(57)【要約】  本明細書において、卵巣がんを診断するための方法を記述する。特に、特定のマイクロＲＮＡは卵巣がん患者の化学療法への抵抗性に対して有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において化学療法介入に抵抗性である卵巣がんを診断する方法であって、以下の工程：
ａ）対照発現レベルと比較した場合の、前記対象からの試料中のｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを同定し、そして
ｂ）前記対象が前記対照発現レベルと比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを有する場合、前記対象において化学療法抵抗性卵巣がんがあると診断し、または
ｃ）前記対象が前記対照発現レベルと比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを有しない場合、前記対象において化学療法抵抗性卵巣がんではないと診断する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
工程ａ）がさらに、対照発現レベルと比較した場合の、ｍｉＲ−５９２、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｍｉＲ−７４４の発現レベルを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）がさらに、対照発現レベルと比較した場合の、ｍｉＲ−２９６−５ｐおよび／またはｍｉＲ−５１８ｅの発現レベルを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７の発現レベルを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法介入が、プラチナをベースにした薬物、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、タキサン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、イクサベピロン（ｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））、エピテロン系薬物、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））および／またはフェノクソディオールの１種類以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）が以下の工程：
１）前記試料からのｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し；
２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７  ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
３）工程（２）の前記プロファイルを対照と比較する；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程３）が前記試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から作成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程３）が前記試料のハイブリダイゼーションプロファイルを非がん性試料と関係するｍｉＲレベルのデータベース、統計、または表と比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記卵巣がんが漿液性上皮性卵巣癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対照と比較して低下したｍｉＲ−４８４の発現が化学療法抵抗性卵巣がんの診断を確証する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト対象が卵巣がんに関して悪い生存予後を有するかどうかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ）前記ヒト対象からの卵巣組織の試料中のｍｉＲ遺伝子産物シグネチャーの発現レベルを測定し、前記ｍｉＲ遺伝子産物シグネチャーは以下のｍｉＲ遺伝子産物からなり：ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７；そして
ｂ）前記試料中の前記ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の発現レベルが、がんを有しない卵巣組織の対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルと比較して低下していることを、前記ヒト対象が卵巣がんにより悪い生存予後を有することの指標として、前記ヒト対象の悪い生存予後を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
工程（ａ）が以下の工程：
１）前記試料からのｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し；
２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
３）工程（２）の前記プロファイルを対照と比較する；
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象の前記生存予後を決定する前記工程（ｂ）で漿液性卵巣がんを他の卵巣がんと識別する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象の前記生存予後を決定する前記工程（ｂ）で化学療法介入に対する応答を予測する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７がｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７に特異的である１種類以上のプローブにそれぞれハイブリダイズし、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の前記発現レベルが前記対照試料と比較して低下していることが、化学療法介入に対する乏しい応答、ヒト患者における悪い生存の予後、および／または漿液性卵巣がんの存在の指標となる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
対象が化学療法抵抗性卵巣がんであることを決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記対象からの試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを検出し、
ｂ）前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを非がん性卵巣細胞を含む対照試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較し、そして
ｃ）前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルが前記試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７の１種類以上の発現レベルにおいて統計的に有意な変化を含む場合、化学療法抵抗性卵巣がんと判定する；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）における前記統計的に有意な変化がｍｉＲ−４８４の発現レベルの低下である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記卵巣がんが漿液性上皮性卵巣がんを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロＲＮＡ発現プロファイルが少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１７を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
患者の病態の評価のための方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者からの生物学的試料を用意し、
ｂ）前記試料中の予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーの発現レベルを決定してｍｉＲＮＡ発現プロファイルを得て、前記予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーが少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７を含み、
ｃ）工程（ｂ）の前記発現レベルを卵巣がんが含まれる様々な疾患に特徴的な１又はそれより多くの参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較し、そして
ｄ）工程（ｃ）の比較に基づいて前記患者の病態を評価する；
を含む、前記方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）における前記参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイルがインターネットデータベース、集中型データベースまたは非集中型データベースの１以上で見付かるデータベースから得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）における決定が前記予め決められたｍｉＲＮＡのセットの定性的、定量的または半定量的決定を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｂ）における決定が核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、質量分析、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
以下：
ａ）患者からの生物学的試料中の予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーを決定するための１種類以上のバイオマーカー、当該予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーはｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７の少なくとも１つを含む、および
ｂ）卵巣がんが含まれる様々な疾患に特徴的な複数のｍｉＲＮＡ参照発現プロファイル；
を含む、患者の病態の評価のためのキット。
【請求項２５】
前記ｍｉＲＮＡ参照発現プロファイルがデータベース、例えばインターネットデータベース、集中型または非集中型データベース中に置かれている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
患者において卵巣がんを診断するためのキットであって、以下：
ａ）少なくとも１種類の卵巣がん診断用バイオマーカーに特異的な１種類以上の検出物質を含む捕捉試薬、ここで少なくとも第１卵巣がんバイオマーカーはｍｉＲ−４８４バイオマーカーである
ｂ）検出試薬、および
ｃ）キットを用いて前記患者からの生物学的試料中のｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照の対象における同じバイオマーカーの発現レベルよりも低い場合に患者が卵巣がんを有すると診断するための説明書；
を含む、前記キット。
【請求項２７】
さらにｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７バイオマーカーから選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれる、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
さらにｈｓａ−ｍｉＲ−５９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ−７４４から選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれる、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７、および／またはそれらの相補物から選択されるｍｉＲＮＡのセットの配列を含む、卵巣がんを診断するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
【請求項３０】
患者において卵巣がんを診断するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者からの生物学的試料中の少なくとも１種類の診断用バイオマーカーの発現レベルを検出し、ここで少なくとも第１診断用バイオマーカーはｍｉＲ−４８４バイオマーカーであり、そして
ｂ）前記患者の試料中の少なくともｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照からの生物学的試料に由来する同じバイオマーカーの正常な発現レベルよりも低い場合に、前記患者を卵巣がんを有すると診断する；
を含む、前記方法。
【請求項３１】
さらにｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７バイオマーカーから選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーの発現レベルを検出することが含まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
さらにｈｓａ−ｍｉＲ−５９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ−７４４から選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーの発現レベルを検出することが含まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程：
ａ）前記試料を得て、ここで前記試料は卵巣細胞を含み；
ｂ）前記試料からのｍｉＲＮＡ発現プロファイル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡを増幅し；
ｄ）前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを決定し；そして
ｅ）前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２７１を含む対照ｍｉＲＮＡシグネチャーと比較し、
ここで前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイル内の前記対照ｍｉＲＮＡシグネチャーの再現は、前記試料が化学療法処置に抵抗性の卵巣がん細胞を含むことを示す；
を含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は２０１１年１０月１４日に出願された米国仮特許出願一連番号６１／５４７，１０９、および２０１２年７月２５日に出願された米国仮特許出願一連番号６１／６７５，４４９の利益を主張し、その開示を明確に全ての目的に関して参照により本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
[0002]  この発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ／ＥＤＲＮ）により与えられた助成金番号Ｕ０１ＣＡ１５２７５８の下での米国政府援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列リストに関する記載
[0003]  この出願は、ＭＰＥＰ§１７３０  ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ａ）において認可され、示されているように、ＵＳＰＴＯ  ＥＦＳ−ＷＥＢサーバーを介して電子出願されており、この電子出願には電子的に提出された配列（ＳＥＱ  ＩＤ）リストが含まれる。この配列リストの全内容を、全ての目的に関して、参照により本明細書に援用する。その配列リストは、２０１２年１０月１１日に作成された以下：６０４＿５３３２４＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿２０１２−０３０．ｔｘｔのような電子出願された．ｔｘｔファイル上で同定され、大きさは３，２８７バイトである。
【０００４】
[0004]  この出願は、医学、特に腫瘍学の分野における。本発明はまた、分子生物学、特にマイクロＲＮＡの分野における。
【背景技術】
【０００５】
[0005]  卵巣がんは、先進諸国における婦人科系がん関連死の主因である。向上した減量手術およびプラチナ−タキサン投与計画の導入により、その処置方法は進歩してきたが、全体の５年生存率は進行期の疾患において２９％にすぎず、これは大部分は進行期における診断ならびにプラチナをベースにした化学療法に対する内因性および後天性の抵抗性によるものである。従って、卵巣がんの化学療法抵抗性の分子マーカーを同定することは決定的に重要である。分子レベルでの発見をうまく橋渡しすることは、個別化された処置計画、向上した化学療法奏効率および不必要な処置の回避につながるであろう。
【０００６】
[0006]  特に、上皮性卵巣がんは最も一般的な婦人科系悪性腫瘍であり；非常に侵攻性であり、毎年１２５，０００件近い死亡を引き起こしている。検出および細胞傷害性療法における進歩にも関わらず、進行期の疾患を有する患者の非常に低い割合しか初診の５年後に生存していない。この疾患の高い死亡率は主に利用可能な療法への抵抗性によるものである。
【０００７】
[0007]  マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は小さい非コードＲＮＡのクラスであり、それは遺伝子発現を調節して翻訳抑制、ｍＲＮＡの切断、または不安定化を引き起こす。それらは数多くの生理的細胞プロセスに関わっている。最も重要なことには、蓄積する証拠は、多くのｍｉＲがヒトのがんにおいて異常に発現しており、それらの発現プロファイルは一部のがんの病期、亜型および予後を分類することができることを示している。
【０００８】
[0008]  本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１個の図面を含有する。カラーの図面（単数または複数）を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要請して必要な料金を払えば特許庁により提供されるであろう。
【発明の概要】
【０００９】
[0049]  第１観点において、以下の工程を含む、対象において化学療法介入に抵抗性である卵巣がんを診断する方法を本明細書において記述する：
ａ）対照発現レベルと比較した場合の、その対象からの試料中のｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを同定し、そして
ｂ）その対象がその対照発現レベルと比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを有する場合、その対象において化学療法抵抗性卵巣がんがあると診断し、または
ｃ）その対象がその対照発現レベルと比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを有しない場合、その対象において化学療法抵抗性卵巣がんがないと診断する。
【００１０】
[0050]  特定の態様において、その方法にはさらに、対照の発現レベルと比較した、ｍｉＲ−５９２、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｍｉＲ−７４４の発現レベルを同定することが含まれる。
【００１１】
[0051]  特定の態様において、その方法には、対照の発現レベルと比較した、ｍｉＲ−２９６−５ｐおよび／またはｍｉＲ−５１８ｅの発現レベルを同定することが含まれる。
【００１２】
[0052]  特定の態様において、その方法は、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７のレベルを同定することを含む。
【００１３】
[0053]  特定の態様において、その化学療法介入は以下の薬物の１種類以上の投与を含む：プラチナをベースにした薬物、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、タキサン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、エピテロン（ｅｐｉｔｈｅｌｏｎｅ）系薬物であるイクサベピロン（ｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））および／またはフェノクソディオール。
【００１４】
[0054]  特定の態様において、その方法には以下の工程が含まれる：
１）対象から得られた試料からのｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのシグネチャーを用意し；
２）その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７  ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
３）工程（２）のプロファイルを対照と比較する。
【００１５】
[0055]  特定の態様において、その方法には、その試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することが含まれる。
【００１６】
[0056]  特定の態様において、その方法には、その試料のハイブリダイゼーションプロファイルを非がん性試料と関係するｍｉＲレベルのデータベース、統計、または表と比較することが含まれる。
【００１７】
[0057]  特定の態様において、その卵巣がんは漿液性上皮性卵巣癌である。
【００１８】
[0058]  特定の態様において、対照と比較して低下したｍｉＲ−４８４の発現は化学療法抵抗性卵巣がんの診断を確証する。
【００１９】
[0059]  別の観点において、以下の工程を含む、ヒト対象が卵巣がんに関して悪い生存予後を有するかどうかを決定する方法を本明細書において記述する：
ａ）そのヒト対象からの卵巣組織の試料中のｍｉＲ遺伝子産物シグネチャーのレベルを測定し、そのｍｉＲ遺伝子産物シグネチャーは以下のｍｉＲ遺伝子産物からなり：ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７；そして
ｂ）その試料中のｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上のレベルにおける、がんを有しない卵巣組織の対照試料中のｍｉＲ遺伝子産物の対応するレベルと比較した低下が、そのヒト対象が卵巣がんに関する悪い生存予後を有することを示す場合、そのヒト対象の悪い生存予後を決定する。
【００２０】
[0060]  特定の態様において、その方法は以下の工程を含む：
１）その試料からのｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのシグネチャーを用意し；
２）その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７  ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
３）工程（２）のプロファイルを対照と比較する。
【００２１】
[0061]  特定の態様において、その対象の生存予後を決定する工程は、漿液性卵巣がんを他の卵巣がんと識別する。
【００２２】
[0062]  特定の態様において、その対象の生存予後を決定する工程は、化学療法介入に対する応答を予測する。
【００２３】
[0063]  特定の態様において、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のシグネチャーセットはそれぞれｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７に特異的である１種類以上のプローブにハイブリダイズし、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のレベルにおける対照試料と比較した低下の存在は、化学療法介入に対する乏しい応答、ヒトの患者における悪い生存の予後、および／または漿液性卵巣がんの存在を示している。
【００２４】
[0064]  別の観点において、化学療法抵抗性卵巣がんが対象であることを決定するための方法を本明細書において記述し、その方法は以下の工程を含む：
ａ）その対象からの試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを検出し、
ｂ）その試料のｍｉＲＮＡプロファイルを非がん性卵巣細胞を含む対照試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較し、そして
ｃ）そのｍｉＲＮＡ発現プロファイルがその試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７の１種類以上の発現における統計的に有意な変化を含む場合、化学療法抵抗性卵巣がんを決定する。
【００２５】
[0065]  特定の態様において、その統計的に有意な変化はｍｉＲ−４８４の発現レベルにおける低下である。
【００２６】
[0066]  特定の態様において、そのマイクロＲＮＡシグネチャーは少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１７を含む。
【００２７】
[0067]  別の観点において、以下の工程を含む、患者の病態の評価のための方法を本明細書において記述する：
ａ）その患者からの生物学的試料を用意し、
ｂ）その試料中の予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーの発現レベルを決定してｍｉＲＮＡ発現プロファイルを得て、その予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーは少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７を含み、
ｃ）工程ｂ）のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを卵巣がんが含まれる様々な疾患に特徴的な１以上の参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較し、そして
ｄ）工程（ｃ）の比較に基づいてその患者の病態を評価する。
【００２８】
[0068]  特定の態様において、その参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、インターネットデータベース、集中型データベースまたは非集中型データベースの１個以上で見付かるデータベースから得られる。
【００２９】
[0069]  特定の態様において、その決定は、その予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーの定性的、定量的または半定量的決定を含む。
【００３０】
[0070]  特定の態様において、その決定は、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、質量分析、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。
【００３１】
[0071]  別の観点において、以下：
ａ）患者からの生物学的試料中の予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーを決定するためのバイオマーカー（その予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーはｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７の少なくとも１つを含む）、および
ｂ）卵巣がんが含まれる様々な疾患に特徴的な複数のｍｉＲＮＡ参照発現プロファイル
を含む、患者の病態の評価のためのキットを本明細書において記載する。
【００３２】
[0072]  特定の態様において、そのｍｉＲＮＡ参照発現プロファイルはデータベース、例えばインターネットデータベース、集中型または非集中型データベース中に置かれている。
【００３３】
[0073]  別の観点において、以下：
ａ）少なくとも１種類の卵巣がん診断用バイオマーカーに特異的な１種類以上の検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）を含む捕捉試薬、ここで少なくとも第１卵巣がんバイオマーカーはｍｉＲ−４８４バイオマーカーである
ｂ）検出試薬、および
ｃ）そのキットを用いて患者からの生物学的試料中のｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照の対象における同じバイオマーカーの発現レベルよりも低い場合に患者を卵巣がんを有すると診断するための説明書
を含む、患者において卵巣がんを診断するためのキットを本明細書において記述する。
【００３４】
[0074]  特定の態様において、そのキットにはさらに、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７バイオマーカーから選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれる。特定の態様において、そのキットにはさらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ−７４４から選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれる。
【００３５】
[0075]  別の観点において、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７、および／またはそれらの相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ）から選択されるｍｉＲＮＡのセットの配列を含む卵巣がんを診断するためのオリゴ−またはポリヌクレオチドのセットを本明細書において記述する。
【００３６】
[0076]  別の観点において、以下の工程を含む、患者において卵巣がんを診断するための方法を本明細書において記述する：
ａ）患者からの生物学的試料中の少なくとも１種類の診断用バイオマーカーの発現レベルを検出し、ここで少なくとも第１診断用バイオマーカーはｍｉＲ−４８４バイオマーカーであり、そして
ｂ）その患者の試料中の少なくともｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照の対象からの生物学的試料に由来する同じバイオマーカーの正常な発現レベルよりも低い場合に、患者を卵巣がんを有すると診断する。
【００３７】
[0077]  特定の態様において、その方法にはさらに、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７バイオマーカーから選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーの発現レベルを検出することが含まれる。特定の態様において、その方法にはさらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ−７４４から選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーの発現レベルを検出することが含まれる。
【００３８】
[0078]  特定の態様において、その方法はさらに以下の工程を含む：
ａ）試料を得て、ここでその試料は卵巣細胞を含み；
ｂ）その試料からｍｉＲＮＡ発現プロファイル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡを増幅し；
ｃ）その試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを決定し；そして
ｄ）その試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２７１を含む対照ｍｉＲＮＡシグネチャーと比較し、ここでその試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイル内の対照ｍｉＲＮＡシグネチャーの再現は、その試料が化学療法処置に抵抗性の卵巣がん細胞を含むことを示す。
【００３９】
[0079]  卵巣がんを診断するための装置も本明細書において記述する。その卵巣がん診断装置は、以下：
ａ）少なくともｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７診断用バイオマーカーに特異的な１種類以上の検出物質を含む捕捉試薬、ならびに
ｂ）その患者からの生物学的試料中の少なくともその診断用バイオマーカーの発現レベルを検出するための検出試薬、ここでその患者は、その患者の生物学的試料中のその診断用バイオマーカーの少なくとも１種類の発現レベルが卵巣がんを有しない対照の対象における発現レベルよりも低い場合、卵巣がんを有すると診断される；
を含むことができる。
【００４０】
[0080]  その装置の捕捉試薬は、その診断用バイオマーカーと特異的に相互作用する有機性化学物質もしくは無機性化学物質、生体分子、またはそのあらゆる断片、相同体、類似体、コンジュゲート、もしくは誘導体であることができる。特定の態様において、その捕捉試薬はタンパク質および／または抗体であり、固体支持体上に固定されていてよい。
【００４１】
[0081]  化学療法剤を用いた処置に応答性でありうる卵巣がん患者を化学療法剤を用いた処置から利益を得ないであろう化学療法抵抗性卵巣がんを有する患者に対して識別する診断用バイオマーカーのパネル（ｐａｎｅｌ）も本明細書において記述する。
【００４２】
[0082]  その診断用バイオマーカーのパネルには、一般に少なくともこれらの２つのタイプの患者を識別する、および／または悪い予後の結果に関する最高の危険性および／または現在利用可能な化学療法介入への乏しい応答を有する患者を同定するための化学療法抵抗性卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれ得る。そのような悪い予後に関する危険にさらされている患者を同定することは、卵巣がん患者のこれらの亜集団に関するより特異的、積極的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）な療法につながるであろう。
【００４３】
[0083]  特定の態様において、バイオマーカーの結果の組み合わせはその診断の正確性を大きく増大させる。
【００４４】
[0084]  別の広い観点において、以下の工程を含む、対象において化学療法抵抗性に関連する漿液性卵巣がんを診断する方法を本明細書において記述する：
ａ）対照と比較した相対的なｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現を同定し、そして
ｂ）その対象が対照と比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現を有する場合、その対照において化学療法抵抗性に関連する漿液性卵巣がんがあると診断し、または
ｃ）その対象が対照と比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現を有しない場合、その対照において化学療法抵抗性に関連する漿液性卵巣がんではないと診断する。
【００４５】
[0085]  特定の態様において、その方法には対照と比較した場合の相対的なｍｉＲ発現を同定することが含まれ、ここで工程ａ）にはさらに図１Ｃにおいて列挙されている１種類以上の追加のｍｉＲ：ｍｉＲ−５９２、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−７４４を同定することが含まれる。特定の態様において、その方法には対照と比較した相対的なｍｉＲ−５１８ｅおよび／または２９６−５ｐの発現を同定することが含まれる。
【００４６】
[0086]  特定の態様において、その方法にはその診断に基づいて処置計画を立てることが含まれる。特定の態様において、その方法にはその診断に基づいて処置を施すことが含まれる。特定の態様において、その方法には卵巣がんがあると診断された場合に抗血管新生処置を施すことが含まれる。特定の態様において、その方法にはその診断に基づいて予後を決定することが含まれる。
【００４７】
[0087]  別の広い観点において、上皮性卵巣がんを有する患者の上皮性卵巣がん細胞中のｍｉＲ−４８４のレベルを増大させることを含む、上皮性卵巣がんを有する患者において薬物感受性を増大させるための方法を本明細書において提供する。
【００４８】
[0088]  特定の態様において、そのｍｉＲを遺伝子療法、小分子、または生物学的（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）からなる群から選択される装置により増大させる。
【００４９】
[0089]  別の広い観点において、上皮性卵巣がんを有する患者の上皮性卵巣がん細胞中のｍｉＲのレベルを増大させることを含む、上皮性卵巣がん関連血管新生を抑制するための方法を本明細書において提供する。
【００５０】
[0090]  特定の態様において、そのｍｉＲを遺伝子療法、小分子、または生物学的からなる群から選択される装置により増大させる。
【００５１】
[0091]  特定の態様において、その方法には、漿液性卵巣がんを他の卵巣がんから識別する、その対象の生存予後を決定することが含まれる。
【００５２】
[0092]  特定の態様において、その方法には、化学療法介入への応答を予測する、その対象の生存予後を決定することが含まれる。
【００５３】
[0093]  特定の態様において、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７のシグネチャーは、それぞれｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７に特異的であるプローブにハイブリダイズし、対照試料と比較したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７のレベルにおける低下の存在は、化学療法介入への乏しい応答、ヒトの患者における悪い生存の予後、および／または漿液性卵巣がんの存在を示している。
【００５４】
[0094]  別の広い観点において、以下の工程を含む、化学療法抵抗性卵巣がんの存在を決定する方法を本明細書において提供し：
ａ）卵巣がん細胞の試料を得て；
ｂ）その試料の総ＲＮＡを抽出し；
ｃ）その試料から少なくとも１種類のｍｉＲＮＡを増幅し；
ｄ）その試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを決定し；そして
ｅ）その腫瘍試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２７１の１種類以上からなるｍｉＲＮＡシグネチャーと比較する；
ここで、その試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイル内のそのｍｉＲＮＡシグネチャーの再現は、その卵巣がん細胞が化学療法処置に抵抗性であることを示す。特定の態様において、その卵巣がんは漿液性卵巣がんを含む。
【００５５】
[0095]  別の広い観点において、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１７からなる群から選択される１種類以上のｍｉＲＮＡを含むマイクロＲＮＡシグネチャーを本明細書において提供し、ここで卵巣細胞中のこれらのｍｉＲＮＡの低下した発現はその卵巣細胞が卵巣がん細胞であることを示す。
【００５６】
[0096]  特定の態様において、これらのｍｉＲＮＡのいずれか１種類の発現における統計的に有意な変化は、その卵巣がん細胞が化学療法介入に抵抗性であることを示す。
【００５７】
[0097]  別の広い観点において、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７、および／またはそれらの相補物から選択されるｍｉＲＮＡのセットの配列を含む、卵巣がんを診断するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを本明細書において提供する。
【００５８】
[0098]  その一部が具体的に記述されており、他のものは具体的に記述されていない、本発明のこれらおよび他の目的および利点は、下記の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】[0010]  図１Ａ．ＴＬＤＡカードを用いたトレーニングセット（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）の分析。重要なｍｉＲを示す。
【図１Ｂ】[0011]  図１Ｂ．同定されたｍｉＲの重心（Ｃｅｎｔｒｏｉｄ）分析。緑で下方制御されるｍｉＲを、赤で上方制御されるｍｉＲを示す。
【図１Ｃ】[0012]  図１Ｃ．２つのクラス：非応答者（安定疾患および進行性疾患）および応答者（完全応答者および部分応答者）において再定義されたトレーニングセット中の重要なｍｉＲ。
【図１Ｄ】[0013]  図１Ｄ．トレーニングセット中の重要なｍｉＲ。
【図２Ａ】[0015]  図２Ａ．右側腹部中にＭＤＡＨ−２２７４対照細胞を、左側腹部中にｍｉＲ−４８４を過剰発現するＭＤＡＨ−２２７４を注射されたマウスの腫瘍体積。ＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘ処置の開始の日の腫瘍の大きさ（左のグラフ）および２１日間の処置後のそれらの増大（右のグラフ）を示す。
【図２Ｂ】[0016]  図２Ｂ．右側腹部中にＳＫＯＶ−３対照細胞を、左側腹部中にｍｉＲ−４８４を過剰発現するＳＫＯＶ−３を注射されたヌードマウスのインビボ画像化。処置の開始の直前（左のパネル）および２１日間のＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘ処置後に画像を得た。
【図２Ｃ】[0017]  図２Ｃ．Ｂにおいて記述された実験の、０日目（左のグラフ）ならびに７、１４および２１日間の処置後（右のグラフ）のインビボＥＧＦＰ蛍光の定量化。
【図２Ｄ】[0018]  図２Ｄ．ＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘ処置の存在下での対照（ｓｃｒ）またはｍｉＲ−４８４を発現するレンチウイルスの腫瘍内注射の作用。ノンパラメトリックｔ検定により評価した際に有意差がそれぞれのグラフにおいて報告されている。差は０．０５未満である場合に有意であるとみなされた。
【図３Ａ】[0020]  図３Ａ．左のパネル：ＶＥＧＦＢの３’ＵＴＲ中の可能性のあるｍｉＲ−４８４結合部位のアラインメント。中央のパネル：２９３細胞におけるｍｉＲ−４８４の導入後のＶＥＧＦＢのウェスタンブロット分析。右のパネル：デンシトメトリーでのチューブリンおよびＶＥＧＦＢの発現の間の比率。
【図３Ｂ】[0021]  図３Ｂ．左のパネル：ＶＥＧＦＲ２の３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−４８４結合部位候補のアラインメント。中央のパネル：ＨＵＶＥＣ細胞におけるｍｉＲ−４８４の導入後のＶＥＧＦＲ２のウェスタンブロット分析。右のパネル：デンシトメトリーでのチューブリンおよびＶＥＧＦＲ２の発現の間の比率。
【図３Ｃ】[0022]  図３Ｃ．（左から右へ）スクランブルｍｉＲと共に（ＶＥＧＦＢ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−４８４と共に（ＶＥＧＦＢ−ｍｉＲ−４８４）導入された野生型ＶＥＧＦＢ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含有するベクター、スクランブルｍｉＲと共に（ＶＥＧＦＢ−ｍｕｔ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−４８４と共に（ＶＥＧＦＢ−ｍｕｔ−ｍｉＲ−４８４）導入された変異したｍｉＲ−４８４結合部位を含有するベクター、スクランブルｍｉＲと共に（ＶＥＧＦＲ２  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−４８４と共に（ＶＥＧＦＲ２−ｍｉＲ−４８４）導入された野生型ＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含有するベクター、およびスクランブルｍｉＲと共に（ＶＥＧＦＲ２−ｍｕｔ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−４８４と共に（ＶＥＧＦＲ２−ｍｕｔ−ｍｉＲ−４８４）導入された変異したｍｉＲ−４８４結合部位を含有するベクターのルシフェラーゼアッセイ。
【図４−１】[0024]  図４Ａ〜４Ｂ．応答者（図４Ａ）および非応答者（図４Ｂ）の腫瘍のＣＤ３４染色；後者において、明白な微小血管の形成を伴うより高い血管密度を示している。
【図４−２】[0025]  図４Ｃ．ＳＫ−ＯＶ３またはＭＤＡＨ２７７４細胞における、ｍｉＲ−４８４または対照を導入されたマウス異種移植片腫瘍中の腫瘍血管数。 [0026]  図４Ｄ．ｍｉＲ−４８４および血管数の回帰分析。
【図５−１】[0028]  図５Ａ〜５Ｂ．安定形質移入後の（図５Ａ）、および同じ細胞株に由来するＣＭ培地中の（図５Ｂ）、卵巣がん由来細胞株におけるｍｉＲ−４８４の発現を示す。 [0029]  図５Ｃ．卵巣がん由来細胞株と共培養されたＨＵＶＥＣ細胞中のｍｉＲ−４８４のレベル。
【図５−２】[0030]  図５Ｄ．共培養されたｍｉＲ−４８４−ＦＩＴＣコンジュゲートを形質移入されたＳＫ−ＯＶ３細胞（緑）およびＣＤ３１抗体−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄコンジュゲートで染色されたＨＵＶＥＣ（赤）の共焦点顕微鏡画像。 [0031]  図５Ｅ．右のパネル：ｍｉＲ−４８４またはＥＧＦＰを安定導入されたＳＫ−ＯＶ３細胞からのＣＭ中で培養されたＨＵＶＥＣ細胞におけるＶＥＧＦＲ２発現のウェスタンブロット分析。左のパネル：デンシトメトリーでのチューブリンおよびＶＥＧＦＲ２の発現の間の比率。
【図６−１】[0033]  図６Ａ．ＥＯＣ中のｍｉＲ  ２９６および４８４の発現。 [0034]  図６Ｂ．表は、示した卵巣がん細胞株におけるｍｉＲ−２９６、４８４の正規化された発現レベルならびに方法の節で記述されるように評価されたＣＢＤＣＡ処理に関するそれらのＩＣ値を示す。
【図６−２】[0035]  図６Ｃ．ＭＤＡＨ−２７７４細胞のＣＢＤＣＡ（上のパネル）およびＴａｘｏｌ（下のパネル）処理に対するインビトロでの感受性へのｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−２９６発現の作用。
【図６−３】図６Ｄ．ＳＫＯＶ−３細胞のＣＢＤＣＡ（上のパネル）およびＴａｘｏｌ（下のパネル）処理に対するインビトロでの感受性へのｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−２９６発現の作用。
【図７】[0036]  図７．３Ｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス上で示した条件培地（ＣＭ）または対照の存在下で２０時間培養したＨＵＶＥＣの画像。示したように、ｍｉＲ−４８４を導入されたＳＫＯＶ−３およびＭＤＡＨ２７７４細胞からのＣＭは、ＨＵＶＥＣの３Ｄ中で管様構造を正しく形成および維持する能力を対照細胞からのＣＭと比較した場合に低減する。
【図８】[0037]  図８．卵巣の浸潤性漿液性癌の患者のデータ、臨床転帰に関するデータを示す表。
【図９】[0038]  図９．応答性（Ｒｅｓｐｏｎｓｅｒ）対不応性卵巣癌におけるｍｉＲ発現シグネチャー。
【図１０Ａ】[0040]  図１０Ａ．それぞれＨＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）およびＶＥＧＦＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の３’ＵＴＲ中の可能性のあるｍｉＲ−２９６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）および４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の結合部位のアラインメント。
【図１０Ｂ】[0041]  図１０Ｂ．２９３細胞におけるトランスフェクション後のｍｉＲ  ２９６および４８４の発現を示す。
【図１０Ｃ】[0042]  図１０Ｃ．左のパネル、２９３細胞におけるｍｉＲ−２９６および４８４のトランスフェクション後のＨＧＳ、ＶＥＧＦＢおよびチューブリンのウェスタンブロット分析、右のパネル、デンシトメトリーでのチューブリン、ＨＧＳおよびＶＥＧＦＢの発現の間の比率。
【図１０Ｄ】[0043]  図１０Ｄ．スクランブルｍｉＲと共に（ＨＧＳ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−２９６と共に（ＨＧＳ−ｍｉＲ  ２９６）導入された野生型ＨＧＳ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼアッセイベクター、およびスクランブルｍｉＲと共に（ＨＧＳｍｕｔ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−２９６と共に（ＨＧＳｍｕｔ−ｍｉＲ  ２９６）導入された変異したｍｉＲ  ２９６結合部位を含有するベクター。
【図１０Ｅ】[0044]  図１０Ｅ．スクランブルｍｉＲと共に（ＶＥＧＦＢ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−４８４と共に（ＶＥＧＦＢ−ｍｉＲ  ４８４）導入された野生型ＶＥＧＦＢ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼアッセイベクター、およびスクランブルｍｉＲと共に（ＶＥＧＦＢｍｕｔ  ｃｎｔ）、またはｍｉＲ−４８４と共に（ＶＥＧＦＢｍｕｔ−ｍｉＲ  ４８４）導入された変異したｍｉＲ  ４８４結合部位を含有するベクター。
【図１１Ａ】[0046]  図１１Ａ．ヒトの漿液性卵巣癌の３０の症例（１５ＮＲおよび１５Ｒ）中の腫瘍血管数。
【図１１Ｂ】[0047]  図１１Ｂ．ＳＫＯＶ−３またはＭＤＡＨ２７７４細胞における、ｍｉＲ  ４８４または対照を導入されたマウス異種移植片腫瘍中の腫瘍血管数。
【図１１Ｃ】[0048]  図１１Ｃ．ＮＲ（左のパネル）およびＲ（右のパネル）腫瘍のＣＤ３４染色；前者において、明白な微小血管の形成を伴うより高い血管密度を示している。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
[0099]  この開示全体を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書を、引用を同定することにより参照する。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示を、この発明が属する技術の現状をより完全に記述するために本開示の中に参照により援用する。
【００６１】
[00100]  定義
[00101]  前記の一般的な記述および以下の詳細な記述は両方とも典型的かつ説明的なものでしかなく、本教示の範囲を限定することは意図していないことは理解されるべきである。この出願において、別途明確に記載しない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。
【００６２】
[00102]  単語“ａ”または“ａｎ”の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中で用語“含む”と合わせて用いられる場合、“１”を意味してよいが、それは“１以上”、“少なくとも１”、および“１または１より多く”の意味とも矛盾しない。
【００６３】
[00103]  また、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”、“含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）”、および“含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）”、またはそれらの基語の修飾、例えば“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“含有した（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）”、および“含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”（それらに限定されない）の使用は、限定であることを意図していない。用語“および／または”は、前後の用語を一緒に、または別々に選ぶ（ｔａｋｅｎ）ことができることを意味する。説明目的のため、しかし限定としてではなく、“Ｘおよび／またはＹ”は“Ｘ”もしくは“Ｙ”または“ＸおよびＹ”を意味することができる。
【００６４】
[00104]  ｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解されている。この点において、用語“遺伝子”は簡単化のために所与のｍｉＲＮＡに関する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を指して用いられている。しかし、本発明の態様は、その発現に関わるｍｉＲＮＡのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を含んでよい。
【００６５】
[00105]  用語“ｍｉＲ”、“ｍｉｒ”および“ｍｉＲＮＡ”は一般に、ＲＮＡの翻訳を調節することができる小さいＲＮＡ分子のクラスであるマイクロＲＮＡを指す（Zeng and Cullen, RNA, 9(1):112-123, 2003; Kidner and Martienssen Trends Genet, 19(1):13-6, 2003; Dennis C, Nature, 420(6917):732, 2002; Couzin J, Science 298(5602):2296-7, 2002を参照、そのそれぞれを参照により本明細書に援用する）。
【００６６】
[00106]  ｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解されている。この点において、用語“遺伝子”は簡単化のために所与のｍｉＲＮＡに関する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を指して用いられている。しかし、本発明の態様は、その発現に関わるｍｉＲＮＡのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を含んでよい。
【００６７】
[00107]  用語“ｍｉＲＮＡ”は一般に一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明において実現される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域に、または別の核酸に部分的に（鎖の長さにわたる相補性が１０〜５０％）、実質的に（鎖の長さにわたる相補性が５０％より大きいが１００％未満）、または完全に相補的である領域または追加の鎖も含むであろう。従って、核酸は、分子を含む特定の配列の１個以上の相補または自己相補鎖（単数または複数）または“相補物（単数または複数）”を含む分子を含んでよい。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは１００％まで相補的である自己相補的な領域を有していてよく、本発明のｍｉＲＮＡプローブはそれらの標的に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％相補的でもよく、または相補的である。
【００６８】
[00108]  用語“それらの組み合わせ”は、本明細書で用いられる際、その用語に先行する列挙された項目の全ての並べ替えおよび組み合わせを指す。例えば、“Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ”は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことを意図している。
【００６９】
[00109]  別途言及しない限り、技術用語は慣習的な用法に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版、1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (編者), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版、1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (編者), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版、1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる。
【００７０】
[00110]  本開示の様々な態様の再考を容易にするため、以下の特定の用語の説明を提供する。
【００７１】
[00111]  補助的療法：一次処置の効果を向上させるために一次処置との組み合わせで用いられる処置。
【００７２】
[00112]  臨床転帰：疾患もしくは障害に関する処置後の、または処置なしでの患者の健康状態を指す。臨床転帰には、死亡までの時間の長さの増大、死亡までの時間の長さの減少、生存チャンスの増大、死亡の危険性の増大、生存、疾患なしでの生存、慢性疾患、転移、進行した、または侵攻性の疾患、疾患の再発、死亡、および療法に対する望ましい、または乏しい応答が含まれるが、それらに限定されない。
【００７３】
[00113]  対照：“対照”は、実験試料、例えば患者ら得られた腫瘍試料との比較のために用いられる試料または標準を指す。
【００７４】
[00114]  生存における減少：本明細書で用いられる際、“生存における減少”は、患者の死亡前の時間の長さにおける減少、またはその患者の死亡の危険性における増大を指す。
【００７５】
[00115]  発現のレベルを検出すること：例えば、“ｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ発現のレベルを検出すること”は、試料中に存在するｍｉＲまたはｍｉＲＮＡの量を定量化することを指す。特定のｍｉＲ、またはあらゆるマイクロＲＮＡの発現を検出することは、当技術で既知の、または本明細書で記述されるあらゆる方法を用いて、例えばｑＲＴ−ＰＣＲにより達成することができる。ｍｉＲの発現を検出することには、ｍｉＲの成熟形態またはｍｉＲの発現と相関している前駆体形態のどちらかの発現を検出することが含まれる。典型的には、ｍｉＲＮＡ検出法は、例えばＲＴ−ＰＣＲによる配列特異的検出を含む。ｍｉＲ特異的プライマーおよびプローブは、その前駆体および成熟したｍｉＲ核酸の配列を用いて設計することができ、それは当技術で既知である。
【００７６】
[00116]  マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡは一般に２１〜２３ヌクレオチドの長さである。マイクロＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物からプロセシングされて前駆体（前）ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造になり、最終的に機能する成熟したマイクロＲＮＡになる。成熟したマイクロＲＮＡ分子は１種類以上のメッセンジャーＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、それらの主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。マイクロＲＮＡは遺伝子発現をＲＮＡｉ経路を通して制御する。
【００７７】
[00117]  ｍｉＲ発現：本明細書で用いられる際、“低ｍｉＲ発現”および“高ｍｉＲ発現”は、試料中にあるｍｉＲＮＡのレベルを指す相対的な用語である。一部の態様において、低および高ｍｉＲ発現は、対照試料および試験試料の群中のｍｉＲＮＡレベルの比較により決定される。次いで低および高発現を、試料中のｍｉの発現が平均ｍｉＲ発現レベルまたはｍｉＲ発現レベルの中央値よりも上である（高い）か、または下である（低い）かに基づいて、それぞれの試料に割り当てることができる。個々の試料に関して、高ｍｉＲ発現または低ｍｉＲ発現は、その試料の高発現もしくは低発現を有することが既知である対照試料もしくは基準試料に対する比較により、または標準値に対する比較により決定することができる。低ｍｉＲ発現および高ｍｉＲ発現には、ｍｉＲＮＡの前駆体もしくは成熟形態のどちらか、または両方の発現が含まれ得る。
【００７８】
[00118]  対象：本明細書で用いられる際、用語“対象”にはヒトおよび非ヒト動物が含まれる。処置に関する好ましい対象はヒトである。“患者”および“対象”は、本明細書において互換的に用いられている。
【００７９】
[00119]  医薬的に許容できるビヒクル：この開示において有用な医薬的に許容できるキャリヤー（ビヒクル）は従来のものである。E. W. Martin, Mack Publishing Co.（ペンシルベニア州イーストン）によるRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１５版(1975)は、１種類以上の療法化合物、分子または薬剤の医薬的送達に適した組成物および配合物を記載している。
【００８０】
[00120]  疾患を予防、処置または改善すること：疾患を“予防すること”は、疾患の完全な発現を抑制することを指す。“処置すること”は、疾患の徴候もしくは症状または病的状態をそれが発現し始めた後に改善する療法的介入を指す。“改善すること”は、疾患の徴候または症状の数または重症度における低減を指す。
【００８１】
[00121]  スクリーニング：本明細書で用いられる際、“スクリーニング”は、そのような疾患に影響を及ぼす候補薬剤を評価および同定するために用いられるプロセスを指す。マイクロＲＮＡの発現は、当技術で既知の、および本明細書で記述されるいくつかの技法のいずれか１つを用いて、例えばマイクロアレイ分析により、またはｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化することができる。
【００８２】
[00122]  小分子：典型的には約１０００ダルトン未満、または一部の態様において約５００ダルトン未満の分子量を有する分子であり、ここでその分子はある測定可能な程度まで標的分子の活性を調節することができる。
【００８３】
[00123]  療法的：診断および処置の両方が含まれる総称。
【００８４】
[00124]  療法剤：対象に適切に投与された際に所望の療法的または予防的作用を誘導することができる化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
【００８５】
[00125]  本明細書で用いられる際、“候補薬剤”は、それが療法剤として機能することができるかどうかを決定するためのスクリーニングのために選択された化合物である。“インキュベート”には、薬剤を細胞または組織と相互作用させるための十分な長さの時間が含まれる。“接触させること”には、固体状または液体状の薬剤を細胞または組織と共にインキュベートすることが含まれる。細胞または組織を薬剤で“処置すること”には、その薬剤をその細胞もしくは組織と接触させること、またはその薬剤をその細胞もしくは組織と共にインキュベートすることが含まれる。
【００８６】
[00126]  療法上有効量：その薬剤で処置されている対象において、または細胞において所望の作用を達成するために十分な明記された医薬または療法剤の量。薬剤の有効量は、処置されている対象または細胞、およびその療法組成物の投与の方法が含まれるがそれらに限定されないいくつかの要因に依存するであろう。
【００８７】
[00127]  本方法の一部の態様において、対照の使用が望ましい。その点において、その対照は同じ患者から得られた非がん性細胞／組織試料、または健康な対象、例えば健康な組織提供者から得られた細胞／組織試料であってよい。別の例において、その対照は既存の（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）値から計算された標準である。腫瘍試料および非がん性細胞／組織試料は、当技術で既知のあらゆる方法に従って得ることができる。例えば、腫瘍および非がん性試料は、切除を受けたがん患者から得ることができ、またはそれらは皮下針を用いた抜き取りにより、顕微手術により、もしくはレーザー捕獲により得ることができる。対照（非がん性）試料は、例えば死体提供者から、または健康な提供者から得ることができる。
【００８８】
[00128]  その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体から、天然のプロセシング経路を通して（例えば完全な細胞または細胞溶解物を用いて）、または合成的プロセシング経路により（例えば単離されたプロセシング酵素、例えば単離されたＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、またはＲＮａｓｅＩＩＩを用いて）得ることができる。その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子はｍｉＲ前駆体からプロセシングされなければならないわけではなく、生物学的合成または化学合成により直接生成することもできることは理解されている。マイクロＲＮＡが本明細書において名前により言及される場合、別途示さない限り、その名前はその前駆体および成熟形態両方に対応する。
【００８９】
[00129]  少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対象から得た生物学的試料の細胞において測定することができる。例えば、組織試料を卵巣がんを有することが疑われる対象から従来の生検技法により採取することができる。別の態様において、血液試料を対象から採取することができ、標準的な技法によるＤＮＡ抽出物のために白血球を分離することができる。その血液または組織試料は、好ましくは放射線療法、化学療法、または他の療法処置の開始前に対象から得られる。対応する対照組織もしくは血液試料、または対照参照試料は、その対象の冒されていない組織から、正常なヒトの個体もしくは正常な個体の集団から、またはその対象の試料中の細胞の大部分に対応する培養細胞から得ることができる。次いでその対照の組織または血液試料を、その対象の試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対照試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができるように、その対象からの試料と一緒に処理する。あるいは、参照試料をその試験試料とは別に（例えば異なる時点において）得て処理することができ、その試験試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその参照試料からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。
【００９０】
[00130]  １態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも大きい（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物の発現は“上方制御されている”、または“増大している”）。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は、対象からの細胞または組織試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量が対照の細胞または組織試料中の同じ遺伝子産物の量よりも大きい場合に増大している。別の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも小さい（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物の発現は“下方制御されている”、または“減少している”）。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子の発現は、対象からの細胞または組織試料中のその遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照の細胞または組織試料中の同じ遺伝子から産生された量よりも少ない場合に減少している。対照および正常な試料中の相対的なｍｉＲ遺伝子発現は、１種類以上のＲＮＡ発現標準に関して決定することができる。その標準は、例えばゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準的な細胞株におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、その対象の冒されていない組織におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、または以前に正常なヒトの対照の集団に関して得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含み得る。
【００９１】
[00131]  その対象から得られた試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した変化（すなわち増大または減少）は、その対象における卵巣がんの存在を示している。１態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも大きい。別の態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも小さい。
【００９２】
[00132]  特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は本明細書における表および図において示されているような群から選択される。
【００９３】
[00133]  試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適したあらゆる技法を用いて測定することができる。生物学的試料（例えば細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを決定するための適切な技法（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者には周知である。特定の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、細胞の総ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーション、続いて遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをＤＮＡ分解酵素による処理および沈殿により除去する。次いでそのＲＮＡ分子を標準的な技法に従うアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて成し遂げられる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第７章を参照、その全開示を参照により援用する。
【００９４】
[00134]  所与のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションのための適切なプローブ（例えばＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は本明細書中の表において提供される核酸配列から生成することができ、それには対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製のための方法ならびにその標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションに関する条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第１０章および第１１章において記述されており、その開示を参照により本明細書に援用する。
【００９５】
[00135]  例えば、その核酸プローブは、例えば放射性核種、例えば３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３５Ｓ；重金属；標識された結合基（ｌｉｇａｎｄ）に関する特異的な結合対のメンバーとして機能することができる結合基（例えばビオチン、アビジン、または抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素等を用いて標識することができる。
【００９６】
[00136]  プローブは、Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113:237-251のニックトランスレーション法またはFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13のランダムプライミング法のどちらかにより高い特異的活性まで標識することができ、その全開示を参照により本明細書に援用する。後者は一本鎖ＤＮＡから、またはＲＮＡ鋳型から高い特異的活性の３２Ｐ標識されたプローブを合成するための一般的に好まれる方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って既存のヌクレオチドを高度に放射性のヌクレオチドを用いて置き換えることにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを十分に超える特異的活性を有する３２Ｐ標識された核酸プローブを調製することが可能である。次いでハイブリダイズさせたフィルターを写真フィルムに曝露することにより、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出を実施することができる。ハイブリダイズさせたフィルターに曝露した写真フィルムのデンシトメトリーによる走査は、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いて、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルをコンピューター化された画像化システム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにより定量化することができる。
【００９７】
[00137]  ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が現実的でない場合、ランダムプライマー法を用いて類似体、例えばｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子中に組み込むことができる。そのビオチン化されたプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応を生成する酵素に連結したビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、ストレプトアビジンおよび抗体（例えば抗ビオチン抗体）との反応により検出することができる。
【００９８】
[00138]  ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション技法に加えて、ＲＮＡ転写産物のレベルを決定することはインサイチュハイブリダイゼーションの技法を用いて成し遂げることができる。この技法はノーザンブロッティング技法よりも少ない細胞しか必要とせず、細胞全体を顕微鏡カバーガラス上に置き、その細胞の核酸内容物を放射性または他の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含有する溶液で調べることを含む。この技法は、対象からの組織生検試料を分析するのに特によく適している。インサイチュハイブリダイゼーション技法の実施は米国特許第５，４２７，９１６号においてより詳細に記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。所与のｍｉＲ遺伝子産物のインサイチュハイブリダイゼーションのための適切なプローブは、本明細書中の表において提供されている核酸配列から生成することができ、それには、上記で記述されたような対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。
【００９９】
[00139]  細胞中のｍｉＲ遺伝子転写産物の相対的な数は、ｍｉＲ遺伝子転写産物の逆転写、続いてポリメラーゼ連鎖反応による逆転写された転写産物の増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルは、内部標準、例えば同じ試料中に存在する“ハウスキーピング”遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部標準としての使用のための適切な“ハウスキーピング”遺伝子には、例えばミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的および半定量的ＲＴ−ＰＣＲならびにその変形を実施するための方法は、当業者には周知である。
【０１００】
[00140]  一部の場合において、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましい可能性がある。他の場合では、がんと相関している全ての既知のｍｉＲ遺伝子の転写産物の発現レベルを決定することが望ましい可能性がある。数百のｍｉＲ遺伝子または遺伝子産物のがん特異的発現レベルを評価することは時間がかかり、大量の総ＲＮＡ（例えばそれぞれのノーザンブロットに関して少なくとも２０μｇ）および放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィーの技法を必要とする。
【０１０１】
[00141]  これらの限界を克服するため、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的であるオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセット（またはシグネチャー）を含有するマイクロチップ形式（すなわちマイクロアレイ）のオリゴライブラリーを構築することができる。そのようなマイクロアレイを用いることで、生物学的試料中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを生成し、それらをそのマイクロアレイ上のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションプロファイルまたは発現プロファイルを作成することにより決定することができる。次いでその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルと比較して、どのマイクロＲＮＡが卵巣がん細胞において変化した発現レベルを有するかを決定することができる。本明細書で用いられる際、“プローブオリゴヌクレオチド”または“プローブデオキシオリゴヌクレオチド”は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。“標的オリゴヌクレオチド”または“標的デオキシオリゴヌクレオチド”は、（例えばハイブリダイゼーションにより）検出されるべき分子を指す。“ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド”または“ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド”は、特異的なｍｉＲ遺伝子産物に、または特異的なｍｉＲ遺伝子産物の逆転写産物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１０２】
[00142]  特定の試料の“発現プロファイル”または“ハイブリダイゼーションプロファイル”は、本質的にその試料の状態のフィンガープリントであり；２つの状態には同様に発現するあらゆる特定の遺伝子がありうるが、いくつかの遺伝子の評価はその細胞の状態に特有である遺伝子発現プロファイルの作成を同時に可能にする。すなわち、正常な組織をがん細胞から識別することができ、がん細胞の複数のタイプ内で異なる予後の状態（例えば良好な、または悪い長期生存の見込み）を決定することができる。異なる状態にある卵巣細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方および下方制御両方が含まれる）が得られる。がん細胞または正常細胞において差次的に発現している配列、ならびに結果として異なる予後転帰をもたらす差次的発現の同定は、いくつかの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の処置計画を（例えば化学療法薬が特定の患者において長期予後を向上させるように作用するかどうかを決定するために）評価することができる。同様に、患者の試料を既知の発現プロファイルと比較することにより、診断を行う、または確証することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）は、ｍｉＲもしくは疾患発現プロファイルを抑制する、または悪い予後のプロファイルをよりよい予後のプロファイルに変換する薬物候補のスクリーニングを可能にする。
【０１０３】
[00143]  従って、本発明は、その対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そしてその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することを含む、対象ががんを有する、またはがんを発現する危険にさらされているかどうかを診断する方法を提供し、ここで少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化は、その対象が卵巣がんを有するか、または卵巣がんを発現する危険にさらされているかのどちらかであることを示している。１態様において、そのマイクロアレイはヒトのｍｉＲＮＡに関するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０４】
[00144]  そのマイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から作製された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。そのアレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに関する２種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（一方は活性な成熟した配列を含有し、他方はそのｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である）を含有することができる。そのアレイは、対照、例えばヒトのオルソログと数塩基のみ異なる１種類以上のマウスの配列も含有していてよく、それはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの条件に関する対照の役目を果たすことができる。両方の種からのｔＲＮＡおよび他のＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）をマイクロチップ上にプリントし、特定のハイブリダイゼーションに関する内部の（比較的安定な）陽性対照を提供することもできる。非特異的ハイブリダイゼーションに関する１種類以上の適切な対照がそのマイクロチップ上に含まれていてもよい。この目的に関して、配列はあらゆる既知のｍｉＲＮＡと一切相同性がないことに基づいて選択される。
【０１０５】
[00145]  そのマイクロアレイは当技術で既知の技法を用いて製作することができる。例えば、適切な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位において５’−アミン修飾し、商業的に入手可能なマイクロアレイシステム、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００マイクロアレイヤーおよびＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライドを用いてプリントする。その標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーを、その標的ＲＮＡを標識されたプライマーを用いて逆転写することにより調製する。最初の鎖の合成の後、そのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。こうして調製された標識された標的ｃＤＮＡを、次いでそのマイクロアレイチップにハイブリダイズする条件（例えば２５℃において６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中で１８時間）下でハイブリダイズさせ、続いて０．７５×ＴＮＴで３７℃において４０分間洗浄する。その固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置において、ハイブリダイゼーションが起こる。その標識された標的ｃＤＮＡは結合が起こるアレイ上の正確な位置を示し、自動的な検出および定量化を可能にする。その出力は、患者試料中の特異的なｃＤＮＡ配列の相対的存在量、従って対応する相補的ｍｉＲの相対的存在量を示すハイブリダイゼーション事象のリストからなる。１態様によれば、その標識されたｃＤＮＡオリゴマーはビオチン標識されたプライマーから調製されたビオチン標識されたｃＤＮＡである。次いでそのマイクロアレイを、例えばストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを用いるビオチン含有転写産物の直接検出により処理し、一般に用いられる走査法を利用して走査する。そのアレイ上のそれぞれのスポットの画像強度は、その患者試料中の対応するｍｉＲの存在量に比例している。
【０１０６】
[00146]  そのアレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現の検出に関するいくつかの利点を有する。第１に、数百種類の遺伝子の全体的な発現を同じ試料中で１つの時点において同定することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計により、成熟した分子および前駆体分子の両方の発現を同定することができる。第３に、ノーザンブロット分析と比較して、そのチップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの総ＲＮＡを用いて再現性のある結果を提供する。その比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種あたり数百）は、それぞれに関して異なるオリゴヌクレオチドプローブを有する、いくつかの種に関する共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのような道具は、様々な条件下でのそれぞれの既知のｍｉＲに関する種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
【０１０７】
[00147]  特異的なｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的な部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを用いて、ｍｉＲ発現パターンの分析のためにｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施することができる。異なるｍｉＲシグネチャーを、確立された疾患マーカーと、または直接疾患状態と関連付けることができる。
【０１０８】
[00148]  本明細書に記述される発現プロファイリング法に従って、がん（例えば卵巣がん）を有することが疑われる対象からの試料からの総ＲＮＡを定量的に逆転写して、その試料中のＲＮＡに相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意する。次いでその標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意する。その結果は、その試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表すその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルである。そのハイブリダイゼーションプロファイルは、その試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドのそのマイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの結合からのシグナルを含む。そのプロファイルは、結合の存在または非存在（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、その記録されたプロファイルには、それぞれのハイブリダイゼーションからのシグナルの強度が含まれる。そのプロファイルを正常な、例えば非がん性の対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。そのシグナルにおける変化は、その対象におけるがんの存在またはがんを発現する傾向を示している。
【０１０９】
[00149]  ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技法も当技術分野における技術の範囲内であり、それにはＲＮＡの転写および分解の速度を測定するための様々な技法が含まれる。
【０１１０】
[00150]  本発明は、対象からの試験試料中の、卵巣がんにおける特定の予後（例えば良好な、または楽観的な（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）予後、悪い、または不良な予後）と関係している少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、卵巣がんを有する対象の予後を決定する方法も提供する。これらの方法に従って、試験試料中の特定の予後と関係しているｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した場合の変化は、その対象が特定の予後を有する卵巣がんを有することを示している。１態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は不良な（すなわち悪い）予後と関係している。悪い予後の例には低い生存率および急速な疾患の進行が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１１】
[00151]  特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し、そしてその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定される。
【０１１２】
[00152]  いずれか１つの理論により束縛されることを望むわけではないが、細胞中の１種類以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける変化は結果としてこれらのｍｉＲに関する１種類以上の意図される標的の分解をもたらす可能性があり、それが卵巣がんの形成につながり得ると信じられている。従って、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを（例えば卵巣がん細胞中で上方制御されているｍｉＲのレベルを低下させることにより、卵巣がん細胞において下方制御されているｍｉＲのレベルを増大させることにより）変化させることは、化学療法抵抗性卵巣がんの症状を改善するであろう。
【０１１３】
[00153]  従って、本発明は対象において卵巣を処置する方法を含み、ここでその対象の細胞（例えば卵巣がん細胞）中で少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物が脱制御されている（例えば下方制御されている、上方制御されている）。１態様において、試験試料（例えば卵巣がん試料）中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも大きい。別の態様において、試験試料（例えば卵巣がん試料）中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも小さい。その少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物がその卵巣がん細胞において下方制御されている場合、その方法は、有効量のその少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、またはその単離された変異体もしくは生物学的に活性な断片を、その対象中のがん細胞の増殖が阻害されるように投与することを含む。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物が対象中のがん細胞において下方制御されている場合、有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物をその対象に投与することはそのがん細胞の増殖を阻害し得る。その対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、そのがん細胞中で下方制御されている内因性の野生型ｍｉＲ遺伝子産物（例えば本明細書中の表において示されているｍｉＲ遺伝子産物）と同一であることができ、またはそれはその変異体もしくは生物学的に活性な断片であることができる。
【０１１４】
[00154]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“変異体”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有し、その対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲＮＡを指す。そのような生物学的活性の例には、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害（例えば、標的ＲＮＡ分子の翻訳を阻害する、標的ＲＮＡ分子の安定性を調節する、標的ＲＮＡ分子のプロセシングを阻害する）および卵巣と関係する細胞プロセス（例えば細胞分化、細胞増殖、細胞死）の阻害が含まれるが、それらに限定されない。これらの変異体には、種変異体およびｍｉＲ遺伝子中の１個以上の変異（例えば置換、欠失、挿入）の結果である変異体が含まれる。特定の態様において、その変異体は対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
【０１１５】
[00155]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“生物学的に活性な断片”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を指す。上記で記述したように、そのような生物学的活性の例には、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害および卵巣がんと関係する細胞プロセスの阻害が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、その生物学的に活性な断片は少なくとも約５、７、１０、１２、１５、または１７ヌクレオチド長である。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は１種類以上の追加の抗がん処置との組み合わせで対象に投与することができる。適切な抗がん処置には、化学療法、ホルモン療法、放射線療法および組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１６】
[00156]  ホルモン療法は、化学療法に耐えることができない、または化学療法では助からない患者のための選択肢である。ホルモン療法薬には、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、ならびにアロマターゼ阻害剤、例えばレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、およびエキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））が含まれる。
【０１１７】
[00157]  マイクロＲＮＡに基づく処置および診断法は卵巣がんに関する処置を向上させることができ、療法の組み合わせを含んでよい。卵巣がんの処置において、プラチナをベースにした薬物、例えばカルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））またはシスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））を用いてよい。他の処置には、タキサン、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））またはドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））が含まれてよい。現在、パクリタキセルがプラチナ系薬物との組み合わせでの初期療法として最も頻繁に用いられる薬物である。
【０１１８】
[00158]  用いられる他の薬物は、以下の薬物である可能性がある：ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、イクサベピロン（ｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））および他のエピテロン（ｅｐｉｔｈｅｌｏｎｅ）系薬物、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ならびにフェノクソディオール。
【０１１９】
[00159]  本発明の態様を用いて、適切な薬物を選択し、その腫瘍の選択された処置への応答性の予測および指標に基づいて患者の処置を適合させることができる。例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））はがん細胞の増殖に関わるタンパク質である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を標的とする。ＶＥＧＦＢおよびＶＥＧＦＲ２経路はｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−２９６−５ｐの影響を受ける。マイクロＲＮＡ測定を用いて薬物の有効性および化学療法抵抗性を予測することができる。
【０１２０】
[00160]  少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物がそのがん細胞において上方制御されている場合、その方法は、卵巣がん細胞の増殖が阻害されるように、その対象に有効量の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する化合物を投与することを含む。そのような化合物は本明細書においてｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物と呼ばれる。適切なｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の例には、本明細書で記述されているｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（例えば二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸および酵素的ＲＮＡ分子）が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を１種類以上の追加の抗がん処置との組み合わせで対象に投与することができる。適切な抗がん処置には、化学療法、放射線療法およびそれらの組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２１】
[00161]  用語“処置する”、“処置すること”および“処置”は、本明細書で用いられる際、疾患または病気、例えば卵巣がんと関係する症状を改善することを指し、それにはその疾患症状の開始を予防する、もしくは遅らせる、および／またはその疾患もしくは病気の症状の重症度もしくは頻度を減らすことが含まれる。用語“対象”および“個体”は、本明細書において、動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、齧歯類の、もしくはマウスの種が含まれるがそれらに限定されない哺乳類を含むように定義されている。好ましい態様において、その動物はヒトである。
【０１２２】
[00162]  本明細書で用いられる際、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の“有効量”は、卵巣がんを患う対象中のがん細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、所与の対象に投与するべきｍｉＲ遺伝子産物の有効量を、その対象の大きさおよび体重；疾患浸透（ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の程度；その対象の年齢、健康状態および性別；投与の経路；ならびにその投与が局所性か全身性かのような要因を考慮することによりすぐに決定することができる。
【０１２３】
[00163]  例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。その腫瘍塊のおおよその重量は、その塊のおおよその体積を計算することにより決定することができ、ここで１立方センチメートルの体積はおおよそ１グラムに相当する。腫瘍塊の重量に基づく単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約１０〜５００マイクログラム／腫瘍塊１グラムの範囲であることができる。特定の態様において、その腫瘍塊は、少なくとも約１０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、少なくとも約６０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、または少なくとも約１００マイクログラム／腫瘍塊１グラムであることができる。
【０１２４】
[00164]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき対象のおおよその、または推定される体重に基づくこともできる。好ましくは、そのような有効量は、本明細書で記述されるように、非経口で、または経腸的に投与される。例えば、対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約５から３０００マイクログラム／ｋｇ体重まで、約７００から１０００マイクログラム／ｋｇ体重までの範囲、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重より多い量であることができる。
【０１２５】
[00165]  当業者は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の所与の対象への投与のための適切な投与計画もすぐに決定することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に一度に（例えば単回注射または沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）として）投与することができる。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に約３日間から約２８日間まで、より詳細には約７日間から約１０日間までの期間の間、１日１回または２回投与することができる。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は１日１回７日間投与される。投与計画が多数回投与を含む場合、その対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、その投与計画全体にわたって投与される遺伝子産物の総量を含むことができる。
【０１２６】
[00166]  本明細書で用いられる際、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された、またはヒトの介入により天然の状態から変化した、もしくは取り出されたｍｉＲ遺伝子産物である。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、またはその天然の状態の一緒に存在する物質から部分的に、もしくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離されている”と考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形態で存在することができ、またはその中にそのｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞中に存在することができる。従って、細胞に意図的に送達された、またはその中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。細胞内部でｍｉＲ前駆体分子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物も、“単離された”分子であると考えられる。本発明によれば、本明細書で記述される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、対象（例えばヒト）中の卵巣がんを処置するための医薬品の製造のために用いることができる。
【０１２７】
[00167]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、いくつかの標準的な技法を用いて得ることができる。例えば、そのｍｉＲ遺伝子産物は当技術で既知の方法を用いて化学合成することができ、または組み替えで生成することができる。１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび一般に用いられるＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的な供給業者には、例えばＰｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルク）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アッシュランド）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）が含まれる。
【０１２８】
[00168]  あるいは、そのｍｉＲ遺伝子産物はあらゆる適切なプロモーターを用いて組み替え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。ＲＮＡをプラスミドから発現させるための適切なプロモーターには、例えばＵ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当技術の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、がん細胞におけるそのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【０１２９】
[00169]  組み換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物を、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することができる。組み換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達することもでき、がん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組み換えプラスミドの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【０１３０】
[00170]  そのｍｉＲ遺伝子産物は別の組み換えプラスミドから発現させることができ、またはそれらは同じ組み換えプラスミドから発現させることができる。１態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、その前駆体分子ががん細胞内に現存するプロセシング系が含まれるがそれらに限定されない適切なプロセシング系によりプロセシングされて機能するｍｉＲ遺伝子産物になる。他の適切なプロセシング系には、例えばインビトロドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞溶解物系（例えばＴｕｓｃｈｌらへの米国公開特許出願第２００２／００８６３５６号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）および大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ系（例えばＹａｎｇらへの米国公開特許出願第２００４／００１４１１３号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）が含まれる。
【０１３１】
[00171]  ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるのに適したプラスミドの選択、核酸配列をそのプラスミド中に挿入してその遺伝子産物を発現させるための方法、およびその組み換えプラスミドを対象の細胞に送達する方法は、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;およびPaul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１３２】
[00172]  １態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターの制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で用いられる際、プロモーターの“制御下”は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がそのプロモーターの３’に、そのプロモーターがそのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列の転写を開始することができるように位置していることを意味する。
【０１３３】
[00173]  そのｍｉＲ遺伝子産物は、組み換えウイルスベクターから発現させることもできる。そのｍｉＲ遺伝子産物は、２個の別個の組み換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現させることができることが意図されている。その組み換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することもでき、またはがん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組み換えウイルスベクターの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【０１３４】
[00174]  本発明の組み換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列およびそのＲＮＡ配列を発現するためのあらゆる適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。他の適切なプロモーターの選択は、当技術分野における技術の範囲内である。本発明の組み換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物のがん細胞中での発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【０１３５】
[00175]  ｍｉＲ遺伝子産物に関するコード配列を受け入れることができるあらゆるウイルスベクターを用いることができる；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス類（ＬＶ）、ラブドウイルス類、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等。そのウイルスベクターの指向性を、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原を用いてそのベクターを偽型化することにより、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることにより、適宜改変することができる。
【０１３６】
[00176]  例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス等からの表面タンパク質を用いて偽型化することができる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにそのベクターを操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子により置き換えてＡＡＶ２／５ベクターを生成することができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当技術分野における技術の範囲内であり；例えばRabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１３７】
[00177]  本発明における使用に適した組み換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列をそのベクター中に挿入するための方法、そのウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法、および発現したＲＮＡ産物の回収は、当技術分野における技術の範囲内である。例えばDornburg (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1:5-14;およびAnderson (1998), Nature 392:25-30を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１３８】
[00178]  特に適切なウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のウイルスベクターである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＶベクター、その組み換えＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はXia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＡＶベクター、その組み換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はSamulski et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。１態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物はＣＭＶ中初期プロモーターを含む単一の組み換えＡＡＶベクターから発現される。
【０１３９】
[00179]  特定の態様において、本発明の組み換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終結配列と作動可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で用いられる際、“ポリＴ終結配列と作動可能に連結された”は、そのセンスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列がポリＴ終結シグナルに５’方向において直接隣接していることを意味する。そのｍｉＲ配列のそのベクターからの転写の間、そのポリＴ終結シグナルは転写を終結するように作用する。
【０１４０】
[00180]  本発明の処置法の他の態様において、有効量のｍｉＲ発現を阻害する少なくとも１種類の化合物をその対象に投与することができる。本明細書で用いられる際、“ｍｉＲ発現を阻害する”は、処置後のｍｉＲ遺伝子産物の前駆体および／または活性な、成熟した形態の産生が処置前に産生されていた量よりも少ないことを意味する。当業者は、ｍｉＲ発現ががん細胞中で阻害されているかどうかを、例えば本明細書で論じられるｍｉＲ転写産物レベルを決定するための技法を用いて容易に決定することができる。阻害は遺伝子発現のレベルで（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することにより）、またはプロセシングのレベルで（例えば、ｍｉＲ前駆体の成熟した、活性ｍｉＲへのプロセシングを阻害することにより）起こり得る。
【０１４１】
[00181]  本明細書で用いられる際、ｍｉＲ発現を阻害する化合物の“有効量”は、がん（例えば卵巣がん）を患っている対象中のがん細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、所与の対象に投与するべきｍｉＲ発現阻害化合物の有効量を、その対象の大きさおよび体重；疾患浸透の程度；その対象の年齢、健康状態および性別；投与の経路；ならびにその投与が局所性か全身性かのような要因を考慮することによりすぐに決定することができる。
【０１４２】
[00182]  例えば、発現阻害化合物の有効量は、本明細書で記述されたように、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。ｍｉＲ発現を阻害する化合物の有効量は、本明細書で記述されたように、処置されるべき対象のおおよその、または推定される体重に基づくこともできる。
【０１４３】
[00183]  当業者はまた、本明細書で記述されたように、ｍｉＲ発現を阻害する化合物を所与の対象に投与するための適切な投与計画をすぐに決定することができる。
【０１４４】
[00184]  ｍｉＲ遺伝子発現を阻害するための適切な化合物には、二本鎖ＲＮＡ（例えば短い、もしくは小さい干渉性ＲＮＡまたは“ｓｉＲＮＡ”）、アンチセンス核酸、および酵素的ＲＮＡ分子、例えばリボザイムが含まれる。これらの化合物のそれぞれが所与のｍｉＲ遺伝子産物を標的としてその標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現を（例えば翻訳を阻害することにより、切断および／または分解を誘導することにより）妨げることができる。
【０１４５】
[00185]  例えば、所与のｍｉＲ遺伝子の発現を、そのｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（“ｄｓＲＮＡ”）分子を用いてそのｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより妨げることができる。特定の態様において、そのｄｓＲＮＡ分子は“短い、または小さい干渉性ＲＮＡ”または“ｓｉＲＮＡ”である。
【０１４６】
[00186]  本方法において有用なｓｉＲＮＡは、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドまでの長さの、好ましくは約１９ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまでの長さの短い二本鎖ＲＮＡを含む。そのｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対合相互作用により一緒にアニーリングした（以下“塩基対合した”）センスＲＮＡ鎖および相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。そのセンス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含有される核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。
【０１４７】
[00187]  本明細書で用いられる際、その標的ｍＲＮＡ内に含有される標的配列と“実質的に同一”であるｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、その標的配列と同一である、またはその標的配列と１もしくは２ヌクレオチド異なる核酸配列である。そのｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または２つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖の“ヘアピン”領域により共有結合的に連結されている単一の分子を含むことができる。
【０１４８】
[00188]  そのｓｉＲＮＡは、１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により天然存在ＲＮＡと異なる変化したＲＮＡであることもできる。そのような変更には、非ヌクレオチド物質の、例えばそのｓｉＲＮＡの末端（単数または複数）への、もしくはそのｓｉＲＮＡの１個以上の内部のヌクレオチドへの付加、またはそのｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾、またはそのｓｉＲＮＡ中の１個以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換が含まれ得る。
【０１４９】
[00189]  そのｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は３’突出を含むこともできる。本明細書で用いられる際、“３’突出”は二本鎖のＲＮＡ鎖の３’末端から伸びた少なくとも１個の対合していないヌクレオチドを指す。従って、特定の態様において、そのｓｉＲＮＡは、１から約６ヌクレオチドまで（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれる）の長さ、１から約５ヌクレオチドまでの長さ、１から約４ヌクレオチドまでの長さ、または約２から約４ヌクレオチドまでの長さの少なくとも１個の３’突出を含む。特定の態様において、その３’突出はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチドの長さである。例えば、そのｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖はジチミジル酸（“ＴＴ”）またはジウリジル酸（“ｕｕ”）の３’突出を含むことができる。
【０１５０】
[00190]  そのｓｉＲＮＡは、上記で単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して記述したように、化学的もしくは生物学的に生成することができ、または組み替えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を生成および試験するための典型的な方法が、Ｇｅｗｉｒｔｚへの米国公開特許出願第２００２／０１７３４７８号において、およびＲｅｉｃｈらへの米国公開特許出願第２００４／００１８１７６号において記述されており、その両方の全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１５１】
[00191]  所与のｍｉＲ遺伝子の発現をアンチセンス核酸により阻害することもできる。本明細書で用いられる際、“アンチセンス核酸”はＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合する核酸分子を指し、それはその標的ＲＮＡの活性を変化させる。本方法における使用に適したアンチセンス核酸は、一般にｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に相補的な核酸配列を含む一本鎖核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。そのアンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に対して５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的である核酸配列を含むことができる。特定のヒトｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列が本明細書中の表において提供されている。いずれかの理論により束縛されることを望むわけではないが、そのアンチセンス核酸はｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸の二本鎖を消化するＲＮａｓｅＨまたは他の細胞性ヌクレアーゼを活性化すると信じられている。
【０１５２】
[00192]  アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達またはその分子の有効性に関連する他の特性を高めるために、核酸主鎖への、またはその糖および塩基部分（またはそれらの均等物）への修飾を含有することもできる。そのような修飾には、コレステロール部分、二本鎖インターカレーター、例えばアクリジン、または１種類以上のヌクレアーゼ耐性基が含まれる。
【０１５３】
[00193]  アンチセンス核酸は、上記で単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して記述したように、化学的もしくは生物学的に生成することができ、または組み替えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。生成および試験するための典型的な方法は当技術分野における技術の範囲内であり；例えば、Stein and Cheng (1993), Science 261:1004およびＷｏｏｌｆらへの米国特許第５，８４９，９０２号を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１５４】
[00194]  所与のｍｉＲ遺伝子の発現を酵素的核酸により阻害することもできる。本明細書で用いられる際、“酵素的核酸”は、ｍｉＲ遺伝子産物の連続した核酸配列に対する相補性を有する基質結合領域を含み、ｍｉＲ遺伝子産物を特異的に切断することができる核酸を指す。酵素的核酸の基質結合領域は、例えばｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に対して５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的であることができる。酵素的核酸は、塩基、糖、および／またはホスフェート基における修飾を含むこともできる。本方法における使用のための典型的な酵素的核酸はリボザイムである。
【０１５５】
[00195]  酵素的核酸は、上記で単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して記述したように、化学的もしくは生物学的に生成することができ、または組み替えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を生成および試験するための典型的な方法が、Werner and Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31;およびＣｅｃｈらへの米国特許第４，９８７，０７１号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１５６】
[00196]  少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物、またはｍｉＲ発現を阻害するための少なくとも１種類の化合物の投与は、がん（例えば卵巣がん）を有する対象においてがん細胞の増殖を阻害するであろう。本明細書で用いられる際、“がん細胞の増殖を阻害する”は、その細胞を殺す、またはその細胞の増殖を永久にもしくは一時的に停止する、もしくは遅くすることを意味する。がん細胞増殖の阻害は、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現阻害化合物の投与後に対象中のそのような細胞の数が一定のままである、または減少する場合に推測され得る。がん細胞増殖の阻害は、そのような細胞の絶対数が増大するが腫瘍成長の速度が低下する場合にも推測され得る。
【０１５７】
[00197]  対象の体の中のがん細胞の数は、直接測定により、または原発性もしくは転移性腫瘍塊の大きさからの推定により決定することができる。例えば、対象中のがん細胞の数は、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、またはがん細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の技法により測定することができる。
【０１５８】
[00198]  そのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物を対象のがん細胞に送達するのに適したあらゆる手段により対象に投与することができる。例えば、そのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現阻害化合物は、その対象の細胞にこれらの化合物を、またはこれらの化合物をコードする配列を含む核酸を導入するのに適した方法により投与することができる。１態様において、その細胞に少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターによりトランスフェクションする。
【０１５９】
[00199]  真核細胞に関するトランスフェクション法は当技術において周知であり、それには例えば、核酸の細胞の核または前核中への直接注入；電気穿孔法；リポソームによる移送（ｔｒａｎｓｆｅｒ）または親油性物質に媒介される移送；受容体に媒介される核酸送達、バイオバリスティック（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）または粒子加速；リン酸カルシウム沈殿、およびウイルスベクターに媒介されるトランスフェクションが含まれる。
【０１６０】
[00200]  例えば、細胞にリポソーム性移送化合物、例えばＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウム  メチルサルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）または均等物、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮを用いてトランスフェクションすることができる。用いられる核酸の量は本発明の実施にとって重要ではなく；許容可能な結果は０．１〜１００マイクログラムの核酸／１０５個の細胞で達成され得る。例えば、細胞１０５個あたり３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中の約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比率を用いることができる。
【０１６１】
[00201]  ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、あらゆる適切な経腸または非経口投与経路により対象に投与することもできる。本方法に関する適切な経腸投与経路には、例えば経口、直腸、または鼻内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系中へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注射または皮下注入が含まれる沈着法（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルまたは他の留置装置（例えば、網膜ペレットまたは坐薬または多孔性、非多孔性、もしくはゲル状材料を含むインプラント）による、対象組織への直接適用；ならびに吸入が含まれる。特に適切な投与経路は、注射、注入および腫瘍中への直接注射である。
【０１６２】
[00202]  本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を、ｎａｋｅｄＲＮＡとして、送達試薬との組み合わせで、またはそのｍｉＲ遺伝子産物もしくはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで対象に投与することができる。適切な送達試薬には、例えばＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ；ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ；ポリカチオン類（例えばポリリジン）およびリポソームが含まれる。
【０１６３】
[00203]  ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を発現する配列を含む組み換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにそのようなプラスミドおよびベクターをがん細胞に送達するための技法は本明細書において論じられており、および／または当技術で周知である。
【０１６４】
[00204]  特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を対象に送達するためにリポソームが用いられる。リポソームはその遺伝子産物または核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明における使用に関する適切なリポソームは標準的なベシクル形成性脂質から形成させることができ、それには一般に中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、所望のリポソームの大きさおよび血流中でのリポソームの半減期のような要因の考慮により導かれる。リポソームを調製するための様々な方法、例えばSzoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第５，０１９，３６９号において記述されているような方法が既知であり、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１６５】
[00205]  本方法における使用のためのリポソームは、そのリポソームをがん細胞に標的化するリガンド分子を含むことができる。がん細胞に広く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１６６】
[00206]  本方法における使用のためのリポソームを、単核性マクロファージ系（“ＭＭＳ”）および網内系（“ＲＥＳ”）による排除を回避するように修飾することもできる。そのような修飾されたリポソームは、表面上に、またはそのリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン作用阻害部分を有する。特に好ましい態様において、本発明のリポソームはオプソニン作用阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１６７】
[00207]  本発明のリポソームの調製における使用のためのオプソニン作用阻害部分は、典型的にはリポソーム膜に結合した大型の親水性ポリマーである。本明細書で用いられる際、オプソニン作用阻害部分は、それが例えば脂溶性アンカーの膜自体中へのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基に直接結合することによりその膜に化学的または物理的に付着している場合、リポソーム膜に“結合している”。これらのオプソニン作用阻害性の親水性ポリマーは、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取込みを著しく減少させる防御表面層を形成し；これは例えば米国特許第４，９２０，０１６号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１６８】
[00208]  リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは約５００から約４０，０００ダルトンまで、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンまでの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそれらの誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧ、およびＰＥＧステアレートまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；線状、分枝状またはデンドリマー状のポリアミドアミン類；ポリアクリル酸類；カルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結されたポリアルコール類、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド類、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧ、またはそれらの誘導体のコポリマーも適切である。加えて、そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかのブロックコポリマーであることができる。そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖類であることもでき、それは例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化された多糖類もしくはオリゴ糖（線状または分枝状）；またはカルボキシル化された多糖類もしくはオリゴ糖類、例えばカルボン酸の誘導体と反応して結果としてもたらされたカルボキシル基の連結を有する多糖類もしくはオリゴ糖類である。好ましくは、そのオプソニン作用阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは時々“ＰＥＧ化リポソーム”と呼ばれる。
【０１６９】
[00209]  そのオプソニン作用阻害部分は、数多くの周知の技法のいずれか１つによりリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーと結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比率でのテトラヒドロフランおよび水を６０℃で用いる還元的アミノ化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用いて誘導体化することができる。
【０１７０】
[00210]  オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは未修飾のリポソームよりもはるかに長く循環中に留まる。この理由のため、そのようなリポソームは時々“ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）”リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは多孔性または“漏出性”微小血管系により養われる（ｆｅｄ）組織中に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管系の障害を特徴とする組織、例えば固形腫瘍（例えば卵巣がん）は、これらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53を参照。加えて、ＲＥＳによる取込みの低減は、リポソームの肝臓および脾臓における著しい蓄積を予防することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１７１】
[00211]  そのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物は、それらを対象に投与する前に、当技術で既知の技法に従って医薬組成物（時々“医薬品”と呼ばれる）として配合することができる。従って、本発明は卵巣がんを処置するための医薬組成物を含む。１態様において、その医薬組成物は、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、または単離されたその変異体もしくは生物学的に活性な断片、および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む。特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、卵巣がん細胞において適切な対照細胞と比較して低下した発現のレベルを有するｍｉＲ遺伝子産物に対応する。
【０１７２】
[00212]  説明
[00213]  検出および細胞傷害性療法における進歩にも関わらず、進行期の疾患を有する患者の非常に低い割合しか初診の５年後に生存していない。この疾患の高い死亡率は主に利用可能な療法への抵抗性によるものである。
【０１７３】
[00214]  主に遅い診断および化学療法への低い応答による卵巣新生物の悪い予後を考慮して、本発明者らはここで療法応答の予測マーカーおよび処置への感受性を増大させるための新規の分子標的（単数または複数）を同定してきた。
【０１７４】
[00215]  本明細書において、従来の化学療法に応答するであろう患者および抗血管新生化合物の追加から有効に利益を得るであろう患者を同定し、それによりその療法のコストも低減し、その薬物の有効性も向上させるために有用であるｍｉＲの分子シグネチャーを記述する。
【０１７５】
[00216]  さらに、そのデータは、抗ＶＥＧＦＡ抗体単独の使用によるＶＥＧＦの遮断は、ＶＥＧＦＢシグナル伝達も遮断しない限り、卵巣がん患者において有用ではないことを実証している。あるいは、小さい化合物、例えばＶＥＧＦＲ１および２受容体を標的とする官能化された（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ナノ粒子をこの患者において有効な療法として用いて、卵巣がんの予後および処置の過程を変化させることができる。
【０１７６】
[00217]
【実施例】
【０１７７】
[00218]  本発明の特定の態様が本明細書中の実施例において定義されている。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、説明としてのみ与えられていることは理解されるべきである。上記の論考およびこれらの実施例から、当業者はこの発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更および修正を行ってそれを様々な用途および状況に適応させることができる。
【０１７８】
[00219]  実施例１．
[00220]  方法
[00221]  施設内審査委員会がその試験を承認し、全ての患者が彼らのインフォームドコンセントを与えた後、本発明者らは卵巣の浸潤性漿液性癌の１９８個の標本を得た。臨床転帰に関するデータを患者の記録から得た。初期の化学療法への応答を、ＲＥＣＩＳＴガイドラインに従って、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）および進行性疾患（ＰＤ）として分類した。
【０１７９】
[00222]  ｍｉＲ発現プロファイリングおよびデータの検証
[00223]  ｍｉＲ発現プロファイリングを、トレーニングセット（８６個の試料）において、合計６７６の独特のアッセイを含有するＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｒｒａｙ  ＨｕｍａｎマイクロＲＮＡセットｖ２．０，を用いて実施した。差次的に発現されたｍｉＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイを用いて検証セット（１１２個の試料）において検証した。
【０１８０】
[00224]  統計分析
[00225]  ＴａｑＭａｎ低密度アレイカード（ＴＬＤＡ）およびＲＴ−ＰＣＲデータを、遺伝子発現の相対的定量化のための比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）法を用いて、Ｄａｔａ  Ａｓｓｉｓｔ  ｖｅｒ．１．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティ）上で分析した。それぞれの試料に関して平均ｍｉＲＮＡ発現値を３５より小さいＣｔ値の平均として計算した。試料を最初の化学療法または他の臨床パラメーターに対する彼らの応答のどちらかに基づいて分類した。Ｒソフトウェアを用いて一元配置ａｎｏｖａ検定を適用して差次的に発現したｍｉＲＮＡを同定した。全体中央値正規化（Ｇｌｏｂａｌ  ｍｅｄｉａｎ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）をＴＬＤＡカードの発現分析に関して用いた。トレーニングセット中の最も不変のｍｉＲＮＡの中の２つであるｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−１９１を、検証セットにおけるＲＴ−ＰＣＲの正規化に関する内在性対照として用いた。全てのデータを平均±ＳＥＭとして表した。非応答者対応答者（対照）の間の統計的有意差を、独立スチューデント両側ｔ検定を用いることにより決定した。０．０５未満のＰの値を統計的有意とみなした。図形出力に関して重心分析をＪａｖａ  ＴｒｅｅＶｉｅｗと組み合わせたＣｌｕｓｔｅｒを用いて実施した。
【０１８１】
[00226]  ｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−２９６を発現する卵巣癌細胞株の作製
[00227]  ｍｉＲ−４８４を発現するレンチウイルスを、トランスフェクションおよび形質導入に関して陽性の細胞の簡単な同定および監視のための特異的なｍｉＲおよびｃｏｐＥＧＦＴ蛍光マーカーの二重発現を含有するＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ，米国）ｍｉＲ前駆体コンストラクトを用いて、２９３ＦＴ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において生成した。
【０１８２】
[00228]  卵巣癌細胞株の増殖およびカルボプラチン＋Ｔａｘｏｌ処置に対する感受性のインビボ分析
[00229]  ２つのアプローチを用いて、ｍｉＲ−４８４発現のインビボ化学療法感受性への作用を評価した：１）ＭＤＡＨ−２７７４細胞スクランブルｍｉＲ（右側腹部）またはｍｉＲ−４８４（左側腹部）、およびＳＫＯＶ−３スクランブルｍｉＲ（右側腹部）またはｍｉＲ−４８４（左側腹部）を注射し、週２回３週間のカルボプラチン（１５ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔａｘｏｌ（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で処置した。腫瘍成長を、カリパス測定により、および／またはＩｖｉｓ  Ｌｕｍｉｎａ，Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓを用いたＧＦＰ可視化により追跡した。２）カルボプラチン（１５ｍｇ／ｋｇ）＋ｔａｘｏｌ（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内処置を伴う、スクランブルｍｉＲ（右側腹部）またはｍｉＲ４８４（左側腹部）を発現するレンチウイルスの直接腫瘍内送達。
【０１８３】
[00230]  ＲＮＡ抽出手順。
【０１８４】
[00231]  低密度アレイ分析のための総ＲＮＡを、パラフィン包理された組織（ＦＦＰＥ）からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ドイツ、マンハイム）を製造業者のプロトコルに従って用いて単離した。抽出後、総ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，米国）を用いて定量化した。
【０１８５】
[00232]  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイヒトマイクロＲＮＡセットカードｖ２．０を用いたマイクロＲＮＡ発現プロファイリング。
【０１８６】
[00233]  ｍｉＲ発現プロファイリングをＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイヒトマイクロＲＮＡセットｖ２．０（ヒトのマイクロＲＮＡに特異的な６７６の独特のアッセイを含有する予め構成された２つのマイクロ流体カードセットＡおよびＢ）を用いてトレーニングセットにおいて実施した。加えて、それぞれのアレイは４つの対照アッセイを含有しており、３つは選択された候補内在性対照アッセイであり、１つは陰性対照アッセイであった。このアレイセットはマイクロＲＮＡの逆転写のためにＭｅｇａｐｌｅｘ（商標）ＲＴプライマー、ヒトプールセットｖ２．０の使用を必要とした。全ての試料の濃度を下限の試料に合わせた（１５ｎｇ／ｕｌ）。感度を増大させるため、リアルタイムＰＣＲの前にＭｅｇａｐｌｅｘ（商標）ＰｒｅＡｍｐプライマー、ヒトプールセットｖ２．０を用いた任意の前増幅工程が含まれた。
【０１８７】
[00234]  ｍｉＲの逆転写。
【０１８８】
[00235]  ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ合成のため、ＲＮＡを、６７６種類のｍｉＲＮＡおよび内在性対照の同時逆転写を可能にするＴａｑＭａｎアレイヒトＡおよびＢカードのためのステムループＭｅｇａｐｌｅｘ（商標）プライマープール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせたｍｉＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。簡潔には、それぞれのカードＡおよびＢに関して別々に、７．５μｌの総反応体積中で３ｕｌの総ＲＮＡ（４５ｎｇ／ｕｌ）にＭｅｇａｐｌｅｘ  ＲＴプライマー（１０×）、ｄＮＴＰ（１００ｍＭ）、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（５０Ｕ／μｌ）、ＲＴ緩衝液（１０×）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（２０Ｕ／ｕｌ）を補った。氷上で５分間インキュベートした後、次のＲＴプロトコルを用いた：１６Ｃで２分間、４２Ｃで１分間および５０Ｃで１秒間を４０サイクル、続いて最後の８５Ｃで５分間の逆転写酵素の不活性化。
【０１８９】
[00236]  ｃＤＮＡの前増幅
[00237]  それぞれのカードＡおよびＢに関して、Ｍｅｇａｐｌｅｘ  ＲＴ産物（２．５μｌ）をＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐマスター混合物（１０×）およびＭｅｇａｐｌｅｘ  ＰｒｅＡｍｐプライマー（１０×）を２５μｌのＰｒｅＡｍｐ反応において用いて前増幅した。その前増幅サイクル条件は以下の通りであった：９５Ｃで１０分間、５５Ｃで２分間および７２Ｃで２分間、続いて９５Ｃで１５秒間および６０Ｃで４分間を１２サイクル。
【０１９０】
[00238]  リアルタイムｑＰＣＲ。
【０１９１】
[00239]  それぞれのカードＡおよびＢに関して、２５ｕｌのＰｒｅＡｍｐ反応物を７５μｌの０．１×ＴＥ  ｐＨ８．０で希釈した。ＰＣＲ増幅反応をそれぞれのカードに関して４５０μｌのＴａｑｍａｎ  ２×ユニバーサルＰＣＲマスター混合物、ｗ／ｏ  ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、４４１のヌクレアーゼを含まない水、および９μｌの希釈したＰｒｅＡｍｐ産物を含有する９００μｌの総体積で調製した。そのＰＣＲ反応混合物の１００μｌをカードＡおよびＢのそれぞれの出入口（ｐｏｒｔ）の中にそれぞれ装填した。カードＡおよびＢを特別なバケット中で遠心分離した。２回の１２００ｒｐｍで１分間の遠心分離を実施した。アレイＡおよびＢを密封し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に別々に装填した。サイクル条件は以下の通りであった：５０Ｃで２分間、９４．５Ｃで１０分間、続いて９７Ｃで３０秒間および５９．７Ｃで１分間を４０サイクル。全てのＰＣＲ反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実施された。生のＣｔ値を、ＳＤＳソフトウェアｖ２．１を用いて、自動ベースライン設定および０．２の閾値を用いて計算した。
【０１９２】
[00240]  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アレイヒトマイクロＲＮＡセットカードｖ２．０のデータの検証。
【０１９３】
[00241]  差次的に発現されたｍｉＲを、検証セットにおいてＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡアッセイを用いて検証した。単一チューブＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡアッセイを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲ機器上で成熟マイクロＲＮＡを検出および定量化した。全ての試薬、プライマーおよびプローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）から得た。正規化はＲＮＵ４４およびＲＮＵ４８を用いて実施された。逆転写反応およびリアルタイムＰＣＲは製造業者に従って実施された。鋳型なしの対照およびＲＴを除いた対照を含め、全てのＲＴ反応をＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ９７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った。遺伝子発現レベルをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量化した。比較リアルタイムＰＣＲは鋳型なしの対照を含めて３通り（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で実施された。相対発現を比較Ｃｔ法を用いて計算した。
【０１９４】
[00242]  細胞中およびＣＭ中の成熟ｍｉＲＮＡに関するリアルタイムＰＣＲ。
【０１９５】
[00243]  総ＲＮＡを細胞からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、およびＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、液体試料に関する製造業者の説明書に従って単離した。成熟ｍｉＲを単一チューブＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡアッセイにより評価した。ｍｉＲ発現を細胞中でＲＮＵ４４およびＲＮＵ４８に対して正規化した。鋳型なしの対照およびＲＴを除いた対照を含め、全ての逆転写酵素（ＲＴ）反応をＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ９６００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った。
【０１９６】
[00244]  それぞれの試料を、別途明記しない限り３通りで試験した。培地試料からのマイクロＲＮＡを単離した。ＤＮＡ分解酵素処理（Ａｍｂｉｏｎ）後、ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。血清試料において、示したようにＵ６ｓｎＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して正規化した。Ｕ６は不定であるため、標的ｍｉＲＮＡの発現レベルは総ＲＮＡに対して直接正規化された（本発明者らは前もって非条件培地中にｍｉＲ−２９６−５ｐおよびｍｉＲ−４８４が存在しないことを試験した）。
【０１９７】
[00245]  ｍｉＲＮＡ過剰発現およびウェスタンブロット。
【０１９８】
[00246]  ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４８４の過剰発現のため、１００ｎＭのプレ−ｍｉＲ−２９６、プレ−ｍｉＲ−４８４およびプレ−陰性対照−２（Ａｍｂｉｏｎ）をＨＥＫ２９３およびＨＵＶＥ細胞中にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した。２４時間後、細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。全細胞溶解物のタンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質アッセイ色素試薬濃縮液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定し、３５μｇの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分解し、ニトロセルロースに転写した後、ＥＣＬ検出試薬（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた可視化を行った。以下の一次抗体を用いた：マウスモノクローナル抗Ｈｇｓ（１：１０００，Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ウサギポリクローナル抗ＶＥＧＦ受容体２（１：１０００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ−Ｂ（１：２００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスモノクローナル抗ａ−チューブリン（１：２０００，Ｓｉｇｍａ）。
【０１９９】
[00247]  ルシフェラーゼｍｉＲＮＡ標的レポーターアッセイ。
【０２００】
[00248]  ヒトＨＧＳおよびＶＥＧＦＢ遺伝子の３’ＵＴＲを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し：
ＨＧＳ  Ｆｗ  ５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および
ＨＧＳ  Ｒｗ  ５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  Ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；
ＶＥＧＦＢ  Ｆｗ  ５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および
ＶＥＧＦＢ  Ｒｗ  ５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
[00249]  ｐＧＬ３  ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にホタルルシフェラーゼの停止コドンからすぐ下流のＸｂａ１部位を用いることにより挿入し、ｐ３’ＵＴＲ−ＨＧＳおよびｐ３’ＵＴＲ−ＶＥＧＦＢプラスミドが得られた。これらのコンストラクトを用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてｐ３’−ＵＴＲｍｕｔ−ＨＧＳプライマー：
Ｆｗ：５’−ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；
Ｒｗ：５’−ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、および
ｐ３’−ＵＴＲｍｕｔ−ＶＥＧＦＢプラスミドプライマー：
Ｆｗ：５’−ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  Ｃ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
Ｒｗ：５’−ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  Ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
を作製した。
【０２０１】
[00250]  ＨＥＫ２９３細胞に１μｇのｐ３’ＵＴＲ−ＨＧＳ、またはｐ３’ＵＴＲ−ＶＥＧＦＢおよびｐ３’ＵＴＲｍｕｔ−ＨＧＳ、またはｐ３’ＵＴＲｍｕｔ−ＶＥＧＦＢプラスミド、ならびに０．１μｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現コンストラクトｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１００ｎＭのｍｉＲＮＡまたは対照の前駆体を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることにより同時導入した。細胞をトランスフェクションの２４時間後に回収し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って用いてアッセイした。３つの独立した実験を３回ずつ実施した。
【０２０２】
[00251]  免疫組織化学および血管密度の評価。
【０２０３】
[00252]  腫瘍切片（２μｍ厚）を切り、ホルマリン固定されパラフィン包理された試料に関して段階的なアルコール類により脱パラフィンを達成した。ＣＤ３４に対する一次抗体を製造業者の説明書に従って適用した。血管密度（ＣＤ３４＋）をＣｈａｌｋｌｅｙアイピース法を用いて評価した。腫瘍切片全体を２人の観察者がカンファレンス（ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）顕微鏡下で低倍率で走査した。最も高い血管密度を有する３個の領域（血管ホットスポット）を同定した。高倍率（×４００）で２５点Ｃｈａｌｋｌｅｙアイピース直交線網をそれぞれのホットスポットに適用し、最大数の点が血管上または血管内に当たることを可能にするように方向付けた。その３つの計数の平均値はその腫瘍の血管密度を表す。
【０２０４】
[00253]  ｍｉＲ−４８４を発現する卵巣癌細胞株の作製。
【０２０５】
[00254]  ｍｉＲ−４８４を発現するレンチウイルスを２９３ＦＴ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてリン酸カルシウムによるトランスフェクションにより産生させた。この目的のため、トランスフェクションおよび形質導入に関して陽性の細胞の簡単な同定および監視のための特異的なｍｉＲおよびｃｏｐＧＦＰ蛍光マーカーの二重発現を含有するＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ，米国）ｍｉＲ前駆体コンストラクトを用いた。ウイルスを含有する条件培地をトランスフェクションの７２時間後に回収し、それを用いて上皮性卵巣がん細胞株（ＥＯＣ）に形質導入した。特に、ＳＫＯＶ−３およびＭＤＡＨ−２７７４にＧＦＰ単独を発現するウイルス（以下空ベクターと呼ぶ）またはＧＦＰおよびｍｉＲ−４８４の前駆体を発現するウイルスのどちらかを用いて形質導入し、次いでそれらの蛍光発現に関して監視した。
【０２０６】
[00255]  ｍｉＲ−４８４を発現する卵巣癌細胞株のカルボプラチン＋Ｔａｘｏｌ処理に対するインビトロでの感受性。
【０２０７】
[00256]  ＥＯＣ細胞株のＩＣ５０を決定するため、ＭＤＡＨ  ２７７４、ＳＫＯＶ−３、ＴＯＶ２１Ｇ、ＴＯＶ１１２Ｄ、ＯＶＣＡＲ８およびＩＧＲＯＶを９６ウェルプレートに（６通りで）１０００細胞／ウェルの密度で蒔き、２４時間後に増大する用量のカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）（１から１５０ｍｇ／ｍｌまでの範囲）またはｔａｘｏｌ（ＴＡＸ）（１から２００ｎＭまでの範囲）で無血清培地中で６時間処理した。薬物を除去した後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、血清の存在下でさらに４日間インキュベートした。細胞生存度をＭＴＳアッセイ（ＳＩＧＭＡ）を製造業者の説明書に従って用いて評価した。報告されたＩＣ５０値は少なくとも３つの独立した実験の平均を表す。ｍｉＲ−４８４のインビトロでの薬物感受性への作用の評価のため、親、スクランブル、およびｍｉＲ−４８４発現細胞を９６ウェルプレートに蒔き（１０００細胞／ウェル）、示した用量のＣＢＤＣＡおよびＴＡＸで処理した。生存度を４日後に上記で記述したように評価した。
【０２０８】
[00257]  ｍｉＲ−４８４を発現する卵巣癌細胞株から回収した条件培地を用いて刺激したＨＵＶＥＣ細胞における管形成アッセイ。
【０２０９】
[00258]  ４８ウェルプレートからのウェルに１２５ｍｌのｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ、成長因子非低減、８〜１０ｕｇ／ｕｌ）を満たし、３７℃で１時間凝固させた。ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ、１×１０５個）を２００ｍｌの培地中で再懸濁し、次いでｍａｔｒｉｇｅｌ層上に層にし、管様構造の形成に関して時間にわたって監視した。タイムラプスビデオ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いてこのプロセスの動画を作成し、２０時間に至るまでの間５分ごとに画像を収集した。内皮細胞を再懸濁するために用いた培地は、１−内皮細胞に関する完全培地、陽性対照として使用、２−血清低減培地（２％）、陰性対照として使用、３−スクランブルｍｉＲまたはｍｉＲ−４８４を用いて形質導入したＳＫＯＶ−７またはＭＤＡＨ−２７７４からの条件培地（＋２％血清）であった。
【０２１０】
[00259]  ｍｉＲ−４８４を発現する卵巣癌細胞株の増殖およびカルボプラチン＋Ｔａｘｏｌ処理に対する感受性のインビボ分析。
【０２１１】
[00260]  無胸腺雌ヌードマウス（８匹／群）に、１００ｕｌの１．５×１０６個のＭＤＡＨ−２７７４細胞スクランブルｍｉＲ（右側腹部）またはｍｉＲ−４８４（左側腹部）を含有するＰＢＳを、両方の背面側腹部上に皮下注射した。
【０２１２】
[00261]  ２．２×１０６個の細胞を注射したことを除いて、同じ処置をＳＫＯＶ−３を用いて実施した。腫瘍塊が目に見えるようになったら、ＣＢＤＣＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）およびＴａｘ（５ｍｇ／ｋｇ）による処置を開始した。薬物は２００ｕｌのＰＢＳ中で希釈されて送達され、週２回４週間腹腔内注射された。腫瘍塊をカリパスを用いて週２回４週間測定した。さらに、利用した卵巣がん細胞によるＧＦＰ蛍光マーカーの発現を利用して、マウスを麻酔し、腫瘍塊をＩｖｉｓ  Ｌｕｍｉｎａ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓにより週１回４週間画像化した。次いでマウスを屠殺し、腫瘍塊を切り取り、さらなる分析のためにＯＣＴ中に入れた。
【０２１３】
[00262]  結果
[00263]  化学療法抵抗性に関連する漿液性卵巣癌におけるｍｉＲ発現。
【０２１４】
[00264]  ｍｉＲが漿液性卵巣癌（ＥＯＣ）の化学療法抵抗性を予測するために有用であるかどうかを決定するため、６７６種類のｍｉＲの発現を分析した。図１Ａにおいて示したように、４つの異なる群の間を識別することができる２３種類の差次的に発現したｍｉＲを有する応答シグネチャーを同定した。重心のクラスター分析（図１Ｂ）は、ＥＯＣ試料を一方の側において２つの主なクラス：完全および部分的応答者（さらに応答者と呼ばれる）に分類し、他方の側において安定および進行性疾患（非応答者と呼ばれる）に分類することができることを示している。これらの２つのクラスは、応答シグネチャーをさらに精密にし、１２種類のｍｉＲＮＡを定めるために有用である（図１Ｃ）。また、第２患者コホートからの１１２個のＥＯＣ試料を用いて応答ｍｉＲＮＡを検証した（図１Ｄ）。最初に同定された１２種類のｍｉＲの内で、３種類のｍｉＲは非応答者の腫瘍において下方制御されていることが示された：ｍｉＲ−４８４（ｐ値＝０．０００７）、ｍｉＲ−６４２（ｐ値＝０．０４１）およびｍｉＲ−２１７（ｐ値＝０．０４６）。
【０２１５】
[00265]  ｍｉＲ−４８４発現はカルボプラチンおよびＴａｘｏｌに対するインビトロ感受性を変化させない。
【０２１６】
[00266]  ｍｉＲ−４８４の発現レベルを６種類の異なる上皮性卵巣癌細胞株において評価した（図６Ａ〜６Ｂ）。濃度を増大させたカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）およびＴａｘｏｌ（Ｔａｘ）で細胞を２〜４時間処理したにも関わらず、それらのＩＣ５０は、４日後にＭＴＳアッセイにより評価した際に、ｍｉＲ−４８４の内在性レベルと関連していなかった。さらに、ＭＤＡＨ−２２７４およびＳＫ−ＯＶ３細胞株両方におけるｍｉＲ−４８４の過剰発現はＣＢＤＣＡおよびＴａｘに対するそれらのインビトロでの感受性に有意に影響を及ぼさなかった（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【０２１７】
[00267]  化学療法抵抗性の獲得におけるｍｉＲ−４８４の役割。
【０２１８】
[00268]  ４８４のレベルは細胞株の間で非常に類似していたため、対照ｍｉＲ（スクランブル）またはｍｉＲ−４８４のどちらかを過剰発現するＭＤＡＨ−２７７４およびＳＫ−ＯＶ３細胞は、インビボで非応答者の表現型を再現し、ｍｉＲが卵巣がんの化学療法抵抗性に状況依存性の様式で影響を及ぼすかどうかを決定するために行った。ＥＧＦＰタンパク質もコードしているレンチウイルスベクターをインビボでの腫瘍増殖を追跡するために用いた。細胞（１．５×１０６個）をヌードマウスに左側腹部（ｍｉＲ−４８４−ＭＤＡＨ−２７７４）および右側腹部（ＥＧＦＰ−ＭＤＡＨ−２７７４）中に皮下に接種し、１５日間増殖させた。この時点で、６匹／８匹のマウスにおいて、ｍｉＲ−４８４発現細胞により形成された腫瘍体積は対照のＥＧＦＰ発現細胞において観察された腫瘍体積より大きく、これは原発腫瘍の成長はｍｉＲの発現により影響を受けなかったことを実証している（図２Ａ）。
【０２１９】
[00269]  ＣＢＤＣＡおよびＴａｘ処置の後、１匹のマウスは応答せず、試験から除外された。他の７匹のマウスの分析は、対照の腫瘍は処置の終了時にそれらの大きさを０日目に関して約６倍（２．３〜１７．７の範囲）に増大させたことを実証した。同じマウスにおいて、ｍｉＲ−４８４を発現する腫瘍は１．３倍（０．８〜１．８の範囲）しか増大させず、これは対照よりもその薬物にはるかに大きく感受性であることを実証している（図２Ａ）。
【０２２０】
[00270]  ＥＧＦＰ蛍光を検出することができるインビボ画像化系を用いて、ＳＫ−ＯＶ３細胞の分析はｍｉＲ−４８４は原発腫瘍の成長に影響を及ぼさないが処置に対する感受性を有意に増大させることを確証した（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【０２２１】
[00271]  ヌードマウス中でＳＫＯＶ−３細胞よりも急速に増殖するＭＤＡＨ−２７７４細胞を用いて、そのｍｉＲのインビボ投与がＥＯＣのＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘ処置に対する感受性を変化させることができるかどうか調べた。親ＭＤＡＨ−２７７４細胞をヌードマウスの側腹部中で２週間増殖させ、次いで右側腹部においてＥＧＦＰ−対照ｍｉＲを発現するレンチウイルスを、左側腹部においてＥＧＦＰ−ｍｉＲ−４８４を発現するレンチウイルスを注射した。２日後、マウスをＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘで隔週で３週間処置し、ウイルスの腫瘍内注射を１週間後に繰り返した。２１日後に腫瘍成長を評価した。驚くほどに、６例／６例においてｍｉＦ−４８４は薬物感受性を増大させ、これはその発現がインビボで上皮性卵巣がんにおいてＣＢＤＣＡおよびＴａｘに対する耐性を調節することができることを実証している（図２Ａ〜２Ｄ）。
【０２２２】
[00272]  ｍｉＲ−４８４は血管新生因子の発現を制御する。
【０２２３】
[00273]  ｍｉＲ−４８４は血管新生因子の制御に関わっている。ｍｉＲ−４８４は、内皮細胞の増殖および移動を直接刺激することができる血管内皮成長因子Ｂ（ＶＥＧＦＢ）、ならびに正常および病的な血管内皮細胞生物学の全ての側面に関わっていることが示されている血管内皮成長因子２（ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ）を標的とする。ルシフェラーゼおよびウェスタンブロット分析は、ｍｉＲ−４８４がＶＥＧＦＢおよびＶＥＧＦＲ２の内在性レベルを調節することを確証した（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０２２４】
[00274]  血管密度を抗ＣＤ３４抗体を用いて３０症例のヒト漿液性卵巣癌（１５人の応答者／１５人の非応答者）および２８症例のマウス異種移植片腫瘍［Ｓｋ−ｏｖ３からの１４およびＭＤＡＨ−２７７４からの１４（ｍｉＲ−４８４を導入された７およびＧＦＰを導入された７）］において抗ＣＤ３４抗体を用いてアッセイし、Ｃｈａｌｋｌｅｙアイピース法により評価した。ヒトの腫瘍において、平均微小血管密度は応答者に関して３０±１．１７（９〜５４の範囲）および非応答者に関して６８±１．６（１５〜１１４の範囲）であり（Ｐ＝０．００００００２）、マウスにおいてそれはＳＫ−ＯＶ３−ｍｉＲ  ４８４に関して９±５．５（１〜１８の範囲）、ＳＫ−ＯＶ３−ＥＧＦＰに関して２３±１２（５〜３７の範囲）（Ｐ＝０．０００４）、およびＭＤＡＨ−２７７４−ｍｉＲ  ４８４に関して１０±６．２（４〜２２の範囲）、ＭＤＡＨ−２７７４−ＥＧＦＰに関して１７±８．９（５〜２８の範囲）（Ｐ＝０．０００９）であった（図４Ａ〜４Ｃ）。
【０２２５】
[00275]  スピアマン順位相関検定は血管数およびｍｉＲ発現の間の強い関係を示し（ｒ＝−０．８、ｐ＝１．５６Ｅ−０７）、これはこれらの腫瘍の感受性はｍｉＲ制御により駆動されるそれらの微小血管資産（ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ  ａｓｓｅｔ）によるものであることを示している（図４Ｄ）。
【０２２６】
[00276]  ｍｉｒ−４８４に媒介される血管資産の調節を確証するため、ｍｉＲ−４８４またはｓｃｒベクターを安定導入されたＭＤＡＨ−２７７４またはＳＫ−ＯＶ３細胞株をＶＥＧＦＢ発現に関してウェスタンブロットにより分析した。ＨＵＶＥＣ細胞をそのトランスフェクションされた細胞から得られた条件培地（ＣＭ）中で培養した。ビデオタイムラプス顕微鏡は、ｓｃｒ−ＭＤＡＨ−２７７４またはＳＫ−ＯＶ３細胞からのＣＭはＨＵＶＥＣ細胞を３Ｄ  ｍａｔｒｉｇｅｌ上で６時間培養した際に管様構造の形成を誘導することができることを実証した。この作用は、ｍｉＲ−４８４を過剰発現するＭＤＡＨ−２７７４またはＳＫ−ＯＶ３からのＣＭを用いた場合弱められ、細胞をＣＭの存在下で２０時間培養した場合消失した（図７）。
【０２２７】
[00277]  全体として、これらのデータはＥＯＣ細胞におけるｍｉＲ−４８４の発現は内皮細胞の管様構造を形成してその構造を維持する能力に影響を及ぼすことができることを確証している。理論により束縛されることを望むわけではないが、本発明者らは、本明細書においてここで、ＶＥＧＦＢのｍｉＲ−４８４制御は新生物細胞において可能であるが、ＶＥＧＦＲ２を制御するため、そのｍｉＲは腫瘍関連内皮細胞に対して直接その作用を発揮しなければならないと信じている。
【０２２８】
[00278]  ＥＯＣにより産生されるｍｉＲ−４８４が局所的微小環境中に放出され、次いで内皮細胞に入り、そこでそれがその標的に到達し得るのかどうかを決定するため、ＨＵＶＥＣおよびｍｉＲ−４８４−ＥＧＦＰまたはスクランブルｍｉＲ−ＥＧＦＰを過剰発現する卵巣がん細胞由来細胞株を共培養した。ｍｉＲ−４８４−ＥＧＦＰのＭＤＡＨ−２７７４およびＳＫ−ＯＶ３における安定導入は、結果としてその発現の対照と比較した少なくとも２倍の増大をもたらした（図５Ａ）。
【０２２９】
[00279]  ｍｉＲ−４８４は安定導入された卵巣がん細胞由来細胞株のＣＭ中で増大した（図５Ｂ）。ｍｉＲ−４８４のレベルは、ｍｉＲ−４８４を過剰発現する細胞株の存在下で培養されたＨＵＶＥＣ細胞において、対照に関して０．２から５倍まで増大した（図５Ｃ）。そのデータは、その共培養実験は癌細胞をウェル上に、ＨＵＶＥＣをトランスウェル上に蒔くことにより行われたため（または逆もまた同様であり、有意な差はない）、卵巣がん由来細胞株およびＨＵＶＥＣ細胞の間の直接的な接触は必要ではないことを実証している。まとめると、これらのデータはｍｉＲ−４８４が新生物細胞により局所的微小環境中で分泌され、そして２４時間以内にＨＵＶＥＣ細胞に入ることを実証している（図５Ｄ）。
【０２３０】
[00280]  さらに、ＨＵＶＥＣを対照およびｍｉＲ−４８４を過剰発現するＳＫ−ＯＶ３細胞と共に２４時間共培養した際、後者のみが内皮細胞上のＶＥＧＦＲ２の発現を有意に減少させることができた（図５Ｅ）。
【０２３１】
[0001]  ｍｉＲ−４８４を過剰発現する卵巣がん細胞は、インビトロでの内皮細胞の再編成およびマウスにおける血管新生を刺激する能力がより低い。ＶＥＧＦＲ１および２のシグナル伝達の間の協調は、卵巣がんの増殖および薬物感受性に必要である。
【０２３２】
[00281]  実施例２．
[00282]  応答性対不応性卵巣癌におけるｍｉＲ発現シグネチャー。
【０２３３】
[00283]  ｍｉＲが卵巣癌の化学療法抵抗性を予測するかどうかを調べるため、トレーニングセット中の６７６種類のｍｉＲの発現を分析した。カードＡ中の３８１種類の標的ｍｉＲおよびカードＢ中の２９５種類の標的ｍｉＲの内で、それぞれ３６４種類（９６％）および２４０種類（８１％）がその試料の少なくとも１つにおいて増幅された。カードＡからの１７種類およびカードＢからの５５種類のみが全ての試料にわたって未決定であった（Ｃｔ＝４０）。図９において示されるように、Ｒ漿液性癌をＮＲ漿液性癌から識別することができる１６種類の差次的に発現しているｍｉＲが同定された。手術の結果および／または腫瘍悪性度に関して統計的に有意であるｍｉＲは見付からなかった（データは示していない）。次いで差次的に発現したｍｉＲを検証セットにおいて検証した。最初に同定された１６種類のｍｉＲの内で、３種類のｍｉＲが２つの群において差次的に発現しており、２種類はＲ腫瘍において下方制御されており（ｍｉＲ−２９６−５ｐおよびｍｉＲ−５１８ｅ）、１種類は上方制御されていた（ｍｉＲ−４８４）（図９）。これらの３種類のｍｉＲは、その２つの群を識別することができ、かつ識別するために十分である。
【０２３４】
[00284]  ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４８４の発現はＣＢＤＣＡおよびＴａｘに対するインビトロでの感受性を変化させない。
【０２３５】
[00285]  薬物耐性の発現におけるｍｉＲの役割を決定するため、ｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−２９６の発現レベルを６種類の異なる上皮性卵巣癌細胞株（ＥＯＣ）において評価した。ｍｉＲ−４８４は全ての細胞株において容易に検出可能であったが、ｍｉＲ−２９６はＭＤＡＨ−２７７４およびＴＯＶ−１１２Ｄにおいてほとんど発現していなかった。細胞を増大する濃度のＣＢＤＣＡおよびＴａｘにより２または４時間処理したにも関わらず、それらのＩＣ５０は４日後にＭＴＳアッセイにより評価した際に内因性のｍｉＲ−４８４または２９６のレベルと関連していなかった。さらに、ＭＤＡＨ−２７７４およびＳＫＯＶ−３細胞株両方におけるｍｉＲ−４８４および２９６の過剰発現は、それらのＣＢＤＣＡおよびＴａｘに対するインビトロでの感受性に有意に影響を及ぼさなかった。
【０２３６】
[00286]  化学療法抵抗性の獲得におけるｍｉＲ−４８４の役割。
【０２３７】
[00287]  ｍｉＲ−２９６はＥＯＣにおいて非常に低いレベルで発現しており、ｍｉＲ−４８４のレベルは細胞株の間で非常に類似していたため、対照ｍｉＲ（スクランブル）またはｍｉＲ−４８４のどちらかを過剰発現するＭＤＡＨ−２７７４およびＳＫＯＶ−３細胞を用いてインビボでＲ表現型を再現し、ｍｉＲが卵巣がんの化学療法感受性に状況依存性の様式で影響を及ぼすかどうかを決定した。ＥＧＦＰ−タンパク質もコードしているレンチウイルスベクターをインビボでの腫瘍成長を追跡するために用いた。細胞（１．５×１０６）をヌードマウスに左側腹部（ｍｉＲ−４８４−ＭＤＡＨ−２７７４）および右側腹部（ＥＧＦＰ−ＭＤＡＨ−２７７４）中に皮下接種し、１５日間増殖させた。この時点で、６匹／８匹のマウスにおいて、ｍｉＲ−４８４を発現する細胞により形成された腫瘍の体積は対照のＥＧＦＰを発現する細胞において観察された腫瘍の体積よりも大きく、これは原発腫瘍の成長がそのｍｉＲの発現により影響を受けなかったことを実証している。
【０２３８】
[00288]  ＣＢＤＣＡおよびＴａｘ処置の後、１匹のマウスは応答せず、試験から除外された。他の７匹のマウスの分析は、対照の腫瘍は処置の終了時にそれらの大きさを０日目に関して約６倍（２．３〜１７．７の範囲）増大させたことを実証した。同じマウスにおいて、ｍｉＲ−４８４を発現する腫瘍は１．３倍（０．８〜１．８の範囲）しか増大させず、これはその薬物に対して対照よりもはるかに大きく感受性であることを実証している。ＥＧＦＰ蛍光を検出することができるインビボ画像化システムを用いて、ＳＫＯＶ−３細胞の分析は、ｍｉＲ−４８４の発現は原発腫瘍の成長に影響を及ぼさないが処置に対する感受性を有意に増大させることを確証した。
【０２３９】
[00289]  ヌードマウス中でＳＫＯＶ−３よりも急速に増殖したＭＤＡＨ−２７７４細胞を用いて、ｍｉＲのインビボ投与がＥＯＣのＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘ処置に対する感受性を変化させ得るかどうかを決定した。親ＭＤＡＨ−２７７４細胞をヌードマウスの側腹部中で２週間増殖させ、次いで右側腹部中にＥＧＦＰ対照ｍｉＲを発現するレンチウイルスを、左側腹部中にＥＧＦＰ−ｍｉＲ−４８４を発現するレンチウイルスを注射した。２日後、マウスをＣＢＤＣＡ＋Ｔａｘで隔週で３週間処置し、ウイルスの腫瘍内注射を１週間後に繰り返した。２１日後、腫瘍成長を評価した。驚くほどに、６例／６例においてｍｉｒ−４８４は薬物感受性を増大させ、これはその発現がインビボで上皮性卵巣がんにおいてＣＢＤＣＡおよびＴａｘに対する耐性を調節することができることを実証している。
【０２４０】
[00290]  ｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−２９６は血管新生因子の発現を制御している。
【０２４１】
[00291]  ｍｉＲ−４８４（およびより低い程度までｍｉＲ−２９６）はＥＯＣ細胞のインビボでの化学療法抵抗性において役割を有するが、インビトロではそうではなく、これはそれらが細胞自律的様式でではなく腫瘍の微小環境に作用することを示している。両方のｍｉＲが血管新生因子の制御に関わっている。ルシフェラーゼおよびウェスタンブロット分析は、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４８４はそれぞれＨＧＳおよびＶＥＧＦＢの内因性レベルを調節することを確証した（図１０Ｂ〜１０Ｅ）。
【０２４２】
[00292]  血管密度を、抗ＣＤ３４抗体を３０症例のヒト漿液性卵巣癌（１５Ｒ／１５ＮＲ）および２８症例のマウス異種移植片腫瘍［Ｓｋｏｖ−３から１４症例およびＭＤＡＨ−２７７４から１４症例（７症例はｍｉＲ−４８４を、７症例はＧＦＰを導入された）］に対して用いて評価し、Ｃｈａｌｋｌｅｙアイピース法により評価した。ヒトの腫瘍において、平均微小血管密度はＲに関して３０（９〜５４の範囲）およびＮＲに関して６８（１５〜１１４の範囲）（Ｐ＝０．００００００２）であり、マウスにおいてそれはＳＫＯＶ−３−ｍｉＲ  ４８４に関して９（１〜１８の範囲）、ＳＫＯＶ−３−ＥＧＦＰに関して２３（５〜３７の範囲）（ｐ＝０．０４）、およびＭＤＡＨ−２７７４−ｍｉＲ  ４８４に関して１０（４〜２２の範囲）、ＭＤＡＨ−２７７４−ＥＧＦＰに関して１７（５〜２８の範囲）（ｐ＝０．０１）であり（図１１Ａ〜１１Ｃ）、これはこれらの腫瘍の感受性がｍｉＲ制御により駆動されるそれらの微小血管資産によるものであることを実証している。ｍｉＲ−４８４に媒介される血管資産の調節を確証するため、ｍｉＲ−４８４またはｓｃｒベクターを安定導入されたＭＤＡＨ−２７７４またはＳＫＯＶ−３細胞株をＶＥＧＦＢ発現に関してウェスタンブロットにより分析し、それは下方制御されていた（データは示していない）。ＨＵＶＥＣ細胞を、トランスフェクションされた細胞から得られた条件培地（ＣＭ）中で培養した。ビデオタイムラプス顕微鏡は、ｓｃｒ−ＭＤＡＨ−２７７４またはＳＫＯＶ−３（データは示していない）細胞からのＣＭはＨＵＶＥＣ細胞を３Ｄ  ｍａｔｒｉｇｅｌ上で６時間培養した際に管様構造の形成を誘導することができることを実証した。この作用は、ｍｉＲ−４８４を過剰発現するＭＤＡＨ−２７７４またはＳＫＯＶ−３からのＣＭを用いた場合弱められ、細胞をＣＭの存在下で２０時間培養した場合消失した。全体として、これらのデータはＥＯＣ細胞におけるｍｉＲ−４８４の発現は内皮細胞の管様構造を形成してその構造を維持する能力に影響を及ぼすことができることを確証している。
【０２４３】
[00293]  ｍｉＲ−４８４はＶＥＧＦＢの発現を制御しており、結果的に腫瘍微小環境中で分泌されるリガンドの量を制御しているが、その受容体のレベルを制御しているｍｉＲ−２９６は腫瘍関連内皮細胞に対して直接その作用を発揮しなければならない。理論により束縛されることを望むわけではないが、本発明者らは、本明細書においてここで、特に薬物処置の後に、ＥＯＣ細胞により産生されるｍｉＲ−２９６が局所的微小環境中に放出され、次いで内皮細胞に入り、そこでそれはＨＧＳを標的とし、最終的にＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を調節すると信じている。確証するため、ＨＵＶＥＣおよびｍｉＲ−２９６−ＥＧＦＰまたはスクランブルｍｉＲ−ＥＧＦＰを過剰発現するＥＯＣ細胞を共培養した。ｍｉＲ−２９６−ＥＧＦＰの異なるＥＯＣ細胞における安定導入は、結果としてその発現の対照と比較した少なくとも２倍の増大をもたらした。ｍｉＲ−２９６はそのｍｉＲを過剰発現するＥＯＣ細胞のＣＭ中で見付かった。ｍｉＲ−２９６のレベルは、ｍｉＲ−２９６を過剰発現するＥＯＣ細胞の存在下で培養されたＨＵＶＥＣ細胞において、対照に関して１から１１倍まで増大した。これらのデータは、その共培養実験はＥＯＣをウェル上に、ＨＵＶＥＣをトランスウェル上に蒔くことにより行われたため（または逆もまた同様であり、有意な差はない）ＥＯＣおよびＨＵＶＥＣ細胞の間の直接的な接触は必要ではないことを実証している。まとめると、これらのデータはｍｉＲ−２９６がＥＯＣ細胞により局所的微小環境中で分泌され、そして２４時間以内にＨＵＶＥＣ細胞に入ることを実証している。さらに、ＨＵＶＥＣを対照およびｍｉＲ−２９６を過剰発現するＥＯＣ細胞と共にカバーガラス上で２４時間共培養した際、後者のみが内皮細胞上のＶＥＧＦＲ２の発現を有意に増大させることができた。これは試験した全ての細胞において一貫して再現された。
【０２４４】
[00294]  実施例３
[00295]  キット
[00296]  本明細書で記述された組成物のいずれもキット中に含まれてよい。限定的でない例において、ｍｉＲＮＡを単離する、ｍｉＲＮＡを標識する、および／またはｍｉＲＮＡ集団をアレイを用いて評価するための試薬がキット中に含まれる。そのキットにはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを作製または合成するための試薬が含まれていてよい。従って、そのキットは、適切な容器手段（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  ｍｅａｎｓ）中に、標識されたヌクレオチドまたは後で標識される未標識のヌクレオチドを組み込むことによりｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含むであろう。それには１種類以上の緩衝液、例えば反応緩衝液、標識緩衝液、洗浄緩衝液、またはハイブリダイゼーション緩衝液、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、およびｍｉＲＮＡを単離するための構成要素も含まれてよい。他のキットには、ｍｉＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素も含まれてよく、従って例えば固体支持体が含まれてよい。
【０２４５】
[00297]  アレイが含まれるあらゆるキットの態様に関して、本明細書で記述されたｍｉＲのいずれかの全部または一部と同一または相補的である配列を含有する核酸分子が存在することができる。
【０２４６】
[00298]  そのキットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥された形態のどちらかで包装されてよい。そのキットの容器装置には一般に、その中に構成要素を入れる、そして好ましくは適切に分取する（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）ことができる少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器装置が含まれるであろう。そのキット中に１種類より多くの構成要素が存在する場合（標識試薬および標識は一緒に包装されてよい）、そのキットは一般に、その中に追加の構成要素を別々に入れることができる第２、第３または他の追加の容器も含有するであろう。しかし、構成要素の様々な組み合わせが１個のバイアル中に含まれてよい。本発明のキットには典型的には、核酸を含有するための装置、および商業販売のために厳重に密閉されたあらゆる他の試薬容器も含まれるであろう。そのような容器には、その中に所望のバイアルが保持される射出成形または吹込成形されたプラスチック容器が含まれてよい。
【０２４７】
[00299]  そのキットの構成要素が１種類以上の液体溶液中で提供される場合、その液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が１つの好ましい溶液である。キット中に含まれてよい他の溶液は、ｍｉＲＮＡの混合された試料からの単離および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）に関わる溶液である。
【０２４８】
[00300]  しかし、そのキットの構成要素は乾燥粉末（単数または複数）として提供されてよい。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は適切な溶媒の添加により再構成され得る。その溶媒は別の容器装置中で提供されてもよいと予想される。そのキットには標識されたｍｉＲＮＡの単離を容易にする構成要素も含まれてよい。そのキットにはそのｍｉＲＮＡを保存もしくは維持する、またはその分解に対して保護する構成要素も含まれてよい。その構成要素はＲＮＡ分解酵素非含有であることができ、またはＲＮＡ分解酵素から保護することができる。
【０２４９】
[00301]  また、そのキットは一般に、適切な装置中で、それぞれの個々の試薬または溶液のための別個の容器を含むことができる。そのキットには、そのキットの構成要素の使用ならびにそのキット中に含まれていないあらゆる他の試薬の使用のための説明書も含まれ得る。説明書には実施することができる変更が含まれていてよい。そのような試薬は本発明のキットの態様であることが意図されている。また、そのキットは上記で確認された特定の品目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作または特性付けのために用いられるあらゆる試薬が含まれてよい。
【０２５０】
[00302]  ｍｉＲＮＡアレイの文脈で論じられたあらゆる態様は、本発明のスクリーニングまたはプロファイリングの方法またはキットにおいてより一般的に用いられてよいことも意図されている。言い換えれば、特定のアレイ中に何が含まれていてよいかを記述しているあらゆる態様は、ｍｉＲＮＡプロファイリングの状況においてより一般的に実施することができ、アレイ自体を含む必要はない。
【０２５１】
[00303]  あらゆるキット、アレイまたは他の検出技法もしくは道具、またはあらゆる方法は、これらのｍｉＲＮＡのいずれかに関するプロファイリングを含み得ることも意図されている。また、ｍｉＲＮＡアレイの文脈で論じられたあらゆる態様は本発明の方法におけるアレイ形式を用いて、または用いずに実施することができ；言い換えれば、ｍｉＲＮＡアレイ中のあらゆるｍｉＲＮＡは本発明のあらゆる方法において当業者に既知のあらゆる技法に従ってスクリーニングまたは評価することができることが意図されている。そのアレイ形式は、実施されるスクリーニングおよび診断法に必要ではない。
【０２５２】
[00304]  療法的、予後的、または診断的適用のためにｍｉＲＮＡアレイを用いるためのキットおよびそのような使用が意図されている。そのキットには、ｍｉＲＮＡアレイ、ならびにそのアレイ上のｍｉＲＮＡに関する標準的な、または正規化されたｍｉＲＮＡプロファイルに関する情報が含まれ得る。また、特定の態様において、対照ＲＮＡまたはＤＮＡがそのキット中に含まれ得る。その対照ＲＮＡは、標識および／またはアレイ分析に関する陽性対照として用いることができるｍｉＲＮＡであることができる。また、その試料は血液または組織であることができる。
【０２５３】
[00305]  １態様において、卵巣がんの特性付けのためのキットには、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７に関する少なくとも１種類の検出プローブが含まれる。特定の態様において、そのキットはオリゴヌクレオチドアレイの形態であり、またはオリゴヌクレオチドアレイを含む。
【０２５４】
[00306]  本明細書には、以下を含む、卵巣がんを診断する、および／または卵巣がんにおける化学療法抵抗性を予測するためのキットも含まれる：
ａ）ｍｉＲ−４８４の発現レベルを決定するためのヌクレオチドプライマーの対および検出試薬が含まれる、ｍｉＲ−４８４定量化キット、
ｂ）ｍｉＲ−６４２の発現レベルを決定するためのヌクレオチドプライマーの対および検出試薬が含まれる、ｍｉＲ−６４２定量化キット、
ｃ）ｍｉＲ−２１７の発現レベルを決定するためのヌクレオチドプライマーの対および検出試薬が含まれる、ｍｉＲ−２１７定量化キット、ならびに
ｄ）ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７の発現レベルを入力して卵巣がんのインビトロ診断のための方法を実施するために提供される、プログラム可能なオブジェクト。
【０２５５】
[00307]  本明細書において、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のキット中の診断用バイオマーカーとしての使用も提供する。これらの診断用バイオマーカーの発現レベルを患者からの生物学的試料において捕捉剤を用いて検出し、次いで健康な対象における同じバイオマーカーに関する参照値と比較することができる。その検出された値が比較される参照値は、その疾患に関して陽性の患者に関して確立された参照値、その疾患に関して陰性の患者に関して確立された参照値、または両方であることができる。その参照値と比較したその患者からの生物学的試料中のそのバイオマーカーの少なくとも１つ、２つ、および／または全部の発現レベルにおける変化は、その患者がその疾患に冒されているか否かを示す。
【０２５６】
[00308]  その捕捉試薬は、その診断用バイオマーカーと特異的に相互作用するあらゆる有機性もしくは無機性化学物質、生体分子、またはそのあらゆる断片、相同体、類似体、コンジュゲート、もしくは誘導体であることができる。特定の態様において、その捕捉試薬は、診断用バイオマーカーのパネル中でその診断用バイオマーカーを特異的に検出するタンパク質または抗体である。他の態様において、その捕捉剤は、バイオマーカーオリゴヌクレオチドＲＮＡまたはＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドである。さらに特定の他の態様において、その捕捉試薬は固体支持体に結合していることができる。さらに特定の態様において、その患者からの生物学的試料は組織、生物学的流体であり、それには全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、または尿が含まれるが、それらに限定されない。
【０２５７】
[00309]  また、特定の態様において、その方法はさらにその患者からの生物学的試料中の追加のバイオマーカーの発現レベルを検出する工程を含むことができる。本明細書で用いられる際、その追加のバイオマーカーには、診断パネル中の現在既知の、または後に発見される診断用バイオマーカー、および患者がその疾患を有すると診断するための検出されたこれらのバイオマーカーの発現レベルにおける参照値と比較した変化の評価が含まれるが、それらに限定されない。
【０２５８】
[00310]  特定の態様において、そのキットは以下：ａ）少なくとも１種類の診断用バイオマーカーに特異的な１種類以上の検出物質、ここでそのバイオマーカーはｍｉＲ−４８４である；ｂ）検出試薬、およびｃ）そのキットを用いて、患者の試験試料における少なくともそのｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照の対象における同じバイオマーカーの発現レベルよりも低い場合に、患者を卵巣がんを有すると診断するための説明書を含む捕捉試薬を含むことができる。
【０２５９】
[00311]  そのキットはさらに、それに対して患者からの生物学的試料を比較することができる適切な陽性および陰性対照を含むことができる。そのキットはさらに、そのような疾患に関して陽性の疾患患者、そのような疾患に関して陰性の患者、または両方の発現に関して確立された参照値の範囲を含むことができる。
【０２６０】
[00312]  特定の態様において、本発明は、どの卵巣がんを有する患者が少なくとも化学療法介入に応答しそうであるか、および／またはその疾患からの悪い転帰を決定するための診断法、キット、および装置を提供する。その患者の体からの試料に対してアッセイを行い、卵巣がんと関係する少なくとも１種類以上のバイオマーカーを検出する。それぞれのバイオマーカーは、手作業の、またはコンピューターに支援される決定により卵巣がんおよび対照を区別するルーチン的に決定可能なカットオフ点を有する。
【０２６１】
[00313]  特定の態様において、バイオマーカーの組み合わせは結果としてその診断の正確性を大きく増大させる。
【０２６２】
[00314]  本教示の方法およびキットは、本明細書において広く、かつ一般的に記述されてきた。その一般的な開示の範囲内に入るより狭い種および一般性の低い（ｓｕｂ−ｇｅｎｅｒｉｃ）グループ分けのそれぞれも、本教示の一部を形成している。これには、削除される物質が本明細書において具体的に列挙されたか否かに関わらず、その属（ｇｅｎｕｓ）からあらゆる主題を除去する条件または消極的限定を有する本教示の一般的記述が含まれる。
【０２６３】
[00315]  実施例４
[00316]  アレイの調製およびスクリーニング
[00317]  本明細書において、ｍｉＲＮＡアレイの調製および使用も提供され、それは複数のｍｉＲＮＡ分子または前駆体ｍｉＲＮＡ分子に完全に相補的もしくはほぼ相補的または同一であり支持体物質上に空間的に分離された構成で配置された核酸分子（プローブ）の整然とした（ｏｒｄｅｒｅｄ）マクロアレイまたはマイクロアレイである。マクロアレイは典型的にはその上にプローブがスポットされたニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは核酸プローブをより高密度に、１０，０００種類に至るまでの核酸分子を典型的には１〜４平方センチメートルの領域中に収めることができるように配置する。マイクロアレイは、核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチド等を支持体上にスポットする、またはオリゴヌクレオチド配列を支持体上でその場で製作することにより製作することができる。スポットまたは製作される核酸分子は、平方センチメートルあたり約３０種類に至るまで、またはより多く、例えば平方センチメートルあたり約１００種類、もしくはさらには１０００種類に至るまでの同一でない核酸分子の高密度マトリックスパターンで適用することができる。マイクロアレイは典型的には、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対照的に、コートされたガラスを固体支持体として用いる。ｍｉＲＮＡに相補的な核酸試料の整然としたアレイを有することにより、それぞれの試料の位置を追跡し、元の試料に結びつけることができる。複数の別個の核酸プローブが固体支持体の表面と安定して結合している様々な異なるアレイ装置が当業者に既知である。アレイのための有用な支持体には、ナイロン、ガラスおよびシリコンが含まれる。そのアレイはいくつかの異なる方法で異なっていてよく、それには平均プローブ長、プローブの配列またはタイプ、プローブおよびアレイ表面の間の結合の性質、例えば共有結合性または非共有結合性等が含まれる。本明細書で記述された標識およびスクリーニング法ならびにアレイは、そのプローブがｍｉＲＮＡを検出することを除いて、その有用性においてあらゆるパラメーターに関して限定されておらず；結果的に、方法および組成物は様々な異なるタイプのｍｉＲＮＡアレイと共に用いられてよい。特定の態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は本明細書で記述されるｍｉＲの１種類以上を含む。
【０２６４】
[00318]  マイクロアレイ
[00319]  そのマイクロアレイは、既知の、または予測されるｍｉＲＮＡ配列から得られたオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。そのアレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに関する異なるオリゴヌクレオチドプローブ、例えば活性な成熟配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブおよびそのｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である別のオリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。そのアレイは、対照、例えばヒトのオルソログと数塩基のみ異なる１種類以上の配列も含有していてよく、それはハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関する対照の役目を果たすことができる。ウイルスのｍｉＲＮＡまたは生物情報学のツールから予測されるような推定上のｍｉＲＮＡが含まれることも可能である。さらに、マイクロアレイ上の非特異的ハイブリダイゼーションに関する適切な対照が含まれることも可能である。
【０２６５】
[00320]  特定の態様において、その核酸ハイブリダイゼーションは固相核酸バイオチップアレイ、特にマイクロアレイもしくはインサイチュハイブリダイゼーションを用いて実施され、またはここでその核酸増幅法はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）または定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。
【０２６６】
[00321]  特定の態様において、そのキットはｍｉＲＮＡの決定のための固相核酸バイオチップアレイ、特にマイクロアレイ、またはビーズのセットを含む。
【０２６７】
[00322]  特定の態様において、そのキットはハイブリダイゼーションおよび場合により増幅、例えばＲＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲに基づく核酸検出を実施するための装置を含む。
【０２６８】
[00323]  本明細書において、示したｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、好ましくは少なくとも３、５、１０種類、または全部の配列、および／またはそのような配列の相補物を含む、がんを診断するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットも記述する。
【０２６９】
[00324]  方法
[00325]  本明細書において、患者のがんと関連する病態の評価のための方法も記述される。１態様において、卵巣がんのインビトロ診断のための方法は以下の工程を含む：
ａ）対象から試料を得て；
ｂ）卵巣がんバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡおよび内部対照ＲＮＡの発現レベルを決定し；
ｃ）卵巣がんバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡの相対的発現レベルを計算し；
ｄ）１個以上の変数を用いることにより予測モデルを計算し、ここでその変数には卵巣バイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡの相対的発現レベルおよび場合により１種類以上の卵巣がんの危険因子が含まれ；そして、
ｅ）予測モデルにより疾患危険確率を計算し、ここでその対象はその疾患危険確率が０．５より大きい場合に卵巣と診断される。
【０２７０】
[00326]  特定の態様において、卵巣がんのインビトロ診断のための方法において、卵巣がんバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡは、疾患診断用バイオマーカーとしての使用のためのｍｉＲＮＡを選択するための方法から得られ、それは以下の工程を含む：
ａ）対象から試料を得て、ここでその対象はその疾患を患っている人々およびその疾患を患っていない人々からなり；
ｂ）その試料中の候補ｍｉＲＮＡおよび内部対照ＲＮＡの発現レベルを決定し；
ｃ）その候補ｍｉＲＮＡの相対的発現レベルを計算し；
ｄ）１個以上の変数を用いて予測モデルを計算し、ここでその変数には１種類以上の候補ｍｉＲＮＡの相対的発現レベルおよび場合により１種類以上のその疾患の危険因子が含まれ；そして
ｅ）予測モデルにより疾患危険確率、感受性および特異性を計算し、ここで最高の感受性および最高の特異性を有する１種類以上の候補ｍｉＲＮＡがその疾患の診断用バイオマーカーとして選択される。特定の態様において、その危険因子は卵巣がんの危険因子である。特定の態様において、その１種類以上のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７からなる群から選択される。
【０２７１】
[00327]  特定の態様において、その１種類以上のｍｉＲＮＡは、卵巣がん処置の効果を評価する、および卵巣がんに対する薬物をスクリーニングするための参照パラメーターとして用いられる。
【０２７２】
[00328]  特定の態様において、そのｍｉＲ−４８４は卵巣がん患者および正常な健康な対象の間で有意に異なる発現レベルを有する。
【０２７３】
[00329]  特定の態様において、１種類以上のｍｉＲＮＡおよび内部対照ＲＮＡの発現レベルは定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定され、サイクル閾値（Ｃｔ）として表される。
【０２７４】
[00330]  特許制定法の規定に従って、この発明の原理および作動方式をその好ましい態様において説明および図説してきた。しかし、この発明は、その精神および範囲から逸脱することなく、具体的に説明および図説されたものと異なる方法で実施されてよいことは理解されなければならない。
【０２７５】
[00331]  本明細書で列挙されたあらゆる文書の引用は、前記のいずれかが関連する選考技術であるという自認として意図されているわけではない。そのデータに関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書のデータまたは内容の正確さに関する自認を構成することは一切ない。
【０２７６】
[00332]  本発明は様々な好ましい態様に関連して記述されてきたが、当業者は、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく様々な変更を行い、その要素の代わりに均等物を用いてよいことを理解するべきである。加えて、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、その本質的な範囲から逸脱することなく多くの修正を行うことができる。従って、本発明は本明細書で開示されたこの発明を実施するために熟慮された特定の態様に限定されるのではなく、本発明には特許請求の範囲内に入る全ての態様が含まれるであろうことが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
2014530612.tif 000028
【図１１Ｂ】
2014530612.tif 000029
【図１１Ｃ】
2014530612.tif 000030
【配列表】
2014530612000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月10日(2014.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において化学療法介入に抵抗性である卵巣がんの検出を補助する方法であって、以下の工程：
ａ）対照発現レベルと比較した場合の、前記対象から採取した試料中のｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを同定し、そして
ｂ）前記試料が前記対照発現レベルと比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを有する場合、前記対象が化学療法抵抗性卵巣がんを有するという指標を提供し、または
ｃ）前記試料が前記対照発現レベルと比較して低下したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の発現レベルを有しない場合、前記対象が化学療法抵抗性卵巣がんを有しないという指標を提供する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
工程ａ）がさらに、対照発現レベルと比較した場合の、ｍｉＲ−５９２、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｍｉＲ−７４４の発現レベルを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）がさらに、対照発現レベルと比較した場合の、ｍｉＲ−２９６−５ｐおよび／またはｍｉＲ−５１８ｅの発現レベルを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７の発現レベルを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法介入が、プラチナをベースにした薬物、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、タキサン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、イクサベピロン（ｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））、エピテロン系薬物、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））および／またはフェノクソディオールの１種類以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）が以下の工程：
１）前記試料から採取したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し；
２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７  ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
３）工程（２）の前記プロファイルを対照と比較する；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程３）が前記試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から作成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程３）が前記試料のハイブリダイゼーションプロファイルを非がん性試料と関係するｍｉＲレベルのデータベース、統計、または表と比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記卵巣がんが漿液性上皮性卵巣癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対照と比較して低下したｍｉＲ−４８４の発現が化学療法抵抗性卵巣がんの診断を確証する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト対象が卵巣がんに関して悪い生存予後を有することの検出を補助する方法であって、以下の工程：
ａ）前記ヒト対象から採取した卵巣組織の試料中のｍｉＲ遺伝子産物シグネチャーの発現レベルを測定し、前記ｍｉＲ遺伝子産物シグネチャーは以下のｍｉＲ遺伝子産物からなり：ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７；そして
ｂ）前記試料中の前記ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の発現レベルが、がんを有しない卵巣組織の対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルと比較して低下している場合には、前記ヒト対象が卵巣がんにより悪い生存予後を有するという指標を提供する；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
工程（ａ）が以下の工程：
１）前記試料から採取したｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し；
２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
３）工程（２）の前記プロファイルを対照と比較する；
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象の前記生存予後の指標を提供する前記工程（ｂ）で漿液性卵巣がんを他の卵巣がんと識別する指標を提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象の前記生存予後の指標を提供する前記工程（ｂ）で化学療法介入に対する応答を予測する指標を提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７がｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７に特異的である１種類以上のプローブにそれぞれハイブリダイズし、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２１７の前記発現レベルが前記対照試料と比較して低下していることが、化学療法介入に対する乏しい応答、ヒト患者における悪い生存の予後、および／または漿液性卵巣がんの存在の指標となる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
対象の化学療法抵抗性卵巣がんの検出を補助するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記対象から採取した試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを検出し、
ｂ）前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを非がん性卵巣細胞を含む対照試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較し、そして
ｃ）前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルが前記試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７の１種類以上の発現レベルにおいて統計的に有意な変化を含む場合には、前記対象が化学療法抵抗性卵巣がんを有するという指標を提供する；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）における前記統計的に有意な変化がｍｉＲ−４８４の発現レベルの低下である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記卵巣がんが漿液性上皮性卵巣がんを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロＲＮＡ発現プロファイルが少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２およびｈｓａ−ｍｉＲ−２１７を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
患者の病態の評価を補助するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から採取した生物学的試料を用意し、
ｂ）前記試料中の予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーの発現レベルを決定してｍｉＲＮＡ発現プロファイルを得て、前記予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーが少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７を含み、
ｃ）工程（ｂ）の前記発現レベルを卵巣がんが含まれる様々な疾患に特徴的な１又はそれより多くの参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較し、そして
ｄ）工程（ｃ）の比較に基づいて前記患者の病態の評価を補助する；
を含む、前記方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）における前記参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイルがインターネットデータベース、集中型データベースまたは非集中型データベースの１以上で見付かるデータベースから得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）における決定が前記予め決められたｍｉＲＮＡのセットの定性的、定量的または半定量的決定を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｂ）における決定が核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、質量分析、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
以下：
ａ）患者からの生物学的試料中の予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーを決定するための１種類以上のバイオマーカー、当該予め決められたｍｉＲＮＡのシグネチャーはｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１７の少なくとも１つを含む、および
ｂ）卵巣がんが含まれる様々な疾患に特徴的な複数のｍｉＲＮＡ参照発現プロファイル；
を含む、患者の病態の評価のためのキット。
【請求項２５】
前記ｍｉＲＮＡ参照発現プロファイルがデータベース、例えばインターネットデータベース、集中型または非集中型データベース中に置かれている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
患者において卵巣がんを診断するためのキットであって、以下：
ａ）少なくとも１種類の卵巣がん診断用バイオマーカーに特異的な１種類以上の検出物質を含む捕捉試薬、ここで少なくとも第１卵巣がんバイオマーカーはｍｉＲ−４８４バイオマーカーである
ｂ）検出試薬、および
ｃ）キットを用いて前記患者からの生物学的試料中のｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照の対象における同じバイオマーカーの発現レベルよりも低い場合に患者が卵巣がんを有すると診断するための説明書；
を含む、前記キット。
【請求項２７】
さらにｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７バイオマーカーから選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれる、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
さらにｈｓａ−ｍｉＲ−５９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ−７４４から選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーが含まれる、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７、および／またはそれらの相補物から選択されるｍｉＲＮＡのセットの配列を含む、卵巣がんを診断するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
【請求項３０】
患者における卵巣がんの検出を補助するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から採取した生物学的試料中の少なくとも１種類の診断用バイオマーカーの発現レベルを検出し、ここで少なくとも第１診断用バイオマーカーはｍｉＲ−４８４バイオマーカーであり、そして
ｂ）前記患者の試料中の少なくともｍｉＲ−４８４診断用バイオマーカーの発現レベルが卵巣がんを有しない対照から採取した生物学的試料に由来する同じバイオマーカーの正常な発現レベルよりも低い場合に、前記患者は卵巣がんを有するとの指標を提供する；
を含む、前記方法。
【請求項３１】
さらにｍｉＲ−６４２およびｍｉＲ−２１７バイオマーカーから選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーの発現レベルを検出することが含まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
さらにｈｓａ−ｍｉＲ−５９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｈｓａ−ｍｉＲ−７４４から選択される１種類以上の追加の卵巣がん診断用バイオマーカーの発現レベルを検出することが含まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程：
ａ）前記試料を得て、ここで前記試料は卵巣細胞を含み；
ｂ）前記試料からのｍｉＲＮＡ発現プロファイル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡを増幅し；
ｄ）前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを決定し；そして
ｅ）前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルをｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−６４２および／またはｍｉＲ−２７１を含む対照ｍｉＲＮＡシグネチャーと比較し、
ここで前記試料の前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイル内の前記対照ｍｉＲＮＡシグネチャーの再現は、前記試料が化学療法処置に抵抗性の卵巣がん細胞を含むことを示す；
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
卵巣がんを有する患者の化学療法介入に対する感受性を増大させるための医薬組成物であって、ｍｉＲ−４８４をコードする塩基配列を含むプラスミド又はウイルスベクターを含有する、前記医薬組成物。
【請求項３５】
前記化学療法介入がカルボプラチン処理若しくはＴａｘｏｌ処理又はそれらの組み合わせである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記プラスミド又は前記ウイルスベクターによって卵巣がん細胞にｍｉＲ−４８４を送達し、患者の卵巣がん細胞中のｍｉＲ−４８４のレベルを増大させる、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ｍｉＲ−２９６をコードする塩基配列を含むプラスミド又はウイルスベクターをさらに含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2014530612.tif 000031