(57)【要約】水、第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、及び複数の粒子を含む、組成物を提供する。第１の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、蛍光発生性酵素基質を含むことができる。本粒子は、水性液体からの第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる。第１の生物学的誘導体は、微生物を指示することができる。本組成物は更に、ゲル化剤を含むことができる。試料中の微生物の存否を検出するために本組成物を使用する方法も提供する。【選択図】図３
2014503196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性を検出する方法であって、
第１の生物活性を含んでもよい試料、
前記第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬であって、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含む、第１の指示薬、及び
複数の粒子であって、各粒子が、前記第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含む、複数の粒子、を準備すること、
前記第１の指示薬及び前記複数の粒子を含む水性分散液を形成すること、
前記試料を前記水性分散液と流体連通させること、並びに
前記第１の生物学的誘導体の存否を検出することであって、前記第１の生物学的誘導体は粒子によって保持されること、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の生物学的誘導体の存否を検出することが、蛍光性の第１の生物学的誘導体を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的誘導体の存否を検出することが、着色された生物学的誘導体を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ゲル化剤を準備することを更に含み、前記水性分散液を形成することが、ヒドロゲルを形成することを含み、前記複数の粒子の少なくとも一部分が、前記ヒドロゲル中に分散される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、及び
前記第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含み、
前記水性分散液を形成することが、前記第２の指示薬を含む水性分散液を形成することを含み、
前記第２の指示薬が蛍光発生性酵素基質を含む時に、前記第２の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、
前記第２の指示薬を前記ヒドロゲルと流体連通させること、及び
前記第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含み、
前記第２の指示薬が蛍光発生性酵素基質を含む時に、前記第２の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料を水性分散液と流体接触させることが、前記試料と、前記第１の指示薬と、前記複数の粒子と、を含む、前記水性分散液を形成することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料を前記水性分散液と流体連通させた後に、前記方法が、前記複数の粒子の一部分を前記水性分散液から又は前記水性分散液内で、分離することを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記一部分を分離することが、沈殿、遠心分離、凝集、又は濾過によって前記一部分を分離することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生物活性を検出する方法であって、
第１の生物活性を含んでもよい試料、
前記生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬であって、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含む、第１の指示薬、
複数の粒子であって、各粒子が、前記第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含む、複数の粒子、及び
ゲル化剤、を準備すること、
前記第１の指示薬と前記ゲル化剤とを含む、ヒドロゲルを形成すること、
前記ヒドロゲルの主表面の少なくとも一部上に前記粒子を分布させること、
前記試料を前記ヒドロゲルの一部分と流体連通させること、並びに
前記第１の生物学的誘導体の存否を検出することであって、前記第１の生物学的誘導体が粒子によって保持され、前記第１の生物学的誘導体の存在が、第１の生物活性の存在を指示すること、を含む、方法。
【請求項１１】
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る、第２の指示薬を準備すること、
前記第２の指示薬を前記ヒドロゲルと流体連通させること、及び
前記第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含み、
前記第２の生物学的誘導体の存在が、前記第１の生物活性の存在を指示する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る、第２の指示薬を準備すること、
前記第２の指示薬を前記ヒドロゲルと流体連通させること、及び
前記第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の生物学的誘導体の存否を検出することが、別個の蛍光ゾーンを検出することを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
水、
第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、及び
複数の粒子、を含み、
前記第１の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含み、
前記粒子が、水性液体からの前記第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる、組成物。
【請求項１５】
第１の主表面と第２の主表面とを有する、自己支持形の耐水基質を含む本体部材、及び
前記第１の主表面の少なくとも一部に接着されるコーティングであって、ゲル化剤と複数の粒子とを含むコーティング、を含む、物品であって、
前記粒子が、ヒドロゲルからの第１の指示薬の第１の生物学的誘導体を受容及び保持し、
前記第１の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、蛍光発生性酵素基質を含む、物品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許仮出願第６１／４１６，８５８号（２０１０年１１月２４日出願）の利益を請求するものであり、参照によりこの開示内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［背景］
試料中の標的微生物を検出するための方法は、しばしば、検出可能な生成物を形成するために、標的微生物によって作用される指示薬の使用を含む。例えば、生物活性は、病原性微生物、生物指標細菌、又は癌細胞等の細胞と関連する触媒活性によって検出されてもよい。
【０００３】
試料中のある特定の生物活性の中のある特定の微生物を指示し得る。例えば、細菌胞子は、試料中の生存胞子の存在を検出する方法（例えば、迅速方法を含む）で使用され得る、生物活性（例えば、α−グルコピラノシダーゼ又はβ−グルコピラノシダーゼ等の酵素活性）を含む。これら又は他の生物活性のうちの１つの破壊が、滅菌プロセスの有効性を検証及び／又は実証するために使用され得る。
【０００４】
［発明の概要］
本開示は、概して、試料中の生物活性の存否を検出するための組成物、物品、及び方法に関する。いくつかの実施形態では、生物活性の存否は、微生物の存否を指示することができる。本発明の方法は、試料と、第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬と、水性液体からの第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる複数の粒子との間で流体連通を提供することを含む。有利に、第１の生物学的誘導体は、水性液体から粒子上及び／又は粒子中に分配することができ、それによって、第１の生物学的誘導体を比較的小さい面積又は体積に濃縮することができる。第１の生物学的誘導体を粒子上及び／又は粒子中に分配することは、第１の生物学的誘導体を、そうでなければ水性液体中にあるであろうものよりも容易に検出可能なものにし得る。更に、粒子は、ヒドロゲル中の第１の生物学的誘導体の拡散を実質的に制限することができ、したがって、ヒドロゲル中に存在する複数の別々の生物活性、微生物、又はマイクロコロニーの検出を可能にする。
【０００５】
一態様では、本開示は、生物活性を検出する方法を提供する。方法は、第１の生物活性を含んでもよい試料、第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、及び複数の粒子を準備することを含んでもよく、各粒子は、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含む。第１の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、蛍光発生性酵素基質を含むことができる。方法は、更に、第１の指示薬及び複数の粒子を含む水性分散液を形成すること、試料を水性分散液と流体連通させること、並びに第１の生物学的誘導体の存否を検出することを含むことができ、第１の生物学的誘導体は、粒子によって保持される。
【０００６】
方法の上記の実施形態のいずれかにおいて、生物学的誘導体の存否を検出することは、蛍光性の第１の生物学的誘導体又は着色された生物学的誘導体を検出することを含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は、更に、ゲル化剤を提供することを含むことができ、水性分散液を形成することは、ヒドロゲルを形成することを含み、複数の粒子の少なくとも一部分は、ヒドロゲル中に分散される。方法の上記の実施形態のいずれかにおいて、ゲル化剤を提供することは、冷水可溶性ゲル化剤を提供することを含むことができる。いくつかの実施形態では、冷水可溶性ゲル化剤は、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択され得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、方法は、更に、第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させること、及び第２の生物学的誘導体の存否を検出することを含むことができる。第２の指示薬が蛍光発生性酵素基質を含む時に、第２の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有することができる。
【０００８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は、更に、第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、及び第２の生物学的誘導体の存否を検出することを含むことができる。第２の指示薬が蛍光発生性酵素基質を含む時に、第２の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有することができる。水性分散液を形成することは、第２の指示薬を含む水性分散液を形成することを含むことができる。
【０００９】
方法の上記の実施形態のいずれかにおいて、試料を水性分散液と流体接触させることは、試料と、第１の指示薬と複数の粒子と、を含む、水性分散液を形成することを含むことができる。
【００１０】
方法の上記の実施形態のいずれかにおいて、試料を水性分散液と流体連通させた後に、方法は、複数の粒子の一部分を水性分散液から又は水性分散液内で、分離することを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、一部分を分離することは、沈殿、遠心分離、凝集、又は濾過によって一部分を分離することを含む。
【００１１】
別の態様では、本開示は、生物活性を検出する方法を提供する。方法は、第１の生物活性を含んでもよい試料、第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、複数の粒子であって、各粒子が、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含む、複数の粒子、及びゲル化剤、を準備することを含むことができる。第１の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含むことができる。方法は、更に、第１の指示薬とゲル化剤とを含む、ヒドロゲルを形成すること、ヒドロゲルの主表面の少なくとも一部上に粒子を分布させること、試料をヒドロゲルの一部分と流体連通させること、並びに第１の生物学的誘導体の存否を検出することを含むことができ、第１の生物学的誘導体は、粒子によって保持される。いくつかの実施形態では、第１の生物学的誘導体の存否を検出することは、蛍光性の第１の生物学的誘導体又は着色された第１の生物学的誘導体を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤を提供することは、冷水可溶性ゲル化剤を提供することを含むことができる。いくつかの実施形態では、冷水可溶性ゲル化剤は、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、方法は、更に、第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る、第２の指示薬を準備すること、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させること、及び第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を含むことができる。第２の指示薬が蛍光発生性酵素基質を含む時に、第２の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有することができる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルの主表面の少なくとも一部上に粒子を分布させることは、更に、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、試料をヒドロゲルの主表面の少なくとも一部分と流体連通させることは、更に、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルを形成することは、更に、第２の指示薬を含むヒドロゲルを形成することを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の生物学的誘導体の存否を検出することは、別個の蛍光ゾーンを検出することを含むことができる。いく���かの実施形態では、別個の蛍光ゾーンを検出することは、更に、別個の蛍光ゾーンの数量を計算することを含む。いくつかの実施形態では、第１の生物学的誘導体の存否を検出することは、別個の着色ゾーンを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、別個の蛍光ゾーンを検出することは、更に、別個の着色ゾーンの数量を計算することを含む。
【００１２】
更に別の態様において、本開示は、組成物を提供する。組成物は、水、第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、及び複数の粒子、を含むことができ、粒子は、水性液体からの第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる。第１の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、更に、微生物の成長を促進する栄養素を含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、組成物は、更に、ゲル化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、水と反応してヒドロゲルを形成することができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、冷水可溶性ゲル化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、冷水可溶性ゲル化剤は、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、複数の粒子の少なくとも一部分は、ヒドロゲル中に分散され得る。いくつかの実施形態では、複数の粒子の少なくとも一部分は、ヒドロゲルの主表面上に配置され得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、組成物は、更に、界面活性剤を含むことができる。組成物のいずれかの実施形態において、粒子は、アクリレートポリマー、ポリスチレンポリマー、セルロース系ポリマー、デキストランポリマー、上記の任意の組み合わせ、及び上記の任意の誘導体からなる群から選択される有機ポリマーを含むことができる。
【００１３】
更に別の態様では、本開示は、物品を提供する。物品は、第１の主表面と第２の主表面とを有する、自己支持形の耐水基質を含む本体部材、及び第１の主表面の少なくとも一部に接着されるコーティング、を含むことができ、コーティングは、ゲル化剤と複数の粒子とを含む。粒子は、ヒドロゲルからの第１の指示薬の第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択され得る。物品の上記の実施形態のいずれかにおいて、第１の生物学的誘導体は、蛍光発生性酵素基質から得られる蛍光化合物であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、物品は、更に、第１の指示薬を含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、第１の指示薬は、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、蛍光発生性酵素基質を含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、物品は、更に、コーティングと第１の主表面との間に配置される、接着層を含むことができ、接着層は、第１の主表面とコーティングとの間に配置され、それらに接着接合される。物品の上記の実施形態のいずれかにおいて、コーティングは、更に、栄養素を含むことができる。物品の上記の実施形態のいずれかにおいて、コーティング又は接着層は、第２の指示薬を含むことができる。物品の上記の実施形態のいずれかにおいて、コーティング又は接着層は、更に、選択剤を含む。物品の上記の実施形態のいずれかにおいて、粒子は、アクリレートポリマー、ポリスチレンポリマー、セルロース系ポリマー、デキストランポリマー、上記の任意の組み合わせ、及び上記の任意の誘導体からなる群から選択される有機ポリマーを含むことができる。物品の上記の実施形態のいずれかにおいて、コーティングは、更に、界面活性剤を含むことができる。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかにおいて、粒子は、約０．０１μｍ〜約１０００μｍの直径であってもよい。
【００１５】
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ、又は他の状況下においては他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用ではないという意味を含むものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図しない。
【００１６】
「含む」なる用語及びその変化形は、これらの用語が説明文及び特許請求の範囲において用いられている場合に限定的な意味を有するものではない。
【００１７】
本明細書で使用するところの「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えば、微生物（a microorganism）は、「１つ以上の」微生物を意味すると解釈され得る。
【００１８】
用語「及び／又は」は、列挙されている要素の１つ又は全て、あるいは、列挙されている要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１９】
本明細書で使用するところの「生物活性」は、生体細胞と関連する任意の特定の触媒プロセス又はプロセス群を指す。生物活性の非限定的な例としては、異化酵素活性、同化酵素活性、共役反応（例えば、代謝経路）、生体分子の媒介による酸化還元反応、及び生物発光反応が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用するところの「生物学的誘導体」は、生物活性の任意の生成物を指す。これには、例えば、酵素反応の生成物、及び電子伝達系が含まれる。
【００２１】
本明細書で使用するところの「生体細胞」は、単細胞生物（例えば、細菌、酵母菌、糸状菌、原生動物、藻類）又はその誘導体、及び多細胞生物（植物、動物、若しくは多細胞真菌由来の種々の種類の細胞）又はその誘導体の両方を指す。生体細胞の誘導体としては、休眠状態（例えば、胞子）、遺伝子組み換え変異体、倍数体細胞、及びハイブリッド細胞（例えば、ハイブリドーマ）が挙げられる。生体細胞としては、自然環境中に見られる細胞、並びにインビトロで培養される細胞が挙げられる。
【００２２】
また、本明細書における端点による数の範囲の記載には、その範囲に含まれる全ての数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、などが含まれる）。
【００２３】
上記の本発明の概要は、開示される本発明の実施形態のそれぞれ又は全ての実施の態様を説明することを目的としたものではない。以下の説明は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通してガイダンスを提供するが、実施例は様々な組み合わせにおいて使用できる。それぞれの場合において記載される一覧はあくまで代表的な群として与えられるものであって、排他的な羅列として解釈されるべきものではない。
【００２４】
本開示のその他の特徴及び態様は、発明を実施する形態及び添付図面を熟考することによって、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本開示に従った、生物活性を検出するための方法の一実施形態のブロック図。
【図２】本開示に従った、複数の粒子を含む水性液体の一実施形態の垂直断面図。
【図３】本開示に従った、ヒドロゲルを含み、複数の粒子がその上に配置される、物品の一実施形態の垂直断面図。
【００２６】
［詳細な説明］
本開示は、試料中の微生物を検出するための組成物、物品、及び迅速方法に関する。本発明の組成物及び物品は、生物活性の蛍光生成物を受容及び保持するように構成される、複数の粒子を含む。したがって、蛍光分子が、水性媒体から粒子上及び／又は粒子中に分配（例えば、濃縮）され得る。有利に、蛍光分子を粒子上又は粒子中に分配することは、周囲の水性媒体中よりも粒子中で、より高い蛍光分子の局所濃度を提供する。この濃縮効果は、有意に濃縮された蛍光信号を提供することができ、それは、バックグラウンド蛍光よりも検出が容易であり得る。
【００２７】
一態様では、本開示は、試料中の微生物を検出する方法を提供する。図１は、本開示に従った方法の一実施形態のブロック図である。方法は、試料と、第１の指示薬と、複数の粒子とを提供する工程１８０を含む。試料は、本明細書に記載する任意の好適な試料であってもよい。第１の指示薬は、生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る。粒子は、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含むことができる。方法は、更に、第１の指示薬及び複数の粒子を含む、水性分散液を形成する工程１８５、試料を水性分散液と流体連通させる工程１９０、並びに粒子によって保持される第１の生物学的誘導体の存否を検出する工程１９５を含む。
【００２８】
本発明の方法は、試料中の生物活性の検出に関する。試料は、本明細書に定義するような、生物活性を含む任意の試料であってもよい。好適な試料の非限定的な例としては、細胞懸濁液又は培養（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、糸状菌、細菌細胞）、環境試料（例えば、表面スワブ）、食物（例えば、原料、工程内試料、及び最終生成物試料）、飲料、臨床試料（例えば、血液、尿、痰、組織、粘液、便、傷からの滲出液、膿）、並びに水（例えば、表面水、飲料水、プロセス水）が挙げられる。
【００２９】
微生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス）は、生物活性の源であり、生理的液体、例えば、血液、唾液、眼液、滑液、脳脊髄液、膿、汗、滲出液、尿、粘液、分泌乳等の任意の源に由来し得る試験試料中で分析され得る。更に、試験試料は、例えば、創傷、皮膚、鼻孔、頭皮、爪等の体部位に由来し得る。
【００３０】
特に関心のある試料としては、鼻からの試料（例えば、前鼻孔、鼻咽頭腔、鼻腔、前鼻孔前庭等）等の粘液含有試料、並びに外耳、中耳、口、直腸、膣、又は他の類似の組織からの試料が挙げられる。特定の粘膜組織の例には、頬、歯肉、鼻、眼球、気管、気管支、胃腸、直腸、尿道口、尿管、膣、頚部、及び子宮粘膜のような粘膜が挙げられる。
【００３１】
生理的液体以外に、他の試験試料は、他の液体並びに液体媒質に溶解した固体（１つ又は複数）を含んでよい。対象試料としては、プロセス流、水、土壌、植物又はその他の草木、空気、表面（例えば、汚染された表面）などを挙げることができる。試料は、培養細胞を含むこともできる。試料はまた、細胞、胞子、又は酵素を含むデバイス（例えば、生物学的指示デバイス）の上又は中の試料を含むことができる。
【００３２】
固体試料は、分解されてもよく（例えば、ブレンド、音波処理、均質化によって）、液体中に懸濁されてもよい（例えば、水、緩衝液、ブロス）。いくつかの実施形態では、試料物質を含有する試料採取デバイス（例えば、スワブ、スポンジ）が、方法で使用されてもよい。あるいは、試料物質は、方法で試料物質を使用する前に、試料採取デバイスから溶出されてもよい（例えば、すすがれる、擦り取られる、圧搾される）。いくつかの実施形態では、液体又は固体試料は、液体（例えば、水、緩衝液、ブロス）中で希釈されてもよい。
【００３３】
好適な試料はまた、滅菌剤に暴露された液体及び／又は固体試料である。これらの試料の非限定的な例としては、胞子懸濁液、胞子片、及び胞子又は増殖性微生物細胞の懸濁液が用いられた種々の材料の試験片が挙げられる。
【００３４】
また、好適な試料としては、細胞を含有する、又はすでに細胞を含有していた、細胞懸濁培地（例えば、培養ブロス、半固体細胞培地、及び組織培地、ろ液）が挙げられる。また、好適な試料としては、細胞溶解物が挙げられる。細胞溶解物は、化学的手段（例えば、洗剤、酵素）、機械的手段（音波振動、均質化、加圧型細胞破壊装置）、又は当該技術分野において既知の他の細胞溶解手段によって生成されてもよい。
【００３５】
試料は、第１の微生物を含んでもよい。第１の微生物は、汚染（例えば、糞便汚染）、感染（例えば、病原性微生物の感染）、又は滅菌プロセスの失敗（例えば、生物学的滅菌インジケーター）を指示する、標的微生物であってもよい。
【００３６】
特に関心のある微生物としては、原核生物及び真核生物、特にグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、酵母、ウイルス、及び脂質エンベロープウイルスさえ挙げられる。特に関連性のある生物としては、腸内細菌科若しくは球菌科、又はブドウ球菌属の種、連鎖球菌種、シュードモナス種、腸球菌種、サルモネラ菌種、レジオネラ菌種、赤痢菌種、特に悪性の生物には、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などの耐性菌株を包含する）、表皮ブドウ球菌、肺炎球菌、ストレプトコッカスアガラクチア、化膿レンサ球菌、エンテロコッカスフィカリス、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン低度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、炭疽菌、緑膿菌、大腸菌、クロコウジカビ、アスペルギルスフミガータス、アスペルギルスクラバタス、フザリウムソラニ、フザリウムオキシスポラム、フザリウムクラミドスポラム（F. chlamydosporum）、リステリアモノサイトゲネス、リステリアイバノビ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、サルモネラコレラスイス、チフス菌、ネズミチフス菌、カンジダアルビカンス、カンジダグラブラタ、カンジダクルセイ、エンテロバクターサカザキ、大腸菌Ｏ１５７及び多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ）が挙げられる。
【００３７】
グラム陽性及びグラム陰性細菌は、特に関心が持たれている。更により関心が持たれているのは、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性細菌である。また、特に対象となるものは、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥ、及びＭＤＲ等の抗生物質耐性菌である。
【００３８】
本開示に従った方法は、第１の指示薬の使用を含む。第１の指示薬は、本明細書に記載する任意の好適な指示薬であってもよい。第１の指示薬は、生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る。いくつかの実施形態では、第１の指示薬は、生物活性（例えば、酵素活性）によって第１の生物学的誘導体に変換される、酵素基質であってもよい。好適な生物活性の非限定的な例としては、グリコシダーゼ酵素、エステラーゼ酵素、ホスファターゼ酵素、スルファターゼ酵素、プロテアーゼ酵素、アミダーゼ酵素等が挙げられる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、第１の指示薬は、蛍光発生性指示薬（例えば、蛍光発生性酵素基質）を含む。蛍光発生性指示薬は、それ自体が、対応する生物学的誘導体とは明らかに異なる方法で、例えば、強度又は発光スペクトルのいずれかによって、非蛍光性又は蛍光性のいずれかであることが認識されている。蛍光発生性指示薬は、特有の蛍光発光スペクトルを有する、蛍光成分（フルオロフォア）を含む。いくつかの実施形態では、蛍光発生性指示薬は、蛍光発生性酵素基質であってもよい。本開示に従って第１の指示薬で使用され得るフルオロフォアの非限定的な例としては、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせが挙げられる。本明細書で使用するところの、上記のフルオロフォアのうちのいずれか１つの「誘導体」は、フルオロフォアの共役環構造を含む、蛍光分子を指す。例示的な誘導体としては、例えば、元のフルオロフォア中の１つ以上の水素原子がハロゲン、アルカン、酸、アミン、ヒドロキシル、ニトロ、スルフェート等の官能基で置換される、フルオロフォアが挙げられ、ただし、置換は、フルオロフォアが蛍光を発する能力を実質的に排除しない、及び／又は生物活性がフルオロフォア誘導体を含む指示薬と反応することを阻止しない。フルオロフォアは、例えば、本明細書に記載するような第１の指示薬として使用され得る、蛍光発生性誘導体を生成するために、種々のグリコシド、アミド、ペプチド、ホスフェート、スルフェート、又は脂肪酸と共役され得る。
【００４０】
従来技術は、既知である、市販されている、酵素学的方法で使用されてきた、かつ本開示に従った第１の指示薬としての使用に好適である、多様な起源の多くの蛍光発生性化合物（例えば、蛍光発生性酵素基質）を含む。有用な蛍光発生性酵素基質としては、蛍光発生性酵素基質の水溶性塩が挙げられる。
【００４１】
蛍光発生性酵素基質の中には、種々の蛍光発生性４−メチルウンベリフェリル化合物（４−メチルウンベリフェロンに加水分解可能）、例えば、英国特許第１，５４７，７４７号及び欧州特許第０，０００，０６３号（それぞれは、参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるような、７−アミド−４−メチル−クマリンの蛍光発生性誘導体、蛍光発生性ジアセチルフルオレセイン化合物、及びルオレスカミンがある。
【００４２】
有用な蛍光発生性４−メチルウンベリフェリル化合物としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−２−アセトアミド−４、６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノシド、４−メチルウンベリフェリルブチラート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−セロビオシド、メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ、Ｎ’ジアセチルキトビオシド、４−メチルウンベリフェリルエライダート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルｐ−グアニジノ安息香酸、４−メチルウンベリフェリルヘプタン酸、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルオレイン酸、４−メチルウンベリフェリルパルミチン酸、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、４−メチルウンベリフェリルプロピオン酸、４−メチルウンベリフェリルステアリン酸、４−メチルウンベリフェリルスルフェート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキトトリオース、４−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ｐ−トリメチルアンモニウムケイ皮酸クロライド、及び４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−キシロシドが挙げられる。
【００４３】
有用な蛍光発生性７−アミド−４−メチルクマリン化合物としては、例えば、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−プロリン７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、及び７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられる。
【００４４】
有用な蛍光発生性β−ナフチルアミン化合物としては、例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−２−ナフチルアミド、Ａｌａ−Ａｒｇ−２−ナフチルアミド、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−２−ナフチルアミド、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−２−ナフチルアミド、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−メトキシ−２−ナフチルアミド、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−２−ナフチルアミド、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−２−ナフチルアミド、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−２−ナフチルアミド、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−２−ナフチルアミド、α−Ａｓｐ−Ａｒｇ−２−ナフチルアミド、及びＧｌｙ−Ｔｒｐ−２−ナフチルアミドが挙げられる。
【００４５】
有用な蛍光発生性β−ナフトール化合物としては、例えば、２−ナフチルアセテート、２−ナフチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、２−ナフチルホスフェート、２−ナフチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、及び２−ナフチル−α−Ｌ−フコピラノシドが挙げられる。
【００４６】
７−アミド−４−メチルクマリンを含む、有用な蛍光発生性ペプチド化合物としては、例えば、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチル−クマリン、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン、及びＮ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられる。
【００４７】
有用な蛍光発生性フルオレセイン化合物としては、例えば、フルオレセインジアセテート、フルオレセインモノ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、フルオレセインジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、フルオレセインジ−（β−Ｄ−グルコピラノシド）、フルオレセインジ−（β−Ｄ−グルクロニド）、フルオレセインジラウレート、フルオレセインジホスフェート、及び上記のフルオレセイン化合物の任意の誘導体が挙げられる。
【００４８】
有用な蛍光発生性レゾルフィン化合物としては、例えば、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、レゾルフィン−β−Ｄ−グルクロン酸、レゾルフィン−α−Ｄ−マンノピラノシド、レゾルフィンエチルエーテル、レゾルフィンメチルエーテル、レゾルフィンベンジルエーテル、レゾルフィンホスフェート、及びレゾルフィンアセテートが挙げられる。
【００４９】
有用な蛍光発生性ローダミン化合物としては、例えば、ビス−（アスパラギン酸アミド）ローダミン１１０、ビス−（ＣＢＺ−アルギニンアミド）ローダミン１１０、ビス−（ｐ−トシル−Ｌ−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンアミド）ローダミン１１０、ビス−（ＣＢＺ−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンアミド）ローダミン１１０二塩酸塩、ビス−（ＣＢＺ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミド）ローダミン１１０二塩酸塩、ビス−（ＣＢＺ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニンアミド）ローダミン１１０、ビス−（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパラギン酸アミド）ローダミン１１０、ビス−（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−アスパラギン酸アミド）ローダミン１１０が挙げられる。
【００５０】
検出される生物活性が、例えば、ゲオバチルスステアロサーモフィルスからのα−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシン、又は脂肪酸エステラーゼである場合、好適な蛍光発生性酵素基質は、それぞれ、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシド、７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、又は４−メチルウンベリフェリルヘプタン酸である。検出される生物活性が、例えば、バチルスズブチルス由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである場合、好適な蛍光発生性酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−アラビノフラノシドである。検出される生物活性が、例えば、バチルスズブチルス由来のβ−Ｄ−グルコシダーゼである場合、好適な蛍光発生性酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄグルコシドである。
【００５１】
第１の指示薬として好適な他の化合物としては、水溶性誘導体発色団を生成するように作用（例えば、加水分解、酸化、又は還元）され得る、発色化合物が挙げられる。発色化合物は、それ自体が、対応する第１の生物学的誘導体とは明らかに異なる方法で、例えば、色又は強度のいずれかによって、非着色又は着色のいずれかであることを理解されたい。存在し得る任意の他の色から、第１の生物学的誘導体によって発生する着色信号を分離するために、比色分析器具の使用者には周知である方法における適切な検出波長が使用される。
【００５２】
酵素学的方法において、多くの発色基質が使用されてきた。有用な発色基質の中には、ニトロフェニル誘導体及びフェノールフタレイン化合物がある。
【００５３】
有用なニトロフェニル化合物としては、ｐ−ニトロフェノール及びｏ−ニトロフェノール誘導体が挙げられる。特定の有用なｐ−ニトロフェノールとしては、ジエチル−ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ジ−ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−β−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニルアセテート、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎ−Ｎ’−ジアセチルキトビオシド、ｐ−ニトロフェニル−α−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−β−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニルミリステート、ｐ−ニトロフェニルパルミテート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−グルクロニド、α−ｐ−ニトロフェニルグリセリン、ｐ−ニトロフェニル−α−ラムノピラノシド、ニトロフェニルチミジンモノホスフェート、ｐ−ニトロフェニルステアレート、ｐ−ニトロフェニルスルフェート、ｐ−ニトロフェニルスルフェート、ｐ−ニトロフェニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコサミニド、ｐ−ニトロフェニルチミジンモノホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−グルクロン酸メチルエステル、及びｐ−ニトロフェニルバレレートが挙げられる。
【００５４】
特定の有用な発色ｏ−ニトロフェノール指示薬としては、ｏ−ニトロフェニルアセテート、ｏ−ニトロフェニル−ｂ−グルコシド、及びｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドが挙げられる。他の特定の有用な発色ニトロフェニル化合物としては、ニトロフェニル−β−フコピラノシド、ニトロフェニル−α−ガラクトピラノシド、ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド、ニトロフェニルブチラート、ニトロフェニルカプラート、ニトロフェニルカプロエート、ニトロフェニルカプリレート、ニトロフェニルラウレート、及びニトロフェニルプロピオネートが挙げられる。
【００５５】
有用な発色フェノールフタレイン含有指示薬としては、フェノールフタレインジブチラート、フェノールフタレインジホスフェート、フェノールフタレインジスルフェート、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ−β−グルコシドウロン酸、フェノールフタレインモノ−β−グルクロン酸、及びフェノールフタレインモノホスフェートが挙げられる。
【００５６】
上記の発色指示薬の全ては、発色団を生成するように適切な生物活性（例えば、酵素）と直接反応する。
【００５７】
酵素反応の生成物が、ジアゾ化染料、例えば、Ｉ−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから「Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＢ  Ｓａｌｔ」として市販されている）、１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼン、ｐ−ジアゾ−２，５−ジエトキシＮ−ベンゾイルアラニン、４−クロロ−２−メチルベンゼンジアゾニウムクロライド、及びｏ−アミノアゾトルエンジアゾニウム塩等の発色試薬と更に反応させられ発色団を生成する場合、１−ナフチル、２−ナフチル、及びナフトール−ＡＳＢＩ化合物を含有する更なる発色酵素基質が有効に利用される。
【００５８】
特定の有用な発色１−ナフチル化合物としては、１−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが挙げられる。
【００５９】
特定の有用な発色２−ナフチル化合物としては、２−ナフチル−ホスフェート、２−ナフチル−ブチラート、２−ナフチルカプリレート、２−ナフチル−ミリステート、Ｌ−ロイシル−２−ナフチルアミド、Ｌ−バリル−２−ナフチルアミド、Ｌ−シスチル−２−ナフチルアミド、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド、Ｎ−グルタリル−フェニルアラニン−２−ナフチル−アミン、２−ナフチル−ホスフェート、６−Ｂｒ−２−ナフチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ナフチル−２−Ｄ−グルコピラノシド、６−ブロモ−２−ナフトール−β−Ｄ−グルコピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−２−Ｄ−マンノピラノシド、及び２−ナフチル−α−Ｌ−フコピラノシドが挙げられる。
【００６０】
特定の有用な発色ナフトール−ＡＢＩ化合物としては、ナフトール−ＡＳＢＩ−ホスフェート、及びナフトール−ＡＳＢＩ−β−Ｄ−グルクロニドが挙げられる。
【００６１】
検出される生物活性が、例えば、ジェオバシラスステアロサーモフィラスからのα−Ｄ−グルコシダーゼであるいくつかの実施形態において、発色酵素基質は、好ましくは、ｐ−ニトロフェニル−ａ−グルコピラノシドである。検出される生物活性が、例えば、バチルスズブチルス由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼであるいくつかの実施形態において、好ましい発色酵素基質は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドである。検出される生物活性が、例えば、バチルスズブチルス由来のβ−Ｄ−グルコシダーゼであるいくつかの実施形態において、好ましい発色酵素基質は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００６２】
酵素を含む生物活性の検出において、本発明の方法を実施するために、技師は、検出される酵素活性、及びその蛍光、色等のいずれかによって検出され得る生成物を生成するように、酵素と反応する酵素基質に詳しくなければならない（参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ｒｏｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．７，Ｄ．Ｇｌｏｃｋ，Ｅｄ．，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９６９を参照されたい）。利用される適切な酵素基質は、検出される生物活性によって決まる。
【００６３】
本開示に従った方法は、有機ポリマー材料を含む、複数の粒子の使用を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、水分散性粒子であり、有機ポリマー材料は、比較的親水性である官能基を有する。いくつかの実施形態では、界面活性剤が粒子、又は粒子を含む組成物（例えば、水性組成物）に添加され得る。これらの実施形態では、界面活性剤は、親水性が低い粒子の水分散性を促進することができる。
【００６４】
粒子は、本明細書に記載されるような第１の生物学的誘導体を受容及び保持するように構成される。本明細書に記載するような、生物学的誘導体を「受容及び保持するように構成される」とは、生物学的誘導体が水性液体又はヒドロゲルからポリマー粒子上（例えば、上及び／又は中）に優先的に分配されることを意味する。したがって、分配することによって、バルク水性液体又はヒドロゲル中の第１の生物学的誘導体の濃度が減少され、それに応じて、粒子によって保持される第１の生物学的誘導体の量が増加する。粒子が界面活性剤を含む実施形態、及び／又は界面活性剤が粒子を含む組成物に添加される実施形態において、界面活性剤は、粒子による第１の生物学的誘導体の受容及び／又は保持を容易にし得る。理論によって束縛されることなく、生物学的誘導体の基質物質上及び／又は中への蓄積は、例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、及び水素結合が挙げられるが、これらに限定されない、種々の化学的引力のうちの１つ以上によって生じ得る。
【００６５】
好適な粒子の非限定的な例としては、アクリレートポリマー、ポリスチレンポリマー、セルロース系ポリマー、デキストランポリマー、及び上記の任意の組み合わせ又は誘導体を含む粒子が挙げられる。市販の粒子は、本発明の方法での使用に好適である。これらの粒子としては、例えば、Ｓｏｋｅｎ  ＭＸ、ＭＲ、及びＭＰシリーズ、Ｓｏｋｅｎ  ＳＧＰシリーズ、及びＳｏｋｅｎ  ＳＸ−５００シリーズ（全てＳｏｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から入手可能）、オイドラギット（商標）ＲＬＰＯ及びＳ−１００シリーズ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥから入手可能）、アンバーライト（商標）非イオン性吸収体及びアンバーライト（商標）イオン交換樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能）、アンバーリスト（商標）イオン交換樹脂（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から入手可能）、ワットマンＱＡ  ５２及びワットマンＤＥ  ５３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能）、並びにセファデックス（商標）粒子（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能）が挙げられる。
【００６６】
種々の粒径は、本開示に従った使用に好適である。いくつかの実施形態では、粒子は、約０．４マイクロメートル、約１．０マイクロメートル、約１．８マイクロメートル、約２．０マイクロメートル、約５．０マイクロメートル、約１０．０マイクロメートル、又は約２０．０マイクロメートルの平均粒径を有することができる。いくつかの実施形態では、粒子は、好ましくは、約０．０１マイクロメートル〜約１ミリメートル、より好ましくは、約０．０５マイクロメートル〜約２０マイクロメートル、更により好ましくは、約０．１マイクロメートル〜約５マイクロメートル、更により好ましくは、約０．２マイクロメートル〜約２マイクロメートルであってもよい。
【００６７】
本開示に従った方法は、第１の指示薬、及び第１の生物学的誘導体を受容及び保持する複数の粒子を含む、水性分散液を形成することを含む。いくつかの実施形態では、粒子及び／又は第１の指示薬は、実質的に乾燥した形態で提供されてもよく、別個あるいは同時に、水性液体（例えば、水、水性緩衝液、栄養ブロス、水性試料）又はヒドロゲルと混合されてもよく、粒子は、水性液体中に実質的に分散される。ある特定の好ましい実施形態では、粒子は、水性液体又はヒドロゲル中に実質的に均一に分散される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、粒子の水分散性を促進するために、水性混合物に添加されてもよい。典型的には、水性分散液を形成することは、水性液体及び粒子を混合すること（例えば、撹拌、かき混ぜ等による混合）を含む。
【００６８】
方法のいくつかの実施形態では、水性液体は、更に、ゲル化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、寒天を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、冷水可溶性ゲル化剤を含むことができる。
【００６９】
好適な冷水可溶性ゲル化剤としては、室温の水中で溶液又はヒドロゲルを形成する、天然及び合成の両方のゲル化剤が挙げられる。好適なゲル化剤の非限定的な例としては、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、並びにグリコール修飾ポリサッカライド、及びＷＡＴＥＲ  ＬＯＣＫ高吸水剤（ＳＮＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｇｅｎｅｓｅｏ，ＩＬ））等のデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）を含む高吸水性材料が挙げられる。好ましい実施形態では、グアーガム及びキサンタンガムは、１：２の重量比で組み合わされる。これらの実施形態では、第１の指示薬と複数の粒子とを含む水性混合物を形成することは、第１の指示薬が溶解及び／又は懸濁され、粒子が分散（例えば、懸濁）される、ヒドロゲルを形成することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル組成物は、更に、界面活性剤を含んでもよい。
【００７０】
本開示に従った方法は、第１の微生物を含んでもよい試料を、本明細書に記載する第１の指示薬及び複数の粒子を含む水性分散液と流体連通させることを含む。いくつかの実施形態では、試料を水性分散液と流体連通させることは、試料を水性分散液と混合することを含む。例えば、試料が液体を含む場合、試料は、容器（例えば、フラスコ、ビーカー、管、マイクロウェル）中で水性分散液と組み合わされ得る。例えば、試料が固体である場合、試料は、液体中で懸濁され、任意に均質化されてもよく、続いて、懸濁液又はホモジネートは、水性分散液と組み合わされてもよい。あるいは、固体試料は、第１の指示薬及び複数の粒子を含む、水性分散液中で、直接懸濁され、任意に均質化されてもよい。いくつかの実施形態では、試料は、多孔質膜（例えば、フィルタ膜）上で捕捉及び保持されてもよく、膜は、水性分散液と接触してもよく、試料は、膜の一方の側にとどまり、水性分散液は、膜のもう一方の側にとどまり、水性液体は、膜を通過することができ、したがって、試料及び水性分散液は、流体連通する。
【００７１】
試料を水性分散液と流体連通させることは、存在する場合、第１の微生物と関連する生物活性が、第１の生物学的誘導体を形成するように第１の生物学的指示薬と相互作用することを可能にする。同時に及び／又は続いて、第１の生物学的誘導体は、複数の粒子のうちの少なくとも１つと関連する。
【００７２】
方法の実施形態のいずれかにおいて、試料を水性分散液と流体連通させることは、更に、一定期間にわたって、流体連通している一方で、試料及び水性分散液をインキュベートすることを含むことができる。本明細書で使用するところの「インキュベートすること」とは、第１の微生物と関連する１つ以上の生物活性を促進する条件を提供することを意味する。当業者は、微生物（例えば、標的微生物）と関連する生物活性を促進する条件を認識するであろう。そのような条件の非限定的な例としては、温度、酸素及び／又は二酸化炭素等のガスの存在又は量、栄養素、ビタミン、及び／又は補因子の存在又は量、ｐＨ、酸化還元電位、並びにインキュベーション期間が挙げられる。一般的には、より長いインキュベーション期間が、生物活性による、より大量の第１の生物学的誘導体の生成を可能にする。
【００７３】
本開示に従った方法は、第１の生物学的誘導体の存否を検出することを含み、第１の生物学的誘導体は、複数の粒子のうちの１つ以上によって保持される。いくつかの実施形態では、第１の生物学的誘導体は、発色団を含むことができ、したがって、粒子のうちの１つ以上によって保持される色（例えば、発色団の色特性）を検出することによって、検出されてもよい。色は、当該技術分野において既知の着色粒子を検出する任意の手段によって（例えば、吸収度、反射率によって）、検出されてもよい。いくつかの実施形態では、第１の生物学的誘導体は、フルオロフォアを含むことができ、したがって、粒子のうちの１つ以上によって保持される蛍光を検出することによって、検出されてもよい。蛍光は、当該技術分野において既知の蛍光粒子を検出する任意の手段によって、検出されてもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の粒子によって保持される生物学的誘導体の存否を検出することは、１つ以上の粒子によって保持される生物学的誘導体を検出するために、器具又は器具の組み合わせ（例えば、顕微鏡、カメラ）を使用することを含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の粒子によって保持される生物学的誘導体の存否を検出することは、複数の粒子によって保持される生物学的誘導体を視覚的に検出することを含むことができる。
【００７５】
図は、本開示のある特定の態様を明示するのに役立つであろう。図２は、水性液体２１０の断面図を示し、その中で分散される複数の粒子２２０を含む。粒子２１０は、本明細書に記載するように、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する、任意の好適な粒子であってもよい。水性液体２１０は、液体を保持するための好適な液体容器（図示せず。例えば、管、フラスコ、ビーカー、ペトリ皿、マイクロウェル等）中の液体であってもよい。水性液体２１０は、液体中に溶解及び／又は懸濁される、第１の指示薬（図示せず）を含む。いくつかの実施形態では、水性液体２１０は、微生物の成長を支持する栄養素を含むことができる。図２には、生物学的薬剤２３０も示される。生物学的薬剤２３０は、生物活性（例えば、酵素活性）の源（例えば、細胞、組織、コロニー、菌糸体等）である。
【００７６】
生物学的薬剤２３０が第１の指示薬と反応すると、それは、遊離した第１の生物学的誘導体（「ｆ」）を生成する。遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」は、わずかに水溶性〜極度に水溶性であってもよく、したがって、水性液体２１０を通って生物学的薬剤２３０から拡散することができる。遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」が粒子２２０と接触すると、遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」は、２２０によって受容及び保持され、それは、保持された第１の生物学的誘導体（「Ｆ」）になる。図２からわかるように、保持された第１の生物学的誘導体「Ｆ」の局所濃度は、周囲の水性媒体２１０よりも、粒子２２０中でより高くあり得る。有利に、この保持された第１の生物学的誘導体「Ｆ」のより高い局所濃度は、遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」よりも、第１の生物学的誘導体をより容易に検出可能なものにすることができる。いくつかの実施形態では、遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」の保持された第１の生物学的誘導体「Ｆ」への変換は、更に、第１の生物学的誘導体の検出を強化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、弱蛍光性の遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」と粒子との相互作用は、例えば、水性液体の蛍光消光効果を減少させることによって、保持された第１の生物学的誘導体「Ｆ」の蛍光を増強することができる。例えば、いくつかの実施形態では、最初に着色された遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」と粒子との相互作用は、保持された第１の生物学的誘導体「Ｆ」の色の変化及び／又は色の強度をもたらし得る。
【００７７】
例示された実施形態に記載される利点はまた、ヒドロゲル（図示せず）を含む水性液体２１０中で実現され得ることが認識されるであろう。例えば、ヒドロゲルは、培養デバイス（例えば、ペトリ皿、薄膜培養デバイス、例えば、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ培養デバイス等）中のヒドロゲルであってもよい。更に、ヒドロゲルを含む組成物中で、更なる利点が得られ得る。具体的に、ヒドロゲルは、その中に懸濁されるか、又はその上に配置される粒子２２０の運動を制限することができる。したがって、遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」が受容及び保持されると（それによって、保持された第１の生物学的誘導体「Ｆ」になる）、それは、もはやヒドロゲル中で自由に拡散することができない。
【００７８】
典型的には、生物学的薬剤が自由に拡散可能な生成物をヒドロゲル中に放出する時に、長い期間にわたって、生成物は、生物学的薬剤から拡散することができ、生物学的薬剤を包囲する非常に大きい領域の形態で蓄積することができる。この現象は、例えば、米国特許第５，６０１，９９８号に記載され、それは、参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる。有利に、本開示の方法及び組成物は、水溶性生物学的誘導体の拡散を制限する手段を提供する。これは、ヒドロゲル上又は中で、比較的接近し得る生物活性の複数の源（例えば、コロニー形成単位）を列挙しようと試みる時に、特に有利であり得る。
【００７９】
図３は、本開示に従った診断デバイス３００の垂直断面図を示す。診断デバイス３００は、耐水基質３０５を備える。耐水基質３０５は、例えば、ペトリ皿、又は薄膜培養デバイス、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、同第５，２３２，８３８号、同第５，６０１，９９８号、同第５，６８１，７１２号、同第７，１４１，３８７号、及び米国特許出願第６１／３６０，１６６号に記載される薄膜培養デバイスであってもよく、それらのそれぞれは、参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる。デバイス３００は、更に、ヒドロゲル３１５を含む。ヒドロゲル３１５は、第１の指示薬（図示せず）を含む。第１の指示薬は、本明細書に記載するような任意の好適な第１の指示薬であってもよい。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル３１５は、微生物の成長を支持する栄養素を含むことができる。
【００８０】
ヒドロゲル３１５の主表面には、複数の粒子３２０が配置される。粒子３２０は、本明細書に記載するような、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する任意の好適な粒子であってもよい。図３にはまた、生物学的薬剤３３０（例えば、上記のような生物活性の源）も示される。生物学的薬剤３３０は、図３に示すように、ヒドロゲル３１５の主表面上に配置されてもよく（例えば、微生物学的表面平板技術にあるような）、又は図２及び上記に示すように、ヒドロゲル中に懸濁されてもよい（例えば、微生物学的注入平板技術）。
【００８１】
再び図３を参照すると、生物学的薬剤３３０は、第１の指示薬と反応し、上記のような遊離した第１の生物学的誘導体（「ｆ」）を生成する。遊離した第１の生物学的誘導体は、上記のように、水性液体（例えば、ヒドロゲル３１５）を通して生物学的薬剤３３０の周囲に拡散する。複数の粒子３２０のうちの１つと接触すると、遊離した第１の生物学的誘導体「ｆ」は、上記のように、粒子３２０によって受容及び保持され、保持された第１の生物学的誘導体（「Ｆ」）になる。
【００８２】
図３に示す実施形態において、生物学的薬剤３３０（元は、試験される試料の一部であり得る）、複数の粒子３２０、及び第１の指示薬（図示せず）は、別個に、あるいは任意の組み合わせで、ヒドロゲル３１５と流体接触させられてもよい。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル３１５は、第１の指示薬を含む水性液体、及び／又は生物学的薬剤３３０を含む試料を使用して形成されてもよい。いくつかの実施形態では、生物学的薬剤３３０は、複数の粒子３２０がヒドロゲル３１５と流体接触させられる前のある期間にわたって、第１の指示薬を含むヒドロゲル３１５と流体接触してもよい。
【００８３】
実施形態のいずれかにおいて、方法は、更に、第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る、第２の指示薬を準備することを含むことができる。これらの実施形態では、第１の指示薬及び複数の粒子を含む水性分散液を形成することは、第２の指示薬を含む水性分散液を形成することを含む。これらの実施形態では、方法は、更に、第２の生物学的誘導体の存否を検出することを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、第２の生物学的誘導体の存在は、第１の微生物の存在を指示する。したがって、これらの実施形態では、試料中の第１の微生物の存在と関連する、第１の生物学的誘導体の存在及び第２の生物学的誘導体の存在を検出することが可能であり得る。有利に、これらの実施形態では、第２の生物学的指示薬は、第１の指示薬を使用して得られる結果を独立して確認する機能を果たすことができる。いくつかの実施形態では、第２の指示薬は、フルオロフォアを含むことができる。いくつかの実施形態では、その蛍光性の第２の生物学的誘導体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）反応において、蛍光性の第１の生物学的誘導体と反応することができる。ＦＲＥＴ反応は、当該技術分野において既知であり、本開示に従って、第１及び第２の両方の生物活性の存在を指示することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、第２の生物学的指示薬の存在は、第２の微生物の存在を指示する。したがって、これらの実施形態では、第１の生物学的誘導体の存在を検出することによって、第１の微生物の存在を検出すること、及び第２の生物学的誘導体の存在を検出することによって、第２の微生物の存在を検出することが可能であり得る。有利に、これらの実施形態では、第２の生物学的指示薬は、試料中の２つ以上の微生物の存在を指示する機能を果たすことができる。
【００８６】
第２の指示薬は、第２の生物学的誘導体を形成するように生物活性と反応させられ得る、本明細書に記載するような任意の発色又は蛍光発生性指示薬であってもよく、第２の生物学的誘導体は、第１の生物学的誘導体とは別に検出可能（すなわち、区別可能）であり、第２の生物学的指示薬及び第２の生物学的誘導体のどちらも、第１の指示薬の第１の生物学的誘導体への変換を実質的に妨げず、複数の粒子のうちの少なくとも１つによって保持される第１の生物学的誘導体の検出も実質的に妨げない。
【００８７】
実施形態のいずれかにおいて、方法は、更に、水性分散液から複数の粒子の少なくとも一部分を分離することを含むことができる。典型的には、分離することは、試料が、第１の指示薬及び複数の粒子を含む水性分散液と接触した後に行われる。いくつかの実施形態では、複数の粒子の少なくとも一部分を分離することは、水性液体の少なくとも一部分から１つ以上の粒子を分離することを含むことができる。いくつかの実施形態では、水性液体の少なくとも一部分から複数の粒子の少なくとも一部分を分離することは、元の体積の水性液体中で分離した粒子の局所濃縮を形成するためのプロセスである（例えば、沈殿、凝集、又は遠心分離による）。加えて又はあるいは、いくつかの実施形態では、水性液体の少なくとも一部分から複数の粒子の少なくとも一部分を分離することは、より小さい体積の水性液体中で分離した粒子を濃縮するプロセス、又は一部分から水性液体を実質的に除去するプロセスである（例えば、傾斜、ピペット、又は濾過によって、水性液体の少なくとも一部分を除去することによって）。いくつかの実施形態では、分離することは、検出器具（例えば、蛍光セルソーター）中の光学経路上で、粒子のうちの１つ以上を局所化させるために使用され得る。
【００８８】
上記のように、本開示の方法は、第１の指示薬、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する複数の粒子、並びにゲル化剤を含む、水性分散液を形成することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤を含む水性分散液は、更に、試料（例えば、寒天注入プレート技術にあるような、又は３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭ培地を使用した、ある特定の一般的な技術におけるような試料。試料は、形成されるゲル中に分配される）を含むことができる。
【００８９】
いくつかの代替の実施形態では、複数の粒子、ゲル化剤、及び任意に第１の指示薬を含む水性分散液が形成されてもよい。ゲルが形成された後に、試料、及び水性分散液中にまだ存在していない場合、第１の指示薬は、最後にゲルの表面の一部分上に分配され得る（例えば、寒天培地で用いられる一般的な表面平板技術にあるような）。任意に、試料を含む組成物は、本明細書に記載するように、一定期間にわたってインキュベートされてもよい。第１の生物学的誘導体の存否を検出するために、粒子が観察されるが、第１の生物学的誘導体は、粒子によって保持される。これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載するような第２の指示薬は、水性分散液と流体接触させてもよい（例えば、ゲルの形成の前に、第２の指示薬を水性分散液に添加することによって、又はゲルが形成された後に、ゲルの表面上に第２の指示薬を分配することによって）。
【００９０】
いくつかの代替の実施形態では、水性ゲル（例えば、寒天を含む水性ゲル、又は当該技術分野において既知の、若しくは本明細書に記載する他の好適なゲル化剤）が形成されてもよい。任意に、水性ゲルは、第１の指示薬を含むことができる。ゲルが形成された後に、試料、複数の粒子、及び水性ゲル中にまだ存在していない場合、第１の指示薬は、ゲルの表面の少なくとも一部分上に分配され得る。任意に、試料を含む組成物は、本明細書に記載するように、一定期間にわたってインキュベートされてもよい。第１の生物学的誘導体の存否を検出するために、粒子が観察されるが、第１の生物学的誘導体は、粒子によって保持される。これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載するような第２の指示薬は、水性分散液と流体接触させてもよい（例えば、ゲルの形成の前に、第２の指示薬を水性分散液に添加することによって、又はゲルが形成された後に、ゲルの表面上に第２の指示薬を分配することによって）。
【００９１】
本開示は、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載するように、第１の微生物の存在を検出する方法で使用され得る。組成物は、水、第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、及び複数の粒子を含む。粒子は、本明細書に記載するように、水性液体からの第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、更に、栄養素を含むことができる。栄養素は、微生物（例えば、本明細書に記載するような第１の微生物及び／又は第２の微生物）の成長及び／又は代謝を促進することができる。実施形態のいずれかにおいて、組成物は、更に、ゲル化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、冷水可溶性ゲル化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲル化剤は、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、並びにグリコール修飾ポリサッカライド及びデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）を含む、高吸収性材料からなる群から選択され得る。ゲル化剤は、水と反応してヒドロゲルを形成することができる。組成物の実施形態のいずれかにおいて、複数の粒子の少なくとも一部分は、ヒドロゲル中に分散（例えば、懸濁）されてもよい。組成物の実施形態のいずれかにおいて、複数の粒子の少なくとも一部分は、ヒドロゲルの主表面上に配置されてもよい。実施形態のいずれかにおいて、組成物は、更に、界面活性剤を含むことができる。有利に、界面活性剤は、組成物中の粒子の水分散性を促進することができる。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又はカチオン性界面活性剤であってもよい。界面活性剤は、スルフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、スルホネート、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、長鎖カルボキシレート、ホスフェートエステル、四級アンモニウム塩、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、ポリソルベート、トゥイーン（商標）界面活性剤（例えば、トゥイーン２０（商標））、スパン（商標）界面活性剤、アルコールエトキシレート、トリトンＸ−１００、ポリエチレンオキシド誘導体、及びポリプロピレンオキシドを含む共重合体（例えば、プルロニック（商標）又はタージトール（商標）界面活性剤）からなる群から選択され得る。
【００９２】
実施形態のいずれかにおいて、組成物は、更に、生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る、第２の指示薬を含むことができる。第２の指示薬は、第２の生物学的誘導体を形成するように生物活性と反応させ得る、本明細書に記載するような任意の発色又は蛍光発生性指示薬であってもよく、第２の生物学的誘導体は、第１の生物学的誘導体とは別に検出可能（すなわち、区別可能）であり、第２の生物学的指示薬及び第２の生物学的誘導体のどちらも、第１の指示薬の第１の生物学的誘導体への変換を実質的に妨げず、複数の粒子のうちの少なくとも１つによって保持される第１の生物学的誘導体の検出も実質的に妨げない。
【００９３】
別の態様では、本開示は物品を提供する。物品は、第１の微生物（例えば、診断検査における標的微生物）を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、物品は、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、同第５，２３２，８３８号、同第５，６０１，９９８号、同第５，６８１，７１２号、同第７，１４１，３８７号、及び米国特許出願第６１／３６０，１６６号に記載される培養デバイス等の、乾燥培地を含む物品であってもよい。
【００９４】
物品は、第１の主表面及び第２の主表面を有する自己支持形の耐水基質を備える本体部材、並びに第１の主表面の少なくとも一部分に接着されるコーティングを備えることができる。コーティングは、ゲル化剤及び複数の粒子を含む。粒子は、ヒドロゲルからの第１の指示薬の第１の生物学的誘導体を受容及び保持し、本明細書に記載するような任意の好適な粒子を含むことができる。いくつかの実施形態では、粒子は、アクリレートポリマー、ポリスチレンポリマー、セルロース系ポリマー、デキストランポリマー、及び上記の任意の組み合わせ又は誘導体からなる群から選択される有機ポリマーを含むことができる。市販の粒子は、本発明の方法での使用に好適である。これらの粒子としては、例えば、Ｓｏｋｅｎ  ＭＸ、ＭＲ、及びＭＰシリーズ、Ｓｏｋｅｎ  ＳＧＰシリーズ、及びＳｏｋｅｎ  ＳＸ−５００シリーズ（全てＳｏｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から入手可能）、オイドラギット（商標）ＲＬＰＯ及びＳ−１００シリーズ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）から入手可能）、アンバーライト（商標）非イオン性吸収体及びアンバーライト（商標）イオン交換樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能）、アンバーリスト（商標）イオン交換樹脂（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から入手可能）、ワットマンＱＡ  ５２及びワットマンＤＥ  ５３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能）、並びにセファデックス（商標）粒子（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能）が挙げられる。いくつかの実施形態では、粒子は、単分散粒子である。いくつかの実施形態では、平均粒径は、好ましくは、約０．０１マイクロメートル〜約１ミリメートル、より好ましくは、約０．０５マイクロメートル〜約２０マイクロメートル、更により好ましくは、約０．１マイクロメートル〜約５マイクロメートル、更により好ましくは、約０．２マイクロメートル〜約２マイクロメートルである。いくつかの実施形態では、コーティングは、複数の粒子が中で分散されるゲル化剤を含む、脱水状態の冷水で再構成可能なコーティングを含むことができ、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号及び本明細書の実施例に記載されるように調製され得る。
【００９５】
いずれの実施形態においても、物品は、更に、コーティングの基層の第１の主表面の間に配置され、それに接着接合される、接着層を含むことができる。いくつかの実施形態では、コーティングは、ゲル化剤及び複数の粒子を含む、乾燥粉末コーティングを含み、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号に記載されるように調製され得る。
【００９６】
物品のいずれかの実施形態において、コーティング及び／又は接着層は、更に、第１の指示薬を含むことができる。第１の指示薬は、本明細書に記載するような任意の好適な第１の指示薬であってもよい。物品の実施形態のいずれかにおいて、コーティング又は接着層は、第２の指示薬を含むことができる。第２の指示薬は、本明細書に記載するような任意の好適な第２の指示薬であってもよい。物品のいずれかの実施形態において、コーティングは、界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又はカチオン性界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、スルフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、スルホネート、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、長鎖カルボキシレート、ホスフェートエステル、四級アンモニウム塩、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、ポリソルベート、トゥイーン（商標）界面活性剤（例えば、トゥイーン２０（商標））、スパン（商標）界面活性剤、アルコールエトキシレート、トリトンＸ−１００、ポリエチレンオキシド誘導体、及びポリプロピレンオキシドを含む共重合体（例えば、プルロニック（商標）又はタージトール（商標）界面活性剤）からなる群から選択され得る。
【００９７】
［実施形態］
実施形態１は、生物活性を検出する方法であって、
第１の生物活性を含んでもよい試料、
第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬であって、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含む、第１の指示薬、及び
複数の粒子であって、各粒子が、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含む、複数の粒子、を準備すること、
第１の指示薬及び複数の粒子を含む水性分散液を形成すること、
試料を水性分散液と流体連通させること、並びに
第１の生物学的誘導体の存否を検出することであって、第１の生物学的誘導体は粒子によって保持されること、を含む、方法である。
【００９８】
実施形態２は、第１の生物学的誘導体の存否を検出することが、蛍光性の第１の生物学的誘導体を検出することを含む、実施形態１の方法である。
【００９９】
実施形態３は、生物学的誘導体の存否を検出することが、着色された生物学的誘導体を検出することを含む、実施形態１の方法である。
【０１００】
実施形態４は、更に、ゲル化剤を提供することを含み、
水性分散液を形成することが、ヒドロゲルを形成することを含み、複数の粒子の少なくとも一部分が、ヒドロゲル中に分散される、実施形態１又は２の方法である。
【０１０１】
実施形態５は、ゲル化剤を提供することが、冷水可溶性ゲル化剤を提供することを含む、実施形態４の方法である。
【０１０２】
実施形態６は、冷水可溶性ゲル化剤が、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択される、実施形態５の方法である。
【０１０３】
実施形態７は、更に、
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、及び
第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含み、
水性分散液を形成することが、第２の指示薬を含む水性分散液を形成することを含み、
第２の指示薬が蛍光発生性酵素基質を含む時に、第２の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、上記の実施形態のいずれか１つの方法である。
【０１０４】
実施形態８は、更に、
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、
第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させること、及び
第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含む、実施形態４〜７のいずれか１つの方法である。
【０１０５】
実施形態９は、試料を水性分散液と流体接触させることが、試料と、第１の指示薬と、複数の粒子と、を含む、水性分散液を形成することを含む、上記の実施形態のいずれかの方法である。
【０１０６】
実施形態１０は、試料を水性分散液と流体連通させた後に、方法が、複数の粒子の一部を水性分散液から又は水性分散液内で、分離することを更に含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法である。
【０１０７】
実施形態１１は、一部分を分離することが、沈殿、遠心分離、凝集、又は濾過によって一部分を分離することを含む、実施形態１０の方法である。
【０１０８】
実施形態１２は、生物活性を検出する方法であって、
第１の生物活性を含んでもよい試料、
生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬であって、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する蛍光発生性酵素基質を含む、第１の指示薬、
複数の粒子であって、各粒子が、第１の生物学的誘導体を受容及び保持する有機ポリマーを含む、複数の粒子、及び
ゲル化剤、を準備すること、
第１の指示薬とゲル化剤とを含む、ヒドロゲルを形成すること、
ヒドロゲルの主表面の少なくとも一部上に粒子を分布させること、
試料をヒドロゲルの一部分と流体連通させること、並びに
第１の生物学的誘導体の存否を検出することであって、第１の生物学的誘導体が粒子によって保持され、第１の生物学的誘導体の存在が、第１の生物活性の存在を指示すること、を含む、方法である。
【０１０９】
実施形態１３は、第１の生物学的誘導体の存否を検出することが、蛍光性の第１の生物学的誘導体又は着色された第１の生物学的誘導体を検出することを含む、実施形態１２の方法である。
【０１１０】
実施形態１４は、ゲル化剤を提供することが、冷水可溶性ゲル化剤を提供することを含む、実施形態１２又は１３の方法である。
【０１１１】
実施形態１５は、冷水可溶性ゲル化剤が、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択される、実施形態１４の方法である。
【０１１２】
実施形態１６は、更に、
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る第２の指示薬を準備すること、
及び第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させること、及び
第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含み、
第２の生物学的誘導体の存在が、第１の生物活性の存在を指示する、実施形態１２〜１５のいずれか１つの方法である。
【０１１３】
実施形態１７は、ヒドロゲルの主表面の少なくとも一部分上に粒子を分配することが、更に、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させることを含む、実施形態１６の方法である。
【０１１４】
実施形態１８は、試料をヒドロゲルの主表面の少なくとも一部分と流体連通させることが、更に、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させることを含む、実施形態１６の方法である。
【０１１５】
実施形態１９は、ヒドロゲルを形成することが、更に、第２の指示薬を含むヒドロゲルを形成することを含む、実施形態１６の方法である。
【０１１６】
実施形態２０は、更に、
第２の生物活性によって第２の生物学的誘導体に変換され得る、第２の指示薬を準備すること、
第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させること、及び
第２の生物学的誘導体の存否を検出すること、を更に含む、実施形態１２〜１５のいずれか１つの方法である。
【０１１７】
実施形態２１は、ヒドロゲルの主表面の少なくとも一部分上に粒子を分配することが、更に、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させることを含む、実施形態２０の方法である。
【０１１８】
実施形態２２は、試料をヒドロゲルの主表面の少なくとも一部分と流体連通させることが、更に、第２の指示薬をヒドロゲルと流体連通させることを含む、実施形態２０の方法である。
【０１１９】
実施形態２３は、ヒドロゲルを形成することが、更に、第２の指示薬を含むヒドロゲルを形成することを含む、実施形態２０の方法である。
【０１２０】
実施形態２４は、第１の生物学的誘導体の存否を検出することが、別個の蛍光ゾーンを検出することを含む、実施形態１２〜２３のいずれか１つの方法である。
【０１２１】
実施形態２５は、別個の蛍光ゾーンを検出することが、更に、別個の蛍光ゾーンの数量を計算することを含む、実施形態２４の方法である。
【０１２２】
実施形態２６は、第１の生物学的誘導体の存否を検出することが、別個の着色ゾーンを検出することを含む、実施形態１２〜２３のいずれか１つの方法である。
【０１２３】
実施形態２７は、別個の蛍光ゾーンを検出することが、更に、別個の着色ゾーンの数量を計算することを含む、実施形態２６の方法である。
【０１２４】
実施形態２８は、組成物であって、
水、
第１の生物活性によって第１の生物学的誘導体に変換され得る第１の指示薬、及び
複数の粒子、を含み、
第１の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、蛍光発生性酵素基質を含み、
粒子が、水性液体からの第１の生物学的誘導体を受容及び保持することができる、組成物である。
【０１２５】
実施形態２９は、更に、微生物の成長を促進する栄養素を含む、実施形態２８の組成物である。
【０１２６】
実施形態３０は、更に、ゲル化剤を含む、実施形態２８又は実施形態２９の組成物である。
【０１２７】
実施形態３１は、ゲル化剤が水と反応してヒドロゲルを形成する、実施形態３０の組成物である。
【０１２８】
実施形態３２は、ゲル化剤が冷水可溶性ゲル化剤を含む、実施形態３０又は３１の方法である。
【０１２９】
実施形態３３は、冷水可溶性ゲル化剤が、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択される、実施形態３２の組成物である。
【０１３０】
実施形態３４は、複数の粒子の少なくとも一部分が、ヒドロゲル中に分散される、実施形態３１〜３３のいずれか１つの組成物である。
【０１３１】
実施形態３５は、複数の粒子の少なくとも一部分が、ヒドロゲルの主表面上に配置される、実施形態３１〜３４のいずれか１つの組成物である。
【０１３２】
実施形態３６は、更に、界面活性剤を含む、実施形態２８〜３５のいずれか１つの組成物である。
【０１３３】
実施形態３７は、粒子が、アクリレートポリマー、ポリスチレンポリマー、セルロース系ポリマー、デキストランポリマー、上記の任意の組み合わせ、及び上記の任意の誘導体からなる群から選択される有機ポリマーを含む、実施形態２８〜３６のいずれか１つの組成物である。
【０１３４】
実施形態３８は、物品であって、
第１の主表面と第２の主表面とを有する、自己支持形の耐水基質を含む、本体部材、及び
第１の主表面の少なくとも一部に接着されるコーティングであって、ゲル化剤と複数の粒子とを含むコーティング、を含む、物品であって、
粒子が、ヒドロゲルからの第１の指示薬の第１の生物学的誘導体を受容及び保持し、
第１の指示薬が、ウンベリフェロン、７−アミノクマリン、β−ナフチルアミン、β−ナフトール、フルオレセイン、レゾルフィン、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、ローダミン１１０、上記のフルオロフォアの任意の誘導体、及び上記のフルオロフォアの任意の組み合わせからなる群から選択されるフルオロフォアを有する、蛍光発生性酵素基質を含む、物品である。
【０１３５】
実施形態３９は、ゲル化剤が、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含む、実施形態３８の物品である。
【０１３６】
実施形態４０は、ゲル化剤が、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ−アクリルアミド、イナゴマメゴム、グアーガム、キサンタンガム及びアルギン、グリコール修飾ポリサッカライド、並びにデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム−ｃｏ−アクリルアミド）からなる群から選択される、実施形態３９の物品である。
【０１３７】
実施形態４１は、第１の生物学的誘導体が蛍光化合物である、実施形態３８〜４０のいずれか１つの物品である。
【０１３８】
実施形態４２は、物品が、更に、第１の指示薬を含む、実施形態３８〜４１のいずれか１つの物品である。
【０１３９】
実施形態４３は、更に、コーティングと第１の主表面との間に配置される接着層を含み、接着剤が、第１の主表面とコーティングとの間に配置され、かつそれらに接着接合される、実施形態３８〜４２のいずれか１つの物品である。
【０１４０】
実施形態４４は、コーティングが、更に、栄養素を含む、実施形態３８〜４３のいずれか１つの物品である。
【０１４１】
実施形態４５は、コーティング又は接着層が、第２の指示薬を含む、実施形態３８〜４４のいずれか１つの物品である。
【０１４２】
実施形態４６は、コーティング又は接着層が、更に、選択剤を含む、実施形態３８〜４５のいずれか１つの物品である。
【０１４３】
実施形態４７は、粒子が、アクリレートポリマー、ポリスチレンポリマー、セルロース系ポリマー、デキストランポリマー、上記の任意の組み合わせ、及び上記の任意の誘導体からなる群から選択される有機ポリマーを含む、実施形態３８〜４６のいずれか１つの物品である。
【０１４４】
実施形態４８は、コーティングが、更に、界面活性剤を含む、実施形態３８〜４７のいずれか１つの物品である。
【０１４５】
実施形態４９は、界面活性剤が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又はカチオン性界面活性剤を含む、実施形態４８の物品である。
【０１４６】
実施形態５０は、界面活性剤が、スルフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、スルホネート、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、長鎖カルボキシレート、ホスフェートエステル、四級アンモニウム塩、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、ポリソルベート、トゥイーン（商標）界面活性剤（例えば、トゥイーン２０（商標））、スパン（商標）界面活性剤、アルコールエトキシレート、トリトンＸ−１００、ポリエチレンオキシド誘導体、及びポリプロピレンオキシドを含む共重合体（例えば、プルロニック（商標）又はタージトール（商標）界面活性剤）からなる群から選択される、実施形態４９の物品である。
【０１４７】
実施形態５１は、粒子が、約０．０１μｍ〜約１０００μｍの直径である、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法、実施形態２８〜３７のいずれか１つの組成物、又は実施形態３８〜５０のいずれか１つの物品である。
【０１４８】
実施形態５２は、粒子が、水分散性である、実施形態１〜２７若しくは５１のいずれか１つの方法、実施形態２８〜３７若しくは５１のいずれか１つの組成物、又は実施形態３８〜５１のいずれか１つの物品である。
【０１４９】
実施形態５３は、第１の生物活性が、第１の微生物の存在の指示薬である、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法である。
【０１５０】
実施形態５４は、第２の指示薬が、第１の微生物の存在の指示薬である、実施形態７〜１３及び１８〜２７のいずれか１つの方法である。
【０１５１】
実施形態５５は、第２の指示薬が、第２の微生物の存在の指示薬である、実施形態７〜１３、１８〜２７、又は実施形態５４のいずれか１つの方法である。
【０１５２】
実施形態５６は、第２の指示薬が存在する場合、発色指示薬を含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法である。
【０１５３】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１５４】
実施例で使用した材料
●Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られる、ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
●３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から得られる、バターフィールド緩衝液
●ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得られる、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（カタログ番号３４５７８８）
●Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られる、豚肝臓エステラーゼ（番号Ｅ３０１９）
●ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から得られる、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド
●Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから得られる、ＴＳＢ−トリプチックソイブロス−ＢＤ番号２１１８２２
●ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ（Ａｔｌａｎｔａ．ＧＡ）から入手可能な、キサンタンガム−ケルトロールキサンタンガム
●ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ（Ａｔｌａｎｔａ．ＧＡ）から入手可能な、イナゴマメゴム−Ｇｅｎｕ（登録商標）ゴム
【０１５５】
界面活性剤
●Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られる、トリトンＸ−１００（商標）−非イオン性界面活性剤
●Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られる、トゥイーン−２０（商標）−ポリソルベート界面活性剤
●ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）から得られる、ＳＤＢＳ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
●Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得られる、ＤＴＡＣ−塩化ドデシルトリメチルアンモニウム
●Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から得られる、ＳＤＳ−ドデシル硫酸ナトリウム
【０１５６】
フルオロゲン：
●Ｃｈｉｌｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１，９１，１１１８〜１１３０に記載されるように調製される、ＭＨＣｇａｌ−メチル−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキシレートガラクトシド
●米国特許第６，５５６，５０８号に記載されるように調製される、ＴＵａｃｅｔａｔｅ−３−チエニルウンベリフェロンアセテート
●米国特許第６，５５６，５０８号に記載されるように調製される、ＴＵｇａｌ−３−チエニルウンベリフェロンガラクトシド
【０１５７】
粒子：
●Ｓｏｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から得られる、ポリアクリレート粒子
○  ＭＸ−１８０−単分散アクリレート粒子（１．８マイクロメートルの平均径）
○  ＭＸ−２０００−単分散アクリレート粒子（２０．０マイクロメートルの平均径
○  ＭＸ−５００−単分散アクリレート粒子（５．０マイクロメートルの平均径）
○  ＭＲ−１０ＨＧ−多分散アクリレート粒子（１０．０マイクロメートルの平均径）
○  ＭＲ−７ＨＧ−多分散アクリレート粒子（６．０マイクロメートルの平均径）
○  ＭＲ−２ＨＧ−多分散アクリレート粒子（２．０マイクロメートルの平均径）
○  ＭＲ−２Ｇ−多分散アクリレート粒子（１．０マイクロメートルの平均径）
○  ＭＰ−１０００−単分散アクリレート粒子（０．４０マイクロメートルの平均径）
○  ＳＧＰ−７０Ｃ−多分散ポリスチレン粒子（２０．０マイクロメートルの平均径）
○  ＳＸ−５００Ｈ−単分散ポリスチレン粒子（５．０マイクロメートルの平均径）
●ワットマン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得られる、ＱＡ  ５２−ワットマンＱＡ  ５２−強塩基アニオン交換セルロース系樹脂
●ワットマン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得られる、ＤＥ  ５３−ワットマンＤＥ  ５３−弱塩基アニオン交換セルロース系樹脂
●Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られる、ＸＡＤ−１６−アンバーライト（商標）ＸＡＤ−１６−非イオン性ポリスチレン系吸収体
●Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られる、Ｇ−７５−５０−セファデックス（商標）Ｇ−７５−４０架橋デキストラン
●ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから得られる、Ｓ−３００−セファクリル（商標）Ｓ−３００アリルデキストラン粒子
●Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）から得られる、ＩＲ−４５ＣＰ−アンバーライト（商標）ＩＲ−４５ＣＰ−弱塩基性マクロ網状ポリスチレンアニオン交換樹脂
●Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）から得られる、ＩＲＡ−４００ＣＰ−アンバーライト（商標）ＩＲＡ−４００ＣＰ−強塩基性ポリスチレンアニオン交換樹脂
●Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から得られる、Ａ−２１−アンバーリスト（商標）Ａ−２１−弱塩基性マクロ網状ポリスチレンアニオン交換樹脂
●米国特許第７，６４７，８３５号に従って調製される、水中約１０重量％のＭＡＰＴＡＣ−［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］塩化トリメチルアンモニウム分散
【０１５８】
培養プレートの調製
５０ｇのキサンタンガム粉末及び５０ｇのイナゴマメゴム粉末の混合物を、５００ｍＬのボトル中に配置し、約５分間手動で撹拌した。感圧接着剤でコーティングされたシート（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から得られる９７９５Ｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅａｌｉｎｇ  Ｔａｐｅの接着剤側上に、混合物を振りかけることによって、カバーフィルムを調製した。ゴムのコーティング重量は、約８５ｍｇ／２４平方インチ（０．５５ｍｇ／ｃｍ２）であった。
【０１５９】
２２．８部のカゼインの脾臓消化物、１５．９部の酵母抽出物、４５．５部のピルビン酸ナトリウム、４．１部のデキストロース、９部の二塩基性リン酸カリウム、及び２．８グラムの一塩基性リン酸カリウムを混合することにより栄養素混合物を調製した。空気圧ミキサを用いてビーカー内で、５００ｍＬの脱イオン水を１４．７８グラムの上記栄養素混合物と混合することにより栄養素ブロスを調製した。次いで、５グラムのイナゴマメゴムをブロスと少しずつ混合し、続いて、数分間にわたって十分に混合した。次いで、ビーカーをホイルで被覆し、混合物を８０℃まで加熱し、約６分間混合し、次いで、加熱なしで混合しながら、約１０分間冷却した。次いで、ブロスを滅菌ビーカーに注入し、プラスチック袋で被覆し、冷蔵した。気泡の形成を防ぐためにスパチュラを用いて冷却ブロスを慎重に撹拌し、次いで、９．５インチ（２４．１ｃｍ）幅、４ｍｉｌ（０．１０ｍｍ）厚のポリエチレンテレフタレートフィルムのシート（ＤｕＰｏｎｔ  Ｔｅｉｊｉｎ  Ｆｉｌｍｓ（Ｈｏｐｅｗｅｌｌ，ＶＡ）からＭＥＬＩＮＥＸ  ４５３として入手可能）上で、約１５０ｍｇ／２４平方インチ（約１ｍｇ毎平方センチメートル）の乾燥コーティング重量になるまでナイフコーティングした。コーティングフィルムを２１０℃の温度設定のオーブン内で約１０分間乾燥させた。
【０１６０】
幅８インチ（２０．３ｃｍ）のシートを、厚さ４ｍｉｌ（０．１０ｍｍ）のポリスチレン発泡体をライナ上の感圧性接着剤転写テープに積層させることにより積層体を調製した。直径５ｃｍに測定した円形ディスクを積層体から打ち抜いて、積層体上の３インチ（７．６センチメートル）の正方形内の中心にある円形の切り抜きディスクを形成し、ディスクを除去した。残りの積層体からライナを取り外し、ポリスチレン発泡体の接着剤コーティング表面をブロスコーティングシートに接着し、ブロスコーティング自己支持性基材と支持性基材のブロスコーティング表面に接着している疎水性スペーサ要素（すなわち、「発泡体ダム」）を有する基板部材を提供した。３インチ×４インチ（７．６センチメートル×１０．１６センチメートル）に測定した矩形プレートを積層体から切断し、円形の切り抜き開口部を、長さ４インチ（１０．２ｃｍ）の一端部から、３インチ（７．６センチメートル）の正方形内の中心に配置した。カバーフィルムを、粉末コーティング面が発泡体ダムに面したプレート上に配置し、両面感圧接着テープで取り付け、培養プレートを形成した。
【０１６１】
実施例１〜７及びＣ１−粒子及び酵素を有するＴＵａｃｅｔａｔｅ
１ｍｇのＴＵａｃｅｔａｔｅを１ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解することによって、染料溶液を調製した。バイアル瓶の中で０．５ｍＬの染料溶液を表１に示す約１００ｍｇの粒子と混合することにより、水性分散微粒子を調製した。次いで、５０μＬの豚肝臓エステラーゼ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を各バイアル瓶に添加し、蛍光ＴＵを遊離させた。標準的な研究用蛍光ランプ（３６５ｎｍ）下で、蛍光に関してバイアル瓶を観察した。蛍光を以下のようにランク付けした。−−−又はなし、＋（弱）、＋＋（やや弱）、＋＋＋（中程度）、＋＋＋＋（強）。各粒子に関する、及び粒子の非存在下での観察結果を表１に示す。
【０１６２】
【表１】
2014503196.tif 000003
【０１６３】
分子素子からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５蛍光プレートを用いて、溶液に分光測定（図示せず）を行った。結果は、オンマトリックス（例えば、ＱＡ５２、ＩＲＡ−４００ＣＰ）において、フルオロフォアがイオン状態から放出されることを示す。非イオンマトリックス、又は活性プロトン（弱塩基）を含有するもの、例えば、ＤＥ−５３において、中性状態からの放出が優位に立つことができる。
【０１６４】
実施例８〜１０及びＣ２−酵素溶液の存在及び非存在下での比較
１ｍｇのＴＵｇａｌ又はＭＨＣｇａｌのいずれかを１ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解することにより、染料溶液を調製した。約２００μＬのβ−ガラクトシダーゼ原液を、０．７ｍＬのβ−メルカプトエタノール、０．２ｇのＭｇＣｌ２と混合し、脱イオン水で１０ｍＬに希釈することにより、酵素試薬溶液を調製した。染料溶液の１０μＬ部のアリコートをバイアル瓶に添加し、それぞれは、１ｍＬのＰＢＳ、５０μＬの試薬溶液、及び１００ｍｇの表２に示す粒子のうちの１つを含有した。対照試料を試薬（酵素）溶液なしで調製した。バイアル瓶を０．５時間後に検査し、実施例１に記載するようにランク付けした。
【０１６５】
【表２】
2014503196.tif 000004
ｎ／ａ−データ該当なし
【０１６６】
実施例８〜１０において、見られる蛍光は、溶液ではなく粒子から得られた。これは、可溶性フルオロフォアの蛍光信号が、適切な粒子を用いることにより、固相中へと隔離され得ることを示す。
【０１６７】
実施例１１〜１６、Ｃ３−粒子及びＭＨＣｇａｌを有するプレート中の大腸菌の蛍光
ＭＨＣｇａｌをＤＭＳＯに添加し、２０ｍＭの溶液を作ることにより、染料溶液を調製した。２５０ｍｇの表３に示す粒子のうちの１つを、５ｍＬのバターフィールド緩衝液に添加し、室温で５０分間、超音波浴中で超音波分解することにより、実施例１１〜１４の水性分散微粒子を調製した。
【０１６８】
１ｍＬのセファクリルＳ−３００又はＭＡＰＴＡＣをバターフィールド緩衝液で４倍に希釈することにより、実施例１５及び１６の水性分散微粒子を調製した。
【０１６９】
単一コロニーを１０ｍＬのＴＳＢ（トリプチックソイブロス）に接種することにより、大腸菌の一晩培養物（ＡＴＣＣ番号１１２２９）を調製した。培養物を、２４時間にわたり、イノーバ４０００インキュベーターシェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３０℃及び２００ｒｐｍで撹拌した。翌朝、一晩培養物をバターフィールド緩衝液で３回、１００倍に希釈し、１ｍＬの溶液当たり約１０３の微生物を含有する溶液を準備した。
【０１７０】
分散微粒子のそれぞれの１ｍＬのアリコートを、８μＬのＭＨＣｇａｌ染料溶液及び１０μＬの希釈大腸菌培養物と混合した。分散液のそれぞれを、上記のように調製した別個の培養プレートに接種した。培養プレートを３０℃で１８時間インキュベートし、次いで、傾向に関して検査し、ランク付けした。結果を表３に示す。
【０１７１】
【表３】
2014503196.tif 000005
【０１７２】
これらの実施例のデータは、非沈殿フルオロフォア及び固体粒子を用いることによる、再水和培地中の微生物の検出の強化を示す。
【０１７３】
実施例１７〜２１及びＣ４−界面活性剤の効果
ＴＵｇａｌをＤＭＳＯに添加し、２０ｍＭの溶液を作ることにより、染料溶液を調製した。これを更に、ＤＭＳＯで希釈し、１ｍＭの溶液を作った。約２００μＬのβ−ガラクトシダーゼ原液を、０．７ｍＬのβ−メルカプトエタノール、０．２ｇのＭｇＣｌ２と混合し、脱イオン水で１０ｍＬに希釈することにより、試薬溶液を調製した。１０μＬの１ｍＭ染料溶液を、５０μＬの試薬溶液と６０ｍｇの実施例１７〜２０に関する表８に示す粒子とを含有する、２ｍＬのＰＢＳに添加することにより、水性分散液を調製した。実施例２１を粒子なしで調製した。実施例１７〜２１はまた、表８に挙げられる０．５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤も含んだ。実施例Ｃ４を粒子なし、かつ酵素溶液なしで調製した。
【０１７４】
【表４】
2014503196.tif 000006
ＮＴ−未試験
【０１７５】
表８のデータは、界面活性剤を有するＴＵｇａｌの蛍光発光の変化を示す。
【０１７６】
本発明の広い範囲を示している数値範囲及びパラメータは近似値であるが、具体的な実施例で示している数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、数値は全て、それぞれの試験測定値における標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を本質的に含むものである。
【０１７７】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであって、特に断らない限り、見出しの後に続く文面の意味を限定するために使用されているものではない。
【０１７８】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、出版物、並びに核酸及びタンパク質データベース入力の全部の開示は、あたかも個別に組み込まれたかのように、本明細書に参照として組み込まれる。本発明の範囲及び意図から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び変化が当業者には明らかであろうし、本明細書に記載の説明的実施例に本発明が不当に制限されないことは理解されるべきである。
【図１】
2014503196.tif 000007
【図２】
2014503196.tif 000008
【図３】
2014503196.tif 000009
【国際調査報告】
2014503196.tif 000010
2014503196.tif 000011
2014503196.tif 000012