(57)【要約】  本発明は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの処置のために、適する抗がん剤療法を選択するための、並びに応答を同定及び予測するための方法を提供する。本発明は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの状態をモニターするための、及び悪性がん患者が抗がん剤療法にどのように応答しているかをモニターするための方法も提供する。【選択図】図３−１
2014503821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する対象のための療法選択のための方法であって、
（ａ）対象から採取された試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップと、
（ｂ）前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップと、
（ｃ）前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを、（ｉ）対照タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベル並びに／又は（ｉｉ）対照試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベルと比較するステップと、
（ｄ）対照タンパク質及び／又は対照試料と比較した、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの間の差に基づいて、ｃＭｅｔ阻害剤を単独で又はｃＭｅｔ阻害剤を経路標的療法と組み合わせて投与するかどうかを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
対照タンパク質が、ＩｇＧを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照試料が、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む前記悪性腫瘍を有さない細胞株又は組織試料を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｃＭｅｔ阻害剤が、マルチキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、及びその組合せからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３、ＪＮＪ３８８７７６０５、及びその組合せからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、ＭｅｔＭａｂ、ＡＭＧ１０２、及びその組合せからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む前記悪性腫瘍が、乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、甲状腺の癌腫及びその組合せからなる群から選択されるメンバーである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む前記悪性腫瘍が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
対象が、コーカサス人である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｃＭｅｔタンパク質の活性化レベルが、ｃＭｅｔタンパク質のリン酸化レベルに対応する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＥＲ３タンパク質の活性化レベルが、ＨＥＲ３タンパク質のリン酸化レベルに対応する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＥＲ１タンパク質、ＨＥＲ２タンパク質、ＨＧＦ／ＳＦタンパク質、又はその組合せの発現レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるＨＥＲ１タンパク質の発現レベル及びＨＥＲ２タンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して低度である場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであるとさらに決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるＨＧＦ／ＳＦタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、ＫＲＡＳ突然変異を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＫＲＡＳ突然変異が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｖ、及びその組合せからなる群から選択されるメンバーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）が、ＫＲＡＳ突然変異が前記試料中に存在し、且つ前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質、ＨＥＲ３タンパク質、及びＨＧＦ／ＳＦタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して低度〜中程度の範囲であると決定される場合、並びにｃＭｅｔタンパク質の活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して高度である場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して低度〜中程度の範囲であると決定される場合、並びにＨＥＲ３タンパク質の活性化レベルが対照タンパク質又は対照試料と比較して高度である場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
試料における切断型ｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）が、試料における切断型ｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが検出可能であり、前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試料における切断型ＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｄ）が、試料における切断型ＨＥＲ３タンパク質の発現レベルが検出可能であり、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料におけるＰＩ３Ｋタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｄ）が、ＰＩ３Ｋタンパク質が前記試料において活性化されており、且つ前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及びＨＧＦ／ＳＦタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が単独で投与されるべきであると決定することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＧＦＲ突然変異について前記対象を遺伝子型同定するステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＥＧＦＲ突然変異が、エキソン１９中の欠失、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｌ８６１Ｑ、Ｓ７６８Ｉ、エキソン２０中の挿入、Ｔ７９０Ｍ、及びその組合せからなる群から選択されるメンバーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｄ）が、前記ＥＧＦＲ突然変異が存在する場合、並びに前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
経路標的療法が、ＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
試料におけるＥＧＦＲタンパク質、ＨＥＲ２タンパク質、ＰＩ３Ｋタンパク質、ＶＥＧＦＲ１タンパク質、ＶＥＧＦＲ２タンパク質、及び／又はＶＥＧＦＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び定量化するステップをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるＥＧＦＲタンパク質、ＨＥＲ２タンパク質、及びＨＥＲ３タンパク質の活性化レベルが、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると各々独立して決定され、且つ前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるＰＩ３Ｋタンパク質の活性化レベルが対照タンパク質又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると決定され、且つ前記試料におけるＨＥＲ２タンパク質、ＨＥＲ３タンパク質、及びｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが、対照タンパク質又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質、ＥＧＦＲタンパク質、及びＨＥＲ２タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲にあると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
経路標的療法が、ＥＧＦＲ阻害剤、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、又はその組合せである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｄ）が、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質、ＨＥＲ３タンパク質、及びＶＥＧＦＲ１〜３タンパク質のいずれか１つ、２つ、又は３つ全ての発現レベル及び／又は活性化レベルが、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度〜高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤が経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
経路標的療法が、ＶＥＧＦＲ阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが、近接二重検出アッセイにより検出及び定量化される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
近接二重検出アッセイが、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
対象において異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の状態をモニターする、又は前記悪性腫瘍を有する患者が療法に対してどのように応答しているかをモニターするための方法であって、
（ａ）対象から採取された試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルに対する連続変化を検出及び／又は定量化するステップと、
（ｂ）前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルに対する連続変化を検出及び／又は定量化するステップと、
（ｃ）前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを、（ｉ）対照タンパク質の経時的な発現レベル及び／若しくは活性化レベル並びに／又は（ｉｉ）対照試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の経時的な発現レベル及び／若しくは活性化レベルと比較するステップと
を含み、
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの経時的な増加が、疾患進行又は前記療法に対する陰性応答を示し、
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの経時的な低下が、疾患寛解又は前記療法に対する陽性応答を示す、方法。
【請求項４２】
対照タンパク質が、ＩｇＧを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
対照試料が、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む前記悪性腫瘍を有さない細胞株又は組織試料を含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記療法が、ｃＭｅｔ阻害剤を用いる処置を含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｃＭｅｔ阻害剤が、マルチキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、及びその組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３、ＪＮＪ３８８７７６０５、及びその組合せからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記モノクローナル抗体が、ＭｅｔＭａｂ、ＡＭＧ１０２、及びその組合せからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む前記悪性腫瘍が、乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、甲状腺の癌腫及びその組合せからなる群から選択されるメンバーである、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む前記悪性腫瘍が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患寛解又は陽性応答が、臨床転帰を使用して示される、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記臨床転帰が、応答率（ＲＲ）、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、安定した疾患（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）、及び全生存期間（ＯＳ）からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが、近接二重検出アッセイにより検出及び／又は定量化される、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
近接二重検出アッセイが、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）である、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
[0001]本出願は、２０１１年２月２日に出願の米国特許仮出願第６１／４３８，９０４号及び２０１０年１２月２３日に出願の米国特許仮出願第６１／４２６，９４８号への優先権を主張し、その開示は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の背景］
[0002]乳房、肝臓、肺、卵巣、腎臓及び甲状腺の癌腫を含む多種多様なヒト悪性腫瘍は、持続的なｃＭｅｔの刺激、過剰発現又は突然変異に起因する。ｃＭｅｔの活性化は、細胞成長、浸潤、血管形成及び転移の増加を誘導することができる。例えば、ｃＭｅｔ遺伝子（ＭＥＴ）の突然変異の活性化が、乳頭状腎臓がんの特定の遺伝形式を有する患者で同定され、ヒト腫瘍形成におけるｃＭｅｔの関係を直接に示唆している。ゲノム変化又はタンパク質発現の増加を介したｃＭｅｔ受容体の活性化によるｃＭＥＴシグナル伝達の調節不全は、多くの原発性腫瘍と関連していた。例えば、原発性腫瘍患者の肺腫瘍の４１〜７２％はｃＭｅｔ発現の増加を示し、腫瘍の８〜１３％はＭＥＴ突然変異を有していた。
【０００３】
[0003]ｃＭｅｔは、多くのがん、特に非小細胞肺がんで突然変異し、過剰発現されるチロシンキナーゼ受容体である。そのリガンドＨＧＦに結合する結果、ｃＭｅｔは二量体化し、そのキナーゼドメインでチロシン残基を自己リン酸化する。これは、ＭＡＰＫ及びＡＫＴ経路などの多数の下流カスケードを通して、アダプタータンパク質の補充及びシグナル伝達を誘導する。
【０００４】
[0004]異常なｃＭｅｔシグナル伝達は、がんの進行、並びに抗がん剤への患者の応答との関係が示唆されている。タンパク質発現の増加をもたらすｃＭＥＴ遺伝子の増幅、並びにＨＧＦ刺激の両方は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を活性化することにより肺がん細胞の薬剤耐性を誘導することができる（例えば、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔらＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、７１巻：１６２５〜１６３４頁（２０１０年）；ＥｎｇｅｌｍａｎらＳｃｉｅｎｃｅ、３１６巻：１０３９〜１０４３頁（２００７年）；及びＹａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６８巻：９４７９〜９４８７頁（２００８年）を参照）。Ｅｎｇｅｌｍａｎらは、チロシンキナーゼ阻害剤（ゲフィチニブ）の存在下で、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路がｃＭｅｔによるＨＥＲ３のリン酸化を通して活性化されることも示す。Ｚｕｃａｌｉら（Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９巻：１６０５〜１２頁（２００８年））は、活性化ｃＭｅｔの発現の上昇が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者での無進行期間（ＴＴＰ）の短縮と有意に相関することを記載する。
【０００５】
[0005]腫瘍の成長及び進行とのｃＭｅｔシグナル伝達の関連は、ｃＭｅｔシグナル伝達を妨害することを目指した様々な抗がん剤の開発につながった。Ｈｏｌｍｅｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６７巻：３９５〜４０８頁（２００７年））は、ＨＧＦのＮ末端はｃＭｅｔシグナル伝達に結合することができるが、ｃＭｅｔシグナル伝達を活性化することはできないことを記載し、これがｃＭｅｔ経路に拮抗する有効な方法になることができることを示唆する。開発中の現在のｃ−Ｍｅｔ薬剤の例には、ＭＡＧ１０２（Ａｍｇｅｎ）及びＭｅｔＭａｂ（Ｒｏｃｈｅ）などの中和抗体、並びにＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＩＮＣ２８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３及びＪＮＪ３８８７７６０５などのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が含まれる。これらの薬剤のいくつかの予備臨床結果は有望であった。
【０００６】
[0006]ゲフィチニブ及びエルロチニブなどの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を対象とするチロシンキナーゼ阻害剤は、ＮＳＣＬＣを含むがんを処置するために用いられている。これらの薬剤は、ＮＳＣＬＣ患者の１０〜２０％で部分的な応答を引き出すことが示された（ＦｕｋｕｏｋｏらＪ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ、２１巻：２２３７〜２２４６頁（２００３年）及びＫｒｉｓらＪＡＭＡ、２９０巻：２１４９〜２１５８頁（２００３年））。ＥＧＦＲ突然変異を有していて、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ療法中のＮＳＣＬＣ患者のうち、７０〜７５％は陽性応答率を示す（例えば、Ｙａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６８巻：９４７９〜９４８７頁（２００８年）を参照）。しかし、患者の２５〜３０％はＥＧＦＲ−ＴＫＩに本質的に耐性である。さらに、処置に対して初期応答者である患者でさえ、時間とともに耐性を獲得する。Ｃａｐｐｕｚｚｏら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２７巻：１６６７〜１６７４頁（２００９年））は、蛍光性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による検査で、外科的に切除されたＮＳＣＬＣ患者の腫瘍試料がＭＥＴコピー数の増加を示したことを記載している。外科的に切除されたＮＳＣＬＣ患者の腫瘍試料のサブセット（２０％）は、ＥＧＦＲ及びＭＥＴのコピー数の増加を示し、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性とｃＭｅｔ−ＴＫＩ耐性の間の相関を示唆した（Ｃａｐｐｕｚｚｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２７巻：１６６７〜１６７４頁（２００９年））。驚くことに、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔらは、ＥＧＦＲ  ＴＫＩへの感受性がｃＭｅｔ  ＴＫＩへの獲得耐性と関連していることを示す。
【０００７】
[0007]したがって、当技術分野において、ｃＭｅｔ阻害剤療法をモニターするため、及び処置決定を導くために、患者試料における異常なｃＭｅｔシグナル伝達の存在を検出するアッセイの必要性がある。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
【０００８】
［発明の簡単な概要］
[0008]本発明は、腫瘍細胞（例えば、非小細胞肺がん細胞）でのシグナル伝達経路の構成成分の状態（例えば、発現及び／又は活性化レベル）を検出するための組成物及び方法を提供する。本発明の実施に由来するシグナル伝達経路の構成成分（例えば、ＨＥＲ３及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路構成成分）の発現及び／又は活性化状態に関する情報は、悪性がんの診断、予後診断のために、及び異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍のためのがん処置の設計で用いることができる。
【０００９】
[0009]一態様では、本発明は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する対象のための療法選択の方法を提供し、前記方法は：
（ａ）対象から採取された試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップと、
（ｂ）前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップと、
（ｃ）前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベルを、（ｉ）対照タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベル並びに／又は（ｉｉ）対照試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベルと比較するステップと、
（ｄ）対照タンパク質及び／又は対照試料と比較した、前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの間の差に基づいて、ｃＭｅｔ阻害剤を単独で又はｃＭｅｔ阻害剤を経路標的療法と組み合わせて投与するかどうかを決定するステップとを含む。
【００１０】
[0010]特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較した、試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの間の差に基づいて、ｃＭｅｔ阻害剤を単独で又はｃＭｅｔ阻害剤を経路標的療法と組み合わせて投与することを含む。特定の例では、対照タンパク質の発現又は活性化のレベルは、カットオフ値又は閾値に対応する。他の例では、対照試料中のｃＭｅｔタンパク質又はＨＥＲ３タンパク質の発現又は活性化のレベルは、カットオフ値又は閾値に対応する。
【００１１】
[0011]一部の実施形態では、本発明の方法は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の処置のために、適する抗がん剤（例えば、ｃＭｅｔ阻害剤）の選択を助けるか支援するのに役立ち得る。他の実施形態では、本発明の方法は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の処置のために、適する抗がん剤（例えば、ｃＭｅｔ阻害剤）の選択を向上させるのに役立ち得る。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、抗がん剤（例えば、ｃＭｅｔ阻害剤）による処置に対する、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の応答（又は、応答の見込み）、又は悪性腫瘍を有する対象の応答（又は、応答の見込み）を予測又は同定するのに役立ち得る。
【００１２】
[0012]別の態様では、本発明は、対象において異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の状態をモニターする、又は悪性腫瘍を有する患者が療法にどのように応答しているかをモニターするための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）対象から採取された試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの連続変化を検出及び／又は定量化するステップと、
（ｂ）前記試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの連続変化を検出及び／又は定量化するステップと、
（ｃ）前記試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを、（ｉ）対照タンパク質の経時的な発現レベル及び／若しくは活性化レベル並びに／又は（ｉｉ）対照試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の経時的な発現レベル及び／若しくは活性化レベルと比較するステップと
を含み、
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの経時的な増加は、疾患進行又は療法に対する陰性応答を示し、
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの経時的な低下は、疾患の寛解又は療法に対する陽性応答を示す。
【００１３】
[0013]一部の実施形態では、本発明の方法は、対象において異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の状態をモニターするか、悪性腫瘍を有する患者が抗がん剤（例えば、ｃＭｅｔ阻害剤）療法にどのように応答しているかをモニターするのを助けるか支援するのに役立ち得る。他の実施形態では、本発明の方法は、対象における異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の状態のモニターか、悪性腫瘍を有する患者が抗がん剤（例えば、ｃＭｅｔ阻害剤）療法にどのように応答しているかのモニターを向上させるのに役立ち得る。
【００１４】
[0014]以下の特許文書の開示は、全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる：ＰＣＴ公開国際公開第２００８／０３６８０２号；ＰＣＴ公開国際公開第２００９／０１２１４０号；ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号；ＰＣＴ公開国際公開第２０１０／１３２７２３号；ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００８９９０号；及びＰＣＴ公開国際公開第２０１１／０５００６９号。
【００１５】
[0015]本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[0016]本明細書に記載される共同酵素強化反応性イムノアッセイ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）（ＣＥＥＲ）を用いた、コーカサス人患者のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ及びＳｈｃの発現プロファイリングを示す図である。ＩｇＧ及びサイトケラチン（ＣＫ）を対照として用いた。
【図２−１】[0017]ＣＥＥＲによって決定された、アジア人患者とコーカサス人患者の両方のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２トータルタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図２−２】[0017]ＣＥＥＲによって決定された、アジア人患者とコーカサス人患者の両方のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２トータルタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図３−１】[0018]ＣＥＥＲによって決定された、アジア人患者とコーカサス人患者の両方のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ３及びｃＭＥＴトータルタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図３−２】[0018]ＣＥＥＲによって決定された、アジア人患者とコーカサス人患者の両方のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ３及びｃＭＥＴトータルタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図４−１】[0019]図４Ａは、アジア人患者のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ及びＣＫの発現レベルの要約表を示す図である。
【図４−２】図４Ｂは、コーカサス人患者のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ及びＣＫの発現レベルの要約表を示す図である。
【図５】[0020]アジア人及びコーカサス人の患者のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料の示差的なＨＥＲ３及びｃＭＥＴプロファイリングの比較を示す図である。
【図６】[0021]生体試料中の活性化された（例えば、リン酸化された）及びトータルの分析物レベルを決定するのに特に有益である、本発明の別の実施形態を示す図である。非限定例として、トータルのＨＥＲ３、ｃＭＥＴ及びＰＩ３Ｋ、並びにリン酸化されたＨＥＲ３、ｃＭＥＴ及びＰＩ３Ｋの発現プロファイルを、ＣＥＥＲアレイを用いて検出することができる。
【図７】[0022]ＣＥＥＲを用いた、アジア人患者のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ及びＳｈｃの発現プロファイリングを示す図である。ＩｇＧ及びサイトケラチン（ＣＫ）を対照として用いた。
【図８】[0023]ＣＥＥＲを用いた、アジア人患者のＮＳＣＬＣ腫瘍組織試料におけるＶＥＧＦＲ２の発現プロファイリングを示す図である。ＩｇＧを対照として用いた。
【図９−１】[0024]ＣＥＥＲによって決定された、ｃＭＥＴ阻害剤の様々な投与量で処置したＮ８７細胞での活性化ｃＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋの発現を示す図である。
【図９−２】[0024]ＣＥＥＲによって決定された、ｃＭＥＴ阻害剤の様々な投与量で処置したＮ８７細胞での活性化ｃＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋの発現を示す図である。
【図１０−１】[0025]ＣＥＥＲを用いた、様々な量のＨＧＦで処置したＨＣＣ８２７細胞におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ及びＳｈｃタンパク質の発現プロファイルを示す図である。ＩｇＧ及びＣＫを対照として用いた。非限定例では、細胞を処置するために広い範囲のＨＧＦが用いられた。
【図１０−２】[0025]ＣＥＥＲを用いた、様々な量のＨＧＦで処置したＨＣＣ８２７細胞におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ及びＳｈｃタンパク質の発現プロファイルを示す図である。ＩｇＧ及びＣＫを対照として用いた。非限定例では、細胞を処置するために広い範囲のＨＧＦが用いられた。
【００１７】
［発明の詳細な説明］
Ｉ．序論
[0026]ｃＭｅｔは、ジスルフィド結合によって連結された５０ｋＤａの細胞外のアルファ鎖及び１４０ｋＤａの膜貫通ベータ鎖からなるチロシンキナーゼ受容体である。肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、そのリガンドへの結合の結果、ｃＭｅｔは二量体化し、そのキナーゼドメインのチロシン残基を自己リン酸化する。これは、ＭＡＰＫ及びＡＫＴ経路などの多数の下流のシグナル伝達カスケードを通して、アダプタータンパク質の補充及びシグナル伝達を誘導する。一緒になると、ＨＧＦ／ＳＦ及びｃＭｅｔは、複数の細胞性シグナル伝達経路と、増殖、細胞生存、運動性及び形態形成を含む多数の細胞性機能の両方に関与するよく特徴づけられたリガンド／受容体複合体を構成する。
【００１８】
[0027]ｃＭｅｔシグナル伝達の調節不全は、結腸、胃、膀胱、乳房、卵巣、すい臓、腎臓、肝臓、肺、頭けい部、甲状腺及びすい臓のがんを含む、多くの異なる型のがんとの関係が示唆されている（例えば、Ｐｅｒｕｚｚｉ、Ｂ及びＢｏｔｔａｒｏ、ＤＰ、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１２巻：３６５７〜３６６０頁（２００６年）を参照）。腫瘍細胞では、ｃＭｅｔシグナル伝達の活性化は、多様な一連のシグナル伝達カスケード（例えば、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３経路）を誘発し、細胞成長、増殖、浸潤、移動、アポトーシスからの保護及び転移をもたらす（例えば、Ｅｄｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１５巻：２２０７〜２２１４頁（２００９年）を参照）。例えば、ｃＭｅｔシグナル伝達は、内皮細胞の増殖及び移動を誘導するだけでなく、ＶＥＧＦの発現を誘導することによって、腫瘍血管形成を誘導する（例えば、Ｒｏｓｅｎら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻：２５７〜２７９頁（１９９５年）を参照）。ｃＭｅｔは、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ及びＳＨＣなどのキナーゼと相互作用して、リン酸化することが実証されている。ｃＭｅｔは、他のキナーゼ、例えば、ｐ９５ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＫＩＴ及び他とも相互作用することができる。ｃＭｅｔ受容体の調節不全又はそのリガンド、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）の過剰発現によるｃＭｅｔシグナル伝達経路の異常なシグナル伝達は、侵襲性乳頭状腎臓がんと関連づけられている。
【００１９】
[0028]異常なｃＭｅｔシグナル伝達は、遺伝子の増幅又は突然変異などのゲノム変化、並びにｃＭｅｔタンパク質及びＨＧＦ／ＳＦの過剰発現に起因する可能性がある。ｃＭｅｔ遺伝子での遺伝子増幅及び／又は活性化突然変異は、受容体のチロシンキナーゼ、膜近傍及びセマフォリンドメイン内で同定された。原発性腫瘍患者の分析は、原発性肺腫瘍患者の４１〜７２％はｃＭｅｔタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞を有するが、患者の８〜１３％はｃＭｅｔ突然変異を有する肺腫瘍細胞を有することを明らかにした（実施例４の表３を参照）。突然変異を起こしたｃＭｅｔ及び過剰発現したｃＭｅｔが、がんのより悪い予後と一般的に関連することがわかっている。より重要なことに、過去２、３年に、異常なｃＭｅｔシグナル伝達は、抗がん療法（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、特にＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ  ＴＫＩ））への耐性と相関していた。
【００２０】
[0029]ｃＭｅｔを抑制するために、モノクローナル抗体及び小分子チロシンキナーゼ阻害剤などのいくつかの治療戦略が使用されてきた。開発中のｃＭｅｔ阻害剤の例には、ＭＡＧ１０２（Ａｍｇｅｎ）及びＭｅｔＭａｂ（Ｒｏｃｈｅ）などの中和抗体、並びにＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３及びＪＮＪ３８８７７６０５などのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が含まれる。ｃＭＥＴ及びＨＧＦ／ＳＦは、ｃＭＥＴ阻害剤に対する陽性応答のマーカーであることが実証されている（ＡＲＱ１２７  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ＭｅｔＭａｂ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、２０１０年１０月１７日を参照）。さらに興味深いことに、悪性腫瘍（例えば、胃がん）及びｃＭｅｔ遺伝子増幅を有する患者は、チロシンキナーゼ阻害剤に応答しない。Ｅｎｇｅｌｍａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１６巻：１０３９〜１０４３頁（２００７年））は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩゲフィチニブへの耐性が、ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を活性化する活性化ｃＭｅｔと関連することを実証した。ｃＭＥＴ及び／又はＥＧＦＲ阻害剤への耐性は、複数のシグナル伝達経路の間の機能的冗長性に帰することができる。したがって、多くの場合、チロシンキナーゼ阻害剤への耐性を克服するために、及び異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を効果的に処置するために、多標的療法を採用する必要性がある。
【００２１】
[0030]ＨＥＲ２を過剰発現している胃がん細胞（例えば、Ｎ８７細胞）のｃＭｅｔ阻害剤による処置が、活性化ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３タンパク質のレベルの増加を引き起こしたことが示されている。ｃＭｅｔ阻害剤によるＮＳＣＬＣ細胞（例えば、ＨＣＣ８２７細胞）の処置は、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路の活性化を通してｃＭｅｔ及びＰＩ３Ｋの活性化を誘導した（実施例１０を参照）。
【００２２】
[0031]コーカサス人のＮＳＣＬＣ患者での第ＩＩ相臨床試験は、ｃＭｅｔ阻害剤に対する陽性応答（ＡＲＱ１９７  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ＭｅｔＭａｂ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、２０１０年１０月１７日を参照）が、無進行生存期間と生存の両方の増加をもたらすことができることを実証した。本発明の例示的な実証では、コーカサス人のＮＳＣＬＣ患者のほとんどはＨＥＲ１及びＨＥＲ２の低い発現を示し、前記患者の５０％超はｃＭｅｔ及びＨＥＲ３の高い発現も有していた（実施例８を参照）。さらなる分析は、ｃＭｅｔ阻害剤療法に対する陽性応答を有するコーカサス人患者は、ｃＭｅｔ及びＨＥＲ３の活性化形（それぞれ、ホスホｃＭｅｔ及びホスホＨＥＲ３）も発現することを明らかにし、これらの患者の腫瘍細胞でｃＭｅｔ及びＨＥＲ３シグナル伝達経路を同時活性化させることができることを示している。同時活性化のための可能な機構には、ｃＭｅｔと切断型ＨＥＲ３タンパク質との相互作用又はＨＥＲ３と切断型ｃＭｅｔタンパク質との相互作用が含まれる。これから、ｃＭｅｔ及びＨＥＲ３は、コーカサス人のＮＳＣＬＣ患者ではｃＭＥＴ阻害剤療法に対する陽性応答のマーカーである。本発明の別の実証では、ＫＲＡＳ突然変異を有するＮＳＣＬＣのコーカサス人患者は、高レベルのｃＭｅｔ及びＨＥＲ３発現を示すことがわかった（実施例８を参照）。さらに、本発明を用いて、これらのコーカサス人の患者を単独療法などのｃＭｅｔ阻害剤単独で処置することが、ｃＭｅｔとＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ経路の両方の阻害のために陽性応答をもたらすと予測された。
【００２３】
[0032]本発明の別の例示的な実証では、アジア人のＮＳＣＬＣ患者から得られた試料は、活性化（すなわち、リン酸化）ＨＥＲ１の発現と同時に高レベルのＨＥＲ１を示した（実施例９を参照）。コーカサス人の患者と異なり、アジア人の患者は、高レベルのｃＭｅｔ及びＨＥＲ３を発現しなかった（実施例９を参照）。本発明の予測的方法に基づき、ｃＭｅｔ阻害剤は、アジア人のＮＳＣＬＣ患者で有効でないと予想される。アジア人ＮＳＣＬＣ患者の発現／活性化プロファイルは、ＥＧＦＲ阻害剤がアジア人患者で非常に有効であるという考えを支持するデータと相関する。
【００２４】
[0033]本発明は、特定の患者集団で所与の型のがんの発現／活性化のプロファイル又はサインの役割をする、特定のシグナル伝達経路及びその構成成分の活性の検出、定量化及び比較に基づいた、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の患者のための、療法選択のための方法を提供する。したがって、処置の前、その間及びその後のがん細胞中の特定のシグナル伝達系の活性レベルについての知識は、採用する適当な処置クールを選択するために用いることができる非常に適切な情報を医師に提供する。さらに、処置の進行に従って、がん細胞で活性であるシグナル伝達経路を連続してモニターすることは、処置の効力に関する追加の情報を医師に提供して、例えば、同じ又は別のシグナル伝達経路を活性化するさらなる異常を通してがん細胞が処置に対して耐性になった場合、特定の処置クールを続けるか、別の系列の処置に切り替えるかを医師に促すことができる。
【００２５】
[0034]したがって、本発明は、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）などの特定の多重ハイスループットアッセイにおいて、固形腫瘍の腫瘍組織における複数の調節不全シグナル伝達分子の発現及び活性化状態を検出、定量化及び比較することによる、療法選択のための方法を提供する。本発明は、調節不全シグナル伝達経路を下方制御又は遮断するための、適当な療法（単一の薬剤又は薬剤の組合せ）の選択のための方法も提供する。したがって、本発明は、がん患者のためにカスタマイズされた療法の設計を促進するために用いることができる。
【００２６】
[0035]調節不全ｃＭｅｔシグナル伝達を特徴とする腫瘍細胞で複数のシグナル伝達経路の活性を検出及び定量化し、次に対照のタンパク質及び試料と比較した標的タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの間の差に基づいて、ｃＭｅｔ阻害剤を単独で（例えば単独療法）又は経路標的療法と組み合わせて（例えば併用療法）投与するかどうかを決定する能力は、本発明の重要な利点である。がん患者のために有効な治療戦略を選択することにおける現在の問題は、抗がん剤処置（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）への内在性及び後天的な耐性の高い発生率による。例えば、非小細胞肺がんを有する患者のサブセットは、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに本質的に耐性である。さらに、最初は療法に応答性の患者でさえ、時間とともに耐性になる傾向がある。本発明は、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）などの特定の多重ハイスループットアッセイによって決定される、固形腫瘍の腫瘍組織における複数の調節不全シグナル伝達分子の予測的発現／活性化プロファイルに基づく、適当な療法（単一薬剤又は薬剤の組合せ）の選択のための方法を提供することによって、この問題及び他の問題を克服又は軽減する。このように、腫瘍の稀な細胞での複数のシグナルトランスデューサーの活性化状態の検出は、がんの予後診断及び診断並びにカスタマイズされた標的療法の設計を促進する。
【００２７】
[0036]本発明の方法は、がん管理での重要な問題に対処するように有利に仕立てられ、悪性がん患者のためにより高い医療標準を提供するが、その理由は、それらが（１）がんと関連する複数のシグナル伝達経路の構成成分のタンパク質発現及び／又は活性化タンパク質レベルを検出及び定量化する方法を提供し、（２）タンパク質発現及び／又は活性化タンパク質レベルを対照タンパク質又は対照試料と比較する方法を提供し、（３）経路プロファイリングを可能にし（例えば、特定のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を患者の腫瘍試料で検出することができる）、（４）抗がん療法に対する患者の応答の予測的指標として用いることができるからである。このように、本発明の方法は悪性腫瘍組織の連続試料採取を可能にし、時間及び療法の関数として腫瘍細胞で起こっている変化に関する価値ある情報をもたらし、速やかに発展するがん経路のサインをモニターする手段を臨床医に提供する。
【００２８】
[0037]つまり、本発明の方法は、例えばＣＥＥＲなどの多重化された抗体ベースのアッセイを用いて経路プロファイリングを実行し、経路プロファイルを特定の抗がん療法への患者の応答を予測する予後診断分子プロファイルと比較することによって、標的療法が有益である可能性が非常に高い異常なｃＭｅｔシグナル伝達を有するがん患者の正確な予測、選択及びモニターを有利に可能にする。
【００２９】
ＩＩ．定義
[0038]本明細書で用いるように、以下の用語は、特に明記しない限りそれらに帰される意味を有する。
【００３０】
[0039]用語「がん」は、異常な細胞の無制御の増殖を特徴とする疾患のクラスのあらゆるメンバーを含むものとする。この用語は、悪性、良性、軟組織又は固形と特徴づけられようが全ての既知のがん及び新生物状態、並びに転移前後のがんを含む全ての段階及びグレードのがんを含む。異なる型のがんの例には、それらに限定されないが、消化器及び胃腸のがん、例えば胃部のがん（例えば、胃がん）、結腸直腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃腸カルチノイド腫瘍、結腸がん、直腸がん、肛門がん、胆管がん、小腸がん及び食道がん；乳がん；肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））；胆嚢がん；肝がん；すい臓がん；虫垂がん；前立腺がん、卵巣がん；腎臓がん（例えば、腎細胞がん）；中枢神経系のがん；皮膚がん；リンパ腫；神経膠腫；絨毛がん；頭けい部がん；骨原性肉腫；並びに血液がんが含まれる。本明細書で用いるように、「腫瘍」は１つ又は複数のがん性細胞を含む。
【００３１】
[0040]用語「非小細胞肺がん」又は「ＮＳＣＬＣ」には、悪性のがん細胞が肺の組織に形成される疾患が含まれる。非小細胞肺がんの例には、それらに限定されないが、扁平上皮がん、大細胞がん及び腺がんが含まれる。
【００３２】
[0041]用語「分析物」には、その存在、量（発現レベル）、活性化状態及び／又は同一性が決定される対象の任意の分子、一般的にはポリペプチドなどの巨大分子が含まれる。特定の例では、分析物は、例えばＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）又はｃＭｅｔシグナル伝達経路の構成成分などのシグナル伝達分子である。
【００３３】
[0042]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナルトランスデューサー」には、細胞の中での順序良く連続した生化学反応を一般的に含む、細胞外のシグナル又は刺激を細胞が応答に変換する過程を実行するタンパク質及び他の分子が含まれる。シグナル伝達分子の例には、それらに限定されないが、受容体チロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ〜Ｃ、ｃ−ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３及びＲＴＫ１０６；受容体チロシンキナーゼの切断型、例えばアミノ末端細胞外ドメインの欠落している切断型ＨＥＲ２受容体（例えば、ｐ９５ＥｒｂＢ２（ｐ９５ｍ）、ｐ１１０、ｐ９５ｃ、ｐ９５ｎなど）、アミノ末端細胞外ドメインの欠落している切断型ｃＭＥＴ受容体、及びアミノ末端細胞外ドメインの欠落している切断型ＨＥＲ３受容体；受容体チロシンキナーゼ二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；切断型ＨＥＲ３受容体とＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４；ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ３／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＨＥＲ１／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ４；ＨＥＲ３／ＨＥＲ４；など）；非受容体チロシンキナーゼ、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ及びＬＩＭＫ；チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの構成成分、例えばＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、ｐ７０  Ｓ６キナーゼスプライス変異体アルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＧＳＫ−３β、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７及びパキシリン；核ホルモン受容体、例えばエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、糖質コルチコイド受容体、無機質コルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体及びオーファン受容体；核内受容体活性化補助因子及びリプレッサー、例えば、それぞれ乳がん１（ＡＩＢ１）及び核内受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）で増幅されるもの；並びにその組合せが含まれる。
【００３４】
[0043]用語「ＨＥＲ３シグナル伝達経路の構成成分」には、ＨＥＲ３の上流リガンド、ＨＥＲ３の結合パートナー及び／又はＨＥＲ３を通して調整される下流エフェクター分子のいずれか１つ又は複数が含まれる。ＨＥＲ３シグナル伝達経路の構成成分の例には、それらに限定されないが、ヘレグリン、ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、スプライス変異体アルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＨＥＲ３二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３／ＨＥＲ４など）、ＧＳＫ−３β、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７及びその組合せが含まれる。
【００３５】
[0044]用語「ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の構成成分」には、ｃ−Ｍｅｔの上流リガンド、ｃ−Ｍｅｔの結合パートナー及び／又はｃ−Ｍｅｔを通して調整される下流エフェクター分子のいずれか１つ又は複数が含まれる。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の構成成分の例には、それらに限定されないが、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、プレキシンＢ１、ＣＤ４４ｖ６、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＳＴＡＴ（例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＧＲＢ２、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１、ＳＨＰ２、ＳＲＣ、ＧＲＢ２、ＣＲＫＬ、ＰＬＣγ、ＰＫＣ（例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ）、パキシリン、ＦＡＫ、アデューシン、ＲＢ、ＲＢ１、ＰＹＫ２、及びその組合せが含まれる。
【００３６】
[0045]用語「異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達」は、それらに限定されないが、ゲノム変化によるｃ−Ｍｅｔ受容体の活性化、タンパク質発現レベルの変化、活性化タンパク質レベルの変化及びリガンド刺激の増加などの原因によるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路構成成分の１つ又は複数の調節解除を指す。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の構成成分の例には、それらに限定されないが本明細書に記載されるものが含まれる。
【００３７】
[0046]用語「切断型ｃ−Ｍｅｔタンパク質」には、それらに限定されないが、ｃ−Ｍｅｔの細胞質及び膜近傍ドメインを含有するタンパク質（例えば、Ａｍｉｃｏｎｅら、Ｇｅｎｅ、１６２巻：３２３〜３２８頁（１９９５年）及びＡｍｉｃｏｎｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１巻：１３３５〜１３４５頁を参照）；ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインを含有するタンパク質；ｃ−Ｍｅｔのアルファ鎖及び８５ｋＤａのＣ末端の切断型ベータ鎖を含むタンパク質（例えば、Ｐｒａｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１巻：５９５４〜５９６２頁（１９９１年）を参照）；並びにｃ−Ｍｅｔのアルファ鎖及び７５ｋＤａのＣ末端の切断型ベータ鎖を含むタンパク質（例えば、Ｐｒａｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１巻：５９５４〜５９６２頁（１９９１年）を参照）を含む、ｃ−Ｍｅｔ受容体の切断型が含まれる。特定の例では、切断型受容体は一般的に完全長受容体の断片であり、完全長受容体と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を共有する。特定の実施形態では、完全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論にも縛られることなく、例えば、短縮されたＥＣＤを有する切断型ｃ−Ｍｅｔ受容体又は膜関連若しくはサイトゾルのＩＣＤ断片を含む切断型ｃ−Ｍｅｔ受容体を形成するために、切断型受容体は、完全長受容体のＥＣＤのタンパク分解過程を通して、又は膜貫通ドメインの前、その中若しくは後ろに位置するメチオニン残基からの翻訳の選択的開始によって起こることができる。
【００３８】
[0047]用語「切断型ＨＥＲ３タンパク質」には、それらに限定されないが、ＨＥＲ３の細胞質及び膜近傍ドメインを含有するタンパク質；４３個の特異な残基が続く１４０アミノ酸のＨＥＲ３の切断型細胞外断片（例えば、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、１３巻：３２１〜３０頁（２００１年）を参照）；並びに４５ｋＤａのグリコシル化ＨＥＲ３タンパク質（例えば、Ｌｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２７巻：５１９５〜５２０３頁（２００８年）を参照）を含む、ＨＥＲ３受容体の切断型が含まれる。特定の例では、切断型受容体は一般的に完全長受容体の断片であり、完全長受容体と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を共有する。特定の実施形態では、完全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論にも縛られることなく、例えば、短縮されたＥＣＤを有する切断型ＨＥＲ３受容体又は膜関連若しくはサイトゾルのＩＣＤ断片を含む切断型ＨＥＲ３受容体を形成するために、切断型受容体は、完全長受容体のＥＣＤのタンパク分解過程を通して、又は膜貫通ドメインの前、その中若しくは後ろに位置するメチオニン残基からの翻訳の選択的開始によって起こることができる。
【００３９】
[0048]用語「活性化状態」は、ＨＥＲ３又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路構成成分などの特定のシグナル伝達分子が活性化されるかどうかを指す。同様に、用語「活性化レベル」は、ＨＥＲ３又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路構成成分などの特定のシグナル伝達分子がどの程度活性化されるかを指す。活性化状態は、１つ又は複数のシグナル伝達分子のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態に一般的に対応する。活性化状態（括弧で記載される）の非限定例には、以下のものが含まれる：ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＨＥＲ２（切断型ＥｒｂＢ２）、ｐ−ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、切断型ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−ＭＥＴ（ｐ−ｃ−ＭＥＴ、切断型ｃ−ＭＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ：ＨＧＦ複合体）；ＡＫＴ１（ｐ−ＡＫＴ１）；ＡＫＴ２（ｐ−ＡＫＴ２）；ＡＫＴ３（ｐ−ＡＫＴ３）；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ）；ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）；ＥＲＫ１（ｐ−ＥＲＫ１）；ＥＲＫ２（ｐ−ＥＲＫ２）；ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）；ＰＤＫ２（ｐ−ＰＤＫ２）；ＳＧＫ３（ｐ−ＳＧＫ３）；４Ｅ−ＢＰ１（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）；ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ−ＰＩＫ３Ｒ１）；ｃ−ＫＩＴ（ｐ−ｃ−ＫＩＴ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲ１（ｐ−ＨＧＦＲ１）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲＡ（ｐ−ＰＤＧＦＲＡ）；ＰＤＧＦＲＢ（ｐ−ＰＤＧＦＲＢ）；ＶＥＧＦＲ１（ｐ−ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：硫酸ヘパリン、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；ＴＩＥ１（ｐ−ＴＩＥ１）；ＴＩＥ２（ｐ−ＴＩＥ２）；ＥＰＨＡ（ｐ−ＥＰＨＡ）；ＥＰＨＢ（ｐ−ＥＰＨＢ）；ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）；ＮＦＫＢ（ｐ−ＮＦＫＢ）、ＩＫＢ（ｐ−ＩＫＢ、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢ）；ＢＡＤ（ｐ−ＢＡＤ、ＢＡＤ：１４−３−３）；ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１）；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ）；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８）；ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）；ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）；ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）；ＲＢ（ｐ−ＲＢ）；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３）；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ）；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）；ｃ−Ｓｒｃ（ｐ−ｃ−Ｓｒｃ）；パキシリン（ｐ−パキシリン）；ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ���）、Ｓｈｃ（ｐ−Ｓｈｃ）、Ｒａｓ（ｐ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１（ｐ−ＧＡＢ１）、ＳＨＰ２（ｐ−ＳＨＰ２）、ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、ＣＲＫＬ（ｐ−ＣＲＫＬ）、ＰＬＣγ（ｐ−ＰＬＣγ）、ＰＫＣ（例えば、ｐ−ＰＫＣα、ｐ−ＰＫＣβ、ｐ−ＰＫＣδ）、アデューシン（ｐ−アデューシン）、ＲＢ１（ｐ−ＲＢ１）及びＰＹＫ２（ｐ−ＰＹＫ２）。
【００４０】
[0049]用語「ＫＲＡＳ突然変異」には、ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ２又はＲＡＳＫ２と呼ぶこともできる）遺伝子での任意の１つ又は複数の突然変異が含まれる。ＫＲＡＳ突然変異の例には、それらに限定されないがＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｖが含まれる。
【００４１】
[0050]用語「ＥＧＦＲ突然変異」には、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１と呼ぶこともできる）遺伝子での任意の１つ又は複数の突然変異が含まれる。ＥＧＦＲ突然変異の例には、それらに限定されないがＬ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｌ８６１Ｑ及びＳ７６８Ｉなどのエクソン１９中の欠失、並びにＴ７９０Ｍなどのエクソン２０中の挿入が含まれる。
【００４２】
[0051]用語「経路標的療法」は、タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを変更することができる治療薬の使用を含む。
【００４３】
[0052]用語「ｃＭｅｔ阻害剤」には、ｃＭｅｔ経路構成成分の機能を妨害する治療薬が含まれる。ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の例には、それらに限定されないが、ＭＡＧ１０２（Ａｍｇｅｎ）及びＭｅｔＭａｂ（Ｒｏｃｈｅ）などの中和抗体、並びにＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３及びＪＮＪ３８８７７６０５などのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が含まれる。
【００４４】
[0053]用語「ＥＧＦＲ阻害剤」には、ＥＧＦＲ経路構成成分の機能を妨害する治療薬が含まれる。非限定例には、セタキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＥｒｂＢ１ワクチン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＥＫＢ５６９及びＣＬ−３８７−７８５が含まれる。
【００４５】
[0054]用語「ＶＥＧＦＲ阻害剤」には、それらに限定されないが、ＶＥＧＦ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＳＴＡＴ（例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＧＲＢ２、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１、ＳＨＰ２、ＳＲＣ、ＧＲＢ２、ＣＲＫＬ、ＰＬＣγ、ＰＫＣ（例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ）、パキシリン、ＦＡＫ、アデューシン、ＲＢ、ＲＢ１、ＰＹＫ２、ｅＮＯＳ、ＨＳＰ２７及びその組合せを含む、ＶＥＧＦ受容体経路構成成分の機能を妨害する治療薬が含まれる。ＶＥＧＦＲ阻害剤の非限定例には、ベバシズマブ（アバスチン）、ＨｕＭＶ８３３、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＡＺＤ２１７１、ＡＭＧ−７０６、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＡＥ−９４１（ネオバスタト）及びバタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）が含まれる。
【００４６】
[0055]用語「連続変化」には、異なる時点で対象から採取される試料中のタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの変化を検出するアッセイの能力が含まれる。例えば、ｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルは、療法の開始前の時間を含む療法の過程で患者においてモニターすることができる。
【００４７】
[0056]用語「陰性応答」には、患者が疾患のさらなる徴候若しくは症状又はその増加を経験するような、療法を受ける患者の疾患状態の悪化が含まれる。
【００４８】
[0057]用語「陽性応答」には、療法が疾患の徴候又は症状を軽減するような、疾患状態を有する患者の改善が含まれる。
【００４９】
[0058]用語「疾患寛解」には、疾患の徴候及び症状の消失があるがんの分類が含まれる。
【００５０】
[0059]用語「疾患進行」には、がんのさらなる徴候又は症状をもたらすことができる、増殖又は拡散し続けるがんの分類が含まれる。例えば、ＮＳＣＬＣ患者の肺組織での腫瘍の再発は、本明細書では疾患進行として記載される。
【００５１】
[0060]用語「応答率」又は「ＲＲ」には、疾患の処置のための既定の療法に対する陽性応答、例えば腫瘍の収縮又は消失を有する患者の百分率が含まれる。
【００５２】
[0061]用語「完全応答」又は「完全寛解」又は「ＣＲ」には、処置に応じてのしばらく後のがんの全ての徴候の消失と記載される臨床エンドポイントが含まれる。例えば、その時間又は処置過程の終了後に、疾患の検査、Ｘ線及びスキャン、又はそのバイオマーカーの分析によって実施されるような、症状制御及び生活の質の測定によって同定することができる残存疾患がない場合は、患者は本明細書で療法に対して完全応答を示すと記載される。特定の例では、完全応答は、全ての腫瘍病変の消失である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）、２００９年１月改訂を参照）。
【００５３】
[0062]用語「部分応答」又は「ＰＲ」には、処置に応じてのしばらく後のがんの全てではなく一部の徴候の消失と記載される臨床エンドポイントが含まれる。例えば、その時間又は処置過程の終了後に、疾患の検査、Ｘ線及びスキャン、又はそのバイオマーカーの分析によって実施されるような、症状制御及び生活の質の測定によって同定することができる多少の検出可能な残存疾患がある場合は、患者は本明細書で療法に対して部分応答を示すと記載される。特定の例では、部分応答は、腫瘍病変の最大直径の合計の３０％の減少である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）、２００９年１月改訂を参照）。
【００５４】
[0063]用語「安定した疾患」又は「ＳＤ」には、新しい腫瘍のないこと及び既存の既知の腫瘍のサイズに実質的な変化のないことを特徴とするがんの臨床エンドポイントが含まれる。ＲＥＣＩＳＴにより、安定した疾患は、完全応答、部分応答及び進行性疾患（腫瘍病変の最大直径の合計の２０％増と定義される）の基準を満たさない小さな変化と定義される。
【００５５】
[0064]用語「無進行期間」又は「ＴＴＰ」には、疾患が診断又は処置されてから疾患が悪化（例えば、新しい腫瘍の出現、腫瘍サイズの増加；生活の質の変化又は症状制御の変化）し始めるまでの時間の測定が含まれる。
【００５６】
[0065]用語「無進行生存期間」又は「ＰＦＳ」には、患者が疾患のさらなる症状なしで疾患を有して生存している、疾患の処置の間及び後の時間の長さが含まれる。
【００５７】
[0066]用語「全生存期間」又は「ＯＳ」には、がんなどの疾患と診断されたかそれが処置された後の既定の期間生存している患者を記載する臨床エンドポイントが含まれる。
【００５８】
[0067]本明細書で用いるように、用語「希釈系」は、特定の試料（例えば、細胞溶解物）又は試薬（例えば、抗体）の一連の下降濃度を含むものとする。希釈系は、試料又は試薬の開始濃度の測定された量と希釈剤（例えば、希釈緩衝液）とを混合して、より低い濃度の試料又は試薬を作製する工程、及び所望の数の連続希釈を得るのに十分な回数この工程を繰り返すことによって一般的に生成される。試料又は試薬は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００又は１０００倍に連続希釈して、試料又は試薬の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０段階の下降濃度を含む希釈系を生成することができる。例えば、１ｍｇ／ｍｌの開始濃度の捕捉抗体試薬の２倍連続希釈を含む希釈系は、捕捉抗体の開始濃度の量と希釈緩衝液の等量を混合して０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の捕捉抗体を作製し、この工程を繰り返して０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．０３２５ｍｇ／ｍｌなどの捕捉抗体濃度を得ることによって生成することができる。
【００５９】
[0068]本明細書で用いられる用語「優れたダイナミックレンジ」は、わずか１つの細胞又は何千もの細胞で特定の分析物を検出するアッセイの能力を指す。例えば、本明細書に記載されるイムノアッセイは、捕捉抗体濃度の希釈系を用いて、約１〜１００００個の細胞（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００又は１０，０００個の細胞）で対象の特定のシグナル伝達分子を有利に検出するので、優れたダイナミックレンジを有する。
【００６０】
[0069]本明細書で用いるように、用語「循環細胞」は、固形腫瘍から転移又は微小転移した腫瘍外細胞を含む。循環細胞の例には、それらに限定されないが、循環する腫瘍細胞、がん幹細胞及び／又は腫瘍へ移動する細胞（例えば、循環する内皮始原細胞、循環する内皮細胞、循環する血管新生促進骨髄細胞、循環する樹状細胞など）が含まれる。循環細胞を含有する患者試料は、任意の入手可能な生物体液（例えば、全血、血清、血漿、痰、気管支洗浄液、尿、乳首吸引液、リンパ、唾液、微細針吸引液など）から得ることができる。特定の例では、全血試料は、血漿又は血清部分及び細胞性部分（すなわち、細胞ペレット）に分離される。細胞性部分は、赤血球、白血球及び／又は固形腫瘍の循環細胞、例えば循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環内皮始原細胞（ＣＥＰＣ）、がん幹細胞（ＣＳＣ）、リンパ節の播種性腫瘍細胞及びその組合せを一般に含む。血漿又は血清部分は、なかでも、固形腫瘍の循環細胞によって放出される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びタンパク質を通常含有する。
【００６１】
[0070]一般的に、循環細胞は、例えば免疫磁気分離（例えば、Ｒａｃｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻：４５８９〜４５９４頁（１９９８年）；Ｂｉｌｋｅｎｒｏｔｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９２巻：５７７〜５８２頁（２００１年））、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡを参照）によるセルトラックス（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ）（登録商標）システム、微流動分離（例えば、Ｍｏｈａｍｅｄら、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉ．、３巻：２５１〜２５６頁（２００４年）；Ｌｉｎら、要旨番号５１４７、第９７回ＡＡＣＲ年次総会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（２００６年）を参照）、ＦＡＣＳ（例えば、Ｍａｎｃｕｓｏら、Ｂｌｏｏｄ、９７巻：３６５８〜３６６１頁（２００１年）を参照）、密度勾配遠心法（例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３巻：４８６５〜４８７１頁（２００３年）を参照）、及び消耗法（例えば、Ｍｅｙｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２１巻：５２１〜５３０頁（２００２年）を参照）を含む１つ又は複数の分離法を用いて患者試料から単離される。
【００６２】
[0071]本明細書で用いられる用語「試料」には、患者から得られる任意の生物検体が含まれる。試料には、限定されずに、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核細胞）、管洗浄液、乳首吸引液、リンパ（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄穿刺液、唾液、尿、大便（すなわち、糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、微細針吸引液（例えば、ランダムな乳輪周囲微細針吸引によって収集されるもの）、任意の他の体液、組織試料（例えば、腫瘍組織）、例えば腫瘍（例えば、針生検）若しくはリンパ節（例えば、センチネルリンパ節生検）の生検材料、組織試料（例えば、腫瘍組織）、例えば腫瘍の外科切除及びその細胞抽出物が含まれる。一部の実施形態では、試料は、全血又はその画分構成成分、例えば血漿、血清又は細胞ペレットである。好ましい実施形態では、試料は、当技術分野で公知である任意の技術を用いて、全血又はその細胞画分から固形腫瘍の循環細胞を単離することによって得られる。他の実施形態では、試料は、例えば胃又は胃腸管の他の部分の固形腫瘍からの、ホルマリンで固定され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
【００６３】
[0072]「生検」は、診断又は予後診断評価のための組織試料を取り出す過程、及び組織検体それ自体を指す。本発明の方法及び組成物へ、当技術分野で公知である任意の生検技術を適用することができる。適用される生検技術は、他の要素の中でも、評価される組織型並びに腫瘍のサイズ及び型（すなわち、固形又は懸濁状（すなわち、血液又は腹水））によって一般に決まる。代表的な生検技術には、切採生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、微細針吸引生検など）、外科生検及び骨髄生検が含まれる。生検技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら編、第１６版、２００５年、第７０章、及びパートＶ全体で議論される。当業者は、所与の組織試料でがん性及び／又は前がん性の細胞を同定するために、生検技術を実施することができることを理解するであろう。
【００６４】
[0073]用語「対象」又は「患者」又は「個体」には一般的にヒトが含まれるが、他の動物、例えば他の霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどが含まれてもよい。
【００６５】
[0074]用語「コーカサス人」には、非ヒスパニック系ヨーロッパ人の子孫の人のヒト分類が含まれる。例えば、欧州、中東又は北アフリカの元の民族のいずれかに起源を有する人。
【００６６】
[0075]用語「アジア人」には、アジアの人種集団の出である人のヒト分類が含まれる。例えば、極東、東南アジア、又は例えばカンボジア、中国、インド、日本、韓国、マレーシア、パキスタン、フィリピン群島、タイ及びベトナムを含むインド亜大陸の元の民族のいずれかに起源を有する人。
【００６７】
[0076]「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、固体支持体、例えばガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズなど）、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は他の任意の適する基材に固定化されるか拘束される捕捉抗体の異なるセット及び／又は希釈系を含む。捕捉抗体は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用（例えば、イオン結合、疎水性の相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子双極子結合）を通して固体支持体に一般に固定化されるか拘束される。特定の例では、捕捉抗体は、固体支持体に結合している捕捉剤と相互作用する捕捉タグを含む。本明細書に記載されるアッセイで用いられるアレイは、異なる既知の／接近可能な場所の固体支持体の表面に結合している複数の異なる捕捉抗体及び／又は捕捉抗体濃度を一般的に含む。
【００６８】
[0077]用語「捕捉抗体」は、細胞抽出物などの試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的な（すなわち、結合するか、結合されるか複合体を形成する）固定化抗体を含むものとする。特定の実施形態では、捕捉抗体は、アレイの固体支持体に拘束される。固体支持体に様々なシグナル伝達分子のいずれかを固定化するのに適する捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。
【００６９】
[0078]本明細書で用いられる用語「検出抗体」には、試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的な（すなわち、結合するか、結合されるか複合体を形成する）検出可能な標識を含む抗体が含まれる。本用語は、検出可能な標識を含む別の種が抗体に結合することができる、対象の１つ又は複数の分析物に特異的である抗体も包含する。検出可能な標識の例には、それらに限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）標識、化学反応性標識、蛍光性標識、酵素標識、放射性標識及びその組合せが含まれる。様々なシグナル伝達分子のいずれかの活性化状態及び／又は総量を検出するのに適する検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。非限定例として、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＫ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ｒａｆ及びＭＥＫなどのシグナル伝達分子の様々なリン酸化フォームに対するホスホ特異抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である。
【００７０】
[0079]用語「活性化状態依存性抗体」には、試料中の対象の１つ又は複数の分析物の特定の活性化状態に特異的な（すなわち、結合するか、結合されるか複合体を形成する）検出抗体が含まれる。好ましい実施形態では、活性化状態依存性抗体は、１つ又は複数のシグナル伝達分子などの１つ又は複数の分析物のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態を検出する。一部の実施形態では、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバーの間のヘテロダイマー複合体の形成は、活性化状態依存性抗体を用いて検出される。特定の実施形態では、活性化状態依存性抗体は、以下のシグナル伝達分子の１つ又は複数でのリン酸化の１つ又は複数の部位を検出するのに有益である（リン酸化部位はヒトタンパク質配列のアミノ酸の位置に対応する）：ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１（例えば、チロシン（Ｙ）１０６８）；ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２（例えば、Ｙ１２４８）；ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３（例えば、Ｙ１２８９）；ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４（例えば、Ｙ１２８４）；ｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｙ１００３、Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５及び／又はＹ１３４９）；ＳＧＫ３（例えば、トレオニン（Ｔ）２５６及び／又はセリン（Ｓ）４２２）；４Ｅ−ＢＰ１（例えば、Ｔ７０）；ＥＲＫ１（例えば、Ｔ１８５、Ｙ１８７、Ｔ２０２及び／又はＹ２０４）；ＥＲＫ２（例えば、Ｔ１８５、Ｙ１８７、Ｔ２０２及び／又はＹ２０４）；ＭＥＫ（例えば、Ｓ２１７及び／又はＳ２２１）；ＰＩＫ３Ｒ１（例えば、Ｙ６８８）；ＰＤＫ１（例えば、Ｓ２４１）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔ２２９、Ｔ３８９及び／又はＳ４２１）；ＰＴＥＮ（例えば、Ｓ３８０）；ＡＫＴ１（例えば、Ｓ４７３及び／又はＴ３０８）；ＡＫＴ２（例えば、Ｓ４７４及び／又はＴ３０９）；ＡＫＴ３（例えば、Ｓ４７２及び／又はＴ３０５）；ＧＳＫ−３β（例えば、Ｓ９）；ＮＦＫＢ（例えば、Ｓ５３６）；ＩＫＢ（例えば、Ｓ３２）；ＢＡＤ（例えば、Ｓ１１２及び／又はＳ１３６）；ｍＴＯＲ（例えば、Ｓ２４４８）；Ｒｓｋ−１（例えば、Ｔ３５７及び／又はＳ３６３）；Ｊｎｋ（例えば、Ｔ１８３及び／又はＹ１８５）；Ｐ３８（例えば、Ｔ１８０及び／又はＹ１８２）；ＳＴＡＴ３（例えば、Ｙ７０５及び／又はＳ７２７）；ＦＡＫ（例えば、Ｙ３９７、Ｙ５７６、Ｓ７２２、Ｙ８６１及び／又はＳ９１０）；ＲＢ（例えば、Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ６１２及び／又はＳ７８０）；ＲＢ１（例えば、Ｓ７８０）；アデューシン（例えば、Ｓ６６２及び／又はＳ７２４）；ＰＹＫ２（例えば、Ｙ４０２及び／又はＹ８８１）；ＰＫＣα（例えば、Ｓ６５７）；ＰＫＣα／β（例えば、Ｔ３６８及び／又はＴ６４１）；ＰＫＣδ（例えば、Ｔ５０５）；ｐ５３（例えば、Ｓ３９２及び／又はＳ２０）；ＣＲＥＢ（例えば、Ｓ１３３）；ｃ−Ｊｕｎ（例えば、Ｓ６３）；ｃ−Ｓｒｃ（例えば、Ｙ４１６）；並びにパキシリン（例えば、Ｙ３１及び／又はＹ１１８）。
【００７１】
[0080]用語「活性化状態非依存性抗体」には、それらの活性化状態に関係なく試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的な（すなわち、結合するか、結合されるか複合体を形成する）検出抗体が含まれる。例えば、活性化状態非依存性抗体は、１つ又は複数のシグナル伝達分子などの１つ又は複数の分析物のリン酸化フォームと非リン酸化フォームの両方を検出することができる。
【００７２】
[0081]活性化状態非依存性ｃ−Ｍｅｔ抗体の非限定例には、以下のカタログ番号で入手できるものが含まれる：ＡＦ２７６、ＭＡＢ３５８１、ＭＡＢ３５８２、ＭＡＢ３５８３及びＭＡＢ５６９４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ａｂ５１０６７、ａｂ３９０７５、ａｂ４７４３１、ａｂ１４５７１、ａｂ１０７２８、ａｂ５９８８４、ａｂ４７４３１、ａｂ４９２１０、ａｂ７１７５８、ａｂ７４２１７、ａｂ４７４６５、ａｂ２７４９２（Ａｂｃａｍ）；ＳＣ１６１ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；ＰＡ１−１４２５７、ＰＡ１−３７４８３及びＰＡ１−３７４８４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；０５−１０４９、ＭＡＢ３７２９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ｓｃ−１６２、ｓｃ−３４４０５、ｓｃ−１６１、ｓｃ−１０、ｓｃ−８３０７、ｓｃ−４６３９４、ｓｃ−４６３９５、ｓｃ−８１４７８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；８１９８、３１２７、３１４８及び４５６０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；並びに、７００２６１、３７０１００、７１８０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７３】
[0082]活性化状態依存性ｃＭＥＴ抗体の非限定例には、以下のカタログ番号で入手できるものが含まれる：ＡＦ２４８０、ＡＦ３９５０、ＡＦ４０５９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＰＡ１−１４２５４、ＰＡ１−１４２５６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ｓｃ−１６３１５、ｓｃ−３４０８６、ｓｃ３４０８５、ｓｃ−３４０８７、ｓｃ−１０１７３６、ｓｃ−１０１７３７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ａｂ６１０２４、ａｂ５６６２、ａｂ７３９９２及びａｂ５６５６（Ａｂｃａｍ）；３１３５、３０７７、３１２９、３１２６、３１３３、３１２１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；並びに４４８９２Ｇ、４４８９６Ｇ、７００１３９、４４８８７Ｇ、４４８８８Ｇ、４４８８２Ｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７４】
[0083]ｃＭＥＴを認識する捕捉抗体の非限定例には、以下のカタログ番号で入手できるものが含まれる：ＡＦ２７６、ＭＡＢ３５８１、ＭＡＢ３５８２、ＭＡＢ３５８３及びＭＡＢ５６９４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ａｂ５１０６７、ａｂ３９０７５、ａｂ４７４３１、ａｂ１４５７１、ａｂ１０７２８、ａｂ５９８８４、ａｂ４７４３１、ａｂ４９２１０、ａｂ７１７５８、ａｂ７４２１７、ａｂ４７４６５、ａｂ２７４９２（Ａｂｃａｍ）；ＳＣ１６１ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；ＰＡ１−１４２５７、ＰＡ１−３７４８３及びＰＡ１−３７４８４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；０５−１０４９、ＭＡＢ３７２９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ｓｃ−１６２、ｓｃ−３４４０５、ｓｃ−１６１、ｓｃ−１０、ｓｃ−８３０７、ｓｃ−４６３９４、ｓｃ−４６３９５、ｓｃ−８１４７８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；８１９８、３１２７、３１４８及び４５６０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；並びに７００２６１、３７０１００、７１８０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７５】
[0084]活性化状態非依存性ＨＥＲ３抗体の非限定例には、以下のカタログ番号で入手できるものが含まれる：ＰＡ１−８６６４４及びＭＳ−２０１−ＰＡＢＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＭＡＢ３４８、ＭＡＢ３４８１、ＭＡＢ３４８２、ＭＡＢ３４８３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ｓｃ−４１５、ｓｃ−５３２７９、ｓｃ−２３８６５、ｓｃ−７３９０、ｓｃ−７１０６７、ｓｃ−７１０６６、ｓｃ−５６３８５、ｓｃ−２８５、ｓｃ−７１０６８、ｓｃ−８１４５４、ｓｃ８１４５５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；並びに４４８９７Ｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７６】
[0085]活性化状態依存性ＨＥＲ３抗体の非限定例には、以下のカタログ番号で入手できるものが含まれる：ＡＦ５８１７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ｓｃ−１３５６５４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；８０１７、４５６１、４７８４、４７９１及び４７５４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；並びに４４９０１Ｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７７】
[0086]ＨＥＲ３を認識する捕捉抗体の非限定例には、以下のカタログ番号で入手できるものが含まれる：ＰＡ１−８６６４４及びＭＳ−２０１−ＰＡＢＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＭＡＢ３４８、ＭＡＢ３４８１、ＭＡＢ３４８２、ＭＡＢ３４８３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ｓｃ−４１５、ｓｃ−５３２７９、ｓｃ−２３８６５、ｓｃ−７３９０、ｓｃ−７１０６７、ｓｃ−７１０６６、ｓｃ−５６３８５、ｓｃ−２８５、ｓｃ−７１０６８、ｓｃ−８１４５４、ｓｃ８１４５５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；並びに４４８９７Ｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７８】
[0087]ホスホチロシン残基を認識する活性化状態依存性抗体の例には、それらに限定されないが、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの４Ｇ１０抗ホスホチロシン抗体；Ａｂｃａｍ  ｐｌｃからの抗ホスホチロシン抗体［ＰＹ２０］（ａｂ１０３２１）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．からのデルフィア（ＤＥＬＦＩＡ）Ｅｕ−Ｎ１抗ホスホチロシンＰ−Ｔｙｒ−１００、ＰＴ６６及びＰＹ２０抗体；並びにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．からの抗ホスホチロシンＰＹ２０、ＰＴ−６６及びＰＴ−１５４モノクローナル抗体が含まれる。ホスホセリン残基を認識する活性化状態依存性抗体の例には、それらに限定されないが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．からのＰＳＲ−４５モノクローナル抗体；Ａｂｃａｍ  ｐｌｃからの抗ホスホセリン抗体［ＰＳＲ−４５］（ａｂ６６３９）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの抗ホスホセリンクローン４Ａ４；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからのホスホセリン抗体（ＮＢ６００−５５８）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．からのデルフィアＥｕ−Ｎ１標識抗ホスホセリン抗体；並びにＱｉａｇｅｎからのホスホセリン抗体Ｑ５が含まれる。ホスホトレオニン残基を認識する活性化状態依存性抗体の例には、それらに限定されないが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．からのＰＴＲ−８モノクローナル抗体Ｐ３５５５；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのホスホトレオニン抗体（Ｐ−Ｔｈｒ−ポリクローナル）＃９３８１；Ａｂｃａｍ  ｐｌｃからの抗ホスホトレオニン抗体（ａｂ９３３７）；並びにＱｉａｇｅｎからのホスホトレオニン抗体Ｑ７が含まれる。
【００７９】
[0088]用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」には、一本鎖又は二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマー、例えばＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。核酸には、合成され、天然に存在し、及び天然に存在せず、並びに参照核酸に類似した結合特性を有する、公知のヌクレオチド類似体又は改変された骨格残基若しくは結合を含む核酸が含まれる。そのような類似体の例には、限定されずに、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸に類似した結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体及び相補的な配列も暗に包含する。
【００８０】
[0089]用語「オリゴヌクレオチド」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド及び／又はその模倣体の一本鎖のオリゴマー又はポリマーが含まれる。特定の例では、オリゴヌクレオチドは、天然に存在する（すなわち、改変されていない）核酸塩基、糖及びヌクレオシド間の（骨格）結合で構成される。特定の他の例では、オリゴヌクレオチドは、改変された核酸塩基、糖及び／又はヌクレオシド間結合を含む。
【００８１】
[0090]本明細書で用いるように、用語「ミスマッチモチーフ」又は「ミスマッチ領域」は、その相補配列と１００％の相補性を有さないオリゴヌクレオチドの部分を指す。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のミスマッチ領域を有することができる。ミスマッチ領域は連続することができるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又はそれ以上のヌクレオチドによって分離されてもよい。ミスマッチのモチーフ又は領域は、単一のヌクレオチドを含むことができるか、２、３、４、５個又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【００８２】
[0091]語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、オリゴヌクレオチドがその相補配列とハイブリダイズするが他のいかなる配列ともハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、平衡状態（Ｔｍでは標的配列が過度に存在するので、平衡状態ではプローブの５０％が占められる）で、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核濃度の下で）である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することもできる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、少なくとも２回のバックグラウンドの、好ましくは１０回のバックグラウンドのハイブリダイゼーションである。
【００８３】
[0092]２つ以上の核酸との関連で用語「実質的に同一の」又は「実質的な同一性」は、配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動アラインメント及び目視検査によって測定される、比較ウインドウ又は指定領域にわたる最大対応のために比較し、整列させたときに、同じであるか、又は同じであるヌクレオチドの特定の百分率（すなわち、特定の領域にわたって少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性）を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。文脈が示す場合、この定義は配列の相補配列も同様に指す。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００８４】
[0093]用語「インキュベートする」ことは、「接触させる」こと及び「曝露する」ことと同義に用いられ、特に明記しない限りいかなる特定の時間又は温度要件も意味しない。
【００８５】
[0094]「受容体チロシンキナーゼ」又は「ＲＴＫ」には、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼモチーフを特徴とする５６（５６）個のタンパク質のファミリーが含まれる。ＲＴＫは細胞シグナル伝達で機能し、増殖、分化、接着、移動及びアポトーシスを調節するシグナルを伝える。受容体チロシンキナーゼの突然変異活性化及び／又は過剰発現は、細胞を形質転換し、がんの発達で重要な役割をしばしば果たす。ＲＴＫは、様々な分子標的剤、例えばトラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、イマチニブ、ニロチニブなどの標的になっている。１つのよく特徴づけられたシグナル伝達経路はＭＡＰキナーゼ経路であり、それは、細胞での上皮増殖因子（ＥＧＦ）からのシグナルを細胞成長の促進に伝達する役割を担う。
【００８６】
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0095]本発明は、腫瘍組織に由来する腫瘍細胞又は固形腫瘍の循環細胞でシグナル伝達経路の構成成分の状態（例えば、発現及び／又は活性化レベル）を、本明細書に記載される特異的な多重ハイスループット近接アッセイなどのアッセイで検出するための方法を提供する。本発明は、１つ又は複数の調節解除されたシグナル伝達経路を下方制御するために適当な療法を選択するための方法も提供する。したがって、本発明の特定の実施形態は、所与の患者の腫瘍（例えば、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）でトータルの及び活性化されたシグナル伝達タンパク質の集合によって提供される特定の分子サインに基づいて、カスタマイズされた療法の設計を容易にするために用いることができる。
【００８７】
[0096]特定の態様では、本発明は、抗がん剤、例えばＥＧＦＲ調整化合物（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）、ＶＥＧＦＲ調整化合物（例えば、ＶＥＧＦＲ阻害剤）及び／又はｃＭｅｔ調整化合物（例えば、ｃＭｅｔ阻害剤）に対して特定のがんが応答することができるか有利に応答する可能性があるかの決定又は予測を可能にする分子マーカー（バイオマーカー）を提供する。特定の実施形態では、ＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路の１つ又は複数の構成成分（例えば、ｃＭｅｔ、切断型ｃＭｅｔ受容体、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、切断型ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、Ａｋｔ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＶＥＧＦＲ１−３及び／又はＰＤＧＦＲ）の発現及び／又は活性化のレベルを測定することは、悪性のがん細胞などの細胞で適する抗がん剤を選択するために、及び／又はそれへの応答を同定若しくは予測するために特に有益である。
【００８８】
[0097]一態様では、本発明は、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する対象のための療法選択の方法を提供し、前記方法は：
（ａ）対象から採取された試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップと、
（ｂ）試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップと、
（ｃ）試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベルを（ｉ）対照タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベル並びに／又は（ｉｉ）対照試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／若しくはＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／若しくは活性化レベルと比較するステップと、
（ｄ）対照タンパク質及び／又は対照試料と比較した、試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの間の差に基づいて、ｃＭｅｔ阻害剤を単独で又はｃＭｅｔ阻害剤を経路標的療法と組み合わせて投与するかどうかを決定するステップとを含む。
【００８９】
[0098]一部の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現（例えば、トータルの）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルは、例えば本明細書に記載される共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物のシグナル強度に対応する相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値として表される。他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定されるＲＦＵ値を、対象の特定の分析物について生成される標準曲線に対して較正するか標準化することによって数量化される。特定の例では、ＲＦＵ値は、標準曲線に基づいて計算することができる。
【００９０】
[0099]さらなる実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物のシグナル強度の増加に対応する、「低度」、「中程度」又は「高度」で表される。場合によっては、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の発現又は活性化の検出不能であるか最小限に検出可能なレベルは、「検出不能」と表すことができる。他の場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の低レベルの発現又は活性化は、「低度」と表すことができる。さらに他の場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の中レベルの発現又は活性化は、「中程度」と表すことができる。さらに他の場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の中から高レベルの発現又は活性化は、「中程度から高度」と表すことができる。さらなる場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の非常に高いレベルの発現又は活性化は、「高度」と表すことができる。
【００９１】
[0100]特定の実施形態では、対象の特定の分析物の発現（例えば、トータルの）レベル又は活性化（例えば、リン酸化）レベルは、「低度」、「中程度」又は「高度」で表される場合、例えば、ＩｇＧ対照などの陰性対照と比較したとき、対象の分析物のために生成された標準曲線と比較したとき、ｐａｎ−ＣＫ対照などの陽性対照と比較したとき、抗がん剤の存在下で決定された発現又は活性化レベルと比較したとき、及び／又は抗がん剤の不在下で決定された発現又は活性化レベルと比較したとき、少なくとも約０；５０００；１００００；１５０００；２００００；２５０００；３００００；３５０００；４００００；４５０００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００ＲＦＵ；又はそれ以上であるレベルの発現又は活性化に対応し得る。場合によっては、相関は分析物特異的である。非限定例として、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される「低度」レベルの発現又は活性化は、参照の発現又は活性化レベルと比較したとき、１つの分析物の発現又は活性化で１００００ＲＦＵに、及び別の分析物では５００００ＲＦＵに対応することができる。
【００９２】
[0101]特定の実施形態では、対象の特定の分析物の発現又は活性化レベルは、例えばＩｇＧ対照などの陰性対照と比較したとき、対象の分析物のために生成された標準曲線と比較したとき、ｐａｎ−ＣＫ対照などの陽性対照と比較したとき、抗がん剤の存在下で決定された発現又は活性化レベルと比較したとき、及び／又は抗がん剤の不在下で決定された発現又は活性化レベルと比較したとき、参照の発現レベル又は活性化レベルに対して「低度」、「中程度」又は「高度」と呼ばれるレベルの発現又は活性化に対応することができる。場合によっては、相関は分析物特異的である。非限定例として、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される「低度」レベルの発現又は活性化は、参照の発現又は活性化レベルと比較したとき、１つの分析物の発現又は活性化での２倍の増加に、及び別の分析物では５倍の増加に対応することができる。
【００９３】
[0102]特定の実施形態では、対象の特定の分析物の発現又は活性化レベルは、ＩｇＧ対照（すなわち、対照タンパク質）などの陰性対照と比較される、対象の分析物のために生成される標準曲線と比較される、ｐａｎ−ＣＫ対照（すなわち、対照タンパク質）などの陽性対照と比較される、抗がん剤の存在下（すなわち、対照試料）で決定される発現又は活性化レベルと比較される、及び／又は抗がん剤の不在下（すなわち、対照試料）で決定される発現又は活性化レベルと比較される、発現レベル又は活性化レベルに対応することができる。特定の実施形態では、対照試料は、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の存在しない細胞株又は組織試料に由来することができる。
【００９４】
[0103]好ましい実施形態では、経路標的療法は、それらに限定されないがｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ｃＭｅｔ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤などの、シグナル伝達経路構成成分の発現及び／又は活性化を変更することができる治療薬である。ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤の非限定例には、ＰＦ−００２９９８０４、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ−５９９６２６）、ＢＭＳ−６９０１５４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＣＩ−１０３３、ＢＩＢＷ−２９９２及びその組合せが含まれる。ＨＥＲ２阻害剤の例には、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３８０、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＣＵＤＣ−１０１、ＪＮＪ−２６４８３３２７及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにその組合せが含まれる。ＥＧＦＲ阻害剤の非限定例には、セタキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＥｒｂＢ１ワクチン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ５６９、ＣＬ−３８７−７８５、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＶ−４１２及びその組合せが含まれる。ＶＥＧＦＲ阻害剤の非限定例には、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ））、ＨｕＭＶ８３３、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＡＶ−９５２、ＡＺＤ２１７１、ＡＭＧ−７０６、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＡＥ−９４１（ネオバスタト（Ｎｅｏｖａｓｔａｔ））、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＧＳＫ−１３６３０８９、ＰＴＫ−７８７、ＸＬ−８００、ＺＤ６４７４、ＡＧ１３９２５、ＡＧ０１３７３６、ＣＥＰ−７０５５、ＣＰ−５４７，６３２、ＧＷ７８６０２４、ＧＷ６５４６５２、ＧＳＫ−ＶＥＧ１００３、ＧＷ７８６０３４Ｂ及びその組合せが含まれる。
【００９５】
[0104]一部の実施形態では、ｃＭｅｔ阻害剤は、マルチキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びモノクローナル抗体からなる群から選択される。特定の態様では、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤）は、複数のキナーゼ、例えば、それらに限定されないが、ｃＭｅｔ、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、ｐ９５ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ及び／又はｃ−Ｋｉｔを妨害する作用剤である。他の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、それらに限定されないが、ｃＭｅｔ、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３からなる群から選択されるチロシンキナーゼを特異的に妨害する作用剤である。本発明で用いることができる小分子チロシンキナーゼ阻害剤の非限定例には、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７及びＪＮＪ−２６４８３３２７；及びその組合せが含まれる。本発明に用いられるモノクローナル抗体の非限定例には、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、ゲムツズマブ（マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（商標））、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））及びトシツモマブ（ベキサール（ＢＥＸＸＡＲ）（登録商標））並びにその組合せが含まれる。ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤の非限定例は、上に記載される。
【００９６】
[0105]ｃＭｅｔ活性を調整する化合物の非限定例は本明細書に記載され、モノクローナル抗体、小分子阻害剤及びその組合せを含む。好ましい実施形態では、ｃＭｅｔ調整化合物はｃＭｅｔ活性を阻害し、及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達を妨害し、例えばｃＭｅｔ阻害剤である。ｃＭｅｔ阻害剤の例には、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、例えばＡＶ２９９、Ｌ２Ｇ７、ＡＭＧ１０２、ＤＮ３０、ＯＡ−５Ｄ５及びＭｅｔＭＡｂ；並びにｃＭｅｔの小分子阻害剤、例えばＡＲＱ１９７、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ−７７７６０７、ＸＬ１８４、ＸＬ８８０、ＩＮＣＢ２８０６０、Ｅ７０５０、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、Ｋ２５２ａ、ＬＹ２８０１６５３、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、ＮＫ２、ＮＫ４、ＳＧＸ５２３、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＨＡ−６６５７５２、ＪＮＪ−３８８７７６０５；並びにその組合せが含まれる。
【００９７】
[0106]特定の実施形態では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、１つ又は複数のＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍組織を保有する。ＫＲＡＳ突然変異は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｖ及びその組合せからなる突然変異の群から選択されるメンバーであってもよい。
【００９８】
[0107]特定の例では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍は、乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、甲状腺の癌腫又はその組合せを含む。特定の他の例では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性のがんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。特定の実施形態では、ＮＳＣＬＣは小細胞肺癌以外の任意の型の上皮肺がんである。当業者に公知であるように、ＮＳＣＬＣの最も一般的な型は、扁平上皮癌、大細胞癌及び腺癌である。
【００９９】
[0108]一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。特定の実施形態では、ｃＭｅｔタンパク質の中程度から高度のレベルの発現及び／又は活性化を有する対象は、コーカサス人の対象である。特定の実施形態では、ｃＭｅｔタンパク質の活性化レベルは、リン酸化されたｃＭｅｔタンパク質のレベルに対応する。
【０１００】
[0109]他の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。特定の実施形態では、中程度から高度のレベルのＨＥＲ３の発現及び／又は活性化を有する対象は、コーカサス人の対象である。特定の実施形態では、ＨＥＲ３タンパク質の活性化レベルは、リン酸化されたＨＥＲ３タンパク質のレベルに対応する。
【０１０１】
[0110]さらなる実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるｃＭｅｔタンパク質及びＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。特定の他の実施形態では、ｃＭｅｔタンパク質及びＨＥＲ３タンパク質の中程度から高度のレベルの発現及び／又は活性化を有する対象は、コーカサス人の対象である。このように、これらの実施形態では、ステップ（ｄ）でｃＭｅｔ阻害剤を単独で投与するかどうかを決定することは、ｃＭｅｔタンパク質及びＨＥＲ３の両方の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲内にあるかどうかを決定することを含む。前記のように、特定の好ましい実施形態では、分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、ＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定することができ、「低度」、「中程度」又は「高度」と記載することができるＲＦＵ値で表すことができる。
【０１０２】
[0111]本発明のさらに他の実施形態では、ステップ（ｄ）でｃＭｅｔ阻害剤を単独で投与するかどうかを決定することは、試料におけるｃＭｅｔ及びＨＥＲ３タンパク質の両方の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲内にあるかどうかを決定すること、並びに、試料におけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２タンパク質の両方の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して低いかどうかを決定することを含む。特定の例では、中程度から高度のレベルのｃＭｅｔ及びＨＥＲ３、並びに低レベルのＨＥＲ１及びＨＥＲ２を有すると記載される対象の腫瘍試料の発現／活性化プロファイルは、対象にｃＭｅｔ阻害剤を投与することを医師に指示することができる。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１０３】
[0112]さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ＨＧＦ／ＳＦタンパク質、ｃＭｅｔのリガンドの発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び定量化するステップをさらに含む。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）でｃＭｅｔ阻害剤を単独で投与するかどうかを決定することは、試料におけるｃＭｅｔ、ＨＥＲ３及びＨＧＦ／ＳＦタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲内にあるかどうかを決定することを含む。場合によっては、中程度から高度のレベルのｃＭｅｔ、ＨＥＲ３及びＨＧＦ／ＳＦを有すると記載される対象の腫瘍試料の発現／活性化プロファイルは、対象のためにｃＭｅｔ阻害剤療法に対する陽性応答を予測することができる。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１０４】
[0113]さらなる実施形態では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する対象は、１つ又は複数のＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍組織を保有する。ＫＲＡＳ突然変異の非限定例には、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｖ及びその組合せが含まれる。特定の例では、ステップ（ｄ）は、試料中にＫＲＡＳ突然変異が存在し、試料におけるｃＭｅｔタンパク質、ＨＥＲ３タンパク質及びＨＧＦ／ＳＦタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。そのような例では、ＫＲＡＳ突然変異、並びに中程度から高度のレベルのｃＭｅｔ、ＨＥＲ３及びＨＧＦ／ＳＦを有すると記載される対象の腫瘍試料の発現／活性化プロファイルは、対象のためにｃＭｅｔ阻害剤療法に対する陽性応答を予測することができる。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１０５】
[0114]特定の実施形態では、ステップ（ｄ）でｃＭｅｔ阻害剤を対象に単独で投与するかどうかを決定することは、各々対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して、ｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが低度から中程度の範囲内であるかどうか、及びｃＭｅｔタンパク質の活性化（例えば、リン酸化）レベルが高であるかどうかを決定することを含む。特定の他の実施形態では、ステップ（ｄ）でｃＭｅｔ阻害剤を対象に単独で投与するかどうかを決定することは、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して、ＨＥＲ３タンパク質の発現レベルが低度から中程度の範囲内であるかどうか、及びＨＥＲ３タンパク質の活性化（例えば、リン酸化）レベルが高であるかどうかを決定することをさらに含む。そのような例では、ｃＭｅｔタンパク質の低度から中程度の発現レベルを単独で、又はＨＥＲ３タンパク質の低度から中程度の発現レベルと一緒に有し、及びｃＭｅｔタンパク質の高い活性化レベルを単独で、又はＨＥＲ３タンパク質の高い活性化レベルと一緒に有すると記載される対象の腫瘍試料の発現／活性化プロファイルは、対象のためにｃＭｅｔ阻害剤療法に対する陽性応答を予測することができる。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。前記のように、好ましい実施形態では、分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、ＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定することができ、「低度」、「中程度」又は「高度」と記載することができるＲＦＵ値で表すことができる。
【０１０６】
[0115]他の実施形態では、本発明の方法は、対象から得られる試料における切断型ｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む。特定の例では、ステップ（ｄ）は、試料における切断型ｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが検出可能であり、試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１０７】
[0116]さらに他の実施形態では、本発明の方法は、対象から得られる試料における切断型ＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む。特定の例では、ステップ（ｄ）は、試料における切断型ＨＥＲ３タンパク質の発現レベルが検出可能であり、試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１０８】
[0117]さらなる実施形態では、本発明の方法は、対象から得られる試料におけるＰＩ３Ｋタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む。特定の例では、ステップ（ｄ）は、ＰＩ３Ｋタンパク質が試料中で活性化され、試料におけるｃＭｅｔタンパク質及びＨＧＦ／ＳＦタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は単独で投与されるべきであると決定することを含む。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１０９】
[0118]他の実施形態では、本発明の方法は、ＥＧＦＲ突然変異について対象を遺伝子型同定するステップをさらに含む。ＥＧＦＲ突然変異の非限定例には、エクソン１９中の欠失、エクソン２０中の挿入、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｌ８６１Ｑ、Ｓ７６８Ｉ、Ｔ７９０Ｍ、及びその組合せが含まれる。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ＥＧＦＲ突然変異が存在する場合、及び試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む。好ましい実施形態では、経路標的療法は、ＥＧＦＲ阻害剤である。ＥＧＦＲ阻害剤の例には、それらに限定されないが、セタキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＥｒｂＢ１ワクチン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ５６９、ＣＬ−３８７−７８５、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＶ−４１２及びその組合せが含まれる。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１１０】
[0119]さらに他の実施形態では、本発明の方法は、対象から得られる試料におけるＥＧＦＲタンパク質、ＨＥＲ２タンパク質、ＰＩ３Ｋタンパク質、ＶＥＧＦＲ１タンパク質、ＶＥＧＦＲ２タンパク質及び／又はＶＥＧＦＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを検出及び／又は定量化するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるＥＧＦＲタンパク質、ＨＥＲ２タンパク質及びＨＥＲ３タンパク質の活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると各々独立して決定される場合、並びに試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む。他の特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるＰＩ３Ｋタンパク質の活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると決定される場合、並びに試料におけるＨＥＲ２タンパク質、ＨＥＲ３タンパク質及びｃＭｅｔタンパク質の発現レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して各々独立して中程度から高度の範囲であると決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む。さらに他の特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるｃＭｅｔタンパク質、ＥＧＦＲタンパク質及びＨＥＲ２タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１１１】
[0120]好ましい実施形態では、経路標的療法は、ＥＧＦＲ阻害剤、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤又はその組合せである。ＥＧＦＲ阻害剤の非限定例には、セタキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＥｒｂＢ１ワクチン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ５６９、ＣＬ−３８７−７８５、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＶ−４１２及びその組合せが含まれる。ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤の非限定例には、ＰＦ−００２９９８０４、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ−５９９６２６）、ＢＭＳ−６９０１５４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＣＩ−１０３３、ＢＩＢＷ−２９９２及びその組合せが含まれる。
【０１１２】
[0121]さらに他の特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料におけるｃＭｅｔタンパク質、ＨＥＲ３タンパク質、及びＶＥＧＦＲ１〜３タンパク質のいずれか１つ、２つ又は３つ全ての発現レベル及び／又は活性化レベルが、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して中程度から高度の範囲であると各々独立して決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤は経路標的療法と組み合わせて投与されるべきであると決定することを含む。好ましい実施形態では、経路標的療法は、それらに限定されないがＶＥＧＦＲ阻害剤などの、シグナル伝達経路構成成分の発現及び／又は活性化を変更することができる作用剤である。ＶＥＧＦＲ阻害剤の例には、それらに限定されないが、ベバシズマブ（アバスチン）、ＨｕＭＶ８３３、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＡＺＤ２１７１、ＡＭＧ−７０６、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＡＥ−９４１（ネオバスタト）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）及びその組合せが含まれる。特定の実施形態では、対象はコーカサス人の対象である。
【０１１３】
[0122]さらなる実施形態では、ステップ（ｄ）は、対照タンパク質及び／又は対照試料と比較して、ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルが各々独立して低い又は検出不能であり、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）タンパク質の発現（例えば、トータルの）及び活性化（例えば、リン酸化）の両方のレベルが高い場合は、ｃＭｅｔ阻害剤が対象に投与されるべきでないと決定することを含む。これらの特定の実施形態では、本方法は、対象の腫瘍試料がそのような発現／活性化プロファイルを示す場合は、ＥＧＦＲ阻害剤を投与するべきであると決定することをさらに含むことができる。ＥＧＦＲ阻害剤の非限定例には、セタキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＥｒｂＢ１ワクチン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ５６９、ＣＬ−３８７−７８５、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＶ−４１２及びその組合せが含まれる。特定の実施形態では、対象はアジア人対象である。
【０１１４】
[0123]本明細書に記載されるように、分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）などの近接二重検出アッセイで検出及び定量化することができる。特定の実施形態では、検出及び定量化される分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えば「低度」、「中程度」又は「高度」と記載することができるＲＦＵ値で表すことができる。
【０１１５】
[0124]別の態様では、本発明は、対象において異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の状態をモニターする、又は悪性腫瘍を有する患者が療法にどのように応答しているかをモニターする方法を提供し、前記方法は、
（ａ）対象から採取された試料におけるｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの連続変化を検出及び／又は定量化するステップと、
（ｂ）試料におけるＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの連続変化を検出及び／又は定量化するステップと、
（ｃ）試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを、（ｉ）対照タンパク質の経時的な発現レベル及び／又は活性化レベルと、及び／又は（ｉｉ）対照試料におけるｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の経時的な発現レベル及び／又は活性化レベルと比較するステップと
を含み、
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの経時的な増加は、疾患進行又は療法に対する陰性応答を示し、
ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの経時的な低下は、疾患の寛解又は療法に対する陽性応答を示す。
【０１１６】
[0125]特定の実施形態では、本発明は、抗がん療法を受けていても受けていなくてもよい患者において悪性がんの状態をモニターする方法を含む。特定の態様では、本方法は、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者から採取された腫瘍組織試料における、ｃＭｅｔとＨＥＲ３タンパク質の両方の経時的発現及び／又は活性化レベルを検出及び定量化するステップを含む。特定の例では、患者の腫瘍の変化をモニターするために、本発明の方法で検定される患者の連続腫瘍組織試料が臨床医によって評価される。特定の例では、ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現及び／又は活性化レベルが経時的に増加する場合、発現／活性化プロファイルは疾患進行又は抗がん療法に対する陰性応答を示すことができる。疾患進行は、疾患（例えば、がん）のさらなる徴候又は症状の出現に一般的に対応する。療法に対する陰性応答は、処置を受ける患者が、疾患進行又は疾患の症状の悪化を経験する状況を記載する。他の例では、ｃＭｅｔタンパク質及び／又はＨＥＲ３タンパク質の発現及び／又は活性化レベルが経時的に低下する場合は、発現／活性化プロファイルは疾患の退行又は抗がん療法に対する陽性応答を示すことができる。疾患の寛解又は療法に対する陽性応答は、患者の疾患状態の改善と一般的に相関する。それは、特定の抗がん療法が疾患の徴候又は症状の緩和に効を奏することを示すことができる。
【０１１７】
[0126]特定の実施形態では、対象の特定の分析物の発現又は活性化レベルは、ＩｇＧ対照（すなわち、対照タンパク質）などの陰性対照と比較され、対象の分析物のために生成された標準曲線と比較され、ｐａｎ−ＣＫ対照（すなわち、対照タンパク質）などの陽性対照と比較され、抗がん剤の存在下（すなわち、対照試料）で決定される発現又は活性化のレベルと比較され、及び／又は抗がん剤の不在下（すなわち、対照試料）で決定される発現又は活性化のレベルと比較される、発現又は活性化のレベルに対応することができる。特定の態様では、対照試料は、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の存在しない細胞株又は組織試料であってもよい。
【０１１８】
[0127]一部の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現（例えば、トータルの）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルは、それが、療法（例えば、抗がん剤）の不在下のときよりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％多くか少なく活性化される場合、抗がん剤などの療法の存在下で「変化した」とみなされる。他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現（例えば、トータルの）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルは、それが、療法の不在下のときよりも少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％少なく活性化される場合、抗がん剤などの療法の存在下で「実質的に低下した」とみなされる。さらに他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現（例えば、トータルの）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルは、（１）療法のないときの分析物の「高度」又は「中程度から高度」の発現及び／又は活性化から、療法があるときの分析物の「低度」の、「弱い」又は「検出可能な」発現及び／又は活性化への変化がある場合、或いは（２）療法のないときの分析物の「中程度」の発現及び／又は活性化から、療法があるときの分析物の「低度」の、「弱い」又は「非常に弱い」発現及び／又は活性化への変化がある場合、抗がん剤などの療法の存在下で「実質的に低下した」とみなされる。
【０１１９】
[0128]他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えば本明細書に記載される共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物のシグナル強度に対応する、相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値で表される。さらに他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定されるＲＦＵ値を、対象の特定の分析物について生成される標準曲線に対して較正又は標準化することによって数量化される。特定の例では、ＲＦＵ値は、標準曲線に基づいて計算することができる。
【０１２０】
[0129]さらに他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えば本明細書に記載されるＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物のシグナル強度に対応する、相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値で表される。他の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物のシグナル強度の増加に対応する、「低度」、「中程度」又は「高度」で表される。場合によっては、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の発現又は活性化の検出不能であるか最小限に検出可能なレベルは、「検出不能」と表すことができる。他の場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の低レベルの発現又は活性化は、「低度」と表すことができる。さらに他の場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の中レベルの発現又は活性化は、「中程度」と表すことができる。さらに他の場合には、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の中から高レベルの発現又は活性化は、「中程度から高度」と表すことができる。さらなる例では、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の非常に高いレベルの発現又は活性化は、「高度」と表すことができる。
【０１２１】
[0130]特定の実施形態では、対象の特定の分析物の発現又は活性化レベルは、「低度」、「中程度」又は「高度」で表される場合、例えば、ＩｇＧ対照などの陰性対照と比較したとき、対象の分析物のために生成された標準曲線と比較したとき、ｐａｎ−ＣＫ対照などの陽性対照と比較したとき、抗がん剤の存在下で決定された発現又は活性化レベルと比較したとき、及び／又は抗がん剤の不在下で決定された発現又は活性化レベルと比較したとき、少なくとも約０；５０００；１００００；１５０００；２００００；２５０００；３００００；３５０００；４００００；４５０００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００ＲＦＵである発現又は活性化のレベルに対応することができる。場合によっては、相関は分析物特異的である。非限定例として、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される「低度」レベルの発現又は活性化は、参照の発現又は活性化レベルと比較したとき、１つの分析物の発現又は活性化で１００００ＲＦＵに、及び別の分析物では５００００ＲＦＵに対応することができる。
【０１２２】
[0131]特定の実施形態では、対象の特定の分析物の発現又は活性化レベルは、例えば、ＩｇＧ対照などの陰性対照と比較したとき、対象の分析物のために生成される標準曲線と比較したとき、ｐａｎ−ＣＫ対照などの陽性対照と比較したとき、抗がん剤の存在下で決定される発現又は活性化レベルと比較したとき、及び／又は抗がん剤の不在下で決定される発現又は活性化レベルと比較したときに、参照の発現レベル又は活性化レベルに対して「低度」、「中程度」又は「高度」と呼ばれるレベルの発現又は活性化に対応することができる。場合によっては、相関は分析物特異的である。非限定例として、例えばＣＥＥＲなどの近接アッセイを用いて決定される「低度」レベルの発現又は活性化は、参照の発現又は活性化レベルと比較したとき、１つの分析物の発現又は活性化での２倍の増加に、及び別の分析物では５倍の増加に対応することができる。
【０１２３】
[0132]特定の実施形態では、療法はｃＭｅｔ阻害剤による処置を含む。一部の実施形態では、ｃＭｅｔ阻害剤は、マルチキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びモノクローナル抗体からなる群から選択される。特定の態様では、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤）は、複数のキナーゼ、例えば、それらに限定されないが、ｃＭｅｔ、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、ｐ９５ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ及びｃ−Ｋｉｔを妨害する作用剤である。他の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、それらに限定されないが、ｃＭｅｔ、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３などの１つ又は複数のチロシンキナーゼを妨害する作用剤である。本発明で用いることができる小分子チロシンキナーゼ阻害剤の非限定例には、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７及びＪＮＪ−２６４８３３２７；及びその組合せが含まれる。本発明に用いられるモノクローナル抗体の非限定例には、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、アレムツズマブ（キャンパス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、ゲムツズマブ（マイロターグ（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（商標））、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））及びトシツモマブ（ベキサール（登録商標））並びにその組合せが含まれる。ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤の非限定例が上に記載される。
【０１２４】
[0133]ｃＭｅｔ活性を調整する化合物の非限定例は本明細書に記載され、モノクローナル抗体、小分子阻害剤及びその組合せを含む。好ましい実施形態では、ｃＭｅｔ調整化合物はｃＭｅｔ活性を阻害し、及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達を妨害し、例えばｃＭｅｔ阻害剤である。ｃＭｅｔ阻害剤の例には、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、例えばＡＶ２９９、Ｌ２Ｇ７、ＡＭＧ１０２、ＤＮ３０、ＯＡ−５Ｄ５及びＭｅｔＭＡｂ；並びにｃＭｅｔの小分子阻害剤、例えばＡＲＱ１９７、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ−７７７６０７、ＸＬ１８４、ＸＬ８８０、ＩＮＣＢ２８０６０、Ｅ７０５０、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、Ｋ２５２ａ、ＬＹ２８０１６５３、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、ＮＫ２、ＮＫ４、ＳＧＸ５２３、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＨＡ−６６５７５２、ＪＮＪ−３８８７７６０５；及びその組合せが含まれる。
【０１２５】
[0134]好ましい実施形態では、対象は、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性がんを有する。特定の例では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍は、乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、甲状腺の癌腫又はその組合せである。特定の他の例では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。
【０１２６】
[0135]特定の例では、本発明は、患者で悪性腫瘍の状態をモニターする、又はそのような悪性腫瘍を有する患者が療法にどのように応答しているかをモニターする方法を提供する。特定の例では、患者の疾患の状態は、疾患の寛解又は療法に対する陽性応答に対応することができ、そこで、疾患（例えば、がん）の症状が評価され、臨床的に規定される患者の転帰（例えば、臨床転帰）と関連づけられる。臨床転帰の非限定例には、応答率（ＲＲ）、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、安定した疾患（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）が含まれる。応答率には、疾患の処置のための既定の療法に対する陽性応答、例えば腫瘍の収縮又は消失を有する患者の百分率が含まれる。完全応答には、処置に応じてのしばらく後のがんの全ての徴候の消失によって記載される臨床エンドポイントが含まれる。例えば、その時間又は処置過程の終了後に、疾患の検査、Ｘ線及びスキャン、又はそのバイオマーカーの分析によって実施されるような、症状制御及び生活の質の測定によって同定することができる残存疾患がない場合は、患者は本明細書で療法に対して完全応答を示すと記載される。特定の例では、完全応答は、全ての腫瘍病変の消失である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲＥＣＩＳＴ、２００９年１月改訂版を参照）。他方、部分応答には、処置に応じてのしばらく後のがんの全てではなく一部の徴候の消失と記載される臨床エンドポイントが含まれる。例えば、その時間又は処置過程の終了後に、疾患の検査、Ｘ線及びスキャン、又はそのバイオマーカーの分析によって実施されるような、症状制御及び生活の質の測定によって同定することができる多少の検出可能な残存疾患がある場合は、患者は本明細書で療法に対して部分応答を示すと記載される。特定の例では、部分応答には、腫瘍病変の最大直径の合計の３０％の減少が含まれる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲＥＣＩＳＴ、２００９年１月改訂版を参照）。安定した疾患には、新しい腫瘍の出現がないこと及び既存の既知の腫瘍のサイズに実質的な変化のないことを特徴とするがんの臨床エンドポイントが含まれる。ＲＥＣＩＳＴにより、安定した疾患は、完全応答、部分応答及び進行性疾患（腫瘍病変の最大直径の合計の２０％増と定義される）の基準を満たさない小さな変化と定義される。無進行期間（ＴＴＰ）には、疾患が診断又は処置されてから疾患が悪化（例えば、新しい腫瘍の出現、腫瘍サイズの増加；生活の質の変化又は症状制御の変化）し始めるまでの時間の測定が含まれる。無進行生存期間（ＰＦＳ）には、患者が疾患のさらなる症状なしで疾患を有して生存している、疾患の処置の間及び後の時間の長さが含まれる。全生存期間（ＯＳ）には、がんなどの疾患と診断されたかそれが処置された後の既定の期間生存している患者を記載する臨床エンドポイントが含まれる。
【０１２７】
[0136]一部の実施形態では、経路標的療法は、がん細胞で活性化シグナル伝達経路構成成分の機能に干渉する作用剤を含む。そのような作用剤の非限定例には、下の表１に記載されるものが含まれる。
【０１２８】
【表１−１】
2014503821.tif 000003
【表１−２】
2014503821.tif 000004
【表１−３】
2014503821.tif 000005
【表１−４】
2014503821.tif 000006
【０１２９】
[0137]特定の実施形態では、経路標的療法は、抗シグナル伝達剤（すなわち、細胞増殖抑制剤）、例えばモノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤；増殖抑制剤；化学療法剤（すなわち、細胞毒性薬）；ホルモン治療薬；放射線治療剤；ワクチン；及び／又はがん性細胞などの異常な細胞の無制御の増殖を低減又は抑止する能力を有する他の任意の化合物を含む。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの化学療法剤と一緒の、１つ又は複数の抗シグナル伝達剤、増殖抑制剤及び／又はホルモン治療薬で処置される。
【０１３０】
[0138]本発明で使用するのに適する抗シグナル伝達剤の例には、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、アレムツズマブ（キャンパス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、ゲムツズマブ（マイロターグ（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（商標））、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（登録商標））、ＡＶ２９９、Ｌ２Ｇ７、ＡＭＧ１０２、ＤＮ３０、ＯＡ−５Ｄ５及びＭｅｔＭＡｂ；チロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（ステント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、イマチニブメシレート（グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクチマ（ＺＡＣＴＩＭＡ）（商標）；ＺＤ６４７４）、ペリチニブ、ＣＩ−１０３３、ＣＬ−３８７−７８５、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、ＣＵＤＣ−１０１、ＨＫＩ−２７２、ＨＫＩ−３５７、ＰＫＩ−１６６、ＡＲＱ１９７、ＡＭＧ４５８、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＢＭＳ−６９０１５４、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ５６９、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＡＲＲＹ−３８０、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＶ−４１２、ＢＭＳ−７７７６０７、ＸＬ１８４、ＸＬ８８０、ＩＮＣＢ２８０６０、Ｅ７０５０、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、Ｋ２５２ａ、ＬＹ２８０１６５３、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、ＮＫ２、ＮＫ４、ＳＧＸ５２３、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＨＡ−６６５７５２、ＰＦ−００２９９８０４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＪＮＪ−２６４８３３２７及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにその組合せが含まれる。
【０１３１】
[0139]例示的な増殖抑制剤には、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばシロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＢＥＺ２３５及びＸＬ７６５；ＡＫＴ阻害剤、例えば１Ｌ６−ヒドロキシメチル−カイロ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセテート、１，３−ジヒドロ−１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２複合体）、ＡＰＩ−２、プロトオンコジーンＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５量体ペプチド（Ｈｉｒｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻：５３４０７〜５３４１８頁（２００４年））、ＫＰ３７２−１、及び、Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻：１１４４〜１１４５頁（２００３年）及びＫａｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、４巻：４６３〜４７６頁（２００３年）に記載される化合物；ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばＰＸ−８６６、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、テトロドトキシンクエン酸塩、マレイン酸チオペラミド、ＧＤＣ−０９４１（９５７０５４−３０−７）、ＩＣ８７１１４、ＰＩ−１０３、ＰＩＫ９３、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、ＴＧＸ−１１５、ＺＳＴＫ４７４、（−）−デグエリン、ＮＵ７０２６、ミリセチン、タンデュチニブ、ＧＤＣ−０９４１ビスメシレート、ＧＳＫ６９０６９３、ＫＵ−５５９３３、ＭＫ−２２０６、ＯＳＵ−０３０１２、ペリホシン、トリシリビン、ＸＬ−１４７、ＰＩＫ７５、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＰＩ８２８、ＸＬ−７６５及びＷＨＩ−Ｐ１５４；ＭＥＫ阻害剤、例えばＰＤ９８０５９、ＡＲＲＹ−１６２、ＲＤＥＡ１１９、Ｕ０１２６、ＧＤＣ−０９７３、ＰＤ１８４１６１、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ０３２５９０１及びＡＲＲＹ−１４２８８６；並びにその組合せが含まれる。
【０１３２】
[0140]ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤の非限定例には、ＰＦ−００２９９８０４、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ−５９９６２６）、ＢＭＳ−６９０１５４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＣＩ−１０３３、ＢＩＢＷ−２９９２及びその組合せが含まれる。
【０１３３】
[0141]化学療法剤の非限定例には、白金をベースとした薬剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソ尿素など）、代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ゲムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標））、ペメトレキセド（アリムタ（ＡＬＩＭＴＡ）（登録商標））、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標））など）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、薬学的に許容されるその塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体及びその組合せが含まれる。
【０１３４】
[0142]ホルモン治療薬の例には、それらに限定されないが、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））、レトロゾール（フェマラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））、ボロゾール、エクセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、ホルメスタン（レンタロン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ）（登録商標））など）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラソホキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンなど）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド及びゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、例えばゴセレリン、薬学的に許容されるその塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体及びその組合せが含まれる。
【０１３５】
[0143]本発明で有益ながんワクチンの非限定例には、Ａｃｔｉｖｅ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＡＮＹＡＲＡ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ＢｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＤＣＶａｘ−ＬＢ、ＩＤＭ  ＰｈａｒｍａからのＥＰ−２１０１、ＰｈａｒｍｅｘａからのＧＶ１００１、Ｉｄｅｒａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＩＯ−２０５５、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＩＮＧＮ２２５及びＢｉｏｍｉｒａ／ＭｅｒｃｋからのＳｔｉｍｕｖａｘが含まれる。
【０１３６】
[0144]放射線治療剤の例には、それらに限定されないが、腫瘍抗原に対する抗体に任意選択でコンジュゲートされる、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ及び２１２Ｂｉなどの放射性核種が含まれる。
【０１３７】
[0145]ＨＥＲ２活性を調整する化合物の非限定例は本明細書に記載され、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤及びその組合せを含む。好ましい実施形態では、ＨＥＲ２調整化合物はＨＥＲ２活性を阻害し、及び／又はＨＥＲ２シグナル伝達を妨害し、例えばＨＥＲ２阻害剤である。ＨＥＲ２阻害剤の例には、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３８０、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＣＵＤＣ−１０１、ＪＮＪ−２６４８３３２７及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにその組合せが含まれる。他の実施形態では、ＨＥＲ２調整化合物はＨＥＲ２経路を活性化し、例えばＨＥＲ２活性化因子である。
【０１３８】
[0146]ｃＭｅｔ活性を調整する化合物の非限定例は本明細書に記載され、モノクローナル抗体、小分子阻害剤及びその組合せを含む。好ましい実施形態では、ｃＭｅｔ調整化合物はｃＭｅｔ活性を阻害し、及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達を妨害し、例えばｃＭｅｔ阻害剤である。ｃＭｅｔ阻害剤の例には、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、例えばＡＶ２９９、Ｌ２Ｇ７、ＡＭＧ１０２、ＤＮ３０、ＯＡ−５Ｄ５及びＭｅｔＭＡｂ；ｃＭｅｔの小分子阻害剤、例えばＡＲＱ１９７、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ−７７７６０７、ＸＬ１８４、ＸＬ８８０、ＩＮＣＢ２８０６０、Ｅ７０５０、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、Ｋ２５２ａ、ＬＹ２８０１６５３、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、ＮＫ２、ＮＫ４、ＳＧＸ５２３、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＨＡ−６６５７５２及びＪＮＪ−３８８７７６０５；並びにその組合せが含まれる。
【０１３９】
[0147]特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で決定される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の参照発現又は活性化のレベルは、非小細胞肺がんなどのがんを有していない健康な個体からの非がん性細胞などの正常な細胞から得られる。他の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で決定される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の参照発現又は活性化のレベルは、非小細胞肺がんなどのがんを有する患者の試料からの非小細胞肺がん細胞などの腫瘍細胞から得られる。
【０１４０】
[0148]一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で決定される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の参照発現又は活性化のレベルは、抗がん剤で処置されない細胞（例えば、患者試料から得られる悪性がん細胞などの腫瘍細胞）から得られる。特定の実施形態では、抗がん剤で処置されない細胞は、細胞抽出物を生成するために用いられる単離細胞（例えば、調べる検査細胞）が得られるのと同じ試料から得られる。特定の例では、参照発現又は活性化のレベルと比較した、１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）のより低いレベルの発現又は活性化の存在は、抗がん剤が、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの処置に適する（例えば、悪性腫瘍が抗がん剤に応答する見込みの増加を有する）ことを示す。他の特定の例では、参照発現又は活性化のレベルと比較した、１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の同じであるか、類似しているか、より高いレベルの発現又は活性化の存在は、抗がん剤が、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの処置に不適である（例えば、悪性腫瘍が抗がん剤に応答する見込みの低下を有する）ことを示す。
【０１４１】
[0149]代替の実施形態では、ステップ（ｃ）で決定される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の参照発現又は活性化のレベルは、抗がん剤で処置される抗がん剤に感受性である細胞から得られる。そのような実施形態では、参照発現又は活性化のレベルと比較した、１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の同じであるか、類似しているか、より低いレベルの発現又は活性化の存在は、抗がん剤が、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの処置に適する（例えば、悪性腫瘍が抗がん剤に応答する見込みの増加を有する）ことを示す。特定の他の代替の実施形態では、ステップ（ｃ）で決定される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の参照発現又は活性化のレベルは、抗がん剤で処置される抗がん剤に耐性である細胞から得られる。そのような実施形態では、参照発現又は活性化のレベルと比較した、１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）の同じであるか、類似しているか、より高いレベルの発現又は活性化の存在は、抗がん剤が、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの処置に不適である（例えば、悪性腫瘍が抗がん剤に応答する見込みの低下を有する）ことを示す。
【０１４２】
[0150]特定の実施形態では、抗がん剤で処置されない細胞（例えば、患者試料から得られる悪性がん細胞）、抗がん剤で処置される抗がん剤感受性の細胞、又は抗がん剤で処置される抗がん剤耐性の細胞での対応する分析物の参照発現又は活性化のレベルより、発現又は活性化レベルが少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は１００倍より高い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０又は５〜５０倍より高い）場合、ステップ（ａ）及び（ｂ）で検出及び定量化される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）のより高いレベルの発現又は活性化が試料（例えば、細胞抽出物）に存在するとみなされる。
【０１４３】
[0151]他の実施形態では、抗がん剤で処置されない細胞（例えば、患者試料から得られる悪性がん細胞）、抗がん剤で処置される抗がん剤感受性の細胞、又は抗がん剤で処置される抗がん剤耐性の細胞での対応する分析物の参照発現又は活性化のレベルより、発現又は活性化レベルが少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は１００倍より低い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０又は５〜５０倍より低い）場合、ステップ（ａ）及び（ｂ）で検出及び定量化される１つ又は複数の分析物（例えば、１つ又は複数のＨＥＲ３及び／又はｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分）のより低いレベルの発現又は活性化が試料（例えば、細胞抽出物）に存在するとみなされる。
【０１４４】
[0152]本発明を用いて調べることができるシグナル伝達分子及び経路の非限定例には、表２に示すものが含まれる。
【０１４５】
【表２−１】
2014503821.tif 000007
【表２−２】
2014503821.tif 000008
【０１４６】
[0153]細胞抽出物などの試料における発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルについて調べることができるシグナル伝達分子などの分析物の非限定例には、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成成分、核ホルモン受容体、核内受容体活性化補助因子、核内受容体リプレッサー及びその組合せが含まれる。
【０１４７】
[0154]一実施形態では、本発明の方法は、細胞抽出物における以下の分析物の１つの発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：（１）ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１；（２）ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２；（３）ｐ９５ＨＥＲ２；（４）ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３；（５）ｃＭｅｔ；（６）切断型ｃＭｅｔ；（７）ＨＧＦ／ＳＦ；（８）ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）；（９）Ｓｈｃ；（１０）Ａｋｔ；（１１）ｐ７０Ｓ６Ｋ；（１２）ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３）；並びに（１３）切断型ＨＥＲ３。
【０１４８】
[0155]別の実施形態では、本発明は、細胞抽出物における以下の２つの分析物の組の１つの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含み、そこで、「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３である：１、２；１、３；１、４；１、５；１、６；１、７；１、８；１、９；１、１０；１、１１；１、１２；１、１３；２、３；２、４；２、５；２、６；２、７；２、８；２、９；２、１０；２、１１；２、１２；２、１３；３、４；３、５；３、６；３、７；３、８；３、９；３、１０；３、１１；３、１２；３、１３；４、５；４、６；４、７；４、８；４、９；４、１０；４、１１；４、１２；４、１３；５、６；５、７；５、８；５、９；５、１０；５、１１；５、１２；５、１３；６、７；６、８；６、９；６、１０；６、１１；６、１２；６、１３；７、８；７、９；７、１０；７、１１；７、１２；７、１３；８、９；８、１０；８、１１；８、１２；８、１３；９、１０；９、１１；９、１２；９、１３；１０、１１；１０、１２；１０、１３；１１、１２；１１、１３；及び１２、１３。
【０１４９】
[0156]さらに別の実施形態では、本発明は、細胞抽出物における以下の３つの分析物のセットの１つの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含み、そこで、「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３である：１、２、３；１、２、４；１、２、５；１、２、６；１、２、７；１、２、８；１、２、９；１、２、１０；１、２、１１；１、２、１２；１、２、１３；１、３、４；１、３、５；１、３、６；１、３、７；１、３、８；１、３、９；１、３、１０；１、３、１１；１、３、１２；１、３、１３；１、４、５；１、４、６；１、４、７；１、４、８；１、４、９；１、４、１０；１、４、１１；１、４、１２；１、４、１３；１、５、６；１、５、７；１、５、８；１、５、９；１、５、１０；１、５、１１；１、５、１２；１、５、１３；１、６、７；１、６、８；１、６、９；１、６、１０；１、６、１１；１、６、１２；１、６、１３；１、７、８；１、７、９；１、７、１０；１、７、１１；１、７、１２；１、７、１３；１、８、９；１、８、１０；１、８、１１；１、８、１２；１、８、１３；１、９、１０；１、９、１１；１、９、１２；１、９、１３；１、１０、１１；１、１０、１２；１、１０、１３；１、１１、１２；１、１１、１３；１、１２、１３；２、３、４；２、３、５；２、３、６；２、３、７；２、３、８；２、３、９；２、３、１０；２、３、１１；２、３、１２；２、３、１３；２、４、５；２、４、６；２、４、７；２、４、８；２、４、９；２、４、１０；２、４、１１；２、４、１２；２、４、１３；２、５、６；２、５、７；２、５、８；２、５、９；２、５、１０；２、５、１１；２、５、１２；２、５、１３；２、６、７；２、６、８；２、６、９；２、６、１０；２、６、１１；２、６、１２；２、６、１３；２、７、８；２、７、９；２、７、１０；２、７、１１；２、７、１２；２、７、１３；２、８、９；２、８、１０；２、８、１１；２、８、１２；２、８、１３；２、９、１０；２、９、１１；２、９、１２；２、９、１３；２、１０、１１；２、１０、１２；２、１０、１３；２、１１、１２；２、１１、１３；２、１２、１３；３、４、５；３、４、６；３、４、７；３、４、８；３、４、９；３、４、１０；３、４、１１；３、４、１２；３、４、１３；３、５、６；３、５、７；３、５、８；３、５、９；３、５、１０；３、５、１１；３、５、１２；３、５、１３；３、６、７；３、６、８；３、６、９；３、６、１０；３、６、１１；３、６、１２；３、６、１３；３、７、８；３、７、９；３、７、１０；３、７、１１；３、７、１２；３、７、１３；３、８、９；３、８、１０；３、８、１１；３、８、１２；３、８、１３；３、９、１０；３、９、１１；３、９、１２；３、９、１３；３、１０、１１；３、１０、１２；３、１０、１３；３、１１、１２；３、１１、１３；３、１２、１３；４、５、６；４、５、７；４、５、８；４、５、９；４、５、１０；４、５、１１；４、５、１２；４、５、１３；４、６、７；４、６、８；４、６、９；４、６、１０；４、６、１１；４、６、１２；４、６、１３；４、７、８；４、７、９；４、７、１０；４、７、１１；４、７、１２；４、７、１３；４、８、９；４、８、１０；４、８、１１；４、８、１２；４、８、１３；４、９、１０；４、９、１１；４、９、１２；４、９、１３；４、１０、１１；４、１０、１２；４、１０、１３；４、１１、１２；４、１１、１３；４、１２、１３；５、６、７；５、６、８；５、６、９；５、６、１０；５、６、１１；５、６、１２；５、６、１３；５、７、８；５、７、９；５、７、１０；５、７、１１；５、７、１２；５、７、１３；５、８、９；５、８、１０；５、８、１１；５、８、１２；５、８、１３；５、９、１０；５、９、１１；５、９、１２；５、９、１３；５、１０、１１；５、１０、１２；５、１０、１３；５、１１、１２；５、１１、１３；５、１２、１３；６、７、８；６、７、９；６、７、１０；６、７、１１；６、７、１２；６、７、１３；６、８、９；６、８、１０；６、８、１１；６、８、１２；６、８、１３；６、９、１０；６、９、１１；６、９、１２；６、９、１３；６、１０、１１；６、１０、１２；６、１０、１３；６、１１、１２；６、１１、１３；６、１２、１３；７、８、９；７、８、１０；７、８、１１；７、８、１２；７、８、１３；７、９、１０；７、９、１１；７、９、１２；７、９、１３；７、１０、１１；７、１０、１２；７、１０、１３；７、１１、１２；７、１１、１３；７、１２、１３；８、９、１０；８、９、１１；８、９、１２；８、９、１３；８、１０、１１；８、１０、１２；８、１０、１３；８、１１、１２；８、１１、１３；８、１２、１３；９、１０、１１；９、１０、１２；９、１０、１３；９、１１、１２；９、１１、１３；９、１２、１３；１０、１１、１２；１０、１１、１３；１０、１２、１３；及び１１、１２、１３。
【０１５０】
[0157]さらに別の実施形態では、本発明は、細胞抽出物における以下の４つの分析物のセットの１つの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含み、そこで、「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３である：１、２、３、４；１、２、３、５；１、２、３、６；１、２、３、７；１、２、３、８；１、２、３、９；１、２、３、１０；１、２、３、１１；１、２、３、１２；１、２、３、１３；１、３、４、５；１、３、４、６；１、３、４、７；１、３、４、８；１、３、４、９；１、３、４、１０；１、３、４、１１；１、３、４、１２；１、３、４、１３；１、４、５、６；１、４、５、７；１、４、５、８；１、４、５、９；１、４、５、１０；１、４、５、１１；１、４、５、１２；１、４、５、１３；１、５、６、７；１、５、６、８；１、５、６、９；１、５、６、１０；１、５、６、１１；１、５、６、１２；１、５、６、１３；１、６、７、８；１、６、７、９；１、６、７、１０；１、６、７、１１；１、６、７、１２；１、６、７、１３；１、７、８、９；１、７、８、１０；１、７、８、１１；１、７、８、１２；１、７、８、１３；１、８、９、１０；１、８、９、１１；１、８、９、１２；１、８、９、１３；１、９、１０、１１；１、９、１０、１２；１、９、１０、１３；１、１０、１１、１２；１、１０、１１、１３；１、１１、１２、１３；２、３、４、５；２、３、４、６；２、３、４、７；２、３、４、８；２、３、４、９；２、３、４、１０；２、３、４、１１；２、３、４、１２；２、３、４、１３；２、４、５、６；２、４、５、７；２、４、５、８；２、４、５、９；２、４、５、１０；２、４、５、１１；２、４、５、１２；２、４、５、１３；２、５、６、７；２、５、６、８；２、５、６、９；２、５、６、１０；２、５、６、１１；２、５、６、１２；２、５、６、１３；２、６、７、８；２、６、７、９；２、６、７、１０；２、６、７、１１；２、６、７、１２；２、６、７、１３；２、７、８、９；２、７、８、１０；２、７、８、１１；２、７、８、１２；２、７、８、１３；２、８、９、１０；２、８、９、１１；２、８、９、１２；２、８、９、１３；２、９、１０、１１；２、９、１０、１２；２、９、１０、１３；２、１０、１１、１２；２、１０、１１、１３；２、１１、１２、１３；３、４、５、６；３、４、５、７；３、４、５、８；３、４、５、９；３、４、５、１０；３、４、５、１１；３、４、５、１２；３、４、５、１３；３、５、６、７；３、５、６、８；３、５、６、９；３、５、６、１０；３、５、６、１１；３、５、６、１２；３、５、６、１３；３、６、７、８；３、６、７、９；３、６、７、１０；３、６、７、１１；３、６、７、１２；３、６、７、１３；３、７、８、９；３、７、８、１０；３、７、８、１１；３、７、８、１２；３、７、８、１３；３、８、９、１０；３、８、９、１１；３、８、９、１２；３、８、９、１３；３、９、１０、１１；３、９、１０、１２；３、９、１０、１３；３、１０、１１、１２；３、１０、１１、１３；３、１１、１２、１３；４、５、６、７；４、５、６、８；４、５、６、９；４、５、６、１０；４、５、６、１１；４、５、６、１２；４、５、６、１３；４、６、７、８；４、６、７、９；４、６、７、１０；４、６、７、１１；４、６、７、１２；４、６、７、１３；４、７、８、９；４、７、８、１０；４、７、８、１１；４、７、８、１２；４、７、８、１３；４、８、９、１０；４、８、９、１１；４、８、９、１２；４、８、９、１３；４、９、１０、１１；４、９、１０、１２；４、９、１０、１３；４、１０、１１、１２；４、１０、１１、１３；４、１１、１２、１３；５、６、７、８；５、６、７、９；５、６、７、１０；５、６、７、１１；５、６、７、１２；５、６、７、１３；５、７、８、９；５、７、８、１０；５、７、８、１１；５、７、８、１２；５、７、８、１３；５、８、９、１０；５、８、９、１１；５、８、９、１２；５、８、９、１３；５、９、１０、１１；５、９、１０、１２；５、９、１０、１３；５、１０、１１、１２；５、１０、１１、１３；５、１１、１２、１３；６、７、８、９；６、７、８、１０；６、７、８、１１；６、７、８、１２；６、７、８、１３；６、８、９、１０；６、８、９、１１；６、８、９、１２；６、８、９、１３；６、９、１０、１１；６、９、１０、１２；６、９、１０、１３；６、１０、１１、１２；６、１０、１１、１３；６、１１、１２、１３；７、８、９、１０；７、８、９、１１；７、８、９、１２；７、８、９、１３；７、９、１０、１１；７、９、１０、１２；７、９、１０、１３；７、１０、１１、１２；７、１０、１１、１３；７、１１、１２、１３；８、９、１０、１１；８、９、１０、１２；８、９、１０、１３；８、１０、１１、１２；８、１０、１１、１３；８、１１、１２、１３；９、１０、１１、１２；９、１０、１１、１３；９、１１、１２、１３；並びに１０、１１、１２、１３。
【０１５１】
[0158]別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の５つの任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、５つの分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５；２、３、４、５、６；３、４、５、６、７；４、５、６、７、８；５、６、７、８、９；６、７、８、９、１０；７、８、９、１０、１１；８、９、１０、１１、１２；又は９、１０、１１、１２、１３。
【０１５２】
[0159]さらに別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の６つの任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、６つの分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６；２、３、４、５、６、７；３、４、５、６、７、８；４、５、６、７、８、９；５、６、７、８、９、１０；６、７、８、９、１０、１１；７、８、９、１０、１１、１２；又は８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５３】
[0160]さらに別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の７つの任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、７つの分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６、７；２、３、４、５、６、７、８；３、４、５、６、７、８、９；４、５、６、７、８、９、１０；５、６、７、８、９、１０、１１；６、７、８、９、１０、１１、１２；又は７、８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５４】
[0161]別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の８つの任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、８つの分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６、７、８；２、３、４、５、６、７、８、９；３、４、５、６、７、８、９、１０；４、５、６、７、８、９、１０、１１；５、６、７、８、９、１０、１１、１２；又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５５】
[0162]さらに別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の９つの任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、９つの分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６、７、８、９；２、３、４、５、６、７、８、９、１０；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１；４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２；又は５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５６】
[0163]さらに別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の１０個の任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、１０個の分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２；又は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５７】
[0164]別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の１１個の任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ｃＫｉｔ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、１１個の分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２；又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５８】
[0165]さらに別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の１２個の任意の可能な組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。非限定例として、１２個の分析物の組合せは、以下の１つを含むことができる：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２；又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３。
【０１５９】
[0166]さらに別の実施形態では、本発明は、以下の分析物の全１３個の発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む：「１」＝ＨＥＲ１、「２」＝ＨＥＲ２、「３」＝ｐ９５ＨＥＲ２、「４」＝ＨＥＲ３、「５」＝ｃＭｅｔ、「６」＝切断型ｃＭｅｔ、「７」＝ＨＧＦ／ＳＦ、「８」＝ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、「９」＝Ｓｈｃ、「１０」＝Ａｋｔ、「１１」＝ｐ７０Ｓ６Ｋ、「１２」＝ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）並びに「１３」＝切断型ＨＥＲ３。
【０１６０】
[0167]特定の一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、切断型ｃＭｅｔ、及び／又は切断型ＨＥＲ３の発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、Ｓｈｃ、切断型ｃＭｅｔ及び／又は切断型ＨＥＲ３の発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む。さらに別の特定の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、Ｓｈｃ、Ａｋｔ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／又は３）、切断型ｃＭｅｔ及び／又は切断型ＨＥＲ３の発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することを含む。
【０１６１】
[0168]特定の実施形態では、本発明は、細胞抽出物における１つ又は複数（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上）のさらなる分析物の発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、１つ又は複数（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上）のさらなる分析物は、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成成分、核ホルモン受容体、核内受容体活性化補助因子、核内受容体リプレッサー及びその組合せからなる群から選択される１つ又は複数のシグナル伝達分子を含む。
【０１６２】
[0169]特定の実施形態では、本発明は、細胞抽出物における以下のさらなる分析物の１つ、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上の任意の組合せの発現（例えば、トータル）レベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定することをさらに含む：ＨＥＲ４、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＧＳＫ−３β、Ｒａｆ、ＳＲＣ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴＯＲ、ＥＰＨ−Ａ、ＥＰＨ−Ｂ、ＥＰＨ−Ｃ、ＥＰＨ−Ｄ、ＦＬＴ−３、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ｃ−ＦＭＳ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、ＲＯＮ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、受容体二量体、他のＨＥＲ３シグナル伝達経路構成成分、他のｃＭｅｔシグナル伝達経路構成成分及びその組合せ。
【０１６３】
ＩＶ．ｃ−Ｍｅｔ媒介がん
[0170]ｃ−Ｍｅｔは、多くの悪性腫瘍で過剰発現される可能性がある。ｃ−Ｍｅｔ媒介がんでは、チロシンキナーゼドメイン、膜近傍ドメイン又はセマフォリンドメインの中での増幅及び／又は活性化突然変異が同定されている。ｃ−Ｍｅｔ媒介がんの処置に適する抗がん剤を選択することは、治療の存在下でｃ−Ｍｅｔの発現レベル及び／又は活性化状態を評価することによって可能である。ｃ−Ｍｅｔの活性化は、増加する細胞成長、浸潤、血管形成及び転移につながる。特定の実施形態では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔの活性化及び／又は過剰発現を阻害するのに適当な治療戦略を選択する方法を提供する。
【０１６４】
[0171]一実施形態では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）の処置に適する抗がん剤を選択するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）単離されたがん細胞から生成された細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定される１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルに基づいてｃ−Ｍｅｔ媒介がんの処置に適する抗がん剤を選択するステップとを含む。
【０１６５】
[0172]一部の例では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）の処置に適する抗がん剤を選択するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）抗がん剤の投与後か抗がん剤とのインキュベーションの前にがん細胞を単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを、抗がん剤がない場合に生成されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の参照発現及び／又は活性化のプロファイルと比較して、ｃ−Ｍｅｔ媒介がんの処置のために前記抗がん剤が適するか不適であるかを決定するステップとを含む。
【０１６６】
[0173]別の実施形態では、本発明は、抗がん剤による処置へのｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）の応答を同定するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）単離されたがん細胞から生成された細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定される１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルに基づいて抗がん剤による処置へのｃ−Ｍｅｔ媒介がんの応答を同定するステップとを含む。
【０１６７】
[0174]一部の例では、本発明は、抗がん剤による処置へのｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）の応答を同定するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）抗がん剤の投与後か抗がん剤とのインキュベーションの前にがん細胞を単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを、抗がん剤がない場合に生成されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の参照発現及び／又は活性化のプロファイルと比較して、ｃ−Ｍｅｔ媒介がんが前記抗がん剤による処置に応答するか応答しないかを識別するステップとを含む。
【０１６８】
[0175]さらに別の実施形態では、本発明は、抗がん剤による処置へのｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）を有する対象の応答を予測するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）単離されたがん細胞から生成された細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定される１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルに基づいて抗がん剤による処置へのｃ−Ｍｅｔ媒介がんを有する対象の応答を予測するステップとを含む。
【０１６９】
[0176]一部の例では、本発明は、抗がん剤による処置へのｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）を有する対象の応答を予測するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）抗がん剤の投与後か抗がん剤とのインキュベーションの前にがん細胞を単離するステップと、
（ｂ）単離細胞を溶解して細胞抽出物を生成するステップと、
（ｃ）細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを、抗がん剤がない場合に生成されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の参照発現及び／又は活性化のプロファイルと比較して、ｃ−Ｍｅｔ媒介がんを有する対象が抗がん剤による処置に応答する見込みを予測するステップとを含む。
【０１７０】
[0177]さらなる実施形態では、本発明は、対象でｃ−Ｍｅｔ媒介がん（例えば、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍）の状態をモニターする方法、又はｃ−Ｍｅｔ媒介がんを有する患者が療法にどのように応答しているかをモニターする方法を提供し、前記方法は、
（ａ）単離されたがん細胞から生成された細胞抽出物におけるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の経時的な発現レベル及び／又は活性化レベルを決定して、ｃＭｅｔタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルの連続変化を検出及び定量化するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で経時的に決定される１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルに基づいて、ｃ−Ｍｅｔ媒介がんの状態又はｃ−Ｍｅｔ媒介がんを有する患者が療法にどのように応答しているかをモニターするステップとを含む。
【０１７１】
[0178]一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で経時的に決定されるｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルを、ｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の経時的な参照発現及び／又は活性化のプロファイルと比較して、ｃ−Ｍｅｔ媒介がんの状態又はｃ−Ｍｅｔ媒介がんを有する患者が療法にどのように応答しているかをモニターすることを含み、そこで、ステップ（ａ）で決定されるｃＭｅｔタンパク質及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現及び／又は活性化のレベルの経時的な増加は、疾患進行又は療法に対する陰性応答を示し、ステップ（ａ）で決定されるｃＭｅｔタンパク質及び任意選択で１つ又は複数の追加の分析物の発現及び／又は活性化のレベルの経時的な低下は、疾患の寛解又は療法に対する陽性応答を示す。
【０１７２】
[0179]特定の態様では、本発明は、腫瘍組織、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、又は微細針吸引液（ＦＮＡ）などの患者試料でｃ−Ｍｅｔ媒介がんの経路を評価する方法を提供する。本明細書で、この方法は、患者のために最適な治療戦略を提供する。一態様では、以下の追加の分析物の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上をスクリーニングするか調べて、ｃ−Ｍｅｔ媒介がん療法（例えば、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）への応答を決定することができる：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、切断型ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ＰＩＫ３Ｒ１）、Ｓｈｃ、Ａｋｔ（例えば、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３）、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３）、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ＲＯＮ及びその組合せ。例えば、ＸＬ−８８０への応答者は活性化ｃ−ＭＥＴ及びＶＥＧＦＲ２を有するが、不応答者は活性化ＲＴＫの組合せを有する可能性がある。
【０１７３】
[0180]特定の他の例では、本明細書で提供される方法は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性がんの処置のための併用療法の選択で有用である。例えば、活性化ｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２及びＥＧＦＲを有するがん患者はイレッサ（登録商標）とＸＬ−８８０の組合せで首尾よく処置することができるが、活性化ｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２及びＨＥＲ３を有するがん患者はタイケルブ（登録商標）＋ＸＬ−８８０で処置することができる。
【０１７４】
[0181]腫瘍細胞では、ｃ−Ｍｅｔ活性化が、細胞成長、増殖、浸潤及びアポトーシスからの保護をもたらす、多様な連続したシグナル伝達カスケードの誘発を引き起こすと考えられている。細胞及び動物腫瘍モデルからのデータは、ｃ−Ｍｅｔ媒介がんの腫瘍原性の基礎をなす生物学的機構は、３つの異なる方法で一般的に達成されることを示唆する：（１）ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔオートクリンループの確立による、（２）ｃ−Ｍｅｔ又はＨＧＦ過剰発現による、及び（３）ｃ−Ｍｅｔ受容体コード配列でのキナーゼ活性化突然変異の存在下で。ＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの過剰発現は、がん患者での腫瘍の攻撃性の増加及び予後診断の劣化徴候の指標となる。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、内皮細胞で増殖及び移動を誘導することによって、重要な前血管形成因子である血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を誘導することによって、並びに血管形成の負の調節因子であるトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）を劇的に下方制御することによって、腫瘍血管形成を誘導する。ＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの発現はほとんどの固形腫瘍の腫瘍生検材料で観察され、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、胃（胃部）、膀胱、乳房、けい部、結腸直腸、胃部、頭けい部、肝臓、肺、卵巣、すい臓、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、腎臓及び甲状腺のがんを含む広範囲のヒト悪性腫瘍、並びに様々な肉腫、造血悪性腫瘍及び黒色腫で実証されている。最も注目すべきは、ｃ−Ｍｅｔのチロシンキナーゼドメインでの活性化突然変異が、乳頭状腎臓がんの遺伝形式を有する患者で陽性に同定され、ヒト腫瘍形成におけるｃ−Ｍｅｔの連座を直接に示している。
【０１７５】
[0182]特定の実施形態では、本発明は、固形腫瘍の腫瘍組織又は循環細胞に由来する腫瘍細胞で、ｃ−Ｍｅｔ及び任意選択で複数の脱調節されたシグナルトランスデューサーの発現及び活性化状態を、特異的な多重ハイスループットアッセイで検出する方法を提供する。本発明は、１つ又は複数の脱調節されたシグナル伝達経路を下方制御又は遮断するための適当な療法の選択のための方法及び組成物も提供する。したがって、本発明の実施形態は、所与の患者の腫瘍、例えば肺腫瘍（例えば、ＮＳＣＬＣ）で活性化されたシグナル伝達タンパク質の集合によって提供される特定の分子サインに基づいて、カスタマイズされた療法の設計を容易にするために用いることができる。
【０１７６】
[0183]一部の実施形態では、抗がん剤（例えば、非小細胞肺がんなどのｃ−Ｍｅｔ媒介がんの処置に適する１つ又は複数の抗がん剤）は、抗シグナル伝達剤（すなわち、細胞増殖抑制剤）、例えばモノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤、増殖抑制剤、化学療法剤（すなわち、細胞毒性薬）、ホルモン治療薬、放射線治療剤、ワクチン、及び／又はがん性細胞などの異常な細胞の無制御の増殖を低減又は抑止する能力を有する他の任意の化合物を含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、少なくとも１つの化学療法剤と一緒の、１つ又は複数の抗シグナル伝達剤、増殖抑制剤及び／又はホルモン治療薬で処置される。
【０１７７】
[0184]特定の実施形態では、ＨＧＦ特異的又はｃ−Ｍｅｔ特異的抗体などの抗体は、リガンド／受容体結合を防止し、その結果増殖を阻害し、アポトーシスを強化することによって増殖阻害及び腫瘍退行をもたらす。場合によっては、モノクローナル抗体の組合せを用いることもできる。モノクローナル抗体を用いる戦略は、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔに対する排他的特異性、小分子キナーゼ阻害剤と比較して比較的長い半減期、及び腫瘍細胞に対して宿主免疫応答を導き出す能力を可能にする。ＡＭＧ１０２は、ＨＧＦに選択的に結合して中和し、それによってｃ−Ｍｅｔへのその結合及び以降の活性化を防止する、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。併用されると、ＡＭＧ１０２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、及び異種移植で、テモゾロマイド及びドセタキセルなどの様々な標準の化学療法剤の効果を強化することが示されている。ＭｅｔＭＡｂは、アゴニストモノクローナル抗体５Ｄ５に由来する、ヒト化された一価のアンタゴニスト抗ｃ−Ｍｅｔ抗体である。ＭｅｔＭＡｂはｃ−Ｍｅｔと高親和性で結合し、ｃ−Ｍｅｔと一緒に細胞表面に残り、ＨＧＦ結合及び以降のｃ−Ｍｅｔリン酸化に加えて下流のシグナル伝達活性及び細胞性応答を阻止する。近年の前臨床試験は、ＭｅｔＭＡｂが、特にＥＧＦＲ及び／又はＶＥＧＦ阻害剤と一緒に、ヒトがんで治療抗体として有望な強力な抗ｃ−Ｍｅｔ阻害剤であることを示す。
【０１７８】
[0185]ｃ−Ｍｅｔの小分子阻害剤には、それに限定されないが、ｃ−Ｍｅｔ受容体に非常に選択的な非ＡＴＰ競合剤であるＡＲＱ１９７（ＡｒＱｕｌｅ）が含まれる。他の選択的なｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、最初の臨床評価に近年入っており、それらには以下のものが含まれる。ｃ−Ｍｅｔの触媒活性の小分子ＡＴＰ競合的阻害剤であるＪＮＪ−３８８７７６０５（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、１５０個を超えるタンパク質キナーゼのスクリーニングパネルと比較してｃ−Ｍｅｔに対して１０００倍を超える選択性を有するｃ−Ｍｅｔの経口利用できるＡＴＰ競合的小分子阻害剤であるＰＦ−０４２１７９０３（Ｐｆｉｚｅｒ）、２１３個のタンパク質キナーゼのスクリーニングパネル内の他の全てのキナーゼと比較してｃ−Ｍｅｔに対して１，０００倍を超える選択性を有し、ヒト異種移植モデルに経口投薬されたときに明白な毒性なしに強力な抗腫瘍活性を有するｃ−Ｍｅｔの別の非常に選択的なＡＴＰ競合的阻害剤であるＳＧＸ５２３（ＳＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
【０１７９】
[0186]ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）は、０．４ｎＭのＩＣ５０でｃ−Ｍｅｔを標的にするｃ−Ｍｅｔの小分子阻害剤の別の例である。結合親和性はｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦＲ２の両方に対して高く、キナーゼの立体配置変化を引き起こし、ＸＬ８８０をＡＴＰ結合ポケットにより深く移動させる。標的上の時間は、両受容体について２４時間を超える。ＸＬ８８０は優れた経口的生物学的利用能を有し、それはＣＹＰ４５０基質であるが阻害剤でもインデューサーでもない。５日間投薬／９日間休止スケジュール（試験１）で、又は固定日用量（試験２）として、２つの第Ｉ相臨床試験でＸＬ８８０の異なる投与スケジュールを検討した。ＸＬ８８０は異なる時点で増殖及び生存のために２つの協力経路に作用し、腫瘍血管形成に対する最初の攻撃への腫瘍応答のための治療的解決策を既に提供している。乳頭状腎臓がん、胃がん及び頭けい部がんを含む複数の腫瘍型で第ＩＩ相試験が開始されている。
【０１８０】
[0187]ＸＬ１８４（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）は、前臨床モデルでｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦＲ２の両方の強力な阻害を実証した、新規の経口投与される小分子抗がん化合物である。ＭＰ４７０（ＳｕｐｅｒＧｅｎ）は、ｃ−Ｍｅｔに加えて、ｃ−Ｋｉｔの突然変異形、突然変異体ＰＤＧＦＲａ及び突然変異体Ｆｌｔ−３を含むいくつかの他のタンパクチロシンキナーゼ標的に対する阻害活性を有する、新規の経口的に生物的に利用可能である小分子である。ＭＧＣＤ２６５（Ｍｅｔｈｙｌｇｅｎｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｃ−Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、ＶＥＧＦＲ及びＴｉｅ−２酵素活性を強力に抑制し、細胞分散、傷治癒などのＨＧＦ依存性細胞性エンドポイント、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成及びｉｎ  ｖｉｖｏ血管透過性などのＶＥＧＦ依存性応答を抑止することが報告されている。ＭＫ−２４６１（Ｍｅｒｃｋ）は、ｃ−Ｍｅｔが構成的にリン酸化されるＭＥＴ遺伝子増幅を有する前臨床モデルで特に活性である、ｃ−Ｍｅｔ、ＫＤＲ、ＦＧＦＲ１／２／３及びＦｌｔ１／３／４の強力な阻害剤である。ＭＫ−２４６１は、早期第Ｉ相評価で良好な耐容性を示している。
【０１８１】
[0188]特定の例では、ｃ−Ｍｅｔ受容体へのＨＧＦリガンドの結合は、デコイ又はアンタゴニストとして作用することができるＨＧＦ又はｃ−Ｍｅｔの小領域によって阻害することができる。これらのデコイ及びアンタゴニストは、ｃ−Ｍｅｔ活性化につながることなくリガンド又は受容体と化学量論的に競合し、それによって下流経路の活性化及び生物学的転帰を阻止する。いくつかのＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔ変異体はｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方でアンタゴニストとして実験的に検証されており、リガンド結合の妨害又はｃ−Ｍｅｔ二量体化の阻止により作用する。さらに、ｃ−Ｍｅｔ結合に関してＨＧＦと競合することがわかっているＨＧＦの分子類似体が開発されている。
【０１８２】
Ｖ．抗体アレイの構築
[0189]特定の態様では、肺がん細胞などの腫瘍細胞の細胞抽出物での分析物（例えば、シグナル伝達分子）の１つ又は複数（例えば、複数）の発現レベル及び／又は活性化状態は、固体支持体に拘束される捕捉抗体の希釈系を含む抗体ベースのアレイを用いて検出される。アレイは、異なる接近可能な場所の固体支持体の表面に結合している複数の異なる捕捉抗体を広範囲の捕捉抗体濃度で一般的に含む。
【０１８３】
[0190]特定の一実施形態では、本発明は、固体支持体に拘束された捕捉抗体の複数の希釈系を含む優れたダイナミックレンジを有する接近可能なアレイを提供し、そこで、各希釈系の捕捉抗体は、シグナル伝達経路の構成成分及び他の標的タンパク質に対応する１つ又は複数の分析物に特異的である。様々な態様では、この実施形態は、特定の腫瘍に特徴的なシグナル伝達経路、例えば肺がん細胞で活性であるシグナル伝達経路（例えば、ｃ−Ｍｅｔ経路）の構成成分を含むアレイを含む。したがって、本発明は、がんを引き起こす潜在的な発現又は活性化の欠陥を有する各シグナル伝達分子又は対象の他のタンパク質が単一のアレイ又はチップの上で表示される場合、有利に実施することができる。一部の態様では、特定の腫瘍細胞で活性である所与のシグナル伝達経路の構成成分は、細胞内のシグナル伝達経路を通して情報が伝達される配列に対応する線状配列に整列させられる。そのようなアレイの例は本明細書に記載され、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号の図５〜９にも示されているが、その開示は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。表面関連のいかなるアーチファクトも最小にするために、特定の腫瘍細胞で活性である所与のシグナル伝達経路の１つ又は複数の構成成分に特異的な捕捉抗体をランダムに印刷することもできる。
【０１８４】
[0191]固体支持体は、タンパク質を固定化するための任意の適する基質を含むことができる。固体支持体の例には、それらに限定されないが、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、ゲル、金属、セラミックなどが含まれる。膜、例えばナイロン（バイオトランス（Ｂｉｏｔｒａｎｓ）（商標）、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）、ゼータプローブ（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ）（登録商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））、ニトロセルロース（プロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）（登録商標）、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ））、及びＰＶＤＦ（イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）（商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））は、本発明のアレイで固体支持体として使用するのに適する。好ましくは、捕捉抗体は、ニトロセルロースポリマー、例えばＷｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）から市販されているＦＡＳＴ（登録商標）スライドでコーティングされたガラススライドの上に拘束される。
【０１８５】
[0192]望ましい固体支持体の特定の態様は、大量の捕捉抗体に結合する能力及び最小限の変性で捕捉抗体に結合する能力を含む。別の適する態様は、捕捉抗体を含有する抗体溶液が支持体に加えられるときに、固体支持体が最小限の「ウィッキング」を示すことである。最小限のウィッキングの固体支持体は、支持体に加えられる捕捉抗体溶液の小分量が、固定化捕捉抗体の小さく明確なスポットをもたらすことを可能にする。
【０１８６】
[0193]捕捉抗体は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子双極子結合）を通して、固体支持体に一般に直接か間接的に（例えば、捕捉タグを通して）拘束される。一部の実施形態では、捕捉抗体は、標準の架橋の方法及び条件を用いて、ホモ二官能基であるかヘテロ二官能基架橋剤を用いて固体支持体に共有結合される。適する架橋剤は、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）などの販売会社から市販されている。
【０１８７】
[0194]本発明で使用するために適するアレイを生成する方法には、それらに限定されないが、タンパク質又は核酸アレイを構築するために用いられる任意の技術が含まれる。一部の実施形態では、捕捉抗体は、一般的にスプリットピン、ブラントピン又はインクジェット印刷を備えているロボット印刷機であるマイクロスポッターを用いてアレイの上へスポットされる。本明細書に記載される抗体アレイを印刷するのに適するロボットシステムには、ＣｈｉｐＭａｋｅｒ２スプリットピン（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を備えたＰｉｘＳｙｓ５０００ロボット（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、並びにＢｉｏＲｏｂｉｃｓ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）及びＰａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）から入手可能な他のロボット印刷機が含まれる。好ましくは、少なくとも２、３、４、５、又は６反復の各捕捉抗体希釈溶液がアレイの上へスポットされる。
【０１８８】
[0195]本発明で使用するのに適するアレイを生成する別の方法は、支持体の上に規定量の液体を引き抜くのに有効な条件の下で固体支持体の上へ毛細管ディスペンサーを接触させることによって、選択された各アレイ位置で既知の量の捕捉抗体希釈溶液を分注することを含み、そこで、完全なアレイを作製するために、選択された各アレイ位置で選択された捕捉抗体希釈溶液を用いてこの方法が繰り返される。この方法は、複数のそのようなアレイの形成で実施することができ、そこでは、各反復サイクルで溶液沈着ステップが複数の固体支持体の各々の上の選択された位置へ適用される。そのような方法のさらなる記載は、例えば、米国特許第５，８０７，５２２号に見出すことができる。
【０１８９】
[0196]特定の例では、抗体アレイを生成するために、紙に印刷する装置を用いることができる。例えば、所望の捕捉抗体希釈溶液をデスクトップジェットプリンターのプリントヘッドに詰めて、適する固体支持体に印刷することができる（例えば、Ｓｉｌｚｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４４巻：２０３６〜２０４３頁（１９９８年）を参照）。
【０１９０】
[0197]一部の実施形態では、固体支持体上に生成されたアレイは、少なくとも約５スポット／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００又は９０００、又は１００００スポット／ｃｍ２の密度を有する。
【０１９１】
[0198]特定の例では、固体支持体上のスポットは、各々異なる捕捉抗体を表す。特定の他の例では、固体支持体上の複数のスポットは、例えば、一連の下行する捕捉抗体濃度を含む希釈系として同じ捕捉抗体を表す。
【０１９２】
[0199]固体支持体の上に抗体アレイを調製して、構築する方法の追加の例は、米国特許第６，１９７，５９９号、第６，７７７，２３９号、第６，７８０，５８２号、第６，８９７，０７３号、第７，１７９，６３８号及び第７，１９２，７２０号、米国特許出願公開第２００６０１１５８１０号、第２００６０２６３８３７号、第２００６０２９２６８０号及び第２００７００５４３２６号、並びにＶａｒｎｕｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４巻：１６１〜１７２頁（２００４年）に記載される。
【０１９３】
[0200]抗体アレイのスキャン方法は当技術分野で公知であり、それらに限定されないがタンパク質又は核酸アレイをスキャンするために用いられるあらゆる技術が含まれる。本発明で使用するのに適するマイクロアレイスキャナーは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（Ｉｓｓａｑｕａｈ、ＷＡ）、ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）及びＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能である。非限定例として、蛍光検出のためのＧＳＩ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００を、定量化のためのＩｍａＧｅｎｅソフトウェアと一緒に用いることができる。
【０１９４】
ＶＩ．単一検出アッセイ
[0201]一部の実施形態では、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物で対象の１つ又は複数の分析物（例えば、ＨＥＲ３及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の１つ又は複数の構成成分などの１つ又は複数のシグナル伝達分子）の発現及び／又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重ハイスループットの２抗体アッセイである。非限定例として、アッセイで用いられる２つの抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、及び（２）分析物の活性化形に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存性抗体）を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態を検出することが可能である。或いは、検出抗体は、細胞抽出物で分析物の総量を検出する活性化状態非依存性抗体を含む。活性化状態非依存性抗体は、分析物の活性化及び非活性化の形の両方を検出することが一般に可能である。
【０１９５】
[0202]特定の一実施形態では、対象の分析物の発現又は活性化レベルを検出するための２抗体アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の１つ又は複数の希釈系とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成するステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するステップであって、検出抗体は分析物の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は分析物の発現レベル（例えば、総量）を検出するための活性化状態非依存性抗体を含むステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップとを含む。
【０１９６】
[0203]本明細書に記載される２抗体アッセイは、一般的に、異なるアドレス可能な場所の固体支持体の表面に結合している複数の異なる捕捉抗体を広範囲の捕捉抗体濃度で含む抗体ベースのアレイである。本発明で用いるのに適する固体支持体の例は上に記載される。
【０１９７】
[0204]捕捉抗体及び検出抗体は、好ましくは、分析物との結合（すなわち、捕捉及び検出抗体の両方はそれらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）に関してそれらの間の競合を最小にするように選択される。
【０１９８】
[0205]一実施形態では、検出抗体は結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。結合対メンバーは、当分野で周知である方法を用いて検出抗体に、又はシグナル増幅対の第１のメンバーに直接又は間接に結合することができる。特定の例では、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、デヨージナーゼなど）であり、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）である。これらの例では、増幅されるシグナルはチラミド試薬のペルオキシダーゼ酸化によって生成され、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で活性化チラミドを生成する。
【０１９９】
[0206]活性化チラミドは直接に検出されるか、シグナル検出試薬、例えばストレプトアビジン標識蛍光団又はストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと発色性試薬の組合せの添加の結果検出される。本発明で使用するのに適する蛍光団の例には、それらに限定されないが、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）色素（例えば、アレクサフルオール（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが含まれる。ストレプトアビジン標識は、当分野で周知である方法を用いて蛍光団又はペルオキシダーゼに直接又は間接に結合することができる。本発明で使用するのに適する発色性試薬の非限定例には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）（４ＣＮ）及び／又はポルフィリノーゲンが含まれる。
【０２００】
[0207]本明細書に記載される２抗体アッセイを実施するための例示的プロトコルは、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号の実施例３で提供されているが、その開示は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
[0208]２抗体法の別の実施形態では、本発明は、切断型受容体の発現又は活性化のレベルを検出する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズと一緒にインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体の希釈系と一緒にインキュベートして複数の捕捉された切断型受容体を形成するステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉された切断型受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な検出抗体と一緒にインキュベートして複数の検出可能な補足された切断型受容体を形成するステップであって、検出抗体は切断型受容体の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は切断型受容体の発現レベル（例えば、総量）を検出するための活性化状態非依存性抗体を含むステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉された切断型受容体をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップとを含む。
【０２０２】
[0209]特定の実施形態では、切断型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。他の実施形態では、切断型受容体はＨＥＲ３の切断型であり、完全長受容体はＨＥＲ３である。さらに他の実施形態では、切断型受容体はｃ−Ｍｅｔの切断型であり、完全長受容体はｃ−Ｍｅｔである。さらなる実施形態では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、そこで、ビオチンはビーズへ結合され、ビオチンは抗体へ結合される（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的な場合）。
【０２０３】
[0210]その開示が全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号の図１４Ａは、対象の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体でコーティングされたビーズは完全長受容体（例えば、ＨＥＲ２）に結合するが、切断型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）に結合せず、アッセイからあらゆる完全長受容体を除去することを示す。ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号の図１４Ｂは、切断型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）が捕捉抗体に結合すると、次に完全長受容体（例えば、ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に特異的な検出抗体によって検出することができることを示す。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）へ直接にコンジュゲートすることができる。検出するシグナルを生成するために、次にチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を実施することができる。切断型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）の発現レベル又は活性化状態は、例えば、その全体の濃度又はそのリン酸化状態、ユビキチン化状態及び／若しくは複合体生成状態を決定するために調べることができる。
【０２０４】
[0211]別の実施形態では、本発明は、（ａ）固体支持体に拘束される１つ又は複数の捕捉抗体の希釈系、及び（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化状態非依存性抗体及び／又は活性化状態依存性抗体）を含む上記の２抗体アッセイを実施するためのキットを提供する。場合によっては、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現レベル及び／又は活性化状態を検出するためにキットを用いる方法の指示書をさらに含むことができる。キットは、本発明の特定の方法の実施に関して上で記載される追加の試薬、例えばシグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、洗浄緩衝液などのいずれかを含むこともできる。
【０２０５】
ＶＩＩ．近接二重検出アッセイ
[0212]一部の実施形態では、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物で対象の１つ又は複数の分析物（例えば、ＨＥＲ３及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の１つ又は複数の構成成分などの１つ又は複数のシグナル伝達分子）の発現及び／又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重ハイスループットの近接（すなわち、３抗体）アッセイである。非限定例として、近接アッセイで用いられる３つの抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、（２）分析物の活性化形に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存性抗体）、及び（３）分析物の総量を検出する検出抗体（すなわち、活性化状態非依存性抗体）を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば分析物のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態を検出することが可能であるが、活性化状態非依存性抗体は、分析物の総量（すなわち、活性化と非活性化の両方の形）を検出することが可能である。本明細書に記載される近接アッセイは、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）又は共同近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）としても知られる。
【０２０６】
[0213]特定の一実施形態では、対象の分析物の活性化のレベル又は状態を検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の１つ又は複数の希釈系とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成するステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の活性化状態非依存性抗体及び１つ又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体と一緒にインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するステップであって、
活性化状態非依存性抗体は促進する部分（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）で標識され、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進する部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながり、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップとを含む。
【０２０７】
[0214]別の特定の実施形態では、切断型受容体である対象の分析物の活性化のレベル又は状態を検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズと一緒にインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体と一緒にインキュベートして複数の捕捉された切断型受容体を形成するステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉された切断型受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の活性化状態非依存性抗体及び１つ又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体と一緒にインキュベートして複数の検出可能な捕捉された切断型受容体を形成するステップであって、
活性化状態非依存性抗体は促進する部分で標識され、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進する部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながり、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉された切断型受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップとを含む。
【０２０８】
[0215]特定の実施形態では、切断型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。他の実施形態では、切断型受容体はＨＥＲ３の切断型であり、完全長受容体はＨＥＲ３である。さらに他の実施形態では、切断型受容体はｃ−Ｍｅｔの切断型であり、完全長受容体はｃ−Ｍｅｔである。さらなる実施形態では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、そこで、ビオチンはビーズへ結合され、ビオチンは抗体へ結合される（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的な場合）。
【０２０９】
[0216]代替の実施形態では、活性化状態依存性抗体は促進する部分で標識されてもよく、活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されてもよい。
【０２１０】
[0217]別の非限定例として、近接アッセイで用いられる３つの抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、（２）分析物の総量を検出する第１の検出抗体（すなわち、第１の活性化状態非依存性抗体）、及び（３）分析物の総量を検出する第２の検出抗体（すなわち、第２の活性化状態非依存性抗体）を含むことができる。好ましい実施形態では、第１及び第２の活性化状態非依存性抗体は、分析物上の異なる（例えば、別個の）エピトープを認識する。
【０２１１】
[0218]特定の一実施形態では、対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の１つ又は複数の希釈系とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成するステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体と一緒にインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するステップであって、
第１の活性化状態非依存性抗体は促進する部分で標識され、第２の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進する部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながり、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップとを含む。
【０２１２】
[0219]別の特定の実施形態では、切断型受容体である対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズと一緒にインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体と一緒にインキュベートして複数の捕捉された切断型受容体を形成するステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉された切断型受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体と一緒にインキュベートして複数の検出可能な捕捉された切断型受容体を形成するステップであって、
第１の活性化状態非依存性抗体は促進する部分で標識され、第２の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進する部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながり、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉された切断型受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップとを含む。
【０２１３】
[0220]特定の実施形態では、切断型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。他の実施形態では、切断型受容体はＨＥＲ３の切断型であり、完全長受容体はＨＥＲ３である。さらに他の実施形態では、切断型受容体はｃ−Ｍｅｔの切断型であり、完全長受容体はｃ−Ｍｅｔである。さらなる実施形態では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、そこで、ビオチンはビーズへ結合され、ビオチンは抗体へ結合される（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的な場合）。
【０２１４】
[0221]代替の実施形態では、第１の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されてもよく、第２の活性化状態非依存性抗体は促進する部分で標識されてもよい。
【０２１５】
[0222]本明細書に記載される近接アッセイは、一般的に、異なるアドレス可能な場所の固体支持体の表面に結合している１つ又は複数の異なる捕捉抗体を広範囲の捕捉抗体濃度で含む抗体ベースのアレイである。本発明で用いるのに適する固体支持体の例は上に記載される。
【０２１６】
[0223]捕捉抗体、活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体は、好ましくは、分析物との結合（すなわち、全ての抗体はそれらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）に関してそれらの間の競合を最小にするように選択される。
【０２１７】
[0224]一部の実施形態では、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、或いは分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は、検出可能な部分をさらに含む。このような場合には、検出可能な部分の量は、細胞抽出物中の分析物の１つ又は複数の量と相関する。検出可能な部分の例には、それらに限定されないが、蛍光性標識、化学反応性標識、酵素標識、放射性標識などが含まれる。好ましくは、検出可能な部分は、アレクサフルオール（登録商標）色素（例えば、アレクサフルオール（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などの蛍光団である。検出可能な部分は、当分野で周知である方法を用いて活性化状態非依存性抗体に直接又は間接に結合することができる。
【０２１８】
[0225]特定の例では、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態依存性抗体、或いは分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は、促進する部分で直接に標識される。促進する部分は、当分野で周知である方法を用いて活性化状態非依存性抗体に結合することができる。本発明で用いるのに適する促進する部分には、促進する部分に近接する（すなわち、空間的に近いか近接する）別の分子につながり（すなわち、向けられる）、それと反応する（すなわち、結合するか、結合されるか、複合体を形成する）酸化剤を生成することが可能ないかなる分子も含まれる。促進する部分の例には、それらに限定されないが、酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、又は電子受容体として分子酸素（Ｏ２）を含む酸化／還元反応を触媒する他の任意の酵素、及び光増感剤、例えばメチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアラート色素、フタロシアニンなどが含まれる。酸化剤の非限定例には、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応で酸素原子を移すか電子を得る他の任意の化合物が含まれる。好ましくは、適する基質（例えば、グルコース、光など）の存在下で、促進する部分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）は、酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、単一の酸素など）を生成し、酸化剤は、２つの部分が互いに近接する場合にシグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基によって保護されるハプテン、酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活性化される酵素など）につながり、それと反応する。
【０２１９】
[0226]他の特定の例では、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、或いは分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーと促進する部分にコンジュゲートされる相補的なオリゴヌクレオチドリンカーの間のハイブリダイゼーションを通して、促進する部分で間接に標識される。オリゴヌクレオチドリンカーは、当分野で周知である方法を用いて促進する部分又は活性化状態非依存性抗体に結合することができる。一部の実施形態では、促進する部分にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーと１００％の相補性を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションの結果、少なくとも１、２、３、４、５、６個、又はそれ以上のミスマッチ領域を含む。当業者は、異なる分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体は、同じオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーにコンジュゲートすることができることを理解するであろう。
【０２２０】
[0227]促進する部分又は活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーの長さは、変更することができる。一般に、リンカー配列は、長さが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドであってよい。一般的に、結合のためにランダムな核酸配列が生成される。非限定例として、オリゴヌクレオチドリンカーのライブラリーは、スペーサードメイン、サインドメイン及びコンジュゲーションドメインの３つの異なる連続したドメインを有するように設計することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドリンカーは、それらがコンジュゲートされる促進する部分又は活性化状態非依存性抗体の機能を破壊することのない、効率的な結合のために設計される。
【０２２１】
[0228]オリゴヌクレオチドリンカー配列は、様々なアッセイ条件の下でいかなる２次構造の形成も阻止又は最小にするように設計することができる。アッセイ手順全体でそれらの関与を可能にするために、融点は、一般的にリンカーの中の各セグメントについて慎重にモニターされる。一般に、リンカー配列のセグメントの融点の範囲は、１〜１０℃の間にある。各リンカーの中の３つの異なるドメインの各々を分析するために、規定のイオン濃度の下で融点、２次構造及びヘアピン構造を決定するためのコンピュータアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ６．０）を用いることができる。合わせた配列全体を、それらの構造特徴づけ及び他のコンジュゲートオリゴヌクレオチドリンカー配列とのそれらの比較のために、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でそれらが相補的なオリゴヌクレオチドリンカーとハイブリダイズするかどうかについて分析することもできる。
【０２２２】
[0229]オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域は、オリゴヌクレオチド架橋部位からのコンジュゲーションドメインの十分な分離を提供する。コンジュゲーションドメインは、相補的なオリゴヌクレオチドリンカー配列で標識された分子を、核酸ハイブリダイゼーションを通してコンジュゲーションドメインに連結する働きをする。核酸媒介ハイブリダイゼーションは、抗体−分析物（すなわち、抗原）複合体の形成の前又は後に実施することができ、より柔軟なアッセイフォーマットを提供する。多くの直接的な抗体コンジュゲーション方法と異なって、比較的小さなオリゴヌクレオチドを抗体又は他の分子に連結することは、抗体のそれらの標的分析物との特異的親和性に、又はコンジュゲート分子の機能に最小限の影響を及ぼす。
【０２２３】
[0230]一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカーのサイン配列ドメインは、複合多重化タンパク質アッセイで用いることができる。複数の抗体を、異なるサイン配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーにコンジュゲートすることができる。多重イムノアッセイでは、抗体とそれらの抗原の間の交差反応性を多重アッセイフォーマットで検出するために、適当なプローブで標識されたリポーターオリゴヌクレオチド配列を用いることができる。
【０２２４】
[0231]オリゴヌクレオチドリンカーは、いくつかの異なる方法を用いて抗体又は他の分子にコンジュゲートすることができる。例えば、オリゴヌクレオチドリンカーは、５’又は３’末端のチオール基で合成することができる。チオール基は、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）を用いて脱保護することができ、生じたリンカーは脱塩スピンカラムを用いることによって精製することができる。生じた脱保護されたオリゴヌクレオチドリンカーは、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能基架橋リンカーを用いて抗体又は他の型のタンパク質の一次アミンにコンジュゲートすることができる。或いは、オリゴヌクレオチドの上の５’リン酸基は、水溶性カルボジイミドＥＤＣで処理してリン酸エステルを形成し、その後アミン含有分子に結合することができる。特定の例では、３’リボース残基上のジオールは、アルデヒド基に酸化し、その後還元アミノ化を用いて抗体又は他の型のタンパク質のアミン基にコンジュゲートすることができる。特定の他の例では、オリゴヌクレオチドリンカーは、３’又は５’末端のビオチン改変で合成して、ストレプトアビジン標識分子にコンジュゲートすることができる。
【０２２５】
[0232]オリゴヌクレオチドリンカーは、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９巻：７８４５頁（１９８７年）、Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８巻：５４３３頁（１９９０年）、Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻：２６７７〜２６８４頁（１９９５年）、及びＷｉｎｃｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、７４巻：５９頁（１９９７年）に記載されるものなどの、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかを用いて合成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドの合成では、一般的な核酸保護基及び結合基、例えば５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホラミダイトを利用する。オリゴヌクレオチド合成に適する試薬、核酸脱保護の方法、及び核酸精製方法は当業者に公知である。
【０２２６】
[0233]特定の例では、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態依存性抗体、或いは分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第２の活性化状態非依存性抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接に標識される。シグナル増幅対メンバーは、当分野で周知である方法を用いて活性化レベルを検出するために活性化状態依存性抗体に、又は発現レベルを検出するために第２の活性化状態非依存性抗体に結合することができる。特定の他の例では、活性化状態依存性抗体又は第２の活性化状態非依存性抗体は、活性化状態依存性抗体又は第２の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされる結合対の第１のメンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされる結合対の第２のメンバーの間の結合を通して、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接に標識される。結合対メンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）は、当分野で周知である方法を用いてシグナル増幅対メンバーに、又は活性化状態依存性抗体若しくは第２の活性化状態非依存性抗体に結合することができる。シグナル増幅対のメンバーの例には、それらに限定されないが、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、デヨージナーゼなどが含まれる。シグナル増幅対メンバーの他の例には、保護基によって保護されるハプテン、及び酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活性化される酵素が含まれる。
【０２２７】
[0234]近接性チャネリングの１つの例では、促進する部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯをグルコースなどの基質と接触させると、それは酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））を生成する。ＨＲＰがＧＯに近接するチャネリングの中にある場合、ＧＯによって生成されるＨ２Ｏ２はＨＲＰとつながって複合体を形成し、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成するが、それは、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、化学発光基質、例えばルミノール若しくはイソルミノール、又は蛍光原基質、例えばチラミド（例えば、ビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、又は４−ヒドロキシフェニル酢酸）の存在下で、増幅されたシグナルを生成する。ＧＯ及びＨＲＰを近接アッセイで用いる方法は、例えば、Ｌａｎｇｒｙら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ第ＵＣＲＬ−ＩＤ−１３６７９７号（１９９９年）に記載される。ビオチン−チラミドがシグナル増幅対の第２のメンバーとして用いられる場合は、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体はチラミドを酸化して、近くの求核残基と共有結合する反応性チラミドラジカルを生成する。活性化チラミドは直接に検出されるか、シグナル検出試薬、例えばストレプトアビジン標識蛍光団又はストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと発色性試薬の組合せの添加の結果検出される。本発明で使用するのに適する蛍光団の例には、それらに限定されないが、アレクサフルオール（登録商標）色素（例えば、アレクサフルオール（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが含まれる。ストレプトアビジン標識は、当分野で周知である方法を用いて蛍光団又はペルオキシダーゼに直接又は間接に結合することができる。本発明で使用するのに適する発色性試薬の非限定例には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）及び／又はポルフィリノーゲンが含まれる。
【０２２８】
[0235]一部の実施形態では、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）及び検出抗体（例えば、活性化状態非依存性抗体）は、例えば、その開示は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号の実施例１６〜１７に記載されるように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００又は７５０ｋＤａ）の分子量を一般的に有する。他の特定の実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び検出抗体（例えば、活性化状態依存性抗体）は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｋＤａ）の分子量を一般的に有する。
【０２２９】
[0236]近接チャネリングの別の例では、促進する部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは、特異的な結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）へのそのハプテンの結合を阻止する保護基で保護されている複数のハプテンで標識される大きな分子である。例えば、シグナル増幅対のメンバーは、保護されたビオチン、クマリン及び／又はフルオレセイン分子で標識されるデキストラン分子であってよい。適する保護基には、それらに限定されないが、フェノキシ、アナリノ、オレフィン、チオエーテル及びセレノエーテル保護基が含まれる。本発明の近接アッセイで使用するのに適する追加の光増感剤及び保護されたハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号に記載される。光増感剤が光によって励起されるとき、それは酸化剤（すなわち、一重項酸素）を生成する。ハプテン分子が光増感剤に近接したチャネリングの中にある場合は、光増感剤によって生成される一重項酸素はハプテンの保護基の上のチオエーテルにつながってそれと反応して、カルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を生じ、ハプテンから保護基を放出する。保護されていないハプテンは、次にシグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを生成することができる特異的な結合パートナー）に特異的に結合するのに利用可能である。例えば、ハプテンがビオチンである場合は、特異的な結合パートナーは酵素標識ストレプトアビジンであってよい。例示的な酵素には、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどが含まれる。未結合の試薬を除去するために洗浄した後、検出可能なシグナルは、酵素の検出可能な（例えば、蛍光性、化学発光性、発色性など）基質を加えることによって生成することができ、当技術分野で公知の適する方法及び装置を用いて検出することができる。或いは、検出可能なシグナルは、チラミドシグナル増幅を用いて増幅することができ、活性化チラミドは、前記のように直接に検出するかシグナル検出試薬の添加により検出することができる。
【０２３０】
[0237]近接性チャネリングのさらに別の例では、促進する部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−阻害剤複合体である。酵素及び阻害剤（例えば、ホスホン酸標識デキストラン）は、切断可能なリンカー（例えば、チオエーテル）によって一緒に連結される。光増感剤が光によって励起されるとき、それは酸化剤（すなわち、一重項酸素）を生成する。酵素−阻害剤複合体が光増感剤に近接するチャネリングの中にある場合は、光増感剤によって生成される一重項酸素は切断可能なリンカーにつながってそれと反応し、酵素から阻害剤を放出し、それによって酵素を活性化する。検出可能なシグナルを生成するために酵素基質が添加され、或いは、増幅されたシグナルを生成するために増幅試薬が添加される。
【０２３１】
[0238]近接性チャネリングのさらなる例では、促進する部分はＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは前記のように保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体であり、保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２の添加は反応性フェニレンジイミンを生成し、それは、保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体につながり、ｐ−アルコキシフェノール保護基と反応して露出したハプテン又は反応性酵素を生じる。前記のように増幅されたシグナルが生成され、検出される（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号及び第５，４４５，９４４号を参照）。
【０２３２】
[0239]本明細書に記載される近接アッセイを実施するための例示的プロトコルは、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１０８６３７号の実施例４で提供されているが、その開示は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
[0240]別の実施形態では、本発明は、（ａ）固体支持体に拘束される１つ又は複数の捕捉抗体の希釈系、及び（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体と活性化状態依存性抗体の組合せ及び／又は発現レベルを検出するための第１及び第２の活性化状態非依存性抗体の組合せ）を含む上記の近接アッセイを実施するためのキットを提供する。場合によっては、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を検出するためにキットを用いる方法の指示書をさらに含むことができる。キットは、本発明の特定の方法の実施に関して上で記載される追加の試薬、例えばシグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、促進する部分のための基質、洗浄緩衝液などのいずれかを含むこともできる。
【０２３４】
ＶＩＩＩ．抗体作製
[0241]本発明に従う、非小細胞肺がん腫瘍細胞などの細胞でシグナル伝達分子（例えば、ＨＥＲ３及び／又はｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路構成成分）の発現及び／又は活性化レベルを分析するための、まだ市販されていない抗体の生成及び選択は、いくつかの方法で達成することができる。例えば、１つの方法は当技術分野で公知のタンパク質発現及び精製方法を用いて対象のポリペプチド（すなわち、抗原）を発現及び／又は精製することであり、別の方法は、当技術分野で公知の固相ペプチド合成方法を用いて対象のポリペプチドを合成することである。例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．Ｄｅｕｔｃｈｅｒ編、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２巻（１９９０年）、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇｒｅｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ編、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２８９巻（１９９７年）、Ｋｉｓｏら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３８巻：１１９２〜９９頁（１９９０年）、Ｍｏｓｔａｆａｖｉら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、１巻：２５５〜６０頁（１９９５年）、及びＦｕｊｉｗａｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４４巻：１３２６〜３１頁（１９９６年）を参照。次に、精製又は合成されたポリペプチドは、例えばマウス又はウサギに注射して、ポリクローナル又はモノクローナルの抗体を生成することができる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年）に記載されているように、抗体作製のために多くの手法が利用できることを当業者は認めるであろう。当業者は、抗体を模倣する（例えば、その機能的結合領域を保持する）結合断片又はＦａｂ断片は、遺伝情報から様々な手法によって調製することもできることも理解する。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５年）；及びＨｕｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻：３９１４〜３９２０頁（１９９２年）を参照。
【０２３５】
[0242]さらに、選択された標的抗原への結合についてポリペプチドのライブラリーを生成してスクリーニングするためのファージディスプレイ技術の使用を多数の刊行物が報告している（例えば、Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：６３７８〜６３８２頁（１９９０年）、Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４〜４０６頁（１９９０年）、Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６〜３８８頁（１９９０年）、及びＬａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号を参照）。ファージディスプレイ法の基礎概念は、ファージＤＮＡによってコードされるポリペプチドと標的抗原の間の物理的関係の確立である。この物理的関係はファージ粒子によって提供され、それは、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入するカプシドの一部としてポリペプチドを提示する。ポリペプチドとそれらの遺伝物質の間の物理的関係の確立は、異なるポリペプチドを有している極めて多数のファージの同時マススクリーニングを可能にする。標的抗原への親和性を有するポリペプチドを提示するファージは、標的抗原に結合し、これらのファージは標的抗原への親和性スクリーニングによって濃縮される。これらのファージから提示されるポリペプチドの素生は、それらのそれぞれのゲノムから決定することができる。これらの方法を用いて、所望の標的抗原に結合親和性を有すると同定されるポリペプチドは、次に従来の手段によって大量に合成することができる（例えば、米国特許第６，０５７，０９８号を参照）。
【０２３６】
[0243]これらの方法によって生成される抗体は、次に、精製された対象のポリペプチド抗原との親和性及び特異性について先ずスクリーニングし、必要な場合は、結合から排除することが望ましい他のポリペプチド抗原との抗体の親和性及び特異性とその結果を比較することによって選択することができる。スクリーニング手法は、マイクロタイタープレートの別々のウェルでの精製されたポリペプチド抗原の固定化を含むことができる。次に、潜在的抗体又は抗体群を含有する溶液をそれぞれのマイクロタイターウェルに入れ、約３０分から２時間までインキュベートする。マイクロタイターウェルを次に洗浄し、標識二次抗体（例えば、作製した抗体がマウス抗体である場合はアルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートした抗マウス抗体）をウェルに追加して約３０分の間インキュベートし、次に洗浄する。基質をウェルに追加し、固定化ポリペプチド抗原に対する抗体が存在する場合は呈色反応が現れる。
【０２３７】
[0244]このように同定される抗体は、次に親和性及び特異性についてさらに分析することができる。標的タンパク質のためのイムノアッセイの開発では、精製された標的タンパク質は、選択された抗体を用いてイムノアッセイの感度及び特異性を判断するための標準としての働きをする。様々な抗体の結合親和性は異なる可能性があり、例えば、特定の抗体組合せは立体配置的にお互いに干渉することがあるので、抗体のアッセイ性能はその抗体の絶対的親和性及び特異性よりも重要な測定手段である可能性がある。
【０２３８】
[0245]当業者は、抗体又は結合断片の生成で、並びに対象の様々なポリペプチドの親和性及び特異性についてのスクリーニング及び選択で多くの方法をとることができるが、これらの方法は本発明の範囲を変更しないことを認識するであろう。
【０２３９】
Ａ．ポリクローナル抗体
[0246]ポリクローナル抗体は、好ましくは対象のポリペプチド及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって動物で作製される。二官能性であるか誘導体化する作用剤を用いて、対象のポリペプチドを、免疫化する種で免疫原性であるタンパク質担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン又はダイズのトリプシンインヒビターにコンジュゲートすることが有益であるかもしれない。二官能性であるか誘導体化する作用剤の非限定例には、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通してのコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を通してのコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２及びＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲが含まれ、そこでＲ及びＲ１は異なるアルキル基である。
【０２４０】
[0247]例えば、抗原又はコンジュゲートの１００μｇ（ウサギの場合）又は５μｇ（マウスの場合）を３容のフロインド完全アジュバントと合わせ、溶液を複数の部位に皮内注射することによって、対象のポリペプチド又は免疫原性コンジュゲート若しくはその誘導体に対して動物を免疫する。１カ月後に、複数部位での皮下注射によってフロインド不完全アジュバント中のポリペプチド又はコンジュゲートの元の量の約１／５〜１／１０で動物をブーストする。７〜１４日後に、動物を放血させ、抗体価について血清を分析する。一般的に、動物は力価がプラトーに達するまでブーストされる。好ましくは、動物は同じポリペプチドのコンジュゲートでブーストされるが、異なる免疫原性タンパク質への及び／又は異なる架橋試薬を通してのコンジュゲーションを用いることができる。コンジュゲートは、組換え体細胞培養で融合タンパク質として作製することもできる。特定の例では、免疫応答を増強するためにミョウバンなどの凝集剤を用いることができる。
【０２４１】
Ｂ．モノクローナル抗体
[0248]モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から一般に得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在するかもしれない可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物でない抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）に記載されるハイブリドーマ法を用いて、又は当技術分野で公知である任意の組換え体ＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製することができる。
【０２４２】
[0249]ハイブリドーマ法では、免疫のために用いられる対象のポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成するか生成することが可能なリンパ球を導き出すために、上記のようにマウス又は他の適当な宿主動物（例えば、ハムスター）が免疫される。或いは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫される。免疫されたリンパ球は、次にポリエチレングリコールなどの適する融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９〜１０３頁（１９８６年）を参照）。このように調製されるハイブリドーマ細胞は、未融合の親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を抑制する１つ又は複数の物質を好ましくは含む、適する培地に播種され、増殖させられる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスフォリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ）を欠く場合は、ハイブリドーマ細胞のための培地はヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを一般的に含み（ＨＡＴ培地）、それはＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
【０２４３】
[0250]好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定したハイレベルの生成を支え、及び／又はＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのそのような好ましい骨髄腫細胞株の例には、それらに限定されないが、マウス骨髄腫株、例えばＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、ＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（アメリカ基準株保存機構、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能）、並びにヒト骨髄腫又はマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が含まれる（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）、及びＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、５１〜６３頁（１９８７年）を参照）。
【０２４４】
[0251]ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、対象のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の生成について分析することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のスキャチャード解析を用いて決定することができる。
【０２４５】
[0252]所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞の同定の後、クローンは、限界希釈法によってサブクローニングして、標準方法によって増殖させることができる（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９〜１０３頁（１９８６年）を参照）。この目的のための適する培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物で腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の抗体精製手法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーによって、培地、腹水液又は血清から分離することができる。
【０２４６】
[0253]モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離し、配列決定をすることができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源の役割をする。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、それは、大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は他の抗体を生成しない骨髄腫細胞などの宿主細胞に次にトランスフェクトされて、組換え体宿主細胞でのモノクローナル抗体の合成を誘導する。例えば、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６〜２６２頁（１９９３年）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．、１３０巻：１５１〜１８８頁（１９９２年）を参照。ＤＮＡは、例えば、相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１頁（１９８４年）を参照）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て若しくは一部を共有結合することによって改変することもできる。
【０２４７】
[0254]さらなる実施形態では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）、及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載される技術を用いて生成される抗体ファージライブラリーから単離することができる。鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭの範囲）ヒトモノクローナル抗体の生成は、Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載される。非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての組合せ感染及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換えの使用は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載される。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の生成のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替手段である。
【０２４８】
Ｃ．ヒト化抗体
[0255]ヒト以外の抗体をヒト化する方法は、当技術分野で公知である。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト以外の供与源からそれに導入される１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、それらは「インポート」可変ドメインから一般的にとられる。ヒト化は、ヒト以外の抗体の超可変領域配列をヒト抗体の対応配列に置換することによって事実上実施することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年）を参照。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に完全未満のヒト可変ドメインがヒト以外の種からの対応配列によって置換されているキメラ抗体である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。実際には、一般的に、ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基及びおそらく一部の枠組み領域（ＦＲ）残基が齧歯動物の抗体の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０２４９】
[0256]本明細書に記載されるヒト化抗体の作製で用いられる軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性の低減のための重要な考慮事項である。いわゆる「最良適合」法により、齧歯動物の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次に、齧歯動物のそれに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトＦＲとして認められる（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１頁（１９８７年）を参照）。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のＦＲを用いる。いくつかの異なるヒト化抗体のために、同じＦＲを用いることができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）及びＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年）を参照）。
【０２５０】
[0257]抗原への高い親和性及び他の好都合の生物学的特性を保持して抗体がヒト化されることも重要である。この目標を達成するために、ヒト化抗体は、親の及びヒト化配列の三次元モデルを用いることによる親の配列及び様々な概念上のヒト化生成物の分析過程によって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者によく知られている。選択される候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配置構造を図示し、提示する、コンピュータプログラムが利用できる。これらの提示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能での残基のありそうな役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能にする。この方法で、所望の抗体特性、例えば標的抗原（複数可）への増加した親和性が達成されるように、レシピエント及びインポート配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に及ぼす影響に直接及び特異的に関与する。
【０２５１】
[0258]ヒト化抗体の様々な形が、本発明によって企図される。例えば、ヒト化抗体は、Ｆａｂ断片などの抗体断片であってよい。或いは、ヒト化抗体は完全な抗体、例えば完全なＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体であってよい。
【０２５２】
Ｄ．ヒト抗体
[0259]ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体を生成することができる。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリンの生成の不在下で、免疫の後にヒト抗体の完全なレパートリーを生成することが可能であるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生成することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスでの抗体重鎖結合域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内在性抗体産生の完全な阻止をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系突然変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原刺激の後にヒト抗体の生成をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．、７巻：３３頁（１９９３年）並びに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号及び第５，５４５，８０７号を参照。
【０２５３】
[0260]或いは、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を生成するために、ファージディスプレイ技術（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５３頁（１９９０年）を参照）を用いることができる。この技術により、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要又は副次的なコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択にもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、例えばＪｏｈｎｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３巻：５６４〜５７１頁（１９９３年）に記載される様々なフォーマットで実施することができる。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイのために用いることができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）を参照。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体は、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）、並びに米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号に記載される技術に事実上従って単離することができる。
【０２５４】
[0261]特定の例では、ヒト抗体は、例えば米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって生成することができる。
【０２５５】
Ｅ．抗体断片
[0262]抗体断片の生成のために様々な技術が開発されている。伝統的に、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解を通して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）、及びＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照）。しかし、現在、これらの断片は、組換え体宿主細胞を用いて直接に生成することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌細胞から直接に回収し、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年）を参照）。別の方法により、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え体宿主細胞培養から直接に単離することができる。抗体断片を生成するための他の技術は、当業者に明らかになる。他の実施形態では、最良の抗体は単一鎖のＦｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照。抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載される線状抗体であってもよい。そのような線状抗体断片は、単一特異的又は二重特異的であってよい。
【０２５６】
Ｆ．二重特異的抗体
[0263]二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異的抗体は、同じ対象のポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合することができる。他の二重特異的抗体は、対象のポリペプチドの結合部位を１つ又は複数の追加の抗原のための結合部位（複数可）と組み合わせることができる。二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製することができる。
【０２５７】
[0264]二重特異的抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。完全長二重特異的抗体の伝統的な生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、そこで２つの鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁（１９８３年）を参照）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その中で１つだけが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィーによって実施される。類似した手法は、ＰＣＴ公開国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。
【０２５８】
[0265]異なる方法により、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインに対してである。融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適する宿主生物体に同時トランスフェクトされる。これは、構築で用いられる３つのポリペプチド鎖の不等な比が最適な収量を提供するときの実施形態で３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整することにおいて、大きな柔軟性を可能にする。しかし、同等の比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、又は比が特に重要でない場合は、２つ又は全３つのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２５９】
[0266]この方法の好ましい実施形態では、二重特異的抗体は、一方の腕に第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、他方の腕にハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）で構成される。二重特異的分子の片方の半分だけへの免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を可能にするので、この不斉構造は望ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二重特異的化合物の分離を促進する。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９４／０４６９０号及びＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照。
【０２６０】
[0267]米国特許第５，７３１，１６８号に記載される別の方法により、一対の抗体分子の間のインターフェースは、組換え体細胞培養から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大にするように操作することができる。好ましいインターフェースは、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子のインターフェースの１つ又は複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニン又はトレオニン）と交換することによって、大きな側鎖（複数可）と同一であるか類似したサイズの代償の「空洞」が、第２の抗体分子のインターフェースに形成される。これは、ホモダイマーなどの他の望ましくない最終産物よりもヘテロダイマーの収量を増加させる機構を提供する。
【０２６１】
[0268]二重特異的抗体には、架橋された又は「ヘテロコンジュゲート」の抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の１つはアビジンに、他はビオチンに結合することができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋方法を用いて作製することができる。適する架橋剤及び技術は当分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【０２６２】
[0269]抗体断片から二重特異的抗体を生成するのに適する技術も、当技術分野で公知である。例えば、化学結合を用いて二重特異的抗体を調製することができる。特定の例では、二重特異的抗体は、完全な抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２断片を生成する手法によって生成することができる（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照）。近接のジチオールを安定させて、分子間ジスルフィド形成を阻止するために、これらの断片はジチオール複合体形成剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。生成されるＦａｂ’断片は、次にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、次にメルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。
【０２６３】
[0270]一部の実施形態では、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接に回収し、化学的に結合して二重特異的抗体を形成することができる。例えば、Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７〜２２５頁（１９９２年）に記載される方法によって、完全ヒト化二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子を生成することができる。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別々に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導化学結合を受けて二重特異的抗体を形成した。
【０２６４】
[0271]二重特異的抗体断片を組換え細胞培養から直接に作製して単離する様々な技術も、記載されている。例えば、ロイシンジッパーを用いて二重特異的抗体が生成されている。例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）を参照。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次に再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの生成のために利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）に記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異的抗体断片を作製するための代替機構を提供している。断片は、同じ鎖の上の２つのドメインの間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続されている、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対を形成するように強制され、それによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いて二重特異的抗体断片を作製する別の戦略は、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）に記載される。
【０２６５】
[0272]２価を超える抗体も、企図される。例えば、三重特異的抗体を調製することができる。例えば、Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年）を参照。
【０２６６】
Ｇ．抗体精製
[0273]組換え技術を用いる場合、抗体は、単離された宿主細胞の中、宿主細胞のペリプラズム間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐａｃｅ）に生成することができるか、宿主細胞から培地に直接に分泌させることができる。抗体が細胞内に生成される場合、粒状細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって先ず除去される。Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈ．、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年）は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離する手法を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍される。細胞片は、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて一般に濃縮される。タンパク質分解を抑制するために上記ステップのいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれてもよく、偶発汚染菌の増殖を阻止するために抗生物質が含まれてもよい。
【０２６７】
[0274]細胞から調製される抗体組成物は、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプによって決まる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために用いることができる（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁（１９８３年）を参照）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプのために、及びヒトγ３のために推奨される（例えば、Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５巻：１５６７〜１５７５頁（１９８６年）を参照）。親和性リガンドが結合するマトリックスは最も多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスを利用できる。制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成することができるものより速い流速及びより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、ベーカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有益である。回収する抗体に従い、タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムでの画分、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫安沈殿も利用できる。
【０２６８】
[0275]任意の予備精製ステップ（複数可）の後、対象の抗体及び汚染物を含む混合物は、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を用いる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることができる。
【０２６９】
[0276]当業者は、抗体に類似した機能を有する任意の結合分子、例えば試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的である結合分子又は結合パートナーも、本発明の方法及び組成物で用いることができることを理解する。適する抗体様分子の例には、それらに限定されないが、ドメイン抗体、ユニボディ、ナノボディ、サメ抗原反応性タンパク質、アビマー、アドネクチン、アンチカーム、親和性リガンド、フィロマー、アプタマー、アフィボディ、トリネクチンなどが含まれる。
【０２７０】
ＩＸ．投与方法
[0277]本発明の方法により、本明細書に記載される抗がん剤は、当技術分野で公知である任意の都合のよい手段によって対象に投与される。本発明の方法は、対象で腫瘍、例えば非小細胞肺がん腫瘍の処置のために適する抗がん剤又は抗がん剤の組合せを選択するために用いることができる。本発明の方法は、対象で抗がん剤又は抗がん剤の組合せによる処置への腫瘍、例えば非小細胞肺がん腫瘍の応答を確認するために用いることもできる。さらに、本発明の方法は、抗がん剤又は抗がん剤の組合せによる処置への、腫瘍、例えば非小細胞肺がん腫瘍を有する対象の応答を予測するために用いることができる。本発明の方法は、対象で腫瘍、例えば非小細胞肺がん腫瘍の状態をモニターするために、又は腫瘍を有する患者が抗がん剤若しくは抗がん剤の組合せによる処置にどのように応答しているかをモニターするために用いることもできる。当業者は、本明細書に記載される抗がん剤は、単独で、又は従来の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法及び／若しくは外科手術と組み合わせた治療方法の一部として投与することができることを理解する。
【０２７１】
[0278]特定の実施形態では、抗がん剤は、抗シグナル伝達剤（すなわち、細胞増殖抑制剤）、例えばモノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤、増殖抑制剤、化学療法剤（すなわち、細胞毒性薬）、ホルモン治療薬、放射線治療剤、ワクチン、及び／又はがん性細胞などの異常な細胞の無制御増殖を低減又は抑止する能力を有する他の任意の化合物を含む。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの化学療法剤と一緒の、１つ又は複数の抗シグナル伝達剤、増殖抑制剤及び／又はホルモン治療薬で処置される。例示的なモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、増殖抑制剤、化学療法剤、ホルモン治療薬、放射線治療剤及びワクチンは上で記載される。
【０２７２】
[0279]一部の実施形態では、本明細書に記載される抗がん剤は、従来の免疫療法剤、例えば、それらに限定されないが免疫活性化剤（例えば、カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン２、アルファインターフェロンなど）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体−カリケアマイシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−シュードモナス外毒素コンジュゲートなど）及び放射線免疫治療（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ又は１３１Ｉにコンジュゲートした抗ＣＤ２０モノクローナル抗体など）と同時投与されてもよい。
【０２７３】
[0280]抗がん剤は必要に応じて適する医薬用賦形剤と一緒に投与されてもよく、容認された投与様式のいずれかで実施することができる。したがって、投与は、例えば経口、口内、舌下、歯肉、口蓋、静脈内、局所、皮下、経皮、経真皮、筋肉内、関節内、非経口、小動脈内、皮内、心室内、脳内、腹腔内、膀胱内、鞘内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣投与であるか、吸入によってもよい。「同時投与」は、抗がん剤が、第２の薬剤（例えば、別の抗がん剤、抗がん剤療法と関連する副作用を低減するのに有益な薬剤、放射線治療剤、ホルモン治療薬、免疫療法剤など）の投与と同時に、その直前に、又はその直後に投与されることを意味する。
【０２７４】
[0281]抗がん剤の治療的有効量は、繰り返し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８回又はそれ以上投与することができるか、又は用量を連続注入によって投与することができる。用量は、好ましくは正確な投薬量の単回投与に適する単位用量剤形での、固体、半固体、凍結乾燥粉末又は液体剤形、例えば錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐薬、停留浣腸剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアゾール剤、フォーム剤などの形をとることができる。
【０２７５】
[0282]本明細書で用いるように、用語「単位用量剤形」は、ヒト対象及び他の哺乳動物のための単一投薬量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の開始、耐容性及び／又は治療効果を生むように計算された抗がん剤の所定量を、適する医薬用賦形剤と一緒に含有する（例えば、アンプル）。さらに、より希釈された単位用量剤形を次に生成することができる、より濃縮された剤形を調製することができる。したがって、より濃縮された剤形は、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれ以上の量の抗がん剤より実質的に多くを含有する。
【０２７６】
[0283]そのような剤形の調製法は、当業者に公知である（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０年）を参照）。剤形は、従来の医薬用担体又は賦形剤を一般的に含み、他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織浸透増強剤、可溶化剤などをさらに含むことができる。適当な賦形剤は、当技術分野で周知である方法によって、特定の剤形及び投与経路に合うように調整することができる（例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照）。
【０２７７】
[0284]適する賦形剤の例には、それらに限定されないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカンタ、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリアクリル酸、例えばカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、例えばカーボポール９４１、カーボポール９８０、カーボポール９８１などが含まれる。剤形は、潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、例えばメチル−、エチル−及びプロピル−ヒドロキシベンゾエート（すなわち、パラベン）、ｐＨ調整剤、例えば無機及び有機の酸及び塩基、甘味料、並びに香味料剤をさらに含むことができる。剤形は、生分解性ポリマービーズ、デキストラン及びシクロデキストリン封入複合体を含むこともできる。
【０２７８】
[0285]経口投与については、治療的有効用量は、錠剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、スプレー剤、ロゼンジ剤、散剤及び徐放性製剤の形であってよい。経口投与に適する賦形剤には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０２７９】
[0286]一部の実施形態では、治療的有効用量は、丸剤、錠剤又はカプセル剤の形をとり、したがって、剤形は抗がん剤と一緒に以下のいずれかを含有することができる。希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなど、崩壊剤、例えばデンプン又はその誘導体、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムなど、並びに結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びその誘導体。抗がん剤は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体に置かれる坐薬に製剤化されてもよい。
【０２８０】
[0287]液体剤形は、抗がん剤及び任意選択で１つ又は複数の薬学的に許容されるアジュバントを担体に、例えば食塩水（例えば、０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに溶解するか分散させ、例えば経口、局所又は静脈内投与のための溶液又は懸濁液を形成することによって調製することができる。抗がん剤は、停留浣腸剤に製剤化することもできる。
【０２８１】
[0288]局所投与については、治療的有効用量は、乳剤、ローション剤、ゲル剤、フォーム剤、クリーム剤、ゼリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏剤及び経皮パッチ剤の形であってよい。吸入による投与については、抗がん剤はネブライザーを通して乾燥粉末として、又は液剤形で送達することができる。非経口投与については、治療的有効用量は無菌注射液及び無菌のパッケージされた散剤の形であってよい。好ましくは、注射液は、約４．５〜約７．５のｐＨで製剤化される。
【０２８２】
[0289]治療的有効用量は、凍結乾燥形で提供することもできる。そのような剤形は、投与前の再構成のための緩衝剤、例えば重炭酸塩を含むことができ、又は、緩衝剤は、例えば水による再構成のために凍結乾燥剤形で含まれてもよい。凍結乾燥剤形は、適する血管収縮剤、例えばエピネフリンをさらに含むことができる。凍結乾燥剤形は、再構成される剤形を対象に直ちに投与することができるように、任意選択で再構成のための緩衝剤と一緒にパッケージして注射器で提供することができる。
【０２８３】
[0290]特定の治療計画の効力を評価するために、対象を定期時間間隔でモニターしてもよい。例えば、特定のシグナル伝達分子の活性化状態は、本明細書に記載される抗がん剤の１つ又は複数による処置の治療効果に基づいて変わることができる。個人別に設定された方法で応答を評価し、特定の薬剤又は処置の効果を理解するために、対象をモニターすることができる。さらに、特定の抗がん剤又は抗がん剤の組合せに最初に応答する対象は、薬剤又は薬剤の組合せに不応性になることがあり、これらの対象が後天的な薬剤耐性を発達させたことを示す。これらの対象は彼らの現在の療法を中止し、本発明の方法に従って代替処置を処方することができる。
【０２８４】
[0291]特定の態様では、本明細書に記載される方法は、様々な集団で胃がん予後の見込み及び／又は再発を予測する遺伝子発現マーカーのパネルと一緒に用いることができる。これらの遺伝子パネルは、再発を経験する可能性が低く、したがって補助化学療法が有益である可能性が低い個体を同定するために役立つことがある。発現パネルは、無症候生存率及び全生存率の結果に負の影響を及ぼさずに補助化学療法を安全に避けることができる個体を同定するために用いることができる。適する系には、それらに限定されないが、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．からの２１遺伝子パネルであるオンコタイプ（Ｏｎｃｏｔｙｐｅ）ＤＸ（商標）、Ａｇｅｎｄｉａからの７０遺伝子パネルであるマンマプリント（ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ）（登録商標）及びＶｅｒｉｄｅｘからの７６遺伝子パネルが含まれる。
【０２８５】
[0292]さらに、他の特定の態様では、本明細書に記載される方法は、原発不明のがん（ＣＵＰ）の元の腫瘍を同定する遺伝子発現マーカーのパネルと一緒に用いることができる。これらの遺伝子パネルは、最初に肺がんと診断される患者に与えられるものと一貫した療法が有益となるであろう転移がん患者を同定するのに役立つことがある。適する系には、それらに限定されないが、Ａｖｉａｒａ  ＣａｎｃｅｒＴＹＰＥ  ＩＤアッセイ、３９個の腫瘍型の起源の原発部位を同定するために９２個の遺伝子を測定するＲＴ−ＰＣＲをベースとした発現アッセイ、及び、マイクロアレイ上の１６００個を超える遺伝子の発現を測定して、１５個の既知の組織型のそれらに対して腫瘍の遺伝子発現「サイン」を比較する、パスワーク（Ｐａｔｈｗｏｒｋ）（登録商標）始原組織検査が含まれる。
【０２８６】
Ｘ．実施例
[0293]以下の実施例は、請求項に記載される本発明を説明するために提供され、請求項に記載される本発明を限定するために提供されるのではない。
【０２８７】
[0294]２０１０年７月１５日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２の実施例１及び２は、全ての目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２８８】
実施例１．チラミドシグナル増幅を用いる単一検出マイクロアレイＥＬＩＳＡ。
[0295]本実施例は、全血（例えば、稀な循環細胞）又は腫瘍組織（例えば、微細針吸引液）などのような試料中のシグナル伝達分子の発現レベル又は活性化レベルを分析するのに適した、優れたダイナミックレンジを有する多重ハイスループット単一検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを説明する。
１）捕捉抗体を、２倍段階希釈溶液で、１６パッドＦＡＳＴスライド（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）上にプリントした。
２）一晩乾燥させた後に、Ｗｈａｔｍａｎ遮断緩衝液を用いてスライドを遮断した。
３）８０μｌの細胞溶解産物を、１０倍段階希釈溶液でそれぞれのパッド上に追加した。スライドを室温で２時間インキュベートした。
４）ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄した後に、８０μｌのビオチン標識検出抗体（例えば、リン酸化ｃ−Ｍｅｔを認識するモノクローナル抗体又は活性化状態に関係なくｃ−Ｍｅｔを認識するモノクローナル抗体）を室温で２時間インキュベートした。
５）６回洗浄した後に、ストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を追加し、１時間インキュベートして、ＳＡ−ＨＲＰをビオチン標識検出抗体に結合させた。
６）シグナル増幅のために、５μｇ／ｍｌのビオチン−チラミド８０μｌを追加し、１５分間反応させた。スライドは、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回、２０％ＤＭＳＯ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回、ＴＢＳで１回洗浄した。
７）８０μｌのＳＡ−アレクサ５５５を追加し、３０分間インキュベートした。その後、スライドを、２回洗浄し、５分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上でスキャンした。
【０２８９】
実施例２．チラミドシグナル増幅を用いる近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡ。
[0296]本実施例は、全血（例えば、稀な循環細胞）又は腫瘍組織（例えば、微細針吸引液）などのような試料中のシグナル伝達分子の発現レベル及び／又は活性化レベルを分析するのに適した、優れたダイナミックレンジを有する多重ハイスループット近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡ（例えば、共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ））を説明する。
１）捕捉抗体を、１ｍｇ／ｍｌ〜０．００４ｍｇ／ｍｌの範囲の段階希釈溶液で、１６パッドＦＡＳＴスライド（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．）上にプリントした。
２）一晩乾燥させた後に、Ｗｈａｔｍａｎ遮断緩衝液を用いてスライドを遮断した。
３）８０μｌのＡ４３１細胞溶解産物を、１０倍段階希釈溶液でそれぞれのパッド上に追加した。スライドを室温で２時間インキュベートした。
４）ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄した後に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／２％  ＢＳＡ／１％  ＦＢＳ中で希釈した近接アッセイ用の８０μｌの検出抗体をスライドに追加した。インキュベーションは、室温で２時間とした。
ａ）非限定的な例として、検出抗体は、次のものを含むことができる：（ｉ）グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）と直接コンジュゲートした、その活性化状態に関係なくｃ−Ｍｅｔを認識するモノクローナル抗体；及び（ｉｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と直接コンジュゲートした、リン酸化ｃ−Ｍｅｔを認識するモノクローナル抗体又はＨＲＰと直接コンジュゲートした、第１の検出抗体とは異なるエピトープで、その活性化状態に関係なくｃ−Ｍｅｔを認識するモノクローナル抗体。
ｂ）あるいは、検出ステップは、第２の検出抗体のビオチンコンジュゲートを利用することができる。これらの実施形態では、６回の洗浄の後に、１時間のストレプトアビジン−ＨＲＰとのインキュベーションのさらなる連続的なステップが、含まれる。
ｃ）あるいは、検出ステップは、第１の検出抗体のオリゴヌクレオチド媒介性のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）コンジュゲートを利用することができる。第２の検出抗体と直接コンジュゲートしたＨＲＰ又は第２の検出抗体にＨＲＰがビオチン−ストレプタビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（ＳＡ）によって連結されたコンジュゲートを使用することができる。
５）シグナル増幅のために、５μｇ／ｍｌのビオチン−チラミド８０μｌを追加し、１５分間反応させた。スライドは、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回、２０％ＤＭＳＯ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回、ＴＢＳで１回洗浄した。
６）８０μｌのＳＡ−アレクサ５５５を追加し、３０分間インキュベートした。その後、スライドを、２回洗浄し、５分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）上でスキャンした。
【０２９０】
実施例３．薬剤選択のための活性化プロファイルの生成。
[0297]本発明の方法及び組成物は、がん治療のための薬剤選択に適用することができる。典型的なプロトコールは、２つのプロファイル、参照活性化プロファイル及び試験活性化プロファイルの生成を必要とし、これらは、その後、特定の薬物治療計画の効能を決定するために比較される（全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１０年７月１５日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２の図２を参照）。
【０２９１】
参照活性化プロファイル
[0298]参照活性化プロファイルを得るために、腫瘍組織、血液、又は微細針吸引液（ＦＮＡ）試料を、抗がん剤治療に先立って、特定のタイプのがん（例えば、肺がん）を有する患者から得る。腫瘍細胞を、腫瘍、血液、又はＦＮＡ試料から単離する。単離した細胞は、１つ又は複数の増殖因子によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激することができる。その後、刺激した細胞は、細胞抽出物を産生するために溶解する。細胞抽出物は、活性化状態が患者のがんのタイプで改変され得るシグナル伝達分子に対して特異的な捕捉抗体のパネルの希釈系を含有する、アドレス指定可能なアレイに適用する。単一検出アッセイ又は近接アッセイは、対象のそれぞれのシグナル伝達分子の活性化状態を決定するために、適切な検出抗体（例えば、活性化状態非依存性抗体及び／又は活性化状態依存性抗体）を使用して実行する。表２に示される「経路選択」表は、患者のがんのタイプに基づいてどの活性化状態を検出するかを選択するのに特に有用である。例えば、ある患者は、表２の「経路１」に記載されるＥＧＦＲ経路の活性化状態を示すタイプのがんを有していてもよい。あるいは、他の患者は、表２の「経路２」に記載されるＥＧＦＲ経路の活性化状態を示す他のタイプのがんを有していてもよい。参照活性化プロファイルは、このように生成され、いかなる抗がん剤もない状態で患者のがんにおけるシグナル伝達分子の活性化状態を提供する。
【０２９２】
試験活性化プロファイル
[0299]試験活性化プロファイルを得るために、第２の腫瘍組織、血液、又はＦＮＡ試料を、抗がん剤治療に先立って又は抗がん剤の投与（例えば、がん治療の経過の全体にわたって任意の時の）の後に、特定のタイプのがん（例えば、肺がん）を有する患者から得る。腫瘍細胞を、腫瘍、血液、又はＦＮＡ試料から単離する。単離した細胞が、抗がん剤による処置を受けたことがない患者から得られる場合、単離した細胞は、上記に記載される参照活性化プロファイルから決定された１つ又は複数の活性化シグナル伝達分子を標的にする抗がん剤と共にインキュベートする。「薬剤選択」表（表１）は、承認されている適切な抗がん剤を選択するのに又は特異的な活性化標的シグナル伝達分子を阻害する臨床試験において特に有用である。例えば、ＥＧＦＲが活性化されていることが参照活性化プロファイルから決定される場合、細胞は、表１の欄「Ａ」又は「Ｂ」において列挙される１つ又は複数の薬剤と共にインキュベートすることができる。単離した細胞は、その後、１つ又は複数の増殖因子によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激することができる。その後、単離した細胞は、細胞抽出物を産生するために溶解する。細胞抽出物は、アドレス指定可能なアレイに適用され、近接アッセイは、対象のそれぞれのシグナル伝達分子の活性化状態を決定するために実行する。患者についての試験活性化プロファイルは、このように生成し、特定の抗がん剤がある状態で患者のがんにおけるシグナル伝達分子の活性化状態を提供する。
【０２９３】
薬剤選択
[0300]抗がん剤は、試験活性化プロファイルを参照活性化プロファイルと比較することによって、患者のがんの処置に適しているか又は適していないかを決定する。例えば、薬物処置により、薬剤のない状態よりも、ほとんど又は全てのシグナル伝達分子の活性化が実質的に小さくなる場合、例えば、薬剤を伴わない強力な活性化から薬剤を伴う弱い又は非常に弱い活性化への変化を引き起こす場合、その処置は、患者のがんに適していると決定される。そのような例では、処置が、薬物療法を受けたことがない患者において適した抗がん剤により開始される又は続く処置が、既に薬剤を受けている患者において適した抗がん剤により継続される。しかしながら、薬物処置が患者のがんの処置に適していないと考えられる場合、異なる薬剤を、選択し、新しい試験活性化プロファイルを生成するために使用し、その後、この試験活性化プロファイルを、参照活性化プロファイルと比較する。そのような例では、処置が、薬物療法を受けたことがない患者において適した抗がん剤により開始される又は続く処置が、現在適していない薬剤を受けている患者において適した抗がん剤に変更される。
【０２９４】
実施例４．抗がん剤療法選択のためにｃ−Ｍｅｔ活性化を検出するための方法。
[0301]本実施例は、抗ｃ−Ｍｅｔ阻害剤に応答する患者を同定するための及び他の標的作用物質と抗ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の併用から利益を得る患者を同定するための、本明細書において記載される多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームの使用を説明する。
【０２９５】
[0302]乳房、肝臓、肺、卵巣、腎臓、及び甲状腺のがん腫を含む種々様々のヒト悪性腫瘍は、ｃ−Ｍｅｔ刺激の持続、過剰発現、又は突然変異を示す。特に、ｃ−Ｍｅｔにおける活性化突然変異は、特定の遺伝形式の乳頭状腎臓がんを有する患者において陽性と同定され、ヒト腫瘍形成におけるｃ−Ｍｅｔの関係を直接に示唆している。ｃ−Ｍｅｔ受容体の調節不全又はそのリガンド、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の過剰発現によるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の異常なシグナル伝達は、侵襲性の表現型に関連してきた。
【０２９６】
[0303]ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達がいくつかのがんの進行及び拡散に関与するという広範囲な証拠並びに疾患におけるその役割についての理解の向上が、制がん剤開発における主な標的としてのｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦへの少なからぬ関心を生じさせた。これは、臨床的用途の可能性がある様々なｃ−Ｍｅｔ経路アンタゴニストの開発に至った。経路選択的抗がん剤開発の３つの主なアプローチは、リガンド／受容体相互作用の拮抗作用、チロシンキナーゼ触媒活性の阻害、及び受容体／エフェクター相互作用の遮断を含んだ。
【０２９７】
[0304]いくつかのｃ−Ｍｅｔアンタゴニストが、現在、臨床試験中である。モノクローナル抗体及び小分子チロシンキナーゼ阻害剤の両方を含むこれらの作用物質のいくつかの予備臨床結果が、有望である。興味深いことには、ｃ−Ｍｅｔが増幅している患者は、チロシンキナーゼ阻害剤に応答しない。いくつかの多重標的療法もまた、臨床において試験中であり、特にチロシンキナーゼ阻害に関する見込みを実証した。
【０２９８】
[0305]ｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼは、多くの悪性腫瘍において過剰発現され得、生物学的及び生化学的機能において重要である。ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性化は、細胞成長、浸潤、血管新生、及び転移の増加に至り得る。チロシンキナーゼドメイン、膜近傍ドメイン、又はセマフォリンドメイン内の増幅及び／又は活性化突然変異が、ｃ−Ｍｅｔについて同定されている。多くの治療上の戦略が、ｃ−Ｍｅｔを阻害するために用いられてきた。いくつかの臨床試験により、様々な悪性腫瘍についてのｃ−Ｍｅｔ及びそのリガンド、肝細胞増殖因子が試験されている。そのため、患者の腫瘍組織、全血、又は微細針吸引液（ＦＮＡ）試料において見つけられたがん細胞におけるｃ−Ｍｅｔ発現及び／又はリン酸化をプロファイリングするための方法は、全体的な疾患病因に対する価値のある洞察を提供し、そのため、より好適な抗がん療法選択に至る。例えば、全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００８９９０号の図３及び４を参照されたい。
【０２９９】
[0306]本明細書において記載される多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォーム（例えば、ＣＥＥＲ）は、一度、標的タンパク質がマイクロアレイ表面上に捕捉されたら、２つの検出器である酵素とコンジュゲートした抗体の共存を必要とする特有の免疫複合物の形成を利用する。近接した２つの検出器である酵素（グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））の間のチャネリング事象が、ｃ−Ｍｅｔなどのような受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のプロファイリングを高感度で可能にする。分析の特異度は、３つの異なる抗体の同時の結合が必要とされることを前提として、非常に増強される。特に、多重化近接アッセイは、（２）三重抗体酵素チャネリングシグナル増幅プロセスと組み合わせられた（１）多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームに基づく。特有で新規な設計は、特異度を保持しながら、極めて高い感度を与える三重抗体酵素アプローチによってもたらされる。
（１）選択された標的は、マイクロアレイ表面上に段階希釈溶液においてプリントされた標的特異的抗体によって捕捉される。この構成は、結合したそれぞれの標的タンパク質当たりの続くチャネリング事象のための酵素と連結された２つのさらなる検出器抗体の共存を必要とする（例えば、全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００８９９０号の図５を参照）。
（２）捕捉抗体による最初の標的結合及び捕捉された標的分子上の代替のエピトープを認識する、ＧＯ（１０５／分のＴＯＮ）とコンジュゲートした抗体の２次的な結合によって形成された免疫複合物は、ＧＯ基質であるグルコースがある状態でＨ２Ｏ２を産生することができる。
（３）その後、標的特異的に局所的に流入したＨ２Ｏ２が、捕捉された標的上のリン酸化ペプチドに結合する、ＨＲＰ（１０４／分のＴＯＮ）とコンジュゲートしたホスホペプチド特異的抗体によって利用され、よって、標的特異的なシグナルを増幅する。リン酸化標的の検出についての特異度は、３つの異なるタイプの抗体の同時の結合が必要とされることを前提として、共同免疫検出及び増幅プロセスによって非常に増加する。わずか約２〜３×１０４リン酸化事象の検出及び定量が、この方法によってルーチン的に実現され、その検出を「単一」細胞レベルまで到達させる。ある例では、この共同イムノアッセイ構造は、タンパク質相互作用及び活性化を試験するためにさらに適用することができる。
【０３００】
[0307]表３は、ｃ−Ｍｅｔ発現、突然変異、又は活性化を有する原発性の腫瘍を有する患者の百分率を示す。興味深いことには、胃がんでＭＥＴが増幅している患者は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤に応答しない。
【０３０１】
【表３】
2014503821.tif 000009
【０３０２】
[0308]ｃ−Ｍｅｔは、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及びＳＨＣなどのようなキナーゼと相互作用し、リン酸化することが実証されている。ｃ−Ｍｅｔは、同様に、他のキナーゼ、例えば、ｐ９５ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＫＩＴなどと相互作用し得る。本明細書において記載される多重化タンパク質マイクロアレイは、患者の腫瘍組織、全血（例えば、循環腫瘍細胞）、又はＦＮＡ試料を使用して、１つ又は複数のこれらのキナーゼの状態及びそれらの経路を調べるために実行されてもよい。アッセイの結果は、それぞれの個々の患者についての正確な抗がん療法の決定を可能にする。
【０３０３】
[0309]全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００８９９０号の図６は、以下のマーカーの発現及び／又は活性化状態を決定するための本発明の例示的なアドレス指定可能なアレイを示す：ｃ−ＭＥＴ、ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＲＯＮ、ｃ−ＫＩＴ、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３。近接アッセイマイクロアレイ構成を使用するこれらの受容体チロシンキナーゼ及びそれらの経路の情報取得（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）は、好都合にも、特定のｃ−Ｍｅｔ阻害剤療法に対する患者の応答の予測を可能にする。非限定的な例として、ＸＬ−８８０に応答する患者は、ｃ−ＭＥＴ及びＶＥＧＦＲ２が活性化されているであろうが、非応答者は、ＲＴＫが組み合わさって活性化されているであろう。重要なことには、近接アッセイマイクロアレイプラットフォームはまた、適切な併用療法を選択するために使用することもできる。例えば、ｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、及びＥＧＦＲが活性化されている患者はイレッサ＋ＸＬ８８０の併用により処置されるべきであり、ｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びｐ９５ＥｒｂＢ２が活性化されている患者は、タイケルブ＋ＸＬ８８０により処置されるべきである。
【０３０４】
[0310]多重化近接媒介性プラットフォームは、限られた量の試料において、ｃ−ＭｅｔなどのようなＲＴＫの活性化を検出するために、単一細胞レベルの感度を好都合にも提供する。そのため、転移性がんを有する患者から得られた腫瘍組織、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、及び／又はｍＦＮＡ試料は、療法を適合させ、診療に影響を与えるのに価値のある情報を提供するためにプロファイリングすることができる。
【０３０５】
実施例５．がん療法の連続プロファイリング及びモニター。
[0311]連続して試料採取した腫瘍組織についてのキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化プロファイリングは、時間及び療法の関数として、腫瘍細胞において起こる変化についての価値のある情報を提供する。腫瘍進行についてのこの一時的なプロファイリングによって、臨床医は、それぞれの患者において急速に進展するがんサインをモニターすることができる。本実施例は、がんに関係する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）経路の発現のレベル及びリン酸化の程度を検出するための新規で頑健なアッセイを説明し、単一細胞レベルの感度を有する、そのような、療法に指針を与える診断システムを使用する利点を実証する。アッセイは、一般的には、腫瘍組織（例えば、肺腫瘍）、微細針吸引液（ＦＮＡ）、及び血液などのような試料に依存し、そのような試料から得られた限られた量のがん細胞を調べるのに高感度及び高特異度を実現する。
【０３０６】
[0312]本明細書において記載される多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォーム（例えば、ＣＥＥＲ）は、異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍（例えば、肺がん）に関連するキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化を調べるために使用することができる。そのため、患者の腫瘍組織、全血、又は微細針吸引液（ＦＮＡ）試料において見つけられたがん細胞におけるがんマーカーをプロファイリングするための方法は、全体的な疾患病因に対する価値のある洞察を提供し、そのため、より好適な抗がん療法選択に至る。
【０３０７】
[0313]非限定的な例として、腫瘍組織、全血、又はＦＮＡ試料は、本明細書において記載される近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ）を使用して、ＲＴＫ経路の情報取得のために肺がんを有する患者から得られてもよい。その代わりに、経路分析のための試料は、切片を作製する又は凍結ＦＮＡ手順を実行することによって凍結組織から得ることができる。ある例では、組織切片作製は、続くプロファイル分析のための凍結検体についての好ましい方法であるが、比較的非侵襲性のＦＮＡ手順が、臨床環境において、患者（及び異種移植片）から試料を得る好ましい方法である。
【０３０８】
[0314]凍結組織試料は、以下の方法によって収集されてもよい：
選択肢  ＃１．組織切片収集：
１．試料切断を行うドライアイス上にプラスチック計量ボートを保つ。
ａ．材料を冷やすために、かみそり刃又はミクロトーム刃、鋭いピンセット、及びあらかじめ標識した試料収集バイアルをドライアイス上に保つ。
２．−８０℃のフリーザーから凍結ヒトがん組織を取り出し、ドライアイス上に試料を直ちに移す。
３．ドライアイス上の計量ボートに凍結組織を置き、かみそり刃又はミクロトーム刃を使用して、凍結組織の小片（１０μｍ切片×３）を切断し、組織を、あらかじめ冷やしたピンセット使用して、あらかじめ冷やし、あらかじめ標識した試料収集バイアルに移す。
４．キャップを閉じて、ドライアイス上にそれを保つ。
５．最初に二重のプラスチック袋の中に、収集した検体を置き、その後、発泡スチロール容器（一次容器）の中に適切な量のドライアイスと共に置く。
ａ．少なくとも６〜８ポンドのドライアイスを使用する。夏の月はもっと使用する。
注：正確な量のドライアイスは、運送会社と相談した後に決定する。
ｂ．必要な許可及び資料作成のための国際的な輸送プロセスについて船会社と相談する。
ｃ．湿った氷又は冷却剤（すなわち、クールパック（Ｃｏｏｌ  Ｐａｃｋ））は使用しない。
６．箱の中であるが二重の袋の外側に注文書及び試料リストが置かれていることを確認する。
７．しっかりと容器を密閉し、「凍結組織−解凍しないこと」と標識する。
【０３０９】
選択肢  ＃２．凍結組織からのＦＮＡプレップ：
１．−８０℃のフリーザーから凍結ヒトがん組織を取り出し、ドライアイス上に試料バイアルを直ちに移す。
２．ＦＮＡ手順の準備ができている試料は、組織を柔らかくするために１０分間、湿った氷上に置かなければならない。
３．ＦＮＡ試料収集は、柔らかくなった凍結組織に２３又は２５ゲージ針を５〜１０回通過させることによって実行されるべきである。残りの試料バイアルをドライアイスに戻す。
４．ＦＮＡ試料収集バイアルの蓋をアルコールでふく。
５．凍結ＦＮＡ組織は、１００μｌの「タンパク質後期溶液（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有する収集バイアルに直接注射することによって収集されるべきである。穏やかに内容物を混合することによって収集した組織材料を分注する。
６．片手でＦＮＡ収集バイアルをしっかりと持ち、完全な細胞溶解を確実にするために迅速な指によるタッピングを実行する（約１５×）（できれば１０秒間、ボルテックスする）。
７．最初に二重のプラスチック袋の中に、収集した検体を置き、その後、発泡スチロール容器（一次容器）の中にクールパックと共に置く。
ａ．必要な許可及び資料作成のための国際的な輸送プロセスについて船会社と相談する。
８．箱の中であるが二重の袋の外側に注文書及び試料リストが置かれていることを確認する。
９．容器を確実に密閉し、「生物学的検体」と標識する。
【０３１０】
[0315]多重化近接媒介性プラットフォームは、時間及び療法の関数として、腫瘍細胞において起こる変化を検出するために、経時的にＲＴＫ及びそれらの経路の発現及び／又は活性化を検出するための単一細胞レベルの感度を好都合にも提供する。例えば、経時的に腫瘍組織又は他の試料を連続して試料採取することを実行することによる、腫瘍状態のこの一時的なプロファイリングによって、臨床医は、それぞれの患者において急速に進展するがんサインをモニターすることができ、療法を適合させ、診療に影響を与えるのに価値のある情報を提供する。
【０３１１】
実施例６．遺伝子発現パネルによる原発性組織の決定の後の処置についての患者の選択。
[0316]全ての転移性腫瘍のうちおよそ３％〜５％が、原発不明がん（ＣＵＰ）のカテゴリーに分類される。現在の療法がほとんど解剖学的部位に基づくので、原発組織の正確な診断は、処置決定において重要である。例えば、遺伝子発現パネルは、肺がんと最初に診断された患者に与えられたものと一致する療法から利益を得る、転移性肺がんを有する患者を同定するのに有用になり得る。適したシステムは、マイクロＲＮＡの発現パターンの分析を通してがん及び原発組織を分類するＲｏｓｅｔｔａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＣＵＰアッセイ（例えば、ＰＣＴ公開国際公開０８／１１７２７８号を参照）；Ａｖｉａｒａ  ＤＸ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）  ＣａｎｃｅｒＴＹＰＥ  ＩＤ（商標）アッセイ、３９の腫瘍タイプについての原発性部位を同定するために９２の遺伝子を測定するＲＴ−ＰＣＲベースの発現アッセイ；及びマイクロアレイ上で１６００を超える遺伝子の発現を測定し、腫瘍の遺伝子発現「サイン」を１５の既知の組織タイプのものと比較するパスワーク（商標）原発組織試験（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。一度、患者が、原発性がんの組織として肺と同定されたら、経路活性化プロファイルは、処置スケジュールに含めるための適切な標的療法を選択するために使用することができる。
【０３１２】
[0317]以下のプロトコールは、遺伝子発現プロファイリングが、肺がんなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍の処置のための適切な標的療法又は標的療法の併用を選択するために、活性化状態プロファイリングと共に使用される、本発明の例示的な実施形態を提供する。
１）転移性腫瘍から外科的に又は細針生検によって摘出した組織の７μｍの厚い切片を有する２枚以上のスライドガラスを、患者から得る。これらの細胞をホルマリンにおいて固定し、パラフィン（ＦＦＰＥ）に包埋する。同じ腫瘍のもう１枚のスライドをＨ＆Ｅにより染色する。
２）病理学者はＨ＆Ｅスライドを調査し、ＣａｎｃｅｒＴＹＰＥ  ＩＤ（商標）アッセイのための収集するためのエリアを指示する。スライドは、分析のためにＡｖｉａｒａ  ＤＸに送られる。
３）Ａｖｉａｒａ  ＤＸからの試験報告書は、ｋ−最近接近傍分析（ｋ−ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）から決定されるように、上位５つの最も可能性の高い原発部位を示し、予測が得られる。非限定的な例として、患者についての予測が原発不明腫瘍として肺となる場合、患者の腫瘍細胞は、経路活性化について評価することができる。
４）腫瘍細胞（例えば、ＣＴＣ）を血液から単離し、例えば、全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００８９９０号の実施例１において記載されるように分析のために調製する。その代わりに、細針生検は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００８９９０号の実施例２において記載されるように、腫瘍細胞抽出物を調製するために使用することができる。細胞調製物は、本明細書における実施例１又は実施例２のいずれかにおいて記載されるようにアッセイされる。活性化プロファイルは、本明細書における実施例４又は実施例５において記載されるものと同様の方法で評価される。その後、適切な標的療法又は標的療法の併用が、選択される。
【０３１３】
実施例７．がん細胞におけるシグナル伝達経路タンパク質の定量化のためのデータ分析。
[0318]本実施例は、対象の特定の分析物について生成された標準曲線に対する、生物学的試料（例えば、血液又は腫瘍組織）における１つ又は複数のシグナル伝達タンパク質などのような１つ又は複数の分析物の発現及び／又は活性化レベルの定量化を説明する。
【０３１４】
[0319]いくつかの実施形態では、それぞれのＣＥＥＲスライドが、感度を改善し、且つ飽和の影響を低下させるために、３つの光電子増倍管（ＰＭＴ）ゲイン設定でスキャンされる。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを、スポット発見及びシグナル定量化に使用する。それぞれのスポットについての識別子は、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ａｒｒａｙ  Ｌｉｓｔ（．ｇａｌ）ファイルからインポートする。スライド上のそれぞれの臨床試料についての、識別子を外した、研究固有の番号を、最終的なデータセットの中に組み込む。
【０３１５】
[0320]他の実施形態では、バックグラウンド補正シグナル強度が、三通りプリントされた反復スポットについて平均される。それぞれの試薬ブランクについての相対蛍光値を、それぞれの試料から減じる。スポットフットプリントの限界、スポット反復実験についての変動係数、全体的なパッドのバックグラウンド、及び試薬ブランクの強度を含むさらなる分析からデータを選別するためにいくつかの品質基準を使用する。
【０３１６】
[0321]それぞれのアッセイについて、Ｓ字状標準曲線は、ＭＤ−４６８（ＨＥＲ１ポジティブ）、ＳＫＢｒ３（ＨＥＲ２ポジティブ）、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２ポジティブ）、ＨＣＣ８２７（ｃ−ＭＥＴ及びＨＥＲ１ポジティブ）、ＩＧＦにより刺激されたＴ４７Ｄ（ＩＧＦ１Ｒポジティブ）、並びに／又はＨＲＧにより刺激されたＴ４７Ｄ（ＨＥＲ３ポジティブ）などのような細胞株から調製された、複数の（例えば、２、３、４、５、６、７など）濃度の段階希釈細胞溶解産物から生成することができる。それぞれの曲線は、シグナル強度対ｌｏｇ濃度誘導単位、ＣＵ（算出単位（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｕｎｉｔ））の関数としてプロットすることができる。データは、非線形回帰によって５パラメーター方程式（５ＰＬ）に適合させ（Ｒｉｔｚ，Ｃ．及びＳｔｒｅｉｂｉｇ，Ｊ．Ｃ．、Ｊ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、１２巻、１〜２２頁（２００５年））、捕捉抗体の３つの希釈液全てを同時に適合することができる。適合は、Ｒ、オープンソース統計ソフトウェアパッケージを使用して実行する（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ、Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．Ｒ（２００８年））。数学的モデルの過剰パラメーター表現（ｏｖｅｒ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を避け、それによって精度を改善するために、４つのパラメーターを制限することができるが、それぞれの希釈液は、個々の変曲点について解を出すことができる。このプロセスは、４５、５０、及び６０のそれぞれのＰＭＴゲイン設定について反復することができる。これにより、捕捉抗体の３つの希釈液及び３つのＰＭＴスキャンから、アッセイ当たりに生成される９つの標準曲線がもたらされる。標準曲線の適合が０．９５未満のＲ２を有する場合、アッセイにおける組込み冗長性（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）により、１つ又は複数の希釈液／スキャンの組合せを排除することができ、したがって続く予測を改善する。
【０３１７】
[0322]ＣＵ計算（標準曲線に基づく）−標準曲線（例えば、３つの捕捉抗体希釈液及び３つのＰＭＴゲイン設定スキャニング）のそれぞれからの個々の予測は、単一の最終的な予測に組み合わせることができる。それぞれの予測について、標準曲線上の点の傾斜を計算する。この傾斜は、Ｘ軸上のｌｏｇ単位を用いて得る、すなわち、傾斜の分母の単位は、ｌｏｇ計算単位（ＣＵ）となる。次に、予測の加重平均を計算する、ここで、重みは、傾斜から決定される。詳細に述べると、重みを合計し、全傾斜で割ったその傾斜と等しい重みがそれぞれの点に与えられる。それぞれのアッセイは、既知の対照についての予測に対して検証することができる。
【０３１８】
実施例８．ＮＳＣＬＣのコーカサス人の患者試料における、全腫瘍形成タンパク質レベル及び活性化タンパク質レベルの検出及び定量。
[0323]本実施例は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の症状を示すコーカサス人の患者から採取した悪性腫瘍組織におけるタンパク質レベルの検出及び定量のための方法を実証する。特定の一実施形態では、本発明の方法は、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、及びＣＫを含むが、これらに限定されないものなどのような、ＮＳＣＬＣに関連する複数のバイオマーカーの発現レベルの検出及び測定を可能にする。方法はまた、患者の肺腫瘍組織から収集した同じ生物学的試料におけるトータルタンパク質及び活性化（例えば、リン酸化）タンパク質のレベルを検出し、定量化することもできる。
【０３１９】
[0324]ある実施形態では、タンパク質レベルが、ＣＥＥＲなどのような多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームアレイを使用して、活性化タンパク質レベルと共に決定される。複数の完全長及び修飾（すなわち、切断型、リン酸化、及び／又はメチル化）タンパク質の発現レベルを検出し、定量化することができる。タンパク質の発現レベルは、これらに限定されないがＩｇＧ及びＣＫなどのような対照タンパク質に対する比較によって定量化することができる。ある実施形態では、リガンド、受容体、及び下流のシグナル伝達エフェクターなどのような複数の腫瘍形成タンパク質の同時発現レベルを、決定し、直接比較することができる。
【０３２０】
[0325]ある実施形態では、本発明において使用される生物学的試料が、ＮＳＣＬＣを有する患者から収集された腫瘍組織試料から単離することができる。肺腫瘍組織は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性に関連する、活性化遺伝子突然変異を運び得る。ＮＳＣＬＣでは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、及び／又はＧ１２Ｖ）は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する一次耐性（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関連し、ＥＧＦＲ突然変異Ｔ７９０Ｍは、主に、二次耐性（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は獲得耐性に関連する。
【０３２１】
[0326]図１は、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２タンパク質のレベルが、コーカサス人の患者由来のほとんどのＮＳＣＬＣ腫瘍試料において非常に低かったことを示す。対照的に、ＨＥＲ３及びｃＭＥＴタンパク質は、５０％を超える患者試料において中程度から高度なレベルまで発現した。図１では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＣＫ、ＰＩ３Ｋ、及びＳＨＣタンパク質の全レベルが、アレイ上にはっきりと可視化される。図１はまた、これらに限定されないがＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、又はＧ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃのホモ接合性突然変異などのようなＫＲＡＳ突然変異を有するＮＳＣＬＣ試料におけるタンパク質発現を検出するために本明細書において記載される方法を使用することができることを実証する。図２Ｃ、２Ｄ、３Ｃ、及び３Ｄは、ＮＳＣＬＣ腫瘍試料において検出されたタンパク質発現プロファイルのさらなる実例を提供する。特に、これらの図は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｃＭＥＴについての発現レベルを、高度、中程度、及び低度のレベルの発現の３つの別個のカテゴリーにグループ化することができることを実証する。図４Ｂは、ＮＳＣＬＣを有する５１人のコーカサス人の患者から収集された腫瘍組織におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、及びＣＫの発現レベルの概略の図表を提供する。図５は、腫瘍形成シグナル伝達分子の間の関係を決定するために複数のタンパク質のタンパク質レベルを比較することができることを示す。図５は、高度なｃＭＥＴ発現が、コーカサス人の患者由来のＮＳＣＬＣ試料における中程度〜高度なＨＥＲ３発現に関連したことを示す。図５はまた、コーカサス人の患者が、アジア人の患者と比較して、高度なｃＭｅｔレベルを有する傾向があることを示す。図６は、リン酸化ｃＭＥＴ、ＨＥＲ３、及びＰＩ３Ｋもまた発現し、高度なレベルのトータルｃＭＥＴタンパク質及びトータルＨＥＲ３タンパク質を発現した２つの患者の例を示す。
【０３２２】
実施例９．アジア人の患者試料における、トータル腫瘍形成タンパク質レベル及び活性化タンパク質レベルの検出及び定量。
[0327]本実施例は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の症状を示すアジア人の患者から採取した悪性腫瘍組織における腫瘍形成タンパク質レベルの同時の検出及び定量のための方法を実証する。特定の一実施形態では、本発明の方法は、患者腫瘍組織から収集した生物学的試料における複数の腫瘍形成タンパク質（例えば、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、及びＣＫ）の発現レベル並びにそれらの活性化（例えば、リン酸化）形態の発現レベルの検出並びに測定を可能にする。
【０３２３】
[0328]ある実施形態では、トータルタンパク質レベル及び活性化タンパク質レベルは、ＣＯＰＩＡ（ＣＥＥＲとも呼ばれる）アレイを使用して決定される。複数の完全長及び修飾（すなわち、切断型、リン酸化、及び／又はメチル化）タンパク質の発現レベルを検出し、定量化することができる。トータルタンパク質の発現レベルは、これに限定されないがＩｇＧなどのような対照タンパク質に対する比較によって定量化することができる。ある実施形態では、リガンド、受容体、及び下流のシグナル伝達エフェクターなどのような複数の腫瘍形成タンパク質の同時発現レベルを、測定し、生物学的試料の中で直接比較することができる。
【０３２４】
[0329]ある実施形態では、本発明において使用される生物学的試料は、ＮＳＣＬＣを有する患者から単離することができる。これらの患者から収集された肺腫瘍試料は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性に関連する、活性化遺伝子突然変異を含有し得る。ＮＳＣＬＣでは、ＫＲＡＳ突然変異は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する一次耐性に関連し、ＥＧＦＲ突然変異Ｔ７９０Ｍは、主に、二次耐性又は獲得耐性に関連する。
【０３２５】
[0330]ある実施形態では、ＣＥＥＲアッセイを使用して検出されるタンパク質発現のダイナミックレンジは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）値に基づいて３つの別々のグループに分類することができる。ＨＥＲ１発現の範囲は、低度のレベルの発現については１〜１０，０００ＲＦＵ；中程度については１００００〜３６０００；及び高度については３６０００以上であることが確立された。５００００ＲＦＵ未満のＨＥＲ２の発現は、低度として定義され、５００００を超えるものは、中程度の発現として指定される。ＨＥＲ３については、５０００未満のＲＦＵは、低度の発現と考えられ、５０００〜３００００ＲＦＵは、中程度となり、３００００超は、高度となる。ある実施形態では、低度のレベルのｃＭＥＴが、１００００未満のＲＦＵであり、１００００〜４００００で中程度となり、４００００ＲＦＵ超で高度となる。
【０３２６】
[0331]図７は、ＮＳＣＬＣを有する２９人のアジア人の患者試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、及びＣＫの発現レベルのダイナミックレンジを示す。特に、患者の約４８％は、高度なレベルのＨＥＲ１を発現し、ほとんどが、低度なレベルのＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｃＭＥＴを発現した。非常に低い百分率の、試料採取した患者は、高度なレベルのｃＭＥＴ及びＨＥＲ３を同時発現した（２９人の患者のうち１人）。これは、５１のＮＳＣＬＣ腫瘍試料のうち２７が、高度なレベルのｃＭＥＴ及び中程度〜高度なレベルのＨＥＲ３を同時発現した、コーカサス人の患者において実行された研究と対照的である。図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、及び３Ｂは、ＮＳＣＬＣを有するアジア人の患者由来の組織試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｃＭＥＴ発現プロファイルのさらなる実例を提供する。発現レベルは、ＣＥＥＲアッセイからの広範囲のＲＦＵ値に基づいて、３つの別個のカテゴリーにグループ化ことができる。図４Ａは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、及びＣＫの発現プロファイルについての概略の図表を提供する。図５は、ｃＭＥＴの低度の発現が、アジア人の患者試料のコホートにおいて最も一般的であったことを示す。図５はまた、ＮＳＣＬＣを有する４人のアジア人の患者が、中程度のレベルのｃＭＥＴ及び高度なレベルのＨＥＲ３を発現したことを示す。図８は、アジア人の患者から収集されたＮＳＣＬＣ腫瘍試料が、ＶＥＧＦＲ２の多様なレベルの発現を示したことを示す。特に、２９の患者試料のうちの６は、高度なレベルのＶＥＧＦＲ２を示し、３人の患者は、中レベルを示した。
【０３２７】
実施例１０．様々ながん細胞株におけるｃＭｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、及びＣＫの活性化レベルの検出。
[0332]本実施例は、ｃＭＥＴ刺激又は阻害に続く、がん細胞株におけるｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、及びＣＫタンパク質の活性化（リン酸化）レベルの検出を実証する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ療法に対する一次及び／又は二次耐性に相関する腫瘍形成タンパク質の存在及び／又は活性化状態を、ＣＥＥＲなどのような近接アッセイを使用して測定することができる。
【０３２８】
[0333]特定の一実施形態では、ヒトがん細胞株由来の細胞（例えば、患者由来の胃がん腫の肝転移から確立されたＮＣＩ−Ｎ８７細胞株；Ｐａｒｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０巻：２７７３〜２７８０頁、１９９０年）を、異なる濃度のｃＭＥＴ阻害剤で処置した。がんに関連するタンパク質の発現及び活性化のレベルを、高感度ＣＥＥＲアレイを使用して細胞において検出した。用量応答曲線は、分析したタンパク質の阻害及び活性化状態を示すＥＣ５０値を計算するために使用した。
【０３２９】
[0334]図９は、ｃＭＥＴ阻害剤がＮ８７細胞においてｃＭＥＴ活性化を特異的に阻害したことを示す。図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃにおける薬剤応答曲線の比較並びに図９Ｄにおける概略の図表は、阻害剤濃度の増加が、ホスホｃＭＥＴのＥＣ５０値の増加を引き起こしたことを示し、これは、ｃＭＥＴ阻害を実証する。ＥＣ５０の急激な減少によって示されるように、１×濃度のｃＭＥＴ阻害剤への細胞の曝露は、ＰＩ３Ｋ活性化を劇的に誘発した。図９Ｄはまた、ｃＭＥＴ阻害剤がある状態でのＨＥＲ３のわずかな活性化をも示す。２×までのｃＭＥＴ阻害剤の濃度の増加は、ＰＩ３Ｋ活性化のさらなる増加を誘発し、実験におけるリン酸化ＰＩ３Ｋが、ｃＭＥＴ非依存性シグナル伝達経路によるものであることを示唆する。
【０３３０】
[0335]特定の一実施形態では、ＮＳＣＬＣ細胞株由来の細胞（例えば、ＨＣＣ８２７細胞又はＥＧＦＲ活性化突然変異を有する他のゲフィチニブ感受性肺腺がん細胞；アメリカ基準株保存機構、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、異なる濃度のリガンド又はシグナル伝達分子（例えば、ｃＭＥＴ受容体に対するリガンド、ＨＧＦ）で処置した。がんに関連するタンパク質の発現及び活性化のレベルを、ＣＥＥＲアレイを使用して高感度で処置細胞において測定した。がん細胞に曝露されるリガンドの量を変えることによって、分析したタンパク質の発現プロファイルを、細胞を刺激するために使用したリガンドの量に相関させた。用量応答曲線は、分析したタンパク質の阻害及び活性化状態を判断するために使用することができるＥＣ５０値を計算するために使用した。
【０３３１】
[0336]図１０は、ＨＧＦ刺激に続くＨＣＣ８２７細胞のタンパク質発現の差を示す。図１０Ａは、活性化されたｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、及びＣＫタンパク質の発現レベルが、様々なＨＧＦレベルに応答したことを示す。図１０Ｂは、ＨＧＦが、ｃＭＥＴを有効に活性化したが、他方では、ＨＧＦが、ＨＧＦ処置に続く、ＥＣ５０値の増加によって決定されるようにＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３の活性化を減少させたことを示す。図１０Ｅは、ＨＧＦ及びｃＭＥＴの結合が、ＨＥＲ３の活性化を妨害し、程度はより少ないが、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２の活性化を妨害することを例証する（図１０Ｃ及び１０Ｄもまた参照されたい）。
【０３３２】
[0337]本実施例は、ｃＭＥＴが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３と相互作用することを実証する。相互作用は弱いが、その相互作用は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３をトランスリン酸化し、活性化するのに十分である。ｃＭＥＴがＨＧＦに結合すると、複合物は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３と相互作用しない安定したホモ二量体を形成する。これは、ＨＧＦ刺激に際してのリン酸化ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３の減少をもたらす。
【０３３３】
実施例１１．異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者のための抗がん剤療法の選択。
[0338]本実施例は、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する対象のための適切な療法の選択を決定するための方法を実証する。方法は、例えば、本明細書において記載される共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）を使用する、対象の腫瘍組織試料におけるシグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、切断型ｃＭｅｔ、及び／又は切断型ＨＥＲ３）についての、分析物の発現／活性化プロファイリングに基づく。さらに、対象から腫瘍組織を連続して試料採取したキナーゼ及び他のシグナル伝達経路構成成分の発現／活性化プロファイリングは、時間及び治療計画の関数として、腫瘍細胞において起こる変化についての価値のある情報を提供する。腫瘍進行についてのこの一時的なプロファイリングによって、臨床医は、それぞれの対象において急速に進展するがんサインをモニターすることができる。本実施例は、対象の腫瘍組織試料における複数のシグナル伝達経路構成成分の発現／活性化プロファイルに基づいて、療法に対する対象の応答を予測するための本発明の方法の使用を示す。
【０３３４】
[0339]非限定的な例として、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍（これらに限定されないが乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、及び甲状腺のがん腫並びに非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）など）を有する患者は、ＨＥＲ３、ＨＧＦ／ＳＦ、及びｃＭｅｔの転写物及びタンパク質の発現によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。ｃＭｅｔ阻害剤の例は、ＡＭＧ１０２及びＭｅｔＭＡｂなどのようなモノクローナル抗体；ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＧＳＫ  １３６３０８９／ＸＬ８８０、ＸＬ１８４、ＭＧＣＤ２６５、及びＭＫ−２４６１などのようなｃＭｅｔの小分子阻害剤並びにその組合せを含むが、これらに限定されない。他の態様では、ＫＲＡＳ突然変異を有するＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ＨＥＲ３、ＨＧＦ／ＳＦ、及びｃＭｅｔの発現によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。本発明のさらに他の態様では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍及び活性化ＰＩ３Ｋの発現を有する患者は、ｃＭｅｔ及びＨＧＦ／ＳＦの発現によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。他の非限定的な例では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ｃＭｅｔの活性化（例えば、ホスホｃＭｅｔ）又はｃＭｅｔ及びＨＥＲ３の同時活性化（例えば、ホスホｃＭｅｔ及びホスホＨＥＲ３）によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。他の態様では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、切断型ｃＭｅｔタンパク質の発現及びＨＥＲ３の高度な発現によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。さらに他の態様では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、切断型ＨＥＲ３タンパク質の発現及びｃＭｅｔの高度な発現によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。他の非限定的な例では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ｃＭｅｔ発現及び活性化によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。さらなる非限定的な例では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２の低度な発現に加えてｃＭｅｔ及びＨＥＲ３の発現及び活性化によりｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。
【０３３５】
[0340]本実施例は、本明細書において記載される共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）を使用する、対象の腫瘍組織試料における、シグナル伝達経路タンパク質についての分析物（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫｉｔ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、切断型ｃＭｅｔ、及び／又は切断型ＨＥＲ３）の発現の間の差に基づく、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する対象のために、ｃＭｅｔ阻害剤を単独で又は経路標的（ｐａｔｈｗａｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）療法と組み合わせてｃＭｅｔ阻害剤を投与するかどうかの決定を実証する。
【０３３６】
[0341]経路標的療法は、患者の疾患の処置のための治療剤の使用を含み、作用物質は、１つ又は複数のシグナル伝達経路構成成分の発現レベル及び／又は活性化レベルを改変することができる。経路標的療法の非限定的な例は、ｃＭｅｔ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、及びその組合せを含む。ｃＭｅｔ阻害剤の例は、ＭＡＧ１０２（Ａｍｇｅｎ）及びＭｅｔＭａｂ（Ｒｏｃｈｅ）などのような中和抗体並びにＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３、ＪＮＪ３８８７７６０５、及びその組合せなどのようなチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含むが、これらに限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤の例は、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＥｒｂＢ１ワクチン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＥＫＢ５６９、ＣＬ−３８７−７８５、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。ＶＥＧＦ阻害剤の例は、ベバシズマブ（アバスチン）、ＨｕＭＶ８３３、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＡＺＤ２１７１、ＡＭＧ−７０６、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＡＥ−９４１（ネオバスタト）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。ｐａｎ−ＨＥＲの非限定的な例は、ＰＦ−００２９９８０４、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ−５９９６２６）、ＢＭＳ−６９０１５４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＣＩ−１０３３、ＢＩＢＷ−２９９２、及びその組合せを含む。
【０３３７】
[0342]非限定的な例として、異常なｃＭｅｔシグナル伝達（これらに限定されないが乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、及び甲状腺のがん腫並びに非小細胞肺がん）を含む悪性腫瘍を有する患者は、ｃＭｅｔ発現に加えて、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３の同時活性化により、経路標的療法と組み合わせたｃＭｅｔ阻害剤を含む療法におそらく応答するであろう、またその療法を受けるべきである。特定の一例では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＨＥＲ２の発現及び活性化により、ｃＭｅｔ阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を含む併用療法におそらく応答するであろう。他方では、患者は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の同時活性化が患者の腫瘍試料において決定される場合、ｃＭｅｔ阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を含む併用療法に対しておそらく耐性であろう。他の態様では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ＰＩ３Ｋの活性化に加えてｃＭｅｔ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３の同時発現により、経路標的療法と組み合わせたｃＭｅｔ阻害剤におそらく応答するであろう。他の特定の例では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及び／又はＶＥＧＦＲ３の発現及び活性化に加えて、ｃＭｅｔ及びＨＥＲ３の発現及び活性化により、ｃＭｅｔ阻害剤及びＶＥＧＦ阻害剤を含む併用療法におそらく応答するであろう、また、その療法を受けるべきである。他の非限定的な例では、ＥＧＦＲ突然変異及びｃＭｅｔの発現を有するＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ｃＭｅｔ阻害剤及び経路標的療法の併用療法におそらく応答するであろう。
【０３３８】
[0343]非限定的な例では、異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍（これらに限定されないが乳房、肝臓、肺、胃、卵巣、腎臓、及び甲状腺のがん腫並びに非小細胞肺がんなど）を有する患者は、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦＲ２（例えば、図８を参照）、及びＥＧＦＲの同時活性化により、イレッサ（すなわち、ゲフィチニブ）と組み合わせたｃＭｅｔ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤におそらく応答するであろう。他の非限定的な例では、ＮＳＣＬＣなどのような異常なｃＭｅｔシグナル伝達を含む悪性腫瘍を有する患者は、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び切断型ＨＥＲ２タンパク質（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）の同時活性化によりｃＭｅｔ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、及びタイケルブ（すなわち、ラパチニブ）を用いる併用療法に応答するであろう。
【０３３９】
実施例１２．ＮＳＣＬＣ患者におけるマッチングディファレンシャルタンパク質発現（Ｍａｔｃｈｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）及び突然変異プロファイルに基づく標的作用物質（複数可）の選択。
[0344]本実施例は、追加の研究を提供する。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有するアジア人及びコーカサス人の患者から採取された悪性腫瘍組織におけるタンパク質レベルの検出及び定量のための方法をさらに実証する。一実施形態では、本発明の方法は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫＩＴ、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＶＥＧＦＲ２、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、Ｓｔａｔ５、ＪＡＫ２、及びＣｒＫＬを含むが、これらに限定されない、ＮＳＣＬＣに関連する複数のバイオマーカーの発現及び／又は活性化レベルの検出及び測定を可能にする。方法はまた、患者の肺腫瘍組織から収集した同じ生物学的試料におけるトータルタンパク質及び活性化（例えば、リン酸化）タンパク質のレベルを検出し、定量化することもできる。
【０３４０】
背景：
[0345]チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を用いる非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の処置は、初期の応答を示すが、ほとんどの腫瘍は、他のＲＴＫの二次耐性の突然変異（例えば、Ｔ７９０Ｍ）及び増幅によりＴＫＩに対する獲得耐性を発達させる。遺伝子型のみに基づいて単独療法処置について階層化された患者は、他のキナーゼが腫瘍細胞の生存の一因となるので、十分ではなく、したがって、複数のキナーゼの阻害を必要とする。
【０３４１】
方法：
[0346]共同酵素強化反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）は、２つの検出器である酵素とコンジュゲートした抗体の共存を必要とする多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームである。ＣＥＥＲは、微細針吸引液（ＦＮＡ）及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などのような生組織試料から高い検出感度が可能である。いくつかの例では、試料は、２３〜３５ゲージ針を使用して収集される。溶解産物は、ＮＳＣＬＣを有する７１人のコーカサス人の患者及び２９人のアジア人の患者から外科的に得られた、凍結組織から調製した。ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫＩＴ、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＶＥＧＦＲ２、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、Ｓｔａｔ５、ＪＡＫ２、ＣｒＫＬ、及び他の経路のタンパク質の発現及び活性化をプロファイリングした。ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、及びＢＲＡＦにおける突然変異のパネル上での遺伝子型同定を、全ての試料に対して実行した。
【０３４２】
結果：
[0347]発明者らは、アジア人及びコーカサス人の患者の間で発現パターンの差異を観察した。ＫＲＡＳは、全ての患者の３０％において突然変異していた。アジア人の患者では、コーカサス人（３％）と比較して、ＥＧＦＲ過剰発現はより高かった（２７％）。コーカサス人の患者は、高度なＨＥＲ３（５８％）、ｃＭＥＴ（２５％）、並びにｃＭＥＴ及びＨＥＲ３の両方の同時発現（２７％）を発現した。ＶＥＧＦＲ２は、全ての患者の１７％において高度に発現された。ｃＭＥＴ、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ２を過剰発現する患者は、ｐａｎ−ＨＥＲ及びｃＭＥＴの阻害剤の組合せから利益を得るであろう。ｃＭＥＴ及びＥＧＦＲを過剰発現する人々は、ｃＭＥＴ及びＥＧＦＲの阻害剤から利益を得るであろう。最後に、ＶＥＧＦＲ２及びｃＭＥＴを過剰発現する患者は、ｃＭＥＴ及びＶＥＧＦＲの阻害剤から利益を得るであろう。本明細書において記載される方法は、全ての試験したＲＴＫ及びシグナル伝達タンパク質について、それぞれのＮＳＣＬＣ亜集団について包括的なバイオマーカー差異についての有病率分析を提供することができる。
【０３４３】
結論：
[0348]遺伝子型に基づく単独療法及び患者の選択は、処置の選択肢についての有効な基準とならない。その代わりに、ＦＮＡ／ＣＴＣを使用する包括的な経路プロファイルは、適切な療法（例えば、組合せの又は順番に並べた）の選択の指針を与えるはずであり、経路プロファイルの変化が、適切な応答についてモニターされるはずである。
【０３４４】
[0349]本明細書において引用される刊行物及び特許出願は全て、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照によって組み込まれるように明確に且つ個々に示されるかのように、参照によって本明細書において組み込まれる。前述の発明は、理解の明瞭さのために例証及び実施例として詳細に記載されたが、添付の請求項の精神又は範囲から逸脱することなく、ある変更及び修飾が成されてもよいことは、本発明の教示を考慮して当業者らに容易に明らかであろう。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【国際調査報告】
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