(57)【要約】  本発明は、二価カチオン結合タンパク質をアニオン交換樹脂材料にて高収率および高純度で精製する二段階方法に、該方法により得られる二価カチオン結合タンパク質に、および該方法を実施するための手段を含むキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）二価カチオンが存在しないか、または低濃度で存在するローディングバッファー中の二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料にロードし、つづいて任意で１ないし３回の洗浄工程を行い；
（ｂ）二価カチオン結合タンパク質を、二価カチオンおよび対アニオンを含む溶離液で溶出し、二価カチオン結合タンパク質を含有する溶出液を形成し；
（ｃ）得られた溶出液のプールを希釈し、（（１）導電性を適宜下げてもよく、）二価カチオンの濃度を上げ；
（ｄ）第二アニオン交換樹脂材料に、工程（ｃ）で得られた溶出液をロードし；および
（ｅ）二価カチオン結合タンパク質を含有するフロースルーを採集する
工程を含む、二価カチオン結合タンパク質の精製方法。
【請求項２】
ローディング工程の後で、１回または複数回の洗浄工程（１）、（２）および／または（３）を、洗浄バッファー（１）、（２）および／または（３）を用い、二価カチオンは不在であるが、対アニオンの存在下で行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ローディングバッファーおよび／または洗浄バッファーの少なくとも１つが工程（ｂ）の溶離液のｐＨよりもｐＨ単位で少なくとも０．５低いｐＨを有し、好ましくはローディングバッファーおよび／または洗浄工程（２）のバッファーのいずれかが工程（ｂ）の溶離液のｐＨよりもｐＨ単位で少なくとも０．５低いｐＨを有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）の溶離液が、工程（ａ）のローディングバッファーおよび任意の洗浄バッファーの導電性よりも高い導電性を有し、工程（ｃ）にて補充される、すなわち希釈される溶出液が工程（ｂ）の溶離液の導電性よりも低い導電性を有する、請求項１〜３のいずれか一のまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の少なくとも一つの二価カチオンがＣａ２＋、Ｂｅ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、およびＣｕ２＋からなる群より、またはその組み合わせより選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第一および第二アニオン交換樹脂材料が、各々、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエタン（ＤＭＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、四級アミノアルキル、四級アミノエタン（ＱＡＥ）、および四級アンモニウム（Ｑ）からなる群より独立して選択される正に帯電した基を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一および第二アニオン交換樹脂材料が、各々、アミノヘキシル、ベンズアミジン、リシンおよびアルギニンからなる群より独立して選択される、一級アミンを配位子として担持する、項目１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
二価カチオン結合タンパク質がカルシウム結合タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
二価カチオン結合タンパク質がビタミンＫ−依存性タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
二価カチオン結合タンパク質が、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、アネキシンおよびカルモジュリンからなる群より、特に好ましくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）およびアネキシンＶからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）のｐＨが、任意の洗浄工程が行われる場合で、６.８〜７.５、好ましくは７.０〜７.４であり、任意の洗浄工程が行われない場合では、ｐＨが５.５〜６.５、好ましくは５.９〜６.１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
任意の洗浄工程（３）におけるｐＨが７.０〜８.２、好ましくは７.３〜８.０、さらにより好ましくは７.３〜７.５である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
任意の洗浄工程（１）におけるｐＨが７.３〜７.５であり、任意の洗浄工程（２）におけるｐＨが好ましくは５.５〜６.５、より好ましくは５.９〜６.１である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）における溶出バッファー（すなわち、溶離液）がカルシウムを含有し、７.５〜８.５（好ましくは７.８〜８.２）のｐＨを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ローディング工程（ｄ）におけるローディングバッファーのｐＨが、ローディング工程（ａ）におけるローディングバッファーのｐＨ、またはローディングの後になされる洗浄におけるｐＨのいずれかよりも高い、上記の請求項１〜１４のいずれかに、特に請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
ローディング工程（ｄ）における導電性が、ローディング（ａ）の後になされる洗浄における導電性以下である、上記の請求項１〜１５のいずれかに、特に請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）におけるローディングバッファーでの二価カチオンの濃度が、工程（ｂ）における溶出バッファーでの二価カチオンの濃度よりも高い、上記の請求項１〜１６のいずれかに、特に上記の請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
得られた溶出液のプールに低導電性を提供する工程が、適切な希釈バッファーで希釈することにより、別法としてバッファー組成を変更することにより、あるいはまた透析、透析濾過またはゲル濾過により行われる、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
上記の請求項１〜１８のいずれか一つに記載の方法により得られる二価カチオン結合タンパク質。
【請求項２０】
上記の請求項１〜１８のいずれか一つに記載の方法により得られる（ｒ）ＦＩＸ。
【請求項２１】
少なくとも２７０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性、好ましくは２７０〜３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性、より好ましくは２７０〜３２０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性、特に好ましくは２８０〜３００Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性を有する、請求項２０に記載の（ｒ）ＦＩＸ。
【請求項２２】
約２．５−３の対数減少のＣＨＯ  ＨＣＰ減少比率を有する、請求項２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
５０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ  Ａｇ、好ましくは２０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ  Ａｇ、さらにより好ましくは１０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ  ＡｇのＣＨＯ  ＨＣＰ不純物を含む、請求項２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物、および／または請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
１０ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯ  ＤＮＡ、好ましくは５ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯ  ＤＮＡ、さらにより好ましくは１ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯ  ＤＮＡを含む、請求項２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物、および／または請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
（ｒ）ＦＩＸ組成物が、１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）活性／単位のＦＩＸ凝固活性、好ましくは０.７５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、より好ましくは０.５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、さらにより好ましくは０.３ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性を含む、請求項２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物、および／または請求項２２−２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１−１８のいずれか一項に記載の方法を行うための手段を含むキット
【請求項２７】
１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）活性／単位のＦＩＸ凝固活性、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性を含む、請求項１−１８のいずれか一項に記載の方法により得ることのできる（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【請求項２８】
請求項２０−２４のいずれか一項に記載の１または複数の特性によりさらに特徴付けられる、請求項２７に記載の（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【請求項２９】
１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）活性／単位のＦＩＸ凝固活性、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性を含む、（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【請求項３０】
請求項２０−２４のいずれか一項に記載の１または複数の特性によりさらに特徴付けられる、請求項２９に記載の（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二価カチオン結合タンパク質をアニオン交換樹脂材料で高収率かつ高純度で精製する二段階方法に、好ましくは該方法により得られ得る二価カチオン結合タンパク質、特にＦＩＸに、および該方法を実施するための手段を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え技法が開発されて以降、宿主細胞にて、例えば、該細胞に該タンパク質をコードするＤＮＡをトランスフェクトし、その組換え細胞を該タンパク質を発現するのに好都合な条件下で増殖させることで多くの哺乳動物タンパク質が産生された。該細胞によって細胞培地に分泌されるタンパク質、あるいは細胞内部に残存するタンパク質は、クロマトグラフィー技法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を用いて、該培地および他の構成成分から分離され得る。さらに医薬に用いるためには、純度が特に重要となる。しかしながら、それと同時に、該タンパク質の生物活性も目的とするタンパク質が十分に精製された後も保持されなければならない。
【０００３】
およそ３０年前に、二価カチオンによってアニオン交換樹脂からカルシウム結合タンパク質を溶出する概念が初めて報告された。ウシ血漿からウシ第ＶＩＩ因子を単離するのは成功したが、ヒト第ＶＩＩ因子の精製は未だに問題があり、すなわち産生される物質は純度がそれほど高くないか、あるいは検出可能なタンパク質ではなく、活性として特徴付けられるような少量にて得られるに過ぎなかった。その分野の研究者は、タンパク質を二価カチオン、すなわちクエン酸バリウムに吸着させ、次に該タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにより分離することにより、ヒト血漿からヒト第ＶＩＩ因子を十分な量で（約３０％の収率で）単離するのに成功した。さらには、通常のイオン交換樹脂、例えばアニオン交換樹脂で、二価カチオン、例えばカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、バリウムイオン（Ｂａ２＋）およびストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）含有の溶離溶を用いることによって、種々の比活性を有するビタミンＫ−依存性タンパク質を産生する細胞培地から、ビタミンＫ−依存性タンパク質を回収かつ精製する方法も利用可能であった。
【０００４】
その上さらに、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）含有の溶液をアニオン交換樹脂に適用し、ＦＩＸを該樹脂より溶出するのに必要とされるよりも低い導電性の溶液で該アニオン交換樹脂を洗浄し、二価カチオンを含む第一溶離液でＦＩＸを該アニオン交換樹脂より溶出し、第一溶出液を形成する工程を含む、ＦＩＸの溶液での精製方法が利用可能であった。第一溶出液を次にヘパリンまたはヘパリン様樹脂に適用して第二溶出液を形成し、その第二溶出液をヒドロキシアパライトに適用し、洗浄工程にて高導電性洗浄剤を利用して第三溶出液を形成する。
【０００５】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、ペプチダーゼファミリーＳ１に属する、血液凝固システムのビタミンＫ−依存性セリンプロテアーゼである。ＦＩＸは、第ＶＩａ因子または第ＶＩＩａ因子により活性化されない限り、不活性である。その活性化のためには、カルシウムおよび膜リン脂質が必要である。ＦＩＸの欠乏は劣性遺伝性出血性障害である血友病Ｂを惹起し、その障害は翻訳後に修飾されたＦＩＸ、すなわちリン酸化および硫酸化されたＦＩＸを投与することで治療され得る。ＦＩＸは活性化されたＦＩＸ、すなわちＦＩＸａにさらに変換され得る。ＦＩＸａは（例えば、文献に記載されるようにその血栓形成能を強化することにより）ＦＩＸの所定の組成に悪影響を及ぼしうるため、ＦＩＸ産物はＦＩＸａを低含量で含有することを優先すべきである。
【０００６】
さらには、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、血液凝固カスケードにて顕著な役割を果たすビタミンＫ−依存性セリンプロテアーゼであり、そのカスケードにおいて組織因子（ＴＦ）との血液凝固プロセスを開始する。血管が傷つくと、ＴＦが血液および循環性ＦＶＩＩに曝される。一旦ＴＦと結合すると、ＦＶＩＩは、ＦＶＩＩａ（トロンビンによる）、第Ｘａ、第ＩＸａ、第ＸＩＩａ因子およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体（その基質はＦＸおよびＴＩＸである）に活性化される。さらには、アネキシンＶは、カルシウム依存的にホスファチジルセリンと結合し、膜結合した二次元結晶格子を形成する能力を有するアネキシン群に属する細胞タンパク質である。それは、血液凝固、アポトーシス、食作用および細胞膜由来微粒子の形成に一の役割を果たしているかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かくして、本発明の根底にある課題は、二価カチオン結合タンパク質を高収率および高純度で精製する改善された方法を提供することである。上記した技術的課題の解決方法は特許請求の範囲で特徴付けられる実施態様により達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、好ましい実施態様（項目１）において、二価カチオン結合タンパク質の精製方法であって、
（ａ）二価カチオンが存在しないか、または低濃度で存在するローディングバッファー中の二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料にロードし、つづいて任意で１ないし３回の洗浄工程を行い；
（ｂ）二価カチオン結合タンパク質を、二価カチオンおよび対アニオンを含む溶離液で溶出し、二価カチオン結合タンパク質を含有する溶出液を形成し；
（ｃ）得られた溶出液のプールを希釈し、（（１）導電性を適宜下げてもよく、）二価カチオンの濃度を上げ；
（ｄ）第二アニオン交換樹脂材料に、工程（ｃ）を行って得られた溶出液をロードし；および
（ｅ）二価カチオン結合タンパク質を含有するフロースルーを採集する
工程を含む、方法に関する。
【０００９】
ついては、上記されるような工程（ａ）は、遊離二価カチオンを含むことなく実施されることが好ましい。この文脈において「遊離」二価カチオンとは錯形成されていない二価カチオンを意味する。すなわち、例えば約１ｍＭのＣａ＋＋がＥＤＴＡと錯形成して存在するならば、（遊離）二価カチオンは含まれていないものと考えられる。
【００１０】
最後の任意の洗浄工程において導電性がまだ下がっていない場合には、導電性を下げる任意の工程Ｃ（１）が必要となるだけであり；以下に詳細に記載されるように、導電性を下げるのは洗浄工程３にて実施されるのが好ましい。
【００１１】
項目２    ローディング工程の後で、１回または複数回の洗浄工程（１）、（２）および／または（３）を、洗浄バッファー（１）、（２）および／または（３）を用い、二価カチオンは不在であるが、対アニオンの存在下で行う、項目１に記載の方法。
【００１２】
好ましい対アニオンは：クロリド（最も好ましい）、アセテート、ホスフェート、サルフェート、カルボネートであるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
項目３    ローディングバッファーおよび／または洗浄バッファーの少なくとも１つが工程（ｂ）の溶離液のｐＨよりもｐＨ単位で少なくとも０．５低いｐＨを有し、好ましくはローディングバッファーおよび／または洗浄工程（２）のバッファーのいずれかが工程（ｂ）の溶離液のｐＨよりもｐＨ単位で少なくとも０．５低いｐＨを有する、項目１または２記載の方法。
【００１４】
項目４    工程（ｂ）の溶離液が、工程（ａ）のローディングバッファーおよび任意の洗浄バッファーの導電性よりも高い導電性を有し、工程（ｃ）にて補充される溶出液が工程（ｂ）の溶離液の導電性よりも低い導電性を有する、項目１〜３のいずれかまたは複数の項目に記載の方法。
【００１５】
好ましい実施態様において、溶出バッファーの導電性は１６〜２５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）で、好ましくは１９〜２０ｍＳ／ｃｍ（ＴＲ）である。任意の洗浄工程２が行われる場合（「酸性洗浄」）、導電性は好ましくは１４〜１９ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）であり、より好ましくは１６〜１８ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）であり、あらゆる場合で上記した項目４の要件は満たされていなければならない。
【００１６】
項目５    工程（ｂ）の少なくとも一つの二価カチオンがＣａ２＋、Ｂｅ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、およびＣｕ２＋からなる群より、またはその組み合わせより選択される、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１７】
項目６    第一および第二アニオン交換樹脂材料が、各々、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエタン（ＤＭＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、四級アミノアルキル、四級アミノエタン（ＱＡＥ）、および四級アンモニウム（Ｑ）からなる群より独立して選択される正に帯電した基を有する、項目１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【００１８】
項目７    第一および第二アニオン交換樹脂材料が、各々、アミノヘキシル、ベンズアミジン、リシンおよびアルギニンからなる群より独立して選択される、第一級アミンを配位子として担持する、項目１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【００１９】
項目８    二価カチオン結合タンパク質がカルシウム結合タンパク質である、項目１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【００２０】
項目９    二価カチオン結合タンパク質がビタミンＫ−依存性タンパク質である、項目１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【００２１】
項目１０    二価カチオン結合タンパク質が、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、アネキシンおよびカルモジュリンからなる群より、特に好ましくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）およびアネキシンＶからなる群より選択される、項目１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【００２２】
上記のタンパク質のいずれか一つは、天然源、例えば血漿から、あるいは組換え技法によるかのいずれかで誘導され得る。
【００２３】
項目１１    工程（ａ）のｐＨが、任意の洗浄工程が行われる場合で、６.８〜７.５、好ましくは７.０〜７.４であり、任意の洗浄工程が行われない場合では、ｐＨが５.５〜６.５、好ましくは５.９〜６.１である、項目１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【００２４】
項目１２    任意の洗浄工程（３）におけるｐＨが７.０〜８.２、好ましくは７.３〜８.０、さらにより好ましくは７.３〜７.５である、項目１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【００２５】
項目１３    任意の洗浄工程（１）におけるｐＨが７.３〜７.５であり、任意の洗浄工程（２）のｐＨが好ましくは５.５〜６.５、より好ましくは５.９〜６.１である、項目２〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【００２６】
項目１４    工程（ｂ）における溶出バッファー（すなわち、溶離液）がカルシウムを含有し、７.５〜８.５（好ましくは７.８〜８.２）のｐＨを有する、項目１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【００２７】
項目１５    ローディング工程（ｄ）におけるローディングバッファーのｐＨが、ローディング工程（ａ）におけるローディングバッファーのｐＨ、またはローディング（ａ）の後になされる洗浄におけるｐＨのいずれかよりも高い、上記の項目１〜１４のいずれかに、特に項目３に記載の方法。
【００２８】
上記の、およびまた下記の文脈において「ローディング（ａ）の後になされる洗浄」は、本明細書にて「酸性洗浄」または洗浄２をいう。
【００２９】
項目１６    ローディング工程（ｄ）における導電性が、ローディング（ａ）の後になされる洗浄における導電性以下である、上記の項目１〜１５のいずれかに、特に項目３に記載の方法。
【００３０】
項目１７    工程（ｄ）におけるローディングバッファーでの二価カチオンの濃度が、工程（ｂ）における溶出バッファーでの二価カチオンの濃度よりも高い、上記の項目１〜１６のいずれかに、特に上記の項目３に記載の方法。
【００３１】
項目１８    得られた溶出液のプールに低導電性を提供する工程が、適切な希釈バッファーで希釈することにより、別法としてバッファー組成を変更することにより、あるいはまた透析、透析濾過またはゲル濾過により行われる、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
【００３２】
項目１９    上記の項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法により得られる二価カチオン結合タンパク質。
【００３３】
項目２０    上記の項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法により得られる（ｒ）ＦＩＸ。
【００３４】
項目２１    少なくとも２７０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性、好ましくは２７０〜３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性、より好ましくは２７０〜３２０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性、特に好ましくは２８０〜３００Ｉ．Ｕ．／ｍｇ  ＦＩＸ  Ａｇの比活性を有する、項目２０に記載の（ｒ）ＦＩＸ。
【００３５】
項目２２    約２．５−３の対数減少のＣＨＯ  ＨＣＰ減少比率を有する、項目２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む、医薬組成物。
【００３６】
２.５−３の対数減少は、下記の表４からも誘導されるように、ＣＨＯ  ＨＣＰの減少全体の対数であり、その表４には、２２９（工程１から工程２へ）および１．７５（工程２から工程３へ）のＣＨＯ  ＨＣＰの減少、すなわち１．７５ｘ２２９＝約４４０（その対数は２．６となる）の減少が示される。
【００３７】
項目２３    ５０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ  Ａｇ、好ましくは２０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ  Ａｇ、さらにより好ましくは１０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ  ＡｇのＣＨＯ  ＨＣＰ不純物を含む、項目２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物、および／または項目２２に記載の医薬組成物。
【００３８】
項目２４    １０ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯ  ＤＮＡ、好ましくは５ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯ  ＤＮＡ、さらにより好ましくは１ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯ  ＤＮＡを含む、項目２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物、および／または項目２２または２３に記載の医薬組成物。
【００３９】
項目２５    （ｒ）ＦＩＸ組成物が、１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）活性／単位のＦＩＸ凝固活性、好ましくは０.７５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、より好ましくは０.５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、さらにより好ましくは０.３ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性を含む、項目２０または２１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物、および／または項目２２−２４のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【００４０】
１ｍＵのＦＩＸａ活性／単位のＦＩＸ凝固活性は、ＩＵ／ｍｌのＦＩＸ凝固活性当たりの０．１％の発色活性に等しい（後記されるアッセイ方法を参照のこと）。
【００４１】
項目２６    項目１−１８のいずれか一つに記載の方法を行うための手段を含むキット。
【００４２】
項目２７    １ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）活性／単位のＦＩＸ凝固活性、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性を含む、項目１−１８のいずれか一つに記載の方法により得ることのできる（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【００４３】
項目２８    項目２０−２４のいずれか一つに記載の１または複数の特性によりさらに特徴付けられる、項目２７に記載の（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【００４４】
項目２９    １ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）活性／単位のＦＩＸ凝固活性、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸ活性／単位のＦＩＸ凝固活性を含む、（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【００４５】
項目３０    項目２０−２４のいずれか一つに記載の１または複数の特性によりさらに特徴付けられる、項目２９に記載の（ｒ）ＦＩＸ組成物。
【００４６】
特に好ましい実施態様において、本発明は次の方法に関する：
【００４７】
好ましくは、溶出（ｂ）は、１.８−２.２ｍＭのカルシウムを含有する溶出バッファー（ｐＨ＝７.８−８.２）を用いて行われる。
【００４８】
好ましくは、工程（ｃ）は、カルシウム含有のバッファーを用いてカルシウム濃度を５−７ｍＭに調整し、導電性を１５−１８ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）に下げ、その結果としてｐＨを７.４−７.８として行われる。
【００４９】
かくして、本発明はまた、上記した方法により得られる精製された二価カチオン結合タンパク質に、上記した方法を行うための手段を含むキットに関する。したがって、本発明はまた、本発明の方法により得ることができる、あるいは本発明の方法によって得られたＦＩＸに、好ましくは組換えＦＩＸに関する。本発明はまた、ＦＩＸまたはＦＩＸ組成物に、好ましくは組換えＦＩＸまたはＦＩＸ組成物（ＦＩＸａの含量が低い）に関する。かかるＦＩＸまたはＦＩＸ組成物は本発明の方法により得ることができ、あるいは本発明の方法により得られた。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
一の態様において、本発明は、二価カチオン結合タンパク質の精製方法であって、
（ａ）二価カチオンが存在しないか、または低濃度で存在するローディングバッファー中の二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料にロードし、つづいて任意で１ないし３回の洗浄工程を行い；
（ｂ）二価カチオン結合タンパク質を、二価カチオンおよび対アニオンを含む溶離液で溶出し、二価カチオン結合タンパク質を含有する溶出液を形成し；
（ｃ）得られた溶出液のプールを希釈し、（（１）導電性を適宜下げてもよく、）二価カチオンの濃度を上げ；
（ｄ）第二アニオン交換樹脂材料に、工程（ｃ）で得られた溶出液をロードし；および
（ｅ）二価カチオン結合タンパク質を含有するフロースルーを採集する
工程を含む、方法に関する。
【００５１】
本発明の方法は、２つのアニオン交換カラムを、すなわち第一カラムにて生成物を結合させるモードで操作し、第二カラムにて生成物を非結合させるモードで操作する手順を用いる。該手順の原理は、好ましい実施態様において、カチオン結合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸ）溶液を第一アニオン交換樹脂と（上に）、中性または酸性ｐＨ（ｐＨ＝６.８−７.５、好ましくは７.０−７.４、例えば７.０−７.２）で、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）の存在下で接触させること（すなわち、ロードすること）を要件とする。生成物の収量をさらに改善することを意図とするならば、ＥＤＴＡが選択され得る。ＥＤＴＡは二価カチオン結合タンパク質、例えば、ＦＩＸの結合を改善しうる。好ましい実施態様において、（例えば、以下にさらに詳細に規定されるｐＨで）洗浄し、つづいて低導電性で洗浄（この洗浄は溶出する直前の洗浄である）した後、生成物を、例えばカルシウム含有のバッファー（例えば、ｐＨ＝約８．０）で溶出する。得られた溶出液のプールを希釈して導電性を低下させて、カルシウム濃度を増大させる。希釈溶液は、例えば７.６−７.８のｐＨを有する。第一アニオン交換精製工程の条件付き溶出液のプールを次に第二アニオン交換カラムに移し（例えば、ポンプで送り込み）、その場合、例えばｒＦＩＸ等のカチオン結合タンパク質は、適用される条件（特に、高濃度の二価カチオンが存在し、わずかに塩基性のｐＨおよび約１５−２１ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）の導電性の条件）下では結合せず、それに対してタンパク質不純物は結合する。得られるカチオン結合タンパク質、例えば、第二アニオン交換精製のカラム溶出液に含まれる、ｒＦＩＸは、高アフィニティおよび高比活性を有する。
【００５２】
本明細書で使用される「二価カチオンが存在しない」なる語は、バッファー中に遊離する二価カチオンのないことをいい、ここでタンパク質と結合しているか、キレート化剤、例えばＥＤＴＡと錯形成している二価カチオンは存在してもよい。「二価カチオンが低濃度で存在する」なる語は、二価カチオンがμＭの範囲での濃度、特に最大１０００μＭ、好ましくは最大８００μＭ、さらにより好ましくは最大５００μＭの濃度で存在することをいう。本願では、「二価カチオンが存在しない」なる語はまた、「二価カチオンが低濃度で存在する」について上記した定義を包含することを意味する。
【００５３】
既に上記されるように、 タンパク質と結合したカルシウム、例えばＥＤＴＡと結合したカルシウムは一の実施態様において容認され得る。カルシウムがタンパク質と結合しているならば、それは、本発明との関連で、「不活性な」カルシウムであると考えられる。
それで、そのカルシウムは生成物の結合を干渉しない。他方で、遊離カルシウムは生成物の結合を干渉しうる。
【００５４】
第一アニオン交換樹脂材料の、二価カチオンが存在しない状況下でのローディングバッファーでの二価カチオン結合タンパク質でのローディング（ａ）は、当該分野にて既知のいずれかの方法により実施され得る。特に、二価カチオン結合タンパク質のアニオン交換樹脂材料へのローディングに適する条件は当業者に周知である。生成物の結合を可能とするローディングバッファーの導電性の一定の条件は、使用されるタンパク質およびアニオン交換樹脂材料の個々の特性（例えば、配位子の密度、配位子のプレゼンテーション等）に依存する。二価カチオンは、通常、強酸性である領域（すなわち、負に帯電している領域）でタンパク質と結合する。二価カチオンが結合すると、負電荷は遮蔽される。しかしながら、アニオン交換材料に二価カチオン結合タンパク質を二価カチオンが存在しない状況下でローディングすることによって、例えば、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）によって結合した二価カチオンを取り除くことによって、タンパク質はその表面に、アニオン交換配位子への強固な結合を可能とする、強い負電荷のある区分を担持する。さらには、タンパク質をアニオン交換樹脂材料にロードするための条件は、常に、ｐＨと対イオン（例えば、Ｃｌ−）の濃度との平衡を要求する。対イオンの化学は溶出挙動にも影響を及ぼし、例えばＣｌ−は一価の負電荷を担持し、ホスフェートは中性ｐＨで二価の負電荷を担持する。後者は、Ｃｌ−と比べて、導電性が低いときでさえ、高溶出力を有しうる。
【００５５】
アニオン交換カラム１のローディング（すなわち、工程（ａ））は、好ましくは６.８−７.５、好ましくは７.０−７.４のｐＨでなされ、つづいてローディングを終えるのに７.３−７.５のｐＨで洗浄１がなされ、酸性条件（ｐＨ５.５−６.５、好ましくは５.８−６.２、より好ましくは５.９−６.１）での洗浄２がなされる。さらなる実施態様において、溶出のためのカラムを調製するのにｐＨを７.０−８.２、好ましくは７.３−８.０、例えばｐＨを７.３−７.５とする任意の洗浄３（低導電性洗浄、これは溶出直前に実施される洗浄である）が実施され得る。溶出は７.５−８.５の、より好ましくは７.８−８.２のｐＨで実施される。溶出バッファーのｐＨが、上記される洗浄２（高導電性洗浄、上記の導電性条件を参照のこと）のｐＨよりもｐＨ単位で少なくとも０.５高いことが本発明の特徴の一つである。この第二「酸性」高導電性洗浄は、溶出の導電性よりも低い導電性を有する。
【００５６】
最も好ましい実施態様において、仮に任意の洗浄工程（複数でも可）がなされるならば、第一アニオン交換のローディング工程は、中性ないしわずかに酸性のｐＨで、例えば、６.８−７.５、好ましくは７.０−７.４のｐＨで実施される。好ましくは、このローディング工程の後に、第一洗浄（ｐＨ＝７.３−７.５）を行ってローディングを終え、酸性条件下（ｐＨ＝５.５−６.５、好ましくは５.８−６.２）で第二洗浄、および洗浄３（ｐＨ＝７.３−７.５）を行って溶出のためのカラムを調製する。仮に任意の洗浄工程（複数でも可）がなされないとすれば、第一アニオン交換カラムのローディング工程のｐＨを５.５〜６.５に、より好ましくはｐＨを５.９−６.１にセットする。特に、溶出工程がなされる前に、ｐＨを、好ましくはｐＨ単位で少なくとも０．５大きくすることを要件とするのが本発明の特徴の一つである。この増加は、すべての段階で、例えば、ローディング工程から溶出工程に直に移る段階で、仮に洗浄工程がその間でなされなかったとしても、起こりうる。別の実施態様において、ｐＨの増加は上記されるように酸性洗浄の後に起こる。後記されるように、溶出は、好ましくは７.５−８.５、より好ましくは７.８−８.２で実施される。
【００５７】
洗浄工程が１回だけ実施される、すなわち洗浄工程（１）だけが実施される場合には、この洗浄工程は塩を添加することなく実施され；結果として、ローディング工程と比べて、溶出工程にて最終的にｐＨ単位でｐＨが少なくとも０．５増加している限り、そのｐＨがその洗浄工程で直ちに重要となるものではない。
【００５８】
一の好ましい実施態様において、２つの洗浄工程、すなわち洗浄工程（１）および（２）が実施される場合、あるいはストリンジェントな洗浄工程（２）（下記も参照のこと）だけが実施される場合、このローディングバッファーは、上記されるように中性ないしわずかに酸性の領域にあるｐＨを有するが、このことは、本発明の原理に従えば、第二洗浄工程（すなわち、洗浄工程２）が５.５−６.５または５.９−６.１という低ｐＨである場合にのみ可能となる。仮にローディング工程が既にこの低ｐＨで実施されているならば、洗浄工程（２）もこの低ｐＨであることが好ましい。洗浄工程（２）は、好ましい実施態様において、上記されるように高導電性でなされる。
【００５９】
さらに好ましい実施態様において、３つの洗浄工程、すなわち洗浄工程（１）、（２）および（３）を実施する場合、その洗浄工程（３）は、好ましくは、塩を全く含有せず；その結果、２つの洗浄工程の場合に言及されている上記の条件が提供され、好ましくはローディング工程および／または洗浄工程（２）と比べて、溶出工程にてｐＨがｐＨ単位で少なくとも０.５大きい限り、この工程におけるｐＨは関係ない。洗浄（３）は、好ましくは、低導電性洗浄である（その場合、得られる溶出液の導電性が既に低いならば、工程ｃ（１）は実施する必要がない）。
【００６０】
特に好ましい実施態様において、洗浄工程（３）におけるｐＨは既に、溶出工程のｐＨレベルまで上げられていてもよい。かくして、洗浄工程（３）の好ましいｐＨは７.０と８.２の間、好ましくは７.３と８.０の間にあり、さらにより好ましくは７.３−７.５にある。洗浄工程（３）がこの特定のｐＨ条件で実施されるならば、本発明者らは、洗浄工程（３）が行われないか、この工程が異なるｐＨ、例えば、ローディング工程および／または洗浄工程（１）および（２）の間で使用されるｐＨと同じくらい低いｐＨで行われる状況と比べて、溶出される所望の生成物に含まれる不純物の程度がさらに低下することを見出した。仮説に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、洗浄工程（３）のｐＨを溶出と同じｐＨに調節することで溶出の間のｐＨ勾配を回避しうると考える。溶出の間のｐＨ勾配は、ある種の不純物が生成物と一緒に溶出することを可能とする、干渉源であり得る。上記される洗浄３はカラムを溶出のために有利に条件付ける。この洗浄の高ｐＨおよび低導電性は次の溶出の間に不純物が一緒に溶出することを防止する。
【００６１】
さらにより好ましくは、洗浄工程（３）は、極めて低い、または正に０に近い、導電度を、特に溶出力を有するべきである。そのような極めて低い導電度は、好ましくは１−１５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）であり、より好ましくは５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）より低い。
【００６２】
好ましい実施態様において、ローディング工程（ａ）は、タンパク質、所望の生成物、および細胞培養基のすべての化合物（アミノ酸、ビタミン、糖類、微量の金属等（ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｃａ、約１３ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）を包含する）を含む、溶液を含む。ローディング工程の後で、洗浄工程１を行い、それでローディングを終わらせることが好ましい（好ましくは、中性に近いか、中性のｐＨ、および低導電性）。その後に、好ましくは、第二洗浄工程２が続き、それはストリンジェントな洗浄であると考えられ、好ましくは、低ｐＨおよび１５０〜２１０、好ましくは１７０〜１９０ｍＭ、最も好ましくは１８０ｍＭ（これはＮａＣｌで実施される場合であり、異なる塩での好ましい条件は当業者の知識の範囲内にある）で実施されるのが好ましい。さらに好ましい実施態様において、洗浄工程３を行い、溶出のためのロードされたカラムを調製する。この第三洗浄工程は、好ましくは、上記されるような低導電性およびｐＨで実施される。この洗浄工程は、上記で説明されるように、前の洗浄が低ｐＨであり、カラムを溶出のｐＨに近いものとするために、カラムにおける導電性を下げ、ｐＨを中性に戻すという大きな役割がある。これらの基準は、カルシウムと擬似アフィニティで溶出するカラムを調製し、溶出バッファーと洗浄２バッファーの間の界面で不純物が一緒に溶出することを防止する。
【００６３】
溶出は、好ましくは、二価カチオンを、１５０〜２１０、好ましくは１７０〜１９０ｍＭで、最も好ましくは１８０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで実施される。上記のクロリド（最も好ましい）に加えて、他の対イオン、例えば、以下に限定されるものではないが、アセテート、ホスフェート、サルフェート、カルボネートが可能であり、７.５〜８.５の、好ましくは７.８〜８.２のｐＨで、最も好ましくは８.０のｐＨで、いずれの場合にあっても、ローディングの間に使用されるｐＨと、任意の洗浄の間に、好ましくは洗浄２の間に使用されるｐＨよりもｐＨ単位で少なくとも０.５高いｐＨで実施される。
【００６４】
さらには、二価カチオン結合タンパク質がアニオン交換材料に結合するという条件下で、本発明の方法の工程（ａ）にてその二価カチオン結合タンパク質を該アニオン交換材料にロードするのに適するローディングバッファーは当該分野にて周知である。上記されるように、任意の洗浄工程（複数でも可）が実施されるならば、例えば、該ローディングバッファーは６．８〜７．５のｐＨを、好ましくは７．０〜７．４のｐＨを有し得る。それは、当業者が容易に決定することのできる、二価カチオン結合タンパク質をアニオン交換樹脂材料に結合するのに適するいずれの塩濃度を含有してもよい。好ましい実施態様において、ローディングバッファーは、キレート化剤を、例えばＥＤＴＡを、好ましくは０．５〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは１〜５ｍＭのＥＤＴＡ、好ましくは約２ｍＭのＥＤＴＡを含有してもよい。別途可能性のあるキレート化剤も使用可能であり、それは当業者に周知である。本発明の方法にてアニオン交換樹脂材料に適用されてもよい二価カチオン結合タンパク質を含有するローディングバッファーは、例えば、２０ｍＭのＭＥＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有してもよい。ＭＥＳはｐＨ６とするための緩衝剤の一例であり；ｐＨ７以上では、例えば、トリスバッファーを用いることができる。ローディング材料は、好ましい実施態様において、細胞培養上清であり、基本的にはカルボネートおよびアミノ酸で緩衝化されるため、ローディング材料は必ずしも存在する必要はない。
【００６５】
本発明の方法は、好ましくは、ロードされたアニオン交換樹脂材料を、二価カチオンが存在しない洗浄バッファーで洗浄する工程を含む。この洗浄工程は当該分野にて公知のいずれかの方法によって実施され得る。実質的に二価カチオン結合タンパク質を溶出することなく、アニオン交換材料から不純物を洗浄するのに適する洗浄バッファーは当該分野にて周知である。例えば、洗浄バッファーは、ローディングバッファーのｐＨよりも、ｐＨ単位で少なくとも１．０または少なくとも０．５低く、好ましくは５．５−６．５、より好ましくは５．９−６．１のｐＨを有する。洗浄バッファーは、二価カチオン結合タンパク質を有意な量（当業者であれば容易に決定することのできる量）で溶出することなく、アニオン交換樹脂材料を洗浄するのに適するいずれの塩濃度を含有してもよい。例えば、洗浄バッファーは、例えば、ビス−トリス、酢酸バッファー、クエン酸バッファーまたはリン酸バッファー等の、好ましくは２０ｍＭのビス−トリスの適当な緩衝剤を含有してもよい。好ましくは、洗浄１および３は洗浄バッファーとしてトリスを有し、その一方で洗浄２はＭＥＳを有する。また、例えば、ＥＤＴＡを、好ましくは０．５〜１０ｍＭのＥＤＴＡを、より好ましくは１〜５ｍＭのＥＤＴＡを、好ましくは約２ｍＭのＥＤＴＡ等キレート化剤を含有してもよい。さらには、適当な塩、例えば次のカチオンとアニオンの塩：Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋と、クロリド、ホスフェート、サルフェート、カルボネート、アセテート等のアニオンとの塩であり、洗浄バッファーの導電性を調節するために、例えば、ＮａＣｌ等では＜２００ｍＭの、好ましくは１００ｍＭ〜２００ｍＭ、より好ましくは１５０ｍＭ〜２００ｍＭ、さらに好ましくは１７０ｍＭ〜１９０ｍＭ、および最も好ましくは１７５ｍＭ〜１８５ｍＭの濃度で配合されていてもよい。本発明の別の好ましい実施態様において、洗浄バッファーは１００〜２００ｍＭのＮａＣｌを含有する。塩濃度の絶対値は精製される二価カチオン結合タンパク質に応じて変化し、二価カチオン結合タンパク質が最適純度を得るのに塩濃度を下げるか、または上げる必要があるかを決定することも当業者の認識の範囲内にある。
【００６６】
好ましくは、二価カチオン結合タンパク質を精製するための本発明の方法によれば、第二洗浄工程は上記した第一洗浄工程の後に実施される。この洗浄工程が、溶出する直前の洗浄であるならば、低導電性で実施される。この導電性は、ローディング工程および第一洗浄工程の導電性よりも低いことが好ましい。その上さらに好ましくは、第三洗浄工程が実施され得る。この実施態様は上記に詳細に記載されている。
【００６７】
二価カチオン結合タンパク質の、二価カチオンを含む溶離液での溶出は、当該分野にて既知の方法で実施され得る。好ましい対イオンとして、Ｃａ２＋、Ｂｅ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｕ２＋、あるいはその組み合わせが挙げられる。最も好ましくは、カルシウムである。溶出バッファーは、好ましくは、洗浄バッファーのｐＨよりも高いｐＨを有する。ｐＨは、ｐＨ単位で少なくとも０.５、好ましくは１.０高いことが好ましい。溶出バッファーはｐＨが７.５と８.５の間にあることが極めて好ましく、７.９と８.１の間にあることがさらにより好ましい。溶出バッファーは、当業者が容易に測定することのできる有意な量で不純物を溶出することなく、二価カチオン結合タンパク質を第一アニオン交換樹脂材料より溶出するのに適するいずれの塩濃度を含有してもよい。例えば、それは適当なバッファー剤（例えば、ＨＥＰＥＳ、トリス、好ましくは２０ｍＭトリス、トリス／アセテート、ヒスチジン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ＭＯＰＳ、またはトリシン等）を、典型的には５〜５０ｍＭの範囲にある濃度で含有してもよい。また、それは、バッファーの導電性を制御するために、適当な塩、例えば、以下のカチオンおよびアニオン：Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋と、クロリド、ホスフェート、サルフェート、カルボネート、アセテートなどのアニオンとの塩（例えば、ＮａＣｌ等）を含有してもよく、１５０−２００ｍＭの濃度で存在してもよい。以下が特に好ましい一連のバッファーである：
トリス：ｐＨ＝８.０６±１.０のバッファー；
ＨＥＰＥＳ：ｐＨ＝７.７±１.０のバッファー；
ＭＯＰＳ：ｐＨ＝７.３±１.０のバッファー；
トリシン：ｐＨ＝８.３±１.０のバッファー；
ヒスチジン：ｐＨ＝７.６±１.０のバッファー；
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：ｐＨ＝７.４±１.０のバッファー；
ビス−トリス：ｐＨ＝６.３５±１.０のバッファー；
ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）：ｐＨ＝７.０±１.０のバッファー；
ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノジ酢酸）：ｐＨ＝７.０±１.０のバッファー；
ＭＥＳ：ｐＨ＝約６.０のバッファー。
【００６８】
溶出バッファーも、洗浄バッファーの導電性を制御するために、適当な塩（例えば、ＮａＣｌ等）を含有してもよく、１００−２００ｍＭの濃度で存在してもよい。塩濃度の絶対値は精製されるべき二価カチオン結合タンパク質に依存しており、二価カチオン結合タンパク質が最適純度を得るのにより低いまたはより高い塩濃度を必要とするかどうかを決定することは当業者の知識の範囲内にある。
【００６９】
溶出工程の後で、得られた溶出液のプールを希釈して導電性を下げ、二価カチオンの濃度、好ましくはカルシウム濃度を上げる。この基準は、生成物の第二アニオン交換樹脂への結合を防止する条件を提供し、宿主細胞タンパク質の結合を促進する。そのような希釈は当業者に公知であり、周知方法により行われる。例えば、一カラム容量の希釈バッファーを添加することで、Ｃａは増加し、伝導率はわずかに減少する。この希釈された溶液は、好ましくは、７ないし８の、より好ましくは７.５ないし７.９の最終ｐＨを有する。
【００７０】
当業者であれば、得られた溶出液のプールに低伝導性を付与するさらなる操作も、溶出液のプールを希釈し、導電性を下げる定義の範囲内にあることを理解する。かくして、溶出液のプールの導電性を下げる可能性のあるさらなる手段は、例えば、低塩バッファーで希釈するか、または透析するか、あるいは透析濾過を用いてバッファーの組成を変えることである。
【００７１】
本明細書で用いるように、「アニオン交換樹脂材料」なる語は、特定の制限を基礎とするものではない。本発明によれば、第一および第二樹脂は、例えばアガロースを基剤とするクロマトグラフィー材料（例えば、セファロース・ファーストフロー（Fast Flow）またはカプト（Capto））、ポリマー合成材料（例えば、ポリメタクリレート・トーヨーパールズ（Toyopearls））、ポリスチレン／ジビニルベンゼン（例えば、ポロス（Poros）、ソース（Source））またはセルロース（例えば、セルフィン（Cellufine））等の、当該分野にて公知のアニオン交換クロマトグラフィーに適するいずれの材料も包含する。本発明の特定の例において、第一および第二アニオン交換樹脂材料はセファロースであり、それは修飾アガロースを基剤とし、その多糖鎖が架橋して三次元網目構造を形成する。好ましい実施態様において、第一および第二アニオン交換樹脂材料は、以下のものに限定されないが、配位子として第一アミンを担持する樹脂（例えば、アミノヘキシルセファロース、ベンズアミジンセファロース、リシンセファロース、またはアルギニンセファロース）を包含する。別の好ましい実施態様において、第一および第二アニオン交換樹脂材料は、以下のものに限定されないが、アルキルアミノエタン（例えば、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエタン（ＤＭＡＥ）またはトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、四級アミノアルキル、四級アミノエタン（ＱＡＥ）、四級アンモニウム（Ｑ）等などの、中性ｐＨで正に帯電した部分を有する樹脂を包含する。特に好ましい実施態様において、アニオン交換樹脂材料は、Ｑ−セファロース・ファーストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）である。本発明の方法によれば、第一および第二アニオン交換樹脂材料は同じであっても、異なってもよい。
【００７２】
第二アニオン交換工程のローディングバッファー（工程ｄ）は、第一アニオン交換工程で上記したローディングバッファーと同じとすることができる。本発明に従って提供されるような２つのアニオン交換工程間の違いは、本質的には、以下のとおりである：
ａ）第一アニオン交換カラムには、出発材料、すなわち、好ましい実施態様において、細胞培養材料がロードされる。これは不純度が高い出発材料である。第二アニオン交換カラムでは、それは溶出（および補填）工程の後に得られる材料であるため、既にある程度精製されている材料がロードされる。
ｂ）第一アニオン交換工程は、二価カチオンの不在下で第一アニオン交換カラムをロードした後に、生成物を溶出するのに、二価カチオンで実施される。
ｃ）第二アニオン交換についてのロードの二価アニオンのｐＨおよび濃度は、好ましい実施態様にて、ロード（ｄ）のｐＨが、ロード（ａ）の後の洗浄（酸性洗浄、例えば洗浄２）のｐＨ、または洗浄工程が用いられないとした場合のロード（ａ）そのもののｐＨよりも高いように選択される。さらには、ロード（ａ）の導電性は酸性洗浄のそれと対比可能であるが、この洗浄が実施されるとした場合には、低いことが好ましい。二価カチオン濃度、すなわちＣａ＋＋濃度は、工程（ｂ）の溶出バッファーでのｐＨよりもロード（ｄ）において高い。
ｄ）従って、第一アニオン交換カラムでは、生成物は該カラムと結合するが、第二アニオン交換カラムでは、生成物は結合しない。
【００７３】
本発明の二価カチオン結合タンパク質は、例えばカルシウム結合タンパク質および／またはビタミンＫ−依存性タンパク質等のいずれの二価カチオン結合タンパク質であってもよい。好ましい実施態様において、二価カチオン結合タンパク質は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ，アネキシンおよびカルモジュリンからなる群より選択され、特に好ましくは第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子およびアネキシンＶからなる群より選択される。
【００７４】
二価カチオン結合タンパク質についての出発材料（「サンプル」）は、当業者に公知の方法を用いて得られてもよく、例えば、ＣＨＯ細胞を用いる、血漿由来タンパク質、遺伝子導入で産生されるタンパク質、または遺伝子組換えで産生されるタンパク質である。細胞培養体よりタンパク質を抽出する分泌的および非分泌的方法は当業者に周知である。これは、粗製二価カチオン結合タンパク質を得るために、（ｉ）遺伝的操作により、例えばＲＮＡの逆転写を介して、および／またはＤＮＡの増幅を介して、組換えＤＮＡを産生すること、（ｉｉ）組換えＤＮＡをトランスフェクションにより、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介して原核細胞または真核細胞に導入すること、（ｉｉｉ）該形質転換された細胞を、例えば、連続的方法またはバッチ毎の方法で培養すること、（ｉｖ）二価カチオン結合タンパク質を、例えば構成的に、または誘発で発現すること、（ｖ）タンパク質を、例えば培養基より、あるいは形質転換細胞を収穫することで単離することについて、当該分野にて既知のいずれの方法も包含する。また、二価カチオン結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ、例えば、プラスミドはまた、組換えＤＮＡでトランスフェクトするのに成功している細胞を選択するための選択性マーカーをコードするＤＮＡ配列を含有してもよい。
【００７５】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の出発材料は、ＦＩＸを含む材料、好ましくはＦＩＸを含む血漿、または組換え操作により産生されるＦＩＸである。ＦＩＸの組換え産生は当該分野にて周知である。組換えＦＩＸであるｒＦＩＸは、好ましい実施態様によれば、細胞培養上清（ＣＣＳ）に分泌され、その場合、このＣＣＳが本発明の方法の出発材料として使用される。
【００７６】
タンパク質は、例えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、ゲル濾過、遠心分離、濾過、沈降、結晶化、または当該分野にて公知の他の方法により、予め精製されて不純物を減少させてもよい。本明細書にて使用される「不純物」なる語は、二価カチオン結合タンパク質の産生を起源とするいずれの不純物も包含し、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物、核酸不純物、ポリペプチド不純物、バッファーおよび塩不純物、細胞培養基を起源とする不純物、ダイマーまたはフラグメントなどの生成物関連の不純物、およびその組み合わせを包含する。
【００７７】
本明細書に記載の方法は、活性なＦＩＸ産物から、例えばＦＩＸの不活性で末端切断された形態を除去または分離することを可能とする。該方法はまた、生成物関連の不純物（例えば、分解産物、産物の凝集、粒子）の形成を極めて低いレベルで制御または維持することを可能とする。その上さらに、該方法は、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）の量を特に低レベルで維持する条件を提供する。加えて、該方法はプロセス関連の不純物（ＣＨＰ  ＨＣＰ、ＣＨＯ  ＤＮＡ、培地成分）を活性なＦＩＸ産物より分離するのに特に有力である。
【００７８】
特にＦＩＸ調製物、さらにはＦＩＸ医薬調製物中に認められるさらなる不純物は、活性化ＦＩＸ、すなわちＦＩＸａである。ＦＩＸａは血栓形成を引き起こすため、望ましい結果として得られるＦＩＸ調製物に悪影響を及ぼすことが分かっている。かくして、ＦＩＸ調製物中のＦＩＸａの含有量を減少させる方法を提供することが極めて望ましい。
【００７９】
本発明の方法は、該方法によって得られる調製物中のＦＩＸａの形成を防止することによりこの目的を達成する。
【００８０】
有利かつ意外な方法において、使用される出発材料が、細胞培養または細胞培養上清にて組換え技法により産生されるＦＩＸであるならば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、特にＣＨＯ細胞ＨＣＰの含有量を減少させることも可能である。
【００８１】
さらなる有利かつ意外な方法において、本発明の方法によって得られる組成物中の宿主細胞ＤＮＡ、特にＣＨＯＤＮＡの含有量を減少させることも可能である。
【００８２】
上記によれば、本発明によって提供される収率および比活性においてさらなる改善がもたらされる。
【００８３】
好ましい実施態様において、本発明の方法に従って精製される二価カチオン結合タンパク質は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物に関して、全タンパク質にて、少なくとも９５％ｗ／ｗの、より好ましくは少なくとも９８％ｗ／ｗの、より好ましくは少なくとも９９％ｗ／ｗの、最も好ましくは少なくとも９９．５％ｗ／ｗの、二価カチオン結合タンパク質の純度を有する。従って、好ましい実施態様において、精製された二価カチオン結合タンパク質中のＨＣＰ不純物の含有量は５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは２％ｗ／ｗ未満、より好ましくは１％ｗ／ｗ未満、最も好ましくは０．５％ｗ／ｗ未満である。ＨＣＰ不純物の割合は、生成物の、すなわち精製された二価カチオン結合タンパク質のｗ／ｗをいい、例えば、ＨＰＬＣまたはＥＬＩＳＡで測定され得る。
【００８４】
さらには、本発明の別の態様にて、本発明の方法によって得ることのできる、または得られた、精製された二価カチオン結合タンパク質が提供される。また、本発明の方法を実施するための手段を含むキットも提供される。特に、本発明のキットは、本発明に従ってアニオン交換樹脂材料を用いて二価カチオン結合タンパク質を精製するのに適する、ローディングバッファーおよび／または溶離液および／または洗浄バッファー、および／または二価カチオンの溶液を含有してもよい。好ましい実施態様において、ローディングバッファー、洗浄バッファーおよび／または溶離液は上記されるとおりである。さらには、本発明のキットは、適当なアニオン交換樹脂材料を含有してもよい。
【００８５】
本発明は、さらには、二価カチオン結合タンパク質を精製するための、上記される本発明の方法の、および／または上記される本発明のキットの使用に関する。
【００８６】
本発明は、アニオン交換樹脂材料を用いて、生成物を高収率で産生すると同時に、タンパク質のプロセス関連の不純物を大きく減少させることのできる、二価カチオン結合タンパク質を効率よく精製する方法を提供する。
【００８７】
次に、第一アニオン交換精製工程にて希釈される溶出液のプールを、二価カチオン結合タンパク質が適用される条件下では結合しない、第二アニオン交換カラムにロードする。結果として、第二アニオン交換精製のカラム流出液に含まれる二価カチオン結合タンパク質は純度が高く、比活性も高い。さらには、それは（ＣＨＯ）ＨＣＰの含量が低く、（ＣＨＯ）ＤＮＡの含量およびＦＩＸａの含量も低い。
【００８８】
ＦＩＸａの含量は、第ＩＸ因子活性に対する活性％で表される、その活性により測定される。
【００８９】
組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）生成物の有効性（国際単位、ＩＵでの）は、周知で、認知されているインビトロでの一段階の凝固アッセイを用い、第ＩＸ因子の濃縮物について世界保健機関（ＷＨＯ）の国際基準に対して調整されたリファレンスを用いて決定される。一の国際単位は、プールされたヒト正常血漿（１ｍＬ）中に存在するＦＩＸ活性の量である。
【００９０】
該生成物中のＦＩＸａは、当業者に一般に周知である、アッセイを用いて測定される。一例として、第ＩＸ因子について世界保健機関（ＷＨＯ）の国際基準に対して調整されたリファレンスを利用する、市販品として入手可能な発色性ＦＩＸａキット（Ｒｏｘ  ＦＩＸ−Ａ等、製品番号９５００３０；Rossix, Molndal, Sweden）が挙げられる。かかるアッセイを実施するために、ＦＶＩＩＩ、トロンビン、カルシウムおよびリン脂質の存在下で、ＦＩＸａにより、ヒトＦＸを活性化してＦＸａとする。生成されるＦＸａの量を、切断すると、ＦＸａの量に比例する量でｐ−ニトロアニリンを遊離する、特異的ＦＸａ基質で測定する。該アッセイは、下限が０．１０ｍＩＵ／ｍＬの量でＦＩＸａに対して極めて感受的である。
【００９１】
最終生成物（本発明の方法により得られる生成物）中の予め活性化されたＦＩＸ（ｒＦＩＸａ）のレベルはずっと非常に低かった。許容される限界は＜０．１０％ＦＩＸａ（発色性ＩＵ／ｍＬ）／ＦＩＸ活性（凝固性ＩＵ／ｍＬ）として設定される。本発明の１５個のテストバッチの実際のＦＩＸａ含量は、しかしながら、＜０．０２％ＦＩＸａ／ＦＩＸと低かった。本発明の精製プロセスに従って得られたＦＩＸ調製物はすべて、０．０２％ＦＩＸａ／ＦＩＸ未満の値を有した。一つのＢｅｎｅＦＩＸロット（市場で入手可能な比較製品としてのＥ９４７９１）を同じアッセイで分析し、ＦＩＸａの相対含量を０．１１％と測定した。
【００９２】
総合すれば、あらゆるロットのＦＩＸａ含量は一貫して低く、比較可能な製品の含量よりも最大１０倍低いのは明らかであった。
【００９３】
特に、本発明の方法は、次の原理に基づく。一般に、タンパク質とアニオン交換樹脂材料との結合は低導電性および高ｐＨ値で強くなる。反対に、タンパク質とアニオン交換樹脂材料との結合は高伝導率および低ｐＨ値で弱くなる。本発明の方法にて、二価カチオン結合タンパク質は、上記で詳細に説明されるように、低ｐＨでロードおよび／または洗浄されるのが好ましく、それはさらに二価カチオン結合タンパク質の第一アニオン交換材料への結合を可能とし、二価カチオン結合タンパク質の構造的完全性または活性に害を及ぼさない。タンパク質の多くの不純物は第一アニオン交換樹脂材料に結合せず、したがって不純物と第一アニオン交換樹脂材料との結合は大きく減少し、その一方で生成物は実に第一アニオン交換カラムと結合する。これらの条件下で第一アニオン交換樹脂材料に結合し、洗い落とされないタンパク質の不純物は、溶出の間にｐＨを上げることによって一緒に溶出することが妨げられる。溶離液のｐＨを上げることはすべてのタンパク質を第一アニオン交換樹脂材料とさらに強く結合させるようにするが、二価カチオンが溶出を惹起する生成物と特異的に相互に作用する。第一アニオン交換カラムの溶出液は、導電性を（上記されるように、酸性洗浄と比べて等しいまたはそれよりも低い導電性に）調節し、ｐＨを（ロード（ａ）または酸性洗浄よりも少なくとも０．５高いｐＨに）上げ、および二価カチオンの濃度を（ロード（ａ）での濃度よりも高い濃度に）上げるように条件付けられる。これらの基準は、アニオン交換樹脂に対する不純物の選択的結合および生成物の選択的非結合の条件を提供する。本発明の方法によれば、溶出液に存在する二価カチオンが原因で、二価カチオン結合タンパク質だけが第二アニオン交換材料に結合しない。対照的に、工程（ｂ）の溶出の間にｐＨを上げることはアニオン交換溶出操作については極めて特殊であり、酸性洗浄と比べて工程（ｄ）におけるローディングのためにｐＨを上げることは陰性クロマトグラフィー、すなわちアニオン交換クロマトグラフィーでは極めて特殊である（上記されるように、タンパク質は一般に高ｐＨ値でアニオン交換樹脂材料とより強く結合するため、精製されるタンパク質はフロースルーすると考えられる）。第一アニオン交換樹脂材料からの溶出液を少なくとも１つの二価カチオンと一緒に用いることにより、本発明の方法は、意外かつ有利にも、アニオン交換クロマトグラフィーによる二価カチオン結合タンパク質の生成物の優れた精製を達成する。
【００９４】
特に、工程（ｂ）でのＣａ誘発の生成物を溶出する間のｐＨを増加させること（溶出バッファーが工程（ａ）のローディングバッファーまたは工程（ａ）の酸性洗浄よりもｐＨが高いこと）および工程（ｄ）についてのロードを調節すること（工程（ａ）の酸性洗浄よりもｐＨが高く、工程（ｂ）の溶離液よりも二価カチオンを高くすること）は、二価（Ｃａ）結合タンパク質の選択的精製を提供し、不純物が一緒に溶出することを防止する。第二アニオン交換樹脂材料の高ｐＨおよび（二価カチオンの一例としての）高カルシウムでのローディングは不純物を第二アニオン交換樹脂材料に結合させ、その一方で二価カチオンを補填することで精製すべきタンパク質の結合を阻害する。本発明によれば、上記した条件は二価カチオン結合タンパク質の高純度ならびに高収率をもたらす。本発明の方法は、例えば、タンパク質の溶液をアニオン交換樹脂材料上に低ｐＨでロードし、該生成物を高ｐＨで少なくとも一の二価カチオンでの溶離液で溶出し、その溶出液を高ｐＨで、二価カチオンを高濃度とする条件下で第二アニオン交換樹脂材料上にロードし、フロースルーを収集することにより、プロセス関連のポリペプチドの不純物を有意に減少させる方法を提供する。
【００９５】
本発明にて記載の方法および生成物の種々の修飾および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施態様に関連して記載されるが、かかる実施態様に不当に限定されるべきではない。
【００９６】
精製方法はビタミンＫ依存性タンパク質の独特な生化学特性に基づく。例えば、Ｇｌａドメインにて、約１２の負電荷を短アミノ酸ストレッチ内でフォーカスする。この負電荷は、二価カチオン（例えば、Ｃａ２＋）を該系に加えることで、中和されるか、または正電荷に変換され得る。この作用に基づき、ｒＦＩＸを一の特定の電荷状態でイオン交換樹脂に結合させ、Ｃａ２＋を除去すること（または加えること）によりその電荷を変換することでゲルより溶出することができる。この分離の原理は「シュードアフィニティクロマトグラフィー」と称される。この原理は、Ｇｌａ−ドメインを含まないそれらのビタミンＫ依存性タンパク質においても反映される。例えば、ｒＦＩＸ等の二価カチオン結合タンパク質の精製に適用される本発明の方法は、そのローディング、洗浄および／または溶出バッファーにｐＨシフトを導入し、生成物および不活性なＦＩＸ種およびＣＨＯ宿主細胞タンパク質等のプロセス関連の不純物の取りだしを有意に改善する。
【００９７】
ｒＦＩＸの精製操作
本発明者らは、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１非経口（parenteral）細胞系に基づいて、組換えヒト第ＩＸ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞系を開発した。組換えヒトフューリンを共発現し、プロＦＩＸのＦＩＸへの細胞内変異を改善するように、細胞系を遺伝子操作した。生成プロセスでは、ケモスタットモードにて懸濁中に細胞を培養させ、それらを、哺乳類または血漿由来のタンパク質が添加されていない合成培地に順応させた。大豆ペプトンを該培地に加え、クローンの産生を改善した。
【００９８】
ケモスタット産生キャンペーンにて、集めた細胞の培養ハーベストを、クノ（Cuno）デプスフィルター（陽性ゼータ電位のフィルター）での深層濾過に、ＰＶＤＦまたはＰＥＳフィルター膜で０．２ｐｍの膜濾過に付することにより浄化し、細胞および細胞残骸を除去する。濾過した細胞不含のハーベストはｒＦＩＸの精製プロセスを開発するための出発材料として供する。
【実施例】
【００９９】
ｒＦＩＸの臨床的生成に適用される大規模の精製プロセスは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでのアニオン交換クロマトグラフィーによる捕獲工程で始まり、その浄化されたハーベストに２ｍＭ  ＥＤＴＡを補充し（表１を参照）、約７．０−７．４のｐＨでロードする。ロード（そのローディングバッファーはｒＦＩＸを発現するＣＨＯ細胞系の細胞不含の培養上清であった）および洗浄１を行った後、低ｐＨでの洗浄２をｐＨ６．０で行い、不活性なＦＩＸ種および結合したＣＨＯタンパク質を除去する。導電性が低く、ｐＨが７．３−７．５での第三洗浄を行い、溶出のためのカラムを調製する。該カラムから、カルシウムを含有し、洗浄２のｐＨよりも有意に高いｐＨ（８．０）を有するバッファーで、結合ＦＩＸを溶出する。この操作は、ＦＩＸの選択的溶出、ならびに生成物およびプロセス関連の不純物（不活性なＦＩＸ種およびＣＨＯ宿主細胞タンパク質）の極めて低い共溶出をもたらす。カラムに加えられたＣＨＯ  ＨＣＰタンパク質の約９９．５％はこの工程で除去され（ＣＨＯ  ＨＣＰ減少係数は約１９０）、ＦＩＸの比活性は約１．５倍に増加した。下記の表２はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ工程（第一アニオン交換工程）のためのバッファーの組成を要約する。
【０１００】
第一アニオン交換精製工程の溶出液のプールに、１％トリトンＸ−１００／トリ−ｎ−ブチルホスフェートおよび０．３％ポリソルベート８０を添加することで、溶媒／洗浄剤のウイルスの不活化を行う。Ｓ／Ｄ処理したＦＩＸ溶液をつぎにカルシウム含有のバッファーで希釈し、そのカルシウム濃度を約６ｍＭに調整し、導電性を１５−１８ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）に下げる。溶液のｐＨは８．０から約７．６−７．８にわずかに低下した。
【０１０１】
次に、適用される条件下で、ＦＩＸと結合しない、Ｓ／Ｄ処理および希釈したＦＩＸ溶液をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでの第一精錬工程に適用する（以下の表３を参照のこと）。残りのＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＣＨＯ  ＨＳＰ）は、洗浄２（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでの捕獲工程）と比べてｐＨが高く、捕獲工程の溶出液のプールと比べて導電性が低いため、アニオン交換樹脂に結合しうる。
【０１０２】
この改善された精製方法で得られる結果を以下の表４および５に要約する；表４および５は、その後で行われた２回の実験の結果を示す。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
【表５】
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【国際調査報告】
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