(57)【要約】  本発明は、Ｎｏｘ４阻害物質、その医薬組成物、ならびに骨粗鬆症または破骨細胞形成不全、特に骨粗鬆症性および前骨粗鬆症性破骨細胞形成不全の治療および／または予防のためのそれらの使用に関する。また、本発明は、骨粗鬆症性または骨減少症性の破骨細胞形成不全の予防および／または治療のための、Ｎｏｘ４阻害物質に関する。前記Ｎｏｘ４阻害物質は、好ましくはＲＯＳ産生の機能的アッセイにおいて、Ｎｏｘ４阻害活性に関して約１０ｎＭから５００ｎＭまでの範囲の阻害定数（Ｋｉ）を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症の予防および／または治療に用いられる、Ｎｏｘ４阻害物質。
【請求項２】
ＲＯＳ産生の機能的アッセイにおいて、Ｎｏｘ４阻害活性に関して約１０ｎＭから５００ｎＭまでの範囲の阻害定数（Ｋｉ）を示す、請求項１に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項３】
骨粗鬆症の予防および／または治療のための、請求項１または２に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項４】
骨粗鬆症性または骨減少症性の破骨細胞形成不全の予防および／または治療のための、請求項１または２に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項５】
パジェット病、不動化によりもたらされる骨量減少、溶骨性の骨転移、および骨腫瘍から選択される二次的原因による骨吸収の予防および／または治療に用いられる、請求項１または２に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項６】
びらん性関節破壊、糖尿病による変形性関節症、骨転移、歯根吸収または原発性萌出不全、骨量減少を伴う二次性副甲状腺機能亢進症、および不動症が原因の骨萎縮の予防および／または治療に用いられる、請求項１または２に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項７】
以下の群：
４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−５−［（２−メトキシピリジン−４−イル）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−メチル−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−５−［（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−メチル−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（３−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（３−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−［（２−メトキシピリジン−４−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，６−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−メチル−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−５−メチル−４−［３−（メチルアミノ）フェニル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（１，３−チアゾール−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，６−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；および
２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン
から選択されるＮｏｘ４阻害物質、ならびにその互変異性体、幾何異性体、光学活性体およびこれらの薬剤的に許容される塩。
【請求項８】
薬剤として用いられる、請求項７に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項９】
少なくとも１つの請求項７に記載のＮｏｘ４阻害物質と、薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０】
Ｎｏｘ４阻害物質が請求項７に記載のものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の用途に用いられる、Ｎｏｘ４阻害物質。
【請求項１１】
Ｎｏｘ４阻害物質が、骨粗鬆症の治療または予防に有用な少なくとも１つの共薬剤と共に投与されるものである、請求項１〜６または請求項１０のいずれか一項に記載の用途に用いられる、Ｎｏｘ４阻害物質。
【請求項１２】
前記共薬剤がビスホスホネート、エストロゲン、およびビタミンＤから選択されるものである、請求項１１に記載のＮｏｘ４阻害物質。
【請求項１３】
破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症の予防および／または治療に有用な少なくとも１つの共薬剤と併用される少なくとも１つのＮｏｘ４阻害物質と、少なくとも１つの薬剤的に許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
前記Ｎｏｘ４阻害物質が請求項７に記載のものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記共薬剤がビスホスホネート、エストロゲン、およびビタミンＤから選択されるものである、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
破骨細胞形成阻害物質の同定方法であって、
（ｉ）スクリーニングの目的物質をＮｏｘ４をコードするかまたは発現する系に接触させる工程と；
（ｉｉ）前記の系におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能を評価する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能を、該物質が存在しない系におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能と比較する工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能の低下が観察される物質を選択する工程と
を含んでなる方法。
【請求項１７】
被験体の破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症を予防または治療する方法であって、それを必要とする被験体に、１またはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質を有効量投与することを含んでなる、方法。
【請求項１８】
被験体の骨における破骨細胞形成を減少させる方法であって、それを必要とする被験体に、１またはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤を有効量投与することを含んでなる方法。
【請求項１９】
前記被験体が、破骨細胞形成の増大または細胞活性の増大の結果としての、破骨細胞の活動亢進からもたらされる骨量減少を患っていることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体が破骨細胞形成不全を患っていることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体が、パジェット病、不動化によりもたらされる骨量減少、溶骨性の骨転移、および骨腫瘍から選択される二次的原因による骨吸収を患っていることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
該被験体が、（リウマチ性）関節炎にみられるようなびらん性関節破壊、糖尿病による変形性関節症、骨転移、歯根吸収または原発性萌出不全、骨量減少を伴う二次性副甲状腺機能亢進症、および不動症が原因の骨萎縮のような破骨細胞形成不全を患っていることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症および／または破骨細胞形成不全、例えば骨粗鬆症性もしくは骨減少症性の破骨細胞形成不全の治療および／または予防に有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、成熟した個体であっても、その生物の必要に応じて絶え間なくリモデリングされるダイナミックな臓器である。骨芽細胞は骨形成を担い、骨髄系列由来の破骨細胞は骨を吸収する。破骨細胞形成には、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび培養モデルの両方において、ＴＮＦスーパーファミリーである「ＮＦκＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）」およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が分化因子として必要とされる。Ｍ−ＣＳＦは、骨髄系細胞におけるＲＡＮＫＬの受容体であるＲＡＮＫの発現を誘導し、ＲＡＮＫリガンドの結合によって破骨細胞形成プログラムが開始され、そして酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）およびカテプシンＫのような破骨細胞遺伝子の誘導が開始される。成熟破骨細胞であってもＲＡＮＫＬによって活性化され、その生存が促進され、構造変化が誘導されて骨の吸収が起こる。破骨細胞形成は、ＴＧＦβのようなサイトカインによってさらに促進され得る。ＴＧＦβは活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を増大させ、かつＮＡＤＰＨ酸化酵素であるＮｏｘ４の発現を誘導することから、酸化ストレスに関連する（Ｓｔｕｒｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９０：Ｌ６６１−Ｌ６７３）。
【０００３】
破骨細胞形成不全は、進行性の骨減少を導く状態として広く報告されており（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，７１４：１１３−２８；Ｍａｒｕｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１１（３）：１３７−４５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．，１７（２）：１２９−４２）、とりわけ破骨細胞によって引き起こされる疾病には、例えばびらん性関節破壊、歯根吸収または原発性萌出不全、および骨粗鬆症発生の前症状がある。したがって、破骨細胞形成過程の障害はこれらの疾病の原因に影響するが、骨芽細胞機能の増大は、骨代謝を増大させ、好ましくない骨構造を形成する可能性のある望まれない副作用を伴って、臨床転帰にのみ影響し得る。
【０００４】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素（ＮＯＸ）は、生体膜を通して電子を伝達するタンパク質である。一般に電子受容体は酸素であり、電子伝達反応の産物はスーパーオキシドである。したがってＮＯＸ酵素の生物学的機能は、酸素からの活性酸素種（ＲＯＳ）の産生である。活性酸素種（ＲＯＳ）は酸素に由来する低分子であり、これには酸素ラジカル（スーパーオキシドアニオン［●Ｏ２−］、ヒドロキシル［ＨＯ●］、ペルオキシル［ＲＯＯ●］、アルコキシル［ＲＯ●］、およびヒドロペルオキシル［ＨＯＯ●］）、ならびに過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のような、酸化剤であり、かつ／または容易にラジカルに転換される一部の非ラジカルが含まれる。一酸化窒素のような窒素含有酸化剤は、活性窒素種（ＲＮＳ）とも称される。ＲＯＳの産生は、一般にスーパーオキシドまたは過酸化水素の産生から始まる反応のカスケードである。スーパーオキシドはまた、特に低いｐＨにおいて自発的に、またはスーパーオキシドジスムターゼの触媒作用によって過酸化水素へと不均化される。ＲＯＳ産生カスケードにおけるその他の要素には、スーパーオキシドと一酸化窒素との反応によるペルオキシ亜硝酸の産生、ペルオキシダーゼを触媒とした、過酸化水素からの次亜塩素酸の産生、および鉄触媒を用いたフェントン反応によるヒドロキシルラジカルの産生が含まれる。
【０００５】
ＲＯＳは、その他の無機低分子、ならびにＤＮＡ、タンパク質、脂質、炭水化物、および核酸のような多数の分子と強力に相互作用する。この初期反応によって第２のラジカルが産生され、損傷の可能性が高まることがある。ＲＯＳは細胞の損傷および病原体の死滅のみではなく、実質的に全ての細胞内および組織内における多くの可逆的調節過程にも関わっている。しかし、基本となる生理的過程の調節におけるＲＯＳの重要性にもかかわらず、ＲＯＳの産生によって標的分子の機能が非可逆的に破壊されるかまたは変化する可能性もある。結果的にＲＯＳに対しては、生物有機体に主に損傷を与えるいわゆる「酸化ストレス」としての認識が高まっている。
【０００６】
Ｎｏｘタンパク質の機能で唯一知られているものは活性酸素種（ＲＯＳ）の産生であるが、Ｎｏｘ４は、スーパーオキシドよりも水素ペルオキシダーゼを産生する点、および構成的に活性化された酵素活性が、迅速な活性化をもたらすシグナル伝達ではなく発現量によって制御されている点で、その他のＮＡＤＰＨ酸化酵素とは異なっている（Ｔａｋａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：１３３０４−１３３１３；Ｈｅｌｍｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ．Ｓｉｇｎａｌ．，１１：１２７９−１２８７）。ＮＡＤＰＨ酸化酵素であるＮｏｘ４は分化した細胞に遍在的に発現しており、Ｎｏｘ４の誘導は、心筋細胞、脂肪細胞、および平滑筋細胞のような間葉系細胞の分化過程に関連している。
【０００７】
破骨細胞の作用の増大による酸化ストレスは、骨吸収の増大、ならびに骨粗鬆症および細胞培養モデルにおける破骨細胞形成に関係する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０６：８５２−８５９；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ，５６：３３−４１）。しかし、破骨細胞形成の間にＮＡＤＰＨ酸化酵素の発現が上昇すること、ならびに全てのＮｏｘタンパク質およびｐ２２ｐｈｏｘの一成分を抑制することで、破骨細胞形成が阻止されることが示されてきたものの（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、上記）、触媒的に作用するＮｏｘアイソフォームそれぞれの役割は明確ではなく、意見の分かれるところである。Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４７，１８９−１９９には、破骨細胞形成を制限するにはＮｏｘ１およびＮｏｘ２を阻害すべきであることの根拠、およびＮｏｘ４の阻害はＲＯＳ産生および破骨細胞形成を阻止するには効率的ではなかったことが示されており、上記のＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５では、骨髄の単球−マクロファージ系細胞におけるＲＡＮＫＬ誘導性のＲＯＳ産生に対しては、Ｎｏｘ２またはＮｏｘ４よりもＮｏｘ１が重要であると結論付けられた。
【０００８】
したがって、破骨細胞、骨吸収、および破骨細胞形成における作用に焦点を当てた、骨粗鬆症治療のための新規な有効薬剤の開発が強く望まれている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、遺伝的なＮｏｘ４の欠失によって、破骨細胞マーカータンパク質である破骨細胞会合受容体（ＯＳＣＡＲ）の発現低下、および骨における骨芽細胞マーカータンパク質であるオステオポンチンの発現上昇の両方が誘導され、この結果得られる、Ｎｏｘ４が破骨細胞形成を制御することによって骨量を調節するという予期せぬ知見に沿うものである。本発明は特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｏｘ４の阻害によって骨量減少を抑制できるという予期せぬ知見に沿うものである。本発明は特に、ＮＯＸ４の発現上昇の結果としての破骨細胞形成不全を、本発明によるＮＯＸ４阻害物質の使用により抑制する能力に関する。
【００１０】
本発明は、骨粗鬆症、特に骨粗鬆症性または骨減少症性の破骨細胞形成不全の治療および／または予防に有用なＮｏｘ４阻害物質に関する。本発明はとりわけ、Ｎｏｘ４活性の阻害または低下に有用な新規分子に関する。
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症の治療および／または予防に用いられるＮｏｘ４阻害物質が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、骨粗鬆症を治療および／または予防する医薬組成物を調製するための１またはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質の使用が提供される。
【００１３】
本発明の第３の態様によれば、新規なＮｏｘ４阻害物質、ならびにその互変異性体、幾何異性体、光学活性体およびこれらの薬剤的に許容される塩が提供される。
【００１４】
本発明の第４の態様は、薬剤として用いられる、新規なＮｏｘ４阻害物質、ならびにその互変異性体、幾何異性体、光学活性体およびこれらの薬剤的に許容される塩に関する。
【００１５】
本発明の第５の態様は、本発明によるＮｏｘ４阻害物質、ならびにその互変異性体、幾何異性体、光学活性体およびこれらの薬剤的に許容される塩の少なくとも１つと、それらの薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の第６の態様は、骨粗鬆症の治療または予防に有用な少なくとも１つの共薬剤と併用される少なくとも１つのＮｏｘ４阻害物質と、少なくとも１つの薬剤的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明の第７の態様は、破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症を予防または治療する方法であって、１またはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質をそれを必要とする被験体に有効量投与することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明の第８の態様は、患者の骨における破骨細胞形成を減少させる方法であって、１つまたはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤をそれを必要とする患者に有効量投与することを含む方法に関する。
【００１９】
本発明の第９の態様は、破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症を予防および／または治療する医薬製剤を調製するための、Ｎｏｘ４阻害物質の使用に関する。
【００２０】
本発明の第１０の態様は、骨粗鬆症性破骨細胞形成および骨減少症性破骨細胞形成を予防および／または治療する医薬製剤を調製するための、Ｎｏｘ４阻害物質の使用に関する。
【００２１】
本発明の第１１の態様は、破骨細胞形成阻害物質の同定方法に関する。
【００２２】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】マウスの骨密度、破骨細胞数、分化、およびＲＯＳ形成に対するＮｏｘ４の遺伝的ノックアウトの影響を示す。Ａ：実施例２で測定した海綿骨密度；Ｂ：ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ，１９０１，Ｂｅｉｔ．Ｐａｔｈ．Ａｎａｔ．，２９：１６３に記載されるフォン・コッサ法によって染色した、非脱灰大腿骨遠位部切片の写真；Ｃ：実施例２で測定した最大力（Ｆｍａｘ）；Ｄ：実施例３で測定した、組織形態計測分析によるＴＲＡＰ陽性破骨細胞数（Ｎ．Ｏｃ）、およびＥ：シグマ−アルドリッチのプロトコル３８７Ａ−１ＫＴ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を用いて、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：４９１−５０４の記載に従って、マイヤーのヘマラウンで対比染色した、ＴＲＡＰ染色切片の代表的な写真；Ｆ：Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，４０５８９−９８の記載に従った、破骨細胞マーカータンパク質である破骨細胞会合受容体（ＯＳＣＡＲ）、骨芽細胞マーカーであるオステオポンチン、およびローディングコントロールとしてのＧＡＤＰＨについての大腿骨ライセートのウェスタンブロット分析；Ｇ，Ｈ：実施例３に記載するように、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて骨髄細胞から分化させ、ＴＲＡＰ染色によって同定した破骨細胞の数（Ｇ）および代表的な写真（Ｈ）；Ｉ：実施例３で測定した、分化前の脾細胞のＲＯＳパーセンテージ；ｎ＞３；＊ｐ＜０．０５。
【図２】実施例３に記載するように、野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウスにおける骨形成マーカー（Ｉ型プロコラーゲンＮ末端ペプチド、ＰＩＮＰ）（Ａ）の血清濃度を、骨吸収マーカーである（ＴＲＡＰ  ５ｂ）（Ｂ）およびコラーゲン架橋Ｃ末端ペプチド（ＣＴＸ）（Ｃ）と比較して示す；ｎ＞３；＊ｐ＜０．０５。
【図３】実施例２に記載するように、野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウスの大腿骨遠位部を（Ａ）骨梁幅および（Ｂ）骨梁厚について組織形態計測した結果を示す；ｎ＞３；＊ｐ＜０．０５。
【図４】実施例４に記載するように、ＲＡＮＫＬによる３０時間の前処置あり（ＲＡＮＫＬ）またはなし（ｃｔｌ）でＭ−ＣＳＦでプライムした骨髄由来単核細胞の細胞内Ｃａ２＋をＦｕｒａ２蛍光で測定することにより、ＲＡＮＫＬにより誘導されたシグナル伝達におけるＮｏｘ４の役割およびそれに対するＮｏｘ４阻害物質の影響を示す。Ａ：野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウス由来の細胞の比較；Ｂ：野生型細胞におけるカルシウム濃度に対するＮｏｘ４阻害物質（化合物（１））または溶媒の影響；ｎ＞３；＊ｐ＜０．０５。
【図５】実施例５に記載するように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨量減少に対するＮｏｘ４の役割を示す。Ａ：健常被験体および骨粗鬆症またはパジェット病の患者に由来するヒト骨材料のＮｏｘ４染色強度の統計分析、ｎ＝３〜４；＊ｐ＜０．０５；ＢおよびＣ：卵巣摘出後６週間目の、大腿骨遠位部の海綿骨密度。野生型動物（表示なし）、タモキシフェンで治療した野生型動物（ＷＴ）、およびタモキシフェンで治療したＮｏｘ４−Ｆｌｏｘ−Ｆｌｏｘ−ＥＲＴ２−Ｃｒｅ＋／０マウス（Ｎ４−Ｃｒｅ＊／＊）の比較、ｎ＝８〜１２；＊ｐ＜０．０５（Ｃ）；溶媒（ｃｔｌ）またはＮｏｘ４阻害物質で処置した野生型動物の比較、６週間のｎ＝１１〜１４（Ｄ）。  統計分析：全ての値は平均±ＳＥＭで表した。統計分析はＡＮＯＶＡとそれに続くＬＳＤ事後検定によって行った。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意であるとみなした。ＷＴ：野生型マウス；Ｎ４−／−：Ｎｏｘ４ノックアウトマウス。
【図６ＡＢＣＤ】実施例５に記載のように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨量減少に対するＮｏｘ４の役割を示す。Ｎｏｘ４阻害物質で治療した野生型動物を、偽手術を施した動物、コントロール（すなわち卵巣を摘出して溶媒で処置した動物（ｃｔｌ））、およびパミドロネート群、すなわち卵巣を摘出した後、１０ｍｇ／ｋｇのパミドロネートで１週間に１回治療した動物と比較した。ＡおよびＢ：卵巣摘出後６週間目の、大腿骨遠位部の全体（Ａ）および海綿（Ｂ）の骨密度；＊ｐ＜０．０５；ＣおよびＤ：キャリブレーションしたマイクロＣＴ技術によって測定した、卵巣摘出後６週間目の、大腿骨遠位部の全体（Ｃ）および海綿（Ｄ）の骨密度の回復；Ｅ：全体の破壊強度（図１における概要と同様）。  統計分析：全ての値は平均±ＳＥＭで表した。統計分析はＡＮＯＶＡとそれに続くＬＳＤ事後検定によって行った。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意であるとみなした。
【図６Ｅ】図６ＡＢＣＤを参照。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下の段落では、本発明の化合物を形成する様々な化学成分の定義を説明するが、これらがより広範な意味をもつことが明確に示されない限り、これらの定義は明細書および特許請求の範囲を通して一律に適用されることが意図される。
【００２５】
本明細書で用いられる「ＮＯＸ４阻害物質」は、直接にＮＯＸ４を、完全にまたは部分的に阻害、遮断、減弱、または妨害することのできるいずれかの物質を指す。「直接に」との用語は、当該化合物が、Ｎｏｘ４の、酵素としての酵素活性、細胞内局在性、タンパク質としての安定性、およびメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質の発現に影響を及ぼすこととして定義される。Ｎｏｘ４阻害物質は、好ましくは組換えタンパク質ＮＯＸ４のようなＮＯＸアイソフォームであるＮＯＸ４タンパク質のみを発現する膜を用いる無細胞アッセイにおいて、酵素活性およびＲＯＳ産生を減少させることができるものである。したがって「阻害物質」との用語は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素４の活性を完全にまたは部分的に阻害する分子を包含することが意図されるが、これに限定されない。特定の実施形態によれば、Ｎｏｘ４阻害物質は、その他のＮｏｘタンパク質、例えばＮｏｘ２と比較して、主要Ｎｏｘ阻害活性成分を有する。
【００２６】
例えば、ＮＯＸ４阻害物質としては、破骨細胞の分化を阻止もしくは減少させるか、または骨変性の起点である破骨細胞集団を減少させることで、破骨細胞形成不全を予防し、減少させ、または除去する物質が含まれる。例えば、ＮＯＸ４阻害物質としては、低分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、キメラタンパク質、天然または非天然のタンパク質、核酸に由来するポリマー（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、またはＬＮＡ）、ＮＯＸ４拮抗活性を有する融合タンパク質、抗ＮＯＸ４中和抗体のような抗体アンタゴニスト、またはこのようなＮＯＸ４アンタゴニストの発現を駆動する遺伝子療法ベクターが挙げられる。
【００２７】
ＮＯＸ４阻害物質は特に、Ｇａｇｇｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１９（２３），６９８９−６９９９に記載の機能的ＲＯＳ産生アッセイにおいて５マイクロモル濃度未満の阻害定数Ｋｉを示す薬剤である。例えば、ＮＯＸ４阻害物質は、組換えタンパク質ＮＯＸ４のようなＮＯＸアイソフォームであるＮＯＸ４タンパク質のみを発現する膜を用いる無細胞アッセイにおいて、１ないし２マイクロモル濃度の範囲でＲＯＳ産生を阻害する薬剤である。
【００２８】
「ｓｉＲＮＡ」との用語は低分子干渉ＲＮＡを指し、これは標的遺伝子に由来する標的ｍＲＮＡをノックダウンまたはサイレンシングさせ得る二本鎖ＲＮＡ（約１９〜２３ヌクレオチド）である。人工のｓｉＲＮＡは、オリゴヌクレオチドとして化学的に合成でき、あるいはプラスミドまたはウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス）内へショートヘアピン型ＲＮＡとしてクローン化でき、あらゆる型の細胞へ一過的または安定的にトランスフェクションできる（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，８：８１−１０８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，１２（５），６３７−６４５）。
【００２９】
本発明による治療または方法の「有効性」との用語は、疾病または状態の経過が、本発明による使用または方法に応答して変化することに基づいて評価可能なものである。例えば、本発明による治療または方法の有効性は、骨量減少の低下および／または骨密度の増大（断層撮影法、密度測定法、または二重エネルギーＸ線吸収測定法により測定）ならびにコラーゲン片のような骨代謝回転の血漿マーカーの変化および／または骨粗鬆症患者の骨粗鬆症による骨折の危険性の減少によって、あるいは例えば閉経後の女性、摂食障害を呈する個人、または経口副腎皮質ステロイド（すなわちヒドロコルチゾン）もしくは抗エストロゲンのような薬物を過剰使用している患者における骨粗鬆症、特に破骨細胞形成不全の発生の危険性の低下によって評価できる。さらなる態様によれば、本発明による治療または方法の有効性は、骨密度、骨の石灰化、または血中にみられる骨代謝マーカーの一部、例えばアルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲンＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）、およびオステオカルシンの測定によって評価できる。
【００３０】
本明細書で用いられる「有効量」との用語は、本発明による少なくとも１つのＮＯＸ４阻害物質またはその医薬製剤の量であって、破骨細胞分化および／または破骨細胞数、あるいは破骨細胞形成を検出可能に低下させる量を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる「破骨細胞形成不全」との用語は、骨代謝回転の亢進、または不動化によりもたらされるパジェット病による骨量減少、溶骨性の骨転移、および骨腫瘍のような二次的原因による骨吸収の亢進に関連するいずれかの状態を指す。
【００３２】
本明細書で用いられる「破骨細胞形成不全」との用語は、パジェット病、不動化によりもたらされる骨量減少、溶骨性の骨転移、および骨腫瘍のような二次的原因による骨吸収の亢進に関連するいずれかの状態を指し、このような骨吸収は破骨細胞形成の増大または細胞活性の増大の結果としての、破骨細胞の活動亢進からもたらされる。別の実施形態によれば、破骨細胞形成不全として、（リウマチ性）関節炎にみられるようなびらん性関節破壊、糖尿病による変形性関節症、骨転移、歯根吸収または原発性萌出不全、骨量減少を伴う二次性副甲状腺機能亢進症、および不動状態が原因の骨萎縮が挙げられる。
【００３３】
被験体に見られる破骨細胞形成不全は、典型的には骨密度の測定、組織検査の実施、または酒石酸抵抗性アルカリホスファターゼのような血漿中の破骨細胞酵素の定量によって検出され得る。
【００３４】
本明細書で用いられる「治療」および「治療する」などは、一般に所望の薬理学的および生理学的効果を得ることを意味する。この効果は疾病、その症状もしくは状態を阻止するかまたは部分的に阻止する点から予防的であってよく、かつ／または疾病に起因する障害、状態、症状、もしくは有害作用の部分的または完全な治癒の点から治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」との用語は、哺乳類、特にヒトの疾病のいずれの治療も網羅し、かつ（ａ）疾病にかかりやすい可能性があるが、まだそうであるとは診断されていない被験体の疾病を発生から予防すること；（ｂ）疾病を阻害すること、すなわちその発症を抑止すること；または疾病を軽減すること、すなわち疾病および／またはその症状もしくは状態を退行させることを包含する。
【００３５】
本明細書で用いられる「被験体」との用語は、哺乳類を指す。例えば本発明が意図する哺乳類としては、ヒト、霊長類、およびウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなどのような家畜が挙げられる。
【００３６】
「薬剤的に許容される塩または錯体」との用語は、本発明による以下の具体的な化合物の塩または錯体を指す。このような塩の例としては、本発明による化合物と有機塩基または無機塩基、例えばアルカリ金属（ナトリウム、カリウム、またはリチウム）およびアルカリ土類金属（例えばカルシウムまたはマグネシウム）からなる群より選択される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩、または炭酸水素塩とを反応させるか、または本発明の化合物と有機一級、二級、また三級アルキルアミンとを反応させて形成される塩基付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。このような塩のその他の例としては、本発明による化合物と塩酸またはシュウ酸などのような有機酸または無機酸とを反応させて形成される酸付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「薬剤的に活性のある誘導体」は、レシピエントへの投与によって本明細書に開示する活性を直接的または間接的に提供できる任意の化合物を指す。また、「間接的」との用語は、内在性の酵素または代謝を通して活性型の薬物に変換され得るプロドラッグを包含する。プロドラッグは、ＮＡＤＰＨ酸化酵素４阻害活性を示す本発明による化合物の誘導体であり、化学的または代謝的に分解され得る基を有する。化合物は生理的条件下での加溶媒分解により、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬剤的に活性のある化合物に変換され得る。本発明は、本発明による化合物の任意の互変異性体をさらに包含する。
【００３８】
本発明によるＮｏｘ４阻害物質
一つの実施形態によれば、本発明は、ＲＯＳ産生の機能的アッセイにおいて、Ｎｏｘ４阻害活性に関して１０ｎＭから５００ｎＭまでの範囲の阻害定数（Ｋｉ）を示すＮＯＸ４阻害物質を提供する。
【００３９】
別の特定の実施形態によれば、提供されるＮＯＸ４阻害物はｓｉＲＮＡである。
【００４０】
別の特定の実施形態によれば、提供されるＮＯＸ４阻害物は抗ＮＯＸ４抗体である。
【００４１】
別の特定の実施形態によれば、提供されるＮＯＸ４阻害物質は以下の群から選択されるものである：
４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−５−［（２−メトキシピリジン−４−イル）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−メチル−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−５−［（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−メチル−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（３−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（３−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−［（２−メトキシピリジン−４−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，６−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−メチル−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−５−メチル−４−［３−（メチルアミノ）フェニル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−メトキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−クロロフェニル）−５−（１，３−チアゾール−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−５−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，６−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
４−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピラジン−２−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；
２−（２−クロロフェニル）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン；および
２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン。
【００４２】
別の特定の実施形態によれば、提供される本発明のＮＯＸ４阻害物質は薬剤として使用されるものである。
【００４３】
組成物
本発明は組成物としての医薬品または治療薬、および骨粗鬆症、特に破骨細胞形成不全を患う患者、好ましくは哺乳類患者、最も好ましくはヒト患者を治療する方法を提供する。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、１またはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質を、本明細書に記載されるいずれかの形態で含有してよい。本発明の組成物は、１またはそれ以上の薬剤的に許容される付加成分、例えばミョウバン、安定剤、抗菌剤、緩衝液、着色剤、香味料、アジュバントなどをさらに含有してよい。
【００４５】
本発明の化合物は、従来から用いられているアジュバント、担体、希釈剤、または賦形剤と共に医薬組成物の形態およびその単位剤形へと調製してよく、そのような形態としては、経口用として、錠剤もしくは充填カプセルのような固形剤、または溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤のような液剤、もしくはそれらを充填したカプセルが用いられてよく、あるいは非経口（皮下を含む）用として、注射用無菌溶液が用いられてよい。このような医薬組成物およびその単位剤形は、ある成分を従来の比率で、付加活性化合物または成分と共に、またはそれらなしで含んでよく、このような単位剤形は、使用が意図された一日投与量に相応の範囲内にある任意の適切な有効量の有効成分を含有してよい。本発明による組成物は、好ましくは注射用である。
【００４６】
本発明の組成物は、水性または油性懸濁液、溶液、エマルション、シロップ、およびエリキシル剤のような液体製剤であってもよいが、これらに限定されない。経口投与に適した液体剤形には、緩衝液、懸濁剤および調剤、着色剤、香味料などを含む適切な水性または非水性ビヒクルが含まれてよい。組成物はまた、使用前に水またはその他の適切なビヒクルで再構成する乾燥製剤として処方されてもよい。このような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、および保存料のような添加物を含有してもよいが、これらに限定されない。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および食用水素化油脂が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエート、およびアカシアが挙げられるが、これらに限定されない。非水性ビヒクルとしては、食用油、アーモンド油、分留ココナッツ油、油状エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。保存料としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる材料および加工技術などについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓの第５部に記載されており、これらは参照することにより本明細書に取り込まれる。
【００４７】
本発明の固形組成物は、従来の方法で処方された錠剤または舐剤の形態であってよい。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、結合剤、フィラー、潤滑剤、崩壊剤、および湿潤剤のような従来の賦形剤を含有してよいが、これらに限定されない。結合剤としては、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液、およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。フィラーとしては、ラクトース、糖、微結晶セルロース、トウモロコシでんぷん、リン酸カルシウム、およびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤としては、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。湿潤剤としてはラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。錠剤は、当該技術分野において公知の方法によってコートされてもよい。
【００４８】
注射用組成物は、典型的には注射用の無菌生理食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水、または当該技術分野において公知であるその他の注射用担体に基づくものである。
【００４９】
本発明の組成物は、限定はされないが、注射または持続点滴のような非経口投与用に処方されてもよい。注射用製剤は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションの形態であってよく、限定はされないが、懸濁剤、安定剤、および分散剤のような製剤用の薬剤を含有してよい。組成物は、限定はされないが、発熱物質を含まない無菌水のような適切なビヒクルによって再構成される散剤の形態で提供されてもよい。
【００５０】
本発明の組成物は、移植または筋肉内注射によって投与され得るデポ製剤としても処方されてよい。組成物は、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば許容される油中のエマルションとして）、イオン交換樹脂、または難溶性の誘導体（例えば難溶性の塩として）によって処方されてよい。
【００５１】
本発明の化合物は、持続放出剤形として、または持続放出薬物送達系から投与されてよい。代表的な持続放出材料についての記載は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに収載されている材料についても見出すことができる。
【００５２】
投与方法
本発明の組成物は、経口、非経口、舌下、経頬投与、またはそれらの組み合わせのようないずれの方法によって投与されてもよいが、これらに限定されない。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、包膜内、および関節内投与が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、遅く調節した点滴と同様に組成物の徐放を可能にする、植込錠の形態によって投与されてもよい。特定の実施形態によれば、１またはそれ以上のＮｏｘ４阻害物質は経口的に投与される。
【００５３】
単回または複数回用量で個体に投与される投与量は、薬物動態特性、患者の状態および特性（性、年齢、体重、健康状態、および大きさ）、症状の程度、併用治療法、治療頻度、および所望の効果のような様々な因子によって異なり得る。
【００５４】
併用
本発明の一つの実施形態によれば、Ｎｏｘ４阻害物質およびその医薬製剤は、単独で、または骨粗鬆症もしくは破骨細胞形成不全の予防および／または治療に有用な共薬剤、例えばビスホスホネート、エストロゲン、またはビタミンＤと併用して投与できる。
【００５５】
本発明は、Ｎｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤の投与を包含し、ここで、Ｎｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤は、その他の治療法または骨粗鬆症の治療に有用な共薬剤（例えば、複数の薬物による治療法）に先立ち、それらと同時に、またはそれらと連続的に治療有効量を個体へ投与される。前記共薬剤と同時に投与されるＮｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤は、同一かまたは異なる組成物として、同一かまたは異なる投与経路によって投与できる。
【００５６】
患者
一つの実施形態によれば、本発明による患者は骨粗鬆症患者である。
【００５７】
特定の実施形態によれば、本発明による患者は破骨細胞形成不全を患う患者である。
【００５８】
別の特定の実施形態によれば、本発明による患者は、破骨細胞形成の増大または細胞活性の増大の結果としての、破骨細胞の活動亢進からもたらされる骨量減少を患っている患者である。
【００５９】
別の特定の実施形態によれば、本発明による患者は、パジェット病、不動化によりもたらされる骨量減少、溶骨性の骨転移、および骨腫瘍から選択される二次的原因による骨吸収を患っている患者である。
【００６０】
別の特定の実施形態によれば、本発明による患者は、（リウマチ性）関節炎にみられるようなびらん性関節破壊、糖尿病による変形性関節症、骨転移、歯根吸収または原発性萌出不全、骨量減少を伴う二次性副甲状腺機能亢進症、および不動状態が原因の骨萎縮のような破骨細胞形成不全を患っている患者である。別の特定の実施形態によれば、本発明による患者は、骨粗鬆症発生の危険性を有する患者である。
【００６１】
本発明による使用
別の実施形態によれば、本発明は、骨粗鬆症を治療または予防する医薬組成物を調製するための、Ｎｏｘ４阻害物質、ならびにその互変異性体、幾何異性体、光学活性体およびこれらの薬剤的に許容される塩を提供する。
【００６２】
特定の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞形成不全を治療または予防する医薬組成物を調製するための、Ｎｏｘ４阻害物質を提供する。
【００６３】
別の実施形態によれば、本発明は、骨粗鬆症を治療または予防するためのＮｏｘ４阻害物質を提供する。
【００６４】
別の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞形成不全を治療または予防するためのＮｏｘ４阻害物質を提供する。
【００６５】
別の実施形態によれば、本発明は骨粗鬆症を患っている患者を治療する方法を提供し、該方法が、それを必要とする患者に、Ｎｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤を有効量投与することを含む。
【００６６】
別の実施形態によれば、本発明は破骨細胞形成不全の患者を治療する方法を提供し、該方法が、それを必要とする患者に、Ｎｏｘ４阻害物質またはその医薬製剤を有効量投与することを含む。
【００６７】
別の実施形態によれば、本発明は、それを必要とする患者において破骨細胞形成を阻害する方法を提供し、該方法は、それを必要とする患者に、Ｎｏｘ４阻害物質を有効量投与することを含む。
【００６８】
別の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞形成阻害物質の同定方法であって、
（ｉ）スクリーニングの目的物質をＮｏｘ４をコードするかまたは発現する系に接触させる工程と；
（ｉｉ）前記の系におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能を評価する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能を、該物質の非存在下でのＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能と比較する工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）におけるＮｏｘ４の活性またはＮｏｘ４の発現能の低下が観察される物質を選択する工程と
を含んでなる方法を提供する。
【００６９】
特定の実施形態によれば、破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症の予防および／または治療に用いられる破骨細胞形成阻害物質の同定方法が提供される。
【００７０】
別の特定の実施形態によれば、本発明による破骨細胞形成阻害物質の同定方法では、Ｎｏｘ４活性が酵素アッセイ、免疫アッセイ、ウェスタンブロッティングアッセイ、およびＲＯＳ形成アッセイによって評価される。
【００７１】
別の特定の実施形態によれば、本発明による破骨細胞形成阻害物質の同定方法では、ＮＦＡＴ１ｃもしくはＡＰ−１のようなＮｏｘ４によって調節される遺伝子の発現または活性をアッセイすることによって、Ｎｏｘ４の発現能が評価される。
【００７２】
別の特定の実施形態によれば、本発明による破骨細胞形成阻害物質の同定方法では、Ｎｏｘ４の発現能がノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析、またはＲＴ−ＰＣＲによって評価される。
【００７３】
別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明によるＮｏｘ４阻害物質と、その薬剤的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００７４】
別の実施形態によれば、本発明は、骨粗鬆症の治療に有用な少なくとも１つの共薬剤と併用される少なくとも１つのＮｏｘ４阻害物質と、その薬剤的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００７５】
特定の実施形態によれば、本発明の化合物、医薬製剤、および方法は、患者の破骨細胞形成不全および／または骨粗鬆症の予防および／または治療に用いられることを意図する。
【００７６】
特定の実施形態によれば、本発明はＮｏｘ４阻害物質またはその使用、および本発明による方法を提供し、ここでＮｏｘ４阻害物質は、骨粗鬆症または破骨細胞形成不全の治療に有用な共薬剤と併用投与される。
【００７７】
本発明の化合物は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅプログラム（製品バージョン１０．０１）において用いられるＩＵＰＡＣ基準に従って命名された。
【００７８】
本明細書に引用される参考文献は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載した特定の実施形態は本発明の個別の態様に関する単一の例証を意図したものであり、本発明はこれらの実施形態の範囲に限定されるものではなく、機能的に等価な方法および構成要素も本発明の範囲内にある。実際に、本明細書の提示および記載に加え、本発明の様々な改変が、前述の記載および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。このような改変は添付の特許請求の範囲内にある、と意図される。
【００７９】
本発明について説明してきたが、以下の実施例は限定目的ではなく、例示のために示される。
【実施例】
【００８０】
骨粗鬆症の治療におけるＮｏｘ４阻害の有効性を、以下の実施例によって示す。
【００８１】
以下の略語の定義をそれぞれ以下に示す：
ｅｑ．（当量）、ｎｍ（ナノメートル）、ＢＭＮＣ（骨髄単核細胞）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＤＣＦ（２，７−ジクロロジヒドロフルオレセイン）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、ＤＰＩ（ジフェニルヨードニウム）、ＥＡ（酢酸エチル）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、ＧＡＤＰＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＨＢＳＳ（ハンクス緩衝塩類溶液）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、ＭＥＭ（最少必須培地）、ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＰＥ（石油エーテル）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＴＧＦ−β（腫瘍増殖因子β）、ＲＯＳ（活性酸素種）、ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）、およびＳＹＢＲ（Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（商標）Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−［４−［（Ｅ）−（３−メチル−１，３−ベンゾチアゾール−２−イリデン）メチル］−１−フェニルキノリン−１−イウム−２−イル］−Ｎ−プロピルプロパン−１，３−ジアミン）。
【００８２】
実施例１：様々な細胞培養における活性酸素種量の測定
本発明によるＮｏｘ４阻害物質のＮｏｘ４活性は、無細胞アッセイにおける酸素からの活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を阻害または低下する活性として試験されてよい。Ｎｏｘ４阻害物質を十分に特徴付けるため、Ｎｏｘサブユニットに特異的な無細胞の膜を基礎とした系を開発し、特異的な組換えタンパク質を膜に加えて、その特異的なアイソフォームを過剰に異種発現させた。Ｎｏｘ酵素はスーパーオキシド（Ｏ２．−）を主要な産物として産生するが、この分子は不安定性および反応性が高く、自然に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へと不均化する。そのため、Ｈ２Ｏ２を測定するプローブによる読み取り技術を用いた（例えば、一貫した正確な測定を容易にするため、プローブとしてＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを用いる）。化合物の活性は、以下に記載する技術を用いた無細胞アッセイにより試験した。
【００８３】
材料
ＮＡＤＰＨ（Ａ１３９５．０１００）はＡｘｏｎｌａｂから購入した。Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ（Ａ２２１７７）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１０１０８０９０００１）はＲｏｃｈｅから購入した。
【００８４】
プラスミド構築
ヒトＮｏｘ１（ＮＭ＿００７０５２．４）、ヒトＮＯＸ２（ＮＭ＿０００３９７）、およびヒトＮＯＸ５（ＮＭ＿０２４５０５２２４４）のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。ヒトｐ２２（ＮＭ＿０００１０１．２）をｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングし、ヒトＮＯＸＡ１（ＡＹ２５５７６９．１）およびヒトＮＯＸＯ１（ＡＢ０９７６６７）をバイシストロニックｐＶＩＴＲＯ１−ｎｅｏ−ｍｃｓプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）へクローニングした。
【００８５】
細胞培養
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した、トランスフェクトされたＴ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞（Ｒ７１８−０７）およびｈＮＯＸ４を発現するＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞株（ｈＮＯＸ４  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３）（Ｓｅｒｒａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，４０６，１０５−１１４）を、ＤＭＥＭおよびハムＦ１２培地中でそれぞれ培養した。両培地には１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。ブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ）、および／またはＧ４１８（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、および／またはハイグロマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、および／またはゼオシン（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）を持続的に含めることで、選択圧を維持した。
【００８６】
安定的にトランスフェクトされた細胞株の作製
細胞をＦｕＧＥＮＥ６法を用いてトランスフェクションした。Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞にヒトＮｏｘ１、ヒトｐ２２、ヒトＮＯＸＡ１、およびヒトＮＯＸＯ１を共トランスフェクトすることによって、機能性ヒトＮｏｘ１を安定的に発現する細胞（ｈＮＯＸ１  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ）を得た。Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞にヒトｎｏｘ２、ヒトｐ２２、およびヒト補因子を共トランスフェクトすることによって、機能性ヒトＮｏｘ２を安定的に発現する細胞（ｈＮＯＸ２  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ）を得た。Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞にヒトＮｏｘ５をトランスフェクトすることによって、機能性ヒトＮｏｘ５を安定的に発現する細胞（ｈＮＯＸ５  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ）を得た。共トランスフェクションした細胞を１０日間適切な抗生物質を用いて選択した。選択のために、２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよびＧ４１８、ならびに０．１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを用いた。安定的にトランスフェクトされた各細胞株を確立するため、抗生物質耐性細胞をプールした。細胞は限界希釈法によってクローニングした。数クローンを確立した後、テトラサイクリン誘導ｈＮｏｘの発現によるＲＯＳ産生を、細胞ＡＲアッセイを用いて調べた。アッセイに先立ち、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を２４時間用いてＮＯＸを発現させた。
【００８７】
膜の調製
膜の調製に先立ち、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を２４時間用いることで、ヒトＮｏｘ１、Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ４、およびＮｏｘ５の発現を誘導した。Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ４、またはＮｏｘ５を過剰発現させたトランスフェクション細胞からの膜を、Ｐａｌｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，７６，３０９０−３０９７に記載された方法で調製した。超音波処理用緩衝液（ＰＢＳ中に１１％のスクロース、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４、Ｎｏｘ４またはＮＯＸ５発現細胞用。）または溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、３ｍＭ  ＮａＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁した後、細胞を超音波処理によって破壊し、遠心分離した（２００ｇ、１０分）。上清を１７／４０％（ｗ／ｖ）の不連続スクロース勾配上に重層ね、遠心分離した（１５０，０００×ｇ、６０分間）。１７／４０％の界面から膜分画を回収し、−８０℃で保管した。ブラッドフォード試薬を用いてタンパク質濃度を決定した。
【００８８】
ＲＯＳ産生の測定
ヒトＮｏｘ１、ヒトＮｏｘ２、ヒトＮｏｘ４、もしくはヒトＮｏｘ５を発現する膜による、またはキサンチン／キサンチン酸化酵素による活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、製造業者の指示書をわずかに改変したＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（ＡＲ）法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。簡潔に述べると、膜またはキサンチンをＰＢＳ中でＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および適切な補因子と共にインキュベートした。ＮＯＸを発現する膜にＮＡＤＰＨを加えるか、またはキサンチン酸化酵素にキサンチンを加えることで、ＲＯＳの産生を誘導した。膜の非存在下、またはキサンチンの非存在下で非特異的シグナルを測定した。化合物を１ｎＭから１００μＭの範囲で濃度を増大させて加え、そのアンタゴニスト活性を測定した。インキュベータつきプレート振盪機（Ｔｉｔｒａｍａｘ  １０００、ＶＷＲ）で３７℃にて緩やかに攪拌（３００ｒｐｍ）しながら２０分間インキュベートした後、ＢＭＧ  Ｆｌｕｏｓｔａｒマイクロプレートリーダーで５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長それぞれにおけるＲＯＳの量を１０分間測定した。
【００８９】
Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてデータを解析した。チェン−プルソフ式を用いてＫｉ値を算出し、トリプリケートで行った少なくとも３つの個別実験の平均として示す（第１表）。Ｎｏｘ４の阻害を、実施例１に記載した方法を用いて測定したシンバスタチン（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡＳ番号７９９０２−６３−９）の阻害と比較した。ヒトＮｏｘ４を発現する膜による活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（ＡＲ）を用いて測定した。
【００９０】
【表１】
2014533263.tif 000002
【００９１】
【表２】
2014533263.tif 000003
【００９２】
Ｋｉ値によってシンバスタチンが直接の本発明によるＮＯＸ４阻害物質ではないことが確認されたことから、既に報告されているように（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５０（１），９−１６）、スタチンはＮＡＤＰＨ阻害物質としては使用できないことが確認された。スタチンはＲａｃの活性化を阻害してＲＯＳ産生を抑制することにより抗酸化作用を発揮することが知られているが、ＮＯＸ４活性はＲａｃとは全く関係のないものであることが知られている。
【００９３】
実施例２：骨の破骨細胞数を増加させることによる、Ｎｏｘ４のマウスの骨密度に及ぼす負の影響
骨の恒常性に対するＮＡＤＰＨ酸化酵素の役割を決定するため、以下に記載する末梢骨定量的コンピュータ断層撮影法によって測定したノックアウトマウス系統の海綿密度を、それらの野生型の同腹仔と比較したところ、Ｎｏｘ４−／−は大腿骨遠位部で３０％高い海綿密度を示した（図１ＡおよびＢ）。一方、この効果はＮｏｘ２ｙ／−（Ｎｏｘ２ｙ／＋：３４５．３±１２．５；Ｎｏｘ２ｙ／−：３２９．０±１８．９ｍｇ／ｍ３）またはＮｏｘ１ｙ／−（Ｎｏｘ１ｙ／＋：２６２．２±１９．７；Ｎｏｘ１：２６８．７±１１．０ｍｇ／ｍ３）マウスでは観察されなかった。これらから、他のＮｏｘホモログではなく、Ｎｏｘ４のみが骨粗鬆症に関連することが初めて立証された。Ｎｏｘ４−／−マウスの骨密度が野生型マウスと比較して高いことは、骨梁幅および骨梁厚がより大きいことでも証明されたが、骨梁数（４．３±０．４対４．４±０．３個／ｍｍ２；野生型対Ｎｏｘ４−／−）および骨梁間隔（２１７±２３対２０７±１４ｍｍ；野生型対Ｎｏｘ４−／−）は野生型およびＮｏｘ４−／−マウスで同様であった。機能的結果として、Ｎｏｘ４−／−マウスの骨の安定性（後述する３点曲げ試験によって測定した）は、野生型マウスのそれよりも有意に高かった（図１Ｃ）。
【００９４】
Ｎｏｘ４−／−の骨密度が野生型の同腹仔と比較して高いことにより、Ｎｏｘ４が骨吸収を促進するか、または骨形成を阻害する可能性が示唆される。以下に記載するカルセイン標識から判断されるように、骨形成速度は野生型マウスとＮｏｘ４−／−マウスとで同様であり、骨石灰化速度および二重標識された表面も野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウスの間で違いはなかった。骨芽細胞活性マーカーであるＩ型プロコラーゲンＮ末端ペプチドの血漿濃度（後述するＥＬＩＳＡアッセイによって測定した）は、野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウスの血漿では一貫して同様であった（図２Ａ）。このデータは、Ｎｏｘ４−／−マウスの骨密度の増大の基礎をなす機序としての、Ｎｏｘ４依存性の骨芽細胞の阻害については除外しており、破骨細胞の影響に焦点を当てている。
【００９５】
実際に、Ｎｏｘ４−／−マウスの血漿において、ＴＲＡＰ  ５ｂおよびコラーゲン架橋Ｃ末端ペプチド（ＣＴＸ）のような骨吸収マーカーは野生型マウスと比較して有意に低かったことから（図２ＢおよびＣ）、野生型動物では破骨細胞の活性が高いか、またはその数が多いことが示される。実際に、後述するＴＲＡＰ陽性細胞の免疫組織学的分析を骨に対して行うことによって、Ｎｏｘ４−／−マウスでは破骨細胞の数（Ｎ．Ｏｃ）が野生型動物と比較しておおよそ５０％減少していることが示された（図１Ｄ／Ｅ）。したがって、骨タンパク質の比較により、Ｎｏｘ４−／−動物の骨では、野生型動物と比較して、破骨細胞マーカータンパク質である破骨細胞会合受容体（ＯＳＣＡＲ）の発現が低下しており、骨芽細胞タンパク質であるオステオポンチンの発現が上昇していることが明らかとなった（図１Ｆ）。
【００９６】
これらの所見から、Ｎｏｘ４の遺伝的欠損により、破骨細胞の形成の減少、またはアポトーシスの増大がもたらされることが示される。
【００９７】
マウスおよび動物実験手順
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０７：１８１２１−１８１２６の記載に従って、Ｎｏｘ４遺伝子（Ｇｅｎｏｗａｙ）の翻訳開始部ならびにエクソン１および２を標的欠失させてＮｏｘ４欠損マウスを作製した。簡潔に述べると、Ｎｏｘ４ゲノムＤＮＡ５’断片を１２９ｓｖマウスのＤＮＡ  ＢＡＣライブラリーから単離し、これを用いて、ｌｏｘＰ部位を隣接させたエクソン１および２、ネガティブセレクション用ジフテリア毒素Ａカセット、ならびにフリッパーゼ認識標的部位を隣接させたポジティブセレクション用ネオマイシンカセットを含む標的構築物を作製した。この標的構築物を１２９ｓｖの胚性幹細胞内へエレクトロポレーションした後、ＰＣＲおよびサザンブロット分析によって同定した組換えクローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞へ注入した。生殖系列キメラから得たヘテロ接合マウスをＣ５７ＢＬ／６のＣｒｅデリーターマウスおよびＦｌｐデリーターマウスと交配して、ヘテロ接合ノックアウトマウスを得た。子孫を交雑させてＮｏｘ４欠損動物を得て、１０世代を超えてＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配させた。
【００９８】
６週間後に骨の組成を調べた。骨形成はカルセイン法で測定した。マウスを殺処分する２日および１日前に、カルセインを皮下注射した（２０ｍｇ／ｋｇ体重）。
【００９９】
生化学
Ｉ型プロコラーゲンＮ末端ペプチドであるＰＩＮＰ（ＤＲＧ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＴＲＡＰ−５ｂ（ＤＲＧ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、およびＣＴＸ（ＵＳＣＮＫ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）の血清濃度を、製造業者の指示によるマウス特異的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。
【０１００】
骨密度（ＢＭＤ）の測定
左大腿骨のＢＭＤを、ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＱＣＴ装置（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ、プフォルツハイム、独国）を用いた末梢骨定量的コンピュータ断層撮影法（ＱＣＴ）によって測定した。大腿骨の骨幹中央の１切片（厚さ０．２ｍｍ）および膝関節の関節面に対して１．５ｍｍ、２ｍｍ、および２．５ｍｍの近位に位置する大腿骨の遠位骨幹端の３切片を測定した。３切片の平均を、大腿骨の遠位骨幹端のＢＭＤ値として算出した。Ｈｏｆｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，６０（５）：１４２７−１４３７の記載に従って、０．０７０ｍｍのボクセルサイズおよび７１０ｍｇ／ｃｍ３の閾値を用いてＢＭＤを算出した。
【０１０１】
骨の組織構造および組織形態計測
大腿骨の遠位骨幹端の骨検体処理および海綿骨組織形態計測を、大腿骨の遠位骨幹端の石灰化した骨切片について行い、Ｒｅｉｍ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２３（５）：６９４−７０４の記載に従って、画像解析のためにＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ  ３．０（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ、アトランタ、ジョージア州）およびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ４．６（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、独国）ソフトウェアを用いて測定した。
【０１０２】
骨の生体力学の分析
１ｋＮの力検出部および０．０１Ｎの力分解能を有するＺｗｉｃｋ  Ｚ０２０／ＴＮ２Ａ材料試験機（Ｚｗｉｃｋ、ウルム、独国）を用いた３点曲げ試験により、大腿骨に荷重を加えた。曲げ試験のための下部支点間距離は５ｍｍであった。全ての測定で、試験時のクロスヘッド速度は０．２ｍｍ／分であった。Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５：４１７−４２４に記載のとおり、力−変位データから最大力（Ｆｍａｘ；単位はＮ）を算出した。
【０１０３】
実施例３：破骨細胞形成時におけるＮｏｘ４依存性ＲＯＳ形成の増大
破骨細胞形成におけるＮｏｘ４の役割を調べるため、以下に示すマウスのｅｘ−ｖｉｖｏ分化アッセイにより、分化過程におけるＮｏｘ４の発現、および分化過程でのＮｏｘ４の遺伝的ノックアウトの影響を判定した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が破骨細胞に分化する際、２１日間のプロトコルの間にわたって、Ｎｏｘ１およびＮｏｘ４の発現の経時的な増大が観察された（図３）。
【０１０４】
以下に述べるように骨髄単核細胞（ＢＭＮＣ）をＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬで刺激し、分化した破骨細胞を、シグマアルドリッチのプロトコル３８７Ａ−１ＫＴ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を用いて、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：４９１−５０４の記載に従いＴＲＡＰ染色によって同定することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの破骨細胞形成を行った。このアプローチにより、Ｎｏｘ４−／−細胞では野生型群と比較して、おおよそ５０％の破骨細胞形成の低下がもたらされた（図１ＧおよびＨ）。これにより、骨切片中の破骨細胞数の減少は分化の障害によるものであることが示唆される。Ｎｏｘ４の役割についての幾つかの機能的証拠を提示するため、ＲＯＳ形成を測定した。ヒトＰＢＭＣの分化の間にＮｏｘ４の発現が増大することから既に示唆されるように、プライムされたＢＭＮＣをＲＡＮＫＬで刺激した後にＲＯＳ形成は増大した（図１Ｉ）。
【０１０５】
重要なことは、この効果はあまり明確ではなく、Ｎｏｘ４−／−マウス由来の細胞において統計的有意性に達しなかったことであり、したがってＮｏｘ４は分化の過程でＲＡＮＫＬに応答してＲＯＳ形成の増大を仲介することがはっきりと示される。
【０１０６】
細胞培養
Ｒａｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１１；１５２（１）：１０３−１１２の記載に従って、ヒト破骨細胞を産出した。簡潔に述べると、地域の血液バンクより提供されたバッフィーコートから、フィコール（１．０７７ｇ／ｍｌ、９５、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に加えた後、培地を３日間、２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた基本培地に交換した。その後、２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む破骨細胞形成用分化培地中で、細胞を２１日間まで培養した。骨芽細胞の分化を誘導するため、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル（１００μＭ）、β−グリセロリン酸（１０ｍＭ）、およびデキサメタゾン（１０ｎＭ）を加えた増殖培地中で細胞を培養した。
【０１０７】
マウス破骨細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける分化
大腿骨および脛骨の骨端部を切り出し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで骨髄を洗い出した。骨髄の間質細胞を回収し、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ中で、２×１０６細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。付着後、培地を２日間、２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた基本培地に交換した。その後、２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む分化培地中で、細胞をさらに６日間培養した。ＴＲＡＰ染色は、白血球酸ホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ）を用い、上記Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８による製造業者の指示に従って行った。
【０１０８】
Ａｍｐｌｅｘ  ＲｅｄによるＨ２Ｏ２産生のアッセイ
わずかに改変したＳｃｈｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１０５（６）：５３７−５４４に従って、ＲＯＳ産生を評価した。細胞を１２ウェルプレートで増殖させ、前述のようにＲＡＮＫＬの存在下または非存在下で分化させた。洗浄工程後、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（５０μｍｏｌ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（２Ｕ／ｍＬ）を含み、ＢＳＡを含まないＨＥＰＥＳタイロード液中で細胞をインキュベートした。４５分後、上清を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート蛍光光度計（励起５４０ｎｍ、発光５８０ｎｍ）にて、Ｈ２Ｏ２依存性のＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄの酸化を測定した。実験はカタラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）の存在下または非存在下で行った。Ｈ２Ｏ２の形成を、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄの酸化のカタラーゼ感受性部分として判定した。
【０１０９】
定量的ＰＣＲ
Ｒｏｃｈｅより購入したＨｉｇｈＰｕｒｅ  ＲＮＡ抽出キットを製造業者のプロトコルに従って用い、ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５００ｎｇのＲＮＡを逆転写した後、標準プロトコルを用いたＳＹＢＲ（商標）ｇｒｅｅｎによるリアルタイムＰＣＲ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。プライマー配列は以下の通りであった（５’−３’）：
マウスβアクチン−順方向：ｇａｔｃｔｇｇｃａｃｃａｃａｃｃｔｔｃｔ、逆方向：ｇｇｇｇｔｇｔｔｇａａｇｇｔｃｔｃａａａ；
ｎｏｘ４−順方向：ｔｃｔｃａｇｇｔｇｔｇｃａｔｇｔａｇｃｃ、逆方向：ｔｔｃｔｇｇｇａｔｃｃｔｃａｔｔｃｔｇｇ；
Ｎｏｘ１−順方向：５’ａａａｇｃｃａｔｔｇｇａｔｃａｃａａｃｃ３’；および
Ｎｏｘ１−逆方向：５’ｃａｇａａｇｃｇａｇａｇａｔｃｃａｔｃｃ３’。
【０１１０】
ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分；それに続く９５℃、１０秒の３０サイクル；および５６℃、６０秒であった。発現量はβアクチンに対して標準化した。
【０１１１】
実施例４：ＲＡＮＫシグナル伝達におけるＮｏｘ４の役割
Ｎｏｘ４−／−マウスにおける破骨細胞形成低下の基礎となる機序を決定するため、ＲＡＮＫシグナル伝達におけるこのＮＡＤＰＨ酸化酵素の役割について調べた。野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウス由来のＭ−ＣＳＦでプライムしたＢＭＮＣの間でＲＡＮＫ受容体の発現に差はなかったことから、野生型マウスおよびＮｏｘ４−／−マウスの間では、Ｎｏｘ４が介在したＲＡＮＫＬシグナル伝達に違いがあることが示唆された。
【０１１２】
ＲＡＮＫＬにより誘導されるサイトゾルＣａ２＋の増大に対するＮｏｘ４の役割を、後述するＦＵＲＡ２蛍光を用いて調べた。Ｍ−ＣＳＦでプライムしたマウスＢＭＮＣをＲＡＮＫＬと共にインキュベートすることで（３０時間）、野生型マウス由来の細胞ではサイトゾルＣａ２＋の顕著な増大が誘導された。対照的に、Ｎｏｘ４欠損動物から得た細胞ではこの効果は観察されなかった（図４Ａ）。
【０１１３】
Ｎｏｘ４の薬理学的な阻害は、ＮＯＸ４阻害物質である２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオンによって達成された。この化合物はＮｏｘ４に対してＮｏｘ２よりもおおよそ１０倍高いＩＣ５０を示し、実施例１のアッセイによる測定によれば抗酸化活性は示さなかった（６０ｍｇ／ｋｇ／日）。投与は毎日経管により６週間行い、一方でＮｏｘ４の遺伝的欠失は、タモキシフェンの注射（上記のように、卵巣摘出前の３日間に連続して４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）によって誘導した。対照群には、毎日経管により溶媒を投与した。
【０１１４】
ＮＯＸ４阻害物質（２０μｍｏｌ／Ｌ）によるＮｏｘ４の薬理学的な阻害は、刺激の際にＲＡＮＫＬを同時投与することで、Ｎｏｘ４の遺伝的欠失と同様に、ＲＡＮＫＬにより誘導されるサイトゾルＣａ２＋の増大を抑制した（図４Ｂ）。このことから、Ｎｏｘ４−／−マウスにおけるＮｏｘ４活性の不足は、同定されていない幾つかの遺伝的特性を除き、Ｎｏｘ４−／−細胞におけるＲＡＮＫＬシグナル伝達の欠損の原因であることが明確に示される。
【０１１５】
カルシウムに応答する破骨細胞の分化は、転写因子ＮＦＡＴ１ｃによって仲介される。この転写因子は、カルシウム感受性ホスファターゼであるカルシニューリンにより活性化された後、またはカルシウムにより活性化されるプロテアーゼであるμ−カルパインにより部分的に切断された後に核へ移行する以下に示すウェスタンブロット分析により、活性型μ−カルパインが豊富に存在することで、Ｍ−ＣＳＦによりプライムしたマウスＢＭＮＣにおいてＲＡＮＫＬに対する応答が増大し、これはＮＦＡＴ１ｃの核への蓄積と同時に起きていることが示された。重要なことは、この効果がＮｏｘ４−／−マウスから得た細胞には見られないことであるが、カルシニューリンの量は、野生型およびＮｏｘ４−／−マウスから得た細胞の間で同様であった。これらのデータにより、細胞内カルシウムを通したＮｏｘ４の作用は、ＲＡＮＫシグナル伝達の中心的なメディエーターであり、ＮＦＡＴ１ｃにより誘導される遺伝子発現に必要であることが実証された。
【０１１６】
Ｃａ２＋測定
細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、前述のようにＲＡＮＫＬの存在下または非存在下で分化させた。洗浄工程後、細胞に１．５μＭのＦｕｒａ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を６０分間ロードした。さらなる洗浄工程後、細胞内の遊離Ｆｕｒａ−２およびＣａ２＋結合Ｆｕｒａ−２を、１００μｌのＨＥＰＥＳタイロード液中で、ＥＬＩＳＡリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、波長３４０および３８０ｎｍにて測定した。測定は、４０μＬの２０μＭイオノマイシン、１００ｍＭ  ＥＧＴＡ、および飽和ＭｎＣｌ２を工程ごとに添加した後に３回繰り返した。最終的に、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（６）：３４４０−３４５０の記載に従って細胞内Ｃａ２＋を算出した。
【０１１７】
免疫ブロッティング
赤外線に基づいた検出系によりウェスタンブロット分析を行った（Ｏｄｙｓｓｅｙ、Ｌｉｃｏｒ、バート・ホンブルク、独国）。全ての一次抗体はＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入し、赤外蛍光色素を結合させた二次抗体はＬｉｃｏｒ（バート・ホンブルク）から得た。以下の溶解緩衝液を用いた（ｐＨ７．４、濃度はｍｍｏｌ／ｌである）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０）、ＮａＣｌ（１５０）、ピロリン酸ナトリウム（１０）、フッ化ナトリウム（２０）、ノニデットＰ４０（１％）、デソキシコール酸ナトリウム（０．５％）、プロテイナーゼ阻害剤ミックス、フッ化フェニルメチルスルホニル（１）、オルトバナデート（２）、およびオカダ酸（０．００００１）。
【０１１８】
実施例５：ヒト骨粗鬆症におけるＮｏｘ４の増大およびＮＯＸ４阻害によるマウス骨粗鬆症の予防効果
骨粗鬆症は、骨芽細胞活性と破骨細胞活性との間の不均衡の結果である。上記のデータにより、破骨細胞活性におけるＮｏｘ４の役割が支持されたが、このＮＡＤＰＨ酸化酵素の役割で、ヒト骨粗鬆症に関係する可能性のあるものについて調べた。健常患者、および骨粗鬆症患者またはパジェット病患者由来のヒト骨検体（後の２つの疾患は高い破骨細胞活性を示すことが知られている）をＮｏｘ４について染色し、続いて以下に述べる画像解析に付した。
【０１１９】
骨粗鬆症の骨は健常な骨と比較して、そしてパジェット病患者の骨は健常群と比較して、Ｎｏｘ４の染色強度は有意に高かった（図５Ａ）。これらのデータにより、Ｎｏｘ４はヒトにおける骨量減少にも寄与しており、そして骨粗鬆症のメディエーターでもあることが示唆される。
【０１２０】
後者の影響について調べるため、雌マウスの卵巣を摘出して骨粗鬆症を誘導し、Ｎｏｘ４阻害物質によるＮｏｘ４の薬理学的な阻害効果、およびタンパク質の急性遺伝的ノックアウトの効果について調べた。このために、生後８週目のマウスの卵巣を摘出し、手術後２日目から６０ｍｇ／ｋｇの本発明のＮｏｘ４阻害物質による処置を開始し、試験期間を通じて継続した（６週間）。
【０１２１】
予想したように、対照マウスでは卵巣摘出後６週間目の骨密度が低下していた。薬理学的な阻害に付したマウスは、溶媒で処置したマウスに比較して有意に高い骨密度を示した（図５Ｃ）。
【０１２２】
図６に示すように、上記と同条件で行った、本発明のＮｏｘ４阻害物質（化合物１）を２０および６０ｍｇ／ｋｇ用いたマウスの治療でも、より有利な骨の特色が得られた。破骨細胞活性を完全に遮断するビスホスホネートであるパミドロネートを、ｍｅｄａｃ  ＧｍｂＨ，Ｆｅｈｌａｎｄｓｔｒ．３，ハンブルクから購入し、陽性コントロールとして用いた。全ての化合物の絶対骨密度（図６Ａ）および絶対海綿骨密度（図６Ｂ）は増大し、キャリブレーションしたマイクロＣＴ技術による測定では、卵巣摘出により誘導された骨量減少全体の約５０％が相対的に阻害され（図６Ｃ）、そして海綿骨量減少の約６０％が相対的に阻害された（図６Ｄ）ことが示された。このため、骨をｓｋｙｓｃａｎ１１７６で走査し、０．２５ｇ／ｃｍ３および０．７５ｇ／ｃｍ３の２つのファントムを参照として用いた統合ソフトウェアによって骨密度を分析した。脛骨プラトーから２ｍｍの大腿骨部分の全体骨密度および海綿骨密度を、装置の製造業者により提供されたソフトウェアを用いて分析した。図１Ｃと同様に行った３点破壊試験により測定したように、骨の破壊強度は卵巣摘出によって低下し、最大濃度の化合物１による治療で骨の破壊強度は有意に増大した（図６Ｅ）。この方法のため、１ｋＮの力検出部および０．０１Ｎの力分解能を有するＺｗｉｃｋ  Ｚ０２０／ＴＮ２Ａ材料試験機（Ｚｗｉｃｋ、ウルム、独国）を用いた３点曲げ試験により、大腿骨に荷重を加えた。曲げ試験のための下部支点間距離は５ｍｍであった。全ての測定で、試験時のクロスヘッド速度は０．２ｍｍ／分であった。力−変位データから最大力（Ｆｍａｘ；単位はＮ）を算出した。
【０１２３】
Ｎｏｘ４活性の変化が骨粗鬆症の治療に有用であることを確認するため、後述するように、Ｎｏｘ４−Ｆｌｏｘ−ＦｌｏｘマウスをＥＲＴ２−Ｃｒｅ−タモキシフェンデリーターマウスと交配して、Ｎｏｘ４を強くノックアウトした。動物の卵巣を摘出する２日前にタモキシフェンを３回注射し（無菌トウモロコシ油に溶解し、４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した）、６週間後に骨を分析した。既に報告したように、エストロゲン受容体に対するタモキシフェンの部分的なアゴニスト活性の結果として、タモキシフェンそれ自体が海綿密度の減少を弱めた。それにもかかわらず、Ｎｏｘ４のさらなるノックアウトは相加的な有益効果をもたらした（図５Ｃ）。
【０１２４】
ヒト骨粗鬆症の骨切片でのＮｏｘ４の発現上昇、およびＮｏｘ４のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害（薬理学的または遺伝学的な）によるマウスの卵巣摘出モデルにおける骨量減少の抑制が示されたことにより、上記の結果は概して、Ｎｏｘ４と骨量減少の予期せぬ直接の関連を支持するものである。したがってこれにより、骨粗鬆症における骨量減少はＮｏｘ４の阻害によって抑制されるか、少なくとも軽減されることが支持される。
【０１２５】
骨の免疫染色
診断目的の匿名のヒト骨生検の組織切片を、抗Ｎｏｘ４抗体（Ｓｚｏｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２２：２１−７）を用いて免疫組織化学により染色した。このため、脱灰した骨のパラフィン切片を５μｍに薄切し、脱パラフィン、再水和、そしてクエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）中での抗原デマスキングを行った後、一次抗体（０．５％のＴｗｅｅｎを含むリン酸緩衝食塩水に溶解し、１：３００に希釈）を加えて６０分間室温でインキュベートした。続いて抗体を洗浄し、染色をＡＢＣ−ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｉｎ  ＨＲＰキット（ＶＥＣＴＯＲ）で現像して、ヘマラウンで対比染色した。
【０１２６】
マウスおよび動物実験手順
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０７：１８１２１−１８１２６の記載に従って、Ｎｏｘ４遺伝子（Ｇｅｎｏｗａｙ）の翻訳開始部ならびにエクソン１および２を標的欠失させてＮｏｘ４欠損マウスを作製した。簡潔に述べると、Ｎｏｘ４ゲノムＤＮＡ５’断片を１２９ｓｖマウスのＤＮＡ  ＢＡＣライブラリーから単離し、これを用いて、ｌｏｘＰ部位を隣接させたエクソン１および２、ネガティブセレクション用ジフテリア毒素Ａカセット、ならびにフリッパーゼ認識標的部位を隣接させたポジティブセレクション用ネオマイシンカセットを含む標的構築物を作製した。この標的構築物を１２９ｓｖの胚性幹細胞内へエレクトロポレーションした後、ＰＣＲおよびサザンブロット分析によって同定した組換えクローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞へ注入した。生殖系列キメラから得たヘテロ接合マウスをＣ５７ＢＬ／６のＣｒｅデリーターマウスおよびＦｌｐデリーターマウスと交配して、ヘテロ接合ノックアウトマウスを得た。子孫を交雑させてＮｏｘ４欠損動物を得て、１０世代を超えてＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配させた。
【０１２７】
実施例６：ＮＯＸ４阻害物質
以下の第２表に挙げる化合物は、本発明により使用可能なＮｏｘ４阻害物質の例である。
【０１２８】
【表３】
2014533263.tif 000004
【０１２９】
【表４】
2014533263.tif 000005
【０１３０】
【表５】
2014533263.tif 000006
【０１３１】
【表６】
2014533263.tif 000007
【０１３２】
【表７】
2014533263.tif 000008
【０１３３】
【表８】
2014533263.tif 000009
【０１３４】
【表９】
2014533263.tif 000010
【０１３５】
【表１０】
2014533263.tif 000011
【０１３６】
ＮＯＸ４阻害物質の合成
上記のＮＯＸ４阻害物質は、以下に詳述する化合物（１）のための方法を用いて、容易に入手可能な出発物質から調製できる。典型的または好ましい実験条件（すなわち反応温度、時間、試薬のモル、溶媒など）の説明については、特に記載のない限り、その他の実験条件も用いることができる。至適な反応条件は特定の反応物または使用する溶媒によって異なり得るが、当業者はこのような条件を通常の最適化手順を用いて決定できる。以下の合成方法が適用できない場合および／または化合物の合成に中間体が必要な場合には、当業者に公知の適切な調製方法を用いるべきである。一般には、個々の任意の化合物の合成経路も、それぞれの分子に特異的な置換基および必要な中間体の利用容易性に依存し得るが、繰り返しになるが、このような因子は当業者に理解可能である。全ての保護および脱保護法については、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ”，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，２００５およびＴｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００６を参照されたい。本発明の化合物は、適切な溶媒の蒸発によって結晶化することで、溶媒分子との会合から分離できる。
【０１３７】
４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン（化合物１）の形成
【化１】
2014533263.tif 000012
ａ）２−フルオロ−４−メトキシベンゾイルクロリド（化合物Ｂ）
【化２】
2014533263.tif 000013
ＳＯＣｌ２（２５００ｍｌ）中の出発化合物Ａ（２−フルオロ−４−メトキシ安息香酸、Ａｌｄｒｉｃｈ）（３５０ｇ、２．０６ｖｍｏｌ）をＮ２下で一晩還流した。反応はＴＬＣでモニターした（７２時間）。反応混合物から所望の中間体Ｂを蒸留して（１４０℃、１０ｍｍＨｇ）、白色の固体を得た（３６５ｇ、収率：９４％）。
【０１３８】
ｂ）メチル［５−ヒドロキシ−１−（２−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アセテート（化合物Ｄ）
【化３】
2014533263.tif 000014
出発化合物Ｃ（２−メトキシフェニルヒドラジン塩酸塩、Ａｌｄｒｉｃｈ）（３５０ｇ、１ｅｑ．）のＭｅＯＨ溶液（２Ｌ）に３−オキソ−ペンタン二酸ジメチルエステル（Ａｌｄｒｉｃｈ）（１．２ｅｑ．）をＮ２下で加え、この溶液を１時間還流した。ＴＬＣにより出発物質が存在しないことが示された。溶媒を蒸発させて除去し、残渣をシリカカラム（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２００：１〜５０：１）で精製して、所望の中間体Ｄを白色の固体として得た（３６０ｇ、収率６８％）。
【０１３９】
ｃ）メチル｛４−［（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）カルボニル］−５−ヒドロキシ−１−（２−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル｝アセテート（化合物Ｅ）
【化４】
2014533263.tif 000015
上記で得た中間体Ｄ（２０ｇ、１ｅｑ．）をジオキサン（１２００ｍｌ）に懸濁し、次にＮ２下でＣａ（ＯＨ）２（１５ｅｑ．）を加えた。反応混合物を１１０℃まで加熱し、上記で得た２−フルオロ−４−メトキシベンゾイルクロリド（化合物Ｂ、０．９ｅｑ．）をジオキサン（１００ｍＬ）に溶解して、該混合物に滴下した。反応は１１０℃にて撹拌し、出発物が消失するまでＬＣＭＳによってモニターした（ｔ＝４時間）。混合物を濾過し、残渣を酢酸エチルで洗浄した（５×１５０ｍＬ）。濾過物を合わせて濃縮し、ＰＥにより再結晶化して、クルードな中間体産物Ｅを黄色の粉末として得たが、さらなる精製は行わなかった（１１．３ｇ、収率：３６．９％）。
【０１４０】
ｄ）メチル［（４Ｅ）−４−｛（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）［（ピリジン−３−イルメチル）アミノ］メチリデン｝−１−（２−メトキシフェニル）−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アセテート（化合物Ｆ）
【化５】
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上記で得た中間体Ｅ（２０ｇ、１ｅｑ．）をトルエン（５００ｍＬ）に溶解し、９０℃にてＮ２下で、ＴｉＣｌ４（２ｍＬ）およびＡｃＯＨ（１００ｍｌ）を加えた。１−ピリジン−３−イルメタンアミン（２．０ｅｑ．）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた後、反応混合物を１００℃にて撹拌した。ＬＣＭＳでのモニタリングにより、出発物質の消失が示された（１．５時間）。反応混合物を乾燥するまで蒸発させた。残渣をＥＡ（５００ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。ＤＣＭおよびＰＥで再結晶化して、白色の固体の化合物Ｆを得た（９．５ｇ、収率：３７．９％）。
【０１４１】
ｅ）４−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン（化合物１）
上記で得たエナミン中間体Ｆ（１６０ｇ、１ｅｑ．）を新たに調製したＭｅＯＨ中のＭｅＯＮａ（２Ｍ、１０００ｍｌ）で処理し、出発物質のエナミンが消失するまで溶液を室温にて撹拌した（ｔ＝１時間）。反応混合物を濃縮してＭｅＯＨを除き、クルードを水に溶解して（８００ｍｌ）、ＤＣＭで抽出した（３００ｍｌ×６）。次に、水相をＨＣｌ水溶液でｐＨ＝５〜６に酸性化した後、ＤＣＭで抽出した（３００ｍｌ×３）。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して最終産物の化合物（１）を黄色の固体として得た（１１０ｇ、収率：６８％）。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＢＣＤ】
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【図６Ｅ】
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【図１】
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【国際調査報告】
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