(57)【要約】  本発明は、改良された抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン、ならびにそのような可変ドメインを含むリガンドおよび薬物コンジュゲート、組成物、核酸、ベクターおよび宿主に関するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1〜21から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む、抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
配列番号1〜21から選択されるアミノ酸配列と比較して4個までのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む、抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
配列番号25〜45から選択される配列に対して少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
配列番号1〜21のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴で測定して、約0.1〜約10000nM、必要に応じて約1〜約6000nMの解離定数(KD)でヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴で測定して、約1.5×10-4〜約0.1sec-1、必要に応じて約3×10-4〜約0.1sec-1のオフ速度定数(Kd)でヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴で測定して、約2×106〜約1×104M-1sec-1、必要に応じて約1×106〜約2×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)でヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項８】
表面プラズモン共鳴で測定して、約0.1〜約10000nM、必要に応じて約1〜約6000nMの解離定数(KD)でカニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項９】
表面プラズモン共鳴で測定して、約1.5×10-4〜約0.1sec-1、必要に応じて約3×10-4〜約0.1sec-1のオフ速度定数(Kd)でカニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項１０】
表面プラズモン共鳴で測定して、約2×106〜約1×104M-1sec-1、必要に応じて約1×106〜約5×103M-1sec-1のオン速度定数(Ka)でカニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項１１】
前記可変ドメインが、DSC（示差走査熱量測定）で測定して少なくとも55℃、必要に応じて55 ≦ Tm ≦ 75℃の融解温度（Tm）を有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項１２】
前記可変ドメインが、SEC-MALLS（多角度レーザ光散乱を備えたサイズ排除クロマトグラフィー）で測定して実質的に単量体である、請求項1〜11のいずれか一項記載の可変ドメイン。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項記載の抗SA可変ドメインと、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含んでなる多重特異性リガンドであって、必要に応じて結合成分がTNFR1アンタゴニストである、多重特異性リガンド。
【請求項１４】
前記可変ドメインが薬物(必要に応じてNCE薬物)にコンジュゲート化され、必要に応じて、選択された可変ドメインが請求項4記載のものである、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗SA単一可変ドメイン。
【請求項１５】
請求項1〜12のいずれか一項記載の可変ドメインに融合されたポリペプチドまたはペプチド薬物を含んでなる融合タンパク質であって、必要に応じて、選択された可変ドメインが請求項4記載のものである、融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項1〜12および14のいずれか一項記載の可変ドメイン、請求項15記載の融合タンパク質または請求項13記載の多重特異性リガンドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤またはビヒクルとを含む組成物。
【請求項１７】
請求項1〜12および14のいずれか一項記載の可変ドメイン、または請求項13記載の多重特異性リガンド、または請求項15記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１８】
配列番号25〜45から選択された配列に対して少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１９】
請求項17または18記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項19記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２１】
少なくとも1回量の請求項1〜12および14のいずれか一項記載の可変ドメイン、請求項13記載の多重特異性リガンド、または請求項15記載の融合タンパク質を患者に投与することを含んでなる、患者の疾患もしくは障害の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン、ならびにそのようなドメインを含むリガンドおよび薬物コンジュゲート、組成物、核酸、ベクターおよび宿主に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
WO04003019およびWO2008/096158は、治療上有用な半減期を有する抗血清アルブミン(SA)結合成分、例えば抗SA免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を開示している。これらの公報は、単量体の抗SA dAbだけでなく、そのようなdAbを含む多重特異性リガンド、例えば抗SA dAbと標的抗原(TNFR1など)に特異的に結合するdAbとを含むリガンドを開示している。2種以上の動物種に由来する血清アルブミンに特異的に結合する結合成分、例えばヒト/マウス交差反応性抗SA dAbが開示されている。
【０００３】
WO05118642およびWO2006/059106は、薬物の半減期を増加するために、その薬物に抗SA結合成分、例えば抗SA免疫グロブリン単一可変ドメイン、をコンジュゲート化または会合させるという概念を開示している。タンパク質、ペプチドおよびNCE（化学物質）の薬物が開示され、かつ例示されている。WO2006/059106は、インスリン分泌増強薬、例えばグルカゴン様ペプチド(GLP)-1などのインクレチンホルモン、の半減期を高めるために、この概念を使用することを開示している。
【０００４】
Holt et al,“Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs”, Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, no 5, pp283-288, 2008をも参照されたい。
【０００５】
血清アルブミン、好ましくはヒトおよび非ヒト種由来のアルブミンに特異的に結合する、改良された重鎖可変ドメインdAbを提供することが望ましく、こうした改良型のdAbは、疾患の動物モデルにおいて、ならびにヒトの治療および/または診断において有用性があると考えられる。また、相対的に中程度の親和性から高度の親和性の抗SA結合成分(dAb)の選択肢を与えることも望ましいと考えられる。そのような成分は薬物に連結させることが可能であり、抗SA結合成分は意図された最終用途に応じて選択される。それによって、薬物は、抗SA結合成分の選択に応じて、慢性または急性の適応症を治療および/または予防するために、より良く調整することができるようになるだろう。単量体状態であるか、または溶液中で実質的にそのような状態である抗SA dAbを提供することも望ましいと考えられる。このことは、抗SA dAbがTNFR1などの細胞表面受容体に特異的に結合する結合成分(例えば、dAb)と、その受容体に拮抗することを目的として、連結される場合に、特に有利であろう。抗SA dAbの単量体状態は、多量体を形成する可能性が低いので、受容体架橋の機会を減らすのに有用である。多量体は、細胞表面上の受容体(例えば、TNFR1)に結合してそれらを架橋し、したがって、受容体アゴニズムおよび有害な受容体シグナル伝達の可能性を高めると考えられる。相対的に高い融解温度を有する抗SA dAbを提供することも望ましいであろう。これは、安定な製剤、例えば保存安定性の良い製剤、および良好な貯蔵寿命を有する可変ドメインを提供するために有用である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の態様はこれらの課題を解決する。
【０００７】
本発明の一態様において、配列番号1〜21から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む、抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【０００８】
本発明の一態様は、配列番号1〜21から選択されるアミノ酸配列と比較して4個までのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む、抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、1個、2個、3個または4個のアミノ酸の相違を除き、選択されたドメインのアミノ酸配列と同一の変異体単一可変ドメインが提供される。例えば、可変ドメインは、配列番号1〜21のいずれか1つのアミノ酸配列（または配列番号1〜21のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも95、96、97、98または99％同一であるアミノ酸配列）を含むか、またはこれからなる。
【０００９】
本発明の一態様は、配列番号25〜45から選択される配列に対して少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM7r-31-14、DOM7r-31-100、DOM7r-31-101、DOM7r-31-102、DOM7r-31-103、DOM7r-31-104、DOM7r-36-2、DOM7r-36-100、DOM7r-36-101、DOM7r-36-102、DOM7r-36-103、DOM7r-36-104、DOM7r-36-105、DOM7r-36-106、DOM7r-36-107、DOM7r-36-108、DOM7r-92-4、DOM7r-92-100、DOM7r-92-101、DOM7r-92-102およびDOM7r-92-103から選択される抗血清アルブミン（SA）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１０】
本発明の一態様は、本発明の抗SA可変ドメインと、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含んでなる多重特異性リガンドを提供する。
【００１１】
本発明の一態様は、薬物（必要に応じてNCE薬物）にコンジュゲート化された本発明の抗SA単一可変ドメインを提供する。本発明のある態様は、本発明の抗SA可変ドメインに融合された、もしくはコンジュゲートされた（NCEの場合）ポリペプチド、タンパク質、ペプチドもしくはNCE薬物を含んでなる融合産物、例えば融合タンパク質またはペプチドもしくはNCE（新規化学物質）薬物との融合物を提供する。好適には、融合産物において有用となるパートナーに融合もしくはコンジュゲートした時に観察される変異体のその結合パートナーに対する親和性の低下はわずかである。
【００１２】
本発明の一態様は、本発明の可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤またはビヒクルとを含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明のある態様は、本明細書に開示する抗血清アルブミンdAbと、インクレチンまたはインスリン分泌促進剤、例えばエキセンディン-4、GLP-1(7-37)、GLP-1(6-36)またはWO06/059106に開示された任意のインクレチンもしくはインスリン分泌促進剤（これらの薬剤は参照により本明細書に明示的に組み入れられ、本発明および請求の範囲に含めるために本明細書に記載されているものとする）とを含むポリペプチド融合物またはコンジュゲートを提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、上記の更なる態様の抗SA単一可変ドメインと、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含んでなる多重特異性リガンドを提供する。
【００１５】
本発明の一態様は、本発明の可変ドメイン、または多重特異性リガンド、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１６】
本発明の一態様は、配列番号25〜45から選択された配列に対して少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１７】
本発明の一態様は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００１８】
本発明の一態様は、本発明のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００１９】
本発明のある態様は、少なくとも1回量の本発明の可変ドメイン、多重特異性リガンド、または融合タンパク質を患者に投与することを含んでなる、患者の疾患もしくは障害の治療または予防方法を提供する。
【００２０】
本発明の任意の態様の実施形態では、抗血清アルブミン親和性が良好な抗血清アルブミン単一可変ドメインが提供される。可変ドメインの選択によって、所望の治療および／または予防の状況に従って半減期を調整することが可能である。例えば、一実施形態において、血清アルブミンに対する可変ドメインの親和性は比較的高く、その場合可変ドメインは慢性もしくは持続性の疾患、症状、毒性または他の慢性の適応症を治療および／または予防するのに有用な製品に含めるのに有用であろう。一実施形態において、血清アルブミンに対する可変ドメインの親和性は比較的低く、その場合可変ドメインは急性の疾患、症状、毒性または他の急性の適応症を治療および／または予防するのに有用な製品に含めるのに有用であろう。一実施形態において、血清アルブミンに対する可変ドメインの親和性は中等度であり、その場合可変ドメインは急性もしくは慢性の疾患、症状、毒性または他の急性もしくは慢性の適応症を治療および／または予防するのに有用な製品に含めるのに有用であろう。
【００２１】
血清アルブミンに対して適度に高い親和性および特異性を有する分子が所望の治療効果を有するのに十分長い時間循環中に留まることは想定される(Tomlinson, Nature Biotechnology 22, 521-522 (2004))。ここで、高親和性の抗SA可変ドメインは、その種の血清アルブミンに合致して血清循環中に留まるであろう(WO20080096158)。一旦循環中に入れば、AlbudAb可変ドメインに対するいずれかの融合された治療剤は、NCE、ペプチドまたはタンパク質のいずれであれ、その標的に対してより長く作用し、より長期間持続する治療効果を発揮することができるであろう。これにより、頻繁に投与する必要なく、慢性または持続性の疾患を標的とすることが可能となるであろう。
【００２２】
中等度の親和性を有する(しかしSAに対する特異性を有する)可変ドメインは血清循環中に短時間のみ留まり(例えば数時間または数日間)、融合された治療剤によって急性疾患に関わる治療標的を特異的に標的とすることを可能とするであろう。
【００２３】
このようにして、適切なアルブミン結合親和性および／または血清半減期を有する抗SA可変ドメインを選択することによって、治療対象の疾患領域に抗SA含有産物を合わせることが可能である。
【００２４】
ドメイン抗体の特性の1つは、それらが単量体または二量体の形態で存在し、標的に結合し得ることである。本発明の任意の態様の他の実施形態は、単量体または二量体もしくは多量体の変異体を提供する。標的の架橋を抑制することが有利な場合(例えば標的が受容体チロシンキナーゼ等の細胞表面受容体、例えばTNFR1である場合)には、単量体dAbが特定の標的または適応症に好ましい場合がある。場合によっては、二量体または多量体としての結合が細胞表面上の受容体の架橋を生じさせ、それにより受容体の作動および有害な受容体シグナル伝達の可能性を増大させ得る。あるいはまた、標的の架橋を確実にするために、または例えば親和性の効果、安定性または溶解性によって結合を改善するために、二量体を形成するdAbが好ましい場合がある。
【００２５】
多重ドメイン(multidomain)構築物の関与する特定の標的化アプローチにおいては、dAbの二量体化は高分子量のタンパク質凝集物の形成に到ることがあるために、例えば上記のようなdAb-AlbudAb(商標)(AlbudAbが血清アルブミンに結合する)等の二価の標的化分子を生成させるべき場合に単量体のdAbを使用することが好ましい場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書では、本発明は、明確かつ簡潔な明細書を記載することができるように、実施形態に関連して、説明されている。実施形態は、本発明から逸脱することなく、さまざまに組み合わせたり、分離したりできることが意図されており、また、そのように理解されるべきである。
【００２７】
他に定義がない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学の分野の当業者)が一般に理解しているものと同じ意味を有する。分子遺伝学的および生化学的方法(一般的には、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと)ならびに化学的方法については標準的な技術が使用される。
【００２８】
「患者」とは、任意の動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類(ヒヒ、アカゲザルもしくはカニクイザル)、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、イヌ、ネコまたはブタである。一実施形態では、患者がヒトである。
【００２９】
本明細書中で用いる「抗体」とは、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、またはフラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、閉鎖立体配座の多重特異性抗体、ジスルフィド結合したscFv、ダイアボディなど)を指し、天然で抗体を産生するどの種に由来するか、または組換えDNA技術によって作製されるか、または血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母もしくは細菌から単離されるかどうかを問わない。
【００３０】
本明細書中で用いる「抗体フォーマット」とは、1つ以上の抗体可変ドメインが抗原に対する結合特異性をポリペプチド構造に付与するように組み込まれ得る、任意の適切なポリペプチド構造を指す。さまざまな適切な抗体フォーマットが当技術分野で知られており、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および/または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前述のいずれかの抗原結合フラグメント(例えば、Fvフラグメント(例：一本鎖Fv (scFv)、ジスルフィド結合Fv)、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント)、単一抗体可変ドメイン(例えば、dAb、VH、VHH、VL)、および前述のいずれかの改変型(例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の適切なポリマーの共有結合により改変されたもの、またはヒト化VHH)などである。
【００３１】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、異なるV領域またはドメインから独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインと共にフォーマット(例えば、ホモまたはヘテロ多量体)で存在することができるが、その場合、他の領域またはドメインは単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合にとって必要とされない(すなわち、その場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは追加の可変ドメインから独立して抗原に結合する)。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語と同じである。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体の可変ドメインであるが、げっ歯類(例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 00/29004に開示される)、テンジクザメおよびラクダ科動物のVHH dAbなど、他の種に由来する単一抗体可変ドメインをも包含する。ラクダ科動物VHHは、もともと軽鎖を欠いている重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。VHHはヒト化することができる。
【００３２】
「ドメイン」とは、タンパク質の残りの部分から独立した三次構造を有する、折りたたまれたタンパク質構造のことである。一般的に、ドメインはタンパク質の個別の機能的特性に関与しており、多くの場合、そのタンパク質の残部の機能および/またはそのドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加、移動または転移することができる。「単一抗体可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折りたたまれたポリペプチドドメインである。したがって、それには、完全な抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメイン、例えば1つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換されたもの、あるいはトランケートされているかまたはN末端もしくはC末端の延長部を有する抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する折りたたまれた可変ドメインのフラグメントが含まれる。
【００３３】
本出願において、用語「予防」および「予防する」は、疾患または症状の誘導に先立って保護組成物を投与することを含む。「治療」および「治療する」は、疾患または症状の徴候が明らかになった後で保護組成物を投与することを含む。「抑制」または「抑制する」は、誘導事象の後で、しかし疾患または症状の臨床的出現の前に、該組成物を投与することを意味する。
【００３４】
本明細書中で用いる用語「用量」は、一度に全部(単位用量)、または特定の時間間隔で2回以上、被験者に投与されるリガンドの量を意味する。例えば、用量は、1日(24時間)(1日量)、2日間、1週間、2週間、3週間、または1ヶ月以上にわたって(例えば、単回投与により、または2回以上の投与により)被験者に投与されるリガンド(例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド)の量を指すことができる。投与と投与の間隔は希望する任意の時間であり得る。用量に言及するときの用語「薬学的に有効な」とは、所望の効果を提供するのに十分な、リガンド、ドメインまたは医薬活性剤の量を意味する。「有効」である量は、個体の年齢および全身状態、特定の薬物または医薬活性剤などに応じて、被験者ごとに異なるだろう。したがって、すべての患者に適用できる正確な「有効」量を指定することが常に可能とは限らない。しかしながら、個々のケースにおける適切な「有効」用量は、ルーチンワーク的な実験を用いることにより、当業者が決定することができる。
【００３５】
薬物動態の解析方法およびリガンド(例えば、単一可変ドメイン、融合タンパク質、または多重特異性リガンド)の半減期の測定方法は当業者によく知られている。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見いだすことができる。また、tαおよびtβ半減期、曲線下面積(AUC)などの薬物動態パラメータについて記載している“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, 発行Marcel Dekker, 第2改訂版 (1982)をも参照されたい。必要に応じて、本明細書中に引用されたすべての薬物動態パラメータおよび値は、ヒトの値であると解釈されるべきである。必要に応じて、本明細書中に引用されたすべての薬物動態パラメータおよび値は、マウスまたはラットまたはカニクイザルの値であると解釈されるべきである。
【００３６】
半減期(t1/2αおよびt1/2β)とAUCは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から求めることができる。例えば、その曲線をモデル化するために、WinNonlin解析パッケージ、例えばバージョン5.1 (Pharsight社(Mountain View, CA94040, 米国)から入手可能)を用いることができる。2コンパートメントモデルを使用する場合、第1相(α相)では、リガンドが、若干の排出を伴って、患者の体内に主に分布していく。第2相(β相)は、リガンドが全身にいきわたり、そしてリガンドが患者から消失されるにつれて血清濃度が低下していく時の相である。tα半減期は第1相の半減期であり、そしてtβ半減期は第2相の半減期である。かくして、一実施形態では、本発明との関連で、可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、(約)15分またはそれ以上のtαを有する。一実施形態では、その範囲の下端は(約)30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。さらに、あるいはこれとは別に、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、12時間(または約12時間)までのtαを有するだろう。一実施形態では、その範囲の上端は(約)11、10、9、8、7、6または5時間である。適切な範囲の例は(約)1〜6時間、2〜5時間または3〜4時間である。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、(約)2.5時間またはそれ以上のtβを有する本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドを提供する。一実施形態では、その範囲の下端は(約)3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間もしくは12時間である。さらに、あるいはこれとは別に、tβは最大で(約)21または25日間である。一実施形態では、その範囲の上端は(約)12時間、24時間、2日間、3日間、5日間、10日間、15日間、19日間、20日間、21日間または22日間である。例えば、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは12〜60時間(または約12〜60時間)の範囲のtβ半減期を有するであろう。さらなる実施形態では、それは12〜48時間(または約12〜48時間)の範囲である。さらに別の実施形態では、それは12〜26時間(または約12〜26時間)の範囲である。
【００３８】
2コンパートメントモデルに代わる手段として、当業者はノンコンパートメントモデルの使用に精通しており、このモデルを用いて終末半減期を求めることができる(これに関連して、本明細書中で用いる用語「終末半減期」とは、ノンコンパートメントモデルを用いて測定された終末半減期を意味する)。例えば、この方法でその曲線をモデル化するために、WinNonlin解析パッケージ、例えばバージョン5.1 (Pharsight社(Mountain View, CA94040, 米国)から入手可能)を使用することができる。この場合、一実施形態では、単一可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、少なくとも(または少なくとも約)8時間、10時間、12時間、15時間、28時間、20時間、1日間、2日間、3日間、7日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間または25日間の終末半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上端は(約)24時間、48時間、60時間、72時間または120時間である。例えば、終末半減期は、例えばヒトでは、(約)8〜60時間、8〜48時間または12〜120時間である。
【００３９】
さらに、あるいは上記の基準とは別に、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、(約)1mg.min/mlまたはそれ以上のAUC値を有する。一実施形態では、その範囲の下端は(約)5、10、15、20、30、100、200または300mg.min/mlである。さらに、あるいは別に、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、最大(約)600mg.min/mlまでの範囲のAUCを有する。一実施形態では、その範囲の上端は(約)500、400、300、200、150、100、75または50mg.min/mlである。有利には、可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、以下からなる群より選択される(およその)範囲のAUCをもつだろう：15〜150mg.min/ml、15〜100mg.min/ml、15〜75mg.min/ml、および15〜50mg.min/ml。
【００４０】
「表面プラズモン共鳴」：競合アッセイを用いて、ヒト血清アルブミンなどの特定の抗原またはエピトープが、本明細書に記載の血清アルブミン結合リガンド(特定のdAbなど)への結合について、カニクイザル血清アルブミンなどの別の抗原またはエピトープと競合するかどうかを調べることができる。同様に、競合アッセイを用いて、dAbなどの第1のリガンドが、標的抗原またはエピトープへの結合について、dAbなどの第2のリガンドと競合するかどうかを調べることができる。本明細書中で用いる用語「競合する」とは、2つ以上の分子間の特異的結合相互作用をいくらかでも妨げることができる分子、化合物、好ましくはタンパク質、などの物質を指す。語句「競合的に阻害しない」とは、物質、例えば分子、化合物、好ましくはタンパク質が、2つ以上の分子間の特異的結合相互作用を測定可能な程度または有意な程度には妨げないことを意味する。2つ以上の分子間の特異的結合相互作用には、好ましくは、単一可変ドメインとそのコグネイトのパートナーまたは標的との特異的結合相互作用が含まれる。妨害または競合する分子は、別の単一可変ドメインであってもよいし、それはコグネイトのパートナーまたは標的と構造的および/または機能的に類似する分子であってもよい。
【００４１】
用語「結合成分」とは、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインから独立して、ある抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。結合成分はドメイン抗体(dAb)であってもよいし、天然のリガンド以外のリガンドに結合する非免疫グロブリンタンパク質スカフォールド、例えば、CTLA-4、リポカリン、SpA、アドネクチン、アフィボディ、アビマー(avimer)、GroE1、トランスフェリン、GroESおよびフィブロネクチンからなる群より選択されるスカフォールド、の誘導体であるドメインであってもよい(本発明の場合には、その成分は血清アルブミンに結合する)。タンパク質スカフォールドの例、およびレパートリーから抗原またはエピトープに特異的な結合ドメインを選択するための方法を開示する、WO2008/096158を参照されたい(実施例17〜25参照)。WO2008/096158のこれらの具体的な開示は、本発明で使用するために本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、そしてそのような開示のどの部分も本明細書中の1つ以上の請求項に組み入れることができるものとする。
【００４２】
一実施形態において、本発明の可変ドメインは次の動態特性の1つ以上を含む：
(a)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)0.1〜(約)10000nM、必要に応じて(約)1〜(約)6000nMの解離定数(KD)で、ヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(b)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1.5×10-4〜(約)0.1sec-1、必要に応じて(約)3×10-4〜(約)0.1sec-1のオフ速度定数(Kd)で、ヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(c)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)1×106〜(約)2×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、ヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(d)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)0.1〜(約)10000nM、必要に応じて(約)1〜(約)6000nMの解離定数(KD)で、カニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(e)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1.5×10-4〜(約)0.1sec-1、必要に応じて(約)3×10-4〜(約)0.1sec-1のオフ速度定数(Kd)で、カニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(f)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)1×106〜(約)5×103M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、カニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(g)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1〜(約)10000nM、必要に応じて(約)20〜(約)6000nMの解離定数(KD)で、ラットSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(h)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×10-3〜(約)0.15sec-1、必要に応じて(約)9×10-3〜(約)0.14sec-1のオフ速度定数(Kd)で、ラットSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(i)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)1×106〜(約)3×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、ラットSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(j)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1〜(約)10000nMの平衡解離定数(KD)で、マウスSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(k)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×10-3〜(約)0.15sec-1のオフ速度定数(Kd)で、マウスSAに特異的に結合する結合部位を含む；および/または
(l)  可変ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)2×106〜(約)1.5×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、マウスSAに特異的に結合する結合部位を含む。
【００４３】
必要に応じて、可変ドメインは以下を有する：
I:  (a)と(d)に記載のKD、(b)と(e)に記載のKd、および(c)と(f)に記載のKa；または
II: (a)と(g)に記載のKD、(b)と(h)に記載のKd、および(c)と(i)に記載のKa；または
III:(a)と(j)に記載のKD、(b)と(k)に記載のKd、および(c)と(l)に記載のKa；または
IV:  IおよびIIに記載の動態；または
V:   IおよびIIIに記載の動態；または
VI:  I、IIおよびIIIに記載の動態。
【００４４】
本発明はまた、本発明の上記態様または実施形態のいずれかの可変ドメインを含むリガンドを提供する。例えば、リガンドは二重特異性リガンドであり得る(二重特異性リガンドの例についてはWO04003019を参照されたい)。一態様では、本発明は、本発明の上記態様または実施形態のいずれかの抗SA可変ドメインと、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含む、多重特異性リガンドを提供する。結合成分は標的に特異的に結合するどのような結合成分であってもよく、例えば、その成分はMAb等の抗体、抗体フラグメント、scFv、Fab、dAb、または非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドを含む結合成分である。そのような成分はWO2008/096158に詳しく開示されている(実施例17〜25参照、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。非免疫グロブリンスカフォールドの例は、CTLA-4、リポカリン、ブドウ球菌プロテインA(spA)、アフィボディ(Affibody(商標))、アビマー(Avimer(商標))、アドネクチン、GroELおよびフィブロネクチンである。
【００４５】
一実施形態では、抗標的結合成分と抗SA可変ドメインとの間にリンカーが配置され、そのリンカーはアミノ酸配列AST、必要に応じてASTSGPSを含む。代替リンカーはHuston等, 1988, PNAS 85: 5879-5883; Wright & Deonarain, Mol. Immunol, 2007, 44: 2860-2869; Alfthan等, Prot. Eng., 1995, 8: 725-731; Luo等, J. Biochem., 1995, 118: 825-831; Tang等, 1996, J. Biol. Chem. 271: 15682-15686; Turner等, 1997, JIMM 205, 42-54（代表的な実施例として表１を参照されたい）; WO 2009/040562; WO2007/085814およびWO2008/096158（135頁12行〜140頁14行の文脈を参照されたい）に記載されており、これらの文献すべて、および開示されたリンカーのすべての配列は、本発明で使用するために本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、そしてそのような開示内容のどの部分も本明細書中の1つ以上の請求項に組み入れることができるものとする。
【００４６】
本明細書で使用する用語「腫瘍壊死因子受容体１(TNFR1)のアンタゴニスト」または「抗TNFR1アンタゴニスト」等は、TNFR1に結合し、TNFR1のある(すなわち1以上の)機能を阻害し得る物質(例えば分子、化合物)をいう。例えば、TNFR1のアンタゴニストはTNFαのTNFR1への結合を阻害し、および／またはTNFR1が介在するシグナル伝達を阻害し得る。従って、TNFR1-介在性のプロセスおよび細胞応答(例えば標準的なL929細胞毒性アッセイにおけるTNFα誘導性の細胞死)は、TNFR1のアンタゴニストによって阻害され得る。
【００４７】
一実施形態において、多重特異性リガンドは本発明の抗SA dAb変異体または成分と抗TNFR1結合成分(例えば、抗TNFR1 dAb)を含む。場合により、前記リガンドは、受容体の架橋の可能性を減らすために、ただ1つの抗TNFR1結合成分(例えば、dAb)を有する。抗TNFR1 dAbは、例えばWO2006/038027、WO2007/049017、WO2008/149148およびWO2010/081787に記載されている(これらのPCT出願に開示される、そのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、本発明で使用するために本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、そしてそのような開示内容のどの部分も本明細書中の1つ以上の請求項に組み入れることができるものとする)。
【００４８】
一実施形態において、多重特異性リガンドは、本発明の抗SA dAb可変ドメインと抗TNFR1結合成分、例えば抗TNFR1 dAbとを含む。必要に応じて、リガンドはただ1つの抗TNFR1結合成分（例えばdAb）を有し、受容体の架橋の可能性を低減させる。
【００４９】
一実施形態において、本発明のリガンドは、1つ以上のポリペプチドに直接または間接的に融合された本発明の変異体または成分を含む融合タンパク質である。例えば、その融合タンパク質は、WO2005/118642(その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)に開示されるような「薬物融合体」であってよく、それは本発明の変異体または成分とそのPCT出願に明示されるポリペプチド薬物とを含む。
【００５０】
多重特異性リガンドの一実施形態において、標的抗原はポリペプチド、タンパク質もしくは核酸であっても、その一部であっても良く、これらは天然のものであっても合成のものであっても良い。この点で、本発明のリガンドは、その標的抗原に結合し、アンタゴニストまたはアゴニスト（例えばEPO受容体アゴニスト）として作用し得る。当業者であれば、その選択肢は大きく、様々であることを理解するであろう。これらは例えば、ヒトもしくは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体であって良く、サイトカイン受容体には、サイトカインの受容体、酵素、酵素の補因子またはDNA結合タンパク質が含まれる。好適なサイトカインおよび増殖因子としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エクソダス-2、EpoR、酸性FGF、塩基性FGF、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (72 a.a.)、IL-8 (77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2 (KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、インホタクチン、ミュラー管抑制物質（Mullerian inhibitory substance）、単球コロニー抑制因子（monocyte colony inhibitory factor）、単球誘引タンパク質(monocyte attractant protein)、M-CSF、MDC (67 a.a.)、MDC (69 a.a.)、MCP-1 (MCAF) 、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67 a.a.)、MDC (69 a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆細胞抑制因子（myeloid progenitor inhibitor factor）-1 (MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子 (TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4、CD4、ヒトケモカイン受容体CXCR4もしくはCCR5、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質タイプ3 (NS3)、TNF-α、IgE、IFN-γ、MMP-12、CEA、ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori）、TB、インフルエンザ、E型肝炎、MMP-12、特定の細胞上で過剰発現する内在化性受容体(internalizing receptor)、例えば上皮成長因子受容体 (EGFR)、腫瘍細胞上のErBb2受容体、内在化性細胞受容体、LDL受容体、FGF2受容体、ErbB2受容体、トランスフェリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、PsmAr、細胞外マトリックスタンパク質、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4、CD4、ヒトケモカイン受容体CXCR4またはCCR5、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質タイプ3 (NS3)、TNF-α、IgE、IFN-γ、MMP-12、ウイルス。このリストはいかなる意味でも網羅的なものではないことが理解されよう。
【００５１】
本明細書中で用いる「薬物」とは、個体の生物学的標的分子に結合するおよび/または該標的分子の機能を変更することによって有益な、治療上のまたは診断上の効果を生み出すために、個体に投与することができる任意の化合物(例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド)を指す。標的分子は個体のゲノムによってコードされる内因性の標的分子(例えば、個体のゲノムによってコードされる酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン)であってもよいし、病原体のゲノムによってコードされる外因性の標的分子(例えば、ウイルス、細菌、真菌、線虫または他の病原体のゲノムによってコードされる酵素)であってもよい。本発明の抗SA dAbドメインを含む融合タンパク質およびコンジュゲートで使用するための適切な薬物は、WO2005/118642およびWO2006/059106に開示されている(これらの全開示内容は、具体的な薬物の全リストを含めて、そのリストが本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に組み入れられ、そしてそのように組み入れることは本明細書の請求項に含めるための具体的な薬物の開示を提供するものとする)。例えば、その薬物はグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)もしくはその変異体、インターフェロンα2bもしくはその変異体、またはエキセンディン-4もしくはその変異体であり得る。
【００５２】
一実施形態において、本発明は、WO2005/118642およびWO2006/059106に定義されかつ開示された薬物コンジュゲートを提供し、該コンジュゲートは本発明の可変ドメインを含む。一例では、薬物が可変ドメインに共有結合で結合される(例えば、可変ドメインと薬物は単一のポリペプチドの部分として発現される)。これとは別に、一例では、薬物が可変ドメインに非共有結合で結合または会合される。薬物は可変ドメインと直接または間接的に(例えば、適切なリンカーを介しておよび/または相補的結合パートナー(例：ビオチンとアビジン)の非共有結合を介して)共有結合または非共有結合で結合され得る。相補的結合パートナーを用いる場合には、結合パートナーの一方を薬物に直接または適切なリンカー成分を介して共有結合で結合させることができ、また、その相補的結合パートナーを可変ドメインに直接または適切なリンカー成分を介して共有結合で結合させることができる。薬物がポリペプチドまたはペプチドである場合、その薬物成分を融合タンパク質とすることができ、その場合にポリペプチドまたはペプチド薬物およびポリペプチド結合成分は連続したポリペプチド鎖の個別の部分(成分)である。本明細書に記載されるように、ポリペプチド結合成分とポリペプチド薬物成分はペプチド結合を介して相互に直接結合されてもよいし、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して連結されてもよい。
【００５３】
血清アルブミンに特異的に結合する、本発明の1つの単一可変ドメインを含むリガンド(例えば単量体)、または2つ以上の単一可変ドメインを含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)は、以下から選択される1つ以上の成分をさらに含むことができるが、好ましくはそれらに限定されるものではない：標識、タグ、追加の単一可変ドメイン、dAb、抗体、抗体フラグメント、マーカーおよび薬物。これらの成分の1つ以上は、単一可変ドメイン(免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのいずれかの単一可変ドメイン)を含むリガンドのCOOH末端もしくはN末端に、またはN末端とCOOH末端の両方に位置づけることができる。これらの成分の1つ以上は、1つの単一可変ドメインを含むリガンド(単量体)または2つ以上の単一可変ドメインを含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)の、血清アルブミンに特異的に結合する単一可変ドメインのCOOH末端もしくはN末端、またはN末端とCOOH末端の両方に位置づけることができる。これらの末端の一方または両方に位置づけられるタグの非限定的な例としては、HA、hisまたはmycタグが挙げられる。1つ以上のタグ、標識および薬物を含めて、これらの成分は、血清アルブミンに結合する、1つの単一可変ドメインを含むリガンド(単量体)または2つ以上の単一可変ドメインを含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)に、上で説明したように直接またはリンカーを介して、結合させることができる。
【００５４】
本発明のある態様は、上記の任意の可変ドメインに融合もしくはコンジュゲート（NCEの場合）したポリペプチド薬物を含む融合産物、例えば融合タンパク質またはペプチドとの融合物もしくはNCE（新規化学物質）とのコンジュゲートを提供する。
【００５５】
本発明は、本発明の任意の態様の可変ドメイン、融合タンパク質、コンジュゲートまたはリガンドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤またはベヒクルとを含む組成物を提供する。
【００５６】
本明細書にはまた、本明細書に記載の可変ドメイン、融合タンパク質、コンジュゲートまたはリガンドのいずれかをコードする単離された核酸、例えば、血清アルブミンに特異的に結合する、またはヒト血清アルブミンと少なくとも1種の非ヒト血清アルブミンの両方に特異的に結合する、本発明の1つの単一可変ドメインを含むリガンド(例えば単量体)もしくは2つ以上の単一可変ドメインを含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)またはその機能的に活性なフラグメントをコードする単離された核酸が包含される。さらに、本明細書には、ベクターおよび/または発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞（例えば非ヒト宿主細胞、またはヒトもしくはヒト胚から単離されていない宿主細胞）、例えば、ベクターで形質転換された植物もしくは動物細胞および/または細胞株、前記ベクターによってコードされる、血清アルブミンに特異的に結合する、1つの単一可変ドメイン(単量体)または2つ以上の単一可変ドメイン(例えば、本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)を含む1つ以上の可変ドメイン、融合タンパク質もしくはリガンド、またはそのフラグメントを発現および/または産生させる方法を包含し、その方法は、場合によって、1つ以上の可変ドメイン、融合タンパク質もしくはリガンド、またはそのフラグメントが発現されるように宿主細胞を培養し、任意で、血清アルブミンに特異的に結合する、1つの単一可変ドメイン(単量体)または2つ以上の単一可変ドメイン(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)を含むリガンドを宿主細胞の培養培地から回収することを含む。また、本明細書に記載のリガンドを、血清アルブミン(血清アルブミンおよび/または非ヒト血清アルブミンを含む)、および/または血清アルブミン以外の1つ以上の標的(ここで、その標的は生物学的活性分子を含み、先に挙げた動物タンパク質、サイトカインを含む)と接触させる方法が包含され、そして前記接触がin vitroである方法だけでなく、本明細書に記載の可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドのいずれかを個々の宿主動物または細胞にin vivoおよび/またはex vivoで投与する方法も包含される。好ましくは、血清アルブミンおよび/または非ヒト血清アルブミンに対する単一可変ドメイン(免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン)と、血清アルブミン以外の1つ以上の標的に対する1つ以上のドメインとを含む、本明細書に記載のリガンドを投与することは、その抗標的リガンドの半減期(Tβおよび/または終末半減期を含む)を高めるだろう。前記ドメイン、融合タンパク質もしくは単一ドメイン含有リガンドまたはそのフラグメント(その機能性フラグメントを含む)をコードする核酸分子は、本明細書において企図される。前記核酸分子をコードするベクター(発現ベクターを含むが、好ましくはそれに限定されない)は本明細書中で企図され、これらの発現ベクターの1つ以上を含む細胞株または生物に由来する宿主細胞も同様に企図される。また、上記の核酸、べクターおよび宿主細胞のいずれかを含むが、好ましくはそれらに限定されない、任意のドメイン、融合タンパ��質またはリガンドの生産方法も企図される。
【００５７】
本発明の一態様は、本発明による可変ドメイン、または本発明の多重特異性リガンド、または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５８】
本発明の一態様は、配列番号25〜45のいずれか1つから選択されるヌクレオチド配列、または選択された前記配列に対して少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５９】
本発明の一態様は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。本発明の一態様は、該ベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００６０】
ライブラリーベクター系、単一可変ドメインの組み合わせ、二重特異性リガンドの特性解析、二重特異性リガンドの構造、二重特異性リガンドの構築に用いるスカフォールド、抗血清アルブミンdAbおよび多重特異性リガンドおよび半減期増強リガンドの使用、ならびに抗血清アルブミンdAbを含む組成物および製剤の詳細については、WO2008/096158を参照されたい。これらの開示内容は、本発明のドメイン、リガンド、融合タンパク質、コンジュゲート、核酸、ベクター、宿主および組成物に関する指針を含めて、本発明で使用するための指針を与えるために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
2014501515.tif 000002
2014501515.tif 000003
2014501515.tif 000004
2014501515.tif 000005
2014501515.tif 000006
2014501515.tif 000007
2014501515.tif 000008
2014501515.tif 000009
例証
抗SA免疫グロブリン単一可変ドメインの選択および親和性成熟は、例えばWO2008/096158、WO2010/094722およびWO2010/094723に記載されている。PCT/EP2010/06112には、多くのVH配列を含む抗SA免疫グロブリン単一可変ドメインの親配列が記載されている。
【００６２】
親配列DOM7r31（配列番号22）、DOM7r36（配列番号23）およびDOM7r92（配列番号24）は、実質的に上記のようなVHナイーブライブラリーのクロスオーバー選択（ヒトおよびラットSA）と、それに続いてヒトおよびラットSAに対するスクリーニングによって得られた。更なる選択は以下のように行った：
DOM7r-31およびDOM7r-36の個々のエラープローンライブラリー（EP）を作製した。DOM7r-92親クローンはプールし、単一のEP（エラープローン）ライブラリーに合わせ、一緒にスクリーニングした。個々のライブラリーはすべて2×109 PFU/mLより大きかった。
【００６３】
選択は、クロスオーバー選択により、可溶性抗原（ビオチン-HSA；ビオチン-RSA；2％ Marvelでブロッキング）で抗原濃度を下げながら4ラウンド行った。ラウンド1は1μM（HASまたはRSA）、ラウンド2は1μM（RSAまたはHSA）、続いて更なる2回のラウンドの選択はそれぞれ100nMおよび10nMで、ラウンド2と同じ抗原で行った。R3およびR4の双方の結果物から約3000クローンが上清BIAcoreによってスクリーニングされ、このクローンをオフ速度（kd；sec-1）のみでランク付けした。異種間の反応性（ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスSAへの結合）および生化学的特性（溶液内状態および熱安定性）に基づいて3つの系統を選択した。
【００６４】
2014501515.tif 000010
2回目の親和性成熟において、上記の3つの親系統に基づいて、ライブラリーサイズが1×108〜1×109 PFU/mLの範囲の14 NNKのCDR-ライブラリー（クローンあたり4-5アミノ酸が多様化）を構築した。ビオチン化した可溶性抗原に対し、クロスオーバー選択を使用して上記のように4ラウンドの選択を実施した。選択を2つの群に分けた：
1群：ラウンド1  1μMのヒトSA、ラウンド2  1μMのラットSA、ラウンド3  10nMのラットSA、ラウンド4  1nMのラットSA。
【００６５】
2群：ラウンド1  1μMのラットSA、ラウンド2  1μMのヒトSA、ラウンド3  10nMのヒトSA、ラウンド4  1nMのヒトSA。
【００６６】
ラウンド3およびラウンド4の選択の結果物を使用してヒト、ラット、カニクイザルおよびマウスSAに対してBIAcoreスクリーニングを実施した。発現したdAbを含む清澄化大腸菌培養上清（記載したような30℃で48時間のOnEx発現）をBIAcoreスクリーニングに使用し、オフ速度の改善に基づいて陽性のクローンを選択した。
【００６７】
30℃で48時間、Onex培地を入れた0.5Lの振とうフラスコ（250rpm）中で細菌上清としてユニークなdAbを発現させた。遠心分離によって細菌細胞から細胞培養物を清澄化させた。清澄化した培養培地から、プロテインAストリームラインへの吸着、続いて100 mMグリシンpH 2.0による溶出によって、dAbを精製した。
【００６８】
AlbudAbのヒト、ラット、マウスおよびカニクイザル血清アルブミンへの結合親和性（KD）を決定するために、精製したdAbを、様々な種の血清アルブミンを共有結合させたCM5 BIacoreチップを使用して、5000nM〜39nMの範囲の濃度（5000 nM、2500 nM、1250 nM、312.5 nM、156.25 nM、78.125 nM、39.0625 nM）でBIAcoreで分析した。
【００６９】
MSA抗原はSigmaから入手し（本質的に脂肪酸を含まない、〜99％(アガロースゲル電気泳動)、凍結乾燥粉末  Cat. No. A3559）、CSAはprometic blue resin（Amersham）を使用してカニクイザル血清アルブミンから精製した。
【００７０】
生物物理学的特性解析：
2.5Lの振とうフラスコでのルーチンの細菌発現レベルは、Onex培地中で30℃で48時間、250rpmで培養した後に分光光学的に測定した。
【００７１】
生物物理学的特性はSEC MALLSおよびDSCで測定した。
【００７２】
SEC MALLS(多角度レーザー光散乱を装備したサイズ排除クロマトグラフィー)は、溶液中の高分子を特性解析するための非侵襲的な手法である。簡単に説明すると、タンパク質(ダルベッコPBSバッファー中の濃度1mg/mL)を、その流体力学的特性に従って、サイズ排除クロマトグラフィー(カラム：TSK3000；S200)により分離する。分離後、そのタンパク質が光を散乱させる傾向を、多角度レーザー光散乱(MALLS)検出器を用いて測定する。タンパク質が検出器を通過している間の散乱光の強度を角度の関数として測定する。この測定を、インライン屈折率(RI)検出器を用いて測定したタンパク質濃度と組み合わせると、適切な式(解析ソフトウェアAstra v.5.3.4.12の必須部分)を用いるモル質量の計算が可能となる。溶出ピークの中間点での最高濃度は、1mg/mLのタンパク質溶液の初期ローディングで約8-10μMであり、結果的にこれがMALLSによってタンパク質の溶液内状態を測定する濃度である。
【００７３】
MALLSの結果：単一VH AlbudAbは14kDaの大きさである。MALLSで測定して14〜28kDaの間の任意の値が自己会合または二量体形成の程度を示す（すなわち16kDaは試験した条件下で主に単量体であり、22kDaはMALLS条件下で二量体化する強い傾向を示す）。
【００７４】
DSC(示差走査熱量測定)：簡単に説明すると、タンパク質(PBS中1mg/mL)を180℃/時の一定速度で加熱し、熱変性に伴う検出可能な熱変化を測定する。転移中間点(appTm)が測定されるが、これはタンパク質の50％がその天然のコンフォメーションをとり、残りの50％が変性されるときの温度として説明される。ここでは、検査したタンパク質のほとんどが完全にはリフォールディングしないため、見かけの転移中間点(appTm)をDSCにより測定した。Tmが高ければ高いほど、その分子は安定している。用いたソフトウェアパッケージはOrigin(登録商標)v7.0383であった。
【００７５】
DSCの結果：DSC実験でのタンパク質の濃度は実際の反応セル中で1mg/mLであり、MALLSと比較してずっと高濃度である。この高濃度によって、表１に示すように、一部のAlbudAbで２つのappTmが存在する理由の一部が説明できる。第一のTmは二量体複合体の解離を構成し、第二のTmは実際のAlbudAbタンパク質のアンフォールディングを示す。VH dAbの性質を以下の表１にまとめる。
【表１】
2014501515.tif 000011
【００７６】
表面プラズモン共鳴（SPR）を用い、ヒト、カニクイザル（cyno）、ラットおよびマウスの血清アルブミンに対するAlbudAb（商標）（抗血清アルブミンdAb）の交差反応性を測定した。この場合、Biacore（商標）を使用した。本明細書に記載するdAbの全てについて上清のスクリーニングおよび結合速度の測定のためにBiacore（商標）2000/3000を使用した。より広範囲の種のSA（合計12種）に対するリードVkおよびVH AlbudAbの交差反応性の測定のためにはBiacore（商標）T100を使用した。タンパク質サンプルをBIAcore 2000/3000実験について記載したようにT100 BIAcore上で通過させた。ここで、BIAcore用緩衝液（HBS-EP）で精製タンパク質を2倍ずつ5μMから39nMまで連続希釈した希釈液を、流速50μL/分、接触時間60秒間、解離200秒間で行った。BIAcore T100は、BIAcore 2000/3000よりも技術的に進歩したものであり、高い感度を有し、主観的なデータ解析が少なくなるように解析ソフトウェアが改良されている。適切な場合、動的Langmuir 1:1フィッティングモデルを使用した。非常に速いオン速度またはオフ速度のために動的適合ルーチンができない場合、代わりに定常状態の適合値を用いた。
【表２】
2014501515.tif 000012
【表３】
2014501515.tif 000013
【表４】
2014501515.tif 000014
（実施例２）
【００７７】
IFN-α2b-Vh AlbudabラットPK研究
クローニングおよび発現
親和性成熟させたVH Albudabをインターフェロンα2b（IFNα2b）に連結し、AlbudAbの有用なPKが融合タンパク質で維持されるか否かを測定した。
【００７８】
2014501515.tif 000015
IFNα2bを、TVAAPSリンカー領域を介してAlbudAbに連結した（WO2007085814を参照されたい）。構築物をSOE-PCR（Horton等、Gene, 77, p61(1989)の方法による単一重複伸長）によってクローニングした。AlbudAbおよびIFN配列のPCR増幅は、TVAAPSリンカー領域で重複する約15塩基対のプライマーを使用して別個に実施した。
【００７９】
2014501515.tif 000016
断片を別個に精製し、次いでフランキングプライマーのみを使用してSOE（単一重複伸長PCR伸長）反応で組み立てた。
【００８０】
2014501515.tif 000017
組み立てたPCR産物を制限酵素BamHIおよびHindIIIを使用して切断し、細胞培地内への発現を容易にするN-末端V-J2-CマウスIgG分泌リーダー配列を有するpTT5誘導体の哺乳動物発現ベクター、pDOM50中の対応部位に遺伝子をライゲートした。
【００８１】
2014501515.tif 000018
QIAフィルターmegaprep（Qiagen）を使用してプラスミドDNAを調製した。1μg/mlのDNAを293-FectinでHEK293E細胞中にトランスフェクトし、無血清培地中で増殖させた。タンパク質を培地中で5日間発現させ、protein A親和性樹脂を使用して培養上清から精製し、100mM グリシンpH2で溶出させた。タンパク質を1mg/ml以上となるように濃縮し、PBSにバッファー交換して、Qスピンカラム（Vivascience）でエンドトキシンを枯渇させた。
【表５】
2014501515.tif 000019
2014501515.tif 000020
2014501515.tif 000021
2014501515.tif 000022
【００８２】
ラットでの血清半減期の測定
DOM7r-31-103myc；DOM7r-36-100myc；DOM7r-92-100myc；DOM7r-92-101mycのインターフェロン-AlbudAb融合物をpDOM30ベクター中にクローニングした。それぞれのAlbudAbで、20-50mgの量をHEK293哺乳動物細胞中で上記のように発現させ、清澄化した上清からprotein A親和性樹脂を使用して精製し、100mM グリシンpH2で溶出させた。このタンパク質を1mg/mL以上になるまで濃縮し、PBSにバッファー交換し、Qスピンカラム（Vivascience）でエンドトキシンを枯渇させた。ラットの薬物動態（PK）解析のために、AlbudAbを単回のi.v.注射で2.0mg/kg投与した。血清サンプルを0.16、1、4、12、24、48、72、120、168時間の時点で採取した。
【００８３】
AlbudAb-hIFNα2分子のPK特性を測定するために、in vivo薬物動態（PK）試験で用いた動物サンプルを記載した手法を用いて試験した。
【００８４】
このアッセイで、マウス抗ヒトIFNα2モノクローナル抗体（PBL Biomedical Laboratories, Cat No: 21105-1）を96ウェルの標準的な結合MSDプレートの表面上に捕捉する。次いでこの固定化したmAbを用いて血清サンプル中のAlbudAb-ヒトIFNα2を捕捉する。結合したAlbudAb-ヒトIFNαを、適切なスルホ-タグを付けた検出用抗体（ウサギ抗-VHスルホタグ；社内供給バッチ090430DR-1）を使用して検出する。アッセイからのシグナルはサンプル中のAlbudab-ヒトIFNα2の量に比例しており、校正曲線から血清中の実際のμg/mL量に変換することができる。ラットの血清は、マトリクス適合の決定のために10％で含めた（Sera Labs, Cat No: S-909-D）。
【００８５】
結果を表６に示す。試験した全てのAlbudAbが、様々な程度に血清半減期延長能を示し（陰性対照HEL4 dAbはラットで20分のT 1/2を有する）、この傾向は計算したAUCでも見ることができ、最高値が最長のt1/2であった。最も長い血清半減期は40.6時間であり、ラット血清アルブミンの血清半減期と近似している。
【００８６】
ラットPK：hIFNa2b-DOM7r-31-103 myc；hIFNa2b-DOM7r-36-100 myc；hIFNa2b-DOM7r-92-100 myc；hIFNa2b-DOM7r-92-101 myc
【表６】
2014501515.tif 000023
【００８７】
Vk AlbudAbリードについて記載したように、IFNα2b VH AlbudAb融合物について、簡略化ラットPKのfeed and bleed試験を行った。治療用タンパク質に融合させると、ベースのAlbudabは通常SAに対する親和性が約2-10倍低下することが示された。このことから、対応するベースのAlbudAbと比較したIFN-融合物の親和性の違いが説明される（上記の表６）。
【００８８】
本明細書で記載するIFN-Albudab融合物は、IFN-Vk AlbudAb融合物について先に記載したもの（WO 2010/094723; WO 2010/094722を参照されたい）と同じKDとT 1/2（または血清アルブミンに対する親和性と血清滞留時間）との直接的な相関性を示す。
【００８９】
2014501515.tif 000024
【配列表】
2014501515000001.app
【国際調査報告】
2014501515.tif 000025
2014501515.tif 000026
2014501515.tif 000027
2014501515.tif 000028
2014501515.tif 000029
2014501515.tif 000030