(57)【要約】  組織の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイスであって、シルクフィブロインからなり、平滑面及び多孔質面を有することを特徴とする修復デバイスを対象としている。平滑面は、原子間力顕微鏡法（例えば、BrukerのDimension Icon System）を使用した場合であって、修復デバイスのサンプルが十分に水和されている場合に、ピークフォース・タッピングモードで流体を通じて画像化することにより、約０．１μｍ未満の測定Ｓａ値を有する面として定義される。組織の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイス、または、そのような修復デバイスの一部または層の調製方法であって、モールド内にフィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、ゲルを凍結及び解凍するステップを１回以上受けさせて材料を調製するステップと、修復デバイスに多孔質面を生成するステップとからなり、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップでは、モールドの一部は、少なくとも１つの平滑面を提供するように構成されている調製方法も対象としている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイスであって、
シルクフィブロインからなり、平滑面及び多孔質面を有することを特徴とする修復デバイス。
【請求項２】
前記平滑面は、原子間力顕微鏡法（例えば、ＢｒｕｋｅｒのＤｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した場合であって、前記修復デバイスのサンプルが十分に水和されている場合に、ピークフォース・タッピングモードで流体を通じて画像化することにより、約０．１μｍ未満の測定Ｓａ値を有する面として定義される請求項１に記載の修復デバイス。
【請求項３】
前記修復デバイスは、シルクフィブロインからなるボディとして形成されており、
前記ボディが、前記平滑面及び多孔質面を有する請求項１または２に記載の修復デバイス。
【請求項４】
前記平滑面は、前記ボディ上のスキンの表面を構成している請求項１乃至３のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項５】
前記ボディの第１の部分が、前記スキンを構成している請求項４に記載の修復デバイス。
【請求項６】
前記スキンは、厚みが約１ミクロンから約５００ミクロンの間である請求項４または５に記載の修復デバイス。
【請求項７】
前記第１の部分が、前記修復デバイスの前記ボディの一部として一体に形成されている請求項５または６に記載の修復デバイス。
【請求項８】
前記ボディは、第１及び第２の部分を備え、
前記第１の部分は、少なくとも前記平滑面を有しており、
前記第２の部分は、少なくとも前記多孔質面を有している請求項１乃至７のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項９】
前記第１及び第２の部分は、それぞれ、相互に取り付けられている、個別の第１及び第２の層を構成している請求項１乃至６のいずれか１項に従属する請求項８に記載の修復デバイス。
【請求項１０】
前記修復デバイスの前記第２の部分（または層）は、部分的にまたは完全に、骨材料またはインプラント可能な骨生体材料からなる請求項８または９に記載の修復デバイス。
【請求項１１】
前記ボディは、再生シルクフィブロインからなる請求項３乃至１０のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項１２】
前記ボディの前記第２の部分の少なくとも一部が多孔質である請求項３乃至１１のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項１３】
前記ボディの前記第２の部分の実質的に全てが多孔質である請求項３乃至１２のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項１４】
前記多孔質なボディまたは部分は、"開放孔"の大きな割合を占めている請求項１２または１３に記載の修復デバイス。
【請求項１５】
前記多孔質面がミネラル化されている請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項１６】
前記多孔質面は、ハイドロオキシアパタイトまたはリン酸カルシウムでミネラル化されている請求項１５に記載の修復デバイス。
【請求項１７】
前記修復デバイスは、生体適合性のある個々の繊維または繊維層からなる請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の修復デバイス。
【請求項１８】
前記繊維または前記繊維層は、部分的に、前記修復デバイスの前記ボディに溶解している請求項１７に記載の修復デバイス。
【請求項１９】
組織の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイス、または、そのような修復デバイスの一部または層の調製方法であって、
モールド内にフィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、
前記ゲルを凍結及び解凍するステップを１回以上受けさせて材料を調製するステップと、
前記修復デバイスに多孔質面を生成するステップとからなり、
前記フィブロイン溶液からゲルを調製するステップでは、前記モールドの一部は、少なくとも１つの平滑面を提供するように構成されている調製方法。
【請求項２０】
前記修復デバイスに多孔質面を生成するステップは、前記修復デバイスの表面の少なくとも一部を取り除き、その下に存在する孔を露出させるステップを含む請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２１】
前記モールドの少なくとも一部は、透析膜、透析バッグ、透析容器または透析面からなり、
前記シルクフィブロイン溶液は、平滑面を有するスキンを得るために、透析膜、透析バッグ、透析容器または透析面に対してゲル化される請求項１９または２０に記載の調製方法。
【請求項２２】
ボディを予め形成し、予め形成された前記ボディに前記平滑面及び前記スキンを形成することを含む請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２３】
再生フィブロイン溶液から前記修復デバイスを形成する請求項１９乃至２２のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２４】
少なくとも前記多孔質面をミネラル化するステップを含む請求項１９乃至２３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２５】
生体適合性のある繊維または繊維層を前記フィブロイン溶液に入れるステップを含む請求項１９乃至２４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２６】
ゲル化する前に、前記修復デバイスに前記繊維を部分的に溶解させることを含む請求項２５に記載の調製方法。
【請求項２７】
前記繊維または前記繊維層は、フィブロインからなる請求項２５または２６に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、インプラント可能な修復デバイス（implantable repair devices）の分野に関するものである。より具体的には、しかし非排他的には、本発明は、損傷または罹患した軟骨（cartilage）を置換、修復及び／または再生するための医療デバイス（medical devices）、及びそのようなデバイスの製造方法に関係する。本発明は、さらに具体的に言うと、例えば膝関節（knee joint）、股関節（hip joint）、肩関節（shoulder joint）、指の関節（finger joints）及び足関節（ankle joint）の関節軟骨（articular cartilage）を含む、損傷した関節軟骨の置換、部分置換またはオーグメンテーション（augmentation）のためのデバイスに関する。
【０００２】
以下規定されていない限り、用語「フィブロイン（fibroin）」は、家畜化された桑蚕（domesticated Mulberry Silkworm）（ボンビックス・モリ［Bombyx mori］）、遺伝子組み換え蚕（transgenic silkworm）、または、ムガシルク（Muga silks）、エリシルク（Eri silks）若しくはタッサーシルク（Tussah silks）を生産するものを含むがこれらに限定されない野蚕（Wild Silkworm）のいずれの由来であるにかかわらず、一般的に、繭のシルク(cocoon silks)の主要構造のタンパク質を示すものとして使われている。さらに、用語「シルク（silk）」は、主として２つの主要なタンパク質である、セリシン（sericin）とフィブロイン（fibroin）とを含む、蚕が吐き出す（extrude）天然の微細繊維（natural fine fibre）を示すものとして使われている。フィブロインは、シルクの構造的繊維である。セリシンは、フィブロインを取り囲み、繭の中で繊維同士を接着する材料である。「繭（'Silk cocoon' or 'cocoon'）」は、蛹期（pupal stage）の間の保護のために蚕の幼虫（larvae）によって紡がれたシルクによるケーシング（casing）を示すものとして使われている。
【背景技術】
【０００３】
成体の哺乳動物の体内の軟骨は、硝子軟骨(hyaline cartilage)、白色線維軟骨(white fibrocartilage)、及び、黄色弾性軟骨(yellow elastic cartilage)の３つの主要な形態で見出される。硝子軟骨は、主に、膝、股及び肩のような滑膜可動関節（synovial diarthrodial joints）内並びに長骨（long bones）間において、関節軟骨として存在し、堅く（stiff）且つ滑らかな（smooth）関節面を形成している。白色線維軟骨は、膝及び顎の顎関節（temporomandibular joint）の半月板（menisci）内、及び、椎間板（intervertebral discs）内に存在する。黄色弾性軟骨は、喉頭蓋（epiglottis）、耳管（エウスタキー管［Eustachian tube］）及び外耳（external ear）をサポートする。
【０００４】
軟骨の損傷を伴う３つの病理的状態（pathological conditions）は非常に一般的である。すなわち、関節軟骨の変形性関節症（osteoarthrosis）、膝半月板の線維軟骨の損傷、椎間板の崩壊（collapse）・断裂（rupture）またはヘルニア形成（herniation）、及び、関節リウマチ（rheumatoid arthritis）により生じる損傷である。変形性関節症は、股関節（hip）及び膝におけるものが最も一般的であり、関節軟骨の進行性の損傷及び破壊（breakdown）により引き起こされる。また、変形性関節症は、若者も老人も、痛み及び運動障害（reduced mobility）の重要な要因である。膝半月板の線維軟骨の損傷は、一般的な、スポーツによるけがであり、また、交通事故その他の外傷（traumatic injuries）の結果としても見られる。
【０００５】
関節軟骨は、高度に分化（highly specialized）されており、比較的堅い骨と骨の間に、比較的摩擦がなく、高度に潤滑化された、耐摩耗表面を提供している。また関節軟骨は、周囲の軟骨及びその下の軟骨下骨梁（subchondral trabecular bone）に対する負荷接触（loaded contact）により生じる力を伝達及び分散するように機能する。関節軟骨は、主に水及び電解質からなる液相（fluid phase）から大部分が構成されている無血管性の結合組織（nonvascular connective tissue）である。水及び電解質は、ＩＩ型コラーゲン原線維（type II collagen fibrils）、プロテオグリカン（proteo-glycan）及びその他の糖タンパク質（glycoproteins）を含む固相（solid phase）中に散在している（interspersed）。後者の構成成分は、高度に分化された間葉細胞（mesenchymal cells）である軟骨細胞（chondrocytes）を取り囲み、また、軟骨細胞によって分泌される。軟骨細胞は、関節軟骨の体積（volume）のおよそ１０％の割合を占めている。関節軟骨中のコラーゲン原線維は、骨軟骨（osteochondral）の接合部（junction）に対して垂直に（normal）、且つ、固定されるように配置されたカラム（columns）を形成する、複雑なアーケード構造（complex arcade structure）に配列されている。これらのカラムは、軟骨の深層（deep layer）を通って延びるが、表面軟骨（superficial cartilage）においてアーケード構造のアーチを形成するように、主要な線維配向は徐々に変化する。関節腔（joint space）に接する表層においては、コラーゲン原繊維の網（meshwork）は、非常に密度が高い。一方、原繊維は、軟骨表面に対してほぼ完全に接線方向に延びている。関節軟骨中のコラーゲンの配向は、その機械的機能のために不可欠である。健康な関節軟骨は強く、堅い（１〜２０ＭＰａの間のモジュラス［modulus］）。
【０００６】
変形性関節症における損傷した関節軟骨を置換するための、完全に満足のいく治療は存在しない。その代わりに、最も頻繁に損傷しやすい関節である股関節と膝関節の２つについては、関節全体を置換するために、人工関節（artificial prostheses）が最も一般に使用されている。人工関節は、運動性を向上し、また、痛みを軽減するが、進行性の摩耗（progressive wear）、機械的な故障（mechanical failure）、組織への有害反応（adverse tissue reactions）、及び、骨との界面の緩みに悩まされることになる。したがって、現在利用可能な人工器官（prostheses）を超える改善された性能を有する、適切なインプラント可能な修復材料（material）を提供することについての分野において、多くの研究がなされている。
【０００７】
そのようなデバイスの１つがＷＯ２００７／０２０４４９Ａ２公報に記載されている。この公報には、生体適合性（biocompatible）、生体吸収性（bioresorbable）を有する三次元のシルク若しくは他の繊維の層、または、生体適合性、生体吸収性を有する実質的に多孔性のシルクに基づくヒドロゲル（hydrogel）、若しくは、他のヒドロゲルであって、繊維層の隙間を部分的にまたは実質的に埋めるものを有する軟骨質組織修復デバイス（cartilaginous tissue repair device）が記載されている。
【０００８】
国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５１７７５(ＷＯ２００９／１３３５３２Ａ２で公開)は、軟骨の修復のためのインプラントとして有効であることが判明した、改良されたフィブロイン材料を製造するのに用いることができるシルクフィブロイン溶液及び方法を開示している。再生シルクフィブロイン溶液を調製する方法は、(a)シルクまたはシルクを、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、硝酸アンモニウム、水酸化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウムまたは硝酸カリウムのうち１つ以上の水溶液からなるイオン試薬（ionic reagent）で処理するステップと、(b)続いて、イオン試薬でシルクまたは繭を処理した後に、シルクまたは繭を乾燥するステップと、(c)続いて、カオトロピック剤（chaotropic agent）中に、シルクまたは繭を溶解するステップとからなる。
【０００９】
さらにまた、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０７２７(ＷＯ２００９／１５６７６０Ａ２で公開)は、骨の修復、オーグメンテーションまたは置換のために、フィブロイン溶液から、インプラント可能な材料を調製する方法を開示している。この方法は、フィブロイン溶液からゲル（gel）を調製し；ゲルを凍結して解凍する（thawing）１以上のステップをゲルに受けさせて材料を調製することからなり、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、リン酸イオン（phosphate ions）の存在下で実行されることを特徴としている。一般的に、材料は、カルシウムイオン（calcium ions）で処理され、フィブロイン・アパタイト（fibroin-apatite）が形成される。追加的な方法のステップは、材料をイソシアネート（isocyanate）で処理し、架橋（cross-links）を形成するステップからなる。このインプラント可能な材料は、骨の修復のためのインプラントとして有効であることが判明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０２０４４９Ａ２公報
【特許文献２】ＷＯ２００９／１３３５３２Ａ２公報
【特許文献３】ＷＯ２００９／１５６７６０Ａ２公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、負荷に耐えることができ、且つ、既存の骨または軟骨と一体化する能力が改善ないし強化された、インプラント可能な修復デバイスを提供することにある。本発明の他の目的は、軟骨の置換の後に、改善された関節の接合（articulation）を提供するのに適したインプラント可能な修復デバイスを提供することにある。本発明のさらなる目的は、並置される組織への損傷を最小限化する、比較的摩擦が少なく、高度に潤滑され、耐摩耗性を有する表面を有し、且つ、可能な限り関節軟骨の機能（capabilities）に近付けたデバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの態様においては、組織の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイスが提供され、この修復デバイスはシルクフィブロインからなる。そしてこの修復デバイスは平滑面（smooth surface）と多孔質面（porous surface）とを有する。
【００１３】
「平滑面（smooth surface）」が意味するところは、その面が比較的摩擦がなく、比較的堅い骨または隣接する組織に対して耐摩耗の関節表面を提供するために潤滑にすることを可能にするために、凹凸（irregularities）、粗さ（roughness）、または突起（projections）が十分に存在しない、きめ細かい（fine texture）面であることである。さらに詳細には、平滑面とは、原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy）（例えば、ＢｒｕｋｅｒのＤｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した場合であって、修復デバイスのサンプルが十分に水和されている（fully hydrated）場合に、ピークフォース・タッピングモード(peak force tapping mode)で流体（fluid）を通じて（through）画像化する（imaging）ことにより、約０．１μｍ未満の測定Ｓａ値を有する面として定義される。明確に、上記の結果は約２０μｍ×２０μｍのサンプルサイズの分析において比較可能である。
【００１４】
本発明によって製造されたデバイスは、ヘルニア（hernias）及びフィステル（fistulas）のような特定の医療適応（medical indications）の修復はもちろん、例えば軟骨、骨、血管組織（vascular tissue）、心臓組織（cardiac tissue）、胃腸組織（gastrointestinal tissue）、泌尿生殖器組織（urinogenital tissue）、靱帯（ligaments）や腱（tendons）、脊椎円板（spinal discs）等のさまざまな組織の修復、オーグメントまたは置換に利用可能であると予想される。
【００１５】
このアレンジメントによって、デバイスは、ＢＳ ＩＳＯ７２０６パート２による関節置換面におけるポリマーコンポーネントに要求されるもの（２μｍ Ｒａよりも良好な平均粗さ）よりも、かなり「より平滑（smoother）」な平滑面を有する。さらにまた、デバイスは、金属製及びセラミック製のコンポーネントの球形の（spherical）関節軟骨の標準の範囲（domain）に必要とされる平滑面を有する（ＩＳＯ４６８：１９８２に定められた原理に従って計測した場合、金属製及びセラミック製のコンポーネントの球形の（spherical）関節軟骨は、０．０８ｍｍのカットオフ値を使用して、それぞれ０．０５μｍ及び０．０２μｍを超えないＲａ値を有するものとする）。これに関して、Ｒａ及びＳａ値は、いずれも表面の「平均粗さ」に関するものであるが、Ｒａは単一の輪郭トレース（single profile trace）から計算され、Ｓａは領域全体に亘って計算されるものであり、これらの値は、大まかにしか比較できないことに注意を要する。
【００１６】
よって、本発明によるデバイスは、耐久性があり、比較的摩擦がなく、また、潤滑にすることが可能な平滑面を有し、比較的堅い骨や隣接する組織との間に耐摩耗の関節表面を提供することができる。加えて、多孔質面は、細胞及び組織の侵入（ingress）を助ける表面を提供することにより、既存の骨または軟骨との一体化を促進する。
【００１７】
好ましくは、上述の原子間力顕微鏡法を用いて計測した場合に、平滑面は、０．０８μｍ未満のＳａ値を有し、より好ましくは、０．０６μｍ未満のＳａ値を有し、さらにより好ましくは、０．０５μｍ未満のＳａ値を有し、最も好ましくは、０．０４μｍ未満のＳａ値を有している。
【００１８】
デバイスはシルクフィブロインからなるボディとして形成され、ボディは平滑面及び多孔質面を有することが好ましい。
【００１９】
平滑面は、スキン（skin）の表面を構成していることが好ましい。ボディの第１の部分は、スキンを構成していることが好ましい。スキンは、ボディの第１の部分の全体を形成することが好ましい。
【００２０】
スキンは、厚みが約１ミクロンから約５００ミクロンの間であってもよい。好ましくは、スキンは、厚みが約５０ミクロンから約３００ミクロンの間である。さらに好ましくは、スキンは、厚みが約８０ミクロンから約２００ミクロンの間である。最も好ましくは、スキンは、厚みが約１００ミクロンである。
【００２１】
（平滑面を有するスキンを伴う）ボディの第１の部分は、デバイスのボディの一部として一体に形成されることが好ましい。
【００２２】
代わりに、スキンは、予め形成されたボディ（pre-formed body）に取り付けてもよい。スキンと予め形成されたボディは、接着剤のような、適切な方法で相互に取り付けられてもよい。
【００２３】
代わりに、スキンは、予め形成されたボディのその位置に（in situ）形成されてもよい。例えば、スキンは、予め形成されたボディ、または、ボディの一部を構成する材料の予め形成された部分の上にゲル化されてもよい。
【００２４】
ボディは、さらに第２の部分を備え、第１の部分は、少なくとも平滑面を有し、第２の部分は、少なくとも多孔質面を有していることが好ましい。そのため、この場合も、第１の部分は、スキンを構成することが好ましい。第２の部分は、多孔質面に加えて、ボディの一部を構成することが好ましい。
【００２５】
第１及び第２の部分は、それぞれ、ボディの体積の約５０％を構成してもよい。代わりに、第２の部分は、ボディの体積の約５０％から約９９％を構成してもよい。好ましくは、第２の部分は、ボディの体積の約９５％を構成してもよい。そのため、最も好ましくは、第２の部分は、多孔質面とそれ以外の部分（further part）を有し、第１の部分はスキンと平滑面を有する。第１及び第２の部分は、一体に形成されることが好ましい。
【００２６】
代わりに、第１及び第２の部分は、それぞれ、相互に固定された、個別の第１と第２の層を構成してもよい。第１及び第２の層は、予め形成された層を接着剤で取り付けたり、または、予め形成された層に１つの層を形成するような、任意の適当な方法で取り付けることができる。後者のシナリオにおいては、第１の層は、予め形成された第２の層の上に形成されることが好ましい。例えば、平滑面及び／またはスキンは、予め形成された層の上にゲル化されてもよい。
【００２７】
第１及び第２の層の少なくとも１つは、２つの層の取り付けを促進するように適合された多孔質面を有していてもよい。１つの層が予め形成されている場合、予め形成されている層のみがそのような面を提供する。両方の層が予め形成されている場合、第１及び第２の層の両方が、相互の取り付けを促進するように適合された多孔質層を有していることが好ましい。
【００２８】
デバイスの第２の部分（または層）は、部分的にまたは完全に、骨材料（bone material）またはインプラント可能な骨生体材料（implantable bone bio-material）からなるようにしてもよい。
【００２９】
「骨材料」または「骨生体材料」により、我々は、自家移植片（autograft）、同種移植片（allograft）または脱灰骨(demineralised bone)、リン酸カルシウム（calcium phosphate）をベースとした材料、その他のミネラル複合材料（mineral composites）、ポリマー−ミネラル複合材料（polymer-mineral composites）、多孔質骨生体材料または例えばＷＯ２００９／１５６７６０Ａ２に開示されたような方法により製造された材料、すなわち、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、ゲルを凍結及び解凍するステップを１回以上受けさせて材料を調製するステップとからなり、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップが、リン酸イオン（phosphate ions）の存在下で実行され、さらに、材料をカルシウムイオン（calcium ions）で処理し、フィブロイン・アパタイト（fibroin-apatite）を形成することにより製造された材料を含む、任意の適当な材料を意味する。骨材料は、イソシアネートで処理されていてもよい。
【００３０】
ＷＯ２００９／１５６７６０の材料については、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップの前に、フィブロイン溶液をリン酸イオンで分散させてもよい（dispersed）。フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、リン酸イオンを含むゲル化試薬を備えることが好ましい。アルカリ性ｐＨに調整されたリン酸二水素ナトリウム（dihydrogen sodium phosphate）のバッファ水溶液（aqueous buffered solution）を使用してフィブロイン溶液がゲル化された場合に、特に良好な結果が観察されている。例えば水、ジメチルスルホキシド（dimethylsulphoxide）、またはジメチルホルムアミド（dimethylformamide）のような、実質的にフィブロインを有さない膨張剤（swelling agents）を伴う、架橋剤（cross- linking agent）による処理が実行される場合に、特に良好な結果が得られている。
【００３１】
ボディ、またはボディを形成する層または部分は、再生シルクフィブロインからなる。
【００３２】
「再生シルクフィブロイン」により、我々は、ＷＯ２００９／１３３５３２Ａ２に開示されているような再生シルクフィブロイン溶液、すなわち、(a)シルクまたは繭を、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、硝酸アンモニウム、水酸化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウムまたは硝酸カリウムのうち１つ以上の水溶液からなるイオン試薬（ionic reagent）で処理するステップと、(b)続いて、イオン試薬でシルクまたは繭を処理した後に、シルクまたは繭を乾燥するステップと、(c)続いて、カオトロピック剤（chaotropic agent）中にシルクまたは繭を溶解するステップとからなる方法から作られた再生フィブロイン溶液から製造されたシルクフィブロインを意味している。
【００３３】
ボディの少なくとも一部は、多孔質であることが好ましい。（多孔質面と隣接する）ボディの第２の部分の少なくとも一部は、多孔質であることが好ましい。そのため、多孔質層は、ボディの多孔質部の続きであることが、より好ましい。ボディの第２の部分の実質的に全てが、多孔質である（例えば、平滑面及び／またはスキンではない）ことが最も好ましい。
【００３４】
孔の直径は、約１０μｍから約１０００μｍまでの範囲でよい。孔の平均直径は、約１００μｍから約５００μｍまででよく、特に、約２００μｍから約４００μｍまででよい。孔の平均サイズは、約３００μｍでもよい。
【００３５】
ボディの多孔質部（part）、部分（portion）または層は、体積空隙率（porosity by volume）が、約１０％から約９５％までの間になるようにしてもよい。ボディは、体積空隙率が、約６０％から約９５％までの間であることが好ましい。ボディは、体積空隙率が、約７０％から約９５％までの間であることがさらに好ましい。ボディは、体積空隙率が、約８５％であることが最も好ましい。
【００３６】
ボディの多孔質部、部分または層は、大多数の孔が多孔質面と連通し、各孔が通路の分岐構造を形成している「開放孔（open pores）」がかなり大きな割合を占めることが好ましい。「開放孔」は、分離した別々の空洞（voids）を形成する「閉鎖孔（closed pores）」の対語である。
【００３７】
体積に対して開放孔が全ての孔のうち約７０％より多くを占めてもよく、体積に対して開放孔が全ての孔のうち約８０％より多くを占めることが好ましく、体積に対して開放孔が全ての孔のうち約９５％より多くを占めることがさらに好ましく、体積に対して開放孔が全ての孔のうち約９９％よりも多くを占めることが最も好ましい。
【００３８】
多孔質面は、ミネラル化（mineralised）されていてもよい。ボディは、選択的にミネラル化されていてもよい。「選択的にミネラル化（selectively mineralised）」により、我々は、ボディの選択された領域がミネラル化されていることを意味する。多孔質面を含む、ボディの第２の部分または第２の層がミネラル化されていることが最も好ましい。ボディの第１の部分または第１の層もミネラル化されていてもよいが、スキンまたは平滑面は含まない。
【００３９】
ボディの選択された領域は、リン酸カルシウム（calcium phosphate）によりミネラル化されていることが好ましく、ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）によりミネラル化されていることが最も好ましい。ヒドロキシアパタイトは、本体の選択された多孔質の領域の任意の場所に、ナノ複合材料として存在することが好ましい。
【００４０】
代わりに、リン酸カルシウム結晶（calcium phosphate crystals）は、多孔質面上において核となる（nucleated）ことができる。さらに、代わりに、リン酸カルシウム結晶は、多孔質面上及びボディの選択された領域全体において核となることができる。
【００４１】
代わりに、ボディの選択された領域は、ハイドロオキシアパタイトまたはリン酸カルシウムの顆粒によりミネラル化されていてもよい。顆粒は、接着剤を用いて取り付けられていてもよく、また、ボディ内／ボディの下層に入れられてもよい。
【００４２】
顆粒の直径は、約０．２ｍｍから約２ｍｍの範囲であってもよい。顆粒の直径は、約０．３ｍｍから約１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒の直径は、約０．３ｍｍから約０．７ｍｍの範囲または約０．７ｍｍから約１．５ｍｍの範囲であってもよい。さらに、または、代わりに、顆粒の一部または全ては、直径１４０μｍほどの小ささで提供してもよい。
【００４３】
デバイスは、生体適合性の繊維または繊維層からなるようにしてもよい。
【００４４】
繊維層は、三次元的でもよい。繊維層は、ゲルにより、少なくとも部分的に浸潤されていてもよい（infiltrated）。繊維層は、巻き付けた（wound）、織った（woven）、撚り合わせた（twisted）、編んだ（knitted）、組紐にした（braided）、縫った（stitched）、若しくは、刺繍した（embroidered）繊維、または、圧縮したフェルト（compressed felts）、または、布を組み合わせた層でもよい。繊維層はメッシュ（mesh）でもよい。どの繊維層も、シルクフィブロインからなることが好ましい。繊維層は、実質的に、修復される軟骨質組織の繊維パターンの生体模倣（biomimetic）であってもよい。
【００４５】
繊維の外側の層がデバイスのボディ中に十分に溶け込む（blend）、または、融合する（merge）ように、繊維または繊維層は、デバイスのボディ中で部分的に溶解する。これは、デバイスのボディと一層強化された結合を形成して、デバイスの頑丈さを増大させる。
【００４６】
表面再建処置（resurfacing procedures）における使用に適合するように、デバイスは、約０．２ｍｍから約６ｍｍの厚さの範囲の「薄い（thin）」コンポーネントとして提供されてもよい。
【００４７】
代わりに、置換処置（replacement procedures）における使用に適合するように、デバイスは、約０．６ｍｍから約１０ｍｍの厚さの範囲の「厚い（thick）」コンポーネントとして提供されてもよい。
【００４８】
デバイスは、置き換えようとする軟骨コンポーネント（cartilage component）の外形及び輪郭（shape and contours）を模倣する（mimic）ように成形されていてもよい。例えば、表面再生手術のためにディスク（disk）が提供されてもよく、置換処置のために輪郭に沿うように形成されたデバイスが提供されてもよい。
【００４９】
加えて、または、代わりに、デバイスは、その位置に配置する軟骨コンポーネント及び／または骨コンポーネントの輪郭に適合するように、可撓性（flexible）を有するようにしてもよい。
【００５０】
使用の際に、デバイスは、ピン（pins）、鋲（tacks）、釘（nails）、ダーツ（darts）、矢（arrows）、バーブ（barbs）、接着剤（adhesive）、または、縫合糸（sutures）／縫い糸（stitches）を使用して、生体内に取り付けられてもよい。
【００５１】
そのため、本発明の他の形態においては、軟骨の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイス、または、そのような修復デバイスの一部または層の調製方法であって、モールド内にフィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、ゲルを凍結及び解凍するステップを１回以上受けさせて材料を調製するステップと、修復デバイスに多孔質面を生成するステップとからなり、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップでは、モールドの一部は、少なくとも１つの平滑面を提供するように構成されている調製方法が提供される。
【００５２】
「モールド（mould）」により、我々は、フィブロイン溶液、及び、後にゲルが入れられる容器（vessel）を意味する。
【００５３】
修復デバイスに多孔質面を生成するステップは、修復デバイスの表面の少なくとも一部を取り除き、その下に存在する孔を露出させるステップを含む。そのため、モールドの実質上全ては、ゲル上に平滑面を提供するように適合していることが好ましい。
【００５４】
表面を取り除くことは、ゲルから表面を切除する（cutting away）ことを含む。多孔質面を露出するために、例えば、表面を削り落とす（shaving）、擦り落とす（abrading）または溶解するなど、任意の適合する方法を使用することができる。
【００５５】
代わりに、モールドは、多孔質面を提供するのに適合していてもよい。このケースでは、モールドの約５０％がゲル上に平滑面を提供するのに適合しており、モールドの約５０％がゲル上に多孔質面を提供するのに適合していてもよい。代わりに、モールドの約６０％が平滑面を提供するのに適合していてもよく、他の応用では、モールドの約２０％が平滑面を提供するのに適合していてもよい。
【００５６】
モールドの一部は、研磨されていてもよい。
【００５７】
モールドの少なくとも一部は、透析膜（dialysis membrane）、透析バッグ（dialysis bag）、透析容器（dialysis vessel）または透析面（dialysis surface）からなり、シルクフィブロイン溶液は、平滑面を有するスキンを得るために、透析膜、透析バッグ、透析容器または透析面に対してゲル化される（gelled against）。この方法は、酢酸セルロース透析膜（cellulose acetate dialysis membrane）からなる透析膜、透析バッグ、透析容器または透析面を使用してもよい。
【００５８】
代わりに、シルクフィブロイン溶液は、ガラス面（glass surface）または他の平滑面に対してゲル化されてもよい。
【００５９】
代わりに、この方法は、平滑面を実現するために、デバイスに後成形過程（post- forming processing）を受けさせることを含むようにしてもよい。
【００６０】
シルクフィブロイン溶液は、例えば酸（acid）のような１以上のゲル化試薬の水溶液でフィブロイン溶液を処理することによりゲル化されることが好ましい。例として、酢酸溶液（acetic acid solution）からなるゲル化剤を使用すると、特に良好な結果が得られる。ヒドロゲルを形成するために、再生シルクフィブロイン溶液をゲル化してもよい。ゲル化は、約２０℃の温度で、１％の酢酸溶液を使用し、ゲル化が必要な針入深さ（depth of penetration）により決定される時間に亘って実行される。例えば、約８ｍｍの厚さのデバイスでは、ゲル化時間は約２時間から８時間の間でよく、より好ましくは、４時間から６時間の間である。
【００６１】
任意のモールドを、凍結及び解凍ステップ前に取り除いてもよい。（解凍ステップは不要であるが、）凍結ステップは、任意のモールドを所定の位置に配置して実行されることが好ましい。
【００６２】
ゲルの凍結は、例えば約−１℃から約−１２０℃の温度範囲内の適度な温度で実行されてもよい。凍結は、約−１０℃から約−３０℃の温度範囲内で実行されることが好ましい。凍結は、約−１４℃から約−２０℃の温度範囲内で実行されることがさらに好ましい。例えば、約−１４℃から約−１８℃の温度範囲内で実行された場合に、良好な結果が得られた。
【００６３】
孔の直径を大きくするために、複数の凍結及び解凍サイクルを実行してもよい。
【００６４】
本方法により、インプラント可能なデバイスの一部または層を提供することができる。しかしながら、本方法は、上述の平滑面及び上述の多孔質面が相互に一体化した、一体型デバイスとしてのデバイスの形成を含むことが好ましい。平滑面は、実質的に孔がないか、または、少なくとも約１μｍ未満のオーダーの孔しか有さないスキンの一部として形成されることが好ましい。
【００６５】
代わりに、本方法は、スキン及び平滑面を有する第１の層を予め形成し、多孔質面を有する第２の層を予め形成し、この２つのパーツを取り付けることを含んでもよい。本方法は、接着剤などの任意の適切な方法で、予め形成された層同士を相互に取り付けることを含んでもよい。
【００６６】
さらに代わりに、本方法は、スキンを予め形成し、ボディを予め形成し、この２つのパーツを取り付けることを含んでもよい。本方法は、接着剤などの任意の適切な方法で、予め形成されたスキンと予め形成されたボディとを相互に取り付けることを含んでもよい。
【００６７】
さらに代わりに、本方法は、ボディを予め形成し、予め形成されたボディに平滑面及びスキンを形成することを含んでもよい。そのため、本方法は、予め成形されたボディの上にシルクフィブロイン溶液をゲル化することを含んでもよく、その場合、平滑面を提供するのに適合したモールドに対して、前述のいずれかの方法に従って、シルクフィブロイン溶液を形成することにより、または、ゲルの面に後形成過程を受けさせることにより、平滑面を得ることができる。
【００６８】
本方法は、例えばＷＯ２００９／１３３５３２Ａ２に開示され、詳細に上述したように、再生フィブロイン溶液からボディ、または、予め形成された層若しくはスキンを形成することを含んでもよい。
【００６９】
再生シルクフィブロイン溶液を使用する際には、イオン試薬による処理の前若しくは後に、または処理と連続して、シルクまたは繭を、精練（degummed）（セリシン［sericin］の除去）してもよい。精練には、選択的にセリシンを除く（leaves）が、フィブロインは取り除かない、例えばトリプシン（trypsin）のようなタンパク質分解酵素（proteolytic enzyme）を使用してもよい。カオトロピック剤中でのシルクの溶解は、最大で９．４Ｍのカオトロピック剤及び／または２４時間未満の時間に亘っていてもよく、より好ましくは、約８．０Ｍから９．４Ｍの間のカオトロピック剤を使用し、さらにより好ましくは、３７℃でなされる。カオトロピック剤中でのシルクの溶解は、約８．２５Ｍから９．０Ｍまでの溶液で行うことが最も好ましく、この場合も、好ましくは３７℃でなされる。良好な結果は、３７℃、カオトロピック剤の濃度８．５Ｍ、及び１２時間未満の時間で良好な結果が得られた。カオトロピック剤は、臭化リチウムが好ましい。
【００７０】
本方法は、次の順のステップからなる。（ａ）カオトロピック剤を除去する再生フィブロイン溶液の透析、（ｂ）モールド内での透析された再生フィブロイン溶液の凍結、（ｃ）モールドの除去、（ｄ）透析された再生フィブロイン溶液の同時進行の解凍及びゲル化、及び、（ｅ）１以上の凍結／解凍サイクルをゲルに受けさせること。
【００７１】
ステップ（ａ）に先だって、個々の繊維または繊維層は、再生フィブロイン溶液の透析の開始に先だち、特定の時間に亘って、カオトロピック剤とともに、再生フィブロイン溶液に導入されることが好ましい。個々の繊維／繊維層がフィブロインまたはカオトロピック剤に溶解するその他の材料からなる場合、このことにより、導入した繊維／繊維層の制御された／部分的な溶解の導入の効果を有する。溶解は、透析の間に、カオトロピック剤の除去を開始することにより中断される。このことは、溶解しない個々の繊維／繊維層が再生フィブロイン溶液と融合する（integrate）ように働き、続く過程ステップで、個々の繊維／繊維層と、デバイスのボディの残りの部分との間の連続体（continuum）をもたらすため、有益であると考えられる。個々の繊維／繊維層とデバイスのボディの残りの部分の一体化は、機械的性能の改善、及び／または、個々の繊維／繊維層とデバイスのボディの残りの部分との層間剥離（delamination）に対する耐性の改善を提供することができる。
【００７２】
純水に対する透析は、カオトロピック剤の除去に使用してもよく、溶液は、約５−２５％ｗ／ｖに濃縮されてもよい。透析の間、再生フィブロイン溶液及び透析液（dialysate）は、「穏やかな振動（gentle shake）」で撹拌（agitate）することが好ましい。透析の間、透析液は、カオトロピック剤の検査がなされることが好ましい。この検査は、透析液に実施される硝酸銀試験（silver nitrate test）からなるようにしてもよい。しかしながら、この検査は、透析液の導電率（conductivity）の確認を含むようにすることが好ましい。そのため、この検査は、透析液中に配置される、電解導電率計（conducting/ electrolysis meter）の使用を含むことが好ましい。再生フィブロイン溶液の透析は、導電率の測定値が、好ましくは、５００μＳ／ｃｍ（マイクロジーメンス毎センチメートル）以下になったとき、より好ましくは１００μＳ／ｃｍ以下、最も好ましくは５０μＳ／ｃｍ以下になったときに完了する。導電率の測定値が選ばれた測定値外にあった場合には、より高い導電率が容認される（tolerated）と解釈されるが（appreciated）、再生フィブロイン溶液をさらに透析を受けさせることが可能である。透析液中のカオトロピック剤の量の検査は、フィブロイン溶液中にどれだけの量のカオトロピック剤が残っているかについての直接の指標を提供する。
【００７３】
ステップ（ｂ）においては、ステップ（ｃ）に先立って、凍結は、溶液の形状をモールドの形状に維持することに役立つ。
【００７４】
ステップ（ｄ）は、上記の条件でのゲル化を含むことが好ましい。ゲル化の間に解凍することにより、モールドの形状は維持される。
【００７５】
ステップ（ｅ）により、ゲル中に、孔が導入される。
【００７６】
本方法は、デバイスに生体適合性のある繊維または繊維層を組み込むことを含んでいてもよい。そのため、本方法は、繊維層を、繊維を巻き付け（winding）、織り（weaving）、撚り合わせ（twisting）、編み（knitting）、組紐にし（braiding）、縫い（stitching）、若しくは、刺繍し（embroiding）、または、フェルトを圧縮（compressing felts ）、または、布の層を組み合わせて形成することからなってもよい。繊維層は、修復される軟骨性組織の繊維パターンの実質的な生体模倣になるように形成してもよい。
【００７７】
本方法は、繊維層を、ゲルにより、少なくとも部分的に浸潤させることを含んでもよい。そのため、本方法は、繊維層をフィブロイン溶液とともに、モールドの中に置く付加的なステップを含んでもよい。
【００７８】
本方法は、透析に先立って、溶液に繊維または繊維層を添加することを含むことが好ましい。繊維／繊維層は、溶液を繊維／繊維層の周囲でゲル化する前に、溶液に部分的に溶解されていることが好ましい。これにより、繊維の外側の層が、デバイスの最終的なボディにおいて、周囲にあるフィブロイン・マトリックス（matrix）と、実質的に溶け込むまたは融合することができる。
【００７９】
あらゆる繊維層は、シルクフィブロインからなることが好ましい。
【００８０】
本方法は、少なくとも多孔質面を、ミネラル化するステップを含むようにしてもよい。そのため、本方法は、多孔質面を形成し、続いて、少なくとも多孔質面を選択的にミネラル化するステップを含むことが好ましい。
【００８１】
本方法は、続いて、ゲルの少なくとも多孔質面をカルシウムイオンで処理し、少なくともその多孔質面上にヒドロキシアパタイトナノ複合材料を形成することを含むことが好ましい。ゲルの少なくとも第２の部分または第２の層をカルシウムイオンで処理し、第２の部分または第２の層にヒドロキシアパタイトナノ複合材料を形成することが最も好ましい。本方法は、少なくとも多孔質面がカルシウムイオン溶液中に入るようにゲルを部分的に浸漬する（submersing）ステップ、または、最初にリン酸塩（phosphate）、次にカルシウムイオンを含む溶液に連続して浸す（dipping）ステップを採用してもよい。カルシウムイオンがゲルを通過し、所定の点を超えて移動するのを阻止するために、バリア手段（barrier means）を使用してもよい。
【００８２】
「バリア手段」により、我々は、例えば、薄いポリマーのバリア層、ゲルの上側の部分若しくは層の選択的な凍結により形成されるバリア、または、ゲルの上側と下側の部分若しくは層の間のイオン排除膜（ion exclusion membrane）の組み込みまたは適用を意味する。
【００８３】
本方法は、予め形成された下側の層または予め形成されたボディとして、ＷＯ２００９／１５６７６０Ａ２に開示され、また、上述のインプラント可能な生体材料（bio-material）を含んでもよい。
【００８４】
代わりに、本方法は、少なくとも多孔質面上に、リン酸カルシウム結晶（calcium phosphate crystals）を核とする（nucleating）ステップを含むようにすることができる。本方法は、少なくとも多孔質面がリン酸カルシウム溶液中に入るようにゲルを部分的に浸漬するステップ、または、最初にリン酸塩、次にカルシウムイオンを含む溶液に連続して浸すステップを採用してもよい。溶液がゲルを通過し、所定の点を超えて移動するのを阻止するために、バリア手段（上述の通り）を使用してもよい。
【００８５】
さらに代わりに、本方法は、多孔質面にミネラル顆粒（mineral granules）を含有させるステップを含むようにしてもよい。本方法は、顆粒のベッド（bed）の上に、第２の部分または第２の層の少なくとも表面をキャストする（casting）ステップを含むようにしてもよい。顆粒のベッドは、支持面に緩く取り付けられていてもよく、また、そうでなければ、支持面に一時的に固定されていてもよい。代わりに、本方法は、接着剤のような定着剤（fixative）を使用して、多孔質面を成形した後に、顆粒を多孔質面に取り付けるステップを含むようにしてもよい。
【００８６】
本発明の上記形態それぞれに関連して述べられた望ましい特徴は、本発明の他の形態全てに応用されることは認識されるであろう。
【００８７】
本発明のより深い理解のため、及び典型的な実施形態がどのように実施されうるのかを示すために、ここに添付図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の代表的な実施形態によるインプラント可能な修復デバイスの断面の平滑面及び多孔質なボディの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（×５４倍）である。
【図２】図１に示したデバイスの一部の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（×１１０倍）である。
【図３ａ】本発明の実施形態に従って製造されたインプラント可能な修復デバイスの平滑な上面及び顆粒（granule）（小さなサイズ）が埋め込まれた下面を示す側面画像である。
【図３ｂ】本発明の他の実施形態に従って製造された他のインプラント可能な修復デバイスの平滑な上面及び顆粒(大きいサイズ)が埋め込まれた下面を示す側面画像である。
【図４】図３ａ及び図３ｂの２つのインプラント可能な修復デバイスの平滑な上面を示す画像である。
【図５】図３ａ及び図３ｂの２つのインプラント可能な修復デバイスの顆粒が埋め込まれた下面を示す画像である。
【図６】図３ｂのインプラント可能な修復デバイスの可撓性を実証する画像である。
【図７】図３ｂのインプラント可能な修復デバイスの可撓性を実証する別の画像である。
【図８】図３ａの他のインプラント可能な修復デバイスの可撓性を実証する画像である。
【図９】図３ａのインプラント可能な修復デバイスの可撓性を実証する別の画像である。
【図１０】本発明の他の実施形態によるインプラント可能な修復デバイスを示す略図である。
【図１１】本発明の他の実施形態に従って製造された他のインプラント可能な修復デバイスの平滑な上面と多孔質な下面とを示す画像である。
【図１２ａ】本発明によるインプラント可能な修復デバイスの製造方法のステップを示すフローチャートである。
【図１２ｂ】本発明によるインプラント可能な修復デバイスの製造方法のステップを示すフローチャートである。
【図１２】十分な水和状態（full hydration）で、且つ、流体を通じて、ピークフォース・タッピングモードでＡＦＭ Ｂｒｕｋｅｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた本発明によるデバイスの２０μｍ×２０μｍサンプルの３ｄ表面画像である。
【図１４】流体を通じて、ピークフォース・タッピングモードでＡＦＭ Ｂｒｕｋｅｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた図１２の５μｍ×５μｍサンプルの３ｄ表面画像である。
【図１５】図１２及び図１３の３Ｄ表面テクスチャ・パラメータを示す。
【図１６】部分的に乾燥した状態の本発明によるデバイスのサンプルの３Ｄ表面マップを示し、走査型白色光干渉計（white light scanning interferometer）による２０倍の倍率を使用して計測され、約１ｍｍ×１ｍｍの領域が得られたものである。
【図１７】部分的に乾燥した状態の本発明によるデバイスの第２のサンプルの３Ｄ表面マップを示し、走査型白色光干渉計による２０倍の倍率を使用して計測され、約１ｍｍ×１ｍｍの領域が得られたものである。
【図１８】図１６及び図１７の３Ｄ表面テクスチャ・パラメータを示す。
【図１９】繊維層を含む本発明の実施形態による半月板修復デバイスの一例を示す。
【図２０ａ】繊維層を含む本発明の実施形態によるデバイスを有するラット内の皮下インプラントの断面を示す。
【図２０ｂ】繊維層を含む本発明の実施形態によるデバイスを有するラット内の皮下インプラントの断面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
図１０に詳細に示されるように、関節軟骨の修復、オーグメンテーションまたは置換のためのインプラント可能な修復デバイス１は、平滑面３と多孔質面４とを備えるボディ２からなる。
【００９０】
１つの実施形態においては、デバイス１のボディ２の全体は、実質的に多孔質である。孔２ａは、図１及び図２の電子顕微鏡写真に詳細に示されており、ボディ２は少なくとも約８５％の空隙率（porosity）を有する。加えて、孔２ａの少なくとも９５％は"開放"孔（"open" pore）、すなわち孔の大多数は多孔質面に通じており、また、各孔は、ボディ２の内部深くまで、分岐してチャネル２ａの独自のネットワークを形成していると考えられる。これは、ボディ２のあらゆる場所に分布している、独立し及び／または閉鎖した空洞を提供する孔とは対照的である。
【００９１】
分岐した孔のいくつかは、他の孔と交差していてもよい。孔の間のネットワークは、レーザーまたはドリル、あるいは他の孔を空けるデバイスを使用することにより増やすことができる。
【００９２】
平滑面３は、厚みが約５０ミクロンであり、実質的に非多孔質のスキン３ａのその一部（その表面）として、多孔質のボディ２に完全に一体になっていることが示されている。平滑面３／スキン３ａが多孔質のボディ２と一体的に形成されていれば、ボディ２が面３／スキン３ａから層間剥離するリスクは低減する。
【００９３】
多孔質面４は、多孔質のボディ２と連続している。
【００９４】
図３ａ及び図３ｂにはデバイス１の２つの異なる実施形態が示されており、多孔質面４は、リン酸カルシウム顆粒（calcium phosphate granules）５を用いてミネラル化されている。リン酸カルシウム顆粒５は、多孔質面４に、且つ、デバイス１の多孔質ボディ内に埋め込まれている。顆粒５のサイズは変えてもよく、図３ａ（さらに図８及び図９）においては、顆粒５は平均直径が約０．３ｍｍであり、一方、図３ｂ（さらに図６及び図７）においては、顆粒５は平均直径が約１ｍｍである。
【００９５】
別の好適な実施形態（図１０）においては、多孔質ミネラル化構造（porous mineralised architecture）は高い含有量のリン酸カルシウム結晶を有する。これはヒドロキシアパタイトナノ複合材料（hydroxyapatite nanocomposite）の形態で孔の壁を覆う。
【００９６】
さらなる好適な実施形態（図１１）においては、多孔質面はミネラル化されていない。
【００９７】
さらに別の実施形態が図１９に示される。これは半月板修復デバイス１を示している。繊維層６は、多孔質のボディ２と明確に一体化されている。平滑面３を見ることができる。
【００９８】
＜インプラント可能な修復デバイスの特徴＞
デバイスの平滑面は、関節を補助するが、多孔質面は、その位置での（in situ）デバイスの一体化を容易にする。加えて、薄い構成要素としてのデバイスの可撓性は、デバイスを丸めて関節鏡により（arthroscopically）導入することができるということを意味する。
【００９９】
多孔質で、生体適合性があり、ほとんど発熱因子がなく（pyrogen-free）、インプラント可能な上述のデバイスは、極めて有利である。なぜならこれは、既定の目標値のそれに近い圧縮強度（compressive strength）、圧縮弾性率（compressive elastic modulus）及び圧縮靭性（compressive toughness）の特性、及び、優秀な組織再生特性（tissue regenerative properties）を兼ね備えているからである。これらの特性のおかげで、あらゆる緊急（immediate）及び非緊急（non-immediate）の耐荷重アプリケーション（load-bearing applications）及び非耐荷重アプリケーション（non-load-bearing applications）に、デバイスを適合させることができる。
【０１００】
インプラント可能なデバイスの機械的特性と自然の骨及び軟骨のそれらとの類似性は、平常の動作において骨及び軟骨が受ける応力（stresses）を、材料が直接耐えることを可能にしている。従って、ベッドでの療養の期間が長引く必要を回避し、また内部または外部サポート（internal or external supports）の使用を最小限化することができる。そのため、インプラント可能な材料は、耐荷重インプラント位置に使用され、自然の構成要素の全てまたは一部を置換することが可能である。
【０１０１】
インプラント可能な材料の高く且つ開放した空隙率及び適切な平均孔サイズは、例えば細胞、栄養物（nutrients）、組織、流体及び成長中の毛細血管（developing capillaries）が、デバイス内に移行する（migrate）ことを可能し、新たな筋骨格または他の組織の付着を促進する。このことと、インプラント可能な材料の優秀な生体適合性とにより、デバイスの孔の内部で細胞を成長及び分化（differentiate）させることができ、迅速な自然組織の新たな（de novo）生成を可能にする。
【０１０２】
＜本発明によるインプラント可能な修復デバイスの製造方法の概観＞
［再生シルクフィブロイン溶液の調製］
●アンモニアまたはアンモニアイオンを含む水溶液で、シルクまたは繭を処理する。
【０１０３】
アンモニアガス、またはアンモニアあるいはアンモニウム塩の希薄溶液（dilute solution）によるシルクの処理は、臭化リチウム溶液または他のカオトロピック剤にシルクを溶解させる準備（readiness）を大幅に進めさせる。このステップにおいてアンモニウムイオンは、タンパク鎖（protein chains）を取り囲む水の内殻（inner water shell）の除去を補助し、フィブロインの荷電アミノ酸側鎖（charged amino acid side chains）に結合することにより、後続のカオトロピック試薬中へのタンパク質の溶解度を向上させる「塩溶(salting in)」試薬としての役割を果たすと考えられている。この処理は、精練されていない（undegummed）繭に、または生糸繊維（raw silk fibres）に、または伝統的な工業的精練方法による精練であろうが酵素精練（enzymatic degumming）であろうが、精練され、あるいは部分的に精練されたシルクに、直接適用すると効果的であることが判明している。アンモニアまたはアンモニウムイオンも、酵素精練のために使用するバッファ（buffer）の成分として含まれている場合に効果的である。そのため、アンモニアまたはアンモニウムによる処理により、温度、カオトロピック剤の濃度、または溶解に要する時間を、単独または組み合わせて変化させることができ、より軽度（milder）の範囲の処理を可能にする。これらのより軽度の処理は、フィブロイン溶液のゲル化時間をより迅速にし、また過程の終わりには、より頑丈で堅い材料を得ることができる。現在のところ、塩化カリウム等の同じサイズのイオン対（other pairs of ions）も同じ効果を有し、アンモニアの代わりに使用されうると考えられている。このことは、２つの一連の証拠により支持されている。すなわち（１）カリウム及び塩素イオンのJones-Dole粘度（Jones-Dole viscosity）（カオトロピック性の尺度）は、電荷密度がイオン対を形成し、タンパク質の水の内殻を除去するのに役立つ点で類似し(塩化アンモニウムと共通する特性)、また、（２）塩化カリウムは、塩の濃度が通常５０ｍＭから６００ｍＭの範囲で、タンパク質を「塩溶」するために使用されていることであ
る。適切なイオン試薬は、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、硝酸アンモニウム、水酸化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硝酸カリウム、水酸化ルビジウム、塩化ルビジウム、臭化ルビジウム、及び、硝酸ルビジウムの水溶液を含んでいてもよい。
【０１０４】
●選択的にセリシンを除去するより、マイルドな条件下でシルクまたは繭を精練する。これは、セリシンを開裂する（cleaves）が、フィブロインの開裂はごく僅かか全く生じない、適切な酵素を使用して、セリシンを酵素により切り取って除去することによりなされる。
【０１０５】
精練方法の選択は、フィブロインのゲル化時間及び最終的な材料の堅さと頑丈さのために極めて重要であることが判明している。商用の（commercial）繰糸（reeling）及び精練の過程は、どちらも１００℃前後の温度及び炭酸ナトリウム及び／またはマルセル石鹸（Marseile's soap）を使用している。おそらくこの処置の結果として、繰糸された生糸と精練されたシルクは、繭のシルクよりも溶解しにくいことが見出されている。商用のアルカラーゼ（alcalase）（細菌のサブチリシン［bacterial subtilisin］）による精練は、精練温度を６０℃に低下させることを可能にした。アルカラーゼは、セリンＳ８エンドプロテアーゼ属の一種（a member of the Serine S8 endoproteinase family）であり、Ｐ１位置における大きな非荷電性残基（uncharged residue）を選好する広範な特異性（specificity）を有するため、フィブロインをひどく分解する可能性がある。Ｂ．モリ（B. mori）及びサクサン（Antheraea pernyi）の重鎖フィブロイン（heavy chain fibroins）は、この酵素のために多くの予測開裂部位（predicted cleavage sites）を有する。Ｂ．モリのフィブロインのアルカラーゼ開裂（alcalase cleavage）に対する感受性（susceptibility）は、アルカラーゼにより精練されたシルクから調製された再生フィブロイン溶液のポリアクリルアミドゲル電気泳動法（polyacrylamide gel electrophoresis）により確認済みである。トリプシン（trypsin）を用いて精練する場合、従来の高温での精練手順に比べて、精練の温度は２０℃から４０℃まで下げることができ、ゲル化時間が短縮され、堅さと頑丈さが改善されたゲルを得られた。アルカラーゼとは対照的に、ＰｅｐｔｉｄｅＣｌｅａｖｅｒというツールは、Ｂ．モリのフィブロイン重鎖フィブロインの繰り返し結晶領域（repetitive crystalline domains）と親水性スペーサー（hydrophilic spacers）のコンセンサス配列（consensus sequence）中に予測開裂部位はほとんどなく、Ａ．ｐｅｒｎｙｉの重鎖フィブロインのコンセンサス配列または親水性スペーサー中にはなかった（none）ことを示した。このことは、再生フィブロイン溶液の調製のために、トリプシン中でシルクの精練を行うことが有益であると示唆した。トリプシンは、実際に、改善された再生フィブロイン溶液の作成のためのシルクの精練のために、実際にかなり有利であることが判明した。トリプシンで精練したシルクは、アルカラーゼで精練したシルクから調製された再生シルクから得たものに比べて、より短いゲル化時間でより堅いゲルが形成可能な再生シルク溶液が得られた。トリプシンによる精練は、ゲル化剤の一つである氷酢酸蒸気（glacial acetic acid vapour）に曝す５分未満のゲル化時間をもたらし、また最も堅くて頑丈な材料が得られた。このことは、これらの条件下ではトリプシンが、アルカラーゼ処理よりも生成する鎖の開裂が非常に少ない、ということを示唆する。当然のことながら、フィブロインの開裂をごく僅かか全く生じない他のタンパク質分解酵素も、改善された再生フィブロイン溶液の調製のために、シルクを精練するのに有利である。Ｂ．モリの重鎖フィブロインは、プロリン（proline）をごく僅かしか含まず、一方このアミノ酸はセリシンが比較的豊富であるという観察結果は、プロリンエンドペプチターゼ（proline endopeptidase）が、セリシンを選択的に除去するがフィブロインにはごく僅かか全く損傷を生じさせない、理想的な候補となり得ることを示唆する。４０℃の炭酸アンモニウムバッファ中でトリプシンで精練した繭または生糸を使用すると、さらに有利になると考えられる。
【０１０６】
●水を抽出することにより、シルクまたは繭を乾燥させる。
【０１０７】
●６０℃未満のいずれかの温度で、及び／または、９．５Ｍ未満の臭化リチウム濃度で、及び／または、２４時間未満の時間に亘り、含水臭化リチウム（aqueous lithium bromide）（カオトロピック剤）溶液中に、シルクまたは繭を溶解する。
【０１０８】
●約４−５０℃の範囲の温度で、超純水を用いた透析により、カオトロピック剤を除去する。フィブロイン溶液は濃縮してもよい。
【０１０９】
シルク溶液からカオトロピック剤を除去するために、超純水（ultrapure water）としても知られているタイプＩ ｍｉｌｌｉＱ水（Millipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821, USから入手可能)に対して、再生フィブロイン溶液を透析することが、非常に有益であると判明した。なお、ＰＩＰＥＳ、トリスバッファ（Tris buffers）、または、脱イオン水中の不純物（impurities）は、透析剤（dialysants）として使用すると、最終生成物の堅さ及び頑丈さに不利に影響したことを特に言及する。なお、ＰＩＰＥＳまたはトリスバッファ、または脱イオン水中の不純物を透析剤中に含有すると、おそらくフィブロイン鎖に結合することによるフィブロイン鎖の凝集（aggregation）を促進する能力の結果として、再生シルクフィブロイン溶液の粘度が上昇することを特に言及する。これは、頑丈で堅いフィブロインゲルの形成に不利であると考えられる。
【０１１０】
Ａ．再生シルクフィブロイン溶液からの一体型デバイスの調製
●フィブロイン溶液を含む透析バッグ／膜を、成形容器（shaped vessel）中に配置し、透析バッグを両端でクランプし、要求されるデバイスの形状を得る。これにより、バッグを都合の良いモールドの形状に引き伸ばすとともに、また、膜にしわを生じさせることがある、その後のモールドへの移動の必要性をなくす。代わりに、ボディに平滑面を提供するように適合されている。研磨面（polished surface）を有するモールドに溶液を移動する。
【０１１１】
１％酢酸中に室温で６時間まで、８ｍｍの奥行（deep）のコンポーネントを作り出すための透析容器に入った、トリプシンで精練されたシルクから調製された、８−１０％ｗ／ｖの最適化された再生フィブロイン溶液を、ゲル化することが有利であることが判明している。透析バッグの中で、溶液はゲル化される。
【０１１２】
ゲル化不足のフィブロインの凍結は、孔のサイズの縮小及び材料の弱体化を招き、一方、強いゲル化過剰は、大きな氷の結晶により作られる大きな割れのある低い密集状態を含む非多孔質のゲルが生じることが判明している。最適なゲル化のために必要なバッファまたは蒸気の暴露時間の長さ及び濃度は、フィブロイン・キャスト（cast）の形状及びサイズにより決まることが判明している。よって、直径１０ｍｍ透析管と比較すると、直径２０ｍｍ透析管から構築されるモールド中のフィブロインの最適なゲル化のためには、より長時間の処理が必要となる。
【０１１３】
●１回（またはより多くの）凍結サイクルをゲルに受けさせる。各凍結サイクルは、凍結ステップと解凍ステップとからなる。ゲルを凍結させることにより、水滴は、ゲル内にポケットまたは孔を形成する氷晶に変化する。１以上の凍結サイクルをゲルに受けさせると、開放孔の度合いをより大きくすることができる。
【０１１４】
凍結は、フィブロインが豊富な相とフィブロインに乏しい相との相分離を生じ、氷晶は後者において形成されると考えられている。これら２つのメカニズムは、組み合わされて、ゲル中の開放孔の密度を高めると考えられる。凍結ステップによって孔の壁の中のフィブロインは水及び他のほとんどの水性溶媒に不溶性となり、これは不溶性のシルクＩＩ状態（silk II state）に部分的に変換されたことを示唆する。この状態では分子内結合及び分子間結合した（intra- and inter -molecularly bonded）βシート（beta-sheets）が優勢になっている。シルクＩＩ状態への転移は、いずれも氷晶形成の論理的帰結である相分離と、その整列及び引っ張り合いとの組み合わせにより生じた、タンパク鎖からの水の除去に起因するのかもしれない。よって、不溶性のシルクＩＩ状態の形成は、むしろ、シルクが蚕から吐き出される自然の過程の忠実な模倣（mimics）である。蚕からの場合のプロセスも、相分離、フィブロインが豊富な相からの水の消失、歪みに依存する配向（strain dependent orientation）、及び、シルクＩＩ型の形成によるものである。１回の凍結サイクルでは、凍結ステップの温度が孔のサイズに影響し、最も大きな孔は−１２℃から−１８℃の間の凍結により生じる。温度を変化させ、また再生タンパク質溶液に低濃度の不凍液（antifreezes）または糖類を含ませることは、氷晶のサイズ及び形態（morphology）を変化させるために、従って、材料中の孔のサイズ及び形状を変化させるために使用できる。凍結サイクルの数を増やすと、氷晶による損傷の結果、孔のサイズの増大を生じた。これは、最終材料の堅さ及び頑丈さに多少の損失を伴った。最適化された再生フィブロイン溶液中に開放孔を導入するために、ゲル化と凍結以外の方法が使用できるということは理解されるだろう。一例として、これらには、ソルトリーチング（salt leaching）やガスフォーミング（gas foaming）が含まれる。
【０１１５】
ゲル化の前のフィブロイン溶液中に、他の要素を導入することが可能であり、これらには、例えば繊維層、短いステープル繊維（short staple fibres）、充填粒子（filler particles）、薬品（drugs）、抗がん薬（antineoplastic drugs）、抗生物質（antibiotics）、他の生物高分子（biopolymers）及び他の有効成分（active principles）を含む。特に、多くの場合、繊維は、透析ステップの開始時に組み込まれるが、繊維は、ゲル化に先立つほとんど全てのステップにおいてボディ内に組み込むことが可能である。
【０１１６】
●材料をエタノール水溶液に浸し（immerse）、部分的に脱水し、フィブロインのシルクＩＩ型（βシート）の形成を促進する。
【０１１７】
凍結後にエタノール水溶液で材料を処理すると、シルクＩＩ型（βシート）の分子間及び分子内の水素結合の形成を促進すると考えられる。これはゲルの機械的安定性を改善し、不溶性及び酵素の攻撃に対する耐性を増す。
【０１１８】
●蒸留水（distilled water）または生理食塩水（saline）で材料を再水和する（rehydrated）。また、切開し、対象とする多孔質面のボディ内の孔を露出させてもよい。
【０１１９】
材料は、場合によっては、ジメチルスルホキシド（dimethylsulphoxide）またはその他の有機溶媒中の無希釈のイソシアネート（undiluted isocyanate）または高濃度のイソシアネート溶液（highly concentrated isocyanate solution）を使用して、フィブロインを架橋する（crosslinking）付加的なステップを含むことができる。この場合、過剰のイソシアネート（及び溶媒）はその後除去される。このステップは、エタン酸洗浄（ethanoic washing）と再水和との間に導入してもよい。
【０１２０】
Ｂ．ヒドロキシアパタイトを用いた再生シルクフィブロイン溶液からの一体型デバイスの調製
●上述のように、フィブロイン溶液は調製方法Ａにおいてゲル化される。一方、リン酸イオンを含む高濃度のバッファ溶液でフィブロイン溶液を処理することにより、フィブロイン溶液中にリン酸イオン（phosphate ions）が導入される。好適な実施形態においては、緩衝化されたリン酸溶液は、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（トリス）バッファ（2-amino-2- (hydroxymethyl)propane-l,3-diol (Tris) buffer）で緩衝化され、アルカリｐＨに調整された、リン酸二水素ナトリウム（dihydrogen sodium phosphate）からなる。リン酸二水素ナトリウムの濃度は、１％トリスバッファ中に０．９Ｍであり、ｐＨ９．０に調整されている。
【０１２１】
リン酸二水素ナトリウムの濃度及びそれに材料を曝す長さは、生じるゲルの孔のサイズ及び堅さと頑丈さにとって極めて重要である。リン酸イオンの存在下で溶液をゲル化することで、リン酸イオンは溶液全体に亘って分布することができ、そのため、ゲルの中に溶け込むことが発見された。これは、後の段階でカルシウムイオンが添加されるときに、フィブロイン−アパタイトナノ複合材料（fibroin-apatite nanocomposite）の形成を促進する。ゲルがその後リン酸イオンで処理されると、後のステップでカルシウムイオンが添加されたときに、アパタイト被覆が実現されることが判明した。好適な実施形態は、単一のステップの中にリン酸イオンの導入とフィブロイン溶液のゲル化を組み合わせるが、リン酸イオンを導入する前に、他のゲル化剤またはゲル化方法を使用してフィブロイン溶液をゲル化することもできる。例として、熱（heat）、マイクロ波放射（microwave radiation）、超音波処理（ultrasound treatment）、レーザー光線照射（laser radiation）、酸性溶液（acidic solutions）及び酸性蒸気（acidic vapours）を含む。
【０１２２】
●カルシウムイオンを含む高濃度のバッファ溶液でフィブロインゲルを処理し、フィブロイン−アパタイト材料を形成する。アパタイトは、ナノ複合材料として孔の壁の中及び上に存在する。緩衝化されたカルシウム溶液は、これもトリスでアルカリｐＨに緩衝化された塩化カルシウム（calcium chloride）からなる。
【０１２３】
カルシウムイオンは、リン酸イオンとともにアパタイトを形成する。ゲル化前に、リン酸イオンがフィブロイン溶液全体に亘って分布されると、フィブロイン−アパタイトナノ複合材料を得られる。しかしながら、もしフィブロイン溶液がまずゲル化され、続いてリン酸イオンで処理されたとすると、アパタイト被覆は観察されるが、ナノ複合材料は観察されない。塩化カルシウムの使用は、アパタイトの塩素置換（chloride substitution）を多少誘発する。このことは、置換されていないヒドロキシアパタイトと比較して、アパタイトの吸収（resorption）を加速すると考えられているので、望ましい。さらなる実施形態は、塩化カルシウム溶液の代わりに硝酸カルシウム溶液（calcium nitrate solution）を使用する。これにより、アパタイト中の塩素の存在を回避し、部分的に塩素置換したヒドロキシアパタイト（すなわち、一部塩素アパタイト、一部ヒドロキシアパタイト）よりも、純度の高いヒドロキシアパタイトの形成をもたらす。材料は、塩基性ｐＨ（basic ph）でカルシウムイオンにより処理されて、このことにより、酸性または非晶質のアパタイトの形成を避ける。ｐＨが約９．０で、カルシウムイオンにより材料が処理されたときに、良好な結果が得られた。
【０１２４】
●エタノール中で部分的に脱水した後、例えば真空乾燥（vacuum drying）またはエタン脱水素（ethanoic dehydration）によって、できるだけ多くの遊離水（free water）を材料から取り除く。
【０１２５】
●ジメチルスルホキシド（dimethylsulphoxide）またはその他の有機溶媒中の無希釈のイソシアネート（undiluted isocyanate）または高濃度のイソシアネート溶液を使用して、材料中のフィブロインを任意に架橋する。
【０１２６】
架橋は、インプラント可能な修復デバイスの堅さを増強し、且つ、酵素の攻撃に対するデバイスの耐性を強化し、その結果吸収が遅くなる。膨張剤（swelling agent）を使うと、フィブロインを膨張させ、フィブロインからアパタイトが分離することが判明した。従って、これは材料の堅さを減じ、材料に可撓性（flex）をもたらすようになり、また、アパタイトの材料からの「剥がれ落ち」（'flake' out）を引き起こす。また、フィブロイン−アパタイトをイソシアネート架橋剤に曝す長さを変化させることは、共有結合性の架橋の密度を調整するために利用でき、したがって、インプラント可能な修復デバイスの堅さを調整するために利用できることも判明した。また、共有結合性の架橋の密度を変化させることは、フィブロインゲルの酵素攻撃に対する耐性も変化させ、その結果、制御された方法で吸収時間を延長させるために使用可能であることも判明した。前掲の（op.cit.）Arai, T, Ishikawa, H., Freddi, Winkler, GS及びTsukada, M (2001)により記述され、公開されたプロトコル（protocol）を使用して、材料中のフィブロインをジメチルスルホキシド（dimethylsulphoxide）（ＤＭＳＯ）中の２０％ヘキサメチレンジイソシアネート（hexamethylene di-isocyanate）溶液で架橋する試みは、満足のいくインプラント可能な修復デバイスを作り出すことができなかった。公開されたプロトコルにおいて、ＤＭＳＯ内でのフィブロイン−アパタイトの膨張が、フィブロインからのミネラルの分離を生じさせたことが原因と考えられる。それため、この方法は、水やジメチルスルホキシドのような他の膨張剤がない場合に、イソシアネート架橋剤を使用する。
【０１２７】
●材料を乾燥溶媒で処理することにより、過剰のイソシアネートを除去する。
【０１２８】
徹底した洗浄により過剰の架橋剤を除去しておけば、イソシアネート架橋は、材料の生体適合性を阻害するようなことはない。このことは、生体外で（in vitro）多孔質フィブロイン−アパタイトナノ複合材料上及びその中でヒト間質細胞（human stromal cells）を育て、及び、生体内（in vivo）でマウスへの皮下移植の後に立証されている。
【０１２９】
ミネラル化（mineralisation）により、既存のヒトの骨の耐荷重性能と同じような性能を得られる。
【０１３０】
Ｃ．ヒドロキシアパタイトナノ複合材料部分を用いた一体型デバイスの調製
上記の方法は、多孔質面を有し、且つ、カルシウムイオンに平滑面が曝されていない、ゲル・デバイスの第２の部分のみがヒドロキシアパタイトを形成するように適合されている。これは２つの方法のうちの１つで達成される。
【０１３１】
第１の方法では、多孔質面及び多孔質面に隣接する第２の部分は、カルシウムイオン溶液中に浸される。このとき平滑面を有する第１の部分は、カルシウムイオンに曝されないようにする（部分的浸漬［partial submergence］）。そのため、第１の部分及び平滑面は、カルシウムイオンを用いたヒドロキシアパタイトを形成しない。
【０１３２】
第２の実施形態は、単独で、または、部分的浸漬に加えて使用することが可能であり、平滑面を有する第１の部分と多孔質面に隣接する第２の部分との間にバリア手段が提供されている。バリア手段は、カルシウムイオンが第１の部分に到達することを阻止する、及び／または、カルシウムイオンがリン酸イオンと反応することを阻止する、任意の適当な手段を含むことができる。
【０１３３】
Ｄ．ヒドロキシアパタイトナノ複合材料またはその他の骨生体材料（bone biomaterials）を用いた積層デバイスの調製
ミネラル化されていない、すなわち、リン酸の存在下でゲル化されず、その後カルシウムイオンに曝されず架橋もされていない第１の層が、予め形成された第２の層の上に提供されている。
【０１３４】
第１の方法においては、平滑面を作成することを何ら考慮することなく、上述の方法Ａを用いて、第２の層が形成、ミネラル化及び架橋される。第２の層として、代わりに、あらゆる適切な骨材料を用いることもできる。第２の層は、例えば透析膜のような、平滑面を提供するのに適合したモールド内に配置される。第１の層は、リン酸イオンの存在なく、第２層の上にそのままの位置で（in situ）ゲル化され、続いて、凍結（及び潜在的に解凍）ステップを受けさせて、第１の層に孔を形成し、上述のように部分的にエタノールで脱水され再水和される。第１の層は、ミネラル化されていない。
【０１３５】
第２の方法においては、第１の層は、孔が予め形成されているが、リン酸イオンに曝されていない。孔を伴う第１の層は、予め形成されたヒドロキシアパタイトナノ複合材料の第２の層に固定／接着される。第２の層として、代わりに、任意の適切な骨材料を用いることもできる。２つの層を互いに固定するために、適当な接着剤を使用してもよい。
【０１３６】
第３の方法において、第２の層は、リン酸イオンに曝されたゲルとして予め形成されている。第２のゲル層は、平滑面を提供するのに適合したモールドに移動させられる。第１の層は、リン酸イオンの存在なしに、第２のゲル層上にゲル化される。２つの層は、凍結及び解凍ステップをともに受けさせられる。カルシウムイオンは、上述のようにして導入される。カルシウムイオンが導入されると、カルシウムイオンは、第２の層の中のリン酸イオンとヒドロキシアパタイトナノ複合材料を形成するのみであり、よって、第１の層はミネラル化されない。
【０１３７】
Ｅ．ミネラル化された多孔質面を伴うデバイスの調製
フィブロイン溶液はモールドに移され、先の調製方法Ａの通りゲル化される。先の通り、ゲルは１以上の凍結サイクルを受けさせられる。２つの方法のうちの１つの過程で、デバイスの多孔質面にリン酸カルシウム顆粒が塗布される。
【０１３８】
第１の方法においては、フィブロイン溶液は、顆粒がボディ内に埋め込まれ、ゲルの多孔質面に面（face）を示すように、リン酸カルシウム（またはバイオセラミック［bio ceramic］、バイオガラス［bio glass］または硫酸カルシウム顆粒［calcium sulphate granules］のような他の適当な骨生体材料）のベッド（bed）の上にゲル化される。
【０１３９】
第２の方法においては、ゲルは、切開されて孔を露出させてもよく、顆粒は、対象とする多孔質面上で、ボディ内に埋め込まれる。
【０１４０】
代わりの方法では、リン酸カルシウム（またはバイオセラミック、バイオガラスまたは硫酸カルシウム顆粒のような他の適当な骨生体材料）が、適当な接着剤を用いて、多孔質面に固定される。
【０１４１】
上記の実施形態のいずれにおいても、繊維または繊維層も利用されうる。繊維または繊維層は、透析バッグの内側に配置されうる。シルクフィブロイン繊維層を採用すると、充填されたバッグ（filled bag）を、シルクフィブロイン繊維の表面が部分的に溶解することのできる時間放置することができる。このことは、デバイスがゲル化される際に、連続シルクフィブロイン繊維マトリックス複合材料（continuous silk fibroin fibre-matrix composite）の形成を許容し、デバイスの全体的な頑丈さを改善するので有益である。繊維層は、精練された桑蚕シルクフィブロイン繊維から製造することができる。
【０１４２】
一つの実施形態において、繊維層は、バッグを上側と下側の部分にほぼ分割するように、透析バッグの内側に配置することができる。繊維層の隙間（interstices）は、顆粒が繊維層を通り抜けるのを妨げるのに十分な小ささである。（カオトロピック剤を伴う、または伴わない）シルクフィブロインの混合物と顆粒とは、分割された透析バッグの下側の部分に配置され、（カオトロピック剤を伴う、または伴わない）シルクフィブロインは透析バッグの上側の部分に配置される。バッグと繊維層は、バッグの両端でクランプされて、繊維層を透析バッグの長手方向に沿う位置に保持し、且つ、デバイスの下側部分に顆粒を分離する（segregate）。続いて、デバイスは、透析され、ゲル化され、（上述のように）凍結され、そして（エタン酸脱水により）硬化され、多孔質の面及び埋め込まれた顆粒が露出するように、デバイスから透析バッグが除去され、且つ、下側の面が除去される。
【０１４３】
代わりに、顆粒は、２つの上述の繊維層の間に、顆粒数個分の深さの厚さで配置されている。その間に顆粒が挟まれた（sandwich）繊維層は、続いて、透析バッグ内に長手方向に配置され、バッグを閉じ、繊維層及び挟まれた顆粒がバッグの中心を貫いて延びるように保持するように、バッグ及び２つの繊維層はクランプされる。続いて、バッグには（カオトロピック剤を伴う、または伴わない）フィブロイン溶液が充填され、繊維層とバッグは他端でクランプされ、続いて全体が成形容器内に配置され、上述したように繊維層の表面が溶解できる期間放置される（しかし繊維層の構造まで危うくするような長さではない）。それから、全体が透析され、ゲル化され、（上述のように）凍結され、そして（エタン酸脱水により）硬化されて、透析バッグが除去される。これに続き、顆粒及び内側のフィブロイン孔が露出されるように、ゲルは、顆粒の中心にそって長手方向に切断される。これにより、それぞれ（透析バッグと近接していた）平滑面、及び、多孔質の顆粒が埋め込まれた面を備える２個のほぼ同一のデバイスを得ることができる。
【０１４４】
上述のいずれにおいても、複数の繊維層を採用して、得られるデバイスの構造的な頑丈さを増強するようにしてもよい。
【０１４５】
＜インプラント可能な修復デバイスのインプラント方法の概観＞
好適な実施形態において、デバイスは、最初に組織培養細胞（tissue cultured cells）と播種する（seed）ことなく、しかし、多孔質面は、患者の骨または軟骨の面に隣接し、平滑面は、関節部材を受けるのに適した位置に配置されるように、生体内にインプラントされる。
【０１４６】
代わりに、デバイスは、インプラントに先立って、自家（autologous）若しくは同種（allogeneic）の組織培養細胞、または、血液（blood）、骨髄（bone marrow）、多血小板血漿（platelet-rich plasma）若しくはインプラントの直前に患者から採取した細胞と直接播種させることができる。
【０１４７】
一例ではあるが、このような組織培養細胞には、骨髄間質細胞（bone marrow stromal cells）、間充織幹細胞（mesenchymal stem cells）、骨形成原細胞系列（osteogenic cell line）、または軟骨細胞（chondrocytes）が含まれる。さらに代わりとして、デバイスに細胞を播種し、それから、適用された周期的負荷（cyclical strain）を伴ってまたは伴わずに、組織培養（tissue culture）を受けさせ、インプラントに先立って、デバイス内での組織の形成を早めることができる。
【０１４８】
デバイスのサイズ及び形状は、異なる用途（applications）のために変化させることができる。従って、適切に成型されたモールドの中で材料をキャストする（cast）ことにより、または、材料の大きなブロックを研磨（grinding）、切断（cutting）若しくはその他の機械加工により、解剖学的に成型されたデバイス（anatomically-shaped device）を製造することができる。代わりに、表面再建（resurfacing）の適用のために、キャスト、または機械加工、またはこれらの過程の組み合わせにより、ディスク（disks）を製造することができる。また材料は、手術室（theatre）内で外科用メス（scalpel）またはその他の道具を使用して成型して、材料が収められる所望のスペースまたは窪み（cavity）に近付けることができる。
【０１４９】
＜選択形態（select embodiments）の具体的な方法＞
実施例１：繰糸された生糸または繭からの最適化された再生フィブロイン溶液の調製、及び、最適化された再生フィブロイン溶液からの一体型のインプラント可能な修復デバイスの調製プロトコル
［シルクの供給（Silk Supply）］
未加工の桑蚕のシルク繊維（ボンビックス・モリ）を使用した。好適な仕様は、ブラジル産、２０／２２デニール、単一のかせ（skeins）、オン・ハンク（on hank）、２歳を超えないものである。好適なシルク供給業者（supplier）はＳｉｌｋ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ Ｌｔｄ．である。
【０１５０】
［精練（Degumming）（図１２ａ）］
７．１１ｇの重炭酸アンモニウム（Ammonium bicarbonate）
６．７５ｇのＥＤＴＡ
０．１８ｇのブタトリプシン（porcine trypsin）
１．８ｇのＴｗｅｅｎ−２０溶液
Ｍｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ  グレード１の水（２５℃における比抵抗値［resistivity］１５−１８．２ＭΩ・ｃｍ）
６０ｇのシルク
１．シルクのかせを取り、シルクを結束していた紐を切る。紐は廃棄する。：
２．かせを＋／−５ｃｍの片にカットし、バッグの中に広げる（spread them open）。：
３．カットしたシルク片６０ｇを４．６ｌのボックス（box）の中に計り取る。：
４．６００ｍｌのガラス製ビーカー及びプラスチック製秤量ボート（weighing boat）を取る；ボートにＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウム及びＴｗｅｅｎ−２０を計る；ガラス製ビーカーに、これと６００ｍｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水を加える：磁気撹拌器（magnetic stirrer）を使用して溶解するまで撹拌する。：
５．溶解したら、冷蔵庫からトリプシンを取りだして計量する。：
６．ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウム及びＴｗｅｅｎ−２０を含む６００ｍｌの水にトリプシンを加える；溶解するまで手動で（manually）撹拌する。：
７．ステップ６からの６００ｍｌの溶液をシルク片の入ったボックスに加える；さらに、１２００ｍｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水を加える。：
８．十分に濡れた状態になるまで、溶液内のシルク片を撹拌する。：
９．４．６ｌのボックスの封をして（seal）、振とう培養器（shaker incubator）内に入れる。：
１０．振とう培養器のタイマを、３７Ｃ、１５０ｒｐｍで、４時間にセットする。：
１１．４時間後、ふるい（sieve）を通して溶液を排水し（drain）、精練されたシルク（フィブロイン）片を分離する。
【０１５１】
［洗浄／乾燥（Washing/Drying）（図１２ａ）］
ステップ１１からの精練されたフィブロイン片
２ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０
Ｍｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ  グレード１の水（２５℃における比抵抗値１５−１８．２ＭΩ・ｃｍ）
水道水（Tap water）
１２．ふるいを通して水道水を流し、フィブロイン片を洗浄する。：
１３．１．５ｌの防水プラスチックタブの中にシルク片を入れ、２ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０と共に、１ｌの水道水を加える。：
１４．手動で（by hand）しっかりと振り、５分間放置する。：
１５．ふるいを通してフィブロイン片を排出する。：
１６．ふるいを通して水道水を流し、フィブロイン片を洗浄する。：
１７．フィブロイン片を洗浄機（washing machine）の中に入れる。：
１８．５ｌの温かい水道水を加える。'ｄｒａｉｎ'の設定で、洗浄機の１５分間の洗浄サイクルを作動させる。：
１９．ステップ１８をさらに３回繰り返す。：
２０．５ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水を加える。'ｄｒａｉｎ'の設定で、洗浄機の１５分間の洗浄サイクルを作動させる。：
２１．ステップ２０をさらに３回繰り返す。：
２２．洗浄おけ（washing tub）の脱水側（spin side）にフィブロイン片を移す。：
２３．５分間脱水する。：
２４．洗浄おけからフィブロイン片を取り除き、ペーパータオルの上に広げて、夜通し（overnight）で空気乾燥させる。：
２５．フィブロインの重さが４５ｇ未満ならば、ステップ２６に進むのに十分乾燥されている。フィブロインの重さが４５ｇを超える場合は、真空オーブン（vacuum oven）を使用して、さらに乾燥させる。これを行うため、フィブロイン片をオーブンの中へ配置する。ドアを閉め、ロックする。真空ポンプ（vacuum pump）のスイッチを入れ、オーブンの上バルブ（top valve）を閉め、オーブンの下バルブ（bottom valve）を開け、コールドトラップ（cold trap）のスイッチを入れ、コールドトラップの蓋（lid）を閉め、オーブンのゲージ（gauge）が１０００ｍＢａｒに達するどうかチェックする。１時間放置する。
【０１５２】
フィブロインは、この段階においては、室温で１週間まで保存することが可能である。
【０１５３】
［溶解（Dissolving）（図１２ａ）］
ステップ３からの精練、洗浄、乾燥されたフィブロイン
３６９．０９ｇの臭化リチウム（ＬｉＢｒ）
Ｍｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ  グレード１の水（２５℃における比抵抗値１５−１８．２ＭΩ・ｃｍ）
２６．ＬｉＢｒ溶液を作成するため：３６９．０９ｇｇのＬｉＢｒを計量し、磁気撹拌しながら５００ｍｌのビーカー内の３００ｍｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水に静かに注ぐ（注意：発熱反応［exothermic reaction］）。溶解したら、５００ｍｌ計量三角フラスコ（500ml measuring Erlenmeyer）に上面５００ｍｌの線までＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水を注ぎ入れ、８．５Ｍ溶液を得る。：
２７．ステップ２５からのフィブロインの重さを５倍にし（multiply〜by a factor of five）、（ｍｌ単位で）所望の量のＬｉＢｒ溶液を得る。：
２８．フィブロインを１ｌのボトルに入れ、ステップ２６から算出されたＬｉＢｒ溶液を計量して加える。ボトルに栓をして（stopper）、ボトルホルダーに入れ、振とう培養器に入れる。：
２９．振とう培養器を３７℃、２００ｒｐｍで１０時間にプログラムし、その後１０℃、７５ｒｐｍに戻す（revert）（標準的な手順としては、通常の労働時間にフィットさせるために、午後４時（4pm）に溶解過程を開始して、次の日の午前１０時（10am）に振とう培養器から取り出す）。：
３０．直接ステップ３１に進む。あるいは、溶解フィブロイン／ＬｉＢｒ溶液を４℃で１日間、冷蔵庫に保管してもよい。
【０１５４】
［透析（Dialysis）（図１２ｂ）］
ステップ３０からの溶解フィブロイン／ＬｉＢｒ溶液
Ｍｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ  グレード１の水（２５℃における比抵抗値１５−１８．２ＭΩ・ｃｍ）
３１．プラスチック製のふるいを通して溶解フィブロイン／ＬｉＢｒ溶液をふるいにかけ、６００ｍｌのビーカーに入れる。：
３２．２５ｃｍの長さに透析膜（dialysis membrane）を切り、５分間より長く水の中で軟化させ、Ｍｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水を透析膜を通して流し、透析膜の内側をすすぐ。：
３３．軟化させた透析膜の一端に結び目を作る（tie a knot）。：
３４．結び目に隣接して、且つ、結び目の上に、透析膜にクランプ（clamp）を配置する。：
３５．クランプのヒンジを有さない端部の周りにゴムバンド（elastic band）を繰り返し巻くことにより、クランプによる締め付け（closure）を強くする。：
３６．ループ状のゴムバンドを用いて、透析膜の他端に１ｃｍのプラスチック製シリンダーを固定し、透析膜を開いた状態に保持し、フィブロイン／ＬｉＢｒ溶液を透析膜に注ぎやすくする。：
３７．下側モールドの中央部に沿って軟化した透析膜を対称的に配置し、しわを伸ばす。：
３８．所定の位置に上側モールドを配置し、（４個のネジ［screws］と４個のウィングナット［wingnuts］で）透析膜を狭持するようにモールドをネジ止めする。：
３９．フィブロイン／ＬｉＢｒ溶液をシリンジ（syringes）に注ぎ入れ、先端に気泡が集まるようにして空気を抜く。：
４０．透析膜に１５ｍｌのフィブロイン／ＬｉＢｒ溶液を注入し（inject）、気泡を除去し、クランプされた透析膜に空気が閉じ込められないように、第２のクランプを用いてクランプする。ゴムバンドを用いてクランプをしっかりと固定し、透析膜の端部を流水で洗い流し、第２のクランプに近い位置に結び目をつくる。：
４１．４．６ｌのボックスごとに１つのモールドを配置し、３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水を加える。ボックスの封をする。：
４２．室温で２時間放置する。空にして、３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水をリフレッシュする（refresh）。ボックスの封をする。：
４３．一晩放置し、次の日の朝及び晩に、３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水で同様のことを繰り返す。：
４４．一晩放置し、朝に、３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ／Ｅｌｉｘ水（２５℃における比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｔｅｇｒａｌ ５ ｕｎｉｔ）でリフレッシュする。：
ステップ４２から４４を通じて、多くの場合、ボックスは、"穏やかな振動"で継続的に撹拌すべきである。：
４５．午後まで放置し、続いて、透析液（dialysate）にＬｉＢｒが残っているかどうか検査する。：
４６．０．５ｍｌの透析液を取り、１．５ｍｌのエッペンドルフ（eppendorf）内の０．５ｍｌの１％硝酸銀（silver nitrate）を加える。：
４７．蓋をして、振って、３０分間、環境の自然光（ambient natural light）の中（例えば窓台［windowsill］）に放置する。：
４８．黒い沈殿物（precipitation）は、まだＬｉＢｒが存在し、さらに透析が必要であることを示す。：
４９．４．６ｌのボックスを３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水でリフレッシュし、一晩放置する。：
ステップ４６から４９の代わりに、再生フィブロイン溶液中の残留ＬｉＢｒの検査は、溶液中に配置される、電解導電率計（conducting/ electrolysis meter）を利用することができる。もし、５０μＳ／ｃｍ（マイクロジーメンス毎センチメートル）以上の導電率が計測された場合、溶液をさらに透析を受けさせることができる。ただし、より高い導電率が容認されると解釈される。：
５０．許容できる程度にＬｉＢｒが透析液から取り除かれるまで、透析を繰り返す。：
５１．ＬｉＢｒを含まない透析液からモールドを取り除き、最低４時間、または十分に凍結するまで、冷凍装置（freezer）に入れる。
【０１５５】
［ゲル化（Gelling）（図１２ｂ）］
ステップ５１からの固定されたモールド内のクランプされた透析膜内のフィブロイン溶液
氷酢酸（１００％）（Glacial (100%) Acetic acid）
Ｍｉｌｌｉ Ｑ水（２５℃における比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ）
５２．凍結した透析膜及びフィブロイン溶液からモールドを除去する。：
５３．４．６ｌのボックスを１．５ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水で満たす。：
５４．１５ｍｌの酢酸（acetic acid）を加え、１％の酢酸溶液を得る。：
５５．１％酢酸中に、凍結した透析膜及びフィブロイン溶液を水平に置く（ボックスごとに２つ）。別に２分間が与えられ、後にモールドを閉める。ボックスの封をする。：
５６．酢酸溶液中に２時間放置する。：
５７．酢酸溶液から取り除き、モールド内に戻す。ネジ及びウィングナットでモールドを固定する。：
５８．直接ステップ５９に進む。
【０１５６】
［凍結（Freezing）（図１２ｂ）］
ステップ５８からの固定されたモールド内のクランプされた透析膜内のフィブロインゲル（fibroin gel）
５９．ステップ５８からの固定されたモールド内のクランプされた透析膜内のフィブロインゲルを冷凍装置内に置く。：
６０．少なくとも２日間に亘って、−−１８Ｃで凍結させる（この段階で不定期に（indeterminately）貯蔵することが可能である）。：
６１．１２時間後、再利用のためにモールドを除去可能である。
【０１５７】
［硬化（Hardening）（図１２ｂ）］
ステップ６１からの固定されたモールド内のクランプされた透析膜内の凍結フィブロインゲル（frozon fibroin gel）
１００％エタノール
Ｍｉｌｌｉ Ｑ水（２５℃における比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ）
６２．４．６ｌのボックスを１ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水で満たす。：
６３．５０％溶液を得るため、１ｌの１００％エタノールを加える。：
６４．透析膜内の凍結フィブロインゲルデバイスからモールド及びクランプを取り除く。：
６５．１つのボックス当たり最大で８つ、透析膜内の凍結フィブロインゲルデバイスを５０％エタノール内に配置する。：
６６．ボックスの封をして、室温で２日間放置する。
【０１５８】
［洗浄（Washing）（図１２ｂ）］
ステップ６６からの透析膜内の硬化フィブロインゲル（hardened fibroin gel）
Ｍｉｌｌｉ Ｑ水（２５℃における比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ）
６７．４．６ｌのボックスを３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水で満たす。：
６８．透析膜内の硬化フィブロインゲルをエタノールから取り、４．６ｌのボックス内のＭｉｌｌｉ Ｑ水に入れる。ボックスの封をする。：
６９．２４時間後に水を捨てて、３ｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水でリフレッシュする。：
７０．ステップ６９をさらに２回繰り返す。
【０１５９】
［切断（Cutting）］
７１．清潔なカミソリの刃を用いて、透析膜及びデバイスの平滑面の１つの一部を切り取り（cut away）、多孔質のボディを露出させる。透析膜と平滑な切れ端は廃棄する。
【０１６０】
実施例２：最適化されたフィブロイン溶液からの、ミネラル化された表面を備えた、一体型インプラント可能な修復デバイスの調製のための第１のプロトコル
１．上記実施例１に示された通り、１０％ｗ／ｖのボンビックス・モリの最適化された再生フィブロイン水溶液（aqueous solution）を調製した。：
２．平均直径が１００ミクロンから３ｍｍの間である、（天然及び合成の両方のポリマー、成長因子［growth factor］、細胞またはその他の生物製剤［biologics］との組み合わせの）多孔質の骨材料の顆粒を、ステップ１からの溶液と混ぜた。実際には、実施例１のステップ２９／３０の後で、ステップ４１の溶液の透析の前のいずれかの時点で、フィブロイン溶液に混ぜてもよい。：
３．必要な大きさのヴィスキング・バッグ（Visking bag）（分画分子量［molecular weight cut-off］１２−１４ｋＤａ）に混合液を収容した。：
４．（例えば、必要な厚みを有する平らなデバイスを得るためには、スペーサによって隔てられた２つの平滑面を有する）適当なサイズ及び形状の成形容器内にヴィスキング・バッグを配置し、ヴィスキング・バッグの両端をクランプして閉じた。：
５．顆粒が重力によってヴィスキング・バッグの底に沈むように、モールドを水平に置いた（この後は、後続の過程において、この配置を乱さないように注意を払う）。：
６．最短で５時間、最長で３日間、混合液の透析を行った。透析は、５℃から３０℃の間で、超純水（ultrapure water）に対して行われ、その間、蓋付きビーカー内でコンスタントに撹拌してもしなくてもよい。等間隔で、少なくとも５回、大量の余分な超純水を取り換えた。：
７．透析の後、再生フィブロイン溶液に対して、次のいずれかを行った：
ｉ．透析膜内のフィブロイン溶液の形状を維持するために凍結し、その後モールドを除去した、または、
ｉｉ．非多孔質のモールドを取り除き、同形状であり、且つ、実施例１のステップ５５で使用したゲル化剤（gelation agent）が自由に侵入（ingress）できるようにするのに十分な多孔質のモールドと置き換えた。：
８．透析の後、２０℃で、最適な時間に亘り、１％ｗ／ｖの酢酸水溶液によりヴィスキング・バッグ内で再生フィブロイン溶液をゲル化した。最適な時間は、ヴィスキング・バッグのサイズ次第である。：
９．本実施例のステップ８により得られたゲルのサンプルを低温槽（freezer bath）に移し、２４時間、−１３℃にさらし、材料内に孔を導入した。：
１０．５０％エタノール中にサンプルを２日間に亘って置いて、タンパク質をシルクＩＩ状態に変換した。：
１１．生理食塩水（saline）または超純水を使用して２日間に亘って、サンプルを再水和した。：
１２．デバイスから透析膜を取り除き、同時に、デバイスの顆粒を含む表面を切り、または、削り（shaved）、表面をすり減らして（abrade away）、または、溶かして（dissolve away）、孔を露出させた。
【０１６１】
実施例３：最適化されたフィブロイン溶液からの、ミネラル化された表面を備えた、一体型インプラント可能な修復デバイスの調製のための第２のプロトコル
１．上記実施例１に示された通り、１０％ｗ／ｖのボンビックス・モリの最適化された再生フィブロイン水溶液（aqueous solution）を調製した。：
２．例えば、リン酸カルシウム（calcium phosphate）、生体ガラス（bio glass）、生体セラミック（bio ceramic）、硫酸カルシウム（calcium sulphate）（上記のいずれと天然及び合成の両方のポリマー、成長因子、細胞またはその他の生物製剤との組み合わせ）から形成されており、平均直径が１００ミクロンから３ｍｍの間である多孔質骨置換材（bone replacement material）（ＢＲＭ）、骨代用材（bone substitute material）（ＢＳＭ）、または骨補填材（bone graft material）（ＢＧＭ）の顆粒を、ステンレススチール製または他の不活性物質製の平らなプレートの表面に配置し、ポリ（４−ビニルピリジン）接着剤（Poly(4-vinyl pyridene) adhesive）でプレートに接着した。ただし、（後に溶け去る）任意の適当な他の接着剤が使用可能である。：
３．（実施例１のステップ２９／３０の後で、ステップ４１の溶液の透析の前のいずれかの時点で）プレートを十分に収納できる大きさのヴィスキング・バッグの内部にプレートを収納し、ヴィスキング・バッグをフィブロイン溶液で満たした。：
４．ヴィスキング・バッグの底にプレートがある状態で、成形容器内にヴィスキング・バッグを配置した。：
５．最短で５時間、最長で３日間、混合液の透析を行った。透析は、５℃から３０℃の間で、超純水（ultrapure water）に対して行われ、その間、蓋付きビーカー内でコンスタントに撹拌してもしなくてもよい。等間隔で、少なくとも５回、大量の余分な超純水を取り換えた。：
６．透析の後、再生フィブロイン溶液に対して、次のいずれかを行った：
ｉ．透析膜内のフィブロイン溶液の形状を維持するために凍結し、その後モールドを除去した、または、
ｉｉ．非多孔質のモールドを取り除き、同形状であり、且つ、実施例１のステップ５５で使用したゲル化剤が自由に侵入できるようにするのに十分な多孔質のモールドと置き換えた。：
７．透析の後、２０℃で、最適な時間に亘り、１％ｗ／ｖの酢酸水溶液によりヴィスキング・バッグ内で再生フィブロイン溶液をゲル化した。最適な時間は、ヴィスキング・バッグのサイズ次第である。：
８．本実施例のステップ７により得られたゲルのサンプルを低温槽に移し、２４時間、−１３℃にさらし、材料内に孔を導入した。：
９．５０％エタノール中にサンプルを２日間に亘って置いて、タンパク質をシルクＩＩ状態にした。：
１０．デバイスから透析膜を取り除き、スチールプレートを取り除いた。：
１１．生理食塩水または超純水を使用して２日間に亘って、サンプルを再水和した。：
１２．デバイスの顆粒を含む表面を切り、または、削り、表面をすり減らして、または、溶かして、孔を露出させた。
【０１６２】
＜インプラントの研究＞
２匹のラットの皮下モデル（sub-cut model）において、繊維のあらゆる毒性（toxic effects）についての１ヶ月間のパイロット研究（pilot study）が実施された。図２０ａには、ラットのＮＰＩＭＲ皮下インプラントが示されており、図２０ｂには、そのクローズアップが示されている。
【０１６３】
図２０ａは、デバイス１の多孔質のボディ２中の孔２ａ及び平滑面３を非常に明瞭に示している。繊維６を通る断面も示されている。図２０ｂには、繊維の部分的な溶解の結果が示されており、ここでは繊維６はデバイスのボディ２を取り囲む連続体（continuum）を形成している。繊維６とボディ２との間のこの融合した接触面（blended interface）は、いくらか部分的に溶解した繊維または繊維層によって、材料の頑丈さを増大させ、また、層間剥離の可能性を減少させると考えられている。
【０１６４】
この研究は、生存中の異常な（aberrant）振る舞いや臨床観察（clinical observations）を示さず、サンプルは良好に耐えていた（tolerated）。最小限度の（minimal）繊維カプセル化（fibrous encapsulation）が観察され、繊維により引き起こされたいかなる悪影響の証拠もなかった。作られた８つのサンプルの１つにおいて、軽度のプラズマ細胞反応（mild plasma cell reaction）が観察された。全般的に見て、この研究は良好な孔構造、厚い骨梁（trabeculae）、及び多孔質のボディのマトリックス（matrix）と十分に一体化しているように見える繊維を示した。
【０１６５】
＜サンプルの初期表面構造の特性評価＞
表面構造の特性評価（Surface texture characterisation）を実施した。
【０１６６】
分析のためにサンプルを供給し、２つの方法を利用して特性評価を受けさせた。
【０１６７】
１．白色光走査干渉法（White Light Scanning Interferometry）−Ｔａｌｙｓｕｒｆ ＣＣＩ ３０００を使用
測定の前にサンプルを部分的に乾燥し、表面を安定化させ、２０倍の倍率を使用して測定し、約１ｍｍ×１ｍｍの領域の分析を行った。
【０１６８】
２．原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy）−ＢｒｕｋｅｒのＤｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用
サンプルを十分に水和し、ピークフォース・タッピングモードで流体を通じて画像化することにより測定した。
【０１６９】
測定後、領域の表面構造パラメータ（areal surface texture parameters）を算出した。
【０１７０】
２つの試験の結果は以下の通りである。
【０１７１】
［原子間力顕微鏡法］
ＡＦＭにおいて、２０μｍ×２０μｍ及び５μｍ×５μｍの領域で測定を実行した。それぞれの画像は、図１３及び図１４に示してある。
【０１７２】
２０μｍ×２０μｍスケールにおける平均表面粗さは４０ｎｍ（０．０４μｍ）のＳａ値を示し、５μｍ×５μｍスケールでは３２ｎｍ（０．０３２μｍ）を示した。結果一式は、図１５に示してある。
【０１７３】
状態及び使用が原因で変化する表面であるため、関節軟骨の表面粗さの確定値（definitive value）は存在しない。しかしながらいくつかの研究では、ほとんどの関節軟骨の表面に、山から谷までの深さ（peak to valley depth）が２．５μｍという特徴が存在することを報告されている(Ian C Clarke (1971) "Surface Characteristics of human articular cartilage - a scanning electron microscopy study" Journal of Anatomy, vl08, pp22- 30)。対して、ＢＳ ＩＳＯ７２０６パート２は、関節置換面におけるポリマー・コンポーネントは、Ｒａが２μｍより良好な平均粗さ（average roughness）を示すべき、と規定している。さらにまた、ＢＳ ＩＳＯ７２０６パート２は、「ＩＳＯ４６８：１９８２に定められた原理に従って計測した場合、金属製及びセラミック製のコンポーネントの球形の（spherical）関節軟骨は、０．０８ｍｍのカットオフ値を使用して、それぞれ０．０５μｍ及び０．０２μｍを超えないＲａ値を有するものとする。」とも規定している。
【０１７４】
Ｒａ及びＳａ値は、いずれも表面の「平均粗さ」に関するものである。Ｒａは単一の輪郭トレース（single profile trace）から計算され、Ｓａは領域全体に亘って計算されるものである。そのため、Ｓａは、数本のＲａ線輪郭トレースを平均したものと同等とすることができる。Ｓａは、ｘ及びｙにおけるデータを考慮しているので、より正確な表面の記述子（descriptor）である。
【０１７５】
いずれにしても、平均Ｓａ値は、関節置換面におけるポリマー・コンポーネントの許容される平均粗さよりも著しく低く、また、金属製のコンポーネントの球形の関節軟骨とセラミック製のコンポーネントの球形の関節軟骨とに許容される値の間の値になる。そのため、平滑面は十分に平滑であり、インプラント可能な修復デバイスとして非常に有利であると考えられる。
【０１７６】
［白色光走査干渉法］
図１６及び１７の画像は、白色光走査干渉計（white light scanning interferometer）による試料（specimens）の３Ｄ表面マップ（3D surface maps）を示している。ここではガウス多項式による近似法（Gaussian Polynomia fitting technique）を用いて、全体の形（gross form）は測定から除去されている。そのため、結果として得られた画像は、表面のテクスチャ（texture）及び表面の"うねり（waviness）"を含む、表面のトポグラフィー（topography）を示す。
【０１７７】
領域のパラメータ特性評価は、図１８に示されているように、４つのサンプル全体の平均表面粗さ（Ｓａ）が０．６８μｍであることを示している。値の範囲は、０．６４７から０．７０９μｍである。
【０１７８】
さらに、表面の"うねり"を考慮しても、平均Ｓａ値は、関節置換面におけるポリマー・コンポーネントの許容される平均粗さよりも著しく低く、そのため、インプラント可能な修復デバイスとして非常に有利である。
【０１７９】
本発明によるデバイスは、耐久性があり、比較的摩擦がなく、また、潤滑にすることが可能な平滑面を有し、比較的堅い骨や隣接する組織との間に耐摩耗の関節表面を提供することができるものとして示されており、これは、この種のインプラント可能なデバイスのための許容可能なＩＳＯ４６８：１９８２よりも勝っている。加えて、多孔質面は、細胞及び組織の侵入を助ける表面を提供することにより、既存の骨または軟骨との一体化を促進する。
【０１８０】
いくつかの好適な実施例を示して説明したが、添付の請求の範囲に記載の発明の範囲を逸脱することなく、さまざまな変更及び変形をなし得ることは、当業者なら理解するであろう。
【図１】
2014530698.tif 000003
【図２】
2014530698.tif 000004
【図３ａ】
2014530698.tif 000005
【図３ｂ】
2014530698.tif 000006
【図４】
2014530698.tif 000007
【図５】
2014530698.tif 000008
【図６】
2014530698.tif 000009
【図７】
2014530698.tif 000010
【図８】
2014530698.tif 000011
【図９】
2014530698.tif 000012
【図１０】
2014530698.tif 000013
【図１１】
2014530698.tif 000014
【図１２ａ】
2014530698.tif 000015
【図１２ｂ】
2014530698.tif 000016
【図１３】
2014530698.tif 000017
【図１４】
2014530698.tif 000018
【図１５】
2014530698.tif 000019
【図１６】
2014530698.tif 000020
【図１７】
2014530698.tif 000021
【図１８】
2014530698.tif 000022
【図１９】
2014530698.tif 000023
【図２０Ａ】
2014530698.tif 000024
【図２０Ｂ】
2014530698.tif 000025
【国際調査報告】
2014530698.tif 000026
2014530698.tif 000027
2014530698.tif 000028