(57)【要約】組換え細胞集団を製造するための方法が開示される。この開示された方法は、治療用のポリクローナルタンパク質を製造するために用いられ得る。本発明は、一部は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、個々の細胞株の産生も必要としない、安定な細胞集団の産生のための方法の開発に基づく。本明細書に開示されるような、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性は、大集団の形質転換細胞を用いることによって達成される。驚くべきことに、開示された方法を用いれば、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性が達成され、それが経時的に、集団の特定の細胞へのバイアスなしに維持され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団を作製するための方法であって、前記方法は以下の工程：
ａ）宿主細胞の集団を、前記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムＤＮＡへ組み込む、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを含んでいる少なくとも１つのベクターを用いて形質転換して、それによって目的のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成し、
前記宿主細胞の集団は、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含み、かつ前記目的のタンパク質を産生できる前記宿主細胞の集団の前記生成は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択を必要としない工程と；
ｂ）前記宿主細胞の集団を維持して目的のタンパク質を産生する工程と；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに以下の工程：
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、複数の細胞集団を生成し、各々の集団が、ポリクローナルタンパク質の組成物の種々の構成要素を産生できる、工程と；
ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）によって生成される前記複数の細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記宿主細胞の集団が、複数のベクターを用いて形質転換され、各々のベクターが、前記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムＤＮＡへ組み込む、目的の２つ以上のタンパク質をコードする核酸配列の異なるコピーを含んでおり、それによって目的の２つ以上のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを用いて形質転換された前記宿主細胞の集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
目的の２つ以上のタンパク質をコードする核酸配列で形質転換された前記宿主細胞集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記選択がネガティブ選択工程である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記選択がポジティブ選択工程である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記選択工程が、前記複数の細胞集団を混合する前に起こる、請求項４、６または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記選択工程が、前記複数の細胞集団を混合した後に起こる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびリコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子エレメントを担持していないベクターからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、ベクターのライブラリーである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリクローナル細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
ａ）１つ以上の宿主細胞を、レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む少なくとも１つのレトロウイルスベクターを用いて形質転換し、前記少なくとも１つのレトロウイルスベクターが前記レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質に結合されるか、またはそれによって結合され得、かつ前記形質転換が個々の細胞のクローン選択を必要としない、工程と；
ｂ）ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；
ｃ）工程（ａ）〜（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；
ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）によって生成される少なくとも２つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を産生する工程と、
を包含する、方法。  
【請求項１４】
工程ｂで生成される前記細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｂの後に、形質転換された宿主細胞の細胞集団を選択することをさらに包含する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択工程が、個々の前駆細胞の選択も、単一の前駆細胞からの細胞株の産生も必要としない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択工程が、Ｇ４１８、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびゼオシンからなる群より選択される少なくとも１つの選択可能なマーカーを使用する、請求項１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質が、パッケージング細胞株中の前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質、別のＤＮＡベクター上にコードされる前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質、および組換えタンパク質として前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質からなる群より選択される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのレトロウイルスベクターが、レトロウイルスベクターのライブラリーである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記レトロウイルスベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリクローナル細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は以下の工程：
ａ）１つ以上の宿主細胞を、ｒｅｐタンパク質またはｒｅｐ様タンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含んでいる少なくとも１つのベクターで形質転換し、前記ｒｅｐタンパク質またはｒｅｐ様タンパク質が、核酸配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介し、かつ前記形質転換が個々の細胞のクローン選択を必要としない工程と；
ｂ）ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；
ｃ）工程（ａ）〜（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；
ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）によって生成される少なくとも２つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２２】
工程ｂで生成される前記細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｂの後に、形質転換された宿主細胞の細胞集団を選択する工程をさらに包含する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記選択工程が、個々の細胞の選択も単一の前駆細胞からの細胞株の産生も必要としない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択工程が、Ｇ４１８、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンからなる群より選択される少なくとも１つの選択マーカーを用いる、請求項２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｒｅｐタンパク質またはｒｅｐ様タンパク質が、パッケージング細胞株中の前記宿主細胞に提供されるｒｅｐまたはｒｅｐ様タンパク質、別のＤＮＡベクター上にコードされる前記細胞に提供されるｒｅｐまたはｒｅｐ様タンパク質、および組換えタンパク質として前記細胞に提供されるｒｅｐまたはｒｅｐ様タンパク質からなる群より選択される、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターが、一本鎖ＤＮＡウイルスベクターおよび二本鎖ＤＮＡベクターからなる群より選択される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが、ベクターのライブラリーである、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記単一の多量体タンパク質が、抗体およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数のポリペプチドが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでいるポリペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項１２、２０または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数のポリペプチドが、一緒になってＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を形成する２つのポリペプチドを含んでなる、請求項１２、２０または３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記一緒になってＴＣＲを形成する２つのポリペプチドが、ＴＣＲのα鎖を含んでいるポリペプチド、およびＴＣＲのβ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記一緒になってＴＣＲを形成する２つのポリペプチドが、ＴＣＲのγ鎖を含んでいるポリペプチド、およびＴＣＲのδ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのベクターが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の両方をコードする核酸を含む、請求項１、１３または２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのベクターが、ワクチンの構成要素をコードする、請求項１、１３または２１に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｄ）において、工程（ｃ）において生成された細胞の大集団が混合されて、ポリクローナル細胞集団が生成される、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｄ）において生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも一万個の細胞を含む、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ｄ）において、生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも１０万個の細胞を含む、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｄ）において、生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも１００万個の細胞を含む、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｄ）において、生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも一千万個の細胞を含む、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ｄ）において、少なくとも２つの細胞集団が１：１の比で混合される、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｄ）において、少なくとも２つの細胞集団が１：１とは異なる比で混合される、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｄ）において生成されるポリクローナル細胞集団をバンキングすることをさらに包含する、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ｄ）の後、工程（ａ）〜（ｂ）によって生成される個々の細胞集団がバンキングされない、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｄ）において生成されるポリクローナル細胞集団からポリクローナルタンパク質組成物を精製することをさらに包含する、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ａ）において、宿主細胞が、前記少なくとも１つのベクターを用いて少なくとも２回形質転換される、請求項１、２、１３または２１に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ａ）において、宿主細胞が、前記少なくとも１つのベクターを用いて少なくとも５回形質転換される、請求項１、２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも２つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも５つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも１０個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも１５個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも２０個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも２５個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも５０個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項２、１３または２１に記載の方法。
【請求項５７】
前記宿主細胞の集団が、少なくとも２つの異なるタンパク質を産生できる、請求項３に記載の方法。
【請求項５８】
前記宿主細胞の集団が、少なくとも５つの異なるタンパク質を産生できる、請求項３に記載の方法．
【請求項５９】
前記宿主細胞の集団が、少なくとも１０個の異なるタンパク質を産生できる、請求項３に記載の方法。
【請求項６０】
前記タンパク質が抗体である、請求項５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記タンパク質が、Ｔ細胞レセプターである、請求項５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記タンパク質が、ワクチン中で使用される、請求項５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される方法によって精製される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリクローナルタンパク質の組成物の安定性が、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、パパイン消化に続く２−Ｄゲル分析、マイクロアレイ、ｑＰＣＲ、およびＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択される方法によって決定される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１、２、３、１３または２１に記載の方法によって産生される、細胞集団。
【請求項６６】
請求項４７に記載の方法によって産生される、組換え抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１０年１１月１６日出願の米国仮出願第６１／４１４，２２５（その開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される）の恩典およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、分子生物学および免疫学である。さらに具体的には、この分野は、抗体、ワクチンおよびＴ細胞レセプターのような組換えポリクローナルタンパク質の産生である。
【背景技術】
【０００３】
１９８７年に初めて上市された組換え治療薬としての組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）の製造以来、組換えタンパク質を産生するための方法はほぼ不変のままである。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、安定な組換えポリペプチド産生細胞株を創出するための選り抜きの細胞株であった。しかし、ＣＨＯ細胞では、他の癌由来の細胞株と同様に、安定なクローンを見出す過程を難しくする、細胞の異数性および染色体再配置に関する偏好のせいで、本質的に不安定である。最近２５年の相対的産生の増大は、５０〜１００ｍｇ／ｌから１〜５ｇ／ｌと重要であるが、その収率増大は、用いられる技術の改善ではなく過程の改善に起因し得る（例えば、Ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ  ＆  Ｗｕｒｍによる概説、非特許文献１を参照のこと）。従って、組換えタンパク質を産生するための現在の方法論は、高い発現レベルでタンパク質を安定に産生するクローン細胞株の創出に依拠する。このプロセスは、労働集約的であって、産生のために適切な産生ベースの細胞株の創出には１年以上を要し得る。
【０００４】
あるいは、一過性の遺伝子発現を用いて、組換えポリペプチドの一過性の中程度の収率を達成してもよい（例えば、非特許文献２によって概説される）。この方法論は、より簡易で、かつより迅速である（例えば、２週間に１リットルあたり１グラムで産生する能力を有する）が、この技術を、１００リットルを超えて拡大する能力はまだ存在しない。従って、安定な組換えポリペプチドを、さらに迅速かつ費用効果的な方式で生成するための拡張性のシステムの必要性が存在する。
【０００５】
組換えポリクローナルタンパク質に基づく多構成要素の治療法は、感染性疾患、癌、神経学的障害、炎症および免疫障害、ならびに心血管系疾患を含む種々の疾患および障害の処置のための見込みのある新規な薬物である。ポリクローナルのタンパク質、例えば、ワクチンおよびポリクローナル抗体は、病原体および他の疾患原因因子を処置するために特異的に適している。なぜならそれらは同時に複数のエピトープを標的にし、従って、耐性株の発達に対する選択的な圧力を低下させるからである。例えば、高度免疫の免疫グロブリンの有効性は標的病原体の変異によって影響される場合は少ない。なぜならこれらの免疫グロブリンは、特定の感染性疾患に対して高力価を有する個体由来の抗体の複雑なプールからなるからである。例示的な高度免疫の免疫グロブリンとしては、ＣｙｔｏＧＡＭ（登録商標）（サイトメガロウイルスを標的にする）、ＶＺＩＧ（水痘ウイルスを標的にする）、ＨＢＩＧ（Ｂ型肝炎ウイルスを標的にする）およびＲＩＧ（狂犬病ウイルスを標的にする）が挙げられる。しかし、それらの有効性にもかかわらず、高度免疫の免疫グロブリンには、バッチ間の変動、利用性の限界および血液伝播性の疾患伝染の危険性の可能性がある。さらに、比較的高用量が必要である。なぜなら構成要素の抗体のうちわずかな割合しか目的の因子におけるエピトープを認識しないからである。
【０００６】
モノクローナル抗体療法も開発されたが、感染性疾患の処置のためのモノクローナル抗体の使用は、いままでのところほとんど成功していない。現在、感染性疾患因子に対する市場の唯一のモノクローナル抗体は、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）であり、これは、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）を標的とする。Ｓｙｎａｇｉｓは、早産児において感染を首尾よく防止したが、膿疱性線維症を有する小児での疾患の予防、または幹細胞移植の成体での処置のような他の適用におけるその有効性は不明である。他の研究では、いくつかのモノクローナル抗体療法は、感染性疾患の動物モデルにおいてある程度の保護を提供できるが、必要な用量は高い場合が多い。さらに高率の遺伝子多様性および細菌株間の発現の変動によって、単一のモノクローナルの処置が全ての株に対して有効である確率は低下する。
【０００７】
免疫グロブリン（例えば、受動免疫療法）は、１８００年代後期から、およびモノクローナル抗体は１９８０年代からヒトの医薬に使用されてきたが、ヒト組換えポリクローナル抗体（ＨＲＰＡｓ）は、免疫療法の比較的新しい形態である。静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧｓ）と同様に、ＨＲＰＡｓは、有効性の重大な損失なしに複数の突然変異チャレンジを克服可能で、それによって耐性株の出現をもたらす選択圧を低下させる。しかし、血清由来のポリクローナル免疫グロブリンとは異なり、ＨＲＰＡ療法の組換えの性質によって、組成物および利用可能性の変動は回避され、同様に、ＩＶＩＧ調製物に固有の血液伝播性の疾患伝染の危険性も回避される。さらに、ＨＲＰＡ内の大群の極めて特異的な抗体の相乗活性によって、モノクローナルまたはＩＶＩＧで達成できる有効性をはるかに超えて、受動免疫療法の有効性が向上され得る。
【０００８】
組換え抗体の製造のための多数の方法が、診療用途のための大量の組換えタンパク質を生成するために、以前に記載されている。これらの方法の多くは、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションと、その後の遺伝子の宿主細胞ゲノムＤＮＡへのランダムな組み込み、高い発現レベルを有する個体の前駆クローンの選択、およびマスター細胞株を生成するための増殖に依拠する。ゲノムへのランダムな組み込みは、ゲノムの「非許容」領域における挿入に起因して位置効果を生じ得る。一旦高度に発現するクローンが得られれば、発現は不安定であり、メチル化またはヘテロクロマチン形成のような遺伝子サイレンシング機構に起因して経時的に減少する場合がある。バルクの形質転換細胞集団も用いられるが、高度に安定な特定のプロデューサー細胞株を選択するためだけである。組換えポリクローナルタンパク質の産生のための方法の数はさらに限られる。さらに、細胞株の混合物が不安定である組換えタンパク質発現の分野では、これは十分理解される（例えば、細胞のゲノムへの外因性ＤＮＡの組み込みが本質的に不安定である場合が多いことを記載している、非特許文献３、および混合された細胞株中の抗体産生細胞の不安定性とバイアスとを考察する、非特許文献４を参照のこと）。
【０００９】
無作為の組み込み技術で観察された位置効果を回避するため、ゲノムへの発現構築物の部位特異的な組み込みのための方法が記載されている（例えば、特許文献１および特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５および特許文献６を参照のこと）。例えば、特許出願ＷＯ２００４／０６１１０４は、ベクターのライブラリーを、これらのベクターの相対的な発現レベルが経時的に維持されるような方法で用いる、抗体を含めた組換えポリクローナルタンパク質の産生方法を記載している。この方法は、部位特異的なＦｌｐリコンビナーゼを利用して、組換えタンパク質発現カセットの組み込みが、遺伝子発現を許容すると推定されるゲノム中に存在するＦＲＴ部位で生じるのを確実にする。しかし、ポリクローナル抗体の産生のための部位特異的なＦｌｐリコンビナーゼの使用により、産生中の低い発現レベル、発現の損失およびランダムに組み込まれたＤＮＡで観察されるのと同様のゲノム不安定性が生じる場合がある。なぜなら（ａ）ＦＲＴ部位（単数または複数）は、発現細胞株のゲノム中に遺伝子操作されなければならないからである。この不安定性および低い非一貫性の発現の可能性に対処するため、細胞株を、高い安定性および発現を付与する特に許容される部位に位置するＦＲＴ部位によって選択してもよい（Ｚｈｏｕら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４７（２０１０）１２２〜１２９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，９５９，３１７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５４，１８２号明細書
【特許文献３】国際公開第９８／４１６４５号
【特許文献４】国際公開第０１／０７５７２号
【特許文献５】国際公開第２００５／０４２７７４号
【特許文献６】国際公開第２００４／０６１１０４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２０１１）７８  １８４〜１８８
【非特許文献２】Ｈｏｐｋｉｎｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１２，８０１：２５１〜６８
【非特許文献３】Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら，Ｇｅｎｅ（２０００）２５６  １９７〜２１４
【非特許文献４】Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）４５：２５７〜２６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
というわけで、治療剤として有用な改良された組換えポリクローナルタンパク質、および組換えポリクローナルタンパク質の安定な集団を産生するための方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、一部は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、個々の細胞株の産生も必要としない、安定な細胞集団の産生のための方法の開発に基づく。本明細書に開示されるような、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性は、大集団の形質転換細胞を用いることによって達成される。驚くべきことに、開示された方法を用いれば、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性が達成され、それが経時的に、集団の特定の細胞へのバイアスなしに維持され得る。
【００１４】
本明細書において開示されるとおり、形質転換された細胞の大集団の使用は、安定な細胞集団（例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団または多数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団）を調製および維持するための驚くべき利点を提供する。例示的な実施形態では、安定な細胞集団は、大型だが有限の集団の進化動態で概説されるような特定の数学的限界に従って生成される。単一の組換えポリペプチドを発現する安定な形質転換された細胞集団は、個々の形質転換細胞の大きい集団を生成するために、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含んでいる少なくとも１つのベクターの宿主細胞の集団を、宿主細胞のゲノムＤＮＡに形質転換し（例えば、優先的組み込みによって）、その宿主細胞の集団を維持することによって得てもよい。例示的な実施形態では、複数の組換えポリペプチドを発現する安定な形質転換細胞の集団は、個々の形質転換された細胞の大きい集団を最初に生成し（例えば、優先的組み込みによって）、次いで、多数の個々の細胞集団（例えば、個々の細胞集団あたり、約１００，０００以上の細胞）を混合することによって得てもよい。個々の形質転換された細胞の大集団を用いて、安定なポリクローナル細胞集団が生成されるので、開示された方法は、個々の細胞株をバンキングする必要はない。さらに、安定な細胞集団は、経時的に集団の特定の細胞に対するバイアスなしに、形質転換されていない細胞の存在下で維持され得る。結果として、開示された方法は、安定なクローンの選択を要する方法よりも迅速で、効果的で、かつ費用が少ない。
【００１５】
細胞集団を産生するための開示された方法は、治療用の組換えタンパク質および治療用の組換えポリクローナルタンパク質組成物、例えば、組換えポリクローナルワクチン、組換えポリクローナル抗体組成物、および組換えポリクローナルＴ細胞レセプター組成物の大規模産生および製造のために用いられ得る。
【００１６】
一つの態様では、本明細書に提供されるのは、細胞集団を産生するための方法である。この細胞集団は、「モノクローナル」細胞集団（例えば、この細胞集団は、目的の単一のタンパク質を産生する）であっても、または「ポリクローナル」細胞集団（例えば、この細胞集団は、目的の複数のタンパク質、例えば、ポリクローナル抗体組成物を産生する）であってもよい。この方法は、（ａ）宿主細胞の集団を、その宿主細胞の集団のサブセットのゲノムＤＮＡへ組み込む、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを含む少なくとも１つのベクターを用いて形質転換して、それによって目的のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成するという工程と、（ｂ）この宿主細胞の集団を維持して目的のタンパク質を産生するという工程とを包含する。宿主細胞のこの集団は、形質転換された宿主細胞と形質転換されていない宿主細胞の両方を包含してもよく、かつ細胞集団の生成および／または維持のための個々の前駆細胞クローンのクローン選択を必要としない。例示的な実施形態では、宿主細胞の集団は、宿主細胞ゲノムＤＮＡへ優先的に組み込むベクターを用いて形質転換される。
【００１７】
特定の実施形態では、この方法は、（ｃ）の工程であって、工程（ａ）および（ｂ）を少なくとも１回繰り返して複数の細胞集団を生成（ここで各々の集団は、ポリクローナルタンパク質の組成物の種々の構成要素を産生できる）する工程と；（ｄ）の工程であって、工程（ａ）〜（ｃ）によって生成される上記複数の細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、をさらに包含してもよい。
【００１８】
特定の実施形態では、この細胞集団は、上記宿主細胞の集団を、複数のベクターを用いて形質転換（各々のベクターは、上記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムＤＮＡへ組み込む、目的の２つ以上のタンパク質をコードする核酸配列の異なるコピーを含んでおり、それによって目的の２つ以上のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団が生成される）することによって産生され得る。この実施形態では、ポリクローナル細胞集団および従ってポリクローナルタンパク質組成物は、複数の細胞集団を混合することなく得ることが可能（ここで各々の細胞集団は、ポリクローナルタンパク質組成物の異なる構成要素を産生する）である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、この細胞集団は、形質転換された宿主細胞と、形質転換されてない宿主細胞の両方を包含し得る。形質転換されてない宿主細胞が存在する場合、この開示された方法はさらに、この集団中で形質転換された細胞のサブセットを選択するための選択工程を包含し得る。この選択工程は、ネガティブ選択工程であっても、またはポジティブ選択工程であってもよい。例示的なネガティブ選択マーカーとしては、限定するものではないが、Ｇ４１８、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびゼオシンが挙げられる。例示的なポジティブ選択としては、培養培地に与えられない必須アミノ酸を作製できる酵素の使用が挙げられる。この選択工程は、上記複数の個々の細胞集団を混合する前に行われてもよい。あるいは、この選択工程は、上記複数の細胞集団を混合した後に行われてもよい。選択はまた、複数のベクターを用いて生成される細胞集団で、一回の形質転換で行われてもよい（例えば、一回の形質転換における各々のベクターが、目的の２つ以上のタンパク質をコードする場合）。
【００２０】
開示される方法で用いられ得る例示的なベクターとしては、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、例としては、一本鎖ＤＮＡウイルスベクターであるＡＡＶベクター、二本鎖ＤＮＡベクターであるＡＡＶベクターおよび宿主細胞のゲノムへリコンビナーゼまたはインテグラーゼ媒介で挿入するための遺伝子エレメントを欠いている二本鎖ＤＮＡベクターが挙げられる。
【００２１】
例示的な実施形態では、組換えのポリクローナル細胞集団は、レトロウイルスのインテグラーゼ、あるいは一本鎖ＤＮＡウイルス由来のｒｅｐタンパク質（またはｒｅｐ様タンパク質）を用いて生成され得る。レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質またはウイルスのｒｅｐタンパク質（例えば、アデノウイルスｒｅｐタンパク質）の使用は、他の形質転換方法よりも利点がある。なぜなら各々が、宿主細胞ゲノムへの（例えば、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの）高効率組み込みおよび／または高効率の優先的組み込みを媒介し得るからである。レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質の場合、目的の核酸の複数のコピーを、高発現に関連する位置で宿主細胞ゲノムへ組み込んでもよい。ｒｅｐタンパク質の場合、ヒト細胞株を用いれば、目的の核酸の組み込みは典型的にはＡＡＶＳ部位で生じる。例えば、ヒト細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞を、繰り返し形質転換して、高レベルの発現が可能な、複数のＡＡＶＳ部位に安定に組み込まれるＤＮＡを含有する細胞株を得てもよい。さらに、宿主細胞をいずれかのベクターで繰り返し形質転換して、完全に形質転換されている細胞集団（例えば、細胞の少なくとも９８％が、目的のＤＮＡの少なくとも１つのコピーを担持する）を生成してもよい。従って、レトロウイルスインテグラーゼ、あるいは一本鎖ＤＮＡウイルス由来のｒｅｐタンパク質の使用によって、個々の形質転換細胞の大集団が生成できる。
【００２２】
一態様では、本発明は、ポリクローナル細胞集団を産生するための方法を提供する。この方法は、（ａ）１つ以上の宿主細胞を、レトロウイルスインテグラーゼタンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む少なくとも１つのレトロウイルスベクターを用いて形質転換するという工程と；（ｂ）ポリクローナルタンパク質組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；（ｃ）形質転換および生成の工程を少なくとも１回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）によって生成される少なくとも２つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を産生する工程と、を包含する。形質転換工程（工程（ａ））では、少なくとも１つのレトロウイルスベクターが結合されるか、またはそれがレトロウイルスのインテグラーゼタンパク質によって結合されてもよい。さらに、１つ以上の宿主細胞の形質転換は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、および／または細胞株の産生も必要としない。
【００２３】
本明細書に開示されるとおり、宿主細胞のゲノムへのレトロウイルスベクターの組み込みは、組み込みの有効性を増強するインテグラーゼによって媒介される。レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質の使用によって、ほぼあらゆる細胞が少なくとも１つの組換え事象を有する、少数の細胞の形質転換が可能になる。例示的なインテグラーゼとしては、限定するものではないが、レンチウイルスを含むＲＮＡウイルス由来のインテグラーゼが挙げられる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ポリクローナルタンパク質組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含んでいる少なくとも１つのレトロウイルスベクターを用いた１つ以上の宿主細胞の形質転換は、この宿主細胞のゲノムへポリクローナルタンパク質組成物の構成要素をコードする核酸配列のコピーを組み込むことになる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのレトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのライブラリーである。レトロウイルスベクターのライブラリーは、一緒になって多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードし得る。例示的な多量体タンパク質としては、抗体およびＴ細胞レセプターが挙げられる。他の実施形態では、このレトロウイルスベクターは、２つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでもよい（例えば、この核酸は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方をコードしてもよく、またはこの核酸は、Ｔ細胞レセプターの両方の鎖をコードしてもよい）。
【００２６】
別の態様では、本発明は、形質転換工程のために一本鎖ＤＮＡウイルスベクターまたは二本鎖ＤＮＡベクターを用いる、ポリクローナル細胞集団を産生するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：（ａ）１つ以上の宿主細胞を、ｒｅｐタンパク質（またはｒｅｐ様タンパク質）を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含んでいる少なくとも１つのベクターで形質転換する工程と；（ｂ）ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；（ｃ）形質転換および生成の工程を少なくとも１回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と；（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）によって生成される少なくとも２つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できる細胞のポリクローナル集団を生成する工程と、を包含する。この形質転換工程では、ｒｅｐ（またはｒｅｐ様）タンパク質は、宿主細胞ゲノムへの核酸配列の組み込みを媒介する。さらに、１つ以上の宿主細胞の形質転換は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、および／または細胞株の産生も必要としない。
【００２７】
一本鎖ＤＮＡウイルスベクターまたは二本鎖ＤＮＡベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのベクターとは、一本鎖ＤＮＡウイルスベクターまたは二本鎖ＤＮＡベクターのライブラリー（例えば、ＡＡＶベクターのライブラリー）である。このベクターのライブラリーは、一緒になって多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードし得る。例示的な多量体タンパク質としては、抗体およびＴ細胞レセプターが挙げられる。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、２つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでもよい（例えば、この核酸は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方をコードしてもよいし、またはこの核酸は、Ｔ細胞レセプターの両方の鎖をコードしてもよい）。
【００２８】
別の態様では、本明細書に提供されるのは、リコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子レメントなしで、形質転換工程のために、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのベクター（例えば、リコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子レメントを含まないベクター、例えば、優先的な組み込みに適切でないベクター）を用いて、ポリクローナル細胞集団を生成するための方法である。例示的なベクターを図１４に示す。この態様では、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの優先的な組み込みのための遺伝子エレメントがないので、この組み込みは、宿主細胞のゲノムＤＮＡへ「ランダム」である。開示されたベクターを用いるランダムな組み込みによって、形質転換細胞の数が少なくなり、全体的な発現レベルが少なくなる場合があるが、安定な集団を得られる場合もある。安定な集団の生成は、予想されていなかった。なぜなら、ランダムな組み込みによって形質転換された細胞は一般には、不安定であると考えられているからである。
【００２９】
前述の実施形態のいずれにおいても、１つ以上の宿主細胞を、同じウイルスベクターで、複数の反復的な形質導入を用いて形質転換してもよく、例えば、宿主細胞は、少なくとも１つのウイルスベクターを用いて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の回数、形質転換される。宿主細胞集団に対する複数の反復的な形質転換の使用によって、宿主細胞ゲノムへ組み込まれたウイルスベクターの少なくとも１つのコピーを含む細胞の割合が増大し得る。
【００３０】
前述の実施形態のいずれかでは、本明細書に開示のような組換え細胞集団は、少なくとも２つの異なる細胞集団（ここで各々の細胞は異なる組換えタンパク質を産生できる）を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上細胞集団（各々の細胞集団は、異なるタンパク質を産生する）を含む。宿主細胞集団が、複数のベクターで形質転換された特定の実施形態では、宿主細胞の集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の異なるタンパク質を産生できる場合がある。この組換えタンパク質は、抗体であっても、Ｔ細胞レセプターであっても、またはワクチン中へ封入される因子であってもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも２つの異なる細胞集団（各々の細胞集団は、抗体を産生できる）を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の細胞集団（各々の細胞集団は、異なる抗体を産生する）を含んでもよい。例示的なポリクローナル抗体組成物では、２つ以上の抗体が、同じ、同様もしくは異なる抗原性エピトープ、またはそれらの組み合わせに結合し得る。抗体が、異なる抗原性エピトープに結合する場合、このエピトープは、１つ以上の標的ポリペプチド上にあってもよい。いくつかの実施形態では、組換え抗体組成物中の１つ以上の抗体は、抗原結合フラグメントであってもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも２つの異なる細胞集団（ここで各々の細胞集団は、ワクチンに含まれるべき異なる組換えタンパク質を産生できる）を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の細胞集団（各々の細胞集団は、ワクチンへの封入のための異なる組換えタンパク質を産生する）を含んでもよい。例えば、組換えタンパク質は、同じ病原体の１つ以上の感染因子、所定の感染因子の改変体（例えば、変異体型）、または異なる感染因子を模倣し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、組換え細胞集団は、各々の細胞集団が、Ｔ細胞レセプターを産生できる、少なくとも２つの異なる細胞集団を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の細胞集団（各々の細胞集団は、異なるＴ細胞レセプターを産生する）を含んでもよい。Ｔ細胞レセプターは、主要組織適合性複合体分子に結合した、同じ、同様もしくは異なる抗原、またはそれらの組み合わせを認識し得る。ポリクローナルＴ細胞レセプター組成物は、α−βヘテロ二量体およびγ−δヘテロ二量体の組み合わせであってもよい。
【００３４】
少なくとも２つの個々の細胞集団は、組換えポリクローナル細胞集団を生成するため、１：１の比、または１：１とは異なる比で混合され得る。例示的な実施形態では、この組換えポリクローナル細胞集団は、少なくとも１００個の細胞、少なくとも１，０００個の細胞、少なくとも１０，０００個の細胞、少なくとも１００，０００個の細胞、少なくとも百万個の細胞、少なくとも一千万個の細胞、少なくとも二千万個の細胞、またはそれ以上の細胞を含んでもよい。例示的な実施形態では、個々の細胞集団は、ポリクローナル細胞集団中に等しく存在する。
【００３５】
組換え細胞集団は、将来の試験、スクリーニング、製造または使用（例えば、治療用ポリクローナル抗体、ワクチン製造など）を含むその他の使用のためにバンキングされてもよい。例示的な実施形態では、個々の細胞株は、組換えポリクローナル細胞集団の生成前にはバンキングされない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、この方法は、ポリクローナルタンパク質組成物をポリクローナル細胞集団から精製することを包含する。
【００３７】
本発明のこれらならびに他の態様および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲によって示される。本明細書において用いる場合、「含んでいる、包含している」とは、限定のないことを意味し、言及される例は非限定的である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質が培養細胞中の外因性ＤＮＡ配列の安定な発現を増強することを示しているグラフである。
【図２】図２は、非ウイルスＡＡＶ組み込みが１１週の期間にわたって安定な抗体発現を生じることを示しているグラフである。
【図３】図３は、一連のクロマトグラフ（Ａ）およびグラフ（Ｂ−Ｃ）であって、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系を用いて産生された安定なポリクローナル細胞集団の産生を示している。この安定なポリクローナル細胞集団は、４つの異なる細胞集団の混合物（各々が異なる抗体、例えば、抗体４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２を発現する）を含む。（Ａ）は、ポリクローナル細胞集団の生成３日後〜３５日後の間に得られる一連のＩＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。（Ｂ）は、各々の抗体のピーク下面積を示しており、これを用いて、総集団内の各々の抗体の割合を経時的に算出した。（Ｃ）は、実験の全経過にわたり集団内の各々の抗体の平均割合を示す。
【図４】図４は、一連のクロマトグラフ（Ａ）およびグラフ（Ｂ〜Ｃ）であって、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ／ｐ５ベクター系を用いて産生される安定なポリクローナル細胞集団含有の産生を示している。この安定なポリクローナル細胞集団は、４つの異なる細胞集団の混合物（各々が異なる抗体、例えば、抗体４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２を発現する）を含む。（Ａ）は、ポリクローナル細胞集団の生成３日後〜３５日後との間に得られる一連のＩＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。（Ｂ）は、各々の抗体のピーク下面積を示しており、これを用いて、総集団内の各々の抗体の割合を経時的に算出した。（Ｃ）は、実験の全経過にわたり集団内の各々の抗体の平均割合を示す。
【図５】図５は、一連のグラフであって、これは、安定なポリクローナルの集団が、個々のモノクローナル細胞集団を選択する前に生成され得ることを示している。（Ａ）は、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系を用いて、ポリクローナル細胞集団における構成要素の抗体の比を示しており、ここでは個々の細胞が、Ｇ４１８を用いる選択の前に混合された。（Ｂ）は、（Ａ）からの平均抗体の比を経時的に示す。（Ｃ）は、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ／ｐ５ベクター系を用いて、ポリクローナル細胞集団における構成要素の抗体の比を示しており、ここでは個々の細胞が、Ｇ４１８を用いる選択の前に混合された。（Ｄ）は、（Ｃ）からの平均抗体の比を経時的に示す。
【図６】図６は、一連のグラフであって、これは、ポリクローナル細胞の集団の再現性を示している。（Ａ）は、４つの抗体４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２を発現するポリクローナル細胞集団における構成要素抗体の比を経時的に示す。（Ｂ）は、新鮮および凍結／解凍培養物におけるポリクローナル細胞集団の構成要素の抗体の比を示す。
【図７】図７は、抗体の複雑な混合物が、ポリクローナル細胞集団から精製され得ることを示しているグラフである（例えば、上清画分（未精製）と精製画分とを比較する）。
【図８】図８は、ポリクローナル細胞集団が、細胞集団を維持するための選択圧の非存在下で安定であることを示しているグラフである
【化１】
2014501505.tif 000002
【図９】図９は、ＡＡＶＲｅｐ依存性の組み込みが、タンパク質発現レベルの増強をもたらすことを示しているグラフである
【化２】
2014501505.tif 000003
【図１０】図１０は、ＡＡＶエレメントが、細胞ゲノムへの外因性ＤＮＡの組み込み有効性を向上させることを示しているグラフである。
【図１１】図１１は、レトロウイルスのインテグラーゼを用いて形質導入されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞におけるＧＦＰの一定の発現を、２７日間にわたって示しているグラフである。
【図１２】図１２は、レトロウイルスのインテグラーゼを用いて産生されたポリクローナル細胞集団の個々の抗体構成要素（例えば、抗体４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２）を示している一連のＨＰＬＣクロマトグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、グラフ（Ａ）を示しており、これらは、抗体ベクターの形質導入有効性のレベルおよびそれらの個々の発現された抗体プロフィールを示している。（Ａ）はレトロウイルスインテグラーゼでの形質導入の４日および７日後、ＦＩＴＣ陽性染色したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞の平均パーセントを示しているグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、一連のクロマトグラム（Ｂ）を示しており、抗体ベクターの形質導入有効性のレベルおよびそれらの個々の発現された抗体プロフィールを示している。（Ｂ）は、ラムダ抗体（５．５５．Ｄ２）およびκ抗体（２６．３．Ｅ２）の形質導入の４日および７日後の一連のＦＡＣＳ散布図およびＦＩＴＣ−ヒストグラムである。
【図１４】図１４は、以下のエレメントを含んでいるｐＥｘｃｅｌ抗体発現ベクターの模式図である：ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ＝細菌の複製起点；ＣＭＶ＝ＣＭＶエンハンサー；ｈＦｅｒＬ＝耐性遺伝子の発現を駆動する、ｈＦｅｒＬ真核生物コアプロモーター；ＥＭ７＝耐性遺伝子の発現を駆動する、細菌プロモーター；Ｎｅｏ／Ｋａｎ：ネオマイシン（真核生物）／カナマイシン（原核生物）耐性遺伝子；ＢグロビンｐＡ＝βグロビンポリアデニル化配列；ｈＥＦ１α＝ヒトＥＦ１αプロモーター；重鎖リーダー（Ｈｅａｖｙ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ＶｈＸ由来のリーダー；軽鎖リーダー（Ｌｉｇｈｔ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ｋＸ由来のリーダー；可変重鎖＝制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域；ｈＩＧ１定常重鎖（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｈｅａｖｙ）＝ヒトＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡ；ＳＶ４０  ｐＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列；ＢＧＨ  ｐＡ＝ＢＧＨポリアデニル化配列；軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）＝制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域；ならびにｒＥＦ１α＝ラットＥＦ１αプロモーター（イントロンおよびエキソンは、ＥＦ１αプロモーターおよびリーダーについてアノテーションされる）。
【図１５】図１５は、以下のエレメントを含んでいるｐＥＸＣＥＬ／ＩＴＲ発現ベクターの模式図である：左ＩＴＲ（Ｌｅｆｔ  ＩＴＲ）および右ＩＴＲ（Ｒｉｇｈｔ  ＩＴＲ）＝ＡＡＶ２由来の逆方向末端反復配列；ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ＝細菌の複製起点；ＣＭＶ＝ＣＭＶエンハンサー；ｈＦｅｒＬ＝耐性遺伝子の発現を駆動する、ｈＦｅｒＬ真核生物コアプロモーター；ＥＭ７＝耐性遺伝子の発現を駆動する、細菌プロモーター；Ｎｅｏ／Ｋａｎ：ネオマイシン（真核生物）／カナマイシン（原核生物）耐性遺伝子；ＢグロビンｐＡ＝βグロビンポリアデニル化配列；ｈＥＦ１α＝ヒトＥＦ１αプロモーター；重鎖リーダー（Ｈｅａｖｙ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、Ｖｈ５−５１由来のリーダー；軽鎖リーダー（Ｌｉｇｈｔ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ｋ２−０５由来のリーダー；可変重鎖＝制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域；ｈＩＧ１定常重鎖（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｈｅａｖｙ）＝ヒトＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡ；ＢＧＨ  ｐＡ＝ＢＧＨポリアデニル化配列ＳＶ４０  ｐＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列；軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）＝制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域；ならびにｒＥＦ１α＝ラットＥＦ１αプロモーター（イントロンおよびエキソンは、ＥＦ１αプロモーターおよびリーダーについてアノテーションされる）。
【図１６】図１６は、ｐＥＸＣＥＬ−ＩＴＲ／ｐ５の模式図であって、ｐＥＸＣＥＬ−ＩＴＲの各々のエレメントに加えてＡＡＶ２のｐ５プロモーター領域由来のｐ５ＩＥＥ：ｐ５組み込み有効性エレメント（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでいる。
【図１７】図１７は、Ｒｅｐ７８ベクターの模式図であって、以下のエレメントを含んでいる：ＳＶ４０プロモーター＝Ｒｅｐ７８由来の真核生物プロモーター；Ｒｅｐ７８＝ＡＡＶ２由来のＲｅｐ７８のコード配列；ＳＶ４０後期ｐＡ＝ＳＶ４０由来の後期ポリアデニル化配列；Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子および細菌プロモーター；ならびにＯＲＩ＝細菌の複製起点の開始部位。
【図１８】図１８は、以下のエレメントを含んでいるレトロウイルスベクターであるｐ４８６ベクターの模式図である：ＣＭＶ＝ＣＭＶ最初期プロモーター（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）；ＧＦＰ＝ＧＦＰ遺伝子；ＩＲＥＳ  ＥＭＣＶ＝脳心筋炎ウイルス配列内リボソーム進入部位；ネオマイシン−Ｒ＝ネオマイシン耐性遺伝子；３’ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲ（Ｕ３欠失）＝エンハンサーＵ３領域に欠失を有するモロニーマウス白血病ウイルス由来の３’長末端反復配列（ＬＴＲ）領域；ＳＶ４０プロモーター＝シミアンウイルス４０プロモーター配列；ＳＶ４０  ｏｒｉ＝シミアンウイルス４０複製起点；ＣｏｌＥ１  Ｏｒｉ＝コリシンＥ１複製起点；ＣＭＶ／ＭＳＶハイブリッドプロモーター、ＣＭＶ／ＭＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｒ領域およびＵ５領域＝サイトメガロウイルスおよびマウス肉腫ウイルス由来のハイブリッド５’長末端反復配列の構成要素；Ｐｓｉ＋伸長パッケージングシグナル（Ｐｓｉ＋Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ）＝レトロウイルスパッケージングシグナル。
【図１９】図１９は、以下のエレメントを含んでいるレトロウイルスベクターであるｐ５４３の模式図である：ＣＭＶ＝ＣＭＶ最初期プロモーター（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）；ＧＦＰ＝ＧＦＰ遺伝子；ＩＲＥＳ  ＥＭＣＶ＝脳心筋炎ウイルス配列内リボソーム進入部位；３’ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲ（Ｕ３欠失）＝エンハンサーＵ３領域に欠失を有するモロニーマウス白血病ウイルス由来の３’長末端反復配列（ＬＴＲ）領域；ＳＶ４０プロモーター＝シミアンウイルス４０プロモーター配列；ＳＶ４０  ｏｒｉ＝シミアンウイルス４０複製起点；ＣｏｌＥ１  Ｏｒｉ＝コリシンＥ１複製起点；ＣＭＶ／ＭＳＶハイブリッドプロモーター、ＣＭＶ／ＭＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｒ領域およびＵ５領域＝サイトメガロウイルスおよびマウス肉腫ウイルス由来のハイブリッド５’長末端反復配列の構成要素；Ｐｓｉ＋伸長パッケージングシグナル（Ｐｓｉ＋Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ）＝レトロウイルスパッケージングシグナル；軽鎖リーダー＝ヒトκリーダー配列；軽鎖＝制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域；ｈＡｐリーダー＝ヒトアルカリホスファターゼリーダー配列；可変重鎖＝制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域；ｈＩＧ１定常重鎖（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｈｅａｖｙ）＝ヒトＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡ。
【図２０】図２０は、以下のエレメントを含んでいるレトロウイルスベクターであるｐ４９８の模式図である：ＣＭＶ＝ＣＭＶ最初期プロモーター（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）；軽鎖リーダー＝ヒトκリーダー配列；軽鎖＝制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域；ｈＡｐリーダー＝ヒトアルカリホスファターゼリーダー配列；ＩＲＥＳ  ＥＭＣＶ＝脳心筋炎ウイルス配列内リボソーム進入部位；ピューロマイシン−Ｒ＝ピューロマイシン耐性遺伝子；３’ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲ（Ｕ３欠失）＝エンハンサーＵ３領域に欠失を有するモロニーマウス白血病ウイルス由来の３’長末端反復配列（ＬＴＲ）領域；ＳＶ４０プロモーター＝シミアンウイルス４０プロモーター配列；ＳＶ４０  ｏｒｉ＝シミアンウイルス４０複製起点；ＣｏｌＥ１  Ｏｒｉ＝コリシンＥ１複製起点；ＣＭＶ／ＭＳＶハイブリッドプロモーター、ＣＭＶ／ＭＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｒ領域およびＵ５領域＝サイトメガロウイルスおよびマウス肉腫ウイルス由来のハイブリッド５’長末端反復配列の構成要素；Ｐｓｉ＋伸長パッケージングシグナル（Ｐｓｉ＋Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ）＝レトロウイルスパッケージングシグナル。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書に開示されるのは、安定な細胞集団（例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団、および複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団）を産生するための方法、ならびに抗体、Ｔ細胞レセプターおよびワクチンのような組換えのポリクローナルタンパク質を産生するための方法である。この開示された方法によって、安定な細胞集団を産生するための公知の方法および／または組換えポリクローナルタンパク質を産生するための公知の方法を上回る有意な利点が得られる。なぜなら開示された方法は、クローン選択（すなわち、個々の細胞クローン（前駆細胞）（次に個々の細胞株として増殖される）を選択する選択マーカーの使用）を必要としないからである。結果として、開示された方法は、個々の安定な細胞クローンの選択を要する方法よりも迅速かつ効果的である。
【００４０】
本明細書に記載されるとおり、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドのいずれかを発現する安定な細胞集団は、個々の形質転換された細胞の大集団から生成され得、これによって安定な細胞集団を調製し、かつ維持するための驚くべき利点が得られる。さらに、開示された方法を用いて生成される細胞集団は、経時的に集団中の特定の細胞に対するバイアスなしに維持され得ることは予想外であった。さらに、本開示の方法では、細胞の大集団を用いて安定な細胞集団（本明細書では、「組換えポリクローナル細胞集団」または「ポリクローナル細胞集団」と呼ばれる）を生成するので、個々の細胞株（例えば、選択プロセスを用いて単一の前駆細胞から生成された個々のクローン細胞株）のバンキングの必要はない。
【００４１】
本明細書に記載される、組換え細胞集団（例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団）は、大型だが有限の集団の進化動態で概説されるように、特定の数学的限界内で挙動する（例えば、進化的に安定な集団を維持するために、変異体が、進化的に適合が乏しい場合に、その基準を規定している初期モデルを記載している、Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，（１９７４）Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．４７：２０９〜２２１；Ｎａｓｈ均衡を用いることによって、有限だが大型の集団が安定なままであり得ることを数学的に決定することが容易であったことを記述している、Ｃｒａｗｆｏｒｄ（１９９０）Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１４５：８３−９４；変異の逸脱が、集団サイズの増大とともに増大する特定の閾値を超える場合にのみ、ある集団を凌駕し得るということを示した、Ｎｏｗａｋら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４２８：６４６〜６５０およびＬｅｓｓａｒｄ（２００５）Ｔｈｅｏｒ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌ．６８：１９−２７を参照のこと）。これらのモデルによれば、有限だが大きい類似のタイプの集団を混合した場合、ある限られた時間の長さにわたって安定なままであるという可能性が高い；しかしこの時間の長さは、十分に大きい集団の状況では本質的に無限であり得る。
【００４２】
理論的に束縛されることは望まないが、安定な進化挙動のモデルが、大きい個々の形質転換細胞集団で開始することによって、組換え細胞集団（例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団）に適用され得る。ポリクローナル細胞集団に関しては、個々の細胞集団は、増殖およびタンパク質発現に関して同様のプロフィールを有する組換えポリクローナルタンパク質の発現への実際の適用に基づいて、関連付けてもよい。本明細書では、各々の構成要素の細胞集団の比は、細胞集団の混合物を得るために、所望されるとおりに（すなわち各々が単一のタンパク質を発現し、全体として所望されるどのような比ででも複数のタンパク質の所定の安定な混合物を発現させるように）調節可能であると、想定されている。例えば、組換えポリクローナル細胞集団が、組換えポリクローナル抗体を産生するための細胞集団である場合、単一の抗体を各々が産生する、個々の細胞集団の比は、ポリクローナル混合物中の個々の抗体の役割を考慮して、治療上有効なポリクローナル抗体集団を生成するように調節できる。
【００４３】
開示される方法は、ポリクローナル細胞集団中のバランスを達成するように設計される。例えば、バランスは、抗体のような複数の構成要素タンパク質を作製する場合、および異なる抗体を含有する混合細胞集団中の両方で必要である。ポリクローナル細胞集団中のバランスは、安定な個々の細胞集団を生成することによって、次いで安定な個々の細胞集団を混合して、ポリクローナル細胞集団を得ることによって達成され得る。個々の細胞集団およびポリクローナル細胞集団の両方で安定性を達成するために、両方の集団の進化動態を考慮しなければならない。本明細書で開示されるように、同様の細胞の大集団が混合される場合、それらは、集団中での特定の細胞に対する経時的なバイアスなしに、限られた時間の長さにわたって安定なままである、という事実が驚くべきことに発見された；しかし、時間の長さは、十分に大きい集団の状況では本質的に無限であり得る。
【００４４】
安定なポリクローナル細胞集団は、十分な数の個々の細胞を用いて細胞集団を生成する場合、本明細書に記載のように継続して生成されてもよい。本明細書では、１０，０００個を超える個々の細胞を有する細胞集団が混合される場合、合わせた細胞集団は、安定なポリクローナル細胞集団を生じて、限られた時間の間（ポリクローナルタンパク質の生産プロセスにおいて、それは本質的に無限である）に、このようなポリクローナルタンパク質産物を生成する。
【００４５】
例示的な実施形態では、本明細書に記載される安定な細胞集団は、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含んでいる少なくとも１つのベクターの、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの優先的な組み込みを用いて、宿主細胞の集団を形質転換して、個々の形質転換された細胞の大集団を生成することによって得られる。優先的組み込みを用いる開示された方法を用いて、単一の組換えポリペプチドおよび複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団を生成してもよい。優先的組み込みのための例示的なベクターは、下に詳細に記載される。
【００４６】
開示された方法のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。これらの定義は、当業者によって、開示の残りの部分と照合して読まれ、理解されるべきである。他に規定されない場合には、本明細書に用いられる全ての技術および化学的用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００４７】
「細胞株」という用語は、本明細書において用いる場合、単一の前駆細胞由来の細胞の集団を指す。当業者は、所定の細胞株中に含まれる細胞が単一の前駆細胞由来であるので、その細胞株中の細胞の各々は、少なくとも最初は、同じゲノム特徴を共有していることを理解するであろう（例えば、Ｐｏｓｔｅら、ＰＮＡＳ  １９８１  ７８：６２２６〜６２３０を参照のこと）。細胞株は典型的には、個々の前駆細胞クローンを選択することによって（例えば、選択マーカー、例えば、抗生物質選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、またはハイグロマイシンを用いて）生成される。次いで、この個々の前駆細胞クローンを培養して、目的の遺伝子産物を産生できる細胞株を増殖する。
【００４８】
「細胞集団」、「細胞混合物」、「形質転換された細胞集団」および「組換え細胞集団」という用語は、本明細書において用いる場合、共通の遺伝的背景を共有するが、遺伝子的に同一ではない細胞の集団を指す。単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団では、目的のＤＮＡフラグメントは、複数の細胞に組み込まれ（ここで各々の細胞における組み込み部位は、ゲノムの１つ以上の位置であってもよい）、これによって遺伝子的に同一ではない集団の細胞が創出される。細胞集団とは、個々のタンパク質細胞由来ではなく、および／または同じゲノム内容物を有する細胞から構成されていないので、細胞株とは異なる。例えば、本明細書に記載される細胞集団では、単一の前駆細胞を特定するための選択プロセス、およびその後の単一の前駆細胞のクローン増殖はない。本明細書に記載される細胞集団は、むしろ細胞の混合物であり、この混合物中の各々の細胞は、ゲノム中の１つ以上の位置に組み込まれているＤＮＡを有し得る。単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性は、個体群動態学によって達成される。
【００４９】
例示的な実施形態では、本明細書に記載される細胞集団，細胞混合物または形質転換された細胞集団は、例えば、複数の組換えポリペプチドを発現するポリクローナルであってもよい。ポリクローナルの細胞集団では、目的の２つ以上のＤＮＡフラグメントを、複数の細胞に組み込んで（ここで各々の細胞における組み込み部位は、ゲノム中の１つ以上の位置である）、遺伝子的に同一ではない細胞を創出してもよい。本明細書に記載されるポリクローナル細胞集団は、２つ以上のモノクローナル細胞集団を混合することによって生成され得る。あるいは、ポリクローナル細胞集団は、バルクの質転換手順によって生成されてもよく、その場合、目的の複数のＤＮＡフラグメントが、複数の宿主細胞に組み込まれる（例えば、宿主細胞１つあたり目的のＤＮＡフラグメントが１つ）。本明細書に記載されるポリクローナル細胞集団は、個々の前駆細胞を特定するための選択プロセスも、その後の個々の細胞株のクローン増殖も必要としない（例えば、ポリクローナル細胞集団は、各々が個々の前駆体細胞に由来する個々の細胞株の混合物ではない）。ポリクローナル細胞集団の安定性は、個体群動態学によって達成される。
【００５０】
本明細書に用いられる「形質転換」という用語は、外来ＤＮＡを細胞に導入するための任意の方法を指す。本明細書において用いる場合、「形質転換」とは、トランスフェクション、感染、形質導入またはドナー細胞とアクセプター細胞との融合を含めて、外来ＤＮＡを細胞に導入するための方法を包含する広義の用語である。
【００５１】
「ランダム組み込み」という用語は、本明細書において用いる場合、目的のＤＮＡフラグメント（例えば、目的のタンパク質をコードする部分的または完全なＤＮＡ）を細胞のゲノムに組み込むプロセスであって、このＤＮＡのフラグメントが、そのゲノムの任意の一部に等しい確率で組み込まれ得るプロセスを指す。当業者は、ランダムな組み込みが、形質転換手順を指しており、宿主細胞ゲノム中の所定の位置へ発現構築物をガイドすることは一切行われないことを理解するであろう。例えば、特定の実施形態では、ランダムな組み込みとは、天然の組み込み部位に影響する外因的に追加された配列または酵素の補助なしに、宿主細胞の機構によって自然に行われる組み込みプロセスを指す（Ｈ．Ｗｕｒｔｅｔｌｅ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００３，１０：１７９１〜１７９９）。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「部位特異的組み込み」という用語は、目的のＤＮＡフラグメント（例えば、目的のタンパク質をコードする部分的または完全なＤＮＡ）を細胞のゲノムに組み込むプロセスであって、目的のＤＮＡのフラグメントが、そのゲノム中の特定の配列に標的にされるプロセスを指す。この特定の標的配列は、ゲノム中に天然に存在してもよいし、または宿主細胞のゲノム中に遺伝子操作（例えば、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介性組み込みのために、細胞のゲノムへＦＲＴ部位を遺伝子操作）されてもよい。
【００５３】
部位特異的組み込みの例は、宿主細胞ゲノム中の特定の部位へ目的のＤＮＡフラグメントを標的組み込みするためのＦｌｐリコンビナーゼの使用である。組み込みの特異的な部位は、ＦＲＴ部位として公知のＤＮＡ配列で生じる。ＦＬＰは、ＦＲＴ部位に対して極めて特異的であるという点で、インテグラーゼの中でも例外である。ＦＲＴ部位へのＤＮＡの部位特異的な組み込みは、標的組み込みのためにＤＮＡフラグメント中にＦＲＴ部位ＤＮＡ配列を含むことによって達成し得る。しかし、ＦＲＴ部位は、ほとんどのゲノムでは天然には存在しないので、典型的には、ＦＲＴ部位は、目的のＤＮＡフラグメントの導入前に目的の宿主細胞のゲノムに組み込まれなければならない。
【００５４】
「優先的組み込み（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、目的のＤＮＡフラグメント（例えば、目的のタンパク質をコードする部分的または完全なＤＮＡ）を細胞のゲノムに組み込むプロセスを指し、この場合、ＤＮＡのフラグメントは、ゲノムの所定の領域を標的とする（ただし、単一の規定の部位、例えば、ＦＲＴ部位は標的とされない）。本明細書において用いる場合、優先的な組み込みは、ランダムな組換え事象ではない。なぜなら、目的のＤＮＡは、宿主細胞ゲノム中の規定の領域または特異的な部位に組み込まれる可能性が増大しているからである。優先的な組み込みはまた、組み込み部位での変動があるので、部位特異的な組み込みとは異なる。
【００５５】
優先的組み込みの例としては、ＡＡＶｒｅｐタンパク質（単数または複数）によるＡＡＶシステムを用いる組み込みが挙げられる。ＡＡＶＳ１部位への安定な組み込みは、逆方向末端反復または「ＩＴＲ」配列によって媒介され、各々のＩＴＲ配列は、１４５塩基対を含む（例えば、Ｂｏｈｅｎｚｋｙら、（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６６（２）：３１６〜２７；Ｗａｎｇ，ＸＳら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０（５）：５７３〜８０；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，ＭＤら、（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１（１３）：５８０８〜１２）。近年のデータでは、ＡＡＶベクターは、宿主細胞へ、そして染色体１９上に位置するＡＡＶＳ１部位のようなｒｅｐ標的配列（「ＲＴＳ」）へ、約１０％の効率で（残りの９０％は、ヒトゲノムにまたがるタンパク質のＲＴＳ部位にまたがってひろがる）、組み込むことが示唆されている（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＲＨ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，８１７〜８２２およびＨｕｅｓｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６（７）：ｅ１０００９８５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１０００９８５に記載のとおり）。
【００５６】
優先的組み込みの他の例としては、レトロウイルスベクター系の使用（ここでレトロウイルスベクターは、総ゲノムの約５％を包含する開口クロマチンドメインへ組み込まれる）；ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間で組換えを行う、ファージインテグラーゼΦＣ３１またはλインテグラーゼの使用（Ａ．Ｃ．Ｇｒｏｔｈら、ＰＮＡＳ，２０００，９７：５９９９５〜６０００）；ならびにＣｒｅリコンビナーゼおよび種々のｌｏｘ部位、例えば、バクテリオファージＰ１由来のｌｏｘＰまたはそれらの改変体もしくは変異体、例えば、ｌｏｘ４３、ｌｏｘ４４、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ７５、ｌｏｘ７６、およびｌｏｘ５１１（Ｃ．ＧｏｒｍａｎおよびＣ．Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００：１１：４５５〜４６０）の使用が挙げられる。優先的組み込みにおける相違はまた、特定のレトロウイルスのインテグラーゼで観察され得、例えば、ＨＩＶは好ましくは、発現された遺伝子中でリッチな染色体領域に組み込まれ、ＭＭＬＶは好ましくは、転写開始部位付近に組み込まれ、そしてＡＳＬＶは、活性な遺伝子について弱い優先度（ただし、転写開始領域に関する優先度はない）で組み込まれる（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ，２００４，２：ｅ２３４）。
【００５７】
Ｉ．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、目的の少なくとも１つのポリペプチドをコードするように構築される。本明細書において用いる場合、「目的のポリペプチド」および「目的のタンパク質」という用語は、目的の核酸または遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。本明細書において開示された方法は、組換えのポリクローナル細胞集団によって発現され得るポリペプチドまたはタンパク質の種類によって限定されないと想定されている。目的の例示的なタンパク質としては、抗体（免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む）またはそのフラグメント、Ｔ細胞レセプター分子、およびワクチンのタンパク質成分が挙げられる。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素」という用語は、ポリクローナルタンパク質の組成物中に含まれるタンパク質を指す。このタンパク質は、単一のポリペプチドを含んでもよいし、または２つ以上のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であってもよい。例示的な多量体タンパク質としては、抗体およびＴ細胞レセプターが挙げられる。例えば、インタクトな四量体抗体は、特定の標的ポリペプチドに一緒に結合する、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖と呼ばれる、２つの異なるポリペプチド配列から産生される。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、２つのポリペプチド鎖を含んでいるヘテロ二量体タンパク質である（例えば、このヘテロ二量体は、αおよびβのポリペプチド鎖またはγおよびδのポリペプチド鎖を含んでもよい）。
【００５９】
ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素が単一のポリペプチドを含む場合、このタンパク質の構成要素は、単一の発現ベクターによってコードされてもよい。例えば、この発現ベクターは、目的の単一のポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含んでもよい。
【００６０】
単一の発現ベクターが２つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでもよいということも想定されている。例えば、単一の発現ベクターは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の配列の両方をコードする核酸配列、またはＴＣＲの両方のポリペプチド鎖をコードする核酸配列のうちの少なくとも１つのコピーを含んでもよい。発現ベクターが、目的の２つ以上の核酸を含む場合（例えば、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方、またはＴＣＲの両方の鎖）、目的の核酸は、ポリシストロン性配列でベクター中に配列されてもよく、必要に応じて、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられてもよい。あるいは、目的の各々の核酸は、個々の調節性エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列）の制御下でベクター中に配列されてもよい。いくつかの実施形態では、目的の各々の核酸は、ベクター中に同じ方向で、ただし個々の調節性エレメントの制御下で配列されてもよい。他の実施形態では、目的の各々の核酸は、ベクター中に反対方向で配列されてもよい。
【００６１】
あるいは、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素は、２つ以上の発現ベクターによってコードされてもよい。例えば、ポリクローナル組成物の構成要素が多量体タンパク質である場合、２つ以上のポリペプチドが少なくとも２つの異なる発現ベクター上にコードされてもよく（例えば、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、別々のベクター上にコードされる）。従って、多量体タンパク質の個々のポリペプチド鎖が２つ以上のベクターに含まれる場合、当業者は、両方のベクターとも、同じ宿主細胞中に形質転換されて、多量体タンパク質を生成することを理解するであろう。
【００６２】
例示的な実施形態では、一緒になって単一の多量体タンパク質（例えば、抗体またはＴＣＲ）を形成する複数のポリペプチドをコードするために、ベクターのライブラリーを用いてもよい。例えば、ベクターのライブラリーは、各々のベクターが１つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含む、複数のベクターを含んでもよい。当業者は、ベクターのライブラリーが、単一の宿主細胞中にトランスフェクトされて、多量体タンパク質を生成し得ることを理解するであろう。
【００６３】
例示的な発現ベクターとしては、宿主細胞ゲノムへ組み込み得るウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターおよび一本鎖ＤＮＡウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）が挙げられる。
【００６４】
例示的なレトロウイルスベクター（レトロベクターとしても公知）は、レトロウイルス類、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、およびレンチウイルス類（宿主細胞のゲノムへ組み込み得る）由来であり得る。レトロウイルス類は、細胞へＤＮＡフラグメントを導入し、かつそれらをウイルスのコードするインテグラーゼ酵素の活性を通じてゲノムに組み込み得る。インテグラーゼ媒介性のプロウイルス組み込みは、ランダム組み込みまたはリコンビナーゼベースの方法と比較してはるかに効率的である。レトロウイルス組み込みは、開口クロマチンの領域で優先的に生じ、これは他の方法と比較して低率の発現サイレンシングをもたらす。レトロウイルス組み込みは、ゲノムを通じて単一部位で生じても、複数部位で生じてもよく、コピー数は、複数回の形質導入またはより多数の感染を通じて増大され得る（下に詳細に考察）。
【００６５】
種々のレトロウイルスベクターが当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、複製欠損（例えば、ウイルス複製の必須遺伝子、例えば、ウイルス粒子の構造、レプリカトリー（ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｙ）およびＤＮＡ修飾タンパク質をコードする遺伝子が欠失されるか、または無効にされる）であってもよい。当業者は、このような遺伝子の欠失が、目的のＤＮＡの挿入のためにベクター中でスペースを提供し得ることを理解する（例えば、８〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメント）。このウイルス粒子構造、レプリカトリー（ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｙ）およびＤＮＡ修復タンパク質は、ウィルス粒子のタンパク質をコードする核酸の一過性の同時トランスフェクションを通じて（例えば、インテグラーゼタンパク質は、別のＤＮＡベクター上にコードされる）、または組換えタンパク質として、ウイルスパッケージングの間に、パッケージング細胞株中にトランスで提供される。この方法を用いれば、高いウイルス力価を達成することが可能である。この方法でパッケージングされたレトロウイルスを用いて細胞集団を繰り返し感染することによって、複数のゲノム挿入が達成され得、これによって、目的の組換えタンパク質の安定かつ高レベルの発現がもたらされる。これは、プラスミドコードｃＤＮＡの多数のコピーのトランスフェクションおよび組み込みを通じて、または遺伝子増幅方法を通じて生み出される細胞株の特徴である不安定性とは対照的である。
【００６６】
一般には、レトロウイルスベクターは、「長末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）」または「ＬＴＲ」配列（すなわち、５’および３’のＬＴＲ）に隣接される目的の２つ以上の遺伝子を含む。本発明のレトロウイルスベクターは、特定のＬＴＲに限定されないと想定されている。例示的なＬＴＲとしては、限定するものではないが、ＭｏＭＬＶ、ＭｏＭｕＳＶ、ＭＭＴＶ、ＨＩＶおよびウマ伝染性貧血ＬＴＲが挙げられる。ＬＴＲは、ウイルスのゲノムＲＮＡの会合に必要な配列、逆転写酵素およびインテグラーゼ機能、ならびにウイルス粒子にパッケージングされるべきゲノムＲＮＡの発現の指向に関与する配列を含み得る。例示的なレトロウイルスベクターは、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，８５２，５１０号、および同第７，３７８，２７３号に開示される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、Ｇ糖タンパク質を含んでいる偽型レトロウイルスベクターであってもよい（例えば、このＧ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス、ピリー（Ｐｉｒｙ）ウイルス、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルス、コイ春季ウイルス血症ウイルス、およびモコラウイルスのＧ糖タンパク質からなる群より選択され得る）。
【００６８】
他のウイルスベクターおよび形質導入方法もまた記載されており、これには、レンチウイルス系（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ビスナウイルス、およびジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ））が挙げられる。レンチウイルスベクターおよび系は、非分裂性の、最終的に分化された細胞に感染する能力、およびインテグラーゼベースの機構を通じてゲノムへ挿入する能力の故に興味深い。ＨＩＶベースの系は、ヒト臨床産物の産生および遺伝子療法適用に関していくつかの安全性の懸念を提起するが、多数の関連の動物ウイルスが、これらの目的で開発されている（例えば、Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１４８１〜１４８７を参照のこと）。追加的に、イントロンのような、レトロウイルスビリオンでは通常見出されないさらなるエレメントを、当該分野で公知の方法を用いて組み込んでもよい（Ｂｌｏら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７，２６：７７３〜９）。
【００６９】
あるいは、レトロウイルスエレメントは、ＤＮＡプラスミドでウイルス粒子を創出することなく用いられ得る。これらのＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列がレトロウイルスＬＴＲで置換されており、ｒｅｐタンパク質がレトロウイルスインテグラーゼで置換されていること以外は、上記のようにＡＡＶの二本鎖ＤＮＡプラスミドについて記載されたのと概念的に同様である。
【００７０】
あるいは、一本鎖ＤＮＡウイルス類を用いて、目的の核酸を宿主細胞ゲノムに組み込んでもよい。一本鎖ＤＮＡウイルス類としては、限定するものではないが、ＤＮＡウイルスのボルティモア分類システムで第ＩＩ群または第ＶＩＩ群に分類されるウイルスが挙げられる。第ＩＩ群のウイルスの例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびパルボウイルスが挙げられ、第ＶＩＩ群のウイルスの例としてはＢ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００７１】
例示的な一本鎖ＤＮＡウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、これは、分裂している細胞および非分裂細胞の両方に感染可能であり、かつＡＡＶＳ１と命名される、特定の部位（ヒト第１９染色体において、時間のほぼ１０％、残りの９０％はヒトゲノムにまたがる他のＲＴＳ部位に広がっている）で、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる能力を有している（Ｈｕｅｓｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６（７）：ｅｌ０００９８５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１０００９８５）。ＡＡＶＳ１部位への安定な組み込みは、逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）すなわち「ＩＴＲ」配列によって媒介され、各々のＩＴＲ配列は、１４５塩基対を含む（例えば、Ｂｏｈｅｎｚｋｙら，（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６６（２）：３１６〜２７；Ｗａｎｇ，ＸＳら，（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０（５）：５７３〜８０；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，ＭＤら，（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１（１３）：５８０８〜１２を参照のこと）。
【００７２】
ＡＡＶのＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は、当該分野で周知である（例えば、Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１）。例示的なＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、野性型核酸配列であってもよく、あるいは、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。ＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、限定するものではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７を含む任意のＡＡＶ血清型由来であってもよい。一般には、５’および３’のＩＴＲ配列は、目的の選択された核酸に隣接するが、当業者は、５’および３’のＩＴＲ配列が、同じＡＡＶ血清型由来であっても、または異なるＡＡＶ血清型由来であってもよいことを理解するであろう。
【００７３】
例示的なＡＡＶベクターが当該分野で周知であり、これには限定するものではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７が挙げられる（例えば、米国特許第６、８５２、５１０号を参照のこと）。
【００７４】
ＡＡＶのｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムのＡＡＶＳ１特異的な組み込みに必須であることが示された。ｒｅｐタンパク質は、シスで（すなわち、ＩＴＲ配列に隣接する目的の核酸と同じベクター上に）提供されてもよく、または、限定するものではないが、組換えタンパク質として、またはエピソームベクターを含む別のＤＮＡベクターのいずれかとしてトランスで提供されてもよい（例えば、Ｗｅｉｔｚｍａｎ，ＭＤら、上記；Ｚｈｏｕ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（４）：３２４１〜７を参照のこと）。
【００７５】
レトロウイルス類と同様に、ＡＡＶベクターのクローニング能力は、ウイルス遺伝子の置換から生じる。ＡＡＶベクターのクローニング能力は限られている（４．８キロベース（ｋｂ））が、挿入スペースは、ポリペプチドの発現に十分であり（例えば、免疫グロブリン軽鎖は、約６７０塩基対のｃＤＮＡによってコードされ、免疫グロブリン重鎖は、約１．２ｋｂのｃＤＮＡによってコードされる）、種々の調節性および発現エレメントの挿入用に約３．０ｋｂを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヘッド−ツー−テール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）コンカテマー（これはベクターのクローニング能力を倍化し得る）を形成するように配置された（例えば、アニーリングされた）２つ以上のゲノム由来のＩＴＲ配列を含むように設計され得る。
【００７６】
特定の実施形態では、ＡＡＶまたはレトロウイルスベクターからビリオンを生成しなければならないことによって具体化されるサイズ限界は、ＡＡＶｂのＩＴＲ、またはレトロウイルスベクターのＬＴＲを担持する二本鎖プラスミドＤＮＡベクターを創出し、インテグラーゼを提供することによって回避され得るが、この場合、ＡＡＶｒｅｐタンパク質またはレトロウイルスインテグラーゼは、ＤＮＡベクター上またはタンパク質としてのいずれかで、トランスである。例えば、図１５に示されるベクターマップは、このようなＩＴＲ二本鎖ＤＮＡベクターの１つを示し、図１７に示されるベクターマップは、ｒｅｐ発現プラスミドを示す。
【００７７】
目的の１つ以上の遺伝子（例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ分子）を含有するベクター（例えば、レトロベクターまたはＡＡＶベクター）を生成するために、公的に利用可能な、または以前に決定された配列情報を用いて化学的に合成してもよい。合成ＤＮＡ分子を、定常領域コード配列および発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列に連結して、所望のタンパク質をコードする従来の遺伝子発現構築物を生成してもよい。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質が抗体である場合、抗体配列は、Ｂ細胞、例えば、形質細胞、またはハイブリドーマから、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、合成核酸プローブ（その配列は本明細書に提供される配列情報に基づく）、またはＢ細胞もしくはハイブリドーマ細胞における抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に関する先行技術の配列情報を用いて、クローニングしてもよい。
【００７８】
規定の遺伝子構築物の産生は、当該分野の慣用的な技術に含まれる。所望の抗体をコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターの５’と３’ＬＴＲ配列の間、またはＡＡＶベクターの５’と３’ＩＴＲ配列の間で発現ベクターに組み込まれてもよい（連結されてもよい）。このベクターはまた、目的の遺伝子、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列、スプライシングシグナルなどの効率的な発現に必要な配列、および感染性ビリオンへウイルスＲＮＡを効率的にパッケージングするのに必要な配列を含んでもよい（例えば、パッケージングシグナル（Ｐｓｉ）、ｔＲＮＡプライマー結合部位（−ＰＢＳ）、逆転写に必要な３’調節性配列（＋ＰＢＳ））。
【００７９】
目的の１つ以上の遺伝子は、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような調節性エレメントに作動可能に連結され得る。本発明は、特定のプロモーターに限定されないものと想定されている。目的の遺伝子を発現するための適切なプロモーターとしては、限定するものではないが、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＦｅｒＬプロモーター、複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ  ＥＦ−１αの組み合わせ、ＳＶ４０エンハンサー、基本プロモーターおよび三分節リーダー複合プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、およびモロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復配列が挙げられる。目的の１つ以上の遺伝子を発現するための適切なエンハンサーとしては、ＳＶ４０およびＣＭＶエンハンサーが挙げられる。
【００８０】
ベクターとしてはまた、イントロンに関連するスプライシング配列が挙げられ、このようなイントロンの例は、βグロビンイントロン１、ＥＦ−１αイントロン１およびβアクチンイントロン１、および／または１つ以上のポリＡ配列、例えば、早期および後期ＳＶ４０ポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ、ヒト成長ホルモンポリＡ、ＥＦ−１αポリＡおよびチミジンキナーゼポリＡである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質の分泌が所望される場合、そのベクターは、シグナルペプチド配列を含むように改変されてもよい。一般には、シグナルペプチド配列は、約１５〜３０個の疎水性アミノ酸残基を含んでもよい。（例えば、Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉら，（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１６）：７９７３−７７，Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ  ３９（２）：２４７−５４［１９８５］、およびＭａｒｔｉａｌら，（１９７９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０５：６０２〜６０７を参照のこと）。シグナルペプチド配列は、当該分野で公知であり、これには、限定するものではないが、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、血清アルブミンα−カゼイン、分泌アルカリホスファターゼ、抗体κ、λまたは重鎖の生殖系列、およびα−ラクトアルブミン由来のシグナルペプチド配列を挙げることができる。
【００８２】
このベクターとしてはまた、ポリシストロン性ｍＲＮＡの翻訳の内部開始により、例えば、第二の遺伝子に由来する発現産物の産生を可能にするため、ポリシストロン遺伝子の間に位置する、追加の「配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）」すなわち「ＩＲＥＳ」配列を含んでもよい。ＩＲＥＳ配列を組み込んでいるベクターは当該分野で公知である。
【００８３】
このベクターとしてはまた、タンパク質生成物の酵素的切断により、例えば、第二の遺伝子に由来する発現産物の産生を可能にするため、ポリシストロン遺伝子の間に位置する、追加的な２／フリン配列を含んでもよい。２Ａ／フリン配列を組み込んでいるベクターは当該分野で公知である（Ｊｏｓｔｏｃｋら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）８７：１５１７〜１５２４）。
【００８４】
このベクターはまた、目的の遺伝子に対して５’または３’のいずれかでＲＮＡエクスポートエレメントを含むように改変され得る（例えば、米国特許第５，９１４，２６７号；同第６，１３６，５９７号；および同第５，６８６，１２０号；ならびにＷＯ９９／１４３１０を参照のこと）。ＲＮＡエクスポートエレメントの封入によって、目的のタンパク質をコードする核酸配列にスプライスシグナルもイントロンも組み込むことなく、目的のタンパク質の高い発現が生じ得る。
【００８５】
例示的な実施形態では、本発明のベクターは、形質転換された細胞の選択を提供する選択マーカーを含まない。
【００８６】
上記で考察されたとおり、一般には、レトロウイルスベクターは、以下の構造を有し得る：
ＬＴＲ−ＸＸＸＸＸ−ＬＴＲ
ここで、ＬＴＲ配列が隣接するＸＸＸＸＸは、プロモーター、リーダー配列、目的のタンパク質をコードする核酸配列（例えば、軽鎖配列および／または重鎖配列またはＴ細胞レセプター配列）、および／またはポリＡ配列のようなエレメントの組み合わせであってもよい。他の調節性エレメントが必要に応じて含まれてもよい。
【００８７】
例示的な実施形態では、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方を含んでいるレトロウイルスベクターは、以下の構造を有してもよい：
ＬＴＲ−Ｘ−軽鎖のプロモーター−κリーダー配列−免疫グロブリン軽鎖配列−軽鎖のポリＡ配列−重鎖のエンハンサー−重鎖のプロモーター−重鎖リーダー配列−免疫グロブリン重鎖可変配列−重鎖定常領域配列（ＣＨ）−重鎖のポリＡ配列−Ｘ−ＬＴＲ。
この構造を有しているレトロウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列の両方を同じ方向に含む。このレトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶエンハンサーおよび／またはＳＶ４０エンハンサーを先行して有するＥＦ１αプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、調節性エレメントの組み合わせ、例えば、ＣＭＶエンハンサーを軽鎖配列の前に有するヒトＥＦ−１αプロモーター、および重鎖配列の前にＳＶ４０エンハンサーを有するラットまたはマウスのＥＦ−１αプロモーターの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、調節性エレメントの組み合わせ、例えば、１つの核酸の発現を駆動するヒトＥＦ−１αプロモーター、および第二の核酸の発現を駆動するラットまたはマウスのＥＦ−１αプロモーターの組み合わせは、レトロウイルスベクター構築物の安定性を増強し得る。
【００８８】
別の実施形態では、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方を含んでいるレトロウイルスベクターは、以下の配列を有し得る：
ＬＴＲ−Ｘ−軽鎖のポリＡ−軽鎖配列−κリーダー配列−軽鎖のプロモーター−エンハンサー配列−重鎖のプロモーター−重鎖リーダー配列−免疫グロブリン重鎖可変配列−重鎖定常領域配列（ＣＨ）−重鎖のポリＡ配列−Ｘ−ＬＴＲ。
この構造を有しているレトロウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列の両方を反対方向に含む。このベクターの例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶエンハンサーおよび／またはＳＶ４０エンハンサーをそのプロモーターに先行して有するＥＦ−１αプロモーター、またはそれらの調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。
【００８９】
別の例示的な実施形態では、免疫グロブリン軽鎖のみを含んでいるレトロウイルスベクターは以下の構造を有し得る：
ＬＴＲ−Ｘ−軽鎖のプロモーター−κリーダー配列−免疫グロブリン軽鎖配列−軽鎖のポリＡ配列−Ｘ−ＬＴＲ。
レトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶエンハンサーおよび／またはＳＶ４０エンハンサーを先行して有するＥＦ−１αプロモーター、またはそれらの調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
別の例示的な実施形態では、免疫グロブリン重鎖のみを含んでいるレトロウイルスベクターは以下の構造を有し得る：
ＬＴＲ−Ｘ−重鎖のプロモーター−重鎖リーダー配列−
免疫グロブリン重鎖可変配列−重鎖定常領域配列（ＣＨ）−重鎖のポリＡ配列
−Ｘ−ＬＴＲ。
レトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶエンハンサーおよび／またはＳＶ４０エンハンサーを先行して有するＥＦ−１αプロモーター、または調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。
【００９１】
例示的なＡＡＶベクターは、隣接するＬＴＲ配列が隣接するＩＴＲ配列によって置き換えられていることを除いて、上記の構造と類似の構造を有し得る。
【００９２】
図１４は、ｐＥｘｃｅｌとして本明細書に言及される例示的な抗体発現ベクターの略図を示す。このｐＥｘｃｅｌベクターは、本明細書に記載されるように、抗体発現カセットの一過性発現または組み込みのために免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方を発現して、ポリクローナル細胞集団を生成するために用いられ得る。重鎖および軽鎖の両方の免疫グロブリン発現のためのｐＥｘｃｅｌベクターは以下のエレメントを含む：ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ＝細菌複製起点；ＣＭＶ＝ＣＭＶエンハンサー；ｈＦｅｒＬ＝耐性遺伝子の発現を駆動する、ｈＦｅｒＬ真核生物コアプロモーター；ＥＭ７＝耐性遺伝子の発現を駆動する、細菌プロモーター；Ｎｅｏ／Ｋａｎ：Ｎｅｏｍｙｃｉｎ（真核生物）／Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（原核生物）耐性遺伝子；Ｂグロビン  ｐＡ＝βグロビンポリアデニル化配列；ｈＥＦ１α＝ヒト  ＥＦ１αプロモーター；重鎖リーダー（Ｈｅａｖｙ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ＶｈＸ由来のリーダー；軽鎖リーダー（Ｌｉｇｈｔ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ｋＸ由来のリーダー；可変重鎖＝制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域；ｈＩＧ１定常重鎖＝ヒトＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡ；ＳＶ４０  ｐＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列；ＢＧＨ  ｐＡ＝ＢＧＨポリアデニル化配列；軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）＝制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域；およびｒＥＦ１α＝ラットＥＦ１αプロモーター（イントロンおよびエキソンは、ＥＦ１αプロモーターおよびリーダーについてアノテーションされている）。
【００９３】
図１５は、以下のエレメントを含んでいるポリクローナル細胞集団への抗体発現カセットの一過性発現または組み込みのための、ｐＥＸＣＥＬ／ＩＴＲと本明細書で呼ばれる例示的な抗体発現ベクターの略図を示す：左ＩＴＲおよび右ＩＴＲ＝ＡＡＶ２由来の逆末端反復（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）配列；ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ＝細菌複製起点；ＣＭＶ＝ＣＭＶエンハンサー；ｈＦｅｒＬ＝耐性遺伝子の発現を駆動する、ｈＦｅｒＬ真核生物コアプロモーター；ＥＭ７＝耐性遺伝子の発現を駆動する、細菌プロモーター；Ｎｅｏ／Ｋａｎ：Ｎｅｏｍｙｃｉｎ（真核生物）／Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（原核生物）耐性遺伝子；Ｂグロビン  ｐＡ＝βグロビンポリアデニル化配列；ｈＥＦ１α＝ヒト  ＥＦ１αプロモーター；重鎖リーダー（Ｈｅａｖｙ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ＶｈＸ由来のリーダー；軽鎖リーダー（Ｌｉｇｈｔ  Ｌｅａｄｅｒ）＝例えば、ｋＸ由来のリーダー；可変重鎖＝制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域；ｈＩＧ１定常重鎖（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｈｅａｖｙ）＝ヒトＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡ；ＢＧＨ  ｐＡ＝ＢＧＨポリアデニル化配列  ＳＶ４０  ｐＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列；軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）＝制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域；およびｒＥＦ１α＝ラットＥＦ１αプロモーター（イントロンおよびエキソンは、ＥＦ１αプロモーターおよびリーダーについてアノテーションされている）。
【００９４】
図１６は、ｐＥＸＣＥＬ−ＩＴＲのエレメント並びにＡＡＶ２のｐ５プロモーター領域由来のｐ５ＩＥＥ：ｐ５組み込み有効性エレメント（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）の各々を含んでいるポリクローナル細胞集団へ抗体発現カセットを一過性発現させるまたは組み込みのための、ｐＥＸＣＥＬ−ＩＴＲ／ｐ５と本明細書で呼ばれる例示的な抗体発現ベクターの略図である。このエレメントは、ＩＴＲ配列に隣り合う位置であってもよい。あるいは、ｐ５エレメントは、ＩＴＲ配列のうちの一方または両方を置き換えてもよい。
【００９５】
図１７は、本明細書においてｐＥｘｃｅｌ−Ｒｅｐ７８ベクターと呼ばれる、例示的なＲｅｐ７８ベクターの略図である。このｐＥｘｃｅｌ−Ｒｅｐ  ７８ベクターは、以下のエレメントを含む：ＳＶ４０プロモーター＝Ｒｅｐ７８由来の真核生物プロモーター；Ｒｅｐ７８＝ＡＡＶ２由来のＲｅｐ７８のコード配列；ＳＶ４０後期ｐＡ＝ＳＶ４０由来の後期ポリアデニル化配列；Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子および細菌プロモーター；ならびにＯＲＩ＝細菌複製起点の開始部位。
【００９６】
組換えレトロウイルスベクターの構築後、レトロベクターを、パッケージング細胞株に導入する。パッケージング細胞株は、所望の宿主範囲を有するウイルス粒子へウイルスのゲノムＲＮＡをパッケージングするために、トランスで必要なタンパク質（すなわち、ウイルスがコードしているｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのタンパク質）を提供する。この宿主範囲は、ウイルス粒子の表面上に発現されるエンベロープ遺伝子産物の種類によって部分的に制御される。パッケージング細胞株は、エコトロピック（狭宿主性）、アンホトロピック（広宿主性）またはキセノトロピック（異種指向性）なエンベロープ遺伝子産物を発現し得る。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスのエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質をコードする配列を欠いてもよい。この場合、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムを、膜会合タンパク質（例えば、ｅｎｖタンパク質）を欠く粒子にパッケージングし得る。細胞へのウイルスの進入を可能にする膜会合タンパク質を含有するウイルス粒子を生成するために、レトロウイルス配列を含んでいるパッケージング細胞株を、膜会合タンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質）をコードする配列でトランスフェクトする。すると、このトランスフェクトされたパッケージング細胞は、トランスフェクトされたパッケージング細胞株発現の膜会合タンパク質を含むウイルス粒子を生成し得る；これらのウイルス粒子（別のウイルスのエンベロープタンパク質によってキャプシド形成される、１つのウイルス由来のウイルスゲノムＲＮＡも含む）は、偽型ウイルス粒子と呼ばれる。
【００９７】
一本鎖ＤＮＡウイルスベクターが用いられる場合、例えば、ＡＡＶベクターでは、このベクターを、宿主細胞の増殖感染を促進するために、無関係のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクチンで同時感染させる。例示的な実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクターおよびＡＡＶヘルパープラスミドの両方でトランスフェクトされた宿主細胞中で産生され得る。ＡＡＶヘルパープラスミドは一般的に、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を含むが、ＡＡＶのＩＴＲは欠く。従って、ＡＡＶヘルパープラスミドは、それ自体を複製もパッケージングもできない。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶのＩＴＲ配列（ウイルスの複製およびパッケージング機能を提供する）が隣接する目的の遺伝子を含む。ヘルパープラスミドおよびＡＡＶベクター（目的の核酸を含んでいる）が、当該分野で周知の方法を用いて宿主細胞に同時形質転換された後、宿主細胞をヘルパーウイルスで感染させて、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の発現を促す、ヘルパープラスミドに存在するＡＡＶプロモーターをトランス活性化する。次に、目的の核酸を含んでいる組換えＡＡＶビリオンを精製し、これを用いて所望の多重度の感染で宿主細胞を感染させて、１細胞あたり高コピー数を提供してもよい。下に考察されるとおり、宿主細胞は、同じＡＡＶベクターおよび／またはＡＡＶベクターのライブラリーを用いて繰り返し形質導入されてもよい。
【００９８】
ＩＩ．宿主細胞
ウイルスベクターによる形質導入に適した種々の宿主細胞（例えば、レトロベクター、ＡＡＶベクターなど）の使用が想定されている。例示的な宿主細胞株としては、哺乳動物細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓ＣＶ１（ＣＯＳ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、アフリカ遺伝子サル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト肺線維芽細胞（ＷＩ−３８、ＩＭＲ−９０またはＭＲＣ−５）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲ１細胞、ラット線維芽細胞、および骨髄腫細胞が挙げられる。
【００９９】
哺乳動物細胞に加えて、昆虫細胞株、両生類細胞株、および植物細胞も用いられてよい。適切な昆虫細胞株の例としては、限定するものではないが、Ｓｆ細胞（例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞株、ならびにＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞株）および蚊の細胞株（例えば、ＭＯＳ−５５細胞株）が挙げられる。
【０１００】
ＩＩＩ．形質転換方法および細胞集団の生成
例示的な実施形態では、目的の少なくとも１つのタンパク質または目的のタンパク質のライブラリーをコードするウイルスベクターを用いて、宿主細胞ゲノム（例えば、宿主細胞ゲノムＤＮＡ）を形質転換してもよい。例えば、宿主細胞は、レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスのインテグラーゼタンパク質を用いて、または一本鎖ＤＮＡウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）およびｒｅｐタンパク質を用いて、１細胞あたり少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回以上のウイルスベクターの多重感染で形質導入してもよい。約１０〜約１，０００，０００という感染の多重度を用いて、組み込まれたベクターの約２〜約１００コピーを含んでいる感染した宿主細胞のゲノムを生成してもよい。いくつかの実施形態では、約１０〜約１０，０００という感染の多重度が用いられる。
【０１０１】
例示的な実施形態では、１つ以上の宿主細胞は、繰り返し形質転換され得る。例えば、宿主細胞は、米国特許第６，８５２，５１０号および同第７，３７８，２７３号に記載のように、同じウイルスベクター（例えば、レトロベクター、ＡＡＶベクターなど）で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０回以上形質導入される。同じ細胞集団に対する、複数の繰り返しの形質導入の使用は、組み込まれたベクターの少なくとも１つのコピーを含んでいる宿主細胞の割合を増大し、かつ複数の組み込まれたコピーを含有する宿主細胞集団を生成するために用いられ得ると想定されている。理論によって束縛されることは望まないが、複数の反復の形質転換は、得られた細胞集団からのタンパク質産生も増大し得る。
【０１０２】
宿主細胞を形質転換するための方法は、当該分野で周知である。要するに、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムへの目的の１つ以上の遺伝子の感染および引き続く組み込みを可能にするのに十分な時間、感染性ベクターを含んでいる培地に暴露される。当業者は、組み込みの量が、（１）宿主細胞に積層するために用いられる培地の量（例えば、小容積を用いる）と、（２）宿主細胞がベクターに暴露される時間の長さと、（３）宿主細胞のコンフルエンシーと、（４）感染の多重度とを操作することによって最大化され得る。
【０１０３】
本明細書に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、ベクターのライブラリーを用いて宿主細胞の集団を形質転換する。宿主細胞を、２つ以上のベクターで形質転換する場合、２つ以上のベクターの形質転換は、同時であってもよいし（例えば、宿主細胞は、２つ以上のベクター、例えば、ベクターのライブラリーを含有する溶液に暴露される）、または異なる時点（例えば、連続）であってもよい。宿主細胞が各々のベクター（例えば、ウイルスベクター）で連続して形質転換される場合、宿主細胞は、第一のベクターでトランスフェクトされ、ある期間継代され、次いで、任意の引き続くベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、第一のベクターで繰り返し形質転換され、その後任意の追加のベクターで形質転換（例えば、繰り返し形質転換）されてもよい。
【０１０４】
例示的な実施形態では、本明細書に開示される形質転換方法は、個々の前駆細胞（例えば、個々の細胞クローン）のクローン選択の使用ならびに／または組み込まれた目的の遺伝子を含有する細胞を特定および選択するための細胞株の産生を必要としない。上記のように、本発明のベクターは、選択マーカーを含まなくてもよい。本明細書に開示される方法は、複数の、反復的な形質転換を利用して、目的の１つ以上の遺伝子の少なくとも１つが組み込まれたコピーを含有する細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％および１００％を含む宿主細胞集団を生成する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、形質転換された宿主細胞と形質転換されていない宿主細胞との両方を含んでもよい。形質転換されていない宿主細胞が存在する場合、この開示された方法はさらに、集団中の形質転換された細胞のサブセットを選択する選択工程を包含し得る。この選択工程は、ネガティブ選択であっても、またはポジティブ選択であってもよい。例示的なネガティブ選択マーカーとしては、限定するものではないが、Ｇ４１８、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンが挙げられる。例示的なポジティブ選択としては、培養培地から排除される必須アミノ酸を作製可能な酵素の使用が挙げられる。選択工程は、複数の個々の細胞集団を混合する前に行われてもよい。あるいは、この選択工程は、複数の個々の細胞集団の混合後に行ってもよい。選択はまた、複数のベクターを用いて生成される細胞集団で、単回の形質転換で行われてもよい（例えば、単回の形質転換における各々のベクターが、目的の２つ以上のタンパク質をコードする場合）。
【０１０６】
目的の遺伝子の少なくとも１つ以上のコピーを組み込んでいる宿主細胞は、さらに多くの細胞数が望まれる場合、当該分野で周知の標準的な技術を用いて増殖してもよい。個々の細胞集団は、約百万個の細胞、約５百万個の細胞、約一千万個の細胞、約二千万個の細胞またはそれ以上の個数の細胞まで増殖されてもよい。例示的な実施形態では、個々の細胞集団は、下に考察されるように細胞集団を混合する前に約一千万個の細胞まで増殖される。
【０１０７】
ＩＶ．組換えポリクローナル細胞集団を産生するための細胞集団の混合
少なくとも２つの個々の細胞集団（各々が、異なるタンパク質を産生する）は、本明細書に記載の方法工程から生成される場合、細胞のポリクローナル混合物（本明細書においては「ポリクローナル細胞集団」と呼ばれる）を生成するように混合されてもよい。例示的な実施形態では、少なくとも２つの個々の細胞集団を生成して、それを混合し、複数のタンパク質を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する。ポリクローナル細胞集団は、各々が異なるタンパク質を産生できる少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００またはそれ以上の細胞集団を含んでもよい。
【０１０８】
少なくとも２つの個々の細胞集団は、等しい数（例えば、１：１の比）で混合されても、または１：１とは異なる比（例えば、１：２の比、１：３の比、１：４の比、１：５の比、１：１０またはそれ以上の比）で混合されてもよい。３つ以上の個々の細胞集団が混合される場合、その細胞は、例えば、１：１：１の比、または例えば、１：１：１の比とは異なる任意の可能な比率で混合されてよいことも想定されている。
【０１０９】
ポリクローナル細胞集団はさらに、当該分野で周知の方法を用いて増殖されてもよいし、または細胞バンクを形成するために凍結されてもよい（下に考察される）。ポリクローナル細胞集団の全体的なサイズは、少なくとも１００個の細胞、少なくとも１，０００個の細胞、少なくとも１万個の細胞、少なくとも１０万個の細胞、少なくとも百万個の細胞、少なくとも５百万個の細胞、少なくとも一千万個の細胞、少なくとも二千万個の細胞、少なくとも５千万個の細胞またはそれ以上の細胞を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換えポリクローナル細胞集団は、個々の細胞集団（各々が異なるタンパク質を産生できる）から生成されてもよく、ここで各々の個々の細胞集団は、約百万個の細胞である。例えば、組換えのポリクローナルタンパク質の組成物が５つの異なるタンパク質を含む場合、組換え細胞集団の大きさは、少なくとも５百万個の細胞（例えば、５つの個々の細胞株の各々から約百万個の細胞）である。ポリクローナル細胞集団のサイズは、十分大きく、１つの細胞を産生する１つのトランスフェクトされた細胞集団のガウス増殖曲線は、第二（または第三など）のタンパク質を産生するトランスフェクトされた細胞集団に対して同一であるか、または実質的に同一であると考えられる。本明細書に記載されるポリクローナル細胞集団の安定性は、トランスフェクトされた細胞の大集団を用いること、および個々の細胞集団のうち多数（例えば、１つの個々の細胞集団あたり約百万個以上の細胞）を混合して、組換えポリクローナル細胞集団を産生することによって達成される。
【０１１０】
Ｖ．組換え細胞集団のバンキング
組換え細胞集団（例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および異なるタンパク質を産生できる少なくとも２つの異なる細胞集団を含んでいるポリクローナルの細胞集団）を、将来の試験、スクリーニング、製造および／または使用のためにバンキング（すなわち、凍結および貯蔵）してもよい。細胞集団は、当該分野で周知の方法を用いて、個々のバイアルまたはアンプル中でアリコートにされて、凍結され得る（例えば、凍結ストックを生成するために）。アリコートのサイズ、１バイアルあたりの細胞の数、およびバイアル（またはアンプル）の数は、細胞集団の所望の用途次第で変化し得る。いくつかの実施形態では、細胞集団は、１バイアルあたり約百万個、約５百万個、約一千万個、または約二千万個の細胞という総細胞カウントでバンキングされ得る。例示的な実施形態では、ポリクローナル細胞集団は、１バイアルあたり約一千万個の細胞という総細胞カウントでバンキングされる。
【０１１１】
細胞集団（例えば、ポリクローナル細胞集団）は、バンキングされて、タンパク質組成物（例えば、ポリクローナルタンパク質組成物）のさらなる試験および確認に供されてもよいことが想定されている。本明細書に記載される方法によって産生されるポリクローナルタンパク質組成物の確認の際、細胞集団の１つ以上の凍結アンプル（例えば、モノクローナルまたはポリクローナルの細胞集団）が解凍されて、標準的な細胞培養技術を用いて増殖されてもよいと考えられることが想定されている。このような工程は、所定のポリクローナルタンパク質組成物の大規模容量を産生できる細胞株を樹立（例えば、治療用途用のポリクローナルタンパク質組成物を産生するための細胞株の製造）するために行われ得る。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、単一のタンパク質（例えば、単一の抗体）を発現する個々の細胞集団はバンキング（すなわち、凍結および貯蔵）されない。
【０１１３】
ＶＩ．組換えポリクローナルタンパク質組成物
本明細書に記載の方法によって産生される組換えポリクローナルタンパク質の組成物は、タンパク質の混合物を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ポリクローナルタンパク質の組成物は、１つ以上の標的タンパク質上の異なる抗原性エピトープに結合する抗体の混合物である。例えば、ポリクローナル細胞集団は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、または１００個の異なる抗原性エピトープに結合する、ポリクローナル抗体組成物を産生できる少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００またはそれ以上の細胞集団を含み得る。異なる抗原性エピトープに結合する場合、これらのエピトープは、同じ標的タンパク質上に存在していてもよいし、異なる標的タンパク質（例えば、少なくとも２、３、４、５個以上の異なる標的タンパク質）上に存在していてもよい。
【０１１５】
２つ以上のポリペプチドを標的にする例示的なポリクローナル抗体組成物としては、限定するものではないが、同じ分子経路でポリペプチドを標的にする組成物（例えば、リガンド、その同族のレセプター、および／または下流のエフェクター分子）、重複機能を有するポリペプチド（例えば、同じレセプターを通して機能する２つのリガンド）、または同じ細胞の表面上に各々が発現されるポリペプチド（例えば、少なくとも２つのポリペプチドが、同じ疾患関連細胞、例えば、腫瘍細胞上で両方とも発現される）が挙げられる。いくつかの実施形態では、２つ以上の標的ポリペプチドは、同じ疾患、障害または状態との関連を除いて、無関係のポリペプチドであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、組換えポリクローナルタンパク質の組成物は、単一のポリペプチドを標的にする抗体の混合物を含んでいる組換えポリクローナル抗体組成物である（例えば、抗体の混合物は、同じ、類似（例えば、部分的に重複するエピトープ）、または異なる抗原性エピトープを同じ標的ポリペプチド上で標的にし得る）。いくつかの実施形態では、組換えポリクローナル抗体組成物は、野性型および変異体型（例えば、治療法（例えば、癌の処置）に対する抵抗性または疾患重篤度の増大に関連する公知の変異体）の両方のポリペプチドを標的にし得る。
【０１１７】
本発明の例示的な抗体ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（すなわち、免疫グロブリン重鎖上の３つのＣＤＲ、および免疫グロブリン軽鎖の上の３つのＣＤＲ）を含んでいる四量体抗体を形成する。本発明の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列は、天然の抗体配列、または遺伝子操作された抗体配列、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および多価特異的抗体（例えば、二価特異的抗体）に相当し得ることが想定されている。目的のポリペプチドは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖフラグメントのような抗原結合フラグメントに相当し得るとも考えられる。抗体および抗体フラグメントの抗原性を減少または排除するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体組成物は、四量体のインタクトな抗体（例えば、天然に存在する抗体および／または遺伝子操作された抗体）および／またはその抗原結合フラグメントの組み合わせを含み得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体組成物中の１つ以上の抗体は、検出可能な標識またはエフェクター分子、例えば低分子（例えば、毒素）のような他の部分に対して化学的にコンジュゲートされてもよい。
【０１１９】
ポリクローナル抗体組成物は、２つ以上のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖を含んでもよい。例えば、免疫グロブリン重鎖は、以下のアイソタイプのうちいずれか１つを含んでもよい：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ。個々の細胞集団の混合の際、組換えポリクローナル混合物は、同じまたは異なるアイソタイプの免疫グロブリン重鎖配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組換えポリクローナル抗体組成物は、少なくとも２つ以上の異なるアイソタイプを含んでもよい。
【０１２０】
ポリクローナル抗体組成物は、当該分野で周知の方法を用いて精製され得る。例示的な方法としては、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。選択された精製方法は、ポリクローナル抗体組成物中の全ての抗体が同じアイソタイプであるかまたは関連のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４）であるかに依存し得る。この抗体が、同じアイソタイプであるか、または関連のアイソタイプである（例えば、全ての抗体がＩｇＧ抗体である）場合、この抗体は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製され得る。この抗体が異なる（および無関係の）アイソタイプである場合、ゲル濾過を用いて、ポリクローナル抗体組成物を精製してもよい。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、このポリクローナルタンパク質の組成物は、ワクチンとして使用するためのタンパク質の混合物である。このポリクローナル組成物は、同じ病原体の１つ以上の感染性因子、所定の感染因子の改変体（例えば、変異体型、アイソフォームなど）、または異なる感染性因子を模倣する組換えタンパク質を含んでもよい。ポリクローナルタンパク質の組成物のタンパク質構成要素は、疾患を生じることが公知であるかまたは疑われるタンパク質標的または因子の組み合わせを含んでもよい。ポリクローナルタンパク質の組成物は、限定するものではないが、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む当該分野で周知の方法を用いて精製されてもよい。
【０１２２】
限定するものではないが、ポリクローナル抗体組成物、ポリクローナルワクチン組成物を含む、ポリクローナルタンパク質の組成物の安定性は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。例示的な方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、パパイン消化に続く２−Ｄゲル分析、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。バンキングされたポリクローナルタンパク質の組成物を経時的に定期的にモニターして、組換えポリクローナルタンパク質の組成物を構成する個々のタンパク質の安定性をアッセイしてもよいことが想定されている。
【０１２３】
特定の実施形態では、ポリクローナルタンパク質混合物の安定性は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析され得る。サンプルは以下に記載のように調製してもよい：細胞（例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ培養物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））は、４００×ｇで５分間の遠心分離に供し、この上清を次に、急速凍結および−２０℃で貯蔵し、そして９６ウェルフィルタープレート（３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ，カタログ番号６０６５）を用いる引き続く濾過に供してもよい。ＨＰＬＣ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣ，Ｄｉｏｎｅｘ）分析を、ＷＣＸ−１０  ＰｒｏＰａｃカラム（Ｄｉｏｎｅｘ，カタログ番号０１６８３０）、流速１ｍｌ／分、３０℃のカラム温度、および２２０／２８０ｎｍの検出を用いて行ってもよい。抗体タンパク質は、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．６（緩衝液Ａ）と２０ｍＭのＭＥＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．６（緩衝液Ｂ）との間の直線勾配を有するイオン交換カラムから溶出してもよい。各々の上清のサンプルのクロマトグラフィー分析は、連続工程、例えば（全部で１４分）７分にわたる５％〜３３％の緩衝液Ｂの勾配、０．５分にわたる３３％〜１００％の緩衝液Ｂの勾配、１分間の１００％緩衝液Ｂ、０．５分にわたる１００％〜５％の緩衝液Ｂの勾配、および５分間の５％の緩衝液Ｂで行われてもよい。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅプログラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて、ピークの値を、ｍＡＵ（Ａ２８０）および保持時間（分）の関数として算出してもよい。これらのクロマトグラフィー条件を用いて、抗体タンパク質を別個の保持時間で溶出してもよい。別の例示的な精製プロトコールでは、抗体タンパク質は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、２９３ｆｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１２３４７−０１９）を製造業者の指示に従って用いて発現させ、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−４０８２−５３）カラムを用いて精製してもよく、緩衝液はＢｉｏｓｃａｌｅ  Ｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｇｅｌ  Ｐ６  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｂｉｏｒａｄ，カタログ番号７３２−５３０４）で交換されてもよい。この溶出された抗体タンパク質は、Ａ２８０によって定量され、混合され、ＨＰＬＣによって分析されてもよい。
【０１２４】
ＶＩＩ．組換えポリクローナルタンパク質組成物の使用
本発明の組換えポリクローナルタンパク質の組成物を用いて、癌を含む種々の疾患および障害（例えば、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および頭頸部癌）を処置してもよい。例えば、癌細胞を、治療上有効な量のポリクローナルタンパク質組成物（例えば、ポリクローナル抗体組成物）に暴露して、癌細胞の増殖を阻害または軽減してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の組換えポリクローナル抗体組成物は、癌細胞増殖を、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％まで阻害する。
【０１２５】
他の実施形態では、本発明のポリクローナルタンパク質の組成物を用いて、細菌および／またはウイルス感染症、ならびに感染性タンパク質、例えば、プリオン類および毒素類を処置してもよい。
【０１２６】
本明細書において用いる場合、「処置する、処理する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること、処理すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置、処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、哺乳動物における、例えば、ヒトにおける疾患の処置を意味する。これには以下が含まれる：（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止すること；および（ｂ）疾患の軽減、すなわち、疾患状態を退行させること；および（ｃ）疾患を治癒すること。
【０１２７】
一般には、活性成分の治療上有効な量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与される量は、処置されるべき疾患または適応症の種類および程度、患者の全体的な健康度合、抗体のインビボ力価、薬学的処方物および投与経路などの変数に依存する。初回投薬量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために上限を超えて増大されてもよい。あるいは、初回投薬量は、最適量よりも少なくてもよく、毎日の投薬量は、処置の経過の間に漸増してもよい。ヒト投薬量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで移行するようにデザインされた従来の第Ｉ相用量漸増試験で、最適化され得る。投薬頻度は、投与の経路、投薬量および処置されている疾患などの因子に依存して変化し得る。例示的な投与頻度は、１日に１回、週に１回、および２週に１回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。ポリクローナルタンパク質ベースの薬物の処方物（例えば、ポリクローナル抗体、ワクチンなど）は、当該分野の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、ポリクローナルタンパク質組成物（例えば、ポリクローナル抗体組成物）を凍結乾燥して、投与時点で緩衝化生理食塩水中に再懸濁する。
【０１２８】
治療用途に関しては、本発明のポリクローナルタンパク質の組成物を薬学的に許容される担体と合わせるのが好ましい。本明細書において用いる場合、「薬学的に許容される担体」とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題も合併症もなく、ヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに適した緩衝液、担体および賦形剤（合理的な利点／リスクの比が釣り合っている）を意味する。この担体（単数または複数）は、処方物の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体としては、薬学的投与に適した、緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張性および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および因子の使用は当該分野で公知である。
【０１２９】
本発明のポリクローナルタンパク質を含んでいる薬学的組成物（例えば、抗体、ワクチン）は、単位投与剤形で与えられてもよく、任意の適切な方法によって調製されてもよい。薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方されるべきである。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜および直腸の投与である。ポリクローナル抗体の投与の好ましい経路は、ＩＶ注入である。有用な処方物は、薬学の分野で周知の方法によって調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。非経口投与に適した処方成分としては、滅菌希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；ならびに張度の調節剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられる。
【０１３０】
静脈内投与のための適切な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。この担体は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物に対して防腐されなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散培地であってもよい。
【０１３１】
薬学的処方物は好ましくは無菌である。滅菌は例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に行われてもまたは後に行われてもよい。
【０１３２】
実施例
以下の実施例は、単に例示であって、決して本発明の範囲や内容を限定するものではない。
実施例１：外因性ＤＮＡ配列の安定な発現を促進するための、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質を用いる安定なポリクローナル細胞集団の産生
【０１３３】
Ａ．ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、培養された細胞において、外因性ＤＮＡ配列の安定な発現を増強する。
【０１３４】
本実施例の目的は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質が、培養された細胞中で外因性のＤＮＡの安定な発現を増強するか否かを決定することであった。
【０１３５】
ＧＦＰを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞中で発現し、続いて種々の濃度のｐＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８とともにｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：ＧＦＰの同時トランスフェクションを行った。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（２×１０６）を、２μｇのｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：ＧＦＰおよび２μｇ、４０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇまたは４ｎｇのｐＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８とともに、２９３−Ｆｅｃｔｉｎを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクトを行った。細胞を、選択なしに２５日間培養した。３〜４日毎に、ＧＦＰ発現を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。１７、２１および２５日のＧＦＰを発現する細胞の割合を平均したが、エラーバーは、図１に示されるように、標準偏差を示している。ベクター単独（ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：ＧＦＰ対ｐＲｅｐ７８が１：０）によって、図１に示されるように、約１％の組み込みが生じた。高レベルのＲｅｐ７８は、細胞に対して毒性であるが、Ｒｅｐ７８は、毒性未満の用量で投与された場合、より高い全体的に安定な組み込み効率を媒介し（例えば、図１に示されるようなｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：ＧＦＰ対ｐＲｅｐ７８の１：１の濃度比は、ベクター単独での組み込みと比較してＡＡＶ  ｒｅｐ７８媒介性の組み込みのわずかな増大しか生じなかった（図１では１：０））、ｐＲｅｐ７８の滴定によって、安定な発現を約５倍まで増強した、ｐＲｅｐ７８の濃度（例えば、１：５０および１：１００）が明らかになった。
【０１３６】
Ｂ．非ウイルスＡＡＶ組み込みは、安定な抗体発現を生じる
この実施例の目的は、非ウイルスＡＡＶ組み込みが安定な抗体発現を生じるか否かを検討することであった。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（３０×１０６）を、３０μｇのｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：５．５５．Ｄ２（これは、抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓδ毒素ＩｇＧ１を発現する）と１５０ｎｇのｐＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８とともに、２９３−Ｆｅｃｔｉｎを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクトし、ＩｇＧ１産生を経時的にモニターした。トランスフェクションの３日後、細胞を、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有している増殖培地で継代した。細胞培養上清のＦｃ−特異的ＥＬＩＳＡを、１週に２回行った。各々の時点でのＩｇＧ１の総ｐｇ／ｍｌを、培養物中の１日あたりの平均細胞数で割った。図２に示すとおり、１日あたり１細胞に産生される抗体のピコグラム数（ｐｇ／細胞／日）として測定した場合の相対発現は、１１週間にわたって４〜８（ｐｇ／細胞／日）の間で維持される。細胞の密度および生育可能性は、Ｇ４１８選択期間の間に低下するようであり、これはこの期間に細胞の抗体産生に影響を与えたが、２１日（３週）までには、細胞の密度および生育可能性は、トランスフェクション前レベルまで回復した（発現レベルは、Ｇ４１８選択開始の１４日後に一過性のトランスフェクションレベル（時間＝０）に接近する）。
【０１３７】
追加実験をまた、全部で５つの異なる抗体産生細胞集団で行い（二連で実施）、１１週の期間にわたって安定性をモニタリングした。これらの集団の発現レベルは、実験の経過中、３〜１０ｐｇ／細胞／日で維持された。
【０１３８】
得られた細胞集団は、クローン細胞株ではなく、ほとんどＲｅｐ７８タンパク質によって媒介される多様な分布の組み込み事象を有している細胞で構成されているバルク細胞集団である（図１および図１０に示される結果によって示されるとおり）。これらの結果によって、４×１０６個の細胞／ｍｌという細胞濃度では、１０，０００Ｌの容積を満たすのにこの実験では３１日を要することが示唆される。１１週まで、これは、７．７５×１０１２リットルに等しいか、または７．７５×１０７の１万リットルの製造容器に等しい。ポリクローナル集団混合物の引き続く例では、１０，０００Ｌの産生容器に繁殖させるのに十分な数の細胞集団を産生させる間ずっと安定であることを示す時間的期間が示される。このデータではまた、図２に示されるように、これらの細胞集団が、その産生容積の何倍も安定に抗体を産生できることが示唆される。
【０１３９】
Ｃ．安定なポリクローナル細胞混合物の産生
組換えポリクローナル細胞集団の個々の抗体構成要素を経時的にモニターして、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質組み込みを用いて産生される種々のポリクローナル細胞集団の安定性を評価した。
【０１４０】
以下の抗体名称を有する４つの異なる抗体を発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞集団を、図２に記載されるようなｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系を用いて生成した：４２．１１．Ｄ４（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ特異的な抗体）、５．５５．Ｄ２（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的な抗体）、２６．３．Ｅ２（ウシκ−カゼイン特異的な抗体）および４２．１８．Ｃ２（破傷風毒素特異的な抗体）。トランスフェクションの２１日後、４つの集団の各々を等しい数の細胞（２×１０５／ｍＬ）混合して、時間を０日と指定した。図３に示されるとおり、表示された時点（例えば、３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日、２８日、３１日、３５日）で、細胞培養上清のＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析を行った。各々の時点のスタックされたＨＰＬＣクロマトグラムを図３Ａに示す。ＨＰＬＣ分析からの各々の抗体のピーク下面積を用いて、図３Ｂに示されるように、総集団内の各々の抗体の割合を経時的に算出した。実験の全経過にわたり集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図３Ｃに示す。例えば、図３Ｂ〜図３Ｃでは、抗体４２．１１．Ｄ４を発現する細胞は、総細胞集団の２３．１％±２．１％であり；抗体５．５５．Ｄ２を発現する細胞は、総細胞集団の３０．３％±２．２％であり；抗体２６．３．Ｅ２を発現する細胞は、総細胞集団の２６．０％±２．１％であり、抗体４２．１８．Ｃ２を発現する細胞は、総細胞集団の２０．６％±３．０％である。
【０１４１】
図３に示されるデータは、ＡＡＶのＲｅｐ７８タンパク質を用いるｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系が、試験された４つの抗体集団で構成される安定なポリクローナル集団を産生したことを示す。ポリクローナル集団内の４つの細胞集団の各々（各々が異なる抗体を発現する）は、お互いに対して３５日間にわたって安定であった（例えば、ＨＰＬＣプロフィールで測定されるとおり、全経過時間にわたって、全発現で、任意の所定の抗体にはほとんど変動がなかった）。ポリクローナル集団が一旦確立されれば、観察されたポリクローナル内の４つの異なる集団のいずれにも、偏りもバイアスもなかった。
【０１４２】
ポリクローナル細胞集団はまた、ＡＡＶのＲｅｐ７８タンパク質およびｐ５エレメント（本明細書ではｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ／ｐ５と呼ばれる）を有するｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系を用いて産生された。組換えポリクローナル細胞集団の個々の抗体構成要素を経時的にモニターして、ポリクローナル集団の安定性を評価し、ｐ５エレメントが集団の安定性に及ぼす効果を測定した。
【０１４３】
以下の抗体名称を有する４つの異なる抗体を発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞集団を、図３に記載されるようなｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ／ｐ５ベクター系を用いて生成した：４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２。トランスフェクションの２１日後、４つの集団の各々を等しい細胞数（２×１０５／ｍＬ）混合して、時間を０日と指定した。図４に示されるとおり、表示された時点（例えば、３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日、２８日、３１日、３５日）で、細胞培養上清のＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析を行った。各々の時点のスタックしたＨＰＬＣクロマトグラムを、図４Ａに示す。ＨＰＬＣ分析由来の各々の抗体のピーク下面積を図４Ａに示す。ＨＰＬＣ分析からの各々の抗体のピーク下面積を用いて、図４Ｂに示されるように、経時的に、総集団内の各々の抗体の割合を算出した。実験の全経過にわたり集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図４Ｃに示す。例えば、図４Ｂ〜図Ｃでは、抗体４２．１１．Ｄ４を発現する細胞は、総細胞集団のうち２３．４％±１．９％であり；抗体５．５５．Ｄ２を発現する細胞は、総細胞集団のうち２８．６％±２．５％であり；抗体２６．３．Ｅ２を発現する細胞は、総細胞集団のうち２８．７％±１．６％であり；かつ抗体４２．１８．Ｃ２を発現する細胞は、総細胞集団のうち１９．４％±２．８％である。
【０１４４】
図４に示されるデータによって、ｐ５エレメントを有するＡＡＶのＲｅｐ７８タンパク質を用いるｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ／ｐ５ベクター系が、試験された４つの抗体集団からなる安定なポリクローナル集団を生成したことが示される。ｐ５エレメントで達成された結果は、ｐ５エレメントなしに達成された結果と同様であって、このポリクローナル集団の正確な混合物は、図３に示されるものとはわずかに異なっていたが、ｐ５エレメントがポリクローナル細胞集団の安定性を変化させなかったことを、これは示している。両方の例（例えば、ｐＥＸＣＥＬ−ＩＴＲ系対ｐＥＸＣＥＬ−ＩＴＲ／ｐ５系を用いる）とも、ほぼ等しい数の細胞集団を単に混合したに過ぎない。これは細胞混合物中の各々の抗体について異なる結果をもたらし得るが、ポリクローナルの集団が一旦確立されたら、観察されたポリクローナル細胞集団内の４つの異なる集団のいずれにも、偏りもバイアスもなかった。
【０１４５】
Ｄ．モノクローナルの安定な細胞集団を選択する前の、安定なポリクローナル細胞混合物の産生
この実験の目的は、安定なポリクローナル細胞混合物は、モノクローナルの安定な細胞集団を選択する前に生成され得るか否かを検討することであった。例えば、この実験では、細胞集団を混合してポリクローナル細胞集団を生成したが、選択マーカー（例えば、Ｇ４１８を含有する培地中で選択され得る、選択マーカーネオマイシン）を用いて、個々の安定な細胞集団を選択することはなかった。
【０１４６】
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（３０×１０６）を、以下の抗体のうちの１つをコードする１５０ｎｇのｐＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８および３０μｇのいずれかのｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ（図５Ａ−Ｂを参照）またはｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ／ｐ５（図５Ｃ〜Ｄを参照）を用いてトランスフェクトした：４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２または４２．１８．Ｃ２。トランスフェクションの３日後、４つの集団の各々を等しい細胞数（２×１０５／ｍＬ）混合して、時間を０日と指定した。混合の直後に、細胞を、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有する増殖培地に継代した。細胞培養上清のＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析を、上記のように、３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日、２８日、３１日および３５日に行った。各々の抗体のピーク下面積を用いて、図５Ａおよび図５Ｃに示されるように、経時的に総集団内の各々の抗体の割合を計算した。例えば、図５Ａおよび図５Ｂに示されるとおり、抗体４２．１１．Ｄ４は、総細胞集団のうち３７．６％±１．１％であり；抗体５．５５．Ｄ２は、総細胞集団のうち３３．６％±１．０％であり；抗体２６．３．Ｅ２は、総細胞集団のうち２０．７％±０．７％であり；抗体４２．１８．Ｃ２は、総細胞集団のうち８．１％±０．５％である。別の例では、図５Ｃおよび図５Ｄに示されるように、抗体４２．１１．Ｄ４は、総細胞集団のうち３１．１％±１．２％であり；抗体５．５５．Ｄ２は、総細胞集団のうち２７．０％±２．５％であり；抗体２６．３．Ｅ２は、総細胞集団のうち３５．５％±０．８％であり；抗体４２．１８．Ｃ２は、総細胞集団のうち６．４％±１．４％である。実験の全経過にまたがる集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図５Ｂおよび図５Ｄに示す。
【０１４７】
このデータによって、ポリクローナル細胞集団は、Ｇ４１８で選択する前に混合される場合、安定であることが示される。このデータはまた、個々の構成要素の損失（例えば、単一の抗体構成要素のいずれか）がポリクローナル集団について１０％未満であることも示す（例えば、抗体４２．１８．Ｃ２を発現する細胞の損失は１０％未満であるので、抗体４２．１８．Ｃ２の発現は、ポリクローナル混合物中で経時的に失われることはない）。このデータによってまた、低く表されている集団（または小細胞集団）が、経時的に失われることなく、試験される期間全体を通じて同じ比率で残っていることが示される。
【０１４８】
さらなる実験を行って、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系を用いて安定なポリクローナル細胞集団を産生する場合の再現性の試験を行った。二連のポリクローナル細胞集団を産生した。個々の細胞集団が、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲベクター系を用いて以下の抗体のうちの１つを発現した：４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２。上記のような４つの抗体の各々を発現する細胞を含んでいるポリクローナル細胞集団を混合した直後に、ポリクローナル細胞集団を二つの培養物に分けて、平行培養した。
【０１４９】
細胞培養上清のＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析は、上記のように、３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日、２８日、３１日および３５日に行った。二連の培養物中の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図６Ａに示す。
【０１５０】
本実施例では、これらの二連の培養物の間の相対的な相違は、データで反映されるとおり最小である。いずれの抗体にも、平均から離れた偏りもバイアスもない。標準偏差は、ＨＰＬＣピーク下の総面積が小さいほど大きいという意味で、測定方法を反映している。
【０１５１】
さらなる実験では、抗体４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２を発現するポリクローナル集団を生成して、上記のように分けた。一部を培養物中に維持したが、残りは凍結して、液体窒素中に保管した。１週後に、凍結されたポリクローナル集団を解凍して、回収した。細胞培養上清のＨＰＬＣ分析は、新鮮なポリクローナル集団および解凍したポリクローナル集団の両方で行った。同じ１７日の期間にまたがって２つの集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図６Ｂに示す。
【０１５２】
このデータによって、ポリクローナル集団内の構成要素抗体の比の変動は、独立して培養される場合でも、または凍結保存された後でさえも、識別可能だとしても極めて小さいことが示される。これらの結果によって、特異的な特徴および所望の特徴を有するポリクローナル集団は、予想可能な結果をふまえて、貯蔵および回収できることが示される。
【０１５３】
Ｅ．抗体の複雑な混合物は、ポリクローナル集団から精製され得る。
本実施例の目的は、抗体の複雑な混合物が、ポリクローナル細胞集団から継続して精製され得るか否かを決定することであった。抗体４２．１１．Ｄ４、５．５５．Ｄ２、２６．３．Ｅ２および４２．１８．Ｃ２を発現するポリクローナル集団の細胞培養上清由来の抗体集団を、プロテインＡ−ベースの捕獲プロトコールを用いて精製した。精製された抗体集団のＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析を、精製していない培養上清の抗体集団と比較した（図７）。これらの結果、精製によって、ポリクローナル集団内の異なる抗体エレメントの全てが効率的に回収されることが示唆される。サンプルの容量が増大し、相対的なピークの高さが大きくなるとき、サンプル中の相対的な標準偏差が有意に低下することも、観察された。この結果は、これらの全実施例の全データの基礎であるＨＰＬＣプロフィールから得られる実測値の小さい相違は、組成物中の真の変化よりもむしろ、相対的な観察誤差である可能性が高いことを示唆している。
【０１５４】
Ｆ．ポリクローナル細胞集団は、選択圧なしで安定である。
細胞集団の安定性を、選択圧の非存在下で試験した。図２に記載されるような細胞集団を確立した。６週後、抗体５．５５．Ｄ２を発現する細胞集団を２つの培養物に分けた。一方は、選択薬物Ｇ４１８
【化３】
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の存在下で培養を継続したが、Ｇ４１８は他の増殖培地からは除去した（◆）。細胞培養上清のＦｃ特異的ＥＬＩＳＡは、１週に２回行った。ＩｇＧ１の総ｐｇ／ｍｌを、各々の時点で、培養物中の１日あたりの平均細胞数で割った；両方の培養物について、各週の平均ｐｇ／細胞／日を図８に示す。このデータによって、ＩｇＧ１産生には４週間にわたって有意な相違が観察されなかったことが示される。このデータによって、この細胞集団における抗体産生ベクターの組み込みは、選択圧の非存在下でさえ安定なままであることが示唆される。
【０１５５】
Ｇ．ＡＡＶ−Ｒｅｐ依存性の組み込みは、抗体産生の増大をもたらす。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（３０×１０６）を、２９３−Ｆｅｃｔｉｎを用いて、１５０ｎｇのｐＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８を含む場合と含まない場合に分けて、３０μｇのｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：５．５５．Ｄ２でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、両方のトランスフェクトされた集団を、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有する増殖培地中に継代した。細胞培養上清のＦｃ特異的ＥＬＩＳＡを、週に２回行った。ＩｇＧ１の総ｐｇ／ｍｌを、各時点で、培養物中の１日あたりの平均細胞数で割った；選択中の各週について、平均ｐｇ／細胞／日を、図９に示す。
【０１５６】
Ｒｅｐタンパク質の非存在下では、ｐＥｘｃｅｌ−ＩＴＲ：５．５５．Ｄ２は、ランダムな組み込みを介して組み込まれる。ｐｇ／細胞／日で測定された相対的な産生は、、Ｒｅｐタンパク質が組み込みを媒介する場合さらに高く、このことは、Ｒｅｐ媒介性の組み込み（これは、本明細書に規定のように優先的な組み込みである）とランダムな組み込みとの間に質的な相違が存在することを示している（例えば、Ｒｅｐタンパク質が、さらに発現許容的な部位にＩＴＲを運ぶプラスミドを組み込むのを助けることを記載している、Ｓｍｉｔｈ，ＲＨ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，８１７〜８２２を参照のこと）。
【０１５７】
図９では、図２について上記されるとおり、得られた集団は、クローンではなく（すなわち、細胞株ではなく）、実際には、組み込み事象の多様な分布からなる可能性が高いバルク集団に相当する。ランダム組み込みおよび優先的組み込みの両方とも、安定的に発現する集団をもたらし得る。
【０１５８】
Ｈ．ＡＡＶ−Ｒｅｐ依存性の組み込みは、組み込み事象の増大をもたらす。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（２×１０６）を、２９３−Ｆｅｃｔｉｎを用いて、１０ｎｇのｐＡＡＶ２−Ｒｅｐ７８とともに抗体５．５５．Ｄ２を発現する２μｇの表示されたベクター系でトランスフェクトした。細胞を選択なしに１７日間培養した。３〜４日ごとに、抗体５．５５．Ｄ２を発現する細胞数をＦＡＣＳ分析によって評価した。１７日目に抗体５．５５．Ｄ２を発現する細胞の割合を示す。
【０１５９】
図２および図９に示される結果と同様に、得られた集団はクローンではなく、実際には、多様な分布の組み込み事象で構成されている可能性が高いバルク集団に相当する。非ウイルスのＡＡＶ媒介性の組み込みは、集団中の細胞数の増大をもたらし、ランダムな組み込みと比較して少なくとも１つの組み込み事象を経験する（図１および図１０に示されるとおり）。ランダム組み込みを用いて、目的のタンパク質を発現する安定な集団を創出できるが、組み込みの相対数およびそれらの組み込みの質は、非ウイルスＡＡＶ媒介性の系の質よりも低い（例えば、ヒトゲノムにおけるランダム組み込みの大半が相対的に不安定であることを記載している、ＭｉｇＬｉａｃｃｉｏら、Ｇｅｎｅ  ２５６（２０００）１９７〜２１４を参照のこと）。
【０１６０】
実施例２：外因性ＤＮＡ配列の安定な発現を促進するため、レトロウイルスインテグラーゼを用いる安定なポリクローナル細胞集団の産生
Ａ．レトロウイルスインテグラーゼは、培養細胞において、外因性ＤＮＡ配列の安定な発現を促進する。
この実験の目的は、レトロウイルスインテグラーゼが、培養された細胞で外因性ＤＮＡ配列の安定な発現を促進することを示すことであった。
【０１６１】
ＧＰ２−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、レトロウイルスパッケージング細胞株を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖タンパク質を発現するベクターであるｐ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃ／ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からクローニングされたＧＦＰを含有する修飾されたｐＱＣＸＩＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であるｐ４８６（図１８）を用いて同時トランスフェクトした。
【０１６２】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞を、トランスフェクションの４８時間後に、ＧＦＰを含有する、上で得られたレトロウイルス粒子を用いて形質導入した。この形質導入された細胞を、抗生物質選択なしで連続的に継代培養し、形質導入の有効性は、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴを用いてＦＡＣＳを介して定期的にアッセイした（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。
【０１６３】
図１１のグラフは、複製の培養物由来のＧＦＰ陽性細胞の平均パーセントを示す。このデータによって、ＧＦＰ発現陽性の細胞のパーセントが、表示された時間的期間中一貫していることが示され、形質導入の有効性は、細胞のうち９５％超が、単一の形質導入後に安定してＧＦＰ陽性であることを示す。このデータはまた、抗生物質選択が無い状態では、安定な組み込み集団は、組み込み体を有さない細胞の存在下でさえ維持され得ることを示す。従って、細胞集団が生成され、かかる細胞の大半がゲノムＤＮＡに１つ以上の組み込みを有しているが、その細胞集団は、組み込みが生じない細胞のサブセットも有しているような状態で、維持されてもよい。この集団のこの形質転換されてないサブセット（例えば、ＤＮＡフラグメントの組み込みがなかった細胞）は、より進化的に適合せず、細胞集団で細胞の全体的な割合を経時的に変化しない（例えば、組み込み体が存在しない（あるいは反対に、組み込み体が存在する）集団がより顕著になる場合に、偏りもバイアスも観察されない）。本明細書で記載されるような細胞集団で得られるデータによって、開示された細胞集団が、混合された個々の細胞株とは異なって挙動することが示される。例えば、細胞株（例えば、ＭｉｇＬｉａｃｃｉｏら、Ｇｅｎｅ  ２５６（２０００）１９７〜２１４）、および混合された細胞株は不安定である場合が多い。驚くべきことに、本明細書で開示されるデータは、ポリクローナル細胞集団が経時的に安定であることを示す。
【０１６４】
Ｂ．レトロウイルスのインテグラーゼを用いる、安定なポリクローナル細胞集団の産生
本実験の目的は、レトロウイルスのインテグラーゼを用いて抗体を発現する安定なポリクローナル細胞集団を生成することであった。
【０１６５】
ＧＰ２−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（レトロウイルスパッケージング細胞株）を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖タンパク質を発現するベクターであるｐ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびに抗体の重鎖および軽鎖を含んでいる改変ｐＱＣＸＩＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（例としては、ベクターｐ５４３（図１９）を参照のこと）を用いて同時トランスフェクトした。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞は、トランスフェクション４８時間後に、各々が以下の抗体を含んでいる上で得られたレトロウイルス粒子を用いて形質導入した：５．５５Ｄ２、２６．３Ｅ２、４２．１１Ｄ４、または４２．１８Ｃ２。この形質導入された細胞を連続して継代培養した。
【０１６６】
培養上清を形質導入の１０日後に取り除き、ＨＰＬＣを介して分析した。頂部のクロマトグラムは、レトロウイルスベクター系によって生成される抗体に相当する精製抗体の標準の混合物である。４つの引き続くクロマトグラムは、レトロウイルスベクター系を用いて産生された抗体を含有する培養上清の分析を示す（図１２に示すとおり）。図１２に示すとおり、抗体タンパク質は、別個の保持時間でＨＰＬＣカラムから溶出した。さらに、レトロウイルスベクター系を用いて産生された抗体、および標準抗体混合物由来の対応する抗体は、同様の保持時間を示す。このクロマトグラムの標識された５．５５Ｄ２では、１つのピークは、標準的な抗体混合物における全長５．５５Ｄ２抗体に対応する。より短い保持時間を有する第二のピークは、抗体のλ軽鎖の過剰産生に相当し得る。
【０１６７】
本実施例は、バランスのとれた抗体発現ベクターが宿主細胞ゲノムＤＮＡ中に安定に組み込まれ得ることを示す。当業者は、重鎖および軽鎖のバランスが常に単純ではないこと、および較正されなければならないことを理解するであろう。例えば、図１９に示される構築物を含んでいるＩＲＥＳについては、重鎖および軽鎖のバランスは、４つの抗体のうち３つで存在した。バランスを得るためには、レトロウイルスベクターまたはそれらの構成要素を用いる種々の選択肢がある。１つの選択肢は、一本鎖のベクターを用いて１細胞あたり複数の組み込みで完全なバランスを示す細胞株を選択することである（例えば、米国特許第６，８５２，５１０号を参照のこと）。あるいは、図１９に存在するＩＲＥＳエレメントは、プロモーターエレメントのような別のエレメントで置き換えてもよい。ＩＲＥＳがプロモーターで置き換えられた１つのこのような構築物は、追加の推定の過剰のλ軽鎖なしに、５．５５．Ｄ２抗体を生じるのに成功した。さらに、２Ａ／フリン切断部位を用いてもよい（Ｊｏｓｔｏｃｋら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）８７：１５１７〜１５２４）。あるいは、ＤＮＡプラスミドベクターを、例えば、図１５に示されるように用いてもよく、その場合、ＩＴＲエレメントをＬＴＲエレメントで置換して、クローニングされたレトロウイルスのインテグラーゼ遺伝子を、Ｒｅｐタンパク質の代わりに用いる（図１７に示すＲｅｐ含有プラスミド）。
【０１６８】
別の実験では、抗体軽鎖を形質導入されたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞の形質導入効率もまた試験した。上記のとおり、ＧＰ２−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（レトロウイルスパッケージング細胞株）を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖タンパク質を発現するベクターであるｐ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびに抗体の軽鎖を含んでいる改変ｐＱＣＸＩＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（例としては、ｐ４９８（図２０）を参照のこと）を用いて同時トランスフェクトした。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞は、トランスフェクション４８時間後に、抗体５．５５Ｄ２、２６．３Ｅ２、４２．１１Ｄ４、または４２．１８Ｃ２由来の軽鎖を含んでいる上で得られたレトロウイルス粒子を用いて形質導入した。この形質導入された細胞を、抗生物質選択の非存在下で連続して継代培養した。
【０１６９】
形質導入の４日後および７日後に、細胞を固定して、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ＦＩＸ＆ＰＥＲＭ試薬を用いて透過化処理し、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたマウス抗ヒト軽鎖λ抗体またはκ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてλ軽鎖またはκ軽鎖について染色した。形質導入効率は、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＦＡＣＳを介してアッセイした。ＦＩＴＣ−染色したλもしくはκ軽鎖またはモック形質導入細胞の平均パーセントを図１３に示す。図１３から、形質導入の有効性は、４日〜７日の間で増大するか、または標準誤差内にとどまった。代表的なＦＡＣＳの側面対前方散乱プロットおよび緑色蛍光ヒストグラムを、λ抗体（５．５５Ｄ２）およびκ抗体（２６．３Ｅ２）の形質導入の４日および７日間について、図１３Ｂに示す（図１３Ｂ）。
【０１７０】
図１３によって、抗体鎖、すなわち、免疫グロブリン軽鎖が、図１１に示されるＧＦＰ構築物に近い率で細胞集団中に形質転換され得ることが示される。従って、抗体重鎖を担持するベクターがこれらの細胞集団中にその後形質転換されて、重鎖および軽鎖の両方を含んでいる完全な抗体が作製され得る。
【０１７１】
参照による援用
本明細書で言及される特許文献および科学的文献の各々の全開示は、全ての目的のために参照によって本明細書に援用される。
【０１７２】
等価物
本発明は、その趣旨からもその本質的な特徴からも逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明に限定されるものではなく、あらゆる点で例示とみなされるべきである。従って本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、この特許請求の範囲の意味および等価な範囲に該当するあらゆる変更が、その中に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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