(57)【要約】  本明細書において、バチルスの胞子形成株を含む殺微生物組成物が開示される。本組成物は、養殖魚または甲殻類などの水生動物の疾患を治療または予防するために用いることができる。【選択図】なし
2014519316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルスの胞子形成株を含む、水生動物のための飼料組成物。
【請求項２】
バチルスの胞子形成株が、配列番号1、2もしくは3を含む16S rDNA配列を有するバチルス種であるか、または配列番号1、2もしくは3に対して少なくとも約90%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含むバチルス種である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
バチルスの胞子形成株が、カルベニシリン、アンピシリン、スペクチノマイシン、オキサシリン、バンコマイシン、セファロチン、ノボビオシン、スルファジアジン、アミカシン、エリスロマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、クロラムフェニコール、スルファメトキサゾール、ノルフロキサシン、ゲンタマイシンおよびシプロフロキサシンからなる群から選択される1以上の抗生物質に感受性を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
バチルスの胞子形成株が、アクセッション番号NRRL B-50745、NRRL B-50741、NRRL B-50742およびNRRL B-50743およびNRRL B-50745として寄託された株からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
飼料組成物が養殖魚のための飼料組成物である、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
バチルスの胞子形成株が、少なくとも約104CFU/飼料1gの濃度で存在する、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
単一のバチルス株を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
株の混合物を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
バチルスの胞子形成株が、アエロモナス・ヒドロフィラ、エドワルドシエラ・イクタルリ、エドワルドシエラ・タルダ、フラボバクテリウム・コルムナーレ、ストレプトコッカス・イニエおよびエルシニア・ルケリからなる群から選択される1以上の細菌の増殖を抑制する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
バチルスの胞子形成株が、卵菌真菌サプロレグニアの増殖を抑制する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
E.イクタルリを感染させるバクテリオファージをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
バクテリオファージがφeiAUである、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
スルファジメトキシン、オルメトプリムおよびフロルフェニカルからなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
E.イクタルリの弱毒化株をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項1を動物に投与することを含む、動物の疾患の治療または予防方法。
【請求項１６】
動物が養殖魚である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が腸敗血症である、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
水環境への投与のために処方され、腸敗血症を治療または予防するためのバチルスの胞子形成株の有効量を含む殺微生物組成物。
【請求項１９】
水環境が、水生動物が飼養される環境である、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
水生動物の腸敗血症の治療または予防方法であって、水生動物が飼養される環境に請求項18に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物の疾患を治療または予防するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物などの腸敗血症などの疾患を治療または予防するためのバチルス(Bacillus)の胞子形成株を含むかまたは用いる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、動物の健康および栄養を改善するためのプロバイオティクスの使用に関心が高まっている。養殖への応用のためのプロバイオティクス菌への関心は、ヒト医学および農業におけるプロバイオティクス菌の使用に続くものであり(FullerおよびTurvey(1971);RoachおよびTannock(1980);Fuller(1987);Smoragiewiczら(1993);Fuller(1997))、その場合、微生物は一般に飼料中の生きたサプリメントとして投与される(Fuller(1997))。宿主への有益な効果には、栄養学上の効果があること、免疫学上の効果があること、および/または消化管において潜在的病原体に打ち勝つ競合的排除を含むことが報告されている(Smoragiewiczら(1993))。プロバイオティクスは、ニジマスにおけるA.サルモニシダ(A. salmonicida)によってひき起こされるせっそう病(IriantoおよびAustin(2002))、ショートフィンイール(アンギラ・オーストラリス(Anguilla australis))におけるサプロレグニア・パラシチカ(Saprolegnia parasitica)による水カビ病(Lateganら(2004))、ヨーロッパウナギ(アンギラ・アンギラ(Anguilla anguilla))におけるエドワルドシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)によるエドワルドシエラ症(ChangおよびLiu(2002))、ニジマスにおけるそれぞれラクトコッカス・ガルビエ(Lactococcus garvieae)およびストレプトコッカス・イニエ(Streptococcus iniae)によるラクトコッカス症および連鎖球菌症(BruntおよびAustin(2005))ならびにAtlantic cod fryにおけるビブリオ・アングイラルム(Vibrio anguillarum)によって引き起こされる疾患(GildbergおよびMikkelsen(1998))を含む養殖における種々の感染症の抑制に有効であることが示されている。プロバイオティクスに用いられる細菌は、エンテロコッカス(Enterococcus)種、アエロモナス(Aeromonas)種、ビブリオ(Vibrio)種および乳酸菌(GildbergおよびMikkelsen(1998);ChangおよびLiu(2002);IriantoおよびAustin(2002);Lateganら(2004);BruntおよびAustin(2005))を含む。プロバイオティクス菌の大部分は、養殖動物の腸から単離された(GildbergおよびMikkelsen(1998);IriantoおよびAustin(2002);Lateganら(2004);BruntおよびAustin(2005))。養殖動物の生息環境から単離された細菌の一部もまた、プロバイオティクス活性を示した(Rengpipatら(1998))。潜在的プロバイオティクス菌の主な選択基準として特定の病原体に対する抗菌力が用いられる(Rengpipatら(1998);IriantoおよびAustin(2002))。本研究の細菌株の収集物には、植物の疾患の生物的制御およびそれらの植物成長促進能力に有用な土壌由来細菌(Kloepperら(2004))に関する以前の研究ばかりでなく、本研究で同定されたナマズの腸管試料由来の細菌培養物に由来するものも用いた。
【発明の概要】
【０００３】
細菌を殺すかまたはその増殖を抑制する殺微生物組成物が開示される。本組成物は、腸敗血症と関連する細菌などの病原菌を殺すかまたはその増殖を抑制することができる。本組成物は、腸敗血症と関連する細菌などの細菌を殺すかまたはその増殖を抑制するバチルスの胞子形成株の有効量を含む。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物のための飼料組成物として処方される。他の実施形態において、開示された組成物は、水生動物が住んでいるかまたは飼養されている環境に投与するために処方されることができる。
好ましくは、本組成物は、少なくとも約104CFU/飼料1gまたは水1mlの濃度でバチルス属の胞子形成株を含む。より好ましくは、バチルス属の胞子形成株は、少なくとも約105CFU/飼料1gまたは水1mlの濃度で組成物中に存在する。よりさらに好ましくは、バチルス属の胞子形成株は、少なくとも約106CFU/飼料1gまたは水1mlまたは少なくとも約107CFU/飼料1gまたは水1mlの濃度で組成物中に存在する。適切な濃度範囲は、104〜107CFU/飼料1gまたは水1mlあるいはその部分範囲を含むことができる。
【０００４】
本組成物は、バチルス属の単一の株を含むことができる。あるいはまた、本組成物は、バチルス属の株の混合物を含むことができる。
本組成物は一般的に、1以上の病原性微生物を殺すかまたはその増殖を抑制するためのバチルス属の胞子形成株の有効量を含む。例えば、病原菌は、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、エドワルドシエラ・イクタルリ(Edwardsiella ictaluri)、エドワルドシエラ・タルダ、フラボバクテリウム・コルムナーレ(Flavobacterium columnare)、ストレプトコッカス・イニエおよびエルシニア・ルケリ(Yersinia ruckeri)からなる群から選択されることができる。病原性真菌は、卵菌真菌サプロレグニア(Saprolegnia)を含むことができる。
本開示の組成物は、バチルスの胞子形成株を含む。本組成物は、病原微生物を殺すかまたはその増殖を抑制するためのさらなる薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本組成物は、さらに、E.イクタルリ(E. ictaluri)を感染させるバクテリオファージ(例えばφeiAU)を含む。本開示の組成物は、スルファジメトキシン、オルメトプリム、および/またはフロルフェニカルなどの抗生剤を含むことができる。本開示の組成物は、さらに、ワクチン剤としての弱毒化細菌(例えば、E.イクタルリの弱毒化株)を含むことができる。
動物の疾患を治療または予防するための方法であって、本開示の組成物を投与することを含む前記方法もまた開示される。例えば、本方法は、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物にバチルスの胞子形成株を含む飼料組成物を投与することを含むことができる。本方法は、さらに、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物が住んでいるかつ/または飼養されている環境に本明細書に記載の殺微生物組成物を投与することを含むことができる。本方法は、腸敗血症などの疾患を治療または予防するために用いることができる。本方法は、アエロモナス・ヒドロフィラ、エドワルドシエラ・イクタルリ、エドワルドシエラ・タルダ、フラボバクテリウム・コルムナーレ、ストレプトコッカス・イニエ、エルシニア・ルケリ、ビブリオ種および/または卵菌真菌サプロレグニアなどの病原微生物によって養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物の感染を治療または予防するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】バチルス株AP102(左部分)によるA.ヒドロフィラ株ML09-119(右部分)の増殖抑制を示す、軟寒天オーバーレイの10x倍率での顕微鏡写真を示す図である。
【図２】バチルスで改善した飼料またはバチルスで改善してない飼料で給餌後の、バチルス株CFU/gナマズ腸を示す図である(バチルス1株あたり動物n=3)。
【図３】バチルスで改善した飼料の飼料の有無による、ESCに暴露されたアメリカナマズ稚魚の累積日死亡率を示す図である。
【図４】バチルスで改善した飼料またはバチルスで改善してない飼料で給餌後の、バチルス株CFU/gナマズ腸の濃度を示す図である(バチルス1株あたり動物n=3)。
【図５Ａ】バチルス株の添加の有無で給餌し、E.イクタルリでチャレンジした、毎日20〜30分間の水交換をする静置システムにおけるアメリカナマズの日平均累積死亡率を示す図である。すべての数値は、治療群あたりの4連の平均値である。治療群:(○)対照群、(●)AP79、(▼)AP193L、(△)AB01、(■)AP143および(◆)AP254L。
【図５Ｂ】バチルス株の添加の有無で給餌し、E.イクタルリでチャレンジした、毎日フロースルー水5〜7時間でのアメリカナマズの日平均累積死亡率を示す図である。すべての数値は、治療群あたりの4連の平均値である。治療群:(○)対照群、(●)AP79、(▼)AP193L、(△)AB01、(■)AP143および(◆)AP254L。
【図５Ｃ】バチルス株の添加の有無で給餌し、E.イクタルリでチャレンジした、毎日20〜30分間水交換をする静置システムにおけるゴンズイ、の日平均累積死亡率を示す図である。すべての数値は、治療群あたりの4連の平均値である。治療群:(○)対照群、(●)AP79、(▼)AP193L、(△)AB01、(■)AP143および(◆)AP254L。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本明細書において、殺微生物組成物が開示される。本開示の殺微生物組成物は、以下に述べるように、いくつかの定義を用いて説明することができる。
特記しない限り、あるいは文脈から明白でない限り、用語“ある(a)”、“ある(an)”および“その(the)”は、“1以上の”を意味する。さらに、“バチルス株(a strain of Bacillus)”などの単数名詞は、特記しない限り、あるいは文脈から明白でない限り、“1以上のバチルス株”を意味すると解釈されなければならない。
本明細書において、“約”、“おおよそ”、“実質的に”および“顕著に”は、当業者に理解されると考えられるが、それらが用いられる文脈によってある程度は異なるであろう。それらが用いられている文脈において当業者には明確ではない用語の使用がある場合には、“約”および“おおよそ”は特定の用語のプラスマイナス≦10%を意味し、“実質的に”および“顕著に”は、特定の用語のプラスマイナス>10%を意味することができる。
本明細書において、用語“含有する”および“含有し”は、用語“含む”および“含み”と同じ意味を有する。
【０００７】
本開示の組成物および方法は、バチルス属の胞子形成株を含むかまたは用いる。本明細書において、バチルス属は、フィルミクテス門のメンバーであるグラム陽性桿菌の属の1つのことを言う。ストレスの多い環境条件下では、バチルス菌は、長期間休眠状態を続けることができる楕円の内生胞子を形成する。バチルス菌は、それらの16S rRNAのヌクレオチド配列またはそれらの断片(例えば、16S rRNAまたはrDNAヌクレオチド配列のおおよそ1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400ntまたは1500ntの断片)に基づいて特性決定され、同定されることができる。バチルス菌は、限定するものではないが、B.アシディセレル(B. acidiceler)、B.アシディコーラ(B. acidicola)、B.アシディプロデュセンス(B. acidiproducens)、B.アエオリウス(B. aeolius)、B.アエリウス(B. aerius)、B.アエロフィルス(B. aerophilus)、B.アガラドヘレンス(B. agaradhaerens)、B.アイジンゲンシス(B. aidingensis)、B.アキバイ(B. akibai)、B.アルカリフィルス(B. alcalophilus)、B.アルギコーラ(B. algicola)、B.アルカリニトリリクス(B. alkalinitrilicus)、B.アルカリセディミニス(B. alkalisediminis)、B.アルカリテルリス(B. alkalitelluris)、B.アルティチュジニス(B. altitudinis)、B.アルベアユエンシス(B. alveayuensis)、B.アミロリクエシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.アンスラシス(B. anthracis)、B.アクイマリス(B. aquimaris)、B.アルセニカス(B. arsenicus)、B.アリアブハッタイ(B. aryabhattai)、B.アサヒイ(B. asahii)、B.アトロファエウス(B. atrophaeus)、B.アウランティアカス(B. aurantiacus)、B.アゾトフォーマンス(B. azotoformans)、B.バディウス(B. badius)、B.バーバリカス(B. barbaricus)、B.バタビエンシス(B. bataviensis)、B.ベイジンゲンシス(B. beijingensis)、B.ベンゾボランス(B. benzoevorans)、B.ベベリジェイ(B. beveridgei)、B.ボゴリエンシス(B. bogoriensis)、B.ボロニフィルス(B. boroniphilus)、B.ブタノリボランス(B. butanolivorans)、B.カナベラリウス(B. canaveralius)、B.カーボニフィルス(B. carboniphilus)、B.セセンベンシス(B. cecembensis)、B.セルロシリティカス(B. cellulosilyticus)、B.セレウス(B. cereus)、B.チャガノレンシス(B. chagannorensis)、B.チュンゲンゲンシス(B. chungangensis)、B.キビ(B. cibi)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.クラルキィ(B. clarkii)、B.クラウシィ(B. clausii)、B.コアギュランス(B. coagulans)、B.コアウイレンシス(B. coahuilensis)、B.コーニー(B. cohnii)、B.デシシフロンディス(B. decisifrondis)、B.デコロラチオニス(B. decolorationis)、B.ドレンテンシス(B. drentensis)、B.ファラギニス(B. farraginis)、B.フォスティディオサス(B. fastidiosus)、B.ファルマス(B. firmus)、B.フレクサス(B. flexus)、B.ホラミニス(B. foraminis)、B.フォルディ(B. fordii)、B.フォルティス(B. fortis)、B.フマリオリィ(B. fumarioli)、B.フニクルス(B. funiculus)、B.ガラクトシディリティカス(B. galactosidilyticus)、B.ガリシエンシス(B. galliciensis)、B.ゲラティニ(B. gelatini)、B.ギブソニー(B. gibsonii)、B.ギンセンギ(B. ginsengi)、B.ギンセンギフミ(B. ginsengihumi)、B.グラミニス(B. graminis)、B.ハルマパルス(B. halmapalus)、B.ハロカレス(B. halochares)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.ヘミセルロシリティカス(B. hemicellulosilyticus)、B.ハーバーステイネンシス(B. herbertsteinensis)、B.ホリコシ(B. horikoshi)、B.ホルネッキアエ(B. horneckiae)、B.ホルティ(B. horti)、B.フミ(B. humi)、B.ファジンポエンシス(B. hwajinpoensis)、B.イドリエンシス(B. idriensis)、B.インディカス(B. indicus)、B.インファンティス(B. infantis)、B.インフェルヌス(B. infernus)、B.イ��ベリアエ(B. isabeliae)、B.イスロネンシス(B. isronensis)、B.チョッカリ(B. jeotgali)、B.コレエンシス(B. koreensis)、B.コルレンシス(B. korlensis)、B.クリベンシス(B. kribbensis)、B.クルルウィッチアエ(B. krulwichiae)、B.レヘンシス(B. lehensis)、B.レンタス(B. lentus)、B.リケニホルミス(B. licheniformis)、B.リトラリス(B. litoralis)、B.ロシサリス(B. locisalis)、B.ルシフェレンシス(B. luciferensis)、B.ルテオルス(B. luteolus)、B.マカウエンシス(B. macauensis)、B.マキアエ(B. macyae)、B.マンナニリティカス(B. mannanilyticus)、B.マリスフラビィ(B. marisflavi)、B.マルマレンシス(B. marmarensis)、B.マシリエンシス(B. massiliensis)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.メタノリクス(B. methanolicus)、B.メチロトロフィクス(B. methylotrophicus)、B.モジャベンシス(B. mojavensis)、B.ムラリス(B. muralis)、B.ムリマルティニ(B. murimartini)、B.ミコイデス(B. mycoides)、B.ナンハイエンシス(B. nanhaiensis)、B.ナンハイイセディミニス(B. nanhaiisediminis)、B.ネアルソニィ(B. nealsonii)、B.ネイゾウエンシス(B. neizhouensis)、B.ニアベンシス(B. niabensis)、B.ニアキニ(B. niacini)、B.ノバリス(B. novalis)、B.オセアニセディミニス(B. oceanisediminis)、B.オデッセイ(B. odysseyi)、B.オクヘンシス(B. okhensis)、B.オクヒデンシス(B. okuhidensis)、B.オレロニウス(B. oleronius)、B.オシメンシス(B. oshimensis)、B.パナシテラエ(B. panaciterrae)、B.パタゴニエンシス(B. patagoniensis)、B.ペルセポレンシス(B. persepolensis)、B.プラコルチディス(B. plakortidis)、B.ポチェオネンシス(B. pocheonensis)、B.ポリゴニ(B. polygoni)、B.シュードアルカリフィルス(B. pseudoalcaliphilus)、B.シュードファーマス(B. pseudofirmus)、B.シュードミコイデス(B. pseudomycoides)、B.シュクロサッカロリティクス(B. psychrosaccharolyticus)、B.プミラス(B. pumilus)、B.キングダオネンシス(B. qingdaonensis)、B.リグイ(B. rigui)、B.ルリス(B. ruris)、B.サフェンシス(B. safensis)、B.サラリウス(B. salarius)、B.サリフィルス(B. saliphilus)、B.シュリジェリー(B. schlegelii)、B.セレナターセナティス(B. selenatarsenatis)、B.セレニティレドセンス(B. selenitireducens)、B.セオハエアネンシス(B. seohaeanensis)、B.サックレトニィ(B. shackletonii)、B.シアメンシス(B. siamensis)、B.シンプレックス(B. simplex)、B.シラリス(B. siralis)、B.スミシー(B. smithii)、B.ソリ(B. soli)、B.ソリサルシ(B. solisalsi)、B.ソノレンシス(B. sonorensis)、B.スポロテルモデュランス(B. sporothermodurans)、B.ストラトスフェリクス(B. stratosphericus)、B.スブテルラネウス(B. subterraneus)、B.スブチリス(B. subtilis)、B.タエアンシス(B. taeansis)、B.テクィレンシス(B. tequilensis)、B.サーマンタルクティカス(B. thermantarcticus)、B.テルモアミロボランス(B. thermoamylovorans)、B.テルモクローカー(B. thermocloacae)、B.テルモモラクティス(B. thermolactis)、B.チオパランス(B. thioparans)、B.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、B.トリポキシコーラ(B. tripoxylicola)、B.ツスシー(B. tusciae)、B.バリスモーチス(B. vallismortis)、B.ベデリ(B. vedderi)、B.ビエトナメンシス(B. vietnamensis)、B.ビレティ(B. vireti)、B.ワコエンシス(B. wakoensis)、B.ヴェイヘンステファネンシス(B. weihenstephanensis)、B.キシアオキシエンシス(B. xiaoxiensis)およびそれらの混合物またはブレンドを含むことができる。
【０００８】
本開示の組成物および方法は、B.スブチリスまたはB.スブチリスに密接に関連したバチルス種を含むかまたは用いることができる。B.スブチリス株NH.259の16SリボソームrDNAの部分配列(Genbankアクセッション番号EU627171.1)は、本明細書では配列番号1で示される。B.スブチリスに密接に関連したバチルス種は、配列番号1を含む16S rDNA配列を含むかまたは、配列番号1に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義することができる。
本開示の組成物および方法は、B.アミロリクエシエンスまたはB.アミロリクエシエンスに密接に関連したバチルス種を含むかまたは用いることができる。B.アミロリクエシエンス株Chilli-1 16SリボソームrDNAの部分配列(Genbankアクセッション番号HQ021420.1)は、本明細書では配列番号2で示される。B.アミロリクエシエンスに密接に関連したバチルス種は、配列番号2を含む16S rDNA配列を含むか、または配列番号2に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義することができる。
本開示の組成物および方法は、バチルス種株の選択されたコンセンサス配列に密接に関連した16S rDNAを有するバチルス種を含むかまたは用いることができる。バチルス種株のコンセンサス配列の1つは配列番号3で示される。本開示の組成物および方法は、配列番号3を含む16S rDNA配列を含むか、または配列番号3に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含むバチルス種を含むかまたは用いることができる。
【０００９】
“パーセンテージ配列同一性”は、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)のウェブサイトで入手することができるBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(すなわち、Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250 に記載されている“bl2seq”(参照によりその全体が本願に組み込まれる))を用いて等しい長さの2つの配列をアラインメントすることによって決定することができる。例えば、配列番号1、配列番号2または配列番号3の間のパーセンテージ配列同一性は、NCBIウェブサイトで提供されているBLASTソフトウェアをオンラインで用いてこれらの2つの配列をアラインメントすることによって決定することができる。
2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の“パーセンテージ配列同一性”は、4つのヌクレオチドの頻度は同じであり、置換率は部位によって異ならないと仮定すると同時に、多重ヒットを補正し、トランジションおよびトランスバージョン置換率を考慮に入れる木村の2パラメータモデル(Kimura2-parameter distance model)(NeiおよびKumar(2000))を用いて決定することもでき、これはMEGA4(Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599)、好ましくはバージョン4.0.2またはそれ以後のバージョンにより実行される。ギャップ開始ペナルティとギャップ伸長ペナルティは、それぞれ15および6.66にセットされる。末端ギャップはペナルティなしである。ディレイダイバージェント配列スイッチは30にセットする。全ミスマッチスコアとマッチドペアスコアとの間のバランスとしてトランジション加重スコアを35から0.5にセットする。用いるDNA加重マトリックスは、x'sおよびn'sが任意のIUB多義性記号にマッチし、すべてのマッチドスコアを1.9とし、すべてのマッチドスコアをOとする。
【００１０】
本開示の組成物および方法のための適切なバチルス株は、本明細書で提供される実施例において開示された株を含む。これらの適切な株は、限定するものではないが、2012年4月27日に、アメリカ合衆国農務省(United States Department of Agriculture)に、それぞれ、アクセッション番号NRRL B-50745、NRRL B-50741、NRRL B-50742およびNRRL B-50743ならびにNRRL B-50745として寄託されたバチルス・スブチリス(Bachillus subtilis)株AB01ならびにバチルス・アミロリクエシエンス(Bachillus amyloliquefaciens)株AP79、AP143、AP193LおよびAP254Lを含む。
【００１１】
本開示のバチルス株は、エドワルドシエラ・イクタルリなどのエドワルドシエラ菌の種を含む、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物の種々の病原菌において抗菌活性を示す。いくつかの実施形態において、本開示のバクテリオファージまたはそれらのバリアントは、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物の病原菌または真菌を殺すかまたはその増殖を抑制するための方法に用いることができる。特に、本方法は、ナマズが住んでいるかまたは飼養されている環境(例えば養殖池)の病原菌または真菌またはコロニー形成によるナマズ(例えば、イクタルリ・プンクタートゥス・ラフィネスク(Ictaluri punctatus Rafinesque))の感染またはコロニー形成を制御または予防するために用いることができる。また、本開示の方法は、試料(例えば、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの感染した水生動物から得られた試料)あるいは養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物が住んでいるかまたは飼養されている環境から単離された試料における細菌の存在を検出するために用いることができる。
養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物を飼養するために用いられる環境または器械から病原菌または真菌を除去するために本開示のバチルス株を用いる方法であって、それによって、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物に細菌または真菌が広まる可能性を減ずる前記方法もまた開示される。
病原菌または真菌によって引き起こされる疾患を治療または予防するために(例えば、ナマズの腸敗血症(ESC)を治療または予防するために)本開示のバチルス株を用いる方法もまた開示される。さらなる実施形態において、病原菌または真菌の増殖を制御または抑制するために、あるいは病原菌または真菌を除去するために、本開示のバチルス株を環境(例えば池)または器械に投与することもできるし、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物に本開示のバチルス株を投与することもできる。
用語“ナマズ”とは、イクタルリ(Ictaluri)属に属する魚類のことを言う。ナマズは、イクタルリ・プンクタートゥス・ラフィネスク種を含むことができる。
【００１２】
本開示の胞子形成バチルス株は、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物に病原性を示す細菌または真菌の増殖を殺すかまたは予防するために用いることができる。“病原菌”は、限定するものではないが、A.ヒドロフィラ(A. hydrophila)、E.イクタルリ、E.タルダ(E. tarda)、F.コルムナーレ(F. columnare)、ストレプトコッカス・イニエ、F.コルムナーレ、エルシニア・ルケリおよびビブリオ種を含むことができる。“病原性真菌は、限定するものではないが、卵菌真菌サプロレグニアを含むことができる。
本開示の胞子形成バチルス株は、病原菌または真菌を殺すかまたはその増殖を抑制するための追加の薬剤を投与することができる。追加の薬剤は、スルファジメトキシンおよびオルメトプリムなどの抗生物質、細菌の弱毒化株(例えば、E.イクタルリの弱毒化株)、フロルフェニカルならびにバクテリオファージを含むことができる。バクテリオファージは、10801、ユニバーシティー・ブルヴァード(University Boulevard)、マナッサス、バージニア州20110-2209、米国に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に、アクセッション番号PTA-10342で、2009年9月15日に寄託された、ΦeiAUで表わされるバクテリオファージを含むことができる。
本明細書においては、用語“試料”は、その最も広い意味で用いられる。試料は、動物からの生体試料(例えば養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ))などの水生動物から得られる生体試料)を含むこともできるし、環境から採取される試料(例えば、池からの水試料または容器もしくは器械から採取される表面スワブ試料)を含むこともできる。
【００１３】
実施形態例
以下の実施形態は例示であって、請求された主題事項を限定するものではない。
【００１４】
実施形態1.バチルス属の胞子形成株を1以上含む飼料組成物。
実施形態2.バチルス属の胞子形成株がバチルス・スブチリスであるか、あるいは配列番号1を含む16S rDNA配列を含むバチルス種であるか、または配列番号1に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含むバチルス種である、実施形態1に記載の組成物。
実施形態3.バチルス属の胞子形成株がバチルス・アミロリクエファシエンスであるか、あるいは配列番号2を含む16S rDNA配列を含むバチルス種であるかまたは配列番号2に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含むバチルス種である、実施形態1に記載の組成物。
実施形態4.バチルス属の胞子形成株が、配列番号3を含む16S rDNA配列を含むバチルス種であるか、または配列番号3に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する16S rDNA配列を含むバチルス種である、実施形態1に記載の組成物。
実施形態5.バチルス属の胞子形成株が、2012年4月27日に、アメリカ合衆国農務省にそれぞれ、アクセッション番号NRRL B-50745、NRRL B-50741、NRRL B-50742、NRRL B-50743およびNRRL B-50745として寄託された、AB01、AP79、AP143、AP193L、AP254Lからなる群から選択される株である、実施形態1に記載の組成物。
実施形態6.飼料組成物が、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物のための飼料組成物である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態7.バチルス属の胞子形成株が、少なくとも約104CFU/飼料1gの濃度で組成物中に存在する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００１５】
実施形態8.バチルス属の胞子形成株が、少なくとも約105CFU/飼料1gの濃度で組成物中に存在する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態9.バチルス属の胞子形成株が、少なくとも約106CFU/飼料1gの濃度で組成物中に存在する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態10.バチルス属の単一の株を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態11.バチルス属の株の混合物を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態12.バチルス属の胞子形成株が、アエロモナス・ヒドロフィラ、エドワルドシエラ・イクタルリ、エドワルドシエラ・タルダ、フラボバクテリウム・コルムナーレ、ストレプトコッカス・イニエおよびエルシニア・ルケリからなる群から選択される1以上の細菌の増殖を抑制する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態13.バチルス属の胞子形成株が、卵菌真菌サプロレグニアの増殖を抑制する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態14.E.イクタルリを感染させるバクテリオファージをさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態15.バクテリオファージがφeiAUである、実施形態14に記載の組成物。
実施形態16.スルファジメトキシン、オルメトプリム、およびフロルフェニカルからなる群から選択される薬剤をさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
【００１６】
実施形態17.E.イクタルリの弱毒化株をさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態18.バチルス属の胞子形成株が、カルベニシリン、アンピシリン、スペクチノマイシン、オキサシリン、バンコマイシン、セファロチン、ノボビオシン、スルファジアジン、アミカシン、エリスロマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、クロラムフェニコール、スルファメトキサゾール、ノルフロキサシン、ゲンタマイシンおよびシプロフロキサシンからなる群から選択される1以上の抗生物質に感受性を示す、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態19.前述の実施形態のいずれかに記載の飼料組成物を動物に投与することを含む、動物の疾患の治療または予防方法。
実施形態20.動物が、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物である、実施形態19に記載の方法。
実施形態21.疾患が腸敗血症である、実施形態19または20に記載の方法。
実施形態22.水環境への投与のために処方され、腸敗血症を治療または予防するためのバチルス属の胞子形成株の有効量を含む殺微生物組成物。
実施形態23.水環境が、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物が飼養される環境である、実施形態22に記載の組成物。
実施形態24.養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物の腸敗血症の治療または予防方法であって、養殖魚(例えばナマズまたはティラピア)および甲殻類(例えばシュリンプ)などの水生動物が飼養される環境に実施形態22に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
以下の実施例は例示であって、請求された主題事項を限定するものではない。
【実施例１】
【００１７】
アメリカナマズの疾患の生物的制御
序論
米国南東部におけるアメリカナマズ(イクタルルス・パンクタツス(Ictalurus punctatus))の商業生産の環境持続可能性および経済的妥当性を改善する大きな潜在能力を有する研究が提案される。エドワルドシエラ・イクタルリならびに他の病原菌および病原真菌(例えば、アエロモナス・ヒドロフィラ、フラボバクテリウム・コルムナーレおよびサプロレグニア種)によって引き起こされるナマズ(ESC)の腸敗血症は、毎年、ナマズ産業に数百万ドルの損失を与えている。養殖業者にとって、疾患の生物的制御のための有益な微生物の使用は、1)低いアプリケーションコスト、2)他の細菌、環境またはヒト消費者に有害な影響のないことおよび3)生物的制御と既存の疾患制御戦略との間の期待される相乗効果、という期待利益を有する。
本研究は、ナマズを冒す病原体を制御するための代替戦略をナマズ生産者に提供し、それと共に、より効率的な生産を促進し、田舎の南東部州の養殖業者の経済生活にプラス効果を与えることによって、最終的にはナマズ生産者のためになると考えられる。さらにまた、養殖池の抗生物質(または他の化学物質)処理の必要性を減じるかまたは除去するによって、生物的制御は、養殖生産の環境への悪影響を減らすことができる。養殖池における疾患の発症頻度と重症度を低下させる生物的制御剤を適用する最終目標を有する環境にやさしく費用対効果が高い技術が所望される。
【００１８】
ここ30年間では、北アメリカにおいて、アメリカナマズの養殖は最も成功した動物生産産業の1つであり、現在、アメリカ合衆国における最も大規模な養殖産業の代表である。2009年においては、2億1千万kgを超えるナマズが加工されたが、これは生産者による直売の総売り上げ高3億6千万ドル以上に相当する。アラバマ州、アーカンソー州、ルイジアナ州およびミシシッピ州において全ナマズの90%以上が生産され、主として大きさが2〜10ヘクタールの土の池において飼育されている(USDA, Part I: Reference of Fingerling Catfish Health and Production Practices in the United States, 2003; USDA, Part II: Reference of Foodsize Catfish Health and Production Practices in the United States, 2003)。ナマズ養殖業者は、一般的には、高い密度で魚を放流し、環境条件が大変急速に変化し得る養殖システムを用いる。これらの悪条件は、魚に追加のストレスを与え、種々のナマズの疾患の発症および集団発生に好条件を与える。その結果、ナマズ産業において、多くの疾患が生じ、集団発生となる。これらの集団発生の最も重要なものはESCであり、全操業の78%以上において損害が生じ、食用魚生産池の42%において発生が報告されている(USDA, Part I: Reference of Fingerling Catfish Health and Production Practices in the United States, 2003; USDA, Part II: Reference of Foodsize Catfish Health and Production Practices in the United States, 2003)。飼料価格の高騰は高い疾患発生率と共同して、アメリカナマズ生産者に経済的困難をもたらしている。
【００１９】
E.イクタルリは、アメリカナマズに高度に宿主特異的なグラム陰性桿菌である(Plumb(1999))。本細菌のナマズ産業における経済的影響は、1981年にESCの病原体として初めて記載されて以後、著しく増加した(Hawkeら(1981))。今日、ESCは、ナマズ産業に年間2千万ドル〜3千万ドルの直接損失を与えていると推定されている(Delbosら(2001))。アメリカナマズにおいて、腸敗血症は急性型、亜急性型および慢性型で発症する(Hawkeら(1981))。ESCを有する魚は力なく、多くの場合、水の表面を不規則ならせんを描いてゆっくりと泳ぐ。疾患が進行するに従って、この魚の脇腹および背中に沿って出血および潰瘍が認められる。慢性疾患の魚では、頭頂部に開いた傷口ができる場合があり、この疾患に一般名‘頭部穴あき病’が与えられている。
また、A.ヒドロフィラはグラム陰性菌病原体であり、世界中に分布するすべての淡水魚において出血性敗血症を引き起こすことによって、E.イクタルリよりも広い宿主域を有する(Ciprianoら(1984);Fordら(1991))。A.ヒドロフィラ感染によって生じる損失は、一般的には、E.イクタルリによって生じる損失よりもかなり程度が低く、多くの場合、ストレス、取扱いまたは日和見感染と関連する二次的病原菌と考えられている(Plumb(1999))。しかしながら、アラバマ州のナマズ生産者の間での2009年のA.ヒドロフィラ感染の集団発生は、アメリカナマズ疾患池のナマズの生物的制御の間でのそのビルレンスおよび速い伝播において過去にないものであった(Terhune、Lilesら、投稿準備中)。この新規A.ヒドロフィラ株の発生は、アラバマ州西部の48養殖場で記録され、生産コストがすでに大きく投入されてきた主として収穫期のサイズの動物である魚に380万ポンドの推定損失を引き起こした(W. Hemstreet, personal communication, Alabama Fish Farming Center, Greensboro, AL)。
【００２０】
若い当歳ナマズは、ESCおよび他の病原体に最も感染しやすい。8月下旬または9月に、水温が夏季の最高温度からE.イクタルリの増殖が促進される温度(22〜28℃)にまで下がった場合に、稚魚飼育における発生が始まる。魚が初感染から生き延びた場合、魚は、獲得免疫系による応答によってその後の感染に対して免疫になることができる(Klesius(1992))。食用サイズの魚の生産のために管理される池は、通例、池の連続的な収穫を可能にするために、生産サイクル中に複数回稚魚が新たに供給される。故に、食用魚生産池は、通例、種々の年齢および免疫状態を有する魚の混合物を含む。食用魚池における成魚の大部分は、すでに疾患の発生を経験しており、その疾患に免疫であるが、それらの一定の割合は、その病原体のキャリアとなる(Klesius、P.H.(1992))。従って、未経験稚魚が食用魚池に放流される場合、それらの稚魚は池環境における病原体に暴露されるため、それらの稚魚は疾患を発生しがちである(Wiseら(1998))。
ESC、A.ヒドロフィラおよび他の病原菌を制御するための初期の努力は、抗生物質添加飼料で飼養することに基づいて行われた。過去20年間、ESCおよびアエロモナス感染を制御するために米国食品医薬品局(FDA)によって認められた抗生物質は、それぞれRomet(登録商標)(オルメトプリム-スルファメトキシン)およびテラマイシン(登録商標)(オキシテトラサイクリン)だけであった。最近、FDAは、ESC発生に対するAquaflor(登録商標)(フロルフェニカル)の使用を認可したが、現在これはSchering Plough社によって市販されている(Gauntら(2003);Gauntら(2004))。しかしながら、薬物を添加した飼料は高価であり、処理集団から感染を除去するために薬物を添加した飼料の適切な量を病気の魚は食べないため、商業実務に通例わずかにしか影響がない。さらに、Aquaflorは、獣医師への飼料指示によってのみ投与することができ、これは認可された獣医による細菌の同定および発行を必要とし、これはさらに矯正的治療行為の実行を遅らすことになる。抗生物質の体系的な使用はまた、細菌耐性の発生を引き起こした(Khoo(2001))。ストーンビルにおけるナマズ池の最近の研究において、MSは、Aquaflor(登録商標)24に耐性を付与する、E.イクタルリ疾患分離株におけるプラスミドの存在を示した。
【００２１】
大部分の生産者は、ESC発生中に死亡率を低下させるために、給餌の使用の制限を織り込んだ。しかしながら、給餌量を減ずることによって、魚の成長は犠牲となり、生産者の利益に著しく影響を及ぼした(Wiseら(1998))。最近、ワクチン接種目的で、E.イクタルリの生弱毒化株が開発され、実験条件下および商業的条件下の両方で、10日齢でワクチン接種したとき、稚魚のアメリカナマズにおいて限定的な防御が認められた(Limら(2003);Shoemakerら(1999);Wiseら(1998);Wiseら(2001))。しかしながら、多くの場合、ワクチン接種された魚集団に疾患が生じ、先行投資のコストがひどく高いものになり得るため、このワクチンはナマズ生産者に広くは受け入れられていない
ナマズの疾患の予防のために種々の制御戦略が用いられてきたが、それでもやはり、今でも病原体による著しい損失が生じるため、ナマズ生産者は、他の相補的アプローチを歓迎するであろう。有効な生物的制御剤は、優れた有効性を必要とし、大変低コストであり、強力な抗菌活性を有し、環境への悪影響がないものであるが、理想的には、有機産物としてナマズの売買を可能にするものであろう。最近、本発明者らによって生物的制御剤が同定された。
【００２２】
論拠および意義
あらゆる動物は、各動物の外部および内部に多くの特有の微生物生息環境を有する複合微生物生態系の宿主である。この複合微生物共同体は、疾患に対する防御を提供し、必須栄養素の取得の助けとなることができる。病原体を抑制し、動物および植物の作物の健康および成長を促進する有益な微生物は、農業および養殖の両方において接種剤として活用されている。提案された本研究は、1)病原菌および病原真菌による疾患を予防し、2)持続可能な養殖業務を促進し、3)アラバマ州の養殖業者の生計のためになる、養殖に使用するためのバチルス株を明らかにする。
農業を悩ます疾患を予防および制御するための生物的制御の使用によって、食用作物生産における化学農薬および抗生物質の必要性が減少することがすでに明らかにされている(Kloepperら(2004);Lewisら(1997);Zehnderら(2001))。代替農薬としてのバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Bt)の殺虫毒素の世界的な使用は、有益な微生物およびその天然産物の、食物の安全性のためになり、化学療法レジメンへの依存を減らし、経済的および環境的に持続可能な生産を助長する能力の1例である(Sanchis(2008))。農業と同様に、養殖は、高密度単一作物システムに依存するため、病原微生物の増殖に理想的条件を提供する。養殖場で飼養される魚および甲殻類の抗生物質処理は、ヒト集団に持ち込まれる恐れがある抗生物質耐性病原体の出現率の増加をもたらし、疾患制御の高価な化学的方法に依存せざるを得ない養殖業者の市場価値を低下させる。21世紀には、上質な動物タンパク源の需要が増し、野生魚の資源も枯渇することが予想されるため、養殖業務に組み込むことができる、環境的に持続可能で費用効果がある方法の社会的必要性がある(Harlander(2002);Serageldin(1999))。
【００２３】
本発明者らは、病原菌または病原真菌による植物の疾患の予防に生物的制御剤として作用するバチルス属の胞子形成メンバーである有益な細菌の有効性を明らかにした(Kloepper et al., “Theory and applications of rhizobacteria for transplant production and yield enhancement”, 2004; Kloepper et al., “Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp.”, 2004; Kokalis-Burelle et al., 2003)。また、場合によっては、バチルス株は、作物の成長を劇的に促進し、土壌栄養素の植物による取り込みを増加させることが見出された(Enebakら(1998);Kloepperら(2004);Kokalis-Burelleら(2003))。バチルスの胞子を植物の種子または根に用いることによって、植物が病原体に暴露された場合に、疾患症状および死亡率の有意な減少をもたらすことができる。アメリカナマズの腸管ホモジネートから単離されたバチルス培養物(n=17)に加えて、植物病原体に対して有用なバチルス生物制御株の大規模な収集物(n=160)を、養殖疾患および世界中の経済的損失の主要な原因である7つの病原体のパネルに対する生物制御活性に関して試験した(例えば図1)。具体的には、病原菌A.ヒドロフィラ、E.イクタルリ、E.タルダ、F.コルムナーレ、ストレプトコッカス・イニエ、F.コルムナーレ、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)、エルシニア・ルケリおよび卵菌真菌サプロレグニアに対する活性に関して細菌分離株のそれぞれを試験した。このバチルス株の収集物の中から、それらによる病原体増殖のin vitro抑制に基づいて、養殖用途に最も有効な株(n=21)を同定した。バチルス胞子をナマズ飼料に別々にスプレーし(〜106CFU/g飼料)、アクアリウムに収容したナマズの稚魚をバチルスで改善した飼料を1週間給餌し、次いで3日間通常飼料を給餌し、次いで動物を殺し、腸管組織1g当たりのバチルス数を推定することによって、アメリカナマズの腸内で生存し増殖する能力に関してこれらの21のバチルス株を試験した(図2)。バチルス株の多くは高い菌数を達成し(>108CFU/g腸)、それらがナマズ消化管に首尾よくコロニーを作ったことが示唆されたが、7つの株は(固有の腸管集団からの)対照群と同様なバチルスレベルを有していた。進行中の試験によって、ナマズの腸から回収された代表的バチルスコロニーの16S rRNA遺伝子配列が決定されて、それらが、改善飼料によって動物に導入されたものと同じ株であったことが実証されると考えられる。
【００２４】
いくつかのバチルス株を選択することによって“バチルスカクテル”を調製し、おおよそ105CFU/株/g飼料に等しい量でナマズ飼料にバチルス胞子を添加した。バチルスで改善した飼料をナマズの稚魚に給餌し(n=15/タンク、5タンク/治療群)、2日後に2x105CFU/ml E.イクタルリ株S97で浸漬チャレンジ(immersion challenge)し、次いで死亡率を経時的に記録した。バチルスで改善した飼料を給餌したナマズに関して、対照群と比較して死亡率の有意な減少が観察された(図3)。アメリカナマズの飼料に導入されたバチルス胞子は、制御されたアクアリウム疾患モデルにおける疾患および死亡率を減少させる能力を有することをこの実験は明らかにした。本提案と共に、これらの科学者らは、アメリカナマズにおける疾患制御のためにバチルス生物制御株を試験し、生物的制御用途のためのこれらのバチルス株(単数または複数)を開発するために、重要な実験を行うであろう。
疾患制御のための有益なプロバイオティクス菌の将来性にもかかわらず、科学のこの分野は、いくつかの提案されたプロバイオティクスの評価において科学的厳密性を欠くことによって限定されており、有効であり規制当局の認可を得ることができる多くの可能な生物剤を体系的に評価する必要がある。本明細書に開示された実験は、1)アメリカナマズ飼料への添加によって疾患制御のために使用することができる特定のバチルス株を同定し、2)疾患の予防に最高の約束を示す特定のバチルス株(単数または複数)のゲノム配列を完成し、3)各バチルス株によって産生される抗生物質(単数または複数)の構造を決定し、4)バチルス投与に関する理想的な用量およびタイミングに関して有効性試験を行い、5)バチルスで改善したナマズ飼料での長期飼養後のナマズの健康を評価することである。本研究のために、疾患の予防における相対的有効性の合理的評価およびアメリカナマズ生産のために首尾よく使用するのに重要な上記の特定の基準によってバチルス株が選択されるであろう。
【００２５】
アプローチ
ESCの制御のための各バチルス株の相対利益の試験
各特定の細菌株の細菌による生物的制御を評価するために、アクアリウムにおける制御された実験感染を用いる。それぞれの生物的制御活性に関する細菌培養物の感染防御効果の確証において、いくつかの変数が評価される。商業用途には長期環境貯蔵が必要条件であるので、生物的制御能力を評価するために、バチルス属内の内生胞子形成細菌が選択された。1)複数の養殖病原体に対して強い阻害活性を発揮し(例えば図1)、2)ナマズの腸内で生存し、複製することができる(図2)15のバチルス培養物に関して、アクアリウム内のESCチャレンジに対して別々にスクリーニングし、in vivo感染防御効果のための最も有効な株が同定される。各バチルス培養物を胞子形成培地上で48時間増殖させ、次いで滅菌綿棒で細菌細胞を取り去り、50mlコニカルチューブ内の滅菌水に懸濁する。滅菌水で2回洗浄後、生菌コロニー形成単位(CFU)に関して胞子懸濁液を試験し、次いで、8%の用量(v/w)で胞子懸濁液をスプレーすることによっておおよそ107細菌CFU/g飼料でナマズ飼料をコーティングするために用いる。ナマズに給餌する前に細菌コーティング飼料を乾燥する。バチルス胞子コーティング飼料は、給餌の前に4℃で保存され、内生胞子形成のために、長期(数ヶ月間)貯蔵の間、高度に安定していると期待される。
【００２６】
制御されたアクアリウムチャレンジにおいてESCを予防する個々のバチルス株の評価
これらのチャレンジ実験において、バチルス1株あたり4つのアクアリウムを用いるか、あるいはアクアリウムあたり15匹の特定病原体不在稚魚ナマズを含む対照群を用いる。チャレンジの1週間前に、1日1回、特定のバチルス株でコーティングされたナマズ飼料で充足するまでナマズの稚魚に給餌し、対照タンクには、滅菌細菌細胞(オートクレーブ処理によって)を添加するかまたは細菌を添加しない。チャレンジアッセイに関しては、静置条件下で、おおよそ105CFU/mlの対数増殖期E.イクタルリ培養物をアクアリウムに加える。魚の生存を毎日モニターし、用いた処理のそれぞれにおける最終生存率をESCの発症を予防する各バチルス株の能力を評価するために使用する。ナマズ生存率にバチルスの有害な影響がないことを確かめるために、対照タンクには生菌で改善した飼料を入れるが、E.イクタルリを入れない。
【００２７】
各バチルス株によって産生される抗生物質(単数または複数)の解析
抗生物質産生バチルス株のそれぞれは、その増殖培地中に抑制化合物(単数または複数)を分泌することが見出された。M9最小培地または複合tryptic soy broth培地のいずれかで培養されたバチルス株の無細胞上清は細胞ベースのバイオアッセイにおいて以前に試験された病原体に対して抗菌活性を有する(例えば図1)。バチルス株によって産生される抗生物質(単数または複数)の同定は、疾患制御のために、単独で、または組み合わせで、これらの株の使用のために来るべき規制当局の認可にとって大変重要であろう。
【００２８】
液体クロマトグラフィー(LC)による抗生物質の部分精製
化合物は、最初に、サイズ排除LCおよび逆相LCを用いて精製され、本明細書に開示されたバイオアッセイを用いて試験される。部分精製された化合物は、使用済み培地からの迅速抽出条件を決定するために種々の有機抽出および相分離にかけられる。これらの条件を確定した後、‘最終’精製ステップとして定義されたC18保持指数を用いて精製を進める。この戦略は、可能であれば精製を3段階プロトコルに限定することによって、生物活性化合物の迅速精製の達成に努める。
多くの薬物合成経路は2以上の産物を生じる。不活性な化合物に加えて、様々な効力および活性スペクトルを有する化学的に関連する抗生物質を含むことができる。例えば、抗癌剤候補物質であるエポチロンを産生する細菌は、その培地中に化学的に類似したエポチロンA、BおよびDを分泌する(Tangら(2000))。これらのような共存する薬物様分子は、画分の中から、複数の活性ピークとしてLCによって分離されることができる。最初のLC部分精製ステップによって活性化合物が分離され、個々の化合物の抗菌活性スペクトルが明らかにされる。個々の成分を均一になるまで精製することによって、その下流の質量分析法(MS)解析の成功の見込みが著しく増す。
【００２９】
3つのタイプの抗生物質分子(小ペプチド、有機分子または脂質)が得られる可能性がある。サイズ排除クロマトグラフィーおよびC18クロマトグラフィーによって、これらのクラスを分離することができる。C18に保持されないことによって、追加の化学的性質を試みる必要が生じる場合がある。しかしながら、バチルス抗生物質の一次スクリーニングにおいて、我々は、最初の精製で単分散であることが明白であるUV活性化合物を好む。複雑な混合物の分離を促進するために、溶媒系およびpHの変化が用いられるが、本明細書に開示されたバイオアッセイは、我々の分子の完全性をモニターするための強力なツールを提供する。大量に精製されることができる活性化合物は、構造情報に関してLC/MSで分析される。多くの潜在的障害が化合物の精製を妨げる場合がある。生物活性が多サブユニット分子によるものがあり、これらはクロマトグラフィーによって成分が分離されるときに活性を消失する恐れがある(例えばヴィオラセイン)。さらに、LC中の溶媒和および他の処理は一部の分子を不活化する場合がある。これらの2つの選択肢を識別するために、種々のクロマトグラフィー分画を合わせ、活性の回復を試験することができる。
【００３０】
活性化合物の化学解析
薄層クロマトグラフィーおよびMS分析を用いて活性化合物の化学解析が試みられる。薄層クロマトグラフィー(TLC)は、バチルス株によって産生される抗生物質の最終化合物(例えば、UVモニタリング、硫酸炭化)および化学官能基(例えば、ニンヒドリン反応またはアセチル化反応)の均一性を試験するための安価な戦略として用いられる。これらの最初の化学的アッセイは、MSおよびNMRなどの複雑な分析の基礎を築く。LC/MS条件はまた、混合試料中に存在する可能性のある任意の潜在的なイオンの抑制の回避を可能にする。さらなるLC/MS実験はまた、精製戦略の精密化に有益である。構造的類似性を有するグループに化合物を分類するために、追加のLC/MS/MSおよび精密質量実験が行われる。1ラウンドのLC/MS/MSからの構造データは、多くの場合、分子構造を完全に決定するためには不十分である。それにもかかわらず、前述の化合物を同定するために、データを文献値とマッチさせることができる。不完全な構造データであっても、溶解性および安定性を予測するために用いることができ、分子量の決定によって、既知のモル濃度の溶液の調製が可能となる。既知の濃度の抗生物質を調製できることは、有効性および細胞毒性の決定にとって重要である。化学構造解析が行われる。予備的LC/MSデータは、活性分子の構造決定の助けとなる。産物分子の構造を見出すための抽出および化学分析は比較的費用のかかるプロセスである。プロジェクト予算を節約するために、事前評価に合格した、顕著な生物的制御活性を有するとして同定されたバチルス株に対応する、少数(例えば6未満)の活性の高い抗生物質のみに関して完全な化学構造解析が行われる。各構造類似性グループからの有望な候補分子は、分光学的技術(UV-vis、UV-vis-NIR、FT-IR、FT-ラマン、GC-FTIR、共鳴ラマンおよびNMR分光法)のフルセットを用いてさらに解析される。初期段階において、化合物を類別するために、一次元1Hおよび13C NMR(天然存在比で)実験ならびに多次元NMR 1H-13C (天然存在比で)異核種単一量子コヒーレンス法(HSQC)実験を行う。完全NMR解析もまた行うことができる。
【００３１】
種々の病原体に対する抗生物質の相対的有効性の決定
抗生物質としての能力に関して化合物を評価するために、絶対的および相対的有効性データを用いることができる。以前に試験した病原菌および病原真菌のそれぞれ(n=7、上記参照)を、最小発育阻止濃度(MIC)を測定するために、精製された抗生物質(単数または複数)の希釈系列に暴露させる。精製された化合物およびLC/MS構造解析からの分子量データを用いて、既知濃度に化合物を溶解する。標準的抗生物質アッセイ条件および培地(必要に応じてカチオン調整ミューラーヒントンブロス)を、抗生物質の有効性を評価するために用いる。簡潔に言えば、対数増殖期の細菌培養物を3連で広範囲の抗生物質濃度で接種し、陰性対照(抗生物質に用いられる溶媒または緩衝液)に対して増殖抑制が測定される。各細菌種の増殖動態がMIC50(50%増殖抑制)の算出によって測定され、各化合物の有効性が他の既知の抗生物質に対して比較される。陽性対照は、あらかじめ確定された効力を有する種々のクラスの抗生物質を含む。
【００３２】
最も有効なバチルス生物制御株(単数または複数)のゲノムの配列決定
本明細書において、実験によって同定されたバチルス株は配列決定されることができる。得られたDNA配列情報は、環境に導入された有益な株の移動をモニタリングするためのDNAベースの株特異的追跡システムを開始するために用いることができる。さらに、本研究は、天然物の合成に関与する生合成経路の多数の遺伝子の明細目録を提供し、各株の代謝および酵素能力を示し、それによって、バチルスの世界的な遺伝子発現をアッセイし、生物的制御中に抗菌剤の生合成を促進するためにこれらのゲノム配列を使用する将来の研究を可能にする。
【００３３】
バチルス株のゲノム配列決定およびアセンブリ
予想される各バチルス株のゲノムサイズは、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)によって推定される。大部分のバチルスゲノムは4〜7Mbpであるため、次世代配列決定アプローチを用いれば、バチルスゲノムの50倍のカバレッジを容易に達成することができる。454パイロシークエンス(454pyrosequencing)を用いる>30xゲノム配列カバレッジ(〜500bpの読み取り長)およびIllumina sequencingを用いる>50xゲノム配列カバレッジ(〜70bpペアエンド読み取り長)の両方を用いる組み合わせアプローチがデノボ細菌ゲノム配列決定の最適の戦略である。DNA抽出のためにバチルス培養物を大規模(500ml)に増殖させ、ゲノムDNAをバーコードサブライブラリーとして調製し、配列決定する。1/2プレート454フォーマットを用いれば、単一のバチルスゲノムに対して十分な程度の配列カバレッジが得られる。これらのゲノム配列は、1つの連続ゲノムにアセンブルされる。ハイスループットデノボゲノムのアセンブリと注釈を行うために、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージである、CLC Bio Genome Workbenchが用いられる。特に、ゲノム解析は、抗生物質合成に関与する遺伝経路を同定し、病因(例えば、ヘモリシン、毒素)に潜在的に関与する任意の遺伝子(単数または複数)の根拠のためにゲノムをスキャンすることを試みる。予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)のリストは、他の完全に配列決定したバチルスゲノムを訓練データとして用いる隠れマルコフモデルを用いて同定される。バチルスORFのデータベースは、BLASTアルゴリズム探索によるGenBank nr/ntデータベースおよび、それぞれのORFのトップGenbankヒットに従って調製した予備的注釈と比較される。完全(またはほぼ完全)バチルスゲノムは、所外ファンディング機会を支えるための将来の遺伝子マイニング実験および遺伝子発現実験の価値ある資源である。
【００３４】
抗生物質合成を欠くバチルス変異体の作成
抗生物質合成に必要な特定の遺伝子(単数または複数)を同定するために、Marinerトランスポゾンシステム(Wilsonら(2007))を用いて完全ゲノム配列決定のために選択されるバチルス株(n=3)を無作為にトランスポゾン変異させる。バチルスTn変異体はスペクチノマイシン耐性をコードし、各変異体コロニーは、E.イクタルリの対数増殖期の培養物を含む軟寒天(0.7%)でオーバーレイする。阻止帯を欠く変異体のそれぞれを、さらなる研究のために選択する。このように、機能喪失のための数万もの変異体を大変素早くスクリーニングすることが可能であり、網羅的な収集物が提供される。変異体のそれぞれは、トランスポゾンカセットのプローブターゲッティングを用いてサザンブロット分析によって比較し、それによって、同じ(または直接隣接した)遺伝子座にトランスポゾン挿入を有する変異体が示される。E.イクタルリの増殖を抑制する抗生物質の機能喪失が、同様に他の病原体に対しても欠損しているかどうかを決定するために、あらゆる特有の変異体は前述の病原菌および病原真菌のより広いパネルに対して試験される。これはバチルス株が複数の抗生物質を発現することができる場合に行われるが、その場合、抗生物質合成を欠損する機能喪失変異体を同定するために、一次スクリーニングに種々の病原体を用いることができる、
抗生物質の合成に必要な遺伝子(単数または複数)を同定するために、特有の変異体のゲノムDNAが抽出され、トランスポゾン挿入部位に隣接したバチルス遺伝子(単数または複数)を同定するために、トランスポゾンカセットの内部に対するプライマーを用いるインバースPCRの鋳型として用いる。ゲノム内の各トランスポゾンの相対挿入部位を示すために、これらのDNA配列が完全バチルスゲノム配列(参照ゲノムとしての)と比較される。E.イクタルリおよび他の病原体の増殖または生存を害することができる抗生物質の合成に関与する遺伝経路(単数または複数)を理解するために、これは重要な情報である。生物的制御のために複数のバチルス株を用いることによって、これは実際上複数の薬物製剤を用いていることになるが、それによって薬剤耐性病原体の可能性が減少する。抗生物質の合成を欠くバチルス変異体が、その野生型親株と比較して、その生物的制御活性が害されるかどうかを試験することもまた目的である。
【００３５】
疾患の生物的制御のための最適バチルス株製剤の開発
疾患の生物的制御のための最適のバチルス株または株の組み合わせの選択は、多くの異なる実験データ源によって導くことができる。提案された本研究によって、最適のバチルス株(単数または複数)およびESCの制御のための条件が同定される。
【００３６】
バチルスの用量依存性
in vivoで疾患を制御する各株の能力を評価するためのこれらの実験の最初に、E.イクタルリ感染および死亡を予防するとして前述された最も好ましいバチルス株の内の4つを、投与のために飼料に組み込む最も好ましい用量を決定するために用いる。バチルス胞子および飼料の調製は前述のように行われる。しかしながら、飼料に組み込まれる胞子数は変更される。用量は、104、105、106または107CFU/飼料1gに加えて対照治療を含む。魚は、(前述のように)チャレンジアクアリウムに入れられ、治療群(1用量当たり5連のアクアリウム)に分けられ、毎日充足するまで治療用飼料で給餌し、治療用飼料での給餌を2週間続ける。魚は、前述のように、静置浸漬下でチャレンジされる。魚は、チャレンジの日には給餌しないが、チャレンジ1日後に給餌を開始し、割り当てられた治療用飼料でチャレンジ研究の間給餌を続ける。死亡は、少なくとも21日間モニターする。各バチルス株は別々に評価される。
【００３７】
予防法または治療法としてのバチルス
実験の第2シリーズにおいて、バチルス株は、進行中の感染の予防および/または除去能力に関して試験される。これらの試験は、チャレンジのタイミングに関して、胞子が魚に最初に給餌される時間を変えることによって行われる。上記で同定され、用いられる各バチルス株に関して、対照群に加えて、4つの開始時間が評価される。前述のように、魚はチャレンジアクアリウム中に放流され、以下の治療群の1つに無作為に割り付けられる:1)チャレンジ1週間前に開始されるバチルスで改善した飼料、2)チャレンジ3日前に開始されるバチルスで改善した飼料、3)チャレンジ1日後に開始されるバチルスで改善した飼料、4)E.イクタルリに関連する死亡の初日(臨床徴候および行動的徴候に基づく)に開始されるバチルスで改善した飼料および5)対照飼料。すべての治療群は、実験を通じて、充足するまで提供される飼料量で、バチルスで改善した飼料を給餌される。飼料の調製およびチャレンジプロトコルは、前述のように行われる。
【００３８】
バチルス投与に関連する成長および病状
上記のバチルスの用量に基づいて、最も好ましいと同定された4つの細菌株のそれぞれおよび最も好ましい用量のそれぞれを用いて、ナマズを発育成績試験に供する。適切なバチルス用量を用いて、飼料を既述のように調製する。幼魚(各〜5g)を一まとめにして計数し、計量してアクアリウムに入れ、治療群あたり4連のアクアリウムを用い、1連あたり16匹の魚を用いる指定される飼料治療群に無作為に割り付ける。魚は、1日一回、調製された飼料を用い、おおよそ4〜5%体重(およその充足;最初の体重に基づく)で給餌する。飼料は毎日計量する。2週間ごとに8週間、すべての魚をタンクから取り除き、一まとめにして計量し、体重によって与える飼料量を調節する。4週目および8週目に、各タンクから4匹の魚を取り出す。腸下部を摘出し、その組織に住み着いている望ましいバチルス微生物数を評価するために用いる。組織病理学的評価のために、残りの魚組織を10%中性緩衝化ホルマリン中に保存する。魚の最終体重を用いて発育成績への影響および飼料要求率を決定する。
【００３９】
ESCの生物的制御のための種々のバチルス株の組み合わせ(“カクテル”)
各バチルス“カクテル”のESC疾患の抑制におけるその能力を評価するために、あらゆる可能な組み合わせで、その理想的な用量で各バチルス株を使用する。等しい胞子用量の1から4までのバチルス株を用いて、既述のように治療用飼料を調製する。1連あたり15匹の魚を用い、カクテル治療群あたり5連のアクアリウムを用いて、前述のように魚チャレンジ実験を行う。次いで、チャレンジ1週間前に適切な治療用飼料で魚を給餌し、次いで実験の間チャレンジ後を続ける。
【実施例２】
【００４０】
ナマズ病原体の生物的制御のためのバチルス株の同定
実施例1において提案され完了された研究は、以下の実施例2においてさらに実施され、反復される。
要約
ナマズにおける疾患の生物的制御のためのバチルス株を選択し評価した。土壌またはアメリカナマズの腸からバチルス株を単離し、エドワルドシエラ・イクタルリおよびアエロモナス・ヒドロフィラに対する強力な拮抗作用に関してスクリーニングした。21株を選択し、他の水中病原体に対するそれらの拮抗作用もまた試験した。アメリカナマズの腸における各バチルス株の生存を決定し、最も好ましい抗菌スペクトルおよび腸管生存を有する5つのバチルス株を、さらに、レプリケートアクアリウムにおけるE.イクタルリチャレンジに対する防御活性に関して評価した。2つのバチルス株が、ナマズ死亡率の低減に著しい効果をもたらした(P<0.05)。5つのバチルス株の内の4つを用いてベトナムで行った同様なチャレンジ実験もまた、ゴンズイにおいて、E.イクタルリに対する感染防御効果を示した。選択された株の内の3つにおける安全性試験において、臨床的に重要な抗生物質に対するプラスミドおよび耐性の存在が示されなかった。E.イクタルリによって引き起こされる疾患の制御のための飼料サプリメントとして投与されるとき、バチルス株はナマズに有益であった。本研究において選択されたバチルス株は、抗菌化合物の現行の使用に代わる費用対効果が高い選択肢として、養殖における潜在的な用途を有する。
【００４１】
序論
アメリカナマズ(イクタルルス・パンクタツス)の養殖は、ここ30年間では、北アメリカにおいて、最も成功した動物生産産業の1つであり、現在、アメリカ合衆国における最も大規模な養殖産業の代表である。アラバマ州、アーカンソー州、ルイジアナ州およびミシシッピ州において米国における全ナマズの90%上が生産され主として大きさが2〜10ヘクタールの土の池において飼育されている(USDA 2003a、2003b)。ナマズ養殖業者は、一般的には、高い密度で魚を放流する。
高密度の魚の養殖と関連する高い給餌量は、日和見菌の増殖を促進する(Austinら(1995))。また、高い魚密度ならびに養殖池の温度および化学組成の急激な変化は、魚にストレスを与え、疾患の開始および蔓延に好ましい条件ができる。グラム陰性細菌エドワルドシエラ・イクタルリ(Hawke(1979))によって引き起こされるナマズ(ESC)の腸敗血症は、アメリカナマズ養殖産業における最も重要な地域流行である(HawkeおよびKhoo(2004))。ESCによって生じる損失は、全操業の78%以上において報告され、食用魚生産池の42%において発生が報告され、経済的損失は2千万ドル〜3千万ドルである(Wagnerら(2002);USDA 2003a、2003b)。
【００４２】
アメリカナマズにおけるもう1つの重要な病原体はアエロモナス・ヒドロフィラであり、これは運動性アアエロモナス敗血症(MAS)の主要な原因菌であり(Harikrishnanら(2003))、ティラピア、ナマズ、キンギョ、コイおよびウナギを含む多数の魚種を感染させることができる(Pridgeonら(2011))。2009年および2010年において、養殖アメリカナマズにおける疾患の集団発生の病原体としてA.ヒドロフィラが同定され、MASにおける典型的な死亡率よりも高い死亡率が認められ、アラバマ州の商業用ナマズ産業において3百万ポンド以上のナマズの損害が生じた。この集団発生中に病気の魚から単離されたA.ヒドロフィラ株(例えば株AL09-119)は、A.ヒドロフィラ参照株よりも、アクアリウム疾患チャレンジ研究において悪性が高い(Pridgeonら(2011))。
ゴンズイ(striped catfish)として一般に知られているパンガシアノドン・ヒポプタルムス(ソヴァージュ)(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage)は、ベトナムのメコンデルタにおける天然ナマズである。P.ヒポプタルムス(P. hypophthalmus)の養殖セクターは、この10年間にわたって、世界的に任意の他の養殖産品と比較して量において最も高い成長速度を記録した(Phanら(2009);PhuongおよびOanh(2009))。このセクターは、2007年および2008年において、それぞれ687,000トンおよび1,094,879トンの生産を計上し、後者は、世界における養殖生産の5番目に位する国家であるベトナムにおける全養殖生産の34%に達した(De Silvaら(2010))。さらにまた、この養殖ナマズの90%以上が加工され、全世界の100を超える国々に輸出されている(PhuongおよびOanh(2009))。同様にE.イクタルリによって引き起こされるパンガシウス(Pangasius)種の細菌性壊死症(BNP)はメコンデルタにおけるゴンズイ養殖産業の経済的に重要な疾患であり、50〜90%の死亡率を引き起こす恐れがあり、98%の養殖場で発生する(Phanら(2009))。
【００４３】
魚飼料中の抗生物質の経口投与による化学療法が、細菌性疾患の最も一般的な治療である。しかしながら、養殖における抗生物質の使用は、薬剤耐性微生物の出現および抗生物質の残留物によって、公衆衛生および環境に潜在的な害をもたらす恐れがある(Johnson(1991);DePaolaら(1995);Plumbら(1995))。さらにまた、魚の健康と栄養に寄与する消化管における通常の片利共生微生物は経口化学療法によって抑制される(GeraldおよびJane(1966);Sugitaら(1990))。この状況を直すために、より良い栄養、改善された水質、低い養殖密度ならびにワクチンおよび非特異的免疫賦活剤による改善された管理がより重視されてきた(AustinおよびAustin(1999))。アメリカナマズにおける感染症を緩和するプロバイオティクス菌の研究はほとんど行われておらず、飼料における直接投与を用いる研究は報告されていない。QueirozおよびBoyd(1998)は、数種のバチルス種を含む市販のプロバイオティクス製品であるBiostartをアメリカナマズ池の水に適用し、バチルス種で治療された魚の生存および純生産は、対照よりも著しく高かったことを明らかにした。しかしながら、この以前の研究に用いられた細菌は、アメリカナマズに使用するために特別に単離されたものではなく、アメリカナマズの重要な病原体に対するそれらの抗菌力も特性決定されていない。
本研究において、土壌から単離されたバチルス株(n=160)およびアメリカナマズの腸からの株(n=17)の大規模な収集物を、病気のナマズから単離されたE.イクタルリ株、A.ヒドロフィラならびにアメリカナマズの他の病原菌および病原真菌に対するin vitro抗菌力に関して試験した。有効な抗生作用を示したバチルス株を、アメリカナマズの腸におけるそれぞれの生存に関して評価した。アクアリウムシステムにおけるアメリカナマズおよびゴンズイの疾患チャレンジ研究を用いて、飼料に改善を加えた場合に最も好ましい性能を示したバチルス株の生物的制御活性を研究した。また、抗生物質に対するプラスミドおよび耐性の存在に関して、選択されたバチルス株の安全性を評価した。
【００４４】
材料および方法
細菌株
バチルスの抗生作用およびESCチャレンジ実験の一次スクリーニングにE.イクタルリ株S97-773を用いた。なぜなら、この株はアメリカナマズに病原性が高く、オーバーン大学(Auburn University)のSoutheastern Cooperative Fish Disease Laboratory(SCFDL)において、以前チャレンジ研究に用いられているからである。E.イクタルリ株R-4383、E.イクタルリ株Alg-08-200、エドワルドシエラ・タルダ、ストレプトコッカス・イニエ、エルシニア・ルケリ、フラボバクテリウム・コルムナーレおよびサプロレグニア・フェラックス(Saprolegnia ferax)は、SCFDLにおける病原性分離株の収集物からのものであった。E.イクタルリNLF33は、ベトナムにおいて病気のゴンズイから単離された。アエロモナス・ヒドロフィラAL09-119は、2009年に、MASを有する病気のアメリカナマズから単離された。土壌由来のバチルス株の収集物(n=160)は、Dr. Joseph Kloepperの試験所(Department of Entomology and Plant Pathology、オーバーン大学)から提供された。バチルス・スブチリス1E17は、Bacillus Genetic Stock Centreから入手した。
【００４５】
アメリカナマズの腸からのバチルス種株の単離および抗菌力の評価
MS-222の過量投与によって健康なナマズ(7〜10cm)を殺し、消化管全体を摘出した。滅菌生理食塩水(0.9%w/v)9.0ml中でおおよそ1.0gをホモジナイズした。新鮮な生理食塩水で10-6まで10倍連続希釈液を調製し、トリプトンソーヤ寒天培地(TSA)の3連プレートの表面に0.1mlを広げ、28℃で48時間インキュベートした(IriantoおよびAustin(2002))。バチルス様コロニーを無作為に拾い、新鮮培地上に単離されたコロニーをストリーキングすることによって精製し、軟寒天重層法(Jackら(1996))を用いてE.イクタルリの増殖抑制を試験した。軟寒天オーバーレイのために、トリプトンソーヤブロス(TSB)5ml中、30℃で24時間細菌分離株を増殖させた。次いで5μl量をTSAの3連プレート上にスポットし、さらに24時間インキュベートした。TSBで調製した軟寒天(0.7%w/v寒天)を融解させ、37℃に冷却し、対数増殖期のE.イクタルリ株S97-773の接種物で少し濁るまで(すなわち107細胞/ml)播種した。軟寒天の細菌細胞浮遊液をただちにTSAプレート上に注ぎ、30℃で24時間インキュベートし、次いで、E.イクタルリの菌叢の増殖のクリアゾーンの存在を増殖抑制の根拠として記録した(mmで)。E.イクタルリを抑制するとみなされた培養物を、グラム染色ならびに、‘ユニバーサル細菌’プライマーセット27Fおよび1492Rを用いる16S rRNA遺伝子配列決定(Weisburgら(1991))で特性解析した。コンセンサス16S rRNA配列はChromas Pro(Technelysium Pty社、クイーンズランド、オーストラリア)を用いて作成し、BLASTnによって、各配列をGenBank非縮重(non-redundant)ヌクレオチドデータベースと比較した。バチルス種株を-80℃で冷凍保存した。土壌由来バチルス株の収集物(n=160)を、同じ方法を用いてE.イクタルリに対する抗菌力を試験した。
【００４６】
E.イクタルリS97-773に対して拮抗作用を有する50のバチルス株を他のE.イクタルリ株(E.イクタルリR-483、E.イクタルリAlg-08-200)に対する阻害活性に関して試験した。E.イクタルリ株3つすべてに対して抗菌力を示すバチルス株を、A.ヒドロフィラ株AL09-119の増殖を抑制する活性に関してさらに評価した。E.イクタルリおよびA.ヒドロフィラの両方に対して著しい抗菌力を示した21のバチルス株を、前述の軟寒天オーバーレイ法を用い、エドワルドシエラ・タルダ、ストレプトコッカス・イニエ、エルシニア・ルケリ、サプロレグニア・フェラックスを含むいくつかの他のアメリカナマズ病原体に対して活性を試験した。
寒天ウェル拡散法によってフラボバクテリウム・コルムナーレに対する抗菌力を試験した。このウェル拡散法に関して、バチルス株をTSB5ml中30℃で48時間増殖させた。3,600x gで10分間遠心分離した後、培養上清を0.2μmフィルターで濾過した。次いで、F.コルムナーレ増殖培地(FCGM)寒天プレートで作られる円いウェル(およそ直径で20mm)にフィルター滅菌上清200μlを加えた(Farmer(2004))。上清が寒天培地に吸収された後、FCGMブロス中で増殖させた対数増殖期のF.コルムナーレ培養物を滅菌綿棒を用いてプレート上に十分に塗布した。プレートを30℃で48時間インキュベートした。
また、ゴンズイにおけるBNPの原因菌であるE.イクタルリNLF33に対するin vitro抗菌力に関して、バチルス株AP79、AP143、AP193L、AP254LおよびAB01を試験した。E.イクタルリのブロス培養物を106CFU/mLに調整し、TSAプレート上に均等にスワブした。寒天プレートから3つのウェルをパンチし、各ウェルに108CFU/mLのバチルス無細胞上清(TSB中の48時間培養物)50μLを加えた。30℃で24時間インキュベートした後、阻止帯を測定した。
【００４７】
バチルスゲノムの配列決定
TSB中で増殖させた培養物500mlからPromegaゲノムDNA単離キット(マディソン、ウィスコンシン州)を用いてバチルス株ゲノムDNAを抽出した。Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific社、ウィルミントン、デラウェア州)を用いてゲノムDNAの収率および純度を推定し、チタニウム化学を用いる454パイロシークエンスのためのバーコードサブライブラリー作成のためにLucigen社(ミドルトン、ウィスコンシン州)におおよそ7マイクログラムのバチルスゲノムDNAを送った。1/2 454プレートあたり2つのバチルスゲノム(株AP143およびAP254L)またはフル454プレートあたり3つのバチルスゲノム(株AP18、AP193Lおよび本研究には記載されないもう1つの株)のいずれかで、Roche 454 Genome Sequencer FLX(ブランフォード、コネティカット州)を用いて、Genomic Services Lab at Hudson Alpha(ハンツヴィル、アラバマ州)においてバーコードバチルスサブライブラリーを配列決定した。ゲノム配列をCLC Genomics Workbench(ケンブリッジ、マサチューセッツ州)にインポートし、ストリンジェンシー0.01でトリムし、length fraction=0.5、similarity=0.8のアセンブリの設定を用いてデノボアセンブルを行った。10kbより大きいコンティグゲノム配列(コンティグ)の収集をFASTA formatted fileにエクスポートし、各コンティグをBLASTnによってGenBank nrデータベースと比較した。さらに、B.スブチリスORF発見モデルを用いる原核生物プログラムのためのGeneMark.hmmで各コンティグのオープンリーディングフレーム(ORF)を予測した。各バチルスゲノムの予測されるORFを、BLASTnおよびBLASTxによって、GenBankにおけるnrデータベースにおける配列と比較した。GenBankデータベースにおける既知のバチルスゲノムに対するバチルスゲノム配列の同一性パーセントを、10kbを超えるすべてのコンティグのBLAST結果を含めて、これらのコンティグ内の配列決定した塩基対の総数によって割ったそれぞれのアラインメントしたゲノム領域の特定のバチルスゲノムに対するすべてのコンティグの累積同一性パーセントを評価することによって推定した。このようにして、配列決定したバチルス株のそれぞれの種名を決定した。種の認定を示す70%を超える%一致値を有するものを表1に示す。
【００４８】
バチルス胞子および胞子で改善した飼料の調製
バチルス胞子は、KennyおよびCouch(1981)によって記載された方法に少し改変を加えた方法で調製した。バチルス株は、TSB中、30℃で終夜増殖させた。次いで、滅菌綿棒によって、胞子調製用寒天(ペプトン3.3g/l、牛肉エキス末1.0g/l、NaCl 5.0g/l、K2HPO4 2.0g/l、KCl 1.0g/l、MgSO4・7H2O 0.25g/l、MnSO4 0.01g/l、ラクトース5g/l、寒天15g/l)上にブロスを塗布し、28℃で5〜7日間インキュベートした。胞子を集めるために、プレートに滅菌蒸留水5mlを加え、接種用ループを用いて胞子を水に懸濁した。次いで胞子懸濁液を85℃で15分間インキュベートし、栄養細胞を殺した。胞子懸濁液の濃度は、段階希釈し、TSA上に塗布することによって測定した。胞子懸濁液の最終濃度は、滅菌水によって、腸管生存アッセイには1.25x1010CFU/mlに、ESCチャレンジ研究には109CFU/mlに調整した。胞子で改善した飼料を調製するために、漂白剤およびエタノール滅菌ポンプスプレイヤーを用いて、市販のスローシンキングペレット化魚飼料(2mm、タンパク質40%、Zeigler社、ガードナーズ、ペンシルベニア州)1000gに胞子懸濁液80mlをスプレーし、おおよそ8%v/wの胞子懸濁液塗布物を得た。次いで、この飼料を魚油30mlと十分に混合した。対照飼料は、単に魚油のみで改善した。
【００４９】
アメリカナマズの腸におけるバチルス種の接種および定量
アメリカナマズの稚魚(7〜10cm)を22個の60Lタンクに割り当て、それぞれには水15Lおよび魚3匹を含ませた。実験の1週間前に魚を飢餓状態においた。前述の胞子添加法を用い、別々のバッチにおいて、E.イクタルリおよびA.ヒドロフィラの両方に対して優れた抗菌力を示した21のバチルス株でナマズ飼料を改善した。特有のバチルス株で改善した飼料(〜109CFU/g飼料)のそれぞれを1つのアクアリウムタンクに加えた。胞子で改善した飼料または対照飼料で毎日1回、1週間魚に給餌し、その後すべての魚に3日間対照飼料を与えた。実験の間、タンク1つを対照として用をい、未処理の魚飼料を与えた。毎日の給餌率は全体重の3%であった。
実験の終了時点で、すべての魚をMS-222の過量投与によって殺した。腸を摘出し、計量し、次いで滅菌生理食塩水(0.9%w/v)2ml中でホモジナイズした。次いで、ホモジナイズした試料を滅菌生理食塩水で段階希釈し、TSA上に塗布し、28℃で48時間インキュベートした。適用したバチルス株と同様な形態を示す3つの代表的コロニーをプレートから無作為に拾い、新規プレート上で精製し、同様に前述の16S rRNA遺伝子配列決定によって同定し、各バチルス株からの既知の16S rRNA遺伝子配列と比較した。対照群および治療群に関して、改善バチルス株の形態に対応する特有のコロニー形態のみを記録した。腸から回収した各バチルス株のコロニーを形成する能力のある計測数を腸試料のCFU/gと決定した。
【００５０】
アクアリウムチャレンジ研究
E.イクタルリ株S97-773を用いるアクアリウムチャレンジ研究においてさらに評価するために、5つのバチルス株(AB01、AP143、AP193L、AP254LおよびAP79)を選択した。5つのバチルス治療群および1つの対照群のそれぞれには、4連のアクアリウムを含めた。各レプリケートアクアリウムには、約13gの重量のアメリカナマズの稚魚25匹を放流した。魚は、市販の乾燥飼料で1週間馴化させた。次いで、各治療群からの魚にバチルス株の胞子(8×107CFU/g)を補充した実験食を、2.5%fw/bw(飼料重量/体重)の給餌率で毎日2週間給餌した。対照群の魚には通常の飼料のみを与えた。
E.イクタルリS97-773を含む水10Lで魚を45分間浸漬チャレンジした。同じ群のすべての魚を単一容器中で浸漬した。E.イクタルリS97-773の濃度は4.5×106CFU/mlであると決定された。対照群のチャレンジ条件は、E.イクタルリ培養物の代わりにBHI培地を加えたこと以外は他の治療群と同じであった。死亡率を21日間モニターし、死亡した魚を切開し、TSA上での腎臓および肝臓スワブの微生物試験によってE.イクタルリの存在を確定した。回収したE.イクタルリの同一性は生化学分析によって確定した。
【００５１】
馴化期間中、魚は再循環システム中で飼養した。バチルス給餌の開始後およびチャレンジ期の間は、毎日20〜30分の水交換を用いる静置システムに組み入れた。潜在的な水質問題を制御するために、スポンジバイオフィルターおよび毎日の食べ残し/廃棄材料の除去を組み入れた。水温を26±2℃に維持した。静置期の間、必要な水温を制御するために、水中で作動するアクアリウム水ヒーターと組み合わせてセントラルルームヒーティングシステムを用い、水交換中に入ってくる水の温度を調節するために、水ヒーターシステムを用いた。
低投与量のE.イクタルリおよびフロースルー条件による、アメリカナマズを用いるもう1つのチャレンジを行った。このチャレンジ実験において、それぞれが4連のアクアリウムを用いる5つのバチルス治療群(AP79、AP143、AP193LおよびAB01)ならびに1つの対照群を含めた。各アクアリウムには、アメリカナマズの稚魚(〜12g)20匹を放流した。魚をチャレンジするために低投与量のE.イクタルリS97-773(8×105CFU/ml)を用い、チャレンジの直後に開始して、1日に5〜8時間、アクアリウムに水を急激に流した。このチャレンジにおけるすべての他の条件は、前のものと同じであった。チャレンジ後、死亡率を21日間モニターし、死んだ魚におけるE.イクタルリの存在を既述のようにして確定した。
ゴンズイに関して、E.イクタルリに対する4つのバチルス株(AP79、AP193L、AP254LおよびAB01)の感染防御効果を評価するために、追加のチャレンジ研究を行った。4連のタンクを用いる5つの治療群のそれぞれを本研究に含めた。各タンクには、ゴンズイ(〜14g)18匹を放流した。バチルス胞子で改善した飼料(〜107CFU/g飼料)および対照飼料を2週間ゴンズイに投与し、E.イクタルリNLF33での水槽チャレンジのために80Lタンクに魚を移した。静置し通気したアクアリウムにおいて、対照群において約70%の死亡率を導く〜106CFU/mLの用量で魚を30分間浸漬した。チャレンジ期を通じて、対照食および試験食を与えた。死亡率の記録および死んだ魚におけるE.イクタルリの確認を上記の様に行った。
【００５２】
プラスミド分析
アルカリ溶解法(BirnboimおよびDoly(1979))によってバチルス株AP79、AP193LおよびAB01からプラスミドDNAを抽出した。プラスミドpC194を含むバチルス・スブチリス1E17を陽性対照として用いた。抽出されたDNAをChef-DR IIパルスフィールド電気泳動システム(Bio-Rad社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州)によって分析した。6V/cmで15時間、パルス時間1〜15で行った。ゲルを臭化エチジウムで染色し、AlphaImager HPゲル撮影装置(ProteinSimple社、サンタクララ、カリフォルニア州)を用いて可視化した。
【００５３】
抗生物質耐性分析
カルベニシリン、アンピシリン、スペクチノマイシン、オキサシリン、バンコマイシン、セファロチン、ノボビオシン、スルファジアジン、アミカシン、エリスロマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、クロラムフェニコール、スルファメトキサゾール、ノルフロキサシン、ゲンタマイシンおよびシプロフロキサシンに対するバチルス株AP79、AP193LおよびAB01の感受性を、米国臨床検査標準委員会(National Committee for Clinical Laboratory Standards)(CLSI(2012))で概略が述べられている手順に従って、ディスク拡散法によって測定した。各株の対数増殖期培養物をおおよそ1×108〜2×108CFU/ml(マクファーランド標準0.5)の濃度に希釈した。次いで、接種物を綿棒を用いてミューラーヒントン寒天培地プレート上に播種した。播種したプレート上に抗生物質含侵ディスク(BD Biosciences社)を置き、37℃で18時間インキュベートした後に増殖阻止帯の直径を測定した。実験を3回繰り返し、阻止帯の平均直径を算出した。
【００５４】
統計
本研究において完全無作為法を用いた。データは平均±標準誤差(SE)で提示した。チャレンジデータはSAS9.2において分散分析に供した。テューキーの範囲検定によって平均値の差の検定を行い、確率(P)値<0.05が得られた場合に有意とした。
【００５５】
結果
バチルス分離株の解析
E.イクタルリおよびA.ヒドロフィラの両方に対して阻害活性を示す、土壌またはナマズの腸から単離されたバチルス株のそれぞれは内生胞子の形成が可能であった。純粋なそれぞれのバチルス培養物のリボタイピングを行ったところ、バチルス株の大部分はB.スブチリスグループ(B.アミロリクエファシエンスを含めて)内に入り、B.プミルス(B. pumilus)の2つの株も収集物に含まれることが示された。B.スブチリスまたはB.アミロリクエファシエンス分離株は、生化学的データまたは16S rRNA遺伝子配列データに基づいてははっきりと区別できないので、場合によってはゲノム配列データが利用可能であり(すなわち、株AP18、AP143、AP193LおよびAP254Lに関して)、系統分類に用いた。これらの株のそれぞれに関して、最も密接に関連しているバチルス株ゲノムに対して>80%一致が認められ、系統認定の明白な根拠が得られた。ゲノム配列決定のために選択した株の内、株AP193Lのみが、単に養殖病原体に対するその拮抗作用およびESCによる死亡率の低減における有効性に基づいて選択された。これらのゲノムの完全な注釈は本研究の範囲を超えているが、これらのゲノム配列は系統の客観的評価を提供し、ナマズ病原体の生物的制御に関連する可能性のある抗菌剤合成の推定上の生合成経路を示すものである(データは示さず)。
【００５６】
バチルス株の抗菌力
ナマズの腸から単離されたバチルス株AB01は、E.イクタルリに対して著しい抗菌力を示した。土壌由来バチルス株の収集物からは、50株がE.イクタルリに対して著しい拮抗作用を示した。また、50のバチルス株のすべては、E.イクタルリR-4383およびE.イクタルリAlg-08-200に対して阻害活性を示した。全部で21のバチルス株が、E.イクタルリおよびA.ヒドロフィラの両方に対して強力な抗菌活性を示した(例えば図1)。選択された21のバチルス株を、養殖における多数の病原体に対するそれらの活性に関して試験した。これらの株のすべては、グラム陰性菌、グラム陽性菌および卵菌サプロレグニアを含む多数のナマズ病原体に対して拮抗した。バチルス株AB01、AP193L、AP219およびAP301は、試験した病原体のすべてに対して抗菌力を示した(表1)。また、試験したバチルス株5つすべて(AP79、AP143、AP193L、AP254LおよびAB01)は、E.イクタルリNLF33に対して顕著な拮抗作用を示した。
【００５７】
アメリカナマズの腸におけるバチルス株の生存および残留性
投与した細菌を腸から回収した。株AB01、AP76、AP77、AP79、AP143およびAP254Lに関して、導入されたバチルスの107CFU/g以上が消化管において観察された(図4)。株AP18、AP280およびAP303に関しては、回収された細菌数は比較的低く、それらをさらなる研究から除外した。対照群からは、21のバチルス株のいずれも回収されなかった。すべての場合において、代表的コロニーから決定された16S rRNA遺伝子配列は、ナマズ飼料に添加されたそれぞれのバチルス株からの16S rRNA遺伝子配列に一致した。高いCFU/g腸管数(例えば株AB01およびAP76)を有することが観察されたバチルス株のいくつかに関して、10-6および10-7希釈液において観察されたコロニーのみを、それぞれのバチルスコロニー形態に対応させた。
【００５８】
チャレンジ研究
1番目のチャレンジにおいて、対照群の平均死亡率は98.0%であった。バチルス株AP143またはAB01の治療群は対照と比較して著しく低下した死亡率を示し(P<0.05)、これらの株に関してそれぞれ83.1%、84.8%および79.6%の死亡率であった。2つの株の間に有意差は認められなかった。バチルス株AP79、AP193LまたはAP254Lの治療群(それぞれ、死亡率89.0%、95.0%および93.7%)は、対照と比較して有意差は認められなかった(図5A、表2)。2番目のチャレンジでは、対照群において魚の41.3%が死んだ。治療群における死亡率は35.0%から46.3%の範囲であり、治療群のいずれも、対照群との間に有意差は認められなかった(図5B、表2)。
ゴンズイチャレンジ実験において、株AP79の胞子で改善した飼料を給餌した治療群は、最低の(9.7%)累積死亡率を示し、対照とは大きく異なっていた(P<0.05)。株AP193Lで改善した飼料を給餌した治療群は30.6%の死亡率を達成した。しかしながら、死亡率の大部分は、チャレンジの4日目に単一のアクアリウムタンクにおいて記録されたことに留意すべきである。株AP254LおよびAB01を給餌したナマズは、それぞれ54.2%および56.9%の死亡率を示したが、対照群は70.8%の死亡率を示した(図5C、表2)。
【００５９】
プラスミドおよび抗生物質耐性研究
選択されたバチルス株のプラスミドDNA量の分析をPFGEによって行ったところ、これら4つの株にはプラスミドの存在は観察されなかったが、陽性対照にはプラスミドpC194の存在が認められた(データは示さず)。抗生物質感受性の評価によって、全4株は、試験された抗生物質のすべてに様々な程度に感受性を示したことが測定された。全4株は、すべて、カルベニシリン、セファロチン、スルファメトキサゾンおよびシプロフロキサシンに強い感受性を示した(阻止帯の直径>25mm)。アンピシリン、ペニシリン、バンコマイシン、ノボビオシン、アミカシン、エリスロマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシンおよびゲンタマイシンもまた、全4株の増殖を効果的に抑制したが(20〜25mmの阻止ゾーン)、スペクチノマイシン、オキサシリン、スルファジアジンは中程度の抑制しか示さなかった(15〜20mmの阻止帯)。これら4株は、大変類似したアンチバイオグラムを示し、これら4株内の阻止帯の直径の変動は、試験された抗生物質のそれぞれに対して、平均直径の10%未満であった。
【００６０】
考察
本研究の結果は、バチルス・スブチリスグループ内の特定の株がナマズ養殖における疾患制御に有望であることを示している。以前の研究において、池の水へのバチルス培養物の添加によって、魚の生存および収穫量の改善がもたらされた(QueirozおよびBoyd(1998))。しかしながら、後者の研究において、使用されたバチルス培養物は、E.イクタルリまたは他の養殖病原体に対する拮抗作用は評価されていない。さらにまた、この市販品からのバチルス培養物のESCによる死亡または疾患症状を抑制する能力は評価されておらず、実験期間中のテロハネルス症(proliferative gill disease)によるナマズの感染によって複雑化している。ナマズにおけるESCおよび他の病原体の制御のためのプロバイオティクス菌を選択し、それらの飼料投与による生物制御の有効性を評価したのは本研究が初めてである。バチルス種は胞子形で投与することが可能であり、従って貯蔵および添加が容易であり、バチルス株の多くが、以前に、植物の細菌および/または病原真菌に拮抗する能力に関して研究されているため(Kloepperら(2004))、バチルス種を本研究に用いた。
【００６１】
養殖のためのプロバイオティクスは、病原体に拮抗し、腸にコロニーを形成し、病原体に対する宿主の抵抗性を増すべきであるとGatesoupe(1999)は結論した。理想的には、プロバイオティクス菌は、3つすべての基準を考慮して選択されるべきである。しかしながら、多数の候補細菌について、第2および第3の基準に関して潜在的プロバイオティクス菌株を評価することは困難である。従って、多数の株が評価されるin vitro抗菌力が第一基準であり、拮抗作用を示さなかった候補細菌株は、さらなる研究から除外される。本研究プロジェクトの第一目的は、ナマズのE.イクタルリ、A.ヒドロフィラおよび他の細菌ならびに卵菌病原体を制御するために投与することができる細菌株を同定することであった。病原菌E.イクタルリおよびA.ヒドロフィラは、ナマズ養殖において現在観察される死亡率の大部分に関与しているため、これらの2つの病原体の増殖を抑制するバチルス株の能力は極めて重要であり、両方の病原体を抑制することができる株のみを、アクアリウム疾患チャレンジにおける試験のために選択した。
【００６２】
その宿主内およびその宿主上でコロニーを形成し生存するプロバイオティクス菌株の能力もまた株の選択のための重要な基準である。しかしながら、多くの場合、プロバイオティクス菌は消化管に永続的にコロニーを形成することができず、その代わりに短期残留状態を達成する(Robertson(2000);IriantoおよびAustin(2002))。継続的にまたは半継続的に、食物によって人工的に細胞が導入される場合、一過性の細菌であっても、疾患の生物的制御の介在に効率的であることができる(Gournier-Chateauら(1994);Gatesoupe(1999);)。バチルス胞子で改善された飼料で3日間給餌したナマズの腸から高い集団レベルのいくつかのバチルス株が回収された。腸における高い計数のバチルス株に関して、TSAプレートで優位を占める投与したバチルス株と同じ形態を示すコロニーおよびその代表的コロニーのリボタイプによって、投与したバチルス株との一致を確定した。アメリカナマズの腸内のE.イクタルリ特異的バクテリオファージの残留性に関する以前の研究において、給餌後72時間において、腸管試料内でバクテリオファージを検出することができないことが観察された(Carrias(2011))。このことは、給餌後72時間までには、ナマズの腸から不活性粒子はいずれも除去され、この時間枠後に検出された細菌株はある程度の腸管残留性を有することを意味する。腸内の細菌集団レベルが、胞子含有食の給餌の中止後に下落することを考慮すれば、給餌レジメン中に到達した腸管組織のバチルス株CFU/gの最高レベルはさらに高い可能性がある。本明細書における細菌集団レベル(大部分の株に関して106〜107CFU/g)は、一般に魚に関する以前の研究と一致する(Jobornら(1997);GildbergおよびMikkelsen(1998);Robertsonら(2000);IriantoおよびAustin(2002))。本研究において評価されたバチルス株の一部は、ナマズ消化管内で少なくとも3日間残留することができることをこれらの結果は明らかにしている。しかしながら、本時点において、残留性の程度および腸粘膜にコロニーを形成する能力は、各株に関して未知である。バチルス株の生物制御機構(単数または複数)を理解し、バチルスの給餌の期間およびタイミングの手引きをするのに役立てるために、ナマズの腸内での特定のバチルス株のコロニー形成および/または残留性を評価するためのより詳細な実験が行なわれるであろう。将来の研究によって、腸管微生物叢ならびに、養殖病原体の非存在下での魚の健康および飼育に関して各バチルス株の影響も試験されるであろう。
【００６３】
ESCチャレンジ研究の1つにおいて、対照群において大変高い死亡率(98.0%)が観察されたが、これはバチルス株によって提供され得る防御の程度に影響を及ぼした可能性がある。理想的には、アクアリウム疾患チャレンジは、60%〜70%の死亡率をもたらすものであり、このほうがESCの自然発症をより正確にシミュレーションする。高い死亡率は、恐らく、チャレンジ中に静置システムに維持した結果であり、その場合、E.イクタルリはタンクに長期間残存する。このチャレンジにおいて観察されるより高い死亡率にもかかわらず、2つのバチルス株(AP143およびAB01)はアメリカナマズに顕著な防御を提供した。バチルス株に関する感染防御効果を示す2つのチャレンジは、毎日20〜30分の水交換を用いる静置システムにおいて行ったが、顕著な効果を示さなかったチャレンジは、チャレンジ後、毎日5〜8時間洗い流すシステムにおいて行ったことに注意することが重要である。プロバイオティクス菌が水中および潜在的に魚の皮膚およびえらに維持されているより池に類似した環境が疾患の有効な生物的制御により役立つことができることをこのことは示唆している。さらに、おそらくは、養殖池においてナマズが一般的に暴露される低投与量のE.イクタルリにおいて、バチルス株によって提供される生物制御の程度は、より強いものであろう。
【００６４】
ゴンズイを用いたチャレンジ研究では、すべてのバチルス株について、E.イクタルリによる死亡率のレベル低下が明らかとなったが、特に株AP79を用いた場合、70.8%の死亡率の対照レベルと比較して死亡率はわずか9.7%にまで減少した。試験されたバチルス株の相対的な生物制御活性が2つのナマズ種において異なっていたことは興味深い。これは、バチルス株とそれぞれの宿主との間の相互作用における生物学的に意味のある差異を反映しているものと考えられる。また、宿主、病原体およびプロバイオティクス菌の間の、環境要因によって影響され得る特有のトリパタイト相互作用が存在し得ると考えられる。宿主、病原体およびプロバイオティクスバチルス株の間の複雑な相互作用ならびに疾患の最適の生物的制御を達成するための環境の操作方法を理解するためのさらなる研究が必要なことは明らかである。最も優れたバチルス株で用量およびタイミングなどのチャレンジの重要なパラメータを最適化し、その後の池規模での研究において、養殖池生態系内で生物的制御の有効性を評価するために、静置条件でのアクアリウム疾患モデルを用いるさらなる研究を行う必要がある。
【００６５】
ヒトによって直接に消費される生菌の安全要件の1つは、臨床的に重要な抗生物質に対する任意の獲得耐性の非存在である(Sorokulova(2008))。本研究に用いたバチルス株はヒトによる直接消費のためのものではなかったが、それらの宿主が食物のために養殖されるため、偶然に消費される恐れがある。従って、プロバイオティクス株において抗生物質耐性を分析し、種の表現型特性の1つである自然耐性と、プラスミドの存在と関連する獲得(すなわち伝達性)耐性とを区別することが重要である。また、病原性とエンテロトキシン産生は、プラスミドと密接に関連する(Pannucciら(2002))。選択されたバチルス株のいずれもプラスミドを有さず、株のそれぞれが試験された広域スペクトルの抗生物質に感受性を示すことによって、抗生物質耐性を付与する恐れのあるプラスミドを接合移行することができないことが確実となる。
【００６６】
各バチルス株によって発現される二次代謝物の知識は、養殖病原体に対する生物的制御の有効性を促進する株および株“カクテル”の合理的選択を改善することができる。養殖病原体および植物病原体に対する同様な抗生作用プロフィールを有するバチルス株はグループにまとめることができる(Kloepperら(2004))。異なる抗生作用グループからの株によって産生される抗菌化合物(単数または複数)は異なるのが当然である。おそらく、異なる抗生作用グループからの株の組み合わせは、異なる機構で作用する複数の抗生物質の生産によって疾患のより優れた生物制御を提供するであろう。軟寒天オーバーレイおよび拡散試験において観察されたin vitro拮抗作用に拡散性の抗菌化合物は明らかに関与していた。in vivo生物的制御にとって、二次代謝物の相対的重要性は、魚の免疫適格および/または病原体拮抗作用の競合的排除機構の促進と比較して未知である。将来の研究によって、バチルス株の一部の生物的制御活性への特定の抗生物質の相対的寄与が研究されるであろう。
【００６７】
結論として、ナマズの一次病原体に拮抗し、それぞれESCおよびBNPの制御のために飼料に投与されるとき、アメリカナマズおよびゴンズイの両方に有益な一群のバチルス株が同定された。これらの細菌は、抗菌化合物の現行の使用に代わる費用対効果が高い選択肢として、養殖における潜在的な用途を有する。
【００６８】
参考文献
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2014519316.tif 000005
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2014519316.tif 000009
2014519316.tif 000010
【００６９】
本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく本明細書に開示された本発明に様々な置換および修飾をなし得ることは当業者には容易に明らかであろう。例示的に本明細書に適切に記載されている本発明は、任意の要素(単数または複数)、限定(単数または複数)のない場合でも実施することができるが、それらは本明細書に具体的に開示されていない。用いられてきた用語および表現は、説明のための用語として用いられるものであって、限定するものではない。これらの用語および表現の使用は、図面に示されかつ明細書に記載されている特徴の任意の等価物またはその部分を排除することを意図するものではなく、本発明の範囲内の様々な改変が可能であることは明らかである。従って、特定の実施形態および任意の特徴によって本発明を説明してきたが、当業者は、本明細書に開示された概念の修飾および/または変更の助けを借りることができ、このような修飾および変更は本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【００７０】
本明細書において、多くの特許および非特許文献の引用がなされている。引用された文献は、その全体が参照により本願に組み込まれる。引用文献における用語の定義と本明細書における用語の定義との間に一貫性が認められない場合、その用語は本明細書における定義に基づいて解釈されなければならない。
【表１】
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【表２】
2014519316.tif 000013
同じ欄の同じ上付文字のついた平均値はテューキー検定によれば有意な相違が無かった(P > 0.05)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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