(57)【要約】  本発明は、食料、飼料、または麦芽飲料製品の製造、例えば醸造プロセスなどで使用するのに適した、改善された特性を有する新しい酵素およびこれらの酵素を含む組成物に関する。
2014527813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１７、および配列番号１８から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素。
【請求項２】
前記酵素が、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満などである、可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）における活性の、不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質における活性に対する比率を有する、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素。
【請求項４】
前記酵素が、４０〜７０℃の範囲、例えば４５〜６５℃の範囲、例えば５０〜６５℃の範囲、例えば５５〜６５℃の範囲などの温度最適条件を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項５】
前記酵素が、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
３５０未満のアミノ酸、例えば３４０未満、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば３００未満などのアミノ酸、例えば２００〜３５０の範囲、例えば２２０〜３４５の範囲などのアミノ酸の総数を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項７】
前記酵素のアミノ酸配列が、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
前記酵素のアミノ酸配列が、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項９】
前記酵素が、配列番号１〜１８のいずれか１つ、またはその任意の機能性断片によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１０】
前記酵素が、配列番号１〜１８のいずれか１つ、またはその任意の機能性断片によって同定されるアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載の酵素。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡ構築物を含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＤＮＡ構築物または請求項１２に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１１に記載のＤＮＡ構築物、または請求項１２に記載のベクター、または請求項１３に記載の細胞を含む調製物。
【請求項１５】
請求項１、２、４〜１０のいずれか一項に記載のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素を、いずれか１つまたは複数のβ−グルカナーゼと組み合わせて含む組成物。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のβ−グルカナーゼが、請求項３〜１０のいずれか一項に記載のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項３〜１０のいずれか一項に記載のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素を、いずれか１つまたは複数のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のキシラナーゼが、請求項１、２、４〜１０のいずれか一項に記載のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性および前記エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性が、少なくとも２つの異なる酵素、例えば２つの異なる種からの少なくとも２つの異なる酵素などに由来する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも２つの酵素の組み合わせを含み、前記２つの酵素、またはそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２つの酵素、またはこれらの任意の機能性断片が、
配列番号１および配列番号７、
配列番号２および配列番号７、
配列番号３および配列番号７、
配列番号４および配列番号７、
配列番号５および配列番号７、
配列番号６および配列番号７、
配列番号１７および配列番号７、
配列番号１８および配列番号７、
配列番号１および配列番号８、
配列番号２および配列番号８、
配列番号３および配列番号８、
配列番号４および配列番号８、
配列番号５および配列番号８、
配列番号６および配列番号８、
配列番号１７および配列番号８、
配列番号１８および配列番号８、
配列番号１および配列番号９、
配列番号２および配列番号９、
配列番号３および配列番号９、
配列番号４および配列番号９、
配列番号５および配列番号９、
配列番号６および配列番号９、
配列番号１７および配列番号９、
配列番号１８および配列番号９、
配列番号１および配列番号１０、
配列番号２および配列番号１０、
配列番号３および配列番号１０、
配列番号４および配列番号１０、
配列番号５および配列番号１０、
配列番号６および配列番号１０、
配列番号１７および配列番号１０、
配列番号１８および配列番号１０、
配列番号１および配列番号１１、
配列番号２および配列番号１１、
配列番号３および配列番号１１、
配列番号４および配列番号１１、
配列番号５および配列番号１１、
配列番号６および配列番号１１、
配列番号１７および配列番号１１、
配列番号１８および配列番号１１、
配列番号１および配列番号１２、
配列番号２および配列番号１２、
配列番号３および配列番号１２、
配列番号４および配列番号１２、
配列番号５および配列番号１２、
配列番号６および配列番号１２、
配列番号１７および配列番号１２、
配列番号１８および配列番号１２、
配列番号１および配列番号１３、
配列番号２および配列番号１３、
配列番号３および配列番号１３、
配列番号４および配列番号１３、
配列番号５および配列番号１３、
配列番号６および配列番号１３、
配列番号１７および配列番号１３、
配列番号１８および配列番号１３、
配列番号１および配列番号１４、
配列番号２および配列番号１４、
配列番号３および配列番号１４、
配列番号４および配列番号１４、
配列番号５および配列番号１４、
配列番号６および配列番号１４、
配列番号１７および配列番号１４、
配列番号１８および配列番号１４、
配列番号１および配列番号１５、
配列番号２および配列番号１５、
配列番号３および配列番号１５、
配列番号４および配列番号１５、
配列番号５および配列番号１５、
配列番号６および配列番号１５、
配列番号１７および配列番号１５、
配列番号１８および配列番号１５、
配列番号１および配列番号１６、
配列番号２および配列番号１６、
配列番号３および配列番号１６、
配列番号４および配列番号１６、
配列番号５および配列番号１６、
配列番号６および配列番号１６、
配列番号１７および配列番号１６、ならびに
配列番号１８および配列番号１６
からなるリストから選択される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
醸造用途においてロータリングの前に使用される場合に、増大される全圧が４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満などの値まで低減される、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
醸造用途においてロータリングの前に使用される場合に、増大される全圧が、前記組成物を含まない負の対照の使用と比較して少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３または９５％だけ低減される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
麦汁分離の前に醸造用途において使用される場合に、ろ過の５分後に捕集される麦汁体積で測定される麦汁のろ過性が、酵素を含まない対照に対して、１．５を超えて、例えば１．６を超えて、例えば１．７を超えて、例えば１．８を超えて、例えば１．９を超えて、例えば２．０を超えて、例えば２．１を超えて、例えば２．２を超えて、例えば２．３を超えて、例えば２．４を超えて、例えば２．５を超えて増大される、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
麦汁分離の前に醸造用途において使用される場合に、ろ過の５分後に捕集される麦汁体積で測定される麦汁のろ過性が、前記組成物を含まない負の対照の使用と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００％だけ増大される、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
いずれか１つまたは複数のさらなる酵素を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記１つまたは複数のさらなる酵素が、ＥＣ３．２．１．３２、ＥＣ３．２．１．１３６、またはＥＣ３．２．１．１５６に分類されるキシラナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼおよびα−Ｎ−
アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、食料、飼料、または麦芽飲料製品の製造における使用。
【請求項２８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、生地または焼き製品の製造における使用。
【請求項２９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、パルプまたは紙の調製における使用。
【請求項３０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、穀類成分の調製のための使用。
【請求項３１】
前記穀類がライ麦、小麦、または大麦である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、ビールの製造または醸造プロセスからの副産物の改変における使用。
【請求項３３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、ワインまたはジュースの製造における使用。
【請求項３４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の、バイオエタノールなどの第１または第２世代バイオ燃料の製造における使用。
【請求項３５】
デンプンを含む材料のろ過性を変更する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物により前記デンプンを含む材料を処理するステップを含む方法。
【請求項３６】
醸造用途においてロータリングの間に増大される圧力を低減する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物で醸造マッシュを処理するステップを含む方法。
【請求項３７】
食料、飼料、または飲料製品、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えばビールまたはウイスキーのような穀類または麦芽ベースの飲料の製造のための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む方法。
【請求項３８】
醸造マッシュの製造のための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む方法。
【請求項３９】
バイオエタノールなどの第１または第２世代バイオ燃料の製造のための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、または請求項１４に記載の調製物、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む方法。
【請求項４０】
請求項３８又は３９に記載の方法によって得られる製品。
【請求項４１】
請求項４０に記載の製品を含み、例えば、前記製品が０．１％〜９９．９％の範囲であるような組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食料、飲料（例えば、ビール）、飼料、またはバイオ燃料の製造、例えば醸造プロセスなどで使用するのに適した改善された特性を有する酵素およびこれらの酵素を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビールの製造における酵素の使用はよく知られている。マッシュのろ過性を改善させ、抽出物の収量を増大するために酵素をマッシング工程へ適用することは、特許文献１に記載されている。
【０００３】
特許文献２および３は、ビールの製造プロセスにおけるマッシングおよびろ過工程と、このようなプロセスで使用するための酵素組成物とに関する。
【０００４】
特許文献４は、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）株と、それから得られる新しい酵素混合物と、それに対する核配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とに関する。
【０００５】
しかしながら、食料および飲料製品の製造、例えばビールまたはウイスキーなどのアルコール飲料の製造におけるマッシング、調理およびろ過工程などで有用である改善された酵素および酵素の組み合わせが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９７／４２３０２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５１１８７６９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５０５９０８４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第１９９９０５７３２５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の実施形態の目的は、食料および飲料製品の製造、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えばビールまたはウイスキーのような穀類または麦芽ベースの飲料などの製造に適した酵素を提供することである。提供される酵素は、醸造における使用に関して改善された特性を有することができる。これらの広範な種類の改善された特性には、例えば、改善された温度最適条件、可溶性（ＷＥ−ＡＸ）アラビノキシラン基質における活性の、不溶性（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質における活性に対する改善された比率、醸造プロセスのロータリングおよび／またはろ過工程の間に増大される全圧の低減、ならびに酵素処理された材料の増大されたろ過性が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らによって、１つまたは複数の酵素および酵素の特定の組み合わせは、特に、デンプン含有材料が１つまたは複数の酵素で処理されて醸造マッシュが生じる醸造プロセスでの使用に関して、既知の酵素および酵素の組み合わせに対して改善された特性を有することが見出された。
【０００９】
従って、第１の態様では、本発明はエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１７、および配列番号１８から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「機能性断片」は、切断されていない基準酵素と本質的に同じであるかまたは少なくともかなりの程度の酵素活性を有する酵素の切断型を指す。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、本発明に従う酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物に関する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を含む組換え発現ベクターに関する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換された細胞に関する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、またはＤＮＡ構築物、またはベクター、または細胞を含む調製物に関する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、いずれか１つまたは複数のβ−グルカナーゼと組み合わせて、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素を含む組成物に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、いずれか１つまたは複数のキシラナーゼと組み合わせて、本発明に従うエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素を含む組成物に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、食料、飼料、または麦芽飲料製品、例えばビールまたはウイスキーなどの製造における使用に関する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、生地（ｄｏｕｇｈ）または焼き製品の製造における使用に関する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、パルプまたは紙の調製における使用に関する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、穀類成分の調製のための使用に関する。いくつかの実施形態では、穀類はライ麦、小麦、または大麦である。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、ビールの製造または醸造プロセスからの副産物の改変における使用に関する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、ワインまたはジュースの製造における使用に関する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う酵素、または本発明に従う調製物、または本発明に従う組成物の、バイオエタノールなどの第１または第２世代バイオ燃料の製造における使用に関する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、デンプンを含む材料のろ過性を変更する方法に関し、前記方法は、本発明に従う酵素、または調製物、または組成物により前記デンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、醸造用途においてロータリングの間に増大される圧力を低減する方法に関し、前記方法は、本発明に従う酵素、または調製物、または組成物で醸造マッシュを処理するステップを含む。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、食料、飼料、または飲料製品、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えばビールまたはウイスキーのような穀類または麦芽ベースの飲料の製造のための方法に関し、前記方法は、本発明に従う酵素、または調製物、または組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、醸造マッシュの製造のための方法に関し、前記方法は、発明に従う酵素、または調製物、または組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、バイオエタノールなどの第１または第２世代バイオ燃料の製造のための方法に関し、前記方法は、本発明に従う酵素、または調製物、または組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う方法によって得られる製品に関する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う方法によって得られる製品を含み、例えば、本製品が０．１％〜９９．９％の範囲であるような組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実験室スケールおよびパイロットスケールの醸造で使用されるマッシングプロファイル。１０分のマッシングイン（ｍａｓｈｉｎｇ−ｉｎ）時間の後に酵素を添加することによって、マッシングを開始した。
【図２】グルカナーゼおよびキシラナーゼのスクリーニングの検証からの、パイロットスケールの醸造用途の結果である。Ａ．ｔｕｂキシラナーゼと組み合わせたＢ．ｓｕｂグルカナーゼＳを、ブランクおよびＵｌｔｒａＦｌｏ  ｍａｘに対して試験した。収集されたデータは、平均流量（Ｌ／ｈ）、ロータリングを通して増大される全圧（ｍｍＷＣ、ここで、１ｍｍＷＣ＝９．８０６６５Ｐａである）、およびロータリング間に記録される最大圧力（ｍｍＷＣ）であった。
【図３】醸造におけるキシラナーゼの機能性。
【図４】流量−種々のキシラナーゼ候補を適用するロータリング。
【図５】ビールのろ過−繰り返したろ過の平均。
【図６】ビールのろ過−繰り返したろ過の平均。
【図７】実施例３のマッシング図。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ビールは、伝統的に、麦芽（例えば、大麦粒から得られる麦芽など）および場合により添加物（例えば、デンプン含有材料（例えば、穀類粒）など）から得られ、そして場合により、例えばホップによって風味が付けられたアルコール飲料であるといわれる。
【００３４】
本発明との関連では、「ビール」という用語は、デンプン含有植物材料の発酵／醸造によって生じるあらゆる発酵麦汁を含み、従って特に、添加物、または麦芽および添加物の任意の組み合わせから排他的に生じるビールも含むことを意味する。
【００３５】
「発酵」という用語は、本発明との関連では、培養液中で微生物を増殖させることによる、エタノールなどの物質の製造を意味する。一般に、発酵のために酵母などの微生物が使用される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「麦芽」という用語は任意の穀類粒麦芽、例えば大麦麦芽などであると理解される。「添加物」は麦芽または大麦麦芽ではない任意のデンプン含有植物材料であると定義することができる。
【００３７】
「デンプン含有植物材料」は、例えば、大麦、小麦、トウモロコシ、ライ麦、ソルガム、キビ、または米、およびこれらの任意の組み合わせなどの１つまたは複数の穀類であり得る。デンプン含有植物材料は、加工、例えば、製粉、麦芽化、特に麦芽化することもできるし、あるいは麦芽化しなくてもよい。麦芽化されない穀類は「未加工穀物」とも呼ばれる。穀類でないデンプン含有植物材料の例には、例えば、ジャガイモおよびキャッサバなどの塊茎が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「飲料」および「飲料製品」という用語は、全麦芽ビール、「ビール純粋令（Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｇｅｂｏｔ）」の下で醸造されたビール、エール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、ローアルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、モルトリカー、ノンアルコールビール、ノンアルコールモルトリカーなどの発泡性発酵飲料を含む。「飲料」または「飲料製品」という用語は、果実風味の麦芽飲料、例えば、シトラス風味（例えば、レモン、オレンジ、ライムなど）、もしくはベリー風味の麦芽飲料、リカー風味の麦芽飲料、例えば、ウオッカ、ラム、もしくはテキーラ風味のモルトリカー、またはコーヒー風味の麦芽飲料（例えば、カフェイン風味のモルトリカーなど）などの非発泡性ビールおよび代替麦芽飲料も含む。
【００３９】
ビールは、様々なデンプン含有植物材料から本質的に同一のプロセスによって製造することができ、ここで、デンプンは主にグルコースホモポリマーからなり、グルコース残基はアルファ−１，４−結合またはアルファ−１，６−結合のずれかによって連結されており、前者の方が主である。
【００４０】
ビールなどの発酵飲料の製造プロセスは通常醸造と呼ばれる。これらの飲料の製造で使用される典型的な原材料は、水、ホップおよび麦芽である。麦芽に加えて、あるいは麦芽の代わりに、一般的なひき割りトウモロコシ、精製ひき割りトウモロコシ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンスターチ、大麦、大麦デンプン、脱穀大麦、小麦、小麦デンプン、焙焼（ｔｏｒｒｉｆｉｅｄ）穀類、穀類フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、およびシロップ（例えば、コーンシロップ、サトウキビシロップ、転化糖シロップ、大麦および／または小麦シロップなど）などの添加物がデンプン源として使用されてもよい。デンプンは、最終的に、酵素により発酵性糖に転化されるであろう。
【００４１】
主に麦芽から製造されるビール（例えば、１５〜２０％までの添加物）に関して、いくつかの理由で、選択される種々の大麦から主に製造される麦芽は、ビールの全体の特徴および品質に最も大きな影響を与える。第１に、麦芽はビールの主要な風味剤である。第２に、麦芽は発酵性糖の大部分を提供する。第３に、麦芽はタンパク質を提供し、これは、ビールのこくおよび泡の特徴に寄与し得る。第４に、麦芽はマッシングの間に必要な酵素活性を提供する。
【００４２】
ホップも、風味を含むビール品質に著しく寄与する。特に、ホップ（またはホップ構成物質）はビールに望ましい苦味物質を添加する。さらに、ホップはタンパク質沈殿剤の機能を果たし、防腐剤を確立し、泡の形成および安定化に役立つ。全てのビールがホップを用いて製造されるわけではない。プロテアーゼ（例えば、パパイン）などの他の安定剤も使用され得る。
【００４３】
本発明に対する限定であると解釈されることは望まないが、従来の醸造プロセスは以下のように説明することができる。
【００４４】
ビールの製造プロセスは当該技術分野においてよく知られているが、簡単に言うと、５つの工程：（ａ）マッシングおよび／または添加物調理と、（ｂ）麦汁分離および抽出と、（ｃ）麦汁の沸騰およびホッピングと、（ｄ）冷却、発酵および貯蔵と、（ｅ）熟成、加工および梱包とが含まれる。通常、第１の工程では、製粉または破砕された麦芽は水と混合され、制御された温度下で一定期間保持され、麦芽中に存在する酵素によって、麦芽中に存在するデンプンを発酵性糖に転化させる。
【００４５】
第２の工程では、マッシュは「ロータータン（ｌａｕｔｅｒ  ｔｕｎ）」またはマッシュフィルタに移され、そこで穀物残渣から液体が分離される。この甘い液体は「麦汁」と呼ばれ、残された穀物残渣は「使用済み穀物」と呼ばれる。使用済み穀物から残りの可溶性抽出物を回収するために、通常マッシュは、水をマッシュに添加することを含む抽出を受ける。
【００４６】
第３の工程では、麦汁は激しく沸騰される。これにより麦汁は殺菌され、色、風味および香りの発生が助けられる。ホップは沸騰中のある時点で添加される。
【００４７】
第４の工程では、麦汁は冷却され、酵母を含有するかあるいは酵母が添加される発酵槽に移される。酵母は発酵により糖をアルコールおよび二酸化炭素ガスに転化させ、発酵の最後に、発酵を停止させるために発酵槽は冷却される、あるいは発酵槽は冷却され得る。酵母は凝結し、そして除去される。
【００４８】
最後の工程では、ビールは冷却されて一定期間貯蔵され、その間にビールは透明になり、その風味が発生し、ビールの外観、風味および貯蔵期間を損なう可能性のあるあらゆる材料が沈降する。梱包の前に、ビールは炭酸ガスで飽和され、場合によりろ過および低温殺菌される。
【００４９】
発酵の後、通常約２重量％〜約１０重量％のアルコールを含有する飲料が得られる。非発酵性炭水化物は発酵中に転化されず、最終ビール中に溶解された固形分の大部分を形成する。
【００５０】
麦芽アミラーゼはデンプンのアルファ−１，６−結合を加水分解することができないので、この残渣が残る。非発酵性炭水化物は、ビール１２オンス当たり約５０カロリーを与える。
【００５１】
近年、特に米国市場において、ライトビール、カロリーが低下されたビールまたは低カロリービールと呼ばれる醸造飲料が広く普及してきた。米国において定義されるように、これらのビールは、製造業者の「普通の」ビールよりもカロリーが約３０％少ない。
【００５２】
従来の醸造プロセスについてのさらなる情報、および本発明に適用される醸造技術の分野で使用される用語についての定義は、ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ）のＷｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅによる「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ」第２改訂版１９９９，ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−３９−０，第３版（２００４）：ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−４９−８，第４最新版，２０１０（ＩＳＢＮ  ９７８−３−９２１６９０−６４−２）において見出すことができる。
【００５３】
キシラナーゼは、ＥＣ３．２．１．８、ＥＣ３．２．１．３２、ＥＣ３．２．１．１３６およびＥＣ３．２．１．１５６に分類され、これらの活性は、例えば、実施例に記載されるように測定することができる。本発明に従うエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素と組み合わせて使用すべき適切なキシラナーゼには、国際公開第２０１００７２２２６号パンフレット、国際公開第２０１００７２２２５号パンフレット、国際公開第２０１００７２２２４号パンフレット、国際公開第２００５０５９０８４号パンフレット、国際公開第２００７０５６３２１号パンフレット、国際公開第２００８０２３０６０Ａ号パンフレット、国際公開第９４２１７８５号パンフレット、国際公開第２００６１１４０９５号パンフレット、国際公開第２００６０６６５８２号パンフレット、米国特許出願公開第２００８２３３１７５号明細書、および国際公開第１００５９４２４号パンフレットに開示されるいずれか１つのキシラナーゼなど、ＥＣ３．２．１．８、ＥＣ３．２．１．３２、ＥＣ３．２．１．１３６およびＥＣ３．２．１．１５６に分類されるあらゆるキシラナーゼが含まれる。
【００５４】
エンド−１，４−ベータキシラナーゼはＥＣ３．２．１．８に分類される。酵素は、キシランの１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド（ｘｙｌｏｓｉｄｉｃ）結合のエンド加水分解（ｅｎｄｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を引き起こす。
【００５５】
「ファミリー１１キシラナーゼ」、「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１」または単に「ＧＨ１１キシラナーゼ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＥＣ３．２．１．８に分類されるエンド−１，４−ベータキシラナーゼを指し、これは、キシランの１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド結合のエンド加水分解を引き起こし、Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ａ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０（１９９１），ｐｐ．３０９−３１６に従ってファミリー１１キシラナーゼに分類される。
【００５６】
「ファミリー１０キシラナーゼ」、「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１０」、または単に「ＧＨ１０キシラナーゼ」という用語は、キシラナーゼ（ＥＣ：３．２．１．８）、エンド−１，３−ベータ−キシラナーゼ（ＥＣ：３．２．１．３２）、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ：３．２．１．９１）などのいくつかの既知の活性を有する酵素を含む。これらの酵素は、以前は、セルラーゼファミリーＦとして知られていた。
【００５７】
いくつかの実施形態では、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、ファミリー１１キシラナーゼである。いくつかの実施形態では、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素はファミリー１０キシラナーゼである。
【００５８】
１つの態様では、本発明に従う酵素組成物は、実施例において記載されるアッセイによって測定されるエンド−１，４−ベータキシラナーゼ活性を有する。
【００５９】
キシラナーゼ活性を測定するためのアッセイは、基質としてキシランを用いて、ｐＨ３．５またはｐＨ５および５０℃で実行されてもよいし、あるいは、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために異なるｐＨおよび温度値で実施することもできる。酵素活性は、５４０ｎｍにおいてキシロースによって生じる単位時間当たりの吸光度の増大から計算される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素組成物は、実施例において記載されるアッセイによって測定される場合に、少なくとも約５０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約６０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約７０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約８０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約８５００Ｕ／ｇなどのキシラナーゼ活性を含む。
【００６１】
本発明に従う酵素組成物はセルロース分解活性を有する。セルロースの系統名は４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼであり、セルロース分解酵素またはセルラーゼはＥＣ３．２．１．４に分類される。セルラーゼは、例えば、セルロース、リケニンおよび穀類のβ−Ｄ−グルカンの（１→４）−β−Ｄ−グルコシド結合をエンド加水分解し、１，３−結合も含有するβ−Ｄ−グルカンの１，４−結合も加水分解し得る。またセルラーゼは、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ、セルラーゼＡ、セルロシンＡＰ、エンドグルカナーゼＤ、アルカリセルロース、セルラーゼＡ３、セルデキストリナーゼ、９．５セルラーゼ、アビセラーゼ、パンセラーゼＳＳおよび１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼなどの他の名称も有する。
【００６２】
本発明の１つの態様では、本発明に従う酵素組成物のセルラーゼ活性は、「アッセイ」という表題の下で以下に記載されるような「セルラーゼ活性方法」によって測定される。
【００６３】
さらなる態様では、本発明は、実施例において記載されるアッセイによって決定されるエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を有する酵素に関する。
【００６４】
「β−グルカナーゼ」または「ベータ−グルカナーゼ」は、本明細書で使用される場合、ＥＣ３．２．１．６のエンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼを指す。加水分解すべき結合中にその還元性基が含まれるグルコース残基がそれ自体Ｃ−３で置換されている場合に、ベータ−Ｄ−グルカンの（１→３）−または（１→４）−結合のエンド加水分解を触媒する。本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素と組み合わせて使用すべき適切なベータ−グルカナーゼには、国際公開第２００４０８７８８９号パンフレット、国際公開第２００５０５９０８４号パンフレット、国際公開第９４１４９５３号パンフレット、国際公開第２００７０５６３２１号パンフレット、国際公開第９５３１５３３号パンフレット、国際公開第０８０２３０６０号パンフレット、国際公開第２００５１００５８２号パンフレット、国際公開第９８２８４１０号パンフレット、国際公開第９７４２３０１号パンフレット、国際公開第２００６０６６５８２号パンフレット、国際公開第０５１１８７６９号パンフレット、国際公開第２００５００３３１９号パンフレット、および国際公開第１００５９４２４号パンフレットにおいて開示されるいずれか１つのベータ−グルカナーゼが含まれる。
【００６５】
標準アッセイはｐＨ５．０で実行され、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために、異なるｐＨ値で実施されることが可能である。
【００６６】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定される通り）および５０℃）下で１分につき１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素組成物は、実施例において記載されるアッセイによって測定される場合に、少なくとも約１００００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１２０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１４０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１５０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１８０００Ｕ／ｇなどのβ−グルカナーゼ活性を含む。
【００６８】
さらなる態様では、本発明に従う酵素組成物はラミナリナーゼ活性を有するか、あるいはラミナリナーゼ活性を有するいずれか１つまたは複数のさらなる酵素を含む。ラミナリナーゼ活性は、アッセイのセクションで記載されるラミナラーゼ（ｌａｍｉｎａｒａｓｅ）アッセイに記載されるように決定される。
【００６９】
ラミナリナーゼは、Ｅ．Ｃ．３．２．１．６に分類されるエンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼまたはＥ．Ｃ．３．２．１．３９に分類されるグルカンエンド−１，３−ベータ−Ｄ−グルコシダーゼであり得る。ラミナリナーゼ、エンド−１，３−ベータ−グルカナーゼ、エンド−１，４−ベータ−グルカナーゼという代替名を有するエンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼは、Ｅ．Ｃ．３．２．１．６に分類される。基質には、ラミナリン、リケニンおよび穀類Ｄ−グルカンが含まれ、加水分解すべき結合中にその還元性基が含まれるグルコース残基がそれ自体Ｃ−３で置換されている場合に、酵素はベータ−Ｄ−グルカンの（１→３）−または（１→４）−結合のエンド加水分解を触媒する。（１→３）−ベータ−グルカンエンドヒドロラーゼ、エンド−１，３−ベータ−グルカナーゼおよびラミナリナーゼという代替名を有するグルカンエンド−１，３−ベータ−Ｄ−グルコシダーゼはＥ．Ｃ．３．２．１．３９に分類され、例えばラミナリン、パラミロンおよびパキマンのような基質の（１→３）−ベータ−Ｄ−グルカンの（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解する。
【００７０】
いくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はアラビナナーゼ活性を有するか、あるいはアラビナナーゼ活性を有するさらなる酵素を含む。アラビナナーゼはＥＣ３．２．１．９９に分類される。系統名は５−α−Ｌ−アラビナン５−α−Ｌ−アラビナノヒドロラーゼであるが、アラビナンエンド−１，５−α−Ｌ−アラビノシダーゼ、およびエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、エンド−α−１，５−アラバナーゼ、エンド−アラバナーゼ、１，５−α−Ｌ−アラビナンおよび１，５−α−Ｌ−アラビナノヒドロラーゼなどのいくつかの他の名前を有する。アラビナーゼは、（１→５）−アラビナンの（１→５）−α−アラビノフラノシド結合をエンド加水分解する。アラビナナーゼはアラビナンにも作用する。
【００７１】
本発明の１つの態様では、本発明に従う酵素組成物のアラビナーゼ活性は、「アッセイ」という表題の下で以下に記載されるようなアラビナーゼアッセイによって測定される。アッセイは基質として砂糖大根アラビナンを用いてｐＨ３．５および５０℃で実行することができ、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために異なるｐＨおよび温度値で実施することができる。酵素活性は、単位時間当たりの５４０ｎｍにおける吸光度の増大から計算される。
【００７２】
アラビナーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ３．５および５０℃）下でΔＯＤ５４０ｎｍ．ｍｉｎ−１の増大を与える酵素の量（全アッセイ容積に対して基準化）として定義される。
【００７３】
いくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ活性を有するか、あるいはベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ活性を有するさらなる酵素を含む。ベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼは、Ｅ．Ｃ３．２．１．２１の酵素を指す。
【００７４】
いくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はβ−キシロシダーゼ活性を有するか、あるいはβ−キシロシダーゼ活性を有するさらなる酵素を含む。「β−キシロシダーゼ」または「キシラン１，４−ベータ−キシロシダーゼ」は、Ｅ．Ｃ３．２．１．３７の酵素を指す。β−キシロシダーゼは（１→４）−ベータ−Ｄ−キシランの加水分解を触媒し、非還元性末端から連続的なＤ−キシロース残基を除去する。
【００７５】
本発明のいくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はセロビオヒドロラーゼ活性を有するか、あるいはセロビオヒドロラーゼ活性有するさらなる酵素を含む。「セロビオヒドロラーゼ」または「セルロース１，４−ベータ−セロビオシダーゼ」は、ＥＣ３．２．１．９１の酵素を指す。セルロース１，４−ベータ−セロビオシダーゼは、セルロースおよびセロテトラオースの１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒して、鎖の非還元性端部からセロビオースを放出する。
【００７６】
本発明に従う酵素組成物のセロビオヒドロラーゼ活性は、「アッセイ」という表題の下で以下に記載されるようなセロビオヒドロラーゼアッセイによって測定される。標準アッセイはｐＨ５．０で実行され、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために異なるｐＨ値で実施されることが可能である。
【００７７】
セロビオヒドロラーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定される通り）および５０℃）下でｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオピラノシドから１分につき１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生じる酵素の量として定義される。
【００７８】
いくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はα−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するか、あるいはアラビノフラノシダーゼ活性を有するさらなる酵素を含む。「α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ」または「アルファ−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ」は、ＥＣ３．２．１．５５の酵素を指す。α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼは、アルファ−Ｌ−アラビノシドの末端非還元性アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒する。
【００７９】
本発明の１つの態様では、本発明に従う酵素組成物のアラビノフラノシダーゼ活性は、「アッセイ」という表題の下で以下に記載されるようなアラビノフラノシダーゼアッセイによって測定される。標準アッセイはｐＨ５．０および５０℃で実行することができ、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために、異なるｐＨおよび温度の値で実施することができる。
【００８０】
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０および５０℃（または指定される通り））下でｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシドから１分につき１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生じる酵素の量として定義される。
【００８１】
いくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はグルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ活性を有するか、あるいはグルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ活性を有するさらなる酵素を含む。「グルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ」または「グルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ」は、Ｅ．Ｃ３．２．１．７４の酵素を指す。グルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼは、（１→４）−ベータ−Ｄ−グルカンの（１→４）−結合の加水分解を触媒して、連続的なグルコース単位を除去する。
【００８２】
いくつかの態様では、本発明に従う酵素組成物はキシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼ活性を有するか、あるいはキシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼ活性を有するさらなる酵素を含む。「キシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼ」は、Ｅ．Ｃ３．２．１．１５５の酵素を指す。キシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼは、キシログルカンの（１→４）−ベータ−Ｄ−グルコシド結合のエキソ加水分解（ｅｘｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を触媒する。
【００８３】
先行する（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ）態様に従う酵素および酵素組成物は、デンプン加水分解物を含む水溶液の粘度の低減を含むプロセスにおいて使用することができる。
【００８４】
酵素および酵素組成物は、デンプン加水分解物を含む水溶液のろ過を含むプロセスにおいて使用することもできる。いくつかの実施形態では、デンプン加水分解物を含む水溶液はビール製造のためのマッシュであり、他の実施形態では、デンプン加水分解物を含む水溶液は食料組成物である。
【００８５】
あるいは、本発明に従う酵素組成物は、果実ジュース、ワイン、穀物加工、燃料アルコール、第１または第２世代バイオ燃料（例えば、バイオエタノールなど）、および飲料アルコールの製造において使用することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、第１または第２世代バイオ燃料（例えば、バイオエタノールなど）は、サトウキビ、ジャガイモ、トウモロコシ、小麦ソルガムなどの農業供給原料から、あるいはトウモロコシ茎葉、スイッチグラスまたは他の植物材料などのセルロース系材料から製造される。いずれの場合も、発酵性糖は原材料から抽出され、微生物によりアルコールへ発酵され、蒸留されて、輸送燃料として使用され得る。本発明に従う酵素組成物は、このバイオ燃料の製造において使用され得る。原材料からの多糖類の抽出を高めるため、多糖類の発酵性糖への分解を促進するため、そして／あるいは、固形分からの液体の分離、流量特性およびポンプ能力などの加工パラメータを高めるために、酵素複合体が添加されてもよい。
【００８７】
本発明のプロセスは、任意のグリストのマッシングにおいて適用され得る。本発明によると、グリストは、任意の植物および植物の一部（塊茎、根、茎、葉および種子を含む）から得ることができる任意のデンプンおよび／または糖含有植物材料を含み得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、グリストは、大麦、小麦、ライ麦、オート麦、トウモロコシ、米、ミロ、キビおよびソルガムからの穀物などの穀物を含み、より好ましくは少なくとも１０％、またはより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、または最も好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに１００％（ｗ／ｗ）の麦汁のグリストが穀物に由来する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、グリストは、大麦麦芽などの穀物麦芽を含む。好ましくは、少なくとも１０％、またはより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、または最も好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％またはさらに１００％（ｗ／ｗ）の麦汁のグリストが穀物麦芽に由来する。
【００９０】
「マッシュ」という用語は、例えば、破砕大麦麦芽、破砕大麦、および／または他の添加物またはこれらの組み合わせを含み、水と混合された水性デンプンスラリーであり、後で、麦汁および使用済み穀物に分離されると理解される。
【００９１】
「マッシュ分離」という用語は、例えばロータリングまたはマッシュろ過などによる、使用済み穀物からの麦汁の分離であると理解される。
【００９２】
「ビールろ過」という用語は、例えば精密ろ過または膜処理などにより、ビール中にまだ存在している酵母細胞および他の濁りを生じる材料が除去される分離プロセスであると理解される。
【００９３】
例えば、本発明に従って調製される食品成分の形態などの酵素調製物は、使用および／または適用モードおよび／または投与モードに依存して、溶液の形態であっても固体であってもよい。固体形態は乾燥酵素粉末として、あるいは粒状酵素としての何れかであり得る。
【００９４】
１つの態様では、本発明は、本発明に従う酵素または酵素組成物、酵素キャリア、ならびに場合により安定剤および／または防腐剤を含む酵素組成物調製物を提供する。
【００９５】
本発明のまたさらなる態様では、酵素キャリアは、グリセロールまたは水からなる群から選択される。
【００９６】
さらなる態様では、調製物は安定剤を含む。１つの態様では、安定剤は、無機塩、ポリオール、糖およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。１つの態様では、安定剤は塩化カリウムなどの無機塩である。別の態様では、ポリオールはグリセロール、プロピレングリコール、またはソルビトールである。さらに別の態様では、糖は小分子炭水化物、特に、グルコース、フルクトースおよびサッカロースなどのいくつかの甘味のある糖のいずれかである。
【００９７】
またさらなる態様では、調製物は防腐剤を含む。１つの態様では、防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンゾアート、ソルバート、もしくは他の食品認可された防腐剤、またはこれらの混合物である。
【００９８】
本発明の特定の実施形態
いくつかの実施形態では、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、場合により、いずれか１つまたは複数の本発明に従うβ−グルカナーゼと組み合わせられて、醸造用途における粘度の著しい低下を提供し、マッシュおよびビールの改善された分離を容易にする。
【００９９】
醸造用途のために所望されるキシラナーゼ特性は、以下の態様のうちの１つまたは複数を含むことができる：
ａ）酵素基質特異性
ＷＥ−ＡＸ／ＷＵ−ＡＸ比は粘度に影響を与える。いくつかの実施形態では、この比は、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満などである。
ｂ）酵素基質選択性
酵素が切断する分岐点にどれくらい近いかが機能性に影響を与えると考えられる。
ｃ）酵素の熱安定性
マッシング中のＡＸの連続的な可溶化−重要な特徴の熱安定性。従って、いくつかの実施形態では、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、６５〜７８℃の温度範囲内で熱安定性である。
ｄ）酵素のｐＨ最適条件。従って、いくつかの実施形態では、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、ｐＨ５．４〜５．６の範囲のｐＨ最適条件を有する。
ｅ）酵素阻害（例えば、キシラナーゼの既知の重要な因子）。
【０１００】
醸造用途における粘度の前記著しい低下は、同一条件および量で使用される既知の酵素または酵素活性の組み合わせを有する対照、例えばＵｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘなどと比較したときの、醸造用途における粘度の低下として測定することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、場合により、いずれか１つまたは複数の本発明に従うβ−グルカナーゼと組み合わせられて、醸造用途におけるマッシュおよびビールの改善された分離を提供する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、場合により、いずれか１つまたは複数の本発明に従うβ−グルカナーゼと組み合わせられて、異臭形成（アラビノキシランの分解に関連する異臭形成など）の低い可能性を提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、場合により、いずれか１つまたは複数の本発明に従うβ−グルカナーゼと組み合わせられて、ロータリングなどにおけるろ床（ｆｉｌｔｅｒ  ｂｅｄ）崩壊の危険性の低下を提供する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、場合により、いずれか１つまたは複数の本発明に従うβ−グルカナーゼと組み合わせられて、異臭の可能性の低減および／または異臭形成の低減を提供する。本発明の１つの態様は、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１７、および配列番号１８から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
別の態様は、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態では、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素は、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満などである、可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）における活性の、不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質における活性に対する比率を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素は、４０〜７０℃の範囲、例えば４５〜６５℃の範囲、例えば５０〜６５℃の範囲、例えば５５〜６５℃の範囲などの温度最適条件を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素は、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素は、３５０未満のアミノ酸、例えば３４０未満、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば３００未満などのアミノ酸、例えば２００〜３５０の範囲、例えば２２０〜３４５の範囲などのアミノ酸の総数を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明に従う前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明に従う前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素は、配列番号１〜１８のいずれか１つ、またはその任意の機能性断片によって同定されるアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明に従う酵素は、配列番号１〜１８のいずれか１つ、またはその任意の機能性断片によって同定されるアミノ酸配列からなる。
【０１１４】
本発明のさらに重要な態様は、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素を、いずれか１つまたは複数のβ−グルカナーゼと組み合わせて含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、この１つまたは複数のβ−グルカナーゼは本発明に従う。
【０１１５】
本発明のさらに重要な態様は、本発明に従うエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素を、いずれか１つまたは複数のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物である。いくつかの実施形態では、この１つまたは複数のキシラナーゼは、本発明に従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素である。いくつかの実施形態では、この１つまたは複数のキシラナーゼは、配列番号１７および／または配列番号１８、またはその任意の機能性断片に従う酵素である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素と、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素との組み合わせは、以下の表に従う：
【０１１７】
【表１】
2014527813.tif 000003
【０１１８】
エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素である上記の第１の酵素の組み合わせのいずれか１つは、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素の１つと組み合わせることができ、２つの酵素間の比率が１：１０、２：１０、３：１０、４：１０、５：１０、６：１０、７：１０、８：１０、９：１０、１０：１０、１０：９、１０：８、１０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１０：２、または１０：１、例えば１：１０〜１０：１の範囲内、例えば２：１０〜１０：２、例えば３：１０〜１０：３、例えば４：１０〜１０：４、例えば５：１０〜１０：５、例えば６：１０〜１０：６、例えば７：１０〜１０：７、例えば８：１０〜１０：８、例えば９：１０〜１０：９の範囲内であり得ることは理解されるべきである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明に従う組成物は少なくとも２つの酵素の組み合わせを含み、前記２つの酵素、またはそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２つの酵素、またはこれらの任意の機能性断片は、
配列番号１および配列番号７、
配列番号２および配列番号７、
配列番号３および配列番号７、
配列番号４および配列番号７、
配列番号５および配列番号７、
配列番号６および配列番号７、
配列番号１７および配列番号７、
配列番号１８および配列番号７、
配列番号１および配列番号８、
配列番号２および配列番号８、
配列番号３および配列番号８、
配列番号４および配列番号８、
配列番号５および配列番号８、
配列番号６および配列番号８、
配列番号１７および配列番号８、
配列番号１８および配列番号８、
配列番号１および配列番号９、
配列番号２および配列番号９、
配列番号３および配列番号９、
配列番号４および配列番号９、
配列番号５および配列番号９、
配列番号６および配列番号９、
配列番号１７および配列番号９、
配列番号１８および配列番号９、
配列番号１および配列番号１０、
配列番号２および配列番号１０、
配列番号３および配列番号１０、
配列番号４および配列番号１０、
配列番号５および配列番号１０、
配列番号６および配列番号１０、
配列番号１７および配列番号１０、
配列番号１８および配列番号１０、
配列番号１および配列番号１１、
配列番号２および配列番号１１、
配列番号３および配列番号１１、
配列番号４および配列番号１１、
配列番号５および配列番号１１、
配列番号６および配列番号１１、
配列番号１７および配列番号１１、
配列番号１８および配列番号１１、
配列番号１および配列番号１２、
配列番号２および配列番号１２、
配列番号３および配列番号１２、
配列番号４および配列番号１２、
配列番号５および配列番号１２、
配列番号６および配列番号１２、
配列番号１７および配列番号１２、
配列番号１８および配列番号１２、
配列番号１および配列番号１３、
配列番号２および配列番号１３、
配列番号３および配列番号１３、
配列番号４および配列番号１３、
配列番号５および配列番号１３、
配列番号６および配列番号１３、
配列番号１７および配列番号１３、
配列番号１８および配列番号１３、
配列番号１および配列番号１４、
配列番号２および配列番号１４、
配列番号３および配列番号１４、
配列番号４および配列番号１４、
配列番号５および配列番号１４、
配列番号６および配列番号１４、
配列番号１７および配列番号１４、
配列番号１８および配列番号１４、
配列番号１および配列番号１５、
配列番号２および配列番号１５、
配列番号３および配列番号１５、
配列番号４および配列番号１５、
配列番号５および配列番号１５、
配列番号６および配列番号１５、
配列番号１７および配列番号１５、
配列番号１８および配列番号１５、
配列番号１および配列番号１６、
配列番号２および配列番号１６、
配列番号３および配列番号１６、
配列番号４および配列番号１６、
配列番号５および配列番号１６、
配列番号６および配列番号１６、
配列番号１７および配列番号１６、ならびに
配列番号１８および配列番号１６、
からなるリストから選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性およびエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性は、少なくとも２つの異なる酵素、例えば２つの異なる種からの少なくとも２つの異なる酵素などに由来する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、醸造用途において本発明に従う組成物がロータリングの前に使用される場合に、増大される全圧は、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満などの値まで低減される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、醸造用途においてロータリングの前に使用される場合に、増大される全圧は、前記組成物を含まない負の対照の使用と比較して少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３または９５％だけ低減される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、麦汁分離の前に醸造用途において本発明に従う組成物が使用される場合に、ろ過の５分後に捕集される麦汁体積で測定される麦汁のろ過性は、酵素を含まない対照に対して、１．５を超えて、例えば１．６を超えて、例えば１．７を超えて、例えば１．８を超えて、例えば１．９を超えて、例えば２．０を超えて、例えば２．１を超えて、例えば２．２を超えて、例えば２．３を超えて、例えば２．４を超えて、例えば２．５を超えて増大される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ろ過の５分後に捕集される麦汁体積で測定される麦汁のろ過性は、前記組成物を含まない負の対照の使用と比較して少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００％増大される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明に従う組成物は、いずれか１つまたは複数のさらなる酵素を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のさらなる酵素は、ＥＣ３．２．１．３２、ＥＣ３．２．１．１３６、またはＥＣ３．２．１．１５６に分類されるキシラナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼおよびα−Ｎ−アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される。
【０１２６】
本明細書において言及される配列によって同定され、本発明に従って単独で、あるいは他の酵素または化合物と組み合わせて使用される配列および酵素は、シグナルペプチドを有していてもいなくてもよい。
【０１２７】
アッセイ
ＤＮＳセルラーゼ活性方法（ＤＮＳ  ＣＭＣ方法）
系統名：１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ
ＩＵＢ番号：ＥＣ３．２．１．４
【０１２８】
原理
セルラーゼのアッセイは、β−１，４−グルカンであるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の酵素的なエンド加水分解に基づく。反応の生成物（β−１，４グルカンオリゴ糖）は、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増大を測定することによって、比色測定で決定した。酵素活性は、グルコース当量としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍにおける吸光度との間の関係から計算した。
【０１２９】
アッセイはｐＨ５．０で実行したが、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために、異なるｐＨ値で実施することができる。
【０１３０】
単位の定義
セルラーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定される通り）および５０℃）下で１分につき１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。
【０１３１】
材料
カルボキシメチルセルロース。供給業者：Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｌｔｄ。製品番号：ＣＭ−セルロース４Ｍ
Ｄ−グルコース‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０１１７。Ｍ．Ｗ．：１８０．１６
無水酢酸ナトリウム‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０２３６。Ｍ．Ｗ．：８２．０３
酢酸（「氷」）‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０００１。Ｍ．Ｗ．：６０．０５
３，５−ジニトロサリチル酸ＧＰＲ（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシ安息香酸）。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：２８２３５
水酸化ナトリウムペレット‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０２５２。Ｍ．Ｗ．：４０．００
（＋）−酒石酸カリウムナトリウム ‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０２１９。Ｍ．Ｗ．：２８２．２２
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中１．５％（ｗ／ｖ溶液）のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液（基質溶液）
３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液。３２ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムペレット、および６００ｇ／Ｌの（＋）−酒石酸カリウムナトリウムを含有する緩衝液中２０ｇ／ＬのＤＮＳ
グルコース標準溶液（０．５０ｍｇ／ｍｌ）
【０１３２】
手順
酵素組成物をサンプル中に希釈し、０、０．１２５、０．２５、０．３７５、および０．５ｍｇ／ｍｌのグルコース濃度を用いて、図２に示されるグルコース標準曲線を作成した。
【０１３３】
０．２５ｍｌの酵素溶液を５０℃で１．７５ｍｌの基質溶液（１．５％ｗ／ｖ）と混合し、１０分後にＤＮＳ溶液の添加により反応を停止させた。この後、９５℃で５分間加熱した。
【０１３４】
光学濃度は、異なるサンプルについて５４０ｎｍで測定した（ＯＤ５４０ｎｍ）。
【０１３５】
計算
酵素活性は、図２に示される標準曲線から決定される。
【０１３６】
活性は次のように計算される：
【数１】
2014527813.tif 000004
式中：
Ｔ＝ΔＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ
＝ＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ−ＯＤ５４０ｎｍＢＬＡＮＫ
ｍ＝標準曲線の勾配（約１．０）
ｃ＝標準曲線のｙ軸切片（常に負であり、そして約−０．０２）
１８０．１６≡グルコースの分子量
１０３≡μｍｏｌへ変換するため
Ａ≡アッセイ体積（ｍｌ）
Ｖ≡酵素体積（ｍｌ）
ｔ≡アッセイ時間（分）
Ｄ＝実際の酵素希釈因子（例えば、１．０００ｇを１リットルに希釈する場合、Ｄ＝１０００）
【０１３７】
ラミナリナーゼ（ＤＮＳラミナリン方法）
原理
ラミナリナーゼによって触媒される反応は、１，３−β−Ｄ−グルカンの１，３−グルコシド結合のエンド加水分解を含む。基質には、ラミナリン、パラミロンおよびパキマンが含まれる。反応の生成物（β−１，３−グルカンオリゴ糖）は、３，５−ニトロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増大を測定することによって、比色測定で決定される。酵素活性は、グルコース当量としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍにおける吸光度との間の関係から計算される。
【０１３８】
アッセイはｐＨ５．０および５０℃で実行したが、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために、異なるｐＨおよび温度の値で実施することができる。
【０１３９】
単位の定義
ラミナリナーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０および５０℃（または指定される通り））下で１分につき１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。
【０１４０】
材料
セルラーゼ活性アッセイについて上記で与えられた材料を参照。
【０１４１】
ラミナリン（ラミナリア・ディギタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）由来）。供給業者：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ。製品番号：Ｌ９６３４
１．００％（ｗ／ｖ溶液）ラミナリン溶液（基質溶液  ０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）
【０１４２】
１．７５ｍｌのラミナリン溶液は５０℃で１０分間０．２５ｍｌの希釈酵素溶液と混合され、反応は、２ｍｌのＤＮＳ溶液の添加により停止される。
【０１４３】
０、０．１２５、０．２５、０．５および０．７５ｍｇ／ｍｌのグルコース溶液を用いて標準曲線を作成した。
【０１４４】
光学濃度は５４０ｎｍで測定した（ＯＤ５４０ｎｍ）。
【０１４５】
計算
活性は次のように計算される：
【数２】
2014527813.tif 000005
式中：
Ｔ＝ΔＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ
＝ＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ−ＯＤ５４０ｎｍＢＬＡＮＫ
ｍ＝標準曲線の勾配（約１．０）
ｃ＝標準曲線のｙ軸切片（常に負であり、そして約−０．０３）
１８０．１６≡グルコースの分子量
１０３  ≡μｍｏｌへ変換するため
Ａ≡アッセイ体積（ｍｌ）
Ｖ≡酵素体積（ｍｌ）
ｔ≡アッセイ時間（分）
Ｄ＝酵素希釈因子（例えば、１ｇを１リットルに希釈する場合、Ｄ＝１０００）
【０１４６】
アラビナーゼアッセイ
原理
アラビナーゼ活性のアッセイは、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増大を測定することにより、比色測定による決定に基づく。酵素活性は、アラビノース当量としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍにおける吸光度との間の関係から計算した。
【０１４７】
アッセイはｐＨ３．５で実行したが、酵素の付加的な特徴付けおよび特定化のために、異なるｐＨ値で実施することができる。
【０１４８】
単位の定義
アラビナーゼ（アラビナナーゼ（エンド−１，５−アルファ−Ｌ−アラビナナーゼ））活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ３．５（または指定される通り）および５０℃）下で１分につき１μｍｏｌのグアラビノース当量を生じる酵素の量として定義される。
【０１４９】
材料
Ｍｅｇａｚｙｍｅ砂糖大根アラビナン
アラビノースＳｉｇｍａ  Ａ３１３１  Ｍ．Ｗ．：１５０．１
酢酸ナトリウム無水‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０２３６。Ｍ．Ｗ．：８２．０３
酢酸（「氷」）‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０００１。Ｍ．Ｗ．：６０．０５
３，５−ジニトロサリチル酸ＧＰＲ（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシ安息香酸）。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：２８２３５
水酸化ナトリウムペレット‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０２５２。Ｍ．Ｗ．：４０．００
（＋）−酒石酸カリウムナトリウム ‘ＡｎａｌａＲ’。供給業者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。製品番号：１０２１９。Ｍ．Ｗ．：２８２．２２
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．５中１．５％（ｗ／ｖ溶液）のアラビナン溶液（基質溶液）
３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液。３２ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムペレット、および６００ｇ／Ｌの（＋）−酒石酸カリウムナトリウムを含有する緩衝液中２０ｇ／ＬのＤＮＳ
アラビナーゼ標準溶液（０．５０ｍｇ／ｍｌ）
【０１５０】
手順
酵素組成物をサンプルに希釈し、０、０．１２５、０．２５、０．３７５、および０．５ｍｇ／ｍｌのアラビナーゼ濃度を用いてグルコース標準曲線を作成した。
【０１５１】
０．２５ｍｌの酵素溶液を５０℃で１．７５ｍｌの基質溶液（１．５％ｗ／ｖ）と混合し、１０分後にＤＮＳ溶液の添加により反応を停止させた。この後、９５℃で５分間加熱した。
【０１５２】
光学濃度は、異なるサンプルについて５４０ｎｍで測定した（ＯＤ５４０ｎｍ）。
【０１５３】
計算
酵素活性は、標準曲線から決定される。
【０１５４】
活性は次のように計算される：
【数３】
2014527813.tif 000006
式中：
Ｔ＝ΔＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ
＝ＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ−ＯＤ５４０ｎｍＢＬＡＮＫ
ｍ＝標準曲線の勾配（約１．０）
ｃ＝標準曲線のｙ軸切片（常に負であり、そして約−０．０２）
１５０．１３≡アラビナーゼの分子量
１０３≡μｍｏｌへ変換するため
Ａ≡アッセイ体積（ｍｌ）
Ｖ≡酵素体積（ｍｌ）
ｔ≡アッセイ時間（分）
Ｄ＝実際の酵素希釈因子（例えば、１．０００ｇを１リットルに希釈する場合、Ｄ＝１０００）
【０１５５】
アラビノフラノシダーゼアッセイ
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼによって触媒される反応は、α−Ｌ−アラビノシドの非還元性α−Ｌ−アラビノフラノシド残基における末端結合の加水分解を含む。酵素は、α−Ｌ−アラビノフラノシド、（１，３）−および／または（１，５）−結合を含有するα−Ｌ−アラビナン、アラビノキシランならびにアラビノガラクタンに作用する。
【０１５６】
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼのアッセイは、ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシドの酵素的な加水分解に基づく。アッセイは、「継続監視」方法ではなく「２点」方法である。酵素活性の計算は、インキュベーション期間の最初および最後にのみ行われる測定に基づく。反応の生成物のｐ−ニトロフェノールは、比色測定で決定される（ｐＨ調整の後）。酵素活性は、ｐ−ニトロフェノールの濃度と、４００ｎｍにおける吸光度との間の関係から計算される。
【０１５７】
希釈酵素溶液の調製：
全ての酵素溶液を、ガラス蒸留水を用いて粉末または液体酵素調製物から調製する。少量の体積または重量を伴う大きい希釈工程を回避することによって、アッセイ希釈誤差を最小限にする。酵素希釈物を作る際、液体サンプルについても、初期酵素サンプルを検量することがより正確である。これを行う場合、従って、液体サンプルの場合には２０℃の液体の比重を測定することが必要である。
【０１５８】
アッセイは「継続監視」方法ではなく「２点」方法であるので、異なる酵素系および条件によりインキュベーション期間内の直線性を保証することが重要である。基質濃度、ｐＨ、温度およびアッセイ時間の標準アッセイ条件下、アッセイは、ΔＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ（Ｔ）＝０．２０〜１．５０の範囲内で直線的であることが実証された。しかしながら、優れた実施のためには、アッセイは、ΔＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ（Ｔ）＝０．４００〜０．８００の画定範囲内で行われる。
【０１５９】
手順
各酵素サンプルアッセイは、３つの分析：２重試験（ＴＥＳＴ）分析およびブランク（ＢＬＡＮＫ）分析を含む。与えられる手順には、単一の酵素サンプルの分析が記載される。
【０１６０】
【表２】
2014527813.tif 000007
【０１６１】
０．２５ｍｌの希釈酵素溶液を５０℃で溶液に添加し、１０分後に４ｍｌの０．４Ｍグリシン溶液、ｐＨ１０．８（停止試薬）の添加により反応を停止させた。
【０１６２】
吸光度は、２５℃において水のブランクに対して４００ｎｍで測定した。
・  測定した２重ＴＥＳＴＳについてＯＤ４００ｎｍＴＥＳＴを決定。
・  ＯＤ４００ｎｍＢＬＡＮＫを決定。
【０１６３】
計算
【数４】
2014527813.tif 000008
式中：
Ｔ＝ＯＤ４００ｎｍＴＥＳＴ−ＯＤ４００ｎｍＢＬＡＮＫ
１８３００＝ｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（１ｃｍ経路長）
Ｖ＝７．２５（試験における全液体体積（ｍｌ））
ｔ＝１０（分）
１ｕ＝１μｍｏｌ．分−１
Ｅ＝０．２５（希釈酵素サンプルの体積（ｍｌ））
Ｄ＝酵素希釈因子（例えば、１ｍｌを１リットルに希釈する場合、Ｄ＝１０００）
【０１６４】
セロビオヒドロラーゼアッセイ
原理
セロビオヒドロラーゼによって触媒される反応は、セルロースおよびセロテトラオースの１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を含み、鎖の非還元性端部からセロビオースが放出される。
【０１６５】
セロビオヒドロラーゼのアッセイは、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオピラノシドの酵素的な加水分解に基づく。反応の生成物のｐ−ニトロフェノールは、比色測定で決定される（ｐＨ調整の後）。酵素活性は、ｐ−ニトロフェノールの濃度と、４００ｎｍにおける吸光度との間の関係から計算される。
【０１６６】
アッセイは、ΔＯＤ５４０ｎｍＴＥＳＴ（Ｔ）＝０．４００〜０．８００の直線的な画定範囲内で行われる。
【０１６７】
手順
各酵素サンプルアッセイは、３つの分析：２重試験（ＴＥＳＴ）分析およびブランク（ＢＬＡＮＫ）分析を含む。与えられる手順には、単一の酵素サンプルの分析が記載される。
【０１６８】
【表３】
2014527813.tif 000009
【０１６９】
０．２５ｍｌの希釈酵素溶液を５０℃で試験溶液に添加し、３０分後に４ｍｌの０．４Ｍグリシン溶液、ｐＨ１０．８（停止試薬）を各管に添加した。
【０１７０】
吸光度は、１ｃｍのガラスキュベット中４００ｎｍにおいて、水のブランクに対して２０℃で測定した。
・  測定した２重ＴＥＳＴＳについてＯＤ４００ｎｍＴＥＳＴを決定。
・  ＯＤ４００ｎｍＢＬＡＮＫを決定。
【０１７１】
計算
【数５】
2014527813.tif 000010
式中：
Ｔ＝ＯＤ４００ｎｍＴＥＳＴ−ＯＤ４００ｎｍＢＬＡＮＫ
１８３００＝ｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（１ｃｍ経路長）
Ｖ＝７．２５（試験における全液体体積（ｍｌ））
１０００＝リットルへ変換するため
１０６＝μｍｏｌへ変換するため
ｔ＝３０（分）
１ｕ＝１μｍｏｌ．ｍｉｎ−１
Ｅ＝０．２５（希釈酵素サンプルの体積（ｍｌ））
Ｄ＝酵素希釈因子（例えば、１ｍｌを１リットルに希釈する場合、Ｄ＝１０００）
【０１７２】
番号付けされた本発明に従う実施形態：
１．  エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素であって、本酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１７、および配列番号１８から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
２．  実施形態１に従う酵素であって、本酵素は、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満などである、可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）における活性の、不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質における活性に対する比率を有する。
【０１７４】
３．  エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素であって、本酵素は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６から選択されるいずれか１つ、またはその任意の機能性断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
４．  実施形態１〜３のいずれか１つに従う酵素であって、本酵素は、４０〜７０℃の範囲、例えば４５〜６５℃の範囲、例えば５０〜６５℃の範囲、例えば５５〜６５℃の範囲などの温度最適条件を有する。
【０１７６】
５．  実施形態１〜４のいずれか１つに従う酵素であって、前記酵素は、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する。
【０１７７】
６．  ３５０未満のアミノ酸、例えば３４０未満、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば３００未満などのアミノ酸、例えば２００〜３５０の範囲、例えば２２０〜３４５の範囲などのアミノ酸の総数を有する、実施形態１〜５のいずれか１つに従う酵素。
【０１７８】
７．  実施形態１〜６のいずれか１つに従う酵素であって、前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する。
【０１７９】
８．  実施形態１〜７のいずれか１つに従う酵素であって、前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号１〜１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列、またはその任意の機能性断片と比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する。
【０１８０】
９．  実施形態１〜８のいずれか１つに従う酵素であって、本酵素は、配列番号１〜１８のいずれか１つ、またはその任意の機能性断片によって同定されるアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
１０．  実施形態１または３のいずれか１つに従う酵素であって、本酵素は、配列番号１〜１８のいずれか１つ、またはその任意の機能性断片によって同定されるアミノ酸配列からなる。
【０１８２】
１１．  実施形態１〜１０のいずれか１つに従う酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【０１８３】
１２．  実施形態１１に従うＤＮＡ構築物を含む組換え発現ベクター。
【０１８４】
１３．  実施形態１１のＤＮＡ構築物または実施形態１２のベクターで形質転換された細胞。
【０１８５】
１４．  実施形態１〜１０のいずれか１つに従う酵素、または実施形態１１に従うＤＮＡ構築物、または実施形態１２に従うベクター、または実施形態１３に従う細胞を含む調製物。
【０１８６】
１５．  実施形態１、２、４〜１０のいずれか１つに従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素を、いずれか１つまたは複数のβ−グルカナーゼと組み合わせて含む組成物。
【０１８７】
１６．  実施形態１５に従う組成物であって、前記１つまたは複数のβ−グルカナーゼは、実施形態３〜１０のいずれか１つに従うエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素である。
【０１８８】
１７．  実施形態３〜１０のいずれか１つに従うエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を示す酵素を、いずれか１つまたは複数のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物。
【０１８９】
１８．  実施形態１７に従う組成物であって、前記１つまたは複数のキシラナーゼは、実施形態１、２、４〜１０のいずれか１つに従うエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を示す酵素である。
【０１９０】
１９．  実施形態１５〜１８のいずれか１つに従う組成物であって、前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性および前記エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性は、少なくとも２つの異なる酵素、例えば２つの異なる種からの少なくとも２つの異なる酵素などに由来する。
【０１９１】
２０．  少なくとも２つの酵素の組み合わせを含む、実施形態１５〜１９のいずれか１つに従う組成物であって、前記２つの酵素、またはそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２つの酵素、またはこれらの任意の機能性断片が、
配列番号１および配列番号７、
配列番号２および配列番号７、
配列番号３および配列番号７、
配列番号４および配列番号７、
配列番号５および配列番号７、
配列番号６および配列番号７、
配列番号１７および配列番号７、
配列番号１８および配列番号７、
配列番号１および配列番号８、
配列番号２および配列番号８、
配列番号３および配列番号８、
配列番号４および配列番号８、
配列番号５および配列番号８、
配列番号６および配列番号８、
配列番号１７および配列番号８、
配列番号１８および配列番号８、
配列番号１および配列番号９、
配列番号２および配列番号９、
配列番号３および配列番号９、
配列番号４および配列番号９、
配列番号５および配列番号９、
配列番号６および配列番号９、
配列番号１７および配列番号９、
配列番号１８および配列番号９、
配列番号１および配列番号１０、
配列番号２および配列番号１０、
配列番号３および配列番号１０、
配列番号４および配列番号１０、
配列番号５および配列番号１０、
配列番号６および配列番号１０、
配列番号１７および配列番号１０、
配列番号１８および配列番号１０、
配列番号１および配列番号１１、
配列番号２および配列番号１１、
配列番号３および配列番号１１、
配列番号４および配列番号１１、
配列番号５および配列番号１１、
配列番号６および配列番号１１、
配列番号１７および配列番号１１、
配列番号１８および配列番号１１、
配列番号１および配列番号１２、
配列番号２および配列番号１２、
配列番号３および配列番号１２、
配列番号４および配列番号１２、
配列番号５および配列番号１２、
配列番号６および配列番号１２、
配列番号１７および配列番号１２、
配列番号１８および配列番号１２、
配列番号１および配列番号１３、
配列番号２および配列番号１３、
配列番号３および配列番号１３、
配列番号４および配列番号１３、
配列番号５および配列番号１３、
配列番号６および配列番号１３、
配列番号１７および配列番号１３、
配列番号１８および配列番号１３、
配列番号１および配列番号１４、
配列番号２および配列番号１４、
配列番号３および配列番号１４、
配列番号４および配列番号１４、
配列番号５および配列番号１４、
配列番号６および配列番号１４、
配列番号１７および配列番号１４、
配列番号１８および配列番号１４、
配列番号１および配列番号１５、
配列番号２および配列番号１５、
配列番号３および配列番号１５、
配列番号４および配列番号１５、
配列番号５および配列番号１５、
配列番号６および配列番号１５、
配列番号１７および配列番号１５、
配列番号１８および配列番号１５、
配列番号１および配列番号１６、
配列番号２および配列番号１６、
配列番号３および配列番号１６、
配列番号４および配列番号１６、
配列番号５および配列番号１６、
配列番号６および配列番号１６、
配列番号１７および配列番号１６、ならびに
配列番号１８および配列番号１６、
からなるリストから選択される。
【０１９２】
２１．  実施形態１５〜２０のいずれか１つに従う組成物であって、醸造用途においてロータリングの前に使用される場合に、増大される全圧は、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満などの値まで低減される。
【０１９３】
２２．  実施形態１５〜２１のいずれか１つに従う組成物であって、醸造用途においてロータリングの前に使用される場合に、増大される全圧は、前記組成物を含まない負の対照の使用と比較して少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３または９５％だけ低減される。
【０１９４】
２３．  実施形態１５〜２２のいずれか１つに従う組成物であって、麦汁分離の前に醸造用途において使用される場合に、ろ過の５分後に捕集される麦汁体積で測定される麦汁のろ過性は、酵素を含まない対照に対して、１．５を超えて、例えば１．６を超えて、例えば１．７を超えて、例えば１．８を超えて、例えば１．９を超えて、例えば２．０を超えて、例えば２．１を超えて、例えば２．２を超えて、例えば２．３を超えて、例えば２．４を超えて、例えば２．５を超えて増大される。
【０１９５】
２４．  実施形態１５〜２３のいずれか１つに従う組成物であって、麦汁分離の前に醸造用途において使用される場合に、ろ過の５分後に捕集される麦汁体積で測定される麦汁のろ過性は、前記組成物を含まない負の対照の使用と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００％だけ増大される。
【０１９６】
２５．  いずれか１つまたは複数のさらなる酵素を含む、実施形態１５〜２４のいずれか１つに従う組成物。
【０１９７】
２６．  実施形態２５に従う組成物であって、前記１つまたは複数のさらなる酵素は、ＥＣ３．２．１．３２、ＥＣ３．２．１．１３６、またはＥＣ３．２．１．１５６に分類されるキシラナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン１，４−ベータ−グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼおよびα−Ｎ−アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される。
【０１９８】
２７．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、食料、飼料、または麦芽飲料製品の製造における使用。
【０１９９】
２８．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、生地または焼き製品の製造における使用。
【０２００】
２９．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、パルプまたは紙の調製における使用。
【０２０１】
３０．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、穀類成分の調製のための使用。
【０２０２】
３１．  実施形態２９に従う使用であって、穀類はライ麦、小麦、または大麦である。
【０２０３】
３２．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、ビールの製造または醸造プロセスからの副産物の改変における使用。
【０２０４】
３３．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、ワインまたはジュースの製造における使用。
【０２０５】
３４．  実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物の、バイオエタノールなどの第１または第２世代バイオ燃料の製造における使用。
【０２０６】
３５．  デンプンを含む材料のろ過性を変更する方法であって、前記方法は、実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物により前記デンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【０２０７】
３６．  醸造用途においてロータリングの間に増大される圧力を低減する方法であって、前記方法は、実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物で醸造マッシュを処理するステップを含む。
【０２０８】
３７．  食料、飼料、または飲料製品、例えばアルコールまたはノンアルコール飲料、例えばビールまたはウイスキーのような穀類または麦芽ベースの飲料の製造のための方法であって、前記方法は、実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【０２０９】
３８．  醸造マッシュの製造のための方法であって、前記方法は、実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【０２１０】
３９．  バイオエタノールなどの第１または第２世代バイオ燃料の製造のための方法であって、前記方法は、実施形態１〜１０に従う酵素、または実施形態１４に従う調製物、または実施形態１５〜２６のいずれか１つに従う組成物によりデンプンを含む材料を処理するステップを含む。
【０２１１】
４０．  実施形態３８〜３９のいずれか１つに従う方法によって得られる製品。
【０２１２】
４１．  実施形態４０に従う製品を含み、例えば、この製品が０．１％〜９９．９％の範囲であるような組成物。
【実施例】
【０２１３】
実施例１
醸造用途のために提出するキシラナーゼ／グルカナーゼに関する方法および結果
【０２１４】
以下の方法は、醸造における用途を有するキシラナーゼおよびグルカナーゼをスクリーンするために使用されている。
【０２１５】
方法：
水抽出可能なアラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ方法：
このアッセイにおいておよそＯＤ５４０＝０．２５〜０．３０を得るためのサンプル、およびキシロース標準（０、０．１２５、０．２５０、０．３７５および０．５００ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を蒸留水中で調製する。ｔ＝０分の時点で、１．７５ｍｌの可溶性小麦アラビノキシラン（０．１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ５中０．５％の小麦アラビノキシラン（ＰＷＡＸＹＨ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｂｒａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ））を５０℃で試験管に入れる。ｔ＝５分の時点で、２５０μｌの酵素溶液を５０℃で基質に添加した後、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。ｔ＝１５分の時点で、２ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）、１．６％の水酸化ナトリウム、３０％の酒石酸カリウムナトリウム）を酵素−基質溶液および２．０ｍｌの標準溶液に添加する。サンプル、ブランクおよび標準物添加ＤＮＳを、沸騰した水浴（９５℃）に５分間入れる。その後、サンプル、ブランクおよび標準物を、２５℃の水浴に２０分間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度をＯＤ５４０で読み取る。サンプルの希釈、研究に取り入れたサンプルの量および標準物に基づいて、サンプルのキシラナーゼ活性を計算することができる。
【０２１６】
エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼＷＥ−ＡＸ活性の１つの単位は、上記の条件（水抽出可能なアラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ方法）下で１分につき１μｍｏｌのキシロース当量を生じる酵素の量として定義される。
【０２１７】
水抽出不能なアラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナーゼ方法：
サンプルを蒸留水中で調製する。ｔ＝０分の時点で、１．７５ｍｌの不溶性小麦（０．１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ５中０．５％の小麦アラビノキシラン（ＰＷＡＸＹＩ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｂｒａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ））を５０℃で試験管に入れる。ｔ＝５分の時点で、２５０μｌの酵素溶液を５０℃で基質に添加した後、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。ｔ＝１５分の時点で、サンプルおよびブランクを、沸騰した水浴（９５℃）に５分間入れる。その後、サンプルおよびブランクを遠心分離して、残存する不溶性基質を沈殿させる。溶液に取り込まれたアラビノキシランの量は、Ｒｏｕａｕ，Ｘ．ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｔ，Ａ．（１９９４），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１２３−１３２によって記載される方法を用いて決定される。
【０２１８】
ＷＵ−ＡＸエンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ活性は、上記の条件下で、可溶化されたペントースの量（μｇペントース）として定義され、μｇペントース／キシラナーゼサンプル１グラムの単位の定義が得られる。
【０２１９】
キシラナーゼ活性アッセイ
このアッセイにおいておよそＯＤ５４０＝０．２５〜０．３０を得るためのサンプル、およびキシロース標準（０、０．１２５、０．２５０、０．３７５および０．５００ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を蒸留水中で調製する。ｔ＝０分の時点で、１．７５ｍｌの可溶性小麦アラビノキシラン（０．１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ５中０．５％の小麦アラビノキシラン（ＰＷＡＸＹＨ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｂｒａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ））を５０℃で試験管に入れる。ｔ＝５分の時点で、２５０μｌの酵素溶液を５０℃で基質に添加した後、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。ｔ＝１５分の時点で、２ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）、１．６％の水酸化ナトリウム、３０％の酒石酸カリウムナトリウム）を酵素−基質溶液および２．０ｍｌの標準溶液に添加する。サンプル、ブランクおよび標準物添加ＤＮＳを、沸騰した水浴（９５℃）に５分間入れる。その後、サンプル、ブランクおよび標準物を、２５℃の水浴に２０分間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度をＯＤ５４０で読み取る。サンプルの希釈、研究に取り入れたサンプルの量および標準物に基づいて、サンプルのキシラナーゼ活性を計算することができる。
【０２２０】
エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼＷＥ−ＡＸ活性の１つの単位は、上記の条件下で１分につき１μｍｏｌのキシロース当量を生じる酵素の量として定義される。
【０２２１】
グルカナーゼ活性アッセイ
このアッセイにおいて標準曲線内のＯＤ５４０を得るためのサンプル、およびグルコース標準（０、０．１２５、０．２５０、０．５００、および０．７５０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を蒸留水中で調製する。ｔ＝０分の時点で、１，７５ｍｌの大麦ベータ−グルカン（１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ５中１．５％の大麦ベータ−グルカン（ｐ−ＢＧＢＭ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｂｒａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ））を５０℃で試験管に入れる。ｔ＝５分の時点で、２５０μｌの酵素溶液を５０℃で基質に添加した後、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。ｔ＝１５分の時点で、２ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）、１，６％の水酸化ナトリウム、３０％の酒石酸カリウムナトリウム）を酵素−基質溶液および２．０ｍｌの標準溶液に添加する。サンプル、ブランクおよび標準物添加ＤＮＳを、沸騰した水浴（９５℃）に１５分間入れる。その後、サンプル、ブランクおよび標準物を、２５℃の水浴に２０分間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度をＯＤ５４０で読み取る。サンプルの希釈、研究に取り入れたサンプルの量および標準物に基づいて、サンプルのグルカナーゼ活性を計算することができる。
【０２２２】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性の１つの単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定される通り）および５０℃）下で１分につき１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。
【０２２３】
研究室スケールの醸造用途方法：
３：１（１５０ｍｌ：５０ｇグリスト）の水：グリスト比でＰｉｌｓｎｅｒ麦芽：大麦を７５：２５の比率で用いて、研究室スケールの醸造用途の研究を行った。最初に、マッシングインおよびｐＨ調整（５．４、２ＭのＨ２ＳＯ４）の前に水を５３℃に予熱した。初期温度に戻ったら（１０分間）、マッシングプロファイル（図１を参照）を開始させ、酵素を添加する。従来のプラスチック漏斗およびろ紙（紙フィルタ番号１、２４ｃｍ直径、Ｗｈａｔｍａｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いてマッシングオフ麦汁分離を行う。ろ過性能を、いくつかの他の麦汁パラメータ、すなわち粘度、β−グルカンおよびペントサンなどと同様に評価した。
【０２２４】
麦汁ろ過を３０分間測定した、その後ろ過を終了した。捕集した麦汁を冷却した後、任意のさらなる分析を行った。
【０２２５】
ろ過
ろ過データは、ブランク（外因性酵素が添加されない醸造）に対して、５、１０、１５および３０分後に捕集された麦汁体積として与えられる。
【０２２６】
パイロットスケールの醸造
パイロットスケールの醸造施設（２ＨＬ容量）でトライアルを実行した。ロータリングおよび水平ｋｉｓｅｌｇｕｈｒろ過によるビールろ過によって、麦汁分離を行った。
【０２２７】
「挑戦的な」醸造条件下でグルカナーゼおよびキシラナーゼの組み合わせによるろ過の最適化を評価するために、７５％の麦芽および２５％の大麦を含む混合グリストを用いて、パイロットスケールの醸造トライアルを実行した。最初に、水：グリスト比を２．８：１（マッシュ開始）に設定し、ロータリングの開始時に３．１：１に増大させた。比較して、フルスケールの醸造所ロータリングではおよそ３．２〜３．８の水：グリスト比が一般的である。従って、３．１：１の水：グリスト比という本パイロットトライアル設定は、このスケールの挑戦的な限界にあると考えられる。
【０２２８】
２ローターミルを用いて麦芽および大麦を粉砕乾燥した。約０．７ｍｍのローター距離を用いて大麦および麦芽はいずれも２回製粉した。
【０２２９】
５３℃の初期マッシュ温度を目的としてマッシングインを行った。マッシングインの後、２．８：１の水：グリスト比のためのマッシュ体積調整および約５．５６へのｐＨ調整（乳酸）などの小さい調整を行った。マッシュの微調整の後、酵素を添加し、図１で与えられるマッシングプロファイルに従った。７０℃における糖化休止は１５分にプログラムしたが、休止期間は、ヨウ素試験によりデンプンが存在しないことが示されるまで、５分間延長した（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｎａｒｚｉｓｓ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｂａｃｋ，Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｍｕｅｎｃｈｅｎ（Ｆａｋｕｌｔａｅｔ  ｆｕｅｒ  Ｂｒａｕｗｅｓｅｎ，Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ），Ａｂｒｉｓｓ  ｄｅｒ  Ｂｉｅｒｂｒａｕｅｒｅｉ．ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ＧｍｂＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ，２００５）。
【０２３０】
７８℃で５分間の休止の後にマッシングオフを開始した。事前に「二重底（ｆａｌｓｅ  ｂｏｔｔｏｍ）」の真下の高さまで水が入れられたロータータンに、マッシュを移した。ろ過ケークの沈降のためにマッシュを５分間休止させた。この後、１５分間の再循環（１４０Ｌ／ｈ）を行い、ろ過ケークの沈降および麦汁の透明化を保証した。通常、フルスケール醸造では、ろ過は、所与の麦汁濁度が得られたら開始され得るが、本トライアルでは、再循環を１５分で一定に保持し、トライアルの比較を可能にした。ロータリングの間、以下の、時間（分）、捕集された麦汁体積（Ｌ）、ろ過ケークを横切るろ過圧力差（ｍｍＷＣ、ｍｍ水柱）、ポンプ容量（％）、麦汁濁度（ＥＢＣ）およびマッシュ温度（℃）を含むデータを捕集した。
【０２３１】
ろ過中にろ過ケークを横切って増大される圧力は、麦汁ロータリング性能の標準の設定に寄与する因子であると考えられる。非常に高い圧力差（例えば、第１の麦汁捕集中の２５０ｍｍＷＣ、および例えば、リマインダーのロータリングについては４５０ｍｍＷＣ）に到達したら、ろ過ケークのラッキング（ディープカットとしても知られている）が誘発される。ラッキングは、ろ過ケークが崩壊するか、あるいは特別に設計されたナイフでろ過ケークの切断を遅くすることによってろ過チャネル形成が救済されるプロセスである。ろ過ケークのラッキングの後、６分間の麦汁再循環（流速：１２０ｌ／ｈ）を導入し、継続ろ過のためにろ過ケークを満たした。ろ過ケークのラッキングはそうでなければ妥協されるろ過性能を救済し、そうでなければ麦汁品質の悪さももたらし得る。圧力により誘発されるラッキングが３回目のスパージングの始まりまでに導入されていなければ、３回目および４回目のスパージングの初めに自動ラッキングを行い、麦汁分離を終了する直前に完全なろ過のブロックが生じないことを保証した。
【０２３２】
ロータリングは、表１に示される設定を用いて行った。
【０２３３】
【表４】
2014527813.tif 000011
【０２３４】
最後のロータリングの後、麦汁（ｓｗｅｅｔ  ｗｏｒｔ）をマッシュタンに戻し、加熱して沸騰させ、ホップを添加した。ホッピングを８０分間継続させ、ホッピングの最後にｐＨを５．１０±０．０５に調整する。渦の使用によりホップを麦汁（ｂｉｔｔｅｒ  ｗｏｒｔ）から除去し、その後の麦汁を約８℃に冷却した。発酵のために、Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓからの下面発酵乾燥酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））Ｗ３４／７０を選択した。酵母を３０分間再水和させ、１００ｇ／ＨＬで投入した。主発酵を１０℃で５〜６日間維持した後、弱毒化およびジアセチルが８０ｐｐｂ未満になるまで、１５℃で熟成させた。１℃および０．７バールでビールをさらに２〜３週間貯蔵した後、ろ過した。
【０２３５】
１．２μｍのＰＰキャンドルプレートおよび珪藻土の使用によりビールを水平にろ過した。ろ過装置には８枚までのプレートが含まれ、約０．５ｍ２の総ろ過面積が得られる。本研究では、３枚のプレートが含まれ、１３０Ｌ／ｈの流量でろ過を実行し、６．９ＨＬ／（ｈ・ｍ２）のろ過速度が得られた。フルスケールの醸造所では、ろ過速度は通常５〜７ＨＬ／（ｈ・ｍ２）に設定される。従って、本発明の設定は上限であり、醸造プロセスにおける酵素の使用の選択からの潜在的利益を検証するためにビールろ過条件に挑戦する計画的な選択であることが明らかである。ビールろ過中、流量（Ｌ／ｈ）および圧力値（Ｐ−ｉｎおよびＰ−ｏｕｔ）を監視して、ビールのろ過性能を検証した。またビール品質を評価するために、元の重力（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｇｒａｖｉｔｙ）（ＯＧ）、見かけの抽出物（Ａｐｐａｒｅｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）（ＡＥ）、体積によるアルコール（Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｂｙ  Ｖｏｌｕｍｅ）（ＡＢＶ）、見かけの発酵度（Ａｐｐａｒｅｎｔ  Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＡＤＦ）、実際の発酵度（Ｒｅｅｌ  Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＲＤＦ）、ｐＨ、色および苦味などのいくつかのビール分析を実行した。
【０２３６】
結果：
キシラナーゼ：
キシラナーゼを、可溶性基質および不溶性基質におけるその活性、そのｐＨおよび温度特性についてスクリーニングした。
【０２３７】
結果は表２に示される。
【０２３８】
【表５】
2014527813.tif 000012
【０２３９】
ＷＥ−ＡＸおよびＷＵ−ＡＸ酵素活性（Ｕ）は、セクション「水抽出可能なアラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ方法」および「水抽出不能なアラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナーゼ方法」において記載されるように測定した。
【０２４０】
生化学的スクリーニングからの結果に基づいて、適用トライアルにおいてさらに試験するために、可溶性対不溶性アラビノキシランにおける適切な活性比を有するキシラナーゼを選択した。結果は表３に示される。
【０２４１】
【表６】
2014527813.tif 000013
【０２４２】
ろ過性能は、前に記載される（「ろ過」）ように測定され、負の対照（ブランク）に対して、異なる時点のろ液体積として示される。
【０２４３】
ＷＥ−ＡＸおよびＷＵ−ＡＸ酵素活性（Ｕ）は、セクション「水抽出可能なアラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ方法」および「水抽出不能なアラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナーゼ方法」において記載されるように測定した。
【０２４４】
グルカナーゼ：
グルカナーゼをその活性および温度特性についてスクリーニングし、結果は表４に示される。
【０２４５】
【表７】
2014527813.tif 000014
【０２４６】
グルカナーゼ活性／単位は、上記のグルカナーゼ活性アッセイにおいて記載されるように決定した。
【０２４７】
生化学的スクリーニングからの結果に基づいて、適用トライアルにおいてさらに試験するために、適切な特性を有するグルカナーゼを選択した。結果は表５に示される。
【０２４８】
【表８】
2014527813.tif 000015
【０２４９】
ろ過性能は、前に記載される（「ろ過」）ように測定され、負の対照（ブランク）に対
して、ろ液体積として与えられる。
【０２５０】
キシラナーゼおよびグルカナーゼの個々のスクリーニングに基づいて、コンビナトリアル実験を行い、結果は表６に示される。
【０２５１】
【表９】
2014527813.tif 000016
【０２５２】
ろ過性能は、前に記載される（「ろ過」）ように測定され、負の対照（ブランク）に対して、異なる時点のろ液体積として与えられる。
【０２５３】
適切な組み合わせを検証のために２ＨＬパイロットスケール施設においてさらに試験し、結果は、表７および図３に示される。
【０２５４】
【表１０】
2014527813.tif 000017
【０２５５】
実施例２
この実施例では、醸造用途のキシラナーゼが高分子量可溶性アラビノキシラン（ＨＭＷＳ−ＡＸ）および水抽出可能なアラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）に対して非常に高い選択性を有し得ることを示すことを試みた。本明細書により、限られた量のアラビノキシランだけが可溶化される必要があると考えられる。その結果として、関連のある異臭の可能性が非常に低減される。
【０２５６】
著しく低減された粘度はマッシュおよびビールの分離を促進する。醸造用途のために所望されるキシラナーゼ特性は、以下の表８の態様のうちの１つまたは複数を含み得る：
【０２５７】
【表１１】
2014527813.tif 000018
【０２５８】
【表１２】
2014527813.tif 000019
【０２５９】
図３に示されるような穀類中の水不溶性アラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）は、醸造所ではろ過ケークの安定性に結び付けられる。
穀類中のフェルラ酸（ＦＡ）の濃度は、非常に大きく組織に依存する。最高濃度は果皮材料において見出され、胚乳中の濃度はそれよりもかなり低い。異なる濃度が報告される。２７００μｇ／ｇ不溶性繊維、１８５μｇ／ｇ可溶性繊維の濃度があり得る（Ｂｕｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃ．ｏｆ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｖｏｌ．８１，ｐ．６５３−６０）。
【０２６０】
これを客観的にとらえると、不溶性繊維（ＷＵ−ＡＸ）中のアラビノキシランの２００個に１個のキシロース分子、および可溶性繊維（ＷＥ−ＡＸ）中の２５００個に１個のキシロースに対してだけ見出される。
【０２６１】
キシラナーゼが遊離フェルラ酸および４−ＶＧなどの異臭形成をビールにもたらすことはよく知られている事実である。
【０２６２】
方法：
表８および９で言及される基準に基づいて、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから１５個よりも多いキシラナーゼを可能性のある候補として見出した。実験室のマッシング用途において、３０％までの大麦を麦芽と組み合わせて適用してキシラナーゼをスクリーニングした。とりわけ、マッシュ分離速度、ペントサン／アラビノキシランレベルおよび麦汁粘度を監視した。我々の仮説を試験し、キシラナーゼ特性を醸造における機能性に結び付けるために、最高の候補をいくつかのパイロット醸造プラント研究において試験した。選択されたキシラナーゼ候補の最適用量をβ−グルカナーゼと組み合わせて試験した。
【０２６３】
結果および考察：
【０２６４】
【表１３】
2014527813.tif 000020
【０２６５】
パイロットプラント醸造では、酵素用量が唯一の変数である。ＷＵ−ＡＸ選択的キシラナーゼ（Ｘ１）を適用すると、ろ床の崩壊が生じる。ＷＥ−ＡＸ選択的キシラナーゼ候補（リファレンス、Ｘ２、Ｘ３）は、増大される圧力を低くする。リファレンスは、キシラナーゼおよびベータ−グルカナーゼのブレンドである。
【０２６６】
【表１４】
2014527813.tif 000021
【０２６７】
【表１５】
2014527813.tif 000022
【０２６８】
２０％大麦／８０％麦芽においてβ−グルカナーゼ（Ｂ）と組み合わせられた中用量（Ｘ）および高用量（Ｘｈ）で適用されたＷＥ−ＡＸ選択的キシラナーゼの最適化ブレンド。結果は、マッシュおよびビールの良好な分離性能を示し、異臭形成およびろ床崩壊の危険性は低い。
【０２６９】
結論
研究は、マッシングの間にＷＥ−ＡＸに対して高度に選択的であるキシラナーゼを醸造のために適用することの重要性を証明した。以下の利益が達成される：
・  良好なマッシュ分離およびビールろ過性能
・  ロータリング時のろ床崩壊の危険性が最小限
・  アラビノキシランの分解に関連する異臭形成の可能性の低下
・  キシラナーゼの過剰投与に対する許容性
【０２７０】
キシラナーゼは、多くの場合、分離制御のためにベータ−グルカナーゼと組み合わせて非常に有益な効果を伴って適用することができる。
【０２７１】
実施例３：
２ＨＬパイロット醸造トライアルにおけるＸ３／ＢｇｌＳ（ＡｔｕＸｙｎ３／ＢｓｕＧｌｕＳとも呼ばれる）の組み合わせの評価
材料および方法：
実験：酵素：
ＡｔｕＸｙｎ３（Ｘ３）／ＢｓｕＧｌｕＳ（Ｂｇｌｓ）（ａ）：ＢｇｌＳ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）グルカナーゼ）およびＸ３（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）キシラナーゼ）の組み合わせ（ＢｇＬＳ：０．５０ｍｇタンパク質／ｋｇグリスト、およびＸ３：１．５０ｍｇタンパク質／ｋｇグリスト）。
ＡｔｕＸｙｎ３（Ｘ３）／ＢｓｕＧｌｕＳ（Ｂｇｌｓ）（ｂ）：ＡｔｕＸｙｎ３（Ｘ３）／ＢｓｕＧｌｕＳ（Ｂｇｌｓ）（ａ）と同様であるが、ロバスト性を試験するためにＸ３用量が２０％増大されている。
【０２７２】
リファレンス：０．２０ｋｇ／Ｔグリストで投与される基準酵素製品（Ｕｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘ）
【０２７３】
原材料：
添加材料：大麦  ２２％ｗ／ｗ。
【０２７４】
麦芽：Ｐｉｌｓｎｅｒ麦芽Ｃｈｉｒａｚ  ４２，６％ｗ／ｗ、Ｐｉｌｓｎｅｒ麦芽Ｑｕｅｎｃｈ  ＤＭＧ  ３５，４％重量／重量（ｗｗ）。
【０２７５】
ｐＨの酸調整のために使用した全ての材料、カルシウム、亜鉛および苦味は食品グレードであり、標準的な醸造材料であると考えられる。
【０２７６】
醸造のためのレシピは、国際的なラガービールのようなビールスタイルを目的とする。
【０２７７】
製粉：
ｋｕｅｎｚｅｌ  ２ローラーパイロットミル。製粉材料をローラーに２回通して４ローラーミルをシミュレートする。
【０２７８】
麦芽グリスト：ミルは、ローラーの第１の通過の際は１．５ｍｍ、そして第２の通過の際は０．７ｍｍで運転した。
【０２７９】
大麦グリスト：ミルは、ローラーの第１の通過の際は１．５ｍｍ、そして第２の通過の際は０．４ｍｍで運転した。
【０２８０】
醸造所２ＨＬ：
全ての醸造は、１６°プラトー（Ｐｌａｔｏ）を目的として、１９０Ｌ麦汁のＨＧＢ（Ｈｉｇｈ  Ｇｒａｖｉｔｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ）インフュージョンマッシングおよび標準ロータリングに基づいた。固定流量で実施されるロータリングの間、差圧を記録した（ロータリング性能を評価するためのパラメータとして使用した）。全ての醸造材料を前もって（２４時間）製粉し、水との接触の前は閉鎖バケット内で保持した。マッシング開始後、最初の３分以内に全ての材料をマッシュケトルに投入した。酵素添加の前にカルシウムおよびｐＨ調整を行った。５２℃の中断でｐＨ（２０℃）を再検査した。７２℃で１０分後にヨウ素規定度を確認した。ロータリングを７８℃で実施した。
【０２８１】
第１の麦汁捕集の間、固定流量において９０ｌ／Ｈでロータリング性能を評価した。スパージングおよび弱い麦汁捕集の間、流量を１１０Ｌ／時および１３０Ｌ／時に増大させた。冷たい麦汁において化学分析を実施した。
【０２８２】
麦汁沸騰：
外部ボイラーを用いて４〜５％の蒸発で沸騰を行った。最終ビール中２０ＢＵを目的として、麦汁沸騰の最初からホップ抽出物を添加した。
【０２８３】
発酵  ５０Ｌ：
全ての発酵を５０Ｌのシリンドロコニカルミル（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｏｎｉｃａｌ］タンクにおいて実施した。発酵は、標準的な操作手順に従って行った。１５×１０６生酵母細胞／ｍｌで投入を行った。Ｎｕｃｌｅｏカウンターを用いて酵母カウントおよび生存率を計算した。
【０２８４】
ビール加工：
プレートおよびフレームフィルタは一定の圧力で作動した。流量評価は重量で行った。
【０２８５】
１および３枚のフィルタプレートからデータを収集した。
【０２８６】
脱醸造（ｄｅｂｒｅｗｉｎｇ）：
国際的なラガービールの標準であると考えられる５．０％ＡＢＶ（体積によるアルコール）に、全てのビールを脱醸造した。
【０２８７】
瓶詰め：
ＣＯ２を５．０ｇ／Ｌに調整した。ＭｃＬｅｎｎｏｎ自動充てん機において、単一の排出を用いて、全てのビールサンプルを３３ｃｌ標準ボトルに瓶詰めした。
【０２８８】
ビール分析：
ＧＣ−ＭＳを用いて新鮮なビールを分析した。
【０２８９】
ＧＣ−ＭＳを用いて化学的老化プロファイルを決定した。
【０２９０】
結果および観察：マッシング
以下の条件でマッシングを実施した：
５２℃で１０分間（作動中のミルを用いて１５〜２０分のマッシングをシミュレートする）。
６５℃で４０分間。
７２℃で３０分間。
７８℃で１０分間。
【０２９１】
全ての勾配工程を１℃で実行した。グラフ表示は図７に与えられる。
【０２９２】
１６°プラトー醸造を目的としてこのマッシング体制を用いて全てのトライアルを行った。このプロセス工程に対する所見はなかった。
【０２９３】
結果および観察：ロータリング
２ｈｌ醸造所において１５０ｋｇ／ｍ２の負荷でロータリングを実施した。これは、標準的な醸造所操作の代表である。ロータリングプロセスの制御は平均１００リットル／時の固定流量で行った。初期流量は、９０リットル／時であり、弱い麦汁の捕集の間に１３０リットル／時まで増大する。４つの醸造について差圧およびヘイズのインライン測定を記録した。ロータリングおよび麦汁捕集全体を約２時間かけて行った。
【０２９４】
トライアルＸ３／ＢｇｌＳ（ｂ）およびＸ３／ＢｇｌＳ（ａ）は最良のロータリング性能を有するトライアルであると示唆され、その次がトライアルＸ３／ＢｇｌＳ（ａ）であり、そしてトライアルＵＦ  ｍａｘが最低の性能を有する。
【０２９５】
【表１６】
2014527813.tif 000023
【０２９６】
表中の「差圧」および「第１の麦汁の増大される圧力」はｃｍＷＣ（ｃｍ水柱）で測定し、それぞれ（ｃｍ）および（ｃｍ／ｈ）ではない。
【０２９７】
結果および観察：沸騰後の麦汁分析
冷たい麦汁の分析は同様の結果を示す。ベータ−グルカン分析はサンプル間のわずかな違いを示す。
【０２９８】
【表１７】
2014527813.tif 000024
【０２９９】
【表１８】
2014527813.tif 000025
【０３００】
結果および観察：発酵
グリーンビールの分析は表１６に与えられる。
【０３０１】
【表１９】
2014527813.tif 000026
【０３０２】
グリーンビール分析は、トライアル間で高度の類似性を示す。全てのトライアルは相対的に低いＲＤＦを有するが、これは、重量／重量（ｗｗ）基準で計算して２２％の大麦を含む場合に通常見られる。
【０３０３】
結果および観察：ビールろ過
固定圧力を使用し、プレートおよびフレームフィルタを用いてビールサンプルをろ過した。約１５ｋｇの２つの樽をろ過し、個々の樽のろ過データは表１７に与えられる。第１の樽は１枚のフィルタシートを用いてろ過し、第２の樽は３枚のフィルタシートを用いてろ過した。差圧は常に０．５バールであった。フィルタプレートは、ＢｅｇｅｒｏｗからのＫＤ７（２０ｃｍ×２０ｃｍ）である。
【０３０４】
１枚または３枚のフィルタプレートによるろ過からのろ過曲線の全体像は同じである。１枚のフィルタプレートの記録が敏感すぎて実際の比率の違いを示すことができないと考えられる。
【０３０５】
【表２０】
2014527813.tif 000027
【０３０６】
結果および観察：最終ビール分析
標準的な操作手順（ＥＢＣ）に従ってトライアルビールを分析し、表１８に示す。
【０３０７】
【表２１】
2014527813.tif 000028
【０３０８】
結果および観察：最終ビールにおけるストレッカー（Ｓｔｒｅｃｋｅｒ）アルデヒドおよび「熟成マーカー」
新鮮および熟成（ａｇｅｄ）ビールの両方において分析を実施した。新鮮および熟成ビールの両方において、ＧＣ−ＭＳによりにより、ストレッカーアルデヒドおよび「熟成および熱マーカー」（２−Ｍｅ−Ｐｒ（２−メチルプロパナール）、２−Ｍｅ−Ｂｕ（２−メチルブタナール）、３−Ｍｅ−Ｂｕ（３−メチルブタナール）、フルフラール、メチオナール、ＰｈｅＡｃａｌ（フェニルアセトアルデヒド）およびＴ２Ｎ（トランス−２−ノネナール））を分析した。新鮮ビールの分析からのデータは表１９に与えられる。
【０３０９】
【表２２】
2014527813.tif 000029
【０３１０】
ストレッカーアルデヒド分析の前にトライアルビールを３７℃で２週間インキュベートした。熟成ビールサンプルのデータは表２０に与えられる。
【０３１１】
【表２３】
2014527813.tif 000030
【０３１２】
表２０で与えられるデータは、ストレッカーアルデヒドレベルの予想される増大を示す。フルフラールおよびトランス−２−ノネナールの増大は予想レベルに達する。
【０３１３】
結論：
パイロットスケール実験に基づいて、この実験で試験したＢｇｌＳおよびＸ３の比率は、パイロットスケール醸造において、良好に機能する、あるいはリファレンスのＵｌｔｒａＦｌｏ  Ｍａｘよりもさらに良好に機能すると結論付けることができる。
【０３１４】
３００ｍｇ／ｌβ−グルカン含有麦芽と組み合わせて２２％の大麦を含むという挑戦的な原材料の使用を鑑みて、結果は驚くべきものである。性能はマッシュ分離結果において見られるだけでなく、ビールろ過においても見られる。ＢＲＥＷ２（ペントサンデータ）を使用する場合に細胞壁材料の低可溶化のために、味の悪さおよび安定性に関連する品質の問題を引き起こし得る細胞壁材料をより低度で記録することができる。
【０３１５】
最後に、Ｘ３／Ｂｇｌｓ（ｂ）中のキシラナーゼ成分の用量の２０％の増大は、評価されるパラメータのいずれかに影響を与えないと思われ、これによりＸ３／Ｂｇｌｓ（ａ）はロバストな酵素組み合わせであることが示されると結論付けることができる。
【０３１６】
配列：
ＡｔｕＸｙｎ３、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）（配列番号１）、３０２ａａ
ＱＡＳＶＳＩＤＴＫＦＫＡＨＧＫＫＹＬＧＮＩＧＤＱＹＴＬＴＫＮＳＫＴＰＡＩＩＫＡＤＦＧＡＬＴＰＥＮＳＭＫＷＤＡＴＥＰＳＲＧＱＦＳＦＳＧＳＤＹＬＶＮＦＡＱＳＮＮＫＬＩＲＧＨＴＬＶＷＨＳＱＬＰＳＷＶＱＡＩＴＤＫＮＴＬＩＥＶＭＫＮＨＩＴＴＶＭＱＨＹＫＧＫＩＹＡＷＤＶＶＮＥＩＦＮＥＤＧＳＬＲＤＳＶＦＹＱＶＩＧＥＤＹＶＲＩＡＦＥＴＡＲＡＡＤＰＮＡＫＬＹＩＮＤＹＮＬＤＳＡＳＹＰＫＬＴＧＭＶＳＨＶＫＫＷＩＥＡＧＩＰＩＤＧＩＧＳＱＴＨＬＳＡＧＧＧＡＧＩＳＧＡＬＮＡＬＡＧＡＧＴＫＥＩＡＶＴＥＬＤＩＡＧＡＳＳＴＤＹＶＥＶＶＥＡＣＬＤＱＰＫＣＩＧＩＴＶＷＧＶＡＤＰＤＳＷＲＳＳＳＴＰＬＬＦＤＳＮＹＮＰＫＰＡＹＴＡＩＡＮＡＬ
【０３１７】
ＴｅｒＸｙｎ１、ゲオスミチア・エメルソニ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））（配列番号２）
ＡＧＬＮＴＡＡＫＡＩＧＬＫＹＦＧＴＡＴＤＮＰＥＬＳＤＴＡＹＥＴＱＬＮＮＴＱＤＦＧＱＬＴＰＡＮＳＭＫＷＤＡＴＥＰＥＱＮＶＦＴＦＳＡＧＤＱＩＡＮＬＡＫＡＮＧＱＭＬＲＣＨＮＬＶＷＹＮＱＬＰＳＷＶＴＳＧＳＷＴＮＥＴＬＬＡＡＭＫＮＨＩＴＮＶＶＴＨＹＫＧＱＣＹＡＷＤＶＶＮＥＡＬＮＤＤＧＴＹＲＳＮＶＦＹＱＹＩＧＥＡＹＩＰＩＡＦＡＴＡＡＡＡＤＰＮＡＫＬＹＹＮＤＹＮＩＥＹＰＧＡＫＡＴＡＡＱＮＬＶＫＬＶＱＳＹＧＡＲＩＤＧＶＧＬＱＳＨＦＩＶＧＥＴＰＳＴＳＳＱＱＱＮＭＡＡＦＴＡＬＧＶＥＶＡＩＴＥＬＤＩＲＭＱＬＰＥＴＥＡＬＬＴＱＱＡＴＤＹＱＳＴＶＱＡＣＡＮＴＫＧＣＶＧＩＴＶＷＤＷＴＤＫＹＳＷＶＰＳＴＦＳＧＹＧＤＡＣＰＷＤＡＮＹＱＫＫＰＡＹＥＧＩＬＴＧＬＧＱＴＶＴＳＴＴＹＩＩＳＰＴＴＳＶＧＴＧＴＴＴＳＳＧＧＳＧＧＴＴＧＶＡＱＨＷＥＱＣＧＧＬＧＷＴＧＰＴＶＣＡＳＧＹＴＣＴＶＩＮＥＹＹＳＱＣＬ
【０３１８】
ＡｔｕＸｙｎ４、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）（配列番号３）
ＥＰＩＥＰＲＱＡＳＶＳＩＤＴＫＦＫＡＨＧＫＫＹＬＧＮＩＧＤＱＹＴＬＴＫＮＳＫＴＰＡＩＩＫＡＤＦＧＡＬＴＰＥＮＳＭＫＷＤＡＴＥＰＳＲＧＱＦＳＦＳＧＳＤＹＬＶＮＦＡＱＳＮＮＫＬＩＲＧＨＴＬＶＷＨＳＱＬＰＳＷＶＱＳＩＴＤＫＮＴＬＩＥＶＭＫＮＨＩＴＴＶＭＱＨＹＫＧＫＩＹＡＷＤＶＶＮＥＩＦＮＥＤＧＳＬＲＤＳＶＦＹＫＶＩＧＥＤＹＶＲＩＡＦＥＴＡＲＡＡＤＰＮＡＫＬＹＩＮＤＹＮＬＤＳＡＳＹＰＫＬＴＧＭＶＳＨＶＫＫＷＩＡＡＧＩＰＩＤＧＩＧＳＱＴＨＬＳＡＧＧＧＡＧＩＳＧＡＬＮＡＬＡＧＡＧＴＫＥＩＡＶＴＥＬＤＩＡＧＡＳＳＴＤＹＶＥＶＶＥＡＣＬＮＱＰＫＣＩＧＩＴＶＷＧＶＡＤＰＤＳＷＲＳＳＳＴＰＬＬＦＤＳＮＹＮＰＫＰＡＹＴＡＩＡＮＡＬ
【０３１９】
ＡａｃＸｙｎ２、アスペルギルス・アキュリエタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（配列番号４）
ＭＶＧＬＬＳＩＴＡＡＬＡＡＴＶＬＰＮＩＶＳＡＶＧＬＤＱＡＡＶＡＫＧＬＱＹＦＧＴＡＴＤＮＰＥＬＴＤＩＰＹＶＴＱＬＮＮＴＡＤＦＧＱＩＴＰＧＮＳＭＫＷＤＡＴＥＰＳＱＧＴＦＴＦＴＫＧＤＶＩＡＤＬＡＥＧＮＧＱＹＬＲＣＨＴＬＶＷＹＮＱＬＰＳＷＶＴＳＧＴＷＴＮＡＴＬＴＡＡＬＫＮＨＩＴＮＶＶＳＨＹＫＧＫＣＬＨＷＤＶＶＮＥＡＬＮＤＤＧＴＹＲＴＮＩＦＹＴＴＩＧＥＡＹＩＰＩＡＦＡＡＡＡＡＡＤＰＤＡＫＬＦＹＮＤＹＮＬＥＹＧＧＡＫＡＡＳＡＲＡＩＶＱＬＶＫＮＡＧＡＫＩＤＧＶＧＬＱＡＨＦＳＶＧＴＶＰＳＴＳＳＬＶＳＶＬＱＳＦＴＡＬＧＶＥＶＡＹＴＥＡＤＶＲＩＬＬＰＴＴＡＴＴＬＡＱＱＳＳＤＦＱＡＬＶＱＳＣＶＱＴＴＧＣＶＧＦＴＩＷＤＷＴＤＫＹＳＷＶＰＳＴＦＳＧＹＧＡＡＬＰＷＤＥＮＬＶＫＫＰＡＹＮＧＬＬＡＧＭＧＶＴＶＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＧＫＴＴＴＴＴＴＧＡＴＳＴＧＴＴＡＡＨＷＧＱＣＧＧＬＮＷＳＧＰＴＡＣＡＴＧＹＴＣＴＹＶＮＤＹＹＳＱＣＬ
【０３２０】
ＴｒｅＸｙｎ３、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号５）
ＭＫＡＮＶＩＬＣＬＬＡＰＬＶＡＡＬＰＴＥＴＩＨＬＤＰＥＬＡＡＬＲＡＮＬＴＥＲＴＡＤＬＷＤＲＱＡＳＱＳＩＤＱＬＩＫＲＫＧＫＬＹＦＧＴＡＴＤＲＧＬＬＱＲＥＫＮＡＡＩＩＱＡＤＬＧＱＶＴＰＥＮＳＭＫＷＱＳＬＥＮＮＱＧＱＬＮＷＧＤＡＤＹＬＶＮＦＡＱＱＮＧＫＳＩＲＧＨＴＬＩＷＨＳＱＬＰＡＷＶＮＮＩＮＮＡＤＴＬＲＱＶＩＲＴＨＶＳＴＶＶＧＲＹＫＧＫＩＲＡＷＤＶＶＮＥＩＦＮＥＤＧＴＬＲＳＳＶＦＳＲＬＬＧＥＥＦＶＳＩＡＦＲＡＡＲＤＡＤＰＳＡＲＬＹＩＮＤＹＮＬＤＲＡＮＹＧＫＶＮＧＬＫＴＹＶＳＫＷＩＳＱＧＶＰＩＤＧＩＧＳＱＳＨＬＳＧＧＧＧＳＧＴＬＧＡＬＱＱＬＡＴＶＰＶＴＥＬＡＩＴＥＬＤＩＱＧＡＰＴＴＤＹＴＱＶＶＱＡＣＬＳＶＳＫＣＶＧＩＴＶＷＧＩＳＤＫＤＳＷＲＡＳＴＮＰＬＬＦＤＡＮＦＮＰＫＰＡＹＮＳＩＶＧＩＬＱ
【０３２１】
ＴｒｅＸｙｎ５、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号６）
ＱＣＩＱＰＧＴＧＹＮＮＧＹＦＹＳＹＷＮＤＧＨＧＧＶＴＹＣＮＧＰＧＧＱＦＳＶＮＷＳＮＳＧＮＦＶＧＧＫＧＷＱＰＧＴＫＮＲＶＩＮＦＳＧＳＹＮＰＮＧＮＳＹＬＳＶＹＧＷＳＲＮＰＬＩＥＹＹＩＶＥＮＦＧＴＹＮＰＳＴＧＡＴＫＬＧＥＶＴＳＤＧＳＶＹＤＩＹＲＴＱＲＶＮＱＰＳＩＩＧＴＡＴＦＹＱＹＷＳＶＲＲＮＨＲＳＳＧＳＶＮＴＡＮＨＦＮＡＷＡＱＱＧＬＴＬＧＴＭＤＹＱＩＶＡＶＥＧＹＦＳＳＧＳＡＳＩＴＶＳＤ
【０３２２】
ＢｓｕＧｌｕＳ、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号７）、２１４ａａ
ＱＴＧＧＳＦＦＤＰＦＮＧＹＮＳＧＦＷＱＫＡＤＧＹＳＮＧＮＭＦＮＣＴＷＲＡＮＮＶＳＭＴＳＬＧＥＭＲＬＡＬＴＳＰＡＹＮＫＦＤＣＧＥＮＲＳＶＱＴＹＧＹＧＬＹＥＶＲＭＫＰＡＫＮＴＧＩＶＳＳＦＦＴＹＴＧＰＴＤＧＴＰＷＤＥＩＤＩＥＦＬＧＫＤＴＴＫＶＱＦＮＹＹＴＮＧＡＧＮＨＥＫＩＶＤＬＧＦＤＡＡＮＡＹＨＴＹＡＦＤＷＱＰＮＳＩＫＷＹＶＤＧＱＬＫＨＴＡＴＮＱＩＰＴＴＰＧＫＩＭＭＮＬＷＮＧＴＧＶＤＥＷＬＧＳＹＮＧＶＮＰＬＹＡＨＹＤＷＶＲＹＴＫＫ
【０３２３】
ＴｅｒＧｌｕ１、ゲオスミチア・エメルソニ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））（配列番号８）
ＡＰＶＫＥＫＧＩＫＫＲＡＳＰＦＱＷＦＧＳＮＥＳＧＡＥＦＧＮＮＮＩＰＧＶＥＧＴＤＹＴＦＰＮＴＳＡＩＱＩＬＩＤＱＧＭＮＩＦＲＶＰＦＬＭＥＲＭＶＰＮＱＭＴＧＰＶＤＳＡＹＦＱＧＹＳＱＶＩＮＹＩＴＳＨＧＡＳＡＶＩＤＰＨＮＦＧＲＹＹＮＮＩＩＳＳＰＳＤＦＱＴＦＷＨＴＩＡＳＮＦＡＤＮＤＮＶＩＦＤＴＮＮＥＹＨＤＭＤＥＳＬＶＶＱＬＮＱＡＡＩＤＧＩＲＡＡＧＡＴＳＱＹＩＦＶＥＧＮＳＷＴＧＡＷＴＷＴＱＶＮＤＡＭＡＮＬＴＤＰＱＮＫＩＶＹＥＭＨＱＹＬＤＳＤＧＳＧＴＳＤＱＣＶＮＳＴＩＧＱＤＲＶＥＳＡＴＡＷＬＫＱＮＧＫＫＡＩＬＧＥＹＡＧＧＡＮＳＶＣＥＴＡＶＴＧＭＬＤＹＬＡＮＮＴＤＶＷＴＧＡＩＷＷＡＡＧＰＷＷＧＤＹＩＦＳＭＥＰＰＳＧＩＡＹＥＱＶＬＰＬＬＱＰＹＬ
【０３２４】
ＢｓｕＧｌｕ１０３ＦＵＬＬ、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号９）
ＤＤＹＳＶＶＥＥＨＧＱＬＳＩＳＮＧＥＬＶＮＥＲＧＥＱＶＱＬＫＧＭＳＳＨＧＬＱＷＹＧＱＦＶＮＹＥＳＭＫＷＬＲＤＤＷＧＩＴＶＦＲＡＡＭＹＴＳＳＧＧＹＩＤＤＰＳＶＫＥＫＶＫＥＴＶＥＡＡＩＤＬＧＩＹＶＩＩＤＷＨＩＬＳＤＮＤＰＮＩＹＫＥＥＡＫＤＦＦＤＥＭＳＥＬＹＧＤＹＰＮＶＩＹＥＩＡＮＥＰＮＧＳＤＶＴＷＤＮＱＩＫＰＹＡＥＥＶＩＰＶＩＲＤＮＤＰＮＮＩＶＩＶＧＴＧＴＷＳＱＤＶＨＨＡＡＤＮＱＬＡＤＰＮＶＭＹＡＦＨＦＹＡＧＴＨＧＱＮＬＲＤＱＶＤＹＡＬＤＱＧＡＡＩＦＶＳＥＷＧＴＳＡＡＴＧＤＧＧＶＦＬＤＥＡＱＶＷＩＤＦＭＤＥＲＮＬＳＷＡＮＷＳＬＴＨＫＤＥＳＳＡＡＬＭＰＧＡＮＰＴＧＧＷＴＥＡＥＬＳＰＳＧＴＦＶＲＥＫＩＲＥＳＡＳＩＰＰＳＤＰＴＰＰＳＤＰＧＥＰＤＰＧＥＰＤＰＴＰＰＳＤＰＧＥＹＰＡＷＤＳＮＱＩＹＴＮＥＩＶＹＨＮＧＱＬＷＱＡＫＷＷＴＱＮＱＥＰＧＤＰＹＧＰＷＥＰＬＫＳＤＰＤＳＧＥＰＤＰＴＰＰＳＤＰＧＥＹＰＡＷＤＳＮＱＩＹＴＮＥＩＶＹＨＮＧＱＬＷＱＡＫＷＷＴＱＮＱＥＰＧＤＰＹＧＰＷＥＰＬＮ
【０３２５】
ＴｒｅＧｌｕ２、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１０）
ＱＱＴＶＷＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＰＴＮＣＡＰＧＳＡＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＩＰＧＡＴＴＩＴＴＳＴＲＰＰＳＧＰＴＴＴＴＲＡＴＳＴＳＳＳＴＰＰＴＳＳＧＶＲＦＡＧＶＮＩＡＧＦＤＦＧＣＴＴＤＧＴＣＶＴＳＫＶＹＰＰＬＫＮＦＴＧＳＮＮＹＰＤＧＩＧＱＭＱＨＦＶＮＤＤＧＭＴＩＦＲＬＰＶＧＷＱＹＬＶＮＮＮＬＧＧＮＬＤＳＴＳＩＳＫＹＤＱＬＶＱＧＣＬＳＬＧＡＹＣＩＶＤＩＨＮＹＡＲＷＮＧＧＩＩＧＱＧＧＰＴＮＡＱＦＴＳＬＷＳＱＬＡＳＫＹＡＳＱＳＲＶＷＦＧＩＭＮＥＰＨＤＶＮＩＮＴＷＡＡＴＶＱＥＶＶＴＡＩＲＮＡＧＡＴＳＱＦＩＳＬＰＧＮＤＷＱＳＡＧＡＦＩＳＤＧＳＡＡＡＬＳＱＶＴＮＰＤＧＳＴＴＮＬＩＦＤＶＨＫＹＬＤＳＤＮＳＧＴＨＡＥＣＴＴＮＮＩＤＧＡＦＳＰＬＡＴＷＬＲＱＮＮＲＱＡＩＬＴＥＴＧＧＧＮＶＱＳＣＩＱＤＭＣＱＱＩＱＹＬＮＱＮＳＤＶＹＬＧＹＶＧＷＧＡＧＳＦＤＳＴＹＶＬＴＥＴＰＴＧＳＧＮＳＷＴＤＴＳＬＶＳＳＣＬＡＲＫ
【０３２６】
ＴｒｅＧｌｕ３、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１１）
ＱＴＳＣＤＱＷＡＴＦＴＧＮＧＹＴＶＳＮＮＬＷＧＡＳＡＧＳＧＦＧＣＶＴＡＶＳＬＳＧＧＡＳＷＨＡＤＷＱＷＳＧＧＱＮＮＶＫＳＹＱＮＳＱＩＡＩＰＱＫＲＴＶＮＳＩＳＳＭＰＴＴＡＳＷＳＹＳＧＳＮＩＲＡＮＶＡＹＤＬＦＴＡＡＮＰＮＨＶＴＹＳＧＤＹＥＬＭＩＷＬＧＫＹＧＤＩＧＰＩＧＳＳＱＧＴＶＮＶＧＧＱＳＷＴＬＹＹＧＹＮＧＡＭＱＶＹＳＦＶＡＱＴＮＴＴＮＹＳＧＤＶＫＮＦＦＮＹＬＲＤＮＫＧＹＮＡＡＧＱＹＶＬＳＹＱＦＧＴＥＰＦＴＧＳＧＴＬＮＶＡＳＷＴＡＳＩＮ
【０３２７】
ＴｒｅＧｌｕ４、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１２）
ＨＧＨＩＮＤＩＶＩＮＧＶＷＹＱＡＹＤＰＴＴＦＰＹＥＳＮＰＰＩＶＶＧＷＴＡＡＤＬＤＮＧＦＶＳＰＤＡＹＱＮＰＤＩＩＣＨＫＮＡＴＮＡＫＧＨＡＳＶＫＡＧＤＴＩＬＦＱＷＶＰＶＰＷＰＨＰＧＰＩＶＤＹＬＡＮＣＮＧＤＣＥＴＶＤＫＴＴＬＥＦＦＫＩＤＧＶＧＬＬＳＧＧＤＰＧＴＷＡＳＤＶＬＩＳＮＮＮＴＷＶＶＫＩＰＤＮＬＡＰＧＮＹＶＬＲＨＥＩＩＡＬＨＳＡＧＱＡＮＧＡＱＮＹＰＱＣＦＮＩＡＶＳＧＳＧＳＬＱＰＳＧＶＬＧＴＤＬＹＨＡＴＤＰＧＶＬＩＮＩＹＴＳＰＬＮＹＩＩＰＧＰＴＶＶＳＧＬＰＴＳＶＡＱＧＳＳＡＡＴＡＴＡＳＡＴＶＰＧＧＧＳＧＰＴＳＲＴＴＴＴＡＲＴＴＱＡＳＳＲＰＳＳＴＰＰＡＴＴＳＡＰＡＧＧＰＴＱＴＬＹＧＱＣＧＧＳＧＹＳＧＰＴＲＣＡＰＰＡＴＣＳＴＮＰＹＹＡＱＣＬＮ
【０３２８】
ＴｒｅＧｌｕ６、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１３）
ＡＦＳＷＫＮＶＫＬＧＧＧＧＧＦＶＰＧＩＩＦＨＰＫＴＫＧＶＡＹＡＲＴＤＩＧＧＬＹＲＬＮＡＤＤＳＷＴＡＶＴＤＧＩＡＤＮＡＧＷＨＮＷＧＩＤＡＶＡＬＤＰＱＤＤＱＫＶＹＡＡＶＧＭＹＴＮＳＷＤＰＳＮＧＡＩＩＲＳＳＤＲＧＡＴＷＳＦＴＮＬＰＦＫＶＧＧＮＭＰＧＲＧＡＧＥＲＬＡＶＤＰＡＮＳＮＩＩＹＦＧＡＲＳＧＮＧＬＷＫＳＴＤＧＧＶＴＦＳＫＶＳＳＦＴＡＴＧＴＹＩＰＤＰＳＤＳＮＧＹＮＳＤＫＱＧＬＭＷＶＴＦＤＳＴＳＳＴＴＧＧＡＴＳＲＩＦＶＧＴＡＤＮＩＴＡＳＶＹＶＳＴＮＡＧＳＴＷＳＡＶＰＧＱＰＧＫＹＦＰＨＫＡＫＬＱＰＡＥＫＡＬＹＬＴＹＳＷＷＰＤＡＱＬＦＲＳＴＤＳＧＴＴＷＳＰＩＷＡＷＡＳＹＰＴＥＴＹＹＹＳＩＳＴＰＫＡＰＷＩＫＮＮＦＩＤＶＴＳＥＳＰＳＤＧＬＩＫＲＬＧＷＭＩＥＳＬＥＩＤＰＴＤＳＮＨＷＬＹＧＴＧＭＴＩＦＧＧＨＤＬＴＮＷＤＴＲＨＮＶＳＩＱＳＬＡＤＧＩＥＥＦＳＶＱＤＬＡＳＡＰＧＧＳＥＬＬＡＡＶＧＤＤＮＧＦＴＦＡＳＲＮＤＬＧＴＳＰＱＴＶＷＡＴＰＴＷＡＴＳＴＳＶＤＹＡＧＮＳＶＫＳＶＶＲＶＧＮＴＡＧＴＱＱＶＡＩＳＳＤＧＧＡＴＷＳＩＤＹＡＡＤＴＳＭＮＧＧＴＶＡＹＳＡＤＧＤＴＩＬＷＳＴＡＳＳＧＶＱＲＳＱＦＱＧＳＦＡＳＶＳＳＬＰＡＧＡＶＩＡＳＤＫＫＴＮＳＶＦＹＡＧＳＧＳＴＦＹＶＳＫＤＴＧＳＳＦＴＲＧＰＫＬＧＳＡＧＴＩＲＤＩＡＡＨＰＴＴＡＧＴＬＹＶＳＴＤＶＧＩＦＲＳＴＤＳＧＴＴＦＧＱＶＳＴＡＬＴＮＴＹＱＩＡＬＧＶＧＳＧＳＮＷＮＬＹＡＦＧＴＧＰＳＧＡＲＬＹＡＳＧＤＳＧＡＳＷＴＤＩＱＧＳＱＧＦＧＳＩＤＳＴＫＶＡＧＳＧＳＴＡＧＱＶＹＶＧＴＮＧＲＧＶＦＹＡＱＧＴＶＧＧＧＴＧＧＴＳＳＳＴＫＱＳＳＳＳＴＳＳＡＳＳＳＴＴＬＲＳＳＶＶＳＴＴＲＡＳＴＶＴＳＳＲＴＳＳＡＡＧＰＴＧＳＧＶＡＧＨＹＡＱＣＧＧＩＧＷＴＧＰＴＱＣＶＡＰＹＶＣＱＫＱＮＤＹＹＹＱＣＶ
【０３２９】
ＴｒｅＧｌｕ７、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１４）
ＨＧＱＶＱＮＦＴＩＮＧＱＹＮＱＧＦＩＬＤＹＹＹＱＫＱＮＴＧＨＦＰＮＶＡＧＷＹＡＥＤＬＤＬＧＦＩＳＰＤＱＹＴＴＰＤＩＶＣＨＫＮＡＡＰＧＡＩＳＡＴＡＡＡＧＳＮＩＶＦＱＷＧＰＧＶＷＰＨＰＹＧＰＩＶＴＹＶＶＥＣＳＧＳＣＴＴＶＮＫＮＮＬＲＷＶＫＩＱＥＡＧＩＮＹＮＴＱＶＷＡＱＱＤＬＩＮＱＧＮＫＷＴＶＫＩＰＳＳＬＲＰＧＮＹＶＦＲＨＥＬＬＡＡＨＧＡＳＳＡＮＧＭＱＮＹＰＱＣＶＮＩＡＶＴＧＳＧＴＫＡＬＰＡＧＴＰＡＴＱＬＹＫＰＴＤＰＧＩＬＦＮＰＹＴＴＩＴＳＹＴＩＰＧＰＡＬＷＱＧ
【０３３０】
ＴｒｅＧｌｕ８、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号１５）
ＧＫＩＫＹＬＧＶＡＩＰＧＩＤＦＧＣＤＩＤＧＳＣＰＴＤＴＳＳＶＰＬＬＳＹＫＧＧＤＧＡＧＱＭＫＨＦＡＥＤＤＧＬＮＶＦＲＩＳＡＴＷＱＦＶＬＮＮＴＶＤＧＫＬＤＥＬＮＷＧＳＹＮＫＶＶＮＡＣＬＥＴＧＡＹＣＭＩＤＭＨＮＦＡＲＹＮＧＧＩＩＧＱＧＧＶＳＤＤＩＦＶＤＬＷＶＱＩＡＫＹＹＥＤＮＤＫＩＩＦＧＬＭＮＥＰＨＤＬＤＩＥＩＷＡＱＴＣＱＫＶＶＴＡＩＲＫＡＧＡＴＳＱＭＩＬＬＰＧＴＮＦＡＳＶＥＴＹＶＳＴＧＳＡＥＡＬＧＫＩＴＮＰＤＧＳＴＤＬＬＹＦＤＶＨＫＹＬＤＩＮＮＳＧＳＨＡＥＣＴＴＤＮＶＤＡＦＮＤＦＡＤＷＬＲＱＮＫＲＱＡＩＩＳＥＴＧＡＳＭＥＰＳＣＭＴＡＦＣＡＱＮＫＡＩＳＥＮＳＤＶＹＩＧＦＶＧＷＧＡＧＳＦＤＴＳＹＩＬＴＬＴＰＬＧＫＰＧＮＹＴＤＮＫＬＭＮＥＣＩＬＤＱＦＴＬＤＥＫＹＲＰＴＰＴＳＩＳＴＡＡＥＥＴＡＴＡＴＡＴＳＤＧＤＡＰＳＴＴＫＰＩＦＲＥＥＴＡＳＰＴＰＮＡＶＴＫＰＳＰＤＴＳＤＳＳＤＤＤＫＤＳＡＡＳＭＳＡＱＧＬＴＧＴＶＬＦＴＶＡＡＬＧＹＭＬＶＡＦ
【０３３１】
ＢｓｕＧｌｕＣ  ＣＢＤ、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号１６）
ＭＫＲＳＩＳＩＦＩＴＣＬＬＩＴＬＬＴＭＧＧＭＩＡＳＰＡＳＡＡＧＴＫＴＰＶＡＫＮＧＱＬＳＩＫＧＴＱＬＶＮＲＤＧＫＡＶＱＬＫＧＩＳＳＨＧＬＱＷＹＧＥＹＶＮＫＤＳＬＫＷＬＲＤＤＷＧＩＴＶＦＲＡＡＭＹＴＡＤＧＧＹＩＤＮＰＳＶＫＮＫＶＫＥＡＶＥＡＡＫＥＬＧＩＹＶＩＩＤＷＨＩＬＮＤＧＮＰＮＱＮＫＥＫＡＫＥＦＦＫＥＭＳＳＬＹＧＮＴＰＮＶＩＹＥＩＡＮＥＰＮＧＤＶＮＷＫＲＤＩＫＰＹＡＥＥＶＩＳＶＩＲＫＮＤＰＤＮＩＩＩＶＧＴＧＴＷＳＱＤＶＮＤＡＡＤＤＱＬＫＤＡＮＶＭＹＡＬＨＦＹＡＧＴＨＧＱＦＬＲＤＫＡＮＹＡＬＳＫＧＡＰＩＦＶＴＥＷＧＴＳＤＡＳＧＮＧＧＶＦＬＤＱＳＲＥＷＬＫＹＬＤＳＫＴＩＳＷＶＮＷＮＬＳＤＫＱＥＳＳＳＡＬＫＰＧＡＳＫＴＧＧＷＲＬＳＤＬＳＡＳＧＴＦＶＲＥＮＩＬＧＴＫＤＳＴＫＤＩＰＥＴＰＳＫＤＫＰＴＱＥＮＧＩＳＶＱＹＲＡＧＤＧＳＭＮＳＮＱＩＲＰＱＬＱＩＫＮＮＧＮＴＴＶＤＬＫＤＶＴＡＲＹＷＹＫＡＫＮＫＧＱＮＦＤＣＤＹＡＱＩＧＣＧＮＶＴＨＫＦＶＴＬＨＫＰＫＱＧＡＤＴＹＬＥＬＧＦＫＮＧＴＬＡＰＧＡＳＴＧＮＩＱＬＲＬＨＮＤＤＷＳＮＹＡＱＳＧＤＹＳＦＦＫＳＮＴＦＫＴＴＫＫＩＴＬＹＤＱＧＫＬＩＷＧＴＥＰＮ
【０３３２】
ＢｓｕＸｙｎ３、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）キシラナーゼ変異体（配列番号１７）
ＡＳＴＤＹＷＱＮＷＴＦＧＧＧＩＶＮＡＶＮＧＳＧＧＮＹＳＶＮＷＳＮＴＧＮＦＶＶＧＫＧＷＴＴＧＳＰＦＲＴＩＮＹＮＡＧＶＷＡＰＮＧＮＧＹＬＴＬＹＧＷＴＲＳＰＬＩＥＹＹＶＶＤＳＷＧＴＹＲＰＴＧＴＹＫＧＴＶＫＳＤＧＧＴＹＤＩＹＴＴＴＲＹＮＡＰＳＩＤＧＤＤＴＴＦＴＱＹＷＳＶＲＱＳＫＲＰＴＧＳＮＡＴＩＴＦＳＮＨＶＮＡＷＫＳＨＧＭＮＬＧＳＮＷＡＹＱＶＭＡＴＥＧＹＱＳＳＧＳＳＮＶＴＶＷ
【０３３３】
ＢｓｕＸｙｎ４、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）キシラナーゼ変異体（配列番号１８）
ＡＳＴＤＹＷＱＮＷＴＤＧＹＧＩＶＮＡＶＮＧＳＧＧＮＹＳＶＮＷＳＮＴＧＮＦＶＶＧＫＧＷＴＴＧＳＰＦＲＴＩＮＹＮＡＧＶＷＡＰＮＧＮＧＹＬＴＬＹＧＷＴＲＳＰＬＩＥＹＹＶＶＤＳＷＧＴＹＲＰＴＧＴＹＫＧＴＶＹＳＤＧＧＷＹＤＩＹＴＡＴＲＤＮＡＰＳＩＤＧＤＦＴＴＦＴＱＹＷＳＶＲＱＳＫＲＰＴＧＳＮＡＴＩＴＦＳＮＨＶＮＡＷＲＳＨＧＭＤＬＧＳＮＷＡＹＱＶＭＡＴＥＧＹＬＳＳＧＳＳＮＶＴＶＷ
【図１】
2014527813.tif 000031
【図２】
2014527813.tif 000032
【図３】
2014527813.tif 000033
【図４】
2014527813.tif 000034
【図５】
2014527813.tif 000035
【図６】
2014527813.tif 000036
【図７】
2014527813.tif 000037
【配列表】
2014527813000001.app
【国際調査報告】
2014527813.tif 000038
2014527813.tif 000039
2014527813.tif 000040
2014527813.tif 000041
2014527813.tif 000042
2014527813.tif 000043
2014527813.tif 000044
2014527813.tif 000045