(57)【要約】本発明は、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、又は血小板減少のリスクを予測するための方法及びキットに関する。特に、本発明は、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、及び血小板減少からなる群より選択される臓器不全を有するリスクを予測するための方法に関し、前記敗血症患者から得られた血液サンプル中のエンドカンの濃度を測定することからなる工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症患者から得られた血液サンプル中のエンドカンの濃度を測定することからなる工程を含む、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、及び血小板減少からなる群より選択される臓器不全を有するリスクを予測するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、又は血小板減少のリスクを予測するための方法及びキットに関する。
【０００２】
発明の背景：
敗血症は、重度の感染に合併し、全身性炎症及び広範な組織損傷により特徴付けられ、従って、非冠動脈集中治療室（ＩＣＵ）における入院及び死亡の主要な原因を表す臨床的な症候群である。一般的な原因は、グラム陰性生物、ブドウ球菌、及び髄膜炎菌を含む。末端臓器不全及び死亡の漸進的に増加したリスクを伴う炎症反応における３つの認識された段階がある：敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック。重症敗血症は、少なくとも１つの臓器での不全の徴候を伴う敗血症である。心血管不全は、典型的には、低血圧、低酸素血症による呼吸不全、乏尿による腎不全、及び凝血異常による血液不全により顕在化する。
【０００３】
したがって、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、又は血小板減少のリスクを予測する方法が、高度に望ましい。
【０００４】
最近の結果は、敗血症患者において、エンドカンの血液レベルが、疾患の重症度及び患者の転帰に関連し、新規の内皮細胞機能障害マーカーを表しうることを示唆する（Scherpereel A, Depontieu F, Grigoriu B, Cavestri B, Tsicopoulos A, Gentina T, Jourdain M, Pugin J, Tonnel AB, Lassalle P. Endocan, a new endothelial marker in human sepsis. Crit Care Med. 2006 Feb; 34(2): 532-7）。しかし、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、又は血小板減少のリスクを予測するためのエンドカンの役割は、まだ研究されていない。
【０００５】
発明の概要：
本発明は、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、及び血小板減少からなる群より選択される臓器不全を有するリスクを予測するための方法に関し、前記敗血症患者から得られた血液サンプル中のエンドカンの濃度を測定することからなる工程を含む。
【０００６】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、血液エンドカンレベルが、敗血症患者において、呼吸不全、及び／又は腎不全、及び／又は血小板減少を予測するためのツールを表すことを示す。
【０００７】
したがって、本発明は、敗血症患者において呼吸不全、腎不全、及び血小板減少からなる群より選択される臓器不全を有するリスクを予測するための方法に関し、前記敗血症患者から得られた血液サンプル中のエンドカンの濃度を測定することからなる工程を含む。
【０００８】
本明細書において使用する通り、用語「敗血症患者」は、重症敗血症又は敗血性ショックを有する患者を指す。
【０００９】
本明細書において使用する通り、用語「呼吸不全」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、その役割を実施するため、すなわち、正常な血液生成（ｈｅｍａｔｏｓｅ）（ＣＯ２が豊富な静脈血からＯ２が豊富な動脈血への転換）を維持するための呼吸器系の不能として定義される。呼吸不全は、大気と血液の間でのガス交換速度が、身体の代謝要求に一致させることができない場合に発生する。
【００１０】
本明細書において使用する通り、用語「腎不全」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腎臓が、血液から毒素及び老廃物を適当にろ過することに失敗する医学的な状態を記載する。
【００１１】
本明細書において使用する通り、用語「血小板減少」又は「血小板減少症」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血液中の血小板数における異常な減少を定義する。
【００１２】
本明細書において使用する通り、用語「エンドカン」又は「ＥＳＭ−１」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、肺及び腎臓中の内皮細胞により発現される５０ｋＤａのデルマタン硫酸プロテオグリカンである（Lassalle P, Molet S, Janin A, et al: ESM-1 is a novel human endothelial cell-specific molecule expressed in lung and regulated by cytokines. J Biol Chem 1996; 271: 20458-20464）ヒト血液中で検出することができる（Bechard D, Meignin V, Scherpereel A, et al: Characterization of the secreted form of endothelial-cell-specific molecule 1 by specific monoclonal antibodies. J Vasc Res 2000; 37: 417-425；Bechard D,Gentina T, Delehedde M, et al: Endocan is a novel chondroitin sulfate/dermatan sulfate proteoglycan that promotes hepatocyte growth factor/scatter factor mitogenic activity. J Biol Chem 2001; 276: 48341-48349）内皮細胞特異的分子１を指す。
【００１３】
本明細書において使用する通り、用語「血液サンプル」は、全血、血清、又は血漿サンプルを指す。典型的には、血液サンプルは、重症敗血症及び敗血症性ショックを伴う患者の集中治療室（ＩＣＵ）入院時に調製される。
【００１４】
一度、患者からの血液サンプルが調製されると、ＥＳＭ−１の濃度は、当技術分野における任意の公知の方法により測定されうる。例えば、ＥＳＭ−１の濃度は、標準的な電気泳動技術及び免疫診断技術（競合アッセイ、直接反応アッセイ、又はサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む）を使用することにより測定されうる。そのようなアッセイは、しかし、限定しないが、ウエスタンブロット；凝集テスト、酵素標識及び媒介イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡなど）；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、固相親和性などを含む。
【００１５】
特定の実施態様において、そのような方法は、血液サンプルを、血液サンプル中に存在するＥＳＭ−１と選択的に相互作用することが可能である結合パートナーと接触させることを含む。
【００１６】
結合パートナーは、一般的に、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルでありうる抗体でありうる。ＥＳＭ−１に対して向けられたポリクローナル抗体は、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びマウスより選択される宿主動物へ適当な抗原又はエピトープを投与することにより、公知の方法に従って産生することができる。当技術分野において公知の種々のアジュバントを使用し、抗体産生を増強することができる。本発明を実行する際に有用な抗体は、ポリクローナルでありうるが、モノクローナル抗体が好ましい。ＥＳＭ−１に対するモノクローナル抗体は、培養中での連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、調製及び単離することができる。産生及び単離のための技術は、しかし、限定しないが、Kohler and Milstein (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al., 1983）；及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al.1985）を含む。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（例、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）を適応し、抗ＥＳＭ−１、単鎖抗体を産生することができる。本発明を実行する際に有用な抗体は、また、抗ＥＳＭ−１フラグメント（しかし、限定しないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む）（インタクトな抗体分子のペプシン消化により生成することができる）及びＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができる）を含む。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築し、ＥＳＭ−１への所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を許すことができる。例えば、抗体のファージディスプレイを使用しうる。そのような方法において、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はＦａｂフラグメントは、適したバクテリオファージ（例、Ｍ１３）の表面上に発現される。簡単には、タンパク質を用いて免疫化された、適した宿主（例、マウス）の脾臓細胞を除去する。ＶＬ及びＶＨ鎖のコード領域は、タンパク質に対して所望の抗体を産生しているそれらの細胞から得られる。これらのコード領域は、次に、ファージ配列の末端に融合される。一度、ファージが、適したキャリア（例、細菌）中に挿入されると、ファージは抗体フラグメントをディスプレイする。抗体のファージディスプレイも、当業者に公知のコンビナトリアル方法により提供されうる。ファージによりディスプレイされる抗体フラグメントは、次に、イムノアッセイの一部として使用されうる。
【００１７】
抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体は、Lunginnov（Lille, France）から商業的に利用可能である。例えば、抗ヒトエンドカン／ＥＳＭ−１抗体ＭＥＰ０８は、ヒトエンドカンのＮ末端を検出する（Bechard et al.(2000) J. Vasc. Res. 37: 417-425；Grigoriu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12: 4575-4582；Maurage et al. (2009) Exp. Neurol.68: 836-844；Leroy et al. (2010) Histopathology 56: 180-187；Sarrazin et al. (2010) J. Canc. Sci. Ther. 2: 47-52）。抗ヒトエンドカン／ＥＳＭ−１抗体クローンＭＥＰ１９は、ヒトエンドカンのＣ末端を検出する（Bechard et al. (2000) J. Vasc. Res. 37: 417-425；Grigoriu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12: 4575-4582；Maurage et al. (2009) Exp. Neurol. 68: 836-844；Leroy et al. (2010) Histopathology 56: 180-187；Sarrazin et al. (2010a) J. Canc. Sci. Ther. 2: 47-52；及びSarrazin et al. (2010b) Glycobiology 20: 1380-1388）。
【００１８】
別の実施態様において、結合パートナーはアプタマーでありうる。アプタマーは、分子認識に関して、抗体への代替物を表す分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を伴う標的分子の実質的に任意のクラスを認識するための能力を伴うオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を通じて単離されうる（Tuerk C. and Gold L., 1990に記載される通り）。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により入手可能である。このライブラリーにおいて、各々のメンバーは、固有配列の線形オリゴマー（最終的には化学的に修飾される）である。このクラスの分子の可能な修飾、使用、及び利点が、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド方法（Colas et al., 1996）によりコンビナトリアルライブラリーより選択される、プラットフォームタンパク質（例えば大腸菌チオレドキシンＡなど）によりディスプレイされる立体構造的に制約された抗体可変領域からなる。
【００１９】
本発明の結合パートナー（例えば抗体又はアプタマーなど）は、検出可能な分子又は物質（例えば蛍光分子、放射性分子、又は当技術分野において公知の任意の他の標識など）を用いて標識されうる。一般的に（直接的又は間接的のいずれかで）シグナルを提供する標識が、当技術分野において公知である。
【００２０】
本明細書において使用する通り、用語「標識した」は、抗体に関して、検出可能な物質、例えば放射性薬剤又はフルオロフォア（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体又はアプタマーに共役させる（即ち、物理的に連結させる）ことによる抗体又はアプタマーの直接的標識、ならびに、検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識を包含することを意図する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法により放射性分子を用いて標識されうる。例えば、放射性分子は、しかし、限定しないが、シンチグラフィー試験用の放射性原子（例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８など）を含む。
【００２１】
前述のアッセイは、一般的に、固体支持体における結合パートナー（即ち、抗体又はアプタマー）の結合を含む。本発明の実行において使用することができる固体支持体は、基質、例えばニトロセルロース（例、メンブレン又はマイクロタイターウェルの形態で）；ポリ塩化ビニル（例、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化ペーパー；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ；磁気応答性ビーズなどを含む。
【００２２】
特に、ＥＬＩＳＡ方法を使用することができ、それにおいて、マイクロタイタープレートのウェルを、ＥＳＭ−１に対する抗体のセットを用いてコーティングする。ＥＳＭ−１を含む又は含むことが疑われる血液サンプルを、次に、コーティングしたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を許すために十分なインキュベーション期間後、プレートを洗浄し、未結合成分を除去し、検出可能に標識された二次結合分子を加えることができる。二次結合分子は、任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、二次結合分子の存在を、当技術分野において周知の方法を使用して検出することができる。
【００２３】
典型的には、ＥＬＩＳＡキットが、Lunginnov（Lille, France）から商業的に利用可能である：EndoMark H1（登録商標）（ヒトエンドカンを検出するためのＥＬＩＳＡキット）。他のＥＬＩＳＡ方法が以下に記載されている：Bechard et al. (2000) J. Vasc. Res. 37: 417-425；Grigoriu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12: 4575-4582；Leroy et al. (2010) Histopathology 56: 180-187；Sarrazin et al. (2006) BBA Reviews 1765: 25-37；Sarrazin et al. (2010a) J. Canc. Sci. Ther. 2: 47-52；Scherpereel et al. (2003) Cancer Res. 63: 6084-6089；Scherpereel et al. (2006) Crit. Care Med. 34(2):532-537。
【００２４】
ＥＳＭ−１の濃度を測定すること（イムノアッセイベースの方法を伴う又は伴わない）は、また、タンパク質の分離；タンパク質の分子量に基づく遠心；質量及び電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；使用される特定の固相についてのタンパク質の親和性に基づく固相親和性を含みうる。一度、分離されると、ＥＳＭ−１は、そのタンパク質についての、標準的な技術を使用して測定された公知の「分離プロファイル」（例、保持時間）に基づいて同定されうる。あるいは、分離されたタンパク質は、例えば、質量分析計より検出され、測定されうる。
【００２５】
本発明の方法は、重症敗血症及び敗血症ショックを伴う患者のＩＣＵ入院に続く４８〜７２時間に、臓器不全、特に呼吸不全を予測するために特に適している。
【００２６】
本発明の方法は、さらに、ＥＳＭ−１の濃度を所定の閾値と比較する工程を含みうる。前記比較は、前記患者が、呼吸不全、腎不全、又は血小板減少を得るリスクを有するか否かを示している。例えば、所定の閾値は、健康な患者、即ち、臓器不全を発生しないであろう患者における測定された平均での濃度を表す。典型的には、健康な患者において決定された所定の閾値よりも低い濃度は、重症敗血症及び敗血症ショックを伴う患者のＩＣＵ入院に続く４８〜７２時間に、臓器不全、より具体的には呼吸不全を予測する。
【００２７】
本発明の方法は、このように、敗血症に罹患した患者を分類するために有用でありうるが、次に、集中治療室において正確な処置を選ぶために使用されうる。例えば、呼吸不全、腎不全、又は血小板減少を発生する高いリスクを伴う患者は、弱いリスクを伴う患者と比較して、より集中的な処置及び注意を受けうる。そのような方法は、このように、医師が、治療的処置（それは、したがって、正確な薬物を患者に投与することにありうる）に関する選択を行うために役立ちうる。処置のコストは、従って、集中治療室に入院した患者に適応されうるが、したがって、本発明の方法は、そのような室の管理のための有用なツールを表しうる。最後に、本発明の方法は、敗血症に罹患した患者の治療成績をモニターするために適用されうる。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、敗血症患者における呼吸不全、腎不全、又は血小板減少のマーカーとしてのＥＳＭ−１の使用に関する。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、ＥＳＭ−１の濃度を測定するための手段を含む、呼吸不全、腎不全、又は血小板減少からなる群より選択される臓器不全を有するリスクを予測するためのキットに関する。キットは、抗体、又は上に記載する通りの抗体のセットを含みうる。特定の実施態様において、抗体又は抗体のセットは、上に記載する通りに標識される。キットは、また、特定の検出プロトコルのために必要とされる他の適切にパッケージ化された試薬及び材料（固相マトリックス（該当する場合）及びスタンダードを含む）を含みうる。キットは、また、臓器不全の他のマーカー（例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）又はプロカルシトニン（ＰＣＴ）、ＩＬ−６、ＴＮＦαなど）の検出のための手段を含みうる。
【００３０】
本発明を、さらに、以下の図及び実施例により例証する。しかし、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】健康なボランティア（Ｔｅｍｏｉｎ）と比較した、重症敗血症（Ｓｅｐｓｉｓ  Ｓｅｖｅｒｅ）及び敗血症性ショック（Ｃｈｏｃ  Ｓｅｐｔｉｑｕｅ）患者におけるエンドカン血漿レベルの増加（＊：ｐ＜０．０５）。
【図２】エンドカン及び呼吸不全  Ａ：４８時間での、呼吸不全を伴わない（０）、ＡＬＩ／  ＡＲＤＳを伴う（１）患者におけるエンドカンのレベル（＊：ｐ＜０．０５）。Ｂ：７２時間での、呼吸不全を伴わない（０）、ＡＬＩ／  ＡＲＤＳを伴う（１）患者におけるエンドカンのレベル（＊：ｐ＜０．０５）。
【図３】エンドカン及び呼吸重症度  Ａ：４８時間での、呼吸不全を伴わない（０）、ＡＬＩを伴う（ＡＬＩ）、ＡＲＤＳを伴う（ＳＤＲＡ）患者におけるエンドカンのレベル。Ｂ：７２時間での、呼吸不全を伴わない（０）、ＡＬＩを伴う（ＡＬＩ）、ＡＲＤＳを伴う（ＳＤＲＡ）患者におけるエンドカンのレベル。
【図４】４８時間での、呼吸不全の存在を伴う組み入れ時でのエンドカン血漿レベルのＲＯＣ曲線。ＡＵＣ：曲線下面積  グラフ下の表は、エンドカン血漿レベルの値に依存した、計算された感度及び特異性を示す。グレーの症例は、最良の感度／特異性値（それぞれ８４．６２%、１００%）についてのエンドカンのカットオフ（３，５５ng/mL）を確立する。
【００３２】
実施例１：
高レベルの血液エンドカンによって、呼吸不全（Ｐａ０２／Ｆｉ０２＜２００により定義される）、及び／又は腎不全（クレアチニン＞２０mg/mLにより定義される）、及び／又は血小板減少を伴う敗血症患者が選択される（表１）。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
実施例２：低レベルのエンドカンは、重症敗血症及び敗血症性ショックを伴う患者におけるＩＣＵ入院に続く４８〜７２時間に呼吸不全を予測する
序論：
【００３５】
急性肺損傷（ＡＬＩ）及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、急性呼吸不全の発生に導く、肺胞上皮及び内皮損傷により特徴付けられる一般的な臨床障害である。それらは、肺ガス交換により区別される。用語ＡＬＩは、＜３００mmHgのＰａＯ２／ＦｉＯ２比率を伴う患者を指すのに対し、＜２００mmHgの比率はＡＲＤＳを定義する。ＡＬＩ及びＡＲＤＳの両方が、直接的な肺損傷（例えば肺炎、誤嚥、肺挫傷、又は毒性吸入など）又は間接的な肺外傷害（例えば敗血症など）（それは、ＡＲＤＳの最も普及した致死的な原因である）のいずれか、しかし、また、血液製剤の複数の輸血、急性膵炎、ショックを伴う非胸部外傷、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）として生じうる。ＡＬＩ又はＡＲＤＳの発生率は、集中治療室（ＩＣＵ）に入院した全ての患者の７．１%と推定された。ＡＲＤＳ及びＡＬＩに関連付けられる死亡率は、３０〜４０%と推定された。大半のＡＲＤＳ患者について、臨床転帰は、診断後の最初の７〜１０日に決定された。なぜなら、この期間内に、患者の半数が死亡していた、又は、機械的換気から外されていたからである。ＡＲＤＳの生存者は、６〜１２ヶ月にわたり肺機能を回復するが、しかし、残留異常（軽度の制限／閉塞、運動の間での損なわれたガス交換、又は低下した拡散能力を含む）が、しばしば残る。
【００３６】
増加した死亡率の予後指標は、高齢、非肺臓器機能障害の存在、肝硬変、活性な悪性腫瘍、及び敗血症性ショックを含むのに対し；ガス交換障害の初期の程度は、臨床転帰の不良な予測因子である。初期重症度ＡＬＩ／ＡＲＤＳを評価し、炎症現象の進化を密接に追跡することができる、簡単で正確な血液ベースのバイオマーカーは、臨床医が転帰を予測し、治療対策をより適切に選択するために大いに役立ちうる。
【００３７】
ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、滲出、増殖、及び線維化の段階に分けることができ、有意な重なりを伴う。滲出段階は、急性初期段階（損傷後１〜７日）で生じ、肺胞Ｉ型細胞の壊死を伴うびまん性肺胞傷害（ＤＡＤ）、間質及び肺胞タンパク質に富む水腫、出血、ならびに、びまん性好中球浸潤により特徴付けられる。増殖段階は、典型的には、最初の傷害後１〜２週間で開始し、肺胞ＩＩ型細胞の増殖及び過形成により、ならびに、間質中での、後に、肺胞内腔内での繊維芽細胞の増殖により特徴付けられる。一部の患者だけが、線維化段階（典型的には、初期損傷後１０〜１４日に開始する）に入る。それは、リンパ球及びマクロファージの蓄積、ならびに線維症、ならびに筋内膜肥厚及び壁在線維症により狭められた蛇行血管により特徴付けられる。
【００３８】
好中球は、ＡＬＩ／ＡＲＤＳに関連付けられる炎症過程における主なプレーヤーと見なされる。それらは、ＡＲＤＳを伴う患者からの肺組織及び気管支肺胞洗浄液の両方において蓄積する。好中球は、侵入する微生物と戦い、しかし、また、炎症性メディエーター、フリーラジカル、活性酸素種、及びプロテアーゼの産生及び分泌により細胞傷害を起こしうる。これらの知見は、好中球依存的な炎症が、ＡＬＩの結果であるだけでなく、しかし、また、原因であるという概念を支持する。しかし、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの間に肺におけるＰＭＮの蓄積を制御する特定の調節機構は、完全には理解されていない。
【００３９】
敗血症において観察されるような間接的な損傷の場合における主な標的傷害は、肺内皮である。ＡＲＤＳにおける内皮細胞の病態生理学的応答を支配する機構の本発明者らの理解は、不完全なままである。内皮損傷は、血管透過性を増加させ、このように、肺水腫の形成を促進する。しかし、内皮細胞は、また、（ｉ）過剰なフィブリン沈着を招く局所的な凝固の誘導、（ｉｉ）間質及び肺胞腔中への白血球の動員及び移行を支持する接着分子（例えばＩＣＡＭ−１など）の過剰発現を含む、任意の細胞傷害に非依存的に活性化されうる。これは、重症敗血症における可溶性ＩＣＡＭ−１の増加に関連する。しかし、ＩＣＡＭ−１は、また、繊維芽細胞及び白血球上で発現され、肺内皮へのｓＩＣＡＭ−１発現の選択性を低下させる。また、毛細血管肺内皮は、肺ＡＲＤＳからの活性化した毛細血管内皮上でさえ、２つの他の主要な接着分子Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１の発現の非存在により特徴付けられる。
【００４０】
他方で、活性化された肺血管内皮細胞のバイオマーカーとしてエンドカンを考慮することができるという出現する一貫したデータがある。エンドカン（又はＥＳＭ−１）は、２０kDaのタンパク質コア及びコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸の固有のグリコサミノグリカン鎖（セリン１３７にＯ連結されている）で構成される、内皮細胞に特異的なプロテオグリカンとして同定されている。エンドカンは、主に、肺により、そしてより少ない程度で、腎臓の毛細血管により発現される。肺毛細血管の選択性は、短いプロモーター配列により駆動される。サイトカイン（ＴＮＦもしくはＩＬ−１など）又は細菌ＬＰＳは、内皮細胞によるエンドカンの合成及び分泌を誘発する。エンドカンは、その受容体、白血球インテグリンＬＦＡ−１に結合し、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用を阻害し、白血球遊出の制御におけるエンドカンについての役割を示唆する。初期の試験では、エンドカンの血液レベルが重症敗血症を伴う患者において増加していることが実証されており、悪い予後の兆候ならびにプロカルシトニン（現在、敗血症の最良の予後マーカー）として機能している。
【００４１】
ＡＬＩ／ＡＲＤＳが敗血症の間にどのように生じうるのかを説明するために、本発明者らは、肺の細菌攻撃後直ぐに、活性化マクロファージが、好中球を動員するために、ＩＬ−８を、及び、白血球遊出を制御するために、ＴＮＦα（それは、次に、肺内皮細胞を活性化し、ＩＣＡＭ−１及びエンドカンを発現する）を放出すると仮定した。しかし、敗血症が、血管内の好中球の活性化を誘発するのに十分に重度である場合、好中球プロテアーゼにより誘導されるエンドカンタンパク質分解が生じ、好中球遊出の悪化及び臓器不全の誘発に導く。本発明者らの仮説が真実である場合、本発明者らは、次に、エンドカンの動態と、重症敗血症時の呼吸不全の発生の間の関連を見出すことができるはずである。
【００４２】
患者及び方法：
２１人の患者及び９人の正常なボランティアが、本試験においてプロスペクティブに登録されている。全ての患者が、リール大学病院の集中治療室から来た。組み入れ基準は、ＳＣＣＭ／ＡＣＣ分類に従った、重症敗血症又は敗血症性ショックを伴う患者であった。非組み入れ基準は、年齢＜１８歳及び妊娠であった。除外基準は、非敗血症由来の敗血症性ショック、及びＩＣＵにおける入院前１ヶ月での免疫抑制治療であった。
【００４３】
臓器機能障害の指標を、組み入れ時ならびに２４時間、４８時間、及び７２時間に収集した：グラスゴー昏睡スケール≦１４、ＰａＯ２≦９．７５kPa、酸素飽和度≦９２%、ＡＬＩ（ＰａＯ２／ＦｉＯ２≦３００）、ＡＲＤＳ（ＰａＯ２／ＦｉＯ２≦２００）、収縮期血圧≦９０mmHg、ベースラインからの収縮期血圧降下≧４０mmHg、ｐＨ≦７．３、乳酸≧２．５mmol/l、クレアチニン≧１７７μmol/l、公知の腎臓疾患を伴う患者におけるクレアチニンの倍加、乏尿＞３時間にわたり≦３０ml/時間又は≦０．７l/２４時間、プロトロンビン時間≦０．６秒（参照０．７０〜１．３０秒）、血小板≦１００×１０９/l、ビリルビン≧４３μmol/l、及び麻痺性イレウス。敗血症性ショックは、少なくとも１時間にわたる適当な流体蘇生にもかかわらず、持続する低血圧と定義した。
【００４４】
血液は、ＩＣＵ入院時に含まれた患者から、５mLクエン酸チューブ中に採取した。サンプルを次に４℃で１５分間にわたり３０００gで遠心し、チューブ当たり５００μL血漿ずつ分注し、次に、１．５時間以内に−８０℃で凍結した。エンドカンレベルを、ＥＬＩＳＡ（Lunginnov, France）により決定した。
【００４５】
データを、中央値及び四分位範囲として、又は平均値±標準偏差として提示した。データ分析は、組み入れ時でのエンドカン血漿レベルの分散分析による比較及び試験の各時間点での各臓器不全の有無を含んだ。有意な場合、群は、ボンフェローニ補正を用いた事後テストを使用して２対２で比較した。エンドカンの予後値は、ＲＯＣ曲線により行った。全ての統計計算は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアパッケージを用いて実施した。
【００４６】
結果：
エンドカン血漿レベルは、重症敗血症（３，９６±３，３５ng/mL）において、及び、敗血症性ショック（４，３３±５，０１ng/mL）において、健常対照（０，６７±０，２５ng/mL）に対して増加した（ｐ＜０．０５）（図１）。
【００４７】
４８時間及び／又は７２時間での呼吸不全を伴う患者では、同じ時間点で呼吸不全を伴わない患者よりも、組み入れ時での血漿エンドカンの有意に低いレベルが明らかになった（ｐ＜０．０５、図２）。
【００４８】
エンドカンの血漿レベルは、ＡＬＩをＡＲＤＳから識別しなかった。それらは、両方の群において低かった（図３）。
【００４９】
４８時間でのエンドカンと呼吸不全の間でのＲＯＣ曲線は、ＡＵＣ＝０，９２３（ｐ＜０，０５）を示した。入院時でのエンドカンの値＜３，５５ng/mLは、４８時間での呼吸不全を予測し、８４，６２%の感度及び１００%の特異性を伴う（図４）。
【００５０】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最先端技術が記載される。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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