(57)【要約】  本発明は、軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患の治療に関する。特に、本発明は、骨関節炎、骨粗鬆症、乾癬性関節炎またはリウマチ性関節炎の抗NKG2A抗体による治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨破壊および/または骨侵食の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗NKG2A抗体が軟骨破壊細胞の選択的排除を刺激し、および/または骨侵食細胞の形成を低下させる、請求項1に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軟骨破壊細胞が線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)である、請求項1または2に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記骨侵食細胞が破骨細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項５】
軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療のための、請求項1から4のいずれか一項に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記疾患または障害が骨関節炎である、請求項5に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記疾患または障害が骨粗鬆症である、請求項5に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記疾患または障害が乾癬性関節炎である、請求項5に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記疾患または障害がリウマチ性関節炎である、請求項5に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体がヒト化またはヒト抗体である、請求項1から9のいずれか一項に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体がhumZ270またはhumZ199である、請求項10に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体の重鎖が、
配列番号2のアミノ酸残基31から35(SYWMN)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号2のアミノ酸50〜35(RIDPYDSETH)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号2のアミノ酸95〜102(YCARGGYD)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列を含み、前記抗体の軽鎖が、
配列番号3のアミノ酸残基24〜34(RASENIYSYLA)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基50〜56(NAKTLAE)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基89〜97(QHHYGTPRT)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列
を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体の重鎖が、
配列番号4のアミノ酸残基31から35(SYAMS)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号4のアミノ酸50〜65(EISSGGSYTYYADSVK)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2、3または4個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号4のアミノ酸99〜108(HGDYPRFFDV)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列を含み、前記抗体の軽鎖が、
配列番号5のアミノ酸残基24〜34(SASSSVSSYIY)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号5のアミノ酸残基50〜56(LTSNLAS)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号5のアミノ酸残基89〜97(QQWSGNPYT)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列
を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項12の抗体または/および請求項13の抗体と競合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の治療で使用するための、抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
医薬製剤として使用するための、請求項1から14のいずれか一項に記載の治療で使用するための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨侵食および軟骨破壊の治療に関する。特に、例えば抗体などの生物学的薬剤を使用した骨および軟骨破壊疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー(NK)細胞は、ある種の感染および腫瘍に対する宿主の防御に不可欠な骨髄由来リンパ細胞である。このリンパ細胞は、活性化されると一連のサイトカインを迅速に産生し、感染した、ストレスを受けた、または腫瘍化した細胞に対する細胞傷害性の応答を媒介することができる。慢性炎症性疾患におけるNK細胞の役割は明らかになりつつあり、NK細胞は、樹状細胞(DC)の分化および成熟ならびにその後のT細胞応答の極性化を促進する能力によって、TおよびB細胞応答の調節において重要な役割を果たし得ることがますます認識されるようになっている(例えば、Cooper et al. (2004) Trends Immunol. 25: 47-52; Zhang et al. (2007) Blood Oct 1 ;110(7):2484-93を参照のこと)。さらに、NK細胞は、細胞媒介細胞傷害性応答によって、活性化したT細胞のサブセットを直接排除する能力を有することが研究によって示された(Lu et al. (2007) Immunity. 26: 593-604)。NK細胞活性は、活性化シグナルおよび阻害性シグナルの両方が関与する複雑な機構によって調節される(例えば、Moretta et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:197-223; Moretta et al. ( 2003) EMBO j EPub Dec 18; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; Zambello et al. (2003) Blood 102:1797-805; Moretta et al. (1997) Curr Opin Immunol 9:694-を参照のこと)。
【０００３】
HLAクラスI欠損標的細胞のNK細胞媒介認識および殺滅に関与するいくつかの異なるNK特異的受容体が同定されてきた。1つの重要な阻害性NK細胞受容体はCD94/NKG2Aで、これは非古典的なMHCクラスI分子HLA-Eと相互作用する(例えば、Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks et al. (199) J Immunol 162:305-313; Miller et al. (2003) J Immunol 171 :1369-75; Brooks et al. (1997) J Esp Med 185:795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302-4311;米国特許出願公開第20030095965号を参照のこと)。
【０００４】
CD94/NKG2Aは、NK、NKTおよびT細胞のサブセットに見出される阻害性受容体であり、その他のMHCクラスI分子のリーダー配列から通常得られる小さなペプチドを有するCD94/NKG2AリガンドHLA-Eを発現する細胞の殺滅を制限する(例えば、WO99/28748およびBraud et al. (1998) Nature 391:795-799を参照のこと)。
【０００５】
NKG2Aに対する様々な抗体が当分野で述べられてきた。例えば、Sivori et al. (Eur j Immunol 1996;26:2487)は、マウス抗NKG2A抗体Z270について述べており、Carretero et al.(J Exp Med 1999;190:1801-12)は、ラット抗マウスNKG2抗体20D5について述べており、米国特許出願公開第20030095965号として公開された米国特許出願は、NKG2A、NKG2CおよびNKG2Eに結合するマウス抗体3S9について記載しており、特許出願WO06070286は、NKG2Aに対するモノクローナル抗体を開示しており、特許出願WO2008/009545は、ヒト化抗体humZ270およびZ270と実質的に同一の可変重鎖および/または可変軽鎖を有するその他の抗NKG2A抗体について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第20030095965号
【特許文献２】WO99/28748
【特許文献３】米国特許出願公開第20030095965号
【特許文献４】WO06070286
【特許文献５】WO2008/009545
【特許文献６】WO08009545
【特許文献７】WO09092805
【特許文献８】WO2005040219
【特許文献９】米国特許出願公開第20050238646号
【特許文献１０】米国特許出願公開第20020161201号
【特許文献１１】EP404,097
【特許文献１２】WO93/11161
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cooper et al. (2004) Trends Immunol. 25: 47-52
【非特許文献２】Zhang et al. (2007) Blood Oct 1 ;1 10(7):2484-93
【非特許文献３】Lu et al. (2007) Immunity. 26: 593-604
【非特許文献４】Moretta et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:197-223
【非特許文献５】Moretta et al. ( 2003) EMBO j EPub Dec 18
【非特許文献６】Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89
【非特許文献７】Zambello et al. (2003) Blood 102:1797-805
【非特許文献８】Moretta et al. (1997) Curr Opin Immunol 9:694-
【非特許文献９】Braud et al. (1998) Nature 391:795-799
【非特許文献１０】Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204
【非特許文献１１】Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873
【非特許文献１２】Brooks et al. (199) J Immunol 162:305-313
【非特許文献１３】Miller et al. (2003) J Immunol 171 :1369-75
【非特許文献１４】Brooks et al. (1997) J Esp Med 185:795-800
【非特許文献１５】Van Beneden et al. (2001) 4302-4311
【非特許文献１６】Sivori et al. Eur j Immunol 1996;26:2487
【非特許文献１７】Carretero et al.J Exp Med 1999;190:1801-12
【非特許文献１８】Bird et al., Science 1988; 242:42S-426
【非特許文献１９】Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883
【非特許文献２０】Ill et al.. Protein Eng 1997;10:949-57
【非特許文献２１】Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1 126-1136
【非特許文献２２】Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996
【非特許文献２３】Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002
【非特許文献２４】Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655
【非特許文献２５】Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315
【非特許文献２６】Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448
【非特許文献２７】Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10): 1057-1062
【非特許文献２８】Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)
【非特許文献２９】Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901 -917
【非特許文献３０】Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988
【非特許文献３１】Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993
【非特許文献３２】Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994
【非特許文献３３】Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987
【非特許文献３４】Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991
【非特許文献３５】Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)
【非特許文献３６】Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984);Genetics Computer Group, University of Wisconsin,Madison, Wis.
【非特許文献３７】Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)
【非特許文献３８】BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894
【非特許文献３９】Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)
【非特許文献４０】Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992)
【非特許文献４１】Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)
【非特許文献４２】Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)
【非特許文献４３】Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020
【非特許文献４４】Theill et al. (2002) Annu Rev Immunol 20:795-23
【非特許文献４５】Walsh et al. (2005) Immunol Rev 208:228-251
【非特許文献４６】Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
関節リウマチ(RA)は、多数の細胞サブセットによって産生される炎症メディエーターの活性化が最終的に間接軟骨および骨の破壊を引き起こす慢性炎症性疾患である。RAにおける軟骨および骨の破壊に関与する主な細胞サブセットは、線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)および破骨細胞それぞれであることは一般的に受け入れられている。CD94-NKG2Aを発現するT細胞およびNK細胞は、活性化した炎症誘発性細胞を殺滅することによって炎症を抑制することができる。これらの細胞の活性化は、マクロファージ、活性化CD4+T細胞およびB細胞/血漿細胞を含む一連の異なる細胞および分子によって実現することができる。しかし、この制御的抗炎症活性は、CD94-NKG2A受容体が炎症誘発性細胞の表面のHLA-Eリガンドに嵌合すると阻害される。CD94-NKG2A受容体をブロックし、その阻害的シグナル伝達を妨害することによって、NNC141-0100は制御的CD94-NKG2A+T細胞およびNK細胞の抗炎症活性を増強し、例えば、活性化した炎症誘発性CD4+T細胞および線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)を排除する能力を増大させる。休止細胞に影響を及ぼさずに、軟骨を侵食する侵襲性FLSを特異的に排除し、骨侵食性破骨細胞の形成を抑制する治療は、現在のRA治療を上回る顕著な利点を備え、場合によっては変形性関節炎(OA)および乾癬性関節炎(PsA)の治療においても患者に有益に使用することができる。
【０００９】
本発明は、抗NKG2A抗体が、骨を分解する破骨細胞の形成を低下させる抗体の能力、および軟骨を分解するFLSの選択的排除の増強それぞれによって、RAにおける2つの主要な病原経路、すなわち、骨および軟骨の侵食を軽減する方法を開示する。
【００１０】
RAを標的とする既存の治療は炎症カスケードの個々の成分に直接作用し、骨侵食に関するそれらの有効性は抗炎症効果の二次的なものである。HLA-Eの結合を阻害することができるか、またはCD94/NKG2Aの機能を非競合的にブロックし、NK細胞の内在性免疫調節機構を刺激することができる抗NKG2AmAbは、軟骨分解、骨侵食を促進する細胞の選択的排除および炎症を促進することが知られているサイトカイン、IL-6の低下を引き起こす。したがって、抗NKG2AmAbによる治療的療法は、骨侵食または軟骨破壊を特徴とする疾患における病理発生に対して直接的な効果を及ぼすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、軟骨破壊および/または骨侵食を治療することができる抗NKG2A抗体またはその断片の使用を開示する。
【００１２】
本発明は、軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療のための抗NKG2A抗体の使用を開示する。
【００１３】
本発明は、軟骨破壊および/または骨侵食の治療のための抗NKG2A抗体の使用であって、抗NKG2A抗体が軟骨分解または骨侵食を促進する活性化細胞の選択的排除を刺激する使用を開示する。本発明の一実施形態では、軟骨分解細胞は線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)である。一実施形態では、骨侵食細胞は侵食性破骨細胞である。
【００１４】
本発明は、軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療のための抗NKG2A抗体の使用であって、抗NKG2A抗体が軟骨分解または骨侵食を促進する活性化細胞の選択的排除を刺激する使用を開示する。本発明の一実施形態では、軟骨分解細胞は線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)である。一実施形態では、骨侵食細胞は侵食性破骨細胞である。
【００１５】
本発明で使用したNKG2A抗体は、任意の適切な抗NKG2A抗体であることができる。一実施形態では、抗体は抗NKG2Aモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はヒト化抗NKG2Aモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は完全なヒト化抗NKG2A抗体である。一実施形態では、抗体はWO2008/009545で記載された抗NKG2A抗体である。一実施形態では、抗NKG2Aモノクローナル抗体は特許公報WO2008/009545で記載されたhumZ270である。一実施形態では、抗NKG2A抗体は特許公報WO09092805で記載された抗NKG2Aモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗NKG2A抗体は特許公報WO09092805で記載されたhumZ199である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】関節リウマチ(RA)の患者の滑膜組織から得られ、インビトロで生成した線維芽細胞様滑膜細胞によって発現した一連の細胞表面分子の発現プロファイルを示した図である。RA患者から得られた線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)はCD55(右の重ね合わせたヒストグラム)を発現するが、CD68(左の重ね合わせたヒストグラム)は欠如していることを示す図である。
【図１Ｂ】関節リウマチ(RA)の患者の滑膜組織から得られ、インビトロで生成した線維芽細胞様滑膜細胞によって発現した一連の細胞表面分子の発現プロファイルを示した図である。下の重ね合わせた各ヒストグラムに示したように、RA-FLS細胞表面はNK細胞受容体を活性化するためにいくつかのリガンド(例えば、MICA、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ICAM1、CD155、CD48)を発現することを示す図である。示したように、RA-FLSはNKp44-FC融合物で効果的に染色され、RA-FLSはNKp44の推定リガンドを発現することを示唆する。
【図１Ｃ】関節リウマチ(RA)の患者の滑膜組織から得られ、インビトロで生成した線維芽細胞様滑膜細胞によって発現した一連の細胞表面分子の発現プロファイルを示した図である。NKp44に対する抗体はRA-FLS上の可溶性NKp44-FC融合タンパク質の結合を用量依存的に妨害することを示す図であり、RA-FLSはNKp44受容体と相互作用することができるリガンドを発現することを示唆する。
【図１Ｄ】関節リウマチ(RA)の患者の滑膜組織から得られ、インビトロで生成した線維芽細胞様滑膜細胞によって発現した一連の細胞表面分子の発現プロファイルを示した図である。RA-FLSはNK細胞受容体(それぞれ、例えば、CD94/NKG2AおよびLIR-1)によって認識されることが知られているリガンド、MHCクラスIリガンドHLA-EおよびHLA-Gを発現することを示す図である。
【図１Ｅ】関節リウマチ(RA)の患者の滑膜組織から得られ、インビトロで生成した線維芽細胞様滑膜細胞によって発現した一連の細胞表面分子の発現プロファイルを示した図である。RA-FLSは細胞死受容体5(DR5)を発現するが、TRAILに結合する公知の受容体、DR4は発現しないことを示す図である。
【図２Ａ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。ヒトNKp46に対する抗体で染色したRA滑膜組織を示す図である。濃く染まった区域は、NKp46を発現している細胞である。
【図２Ｂ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。ヒトNKG2Aに対する抗体で染色した同じ組織の隣接した区画を示す図である。濃く染まった区域は、NKG2Aを発現している細胞である。
【図２Ｃ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。同位体対照抗体で染色した隣接組織区画を示す図である。
【図２Ｄ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。定量的デジタル画像分析によって評価したNKp46+細胞/mm2滑膜組織の頻度に対してプロットしたNKG2A+細胞/mm2滑膜組織の頻度を示す図である。データは、ほとんどのNKG2A+細胞は炎症を起こしたRA滑膜組織におけるNK細胞であることを示す。
【図２Ｅ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。抗HLA-E抗体で染色したRA滑膜組織を示す図である。RA-FLSを含む滑膜表層の細胞はHLA-Eを発現する。矢印は、濃く染色したHLA-E発現滑膜表層FLS様細胞の区域を示す。
【図２Ｆ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。滑膜表層下の浸潤免疫細胞がHLA-Eを発現することを示す図である。
【図２Ｇ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。同位体対照抗体で染色したRA滑膜組織を示す図である。
【図２Ｈ】NKG2Aを発現するNK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-Eを発現するRA-FLSを含有する区域に見出すことができることを示した図である。血管内皮細胞がHLA-Eを発現することを示す図である。
【図３Ａ１】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。図３Ａ１は、代表的なRA患者のSFMCから得られたゲーティングNK細胞上のNK細胞受容体発現を示す。滑膜NK細胞はNKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM1、2B4、LFA-1およびTRAILを発現するが、重ね合わせた白いヒストグラムによって示されるようにNKG2Cは発現しないか、または非常に低いレベルで発現する。
【図３Ａ２】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。図３Ａ２は、代表的な健康なドナーから得られたPBMCの休止しているCD56brightNK細胞を示す。CD56brightNK細胞はNKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM1、2B4、LFA-1およびTRAILを発現するが、重ね合わせた白いヒストグラムによって示されるようにNKG2Cは発現しないか、または非常に低いレベルで発現する。
【図３Ａ３】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。図３Ａ３は、NishiNK細胞を示す。NishiNK細胞はNKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM1、2B4、LFA-1およびTRAILを発現するが、重ね合わせた白いヒストグラムによって示されるようにNKG2Cは発現しないか、または非常に低いレベルで発現する。
【図３Ｂ１】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。NK細胞がインビトロにおいて接着性RA-FLSを排除することを示した図である。図３Ｂ１は、RA-FLSと一晩共培養したNK細胞は、用量依存的に接着性RA-FLSの排除を引き起こすことを示す。
【図３Ｂ２】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。NK細胞がインビトロにおいて接着性RA-FLSを排除することを示した図である。図３Ｂ２は、単独で培養したとき、または減少する量のNK細胞と一晩共培養したときの、接着性RA-FLSによって覆われたウェル区域を、免疫スポット画像分析によって分析して示す。
【図３Ｃ】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。CD107a/b細胞表面発現によって測定すると、NK細胞はRA-FLSと共培養したときに脱顆粒するが、単独で培養したときは脱顆粒しないことを示す図であり、NK細胞はRA-FLSが活発に殺滅することを示唆する。
【図３Ｄ】RA患者から得られた滑膜NK細胞を含むNK細胞は、RA-FLS上で発現するリガンドに結合することが知られている一連の活性化受容体を発現することを示した図である。エフェクターNK細胞上でCD107a/b細胞表面発現によって測定すると、NK細胞によって発現したNKG2D、NKp44、NKp46、DNAM-1またはTRAILの遮蔽は、RA-FLSの殺滅の有意な減少を引き起こすことを示す図である。
【図４Ａ】RA-FLSは、阻害性CD94-NKG2ANK細胞受容体に結合することができるHLA-Eの発現によって、NK細胞媒介細胞傷害性から保護されることを示した図である。RA滑膜NK細胞(上図)、CD56bright健康PB-NK細胞(中央図)およびNishiNK細胞(下図)は全て細胞表面NKG2A(左)を発現するが、KIR(右)を欠如していることを示す図である。さらに、Nishi細胞はLIR1発現するが、滑膜NK細胞またはCD56brightNK細胞はLIR1を発現しない(中央図)。
【図４Ｂ】RA-FLSは、阻害性CD94-NKG2A NK細胞受容体に結合することができるHLA-Eの発現によって、NK細胞媒介細胞傷害性から保護されることを示した図である。CD107a/b細胞表面発現によって測定すると、NK細胞脱顆粒は、NK細胞を抗NKG2Aの存在下でRA-FLSと共培養すると増加するが(右図)、抗LIR1の存在下では増加しないこと(左図)を示す図である。
【図４Ｃ】RA-FLSは、阻害性CD94-NKG2A NK細胞受容体に結合することができるHLA-Eの発現によって、NK細胞媒介細胞傷害性から保護されることを示した図である。アイソタイプ対照による処理(中央図)と比較して、抗NKG2Aで処理したとき(右図)の、接着性RA-FLSのNK細胞依存性クリアランスの増加を示す図である。NK細胞の非存在下で培養したRA-FLSは、左の顕微鏡写真画像で示す。
【図４Ｄ】RA-FLSは、阻害性CD94-NKG2A NK細胞受容体に結合することができるHLA-Eの発現によって、NK細胞媒介細胞傷害性から保護されることを示した図である。自己由来RA-FLS(14%、上左)と共培養したとき滑膜NK細胞は脱顆粒し、NKG2Aを遮蔽すると脱顆粒の増加が引き起こされること(44%、上右)を示す図である。自己由来CD3+CD8+T細胞は、抗NKG2Aの非存在下(すなわち、アイソタイプ処理培養、下左)または存在下(下右)で、自己由来RA-FLSと共培養すると、あまり脱顆粒しない。
【図４Ｅ】RA-FLSは、阻害性CD94-NKG2ANK細胞受容体に結合することができるHLA-Eの発現によって、NK細胞媒介細胞傷害性から保護されることを示した図である。健康なドナーから新たに単離した、未刺激のCD56brightPB-NK細胞は、抗NKG2Aの存在下でRA-FLSと共培養すると脱顆粒するが、アイソタイプ対照抗体で処理すると最小限に脱顆粒することを示す図である。上図は、代表的な例を示しており、下のグラフは、アイソタイプ対抗NKG2Aの存在下で、RA-FLSと共培養した5つの別々のドナーCD56brightNK細胞における%CD107a/b発現を示す。
【図５Ａ】LDH放出アッセイによって測定すると、NNC141-0100(humZ270)を使用してNKG2Aをブロックすることによって、RA-FLSのNK細胞媒介排除の増加が引き起こされることを示した図である。代表的なRA-FLS標的細胞に対して、NKLエフェクター細胞は左に示され、NishiNK細胞は右に示される。
【図５Ｂ】NNC141-0100(humZ270)を使用してNKG2Aをブロックすることによって、代表的なRA-FLS(RA-FLS2)の溶解の増加が引き起こされるが、正常な包皮線維芽細胞系(FSK4)の排除には影響を及ぼさないことを示した図である。
【図６Ａ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。humlgG4アイソタイプの存在下で7日間培養したRA-SFMCの代表的例を示す図である。大きな多核TRAP+細胞がいくつか認められる。
【図６Ｂ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。humZ270処理によって、大きな多核TRAP+細胞の数の激しい低下が生じることを示す図である。
【図６Ｃ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。示したように、アイソタイプ対照vs.抗NKG2A(humZ270、NNC141-0100)の存在下で、培地またはIL-15中で培養したRAの患者から得られたSFMCにおける破骨細胞の形成を示す図である。IL-15で刺激した培養中のNKG2Aの遮蔽によって、TRAP+多核細胞の数の低下が生じる。
【図６Ｄ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。RAの患者から得られたSFMCにおける骨塩侵食性破骨細胞の形成は、NNC141-0100で処理することによって抑制されることを示す図である。RA患者2357番のSFMC培養物から観察された骨塩侵食の代表的な例を示す。SFMCは、IL-15およびアイソタイプmAb(左)対抗NKG2A(humZ270、右)の存在下で、オステオロジックディスク(osteologic disc)上で増殖させた。このディスクをフォンコッサで染色し、侵食された区域を免疫スポットS5分析器を使用して分析すると、濃い背景に対して白く見える。
【図６Ｅ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。RA患者(n=5)から得られたSFMCを、IL-15 10ng/mLを補給した培地中で培養した。アッセイ開始時に、ヒトlgG4アイソタイプ20マイクログラム/mL(白い棒)またはNNC141-0100 20マイクログラム/mL(humZ270、黒い棒)を培養物に添加した。平均パーセント+/-SEM侵食したディスク区域は、免疫スポットS5分析器を使用して定量した。
【図６Ｆ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。HumZ270が、RA滑膜組織人工培養物における骨塩侵食を抑制することを示す図である。図は、RA滑膜組織切削(shaving)を培地単独(対照、上)、アイソタイプ対照(上から2番目)、インフリキシマブ(IFX、上から3番目)または抗NKG2A(humZ270、下)の存在下で骨塩ディスク上で3つのウェルにおいて増殖させた例を示す。明るい区域は、骨塩侵食を表している。
【図６Ｇ】NNC141-0100(humZ270)がTRAP+多核破骨細胞の形成を阻害することを示した図である。分析した免疫スポットを使用した分析によって測定して認められた骨塩侵食パーセントを示す図である。
【図７Ａ】アイソタイプ対照(淡灰色の棒)と比較してhumZ270(NNC141-0100、濃灰色の棒)で処理した際、インビトロ培養SFMCにおいて24時間後に測定したサイトカインレベルの変調を示した図である。IL6レベルの有意な低下がNKG2Aの遮蔽によって認められる。さらに、M-CSFのわずかな増加が認められる。
【図７Ｂ】RA-SFMC培養物(n=11)における抗NKG2A(NNC141-0100、humZ270)対アイソタイプ対照の存在下で産生したIL-6レベルのペアワイズ比較を示した図である。
【図７Ｃ】抗NKG2Aは、RAの患者から得られたSFMCのエキソビボ培養物中において、ベースライン(すなわち、培地単独)およびIL-15刺激IL-6産生の両方を阻害することを示した図である。2人の代表的RA患者の平均およびSDを示す。
【図８ａ】RA滑膜組織中に存在するNK細胞は阻害性NKG2A受容体を発現し、CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-Eを発現する滑膜細胞に隣接したリンパ球凝集物中に主に局在することを示した図である。（Ａ）抗NKp46抗体でNK細胞を染色したID1144-09のRA滑膜組織を示す図である。（Ｂ）抗NKp46抗体でNK細胞を染色したID1591-08のRA滑膜組織を示す図である。（Ｃ）Z199抗体(抗NKG2A抗体)でNKG2Aを染色したID1144-09のRA滑膜組織を示す図である。（Ｄ）Z199抗体(抗NKG2A抗体)でNKG2Aを染色したID1591-08のRA滑膜組織を示す図である。（Ｅ）3D12抗体でHLA-Eを染色したID1144-09のRA滑膜組織を示す図である。（Ｆ）3D12抗体でHLA-Eを染色したID1591-08のRA滑膜組織を示す図である。
【図８ｂ】RA滑膜組織中に存在するNK細胞は阻害性NKG2A受容体を発現し、CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-Eを発現する滑膜細胞に隣接したリンパ球凝集物中に主に局在することを示した図である。（Ｇ）抗CD3抗体でT細胞を染色したID1144-09のRA滑膜組織を示す図である。（Ｈ）抗CD3抗体でT細胞を染色したID1591-08のRA滑膜組織を示す図である。（Ｉ）lgG2bアイソタイプ対照抗体で染色したID1144-09のRA滑膜組織を示す図である。（Ｊ）lgG2bアイソタイプ対照抗体で染色したID1591-08のRA滑膜組織を示す図である。（Ｋ）ID1595-08のNKp46+NK細胞の高倍率写真を示す図である。（Ｌ）ID1595-08のNKG2A+細胞の高倍率写真を示す図である。
【図８ｃ】RA滑膜組織中に存在するNK細胞は阻害性NKG2A受容体を発現し、CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-Eを発現する滑膜細胞に隣接したリンパ球凝集物中に主に局在することを示した図である。15人のRA患者の滑膜のNKG2A+細胞の数とNKp46+NK細胞の数との相関のデジタル画像分析を示す図である。
【図９Ａ】NKG2Aおよびそのリガンド、HLA-Eは、骨関節炎(OA)の患者の滑膜で発現することを示した図である。浸潤リンパ細胞の中のNKG2A+細胞(Z199抗体)を示す図である。
【図９Ｂ】NKG2Aおよびそのリガンド、HLA-Eは、骨関節炎(OA)の患者の滑膜で発現することを示した図である。浸潤免疫細胞、内皮細胞および滑膜細胞によるHLA-E発現(3D12抗体)を示す図である。
【図９Ｃ】NKG2Aおよびそのリガンド、HLA-Eは、骨関節炎(OA)の患者の滑膜で発現することを示した図である。OA滑膜のNKG2A+細胞の頻度とNK細胞の頻度との相関のデジタル画像分析を示す図である。
【図１０】CD94-NKG2Aリガンドは、RAおよびOA患者だけでなく、PsA患者の炎症を起こした滑膜においても発現することが見出されたことを示す図である。（Ａ）RA患者の滑膜組織試料の染色を示す図である。（Ｂ）PsA患者の滑膜組織試料の染色を示す図である。（Ｃ）RO(OA????)患者の滑膜組織試料の染色を示す図である。（Ｄ）正常対照の滑膜組織試料の染色を示す図である。
【図１１Ａ】配列番号1、humNKG2Aのアミノ酸配列を示した図である。
【図１１Ｂ】配列番号2、humZ270抗体の重鎖可変ドメイン(VH)を示した図である。
【図１１Ｃ】配列番号3、humZ270抗体の軽鎖可変ドメイン(VL)を示した図である。
【図１１Ｄ】配列番号4、humZ199抗体の重鎖可変ドメイン(VH)を示した図である。
【図１１Ｅ】配列番号5、humZ199抗体の軽鎖可変ドメイン(VL)を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で記載した「抗体」という用語は、生殖系列イムノグロブリン配列から得られたポリペプチドを意味する。この用語には、完全長抗体および任意の抗原結合断片またはそれらの1本鎖が含まれる。本明細書で使用したように用語「抗体」、「モノクローナル抗体」および「mAb」は、イムノグロブリン分子および抗原に特異的に結合する能力を有するそれらの断片を意味するものとする。特に薬学的に関心のあるイムノグロブリンのサブクラスは、IgGファミリーに属するイムノグロブリンで、アイソタイプlgG1、lgG2、lgG3およびlgG4にさらに分けることができる。IgG分子は、2個またはいくつかのジスルフィド結合によってつなぎ合わさった2本の重鎖ならびに、1本がジスルフィド結合によって重鎖のそれぞれに付着した2本の軽鎖から構成される。IgG重鎖は、可変ドメイン(VH)および3個の定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3)を含む4個のIgドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)から構成される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。VHおよびVL領域はさらに、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域に分散した、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域にさらに分けられる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順番、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置され、3個のCDRおよび4個のFRから構成される。
【００１８】
抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)、FC受容体(FcR)および古典的な補体系の第1成分(C1q)を含む宿主細胞または要素への抗体の結合を媒介することができる。FcRおよびC1qへの結合は、ADCCまたはCDCなどの効果を媒介することができる。
【００１９】
本発明の抗体は、任意のNKG2A結合抗体、humZ270抗体(配列番号2および配列番号3)またはhumZ199抗体(配列番号4および配列番号5)または本発明の任意のその他の抗体、あるいはこれらの抗体のいずれか1つの変種であってもよい。
【００２０】
本明細書で使用したヒト化Z270またはhumZ270またはhZ270という用語は、本出願に参照として組み込んだ特許出願WO08009545で開示された抗体を含む。本明細書で使用したヒト化Z199またはhumZ199という用語は、本特許出願に参照として組み込んだ特許公報WO09092805で開示された抗体を含む。
【００２１】
本明細書で使用したように、Abという用語は、対応するAgに特異的に結合する抗体またはその断片を含む。抗原結合断片の例には、限定はしないが、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv(通常、抗体の1腕のVLおよびVHドメイン)、1本鎖Fv(scFv;例えば、Bird et al., Science 1988; 242:42S-426;およびHuston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883を参照のこと)、dsFv、Fd(通常、VHおよびCHIドメイン)およびdAb(通常VHドメイン)断片;VH、VL、VhHおよびV-NARドメイン;1個のVHおよび1個のVL鎖を含む1価分子;ミニボディ(minibodies)、2特異性抗体、3特異性抗体、4特異性抗体およびカッパ体(例えば、Ill et al.. Protein Eng 1997;10:949-57を参照のこと);ラクダIgG;IgNAR;ならびに1個または複数の単離されたCDRもしくは機能的パラトープが含まれ、単離されたCDRまたは抗原結合残基またはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するために一緒に関連づけるか、または結合することができる。様々な種類の抗体断片は、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1 126-1136;WO2005040219および公開された米国特許出願公開第20050238646号および第20020161201号に記載されるか、または概括されている。
【００２２】
抗体の「抗原結合断片」という用語は、NKG2Aまたは本明細書で記載した別の標的分子などの抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることが示されてきた。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、ScFv断片、dAb断片および単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。scFvなどの1本鎖抗体およびVHHなどの重鎖抗体および1ドメインラクダ抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得ることができ、その断片は、完全な抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングすることができる。
【００２３】
「Fab」断片には、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインならびに重鎖の可変ドメインおよび第1定常ドメイン(CH1)が含まれる。Fab'断片には、重鎖または軽鎖への1個または複数のシステインカルボキシ末端結合が含まれる。F(ab')2抗体断片には、一般的にカルボキシ末端近くでヒンジシステインによって共有的につながっている1組のFab断片が含まれる。抗体断片のその他の化学結合はまた、当分野で公知である。Fab断片は、場合によっては低い親和性で、抗原に結合する親抗体の能力を保持する。F(ab')2断片は、2価で結合することができ、一方、Fab断片は1価のみで結合することができる。一般的に、Fab断片は、定常CH2およびCH3ドメイン、すなわち、Fc受容体との相互作用を生じるFc部分を欠如している。したがって、Fab断片は一般的に、エフェクター機能を欠いている。
【００２４】
「Fv」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する抗体断片で、天然において、例えば、1本鎖可変ドメイン断片(scFv)において共有結合であることができる強固な関連による1重鎖および1軽鎖可変ドメインの二量体を一般的に含む。各可変ドメインの3個の超可変領域が相互作用して、VH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのはこの配置である。集合的に、6個の超可変領域およびそれらのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、抗原に特異的な3個の超可変領域のみを含む1個の可変ドメインであっても、通常は完全な結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し結合する能力を備えている(Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996)。例えば、重鎖可変ドメイン(VHH)のみを有する天然に生じるラクダ科の抗体は抗原に結合することができる(Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655)。
【００２５】
「1本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは1本のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Fvポリペプチドはさらに、scFvが抗原結合のために望ましい構造をとれるようにするポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間に含む。scFvの概括は、Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照のこと。
【００２６】
「2特異性抗体」という用語は、2個の抗原結合部位を備えた小さな抗体断片のことであり、この断片は、同じポリペプチド鎖(VHおよびVL)中に軽鎖可変ドメイン(VL)に連結した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の2個の可変ドメインの間の組み合わせを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、可変ドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に組み合わされ、2個の抗原結合部位を生じる。2特異性抗体については、例えば、EP404,097、WO93/11161およびHollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448にさらに完全に記載されている。
【００２７】
「線状抗体」という表現は、Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10): 1057-1062に記載されたような抗体を意味する。簡単に説明すると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、1組の抗原結合領域を形成する1組の直列型Fdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含有する。線状抗体は、2特異性または単一特異性であることができる。
【００２８】
本明細書で使用した「モノボディ」という用語は、重鎖可変ドメインを有するが、軽鎖可変ドメインは有さない抗原結合分子を意味する。モノボディは、軽鎖がなくても抗原に結合することができ、一般的に3個の超可変領域、例えば、CDRH1、CDRH2およびCDRH3と呼ばれるCDRを有する。重鎖IgGモノボディは、ジスルフィド結合によって連結した2個の重鎖抗原結合分子を有する。重鎖可変ドメインは、1個のまたは複数の超可変領域、好ましくはCDRH3またはHVL-H3領域を含む。
【００２９】
本明細書で使用したとき、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「超決定領域」または「CDR」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインの残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)ならびに重鎖可変ドメインの31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)のような配列によって規定される、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))および/または「超可変ループ」のアミノ酸残基(構造によって規定され、各抗体によって異なる、例えば、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901 -917を参照のこと)を含む。1例では、HVL残基は軽鎖可変ドメインの26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)および重鎖可変ドメインの26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3)を含むことができる。
【００３０】
抗体断片は、従来の組換えまたはタンパク質操作技術を使用して得ることができ、その断片は、完全な抗体と同じ方法で、NKG2Aに対する結合または別の機能についてスクリーニングすることができる。
【００３１】
本発明の抗体断片は、トランケーションによって、例えば、ポリペプチドのNおよび/またはC末端からの1個または複数のアミノ酸の除去によって形成してもよい。断片はまた、1個または複数の内部欠失によって生成してもよい。
【００３２】
本発明の抗体は、任意の抗NKG2A抗体、humZ270抗体(配列番号2および配列番号3)またはhumZ199抗体(配列番号4および配列番号5)または本発明の任意のその他の抗体、またはこれらの抗体のいずれか1つの変種の断片であってもよく、または含んでいてもよい。本発明の抗体は、これらの抗体の1つまたはそれらの変種の抗原結合部分であってもよく、または含んでいていてもよい。例えば、本発明の抗体は、これらの抗体の1つまたはそれらの変種のFab断片であってもよく、またはこれらの抗体の1つまたはそれらの変種から得られた1本鎖抗体であってもよい。
【００３３】
本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよい。本明細書で使用した「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびCDR領域の両方がヒト生殖系列イムノグロブリン配列から得られた可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有するならば、この定常領域はまた、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列から得られる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、インビトロにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含んでいていてもよい。他方で、本明細書で使用した「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列から得られたCDR配列がヒトフレームワーク配列に継ぎ合わさった抗体は含まないものとする。
【００３４】
このようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。このようなヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物から得られたB細胞を含むハイブリドーマによって産生してもよい。
【００３５】
ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択について構築された配列ライブラリーから単離し、さらに天然および合成配列多様性によって多様化してもよい。
【００３６】
ヒト抗体は、ヒトリンパ細胞のインビトロ免疫化、その後のエプスタインバーウイルスによるこのリンパ細胞の形質転換によって調製してもよい。
【００３７】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体および別の作用物質または抗体のコンジュゲートなどのヒト抗体の任意の修飾された形態を意味する。
【００３８】
本明細書で使用した「ヒト化抗体」という用語は、非ヒトイムノグロブリンから得られた最小配列(CDR領域)を含有するヒト/非ヒトキメラ抗体を意味する。ヒト化抗体は、したがって、レシピエントの超可変領域の残基がマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域の残基と置換しており、所望する特異性、親和性および能力を備えたヒトイムノグロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合、ヒトイムノグロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。このような改変の一例は、1個または複数のいわゆる逆突然変異の導入である。
【００３９】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変を行うと、抗体性能がさらに洗練される。一般的に、ヒト化抗体は、可変ドメインの実質的に全て、少なくとも1つ、通常2つを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒトイムノグロブリンの超可変ループに対応し、FR残基の全てまたは実質的に全てがヒトイムノグロブリン配列のFR残基である。ヒト化抗体は、場合によってまた、イムノグロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、通常ヒトイムノグロブリンの少なくとも一部分を含むことができる。
【００４０】
本明細書で使用した「キメラ抗体」という用語は、軽鎖および重鎖遺伝子が、異なる種から発生したイムノグロブリン可変および定常領域遺伝子から通常遺伝子操作によって構築された抗体を意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変セグメントを、ヒト定常セグメントに接合することができる。
【００４１】
抗体の断片結晶化領域(「Fc領域」/「Fcドメイン」)は、定常CH2およびCH3ドメインを含む抗体の「尾」領域である。Fcドメインは、Fc受容体と称する細胞表面受容体ならびに補体系のいくつかのタンパク質と相互作用することができる。Fc領域は、抗体が免疫系を活性化するのを可能にする。本発明の一態様では、通常、血清半減期、補体固定、Fc受容体結合、タンパク質安定性および/または抗原依存性細胞傷害性などのその機能特性の1つまたは複数を改変するか、またはそれらを欠如するために、抗体はFc領域内に改変を含むように操作されていてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されていてもよく(例えば、1つまたは複数の化学的部分が抗体に付着することができる)、あるいはさらに抗体の1つまたは複数の機能特性を改変するために、その糖鎖修飾を改変するように修飾されていてもよい。好ましくは、修飾されたFcドメインは、ある種のFc受容体に対する親和性の減少(L234A、L235EおよびG237A)およびC1q媒介補体固定の低下(A330SおよびP331S)を引き起こす以下の突然変異それぞれの1つまたは複数、好ましくは全てを含んでいる。
【００４２】
本発明の抗体のアイソタイプは、lgG1、lgG2、lgG4などのIgGであってもよい。所望するならば、抗体のクラスは、公知の技術によって「切り換え(switched)」られていてもよい。例えば、IgM分子として元々産生された抗体は、IgG抗体に切り換えられたクラスであってもよい。クラス切り換え技術はまた、1つのIgGサブクラスから別のものへ、例えば、lgG1からlgG2もしくはlgG4、lgG2からlgG1もしくはlgG4、またはlgG4からlgG1もしくはlgG2に変換するために使用してもよい。異なるIgGサブクラスの領域を組み合わせることによって、定常領域キメラ分子を生成する抗体の操作も実施することができる。
【００４３】
本明細書で使用したように、「エピトープ」という用語は、抗体(Ab)などの「抗原結合ポリペプチド」とその対応する「抗原」(Ag)との間の分子相互作用の場合において定義される。抗原(Ag)という用語は、Agを認識する抗体(Ab)を産生するために、免疫適格脊椎動物を免疫するために使用される分子実体を意味する。本明細書で、Agはより広義に称され、一般的に、Abによって特異的に認識される標的分子を含むものとし、したがって、Abを生じるための免疫プロセスで使用される分子の断片または模倣体が含まれる。
【００４４】
一般的に、「エピトープ」とは、Abが特異的に結合するAg上の区域または領域、すなわち、Abと物理的に接触する区域または領域を意味する。タンパク質エピトープは、Abへの結合に直接関与するAgのアミノ酸残基(エピトープの免疫優性成分とも称される)および、Abによって効果的にブロックされるAgのアミノ酸残基などの結合に直接関与しないその他のアミノ酸残基を含んでいてもよい(言い換えると、このアミノ酸残基は、Abの「溶媒排除表面」および/または「フットプリント(footprint)」内にある)。本明細書では、エピトープという用語は、特に記載しない限り、抗NKG2A抗体または本発明による別のNKG2A特異的作用物質に特異的に結合するNKG2Aの任意の特定の領域の結合部位の両方の種類を含む(例えば、いくつかの場合、本発明は、特定のアミノ酸残基に直接結合する抗体に関する)。NKG2Aは、いくつかの異なるエピトープを含んでいてもよく、限定はしないが、(1)線状ペプチドエピトープ、(2)成熟したNKG2A立体構造の中で互いに近くに位置する1個または複数の非隣接アミノ酸からなる立体構造エピトープおよび(3)全体または一部のいずれかが、炭水化物基などのNKG2Aに共有的に付着した分子構造からなる翻訳後エピトープを含んでいてもよい。
【００４５】
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)組のためのエピトープは、様々な実験的および計算的エピトープマッピング法を使用して、様々なレベルの項目で定義し、特徴付けることができる。実験的方法には、変異誘発、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、水素重水素交換質量分析(HX-MS)および様々な競合結合法、すなわち当分野で公知の方法が含まれる。それぞれの方法は特有の原理に基づくので、エピトープの記載は、測定を行った方法に密接に関連している。したがって、使用したエピトープマッピング法に応じて、所与のAb/Ag組のエピトープは、様々に定義されるだろう。
【００４６】
最も精密なレベルでは、AgとAbの間の相互作用のためのエピトープは、Ag-Ab相互作用において存在する原子の接触を規定する空間座標ならびに結合熱力学に対するそれらの相対的関与についての情報によって定義することができる。あまり精密ではないレベルでは、エピトープはAgとAbの間の原子の接触を規定する空間座標によって特徴付けることができる。さらに精密ではないレベルでは、エピトープはAbおよびAgにおける原子の間の距離などの特異的基準によって規定されるように、エピトープが含むアミノ酸残基によって特徴付けることができる。さらにより精密ではないレベルでは、エピトープは、機能、例えば、その他のAbとの競合結合によって、特徴付けることができる。エピトープはまた、別のアミノ酸によって置換されるとAbとAgの間の相互作用の特徴が変化するアミノ酸残基を含むので、より一般的に定義することができる。
【００４７】
Ab、例えば、Fab断片とそのAgとの間の複合体の空間座標によって定義されるX線によって得られた結晶構造の場合、エピトープという用語は、本明細書では、特に記載していないか、または文脈と矛盾がない限り、Ab内の重い原子から4Åの距離内に重い原子(すなわち、水素以外の原子)を有することによって特徴付けられるNKG2A残基として特に定義される。
【００４８】
使用したエピトープマッピング法に応じて、エピトープの記載および定義が様々なレベルの精密さで得られるという事実から、同じAg上の異なるAbのためのエピトープの比較は、様々なレベルの精密さで同様に実施することができるということになる。
【００４９】
アミノ酸レベルで記載される、例えば、X線構造から決定されるエピトープは、同じ組のアミノ酸残基を含有するならば、同一であると言う。少なくとも1個のアミノ酸がエピトープによって共有されているならば、エピトープは重複していると言う。どのアミノ酸残基もエピトープによって共有されていないならば、エピトープは別個である(特有である)と言う。
【００５０】
競合結合によって特徴付けられるエピトープは、対応するAbの結合が互いに相反する、すなわち、1つのAbの結合がその他のAbの同時結合を排除するならば、重複していると言う。Agが両方の対応するAbの同時結合に適応できるならば、エピトープは別個である(特有である)と言う。
【００５１】
「パラトープ」という用語の定義は、「エピトープ」の前記定義を逆の見方をすることによって得られる。したがって、「パラトープ」という用語は、Agが特異的に結合する、すなわち、Agと物理的に接触するAbの区域または領域を意味する。
【００５２】
Fab断片などのAbとそのAgとの間の複合体の空間座標によって定義されるX線によって得られた結晶構造の場合、パラトープという用語は、本明細書では、特に記載がないか、または文脈と矛盾がない限り、NKG2Aの重い原子から4Åの距離内に重い原子(すなわち、水素以外の原子)を有することによって特徴付けられるAg残基として特に定義される。
【００５３】
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)組のエピトープおよびパラトープは、所定の方法によって同定することができる。例えば、エピトープの一般的位置は、様々な断片または変種NKG2Aポリペプチドに結合する抗体の能力を評価することによって決定することができる。抗体と接触するNKG2A内の特定のアミノ酸(エピトープ)およびNKG2Aと接触する抗体内の特定のアミノ酸(パラトープ)はまた、所定の方法を使用して決定することができる。例えば、抗体および標的分子は一緒にすることができ、Ab/Ag複合体は結晶化することができる。この複合体の結晶構造は、抗体とその標的との間の相互作用の特定部位を同定するために測定し、使用することができる。
【００５４】
同じ抗原に結合する抗体は、共通の抗原に同時に結合する能力に関して特徴付けることができ、「ビニング(binning)」を行うことができる。この文脈において、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体のグループ分けの方法を意味する。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISAまたはフローサイトメトリーなどの標準技術をベースにしたアッセイにおける共通抗原に対する2種類の抗体の競合結合に基づいていてもよい。
【００５５】
「ビン(bin)」は、参照抗体によって定義される。第2抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できなければ、第2抗体は参照抗体と同じ「ビン」に属すると言う。この場合、参照および第2抗体は、抗原に対する結合について競合しており、したがって抗体の組は「競合抗体」と称される。第2抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できるならば、第2抗体は別個の「ビン」に属すると言う。この場合、参照および第2抗体は、抗原に対する結合について競合せず、したがって抗体の組は「非競合抗体」と称される。
【００５６】
抗体「ビニング」は、エピトープに関する直接的な情報を提供しない。競合抗体、すなわち、同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープまたは別々のエピトープも有していてもよい。後者は、抗原上のエピトープに結合した参照抗体が、抗原上のそのエピトープと接触する第2抗体に必要な空間を占める場合である(立体障害)。非競合抗体は、別個のエピトープを有する。
【００５７】
「結合親和性」という用語は、本明細書では、2つの分子、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有的相互作用の強さの基準として使用される。「結合親和性」という用語は、1価の相互作用(固有の活性)を示すために使用される。
【００５８】
2つの分子、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の1価の相互作用による結合親和性は、解離定数(KD)の測定によって定量することができる。次に、KDは複合体形成および解離の動力学の測定によって、例えば、SPR法によって測定することができる。1価複合体の会合および解離に対応する速度定数はそれぞれ、結合速度定数ka(またはkon)および解離速度定数kd(またはkoff)と呼ばれる。KDは、式KD=kd/kaによってkaおよびkdに関与する。
【００５９】
前記の定義に従って、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較などの異なる分子相互作用と関連する結合親和性は、個々の抗体/抗原複合体のKD値の比較によって比較することができる。
【００６０】
同様に、相互作用の特異性は、抗体と抗原の間の特異的相互作用などの関心のある相互作用のKD値の測定および関心の無い相互作用のKD値との比較によって評価することができる。
【００６１】
通常、標的に関する抗体のKDは、無関係な物質または環境中の付随する物質などのその他の非標的分子に関するKDより2倍、好ましくは5倍、より好ましくは10倍小さい。より好ましくは、KDは、50倍、例えば、100倍、または200倍小さく、さらにより好ましくは500倍、例えば、1000倍または10000倍小さい。
【００６２】
この解離定数の値は、周知の方法によって、例えば、当分野で公知の標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価する標準的アッセイによって直接測定することができ、例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIAおよびフローサイトメトリー分析が含まれる。抗体の結合動力学および結合親和性はまた、SPRなどの当分野で公知の標準的アッセイによって評価することができる。
【００６３】
標的に対する抗体の結合を、別の抗体などその標的の別のリガンドによる標的の結合と比較する競合結合アッセイを実施することができる。
【００６４】
本発明の抗体は、その標的に対して、1×10-7M以下、1×10-8M以下または1×10-9M以下または1×10-10M以下、1×10-11M以下または1×10-12M以下のKDを有していてもよい。本発明の抗体のKDは、0.8nM未満、例えば0.7nM未満、例えば0.6nM未満、例えば0.5nM未満、例えば0.4nM未満、例えば0.3nM未満、例えば0.2nM未満、例えば0.1nM未満、例えば0.05nM未満、例えば0.025nM未満、例えば0.015nM未満、例えば0.015nMと0nMの間であってもよい。
【００６５】
当分野で公知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって測定される2個以上のポリペプチドの配列間の関係を意味する。当分野では、「同一性」はまた、2個以上のアミノ酸残基の鎖の間のマッチの数によって測定されるポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)が対応する(もしあるならば)ギャップアライメントによる2本以上の配列の小さい方の間の同一マッチのパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法で容易に計算することができる。このような方法には、限定はしないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)において記載された方法が含まれる。
【００６６】
同一性を測定する好ましい方法は、試験される配列間の最大のマッチを与えるように設計されている。同一性の測定方法は、公衆に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載される。2つの配列間の同一性を測定するための好ましいコンピュータプログラム法には、GAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin,Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))を含むGCGプログラムパッケージが含まれる。BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)およびその他の供給源(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al.上述)から公衆に利用可能である。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムも、同一性を測定するために使用することができる。
【００６７】
例えば、コンピュータアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)を使用して、パーセント配列同一性を測定するべき2つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適マッチのために整列させる(アルゴリズムによって測定した「マッチしたスパン(matched span)」)。ギャップ開始ペナルティ(平均対角(average diagonal)の3倍として計算され、「平均対角」は、用いられる比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は、特定の比較マトリックスによって各々の完全なアミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは番号である)およびギャップ伸長ペナルティ(通常、{分数(1/10)}倍ギャップ開始ペナルティである)、ならびにPAM250もしくはBLOSUM62などの比較マトリックスは、アルゴリズムと組み合わせて用いられる。標準的な比較マトリックス(PAM250比較マトリックスについてはDayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978);BLOSUM62比較マトリックスについてはHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992)を参照のこと)はまた、アルゴリズムによって用いられる。
【００６８】
ペプチド配列の比較のために好ましいパラメーターには、以下のものが含まれる:
アルゴリズム: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970);;比較マトリックス: Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)のBLOSUM62;ギャップペナルティ:12、ギャップ伸長ペナルティ:4、類似性の閾値:0。
【００６９】
GAPプログラムは、前記パラメーターを用いると有用である。前記パラメーターは、GAPアルゴリズムを用いる(エンドギャップ(end gap)に対するペナルティなしに)ペプチド比較のための初期設定パラメーターである。
【００７０】
「類似性」という用語は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一のマッチおよび保存的置換マッチの両方を含む配列関係を意味する。2つのポリペプチド配列が、例えば、(分数(10/20))同一なアミノ酸を有し、残りが全て非保存的置換であるならば、パーセント同一性および類似性は両方とも50%である。同じ例において、保存的置換である位置が5つを上回る場合、パーセント同一性は50%のままであるが、パーセント類似性は75%((分数(15/20)))である。したがって、保存的置換を有する場合、2つのポリペプチド間の類似性の程度は、それら2つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００７１】
「受容体」は、細胞の表面または内側に存在する分子構造として定義される。受容体は、リガンドが結合したとき、特徴的な細胞応答、すなわち、生物学的活性を生じる。受容体の「リガンド」は、選択的に受容体に結合することができる任意の分子(例えば、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、低分子またはイオン)として定義される。作用的リガンド(「アゴニスト」)とは、ある程度まで受容体に結合すると受容体の特徴的な応答を惹起することができるリガンドである。拮抗的リガンド(「アンタゴニスト」)とは、受容体に結合し、アゴニスト、例えば、受容体の天然のリガンドの作用をある程度までブロックする能力を有するリガンドである。
【００７２】
NKG2A(OMIM161555、その開示全体は本明細書に参照として組み込まれる)は、転写物のNKG2群の1構成要素である(Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020)。NKG2Aは、25kbに亘る7つのエキソンによってコードされ、いくつかの異なるスプライシングを示す。CD94と一緒に、NKG2Aは、NK細胞、α/βT細胞、γ/δT細胞およびNKT細胞のサブセットの表面上に見出されるヘテロ二量体阻害性受容体CD94/NKG2Aを形成する。阻害性KIR受容体と同様に、その細胞質内ドメインにITIMを有する。本明細書で使用したように、「NKG2A」は、NKG2A遺伝子またはコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体またはアイソフォームを意味する。野生型、完全長NKG2Aと1つまたは複数の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸またはタンパク質配列も包含される。ヒトNKG2Aは、3つのドメインに233個のアミノ酸を含み、細胞質ドメインは以下の配列の残基1〜70を含み、膜貫通領域は残基71〜93を含み、細胞外領域は残基94〜233を含む。
【００７３】
【化１】
2014519522.tif 000002
【００７４】
HLA-E(OMIM143010、その開示全体は本明細書で参照として組み込まれる)は、細胞表面で発現し、その他のMHCクラスI分子のシグナル配列から得られたペプチドの結合によって調節される非古典的MHC分子である。HLA-Eはナチュラルキラー(NK)細胞およびいくつかのT細胞に結合し、CD94/NKG2A、CD94/NKG2BおよびCD94/NKG2Cに特異的に結合する(例えば、その開示全体が本明細書に参照として組み込まれるBraud et al. (1998) Nature 391 :795-799を参照のこと)。HLA-Eの表面発現は、CD94/NKG2A+NK、TまたはNKT細胞クローンによる溶解から標的細胞を保護するために十分である。本明細書で使用したように、「HLA-E」は、HLA-E遺伝子またはコードされるタンパク質の任意の変種、誘導体またはアイソフォームを意味する。野生型、完全長HLA-Eと1つまたは複数の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸またはタンパク質配列も包含される。
【００７５】
本発明の場合、「ヒトCD94/NKG2A受容体に結合する作用物質」または「抗NKG2A抗体」または「NKG2A結合抗体」とは、作用物質および/または抗体をCD94/NKG2AまたはNKG2Aの存在下でインキュベートし、例えば、放射線標識、質量分析などの物理的方法、または、例えば、細胞蛍光測定分析(例えば、FACScan)を使用して検出される直接または間接的蛍光標識によって結合を検出する任意の標準的アッセイを使用して、ヒトCD94/NKG2A受容体への結合が検出可能な任意の作用物質および/または抗体を意味する。対照、非特異的作用物質で認められる量を上回るいかなる結合量も、作用物質が標的に結合することを示す。
【００７６】
本明細書で使用したヒト化Z270またはhumZ270またはhZ270という用語は、本出願に参照として組み込んだ特許出願WO08009545で開示された抗体(配列番号2および配列番号3)を含む。本明細書で使用したヒト化Z199またはhumZ199という用語は、本特許出願に参照として組み込んだ特許公報WO09092805で開示された抗体(配列番号4および配列番号5)を含む。
【００７７】
本明細書では、「伸長(Protractive)基」/「半減期延長部分(half life extending moieties)」は、-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2または1個もしくは複数のN-および/またはO-グリカン構造などの、1個または複数のアミノ酸側鎖官能基に付着した1個または複数の化学基で、治療タンパク質/ペプチドに結合させると、これらのタンパク質/ペプチドのインビボにおける循環半減期を延長することができる化学基と理解される。「伸長基」の例には、限定はしないが、生体適合性脂肪酸およびそれらの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサンポリマー(HEP)、ホスホリルコリンをベースにしたポリマー(PCポリマー)、フレキシマー(Fleximer)、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTENポリマー、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチドおよび任意のそれらの組み合わせが含まれる。
【００７８】
本明細書では、「NKG2A Fc融合タンパク質」という用語は、任意の抗体アイソタイプから得ることができるFcドメインと融合したNKG2Aを包含することを意味する。
【００７９】
炎症は、病原体、損傷を受けた細胞または刺激物を含む様々な刺激に対する組織の複雑な生物学的応答である。炎症は、生物が有害な刺激を除去または隔離し、治癒プロセスを開始するための防御応答である。炎症は、感染と同じ概念ではなく、感染は外来病原体による生物の侵襲であるが、炎症は病原体に対する免疫系の応答である。
【００８０】
炎症は、脈管構造(例えば、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞)、免疫系の細胞(例えば、TおよびBリンパ細胞、単球、樹状細胞、好中球)、細胞由来可溶性メディエーター(サイトカイン、ケモカイン)および標的組織内の常在細胞(例えば、上皮細胞、滑膜線維芽細胞、神経細胞)も含む多数の成分が関与する事象のカスケードである。急性炎症は、短い期間(数時間から数日)であり、主として組織の常在細胞、白血球の移動ならびに体液および血漿タンパク質の炎症部位への浸出が関与する。これは、血管の流れの変化、細胞活性化および循環から傷害部位へ白血球を誘引する細胞成分から生じる。慢性炎症は、活発な炎症、組織破壊および修復の試みが同時に進行する期間が長い。慢性炎症は、持続的な感染、毒性作用物質への長期および反復曝露から生じるか、または身体の免疫細胞が自分自身の組織を攻撃し、損傷を引き起こす現象、自己免疫によるものである。
【００８１】
通常、免疫系は身体の正常な細胞(または「自己」)と外来病原体または異常な細胞(「非自己」)を区別することができる。いくつかの場合、免疫系は、「自己」を正常として認識する能力を失い、組織または細胞に対する応答を不適切に惹起する。この応答は自己に対する寛容の欠如から生じ、「自己免疫」と称される。自己免疫から生じる病理は、重篤な臨床結果を有することが多く、世界中で、特に先進国において主要な健康問題の1つである。このような自己免疫疾患の例には、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、I型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、過敏性腸症候群、多発性硬化症(MS)、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、アレルギー、喘息および急性もしくは慢性炎症のいずれかの結果であるその他の自己免疫疾患が含まれる。
【００８２】
免疫系が「自己」を正常として認識する能力およびその後の組織または細胞に対する応答を欠如するプロセスは、寛容の欠如、「自己免疫」の状態を引き起こす。自己免疫から生じる病理は、重篤な臨床結果を有することが多く、世界中において主要な健康問題の1つである。
【００８３】
標的化生物学的治療薬は現在、ある種の自己免疫疾患および/または慢性炎症性疾患の治療に利用可能である。例えば、関節リウマチの患者は、抗CD20、TNFアンタゴニスト(可溶性TNFRまたは抗TNF-a)で治療することができ、乾癬の患者は、抗CD11aで治療することができ、多発性硬化症の患者はINF-ベータで治療することができ、潰瘍性大腸炎の患者は抗TNF-aで治療することができ、クローン病の患者は抗-TNF-αまたは抗CD4インテグリンで治療することができる。残念なことに、これらの生物製剤のいずれか1つで治療を受けた患者の多くは様々な副作用を経験することがあり、応答が不十分で、および/または薬剤に対して中和抗体を発生し得る。病原体を特異的に標的とするが、健康な細胞/組織には影響を及ぼさず、重篤な副作用をほとんど引き起こさず、長期間使用することができ、および/または中和抗体の生成を引き起こさない別の生物学的医薬品が未だに必要とされている。本発明は、自己免疫および/または慢性炎症性疾患の患者において未だ満たされていないこれらの要求に関し、このような治療での使用に適した抗体を開示する。
【００８４】
関節リウマチ(RA)は、全身に影響を及ぼす全身性疾患で、関節炎の最も一般的な形態の1つである。疼痛、硬直、温感、発赤および腫脹の原因となる関節の炎症が特徴である。この炎症は、炎症性細胞が関節に侵入した結果で、これらの炎症細胞は、骨および軟骨を消化することができる酵素を放出する。その結果、この炎症は、重篤な骨および軟骨の損傷ならびに関節の変質ならびにその他の生理学的効果の中でも重篤な疼痛を引き起こし得る。関与する関節は、形状および整合性を失うことがあり、疼痛および動きの制限(loss of movement)を生じる。
【００８５】
当分野で知られた関節リウマチの動物モデルはいくつかある。例えば、コラーゲン誘導関節炎(CIA)モデルでは、マウスはヒト関節リウマチに類似した炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと類似の免疫学的および病理学的特徴を共有するので、可能性のあるヒト抗炎症化合物のスクリーニングに適したモデルとなっている。このモデルでの有効性は、関節の腫脹の減少によって評価される。臨床上のRAにおける有効性は、関節の腫脹、赤血球沈降速度、C反応性タンパク質レベルおよび血清因子のレベルの組み合わせとして測定される患者の症状を低下させる能力によって評価される。
【００８６】
RAに関連した軟骨侵食または軟骨破壊は、滑膜下層に存在する線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)のサブセットによって主に引き起こされる。時々、B型滑膜細胞またはRA滑膜線維芽細胞(RASF)とも称されるFLSは間葉由来で、炎症を存続させるサイトカインを産生することによって重要な役割を果たし、軟骨破壊に関与するプロテアーゼの主要な産生体である。RSにおいて、FLSは細胞外軟骨マトリックスに侵入することができる侵襲性の表現型を表し、さらに関節の損傷を悪化させる。
【００８７】
本明細書で言及した軟骨侵食または軟骨破壊は、軟骨組織の欠損または分解である。
【００８８】
破骨細胞による骨組織の除去である骨吸収は、単球細胞系列から得られる特殊化した多核細胞である破骨細胞に特有の機能である。それらの分化は、マクロファージコロニー刺激因子、RANKリガンドおよび破骨細胞分化抑制因子ならびに破骨細胞の分化、活性化および/または生存を正または負に調節することができるその他の多数のメディエーターよって調節される。破骨細胞は、破骨細胞と骨の間に隔離された微小環境を確立させる特殊な細胞骨格を生成し、そこでプロトン輸送および酵素放出が関与するプロセスによって骨タンパク質および無機質の分解が生じる。
【００８９】
本明細書で言及した骨侵食とは、骨吸収の速度が骨形成速度を上回る上昇がわずか(またはわずか以上)ではあるが持続するとき生じる骨重量または骨塩密度の損失である。
【００９０】
骨関節炎(OA)は、特に成人65歳以上において最も一般的な関節炎である。この疾患は、しばしば慢性的な疼痛および身体障害を引き起こす慢性変形性関節障害が特徴である。特定の関節におけるOAの報告されている発症率および有病率は、OAの症例定義の違いによって大きく異なる。例えば、OAはX線撮影診断基準のみ(X線撮影OA)によって、典型的な症状(症候性OA)によって、またはその両方によって定義することができる。X線撮影診断基準を使用すると、手の遠位および近位指節間関節は最も一般的に影響を受ける関節として同定されてきたが、最も症状が起こりにくい。対照的に、X線撮影OAでは2番目および3番目に一般的な位置である膝および腰はそれぞれ、ほとんどいつも症状を示す。第1中足骨指関節および手根中手関節はまた、X線撮影OAの頻繁な部位で、一方、肩、肘、手首および中手指節関節が原因不明のOAを発症することは稀である。
【００９１】
年齢は、OAの最も一貫して同定される危険因子であり、有病率は男性で50歳、女性で40歳以降に急激に上昇する。OAは、典型的な症状、身体的所見およびX線撮影変化の3つの組み合わせによって診断される。アメリカリウマチ学会は、X線撮影所見を含むが、それだけに頼らない症候性OAの患者の同定に役立つ分類基準を示した。早期疾患を有する患者は、活動と共に悪くなり、休息によって軽減する局所的な関節痛を経験し、一方、重篤な疾患の患者は、休息時にも疼痛を有することがある。体重のかかる関節は、疾患の進行の結果である関節内障のため「ロック」または「崩壊する(give way)」ことがある。朝のこわばりまたはその後の不活動(「ゲル現象」)が30分を超えることは稀である。
【００９２】
骨関節炎関節における身体的所見には、骨の拡大、捻髪音、冷たい浸出液(cool effusions)および可動域の減少が含まれる。関節裂隙の触診に対する圧痛および他動運動に対する疼痛も一般的であるが、OAに特有ではない。OAのX線撮影所見(スライド)には、骨棘形成、関節腔狭小化、膝軟骨下硬化および嚢胞が含まれる。骨棘の存在は比較的進行した疾患の指標であるが、最も特異的なX線撮影マーカーである。
【００９３】
X線撮影は、OA診断の「究極の判断基準」試験であるが、X線撮影の変化は、この疾患の比較的後期においてのみ明白である。OAの早期診断およびその進行のモニタリングを可能にする感受性のある特異的な生物学的マーカーが大いに必要とされている。最近の研究によって、CRPの上昇がより迅速に進行性の疾患を予測することが示唆されているが、沈降速度およびC反応性タンパク質などの日常的な実験室研究はOAのマーカーとして有用ではない。しかし、OAのマーカーとしていくらか有望である軟骨成分のいくつかのエピトープが記載されたことがある。例えば、通常胎児および新生児軟骨でのみ発現するコンドロイチン硫酸エピトープ846は、OAでは認められたが、正常な成人の軟骨および滑液では認められなかった。同じように、II型コラーゲンに特有のエピトープがOA軟骨で記載され、正常な軟骨をMMPに曝露することによってインビトロにおいてこのエピトープを明らかにすることができる。このエピトープは、血液および尿中で測定することができ、OA進行の診断またはモニタリングに有用であることを実証することができる。血清ヒアルロン酸レベルの上昇はまた、X線撮影OAと相関することがいくつかによって示された。外傷性関節傷害後の滑液における軟骨オリゴマータンパク質(COMP)レベルの上昇の所見は、損傷を受けた関節におけるOAの発症の前兆となり得る。OAのその他の可能性のあるマーカーが列挙されているが、容易に利用できないか、または可能性のあるOAマーカーとして見なすのに必要な感受性および特異性が欠如している。
【００９４】
炎症の臨床症状、OA滑膜組織における組織学的炎症および炎症を起こした滑膜の辺縁の早期軟骨病変の存在は、滑膜炎がOAの病理発生における中心的要素であるということを強く指示している。軟骨のみの疾患としてのOAの伝統的な見方はもう過去のものである。OAは、滑膜組織を含む関節全体の疾患であると現在では考えるべきである。骨、軟骨および滑膜は細胞-細胞相互作用によって、可溶性メディエーターの放出および機械的シグナルを介して連絡している。滑膜炎症は、OAの発症の必要条件ではないが、軟骨破損、したがって、この疾患の進行に明らかに関与している。炎症性滑膜の標的化は、特に早期OAにおける関節軟骨損傷および骨棘の形成を遅延または防止するだろう。
【００９５】
乾癬性関節炎は、乾癬の患者のサブセットにおいて生じる炎症性関節炎の1種である。これらの患者では、皮膚病理/症状には、関節リウマチにおいて見られるのと同様に、関節腫脹が伴う。落屑を伴う皮膚炎症の斑状の浮き出た赤い区域が特徴である。乾癬は肘および膝の先端、頭皮、臍、ならびに生殖器領域または肛門周辺に影響を及ぼすことが多い。
【００９６】
「乾癬性関節炎」という用語は、末梢単関節、少数関節および多関節型疾患から中軸骨格を含む範囲の関節炎の異種群を意味する。その上、この明らかな臨床的不均一性にも関わらず、これらの様々な症状は、乾癬の皮膚徴候、リウマチ因子の血清学的陰性、類似のヒト白血球抗原(HLA)の関連およびX線撮影の類似性を有する個体で生じることで統合される。
【００９７】
北アメリカの白人人口の約2%が乾癬を有する。これらのうち、5〜7%が何らかの形態の炎症性関節炎に罹患している。全体的に見て、男女は同等の頻度で罹患するが、実際の男性:女性比は問題にするサブセットに応じて変化し得る。発症ピークは、40代から60代である。乾癬皮膚疾患は、症例の70%において関節炎の発症に先行し、症例の15%において関節炎と同時発生し、症例の15%において関節炎の発症後に生じる。
【００９８】
乾癬性関節炎の原因はわかっていない。乾癬性関節炎における末梢関節での作用は、1/3の症例において皮膚での作用と併行しており、一方、皮膚での作用および中軸骨格疾患は一致しないようである。遺伝的要素は、重要な役割を担うようである。一卵性双生児における乾癬の一致は70%である。この疾患の患者の第1度近親者における乾癬性関節炎発症の危険性は50倍に増加する。罹患した母親と比較して、罹患した父親による疾患「伝達」の危険性は2倍に増加する。クラスIおよびクラスII両方のHLA対立遺伝子の発現に疫学的関連がある。環境要素も関わってきた。連鎖球菌感染は、滴状乾癬の発症を誘発し得る。HIV感染は、乾癬および乾癬性関節炎の両方、ならびに既存の疾患の悪化を示し得る。身体的外傷は、関節炎の発症を誘発することが報告されており、乾癬性関節炎は「深刻なケブナー現象」の徴候であることが示唆される。この疾患の炎症および自己免疫の特色は、臨床症状だけでなく、T細胞および様々なサイトカインが疾患作用の開始および永続化の両方において果たすことが示された役割によって支持される。
【００９９】
乾癬悪化の前兆となり得る要素には、広範な皮膚の関与、乾癬の強い家族歴、女性、<20歳の年齢での疾患発症、HLA-B27、-DR3または-DR4対立遺伝子の発現および多関節型または侵食性の疾患が含まれる。
【０１００】
骨粗鬆症(OP)は、骨強度不良および骨折の危険性の増加を引き起こす骨の疾患である(例えば、Theill et al. (2002) Annu Rev Immunol 20:795-23を参照のこと)。骨粗鬆症では、骨塩密度(BMD)が低下し、骨の微小構造が徐々に劣化する。世界保健機構(WHO)によって定義されたように、この疾患は、平均ピーク骨量(若い健康な成人の平均)よりも2.5標準偏差以上下回った骨塩密度によって定義される。この疾患は、原発性タイプ1、原発性タイプ2または続発性に分類することができる。閉経後の女性に最も一般的な骨粗鬆症の形態は、原発性タイプ1または閉経後骨粗鬆症と呼ばれる。原発性タイプ2骨粗鬆症(または老人性骨粗鬆症)は、75歳以後に生じ、女性および男性の両方に2:1の比で見られる。最後に、続発性骨粗鬆症は、いかなる年齢でも生じることがあり、男性および女性が同等に罹患する。骨粗鬆症のこの形態は、慢性的な素因となる医療問題もしくは疾患、またはグルココルチコイドなどの治療薬の長期使用から生じる。骨の吸収は、閉経後骨粗鬆症の主要な病理要素である。迅速な、または比較的迅速な骨量/骨塩密度の損失が、破骨細胞の数の増加または過剰な破骨細胞活性によって引き起こされることが多い(Walsh et al. (2005) Immunol Rev 208:228-251)。
【０１０１】
骨粗鬆症のリスクは、生活様式の変化(例えば、食事、運動、転倒防止)および時々治療薬(例えば、カルシウム、ビタミンD、ビスホスホン酸塩およびその他いくつか)を使用することによって低下させることができる。
【０１０２】
本明細書で使用した「治療」という用語は、任意のヒトの内科的療法を意味する。前記対象は、前記特異的治療の使用が前記ヒト対象の健康に有益であることを示す暫定的または決定的診断を行う医師による理学的検査を受けることが期待される。前記治療の時期および目的は、対象の健康の現状に応じて、個体ごとに異なることがある。したがって、前記治療は、予防的、姑息的、対症的および/または根治的であってもよい。
【０１０３】
本発明に関して、予防的、姑息的、対症的および/または根治的治療は、本発明の別の態様を表していてもよい。
【０１０４】
一態様では、本発明は、本明細書で記載した抗体、抗体の抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞などの本発明の分子を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された本発明の1種もしくは複数の抗体または抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。
【０１０５】
したがって、本発明の一つの目的は、0.25mg/mlから250mg/mlの濃度で存在するこのような抗体を含む医薬製剤を提供することであり、前記製剤のpHは2.0から10.0である。製剤はさらに、緩衝系、保存剤(複数可)、等張化剤(複数可)、キレート剤(複数可)、安定化剤および界面活性剤を含んでいてもよい。保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤および界面活性剤の医薬組成物における使用は当業者には周知である。Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995を参照することができる。
【０１０６】
一実施形態では,医薬製剤は水性製剤である。このような製剤は通常、溶液または懸濁液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む製剤と定義される。同様に、「水性溶液」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む溶液と定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む懸濁液と定義される。
【０１０７】
別の一実施形態では、医薬製剤は凍結乾燥製剤で、医師または患者が使用前に溶媒および/または希釈剤を添加する。
【０１０８】
他の態様では、医薬製剤はこのような抗体の水性溶液および緩衝液を含み、抗体は1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤のpHは約2.0から約10.0である。
【０１０９】
本発明の抗体は、非経口的に、例えば、静脈内、例えば、筋肉内、例えば、皮下に投与してもよい。あるいは、本発明の抗体は、非経口的ではない(non-parenteral)経路で、例えば、経口的または局所的に投与してもよい。本発明の抗体は、予防的に投与してもよい。本発明の抗体は、治療的に投与してもよい(要求に応じて)。
【０１１０】
本発明の文脈では、「軟骨破壊細胞の選択的排除」とは、NKG2Aに対する抗体が、NK細胞が媒介する、例えば、線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)またはその他の軟骨破壊細胞などの軟骨破壊細胞の排除を増加させ、一方、例えば、包皮線維芽細胞(FSK4細胞)またはその他の正常な線維芽細胞などの正常な線維芽細胞の排除は増加させないプロセスを意味する。この選択的排除は、例えば、標準的LDH放出アッセイまたは治療化合物が軟骨破壊細胞を排除する能力を測定するその他の公知の適切なアッセイで測定することができる(例えば、実施例4および図5Bを参照のこと)。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも5%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも10%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも20%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも30%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも40%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも50%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも60%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも70%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも80%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも90%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも100%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも125%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも150%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも175%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも200%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも225%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも250%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも275%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも300%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも350%増加を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも400%増加、または軟骨破壊細胞に特異的な細胞傷害性の少なくとも500%増加を引き起こす。
【０１１１】
本発明の文脈では、「骨侵食細胞の形成を低下させる」とは、抗NKG2A抗体が例えば、破骨細胞、TRAP+多核細胞またはその他の骨侵食細胞などの骨侵食細胞の形成を低下させるプロセスを意味する。
【０１１２】
骨侵食細胞の形成低下は、接着性骨侵食細胞の視覚による計数(実施例6および図6Cを参照のこと)または骨侵食細胞の形成低下を測定する任意のその他の適切な方法によってインビトロで測定することができる。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも5%の低下または骨侵食細胞の少なくとも10%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも20%の低下または骨侵食細胞の少なくとも30%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも40%の低下または骨侵食細胞の少なくとも50%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも60%の低下または骨侵食細胞の少なくとも70%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも80%の低下または骨侵食細胞の少なくとも90%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも100%の低下または骨侵食細胞の少なくとも125%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも150%の低下または骨侵食細胞の少なくとも175%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも200%の低下または骨侵食細胞の少なくとも225%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも250%の低下または骨侵食細胞の少なくとも275%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも300%の低下または骨侵食細胞の少なくとも350%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも400%の低下または骨侵食細胞の少なくとも450%の低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2A抗体は、骨侵食細胞の少なくとも500%の低下を引き起こす。
【０１１３】
さらに、本発明の文脈における「骨侵食細胞の形成の低下」は、インビトロにおける骨塩侵食の低下を意味する。
【０１１４】
インビトロでの骨塩侵食の低下は、骨塩ディスク(すなわち、オステオロジックディスク)上で細胞または組織を培養することによって、またはその他の適切な方法によって測定することができる(実施例6および図6D、6E、6Fおよび6Gを参照のこと)。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の10%低下または骨塩侵食の20%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の30%低下または骨塩侵食の40%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の50%低下または骨塩侵食の60%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の70%低下または骨塩侵食の80%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の90%低下または骨塩侵食の100%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の125%低下または骨塩侵食の150%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の175%低下または骨塩侵食の200%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の250%低下または骨塩侵食の300%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の350%低下または骨塩侵食の400%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の450%低下または骨塩侵食の500%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の550%低下または骨塩侵食の600%低下を引き起こす。一実施形態では、抗NKG2Aは、骨塩侵食の650%低下または骨塩侵食の700%低下を引き起こす。
【０１１５】
(実施例)
(実施例1)
RA患者の線維芽細胞様滑膜細胞上で発現した細胞表面分子
図1Aでは、RA滑膜組織から得られた接着性RA-FLSはEDTA 2mMを使用して脱離し、表面の線維芽細胞マーカーCD55(白いヒストグラム、右図)およびマクロファージマーカーCD68(白いヒストグラム、左図)の発現を染色した。灰色のヒストグラムは、アイソタイプ対照抗体を使用した染色を表す。図1Aに示したように、RA-FLSはCD55の同種発現を示し、CD68の欠損は接着性RA-FLSが線維芽細胞様起源であることを裏付ける。
【０１１６】
図1Bに示したように、RA-FLSは高レベルのULBP-1、ULBP-2およびULBP3、低レベルのMIC-AおよびMIC-Bを発現し、いずれもNK細胞受容体NKG2Dを活性化することが知られているリガンドである。さらに、RA-FLSは、それぞれDNAM-1のリガンドであるCD155(ポリオウイルス受容体PVR)および2B4のリガンドであるCD48を発現する。DNAM-1によって認識される別のリガンド、CD112(ポリオウイルス関連受容体2、PRR2)の発現は検出されなかった。NKp30、NKp44およびNKp46のFc融合タンパク質を使用して、RA-FLSに対する推定NKp44リガンドの比較的高い発現を検出したが、NKp30-FcおよびNKp46-Fcはこれらの細胞を染色することができなかった。細胞はフローサイトメトリーによって分析した。色の付いたヒストグラムは関連するアイソタイプ対照を表している。ヒストグラムは、ドナーn≧3を代表している。
【０１１７】
図1Cは、RA-FLSに対する可溶性NKp44-Fc融合タンパク質の結合が特異的で、抗NKp44mAbの用量を増加させて添加すると消失することを示す。接着性RA-FLSはEDTA 2mMを使用して脱離し、表面はNKp44-Fc融合タンパク質10ug/mL(白いヒストグラム)または陰性対照として同Fc断片(ヒトlgG1)(灰色のヒストグラム)で染色した。指示があれば、NKp44-Fcは抗NKp44または抗NKp46mAbで予めインキュベートした。
【０１１８】
図1Dに示したように、RA-FLSは、阻害性NK細胞受容体CD94- NKG2AのリガンドであるHLA-EおよびLIR-1のリガンドであるHLA-Gの両方を高レベルで発現する。したがって、ほとんどの滑膜NK細胞は阻害性CD94- NKG2A受容体を発現するので、HLA-Eは炎症を起こした滑膜においてNK細胞媒介細胞傷害性からRA-FLSを保護する重要な分子であり得る。
【０１１９】
図1Eにおいて、RA-FLSは、細胞死受容体5(DR5)は発現するが、DR4は発現しないことが示される。これらの受容体は、TRAIL(TNF関連アポトーシス誘導リガンド)による認識においてアポトーシスシグナルを伝達する。したがって、DR5は、炎症を起こした滑膜組織内において場合によってはRA-FLS細胞死を媒介することができるTRAIL発現細胞が認識することができる、RA-FLS上で発現した重要なリガンドであり得る。
【０１２０】
(実施例2)
NKG2A発現NK細胞はRA滑膜に存在し、HLA-E発現RA-FLSを含有する区域内に見出すことができる。
図2A、2Bおよび2Cは、マウス抗NKp46(NK細胞、図2A)、抗NKG2A(図2B)およびアイソタイプ対照抗体(図2C)で染色したRAの患者から得られた一連の滑膜組織切片を示す。免疫特異的反応性は、ジアミノベンジジンで視覚化し(顕微鏡写真の濃いスポット)、核はヘマトキシリンで対比染色した(薄いスポット)。結果は、NKp46+ NK細胞が表層下区域に見出され、RA滑膜の滑膜表層近くに少し見出されることを示す(図2A参照)。NK細胞の局在化および頻度は、NKG2A+細胞と非常に類似していることが見出された(比較については図2B参照)。また、アイソタイプ対照で染色した切片には何もなかった(図2C参照)。定量的デジタル画像分析によって評価すると、NKG2A+細胞の頻度は、図2Dに示したように、NK細胞の数と強く相関し(r2=0.950、p<0.0001)一致することが見出された。
【０１２１】
CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-EのRA-FLS上での発現は生体位で評価した(図2E〜H)。RA滑膜組織切片への抗HLA-E抗体3D12の適用によって、図2Eに示したように、マクロファージ様滑膜細胞(MLS)およびRA-FLSで形成される下層の染色が明らかになった。図2Gに示したように、アイソタイプ対照を使用すると染色は認められない。さらに、図2Fに示した浸潤免疫細胞および図2Hに示した血管内皮細胞の両方は、比較的高いレベルでHLA-Eを発現した。
【０１２２】
これらのデータは一緒にすると、NK細胞はRA患者の滑膜の浸潤リンパ細胞集団で同定することができることを示しており、全部ではないがほとんどのNK細胞がNKG2Aを発現することを示唆している。さらに、NKG2A+ NK細胞のサブセットがHLA-E+ RA-FLSに近い区域で見出される。したがって、これは、NKG2A+ NK細胞が生体位ではRA-FLS上のHLA-Eを認識することを場合によっては意味し得る。
【０１２３】
(実施例3)
NKG2D、DNAM-1、NKp44、NKp46およびTRAILは、RA-FLSに対するNK細胞の細胞傷害性に関与する。
図3A1〜3A3では、以下の各ヒストグラムに示したように、いくつかのNK細胞受容体の表面発現が染色されたNK細胞の異なる3つの種類が示され(白いヒストグラム)、関連するアイソタイプ対照による染色も各パネルで示される(灰色のヒストグラム)。図3A1は、代表的なRA患者のSFMCから得られたNK細胞を示し、図3A2は、代表的な健康なドナーのPBMCから得られた休止しているCD56 bright NK細胞を示し、図3A3はNishi NK細胞を示す。
【０１２４】
細胞はフローサイトメトリーによって分析した。NK細胞は生きたCD3-CD56brightとして定義された。データによって、RA患者から得られた滑膜NK細胞がいくつかの活性化受容体を発現し、それらは、CD56 bright NK細胞およびNishi NK細胞と類似した活性化受容体の発現パターンを示すことが示される。
【０１２５】
図3B1は、48ウェルプレートに細胞10000個/ウェルで接種し、72時間コンフルエントになるまで(細胞約48000個/ウェル)増殖させ、その時点でNishiを指示したエフェクター:標的(E:T)比で添加したRA-FLSを例示している(2連のウェルを設定した)。RA-FLSおよびNishiを一晩37℃で共培養し、非接着性細胞をその後洗浄し、接着性細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、エオジンで染色した。免疫スポット画像分析器を使用して、画像を撮影し、覆われた%ウェル区域を定量した(図3B2に示した通り)。
【０１２６】
図3B1および3B2のデータは、NK細胞がインビトロで用量に依存してプラスチック接着性RA-FLSを排除することを示す。
【０１２７】
図3Cおよび図3Dでは、96ウェルプレートに細胞30000個/ウェルで接種し、翌日Nishi90000個/ウェルを添加したRA-FLSを示した。NishiおよびFLSは、指示したようにBD GolgiStop、FITCコンジュゲート抗CD107a/b抗体およびブロック抗体10μg/mLまたは関連するアイソタイプ対照と共に37℃で5時間共培養した。フローサイトメトリーを実施して、Nishi脱顆粒を測定した。ns=顕著ではない、*P<0.05、**P<0.005、***P<0.001。
【０１２８】
図3Cは、NK細胞は、FLS標的細胞の存在下でのみ脱顆粒し、単独で培養したときには脱顆粒しないことを示す。図3Dは、RA-FLSはNK細胞媒介細胞傷害性に感受性があり、NKG2D、DNAM1、NKp44、NKp46およびTRAILは全て、このような受容体を遮蔽するとCD107a/b発現の有意な低下が示されるので、RA-FLSのNK細胞による特異的認識に関与することを示す。
【０１２９】
(実施例4)
RA-FLSは、NK細胞によって発現される阻害性CD94-NKG2A受容体と相互作用することができるHLA-Eの発現によって、NK細胞媒介細胞傷害性から保護される。
図4Aは、上の行ではRA-SFMCのNK細胞による代表的なヒストグラムを、中央の行では健康なPBMCの休止しているCD56bright NK細胞を、下の行ではNishi NK細胞を示す。NKG2A(左の列)、LIR-1(中央の列)およびKIR(右の列)発現は、対応するアイソタイプ対照(灰色のヒストグラム)と比較して示される(白いヒストグラム)。NK細胞は、抗NKG2A、抗LIR1および抗KIR mAbのカクテルを使用して表面発現を染色し、その後フローサイトメトリーによって分析した。NK細胞は、生きたCD3陰性CD56bright陽性細胞でゲーティングする。
【０１３０】
データは、ほとんどの滑液NK細胞はNishi NK細胞およびCD56bright PB-NK細胞と類似してNKG2Aを発現するが、KIRを欠如していることを示す。滑液NK細胞とは対照的に、Nishi NK細胞はまたLIR-1を発現する。
【０１３１】
図4Bは、96ウェルプレートに細胞3×104個/ウェルで接種し、翌日NishをE:T比3:1(抗LIR-1実験、左図)または6:1(抗NKG2A実験、右図)で添加したRA-FLSを例示している。NishiおよびFLSは、指示したようにBD GolgiStop、FITCコンジュゲート抗CD107a/b抗体およびブロック抗体10μg/mLまたは関連するアイソタイプ対照と共に37℃で5時間共培養した。フローサイトメトリーを実施して、Nishi脱顆粒を測定した。図4Bに示したように、ns=顕著ではない、**P<0.005。
【０１３２】
データは、抗体によるNKG2Aの遮蔽はRA-FLSに対してNK細胞脱顆粒の有意な増加を生じ(右図)、一方、LIR-1の遮蔽はRA-FLSの溶解のいかなる増加も生じないように見える(左図)ことを示す。したがって、NK細胞の抗NKG2A処理によってRA-FLS溶解の増加が生じるという事実は、RA-FLS上で発現したHLA-E分子がCD94-NKG2A阻害性受容体との相互作用に重要な適切なペプチドを提示することを示す。
【０１３３】
図4Cは、96ウェルプレートに細胞2.4×104個/ウェルで接種し、翌日6×103個のNishi/ウェル(すなわち、E:Tは1:4)を添加したRA-FLSを示す。FLSおよびNishiは抗NKG2AまたはヒトlgG4アイソタイプ対照を添加して一晩共インキュベートした。翌日、非接着性細胞を洗浄し、接着性細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、エオジンで染色した。ウェルを分析し、図4Cに示したように、イムノスポット画像分析器を使用して覆われた%ウェル区域を定量した。したがって、データは、NKG2Aの遮蔽が接着性RA-FLSの排除の有意な増加を引き起こすことを示す。
【０１３４】
RA-FLSは、96ウェルプレートに細胞1.5×104個/ウェルで接種し、翌日ウェル当たり4.5×104個の自己由来SMFCを添加した(すなわちE:Tは3:1)。SFMCおよびRA-FLSは、図4Dに示したように、BD GolgiStop、FITCコンジュゲート抗CD107a/b抗体およびブロック抗体10μg/mLまたはヒトIgG4アイソタイプ対照と共に37℃で5時間共培養した。
【０１３５】
したがって、mAbによるNKG2Aの遮蔽は、インビトロにおいて自己由来RA-FLSの排除の著しい増加を引き起こし、抗NKG2A mAbの治療的投与はインビボにおいてRA-FLSの排除の増加を引き起こすことを示唆している。
【０１３６】
図4Eは、96ウェルプレートに接種したFLS3×104個/ウェルを示す。翌日、同種CD56brightCD16dim NK細胞を磁気分離によって健康なドナー血液から単離し、すぐにBDGolgiStop、FITCコンジュゲート抗CD107a/b抗体およびブロック抗体10μg/mLまたは関連するアイソタイプ対照と共にRA-FLSと37℃で5時間共培養した(E:Tは3:1)。フローサイトメトリーを実施して、脱顆粒を測定した。NK細胞は生きたCD3-CD16dimCD56brightとして定義された。下の図は、一人の健康なドナーのCD56bright NK細胞を5人の異なる患者のRA-FLSと共に別々に共培養したことを示す。*P<0.05。
【０１３７】
したがって、休止している新たに単離したPB-NK細胞のNKG2AのmAbによる遮蔽は、インビトロにおいて自己由来RA-FLSの排除の著しい増加を引き起こし、抗NKG2A mAbの治療的投与はインビボにおいてRA-FLSの排除の増加を引き起こすことを再度示唆している。したがって、血流によってその他の関節に移動することができるRA-FLSを拡散する侵襲性の疾患は、CD94-NKG2A阻害性受容体を遮蔽してCD56bright PB-NK細胞を循環させることによって排除することができる。
【０１３８】
図5Aは、2種類の異なるNK細胞系(NKL、左およびNishi、右)をNNC141-0100(HumZ270、黒い棒)、アイソタイプ対照(白い棒)または培地のみ(灰色の棒)の存在下で使用して、FLSのNK細胞媒介細胞傷害性を評価するために使用したLDH放出アッセイを示す。標的に対するNK細胞エフェクター比は1:1である。図5Bは、NNC141-0100(humZ270)を使用してNKG2Aをブロックすることによって、代表的なRA-FLS(RA-FLS2、左図)の溶解の増加が引き起こされるが、正常な包皮線維芽細胞系(FSK4、右図)の排除には影響を及ぼさないことを示した図である。したがって、図3、図4および図5に存在するデータを一緒に考え合わせると、抗NKG2A処理はRA-FLSのNK細胞媒介排除の増加を引き起こすが、正常な線維芽細胞系(FSK4)のNK細胞媒介排除は、NKG2Aを対象とするブロッキング抗体(すなわち、HumZ270)の存在下では影響を受けないことが明らかに示される。
【０１３９】
(実施例6)
humZ270(抗NKG2A)による処理は、TRAP+多核破骨細胞の形成を阻害する。
図6Aは、RA患者から得られたSFMC106個/ウェルをIL-15 10ng/mLを補給した培地中で7日間培養した代表的例を示す。培養物は、アッセイ開始時にヒトlgG4アイソタイプ対照20マイクログラム/ml(図6A)またはhumZ270 20マイクログラム/ml(図6B)で処理した。図6Bにおける抗NKG2A処理は、TRAPを発現する大きなプラスチック接着性多核細胞(すなわち、破骨細胞と定義される)の有意な排除を引き起こすことは理解されよう。
【０１４０】
図6Cは、培地のみ(n=6)またはIL-15 10ng/mLを補給した培地(n=14)で7日間培養したRA患者から得られたSFMCから得られたデータを示す。アッセイ開始時(ベースラインとして定義)に、ヒトlgG4アイソタイプ20マイクログラム/mL(白および濃灰色の棒)またはNNC141-0100 20マイクログラム/mL(humZ270、淡灰色および黒い棒)を培養物に添加した。破骨細胞は、TRAP+多核細胞/ウェルの数として定量した。したがって、図6A、図6Bおよび図6Cを一緒に考えると、インビトロ培養においてSFMCにおけるNKG2Aに対する抗体による処置は、大きな多核TRAP+細胞(すなわち、破骨細胞)の形成によって測定すると、破骨細胞形成の有意な低下を引き起こすことが示される。したがって、この発見は、RA患者における抗NKG2A mAbによる治療的療法は、RAの主要な臨床的特徴である骨侵食の勢いを弱めることを示唆している。
【０１４１】
図6Dでは、RA患者2357番のSFMC培養物で観察された骨塩侵食の代表的な例を示す。ここでは、SFMCは、IL-15およびアイソタイプmAb(左)対抗NKG2A(humZ270、右)の存在下で、骨塩基質の薄層でコーティングしたディスク(すなわち、オステオロジックディスク)上で増殖させた。このディスクをその後フォンコッサで染色し、侵食された区域を免疫スポットS5分析器を使用して分析すると、濃い背景に対して明るい/白い区域として見える。
【０１４２】
図6Eでは、全部で5人のRA患者から得られたデータを示す。SFMCは、IL-15 10ng/mLを補給した培地中で培養した。アッセイ開始時に、ヒトlgG4アイソタイプ20マイクログラム/mL(白い棒)またはNNC141-0100 20マイクログラム/mL(humZ270、黒い棒)を培養物に添加した。平均パーセント+/-SEM侵食したディスク区域は、免疫スポットS5分析器を使用して定量した。図6Dおよび図6Eは一緒にすると、抗NKG2A処置が活性のある骨塩侵食性破骨細胞の形成の有意な低下を引き起こすことを示す。したがって、この発見は、RA患者における抗NKG2A mAbによる治療的療法は、RAの主要な臨床的特徴である骨侵食の勢いを弱めることを示唆している。
【０１４３】
図6Fは、HumZ270(抗NKG2A)は、エキソビボで直接培養したRA滑膜組織人工培養物における骨侵食を抑制することを示す。RA滑膜組織切削は、mAbを添加せずに(対照)またはアイソタイプ、インフリキシマブ(IFX)または抗NKG2A(humZ270)を添加して、FBS10%、HuS2%、P/S、L-glutを補給したIMDM培地で7日間増殖させ、mAbは全て10マイクログラム/mLで培養開始時に添加した。実験は、3連のウェルで設定した。7日目に、ウェルをMilli-Q(商標)水200μLで3回濯ぐことによって培地および細胞を除去した。ディスクはその後漂白溶液(NaOCI約6%、NaCI約5.2%)200μLで5分間濯ぎ、次いでゆっくりピペッティングすることによって残存するいかなる細胞も除去した。最後に、ディスクをMilli-Q(商標)水で3回洗浄し、空気乾燥し、フォンコッサ法で染色した。3連の培養物のこの例から、RA滑膜組織人工培養物のhumZ270処理は、対照またはアイソタイプ処理培養と比較して、侵食(明るい/白い区域)の減少を引き起こすことがわかる。
【０１４４】
図6Gでは、mAbを添加せずに(対照)またはアイソタイプ、インフリキシマブ(IFX)または抗NKG2A(humZ270)を添加して、FBS10%、HuS2%、P/S、L-glutを補給したIMDM培地で7日間増殖させ、mAbは全て10マイクログラム/mLで培養開始時に添加したRA滑膜組織切削の3連の培養物の計算結果(平均+/-SEM)を示す。7日目に、ウェルをMilli-Q(商標)水200μLで3回濯ぐことによって培地および細胞を除去した。ディスクはその後漂白溶液(NaOCI約6%、NaCI約5.2%)200μLで5分間濯ぎ、次いでゆっくりピペッティングすることによって残存するいかなる細胞も除去した。最後に、ディスクをMilli-Q(商標)水で3回洗浄し、空気乾燥し、フォンコッサ法で染色した。RA滑膜組織人工培養物のhumZ270処理は、対照またはアイソタイプ処理培養と比較して、侵食の有意な減少を引き起こす(p=0.005、スチューデントT検定)。したがって、骨物質でコーティングしたディスク(すなわち、オステオロジックディスク)上でエキソビボで直接増殖させたRA組織は著しい侵食能力を示し、このような活性は、抗NKG2Aで処理することによって激しく阻害され、抗NKG2AによるRA患者の治療的療法はRAの主要な臨床的特徴である骨侵食を抑制することが明らかに示唆される。
【０１４５】
(実施例7)
HumZ270(NNC141-0100)の処理によるインビトロ培養におけるSFMC中のサイトカインレベルの変調
図7Aでは、RAの患者から得られたSFMC(n=11)のインビトロ培養物におけるサイトカインレベルの変調(平均+/-SEM)を示す。SFMCは、IL-15 10ng/mLを補給した培地中で7日間培養した。培養物は、アッセイ開始時にヒトlgG4アイソタイプ20マイクログラム/mL(淡灰色の棒)またはNNC141-0100 20マイクログラム/ml(humZ270、濃灰色の棒)で処理した。上清を24時間後に収集し、サイトカインのレベルをBioPlexによって測定した。IL-6レベルは、抗NKG2Aによる処理で有意に低下するが、その他のサイトカインの産生は、M-CSFが24時間後に少し増加した以外は有意には影響を受けない。
【０１４６】
図7Bは、IL-15で刺激し、アイソタイプ対HumZ270(抗NKG2A)で処理したRA-SFMCインビトロ培養物中で測定したIL-6レベル間のペアワイズ比較を示す。IL-6レベルは、インビトロで培養した全SFMCにおいてNKG2Aを遮蔽することによって有意に低下する。
【０１４７】
図7Cにおいて、NNC141-0100(humZ270)は、RAの患者から得られたSFMCのインビトロ培養物中において、ベースラインおよびIL-15刺激IL-6産生の両方を阻害することを示す。RAの患者2人から得られたSFMCによって産生されたIL-6レベルは、示したように、培地のみまたはIL-15 10ng/mLを補給した培地中で確立した培養物において測定した。培養物は、アッセイ開始時にヒトlgG4アイソタイプ20マイクログラム/mL(黒い棒)またはNNC141-0100 20マイクログラム/mlで処理した(humZ270、白い棒)。上清を24、48および72時間後に収集し、IL-6のレベルをBioPlexによって測定した。図7A、7Bおよび7Cは一緒にすると、抗NKG2Aは、インビトロで培養したSFMCにおいてベースラインおよび刺激されたIL-6レベルの両方を抑制することを示す。IL-6は、RA病理発生に関与する重要な炎症誘発性サイトカインである。場合によっては、IL-6の低下は、破骨細胞形成において観察される低下に役割を果たしている。
【０１４８】
(実施例8)
NKG2Aおよび/またはそのリガンドHLA-Eは、RA、骨関節炎(OA)および乾癬性関節炎(PsA)の患者の炎症を起こした滑膜で発現する。
RA滑膜組織中に存在するNK細胞は阻害性NKG2A受容体を発現し、CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-Eを発現する滑膜細胞に隣接したリンパ球凝集物中に主に局在する。これは、15人のドナーのうち2人のRA滑膜組織の代表的写真(ID1144-09:A、C、E、G、IおよびID1591-08:B、D、F、H、J)を示した図8に示される。RA滑膜の一連の切片のNK細胞を抗NKp46抗体(図8ａのAおよびB)、NKG2AをZ199抗体(図8ａのCおよびD)、HLA-Eを3D12抗体(図8ａのEおよびF)およびT細胞を抗CD3抗体(図8ｂのGおよびH)で染色した。IgG2bアイソタイプ対照抗体を使用すると染色は認められなかった(図8ｂのIおよびJ)。免疫特異的反応性は、ジアミノベンジジン(DAB)で視覚化し、核はヘマトキシリン(線=100μm)で対比染色した。矢印頭は、NKp46、NKG2A、HLA-EおよびCD3発現細胞サブセットを有する表層下組織におけるリンパ球凝集を示す。矢印は、NK細胞を有するリンパ球凝集に隣接した過形成性滑膜表層におけるHLA-E+滑膜細胞を示す。アスタリスクは、HLA-E+血管内皮細胞を示す。
【０１４９】
3番目のドナー(ID1595-08)のRA滑膜の一連の切片におけるNKp46+NK細胞(図8ｂのK)およびNKG2A+細胞(L)の高拡大写真は、NK細胞の局在および頻度がNKG2A+細胞と非常に類似していることを強調するために示す。デジタル画像分析を使用して、15人のRA患者の滑膜におけるNKG2A+細胞の数とNKp46+ NK細胞の数とを相関させた(図8ｃ)。結果は、mm2当たりの細胞数として表され、NKG2A+細胞の頻度はNK細胞の数と強く相関し(r2=0.950、p<0.0001)一致することを示す。NKG2A+細胞は、13/15のRA患者の滑膜に存在した。
【０１５０】
これらのデータは一緒にすると、NK細胞はRA患者の滑膜の浸潤リンパ細胞集団で同定することができることを示しており、全部ではないがほとんどのNK細胞がNKG2Aを発現することを示唆している。CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-Eは、多くの浸潤免疫細胞、血管内皮細胞および滑膜細胞(マクロファージ様滑膜細胞(MLS)およびRA-FLS)によって発現される。NKG2A+ NK細胞のサブセットがHLA-E+滑膜細胞に近い区域で見出される。したがって、これは、NKG2A+ NK細胞が生体位ではRA-FLS上のHLA-Eを認識することを場合によっては意味し得る。さらに、HLA-E+浸潤免疫細胞および血管内皮はまた、NKG2A+ NK細胞によって認識され得る。
【０１５１】
NKG2Aおよびそのリガンド、HLA-Eは、骨関節炎(OA)の患者の滑膜で発現する。このことは図9（Ａ〜Ｃ）に示されており、浸潤リンパ細胞の中のNKG2A+細胞(Z199抗体)(図9A)ならびに浸潤免疫細胞、内皮細胞および滑膜細胞によるHLA-E発現(3D12抗体)(図9B)を示している。NKG2A+細胞は、6/9のOA患者の滑膜に存在した。RA患者とは対照的に、デジタル画像分析(r2=0.136、p=0.3295、図9C)によって定量すると、NKG2A+細胞の頻度はOA滑膜におけるNK細胞の頻度とは相関しないようであり、OA滑膜に浸潤するNK細胞のいくつかはNKG2Aを発現しないことがあることを示唆している。
【０１５２】
これらのデータは一緒にすると、OA滑膜細胞サブセットにおけるNKG2AおよびHLA-Eの発現は、RA滑膜における発現と類似していることが示される。したがって、NKG2A+ NK細胞は、OA患者の炎症を起こした滑膜におけるHLA-E+滑膜細胞、血管内皮および浸潤免疫細胞を認識することができる。
【０１５３】
CD94-NKG2Aのリガンド、HLA-Eは、RAおよびOA患者だけでなく、乾癬性関節炎(PsA)患者の炎症を起こした滑膜においても発現することが見出された。このことは、抗HLA-E抗体mAb MEM-E/02によるRA、OAおよびPsA患者(示した通り)の滑膜組織試料の染色を示す図10において示される。正常対照の滑膜において、HLA-E発現は、図10に示したように、血管内皮および、より弱いが、滑膜表層に位置する滑膜細胞のサブセットにおいて認められる。
【０１５４】
これらのデータは、PsA患者の炎症を起こした滑膜における滑膜細胞、血管内皮および浸潤免疫細胞によるHLA-Eの発現を示しており、NKG2A+細胞はこれらの患者のこのようなHLA-E+細胞サブセットを認識できることを意味している。
【０１５５】
本発明のある種の特徴を本明細書で例示し記載するが、多くの改変、置換、変化および同等物が当業者には思い当たるであろう。したがって、添付した特許請求の範囲は、本発明の本当の精神に入れば、このような改変および変化は全て含まれるものとすることは理解されよう。
【０１５６】
実施形態:
1.軟骨破壊および/または骨侵食の治療のための抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１５７】
2.軟骨破壊および/または骨侵食の低下が患者にとって有益な疾患または障害の治療のための、実施形態1に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１５８】
3.前記抗NKG2A抗体が軟骨破壊細胞の選択的排除を刺激し、および/または骨侵食細胞の形成を低下させる、実施形態1または2に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１５９】
4.軟骨破壊細胞の選択的排除および/または骨侵食細胞の低下が患者にとって有益である、実施形態1から3のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６０】
5.軟骨破壊細胞が線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)である、実施形態1から4のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６１】
6.骨侵食細胞が破骨細胞である、実施形態1から5のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６２】
7.骨侵食性破骨細胞がTRAP+多核細胞である、実施形態6に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６３】
8.軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療のための、実施形態1から7のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６４】
9.疾患または障害が骨関節炎である、実施形態8に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６５】
10.疾患または障害が骨粗鬆症である、実施形態8に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６６】
11.疾患または障害が乾癬性関節炎である、実施形態8に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６７】
12.疾患または障害がリウマチ性関節炎(rheumatic arthritis)である、実施形態8に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６８】
13.前記抗体がその抗原結合断片である、実施形態1から12のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１６９】
14.抗体断片がFab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)3、Fv、1本鎖Fv、dsFv、Fd断片、dAb断片、ミニボディ、2特異性抗体、3特異性抗体、4特異性抗体、カッパ体、ラクダIgG、IgNARおよび多特異的抗体断片から選択される、実施形態13に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７０】
15.前記抗体がFab断片である、実施形態1から14のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７１】
16.前記抗体が2特異的抗体である、実施形態1から15のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７２】
17.前記抗体が半減期延長部分にコンジュゲートしている、実施形態1から16のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７３】
18.前記半減期延長部分が、脂肪酸およびそれらの誘導体、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサンポリマー、ホスホリルコリンをベースにしたポリマー、フレキシマー(Fleximer)、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTENポリマー、アルブミン結合ペプチドおよび任意のそれらの組み合わせからなるリストの1つまたは複数から選択される1つまたは複数の半減期延長部分を含む、実施形態1から17のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７４】
19.前記抗体が半減期延長部分の2つ以上の異なる種類にコンジュゲートすることができる、実施形態18に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７５】
20.前記抗体が変異したFcドメインを含み、前記変異がFcγ受容体結合機能の低下を引き起こす、実施形態1から19のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７６】
21.前記Fcドメインが、以下の変異、L234A、L235EおよびG237A、A330SおよびP331S(Kabat番号付け方式に従う)の1つまたは複数を含む、実施形態20に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７７】
22.前記抗体がIgG4Fcドメインを含む、実施形態1から21のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７８】
23.前記IgG4FcドメインがS241P/S228P変異を含む、実施形態22に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１７９】
24.前記抗体が完全長IgG4抗体またはその断片である、実施形態1から23のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８０】
25.前記抗体がヒト化またはヒト抗体である、実施形態1から24のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８１】
26.前記抗体がhumZ270またはhumZ199である、実施形態25に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８２】
27.前記抗体がhumZ270である、実施形態25または26に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８３】
28.前記抗体の重鎖が、
配列番号2のアミノ酸残基31から35(SYWMN)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号2のアミノ酸50〜59(RIDPYDSETH)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号2のアミノ酸95〜102(YCARGGYD)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD3配列
を含む、実施形態25から27のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８４】
29.前記抗体の軽鎖が、
配列番号3のアミノ酸残基24〜34(RASENIYSYLA)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基50〜56(NAKTLAE)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基89〜97(QHHYGTPRT)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列
を含む、実施形態25から28のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８５】
30.前記抗体の重鎖が、
配列番号2のアミノ酸残基31から35(SYWMN)のCRD1配列、および/または
配列番号2のアミノ酸50〜59(RIDPYDSETH)のCRD2配列、および/または
配列番号2のアミノ酸95〜102(YCARGGYD)のCRD3配列
を含む、実施形態25から29のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８６】
31.前記抗体の軽鎖が、
配列番号3のアミノ酸残基24〜34(RASENIYSYLA)のCRD1配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基50〜56(NAKTLAE)のCRD2配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基89〜97(QHHYGTPRT)のCRD3配列
を含む、実施形態25から30のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８７】
32.前記抗体の重鎖が、
配列番号2のアミノ酸残基31から35(SYWMN)のCRD1配列、および/または
配列番号2のアミノ酸残基50〜59(RIDPYDSETH)のCRD2配列、および/または
配列番号2のアミノ酸残基95〜102(YCARGGYD)のCRD3配列を含み、前記抗体の軽鎖が、
配列番号3のアミノ酸残基24〜34(RASENIYSYLA)のCRD1配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基50〜56(NAKTLAE)のCRD2配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基89〜97(QHHYGTPRT)のCRD3配列
を含む、実施形態25〜31のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８８】
33.前記抗体の重鎖が配列番号2を含み、前記抗体の軽鎖が配列番号3を含む、実施形態25から32のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１８９】
34.NKG2Aへの結合に対して実施形態25から33のいずれか一項の抗体と競合する、実施形態1から24のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９０】
35.前記抗体がhumZ199である、実施形態25または26に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９１】
36.前記抗体の重鎖が、
配列番号4のアミノ酸残基31から35(SYAMS)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号4のアミノ酸50〜65(EISSGGSYTYYADSVK)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2、3または4個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号4のアミノ酸99〜108(HGDYPRFFDV)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列
を含む、実施形態25から26または実施形態35のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９２】
37.前記抗体の軽鎖が、
配列番号5のアミノ酸残基24〜34(SASSSVSSYIY)のCRD1配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD1配列、および/または
配列番号5のアミノ酸残基50〜56(LTSNLAS)のCRD2配列であって、これらのアミノ酸残基の1または2個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD2配列、および/または
配列番号5のアミノ酸残基89〜97(QQWSGNPYT)のCRD3配列であって、これらのアミノ酸残基の1、2または3個が異なるアミノ酸によって置換されていてもよいCRD3配列
を含む、実施形態25から26または35から36のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９３】
38.前記抗体の重鎖が、
配列番号4のアミノ酸残基31から35(SYAMS)のCRD1配列、および/または
配列番号4のアミノ酸50〜65(EISSGGSYTYYADSVK)のCRD2配列、および/または
配列番号4のアミノ酸〜108(HGDYPRFFDV)のCDR3配列
を含む、実施形態25〜26または実施形態35から37のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９４】
39.前記抗体の軽鎖が、
配列番号5のアミノ酸残基24〜34(SASSSVSSYIY)のCDR1配列、および/または
配列番号5のアミノ酸残基50〜56(LTSNLAS)のCDR2配列、および/または
配列番号5のアミノ酸残基〜97(QQWSGNPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態25〜26または35から38のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９５】
40.前記抗体の重鎖が、
配列番号2のアミノ酸残基31から35(SYWMN)のCRD1配列、および/または
配列番号2のアミノ酸50〜59(RIDPYDSETH)のCRD2配列、および/または
配列番号2のアミノ酸95〜102(YCARGGYD)のCDR3配列
を含み、前記抗体の軽鎖が、
配列番号3のアミノ酸残基24〜34(RASENIYSYLA)のCDR1配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基50〜56(NAKTLAE)のCDR2配列、および/または
配列番号3のアミノ酸残基89〜97(QHHYGTPRT)のCDR3配列
を含む、実施形態25〜26または35から39のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９６】
41.前記抗体の重鎖が配列番号4を含み、前記抗体の軽鎖が配列番号5を含む、実施形態25から26または35から40のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９７】
42.NKG2Aへの結合に対して実施形態35から41のいずれか一項の抗体と競合する、実施形態1から25のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０１９８】
43.軟骨破壊および/または骨侵食の治療のための実施形態1から7または13から42のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体の使用。
【０１９９】
44.軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療のための、実施形態43に記載の抗NKG2A抗体の使用。
【０２００】
45.疾患または障害が骨関節炎である、実施形態44に記載の抗NKG2A抗体の使用。
【０２０１】
46.疾患または障害が骨粗鬆症である、実施形態44に記載の抗NKG2A抗体の使用。
【０２０２】
47.疾患または障害が乾癬性関節炎である、実施形態44に記載の抗NKG2A抗体の使用。
【０２０３】
48.疾患または障害がリウマチ性関節炎である、実施形態44に記載の抗NKG2A抗体の使用。
【０２０４】
49.実施形態1から48のいずれか一項の抗NKG2A抗体を患者に投与することを含む、軟骨破壊および/または骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療方法。
【０２０５】
50.実施形態1から49のいずれか一項の抗NKG2A抗体を患者に投与することを含む、軟骨破壊を特徴とする疾患または障害の治療方法。
【０２０６】
51.実施形態1から49のいずれか一項の抗NKG2A抗体を患者に投与することを含む、骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療方法。
【０２０７】
52.実施形態1から49のいずれか一項の抗NKG2A抗体を患者に投与することを含む、軟骨破壊および骨侵食を特徴とする疾患または障害の治療方法。
【０２０８】
53.医薬品として使用するための実施形態1から49のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片。
【０２０９】
54.実施形態1から49のいずれか一項に記載の抗体を含む抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片医薬製剤。
【０２１０】
55.医薬品を製造するための実施形態1から49のいずれか一項に記載の抗NKG2A抗体、またはその抗原結合断片の使用。
【０２１１】
本明細書に引用された刊行物、特許出願および特許を含む全参照物は、各参照物が個々におよび特別に参照として組み込まれることが示され、本明細書に全体が記載されたかのように、同じ範囲まで本明細書に参照として組み込まれる。
【０２１２】
表題および副題は全て本明細書では簡便のためのみに使用されており、決して本発明を制限するものではない。
【０２１３】
前記の要素のそれらの可能性のある変種全ての組み合わせは、本明細書で特に示すか、または文脈と明らかに矛盾しない限り本発明に包含される。
【０２１４】
特に表現によって示されているか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本明細書の「または」という用語は、「および/または」の包括的意味で使用され、したがって、用語がこれかあれかのいずれかの排他的意味で解釈されるべきである実施形態または態様を非明示的に支持する。
【０２１５】
本発明を記載する文脈で使用した用語「a」および「an」および「the」および類似の指示物は、本明細書に特に示すか、または文脈と明らかに矛盾しない限り単数および複数の両方を含むものとする。
【０２１６】
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に特に記載がない限り、その範囲に入るそれぞれの別個の値を個々に示す簡略法として役立つよう単に意図されており、それぞれ別個の値は、個々に本明細書に引用されるかのように明細書中に組み込まれる。特に記載しない限り、本明細書で提供される正確な値は全て、対応するおよその値を意味する(例えば、特定の因子または測定値に関して提供される正確な例示的値は全てまた、適切ならば、「約」によって修飾されて、対応するおよその測定値を提供するとみなすことができる)。
【０２１７】
本明細書で記載した方法は全て、本明細書に特に示すか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順番で実施することができる。
【０２１８】
本明細書で提供されたいずれかおよび全ての例、または例示的語句(例えば「など」)の使用は、単に本発明をより明らかにするよう意図されており、特に示さない限り本発明の範囲の限定を示さない。明細書中のいずれの語句も、同様に明らかに記述されていない限り、本発明の実施に不可欠な任意の要素を示すものではない。
【０２１９】
本明細書の特許文献の引用および組み込みは便宜的にのみ行われ、このような特許文献の有効性、特許性および/または実施可能性のいかなる観点も反映しない。
【０２２０】
要素または要素(複数)に関して、「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」または「含有する(containing)」などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施態様の本明細書の記載は、特に記述するか、または文脈に明らかに矛盾しない限り、特定の要素または要素(複数)「からなる(consists of)」、「から本質的になる(consists essentially of)」または「実質的に含む(substantially comprises)」本発明の類似の態様または実施形態の支持を提供することを意図する(例えば、特定の要素を含むと本明細書に記載される組成物は、特に記述するか、または文脈に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物を記載しているとも理解されるべきである)。
【０２２１】
本発明は、適用される法律により許される最大範囲まで、本明細書で提示した態様または特許請求の範囲に引用される主題の改変および均等物全てを含む。
【図１Ａ】
2014519522.tif 000003
【図１Ｂ】
2014519522.tif 000004
【図１Ｄ】
2014519522.tif 000005
【図１Ｅ】
2014519522.tif 000006
【図２Ａ】
2014519522.tif 000007
【図２Ｂ】
2014519522.tif 000008
【図２Ｃ】
2014519522.tif 000009
【図２Ｅ】
2014519522.tif 000010
【図２Ｆ】
2014519522.tif 000011
【図２Ｇ】
2014519522.tif 000012
【図２Ｈ】
2014519522.tif 000013
【図３Ａ】
2014519522.tif 000014
【図３Ａ１】
2014519522.tif 000015
【図３Ａ２】
2014519522.tif 000016
【図３Ａ３】
2014519522.tif 000017
【図３Ｄ】
2014519522.tif 000018
【図４Ｂ】
2014519522.tif 000019
【図６Ａ】
2014519522.tif 000020
【図６Ｂ】
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【図９Ａ】
2014519522.tif 000022
【図９Ｂ】
2014519522.tif 000023
【図１０Ａ】
2014519522.tif 000024
【図１０Ｂ】
2014519522.tif 000025
【図１０Ｃ】
2014519522.tif 000026
【図１０Ｄ】
2014519522.tif 000027
【図１Ｃ】
2014519522.tif 000028
【図２Ｄ】
2014519522.tif 000029
【図３Ｂ１】
2014519522.tif 000030
【図３Ｂ２】
2014519522.tif 000031
【図３Ｃ】
2014519522.tif 000032
【図４Ｃ】
2014519522.tif 000033
【図４Ｄ】
2014519522.tif 000034
【図４Ｅ】
2014519522.tif 000035
【図５Ａ】
2014519522.tif 000036
【図５Ｂ】
2014519522.tif 000037
【図６Ｃ】
2014519522.tif 000038
【図６Ｄ】
2014519522.tif 000039
【図６Ｅ】
2014519522.tif 000040
【図６Ｆ】
2014519522.tif 000041
【図６Ｇ】
2014519522.tif 000042
【図７Ａ】
2014519522.tif 000043
【図７Ｂ】
2014519522.tif 000044
【図７Ｃ】
2014519522.tif 000045
【図８ａ】
2014519522.tif 000046
【図８ｂ】
2014519522.tif 000047
【図８ｃ】
2014519522.tif 000048
【図９Ｃ】
2014519522.tif 000049
【図１１Ａ】
2014519522.tif 000050
【図１１Ｂ】
2014519522.tif 000051
【図１１Ｃ】
2014519522.tif 000052
【図１１Ｄ】
2014519522.tif 000053
【図１１Ｅ】
2014519522.tif 000054
【配列表】
2014519522000001.app
【国際調査報告】
2014519522.tif 000055
2014519522.tif 000056
2014519522.tif 000057
2014519522.tif 000058
2014519522.tif 000059