(57)【要約】  本発明は、哺乳動物に由来する血液及び／又は組織サンプル中のＩＬ−１７発現Ｔ細胞を同定する方法であって、該方法が、ＩＬ−１７Ａ遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、上記サンプル中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、非ＩＬ−１７血液細胞の類似位置と比較した、ＩＬ−１７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の指標となる、方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明による分析は、ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞を同定するとともに、複合サンプル中の他の全ての細胞、例えば他の血液細胞等とＩＬ−１７陽性Ｔ細胞を区別することができる。さらに、本発明は、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨの群から選択される少なくとも１つのマーカーのメチル化とＩＬ−１７Ａのメチル化との比較に基づく、複合サンプル中のＩＬ−１７陽性Ｔ細胞を定量化する改善された方法を提供する。上記方法を、細胞の精製及び／又は濃縮の工程なしに、好ましくは全血及び／又はトリプシン処理されていない組織において行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に由来する血液及び／又は組織サンプル中のＩＬ−１７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を同定する方法であって、該方法が、ＩＬ−１７Ａ遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、前記サンプル中の前記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、非ＩＬ−１７血液細胞の類似位置と比較した、ＩＬ−１７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の指標となる、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、転写開始点より上流の５’領域、プロモーター領域、５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域、イントロン、エクソン／イントロン境界、及び／又は転写終結点の下流の３’領域中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号１７によるＩＬ１７Ａ遺伝子中にあるＣｐＧ位置、配列番号１によるＩＬ１７Ａアンプリコン１９０９、配列番号２若しくは３による標的領域、又は配列番号４〜配列番号１６若しくは配列番号１８〜配列番号２１による配列から選択されるプライマー対により増幅された、配列番号１９及び配列番号２０によるプライマー対により増幅されたＩＬ１７ＡアンプリコンのＣｐＧ位置から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出による他の方法を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
マーカーＣＤ４、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨの分析を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨの群から選択される少なくとも１つのマーカーのメチル化と、ＩＬ１７Ａのメチル化との比較に基づく前記サンプル中のＩＬ１７陽性細胞の定量化を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞の精製及び／又は濃縮の工程なしに、全血及び／又はトリプシン処理されていない組織において行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが患者に移植されるサンプルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
同定された及び／又は定量化された前記Ｔ細胞に基づいて、前記哺乳動物の免疫状態を決定する工程を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物におけるＩＬ−１７発現Ｔ細胞のレベルをモニタリングする方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法と、同定されたＩＬ−１７陽性Ｔ細胞の量を、同じ哺乳動物から採取された以前のサンプル及び／又は対照サンプルと比較することとを含む、方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、乾癬性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチのようなリウマチ性疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、炎症性腸疾患、炎症性疾患、ブドウ膜炎、肝炎疾患、狼瘡、肺疾患、喘息、高ＩｇＥ症候群、抗腫瘍免疫、腎損傷、ウイルス性若しくは細菌性若しくは真菌性若しくは寄生虫性の感染症、内毒素性ショック、及び自己免疫疾患、ウイルス性感染症若しくは細菌性感染症、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー若しくはＩＬ−１７発現Ｔ細胞に直接的に関連する任意の疾患等のＩＬ−１７媒介疾患及び抗ＩＬ−１７療法の副作用を患っているか、又はその可能性がある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物に与えた化学物質及び／又は生体物質に応じた前記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
５ｍＭを超えるＭｇＣｌ２、又は最大６．４ｍＭのＭｇＣｌ２が増幅反応に使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記メチル化が、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（ｆＣ）、及び５−カルボキシシトシン（ｃＣ）の修飾から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実施する材料を含む、ＩＬ−１７Ａ遺伝子中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて哺乳動物においてＩＬ−１７発現Ｔ細胞を同定、定量化、及び／又はモニタリングするキット、ａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）配列番号１７によるＩＬ−１７Ａ遺伝子のＣｐＧ位置、配列番号１によるＩＬ１７Ａアンプリコン１９０９、配列番号２若しくは配列番号３による標的領域、又は配列番号４〜配列番号１６若しくは配列番号１８〜配列番号２１による配列から選択されるプライマー対により増幅された、配列番号１９及び配列番号２０によるプライマー対により増幅されたＩＬ１７ＡアンプリコンのＣｐＧ位置から選択されるＣｐＧ位置のメチル化分析の材料とを含むキット。
【請求項１６】
哺乳動物におけるＩＬ１７発現Ｔ細胞の同定、定量化、及び／又はモニタリングへの、請求項１５に記載のキット、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３によるアンプリコン若しくは標的領域、又は配列番号４〜配列番号１６若しくは配列番号１８〜配列番号２１によるプライマー対若しくはオリゴマーにより産生された、配列番号１９及び配列番号２０によるプライマー対により増幅されたアンプリコンの使用。
【請求項１７】
配列番号４〜配列番号１６又は配列番号１８〜配列番号２１から選択される、又は配列番号１９若しくは配列番号２０によるプライマー又はプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物に由来する血液及び／又は組織サンプル中のＩＬ−１７発現Ｔ細胞を同定する方法であって、該方法は、ＩＬ−１７Ａ遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、上記サンプル中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、ＩＬ−１７陰性血液細胞の類似位置と比較した、ＩＬ−１７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の指標となる、方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明による分析（analysis）は、ＩＬ１７陽性Ｔ細胞を同定するとともに、複合サンプル中の他の全ての細胞、例えば他の血液細胞等とＩＬ１７陽性Ｔ細胞を区別することができる。さらに、本発明は、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨの群から選択される少なくとも１つのマーカーのメチル化とＩＬ１７Ａのメチル化との比較に基づく、複合サンプル中のＩＬ１７陽性Ｔ細胞を定量化する改善された方法を提供する。上記方法を、細胞の精製及び／又は濃縮の工程なしに、好ましくは全血及び／又はトリプシン処理されていない組織において行うことができる。
【背景技術】
【０００２】
Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）は、２００７年に発見されたインターロイキン１７（ＩＬ−１７）を産生するヘルパーＴ細胞のサブセットである。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞とは発生的に明確に異なると考えられ、その細胞量が過剰である場合、（以前はＴｈ１細胞により引き起こされると考えられていた）多発性硬化症のみならず乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性糖尿病、関節リウマチ、及びクローン病等の自己免疫疾患において主要な役割を果たすと考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｔｈ１７細胞は、主に、好中球の動員、活性化及び遊走に関与する、ＩＬ−１７ファミリーの２つの主要なメンバーであるＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆを産生する。また、これらの細胞は、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２も分泌する。近年、Ｔｈ１７極性細胞は、マウスにおいて確立された腫瘍の退縮を調節することが示されている（非特許文献２）。
【０００４】
個体におけるほぼ全ての細胞がＤＮＡコードの全く同一の相補体を含んでいるにも関わらず、高等生物は、様々な組織型において異なる遺伝子発現パターンを課し、維持しなければならない。ほとんどの遺伝子調節は細胞の現在の状態に依存して、一時的であり、外部刺激において変化する。一方、持続的な調節は、ＤＮＡの基本遺伝暗号を変更しないエピジェネティックな遺伝性の調節パターンの主要な役割である。
【０００５】
以下に説明されるように、エピジェネティックな修飾の１つの形態は、塩基シトシンへのメチル基の付着である。「５番目の塩基」（５−メチルシトシン、ｍＣ）に加え、なおも６番目の塩基（５−ヒドロキシメチルシトシン、ｈｍＣ）、７番目の塩基（５−ホルミルシトシン、ｆＣ）、８番目の塩基（５−カルボキシシトシン、ｃＣ）が見られる（非特許文献３）。５−メチルシトシン及び５−ヒドロキシメチルシトシンの両方が、バイサルファイト変換不可能である。
【０００６】
ＤＮＡメチル化はエピジェネティックな調節の典型的な形態であり、安定な細胞記憶として機能し、様々な細胞型の長期同一性を維持する上で重要な役割を果たす。メチル化の主要な標的は、２ヌクレオチド配列であるシトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）であり、この状況でシトシン（Ｃ）は簡単な化学修飾を受けてホルミル化、メチル化、ヒドロキシメチル化、カルボキシル化する場合がある。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は、「ＣｐＧ島」と呼ばれる或る特定の比較的密なクラスターを除くと予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧ島は遺伝子プロモーターと関連することが多く、半数を超えるヒト遺伝子がＣｐＧ島を有すると推定されている（非特許文献４）。
【０００７】
現在のところ、ＤＮＡメチル化からＴｒｅｇ生物学（Treg biology）への非常に急激な変化が存在する。したがって、明確に異なる細胞型は、固有の特徴的なＤＮＡメチル化パターン、すなわち細胞型の同定及び定量化に利用され得るエピジェネティックフィンガープリントを提示することが示されたというような橋渡し的な言い回しを含むことができるかもしれない（非特許文献５）。さらに、自己抗原に対して寛容を確立するが、敵に対する免疫反応を可能とする制御性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ分化及び機能に極めて重要なマスター転写因子であるＦＯＸＰ３遺伝子においてのみ脱メチル化されていることを特徴とする（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖されたＴｒｅｇの養子免疫伝達は、自己免疫疾患及びアロ抗原誘導性疾患に対する有望な治療選択肢である。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養によるＴｒｅｇの表現型及び機能的安定性に関する懸念のため、出発集団の慎重な選択及び最終細胞製品の徹底した特性評価の両方が要求される。
【０００９】
近年、マウスＴｒｅｇ及びＴｈ１７細胞に関して高度な発生的柔軟性が説明されている。同様に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてヒトＴｒｅｇ  のＣＤ４５ＲＡ（−）記憶型亜集団においてＩＬ−１７産生ＦＯＸＰ３（＋）細胞が検出された。これにより、ポリクローナルなｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖の間にＴｈ１７細胞へと発達させるヒト未感作Ｔｒｅｇ及び記憶Ｔｒｅｇの性質の調査が促進された。Ｔｈ１７細胞に対して系譜を決定する転写因子（lineage-defining transcription factor）をコードするＲＯＲＣの刺激誘導性ＤＮＡメチル化が、ＦＯＸＰ３発現レベルにかかわらず、ＣＤ４５ＲＡ（−）記憶型Ｔｒｅｇに選択的に生じる。これに反して、未感作ＣＤ４５ＲＡ（＋）Ｔｒｅｇは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖が延長されても、ＲＯＲＣ遺伝子座にわたって安定したＣｐＧメチル化を維持し、結果として、ごくわずかにＲＯＲＣを発現する傾向を示してＩＬ−１７産生細胞へと発達する（非特許文献８）。
【００１０】
末梢血中の非接着性の非マトリックス化細胞を抗体でマーキングし、フローサイトメトリーによって定量化することができるため、免疫細胞の定量化は比較的容易であり、完全に標準化されていると一般に考えられている。細胞が非接着性の単一細胞懸濁液であり、無傷の細胞型特異的表面抗原が利用可能であれば、フローサイトメトリーは実際に精度の高い細胞定量化ツールである。
【００１１】
しかしながら、研究及び医学的日常業務の多くの用途では、かかる正確な測定の指定の必須条件は得られない：
１．多くの場合、測定される材料／サンプルは末梢血に由来するものではないことから、溶解性及び単一細胞懸濁液特性は満たされない。これは例えば、病理学的日常業務において行われるような全ての生検分析にも当てはまる。
２．これらの細胞を、その構造的完全性（「無損傷」）を維持するように、凍結するか、又はＥＤＴＡ血として顆粒球等の亜画分が分解し始めるまで６時間を超えて保管してはならないため、検体が末梢血であっても無傷細胞を有するという必須条件は満たすことが困難である。
３．一般的な認識とは対照的に、全ての免疫細胞型に対する特異性の高い（表面）抗原は存在せず、したがって細胞型の同定は期待され得るほど明確ではない。
３ａ．抗原発現はデジタルプロセスではないため、細胞が陽性画分又は陰性画分のいずれに属するかを決定するのに閾値を規定する必要がある。Ｔ細胞では、この問題は特に顕著である：
【００１２】
したがって、多くの用途で免疫細胞の定量的判定の現行の方法論的アプローチには依然として問題がある。例えば臨床用途における定期的検査では、通常は幾らかの時間差、したがって検体のロバスト性及び安定性が必要となる。先に述べたように、末梢血中の細胞の測定に用いられるフローサイトメトリー法は、腫瘍成長時又は炎症時／炎症後に固形組織を含む他の組織に浸潤する免疫細胞には適切ではない。したがって、フローサイトメトリー法はこれらの分野に適用されず、代替方法（大抵は免疫組織化学的なものである）は半定量的方法でしかない。
【００１３】
本願の定義の目的上、ＤＮＡ配列におけるエピジェネティック修飾は、ＤＮＡメチル化（５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（ｆＣ）及び／又は５−カルボキシシトシン（ｃＣ））の用語により表される。少なくとも５−メチルシトシン及び５−ヒドロキシメチルシトシンの両方はバイサルファイト変換可能ではなく、バイサルファイト変換分析により区別することができない。
【００１４】
科学論文では、メチル化の状態は「高（hyper）」（正常を上回る、正常を超える（ラテン語：super））又は「低（hypo）」（正常を下回る、正常に満たない（ラテン語：sub））メチル化のいずれかで示されることが多い。本発明者の観点では、これらの用語は「正常」状態との差異を示すため不適切である。しかしながら、或る細胞型ではメチル化されていれば正常であり、他の細胞では非メチル化されていれば正常であるため、健常細胞では異常（non-normal）というものは存在しない。
【００１５】
どちらの特徴も完全に正常である。したがって、本発明者にとっては、遺伝子領域はメチル化又は非メチル化されているかのいずれかである（非メチル化と同義である：脱メチル化）。細胞型の領域が異常にメチル化されている（高メチル化）か、又は異常に脱メチル化されている（低メチル化）かについての潜在的決定は或る特定の疾患において役割を果たす可能性があり、これに基づいて決定が下され得る。しかしながら、これはＤＮＡのメチル化状態を測定する技術的プロセスにおいて論考される又は見られる問題ではない。それにもかかわらず、原則として高メチル化及び低メチル化が記載されている場合には、脱メチル化及びメチル化の技術的分類を示すと考えられる。
【００１６】
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００６．１１は、ヒトＩＬ１７Ａに対するゲノム領域を含む第６染色体を開示している（第６染色体：ｍＲＮＡに対する位置はフォワード鎖上の５２０５１１８５〜５２０５５４３６である）。
【００１７】
本発明者らは、代替的なより効率的、ロバストかつ統合的な定量的アプローチでＬＩ１７陽性Ｔ細胞の同定及び定量化、すなわち細胞型又は細胞状態に特異的なエピジェネティック（ＤＮＡメチル化及び／又はクロマチン構造及び／又はＤＮＡ化学的不活性）マーカーの分析に使用することができるマーカーを提示する。臨床的日常業務及び一般的な細胞生物学的慣行では、特異的なエピジェネティックマーカーの同定は、血液細胞型及び免疫細胞型の測定を大きく促進する。
【００１８】
Janson et al.は（非特許文献９において）、サイトカイン及び転写因子の遺伝子座の特異的なＣｐＧメチル化に基づく、任意のＴ細胞のエフェクター軸（effector axis）上の単離されたヒトＣＤ４（＋）Ｔ細胞の配置を正確に示す方法を記載している。彼らは、かかる方法を関節リウマチ及び多発性硬化症の患者から得られたＣＤ４（＋）細胞に適用し、滑液浸潤性ＣＤ４（＋）Ｔ細胞がＴｈ１及び制御性Ｔ細胞表現型の両方に関係づけられるのに対し、Ｔｈ２反応は抑制されることを示した。さらに、彼らは、ＩＬ−１７Ａ遺伝子はプロモーターのメチル化によって調節され、Ｔｈ１７への関与は関節リウマチ患者の炎症を起こした関節に共通の特徴ではないことを示した。したがって彼らは、上記出版物に記載される方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで単離されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞に関与するＴｈ系譜の正確なプロファイリングを可能とするであろうと結論づけた。
【００１９】
メチル化の重要性は特に腫瘍細胞において明らかである。この場合、健常な細胞の発生に不可欠な「正常な」メチル化パターンが失われているため、細胞はエピジェネティック異常となるだけでなく、制御することができなくなる。異常なメチル化は本発明の第一の主題ではないが、正確なエピジェネティック調節が明らかに重要であることは、がん細胞と不適切なメチル化との間の密接な関連性から明白である。このことから（from）正確なメチル化が重要であると結論付けることができる。単一遺伝子については、ＦＯＸＰ３遺伝子座（非特許文献７、非特許文献１０）及びＣＤ３遺伝子座（非特許文献１１）によって以前に示されているように、所与の遺伝子座でのＤＮＡの化学的／構造的性質（メチル化状態／インプリント等）は或る特定の細胞の分化及び型と一致する。これにより、エピジェネティックフィンガープリントに基づく健常細胞の細胞型の同定及び定量化が可能となる。Ｔｈ１７細胞の高い炎症性質が発がんを引き起こす、又は発がんに寄与するのに十分であるかどうかは、現在議論されている主題である（非特許文献１２、非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Stock-inger B, Veldhoen M (June 2007). "Differentiation andfunction of Thl7 T cells". Current Opinion in Immunology 19 (3): 281-286
【非特許文献２】Martin-Orozco N, Muranski P, Chung Y et al. (November 2009). "Thelper 17 cells promote cytotoxic T cell activation in tumor immunity".Immunity 31 (5): 787-798
【非特許文献３】Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosineand 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol.336 no. 6083 pp. 934-937
【非特許文献４】Antequera and Bird, Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 11995-9, 1993
【非特許文献５】DNA methylation analysis as a tool for cell typing. Baron U, Turbachova I, Hellwag A,Eckhardt F, Berlin K, Hoffmuller U, Gardina P, Olek S. Epigenetics. 2006Jan-Mar; 1(1):55-60. Epub 2006 Feb 25.
【非特許文献６】Epigenetic control of the foxp3 locus in regulatory T cells. FloessS, Freyer J, Siewert C, Baron U, Olek S, Polansky J, Schlawe K, Chang HD, BoppT, Schmitt E, Klein-Hessling S, Serfling E, Hamann A, Huehn J. PLoS Biol. 2007Feb;5(2):e38.
【非特許文献７】DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatoryT cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Baron U, Floess S,Wieczorek G, Baumann K, GrutzkauA, Dong J, Thiel A, Boeld TJ, Hoffmann P, Edinger M, Turbachova I, Hamann A, Olek S, Huehn J. EurJ Immunol. 2007 Sep;37(9):2378-89.
【非特許文献８】Schmidl C, Hansmann L, Andreesen R, Edinger M, Hoffmann P, Rehli M.Epigenetic reprogramming of the RORC locus during in vitro expansion is adistinctive feature of human memory but not naive Treg. Eur J Immunol. 2011 May;41(5):1491-8.Epub 2011 Apr 12
【非特許文献９】Janson PC, Linton LB, Bergman EA, Marits P, Eberhardson M, Piehl F,Malmstrom V,Winqvist O. Profiling of CD4+ T cells with epigenetic immune lineage analysis.J Immunol. 2011 Jan 1;186(1):92-102. Epub 2010 Dec 3.
【非特許文献１０】Wieczorek et al. Cancer Res. 2009 Jan 15;69(2):599-608
【非特許文献１１】Sehouli et al. Epigenetics. 2011 Feb 1; 6(2):236-46
【非特許文献１２】Wu S, Rhee KJ, Albesiano E et al. (September 2009). "A humancolonic commensal promotes colon tumorigenesis via activation of T helper type17 T cell responses". Nature Medicine 15 (9): 1016-1022
【非特許文献１３】Huang C, Fu ZX. Localization of IL-17+Foxp3+ T cells in esophagealcancer. Immunol Invest. 2011;40(4):400-12. Epub 2011 Feb 11.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
以上の点を鑑みると、当該技術分野における一定の進展にもかかわらず、本発明の目的は、例えば、動物／ヒトの血液又は組織に由来する／から得られる所与のサンプル中のＩＬ１７陽性Ｔ細胞をより都合よくかつ確実に同定及び定量化するのに優れたツールとしてバイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はＤＮＡメチル化分析に基づく改善された方法を提供することである。有利には、測定は精製、保管、更には相当の程度（extent）まで組織品質とは無関係に行うことができる。
【００２２】
以上の点を更に鑑みると、本発明の目的は、実際にＩＬ−１７タンパク質を産生する細胞のみならず、例えば、イオノマイシン及びＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）による刺激後にＩＬ−１７タンパク質を産生することが可能な細胞をも同定する改善された方法を提供することである。現在、一般的な細胞同定の技術は、その時点でＩＬ−１７タンパク質を産生している細胞（全血中で最大でも０．１％の細胞）を検出するに過ぎない。しかしながら、本発明によって同定される細胞の割合は、ＩＬ−１７を産生することが可能な（その時点でＩＬ−１７を産生していない）細胞も包含して、０．１％〜２％に達する。ＩＬ１７陽性細胞とは、Ｔｈ１７細胞等の細胞である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
第１の態様では、本発明は、哺乳動物に由来する血液及び／又は組織サンプル中のＩＬ−１７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞（本明細書においてＩＬ−１７発現Ｔ細胞とも表される）を同定する方法であって、該方法は、ＩＬ−１７Ａ遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、上記サンプル中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、非ＩＬ−１７血液細胞中の類似位置と比較した、Ｔｈ１７細胞等のＩＬ−１７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の指標となる、方法を提供することによって上記課題を解決する。
【００２４】
好ましくは、上記方法は、細胞の精製及び／又は濃縮の工程なしに、好ましくは全血及び／又はトリプシン処理されていない組織、又は潜在的にＴ細胞を含有する任意の他の生物学的サンプルにおいて行われる。最も好ましくは、上記サンプルは、患者への自己細胞移入用のサンプル、すなわち患者へと移植されるサンプルである。
【００２５】
また、本発明の更なる実施の形態は、ナチュラルＴｒｅｇ、Ｔ細胞全体及び／又は各組織、特に血液若しくは固形の疾患組織、又はその起源にかかわらず近接する組織のいずれかと比較した、複合組織中のＴｈ１７細胞の定量化を更に含む、本発明の方法を含む。別の態様では、ＩＬ１７Ａは、哺乳動物の免疫状態に重要ないくつかの細胞型の場合に測定される、例えばＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨ等の遺伝子／マーカーの「パネル」の一部であってもよい。
【００２６】
本発明の更なる実施の形態は、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、転写開始点より上流の５’領域、プロモーター領域、５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界、又は転写終結点の下流の３’領域中に存在する、本発明の方法を含む。
【００２７】
また、本発明の更なる実施の形態は、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号１７によるＩＬ１７Ａ遺伝子中にあるＣｐＧ位置、好ましくは配列番号１によるＩＬ１７Ａアンプリコン１９０９、好ましくは配列番号２若しくは配列番号３による標的領域、又は配列番号４〜配列番号１６若しくは配列番号１８〜配列番号２１による配列から選択されるプライマー対により増幅された、特に配列番号１９及び配列番号２０によるプライマー対により増幅されたＩＬ１７ＡアンプリコンのＣｐＧ位置から選択される、本発明の方法を含む。
【００２８】
分析対象の特定のＣｐＧについて、理論上は１つの細胞につき（どちらの対立遺伝子もメチル化されている）、（対立遺伝子Ａがメチル化されており、対立遺伝子Ｂが非メチル化されている）、（対立遺伝子Ａが非メチル化されており、対立遺伝子Ｂがメチル化されている）及び（どちらの対立遺伝子も非メチル化されている）という４つの状態が存在する。これにより、１００％メチル化、５０％メチル化及び０％メチル化という３つの異なる結果がもたらされる。したがって、理論上は、ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞は０％メチル化されており、非ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞はおよそ１００％メチル化されている。上記領域のアクセシビリティを分析するアッセイについて、ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞が０％アクセシブルであり、非ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞がおよそ１００％アクセシブルである、バイサルファイト変換に対して分析されたのと同様の状況が存在する。
【００２９】
例えばバイサルファイトシークエンシングを利用する実用的測定では、利用した技術の僅かな技術的欠陥及び場合によっては僅かな生物学的差異の両方により理論上予測される値が曖昧となるため、完全な「純粋な」メチル化パターンが検出されることは殆どない。したがって、分析対象の上記領域中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、非ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞の類似位置と比較して８０％を超えて、好ましくは９０％を超えて、最も好ましくは９５％を超えて脱メチル化されている、本発明の方法が好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は領域（例えば上記のＡＭＰ１９０９領域（配列番号１）中の）１個以上のＣｐＧ位置、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の位置を分析する、方法を含む。この場合、分析対象の領域の全体的なメチル化（又は脱メチル化）を、非ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞の類似領域と比較して判定することができる。したがって、上記領域が、非ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞の（高メチル化又は完全にメチル化された）類似領域と比較して７０％を超えて、好ましくは８０％又は９０％を超えて、最も好ましくは９５％を超えて脱メチル化（低メチル化）されている、本発明の方法も好ましい。
【００３１】
当業者は、分析する部位の量を最小限に抑えるために、ＣｐＧ位置の具体的なサブセット、例えば、配列番号１によるアンプリコン上に存在する全ての部位、若しくは分析対象のＩＬ−１７遺伝子中の任意の他の選択されたサブシーケンス、例えば上記のように転写開始点より上流の５’領域、プロモーター領域、５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域、イントロン、及び／又はエクソン／イントロン境界、又は転写終結点の下流の３’領域、及び／又は配列番号２若しくは配列番号３による標的領域、又は配列番号４〜配列番号１６若しくは配列番号１８〜配列番号２１による配列から選択されるプライマー対により増幅される、特に配列番号１９及び配列番号２０によるプライマー対によって増幅されるＩＬ１７アンプリコンを更に選択することが可能である。
【００３２】
更に別の態様は、バイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はメチル化状態の分析がメチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ｑＰＣＲから選択される分析、又はゲノムＤＮＡ、化学的若しくは酵素的に修飾されたＤＮＡ、若しくは増幅されたゲノムＤＮＡ、若しくは化学的若しくは酵素的に修飾されたＤＮＡの検出による他の方法を含む、本発明による方法に関する。マーカーＣＤ４、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨの付加的な分析も好ましい。
【００３３】
本発明の別の実施の形態は、上記同定が、上記ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞を全ての主要な末梢血液細胞型又は非血液細胞から区別すること、及び任意で更に定量化することを含み、上記哺乳動物の免疫状態を、同定された上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞に基づいて決定する工程を更に含む、上記の方法に関する。これにより、全血又は様々な亜画分及び組織又は組織の単離亜画分を含む哺乳動物のサンプルにおいて、ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞を分析される遺伝子におけるその（独特の）メチル化パターンにより同定及び定量化することができる。メチル化の喪失がＩＬ−１７陽性Ｔ細胞と厳密に相関するため、これに基づいてＩＬ−１７陽性Ｔ細胞を定量化することもできる。定量化は、ＩＬ−１７メチル化と、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨの群から選択される少なくとも１つのマーカーのメチル化との比較に基づいて、上記サンプル中のＩＬ−１７細胞を定量化することを含むのが好ましい。
【００３４】
本明細書中では個体の「免疫状態」は、任意の所与の疾患状況の任意の所与の組織型での所与の状況における所与の個体の免疫系の状態を意味するものとする。例えば、固形腫瘍を患っている個体の（腫瘍）組織生検では免疫状態を判定することが重要であり得る。また、個体の健康状態を判定するために、末梢血での（推定上）健常な個体の免疫状態を判定することが適切であり得る。この場合、分析される遺伝子特にＩＬ−１７のメチル化コピー及び非メチル化コピーの所与の数によって定量化される細胞の増加又は減少の両方が、疾患、例えば体の未知の部位での腫瘍の存在、又は自己免疫反応若しくは慢性感染等の指標となり得る。
【００３５】
特に、本発明者らは、本明細書に記載の方法が例えばＤＮＡチップ上での日常用途に好適であると考える。サンプルは、哺乳動物の体液、好ましくはヒト血液サンプル（血清サンプル）、又は腫瘍性若しくは非腫瘍性の固形組織サンプル、器官若しくは細胞型の血液サンプルを含む新鮮サンプル、新鮮凍結サンプル又は完全に調製された（例えばホルマリン固定パラフィン包埋）サンプルから選択される。これらのサンプルは哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、サル、ウシ、ブタ又はヒトのものであるものとする。特に好ましいのは、哺乳動物であり、最も好ましくは、例えば、乾癬性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、例えば関節リウマチのようなリウマチ性疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、炎症性腸疾患、炎症性疾患、ブドウ膜炎、肝炎疾患、狼瘡、肺疾患（例えば、喘息）、高ＩｇＥ症候群、抗腫瘍免疫、腎損傷、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性）、内毒素性ショック、及び自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー、又はＩＬ−１７発現Ｔ細胞に直接的に関連する任意の疾患等のＩＬ−１７媒介疾患及び抗ＩＬ−１７療法の副作用を患っているか、又はその可能性があるヒトである。また、本発明を使用して、患者及び／又は患者集団における抗ＩＬ−１７療法をモニタリングすることもできる。
【００３６】
国際公開第２０１２／０９３２５４号（引用することにより本明細書の一部をなす）は、ＩＬ−１７媒介疾患、また抗ＩＬ−１７療法に対する患者の反応のモニタリング、及び本発明とも関連のあるＩＬ−１７関連疾患（関節炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、喘息、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、強皮症、全身性強皮症、肺線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、並びに強直性脊椎炎及び他の脊椎関節症からなる群より選択される障害等）のバイオマーカーとしてのリポカリン２（ＬＣＮ２）の使用を記載している。
【００３７】
更に別の態様は、上記同定及び定量化に基づき、上記サンプル中において同定された上記ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞の数及び／又は量を決定する工程を更に含む、本発明による方法に関する。ＩＬ−１７Ａ遺伝子、並びに配列番号１によるアンプリコン、又は配列番号２若しくは配列番号３による標的領域、又は配列番号４〜配列番号１６、若しくは配列番号１８〜配列番号２１による配列から選択されるプライマー対により増幅された、特に配列番号１９及び配列番号２０によるプライマー対により増幅されたＩＬ１７アンプリコンの脱メチル化が、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞と非常に厳密に関係するため、上記方法の最も都合の良い実施の形態では、アッセイにおけるコピー数及び／又は被検体の性別について正規化した場合に、上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の数及び／又は量を、脱メチル化分析の結果と直接相関させることができる。他の代替形態では、付加的な対照実験（例えば並行した脱メチル化ＧＡＰＤＨの分析）を適用することができる（上記も参照）。
【００３８】
更なる態様では、本発明の方法は、本発明による方法と、同定されたＩＬ−１７陽性Ｔ細胞の量を、同じ哺乳動物から採取された以前のサンプル及び／又は対照サンプルと比較することとを含む、哺乳動物におけるＩＬ−１７陽性Ｔ細胞のレベルのモニタリングに有用である。
【００３９】
更に別の態様は、本明細書の上記のように、上記哺乳動物の免疫状態を、上記サンプルにおける同定された上記ＩＬ１７発現Ｔ細胞の数及び／又は量に基づいて決定する工程を更に含む、本発明による方法に関する。
【００４０】
更に別の態様は、上記哺乳動物が、例えば、乾癬性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、例えば関節リウマチのようなリウマチ性疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、炎症性腸疾患、炎症性疾患、ブドウ膜炎、肝炎疾患、狼瘡、肺疾患（例えば、喘息）、高ＩｇＥ症候群、抗腫瘍免疫、腎損傷、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性）、内毒素性ショック、及び自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー若しくはＩＬ−１７発現Ｔ細胞に直接的に関連する任意の疾患等のＩＬ−１７媒介疾患及び抗ＩＬ−１７療法の副作用を患っているか、又はその可能性がある、本発明による方法に関する。
【００４１】
本発明の別の態様では、この方法は、上記哺乳動物に与えた化学物質及び／又は生体物質に応じた上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量の測定及び／又はモニタリングにも有用である。
【００４２】
更なる別の態様では、本発明は、配列番号１によるアンプリコン、又は好ましくは配列番号２若しくは配列番号３によるその標的領域を提供する。上記アンプリコンは、本発明による方法におけるツールとして使用され得る。
【００４３】
また、本発明は、上述の本発明による方法を実施する材料を含む、ＩＬ−１７遺伝子中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて哺乳動物においてＩＬ−１７発現Ｔ細胞を同定、定量化、及び／又はモニタリングするキットを提供する。
【００４４】
かかる本発明のキットは、好ましくは、ａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）配列番号１７によるＩＬ−１７Ａ遺伝子のＣｐＧ位置、好ましくは配列番号１によるＩＬ１７アンプリコン１９０９、又は配列番号４〜配列番号１６による配列から選択されるプライマー対により増幅されるＩＬ１７アンプリコン、好ましくは配列番号２若しくは配列番号３による標的領域のＣｐＧ位置から選択されるＣｐＧ位置のメチル化分析の材料とを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明は、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の検出及びそれらの区別には、研究開発の本質的に全ての用途、特に全ての臨床（日常）用途で問題があるという上記の課題を、哺乳動物のＩＬ−１７発現Ｔ細胞を同定する方法であって、該方法が例えばＩＬ−１７遺伝子の調節領域、潜在的に、差次的にメチル化された領域の１つ又はいくつかにおける少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、脱メチル化及び／又はバイサルファイト変換へのアクセシビリティが、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞に高度に特異的であるか、又はその指標となる、方法を提供することによって解決する。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施の形態では、本発明者らは、ヒト全血サンプル又は任意の所与の（固形）組織、器官若しくは細胞型を含む全てのヒト体液中のＩＬ−１７発現Ｔ細胞をモニタリングするために、新規のより特異的な方法を更に提示する。
【００４７】
本発明の概念は概して、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞における遺伝子のＩＬ−１７領域のＤＮＡの特異的な脱メチル化及び／又はバイサルファイトへのアクセシビリティ及び他の化学塩基特異的変換に基づく。簡単かつ正確な定量的ＰＣＲ法（例えば正確な定量的ＰＣＲ法又は核酸分子のコピーの判定を可能にする他の方法）をシグナル増幅方法として用いて、本発明者らは、ＩＬ−１７Ａ領域の脱メチル化及び／又はバイサルファイト変換へのアクセシビリティが、血液又は組織におけるＩＬ−１７発現Ｔ細胞数の代替マーカーであることを示す。これにより、本発明者らは、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の存在と機能的に関与する又は確実に関連するＩＬ−１７遺伝子内の特定の新たな領域を同定した。
【００４８】
本発明の主な態様は、一方ではＴ細胞の機能的に異なる画分、すなわちＩＬ−１７発現Ｔ細胞画分と、他方で他のヒト／動物の細胞型との間での区別である。
【００４９】
本発明者らは、全てのＩＬ−１７発現Ｔ細胞ではＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち、７０％を超えて、好ましくは８０％、好ましくは９０％を超えて、及び最も好ましくは９５％を超えて、上記参照）脱メチル化されており、一方で同じモチーフが非ＩＬ−１７発現Ｔ細胞では完全にメチル化されていることを実証することができた。したがって、ＩＬ−１７遺伝子座のメチル化状態の判定は、自己免疫疾患、（ウイルス性）感染症、移植片拒絶反応、がん、感染症及び／又はアレルギーにおけるＩＬ−１７発現Ｔ細胞の測定に必要とされるか、又は少なくとも何らかの価値があるようなＩＬ−１７発現Ｔ細胞の同定に有益なツールである。このアッセイは、精製又は任意の染色手順なしに、２つ以上の細胞型、好ましくは２つ以上の血液細胞型を含有する「複合」生物学的サンプル（すなわち、組織及び／又は血液等のサンプル）中のＩＬ−１７発現Ｔ細胞の測定を可能とする。特に好ましい実施の形態として、本明細書に記載のマーカーのいずれかによって測定されるＩＬ−１７発現Ｔ細胞を、腫瘍性組織又は非腫瘍性組織を含む健常又は病的な性質の固形組織サンプル内から容易に検出及び定量化することができる。かかる分析では、新鮮組織、新鮮凍結組織又は任意のタイプの保存された（例えば、ホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋等）組織のいずれかから分析を行うことが可能である。別の好ましい実施の態様は、一方でＩＬ−１７発現Ｔ細胞と、他方で他のＴ細胞型との間の比率を判定することである。
【００５０】
本発明者らは、哺乳動物免疫細胞のＩＬ−１７発現Ｔ細胞特性を形成する可能性が、ＩＬ−１７の遺伝子領域のエピジェネティックな調節、すなわちＤＮＡメチル化に基づく調節と同時に起こることを示した。ＤＮＡメチル化は、長期的な遺伝子発現変化をもたらす生物学的及び化学的に安定なエピジェネティック修飾である。本発明者らは、ヒトＩＬ−１７遺伝子座での脱メチル化及び／又はゲノムＤＮＡのバイサルファイト変換へのアクセシビリティが、全ての主要な末梢血液細胞型及び選択された異なる非血液細胞型／株に対して試験した場合に、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞に制限されることを見出した。これらのデータから、ＩＬ−１７Ａ遺伝子座におけるエピジェネティック修飾が、任意の遺伝子の発現に関わらず、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の表現型を有する細胞の同定に有益なマーカーとなることが示された。
【００５１】
メチル化による遺伝子調節を受ける付加的な重要な遺伝子調節要素、例えば不可欠な転写調節因子の結合部位であるエンハンサー領域は、所与の遺伝子のオープンリーディングフレームの上流及び下流に位置することが多いことが当該技術分野で確立されている。このため、本発明の好ましい実施の形態として、ＩＬ−１７Ａの転写開始部位の上流の１００００塩基、好ましくはＩＬ−１７Ａの上流の９０００塩基、８０００塩基、７０００塩基、６０００塩基、５０００塩基、４０００塩基、３０００塩基又は２０００塩基、更により好ましくはＩＬ−１７Ａの転写開始点の上流の１０００塩基の領域、最も好ましくはＩＬ−１７Ａの転写開始部位の上流の最初の５００塩基内に位置し得るこの因子の分析が本発明の方法に含まれる。しかしながら、本発明で分析される部位はＩＬ−１７Ａの遺伝子プロモーター内に位置することが特に好ましい。
【００５２】
別の実施の形態では、上記メチル化状態の分析が配列番号１によるアンプリコン又は配列番号２若しくは配列番号３による標的領域の増幅に有用なプライマー対の少なくとも一方のプライマーを用いた増幅を含む、本発明による方法が好ましい。
【００５３】
好ましくは増幅には、ポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ増幅反応若しくは化学的増幅反応、又は下記のような当業者に既知の、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ＭＳ−ＳＮＵＰＥ、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ、シークエンシング又はメチル特異的制限アッセイの状況における他の増幅方法が含まれる。増幅により、本発明による方法（複数の場合もあり）の実行に特に好ましい「ツール」である、本明細書に記載のＩＬ−１７Ａの遺伝子又は任意のパラログ若しくはオーソログのアンプリコンが産生される。結果として、配列番号１又は配列番号１７による領域及びその一部の増幅用のプライマー対並びに配列番号４〜配列番号１６又は配列番号１８〜配列番号２２、特に配列番号１９及び配列番号２０のプライマー対は、本発明の好ましい実施の形態を構成する。
【００５４】
さらに、５ｍＭ超のＭｇＣｌ２、好ましくは最大で６．４ｍＭのＭｇＣｌ２を増幅反応に使用する（ことができる）、本発明による方法が好ましい。
【００５５】
さらに、細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＦＯＸＰ３及び／又はＧＡＰＤＨを分析する工程を更に含む、本発明による方法が好ましい。これらの付加的マーカーを分析するために、抗体を用いた方法及び／又はメチル化分析といった発現を分析する任意の既知の方法を使用することができる。これらのマーカーの分析は、分析の精度を更に改善し、細胞サブセットの同定を可能とし得るのが好ましい。このため、本発明による方法は、上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞と全ての主要な末梢血液細胞型又は非血液細胞との区別である同定を含む。
【００５６】
本発明による方法は、上記のマーカー又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物で行うことができ、該哺乳動物がマウス、ラット、ブタ又はウシ、サル又はヒト、好ましくはヒトである、本発明による方法が好ましい。
【００５７】
本発明による方法（複数の場合もあり）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。概して、好適な細胞又は対象の細胞の好適なＤＮＡを含有する限り、全ての生物学的サンプルを使用することができる。該サンプルが哺乳動物の体液、好ましくはヒト全血サンプル、血清サンプル、又は腫瘍性若しくは非腫瘍性の固形組織、器官若しくは細胞型の血液サンプル、血液リンパ球若しくはその画分のサンプルを含む新鮮サンプル、新鮮凍結サンプル又は完全に調製されたサンプルから選択される、方法が好ましい。
【００５８】
また、本発明の別の好ましい態様は、診断における上記の本発明による方法の使用及び疾患のモニタリングにおける使用に関する。このため、代替的な実施の形態では、本発明は、上記哺乳動物の免疫状態を、同定及び／又は定量化された上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞に基づいて決定する工程を更に含む、本発明による方法に関する。本発明による上記方法では、ＩＬ−１７Ａ遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の指標となる。
【００５９】
また、本発明の別の重要な態様は、哺乳動物においてＩＬ−１７発現Ｔ細胞のレベルをモニタリングする本発明による方法であって、上記本発明による方法と、同定されたＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量を、同じ哺乳動物から以前に採取されたサンプル及び／又は対照サンプルと比較することとを含む、方法に関する。好ましくは、上記方法は、例えば、乾癬性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、例えば関節リウマチのようなリウマチ性疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、炎症性腸疾患、炎症性疾患、ブドウ膜炎、肝炎疾患、狼瘡、肺疾患（例えば、喘息）、高ＩｇＥ症候群、抗腫瘍免疫、腎損傷、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性）、内毒素性ショック、及び自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー、又はＩＬ−１７発現Ｔ細胞に直接的に関連する任意の疾患等の自己免疫性ＩＬ−１７媒介疾患及び抗ＩＬ−１７療法の副作用を患っているか、又はその可能性がある哺乳動物に由来するサンプルに対して行われる。
【００６０】
また、更に好ましくは、本発明による上記方法は、上記哺乳動物に与えた化学物質及び／又は生体物質に応じたＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む。すなわち、例えば疾患（例えば本明細書に記載のもの）の治療、並びにＩＬ−１７発現Ｔ細胞に対する効果に関する該治療の成功及び／又は進行に起因するＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量又は比率の変化は、この方法を用いて追跡することができる。本明細書中のマーカーに基づくメチル化パターンの追跡は、場合によっては表現型変化が観察され得る前でもある、上記化学物質及び／又は生体物質に対する応答による細胞における変化を示す。
【００６１】
本発明の更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載のマーカーを発現するＩＬ−１７発現Ｔ細胞を選択的に調整する化学物質及び／又は生体物質を同定する方法であって、１つ又は複数の上記化学物質及び／又は生体物質と潜在的にＩＬ−１７を発現するＴ細胞とを接触させることと、上記化学物質及び／又は生体物質が分析対象のＣｐＧ位置のメチル化を調整するか否か、及び／又は上記１つ又は複数の上記化学物質及び／又は生体物質が、マーカーを発現するＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量及び／又は比率を選択的に調整するか否かを検出することとを含む、方法を提供する。上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量及び／又は比率を増大させる上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の調整が特に好ましい。
【００６２】
この方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又は好適な動物で行うことができる。この態様では、本発明は、ＩＬ−１７発現Ｔ細胞に特異的な薬物及びそれぞれの医薬組成物の開発の出発点として使用することができる、上記のマーカーの発現を調整する化学物質及び／又は生体物質を同定しようとする方法（「スクリーニング法」と呼ばれる場合もある）を提供する。本発明の方法は、本明細書中で同定されるマーカー遺伝子がＩＬ−１７発現Ｔ細胞の発生の中心的役割を果たすはずであることが広く認められているという事実に基づく。したがって、マーカー発現を刺激する因子は患者の治療にとって興味深い。ＩＬ−１７発現Ｔ細胞の発生／比率／量の安定な修飾、好ましくは誘導をもたらすかかる因子は、本発明で記載の方法を用いて検出することができる。
【００６３】
スクリーニング化合物として好適な化学物質及び／又は生体物質は当業者に既知であり、例えば小分子、ペプチド及びタンパク質、並びに抗体又はその断片を含む。さらに、スクリーニングは、民間の化合物ライブラリを、最適にはロボット等の好適な自動化とともに用いて行うことができる。化学物質及び／又は生体物質を同定する方法の好ましい一実施の形態では、上記物質は、分析対象のＣｐＧ位置の少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の脱メチル化をもたらす。
【００６４】
また、本発明の別の重要な態様は本発明による方法であって、該方法は例えば、乾癬性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、例えば関節リウマチのようなリウマチ性疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、炎症性腸疾患、炎症性疾患、ブドウ膜炎、肝炎疾患、狼瘡、肺疾患（例えば、喘息）、高ＩｇＥ症候群、抗腫瘍免疫、腎損傷、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性）、内毒素性ショック、及び自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー、又はＩＬ−１７発現Ｔ細胞に直接的に関連する任意の疾患等のＩＬ−１７媒介疾患及び抗ＩＬ−１７療法の副作用を患っているか、又はその可能性がある患者の治療を提供する工程を更に含み、ここで、上記治療は、上記患者、好ましくは自己免疫患者又はがん患者におけるＩＬ−１７発現Ｔ細胞の量及び／又は割合を調整し、好ましくは増加する、方法に関する。上記治療が上記患者においてＩＬ−１７発現Ｔ細胞を選択的に刺激する化学物質及び／又は生物学的物質の提供、又は上記マーカー遺伝子の発現を刺激するか、若しくは上記患者における上記ＩＬ−１７発現Ｔ細胞中での上記マーカー遺伝子の生物学的活性を支持する治療から選択される、本発明による方法が好ましい。かかる治療の好ましい例は、上記遺伝子のメチル化の低減をもたらす脱メチル化剤である。かかる治療の他の好ましい例は、自己免疫疾患の場合にＩＬ−１７発現Ｔ細胞の数の減少をもたらす薬剤である。
【００６５】
本発明の更に別の好ましい別の態様は、上記方法を含む、例えば、乾癬性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、例えば関節リウマチのようなリウマチ性疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、炎症性腸疾患、炎症性疾患、ブドウ膜炎、肝炎疾患、狼瘡、肺疾患（例えば、喘息）、高ＩｇＥ症候群、抗腫瘍免疫、腎損傷、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性）、内毒素性ショック、及び自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー、又はＩＬ−１７発現Ｔ細胞に直接的に関連する任意の疾患等のマーカー遺伝子発現及び／又は脱メチル化に関する疾患、ＩＬ−１７媒介疾患及び抗ＩＬ−１７療法の副作用の改善された治療方法に関する。また、「治療」という用語はマーカー遺伝子発現及び／又は脱メチル化関連疾患の予防を包含する。
【００６６】
本発明の更に別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＩＬ−１７発現Ｔ細胞の同定、定量化及び／又はモニタリングへの本発明によるアンプリコン又は本発明によるキットの使用に関する。
【００６７】
これより、本発明をその好ましい実施形態の形で以下の実施例に更により詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。本発明の目的上、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例１に従って増幅されたテストテンプレートの結果を示す。ＴｐＧテンプレート：非メチル化テストＤＮＡ；ＣｐＧテンプレート：メチル化テストＤＮＡ；ＮＴＣ：テンプレートなし対照。
【図２】Ａ）配列番号１によるアンプリコン番号１９０９のゲノム配列を示す。ｑＰＣＲアッセイの標的領域を下線で示し、目的のＣｐＧ位置を二重下線で示す。Ｂ）ｑＰＣＲアッセイシステム（ＴｐＧ特異的）のバイサルファイト変換標的領域１を示す。プライマー及びプローブを下線で示し、目的のＣｐＧ位置を二重下線で示す。また、Ｃ）ｑＰＣＲアッセイシステム（ＴｐＧ特異的）のバイサルファイト変換代替標的領域２を示す。プライマー及びプローブを下線で示し、標的領域を太字で示す。目的のＣｐＧ位置を二重下線で示す。
【図３】脱メチル化テンプレートＤＮＡに対する実施例３による好ましいＴｐＧ特異的ＩＬ１７Ａ  ｑＰＣＲアッセイシステムの特異性を実証する。ＩＬ１７Ａ遺伝子（バイサルファイト変換、非メチル化）の標的領域を保有するプラスミドスタンダードの段階希釈の増幅プロファイルを示している。さらに、非メチル化プラスミドテンプレート（ＴｐＧ；灰色曲線）及びメチル化プラスミドテンプレート（ＣｐＧ；濃い灰色曲線）の増幅プロファイルを示している（各８６０００コピー）。ＴｐＧ特異的ＩＬ１７Ａ  ｑＰＣＲシステムは、高い特異性を伴って非メチル化テンプレートＤＮＡのみを増幅するが、メチル化テンプレートは増幅せず、このアッセイについて技術的な観点から交差反応は存在しないことが示される。
【図４】ＩＬ１７陽性Ｔ細胞の相対量の検出に関する複合サンプル（例えば、血液サンプル）（末梢血）の分析を示す。  上段の図は、本発明によるＴｐＧ（脱メチル）特異的ＩＬ１７Ａ  ｑＰＣＲシステムを説明する。プラスミドスタンダードの増幅プロファイル（５００００コピー〜８０コピー）が示されている。テンプレート濃度の対数に対して測定されるＣＰ値を表すことにより、上記プロファイルより（直線）標準曲線を得た。血液サンプルの増幅プロファイルを薄い灰色で表し、矢印で標識する。濃い灰色曲線：「テンプレートなし」の対照（ＮＴＣ）。  下段の図は、ＴｐＧ（脱メチル化）特異的ＧＡＰＤＨ  ｑＰＣＲシステムを説明する。プラスミドスタンダードの増幅プロファイル（５００００コピー〜１６コピー）が示されている。テンプレート濃度の対数に対して測定されるＣＰ値を表すことにより、上記プロファイルより（直線）標準曲線を得た。血液サンプルの増幅プロファイルを薄い灰色で描き、矢印（薄い灰色）で標識する。濃い灰色曲線：「テンプレートなし」の対照（ＮＴＣ）。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
配列番号１は、ＡＭＰ１９０９のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２及び配列番号３は、図２による標的領域のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４〜配列番号１６は、実施例で使用したプライマー及びプローブのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、ヒトＩＬ１７（Ａ）のｍＲＮＡを開示する。
配列番号１８〜配列番号２２は、実施例３で使用される特に好ましいプライマー及びプローブのヌクレオチド配列を示す。
【実施例】
【００７０】
実施例１
本発明者らは、Ｔ細胞を含む様々な血液サブセットを精製している。精製細胞に由来するＤＮＡをバイサルファイト処理し、様々なＣｐＧジヌクレオチドモチーフで分析した。次いで、本発明者らは、メチル化状態（元の配列で非メチル化されたシトシンについてのＴに対する元の（ゲノム）配列でメチル化されたシトシンについてのＣ）を比較した。
【００７１】
驚くべきことに、ＩＬ−１７のゲノム領域中の特定のエリアが、任意の他の細胞型と比較してＩＬ−１７陽性Ｔ細胞において大幅に脱メチル化されていることが見出された。
【００７２】
次いで、差次的なメチル化を見出したことにより、本発明者らは、バイサルファイトシークエンシングを用いてより大きなゲノム領域を分析した。この後者の手法は、差次的にメチル化された領域を探査し拡大するように働き、例えば、本明細書に開示されるＩＬ−１７Ａの差次的にメチル化されたゲノム領域を用いて行われた。
【００７３】
また、驚くべきことに、ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞と遺伝子、特に分析される領域（アンプリコン）における脱メチル化の厳密な関連性は、ＣＤ４陽性細胞の亜画分の外で実証され、全血サンプル又は組織サンプル（トリプシン処理されていないものであっても）のような複合的な生物学的サンプルにおいてもロバストであることが見出された。
【００７４】
実施例２
特異的ｑＰＣＲアッセイの開発
実施例１で得られた結果より、分析対象である好ましいＣｐＧ位置を含む目的のゲノム領域を同定した（アンプリコン１９０９、図２を参照）。
【００７５】
この領域では、以下の増幅プライマー及びプローブに基づいて高特異的なｑＰＣＲアッセイを開発するため、詳細な分析を行った（図２Ｂを参照）：
【００７６】
フォワードプライマー：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．２:TCTTCTATAACCTCATTAAAAACAA（配列番号4）；
リバースプライマー：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．１：GAGATGGATAAAATGTAGTGTTATT（配列番号５）；
加水分解プローブ：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＰ２．３：ACCCACTACAACACACCACATAAAT（配列番号６）。
【００７７】
テストテンプレート（図１を参照）に基づきＴｐＧ特異的ＰＣＲシステムの特異性を試験したところ、ロバスト性が高く、ＩＬ−１７陽性Ｔ細胞に対して特異的であることが見出された。
【００７８】
更に、ｑＰＣＲアッセイシステムの上記標的領域（領域１）における代替アッセイのため、プライマー変異体（代替形態）を以下の通り開発した：
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．１：TTCTTCTATAACCTCATTAAAAACA（配列番号７）及び、
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．２：ATGGATAAAATGTAGTGTTATTGT（配列番号８）。
【００７９】
標的領域（領域１）に加え、ｑＰＣＲアッセイに対する更なる代替領域（領域２）を以下のプライマー及びプローブを使用してアンプリコン番号１９０９内にて分析した（図２ｃを参照）：
【００８０】
増幅プライマー：
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．３：AACCCACTACAACACACCACA（配列番号９）；
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．４：ACCCACTACAACACACCACATA（配列番号１０）；
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．３：AATGAGGTTTTTTTAGGAGTTATT（配列番号１１）；
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．４：TGAGGTTTTTTTAGGAGTTATTG（配列番号１２）；
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．５．TGGTTTAAATTAGTAAGAGTATTGTAT（配列番号１３）；
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．６：GTTTAAATTAGTAAGAGTATTGTATGT（配列番号１４）；
【００８１】
この領域に対する加水分解プローブは以下の通りとなるであろう：
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＰ２．５：AAAAAACAATAACACTACATTTTATCCATCTCA（配列番号１５）及び、
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＰ２．６：TGAGATGGATAAAATGTAGTGTTATTGTTTTTT（配列番号１６）。
【００８２】
実施例３
最適化された特異的ＩＬ１７Ａ−ｑＰＣＲアッセイの開発
このアッセイに対する特に好ましい「完璧な」プライマーシステムを開発するため、本来のバイサルファイト処理された配列に１００％対応するものではないが、驚くほど特異性を高めた特異的なミスマッチを含むプライマーを開発した。
【００８３】
【表１】
2014530023.tif 000003
【００８４】
血液サンプル（ＷＢＬ６３）のｑＰＣＲ分析の結果を表１に要約する。それぞれＩＬ１７Ａ  ＰＣＲシステム及びＧＡＰＤＨ  ＰＣＲ（対照／正規化／標準化）システムに関する、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＬＣ４８０において測定されたプラスミドスタンダードに対するＣＰ値、及び血液サンプル（ＷＢＬ６３）に対するＣＰ値を示している。プラスミドスタンダードに基づき、測定されたＣＰ値から対応するコピー数（プラスミドコピー）を算出した。ここで、Ｃ．Ｖ．値は、３組の測定の偏差の程度を説明する。
【００８５】
以下の通り、サンプル中の脱メチル化ＩＬ１７Ａコピー数（＝１６．７）及び全コピー数（＝７９９６．６７；ＧＡＰＤＨ−ＰＣＲシステムにより測定）より、サンプル中のＩＬ１７陽性Ｔ細胞の割合を算出することができる：
％ＩＬ１７陽性Ｔ細胞＝脱メチル化ＩＬ１７Ａコピー／全コピー×１００
％ＩＬ１７陽性Ｔ細胞＝１６．７／７９９６．６７×１００＝０．２１％。
【００８６】
本アッセイは、「共通の」適合されたプライマー及び標準的なＰＣＲプロトコルを使用する脱メチル化された（及びバイサルファイト変換された）ＩＬ１７Ａ標的ＤＮＡの増幅が十分な結果を提供しないという意味で特別である。ＰＣＲにおいてより一層高濃度のＭｇＣｌ２の使用と共に、本明細書で同定される戦略的部位に変異（「ミスマッチ」）を有する増幅プライマーを使用した後のみＩＬ１７Ａ標的領域の効率的な増幅を可能とする。したがって、ＩＬ１７Ａ標的領域、すなわちＰＭ−２．４７ｎｍ、ＰＭ−２．４８ｎｍ、ＰＭ−２．５３ｎｍ、及びＰＭ−２．５４ｎｍの特に効果的な増幅を可能とする、特に好ましい４つのプライマー対を同定した。１つのプライマーの組合せ（プライマーミックスＰＭ−２．５３ｎｍ）は、増幅において特に効果的であり、ｑＰＣＲアッセイの性能の改善をもたらした。また、このプライマーの組合せを、図３及び図４に示される実験においても使用した。
【００８７】
増幅プライマーの配列及び「Ｔａｑｍａｎプローブ」は以下の通りである。
ｑＰＣＲアッセイ−オリゴヌクレオチド（５’→３’）
１．増幅プライマー 
フォワードプライマーｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．１＿Ｍ１：ATTCTTCTATAACCTCATTAAAAGCA（配列番号１８）；
フォワードプライマーｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．２＿Ｍ１：TTCTTCTATAACCTCATTAAAAGCAA（配列番号１９）；
リバースプライマーｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．１：GAGATGGATAAAATGTAGTGTTATT（配列番号２０）；
リバースプライマーｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．２ｂ：GATGGATAAAATGTAGTGTTATTG（配列番号２１）。
【００８８】
プライマー配列中のミスマッチを下線及び太字で示す。効果的な増幅のため、以下のプライマーの組合せを使用する：
ＰＭ−２．４７ｎｍ：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．１＿Ｍ１＋ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．１  
ＰＭ−２．４８ｎｍ：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．１＿Ｍ１＋ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．２ｂ  
ＰＭ−２．５３ｎｍ＊：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．２＿Ｍ１＋ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．１  
ＰＭ−２．５４ｎｍ：ｑＰＣＲ１４  ｎｍＦ２．２＿Ｍ１＋ｑＰＣＲ１４  ｎｍＲ２．２ｂ  
*は、この試験において最も良好な増幅効率を示す（特に好ましい実施の形態）。
【００８９】
２．Ｔａｑｍａｎプローブ
ｑＰＣＲ１４  ｎｍＰ５：CCACTACAACACACCACATAAAT（配列番号２２）
変更された反応条件（上記参照）として、好ましくは最大で６．４ｍＭのＭｇＣｌ２、すなわち５ｍＭを超えるＭｇＣｌ２を上記アッセイに使用することができた。
【００９０】
実施例４
フローサイトメトリー及びバイサルファイト変換アッセイにより測定されたＩＬ１７Ａ陽性細胞の割合
本発明者らは、ＰＭＡ及びイオノマイシンによる刺激及び非刺激末梢血サンプルにおいてバイサルファイト変換を分析し、ＩＬ１７Ａ遺伝子の脱メチル化をモニタリングした。結果を、ＩＬ１７Ａ陽性細胞を検出するフローサイトメトリー分析と比較した（表２）。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
表２は、刺激及び非刺激抹消血のＩＬ１７Ａのフローサイトメトリー及び脱メチル化分析の結果を要約する。
【００９３】
結果より、フローサイトメトリーにより試験した際には実質的にはＩＬ１７Ａ陰性であった健常ドナーの末梢血液サンプル中において、およそ１％〜２％のＩＬ１７Ａ脱メチル化が示される。さらに、ＰＭＡ／イオノマイシンによる末梢血の刺激後、本発明者らは、なおもおよそ１％〜２％のＩＬ１７Ａの脱メチル化を測定するが、ＩＬ１７Ａタンパク質レベルは約１％〜２％の値まで跳ね上がる。
【００９４】
驚くべきことに、この新規なアッセイは、サンプル中のＩＬ１７Ａ脱メチル化細胞の割合（％）、すなわち、刺激処理過程から独立したＴｈ１７細胞プールに類似すると考えられる集団を検出し、フローサイトメトリーが刺激（すなわち、ＩＬ１７産生）Ｔｈ１７細胞のみを検出するのに対して、この新規な技術は、エピジェネティックスケールで刺激及び非刺激の両方のＴｈ１７細胞を定量化する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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