(57)【要約】  本発明は、リラキシンA鎖とリラキシンB鎖の並び方が非野生型であって、A鎖とB鎖とがリンカーペプチドによってつながれている、リラキシン融合ポリペプチドA-L-Bを提供する。本発明はさらに、延長された半減期を有するリラキシン融合ポリペプチドを提供する。さらにまた、本発明は、前述の融合ポリペプチドをコードする核酸配列、それを含有するベクター、上記融合ポリペプチドの医薬組成物および医学的使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
A-L-Bを含む、リラキシン活性を有する融合ポリペプチドであって、
BがリラキシンB鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、
AがリラキシンA鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、かつ
Lがリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも1つの半減期延長部分をさらに含む、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
半減期延長部分が、IgG1 Fcドメイン、PEGまたはHESである、請求項2に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
リンカーポリペプチドLが6〜14アミノ酸長である、前述の請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
リラキシンA鎖がヒトリラキシン2 A鎖（配列番号117）であり、リラキシンB鎖がヒトリラキシン2 B鎖（配列番号119）である、前述の請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
表3に示すポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項７】
A-L-Bが、scR3、scR4、scR5、scR3タグなし、scR4タグなし、scR5タグなし、scR-Fc5、scR-Fc6およびscR-Fc7からなるA-L-Bポリペプチドの群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前述の請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項8に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項9に記載のベクターまたは請求項8に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、請求項10に記載の宿主細胞を培養するステップおよびポリペプチドを単離するステップを含む方法。
【請求項１２】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１３】
医薬としての請求項12に記載の医薬組成物または請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
心血管疾患、肺疾患、線維障害または腎臓疾患を処置するための医薬としての、請求項12および13に記載の医薬組成物または請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
心血管疾患、肺疾患、線維障害または腎臓疾患を処置する方法であって、治療有効量の、請求項12および13に記載の医薬組成物または請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの投与を含む方法。
【請求項１６】
心血管疾患が冠動脈心疾患、急性冠症候群、心不全、および心筋梗塞である、請求項14および15に記載の処置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リラキシンA鎖とリラキシンB鎖の並び方が非野生型であって、A鎖とB鎖とがリンカーペプチドによってつながれている、リラキシン融合ポリペプチドA-L-Bを提供する。本発明はさらに、延長された半減期を有するリラキシン融合ポリペプチドを提供する。さらにまた、本発明は、前述の融合ポリペプチドをコードする核酸配列、それを含有するベクター、上記融合ポリペプチドの医薬組成物および医学的使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
インスリンスーパーファミリーのメンバーであるリラキシン2（H2リラキシン、RLN2）は、N末端からC末端に向かって配置された典型的B-C-A鎖プロホルモン構造を遺伝子レベルで呈する2本鎖ペプチドである。このスーパーファミリーの他のメンバーは、ヒトでは7つの遺伝子によってコードされており、リラキシン遺伝子RLN1、RLN3、ならびにインスリン様ペプチド遺伝子INSL3、INSL4、INSL5、およびINSL6である。このファミリーのメンバー間の全体的配列相同性は低いが、それでも、これらの遺伝子はRLN3先祖遺伝子から進化したことが、系統解析によって示される（Hsu, S.Y. (2003)；Wilkinson, T.N. et al. (2005)）。成熟タンパク質は約6000Daの分子量を有し、プロホルモン-コンバターゼ1（PC1）および2（PC2）によって触媒されるプロホルモンの酵素的切断の産物である（Hudson P. et al. (1983)）。その結果生じるA鎖とB鎖は2つの分子間システイン橋によって接合され、A鎖はさらにもう一つの分子内ジスルフィド結合を呈する。
【０００３】
リラキシンは、さまざまな細胞タイプにおいて、複数の経路によって多面発現効果を開始する。リラキシンは、LGR7（ロイシンリッチGタンパク質共役受容体7）と名付けられたクラスI（ロドプシン様）Gタンパク質共役受容体（RXFP1（リラキシンファミリーペプチド1受容体）とも呼ばれる）に結合することによって、またアフィニティはかなり低いがLRG8/RXFP2（リラキシンファミリーペプチド2受容体）に結合することによって、その活性を付与する（Kong RC et al. (2010) Mol Cell Endocrinol. 320:1-15）。リラキシン分子では、B鎖中のアミノ酸モチーフ（Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X）（Schwabe and Buellesbach (2007) Adv Exp Med Biol. 612:14-25およびBuellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10;275(45):35276-80）が、全てのリラキシンペプチドにおいて保存されており、それらは、これらのペプチドと対応する受容体との相互作用にとって極めて重要である。LGR7/RXFP1へのリラキシンの結合は、アデニル酸シクラーゼの活性化と、二次メッセンジャー分子cAMPの増加とにつながる。この機序により、リラキシン2は、例えば、ラット心臓における心房性ナトリウム利尿ペプチドの放出を媒介する（Toth, M. et al. (1996)）。ラット心房筋細胞に対するリラキシン2の正の変力効果も明らかにされている（Piedras-Renteria, E.S. et al. (1997)）。リラキシン/LGR7複合体によって活性化される他のシグナル伝達分子は、ホスホイノシチド-3 キナーゼ、チロシンキナーゼ、およびホスホジエステラーゼである（Bartsch, O. et al. (2001)、Bartsch, O. et al. (2004)）。この系によって活性化される他のシグナル伝達経路として、ラット心臓およびモルモット心臓におけるサイクリックGMPレベルの増加につながる一酸化窒素（NO）経路が挙げられる（Bani-Sacchi, T. et al. (1995)）。
【０００４】
リラキシンは、肺、腎臓、脳、および心臓などの器官に対して生物学的活性を有する多面発現ホルモンとして作用する（Dschietzig T. et al. (2006)）。リラキシンの強い抗線維化活性および血管拡張活性は、さまざまな動物疾患モデルならびに臨床研究において、このペプチドによって得られる正の効果を、最も顕著に担っている（McGuane J.T. et al. (2005)）。RLN2は生理的条件下の心血管系において有益な作用を複数有している。これは、組織ホメオスタシスを維持し、さまざまな病態生理学的過程において、損傷した心筋を保護する。これは、顕著な血管拡張効果を示し、例えばげっ歯類の冠状動脈（Nistri, S. et al. (2003)）および他の器官の血管床において、流量および血管拡張に影響を及ぼす。高血圧自然発症ラットでは、RLN2血圧を低下させた。これは、増加したNO生産量が媒介する効果である。
【０００５】
リラキシン2の心臓保護活性は、モルモット、ラットおよびブタなど、異なる動物モデルにおいて評価されている（Perna A.M. et al. (2005)、Bani, D. et al. (1998)）。RLN2は、心筋損傷、炎症細胞浸潤とそれに続く線維症を改善し、それによって重度の心室機能障害を軽減する（Zhang J. et al. (2005)）。
【０００６】
リラキシン2は強い抗線維化活性を示す。損傷した組織では、線維芽細胞の活性化と増殖が、コラーゲン生産量の増加および間質性線維症を引き起こす。心臓における線維症は生体力学的過負荷によって増加し、心室機能障害、リモデリング、および催不整脈に影響する。動物モデルでは、リラキシン2の持続注入が、心筋症、高血圧、イソプレナリン誘発心毒性、糖尿病性心筋症および心筋梗塞によって引き起こされる心機能障害を阻害し、さらには逆転さえさせる。この線維形成の阻害または確立した線維症の逆転は、心室硬化を低減し、拡張機能を改良することができる。注目すべきことに、リラキシン2は異常なコラーゲン蓄積を低減するが、健常組織における基礎コラーゲン含量には影響を及ぼさないことから、治療的使用に関するその安全性が際立っている。
【０００７】
リラキシン2は、いくつかの臨床研究において、急性心不全患者を処置するための多面発現的血管拡張薬として試験され、非常に有望なアウトカムが得られている。これらの研究において、リラキシン2は、呼吸困難の好都合な緩和および他の臨床アウトカムと関連した（Teerlink J.R. et al. (2009)、Metra M. et al. (2010)）。
【０００８】
リラキシンのインビボ半減期に制約があるので、患者の処置は14日ごとまたは21日ごとに繰り返す必要があり、その際の化合物投与は、少なくとも48時間の持続注入として行う必要がある。
【０００９】
さらにまた、リラキシン2は、膵炎、関節リウマチのような炎症関連疾患、およびがん（Cosen-Binker L.I. et al. (2006) Santora K. et al. (2007)）、または強皮症、肺線維症、腎線維症および肝線維症（Bennett RG. (2009)）などの疾患の処置にも役立ちうる。リラキシン2はヒトMDA-MB-231乳がん細胞の異種移植片腫瘍成長を低減する（Radestock Y, Hoang-Vu C, Hombach-Klonisch S. (2008) Breast Cancer Res. 10:R71）。
【００１０】
化学的方法によるリラキシン2の合成は困難である。B鎖の溶解度が低いことおよびA鎖とB鎖の間にシステイン橋を特異的に導入する手間が必要であることから、これらの方法によって得られる活性ペプチドの収率は極めて低い（Barlos K.K. et al. (2010)）。もう一つの選択肢として、リラキシン2の組換え発現を行うことができる。翻訳後修飾時にプレプロ-ペプチドの切断が効率よく起こり、生物学的に活性な成熟ペプチドの分泌が可能になるように、発現宿主細胞には、通例、プロホルモン-コンバターゼ1および/または2をコードする発現コンストラクトが同時トランスフェクトされる（Park J.I. et al. (2008)）。それでもなお、異種細胞におけるプレプロ-ペプチドのエンドプロテオリティックプロセシング効率が、生物活性分子の生産を著しく制限することは多い（Shaw J.A. et al. (2002)）。
【００１１】
それゆえに、特異的プロテアーゼによって媒介されるエンドプロテオリティックプロセシングに依存せずに完全な生物学的活性を示し、かつ異種発現系を使って有意な収率で生産することができるリラキシン分子を作製することは、大きな利点になるだろう。
【００１２】
ヒトインスリの場合は、切断不可能なポリペプチドがインスリンB鎖とインスリンA鎖とをつないでいる単鎖変異体が作製されている（Rajpal G. et al. (2009)）。これらの変異体の場合、エンドプロテオリティックプロセシングは不要である。
【００１３】
驚いたことに、本発明者らは、A鎖およびB鎖と呼ばれる2本の活性鎖の配向が入れ替えられ、切断可能なC鎖がリンカーペプチドで置換されているリラキシン変異体を同定した。図1に示すように、リラキシンをコードする単鎖の遺伝的に決定された配向、すなわちB鎖-C鎖-A鎖とは異なり、修飾分子の鎖の配向はA鎖-リンカーペプチド-B鎖である。その結果生じる分子は、いかなるエンドプロテオリティックプロセシングにも依存せずに、完全な生物学的活性を示す。したがって、本発明が提供するこの新しい単鎖リラキシン変異体により、低い発現収率という課題またはプロセシング用プロテアーゼの同時トランスフェクションの必要という課題が解決される。
【００１４】
静脈内投与されたリラキシン2のヒトにおける半減期は10分未満である（Dschietzig T. et al. (2009)）。その結果、臨床治験では、リラキシン2を、48時間にわたって持続的に投与する必要がある。それゆえに、生物学的半減期の改良は大きな利点になりうる。
【００１５】
生物学的半減期の改良は、目的のポリペプチドのPEG化またはHES化などといった化学修飾によって、または追加の非天然N-グリコシル化部位の導入によって、またはこのペプチドを、抗体の免疫グロブリンFcフラグメント、トランスフェリン、アルブミン、長い半減期を媒介する他の分子もしくは他のタンパク質にインビボで結合する結合モジュールなどといった他の分子に、それぞれ遺伝子融合することによって行うことができる。本発明は、改良された半減期を有する、抗体のFc部分に融合された単鎖リラキシン変異体を提供する。驚いたことに、これらの変異体は、野生型リラキシンと同じ範囲にある生物学的活性を示す。
【発明の概要】
【００１６】
［発明の概要］
本発明は融合ポリペプチドに関し、以下、これを単鎖リラキシン（sc-リラキシン（scRelaxin））という。
【００１７】
リラキシン2生産の現在の標準はこの分子の化学合成であるが、これは複雑で費用のかかる手法である。リラキシンが翻訳後修飾を受けるという事実、特にプロホルモンコンバターゼ1およびプロホルモンコンバターゼ2によるプレプロ-タンパク質の切断を受けるという事実ゆえに、妥当な発現系の選択は組換え発現にとって不可欠である。インスリンスーパーファミリーに属するタンパク質のエンドプロテオリティックプロセシングは、異種細胞からの生物活性分子の生産を制限する場合が多い。リラキシンのエンドプロテオリティックプロセシングを回避するために、本発明の融合ポリペプチドは、A鎖およびB鎖と呼ばれるリラキシンの2本の活性鎖が遺伝的にコードされた配向とは逆になっていて、A鎖とB鎖とがリンカーペプチドによってつながれている分子である。詳しく述べると、リラキシンドメインをコードする個々のDNAセグメントの遺伝的に決定された配向、すなわちB鎖-C鎖-A鎖とは異なり、本発明が提供するリラキシン変異体におけるDNAセグメントの配向は、A鎖-ペプチドリンカー-B鎖である。これは、リラキシンA鎖のカルボキシ末端がリンカーポリペプチドLのアミノ末端に融合され、リンカーポリペプチドのカルボキシ末端がリラキシンB鎖のアミノ末端に融合されている単鎖リラキシン（A-L-Bと呼ばれる）をもたらす（図1の図解参照）。結果として生じる分子は、野生型リラキシンと類似する生物学的活性を呈するが、その発現はエンドプロテオリティックプロセシングに依存しない。
【００１８】
本発明の一実施形態は、A-L-B［ここで、AはリラキシンA鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、BはリラキシンB鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、Lはリンカーポリペプチドである］を含む融合ポリペプチドである。
【００１９】
さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがリラキシン2 A鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、リラキシンB鎖ポリペプチドがリラキシン2 B鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００２０】
好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがヒト最小リラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号118）またはその機能的変異体を含むか、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体を含む。
【００２１】
好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体を含む。
【００２２】
より好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがヒト最小リラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号118）またはその機能的変異体を含むか、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体を含み、リラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体を含む。
【００２３】
より一層好ましい実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、リラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体である。
【００２４】
ある実施形態では、上述の融合ポリペプチドA-L-BのリンカーポリペプチドLが、6〜14アミノ酸残基長であるポリペプチドからなる。7〜13アミノ酸残基長であるポリペプチドリンカーLは、さらに好ましい。8〜12アミノ酸残基長であるポリペプチドリンカーLは、さらに好ましい。7〜11または9〜11アミノ酸残基長であるポリペプチドリンカーは、より一層好ましい。9アミノ酸残基長であるポリペプチドリンカーLは、より一層好ましい。さらなる好ましい一実施形態では、ポリペプチドリンカーLの長さの整数が、整数6、7、8、9、10、11、12、13および14からなる群より選択される。
【００２５】
リンカーペプチドLは任意のアミノ酸から構成されうる。好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、少なくとも1つのGly、Ser、Arg、Leu、Cys、Ala、Leuおよび/またはLys残基を含む。より好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、Gly残基およびSer残基を含む。さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも3対1であるGly対Serの比を有する、リンカーLである。
【００２６】
さらなる一実施形態では、上述のリンカーLが、半減期延長部分を共有結合でカップリングするための取り付け部位を少なくとも1つは含む。本発明の一実施形態では、上述の取り付け部位がLys残基またはCys残基である。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、かつ
Lが、6〜14、7〜13、8〜12、7〜11、9〜11、または9アミノ酸残基長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。リンカーペプチドLは、任意のアミノ酸から構成されうる。好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、少なくとも1つのGly、Ser、Arg、Leu、Cys、Ala、Leuおよび/またはLys残基を含む。より好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLがGly残基およびSer残基を含む。さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも3対1であるGly対Serの比を有する、リンカーLである。さらなる一実施形態では、上述のリンカーLが、非タンパク質性ポリマー半減期延長部分を共有結合でカップリングするための取り付け部位を少なくとも1つは含む。本発明の一実施形態では、上述の取り付け部位がLys残基またはCys残基である。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態は、半減期延長部分をさらに含む融合ポリペプチドA-L-Bである。
【００２９】
さらなる一実施形態では、上述の融合ポリペプチドがリラキシン活性を有する。さらなる好ましい一実施形態では、リラキシン活性がリラキシン受容体LGR7の活性化である。さらにもう一つの好ましい実施形態では、リラキシン受容体LGR7の活性化が、実験方法の項に開示する方法によって決定される。
【００３０】
もう一つの態様において、本発明は、上述の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドの分泌を可能にするシグナルペプチドのコード配列を、さらに含みうる。そのような融合ペプチドのポリヌクレオチドを含有するベクターも包含される。適切なベクターは、例えば発現ベクターである。本発明のさらなる一実施形態は、上述の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または発現ベクターを含む宿主細胞である。本発明の宿主細胞は真核細胞または原核細胞であることができる。真核細胞は、哺乳動物細胞または酵母もしくは昆虫細胞、好ましくは哺乳動物細胞であることができる。原核細胞は例えば大腸菌（E. coli）細胞であることができる。
【００３１】
もう一つの実施形態において、本発明は、上述の融合ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本組成物は、静脈内、腹腔内または皮下投与用に製剤化することができる。
【００３２】
本発明のもう一つの実施形態は、医薬としての医薬組成物または融合ポリペプチドを提供する。さらなる実施形態は、心血管疾患、膵炎、炎症、がん、強皮症、肺線維症、腎線維症、および肝線維症の処置における、医薬組成物または融合ポリペプチドの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】野生型リラキシンおよび単鎖リラキシンのドメインの遺伝子編成ならびにそれぞれの対応するポリペプチドの模式図である。
【図２】単鎖リラキシン変異体の模式図。
【図３】単鎖リラキシン融合タンパク質変異体ならびにPEG化用の単鎖リラキシン変異体のドメイン編成の模式図。
【図４ａ−ｅ】CHO-CRE-LGR7細胞株を使ったscR3、scR4、およびscR5（図4a）、scR7、scR8、scR9、およびscR10（図4b）、scR11およびscE12（図4c）、ヒトリラキシン3、scR14、およびscR15（図4d）ならびにscR17（図4e）の機能アッセイにおける活性。対照として、h-リラキシン2（hRelaxin2）（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）を使用した。データを、単鎖リラキシン変異体およびリラキシン2が誘導するルシフェラーゼ発現の活性を表す相対発光量として表現する。記号は平均を表し、エラーバーはS.E.M.を表す。
【図５】CHO-CRE-LGR7細胞株を使用することによるscR-Fc1の機能アッセイにおける活性。対照として、h-リラキシン2（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）を使用した。データを、scR-Fc1およびh-リラキシン2が誘導するルシフェラーゼ発現の活性を表す相対発光量として表現する。記号は平均を表し、エラーバーはS.E.M.を表す。
【図６】CHO-CRE-LGR7細胞株を使ったscR-Fc5、scR-Fc6、およびscR-Fc7の機能アッセイにおける活性。h-リラキシン2（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）を対照として使用した。データを、scR-Fc変異体およびh-リラキシン2が誘導するルシフェラーゼ発現の活性を表す相対発光量として表現する。記号は平均を表し、エラーバーはS.E.M.を表す。
【図７】CHO-CRE-LGR7細胞株を使ったscR-Fc11、scR-Fc12、およびscR-Fc13の機能アッセイにおける活性。対照として、h-リラキシン2（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）を使用した。データを、scR-Fc変異体およびh-リラキシン2が誘導するルシフェラーゼ発現の活性を表す相対発光量として表現する。記号は平均を表し、エラーバーはS.E.M.を表す。
【図８】CHO-CRE-LGR7細胞株を使ったscR-Var3、scR-Var4、scR-Var5、およびscR-Var6の機能アッセイにおける活性。対照として、h-リラキシン2（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）を使用した。データを、scR-Fc変異体およびh-リラキシン2が誘導するルシフェラーゼ発現の活性を表す相対発光量として表現する。記号は平均を表し、エラーバーはS.E.M.を表す。
【図９】静脈内投与されたh-リラキシン2またはscR-Fc13のインビボ半減期解析。8週齢雄ウィスターラット（各群3匹）に、ヒトリラキシン2およびscR-Fc13（0.24mg/kg）を、それぞれ単回適用した。適用後の表示した時点において血液試料を収集し、各タンパク質の血清中レベルを、定量ELISAを使用することによって測定した。
【図１０】血液試料中のリラキシン2およびリラキシン変異体の活性。  scR-Fc13処置ラットから得た血液試料中のリラキシン活性を、CHO-CRE-LGR7細胞株を使用することによって決定した。scR-Fc13の静脈内投与の3、5、および7日後に収集した血液試料をCHO-CRE-LGR7細胞株上でインキュベートし、相対発光量を決定した。h-リラキシン2（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）および精製scR-Fc13を使って検量線を決定した。用量応答曲線内のEC50に×印をつける。データを、scR-Fc変異体およびh-リラキシン2が誘導するルシフェラーゼ発現の活性を表す相対発光量として表現する。記号は平均を表し、エラーバーはS.E.M.を表す。
【図１１】単離潅流ラット心臓モデルにおける心拍数、冠流量および収縮力に対するh-リラキシン2およびscR-Fc13の影響。  1nMの濃度において、h-リラキシン2の適用は、心拍数および冠流量の増加につながり、負の変力活性を示す（図11a〜d）。scR-Fc13では、これより10倍高い濃度においてではあるが、これに匹敵する効果が得られる（図11e〜h）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
用語「アミノ酸残基」は、アラニン（AlaまたはA）、システイン（CysまたはC）、アスパラギン酸（AspまたはD）、グルタミン酸（GluまたはE）、フェニルアラニン（PheまたはF）、グリシン（GlyまたはG）、ヒスチジン（HisまたはH）、イソロイシン（IleまたはI）、リジン（LysまたはK）、ロイシン（LeuまたはL）、メチオニン（MetまたはM）、アスパラギン（AsnまたはN）、プロリン（ProまたはP）、グルタミン（GlnまたはQ）、アルギニン（ArgまたはR）、セリン（SerまたはS）、スレオニン（ThrまたはT）、バリン（ValまたはV）、トリプトファン（TrpまたはW）、およびチロシン（TyrまたはY）残基からなる群に含まれるアミノ酸残基を示すものとする。
【００３５】
用語「リラキシンの活性」または「リラキシン活性」は、刺激性Gタンパク質Gsを活性化し、それに続いて二次メッセンジャーサイクリックAMPを生成し、かつ/またはPI3キナーゼを刺激するという、リラキシン、またはその変異体の能力によって定義される。リラキシンまたはその変異体はLGR7に結合すると、刺激性Gタンパク質Gsの細胞内活性化が起き、それが次に二次メッセンジャーサイクリックAMP（cAMP）の生成をもたらす。しかし、cAMP生成は時間依存的な二相応答である。Gs-アデニル酸シクラーゼが媒介する最初の短いcAMP応答の後、受容体シグナルは阻害性Gタンパク質活性化に切り替わり、これにより、PI3キナーゼが媒介する応答に切り替わる（Halls M.L., Bathgate R.A., Summers, R.J. (2005)「Signal Switching after Stimulation of LGR7 Receptors by Human Relaxin 2」Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041:288-291）。
【００３６】
用語「半減期延長部分」は、リラキシン融合ポリペプチドに直接的に、またはリンカーを介して、共有結合で連結（「コンジュゲート」）される、医薬上許容される部分、ドメイン、または「媒体」であって、非コンジュゲート型のリラキシン融合ポリペプチドと比較して、リラキシン融合ポリペプチドのインビボタンパク質分解または活性を減退させる他の化学修飾を防止または緩和し、半減期または他の薬物動態特性を増加させ、例えば限定するわけではないが、吸収速度を増加させ、毒性を低減し、溶解性を改良し、リラキシン融合ポリペプチドの生物学的活性および/または標的選択性を増加させ、製造性を向上させ、かつ/またはリラキシン融合ポリペプチドの免疫原性を低減するものを指す。用語「半減期延長部分」には、PEGまたはHESなどの非タンパク質性半減期延長部分と、血清アルブミン、トランスフェリンまたはFcドメインなどのタンパク質性半減期延長部分とが包含される。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では可換的に使用され、ペプチド結合によって連結された2つ以上のアミノ酸の分子鎖を包含する。これらの用語は生成物の具体的な長さを指していない。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを包含する。加えて、タンパク質フラグメント、類似体、変異型または変異体タンパク質、融合タンパク質なども、ポリペプチドの意味に包含される。この用語は、既知のタンパク質工学的技法を使って合成または組換え発現することができるような、1つ以上のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれている分子も包含する。加えて、本発明の融合タンパク質は、周知の有機化学的技法によって、本明細書に記載するように誘導体化することができる。
【００３８】
用語「機能的変異体」とは、その天然の生物学的活性の一部を少なくとも保持している、変異体ポリペプチドを指す。本発明のリラキシン2変異体の場合、機能的変異体は、その天然の生物学的活性の少なくとも一部、例えばリラキシン受容体LGR7の活性化を示す変異体である。リラキシン受容体LGR7の活性化は、実験方法の項に開示する方法によって決定することができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドを指していう場合、用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、対応する野生型リラキシンポリペプチドの受容体結合特性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのフラグメントには、タンパク質分解フラグメント、ならびに欠失フラグメントが含まれ、アミノ酸の置換、欠失または挿入ゆえに改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は自然界に存在してもよいし、非天然物であってもよい。非天然変異体は、当技術分野において知られている変異導入技法を使って生産することができる。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を含みうる。変異体ポリペプチドを本明細書では「ポリペプチド類似体」という場合もある。本明細書にいうポリペプチドの「誘導体」とは、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1つ以上の残基を有する当該ポリペプチドを指す。20種の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を1つ以上含有するペプチドも「誘導体」に包含される。例えば4-ヒドロキシプロリンでプロリンを置換することができ；5-ヒドロキシリジンでリジンを置換することができ；3-メチルヒスチジンでヒスチジンを置換することができ；ホモセリンでセリンを置換することができ；オルニチンでリジンを置換することができる。
【００４０】
用語「融合タンパク質」は、そのタンパク質が2つ以上の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド構成要素を含むこと、および/またはその融合タンパク質が1つ以上の親タンパク質またはポリペプチドに由来するタンパク質ドメインを含み、それらがその野生型配向では配置されていないことを示す。典型的には、融合タンパク質は、あるタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に、異なるタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチドが、インフレームに付加され、場合によってはリンカーまたはストレッチャーによって隔てられている融合遺伝子から発現する。その場合、融合遺伝子は組換え宿主細胞により単一タンパク質として発現することができる。
【００４１】
用語「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」は、2つ以上のヌクレオチド分子の連続したストレッチを示すものとする。ヌクレオチド配列の起源は、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成またはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００４２】
用語「EC50」（最大半量有効濃度）は、何らかの指定された曝露時間後に、ベースラインと最大値との中間にある応答を誘発する治療化合物の有効濃度を指す。
【００４３】
所与の物質に関連して使用される用語「免疫原性」は、免疫系からの応答を誘発するその物質の能力を示すものとする。免疫応答は細胞を介した応答であっても抗体を介した応答であってもよい（免疫原性のさらなる定義については例えばRoitt「Essential Immunology」（第8版、Black-well）を参照されたい）。通常は、低下した抗体反応性が、低下した免疫原性の目安になるであろう。免疫原性の低下は、当技術分野において知られる任意の適切な方法により、例えばインビボまたはインビトロで決定することができる。
【００４４】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、一般に、例えば米国特許US4,683,195およびUS4,683,195に記述されているように、所望のヌクレオチド配列をインビトロで増幅するための方法を指す。一般に、PCR法では、テンプレート核酸に優先的にハイブリダイズする能力を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使って、プライマー伸長合成のサイクルが繰り返される。
【００４５】
用語「ベクター」は、宿主細胞内で複製するか宿主細胞ゲノム中に組み込まれる能力を有し、それゆえに、適合する宿主細胞と協同して（ベクター-宿主系）、さまざまな機能（ヌクレオチド配列のクローニングを容易にすること、すなわち使用に適した量の配列を生産すること、配列によってコードされる遺伝子産物の発現を指示すること、および宿主細胞のゲノムにヌクレオチド配列を組み込むこと）を果たすのに役立つ、プラスミドまたは他のヌクレオチド配列を指す。
【００４６】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、本明細書では可換的に使用され、これらの用語は全て、細胞の成長または培養の結果として生じる子孫を含むと理解すべきである。
【００４７】
用語「機能的インビボ半減期」は、その通常の意味で使用される。すなわち、ポリペプチドの生物学的活性の50％がまだ体内/標的器官内に存在する時間、またはポリペプチドの活性が初期値の50％になる時間である。
【００４８】
機能的インビボ半減期を決定する代わりに、「血清中半減期」、すなわちポリペプチドの50％がまだ除去されずに血漿中または血流中を循環している時間を決定してもよい。血清中半減期の決定は、機能的インビボ半減期の決定より簡単であることが多く、血清中半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良い目安である。血清中半減期に代わる用語には、「血漿中半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が含まれる。ポリペプチドは、網内系（RES）、腎臓、脾臓もしくは肝臓の1つ以上の作用によって、または組織因子、SEC受容体もしくは他の受容体が媒介する排除によって、または特異的もしくは非特異的タンパク質分解によって除去される。通常、クリアランスは、（糸球体濾過のカットオフと比較した）サイズ、電荷、結合している糖質鎖、およびそのタンパク質に対する細胞受容体の存在に依存する。保持されるべき機能は、通常、受容体結合または受容体活性化から選択される。機能的インビボ半減期および血清中半減期は、当技術分野において知られている任意の適切な方法によって決定することができ、例えば、一般的には、処置されるべき哺乳動物に適切な用量のアミノ酸配列または化合物を適切に投与するステップ；該哺乳動物から一定の間隔で血液試料または他の試料を収集するステップ；該血液試料における本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定するステップ；およびそうして得られたデータ（のプロット）から本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投薬時の初期レベルと比較して50％低減するまでの時間を算出するステップを必要としうる。例えば、Kenneth, A et al「Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists」やPeters et al.「Pharmacokinete analysis: A Practical Approach」(1996)などの標準的ハンドブックを参照されたい。M Gibaldi & D Perron「Pharmacokinetics」発行所Marcel Dekker、改訂2版（1982）も参照されたい。
【００４９】
「グリコシル化」は、糖部分が特異的部位でポリペプチドに付加される化学修飾である。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の取り付けを指す。トリペプチド配列Asn-X-SerおよびAsn-X-Thr（「N-X-S/T」）（ここでXは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素的取り付けのための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列（またはモチーフ）の存在は、潜在的N結合型グリコシル化部位を作り出す。O結合型とは、セリンおよびスレオニンのヒドロキシル基酸素への糖質部分の取り付けを指す。
【００５０】
「単離された」融合ポリペプチドは、それを発現した細胞の構成要素から同定され分離されたものである。細胞の夾雑構成要素は、融合タンパク質の診断的または治療的使用を妨害するであろう物質であり、これには酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれうる。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドが、（1）ローリー法、UV-Vis分光法、または（例えばCaliper LabChip GXII、GX90またはBiorad Bioanalyzerデバイスでの）SDS-キャピラリーゲル電気泳動による決定で、95重量％以上の融合タンパク質まで、さらに好ましくは99重量％以上まで、（2）少なくとも15残基のN末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（3）クマシーブルーか、好ましくは銀染色を使って、還元条件下または非還元条件下でのSDS-PAGEで均一になるまで、精製される。ただし、通常、単離された融合ポリペプチドは、少なくとも一段階の精製ステップによって調製されるであろう。
【００５１】
概観
本願は、A-L-B融合ポリペプチド（本明細書では単鎖リラキシンという用語も使用し、sc-リラキシンまたはscRと略記する）を提供し、ここで「A」はリラキシンA鎖、「B」はリラキシンB鎖、そして「L」はリンカーポリペプチドである。本願は、改良されたリラキシン分子であって、A鎖のC末端がポリペプチドリンカーを介してB鎖のN末端に連結されて、融合タンパク質を機能的sc-リラキシンとして発現させることが可能になっているものを記載する。本願は、一つには、野生型リラキシンについて知られているようなエンドプロテオリシスによるプロホルモンプロセシングを必要とせずに、A-L-B融合ポリペプチドを機能的に発現させることができるという、驚くべき発見に関する。
【００５２】
単鎖型のリラキシン
リラキシンAおよびBドメイン：
本発明の一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、AがリラキシンA鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、BがリラキシンB鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、Lがリンカーポリペプチドである、融合ポリペプチドである。
【００５３】
本発明のさらなる一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、AがリラキシンA鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、BがリラキシンB鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、Lがリンカーポリペプチドであり、リラキシンが、リラキシン1、リラキシン2、リラキシン3、INSL3、INSL4、INSL5、およびINSL6からなるリラキシンの群から選択される、融合ポリペプチドである。さらなる好ましい一実施形態では、リラキシンがリラキシン2またはリラキシン3である。さらなる一実施形態では、上述のリラキシンがヒトリラキシンである。
【００５４】
さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドが、リラキシン2 A鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンB鎖ポリペプチドが、リラキシン2 B鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００５５】
さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがリラキシン2 A鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、リラキシンB鎖ポリペプチドがリラキシン2 B鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００５６】
好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドが、ヒト最小リラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号118）またはその機能的変異体を含むか、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体を含む。好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体を含む。
【００５７】
より好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドが、ヒト最小リラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号118）またはその機能的変異体を含むか、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体を含み、リラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体を含む。
【００５８】
さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがリラキシン3 A鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンB鎖ポリペプチドがリラキシン3 B鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００５９】
さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがヒトリラキシン3 A鎖ポリペプチド（配列番号124）またはその機能的変異体を含む。さらなる一実施形態では、A-L-BのリラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン3 B鎖ポリペプチド（配列番号125）またはその機能的変異体を含む。好ましい一実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがヒトリラキシン3 A鎖ポリペプチド（配列番号124）またはその機能的変異体を含み、リラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン3 B鎖ポリペプチド（配列番号125）またはその機能的変異体を含む。
【００６０】
上述の融合ポリペプチドA-L-Bの好ましい一実施形態では、リラキシンA鎖またはB鎖の機能的変異体が、野生型リラキシンA鎖およびB鎖とそれぞれ比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換、挿入および/または欠失を有する。保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xをさらに含む上述のリラキシン2B 変異体は、さらに好ましい。
【００６１】
リラキシンA鎖およびB鎖変異体は当技術分野において知られている。リラキシンの詳しく特徴づけられた結合部位のジオメトリーは、リラキシンA鎖およびB鎖変異体を設計するための指針を当業者に与える。例えばリラキシンB鎖のバリエーションについては、Buellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10；275(45):35276-80を、またリラキシンA鎖のバリエーションおよび「最小」リラキシンA鎖については、Hossain et al. J Biol Chem. 2008 Jun 20；283(25):17287-97を参照されたい。例えば保存されたリラキシン2Bモチーフ（Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X）の場合、Xは、らせん構造を形成することができるアミノ酸を表す。例えば、特定された3つのアミノ酸がリラキシンB鎖の表面に三角形の接触領域を形成するように、保存されたモチーフ中の適当なアミノ酸Xを選択する（Buellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10；275(45)）。
【００６２】
より一層好ましい実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、リラキシンB鎖ポリペプチドがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体である。より一層好ましい実施形態では、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）の機能的変異体が、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有する機能的変異体である。ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）の機能的変異体であって、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有するものは、さらに好ましい。保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xをさらに含む上述のヒトリラキシン2B変異体は、より一層好ましい。
【００６３】
より一層好ましい実施形態では、A-L-BのリラキシンA鎖ポリペプチドが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸交換を有するその機能的変異体であり、リラキシンB鎖ポリペプチドが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸交換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含む、その機能的変異体である。
【００６４】
機能的変異体を得る方法は当業者には知られている。機能的変異体の例は、リラキシンA鎖については、Hossainら J Biol Chem. 2008 Jun 20；283(25):17287-97または米国特許公開番号US2011/0130332に開示されており、リラキシンB鎖については、Schwabe and Buellesbach (2007) Adv Exp Med Biol. 612:14-25およびBuellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10;275(45):35276-80)に開示されている。
【００６５】
リンカーL：
ある実施形態では、上述の融合ポリペプチドA-L-BのリンカーポリペプチドLが、6〜14アミノ酸残基長のポリペプチドからなる。7〜13アミノ酸残基長のポリペプチドリンカーLは、さらに好ましい。8〜12アミノ酸残基長のポリペプチドリンカーLは、さらに好ましい。7〜11または9〜11アミノ酸残基長のポリペプチドリンカーLは、より一層好ましい。9アミノ酸残基長のポリペプチドリンカーLは、より一層好ましい。さらなる好ましい一実施形態では、ポリペプチドリンカーLの長さの整数が、整数6、7、8、9、10、11、12、13および14からなる群より選択される。
【００６６】
低い免疫原性スコアを示すリンカーが好ましいものの、リンカーのアミノ酸組成はさまざまであることができる。リンカーの例は当業者にはよく知られており、(GGGS)n、(GGSG)nなどの配列（ここでnは整数である）を含む。リンカーペプチドLは任意のアミノ酸で構成させることができる。好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、少なくとも1つのGly、Ser、Arg、Cys、Leuおよび/またはLys残基を含む。より好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLがGly残基およびSer残基を含む。さらなる好ましい一実施形態では、リンカーペプチドLが、例えば米国特許第7,271,149号に開示されている配列[GGGGS]nを含むペプチドなどといった、グリシンリッチリンカーを含む。別の実施形態では、例えば米国特許第5,525,491号に記述されているように、セリンリッチリンカーペプチドLを使用する。
【００６７】
さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも3対1であるGly対Serの比を有する、リンカーLである。
【００６８】
さらなる一実施形態では、上述のリンカーLが、非タンパク質性ポリマー半減期延長部分を共有結合でカップリングするための取り付け部位を、少なくとも1つは含む。本発明の一実施形態では、上述の取り付け部位がLys残基またはCys残基である。
【００６９】
そのようなリンカーの例は、[GlyGlyGlySerGlyGly]（配列番号137）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGly]（配列番号138）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly]（配列番号139）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer]（配列番号140）、
[GlyGlyGlySerGlyCysGlyGlySerGly]（配列番号141）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly]（配列番号143）、
[LysArgSerLeuSerArgLysLysArg]（配列番号144）、
[GlyGlyGlySerGlyLysGlyGlySerGly]（配列番号142）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly]（配列番号145）、および
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly]（配列番号146）
である。
【００７０】
最適なリンカー長およびアミノ酸組成は、当技術分野において知られている常法によって決定することができると考えられる。
【００７１】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含む、その機能的変異体であり、
Lが、6〜14、7〜13、8〜12、7〜11、9〜11、または9アミノ酸残基長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００７２】
好ましい一実施形態では、上述の融合ポリペプチドA-L-BのリンカーポリペプチドLが、7〜11、または9〜11アミノ酸残基長である。9アミノ酸残基長のポリペプチドリンカーLは、より一層好ましい。さらなる好ましい一実施形態では、ポリペプチドリンカーLの長さの整数が、整数6、7、8、9、10、11、12、13および14からなる群より選択される。リンカーポリペプチドLは、任意のアミノ酸から構成されうる。好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLがフレキシブルなリンカーである。
【００７３】
好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、少なくとも1つのGly、Ser、Arg、Leu、Cys、および/またはLys残基を含む。さらなる好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、Gly、Ser、Arg、Leu、Cys、およびLys残基からなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸残基からなる。
【００７４】
より好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLがGly残基およびSer残基を含む。さらなる好ましい一実施形態では、リンカーペプチドLが、例えば米国特許第7,271,149号に開示されている配列[GGGGS]nを含むペプチドなどといったグリシンリッチリンカーである。別の実施形態では、米国特許第5,525,491号に記載されているように、セリンリッチリンカーペプチドLが使用される。
【００７５】
さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも2対1であるGly対Serの比を有する、リンカーポリペプチドLである。
【００７６】
さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも3対1であるGly対Serの比を有する、リンカーポリペプチドLである。
【００７７】
さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも1対2であるGly対Serの比を有する、リンカーポリペプチドLである。
【００７８】
さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも1対3であるGly対Serの比を有する、リンカーポリペプチドLである。
【００７９】
さらなる好ましい一実施形態は、上述の好ましい長さを有し、リンカーLのアミノ酸残基が4アミノ酸残基を除いて全てGlyおよび/またはSer残基からなり、残りの4アミノ酸残基が天然アミノ酸の群から選択される、リンカーポリペプチドLである。
【００８０】
さらなる好ましい一実施形態は、上述の好ましい長さを有し、リンカーLのアミノ酸残基が3アミノ酸残基を除いて全てGlyおよび/またはSer残基からなり、残りの3アミノ酸残基が天然アミノ酸の群から選択される、リンカーポリペプチドLである。
【００８１】
さらなる好ましい一実施形態は、上述の好ましい長さを有し、リンカーLのアミノ酸残基が2アミノ酸残基を除いて全てGlyおよび/またはSer残基からなり、残りの2アミノ酸残基が天然アミノ酸の群から選択される、リンカーポリペプチドLである。
【００８２】
さらなる好ましい一実施形態は、上述の好ましい長さを有し、リンカーLのアミノ酸残基が1アミノ酸残基を除いて全てGlyおよび/またはSer残基からなり、残りのアミノ酸残基が天然アミノ酸の群から選択される、リンカーポリペプチドLである。
【００８３】
さらなる好ましい一実施形態では、上述の天然アミノ酸の群からアミノ酸プロリンが除外される。
【００８４】
さらなる好ましい一実施形態が、上述の好ましい長さを有し、リンカーLのアミノ酸残基が1アミノ酸残基を除いて全てGlyおよび/またはSerからなり、残りのアミノ酸がCysおよびLysの群から選択される、リンカーポリペプチドLである。
【００８５】
さらなる好ましい一実施形態では、リンカーポリペプチドLが、Gly残基およびSer残基からなるアミノ酸残基の群より選択されるアミノ酸残基からなる。
【００８６】
さらなる好ましい一実施形態では、リンカーLが、Gly残基およびSer残基からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸残基からなり、Gly対Serの比が少なくとも2対1である。
【００８７】
さらなる好ましい一実施形態では、リンカーLが、Gly残基およびSer残基からなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸残基からなり、Gly対Serの比が少なくとも3対1である。
【００８８】
さらなる好ましい一実施形態では、リンカーLが、Gly残基およびSer残基からなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸残基からなり、Gly対Serの比が少なくとも1対2である。
【００８９】
さらなる好ましい一実施形態では、リンカーLが、Gly残基およびSer残基からなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸残基からなり、Gly対Serの比が少なくとも1対3である。
【００９０】
さらなる一実施形態では、上述のリンカーLが、非タンパク質性ポリマー半減期延長部分を共有結合でカップリングするための取り付け部位を少なくとも1つは含む。本発明の一実施形態では、上述の取り付け部位がLys残基またはCys残基である。
【００９１】
好ましいリンカーポリペプチドLは、
[GlyGlyGlySerGlyGly]（配列番号137）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGly]（配列番号138）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly]（配列番号139）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer]（配列番号140）、
[GlyGlyGlySerGlyCysGlyGlySerGly]（配列番号141）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly]（配列番号143）、
[LysArgSerLeuSerArgLysLysArg]（配列番号144）、
[GlyGlyGlySerGlyLysGlyGlySerGly]（配列番号142）、
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly]（配列番号145）、および
[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly]（配列番号146）
からなるリンカーポリペプチドの群から選択される。
【００９２】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、かつ
Lが、7、8、9または10アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９３】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体であり、かつ
Lが、7、8、9または10アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９４】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、かつ
Lが、7、8、9または10アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９５】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、かつ 
Lが9アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９６】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体であり、かつ
Lが9アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９７】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、かつ 
Lが9アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９８】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、かつ
Lが、グリシン残基およびセリン残基を少なくとも3：1の比で含む7、8、9または10アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【００９９】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体であり、かつ
Lが、グリシン残基およびセリン残基を少なくとも3：1の比で含む7、8、9または10アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１００】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、かつ
Lが、グリシン残基およびセリン残基を少なくとも3：1の比で含む7、8、9または10アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０１】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、かつ
Lが、グリシン残基およびセリン残基を少なくとも3：1の比で含む9アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０２】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体であり、かつ
Lが、グリシン残基およびセリン残基を少なくとも3：1の比で含む9アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０３】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、かつ
Lが、グリシン残基およびセリン残基を少なくとも3：1の比で含む9アミノ酸長のリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０４】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、かつ
Lが、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０５】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体であり、かつ
Lが、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０６】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aがヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bがヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、かつ
Lが、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１０７】
より好ましい本発明の一実施形態は、scR4の配列（配列番号4）を含む融合ポリペプチドである。
【０１０８】
より好ましい本発明の一実施形態は、scR4タグなしの配列（配列番号45）を含む融合ポリペプチドである。
【０１０９】
本発明の好ましい一実施形態は、A-L-Bを含む融合ポリペプチドであって、
Aが、ヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であるか、配列番号117と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有するその機能的変異体であり、
Bが、ヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であるか、配列番号119と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有し、かつ保存されたモチーフArg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体であり、かつ
Lが、配列番号137〜146のアミノ酸配列を有するリンカーからなるペプチドリンカーの群より選択されるリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチドである。
【０１１０】
リンカー長は6〜14アミノ酸であることができるが、それ自体が追加の機能を媒介する、さらに長いリンカーも考えられる。
【０１１１】
さらなる一実施形態では、上述の融合ポリペプチドA-L-Bがリラキシン活性を有する。さらなる好ましい一実施形態では、リラキシン活性がリラキシン受容体LGR7の活性化である。リラキシン活性を決定するための方法は当技術分野において知られているか、または本明細書に記載する。さらにもう一つの好ましい実施形態では、リラキシン受容体LGR7の活性化が、本明細書の実験方法の項に開示する方法によって決定される。さらにもう一つの好ましい実施形態では、リラキシン受容体LGR7の活性化の決定が、EC50値を決定することである。より一層好ましい実施形態では、上述のリラキシン活性が、対応する野生型リラキシンの、最大半量活性を誘発する有効濃度と比較して、105分の1、104分の1、103分の1、100分の1、75分の1、50分の1、25分の1または10分の1である。例えばヒトリラキシン2に基づく融合ポリペプチドA-L-Bの場合、対応する野生型リラキシンはヒトリラキシン2タンパク質である。
【０１１２】
単鎖リラキシン変異体の生物学的半減期の改良
本発明の融合ポリペプチドの半減期の改良は、半減期延長部分を付加することによって達成することができる。
【０１１３】
本発明の一実施形態では、上述の融合ポリペプチドA-L-Bが、少なくとも1つの半減期延長部分をさらに含む。ある実施形態では、半減期延長部分がタンパク質性または非タンパク質性ポリマーである。
【０１１４】
非タンパク質性ポリマー半減期延長部分による半減期延長：
融合ポリペプチドA-L-Bの生物学的半減期の改良は、A-L-BのN末端および／またはC末端に融合された、非タンパク質性ポリマー半減期延長部分のための取り付け部位を含む、ストレッチャーポリペプチドに共有結合でカップリングされた、非タンパク質性ポリマー半減期延長部分によって達成することができる。
【０１１５】
非タンパク質性ポリマー半減期延長部分は、融合ポリペプチドA-L-Bの取り付け部位に共有結合でカップリングすることができる。取り付け部位は、A、LまたはB内に存在するか、上述の融合ポリペプチドA-L-BのN末端および/またはC末端に組換え的に融合された、そのような取り付け部位を含むポリペプチドによって付加することができる。好ましいのは、リンカーポリペプチドLを介したカップリング、または融合ポリペプチドA-L-BにN末端および/またはC末端融合された、取り付け部位を含むストレッチャーを介したカップリングである。取り付け部位は、取り付けアミノ酸、例えばCysもしくはLys、または糖質の糖部分であることができる。
【０１１６】
変異体ポリペプチドにカップリングされる非タンパク質性ポリマー分子は、任意の適切なポリマー分子、例えば天然ポリマーまたは合成ホモポリマーもしくは合成ヘテロポリマーであることができ、分子量は、典型的には、約300〜100,000Da、例えば約500〜20,000Daの範囲、より好ましくは約500〜15,000Daの範囲、さらに一層好ましくは約2〜12kDaの範囲、例えば約3〜10kDaの範囲にある。一定の分子量に関連して「約」という用語を本明細書において使用する場合、単語「約」は、およその平均分子量を示し、所与のポリマー調製物には通常は一定の分子量分布があるだろうという事実を反映している。ホモポリマーの例として、ポリオール（すなわちポリ-OH）、ポリアミン（すなわちポリ-NH2）およびポリカルボン酸（すなわちポリ-COOH）が挙げられる。ヘテロポリマーは、ヒドロキシル基とアミン基など、異なるカップリング基を含むポリマーである。
【０１１７】
適切なポリマー分子の例として、ポリアルキレンオキシド（PAO）、例えばポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）などのポリアルキレングリコール（PAG）、分岐PEG、ヒドロキシエチルデンプン（HES）などのヒドロキシアルキルデンプン（HAS）、ポリシアル酸（PSA）、ポリ-ビニルアルコール（PVA）、ポリ-カルボキシレート、ポリ-(ビニルピロリドン）、ポリエチレン-co-無水マレイン酸、ポリスチレン-co-無水マレイン酸、デキストラン、例えばカルボキシメチル-デキストラン、または免疫原性を低減しかつ/または機能的インビボ半減期および/もしくは血清中半減期を増加させるのに適した他の任意の生体高分子からなる群より選択されるポリマー分子が挙げられる。ポリマー分子のもう一つの例は、ヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿タンパク質である。一般に、ポリアルキレングリコール由来のポリマーは生体適合性、無毒性、非抗原性、非免疫原性であり、さまざまな水溶性を有し、生体から容易に排出される。
【０１１８】
PEGは、例えばデキストランなどの多糖と比較して、架橋能を有する反応性基が少ないので、好ましいポリマー分子である。特に単官能性PEG、例えばメトキシポリエチレングリコール（mPEG）は、そのカップリング化学が比較的単純である（ポリペプチド上の取り付け基とのコンジュゲーションに利用できる反応性基が一つしかない）ので興味深い。結果的に架橋のリスクが排除されるので、結果として生じる本発明のコンジュゲート融合ポリペプチドは、より均一になり、ポリマー分子と変異体ポリペプチドとの反応を制御することが容易になる。
【０１１９】
本発明の融合ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合による取り付けを達成するには、ポリマー分子のヒドロキシル末端基が、活性化された形態で、すなわち反応性官能基（その例には1級アミノ基、ヒドラジド（HZ）、チオール、スクシネート（SUC）、スクシンイミジルスクシネート（SS）、スクシンイミジルスクシンアミド（SSA）、スクシンイミジルプロピオネート（SPA）、スクシンイミジルブチレート（SBA）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（SCM）、ベンゾトリアゾールカーボネート（BTC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、アルデヒド、ニトロフェニルカーボネート（NPC）、およびトレシレート（TRES）などがある）を有する状態で、提供されなければならない。適切な活性化ポリマー分子は、例えばShearwater Polymer, Inc.（米国アラバマ州ハンツビル）、またはPolyMASC Pharmaceuticals plc（英国）などから市販されている。
【０１２０】
あるいは、ポリマー分子を、当技術分野において知られている従来の方法によって、例えばWO90/13540に開示されているように活性化することもできる。本発明において使用するための活性化線状または分岐ポリマー分子の具体例は、Shearwater Polymers, Inc.の1997年版および2000年版カタログ（「Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives」これは引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。活性化PEGポリマーの具体例としては、次の線状PEG：NHS-PEG（例えばSPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、およびSCM-PEG）、ならびにNOR-PEG、BTC-PEG、EPOXPEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、およびMAL-PEG、ならびに分岐PEG、例えばPEG2-NHS、ならびにUS5,932,462およびUS5,643,575（どちらも引用により本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられる。さらにまた、次の刊行物には有用なポリマー分子および/またはPEG化ケミストリーが開示されている：US5,824,778、US5,476,653、WO97/32607、EP229,108、EP402,378、US4,902,502、US5,281,698、US5,122,614、US5,219,564、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、US5,736,625、WO98/05363、EP809996、US5,629,384、WO96/41813、WO96/07670、US5,473,034、US5,516,673、EP605963、US5,382,657、EP510356、EP400472、EP183503およびEP154316。
【０１２１】
システイン残基へのカップリングにとりわけ好ましい活性化PEGポリマーの具体例としては、次の線状PEGが挙げられる：ビニルスルホン-PEG（VS-PEG）、好ましくはビニルスルホン-mPEG（VS-mPEG）；マレイミド-PEG（MAL-PEG）、好ましくはマレイミド-mPEG（MAL-mPEG）およびオルトピリジル-ジスルフィド-PEG（OPSS-PEG）、好ましくはオルトピリジル-ジスルフィド-mPEG（OPSS-mPEG）。典型的には、そのようなPEGまたはmPEGポリマーは、約5kDa、約10kD、約12kDaまたは約20kDaのサイズを有するであろう。
【０１２２】
本発明の融合ポリペプチドと活性化ポリマー分子とのコンジュゲーションは、任意の従来法によって、例えば次の参考文献（ポリマー分子を活性化するための適切な方法も記述されている）において述べられているように行なわれる：Harris and Zalipsky編「Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Application」AZC Washington；R.F. Taylor（1991）「Protein immobilisation. Fundamental and applications」Marcel Dekker, N.Y.；S.S. Wong（1992）「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」CRC Press、ボカラトン；G.T. Hermanson et al.（1993）「Immobilized Affinity Ligand Techniques」Academic Press, N.Y.）
【０１２３】
使用すべき活性化法および/またはコンジュゲーション化学が、融合ポリペプチドの取り付け基（その例は上に詳しく述べた）ならびにポリマーの官能基（例えばアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテート）に依存することは、当業者にはわかるであろう。PEG化は、融合タンパク質上の利用可能な全ての取り付け基（すなわちポリペプチドの表面に露出している取り付け基）へのコンジュゲーションを目指すものであってもよいし、1つ以上の特定取り付け基、例えばUS5,985,265に記載されているようにN末端アミノ基、またはシステイン残基に対するものであってもよい。さらにまた、コンジュゲーションは一段階で行なわれてもよいし、段階的に（例えばWO99/55377に記述されているように）行なわれてもよい。
【０１２４】
システイン残基へのPEG化（上記参照）では、通常は、PEG化に先だって、融合ポリペプチドをジチオスレイトール（DDT）などの還元剤で処理する。次に、脱塩などの任意の従来法によって還元剤を除去する。システイン残基へのPEGのコンジュゲーションは、典型的には、pH6〜9の適切な緩衝液中、4℃から25℃までの温度で、最大16時間にわたって行なわれる。
【０１２５】
取付けられるPEG分子の数、そのような分子のサイズおよび形態（例えば線状であるか分岐しているか）、および融合タンパク質中の取り付け部位に関して、最適な分子が生産されるようにPEG化が計画されることは、理解されるであろう。使用するポリマーの分子量は、例えば、達成されるべき所望の効果に基づいて選択することができる。
【０１２６】
タンパク質上の単一の取り付け基（例えばN末端アミノ基）だけへのコンジュゲーションについては、ポリマー分子（線状であっても分岐していてもよい）が高い分子量、好ましくは約10〜25kDa、例えば約15〜25kDa、例えば約20kDaを有することが有利になりうる。
【０１２７】
ポリマーコンジュゲーションは、通常は、利用可能なポリマー取り付け基をできるだけ多くポリマー分子と反応させることを目指す条件下で行なわれる。これは、ポリペプチドに対して、適切なモル過剰のポリマーを使うことによって達成される。典型的には、活性化ポリマー分子とポリペプチドとのモル比は、1000-1まで、例えば約200-1まで、または約100-1までである。ただし、いくつかの例では、最適な反応が得られるように、比が、例えば約50-1、10-1、5-1、2-1または1-1までと、多少低くてもよい。
【０１２８】
本発明では、リンカーを介してポリペプチドにポリマー分子をカップリングすることも考えられる。適切なリンカーは当業者には周知である。好ましい一例は塩化シアヌルである（Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581；US4,179,337；Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378）。
【０１２９】
コンジュゲーションに続いて、当技術分野において知られている方法に従って、例えば1級アミンを反応混合物に加えることによって、残存する活性化ポリマー分子をブロッキングし、その結果生じた不活化ポリマー分子を適切な方法によって除去する。
【０１３０】
状況に応じて、例えば融合ポリペプチドのアミノ酸配列、使用する活性化PEG化合物の性質、および具体的PEG化条件（PEGとポリペプチドのモル比を含む）に応じて、さまざまなPEG化度が得られ、融合タンパク質に対するPEGの比が高いほど、一般に高いPEG化度が得られることは、理解されるであろう。ただし、どの所与のPEG化プロセスから得られるPEG化融合ポリペプチドも、通常は、わずかに異なるPEG化度を有するコンジュゲート融合ポリペプチドの確率的な分布を含むことになるだろう。
【０１３１】
リラキシンまたは本発明の融合ポリペプチドの生物学的半減期の改良には、PEG化またはHES化などの化学修飾を応用することができる。
【０１３２】
HASおよびHES非タンパク質性ポリマー、ならびにHASまたはHESコンジュゲートを生産する方法は、例えばWO02/080979、WO03/070772、WO057092391およびWO057092390に開示されている。
【０１３３】
ポリシアル化（polysialytion）は、もう一つの技術であり、この技術では、治療用ペプチドおよびタンパク質の半減期を延長し、その安定性を改良するために、天然ポリマーポリシアル酸（PSA）を使用する。PSAはシアル酸（糖の一つ）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチド薬の送達に使用する場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションにより、保護的微小環境を提供する。これは、循環における治療用タンパク質の活性寿命を増加させ、それが免疫系によって認識されるのを防ぐ。PSAポリマーは人体には自然に見いだされる。これは、細胞壁をPSAポリマーで覆うように何百万年も進化した一定の細菌によって取り入れられた。そうすることで、これらの天然ポリシアリル化（potysialylated）細菌は、分子擬態により、身体の防御系の裏をかくことができるようになった。自然の究極のステルス技術であるPSAは、そのような細菌から、大量に、かつ予め決定された物理的特徴で、容易に生産することができる。細菌PSAは、タンパク質にカップリングした場合でも、人体におけるPSAと化学的に同一であるため、完全に非免疫原性である。
【０１３４】
タンパク質性半減期延長部分による半減期延長：
融合ポリペプチドA-L-Bの半減期を改良する選択肢としてもう一つ考えられるのは、タンパク質性半減期延長部分、例えば抗体の免疫グロブリンFcフラグメント、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、血清アルブミン、もしくはその変異体、または長い半減期を媒介する他の分子にインビボで結合する結合モジュールなどとの融合物であり、例えば血清アルブミン結合タンパク質はよく使用される方法である。
【０１３５】
上述のsc-リラキシンポリペプチドは免疫グロブリンのFc部分に直接またはペプチドリンカーを介して融合することができる。「免疫グロブリン」は、ジスルフィド結合でつながったポリペプチド鎖を含み、典型的には2本の軽鎖と2本の重鎖とを有する分子である。各鎖では、1つのドメイン（V）が、その分子の抗体特異性に応じて、可変的なアミノ酸配列を有する。他のドメイン（C）は同じクラスの分子に共通するかなり定常的な配列を有する。
【０１３６】
本明細書にいう免疫グロブリンの「Fc」部分は、免疫学の分野においてこの用語に一般に与えられている意味を有する。具体的には、この用語は、抗体から2つの抗原結合領域（Fabフラグメント）を除去することによって得られる抗体フラグメントを指す。Fabフラグメントを除去するための一方法は、免疫グロブリンをパパインプロテアーゼで消化することである。こうしてFc部分は、非共有結合的相互作用およびジスルフィド結合によって会合した両重鎖からのほぼ同サイズの定常領域フラグメントから形成される。Fc部分はヒンジ領域を含み、CH2およびCH3ドメインを通って抗体のC末端に至ることができる。ヒトおよびマウス免疫グロブリンの代表的なヒンジ領域は、Borrebaeck, C.A.K.編「Antibody Engineering, A Practical Guide」（W.H. Freeman and Co., 1992）に見いだすことができる。
【０１３７】
ヒト免疫グロブリンFc領域には、エフェクター特性および薬物動態特性が異なる5つのタイプ、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEがある。IgGは血清中で最も豊富な免疫グロブリンである。またIgGは血清中半減期がどの免疫グロブリンよりも長い（23日）。他の免疫グロブリンとは異なり、IgGはFc受容体への結合後に効率よく再循環する。IgGには4つのサブクラスG1、G2、G3、およびG4があり、それぞれが異なる効果または機能を有している。これらのエフェクター機能は、一般的には、Fc受容体（FcγR）との相互作用によってまたはC1qに結合し補体を結合することによって媒介される。FcγRへの結合が抗体依存的細胞媒介性細胞溶解につながりうるのに対し、補体因子への結合は補体媒介性細胞溶解につながりうる。Fc部分がその半減期延長能力のためだけに利用されている異種Fc融合タンパク質を設計する際には、どのエフェクター機能も最小限に抑えることが重要である。全てのIgGサブクラスがFc受容体（CD16、CD32、CD64）に結合する能力を有するが、G1およびG3はG2およびG4より効果的である。IgGのFc受容体結合領域は、ヒンジ領域にある残基とCH2ドメインのカルボキシ末端領域にある残基とによって形成される。
【０１３８】
所望するインビボ効果に応じて、本発明の異種融合タンパク質は、上述したアイソタイプのいずれを含有してもよいし、補体および/またはFc受容体結合機能が改変されている変異型Fc領域を含有してもよい。したがって本発明の異種融合タンパク質は、sc-リラキシン化合物に融合された免疫グロブリンのFc部分全体、免疫グロブリンのFc部分のフラグメント、またはその類似体を含有しうる。
【０１３９】
融合タンパク質の最終構造がどうであれ、FcまたはFc様領域は、そのC末端またはN末端に融合されたsc-リラキシン化合物のインビボ血漿中半減期を延長する役割を果たさなければならない。好ましくは、融合sc-リラキシン化合物は何らかの生物学的活性を保っている。生物学的活性は当技術分野で知られているインビトロ法およびインビボ法によって決定することができる。
【０１４０】
本発明の異種融合タンパク質に使用されるFc領域は、IgG1またはIgG2 Fc領域に由来することが好ましい。
【０１４１】
一般に、本発明の異種融合タンパク質に使用されるFc領域は、ヒト、ラット、マウスおよびブタを含む（ただしこれらに限るわけではない）任意の種に由来することができる。好ましくは、本発明に使用されるFc領域はヒトまたはラットに由来する。ただし、融合タンパク質がヒトにおいて免疫原性であるリスクを低減するために、最も好ましいのは、ヒトFc領域ならびにそのフラグメントおよび変異体である。「ネイティブ配列Fc領域」は、自然界に見いだされるFc領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。「変異体Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾によってネイティブ配列Fcとは異なっているアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Fc領域は、ネイティブ配列Fc領域中または親ポリペプチドのFc領域中に、ネイティブ配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば約1〜約10個のアミノ酸置換、好ましくは約1〜約5個のアミノ酸置換を有する。ここでは変異体Fc領域が、好ましくは、ネイティブ配列Fc領域および/または親ポリペプチドのFc領域と、少なくとも約80％の配列同一性、最も好ましくはそれと少なくとも約90％の配列同一性、さらに好ましくはそれと少なくとも約95％の配列同一性を有するであろう。
【０１４２】
上記のsc-リラキシン化合物は、アルブミンまたはその類似体、フラグメント、もしくは誘導体に、直接またはペプチドストレッチャーを介して融合することができる。一般に、本発明の融合タンパク質の一部を構成するアルブミンタンパク質は、任意の種からクローニングされたアルブミンに由来しうる。ただし、融合タンパク質がヒトにおいて免疫原性であるリスクを低減するには、ヒトアルブミンならびにそのフラグメントおよび類似体が好ましい。ヒト血清アルブミン（HSA）は、66,500の式分子量（formula molecular weight）を有する585アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなる。HSAのアミノ酸配列（配列番号123）は、例えばMeloun et al. (1975)；Behrens et al. (1975)；Lawn et al. (1981)およびMinghetti et al. (1986)に記載されている。アルブミンにはさまざまな多型変異体ならびに類似体およびラグメントが記述されている（Weitkamp et al. (1973)）。例えばEP0322094およびEP0399666には、ヒト血清アルブミンのさまざまなフラグメントが開示されている。本発明の異種融合タンパク質は、任意のアルブミンタンパク質（フラグメント、類似体および誘導体を含む）にカップリングされたsc-リラキシン化合物であって、生物学的に活性であり、sc-リラキシン化合物単独よりも長い血漿中半減期を有するものを含むと理解される。したがって、融合タンパク質のアルブミン部分がネイティブヒトアルブミンの血漿中半減期に等しい血漿中半減期を有する必要は必ずしもない。より長い半減期を有するか、ネイティブヒトアルブミンの半減期と目的のsc-リラキシン化合物の半減期との中間にある半減期を有するフラグメント、類似体、および誘導体は、知られているか、作製することができる。技法は、当技術分野において周知であり、例えばWO93/15199、WO93/15200、WO01/77137およびEP0413622を参照されたい。
【０１４３】
本発明の一実施形態では、タンパク質性半減期延長部分が低い免疫原性を有し、ヒトタンパク質またはヒト化タンパク質である。好ましい一実施形態では、タンパク質性半減期延長部分がヒトタンパク質、例えばヒトトランスフェリン（配列番号122）、ヒト血清アルブミン（配列番号123）、またはヒトIgG1 Fc（配列番号120）である。
【０１４４】
加えて、生物学的半減期を改良する他のタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドも、融合パートナーとして使用することができる。
【０１４５】
ヒト血清アルブミンへの融合による半減期延長は、例えばWO93/15199に開示されている。タンパク質の薬物動態を改良するための一般的戦略としてのアルブミン結合は、例えばDennis et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol.277, No 38, Issue of September 20, pp. 35035-35043に記述されている。ヒト血清アルブミン結合タンパク質への融合による半減期延長は、例えばUS20100104588に開示されている。ヒト血清アルブミンまたはIgG-Fc結合タンパク質への融合による半減期延長は、例えばWO01/45746に開示されている。ヒト血清アルブミン結合ペプチドへの融合による半減期延長のさらなる例は、WO2010/054699に開示されている。
【０１４６】
Fcドメインへの融合による半減期延長は例えばWO2001/058957に開示されている。
【０１４７】
生物学的活性は、目的のタンパク質の、その融合パートナーに対する好ましい配向を決定する。融合パートナーのC末端配向およびN末端配向が含まれる。加えて、生物学的半減期または他の機能を改良するために、融合パートナーをリン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、脱グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化、その他によって修飾してもよい。
【０１４８】
タンパク質性半減期延長部分は、上述の融合ポリペプチドA-L-BのN末端および/またはC末端に組換え的に融合される。融合は、追加のストレッチャーポリペプチドを伴っても伴わなくてもよい。タンパク質性半減期延長部分の例はトランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質、イムノグロブリン、および免疫グロブリンのFcドメインである。好ましいのは、ヒトタンパク質性半減期延長部分、例えばヒトトランスフェリン、ヒトトランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリンまたはヒトFcドメインである。融合パートナーは直接またはストレッチャーとも呼ばれるアミノ酸のストレッチによって連結される。融合接合部は、融合タンパク質中の第1タンパク質またはペプチドの最後のC末端アミノ酸と、第2タンパク質またはペプチドの最初のN末端アミノ酸との間の位置と定義される。したがって、融合接合部またはストレッチャーは、N末端融合パートナーの最後のアミノ酸とC末端融合パートナーの最初のアミノ酸の間にある任意のアミノ酸を含む。
【０１４９】
ストレッチャー単位：
上述のストレッチャーは当技術分野では知られており、1〜約100アミノ酸長、1〜約50アミノ酸長、1〜約25アミノ酸長、1〜約15アミノ酸長、1〜10アミノ酸長、4〜25アミノ酸長、4〜20アミノ酸長、4〜15アミノ酸長、または4〜10アミノ酸長である。
【０１５０】
低い免疫原性スコアを示すストレッチャーが好ましいものの、ストレッチャー配列のアミノ酸組成は可変である。本発明の一実施形態では、融合ポリペプチドA-L-Bをタンパク質性半減期延長部分とつなぐストレッチャーポリペプチドを、任意のアミノ酸で構成させることができる。例に挙げるように、scR-Fc1に使用されるストレッチャーポリペプチドは、嵩高い荷電アミノ酸（例えばGlu、ArgまたはAsp）から構成され、一方、scR-Fc2におけるストレッチャーポリペプチドは、非荷電アミノ酸（例えばGlyおよびSer）から構成される。
【０１５１】
好ましい一実施形態では、ストレッチャーポリペプチドが、少なくとも1つのGly、Ser、Ile、Glu、Arg、Met、および/またはAsp残基を含む。より好ましい一実施形態では、ストレッチャーポリペプチドがGly残基およびSer残基を含む。さらなる好ましい一実施形態では、ストレッチャーペプチドが、グリシンリッチリンカー、例えば米国特許第7,271,149号に開示されている配列[GGGGS]nを含むペプチドである。別の実施形態では、米国特許第5,525,491号に記載されているように、セリンリッチストレッチャーポリペプチドが使用される。さらなる好ましい一実施形態は、Gly残基およびSer残基を含み、かつ少なくとも3対1であるGly対Serの比を有する、ストレッチャーポリペプチドである。C末端および/またはN末端にプロリン残基を有するストレッチャーポリペプチドは、さらに好ましい。
【０１５２】
好ましいストレッチャーペプチドは、
[GlyGlySerPro]（配列番号148）、
[GlyGlySerGlyGlySerPro]（配列番号149）、および
[GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro]（配列番号150）
である。
【０１５３】
改良された半減期を有する上述の融合ポリペプチドの代表例として、配列(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)pを含む融合ペプチドを挙げることができる。
【０１５４】
本発明のさらなる一実施形態は、
(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p 
［ここで、
A、LおよびBは、上に開示した定義を有し、
R1およびR2はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1およびS2が上に定義したストレッチャーペプチドであり、
m、n、o、およびpは独立して整数0または1を有する。ただし、m、n、o、およびpの少なくとも1つは1であるものとする］
を含む融合ポリペプチドである。例えば (S1)n=0はリンカーS1が融合ポリペプチド中に存在しないことを意味する。
【０１５５】
さらなる一実施形態では、mが整数1を有するのであれば、nは整数1を有する。さらなる一実施形態では、pが整数1を有するのであれば、oは整数1を有する。
【０１５６】
好ましい一実施形態では、nおよびmが0であり、oおよびpが1である。さらなる好ましい一実施形態では、nおよびmが1であり、oおよびpが0である。
【０１５７】
本発明のさらなる一実施形態は、
(R1)m=1-(S1)n=0-A-L-B-(S2)o=0-(R2)p=0
を含む融合ポリペプチドである。
【０１５８】
本発明のさらなる一実施形態は、
(R1)m=0-(S1)n=0-A-L-B-(S2)o=0-(R2)p=1
を含む融合ポリペプチドである。
【０１５９】
好ましい一実施形態では、タンパク質性半減期延長部分が、血清アルブミン、トランスフェリン、Fcドメイン、IgG1 Fcドメイン、および血清アルブミン結合タンパク質からなる群より選択される。
【０１６０】
さらなる一実施形態では、少なくとも1つの半減期延長部分をさらに含む上述の融合ポリペプチドが、対応する野生型リラキシンと比較して、延長された半減期を有し、その半減期延長は、少なくとも5、10、20、50、100または500倍である。好ましくは、半減期は血清中半減期として、つまり血清中または全血中の融合タンパク質の検出として、例えば市販の定量ELISAアッセイ（例えばR&D Systems、Human Relaxin-2 Quantikine ELISAキット、カタログ番号DRL200）を使用することによって決定される。半減期は、好ましくは、ヒト血中半減期である。好ましくは、半減期は機能的インビボ半減期として決定される。つまり、血清または血液試料中の融合ポリペプチドの活性が決定される。本発明の融合ポリペプチドA-L-Bの活性を決定するためのアッセイは、当技術分野では知られており、本明細書でも説明する。
【０１６１】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは9アミノ酸長のリンカーポリペプチドであり、
R1およびR2は半減期延長部分、好ましくはタンパク質性半減期延長部分であり、
S1およびS2は上に定義したストレッチャーペプチドであり、
m、n、o、およびpは独立して整数0または1を有する。ただし、m、n、o、およびpの少なくとも1つは1であり、好ましくは少なくともmまたはpは1であり、より好ましくはmおよびnは0、かつoおよびpは1であり、最も好ましくはmおよびnは1、かつoおよびpは0である］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６２】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは9アミノ酸長のリンカーポリペプチドであり、
R1およびR2は半減期延長部分、好ましくはタンパク質性半減期延長部分であり、
S1およびS2は、上に定義したストレッチャーペプチドであり、
m、n、o、およびpは独立して整数0または1を有する。ただし、m、n、o、およびpの少なくとも1つは1であり、好ましくは少なくともmまたはpは1であり、より好ましくはmおよびnは0、かつoおよびpは1であり、最も好ましくはmおよびnは1、かつoおよびpは0である］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６３】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1およびR2は半減期延長部分、好ましくはタンパク質性半減期延長部分であり、
S1およびS2は、上に定義したストレッチャーペプチドであり、
m、n、o、およびpは独立して整数0または1を有する。ただし、m、n、o、およびpの少なくとも1つは1であり、好ましくは少なくともmまたはpは1であり、より好ましくはmおよびnは0、かつoおよびpは1であり、最も好ましくはmおよびnは1、かつoおよびpは0である］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６４】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1およびR2は半減期延長部分、好ましくはタンパク質性半減期延長部分であり、
S1およびS2は、上に定義したストレッチャーペプチドであり、
m、n、o、およびpは独立して整数0または1を有する。ただし、m、n、o、およびpの少なくとも1つは1であり、 好ましくは少なくともmまたはpは1であり、より好ましくはmおよびnは0、かつoおよびpは1であり、最も好ましくはmおよびnは1、かつoおよびpは0である］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６５】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1は半減期延長部分、好ましくはタンパク質性半減期延長部分であり、かつ
S1は上に定義したストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６６】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1は半減期延長部分、好ましくはタンパク質性半減期延長部分であり、かつ
S1は上に定義したストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６７】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1は4〜10アミノ酸長のストレッチャーペプチド、好ましくは
GlyGlySerPro（配列番号148）、
GlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号149）、および
GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号150）
からなる群より選択されるものである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６８】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1は4〜10アミノ酸長のストレッチャーペプチド、好ましくは
GlyGlySerPro（配列番号148）、
GlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号149）、および
GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号150）
からなる群より選択されるものである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１６９】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1は10アミノ酸長のストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１７０】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1は10アミノ酸長のストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１７１】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1は、GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号150）からなるストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１７２】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1は、GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号150）からなるストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１７３】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）またはその機能的変異体であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）またはその機能的変異体であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1は抗体のFcドメイン、好ましくはヒトIgG1またはIgG2 Fcドメインであり、
S1は、GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号150）からなるストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１７４】
本発明の好ましい一実施形態は、
(R1)-(S1)-A-L-B
［ここで、
Aはヒトリラキシン2 A鎖ポリペプチド（配列番号117）であり、
Bはヒトリラキシン2 B鎖ポリペプチド（配列番号119）であり、
Lは、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly（配列番号139）を有するリンカーポリペプチドであり、
R1は、抗体のFcドメイン、好ましくはヒトIgG1またはIgG2 Fcドメインであり、
S1は、GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro（配列番号150）からなるストレッチャーペプチドである］
を含む融合ポリペプチドである。
【０１７５】
本発明のさらなる好ましい一実施形態は、表3に示すポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。
【０１７６】
本発明のさらなる好ましい一実施形態は、表3に示す融合ポリペプチドである。
［表3］
【表１−１】
2014522641.tif 000002
【表１−２】
2014522641.tif 000003
【表１−３】
2014522641.tif 000004
【表１−４】
2014522641.tif 000005
【０１７７】
さらなる一実施形態では、半減期延長部分をさらに含む上述の融合ポリペプチドA-L-Bが、リラキシン活性を有する。さらなる好ましい一実施形態では、リラキシン活性が、リラキシン受容体LGR7の活性化である。リラキシン活性を決定するための方法は、当技術分野において知られているか、または本明細書に記載する。さらにもう一つの好ましい実施形態では、リラキシン受容体LGR7の活性化が、本明細書の実験方法の項に開示する方法によって決定される。さらにもう一つの好ましい実施形態では、リラキシン受容体LGR7の活性化の決定が、EC50値を決定することである。より一層好ましい実施形態では、上述のリラキシン活性が、対応する野生型リラキシン活性と比較して、105分の1、104分の1、103分の1、100分の1、75分の1、50分の1、25分の1または10分の1未満である。例えば、ヒトリラキシン2に基づく融合ポリペプチドA-L-Bの場合、対応する野生型リラキシンはヒトリラキシン2タンパク質である。
【０１７８】
クローニング、ベクター系、発現、宿主、および精製
本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含むベクターも提供する。このベクター系は、宿主細胞におけるその発現を指示する能力を有する発現配列に作動的に連結されている。
【０１７９】
適切な宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌）、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae））、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞からなる群より選択することができる。動物細胞には、例えばHEK293細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞およびさまざまな初代哺乳動物細胞などがあるが、これらに限るわけではない。HEK293T細胞などといった哺乳動物細胞の派生株も応用できる。
【０１８０】
本発明のDNA分子
本発明は本発明の融合タンパク質をコードするDNA分子にも関係する。これらの配列には、表4に示すDNA分子が包含されるが、これらに限るわけではない：
［表4］
【表２−１】
2014522641.tif 000006
【表２−２】
2014522641.tif 000007
【表２−３】
2014522641.tif 000008
【０１８１】
本発明のDNA分子は、本明細書に開示する配列に限定されず、それらの変異体も包含する。本発明に包含されるDNA変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的性質への言及によって記述することができる。核酸ハイブリダイゼーション技法を使えば、DNAを使ってその相補鎖を同定することができ、DNAは二本鎖であるから、その均等物またはホモログも同定できることは、当業者には理解されるであろう。ハイブリダイゼーションが100％未満の相補性で起こりうることもわかるであろう。しかし、条件を適当に選択すれば、ハイブリダイゼーション技法を使用することで、ある特定プローブに対するその構造的関連に基づいて、DNA配列を弁別することができる。そのような条件に関する指針については、Sambrook et al., 1989（前掲）およびAusubel et al., 1995（Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Sedman, J.G., Smith, J.A., & Struhl, K.編(1995)「Current Protocols in Molecular Biology」ニューヨーク：John Wiley and Sons）を参照されたい。
【０１８２】
2つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、それら2つの配列が互いにハイブリダイズする条件の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書において使用する用語「ストリンジェンシー」は、その条件がハイブリダイゼーションを嫌う度合を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く嫌い、そのような条件下では、構造的に最も近縁な分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェント条件は、より低い構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションにとって有利になる。それゆえに、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、2つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。次の関係は、ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに役立つ（式中、Tmは核酸二重鎖の融解温度である）：
a．Tm＝69.3＋0.41(G+C)％
b．二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1％増加するごとに1℃低下する。
c．(Tm)μ2 −(Tm)μ1＝18.5 log10μ2/μ1
式中、μ1およびμ2は2つの溶液のイオン強度である。
【０１８３】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、総DNA濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在などといった数多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いDNA濃度、高いイオン強度、低い温度、長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階と「洗浄」段階の二段階で行われる。
【０１８４】
まず、結合段階では、ハイブリダイゼーションに有利な条件下で、プローブをターゲットに結合させる。この段階では、通常、温度を変えることによって、ストリンジェンシーが制御される。高ストリンジェンシーの場合、短い（＜20nt）オリゴヌクレオチドプローブを使用するのでない限り、温度は通常、65℃〜70℃である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、6×SSC、0.5％SDS、5×デンハルト溶液および100μgの非特異的キャリアDNAを含む。Ausubelら, section 2.9, supplement 27 (1994)参照。異なるバッファー条件であるが機能的には等価なものも、もちろん、数多く知られている。関連性の程度が低い場合は、低い温度を選びうる。低ストリンジェンシー結合温度は約25℃〜40℃である。中ストリンジェンシーは少なくとも約40℃〜約65℃未満である。高ストリンジェンシーは少なくとも約65℃である。
【０１８５】
次に、過剰のプローブを洗浄によって除去する。通常は、この段階において、よりストリンジェントな条件が適用される。したがって、ハイブリダイゼーションによって関連性を決定する際に最も重要なのは、この「洗浄」段階である。洗浄溶液は、典型的には、より低い塩濃度を含有する。例示的な中ストリンジェンシー溶液の一つは2×SSCおよび0.1％SDSを含有する。高ストリンジェンシー洗浄溶液は、（イオン強度で）約0.2×SSC未満に相当するものを含有し、好ましいストリンジェント溶液は約0.1×SSCを含有する。さまざまなストリンジェンシーに関連する温度は「結合」に関して上に述べたものと同じである。また、洗浄溶液は、典型的には、洗浄中に何度か交換される。例えば、典型的な高ストリンジェンシー洗浄条件は、55℃で30分間、2回洗浄すること、および60℃で15分間、3回洗浄することを含む。
【０１８６】
本発明の一実施形態は、本発明の融合ポリペプチドをコードする単離された核酸配列である。
【０１８７】
組換えDNAコンストラクトおよび発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換えDNAコンストラクトを提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用され、そこに、本発明の融合ポリペプチドをコードするDNA分子が挿入される。
【０１８８】
ここに提供される融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞中で組換え発現させることによって調製することができる。融合ポリペプチドを組換え発現させるために、融合ポリペプチドが宿主細胞中で発現するように、融合ポリペプチドをコードするDNAフラグメントを保因する組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えばSambrook, Fritsch and Maniatis編「Molecular Cloning；A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（1989）、Ausubel, F.M. et al.編「Current Protocols in Molecular Biology」Greene Publishing Associates（1989）およびBoss et al.の米国特許第4,816,397号に記述されているものなど、標準的な組換えDNA法を使って、融合ポリペプチドをコードする核酸を調製および/または取得し、それらの核酸を組換え発現ベクター中に組み込み、そのベクターを宿主細胞中に導入することができる。
【０１８９】
融合ポリペプチドを発現させるには、標準的な組換えDNA発現法を使用することができるう（例えばGoeddel「Gene Expression Technology」Methods in Enzymology 185, Academic Press, カリフォルニア州サンディエゴ（1990）参照）。例えば、所望のポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、次にそれを、適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるか誘導性であるかなどといった因子によって左右されることはいうまでもない。
【０１９０】
細菌発現
細菌用の有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターに対して作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅に備えて、1つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属のさまざまな種が含まれる。
【０１９１】
細菌ベクターは、例えばバクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースであることができる。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の要素を含有する市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含有することができる。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを、適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制解除/誘導し、細胞をさらにある期間培養する。細胞を典型的には遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果得られた粗抽出物を、さらなる精製のためにとっておく。
【０１９２】
細菌系では、発現させるタンパク質の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを、有利に選択しうる。例えば、そのようなタンパク質を大量に生産しようとする場合は、容易に精製される融合ポリペプチド産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましいであろう。本発明の融合ポリペプチドには、精製された産物、化学合成的手法の生成物、ならびに例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌などを含む原核宿主や、シュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属のさまざまな種から（好ましくは大腸菌細胞から）組換え技法によって生産された産物が含まれる。
【０１９３】
真核生物発現
真核細胞を使って本発明のポリペプチドを発現させることができる。タンパク質を発現させるための系は当技術分野において知られている。そのような系は、例えば真核細胞、成長培地、および対応する発現ベクターを含む。一般的な発現用真核細胞は、例えば哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞である。
【０１９４】
哺乳動物発現および精製
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）（CMVプロモーター/エンハンサーなど）、シミアンウイルス40（SV40）（SV40プロモーター/エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなどがある。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによるU.S.5,168,062、BellらによるU.S.4,510,245、およびSchaffnerらによるU.S.4,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる（例えばAxelらによるU.S.4,399,216、4,634,665およびU.S.5,179,017を参照されたい）。適切な選択可能マーカーとして、そのベクターが導入された宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
【０１９５】
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびDEAE-デキストラン、リポフェクションまたはポリカチオンによるトランスフェクションなどといった標準的技法を使って行うことができる。
【０１９６】
ここで提供される融合ポリペプチドを発現させるのに適した哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（例えばR.J.KaufmanおよびP.A.Sharp (1982) Mol.Biol.159:601-621に記載されているようにDHFR選択可能マーカーと共に使用されるUrlaubおよびChasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のdhfr- CHO細胞を含む）、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞などがある。一部の実施形態では、宿主細胞が成長している培養培地中に、発現したタンパク質が分泌されるように、発現ベクターが設計される。抗体の一過性トランスフェクション/発現は、例えばDurocherら (2002) Nucl. Acids Res. Vol 30 e9によるプロトコールに従って達成することができる。抗体の安定トランスフェクション/発現は、例えばUCOE系のプロトコール（T. Bentonら (2002) Cytotechnology 38:43-46）に従って達成することができる。
【０１９７】
融合ポリペプチドは標準的なタンパク質精製法を使って培養培地から回収することができる。
【０１９８】
本発明の融合ポリペプチドは、例えば限定するわけではないが、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどといった周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）も精製に使用することができる。例えばColligan「Current Protocols in Immunology」や「Current Protocols in Protein Science」（John Wiley & Sons, ニューヨーク州ニューヨーク）（1997-2001）の例えばChapter 1、4、6、8、9、10を参照されたい（これらは、それぞれ引用により、全て本明細書に組み込まれる）。
【０１９９】
本発明の融合タンパク質には、天然精製産物、化学合成的手法の生成物、ならびに例えば酵母（例えばピキア（Pichia））、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主（好ましくは哺乳動物細胞）から組換え技法によって生産された産物が含まれる。組換え生産手法に使用する宿主に依存して、本発明の融合ポリペプチドはグリコシル化体であることも、非グリコシル化体であることもでき、グリコシル化体は好ましい。そのような方法は、多くの標準的実験マニュアル、例えばSambrook（前掲）のSection 17.37〜17.42；Ausubel（前掲）のChapter 10、12、13、16、18および20などに記載されている。
【０２００】
治療的使用
本発明の一実施形態は、心血管疾患、腎臓疾患、膵炎、炎症、がん、強皮症、肺線維症、腎線維症、および肝線維症の処置における本発明の医薬組成物または融合ポリペプチドの使用である。
【０２０１】
心血管疾患
心血管系の障害または心血管障害とは、本発明においては、例えば次の障害を意味する：高血圧（血圧亢進）、末梢および心臓血管障害、冠動脈心疾患、安定および不安定狭心症、心筋不全、持続性虚血機能障害（「冬眠心筋」）、一過性虚血後機能障害（「気絶心筋」）、心不全、末梢血流異常、急性冠症候群、心不全および心筋梗塞。
【０２０２】
本発明に関して、心不全という用語は、心不全の急性的および慢性的症状発現、ならびに、より具体的な疾患タイプまたは関連する疾患タイプ、例えば急性非代償性心不全、右心不全、左心不全、全般的不全、虚血性心筋症、拡張型心筋症、先天性心欠損、心臓弁欠損、心臓弁欠損に関連する心不全、僧帽弁狭窄、僧帽弁閉鎖不全、大動脈狭窄、大動脈弁閉鎖不全、三尖弁狭窄、三尖弁閉鎖不全、肺動脈狭窄、肺動脈弁閉鎖不全、複合型心臓弁欠陥、心筋炎症（心筋炎）、慢性心筋炎、急性心筋炎、ウイルス性心筋炎、糖尿病性心不全、アルコール性心筋症、心蓄積障害、拡張期および収縮期心不全、ならびに悪化する心不全の急性期を包含する。
【０２０３】
本発明の化合物はさらに、梗塞の影響を受ける領域の低減および二次梗塞の予防にも適している。
【０２０４】
さらにまた、本発明の化合物は、血栓塞栓性障害、虚血後の再潅流損傷、微小血管および大血管病変（血管炎）、動脈および静脈血栓症、浮腫、心筋梗塞、脳卒中および一過性虚血発作などの虚血の予防および/または処置、冠動脈バイパス手術（CABG）、プライマリ経皮経管冠動脈形成術（PTCA）、血栓溶解後のPTCA、レスキューPTCA、心臓移植および開心術に関連する心臓保護、移植、バイパス手術、カテーテル検査および他の外科手術に関連する臓器保護にも適している。
【０２０５】
他の適応領域は、例えば、呼吸障害、例えば慢性閉塞性肺疾患（慢性気管支炎、COPD）、喘息、肺気腫、気管支拡張症、嚢胞性線維症（膵線維症）および肺高血圧、特に肺動脈高血圧などの防止および/または処置である。
【０２０６】
腎臓疾患
本発明は、クレアチニンクリアランスおよび/または水分排泄の異常な低下、尿素、窒素、カリウムおよび/またはクレアチニンの血中濃度の異常な増加、グルタミルシンテターゼなどの腎酵素の活性、尿容量オスモル濃度および尿量の変化、増加したミクロアルブミン尿、マクロアルブミン尿、糸球体および細動脈病変、尿細管拡張、高リン血症および/または透析の必要を特徴とし、それらと診断的に関連付けられる、腎臓疾患、とりわけ急性および慢性の腎臓疾患と急性および慢性の腎機能不全、ならびに透析の必要があるおよび透析の必要がない腎不全の急性期および慢性期を含む急性および慢性腎不全、ならびに基礎腎臓疾患または関連腎臓疾患、例えば腎低潅流、透析誘発性低血圧、腎糸球体症、糸球体性および尿細管性タンパク尿、腎性浮腫、血尿、原発性、続発性ならびに急性および慢性糸球体腎炎、膜性および膜性増殖性糸球体腎炎、アルポート症候群、糸球体硬化症、間質性尿細管疾患、原発性および先天性腎臓疾患などの腎臓疾患、腎臓炎症、腎移植拒絶のような免疫学的腎疾患、免疫複合体誘発性腎疾患、ならびに中毒誘発性腎臓病、糖尿病性および非糖尿病性腎疾患、腎盂腎炎、嚢胞腎、腎硬化症、高血圧性腎硬化症、ネフローゼ症候群を予防および/または処置するための医薬としての、本発明の融合ポリペプチドの使用に関する。
【０２０７】
加えて、本発明の融合ポリペプチドは、腎臓の不完全な切除後の腎臓癌、利尿剤を使いすぎた後の脱水、悪性高血圧による無制御な血圧増加、尿路閉塞および尿路感染、アミロイドーシス、ならびに糸球体損傷に関連する全身性疾患、例えば紅斑性狼瘡、およびリューマチ性全身免疫疾患、ならびに腎動脈狭窄、腎動脈血栓症、腎静脈血栓症、鎮痛薬誘発性ネフロパシーおよび腎尿細管アシドーシスを予防および/または処置するための医薬として使用することができる。
【０２０８】
加えて、本発明の融合ポリペプチドは、造影剤誘発性および薬物誘発性の急性および慢性間質性腎臓疾患、メタボリック症候群ならびに異脂肪血症を予防および/または処置するための医薬として使用することができる。
【０２０９】
加えて、本発明は、急性および/または慢性腎臓疾患に関連する後遺症、例えば肺水腫、心不全、尿毒症、貧血、電解質異常（例えば高カリウム血、低ナトリウム血）、ならびに骨代謝および糖質代謝を予防および/または処置するための医薬としての本発明の融合ポリペプチドの使用を包含する。
【０２１０】
肺疾患
さらにまた、本発明の融合ポリペプチドは、肺疾患、とりわけ喘息性障害、肺動脈高血圧（PAH）および左心疾患を含む他の形態の肺高血圧（PH）、HIV、鎌状赤血球貧血、血栓塞栓症（CTEPH）、サルコイドーシス（sarkoidosis）、COPDまたは肺線維症関連肺高血圧、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、α-1-アンチトリプシン欠損症（AATD）、肺線維症、肺気腫（例えば喫煙によって誘発される肺気腫）および嚢胞性線維症（CF）の処置および/または予防にも適している。
【０２１１】
線維障害
さらにまた、本発明の融合ポリペプチドは、例えば肺、心臓、腎臓、骨髄、そして特に肝臓などといった内臓の線維障害、ならびに皮膚線維症および線維性眼障害の処置および/または予防にも適している。本発明において、線維障害という用語は特に次の用語を包含する：肝線維症、肝硬変、肺線維症、心内膜心筋線維症、ネフロパシー、糸球体腎炎、間質性腎線維症、糖尿病に起因する線維性損傷、骨髄線維症および類似の線維障害、強皮症、モルヘア、ケロイド、肥厚性瘢痕形成（外科手術に続発するものを含む）、母斑、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症および結合組織の障害（例えばサルコイドーシス）。
【０２１２】
がん
がんは、ある細胞群が無制御な成長を示す疾患である。がんは通常は、上皮細胞由来のがんである癌（この群は、乳癌、前立腺癌、肺癌および大腸癌など、最も一般的ながんの多くを含む）；結合組織または間葉細胞に由来する肉腫；造血細胞に由来するリンパ腫および白血病；多能性細胞由来の胚細胞性腫瘍；および未熟「前駆体」または胚性組織に由来するがんである芽細胞腫に分類される。
【０２１３】
さらにまた、本発明は、障害（特に上述の障害）の処置および/または防止を目的とする医薬を製造するための、本発明の融合ポリペプチドの使用を提供する。
【０２１４】
さらにまた、本発明は、有効量の少なくとも1つの本発明の融合ポリペプチドを使って障害（特に上述の障害）を処置および/または防止する方法を提供する。
【０２１５】
さらにまた、本発明は、冠動脈心疾患、急性冠症候群、心不全、および心筋梗塞の処置および/または予防方法において使用するための本発明の融合ポリペプチドを提供する。
【０２１６】
医薬組成物および投与
本発明は、薬学的に許容される媒体中に単鎖リラキシン融合タンパク質を含む医薬組成物も提供する。単鎖リラキシン融合タンパク質は全身投与または局所投与することができる。例えば限定するわけではないが、静脈内、腹腔内、動脈内、鼻腔内、吸入、経口、皮下投与、局所注射または外科的インプラントの形態など、当技術分野において知られている任意の適当な投与様式を使用することができる。
【０２１７】
本発明は、本発明の融合ポリペプチドを単独で含むか、または少なくとも1つの他の薬剤（生体適合性医薬単体など）と組み合わせて含みうる医薬組成物であって、例えば限定するわけではないが食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった任意の滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができるものにも関係する。これらの分子はいずれも、単独で、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて、それが賦形剤または医薬上許容される担体と混合されている医薬組成物として、患者に投与することができる。本発明の一実施形態では、医薬上許容される担体が医薬的に不活性である。
【０２１８】
本発明は医薬組成物の投与にも関係する。そのような投与は経口的または非経口的に達成される。非経口送達の方法には、局所外用（topical）、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。これらの医薬組成物は、活性成分に加えて、活性化合物を医薬的に使用することができる調製物へと加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む適切な医薬上許容される担体を含有しうる。製剤および投与のための技法に関するさらなる詳細は「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Ed. Maack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見いだすことができる。
【０２１９】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野において周知の医薬上許容される担体を使って、経口投与に適した投薬量で、製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、製剤化することを可能にする。
【０２２０】
非経口投与用の医薬製剤には活性化合物の水溶液が含まれる。注射用に、本発明の医薬組成物を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁剤として調製することもできる。適切な親油性の溶剤または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームなどがある。場合によっては、懸濁液が、適切な安定剤、または高濃度溶液の調製が可能になるように化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有してよい。
【０２２１】
本発明の融合ポリペプチドは、単独で使用するか、必要であれば、他の活性化合物と組み合わせて使用することができる。さらにまた、本発明は、少なくとも1つの本発明の融合ポリペプチドと1つ以上のさらなる活性成分とを含む、特に上述の障害を処置および/または防止するための、医薬を提供する。
【０２２２】
併用に適した活性成分は、例えば好ましくは次に挙げるものである：脂質代謝を調整する活性成分、抗糖尿病薬、降圧剤、潅流強化剤および/または抗血栓剤、抗酸化剤、ケモカイン受容体アンタゴニスト、p38キナーゼ阻害剤、NPYアゴニスト、オレキシンアゴニスト、食欲低下薬、PAF-AH阻害剤、消炎薬（COX阻害剤、LTB4受容体アンタゴニスト）、鎮痛薬、例えばアスピリン、抗うつ薬および他の向精神薬。
【０２２３】
本発明は、特に、少なくとも1つの本発明の融合ポリペプチドと少なくとも1つの脂質代謝改変活性成分、抗糖尿病薬、血圧低下活性成分および/または抗血栓効果を有する薬剤との組み合わせに関する。
【０２２４】
本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは、次に挙げる物質の１つ以上と組み合わせることができる：
【０２２５】
・脂質代謝調整活性成分、例えば好ましくは、HMG-CoA還元酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素発現の阻害剤、スクアレン合成阻害剤、ACAT阻害剤、LDL受容体誘導物質、コレステロール吸収阻害剤、ポリマー型胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収阻害剤、MTP阻害剤、リパーゼ阻害剤、LpL活性化物質、フィブラート、ナイアシン、CETP阻害剤、PPAR-α、PPAR-γおよび/またはPPAR-δアゴニスト、RXR調整物質、FXR調整物質、LXR調整物質、甲状腺ホルモンおよび/または甲状腺ホルモンミメティック、ATPクエン酸リアーゼ阻害剤、Lp(a)アンタゴニスト、カンナビノイド受容体1アンタゴニスト、レプチン受容体アゴニスト、ボンベシン受容体アゴニスト、ヒスタミン受容体アゴニストおよび抗酸化剤/ラジカル捕捉剤の群からのもの；
【０２２６】
・Rote Liste 2004/IIのチャプター（chapter）12において言及されている抗糖尿病薬、また、例えば好ましくは、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド誘導体、グルコシダーゼ阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤（DPP-IV阻害剤）、オキサジアゾリジノン、チアゾリジンジオン、GLP1受容体アゴニスト、グルカゴンアンタゴニスト、インスリン抵抗性改善薬、CCK1受容体アゴニスト、レプチン受容体アゴニスト、糖新生および/またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝臓酵素の阻害剤、グルコース取り込みの調整物質、およびカリウムチャネル開口薬、例えばWO97/26265およびWO99/03861に開示されているものなどの群からのもの；
【０２２７】
・降圧活性成分、例えば好ましくは、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンAIIアンタゴニスト、ACE阻害剤、レニン阻害剤、β受容体遮断薬、α受容体遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、ECE阻害剤、ACE/NEP阻害剤およびバソペプチダーゼ阻害剤の群からのもの；および/または
【０２２８】
・抗血栓剤、例えば好ましくは、血小板凝集阻害剤または抗凝固剤の群からのもの；
・利尿剤；
・バソプレシン受容体アンタゴニスト；
・有機ナイトレートおよびNO供与体；
・正の変力活性を有する化合物；
・環状グアノシン一リン酸（cGMP）および/または環状アデノシン一リン酸（cAMP）の分解を阻害する化合物、例えばホスホジエステラーゼ（PDE）1、2、3、4および/または5の阻害剤など、特にPDE5阻害剤、例えばシルデナフィル、バルデナフィルおよびタダラフィル、ならびにPDE3阻害剤、例えばミルリノン；
・ナトリウム利尿ペプチド、例えば「心房性ナトリウム利尿ペプチド」（ANP、アナリチド）、「B型ナトリウム利尿ペプチド」または「脳性ナトリウム利尿ペプチド」（BNP、ネシリチド）、「C型ナトリウム利尿ペプチド」（CNP）およびウロジラチンなど；
・プロスタサイクリン受容体（IP受容体）のアゴニスト、例えばイロプロスト、ベラプロスト、シカプロストなど；
【０２２９】
・If（ファニーチャネル（funny channel））チャネルの阻害剤、例えばイバブラジン；
・カルシウム増感剤、例えば好ましくは、レボシメンダン
・カリウム補給剤；
・グアニル酸シクラーゼのNO非依存性かつヘム依存性刺激物質、例えば特にWO00/06568、WO00/06569、WO02/42301およびWO03/095451に記載の化合物；
・グアニル酸シクラーゼのNO非依存性かつヘム非依存性刺活性化剤、例えば、特にWO01/19355、WO01/19776、WO01/19778、WO01/19780、WO02/070462およびWO02/070510に記載の化合物；
・ヒト好中球エラスターゼ（HNE）の阻害剤、例えばシベレスタットおよびDX-890（レルトラン（Reltran））など；
・シグナル伝達カスケードを阻害する化合物、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、特にソラフェニブ、イマチニブ、ゲフィチニブおよびエルロチニブなど；および/または
・心臓のエネルギー代謝を調整する化合物、例えばエトモキシル、ジクロロアセテート、ラノラジンおよびトリメタジジン。
【０２３０】
脂質代謝調整活性成分は、好ましくは、HMG-CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成阻害剤、ACAT阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、MTP阻害剤、リパーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよび/または甲状腺ホルモンミメティック（thyroid mimetic）、ナイアシン受容体アゴニスト、CETP阻害剤、PPAR-αアゴニスト、PPAR-γアゴニスト、PPAR-δアゴニスト、ポリマー型胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収阻害剤、抗酸化剤/ラジカル捕捉剤およびカンナビノイド受容体1アンタゴニストの群からの化合物を意味すると理解すべきである。
【０２３１】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、スタチン類のクラスからのHMG-CoA還元酵素阻害剤、例えば好ましくは、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチンなどと組み合わせて投与される。
【０２３２】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、スクアレン合成阻害剤、例えば好ましくは、BMS-188494またはTAK-475などと組み合わせて投与される。
【０２３３】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ACAT阻害剤、例えば好ましくは、アバシミベ、メリナミド、パクチミベ、エフルシミベまたはSMP-797などと組み合わせて投与される。
【０２３４】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、コレステロール吸収阻害剤、例えば好ましくは、エゼチミブ、チクエシドまたはパマクエシドなどと組み合わせて投与される。
【０２３５】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、MTP阻害剤、例えば好ましくは、インプリタピド、BMS-201038、R-103757またはJTT-130などと組み合わせて投与される。
【０２３６】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、リパーゼ阻害剤、例えば好ましくは、オルリスタットなどと組み合わせて投与される。
【０２３７】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、甲状腺ホルモンおよび/または甲状腺ホルモンミメティック、例えば好ましくは、D-チロキシンまたは3,5,3'-トリヨードチロニン（T3）などと組み合わせて投与される。
【０２３８】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ナイアシン受容体のアゴニスト、例えば好ましくは、ナイアシン、アシピモクス、アシフランまたはラデコール（radecol）などと組み合わせて投与される。
【０２３９】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、CETP阻害剤、例えば好ましくは、ダルセトラピブ、BAY60-5521、アナセトラピブまたはCETPワクチン（CETi-1）などと組み合わせて投与される。
【０２４０】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、PPAR-γアゴニスト、例えばチアゾリジンジオンのクラスからのもの、例えば好ましくは、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンなどと組み合わせて投与される。
【０２４１】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、PPAR-δアゴニスト、例えば好ましくは、GW-501516またはBAY68-5042などと組み合わせて投与される。
【０２４２】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ポリマー型胆汁酸吸着剤、例えば好ましくは、コレスチラミン、コレスチポール、コレソルバム（colesolvam）、コレスタゲルまたはコレスチミドなどと組み合わせて投与される。
【０２４３】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、胆汁酸再吸収阻害剤、例えば好ましくは、ASBT（＝IBAT）阻害剤、例えばAZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435またはSC-635などと組み合わせて投与される。
【０２４４】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、抗酸化剤/ラジカル捕捉剤、例えば好ましくは、プロブコール、AGI-1067、BO-653またはAEOL-10150などと組み合わせて投与される。
【０２４５】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、カンナビノイド受容体1アンタゴニスト、例えば好ましくは、リモナバントまたはSR-147778などと組み合わせて投与される。
【０２４６】
抗糖尿病薬は、好ましくはインスリンおよびインスリン誘導体、ならびに経口有効性血糖降下活性成分を意味すると理解すべきである。ここで、インスリンおよびインスリン誘導体には、動物、ヒトまたは生物工学起源のインスリンも、その混合物も包含される。経口有効性血糖低下活性成分には、好ましくは、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド誘導体、グルコシダーゼ阻害剤およびPPAR-γアゴニストが含まれる。
【０２４７】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、インスリンと組み合わせて投与される。
【０２４８】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、スルホニル尿素、例えば好ましくは、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドまたはグリクラジドなどと組み合わせて投与される。
【０２４９】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ビグアニド、例えば好ましくは、メトホルミンなどと組み合わせて投与される。
【０２５０】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、メグリチニド誘導体、例えば好ましくは、レパグリニドまたはナテグリニドなどと組み合わせて投与される。
【０２５１】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、グルコシダーゼ阻害剤、例えば好ましくは、ミグリトールまたはアカルボースなどと組み合わせて投与される。
【０２５２】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、DPP-IV阻害剤、例えば好ましくは、シタグリプチンおよびビルダグリプチンなどと組み合わせて投与される。
【０２５３】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、PPAR-γアゴニスト、例えばチアゾリンジオンのクラスからのもの、例えば好ましくは、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンなどと組み合わせて投与される。
【０２５４】
降圧剤は、好ましくは、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンAIIアンタゴニスト、ACE阻害剤、β受容体遮断薬、α受容体遮断薬および利尿剤の群からの化合物を意味すると理解される。
【０２５５】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、カルシウムアンタゴニスト、例えば好ましくは、ニフェジピン、アムロジピン、ベラパミルまたはジルチアゼムなどと組み合わせて投与される。
【０２５６】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、アンジオテンシンAIIアンタゴニスト、例えば好ましくは、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、エンブサルタン（embusartan）、オルメサルタンまたはテルミサルタンなどと組み合わせて投与される。
【０２５７】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ACE阻害剤、例えば好ましくは、エナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル、デラプリル、フォシノプリル、キノプリル（quinopril）、ペリンドプリルまたはトランドプリル（trandopril）などと組み合わせて投与される。
【０２５８】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、β受容体遮断薬、例えば好ましくは、プロプラノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、アルプレノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ブプラノロール、メチプラノロール、ナドロール、メピンドロール、カルアザロール（carazalol）、ソタロール、メトプロロール、ベタキソロール、セリプロロール、ビソプロロール、カルテオロール、エスモロール、ラベタロール、カルベジロール、アダプロロール、ランジオロール、ネビボロール、エパノロールまたはブシンドロールなどと組み合わせて投与される。
【０２５９】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、α受容体遮断薬、例えば好ましくは、プラゾシンなどと組み合わせて投与される。
【０２６０】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、利尿剤、例えば好ましくは、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、ベンドロフルメチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロロメチアジド、クロルタリドン（chlorothalidone）、インダパミド、メトラゾン、キネタゾン、アセタゾラミド、ジクロロフェンアミド、メタゾラミド、グリセロール、イソソルビド、マンニトール、アミロライドまたはトリアムテレンなどと組み合わせて投与される。
【０２６１】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、アルドステロンまたは鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、例えば好ましくは、スピロノラクトンまたはエプレレノンなどと組み合わせて投与される。
【０２６２】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、バソプレシン受容体アンタゴニスト、例えば好ましくは、コニバプタン、トルバプタン、リキシバプタンまたはSR-121463などと組み合わせて投与される。
【０２６３】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、有機ナイトレートまたはNO供与体、例えば好ましくは、ニトロプルシドナトリウム、ニトログリセロール、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、モルシドミまたはSIN-1などと組み合わせて、または吸入NOと組み合わせて投与される。
【０２６４】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、正の変力化合物、例えば好ましくは、強心配糖体（ジゴキシン）、βアドレナリン作動性およびドーパミン作動性アゴニスト、例えばイソプロテレノール、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンまたはドブタミンなどと組み合わせて投与される。
【０２６５】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、抗交感神経刺激剤（antisympathotonic）、例えばレセルピン、クロニジンまたはα-メチルドーパと組み合わせて、またはカリウムチャネルアゴニスト、例えばミノキシジル、ジアゾキシド、ジヒドララジンまたはヒドララジンと組み合わせて、または酸化窒素を放出する物質、例えば硝酸グリセロールまたはニトロプルシドナトリウムと組み合わせて投与される。
【０２６６】
抗血栓剤は、好ましくは血小板凝集阻害剤または抗凝固剤の群からの化合物を意味すると理解すべきである。
【０２６７】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、血小板凝集阻害剤、例えば好ましくは、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジンまたはジピリダモールなどと組み合わせて投与される。
【０２６８】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、トロンビン阻害剤、例えば好ましくは、キシメラガトラン、メラガトラン、ダビガトラン、ビバリルジンまたはクレキサンなどと組み合わせて投与される。
【０２６９】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、GPIIb/IIIaアンタゴニスト、例えば好ましくは、チロフィバンまたはアブシキシマブなどと組み合わせて投与される。
【０２７０】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、第Xa因子阻害剤、例えば好ましくは、リバーロキサバン（BAY59-7939）、DU-176b、アピキサバン、オタミキサバン、フィデキサバン、ラザキサバン、フォンダパリヌクス、イドラパリナックス、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX9065a、DPC906、JTV803、SSR-126512またはSSR-128428などと組み合わせて投与される。
【０２７１】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ヘパリンまたは低分子量（LMW）ヘパリン誘導体と組み合わせて投与される。
【０２７２】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドが、ビタミンKアンタゴニスト、例えば好ましくは、クマリンなどと組み合わせて投与される。
【０２７３】
本発明において、特に好ましいのは、少なくとも1つの本発明の融合ポリペプチドと、HMG-CoA還元酵素阻害剤（スタチン）、利尿剤、β受容体遮断薬、有機ナイトレートおよびNO供与体、ACE阻害剤、アンジオテンシンAIIアンタゴニスト、アルドステロンおよび鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、バソプレシン受容体アンタゴニスト、血小板凝集阻害剤および抗凝固剤からなる群より選択される1つ以上のさらなる活性成分とを含む組み合わせ、ならびに上述の障害を処置および/または防止するためのそれらの使用である。
【０２７４】
さらにまた、本発明は、少なくとも1つの本発明の融合ポリペプチドを、通常は、1つ以上の不活性で無毒性の医薬的に適切な助剤と一緒に含む医薬、ならびに上述した目的でのそれらの使用を提供する。
【０２７５】
治療有効量
本発明における使用に適した医薬組成物としては、意図した目的（例えば心不全）を達成するために活性成分が有効量で含まれている組成物が挙げられる。有効量の決定は当業者の能力で十分に可能である。
【０２７６】
どの化合物についても、治療有効量は、まずはインビトロアッセイ（例えばLGR7受容体活性化）で、または単離潅流ラット心臓においてエクスビボで、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタで、推定することができる。動物モデルを使用することで、望ましい濃度範囲および投与経路も得られる。次に、そのような情報を使って、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
【０２７７】
治療有効量とは、症状または状態を改善する融合ポリペプチドの量を指す。そのような化合物の治療効力および毒性は、例えばED50（集団の50％において治療的に有効な用量）およびLD50（集団の50％に対して致死的な用量）など、標準的な薬学的手法により、インビトロでまたは実験動物で決定することができる。治療効果と毒性効果の用量比が治療係数であり、これは比ED50/LD50として表すことができる。大きな治療係数を呈する医薬組成物は好ましい。インビトロアッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に関して投薬量範囲を策定する際に使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、ED50を含み、毒性がほとんどまたは全くないような循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形、患者の感度、および投与経路に応じてこの範囲内で変動する。
【０２７８】
通常の投薬量は、投与経路に応じて、合計用量で0.1ミリグラムから100,000ミリグラムまで変動しうる。特定の投薬量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。米国特許第4,657,760号；同第5,206,344号；または同第5,225,212号を参照されたい。ポリヌクレオチドについては、タンパク質またはそれらの阻害剤とは異なる製剤を、当業者は使用するであろう。また、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的であるだろう。
【０２７９】
以下に実施例を挙げて、本発明を、さらに詳しく説明する。これらの実施例は、具体的な実施形態を参照して本発明を例証するために提供されるにすぎない。これらの実例は、本発明の一定の具体的態様を例示するものであるが、限定を表すものではなく、ここに開示する発明の範囲を定めようとするものでもない。
【０２８０】
全ての実施例は、別段の説明が詳細になされている場合を除き、当業者にとっては周知でありかつルーチンである標準的技法使って行われた。下記実施例のルーチン分子生物学技法は、Sambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989などの標準的実験マニュアルに記載されているとおりに行うことができる。
【０２８１】
さらなる好ましい実施形態は次のとおりである：
1．A-L-Bを含む、リラキシン活性を有する融合ポリペプチドであって、
BがリラキシンB鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、
AがリラキシンA鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、かつ
Lがリンカーポリペプチドである、
融合ポリペプチド。
【０２８２】
2．BがリラキシンB鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体であり、
AがリラキシンA鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体であり、かつ
Lがリンカーポリペプチドである、
項目1に記載の融合ポリペプチド。
【０２８３】
3．リラキシンB鎖がリラキシン2B鎖またはリラキシン3B鎖である、項目1または2に記載の融合ポリペプチド。
【０２８４】
4．リラキシンA鎖がリラキシン2A鎖またはリラキシン3A鎖である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２８５】
5．リラキシンA鎖がリラキシン2 A鎖である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２８６】
6．リラキシンA鎖がリラキシン3A鎖である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２８７】
7．リラキシンA鎖がリラキシン2 A鎖であり、リラキシンB鎖がリラキシン2 B鎖である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２８８】
8．リラキシンA鎖およびB鎖がヒトリラキシンA鎖およびB鎖である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２８９】
9．少なくとも1つの半減期延長部分をさらに含む、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２９０】
10．半減期延長部分が非タンパク質性またはタンパク質性半減期延長部分である、項目9に記載の融合ポリペプチド。
【０２９１】
11．ポリペプチドが式：
(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p
［ここで、
R1およびR2はタンパク質性半減期延長部分であり、
S1およびS2はストレッチャーペプチドであり、
m、n、oおよびpは独立して数字0または1である。ただし、m、n、o、およびpの少なくとも1つは1であるものとする］
を有する、項目9または10に記載の融合ポリペプチド。
【０２９２】
12．mおよびnが0であり、oおよびpが1である、項目11に記載の融合ポリペプチド。
【０２９３】
13．mおよびnが1であり、oおよびpが0である、項目11に記載の融合ポリペプチド。
【０２９４】
14．mが1であり、n、oおよびpが0である、項目11に記載の融合ポリペプチド。
【０２９５】
15．m、nおよびoが0であり、pが1である、項目11に記載の融合ポリペプチド。
【０２９６】
16．R1およびR2が、免疫グロブリンFcドメイン、血清アルブミン、トランスフェリンおよび血清アルブミン結合タンパク質からなるタンパク質性半減期延長部分の群に含まれるタンパク質性半減期延長部分である、項目11〜15のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２９７】
17．タンパク質性半減期延長部分がIgG1 Fcドメインである、項目10〜16のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２９８】
18．タンパク質性半減期延長部分がヒトタンパク質性である、項目10〜17のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０２９９】
19．非タンパク質性半減期延長部分がPEGまたはHESである、項目10に記載の融合ポリペプチド。
【０３００】
20．ストレッチャーポリペプチドS1およびS2が1〜25アミノ酸長である、項目11〜19のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０１】
21．ストレッチャーポリペプチドS1およびS2が4〜10アミノ酸長、好ましくは10アミノ酸長である、項目11〜20のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０２】
22．ストレッチャーポリペプチドS1およびS2が、配列番号148、配列番号149、および配列番号150に示すポリペプチドからなるストレッチャーポリペプチドの群に含まれる、項目21に記載の融合ポリペプチド。
【０３０３】
23．リンカーポリペプチドLが6〜14アミノ酸長である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０４】
24．リンカーポリペプチドLが7〜11アミノ酸長である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０５】
25．リンカーポリペプチドLが、8、9、または10アミノ酸長である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０６】
26．リンカーポリペプチドLが9アミノ酸長である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０７】
27．リンカーポリペプチドLが、6、7、8、9、10、11、12、13および14アミノ酸長を有するリンカーからなるリンカーの群に含まれる、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０８】
28．リンカーポリペプチドLにおいて、リンカーLのアミノ酸残基が4アミノ酸残基を除いて全てGlyおよび/またはSer残基からなり、残りの4アミノ酸残基が天然アミノ酸の群から選択される、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３０９】
29．リンカーポリペプチドLが少なくとも1つのGly、Ser、Arg、Cys、Leuおよび/またはLys残基を含む、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１０】
30．リンカーポリペプチドLがGly残基およびSer残基を含む、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１１】
31．リンカーポリペプチドLがGly残基およびSer残基からなる前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１２】
32．リンカーポリペプチドLがGly残基およびSer残基を含み、少なくとも3対1であるGly対Serの比を有する、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１３】
33．リンカーポリペプチドLが、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号145および配列番号146に示すポリペプチドからなるリンカーポリペプチドの群に含まれる、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１４】
34．リラキシンA鎖がヒトリラキシン2 A鎖（配列番号117）であり、リラキシンB鎖がヒトリラキシン2 B鎖（配列番号119）である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１５】
35．Aがヒトリラキシン2 A鎖（配列番号117）であり、Bがヒトリラキシン2 B鎖（配列番号119）である、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１６】
36．表3に示すポリペプチドを含む、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１７】
37．A-L-Bが、scR3、scR4、scR5、scR3タグなし、scR4タグなし、scR5タグなし、scR-Fc5、scR-Fc6およびscR-Fc7からなるA-L-Bポリペプチドの群から選択される、前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３１８】
38．表3に示す融合ポリペプチド。
【０３１９】
39．scR3、scR4、scR5、scR3タグなし、scR4タグなし、scR5タグなし、scR-Fc5、scR-Fc6およびscR-Fc7からなる群より選択される融合ポリペプチド。
【０３２０】
40．前記項目のいずれか一つに記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０３２１】
41．項目40に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０３２２】
42．項目41に記載のベクターまたは項目40に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【０３２３】
43．真核細胞または原核細胞である、項目42に記載の宿主細胞。
【０３２４】
44．真核宿主細胞が哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である、項目42または43に記載の宿主細胞。
【０３２５】
45．哺乳動物宿主細胞がCHO細胞である、項目44に記載の宿主細胞。
【０３２６】
46．原核宿主細胞が細菌細胞、好ましくは大腸菌細胞である、項目43に記載の宿主細胞。
【０３２７】
47．項目1〜39のいずれか一つに記載のポリペプチドを生産する方法であって、項目42〜46の宿主細胞を培養するステップおよびポリペプチドを単離するステップを含む方法。
【０３２８】
48．項目1〜39のいずれか一つに記載の融合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【０３２９】
49．医薬としての、項目48に記載の医薬組成物または項目1〜39のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３３０】
50．心血管疾患、肺疾患、線維障害または腎臓疾患を処置するための医薬としての、項目48および49に記載の医薬組成物または項目1〜39のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
【０３３１】
51．治療有効量の、項目48および49に記載の医薬組成物または項目1〜39のいずれか一つに記載の融合ポリペプチドを、投与することを含む、心血管疾患、肺疾患、線維障害または腎臓疾患を処置する方法。
【０３３２】
52．心血管疾患が冠動脈心疾患、急性冠症候群、心不全、および心筋梗塞である、項目50および51に記載の処置。
【実施例】
【０３３３】
実験プロトコール
リラキシン変異体の構築：
リラキシン変異体のcDNA配列を化学的遺伝子合成によって作製した。合成された遺伝子を哺乳類発現ベクターpCEP4（Invitrogen、カタログ番号V044-50）にサブクローニングした。結果として生じるタンパク質を正しく分泌させるためのシグナルリーダー配列として、LDL受容体関連タンパク質（LRP）のリーダー配列（アミノ酸組成MLTPPLLLLLPLLSALVAA）またはCD33のリーダー配列（アミノ酸組成MPLLLLLPLLWAGALA）を使用した。合成されたコンストラクトのサブクローニングには、制限酵素HindIIIおよびBamH1を製造者の指示に従って使用した。
【０３３４】
リラキシン変異体の発現：
小規模発現（培養体積2ミリリットルまで）の場合は、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen、カタログ番号11668-019）を製造者の指示に従って使用することにより、HEK293（ATCC、カタログ番号CRL-1573)細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞は、D-Mem F12（Gibco、#31330）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco、#15140）および10％ウシ胎児血清（FCS、Gibco、#11058）において、5％二酸化炭素の湿潤インキュベーター中、37℃で培養した。
【０３３５】
トランスフェクションの3〜5日後に、安定トランスフェクトCHO-CRE-GR7細胞株を使って、トランスフェクト細胞の条件培地を、活性について試験した。
【０３３６】
大規模発現（培養体積10ミリリットル以上）の場合は、Tom et al., 2007で述べられているように、哺乳動物細胞においてコンストラクトを一過性に発現させた。簡単に述べると、発現プラスミドをHEK293-6E細胞にトランスフェクトし、フェルレンバッハフラスコまたはWAVEバッグにおいてインキュベートした。発現は、F17培地（Invitrogen）中、37℃で5〜6日間行なった。トランスフェクション後に5g/lトリプトンTN1（Organotechnie）、1％Ultra-Low IgG FCS（Invitrogen）および0.5mMバルプロ酸（Sigma）を補足した。
【０３３７】
リラキシン変異体の精製：
リラキシンFc融合コンストラクトを哺乳動物細胞培養上清から精製した。まず、遠心分離によって上清を細胞片から清澄化した。タンパク質は、プロテインA（MabSelect Sure、GE Healthcare）アフィニティークロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）とによって精製した。したがって上清を、PBS pH7.4（Sigma/Aldrich）中で前もって平衡化しておいたプロテインAカラムに適用し、夾雑物を10カラム体積のPBS pH7.4＋500mM NaClで除去した。リラキシンFc融合コンストラクトを50mM酢酸Na pH3.5＋500mM NaClで溶出し、PBS pH7.4中のSuperdex 200カラムによるSECでさらに精製した。
【０３３８】
c-Mycタグ付きタンパク質またはポリペプチドの精製には、c-Myc tagged Protein Mild Purification Gel（Biozol Diagnostic、Protein Mild Purification Gel、カタログ番号3306）を製造者の指示に従って使用する。
【０３３９】
Hisタグ付きタンパク質またはポリペプチドの精製には、Ni-NTAスピンカラム（Qiagen、Ni-NTA Spin Kit、カタログ番号31314）を製造者の指示に従って使用する。
【０３４０】
発現したリラキシン変異体の定量：
分泌され精製された組換えリラキシン変異体の定量には、市販の定量ELISA（R&D Systems、Human Relaxin-2 Quantikine ELISA Kit、カタログ番号DRL200）を製造者の指示に従って使用した。
【０３４１】
加えて、一部のコンストラクトについては、FC-ELISAを使ってタンパク質を定量した。Fc ELISAのために、96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc、Maxi Sorp black、カタログ番号460918）を、抗Fc抗体（SigmaAldrich、カタログ番号A2136）により、4℃で終夜、1ミリリットルあたり5μgの濃度で、コーティングした。PBSと0.05％Tween 20（SigmaAldrich、カタログ番号63158）とからなる緩衝液を、1ウェルあたり50マイクロリットル使って、プレートを1回洗浄した。30マイクロリットルのブロッキング緩衝液（Candor Bioscience、カタログ番号113500）を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。1ウェルあたり50マイクロリットルのPBS/0.05％Tween 20緩衝液を使って、プレートを3回洗浄した。試料を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。必要に応じて、上述のブロッキング緩衝液を使って試料を希釈しなければならない。インキュベーション後に、1ウェルあたり50マイクロリットルのPBS/0.05％Tween 20緩衝液を使って、プレートを3回洗浄した。
【０３４２】
検出のために、10％ブロッキング緩衝液で1：10000希釈した抗h-Fc-POD（SigmaAldrich、カタログ番号A0170）30マイクロリットルを加え、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、1ウェルあたり50マイクロリットルのPBS/0.05％Tween 20緩衝液を使って、プレートを3回洗浄した。30マイクロリットルのBM Blue Substrate POD（Roche Diagnostics、カタログ番号11484281001）を加え、5分間のインキュベーション後に、1モル濃度の硫酸（acid sulfur）溶液の添加によって反応を停止した。Tecan Infinite 500リーダー、吸光度モード、吸光（extinction）450nm、発光（emission）690nmを使って吸収を測定した。
【０３４３】
Mycタグ付きタンパク質の濃度の決定には、Human c-Myc ELISAキット（EIAab & USCNLIFE、Wuhan EIAab Science Co., Ltd、カタログ番号E1290h）を、製造者の指示に従って使用した。
【０３４４】
Hisタグ付きタンパク質の濃度の決定には、His-Tag Protein ELISAキット（BIOCAT GmbH、カタログ番号AKR-130）を製造者の指示に従って使用した。
【０３４５】
HA（ヘマグルチニン）タグ付きタンパク質の濃度の決定には、ヒトヘマグルチンHA ELISAキット（Hoelzel Diagnostika、カタログ番号CSB-E09360h）を製造者の指示に従って使用した。
【０３４６】
活性試験：
CHO K1細胞（ATCC、カタログ番号CCL-61）にサイクリックAMP応答配列（CRE）ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクト（Biomyx Technology、pHTS-CRE、カタログ番号P2100）を安定にトランスフェクトして、CHO-CRE-ルシフェラーゼ細胞株を得た。
【０３４７】
次に、この細胞株に、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1(-)（Invitrogen、カタログ番号V79520）に2271塩基対長のDNAフラグメントとしてクローニングされたヒトLGR7/RXFP1受容体（アクセッション番号NM_021634.2）を安定にトランスフェクトして、CHO-CRE-LGR7細胞株を得た。この細胞株を、D-Mem F12（Gibco、#31330）、2mM Glutamax（Gibco、#35050）、100nMピルビン酸塩（Gibco、#11360-070）、20mM Hepes（Gibco、#15630）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco、#15140）および10％ウシ胎児血清（FCS、Gibco、#11058）で培養した。
【０３４８】
刺激のために、培地を、さまざまな濃度の組換え発現リラキシン変異体タンパク質（通常は100nMの濃度から出発して、1：2ずつ希釈したもの）を含有するOptiMem（Gibco、#11058）＋1％FCSと交換した。陽性対照として、市販の組換え発現ヒトリラキシン2（Genbankアクセッション番号NP_604390.1）を使用した（R&D Systems、カタログ番号6586-RN-025）。次に、5％二酸化炭素の湿潤インキュベーター中、37℃で、細胞を6時間インキュベートした。6時間後に、ルシフェラーゼ・アッセイ・システム（Promega、# E1500）とTecan Infinite 500リーダー（ルミネセンスモード、積分時間1000ミリ秒、測定時間30秒）とを使って、細胞をルシフェラーゼ活性について試験した。
【０３４９】
コンピュータプログラムGraph Pad Prismバージョン5を使用することにより、相対発光量を使って、さまざまな分子のEC50値を決定した。
【０３５０】
リラキシンおよび本発明の融合ポリペプチドの代替的活性試験には、LGR7受容体が内在性に発現している細胞株（例えばTHP1、ATCCカタログ番号TIB-202）または初代細胞（例えばCelprogen Inc.、ヒト心筋細胞細胞培養物、カタログ番号36044-15）を使用する。これらの細胞は製造者の指示に従って培養される。
【０３５１】
リラキシンまたはリラキシン変異体が誘発するcAMPの生成を検出するための方法は、当技術分野では知られている。例えばそのような測定は、cAMP ELISA（例えばIBL International GmbH、cAMP ELISA、カタログ番号CM581001）を使って、製造者の指示に従って行なわれる。
【０３５２】
リラキシンまたはリラキシン変異体が誘発するPI3キナーゼの活性化を検出するための方法は、当技術分野では知られている。例えばそのような測定は、PI3キナーゼHTRFアッセイを使って、製造者の指示に従って行なわれる（例えばMillipore、PI3キナーゼHTRFアッセイ、カタログ番号33-016）。
【０３５３】
PEG化
システイン残基をPEG化するには、通常、PEG化に先だって、融合ポリペプチドをジチオスレイトール（DDT）などの還元剤で処理する。次に、還元剤を任意の従来法によって、例えば脱塩によって除去する。システイン残基へのPEGのコンジュゲーションは、典型的には、pH6〜9の適切な緩衝液中、4℃から25℃までの温度で、最大16時間にわたって行なわれる
【０３５４】
取付けられるPEG分子の数、そのような分子のサイズおよび形態（例えば線状であるか分岐しているか）、および融合タンパク質における取り付け部位に関して、最適な分子が生産されるようにPEG化が計画されることは、理解されるであろう。使用するポリマーの分子量は、例えば、達成されるべき所望の効果に基づいて選択することができる。
【０３５５】
免疫原性試験
免疫原性試験は、MHCII複合体に対するタンパク質またはペプチドの潜在的結合アフィニティを計算するコンピュータプログラムNetMHCIIpan（デンマーク工科大学、システム生物学科、生物配列解析センター）を使って行なわれる。計算された結合アフィニティが高いほど、問題のタンパク質またはポリペプチドに対する抗体が誘導されるリスクは高い。
【０３５６】
T細胞エピトープをマッピングするためのインビトロ決定は、ReijonenおよびKwokが公表したプロトコールに従って行なわれる（Reijonen H., Kwok WW. (2003)「Use of HLA class II tetramers in tracking antigen-specific T cells and mapping T-cell epitopes」Methods 29:282-288）。
【０３５７】
単鎖リラキシン変異体の構築
単鎖リラキシン変異体の最適なリンカー長の決定
A鎖とB鎖とをつなぐリンカー長が異なる単鎖リラキシン変異体を上述のように作製した。配列に示すように、タンパク質発現の代替的決定のために、一部のコンストラクトでは、Mycタグ（アミノ酸配列EQKLISEEDL）をA鎖のN末端に付加し、B鎖のC末端には、ヘマグルチニンタグ（アミノ酸配列YPYDVPDYA）および6ヒスチジンタグ（アミノ酸配列HHHHHH）を付加するか、または付加しなかった。
【０３５８】
実施例1：scR1
scR1では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が3アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加し、ヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグをB鎖のC末端に付加した。
【０３５９】
実施例2：scR2
scR2では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が5アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加し、ヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグをB鎖のC末端に付加した。
【０３６０】
実施例3：scR3
scR3では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が7アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加し、ヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグをB鎖のC末端に付加した。
【０３６１】
実施例4：scR4
scR4では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加し、ヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグをB鎖のC末端に付加した。
【０３６２】
実施例5：scR5
scR5では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が11アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加し、ヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグをB鎖のC末端に付加した。
【０３６３】
実施例6：scR6
scR6では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が15アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加し、ヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグをB鎖のC末端に付加した。
【０３６４】
実施例7：scR7
scR7では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が6アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３６５】
実施例8：scR8
scR8では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が12アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３６６】
実施例9：scR9
scR9では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が13アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３６７】
実施例10：scR10
scR10では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が14アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyを有するポリペプチドからなる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は、上述のプロトコールに従って測定されるであろう。
【０３６８】
実施例11：scR11
scR11では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が10アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyCysGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。非PEG化融合ポリペプチドの活性試験には非精製タンパク質を使用した。
【０３６９】
このコンストラクトの生物学的半減期を改良するために、A鎖とB鎖とをつなぐリンカー内のシステインのPEG化を、上述のプロトコールに従って行なう。PEG化変異体の活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７０】
実施例12：scR12
scR12では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が10アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyLysGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。非PEG化融合ポリペプチドの活性試験には非精製タンパク質を使用した。
【０３７１】
このコンストラクトの生物学的半減期を改良するために、A鎖とB鎖とをつなぐリンカー内のリジンのPEG化を、上述のプロトコールに従って行ないうる。PEG化変異体の活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７２】
実施例13：scR13
scR13では、ヒトリラキシン2のA鎖のC末端とB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列LysArgSerLeuSerArgLysLysArgを有するポリペプチドからなる。活性試験には非精製融合ポリペプチドを使用した。
【０３７３】
実施例14：scR14
scR14では、ヒトリラキシン3（アクセッション番号NP_543140.1）のA鎖のC末端とB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。活性は上述のプロトコールに従って測定される。活性試験には、非精製融合ポリペプチドを使用した。
【０３７４】
実施例15：scR15
scR15では、ヒトリラキシン3（アクセッション番号NP_543140.1）のA鎖のC末端とB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７５】
実施例16：scR16
scR16では、ヒトリラキシン2のB鎖のC末端とA鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７６】
実施例17：scR17
scR17では、ヒトリラキシン3（アクセッション番号NP_543140.1）のA鎖のC末端とヒトリラキシン2のB鎖（アクセッション番号NP_604390.1）のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７７】
実施例18：scR18
scR18では、ヒトリラキシン2（アクセッション番号NP_604390.1）のB鎖のC末端とヒトリラキシン3（アクセッション番号NP_543140.1）のA鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７８】
実施例19：scR19
scR19では、ヒトリラキシン2（アクセッション番号NP_604390.1）のA鎖のC末端とヒトリラキシン3（アクセッション番号NP_543140.1）のB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３７９】
実施例20：scR20
scR20では、ヒトリラキシン3（アクセッション番号NP_543140.1）のB鎖のC末端とヒトリラキシン2（アクセッション番号NP_604390.1）のA鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなるであろう。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加する。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０３８０】
全ての単鎖リラキシン変異体を図2に図式的に表示する。
【０３８１】
さまざまなscRコンストラクトの発現および生物学的活性に関する結果を表1に要約する。3、5、および15アミノ酸のリンカー長を有する単鎖リラキシン変異体が上述のアッセイにおいて検出可能な生物学的活性を何も示さないのに対し、驚いたことに、試験した6、7、9、10、11、12、13、および14アミノ酸のリンカー長は、ヒトリラキシン2に匹敵する生物学的活性を呈する単鎖変異体をもたらす。
【０３８２】
A鎖のC末端をB鎖のN末端とつなぐリンカーの長さは生物学的活性分子の作製にとって重要であるが、リンカーのアミノ酸の組成は可変的である。scR11〜scR13はその例である。ここで、scR11とscR12はリンカー配列中に追加のアミノ酸を呈し（scR11のリンカー中のCおよびscR12のリンカー中のK）、コンストラクトscR13は、上述のリンカー配列とは全く相同性を示さないリンカー配列を呈する。
【０３８３】
単鎖リラキシン変異体の作製はリラキシン2に限定されるわけではない。コンストラクトscR14および15はリラキシン3の単鎖変異体である。リラキシン2とリラキシン3の間の総合的配列相同性は低いが、インスリンスーパーファミリーのメンバーとしてこれら2つの遺伝子のゲノム編成は同一である。リラキシン2と同様に、リラキシン3は古典的B鎖-C鎖-A鎖構造からなる。リラキシン2の場合と同様に、C鎖はプロホルモンコンバターゼIおよびIIによってリラキシン3プロペプチドから切り離され、B鎖とA鎖はジスルフィド橋によってつながれ、それによって活性分子が形成される。コンストラクトscR14およびscR15はリラキシン3の単鎖変異体であり、例えばコンストラクトscR4でリラキシン2について既に示したものと同じリンカー分子がA鎖のC末端をB鎖のN末端とつないでいる。
【０３８４】
scR16、scR17、scR18、scR19、およびscR20は、リラキシン3のA鎖とリラキシン2のB鎖とのキメラまたはその逆のキメラである。ここでは、LGR7受容体を活性化するために、リラキシン2およびリラキシン3のB鎖がそれぞれリラキシン3/リラキシン2キメラのC末端部分にあることが必須である。
【表３】
2014522641.tif 000009
*値は3〜5回の独立した実験の例である。
【０３８５】
h-リラキシン2、scR3、scR4、およびscR5の活性を比較した用量応答曲線および対応するEC50値を図4aに示し、h-リラキシン2、scR7、scR8、scR9、およびscR10については図4bに示し、h-リラキシン2、scR11およびscR12については図4cに示し、h-リラキシン2、h-リラキシン3、scR14およびscR15については図4dに示し、h-リラキシン3およびR17については図4eに示す。
【０３８６】
結論：これは、5アミノ酸より長く15アミノ酸より短いリンカー長が、そのようなリンカーによってA鎖のC末端がB鎖のN末端につながれている単鎖リラキシン変異体の生物学的活性にとって必要であることを示している。さらにまた、本発明の単鎖リラキシンの作製はリラキシン2に限定されない。
【０３８７】
リラキシン2の、対応する受容体LGR7への結合は、2段階プロセスである。第1段階では、ヒトリラキシン2のA鎖が受容体のN末端エクトドメインに結合する。第2段階では、この結合されたエクトドメインがコンフォメーション変化を起こし、リラキシンのB鎖とLGR7の膜貫通ドメインとの間の二次的相互作用が受容体シグナリングを媒介する。リガンド-受容体複合体の活性化にはこの第2段階が最も強く関連している。それゆえに、変異体scR17がヒトリラキシン2ではなくヒトリラキシン3のA鎖を含有しているという事実が、活性の低減したコンストラクトをもたらす。活性のさらなる低減は、ヒトリラキシン2のB鎖の代わりにヒトリラキシン3のB鎖を含有する変異体scR19で観察される。エクトドメインへの結合は、ヒトリラキシン2のA鎖を介して起こるが、ヒトリラキシン3のB鎖は、LGR7の活性化には最適ではない。リラキシン3の対応する受容体はLGR8である。それゆえに、リガンドとしてscR19を使用し、対応する受容体としてLGR8を使用することによって、シグナル強度ははるかに高くなった。これは、本発明の融合ポリペプチドの活性を調整する手段でもある。
【０３８８】
試料中に含まれうる不純物が濃度の誤判定につながるか、または細胞ベースのルシフェラーゼアッセイの正確さに負の影響を有しうるので、scR13が精製されていないことは、低い活性の説明になる。
【０３８９】
結論として、他のリンカー配列（本発明の長さにあるもの）も完全に活性な単鎖リラキシンをもたらすので、これは、有用なリンカー配列がグリシン/セリンリッチ配列に限定されないことを示している。
【０３９０】
改良された生物学的半減期を有する単鎖リラキシン融合タンパク質の構築
単鎖リラキシン変異体の生物学的半減期を改良するために、免疫グロブリン分子のFc部分が単鎖リラキシン変異体のN末端またはC末端に付加されているコンストラクトを設計した。
【０３９１】
ここでは、単鎖リラキシン変異体を免疫グロブリンのFc部分に直接融合するか、または長さとアミノ酸組成が異なるポリペプチドによって連結した。
【０３９２】
ポリペプチドの生物学的半減期を改良するためのもう一つの選択肢は、トランスフェリン（アクセッション番号P02787）またはアルブミン（アクセッション番号P02768）のようなポリペプチドとの融合である（SR Schmid (2009)）。
【０３９３】
PEG化は、ポリペプチドの生物学的半減期を改良するための、よく使用される方法である。この場合はポリエチレングリコールポリマー鎖が共有結合によってポリペプチドに付加される。そのためにPEGの反応性誘導体を標的ポリペプチドと共にインキュベートする。PEGと反応する好ましいアミノ酸はシステインおよびリジンである。Pasut and Veronese (2009))
【０３９４】
リラキシン融合タンパク質-リラキシン-Fcの作製
生物学的半減期を改良するために、ヒトIgG1のFc部分を化学的遺伝子合成によってヒトリラキシン2と組み合わせた。ヒトリラキシン2のカルボキシ末端部分（次のように配置されたそのゲノム編成によるもの：B鎖-C鎖-A鎖）を、ヒトIgG1 Fc部分のN末端に融合することで、融合タンパク質のこれら2つの部分を、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドからなる6アミノ酸長のリンカー配列でつないだ。しかし、リラキシンFcは、CHO-CRE-LGR7細胞株によって決定される活性を示さなかった。
【０３９５】
実施例16：scR-Fc1
scR-Fc1では、scR4のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が6アミノ酸長であり、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドからなる。このポリペプチドおよびFc部分が、scR4中のヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。タンパク質発現の代替的決定のために、MycタグをA鎖のN末端に付加した。
【０３９６】
実施例17：scR-Fc2
scR-Fc2では、単鎖リラキシンscR4のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が4アミノ酸長であり、配列GlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。scR-Fc1とは対照的に、このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０３９７】
実施例18：scR-Fc3
scR-Fc3では、単鎖リラキシンscR4のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が7アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。scR-Fc1とは対照的に、このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０３９８】
実施例19：scR-FC4
scR-Fc4では、単鎖リラキシンscR4のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が10アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。scR-Fc1とは対照的に、このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０３９９】
実施例20：scR-Fc5
scR-Fc5では、単鎖リラキシンscR4のN末端をヒトIgG1 Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列の組成が4アミノ酸長であり、配列GlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。Fc部分は、A鎖のN末端にあるMycタグと置きかわる。このコンストラクトはヘマグルチニンタグおよび/または6ヒスチジンタグをそのC末端に有さない。
【０４００】
実施例21：scR-Fc6
scR-Fc6では、単鎖リラキシンscR4のN末端をヒトIgG1 Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列の組成が7アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。Fc部分は、A鎖のN末端にあるMycタグと置きかわる。このコンストラクトはヘマグルチニンタグおよび/または6ヒスチジンタグをそのC末端に有さない。
【０４０１】
実施例22：scR-Fc7
scR-Fc7では、単鎖リラキシンscR4のN末端をヒトIgG1 Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列の組成が10アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。Fc部分は、A鎖のN末端にあるMycタグと置きかわる。このコンストラクトはヘマグルチニンタグおよび/または6ヒスチジンタグをそのC末端に有さない。
【０４０２】
実施例23：scR-FC8
scR-Fc8では、単鎖リラキシンscR4のC末端をラットIgG2b Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が4アミノ酸長であり、配列GlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。加えて、Fc部分のC末端には6ヒスチジンタグが付加される。scR4とは対照的に、このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。ラットIgG2b Fc部分はヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。
【０４０３】
実施例24：scR-Fc9
scR-Fc9では、単鎖リラキシンscR4のC末端をラットIgG2b Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が7アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。加えて、Fc部分のC末端には6ヒスチジンタグが付加される。scR4とは対照的に、このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。ラットIgG2b Fc部分はヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。
【０４０４】
実施例25：scR-Fc10
scR-Fc10では、単鎖リラキシンscR4のC末端をラットIgG2b Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が10アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。加えて、Fc部分のC末端には6ヒスチジンタグが付加される。scR4とは対照的に、このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。ラットIgG2b Fc部分はヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。
【０４０５】
実施例26：scR-Fc11
scR-Fc11では、単鎖リラキシンscR4のN末端をラットIgG2b Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列の組成が4アミノ酸長であり、配列GlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。加えて、6ヒスチジンタグがFc部分のN末端に付加される。ラットIgG2b Fc部分はMycタグと置きかわる。加えて、このコンストラクトはヘマグルチニンタグおよび/または6ヒスチジンタグをそのC末端に有さない。
【０４０６】
実施例27：scR-Fc12
scR-Fc11では、単鎖リラキシンscR1のN末端をラットIgG2b Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列の組成が7アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。加えて、6ヒスチジンタグがFc部分のN末端に付加される。ラットIgG2b Fc部分はMycタグと置きかわる。加えて、このコンストラクトはヘマグルチニンタグおよび/または6ヒスチジンタグをそのC末端に有さない。
【０４０７】
実施例28：scR-Fc13
scR-Fc11では、単鎖リラキシンscR4のN末端をラットIgG2b Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列の組成が10アミノ酸長であり、配列GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerProを有するポリペプチドからなる。加えて、6ヒスチジンタグがFc部分のN末端に付加される。ラットIgG2b Fc部分はMycタグと置きかわる。加えて、このコンストラクトはヘマグルチニンタグおよび/または6ヒスチジンタグをそのC末端に有さない。
【０４０８】
実施例29：scR-Fc14
単鎖リラキシン変異体とFc部分とをつなぐリンカー配列の影響を解析するために、scR-Fc14では、配列scR4のC末端をヒトIgG1のFc部分に直接融合した。このFc部分はscR4中のヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０４０９】
実施例30：scR-Fc15
scR-Fc15では、単鎖リラキシンscR4のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が6アミノ酸長であり、配列GlySerGlySerGlySerを有するポリペプチドからなる。ヒトIgG1 Fc部分はヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０４１０】
実施例31：scR-Fc16
タンパク質発現および融合タンパク質活性に対するFc部分内のジスルフィド橋の影響を解析するために、scR-Fc16を設計した。そのために、scR-Fc15中のヒトIgG1のFc部分内の86番目のシステイン残基をアラニンで置き換えた。
【０４１１】
実施例32：scR-Fc17
scR-Fc17では、単鎖リラキシンscR4のC末端をラットIgG2b Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が6アミノ酸長であり、配列GlySerGlySerGlySerを有するポリペプチドからなる。ラットIgG2b Fc部分はヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０４１２】
実施例33：scR-Fc18
scR-Fc18では、単鎖リラキシンscR4のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列の組成が21アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyThrLysValThrValSerSerGluSerLysTyrGlyを有するポリペプチドからなる。ヒトIgG1 Fc部分はヘマグルチニンタグおよび6ヒスチジンタグと置きかわる。このコンストラクトはA鎖のN末端にMycタグを有さない。
【０４１３】
実施例34：scR-Var1
scR-Var1では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。加えて、配列がGlyGlySerGlyCysGlyである6アミノ酸長のポリペプチドをB鎖のC末端に付加した。非PEG化融合ポリペプチドの活性試験には非精製タンパク質を使用した。
【０４１４】
このコンストラクトの生物学的半減期を改良するために、B鎖のC末端に融合したストレッチャーポリペプチド内のシステインのPEG化を、上述のプロトコールに従って行なう。PEG化変異体の活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０４１５】
実施例35：scR-Var2
scR-Var2では、ヒトリラキシン2のA鎖とB鎖とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。加えて、配列がGlyCysGlySerGlyGlyである6アミノ酸長のポリペプチドをA鎖のN末端に付加した。非PEG化融合ポリペプチドの活性試験には非精製タンパク質を使用した。
【０４１６】
このコンストラクトの生物学的半減期を改良するために、A鎖のN末端に融合されたストレッチャーポリペプチド内のシステインのPEG化を、上述のプロトコールに従って行なう。PEG化変異体の活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０４１７】
実施例36：scR-Var3
scR-Var3では、ヒトリラキシン2のA鎖のC末端とB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。A鎖のN末端において、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドが、この変異体を、ヒトトランスフェリンタンパク質（アクセッション番号NP_001054.1）のC末端とつないでいる。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０４１８】
実施例37：scR-Var4
scR-Var4では、野生型プロリラキシン2（ゲノム編成）がトランスフェリンに融合されている。そのために、B鎖のN末端において、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドが、この変異体を、ヒトトランスフェリンタンパク質（アクセッション番号NP_001054.1）のC末端につないでいる。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０４１９】
実施例38：scR-Var5
scR-Var5では、ヒトリラキシン2のA鎖のC末端とB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyを有するポリペプチドからなる。A鎖のN末端では、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドが、この変異体を、ヒトアルブミンタンパク質（アクセッション番号NP_000468.1）のC末端とつないでいる。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０４２０】
実施例39：scR-Var6
scR-Var6では、B鎖のN末端にあって第Xa凝固因子切断部位をコードしている配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドが、この変異体を、ヒトアルブミンタンパク質（アクセッション番号NP_000468.1）のC末端とつないでいる。活性は上述のプロトコールに従って測定される。
【０４２１】
実施例40：scR-Var7
scR-Var7では、ヒトリラキシン2のA鎖のC末端とヒトリラキシン2のB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列LysArgSerLeuSerArgLysLysArgを有するポリペプチドからなる。B鎖のC末端をヒトIgG1 Fc部分のN末端とつなぐリンカー配列は6アミノ酸長であり、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドからなる。
【０４２２】
実施例41：scR-Var8
scR-Var8では、A鎖のC末端とB鎖のN末端とをつなぐリンカー配列の組成が9アミノ酸長であり、配列LysArgSerLeuSerArgLysLysArgを有するポリペプチドからなる。A鎖のN末端をヒトIgG1 Fc部分のC末端とつなぐリンカー配列は6アミノ酸長であり、第Xa凝固因子切断部位をコードする配列IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドからなる。
【０４２３】
全ての単鎖リラキシン融合タンパク質およびPEG化用に設計された変異体を図3に図式的に表示する。
【０４２４】
さまざまなscR融合タンパク質コンストラクトの発現および生物学的活性に関する結果を表2に要約する。
【表４】
2014522641.tif 000010
*値は3〜5回の独立した実験の例である。
【０４２５】
列挙した全ての変異体について、発現はヒトリラキシン2 Quantikine ELISAキット（Human Relaxin-2 Quantikine ELISA Kit）を使って決定することができ、活性はCHO-CRE-LGR7細胞株を使って測定することができた。例えば、scR-Fc1、scR-Fc5〜scR-Fc7、scR-Fc11〜scR-Fc13、およびscR-Var3〜scR-Var6に関する用量応答曲線を、それぞれ図5、図6、図7、および図8に示す。
【０４２６】
ヒト野生型リラキシン2分子をその配向B鎖-C鎖-A鎖でヒトIgG分子のFc部分に融合したものは、検出可能な活性を何も示さなかった。この分子に活性がないことの説明としては、C鎖のプロセシングが不完全であることが考えられるであろう。対照的に、単鎖ヒトリラキシン2を含有する全ての融合物コンストラクトにおいて、有意な活性を検出することができた。上に示したように、単鎖リラキシンは、ヒト野生型リラキシン2に匹敵する活性を示すが、タンパク質分解プロセシングは起こらない。
【０４２７】
単鎖リラキシン2融合物コンストラクトの場合、Fc部分の配向は、これらの分子の活性に有意な影響を及ぼすようである。B鎖のC末端にFc部分を保持するコンストラクト（例えばscR-Fc1〜scR-Fc4およびscR-Fc13〜scR-Fc18）は、A鎖のN末端にFc部分を保持するコンストラクト（例えばscR-Fc5〜scR-Fc6およびscR-Fc11〜scR-Fc12）よりわずかに低い活性を呈する。上述のように、対応する受容体LGR7のエクトドメインへのA鎖の結合後に受容体分子内で起こるコンフォメーション変化が、B鎖を、膜貫通ドメインの細胞外ループと接触させる。すると、その第2段階が、受容体の活性化につながる。それゆえに、B鎖にカップリングされたFc部分は、B鎖の最適な結合を妨げ、それが、受容体の完全な活性化を阻害するのかもしれない。
【０４２８】
Fc-単鎖リラキシンのインビボ血漿安定性の解析
scR-Fc13およびh-リラキシン2を、8週齢雄ウィスターラットに、240μｇ/kgの濃度で静脈内投与した。化合物投与の0時間後、1時間後、3日後、5日後、および7日後の時点において、血液試料を採取し、Fc-単鎖リラキシンおよび無修飾h-リラキシン2の濃度を、市販の定量ELISA（R&D Systems、ヒトリラキシン-2 Quantikine ELISAキット、カタログ番号DRL200）を使って決定した。
【０４２９】
図9に示すように、適用の3日後に、無修飾h-リラキシン2は検出不可能であったが、scR-Fc13の場合は、静脈内投与の7日後でさえ検出され、それは、CHO-LGR7ベースの活性試験で得られたEC50を上回ってさえいた。
【０４３０】
血漿から単離されたFc-単鎖リラキシン活性の決定
scR-Fc13が静脈内投与の3日後、5日後および7日後でもまだ活性を示すかどうかを決定するために、血漿試料をCHO-CRE-LGR7細胞株で試験した。図10に示すように、3つの試料の全てについて、活性を決定することができた。また、3つの試料の全てについて、活性値は精製scR-Fc13変異体で得られたEC50と類似している。
【０４３１】
単離潅流ラット心臓
ナルコレン（Narcoren）（100mg/kg i.p.）を使って雄ウィスターラット（200〜250g）を麻酔した。心臓を素早く切開し、ランゲンドルフ潅流システム（FMI GmbH、ドイツ国ゼーハイム-オーバーベーアバッハ）につないだ。95％O2-5％CO2で平衡化したクレブズ‐ヘンセレイト炭酸水素塩緩衝溶液を使って、心臓を10ml/分の一定速度で潅流した。潅流溶液は次の成分を含有した（単位mmol/l）：NaCl 118；KCl 3；NaHCO3 22；KH2PO4 1.2；MgSO4 1.2；CaCl2 1.8；グルコース 10；ピルビン酸Na 2。圧力変換器で潅流システムにおける潅流圧を記録した。左房を通して左室に挿入された水充填バルーンに接続された第2の圧力変換器を使って左室圧（LVP）を測定した。バルーンの体積を調節することによって拡張終期圧をまず8mmHgに設定した。心臓は自発的に拍動していた。圧力変換器からのシグナルを増幅し、記録し、パーソナルコンピュータによる心拍数および+dp/dtの計算に使用した。
【０４３２】
図11に示すように、ヒトリラキシン2（図11a〜d）ならびにscR-Fc13（図11e〜h）の潅流は、心拍数および冠流量の有意な増加と、左室拡張期圧および左室圧（+dp/dtmax）の低下とにつながっている。したがって、CHO-CRE-LGR7細胞株で決定されたsc-リラキシン融合タンパク質変異体とリラキシン2とのEC50値の相違を反映して、h-リラキシン2はscR-Fc13より10倍強力である。
【０４３３】
［表5］コンストラクトおよび対応する配列番号の一覧
【表５−１】
2014522641.tif 000011
【表５−２】
2014522641.tif 000012
【表５−３】
2014522641.tif 000013
【表５−４】
2014522641.tif 000014
【表５−５】
2014522641.tif 000015
【表５−６】
2014522641.tif 000016
【表５−７】
2014522641.tif 000017
【表５−８】
2014522641.tif 000018
【０４３４】
他の参考文献：
Hsu, S.Y.(2003)「New insights into the evolution of the relaxin-LGR signaling system」Trends Endocrinol Metab 14:303−309；
Wilkinson, T.N., Speed, T.P., Tregear, G.W., Bathgate, R.A. (2005)「Evolution of the relaxin-like peptide family」BMC Evol Biol 5:14；
Hudson P, Haley J, John M, Cronk M, Crawford R, Haralambidis J, Tregear G, Shine J, Niall H. (1983)「Structure of a genomic clone encoding biologically active human relaxin」Nature 301: 628-631；
Toth, M., Taskinen, P., & Ruskoaho, H. (1996)「Relaxin stimulates atrial natriuretic peptide secretion in perfused rat heart」J Endocrinol 150: 487-495)；
Piedras-Renteria, E.S., Sherwood, O.D., and Best, P.M. (1997)「Effects of relaxin on rat atrial myocytes: I. Inhibition of I(to) via PKA-dependent phosphorylation」Am J Physiol 272:H1791-H1797；
Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2001)「Relaxin signaling links tyrosine phosphorylation to phosphodiesterase and adenylyl cyclase activity」Mol Hum Reprod 7:799-809；
Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2004)「Phosphodiesterase 4 inhibition synergizes with relaxin signaling to promote decidualization of human endometrial stromal cells」J Clin Endocrinol Metab 89:324-334；
Bani-Sacchi, T., Bigazzi, M., Bani, D., Mannaioni, P. F., and Masini, E. (1995)「Relaxin-induced increased coronary flow through stimulation of nitric oxide production」Br J Pharmacol 116:1589-1594；
Dschietzig T, Bartsch C, Baumann G, Stangl K. (2006)「Relaxin - a pleiotropic hormone and its emerging role for experimental and clinical therapeutics」Pharmacol. Ther. 112:38-56；
McGuane JT, Parry LJ. (2005)「Relaxin and the extracellularmatrix: Molecular mechanisms of action and implications for cardiovascular disease」Expert. Rev. Mol.Med. 7:1-18；
Nistri, S., Chiappini, L., Sassoli, C. and Bani, D. (2003)「Relaxin inhibits lipopolysaccharide-induced adhesion of neutrophils to coronary endothelial cells by a nitric oxide-mediated mechanism」FASEB J. 17:2109-2111；
Perna AM, Masini E, Nistri S, Briganti V, Chiappini L, Stefano P, Bigazzi M, Pieroni C, Bani Sacchi T, Bani D. (2005)「Novel drug development opportunity for relaxin in acute myocardial infarction: evidences from a swine model」FASEB J. 19:1525-1527；
Bani, D., Masini, E., Bello, M. G., Bigazzi, M. and Sacchi, T. B. (1998)「Relaxin protects against myocardial injury caused by ischemia and reperfusion in rat heart」Am. J. Pathol. 152:1367-1376；
Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. (2005)「Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol 」Peptides 26:1632-1639；
Teerlink JR, Metra M, Felker GM, Ponikowski P, Voors AA, Weatherley BD, Marmor A, Katz A, Grzybowski J, Unemori E, Teichman SL, Cotter G. (2009)「Relaxin for the treatment of patients with acute heart failure (Pre-RELAX-AHF): a multicentre, randomised, placebo-controlled, parallel-group, dose-finding phase IIb study」Lancet. 373:1429-39；
Metra M, Teerlink JR, Felker GM, Greenberg BH, Filippatos G, Ponikowski P, Teichman SL, Unemori E, Voors AA, Weatherley BD, Cotter G. (2010)「Dyspnoea and worsening heart failure in patients with acute heart failure: results from the Pre-RELAX-AHF study」Eur J Heart Fail. 12:1130-1139；
Cosen-Binker LI, Binker MG, Cosen R, Negri G, Tiscornia O. (2006)「Relaxin prevents the development of severe acute pancreatitis」World J. Gastroenterol. 12:1558-1568；
Santora K, Rasa C, Visco D, Steinetz BG, Bagnell CA. (2007)「Antiarthritic effects of relaxin, in combination with estrogen, in rat adjuvant induced arthritis」J. Pharmacol. Exp. Ther. 322:887-893；
Bennett RG. (2009)「Relaxin and its role in the development and treatment of fibrosis」Transl Res. 154:1-6
Barlos KK, Gatos D, Vasileiou Z, Barlos K. (2010)「An optimized chemical synthesis of human relaxin-2」J Pept Sci. 16:200-211.
Park JI, Semyonov J, Yi W, Chang CL, Hsu SY (2008)「Regulation of receptor signaling by relaxin A chain motifs: derivation of pan-specific and LGR7-specific human relaxin analogs」J Biol Chem. 283:32099-32109；
Shaw JA, Delday MI, Hart AW, Docherty HM, Maltin CA, Docherty K (2002)「Secretion of bioactive human insulin following plasmid-mediated gene transfer to non-neuroendocrine cell lines, primary cultures and rat skeletal muscle in vivo」J Endocrinol 172:653-672
Rajpal G, Liu M, Zhang Y, Arvan P, (2009)「Single-Chain Insulins as Receptor Agonists」Mol Endocrinol. 23:679-88
Dschietzig T, Teichmann S, Unemori E, Wood S, Boehmer J, Richter C, Baumann G, Stangl K (2009)「Intravenous Recombinant Human Relaxin in Compensated Heart Failure: A Safety, Tolerability, and Pharmacodynamic Trial」J Cardiac Fail  5:182-190；
WO2006053299 A2「Site-directed modification of FVIII」Bayer Healthcare LLC；
Harris JM, Martin NE, Modi M. (2001)「Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics」Clin Pharmacokinet. 40:539-551；
Schmid SR, (2009)「Fusion-proteins as biopharmaceuticals--applications and challenges」Curr Opin Drug Discov Devel.12:284-95；
Pasut and Veronese (2009)「PEGylation for improving the effectiveness of therapeutic biomolecules」Drugs Today 45:687-695
WO97/26265
WO99/03861
WO00/06568
WO00/06569
WO02/42301
WO03/095451
WO01/19355
WO01/19776
WO01/19778
WO01/19780
WO02/070462
WO02/070510
【図１】
2014522641.tif 000019
【図２】
2014522641.tif 000020
【図３】
2014522641.tif 000021
【図４−１】
2014522641.tif 000022
【図４−２】
2014522641.tif 000023
【図４−３】
2014522641.tif 000024
【図４−４】
2014522641.tif 000025
【図４−５】
2014522641.tif 000026
【図５】
2014522641.tif 000027
【図６】
2014522641.tif 000028
【図７】
2014522641.tif 000029
【図８】
2014522641.tif 000030
【図９】
2014522641.tif 000031
【図１０】
2014522641.tif 000032
【図１１−１】
2014522641.tif 000033
【図１１−２】
2014522641.tif 000034
【図１１−３】
2014522641.tif 000035
【図１１−４】
2014522641.tif 000036
【配列表】
2014522641000001.app
【国際調査報告】
2014522641.tif 000037
2014522641.tif 000038
2014522641.tif 000039
2014522641.tif 000040