(57)【要約】本発明は、カルジオトロフィンの少なくとも１つの生物学的活性を有し、生物学的薬物様特性が改善された新規のポリペプチド、および本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリペプチドは、例えば、組織再生法など、治療用に用いることができる。本発明のタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０アミノ酸の単離タンパク質、ならびに以下：ａ）配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓまたはＬｙｓ；ｂ）Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの欠失；ｃ）Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８の、別のアミノ酸による少なくとも１つの置換；およびｄ）薬物動態（ＰＫ）調節剤の付加、のうちの１または複数を包含する、配列番号２に対するタンパク質の修飾を含む。
2014507423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０アミノ酸の単離タンパク質、ならびに以下：
ａ）配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓまたはＬｙｓ；
ｂ）Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの欠失；
ｃ）Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８の、別のアミノ酸による少なくとも１つの置換；および
ｄ）薬物動態（ＰＫ）調節剤の付加
のうちの１または複数を包含する、配列番号２に対するタンパク質の修飾を含む組成物。
【請求項２】
前記単離タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０の連続アミノ酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記単離タンパク質が、
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０の連続アミノ酸と；
ｂ）配列番号２に示される前記連続アミノ酸配列中の１〜７アミノ酸のうちの少なくとも１つの破壊と
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号２の前記自然発生でないアミノ酸位置における前記Ｃｙｓが、前記単離タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１０アミノ酸以内にある、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＫ調節剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、Ｃｙｓ１０５およびＣｙｓ１７８が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＫ調節剤がＰＥＧであり、かつＣｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のいずれかが、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲで置換されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
ａ）少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；
ｂ）単離タンパク質約１分子当たり約１個のＰＥＧ部分と；
を含み、
ｃ）前記単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である、
請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ａ）少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；
ｂ）単離タンパク質約１分子当たり約２個のＰＥＧ部分と；
を含み、
ｃ）前記単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である、
請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ａ）少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；
ｂ）単離タンパク質約１分子当たり約０．５個のＰＥＧ部分と；
を含み、
ｃ）前記単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である、
請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＰＫ調節剤がＰＥＧであり、かつＣｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のいずれかが、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲで置換されており、前記単離タンパク質が細胞ベースのアッセイまたは生化学アッセイにおいて活性を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列との８０％同一性を包含し、重量で少なくとも約９５％純粋であり、かつ以下：
ａ）配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓまたはＬｙｓ；
ｂ）Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの欠失；
ｃ）Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８の、別のアミノ酸による少なくとも１つの置換；および
ｄ）薬物動態（ＰＫ）調節剤の付加
のうちの１または複数を包含する、配列番号２に対するタンパク質の修飾を含む、単離タンパク質を含む組成物。
【請求項１２】
前記単離タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１７０〜１９９のアミノ酸と；アミノ酸の少なくとも１つの欠失と；アミノ酸の少なくとも１つの付加とを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記単離タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１７０〜２００のアミノ酸と；唯一のＣｙｓ残基とを含み、内毒素を実質的に含まない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号２の前記自然発生でないアミノ酸位置における前記Ｃｙｓが、前記単離タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１０アミノ酸以内にあるか、またはその自然発生の位置から５アミノ酸以内の位置にある、請求項１２または請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＰＥＧを含むＰＫ調節剤を含み、Ｃｙｓ１０５およびＣｙｓ１７８の一方または両方が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲで置換されている、請求項１１、１２、１３、および１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
ａ）少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；
ｂ）単離タンパク質約１分子当たり約１個のＰＥＧ部分と
を含み、
ｃ）前記単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記単離タンパク質が、約５％以下のタンパク質凝集物を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＰＫ調節剤を伴わない前記タンパク質の半減期と比較して、前記タンパク質の半減期を延長するＰＫ調節剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
ＰＫ調節剤を伴わない前記タンパク質の半減期と比較して、前記タンパク質の半減期を少なくとも約３倍延長するＰＫ調節剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも１ｍｇ／ｍｌの単離タンパク質濃度を含み、約５％以下のタンパク質凝集物を含み、３７℃で少なくとも約１０時間にわたり安定であり、かつ約６．５〜約８のｐＨで処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
約４０ｋＤ以上のＰＥＧを含むＰＫ調節剤、単離タンパク質を含み、Ｃｙｓ１０５およびＣｙｓ１７８の一方または両方がＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲに置換されており、前記単離タンパク質が細胞ベースのアッセイまたは生化学アッセイにおいて活性を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む生物学的に活性な単離ポリペプチドであって、
１位におけるＸａａが存在しないか、またはメチオニンであり；
２位におけるＸａａが存在しないか、または任意のアミノ酸であり；
２０３位におけるＸａａが存在しないか、または任意のアミノ酸であり；そして
アミノ酸１０６位または１７９位の一方または両方において１または複数のアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、ポリペプチド。
【請求項２３】
２位におけるＸａａが、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、トレオニン、セリン、およびバリンからなる群から選択される、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
２０３位におけるＸａａがシステインである、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
化学修飾を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記化学修飾がＰＥＧ化を含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＰＥＧ化が部位特異的である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
１または複数のシステイン残基においてＰＥＧ化されている、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
アミノ酸１０６位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号４、１０、１２、１４、１７、１９、および２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
アミノ酸１７９位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号３、９、１２、１３、１６、１９、および２０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸２０３位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号７〜８、１２〜１５、および１９〜２２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸１０６位、１７９位、および２０３位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号３〜２２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
化学修飾を含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号３〜４、６〜１０、または１２〜２２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記１または複数のシステイン残基においてＰＥＧ化されている、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号２のポリペプチドと比較して、増大させた生物学的活性を有する、請求項２２から３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号２のポリペプチドと比較して、改善された安定性、溶解度、または薬物動態特性を有する、請求項２２から３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
請求項２２から３８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターを含む、請求項４１に記載のポリヌクレオチドを発現させるための発現系。
【請求項４４】
哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞を含む、請求項４３に記載の発現系。
【請求項４５】
請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
哺乳動物細胞または細菌細胞である、請求項４５に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４３に記載の発現系または請求項４５に記載の宿主細胞により生成させるポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１、２、７〜１３、および１６〜２１のいずれか一項に記載の組成物、あるいは請求項２２から３８のいずれか一項に記載のポリペプチド；請求項２２から３８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または請求項２２から３８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、を含む組成物。
【請求項４９】
薬学的に許容される塩、担体、または賦形剤を含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
水溶液において可溶性である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
注射用に処方される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
静脈内注射、心内注射、皮下注射、腹腔内注射、または組織内への直接注射のうちの１または複数のために処方される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
組織の成長、保護、再生、維持、または修復を促進する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
医学的状態を処置、防止、または緩和する方法であって、請求項４９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５５】
前記医学的状態が、虚血性心疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、高血圧症、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心血管異常、動脈炎、動脈、細動脈、および毛細血管の疾患、肝変性疾患、肝硬変、ならびに肝炎からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物を、医療手順の施行後、傷害の発生後、または疾患の発症後１週間以内に患者に投与するステップを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物を、心筋梗塞後１週間以内に患者に投与するステップを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチドを生成させる方法であって、前記ポリペプチドの発現に適する条件下で請求項４５に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項５９】
以下のステップ：ｉ）配列番号２〜２２、および２４〜２５によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記宿主細胞において発現させるステップ；ｉｉ）前記宿主細胞を培養して、前記ポリペプチドを封入体として発現させるステップ；ｉｉｉ）前記封入体を洗浄するステップ；ｉｖ）前記ポリペプチドを可溶化させるステップ；およびｖ）前記ポリペプチドをリフォールディングさせるステップのうちの１または複数を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法により生成されるポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１７８位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０５位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２０２位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２位および２０３位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６６】
配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１７７位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６７】
配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０４位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６８】
配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０４位、１７７位、および２０１位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項６９】
配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１７７位および２０１位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７０】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０４位および２０１位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２０１位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位および１７８位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位および１０５位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７４】
配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７５】
配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位、１０５位、１７８位、および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７６】
配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位、１７８位、および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７７】
配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位、１０５位、および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７８】
配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含む、ポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号２〜２２、および２４〜２５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含む組成物であって、前記単離ポリペプチドが、
ａ）１ｍｇ当たり約５ＥＵ未満の内毒素プロファイル；
ｂ）２２℃で約１０％未満の凝集プロファイルをさらに含み、
前記ポリペプチドが、治療上受容可能な処方物において可溶性である、組成物。
【請求項８０】
前記内毒素プロファイルが、ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）アッセイにより測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記凝集プロファイルが、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
前記単離ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを有さない、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】
前記治療上受容可能な処方物が、担体タンパク質を含まない、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８４】
前記単離ポリペプチドを細菌で生成させる、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８５】
前記単離ポリペプチドがグリコシル化されておらず、３７℃、担体タンパク質の非存在下において少なくとも１２時間にわたり安定である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８６】
前記単離ポリペプチドが、約５％未満の凝集プロファイルを含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８７】
前記単離ポリペプチドが、ｐＨを約６〜８とし、ポリペプチド濃度を少なくとも約１ｍｇ／ｍｌとして処方される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８８】
ラットへと注射されると、前記単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約１０ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８９】
ラットへと注射されると、前記単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約５ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９０】
前記単離ポリペプチドが、３７℃で約４％未満の凝集プロファイルを有する、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９１】
ラットへと注射されると、前記単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約５ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
配列番号２〜２２、および２４〜２５に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１５０の連続アミノ酸を含む単離ポリペプチドを含む組成物であって、前記単離ポリペプチドが、
ａ）１ｍｇ当たり約５ＥＵ未満の内毒素プロファイル；
ｂ）２２℃で約５％未満の凝集プロファイルをさらに含み、
前記ポリペプチドが、治療上受容可能な処方物において可溶性であり、
哺乳動物の炎症促進性作用物質を実質的に含まない、組成物。
【請求項９３】
前記治療上受容可能な処方物が、担体タンパク質を含まない、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記単離ポリペプチドを細菌で生成させる、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９５】
前記単離ポリペプチドがグリコシル化されておらず、封入体内で作製され、かつ３７℃、担体タンパク質の非存在下において少なくとも１２時間にわたり安定である、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９６】
前記単離ポリペプチドが、３７℃で約１０％未満の凝集プロファイルを含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９７】
前記単離ポリペプチドが、ｐＨを約６〜８とし、イオン強度を少なくとも約５０ｍＭとし、ポリペプチド濃度を少なくとも約１ｍｇ／ｍｌとして処方される、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９８】
ラットへと注射されると、前記単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約１０ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９９】
ラットへと注射されると、前記単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約５ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない、請求項９４に記載の組成物。
【請求項１００】
前記単離タンパク質が、３７℃で約４％未満の凝集プロファイルを有する、請求項９４に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記炎症促進性作用物質が、哺乳動物のサイトカインである、請求項９２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表についての陳述
この出願に付随した配列表は、紙面での複製物の代わりにテキスト形式で提供され、これは、参考として本明細書に援用される。この配列表を含むテキストファイルの名称は、ＦＡＴＥ＿０９６＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは４６ＫＢであり、２０１２年２月１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１１年２月１日に出願された米国仮出願第６１／４３８，５８１号、２０１１年２月１日に出願された米国仮出願第６１／４３８，６０７号、２０１１年２月４日に出願された米国仮出願第６１／４３９，８０１号、および２０１１年２月４日に出願された米国仮出願第６１／４３９，８０３号（これらの各々は、それらの全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は一般に、カルジオトロフィンの少なくとも１つの生物学的活性を有し、所望の薬理学的特性を有する、新規のポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドおよびその組成物は、治療的に、例えば、組織の保護および／または再生を促進するために用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）はまた、心肥大因子とも称するが、いまだ治療的には適用されていない。ＣＴ−１ポリペプチドは元来、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて心筋細胞肥大の活性化因子として同定された２１．２ＫＤａの低分子分泌型タンパク質である。ヒトＣＴ−１およびマウスＣＴ−１の両方をコードする遺伝子がクローニングされている（Ｐｅｎｎｉｃａ，  Ｄ．ら（１９９６年）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、８巻：１８３〜１８９頁；Ｐｅｎｎｉｃａ，  Ｄ．ら（１９９５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９２巻：１１４２〜１１４６頁）。
【０００５】
ＣＴ−１とは、インターロイキン６（ＩＬ６）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ニューロポエチン（ＮＰ）、およびインターロイキン１１（ＩＬ１１）が含まれるサイトカインファミリーのメンバーである。このサイトカインファミリーのメンバーは、ｇｐ１３０のホモ二量体としての共通のｇｐ１３０受容体を介して、またはＬＩＦ受容体／ｇｐ１３０など、よりサイトカイン特異的な受容体のヘテロ二量体の複合体を介してシグナル伝達する。ＩＬ−６サイトカインファミリーの受容体は、異なるサブユニットからなるが、このクラス内の全ての受容体は、ｇｐ１３０サブユニットを共有する（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９４年１月２８日；７６巻（２号）：２５３〜２６２頁）。ファミリーのあるメンバー（ＩＬ−６およびＩＬ−１１）が、ｇｐ１３０のホモ二量体化を誘導する（Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、１９９３年６月１８日；２６０巻（５１１５号）：１８０８〜１８１０頁）のに対し、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などの他のメンバーは、ｇｐ１３０サブユニットの１９０ｋＤａのＬＩＦ受容体とのヘテロ二量体化を誘導する（Ｍｕｒａｋａｍｉ、１９９３年）。ＣＴ−１受容体は、ｇｐ１３０鎖と、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲβ）のβサブユニットと、おそらくはＣＴ−１受容体のαサブユニットとして公知の第３の構成要素とを含有する（Ｐｅｎｎｉｃａ，  Ｄら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９９５年２月１４日；９２巻（４号）：１１４２〜１１４６頁；Ｒｏｂｌｅｄｏ，  Ｏ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２巻（８号）：４８５５〜４８６３頁）。αサブユニットは、ＣＴ−１に高度な感受性および特異性を付与する、３部分からなる複合体の形成に関与しうる。
【０００６】
ＣＴ−１によるシグナル伝達は、ＪＡＫ／Ｓｔａｔ３、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ、およびＥＲＫなど、鍵となる細胞内分子および細胞内経路の活性化を結果としてもたらす。ＣＴ−１によるシグナル伝達機構および虚血に対する保護は、心臓組織、肝臓組織、および神経組織において記載されている（Ｗｏｌｌｅｒｔら、１９９６年；Ｓｈｅｎｇら、１９９７年）。特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５は、心不全、不整脈性障害もしくは変力性障害、または末梢神経障害におけるＣＴ−１およびそのアンタゴニストの使用について記載している。また、がんの診断および処置におけるＣＴ−１の使用も記載されている。
【０００７】
ＣＴ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて虚血性損傷から細胞を保護し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて虚血性損傷から組織を保護する、強力な抗アポトーシス性サイトカインとして記載されている（例えば、Ｌｉａｏ，  Ｚ．ら（２００２年）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．、５３巻：９０２〜９１０頁；Ｊｉｎ，  Ｈ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１９９８年、１０巻：１９〜２５頁；Ｌａｔｃｈｍａｎ，  Ｄ  Ｓ．ら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｐａｔｈｏｌ．、１９９９年、８０巻：１８９〜１９６頁；Ｊｏｕｇｓａｋｉ，  Ｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０００年、１０１巻：１４〜１７頁；Ｈｉｓｈｉｎｕｍａ，  Ｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ、１９９９年、２６４巻：４３６〜４４０頁；Ｓｔｅｐｈａｎｏｕ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９９８年、３０巻：８４９〜８５５頁を参照されたい）。また、ＣＴ−１が、細胞死を引き起こす薬剤から結果として生じる肝細胞のアポトーシス／壊死を軽減して、多様な肝毒性剤に対する肝細胞の保護をもたらし、ＣＴ−１が肝臓の再生を刺激しうることも報告されている（特許文献６）。したがって、ＣＴ−１は、治療剤開発のための対象のタンパク質を表す。
【０００８】
ＣＴ−１は、９０年代半ばに発見されたが、文献および技術分野は、この分子の治療用形態を欠いている。ＣＴ−１の潜在的な治療剤としての向上は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける研究および細胞ベースの研究のほか、ヒトにおける治療的評価のための、信頼できる単離野生型タンパク質の欠如により妨げられている。ＣＴ−１の向上はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける複数の活性に対する潜在的可能性および炎症反応などの潜在的な有害作用によっても妨げられている。ＣＴ−１類縁タンパク質の有益な効果と対比した有害作用の評価は、潜在的に以下：
１）免疫系関連の応答をもたらしうる単離タンパク質の凝集レベル；
２）ＩＬ−６、ＴＮＦ、およびＬＩＦなど、炎症または炎症促進性サイトカインの生成を誘導しうる内毒素レベル；
３）不適正にフォールドされているか、３７℃、生理学的に関連するｐＨで生成させていないＣＴ−１タンパク質の不安定性；および
４）炎症または炎症促進性サイトカインの生成を誘導しうる担体タンパク質を伴う処方
を難題とする。
【０００９】
当技術分野は、ＣＴ−１の治療剤としての開発を可能とするＣＴ−１類縁分子の増強をいまだもたらしていない。ＣＴ−１類縁組成物の改善は、例えば、以下：
１）経時的に異なる曝露プロファイルを達成して、異なる治療的有益性をもたらす、異なる血漿中半減期；
２）心肥大など、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与された高レベルの野生型ＣＴ−１について報告されている潜在的な有害作用を回避する能力；
３）ＣＴ−１と関連しうる望ましくないサイトカインレベルを調節する能力；および
４）所望の活性を保持しながらの部位特異的なＰＥＧ化など、ＣＴ−１類縁分子を制御可能にコンジュゲートする能力
をもたらしうる。
【００１０】
さらに、ＣＴ−１は分子量が小さい（２１．２ＫＤａ）ため、クリアランスおよび／または吸収速度を減少させ、したがって、全身半減期を延長し、投与間隔を増大させる、ＣＴ−１ポリペプチドによる処方物および組成物であれば有利であろう。ＣＴ−１は分子量が小さく、これは、結果として体内からの急速なクリアランスをもたらし、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達する場合に、短い全身半減期および低度のバイオアベイラビリティーをもたらしうる。
【００１１】
場合によっては所望の特性を犠牲にしてではあるが、複数の方法により、静脈内投与された特定のポリペプチドの血漿中半減期を延長することができる。これらの方法には、ポリペプチドのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリ［Ｇｌｕ−Ｌｙｓ］、プルランによる修飾、修飾ポリアスパラギン酸または修飾脂肪酸のほか、ガンマ−グロブリンとの共役が含まれる。しかし、ポリペプチドの修飾は、それらの生体活性、分布、および／または安定性の著明な低減を結果としてもたらしうる。これはとりわけ、薬物動態特性を変化させる関与性のサイズのＰＥＧなど、多数の修飾の付加が、生体活性なポリペプチドの酵素的機能またはシグナル伝達機能を遮断または低減する立体障害を引き起こしうる、低分子ポリペプチドの場合である。
【００１２】
例えば、ＰＥＧ化については、多数の問題が観察されている。タンパク質におけるチロシン残基のアシル化は、結果としてそのタンパク質の生物学的活性の低下をもたらす可能性があり；特定のＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートは、安定性が不十分であり、したがって、薬理学的使用がなされず；ＰＥＧ化に用いられる特定の試薬は、反応性が不十分であり、したがって、その間にタンパク質の変性および／または不活化が生じうる、長い反応時間を要請する。また、ＰＥＧ化剤の選択性も不十分でありうる。困難はまた、ＰＥＧ化されるタンパク質の疎水性の結果としても生じる可能性があり；水性溶媒中では、疎水性タンパク質が、生理学的なｐＨでＰＥＧ化に抵抗する。例えば、特許文献７は、ＰＥＧ化が、ＰＥＧ化されるタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性に及ぼす有害作用について記載し、ＰＥＧ化が、タンパク質の活性をほぼ１０分の１に減少させることを裏付けている。加えて、リシン残基の共有結合的修飾は、特定のタンパク質の生体活性の低減と関連することも公知である。活性化させたＰＥＧエステルによるリシン修飾は、ランダムでコントロールが難しく、結果として修飾タンパク質の生体活性の低減をもたらすことが多い（Ｇｏｏｄｓｏｎ，  Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：３４３頁（１９９０年４月））。ＰＥＧ化された誘導体が実際に得られたことの証拠は公表されておらず、これらの提起される修飾ポリペプチドが生物学的活性を保持したことの証拠も公表されていない。
【００１３】
タンパク質間における物理的特徴および薬物動態の広範な差違を踏まえると、タンパク質、特に、ＣＴ−１などの分子量が小さいタンパク質が、ＰＥＧ化などによる修飾に成功しうるかどうか、および／または修飾タンパク質がその生物学的活性をなおも保持するかどうかをあらかじめ予測することは不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，５３４，６１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５７１，６７５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５７１，８９３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６２４，８０６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６７９，５４５号明細書
【特許文献６】米国特許第７，７３２，３９７号明細書
【特許文献７】国際公開第８７／０００５６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、ＣＴ−１は、多様な障害において治療剤として用いられる可能性があり、血漿中半減期が延長されるなど、薬物動態特性が改善され、かつ／または活性が増強された新規のＣＴ−１変異体が強く所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は一般に、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有する、改善されたポリペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらを含む組成物に関する。多様な実施形態では、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０アミノ酸の単離タンパク質、ならびに以下：配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓまたはＬｙｓ；Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの欠失；Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８の、別のアミノ酸による少なくとも１つの置換；および薬物動態（ＰＫ）調節剤の付加のうちの１または複数を包含する、配列番号２に対するタンパク質の修飾を含む組成物を部分的に意図する。
【００１７】
具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０の連続アミノ酸を含む単離タンパク質を含む。
【００１８】
具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、２８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、または２０１の連続アミノ酸を含む単離タンパク質を含む。
【００１９】
別の具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、２８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、または２０１のアミノ酸を含み、配列番号２に示される連続アミノ酸配列中の１〜７アミノ酸のうちの少なくとも１つの破壊をさらに含む、単離タンパク質を含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０の連続アミノ酸と、配列番号２に示される連続アミノ酸配列中の１〜７アミノ酸のうちの少なくとも１つの破壊とを含む単離タンパク質を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓ残基が、単離タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１０アミノ酸以内にある。
【００２２】
さらなる実施形態では、単離タンパク質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＰＫ調節剤と、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されたＣｙｓ１０５およびＣｙｓ１７８を含む単離タンパク質とを含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、単離タンパク質が、ＰＥＧであるＰＫ調節剤と、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲで置換されたＣｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８を含む単離タンパク質とを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、単離タンパク質が、少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；単離タンパク質約１分子当たり約１個のＰＥＧ部分とを含み、単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である。
【００２５】
具体的な実施形態では、単離タンパク質が、少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；単離タンパク質約１分子当たり約２個のＰＥＧ部分とを含み、単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である。
【００２６】
別の具体的な実施形態では、単離タンパク質が、少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；単離タンパク質約１分子当たり約０．５個のＰＥＧ部分とを含み、単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である。
【００２７】
具体的な一実施形態では、単離タンパク質が、ＰＥＧであるＰＫ調節剤を含み、Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲで置換されており、単離タンパク質が細胞ベースのアッセイまたは生化学アッセイにおいて活性を有する。
【００２８】
多様な実施形態では、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列との８０％同一性を包含し、重量で少なくとも約９５％純粋であり、以下：配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓまたはＬｙｓ；Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの欠失；Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８の、別のアミノ酸による少なくとも１つの置換；および薬物動態（ＰＫ）調節剤の付加のうちの１または複数を包含する、配列番号２に対するタンパク質の修飾を含む、単離タンパク質を含む組成物を部分的に意図する。
【００２９】
具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１７０〜２０１のアミノ酸と；アミノ酸の少なくとも１つの欠失と；アミノ酸の少なくとも１つの付加とを含む単離タンパク質を含む。
【００３０】
具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１７０〜１９９のアミノ酸と；アミノ酸の少なくとも１つの欠失と；アミノ酸の少なくとも１つの付加とを含む単離タンパク質を含む。
【００３１】
別の具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１７０〜２０１のアミノ酸と；唯一のＣｙｓ残基とを含み、内毒素を実質的に含まない単離タンパク質を含む。
【００３２】
別の具体的な実施形態では、組成物が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な１７０〜２００のアミノ酸と；唯一のＣｙｓ残基とを含み、内毒素を実質的に含まない単離タンパク質を含む。
【００３３】
一実施形態では、単離タンパク質が、配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置においてＣｙｓを含み、Ｃｙｓが、単離タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１０アミノ酸以内にあり、この場合、Ｃｙｓは、その自然発生の位置にあるかまたはその自然発生の位置から５アミノ酸以内の位置にある。
【００３４】
一実施形態では、単離タンパク質が、配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置においてＣｙｓを含み、Ｃｙｓが、単離タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１０アミノ酸以内にあるか、またはその自然発生の位置から５アミノ酸以内の位置にある。
【００３５】
一実施形態では、単離タンパク質が、Ｃｙｓを、その自然発生の位置またはその自然発生の位置から５アミノ酸以内の位置に含む。
【００３６】
特定の実施形態では、単離タンパク質が、ＰＥＧであるＰＫ調節剤を含み、Ｃｙｓ１０５およびＣｙｓ１７８が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲで置換されている。
【００３７】
さらなる具体的な実施形態では、単離タンパク質が、少なくとも１０ｋＤのＰＥＧを含むＰＫ調節剤と；単離タンパク質約１分子当たり約１個のＰＥＧ部分とを含み、単離タンパク質が、重量で少なくとも９５％純粋である。
【００３８】
具体的な一実施形態では、組成物が、約５％以下のタンパク質凝集物を含む単離タンパク質を含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、単離タンパク質が、ラットにおけるタンパク質の半減期を、ＰＫ調節剤を伴わないタンパク質の半減期と比較して３倍延長するＰＫ調節剤を含む。
【００４０】
別の実施形態では、単離タンパク質の濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌであり、単離タンパク質が、約５％以下のタンパク質凝集物を含み、３７℃で少なくとも１２時間にわたり安定であり、かつ約６．５〜約８のｐＨで処方される。
【００４１】
別の実施形態では、単離タンパク質の濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌであり、単離タンパク質が、約５％以下のタンパク質凝集物を含み、３７℃で少なくとも１０時間にわたり安定であり、かつ約６．５〜約８のｐＨで処方される。
【００４２】
別の実施形態では、単離タンパク質の濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌであり、単離タンパク質が、約５％以下のタンパク質凝集物を含み、３７℃で少なくとも８時間にわたり安定であり、かつ約６．５〜約８のｐＨで処方される。
【００４３】
別の実施形態では、単離タンパク質の濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌであり、単離タンパク質が、約５％以下のタンパク質凝集物を含み、３７℃で少なくとも６時間にわたり安定であり、かつ約６．５〜約８のｐＨで処方される。
【００４４】
具体的な実施形態では、単離タンパク質が、約４０ｋＤ以上のＰＥＧであるＰＫ調節剤を含み、Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、またはＲに置換されており、前記単離タンパク質が細胞ベースのアッセイまたは生化学アッセイにおいて活性を有する。
【００４５】
他の多様な実施形態では、本発明は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む生物学的に活性な単離ポリペプチドであって、１位におけるＸａａが存在しないか、またはメチオニンであり；２位におけるＸａａが存在しないか、または任意のアミノ酸であり；２０３位におけるＸａａが存在しないか、または任意のアミノ酸であり；アミノ酸１０６位または１７９位において１または複数のアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含むポリペプチドを部分的に提供する。
【００４６】
一実施形態では、２位におけるＸａａが、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、トレオニン、セリン、およびバリンからなる群から選択される。
【００４７】
別の実施形態では、２０３位におけるＸａａがシステインである。
【００４８】
さらなる実施形態では、ポリペプチドが化学修飾を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、化学修飾がＰＥＧ化を含む。
【００５０】
特定の具体的な実施形態では、ＰＥＧ化が部位特異的である。
【００５１】
一実施形態では、ポリペプチドが、１または複数のシステイン残基においてＰＥＧ化されている。
【００５２】
具体的な実施形態では、ポリペプチドが、アミノ酸１０６位においてＰＥＧ化されたシステインを含む。
【００５３】
さらなる実施形態では、ポリペプチドが、配列番号４、１０、１２、１４、１７、１９、および２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００５４】
さらなる実施形態では、ポリペプチドが、アミノ酸１７９位においてＰＥＧ化されたシステインを含む。
【００５５】
別の具体的な実施形態では、ポリペプチドが、配列番号３、９、１２、１３、１６、１９、および２０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００５６】
特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドが、アミノ酸２０３位においてＰＥＧ化されたシステインを含む。
【００５７】
別の特定の具体的な実施形態では、ポリペプチドが、配列番号７〜８、１２〜１５、および１９〜２２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００５８】
一実施形態では、ポリペプチドが、アミノ酸１０６位、１７９位、および２０３位においてＰＥＧ化されたシステインを含む。
【００５９】
さらなる実施形態では、ポリペプチドが、配列番号３〜２２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００６０】
具体的な実施形態では、ポリペプチドが化学修飾を含む。
【００６１】
別の具体的な実施形態では、ポリペプチドが、配列番号３〜４、６〜１０、または１２〜２２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、１または複数のシステイン残基においてＰＥＧ化されている。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１７８位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０５位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２０２位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２位および２０３位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１７７位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０４位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０４位、１７７位、および２０１位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１７７位および２０１位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１０４位および２０１位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸２０１位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７３】
一実施形態では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位および１７８位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位および１０５位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位、１０５位、１７８位、および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７７】
一実施形態では、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位、１７８位、および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位、１０５位、および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸１位および２０２位のうちの１または複数においてＰＥＧ化されたシステインを含むポリペプチドを提供する。さらに別の具体的な実施形態では、ポリペプチドが、配列番号２のポリペプチドと比較して増大させた生物学的活性を有する。
【００８０】
特定の実施形態では、ポリペプチドが、配列番号２のポリペプチドと比較して安定性、溶解度、または薬物動態特性が改善されている。具体的な実施形態では、本発明は、前出のポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを意図する。
【００８１】
他の具体的な実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを意図する。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を意図する。
【００８３】
他の特定の実施形態では、本発明は、本発明の宿主細胞により生成させるポリペプチドを意図する。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させる発現系を提供する。
【００８５】
具体的な実施形態では、発現系が、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞を含む。
【００８６】
特定の実施形態では、宿主細胞が、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【００８７】
さらなる実施形態では、宿主細胞が、哺乳動物細胞または細菌細胞である。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、本発明の発現系または本発明の宿主細胞により生成させるポリペプチドを提供する。
【００８９】
他の多様な実施形態では、本発明は、本発明の組成物、本発明のポリペプチドを含む組成物；本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物；本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物を部分的に意図する。
【００９０】
一実施形態では、組成物が、薬学的に許容される塩、担体、または賦形剤を含む。
【００９１】
具体的な実施形態では、組成物が、水溶液において可溶性である。
【００９２】
別の具体的な実施形態では、組成物が、注射用に処方されている。
【００９３】
特定の実施形態では、組成物が、静脈内注射、心内注射、皮下注射、腹腔内注射、または組織内への直接注射のうちの１または複数のために処方されている。
【００９４】
特定の具体的な実施形態では、組成物が、組織の成長、再生、維持、または修復を促進する。
【００９５】
他の多様な実施形態では、本発明は、医学的状態を処置、防止、または緩和する方法であって、本発明の組成物を投与するステップを含む方法を部分的に意図する。
【００９６】
一実施形態では、医学的状態が、虚血性心疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、高血圧症、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心血管異常、動脈炎、動脈、細動脈、および毛細血管の疾患、肝変性疾患、肝硬変、肝炎、ならびに糖尿病からなる群から選択される。
【００９７】
具体的な実施形態では、組成物を、医療手順の施行後、傷害の発生後、または疾患の発症後１週間以内に患者に投与する。
【００９８】
特定の実施形態では、組成物を、心筋梗塞後１週間以内に患者に投与する。
【００９９】
多様な実施形態では、本発明は、ポリペプチドを生成させる方法であって、ポリペプチドの発現に適する条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
【０１００】
一実施形態では、ポリペプチドを生成させる工程が、以下のステップ：ｉ）配列番号２〜２２、および２４〜２５によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップ；ｉｉ）宿主細胞を培養して、ポリペプチドを封入体として発現させるステップ；ｉｉｉ）封入体を洗浄するステップ；ｉｖ）ポリペプチドを可溶化させるステップ；およびｖ）ポリペプチドをリフォールディングさせるステップのうちの１または複数を含む。
【０１０１】
他の多様な実施形態では、本発明は、以下のステップ：ｉ）配列番号２〜２２、および２４〜２５によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップ；ｉｉ）宿主細胞を培養して、ポリペプチドを封入体として発現させるステップ；ｉｉｉ）封入体を洗浄するステップ；ｉｖ）ポリペプチドを可溶化させるステップ；およびｖ）ポリペプチドをリフォールディングさせるステップのうちの２つ以上を含む工程により生成させるポリペプチドを提供する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明は、配列番号２〜２２、および２４〜２５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含む組成物であって、単離ポリペプチドが、
ａ）１ｍｇ当たり約５ＥＵ未満の内毒素プロファイル；
ｂ）２２℃で約１０％未満の凝集プロファイルをさらに含み、
ポリペプチドが、治療上受容可能な処方物において可溶性である組成物を提供する。
【０１０３】
具体的な実施形態では、内毒素プロファイルが、ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）アッセイにより測定される。一部の実施形態では、凝集プロファイルが、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定される。
【０１０４】
本発明の一部の実施形態では、単離ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを有さない。さらに他の実施形態では、治療上受容可能な処方物が、担体タンパク質を含まない。
【０１０５】
一部の実施形態では、単離ポリペプチドを細菌で生成させる。さらなる実施形態では、単離ポリペプチドがグリコシル化されておらず、３７℃、担体タンパク質の非存在下において少なくとも１２時間にわたり安定である。
【０１０６】
他の実施形態では、単離ポリペプチドが、約５％未満の凝集プロファイルを含む。本発明のさらなる実施形態では、単離ポリペプチドが、ｐＨを約６〜８とし、ポリペプチド濃度を少なくとも約１ｍｇ／ｍｌとして処方される。他の実施形態では、ポリペプチド濃度が、少なくとも約４ｍｇ／ｍｌである。
【０１０７】
さらに他の実施形態では、ラットへと注射されると、単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約１０ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない。本発明の一部の実施形態では、ラットへと注射されると、単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約５ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない。本発明の別の実施形態は、配列番号２〜２２、および２４〜２５に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１５０の連続アミノ酸を含む単離ポリペプチドを含む組成物であって、単離ポリペプチドが、
ａ）１ｍｇ当たり約５ＥＵ未満の内毒素プロファイル；
ｂ）２２℃で約１０％未満の凝集プロファイルをさらに含み、
前記ポリペプチドが、治療上受容可能な処方物において可溶性であり、
哺乳動物の炎症促進性作用物質を実質的に含まない組成物を提供する。
【０１０８】
一実施形態では、治療上受容可能な処方物が、担体タンパク質を含まない。一部の実施形態では、単離ポリペプチドを細菌で生成させる。
【０１０９】
一部の実施形態では、単離ポリペプチドがグリコシル化されておらず、封入体内で作製され、かつ３７℃、担体タンパク質の非存在下において少なくとも１２時間にわたり安定である。他の実施形態では、単離ポリペプチドが、３７℃で約５％未満の凝集プロファイルを含む。さらに他の実施形態では、単離ポリペプチドが、ｐＨを約６〜８とし、イオン強度を少なくとも約５０ｍＭとし、ポリペプチド濃度を少なくとも約１ｍｇ／ｍｌとして処方される。
【０１１０】
本発明のさらなる実施形態では、ラットへと注射されると、単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約１０ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない。他の実施形態では、ラットへと注射されると、単離ポリペプチドにより２時間以内に誘導される少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの分泌が、１ｍｇ当たり約５ＥＵの内毒素プロファイルを有する同等なポリペプチドの場合より少ない。
【０１１１】
一部の実施形態では、単離ポリペプチドが、３７℃で約４％未満の凝集プロファイルを有する。さらに他の実施形態では、炎症促進性作用物質が、哺乳動物のサイトカインである。
【０１１２】
一実施形態では、本発明は、本発明の組成物を生成させる工程であって、以下のステップ：ｉ）配列番号２〜２２、および２４〜２５によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップ；ｉｉ）宿主細胞を培養して、ポリペプチドを封入体として発現させるステップ；ｉｉｉ）封入体を洗浄するステップ；ｉｖ）ポリペプチドを可溶化させるステップ；ｖ）ポリペプチドをリフォールディングさせるステップ；およびポリペプチドを治療上受容可能な緩衝液へと透析するステップのうちの１または複数を含む工程を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、多様な種に由来するＣＴ−１タンパク質配列のアライメントを示す図である。ヒト、マウス、およびラットに由来するカルジオトロフィン１のアミノ酸配列である。同一なアミノ酸に影を付す。ヒト配列におけるシステイン残基および齧歯動物配列における類縁残基を、太字および下線で示す。
【図２】図２は、ＣＴ−１変異体の概要を示す図である。野生型のヒトＣＴ−１と、構築し、発現させ、精製し、試験にかけた新規の組成物との間の相対的なアミノ酸配列の変化を図示する概略図である。構築物を記載するのに本出願全体で用いられる構築物の番号および記号を列挙する。野生型ヒトＣＴ−１（ＦＴＶ３７０）は、１つは１０５位に、２つ目は１７８位に、２つのシステイン残基を含有する。新規の変異体であるＦＴＶ３８０、ＦＴＶ３８１、およびＦＴＶ３８２は、システイン残基の一方または両方を突然変異させている。新規の変異体であるＦＴＶ３８３、ＦＴＶ３８４、およびＦＴＶ３８５は、システインの両方を突然変異（野生型ＣＴ−１における１０５位および１７８位と比べて）させており、アミノ末端もしくはカルボキシル末端または両方の末端においてさらなるシステイン残基を有する。
【図３−１】図３は、ヒトＣＴ−１の野生型および変異体の精製を示す図である。多様なＣＴ−１変異体タンパク質を精製するのに用いられる戦略である：Ａ）封入体をリフォールディングさせるステップとＣＴ−１の最終精製ステップとを明示するフローダイアグラムである。各工程段階のステップ収量を、ｍｇ単位のタンパク質により列挙する。Ｂ）ＣＴ−１の、夾雑する宿主細胞タンパク質からの分離を示す、精製のイオン交換クロマトグラフィー段階を示す図である。クロマトグラフィーのＵＶ（Ａ２８０）出力を、回収された各画分中のタンパク質を図示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥと並べて示す。Ｃ）最終タンパク質の純度を示す、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを例示する図である。Ｄ）調製物の純度および均質性を図示する、精製ＣＴ−１タンパク質のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラフィーを例示する図である。Ｅ）単量体ＣＴ−１ポリペプチドの純度および均質性を示す、曲線下面積解析（ＡＵＣ）を伴うＨＰＬＣ−ＳＥＣを示す図である。
【図３−２】図３は、ヒトＣＴ−１の野生型および変異体の精製を示す図である。多様なＣＴ−１変異体タンパク質を精製するのに用いられる戦略である：Ａ）封入体をリフォールディングさせるステップとＣＴ−１の最終精製ステップとを明示するフローダイアグラムである。各工程段階のステップ収量を、ｍｇ単位のタンパク質により列挙する。Ｂ）ＣＴ−１の、夾雑する宿主細胞タンパク質からの分離を示す、精製のイオン交換クロマトグラフィー段階を示す図である。クロマトグラフィーのＵＶ（Ａ２８０）出力を、回収された各画分中のタンパク質を図示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥと並べて示す。Ｃ）最終タンパク質の純度を示す、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを例示する図である。Ｄ）調製物の純度および均質性を図示する、精製ＣＴ−１タンパク質のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラフィーを例示する図である。Ｅ）単量体ＣＴ−１ポリペプチドの純度および均質性を示す、曲線下面積解析（ＡＵＣ）を伴うＨＰＬＣ−ＳＥＣを示す図である。
【図３−３】図３は、ヒトＣＴ−１の野生型および変異体の精製を示す図である。多様なＣＴ−１変異体タンパク質を精製するのに用いられる戦略である：Ａ）封入体をリフォールディングさせるステップとＣＴ−１の最終精製ステップとを明示するフローダイアグラムである。各工程段階のステップ収量を、ｍｇ単位のタンパク質により列挙する。Ｂ）ＣＴ−１の、夾雑する宿主細胞タンパク質からの分離を示す、精製のイオン交換クロマトグラフィー段階を示す図である。クロマトグラフィーのＵＶ（Ａ２８０）出力を、回収された各画分中のタンパク質を図示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥと並べて示す。Ｃ）最終タンパク質の純度を示す、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを例示する図である。Ｄ）調製物の純度および均質性を図示する、精製ＣＴ−１タンパク質のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラフィーを例示する図である。Ｅ）単量体ＣＴ−１ポリペプチドの純度および均質性を示す、曲線下面積解析（ＡＵＣ）を伴うＨＰＬＣ−ＳＥＣを示す図である。
【図４−１】図４は、システイン修飾戦略の例を示す図である。ＣＴ−１タンパク質および変異体は、システイン残基のチオール基へのマレイミド化学反応によるコンジュゲーションを使用することにより、部位特異的な形で修飾することができる。Ｂ）ＰＥＧ修飾の例を示す図である：単鎖または分枝状鎖のＰＥＧ分子を用いて、マレイミド−チオールコンジュゲーションを介してＣＴ−１タンパク質および変異体を修飾することができる。１２個のＰＥＧ単位および２４個のＰＥＧ単位の低分子単鎖のＰＥＧ分子または３×１２個のＰＥＧ単位の分枝状鎖のＰＥＧ分子をまず用いた。Ｃ）ＰＥＧ修飾のさらなる例を示す図である：また、図示される３０ＫＤａおよび４０ＫＤａのＰＥＧなど、高分子量の単鎖または分枝状鎖のＰＥＧ分子も、ＣＴ−１変異体を単一のシステイン／チオール基で修飾するのに用いた。Ｄ）ＣＴ−１タンパク質および変異体は、２つのマレイミド基を伴う可撓性のＰＥＧリンカーを用いて二量体化することもでき、多量体化することもできる。ＰＥＧリンカーの長さは、立体障害に応じて変化しうることを示す図である。
【図４−２】図４は、システイン修飾戦略の例を示す図である。ＣＴ−１タンパク質および変異体は、システイン残基のチオール基へのマレイミド化学反応によるコンジュゲーションを使用することにより、部位特異的な形で修飾することができる。Ｂ）ＰＥＧ修飾の例を示す図である：単鎖または分枝状鎖のＰＥＧ分子を用いて、マレイミド−チオールコンジュゲーションを介してＣＴ−１タンパク質および変異体を修飾することができる。１２個のＰＥＧ単位および２４個のＰＥＧ単位の低分子単鎖のＰＥＧ分子または３×１２個のＰＥＧ単位の分枝状鎖のＰＥＧ分子をまず用いた。Ｃ）ＰＥＧ修飾のさらなる例を示す図である：また、図示される３０ＫＤａおよび４０ＫＤａのＰＥＧなど、高分子量の単鎖または分枝状鎖のＰＥＧ分子も、ＣＴ−１変異体を単一のシステイン／チオール基で修飾するのに用いた。Ｄ）ＣＴ−１タンパク質および変異体は、２つのマレイミド基を伴う可撓性のＰＥＧリンカーを用いて二量体化することもでき、多量体化することもできる。ＰＥＧリンカーの長さは、立体障害に応じて変化しうることを示す図である。
【図５−１】図５は、新規のＣＴ−１変異体の部位特異的ＰＥＧ化を示す図である。新規のＣＴ−１変異体タンパク質の部位特異的修飾（ＰＥＧ化）と関連する分子量の変化を図示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、１２単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＭＭ（ＰＥＧ）２４とは、２４単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＴＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、鎖１本当たり１２単位を伴う分枝状鎖のＰＥＧを示す。Ａ）自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのアミノ末端に有するタンパク質ＦＴＶ３８３は、効率は低いが、チオール−マレイミドコンジュゲーションを介して、単鎖分子または分枝状鎖分子でＰＥＧ化しうることを示す図である。これに対し、自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのカルボキシル末端に有するＦＴＶ３８４は、単鎖分子または分枝状鎖分子による高効率のＰＥＧ化が可能であることも示す図である。Ｂ）ＦＴＶ３８４が、３０分間にわたる反応の後、修飾されない残留タンパク質がほとんど見られず極めて効率的にＰＥＧ化されることを示す図である。Ｃ）１０５位における自然発生のシステインをセリンで置き換えたＦＴＶ３８０は、効率は低いが、残りのシステイン（１７８）においてＰＥＧ化しうることを示す図である。これに対し、１０５位のシステインを保持し、１７８位のシステインを置き換えたＦＴＶ３８１は、高効率でＰＥＧ化しうることも示す図である。Ｄ）示される通り、ＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４の、高分子量のＰＥＧ分子を用いる部位特異的ＰＥＧ化を提示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。Ｅ）示される通り、ＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４の、高分子量のＰＥＧ分子を用いる部位特異的ＰＥＧ化についての、抗ＣＴ−１抗体を用いるウェスタンブロット解析を示す図である。
【図５−２】図５は、新規のＣＴ−１変異体の部位特異的ＰＥＧ化を示す図である。新規のＣＴ−１変異体タンパク質の部位特異的修飾（ＰＥＧ化）と関連する分子量の変化を図示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、１２単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＭＭ（ＰＥＧ）２４とは、２４単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＴＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、鎖１本当たり１２単位を伴う分枝状鎖のＰＥＧを示す。Ａ）自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのアミノ末端に有するタンパク質ＦＴＶ３８３は、効率は低いが、チオール−マレイミドコンジュゲーションを介して、単鎖分子または分枝状鎖分子でＰＥＧ化しうることを示す図である。これに対し、自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのカルボキシル末端に有するＦＴＶ３８４は、単鎖分子または分枝状鎖分子による高効率のＰＥＧ化が可能であることも示す図である。Ｂ）ＦＴＶ３８４が、３０分間にわたる反応の後、修飾されない残留タンパク質がほとんど見られず極めて効率的にＰＥＧ化されることを示す図である。Ｃ）１０５位における自然発生のシステインをセリンで置き換えたＦＴＶ３８０は、効率は低いが、残りのシステイン（１７８）においてＰＥＧ化しうることを示す図である。これに対し、１０５位のシステインを保持し、１７８位のシステインを置き換えたＦＴＶ３８１は、高効率でＰＥＧ化しうることも示す図である。Ｄ）示される通り、ＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４の、高分子量のＰＥＧ分子を用いる部位特異的ＰＥＧ化を提示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。Ｅ）示される通り、ＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４の、高分子量のＰＥＧ分子を用いる部位特異的ＰＥＧ化についての、抗ＣＴ−１抗体を用いるウェスタンブロット解析を示す図である。
【図５−３】図５は、新規のＣＴ−１変異体の部位特異的ＰＥＧ化を示す図である。新規のＣＴ−１変異体タンパク質の部位特異的修飾（ＰＥＧ化）と関連する分子量の変化を図示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、１２単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＭＭ（ＰＥＧ）２４とは、２４単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＴＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、鎖１本当たり１２単位を伴う分枝状鎖のＰＥＧを示す。Ａ）自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのアミノ末端に有するタンパク質ＦＴＶ３８３は、効率は低いが、チオール−マレイミドコンジュゲーションを介して、単鎖分子または分枝状鎖分子でＰＥＧ化しうることを示す図である。これに対し、自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのカルボキシル末端に有するＦＴＶ３８４は、単鎖分子または分枝状鎖分子による高効率のＰＥＧ化が可能であることも示す図である。Ｂ）ＦＴＶ３８４が、３０分間にわたる反応の後、修飾されない残留タンパク質がほとんど見られず極めて効率的にＰＥＧ化されることを示す図である。Ｃ）１０５位における自然発生のシステインをセリンで置き換えたＦＴＶ３８０は、効率は低いが、残りのシステイン（１７８）においてＰＥＧ化しうることを示す図である。これに対し、１０５位のシステインを保持し、１７８位のシステインを置き換えたＦＴＶ３８１は、高効率でＰＥＧ化しうることも示す図である。Ｄ）示される通り、ＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４の、高分子量のＰＥＧ分子を用いる部位特異的ＰＥＧ化を提示する、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。Ｅ）示される通り、ＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４の、高分子量のＰＥＧ分子を用いる部位特異的ＰＥＧ化についての、抗ＣＴ−１抗体を用いるウェスタンブロット解析を示す図である。
【図６】図６は、新規のＣＴ−１変異体の部位特異的二量体化を示す図である。新規のＣＴ−１変異体の二量体化を示す、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。構築物番号、ＰＥＧリンカー、および反応時間を列挙する。２つのマレイミド活性基を伴う短い、可撓性のリンカーＰＥＧ分子を用いて、ＣＴ−１変異体を二量体化させた（ＢＭ（ＰＥＧ）２は、２個のＰＥＧ単位のリンカーを示し、ＢＭ（ＰＥＧ）３は、３個のＰＥＧ単位のリンカーを示す）。アミノ末端のシステイン残基を有するＦＴＶ３８３は、ある程度二量体化させうるが、工程がやや非効率的である。これに対し、カルボキシ末端のシステインを有するＦＴＶ３８４は、そのシステインを介して効率的に二量体化させることができ、ＰＥＧリンカーを用いて４４ＫＤａのタンパク質を形成する。Ｂ）二量体化させたＦＴＶ３８４タンパク質の精製を示すＦＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図７Ａ】図７は、Ｓｔａｔ３リン酸化アッセイによる新規のＣＴ−１変異体の活性評価を示す図である。新規のＣＴ−１変異体の濃度または野生型タンパク質濃度の滴定を用いて、２０分間にわたりＣ２Ｃ１２細胞を処置した後、細胞を採取し、溶解させた。溶解物には、総Ｓｔａｔ３およびリン酸化Ｓｔａｔ３ならびにローディング対照としてのアクチンについてウェスタンブロット法を施した。Ａ）総Ｓｔａｔ３およびアクチンについて一定のブロット強度を示すウェスタンブロット、ならびに、細胞を、示される濃度のＣＴ−１または変異体で処置する場合の、リン酸化Ｓｔａｔ３についての滴定を例示する図である。Ｂ）ウェスタンブロットに対して密度測定を実施し、リン酸化Ｓｔａｔ３の値を、総Ｓｔａｔ３に照らして標準化し、用量反応曲線を作成した。ＥＣ５０値は、示される曲線から求めた。
【図７Ｂ】図７は、Ｓｔａｔ３リン酸化アッセイによる新規のＣＴ−１変異体の活性評価を示す図である。新規のＣＴ−１変異体の濃度または野生型タンパク質濃度の滴定を用いて、２０分間にわたりＣ２Ｃ１２細胞を処置した後、細胞を採取し、溶解させた。溶解物には、総Ｓｔａｔ３およびリン酸化Ｓｔａｔ３ならびにローディング対照としてのアクチンについてウェスタンブロット法を施した。Ａ）総Ｓｔａｔ３およびアクチンについて一定のブロット強度を示すウェスタンブロット、ならびに、細胞を、示される濃度のＣＴ−１または変異体で処置する場合の、リン酸化Ｓｔａｔ３についての滴定を例示する図である。Ｂ）ウェスタンブロットに対して密度測定を実施し、リン酸化Ｓｔａｔ３の値を、総Ｓｔａｔ３に照らして標準化し、用量反応曲線を作成した。ＥＣ５０値は、示される曲線から求めた。
【図８】図８は、活性を改善した新規のＣＴ−１変異体を示す図である。Ｓｔａｔ３リン酸化活性アッセイを三連で実施し、野生型ＣＴ−１と、１０５位のシステインをセリンへと突然変異させた新規のＣＴ−１変異体であるＦＴＶ３８０とを比較した。ＥＣ５０値を示す。
【図９−１】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける新規のＣＴ−１変異体についての活性評価および比較を示す図である。Ｓｔａｔ３リン酸化活性アッセイを既に記載した通りに完了させ、複数回の実験に由来する平均のＥＣ５０値を標準偏差と共にプロットした。ＣＴ−１変異体およびＰＥＧ修飾または二量体修飾を、平均のＥＣ５０として示す。Ａ）修飾（ＰＥＧ化または二量体化）される前のＣＴ−１変異体を、比活性について比較したことを示す図である。Ｂ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８０と比較する比活性を示す図である。Ｃ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８１と比較する比活性を示す図である。Ｄ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８３と比較する比活性を示す図である。Ｅ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化および二量体化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８４と比較する比活性を示す図である。
【図９−２】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける新規のＣＴ−１変異体についての活性評価および比較を示す図である。Ｓｔａｔ３リン酸化活性アッセイを既に記載した通りに完了させ、複数回の実験に由来する平均のＥＣ５０値を標準偏差と共にプロットした。ＣＴ−１変異体およびＰＥＧ修飾または二量体修飾を、平均のＥＣ５０として示す。Ａ）修飾（ＰＥＧ化または二量体化）される前のＣＴ−１変異体を、比活性について比較したことを示す図である。Ｂ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８０と比較する比活性を示す図である。Ｃ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８１と比較する比活性を示す図である。Ｄ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８３と比較する比活性を示す図である。Ｅ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化および二量体化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８４と比較する比活性を示す図である。
【図９−３】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける新規のＣＴ−１変異体についての活性評価および比較を示す図である。Ｓｔａｔ３リン酸化活性アッセイを既に記載した通りに完了させ、複数回の実験に由来する平均のＥＣ５０値を標準偏差と共にプロットした。ＣＴ−１変異体およびＰＥＧ修飾または二量体修飾を、平均のＥＣ５０として示す。Ａ）修飾（ＰＥＧ化または二量体化）される前のＣＴ−１変異体を、比活性について比較したことを示す図である。Ｂ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８０と比較する比活性を示す図である。Ｃ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８１と比較する比活性を示す図である。Ｄ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８３と比較する比活性を示す図である。Ｅ）ＥＣ５０として提示される平均の比活性であって、野生型のＣＴ−１タンパク質を、ＰＥＧ化および二量体化によるこの変異体の修飾前および修飾後における変異体ＦＴＶ３８４と比較する比活性を示す図である。
【図１０】図１０は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドの内毒素評価を示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドの２つの独立のバッチの内毒素含量を測定するためのカイネティックＬＡＬアッセイの結果について記載する表である。内毒素単位（ＥＵ）は、治療用タンパク質の容量およびｍｇとして表される。
【図１１】図１１は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドのＮ末端の配列決定を示す図である。エドマン分解および質量分析によるＮ末端の配列決定の結果を示す表である。アミノ酸配列は、均質なタンパク質生成物を結果としてもたらすのに有効なＮ末端メチオニン残基の除去を示す。
【図１２Ａ】図１２は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドの総質量および酵素消化物のペプチド解析を示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドの翻訳後における完全性を解析するための、全タンパク質およびトリプシンにより消化されたペプチドの質量分析解析を示す図である。Ａ）全タンパク質の質量分析解析により、質量が２１．０９４ＫＤａのＣＴ−１ポリペプチドが示される図である。Ｂ）ペプチドの保持を示すＣＴ−１のトリプシンによる消化のＬＣ−ＭＳ出力を示す図である。Ｃ）予測されるペプチド配列は、タンパク質の９６．５％を結果として占めたことから、翻訳後修飾が見られないことが示される図である。
【図１２Ｂ】図１２は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドの総質量および酵素消化物のペプチド解析を示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドの翻訳後における完全性を解析するための、全タンパク質およびトリプシンにより消化されたペプチドの質量分析解析を示す図である。Ａ）全タンパク質の質量分析解析により、質量が２１．０９４ＫＤａのＣＴ−１ポリペプチドが示される図である。Ｂ）ペプチドの保持を示すＣＴ−１のトリプシンによる消化のＬＣ−ＭＳ出力を示す図である。Ｃ）予測されるペプチド配列は、タンパク質の９６．５％を結果として占めたことから、翻訳後修飾が見られないことが示される図である。
【図１２Ｃ】図１２は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドの総質量および酵素消化物のペプチド解析を示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドの翻訳後における完全性を解析するための、全タンパク質およびトリプシンにより消化されたペプチドの質量分析解析を示す図である。Ａ）全タンパク質の質量分析解析により、質量が２１．０９４ＫＤａのＣＴ−１ポリペプチドが示される図である。Ｂ）ペプチドの保持を示すＣＴ−１のトリプシンによる消化のＬＣ−ＭＳ出力を示す図である。Ｃ）予測されるペプチド配列は、タンパク質の９６．５％を結果として占めたことから、翻訳後修飾が見られないことが示される図である。
【図１３】図１３は、ＣＴ−１の市販形態についての安定性評価を示す図である。市販のＣＴ−１ポリペプチドの多様な形態および処方物についての安定性評価である。示される通り、タンパク質の形態、処方物、温度、および安定性評価の時点である。表示される時点において溶存している残留タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロット法による評価である。
【図１４Ａ】図１４は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドの安定性評価を示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドの安定性評価である。示される通り、タンパク質の形態、処方物、温度、および安定性評価の時点である。Ａ）表示される時点において溶存している残留タンパク質のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロット法による評価である。Ｂ）出発値に照らして標準化したクーマシーシグナルによる密度測定解析を示す図である。示される通り、保持されるタンパク質の比率である。
【図１４Ｂ】図１４は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドの安定性評価を示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドの安定性評価である。示される通り、タンパク質の形態、処方物、温度、および安定性評価の時点である。Ａ）表示される時点において溶存している残留タンパク質のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロット法による評価である。Ｂ）出発値に照らして標準化したクーマシーシグナルによる密度測定解析を示す図である。示される通り、保持されるタンパク質の比率である。
【図１５Ａ】図１５は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性評価を示す図である。Ｓｔａｔ３リン酸化アッセイを用いる、治療用ＣＴ−１ポリペプチド活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価である。Ａ）ＣＴ−１処置の滴定から結果として生じるリン酸化Ｓｔａｔ３の、三連のウェスタンブロット法による解析を示すデータを例示する図である。示される通り、総Ｓｔａｔ３およびアクチンローディング対照である。Ｂ）ウェスタンブロット法による密度測定の定量化および用量反応関係としてプロットされる曲線の結果として、治療用ＣＴ−１ポリペプチド（ＦＴＶ３７０）およびＣＴ−１の活性が低度な突然変異体（ＦＴＶ３８２）による２つのバッチについてのＥＣ５０値がもたらされることを示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドについての８回にわたる独立の滴定研究の平均のＥＣ５０値および標準偏差を表化する。
【図１５Ｂ】図１５は、治療用ＣＴ−１ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性評価を示す図である。Ｓｔａｔ３リン酸化アッセイを用いる、治療用ＣＴ−１ポリペプチド活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価である。Ａ）ＣＴ−１処置の滴定から結果として生じるリン酸化Ｓｔａｔ３の、三連のウェスタンブロット法による解析を示すデータを例示する図である。示される通り、総Ｓｔａｔ３およびアクチンローディング対照である。Ｂ）ウェスタンブロット法による密度測定の定量化および用量反応関係としてプロットされる曲線の結果として、治療用ＣＴ−１ポリペプチド（ＦＴＶ３７０）およびＣＴ−１の活性が低度な突然変異体（ＦＴＶ３８２）による２つのバッチについてのＥＣ５０値がもたらされることを示す図である。治療用ＣＴ−１ポリペプチドについての８回にわたる独立の滴定研究の平均のＥＣ５０値および標準偏差を表化する。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＣＴ−１をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【０１１５】
配列番号２は、配列番号１によりコードされるヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１６】
配列番号３は、アミノ酸１０５位においてセリンを有する修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１７】
配列番号４は、アミノ酸１７８位においてセリンを有する修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１８】
配列番号５は、アミノ酸１０５位および１７８位においてセリンを有する修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１１９】
配列番号６は、アミノ酸１０６位および１７９位においてセリンを有し、アミノ酸２位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２０】
配列番号７は、アミノ酸１０５位および１７８位においてセリンを有し、アミノ酸２０２位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２１】
配列番号８は、アミノ酸１０６位および１７９位においてセリンを有し、アミノ酸２位および２０３位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２２】
配列番号９は、Ｎ末端メチオニンを欠き、配列番号２の１０５位に対応するアミノ酸位置においてセリンを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２３】
配列番号１０は、Ｎ末端メチオニンを欠き、配列番号２の１７８位に対応するアミノ酸位置においてセリンを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２４】
配列番号１１は、Ｎ末端メチオニンを欠き、配列番号２の１０５位および１７８位に対応するアミノ酸位置においてセリンを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２５】
配列番号１２は、Ｎ末端メチオニンを欠き、配列番号２の２０２位に対応するアミノ酸位置においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
配列番号１３は、Ｎ末端メチオニンを欠き、アミノ酸１０５位においてセリンを有し、配列番号２の２０２位に対応するアミノ酸位置においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２７】
配列番号１４は、Ｎ末端メチオニンを欠き、アミノ酸１７８位においてセリンを有し、配列番号２の２０２位に対応するアミノ酸位置においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
配列番号１５は、Ｎ末端メチオニンを欠き、アミノ酸１０５位および１７８位においてセリンを有し、配列番号２の２０２位に対応するアミノ酸位置においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
配列番号１６は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸１０５位においてセリンを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３０】
配列番号１７は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸１７８位においてセリンを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３１】
配列番号１８は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸１０５位および１７８位においてセリンを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
配列番号１９は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸２０２位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３３】
配列番号２０は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸１０５位においてセリンを有し、アミノ酸２０２位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３４】
配列番号２１は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸１７８位においてセリンを有し、アミノ酸２０２位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３５】
配列番号２２は、Ｎ末端システインを有し、アミノ酸１０５位および１７８位においてセリンを有し、アミノ酸２０２位においてシステインを有する、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３６】
配列番号２３は、修飾ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３７】
配列番号２４は、ヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３８】
配列番号２５は、Ｎ末端メチオニンを欠く、配列番号２４のヒトＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３９】
詳細な説明
Ａ．概観
本発明は、治療的使用に適するＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。一部の態様では、本発明のポリペプチドは、新規のＣＴ−１ポリペプチド、ＣＴ−１の生物学的活性を保有するその変異体、オリゴマー、および化学修飾された誘導体を包含する。本発明はまた、野生型ＣＴ−１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、本発明の方法により生成させ、安定性、純度、または内毒素プロファイルもしくは凝集プロファイルが改善されたポリペプチドも提供する。治療的使用に適する野生型および変異体のＣＴ−１ポリペプチドを生成させる方法に加えて、本発明はまた、野生型または変異体のＣＴ−１ポリペプチドによる組成物であって、哺乳動物、とりわけ、ヒトにおける血漿中半減期の延長など、生物学的薬物様特性が改善され、安定性、溶解度、生成、および処方が増強された組成物、ならびにこのようなＣＴ−１組成物の治療的使用も提供する。本発明のＣＴ−１組成物の治療的使用は、例えば、組織の成長、再生、修復、保護、または維持の促進を包含する。
【０１４０】
本発明の具体的な態様では、本発明の新規の変異体が、ポリペプチドの生物学的活性、安定性、純度、および溶解度を含め、所望のポリペプチドの特性に対して有害作用を引き起こすことなく、血漿中半減期など、ポリペプチドの薬物動態特性を部分的に増強する修飾を包含する。例えば、かつ、限定なしに述べると、本発明の一部の実施形態では、新規の変異体が、ポリペプチドの部位特異的修飾を容易にする１または複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を包含する。一部の実施形態では、新規の変異体を部位特異的修飾により修飾して、ポリペプチドの薬物動態特性および薬物様特性を増大させる。一実施形態では、新規の変異体を部位特異的修飾によりＰＥＧ化して、治療的に用いられるタンパク質の分子量を増大させ、血漿中半減期を延長する。
【０１４１】
本発明はまた、野生型のＣＴ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドのほか、本明細書で記載される新規の変異体を含めた、ＣＴ−１の生物学的活性を保有するポリペプチドを生成させる方法であって、結果として得られるポリペプチドが、治療的特性を増強している（すなわち、本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比較して）方法も提供する。一部の実施形態では、本発明の方法により生成されるポリペプチドが、溶解度、安定性（分解および凝集に対する安定性の増大など）、および純度の、本発明の方法により調製しないＣＴ−１ポリペプチドを上回る改善を呈示する。
【０１４２】
本明細書で開示されるＣＴ−１ポリペプチドの各々および１つ１つは、ＣＴ−１ポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞などの発現系、ＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物、ヒトまたは動物の身体を処置する方法において用いられる本発明のＣＴ−１ポリペプチド、組織の成長および／または再生を促進するための薬物などの薬物の製造におけるＣＴ−１ポリペプチドの使用、ＣＴ−１ポリペプチドおよび他の組成物を作製する方法、本明細書で開示される方法および使用と同様、本発明の態様を表す。
【０１４３】
本発明の実施は、別段にそうでないと示されない限り、当技術分野の範囲内にある従来の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の方法であって、それらの多くが以下で例示を目的として記載される方法を使用する。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月改定）；「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」の縮約版、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩおよびＩＩ巻（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）を参照されたい。
【０１４４】
「市販の化学物質」は、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｐｏｗｅｌｌ、ＯＨ）、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＧｍｂＨ）、Ｎａｎｏｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｙ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、Ｎｅｋｔａｒ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ；Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌおよびＦｌｕｋａを含めた）、Ａｐｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｍｉｌｔｏｎ  Ｐａｒｋ、ＵＫ）、Ａｖｏｃａｄｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｋ．）、ＢＤＨ  Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）、Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ、Ｕ．Ｋ．）、Ｃｈｅｍｓｅｒｖｉｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）、Ｋｅｙ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ、Ｕ．Ｋ．）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ、ＮＨ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ、Ｕ．Ｋ．）、Ｐａｒｉｓｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｏｒｅｍ、ＵＴ）、Ｐｆａｌｔｚ＆Ｂａｕｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ、ＣＮ）、Ｐｏｌｙｏｒｇａｎｉｘ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ  ＡＧ（Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）、Ｔｒａｎｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、およびＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）が含まれるがこれらに限定されない、標準的な市販品供給源から得ることができる。
【０１４５】
当業者に公知の方法は、各種の参考文献およびデータベースにより確認することができる。本明細書で記載される化合物および化合物コンジュゲートの調製において有用な反応物質の合成について詳述するか、または本明細書で記載される化合物および化合物コンジュゲートの調製について記載する論文に言及する、適切な参考文献および論考には、例えば、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓ．  Ｒ．  Ｓａｎｄｌｅｒら、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３年；Ｈ．  Ｏ．  Ｈｏｕｓｅ、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、２版、Ｗ．  Ａ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９７２年；Ｔ．  Ｌ．  Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ、「Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年；Ｊ．  Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年が含まれる。本明細書で記載されるコンジュゲート化合物の調製において有用な反応物質の合成について詳述するか、または本明細書で記載されるコンジュゲート化合物の調製について記載する論文に言及する、さらなる適切な参考文献および論考には、例えば、Ｆｕｈｒｈｏｐ，  Ｊ．およびＰｅｎｚｌｉｎ，  Ｇ．、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、改訂増補２版（１９９４年）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＩＳＢＮ：  ３−５２７−２９０７４−５；Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｒ．Ｖ．、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｔｅｘｔ」（１９９６年）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ：  ０−１９−５０９６１８−５；Ｌａｒｏｃｋ，  Ｒ．  Ｃ．、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、２版（１９９９年）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＩＳＢＮ：  ０−４７１−１９０３１−４；Ｍａｒｃｈ，  Ｊ．、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、４版（１９９２年）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＩＳＢＮ：  ０−４７１−６０１８０−２；Ｏｔｅｒａ，  Ｊ．（編）、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（２０００年）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＩＳＢＮ：  ３−５２７−２９８７１−１；Ｐａｔａｉ，  Ｓ．、「Ｐａｔａｉ’ｓ  １９９２  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ」（１９９２年）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ：  ０−４７１−９３０２��−９；Ｑｕｉｎ，  Ｌ．Ｄ．ら、「Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（２０００年）、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ：  ０−４７１−３１８２４−８；Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，  Ｔ．  Ｗ．  Ｇ．、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、７版（２０００年）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＩＳＢＮ：  ０−４７１−１９０９５−０；Ｓｔｏｗｅｌｌ，  Ｊ．Ｃ．、「Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２版（１９９３年）、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ：  ０−４７１−５７４５６−２；「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ：  Ａｎ  Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」（１９９９年）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＩＳＢＮ：  ３−５２７−２９６４５−Ｘ、全８巻；「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」（１９４２〜２０００年）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、全５５巻；ならびに「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、全７３巻が含まれる。
【０１４６】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
Ｂ．定義
別段に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を用いうるが、本明細書では、方法および材料の好ましい実施形態が記載される。本発明の目的で、下記では、以下の用語について定義する。
【０１４８】
本明細書では、冠詞の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その」が、その冠詞の文法的対象のうちの１または複数（すなわち、少なくとも１つの）を指すのに用いられる。例として述べると、「エレメント」とは、１つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。
【０１４９】
本明細書で用いられる、「約」または「およそ」という用語は、基準の量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％だけ変化する量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さを指す。具体的な実施形態では、数値に前置される場合の「約」または「およそ」という用語は、上下に１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を示す。
【０１５０】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、そうでないと明示されない限り、互換的に用いられ、従来の意味に従って、すなわち、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により連結されたアミノ酸配列として用いられる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長のタンパク質配列を含む場合もあり、全長タンパク質の断片を含む場合もあり、タンパク質のＮ末端、内部部分、および／またはＣ末端における１または複数のアミノ酸の付加、欠失、修飾、または置換を含む場合もあり、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのほか、当技術分野において公知である、他の自然発生の修飾および自然発生でない修飾の両方も包含しうる。本発明のポリペプチドは、周知の多様な組換え法および／または合成法のうちのいずれかを用いて調製することができ、これらの例については以下でさらに論じられる。
【０１５１】
本明細書で用いられる、「野生型ＣＴ−１」および「野生型ＣＴ−１ポリペプチド」という用語は、配列番号２に示されるポリペプチド配列を有するポリペプチドを指す。本明細書で用いられる「ＣＴ−１ポリペプチド」という用語は、配列番号２に示されるポリペプチド配列、ならびにその変異体、類似体、誘導体、および修飾を有するＣＴ−１タンパク質を指し、限定なしに述べると、タンパク質のＮ末端、内部部分、および／またはＣ末端における任意の数のアミノ酸の付加、欠失、修飾、または置換が含まれる（例えば、配列番号３〜２５を参照されたい）。
【０１５２】
「ＣＴ−１変異体」または「修飾ＣＴ−１ポリペプチド」という用語は、修飾または操作されたＣＴ−１ポリペプチドであって、本明細書の別の個所で論じた通り、かつ、当技術分野において理解される通り、少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾、付加、欠失、または置換により野生型ＣＴ−１ポリペプチドから識別されるＣＴ−１ポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ＣＴ−１変異体が、保存的置換の場合もあり、非保存的置換の場合もある、１または複数のアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の置換）により基準ポリペプチドから識別される。具体的な実施形態では、ＣＴ−１変異体が、野生型ＣＴ−１配列と少なくとも約７０％、より好ましくは約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する。同一性は、少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１５０、または１７５以上の連続アミノ酸にわたり評価することもでき、配列の全長にわたり評価することもできる。当技術分野では、同一性％または相同性％を決定する方法が公知であり、任意の適する方法をこの目的で使用することができる。本発明のポリペプチドの変異体には、グリコシル化形態、他の分子との凝集的コンジュゲート、および非類縁の化学的部分との共有結合的コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ化される分子）が含まれる。具体的な実施形態ではまた、変異体に、対立遺伝子変異体、種変異体、およびムテインも含まれる。特定の実施形態ではまた、タンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の切断または欠失も変異体として意図される。ＣＴ−１ポリペプチドおよびＣＴ−１変異体の例示的な例は、配列番号２〜２５に示される。
【０１５３】
本明細書で用いられる「ＣＴ−１活性」、「ＣＴ−１の生物学的活性」、「自然発生のＣＴ−１活性」、または「非修飾ＣＴ−１活性」を有するポリペプチド組成物とは、野生型ＣＴ−１ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドを指し、ここで、このような野生型ＣＴ−１ポリペプチドは、本発明の方法に従い生成、調製、精製、または処方されていない。対象のポリペプチドが、細胞において、本発明の方法により生成させない野生型ＣＴ−１と類似の機能、例えば、類似の酵素反応もしくは類似のシグナル伝達機構を果たすか、または類似の生理学的応答を発生させる場合、ポリペプチドは、野生型ＣＴ−１ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有する。例えば、野生型ＣＴ−１および本発明により提供されるポリペプチドの両方が、ＪＡＫ／Ｓｔａｔ３、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ、および／またはＥＲＫによるシグナル伝達の活性化など、細胞内経路の類似の活性化に関与する場合、本発明のポリペプチドは、ＣＴ−１活性を有する。
【０１５４】
本発明のＣＴ−１活性を有するポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、対応する自然発生のＣＴ−１ポリペプチドによりもたらされる生理学的応答の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％である生理学的応答を発生させうる。
【０１５５】
本明細書で用いられる「〜を促進する」、「〜を増強する」、「〜を刺激する」、または「〜を増大させる」という用語は一般に、本発明のＣＴ−１組成物が、ビヒクル（またはＣＴ−１の非存在）または対照の分子／組成物により引き起こされる応答と比較して大きな生理学的応答（すなわち、下流における測定可能な効果）をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。限定なしに述べると、このような測定可能な１つの生理学的応答には、ＣＴ−１組成物の投与の非存在下におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３キナーゼ、および／またはＥＲＫによる経路の活性化レベルと比較した、またはビヒクルもしくは対照組成物により引き起こされる活性化と比較した、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３キナーゼ、および／またはＥＲＫによる経路の活性化の増大を引き起こす能力が含まれる。例えば、生理学的応答は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上増大しうる。別の非限定的な例では、本発明のＣＴ−１組成物の投与に応答したＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化が、ビヒクルまたは対照の分子／組成物により引き起こされるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上増大しうる。「増大した」または「増強された」応答とは、典型的に「統計学的に有意な」応答であり、これには、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（１を超える全ての整数および間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８倍などを含めた）である増大が含まれうる。
【０１５６】
本明細書で用いられる「〜を保持する」または「〜を維持する」という用語は一般に、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、自然発生のＣＴ−１のアミノ酸配列または核酸配列によるＣＴ−１ポリペプチドにより引き起こされる応答と性質が類似する生理学的応答（すなわち、測定可能な下流における効果）をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。例えば、本発明のＣＴ−１ポリペプチドは、ＣＴ−１の生物学的活性を呈示し、したがって、ＣＴ−１活性を保持する。本発明の組成物はまた、自然発生のＣＴ−１ポリペプチドにより引き起こされる応答と性質が類似する、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３キナーゼ、および／またはＥＲＫによる経路の活性化などの生理学的応答ももたらす。類似の生理学的応答を誘発する本発明のＣＴ−１組成物は、自然発生のＣＴ−１のアミノ酸配列または核酸配列を含む組成物により誘発される生理学的応答レベルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％である生理学的応答を誘発しうる。
【０１５７】
本明細書で用いられる「〜を減少させる」または「〜を低下させる」または「〜を減殺する」または「〜を低減する」または「〜を抑制する」という用語は一般に、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、ビヒクルまたは対照の分子／組成物により引き起こされる応答と比較して小さな生理学的応答（すなわち、下流における効果）、例えば、アポトーシスの減少をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。一実施形態では、減少が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３キナーゼ、および／またはＥＲＫによる経路の活性化の減少でありうる。「減少した」または「低減された」応答とは、典型的に「統計学的に有意な」応答であり、これには、ビヒクル（薬剤の非存在）または対照組成物によりもたらされる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０分の１以下（例えば、５００、１０００分の１）（１を超える全ての整数および間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８分の１などを含めた）である減少が含まれうる。
【０１５８】
本明細書で用いられる「自然発生の」という用語は、天然で見出されうるポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を指す。例えば、自然発生のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在し、生物から単離することが可能であり、実験室において人為的に修飾されていない配列である。「野生型の」という用語は、「自然発生の」という用語と互換的に用いられることが多い。
【０１５９】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、その天然状態では通常それに随伴する成分を実質的または本質的に含まない物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）を意味する。例えば、本明細書で用いられる「単離ポリヌクレオチド」とは、自然発生状態ではそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常は隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。代替的に、本明細書で用いられる「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド分子またはポリペプチド分子の、細胞環境からの単離および／または精製、細胞の他の成分との関連からの単離および／または精製を指す、すなわち、ペプチド分子またはポリペプチド分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）と著明には関連しない。同様に、「単離細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏの組織または器官から得られた細胞であって、細胞外マトリックスを実質的に含まない細胞を指す。
【０１６０】
本明細書で用いられる「〜から得る」という用語は、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの試料が、組換え宿主細胞など、特定の供給源から単離されているかまたはこれに由来することを意味する。別の実施形態では、「〜から得る」という用語が、ｉｎ  ｖｉｖｏの組織または器官などの供給源から単離されているかまたはこれに由来する細胞を指す。
【０１６１】
「ヌクレオチド」とは、リン酸化された糖とＮ−グリコシド連結された窒素性のヘテロ環状塩基を意味する。当技術分野では、ヌクレオチドが、天然（標準）塩基、および、当技術分野において周知の修飾塩基を包含することが認識されている。このような塩基は一般に、ヌクレオチドの糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖部分、リン酸部分、および／または塩基部分において修飾されない場合もあり、修飾される場合もある（互換的にまた、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド、および他のヌクレオチドとも称する（例えば、ＵｓｍａｎおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、前出；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１５１８７号；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、前出を参照されたい））。Ｌｉｍｂａｃｈら（１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻、２１８３〜２１９６頁）によりまとめられている通り、当技術分野では、修飾核酸塩基の複数の例が公知である。
【０１６２】
本明細書で用いられる「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まずに単離されたＤＮＡ分子を指す。したがって、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントとは、１または複数のコード配列を含有するが、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されているか、これを含まずに精製されたＤＮＡセグメントを指す。「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語には、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小型の断片が包含され、また、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含めた組換えベクターも包含される。
【０１６３】
本明細書では、「アミノ末端の」（または「Ｎ末端の」）および「カルボキシル末端の」（または「Ｃ末端の」）という用語が、ポリペプチド内の位置を指すのに用いられる。文脈が許容する限り、これらの用語は、具体的な配列またはポリペプチドの部分への言及と共に、近傍または相対的な位置を指すのに用いられる。例えば、ポリペプチド内の基準配列に対してカルボキシル末端に位置する特定の配列は、基準配列のカルボキシル末端に対して近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するわけではない。
【０１６４】
配列を、基準配列のアミノ酸位置に照らして最適に比較するか、または２元比較するときに、配列内のアミノ酸残基の位置に適用される場合の「〜に対応する」という用語は、複数の配列における対応する位置を意味する。
【０１６５】
本明細書で用いられる「医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）」という用語は、食品、医薬品、および医療機器の製造の管理および統轄、ならびに品質管理試験を指す。ＧＭＰは必ずしもサンプリングに依拠せず、代わりに薬物および医療機器の製造に関わる工程、活動、および業務の全ての側面の文書化に依拠する。製品がどのようにして作製され、試験にかけられたかを示す文書（トレーサビリティーを可能とし、将来において万一問題が生じた場合は、市場からのリコールも可能とする）が正確でなく、整序されていない場合、この製品は、要求される規格を満たさず、純正でない（すなわち、米国では、不良である）と考えられる。加えて、ＧＭＰは典型的に、全ての製造装置および試験装置が、使用に適する純正品であり、薬物製造工程において使用される全ての操業法および操業手順（例えば、製造、洗浄、および分析試験）が、それらの（１または複数の）意図される機能を果たしうることを裏付けるために所定の規格に従い検証されていることを要請する。米国では、「最新版の医薬品の製造管理および品質管理に関する基準」という語句が、１９３８年の食品、医薬、および化粧品法（２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３５１）の５０１（Ｂ）項に見られる。
【０１６６】
Ｃ．ポリペプチド
本発明は、配列番号２〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその類似体を含むポリペプチドであって、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドを部分的に提供する。本発明はまた、配列番号２〜２５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびその組成物であって、本発明の方法により生成させて、改善された安定性、純度、ならびに／または内毒素プロファイルおよび凝集プロファイルを保有するポリペプチドおよびその組成物も提供する。
【０１６７】
本発明者らによるＣＴ−１ポリペプチドについての配列解析からは、グリコシル化および脂質化などの翻訳後修飾の欠如が示唆され、したがって、治療用タンパク質の生成には、一般的な哺乳動物発現系または原核生物発現系を使用しうるであろう。また、本発明の方法により生成させるタンパク質の溶解度の性質、およびその予測される等電点であるｐＩ９．１も、治療剤開発に要請される生成および処方に有利である。しかし、ＣＴ−１ポリペプチドは分子量が小さく（２１．２ＫＤａ）、これは、結果として体内からの急速なクリアランスをもたらし、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達する場合に、短い全身半減期および低度のバイオアベイラビリティーをもたらしうる。したがって、他の実施形態では、本発明はまた、治療的使用に適するＣＴ−１ポリペプチドおよび／またはＣＴ−１ポリヌクレオチドの組成物および処方物も提供する。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、Ｎ最末端のメチオニンを含む。具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、Ｎ最末端のメチオニンを含まない。多様な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチド内の開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニンと、隣接するアミノ酸残基との間に、アミノ酸、例えば、セリンを付加する。付加されるアミノ酸は、任意のアミノ酸の場合もあり、特定のアミノ酸の場合もある。一実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチド内の開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニンと、隣接するアミノ酸残基との間に付加されるアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、トレオニン、セリン、およびバリンからなる群から選択される。
【０１６９】
他の具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、Ｎ最末端のメチオニンを含まず、ポリペプチドのＮ末端において付加された１または複数のアミノ酸を含有する。多様な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドのＮ末端へと付加されるアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、トレオニン、セリン、およびバリンからなる群から選択される。付加されるアミノ酸は、Ｎ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸離れて付加することもでき、Ｎ末端の位置（１位）へも付加しうることが意図される。
【０１７０】
本発明のポリペプチドでは、自然発生のＣＴ−１ポリペプチドに存在する１または複数のシステイン残基を、置換するか、修飾するか、または欠失させる。一部の実施形態では、配列番号２〜５、７、および９〜２２のうちのいずれか１つの１０５位、または配列番号６、８、および２３のうちのいずれか１つの１０６位におけるシステイン残基を、セリンで置き換える。他の実施形態では、配列番号２〜５、７、および９〜２２のうちのいずれか１つの１７８位、または配列番号６、８、および２３のうちのいずれか１つの１７９位におけるシステイン残基を、セリンで置き換える。場合によっては、配列番号２〜５、７、および９〜２２のうちのいずれか１つの１０５位および１７８位、または配列番号６、８、および２３のうちのいずれか１つの１０６位および１７９位におけるシステイン残基の両方を、セリン残基で置き換える。
【０１７１】
具体的な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、配列番号２３に示されるアミノ酸であって、配列番号２３の１位におけるアミノ酸（Ｘａａ）が存在しないか、またはメチオニンであり、配列番号２３の２位におけるアミノ酸が存在しないか、または任意のアミノ酸であり、配列番号２３の２０３位におけるアミノ酸が存在しないか、または任意のアミノ酸であるアミノ酸に対応する。関連する実施形態では、配列番号２３に示されるＣＴ−１ポリペプチドが、例えば、配列番号２３の１０６位、１７９位、２０３位において置換したか、修飾したか、または欠失させた、１または複数のシステイン残基を含む。
【０１７２】
特定の実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、配列番号２３に示されるアミノ酸であって、配列番号２３の１位におけるアミノ酸（Ｘａａ）が存在しないか、またはメチオニンであり、配列番号２３の２位におけるアミノ酸が存在しないか、またはシステイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、トレオニン、セリン、およびバリンであり、配列番号２３の２０３位におけるアミノ酸が存在しないか、またはシステインであるアミノ酸に対応する。関連する実施形態では、配列番号２３に示されるＣＴ−１ポリペプチドが、例えば、配列番号２３の１０６位、１７９位、２０３位において置換したか、修飾したか、または欠失させた、１または複数のシステイン残基を含む。
【０１７３】
特定の具体的な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、配列番号２３に示されるアミノ酸であって、配列番号２３の１位におけるアミノ酸（Ｘａａ）が存在しないか、またはメチオニンであり、配列番号２３の２位におけるアミノ酸がシステイン、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、セリン、またはバリン、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、トレオニン、セリン、およびバリンであり、配列番号２３の２０３位におけるアミノ酸が存在しないか、またはシステインであるアミノ酸に対応する。関連する実施形態では、配列番号２３に示されるＣＴ−１ポリペプチドが、例えば、配列番号２３の１０６位、１７９位、２０３位において置換したか、修飾したか、または欠失させた、１または複数のシステイン残基を含む。
【０１７４】
特定の具体的な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、配列番号２３に示されるアミノ酸であって、配列番号２３の１位におけるアミノ酸（Ｘａａ）が存在せず、配列番号２３の２位におけるアミノ酸がシステインであり、配列番号２３の２０３位におけるアミノ酸が存在しないか、またはシステインであるアミノ酸に対応する。関連する実施形態では、配列番号２３に示されるＣＴ−１ポリペプチドが、例えば、配列番号２３の１０６位、１７９位、２０３位において置換したか、修飾したか、または欠失させた、１または複数のシステイン残基を含む。
【０１７５】
より具体的な実施形態では、配列番号３〜２５のうちのいずれか１つの１または複数のシステインを、置換するか、修飾するか、または欠失させることができる。特定の実施形態では、配列番号３〜２５のうちのいずれか１つの１または複数のシステインをセリンで置き換える。
【０１７６】
他の実施形態では、本発明は、自然発生のＣＴ−１ポリペプチド配列と比較して、ＣＴ−１ポリペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または修飾を含むＣＴ−１ポリペプチドを意図する。一実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、自然発生のＣＴ−１ポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５以上のアミノ酸のＮ末端への付加を含む。一部の実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、１、２、３、４、または５以上のアミノ酸の、Ｎ末端メチオニンを有さない自然発生のＣＴ−１ポリペプチド配列のＮ末端への付加を含む。さらなる実施形態では、本発明は、自然発生のＣＴ−１ポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸のＣ末端への付加を含むＣＴ−１ポリペプチドを意図する。当業者には、Ｎ末端へと付加される任意の数または全てのアミノ酸を、例えば、グリコシル化またはＰＥＧ化など、修飾しうることが察知されるであろう。
【０１７７】
本発明はまた、新規のＣＴ−１ポリペプチドであって、配列番号３〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、場合によってＮ最末端のメチオニンおよび／またはさらなるアミノ酸も含み、化学修飾されたＣＴ−１ポリペプチド、ならびにこれを生成させる方法も提供する。
【０１７８】
一部の実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドを、生体適合性ポリマーとコンジュゲートし、具体的な実施形態では、ＰＥＧ化する。本発明のポリペプチドは、ポリペプチド１分子当たり約５、約４、約３、約２、約１、または約０．５個のＰＥＧ部分を含みうる。
【０１７９】
特定の実施形態では、配列番号３〜２５のうちのいずれか１つの１または複数のシステインを、生体適合性ポリマー、例えば、ＰＥＧとコンジュゲートすることができる。本発明のポリペプチドは、ＣＴ−１の生物学的活性を保持し、一部の実施形態では、ＣＴ−１の生物学的活性を増大させている。本発明の具体的なＣＴ−１ポリペプチドは、血漿中半減期の延長など、薬物動態特性が増強されていることから、治療用に十分に適しており、加えて、野生型のＣＴ−１タンパク質に対する溶解度および／または安定性の改善も呈示しうる。具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、組織の成長、保護、および再生を促進する。本発明はまた、このような新規のＣＴ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに新規のＣＴ−１ポリペプチドおよび／またはＣＴ−１ポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。
【０１８０】
野生型のＣＴ−１ポリペプチドならびに本明細書で記載される新規の変異体の薬物動態特性の増強は、本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比べた増強である。
【０１８１】
一実施形態では、本発明のポリペプチドの半減期が、非修飾ポリペプチド（例えば、自然発生のポリペプチド）および／または本発明の方法に従い生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍に延長されている。
【０１８２】
具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドが、約３７℃で、非修飾ポリペプチド（例えば、自然発生のポリペプチド）および／または本発明の方法に従い生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比較して、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２１時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上にわたり安定である。
【０１８３】
本明細書で用いられる「ＣＴ−１変異体」、「ＣＴ−１変異体ポリペプチド」、「修飾ＣＴ−１ポリペプチド」、「修飾または操作されたＣＴ−１ポリペプチド」、および「操作されたＣＴ−１ポリペプチド」という用語は、互換的に用いられ、野生型ＣＴ−１タンパク質と比較して１または複数のアミノ酸の突然変異、付加、欠失、または置換を含むＣＴ−１ポリペプチド、その生物学的に活性な断片もしくは変異体、またはこれらのホモログ、パラログ、もしくはオーソログを指す。本発明の具体的な実施形態では、修飾ＣＴ−１ポリペプチドが、結果としてＣＴ−１の生物学的活性を保持するＣＴ−１ポリペプチドもまたもたらす、１または複数のアミノ酸の突然変異、付加、欠失、および／または置換を含む。具体的な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチド変異体が、ＰＥＧ化、特に、部位特異的ＰＥＧ化によりさらに修飾されており、ＣＴ−１活性を保持する。一部の実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドが、ＰＥＧ連結または他の生体適合性ポリマーなどにより併せてコンジュゲートされてＣＴ−１オリゴマーを形成し、したがって、本発明は、ＣＴ−１多量体を提供する。好ましくは、本発明のＣＴ−１ポリペプチドが、自然発生のＣＴ−１活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の活性を保持する。ＣＴ−１ポリペプチド変異体の例示的な例は、配列番号３〜２５に示されている。
【０１８４】
本発明の文脈では、ポリペプチド、その生物学的に活性な断片もしくは変異体、またはこれらのホモログ、パラログ、もしくはオーソログは、野生型タンパク質の約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の活性、好ましくは、野生型タンパク質の活性のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％を呈示する場合に、野生型タンパク質と少なくとも実質的に同じ活性を有すると考えられる。具体的な実施形態では、ポリペプチド、その生物学的に活性な断片もしくは変異体、またはこれらのホモログ、パラログ、もしくはオーソログは、野生型タンパク質の活性のうちの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％を呈示する。特定の実施形態では、野生型の活性より大きな活性を達成することができる。ＣＴ−１ポリペプチド、その生物学的に活性な断片もしくは変異体、またはこれらのホモログ、パラログ、もしくはオーソログの活性は、例えば、それが野生型ＣＴ−１の生物学的活性を、例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化することにより模倣する能力を測定し、その能力を野生型タンパク質の活性と比較することにより決定することができる。当技術分野では、ＣＴ−１の生物学的活性を測定する方法が公知である。
【０１８５】
本明細書で、基準ポリヌクレオチド配列または基準ポリペプチド配列の断片に適用されて用いられる「生物学的に活性な断片」という用語は、それが細胞の成長、増殖、および保護を促進する生物学的活性など、基準のＣＴ−１配列の生物学的活性のうちの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００％以上を有する修飾ＣＴ−１ポリペプチドの断片を指す。本発明の一部の実施形態は、長さが、全ての中間の整数を含め、少なくとも約２０、５０、１００、１５０、１７５、もしくは１９９の連続アミノ酸残基である修飾ＣＴ−１ポリペプチドの生物学的に活性な断片またはこれをコードするポリヌクレオチド配列であって、基準のＣＴ−１ポリペプチド、例えば、自然発生のＣＴ−１ポリペプチドの生物学的活性を有するポリペプチドを含むかまたはコードする、ＣＴ−１ポリペプチド断片またはポリヌクレオチド配列を部分的に意図する。
【０１８６】
多様な実施形態では、本発明は、生物学的活性を保持するＣＴ−１ポリペプチド断片を意図する。例示的な断片には、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、２８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、または２０１の連続アミノ酸を含むポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。ポリペプチド断片は、配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓおよび／またはＬｙｓ；配列番号２の自然発生アミノ酸、例えば、Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの欠失；配列番号２の自然発生のアミノ酸、例えば、Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの別のアミノ酸による置換、または配列番号２の自然発生のアミノ酸、例えば、Ｃｙｓ１０５またはＣｙｓ１７８のうちの少なくとも１つの修飾のうちの１または複数をさらに含みうる。特定の実施形態では、Ｃｙｓ１０５およびＣｙｓ１７８が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている。
【０１８７】
具体的な実施形態では、ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一な少なくとも１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、２８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、または２０１の非連続アミノ酸を含むことができ、非連続アミノ酸の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸である。
【０１８８】
特定の実施形態では、配列番号２の自然発生でないアミノ酸位置におけるＣｙｓが、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸以内にある。
【０１８９】
具体的な実施形態では、本発明は、新規のポリペプチドによる組成物が、ポリペプチドについて、重量で少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であることをさらに意図する。
【０１９０】
ＣＴ−１誘導体の化学修飾
ＣＴ−１は分子量が小さく（２１．２ＫＤａ）、これは、体内からの急速なクリアランス、これに対応するｉｎ  ｖｉｖｏで送達する場合の短い全身半減期、低いバイオアベイラビリティーと関連しうるため、クリアランスを減少させ、かつ／または吸収速度を低下させるＣＴ−１の処方物または組成物が、特に所望される。したがって、本発明は、治療的使用の利点を提供するように化学修飾されたＣＴ−１変異体を提供する。
【０１９１】
当技術分野では、治療剤の全身半減期を延長し、バイオアベイラビリティーを増大させる方法が公知であり、これらには、分子量および／または細胞への取込み、ならびに投与された分子の循環を増大させる徐放処方物、タンパク質融合体の使用が含まれる。ＣＴ−１治療剤を具体的に開発する場合、多数の修飾の付加またはタンパク質の二量体化／多量体化の結果として、受容体への結合を著明に低減する可能性があり、したがって、シグナル伝達活性も著明に低減する可能性がある。
【０１９２】
本発明は、修飾と関連する潜在的な有害作用を軽減する、本発明のＣＴ−１タンパク質の部位特異的修飾を提供する。部位特異的修飾により、対象のタンパク質の活性部位または結合部位の一部を形成しないアミノ酸残基を変化させて、タンパク質内に、ＰＥＧ化および／または多量体化などの化学修飾に好ましい部位をもたらすことができる。部位特異的修飾は、タンパク質の領域、または、より具体的に述べると、生体活性に実質的に影響を及ぼさずにタンパク質の修飾のために使用されうるアミノ酸残基を同定することを要請する。ある場合には、残基をタンパク質の部位または領域へと組み込み、化学修飾のための部位を創出するために、ポリペプチドの天然アミノ酸配列のうちのアミノ酸を置換、付加、または除去することが必要である。他の場合には、望ましくない部位における修飾を防止するために、特定のアミノ酸残基の化学反応を領域から除去することができる。
【０１９３】
一態様では、本発明は、本明細書で記載されるＣＴ−１ポリペプチドの部位特異的修飾に用いうる領域および残基を同定するために、ＣＴ−１のアミノ酸配列および構造の解析を提供する。本発明の例示的な実施形態は、タンパク質の特定の部位におけるポリマーのコンジュゲーションなど、タンパク質の部位特異的修飾を可能とするように特定のアミノ酸残基を変化させる一方で、このシグナル伝達分子の生物学的活性を保持する新規のＣＴ−１変異体の同定を提供する。さらに、本発明の具体的な実施形態は、野生型タンパク質と比較して生物学的活性を増大させた新規のアミノ酸組成物を伴うＣＴ−１変異体の同定について記載する。加えて、ＰＥＧ化および二量体化を含めた部位特異的修飾法も記載し、ＣＴ−１の生物学的活性が保持されているかどうかも裏付ける。選択的修飾を有する新規のタンパク質組成物は、治療的特性の改善を可能とする。
【０１９４】
一般に、当技術分野で公知の技法および本明細書で記載される技法により、ＣＴ−１ポリペプチドを、多種多様な生体適合性ポリマーに共有結合的に接合することもでき、コンジュゲートすることもできる。本発明の一実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドの半減期を含めた薬物動態パラメータを、ポリペプチドの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性ポリマーを含めた生体適合性ポリマーへのコンジュゲーションにより改善する。したがって、具体的な実施形態では、ＰＥＧなどの生体適合性ポリマーは、本発明のポリペプチドの薬物動態調節剤である。具体的な実施形態では、ポリマーを、タンパク質の部位特異的修飾により、所望の場所においてＣＴ−１ポリペプチドへとコンジュゲートする。
【０１９５】
本発明の一部の実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドを、少なくとも１つの他のＣＴ−１ポリペプチドとコンジュゲートしてオリゴマーを形成するか、または代替的なポリペプチドとコンジュゲートして融合タンパク質を得る。具体的な実施形態では、２つのＣＴ−１ポリペプチドをコンジュゲートしてホモ二量体を得る。当技術分野において公知であり用いられる方法により、本発明のＣＴ−１ポリペプチドの多量体化を容易にすることができ、本発明の具体的な実施形態では、オリゴマー化を、ＰＥＧ連結を用いて行う。
【０１９６】
本明細書で用いられる、「オリゴマー」という用語は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、および六量体など、ＣＴ−１ポリペプチドの多様な「〜量体」を指す。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドが二量体である。二量体ペプチドは、本明細書の別の個所で記載されるＣＴ−１ポリペプチドの断片、変異体、および修飾ＣＴ−１ポリペプチドを含みうる。互いと共有結合的に連結されれば、分子もまたオリゴマーを形成しうる。例えば、化学合成されるか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて翻訳されるか、または細胞もしくは試料から単離もしくは精製された２つの異なるタンパク質を、非アミド結合を介して併せて化学的に架橋して、オリゴマーを形成することができる。したがって、別個の実体として存在し、非共有結合的相互作用を介してオリゴマーを形成することはないが共有結合を介して併せてつながれる２分子もまた、多量体であると考えられる。したがって、本発明のオリゴマーまたは多量体（例えば、ヘテロ二量体またはホモ二量体、三量体、四量体、五量体、六量体など）は、共有結合、非共有結合的結合、またはこれらの組合せを介して形成することができる。
【０１９７】
したがって、多量体、特に、二量体は、分子間のジスルフィド結合を介して、または、例えば、機能化生体適合性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、他のポリエーテル、ＥＤＴＡ、および当業者に公知の他のリンカーなどの架橋形成剤を介して２つ以上の単量体をつなぐことにより形成することができる。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００１／０００８３４１号を参照されたい。多様な実施形態では、二量体を形成するのに用いられる機能化生体適合性ポリマーは、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のＰＥＧ単量体単位を包含しうる。具体的な実施形態では、単量体単位の数が、１〜５０、２〜３０、３〜２０、または４〜１２でありうる。
【０１９８】
他の実施形態では、ＰＥＧ単量体単位の数が、ＰＥＧポリマー自体の分子量を、２ｋＤａ未満、１．５ｋＤａ未満、１ｋＤａ未満、または５００Ｄａ未満とするような数である。より具体的な実施形態では、ＰＥＧポリマーの分子量が、約２ｋＤａ、約１．８ｋＤａ、約１．８ｋＤａ、約１．５ｋＤａ、約１．２ｋＤａ、約１．０ｋＤａ、約０．８ｋＤａ、約０．７ｋＤａ、約０．６ｋＤａ、約０．５ｋＤａ、または約０．２ｋＤａである。
【０１９９】
特定の実施形態では、個別のＣＴ−１ポリペプチド単量体を、スペーサー基を介してＰＥＧ鎖と隔てさせることができる。例えば、１〜１０個の炭素、１〜６個の炭素、または１〜４個の炭素など、０〜１０個の炭素を有し、場合によって、１または複数のアミド結合、エーテル結合、エステル結合などを含有するスペーサー基を介する。個別のＣＴ−１ポリペプチド単量体とＰＥＧ鎖との間のスペーサー基は、同じ場合もあり異なる場合もあり、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり環状の場合もあり（例えば、脂肪環構造の場合もあり、芳香環構造の場合もあり）、置換されていない場合もあり、置換されている場合もある。スペーサー上の置換基でありうる官能基には、カルボニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）原子、アルコキシ基（メトキシおよびエトキシなど）、ニトロ基、および硫酸（ｓｕｌｆａｔｏ）基が含まれる。
【０２００】
さらなる実施形態では、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、水素結合、または電荷間結合を介して多量体化を付与し、タンパク質間結合を媒介するアミノ酸配列も、本発明のＣＴ−１ポリペプチドに包含されうる。したがって、本発明は、多量体化ドメインを含む多量体化ポリペプチドを生成させる方法を提供する（例えば、それらの各々が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０１３８４４０号および国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０６２３７０号を参照されたい）。
【０２０１】
例示的な生体適合性ポリマーには、非ペプチドポリマー（例えば、共有結合的に連結される少なくとも２つの非ペプチド部分）が含まれるがこれらに限定されず、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、オリゴ糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生体分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、およびこれらの組合せが含まれる。適切な非ペプチドポリマーの例は、例えば、Ｄｕｎｃａｎ（２００３年）において見出すことができ、これらには、ＰＥＧ、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。
【０２０２】
具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドを化学的に修飾するのに用いられるポリマー分子を、水溶性ポリマーから選択することができる。選択されるポリマーは、それが接合されるタンパク質が、生理学的環境などの水性環境で沈殿しないように、水溶性でありうる。最終生成物タンパク質を治療的に用いるには、ポリマーを薬学的に許容されるものとする。水溶性のポリマーは、例えば、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。
【０２０３】
特定の実施形態では、典型的に、修飾ＣＴ−１ポリペプチド、またはこれらの変異体を生成させ（例えば、組換え、合成し）、場合によって、単離した後、これらのポリペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、１または複数の非ペプチドポリマー（例えば、生体適合性ポリマー）を共有結合的に接合することにより化学修飾することができる。修飾ＣＴ−１ポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて既に非ペプチドポリマーへと共有結合的に接合された選択アミノ酸からＣＴ−１ポリペプチドを合成することなどにより、修飾前の構成要素から合成により生成させることもできる。
【０２０４】
特定の実施形態では、代替的に、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける修飾と組み合わせて、組換えＣＴ−１ポリペプチドを、ＣＴ−１ポリペプチドをグリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化）することが可能な宿主細胞など、１または複数の非ペプチド部分を含む生体適合性ポリマーをポリペプチドへと接合するようにデザインされた宿主細胞において発現させることもできる。タンパク質をグリコシル化することが天然で可能な宿主細胞（例えば、真核細胞）、および適切なグリコシル化機構を含有するように操作された宿主細胞が含まれる（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを操作して、Ｎ結合型グリコシル化によりタンパク質を修飾することについては、Ｆｅｌｄｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０２巻：３０１６〜３０２１頁、２００５年を参照されたい）。これらの実施形態では、修飾ＣＴ−１ポリペプチドを宿主細胞から単離することができ、さらに化学修飾（例えば、ＰＥＧ化）することもでき、その既に修飾された形態で用いることもできる。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドを、当技術分野における技法に従いＰＥＧ化することができる。ＰＥＧによる修飾は典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて施される。非限定的な一例として述べると、ＰＥＧの最も一般的な形態は、末端のヒドロキシル基がアニオン開環重合である−ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨにより合成された直鎖状または分枝状のポリエーテルである。モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、メトキシ−ＰＥＧアミン、メトキシ−ＰＥＧマレイミド、およびメトキシ−ＰＥＧカルボン酸など、多数の連結部分において誘導体化しうるため、ペプチド修飾である−ＣＨ３−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨまたはＣＨ３−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈに特に有用でありうる。分子量および構造（例えば、一般に、＞１０００ＤａのＰＥＧもｉｎ  ｖｉｖｏにおける毒性を明示しておらず、最大４０，０００〜５０，０００Ｄａ以上のＰＥＧが臨床適用および承認された医薬適用において用いられている）、ＰＥＧ鎖の数（例えば、２つ以上の低分子量鎖を付加して、ＰＥＧ複合体の総分子量を増大させることができる）、ＰＥＧのポリペプチドへの接合部位の特定の位置、ＰＥＧをポリペプチドへと接合するのに用いられる化学反応を含め、原材料、中間体、および最終生成物の純度を含め、特定の一般的な因子が、ＰＥＧ化ポリペプチドの効能に影響を及ぼしうる。
【０２０６】
本発明のＣＴ−１ポリペプチドは、中間の全ての整数を含め、約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００Ｄａ以上のＰＥＧが含まれるがこれらに限定されない、多様な分子量のＰＥＧ分子への接合（特に、部位特異的接合）により修飾することができる。特定の好ましい実施形態には、分子量を約２０，０００Ｄａまたは４０，０００ＤａとするＰＥＧが包含される。
【０２０７】
典型的に、非限定的な例として述べると、ＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）をポリペプチドへと共役させるときの第１のステップは、末端の一方または両方において官能基を伴うＰＥＧを活性化させることである。官能基の選択は、ポリペプチドにおいて利用可能であるかまたは選択された反応性基（例えば、リシン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、Ｎ末端のアミン、Ｃ末端のカルボン酸、または他の特定の部位）に主に依存する。ポリペプチドとの弱い連結および比較的強い連結の両方を用いることができる。例えば、強い連結は一般に、ポリペプチドの循環半減期を延長し、ポリペプチド溶液の安定性を増大させる目的と合致する。しかし、わずかに酸性の状態では、炭酸スクシンイミジルのヒスチジンとの連結により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて制御放出様に加水分解する（数時間、数日間、または数週間にわたり内因性の循環において生じるように微調整しうる過程）イミダゾールカルバメートが形成される。
【０２０８】
ＰＥＧ化は、例えば、リシンのｓ−アミノ基、システインにおけるａ−アミノ基、ヒスチジンのイミダゾリル窒素、ならびにセリン、トレオニン、およびチロシンのヒドロキシル基を含めた、タンパク質における多数の求核部位のうちのいずれかまたは全てにおいて施しうる。多数の潜在的な反応部位のため、特定の場合には、異なる多様な修飾タンパク質の異種混合物を生成させる可能性もある。
【０２０９】
一実施形態ではまた、例えば、より均質な混合物を発生させるために、部位特異的なＰＥＧ化も用いることができる。非限定的な一例では、保護されていないポリペプチド鎖のＮ末端とのＰＥＧアルデヒドコンジュゲーションにより、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートを形成することができる。
【０２１０】
別の実施形態では、ポリペプチド中のシステインチオールを、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはチオールに特異的な他の化合物により活性化されるＰＥＧまたは他のポリマーとコンジュゲートすることができる。ポリペプチドのこのような化合物とのコンジュゲーションは、共役時にｐＨをモニタリングおよび調整することにより、速度制御および部位制御することができる。
【０２１１】
本発明の特定の実施形態では、非ペプチドポリマーを、部位特異的な形でＣＴ−１ポリペプチドとコンジュゲートして、ＣＴ−１の生物学的活性を有し、薬物動態特性が改善された修飾タンパク質をもたらす。本発明のタンパク質では、インテグリンの結合部位またはその隣接する残基など、所望の場所を、１または複数の非ペプチド部分を含む生体適合性ポリマーの標的とするように、ＰＥＧなどのポリマーを、野生型のシステイン残基（すなわち、野生型のＣＴ−１配列に存在するシステイン残基）に接合することもでき、置換されたシステイン（すなわち、付加または置換により野生型配列へと導入されたシステイン残基）に接合することもできる。特定の実施形態では、野生型ＣＴ−１のシステイン残基のうちのいくつかを、まず別のアミノ酸で置換して、非ペプチドポリマーのこれらの野生型システインへの接合を防止し、そうしない場合に非ペプチドポリマーが所望の生物学的活性を破壊することを主に防止することができる。炭水化物もまた、ヒドラジド化（ｈｙｄｒａｄｉｚｅｄ）されたＰＥＧ誘導体とコンジュゲートすることができる。
【０２１２】
特定の実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドを、当技術分野における技法に従いグリコシル化することができる。グリコシル化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施することもでき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施することもできる。グリコシル化の例には、Ｓ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、およびＮ結合型グリコシル化が含まれる（例えば、米国特許出願第２００９／００５３１６７号を参照されたい）。
【０２１３】
Ｏ結合型グリコシル化とは一般に、酵素であるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼによるＯ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ）のセリン残基またはトレオニン残基への付加に続く、他の炭水化物（ガラクトースおよびシアル酸など）の付加を指す。Ｏ結合型グリコシル化とはまた、Ｏ−フコース、Ｏ−グルコース、およびＯ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）の付加も指す。Ｏ結合型グリコシル化配列を介するペプチドのグリコシル化については、例えば、ＷＯ／２００８／０１１６３３を参照されたい。
【０２１４】
Ｎ結合型グリコシル化とは一般に、オリゴ糖のアスパラギン残基への、典型的に、コンセンサス配列であるＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ［配列中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である］における接合を指す。一般に、３つの主要な種類のＮ結合型オリゴ糖：マンノース高含有オリゴ糖、複合体オリゴ糖、およびハイブリッドオリゴ糖が存在する。マンノース高含有オリゴ糖とは、典型的に、それらの多くがタンパク質に接合する前の前駆体のオリゴ糖中に存在する多数のマンノース残基を含む２つのＮ−アセチルグルコサミンを指す。複合体オリゴ糖は、典型的に、元の２つより多くのＮ−アセチルグルコサミンを含めた、ほとんど任意の数の他の種類の糖を含有する。一例として述べると、成熟糖タンパク質は、５〜９つのマンノース残基を含有する、多様なオリゴマンノースによるＮ結合型オリゴ糖を含有しうる。マンノース残基のさらなる除去は、３つのマンノース残基および２つのＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する構造である「コア」をもたらすが、これは、次いで、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、およびシアル酸を含めた異なる多様な単糖により伸長する場合がある。
【０２１５】
特定の実施形態では、単離ＣＴ−１ポリペプチドを化学合成または組換え微生物における発現によりまず生成させ、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてグリコシル化することができる。例えば、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを用いて、５０℃で、アセトン中の過剰なマルトデキストリンおよびアンモニウム塩により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける酵素的グリコシル化を施す（例えば、Ｌｅｅら、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０巻：７１６〜７２０頁、２００２年を参照されたい）。
【０２１６】
特定の実施形態では、組換えＣＴ−１ポリペプチドを、ポリペプチドを天然で選択的にグリコシル化することが可能な真核細胞などの宿主細胞において発現させ、かつ、グリコシル化することができる。真核細胞におけるＮ結合型グリコシル化では、前駆体のＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖（すなわち、３つのグルコース、９つのマンノース、および２つのＮ−アセチルグルコサミン）分子が、小胞体膜の脂質担体（例えば、ドリキルピロリン酸）上で組み立てられ、次いで、新生ポリペプチド鎖の配列モチーフであるＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ内のＡｓｎ残基を選択するように移動する。この工程は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）により触媒される。
【０２１７】
特定の実施形態では、組換えＣＴ−１ポリペプチドを、作動可能なグリコシル化系を含有するように操作された細菌細胞などの宿主細胞において発現させ、かつ、グリコシル化することができる。一例として述べると、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉのＮ結合型グリコシル化系のＰｇｌＢ遺伝子は、Ｏ−ポリ糖を脂質担体（例えば、ウンデカプレニルピロリン酸）からアクセプタータンパク質へと移す能力を、Ｅ．ｃｏｌｉに付与するのに十分である（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎら、前出；およびペプチドコンジュゲートの細胞内形成についてのＷＯ／２００４／０９１４９９を参照されたい）。
【０２１８】
当技術分野では、ポリペプチドを、１または複数の非ペプチド部分を含む生体適合性ポリマーとコンジュゲートする他の方法を見出すことができる（例えば、均一のタンパク質−ポリマーコンジュゲートの合成については、Ｌｅｌｅら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、６巻：３３８０〜３３８７頁、２００５年；ヒスチジンで連結されるタンパク質−ポリマーコンジュゲートおよびそれらを調製するための過程については、米国特許第５，９８５，２６３号；生体ハイブリッド物質を合成するためにデザインされるアミノ酸用のＡＴＲＰ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒｓについては、Ｂｒｏｙｅｒら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１３０巻：１０４１〜１０４７頁、２００８年；タンパク質−ポリマーコンジュゲートの合成については、米国特許第５，９９８，５８８号およびＨｅｒｅｄｉａら、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ、７巻、４５〜５３頁、２００７年；ならびにＲＡＦＴ（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）法を介する、ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるタンパク質−ポリマーコンジュゲートの形成については、Ｌｉｕら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、４６巻：３０９９〜３１０３頁、２００８年を参照されたい）。
【０２１９】
部位特異的修飾を有する本発明のポリペプチドでは、修飾（例えば、ＰＥＧ）のＣＴ−１ポリペプチドへの共有結合的接合により、安定なコンジュゲート複合体を提供することが好ましい。一般に用いられる化学反応およびコンジュゲーション基を、表１に記載する。
【０２２０】
【表１】
2014507423.tif 000003
例えば、ＣＴ−１変異体を生成させるために、当業者は、例えば、表２によるＤＮＡ配列をコードするコドンのうちの１または複数を変化させることができる。
【０２２１】
【表２】
2014507423.tif 000004
生物学的活性または免疫活性を消失させずにどのアミノ酸残基を置換しうるか、挿入しうるか、または欠失させうるかを決定するときの指針は、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェアなど、当技術分野で周知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。所望の場合は、アミノ酸置換を施し、官能基を変化させることもでき、かつ／または官能基をポリペプチドから除去することもできる。代替的に、本明細書で開示されるタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、帯電または非帯電が同様なアミノ酸の置換でもありうる。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において類縁のアミノ酸ファミリーのうちの１つの置換を伴う。自然発生のアミノ酸は一般に、４つのファミリー：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非帯電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシン）へと分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として共に分類されることもある。表３を参照されたい。
【０２２２】
【表３】
2014507423.tif 000005
他の置換もまた、許容可能であり、これらを経験的に決定することもでき、他の公知の保存的（または非保存的）置換に従い決定することもできる。
【０２２３】
このような変化を施すときは、アミノ酸のハイドロパシー指標を考えることができる。当技術分野では、タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能の付与におけるアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性が一般に理解されている（参照により本明細書に組み込まれる、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。当技術分野では、ハイドロパシー指標またはハイドロパシースコアが同様な特定のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換することが可能であり、生物学的活性が同様なタンパク質をなおも結果としてもたらしうる、すなわち、機能的に同等の生物学的タンパク質をなおも得る可能性があることが公知である。このような変化を施すときは、それらのハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。当技術分野ではまた、同様なアミノ酸の置換を、親水性に基づき有効に施しうることも理解される。
【０２２４】
一実施形態では、タンパク質機能において役割を果たす本発明のポリペプチド内のアミノ酸を、例えば、部位指向突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発により同定することができる。リガンド−受容体間の結合部位はまた、例えば、結晶構造解析、核磁気共鳴、または光親和性標識法などの構造解析により決定することもできる。
【０２２５】
特定の変化は、タンパク質のフォールディングまたは活性にそれほどの影響を及ぼさない。当業者が施すアミノ酸置換の数は、上記の因子を含めた多くの因子に依存する。一般に、任意の所与のポリペプチドに対する置換数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、または３を超えない。
【０２２６】
ポリペプチドは、翻訳と共役的にまたは翻訳後においてタンパク質の移動を方向付ける、タンパク質のＮ末端におけるシグナル（またはリーダー）配列を含みうる。ポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリＨｉｓ）の合成、精製、もしくは同定を容易にするため、または固体の支持体に対するポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列にコンジュゲートすることもできる。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域にコンジュゲートすることができる。
【０２２７】
本発明の特定の実施形態では、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、直接またはアミノ酸リンカーを介して、１または複数の異種ポリペプチド配列（融合体のパートナー）へと共有結合的に連結された本発明のポリペプチドを指す。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、Ｃ末端をＮ末端へと連結することが典型的であるが、また、Ｃ末端同士、Ｎ末端同士を連結する場合もあり、Ｎ末端をＣ末端へと連結する場合もある。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序でありうる。
【０２２８】
本発明のＣＴ−１ポリペプチドは、組換えＤＮＡ法が含まれるがこれらに限定されない、任意の標準的な方法、ならびに、固相合成については、Ｊ．  Ｍ．  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４年）、ならびにＪ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９７３年）に示される合成法、ならびに、溶液合成については、Ｅ．  ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．  Ｌｕｂｋｅ、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９６５年）に示される合成法が含まれるがこれらに限定されない、従来の合成法によりもたらすことができる。前出の論考の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
好ましい実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドを、本明細書で開示される本発明の方法により生成させる。
【０２３０】
Ｄ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のＣＴ−１ポリペプチド、例えば、配列番号３〜２５をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。ＣＴ−１ポリヌクレオチドは、変異体ＣＴ−１ポリペプチドの臨床スケールでの生成、ならびにヒトにおける心臓組織および肝臓組織を含めた傷害組織および疾患組織における修復および再生を増強する方法における使用に適する。
【０２３１】
核酸は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１１巻、３〜１９頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４４５９号；Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻、２６７７〜２６８４頁；Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、７４巻、５９〜６８頁；Ｂｒｅｎｎａｎら、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、６１巻、３３〜４５頁；およびＢｒｅｎｎａｎ、米国特許第６，００１，３１１号において記載されている、当技術分野において公知のプロトコールを用いて合成することができる。
【０２３２】
当業者により理解される通り、本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、ゲノム外のプラスミドによりコードされる配列、およびタンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現させるか、またはこれらを発現させるように適合させうる、低分子の操作された遺伝子セグメントを包含しうる。このようなセグメントは、天然で単離することもでき、人工的に組換えることもでき、合成により修飾することもできる。
【０２３３】
当業者により認識される通り、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）の場合もあり、二本鎖の場合もあり、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）分子の場合もあり、ＲＮＡ分子の場合もある。さらなるコード配列または非コード配列も、本発明のポリヌクレオチド内に存在しうるが、存在しなくともよく、ポリヌクレオチドを、他の分子および／または支持物質へと連結しうるが、連結しなくともよい。
【０２３４】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、本発明のポリペプチドまたはその部分をコードする内因性の配列）を含む場合もあり、変異体を含む場合もあり、このような配列の生物学的機能的同等物を含む場合もある。ポリヌクレオチドの変異体は、好ましくはカノニカルの脂質化部位を欠くポリペプチドをコードするが、シグナル伝達経路活性などの生物学的活性を保持し、一部の実施形態では、これを増大させるように、本明細書の別の個所で記載される１または複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有しうる。
【０２３５】
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含される。「厳密な条件」下でハイブリダイズするとは、互いと少なくとも６０％同一なヌクレオチド配列がハイブリダイズした状態を維持する、ハイブリダイゼーションプロトコールについて記載する。高度な厳密性のハイブリダイゼーション条件とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドがその標的配列だけとハイブリダイズすることを可能とする条件である。厳密な条件は配列依存的であり、異なる。中程度に厳密な条件とは、ポリヌクレオチドが、本発明の核酸の全体、断片、誘導体、または類似体とハイブリダイズするように、高度な厳密性のハイブリダイゼーション条件ほど厳密でない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件を用いる条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年）。中程度の厳密性の条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年において記載されている。低度な厳密性の条件とは、ポリヌクレオチドが、本発明の核酸の全体、断片、誘導体、または類似体とハイブリダイズするように、中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件ほど厳密でない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件を用いる条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年）。異種間ハイブリダイゼーションの条件など、低度な厳密性の条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１年において記載されている。
【０２３６】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書で記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一であるかまたは相補的な配列の、多様な長さの連続的な連なりを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明により提供されるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの少なくとも約５０、１００、１５０、１７５、または約２００以上の連続アミノ酸残基のほか、全ての中間の長さの連続アミノ酸残基をコードする。この文脈における「中間の長さ」とは、５６、５７、５８、５９など、１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など；１９９、２００、２０１など、引例値の間の任意の長さを意味することが容易に理解される。
【０２３７】
当業者には、遺伝子コードの縮重性の結果として、ヒトコドンおよび／または霊長動物コドンの選択について最適化されたポリヌクレオチドを含め、本明細書で記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが察知されるであろう。さらにまた、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も用いることができる。
【０２３８】
本発明のポリヌクレオチド組成物は、十分に確立された多様な技法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年、および他の類似の参考文献を参照されたい）のうちのいずれかを用いて同定、調製および／または操作することができる。
【０２３９】
本発明のポリヌクレオチド組成物は、十分に確立された多様な技法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年、および他の類似の参考文献を参照されたい）のうちのいずれかを用いて同定、調製および／または操作することができる。
【０２４０】
Ｅ．発現系および精製系
多様な実施形態では、本発明は、本発明のＣＴ−１ポリペプチドを発現させて精製する方法を意図する。一般に、ポリペプチドを発現させて精製する技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年、前出）、特に、１６および１７節；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年、前出）、特に、１０および１６章；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、１９９５〜１９９７年）、特に、１、５、および６章に記載されている。一実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドは、以下のステップ：（ａ）ＣＴ−１ポリペプチドをコードし、調節エレメントに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含む構築物を調製するステップ；（ｂ）構築物を宿主細胞へと導入するステップ；（ｃ）宿主細胞を培養して、ＣＴ−１ポリペプチドを発現させるステップ；（ｄ）ＣＴ−１ポリペプチドを宿主細胞から単離するステップのうちの１または複数を含めた手順により調製される。
【０２４１】
ポリヌクレオチド配列を発現させるための多様な系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含有して発現させるのに（「発現系」に）使用することができる。このような発現系には、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクター、もしくは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスであるＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスであるＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系（哺乳動物の宿主細胞を含めた）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４２】
本明細書で用いられる「制御エレメント」または「調節配列」という用語は、発現ベクター内に存在する配列であって、ベクターの非翻訳領域、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’側非翻訳領域および３’側非翻訳領域であり、宿主の細胞内タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を行う配列を指す。このようなエレメントは、それらの強度および特異性において変化しうる。使用されるベクター系および宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導的プロモーターを含め、任意の数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントを用いることができる。例えば、細菌系においてクローニングする場合は、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）などによるハイブリッドのｌａｃＺプロモーターなどの誘導的プロモーターを用いることができる。
【０２４３】
酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなど、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含有する多数のベクターを用いることができる。また、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓによる発現系も含まれる（例えば、Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、２４巻、２１０〜２１５頁、２００６年；およびＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１巻：１２４４頁、２００３年を参照されたい）。
【０２４４】
植物発現ベクターを用いる場合は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーターなど、ウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶに由来するオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻：３０７〜３１１頁（１９８７年））。これらの構築物は、ＤＮＡの直接的な形質転換または病原体を介するトランスフェクションにより植物細胞へと導入することができる。
【０２４５】
また、昆虫系も、対象のポリペプチドを発現させるのに用いることができる。例示的なバキュロウイルス発現系には、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、およびＴｎｉ細胞を使用する発現系が含まれるがこれらに限定されない（例えば、ＭｕｒｐｈｙおよびＰｉｗｎｉｃａ  −  Ｗｏｒｍｓ、「Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．」、５章：５．４部、２００１年を参照されたい）。
【０２４６】
哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーも、哺乳動物の宿主細胞における発現を増大させるのに用いることができる。有用な哺乳動物の宿主細胞系の例には、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞または２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ−７６細胞、ＨＥＬＡ細胞、およびＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含めたＣＨＯ細胞が含まれる。哺乳動物の発現系は、例えば、Ｔ字型フラスコ、ローラーボトル、もしくは細胞ファクトリーにおける付着細胞系、または、例えば、当技術分野において公知の他のバイオリアクターの中でも１Ｌおよび５Ｌのスピナー、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、および２００Ｌの撹拌タンク式バイオリアクター、もしくは２０／５０Ｌおよび１００／２００ＬのＷＡＶＥバイオリアクターにおける懸濁液培養物を使用しうる。
【０２４７】
また、タンパク質の細胞によらない発現も包含される。これらの実施形態および関連の実施形態は典型的に、精製ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ、およびリボヌクレオチドを使用するが、これらの試薬は、細胞または細胞ベースの発現系からの抽出により生成させることができる。
【０２４８】
具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドを、細菌から発現させて精製する。例示的な細菌発現ベクターには、外来のポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるのに用いうる、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：５５０３〜５５０９頁（１９８９年））；およびｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）が含まれる。特定の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉベースの発現系を使用しうる。
【０２４９】
特定の実施形態では、タンパク質の発現を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐＥＴベクターシリーズ）により制御することができる。これらの実施形態および関連の実施形態は、標的タンパク質の安定性を改善するために、発現宿主株であるＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｔ７を介する発現を支持し、ｌｏｎプロテアーゼおよびｏｍｐＴプロテアーゼを欠損させる、ＢＬ２１のλＤＥ３溶原菌を使用しうる。また、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）（ＤＥ３）株およびＲｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）株など、Ｅ．ｃｏｌｉで用いられることがまれなｔＲＮＡをコードするプラスミドを保有する発現宿主株も含まれる。細胞の溶解および試料の操作もまた、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼおよびＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔなどの試薬を用いて改善することができる。細胞の培養では、自己誘導培地により、ハイスループット発現系を含めた多くの発現系の効率を改善しうる。この種類の培地（例えば、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、ＩＰＴＧなど、人工の誘導剤の添加を伴わずに、代謝シフトを介してタンパク質の発現を徐々に誘発する。低温のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるタンパク質の過剰発現は、それらの溶解度および安定性を改善するため、特定の実施形態は、低温ショックにより誘導されるＥ．ｃｏｌｉによる高収率の生成システムを使用しうる（例えば、Ｑｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、２２巻：８７７〜８８２頁、２００４年を参照されたい）。
【０２５０】
組換え細胞により生成させたタンパク質は、多様な技法により精製し、特徴づけることができる。タンパク質の精製を実施し、タンパク質の純度を解析するための例示的なシステムには、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡ製のＦＰＬＣシステムおよびＢｉｏ−Ｒａｄ製のＦＰＬＣシステム）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ社製のＨＰＬＣおよびＷａｔｅｒｓ製のＨＰＬＣ）が含まれる。精製のための例示的な化学反応には、当技術分野において公知の他の化学反応の中でも、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ、Ｓ）、サイズ除外クロマトグラフィー、塩勾配法、アフィニティー精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲル濾過、逆相法、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）が含まれる。また、生成工程または精製工程の任意のステップにおいて、典型的にはタンパク質組成物の純度を測定するのに使用されうる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば、クーマシー染色、銀染色）、免疫ブロット、ブラッドフォード法、およびＥＬＩＳＡなどの解析法も含まれる。
【０２５１】
特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉの封入体から臨床グレードのタンパク質を単離することができる。具体的な実施形態では、本発明は、治療的使用に適する組換えＣＴ−１ポリペプチドを生成させる方法（実施例および本明細書の別の個所で記載される）を意図する。
【０２５２】
一実施形態では、組換えＣＴ−１ポリペプチドを生成させる方法が、以下のステップ：ｉ）宿主におけるＣＴ−１ポリヌクレオチドの発現ステップ；ｉｉ）宿主細胞を培養して、ＣＴ−１ポリペプチド、例えば、配列番号２〜２５を封入体として発現させるステップ；ｉｉｉ）封入体を洗浄する１または複数のステップ；ｉｖ）ポリペプチドを可溶化させるステップ；ｖ）ポリペプチドをリフォールディングさせるステップ；ｖｉ）ポリペプチドを精製するステップ；およびｖｉｉ）ポリペプチドを所望の緩衝液中で透析するステップのうちの１または複数を包含する。
【０２５３】
特定の実施形態では、ＣＴ−１ポリヌクレオチド配列のコドンを細菌宿主による発現について最適化する。関連する実施形態では、宿主がＥ．ｃｏｌｉである。ＣＴ−１ポリヌクレオチドは、細菌発現ベクター、例えば、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）へとクローニングされる。
【０２５４】
具体的な実施形態では、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、本発明のＣＴ−１ポリペプチドをコードする細菌発現プラスミドで形質転換する。細胞を形質転換したら、培養物を適切な抗生剤を補充した自己誘導培地へと希釈することにより、例えば、２５倍に希釈した形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した２倍濃度のＹＴ中で調製した０．５ＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＥＭＤ）自己誘導培地へと希釈することにより、新鮮な培養物を調製することができる。次いで、培養物を、インキュベーター内、適温で、タンパク質を発現させるのに十分な持続時間にわたり、例えば、３７℃で１６時間にわたり、所望のレベルまで増殖させることができる。次いで、遠心分離により細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄することができる。
【０２５５】
したがって、一実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドを調製する方法が、以下のステップ：ＣＴ−１ポリヌクレオチドを細菌発現ベクターへとクローニングするステップ、細菌発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉへと形質転換するステップ、封入体内でＣＴ−１ポリペプチドを生成させるのに十分な時間および温度でＣＴ−１ポリペプチドを発現させるステップ、細菌細胞を溶解させて、封入体を得るステップ、封入体を洗浄するステップ、封入体を可溶化させるステップ、可溶化させたＣＴ−１ポリペプチドをリフォールディングさせるステップ、ＣＴ−１ポリペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーにより、宿主細胞タンパク質から精製するステップ、および純粋なポリペプチドを中性緩衝液（ＰＢＳ）中へと交換し、純粋なポリペプチドを濾過するステップのうちの１または複数を含む。
【０２５６】
具体的な実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドを精製する方法が、以下のステップ：Ｅ．ｃｏｌｉによりＣＴ−１ポリペプチドを発現させるステップ；Ｅ．ｃｏｌｉを溶解させて封入体を得るステップ；１または複数の洗浄緩衝液中で１、２、３、４、５、６回以上にわたり封入体を洗浄するステップ；封入体を可溶化緩衝液中で可溶化させ、可溶化させたＣＴ−１ポリペプチドをリフォールディング緩衝液に対してリフォールディングさせるステップ；リフォールドした可溶性のポリペプチドを濃縮するステップ；ポリペプチドを濾過するステップ；イオン交換クロマトグラフィー、精製を実施するステップ；およびポリペプチドを所望の緩衝液へと透析するステップのうちの１または複数を含む。
【０２５７】
具体的な一実施形態では、ＣＴ−１ポリペプチドを精製する方法が、以下のステップ：本明細書の別の個所で論じた通りにＣＴ−１ポリペプチドを発現させるステップ；Ｅ．ｃｏｌｉのペレットを、溶解緩衝液、例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、および０．１％ｗ／ｖのデオキシコール酸ナトリウムを補充した、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ中に再懸濁させるステップ；超音波処理により細胞を溶解させるステップ；封入体を、１または複数の洗浄緩衝液中で１、２、３、４、５、６回以上にわたり洗浄する、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中で３回にわたり洗浄し、トリス洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）で３回にわたり洗浄するステップ；封入体を、室温の可溶化緩衝液、例えば、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２Ｍの尿素、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ３．５中で可溶化させるステップ；不溶性のタンパク質を濃縮する、例えば、２２，０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離するステップ；可溶性のＣＴ−１ポリペプチドを含有する上清を、リフォールディング緩衝液、例えば、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５に対して、４℃で１６時間にわたり透析するステップ；リフォールドした可溶性のポリペプチドを濃縮する、例えば、２２，０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離するステップ；ポリペプチドを濾過し、イオン交換クロマトグラフィーを実施する、例えば、０．２２μｍのフィルターによる濾過を実施し、溶媒Ａ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）であらかじめ平衡化させたＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  ＦＦイオン交換カラム（５ｍＬ；ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと投入するステップ；カラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌ中の溶媒Ａを介して、次いで、１ＭのＮａＣｌ中の溶媒Ａを介して段階的に溶出させるステップ；溶出物をプールし、適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳに対する、４℃で１６時間にわたる透析を実施するステップのうちの１または複数を含む。
【０２５８】
Ｆ．組成物および処方物
多様な実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチド、およびこれをコードするポリヌクレオチドによる新規の組成物および処方物を部分的に意図する。具体的な実施形態では、本発明は、組織の成長、保護、再生、維持、および修復を促進する、ＣＴ−１活性を有する可溶性のポリペプチドの水性処方物を提供する。
【０２５９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、例えば、配列番号２〜２５を含む組成物であって、治療的使用に適する組成物を部分的に意図する。本発明の具体的な実施形態では、組成物が、精製された単離ＣＴ−１ポリペプチドを含み、組成物が内毒素を実質的に含まず、凝集物の形成をほとんどまたは全く示さず、組成物の精製された単離ポリペプチドが、治療上受容可能な処方物において可溶性である。
【０２６０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を含む組成物であって、精製された単離ポリペプチドおよび組成物が内毒素を実質的に含まず、精製された単離ポリペプチドが凝集物の形成をほとんどまたは全く示さず、精製された単離ポリペプチドが治療上受容可能な処方物において可溶性であり、哺乳動物の炎症促進作用物質を実質的に含まない組成物を意図する。
【０２６１】
内毒素とは、特定の細菌、典型的にグラム陰性菌と関連する毒素であるが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのグラム陽性菌中でも見出すことができる。最もよく見られる内毒素は、多様なグラム陰性菌の外膜において見出され、これらの細菌が疾患を引き起こす能力において中心的な病原性特徴を表す、リポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）である。ヒトにおいては、少量の内毒素も、他の生理学的に有害な作用の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝血の活性化をもたらしうる。したがって、少量であってもヒトにおいて有害作用を引き起こしうるため、内毒素の大半または全ての痕跡を、薬物および医薬品の容器から除去することが所望されることが多い。内毒素を含まない処方物を生成させることは、特殊な装置、専門技術者を要請する場合があり、内毒素を含まなくない処方物を作製するより著明に高価となる場合がある。
【０２６２】
内毒素は、当技術分野で公知の日常的な技法を用いて検出することができる。例えば、カブトガニに由来する血液を使用するＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）アッセイは、内毒素の存在を検出するのに極めて高感度なアッセイである。この試験では、この反応を増幅する強力な酵素的カスケードのために、極めて低レベルのＬＰＳが、リムルス細胞溶解物の検出可能な凝血を引き起こしうる。内毒素はまた、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により定量化することもできる。本明細書で用いられる、「内毒素を含まない」という用語は、含有する内毒素が最大でも微量（すなわち、生理学的に有害な作用を被験体に及ぼさない量）であり、好ましくは検出不可能量である組成物を指す。一実施形態では、「内毒素を含まない」という用語が、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％内毒素を含まない組成物を指す。一実施形態では、「内毒素を含まない」という用語が、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０内毒素単位（ＥＵ）／ｍｌまたはＥＵ／ｍｇ未満でありうる内毒素レベルまたは内毒素プロファイルを指す。典型的に、１ｎｇのリポ多糖（ＬＰＳ）は、約１〜１０ＥＵに対応する。
【０２６３】
内毒素を実質的に含まないためには、内毒素レベルまたは内毒素プロファイルが、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍｌ未満でありうる。
【０２６４】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有し、約５０ＥＵ／ｍｇ未満、約３０ＥＵ／ｍｇ未満、約２５ＥＵ／ｍｇ未満、約２０ＥＵ／ｍｇ未満、約１５ＥＵ／ｍｇ未満、約１０ＥＵ／ｍｇ未満、約８ＥＵ／ｍｇ未満、約７ＥＵ／ｍｇ未満、約６ＥＵ／ｍｇ未満、約５ＥＵ／ｍｇ未満、約４ＥＵ／ｍｇ未満、約３ＥＵ／ｍｇ未満約２ＥＵ／ｍｇ未満、約１．５ＥＵ／ｍｇ未満、約１．４ＥＵ／ｍｇ未満、約１．３ＥＵ／ｍｇ未満、約１．２ＥＵ／ｍｇ未満、約１．１ＥＵ／ｍｇ未満、約１．０ＥＵ／ｍｇ未満、約０．９ＥＵ／ｍｇ未満、約０．８ＥＵ／ｍｇ未満、約０．７ＥＵ／ｍｇ未満、約０．６ＥＵ／ｍｇ未満、約０．５ＥＵ／ｍｇ未満、約０．４ＥＵ／ｍｇ未満、約０．３ＥＵ／ｍｇ未満、約０．２ＥＵ／ｍｇ未満、約０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または精製ＣＴ−１ポリペプチド１ｍｇ当たりでより少ない内毒素単位の内毒素プロファイルを含むＣＴ−１ポリペプチドまたはその断片を部分的に意図する。内毒素レベルまたは内毒素プロファイルは、室温（２０℃〜２５℃）または体温（３７℃）で評価することができる。
【０２６５】
例示的な哺乳動物の炎症促進作用物質には、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ６、およびＴＮＦ−アルファなど、炎症促進性サイトカインが含まれるがこれらに限定されない。他の炎症促進性メディエーターには、ＬＩＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ８、および炎症細胞を化学的に誘引する他の多様なケモカインが含まれる。これらのサイトカインは、内因性の発熱物質（ＩＬ１、ＩＬ６、ＴＮＦ−アルファ）として作用するか、またはマクロファージおよび間葉細胞の両方による二次的メディエーターおよび炎症促進性サイトカインの合成を上方制御する。
【０２６６】
炎症反応は、任意の周知の動物モデル系を用いてアッセイすることができる。非限定的な一例では、本発明の組成物を、齧歯動物、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモットへと注射し、少なくとも１つ、２つ、３つ以上の炎症促進性サイトカインの分泌を測定し、擬似注射対照と比較した。炎症反応は、例えば、動物に注射して３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間以上後に、時間の関数として測定することができる。
【０２６７】
本発明は加えて、本発明の生成法により調製される、配列番号２〜２５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＴ−１ポリペプチドであって、他の手段で調製した自然発生のＣＴ−１、野生型のＣＴ−１、または変異体のＣＴ−１と比較して改善された安定性を保有するＣＴ−１ポリペプチドも提供する。
【０２６８】
安定性とは一般に、分子がそのフォールドされた活性状態にとどまる傾向と定義することができ、所与の時間および温度において活性を保つタンパク質の量を測定することが含まれるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の多様な方法を用いて評価することができる。本発明の方法により生成される、安定性が改善されたＣＴ−１ポリペプチド（野生型配列のＣＴ−１であれ、本明細書で記載される新規のＣＴ−１変異体であれ）を含む組成物は、所与の時点および温度で測定すると、活性タンパク質の百分率が、本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物と比較して大きい。自然発生の分子は通常、それらの代謝が、かつ、しばしば、それらの高代謝が、体内におけるそれらの内因性作用機構の鍵となる特徴であるので、安定性が限定されている。
【０２６９】
通常、そのフォールドされた天然構造において安定なタンパク質は、プロテアーゼまたは他の機構により分解することができない。通常体内でタンパク質が消失するのは、安定状態からの２つの鍵となるオフ経路による。これらの２つの経路とは、アンフォールディングおよび凝集である。これらの２つの経路は通常連関する。アンフォールディングとは、フォールドされた活性な分子を、フォールディングが低度な状態へと戻す経路である。凝集とは、分子が不活性状態へと不可逆的に変化するようなミスフォールディングの結果である。アンフォールディングおよび凝集のいずれも、タンパク質分解的消化または他の消化に対するタンパク質の感受性を著明に増大させる。本発明は、結果として得られる実体が本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドより安定となるような、ＣＴ−１のフォールディング経路およびアンフォールディング経路の修飾を提供する。
【０２７０】
具体的な実施形態では、本発明は、本明細書で開示される本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比較して、不溶性のタンパク質凝集物の形成に対する安定性を増大させたＣＴ−１組成物を提供する。本明細書では、「タンパク質凝集物」または「タンパク質の凝集」を、もはや溶存していないタンパク質、すなわち、ＣＴ−１ポリペプチドを指すのに用いる。タンパク質凝集物とは、２つ以上の個別のタンパク質分子の集塊またはオリゴマー化を指すことが可能であるが、このような定義に限定されない。当技術分野で用いられるタンパク質凝集物は、可溶性である場合もあり不溶性の場合もあるが、別段具体的に言及しない限り、本発明の具体的な実施形態の目的では、タンパク質凝集物は通常、不溶性であると考えられる。本発明による工程ではその形成が防止されるべき不溶性の凝集物は、サイズが少なくとも１μｍであるが、また、１０μｍを超える範囲でもありうるタンパク質凝集物として本質的に理解される。粒子は、例えば、粒子カウンティング器である、ＰＳＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）製のＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７００、またはＬＤ４００レーザーカウンターを装備したＰａｃｉｆｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨＩＡＣ  Ｒｏｙｃｏ液体粒子カウンティングシステム、モデル９７０３など、市販の粒子カウンティング器を用いる、適切な粒子カウンティング法により決定することができる。ＵＳＰ（米国薬局方）によれば、医薬調製物の１回分の注射用量当たり、１０μｍを超える範囲で最大６０００個の粒子、および２５μｍを超える範囲で最大６００個の粒子が許容される。本発明に従いこれを達成して、ＣＴ−１ポリペプチドの治療用組成物を提供することができる。
【０２７１】
具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１組成物が、１もしくは複数の凍結／融解サイクル、撹拌ストレス、または熱ストレス、化学的ストレス（例えば、ｐＨ、低／高濃度の塩など）、流体ストレス（例えば、狭窄した開口部を介する流体の運動により引き起こされるストレスなどの圧縮ストレス）などの非限定的な例を含めた、１もしくは複数の外部からの物理的ストレスもしくは化学的ストレスにより誘導される凝集物の形成に対する安定性を、本明細書で開示される本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物と比べて増大させている。本明細書で用いられる「撹拌ストレス」とは、ＣＴ−１組成物へと受動的または能動的に適用される任意の物理的運動を意味すると理解される。撹拌ストレスの非限定的な例には、バンピングストレス、滴下ストレス、振とうストレス、旋回ストレス、ボルテキシングストレス、デカンティングストレス、注入ストレス、吸引ストレス（容器または器からシリンジへの吸引）などが含まれる。本発明のＣＴ−１ポリペプチドは特に、出荷および輸送のときの力に関して安定化させる。
【０２７２】
本発明の文脈で用いうる安定性の１つの尺度は、本発明のポリペプチドの凝集を、本発明の方法により調製されないＣＴ−１の凝集とある期間にわたり比較することである。例えば、野生型配列または本発明の新規の変異体である、本発明の方法により生成されるＣＴ−１ポリペプチド、および市販のＣＴ−１（すなわち、本発明の方法により調製されない）は、ある範囲の温度（例えば、５℃〜４５℃）で保管し、次いで、当技術分野において公知の日常的な方法を用いて、分解生成物および凝集物質について解析することができる。安定なタンパク質は、フォールドされた状態にとどまりやすく、本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドより分解および凝集への傾向が小さい。
【０２７３】
本発明の方法により生成される、安定性が改善されたＣＴ−１ポリペプチド（野生型配列のＣＴ−１であれ、本明細書で記載される新規のＣＴ−１変異体であれ）は、所与の時点（例えば、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１５時間後、１８時間後、２１時間後、２４時間後）および所与の温度で測定すると、野生型のＣＴ−１タンパク質または本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比較して大きな残留活性の百分率を保持する。残留タンパク質（すなわち、フォールドされたタンパク質、活性タンパク質）の百分率は、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥなどの日常的な生化学法により測定することもでき、結合アッセイなどの活性アッセイにより測定することもでき、細胞からの応答を誘発することにより測定することもできる。
【０２７４】
本発明の方法により生成される、安定性が改善されたＣＴ−１ポリペプチドは一般に、製品原価（ＣＯＧ）の改善を結果としてもたらす、発現の増大および最終段階の加工における収量の増大をもたらす。さらに、本発明の方法により生成される、安定性が改善されたポリペプチドは、本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比べて、保管寿命が改善されている。保管寿命の延長はまた、製品原価にも影響を及ぼすので有益である。
【０２７５】
本発明の方法により生成される、安定性が改善されたＣＴ−１ポリペプチドは、半減期の延長から結果として生じる、体内における有効性を増大させうる。さらに、安定性が改善されたＣＴ−１ポリペプチドは、凝集を低減するため、皮下投与などの投与経路への適性を増大させうるが、これは、有効性を増大させるだけでなく、また、中和抗体または結合抗体を誘発する危険性も低減する。
【０２７６】
具体的な実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドを含む組成物であって、ポリペプチドが、約３７℃で、非修飾ポリペプチド（例えば、自然発生のポリペプチド）と比較して、または本発明の方法に従い処方されないＣＴ−１（例えば、野生型または変異体の）ポリペプチドと比較して、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２１時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上にわたり安定な組成物を意図する。
【０２７７】
「溶解度」という用語は、本明細書で提供される薬剤が、液体溶媒中で溶解し、均質な溶液を形成する特性を指す。溶解度とは典型的に、溶媒単位容量当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質ｇ、溶媒１ｄＬ（１００ｍＬ）当たりの溶質ｇ、ｍｇ／ｍＬなど）、モル濃度、重量モル濃度、モル分率、または濃度についての他の類似の記載による濃度として表される。溶媒量当たりに溶質が溶解しうる最大平衡量とは、温度、圧力、ｐＨ、および溶媒の性質を含め、指定された条件下におけるこの溶媒中のこの溶質の溶解度である。特定の実施形態では、溶解度は、生理学的なｐＨで測定される。特定の実施形態では、溶解度は、水またはＰＢＳなどの生理学的緩衝液中で測定される。特定の実施形態では、溶解度は、血液または血清などの生物学的流体（溶媒）中で測定される。特定の実施形態では、温度が、ほぼ室温（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）の場合もあり、ほぼ体温（３７℃）の場合もある。特定の実施形態では、本発明のＣＴ−１ポリペプチドなどの薬剤の溶解度は、室温（２０℃〜２５℃）または３７℃で、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０ｍｇ／ｍＬである。
【０２７８】
純度、溶解度、および凝集度を含めたタンパク質の特徴は、タンパク質ベースの解析アッセイおよび解析法を用いて評価することができる。タンパク質の純度は、多数のやり方で評価することができる。例えば、純度は、一次構造、高次構造、サイズ、電荷、疎水性、およびグリコシル化に基づき評価することができる。一次構造を評価する方法の例には、Ｎ末端配列決定およびＣ末端配列決定ならびにペプチドマッピング（例えば、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．、２４巻：２５５〜２７５頁、１９９６年を参照されたい）が含まれる。高次構造を評価する方法の例には、円偏光二色法（ｄｉｃｈｒｏｉｓｉｍ）（例えば、Ｋｅｌｌｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１７５１巻：１１９〜１３９頁、２００５年を参照されたい）、蛍光分光分析（例えば、Ｍｅａｇｈｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７３巻：２３２８３〜８９頁、１９９８年を参照されたい）、ＦＴ−ＩＲ、アミド水素−重水素交換反応速度、示差走査熱量測定、ＮＭＲ分光分析、立体構成的に高感度の抗体による免疫反応が含まれる。高次構造はまた、ｐＨ、温度、または塩の添加など、多様なパラメータの関数としても評価することができる。
【０２７９】
サイズなど、タンパク質の特徴を評価する方法の例には、解析的超遠心分離およびサイズ除外ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、または代替的に、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）が含まれ、電荷を測定する例示的な方法には、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動が含まれる。疎水性は、例えば、逆相ＨＰＬＣおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーにより評価することができる。グリコシル化は、薬物動態（例えば、クリアランス）、立体構成または安定性、受容体への結合、およびタンパク質の機能に影響を及ぼす可能性があり、例えば、質量分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析により評価することができる。
【０２８０】
特定の実施形態は、他の使用の中でも、純度、サイズ（例えば、サイズ均質性）、もしくは凝集度など、タンパク質の特徴を評価し、かつ／またはタンパク質を精製するためのＳＥＣ−ＨＰＬＣの使用を包含する。また、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）およびゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）も含めたＳＥＣとは、それらのサイズ、またはより具体的に述べると、それらの流体力学的容量、拡散係数、および／または表面特性に基づき、溶存している分子を多孔性物質により分離するクロマトグラフィー法を指す。この工程は一般に、生体分子を分離し、ポリマーの分子量および分子量の分布を決定するのに用いられる。典型的に、生物学的試料またはタンパク質試料（本明細書で提示され、当技術分野において公知のタンパク質発現法に従い生成させるタンパク質抽出物など）は、規定された定常相（多孔性物質）、好ましくは、試料中のタンパク質と相互作用しない相を伴う、選択されたサイズ除外カラムへと投入する。特定の態様では、定常相が、ガラス製カラム内または鋼製カラム内の稠密な三次元マトリックスへと充填された不活性粒子からなる。移動相は、純水、水性緩衝液、有機溶媒、またはこれらの混合物でありうる。定常相の粒子は典型的に、特定のサイズを下回る分子だけの侵入だけを可能とする小孔および／またはチャネルを有する。したがって、大型の粒子は、これらの孔およびチャネルから除外され、実験開始時に、それらの定常相との限定された相互作用から「完全に除外された」ピークとして溶出する。孔に収まりうる小型の分子が、流動する移動相から抜き取られ、それらが定常相の孔に固定化されて過ごす時間は、部分的に、それらが孔をどのくらい深く貫通するかに依存する。それらは、移動相流から抜き取られると、カラムから溶出するのに長い時間が必要となり、それらのサイズの差違に基づく粒子間の分離が結果としてもたらされる。所与のサイズ除外カラムは、分離しうる分子量の範囲を有する。総じて、上限より大きな分子は定常相に捕獲されず、下限より小さな分子は、固相に完全に侵入して、単一のバンドとして溶出し、範囲内の分子は、流体力学的容量など、それらの特性により規定される異なる速度で溶出する。医薬タンパク質により実施されるこれらの方法の例については、Ｂｒｕｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．、１５巻：１９２９〜１９３５頁、１９９７年を参照されたい。
【０２８１】
また、臨床適用されるタンパク質の純度についても、例えば、Ａｎｉｃｅｔｔｉら（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、７巻：３４２〜３４９頁、１９８９年）により論じられている。タンパク質の純度を解析するより最近の技法には、限定なしに述べると、タンパク質のハイスループットの力価解析、サイジング、および純度解析をもたらす、タンパク質および核酸を迅速に解析するための自動式プラットフォームである、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩが含まれる。特定の非限定的な実施形態では、タンパク質断片および抗体など、臨床グレードのタンパク質は、他の方法の中でも、少なくとも２つの直交するステップにおいてクロマトグラフィー物質の組合せを使用することにより得ることができる（例えば、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、３０８巻、ＳｍａｌｅｓおよびＪａｍｅｓ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、２００５年を参照されたい）。
【０２８２】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドおよび生物学的に活性な断片による組成物は、このポリペプチドに関して当技術分野における日常的な技法に従い測定される純度が少なくとも約９０％である。診断用組成物または特定の治療用組成物などの特定の実施形態では、本発明のポリペプチド組成物の純度は、少なくとも約９５％である。治療用組成物または医薬組成物などの特定の実施形態では、本発明のポリペプチド組成物の純度が、少なくとも約９７％もしくは９８％、または９９％である。基準物質または研究用試薬として用いられる場合などの他の実施形態では、本発明のポリペプチドの純度を低くすることが可能であり、純度は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、または８５％でありうる。純度は、全体として測定することもでき、他のタンパク質など、選択した構成要素との関連で、例えば、タンパク質ベースの純度を測定することもできる。
【０２８３】
また、タンパク質溶解度アッセイも含まれる。このようなアッセイは、例えば、組換え生成に最適の増殖条件および精製条件を決定し、（１または複数の）緩衝液の選択を最適化し、ＣＴ−１ポリペプチドまたは生物学的に活性な断片の選択を最適化するのに用いることができる。溶解度または凝集は、温度、ｐＨ、塩、および他の添加剤の存在または非存在を含めた多様なパラメータに従い評価することができる。溶解度スクリーニングアッセイの例には、限定なしに述べると、他のアッセイの中でも、エンドポイントとして濁度または他の尺度を用いてタンパク質の溶解度を測定するマイクロプレートベースの方法、精製組換えタンパク質の溶解度を解析するためのハイスループットアッセイ（例えば、Ｓｔｅｎｖａｌｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１７５２巻：６〜１０頁、２００５年を参照されたい）、遺伝子マーカータンパク質の構造的相補性を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質のフォールディングおよび溶解度をモニタリングおよび測定するアッセイ（例えば、Ｗｉｇｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、１９巻：１３１〜１３６頁、２００１年を参照されたい）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の溶解度について、走査電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）を用いる、電気化学的スクリーニング（例えば、Ｎａｇａｍｉｎｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．、９６巻：１００８〜１０１３頁、２００６年を参照されたい）が含まれる。本発明の方法により生成させないＣＴ−１ポリペプチドと比較して溶解度を増大させた（または凝集を低減した）ＣＴ−１ポリペプチドまたは生物学的に活性な断片は、タンパク質の溶解度についての単純なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（例えば、Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、８巻：１９０８〜１１頁、１９９９年を参照されたい）を含め、当技術分野における日常的な技法に従い同定または選択することができる。
【０２８４】
具体的な実施形態では、ヒト治療用組成物であって、本明細書の別の個所で記載される本発明の修飾ポリペプチドまたはその断片と薬物動態（ＰＫ）調節剤とを含む組成物が提供される。本明細書で用いられる「薬物動態調節剤」という用語とは一般に、限定なしに述べると、ＰＫ調節剤を欠くＣＴ−１ポリペプチドと比較して、半減期、溶解度、安定性、活性を含めた、ポリペプチドの薬物動態パラメータを増大させるポリペプチド修飾を指す。一実施形態では、ＰＫ調節剤が、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めた、ポリペプチドとコンジュゲートされた生体適合性ポリマーを含む。
【０２８５】
本発明の組成物は、本明細書で記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターと同じポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターなどを含む１または複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、ならびに１または複数の薬学的に許容される塩または担体、および／あるいは単独で、または１もしくは複数の他の治療モダリティーと組み合わせて、細胞または動物へと投与するための生理学的に許容可能な溶液を含みうる。また、所望の場合、例えば、他のタンパク質、ポリペプチド、低分子、または多様な薬学的に活性な薬剤など、本発明の組成物を他の薬剤との組合せでも同様に投与しうることも理解される。組成物が組織の成長、再生、維持、保護、および修復を促進する能力など、ＣＴ−１組成物の治療的可能性に、さらなる薬剤が有害な影響を及ぼさないという条件で、組成物中にもまた包含されうる他の構成要素にはほとんど制限がない。
【０２８６】
本発明のＣＴ−１組成物は、固体形態（顆粒、粉末、または坐剤を含めた）で作製することもでき、液体形態（例えば、溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で作製することもできる。本発明の組成物は、多様な溶液により適用することができる。本発明に従い用いるのに適する溶液は、無菌であり、十分な量のペプチドを溶解させ、提起される適用に有害ではない。この点で、本発明の組成物は、極めて安定であるが、強酸および強塩基により加水分解される。本発明の組成物は、有機溶媒中、および約ｐＨ５〜９、約ｐＨ６〜８、約ｐＨ６．５〜８、約ｐＨ７〜８、約ｐＨ７．４〜８、または任意の中間のｐＨの水溶液において可溶性である。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ｐＨを約５．５、約６、約６．５、約７、約７．４、もしくは約ｐＨ８、または任意の中間のｐＨとして処方される。
【０２８７】
具体的な実施形態では、本発明の組成物は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、もしくは約１００ｍＭ、または任意の中間のイオン強度が含まれるがこれらに限定されない、低イオン強度を有する。
【０２８８】
ＣＴ−１組成物は、滅菌化など、従来の薬学的工程にかけることもでき、かつ／または防腐剤、安定化剤、保湿剤、乳化剤、および緩衝剤など、従来の補助剤を含有する場合もある。
【０２８９】
投与するためには、ＣＴ−１活性薬剤を、示される投与経路に適する１または複数の補助剤と組み合わせることが普通である。ＣＴ−１組成物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシアガム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ならびに／またはポリビニルアルコールと混合することができ、従来の投与用に錠剤化またはカプセル化することができる。代替的に、本発明の化合物は、生理食塩液、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースのコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、および／または多様な緩衝液中に溶解させることもできる。薬学技術分野では、他の補助剤および投与方式も周知である。担体または希釈剤には、単独もしくは蝋を伴うモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリル、または当技術分野において周知の他の物質などの徐放物質が含まれうる。
【０２９０】
局所投与に適する処方物には、皮膚を介する透過に適する液体調製物または半液体調製物（例えば、塗布薬、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）、および眼、耳、または鼻への投与に適する滴下剤が含まれる。
【０２９１】
薬学的に許容される塩には、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）および、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基にも由来しうる。
【０２９２】
本明細書で用いられる「担体」は、任意および全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。当技術分野では、医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。組成物にはまた、補充有効成分も組み込むことができる。
【０２９３】
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与したときに、アレルギー反応または類似の望ましくない反応を発生させない分子実体および組成物を指す。当技術分野では、タンパク質を有効成分として含有する水性組成物の調製が十分に理解されている。典型的に、このような組成物は、溶液または懸濁液としての注射用剤として調製されるが、また、注射前に液体中に溶存または懸濁させるのに適する固体形態も、調製することができる。
【０２９４】
多様な実施形態では、本発明は、ＣＴ−１ポリペプチドを、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、または任意の中間のポリペプチド濃度で含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドを、約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬを超える濃度で含む組成物を含む。
【０２９５】
特定の実施形態では、本発明は、ＣＴ−１ポリペプチドを、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、もしくは約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、または任意の中間のポリペプチド濃度で含む組成物を提供する。
【０２９６】
加えて、本発明は、本発明の方法により調製したＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物であって、凝集プロファイルが、ポリペプチドのうちの約１％〜約１０％、約２％〜約９％、約３％〜約８％、約４％〜約７％、または約５％〜約６％を凝集物として含有する組成物を意図する。特定の実施形態では、本発明は、ＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物であって、凝集プロファイルが、ポリペプチドのうちの約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、または約１０％未満を凝集物として含有する組成物を意図する。
【０２９７】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドおよび生物学的に活性な断片による組成物の純度が、ポリペプチドについて、当技術分野における日常的な技法に従い測定される通り、少なくとも約９０％である。診断用組成物または特定の治療用組成物など、特定の実施形態では、本発明のポリペプチド組成物の純度が少なくとも約９５％である。治療用組成物または医薬組成物など、特定の実施形態では、本発明のポリペプチド組成物の純度が少なくとも約９７％もしくは９８％、または９９％である。基準物質または研究用試薬として用いられる場合など、他の実施形態では、本発明のポリペプチドの純度を低くすることが可能であり、少なくとも約７０％、７５％、８０％、または８５％の純度でありうる。純度は、全体として測定することもでき、他のタンパク質など、選択された構成要素との関連で、例えば、タンパク質ベースの純度として測定することもできる。
【０２９８】
一実施形態では、本発明は、ＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物であって、ポリペプチドの半減期を、非修飾ポリペプチド（例えば、自然発生のＣＴ−１ポリペプチド）と比較して少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍に延長した組成物を意図する。
【０２９９】
具体的な実施形態では、本発明は、ＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物であって、ポリペプチドが、約３７℃で、非修飾ポリペプチド（例えば、自然発生のＣＴ−１ポリペプチド）と比較して、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２１時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上にわたり安定な組成物を意図する。
【０３００】
具体的な実施形態では、本発明は、重量で少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋なＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物をさらに意図する。
【０３０１】
Ｇ．送達法
ＣＴ−１変異体ポリペプチドおよびＣＴ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによる組成物は、直接被験体に投与する（タンパク質／ポリペプチドとして、または発現ベクターの文脈では遺伝子治療のために）こともでき、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて被験体に由来する細胞へと送達する（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療の場合）こともできる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組成物の直接的な送達は、経口経路、非経口経路、吸入スプレー、直腸経路、または局所経路を含めた任意の適切な経路を介して、薬学的に許容される従来の担体、補助剤、およびビヒクルを含有する用量単位の処方物により達成することができる。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下注入法、静脈内注入法、動脈内注入法、筋内注入法、心内注入法、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注入法、腱内注入法、髄腔内注入法、頭蓋内注入法、胸郭内注入法、または腹腔内注入法を包含する。本発明の組成物の投与法は一般に、非経口注射、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、心筋内注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、または組織の間質腔への注射により達成する。
【０３０２】
特定の実施形態では、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアゾール送達ビヒクルを介して組成物を送達することができる。遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を、鼻腔内エアゾールスプレーを介して肺へと直接送達する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（各々が参照によりその全体において具体的に本明細書に組み込まれる）において記載されている。薬学技術分野ではまた、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８年）、およびリソホスファチジルグリセロール化合物（参照によりその全体において具体的に本明細書に組み込まれる米国特許第５，７２５，８７１号）を用いる薬物送達も同様に周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態による経粘膜薬物送達も、米国特許第５，７８０，０４５号（参照によりその全体において具体的に本明細書に組み込まれる）において記載されている。
【０３０３】
本発明の組成物はまた、筋肉などの組織内への直接注射を介して投与することもできる。本発明の一部の実施形態では、本発明の組成物を、組成物を組織へと直接注射することにより投与して、注射される組織における組織の喪失を防止するか、または注射される組織の再生もしくは修復を促進する。
【０３０４】
一般に、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方における適用のための核酸の送達は、例えば、全てが当技術分野において周知の、デキストランを介するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンを介するトランスフェクション、プロトプラスト融合体、電気穿孔、（１または複数の）ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、ＤＮＡの核内への直接的なマイクロインジェクション、およびアデノウイルス（およびアデノ随伴ウイルス）またはアルファウイルスなどウイルスを介するトランスフェクションにより達成することができる。
【０３０５】
特定の実施形態では、ウイルスベクターまたは他のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるポリヌクレオチド送達法を用いて、１または複数の修飾ＣＴ−１組成物を送達することが好ましいであろう。好ましい実施形態では、ウイルスベクターが、非組込み型ベクターまたはトランスポゾンベースのベクターである。これは、発現構築物としてのアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含めたベクター、または他のウイルスベクター（限定なしに述べると、牛痘ウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスを含めた）の使用など、周知の多様な手法のうちのいずれかを用いて達成することができる。
【０３０６】
また、非ウイルス的方法も、本発明のポリヌクレオチドを投与するのに使用することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドを、マイクロインジェクションを介して細胞へと直接投与することもでき、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４年）、またはＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６年）において記載されている技法を用いるなどの注射を介して組織へと直接投与することもできる。対象の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同様の形で導入し、遺伝子産物を発現させることも可能なことが想定される。
【０３０７】
ネイキッドのＤＮＡ発現構築物を細胞へと導入する本発明の別の実施形態は、パーティクルボンバードメントを伴いうる。この方法は、ＤＮＡでコーティングされたマイクロプロジェクタイルを、細胞膜を貫通し、それらを死滅させることなく細胞に侵入することを可能とする高速まで加速化する能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年）。別の実施形態では、ポリヌクレオチドを、電気穿孔を介して細胞へと投与する。
【０３０８】
Ｈ．処置法
本発明のＣＴ−１ポリペプチドおよびＣＴ−１ポリヌクレオチドの治療への適用は、例えば、化学療法または放射線療法の後、筋傷害の後、または疾患および障害の処置もしくは管理において、典型的に、組織の喪失または損傷を置換する必要がある状況に関する。例えば、方法は、筋変性障害、筋ジストロフィー、神経筋変性疾患、ＨＩＶ感染などの処置、管理、または防止において骨格筋幹細胞と共に用いることもでき；パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性障害の処置、管理、または防止において神経幹細胞と共に用いることもでき；心変性疾患または虚血性心疾患、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、高血圧症、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心血管異常、動脈炎、ならびに他の動脈、細動脈、および毛細血管の疾患の処置、管理、または防止において、心弁、刺激伝導組織、または血管平滑筋の再生において心筋細胞と共に用いることもでき、冠動脈バイパス移植術を受ける被験体におけるさらなる疾患の防止において用いることもできる。本発明の方法を用いて処置または防止しうる他の疾患または障害には、肝硬変および肝炎を含めた肝変性疾患ならびに糖尿病が含まれうるがこれらに限定されない。
【０３０９】
特定の実施形態では、本明細書で記載される組成物の、それを必要とする被験体における組織の成長、保護、維持、修復、保護、または再生を促進するための薬物を製造するための使用が提供される。具体的な実施形態では、本明細書で記載される組成物であって、それを必要とする被験体における組織の成長、保護、維持、修復、または組織の再生を促進するための薬物の製造において用いられる組成物が提供される。組織に関して本明細書で用いられる「保護」という用語は、例えば、かつ、限定なしに述べると、低酸素症および／または虚血症により引き起こされる組織損傷を含めた損傷または傷害からの組織の保護を意味する。
【０３１０】
組成物は、治療有効量などの有効量で投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてヒト被験体および非ヒト被験体を処置するために、被験体には通常、有効量の１または複数の本発明の修飾ＣＴ−１ポリペプチドを含む組成物を投与する。「有効量」とは、所望の治療結果または予防結果を達成するのに必要な用量で必要な期間にわたる有効な量を指す。
【０３１１】
本発明のＣＴ−１ポリペプチド、またはこれを含む組成物の「治療有効量」は、疾患状態、年齢、性別、および個体の体重、ならびにＣＴ−１ポリペプチドが個体において所望の応答を誘発する能力などの因子により変化しうる。治療有効量はまた、ＣＴ−１ポリペプチドの任意の毒性作用または有害作用が、治療的に有益な効果により凌駕される量でもある。「治療有効量」という用語は、ＣＴ−１ポリペプチドまたはこれを含む組成物の量であって、哺乳動物（例えば、患者）において疾患または障害を「処置する」のに有効な量を指す。
【０３１２】
「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するのに必要な用量で必要な期間にわたる有効な量を指す。予防用量は、疾患以前の被験体において用いられるか、または疾患の早期段階にある被験体において用いられるので、予防有効量は、治療有効量未満であることが典型的であるが、必ずしもそうではない。
【０３１３】
具体的な実施形態では、１または複数の修飾ＣＴ−１ポリペプチドおよび／または修飾ＣＴ−１ポリヌクレオチドを含む組成物を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそれを必要とする被験体に投与する。本明細書で用いられる「被験体」という用語には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物（例えば、ヒヒ、オランウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、または他の非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物；例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類などの哺乳動物以外の脊椎動物、および哺乳動物以外の非脊椎動物を含めた哺乳動物以外の動物が含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、被験体がヒトである。疾患または状態の処置を必要とする被験体には、疾患または状態を有する被験体のほか、疾患または状態を有する危険性がある被験体など、このような疾患または状態の症状を呈示する被験体が含まれる。
【０３１４】
用量レジメンおよび処置レジメは、傷害の種類、年齢、体重、性別、個体の医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される具体的な化合物を含めた多様な因子に基づき、処置される疾患に応じて変化する。したがって、用量レジメンおよび処置レジメは、変化する可能性があるが、標準的な方法を用いて医師が日常的に決定することが可能である。体重１ｋｇ当たり０．１ｎｇ〜体重１ｋｇ当たり１０ｍｇのオーダーの、体重当たりの活性薬剤の用量レベルは、本明細書で開示される全ての有用な方法に有用である。
【０３１５】
療法は、処置される疾患または状態、年齢、体重、投与経路、および他の因子に基づき決定される用量で毎日１〜６回にわたり投与することができる。これらの実施形態の全てにおいて、本発明の組成物は、計画される医療手順、疾患の発症、または傷害の発生の前に、これと同時に、またはこの後で投与することができる。場合によって、ＣＴ−１組成物は、計画される医療手順などの事象以前の最長３０日にわたり、患者に投与することができ、手術後または他の傷害の発生後もしくは疾患の発症後最長６０日間にわたり患者に投与することができる。本発明の具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１組成物を、計画される医療手順の最長１週間前に患者に投与する。別の具体的な実施形態では、本発明のＣＴ−１組成物を、医療手順の施行後、傷害の発生後、または疾患の発症後１週間以内に患者に投与する。処置は、本発明のＣＴ−１組成物を引き続き投与することにより継続させることができる。本発明の具体的な実施形態では、被験体は、本発明の方法に従い反復される処置サイクルを経る。
【０３１６】
別の本発明の具体的な実施形態では、ＣＴ−１組成物を局所投与する。適切な局所用量および処方物中の有効成分濃度は、皮下投与について記載される通りである。
【０３１７】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、および交付された特許は、各個別の刊行物、特許出願、または交付された特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたと仮定した場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１８】
理解を明確にするための説明および例示を目的として、前出の本発明についてある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らし、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、特定の変化および改変をこれに施しうることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、例示だけを目的として提示するものであり、限定を目的として提示するものではない。当業者は、本質的に同様な結果をもたらすように変化または改変させうる、各種のそれほど重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０３１９】
（実施例１）
方法
分子生物学法
野生型のｈＣＴ−１  ＤＮＡ配列を、細菌による発現のために最適化して合成した。遺伝子は、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）ベクターのＮｄｅ  Ｉ部位とＢａｍＨ  Ｉ部位との間に挿入した。Ｃ１０５Ｓ突然変異体およびＣ１７８Ｓ突然変異体（自然発生のＣＴ−１ポリペプチドに照らしたアミノ酸位置）は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位指向突然変異誘発法を用いて調製した。Ｃ１０５Ｓ突然変異体は、フォワードプライマーである５’−ＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＡ−３’およびリバースプライマーである５’−ＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣ−３’を用いてＷＴから作製した。Ｃ１７８Ｓ突然変異体およびＣ１０５Ｓ／Ｃ１７８Ｓ二重突然変異体は、フォワードプライマーである５’−ＡＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧ−３’およびリバースプライマーである５’−ＣＡＴＴＣＡＣＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＣＡＣＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＴ−３’を用いて、それぞれ、ＷＴおよびＣ１０５Ｓ突然変異体から作製した。Ｎ末端メチオニンと隣接するセリンとの間におけるＮ末端システインの挿入は、フォワードプライマーである５’−ＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧ−３’およびリバースプライマーである５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＣ−３’を用いて、Ｃ１０５Ｓ／Ｃ１７８Ｓ二重突然変異体をＰＣＲ増幅することにより作製した。同様に、終止コドンに隣接する、終止コドンの５’側におけるＣ末端システインの挿入も、フォワードプライマーである５’−ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＧＴＣＧ−３’およびリバースプライマーである５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧ−３’を用いて、Ｃ１０５Ｓ／Ｃ１７８Ｓ二重突然変異体をＰＣＲ増幅することにより作製した。次いで、ＰＣＲ産物を、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）ベクターのＮｄｅ  Ｉ部位とＢａｍＨ  Ｉ部位との間に挿入し戻した。こうして、８つの細菌発現ベクターを生成させたが、その概略は、図２において見ることができる。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド精製キットおよびプロトコールを用いて、細胞への形質転換のためにプラスミドベクターを調製した。
【０３２０】
タンパク質の生成
ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ヒトＣＴ−１野生型ポリペプチドまたは本発明のＣＴ−１ポリペプチドをコードするプラスミド（上記で列挙した）で形質転換した。形質転換細胞から調製した新鮮な出発培養物を、１００μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した２倍濃度のＹＴ中で調製した０．５ＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＥＭＤ）自己誘導培地へと２５倍希釈した。シェーキングインキュベーター内、３７℃で１６時間にわたり培養物を増殖させた。遠心分離により細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。
【０３２１】
タンパク質の精製
発現工程に由来するＥ．ｃｏｌｉ細胞ペレットを、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）および０．１％ｗ／ｖのデオキシコール酸ナトリウムを補充した溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）中で再懸濁させた。細胞は、超音波処理により溶解させた。残留ペレット中に含有される封入体は、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）で３回にわたり洗浄した後、トリス洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）で３回にわたり洗浄した。洗浄された封入体を、室温の可溶化緩衝液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２Ｍの尿素、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ３．５）中で可溶化し、２２，０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離した。上清を、リフォールディング緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５）に対して、４℃で１６時間にわたり透析した。リフォールドさせたタンパク質を、２２，０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離し、０．２２μｍのフィルターを介して濾過し、溶媒Ａ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）であらかじめ平衡化させたＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  ＦＦイオン交換カラム（５ｍＬ；ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと投入した。カラムを５カラム容量の溶媒Ａで洗浄し、結合したタンパク質を、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の溶媒Ａにより、次いで、１Ｍ  ＮａＣｌ中の溶媒Ａにより段階的に溶出させた。０．１ＭのＮａＣｌによる溶出物をプールし、ＰＢＳに対して４℃で１６時間にわたり透析した。本出願で記載される全てのタンパク質は、このやり方で精製した。
【０３２２】
タンパク質の修飾
タンパク質は、示される通り、直鎖状または分枝状のＰＥＧ化または二量体化により修飾した。ＣＴ−１ポリペプチドを修飾するため、直鎖状ＰＥＧ分子であるＭＭ（ＰＥＧ）ｎ［式中、略号は、対向末端においてメチル（−ＣＨ３）基およびスルフヒドリル反応性のマレイミド基を伴うポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを有する化合物のセットのためのものである］試薬（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるＰＥＧ化を用いた。非分枝状、親水性で、長さが区々の分子は、メチル−ＰＥＧｎ−マレイミドの形態を有する［式中、添え字「ｎ」は、エチレングリコール単位の数を示す］。分枝状ＰＥＧのためには、ＴＭＭ（ＰＥＧ）１２（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。「ＴＭＭ（ＰＥＧ）１２」とは、スルフヒドリル基を効率的かつ特異的に修飾するための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分枝状トリメチル（ＴＭ）およびマレイミド（Ｍ）誘導体を示す。メチル終端された各ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分枝は、１２エチレングリコール単位を含有する。３つの分枝は、遠位端にスルフヒドリル反応性のマレイミド基を含有する４単位のＰＥＧステムへと接合される。３０ＫＤａの単鎖および４０ＫＤａの分枝状鎖による大型のＰＥＧ分子は、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐから得た。修飾ＣＴ−１ポリペプチドを架橋形成して、機能的二量体を形成するには、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）試薬を用いた。これらは、ＰＥＧ２スペーサーまたはＰＥＧ３スペーサーの片方の末端においてマレイミド基を含有するホモ二官能性でスルフヒドリル反応性の架橋形成剤である。全ての場合において、マレイミド基は、中性のｐＨで、チオールを含有するタンパク質と自発的に反応性であった。ＰＥＧおよびリンカー生成物を、１０倍のモル濃度過剰のタンパク質と共にインキュベートした。その後、タンパク質を、修飾の効率および比活性について解析した。タンパク質は、必要に応じて非反応性のＰＥＧおよび／またはタンパク質から精製した。
【０３２３】
ＣＴ−１ポリペプチドの解析的評価
ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ−Ｄｏｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎおよびソフトウェアを用いてクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる密度測定解析を実施した。高速液体クロマトグラフィー−サイズ除外クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＨＰＬＣにより実施した。ピーク面積の評価（ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）を用いて、治療用生成物の均質性および純度を評価（ｅｖａｌｕａｔｅ）した。
【０３２４】
ＣＴ−１ポリペプチドの安定性アッセイ
市販のヒトＣＴ−１タンパク質には、ｐＨ４の酢酸中に５００μｇ／ｍＬのＰｒｏＳｐｅｃタンパク質原液を、実験開始時の総容量５００μＬのために２．５μｇ／ｍＬへと希釈した。試験管から試料を取り出し、ある試料は３７℃で、別の試料は４℃で、７日間にわたりインキュベートした。３７．５ｎｇのタンパク質（実験開始時に計算した）を、ウェスタンブロット法のためのゲルへと投入した。ｈＣＴ−１を検出するのに用いられる抗体は、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ２６０の後、ＬＩ−ＣＯＲ製の二次抗体である８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧである９２６−３２２１０であった。本明細書で記載される方法を用いて生成させるＣＴ−１ポリペプチドについては、１ｍｇ／ｍＬのｈＣＴ−１タンパク質のアリコート５０μＬを液体窒素中で瞬時凍結させ、−８０℃で保管した。１４日間にわたり選択された時点において、個別のアリコートを融解させ、３７℃または４℃でインキュベートした。１４日間の終了時に、１μｇの各アリコート（実験開始時に計算したタンパク質濃度）を、クーマシー解析のためのゲルへと投入した。また、１４日間にわたり、合計８つの凍結−融解サイクルにわたり、隔日で、ｈＣＴ−１タンパク質の５０μＬのアリコート１つを融解させ、−２０℃で再凍結させた。
【０３２５】
活性評価およびウェスタンブロット
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、１０％ＦＢＳおよび１倍濃度の非必須アミノ酸を伴うＤＭＥＭ中で培養した。タンパク質による処置の１８時間前に、１．５×１０５個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。処置の直前に、ヒトＣＴ−１変異体の段階希釈液を細胞培養培地中で調製した。細胞から培地を吸引し、ｈＣＴ−１タンパク質または陰性対照としてのＰＢＳを含有する培地で置換した。３７℃で２０分間にわたるインキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの細胞溶解緩衝液［１０倍濃度の細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；９８０３Ｓ）１ｍＬ＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ；０４６９３１５９００１）１錠＋ＨＡＬＴ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ；７８４２０）５０μＬ＋蒸留水、１０ｍＬまで］中で溶解させた。細胞溶解物を氷上で擦り取り、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管へと移し、次いで、４℃、１３，２００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離した。ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  ＢｕｆｆｅｒおよびＳａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を溶解物に付加した。試料をＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動させ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢｌｏｔシステムを用いてニトロセルロース膜へと転写した。ブロットを、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ、９２７−４００００）中、室温で１時間にわたりブロッキングした。一次抗体を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中で以下の通り：１：１０００の抗ホスホ−ＳＴＡＴ３抗体（Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；９１３８）、１：２０００の抗ＳＴＡＴ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；９１３２）、１：４０００の抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ；ｓｃ−１６１６）に希釈した。一次抗体中、室温で１時間にわたるインキュベーション後、ブロットを、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で４５分間ずつ複数回にわたり洗浄した。適切なＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ二次抗体を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中で１：１０，０００に希釈した（８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ、９２６−３２２１０；６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧ、９２６−３２２２１；６８０ロバ抗ヤギＩｇＧ、９２６−３２２２４）。ブロットを、二次抗体と共に室温で４５分間にわたりインキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で３０分間ずつ、複数回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳ中で速やかに洗浄した。ブロットは、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ）により画像化し、バンド強度は、Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを用いて定量化した。ホスホ−ＳＴＡＴ３シグナルは、各試料について、総ＳＴＡＴ３シグナルまたはアクチンシグナルに照らして標準化した。ＥＣ５０の計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて実施した。ＰＥＧ化の前後におけるＣＴ−１についてのウェスタンブロット法は、同じプロトコールを用いるが、抗ＣＴ−１一次抗体であるＭＡＢ２６０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。
【０３２６】
（実施例２）
新規の修飾ＣＴ−１ポリペプチドのデザイン
ＣＴ−１とは、ＩＬ６ファミリーの低分子（２１．５ＫＤａ）分泌型サイトカインであり、虚血性疾患および再生医療を含めた複数の領域における治療への適用の可能性がある。このタンパク質は分子量が小さく、これは、短い全身半減期および低度のバイオアベイラビリティーを結果としてもたらす。ＰＥＧ化および多量体化など、分子量を増大させる修飾であれば、タンパク質のクリアランス速度および皮下コンパートメントまたは筋内コンパートメントからの吸収を減少させ、したがって、全身半減期および要請される処置間隔を延長するであろう。このような低分子のシグナル伝達タンパク質には、ランダムであるかまたは複数の修飾部位が、生物学的活性および／または安定性の著明な低減を結果としてもたらしうる可能性がある。予備的な修飾実験で、タンパク質内の一次アミンが、反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基に連結されたジメチル基などの反応性基で修飾されると、ヒトＣＴ−１は、生物学的活性および安定性の両方を喪失した。したがって、部位特異的修飾、残基のターゲティング、または修飾が許容される領域が要請された。本明細書の別の個所で論じた通りであり、当技術分野において公知である通り、タンパク質を互いとコンジュゲートするか、またはＰＥＧなどのポリマーとコンジュゲートするには、複数の異なる化学反応が利用可能である。マレイミド化学反応は一般に、システイン残基のチオール基内の修飾などの修飾をスルフヒドリルへとコンジュゲートするのに用いられる。ヒトＣＴ−１アミノ酸配列の解析は、１つは１０５位、および２つ目は１７８位に２つのシステイン残基があることを示し、分子内ジスルフィド結合が示唆される。しかし、複数の種をまたぐアミノ酸配列アライメントの解析（図１）は、ヒト配列の１７８位におけるシステインが保存されるのに対し、ヒト配列の１０５位におけるシステインは種間で保存されないことを示した。さらに、ＣＴ−１タンパク質の構造解析は、２つのシステインが、共有結合的なジスルフィド結合を有効に形成するには、互いから離れ過ぎていることを示唆した。欠失または別のアミノ酸への突然変異誘発によるシステインのうちの一方または他方の除去は、生物学的活性および安定性を結果としてもたらした。これは、部位特異的修飾について維持される単一のチオール基を伴うタンパク質を結果としてもたらした。さらに、天然のシステインの両方の除去または置き換えは、ポリペプチド内の他の部位におけるシステインの付加を可能とした。図２は、識別子による構築物名、記号、および配列番号と共に、例示的な修飾ＣＴ−１ポリペプチドデザインの概略を示す。
【０３２７】
（実施例３）
野生型のＣＴ−１および新規のＣＴ−１変異体の生成
治療用ＣＴ−１を生成させる方法
治療的に用いられるヒトＣＴ−１を生成させるための測定可能な方法は、記載されていない。このような方法は、ＧＬＰ／ｃＧＭＰによる製造に適用可能であり、関与性の生物学的活性を有する、純粋で安定的な、担体を含まないタンパク質を結果としてもたらす。治療用ＣＴ−１の最終処方物は、過剰な希釈または再処方に対する要請を伴わずに、直接的なヒト投与に適用可能であることが理想的である。本実施例および後続の実施例は、治療的に有用な少なくとも１つのＣＴ−１の生物学的活性を有するポリペプチドを生成させるのに適する方法について記載する。
【０３２８】
野生型ＣＴ−１タンパク質の解析は、ヒトＣＴ−１ポリペプチドには哺乳動物特異的な翻訳後修飾が存在しないことを示唆した。したがって、自然発生のＣＴ−１および図２および配列番号２〜８に列挙される初期のＣＴ−１変異体の全ては、実施例１で記載した通り、発現ベクターへとサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換して発現させた。野生型および変異体を含めたＣＴ−１のポリペプチドの全ては、封入体としての細菌内に極めて高レベル（振とうフラスコ内１リットル当たり４００〜８００ｍｇ）で発現させた。封入体は、実施例１で記載され、図３Ａで概括される通りに洗浄し、可溶化させ、リフォールドさせた。リフォールドさせたＣＴ−１タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより宿主細胞タンパク質から精製し、純粋なタンパク質を中性緩衝液へと緩衝液交換し、濾過した。野生型のヒトＣＴ−１および本明細書で記載される新規の変異体を含めた全てのポリペプチドは、このやり方で生成させた。全てのポリペプチドは、出発物質の１０〜２５％の間のステップ収量でリフォールドし、精製された。
【０３２９】
治療用ＣＴ−１の純度評価
次いで、実施例１および３で記載される通りに精製および処方したＣＴ−１タンパク質を、純度について評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、本発明の工程により生成させるＣＴ−１タンパク質が、宿主細胞タンパク質を実質的に夾雑させていない（９８．５％）ことを示した（図３Ｃ）。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ解析は、基準物質の標準的な保持時間と比較して、およそ２０ｋＤａの純粋で均質な試料を明示した（図３Ｄ）。試料を、さらにピーク面積解析により均質な単量体（９９．７％）として評価した（図３Ｅ）。
【０３３０】
次に、純粋なタンパク質のバッチ内における内毒素レベルを評価した。内毒素は、治療用タンパク質、とりわけ、細菌系で生成させる治療用タンパク質の主要な問題となる夾雑物でありうる。夾雑度の高い内毒素は、治療的投与時において、重篤な医療合併症を結果としてもたらす炎症反応を誘導しうる。水性試料中の内毒素についての標準的なアッセイであって、規制機関に好ましいアッセイは、ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）アッセイである。カイネティック比色ＬＡＬアッセイを、ＣＴ−１（ＦＴＶ３７０）の２つのバッチに対して実施した。図１０にまとめられたデータを見ることができる：本明細書で記載されるプロトコールを用いて細菌からもたらされ、精製される、ＣＴ−１タンパク質についての内毒素レベルは極めて低い（タンパク質１ｍｇ当たり４．５〜８．４ＥＵの範囲；野生型タンパク質では、０．８９８ＥＵ／ｍｌ）。
【０３３１】
タンパク質は４℃で安定であり、凍結融解後も安定であった：ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより評価される通り、凝集、消化、または多量体化は伴わなかった。新規のＣＴ−１変異体の野生型と比較した生物学的活性は、実施例７で記載される通りに評価した。
【０３３２】
（実施例４）
治療用ＣＴ−１組成物の評価
次いで、上記の通り、本発明の生成法に従い生成させて精製した野生型ＣＴ−１の最終組成物を解析した。エドマン分解によるアミノ末端の配列決定を実施した：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）４９２  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて、パルス液相におけるＮ末端の配列決定を行った。標準的なＡＢＩプログラムにより、１０サイクルのエドマン分解を行った。結果は、各サイクルについて検出される主要なフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸として報告した。生のクロマトグラムデータをまとめて、図１１に列挙されるＮ末端配列が得られる。
【０３３３】
本発明者らによる結果は、ＣＴ−１の精製形態中の第１のアミノ酸がセリンであることを示し、このことから、Ｎ末端メチオニンが切断されていることが示される。原核生物系において生成する組換えタンパク質について常にこのように予測されるわけではない。エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いて、精製されるＣＴ−１タンパク質の完全総質量を規定した（Ｓｃｉｅｘ  Ｑ−Ｓｔａｒ／Ｐｕｌｓａｒ）。Ｃ４  Ｚｉｐチップによる脱塩および０．１％ギ酸を含有する５０％アセトニトリルによる溶出の後、ナノスプレーを介して１μｌの試料アリコートを機器の供給源へと導入した。図１２Ａに見られる通り、試料は、潜在的な多重帯電イオンの主要な系列を伴う、強陽イオンのエレクトロスプレー−ＭＳスペクトルをもたらした。デコンボリューション処理をしたところ、主要な成分は、質量が２１０９４．８ＫＤａであると規定された（明らかに、Ｎ末端メチオニンを伴わないポリペプチドの予測質量と同等である）。さらに、純粋なタンパク質のトリプシン消化およびペプチドマッピングを、図１２Ｂに見られる主要なＵＶ２１４のピークのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを用いて完了させた。図１２Ｃでペプチドの予測配列を一覧すると、これがタンパク質の９６．５％を占めることが表される。まとめると、本発明者らによるデータは、本明細書で記載される方法を用いて生成させた純粋なＣＴ−１タンパク質が、Ｎ末端メチオニンを除去されており、さらなる翻訳後修飾を含有しないことを示す。
【０３３４】
（実施例５）
本発明の方法により生成されるＣＴ−１ポリペプチドの安定性の増強
治療用タンパク質の生成は、最終生成物の安定性を確保する生成法および処方を要請する。タンパク質が異質であるか、緩衝が不十分であるか、または処方が不適正である場合、高濃度では組換えタンパク質の凝集が生じうる。治療用タンパク質の凝集は、生成物の保管寿命に影響を及ぼすだけではなく、また、投与時に抗原反応も誘導する可能性があり、したがって、安全性に対する危険性となる。業界内では、タンパク質の完全性を経時的に、４℃〜８℃、もしくは２２℃〜２８℃、もしくは３７℃、または凍結−融解の反復など、多様な温度で評価する安定性アッセイが標準的である。タンパク質は、対象のタンパク質の可溶性の水性処方物の一助となる担体タンパク質であって、生物学的活性を及ぼさない担体タンパク質と処方することができる。しかし、担体タンパク質は、治療用タンパク質に好ましい処方法ではない。
【０３３５】
複数の供給源に由来するＣＴ−１タンパク質の安定性を、高感度なウェスタンブロット法解析により評価した。図１３から見ることができる通り、Ｐｒｏｓｐｅｃ製の市販の野生型ＣＴ−１タンパク質は、ｐＨ４．０の酢酸緩衝液による処方を示唆した。この処方により、タンパク質を３７℃でインキュベートし、等容量の試料を取り出し、遠心分離により凝集を取り除き、ウェスタンブロット法により評価した。結果は、タンパク質が、８時間後に明らかに溶液から消失することを裏付けた。同じタンパク質調製物を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）など、より治療的に関与性の緩衝液中で処方すると、タンパク質の分解が加速化され、可溶性のタンパク質レベルは、３７℃で２時間後までに劇的に低減される。
【０３３６】
担体タンパク質を伴う処方の結果であって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により３７℃の安定性を増強する場合の結果を図１３に示す。本発明の方法を介して生成させて処方するタンパク質は、担体タンパク質の使用を伴わない市販形態より著明に安定である。図１４Ａのクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析、および図１４Ｂにおけるクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ密度測定による定量化に見られる通り、タンパク質は、３７℃で時間と共に溶液から失われるが、本発明の方法に従い生成させて処方したタンパク質では、分解が、市販形態の場合よりはるかに遅い速度で生じる。本発明の方法で生成させるタンパク質の大半は、３７℃で４日間を超える期間にわたり溶存を維持し、１４日後においても検出可能なレベルが見られる。さらに、本発明者らによる結果は、本発明の方法で生成させるＣＴ−１タンパク質は、４℃で最長１４日間にわたり本質的に安定であり、凍結−融解サイクルを繰り返した後でも、ほとんどまたは全く凝集せずに安定および溶存を維持することを裏付けた。
【０３３７】
（実施例６）
新規のＣＴ−１変異体の部位特異的ＰＥＧ化
実施例１および実施例３で記載される方法を用いて生成させた全てのＣＴ−１タンパク質変異体は、安定で可溶性であった。単一のシステイン残基を伴うＣＴ−１変異体を、多様な長さのＰＥＧ分子であって、マレイミド活性基へと連結された単鎖または分枝状鎖を伴うＰＥＧ分子を用いて、部位特異的な形でＰＥＧ化した。中性のｐＨでは、マレイミドだけが、システイン残基によりもたらされる単一のチオール側鎖と反応した。用いられるＰＥＧ分子の種類の構造例を、図４Ｂおよび４Ｃに図示する。図５では、新規のＣＴ−１変異体タンパク質のＰＥＧ分子による部位特異的修飾と関連する分子量の変化を図示するクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥが見られる。ＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、１２単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＭＭ（ＰＥＧ）２４とは、２４単位を伴う直鎖状鎖のＰＥＧを示し、ＴＭＭ（ＰＥＧ）１２とは、鎖１本当たり１２単位を伴う分枝状鎖のＰＥＧを示す。自然発生のシステイン残基をセリンで置き換え、かつ、さらなるシステイン残基をそのアミノ末端に有するタンパク質ＦＴＶ３８３は、効率は低いが、チオール−マレイミドコンジュゲーションを介して、単鎖分子または分枝状鎖分子でＰＥＧ化された（図５Ａ）。これに対し、自然発生のシステイン残基をセリンで置換し、かつ、さらなるシステイン残基をそのカルボキシル末端に有するＦＴＶ３８４は、単鎖分子または分枝状鎖分子により高効率でＰＥＧ化され、３０分間にわたる反応の後、修飾されない残留タンパク質はほとんど見られなかった（図５ＡおよびＢ）。１０５位における自然発生のシステインをセリンで置換したＦＴＶ３８０は、効率は低いが、残りのシステイン（１７８）においてＰＥＧ化され、不安定な生成物を結果としてもたらした（図５Ｃ）。これに対し、１０５位のシステインを保持し、１７８位のシステインを置換したＦＴＶ３８１は、高効率でＰＥＧ化され、安定な生成物を結果としてもたらした（図５Ｃ）。したがって、修飾生成物の生成可能性および／または安定性に関して、特定の部位では他の部位よりＰＥＧ化の許容度が大きかった。
【０３３８】
さらなる実証では、分子量の小さな修飾を伴う最も効率的で安定的なＰＥＧ化を呈示する２つのＣＴ−１変異体（ＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４）を、はるかに大型のＰＥＧ分子とコンジュゲートした。３０ＫＤａの単一分枝状ＰＥＧ分子または４０ＫＤａの多分枝状ＰＥＧ分子を、ＣＴ−１変異体とコンジュゲートした（図４Ｃ）。小型のＰＥＧ分子の場合と同様に、部位特異的修飾は、マレイミド−チオールコンジュゲーションを介し、反応は、ＰＥＧをタンパク質に対して１０倍モル濃度過剰で進行させた。図５Ｄのクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥに見られる通り、ＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４のいずれも、高分子量のＰＥＧ分子で効率的にＰＥＧ化され、安定な生成物を結果としてもたらした。ＰＥＧ化の性質についてさらに評価するに当たり、抗ＣＴ−１抗体によるウェスタンブロット法を実施して、反応から結果として得られる単一のＰＥＧ化生成物を確認した。結果として得られる図５Ｅのブロットは、単一の高分子量の修飾ＣＴ−１変異体生成物を明確に示す。
【０３３９】
新規のＣＴ−１組成物の修飾可能性についてのさらなる実証では、タンパク質を化学的コンジュゲーションによりホモ二量体化させた。二量体化反応は、図５Ｃで図示されるＰＥＧリンカーなど、２つのマレイミド基を伴う可撓性のＰＥＧリンカーを使用した。図６に見られる通り、単一のアミノ末端のシステインを伴う構築物（ＦＴＶ３８３）はある程度二量体化したが、工程は非効率的であり、二量体生成物の収率は低かった。これに対し、単一のカルボキシ末端のシステインを伴うＣＴ−１変異体を用いる同じ反応は、２または３単位のＰＥＧリンカーを用いて、二量体化が効率的であった。
【０３４０】
したがって、１つのシステインだけを含み、したがって、スルフヒドリル反応性の分子種による修飾の可能性がある単一の部位だけを含むように操作された新規のＣＴ−１組成物は、安定的な生成物を形成するように修飾することができた。一部の修飾部位は、他の修飾部位より許容度が高かった：ＣＴ−１の１０５位におけるシステイン残基が有効に修飾されたのに対し、ＰＥＧの１７８位におけるシステインとのコンジュゲーションは、実施可能ではあるが、幾分不安定な生成物を結果としてもたらした。アミノ末端またはカルボキシ末端において単一のシステイン残基を包含するように生成させた構築物は、カルボキシ末端が、修飾に対してアミノ末端より許容度が高いことを裏付けた。化学的コンジュゲーションによる新規のＣＴ−１変異体の二量体化が裏付けられた。
【０３４１】
（実施例７）
新規のＣＴ−１変異体の活性評価および野生型に対して活性が改善された変異体の同定
次に、新規のＣＴ−１変異体タンパク質を含め、実施例１および実施例３で記載される方法を介して発現させて精製したＣＴ−１ポリペプチドを、ＣＴ−１の生物学的活性について評価した。ＣＴ−１は、ＪＡＫ／ＳｔａｔおよびＥＲＫなど、ｇｐ１３０を介するシグナル伝達経路の強力な活性化因子である。本発明者らは、実施例１で記載される方法を用いて、Ｓｔａｔ３のリン酸化を測定するための高感度アッセイを開発した。図７は、野生型のＣＴ−１活性を新規の変異体のうちの２つと比較する典型的な活性アッセイを示す。ＣＴ−１タンパク質の滴定によりＣ２１２細胞を処置したときのＳｔａｔ３のリン酸化を、ウェスタンブロット法により評価した。総Ｓｔａｔおよび／またはアクチンに照らして標準化した密度測定による定量化は、滴定曲線として定量化し、変異体間で平均のＥＣ５０値を比較した。例えば、かつ、図７で記載される通り、野生型ＣＴ−１のＥＣ５０値はおよそ１ｎｇ／ｍｌであり、変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４のＥＣ５０は、２〜５ｎｇ／ｍｌおよび４ｎｇ／ｍｌである。
【０３４２】
予測外の知見では、配列番号２の１０５位に対応する位置における自然発生のシステイン残基をセリンへと交換した新規のＣＴ−１変異体（ＦＴＶ３８０）が、野生型タンパク質より大きな生物学的活性を再現可能に裏付けた。この知見についての例示的なデータを、ＦＴＶ３８０が、野生型のおよそ１ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０と比較して、０．３５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を裏付けている図８に示す。したがって、タンパク質のこの位置またはこの領域内における他のアミノ酸変化は、活性について許容可能なだけでなく、野生型のＣＴ−１と比べて生物学的活性を増大させた。
【０３４３】
多様な新規のＣＴ−１変異体の、野生型のＣＴ−１と比較した相対的な生物学的活性についての概要を、平均のＥＣ５０値として、図９Ａに示す。活性を変化させても、全ての変異体は、ＣＴ−１の生物学的活性を保持した。とりわけ、ＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４は、ＥＣ５０値をそれぞれおよそ２．５ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌとする比較的高度な生物学的活性を保持した。
【０３４４】
修飾形態および非修飾形態の両方における多様なタンパク質の相対的なＥＣ５０値を、図９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、および９Ｅに示す。実施例６で記載した通り、修飾生成物の相対的な修飾効率および安定性は部位特異的で、一部の部位における許容度が他の部位における許容度より高かった。修飾タンパク質の生物学的活性が実質的に維持されたことから、修飾はＣＴ−１によるシグナル伝達活性に関して許容可能であることが示唆された。とりわけ、安定なＰＥＧ化タンパク質を得るように効率的に修飾されていることが裏付けられている新規の変異体であるＦＴＶ３８１およびＦＴＶ３８４は、修飾後においてもそれらの生物学的活性を実質的に保持した。
【０３４５】
新規のＣＴ−１変異体ＦＴＶ３８４の修飾後におけるＣＴ−１によるシグナル伝達活性は、精製二量体として保持された（図９Ｅ）。
【０３４６】
修飾効率および生物学的活性の評価は、部位特異的修飾を伴う新規の組成物が、ＣＴ−１の生物学的活性を有したことを示唆する。
【０３４７】
（実施例８）
新規のＣＴ−１変異体の薬物動態解析
野生型ＣＴ−１の薬物動態解析は、その全身半減期が、投与経路：静脈内投与、皮下投与、および筋内投与に関わらず極めて短い結果として、タンパク質の用量依存的な全身レベルの半減期は、２〜４時間の範囲となることを示す。ＣＴ−１の、その分子量を２１．５ＫＤａから４５、５０、６０、７０、８０・・・ＫＤａへと増大させる修飾は、クリアランスを減少させ、コンパートメント化投与の場合は全身循環への吸収を減少させることにより、全身半減期を実質的に延長する。本出願において記載される新規のＣＴ−１変異体であって、分子量を増大させながら、生物学的活性を保持する部位特異的修飾を含むＣＴ−１変異体は、バイオアベイラビリティーおよび投与間隔が改善されているために、治療的有用性を増大させうる。
【０３４８】
一般に、以下の特許請求の範囲で用いられる用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲において開示されている特定の実施形態に限定するとみなすべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を認められる同等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を包含するとみなすべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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