(57)【要約】  本発明は、予めデザインされた標的細胞の細胞内コンパートメントへ、活性物質、診断用物質又は研究用物質を送達するためのモジュラー輸送プラットフォーム(MTP)に関する。本MTPは、モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞型への透過、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性、予め選択された細胞内コンパートメントへ指向された細胞内輸送、及び細胞内コンパートメントへの輸送されるべき物質の送達：の1つ以上を達成するために、一つの分子内に機能性モジュールを含む。本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールを含む：(1)標的細胞の表面上の特異的受容体を標的化する、リガンドモジュール；(2)標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール；(4)標的細胞の細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするための、細胞内保持のためのモジュール；(5)細胞内認識のためのモジュール；(6)MTPにより輸送されるべき物質；及び、(7)該モジュールを一体化し、且つ該モジュールを輸送されるべき物質とカップリングさせるための、担体モジュール。【選択図】なし
2014533236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞へ透過し、モジュラー輸送するプラットフォームを標的細胞へ送達し、pH-依存性膜破壊活性、標的細胞の標的細胞内コンパートメントへ指向された細胞内輸送、及びモジュラー輸送プラットフォーム内に活性物質をカップリングする能力を提供するように特に構成された、1つの分子内にいくつかの機能性モジュールを含む、モジュラー輸送プラットフォームであって、該分子が：
モジュラー輸送プラットフォームへの環状テトラピロール部分の非共有的カップリングのためのモジュール；及び
標的細胞内コンパートメント内にモジュラー輸送プラットフォームを維持するように構成されたモジュール：を含む、前記モジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項２】
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を標的とする、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供するエンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす細胞内輸送モジュールであって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパートメントへMTPを送達するもの；
(4)特定の細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(5)MTPにより輸送されるべき物質である治療薬、診断薬又は研究用薬剤；並びに
(6)該モジュールを一体化し、且つ該モジュールを輸送される物質とカップリングするための担体モジュール：
の1以上を更に含む、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項３】
前記非共有的カップリングのためのモジュールが、疎水性ポケットを有する、請求項2記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項４】
前記疎水性ポケットを伴うモジュールが、大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPである、請求項2記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項５】
前記輸送されるべき物質が、前記疎水性ポケットを介して、モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされる、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項６】
前記輸送されるべき物質が、該物質の前記疎水性ポケットへの挿入を介して、モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされる、請求項5記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項７】
前記輸送されるべき物質が、疎水性ポケットへ挿入されるべきテトラピロール分子へのカップリングを介して、モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされる、請求項6記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項８】
前記輸送されるべき物質が、放射性核種である、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項９】
前記MTPが、分子全体として細菌により合成される、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１０】
前記MTPが、いくつかの分離された成分として細菌により合成され、その後これらの成分が統合されMTPを形成する、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１１】
前記分離された成分が、インテインにより組み合わされる、請求項10記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１２】
前記モジュラー輸送プラットフォームの成分の一つが、請求項9記載の不完全なモジュラー輸送プラットフォームであり、且つ第二成分が、該モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を達成する、請求項11記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１３】
前記モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を達成するリガンドモジュールが、細菌により合成される、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１４】
前記モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を達成するリガンドモジュールが、化学的に合成される、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１５】
前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールが、細胞内コンパートメント内の特異的構造(分子)と相互作用する、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１６】
前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールが、細胞核内の特異的構造(分子)と相互作用する、請求項15記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１７】
前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールが、DNAと相互作用する、請求項15記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１８】
前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールが、透明質内の特異的構造(分子)と相互作用する、請求項15記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項１９】
前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールが、プロテアソームと相互作用する、請求項15記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項２０】
前記輸送されるべき作用物質が、モジュラー輸送プラットフォームへ共有的に結合されている、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項２１】
前記輸送されるべき作用物質が、放射性核種である、請求項20記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項２２】
前記輸送されるべき作用物質が、光増感剤である、請求項20記載のモジュラー輸送プラットフォーム。
【請求項２３】
前記MTPが、前記モジュラー輸送プラットフォームの選択された標的細胞への透過、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性、標的細胞内の選択された細胞部位への指向された細胞内輸送、及び輸送されるべき作用物質の付加を達成し、ここで：
該分子が、環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールを有し；並びに
該分子が、選択された細胞内部位内の該モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールを有する、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォームを分子全体としてコードしているプラスミド。
【請求項２４】
輸送されるべき物質として治療薬、診断薬又は研究用薬剤をモジュラー輸送プラットフォームにより送達する方法であって、該モジュラー輸送プラットフォームが：
該モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過；
該モジュラー輸送プラットフォームを放出するための標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性；
標的化された細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送；
環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールへの輸送されるべき物質の付加：を達成する1つの分子内の機能性モジュール；並びに
標的細胞の細胞内コンパートメント内の該モジュラー輸送プラットフォームの保持の機能を伴うモジュール：
を含み、該モジュラー輸送プラットフォームに結合された輸送されるべき物質を伴うモジュラー輸送プラットフォームの全身注入を含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォームを作製する技術。
【請求項２６】
凍結乾燥後に機能性モジュラー輸送プラットフォームを得るために緩衝液を使用することを含む、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォームの乾燥、貯蔵及び再構成の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許出願第13/371,377号、2011年5月23日に出願された米国特許仮出願第61/489,181号、及び2011年8月30日に出願された米国特許仮出願第61/528,971号の優先権を主張するものであり、これらの両出願の内容はそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
(技術分野)
本発明の分野は概して、治療薬の送達を制御するための複数のモジュールを伴うモジュラー輸送プラットフォームを使用することによる、病態を治療するための治療薬の標的化された送達に関する。本発明の分野はまた、病態を診断するための又は研究目的の個別の薬剤の標的化された送達に関する。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
癌及び他のいくつかの状態の治療における大きな問題点は、病的異常細胞に対する（他の健常細胞に対してでなく）薬物の特異的標的化の有効性が貧弱であるか又はごくわずかであるということである。理想を言えば、そのような薬物は、健常細胞への損傷を最小化するために、短い距離にわたり作用しかつ該薬物に対して最も高い感受性を有する細胞内コンパートメントを標的とすべきである。多くの医薬品は、細胞表面受容体へ結合し、且つ受容体が誘導したプロセスによりそれらの作用を明らかにする。しかし、医薬品は、それらの作用の重要な部位である細胞の細胞内コンパートメント内部に直接局在化しないことが多く、このことは薬物の最も強力な作用は実現されないことがあることを意味する。
【０００４】
開発中の細胞内コンパートメントを標的化する一つの方法は、細胞の核の標的化を試みている。例えば、Dinara G. Gilyazovaらの文献、[「新規操作されたモジュラー輸送体による癌細胞の標的化(Targeting Cancer Cells by Novel Engineered Modular Transporters)」, Cancer Res. 2006； 66:(21): 10534-10540]は、ErbB1受容体を過剰発現している癌細胞の（光増感剤の作用が最も顕著である）核へと、光増感剤を標的化するモジュラー組換え輸送体を記載している。この記載された輸送体は、(a)ErbB1受容体へインターナリゼーション可能なリガンドモジュールとしての上皮細胞増殖因子、(b)SV40ラージT-抗原の最適化された核局在化配列、(c)エンドソーム分解性モジュールとしてのジフテリア毒素転座ドメイン、及び(d)担体モジュールとしての大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMP：からなる。
【０００５】
米国特許第6,500,800号[Sobolevら]は、標的細胞に光力学的損傷を引き起こす組成物を開示している。この組成物は、光増感剤、光増感剤担体成分、標的細胞の認識及び特異的受容体-媒介性エンドサイトーシスにより標的細胞内部への光増感剤の輸送を可能にする成分、並びに標的細胞内で光増感剤の効果的な標的化輸送を可能にする成分を含有する。この組成物を使用し、下記の工程に従い、標的細胞の光力学的損傷を引き起こす：該組成物を細胞へ添加する工程；標的細胞への光力学的損傷を引き起こすための、上記成分を含む該組成物と一緒に、該細胞を、正常細胞の生存活性温度で維持する工程；並びに、該細胞を光に曝露する工程。
【０００６】
Deonarainらの米国特許第7,655,753号は、それに合成的に結合された複数の治療的又は診断的部分を有する、少なくとも1本のα-ヘリックスを含むポリペプチドに関する。これらの治療的又は診断的部分は、同じであるか又は異なっていてよく、且つこれらの部分間の相互作用を最小化するように、該ポリペプチド上に空間的に配向されている。米国特許第7,655,753号の更なる態様は、該ポリペプチド；該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列；該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び、該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞：を含む医薬組成物に関する。米国特許第7,655,753号はまた、該ポリペプチドの治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、治療方法を提供している。
【０００７】
米国特許第7,655,753号は、複数の治療的又は診断的部分が結合したα-ヘリックスポリペプチドを含むシステムを開示していると思われる。このポリペプチドは、マルチ-ヘリックスバンドルの形状で、2本以上のα-ヘリックスポリペプチドを含むことができる。米国特許第7,655,753号のα-ヘリックスポリペプチドは、本明細書に開示されたMTPとは多くの点で異なる。例えば米国特許第7,655,753号の構築体は、いくつかの異なるα-ヘリックスポリペプチドの集成を非共有的に必要とするようである。対照的に本明細書に開示されたMTPは、単独のポリペプチドである。更に米国特許第7,655,753号は、ROPタンパク質の変異体型、すなわちα-ヘリックスの少なくとも1つは作用素因(acting principle)の連結のために使用されている4つのα-ヘリックスを持つ変種のみを考慮していると思われる。
【０００８】
米国特許第7,655,753号はまた、リンカー部分を介して直接的又は間接的に連結される標的化タンパク質及びポリペプチドを開示しているようである。リンカー部分は、間接的連結により、標的化タンパク質を融合タンパク質に結合させる。直接的連結は、ヒドロキシ基、カルボキシ基又はアミノ基などの、1つのタンパク質上のいずれか都合の良い官能基により起こり得る。間接的連結は、連結部分を介して起こるであろう。リンカー部分上の官能基を使用し、α-ヘリックスと標的化タンパク質の間の共有結合を形成する。
【０００９】
米国特許第7,655,753号の第9欄の第56〜67行には、「リンカー部分は、二官能性及び多官能性アルキル、アリール、アラルキル又はペプチド性部分、アルキル、アリール又はアラルキルアルデヒドの酸エステル及び無水物、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体などのスルフヒドリル又はカルボキシル基を介して化学反応に使用されるか、或いは、臭化シアヌル又は塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導体化され得る。α-ヘリックスと標的化エレメントの間の共有結合の形成に使用されるリンカー部分上の官能基は、例えば、アミノ基、ヒドラジノ基、ヒドロキシル基、チオール基、マレイミド基、カルボニル基、及びカルボキシル基などの2種以上であってよい。このリンカー部分は、1〜4個のアミノ酸残基の短い配列を含むことができる。」ことが記載されている。そのようなリンカー部分は、モジュールと本発明のMTP残余の間のスペーサーの本発明における使用とは異なる。本発明の一態様において、スペーサー(例えば、可動性アミノ酸挿入断片)は、受容体へのより高いMTP親和性を実現するために使用される。
【００１０】
米国特許第7,655,753号のポリペプチドは更に、細胞内標的化ペプチド及び膜活性化ペプチドを含む。細胞内標的化ペプチドは、該ポリペプチドの標的化エレメント又はα-ヘリックスのいずれか、又は両方に結合することができる。細胞内標的化ペプチドの例は、核局在化配列(NLS)を含む。追加の配列はまた、インターナリゼーション後、融合タンパク質を含むエンドソームコンパートメントを破壊するよう機能する、膜活性化ペプチドであることもできる。これは、そこで治療薬が強力な作用を有することができる細胞の細胞質ゾルへの、治療薬の放出を促進するであろう。しかし米国特許第7,655,753号は、エンドソームコンパートメントの破壊における該ペプチドの作用のpH依存性は明らかにしていない。
【００１１】
本明細書に記載のように、本発明のMTPは、特別な条件下でのみ、すなわちわずかに酸性の環境においてのみ、膜を活性化する特別なモジュールを含み得る。例えばこのモジュールの活性は、pH5.5で最大活性を有することができる。このモジュールのこの作用は、以下に説明しているように、実験により証明され、且つこれらの条件下で、本出願のMTPにより脂質二重層において細孔形成をもたらすことが示されている。更に、細孔形成に加え、pH3〜pH6でのエンドソーム／リソソーム活性は、2つのMTPモジュール、すなわちエンドソーム分解性モジュールと担体モジュールの組合せ作用の結果であることは理解されるべきである。
【００１２】
一態様において、本明細書記載の発明は、後続のエンドソームからのMTP放出のために、酸性pHで脂質膜中に細孔を形成するために、担体モジュール、HMP、及びエンドソーム分解性モジュールの組合せ作用を必要としている。同じく本MTPは、特異的細胞内標的化のためのみではなく、標的細胞の特異的細胞内コンパートメント(すなわち、癌細胞の核)内の保持のためにも、特別なモジュールを含むことができることも追加されなければならない。
【００１３】
米国特許第7,655,753号は、ポリペプチドに直接、又はリンカー基により結合されている治療薬又は診断薬も開示している。本明細書に記載のMTPの特徴の一つは、担体モジュールの疎水性ポケットへと非共有的に輸送されるべき薬剤を含むその能力である。以下に記載のように、これは、(i)直接的に、その後ポケットへ挿入され得るポルフィリン部分へ、又は(ii)間接的に、すなわちその後ポケットへ挿入され得るポルフィリン誘導体へ連結されるか：のいずれかで行うことができる。
【００１４】
別の関連特許は、活性物質の方法に対し、細胞-特異的、コンパートメント-特異的又は膜-特異的に媒介するためのコンジュゲートに関するBraunらの米国特許第6,821,948号である。このコンジュゲートは、細胞膜への輸送メディエーター、細胞-特異的、コンパートメント-特異的又は膜-特異的に対処する(address)タンパク質又はペプチド、並びに輸送されるべき活性物質：を含む。本明細書記載の発明とは対照的に、米国特許第6,821,948号は、薬物の保持機能又は非共有結合を伴うモジュールを開示していない。
【００１５】
Gariepyの米国特許第5,674,977号は、標的細胞表面受容体に結合し、標的細胞へ透過し、且つ所望の作用部位へ診断用プローブ若しくは細胞毒性機能を送達するようにデザインすることができる、分岐型合成ペプチドコンジュゲートに関する。この発明は、所望の数の細胞毒性機能、ペプチド-ベースの局在化シグナル又は診断用プローブの体系的組入れのために分岐型構造を有する可動性デザインの比較的小型の分子を提供している。Gariepyは、タンパク質-ベースの治療薬又は診断薬に関連した問題に対処するものとして自身の発明を説明している。本発明のMTPとは対照的に、Gariepyのシステムは、pH-依存性エンドソーム分解機能；保持機能を持つモジュール；又は、薬物の非共有結合：を有さない。
【００１６】
Welsらの米国特許第6,498,233号は、例えば遺伝子などの核酸の特異的細胞への標的化及び該核酸の発現を得ることに適した、毒素、特にジフテリア毒素の転座ドメインを含む、核酸転移システムに関する。この核酸転移システムは、マルチドメインタンパク質成分及び核酸成分を含む。Welsはまた、マルチドメインタンパク質、このタンパク質をコードしている核酸、該核酸に適した増幅及び発現システム、並びにそれらの調製方法及び使用方法にも関する。本明細書記載の発明とは対照的に、Welsは、コンパートメント-特異的機能、保持機能、又は核酸の輸送機能を開示していない。本明細書記載の本発明の一態様において、本出願のMTPは、切断型ジフテリア毒素転座ドメインを示しているエンドソーム分解性モジュールを有することができる。この切断型(アミノ酸202-384)は、186位及び201位のシステインに加え、切断可能なアミノ酸ループを内包する、194位のアミノ酸に続く切断可能なプロテアーゼ部位を破棄するために行われた。
【００１７】
Murphyの米国特許第5,965,406号は、第一の部位、第二の部位、及び第三の部位を含むハイブリッドタンパク質をコードしている組換えDNA分子に関する。第一の部位は、該ハイブリッドタンパク質の動物細胞への結合を引き起こすのに有効な、細胞結合性ポリペプチドリガンドの結合ドメインの一部を含む。第二の部位は、ジフテリア毒素、ボツリヌス神経毒素、リシン、コレラ毒素、LT毒素、C3毒素、赤痢菌毒素、赤痢菌様毒素、百日咳毒素及び破傷風毒素からなる群から選択される、天然のタンパク質の転座ドメインの一部を含み、これは細胞膜を超え細胞の細胞質ゾルへと該第三の部位を移行させる。第三の部位は、該細胞へ導入されるべきポリペプチド実体を含む。第三の部位は、第二の部位の天然のタンパク質に対して非天然である。
【００１８】
本明細書記載のMTPとは対照的に、米国特許第5,965,406号は、コンパートメント-特異的機能、保持機能、又は薬物の非共有結合を開示していない。更に本明細書に記載のMTPは一般に、標的化された核内送達に必要な少なくとも4つのモジュールを有し、且つ特定の転座ドメイン又は毒素群由来のドメインのみには制限されないであろう。加えて上記のように、本出願のMTPは、切断型ジフテリア毒素転座ドメインを表している、エンドソーム分解性モジュールを有し得る。
【００１９】
Murphyの米国特許第6,022,950号もまた、共有結合により結合されている第一の部位、第二の部位、及び第三の部位を含むハイブリッド分子を開示している。第一の部位は、該ハイブリッドタンパク質の動物細胞への結合を引き起こすのに有効な、細胞結合性ポリペプチドリガンドの結合ドメインの一部を含む。第二の部位は、天然のタンパク質の転座ドメインの一部を含み、これは細胞膜を超え細胞の細胞質ゾルへと該第三の部位を移行させる。第三の部位は、該細胞へ導入されるべき化学物質を含む。第一の部位と第三の部位は、該天然のタンパク質に対して非天然であり、且つ更に第二の部位と第三の部位を結合する共有結合は、切断可能な結合である。第二の部位が、シュードモナス外毒素転座ドメインの一部を含む場合、第三の部位はポリペプチドではない。この説明は、MSHは、メラニン細胞に選択的に結合することができ、ハイブリッドとなり、一旦検出可能なラベルにより標識されると、これはメラノーマの診断並びに転移性メラノーマ遺伝子座のインビボ及びインビトロ検出に有用であることを注記している。そのようなハイブリッドは、検出可能なラベルの代わりに毒素分子の酵素活性のある部位に結合した場合、標的メラノーマ細胞へ特異的にその毒性活性を送達するために利用することができる。
【００２０】
本明細書に記載のMTPとは対照的に、米国特許第6,022,950号は、保持機能、薬物の非共有結合又は細胞膜を超えた細胞の細胞質ゾルへの転座のための任意のモジュール／機能を開示していない。
【発明の概要】
【００２１】
(概要)
本発明の重要な態様は、1つの分子内にいくつかの機能性モジュールを含み、且つ標的細胞へ透過し、モジュラー輸送プラットフォームを標的細胞へ送達し、pH-依存性膜破壊活性、標的細胞の標的細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送、及びモジュラー輸送プラットフォーム内の活性物質にカップリングする能力を提供するように構成された、モジュラー輸送プラットフォームである。本分子は、モジュラー輸送プラットフォームへの環状テトラピロール部分の非共有的カップリングのためのモジュール；及び、標的細胞内コンパートメント内にモジュラー輸送プラットフォームを維持するように構成されたモジュール：を含む。
【００２２】
本モジュラー輸送プラットフォームの実施態様は、下記の特徴の1以上を含んでよい。例えば、本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールの1以上を含んでよい：
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を標的化するための、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュールであって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパートメントへMTPを送達するもの；
(4)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(5)前述のモジュールを一体化し、且つモジュールを輸送される物質とカップリングさせるための、担体モジュール；並びに
(6)MTPにより輸送されるべき物質としての、治療薬、診断薬又は研究用薬剤。
【００２３】
本MTPは、環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールを含んでよい。この非共有的カップリングのためのモジュールは、疎水性ポケットを有してよい。この疎水性ポケットを伴うモジュールは、大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPである。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットを介してモジュラー輸送プラットフォームへカップリングされてよい。輸送されるべき物質は、物質の疎水性ポケットへの挿入を介してモジュラー輸送プラットフォームへカップリングされてよい。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットへ非共有的に挿入されるテトラピロール分子への連結を介して、モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされてよい。これらのテトラピロール分子は、薬物の非共有結合に使用することができる。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットへ挿入されたテトラピロール分子へのカップリングを介して、モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされてよい。
【００２４】
前記輸送されるべき物質は、放射性核種である。
本MTPは、分子全体として細菌により合成されてよい。
本モジュラー輸送プラットフォームは、1又は複数のモジュールの追加のためのドメインを含み、該ドメインは、キチン-結合ドメイン(CBD)を伴う又は伴わないインテインを含んでよい。
【００２５】
本モジュラー輸送プラットフォームは、いくつかの分離された成分として細菌により合成され、その後これらの成分が統合され、MTPを形成してよい。この分離された成分は、インテインにより組み合わされてよい。リガンドモジュールは、これらの成分の一つとして使用することができる。
【００２６】
モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過をもたらすリガンドモジュールは、細菌により合成されてよい。モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を実現するリガンドモジュールは、化学的に合成されてよい。
【００２７】
標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、細胞内コンパートメント内の特異的構造又は分子と相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、細胞核内の特異的構造又は分子と相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、DNAと相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、透明質内の特異的構造又は分子と相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、プロテアソームと相互作用してよい。
【００２８】
輸送されるべき作用物質は、モジュラー輸送プラットフォームへ共有的に結合されてよい。この輸送されるべき作用物質は、放射性核種又は光増感剤である。
【００２９】
本発明の更なる態様は、モジュラー輸送プラットフォーム全体が、単独のマルチモジュラー融合タンパク質としてプラスミドによりコードされ得ることであり、ここで該モジュラー輸送プラットフォームは、該モジュラー輸送プラットフォームの選択された標的細胞への透過、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性、標的細胞内の選択された細胞部位への指向された細胞内輸送、及び輸送されるべき作用物質の追加をもたらす。この分子は、環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュール、及び選択された細胞内部位内の該モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールを有する。本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールを含む：
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を標的化するための、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュールであって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパートメントへMTPを送達するもの；
(4)標的細胞の細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするための、細胞内保持のためのモジュール；
(5)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(6)MTPにより輸送されるべき物質としての、治療薬、診断薬又は研究用薬剤；並びに
(7)前述のモジュールを一体化し、且つモジュールを輸送される物質とカップリングさせるための、担体モジュール。
【００３０】
本モジュラー輸送プラットフォームをコードしているプラスミドの実施態様は、下記の特徴又は先に説明された特徴の1以上を含んでよい。
【００３１】
別の一般的態様において、輸送されるべき治療薬、診断薬又は研究用薬剤をモジュラー輸送プラットフォームに送達する方法が提供される。本モジュラー輸送プラットフォームは：
該モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過；
該モジュラー輸送プラットフォームを放出するための標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性；
標的化された細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送；
環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールへの輸送されるべき物質の追加：を達成する1つの分子内の機能性モジュール；並びに
標的細胞の細胞内コンパートメント内の該モジュラー輸送プラットフォームの保持の機能を伴うモジュール：を含む。本方法は、モジュラー輸送プラットフォームに結合された輸送されるべき物質を伴うモジュラー輸送プラットフォームの全身注入を含む。
【００３２】
別の一般的態様において、前述のMTPなどの、モジュラー輸送プラットフォームを乾燥、貯蔵及び再構成する方法が提供される。本方法は、凍結乾燥後に機能性モジュラー輸送プラットフォームを得るために緩衝液を使用することを含む。
【００３３】
本発明の様々な実施態様の詳細は、添付図面及び下記の説明により示される。本発明の他の特徴及び利点は、説明、図面及び請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
(図面の説明)
【図１】図1は、MTP翻訳後処置の、そのリガンドモジュールの細胞受容体への親和性に対する効果を示すグラフである。
【図２】図2A及び2Bは、インテイン及びCBD(キチン-結合ドメイン)-コード領域を有するMTP-コードしているプラスミドの構築、キチン上のアフィニティクロマトグラフィーによる“ブランク”MTPの精製(工程1、キチンとの結合、及び工程2、スルフヒドリル-含有化合物による“ブランク”又はリガンド非結合のMTPの放出)、並びにリガンド非結合MTPのポリペプチドリガンドへのリガンド負荷工程(N-末端システインを伴うリガンドの“ブランク”MTPへの特異的共有結合)を例示する概略図である。
【図３】図3は、アポプチン(apoptin)断片を含むMTP、DTox-HMP-apo-EGF、及びそれを欠くMTP、DTox-HMP-NLS-EGFのゲル-シフトアッセイである。DS-DNA(190bp)は、20mM HEPES緩衝液(pH7.4)、10mM NaCl、1mM EDTA中で、MTPと共に、室温で30分間インキュベーションし；ゲル-シフトアッセイは、2％アガロースゲルにおいて、臭化エチジウム染色により実行した。
【図４】図4は、下記表に示した結合親和定数で、表面プラズモン共鳴法を用いアッセイした場合の、プラスミドDNAの、DTox-HMP-apo-EGF(左側グラフ)及びDTox-HMP-NLS-EGF(右側グラフ)との相互作用を示すグラフである。
【図５】図5は、異なるpH条件でのMTPの溶解度を示すグラフである。
【図６】図6は、EGF-含有MTPをコードしているプラスミドの集成プロセスを示す図である。
【図７】図7A-Cは、MTPへのCo-塩素複合体の塩素誘導体アジドポリエチレングリコール誘導体(図7A)の挿入を図示し、図7Bは、異なるMRT濃度での複合体のソーレー帯からの非線形回帰によりMTP-Co-Chl-PEG-N3スペクトルから算出したMTP濃度に対する、誘導体Co-Chl-PEG-N3画分の吸収スペクトル(ソーレー帯中の溶液の光学密度−0.24)を例示している。図7Cは、MTPに対するCo-Ch1-PEG-N3の結合のMTP濃度依存性を例示している。
【図８】図8は、血漿中のMTP-ポルフィリン複合体の安定性を示す。
【図９】図9は、B16-F1メラノーマ-有するC57Black/6Jマウスにおける、125I-標識されたDTox-HMP-NLS-αMSHの静脈内注射後の、125Iの腫瘍-対-組織比を示すグラフの対であり、Aは、注射後の時間依存性(11μg MTP)を示し、且つBは、投与量依存性(注射後3時間)を示す。
【図１０】図10は、マウスにおける、DTox-HMP-NLS-αMSH及びDTox-HMP-NLS-EGF MTPの静脈内注射の3時間後の、腫瘍及び隣接組織のインビボにおける免疫蛍光／顕微鏡イメージングによる局在化の結果を示す一連のパネルである。
【図１１】図11は、DTox-HMP-NLS-αMSH MTPにコンジュゲートされたバクテリオクロリンp及び遊離バクテリオクロリンpによる光力学療法の有効性比較を報告している。
【図１２】図12は、遊離塩素e6と比較した、A431ヒト類表皮癌成長を阻害し、且つ担腫瘍Balb/c ByJIco-nu/nuマウスの生存を増強するための、DTox-HMP-NLS-EGF MTPにコンジュゲートされた塩素e6を使用する光力学療法の結果を報告している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
(詳細な説明)
過去の研究が、標的細胞上の特異的インターナリゼーション可能な受容体へ治療薬を送達することができ、受容体-媒介性エンドサイトーシスを介して細胞へインターナリゼーションされることができ、エンドソームから逃れることができ、且つ細胞内の特異的細胞小器官又は細胞内コンパートメントへ標的化することができる輸送体を作製することは可能であることを示している。しかし、どのようにして治療薬を簡単に且つ効率的に該輸送体へカップリングするか、及びどのようにして治療薬が標的化された細胞小器官内に保持されることを確実にするかという問題点が依然存在する。本発明者らは、本発明が、これらの両方の要求を効率的且つ効果的に達成する最初のものであると考える。具体的には、本発明者らは、特異的細胞への、すなわち標的細胞への、及び任意に細胞内の特異的細胞小器官への、治療薬の送達に広範に適用される新規プラットフォームである、モジュラー輸送プラットフォーム(MTP)を開発した。概して本MTPは、一緒にMTPを標的化された細胞の特定のコンパートメントへ標的化し、且つ治療薬をそれらのコンパートメントに到達させる、いくつかの機能性モジュールからなる。本MTPは、下記のモジュール又は成分の1つ以上を含む：(1)細胞の表面上の特異的受容体を標的化し、これにより標的細胞の特異的認識を提供する、リガンドモジュール；(2)該細胞内のMTPを放出するために、エンドサイトーシス小胞を破壊する、エンドソーム分解性モジュール；(3)細胞輸送機構に頼り、特定の細胞内コンパートメントへのMTPの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール；(4)標的細胞の特異的細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするが、非-標的細胞においてではそうではない、細胞内保持のためのモジュール；(5)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；(6)前述のモジュールを一体化し、且つ該モジュールを輸送される物質とカップリングさせると同時に、他のMTPモジュールの最適な空間分布を提供するための、担体モジュール；並びに、(7)治療薬、診断薬又は研究用薬剤。
【００３６】
例えば、送達されるべき治療薬が、非常に強力であるか又は毒性がある場合、該強力な／毒性のある治療薬は、望ましい標的細胞上でのみ発現される受容体を標的化すること、これにより他の標的化されない細胞に対する副次的損傷を回避することにより、主に又はもっぱら標的細胞へ送達されるので、本MTPアプローチは、患者にとって非常に有益である。同様に、標的細胞が、他の細胞においてはわずかにのみ発現される特定の受容体を過剰発現する場合、MTPのそれらの受容体への送達は、治療薬を主に標的細胞へ送達し、特定の受容体を有する他の標的化されない細胞に対しては最小の副次的損傷を伴うであろう。その結果理解することができるように、MTPアプローチが機能する特異性は、MTPが親和性を持つ受容体が標的細胞上で過剰に発現される場合に、大きく増強されるであろう。
【００３７】
本MTPは、抗体、ナノ粒子、リポソームなどの既知の薬物送達ビヒクルからMTPをはっきり区別する独自の特性を有する。下記のリストは本MTPのいくつかの特性を提供し、その1つ以上が本発明のMTPに存在し得る：1)MTPへ共有的又は非共有的のいずれかで連結されることができる広範なスペクトルの物質の送達；2)低い毒性(マウスにおいて示された)；3)低い免疫原性(マウスにおける遅延型過敏テストによる)；4)医薬品のインビトロ有効性の、有意な、20〜3,000倍以上の増強；5)インビボにおける(マウスにおいて示された)医薬品の治療有効性の有意な増強；6)高レベルのMTPの細菌による産出(総可溶性タンパク質の30％まで)；7)簡単な精製；8)標的細胞型を変更する必要がある場合の、MTPモジュールの取り換えの可能性；9)生分解性；10)安価な製造；11)MTPを凍結乾燥し、これを室温で維持し、且つ活性を失うことなくこれを再構成する可能性；並びに、12)長い貯蔵寿命。
【００３８】
本MTPはまた、2種以上のポリペプチドよりもむしろ、単独のポリペプチドで製造されるという特徴を含む。このことは、2種以上のポリペプチドを含む製品に対し下記の利点を提供する。第一に、共有結合は、非共有結合よりもより安定しているので[例えば、J.M. Goddard、J.H. Hotchkissの文献、「生体活性化合物の結合のためのポリマー表面修飾(Polymer surface modification for the attachment of bioactive compounds)、Prog. Polym. Sci. 2007, 32: 698-725参照]、MTPは、2種以上のポリペプチドを含む非共有的複合体よりも、より広範な条件下で安定しているはずである。第二に、MTPは一工程で合成されるので、その製造は常に、2種以上のポリペプチドを含有する複合体の製造よりも、2倍以上単純である。しかし別の実施において、本MTPは、複数のポリペプチドで製造され得ることは理解されなければならない。
【００３９】
概して、本MTPが治療薬、診断薬又は研究用薬剤の標的化された細胞内送達を提供することができることを確実にするために、本MTPは少なくとも4つのモジュールを有するであろう。
【００４０】
本明細書において使用されるモジュラー輸送プラットフォーム(MTP)は、医薬品及び他の物質(以後「物質」)の標的細胞への送達、及び一旦標的細胞内へ送達されたら−予め決定された／所定の細胞内コンパートメントへの送達に関してマルチレベルの特異性を伴うモジュラー組成物である。本MTPは、分子内“認識”プロセスに加え、受容体-媒介性エンドサイトーシス、核細胞質間輸送、及び他のもの、例えばミトコンドリア、ゴルジ装置、ペルオキシソームなどへの輸送などの、細胞内輸送プロセスを活用する。
【００４１】
本明細書に存在し得るデータベース、ウェブページ、記事、書籍などに関する何らかの言及は、本発明に関連した様々な態様に関する裏付けを提供するために使用される。本参照の全内容又は関連のある特定の節は、単に紙面のために、本出願内に文章としては明確に含まれないので、本発明者らは、これらの文書、データベース及びウェブページからの関連のある一節を引用による組込みに頼る。従って本発明者らはこれにより、本明細書に言及された全てのデータベース、ウェブページ、記事、書籍などは、それらが言及した開示についての引用により、それらの全体が本出願中に組み込まれていることを明らかにする。
【００４２】
概して、MTPをデザインするプロセスは、下記工程に従う：
(1.  標的化されるべき病変の選択)
MTPのデザインは、どの治療が、標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの治療用物質の標的化された送達から恩恵を受けるかを決定することを基礎としている。例えば、治療が標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの標的化された送達において恩恵を示さない場合、本MTPは、より複雑でない送達システムと比べ、ほとんど利点を供しない。本MTPは、標的細胞上に過剰発現された受容体が、該標的細胞に対し特異的である場合に有利であろう。従って本MTPは、頭頚部癌、食道癌、膠芽細胞腫、膀胱癌などの、腫瘍学的適用において使用することができる(受容体のより完全な列記に関しては、下記の「遺伝子が腫瘍形成に関連する変異を含む表面細胞受容体のリスト」を参照されたい)。本MTPはまた、いくつかの可能性のある医学的適用を挙げると、例えばアテローム動脈硬化性プラークのアブレーションなどの、心臓病；ウイルス性疾患(例えば、宿主細胞の排泄、例えばHIV治療のためのビリオン合成の阻害など)；婦人科(例えば、子宮内膜症)に適用することができる。当業者は、特定の細胞に関与する状態の文献の報告を基に、どの状態がMTPの適用による治療に適しているかを決定することができる。検索に適したデータベースは、www.medscape.com、www.pubmed.gov、及び当業者に公知の他の検索可能な医学データベースを含む。例えば、標的とする状態が狼瘡である場合、研究者は、www.pubmed.govにアクセスし、且つ「狼瘡の標的細胞」などの用語を用い、Medlineデータベースを検索することができる。研究者は、scholar.google.comなどの公知の検索エンジンを用い、インターネットを検索することもできる。これらの検索の結果により、研究者は、狼瘡に相関していることがわかっている細胞を報告している雑誌記事を読むことができる。
【００４３】
別の実施態様において、本MTPは、メラノコルチン受容体-1(例えばメラノーマ)、ソマトスタチン受容体(例えば髄芽腫)、IL3受容体(例えば急性骨髄性白血病)；Her2/neu及びHer3に対するインターナリゼーション可能な抗体を保有するMTP(例えば乳癌)：などの、受容体に特異的なリガンドモジュールを含むことができる。従って、これらの病変は標的化され得るインターナリゼーション可能な受容体を有するので、これらの病変は、本明細書に記載のMTPシステムを用い治療することができる。先に列記した受容体は、網羅的且つインターナリゼーション可能な受容体ではなく、且つ概してMTPによる標的化に適しているものであることは理解されるべきである。
【００４４】
(2.  インターナリゼーション可能な受容体の同定)
本プロセスの第二の工程は、受容体-媒介性エンドサイトーシスを受け得るインターナリゼーション可能な受容体の選択に関与する。以下により詳細に説明するように、本MTPは、効果がある細胞内においてインターナリゼーションされなければならない。MTPのインターナリゼーションは、MTPのインターナリゼーション可能な受容体への結合により達成される。一旦インターナリゼーション可能な受容体へ結合されると、MTPを含むエンドソームが形成され、これは受容体-媒介性エンドサイトーシスを介して該細胞の内側にMTPを運搬する。特定の受容体は、インターナリゼーションされるか又は封鎖されるが、他のものはされない。当業者は、文献検索を行うことにより、どの受容体がインターナリゼーションされ、且つどの受容体がされないかを区別することができる。例えば、当業者が狼瘡治療のための標的細胞を見つけようとする場合、研究者は、これらの細胞に関連した受容体について、及びどの細胞がインターナリゼーションされるかについて、同様に文献検索を実行するであろう。このことを理解し、インターナリゼーション可能な受容体が選択されるべきである。
【００４５】
例えば、癌及び関連する腫瘍のみを考えてみても、現在、その発現が腫瘍形成時に劇的に増加し得る多くの受容体がわかっている。下記のリストは、これらの公知の受容体の一部を提供する。
【００４６】
遺伝子が腫瘍形成に関連する変異を含む表面細胞受容体のリスト*
【表１】
2014533236.tif 000003
2014533236.tif 000004
*  Sanger(The Wellcome Trust Sanger Institute、ケンブリッジ、英国)により収集され且つ最新されたデータを基にする
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/)
**  標準の国際タンパク質識別子(Swissprot/Refseq)
【００４７】
対応するタンパク質生成物の発現の増加が、上記遺伝子の大部分について認められた：EGFR[Bacusらの文献、1990；Gillaspyらの文献、1992；Rikimaruらの文献、1992；Chingらの文献、1993；Untawaleらの文献、1993；Hoi らの文献、1995；Chenらの文献、1999；Huang及びHarariの文献、1999；Azemarらの文献、2000；Charoenratらの文献、2000；Nouriらの文献、2000；Charoenratらの文献、2001；Halatschらの文献、2001；Udartらの文献、2001；Onoらの文献、2002；Earp, IIIらの文献、2003；Ford及びGrandisの文献、2003；Jungbluthらの文献、2003；Kanematsuらの文献、2003；Ritter及びArteagaの文献、2003]、ErbB2、例えば総説[Cirisano及びKarlanの文献、1996；Kumar及びYarmand-Bagheriの文献、2001；Wangらの文献、2001]、線維芽細胞増殖因子受容体[Jacquemierらの文献、1994；McLeskeyらの文献、1994；Morrisonらの文献、1994；Giriらの文献、1999；Pollettらの文献、2002]、肝細胞増殖因子受容体/met-プロト癌遺伝子[Liuらの文献、1998；Porteらの文献、1998]、神経増殖因子受容体[Walchらの文献、1999]、トランスフェリン受容体[Hogemann-Savellanoらの文献、2003]。
【００４８】
増殖因子受容体の発現の上昇は、増大した浸潤能及び転移能を伴う疾患進行の好ましくない予想と相関することが非常に多い[Chrysogelosらの文献、1994；Itoらの文献、1997；Xuらの文献、1997；Ciardiello及びTortoraの文献、1998；Dunnらの文献、1998；Hsiehらの文献、1998；Kwong及びHungの文献、1998；Charoenratらの文献、2000；Chenらの文献、2001；Hernanらの文献、2003；Khalilらの文献、2003；Baxevanisらの文献、2004]。
【００４９】
変異が癌それ自身と因果関係がある表面タンパク質とは異なり、多くの他の表面タンパク質は、形成異常が起こる場合の生化学的プロセスにおける細胞内変化のために、正常細胞と比べ過剰発現されている腫瘍細胞上に存在する。これらは下記のものである：インスリン受容体−肝癌、乳癌[Frittittaらの文献、1997；Pandiniらの文献、1999；Finlaysonらの文献、2003；Scharf及びBraulkeの文献、2003；Alexiaらの文献、2004]、インスリン様増殖因子1−様々な癌腫及び骨肉腫、甲状腺腫瘍[Weinerの文献、1995；Xieらの文献、1999；Pandiniらの文献、1999；Yu及びRohanの文献、2000；Khandwalaらの文献、2000；Vellaらの文献、2001；Oubanらの文献、2003；Sekharamらの文献、2003；Gydeeらの文献、2004；Gharibらの文献、2004]、ソマトスタチン−神経内分泌腫瘍[de Jongらの文献、2002；Kwekkeboom及びKrenningの文献、2002；de Herderらの文献、2004]、α-メラニン細胞刺激ホルモン−メラノーマ[Jiang らの文献、1996；Funasakaらの文献、1999；Loirらの文献、1999；Wikbergらの文献、2000]、低密度リポタンパク質−リンパ腫、癌腫[Vitolsらの文献、1996；Tatidisらの文献、2002]、マクロファージ刺激タンパク質(マクロファージ分布因子)−乳癌[Maggioraらの文献、1998；Peaceらの文献、2001]、葉酸(folate)−脳及び卵巣の腫瘍[Weitmanらの文献、1992；Mantovaniらの文献、1994]、及び当業者に公知の他のもの。
【００５０】
腫瘍における上昇したタンパク質発現は、必ずしも遺伝子増幅に関連付けられないことも言及する価値がある。多くの例が存在する：遺伝子増幅を伴わない癌遺伝子の発現の増加[Chaffanetらの文献、1992；Kolibaba及びDrukerの文献、1997a；Perezらの文献、2002；Nakamuraらの文献、2003；Muellerらの文献、2004；Kerstingらの文献、2004；Mrhalovaらの文献、2005；Saxbyらの文献、2005]、及び発現レベルの上昇を伴わない遺伝子コピー数の増加[Dawkinsらの文献、1993；Kolibaba及びDrukerの文献、1997b；Durbecqらの文献、2004]。
【００５１】
先に言及された文献は、標的化に適した選択された受容体を表すものとして、本明細書中に組み込まれている：
【化１】
2014533236.tif 000005
2014533236.tif 000006
2014533236.tif 000007
2014533236.tif 000008
2014533236.tif 000009
2014533236.tif 000010
2014533236.tif 000011
2014533236.tif 000012
2014533236.tif 000013
2014533236.tif 000014
【００５２】
前記リストは、腫瘍を標的とするリガンドを詳述しているが、類似のリストが使用可能であるか、又は一般に心臓血管系、神経科学、炎症、呼吸器病態、HIV、感染症などの他の治療分野に関する文献から集めることができる。
【００５３】
(3.  リガンドモジュールの選択)
選択された過剰発現している受容体／表面タンパク質標的により、リガンドモジュールを選択することができる。このリガンドモジュールは、MTPにおいて2つの機能を有する：1)標的細胞の特異的認識、及び2)選択的受容体-媒介性エンドサイトーシスを介した標的細胞への透過。このリガンドモジュールは、選択された過剰発現している受容体への、利用可能な広範なリガンドから選択することができる。当業者は、例えば該受容体に対し親和性を有することが分かっているリガンドの文献検索により選択された受容体を基に好適なリガンドを容易に選択することができる。例えば、リガンドのリストを提供する1つのオンラインデータベースは、9436種のリガンドのリスト(2011年6月8日時点で)を提供する欧州バイオインフォマティクス研究(www.ebi.ac.uk)において見られる。このリガンドリストの内容は、好適なリガンドを提供する際のその使用に関して、引用により本明細書中に組み込まれている。このリストは、欧州タンパク質構造データバンク(PDB)において、タンパク質又はDNA/RNAに結合した完全体の分子の構造全てを与えるものとされている。このリストにより、当業者は、関心対象の受容体を検索し、且つその受容体と結合するのに好適なリガンドを見出すことができる。リガンド分子のリストの具体的なインターネットアドレスは、下記で認められる：
www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/vctr/ligands_search.pl?template=tmplt33
【００５４】
受容体が、好適なリガンドリストが容易に入手できない新たに発見された受容体である場合、研究者は、該受容体に親和性のある好適なリガンドを実験的に決定することができる。リガンドモジュールの選択においては、多くの要因が考慮されなければならない。第一に、リガンドは、受容体に最適な親和性を有さなければならない。例えばリガンドは、特定の受容体に対して又は非常に限定された数の受容体に対して選択されなければならない。MTPの一つの目的は、MTPの特異的細胞への標的化であるので、リガンド選択性は、その製品の有効性及び安全性に恩恵をもたらす。リガンドが、特定の受容体に対し非常に選択性であるように選択することができる場合、これは非標的細胞上の受容体に結合するリガンド及びMTPにより引き起こされる副作用のリスクを低下するであろう。選択的リガンドの必要性のより具体的な例として、遺伝子治療におけるRNA又はDNAの送達が考えられる。リガンドが十分に選択性でない場合、MTPは、標的化されてはならない細胞へ送達されるであろう。RNA又はDNAが、遺伝子治療により損傷を受けるであろう細胞型に送達される場合、患者は、壊滅的な結果を被るであろう。
【００５５】
第二に、リガンドは、受容体へのその親和性を大きく変更することなく修飾を許可することが可能でなければならない。リガンドは、例えばMTPへの組込み時に修飾されてよく、これによりその親和性に潜在的に影響を及ぼす。
【００５６】
同じくこの工程の一部は、リガンドモジュールとMTP部分の残余部分との間にスペーサーを含むかどうかの分析である。この分析は、選択された過剰発現された受容体、そのリガンド、及びMTP部分内のリガンドの位置の特性を知ることを基にしている。例えば、メラノコルチン受容体の活性部位は、それらの構造内の深部であり[Prusis, P.、Schioth H.B.、Muceniece R.、Herzyk P.、Afshar M.、Hubbard R.E.、Wikberg J.E.S.の文献、「ヒトメラノコルチン1受容体の三次元構造のモデル化、自動方法の使用、及び剛性の環状メラノサイト刺激ホルモンコアペプチドとのドッキング(Modeling of the three-dimensional structure of the human melanocortin 1 receptor, using an automated method and docking of a rigid cyclic melanocyte-stimulating hormone core peptide)」、J. Mol. Graphics Modelling 15:307-317, 1997；Yang X.、Wang Z.、Dong W.、Ling L.、Yang H.、Chen R.の文献、「ヒトメラノコルチン4受容体の三次元構造のモデル化及びドッキング(Modeling and Docking of the Three-Dimensional Structure of the Human Melanocortin 4 Receptor)」、J. Protein Chem., 2003, 22:335-344；Lapinsh M.、Veiksina S.、Uhlen S.、Petrovska R.、Mutule I.、Mutulis F.、Yahorava S.、Prusis P.、Wikberg J.E.の文献、「有機化合物のメラノコルチン受容体亜型との相互作用のプロテオケモメトリックマッピング(Proteochemometric mapping of the interaction of organic compounds with melanocortin receptor subtypes)」、Mol. Pharmacol. 2005；67(1):50-59]、そのため、受容体活性部位へのその親和性を低下しないために、MTP内でα-メラノサイト-刺激ホルモン残基(リガンドモジュール)に対しより多くの空間的自由度を提供することが必要である。受容体の特性を知ることにより、受容体に対するMTPの特異性を増大するために、スペーサーが使用されなければならないかどうかが決定される。
【００５７】
(4.  マルチレベル特異性のための1以上の特定されたモジュールの封入)
次の工程は、標的細胞へのMTPの透過を確実にするためのマルチレベル特異性の他の段階を標的化するために、MTP部分内の特定されたモジュールを提供するために必要とされる分析及びデザインである。そのようなモジュールの一つは、エンドソーム分解性モジュールである。エンドソーム分解性モジュールは、本明細書において、小胞内のMTP分解前の適切な期間内でエンドサイトーシス小胞を「破壊する」モジュールとして定義されている。MTPは、受容体-媒介性エンドサイトーシスの結果として、小胞内にある。エンドソーム分解性モジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又はその断片は、エンドソームのpHで、ポリペプチド／タンパク質又はその一部が細胞膜を通り透過することを可能にする公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。ポリペプチド又はその断片は、pH7〜7.4(通常細胞外のpH)で不活性であるが、それよりも低いより酸性のpH(典型的エンドサイトーシス小胞のpH)では活性化するという特性を有さなければならない。より低いpHで、該ポリペプチドは、小胞への開口部の形成を生じる高次構造の変化を有する。膜中の開口部の形成は、小胞の不安定性及びその最終的な破壊を引き起こし、これによりMTPを細胞内部へ放出する。
【００５８】
従って概して、タンパク質、ポリペプチド又はそれらの断片は、MTPが細胞へ放出されるように、小胞の膜壁を崩壊することが可能である特性を有さなければならない。好ましくは、タンパク質、ポリペプチド又は断片は、エンドソームの内部の流体のより低いpH特徴での高次構造の変化によりこの機能を達成するが、一方それによりMTPが送達される体液のより高いpH特徴では不活性であろう。そのようなタンパク質は、文献の検索を実行することにより、当業者により容易に決定される。そのようなタンパク質(又はポリペプチド若しくは断片)は、天然物又は人工物であり得る。
【００５９】
例として、下記の膜-活性ペプチドの配列も、使用することができる：
【化２】
2014533236.tif 000015
[Li W, Nicol F、Szoka FC Jr.の文献、「GALA：薬物及び遺伝子送達における適用を持つデザインされた合成pH-反応性両親媒性ペプチド(GALA: a designed synthetic pH-responsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery)」、Adv Drug Deliv Rev. 2004；56(7):967-985]；
【化３】
2014533236.tif 000016
[Moore NM、Sheppard CL、Barbour TR、Sakiyama-Elbert SE.の文献、「ポリエチレングリコール-ベースのビヒクルのインビトロ遺伝子送達に対するエンドソームエスケープペプチドの効果(The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles)」、J Gene Med. 2008；10(10):1134-1149]；単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Hの誘導性(fusogenic)セグメント
【化４】
2014533236.tif 000017
[Tu Y、Kim JS.の文献、「陽イオン性リポソームのトランスフェクション効率を増強する単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Hの融合性セグメント(A fusogenic segment of glycoprotein H from herpes simplex virus enhances transfection efficiency of cationic liposomes)」、J Gene Med. 2008；10(6):646-654]。
【００６０】
先に説明されたように、このモジュールは、特別な条件下でのみ、すなわちわずかに酸性の環境においてのみ、膜を活性化する。例えば、モジュールの活性は、pH5.5で最大活性を有し得る。このモジュールのこの作用は、これらの条件下で、MTPにより脂質二重層に細孔形成を生じることが示されている。更に細孔形成に加え、pH3〜pH6でのエンドソーム／リソソーム活性は、2種のMTPモジュール、すなわちエンドソーム分解性モジュールと担体モジュールの組合せ作用の結果であることは理解されなければならない。
【００６１】
第二の特定されたモジュールは、細胞輸送機構による、特異的細胞内コンパートメントへのMTPの送達を確実にするための、細胞内輸送のために選択される。そのようなコンパートメントの例は、核、核小体、エンドサイトーシス小胞、小胞体、ゴルジ装置、透明質などを含む。細胞内輸送のためのモジュールのデザインにおいて、アミノ酸配列は、これらのポリペプチド／タンパク質の所望の細胞内標的コンパートメントへの細胞内輸送を確実にするポリペプチド／タンパク質の公知の配列のスペクトルから選択される。選択されたアミノ酸配列は、標的化された細胞内コンパートメントを基に決定される。先に注記したように、そのようなアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり、且つ特定の細胞内コンパートメントを標的化する任意の配列が適している。この配列は、特異的細胞小器官を標的化するアミノ酸配列に関する文献を検索することにより認めることができる。
【００６２】
例えば、核が特異的コンパートメントとして選択される場合、好適な配列は、核局在化シグナルのデータベース(NLSdb、http://rostlab.org/services/nlsdb/)において認めることができる。腫瘍細胞-増強された核蓄積のための関心対象の部分は、T108部位での腫瘍細胞-特異性リン酸化が核外輸送を不活性化するニワトリ貧血ウイルス(CAV)ウイルスタンパク質3(VP3)又はアポプチン(残基74-121)由来の“T-NLS”であり、これは腫瘍細胞におけるより高い核蓄積に繋がる[Poon IK、Oro C、Dias MM、Zhang J、Jans DAの文献、「アポプチン核蓄積は正常細胞において活性があるが腫瘍細胞においては活性がないCRM1-認識された核外輸送シグナルにより調節される(Apoptin nuclear accumulation is modulated by a CRM1-recognized nuclear export signal that is active in normal but not in tumor cells)」、Cancer Res. 2005； 65(16): 7059-7064；Kuusisto HV、Wagstaff KM、Alvisi G、Jans DAの文献、「アポプチンC-末端は独自の腫瘍細胞-増強された核標的化モジュールを示す(The C-terminus of apoptin represents a unique tumor cell-enhanced nuclear targeting module)」、Int J Cancer. 2008；123(12): 2965-2969]。あるいは、最適化された又は修飾されたNLSは、シミアンウイルスSV40ラージ腫瘍抗原の最適化されたNLS(opT-NLS)：
【化５】
2014533236.tif 000018
などを使用することができ[Akhlynina TV、Rosenkranz AA、Jans DA、Statsiuk NV、Balashova IYu、Toth G、Pavo I、Rubin AB、Sobolev ASの文献、「その光感受活性を増強する塩素e6の核標的化(Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity)」、J. Biol. Chem. 1997, 272: 20328-20331]、ここでT-抗原アミノ酸111-132の配列は、T124の核輸送阻害サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位を不活性化するように、123位及び124位で置換されている(AAにより置換されたST)[Fulcher AJ、Roth DM、Fatima S、Alvisi G、Jans DAの文献、「BRCA-1結合タンパク質BRAP2は核局在化シグナルに隣接するリン酸化に依存したウイルスタンパク質の核内移行の新規の負のレギュレーターである(The BRCA-1 binding protein BRAP2 is a novel, negative regulator of nuclear import of viral proteins, dependent on phosphorylation flanking the nuclear localization signal)」、FASEB J. 2010； 24(5):1454-1466]。
【００６３】
第三の特定されたモジュールは、MTPによる特異的細胞内巨大分子の特異的認識のために選択することができる。標的化され得る細胞内巨大分子の例は、DNA、RNA、タンパク質、糖質などを含む。細胞内認識のためのモジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又はその断片は、標的細胞の所与のコンパートメント内の特定型の分子への最適な特異的結合が可能である公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。実質的に、第二の特定されたモジュールは、MTPを特異的細胞小器官へ輸送させ、且つ第三の特定されたモジュールは、MTPを該細胞小器官へ結合させる。
【００６４】
例えば、オンラインデータベースFootprintDBは、DNA-結合するポリペプチドモチーフのリストを提供し、これはEstacion Experimental de Aula Dei(EEAD) (floresta.eead.csic.es/footprintdb/?documentation)において認められ、4760種のアミノ酸モチーフを提供している(2011年6月17日時点で)。別のタンパク質と相互作用する、抗体ではないタンパク質は、ウェブ-ベースの「タンパク質相互作用ネットワーク解析プラットフォーム(PINA)」において認めることができ、これは6種のデータベースのタンパク質−タンパク質相互作用データを統合し、且つネットワークの構築、フィルタリング、解析及び可視化のツールを提供している。そのインターネット上のアドレスは、csbi.ltdk.helsinki.fi/pina/home.doである。糖質部分と特異的に相互作用するタンパク質は、インド科学大学(IISc)のバイオンフォマティクスセンターのレクチンデータベース、LectinDB (proline.physics.iisc.ernet.in/home/Software_and_Databases#Lectin_Database)において認めることができる。多くの細胞内分子は、ナノボディ、単一特異性又は二重特異性ダイアボディなどを含む様々な形態でMTPに含まれ得る抗体の使用により、標的化することができる。
【００６５】
第四の特定されたモジュールは、非-標的細胞内ではない、標的の所望のコンパートメント内での、MTPの保持、すなわち延長された局在化のために選択される。例えば、癌細胞の最も脆弱なコンパートメント(これは通常細胞核である)内のMTPのより長い保持は、非-癌細胞と比べた場合、MTPにより運搬された抗癌剤の選択性及び有効性の両方を増強することができる。多くの癌細胞中の前述のCAV VP3(アポプチン)の特異的リン酸化は、その細胞核を離れる能力の喪失を生じ；このことは、正常細胞とは対照的な、癌細胞核内のその保持に繋がる(Alvisi G.、Poon I.K.H.、Jans D.A.の文献、「腫瘍特異的核標的化：抗癌剤療法に有望か？(Tumor-specific nuclear targeting: Promises for anti-cancer therapy?)」、Drug Resistance Updates, 2006, 9: 40-50)。
【００６６】
別の好適な例は、プロテアソーム阻害を提供するアミノ酸配列である。そのようなアミノ酸配列の2つの例は、以下に提示した、PI31及びPR39である：
PI31タンパク質配列：
【化６】
2014533236.tif 000019
[McCutchen-Maloney SL、Matsuda K、Shimbara N、Binns DD、Tanaka K、Slaughter CA、DeMartino GNの文献、「プロテアソームのプロリンリッチインヒビターであるPI31のcDNAクローニング、発現及び機能の特徴(cDNA cloning, expression, and functional characterization of PI31, a proline-rich inhibitor of the proteasome)」、J Biol Chem. 2000；275(24):18557-18565、その内容は、PI31タンパク質配列、その調製及び使用の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
【００６７】
PR39誘導体：
【化７】
2014533236.tif 000020
[Anbanandam A、Albarado DC、Tirziu DC、Simons M、Veeraraghavan Sの文献、「プロテアソームのプロリン-及びアルギニン-リッチペプチド阻害に関する分子基礎(Molecular basis for proline- and arginine-rich peptide inhibition of proteasome)」、J Mol Biol. 2008；384(1):219-227、その内容は、PR39誘導体、その調製及び使用の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。このモジュールは、(i)MTPのプロテアソーム分解の阻害による送達効率の増強、及び(ii)追加の癌-細胞特異性：に寄与することができる[Eldridge AG、O'Brien Tの文献、「ユビキチンプロテアソームシステム内の治療的戦略(Therapeutic strategies within the ubiquitin proteasome system)」、Cell Death Differ. 2010, 17:4-13；McConkey DJ、Zhu Kの文献、「癌におけるプロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の機序(Mechanisms of proteasome inhibitor action and resistance in cancer)」、Drug Resist Updat. 2008, 11:164-179、両方の内容は、ユビキチンプロテアソームシステムの使用並びに癌におけるプロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
【００６８】
第五の特定されたモジュールである担体モジュールは、前述のモジュールを一緒にし、且つそれらを輸送される活性物質へ連結するために選択される。担体モジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又はその断片は、公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。このポリペプチド／タンパク質は、他のMTPモジュールの最適な空間分布、その生合成時の可溶性MTPの高い収率、及び／又は輸送されるべき物質の共有結合若しくは非共有結合を提供するように選択される。最後の機能である非共有結合は、例えば、ポルフィリン-様分子に対し疎水性ポケットを有する細菌性ヘモグロビン-様タンパク質などの、特定の分子に高い親和性を有するモジュール部分内の例えばアミノ酸“ポケット”の場合に達成することができる。これらの分子は、第五のモジュールのポケットへの挿入後に、直接、又は輸送されるべき物質の担体／キレーターなどとしてのそれらの化学修飾後に使用することができる。そのようなポリペプチドは、RCSB PDB(www.pdb.org)を含む、多くのタンパク質データベースにおいて認めることができる。
【００６９】
(5.  MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールの必要性の決定)
MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールを使用する必要性を決定する一般的スキームは、下記である：
i.  細胞内輸送のための異なる特別なモジュールは、標的化された細胞内コンパートメント(通常、エンドソーム、リソソーム及び透明質ではない)によって選択されるべきである；
ii.  エンドソーム／リソソームが標的化された細胞内コンパートメントではない場合、エンドソーム分解性モジュールがMTP部分に含まれなければならない；
iii.  標的細胞内コンパートメント内の特異的(巨大)分子へのMTPの結合が必要である場合、細胞内認識のためのモジュールがMTP部分に含まれなければならない；
iv.  リガンドモジュールは、標的細胞型により規定され、且つ細胞特異性が必要である場合は不可欠であり；そのような特異性は不要であるか又は広範な細胞型が標的である場合、所望の細胞型上に最大に表された過剰発現されたインターナリゼーション可能な受容体へのリガンドを選択しなければならない；
v.  担体モジュールは、ほとんどのMTP適用について望ましい。
【００７０】
(6.  様々なモジュールをMTPへ集成するプロセス)
モジュールをMTPへ集成するプロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするためにプラスミドを使用する工程に関与している。様々なプラスミドは、当該技術分野において公知であるように、連続クローニングによりMTP全体をコードしている最終プラスミドへと集成される。この集成の順序は、各モジュール(例えば、前述のリガンドモジュール)の性質又は機能を考慮しなければならない。例えば、α-メラニン細胞-刺激ホルモンのC-末端の置換／修飾は、その受容体へのその結合親和性を著しく低下するのに対し、そのN-末端の修飾は、その活性に影響を及ぼさない[Sahm, U. G.、Olivier, G.W.、Branch, S. K.、Moss, S. H.、及びPouton, C. W.の文献、「α-MSH末端アミノ酸のメラノーマ細胞における結合親和性及び生物活性に及ぼす影響(Influence of alpha-MSH terminal amino acids on binding affinity and biological activity in melanoma cells)」、Peptides, 1994, 15: 441-446]。そのため、α-メラニン細胞-刺激ホルモンをリガンドモジュールとして使用することが必要である場合、このオリゴペプチドは、MTPのC-末端に置かれなければならない。モジュールの数及びそれらの機能は、先に全般的に説明された送達の最終ゴールによって変動する。完全サイズの又は完全なMTPは、それに不在のモジュール(例えば不在のリガンドモジュール)が、共有的又は非共有的に結合することができる、単独の分子として、又はその一部分内(例えばリガンドモジュールを含まない)のいずれかで生合成により作製することができる。
【００７１】
(7.  MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセス)
MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセスは、多くの変動を伴い、共有結合又は非共有結合によることができる。例えば、輸送されるべき物質は、直接的又はスペーサーを介してのいずれかで、共有的に(例えば、二官能性架橋剤により)MTPへ結合されてよい。輸送されるべき物質は、非共有的にMTPへ結合されてもよい(例えば、環状テトラピロール分子の一部として又は該物質の環状テトラピロール分子への結合を介して、担体モジュールの“ポケット”への挿入により)。輸送されるべき物質は、非共有的に結合されたスペーサーへ(例えば担体モジュール中の“ポケット”へと挿入されたスペーサーへ)、共有的に結合されてよい。輸送されるべき物質は、共有結合されたスペーサーへ(例えば二官能性架橋剤により結合されたスペーサーへ)、非共有的に結合されてよい。
【００７２】
(MTPの治療的、診断的、及び研究的適用)
多くのMTPの治療的、診断的及び研究的適用が存在する。例えばMTPは、いくつか挙げると、医薬品、実験生物学、及び獣医学用途において適用することができる。例えば医薬品において、MTPは、頭頚部癌、食道癌、膠芽細胞腫、膀胱癌などの、腫瘍学的適用で使用することができる。MTPはまた、いくつか可能性のある医学的適用を挙げると、例えばアテローム性動脈硬化症のプラークのアブレーションなどの心臓病；ウイルス性疾患(例えば、宿主細胞の排泄、例えばHIV治療のためのビリオン合成の阻害)；婦人科(例えば子宮内膜症)において適用することができる。医学診断において、MTPは、MTPの治療的利用が可能である同じ疾患に使用することができる。従ってMTPは、診断的及び治療的手段が一つのプラットフォームで組み合わされているセラノスティック(theranostics)におけるツールとして使用することができる。MTPはまた、特定の細胞型に対し特異性を持つRNA又はDNAを送達する遺伝子治療手法に使用することができる。先に説明したように、本明細書に記載したMTPの概念は、特定の受容体に関するリガンドの親和性を基に治療薬を特定の細胞へより特異的に標的化する手段を提供する。MTPはまた、特異的細胞型内に及び／又は特異的細胞コンパートメント内に活性物質を配置することが望ましい場合などの、研究適用において使用することができる。
【００７３】
実験生物学的適用において、研究目的で、様々な生物学的活性物質を特異的細胞内コンパートメントへ送達するためのビヒクルとして、本適用が可能である。獣医学適用において、本MTPの概念は、例えば腫瘍状態及びその他などの、治療的及び診断的用途に適用することができる。
【００７４】
表1は、本MTPの主な特徴を、他の薬物送達ビヒクル、すなわち、抗体、リポソーム、及びナノ粒子と比較している。
【００７５】
表1：MTPと他の薬物送達ビヒクルの主な特徴の比較
【表２】
2014533236.tif 000021
++、特性は存在する；+、特性はビヒクル及び物質の特定の条件／組成下で存在する；±、認めることは困難である；―、特性は認めることができない
【実施例】
【００７６】
(実施例1−EGFRを過剰発現している腫瘍の治療のためのMTPの使用)
下記実施例は、MTPをデザインする前記プロセス実行の一つを提供する。本実施例は、腫瘍細胞上に上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)の過剰発現を有する、頭頚部癌、多形膠芽腫腫瘍などに特異的である。従ってこの病変は、本MTP概念を使用する治療に適している。以下に記載する一般的原理は、本明細書記載のMTP概念を使用する治療に適している他の病変に適用することができる。
【００７７】
(1.  標的化される病変の選択)
第一の工程は、標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの治療的物質の標的化送達から恩恵を受ける治療を決定することに関与している。標的化送達から恩恵があるであろう病変は、多形膠芽腫、頭頚部癌、又は重度の脳腫瘍を含む。この実施例においては、腫瘍の治療に適したリガンドを送達するためのMTPの調製による治療のために、多形膠芽腫腫瘍が選択される。
【００７８】
(2.  インターナリゼーション可能な受容体の同定)
本プロセスの第二の工程は、所与の病変において標的細胞上で過剰発現されるインターナリゼーション可能な受容体を見つけることを基にした、インターナリゼーション可能な受容体の同定に関与している。文献(例えば、数百以上の刊行物)は、腫瘍細胞において過剰発現された受容体のリストを含んでいる。例えば上皮細胞増殖因子(EGF)の受容体、又はEGF受容体(EGFR)、及びその変種EGFRvIIIが、文献において明らかにされている[例えば、Loew S.らの文献、「多形膠芽腫及び他の悪性新生物における治療的標的としての上皮細胞増殖因子受容体(The epidermal growth factor receptor as a therapeutic target in glioblastoma multiforme and other malignant neoplasms)」、Anticancer Agents Med. Chem. 2009, 9(6):703-715を参照されたい]。
【００７９】
別の実施態様において、MTPは、下記の受容体のリガンドモジュールを含むことができる：メラノコルチン受容体-1(例えば、メラノーマ)、ソマトスタチン受容体(例えば、髄芽腫)、IL3受容体(例えば、急性骨髄性白血病)；Her2/neu及びHer3(例えば、乳癌)に対するインターナリゼーション可能な抗体を運搬するMTP。従って、これらの病変は標的化され得るインターナリゼーション可能な受容体を有するので、これらの病変は、本明細書に記載されたMTPシステムを用いて治療することができる。前記受容体リストは、網羅的ではなく、且つインターナリゼーション可能な受容体は概して、MTPによる標的化に適していることは、理解されるべきである。
【００８０】
(3.  リガンドモジュールのデザイン)
第三の工程は、MTPのリガンドモジュールのデザインに関与している。先に説明したように、リガンドは、過剰発現している受容体に対し最適な親和性を提供し、且つ受容体に対するその親和性の有意な変化を伴わずに修飾可能であるように選択されなければならない。その後、その受容体の知識により、リガンドモジュールとMTP部分の残余部分の間のスペーサーの挿入があるかどうか分析されなければならない。重要なことは、このプロセスにおいて、例えば、リガンドモジュールの代わりに細胞-透過性ペプチドを配置するなど、細胞へ非特異的に透過するMTPを作製することが必要であるかどうかが決定されなければならないことである。そのようなペプチドは、例えばエクスビボ遺伝子治療のため又は研究目的のため(例えば研究者にとってのツールとしてのMTPなど)に、全ての細胞をMTPがアクセス可能であるように処理することが必要である場合に含まれることができる。同様に、選択されたリガンドモジュールの翻訳後処理又は修飾を提供することが必要であるかどうかが決定されなければならない。場合によっては、翻訳後処理は、一部のMTPモジュールの有効性／機能性を増強することができ、例えば、リフォールディングは、いくつかのリガンドモジュール(EGFなど)の結合親和性を増強することができる。別の例は、リガンドモジュールの“ブランク”MTPへの翻訳後付加である(下記参照)。
【００８１】
EGFRの例において、複数の癌細胞型におけるEGFRの過剰発現を考慮する必要がある。具体的には、EGFRは、膠芽細胞腫細胞においてのみではなく、他の癌細胞型においても過剰発現されるので、EGFRに対するリガンドを選択し、その変種EGFRIIIに対するリガンドを選択しないことは妥当である。EGFは、そのN-末端で容易に修飾され得るので、そのためこれは最終の(future)MTPのC-末端に置くことができる。EGFをコードしている遺伝子は、cDNAライブラリーから入手するか、又は購入することができる。例えばこの遺伝子を入手するために、先に作製された遺伝子構築体を使用することが可能であり得る。EGFに関して、ロシア国特許第93031156号の開示を使用し、この遺伝子構築体が作製した。この例において、スペーサーである(Gly-Ser)5は、EGFとMTPの残余の間に含まれた。このスペーサーを使用し、MTPモジュールにより空間的自由を提供し、このことは例えば、MTPへのより高い結合親和性又はMTPと相互作用しなければならない細胞内巨大分子に関するMTPへのより良い接近可能性のいずれかを提供する。
【００８２】
(4.  マルチレベル特異性の1以上の特定されたモジュールの封入)
次の工程は、標的細胞へのMTPの透過を確実にするためのマルチレベル特異性の他の段階を標的化するための、MTP部分内の特定されたモジュールを提供するために必要な分析及びデザインである。先に説明したように、そのようなモジュールの一つは、エンドソーム分解性モジュールであり、並びにGALA又はジフテリア毒素転座ドメインなど、反復された両親媒性配列であることができる。
【００８３】
細胞内輸送に関して、選択された第二のモジュールは、細胞輸送機構により、特異的細胞内コンパートメントへのMTPの送達を確実にする。そのようなモジュールの例は、核標的化部分；SV40ラージT-抗原由来のopT-NLS、又はCAV VP3(アポプチン)T-NLS残基74-121を含み、ここで追加の特異性レベルは癌細胞内の優先的蓄積により達成され得る。
【００８４】
第四の特定されたモジュールである担体モジュールは、モジュールを輸送される物質と連結／一緒にするために選択される。そのような担体モジュールの一つは、大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPである。担体モジュールとして大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPを含むMTPの価値のある特性は、MTPがエンドソーム分解性モジュールとしてジフテリア毒素転座ドメインの断片も含む場合に、明らかにされる。この組合せは、(pH3.5以下に加えて)pH7.5及びよりアルカリ性の条件において、MTPを高濃度で得る能力を提供する。MTPと作用する素因のコンジュゲーションの高い収率を提供するためには、水溶液中の高濃度のMTPが重要である。他方で、HMP及びジフテリア毒素転座ドメインの断片の統合は、MTPにより良いエンドソーム分解能を提供する。更にHMP及びジフテリア毒素転座ドメインの断片の統合は、膜溶解作用の範囲を広げる。図5に図示したように、この組合せは、二つのMTPの高い溶解度の範囲−3.5よりも低いpHに加え7.5より高いpHを提供する。これらのpH値の間では、MTPはそれらのエンドソーム分解活性を示し、すなわち、MTPはエンドソーム／リソソームのpHで、エンドソームから、その膜の外側を通り、透明質へと取り入れられるであろう。
【００８５】
別のHMPの価値のある特性は、高親和性でプロトポルフィリンIXなどのポルフィリンに結合することができる、疎水性ポケットの存在である。この特性は、「ミックスアンドアプライ(mix-and-apply)」法を使用し、輸送されるべき物質のMTPへの非共有的結合を可能にする。例えば、プロトポルフィリンIX又はその類似体／誘導体を、例えば放射性核種のキレーターとして直接的に、又は例えば放射性核種をキレートするか又は輸送されるべき物質と反応するかのいずれかが可能である誘導体を得ることを可能にする誘導体化後に間接的に使用することができる。その後誘導体化されたポルフィリン分子(放射性核種又は医薬品のいずれかを伴う)を、MTPへ化学量論的量で添加し、医薬品／放射性核種を保有する最終のMTPを得ることができる。
【００８６】
細胞内輸送のため(この場合細胞核への輸送のため)のモジュールは、PCRにより作製される。このリガンドモジュール(EGF)は、クローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを使用するPCRにより作製される。(Gly-Ser)5スペーサーは、オリゴヌクレオチドから合成により作製される。担体モジュール(HMP、大腸菌由来のヘモグロビン-様タンパク質)は、鋳型として大腸菌染色体DNAを用いるPCRにより作製される。ジフテリア毒素転座ドメインは、毒素ドメイン間の天然のスペーサー(エンドソーム分解性モジュール)と一緒に、鋳型としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用し、PCRにより同様に作製される。
【００８７】
(5.  MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールの決定の必要性)
次にMTPは、特異的モジュールの使用により、治療薬を特異的部位へ送達するように、デザインされなければならない。この多形神経膠芽腫及び他のEGFRを過剰発現している腫瘍へ癌治療を提供する例において、最終の細胞内のゴールは、多くの抗癌剤に対し最も感度のある細胞内コンパートメントの一つである細胞核である。細胞核は、非常に多様なタンパク質と複合した複数の長い線状のDNA分子として組織化された細胞の遺伝物質のほとんどを含む。従ってエンドソーム分解性モジュールは、α-エミッターなどの作用素因の作用に不可欠であるが、α-粒子は、無作為に移動し且つ任意の核内巨大分子を実現するために十分な範囲を有するので、特別な核内巨大分子を規定する必要はないという理由で、細胞内認識のためのモジュールは不要である。反対の状況は、例えばオージェ(Auger)電子-エミッターの事象において起こり、その理由は、オージェ電子は短いレンジを有し、それらの主な標的は核DNAであり、そのためMTPは細胞内DNA認識のためのモジュールも有さなければならないからである。
【００８８】
(6.  MTPへの様々なモジュールの集成プロセス)
MTPへの様々なモジュールの集成プロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするためにプラスミドを使用する工程に関与している。先に説明したように、様々なプラスミドが、当該技術分野において公知のように、連続クローニングにより、MTP全体をコードしている最終のプラスミドに集成される。この具体的実施例において、創薬のためのMTPの可動性を最小化するために、対応するペプチドモジュールをコードしている遺伝子モジュールを、下記スキームに従いデザインした：
BamHI部位−モジュール配列−BglII部位−停止コドン−HindIII部位
。この構造は、同じ粘着末端を持つBamHI及びBglII制限部位が側面に位置するという事実により、各遺伝子モジュールを、ハイブリッド遺伝子に沿って任意の位置に配置することができるので、選択した。これらの構築体は全て、連続クローニングにより構築し、且つ強力なT5バクテリオファージプロモーターを、細菌におけるタンパク質発現のために使用した。EGFR-標的化されたMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFのためのプラスミド構築を、図6に詳述し、且つここにまとめている：NLSモジュールは、Deep Ventポリメラーゼ(Promega社)、プライマー
【化８】
2014533236.tif 000022
、及び鋳型としてプラスミドpPR28を使用するPCRにより作製される。EGFモジュールは、プライマー
【化９】
2014533236.tif 000023
及びクローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを使用するPCRにより作製される[Lunin, V.G.、Sergienko, O.V.、Khodun, M.‐V.L.、Bader, L.B.、Karpov, V.A.、及びTikhonenko, T.I.の特許、「ソマトスタチン配列を伴うキメラタンパク質をコードする組換えプラスミドpC(Sp)nSの作製方法(Method of preparing recombinant plasmids pC(Sp)nS encoding chimeric protein with somatostatin sequence)」、1995、ロシア特許第2,031,121号]。(Gly-Ser)5スペーサー(sp)は、オリゴヌクレオチドからの合成により作製される。このオリゴヌクレオチド鎖
【化１０】
2014533236.tif 000024
は、個別にリン酸化した。HMPモジュールは、Taqポリメラーゼ(Sib酵素)、PCRプライマー
【化１１】
2014533236.tif 000025
、及び鋳型として大腸菌染色体DNAを使用するPCRにより作製した。毒素全体の残基198-384である毒素ドメイン間に天然のスペーサーを持つジフテリア毒素転座ドメイン(DToxモジュール)は、プライマー
【化１２】
2014533236.tif 000026
及び鋳型としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用する、Taq PCRにより同様に作製した。
【００８９】
このコードしているプラスミドDNAからのMTPの発現は、大腸菌株M15(プラスミドpREP4を保有する)において、QIAGEN社(ヒルデン、独国)のプロトコールに従い実行した。細胞は、10mM HEPES‐NaOH (pH7.5)、0.5％ TritonX-100、1mMフッ化フェニルメタンスルホニル、1.5μg/mlアプロチニン、1mg/mlリゾチーム中に溶解し；40kHzで音波処理し；且つ、17,000rpmで25分間遠心分離した。MTPは、Ni-NTA-アガロース(QIAGEN社)上で、標準手順に従い精製した。最後にMTPは、150mM NaClを含む10mM Na-リン酸緩衝液(pH8)に対して透析した。
【００９０】
EGFRを過剰発現している腫瘍細胞の核内の核局在化のためのMTPである、HMP-NLS-DTox-EGF、HMP-NLS-DTox-EGF(スペーサー欠失)、DTox-HMP-apo-EGFを、同じ方式で作製した。同じ腫瘍細胞型の透明質局在化のためのDTox-HMP-EGF MTPに加え、エンドリソソーム局在化のためのHMP-EGF MTPも作製した。
【００９１】
同様に、メラノーマ治療のためのMTPであるDTox-HMP-NLS-αMSH、神経内分泌腫瘍治療のためのDTox-HMP-NLS-ソマトスタチン、DTox-HMP-NLS(非特異的“ブランクMTP”)、及び他のMTPを作製した。
【００９２】
(7.  MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセス)
MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセスは、例えば直接的に又はスペーサーによるなど、数多くの変形を伴う共有的又は非共有的結合によることができる。結合は、使用することが予定されている医薬品又は治療薬によって決まる。例えば光増感剤は、水溶性カルボジイミドを使用し、結合することができる。次に、結合された医薬品を伴うMTPは、反応していない医薬品及びMTPから分離されなければならない。
【００９３】
或いは、輸送されるべき物質は、担体モジュールHMP中の疎水性ポケットの使用により、MTPへ結合することができる(図7)。図7Aは、そのような物質の一つであるコバルト-塩素のアジド-PEG-誘導体を明らかにしている。この物質の疎水性ポケットへの挿入は、その吸収スペクトルの変化により、記録することができる(図7B)。非線形回帰(Origin 6ソフトウェア)を使用する異なるMTP濃度でのそのソーレー帯の解析は、ポケットに挿入された誘導体の占有率(share)の用量-依存性の変化を明らかにしている(図7C)。得られた誘導体-MTP複合体は、“クリック-反応”を介し、輸送されるべき物質の結合に使用することができる[例えば、Jewett JC、Bertozzi CRの文献、「化学生物学におけるCu-非含有クリック付加環化反応(Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology)」、Chem Soc Rev. 2010, 39(4): 1272-1279を参照されたい]。これらの複合体は、図8に示されるように、血漿のような生物学的液体中で安定している。
【００９４】
(実施例2−特異的細胞受容体に対する親和性増強のための翻訳後修飾の使用)
本EGFRの実施例において、MTPの翻訳後修飾を、ヒトEGF-含有リガンドモジュールのリフォールディングにより行った。ヒトEGF-含有リガンドモジュールのリフォールディングにより、MTPのEGFRへの親和性が増大することがわかった。タンパク質リフォールディングにおける手順は、下記の通りである：
【００９５】
MTP(10μM)を、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5mMフッ化フェニルメチルスルホニル、2mM酸化型グルタチオン、0.67mM還元型グルタチオンを含む、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中で、氷上で20時間インキュベーションした。リフォールディング後、MTPを、150mM NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液に対し、十分透析した。この処理は、EGFRへのMTP親和性の2倍以上の増大を生じた。この結果は、図1に示している。図1は、A431ヒト類表皮癌細胞のEGFR受容体からの、リフォールディングの前(◆)及び後(▲)の、DTox-HMP-NLS-EGFによる[125I]ヨード-EGF(2nM)の置換を測定することによる、MTP翻訳後処理の、細胞受容体へのそのリガンドモジュールの親和性に対する効果を示している。この結果は、[125I]ヨード-EGFは、親和定数0.15±0.02nM-1で、A431細胞表面受容体へ結合されることを示している。受容体とのMTP結合に関する親和定数は、リフォールディング前は19±3pM-1であり、且つリフォールディング後は54±5pM-1であり、すなわち、EGFRに関するMTPの親和性は、2.8倍以上増大する。
【００９６】
(実施例3−細胞内認識のためのモジュール)
選択された第三のモジュールは、細胞内認識のためである。例えば、細胞内認識の標的は、細胞DNAであってよい。標的細胞DNAへの第三のモジュールの一つの好適な例は、CAV VP3/アポプチン(74-121)であり、これはDNAを結合することができる。VP3(74-121)の使用の結果は、図3及び図4に示している。図3は、VP3 74-121を含むMTPであるDTox-HMP-apo-EGF、及びそのような断片を欠くMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFの、ゲル-シフトアッセイの結果を示している。図4は、SAチップ(BiaCore X社)上の表面プラズモンアッセイ法を用いアッセイされた、DTox-HMP-apo-EGF(左側グラフ)及びDTox-HMP-NLS-EGF(右側グラフ)のプラスミドDNAとの相互作用を、グラフ表示している。apoは、アポプチン74-121である。
【００９７】
実験は、BiaCore-X装置(SA-チップ)を使用し実行した。プラスミドDNA(4.7kb)を、ビオチン-11-dUTP及び非放射性DNA標識キット、Biotin-Randomprimeの使用により、ビオチニル化した。DNAを、5.5pMプラスミド溶液60μlを30分間かけて注入することにより、センサーチップ上に固定した。結合は、固定されたDNAを伴うSAチップへ、規定濃度のMTPを、150mM NaCl及び1mM EDTAを含む10mM HEPES／MES緩衝液(pH8)中流量10μl/分で注入することにより測定した。このチップは、8M尿素の1分間の注入により再生した。結合の変数を、BIACOREシステムにおいてソフトウェア(BIAevaluation 4.1)の速度論データ解析を用いることにより、コンピュータ処理した。MTPは、DNAを伴わないSAチップと強力な相互作用を有し、従って「異種リガンド−並行反応」モデルを使用した。非修飾チップとの会合定数値(DTox-HMP-apo-EGFについてKa＝2.66×105 M-1、及びDTox-HMP-NLS-EGFについて1.16×104 M-1、ラングミュア結合)は、別の実験で測定し、且つこのモデルの定数として使用した。これらの結果は、新規モジュールDTox-HMP-apo-EGFを伴うMTPは、DTox-HMP-NLS-EGFのMTPよりも、23倍より高いDNA親和性を提供することを示している。
【００９８】
(実施例4−MTP作製のためのタンパク質スプライシングの適用)
次に、どの型のリガンドモジュールの結合を選択するかを決定しなければならない。実施例1において言及したMTPとは別の広範なリガンドプールが存在する。例えば連結は、遺伝子構築体又はブランクMTP(リガンド非結合のMTP)のC-末端へのタンパク質スプライシングを介することができる。図2A-Bに示したように、リガンドモジュールは、C-末端インテイン-CBD(キチン-結合ドメイン)モジュールを保有するブランクMTPの使用により、MTPへ結合することができる[例えば、Elleuche S、Poggeler S.の文献、「分子生物学及びバイオテクノロジーにおいて価値のある遺伝子エレメントであるインテイン(Inteins, Valuable Genetic Elements in Molecular Biology and Biotechnology)」、Appl Microbiol Biotechnol. 2010； 87(2):479-489を参照されたい]。これは、MTP精製、及びMTPへの任意の追加の又は余計なアミノ酸の付加を伴わずに連結するモジュールの両方のために使用することができる。図2A-Bに示したプロセスは、インテイン及びCBD(キチン-結合ドメイン)-コード領域を有するMPTコードしているプラスミドの集成を示している。インテイン配列の給源は、pTXB1プラスミドである。リガンド非結合のMTP配列の給源は、DTox-HMP-NLS(“ブランク”MTP)をコードしているpR820プラスミドである。インテイン-CBDは、pTXB1プラスミドからのPCR反応、続くBgl II部位及びHind III部位の追加により作製した：Bgl II−インテイン-CBP−Hind III。その後この生成物を、pR820プラスミドに挿入した。
【００９９】
その後この様式で生成された最終プラスミドを、例えばキチンビーズ上で精製し、その後2-メルカプトエタンスルホン酸により開裂させ、SH-基と容易に反応する生成物を生じた。図2Bは、これらの精製プロセス工程を図示している。図2Bに関して、この精製されたリガンド非結合のMTPは、例えば、ダイアボディ又はナノボディ(この種のリガンドを保有するMTP全体は、大腸菌の細胞質において直接生成されることができない)、非-特異的透過のための細胞-透過性ペプチド、又は合成アミノ酸誘導体とのペプチドリガンドなどを含む、N-末端Cysを有するポリペプチドリガンドによりリガンド結合され得る。そのようなペプチドを伴うMTP全体の生成は、大腸菌の生成物の高い毒性により複雑となることは注記されなければならない。
【０１００】
(実施例5−インビボにおける特性及び適用)
前記工程に従い生成されたMTPを、インビボ試験に供した。
(MTP毒性及び免疫原性)  C57Black/6Jマウス(n＝3、4週間観察)は、いかなる毒性徴候も伴わずに、DTox-HMP-NLS-αMSHの最大到達可能静脈注射投与量(7.5mg)に忍容性があり；より高いMTP投与量は、MTP溶解度の限界のために、評価しなかった。C57Black/6Jマウス(n＝5、2週間観察)及びBalb/c ByJIco-nu/nuマウス(n＝8、4週間観察)も、各々、4×2mg DTox-HMP-NLS-αMSH及び6×3mg DTox-HMP-NLS-EGFの投与の間に2〜3日の間隔をあけた反復静脈内注射に忍容性があった。このデータは、MTPは、最大到達可能投与量で単回-注射として投与された場合、又は反復投与レジメンで投与された場合に、マウスに対し毒性はないことを示している。
【０１０１】
遅延型過敏症(DTH)反応が、投与されたポリペプチドに対する免疫応答の相関として使用されることが多い[Kublin JG、Lowitt MH、Hamilton RG、Oliveira GA、Nardin EH、Nussenzweig RSらの文献、「プラスモジウム・ファルシパルム・スポロゾイトに対する合成マルチ抗原ペプチドワクチン(PfCS-MAP1NYU)により免疫した志願者における遅延型過敏症(Delayed-type hypersensitivity in volunteers immunized with a synthetic multi-antigen peptide vaccine (PfCS-MAP1NYU) against Plasmodium falciparum sporozoites)」、Vaccine. 2002； 20:1853-1861]。雌のC57Black/6Jマウス(n＝11、20〜25g)に、DTox-HMP-NLS-αMSH(60μl、フロイントの完全アジュバント(1：1, v/v、Sigma社)と混合した2mg/mlダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))を皮下注射(s.c.)した。5日後、各マウスの1本の後肢足蹠に、DTox-HMP-NLS-αMSH(40μl、2mg/ml)を注射し；並行肢(collateral foot)には、DMEMのみ注射した(実験群)。マウス対照群(n＝8)は、MTP/フロイントのアジュバントを注射しなかった。24時間後に、実験群(mMNT,exp、及び並行肢、mDMEM,exp)及び対照群(mDMEM,contr)の足蹠における浮腫を測定し[Biondo C、Beninati C、Delfino D、Oggioni M、Mancuso G、Midiri Aらの文献、「防御免疫応答を生じるクリプトコッカスのデアセチラーゼの同定及びクローニング(Identification and cloning of a cryptococcal deacetylase that produces protective immune responses)」、Infection Immunity. 2002； 70:2383-2391]、下記のように表した：
【数１】
2014533236.tif 000027
【０１０２】
MTP投与は、DTox-HMP-NLS-αMSHを注射したC57Black/6Jマウスにおいて、わずかなDTHを誘導し5.4％、実験群と対照群の間の差異は統計学的に有意ではなかった。概して、約20％以上の対照を上回る増加は、免疫原性反応を示すと考えられる[Omata Y、Kamiya H、Kano R、Kobayashi Y、Maeda R、Saito Aの文献、「感染したBALB/cマウスにおけるネオスポラ・カニナム・タキゾイト抽出物により誘導された足蹠反応(Footpad reaction induced by Neospora caninum tachyzoite extract in infected BALB/c mice)」、Veterinary Parasitol. 2006； 139:102-108]。実験群と対照群の間の統計学的有意性の欠如は、このMTPに関する低い免疫原性の程度を示唆している。
【０１０３】
(インビボ標的化)  次にインビボ標的化を、125I-標識したMTPにより評価した。DTox-HMP-NLS-αMSHを、N-スクシンイミジル3-[125I]ヨード安息香酸試薬、従来の求電子法と比べ最大2桁インビボにおける脱ヨード化を減少することが示されている方法[Vaidyanathan G、Zalutsky MRの文献、「N-スクシンイミジル3-[*I]ヨード安息香酸の調製：タンパク質の間接的放射性ヨード標識のための試薬(Preparation of N-succinimidyl 3-[*I]iodobenzoate: an agent for the indirect radioiodination of proteins)」、Nat Protocols. 2006；1:707-713]を用い、125Iにより標識した。この125I-標識されたDTox-HMP-NLS-αMSHを、細胞1個につき約10,000個のαMSH受容体を発現しているB16-F1由来のマウスメラノーマ腫瘍を有するC57Black/6Jマウスへ、静脈内注射した[Siegrist W、Solca F、Stutz S、Giuffre L、Carrel S、Girard Jらの文献、「ヒトメラノーマ細胞上のα-メラニン細胞-刺激ホルモン受容体の特徴(Characterization of receptors for α-melanocyte-stimulating hormone on human melanoma cells)」、Cancer Res. 1989； 49:6352-16358]。腫瘍における125I活性の皮膚及び筋肉における活性に対する比を、インビボ標的化の評価のための計量として選択した。その理由は皮膚及び筋肉の組織はメラノーマの近傍にあり、且つ光力学療法からのそれらの副次的損傷は避けなければならないからである。
【０１０４】
図9に示したように、125I-標識されたDTox-HMP-NLS-αMSH保持の選択性は、一般に時間と共に、及びMTP≧200μgの投与量と共に、増加する。図9において、Aと記されたグラフは、MTP投与量11μgの投薬での、腫瘍対非-腫瘍比に対する時間の効果を示している。Bと記されたグラフは、注射後3時間での腫瘍対非-腫瘍比に対するMTP投与量の効果を示している。3時間での標的化に関して認められた最適投与量は、腫瘍：皮膚について214μg(9.8±1.8)及び腫瘍：筋肉について850μg(13.4±1.7)であった。MTPについて決定された腫瘍：皮膚の最大比は、このマウスメラノーマモデルにおけるフリー光増感剤に関して報告されたものよりも3〜8倍高いことは注意されなければならない[Woodburn KW、Fan Q、Kessel D、Luo Y、Young SWの文献、「B16F10マウスメラノーマのルテチウムテキサフィリンによる光力学療法(Photodynamic therapy of B16F10 murine melanoma with Lutetium Texaphyrin)」、J Invest Dermatol. 1998； 110:746-751；Fabris C、Vicente MG、Hao E、Friso E、Borsetto L、Jori Gらの文献、「メソテトラ(4-ニドカルボラニルフェニル)ポルフィリン(H2TCP)の腫瘍-局在化及び光感受性特性(Tumour-localizing and photosensitising properties of mesotetra(4-nidocarboranylphenyl)porphyrin (H2TCP))」、J Photochem Photobiol B. 2007； 89:131-138；Jori G、Soncin M、Friso E、Vicente MG、Hao E、Miotto Gらの文献、「腫瘍のホウ素中性子捕捉療法のための放射能増感剤としての新規ホウ化-ポルフィリン：インビトロ及びインビボ試験(A novel boronated-porphyrin as a radio-sensitizing agent for boron neutron capture therapy of tumours: In vitro and in vivo studies)」、Appl Radiat Isotopes. 2009; 67(7-8 Suppl): S321-S324]。
【０１０５】
(免疫組織化学により評価されたMTPのインビボ標的化)  この評価において、免疫蛍光測定分析を行い、マウスにおける静脈内注射後3時間のMTPの腫瘍及び隣接組織中のインビボ分布並びに細胞内局在を決定した。この評価において、DTox-HMP-NLS-αMSHは、細胞1個につき約5,000個のαMSH受容体を発現しているクラウドマンS91を有するDBA/2マウスへ、静脈内注射した[Siegrist W、Solca F、Stutz S、Giuffre L、Carrel S、Girard Jらの文献、「ヒトメラノーマ細胞上のα-メラニン細胞-刺激ホルモン受容体の特徴(Characterization of receptors for α-melanocyte-stimulating hormone on human melanoma cells)」、Cancer Res. 1989; 49:6352-16358]。
【０１０６】
図10A-Fは、DTox-HMP-NLS-αMSHを受け取るGFP(緑色蛍光タンパク質)で形質転換されたマウスクラウドマンメラノーマS91を有するDBA/2マウスからの10μm組織切片の結果を示している。図10A-Dは、倍率40×での腫瘍切片及び周辺組織切片の結果を示している。図10Aは、MTPについてAlexa Fluor 555染色により染色した組織切片を示し(赤色)；図10Bは、腫瘍細胞からのGFP蛍光を示し(緑色)；図10Cは、細胞核のDAPI染色を示し(青色)；図10Dは、図10A-Cの重ね合わせである。図10Eは、DAPI蛍光(青色)及びMTP(赤色)を重ね合わせた、倍率63×での腫瘍切片を示している。図10Fは、腫瘍細胞及び隣接皮膚細胞の核及び細胞質における特異的MTPシグナルを伴う領域の割合(±SEM)を示している。図10Gは、塩素e6-DTox-HMP-NLS-EGFの静脈内注射後3時間での、ヒトA431類表皮癌を有するBalb/c ByJIco-nu/nuマウスからの2〜3μm腫瘍切片の染色を示し(63×)；DAPI蛍光(青色)及びMTP(赤色)を重ね合わせた。図10D及びEのスケールバーは20μmであり、且つ図10Gのスケールバーは5μmである。腫瘍内のMTPの優先的蓄積は、注射後3時間で認められ、これはトランスフェクションしたメラノーマ細胞のGFP蛍光により周囲の非-腫瘍組織から区別された。
【０１０７】
MTPのDAPI染色に対する比較は、メラノーマ細胞におけるMTP蓄積のかなりの割合が、細胞核において起こることを示唆した(図10C-D)。腫瘍細胞及び近傍の皮膚細胞の核及び細胞質内でMTPシグナルを示す領域の割合も、評価した。図10E-Fに示されたように、皮膚における40％未満の値と比べ、メラノーマの領域の80％以上及びほぼ100％は、各々、核及び細胞質内にMTPシグナルを有した。同様の結果が、EGFR-発現しているヒト類表皮癌A431異種移植片を有するBalb/c ByJIco-nu/nuマウスへの、DTox-HMP-NLS-EGFの静脈内注射後に得られ−腫瘍細胞におけるMTPの蓄積は、細胞核内の局在化の証拠を伴った(図10G)。これらの実験は、MTPは、インビボにおいて、血液プールから、受容体発現している腫瘍細胞内のそれらの意図された細胞内標的へ輸送を行うようにデザインすることができることを確認している。
【０１０８】
(光力学療法を使用するインビボMTP抗-腫瘍有効性)  効果があるべき細胞核内での局在化を必要とする薬物の治療有効性を増強するためにMTPの潜在的有用性を評価する目的で、光力学療法(PDT)試験を、3種の異なるマウス皮下腫瘍モデルにおいて行い、PDTは光増感剤(PS)注射の3時後に開始した。MTPであるDTox-HMP-NLS-αMSHにコンジュゲートされたバクテリオクロリンp及び遊離バクテリオクロリンpによる光力学療法の有効性比較を、図11A-Dにおいて報告した。
【０１０９】
第一の実験は、B16-F1メラノーマを伴うC57Black/6Jマウスにおいて行った。図11Aは、腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図11Bは、カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。腫瘍成長の89％阻害が、バクテリオクロリンp-DTox-HMP-NLS-αMSHコンジュゲートにより認められたのに対し、遊離バクテリオクロリンpによっては有意な効果は認められなかった(図11A)。PS-MTPコンジュゲートを受け取ったマウスの生存中央値は、対照群17.0±1.5日間及びバクテリオクロリン群20.0±5.5日間と比べ、32.0±1.3日間であった(図11B)。PS-MTPと2種の対照群の各々との間の生存の差異は、有意であった(p＜0.01)。
【０１１０】
第二の実験は、クラウドマンS91メラノーマを伴うDBA/2マウスを利用した。図11Cは、腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図11Dは、カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。対照(遊離PSに対しては93％)と比較して、腫瘍成長の98％阻害が、バクテリオクロリンp-DTox-HMP-NLS-αMSHコンジュゲートにより認められた(図11C)。PS-MTPコンジュゲートを受け取ったマウスの生存中央値は、対照群21.0±0.7日間及びバクテリオクロリン群31.0±1.3日間と比べ、56.0±18.6日間であった(図11D)。
【０１１１】
第三の実験は、A431ヒト類表皮癌異種移植片を伴うBalb/c ByJIco-nu/nuマウスにおいて、塩素e6-DTox-HMP-NLS-EGFにより行った。MTPであるDTox-HMP-NLS-EGFは、遊離塩素e6と比べ、A431ヒト類表皮癌成長を阻害し、且つ担腫瘍Balb/c ByJIco-nu/nuマウスの生存を増強した。図12Aは、A431腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図12Bは、カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。対照(遊離PSに対しては94％)と比較して、腫瘍成長の98％阻害が、塩素e6-DTox-HMP-NLS-EGFコンジュゲートにより認められた(図12A)。対照群マウスの生存中央値は、20.0±0.4日間であり、全ての動物は22日までに死亡した(図12B)。対照的に、塩素e6-DTox-HMP-NLS-EGF群においては、塩素e6群の20％と比べ、92日間の観察期間の最後まで、動物の75％が生存し続けた。
【０１１２】
本発明のいくつか特定の形が、例示されかつ説明されているが、本文及び図面に詳述された本発明の様々な変更及び組合せを、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りは、行うことができることは明らかであろう。例えば、構造の物質、構造の方法、具体的次元(specific dimensions)、形状、利用性又は適用への言及は、いかなる意味においても限定を意図するものではなく、他の物質及び次元で置き換えることができ、且つ依然本発明の精神及び範囲内にある。従って添付された請求項を除き、本発明が限定されることを意図するものではない。
【図１】
2014533236.tif 000028
【図２Ａ】
2014533236.tif 000029
【図２Ｂ】
2014533236.tif 000030
【図３】
2014533236.tif 000031
【図４】
2014533236.tif 000032
【図５】
2014533236.tif 000033
【図６】
2014533236.tif 000034
【図７】
2014533236.tif 000035
【図８】
2014533236.tif 000036
【図９】
2014533236.tif 000037
【図１０】
2014533236.tif 000038
【図１１】
2014533236.tif 000039
【図１２】
2014533236.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月6日(2014.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
例として、下記の膜-活性ペプチドの配列も、使用することができる：
【化２】
2014533236.tif 000041
[Li W, Nicol F、Szoka FC Jr.の文献、「GALA：薬物及び遺伝子送達における適用を持つデザインされた合成pH-反応性両親媒性ペプチド(GALA: a designed synthetic pH-responsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery)」、Adv Drug Deliv Rev. 2004；56(7):967-985]；
【化３】
2014533236.tif 000042
[Moore NM、Sheppard CL、Barbour TR、Sakiyama-Elbert SE.の文献、「ポリエチレングリコール-ベースのビヒクルのインビトロ遺伝子送達に対するエンドソームエスケープペプチドの効果(The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles)」、J Gene Med. 2008；10(10):1134-1149]；単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Hの誘導性(fusogenic)セグメント
【化４】
2014533236.tif 000043
[Tu Y、Kim JS.の文献、「陽イオン性リポソームのトランスフェクション効率を増強する単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Hの融合性セグメント(A fusogenic segment of glycoprotein H from herpes simplex virus enhances transfection efficiency of cationic liposomes)」、J Gene Med. 2008；10(6):646-654]。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
例えば、核が特異的コンパートメントとして選択される場合、好適な配列は、核局在化シグナルのデータベース(NLSdb、http://rostlab.org/services/nlsdb/)において認めることができる。腫瘍細胞-増強された核蓄積のための関心対象の部分は、T108部位での腫瘍細胞-特異性リン酸化が核外輸送を不活性化するニワトリ貧血ウイルス(CAV)ウイルスタンパク質3(VP3)又はアポプチン(残基74-121)由来の"T-NLS"であり、これは腫瘍細胞におけるより高い核蓄積に繋がる[Poon IK、Oro C、Dias MM、Zhang J、Jans DAの文献、「アポプチン核蓄積は正常細胞において活性があるが腫瘍細胞においては活性がないCRM1-認識された核外輸送シグナルにより調節される(Apoptin nuclear accumulation is modulated by a CRM1-recognized nuclear export signal that is active in normal but not in tumor cells)」、Cancer Res. 2005； 65(16): 7059-7064；Kuusisto HV、Wagstaff KM、Alvisi G、Jans DAの文献、「アポプチンC-末端は独自の腫瘍細胞-増強された核標的化モジュールを示す(The C-terminus of apoptin represents a unique tumor cell-enhanced nuclear targeting module)」、Int J Cancer. 2008；123(12): 2965-2969]。あるいは、最適化された又は修飾されたNLSは、シミアンウイルスSV40ラージ腫瘍抗原の最適化されたNLS(opT-NLS)：
【化５】
2014533236.tif 000044
などを使用することができ[Akhlynina TV、Rosenkranz AA、Jans DA、Statsiuk NV、Balashova IYu、Toth G、Pavo I、Rubin AB、Sobolev ASの文献、「その光感受活性を増強する塩素e6の核標的化(Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity)」、J. Biol. Chem. 1997, 272: 20328-20331]、ここでT-抗原アミノ酸111-132の配列は、T124の核輸送阻害サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位を不活性化するように、123位及び124位で置換されている(AAにより置換されたST)[Fulcher AJ、Roth DM、Fatima S、Alvisi G、Jans DAの文献、「BRCA-1結合タンパク質BRAP2は核局在化シグナルに隣接するリン酸化に依存したウイルスタンパク質の核内移行の新規の負のレギュレーターである(The BRCA-1 binding protein BRAP2 is a novel, negative regulator of nuclear import of viral proteins, dependent on phosphorylation flanking the nuclear localization signal)」、FASEB J. 2010； 24(5):1454-1466]。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
別の好適な例は、プロテアソーム阻害を提供するアミノ酸配列である。そのようなアミノ酸配列の2つの例は、以下に提示した、PI31及びPR39である：
PI31タンパク質配列：
【化６】
2014533236.tif 000045
[McCutchen-Maloney SL、Matsuda K、Shimbara N、Binns DD、Tanaka K、Slaughter CA、DeMartino GNの文献、「プロテアソームのプロリンリッチインヒビターであるPI31のcDNAクローニング、発現及び機能の特徴(cDNA cloning, expression, and functional characterization of PI31, a proline-rich inhibitor of the proteasome)」、J Biol Chem. 2000；275(24):18557-18565、その内容は、PI31タンパク質配列、その調製及び使用の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
PR39誘導体：
【化７】
2014533236.tif 000046
[Anbanandam A、Albarado DC、Tirziu DC、Simons M、Veeraraghavan Sの文献、「プロテアソームのプロリン-及びアルギニン-リッチペプチド阻害に関する分子基礎(Molecular basis for proline- and arginine-rich peptide inhibition of proteasome)」、J Mol Biol. 2008；384(1):219-227、その内容は、PR39誘導体、その調製及び使用の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。このモジュールは、(i)MTPのプロテアソーム分解の阻害による送達効率の増強、及び(ii)追加の癌-細胞特異性：に寄与することができる[Eldridge AG、O'Brien Tの文献、「ユビキチンプロテアソームシステム内の治療的戦略(Therapeutic strategies within the ubiquitin proteasome system)」、Cell Death Differ. 2010, 17:4-13；McConkey DJ、Zhu Kの文献、「癌におけるプロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の機序(Mechanisms of proteasome inhibitor action and resistance in cancer)」、Drug Resist Updat. 2008, 11:164-179、両方の内容は、ユビキチンプロテアソームシステムの使用並びに癌におけるプロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
(6.  MTPへの様々なモジュールの集成プロセス)
MTPへの様々なモジュールの集成プロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするためにプラスミドを使用する工程に関与している。先に説明したように、様々なプラスミドが、当該技術分野において公知のように、連続クローニングにより、MTP全体をコードしている最終のプラスミドに集成される。この具体的実施例において、創薬のためのMTPの可動性を最小化するために、対応するペプチドモジュールをコードしている遺伝子モジュールを、下記スキームに従いデザインした：
BamHI部位−モジュール配列−BglII部位−停止コドン−HindIII部位
。この構造は、同じ粘着末端を持つBamHI及びBglII制限部位が側面に位置するという事実により、各遺伝子モジュールを、ハイブリッド遺伝子に沿って任意の位置に配置することができるので、選択した。これらの構築体は全て、連続クローニングにより構築し、且つ強力なT5バクテリオファージプロモーターを、細菌におけるタンパク質発現のために使用した。EGFR-標的化されたMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFのためのプラスミド構築を、図6に詳述し、且つここにまとめている：NLSモジュールは、Deep Ventポリメラーゼ(Promega社)、プライマー
【化８】
2014533236.tif 000047
、及び鋳型としてプラスミドpPR28を使用するPCRにより作製される。EGFモジュールは、プライマー
【化９】
2014533236.tif 000048
及びクローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを使用するPCRにより作製される[Lunin, V.G.、Sergienko, O.V.、Khodun, M.‐V.L.、Bader, L.B.、Karpov, V.A.、及びTikhonenko, T.I.の特許、「ソマトスタチン配列を伴うキメラタンパク質をコードする組換えプラスミドpC(Sp)nSの作製方法(Method of preparing recombinant plasmids pC(Sp)nS encoding chimeric protein with somatostatin sequence)」、1995、ロシア特許第2,031,121号]。(Gly-Ser)5スペーサー(sp)は、オリゴヌクレオチドからの合成により作製される。このオリゴヌクレオチド鎖
【化１０】
2014533236.tif 000049
は、個別にリン酸化した。HMPモジュールは、Taqポリメラーゼ(Sib酵素)、PCRプライマー
【化１１】
2014533236.tif 000050
、及び鋳型として大腸菌染色体DNAを使用するPCRにより作製した。毒素全体の残基198-384である毒素ドメイン間に天然のスペーサーを持つジフテリア毒素転座ドメイン(DToxモジュール)は、プライマー
【化１２】
2014533236.tif 000051
及び鋳型としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用する、Taq PCRにより同様に作製した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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