(57)【要約】本発明は、逆転写酵素をコードする核酸配列、逆転写インジケーター、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）をコードする核酸配列、およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、形質転換された酵母細胞、ならびに逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法およびＮＲＴＩ化合物に対する逆転写酵素、特に、被験体に感染しているウイルスに由来する逆転写酵素の感度を予測するための方法におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター、
デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む、形質転換された酵母細胞。
【請求項２】
プラスミド内の、逆転写酵素をコードする核酸配列および逆転写インジケーター、ならびに
ゲノム内の、ｄＣＫをコードする核酸配列およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む、請求項１記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項３】
前記逆転写酵素をコードする核酸配列が、誘導性プロモーターの支配下にある、請求項１〜２のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項４】
前記逆転写酵素が、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素である、請求項１〜３のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項５】
前記逆転写酵素をコードする核酸配列が、レトロウイルス、好ましくは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染した被験体に由来する、請求項１〜４のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項６】
前記逆転写インジケーターが、ｈｉｓ３ＡＩである、請求項１〜５のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項７】
ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２  ＯＡＴ１、ＯＡＴ３およびＯＣＴ１を含む群において選択されるヌクレオシドトランスポーターをコードする１、２、３、４、５、６、７または８つの核酸配列を、最低でも含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項８】
最低でも、ヌクレオシドトランスポーターＯＡＴ１をコードする核酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。
【請求項９】
逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ｉ．請求項１〜７において定義された形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ｉｉ．前記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｉｉ．前記化合物と接触していない前記形質転換された酵母細胞と比較して、前記形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
ｉｖ．前記形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記形質転換された酵母細胞の逆転写酵素が、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記逆転写インジケーターが、ｈｉｓ３ＡＩであり、前記選択培地が、ヒスチジンを欠く細胞培養液である、請求項９〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＮＲＴＩ化合物に対する逆転写酵素の感度を予測するための方法であって、前記方法は、
ｉ．請求項５において定義された形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ｉｉ．前記形質転換された酵母細胞を前記ＮＲＴＩ化合物と接触させる工程、
ｉｉｉ．前記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｖ．ＮＲＴＩ化合物有りまたは無しで、前記形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
ｖ．そこから、研究されている逆転写酵素が前記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記形質転換された酵母細胞を前記ＮＲＴＩ化合物と接触させた後の増殖抑制が、前記被験体に感染しているレトロウイルスの逆転写酵素が前記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であることを示唆する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記逆転写インジケーターが、ｈｉｓ３ＡＩであり、前記選択培地が、ヒスチジンを欠く細胞培養液である、請求項１２または１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＲＴＩ化合物が、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、テノホビルおよびザルシタビンからなる群において選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、参照により本願明細書に援用される、２０１１年５月１７日に出願された欧州特許出願公開第１１００４０５５７号明細書の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を検出するためおよびヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）処置に対する逆転写酵素の感度を予測するための細胞および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかのウイルス感染症は、社会にとって実際に重要な健康問題を構成している。それらのうち、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）感染は、人類に影響を及ぼす最も深刻な疾患の１つである。新しい治療ストラテジー（例えば、化学療法の併用）の開発によって、実際に、ＨＩＶに感染した患者の生活の質および平均余命が改善された。抗逆転写酵素化合物、抗インテグラーゼ化合物、抗侵入化合物および抗プロテアーゼ化合物をはじめとした種々のクラスの抗ＨＩＶ薬が存在する。逆転写酵素阻害剤には、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）が含まれる。
【０００４】
残念なことに、ウイルスは、これらの薬物に応答して、弱まり、薬物耐性が現れ、治療失敗に至る。したがって、ウイルスの薬物耐性および感度は、治療ストラテジーの改善について研究している科学者にとって重要な主題であり、新しい抗ウイルス薬を同定するためおよび抗ウイルス処置を管理するためにそのような機序を研究する重大な必要性がある。
【０００５】
ＨＩＶの逆転写酵素は、変異を受けて、逆転写酵素阻害剤に対して耐性になる。新しい逆転写酵素阻害剤を検出するためのいくつかの試験が開発された。特許文献１および特許文献２は、酵母細胞において逆転写酵素阻害剤を検出するための高価でない単純な試験を記載している。しかしながら、この方法は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）に対しては使用できるとしても、そのような試験は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）の検出には適合していない。実際に、ＮＲＴＩは、ヌクレオシドトランスポーターを介して細胞に侵入する必要がありかつ有効であるためには細胞のキナーゼによって三リン酸化される必要があるプロドラッグであり、酵母ゲノムは、一リン酸化されたヌクレオシドの生成に関わるトランスポーターおよびキナーゼにとって必要な遺伝情報を欠いている。
【０００６】
したがって、ＮＲＴＩまたは候補ＮＲＴＩ化合物を試験するために、特許文献１および特許文献２に記載されている試験を適合させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７１４，３１３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４６２，８７３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、形質転換された酵母細胞を開発した（ここで、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）および少なくとも１つのヌクレオシドトランスポーターの特異的発現によって、上記形質転換された酵母細胞においてヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）が機能的になることが可能になる）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、
デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも１つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
【００１０】
上記形質転換された酵母細胞は、上記逆転写酵素に対するヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）の活性を試験することが可能である。
【００１１】
本発明はまた、逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法にも関し、その方法は、
ｉ．本発明に係る逆転写酵素インジケーターを含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ｉｉ．上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｉｉ．上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
ｉｖ．形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する。
【００１２】
本発明はまた、ＮＲＴＩ化合物に対する逆転写酵素の感度を予測するための方法にも関し、上記方法は、
ｉ．研究されている逆転写酵素を含む、先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ｉｉ．上記形質転換された酵母細胞を上記ＮＲＴＩ化合物と接触させる工程、
ｉｉｉ．形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｖ．ＮＲＴＩ化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
ｖ．そこから、研究されている逆転写酵素が上記ＮＲＴＩ処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図面は、本願明細書の一部分を形成し、本発明のある特定の態様をさらに証明するために含められる。本発明は、本願明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによりよりよく理解され得る。
【図１】ゲノム内にｄＣＫおよびプラスミド内にＯＡＴ１を有する株における逆転写酵素（ＲＴ）活性および阻害剤感受性。図１は、酵母Ａ株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−）（したがって、ｄＣＫおよびＯＡＴ１を有しない）において、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているようにＨＩＶ−１由来の逆転写酵素が発現されるとき、ザルシタビン（ｄｄＣ）（Ａ株＋ｄｄｃ  １００μＭ）、ジダノシン（ｄｄＩ）（Ａ株＋ｄｄＩ  １００μＭ）、ザルシタビン（ＡＺＴ）（Ａ株＋ＡＺＴ  １００μＭ）またはスタブジン（ｄ４Ｔ）（Ａ株＋ｄ４Ｔ  １００μＭ）の存在下における７２時間にわたるインキュベーションは、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ＠６００ｎｍ）によって測定される、細胞の増殖、ひいては逆転写を阻害できないことを示している。ＯＡＴ１トランスポーターをコードする核酸配列を含むプラスミドを有する遺伝的に改変されたＡ株（ここで、ｄＣＫの核酸コード配列は、酵母ゲノム内に組み込まれていた）（Ａ＃株）において、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているようにＨＩＶ−１由来の逆転写酵素が発現されるとき、ｄｄＣ（Ａ＃株＋ｄｄｃ  １００μＭ）、ｄｄＩ（Ａ＃株＋ｄｄＩ  １００μＭ）、ＡＺＴ（Ａ＃株＋ＡＺＴ  １００μＭ）またはｄ４Ｔ（Ａ＃株＋ｄ４Ｔ  １００μＭ）の存在下における７２時間にわたるインキュベーションは、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ＠６００ｎｍ）によって測定される、細胞の増殖、ひいては逆転写を阻害する。
【図２】ゲノム内にｄＣＫおよびＯＡＴ１を有する株におけるＲＴ活性およびＮＲＴＩ感受性。図２は、遺伝的に改変されたＢ株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ＋、ＨＩＳ−、ＬＥＵ＋）（ここで、ｄＣＫ酵素およびＯＡＴ１をコードする両方の核酸配列は、酵母ゲノムに組み込まれていた）（Ｂ＃＃株：Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ｄＣＫ＋、ＯＡＴ１＋）において、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているようにＨＩＶ−１由来の逆転写酵素が発現されるとき、ｄｄＣ（ｄｄｃ  １００μＭ）、ｄｄＩ（ｄｄＩ  １００μＭ）、ＡＺＴ（ＡＺＴ  １００μＭ）またはｄ４Ｔ（ｄ４Ｔ  １００μＭ）の存在下における７２時間にわたるインキュベーションは、６００ｎｍにおける吸光度によって測定される、細胞の増殖（％阻害）、ひいては逆転写を阻害することを示している。
【図３】ゲノム内にｄＣＫおよびＯＡＴ１を有する酵母株におけるＮＲＴＩのＩＣ５０測定。Ｂ＃＃株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ｄＣＫ＋、ＯＡＴ１＋）において、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているようにＨＩＶ−１由来の逆転写酵素活性を発現させ、試験し、種々の濃度のｄｄＣ、ｄｄＩ、ＡＺＴ、ｄ４ＴまたはＴＦＶの存在下において７２時間インキュベートした。細胞の増殖ひいては逆転写の阻害を６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ＠６００ｎｍ）によって測定し、各阻害剤に対するＩＣ５０値を、増殖抑制を５０％に誘導する阻害剤の濃度として定義した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
したがって、本発明者らは、米国特許第５，７１４，３１３号明細書および同第５，４６２，８７３号明細書（これらは参照により本願明細書に援用される）に記載されている方法から得られる系においてＮＲＴＩ化合物を検出かつ試験するために有用な新しい構築物および酵母細胞を開発し、試験した。
【００１５】
（本発明の酵母細胞）
本発明の第１の目的は、
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター、
デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも１つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
【００１６】
これらのエレメントは、ゲノムまたはプラスミドに含められ得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明は、
プラスミド内の、逆転写酵素をコードする核酸配列および逆転写インジケーター、ならびに
ゲノム内の、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）をコードする核酸配列およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも１つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
【００１８】
上記形質転換された酵母細胞は、上記逆転写酵素に対するヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）の活性を試験することが可能である。
【００１９】
用語「ＮＲＴＩ」または「ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤」とは、化学構造が天然のヌクレオシドの改変バージョンを構成している、抗レトロウイルス薬として使用されるヌクレオシドアナログのことを指す。そのような化合物は、ウイルスのレトロ転写事象における生理学的ヌクレオシドに取って代わることによってレトロウイルス逆転写酵素に干渉することによってレトロウイルスの複製を抑制し、ウイルスの新生ＤＮＡのランダムな停止をもたらす。それらは、すべての形態の逆転写酵素、特に、非レトロウイルス逆転写酵素を阻害するためにも使用され得る。
【００２０】
ＮＲＴＩの群は、ジドブジン（ＡＺＴ、ＲＥＴＲＯＶＩＲとも呼ばれる）、ジダノシン（ｄｄＩ、ＶＩＤＥＸとも呼ばれる）、ザルシタビン（ｄｄＣ、ＨＩＶＩＤとも呼ばれる）、スタブジン（ｄ４Ｔ、ＺＥＲＩＴとも呼ばれる）、ラミブジン（３ＴＣ、ＥＰＩＶＩＲとも呼ばれる）、アバカビル（ＡＢＣ、ＺＩＡＧＥＮとも呼ばれる）、エムトリシタビン（Ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＦＴＣ、ＥＭＴＲＩＶＡとも呼ばれる）、テノホビル（ＴＦＶ  ＶＩＲＥＡＤとも呼ばれる）、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ）、アプリシタビン（Ａｐｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（第ＩＩＩ相臨床試験）を含むがこれらに限定されない。
【００２１】
「形質転換された酵母細胞」とは、任意の手段（例えば、感染、結合体化、形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション）によって目的のベクター（またはＤＮＡフラグメント）が移入された酵母細胞のことを意味する。細胞の形質転換の方法は、当該分野で周知である。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。
【００２３】
本願明細書中で使用されるとき、「逆転写酵素」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性および／またはＲＮａｓｅＨ活性および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むいくつかの活性、好ましくは少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質のことを指す。本願明細書中で使用される「逆転写酵素」は、任意のウイルス、より詳細には、任意のレトロウイルスまたは任意のレトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、ならびに変異を有しかつ上で言及された逆転写酵素活性を維持しているそのような逆転写酵素バリアントを含む。
【００２４】
本願明細書中で使用されるとき、「バリアント」または「機能保存的バリアント」は、１つまたはいくつかのヌクレオチドが変更されており、かつＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって測定されたとき少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％のヌクレオチド同一性を有し、かつそれと比較される天然遺伝子または親遺伝子と同じまたは実質的に類似の特性または機能を有する、核酸配列を含む。
【００２５】
本発明によると、上記方法において使用される逆転写酵素は、特に、レトロウイルス逆転写酵素である。
【００２６】
本発明において使用される逆転写酵素は、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ伝染性貧血ウイルスに由来し得る。好ましくは、本発明の逆転写酵素は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素である。
【００２７】
本発明によると、逆転写酵素をコードする核酸は、作製されてもよいし、被験体サンプルから得られてもよく、当該被験体は、逆転写酵素を発現する目的のウイルス、またはより詳細には目的のレトロウイルスに感染している。
【００２８】
本願明細書中で使用されるとき、用語「被験体」は、ウイルス、特に、レトロウイルスに感染した動物、より詳細には、レトロウイルスに感染した哺乳動物（例えば、げっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類）を表す。好ましくは、本発明に係る被験体は、ヒトである。より好ましくは、被験体は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染したヒト患者である。
【００２９】
被験体から得られた逆転写酵素をコードする核酸配列は、遺伝子増幅（ポリメラーゼ連鎖反応法，ＰＣＲ）または精製されたウイルスＤＮＡに対する制限酵素の作用による逆転写酵素の放出によって得られる場合がある。この場合、レトロウイルスのゲノム情報を含む生物学的サンプルは、被験体から得られる。例えば、その被験体が、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスに感染したヒト患者である場合、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素をコードする核酸配列は、当該患者から得られた全血サンプルのリンパ球もしくは血漿から、または他の任意の感染器官から得られる場合がある。そのような方法は、当該分野で周知である（例えば、ＤＷＩＧＨＴ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５，ｖｏｌ４３，ｎ１１，ｐｐ５６９６−５７０４；およびＳＨＡＦＥＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６，ｖｏｌ３４，ｎ７，ｐｐ１８４９−１８５３に開示されている方法を参照のこと）。
【００３０】
参照ＨＩＶ−１逆転写酵素をコードする核酸配列は、核酸配列の配列番号１によって定義される。参照ＨＩＶ−２逆転写酵素をコードする核酸配列は、核酸配列の配列番号２によって定義される。これらのＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方の参照逆転写酵素は、ＮＲＴＩ処置に対して感受性である。
【００３１】
これらの核酸配列に基づいて、当業者は、その一般的な知識に基づいて、感染した患者のサンプルから得られたＤＮＡに対するＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素核酸配列のＰＣＲによって増幅できるプライマーを容易にデザインできる。
【００３２】
例として、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素をコードする核酸配列は、核酸配列の配列番号３および配列番号４によって定義されるプライマー対または核酸配列の配列番号５および配列番号６によって定義されるプライマー対を使用する、感染した患者の血液サンプルからのＰＣＲによって増幅され得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、逆転写酵素をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターの支配下にある。
【００３４】
用語「誘導性プロモーター」とは、ある特定の環境条件が存在するとき適切な遺伝子の転写を促進する転写プロモーターのことを指す。上記プロモーターは、本発明の酵母細胞において有効である。誘導性プロモーターの例としては、ガラクトースによって誘導可能なＧＡＬ−１プロモーターおよびグルコース枯渇によって誘導可能なＡＤＨ−２およびメチオニンによって阻止されるＭＥＴが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「逆転写インジケーター」とは、本発明の形質転換された細胞、好ましくは、形質転換された細胞のゲノム（染色体ＤＮＡ）に挿入された、逆転写酵素をコードする核酸配列の組み込み、発現および機能性の検査を可能にするマーカー核酸配列のことを指す。他の用語において、本発明に係る「逆転写インジケーター」は、逆転写酵素の活性の存在を示唆する。好ましい実施形態において、本発明のために使用される逆転写酵素インジケーターは、当該分野で周知であり、特に、米国特許第５，７１４，３１３号明細書および同第５，４６２，８７３号明細書に記載されている、ｈｉｓ３ＡＩ遺伝子である。
【００３６】
米国特許第５，７１４，３１３号明細書および同第５，４６２，８７３号明細書は、レトロ転位が生じている形質転換された酵母細胞を選択するための方法を記載しており、その方法は、本発明のために使用され得る。この方法は、（ｉ）形質転換された酵母細胞を選択培地上に置く工程、（ｉｉ）その細胞を培養する工程、および（ｉｉｉ）増殖中のコロニー（増殖している細胞のコロニー）について選択する工程を包含する。
【００３７】
本願明細書中で使用されるとき、用語「デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）」とは、ホスフェートをデオキシシチジンに移行させるポリペプチドのことを指す。ｄＣＫは、いくつかのデオキシリボヌクレオシドおよびそれらのヌクレオシドアナログのリン酸化に必要である。この用語は、天然に存在するｄＣＫならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ｄＣＫは、任意の種に由来し得、特に、哺乳動物のｄＣＫ、好ましくは、ヒトｄＣＫであり得る。例示的な天然のヒトｄＣＫ  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００７８８としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号７）。
【００３８】
本願明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオシドトランスポーター」とは、細胞および／または小胞の膜を越えてヌクレオシド（および特に、ヌクレオシドアナログ）を輸送する膜輸送タンパク質の大きな群のことを指す。ヌクレオシドトランスポーターは、特に、平衡ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ）および濃縮型ヌクレオシドトランスポーター（ＣＮＴ）を含むがこれらに限定されない。本発明によると、この用語は、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）および有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）も含む。
【００３９】
本発明によると、ヌクレオシドトランスポーターは、例えば、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３およびＯＣＴ１を含む群において選択され得るがこれらに限定されない。
【００４０】
特定の実施形態において、ヌクレオシドトランスポーターは、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２およびＯＡＴ１を含む群において選択されるがこれらに限定されない。
【００４１】
平衡ヌクレオシドトランスポーター１に対するＥＮＴ１という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２９Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質のことを指す。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２９Ａ１遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２９Ａ１遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２９Ａ１遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２９Ａ１遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２９Ａ１  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１０７８１７４としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号８）。
【００４２】
ＥＮＴ２（平衡ヌクレオシドトランスポーター２）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２９Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質のことを指す。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２９Ａ２遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２９Ａ２遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２９Ａ２遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２９Ａ２遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２９Ａ２  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１５３２としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号９）。
【００４３】
ＣＮＴ１（濃縮型ヌクレオシドトランスポーター１）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２８Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２８Ａ１遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２８Ａ１遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２８Ａ１遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２８Ａ１遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２８Ａ１  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００４２１３としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号１０）。
【００４４】
ＣＮＴ２（濃縮型ヌクレオシドトランスポーター２）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２８Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２８Ａ２遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２８Ａ２遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２８Ａ２遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２８Ａ２  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００４２１２としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号１１）。
【００４５】
ＣＮＴ３（濃縮型ヌクレオシドトランスポーター３）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２８Ａ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２８Ａ３遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２８Ａ３遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２８Ａ３遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２８Ａ３遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２８Ａ３  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１１９９６３３としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号１２）。
【００４６】
ＯＡＴ１（有機アニオントランスポーター１）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２２Ａ６遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２２Ａ６遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２２Ａ６遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２２Ａ６遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２２Ａ６遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２２Ａ６  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００４７９０としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号１３）。
【００４７】
ＯＡＴ３（有機アニオントランスポーター３）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２２Ａ８遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２２Ａ８遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２２Ａ８遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２２Ａ８遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２２Ａ８遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２２Ａ８  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１１８４７３２としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号１４）。
【００４８】
ＯＣＴ１（有機カチオントランスポーター１）という用語は、ヒトにおいてＳＬＣ２２Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するＳＬＣ２２Ａ１遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＳＬＣ２２Ａ１遺伝子は、典型的には、哺乳動物のＳＬＣ２２Ａ８遺伝子、好ましくは、ヒトＳＬＣ２２Ａ１遺伝子である。例示的な天然のヒトＳＬＣ２２Ａ１  ｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００３０５７としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されている（配列番号１５）。
【００４９】
本発明によると、形質転換された酵母細胞は、そのゲノム内に、ヌクレオシドトランスポーターをコードする１、２、３、４、５、６、７または８つの核酸配列を含み得る。
【００５０】
本発明の１つの実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、最低でも、ＯＡＴ１をコードする核酸配列を含む。
【００５１】
実際に、本発明者らは、ＯＡＴ１の発現が、ジドブジン、スタブジン、ジダノシンまたはザルシタビンによるＨＩＶ  ＲＴの良好な阻害を得ることを可能にすること立証した。特定の実施形態において、上記形質転換された酵母細胞は、最低でも、別のヌクレオシドトランスポーターをコードするもう１つの核酸配列を含む。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、最低でも、ＣＮＴ３をコードする核酸配列を含む。
【００５３】
実際に、本発明者らは、ＣＮＴ３の発現が、ＡＺＴ（ジドブジン）またはｄ４Ｔ（スタブジン）によるＨＩＶ  ＲＴの良好な阻害を得ることを可能にすること立証した。特定の実施形態において、上記形質転換された酵母細胞は、最低でも、別のヌクレオシドトランスポーターをコードするもう１つの核酸配列を含む。
【００５４】
本発明の特定の実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、チミジンキナーゼをコードする核酸配列をさらに含む。
【００５５】
本願明細書中で使用されるとき、用語「チミジンキナーゼ」（ＴＫ）は、当該分野におけるその一般的な意味を有し、キナーゼ（多くの抗ウイルス薬の作用に必要である）のことを指す。ＴＫは、いくつかのヌクレオシドアナログのリン酸化に必要である。この用語は、天然に存在するＴＫならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。ＴＫは、任意の種由来であり得る。ＴＫは、例えば、ヒトＴＫであり得るが、ウイルスＴＫでもあり得る。典型的には、本発明に従って使用されるＴＫは、ヒト単純ヘルペスウイルスタイプ１由来のＴＫ、ＨＳＶ１−ＴＫ（配列番号１６）であり得る。
【００５６】
（本発明の方法）
本発明の形質転換された酵母細胞は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を使用する治療を改善および管理するために使用され得る。
【００５７】
したがって、本発明の第２の目的は、逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法に関し、その方法は、
ｉ．本発明に係る逆転写インジケーターを含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ｉｉ．上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｉｉ．上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
ｉｖ．形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する。
【００５８】
本発明によると、用語「増殖抑制」は、スクリーニングされるまたは試験される化合物と接触していない細胞と比べたときの増殖の有意な減少を含む。したがって、それは、定量され得る増殖の任意の相対的な阻害を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、上記増殖抑制とは、スクリーニングされるまたは試験される化合物と接触していない細胞と比べたときの増殖の少なくとも３０％、より詳細には、少なくとも５０％、さらにより詳細には、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の減少のことを指し、ここで、上記化合物は、水性媒質における溶解が可能であるより高い濃度で使用される。
【００６０】
本発明によると、逆転写インジケーターは、形質転換されていない酵母細胞（または逆転写が生じない形質転換された酵母細胞）が増殖できなかった特定の条件において、本発明の形質転換された酵母細胞が増殖するのを可能にする。したがって、逆転写インジケーターは、本発明にとって興味深い、逆転写が生じている形質転換された酵母細胞の選択を可能にする。
【００６１】
選択培地は、上記特定の条件において増殖することができる、逆転写が効率的に生じる酵母細胞を選択するように選択される。
【００６２】
例えば、逆転写インジケーターとしてｈｉｓ３ＡＩを使用する場合、逆転写が生じる酵母細胞は、ヒスチジンを欠く培地中で増殖することができる。したがって、逆転写インジケーターとしてｈｉｓ３ＡＩ遺伝子とともに使用される選択培地は、ヒスチジンを欠く培地である。
【００６３】
本発明によると、試験されるＮＲＴＩ化合物と接触させた本発明の形質転換された酵母細胞は、古典的な細胞培養液（選択的でない）において増殖する。
【００６４】
試験されるＮＲＴＩ化合物の逆転写に対する効果を研究するために、上記化合物は、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）が生じる前に加えられなければならない。
【００６５】
それゆえ、好ましくは、逆転写酵素をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターの支配下にあり、逆転写（例えば、逆転写酵素をコードする核酸配列の発現を誘導する）が、試験されるＮＲＴＩ化合物を本発明の形質転換された酵母細胞と接触させた後に誘導される。
【００６６】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法に関し、その方法は、
ｉ．逆転写インジケーターおよび本発明に係る誘導性プロモーターの支配下の逆転写酵素を含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ｉｉ．逆転写を誘導する工程、
ｉｉｉ．上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｖ．上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の阻害を検出する工程、および
ｖ．形質転換された酵母細胞の増殖を阻害する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程
を包含する。
【００６７】
本発明の方法によると、本発明に従って試験され得る化合物は、ヌクレオシドおよび公知のＮＲＴＩと類似の化学構造を有する。
【００６８】
本発明によると、この方法に従って選択された化合物は、形質転換された酵母細胞の逆転写酵素が由来するレトロウイルスに対する治療ストラテジーを開発するために使用され得る。
【００６９】
本発明によると、上記逆転写酵素は、レトロトランスポゾンまたはウイルス由来、特に、レトロウイルス由来であり得る。
【００７０】
レトロトランスポゾンエレメントにおいてコードされる逆転写酵素は、癌の機序およびウイルス感染症におけるウイルスの逆転写酵素（より詳細には、レトロウイルス逆転写酵素）に結びつけられる。
【００７１】
特定の実施形態において、上記逆転写酵素は、レトロウイルス由来であり得る。
【００７２】
この場合、本発明の方法は、レトロウイルスの複製を阻害する新規化合物の検出を可能にする。
【００７３】
本発明によると、「レトロウイルスの複製を阻害する」は、レトロウイルス逆転写酵素の場合において「逆転写酵素を阻害する」または「逆転写を阻害する」と交換可能に使用され得る。
【００７４】
本発明のより特定の実施形態において、この方法において使用される形質転換された細胞の逆転写酵素は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ伝染性貧血ウイルスを含む群において選択されるレトロウイルスに由来する。好ましくは、その逆転写酵素は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来する。
【００７５】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法によって選択される化合物はさらに、形質転換された酵母細胞の逆転写酵素が由来するレトロウイルスによる感染のモデルにおいて試験され得る。
【００７６】
本発明の第３の目的は、ＮＲＴＩ化合物に対する逆転写酵素の感度を予測するための方法に関し、上記方法は、
ｉ．研究されている逆転写酵素インジケーターおよび逆転写酵素を含む、先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ｉｉ．上記形質転換された酵母細胞を上記ＮＲＴＩ化合物と接触させる工程、
ｉｉｉ．形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｖ．ＮＲＴＩ化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
ｖ．そこから、研究されている逆転写酵素が上記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程
を包含する。
【００７７】
１つの実施形態において、形質転換された酵母細胞をＮＲＴＩ化合物と接触させた後の増殖抑制は、研究されている逆（ｒｅｓｅｒｖｅ）転写酵素が、上記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であることを示唆する。
【００７８】
本発明によると、用語「増殖抑制」は、感受性であると知られている参照逆転写酵素を含む本発明の形質転換された酵母細胞（形質転換された参照酵母細胞）と比べたときの、研究されている逆転写酵素を含む上記形質転換された酵母細胞（試験されている形質転換された酵母細胞）における増殖の任意の減少を含む。
【００７９】
そのような阻害は、試験されている形質転換された酵母細胞と、形質転換された参照酵母細胞とに対する接触されたＮＲＴＩ化合物のＩＣ５０値の比（ＩＣ５０（研究ＲＴ）／ＩＣ５０（参照ＲＴ））を測定することによって判断され得る。
【００８０】
本発明によると、１以下のＩＣ５０（研究ＲＴ）／ＩＣ５０（参照ＲＴ）比は、研究されている逆転写酵素が、上記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であることを示唆し、１より大きいＩＣ５０（研究ＲＴ）／ＩＣ５０（参照ＲＴ）比は、研究されている逆転写酵素が上記ＮＲＴＩ化合物に対して参照逆転写酵素よりも感受性でないことを示唆する。
【００８１】
したがって、好ましい実施形態において、上記方法は、試験されている形質転換された酵母細胞に対する接触されたＮＲＴＩ化合物のＩＣ５０値と、上記ＮＲＴＩ化合物に感受性であると知られている参照逆転写酵素を含む形質転換された参照酵母細胞に対する接触されたＮＲＴＩ化合物のＩＣ５０値との比を測定する工程からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｉｎ）さらなる工程を工程（ｉｖ）の後に包含する。
【００８２】
上記好ましい実施形態によると、１以下の比は、研究されている逆転写酵素が、上記ＮＲＴＩ化合物に感受性であることを示唆する。
【００８３】
本発明によると、研究されている逆転写酵素は、レトロトランスポゾンまたはウイルス、特に、レトロウイルスに由来し得る。
【００８４】
特に、上記逆転写酵素は、レトロウイルスに由来する。
【００８５】
例えば、この方法において研究される逆転写酵素は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ伝染性貧血ウイルスを含む群において選択されるレトロウイルスに由来し得る。
【００８６】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、被験体に感染しているレトロウイルスに由来する逆転写酵素のＮＲＴＩ化合物に対する感度を予測するための方法に関し、上記方法は、
ｉ．先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程（その逆転写酵素は、上記被験体に感染しているレトロウイルスに由来する）、
ｉｉ．上記形質転換された酵母細胞を上記ＮＲＴＩ化合物と接触させる工程、
ｉｉｉ．形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
ｉｖ．ＮＲＴＩ化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
ｖ．そこから、上記被験体に感染しているレトロウイルスに由来する逆転写酵素が上記ＮＲＴＩ処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する。
【００８７】
好ましくは、上記逆転写酵素は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素である（かつ上記被験体は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染したヒト患者である）。
【００８８】
１つの実施形態において、形質転換された酵母細胞をＮＲＴＩ化合物と接触させた後の増殖抑制は、被験体に感染しているレトロウイルスの逆転写酵素およびそのレトロウイルス自体が、上記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であることを示唆する。したがって、その被験体は、上記ＮＲＴＩ化合物に応答する可能性がある。
【００８９】
本発明によると、用語「増殖抑制」は、感受性であると知られている上記レトロウイルスの参照逆転写酵素を含む本発明の形質転換された酵母細胞（形質転換された参照酵母細胞）と比べたときの、レトロウイルスに感染した上記被験体に由来する逆転写酵素を含む形質転換された酵母細胞（試験されている形質転換された酵母細胞）における増殖の任意の減少を含む。
【００９０】
そのような抑制は、試験されている形質転換された酵母細胞に対する接触されたＮＲＴＩ化合物のＩＣ５０値と、形質転換された参照酵母細胞に対する接触されたＮＲＴＩ化合物のＩＣ５０値との比（ＩＣ５０（被験体ＲＴ）／ＩＣ５０（参照ＲＴ））を測定することによって測定され得る。
【００９１】
本発明によると、１以下のＩＣ５０（被験体ＲＴ）／ＩＣ５０（参照ＲＴ）比は、研究されている逆転写酵素が、上記ＮＲＴＩ化合物に対して感受性であり、被験体が、上記ＮＲＴＩ化合物に基づく処置に応答する可能性があることを示唆する。１より大きいＩＣ５０（研究ＲＴ）／ＩＣ５０（参照ＲＴ）比は、研究されている逆転写酵素が上記ＮＲＴＩ化合物に対して参照逆転写酵素よりも感受性でなく、被験体が、上記ＮＲＴＩ化合物に基づく処置に応答しないリスクがあることを示唆する。
【００９２】
本発明によると、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２参照逆転写酵素は、それぞれ核酸配列の配列番号１および配列番号２によって定義され得る。
【００９３】
好ましくは、逆転写酵素をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターの支配下にあり、逆転写（例えば、逆転写酵素をコードする核酸配列の発現を誘導する）は、試験されているＮＲＴＩ化合物を本発明の形質転換された酵母細胞と接触させた後に誘導される。
【００９４】
本発明によると、試験されているＮＲＴＩ化合物と接触された本発明の形質転換された酵母細胞は、古典的な細胞培養液（選択的でない）において増殖する。
【００９５】
本発明のさらに別の実施形態において、形質転換された酵母細胞において使用される逆転写インジケーターは、ｈｉｓ３ＡＩであり、工程（ｉｉ）において使用される選択培地は、ヒスチジンを欠く細胞培地である。
【００９６】
好ましい実施形態において、上記ＮＲＴＩ化合物は、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、テノホビルおよびザルシタビンを含むまたはそれらからなる群において選択され得る。
【００９７】
特定の実施形態において、ＮＲＴＩ化合物の組み合わせが試験され得る。例えば、テノホビル、ラミブジン、アバカビルおよびエムトリシタビンの組み合わせ、スタブジン、ジドブジンおよびジダノシンの組み合わせが試験され得る。
【００９８】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＲＴＩ化合物に対する逆転写酵素の逆転写酵素の耐性または感度を予測するための上記方法に関し、ここで、試験されるＮＲＴＩは、ジドブジンまたはスタブジンであり、形質転換された酵母細胞は、最低でも、ヌクレオシドトランスポーターＣＮＴ３をコードする核酸を含む。
【００９９】
別の特定の実施形態において、本発明は、ＮＲＴＩ化合物に対する逆転写酵素の逆転写酵素の耐性または感度を予測するための前記方法に関し、ここで、試験されるＮＲＴＩは、ジドブジン、スタブジン、ジダノシンまたはザルシタビンであり、形質転換された酵母細胞は、最低でも、ヌクレオシドトランスポーターＯＡＴ１をコードする核酸配列を含む。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、本発明を行うおよび実施する好ましい形式のいくつかを記載する。しかしながら、これらの実施例は、単に例示目的であって、本発明の範囲を限定すると意図されていないことが理解されるべきである。
【０１０１】
実施例１：ｄＣＫおよびＣＮＴ３を有する株におけるＲＴに対するチミジンアナログ逆転写酵素阻害剤の活性
【０１０２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−）を、ｕｒａ３酵母遺伝子をコードする核酸配列を有するＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントで、標準的な酢酸リチウムプロトコルを使用して形質転換した。形質転換された細胞であるＡ１株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ＋、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−）は、そのゲノム遺伝子座にｕｒａ３遺伝子を組み込んだ。Ａ１株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ＋、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−）を、ＳｔｕＩ制限酵素によって予め直線化しておいたｐ４２６ＧＰＤｈｄＣＫプラスミド（ヒトｄＣＫおよびｕｒａ３をコードする核酸配列を含み、ｕｒａ３オープンリーディングフレーム内で直線化は生じた）で、標準的な酢酸リチウムプロトコルを使用して形質転換した。ｕｒａ３遺伝子座においてｄＣＫの組み込みが生じたその新しい株（Ａ＃株）は、以下の表現型（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ｄＣＫ＋）を有する。
【０１０３】
Ａ＃株を、ヌクレオシドトランスポーターＣＮＴ３をコードする核酸配列を含む発現ベクタープラスミドおよび米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているプラスミドｐＨＡＲＴ２１で形質転換した。得られた酵母株および改変されていないＡ株におけるＨＩＶ−１  ＲＴ活性を、２００μＭのＡＺＴ（ジドブジン）またはｄ４Ｔ（スタブジン）の存在下または非存在下における７２時間のインキュベーションの後に、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているように測定した。外来タンパク質が存在したとき、ＨＩＶ−１  ＲＴのＮＲＴＩ依存性阻害が生じた（表１）。
【０１０４】
【表１】
2014519321.tif 000002
表１．ｄＣＫおよびＣＮＴ３の発現によって、酵母細胞においてＨＩＶ逆転写酵素活性が阻害された
【０１０５】
実施例２：ゲノム内にｄＣＫおよびプラスミド内にＯＡＴ１を有する株におけるＲＴ活性および阻害剤感受性
【０１０６】
Ａ＃株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ｄＣＫ＋）を、ヌクレオシドトランスポーターＯＡＴ１をコードする核酸配列を含む発現ベクタープラスミドおよび米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているプラスミドｐＨＡＲＴ２１で形質転換した。得られた酵母株および改変されていないＡ株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−）におけるＨＩＶ−１  ＲＴ活性を、１００μＭのＡＺＴ、ｄｄＣ（ザルシタビン）、ｄｄＩ（ジダノシン）またはｄ４Ｔの存在下または非存在下における７２時間のインキュベーションの後に米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているように測定した。外来タンパク質が存在したとき、ＨＩＶ−１  ＲＴのＮＲＴＩ依存性阻害が生じた（図１）。
【０１０７】
実施例３：ゲノム内にｄＣＫおよびＯＡＴ１を有する株におけるＲＴ活性および阻害剤感受性
【０１０８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｂ株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ＋、ＨＩＳ−、ＬＥＵ＋）を、ＳｔｕＩ制限酵素によって予め直線化しておいたｐ４２６ＧＰＤｈｄＣＫプラスミド（ｄＣＫおよびｕｒａ３をコードする核酸配列を含み、ｕｒａ３オープンリーディングフレーム内で直線化は生じた）で、標準的な酢酸リチウムプロトコルを使用して形質転換した。ｕｒａ３遺伝子座においてｄＣＫの組み込みが生じたその新しい株（Ｂ＃株）は、以下の表現型（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ＋、ｄＣＫ＋）を有する。
【０１０９】
Ｂ＃株を、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを用いた形質転換によって、標準的な方法で遺伝的に改変した。この核酸フラグメントは、ｌｅｕ２遺伝子座の５’および３’非コード領域に隣接した、ＯＡＴ１トランスポーターをコードする核酸配列を含む。ｄＣおよびＯＡＴ１が酵母ゲノムに組み込まれたその新しい改変された株であるＢ＃＃株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ｄＣＫ＋、ＯＡＴ１＋）を、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているプラスミドｐＨＡＲＴ２１で形質転換した。Ｂ＃＃株におけるＨＩＶ−１  ＲＴ活性を、１００μＭのＡＺＴ、ｄｄＣ、ｄｄＩまたはｄ４Ｔの存在下における７２時間のインキュベーションの後に米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているように測定した。外来タンパク質が存在したとき、ＨＩＶ−１  ＲＴのＮＲＴＩ依存性阻害が生じ（図２）、これは、それらのタンパク質の活性が、それらが発現される方法に関係しないことを示している（プラスミドとして、図１または酵母ゲノム内において、図２）。
【０１１０】
実施例４：ゲノム内にｄＣＫおよびＯＡＴ１を有する酵母株（Ｂ＃＃株）におけるＮＲＴＩのＩＣ５０の測定
【０１１１】
ＨＩＶ−１  ＲＴに対するＮＲＴＩのＩＣ５０値の測定を、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されている方法に従って、Ｂ＃＃株において行った。種々の濃度のｄｄＩ、ＡＺＴ、ＴＦＶ（テノホビル）、ｄｄＣまたはｄ４Ｔの存在下または非存在下における７２時間のインキュベーションの後、細胞の増殖を６００ｎｍにおけるＯＤで測定した。酵母の増殖を半分（５０％）に抑制するＮＲＴＩの量（濃度）として定義されるＩＣ５０値を、増殖抑制のパーセンテージをＮＲＴＩ濃度に対してプロットすることによって測定した（対数スケールで表される）（図３）。
【０１１２】
実施例５：ｄＣＫおよびヌクレオシドトランスポーターを有する株と比べたときのＮＴ５Ｃおよびヌクレオシドトランスポーターを有する株の非効率
【０１１３】
サイトゾルの５’ヌクレオチダーゼであるＮＴ５Ｃは、ＮＲＴＩのリン酸化に関わるリン酸基転移能力を有すると示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＡ，Ｆｒｉｄｌａｎｄ  １９８９  Ａ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：２９１−５  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ  ｂｙ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ）。したがって、このタンパク質を、「ｄＣＫ様タンパク質」として本発明の形質転換された酵母細胞において試験し、ＲＴ、ＲＴインジケーター、ＮＴ５Ｃおよびヌクレオシドトランスポーターを含む本発明に類似の構築を行った。
【０１１４】
ヒトサイトゾル５’ヌクレオチダーゼＮＴ５Ｃをコードする核酸配列を、以下のとおり酵母ゲノムに組み込んだ。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ１株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ＋、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−）を、酵母ｕｒａ３遺伝子の開始コドンの上流の５０ヌクレオチド長の配列と同一の核酸配列に続いてＧＰＤプロモーター配列に続いて５’ヌクレオチダーゼをコードする核酸配列に続いて酵母ｕｒａ３遺伝子の終止コドンの下流の５０ヌクレオチド長の配列と同一の核酸配列を含むＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントで、標準的な酢酸リチウム法を使用して形質転換した。ｕｒａ３遺伝子座において外来遺伝子の組み込みが生じたその改変された酵母株Ａ§株（Ｍａｔ  ａ、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ＵＲＡ−、ＮＴ５Ｃ＋）を、ＡＤＨプロモーターの支配下にヒトヌクレオチドトランスポーターＣＮＴ２の核酸コード配列を有するプラスミドで、標準的な方法に従ってさらに形質転換した。この株をＡ§§株と命名した（Ｍａｔ  ａ、ＨＩＳ−、ＬＥＵ＋、ＵＲＡ−、ＮＴ５Ｃ＋、ＣＮＴ２＋）。
【０１１５】
実施例１からのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ＃株（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ−、ｄＣＫ＋）を、ＡＤＨプロモーターの支配下にヒトヌクレオチドトランスポーターＣＮＴ２の核酸コード配列を有するプラスミドで、標準的な方法を用いて形質転換した。この株をＡ＃§株と命名した（Ｍａｔ  ａ、ＵＲＡ−、ＨＩＳ−、ＬＥＵ＋、ｄＣＫ＋、ＣＮＴ２＋）。
【０１１６】
以下のとおり、米国特許第５，７１４，３１３号明細書に記載されているように両方の株においてＨＩＶ  ＲＴ活性を測定した。ＨＩＶ１  ＲＴを発現する両方の株を、ＳＤ−ｕｒａ＋グルコースにおいて飽和するまで生育した。１ＤＯの飽和培地（約１０７個の細胞）を１ｍｌのＳＧａｌ−ｕｒａに播種し、６時間生育した。次いで、グルコースを加えることによって、ＲＴの活性化を停止した。１２時間後、誘導された細胞を、ＳＤ−Ｈｉｓ培地に０．２ＤＯ／ｍｌで播種し、７２時間インキュベートした。振盪しながら３０℃でインキュベーションを行った。表ＩＩに示されるように、２００μＭ濃度のＡＢＣ（アバカビル）またはＴＦＶ（テノホビル）阻害剤の存在下における増殖抑制を測定することによって、ＨＩＶ−１  ＲＴ活性の阻害を測定した。得られた結果は、酵母にｄＣＫが存在することにより、ＮＲＴＩ阻害剤の実質的な活性がもたらされるが、ＮＴ５Ｃの存在は、ＮＲＴＩ阻害剤の実質的な活性をもたらさないことを証明した。
【０１１７】
【表２】
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表２：改変された酵母細胞において測定された、アバカビル（ＡＢＣ）およびテノホビル（ＴＦＶ）によるＨＩＶ−１逆転写酵素の阻害。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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