合体の製造II
<工程1>Fc-PEG複合体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する、3.4kDaのポリエチレングリコールであるALD-PEG-ALD(Shearwater社)と、前記実施例1-1の工程1で製造された免疫グロブリンFc断片が15mg/mLの量で溶解した100mMのリン酸塩緩衝液を、1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20のFc:PEGのモル比で混合した。この混合液に還元剤であるNaCNBH3を最終濃度20mMで添加した後、4℃でゆっくり攪拌しながら3時間反応させた。PEGおよびFcの1:1の複合体を得るために、前記反応混合物をもってスーパーデクスκカラム(Pharmacia社)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を用いてカラムからFc-PEG複合体を溶出させ、PEGと結合していない免疫グロブリンFc断片、未反応PEGおよび2つの免疫グロブリンFc断片がPEGと結合された二量体の副産物を除去した。精製されたFc-PEG複合体を約15mg/mLに濃縮した。この実験から反応性が最もよく、二量体のような副産物が最も少なく生成され、Fc:PEGの最適反応モル比は1:3〜1:10であることが見出された。
【００７６】
<工程2>Fc-PEG複合体とインターフェロンアルファの結合体形成および精製
前記工程1で精製されたFc-PEG複合体をIFNα N末端に結合させるために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解したインターフェロンアルファとFc-PEG複合体を、1:1、1:1.5、1:3および1:6のFc-PEG複合体:IFNαモル比で混合した。反応液のリン酸塩緩衝液濃度を100mMになるように混合した後、還元剤としてNaCNBH3を反応液に最終濃度が20mMになるように添加した後、4℃で20時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。反応完了後、実施例1-1の工程4と同様の精製方法により未反応物質および副産物を除去し、高純度のFc-PEG-IFNαタンパク質結合体を分離した。
【００７７】
実施例2.ダウディ細胞におけるインターフェロンアルファ結合体のin vitro細胞増殖阻害効果試験
ダウディ細胞を用いて、培養培地と試験培地はRPMI1640に10％のFBSおよび10％のPSを添加した培地を用いた。96ウェルの丸底プレートでインターフェロンアルファと本発明のインターフェロンアルファ結合体を4倍ずつ試験培地に10種類の濃度で希釈した。希釈した試験培地をそれぞれ50μLずつ96ウェルの扁平な底プレートに移した。ダウディ細胞を1000rpmに5分間遠心分離した後、PBS50mLでコニカルチューブを洗浄した。前記細胞を1000rpmに5分間遠心分離した後、試験用培地を入れて細胞の数を計数した。ダウディ細胞を5×105cell/mLの濃度で希釈した後、各ウェル当り100μLずつ入れ、37℃で72時間培養した。その後、CCK-8を各ウェル当り20μLずつ入れ、3時間後に450nmで吸光度を測定した。
【００７８】
インターフェロンアルファと本発明のインターフェロンアルファ結合体(持続型インターフェロンアルファ結合体)のin vitro癌細胞の増殖阻害効果をEC50で確認した(表1、図1)。その結果、本発明のインターフェロンアルファ結合体はインターフェロンアルファと比較して優れた癌細胞の増殖阻害効果を示した。
【００７９】
【表１】
2014526460.tif 000003
【００８０】
実施例3.ヒト卵巣癌細胞移植マウスにおけるインターフェロンアルファ結合体単独投与のIn vivo抗癌効果試験
前記実施例1で製造したインターフェロンアルファ結合体のin vivo抗癌効果を測定するために、ヒト卵巣癌細胞(SK-OV-3)を皮下に移植したマウスで腫瘍のサイズの変化を確認した。
【００８１】
5週齢の無胸腺BALB/cヌードマウスにin vitroで培養したSK-OV-3細胞を1×108/4mLの量だけ皮下注射した後、培養した。その後、30mm2のサイズの固形癌をマウスの皮下に移植した。その後、マウスを群当り5匹ずつ皮下に移植された癌のサイズによって4つの群(G1,G2,G3,G4)に分類した。
【００８２】
対照群、インターフェロンアルファ(30mcg/kg,Q1D×5回×4週、皮下注射)、PEG修飾インターフェロンアルファ(150mcg/kg,QW×4週、皮下注射)および本発明のインターフェロンアルファ結合体(150mcg/kg,QW×4週、皮下注射)を前記群に単独投与した。前記試験物質の投与後に前記各群の腫瘍のサイズの変化を4週間測定し、対照群対比腫瘍阻害比率を決定した(表2)。
【００８３】
その結果、本発明のインターフェロンアルファ結合体の投与群は、陰性対照群、天然型インターフェロンアルファおよびPEG修飾インターフェロンアルファ投与群と比較して、腫瘍のサイズが増大しないことが観察された(図2)。
【００８４】
【表２】
2014526460.tif 000004
【００８５】
実施例4.ヒト膵贓癌細胞移植マウスにおけるインターフェロンアルファ結合体単独投与のIn vivo抗癌効果試験
前記実施例1で製造したインターフェロンアルファ結合体のIn vivo抗癌効果を測定するために、ヒト膵贓癌細胞(BxPC3)を皮下に移植したマウスで腫瘍のサイズの変化を確認した。
【００８６】
5週齢の無胸腺BALB/cヌードマウスにin vitroで培養したBxPC3細胞を1×108/4mLの量だけ皮下注射した後、培養した。その後、30mm2のサイズの固形癌をマウスの皮下に移植した。その後、マウスを群当り6匹ずつ皮下に移植された癌のサイズによって5つの群(G1,G2,G3,G4,G5)に分類した。
【００８７】
対照群、ゲムシタビン(30mg/kg,Q3D,4週、静脈注射)、PEG修飾インターフェロンアルファ(30mcg/kg,QW×4週、皮下注射)および本発明のインターフェロンアルファ結合体(30mcg/kg,QW,4週、皮下注射)を前記群に単独投与し、ゲムシタビン(30mg/kg,Q3D,4週、静脈注射)と本発明のインターフェロンアルファ結合体(30mcg/kg,QW,4週、皮下注射)を前記群に併用投与した。前記試験物質の投与後に前記各群の腫瘍のサイズの変化を4週間測定し、対照群と比較した腫瘍阻害比率を決定した(表3)。
【００８８】
その結果、本発明のインターフェロンアルファ結合体の投与群、およびゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の併用投与群において、ゲムシタビン単独投与群およびPEG修飾インターフェロンアルファ単独投与群と比較し、陰性対照群対比腫瘍のサイズが縮小したことが観察された(図3)。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
実施例5.ヒト膵贓癌細胞移植マウスにおけるインターフェロンアルファ結合体単独投与のIn vivo抗癌効果試験
前記実施例1で製造したインターフェロンアルファ結合体のIn vivo抗癌効果を測定するために、ヒト膵贓癌細胞(Panc-1)を皮下に移植したマウスで腫瘍のサイズの変化を確認した。
【００９１】
5週齢の無胸腺BALB/cヌードマウスにin vitroで培養したPanc-1細胞を1×108/4mLの量だけ皮下注射した後、培養した。その後、30mm2サイズの固形癌を再度マウス皮下に移植した。その後、マウスを群当り6匹ずつ皮下に移植された癌のサイズによって5つの群(G1,G2,G3,G4,G5)に分類した。
【００９２】
前記群に対照群、ゲムシタビン(40mg/kg,Q3D,3週、静脈注射)、PEG修飾されたインターフェロンアルファ(30mcg/kg,QW×3週、皮下注射)、本発明のインターフェロンアルファ結合体(30mcg/kg,QW,3週、皮下注射)を単独投与し、ゲムシタビン(40mg/kg,Q3D,3週、静脈注射)と本発明のインターフェロンアルファ結合体(30mcg/kg,QW,3週、皮下注射)を併用投与した。前記試験物質3週間投与後に前記各群の腫瘍のサイズの変化を4週間測定し、対照群と比較した腫瘍阻害比率を決定した(表4)。
【００９３】
その結果、ゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の併用投与群において対照群に比べて腫瘍のサイズが縮小したことが観察され、ゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の相乗効果が観察された(図4および5)。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
実施例6.ヒト膵贓癌細胞移植マウスにおけるインターフェロンアルファ結合体単独投与のIn vivo抗癌効果試験
前記実施例1で製造したインターフェロンアルファ結合体のIn vivo抗癌効果を測定するために、ヒト膵贓癌細胞(Miapaca-2)を皮下に移植したマウスで腫瘍のサイズの変化を調べた。
【００９６】
5週齢の無胸腺BALB/cヌードマウスにin vitroで培養したMiapaca-2細胞を1×108/4mLの量だけ皮下注入した後、培養した。その後、30mm2のサイズの固形癌を再度マウス皮下に移植した。その後、マウスを群当り7匹ずつ皮下に移植された癌のサイズによって5つの群(G1,G2,G3,G4,G5)に分類した。
【００９７】
前記群に対照群、ゲムシタビン(40mg/kg,Q3D,3週、静脈注射)、PEG修飾インターフェロンアルファ(30mcg/kg,QW×4週、皮下注射)、本発明のインターフェロンアルファ結合体(30mcg/kg,QW,4週、皮下注射)を単独投与し、ゲムシタビン(40mg/kg,Q3D,4週、静脈注射)と本発明のインターフェロンアルファ結合体(30mcg/kg,QW,4週、皮下注射)を併用投与した。前記試験物質投与後に前記各群の腫瘍のサイズの変化を4週間測定し、対照群と比較した腫瘍阻害比率を決定した(表5)。
【００９８】
その結果、ゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の併用投与群で陰性対照群と比較して腫瘍のサイズが減少したことが観察され、ゲムシタビン/PEG修飾インターフェロンアルファ併用投与の場合と比較し、ゲムシタビンと本発明のインターフェロンアルファ結合体の相乗効果が観察された(図6)。
【００９９】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月17日(2014.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンアルファを含む癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記インターフェロンアルファは、生体内の受容体に結合して野生型インターフェロンアルファと同一であるかまたは対応する生物学的活性を示す物質であって、野生型インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ誘導体、インターフェロンアルファ変異体またはこれらの断片である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファとポリマーが結合した、ポリマー結合体形態である請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール、抗体、抗体断片、免疫グロブリン不変領域、フィブロネクチン、アルブミンおよびエラスチンからなる群から選択される請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリマー結合体は、インターフェロンアルファと免疫グロブリン不変領域が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸、ボリ乳酸-グリコール酸、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組合わせからなる群から選択される非ペプチド性ポリマーによって互いに結合されて製造されたものである請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、Ras阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤およびMAPK阻害剤からなる群から選択される抗癌剤をさらに含むものである請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、ゲムシタビンまたはソラフェニブをさらに含む請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、k-ras変異を有する癌の治療用である請求項6または7に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は膵贓癌、黒色腫、腎癌または卵巣癌の治療に用いられる請求項6または7に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリンFc領域である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１１】
前記インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ2aまたはインターフェロンアルファ2bである請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記非ペプチド性ポリマーは、ポリマー結合体でインターフェロンアルファのN末端に結合される請求項5に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非ペプチド性ポリマーは、ポリマー結合体でインターフェロンアルファのN末端のアミン基またはチオール基に結合される請求項5に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン不変領域は、非糖鎖化されたものである請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫グロブリン不変領域は、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される1〜4個のドメインからなるものである請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリン不変領域は、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群から選択される重鎖不変領域および軽鎖不変領域の二量体からなる請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫グロブリン不変領域は、ヒンジ領域を含む請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン不変領域は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgMに由来したものである請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン不変領域のそれぞれのドメインがIgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来した異なる起源を有するドメインハイブリッドである請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫グロブリン不変領域は、同一の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２１】
前記免疫グロブリン不変領域は、IgG4 Fc領域である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫グロブリン不変領域は、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc領域である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項２３】
前記非ペプチド性ポリマーは1kDa〜100 kDaの範囲の分子量を有する請求項5に記載の組成物。
【請求項２４】
前記非ペプチド性ポリマーの反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである請求項5に記載の組成物。
【請求項２５】
前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルプロピオン酸エステル、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたは炭酸スクシンイミジルである請求項24に記載の組成物。 
【請求項２６】
前記非ペプチド性ポリマーは、両末端にアルデヒド反応基を有する請求項5に記載の組成物。
【国際調査報告】
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