(57)【要約】本発明は、炎症性腸疾患の処置のためのスクリーニング法および薬学的組成物に関する。より詳細には、本発明は、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、（ａ）各被験物質が総合的ストレス応答を回復する能力についてその被検物質を検査すること、および（ｂ）該総合的ストレス応答を回復する能力がある被検物質をポジティブ選択することから成るステップを含む方法に関する。本発明のさらなる局面は、炎症性腸疾患の処置に使用するための、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、（ａ）各被験物質が総合的ストレス応答（integrated stress response）を回復する能力についてその被検物質を検査することおよび（ｂ）該総合的ストレス応答を回復する能力がある被検物質をポジティブ選択することから成るステップを含む方法。
【請求項２】
スクリーニング法のステップ（ａ）が、被検物質が、ｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させるか、ｉｉ）ＡＴＦ４遺伝子の発現を活性化するか、ｉｉ）表１に示される、ＡＴＦ４によってターゲティングされるいくつかの遺伝子の発現を活性化するか、ｉｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を促進するキナーゼを活性化するか、またはｉｖ）リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害するかどうかを判定することにありうる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｉ）各被験物質がｅＩＦ２αのリン酸化を増加させる能力について該被検物質を検査するステップ、およびｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させる被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｉ）各被験物質がｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害する能力について該被検物質を検査するステップ、およびｉｉ）ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
炎症性腸疾患の処置を必要とする被験体における該処置のための、または炎症性腸疾患を患う被験体を、標準処置または外科手術後に長期寛解に維持するための方法であって、処置に使用するためのまたは使用するための、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤を該被験体に投与することを含む方法。
【請求項６】
薬剤が、ｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させ、ｉｉ）ＡＴＦ４遺伝子の発現を活性化し、ｉｉ）表１に示される、ＡＴＦ４によってターゲティングされるいくつかの遺伝子の発現を活性化し、ｉｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を促進するキナーゼを活性化し、ｉｖ）リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害し、ｖ）ストレス顆粒の形成を促進することができる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
リン酸化ｅＩＦ２の脱リン酸を阻害する薬剤が、サルブリナールまたはグアナベンズである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
薬剤が、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１遺伝子発現の阻害剤である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
薬剤がパテアミンＡである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
炎症性腸疾患の処置に使用するための、または炎症性腸疾患を患う被験体を標準処置および外科手術の後に長期寛解に維持することに使用するための、請求項５〜９のいずれか記載の薬剤を含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、炎症性腸疾患の処置のためのスクリーニング法および薬学的組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、直腸を通じて拡大し、上部に進行する表在性粘膜病変によって特徴づけられる、結腸の慢性間欠性で再発性の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。ＵＣの自然歴は、被験体の最大５０％が慢性病変に進行することによって特徴づけられる。これは、結腸粘膜が環境因子に対して「全体的な（global）」感受性を有することを示唆している。
【０００３】
全ゲノム関連研究によって、ＵＣに関連する遺伝子ローカスがすでに４０個よりも多く同定されたものの、結腸上皮細胞で事象のカスケードを開始して炎症に導く一次欠損は、大部分が未知のままである。動物モデルにおける最近のデータから、腸炎は、上皮バリアでの小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を管理できないことに関連しうることが示された（Heazlewood, C.K. et al. Aberrant mucin assembly in mice causes endoplasmic reticulum stress and spontaneous inflammation resembling ulcerative colitis. PLoS Med 5, e54 (2008). Kaser, A. et al. XBP1 links ER stress to intestinal inflammation and confers genetic risk for human inflammatory bowel disease. Cell 134, 743-56 (2008).; Brandl, K. et al. Enhanced sensitivity to DSS colitis caused by a hypomorphic Mbtps1 mutation disrupting the ATF6-driven unfolded protein response. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 3300-5 (2009).; Van der Sluis, M. et al. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that MUC2 is critical for colonic protection. Gastroenterology 131, 117-29 (2006).; Zhao, F. et al. Disruption of Paneth and goblet cell homeostasis and increased endoplasmic reticulum stress in Agr2-/- mice. Dev Biol 338, 270-9 (2010).; Hammer, R.E., Maika, S.D., Richardson, J.A., Tang, J.P. & Taurog, J.D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell 63, 1099-112 (1990)）。ＵＰＲは、腸上皮細胞が小胞体（ＥＲ）ストレスに対処することで炎症促進経路を阻止するのを助け、細胞が環境変化に適応および応答できるようにする可能性があると示唆されている。ＵＰＲは、ｉ）転写因子Ｘボックスタンパク質１（ＸＢＰ−１）を介してシグナルを伝達してＵＰＲターゲット遺伝子を活性化するＩＲＥ１、ｉｉ）ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡを誘導し、細胞が未フォールディングタンパク質のロードに対処する能力を高めるＡＴＦ６α、およびｉｉｉ）ｅＩＦ２α−ＧＴＰ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ三元複合体の形成を無効にし、大部分のｍＲＮＡの翻訳を阻害する翻訳開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ２α）をリン酸化するＰＥＲＫによって仲介される。この適応は、ストレス下で蓄積しうる有毒な誤フォールディングタンパク質から細胞を保護し、ＥＲストレスを受けた細胞中のＡＴＰおよびアミノ酸を保護すると考えられる。逆説的に、ｅＩＦ２αのリン酸化は、総合的ストレス応答（integrated stress response）（ＩＳＲ）の誘導因子であるＡＴＦ４およびその下流の転写ターゲットであるＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）などの遺伝子サブセットの翻訳を刺激する。
【０００４】
いくつかのＥＲストレスマーカーの調節解除が、ＩＢＤを患う被験体において部分的に調査されたものの（Heazlewood, C.K. et al. "Aberrant mucin assembly in mice causes endoplasmic reticulum stress and spontaneous inflammation resembling ulcerative colitis". PLoS Med 5, e54 (2008).; Kaser, A. et al. "XBP1 links ER stress to intestinal inflammation and confers genetic risk for human inflammatory bowel disease." Cell 134, 743-56 (2008). Shkoda, A. et al. "Interleukin-10 blocked endoplasmic reticulum stress in intestinal epithelial cells: impact on chronic inflammation." Gastroenterology 132, 190-207 (2007).）、ＥＲストレスの総合的な生化学的および超微細構造的証拠ならびに異常ＥＲストレス応答が粘膜バリアの機能不全に与える影響は、ＵＣの病理発生にＥＲストレスが果たす役割を解明するために必要である。別の重要な問題は、ＥＲストレスの変化がＵＣを患う患者における組織学的大腸炎に先行する素因でありうるかどうかである。今までのところ、ＵＣ被験体における組織学的大腸炎に先行する素因としてのＥＲストレス異常は、まだ研究されていない。
【０００５】
発明の概要：
本発明は、炎症性腸疾患の処置のためのスクリーニング法および薬学的組成物に関する。
【０００６】
より詳細には、本発明は、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被験物質をスクリーニングするための方法であって、（ａ）各被験物質が総合的ストレス応答を回復する能力についてその被験物質を検査すること、および（ｂ）前記総合的ストレス応答を回復する能力がある被験物質をポジティブ選択することから成るステップを含む方法に関する。
【０００７】
本発明のさらなる一局面は、炎症性腸疾患の処置に使用するための、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤に関する。
【０００８】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、非罹患のＵＣ粘膜が、対照被験体に比べて不適切なＥＲストレスを表すことを示す。結果から、ｅＩＦ２αのリン酸化の純減が原因でＩＳＲ経路の予想外の障害が示され、したがってＵＣではストレス顆粒の集合欠如および翻訳開始機構の主要構成要素の発現増加に関連するこの中枢性ストレス応答でのこの欠陥が、タンパク質翻訳の再プログラミングを引き起こすことが示唆される。このことは、対照に比べた、ＵＣ被験体の非罹患の粘膜から単離されたポリソーム結合型ｍＲＮＡの全ゲノムマイクロアレイ分析によって裏付けられる。ストレスによってモデュレーションされたこれらの過程は、上皮バリアのいくつかの主要な機能に影響するが、このことで、環境ストレスに対する結腸ＵＣ粘膜の感受性を説明できよう。したがって、ＩＳＲは、ＵＣ被験体を長期寛解に維持するための新規治療選択肢の魅力的なターゲットである。
【０００９】
定義：
本明細書に使用される用語「総合的ストレス応答」または「ＩＳＲ」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、Schroder & Kaufman ER stress and unfolded protein response. Mut Res. 2005, 569: 29; Ron & Walter, "Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein responses", Nat Rev Mol Cell Biol 2007, 8: 519およびMoenner et al., "Integrated stress response in cancer", Cancer Res. 2007, 67: 10631に記載された経路を表す。用語「総合的ストレス応答」は、「ｅＩＦ２α経路」とも名付けられる。
【００１０】
ｅＩＦ２αのリン酸化事象は、アミノ酸欠乏、二本鎖ウイルスＲＮＡへの曝露、浸透圧ストレス、ＵＶ線曝露、ヘム欠乏、低酸素、および酸化ストレスのような、ＥＲストレスを超えた様々な種類の環境ストレスシグナルおよび内因性ストレスシグナルを統合する（Harding et al., (2003) ".An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress" Mol Cell, 11 (3), 619-33）。これらの多岐にわたるシグナルは、ＰＥＲＫ（ＥＲストレス、放射線、または低酸素によって活性化される）、ＧＣＮ２（general control nonderepressible-2、アミノ酸枯渇細胞での未チャージｔＲＮＡによって活性化される）、ヘム調節インヒビター（ＨＲＩ、赤血球前駆細胞でのヘム欠乏によって活性化される）、およびＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡおよびいくつかの状況ではＥＲストレスによって活性化される（Nakamura et al., (2010) "Double-stranded RNA-dependent protein kinase links pathogen sensing with stress and metabolic homeostasis",Cell, 143 (3), 338-48などの４種の異なるｅＩＦ２αキナーゼを活性化する。
【００１１】
ストレスがいったん軽減したならば、哺乳動物細胞は、様々な攻撃に応答して保護メカニズムを活性化してホメオスタシスに必要な生命細胞過程の被害を防止する（Nover et al., (1989), "Cytoplasmic heat shock granules are formed from precursor particles and are associated with a specific set of mRNAs" Mol Cell Biol, 9 (3): 1298-308）。細胞質中のストレス顆粒（ＳＧ）の急速な形成は、細胞が、「ハウスキーピング」機能をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害してストレス応答に必要なシャペロンおよび酵素の合成を優先させる主メカニズムの一つである（Anderson and Kedersha, (2002) "Visibly stressed: the role of eIF2, TIA-1, and stress granules in protein translation" Cell Stress Chaperones, 7 (2), 213-21）。ＥＲストレス時に翻訳を阻害し、ＳＧ集合のための刺激としても作用する過程は、翻訳の開始期を特異的にターゲティングする（Anderson and Kedersha, (2006) "RNA granules" J Cell Biol., 172 (6), 803-8）。実際、亜ヒ酸塩（ＡＳ）およびヒートショック介在性ＳＧ形成が、ｅＩＦ２のリン酸化を誘導し、ｅＩＦ２・ＧＴＰ・Ｍｅｔ−ｔＲＮＡＭｅｔ三元複合体の細胞内レベルの減少および翻訳開始速度の同時減少につながることが示された。結果として、４０Ｓリボソームおよびいくつかの翻訳開始因子がＳＧにリクルートされる。ミトコンドリア毒によるＳＧ形成が、ｅＩＦ２リン酸化の不在下で起こることが実証されている（Kedersha et al., (2002) "Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules", Mol Biol Cell, 13 (1), 195-210）。これは、ｅＩＦ２αリン酸化を誘導しない刺激による翻訳開始阻害も、ＳＧ形成を誘導する能力がありうることを示唆している。
【００１２】
本明細書に使用される用語「ｅＩＦ２α」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、ピューロマイシン感受性８０Ｓ前開始複合体の形成を触媒する６５kDタンパク質である真核生物翻訳開始因子２Ａを表す（Zoll WL et al. (2002). "Characterization of mammalian eIF2A and identification of the yeast homolog". J Biol Chem 277 (40): 37079-87..; Merrick WC (1992). "Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis". Microbiol Rev 56 (2): 291-315）。
【００１３】
本明細書に使用される用語「ＰＥＲＫ」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ３を表す（Shi Y, et al. (1998) "Identification and characterization of pancreatic eukaryotic initiation factor 2 alpha-subunit kinase, PEK, involved in translational control". Mol Cell Biol. 18(12):7499-509）。
【００１４】
本明細書に使用される用語「ＧＣＮ２」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ４を表す（Berlanga JJet al. (1999) "Characterization of a mammalian homolog of the GCN2 eukaryotic initiation factor 2alpha kinase". Eur J Biochem.;265(2):754-62）。
【００１５】
本明細書に使用される用語「ＡＴＦ４」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、活性化転写因子４（ｔａｘ応答エンハンサーエレメントＢ６７）を表す（Tsujimoto Aet al. (1991). "Isolation of cDNAs for DNA-binding proteins which specifically bind to a tax-responsive enhancer element in the long terminal repeat of human T-cell leukemia virus type I". Journal of Virology 65 (3): 1420-6.. Karpinski BAet al. (1992). "Molecular cloning of human CREB-2: an ATF/CREB transcription factor that can negatively regulate transcription from the cAMP response element". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89 (11): 4820-4）。
【００１６】
「ＤＮＡ損傷誘導タンパク質３４」またはＭｙＤ１１６またはＰＰＰ１Ｒ１５Ａについて本明細書に使用される用語「ＧＡＤＤ３４」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、ヒトタンパク質インヒビター１（Ｉ−１）のＣ末端と結合するＩ−１相互作用タンパク質を表す。成長停止、ＤＮＡ損傷、および他の形態の細胞ストレスによって哺乳動物細胞での発現が高まるＧＡＤＤ３４は、以前にＰＰ１と結合することが示された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）神経毒性因子ＩＣＰ−３４５の一領域と構造相同性を有する。ＧＡＤＤ３４は、ＵＰＲシグナル伝達を終止するネガティブフィードバックループのエフェクターであり、タンパク質ホスファターゼ１触媒サブユニット（ＰＰ１ｃ）をリクルートしてｅＩＦ２αを脱リン酸化する。
【００１７】
本明細書に使用される用語「タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）」は、その触媒サブユニット（ＰＰ１ｃ）と、異なる確定済み調節サブユニットまたは推定上の調節サブユニット５０種超との相互作用により多種多様な細胞機能をレギュレーションする主要な真核生物タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼを意味する。
【００１８】
本明細書に使用される用語「ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体形成阻害剤」は、μMレンジでＧＡＤＤ３４と競合してＰＰ１と複合体を形成することによって、前記複合体を非機能性にするか、またはＧＡＤＤ３４の発現を遮断するか、またはＧＡＤＤ３４を構造的に不活性にすることができる阻害剤を意味する。別の言い方では、「ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体形成阻害剤」は、５０μM以下、好ましくは２５μM以下のＥＣ５０を有する。
【００１９】
本明細書に使用される用語「炎症性腸疾患」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、腸を冒す任意の炎症性疾患を表す。この用語には、非限定的に、潰瘍性大腸炎、回腸炎を併発または併発しない、結腸を特異的に冒す状態のクローン病、顕微鏡的大腸炎（リンパ球性大腸炎およびコラーゲン蓄積大腸炎）、細菌またはウイルスに起因する感染性大腸炎、放射線大腸炎、虚血性大腸炎、小児大腸炎、未確定の大腸炎、および腸機能障害（記載症状に明白な外科的異常なし）が挙げられる。
【００２０】
本明細書に使用される、用語「被験体」は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を意味する。好ましくは、本発明による被験体はヒトである。
【００２１】
発明のスクリーニング法：
本発明の一局面は、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、（ａ）各被検物質が総合的ストレス応答を回復する能力についてその被検物質を検査すること、および（ｂ）前記総合的ストレス応答を回復する能力がある被検物質をポジティブ選択することから成るステップを含む方法に関する。
【００２２】
一態様では、スクリーニング法のステップ（ａ）は、被検物質が、ｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させるか、ｉｉ）ＡＴＦ４遺伝子の発現を活性化するか、ｉｉ）表１に示される、ＡＴＦ４によってターゲティングされるいくつかの遺伝子の発現を活性化するか、ｉｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を促進するキナーゼを活性化するか、ｉｖ）リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害するかどうかを判定することにありうる。
【００２３】
【表１】
2014512008.tif 000002
【００２４】
したがって、本発明は、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）各被験物質がＡＴＦ４遺伝子の発現を活性化する能力についてその被検物質を検査するステップ、およびｉｉ）ＡＴＦ４の発現を活性化する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、本発明は、ｉ）被検物質または各被検物質を、ＡＴＦ４遺伝子のプロモーターの全部または一部に作動的に連結されたレポーター遺伝子をトランスフェクションされた細胞と接触させるステップ、ｉｉ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを判断するステップ、およびｉｉｉ）前記レポーター遺伝子の発現を活性化する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、レポーター遺伝子は、ＧＦＰ、ＣＡＴ、ＧＡＬ、ＬＵＣ、およびＧＵＳから成る群の一つをコードする。別の態様では、細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、３Ｔ３、およびＨＥＫ２９３細胞株から成る群の一つである。特定の一態様では、本発明は、ｉ）被検物質または各被検物質を、ＡＴＦ４遺伝子を発現する能力がある細胞と接触させるステップ、ｉｉ）前記遺伝子の発現レベルを判断するステップ、およびｉｉｉ）前記遺伝子の発現を活性化する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、発現レベルは、前記遺伝子の転写レベルを決定することによって判断される。さらなる一態様では、前記遺伝子の翻訳レベルの決定は、イムノアッセイによって行われる。
【００２５】
本発明は、また、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）各被験物質が、表１に示される遺伝子の発現を活性化する能力についてその被験物質を検査するステップ、およびｉｉ）前記遺伝子の発現を活性化する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被験物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、その方法は、ｉ）被検物質または各被検物質を、表１に示されるレポーター遺伝子のプロモーターの全部または一部に作動的に連結された前記遺伝子をトランスフェクションされた細胞と接触させるステップ、ｉｉ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを判断するステップ、およびｉｉｉ）前記レポーター遺伝子の発現を活性化する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む。一態様では、レポーター遺伝子は、ＧＦＰ、ＣＡＴ、ＧＡＬ、ＬＵＣ、およびＧＵＳから成る群の一つをコードする。別の態様では、細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、３Ｔ３、およびＨＥＫ２９３細胞株から成る群の一つである。
【００２６】
任意の遺伝子の発現活性化は、被験物質の不在下で行った対照アッセイに比べて、被検物質の存在下で転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかを決定することによって判断することができる。そのようなアッセイは、当業界で周知であり、本明細書下記に示される。例えば、そのようなアッセイは、遺伝子を発現する能力がある細胞（ホスト細胞）で行うことができる。
【００２７】
本発明は、また、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）各被験物質がｅＩＦ２αのリン酸化を増加させる能力についてその被検物質を検査するステップ、およびｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させる被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被験物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、本発明は、また、ｉ）被検物質または各被検物質を、ｅＩＦ２αを発現する能力がある細胞と接触させるステップ、ｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化レベルを判断するステップ、およびｉｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させる被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、ｅＩＦ２αのリン酸化レベルの判断は、リン酸化型ｅＩＦ２αを特異的に認識する抗体を用いたイムノアッセイによって行われる。別の態様では、ｅＩＦ２αのリン酸化レベルの判断は、ｅＩＦ２αへの放射性ラベルリン酸基の共有結合を追跡することによって行われる。
【００２８】
本発明は、また、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）各被験物質がｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害する能力についてその被験物質を検査するステップ、およびｉｉ）ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被検物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、本発明は、ｉ）被検物質または各被験物質を、精製された複合体型のＧＡＤＤ３４およびＰＰ１ｃタンパク質、ならびにリン酸化型ｅＩＦ２αを含有する無細胞組成物と接触させるステップ、ｉｉ）精製された複合体型のＧＡＤＤ３４およびＰＰ１ｃタンパク質、ならびにリン酸化型ｅＩＦ２αを含有する無細胞組成物中のｅＩＦ２αのリン酸化レベルを、被験物質の不在下で決定されたリン酸化レベルに比べて判断するステップ、ならびにｉｉｉ）被検物質の不在下で決定されたリン酸化レベルよりも高いレベルのｅＩＦ２αリン酸化を提供する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被験物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、ｅＩＦ２αのリン酸化レベルの判断は、リン酸化型ｅＩＦ２αを特異的に認識する抗体を用いたイムノアッセイによって行われる。別の態様では、ｅＩＦ２αのリン酸化レベルの判断は、ｅＩＦ２αへの放射性ラベルリン酸基の共有結合を追跡することによって行われる。
【００２９】
本発明は、また、炎症性腸疾患の予防または治療に有用な複数の被検物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）各被検物質がｅＩＦ２αキナーゼを活性化する能力についてその被験物質を検査するステップ、およびｉｉ）ｅＩＦ２αキナーゼを活性化する被検物質を同定することによって、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤として有用な被験物質を同定するステップを含む方法を目的とする。一態様では、キナーゼはＰＥＲＫである。一態様では、キナーゼはＧＣＮ２である。別の態様では、キナーゼはＨＲＩである。さらなる一態様では、キナーゼはＰＫＲである。
【００３０】
ホスト細胞：
本発明のアッセイに使用される遺伝子を発現するために多種多様なホスト−発現ベクター系を利用することができる。これらには、非限定的に、ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２、ＳＷ４８０、ＨＴＣ１１６細胞株などの結腸腺ガン由来ヒト細胞株のような哺乳動物細胞系が挙げられる。哺乳動物細胞系は、哺乳動物細胞ゲノムまたは哺乳動物ウイルスから得られるプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーターまたは種痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有するリコンビナント発現構築物を収容しうる。
【００３１】
追加的なホスト−発現ベクター系には、非限定的に、ＰＴＫもしくはアダプタータンパク質コーディング配列を含有するリコンビナントバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフォーメーションされた細菌（例えばE. 5 coliもしくはB. subtilis）のような微生物；タンパク質もしくはペプチドコード配列を含有するリコンビナント酵母発現ベクターをトランスフォーメーションされた酵母（例えばSaccharomyces、Pichia）；タンパク質もしくはペプチドコード配列を含有するリコンビナントウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染したＳｆ９もしくはＳｆ２１のような昆虫細胞系；Xenopus卵母細胞のような両生類細胞；またはタンパク質もしくはペプチドコード配列を含有するリコンビナントウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくはリコンビナントプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）をトランスフォーメーションされた植物細胞系が挙げられる。これらの各細胞型のための培養条件は特異的であり、当業界に精通する専門家に公知である。
【００３２】
アッセイされるべきタンパク質をコードするＤＮＡは、リン酸カルシウム介在性、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性、リポソーム介在性、ウイルス介在性、エレクトロポレーション介在性およびマイクロインジェクション送達のような、当業界で公知のいくつかの方法によって細胞株に一過性または安定的に発現させることができる。これらの各方法は、ＤＮＡ、細胞株、およびその後に採用されるべきアッセイの種類に応じて、多彩な実験パラメーターを最適化する必要がありうる。
【００３３】
加えて、ターゲットタンパク質についての核酸配列を自然に保持および発現するネイティブな細胞株を使用することができる。
【００３４】
遺伝子発現を決定するための方法：
遺伝子発現レベルの決定は、様々な技法によって行うことができる。一般に、決定される発現レベルは、相対発現レベルである。
【００３５】
より好ましくは、決定は、試料をプローブ、プライマーまたはリガンドのような選択試薬と接触させることによって、試料中に本来存在する関心対象のポリペプチドまたは核酸の存在を検出または量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイター皿、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどのような任意の適切な装置で行うことができる。具体的な態様では、接触は、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイのような試薬をコーティングした基材上で行われる。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体のような、固形または半固形の基材でありうる。基材は、スライド、メンブラン、ビーズ、カラム、ゲルなどのような様々な形状およびサイズでありうる。接触は、試薬と試料の核酸またはポリペプチドとの間に形成される核酸ハイブリッドまたは抗体−抗原複合体のような検出可能な複合体に適した任意の条件で行うことができる。
【００３６】
好ましい一態様では、ｍＲＮＡの量を決定することによって、発現レベルを決定することができる。
【００３７】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当業界で周知である。例えば、試料中に含有される核酸（例えば、被験体から調製された細胞または組織）を、最初に標準法により、例えば溶解酵素もしくは化学溶液を使用して抽出するか、または製造業者の説明書にしたがって核酸結合樹脂によって抽出する。次に、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは、定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００３８】
他の増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）および核酸配列増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００３９】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、本明細書において関心対象のｍＲＮＡに配列相補性または相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用であることが判明する。そのような核酸は、同一である必要はなく、典型的には比較可能なサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、なおより好ましくは９０〜９５％同一であることが了解されている。ある態様では、ハイブリダイゼーションを検出するための検出可能なラベルなどの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利であろう。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）などの多種多様な適切な指示薬が、当業界で公知である。
【００４０】
プローブは、典型的には、１０から１０００ヌクレオチド長の間、例えば１０から８００ヌクレオチド長の間、より好ましくは１５から７００ヌクレオチド長の間、典型的には２０から５００ヌクレオチド長の間の１本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅されるべき関心対象の核酸と完全にまたはほとんど完全にマッチするように設計された、１０から２５ヌクレオチド長の間の比較的短い１本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする核酸に「特異的」であり、すなわちそれらは、好ましくは高ストリンジェンシハイブリダイゼーション条件（最高の融解温度Ｔｍに対応する、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ。ＳＣＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）でハイブリダイゼーションする。
【００４１】
上記の増幅および検出法に使用される核酸プライマーまたはプローブは、キットとして集合させることができる。そのようなキットには、コンセンサスプライマーおよび分子プローブが含まれる。好ましいキットには、増幅が起こったかどうか判定するために必要な構成要素が挙げられる。キットには、例えばＰＣＲ緩衝液および酵素；陽性対照配列、反応対照プライマー；ならびに特異的配列を増幅および検出するための説明書が含まれる。
【００４２】
別の好ましい態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。そのようなＤＮＡチップまたは核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライドまたはミクロスフェアサイズのビーズでありうる基材に化学的に結合した異なる核酸プローブから成る。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカベーズ材料、カーボン、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースから構成されうる。プローブは、約１０〜約６０塩基対でありうる、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのような核酸を含む。発現レベルを決定するために、場合により最初に逆転写に供された、被験体からの試料を、ラベルし、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合したプローブ配列と相補的なターゲット核酸の間の複合体の形成を導く。次に、ラベルされたハイブリダイゼーション複合体を検出し、定量または半定量することができる。ラベルは、様々な方法によって、例えば放射性ラベルまたは蛍光ラベルを用いることによって行うことができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技法の多数の変形が当業者に利用可能である（例えばHoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説参照）。
【００４３】
前記遺伝子の発現レベルを決定するための他の方法には、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量の決定が含まれる。
【００４４】
そのような方法は、生物学的試料を、その試料中に存在するマーカータンパク質と選択的に相互作用する能力がある結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、一般に、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる抗体、好ましくはモノクローナルでありうる抗体である。
【００４５】
タンパク質の存在は、競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチ型アッセイのようなイムノアッセイなどの、標準的な電気泳動技法および免疫診断技法を使用して検出することができる。そのようなアッセイには、非限定的に、ウエスタンブロット；凝集検査；ＥＬＩＳＡのような酵素標識および酵素介在性イムノアッセイ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などが挙げられる。反応には、一般に蛍光ラベル、化学発光ラベル、放射性ラベル、酵素ラベルもしくは色素分子のような顕示ラベル（revealing label）、または抗原と、その抗原と反応した一つもしくは複数の抗体との間の複合体形成を検出する他の方法が挙げられる。
【００４６】
上述のアッセイは、一般に、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から液相中に未結合タンパク質を分離することを伴う。本発明の実施に使用できる固体支持体には、ニトロセルロース（例えばメンブランまたはマイクロタイターウェルの形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリジン（polyvinylidine fluoride）；ジアゾ化紙；ナイロンメンブラン；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどのような基材が挙げられる。
【００４７】
より詳細には、マイクロタイタープレートのウェルに被験タンパク質に対する抗体がコーティングされるＥＬＩＳＡ法を使用することができる。次に、コーティングされたウェルに、マーカータンパク質を含有するまたは含有すると疑われる生物学的試料が添加される。抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間インキュベーション後に、プレート（一つまたは複数）を洗浄して未結合の部分を除去し、検出可能にラベルされた二次結合分子を添加することができる。二次結合分子を、捕捉された任意の試料マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当業界で周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出する。
【００４８】
ｅＩＦ２αのリン酸化およびキナーゼ活性化の測定：
タンパク質のリン酸化レベルは、イムノアッセイまたは放射性ラベルなどの様々な方法によって判断することができる。ターゲットタンパク質のリン酸化レベルは、イムノアッセイまたは放射性ラベルなどの様々な方法によって判断することができる。具体的には、これらの技法によって、ｅＩＦ２αのリン酸化の増加を測定することができ、ｅＩＦ２αリン酸化を促進するキナーゼの活性化をアッセイすることができ、リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸の阻害も決定することができる。
【００４９】
特定の一態様では、タンパク質のリン酸化レベルは、ターゲットタンパク質に高度に特異的であるべき結合パートナーを利用することによって判断される。結合パートナーが抗体であることが好ましい。抗体は、好ましくは、基材の独特なエピトープに対して発生される。一代替態様では、結合パートナーは、リン酸化型ターゲットタンパク質に特異的であるべきである。ｅＩＦ２αのリン酸化状態を評価するために使用される検出手順は、例えばリン酸化セリンを認識して結合する抗ホスホセリン抗体またはペプチドを採用することができる。検出抗体は、好ましくは、シグナルを最大化するためのポリクローナル抗体であるが、また、シグナル発生のために最適化された特異的モノクローナル抗体でありうる。
【００５０】
一例では、セリン５１（酵母ｅＩＦ２αの場合。げっ歯類またはヒトでの残基５２に対応する）でリン酸化されたｅＩＦ２αのレベルは、市販の抗体、例えばCell Signalling Technologyの製品＃９７２１を利用した免疫ブロットまたは免疫細胞化学法によって測定することができる。一態様では、リン酸化ｅＩＦ２αの蓄積を促進する被検物質用の高処理スクリーニングアッセイを開発するために、リン酸化ｅＩＦ２αに対する市販の抗血清を使用することができる。
【００５１】
別の例では、セリン５１（酵母ｅＩＦ２αの場合。げっ歯類またはヒトでの残基５２に対応する）でのｅＩＦ２α脱リン酸の阻害は、被検物質がＰＰｌｃ−ＧＡＤＤ３４複合体の活性を阻害する能力をスクリーニングすることによってアッセイすることができる（Novoa, I., et al. (2001). "Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α". J. Cell. Biol. 28;153(5):1011-22）。ＰＰｌｃ−ＧＡＤＤ３４複合体はin vitroで活性であり、その活性は、リコンビナントタンパク質を使用して再構成することができる。ＰＰｌｃ／ＧＡＤＤ３４複合体をリン酸化ｅＩＦ２αおよび被検物質と組み合わせる無細胞アッセイを使用することができる。ＥＬＩＳＡアッセイを利用することによって、ＰＰｌｃ／ＧＡＤＤ３４複合体によるｅＩＦ２α脱リン酸および被検物質によるこの脱リン酸の阻害は、リン酸化ｅＩＦ２αシグナルの減少を測定することによってモニターすることができる。
【００５２】
さらなる一例では、ｅＩＦ２αキナーゼであるＰＥＲＫ、ＧＣＮ２、ＨＲＩ、およびＰＫＲの活性化を測定することができる。キナーゼの活性化は、キナーゼ中の既知残基での自己リン酸化事象に関連する（例えば、マウスＧＣＮ２のトレオニン８９８およびマウスＰＥＲＫのトレオニン９８０）。リン酸化型および活性化型のキナーゼを認識する抗血清を使用することによって、ＥＬＩＳＡなどの免疫ブロットまたは免疫組織化学法を使用してキナーゼ活性化を検出することができる。リン酸化型のキナーゼＰＥＲＫおよびＧＣＮ２に対する抗血清が開発されている。（Harding, H., et al. (2000). "Regulated translation initiation controls stress induced gene expression in mammalian cells". Mol. Cell 6, 1099-1108）。
【００５３】
または、イムノアッセイを、標準技法による放射性ラベルリン酸エステルの検出に置き換えることができる。これは、細胞を被検物質および放射性ラベルリン酸エステルと共にインキュベーションすること、細胞を溶解させること、一次元または二次元いずれかのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）技法を使用して溶解物の細胞性タンパク質成分を分離すること、およびＸ線フィルムに露光することによりリン酸化タンパク質の存在を検出することを伴う。
【００５４】
また、タンパク質のリン酸化は、電気泳動ゲル上での泳動およびウエスタンブロットによって好都合に検出し、それによって、タンパク質分子量の変化が起こったかどうかを観察することができる（リン酸化タンパク質は、対応する非リン酸化型よりも重い）。
【００５５】
被検物質：
本発明の一態様によると、被検物質は、ペプチド、ペプチド模倣薬、小型有機分子、抗体、アプタマーまたは核酸から成る群より選択することができる。例えば、本発明による被検物質は、予め合成された化合物のライブラリー、または構造がデータベースから決定される化合物ライブラリー、またはde novo合成された化合物ライブラリーより選択することができる。
【００５６】
特定の一態様では、被検物質は、小型有機分子より選択することができる。
【００５７】
本明細書に使用される用語「小型有機分子」は、一般に医薬品に適する有機分子に匹敵するサイズの分子を表す。この用語は、生物学的高分子（例えばタンパク質、核酸など）を除外し；好ましい小型有機分子は、最大２０００Da、最も好ましくは最大約１０００Daのサイズである。
【００５８】
高処理スクリーニング法
上記アッセイは、炎症性腸疾患の治療または予防に有用でありうる薬物を開発するための被検物質を同定するための高処理スクリーニング技法を使用して行うことができる。高処理スクリーニング技法は、自動ロボットシステムを使用して多重アッセイを実施するために、マルチウェルプレート（例えば、９６、３８９、または１５３６ウェルプレート）を使用して実施することができる。したがって、被検物質の大規模ライブラリーを高効率的にアッセイすることができる。
【００５９】
被検物質を同定するための好ましい戦略は、ストレス応答経路によって活性化された任意の遺伝子のプロモーターに融合されたレポーター遺伝子をトランスフェクションされた培養細胞で開始する。より詳細には、マイクロタイタープレート（９６ウェルまたは３８４ウェル）のウェル中で成長している、安定トランスフェクションされたＨＴ−２９細胞を、化合物ライブラリーの高処理スクリーニングに適合させることができる。ライブラリー中の化合物は、上記トランスジェニック細胞が入っているマイクロタイター皿のウェルに一度に１個ずつ自動的に適用される。
【００６０】
いったんターゲット遺伝子の一つを活性化する被検物質が同定されたならば、次に、総合的ストレス応答経路におけるそれらの被検物質の作用部位を決定することが好ましい。ターゲット物質を最適化するには、より洗練されたアッセイを開発するために作用部位を定義することが特に有用である。ＩＳＲ中のターゲット物質の作用部位を決定するためのアッセイは、高処理技法を用いて実施することができる。
【００６１】
一例では、ＡＴＦ４の翻訳を測定するためのＥＬＩＳＡベースアッセイが、特に、迅速高処理スクリーニングに適応される。同様に高処理スクリーニングのために、市販の抗血清によりリン酸化ｅＩＦ２αを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発することができる。または、リン酸化ｅＩＦ２αキナーゼに対する抗血清をＥＬＩＳＡベースの高処理スクリーニングに好都合に使用して、経路の上流成分に焦点を当てることができる。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ型アッセイは、マイクロタイタープレートで行うことができる。例えばPeraldi et al., (1992), J. Biochem. 285: 71-78; Schraag, et al., (1993), Analytical Biochemistry 211: 233-239; Cleavland, (1990), Analytical Biochemistry 190: 249-253; Farley, (1992), Analytical Biochemistry 203: 151-157；およびLczaro, (1991), Analytical Biochemistry 192: 257-261を参照されたい。正常細胞の状況内でリン酸化に対する被検物質の作用を評価するために、米国特許第５，７６３，１９８号に記載された迅速定量アッセイ系も使用することができる。例えば、二つの態様を以下のように考えることができる。
【００６３】
ターゲットタンパク質のリン酸化度は、ターゲットタンパク質を発現する細胞を被検物質に曝露すること、およびその後に細胞を溶解して細胞内容物を放出させることによって測定することができる。ターゲットタンパク質は、細胞溶解物を固体支持体への結合パートナーと共にインキュベーションすること、およびその後に未結合の細胞成分を洗浄除去することによって単離される。検出手順は、タンパク質上のリン酸化残基の存在または不在を、被験物質に曝露されなかった対照細胞の溶解物に比べて判断するために行われる。または、結合パートナーがリン酸化型のターゲットタンパク質に対するものであってもよく、その場合、単離ステップおよびリン酸化の検出ステップは同時に行われる。
【００６４】
これらのアッセイは、いくつかの利点を与える。ホールセルへの被検物質の曝露は、被検物質が作用しうる自然状況でその活性を評価できるようにする。加えて、このアッセイにはターゲット細胞タンパク質の放射性ラベルが必要ない。このアッセイは、マイクロタイタープレート形式で容易に行えるので、説明したアッセイを自動ロボット系によって行い、適度に短い時間枠内で多数の被験試料を検査可能にすることができる。
【００６５】
本発明の代替的な一態様は、無細胞系においてキナーゼがｅＩＦ２αをリン酸化する能力に対する被検物質の作用を決定するための方法に関する。酵素活性のモデュレーションを評価するために、キナーゼと、抗体によって固体支持体に結合したｅＩＦ２αとを含有する反応混合物に被検物質が添加される。キナーゼの反応は、ＡＴＰの添加によって開始することができる。本明細書記載の検出手順は、物質に対して行われ、リン酸化残基の存在または不在が判断され、結果が、対照（すなわち被検物質が添加されなかった反応混合物）について得られた結果と比較される。
【００６６】
本発明のアッセイは、以前に検査されていない化合物または抽出物の活性を判断するための篩として使用することができ、その場合、一濃度が検査され、対照と比較される。これらのアッセイは、また、例えば範囲１００μM〜１μMの濃度範囲を検査すること、およびリン酸化量が対照の２分の１だけ増加する濃度（ＩＣ５０）を計算することによって、化合物の相対効力を評価するために使用することができる。
【００６７】
本明細書記載の本発明のホールセルアッセイは、例えば関心対象のタンパク質への結合パートナーをコーティングされた固相または検出分子のような任意または全てのアッセイ試薬を含む、プレパッケージされたキットを利用することによって行うことができる。本発明の無細胞アッセイは、例えば、任意または全てのアッセイ試薬を含む、プレパッケージされたキットによって行うことができる。
【００６８】
発明の治療法：
本発明のさらなる一局面は、炎症性腸疾患の処置に使用するための、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤に関する。
【００６９】
一態様では、前記薬剤は、ｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を増加させ、ｉｉ）ＡＴＦ４遺伝子発現を活性化し、ｉｉ）表１に示される、ＡＴＦ４によってターゲティングされるいくつかの遺伝子の発現を活性化し、ｉｉｉ）ｅＩＦ２αのリン酸化を促進するキナーゼを活性化し、ｉｖ）リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害し、ｖ）ストレス顆粒の形成を促進することができる。
【００７０】
本発明のさらなる一局面は、炎症性腸疾患を患う被験体を標準処置または外科手術後に長期寛解に維持することに使用するための、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤に関する。炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎の目下の標準処置には、コルチコステロイド、免疫抑制薬、メサラジン（５−アミノサリチル酸、メサラミン、または５−ＡＳＡとしても知られている。ブランド製剤には、Apriso、Asacol、Pentasa、Mezavant、Lialda、Fivasa、RovasaおよびSalofalkが挙げられる）のようなアミノサリチレートであるスルファサラジン、スルファサラジン（アズルフィジンとしても知られている）、バルサラジド（ColazalまたはColazide（ＵＫ）としても知られている）、オルサラジン（ジペンツムとしても知られている）、免疫抑制剤（アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ラパマイシン、シクロスポリンおよびタクロリムス）またはインフリキシマブ、ビシリズマブ、アダリムマブ、もしくはベドリズマブのような生物学的処置剤の投与が含まれる。
【００７１】
特定の一態様では、リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害する薬剤は、サルブリナール（salubrinal）（３−フェニル−Ｎ−［２，２，２−トリクロロ−１−［［（８−キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］−２−プロペンアミド）である（Boyce et al (2005) "A selective inhibitor of eIF2alpha dephosphorylation protects cells from ER stress". Science 307 935. Long et al (2005) "Structure-activity relationship studies of salubrinal lead to its active biotinylated derivative". Bioorg.Med.Chem.Lett. 15 3849）。サルブリナールは、ｅＩＦ２αを脱リン酸化する細胞性ホスファターゼ複合体の細胞透過性選択的阻害剤である。サルブリナールは、Alexis BiochemicalsもしくはTocris Bioscience（カタログ番号２３４７）から、または当業者に公知の他の販売元から入手することができる。
【００７２】
別の特定の態様では、リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸を阻害する薬剤は、グアナベンズ（２−（２，６−ジクロロベンジリデン）ヒドラジンカルボキシイミダミド）である。グアナベンズは、タンパク質ホスファターゼ１の調節サブユニットＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４に結合した小分子であり、翻訳開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ２α）のストレス誘導脱リン酸を選択的に破壊する（Tsaytler P, Harding HP, Ron D, Bertolotti "A.Selective inhibition of a regulatory subunit of protein phosphatase 1 restores proteostasis.". Science. 2011 Apr 1;332(6025):91-4）。
【００７３】
別の態様では、リン酸化ｅＩＦ２の脱リン酸を阻害する薬剤は、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１の遺伝子発現の阻害剤である。
【００７４】
本発明に使用するための発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づきうる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１のｍＲＮＡに結合することによってそれらの翻訳を直接遮断するように作用し、それによりタンパク質の翻訳を抑制またはｍＲＮＡの分解を増加させ、それによりＧＡＤＤ３４またはＰＰ１のレベルを減少させ、それにより細胞中の活性を減少させる。例えば、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１をコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的な、少なくとも塩基約１５個のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば従来のホスホジエステル技法によって合成し、例えば静脈内注射または注入によって投与することができる。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技法を使用するための方法は、当業界で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；同第６，５６６，１３１号；同第６，３６５，３５４号；同第６，４１０，３２３号；同第６，１０７，０９１号；同第６，０４６，３２１号；および同第５，９８１，７３２号）。
【００７５】
低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明に使用するための発現阻害剤として機能しうる。被験体もしくは細胞を低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、または小型二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させる結果、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１の遺伝子発現が特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）ことによって、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１の遺伝子発現を減少させることができる。配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は、当業界で周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号および同第６，５０６，５５９号；ならびに国際公開公報第０１／３６６４６号、同第９９／３２６１９号、および同第０１／６８８３６号参照）。本発明のｓｉＲＮＡのホスホジエステル結合の全てまたは一部は、有利に保護される。この保護は、一般に、当業界で公知の方法を用いて化学経路を介して実施される。ホスホジエステル結合は、例えばチオールもしくはアミン官能基によって、またはフェニル基によって保護することができる。本発明のｓｉＲＮＡの５’−および／または３’−末端も、例えば、ホスホジエステル結合を保護するための上記技法を用いて有利に保護される。ｓｉＲＮＡ配列は、有利には、少なくとも１２個の隣接ジヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含む。
【００７６】
本発明の核酸配列に関して本明細書に使用される用語「ｓｉＲＮＡ誘導体」は、エリスロポエチンまたはそのフラグメントと少なくとも９０％の、好ましくは少なくとも９５％の、一例として少なくとも９８％の、より好ましくは少なくとも９８％の同一率を有する核酸を表す。
【００７７】
本明細書に使用される、二つの核酸配列の間の「同一率」は、比較されるべき二つの配列の間で、前記配列の最良のアライメントで得られた同一核酸の率を意味し、この率は、純粋に統計的であり、これら二つの配列間の差は、核酸配列にわたりランダムに分散している。本明細書に使用される「最良のアライメント」または「最適なアライメント」は、決定された同一率（下記参照）が最高のアライメントを意味する。二つの核酸配列の間の配列比較は、通常、最良のアライメントにしたがって予めアライメントされたこれらの配列を比較することによって実現され；この比較は、局地的類似領域を同定および比較するために、比較セグメントに関して実現される。比較を行うために最良の配列アライメントは、マニュアル方式に加えて、SmithおよびWatermanによって開発された全体的相同性アルゴリズム（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）を使用することによって、NeddlemanおよびWunschによって開発された局地的相同性アルゴリズム（J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970）を使用することによって、PearsonおよびLipmanによって開発された類似性法（Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988）を使用することによって、そのようなアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）を使用することによって、ＭＵＳＣＬＥ多重アライメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を使用することによって、実現することができる。最良の局地的アライメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアを使用することができる。二核酸配列の間の同一率は、最適にアライメントされたこれら二配列を比較することによって決定され、これら二つの間で最適なアライメントを得るために、核酸配列は参照配列に関して付加または欠失を含むことができる。同一率は、これら二配列間で同一位置の数を決定し、この数を比較された位置の総数で割り、得られた結果を１００倍してこれら二配列間の同一率を得ることによって計算される。
【００７８】
ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）も、本発明に使用するための発現阻害剤として機能しうる。
【００７９】
リボザイムも、本発明に使用するための発現阻害剤として機能しうる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する能力がある酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用メカニズムは、リボザイム分子と相補的ターゲットＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションに続くエンドヌクレアーゼ的切断を伴う。そのため、ＧＡＤＤ３４またはＰＰ１のｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効率的に触媒する操作ヘアピン型リボザイム分子またはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的ＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、典型的には以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣが挙げられるリボザイム切断部位を求めてターゲット分子を走査することによって最初に同定される。いったん同定されたならば、切断部位を含有するターゲット遺伝子領域に対応する、リボヌクレオチド約１５から２０個の間の低分子ＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にするおそれがある二次構造のような、予測される構造特徴について評価することができる。
【００８０】
発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方を公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホルアマダイト（phosphoramadite）化学合成によるなどの、化学合成技法が挙げられる。または、アンチセンスＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivo転写によって発生させることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んでいる多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの様々な改変を、細胞内安定性および半減期を増大させる手段として導入することができる。可能性のある改変には、非限定的に、分子の５’および／もしくは３’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴヌクレオチドバックボーン内へのホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
【００８１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムは、in vivoで単独またはベクターに関連して送達することができる。その最も広い意味で、「ベクター」は、細胞への、好ましくはＧＡＤＤ３４またはＰＰ１を発現している細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸の移行を容易にする能力がある任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じる分解度よりも低下した分解で核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明に有用なベクターには、非限定的に、プラスミド、ファージミド、ウイルス、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌起原から得られた他の媒体が挙げられる。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、それには、非限定的に以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、およびラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス。挙げられていないが当業界で公知の他のベクターも難なく採用することができる。
【００８２】
好ましいウイルスベクターは、可欠遺伝子が、関心対象の遺伝子に置換された非細胞変性性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性性ウイルスには、生活環がゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写に続くホスト細胞性ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを伴うレトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられる。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法の治験に承認されている。複製欠損した（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令する能力があるが、感染性粒子を製造する能力はない）レトロウイルスが最も有用である。そのような遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、遺伝子のin vivo高効率トランスダクションに一般的な有用性がある。複製欠損レトロウイルスを製造するための標準プロトコール（プラスミドへの外因性遺伝材料の組み込み、パッケージング細胞株へのプラスミドのトランスフェクション、パッケージング細胞株によるリコンビナントレトロウイルスの製造、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびターゲット細胞へのウイルス粒子の感染のステップを含む）は、Kriegler, 1990およびMurry, 1991）に提供されている。
【００８３】
ある種の適用に好ましいウイルスは、遺伝子療法でのヒトへの使用がすでに承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスのアデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。実際に、それぞれ異なる組織向性を有する１２種の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られている（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。リコンビナントＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２から得られる（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。アデノ随伴ウイルス１〜１２型は、複製欠損となるように操作することができ、広範囲の細胞型および種に感染する能力がある（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。それは、さらに、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞などの多様な系列の細胞での高いトランスダクション頻度；ならびに重感染阻害の欠如、したがって複数系列のトランスダクションが可能のような利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞性ＤＮＡに組み込むことによって、レトロウイルス感染に特徴的な、挿入突然変異誘発の確率および挿入遺伝子発現の変動性を最小化することができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルスの感染が、組織培養での１００回を超える継代にわたり選択圧の不在下で追跡され、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることが暗に示された。アデノ随伴ウイルスは染色体外方式でも機能しうる。
【００８４】
他のベクターにはプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当業界で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照されたい。プラスミドベクターは、過去２、３年に、細胞に抗原コード遺伝子をin vivo送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念を有さないので、これについて特に有利である。しかし、これらのプラスミドは、ホスト細胞と適合性のプロモーターを有するので、プラスミド内に作動的にコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの通常使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。追加的に、プラスミドは、制限酵素および連結反応を使用してＤＮＡの特異的フラグメントを除去および付加するように注文設計することができる。プラスミドは、多様な非経口、粘膜および局所経路により送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または他の経路により注射することができる。それは、また、鼻腔内スプレーまたは点鼻薬、直腸坐剤および経口で投与してもよい。それは、また、遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与してもよい。プラスミドは、水性液剤として、金粒子上に乾燥させて、または非限定的にリポソーム、デンドリマー、渦巻き型（cochleate）およびマイクロ封入などの別のＤＮＡ送達系に関連して与えてもよい。
【００８５】
好ましい一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターのコントロール下にある。プロモーターは、また、例えば、ＣＭＶプロモーターまたは任意の合成プロモーターのようなウイルスプロモーターでありうる。
【００８６】
特定の一態様では、ストレス顆粒の形成を促進する薬剤はパテアミンＡである。パテアミンは、ニュージーランドの海岸沖から発見されたカイメンMycaleから最初に単離された。Northcote, P. T. et al, Tetrahedron Lett., 32:6411-6414 (1991)。天然型は、１９員マクロ環内のチアゾールおよびＥ，Ｚ−ジエン酸エステルならびにトリエニルアミン側鎖を担持する。追加的なパテアミン２種、パテアミンＢおよびＣも単離された。それらの構造は、トリエニルアミン側鎖の末端基の性質だけがパテアミンＡと異なる。単離された天然型３種全てについての構造を下に示す：
【００８７】
【化１】
2014512008.tif 000003
【００８８】
別の態様では、ストレス顆粒の形成を促進する薬剤は、一般式：
【００８９】
【化２】
2014512008.tif 000004
［式中、
Ａ−Ｂは、エタン、（Ｅ）および（Ｚ）−エテン、（Ｅ）および（Ｚ）−置換エテン、エチンであり、
Ｋは、水素またはＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｘは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アミノカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノであり、
Ｙは、Ｓ、ＮＨ、またはＯであり、
Ｚは、水素、ヒドロキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノであるが、Ｒ４がジメチルアミノである場合はｔ−ブトキシカルボニルアミノではなく、
Ｒ１は、水素またはＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒは、以下：
（ａ）式：
【化３】
2014512008.tif 000005
（式中、Ｒ２は、アルキル、アルキルヒドロキシ、アルキルアルコキシ、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、またはアルキルアミノジアルキルより選択される置換基１個または複数で場合により置換されている）で示されるアルケン；
（ｂ）式：
【化４】
2014512008.tif 000006
（式中、Ｒ３は、水素、アルキル、アルキエニル（alkyenyl）、アンキニル（ankynyl）、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメタン、またはフルオロより選択される置換基１個または複数で場合により置換されている）で示されるアルケニルアリール；および
（ｃ）式：
【化５】
2014512008.tif 000007
（式中、Ｒ４は、水素、アルキル、アルキエニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノより選択される置換基１個または複数で場合により置換されている）で示されるメチルジエニルペンチル；および
（ｄ）式：
【化６】
2014512008.tif 000008
（式中、Ｒ４は、水素、アルキル、アルキエニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノより選択される置換基１個または複数で場合により置換されている）で示されるメチルアルケニルペンチルより選択される］
を有するパテアミンＡの誘導体およびその薬学的に許容される塩である。
【００９０】
本発明の別の目的は、炎症性腸疾患を治療および／または予防するための方法であって、それを必要とする被験体に上記の総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤を投与することを含む方法に関する。
【００９１】
総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤は、下記と同義の薬学的組成物の形態で投与することができる。
【００９２】
好ましくは、前記阻害剤は、治療有効量で投与される。
【００９３】
「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当な効果／リスク比で炎症性腸疾患を治療および／または予防するために十分な量の、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤が意味される。
【００９４】
本発明の化合物および組成物の合計１日使用量は、担当医師が健全な医学的判断の範囲内で決定することが了解されている。任意の特定の被験体に特異的な治療有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；採用される特定化合物の活性；採用される特定組成物、被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および採用される特定化合物の排泄速度；処置期間；採用される特定ポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野で周知の要因などの多様な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで薬用量を徐々に増加させることは、十分に当業界の技術の範囲内である。しかし、製品の１日薬用量は、成体１人あたり１日０．０１〜１，０００mgの広い範囲で変動しうる。好ましくは、組成物は、処置されるべき被験体の症状に応じて薬用量を調整するために活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgを含有する。医薬は、典型的には活性成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは活性成分１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常、１日０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、特に１日約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の薬用量レベルで供給される。
【００９５】
本発明の別の目的は、炎症性腸疾患を処置するための方法であって：
ｉ）それを必要とする被験体にコルチコステロイド、免疫抑制薬、メサラジン（５−アミノサリチル酸、メサラミン、または５−ＡＳＡとしても知られている。ブランド製剤には、Apriso、Asacol、Pentasa、Mezavant、Lialda、Fivasa、RovasaおよびSalofalkが挙げられる）のようなアミノサリチレートであるスルファサラジン、スルファサラジン（アズルフィジンとしても知られている）、バルサラジド（ColazalまたはColazide（ＵＫ）としても知られている）、オルサラジン（ジペンツムとしても知られている）、免疫抑制剤（アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ラパマイシン、シクロスポリンおよびタクロリムス）またはインフリキシマブ、ビシリズマブ、アダリムマブ、もしくはベドリズマブのような生物学的処置剤またはその組み合わせから成る群より選択される標準処置を施すことから成る第１ステップ
ｉｉ）それを必要とする前記被験体に、ステップｉ）の標準処置後に前記被験体を長期寛解に維持するために、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤を投与することから成る第２ステップ
を含む方法に関する。
【００９６】
一態様では、ステップｉ）およびｉｉ）は、同時に行われるか、または好ましくは、ステップｉｉ）はステップｉ）の後に連続して行われる。
【００９７】
総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤を、薬学的に許容されうる賦形剤、および場合によっては生分解性ポリマーのような徐放性マトリックスと組み合わせて治療用組成物を形成させてもよい。
【００９８】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与用の本発明の薬学的組成物中の主薬は、単独または別の主薬と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物としてユニット投与剤形で動物およびヒトに投与することができる。適切なユニット投与剤形は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤または液剤、舌下および口内投与剤形のような経口経路剤形、エアロゾル、植込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内および鼻腔内投与剤形ならびに直腸投与剤形（坐剤および浣腸）を含む。
【００９９】
好ましくは、薬学的組成物は、注射される能力がある製剤に薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張無菌食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物（場合に応じて、無菌水または生理食塩水を添加して注射液を構成できる）でありうる。
【０１００】
注射用途に適する薬学的剤形には、無菌水性液剤または水性分散剤；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液または分散剤の即時調製用無菌散剤が挙げられる。全ての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性（syringablility）が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。
【０１０１】
本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容されうる塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水に入れて調製することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物に入れて、ならびに油に入れて調製することができる。通常の保存および使用条件で、これらの調剤は、微生物の成長を抑制する保存料を含有する。
【０１０２】
本発明の総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復する能力がある薬剤は、中性形態または塩形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容されうる塩には、例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と一緒になって形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と一緒になって形成）が挙げられる。遊離カルボキシル基と一緒になって形成する塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得ることができる。
【０１０３】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。妥当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合は要求される粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを入れることが好ましい。注射用組成物の持続性吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【０１０４】
無菌注射液は、適切な溶媒中に必要量の活性ポリペプチドを上掲の他の成分いくつかと共に混合し、続いて必要に応じて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、塩基性分散媒および上掲からの他の必要成分を含有する無菌ビヒクル中に様々な無菌活性成分を混合することによって調製される。無菌注射液調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ濾過滅菌されたその溶液から活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥技法および凍結乾燥技法である。
【０１０５】
製剤化されると、液剤は、投薬製剤と適合性な方法で、治療有効量で投与される。製剤は、上記種類の注射液などの様々な投薬剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤なども採用することができる。
【０１０６】
水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤を必要に応じて適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にするべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、採用されうる無菌水性媒は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１回量を等張ＮａＣｌ溶液１ml中に溶解し、皮下点滴液１０００mlに添加するか、または申し出られた注入部位に注射するかのいずれかとする。処置される被験体の状態に応じて、薬用量の幾分の変更が必然的に起こる。いずれにしても、投与の担当者が個別の被験体について適切な用量を決定する。
【０１０７】
本発明の総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を回復させる能力がある薬剤は、１回約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、または約０．１〜１．０もしくは約１０ミリグラム程度さえ含むように治療用混合物に入れて製剤化することができる。複数回投与することもできる。
【０１０８】
静脈内または筋肉内注射のような非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容されうる剤形には、例えば経口投与用の錠剤または他の固形剤；リポソーム製剤；時間放出（time release）カプセル剤；および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【０１０９】
以下の図面および実施例にならうことによって、本発明をさらに例示する。しかし、これらの実施例および図面は、決して本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【０１１０】
実施例１：不均衡な小胞体ストレスは潰瘍性大腸炎患者の不活動性結腸において翻訳を再プログラミングする
材料および方法：
患者および生検標本
本研究に組み入れられる全ての患者は、胃腸科で経過観察した（Beaujon病院）。プロトコールは、地域倫理委員会によって承認され、全ての患者から登録前にこの研究のための書面のインフォームドコンセントを得た。ＵＣ患者１１人を内視鏡検査する際に結腸ピンチ（pinch）生検を得た。結腸切除を受けたＵＣ患者１５人から外科的結腸試料を採取した。ＵＣの診断はLennard-Jones基準に基づき、臨床疾患活動性は、前記のように結腸炎活動性指数にしたがって判断した１２。各ＵＣ患者での結腸組織の非炎症領域を内視鏡的にパンチした（生検５〜１０個／患者）。外科的試料を同じプロトコールにしたがって処理した。組織病理グレード付けのために各患者からの生検２個を別にした。対照群は、結腸ポリープスクリーニングのための全結腸鏡検査（ｎ＝９）または結腸直腸ガンのための結腸切除術（ｎ＝１１）を受けた２０人の被験体を含んだ。各健康対照被験体の左右結腸から生検（５〜１０個）を採取し、上記のように処理した。内視鏡所見は全ての被験体で正常であり、生検標本をＨＥ染色で重要ではない異常として系統的に診断した。外科的試料を、ガン部位から少なくとも１０cm離れた健康な結腸粘膜から採取し、上記のように処理した。
【０１１１】
組織病理分析
生検をＨＥで日常的に染色した。粘膜損傷および炎症細胞浸潤の組織学的判断は、同じ熟練病理学者が、ＩＢＤの結腸波及を特徴づけるために以前に検証されたスコアを用いてグレード付けした１２。
【０１１２】
免疫組織化学および免疫蛍光染色
免疫組織学的方法は、対照および非罹患のＵＣ粘膜からの連続４μm脱パラフィン切片で行った。内因性ペルオキシダーゼ除去後に、切片を特異的抗体と共にインキュベーションした。免疫蛍光研究のために、対照および非罹患のＵＣ粘膜からの凍結スライド切片を抗ＴＩＡ−１抗体および抗ｅＩＦ３抗体と共にインキュベーションし、次に二次抗体でラベルした。核は、ＤＡＰＩまたはヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて染色した。蛍光は、共焦点レーザ走査顕微鏡（CLSM-510-META, Zeiss）によって検出した。全ての画像は、Zeiss LSM Image Browserソフトウェアを使用することによって取得した。ストレス顆粒の定量は、結腸上皮１mmあたりの、ストレス顆粒５個以上を含む上皮細胞数を、Image Proソフトウェアを用いて計数することによって行った（ストレス顆粒指数）。対照（ｎ＝１０）およびＵＣ患者（ｎ＝１５）のそれぞれに関して、顕微鏡の少なくとも３視野を計数した。
【０１１３】
リアルタイムＰＣＲ
総ＲＮＡをRNAble（登録商標）で抽出し、ND-1000 NanoDrop分光光度計を用いて定量した。純度／完全性は、ディスポーザブルAgilent ＲＮＡチップおよびAgilent 2100 Bioanalyzerを用いて判断した。プライマー配列を「補足情報」に報告する。ｍＲＮＡレベルは、LightCycler 480装置を用いてｑＰＣＲによって決定した。
【０１１４】
ウエスタンブロット
以前に記載されたように結腸生検を均質化した１３。次に、等量の合計タンパク質（５０〜７５μg）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、iBlotGel Transfer Device（Invitrogen）を用いて移行させ、一次抗体（補足情報参照）で探索した。ラベルされたタンパク質バンドをHP Scanjet 5500で走査し、相対タンパク質含量をデンシトメトリー分析によって決定した。
【０１１５】
電子顕微鏡法
対照（ｎ＝８）およびＵＣ患者（ｎ＝８）からの正常結腸生検を３％グルタルアルデヒド中で即時固定し、四酸化オスミウム中で後固定し、エタノールで脱水し、エポン中に包埋した。クエン酸鉛で染色した超薄切片をJeol 1010 EMで観察した。以前に報告されたように相対表面密度を決定することによりＥＲ面積を計算した１４。
【０１１６】
ポリソームおよびＲＮＡの単離
６人の対照（ｎ＝１８）および６人のＵＣ患者（ｎ＝１８）からの正常結腸生検の３つの異なるプールをポリソーム抽出のために別々に処理した。試料を溶解させ、遠心分離によって核を除去した（３，０００ｇ、５分、４℃）。上清を１０mlスクロース直線勾配（１０〜５０％スクロース）上に重層し、ＳＷ４１Ｔｉローターに入れ、３５，０００ｇで１２０分間、４℃で遠心分離した。２５４nmでの吸光度を測定した。個別の画分からフェノール／クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿によってＲＮＡを回収した。ＲＮＡの質は、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて決定し、ＵＣ患者２人および健康被験体２人からのプール結腸組織を２５mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の存在下で溶解した対照勾配でも同様に決定した。得られたポリソームプロファイルによって、ポリソーム結合画分から、より軽いスクロース画分へのｍＲＮＡの完全な移動が実証され（データは示さず）、これは、ポリソームピークが適正に確認されたことを検証している。
【０１１７】
全ゲノムマイクロアレイ分析
ポリソーム分画およびＲＮＡ単離後に、ポリソームからのＲＮＡ（画分１１〜２２）をプールし、精製した。ＲＮＡ試料を増幅し、製造業者のプロトコールにしたがってＣｙ３ラベルした。ハイブリダイゼーション手順は、Agilent Gene Expression Hybridization Kitおよび４１，０００個を超える遺伝子および転写体を網羅するAgilent Whole Human Genome Oligo Microarrays 4x44Kを使用してAgilent 60残基オリゴマイクロアレイ処理プロトコールにしたがってTebu-Bioが行った。基準化されたデータを以下の順序で連続的にフィルタリングした：全ての群で不在としてフラグを立てられた遺伝子を除去、Ｐ＜０．０５で少なくとも２倍アップレギュレーションまたは２分の１以下にダウンレギュレーションされた遺伝子を選択（非罹患のＵＣ粘膜と対照を比較、Studentのｔ検定および多重検定補正としてのBenjaminiおよびHochbergの誤検出率（false discovery rate））。
【０１１８】
統計解析
差の統計的有意性は、ノンパラメトリックMann-Whitney検定を用いて判定した。全ての統計解析は、ＳＰＳＳソフトウェア（v15.0; SPSS Inc, Chicago）を使用して行った。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【０１１９】
結果
非罹患の結腸ＵＣ粘膜は長期ＩＲＥ１βおよびＡＴＦ６α支流（branch）シグナル伝達を示す
ＵＰＲ活性化は、ＵＣ個体および健康個体からの非罹患の結腸粘膜におけるＸＰＢ−１のＩＲＥ１β介在性スプライシングを決定することによって評価した。スプライシングＸＢＰ−１（ＸＢＰ−１ｓ）のｍＲＮＡレベルは、ＵＣ粘膜で有意に増加し、非スプライシングＸＢＰ−１に対するスプライシングＸＢＰ−１の比（ＸＢＰ−１ｓ／ＸＢＰ−１ｕ）は対照およびＵＣでそれぞれ１．８および３．８であった。ＩＲＥ１β／ＸＢＰ−１部門の過剰活性化に一致して、対照に比べてＵＣ患者でＵＰＲ関連ターゲット遺伝子ＧＲＰ９４、ＧＲＰ７８、およびＥＤＥＭ１の発現増加が観察された。免疫ブロッティングから、非罹患のＵＣ粘膜でＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４タンパク質の発現増加が示された（図１Ｂ）。ＩＲＥ１は、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡをスプライシングすることに加えて、ＴＲＡＦ２／ＭＡＰ３Ｋカスケードを介してアポトーシスおよび／または炎症促進遺伝子発現をレギュレーションするｃ−Ｊｕｎ−Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）を活性化することができる１５。興味深いことに、ＴＲＡＦ２タンパク質の発現ならびにＪＮＫおよびその下流のターゲットｃ−ｊｕｎの両方のリン酸化は、対照よりも非罹患のＵＣ粘膜で増加した。ＪＮＫ活性化は、アポトーシスに役割を演じることが示唆されているが、非罹患のＵＣ粘膜は、活性カスパーゼ３およびＢａｘおよびＢｃｌ−２の発現レベルによって実証されるようにアポトーシス増加を示さなかった。逆に、非罹患のＵＣ粘膜は、８１％のＵＣ患者（１１人中９人）で検出されたＫｉ６７陽性細胞の２７％増加および炎症促進性免疫メディエーターの転写増加を伴う再生応答を示した。
【０１２０】
ＡＴＦ６αは、潜在型ｐ９０ＡＴＦ６αから変換された活性ｂＺＩＰ転写因子であるｐ５０ＡＴＦ６αとして、ＵＰＲの近位誘導因子として機能し、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およびＸＢＰ−１ｕなどの遺伝子のＥＲストレス応答エレメントと結合する９。ｐ５０ＡＴＦ６αの発生はＵＣ患者で再現性があり、対照よりも高いＸＢＰ−１ｕ ｍＲＮＡレベルに関連した。
【０１２１】
ＥＲストレスが主にＵＣ患者の結腸上皮を冒したかどうかを判定するために、ＧＲＰ７８の免疫組織学的検出および透過型電子顕微鏡実験を非罹患のＵＣ粘膜および対照粘膜で行った。ＧＲＰ７８の発現レベルは、対照よりもＵＣ患者の上皮細胞の方が増加したが、これは、悪化したＥＲストレスが本質的にＵＣ粘膜の結腸上皮細胞に存在することを実証している。電子顕微鏡分析から、一見（内視鏡および組織学的に）無波及の結腸領域および不活動型ＵＣの両方に、杯細胞中のＥＲ形態に著しい歪みを伴う特有の超微細構造変化が確認された。ＥＲ表面積の半定量測定は、非罹患のＵＣ粘膜でＥＲ膜表面積が対照粘膜の３倍に有意に増加したことを明らかにした。
【０１２２】
非罹患の結腸ＵＣ粘膜でのｅＩＦ２α依存性ＩＳＲの異常減弱
次に本発明者らは、非罹患の結腸ＵＣ粘膜および対照粘膜でのｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５１）のリン酸化をモニターした。対照からの溶解液は、健康被験体の結腸での生理学的ＥＲストレスを反映した顕著なｅＩＦ２αリン酸化を示した。対照的に、ＵＣ患者では総ｅＩＦ２αタンパク質レベルの発現増加に関連するホスホｅＩＦ２αの有意なモデュレーションは見られなかった（５〜８倍、Ｐ＜０．０００１、対照に対して）。デンシトメトリー定量から、対照に比べてＵＣでホスホｅＩＦ２α／ｅＩＦ２α比がなおいっそう有意に減少したことが示された。興味深いことに、このｅＩＦ２αのリン酸化欠損は、活動型および非活動型ＵＣ患者の両方の組織学的に非罹患の結腸粘膜から観察された。対照での検出可能なｅＩＦ２αリン酸化に一致して、本発明者らは、ＡＴＦ４およびＣＨＯＰタンパク質の測定可能な発現レベルと相関した、ＡＴＦ４およびＣＨＯＰのｍＲＮＡレベルの関連した誘導を観察した。対照的に、ＵＣ粘膜ではＡＴＦ４およびＣＨＯＰの転写体も、ＡＴＦ４およびＣＨＯＰのタンパク質レベルも誘導されなかった。
【０１２３】
ＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α経路は、多数のレベルで負のレギュレーションに供される：タンパク質ホスファターゼ１の調節サブユニットをコードするストレス誘導遺伝子ＰＰＰ１Ｒ１５ａ（ＧＡＤＤ３４）、およびＣＲｅＰ（ＰＰＰ１Ｒ１５ｂ／ＰＰ１ｃ／Ｎｃｋ複合体）はｅＩＦ２α脱リン酸を促進し、翻訳を回復し１６、一方でｐ５８ＩＰＫは、ＰＥＲＫなどの複数のｅＩＦ２αキナーゼを阻害すると考えられる１７。非罹患のＵＣ粘膜（ｎ＝１０）または正常粘膜（ｎ＝１０）からは、ｐ５８ＩＰＫｍＲＮＡの発現レベルに有意差は検出されず、ｅＩＦ２αリン酸化のダウンレギュレーションがＰＥＲＫ活性の変化に直接には関連しなかったことを示唆している。ＰＥＲＫの発現および／またはリン酸化の減少は、ＵＣ粘膜でのｅＩＦ２αリン酸化に対する作用の一因となりうる。しかし、本発明者らは、ＵＣ生検および対照生検中のリン酸化型および合計型のＰＥＲＫを検出する技術的困難に悩まされてきた。しかし、ＵＣ粘膜中に見出されたＧＡＤＤ３４タンパク質レベルの有意な増加から、低レベルのホスホｅＩＦ２α発現を部分的に説明することができよう。
【０１２４】
ストレス顆粒の数は、非罹患のＵＣ粘膜中で減少する
ストレス誘導性翻訳停止は、ストレス時に遺伝子発現を再プログラミングするための重要な防御性細胞メカニズムである。ストレス顆粒（ＳＧ）の形成は、この応答に中心的である。ＳＧは、ｍＲＮＡ翻訳をレギュレーションする特殊な細胞質巣（focus）であって、ｅＩＦ２αリン酸化依存性メカニズム１８および非依存性メカニズム１９の両方によって形成する。ＳＧは、小型４０Ｓリボソームサブユニット、易凝集性リボヌクレオタンパク質（例えばＴＩＡ−１およびＴＩＡＲ）、および異なる翻訳開始因子１８に結合している、停滞した（stalled）ｍＲＮＡを含有する。非罹患のＵＣ粘膜および対照結腸粘膜の凍結スライド切片を、ＳＧの２成分であるＴＩＡ−１およびｅＩＦ３について免疫染色した。対照結腸上皮細胞中の豊富な点状巣からＴＩＡ−１およびｅＩＦ３の共局在が観察された。対照的に、非罹患のＵＣ粘膜からＳＧの顕著な欠如が観察された。少なくとも５個のＳＧを含有するのは対照粘膜細胞の４５％超に比べて、各ＵＣ組織切片からの上皮細胞ではわずか１０％であった。ＳＧ数の減少は、ＴＩＡ−１またはｅＩＦ３のタンパク質発現レベルの減少が原因ではなかった。というのは、ウエスタンブロット分析から、非罹患のＵＣ粘膜中でこれら２種のタンパク質の発現増加が示されたからである。本発明者らが最もよく知るところでは、これは、生理学的ＥＲストレス時にＳＧが健康な被験体の結腸上皮全体に存在すること、およびＳＧの欠如が非罹患のＵＣ結腸粘膜の全般的な特徴であることを示す最初の研究の一つである。ＳＧは、キャップ依存性翻訳開始、アポトーシス、代謝シグナル伝達経路および炎症応答をレギュレーションすることによって、細胞ホメオスタシスに多様で不可欠な役割を演じるので、非罹患の結腸ＵＣ粘膜がＳＧ形成をトリガーできないことで、環境ストレスに対する上皮バリアの感受性が高まると予想できよう。
【０１２５】
ＥＲストレス応答の変化は非罹患のＵＣ粘膜でのｍＲＮＡ翻訳の転写後再プログラミングを必要とする
翻訳は、異なるストレス条件で、主に開始レベルで緊密にレギュレーションされる。ｅＩＦ２α以外に、翻訳開始の立役者は、ｅＩＦ４Ｆ開始複合体の限定成分ｅＩＦ４Ｅである。この複合体は、２個の他のサブユニット：ｅＩＦ４Ａ（ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ）およびｅＩＦ４Ｇ（大型骨格タンパク質）を含有し、これらは、ｅＩＦ４Ｅと会合してＳＧ形成のｅＩＦ２αリン酸化非依存性メカニズムに重要な役割を演じる１９。ｅＩＦ４Ｅ発現レベルは、対照よりも非罹患のＵＣ粘膜の方が約３５％高かった。その発現レベルに加えて、翻訳開始へのｅＩＦ４Ｅの利用能は、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化状態によってコントロールされる２０。過剰リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｓｅｒ６５）レベルは、非罹患のＵＣ粘膜で対照の約３倍に増加することが見出され、一方で合計４Ｅ−ＢＰ１レベルは無影響であった。加えて、翻訳効率２１を刺激するｅＩＦ４Ｅリン酸化（Ｓｅｒ２０９）ならびにｅＩＦ４ＡおよびｅＩＦ４Ｇの発現レベルは、非罹患のＵＣ粘膜で有意に増加し、ｅＩＦ４Ｆの形成およびＲＮＡ二次構造の巻き戻しが非罹患のＵＣ粘膜で最適化されていることを示唆している。
【０１２６】
これらの結果は、翻訳開始が非罹患のＵＣ粘膜で変化している可能性があることをさらに裏付けている。したがって、本発明者らは、脱レギュレーションされたＥＲストレスがｍＲＮＡ翻訳の転写後再プログラミングを誘導して非罹患のＵＣ粘膜でのプロテオームを再構成しうるという仮説を立てた。
【０１２７】
ポリソームＲＮＡマイクロアレイおよび非罹患のＵＣ粘膜での遺伝子発現パターン
非罹患のＵＣ粘膜および正常粘膜におけるポリソーム結合型ｍＲＮＡの翻訳状態を、スクロース勾配をかけた速度沈降によって判断した。結果から、ＵＣと対照との間でポリソーム結合型ＲＮＡの発現プロファイルにおける有意差が示され、２，５８２個の遺伝子／プローブセットが（補足の表２）２倍よりも大きく変化した（Ｐ＜０．０５でのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）。純粋に翻訳調節された遺伝子候補を同定するために、本発明者らは、炎症を起こしていないＵＣ生検の総ｍＲＮＡトランスクリプトーム分析で転写発現の付随的な増加／減少がすでに同定されている遺伝子を除外した２２、２３。遺伝子産物を、Gene Ontology（http://www.geneontology.org）、GeneCards（http://www.genecards.org/）およびGeneNote（http://bioinfo2.weizmann.ac.il/cgibin/genenote）データベースによる機能的カテゴリーおよび分子機能に分類した。実験的結腸炎およびＵＣの病理発生に関与することが知られている翻訳調節遺伝子のサブセット、ならびに細胞増殖、ＥＲストレス、免疫応答および結腸直腸ガンに重大な役割を演じうる、選択された遺伝子を表１に示す。これらには、ＥＲストレス応答をコードする遺伝子（ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ＥＲＯ１）、翻訳をコードする遺伝子（ｅＩＦ２α、ｅＩＦ５Ａ）、ムチンをコードする遺伝子（ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ２０）、細胞間接着をコードする遺伝子（ＺＯ１、ケラチン、クローディン）、免疫応答および抗細菌防御をコードする遺伝子（ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＩＦＲ５、インターロイキン）、解毒および抗酸化ストレスをコードする遺伝子（ＴＳＴ／ＣＥＳ２、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２）、ならびに創傷治癒および細胞周期をコードする遺伝子（ｃｄｃ４２、ｐ２１ＷＡＦ／ｃｉｐ、ＨＭＧＢ１）が含まれ、これは、本発明者らのマイクロアレイ分析が非罹患のＵＣ粘膜での遺伝子発現を正確に描写し、ＵＣにおける新しい生物学的機能変化を明らかにしたことを示している。
【０１２８】
ＵＣと対照との間の、ポリソームへのｍＲＮＡリクルートの差が、タンパク質発現レベルに類似の改変を生じることを実証するために、マイクロアレイ分析によってＵＣの病理発生と潜在的な直接または間接関係があると同定された６個の候補遺伝子を、被験体の独立コホートから分析した。これらには、ＵＣの病理発生およびＵＣ依存性発ガンに関与するＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＷＡＦ／Ｃｉｐ）２４、翻訳伸長、ポリソーム解体、ＳＧ集合、および炎症を促進するｅＩＦ５Ａ２５、Ｗｎｔシグナル伝達経路を強化するＴＣＦ−４の低分子ユビキチン関連Ｅ３リガーゼとして機能するＲａｎＢＰ２２６、抗酸化ストレス防御に主な役割を果たすスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）２７、腸管におけるＩｇＡおよびＩｇＭの経上皮輸送を担うポリマー性免疫グロブリンレセプター（ＰＩｇＲ）２８、ならびにその脱レギュレーションがＵＣおよび結腸直腸ガンに付随する細胞喪失および炎症に不可欠でありうるスルフィド解毒酵素であるチオ硫酸スルフルトランスフェラーゼ（ＴＳＴ／ＣＥＳ２）２９が含まれた。それらそれぞれのポリソーム結合型ｍＲＮＡ発現に基づいて、ｐ２１ＷＡＦ／Ｃｉｐ、ｅＩＦ５Ａ、ＳＯＤ１、ＰＩｇＲ、およびＴＳＴ／ＣＥＳ２タンパク質の発現レベルは、対照粘膜よりも非罹患のＵＣ粘膜の方が有意に減少したが、一方、ＲａｎＢＰ２タンパク質レベルは増加した。ＰＩｇＲ（膜関連タンパク質）およびＴＳＴ／ＣＥＳ２（ミトコンドリア関連タンパク質）におけるタンパク質レベルの変化を、免疫組織化学法により確認した（図５Ｂ）。
【０１２９】
まとめると、これらの結果は、非罹患の結腸ＵＣ粘膜における不均衡なＥＲストレスおよび関連するｍＲＮＡ翻訳再プログラミングが上皮バリアのホメオスタシス変化を誘導し、環境シグナルに対する病的粘膜応答を促進しうると指摘している。
【０１３０】
非罹患のＵＣ粘膜においてアップレギュレーションされたマイクロＲＮＡの限定サブセットにより認識される、翻訳がダウンレギュレーションされたＲＮＡのin silico特徴づけ
マイクロアレイ分析で発現が変化した遺伝子２，５８２個のうち４５．５％（遺伝子１１７３個）が、非罹患のＵＣ粘膜で翻訳が抑制されていることは興味深いことである。本発明者らは、これらの抑制された遺伝子がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって部分的に転写後サイレンシングされている可能性があるという仮説を立てた。この仮説は、発現が対照粘膜よりも非罹患のＵＣ粘膜の方が強くアップレギュレーションされる８種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ）を同定した本発明者らの最近の研究１２に基づいた。したがって、本発明者らは、非罹患のＵＣ粘膜における翻訳が抑制された遺伝子の中からＰＩＴＡカタログを用いてｍｉＲＮＡターゲット配列を検索した（http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html）。この計算分析から、抑制された遺伝子の２５．４％（遺伝子１１７３個中２９８個）は、非罹患のＵＣ粘膜中の一つまたは複数の選択されたｍｉＲＮＡによって認識されうることが示された。このことは、翻訳が抑制された遺伝子のいくつかを、代償性ｍｉＲＮＡ介在性翻訳抑制で説明できることを示唆している。
【０１３１】
考察：
本研究には三つの独特な知見がある。第一に、対照において確認されたＵＰＲの三つの支流全ての協調した発現は、非罹患のＵＣ粘膜では障害される；第二に、非罹患のＵＣ粘膜は、ＩＳＲの障害のせいでＥＲストレスを起こしやすい、第三に、非罹患のＵＣ粘膜で選択的に確認されたｅＩＦ２αリン酸化、ＳＧ形成、および翻訳開始の協調した変化は、ＵＣの病理発生における新規なレギュレーションレベルを表す。
【０１３２】
本研究は、三つの既知のＵＰＲトランスデューサーがＳＧ形成に関連して対照結腸粘膜において協調活性化することを示している。これは、正常粘膜には統合されたＵＰＲ戦略が存在し、その戦略が細菌負荷および環境ストレスに対する動的適応応答を提供して結腸ホメオスタシスおよび免疫監視／寛容を維持することを示唆している。
【０１３３】
本発明者らの研究は、ＡＴＦ４およびＣＨＯＰの発現減少およびシャペロン発現増加につながる、非罹患のＵＣ粘膜でのＩＳＲ経路欠損を確認した。ＩＳＲは、多様なストレス源条件を共通の下流事象（ｅＩＦ２αリン酸化）とカップリングしている翻訳調節の中枢システムである。これは、ｉ）ｅＩＦ２αリン酸化の欠損が大パネルのストレス毒性作用に対するＵＣ粘膜の耐性を障害し、ｉｉ）不適切なＥＲストレスが微小環境での病的変化に対して非罹患のＵＣ粘膜を高度に感受性にすることを示唆している。したがって、ＩＳＲの抑制は、炎症に対する非罹患のＵＣ粘膜の感受性のためのin vivoシグネチャーでありうる。この状況で、ブタにおけるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α活性化障害によって、ＥＲストレスとアテローム感受性領域との関連が明らかにされており、これは、ｅＩＦ２αリン酸化欠乏がアテローム硬化に対する内皮の空間的感受性につながることを実証している３０。そのうえ、マクロファージにおけるサイトカイン産生のためのＩＲＥ１α／ＸＢＰ−１シグナル伝達カスケードを活性化するＴＬＲ４３１は、ＬＰＳに応答してＡＴＦ４／ＣＨＯＰの発現を抑制し３２、これは、細菌シグナルとＥＲストレスの間の密接な関係性を示している。ＵＣにおいて主役を演じると思われる全ての環境リスク因子のうち、タバコだけが保護的役割を演じる。興味深いことに、HengstermannおよびMuller３３は、紙巻きタバコの煙が３Ｔ３細胞においてＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α軸を活性化することによってＥＲストレス応答を誘導することを示したが、これは、ＰＥＲＫ経路の特異的活性化がＵＣでのタバコの保護的役割を説明できることを示唆している。
【０１３４】
本発明者らの結果は、ＵＣにおける慢性炎症の開始が、ｅＩＦ２αのリン酸化状態を動的にリモデリングして可塑性のもっと大きなｍＲＮＡ翻訳リモデリングを維持する能力が損なわれた上皮細胞の存在に左右されることを示唆している。再プログラミングされた翻訳開始という仮説は、ＳＧの顕著な減少と一緒に、非罹患の結腸ＵＣ粘膜における増殖増加によって強化される。シャペロンタンパク質の発現増加とあいまって、これは、非罹患のＵＣ粘膜が、ＵＣに関連する結腸直腸腫瘍形成のリスク増加を説明できる異常なＥＲストレス関連生存促進プロファイルを有することを示唆している。ヒト結腸生検にはプロテオーム分析に十分な材料がないので３４、本発明者らは、ポリソーム結合型ｍＲＮＡから比較汎ゲノムマイクロアレイ分析を行った。多数の脱レギュレーションされた遺伝子は、すでにＩＢＤの病理発生に関連づけられていたタンパク質をコードするが、他の遺伝子は、ＵＣの病理発生を理解するための新規なターゲットを示す。例えば、ＰＩｇＲの発現は非罹患のＵＣ粘膜の上皮細胞で減少するので、抗細菌防御障害が腸管腔への分泌型ＩｇＡの輸送減少によってトリガーされうることが暗に示される。ＳＯＤ１およびＳＯＤ２ならびにいくつかの酸化還元酵素が強くダウンレギュレーションされたので、ＵＣでは抗酸化ストレス防御も欠損していると思われる。非罹患のＵＣ粘膜におけるＴＳＴ／ＣＥＳ２発現減少は、Ｈ２Ｓの毒性作用に対する上皮細胞の曝露を増加させ、ＵＣにつながるか、またはＵＣを悪化させ、さらには結腸直腸発ガンを促進するおそれがある２９。ＵＣにおけるｍＲＮＡ翻訳の再プログラミングによる重大な細胞保護タンパク質のダウンレギュレーションは、上皮ホメオスタシスを障害するおそれがある。このように、本発明者らは、８種のｍｉＲＮＡのサブセットにより特異的にターゲティングされうる、抑制されたポリソームｍＲＮＡであって、非罹患のＵＣ粘膜において過剰発現が共通してレギュレーションされたｍＲＮＡの大プールを同定した１２。これは、翻訳抑制をコントロールするレギュレーションネットワークの同定に向けた最初のステップとなる可能性があり、その翻訳抑制のレギュレーション不全はＵＣの病態生理に関与しうる。
【０１３５】
これらの結果は、臨床的、内視鏡的および組織学的寛解にあると考えられる患者が結腸に対する持続性の細胞損傷および分子損傷を有することを示し、これは、既存の処置を最適化できることを示唆している。したがって、本発明者らの結果は、潜在的治癒および／またはより完全な寛解を達成するためのＵＣ処置の新たな展望を示唆している。例には、ホスホｅＩＦ２α脱リン酸阻害剤サルブリナール３５、および翻訳を抑制し、ｅＩＦ４Ａ阻害によりＳＧ形成を誘導する免疫抑制抗増殖剤パテアミンＡ１９が挙げられる。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
実施例２：サルブリナールのin vivo効果
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、炎症性結腸粘膜における杯細胞の枯渇およびムチン分泌減少に関連する表在性粘膜病変の結腸排他的な波及によって特徴づけられる１１。ＵＣ患者の上皮は炎症とは無関係に広範に異常であると提唱されているが１２、結腸上皮細胞内の炎症に先行する初期変化は理解しにくいままである。上皮細胞における小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の変化による適正なＥＲＳ消散の障害は、動物２−８およびヒト研究１，２の両方で結腸炎症につながるまたは結腸炎症に感受性にするおそれがあることが今や明らかである。しかし、ＵＣ時のＥＲＳ変化の結果は、依然として誤解されている。ＵＰＲは、細胞を多種多様なストレス源条件に対処させる三つの近位センサーＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、およびＩＲＥ１を伴う、入念に編成された過程である。これらのセンサーの複合作用は、タンパク質翻訳休止、シャペロン産生増加、および異常タンパク質負荷の質的低下によって細胞ホメオスタシスを回復する。持続性または異常ＥＲＳは、正常細胞の機能に有害に影響し、炎症および／またはアポトーシスにつながる１３，１４。
【０１３８】
杯細胞および粘液バリアが炎症に関連しているものの、杯細胞、ＥＲＳ、および炎症の間の関係は不明である。しかし、炎症が許容性遺伝的背景でのみ生じるように見え１５，１６、ＵＣ患者がＭＵＣ２を発現するので、マウスにおけるムチン遺伝子Ｍｕｃ２のノックアウトは、結腸炎を起こすには不十分である。そのうえ、杯細胞数の部分枯渇または全枯渇、したがって粘液および抗細菌産物の部分枯渇または全枯渇１７−２０は、結腸炎を誘導するには不十分である。最終的に、ＥＲにおいてミスフォールディングを起こしやすいミスセンス突然変異Ｍｕｃ２ｒｅｆ．７もしくはＨＬＡ−２７タンパク質の蓄積９、またはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡｇｒ２ｒｅｆ．５のノックアウトは、分泌細胞でのＥＲＳ悪化およびそれに続く炎症を誘導する。したがって、結腸炎の素因は、杯細胞自体に、ならびに免疫機能不全の不在下および正常な結腸フローラの状態で杯細胞がＥＲＳを管理できないことにありうる。
【０１３９】
ＵＣで杯細胞がＥＲＳによって冒される不可解な方法を探究するために、本発明者らは、ＥＲＳの状態で杯細胞数を人工的に増加させた。本発明者らは、結腸前駆細胞の精密な脱レギュレーションを示して杯細胞発現増加をもたらすＮｏｘ１欠損マウス１０と、腸上皮細胞に脱レギュレーションされたＥＲＳを発現し、遺伝的背景および環境因子の両方に依存して全腸炎を発生するＩＬ−１０ＫＯマウス８を交配した２１。このＩＬ−１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯモデルの妥当性は、ヒト結腸上皮細胞がＩＬ−１０２２およびＮＯＸ１２３，２４の両方を発現することに依存する。興味深いことに、ＮＯＸ１の発現は、杯細胞２５およびＵＣ病変と同じ結腸勾配をたどる。そのうえ、全ゲノム関連研究は、低分子量ＧＴＰａｓｅであるＲａｃ１ｒｅｆ．２６（ＮＯＸ１ｒｅｆ．２７のパートナー）およびＩＬ−１０遺伝子２８とＵＣとの顕著な関連を実証している。本節に本発明者らは、ＩＬ−１０およびＮＯＸ１の発現レベルが、健康な対照（ｎ＝１２）に比べてＵＣ患者（ｎ＝１２）からの非炎症結腸粘膜で顕著に変化したことを示した。
【０１４０】
全てのＳＰＦ飼育Ｃ５７Ｂｌ／６−ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスは、６／７週間目に結腸炎を自然発生し、下痢、高発生率の直腸出血、体重および結腸重量の変化、ならびに脱出症を含む疾患活動性指数（ＤＡＩ）スコアは、齢と共に重症化した。ＷＴおよびシングルＫＯマウスのどれも、検討した時間枠内で結腸炎を発生しなかった。組織病理スコアから、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスが近位−遠位軸に沿って重症化した結腸炎を発生し、回腸炎の徴候を全く示さずに、多形核球浸潤、陰窩膿瘍、浮腫、限局性上皮びらん、および陰窩欠如などのＵＣの徴候を示したことが明らかとなった。本発明者らは、次に、遠位結腸区域におけるＦＩＴＣ−デキストランの上皮透過性を測定し、７および１２週齢マウスの脾臓への常在細菌の移行を確認した。結腸炎の状態に一致して、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスだけが結腸透過性増加を示し、グラム陰性共生細菌の移行増加と密接に相関する脾腫を示した。興味深いことに、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスは、７／８月齢で結腸炎関連結腸直腸ガンおよび自然発生原発性硬化性胆管炎のようなＵＣの主合併症を示した。対照的に、ＩＬ１０ＫＯマウスは、軽度の全腸炎を低頻度（３４週目に＜２０％）で示し、胆管炎の徴候も結腸直腸ガンの徴候も示さなかった（＞８月齢；本研究および２９）。興味深いことに、本節で本研究者らは、ＷＴマウスに比べてＮｏｘ１ＫＯ、ＩＬ１０ＫＯ、およびＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウス（６および１６週齢）の結腸上皮粘膜のマイクロＲＮＡ、５６１種の総合的全ゲノムスクリーンを報告する。ＵＣ患者での以前の知見に一致して３０，３１、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスは、ＵＣシグネチャーの定義に関連するマイクロＲＮＡのほぼ５０％を発現した。
【０１４１】
炎症部位でのサイトカイン応答を分析するために、結腸試料を採取し、様々なサイトカインをｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で分析した。ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスは、ＵＣに主に関与する炎症促進性サイトカインの発現レベルの増加を示した。脾臓におけるリンパ系および骨髄性細胞集団の分析は、４種の遺伝子型の間で異ならなかった。対照的に、活動性粘膜炎症にかかわらず、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの大量浸潤がＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスの結腸組織だけから観察され、より低い程度で脾臓から観察され、これは、ＵＣでの結果に一致した３２。造血系列の遺伝子型が結腸炎の程度に影響したかどうかを判定するために、本発明者らは、レシピエントおよびドナーがそれぞれＷＴ（ＣＤ４５．１）およびＷＴ、ＩＬ１０ＫＯおよびＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウス（ＣＤ４５．２）の骨髄（ＢＭ）キメラマウスを発生させた。興味深いことに、照射されたＷＴマウスをＩＬ１０ＫＯまたはＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯＢＭで再構成することは、疾患を起こすには不十分であったが、これは、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスにおいて結腸炎が主として造血系列よりも上皮細胞に固有であることを実証している。
【０１４２】
ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスの結腸上皮は、潰瘍化部位での杯細胞の欠如に関連してAlcian Blue／ＰＡＳ陽性ムチンの不足を示した。したがって、Ｍｕｃ２およびＭｕｃ４タンパク質の発現レベルは、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスの炎症結腸領域内で劇的に低値であった。ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスおよびＵＣ患者のどちらの結腸からも、杯細胞の希薄化および異常形態が同様に観察されたが、それらの杯細胞は、少量の粘液および膨化した丸いミトコンドリアに関連する少数の未熟な包膜を有していた。
【０１４３】
ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスの結腸切片は、ＰＣＮＡおよびホスホヒストン３陽性細胞数の増加を示したが、これは、上皮増殖の増加を示唆している。走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）から、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスでの陰窩長の約３０％の増加が示された。興味深いことに、ＳＥＭによって、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスおよびＵＣ患者の非罹患の結腸粘膜の両方に、同一の広域スペクトルの粘膜微細構造変化（陰窩変形、目に見える列状の陰窩開口部、水腫性腺辺縁、および腺管腔の拡大など）が示された。結腸増殖増加にもかかわらず、アポトーシス細胞の染色および定量判定から、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスでの杯細胞の発現減少が結腸でのアポトーシス増加のせいであったことが示された。
【０１４４】
ＵＣに杯細胞が演じる病理発生での役割を評価するために、ＷＴおよびＮｏｘ１ＫＯマウスをＤＳＳの経口投与またはＴＮＢＳの直腸投与に供した。二つのマウスモデルの間にＤＡＩおよび結腸粘膜の組織損傷の有意差は見られず、これは、化学的に誘導された炎症が杯細胞の発現増加とは無関係でありそうなことを示唆している。対照的に、ＥＲＳの正規の誘導因子であるツニカマイシン処置は、ＷＴマウスよりも杯細胞を過剰発現しているマウスの方に有意に重症の結腸炎を誘導し、これは、杯細胞自体がＥＲＳの結果としての結腸炎発生への直接参加者でありうることを示している。したがって、ＵＣ患者で以前に記載されたように、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスは、炎症損傷より前に結腸粘膜にＥＲＳ妨害を示した１。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシング増加、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でのＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＰＤＩ誘導、ならびに杯細胞中のＥＲの槽拡張および著しい変形によって実証されるように、ＩＲＥ１βおよびＡＴＦ６α支流シグナル伝達は結腸上皮細胞において拡大した。興味深いことに、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスおよびＵＣ患者の両方の非罹患の結腸粘膜から、ＡＴＦ４の低発現に相関するｅＩＦ２αの同一のリン酸化欠損が観察された１。ヒトにおける本発明者らの以前のデータに合わせて、タンパク質ホスファターゼ１の触媒サブユニットをリクルートし、ｅＩＦ２α脱リン酸を促進するストレス誘導性タンパク質であるＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４の発現増加がｅＩＦ２αリン酸化減少に一致して検出された１。ＥＩＦ２αリン酸化は、ＥＲＳ時に細胞保護性である。というのは、この経路が遺伝的に除去された時に細胞が細胞死に対して感受性になり３３、それが異所性に実施されると細胞が保護されるからである３４。ＧＡＤＤ３４介在性ｅＩＦ２α脱リン酸の選択的薬理学的阻害剤が結腸炎を軽減しうるかどうかを検査するために、ＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスを１mg/kgサルブリナールで最大３週間処置した３５。本発明者らは、サルブリナールが、結腸にわたり組織学的結腸炎スコアを強く減少させ、免疫細胞の浸潤を顕著に抑制し、正常な杯細胞の無傷の粘膜構造を回復したことを示した。サルブリナールは、強いｅＩＦ２αリン酸化を引き起こし、ＣＨＯＰ発現に対するその抗アポトーシス活性について結腸粘膜をアポトーシスから少なくとも部分的に保護した。さらに、サルブリナール処置マウスでは、Ｇｒｐ７８／ＢｉｐおよびＧｒｐ９４の発現減少に向かう傾向があり、それは、サルブリナールがｅＩＦ２αのリン酸化を誘導することによってＵＰＲの翻訳コントロール部門に従事し、ストレスを受けた細胞でのタンパク質フォールディングを低下することによってタンパク質恒常性レギュレーターのように作用することを実証している。興味深いことに、本発明者らは、ｅＩＦ２αのサルブリナール誘導型リン酸化が主に結腸上皮細胞で検出されたことを実証した。最終的に、炎症促進性サイトカインのレベルならびに結腸および脾臓Ｔｒｅｇ細胞の量は、サルブリナール処置されたＩＬ１０／Ｎｏｘ１ｄＫＯマウスでベースラインまで強く減少した。
【０１４５】
本発明者らの知見は、ｅＩＦ２αリン酸化の欠損がＵＣでの主役であることを補強しており、新しい治療手段を開く可能性がある。ＵＣの現行の処置は、疾患の自然経過を変えることはできない。ＵＣを管理するためのこれらの困難は、免疫モデュレーターの使用によって説明できる。免疫モデュレーターは、主に免疫細胞の活性をモデュレーションするように設計されており、初期の上皮異常の修復にはほとんど有効ではない。このように、ｅＩＦ２αモデュレーターは、ＵＣの本質的なメカニズムに特異的に基づく新規薬物クラスを定義することができ、その薬物クラスが、ＵＣ処置の規範を免疫モデュレーターから上皮モデュレーターに移すものと思われる。
【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
参考文献：
本出願にわたり、本発明が属する技術分野の現状を様々な参考文献が記載している。これにより、これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【国際調査報告】
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