(57)【要約】  本発明は、個体が大腸癌に罹患する可能性を末梢血液サンプルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、被検個体の遺伝子の核酸の発現産物の量と、陽性対照を構成するＣＲＣ患者群から得られた同遺伝子の核酸の発現産物の量及び陰性対照を構成するＣＮＣ個体群から得られた同遺伝子の核酸の発現産物の量と、の比較を用いる方法、並びに前記発現産物に特異的な結合パートナーを含むキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が大腸癌に罹患する可能性を末梢血液サンプルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、
ａ）１種以上７種以下の核酸配列からの少なくとも１種の発現産物の量を末梢血液サンプルにおいて決定するステップであって、前記核酸配列は配列番号１〜１１の配列から選択されるステップと、
ｂ）ステップａ）で決定された前記発現産物の量を、以前に大腸癌と診断された個体群に関する発現産物の基準量及び以前に大腸癌ではないことが確認された個体群に関する発現産物の基準量と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）の結果の解析を行うステップであって、
被検個体に関する結果が、以前に大腸癌と診断された個体群から得られた結果に近いか又はそれに等しい場合、該被検個体は大腸癌患者に分類され、
被検個体に関する結果が、以前に大腸癌ではないことが確認された個体群から得られた結果に近いか又はそれに等しい場合、該被検個体は大腸癌ではない個体に分類される、
ステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）において、少なくとも１種の核酸からの少なくとも１種の発現産物の量は、前記発現産物を、該発現産物に特異的な少なくとも１種の結合パートナーと接触させることによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４、配列番号５又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群から選択される核酸配列からの発現産物の量が決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現産物は少なくとも１種のＲＮＡ転写物又は少なくとも１種のポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現産物は少なくとも１種のｍＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡ転写物は、ハイブリダイゼーション、増幅又は配列決定によって検出及び定量される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ転写物を、少なくとも１種のプローブ及び／又は少なくとも１種のプライマーと、該プローブ及び／又はプライマーのＲＮＡ転写物へのハイブリダイゼーションを可能にする所定の条件下で接触させる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ転写物のＤＮＡコピーを調製し、該ＤＮＡコピーを、少なくとも１種のプローブ及び／又は少なくとも１種のプライマーと、該プローブ及び／又はプライマーの前記ＤＮＡコピーへのハイブリダイゼーションを可能にする所定の条件下で接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
発現したポリペプチドが、少なくとも１種の特異的なリガンド、特に抗体又は親和性タンパク質と接触させることによって検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
発現したポリペプチドを、少なくとも２種の特異的なリガンド、特に、２種の抗体、又は２種の親和性タンパク質、又は１種の抗体及び１種の親和性タンパク質と接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体が大腸癌に罹患する可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するためのキットであって、少なくとも１種の核酸配列の少なくとも１種の発現産物に特異的な少なくとも１種の結合パートナー、最大で７種の核酸配列の７種の発現産物に特異的な７種の結合パートナーを含み、少なくとも１種の結合パートナーは、配列番号１〜１１の核酸配列からなる群から選択される少なくとも１種の核酸配列の発現産物に特異的である、キット。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４、配列番号５又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の配列を有する７種の核酸配列の発現産物に特異的な７種の結合パートナーの組み合わせを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
少なくとも１種の特異的な結合パートナーは少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記特異的な結合パートナーは、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマーを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記特異的な結合パートナーは、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマーを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１種の特異的な結合パートナーは、少なくとも１種の特異的なリガンド、特に１種の抗体又は１種の親和性タンパク質を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
前記特異的な結合パートナーは、少なくとも２種の特異的なリガンド、特に、２種の抗体、又は２種の親和性タンパク質、又は１種の抗体及び１種の親和性タンパク質を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
個体が大腸癌に罹患する可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するための組成物の製造における、少なくとも１種の核酸配列の少なくとも１種の発現産物に特異的な少なくとも１種の結合パートナー、最大で７種の核酸配列の７種の発現産物に特異的な７種の結合パートナーの使用であって、少なくとも１種の核酸配列は、配列番号１〜１１の核酸配列からなる群から選択される配列を有する、使用。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４、配列番号５又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の配列を有する７種の核酸配列の発現産物に特異的な７種の結合パートナーの組み合わせの、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
少なくとも１種の特異的な結合パートナーは少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記特異的な結合パートナーは、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマーを含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記特異的な結合パートナーは、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマーを含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
少なくとも１種の特異的な結合パートナーは、少なくとも１種の特異的なリガンド、特に抗体又は親和性タンパク質を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２４】
前記特異的な結合パートナーは、少なくとも２種の特異的なリガンド、特に、２種の抗体、又は２種の親和性タンパク質、又は１種の抗体及び１種の親和性タンパク質を含む、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は大腸癌の検出に関する。特に、そのような癌に罹患する可能性を決定するための方法及びキットに関する。
【背景】
【０００２】
大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ）、ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ又はｌａｒｇｅ  ｂｏｗｅｌ  ｃａｎｃｅｒ）は、米国では５番目に多い形態の癌であり、中国では４番目に多い癌であり、欧州では３番目に多い癌関連死の原因である。ＣＲＣの早期検出は治療の成功及び患者の生存の鍵であり、公衆衛生上の主要な課題の１つである。実際、ＣＲＣは、特に初期ステージで診断された場合は治療可能なことが多い。多くの国で、いくつかのスクリーニング計画が既に実施されている。従来のＣＲＣのスクリーニング検査としては、例えば、便潜血検査（ＦＯＢＴ）、Ｓ状結腸鏡検査、大腸内視鏡検査、注腸二重造影又は直腸診が挙げられる。これらはいずれも利点と限界があるが、主としてロジスティクス又は患者の不快感のためにコンプライアンスは予想よりも低いままである。
【０００３】
数年前から、ＣＲＣの早期検出を目的とした末梢血液のバイオマーカーの探索は、特にその便利さから注目を集めていた。他方、血液ベースの検査の実行可能性を裏付ける研究がわずかに存在したが、それらの研究は、血液中の遺伝子バイオマーカーがＣＲＣ患者と対照とを識別できることを示していた。それらの研究はフローサイトメトリーに基づいていた。フローサイトメトリーは、顕微鏡レベルの粒子（例えば細胞）を流体の流れに懸濁し、粒子を電子工学的な検出機器を用いて分析することによって、顕微鏡レベルの粒子を計数及び試験する技術である。
【０００４】
本発明者は、差次的に発現される遺伝子が末梢血液サンプル中の重要なバイオマーカーとなることを見出した。本発明者は、古典的なフローサイトメトリーを用いず、全血からの遺伝子の差次的発現の決定を用いた。全血中の転写物を解析することによって遺伝子の発現レベルを決定するのは一般的ではない。特定の精製ステップを行わずにＲＮＡ（全ＲＮＡ）の混合物中に希釈された場合、特定の情報を引き出すのは極めて難しいことが当業者間で一般に認められているからである。本発明の方法の利点はまた、このＲＮＡの精製ステップを回避することにある。
【０００５】
すなわち、本発明は、個体が大腸癌に罹患する可能性を末梢血液サンプルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、
ａ）１種以上７種以下の核酸配列からの少なくとも１種の発現産物の量を末梢血液サンプルにおいて決定するステップであって、前記核酸配列は配列番号１〜１１の配列から選択されるステップと、
ｂ）ステップａ）で決定された前記発現産物の量を、以前に大腸癌と診断された個体群に関する発現産物の基準量及び以前に大腸癌ではないことが確認された個体群に関する発現産物の基準量と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）の結果の解析を行うステップであって、
被検個体に関する結果が、以前に大腸癌と診断された個体群から得られた結果に近いか又はそれに等しい場合、該被検個体は大腸癌患者に分類され、
被検個体に関する結果が、以前に大腸癌ではないことが確認された個体群から得られた結果に近いか又はそれに等しい場合、該被検個体は大腸癌ではない個体に分類される、
ステップと、
を含む、方法に関する。
【０００６】
発現産物の量は、その核酸配列により規定される遺伝子の発現レベルに直接的に関連している。
【０００７】
上記核酸のうちの少なくとも１種の核酸の発現レベルは、個体がＣＲＣ患者であるかどうかを決定するのに十分な情報である。ただし、本発明の好ましい実施形態において、ステップａ）では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４、配列番号５又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群から選択される核酸配列からの発現産物の量が決定される。
【０００８】
核酸からの発現産物の量は、発現産物を、各発現産物に特異的な少なくとも１種の結合パートナーと接触させることによって決定される。
【０００９】
発現産物はＲＮＡ転写物又はポリペプチドを意味する。すなわち、本発明の方法では、少なくとも１種のＲＮＡ転写物又は少なくとも１種のポリペプチドの量が決定される。
【００１０】
ＲＮＡ転写物とは、全ＲＮＡ、すなわち、末梢血液サンプルから直接的に得られた又は細胞溶解後の血液サンプルから間接的に得られたコーディング又はノンコーディングＲＮＡを意味する。特に、全ＲＮＡは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡだけでなく、その他の任意の遺伝子から転写されたｍＲＮＡも含む）、及びリボソームＲＮＡを含む。
【００１１】
例えば、ＲＮＡが細胞内ＲＮＡである場合、被検個体の細胞に含まれる核酸を放出させるための溶解ステップによって、血液サンプル中に存在する細胞からＲＮＡを抽出することができる。例えば、国際公開第００／０５３３８号（磁気的及び機械的な溶解に関する）、国際公開第９９／５３３０４号（電気的な溶解に関する）、国際公開第９９／１５３２１号（機械的な溶解に関する）に記載の溶解法を利用してもよい。当業者であれば、その他の周知の溶解法（例えば、熱若しくは浸透圧ショック、又はカオトロピック剤（例えばグアニジニウム塩）を用いた化学的溶解（米国特許第５２３４８０９号））も使用できる。また、溶解ステップで放出された他の細胞成分から核酸を分離する追加のステップを行うことも可能である。一般に、このステップにより核酸の濃縮が可能になる。
【００１２】
本発明の方法において、ＲＮＡ転写物は、ハイブリダイゼーション、増幅又は配列決定によって検出及び定量することができる。特に、検出及び定量するためには、ＲＮＡ転写物を、少なくとも１種のプローブ又は少なくとも１種のプライマーと、該プローブ及び／又はプライマーのＲＮＡ転写物へのハイブリダイゼーションを可能にする所定の条件下で接触させる。本発明の他の実施形態では、ＲＮＡ転写物のＤＮＡコピーを調製し、該ＤＮＡコピーを、少なくとも１種のプローブ又は少なくとも１種のプライマーと、該プローブ及び／又はプライマーの前記ＤＮＡコピーへのハイブリダイゼーションを可能にする所定の条件下で接触させる。
【００１３】
より正確には、上記方法において、ＲＮＡ転写物又はＤＮＡコピーは、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマー、特に少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマーと接触させる。
【００１４】
「ハイブリダイゼーション」とは、適切な条件下で、２つのヌクレオチド断片が安定的及び特異的な水素結合で結合して二本鎖複合体を形成する過程を意味する。これらの水素結合は、相補的なアデニン（Ａ）塩基とチミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））塩基との間に形成されるか（これはＡ−Ｔ結合と称される）、又は相補的なグアニン（Ｇ）塩基とシトシン（Ｃ）塩基との間に形成される（これはＧ−Ｃ結合と称される）。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは完全（ヌクレオチド断片又は配列は相補的）であってもよい。すなわち、ハイブリダイゼーションで得られた二本鎖複合体はＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみを含んでもよい。ハイブリダイゼーションは部分的（ヌクレオチド断片又は配列は十分に相補的）であってもよい。すなわち、得られた二本鎖複合体は、二本鎖複合体の形成を可能にするＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合に加えて、相補的な塩基に結合していない塩基を含んでもよい。２つのヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、使用される実施条件、特にストリンジェンシーによって決まる。ストリンジェンシーは、特に、２つのヌクレオチド断片の塩基組成の関数として定義され、また、２つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によっても規定される。また、ストリンジェンシーは反応パラメータ（例えば、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及びタイプ、変性剤の性質及び濃度、及び／又はハイブリダイゼーション温度）によっても変わり得る。これらのデータはいずれも周知であり、適切な条件は当業者が決定できる。一般には、ハイブリダイズさせようとするヌクレオチド断片の長さに応じて、ハイブリダイゼーション温度は、約０．５〜１Ｍの濃度において生理食塩水中、約２０〜７０℃、特に３５〜６５℃である。配列又はヌクレオチド断片又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、リン酸エステル結合により構築された一連のヌクレオチドモチーフである。これは、ヌクレオチド断片にハイブリダイズ可能な、天然の核酸の情報配列によって特徴付けられる。このモチーフは、異なる構造を有する単量体を含むことが可能であり、また、天然の核酸分子から、及び／又は遺伝子組換え及び／又は化学合成によって得ることが可能である。モチーフは単量体の誘導体であり、この単量体は、糖、リン酸基及び窒素含有塩基を構成要素とする、核酸の天然ヌクレオチドであり得る。ここで、糖は、ＤＮＡではデオキシ−２−リボース、ＲＮＡではリボースである。窒素含有塩基は、ＤＮＡかＲＮＡかに応じて、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される。あるいは、単量体は、上記３つの構成要素の少なくとも１つにおいて修飾されたヌクレオチドである。例えば、修飾は、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン等の修飾塩基、又はハイブリダイズ可能なその他の任意の修飾塩基によって塩基レベルで起こる。あるいは、糖レベル（例えば、少なくとも１種のデオキシリボースのポリアミドでの置換（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，  １４９７−１５���０（１９９１）））又はリン酸基レベル（例えば、特に、ジホスフェート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート及びホスホロチオエートから選択されるエステルでのリン酸基の置換）で起こる。
【００１５】
本発明において、「増幅プライマー」とは、酵素重合（例えば酵素増幅反応）の開始を可能にする５〜１００個のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０個のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を意味する。「酵素増幅反応」とは、少なくとも１種の酵素の作用によってヌクレオチド断片の複数のコピーを生成する過程を意味する。そのような増幅反応は当業者に周知であり、特に、米国特許第４６８３１９５号、米国特許第４６８３２０２号及び米国特許第４８００１５９号に記載のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、例えばＥＰ０２０１１８４に記載のＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、国際公開第９０／０１０６９号に記載のＲＣＲ（修復連鎖反応）、国際公開第９０／０６９９５号に記載の３ＳＲ（自家持続配列複製）、国際公開第９１／０２８１８号に記載のＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、米国特許第５３９９４９１号に記載のＴＭＡ（転写増幅）、及びＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００１６】
酵素増幅がＰＣＲである場合、標的遺伝子に特異的な物質の増幅を可能にする、標的遺伝子に特異的な少なくとも２種の増幅プライマーが使用される。標的遺伝子に特異的な物質は、好ましくは、標的遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補的ＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）、又は標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの転写によって得られた相補的ＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡ）を含む。酵素増幅が逆転写反応後に行われるＰＣＲである場合、これはＲＴ−ＰＣＲである。
【００１７】
「ハイブリダイゼーションプローブ」とは、少なくとも５個のヌクレオチド、例えば５〜１００個のヌクレオチド、特に１０〜７５個のヌクレオチド（例えば、１５〜３５個のヌクレオチド、６０〜７０個のヌクレオチド）を含むヌクレオチド断片であって、標的遺伝子に特異的な物質とのハイブリダイゼーション複合体が形成されるような所定の条件下においてハイブリダイゼーション特異性を有する断片を意味する。本発明において、標的遺伝子に特異的な物質は、標的遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｍＲＮＡ）に含まれるヌクレオチド配列、前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補的ＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）に含まれるヌクレオチド配列、又は前記ｃＤＮＡの転写によって得られた相補的ＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡ）に含まれるヌクレオチド配列であってもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、その検出のための標識を含んでもよい。「検出」とは、直接的な検出（例えば、計数方法によるもの）、又は標識を用いた検出方法による間接的な検出を意味する。核酸を検出するための多くの検出方法がある（例えば、Ｋｒｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，ｎｏ  ４５（４），ｐ．４５３−４５８；又はＫｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ５  ａｎｄ  ６，ｐ．１７３−２４９を参照）。「標識」とは、検出可能なシグナルを生成できるトレーサーを意味する。これらのトレーサーの非限定的な例としては、例えば比色分析、蛍光又は発光により検出可能なシグナルを生産する酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）；発色団（例えば、蛍光化合物、発光化合物、染色化合物）；電子顕微鏡によって、又はその電気特性（例えば伝導性）に基づいて、又は電流測定若しくはボルタメトリーによって、又はインピーダンス測定によって検出可能な高電子密度の基；光学的な方法（例えば、回折、表面プラズモン共鳴、接触角の変化）又は物理的な方法（例えば、原子間力分光法、トンネル効果）によって検出可能な基；放射性分子（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。
【００１８】
本発明において、ハイブリダイゼーションプローブは「検出」プローブであってもよい。「検出」プローブは標識を用いて標識される。検出プローブは、特に、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，  １４：３０３−３０８）に記載の「分子ビーコン」検出プローブであってもよい。これらの「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーション中に蛍光を発するようになる。分子ビーコンは、ステムループ型の構造を有し、蛍光基及び「消光」基を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列との結合によってステムが広がり、適切な波長での励起中に蛍光シグナルが放出される。検出プローブは、特に、ナノストリング（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）（商標）の技術による「カラーコード化されたバーコード」を含む「レポータープローブ」であってもよい。
【００１９】
ハイブリダイゼーション反応の検出に関しては、直接的に（特に、標的配列内への標識の取り込みによって）、又は間接的に（特に、上で定義した検出プローブを用いて）標識された標的配列を使用してもよい。特に、ハイブリダイゼーションステップの前に、例えば酵素増幅反応中に標識デオキシ−リボヌクレオチド三リン酸を用いて、標的配列を標識及び／又は切断するステップを行うことが可能である。切断は、特に、イミダゾール又は塩化マンガンの作用によって行ってもよい。また、標的配列は、増幅ステップ後に、例えば、国際公開第９１／１９８１２号に記載のサンドイッチハイブリダイゼーション法に従って検出プローブをハイブリダイズすることによって標識してもよい。他の好ましい核酸の具体的な標識方法はＦＲ２７８００５９に記載されている。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、検出プローブは蛍光団及び消光団を含む。本発明のより好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、その５’末端にＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）又はＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）蛍光団を含み、その３’末端に消光団（ダブシル）を含む。
【００２１】
また、ハイブリダイゼーションプローブは「捕捉」プローブであってもよい。「捕捉」プローブは、任意の適切な手段によって、すなわち直接的又は間接的に（例えば、共有結合又は吸着により）固体基板に固定されているか、固定が可能である。固体基板としては、合成材料又は天然材料（これらは化学修飾されていてもよい）、特に、多糖類（例えば、セルロースベースの材料（例えば紙）、セルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、ニトロセルロース）、デキストラン）、ポリマー、コポリマー（特に、スチレンタイプの単量体をベースとしたコポリマー）、天然繊維（例えば綿）、合成繊維（例えばナイロン）、無機材料（例えば、シリカ、石英、ガラス、セラミック）、ラテックス、磁気粒子、金属誘導体、ゲル等を利用することができる。固体基板は、マイクロタイタープレートの形態、ＷＯ−Ａ−９４／１２６７０に記載の膜の形態、又は粒子の形態であってもよい。また、基板上に、各々が標的遺伝子に特異的な数種の異なる捕捉プローブを固定することも可能である。特に、基板として、多数のプローブを固定できるバイオチップを用いてもよい。「バイオチップ」とは、多数の捕捉プローブが所定位置に取り付けられた小さいサイズの固体基板を意味する。バイオチップ又はＤＮＡチップという概念は１９９０年代初頭に遡る。チップは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像解析及び情報技術を統合した複数の専門分野にわたる技術に基づく。作動原理は、分子生物学の基礎、ハイブリダイゼーション現象、すなわち２つのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の塩基の相補性による対形成に基づく。バイオチップ法は、固体基板に取り付けられた捕捉プローブの使用に基づいており、そのプローブ上で、蛍光色素で直接的又は間接的に標識された標的ヌクレオチド断片のサンプルが作用するようになっている。捕捉プローブは基板又はチップ上の特定の位置に配置され、ハイブリダイゼーションごとに標的ヌクレオチド断片に関する特定の情報が得られる。得られた情報は累積され、例えば１種又は複数種の標的遺伝子の発現レベルの定量を可能にする。次いで、標的遺伝子の発現を解析するために、ｍＲＮＡに転写される標的遺伝子の全部又は一部に対応する多数のプローブを含む基板を調製することができる。本発明において、「低密度の基板」とは、５０種未満のプローブを含む基板を意味する。「中密度の基板」とは、５０種のプローブ〜１００００種のプローブを含む基板を意味する。「高密度の基板」とは、１００００種より多いプローブを含む基板を意味する。
【００２２】
解析対象となる標的遺伝子の核酸に特異的なｃＲＮＡ又はｃＤＮＡは、例えば特異的な捕捉プローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、基板又はチップは洗浄され、例えば蛍光色素タイプの標識に結合した高親和性リガンドによって、標識されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ／捕捉プローブ複合体が明らかになる。蛍光は、例えばスキャナを用いて読み取られ、蛍光の解析は情報技術により行われる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社により開発された分子診断用ＤＮＡチップが挙げられる（Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ，  Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，  ２７４，  ６１０−６１４；  Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ａ．  Ｃａｖｉａｎｉ  Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，  ９１，  ５０２２−５０２６）。この技術において、捕捉プローブは一般にサイズが小さく、約２５個のヌクレオチドである。バイオチップのその他の例は、Ｇ．Ｒａｍｓａｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．４０−４４；  Ｆ．  Ｇｉｎｏｔ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，１９９７，Ｎｏ．１０，ｐ．１−１０；  Ｊ．  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１９９６，Ｎｏ．１（３），ｐ．１８３−２００；  Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｎｏ．２２（１５），ｐ．２９１５−２９２１；  Ｊ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．５４１−５４６；あるいは、米国特許第４９８１７８３号、米国特許第５７００６３７号、米国特許第５４４５９３４号、米国特許第５７４４３０５号及び米国特許第５８０７５２２号に記載されている。固体基板の主要な特性は、標的ヌクレオチド断片に対する捕捉プローブのハイブリダイゼーション特性を保存すると同時に、生成するバックグラウンドノイズをその検出方法にとって最小にすることにある。主要な製造法として、３タイプが基板へのプローブの固定に関して区別できる。
【００２３】
まず、第一の方法は、予め合成されたプローブを付着させることによるものである。プローブの取り付けは、マイクロピペット若しくはマイクロドットを用いて又はインクジェット装置を用いて直接移植することによって行われる。この技術は、数塩基（５〜１０個）から比較的大きいサイズの６０塩基（印刷）ないし数百塩基（マイクロデポジション）のサイズを有するプローブの取り付けを可能にする。
【００２４】
印刷は、インクジェットプリンタで使用される方法の改変法である。印刷は、４０００滴／秒に達し得る速度で流体の微小球体（体積＜１ｎｌ）を推進させることに基づく。印刷は、流体を放出するシステムと流体が付着する表面との接触を全く伴わない。
【００２５】
マイクロデポジションは、数十〜数百塩基の長いプローブをスライドガラス表面に取り付けるものである。これらのプローブは一般にデータベースから抽出され、増幅及び精製産物の形態をとる。この技術は、４ｃｍ２弱の表面積に認識ゾーンと呼ばれるＤＮＡのスポットを約１万個有するマイクロアレイと呼ばれるチップを作製することを可能にする。なお、（一般にＰＣＲによる）増幅産物を有する、直径０．５〜１ｍｍ、最大密度２５スポット／ｃｍ２の「マクロアレイ」と称されるナイロン膜の使用を忘れるべきではない。この極めてフレキシブルな技術は多くの研究所で使用されている。本発明において、後者の技術はバイオチップに包含されるものとする。しかし、ＷＯ−Ａ−００／７１７５０及びＦＲ００／１４８９６と同様に、各ウェルに、一定容量のサンプルをマイクロタイタープレートの底部に付着させてもよいし、あるいはＦＲ００／１４６９１に従って、互いに分離した一定数の液滴を１枚の同じペトリ皿の底部に付着させてもよい。
【００２６】
基板又はチップにプローブを取り付ける第二の方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成と呼ばれるものである。この技術により、チップ表面に短いプローブが直接作製される。この技術は、ｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成（特に、国際公開第８９／１０９７７号、国際公開第９０／０３３８２号を参照）に基づいており、また、オリゴヌクレオチド合成装置プロセスに基づいている。この技術は、オリゴヌクレオチドの伸長反応が起こる反応チャンバーをガラス表面に沿って移動させるものである。
【００２７】
第三の方法はフォトリソグラフィーと呼ばれるものであり、これは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発されたバイオチップに関連するプロセスである。フォトリソグラフィーもｉｎ  ｓｉｔｕ合成である。フォトリソグラフィーはマイクロプロセッサ技術から派生したものである。チップ表面は、光で活性化可能な光解離性の化学基の結合により修飾されている。光が照射されると、これらの基はオリゴヌクレオチドの３’末端との反応が可能になる。この表面を所定の形状のマスクで保護することによって、光を選択的に照射することが可能になり、また、その結果、４種のヌクレオチドのいずれか１種を結合させることが所望されるチップの領域を活性化することが可能になる。異なるマスクの逐次的な使用により、保護／反応サイクルを交互に行うことが可能になり、また、その結果、約数十平方マイクロメートル（μｍ２）のスポット上にオリゴヌクレオチドプローブを作製することが可能になる。この手段により、数平方センチメートル（ｃｍ２）の表面積上に最大数十万個のスポットを作製することが可能になる。フォトリソグラフィーは、バルクで同時に、わずか４×ＮサイクルでＮ−ｍｅｒのチップを作製することを可能にするという利点がある。これらの技術はいずれも本発明で使用できる。本発明の好ましい実施形態において、上記ステップｂ）における少なくとも１種の特異的な試薬は、（好ましくは基板に固定された）少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブを含む。この基板は、好ましくは、上で定義した低密度、高密度又は中密度の基板である。
【００２８】
複数のプローブを含む基板上でのこれらのハイブリダイゼーションステップの前に、標的遺伝物質の量を増加させるために、上で定義した酵素増幅反応ステップを行ってもよい。
【００２９】
標的遺伝子の発現レベルの決定は、当業者に知られたプロトコールのいずれによっても行うことができる。一般に、標的遺伝子の発現は、所定の時点で標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を検出することによって解析できる。
【００３０】
本発明は、好ましくは、当業者に周知のプロトコールに従って標的遺伝子由来のｍＲＮＡを検出することによる標的遺伝子の発現レベルの決定に関する。本発明のある実施形態では、各々が標的遺伝子に由来する数種の異なるｍＲＮＡを検出することによって、数種の標的遺伝子の発現レベルが同時に決定される。
【００３１】
増幅による場合、標的遺伝子の発現レベルは以下のように決定することができる。１）全血から全ＲＮＡ（転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。）を抽出した後、ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）を得るために逆転写ステップを行う。例えば、この逆転写反応は、ＲＮＡ断片からの相補的ＤＮＡ断片の入手を可能にする逆転写酵素を用いて行うことができる。特に、ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）又はＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）由来の逆転写酵素を使用することができる。より具体的には、ｍＲＮＡのｃＤＮＡのみを得ることが所望される場合、この逆転写ステップは、相補性によりｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズしてポリＴ−ポリＡ複合体（この複合体は、逆転写酵素により行われる逆転写反応の開始点として機能する。）を形成するチミン塩基（ポリＴ）のみを含むヌクレオチド断片の存在下で行われる。次いで、標的遺伝子由来のｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）、及び標的遺伝子以外の遺伝子由来のｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子に特異的でないｃＤＮＡ）を得る。２）標的遺伝子に特異的な増幅プライマーを、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ、及び標的遺伝子に特異的でないｃＤＮＡと接触させる。標的遺伝子に特異的な増幅プライマーは標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズし、標的遺伝子由来のｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡの（既知の長さの）所定の領域が特異的に増幅される。標的遺伝子に特異的でないｃＤＮＡは増幅されないが、一方で、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られる。本発明において、「標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ」又は「標的遺伝子由来のｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡ」という語は区別なく使用される。このステップは、特に、ＰＣＲタイプの増幅反応を用いて、又は上で定義したその他の任意の増幅技術によって行うことができる。ＰＣＲによれば、各々が異なる標的遺伝子に特異的な数種の異なるｃＤＮＡを、各々が標的遺伝子に特異的な異なる増幅プライマーの数種の対を用いて同時に増幅すること（多重増幅）も可能である。３）標的遺伝子の発現は、上記ステップ２）で得られた標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを検出及び定量することによって決定される。この検出は、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを、そのサイズに応じて移動する電気泳動にかけた後に行うことができる。所定の泳動時間の後にゲルをＵＶ（紫外線）光テーブル上に置いたときに光シグナルの放出により標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを直接検出できるように、泳動用のゲル及び媒体はエチジウムブロマイドを含んでもよい。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量が多いほど、この光シグナルは明るくなる。このような電気泳動技術は当業者には周知である。また、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、飽和するまで行われた増幅反応によって得られた定量範囲を用いて検出及び定量することもできる。種々のステップ（例えば、逆転写、ＰＣＲ）の間に観察される可能性がある酵素効率の変動を考慮に入れるために、種々の患者群の標的遺伝子の発現は、発現が種々の患者群において類似する「ハウスキーピング」遺伝子の発現を同時に決定することによって標準化できる。標的遺伝子の発現とハウスキーピング遺伝子の発現との比率を理解することによって、すなわち、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量とハウスキーピング遺伝子特異的ｃＤＮＡの量との比率を理解することによって、種々の実験間の任意の変動が修正される。当業者は、特にＢｕｓｔｉｎ  Ｓ  Ａ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００２，  ２９：２３−３９；  Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，  ２５：３８６−４０１を参照できる。
【００３２】
ハイブリダイゼーションによる場合、標的遺伝子の発現は以下のように決定することができる。１）全血から全ＲＮＡを抽出した後、標的遺伝子由来のｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）、及び標的遺伝子以外の遺伝子由来のｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子に特異的でないｃＤＮＡ）を得るために、逆転写ステップを上述のようにして行う。２）標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーション反応（標的遺伝子に特異的でないｃＤＮＡは捕捉プローブにハイブリダイズしない。）を行うために、すべてのｃＤＮＡを、発現解析の対象となる標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定された基板と接触させる。ハイブリダイゼーション反応は、上記物質のすべてを含む固体基板上で行うことができる。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは基板に固定されている。好ましくは、基板は、上で定義された低密度、高密度又は中密度の基板である。ハイブリダイゼーション反応の前に、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを得るために、また、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが標的遺伝子に特異的な捕捉プローブにハイブリダイズする可能性を高めるために、上述の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの酵素増幅からなるステップを行ってもよい。また、ハイブリダイゼーション反応の前に、例えば増幅反応用の標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いて、上述の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを標識及び／又は切断するステップを行ってもよい。切断は、特に、イミダゾール及び塩化マンガンの作用によって行うことができる。また、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、例えば、ＷＯ−Ａ−９１／１９８１２に記載のサンドイッチハイブリダイゼーション法に従って、標識されたプローブをハイブリダイズすることによって増幅ステップ後に標識することもできる。その他の好ましい核酸の具体的な標識及び／又は切断方法は、国際公開第９９／６５９２６号、国際公開第０１／４４５０７号、国際公開第０１／４４５０６号、国際公開第０２／０９０５８４号、国際公開第０２／０９０３１９号に記載されている。３）その後、ハイブリダイゼーション反応の検出からなるステップを行う。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズしている基板を、標識で標識された「検出」プローブと接触させること、及び標識により放出されたシグナルを検出することによって行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが予め標識で標識されている場合、標識により放出されたシグナルは直接的に検出される。
【００３３】
また、標的遺伝子の発現は以下の方法で決定することもできる。１）全血から全ＲＮＡを抽出した後、生物学的材料のｍＲＮＡのｃＤＮＡを得るために、逆転写ステップを上述のようにして行う。次いで、プロモーターの制御下で機能し、ＤＮＡテンプレートからの相補的ＲＮＡの入手を可能にするＴ７ポリメラーゼ酵素を用いて、ｃＤＮＡの相補的ＲＮＡの重合を行う。次に、標的遺伝子特異的ｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡ）、及び標的遺伝子に特異的でないｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡを得る。２）標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーション反応（標的遺伝子に特異的でないｃＲＮＡは捕捉プローブにハイブリダイズしない。）を行うために、すべてのｃＲＮＡを、発現解析の対象となる標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定された基板と接触させる。数種の標的遺伝子の発現を同時に解析することが所望される場合、各々が標的遺伝子に特異的な数種の異なる捕捉プローブを基板に固定することができる。また、ハイブリダイゼーション反応の前に、上述の標的遺伝子特異的ｃＲＮＡを標識及び／又は切断するステップを行ってもよい。３）その後、ハイブリダイゼーション反応の検出からなるステップを行う。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが標的遺伝子特異的ｃＲＮＡとハイブリダイズしている基板を、標識で標識された「検出」プローブと接触させること、及び標識により放出されたシグナルを検出することによって行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＲＮＡが予め標識で標識されている場合、標識により放出されたシグナルは直接的に検出される。多数のプローブがハイブリダイズされるバイオチップタイプの基板が用いられる場合、ｃＲＮＡの使用は特に有利である。
【００３４】
発現産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドを、少なくとも１種の特異的なリガンド（例えば、以下で定義されるリガンド）と接触させることにより検出することができる。好ましい実施形態では、発現したポリペプチドを、少なくとも２種の特異的なリガンド（例えば、以下で定義されるリガンド）と接触させる。特異的なリガンドは、例えば、抗体、又は「ナノフィチン（Ｎａｎｏｆｉｔｉｎ）（商標）」という名称の親和性タンパク質を意味する。
【００３５】
ナノフィチンは、競合的特徴部を有する親和性タンパク質である。ナノフィチンは、抗体に類似の競合的な親和性を示す。
【００３６】
「１種又は複数種の抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、組換え抗体を包含する。抗体の生産方法は当業者に周知である。
【００３７】
本発明はまた、個体が大腸癌に罹患する可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するためのキットであって、少なくとも１種の核酸配列に特異的な少なくとも１種の結合パートナー、最大で７種の核酸配列の７種の発現産物に特異的な７種の結合パートナーを含み、少なくとも１種の結合パートナーは、配列番号１〜１１の配列からなる群から選択される少なくとも１種の核酸配列の少なくとも１種の発現産物に特異的である、キットを提供する。
【００３８】
特に、本発明のキットは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４、配列番号５又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の配列を有する７種の核酸配列の発現産物に特異的な７種の結合パートナーの組み合わせを含む。
【００３９】
本発明のキットにおいて、特異的な結合パートナーは、
少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ、又は
少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマー、又は
少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマー、又は
抗体及び／又は親和性タンパク質などの、少なくとも１種の特異的なリガンド又は少なくとも２種の特異的なリガンド
を含む。
【００４０】
最後に、本発明はまた、個体が大腸癌に罹患する可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するための組成物の製造における、少なくとも１種の核酸配列の少なくとも１種の発現産物に特異的な少なくとも１種の結合パートナー、最大で７種の核酸配列の７種の発現産物に特異的な７種の結合パートナーの使用であって、少なくとも１種の核酸配列は、配列番号１〜１１の核酸配列からなる群から選択される配列を有する、使用を提供する。
【００４１】
特に、配列番号１、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４、配列番号５又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の配列を有する７種の核酸配列の７種の発現産物に特異的な７種の結合パートナーの組み合わせの使用である。
【００４２】
特異的な結合パートナーは、
少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ、又は
少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマー、又は
少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマー、又は
抗体及び／又は親和性タンパク質などの、少なくとも１種の特異的なリガンド又は少なくとも２種の特異的なリガンド
を含む。
【実施例】
【００４３】
Ｉ）材料及び方法
１．  患者及びサンプルの採取
２００６年〜２０１０年の間に、１６１人の大腸癌患者（ＣＲＣ）、及び大腸内視鏡検査で陰性の１４８人の対照患者（ＣＮＣ）からの末梢血液サンプルを採取した。ＣＲＣ患者は、ＦＤＵＳＣＣ（中国）の大腸手術部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）で集められた。国際対がん連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＵＩＣＣ）が推奨する腫瘍リンパ節転移（ＴＮＭ）システムに従って腫瘍をステージ分けした。患者は、手術前に放射線療法又は化学療法を受けなかった。遺伝性の大腸癌又は炎症性腸疾患（クローン病又は潰瘍性大腸炎）に罹患した患者は、この研究から除外された。ポリープ又は大腸癌の症状を全く示さない（これは大腸内視鏡検査で確認されていた。）ＣＮＣを、上海圏のＣｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＦＤＵＳＣＣから集めた。各患者につき２．５ｍｌの末梢血液を、ＰＡＸジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ  ＧｍｂＨ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）に採取し、製造元のガイドラインに従って処理した。
【００４４】
この研究は、２つの別個の参加者のコホートを含む。コホート１は、１００人のＣＲＣ患者及び１００人のＣＮＣからなる。ＣＲＣ患者については、ＦＤＵＳＣＣにおいて、外科手術前に、大腸内視鏡検査から少なくとも１週間後に血液サンプルを採取した。ＣＮＣについては、大腸内視鏡検査の１週間前に上海圏のＣｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで血液サンプルを採取した。これらのサンプルの遺伝子発現プロファイルを、ＣＲＣに関連する有意な遺伝子を探索して分子署名（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を同定するためのトレーニングセットとして解析した。コホート２は、６１人のＣＲＣ患者及び４８人のＣＮＣを含む。コホート１と同様にしてサンプルを採取した。コホート２は、コホート１で観察された署名の性能を検証するための独立の試験セットとして使用された。
【００４５】
２．  ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ実験
全ＲＮＡを、ＰＡＸジーン（商標）血液ＲＮＡシステム（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）を用いて製造元の説明書に従い抽出した。全ＲＮＡの量を、分光光度計によって、２６０ナノメートルの光学密度で測定し、品質を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，米国）でＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットを用いて評価した。ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒが７〜１０の間のサンプルのみを解析した。次に、製造元の標準的なプロトコールに従ってＷＴ−オベーション（ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ）（商標）ＲＮＡ増幅システムを用いたリボ−ＳＰＩＡ（Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ）（商標）技術（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，米国）を用いて、５０ナノグラムの全ＲＮＡを逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡに直線的に増幅させ、産物を、ＱＩＡクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）（商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）で精製した。２マイクログラムの増幅及び精製したｃＤＮＡを、ＲＱ１  ＲＮアーゼ非含有のＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，米国）で断片化し、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，米国）及びジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）ＤＮＡ標識試薬（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，米国）を用いてビオチン化デオキシヌクレオシド三リン酸で標識した。標識されたｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションオーブン６４０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、５０℃で１８時間、６０回転／分でジーンチップＨＧ  Ｕ１３３プラス２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上にハイブリダイズさせた。ＨＧ  Ｕ１３３プラス２．０アレイは、約３９０００種の最もよく特徴付けられたヒト遺伝子を示す５４６７５種のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーション後、アレイを洗浄し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコールＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４に従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて染色した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でアレイをスキャンした。
【００４６】
３．  統計的分析
マイクロアレイデータの品質管理を、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの品質管理パラメータの示唆に従って行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの発現アレイを、バックグラウンド補正、ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、及びｍｅｄｉａｎ  ｐｏｌｉｓｈ  ｓｕｍｍａｒｉｚａｔｉｏｎを用いたＲｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｈｉｐ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）法によって包括的に前処理した（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０  ３，  ４：２４９−６４）。
【００４７】
コホート１のデータについて、極端なシグナル強度（ｌｏｇ２（５０）よりも低いか、２Ｅ１４よりも高い）を有するプローブセットを除外した。次に、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベース（Ｍａｇｌｏｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７，  ３５：Ｄ２６−３１）の情報を用いて、生物学的な知見に基づくフィルタリングを行った。Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子番号の注釈がないプローブセットを除去した。同じＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号にマッピングされた複数のプローブセットについては、最も大きい四分位範囲の値を示したプローブセットのみを保持し、残りを除去した。２ステップでフィルタリングした後、９８５９種のプローブセットを下流の解析のために維持した。バッチ効果の可能性を低減するために、コンバット法（Ｃｏｍｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を、フィルタリングした発現データに適用した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＷＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００７，  ８：１１８−２７）。差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）の解析を、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）法（偽発見率＝０．０５；タイプ＝「２クラス間で対応なし」；検定統計量＝「ｔ統計量」；順列の数＝１０００）によって行った（Ｔｕｓｈｅｒ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００１，  ９８：５１１６−２１）。有意な遺伝子選択及び予測モデルの構築を、ＲＦＥ−ＳＶＭ法を用いた５分割交差検定法を用いて行った。トレーニングセット中の２００種のサンプルから１６０種をランダムに選択して学習セットを形成し、ＲＦＥ−ＳＶＭでスコア付けした遺伝子が１〜１００種の範囲の異なるサイズを有する予測モデルを作製し、残りの４０種のサンプルを用いてモデルの性能を評価した。このプロセスを１０００回繰り返した。我々の結果から、１００種の遺伝子をベースとするＳＶＭ予測モデルを用いて最大９７％の精度を達成できることが示唆された。署名サイズの最適化については、予想性能、署名の複雑さ、及び経済性が考慮に入れられた。最終的に我々は、我々の標的の性能に適合する、全体で９０％の精度を有する７種のコア遺伝子を同定した。これらの７種の遺伝子は、ｔ検定Ｐ値、倍数変化、生物学的機能によって選択され、年齢又は性別の要因は無関係であった。
【００４８】
ＩＩ）結果
１．  大腸癌及び対照患者集団の特性
２つのコホートにおける３０９人の参加者には、１６１人のＣＲＣ患者及び１４８人のＣＮＣが存在した。表１に、患者の人口統計学的及び臨床的特徴の概要を示す。
【００４９】
【表１】
2014509863.tif 000002
【００５０】
２．  ７種の遺伝子のＣＲＣバイオマーカーパネル：同定及び確認
トレーニングセット：
発明者は、５分割交差検定法に基づいて、有意な遺伝子選択及び予想モデルの構築を行った。この手順を１０００回繰り返し実行した。繰り返しごとに、発明者は、特有の上位７種の遺伝子セット、及びそれに対応する予想モデルの性能（内部検定により入手）を記録した。最後に、内部検定における１０００種の予想モデルの性能の平均をとることで全体的な性能を見積もった。結果は、予想モデルを用いて９０．０％の全体的な精度性能が達成可能であることを示している。発明者は最良の７種の遺伝子予想モデルを選択した。そのトレーニングセットに関しては、９０．０％の精度、８９．０％の感度、及び９１．０％の特異度を示した。
【００５１】
試験セット：
次いで、発明者は、１０９サンプル、すなわち６１人のＣＲＣ及び４８人のＣＮＣを含む独立のコホート（試験セット）において、トレーニングセットで同定された上記予想モデルの署名の性能を検証した。この署名の全体的な性能は、８３．０％（ＣＩ％：７３．９，  ８８．９）の精度、８４．０％（ＣＩ％：７１．５，  ９１．４）の感度、及び８１．０％（ＣＩ％：６６．９，  ８６．６）の特異度である。
【００５２】
３．  トレーニングセットで観察された署名から個々の遺伝子を区別する能力の解析
表２に、前記７種の遺伝子の性能の概要を示す。各遺伝子に個体特性（例えば、プローブセット番号（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプローブセット番号）；１００人のＣＮＣと１００人のＣＲＣとの間で観察されたＴ検定Ｐ値；１００人のＣＮＣと１００人のＣＲＣとの間で観察された倍数変化）が付与されている。
【００５３】
【表２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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