(57)【要約】胃腸膵神経内分泌新生物(GEP-NEN)バイオマーカーならびにそれを検出するための作用物質、システムおよびキット、ならびにそれに関連したGEP-NENの診断、予後判定および予測の方法およびその使用、例えば検出、予測、病期分類、プロファイリング、分類、ならびに処置有効性および他の転帰のモニタリングに関連する態様を記述する。2014512172.tif 000072
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸膵神経内分泌新生物(GEP-NEN)バイオマーカーのパネルに特異的にハイブリダイズするかまたは結合する単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリペプチドのセットを含む、GEP-NENの診断または予後判定のためのシステムであって、該パネルが、AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、MORF4L2、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC、ZZZ3、APLP2、CD59、ARAF1、BRAF1、KRASおよびRAF1遺伝子産物からなる群より選択される遺伝子産物を含む複数のGEP-NENバイオマーカーを含む、システム。
【請求項２】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、MORF4L2、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDCおよびZZZ3遺伝子産物からなる群より選択される遺伝子産物を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、以下のバイオマーカー: APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT1およびVMAT2遺伝子産物の少なくとも3種を含む、請求項1または請求項2記載のシステム。
【請求項４】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、少なくとも3種、少なくとも11種、少なくとも13種、少なくとも20種、少なくとも21種、少なくとも29種、少なくとも37種、少なくとも51種または少なくとも75種のバイオマーカーを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のシステム。
【請求項５】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、少なくとも51種のバイオマーカーを含む、請求項4記載のシステム。
【請求項６】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、MORF4L2、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDCおよびZZZ3遺伝子産物を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のシステム。
【請求項７】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT1およびVMAT2遺伝子産物を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のシステム。
【請求項８】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、AKAP8L、APLP2、ARAF1、ATP6V1H、BNIP3L、BRAF、C21orf7、CD59、COMMD9、CTGF、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、FZD7、GLT8D1、HDAC9、HSF2、Ki67、KRAS、LEO1、MORF4L2、NAP1L1、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PNMA2、PQBP1、RAF1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TPH1、TRMT112、VMAT1、VMAT2、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDCおよびZZZ3遺伝子産物を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、APLP2遺伝子産物、CD59遺伝子産物、ARAF1遺伝子産物、BRAF1遺伝子産物、KRAS遺伝子産物、またはRAF1遺伝子産物を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１０】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1およびVMAT2遺伝子産物を含む; または
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、APLP2、ARAF1、BRAF1、CD59、KRAS、RAF1、CXCL14、GRIA2、HOXC6、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCK1、X2BTB48、CgA、CTGF、FZD7、Ki-67、Kiss1、MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、NRP2、Tph1、VMAT1、VMAT2およびサバイビン遺伝子産物を含む、
請求項1〜9のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１１】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、MAGE-D2、MTA1、サバイビン、Kiss1、HOXC6、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、CTGF、PTPRN2、SPOCK1およびSCG5遺伝子産物からなる群より選択される遺伝子産物をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１２】
少なくとも21種のGEP-NENバイオマーカーを含むGEP-NENバイオマーカーのパネルに特異的にハイブリダイズするかまたは結合する単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリペプチドのセットを含む、GEP-NEN診断または予後判定のためのシステムであって、ヒト血液サンプル中のGEP-NENを分類または検出することができる、システム。
【請求項１３】
パネルが少なくとも51種のGEP-NENバイオマーカーを含む、請求項12記載のシステム。
【請求項１４】
少なくとも80%の特異性および感度でヒト血液サンプル中のGEP-NENを特定することができる、請求項1〜13のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１５】
GEP-NENを有する対象と別のタイプの胃腸(GI)がんを有する対象とを識別することができる、または小腸NENを有する対象と膵臓NENを有する対象とを識別することができる、請求項1〜14のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１６】
少なくとも90%の精度で、外科的介入もしくはソマトスタチン類似体療法に対する処置反応性を予測することができ、あるいは患者が外科的介入もしくはソマトスタチン類似体療法の後に臨床的に安定になったかどうか、または外科的介入もしくはソマトスタチン類似体療法に反応性であるかもしくは非反応性であるかを判定することができる、請求項1〜15のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１７】
少なくとも85%の感度および特異性で、処置GEP-NENと未処置GEP-NENとを識別することができる、請求項1〜16のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１８】
GEP-NENと以前に診断された対象が完全寛解にあるか否かを判定することができる、請求項1〜18のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１９】
循環血中CgAレベルの検出と比べて高い感度、特異性または精度で、特定、識別または予測が可能である、請求項13〜18のいずれか一項記載のシステム。
【請求項２０】
ハウスキーピング遺伝子産物に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドをさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項記載のシステム。
【請求項２１】
ハウスキーピング遺伝子産物が、ACTB、TOX4、TPT1およびTXNIP遺伝子産物からなる群より選択される、請求項20記載のシステム。
【請求項２２】
ハウスキーピング遺伝子産物が、18S、GAPDH、ALG9、SLC25A3、VAPA、TXNIP、ADD3、DAZAP2、ACTG1、ACTB、ACTG4B、ARF1、HUWE1、MORF4L1 RHOA、SERP1、SKP1、TPT1、TOX4、TFCP2およびZNF410遺伝子産物からなる群より選択される、請求項20または21記載のシステム。
【請求項２３】
ハウスキーピング遺伝子産物が、18S、GAPDH、ALG9、SLC25A3、VAPA、TXNIP、ADD3、DAZAP2、ACTG1、ACTB、ACTG4B、ARF1、HUWE1、MORF4L1 RHOA、SERP1、SKP1、TPT1およびTOX4遺伝子産物からなる群より選択される、請求項22記載のシステム。
【請求項２４】
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、SEQ ID NO:1〜29、105、201、204〜213、215、217〜225、227〜229、232〜240および243〜246からなる群より選択される配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を持つ遺伝子産物を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載のシステム。
【請求項２５】
GEP-NENのサブタイプを区別し、かつバイオマーカーのパネルがバイオマーカーのセットを含み、ここで
(i) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが原発性PDNECおよび原発性WDNETにおいて顕著に異なり、かつ該セットがCXCL14およびMAGE-D2遺伝子産物を含む; 
(ii) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが原発性PDNECおよび原発性WDNECにおいて顕著に異なり、かつ該セットが、PTPRN2遺伝子産物を含む3種のバイオマーカーを含む;
(iii) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが原発性PDNECおよび原発性PDNETにおいて顕著に異なり、かつ該セットがMTA1およびPNMA2遺伝子産物を含む; 
(iv) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが、原発性PDNETおよび原発性WDNETにおいて、もしくは原発性PDNETおよび原発性WDNECにおいて顕著に異なり、かつ該セットが少なくとも4種のバイオマーカーを含む;
(v) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが原発性WDNECおよび原発性WDNETにおいて顕著に異なり、かつ該セットが21種のバイオマーカーを含む;
(vi) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが転移性WDNECおよび転移性WDNETにおいて顕著に異なり、かつ該セットが、CXCL14遺伝子産物を含む少なくとも3種のバイオマーカーを含む;
(vii) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが転移性PDNECおよび転移性WDNECにおいて顕著に異なり、かつ該セットが、NAP1L1遺伝子産物を含む少なくとも4種のバイオマーカーを含む; または
(viii) バイオマーカーのセットの発現プロファイルが転移性PDNECおよび転移性WDNETにおいて顕著に異なり、かつ該セットが、NRP2遺伝子産物を含む少なくとも6種のバイオマーカーを含む、
請求項1〜24のいずれか一項記載のシステム。
【請求項２６】
胃腸膵神経内分泌新生物(GEP-NEN)、GEP-NEN細胞または関連した状態の検出、診断、分類または転帰予測のための方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a) 生体試験サンプルを得る段階; ならびに
(b) 少なくとも2種のGEP-NENバイオマーカーのパネルの存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを検出する段階であって、ここで該パネルが、AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、MORF4L2、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC、ZZZ3、APLP2、CD59、ARAF1、BRAF1、KRASおよびRAF1遺伝子産物からなる群より選択される遺伝子産物を含む、段階。
【請求項２７】
パネルが、AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、MORF4L2、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDCおよびZZZ3遺伝子産物からなる群より選択される遺伝子産物を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
パネルが、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT1およびVMAT2遺伝子産物を含む、請求項27または28記載の方法。
【請求項２９】
パネルが、少なくとも3種、少なくとも11種、少なくとも13種、少なくとも20種、少なくとも21種、少なくとも29種、少なくとも37種、少なくとも51種または少なくとも75種のバイオマーカーを含む、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
パネルが、少なくとも51種のバイオマーカーを含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
パネルが、AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、MORF4L2、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDCおよびZZZ3遺伝子産物を含む、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
パネルが、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT1およびVMAT2遺伝子産物を含む、請求項26〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
パネルが、AKAP8L、APLP2、ARAF1、ATP6V1H、BNIP3L、BRAF、C21orf7、CD59、COMMD9、CTGF、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、FZD7、GLT8D1、HDAC9、HSF2、Ki67、KRAS、LEO1、MORF4L2、NAP1L1、NOL3、NUDT3、OAZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PNMA2、PQBP1、RAF1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TPH1、TRMT112、VMAT1、VMAT2、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDCおよびZZZ3遺伝子産物を含む、請求項26〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
パネルが、APLP2遺伝子産物、CD59遺伝子産物、ARAF1遺伝子産物、BRAF1遺伝子産物、KRAS遺伝子産物、またはRAF1遺伝子産物を含む、請求項26〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
複数のGEP-NENバイオマーカーが、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1およびVMAT2遺伝子産物を含む; または
GEP-NENバイオマーカーのパネルが、APLP2、ARAF1、BRAF1、CD59、KRAS、RAF1、CXCL14、GRIA2、HOXC6、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCK1、X2BTB48、CgA、CTGF、FZD7、Ki-67、Kiss1、MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、NRP2、Tph1、VMAT1、VMAT2およびサバイビン遺伝子産物を含む、
請求項26〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
生体試験サンプルが、血液、血漿、血清、組織、唾液、血清、尿、または精液サンプルである、請求項26〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
生体試験サンプルが血液由来である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
段階(b)での検出が、請求項1〜25のいずれか一項記載のシステムを用いて行われる、請求項26〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
試験サンプルがGEP-NEN患者から採取される、請求項26〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
試験生体サンプルにおいて検出されたバイオマーカーの発現レベルまたは発現プロファイルを、正常もしくは参照の発現レベルまたは正常もしくは参照の発現プロファイルと比較する段階をさらに含む、請求項26〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
比較する段階の前に、正常サンプルまたは参照サンプルを得る段階; および
正常サンプルにおけるGEP-NENバイオマーカーのパネルの存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを検出し、それによって比較において用いられた正常または参照の発現レベルまたは発現プロファイルが判定される段階
をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
段階(b)での検出が、GEP-NENバイオマーカーのパネルに特異的に結合するポリヌクレオチドのセットと試験サンプルを接触させる段階を含む、
請求項26〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドのセットが、DNA、RNA、cDNA、PNA、ゲノムDNAまたは合成オリゴヌクレオチドを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ポリヌクレオチドがセンスおよびアンチセンスプライマーを含み、かつ段階(b)での検出が、(i) 逆転写によって試験サンプルからcDNAを産生する段階; (ii) そのようにして産生されたcDNAを、GEP-NENバイオマーカーのパネルと特異的にハイブリダイズするセンスおよびアンチセンスプライマーの対を用いて増幅する段階; (iii) 増幅の産物を検出する段階によって行われる、請求項42または43記載の方法。
【請求項４５】
前記存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルが、
GEP-NENの存在、非存在、分類、予後判定、リスク、処置に対する反応性、侵襲性、重症度または転移を示す、あるいは
GEP-NEN対象が処置されているかもしくは処置されていないか、完全寛解にあるかどうか、または臨床的に安定であるかどうかを示す、あるいは
GEP-NEN処置の有効性を示す、請求項26〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも80%の特異性または感度で、ヒト血液サンプル中のGEP-NENを分類または検出する、請求項26〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
GEP-NENを有する対象と別のタイプの胃腸(GI)がんを有する対象とを識別する、または小腸NENを有する対象と膵臓NENを有する対象とを識別する、請求項26〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも90%の精度で、外科的介入もしくはソマトスタチン類似体療法に対する処置反応性を予測する、あるいは患者が外科的介入もしくはソマトスタチン類似体療法の後に臨床的に安定になったかどうか、または外科的介入もしくはソマトスタチン類似体療法に反応性であるかもしくは非反応性であるかを判定する、請求項26〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも85%の感度および特異性で、処置GEP-NENと未処置GEP-NENとを識別する、請求項26〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
GEP-NENと診断された対象が完全寛解にあるか否かを判定する、請求項26〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
試験サンプルが血液サンプルであり、かつ前記方法が全血1ミリリットル(mL)あたり少なくとも3個または少なくとも約3個のGEP-NEN細胞を検出する、請求項26〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
試験生体サンプルでのGEP-NENバイオマーカーのパネルに関する平均発現レベルをコンピュータで計算する段階をさらに含む、請求項26〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
コンピュータで計算する段階が、複数のGEP-NENバイオマーカーの各々について検出された発現レベルをベクトル的に合計することによって行われる、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
試験生体サンプルが処置後のGEP-NEN患者由来であり、かつ参照サンプルが処置前の、同じGEP-NEN患者由来である;
参照サンプルが、GEP-NEN細胞を含有していない組織もしくは液体由来である;
参照サンプルが健常個体由来である;
参照サンプルがGEP-NEN以外のがん由来である;
参照サンプルがEC細胞もしくはSI組織由来である;
試験生体サンプルが転移性GEP-NEN由来であり、かつ参照サンプルが非転移性GEP-NEN由来である; または
参照サンプルが、試験生体サンプルが得られるGEP-NEN患者と比べて異なる分類のGEP-NEN由来である、
請求項41記載の方法。
【請求項５５】
80%〜100%の予測値、感度または特異性で、GEP-NENの存在もしくは非存在、分類または病期を特定する、請求項26〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
試験生体サンプルから検出された発現レベルを圧縮し、それによって発現プロファイルを判定する段階をさらに含む、請求項26〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
試験生体サンプルがGEP-NEN患者由来の全血または唾液サンプルであり、かつ試験生体サンプルに関して検出または判定された発現レベルまたは発現プロファイルが、同じ患者から得られたGEP-NEN組織サンプルまたは精製GEP-NEN細胞サンプルに関する同じGEP-NENバイオマーカーの発現レベルまたは発現プロファイルと、少なくとも約0.4のR2で相関する、請求項26〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
予測アルゴリズムを用いてデータを分析する段階をさらに含む、請求項26〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
予測アルゴリズムが、サポートベクタマシン(SVM)、線形判別分析(LDA)、K近傍法(KNN)およびナイーブベイズ(NB)からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
予測アルゴリズムが、決定木、SVM、RDA、およびパーセプトロンからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
血液サンプルを得る段階; および
該血液サンプルを、少なくとも2種のGEP-NENバイオマーカーを含むGEP-NENバイオマーカーのパネルに特異的に結合する1種または複数種の作用物質と接触させる段階
を含む、血液中の神経内分泌腫瘍細胞を検出するための方法であって、血液1mLあたり、少なくとも1、2もしくは3個または少なくとも約1、2もしくは3個のGEP-NEN細胞を検出する、方法。
【請求項６２】
作用物質が請求項1〜25のいずれか一項記載のシステムを構成する、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
CD164に特異的に結合する作用物質と細胞の混合物を接触させる段階; および
作用物質が結合した細胞を精製する段階
を含む、細胞の混合物から神経内分泌腫瘍細胞を濃縮するかまたは単離するための方法。
【請求項６４】
接触させる段階が、GEP-NEN特異的試薬である別の作用物質と細胞を接触させる段階をさらに含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
細胞の混合物が細胞培養物または血液サンプルもしくは他の生体液である、請求項63または64記載の方法。
【請求項６６】
血液1mLあたり、少なくとも3個または少なくとも約3個の細胞を濃縮または単離する、請求項63〜65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
(a) GEP-NEN患者に処置を提供する段階;
(b) GEP-NEN患者からサンプルを得る段階、およびサンプルにおけるGEP-NENバイオマーカーのパネルの発現レベルを検出する段階
を含む、処置の方法。
【請求項６８】
段階(a)が、処置を提供する段階の前に、患者由来のサンプルにおけるGEP-NENバイオマーカーのパネルの処置前の発現レベルを判定する段階をさらに含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
段階(c): 処置前の発現レベルを、段階(b)において検出された発現レベルと比較する段階
をさらに含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
処置前の発現レベルと段階(b)での発現レベルとの間で発現レベルの差異が存在することを判定する段階をさらに含み、この差異が処置の有効性を示す、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
後の時点でGEP-NEN患者におけるバイオマーカーの発現レベルを判定する段階、および
それらを段階(b)での発現レベルと比較する段階
をさらに含み、発現レベル間の差異が再発または処置反応性の欠如を示す、請求項67〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
発現レベルが、請求項1〜25のいずれか一項記載のシステムを用いて検出される、請求項67〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
段階(b)の患者サンプルにおけるCgA発現のレベルが、処置前のCgA発現レベルと比べて、または後の時点のCgA発現レベルと比べて、有意に異ならない、請求項67〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
患者に提供されている処置を中断する段階または処置を修正する段階をさらに含む、請求項67〜73のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
検出が、患者におけるGEP-NEN微小転移巣の存在を示す、請求項67〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
段階(b)でのサンプル、前処置サンプル、または後の時点で採取されたサンプルが、CgAのみの組織診断または検出によって、GEP-NEN、GEP-NEN転移またはGEP-NEN再発のないことが判定されるか、または判定された、請求項75記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年3月1日付で出願された米国仮特許出願第61/448,137号の恩典を主張するものであり、その開示は全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
EFS-Web経由で提出された配列表に関する参照
MPEP $ 1730 II.B.2(a)(C)に指定および規定される通り、USPTO EFS-WEBサーバ経由で電子的に提出した以下の配列表の全内容は、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。配列表は、以下の通りの電子出願テキストファイルにて確認される。
2014512172.tif 000003
【０００３】
技術分野
本明細書において記述される発明は、胃腸膵神経内分泌新生物(GEP-NEN)バイオマーカーならびにそれを検出するための作用物質、システムおよびキット、ならびに関連したGEP-NENの診断および予後判定の方法、例えば検出、予測、病期分類、プロファイリング、分類、ならびに処置有効性および他の転帰のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００４】
胃腸膵神経内分泌新生物(GEP-NEN、胃腸膵(GEP)神経内分泌腫瘍および神経内分泌腫瘍(NET)とも呼ばれる)は、米国で2番目に最も多く見られる胃腸(GI)管悪性腫瘍であり、胃新生物、食道新生物、膵臓新生物および肝胆道新生物よりも多く見られ、100,000症例あたり約2.5〜5症例の発生率がある。発生率および有病率は、この30年ほどの間に米国で100〜600パーセント増えたが、生存の増大はない。
【０００５】
GEP-NENの不均質性および複雑性が、診断、処置および分類を困難にしている。これらの新生物には、他のがんで一般に関連しているいくつかの変異がなく; マイクロサテライト不安定性はほとんど見られない。Tannapfel A, Vomschloss S, Karhoff D, et al., 「BRAF gene mutations are rare events in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors」, Am J Clin Pathol 2005;123(2):256-60（非特許文献1）; Kidd M, Eick G, Shapiro MD, et al. 「Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors」, Cancer 2005;103(2):229-36（非特許文献2）を参照されたい。個々の組織病理学的サブタイプは、異なる臨床的挙動と関係しているが、しかし確定的な、一般に認められている病理学的分類または予測スキームは存在しておらず、処置の開発を妨げている。
【０００６】
既存の診断法および予後判定法は、いくつかの遺伝子産物の画像化(例えば、CTおよびMRI)、組織診断、および検出を含む。利用可能な方法は、例えば、低い感度および/または特異性、ならびに初期段階の疾患を検出できないことによって限界がある。GEP-NENは、転移性になり、多くの場合、処置不可能になるまで、診断されないままになることが多い。
【０００７】
初期段階のGEP-NENを含む、GEP-NENの検出のための、例えば、診断、予後判定、予測、病期分類、分類、処置、モニタリングおよびリスク評価で用いるための、ならびにこの疾患の病因、悪性度および侵襲性の分子的因子の調査および理解のための、特異的かつ高感度な方法および作用物質が必要である。例えば、簡単に、迅速に、かつ比較的低い費用で実施されうる、そのような方法および作用物質が必要とされる。本明細書において提供されるのは、これらの必要にこたえる方法、組成物および組み合わせである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tannapfel A, Vomschloss S, Karhoff D, et al., 「BRAF gene mutations are rare events in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors」, Am J Clin Pathol 2005;123(2):256-60
【非特許文献２】Kidd M, Eick G, Shapiro MD, et al. 「Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors」, Cancer 2005;103(2):229-36
【発明の概要】
【０００９】
概要
1つの局面において、本発明は、胃腸膵神経内分泌新生物(GEP-NEN)バイオマーカー、診断方法、予後判定方法および予測方法において用いられうるそのバイオマーカーの検出に関する。提供される目的のなかには、GEP-NENバイオマーカー、バイオマーカーのパネル、バイオマーカーを結合させかつ検出するための作用物質、そのような作用物質を含有するキットおよびシステム、ならびに、例えば、生体サンプルにおいて、バイオマーカーを検出するための方法および組成物のほかに、その予後判定用途、予測用途、診断用途および治療用途がある。
【００１０】
提供されるのは、GEP-NENの予後判定、検出および診断のための、作用物質、作用物質のセット、および作用物質を含有するシステムである。典型的には、このシステムは、複数の作用物質(例えば、作用物質のセット)を含み、ここでその複数の作用物質は、GEP-NENバイオマーカーのパネルにおける複数のGEP-NENバイオマーカーに特異的に結合し、および/またはそのGEP-NENバイオマーカーを特異的に検出する。典型的には、作用物質は、1種または複数種のGEP-NENバイオマーカーに特異的に結合する単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、提供されるのは、GEP-NENバイオマーカーのパネルに結合する単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドのセット、ならびにその方法および使用である。
【００１１】
同様に提供されるのは、GEP-NENならびに関連した状態、症候群および症状のための予後判定方法、診断方法および予測方法ならびに作用物質、組成物、システムおよびキットの使用である。例えば、提供されるのは、GEP-NEN、またはその転帰、病期または侵襲性もしくはリスクのレベル、あるいは関連した状態の検出、診断、分類、予測、治療的モニタリング、予後判定または他の評価のための方法および使用である。いくつかの態様において、本方法は、GEP-NENバイオマーカー、より典型的には、バイオマーカーのパネルのような、複数のGEP-NENバイオマーカーの存在、非存在、発現レベルもしくは発現プロファイルを判定すること、および/あるいはそのような情報を正常のもしくは参照の発現レベルもしくはプロファイルまたは標準物質と比較することにより行われる。したがって、いくつかの態様において、本方法は、生体試験サンプルを得ること、および本明細書において記述されるGEP-NENバイオマーカーの、より典型的には、提供されるGEP-NENバイオマーカーのうちの少なくとも2種のパネルの、存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを検出することにより行われる。例えば、本方法は、本明細書において提供される、作用物質、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのシステムのいずれかで行うことができる。例えば、本方法は全体として、提供されるシステムの1つまたは複数を用いて行われる。
【００１２】
提供されるのは、いくつかの異なるGEP-NENタイプ、病期および部位(例えば、膵臓 対 小腸のGEP-NEN)の検出および区別のための方法、作用物質および組成物である。1つの局面において、部位の識別は予後判定情報を提供し、またはGEP-NENを特定するのに役立ちうる。したがって、いくつかの態様において、本方法は、小腸NEN (SI-NEN)と膵臓NEN (PI-NEN)を区別する。例示的なGEP-NENタイプおよび病期としては、転移性および原発性GEP-NEN、さまざまな処置手法に反応するGEP-NENまたはさまざまな処置手法に反応しないGEP-NEN、ならびに高分化型NET (WDNET)、原発性高分化型神経内分泌がん(WDNEC)、原発性低分化型神経内分泌腫瘍(PDNET)、原発性低分化型NEC (PDNEC)、転移性WDNET (WDNET MET)、転移性WDNEC (WDNEC MET)、転移性PDNEC (PDNEC MET)および転移性PDNET (PDNET MET)を含む、さまざまなGEP-NENサブタイプが挙げられる。
【００１３】
1つの局面において、提供される方法および組成物は、初期段階の、原発性のまたは無症候性のGEP-NENのような、GEP-NENを特異的にかつ高感度に検出するために用いられうる; いくつかの局面において、本方法および組成物は、疾患進行、処置反応および転移を予測するために用いられうる。本明細書において提供される方法および組成物は、GEP-NEN疾患に関連した、診断、予後判定、予測(すなわち、初期段階および原発性GEP-NENにおける転移の予測)、病期分類、分類、処置、モニタリング、リスクの評価、および分子因子の調査に有用である。
【００１４】
提供されるのは、他の診断方法および予後判定方法と比べて、素早く、簡単に、かつ比較的低い費用で行うことが可能なそのような方法である。
【００１５】
提供されるのは、遺伝子発現に基づくGEP-NEN分類を定義するのに有用であり、したがって、悪性度および転移の予測を例えば初期段階の疾患であるいは組織学的に陰性なサンプルを用いて可能とするために、正確な病期分類を提供するために、合理的な治療を容易とするために、およびGEP-NEN特有の治療用物質のための大規模に確証された臨床データセットを開発する際に有用である、方法および組成物である。
【００１６】
GEP-NENバイオマーカーは、発現がGEP-NENの存在もしくは非存在で異なる、またはGEP-NENの存在もしくは非存在に関連している、あるいは特定の分類、病期、侵襲性、重症度、度合い、転移、症状、リスク、処置反応性もしくは有効性または関連症候群で異なる、または特定の分類、病期、侵襲性、重症度、度合い、転移、症状、リスク、処置反応性もしくは有効性または関連症候群に関連している、バイオマーカーを含む。GEP-NENバイオマーカーのパネルは、典型的には、少なくとも2種のGEP-NENバイオマーカー、典型的には少なくとも3種のバイオマーカーを含む。いくつかの態様において、バイオマーカーのパネルは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種またはそれ以上のバイオマーカーを含み、あるいは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種のまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種のGEP-NENバイオマーカーまたはそれ以上のGEP-NENバイオマーカーを含む。
【００１７】
例えば、いくつかの局面において、バイオマーカーのパネルは、少なくとも3種の、少なくとも11種の、少なくとも21種の、もしくは少なくとも29種のバイオマーカー、少なくとも51種のバイオマーカー、または少なくとも75種のさらに多くのバイオマーカーを含む。特定の例において、パネルは少なくとも51種のバイオマーカーまたは約51種のバイオマーカーもしくは51種のバイオマーカーを含有する。本システムは、パネル中のバイオマーカーに特異的に結合するかまたはハイブリダイズする複数の作用物質(一般的にはポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を含有するので、バイオマーカーの数は一般に、特定のシステム中の作用物質の数に関連している。例えば、提供されるシステムのなかには、それぞれ、51種のGEP-NENバイオマーカーのパネルと特異的にハイブリダイズするまたは結合する、51種の作用物質を含有するシステムがある。
【００１８】
いくつかの局面において、バイオマーカーのパネルは、ポリヌクレオチド(例えば、転写物)およびポリペプチドを含む、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくは51種の、および/または全種の以下の群の遺伝子産物を含む:
2014512172.tif 000004
;
2014512172.tif 000005
;
ならびに
2014512172.tif 000006
。
【００１９】
いくつかの例において、バイオマーカーのパネルは、
2014512172.tif 000007
を含む。
【００２０】
いくつかの例において、バイオマーカーのパネルは、
2014512172.tif 000008
を含む。
【００２１】
いくつかの例において、バイオマーカーのパネルは、
2014512172.tif 000009
を含む。
【００２２】
いくつかの例において、バイオマーカーのパネルは、APLP2遺伝子産物、CD59遺伝子産物、ARAF1遺伝子産物、BRAF1遺伝子産物、KRAS遺伝子産物、またはRAF1遺伝子産物を含む。
【００２３】
いくつかの例において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、
2014512172.tif 000010
を含む; またはGEP-NENバイオマーカーのパネルは、
2014512172.tif 000011
を含む。
【００２４】
いくつかの例において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、
2014512172.tif 000012
からなる群より選択される遺伝子産物をさらに含む。
【００２５】
他の例において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、ポリヌクレオチド(例えば、転写物)およびポリペプチドを含む、遺伝子産物の以下の群のうちの1つ、複数、または全てにおけるバイオマーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29種を含み、あるいはポリヌクレオチド(例えば、転写物)およびポリペプチドを含む、遺伝子産物の以下の群のうちの1つ、複数、または全てにおけるバイオマーカーの各々を含む:
2014512172.tif 000013
。
【００２６】
いくつかの例において、バイオマーカーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50または51種の以下の遺伝子産物(遺伝子産物という用語は、例えば、ポリヌクレオチド(例えば転写物)およびポリペプチドを含む)を含む:
2014512172.tif 000014
。
【００２７】
いくつかの局面において、バイオマーカーは、
2014512172.tif 000015
を含む。
【００２８】
いくつかの例において、バイオマーカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37または38種の以下の遺伝子産物(遺伝子産物という用語は、例えば、ポリヌクレオチド(例えば転写物)およびポリペプチドを含む)を含む:
2014512172.tif 000016
。
【００２９】
いくつかの局面において、バイオマーカーは、
2014512172.tif 000017
を含む。
【００３０】
いくつかの例において、バイオマーカーは、
2014512172.tif 000018
より選択される少なくとも2種のGEP-NENバイオマーカーを含む。
【００３１】
1つの態様において、複数のGEP-NENバイオマーカーはAPLP2遺伝子産物またはCD59遺伝子産物を含む。1つの態様において、GEP-NENバイオマーカーはAPLP2遺伝子産物を含む。1つの態様において、GEP-NENバイオマーカーはCD59遺伝子産物を含む。
【００３２】
1つの態様において、GEP-NENバイオマーカーはAPLP2、CD59、ARAF1、BRAF1、KRASまたはRAF1遺伝子産物を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、KRASもしくはRAF1遺伝子産物、またはGTGF、FZD7、Ki67、NAP1L1、PNMA2、TPH1もしくはVMAT2遺伝子産物を含む。いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、PNMA2遺伝子産物を含む。いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、VMAT2遺伝子産物を含む。いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、CgA、CXCL14、GRIA2、HOXC6、Kiss1、MAGE-D2、MTA1、NKX2-3、NRP2、OR51E1、PTPRN2、SCG5、SPOCK1、サバイビン、VMAT1またはX2BTB48遺伝子産物を含む。他の態様において、パネルはPNMA2バイオマーカーを含む。いくつかの態様において、パネルはVMAT2バイオマーカーを含む。
【００３４】
いくつかの態様において、パネルは、APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1およびVMAT2遺伝子産物を含む; またはMAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、SPOCK1、HOXC6、CTGF、PTPRN2、SCG5、CgAおよびTph遺伝子産物を含む。1つの局面において、バイオマーカーは、以下のバイオマーカーの少なくとも1種を含み、または以下のバイオマーカーの各々を含む:
2014512172.tif 000019
。1つのそのような態様において、バイオマーカーはCgA遺伝子産物をさらに含む。
【００３５】
1つの態様において、GEP-NENバイオマーカーは、SEQ ID NO:1と、もしくはヌクレオチド残基番号158〜2449のSEQ ID NO:1と; SEQ ID NO:2と、もしくはヌクレオチド残基番号195〜2015のSEQ ID NO:2と; SEQ ID NO:3と、もしくはヌクレオチド残基番号62〜2362のSEQ ID NO:3と; SEQ ID NO:4と、もしくはヌクレオチド残基番号278〜664のSEQ ID NO:4と; SEQ ID NO:5と、もしくはヌクレオチド残基番号1〜1374のSEQ ID NO:5と; SEQ ID NO:6と、もしくはヌクレオチド残基番号207〜1256のSEQ ID NO:6と; SEQ ID NO:7と、もしくはヌクレオチド残基番号466〜801のSEQ ID NO:7と; SEQ ID NO:8と、もしくはヌクレオチド残基番号62〜1786のSEQ ID NO:8と; SEQ ID NO:9と、もしくはヌクレオチド残基番号460〜3111のSEQ ID NO:9と; SEQ ID NO:10と、もしくはヌクレオチド残基番号113〜820のSEQ ID NO:10と; SEQ ID NO:11と、もしくはヌクレオチド残基番号196〜9966のSEQ ID NO:11と; SEQ ID NO:12と、もしくはヌクレオチド残基番号155〜571のSEQ ID NO:12と; SEQ ID NO:13と、もしくはヌクレオチド残基番号182〜751のSEQ ID NO:13と; SEQ ID NO:14と、もしくはヌクレオチド残基番号100〜1920のSEQ ID NO:14と; SEQ ID NO:15と、もしくはヌクレオチド残基番号188〜2335のSEQ ID NO:15と; SEQ ID NO:16と、もしくはヌクレオチド残基番号413〜1588のSEQ ID NO:16と; SEQ ID NO:17と、もしくはヌクレオチド残基番号200〜1294のSEQ ID NO:17と; SEQ ID NO:18と、もしくはヌクレオチド残基番号792〜3587のSEQ ID NO:18と; SEQ ID NO:19と、もしくはヌクレオチド残基番号145〜1101のSEQ ID NO:19と; SEQ ID NO:20と、もしくはヌクレオチド残基番号771〜1865のSEQ ID NO:20と; SEQ ID NO:21と、もしくはヌクレオチド残基番号122〜3169のSEQ ID NO:21と; SEQ ID NO:22と、もしくはヌクレオチド残基番号416〜2362のSEQ ID NO:22と; またはSEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23と、もしくはヌクレオチド残基番号118〜756のSEQ ID NO:23と; SEQ ID NO:24と、もしくはヌクレオチド残基番号152〜1471のSEQ ID NO:24と; SEQ ID NO:25と、もしくはヌクレオチド残基番号2811〜2921、3174〜3283、5158〜5275、11955〜12044のSEQ ID NO:25と、またはSEQ ID NO:34と; SEQ ID NO:26と、もしくはヌクレオチド残基番号27〜1361のSEQ ID NO:26と; SEQ ID NO:27と、もしくはヌクレオチド残基番号472〜2049のSEQ ID NO:27と; SEQ ID NO:28と、もしくはヌクレオチド残基番号32〜1576のSEQ ID NO:28と; SEQ ID NO:29と、もしくはヌクレオチド残基番号467〜1801のSEQ ID NO:29と; SEQ ID NO:105と、もしくはヌクレオチド残基番号122〜1456のSEQ ID NO:105と; SEQ ID NO:201と、もしくはヌクレオチド残基番号100〜2040のSEQ ID NO:201と; SEQ ID NO:204と、もしくはヌクレオチド残基番号293〜1744のSEQ ID NO:240と; SEQ ID NO:205と、もしくはヌクレオチド残基番号125〜784のSEQ ID NO:205と; SEQ ID NO:206と、もしくはヌクレオチド残基番号278〜1006のSEQ ID NO:206と; SEQ ID NO:207と、もしくはヌクレオチド残基番号38〜508のSEQ ID NO:207と; SEQ ID NO:208と、もしくはヌクレオチド残基番号260〜1621のSEQ ID NO:208と; SEQ ID NO:209と、もしくはヌクレオチド残基番号281〜1126のSEQ ID NO:209と; SEQ ID NO:210と、もしくはヌクレオチド残基番号30〜4589のSEQ ID NO:210と; SEQ ID NO:211と、もしくはヌクレオチド残基番号852〜1967のSEQ ID NO:211と; SEQ ID NO:212と、もしくはヌクレオチド残基番号362〜2128のSEQ ID NO:212と; SEQ ID NO:213と、もしくはヌクレオチド残基番号188〜1798のSEQ ID NO:213と; SEQ ID NO:215と、もしくはヌクレオチド残基番号17〜2017のSEQ ID NO:215と; SEQ ID NO:217と、もしくはヌクレオチド残基番号505〜1371のSEQ ID NO:217と; SEQ ID NO:218と、もしくはヌクレオチド残基番号194〜853のSEQ ID NO:218と; SEQ ID NO:219と、もしくはヌクレオチド残基番号319〜837のSEQ ID NO:219と; SEQ ID NO:220と、もしくはヌクレオチド残基番号216〜311および313〜786のSEQ ID NO:220と; SEQ ID NO:221と、もしくはヌクレオチド残基番号312〜1151のSEQ ID NO:221と; SEQ ID NO:222と、もしくはヌクレオチド残基番号625〜2667のSEQ ID NO:222と; SEQ ID NO:223と、もしくはヌクレオチド残基番号210〜13117のSEQ ID NO:223と、またはGenBank gi番号205360961にて参照される配列ともしくはヌクレオチド残基番号210〜13118のその配列と; SEQ ID NO:224と、もしくはヌクレオチド残基番号399〜1871のSEQ ID NO:224と; SEQ ID NO:225と、もしくはヌクレオチド残基番号122〜919のSEQ ID NO:225と; SEQ ID NO:227と、もしくはヌクレオチド残基番号320〜1273のSEQ ID NO:227と; SEQ ID NO:228と、もしくはヌクレオチド残基番号121〜4446のSEQ ID NO:228と; SEQ ID NO:229と、もしくはヌクレオチド残基番号229〜1866のSEQ ID NO:229と; SEQ ID NO:232と、もしくはヌクレオチド残基番号102〜1553のSEQ ID NO:232と; SEQ ID NO:233と、もしくはヌクレオチド残基番号176〜1879のSEQ ID NO:233と; SEQ ID NO:234と、もしくはヌクレオチド残基番号618〜1793のSEQ ID NO:234と; SEQ ID NO:235と、もしくはヌクレオチド残基番号526〜1782のSEQ ID NO:235と; SEQ ID NO:236と、もしくはヌクレオチド残基番号65〜1231のSEQ ID NO:236と; SEQ ID NO:237と、もしくはヌクレオチド残基番号89〜1183のSEQ ID NO:237と; SEQ ID NO:238と、もしくはヌクレオチド残基番号227〜4030のSEQ ID NO:238と; SEQ ID NO:239と、もしくはヌクレオチド残基番号104〜1969のSEQ ID NO:239と; SEQ ID NO:240と、もしくはヌクレオチド残基番号94〜612のSEQ ID NO:240と、SEQ ID NO:243と、もしくはヌクレオチド残基番号409〜10988のSEQ ID NO:243と、SEQ ID NO:244と、もしくはヌクレオチド残基番号130〜8499のSEQ ID NO:244と、SEQ ID NO:245と、もしくはヌクレオチド残基番号55〜2187のSEQ ID NO:245と、ならびに/あるいはSEQ ID NO:246と、もしくはヌクレオチド残基番号477〜3188のSEQ ID NO:246と、少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の同一性を有するまたは100%の同一性を有するか、少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の同一性を有するまたは100%の同一性を有するか、あるいは90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の同一性を有するまたは100%の同一性を有するか、約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の同一性を有するまたは100%の同一性を有する(すなわち、上記のヌクレオチド配列を持つ)ヌクレオチド配列を持つ1種または複数種の遺伝子産物を含む。
【００３６】
提供される方法、作用物質およびシステムのなかには、ヒト血液サンプル中のGEP-NENを分類または検出できるものがある。いくつかの態様において、提供されるシステムおよび方法は、ヒト血液サンプル中のGEP-NENを特定または分類することができる; いくつかの態様において、それは、GEP-NENを有する対象と別のタイプの胃腸(GI)がん(もしくは他のがん)を有する対象とを識別することができ、または、例えば、小腸NENを有する対象と膵臓NENを有する対象とを識別することにより、GEP-NENの部位を判定することができる。いくつかの例において、本システムは、そのような情報を、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%、例えば、少なくとも80%の特異性、感度および/または精度で提供することができる。
【００３７】
いくつかの態様において、本システムは、外科的介入または薬物療法(例えば、ソマトスタチン類似体療法)のような、GEP-NEN処置に対する処置反応性を予測することができ、あるいは患者がGEP-NEN処置の後に臨床的に安定になったかどうか、またはGEP-NEN処置に反応性もしくは非反応性であるかどうかを判定することができる。場合によっては、本方法およびシステムは、それを、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の特異性、感度および/または精度で、例えば、少なくとも90%の精度でする。場合によっては、本方法およびシステムは、処置GEP-NENと未処置GEP-NENとを、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の特異性、感度および/または精度で、例えば、少なくとも85%の感度および特異性で識別することができる。
【００３８】
場合によっては、本方法およびシステムは、GEP-NENと以前に診断された対象に関する診断情報または予後判定情報、例えば、対象が安定した疾患、進行性の疾患を持つかどうか、または完全寛解にあるかどうか(例えば、安定した疾患、進行性の疾患を持つと、または完全寛解にあると臨床的に分類されるかどうか)を判定することができる。
【００３９】
いくつかの態様において、バイオマーカーを検出するための作用物質(例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド作用物質のセット)、およびその使用は、生体サンプル中のGEP-NENの存在もしくは非存在を、GEP-NENと他の腸のおよび粘膜のサンプルとを、例えば腸クロム親和性(EC)粘膜サンプルおよび小腸(SI)粘膜サンプルとGEP-NENサンプルとを、転移性もしくは侵襲性GEP-NENサンプルと原発性GEP-NENサンプルとを、ならびに/またはGEP-NENの特有のクラスもしくはサブタイプを区別することが可能である。
【００４０】
いくつかの態様において、本方法は、GEP-NENと、胃腸腺がん、または乳がん、前立腺がんもしくは膵がん、または胃がんもしくは肝がん、例えば食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、結腸がんもしくは直腸がんの1つを含む、腺がんのような、他のがんとを区別する。他の態様において、本方法およびシステムは、小腸のGEP-NENと膵臓のGEP-NENとの間でなど、異なる部位のGEP-NENを識別する。
【００４１】
1つの態様において、作用物質のセットは、腸クロム親和性(EC)粘膜と小腸(SI)粘膜とを区別する。1つの局面において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、CTGF、CXCL14、FZD7、Kiss1、FZD、Kiss1、NKX2-3、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCK1およびX2BTB48遺伝子産物を含む。別の態様において、本システムまたは作用物質のセットは、腺がんとGEP-NENとを、例えば腺がんとGEP-NENサンプルとを区別する。1つの局面において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、CgA遺伝子産物を含む、少なくとも16種のGEP-NENバイオマーカーを含む。別の態様において、本システムまたは作用物質のセットは、原発性GEP-NEN疾患と転移性GEP-NEN疾患とを区別する。この態様の1つの局面において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、少なくとも18種のGEP-NENバイオマーカーを含む。
【００４２】
いくつかの態様において、本システムもしくは作用物質のセットまたはその使用は、GEP-NENの1つもしくは複数のさまざまなサブタイプを区別し、および/または発現プロファイルまたは合計した発現(例えばベクトル的に合計した発現)がさまざまなサブタイプ間で顕著に異なるバイオマーカーのセットに結合するか、またはそのセットを検出する作用物質を含む。この態様の1つの局面において、本システムは原発性PDNECと原発性WDNETとを区別する; 1つの例において、バイオマーカーのパネルはCXCL14およびMAGE-D2遺伝子産物を含む。別の態様において、本システムは原発性PDNECと原発性WDNECとを区別する; 1つの例において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、PTPRN2遺伝子産物を含む、3種のバイオマーカーを含む。別の態様において、本システムは原発性PDNECと原発性PDNETとを区別する; 1つの例において、バイオマーカーのパネルはMTA1およびPNMA2遺伝子産物を含む。別の態様において、本システムは原発性PDNETと原発性WDNETとを区別する; 1つの例において、NEバイオマーカーのパネルは少なくとも4種のバイオマーカーを含む。別の態様において、本システムは原発性WDNECと原発性WDNETとを区別する; 1つの例において、本セットは少なくとも21種のバイオマーカーを含む。
【００４３】
別の態様において、本システムは、GEP-NENの転移性サブタイプを、例えば、パネルが、CXCL14遺伝子産物を含む少なくとも3種のバイオマーカーを含有する場合、例えば転移性WDNECと転移性WDNETとを区別し; 例えば、バイオマーカーのセットが、NAP1L1遺伝子産物を含む少なくとも4種のバイオマーカーを含む場合、転移性PDNECと転移性WDNECとを区別し; 例えば、GEP-NENバイオマーカーのパネルが、例えばNRP2遺伝子産物を含む少なくとも6種のバイオマーカーを含む場合、転移性PDNECと転移性WDNETとを区別する。
【００４４】
1つの局面において、本システムは、ヒト血液サンプルまたはヒト唾液サンプル中のGEP-NENを分類または検出することができる。1つの局面において、ヒトサンプルは全血、または任意の特定の細胞集団について初めに選別もしくは濃縮することなしに、全血から調製された核酸もしくはタンパク質である。1つの局面において、本システムは、少なくとも29種のGEP-NENバイオマーカーのパネル中のバイオマーカーに結合する作用物質を含む。
【００４５】
いくつかの局面において、本方法およびシステムは、循環血中CgAレベルの検出などの、利用可能な検出または診断方法のような、別の診断方法と比べて高い感度、特異性または精度で、上記のそのような診断、識別、検出、予測または予後判定の情報または判定を提供する。
【００４６】
いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーに結合する作用物質に加えて、提供されるシステムは、正規化用または対照として用いるための遺伝子産物、例えば、ACTB、TOX4、TPT1およびTXNIP遺伝子産物のいずれか1種または複数種を含む、ハウスキーピング遺伝子産物;
2014512172.tif 000020
のいずれか1種または複数種を含む、ハウスキーピング遺伝子産物;
2014512172.tif 000021
のいずれか1種または複数種を含む、ハウスキーピング遺伝子; または
ALG9、TFCP2、ZNF410、18SおよびGAPDH遺伝子産物のいずれか1種または複数種を含む、ハウスキーピング遺伝子に結合する1種または複数種の作用物質を含有する。
【００４７】
いくつかの態様において、本システムは、腸クロム親和性(EC)粘膜と小腸(SI)粘膜とを区別し、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、CTGF、CXCL14、FZD7、Kiss1、FZD、Kiss1、NKX2-3、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCK1およびX2BTB48遺伝子産物をさらに含む。別の態様において、GEP-NENバイオマーカーのパネルは、MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、SPOCK1、HOXC6、CgA、CTGF、PTPRN2、SCG5およびTph1遺伝子産物を含む。別の態様において、本システムは、腺がんとGEP-NENとを区別し、CgA遺伝子産物を含む、16種またはそれ以上のGEP-NENバイオマーカーのパネルと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはポリペプチドのセットを含む。
【００４８】
いくつかの態様において、本方法およびシステムはGEP-NENの、存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを判定し、その存在、非存在、分類、予後判定、リスク、処置に対する反応性、侵襲性、重症度または転移を示す。例えば、1つの局面において、試験サンプルにおいて検出された存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルは、GEP-NEN処置の有効性を示す。1つの局面において、検出された存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルは、原発性PDNECと原発性WDNETとを区別し、バイオマーカーのパネルは、CXCL14およびMAGE-D2遺伝子産物を含む; 他の局面において、それは、原発性PDNECと原発性WDNECとを区別し、バイオマーカーのパネルは、PTPRN2遺伝子産物を含む3種のバイオマーカーを含む; 別の局面において、それは、原発性PDNECと原発性PDNETとを区別し、バイオマーカーのパネルは、MTA1およびPNMA2遺伝子産物を含む; 別の局面において、それは、原発性PDNETと原発性WDNETとを、または原発性PDNETと原発性WDNECとを区別し、バイオマーカーのパネルは、少なくとも4種のバイオマーカーを含む; 別の局面において、それは、原発性WDNECと原発性WDNETとを区別し、バイオマーカーのパネルは、21種のバイオマーカーを含む; 別の局面において、それは、転移性WDNECと転移性WDNETとを区別し、バイオマーカーのパネルは、CXCL14遺伝子産物を含む少なくとも3種のバイオマーカーを含む; 別の局面において、それは、転移性PDNECと転移性WDNECとを区別し、パネルは、NAP1L1遺伝子産物を含む少なくとも4種のバイオマーカーを含む; 別の局面において、それは、転移性PDNECと転移性WDNETとを区別し、パネルは、NRP2遺伝子産物を含む少なくとも6種のバイオマーカーを含む。
【００４９】
本方法で用いられる生体試験サンプルは、血液サンプル、例えば血漿、血清、全血、白血球層もしくは他の血液サンプル、組織、唾液、血清、尿、または精液サンプルを含む、組織、生体液、または他のサンプルのような、任意の生体サンプルでありうる。いくつかの局面において、サンプルは血液から得られる。多くの場合、試験サンプルはGEP-NEN患者から採取される。
【００５０】
いくつかの態様において、本方法は、試験サンプルにおいて検出されたバイオマーカーの発現レベルもしくは発現プロファイルまたは存在もしくは非存在を、発現の正常レベルもしくは参照レベルまたは正常もしくは参照の発現プロファイルと、あるいは発現レベル、量もしくは発現プロファイルの標準値と、あるいは参照もしくは正常サンプルにおける検出の存在(またはより典型的には非存在)と比較する段階をさらに含む。
【００５１】
いくつかのそのような態様において、本方法は、正常サンプルまたは参照サンプルを得る段階、および、典型的には比較段階の前に行われる、正常サンプルにおけるGEP-NENバイオマーカーのパネルの存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを検出する段階を含む。1つの局面において、これには、発現の正常レベルもしくは参照レベルまたは正常もしくは参照の発現プロファイルをさらに判定する段階があり、これを、試験生体サンプルにおいて検出された発現レベルまたはプロファイルと比較することができる。
【００５２】
場合によっては、試験生体サンプルにおいて検出された発現レベルと正常サンプルもしくは参照サンプル、または他の標準もしくは参照の発現レベルとの間に、有意な差異などの、差異が存在するかどうか判定するために、統計分析が行われる。例えば、0.05未満のp値が認められる場合、または±2の標準偏差が認められる場合、差異を有意とみなすことができる。差異を判定するための他の方法は、当技術分野において公知である。
【００５３】
正常サンプルまたは参照サンプルは、健常患者またはGEP-NENを抱える患者由来でありうる。試験サンプルが、GEP-NENを有する患者由来である場合、正常または参照のサンプルまたはレベルは、同じまたは異なる患者由来でありうる。例えば、正常サンプルまたは参照サンプルは、GEP-NEN患者からの、GEP-NENまたはGEP-NEN細胞を含有するものと予想されない組織、液体または細胞由来でありうる。別の局面にて、正常または対照サンプルは、外科手術または化学的介入の後のような、治療的介入の前または後のGEP-NEN患者由来である。別の局面において、参照サンプルまたは正常サンプルは、正常ECまたはSIサンプル、あるいは正常肝臓、肺、骨、血液、唾液もしくは他の体液、組織または生体サンプルのような、健常個体由来の、試験サンプルのGEP-NENまたは転移がんに対応する組織または液体由来である。別の態様において、試験サンプルはGEP-NEN患者の転移がん、血漿もしくは全血または他の液体由来であり、参照サンプルは原発性腫瘍または選別された腫瘍細胞由来である。
【００５４】
1つの局面において、試験生体サンプルは、処置前のGEP-NEN患者由来であり、正常サンプルまたは参照サンプルは、処置後のGEP-NEN患者由来である。別の局面において、正常サンプルまたは参照サンプルは、GEP-NEN患者の非転移性組織由来である。
【００５５】
他の局面において、試験サンプルは血液由来であり、かつ試験生体サンプルは処置後のGEP-NEN患者由来であり、かつ参照サンプルは処置前の、試験生体サンプルと同じGEP-NEN患者由来である; 参照サンプルは、GEP-NEN細胞を含有していない組織もしくは液体由来である; 参照サンプルは健常個体由来である; 参照サンプルはGEP-NEN以外のがん由来である; 参照サンプルはEC細胞もしくはSI組織由来である; 試験生体サンプルは転移性GEP-NEN由来であり、かつ参照サンプルは非転移性GEP-NEN由来である; または参照サンプルは、試験生体サンプルが得られるGEP-NEN患者と比べて異なる分類のGEP-NEN由来である。
【００５６】
本作用物質は、バイオマーカーの検出のための任意の作用物質であることができ、典型的には、抗体、例えば、少なくとも21種のGEP-NENバイオマーカーを含むGEP-NENバイオマーカーのパネルと特異的にハイブリダイズするかまたは結合するものなどの、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリペプチドもしくはタンパク質である。
【００５７】
いくつかの態様において、本方法は、提供される作用物質の1つと、より典型的には、提供される作用物質の複数、例えば、GEP-NENバイオマーカーのパネルに特異的に結合するポリヌクレオチドのセットのような、提供されるシステムの1つと試験サンプルを接触させる段階によって行われる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのセットは、DNA、RNA、cDNA、PNA、ゲノムDNAまたは合成オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、本方法は、RT-PCR、例えば、QPCRによるような、検出の前に試験サンプルからRNAを単離する段階を含む。したがって、いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーの発現レベルのような、GEP-NENバイオマーカーの検出は、RNAの存在、非存在または量の検出を含む。1つの例において、RNAはPCRによりまたはハイブリダイゼーションにより検出される。
【００５８】
1つの局面において、ポリヌクレオチドは、バイオマーカーのパネル中のGEP-NENバイオマーカーの各々に特異的であるプライマーの対のような、センスおよびアンチセンスプライマーを含む。この態様の1つの局面において、GEP-NENバイオマーカーの検出はPCR、典型的には定量的PCRまたはリアルタイムPCRにより行われる。例えば、1つの局面において、検出は、逆転写によって試験サンプルからcDNAを産生すること; その後、GEP-NENバイオマーカーのパネルと特異的にハイブリダイズするセンスおよびアンチセンスプライマーの対を用いてcDNAを増幅すること、ならびに増幅の産物を検出することにより行われる。いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカーはmRNA、cDNAまたはタンパク質を含む。
【００５９】
いくつかの態様において、本方法は、低容量GEP-NEN、初期段階GEP-NEN、微小転移巣、循環血中GEP-NEN細胞、および/またはGEP-NENなどの利用可能なバイオマーカーの画像化もしくは検出などの、利用可能な方法によって検出することが困難であるGEP-NENの他の事例を検出することが可能である。例えば、いくつかの態様において、サンプルは、全血サンプルのような血液サンプルであり、本方法は、全血1ミリリットル(mL)あたり少なくとも3個または少なくとも約3個のGEP-NEN細胞を検出する。
【００６０】
いくつかの局面において、本方法は、数学的アルゴリズムのような予測モデルを用いた分析および統計分析をさらに含む。1つの例において、本方法は、試験生体サンプルでのGEP-NENバイオマーカーのパネルに関する平均発現レベルをコンピュータで計算する段階を含む。この態様の1つの局面において、コンピュータで計算する段階は、複数のGEP-NENバイオマーカーの各々に関して検出された発現レベルをベクトル的に合計することによって行われる。いくつかの局面において、平均発現レベルは、参照サンプルまたは正常サンプルに対して本方法を行うことによって得られたものなどの、参照の平均発現レベルと比較される。多くの場合、比較により、参照の平均発現レベルと比べて試験サンプルでの平均発現レベルの有意差が明らかになる。いくつかの局面において、検出された発現または発現プロファイルは、0.05未満のp値もしくは約0.05未満のp値、または+標準偏差の差異、または±0.4のS値が、S < -0.4もしくはS > 0.4、または本明細書において記述されるものなどの、他の公知の方法により認められる場合、十分に異なる、例えば、有意に異なる、あるいは十分に上方もしくは下方制御されている。いくつかの局面において、試験生体サンプルにおいて検出され、および/または判定された平均発現、合計した平均発現または発現プロファイルのような発現は、別のGEP-NENサンプルのそれと相関し、例えば、試験サンプルが全血または他の生体液サンプルである場合、その量はGEP-NEN組織または精製された細胞集団のそれと相関する。例えば、少なくとも約0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9または1のR2となる。
【００６１】
1つの態様において、本方法は、80%〜100%、例えば80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の予測値または約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の予測値、あるいは少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の予測値または少なくとも約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の予測値、感度または特異性でGEP-NENの存在もしくは非存在、分類または病期を特定する。いくつかの態様において、本方法は、試験生体サンプル由来のバイオマーカーの、検出された発現レベルを圧縮する段階を含む。典型的には、この圧縮は、バイオマーカーのパネルの発現プロファイルを判定するために行われる。
【００６２】
いくつかの態様において、試験生体サンプルはGEP-NEN患者由来の全血または唾液サンプルであり、かつ試験生体サンプルに関して検出または判定された発現レベルまたは発現プロファイルは、同じ患者から得られたGEP-NEN組織サンプルまたは精製GEP-NEN細胞サンプルに対する同じGEP-NENバイオマーカーの発現レベルまたは発現プロファイルと、少なくとも約0.4のR2で相関する。
【００６３】
いくつかの態様において、本方法は、予測アルゴリズム、モデルおよび/またはトポグラフィー分析を用いてデータを分析するための段階を含む。いくつかの例において、予測アルゴリズムはサポートベクタマシン(SVM)、線形判別分析(LDA)、K近傍法(KNN)またはナイーブベイズ(NB)である。いくつかの例において、予測アルゴリズムはサポートベクタマシン(SVM)、線形判別分析(LDA)、またはK近傍法(KNN)である。他の例において、アルゴリズムは決定木、SVM、RDAもしくはパーセプトロン、または当技術分野において公知のもしくは本明細書において記述の他のモデルである。1つの局面において、モデルまたはアルゴリズムは、GEP-NENの存在、非存在、転移性もしくは非転移性を判定し、または2つまたはそれ以上のクラスのGEP-NENを、0.05〜0の誤分類率で区別する。
【００６４】
同様に提供されるもののなかには、血液サンプルを得る段階; および少なくとも2種のGEP-NENバイオマーカーを含むGEP-NENバイオマーカーのパネルに特異的に結合する1種または複数種の作用物質と、血液サンプルを接触させる段階により、血液中の神経内分泌腫瘍細胞を検出するための方法であって、血液1mLあたり、少なくとも1、2、3、4または5個の細胞あるいは少なくとも約1、2、3、4または5個の細胞、血液1mLあたりGEP-NEN細胞を検出する該方法がある。
【００６５】
同様に提供される態様のなかには、血漿、血液、白血球層、細胞培養物、生体液または他の細胞調製物のような、細胞の液体および混合物からGEP-NEN細胞を濃縮または単離するための方法がある。この態様の1つの局面において、本方法は、GEP-NENバイオマーカーに特異的に結合する作用物質と細胞の混合物を接触させる段階、および作用物質に結合する細胞を精製する段階によって行われる。この態様の1つの局面において、バイオマーカーはCD164である。1つの局面において、バイオマーカーはポリペプチドバイオマーカーである。1つのそのような局面において、作用物質は、CD164抗体のような、バイオマーカーに特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、精製は、FACSもしくはカラム精製または親和性に基づいて細胞を精製するための任意の他の公知の方法によるものである。1つの局面において、接触させる段階は、別のGEP-NEN特異的な作用物質と細胞を接触させる段階をさらに含む。いくつかの局面において、本方法は、血液1mLあたり、少なくとも1、2、3、4または5個、あるいは少なくとも約1、2、3、4または5個の細胞を濃縮または単離する。
【００６６】
同様に提供されるのは、提供されるバイオマーカー、作用物質、システムおよび検出方法の、GEP-NEN処置および処置モニタリングで用いるための、方法および使用である。例えば、提供されるのは、GEP-NENの処置を受けている対象またはGEP-NENの処置を以前に受けていた対象から得られたサンプルをアッセイするためなどの、GEP-NEN処置と併せて上記の診断方法、予後判定方法および検出方法を用いる方法である。1つの態様において、そのような方法は、そのような患者からサンプルを得る段階、およびサンプルにおける、GEP-NENバイオマーカー、典型的にはGEP-NENバイオマーカーのパネルの発現の存在もしくは非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを検出または判定する段階によって行われる。1つの局面において、この方法は、患者に処置をまず初めに提供する段階を含む。そのような方法において、バイオマーカーまたはパネルは全体として、上記のものなどの、本明細書において提供される作用物質またはシステムを用いて検出される。いくつかの局面において、この方法は、処置を提供する段階の前に、バイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルの、患者由来のサンプルにおける処置前の量、存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルを判定する段階をさらに含む。したがって、いくつかの例において、処置前の量、存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルは、処置後の患者において判定または検出された量、存在、非存在、発現レベルまたは発現プロファイルと比較される。
【００６７】
場合によっては、この分析は、処置の有効性を示しうる、処置前の発現レベルと処置後の発現レベルとの間に発現レベルの差異が存在することを判定する。場合によっては、この方法は、その後になって患者または患者由来のサンプルにおけるバイオマーカーの発現量、存在、非存在、レベルまたはプロファイルを判定する段階をさらに含む。そのような方法は、その後の時点からの情報を、当初検出または判定された情報と比較する段階をさらに含むことができる。この情報、例えば、発現量、存在、非存在、レベルまたはプロファイルレベル間の差異は、個体が処置に反応していたかどうかに関する情報を示すことができ、例えば、再発、処置反応性の欠如、安定した疾患、または進行性の疾患を示すことができる。
【００６８】
いくつかの態様において、そのような方法は、血清または他のサンプルにおけるCgAレベルの検出などの、利用可能な診断方法と比べてさらに高い感度、特異性または精度の情報を提供するという利点を提供する。したがって、1つの例において、この方法は、CgA発現レベルが、アッセイされたサンプルで、例えば処置前のサンプルと処置後のサンプルおよび/もしくは後の時点で採取されたサンプルとの間で、または試験サンプルと正常サンプルとの間で、有意に異ならない場合に、示した診断情報、予後判定情報、または予測情報を提供する。
【００６９】
場合によっては、処置は、本方法からの判定に基づき中断または修正される。本方法は繰り返すやり方で行われてもよく、処置は発現レベルもしくはプロファイルまたは比較によって再評価または修正されてもよい。したがって、いくつかの態様において、本方法は、例えば、診断手法によって判定された情報に基づき、患者に提供された処置を中断する段階または処置を修正する段階をさらに含む。場合によっては、比較および/または発現量、存在、非存在、レベルもしくはプロファイルは、患者におけるGEP-NEN微小転移巣の存在を示す。1つの例において、患者から採取されたサンプルの1つまたは複数は、CgAだけの組織診断または検出によるような、別の診断方法によってGEP-NEN、GEP-NEN転移またはGEP-NEN再発のないことが判定されるか、または判定されている。
【００７０】
他の態様において、処置方法は、GEP-NEN患者から第1のサンプルを得る段階および第1のサンプルにおけるGEP-NENバイオマーカーのパネルの発現レベルを検出する段階; 患者に処置を提供する段階: GEP-NEN患者から第2のサンプルを得る段階および第2のサンプルにおけるGEP-NENバイオマーカーのパネルの発現レベルを検出する段階; ならびに第1のサンプルにおいて検出された発現レベルを第2のサンプルにおいて検出された発現レベルと比較する段階によって行われる。1つの局面において、本方法は、第1および第2のサンプルの間で発現レベルの差異が存在するかどうかを判定する段階、例えば、そのような差異が存在することを判定する段階をさらに含む。1つの例において、差異は、処置の有効性を示す。さらなる態様において、本方法は、患者から第3のサンプルを得る段階、第3のサンプルにおける発現レベルを検出する段階およびそれらを第1または第2のサンプルにおける発現レベルと比較する段階をさらに含む。場合によっては、比較は、微小転移のような、転移の存在を示す。いくつかの態様において、サンプルの1つまたは複数は、CgAのみの検出、画像化または組織診断のような、別のアッセイ法によってGEP-NEN、GEP-NEN転移またはGEP-NEN再発のないことが判定された患者から採取されるが、しかし本方法は、同じサンプルでのGEP-NEN、GEP-NEN転移またはGEP-NEN再発の存在を検出する。
【００７１】
1つの例において、本方法は、第2および第3のサンプルにおいて検出された発現レベルの間に差異が存在することを判定する段階をさらに含み、ここで差異は再発または処置反応性の欠如を示す。いくつかの局面において、第2のサンプルにおけるCgA発現のレベルは、第1のサンプルまたは第3のサンプルにおけるものと比べて有意差がない。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】正常、局所および悪性組織における遺伝子発現の分布。サンプルの（個々のグラフの上に列挙されている）個々の遺伝子の発現を、正常腸クロム親和性（EC）細胞における平均発現と比較し、上方制御、下方制御またはベースラインのクラスに割り当てた。各グラフは、左から右に、正常、悪性および局所組織の結果を示している。楕円は±2標準偏差（SD）の閾値に対応する。すべてのp値：p<0.05。
【図２】原発性小腸神経内分泌腫瘍、転移物および正常EC細胞の主成分（PC）分析。3個のPCまで縮小された、示されているバイオマーカーの、自然対数で表した正規化リアルタイムPCR発現レベルであり、原発性腫瘍サブタイプおよび正常EC細胞調製物における75.6%の分散（2A）ならびに原発性腫瘍サブタイプおよび対応する転移物における73.2%の分散（2C）が示されている。原発性腫瘍および正常EC細胞では、類似の発現パターンを有する3つの遺伝子グループが観測され（2B）、対応する転移物においては2つのグループが同定された（2D）。
【図３】原発性小腸神経内分泌腫瘍および正常EC細胞におけるマーカー遺伝子発現のピアソン相関を用いる類似性マトリクス。示されている遺伝子の、自然対数で表した正規化リアルタイムPCR発現レベルをX軸およびY軸にプロットした。
【図４】正常EC細胞と小腸神経内分泌腫瘍の間の分布の密度マップ。FSによって同定された、示されている転写物の発現レベルをX軸およびY軸にプロットし、正常および新生物サンプルをそれぞれの遺伝子対の発現にしたがい拡散させ、サンプル間の平均ユークリッド距離（発現の差）に基づく分布密度を緑色（正常）および赤色（新生物）に着色した。青色の領域は、正常グループと新生物グループの間の遷移領域を示している。
【図５】原発性小腸神経内分泌腫瘍を分類する決定木。NAP1L1およびKi-67の発現レベルを、特徴選択を用いる決定木分類器における主判別子とした。このモデルは、原発性腫瘍サブタイプに対してNAP1L1およびKi-67の値を相関付けることによって構築した。括弧内の百分率は、原発性小腸神経内分泌腫瘍サブタイプの出現頻度を示している。
【図６】原発性小腸神経内分泌腫瘍とそれらの転移物の間の分布の密度マップ。FSアルゴリズムによって同定されたKiss1、NAP1L1、MAGE-D2およびCgA転写物の発現レベルをX軸およびY軸にプロットした。原発性小腸神経内分泌腫瘍サブタイプ（WDNET、WDNEC、PDNEC）およびそれぞれの転移物（MET）を、それらのそれぞれの遺伝子対の発現にしたがい拡散させた（6A〜C）。サンプル間の平均ユークリッド距離（発現の差）に基づく分布密度を、青色（原発性腫瘍）および赤色（転移物）に着色した。緑色の領域は、原発性腫瘍サブタイプとそれぞれの転移物の間の遷移領域を示している。
【図７】試験セットおよびトレーニングセットにおける分類器の性能の評価。グラフは、トレーニングセットおよび試験セットにおいて正確に検定されたサンプルの百分率を示しており、正常EC細胞が77%の正確度で交差検証され、独立試験セットにおいて76%の正確度で予測されたことを示している（p=0.84）。局所NETは、78%の正確度で交差検証され、試験セットにおいて63%の正確度で予測された（p=0.25）。悪性NETは、83%の正確度で交差検証され、独立セットにおいて83%の正確度で予測された（p=0.80）。
【図８】NET、腺癌および正常組織におけるマーカー遺伝子の主成分分析（PCA）および発現。8A。21種のマーカー遺伝子のパネルの転写物発現を、そのデータセット内の分散の大部分（83%）を網羅する3つの主成分に縮小した。各々の重心（平均発現）は、その主成分ベクトルにより与えられるサンプルの転写物発現プロフィールに対応する。この表示法において、重心間の距離の近さは類似性の程度を示している。したがって、このマーカー遺伝子パネルは、腺癌（乳房、結腸、膵臓）、正常SI粘膜、正常EC細胞ならびに原発性および転移性NETサブタイプを適当に区別することができる。正常EC細胞は、正常SI粘膜および新生物組織とは実質的に異なる遺伝子プロフィールを有していることに注目されたい。8B。各マーカー遺伝子を発現するサンプルの比率の分析であり、腺癌（AC）と比較して有意に多いNETサンプル（>95%）が16種のマーカー遺伝子に関して陽性であることを実証している。両方の腫瘍タイプにおいて高度に発現される遺伝子には、CTGF、FZD7、NRP2、PNMA2およびサバイビンが含まれていた。NML=正常SI粘膜、NML_EC=正常EC細胞、MET=転移物、WDNET=高分化型NET；WDNEC=高分化型神経内分泌癌腫；PDNET=低分化型NET；PDNEC=低分化型NEC。*p<0.002 SI NET 対 腺癌（フィッシャーの正確確率検定）。
【図９】高度に相関する遺伝子対の相関係数のヒートマップおよび関係ネットワーク。9A。すべての組織タイプにおいて各遺伝子のピアソン相関係数（R2）を計算し、これを、最低値（-0.03）を黒色で、中間（0.4）を濃灰色で、最高（1）を薄灰色で表すヒートマップとして表した。9B。共発現のネットワークを、R2>0.40の転写物の対が稜線でつながるように構築した。実際のR2値が、各稜線に上書きされている。
【図１０】遺伝子ランクのボルケーノプロットおよびt検定の有意（p）値。10A。1）EC細胞、正常SI粘膜ならびに原発性および転移性組織；2）原発性NETサブタイプ；3）転移性NETサブタイプ、において差次的に発現される遺伝子を同定するため、2標本t検定を行った。正常EC細胞では、正常SI粘膜と比較して、古典的神経内分泌マーカーTph1の転写物発現が有意に高かった（p<0.001、S=0.7）。10B。正常SI粘膜と比較して、新生物組織は、より高いCgAおよびGRIA-2の転写レベルを発現したが、CgA発現は、新生物組織と正常EC細胞の間で有意に変化しなかった（p=0.07、S=0.39）。10C。グループとしてのすべての転移物およびグループとして分析した場合のすべての異なる原発性NETサブタイプの間で差次的に発現される遺伝子は存在しなかった。10D。PDNET-PDNECおよびWDNET-PDNECの間で差次的に発現される遺伝子は存在せず、WDNEC-PDNECにおいては、MAGE-D2が唯一の有意マーカー（p=0.009、S=1.03）であった。CgA、Kiss1、NRP2およびTph1は、すべての転移物サブタイプの間で差次的に発現された。
【図１１】全血における転写物発現。ハウスキーピング遺伝子（ALG-9、TFCP2、ZNF410）が、Trizol mRNA単離（11A）およびQIAamp RNA Blood Mini Kitアプローチ（11B）後に血漿中で同定され、QIAamp RNA Blood Mini Kitアプローチによる単離後に有意に多くのサンプル（8/15 対 2/15、p=0.05）においてハウスキーピング遺伝子が同定されたことが示されている。同じ3種のハウスキーピング遺伝子および11種のNETバイオマーカー遺伝子の転写物発現レベルを、3名の健常ドナー（正常サンプル）由来の全血から調製したmRNAにおけるPCRによって評価し、サンプル間で高度に相関する遺伝子発現レベルが検出されたことが示されている（図11C）。
【図１２】各遺伝子の平均合算転写物発現（12A）。転写物は、低い変動性：0.04〜0.45（中央値0.12）を示した。全サンプルの平均マーカー遺伝子発現の主成分分析（12B）。数学的アルゴリズム（SVM、LDA、KNNおよびNB）により、時間0、30分、1時間、2時間および4時間で正答コールがなされたことが分かった。不整合なコール率が8〜48時間の間でみられ、これにより凍結前の冷蔵庫保管の最適時間が0〜4時間であることが示された。
【図１３】全血における最も適切なハウスキーピング遺伝子の同定およびALG-9転写物に対する摂食の効果の決定。5名の健常対照において5種のハウスキーピング遺伝子の転写物発現を評価した。ALG-9は、最小の変動性を示すことが同定された（13A）。ALG-9発現を、摂食後の時間の関数として測定し、これにより摂食後に（最大4時間）有意な変化がないことが示された（13B）。
【図１４】血液インタラクトーム（7,000遺伝子、50,000相互作用）にマップされた候補ハウスキーピング遺伝子のトポロジー分析：次数（Degree）（14A）、中継性（Betweeness）（14B）およびクラスタリング（14C）。各カテゴリーにおいて最低値を有する遺伝子には、TXNIP、ACTB、TOX4およびTPT1が含まれた。血液および組織関連ハウスキーピング遺伝子の分析により、正規化プロトコルのための潜在的候補遺伝子が同定された。
【図１５】組織由来または血液由来のいずれかの候補ハウスキーピング遺伝子の関数としてプロットされた生のCT値。最小の変動性の遺伝子には、ALG9、ARF1、ATG4B、RHDAおよびSKP1が含まれた。算術平均およびSDが含まれている。増幅がなかったサンプルに40の値を割り当てた。遺伝子発現がなかったサンプルに40の値を与えた（例えば、MORF4L1を用いて増幅された4個のサンプル）。候補ハウスキーピング遺伝子の分析により、比較的少数（n=6）が低い変動性を示し、正規化プロトコルの構築の候補であることを示した。
【図１６】geNormプログラムを用いて計算された候補ハウスキーピング遺伝子の各々のM値。ALG9は、組織由来遺伝子の中で最も安定性が高かった。10種の血液由来遺伝子のうちの（SERP1を除く）9種がロバストとみなされた。ロバストなマーカー（点線の枠内）。
【図１７】候補ハウスキーピング遺伝子の各々についてプロットされたPCR効率曲線。効率的な増幅は、0.9〜1.0の間でみられる。0.9より低い値は、最適以下のプライマー結合および非効率的な増幅を示す。1.0を超える値は、おそらく特異的なプライマー結合に達さない場合の、過剰増幅を示す。適当な効率を示す遺伝子には、18S、ALG9およびTPT1が含まれた。算術平均±SD、n=3。少数の候補（n=3）が、ハウスキーピング遺伝子としての有効性を示した。
【図１８】ハウスキーピングおよび標的遺伝子の増幅動態における分散。約0.1の値は、類似のPCR効率を示し、そのハウスキーパーを比較CT法において使用できることを示している。ALG9が、正規化プロトコルにおいて許容可能な効率を示す唯一のハウスキーピング遺伝子であった。
【図１９】（ハウスキーピング遺伝子として18S、ALG9およびGAPDHを用いる）geNormプロトコルまたはALG9によるΔΔCTのいずれかを用いる正常サンプルにおける標的遺伝子発現の分散。後者は標的遺伝子の各々について有意に低い変動係数を示し、約60%の遺伝子が正規分布を示した。*p<0.004（マン・ホイットニー検定）。正規化に最適な方法は、ΔΔCTであった。
【図２０】U133AおよびHUGEアレイからの組織関連遺伝子の同定。GEP-NENのPCAは、他の新生物（乳房、結腸、前立腺および肝臓）との比較で、そのトランスクリプトームがクローン病と最も類似することを明らかにした（20A）。他の新生物に関連する転写物発現を差し引くことにより、特異的なGEP-NEN遺伝子シグネチャーが同定された（インタラクトームとしてモデル化 - 20B）。組織アレイへの逆分析は、21種の新規マーカーを同定し、これらは階層的クラスタ分析（20C）および主成分分析（PCA）（20D）の両方により対照とGEP-NENを識別した。SI-NENは、他の癌と異なる転写物スペクトルを示した。これらの腫瘍と対照サンプルを識別することができるNEN特異的遺伝子シグネチャーが同定可能である。
【図２１】血液（21A、D）、「インハウス」（21B、E）および公開データセット（21C、F）における遺伝子発現プロフィール。転写物発現の分析により、GEP-NEN組織および血液の両方に由来するサンプルを対照と識別し得ることが分かった。このことは、これらのコンパートメントの各々が、腫瘍と対照を区別するために測定および使用することができる定義可能なGEP-NEN分子フィンガープリントを含んでいることを示している。
【図２２】転写物の相関プロフィールは血液および組織サンプルにおいて変化する。両方の組織データベースは高度に相関していた（R=0.59、22A）が、血液トランスクリプトームと「インハウス」データセット（R=-0.11、22B）または公開データセット（R=-0.05、22C）のいずれかの間では低い相関が見られた。組織および血液サンプルの両方で同定された共通遺伝子は、候補マーカー転写物のグループを提供し、我々はその後これを血液において試験した。
【図２３】A:末梢血および腫瘍組織サンプル由来のGEP-NENトランスクリプトームにおいて相関するおよび反相関する生物学的プロセス。B & C：腫瘍機能（細胞内シグナル伝達および転写および細胞死の調節）に関連する85種の遺伝子が、組織および血液の両方のサンプルで上方制御されていた。このグループを、評価可能な候補循環血中のバイオマーカーであるとみなした。
【図２４】パラログ数が少ない（0〜3）22種の遺伝子の発現は、すべての他の遺伝子（約6,000種の遺伝子）と比較して、血液インタラクトームにおいて約3倍中心的である。この特定の遺伝子のグループは、いくつかの類縁体と共に、血液に存在し、神経内分泌新生物の潜在的マーカーとみなすことができる。
【図２５】転移性NETを有する患者由来のAO/APC-CD164二重染色全血のFACS。転移性NETを有する患者由来の全血のAO（アクリジンオレンジ）／APC-CD164二重染色後のフローサイトメトリー分析は、NET細胞とサイズの一致する明確な細胞集団を示し（P1、矢印：25A）、これらはNETの特徴的なAO/APC陽性を示した（25B）。この細胞集団を収集し（25C）；抗TPHで免疫染色することにより、これらの細胞がNET細胞であることを確認した（25C - 差し込み図）。
【図２６】全血PCRマーカーレベルとFACS収集された循環血中のNETおよび組織との間の関係。バイオマーカー転写物の全血発現レベルは、FACS分別されたサンプル（循環血中の腫瘍細胞を表す（26A））および組織（26B）と高度に相関し（p<0.0001）、全血がNET転写物の測定に適したコンパートメントであることが確認された。
【図２７】NETを予測する上でのROCならびに感度および特異度。選択された遺伝子（上3つのパネル）および総転写物（V1）（左下）のROCおよびAUCを、実施例5Dに記載されるように行ってYaleサンプル（NETおよび対照）において計算した。BerlinおよびUppsala由来のNETにおいて予測されるカットオフの使用が試験され、感度および特異度を提供する（右下）。
【図２８】血液中の標的遺伝子の再現性研究。マーカー遺伝子ALG9および標的遺伝子FZD7の再現性は、高い相関を示した：R2：0.92〜0.97、p<0.0001（28A〜B）。アッセイ内およびアッセイ間再現性は、正規化されたFDZ7において高く（28C〜D、CV=2.28〜3.95%）；対照と腫瘍サンプルの正規化FZD7の間では差がみられず（28D）、これにより血液測定の有意な再現性が実証された。
【図２９】正常組織とGEP-NEN（処置および未処置）の識別におけるマーカー遺伝子パネルの性能。4つすべての数学的アルゴリズムが、約88%の、類似する性能測定基準（performance metrics）を示した。
【図３０】4つの独立セットの各々における各数学的アルゴリズム（SVM、LDA、KNNおよびベイズ）の正答コール率。マーカーが51種であるパネルは、25種または13種であるパネルサブセットのいずれよりも有意に多い正答コール（20%良い）を示した。マーカー遺伝子の数を増加させると、血液におけるGEP-NEN検出の感度が向上した。算術平均±SEM。*p<0.008 対 13および25パネル（イェーツ値6.8〜14.7；#フィッシャーの両側正確確率検定<0.005）。
【図３１】外科的摘出時の血中PCRマーカーレベルおよびCgAの変化。腫瘍の切除は、術後2週間で測定した場合、実施例5Hに記載されるバイオマーカーパネル（「PCR」）の発現レベルを有意に低下させた（31A）。CgAレベルは様々であった（31B）。水平線=算術平均。n=9名の患者。
【図３２】オクトレオチドLAR療法時の血中PCRマーカーレベルおよびCgAの変化。オクトレオチドLARは、実施例5Hに記載されるバイオマーカーパネル（「PCR」）の血中発現レベルを有意に低下させ；発現は測定期間の間抑制され続けた（32A）。CgAレベルは、6ヶ月で低下する前は様々であった（32B）。*p<0.02 対 治療前。#p=0.06 対1ヶ月。水平線=算術平均。n=8名の患者。
【図３３】冷凍アブレーション後の血中PCRマーカーレベルおよびCgAの変化。実施例5Hに記載される、冷凍アブレーション前およびその後の様々な時点の患者SKにおけるCgAおよび13バイオマーカーパネル（PCR+）の発現レベルであり、バイオマーカー発現の変化が微小転移物の出現と相関している。
【図３４】外科的摘出およびオクトレオチドLAR療法時の血中PCRマーカーレベルおよびCgAの変化。実施例5Hに記載されるように、患者BGにおけるCgAの発現レベルおよびNETバイオマーカーパネルのレベルを、術後2週間およびオクトレオチドLAR後に測定した。
【図３５】完全寛解患者（グループI：完全応答者［CR］、n=12）、外科手術後（n=42、グループII - SD-Sx）または長時間作用型ソマトスタチンアナログ処置後（LAR：n=78、グループIII - SD-LAR）に安定疾患（SD）を示していると臨床的にみなされた患者の全体パーセント正答コール。＊これはパシレオチド；n=1およびエベロリムス：n=4を含む。PCR試験は、処置サンプルに対して90〜100%の間の正答コール率を示した。
【図３６】SVM、LDA、KNNおよびベイズを含む数学的分析は、マーカーが13種であるパネルが約73%の感度で安定疾患と進行疾患の間を識別できることを実証した。
【図３７】対照ならびにGEP-NEN（未処置および処置の両方）血液サンプル（n=130）におけるCgA DAKOレベルの比較。スチューデントt検定（37A）およびノンパラメトリック分析（37B）を用いることで未処置サンプルと処置サンプルの間で違いが確認された。赤色の十字は異常値を表し（37A）、y軸のスケールは、見易くするために対数変換されている（37A、B）。CgAレベルは、正常グループと未処置グループの間で一貫して区別することができるが、処置サンプルに対しては有意な重複がみられる。
【図３８】GEP-NENを正確に検出し処置サンプルと未処置サンプルを識別する上でのCgA ELISAの有用性。（DAKO基準通り）カットオフとして19U/Lを用いた場合、GEP-NENおよび対照の全体パーセント正答コールは70%であり、性能測定基準は、処置患者と比較して未処置患者において良好であった（感度63% 対 45%）。CgAレベルは、未処置患者および疾患を有さない個体（対照）由来のサンプルを最も良く同定した。
【図３９】対照ならびにGEP-NEN（未処置および処置の両方）血液サンプル（n=130）における、循環血中CgA DAKOレベルとPCRベースのアプローチを用いる個々のアルゴリズムの正答コール率の比較。コール率は、CgAの約50%と比較して、PCRベースの試験において有意に高かった（各アルゴリズムで約90〜95%）（図39A）。アルゴリズムにCgA値を含めても正答コール率は向上せず、KNNアルゴリズムでは正答コールが減少した（図39B）。
【図４０】正常対照（黒色の点線：PCRスコア=15、「正常」とコールされたもの）および腸間膜転移を示す症例1（赤色の点線：PCRスコア 68、「未処置腫瘍」とコールされたもの）から得られた血液サンプルのPCRスコア。母集団分布は実線で示されている。これは、アルゴリズムコールとスコア（転写物指数）の間の関係を説明するものである。
【図４１】SI-NEN（n=46）およびPNEN（n=18）のPCAにより、マーカーが51種であるパネルが、膵臓NENと小腸NENの間を識別できることが分かった（41A）。SVM、LDA、KNNおよびベイズを含む様々な数学的アルゴリズムは、これら2つの腫瘍グループが全体的に約92%の感度で識別され得ることを実証した（図41B）。SI-NENのシグネチャーはPNENと異なる。
【図４２】GEP-NEN（n=64）およびGI癌（n=42）のPCAにより、マーカーが51種であるパネルがこれら2つの新生物タイプを識別できることが分かった（図42A）。SVM、LDA、KNNおよびベイズを含む数学的アルゴリズムは、これらの2つの腫瘍タイプが約83%の感度で識別され得ることを実証した（図42B）。GEP-NENのシグネチャーはGI癌と異なる。
【図４３】対照ならびにGEP-NEN（未処置および処置の両方）血液サンプル（n=130）におけるPCRベースのアプローチおよびCgA DAKOレベルの比較。コール率は、GEP-NENの同定または処置サンプルと未処置サンプルの間の識別に関して、PCRベースの試験で有意に高かった。*p<0.0005 対 CgA。#p<0.02 対 CgA。PCR血液試験は、腫瘍を検出し処置患者と非処置患者を識別する上で、CgAレベルの測定よりも正確度が有意に高い。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
詳細な説明
A. 定義
特に定義されていない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語、記号および他の科学用語は、本発明が関与する当業者によって一般に理解される意味を持つことが意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確さのためにおよび/または参照のために本明細書において定義され、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において一般に理解される定義に対する実質的な差異を表すものと解釈されるべきではない。本明細書において記述または参照される技法および手順は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記述の、広く利用されている分子クローニング法など、当業者によって一般に十分理解され、従来法を用いて一般に利用されている。適切であれば、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順が、特に断りのない限り、製造業者が定義するプロトコルおよび/またはパラメータにしたがって一般に行われる。
【００７４】
本明細書において用いられる場合、「GEP-NENバイオマーカー」および「NETバイオマーカー」という用語は、遺伝子産物のような、生体分子を同義的にいい、それ自体に関してのその発現もしくは存在(例えば、発現レベルもしくは発現プロファイル)または1種もしくは複数種の他のバイオマーカーと比較した場合のその発現もしくは存在(例えば、相対発現)は、GEP-NEN疾患の存在、非存在、タイプ、クラス、重症度、転移、位置、病期、予後、関連症状、転帰、リスク、処置反応性の可能性もしくは予後に依って異なり(すなわち、増加または減少し)、またはそのような要因もしくはその予測と正もしくは負の関連を示す。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」または核酸分子という用語は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはどちらかのタイプのヌクレオチドの修飾型のいずれかの、長さが少なくとも10塩基または塩基対のヌクレオチドの重合体型を意味し、DNAの一本鎖型および二本鎖型を含むよう意図される。本明細書において用いられる場合、マイクロアレイ分析においてプローブとして働く本発明の核酸分子または核酸配列は、好ましくは、ヌクレオチドの鎖、より好ましくはDNAおよび/またはRNAを含む。他の態様において、本発明の核酸分子または核酸配列は、例えば、DNA/RNAヘリックス、ペプチド核酸(PNA)、ロックされた核酸(LNA)および/またはリボザイムのような他の種類の核酸構造を含む。ゆえに、本明細書において用いられる場合、「核酸分子」という用語はまた、天然ヌクレオチドと同じ機能を示す非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよび/または非ヌクレオチド構成単位を含む鎖を包含する。
【００７６】
本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも10個のアミノ酸の重合体を意味する。本明細書の全体を通して、アミノ酸の標準的3文字または1文字指定が用いられる。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドとの関連で用いられる、「ハイブリダイズする(hybridize)」、「ハイブリダイズする(hybridizing)」、「ハイブリダイズする(hybridizes)」などの用語は、ハイブリダイゼーションの温度が37℃を上回り、0.1×SSC/0.1% SDS中での洗浄の温度が55℃を上回る、好ましくは50%ホルムアミド/6×SSC/0.1% SDS/100 μg/ml ssDNA中でのハイブリダイゼーションのような、従来のハイブリダイゼーション条件をいうように意図され、最も好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をいうように意図される。
【００７８】
アミノ酸配列比較との関連で、「同一性」という用語は、同じものである、同じ相対位置のアミノ酸残基の割合を表現するために用いられる。同様にこの関連で、「相同性」という用語は、当技術分野において一般に理解されるように、BLAST分析の保存アミノ酸の基準を用いて、同一であるかまたは類似であるかのどちらかの、同じ相対位置のアミノ酸残基の割合を表現するために用いられる。そのような基準の下で保存されていると考えられる、アミノ酸置換に関するさらなる詳細は、以下で提供される。
【００７９】
さらなる定義は、続くサブセクションの全体を通して提供される。
【００８０】
B. GEP-NEN疾患およびバイオマーカー
GEP-NENの診断および予後判定は、一つには、何年間もサイレントなままであることが多い、カルチノイド症候群、下痢、顔面紅潮、発汗、気管支収縮、GI出血、心疾患、間欠的な腹痛のような本疾患の平凡な症状および症候群のせいで、困難であった。利用可能な診断方法には、画像化、例えば、X線胃腸内視鏡検査、腹部コンピュータ断層(CT)、複合型定位放射線治療(combined stereotactic radiosurgery) (SRS)/CTおよびMRIによるような、解剖学的局在性、ならびにいくつかの遺伝子産物の検出が含まれる。既知の方法は、例えば、低い特異性および/もしくは感受性によって、ならびに/または早期疾患を検出する能力において限界がある。単一のバイオマーカーの検出は、例えば、ヒト血液サンプルにおける悪性腫瘍を特定するには、ならびに線維症および転移などの複雑な転帰を予測するには、完全に満足のいくものではなかった。Michiels S, Koscielny S, Hill C, 「Interpretation of microarray data in cancer」, Br J Cancer 2007;96(8): 1155-8を参照されたい。利用可能な方法における限界は、病理学的分類、病期診断および予測、開発中の処置ならびに治療効果のモニタリングにおける障害の一因となっている。本明細書において提供される態様のなかには、これらの限界に対処する方法および組成物がある。
【００８１】
1つの局面において、提供される発明は、例えば、生体サンプルでの、GEP-NENバイオマーカーおよびそのようなバイオマーカーのパネルの検出および特定に関する。提供されるのは、生体サンプル、典型的には血液サンプルでの、バイオマーカーの発現レベルを検出するため、判定するため、およびバイオマーカーを認識するため、またはバイオマーカーに結合するため、ならびにバイオマーカーのパネルの発現プロファイル（シグネチャー）を検出および分析するための、方法および組成物(例えば、ポリヌクレオチドのような、作用物質)である。同様に提供されるのは、提供される方法で用いるための、作用物質のセット(パネル)、システム、およびキットを含めて、作用物質を含有する組成物および組み合わせである。
【００８２】
同様に提供されるのは、1種または複数種のGEP-NENバイオマーカーの発現に基づく、例えば、血液サンプル、培養物、細胞混合物、体液、または他の生体サンプルからの、GEP-NEN細胞、例えば、循環血中GEP-NEN細胞(CNC)の検出、濃縮、単離、および精製のための方法および組成物である。
【００８３】
同様に提供されるのは、GEP-NENおよび関連転帰の予測、分類、および評価のための、例えば、リスク度、処置に対する反応性、転移または侵襲性を予測するための、およびGEP-NENサブタイプを判定するための、モデルおよび生物数理アルゴリズム、例えば、管理学習アルゴリズム、ならびにそれを用いる方法である。
【００８４】
提供される態様を用いたバイオマーカーの検出は、GEP-NEN診断法および予後判定法を改善するために、ならびに処置プロトコルの情報を与えるために有用である。いくつかの局面において、提供される態様によるバイオマーカーおよび/または発現レベルの検出から、GEP-NENの存在、非存在、病期、クラス、位置、サブタイプ、侵襲性、悪性度、転移、予後もしくは他の転帰、またはGEP-NEN細胞、例えば循環血中GEP-NEN細胞(CNC)が確認または示唆される。提供される方法および組成物は、腫瘍局在診断のために、ならびに転移、微小転移および小さな病変を予測もしくは検出するために、ならびに/またはリスク度、再発の可能性、処置反応性もしくは寛解を判定するために、および適切な処置過程の情報を与えるために用いられうる。例えば、バイオマーカーを、例えば、循環血中で検出することを用いて、早期および原発性GEP-NENを検出することができる(例えば、解剖学的局在性のような、別の手法によって以前には「陰性」と考えられていた患者においてGEP-NEN疾患または転移を特定することができる)。
【００８５】
提供される方法および組成物は、患者特有の処置戦略を含めて、処置戦略をデザインするために、実施するために、およびモニタリングするために用いられうる。一例を挙げれば、検出されたGEP-NENバイオマーカー発現レベルは、例えば、わずかな微小転移巣の形態においてさえも、腫瘍の寛解または再発を検出することにより、外科的治療(例えば、腫瘍の除去)、標的内科治療(例えば、腫瘍分泌/増殖の阻害)、および他の治療手法の効果をモニターするための、処置有効性の代用マーカーとして働く。それらの方法は同様に、臨床症状および転帰を評価する際に、ならびにGEP-NENの組織学的悪性度分類および分子学的特徴のために用いられうる。
【００８６】
C. GEP-NENバイオマーカー
GEP-NENバイオマーカー、およびそのパネル(セット)を含む、提供されるバイオマーカー。提供されるGEP-NENバイオマーカーのなかには、転移性腫瘍 対 原発性腫瘍、異なる侵襲性度を有する腫瘍、高リスク腫瘍 対 低リスク腫瘍、反応性腫瘍 対 非反応性腫瘍、病理学的分類および/または特定の処置過程に対する反応の可能性の違いを示す腫瘍において差次的に発現される遺伝子産物のような、GEP-NEN疾患において、および/またはGEP-NENの異なる病期もしくはサブタイプにおいて、または異なるGEP-NEN腫瘍において差次的に発現される、遺伝子産物、例えばDNA、RNA、例えば、転写物、およびタンパク質、ならびにGEP-NEN疾患、病期もしくはタイプの特徴に関係するもの、または神経内分泌細胞もしくは関連した細胞タイプに関係するものがある。
【００８７】
例えば、バイオマーカーは、発現が腫瘍原性、転移もしくはホルモン産生、または原発性もしくは転移性GEP-NENの表現型、例えば接着、遊走、増殖、アポトーシス、転移およびホルモン分泌に関係しているか、または関与している遺伝子産物、ならびに一般に新生物または悪性腫瘍に関係するものを含む。バイオマーカーは同様に、関連する正常組織、例えば神経内分泌細胞、小腸(SI)粘膜、および腸クロム親和性(EC)細胞において発現される遺伝子産物を含む。
【００８８】
バイオマーカーのなかには、ホルモンおよびアミンを含む、GEP-NEN細胞分泌産物、例えば、ガストリン、グレリン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスP、ヒスタミンおよびセロトニン、ならびに腫瘍成長因子-β(TGF-β)および結合組織成長因子(CTGF)のような成長因子があり、これらは循環血中で検出可能である。分泌産物は腫瘍サブタイプおよび起源によって異なりうる。
【００８９】
一例を挙げれば、バイオマーカーは、さまざまなGEP-NENサブタイプ、病期、侵襲性度、または処置反応性の基礎となる調節遺伝子型(すなわち、接着、遊走、増殖、アポトーシス、転移、および/またはホルモン分泌)に関係する遺伝子産物である。
【００９０】
同様にGEP-NENバイオマーカーのなかには、正常小腸粘膜および純粋なEC細胞調製物と比べて原発性GEP-NENおよび肝転移がんにおいて差次的に発現される遺伝子産物がある。Modlin et al., 「Genetic differentiation of appendiceal tumor malignancy: a guide for the perplexed」, Ann Surg 2006;244(1):52-60; Kidd M, et al., 「The role of genetic markers, NAP1L1, MAGE-D2 and MTA1, in defining small intestinal carcinoid neoplasia」, Annals of Surgical Oncology 2006;13:253-62; Kidd M et al., 「Q RT-PCR detection of Chromogranin A: A new standard in the identification of neuroendocrine tumor disease」, Annals of Surgery 2006;243:273-80を参照されたい。
【００９１】
GEP-NENバイオマーカーは、AKAP8L (Aキナーゼ(PRKA)アンカータンパク質8様)、ATP6V1H (ATPase, H+輸送, リソソーム50/57kDa, V1サブユニットH)、BNIP3L (BCL2/アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質3様)、C21orf7 (第21染色体読み取り枠7)、COMMD9 (COMMドメイン含有9)、ENPP4 (エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ4)、FAM13A (配列類似性を有するファミリー13, メンバーA)、FLJ10357 (Rhoグアニンヌクレオチド交換因子40)、GLT8D1 (グリコシルトランスフェラーゼ8ドメイン含有1)、HDAC9 (ヒストンデアセチラーゼ9)、HSF2 (熱ショック転写因子2)、LEO1 (Paf1/RNAポリメラーゼII複合体成分, 相同体(出芽酵母(S. cerevisiae))、MORF4L2 (MORF4L2死亡因子4様2)、NOL3 (核小体タンパク質3 (CARDドメインを有するアポトーシスレプレッサー))、NUDT3 (ヌディックス(nudix) (ヌクレオシド二リン酸結合部分X)型モチーフ3)、OAZ2 (オルニチンデカルボキシラーゼ・アンチザイム2)、PANK2 (パントテン酸キナーゼ2)、PHF21A (PHDフィンガータンパク質21A)、PKD1 (多発性嚢胞腎1 (常染色体優性))、PLD3 (ホスホリパーゼDファミリー, メンバー3)、PQBP1 (ポリグルタミン結合タンパク質1)、RNF41 (ポリグルタミン結合タンパク質1)、RSF1 (リモデリングおよびスペーシング因子1)、RTN2 (レチキュロン2)、SMARCD3 (SWI/SNF 関連、マトリックス結合型、アクチン依存性クロマチン調節因子、サブファミリーd、メンバー3p)、SPATA7 (精子形成関連7)、SST1 (ソマトスタチン受容体1)、SST3 (ソマトスタチン受容体3)、SST4 (ソマトスタチン受容体4)、SST5 (ソマトスタチン受容体5)、TECPR2 (テクトニンβ-プロペラリピート含有2)、TRMT112 (tRNAメチルトランスフェラーゼ11-2相同体(出芽酵母))、VPS13C (液胞タンパク質選別13相同体C (出芽酵母))、WDFY3 (WDリピートおよびFYVEドメイン含有3)、ZFHX3 (亜鉛フィンガーホメオボックス3)、ZXDC (ZXDファミリー亜鉛フィンガーC)、ZZZ3 (亜鉛フィンガー, ZZ型含有3)、アミロイドβ(A4)前駆体様タンパク質2 (APLP2); v-rafマウス肉腫3611ウイルスがん遺伝子相同体(ARAF1); v-rafマウス肉腫ウイルスがん遺伝子相同体B1 (BRAF1); CD59; クロモグラニンA (CgA, 甲状腺分泌タンパク質1とも呼ばれる, CHGA); 結合組織成長因子(CTGF); ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド14 (CXCL14); frizzled相同体7 (FZD7); グルタミン酸受容体, イオンチャネル型, AMPA 2 (GRIA2); ホメオボックスC6 (HOXC6); Ki-67; KiSS-1転移抑制因子(Kiss1); v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子相同体(KRAS); 黒色腫抗原ファミリーD, 2 (MAGE-D2); 転移関連1 (MTA1); ヌクレオソーム集合タンパク質1様1 (NAP1L1); NK2転写因子関連, 遺伝子座3 (例えば、ホモサピエンス(Homo Sapiens) NK2転写因子関連, 遺伝子座3 (ショウジョウバエ(Drosophila))) (NKX2-3); ニューロピリン2 (NRP2); 嗅覚受容体, ファミリー51, サブファミリーE, メンバー1 (OR51E1); 腫瘍随伴性抗原MA2 (PNMA2); タンパク質チロシンホスファターゼ, 受容体型, Nポリペプチド2 (PTPRN2); v-raf-1マウス白血病ウイルスがん遺伝子相同体1 (RAF1); セクレトグラニンV (7B2タンパク質) (SCG5); sparc/オステオネクチン、cwcvおよびkazal様ドメインプロテオグリカン(テスティカン) 1 (SPOCK1); アポトーシス阻害因子サバイビン遺伝子(BIRC5; API4; EPR-1) (サバイビン); トリプトファンヒドロキシラーゼ1 (TPH1), 溶質キャリアファミリー18 (小胞モノアミン), メンバー1 (VMAT1); 溶質キャリアファミリー18 (小胞モノアミン), メンバー2 (VMAT2); およびX2BTB48 (セルピンペプチダーゼ阻害因子, クレイ���A (α-1アンチプロテイナーゼ, アンチトリプシン), メンバー10)を、転写物、mRNA、cDNA、コード配列、タンパク質およびポリペプチドを含む、遺伝子産物、典型的にはヒト遺伝子産物、ならびに天然変種、例えば、対立遺伝子変種、スプライス変種、転写物変種および単一ヌクレオチド多型(SNP)変種を含む、それらのタンパク質およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(核酸)を含めて、含む。例えば、バイオマーカーは、本明細書において開示される配列を持つポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチド、ならびにその天然変種を含む。
【００９２】
GEP-NENバイオマーカーは、CD164をさらに含む。別の局面において、バイオマーカーは、NALP、例えば、カスパーゼ-3活性化アポトーシス遺伝子の産物およびアポトーシスマーカーNALPを含む。
【００９３】
APLP2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトAPLP2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、APLP2バイオマーカーは、(GenBank gi番号214010177にて参照される) SEQ ID NO:1に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号158-2449の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【００９４】
ARAF1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトARAF1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ARAF1バイオマーカーは、(GenBank gi番号283484007にて参照される) SEQ ID NO:2に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:2のヌクレオチド番号195〜2015の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【００９５】
BRAF1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、BRAF1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、BRAF1バイオマーカーは、(GenBank gi番号187608632にて参照される) SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:3のヌクレオチド番号62〜2362の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【００９６】
CD59バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトCD59遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、CD59バイオマーカーは、(GenBank gi番号187829037にて参照される) SEQ ID NO:4に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:4のヌクレオチド番号278〜664の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【００９７】
CgAバイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトCGAまたはCHGA遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、CgAバイオマーカーは、(GenBank gi番号33990769にて参照される) SEQ ID NO:5に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:5のヌクレオチド番号1〜1374の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。ヒトCgAは、神経内分泌細胞の分泌顆粒中に貯蔵される、かつ血漿中で検出できる水溶性酸性糖タンパク質をコードする。
【００９８】
CTGFバイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトCTGF遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、CTGFバイオマーカーは、(GenBank gi番号98986335にて参照される) SEQ ID NO:6に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:6のヌクレオチド番号207〜1256の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【００９９】
CXCL14バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトCXCL14遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、CXCL14バイオマーカーは、(GenBank gi番号208022628にて参照される) SEQ ID NO:7に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号466〜801の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１００】
FZD7バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトFZD7遺伝子産物、例えば、ホモサピエンスfrizzled相同体7 (ショウジョウバエ) (FDZ7)、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、FZD7バイオマーカーは、(GenBank gi番号4503832にて参照される) SEQ ID NO:8に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:8のヌクレオチド番号62〜1786の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１０１】
GRIA2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトGRIA2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、GRIA2バイオマーカーは、(GenBank gi番号134304849にて参照される) SEQ ID NO:9に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:9のヌクレオチド番号460〜3111の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１０２】
ホメオボックスC6 (HOXC6)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトHOXC6遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、HOXC6バイオマーカーは、(GenBank gi番号93141222にて参照される) SEQ ID NO:10に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:10のヌクレオチド番号113〜820の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１０３】
Ki67バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトKi67遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、Ki67バイオマーカーは、(GenBank gi番号225543213にて参照される) SEQ ID NO:11に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:11のヌクレオチド番号196〜9966)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１０４】
Kiss1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトKISS1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、KISS1バイオマーカーは、(GenBank gi番号116829963にて参照される) SEQ ID NO:12に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:12のヌクレオチド番号155〜571の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１０５】
KRASバイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトKRAS遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、KRASバイオマーカーは、(GenBank gi番号34485724にて参照される) SEQ ID NO:13に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:13のヌクレオチド番号182〜751)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１０６】
MAGE-D2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトMAGE-D2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、MAGE-D2バイオマーカーは、(GenBank gi番号29171703にて参照される) SEQ ID NO:14に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:14のヌクレオチド番号100〜1920の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。MAGE-D2は接着関連タンパク質をコードする。
【０１０７】
MTA1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトMTA1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、MTA1バイオマーカーは、(GenBank gi番号115527079にて参照される) SEQ ID NO:15に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:15のヌクレオチド番号188〜2335)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。エストロゲンアンタゴニスト乳がん悪性遺伝子MTAは、乳がん、肝細胞がん、食道がん、胃がん、および結腸直腸がんを含む他の腫瘍における進行性(転移性)疾患を特定するために用いられている。
【０１０８】
NAP1L1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトNAP1L1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、NAP1L1バイオマーカーは、(GenBank gi番号219842231にて参照される) SEQ ID NO:16に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:16のヌクレオチド番号413〜1588の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であるNAP1L1は、クロマチン集合およびDNA複製に関わる核タンパク質をコードする有糸分裂調節遺伝子である。
【０１０９】
NKX2-3バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトNKX2-3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、NKX2-3バイオマーカーは、(GenBank gi番号148746210にて参照される) SEQ ID NO:17に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:17のヌクレオチド番号200〜1294の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１０】
NRP2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトNRP2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、NRP2バイオマーカーは、(GenBank gi番号41872561にて参照される) SEQ ID NO:18に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:18のヌクレオチド番号792〜3587の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１１】
OR51E1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトOR51E1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、OR51E1バイオマーカーは、(GenBank gi番号205277377にて参照される) SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:19のヌクレオチド番号145〜1101の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１２】
PNMA2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPNMA2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PNMA2バイオマーカーは、(GenBank gi番号156766040にて参照される) SEQ ID NO:20に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:20のヌクレオチド番号771〜1865の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１３】
PTPRN2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPTPRN2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PTPRN2バイオマーカーは、(GenBank gi番号194097439にて参照される) SEQ ID NO:21に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:21のヌクレオチド番号122〜3169の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１４】
RAF1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトRAF1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、RAF1バイオマーカーは、(GenBank gi番号189458830にて参照される) SEQ ID NO:22に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:22のヌクレオチド番号416〜2362の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１５】
SCG5バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSCG5遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SCG5バイオマーカーは、(GenBank gi番号221139784にて参照される) SEQ ID NO:23に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:23のヌクレオチド番号118〜756の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１６】
SPOCK1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSPOCK1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SPOCK1バイオマーカーは、(GenBank gi番号82659117にて参照される) SEQ ID NO:24に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:24のヌクレオチド番号152〜1471の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１７】
サバイビンバイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトサバイビン遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、サバイビンバイオマーカーは、(GenBank gi番号59859877にて参照される) SEQ ID NO:25に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:25のヌクレオチド番号122〜550の読み取り枠)またはGenBank gi番号2315862のヌクレオチド番号2811〜2921、3174〜3283、5158〜5275、11955〜12044のタンパク質コード配列(SEQ ID NO:34)を持つポリヌクレオチド、その天然変種、あるいはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１１８】
TPH1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTPH1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TPH1バイオマーカーは、(GenBank gi番号226342925にて参照される) SEQ ID NO:26に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:26のヌクレオチド番号27〜1361の読み取り枠)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。TPH1は、セロトニンの産生に重要な、GI管の腸クロム親和性(EC)細胞によって産生される酵素をコードする。
【０１１９】
VMAT1バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトVMAT1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、VMAT1バイオマーカーは、(GenBank gi番号215272388にて参照される) SEQ ID NO:27に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:27のヌクレオチド番号472〜2049)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２０】
VMAT2バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトVMAT2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、VMAT2バイオマーカーは、(GenBank gi番号141803164にて参照される) SEQ ID NO:28に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:28のヌクレオチド番号32〜1576)、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２１】
X2BTB48バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトセルピンペプチダーゼ阻害因子, クレイドA (α-1アンチプロテイナーゼ, アンチトリプシン), メンバー10)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、X2BTB48バイオマーカーは、(GenBank gi番号154759289にて参照される) SEQ ID NO:29に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:29のヌクレオチド番号467〜1801)、その天然変種、例えばGenBank gi番号154759290にて参照されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:105)もしくはそのコード配列、例えば、ヌクレオチド番号122〜1456のそのコード配列、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、例えばGenBank gi番号7705879にて参照されるアミノ酸配列を持つタンパク質である。
【０１２２】
AKAP8L (Aキナーゼ(PRKA)アンカータンパク質8様)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトAKAP8L遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、AKAP8Lバイオマーカーは、(GenBank gi番号49472840にて参照される) SEQ ID NO:201に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:201のヌクレオチド番号100〜2040のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２３】
ATP6V1H (ATPase, H+輸送, リソソーム50/57kDa, V1サブユニットH)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトATP6V1H遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ATP6V1Hバイオマーカーは、(GenBank gi番号47717103にて参照される) SEQ ID NO:204に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号293〜1744のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２４】
BNIP3L (BCL2/アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質3様)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトBNIP3L遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、BNIP3Lバイオマーカーは、(GenBank gi番号47078259にて参照される) SEQ ID NO:205に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:205のヌクレオチド番号125〜784のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２５】
C21orf7 (第21染色体読み取り枠7)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトC21orf7遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、C21orf7バイオマーカーは、(GenBank gi番号31542267にて参照される) SEQ ID NO:206に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:206のヌクレオチド番号278〜1006のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２６】
COMMD9 (COMMドメイン含有9)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトATP6V1H遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、COMMD9バイオマーカーは、(GenBank gi番号156416006にて参照される) SEQ ID NO:207に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:207のヌクレオチド番号38〜508のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２７】
ENPP4 (エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ4)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトENPP4遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ENPP4バイオマーカーは、(GenBank gi番号194688140にて参照される) SEQ ID NO:208に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:208のヌクレオチド番号260〜1621のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２８】
FAM13A (配列類似性を有するファミリー13, メンバーA)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトFAM13A遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、FAM13Aバイオマーカーは、(GenBank gi番号283806631にて参照される) SEQ ID NO:209に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:209のヌクレオチド番号281〜1126のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１２９】
FLJ10357 (Rhoグアニンヌクレオチド交換因子40)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトARHGEF40遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、FLJ10357バイオマーカーは、(GenBank gi番号50843836にて参照される) SEQ ID NO:210に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:210のヌクレオチド番号30〜4589のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３０】
GLT8D1 (グリコシルトランスフェラーゼ8ドメイン含有1)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトGLT8D1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、GLT8D1バイオマーカーは、(GenBank gi番号58331224にて参照される) SEQ ID NO:211に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:211のヌクレオチド番号852〜1967のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３１】
HDAC9 (ヒストンデアセチラーゼ9)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトHDAC9遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、HDAC9バイオマーカーは、(GenBank gi番号323423043にて参照される) SEQ ID NO:212に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:212のヌクレオチド番号362〜2128のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３２】
HSF2 (熱ショック転写因子2)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトHSF2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、HSF2バイオマーカーは、(GenBank gi番号207113145にて参照される) SEQ ID NO:213に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:213のヌクレオチド番号188〜1798のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３３】
LEO1 (Paf1/RNAポリメラーゼII複合体成分, 相同体(出芽酵母))バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトLEO1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、LEO1バイオマーカーは、(GenBank gi番号37059738にて参照される) SEQ ID NO:215に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:215のヌクレオチド番号17〜2017のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３４】
MORF4L2 (MORF4L2死亡因子4様2)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトMORF4L2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、MORF4L2バイオマーカーは、(GenBank gi番号215490020にて参照される) SEQ ID NO:217に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号505〜1371のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３５】
NOL3 (核小体タンパク質3 (CARDドメインを有するアポトーシスレプレッサー))バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトNOL3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、NOL3バイオマーカーは、(GenBank gi番号297632351にて参照される) SEQ ID NO:218に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号194〜853のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３６】
NUDT3 (ヌディックス(nudix) (ヌクレオシド二リン酸結合部分X)型モチーフ3)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトNUDT3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、NUDT3バイオマーカーは、(GenBank gi番号322302838にて参照される) SEQ ID NO:219に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:219のヌクレオチド番号319〜837のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３７】
OAZ2 (オルニチンデカルボキシラーゼ・アンチザイム2)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトOAZ2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、OAZ2バイオマーカーは、(GenBank gi番号161377456にて参照される) SEQ ID NO:220に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号216〜311および313〜786のそのコード配列、またはその天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３８】
PANK2 (パントテン酸キナーゼ2)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPANK2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PANK2バイオマーカーは、(GenBank gi番号85838514にて参照される) SEQ ID NO:221に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号312〜1151のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１３９】
PHF21A (PHDフィンガータンパク質21A)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPHF21A遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PHF21Aバイオマーカーは、(GenBank gi番号156546893にて参照される) SEQ ID NO:222に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号625〜2667のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４０】
PKD1 (多発性嚢胞腎1 (常染色体優性))バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPKD1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PKD1バイオマーカーは、SEQ ID NO:223に記載のヌクレオチド配列もしくはGenBank gi番号205360961にて参照される配列を持つポリヌクレオチド、またはそのような配列のそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、GenBank gi番号205360961もしくはSEQ ID NO:223のヌクレオチド番号210〜13118もしくはヌクレオチド番号210〜13117のそのコード配列、その天然変種、あるいはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４１】
PLD3 (ホスホリパーゼDファミリー, メンバー3)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPLD3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PLD3バイオマーカーは、(GenBank gi番号166197669にて参照される) SEQ ID NO:224に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:224のヌクレオチド番号399〜1871のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４２】
PQBP1 (ポリグルタミン結合タンパク質1)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトPQBP1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、PQBP1バイオマーカーは、(GenBank gi番号74027246にて参照される) SEQ ID NO:225に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号122〜919のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４３】
RNF41 (ポリグルタミン結合タンパク質1)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトRNF41遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、RNF41バイオマーカーは、(GenBank gi番号338827617にて参照される) SEQ ID NO:227に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:227のヌクレオチド番号320〜1273のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４４】
RSF1 (リモデリングおよびスペーシング因子1)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトRSF1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、RSF1バイオマーカーは、(GenBank gi番号38788332にて参照される) SEQ ID NO:228に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:228のヌクレオチド番号121〜4446のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４５】
RTN2 (レチキュロン2)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトRTN2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、RTN2バイオマーカーは、(GenBank gi番号46255010にて参照される) SEQ ID NO:229に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:229のヌクレオチド番号229〜1866のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４６】
SMARCD3 (SWI/SNF 関連、マトリックス結合型、アクチン依存性クロマチン調節因子、サブファミリーd、メンバー3p)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSMARCD3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SMARCD3バイオマーカーは、(GenBank gi番号51477701にて参照される) SEQ ID NO:232に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号102〜1553のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４７】
SPATA7 (精子形成関連7)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSPATA7遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SPATA7バイオマーカーは、(GenBank gi番号295789142にて参照される) SEQ ID NO:233に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:233のヌクレオチド番号176〜1879のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４８】
SST1 (ソマトスタチン受容体1)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSST1遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SST1バイオマーカーは、(GenBank gi番号33946330にて参照される) SEQ ID NO:234に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:234のヌクレオチド番号618〜1793のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１４９】
SST3 (ソマトスタチン受容体3)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSST3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SST3バイオマーカーは、(GenBank gi番号44890055にて参照される) SEQ ID NO:235に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:235のヌクレオチド番号526〜1782のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５０】
SST4 (ソマトスタチン受容体4)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSST3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SST3バイオマーカーは、(GenBank gi番号149944553にて参照される) SEQ ID NO:236に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号65〜1231のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５１】
SST5 (ソマトスタチン受容体5)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSST3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SST3バイオマーカーは、(GenBank gi番号289547751にて参照される) SEQ ID NO:237に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号89〜1183のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５２】
TECPR2 (テクトニンβ-プロペラリピート含有2)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTECPR2遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TECPR2バイオマーカーは、(GenBank gi番号289547516にて参照される) SEQ ID NO:238に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:238のヌクレオチド番号227〜4030のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５３】
TRMT112 (tRNAメチルトランスフェラーゼ11-2相同体(出芽酵母))バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTRMT112遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TRMT112バイオマーカーは、(GenBank gi番号7705476にて参照される) SEQ ID NO:241に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:241のヌクレオチド番号36〜413のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５４】
VPS13C (液胞タンパク質選別13相同体C (出芽酵母))バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトVPS13C遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、VPS13Cバイオマーカーは、(GenBank gi番号308081495にて参照される) SEQ ID NO:242に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号92〜10978のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５５】
WDFY3 (WDリピートおよびFYVEドメイン含有3)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトWDFY3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、WDFY3バイオマーカーは、SEQ ID NO:243に記載のヌクレオチド配列もしくはGenBank gi番号195972885にて参照される配列を持つポリヌクレオチド、またはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:243もしくはGenBank gi番号195972885のヌクレオチド番号409〜10988のコード配列、その天然変種、あるいはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５６】
ZFHX3 (亜鉛フィンガーホメオボックス3)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトZFHX3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ZFHX3バイオマーカーは、(GenBank gi番号258613986にて参照される) SEQ ID NO:244に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:244のヌクレオチド番号130〜8499のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５７】
ZXDC (ZXDファミリー亜鉛フィンガーC)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトZXDC遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ZXDCバイオマーカーは、(GenBank gi番号217035098にて参照される) SEQ ID NO:245に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:245のヌクレオチド番号55〜2187のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５８】
ZZZ3 (亜鉛フィンガー, ZZ型含有3)バイオマーカーは、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトZZZ3遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ZZZ3バイオマーカーは、(GenBank gi番号141803158にて参照される) SEQ ID NO:246に記載のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのタンパク質コード部分を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:246のヌクレオチド番号477〜3188のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１５９】
いくつかの局面において、提供される方法および組成物はGEP-NENバイオマーカーを検出する; いくつかの例において、提供される方法および組成物は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種またはそれ以上のバイオマーカーのような、2種またはそれ以上のGEP-NENバイオマーカーを含む、GEP-NENバイオマーカーのパネルを検出する。
【０１６０】
例えば、提供されるのは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくは51種の、および/または全種の以下のセットのバイオマーカーを検出する方法および組成物である。
2014512172.tif 000022
【０１６１】
同様に提供されるのは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28もしくは29種の、以下のセットのバイオマーカーを検出する方法および組成物である。
2014512172.tif 000023
【０１６２】
いくつかの局面において、パネルはCD164をさらに含む。
【０１６３】
いくつかの局面において、パネルはNALPまたは他の既知のバイオマーカーをさらに含む。
【０１６４】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのパネルは、「ハウスキーピング」遺伝子または参照遺伝子、例えば、発現の差異が既知である遺伝子、あるいは発現の差異が、分析される変量の差異と、例えば、GEP-NENもしくは他の新生物疾患の存在もしくは非存在、さまざまなGEP-NENサブタイプの識別、転移、粘膜組織もしくは他の組織のタイプ、予後指標、および/または他の表現型、予測もしくは転帰と相関するものと予想されない遺伝子と特異的にハイブリダイズできる1種または複数種のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの局面において、そのようなハウスキーピング遺伝子の発現レベルが、さまざまなサンプルにわたりGEP-NENバイオマーカーについて得られた発現データを正規化するためなどの、全体的な発現レベルの標準物質として検出され使用される。
【０１６５】
ハウスキーピング遺伝子は当技術分野において周知である。典型的には、ハウスキーピング遺伝子は、ALG9、TFCP2およびZNF410のような、GEP-NENサンプルを分析するのに特に適していると特徴付けられた1種または複数種の遺伝子を含む。Kidd M, et al.,「GeneChip, geNorm and Gastrointestinal tumors: novel reference genes for real-time PCR.」Physiol Genomics 2007;30:363-70を参照されたい。他のハウスキーピング遺伝子およびポリヌクレオチドは、当技術分野において周知であり、グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)および18S RNAを含む。
【０１６６】
ALG9ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトALG9 (アスパラギン結合グリコシル化9, α-1,2-マンノシルトランスフェラーゼ相同体)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ALG9ハウスキーパーは、SEQ ID NO:35に記載され、かつGenBank gi番号: 118026920にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはSEQ ID NO:35のヌクレオチド番号100〜1956のそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１６７】
TFCP2ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTFCP2 (転写因子CP2)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TFCP2ハウスキーパーは、SEQ ID NO:36に記載され、かつGenBank gi番号291219872にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはSEQ ID NO:36のヌクレオチド番号722〜2230のそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１６８】
ZNF410ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトZNF410 (亜鉛フィンガータンパク質410)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ZNF410ハウスキーパーは、SEQ ID NO:37に記載され、かつGenBank gi番号10863994にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはSEQ ID NO:37のヌクレオチド番号183〜1619のそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１６９】
GAPDHハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトGAPDH (グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、GAPDHハウスキーパーは、SEQ ID NO:38に記載され、かつGenBank gi番号83641890にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはSEQ ID NO:38のヌクレオチド番号103〜1110のそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７０】
18Sハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒト18S (真核生物18S rRNA)、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、18Sハウスキーパーは、SEQ ID NO:39に記載され、かつGenBank gi番号36162にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドまたはその天然変種である。
【０１７１】
HPRTハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトHPRT遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、HPRTハウスキーパーは、SEQ ID NO:40に記載され、かつGenBank gi番号164518913にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはSEQ ID NO:40のヌクレオチド番号168〜824のそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７２】
SLC25A3ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSLC25A3 (溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアキャリア; リン酸キャリア), メンバー3)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SLC25A3ハウスキーパーは、SEQ ID NO:247に記載され、かつGenBank gi番号:223718119にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:247のヌクレオチド番号121〜1209のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７３】
VAPAハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトVAPA ((小胞会合膜タンパク質)会合タンパク質A)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、VAPAハウスキーパーは、SEQ ID NO:248に記載され、かつGenBank gi番号:94721249にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:248のヌクレオチド番号300〜1184のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７４】
TXNIPハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTXNIP (チオレドキシン相互作用タンパク質)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TXNIPハウスキーパーは、SEQ ID NO:249に記載され、かつGenBank gi番号:171184420にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:249のヌクレオチド番号342〜1517のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７５】
ADD3ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトADD3 (アデュシン3 (γ))遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ADD3ハウスキーパーは、SEQ ID NO:250に記載され、かつGenBank gi番号:62912451にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:250のヌクレオチド番号377〜2497のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７６】
DAZAP2ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトDAZAP2 (DAZ結合タンパク質2)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、DAZAP2ハウスキーパーは、SEQ ID NO:251に記載され、かつGenBank gi番号:211904132にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号185〜691のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７７】
ACTG1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトACTG1 (アクチン, γ1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ACTG1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:252に記載され、かつGenBank gi番号:316659408にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:252のヌクレオチド番号259〜1386のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７８】
ACTBハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトACTB (アクチン, β)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ACTBハウスキーパーは、SEQ ID NO:200に記載され、かつGenBank gi番号:168480144にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:200のヌクレオチド番号85〜1212のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１７９】
ATG4Bハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトACG4B (自己貪食関連4相同体B (出芽酵母))遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ACTG4Bハウスキーパーは、SEQ ID NO:203に記載されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:203のヌクレオチド番号104〜1285のそのコード配列、またはGenBank gi番号:47132610にて参照される配列、その天然変種、あるいはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８０】
ARF1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトARF1 (ADPリボシル化因子1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、ARF1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:202に記載され、かつGenBank gi番号:66879659にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド残基番号229〜774のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８１】
HUWE1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトHUWE1 (HECT、UBAおよびWWEドメイン含有1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、HUWE1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:214に記載され、かつGenBank gi番号:195963314にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号403〜13527のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８２】
MORF4L1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトMORF4L1 (死亡因子4様1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、MORF4L1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:216に記載され、かつGenBank gi番号:45643136にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号189〜1160のコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８３】
RHOAハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトRHOA (ras相同体遺伝子ファミリー, メンバーA)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、RHOAハウスキーパーは、SEQ ID NO:226に記載され、かつGenBank gi番号:50593005にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号277〜858のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８４】
SERP1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSERP1 (ストレス関連小胞体タンパク質1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SERP1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:230に記載され、かつGenBank gi番号:109809760にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号507〜707のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８５】
SKP1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトSKP1 (S期キナーゼ関連タンパク質1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、SKP1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:231に記載され、かつGenBank gi番号:160420325にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号180〜662のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８６】
TOX4ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTOX4 (TOX高可動性グループボックスファミリーメンバー4)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TOX4ハウスキーパーは、SEQ ID NO:239に記載され、かつGenBank gi番号:99077116にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号104〜1969のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８７】
TPT1ハウスキーピング遺伝子は、天然変種、例えば対立遺伝子変種を含む、ヒトTPT1 (翻訳時に制御される腫瘍タンパク質1)遺伝子産物、ならびにその相同体および類似体を含む。一例を挙げれば、TPT1ハウスキーパーは、SEQ ID NO:240に記載され、かつGenBank gi番号:141801911にて参照されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドもしくはそのコード領域を含有するポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド番号94〜612のそのコード配列、その天然変種、またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。
【０１８８】
D. GEP-NENバイオマーカー、腫瘍および細胞を検出するための方法および作用物質
同様に提供されるのは、GEP-NENバイオマーカーの検出のための、ならびにGEP-NENバイオマーカーを発現する腫瘍および細胞を特定、単離および濃縮するための方法、組成物およびシステムである。例えば、提供されるのは、GEP-NENバイオマーカーを検出するための作用物質、作用物質のセットおよびシステム、ならびに診断用途および予後判定用途を含む、その使用のための方法である。
【０１８９】
1. バイオマーカーを検出するための作用物質およびシステム
1つの態様において、作用物質は、GEP-NENバイオマーカーに特異的に結合するか、またはGEP-NENバイオマーカーと特異的にハイブリダイズする、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは他の分子である。作用物質には、mRNAのような、ポリヌクレオチドバイオマーカーと同一性もしくは相補性を持つ、プローブおよびプライマー、例えばセンスおよびアンチセンスPCRプライマーのような、ポリヌクレオチド、ならびにそのようなバイオマーカーに特異的に結合する、抗体のような、タンパク質が含まれる。バイオマーカーのパネルと特異的にハイブリダイズする、またはバイオマーカーのパネルに特異的に結合する作用物質のような、作用物質を含有するセットおよびキットも提供される。
【０１９０】
したがって、本明細書において提供されるシステム、例えば、マイクロアレイ、ポリヌクレオチドのセット、およびキットには、長さが典型的には、15塩基から数キロ塩基まで、例えば20塩基から1キロ塩基まで、40塩基から100塩基まで、および50ヌクレオチドから80ヌクレオチドまでまたは20ヌクレオチドから80ヌクレオチドまで変化する、プライマーおよびプローブのような、核酸分子、典型的にはDNAオリゴヌクレオチドを有するものが含まれる。1つの局面において、ヌクレオチドマイクロアレイ、キットまたは他のシステムの大部分の(すなわち少なくとも60%の)核酸分子が、GEP-NENバイオマーカーとハイブリダイズすることができる。
【０１９１】
1つの例において、バイオマーカーと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有するシステム、例えば、核酸マイクロアレイが、提供される方法にしたがって発現レベルの変化を検出および測定するために、ならびにバイオマーカーの発現プロファイルを判定するために提供される。そのようなシステム、例えば、マイクロアレイのなかには、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種またはそれ以上のバイオマーカーと、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくは51種の、および/または全種の以下のセットのバイオマーカーとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含むものである。
2014512172.tif 000024
;
または
2014512172.tif 000025
の; もしくはバイオマーカーAPLP2、ARAF1、BRAF1、CD59、KRAS、RAF1、CXCL14、GRIA2、HOXC6、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCK1およびX2BTB48の; もしくはバイオマーカーCXCL14、GRIA2、HOXC6、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCK1およびX2BTB48の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28もしくは29種。
【０１９２】
いくつかの局面において、システム、例えば、マイクロアレイの核酸分子の、少なくとも60%、もしくは少なくとも70%、少なくとも80%、またはそれ以上が、バイオマーカーのパネル中のバイオマーカーとハイブリダイズすることができる。1つの例において、そのようなヌクレオチドマイクロアレイ上に固定されたプローブは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくは51種またはそれ以上のバイオマーカーのような、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種またはそれ以上のバイオマーカーとハイブリダイズすることができる少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくは51種またはそれ以上の核酸分子のような、少なくとも2種の、および典型的には少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95もしくは100種またはそれ以上のバイオマーカーを含み、ここで核酸分子の各々が、異なる1種のバイオマーカーと特異的にハイブリダイズすることができ、したがって、少なくともその多くの異なるバイオマーカーが結合されうる。
【０１９３】
1つの例において、マイクロアレイ上のまたはポリヌクレオチドのセット中の40%または多くても40%の核酸分子のような残りの核酸分子は、例えば、全体のバイアスを減らすための正規化を行うために、参照遺伝子のセットまたは正規化用遺伝子のセット(ハウスキーピング遺伝子のような)とハイブリダイズすることができる。全体のバイアスは、例えばアレイの製造、染色およびスキャニングの不一致に起因しうる、全体的性能でのアレイ間の差異によるバラツキ、ならびに例えば純度のバラツキに起因しうる、標識RNAサンプル間のバラツキをもたらす。マイクロアレイ実験におけるサンプルの取り扱いの間に、全体的バイアスが生じうる。全体のバイアスを減らすために、判定されたRNAレベルがバックグラウンドの非特異的なハイブリダイゼーションについて補正され、正規化されることが好ましい。
【０１９４】
そのような参照プローブの使用は有利であるが、しかし強制的ではない。1つの態様において、少なくとも90%の核酸配列がGEP-NENバイオマーカーとハイブリダイズできる、ポリヌクレオチドのセットまたはシステム、例えば、マイクロアレイが提供される; さらなる態様には、少なくとも95%または場合により100%のポリヌクレオチドがバイオマーカーとハイブリダイズする、そのようなシステムおよびセットが含まれる。
【０１９５】
実施例において開示されるのは、PCRプライマーのような、例示となる適当なポリヌクレオチドである。バイオマーカーのさまざまな領域とハイブリダイズすることができる、他の核酸プローブおよびプライマーも、当然ながら、提供されるシステム、キットおよび方法に関連して用いるのに適している。
【０１９６】
2. バイオマーカーの検出
同様に提供されるのは、バイオマーカーの発現レベルまたは発現プロファイルのような、存在、非存在、量または相対量を検出することを含めて、バイオマーカーを検出および定量化するための方法である。典型的には、その方法は、核酸に基づく方法、例えば、バイオマーカーmRNA発現の存在、量または発現レベルを測定することである。そのような方法は、典型的には、例えば、サンプル中の核酸バイオマーカー(例えば、mRNA)の発現レベルを定量化するために、試験サンプルならびに正常および参照サンプルのような、生体サンプルにポリヌクレオチド作用物質を接触させることによって行われる。
【０１９７】
提供される態様によるバイオマーカーの検出および分析は、当技術分野において公知の任意の適当な方法で行うことができる。例えば、バイオマーカーがRNAバイオマーカーである場合、RNA検出および定量化の方法が用いられる。
【０１９８】
核酸発現レベル、例えば、mRNA発現を定量化または検出するための例示的な方法は、周知であり、ノザンブロッティングおよびインサイチュー・ハイブリダイゼーション法(Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283, 1999); RNAse保護アッセイ法(Hod, Biotechniques 13:852-854, 1992); ならびに定量的または半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法(Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264, 1992)を含み、配列決定に基づく遺伝子発現分析のための代表的な方法は、遺伝子発現の連続分析(SAGE)、および大規模並列シグナチャー配列決定(MPSS)による遺伝子発現分析を含む。
【０１９９】
それゆえ、1つの態様において、バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの発現は、RNA発現を含む; この方法は、患者のサンプルから得られるおよび/または患者のサンプル中に存在するRNAのような、バイオマーカーのRNAのレベルを判定する段階、ならびにバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルについて判定されたRNA発現レベルに基づいて分析、診断または予測判定を行う段階を含む。
【０２００】
RNAサンプルは、当業者に公知であるように、多くの方法で加工処理することができる。専売の製剤TRIZOL(登録商標)試薬を用いて行われうる、チオシアン酸グアニジン-フェノール-クロロホルム抽出を含めて、サンプルからのRNAの単離については、いくつかの方法が周知である(Chomczynski P, Sacchi N (2006). 「The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on」. Nat Protoc 1 (2): 581-5を参照のこと)。この方法において、TRIZOL(登録商標)は、RNAおよびDNAを抽出するために用いられる; クロロホルムおよび遠心分離を用いて、他の核酸からRNAを分離し、その後、RNAサンプルの精製のためにエタノールによる一連の洗浄を行う。
【０２０１】
RNAサンプルは細胞または組織から、収集時に新たに調製することができる; あるいは、RNAサンプルは、サンプル調製のために加工処理されるまで-70℃で貯蔵されたサンプルから調製されてもよい。あるいは、組織または細胞サンプルは、例えばホルマリンまたは類似の作用物質による固定化; ならびにRNAsin(登録商標) (Pharmingen)またはRNasecure(登録商標) (Ambion)のようなRNase阻害剤とのインキュベーション; RNAlater(登録商標) (Assuragen)、Hepes-グルタミン酸緩衝液を介した有機溶媒保護効果(HOPE)およびRCL2 (Alphelys)のような水溶液; およびUniversal Molecular Fixative (Sakura Finetek USA Inc.)のような非水溶液を含む、RNAの質を保存するための当技術分野において公知の他の条件の下で貯蔵され、および/またはその条件に供されてもよい。カオトロピック核酸単離溶解緩衝液(Boom method, Boom et al. J Clin Microbiol. 1990; 28:495-503)がRNA単離のために用いられてもよい。
【０２０２】
1つの態様において、RNAは、サンプルをTRIZOL(登録商標)とインキュベートすること、引き続きRNA精製によって白血球層から単離される。RNAをピロ炭酸ジエチル水に溶解し、分光学的に測定し、アリコットをBioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)にて分析し、RNAの質を評価する(Kidd M, et al. 「The role of genetic markers- NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1- in defining small-intestinal carcinoid neoplasia」, Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62)。別の態様において、RNAはQIAamp RNA Blood Mini Kitを用いて血漿から単離される; 場合によっては、この方法は、TRIZOL(登録商標)手法と比べて血漿由来のさらに著しく多くのハウスキーピング遺伝子の、リアルタイムPCRでのさらに良好な検出を可能にする。別の態様において、RNAは、例えば、同じようにQIAamp RNA Blood Mini Kitを用いて、全血から直接単離される。
【０２０３】
RNA供給源としての、固定された、パラフィン包埋組織からRNAを単離するための方法は、周知であり、一般的に、mRNA単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む(例えば: T. E. Godfrey et al,. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001])。1つの例において、RNAはQIAamp RNA Blood Mini Kit RNAを用いて血液サンプルのようなサンプルから抽出される。典型的には、RNAは組織から抽出され、その後にタンパク質およびDNAの除去ならびにRNA濃度の分析を行う。RT-PCR用のRNAの逆転写のための段階のような、RNA修復および/または増幅段階が含まれてもよい。
【０２０４】
RNAバイオマーカーの発現レベルまたは量は、当技術分野において公知の任意の方法により、例えば、ハウスキーピング遺伝子に関してまたは同時に測定された他の遺伝子のRNAレベルに関してRNA発現を定量化することにより、判定または定量化されうる。遺伝子のRNAレベルを判定するための方法は、当業者に公知であり、ノザンブロッティング、(定量的)PCRおよびマイクロアレイ分析を含むが、これらに限定されることはない。
【０２０５】
ノザンブロッティングは、ゲル電気泳動によるRNAの分離の後に、RNAと特異的に相互作用する標識プローブをハイブリダイズさせることにより、特異的なバイオマーカー遺伝子または遺伝子産物のRNAの定量化のために行われうる。プローブは、例えば、放射性同位体または化学発光基質で標識化される。核酸発現産物と相互作用した標識プローブの定量化は、発現のレベルを判定するための尺度となる。判定された発現レベルは、例えば内部または外部キャリブレータを用いて、サンプル間で発現レベルが異ならないことが知られている遺伝子の発現のレベルを比較することにより、または発現レベルを判定する前に既知量のRNAを添加することにより、2つの別個のサンプル間の核酸発現産物の総量の差異について正規化することができる。
【０２０６】
RT-PCRの場合、バイオマーカーRNAはcDNAに逆転写される。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、例えば、関心対象のRNA配列とハイブリダイズする特異的プライマーおよび逆転写酵素を用いて行われる。さらに、RT-PCRは、例えば、RNAに沿って無作為にハイブリダイズするランダムヘキサマーもしくはデカマーのようなランダムプライマー、またはmRNAのポリ(A)尾部とハイブリダイズするオリゴd(T)、および逆転写酵素で行うことができる。
【０２０７】
いくつかの態様において、GEP-NENまたは随伴症状もしくは症候群を患っている、あるいはGEP-NENまたは随伴症状もしくは症候群を患っていることが疑われる患者由来のものなどの、サンプル中のバイオマーカーのRNA発現レベルは、リアルタイムrt-PCR (qPCR)またはマイクロアレイ分析によるような、定量的方法を用いて判定される。いくつかの態様において、核酸の発現のレベルを定量化するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(QPCR)が用いられる。1つの局面において、例えば、異なるサンプル集団中のバイオマーカーRNA、例えば、mRNA、または他の発現産物のレベルを比較するために、遺伝子発現のパターンを特徴付けるために、密接に関係したmRNAを区別するために、およびRNA構造を分析するために、RT-PCR、GeneChip分析、定量的リアルタイムPCR (Q RT-PCR)、またはカルチノイド組織マイクロアレイ(TMA)免疫染色/定量化を用いてバイオマーカーの発現レベルの検出および判定が行われる。
【０２０８】
1つの例において、QPCRは、増幅反応の間に産物の量をモニターするリアルタイムPCR (RTPCR)を用いて、または最終産物の量を判定する終点測定によって行われる。当業者に公知であるように、rtPCRは、例えば、生成された全ての二本鎖産物と相互作用して増幅中の蛍光の増大をもたらす、例えば臭化エチジウムもしくはSYBR(登録商標) Green I色素のような、核酸インターカレータの使用によって、または例えば、関心対象の遺伝子の、生成された二本鎖産物と特異的に反応する標識プローブの使用によって行われる。使用できる代替的な検出方法は、数ある中でも、デンドリマーシグナル増幅、ハイブリダイゼーションシグナル増幅、および分子標識によって提供される。
【０２０９】
1つの態様において、総RNAに対する逆転写は、High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems (ABI), Foster City, CA)を用い、製造業者の薦めるプロトコルにしたがって(手短に言えば、水50マイクロリットル中、2マイクログラムの総RNAを用い、逆転写緩衝液(Reverse Transcription Buffer)、デオキシヌクレオチド三リン酸溶液、ランダムプライマーおよびMultiscribe逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を含有する2×RTミックス50 uLと混合して)行われる。RT反応条件は周知である。1つの例において、RT反応は、以下のサーマルサイクラー条件を用いて行われる: 10分、25℃; 120分、37℃ (Kidd M, et al., 「The role of genetic markers- NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1- in defining small-intestinal carcinoid neoplasia」, Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62を参照のこと)。
【０２１０】
個々の転写物レベルの測定の場合、1つの態様において、Assays-on-Demand (商標)製品を製造業者の提案にしたがってABI 7900 Sequence Detection Systemで用いる(Kidd M, Eick G, Shapiro MD, et al. Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors. Cancer 2005;103(2):229-36を参照のこと)。1つの例において、サイクリングは標準条件下で、TaqMan(登録商標) Universal PCR Master Mix Protocolを用い、384ウェル光学反応プレート中にて、cDNAを水7.2 uL、20・Assays-on-Demandプライマーおよびプローブミックス0.8 uLならびに2×TaqMan Universal Masterミックス8 uL中で混合することにより、以下の条件下で行われる: 50℃、2分; 95℃; 10分; 15分間95℃、1分間60℃で50サイクル(Kidd M, et al., 「The role of genetic markers- NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1- in defining small-intestinal carcinoid neoplasia」, Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62を参照のこと)。
【０２１１】
典型的には、リアルタイムPCRからの結果は、内部標準物質を用いておよび/またはハウスキーピング遺伝子に対する発現レベルとの比較によって正規化される。例えば、1つの態様において、上記のQPCRからの未加工のΔCT (デルタCT = 増幅に応じてのサイクル時間の変化)データは、geNormのような、周知の方法を用いて正規化される(Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 2002;3(7):RESEARCH0034を参照のこと)。ハウスキーピング遺伝子の発現レベルによる正規化も周知である。Kidd M, et al., 「GeneChip, geNorm, and gastrointestinal tumors: novel reference genes for real-time PCR」, Physiol Genomics 2007;30(3):363-70を参照されたい。
【０２１２】
マイクロアレイ分析は、表面上に固定化されている選択された核酸分子の使用を伴う。プローブと呼ばれるこれらの核酸分子は、核酸発現産物とハイブリダイズすることができる。好ましい態様において、プローブは、標識されたサンプル核酸に曝露され、ハイブリダイズされ、洗浄され、プローブと相補的であるサンプル中の核酸発現産物の(相対)量が判定される。マイクロアレイ分析は、多数の遺伝子の核酸発現レベルの同時判定を可能にする。本発明による方法において、本発明による少なくとも5種の遺伝子が同時に測定されることが好ましい。
【０２１３】
バックグラウンドの補正は、例えば、バックグラウンドの減算後の負の強度値を回避する「オフセット」法によって行うことができる。さらに、各単一のアレイの2つのチャネルを、例えば、包括的loess正規化、およびアレイ全体で同じ平均絶対偏差(MAD)を持つように対数比がスケール変更されることを確実にするスケール正規化を用いて比較可能にするために、正規化を行うことができる。
【０２１４】
タンパク質レベルは、例えば、抗体に基づく結合アッセイ法を用いて測定されうる。酵素標識、放射性標識または蛍光標識抗体がタンパク質の検出のために使用されうる。例示的なアッセイ法は、酵素免疫アッセイ法(ELISA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、ウエスタンブロットアッセイ法および免疫組織化学的染色アッセイ法を含む。あるいは、多数のタンパク質の発現レベルを同時に判定するために、抗体アレイのようなタンパク質アレイが用いられる。
【０２１５】
典型的には、バイオマーカーおよびハウスキーピングマーカーは、生体サンプル、例えば組織もしくは液体サンプル、例えば血液、例えば全血、血漿、血清、糞便、尿、唾液、涙液、血清もしくは精液サンプル、またはそのような組織もしくは液体から調製されたサンプル、例えば、血液、唾液もしくは組織、例えば、腸粘膜、腫瘍組織、ならびに肝臓、骨および血液のような、GEP-NEN転移がんもしくは脱落した腫瘍細胞を含有しているおよび/もしくは含有していることが疑われる組織由来の細胞を含む、細胞調製物において検出される。1つの態様において、特異的な細胞調製物は、粘膜、例えば、腸粘膜、血液または白血球層サンプルのような、組織または液体由来の細胞懸濁液または液体の蛍光活性化細胞選別(FACS)によって得られる。
【０２１６】
いくつかの態様において、サンプルは、GEP-NEN患者、GEP-NENを有することが疑われる患者、全体としてがんを抱えているおよび/もしくは有することが疑われる患者、1つもしくは複数のGEP-NEN症状もしくは症候群を示しているまたはGEP-NENのリスクがあると判定されている患者、あるいは、疾患が寛解期にあるおよび/もしくは寛解期にあるものと考えられる患者を含め、処置を受けているまたは処置の完了しているGEP-NEN患者から採取される。
【０２１７】
他の態様において、サンプルは、健常個体、あるいは異なるタイプのがん、例えば腺がん、例えば、胃腸腺がん、または乳がん、前立腺がんもしくは膵がん、または胃がんもしくは肝がん、例えば食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、結腸がんもしくは直腸がんの1つを有する個体のような、GEP-NEN疾患を有していないヒトから採取される。
【０２１８】
いくつかの例において、本方法およびシステムは、GEP-NENと、胃腸腺がん、または乳がん、前立腺がんもしくは膵がん、または胃がんもしくは肝がん、例えば食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、結腸がんもしくは直腸がんの1つを含む、腺がんのような、他のがんとを区別する。他の態様において、本方法およびシステムは、小腸のGEP-NENと膵臓のGEP-NENとの間でなど、異なる部位のGEP-NENを識別する。そのような態様は、例えば、不明である腫瘍の原発部位を判定するのに、および予後を判定するのに(とりわけGEP-NEN腫瘍は出現部位に依って顕著に異なる予後を示しうるので)有用である。いくつかの態様において、本方法およびシステムは、少なくとも80、85、90、91、92またはそれ以上の精度で、異なる部位、例えば、膵臓腫瘍および小腸腫瘍のGEP-NENを識別する。他の態様において、本方法は、神経内分泌成分を有する腺がんを診断または検出することができる。
【０２１９】
いくつかの態様において、サンプルは、GEP-NEN腫瘍または転移がんから採取される。他の態様において、サンプルは、GEP-NEN患者から、しかしGEP-NENまたはGEP-NEN細胞を含有するものと予想されない組織または液体から採取される; そのようなサンプルは参照または正常サンプルとして用いられうる。あるいは、正常または参照サンプルは、GEP-NEN疾患を有していない患者由来の組織もしくは液体または他の生体サンプル、例えば対応する組織、液体もしくは他のサンプル、例えば正常血液サンプル、正常小腸(SI)粘膜サンプル、正常腸クロム親和性(EC)細胞調製物であってよい。
【０２２０】
いくつかの態様において、サンプルは、全血サンプルである。神経内分泌腫瘍は転移する場合、典型的には、血液中へ細胞を脱落させる。したがって、血漿および血液サンプル中での本明細書において提供されるGEP-NENバイオマーカーのパネルの検出は、初期時点でのGEP-NENの特定のために、ならびに、例えば、たとえ解剖学的局在性試験が陰性であっても、腫瘍転移の存在を予測するために使用されうる。したがって、提供される作用物質および方法は、早期診断に有用である。
【０２２１】
したがって、いくつかの態様において、本方法は、全血1 mLまたは約1 mL中でGEP-NEN分子シグネチャーまたは発現プロファイルを特定することができる。いくつかの局面において、分子シグネチャーまたは発現プロファイルは、凍結の前に最大で4時間安定である(例えば、サンプルが静脈切開術の後に4〜8℃で冷蔵される場合)。1つの局面において、腫瘍組織から得られたサンプルを用いて所与のGEP-NENに関連した転帰を診断する、予後判定するまたは予測することができる手法は、血液サンプルを用いて同じ診断、予後判定または予測をすることもできる。
【０２２２】
いくつかの既存の検出および診断方法では、可能性のある肯定的な結果を生じるのに7〜10日を要し、費用がかかりうる。したがって、1つの局面において、提供される方法および組成物は、簡潔さを改善する際、およびGEP-NEN診断に関連した費用を低減する際に有用であり、早期の診断を実現可能にする。
【０２２３】
したがって1つの例において、バイオマーカーは循環血中で、例えば、血液サンプル、例えば血清、血漿、白血球層から得られる、細胞、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)、または全血サンプルにおける検出によって、検出される。
【０２２４】
腫瘍特異的な転写物がいくつかのがんにおいて全血中で検出されている。Sieuwerts AM, et al., 「Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR」, Breast Cancer Res Treat 2009;118(3):455-68およびMimori K, et al., 「A large-scale study of MT1-MMP as a marker for isolated tumor cells in peripheral blood and bone marrow in gastric cancer cases」, Ann Surg Oncol 2008;15(10):2934-42を参照されたい。
【０２２５】
CellSearch(商標) CTC Test (Veridex LLC) (Kahan L., 「Medical devices; immunology and microbiology devices; classification of the immunomagnetic circulating cancer cell selection and enumeration system. Final rule」, Fed Regist 2004;69:26036-8によって記述されている)では、Sieuwerts AM, Kraan J, Bolt-de Vries J, et al., 「Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR」, Breast Cancer Res Treat 2009;118(3):455-68によって記述されているように、上皮細胞(CK-8/18/19)および白血球(CD45)を検出するEpCAM特異抗体でコーティングされている磁気ビーズを用いる。この方法は、循環血中腫瘍細胞(CTC)を検出するために、ならびに転移性前立腺がん(Danila DC, Heller G, Gignac GA, et al. Circulating tumor cell number and prognosis in progressive castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res 2007;13(23):7053-8)、結腸直腸がん(Cohen SJ, Alpaugh RK, Gross S, et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 2006;6(2): 125-32.および乳房がん(Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, et al., Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 2004;351(8):781-91)における疾患進行および治療有効性のモニタリングのために用いられている。
【０２２６】
このおよび他の既存の手法は、さまざまな発現を示しうる、および/またはサイトケラチンを発現しえない、GEP-NEN細胞の検出のためには完全に満足のいくものではなかった(Van Eeden S, et al, 「Classification of low-grade neuroendocrine tumors of midgut and unknown origin」, Hum Pathol 2002;33(11): 1126-32; Cai YC, et al., 「Cytokeratin 7 and 20 and thyroid transcription factor 1 can help distinguish pulmonary from gastrointestinal carcinoid and pancreatic endocrine tumors」, Hum Pathol 2001;32(10): 1087-93、および29個中2個のGEP-NENサンプルにおけるEpCAM転写物の発現を検出している、本明細書において記述の研究を参照のこと)。
【０２２７】
循環血中腫瘍細胞に対して利用可能な検出方法で考慮すべき要因は、末梢血中の比較的少ない細胞数、典型的には、末梢血単核細胞(PBMC)約106個あたり1個(Ross AA, et al. 「Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques」, Blood 1993;82(9):2605-10を参照のこと)、ならびに白血球混入の可能性(Sieuwerts AM, et al.「Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR」, Breast Cancer Res Treat 2009;118(3):455-68; Mimori K, et al)および利用可能な手法の技術的な複雑性を参照されたい。これらの要因は、利用可能な方法を、臨床検査室で用いるのに完全には満足のいかないものにしうる。
【０２２８】
いくつかの態様において、神経内分泌細胞は、Kidd M, et al., 「Isolation, Purification and Functional Characterization of the Mastomys EC cell」, Am J Physiol 2006;291:G778-91; Modlin IM, et al., 「The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells」, J Clin Endocrinol Metab 2006;91(6):2340-8に記述されているように、アクリジン・オレンジ(AO)染色および取り込みの後に、公知の方法を用いて、不均一にFACS選別される。
【０２２９】
いくつかの態様において、提供される検出方法は、血液2〜3 mLまたはそれ以下の中でGEP-NEN細胞および/またはバイオマーカーを検出する、単離する、または濃縮するために用いられる。この方法は、標準的な検査室の装置を用いて行われ、したがって、臨床検査室の場で容易に行われる。1つの例において、読み出しは12時間以内に、サンプルあたりおよそ20〜30の平均費用で得られる。
【０２３０】
E. 診断用途、予後判定用途および予測用途
同様に提供されるのは、GEP-NEN、関連転帰および処置反応性の診断、予後判定および予測のためなどの、本明細書において提供される作用物質および検出方法のための診断用途、予後判定用途および予測用途である。例えば、利用可能なGEP-NEN分類方法は、一つには、不正確な分類により、ならびに個々の病変または腫瘍が、異なるGEP-NENサブタイプもしくはパターンになりえ、および/または2種以上のGEP-NENサブタイプを含有しうることにより限られている。公知の分類枠組みは、例えば、処置に対する反応を予測する能力が、または臨床経過および処置反応が大幅に異なりうる、類似の病理組織学的特徴を有する腫瘍を正確に識別する能力が、ならびに処置反応性を予測する能力が限られている。
【０２３１】
例えば、2000年に採用された世界保健機関(WHO)分類基準では、サイズ、増殖速度、局在性、分化およびホルモン産生に基づいて高分化型NET (WDNET) (良性挙動または不明確な悪性度)、高分化型神経内分泌がん(低悪性度) (WDNEC)、低分化型神経内分泌腫瘍(PDNET) (中悪性度)、および低分化型(通常は小細胞) NEC (PDNEC) (高悪性度)を区別する。転移性サブタイプは、同じ命名法および分類戦略に従う(MET-WDNET; MET-WDNEC、MET-PDNET、MET-PDNEC)。提唱される分類の代替案は主観的でありうる。分子または遺伝子に基づく分類スキームが必要である。GEP-NEN特異的予測の遺伝子に基づくモデルを含めて、提供される方法およびシステムは、これらの問題に対処し、生物学的挙動を予測する分子パラメータの特定および分析、ならびにそのようなパラメータに基づく予測において用いられうる。
【０２３２】
提供される診断方法、予後判定方法および予測方法のなかには、統計分析および生物数理アルゴリズムおよび予測モデルを利用して、GEP-NENバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子のような他のマーカーの発現に関して検出された情報を分析するものがある。いくつかの態様において、発現レベル、検出された結合および他の情報は正規化され、正常サンプルでの発現レベルまたは標準物質のような、参照値に対して評価される。提供される態様は、例えば、分類、病期分類、予後判定、処置デザイン、処置選択肢の評価およびGEP-NEN疾患転帰の予測、例えば、転移発生の予測での、GEP-NENバイオマーカーの発現に関して検出かつ測定された情報を用いたGEP-NENの分類および予測のための方法およびシステムを含む。
【０２３３】
GEP-NENの検出および診断
いくつかの態様において、本方法は、早期の疾患または転移の診断または検出のような、GEP-NEN診断を確立するために、疾患の程度を定義または予測するために、初期の広がりまたは転移を特定するために、転帰または予後を予測するために、進行を予測するために、疾患を分類するために、処置反応性をモニターするために、再発を検出またはモニターするために、および早期の治療的介入を容易にするために用いられる。例えば、提供される方法およびアルゴリズムのなかには、分類、病期分類、予後判定、処置デザイン、処置選択肢の評価およびGEP-NEN疾患転帰の予測、例えば、転移発生の予測で用いるためのものがある。
【０２３４】
1つの態様において、本方法、アルゴリズムおよびモデルは、日常的サーベイランスのような、診断サーベイランスに有用である。いくつかの態様において、本方法、アルゴリズムおよびモデルは、早期診断を提供する; 1つの局面において、本方法は、血液1ミリリットルあたりわずか3個または約3個の循環血中GEP-NEN細胞の検出のような、疾患の初期段階の時点を含めて、低容積腫瘍の検出、および循環血中腫瘍細胞の検出が可能である。いくつかの態様において、早期検出は、治療がいっそう効果的である時点での、早期の治療的介入を可能にし、これによって生存率および疾患転帰を改善することができる。
【０２３５】
例えば、1つの態様において、本方法は、処置の後、例えば、外科的または化学的介入の後などの、GEP-NENの再発および/または転移の早期検出に有用である。いくつかの局面において、本方法は、例えば、ヒト血液サンプルに対して、治療的介入の後に毎週または毎月行われる。いくつかの局面において、本方法は、小さ過ぎて、従来の手段、例えば画像検査法によっては検出できない微小転移巣を検出することが可能である。例えば、1つの局面において、本方法は、肝臓中などの、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2もしくは0.1 cm、または約1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2もしくは0.1 cmの転移巣のような、1センチメートル(cm)未満の転移巣を検出することが可能である。
【０２３６】
例えば、提供される方法およびシステムのなかには、少なくともまたは少なくとも約65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の正しいコール率などの、56〜92%の正しいコール率で対象またはサンプル中のGEP-NENの存在もしくは非存在(または両方)を判定するものがある。場合によっては、本方法は、少なくともまたは少なくとも約70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の特異性または感度を有する診断に有用である。
【０２３７】
他の局面において、本方法は、利用可能なバイオマーカーの検出および画像化のような、他の診断方法と比べて初期段階の初期疾患進行中のまたは処置後のGEP-NENの再発、転移または広がりを検出することが可能である。いくつかの局面において、検出されたバイオマーカーの発現レベルおよび/または発現特性は、疾患の進行、疾患重症度もしくは侵襲性、処置反応性の欠如、処置有効性の低減、GEP-NENに関連した事象、リスク、予後、GEP-NENのタイプもしくはクラスまたは病期とかなり相関する。
【０２３８】
例えば、いくつかの態様において、本方法は、治療的介入の効果を予測またはモニタリングすることが可能である。1つの局面において、提供される本方法は、CgAのような、利用可能なバイオマーカーの検出および画像化による腫瘍および転移がんの検出などの、検出および診断のために利用可能な方法よりも早くにまたは効果的に処置の結果としての疾患の改善を検出することが可能である。
【０２３９】
処置および治療的用法の開発およびモニタリング
提供される態様のなかには、処置に対する反応の評価、ならびに腫瘍の推定自然歴および患者の全般的健康を考慮に入れた患者特有のまたは個別の処置戦略を含めて、処置開発、戦略およびモニタリングにおいて提供されるバイオマーカーおよびその検出を用いる方法である。
【０２４０】
GEP-NEN管理戦略には、外科手術-治癒(めったに達成されない)または細胞切除の場合-放射線学的介入-例えば化学塞栓術または高周波アブレーションによる-化学療法、冷凍アブレーション、および放出ペプチドや神経アミンによって引き起こされた症状を制御するためのソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体(サンドスタチンLAR(登録商標) (オクトレオチド酢酸注入)のような)による処置、C-PET-CT、ならびにmet切除が含まれる。インターフェロンを含む、生物学的作用物質、およびホルモン療法、およびソマトスタチンタグを付加した放射性ヌクレオチドは、研究中である。
【０２４１】
1つの例において、冷凍アブレーションはMazzaglia PJ, et al., 「Laparoscopic radiofrequency ablation of neuroendocrine liver metastases: a 10-year experience evaluating predictors of survival」, Surgery 2007;142(1): 10-9によって記述されているように、血液への流入に向けてGEP-NEN組織を遊離させ、これが症状を誘発する。
【０２４２】
化学療法剤、例えば、全身細胞傷害性化学療法剤は、エトポシド、シスプラチン、5-フルオロウラシル、ストレプトゾトシン、ドキソルビシン; 血管内皮成長因子阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、スニチニブ、ソラフェニブおよびバタラニブ)、およびラパマイシンの哺乳類標的(mTOR)阻害剤(例えば、テムシロリムスおよびエベロリムス)、ならびにそれらの組み合わせを含み、例えば播腫性疾患および/または低分化型疾患を処置する。他の処置手法が周知である。
【０２４３】
いくつかの態様において、検出および診断方法は、例えば、方法を処置の前および/または後に毎週または毎月実施することにより、処置と併用される。いくつかの局面において、発現レベルおよびプロファイルは、疾患の進行、処置の無効性もしくは有効性、および/または疾患の再発もしくはその欠如と相関する。いくつかの局面において、発現情報は、異なる処置戦略が好ましいことを示す。したがって、本明細書において提供されるのは、GEP-NENバイオマーカー検出方法が処置の前に行われ、その後、治療効果をモニターするために用いられる、治療方法である。
【０２４４】
処置を開始または再開した後のさまざまな時点で、バイオマーカーの発現レベルまたは発現プロファイルの有意な変化(例えば、処置前の、もしくは処置後のいくつかの他の時点での、および/または正常サンプルもしくは参照サンプルでの発現または発現プロファイルと比べて)は、治療戦略が成功しているもしくは成功していないこと、疾患が再発していること、または異なる治療手法が用いられるべきであることを示す。いくつかの態様において、治療戦略は、検出方法の実施の後に、例えば現行の手法に加えてもしくは代えて、異なる治療的介入を付加することにより、現行の手法の侵襲性もしくは頻度を増加もしくは減少させることにより、または処置計画を停止もしくは再開することにより、変えられる。
【０２４５】
別の局面において、検出されたバイオマーカー発現レベルまたは発現プロファイルは、初めてGEP-NEN疾患を特定し、またはGEP-NEN疾患の初めての確定診断または分類を提供する。例えば、いくつかの局面において、本方法はWDNEC、WDNET、PDNEC、PDNETおよびその転移形態などの、GEP-NEN分類の1つまたは複数を区別し、ならびに/あるいはGEP-NENと、他の腸がんを含む、他のがんとを区別する。この態様のいくつかの局面において、処置手法は、発現レベルもしくは発現プロファイル、および/または判定された分類に基づいてデザインされる。本方法は、バイオマーカー検出方法の後に治療的介入の開始もしくは変更が行われ、バイオマーカー検出方法の後に周期性の持続的モニタリング、再評価、および修正、中止、または新しい治療的手法の追加が、任意により持続的モニタリングとともに、行われる、繰り返し手法を含む。
【０２４６】
いくつかの局面において、本方法およびシステムは、完全寛解にあると臨床的に分類される対象または安定した疾患を示している対象のような、アッセイされる対象が処置に反応性であるか否かを判定する。いくつかの局面において、本方法およびシステムは、対象が未処置である(もしくは無処置である、すなわち、処置を受けていない)または非反応性である(すなわち「進行性」と臨床的に分類される)か否かを判定する。例えば、本方法は、処置反応性の患者と処置非反応性の患者とを区別するために、および安定した疾患を有する患者または完全寛解にある患者と、進行性疾患を有する患者とを区別するために、提供される。さまざまな局面において、本方法およびシステムは、少なくとも65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の、あるいは少なくとも約65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の正しいコール率(すなわち、精度)、特異性または感度で、そのような判定を下す。
【０２４７】
いくつかの局面において、診断結果または予測結果または予後判定結果のための感度または正しいコール率は、循環血中CgAまたは他の単一のタンパク質の検出および測定のような、公知の診断方法または予後判定方法を用いて得られたものよりも高い、例えば、それよりも有意に高い。
【０２４８】
統計分析、数学的アルゴリズムおよび予測モデル
典型的には、診断方法、予後判定方法および予測方法は、統計分析および数学的モデリングを含む。したがって、提供されるのは、本明細書において特定されたGEP-NENバイオマーカーに基づく、予測モデルの構築に有用な教師あり学習アルゴリズム、ならびにGEP-NENの予測および分類のためのその方法および使用である。
【０２４９】
遺伝子発現の差異を評価するためのいくつかの周知の方法のいずれも使用されうる。そのような方法は、例えば、ANOVA (これは、定量化するには変化の関連性が複雑なために限定される)を用いた、各集団における平均発現レベルの単純な比較から、トポグラフィックな、パターン認識に基づくプロトコル、例えば、サポートベクタマシン(SVM) (Noble WS. What is a support vector machine? Nat Biotechnol. 2006;24(12): 1565-7)に基づく数学的分析に及ぶ。機械学習に基づく技法は、典型的には、高次元かつ多様式の生物医学データを分析するための精巧な、自動のおよび/または客観的なアルゴリズムを開発するのに望ましい。
【０２５０】
いくつかの例において、教師あり学習アルゴリズムの異形であるSVMが、提供される方法およびシステムと併用される。SVMは、90%超の精度で星状細胞腫の、および74〜80%の精度で前立腺がんの悪性度分類を予測するために用いられている(Glotsos D, Tohka J, Ravazoula P, Cavouras D, Nikiforidis G. Automated diagnosis of brain tumours astrocytomas using probabilistic neural network clustering and support vector machines. Int J Neural Syst 2005;15(1-2): 1-11; Glotsos D, Tohka J, Ravazoula P, Cavouras D, Nikiforidis G. Automated diagnosis of brain tumours astrocytomas using probabilistic neural network clustering and support vector machines. Int J Neural Syst 2005; 15(1-2): 1-11)。
【０２５１】
提供される方法およびシステムで用いるための他のアルゴリズムは、線形判別分析(LDA)、ナイーブベイズ(NB)、およびK近傍法(KNN)のプロトコルを含む。そのような手法は、新生物状態での個々のまたは多変量の変化を特定するのに有用である
2014512172.tif 000026
。
【０２５２】
いくつかの態様において、提供される方法およびシステムは、GEP-NENバイオマーカーの発現を群として分析し、その結果、出力は、正常サンプルまたは参照サンプルと、「GEP-NEN」を有する対象から得られたサンプルとの間で異なる発現シグナチャーまたはプロファイルのような、発現シグナチャーに依存する。そのような態様において、パターン認識プロトコルが一般に用いられる。そのような手法は、例えば、(Drozdov I, Kidd M, Nadler B, et al. Predicting neuroendocrine tumor (carcinoid) neoplasia using gene expression profiling and supervised machine learning. Cancer. 2009; 115(8): 1638-50に記述されているものなどの) GEP-NEN腫瘍組織での悪性シグナチャーおよびシグナル伝達経路を特定するために、ならびに(例えば、Modlin IM, Gustafsson BI, Drozdov I, Nadler B, Pfragner R, Kidd M. Principal component analysis, hierarchical clustering, and decision tree assessment of plasma mRNA and hormone levels as an early detection strategy for small intestinal neuroendocrine (carcinoid) tumors. Ann Surg Oncol 2009; 16(2): 487-98に記述されているように)個々の血漿サンプルが正常対照またはGEP-NENから得られたかどうかを判定するのに有用である。
【０２５３】
予測アルゴリズムおよびモデルを用いる方法では、当技術分野において周知のものなどの、統計分析およびデータ圧縮法を用いる。例えば、発現データは、例えば、Partek(登録商標) Genomic Suite (「Partek」, Partek(登録商標) Genomics Suite(商標), ed. Revision 6.3 St. Louis: Partek Inc, 2008)または類似のプログラムのような、統計分析プログラムへ変換され、例えば、自然対数に変換され、かつ取り込まれうる。データは比較のために圧縮され分析される。
【０２５４】
統計分析は、個々のサンプルのタイプに対する遺伝子発現レベルの、平均(M)、例えば、幾何平均の判定、サンプルのタイプ間の標準偏差(SD)の判定、2群のサンプルもしくは値に対する幾何平均の比率として計算される、異なるサンプルのタイプもしくは状態の間の幾何学的な倍率変化(FC)の判定、例えば、さまざまなサンプルおよび組織のタイプの間で差次的に発現されるバイオマーカー遺伝子を特定するための、両側フィッシャー検定、または2サンプルt検定による発現レベルの比較を含む。分散分析(ANOVA)は、異なるサンプルでの発現および/または値の間でバイオマーカー発現レベルの差異を評価するために用いられる。1つの例において、例えば試験サンプルおよび正常サンプル由来の発現レベルまたは2つの群を定義する参照値により、二群不対アルゴリズムが実行される。
【０２５５】
発現のレベル、量または値の差異が有意と見なされるかどうかは、周知の統計手法によって判定されてもよく、典型的には、差異が有意と見なされる、例えば、バイオマーカーの発現が、例えば、2つの異なるGEP-NENサブタイプ、腫瘍、病期、局在性、侵襲性、あるいはGEP-NENまたは正常もしくは参照のサンプルの他の局面を示す、2つの異なるサンプル間で、それぞれ、有意に下方制御または上方制御されると考えられる、閾値p値(例えば、p < 0.05)、閾値S値(例えば、±0.4、その上S < -0.4もしくはS > 0.4)、または他の値のような、特定の統計パラメータに対する閾値を指定することにより行われる。
【０２５６】
1つの局面において、アルゴリズム、予測モデル、および方法は、さまざまなGEP-NENサブタイプの根底にある調節性の遺伝形質(すなわち、接着、遊走、増殖、アポトーシス、転移、およびホルモン分泌)に関連した遺伝子から発現されるバイオマーカーに基づく。
【０２５７】
1つの局面において、本方法は、正常サンプルおよびGEP-NENサンプルを、GEP-NENおよび他のがんを、ならびにさまざまなサブタイプ、病期および疾患または疾患転帰の他の局面を区別する、特定のカットオフ値、例えば、発現のレベルまたは量を特定する数学的定式化、アルゴリズムまたはモデルを適用する。別の局面において、本方法は、予測、分類、予後判定、ならびに処置モニタリングおよびデザインに用いられる。1つの局面において、予測の態様は、生物学的挙動を予測する分子パラメータの特定、およびこのパラメータを用いたさまざまなGEP-NEN関連転帰の予測に有用である。これらの態様の1つの局面において、例えば、高次元かつ多様式の生物医学データの分析のための精巧な、自動のおよび客観的なアルゴリズムを開発するために、機械学習法が用いられる。
【０２５８】
データの圧縮および発現プロファイルの判定
発現レベルまたは他の値の比較のために、およびGEP-NENバイオマーカー発現に基づく発現プロファイル(発現シグナチャー)または調節性シグナチャーを特定するために、データは圧縮される。圧縮は、典型的には、主成分分析(PCA)または高次元データの構造を記述および視覚化するための類似の技法によるものである。PCAは、GEP-NENバイオマーカー発現の視覚化および比較、ならびに異なるサンプル間での、例えば正常サンプルまたは参照サンプルと試験サンプルとの間での、および異なる腫瘍タイプ間での発現プロファイル(発現シグナチャー、発現パターン)の判定および比較を可能にする。
【０２５９】
いくつかの態様において、発現レベルのデータは、例えば、リアルタイムPCRにより得られ、例えば、主成分に縮小または圧縮される。
【０２６０】
PCAは、データ(例えば、測定された発現値)の次元を、ばらつきの約50、60、70、75、80、85、90、95または99%のような、データのばらつきの大部分を説明するかまたは表す無相関の主成分(PC)に小さくするために用いられる。
【０２６１】
1つの例において、PCAは、ばらつきの大部分、例えば、データのばらつきの約75%、80%、85%、90%またはそれ以上をまとめて表す3つのPCが用いられる、3成分PCAである(Jolliffe IT, 「Principle Component Anlysis」, Springer, 1986)。
【０２６２】
PCAマッピング、例えば、3成分PCAマッピングは、例えば、第1(1st)、第2(2nd)および第3(3rd) PCを、それぞれ、x軸、y軸およびz軸に割り当てることにより、視覚化に向けて三次元空間にデータをマップするために用いられる。
【０２６３】
PCAは、さまざまなサンプルでのバイオマーカーに関する発現プロファイルを判定するために用いられうる。例えば、個々のサンプルのタイプ(例えば、各腫瘍のタイプ、サブタイプもしくは悪性度、または正常サンプルのタイプ)に関する縮退された発現データをPCA座標系に局在化させ、局在化データを用いて、個々の転写物の発現プロファイルまたはシグナチャーを判定する。
【０２６４】
1つの局面において、発現プロファイルは、主成分ベクトルにより与えられ、バイオマーカーのパネルの場合にはPCAにより判定される、サンプルの個々の転写物発現プロファイル(調節性シグナチャー)に対応または相当する、重心(質量中心; 平均発現)をプロットまたは定義することにより各サンプルについて判定される。
【０２６５】
一般に、この座標系において比較的大きな距離により分離された2つの重心または局在点は、2つの比較的異なる転写物発現プロファイルを表す。同様に、比較的近い重心は、比較的似たプロファイルを表す。この表示において、重心間の距離は、異なるサンプルに対する類似性測度と逆等価(より遠い距離 = より低い類似性)であり、したがって、重心間の大きな距離または分離は、異なる転写物発現シグナチャーを持つサンプルを示す。重心の近接は、サンプル間の類似性を示す。例えば、異なるGEP-NEN腫瘍サンプルに対する重心間の相対距離は、その調節性シグナチャーまたは転写物発現プロファイルの相対類似性を表す。
【０２６６】
相関関係、直線関係および調節クラスタ
1つの局面において、統計・比較分析は、2種のバイオマーカーに対する発現のレベルまたは値の間の逆相関の判定を含む。1つの例において、個々の発現ベクトルの間のこの相関関係および角度の余弦(より大きな角度 = より低い類似性)は、関連した遺伝子発現クラスタを特定するために用いられる(Gabriel KR, 「The biplot graphic display of matrices with application to principal component analysis」, Biometrika 1971;58(3):453)。
【０２６７】
いくつかの態様において、2種またはそれ以上のバイオマーカーの発現レベル、および/あるいはGEP-NENの存在もしくは非存在、サブタイプ、病期、または他の転帰の間に線形相関がある。1つの局面において、提供されるGEP-NENバイオマーカーと生体サンプルの特徴との間には、例えば、バイオマーカー(およびその発現レベル)とさまざまなGEP-NENサブタイプ(原発性または転移性)との間には、正常サンプル 対 GEP-NENサンプル、および/または原発性疾患 対 転移性もしくは侵攻性疾患との間には発現依存的な相関関係がある。
【０２６８】
値の対の間の、例えば異なる生体サンプル(例えば、腫瘍サブタイプ)に関するバイオマーカーの発現レベルの間の、およびバイオマーカーの対の間の線形関係(相関)を評価するために、ピアソンの相関(PC)係数(R2)が用いられうる。この分析は、(個々の相似行列のx軸およびy軸にプロットされた)バイオマーカーの個々の対に対するPC係数を計算することによって、発現パターンの分布を線形的に分離するために用いられうる。閾値は、(R2 > 0.50または0.40)の、より高い線形相関の閾値などの、さまざまな線形相関度に設定されうる。線形分類器をデータセットに適用することができる。1つの例において、相関係数は1.0である。
【０２６９】
1つの態様において、例えば、バイオマーカーのパネルのサブセットから構成される調節性クラスタを特定するために、統計分析を用いて相関関係のネットワークを構築することにより、調節性クラスタが判定される。1つの例において、PC相関係数を判定し、これを用いて、そのような相関関係のネットワークを構築する。1つの例において、予め定義された閾値を超えるR2を持つ転写物の対の間に輪郭を引くことにより、ネットワークが特定される。相関度は、再現性およびロバスト性に関する情報を与えうる。
【０２７０】
予測モデルおよび教師あり学習アルゴリズム
本明細書において同様に提供されるのは、GEP-NENバイオマーカーパネルの発現を検出するために提供される方法を用いて得られたデータなどの、高次元かつ多様式の生物医学データを分析するための、客観的なアルゴリズム、予測モデルおよびトポグラフィックな分析方法、ならびにそれを用いる方法である。上記のように、客観的なアルゴリズム、モデルおよび分析方法は、トポグラフィックな、パターン認識に基づくプロトコル、例えば、サポートベクタマシン(SVM) (Noble WS. What is a support vector machine? Nat Biotechnol. 2006;24(12): 1565-7)、線形判別分析(LDA)、ナイーブベイズ(NB)、およびK近傍法(KNN)のプロトコルに基づいた数学的分析のほかに、他の教師あり学習アルゴリズムおよびモデル、例えば決定木、パーセプトロンおよび正規化判別分析(RDA)、ならびに当技術分野において周知の類似のモデルおよびアルゴリズム(Gallant SI, 「Perceptron-based learning algorithms」, Perceptron-based learning algorithms 1990; 1(2): 179-91)を含む。
【０２７１】
いくつかの態様において、バイオマーカー発現データは、フィードフォワード型ニューラルネットワークを用い、生体サンプルにおいて分析される; 最良の転写物-予測因子が選択される。
【０２７２】
いくつかの態様において、GEP-NENバイオマーカー発現データセットのような、データセットから最も余剰的な特徴を除去するために、特徴選択(FS)が適用される。FSは、汎化能力を増強し、学習プロセスを加速し、モデル解釈可能性を改善する。1つの局面において、FSは、「貪欲前向き(greedy forward)」選択手法を用いて利用され、ロバスト学習モデルに対して最適な特徴サブセットを選択する(Peng H, Long F, Ding C, 「Feature selection based on mutual information: criteria of max-dependency, max-relevance, and min-redundancy」, IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 2005;27(8): 1226-38)。
【０２７３】
いくつかの態様において、サポートベクタマシン(SVM)アルゴリズムは、nデータセット間のマージンの増大によるデータ分類のために用いられる(Cristianini N, Shawe-Taylor J. An Introduction to Support Vector Machines and other kernel-based learning methods. Cambridge: Cambridge University Press, 2000)。
【０２７４】
いくつかの態様において、予測モデルには、項目に関する観測をその標的値に関する結論にマップする、決定木が含まれる(Zhang H, Singer B. 「Recursive Partitioning in the Health Sciences」, (Statistics for Biology and Health): Springer, 1999.)。木の葉は分類を表し、枝は、個々の分類へ移る特徴の結合を表す。決定木は、転移性乳がん(Yu L et al 「TGF-beta receptor-activated p38 MAP kinase mediates Smad-independent TGF-beta responses.」, Embo J 2002;21(14):3749-59)、および結腸がん(Zhang H et al 「Recursive partitioning for tumor classification with gene expression microarray data.」, Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98(12):6730-5.)の予後を予測するために、90%超の精度で星状細胞腫(Glotsos D et al 「Automated diagnosis of brain tumours astrocytomas using probabilistic neural network clustering and support vector machines.」, Int J Neural Syst 2005; 15(1-2): 1-11.)の、および74〜80%の精度で前立腺がんの悪性度分類を予測するために、効果的に(70〜90%)用いられている。（Mattfeldt T et al. "Classification of prostatic carcinoma with artificial neural networks using comparative genomic hybridization and quantitative stereological data.," Pathol Res Pract 2003;199(12):773-84.）この技法の効率性は、10分割交差検証によって測定されている(Pirooznia M et al 「A comparative study of different machine learning methods on microarray gene expression data.」, BMC Genomics 2008;9 Suppl 1:S13.)。
【０２７５】
予測モデルおよびアルゴリズムには、フィードフォワード型ニューラルネットワークを形成し、かつ入力変量を二項分類器にマップする線形分類器であるパーセプトロンがさらに含まれる(Gallant SI. 「Perceptron-based learning algorithms」, Perceptron-based learning algorithms 1990; 1(2): 179-91)。パーセプトロンは、乳がんの悪性度を予測するために用いられている(Markey MK et al. 「Perceptron error surface analysis: a case study in breast cancer diagnosis.」, Comput Biol Med 2002;32(2):99-109)。このモデルにおいて、学習率は、学習の速度を調節する定数である。より低い学習率は、変量を処理する時間を増やしながら、分析モデルを改善する(Markey MK et al. 「Perceptron error surface analysis: a case study in breast cancer diagnosis.」, Comput Biol Med 2002;32(2):99-109)。1つの例において、0.05の学習率が用いられる。1つの局面において、パーセプトロン・アルゴリズムは、限局性または原発性腫瘍と、対応する転移性腫瘍とを区別するために用いられる。1つの局面において、データをクラスへ明確に分類する決定境界を作出するために、3回のデータスキャンが用いられる。
【０２７６】
予測モデルおよびアルゴリズムには、線形判別分析および二次判別分析(LDA、QDA)を含む、その他のデータマイニング技法の、融通の利く代替として用いられうる正規化判別分析(RDA)がさらに含まれる(Lilien RH, Farid H, Donald BR. 「Probabilistic disease classification of expression-dependent proteomic data from mass spectrometry of human serum.」, J Comput Biol 2003;10(6):925-46.; Cappellen D, Luong-Nguyen NH, Bongiovanni S, et al. 「Transcriptional program of mouse osteoclast differentiation governed by the macrophage colony-stimulating factor and the ligand for the receptor activator of NFkappa B.」, J Biol Chem 2002;277(24):21971-82.)。RDAの正則化パラメータγおよびλは、LDAとQDAとの間の中間分類器をデザインするために用いられる。QDAは、γ=0およびλ=0の場合に行われ、LDAは、γ=0およびλ=1の場合に行われる(Picon A, Gold LI, Wang J, Cohen A, Friedman E. A subset of metastatic human colon cancers expresses elevated levels of transforming growth factor beta 1. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1998;7(6):497-504)。
【０２７７】
過剰適合を減らすために、RDAのパラメータは、0.0001に不等としながら交差検証誤差を最小化するように選択され、かくして、RDAにLDA、QDAおよびL2間の分類器を作出させる(Pima I, Aladjem M., 「Regularized discriminant analysis for face recognition」, Pattern Recognition 2003;37(9): 1945-48)。最後に、正規化それ自体は、機械学習における過剰適合を克服するために広く用いられている(Evgeniou T, Pontil M, Poggio T. 「Regularization Networks and Support Vector Machines.」, Advances in Computational Math 2000;13(1): 1-50.; Ji S, Ye J. Kernel 「Uncorrelated and Regularized Discriminant Analysis: A Theoretical and Computational Study.」, IEEE Transactions on Knowledge and Data Engineering 2000;20(10): 1311-21.)。
【０２７８】
1つの例において、正規化パラメータは、γ = 0.002およびλ = 0と定義される。1つの例において、クラス対ごとに、S値を全ての転写物に割り当て、これらを逓減S値によって並べる。RDAは、N番目の繰り返しが上位Nのスコアリング転写物からなるように、例えば、21回行われる。誤差推定はRDA分類器の10分割交差検証により行われうる。これは、組織データセットを相補サブセットに区分化し、一方のサブセット(トレーニングセットと呼ばれる)に関して分析を行い、他方のサブセット(検証セットまたは試験セットと呼ばれる)に関する分析を検証することにより行われうる。
【０２７９】
誤分類誤差の計算
1つの例において、誤分類誤差は、全体の予測評価のばらつきを減らすように平均化され、これにより、ブートストラッピングおよびleave-one-out交差検証を含む、他の手法と比べて誤差推定に対するさらに正確な手法が提供されうる(Kohavi R. 「A study of cross-validation and bootstrap for accuracy estimation and model selection.」, Proceedings of the Fourteenth International Joint Conference on Artificial Intelligence, 1995;2(12): 1137-43.)。
【０２８０】
1つの例において、例えば、遺伝子ごとのおよびクラス対ごとのランクスコア(S)を
2014512172.tif 000027
のようにコンピュータで計算することにより、組織分類のための選択が行われ、式中、μC1およびμC2は、それぞれ、第1および第2のクラスの平均を表し、σC1およびσC2はクラス間の標準偏差である。大きいS値は、各クラス内でのかなりの差次的発現(「倍率変化」)および低い標準偏差(「転写物安定性」)を示す。遺伝子は、逓減S値により選別され、正規化判別分析アルゴリズム(RDA)のための入力データとして用いられうる。
【０２８１】
アルゴリズムおよびモデルは、例えば、モデルの予測能および分類能を検証するために、ならびに特異性および感度を評価するために、評価、検証および交差検証されうる。1つの例において、放射基底関数がカーネルとして用いられ、分類の感度を測定するために10分割交差検証が用いられる(Cristianini N, Shawe-Taylor J. 「An Introduction to Support Vector Machines and other kernel-based learning methods.」, Cambridge: Cambridge University Press, 2000.)。さまざまな分類モデルおよびアルゴリズムは、特定の結果を予測するための予測モデルの性能を比較するために、提供される方法によって、例えば、本明細書において提供される、トレーニングおよび交差検証を用いて比較されうる。
【０２８２】
提供される方法、システムおよび予測モデルの態様は、高い動的範囲で、再現可能であり、データのわずかな変化を検出することができ、簡単な方法を用いて、低い費用で、例えば、臨床検査室での実施に向けて、行われる。
【０２８３】
F. キット
上記に記述または提示された診断用途、予後判定用途、予測用途、および治療用途で用いるため、キットおよび他の製造品が提供される。いくつかの態様において、キットには、バイアル、チューブ、プレートおよびウェルのような、1つまたは複数の容器であって、その各々が、本明細書において提供される方法で用いるための別個の構成要素の1つを含む、該容器を受けるように区分化された、キャリア、パッケージまたはパッケージングが含まれ、いくつかの局面において、本明細書において記述される使用などの、使用説明の載ったラベルまたは能書がさらに含まれる。1つの例において、個々の容器は、本明細書において提供されるGEP-NENバイオマーカーの検出のための個々の作用物質を含む; いくつかの例において、個々の容器は、ハウスキーピング遺伝子の検出、および/または正規化のための作用物質を含む。
【０２８４】
例えば、容器は、検出可能に標識されるかまたはされてもよい、プローブまたはプライマーのような、作用物質を含むことができる。本方法が検出のために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含有する容器を持つこともできる。キットは、酵素標識、蛍光標識または放射性同位体標識のような、レポーター分子に結合された、アビジンまたはストレプトアビジンなどの、ビオチン結合タンパク質のような、レポーターを含む容器を含むことができる; そのようなレポーターは、例えば、核酸または抗体とともに使用されうる。
【０２８５】
キットは、典型的には、上記の容器と、それに関連した、緩衝液、希釈液、フィルタ、注射針、注射器を含む商業上の観点および使用者の観点から望ましい材料を含む1つまたは複数の他の容器と、内容物および/または使用説明を載せてあるキャリア、パッケージ、容器、バイアルおよび/またはチューブラベル、ならびに使用説明の載った能書とを含む。
【０２８６】
ラベルは容器上にまたは容器とともに提供され、その組成物が特定の治療用途または治療以外の用途、例えば予後判定、予防、診断もしくは実験用途のために使用されることを示すことができ、また、本明細書において記述されるものなどの、インビボでのまたはインビトロでの使用上の指示を示すこともできる。指示およびまたは他の情報はまた、キットとともにまたはキット上に含まれる能書またはラベル上に含まれてもよい。ラベルは容器上にあっても、または容器と関連付けられていてもよい。ラベルを形成する文字、数字または他の字が容器それ自体に成形またはエッチングされる場合、ラベルは容器上にあることになりうる; ラベルが、容器も保持する入れ物またはキャリアの中に、例えば能書として存在する場合、ラベルは容器と関連付けられていることになりうる。ラベルは、組成物がGEP-NENのような、状態の診断、処置、予防または予後判定に使用されることを示しうる。
【０２８７】
別の態様において、アミノ酸配列、小分子、核酸配列および/または抗体のような、組成物、例えば、GEP-NENの診断、予後判定または治療に有用な材料を含有する製造品が提供される。この製造品は、典型的には、少なくとも1つの容器および少なくとも1つのラベルを含む。適当な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器は、ガラス、金属またはプラスチックなどの種々の材料から形成されうる。容器は、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、細胞集団および/または抗体を保持しうる。1つの態様において、容器は、細胞のmRNA発現プロファイルを調べる際に用いるためのポリヌクレオチドを、この目的のために用いられる試薬ととともに保持する。別の態様において、容器は、細胞および組織におけるGEP-NENバイオマーカーのタンパク質発現の評価で用いるための、または関連する実験、予後判定、診断、予防および治療の目的のための、抗体、その結合断片または特異的結合タンパク質を含む; そのような使用の表示および/または指示が、そのような容器上にまたは容器とともに含まれてもよく、同様にこれらの目的に使用される試薬および他の組成物またはツールも含まれうる。
【０２８８】
製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液および/またはデキストロース溶液を含む第2の容器をさらに含むことができる。製造品はさらに、他の緩衝液、希釈液、フィルタ、スターラー、注射針、注射器、および/または能書を含め、商業上の観点および使用者の観点から望ましい他の材料を、使用の表示および/または説明とともに含むことができる。
【実施例】
【０２８９】
本発明の様々な局面は、本発明の範囲の限定を意図しない、後続のいくつかの実施例によってさらに説明および例証される。
【０２９０】
実施例1：GEP-NENおよび正常サンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルの検出および決定
サンプルの調製、RNAの抽出、リアルタイムPCR
リアルタイムPCRによるGEP-NENバイオマーカー発現レベルの検出および決定のために、正常および新生物サンプルを入手した。正常サンプルは、二十七（27）個の正常小腸（SI）粘膜サンプル（NML）および十三（13）個の正常ヒト腸クロム親和性（EC）細胞調製物（NML_EC；正常粘膜の蛍光活性化細胞分別（FACS）を通じて入手；98%を超える純度のEC細胞（Modlin IM et al., "The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells," J Clin Endocrinol Metab 2006;91(6):2340-8）を含むものであった。
【０２９１】
新生物サンプルは、冷凍バイオバンクから収集した五十三（53）個の原発性SI GEP-NENおよび二十一（21）個の対応する肝転移物を含むものであった（すべて組織を顕微解剖した）。GEP-NENサンプルは、Institutional Review Board of Yale Universityによって承認されたプロトコルにしたがい登録された患者から入手した。各々、80%超の純度の新生物細胞であることを示す機能性、およびEC細胞由来であることを確認するTPH1陽性、に分類された（Modlin IM et al., "The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells," J Clin Endocrinol Metab 2006;91(6):2340-8）。患者サンプルを、乳房（n=53）、結腸（n=21）および膵臓（n=16）の腺癌からも収集した。
【０２９２】
原発性GEP-NENを、2000年度版世界保健機関（WHO）標準にしたがい、病理学的に：高分化型NET（（WDNET）（n=26）（良性の挙動または不確定の潜在的悪性））；高分化型神経内分泌癌腫（（WDNEC）（n=20）（低級の悪性））；低分化型神経内分泌腫瘍（（PDNET）（n=5）（中級の悪性））；および低分化型（典型的には小細胞型）神経内分泌癌腫（（PDNEC）（n=2）（上級の悪性））に分類した。転移性GEP-NEN組織サンプル（転移物；MET）（対応する腫瘍タイプの肝摘出物から収集）を、同様の標準を用いて：WDNET MET（n=6）、WDNEC MET（n=12）およびPDNEC MET（n=3）に分類した。転移性PDNET（PDNET MET）は、同じ方法を用いて分類される。
【０２９３】
リアルタイムPCRのために、RNAを、様々な正常および新生物サンプル（27個の正常SI粘膜サンプル、13個の正常ヒトEC細胞調製物、53個の原発性SI GEP-NEN、21個の対応する肝転移物および53個の腺癌サンプル）から、TRIzol（登録商標）試薬（直接利用可、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの単相溶液；Invitrogen（商標）, Carlsbad, California）を用いて抽出した。
【０２９４】
転写物の発現レベルは、Assays-on-Demand（商標）遺伝子発現用製品およびABI 7900 Sequence Detection System（両方ともApplied Biosystems製）を製造元の推奨にしたがい用いるリアルタイムPCRによって測定した（Kidd M et al, "Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors," Cancer 2005;103(2):229-36）。サイクルは、TaqMan（登録商標） Universal PCR Master Mix Protocol（Applied Biosystems）を用いて標準的な条件下で行った。
【０２９５】
GEP-NENバイオマーカーは、各セットがGEP-NENバイオマーカーのパネルに特異的に結合しこれを増幅するよう設計されたプライマー対を含む、ポリヌクレオチドプライマー対のセットを用いるリアルタイムPCRによって検出し、その発現レベルを測定した。GEP-NENバイオマーカーパネルは、典型的な原発性および転移性GEP-NENの表現型に関連する遺伝子、例えば、接着、遊走、増殖、アポトーシス、転移およびホルモン分泌に関与する遺伝子、ならびに神経内分泌マーカー遺伝子の産物（転写物）を含むものであった。ハウスキーピング遺伝子（ALG9、TFCP2およびZNF410）の発現レベルも測定した。バイオマーカー発現の生のΔCT値を、geNormアルゴリズム（Vandesompele J et al., "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes," Genome Biol 2002;3(7):RESEARCH0034）およびハウスキーピング発現レベルを用いて正規化した。
【０２９６】
正規化データを、圧縮のために自然対数（ln）変換し、Partek（登録商標）Genomic Suite（Partek, "Partek（登録商標）Genomics SuiteTM," ed. Revision 6.3 St. Louis: Partek Inc, 2008）にインポートした。様々なバイオマーカー転写物の算術平均遺伝子発現レベル（M）および標準偏差（SD）を計算した。すべての統計計算を、統計計算用のR2.9言語を用いて行った（R Development Core Team. R, "A language and environment for statistical computing," Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing, 2008）。
【０２９７】
バイオマーカーが9種であるパネルの、転写物発現レベルの検出および決定
発現レベルを、9種のGEP-NENバイオマーカー（MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki-67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2およびCgA）（Kidd M. et al., "The role of genetic markers--NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1--in defining small-intestinal carcinoid neoplasia," Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62; Kidd M et al., "Q RT-PCR detection of chromogranin A: a new standard in the identification of neuroendocrine tumor disease," Ann Surg 2006;243(2):273-80を参照のこと）の転写物のパネルに特異的なプライマー対のセットを用いる、上記のようなリアルタイムPCRによって決定した。プライマー対の配列は、以下の表1Aに列挙され、プライマー対に関するその他の情報は表1Bに列挙されている。9種のバイオマーカー（転写物）の発現を、原発性SI GEP-NEN（AKA SI NET）（n=53）、対応する肝転移物（n=21）および正常EC細胞調製物（n=13）由来のサンプルにおいて測定した。各バイオマーカーについて、腫瘍サンプルにおける発現レベルを、正常腸クロム親和性（EC）細胞調製物における対応する平均発現レベルと比較した。この比較に基づき、腫瘍サンプルにおける発現レベルを、上方制御、下方制御またはベースラインに分類した。
【０２９８】
（表１）GEP-NENバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子用のプライマーのセット
（表１Ａ）プライマー配列
2014512172.tif 000028
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【０２９９】
（表１Ｂ）その他の情報
2014512172.tif 000034
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【０３００】
結果が図1に表されており、図中の9つのパネルの各々は正常EC（左）、悪性／転移性（中央）および局所（右）サンプルにおける個々のバイオマーカーの平均発現レベルを示している。楕円は、±2標準偏差（SD）の閾値に対応する。すべてのp値：p<0.05。結果は、SI GEP-NEN（AKA SI NET）におけるMAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki-67、FZD7、CgAおよびNRP2の有意に高い発現レベルならびにサバイビンおよびKiss1の低いレベルを実証しており、これらのGEP-NENバイオマーカーが、GEP-NENサンプルにおいて、正常細胞と比較しておよび異なるGEP-NEN腫瘍グレード間で差次的に発現されることが確認される。
【０３０１】
バイオマーカーが21種であるパネルの、転写物の検出および発現レベルの決定
GEP-NENバイオマーカーが21遺伝子であるパネル（MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、SPOCK1、HOXC6、CTGF、PTPRN2、SCG5およびTph1を含む）からの転写物の発現レベルを測定するため、上記のようにしてプライマー対のセットを用いて定量リアルタイムPCR（QPCR）を行った。プライマーの配列および情報は、上記の表1Aおよび1Bに列挙されている。21種のバイオマーカーの発現を、正常EC細胞（n=13）正常SI粘膜（n=27）ならびに原発性（n=53）および転移性（n=21 肝MET）GEP-NENサブタイプならびに53個の腺癌（結腸、乳房および膵臓）サンプルを含む167個のヒト組織サンプルにおいて測定した。この研究により、21種のバイオマーカーの各々がGEP-NEN腫瘍サンプルにおいて有意に差次的に発現されることが実証された。
【０３０２】
21種のバイオマーカーの各々について、転写物レベルが検出されたGEP-NENサンプル 対 腺癌サンプルの比率を、両側フィッシャー検定（GraphPad Prizm 4；図8B：*p<0.002 SI GEP-NEN 対 腺癌（フィッシャーの正確確率検定））を用いて計算および比較した。図8Bに示されるように、この研究において、腺癌と比較して有意に高い比率（>95%）のGEP-NENサンプルが、21種のGEP-NENバイオマーカー遺伝子のうちの16種（76%）を発現していた（すなわち、それらについて陽性であった）（p<0.002）。両方の腫瘍タイプにおいて高度に発現された遺伝子には、CTGF、FZD7、NRP2、PNMA2およびサバイビンが含まれた。
【０３０３】
異なるGEP-NENサブタイプとは対照的に、様々な正常EC細胞サンプルは、均質な転写物発現を示し、サンプル間の転写物の変動が小さかった（57%）。異なる新生物SI GEP-NEN（a.k.a. SI NET）サブタイプは、転写物レベルで異種性を示し、これによりこの21バイオマーカーパネルにおける転写物の発現レベルを検出および決定することによって異なるGEP-NENサブタイプを識別できることが示された。
【０３０４】
実施例2：主成分分析（PCA）
自然対数（ln）変換およびPartek（登録商標）Genomic Suiteへのインポートの後、高次元発現データの構造を表現するために主成分分析（PCA）を行った。PCAは、様々なサンプル（例えば、正常、新生物、GEP-NEN 対 他の腫瘍、GEP-NENサブタイプ、原発性 対 転移性／悪性）間での転写物発現パターンの可視化および比較を実現する。PCAは、バイオマーカーが9種およびバイオマーカーが21種であるパネルの各々で得られる発現データの次元数を、最大の変動を説明する3つの相関しない主成分（PC）まで縮小する（Jolliffe IT, "Principle Component Analysis," Springer, 1986）。PCAマッピングを、1つ目（第1）、2つ目（第2）および3つ目（第3）のPCがそれぞれx、yおよびz軸に割り当てられた3次元空間で可視化した。
【０３０５】
9遺伝子および21遺伝子のパネルに関する様々なサンプルの平均発現データを、このPCA座標系に上書きした。各サンプルの重心（質量（平均発現）の中心）は、主成分ベクトルにより与えられるその個々の転写物発現プロフィール（調節シグネチャー）を表すものであった。この表示法において、重心間の距離は、その類似度に反比例する（長い距離=低い類似性）。したがって、重心間の大きな距離または隔離は、別個の転写物発現シグネチャーを有するサンプルを示し；重心の近さは、サンプル間の類似を示した。例えば、異なる腫瘍タイプのサンプルの重心間距離は、それらの調節シグネチャー（転写物発現レベル）の相対的類似性を表した。
【０３０６】
バイオマーカーが9種であるパネル
バイオマーカーが9遺伝子であるパネル（MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki-67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2およびCgA）のリアルタイムPCR発現データについて、上記のようにしてPCAを行った。3つのPC（PC#1、PC#2、PC#3）は、原発性SI GEP-NEN、正常EC細胞調製物およびそれぞれの転移物の間の発現の分散の大部分を反映していた。縮小データを3次元空間にマップした（図2）。図2に示されるように、原発性SI GEP-NENおよび正常EC細胞調製物について、PC#1、PC#2およびPC#3は、それぞれ、分散の31.7%、26.5%および17.4%を表し；全体で、この3つのPCは分散の75.6%を表した。
【０３０７】
3つのPCは、原発性腫瘍サブタイプおよび正常EC細胞調製物の分散の75.6%（図2A）ならびに原発性GEP-NEN腫瘍サブタイプおよび対応する転移物の分散の73.2%（図2C）を表した。転移物について、PC#1、PC#2およびPC#3は、それぞれ、分散の40.4%、19.9%および12.9%を表し；全体で、このデータの分散の73.2%が3つすべてのPCによって表された（図2C）。
【０３０８】
バイオマーカー発現レベルと個々の発現ベクトル間の角度のコサインとの間の逆相関（大きな角度=低い類似性）を、関連遺伝子発現クラスターの同定に使用した。クラスターは、原発性SI GEP-NEN（（1）CgA、NRP2、NAP1L1、FZD7；（2）MAGE-D2、MTA1、Kiss1；および（3）Ki-67、サバイビン）については図2Bに、対応する転写物（（1）NAP1L1、FZD7、CgA、サバイビン、Ki-67、Kiss1；（2）MTA1、MAGE-D2、NRP2）については図2Dに示されている（Gabriel KR, "The biplot graphic display of matrices with application to principal component analysis," Biometrika 1971;58(3):453）。
【０３０９】
バイオマーカーが21種であるパネルのPCA
バイオマーカーが21種であるパネル（MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、SPOCK1、HOXC6、CTGF、PTPRN2、SCG5およびTph1）についても、PCAを上記のようにして行った。3つの主成分は、データセット内の分散の大部分（83%）を捕捉した。縮小データを3次元空間にマップした。
【０３１０】
図8Aは、GEP-NEN（様々な原発性および転移性サブタイプを含む）、腺癌（サブタイプ）ならびに正常組織（ECおよびSI）の発現プロフィールの比較を示している。示されているように、3つの腺癌タイプの重心は、正常SI粘膜および新生物GEP-NEN組織サブタイプの両方の重心から離れていた。この観測から、上記のフィッシャーの正確確率検定を用いて示された、この他の（上皮の）腫瘍タイプにおける有意に異なる発現レベルが確認された（図8B）。様々な新生物（SI GEP-NEN）サブタイプは、異種の発現プロフィールを示し、このバイオマーカーパネルを用いてこれらを区別できることが示された。
【０３１１】
すべての正常EC調製物は、同種の転写物発現を示した（サンプル内の変動が小さかった（57%））。さらに、正常サンプルの発現プロフィールは、正常SI粘膜を含む他の組織サブタイプのそれと比較して実質的に異なっていた。正常EC細胞の遺伝子プロフィールは、正常SI粘膜および新生物組織と比較して実質的に異なっていた。
【０３１２】
これらの結果は、GEP-NENバイオマーカーの発現プロフィールが異なること、ならびに原発性SI GEP-NEN腫瘍サブタイプ、正常EC細胞調製物およびSI GEP-NEN転移物で調節発現シグネチャーが別個であることを実証している。この研究から、21種のバイオマーカーの発現の測定が、GEP-NENサブタイプ、腺癌タイプ、正常SI粘膜、正常EC細胞間ならびに原発性および転移性GEP-NENサブタイプ間をうまく区別できることを立証している。
【０３１３】
実施例3：腫瘍プロファイリングおよび分析
上記のバイオマーカーが9種およびバイオマーカーが21種であるパネルから得られた変換後の発現データについて統計分析および腫瘍プロファイリングを行った。
【０３１４】
バイオマーカーが9種であるパネル
算術平均（M）転写物発現レベルおよび標準偏差（SD）を、原発性腫瘍サブタイプおよび正常EC細胞調製物のバイオマーカーが9種であるパネルについて計算した。CgA（M正常=-9.2、SD=4.2）、Ki-67（M正常=-4.5、SD正常=1.1）、Kiss1（M正常=-4.0、SD正常=3.2）、NAP1L1（M正常=-8.3、SD正常=1.1）、NRP2（M正常=-9.3、SD=3.8）およびサバイビン（M正常=-6.0、SD正常=1.0）の算術平均正常発現は、全体（全腫瘍）および個別サブタイプ間の両方で、原発性腫瘍における算術平均発現と比較して有意に異なっていた。以下の表2に列挙されているp値および変化倍率（FC）を参照のこと。転写物発現レベルの測定値を、サンプルのサブセット（n=35）で再評価した。データは高度に相関し（R2=0.93、p=0.001）、これによりこのアプローチが高い再現性およびロバスト性の両方を有することが実証された。
【０３１５】
腫瘍サンプルと正常サンプルの間および正常サンプルと個々の腫瘍サブタイプサンプルの間のバイオマーカー発現レベルの差を評価するため、分散分析（ANOVA）を行った。具体的には、ANOVAにより、正常EC細胞調製物と原発性腫瘍組織の間および正常EC細胞調製物と個々の原発性腫瘍タイプの間で発現を比較した（表2）。腫瘍サンプルデータ（全体または個別サブタイプ）および正常サンプル発現データが2つのグループを定義する、対応のない2標本アルゴリズムを実施した。データセットに欠落データがなかったので、補完は必要なかった。各々のバイオマーカー転写物について、幾何学的変化倍率（FC）を、腫瘍グループおよび正常グループの幾何学的算術平均の比として計算した。
【０３１６】
p<0.05で正常グループと腫瘍グループの間で発現に差があると計算されたバイオマーカー遺伝子を、有意に変化したものとみなした。p<0.05および絶対FC≧2.0の転写物を、グループ間で差次的に発現されたものとみなした。CgA、FZD7、Ki-67、NAP1L1、NRP2およびサバイビンが、正常EC細胞調製物と比較してWDNETにおいて有意に変化していた。CgA、Ki-67、MAGE-D2およびNRP2の転写物レベルは、WDNECにおいて有意に変化していた。PDNETは、CgA、Ki-67、NAP1L1、NRP2およびサバイビンについて別の発現レベルを示した。最後に、PDNECは、NAP1L1およびNRP2の発現についてのみ異なっていた。
【０３１７】
（表２）SI-GEP-NENおよび個々のSI-GEP-NENサブタイプのバイオマーカー発現レベルを正常EC細胞サンプルの発現レベルと比較するANOVA
2014512172.tif 000044
WDNET=高分化型神経内分泌腫瘍、WDNEC=高分化型神経内分泌癌腫、PDNET=低分化型神経内分泌腫瘍、PDNEC=低分化型神経内分泌癌腫；NS=p≧0.05、FC=変化倍率
【０３１８】
バイオマーカー対の間および腫瘍サブタイプの分化とバイオマーカーの発現の間の線形的関係を評価するため、バイオマーカーが9種であるパネルについてピアソン相関（PC）係数（R2）を計算した。（図3に示される個々の類似性マトリックスのx軸およびy軸にプロットされた）個々のバイオマーカー対のPC係数を計算することによって、原発性GEP-NENサブタイプおよび正常ECサンプル間のバイオマーカー発現の分布を線形的に分離した。この研究により、4つのバイオマーカー対（MTA1:MAGE-D2、MTA1:Kiss1、FZD7:NAP1L1およびサバイビン:Ki-67）における発現の高度な線形的（R2>0.50）相関が決定された（高度な相関（R2>0.50））。加えて、WDNET、WDNECおよびPDNETの発現プロフィールの分布は、Kiss1:サバイビン、FZD7:NAP1L1、サバイビン:MTA1およびMTA1:MAGE-D2の発現の対に線形的に相関し、これにより線形的分類器をデータセットに適用できることが示された。データはさらに、これらのバイオマーカーと原発性腫瘍サブタイプの間の発現依存的な相関を示唆している。
【０３１９】
バイオマーカーが21種であるパネル
21遺伝子パネルのバイオマーカーの発現レベルの間の線形的関係を同定するために、ピアソン相関（PC）係数を使用した。すべての組織タイプで、21種のバイオマーカーの各々の対についてPC係数を計算した（図9A）。図9は、その結果を、最低（-0.03）、中間（0.4）および最高（1）の相関を示す対がそれぞれ黒色、濃灰色および薄灰色で示されるヒートマップで示している。バイオマーカーが21種であるパネルは、27種の高度に相関する（R2>0.40）転写物対を含んでおり、最高の相関係数（R2=1.00）がMTA1、NRP2およびKiss1の間で見られた。
【０３２０】
このデータから、予め定義された閾値（R2>0.40）を上回るR2を有する任意の転写物対の間に稜線を引くことによって、相関のネットワークを構築した（図9B、実際のR2値が各稜線に上書きされている）。図9Bに示されるように、このネットワーク内で、各々が固有のバイオマーカーセットを有する5つの別個の調節クラスターが同定された：（1）MAGE-D2、NRP2、Kiss1、MTA1およびCgA（最も緊密に結びついているクラスター（各R2値>0.79））；（2）GRIA2、OR51E1、SPOCK1およびSCG5；（3）CXCL14、NKX2-3、HOXC6、CTGF、PTPRN2；（4）NAP1L1、FZD7およびPNMA2；ならびに（5）サバイビンおよびTph1。図9Bでは、R2値が個々の稜線に上書きされている。各クラスター内の最低のR2値は0.40であり；最高値は1.0である。この結果は、バイオマーカーパネルの発現レベルが生物学的にGEP-NENに関連することを実証している。
【０３２１】
1）EC細胞、正常SI粘膜ならびに原発性および転移性組織；2）原発性GEP-NENサブタイプ；ならびに3）転移性GEP-NENサブタイプの間で差次的に発現されるバイオマーカー遺伝子を同定するために、2標本t検定計算を使用した（図10）。
【０３２２】
各サブセットについて計算されたS値は、-1.4から1.1の範囲であった。遺伝子の数（n=21）およびサンプルサイズ（n=114）に基づき、S値に関する統計的有意性の閾値を±0.4に設定した（Nadler B, "Discussion of "On consistency and sparsity for principal component analysis in high dimensions,"" Journal of the American Statistical Association 2009;104:694-97）。S<-0.4またはS>0.4およびp<0.05の転写物を、それぞれ、有意に下方または上方制御されたものとみなした。結果が、遺伝子ランクのボルケーノプロットおよびt検定の有意（p）値と共に、図10に示されている。
【０３２３】
図10Aは、正常SI粘膜、正常EC細胞およびSI GEP-NEN間の比較を示している。正常粘膜と比較して、古典的な神経内分泌マーカーTph1の転写物発現は、SI GEP-NENサンプルにおいて有意に高かった（p<0.001、S=0.7；図10A）。正常SI粘膜と比較して、新生物組織は、より高いCgAおよびGRIA2の転写物レベルを発現し（図10B）；CgAの発現は、新生物組織と正常EC細胞の間で有意に変化しなかった（p=0.07、S=0.39）。
【０３２４】
図10B は、全GEP-NEN（腫瘍）サンプルと全正常サンプル、全転移性GEP-NENサンプルと全正常サンプル、および全転移性GEP-NENサンプルと全原発性GEP-NENサンプルの間の比較を示している。グループ全体として分析した場合、グループとして分析した原発性GEP-NENサンプル集合と比較して転移性GEP-NENサンプル集合において差次的に発現されるバイオマーカー転写物はなかった。
【０３２５】
図10Cは、原発性GEP-NENサブタイプとグループとしての全転移物の間の比較を示している。PDNECサンプルと比較してPDNETサンプルにおいて（PDNET-PDNEC）、またはPDNECサンプルと比較してWDNETサンプルにおいて（WDNET-PDNEC）、差次的に発現されるバイオマーカー転写物はなかった。WDNECとPDNECの間（WDNEC-PDNEC）で、MAGE-D2は、唯一有意に異なるマーカーであった（p=0.009、S=1.03；図10C）。
【０３２６】
図10Dは、原発性腫瘍と転移性サブタイプの間の比較を示している。CgA、Kiss1、NRP2およびTph1が、すべての転写物サブタイプの間で差次的に発現された（図10D）。
【０３２７】
実施例4：GEP-NENを分類する予測モデル
実施例1〜4の研究で得られたGEP-NENバイオマーカーの発現レベルを、サポートベクターマシン（SVM）、決定木、パーセプトロンおよび正則化判別分析（regularized discrimination analysis）RDAを含む教師あり学習アルゴリズムおよびモデルを用いてさらに分析した（Gallant SI, "Perceptron-based learning algorithms," Perceptron-based learning algorithms 1990;1(2):179-91）。
【０３２８】
実施例4A：バイオマーカーが9種であるパネルの検出された発現を用いる予測およびモデリング
バイオマーカーが9種である場合の研究で得られた発現データを、特徴選択（FS）分類モデルを用いて分析した。このモデルは、Peng H, Long F, Ding C, "Feature selection based on mutual information: criteria of max-dependency, max-relevance, and min-redundancy," IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 2005;27(8):1226-38によって記載された、ロバスト学習モデルに最も関連する特徴のサブセットを選択する「貪欲前向き（greedy forward）」選択アルゴリズムを使用した。
【０３２９】
FSは、この研究において、NAP1L1、FZD7、Kiss1およびMAGE-D2の発現レベルが（9種のバイオマーカーの中で）SVM分類に最良の変数であると決定した。したがって、SVMは、正常EC細胞調製物（n=13）および原発性SI-GEP-NEN（n=36）におけるこれらのバイオマーカーの発現レベルを比較することによって行った。SVMにおいて、放射基底関数をカーネルとして使用し、分類の感度を測定するために10分割交差検証を使用した。Cristofanilli M et al. "Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer," N Engl J Med 2004を参照のこと。結果が以下の表3および図4に示されている。示されているように、SMVは、この研究においてSI GEP-NENを100%の感度および92%のクラス特異度で予測し；正常EC細胞調製物を77%の感度、100%のクラス特異度で正確に予測した。
【０３３０】
（表３）NAP1L1、FZD7、Kiss1およびMAGE-D2の転写物発現レベルを用いるサポートベクターマシン分類モデルにより得られたクラス予測
2014512172.tif 000045
【０３３１】
図4の密度マップは、SI GEP-NENと正常EC細胞の間の分布を示しており、サンプルの密度をカラー化することにより個々の遺伝子発現に基づく差次的領域が示されている。特徴選択アルゴリズムによって同定されたNRP2、MAGE-D2、Kiss1およびFZD7転写物の発現レベルが、X軸およびY軸にプロットされている。正常および新生物サンプルのデータを、それらのそれぞれの遺伝子対の発現にしたがい拡散させた。サンプル間の平均ユークリッド距離（発現の差）に基づき分布密度を緑色（正常）および赤色（新生物）に着色した。青色の領域は、正常グループと新生物グループの間の遷移領域を示している。正常EC細胞と原発性小腸腫瘍の間が明確に分かれていることは、選択された転写物が悪性腫瘍マーカーとして有用であることを示している。
【０３３２】
特徴選択は、決定木分類器における主判別子としてNAP1L1およびKi-67の発現レベルを同定した。この結果に基づき、NAP1L1およびKi-67の発現レベルの値を上記のようにして決定された原発性腫瘍サブタイプの対応する発現レベルに相関付けることにより、個々の原発性SI GEP-NENサブタイプの発現データに関する決定木分類モデルを構築した。その結果が図5に示されており、ここで木の葉は分類を表し、枝分かれ部は個々の分類に分かれる特徴の結びつきを表す。Pirooznia M, et al., "A comparative study of different machine learning methods on microarray gene expression data," BMC Genomics 2008;9 Suppl 1:S13に記載されるようにして、10分割交差検証を使用し、この技術の効率を測定した。図5において括弧内に示されている百分率は、原発性SI GEP-NENサブタイプの出現頻度を示している。以下の表4に示されるように、決定木分類は、この研究におけるWDNETを78%の感度および82%で予測し；この研究におけるWDNECを78%の感度および64%で予測し；そしてこの研究におけるPDNETを71%の感度および63%の特異度で予測した。9バイオマーカーパネルでは、PDNECは、この研究においてWDNETまたはPDNETのいずれかに誤分類された（図5；表4）。
【０３３３】
（表４）Ki-67およびNAP1L1の転写物発現を用いる決定木分類モデルにより得られたクラス予測
2014512172.tif 000046
【０３３４】
原発性SI GEP-NENサブタイプおよび対応する転移物において差次的に発現される転写物を同定するために、ANOVAを行った（表5）。Kiss1の有意な増加（p<0.005）がすべての腫瘍サブタイプにおける転移物に関連していた。
【０３３５】
（表５）小腸神経内分泌腫瘍サブタイプおよび対応する転移物のANOVAの結果
2014512172.tif 000047
MET=転移；FC=変化倍率；「p」=p値；NS=p≧0.05
【０３３６】
分類器を構築するため、（FSによって同定された）MAGE-D2、NAP1L1およびKiss1の検出された発現レベルを、原発性および対応する転移性WDNETにおいてSVMを用いて分析した。原発性腫瘍の転移可能性との比較でバイオマーカーの発現を評価するため、サンプルを、選択された遺伝子の発現レベルと相関させてプロットし、原発性サンプルと転移性サンプルの分離を表すよう分布密度をカラー表示した（図6A）。
【０３３７】
WDNETおよび転移性WDNETの結果を、それらのそれぞれの遺伝子対の発現にしたがい拡散させ、サンプル間の平均ユークリッド距離（発現の差）に基づく分布密度を、青色（原発性腫瘍）および赤色（転移物）に着色し、したがって緑色の領域は、原発性腫瘍と転移性腫瘍の間の遷移領域を示す。示されているように、WDNETおよびWDNET METは、100%の感度および特異度で予測された。WDNETは、転写物レベルが1）NAP1L1>-2.71およびKiss1>-2.50；2）NAP1L1>-3.82およびMAGE-D2>-4.42；3）MAGE-D2>-3.21およびKiss1>-2.12の場合に転移化すると予測することができた。
【０３３８】
局所腫瘍と対応する転移物の間を区別するために、0.05のパーセプトロン分類器（Markey MK et al., "Perceptron error surface analysis: a case study in breast cancer diagnosis," Comput Biol Med 2002;32(2):99-109）を使用した。この方法論は、乳癌の悪性度を効果的に予測することが示されている（Markey MK et al., "Perceptron error surface analysis: a case study in breast cancer diagnosis," Comput Biol Med 2002;32(2):99-109）。WDNECおよびPDNECの転移を予測するために、（0.05の学習率でデータをクラスに明確に分ける決定境界を生成するために3回のデータスキャンを使用する）パーセプトロン分類器を使用した。
【０３３９】
FSアルゴリズムは、NAP1L1およびKiss1がWDNEC METに特異的に高度に発現されることおよびCgAがPDNEC METに特異的に高度に発現されることを予測した。原発性腫瘍の転移可能性は、特徴付けられた遺伝子の発現をプロットし、原発性腫瘍およびそれらの転移物の分布密度をカラー化することによって可視化された。データは図6Bおよび図6Cに示され、そこにはそれらのそれぞれの遺伝子対の発現にしたがい拡散された原発性腫瘍サブタイプおよびそれぞれの転移物のデータが示されており、サンプル間の平均ユークリッド距離（発現の差）に基づく分布密度が、青色（原発性腫瘍）および赤色（転移物）で着色され、そして緑色の領域が、原発性腫瘍サブタイプとそれぞれの転移物の間の遷移領域を示している。WDNECは、NAP1L1>-5.28およびKiss1>-2.83の値で転移化することが予測され、PDNECはCgA>-3.5の場合に転移化すると予測することができた。これらの結果は、原発性SI GEP-NENサブタイプとそれぞれの転移物が明確に分離されることを示しており、これにより、提供されるバイオマーカーの転移物マーカーとしての有用性が実証された。
【０３４０】
実施例4B：バイオマーカーが9種であるパネルの分類および予測能の評価
バイオマーカーが9種であるパネルを用いる分類および予測能を評価するため、正常EC細胞調製物（n=17）、局所SI GEP-NEN（n=8）および悪性SI GEP-NEN（n=12）を含むSI GEP-NEN組織の独立セット（n=37）から得られたサンプルに対してリアルタイムPCRを行い、マーカー遺伝子の転写物発現を測定した。すべてのWDNETが「局所」とみなされ、他の腫瘍サブタイプは「悪性」とみなされた。線形相関する転写物対の評価により、トレーニングセットと類似のパターンが同定され、MTA1:MAGE-D2、MTA1:Kiss1、FZD7:NAP1L1およびサバイビン:Ki-67の転写物対が高度に相関していた（R2>0.50）。トレーニングされたSVMモデルを適用し、76%の正確度で正常EC細胞調製物と新生物を識別した。
【０３４１】
（図7に示される）結果は、（バイオマーカーが9種であるパネルのサブセットを用いた）この研究において、正常EC細胞が独立試験セットにおいて77%のみの正確度で交差検証され、76%の正確度で予測された（p=0.84）ことを示した。局所GEP-NENは、試験セットにおいて78%のみの正確度で交差検証され、63%の正確度で予測された（p=0.25）。悪性GEP-NENは、独立セットにおいて83%のみの正確度で交差検証され、83%の正確度で予測された（p=0.80）。この決定木モデルは、局所および悪性GEP-NENを、それぞれ63%および83%のみの正確度で予測することができた（図7）。トレーニングおよび独立セットの分類結果が有意に異ならないことを確認するため、F検定統計量を計算した。正常、局所および悪性サブグループのp値は、それぞれ、0.84、0.25および0.80であった。
【０３４２】
実施例4C：バイオマーカーが21種であるパネルからの発現レベルを用いる予測およびモデル化
正則化判別分析（RDA）アルゴリズムを設計し、これを上記のバイオマーカーが21種であるパネル
2014512172.tif 000048
の発現データに適用した。組織分類のための遺伝子選択は、各遺伝子および各クラス対のランクスコア（S）を：
2014512172.tif 000049
として計算することによって行った。式中、μC1およびμC2はそれぞれ第1および第2のクラスの算術平均を表し、σC1およびσC2はクラス間標準偏差である。大きなS値は実質的に異なる発現（「変化倍率」）および各クラス内の低い標準偏差（「転写物安定性」）を示す。遺伝子を、S値が漸減するよう分別し、これをRDAへの入力として使用した。
【０３４３】
RDAの正則化パラメータγおよびλを、LDA（γ=0およびλ=1で実施）とQDA（γ=0およびλ=0で実施）の間の中間分類器を設計するために使用した（Picon A, Gold LI, Wang J, Cohen A, Friedman E. A subset of metastatic human colon cancers expresses elevated levels of transforming growth factor beta 1. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1998;7(6):497-504）。過度のフィッティングを減らすために、交差検証誤差を最小化するが0.0001にはならないRDAパラメータを選択し、それによってRDAに、LDA、QDAおよびL2間の分類器を生成させた（Pima I, Aladjem M. Regularized discriminant analysis for face recognition. Pattern Recognition 2003;37(9):1945-48）。
【０３４４】
正則化パラメータをγ=0.002およびλ=0と定義した。各クラス対について、S値を個々の転写物の発現データに割り当て、次いでこれらをS値が漸減するよう配列した。RDAを、N回目の反復が上位N個のスコアの転写物からなるよう、21回実施した。誤差見積もりは、組織データセットを補集合サブセットに分割し、1つのサブセット（トレーニングセットと呼ばれる）において分析を行い、他のサブセット（検証セットまたは試験セットと呼ばれる）においてその分析を検証することによる、RDA分類器の10分割交差検証によって実施した。この作業を、試験・トレーニングセットのすべての並べ替えに対して実施し、そして誤分類の誤りを平均化させ、予測評価全体の変動性を減らした。
【０３４５】
実施例4D：21バイオマーカーパネルからの発現データを用いる、未知の組織およびGEP-NENの高感度、正確な数学的分類、GEP-NENサブタイプの識別ならびにGEP-NENの病期分類
このRDAアルゴリズムを、21種のバイオマーカー（MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、SPOCK1、HOXC6、CTGF、PTPRN2、SCG5およびTph1）のパネルについて上記のようにして得られた発現データに対して適用した。以下のように、GEP-NENの数学的分類のために、このアルゴリズムを使用し、未知の組織タイプ（EC（正常腸クロム親和性細胞））のサンプルを；「正常」（正常小腸粘膜）；「腫瘍」（原発性および転移性GEP-NENならびに癌腫（NET/NEC）の集塊）；ならびに原発性WDNET；WDNEC；PDNET；PDNEC）に区別した。
【０３４６】
各サンプルについて、最初に、その組織が正常か新生物かを決定した。次いで新生物とみなされた組織を評価し、それらが原発性であるか転移性であるかを決定した。次いでGEP-NENサブタイプ（原発性または転移性）の特徴付けを行った。RDAアルゴリズムを、すべての工程で、同じ学習パラメータのセット（γ=0.002およびλ=0）を用いて適用した。この分類器の性能を、誤分類率（任意の2つのクラス間の擬陽性の全体比率）を計算することによって測定した。
【０３４７】
結果が、（誤分類率 対 検出された遺伝子（バイオマーカー）転写物数、各区分で最高ランクの転写物から列挙する）表6A〜Cに示されている。
【０３４８】
（表６Ａ）誤分類率 対 検出された転写物数（正常 対 GEP-NEN；原発性 対 転移性）
2014512172.tif 000050
【０３４９】
（表６Ｂ）誤分類率 対 検出された転写物数（原発性GEP-NEN）
2014512172.tif 000051
【０３５０】
（表６Ｃ）誤分類率 対 検出された転写物数（転移性GEP-NEN）
2014512172.tif 000052
【０３５１】
図6A〜Cに示されているように、この方法およびRDAアルゴリズムは、正常EC細胞、正常小腸粘膜およびGEP-NENサブタイプのペアワイズ反復全体にわたり、誤分類率ゼロで、存在、病期および分類（サブタイプ）を検出できた。
【０３５２】
図6Aに示されているように、RDAアルゴリズムは、正常EC細胞と新生物組織を区別した。最高ランクのバイオマーカー転写物（PNMA2）のみの発現レベルの検出および分析では、0.08の誤分類率でこの区分を行うことができ；それぞれの最高ランクのバイオマーカー（CgA）のみの検出および分析では、0.21の誤分類率で正常SI粘膜と新生物組織の間の区分を行うことができた（表6A）。
【０３５３】
複数のバイオマーカーのデータにこの方法を適用する（バイオマーカーパネルの発現レベルを検出し、そのデータにRDAアルゴリズムを適用する）ことで、誤分類ゼロでGEP-NENと正常サンプルを検出および区別することができる。誤分類率ゼロでのEC細胞と腫瘍組織の区別は、八（8）種のバイオマーカー転写物のパネルを用いて達成された。誤分類率ゼロでの正常SI粘膜と腫瘍組織の区別は、二十（20）種のバイオマーカー転写物のパネルを用いて達成された（表7）。この研究において、誤分類率は、転写物が少なくなるほど高くなった。これらの結果から、異なる組織グループに特異的なバイオマーカーが実証され、そして高い特異度でGEP-NEN疾患を検出しGEP-NEN組織と異なる正常組織タイプを区別する本発明の方法の能力が確認された。
【０３５４】
同様に、バイオマーカーのパネルの発現レベルにRDAアルゴリズムを適用することで、100%の正確度で、未知の組織サンプルが原発性であるか転移性であるかを決定することができた。この決定のために、十八（18）種のバイオマーカー転写物の発現レベルが検出され、そしてそのデータがRDAモデルに含められ（表7）、少ない転写物を用いるほど誤分類率が高くなった。最高ランクの転写物（MAGE-D2）のみの発現の検出およびそれに対するアルゴリズムの適用により、誤分類率0.28で、原発性サンプルと転移性サンプルが区別された（表6A）。
【０３５５】
原発性GEP-NENサブタイプもまた、RDAアルゴリズムを用いることで、100%の正確度で識別することができた。最高ランクの転写物のみを検出した場合の誤分類率は、0.07（PTPRN2、PDNECとWDNECの間の区別の場合）から0.37（NRP2、WDNECとWDNETの間の区別の場合）の範囲であった。全21種のバイオマーカー転写物の発現レベルにRDAアルゴリズムを適用した場合、この方法は、WDNETとWDNECの間を誤分類率ゼロで区別し（表6B）、少ないバイオマーカーを用いるほど誤分類率が高くなった。
【０３５６】
表6Cに示されているように、RDAアルゴリズムはまた、100%の正確度で転移性GEP-NENサブタイプ間を区別するのにも使用された。最高ランクの転写物のみによる誤分類率は、それぞれ、0.22（CXCL14、WDNET METとWDNEC METの間を区別する場合）、0.2（NAP1L1、PDNEC METとWDNEC METの間を区別する場合）および0.17（NRP2、PDNEC METとWDNET METの間を区別する場合）であった（表6C）。
【０３５７】
（表７）様々な数の転写物の検出と誤分類率；最小の誤分類の達成；SVM、決定木（DT）および多層パーセプトロン（MLP）分類器
2014512172.tif 000053
「正常」=正常小腸粘膜；
「腫瘍」=原発性および転移性NETならびに癌種の集塊（NET/NEC）
【０３５８】
表8は、この実施例においてRDAアルゴリズムを用いて示されたサンプル間を区別することができたNETバイオマーカーの数を要約したものである。この実施例において、全21種のバイオマーカーが、誤分類ゼロで、WDNECとWDNETを区別した（転写物が少ないほど誤分類が多かった）。対照的に、わずか2種のバイオマーカーが、誤分類ゼロで、PDNECとWDNETの間（MAGE-D2、CXCL14）およびPDNECとPDNETの間（PTPRN2、MTA1）を識別することができた。この実施例において、11種のバイオマーカーが、誤分類ゼロで、正常腸クロム親和性（EC）細胞と正常SI粘膜を区別した（PNMA2、CXCL14、PTPRN2、Tph1、FZD7、CTGF、X2BTB48、NKX2-3、SCG5、Kiss1、SPOCK1、少ないバイオマーカーを用いるほど誤分類率が高くなった）。正常EC細胞と新生物組織の区別は、数種の転写物で可能であった（n=8、PNMA2、Tph1、PTPRN2、SCG5、SPOCK1、X2BTB48、GRIA2、OR51E1）。（CXCL14を除く）20種のバイオマーカーの発現により、誤分類ゼロで、正常SI粘膜と新生物組織を識別することができた（転写物が少ないほど誤分類率が高かった）。
【０３５９】
（表８）RDAによる分類率ゼロのペアワイズ区分に使用したバイオマーカー転写物の数
2014512172.tif 000054
【０３６０】
最後に、SVM、決定木（DT）およびMLP分類器を、上記のように、バイオマーカーが21種であるパネルの転写物のデータを用いて、RDAと同様の様式で、適用した。バイオマーカーが21種であるパネルの発現の検出によるGEP-NENサブタイプの分類に関して、RDAの性能をSVM、決定木および多層パーセプトロン（MLP）の性能と比較した。すべての分類器を、実施例4Aで概説されているトレーニングおよび交差検証プロトコルに供した。誤分類率を計算した（表7）。SVMは、PDNETとWDNECの区別で誤分類ゼロを達成することができた。決定木は、0.03（ECと腫瘍サンプルの間）から0.33（WDNEC METとWDNET METの間およびPDNEC METとWDNET METの間）の範囲の誤分類率で区別した。MLP分類器は、RDAにある程度匹敵し、7/13反復で、誤分類率ゼロを示し、高い全体正確度であった。RDAアプローチは、マーカー遺伝子が21種であるパネルを用いるこの実施例において最も信頼性が高く、すべての反復で誤分類率ゼロを達成した。
【０３６１】
実施例5：循環血中GEP-NEN細胞（CNC）の検出および血漿からのバイオマーカー転写物（mRNA）の同定
循環血中のGEP-NEN細胞（CNC）を、ヒト血液において、提供される方法およびバイオマーカーを用いて検出した。このプロセスのために、ヒト血液サンプル（血漿、軟膜および全血）を入手し、（GEP-NENバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子を検出するために）染色、細胞分別およびリアルタイムPCRに供した。
【０３６２】
実施例5A：血漿、軟膜および全血からのサンプルの調製およびRNAの単離
ヒト血漿および軟膜中のバイオマーカーの検出に関する以下の研究において、ヒト血液サンプルを、Yale New Haven Hospital, UppsalaまたはBerlinの血液データバンクから、健常対照（n=85）またはGEP-NEN疾患の処置を受けた患者（n=195）由来のサンプルと共に入手した。Kidd M, et al., "CTGF, intestinal stellate cells and carcinoid fibrogenesis," World J Gastroenterol 2007;13(39):5208-16を参照のこと。5mLの血液を、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む試験管に収集した。血漿を、2回の回転サイクル（2,000rpmで5分間）の後に軟膜から分離し、その後それを核酸の単離および／またはホルモン（CgA）の分析まで-80℃で保管した。
【０３６３】
様々な血液サンプルからのRNAの単離
軟膜からのRNAの単離のために、サンプルをTRIZOL（登録商標）と共にインキュベートし、その後にRNAを洗浄した。RNAの品質を評価するため、RNAをジエチルピロカーボネート水溶液中に溶解し、分光光度測定し、そしてアリコートをBioanalyzer（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）において分析した（Kidd M, et al. "The role of genetic markers--NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1--in defining small-intestinal carcinoid neoplasia," Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62）。
【０３６４】
GEP-NEN患者および対照の血漿からのRNAの単離のために、QIAamp RNA Blood Mini Kitを使用し（図11A）、これによって、この研究において、TRIZOL（登録商標）アプローチと比較して有意に多いサンプル中でのハウスキーピング遺伝子のリアルタイムPCR検出を実現した（図11B）（8/15 対 2/15、p=0.05）。全血から直接RNAを単離するために、QIAamp RNA Blood Mini Kitを製造元の手引きにしたがい使用した。
【０３６５】
サンプルの安定性および再現性
血液試験は、EDTA試験管に収集された1mlの全血中のGEP-NEN分子シグネチャーの同定に基づいている。この遺伝子シグネチャーは、凍結前に最大4時間（採血後4〜8℃で冷蔵）安定であることが決定された（図13）。これは絶食／摂食によって影響されない。アッセイ間再現性（別の日に処理された同じサンプル）の分析は、98.8〜99.6%の範囲であり、アッセイ内再現性は99.1〜99.6%であった。
【０３６６】
これらの研究は、この遺伝子シグネチャーが高度の再現性を有し（約99%）、（凍結前に）冷蔵下で最大4時間安定であり、そして絶食／摂食によって影響されないことを示している。
【０３６７】
リアルタイムPCR
血漿、軟膜および全血から上記のようにして得られた総RNAを、High Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems(ABI), Foster City, CA）を製造元推奨のプロトコルに従い用いる逆転写に供した。簡潔に説明すると、水50マイクロリットル中の2マイクログラムの総RNAを、Reverse Transcription Buffer、デオキシヌクレオチド三リン酸溶液、ランダムプライマーおよびMultiscribe Reverse Transcriptaseを含む50uLの2XRTミックスと混合した。RT反応は、サーマルサイクラーにおいて、Kidd M, et al., "The role of genetic markers--NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1--in defining small-intestinal carcinoid neoplasia," Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62に記載されるように、25℃で10分間、その後に37℃で120分間行った。マーカー遺伝子の転写物レベルは、Assays-on-Demand（商標）製品およびABI 7900 Sequence Detection Systemを製造元の推奨にしたがい用いて測定した（Kidd M, Eick G, Shapiro MD, et al. Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors. Cancer 2005;103(2):229-36を参照のこと）。
【０３６８】
サイクルは、TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix Protocolを用い、標準的な条件下で行った。簡潔に説明すると、384ウェル光学反応用プレートにおいて、水7.2uL中の相補的DNAを0.8uLの20 Assays-on-Demandプライマー・プローブミックスならびに8uLの2X TaqMan Universal Masterミックスと混合した。Kidd M, et al., "The role of genetic markers--NAP1L1, MAGE-D2, and MTA1--in defining small-intestinal carcinoid neoplasia," Ann Surg Oncol 2006;13(2):253-62に記載されるように、以下のPCR条件を使用した：50℃で2分間および次いで95℃で10分間、その後に95℃で15分間および60℃で1分間を50サイクル。生のΔCT（デルタCT=増幅の関数としてのサイクル時間の変化）を、geNorm（Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 2002;3(7):RESEARCH0034を参照のこと）ならびにハウスキーピング遺伝子ALG9、TFCP2およびZNF410の発現を用いて正規化した。Kidd M, et al., "GeneChip, geNorm, and gastrointestinal tumors: novel reference genes for real-time PCR," Physiol Genomics 2007;30(3):363-70を参照のこと。圧縮のために、正規化データを自然対数（ln）変換した。ALG-9をハウスキーピング遺伝子として使用し、その発現を検出し、そしてそれをGEP-NENバイオマーカーの発現データの正規化に使用した。
【０３６９】
統計分析のために、すべての計算を、統計計算用のR2.9言語を用いて実施した。R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing, 2008を参照のこと。両側検定を用い、p<0.05を有意とみなす、受信者操作特性（receiver-operator characteristic; ROC）曲線、フィッシャーの正確確率検定および／またはANOVAによるすべての統計分析に、GraphPad（Prizm 4）およびSPSS16.0を使用した。
【０３７０】
実施例5B：ハウスキーピング遺伝子の検出および全血における検出
三（3）種のハウスキーピング遺伝子（ALG9、TFCP2およびZNF410）の転写物発現レベルを、5名の健常ドナー由来の軟膜から上記のTRIZOL（登録商標）アプローチを用いて単離したmRNAにおいて決定した。3種すべての遺伝子が、30から35の間のΔCTレベルで検出された。例示的なプライマー対の配列および情報が表1Aおよび1Bに列挙されている。
【０３７１】
同じ3種のハウスキーピング遺伝子および11種のGEP-NENバイオマーカー遺伝子の転写物発現レベルを、3名の健常ドナー（正常サンプル）由来の全血から調製したmRNAにおいて評価した。この目的のために、異なる人物が、異なる日に、別のプレート上で、異なる日に独立して調製された試薬を用いて、mRNAを単離し、cDNAを合成し、そしてPCRを行った。検出された遺伝子発現レベルは、サンプル間で高度に相関していた（図11C；R>0.99、p<0.0001）。
【０３７２】
5種のハウスキーピング遺伝子（18S、ALG9、GAPDH、TFCP2およびZNF410）の発現を、5名の健常ドナー由来の全血サンプルからTRIZOL（登録商標）を用いて単離したmRNAに対するリアルタイムPCRによって検出した。プライマー対が表1Aおよび1Bに列挙されている。この研究では、ALG9の発現が、サンプル間で最も小さい変動を示した（変動係数=1.6%）（図13A）。ALG9の転写物レベルを、5名の健常対照患者由来の全血から単離したRNAに対するリアルタイムPCRによって、摂食前および摂食後30分間隔で、決定した。その結果は、ALG9の発現レベルが食後最大4時間有意に変化しないことを示した（nANOVAによる決定：p>0.05）（図13B）。これらの結果は、提供される方法にしたがう遺伝子産物の検出が一貫性のある結果をもたすことならびに別の研究者によって異なる日に取得および調製された患者サンプル由来のデータの比較に有用であることを実証している。
【０３７３】
ハウスキーピング遺伝子の記述
正規化において最も有用なハウスキーピング遺伝子を同定するために、GEP-NEN組織から同定されたもの（n=9）およびGEP-NEN血液トランスクリプトームのスクリーニングを通じて得たもの（n=10）を含む候補マーカーのパネル（n=19）を試験した。「ハウスキーパー」マーカーを選択するために、血液インタラクトーム（7,000遺伝子、50,000相互作用）_ENREF_3にマップしたときのトポロジー的重要性、リアルタイムPCR後の安定性（M値）ならびに血液中での転写効率、を含む多くの基準を使用した。加えて、標的遺伝子とハウスキーピング遺伝子の間の効率の存在を試験した。そのような相関関係は、計算において、相対的定量ベースのアルゴリズムを支援する。分析に含めた19種の遺伝子は、組織由来：18S、GAPDH、ALG9、SLC25A3、VAPA、TXNIP、ADD3、DAZAP2、ACTG1、および血液マイクロアレイ由来：ACTB、ACTG4B、ARF1、HUWE1、MORF4L1 RHOA、SERP1、SKP1、TPT1およびTOX4、であった。適当なハウスキーパーとみなされた標的は、3つ以上の特徴を示した。
【０３７４】
血液マイクロアレイにおけるトポロジー的重要性
3つのトポロジー的特徴を試験した：「次数」=各遺伝子における接続数；「中継性」=シグナル伝達における遺伝子の重要性、および「クラスタリング」=遺伝子の類縁体が相互接続されるクラスタリング係数または程度。高い「次数」は、遺伝子あたりの多くの接続を示し、高い「中継性」は、インタラクトーム内での情報の流れにおけるより重要な役割を示し、「高い」クラスタリング係数は、より多くの遺伝子の類縁体が相互に接続されていることを意味する。最も適当な遺伝子は、低い次数、中継性およびクラスタリング値を有するものであろう。これらすべての特徴を充足する遺伝子には、ACTB、TOX4、TPT1およびTXNIPが含まれる（図14A〜C）。遺伝子の序列は：TXNIP=ACTB=TOX4=TPT1>ALG9=ARF1>GAPDH>DAZAP2>VAPA=ATG4B=HUWE1=MORF4L1=RHOA=SERP1>ADD3である。
【０３７５】
変動性（変動係数およびM値）
ハウスキーピング遺伝子の発現の変動を評価するために、2つのアプローチ、つまりgeNormによって測定される、1つは変動性、次にロバスト性（「M」値）、を使用した。生のCT値を、変動について（図15）および発現がダゴスティーノ・ピアソン正規性検定に合格するかどうか（表9）を試験した。
【０３７６】
（表９）候補ハウスキーピング遺伝子および発現の正規性
2014512172.tif 000055
CV = 変動係数、DP = ダゴスティーノ・ピアソン一括正規性検定、N = 正常に分配されず、Y = 正規性テストに合格
【０３７７】
変動分析から、ALG9、ARF1、ATG4B、RHDAおよびSKP1が最小の変動性の遺伝子であることが分かった。サンプル間で最小の変動性（したがって最大の安定性またはロバスト性の発現）を示すものとしてgeNormによって選択された遺伝子が図16に示されている。「M」値は、遺伝子の安定性の尺度であり、その他すべての潜在的参照遺伝子に対する特定の遺伝子の平均ペアワイズ変動性と定義される。最も安定な遺伝子には：ALG9、ACTB、ARF1、ATG4B、HUWE4、MORF4L1、RHDA、SKP1、TPT1およびTOX4が含まれた。
【０３７８】
PCR効率
どの候補ハウスキーピング遺伝子が十分な増幅基準を充足するかを評価するため、PCR効率を試験した。これは、2つの独立サンプルにおいて、標準曲線（希釈：2000〜0.01ng/ul）を用いて行った。PCR効率は、フィンクの式：
効率 = 10^(-1/勾配)-1
を用いて計算した。
【０３７９】
分析により、18SおよびALG9が最も効率的に転写される組織由来遺伝子であり、TPT1が最も効率的に転写される血液由来の候補ハウスキーピング遺伝子であることが同定された（図17）。
【０３８０】
標的遺伝子と比較した増幅の有効性
最後に、標的および参照遺伝子の増幅動態を、類似性に関して試験した。これは、あらゆる適当なPCRプロトコルに必要な前提条件であり、それがなければ、過大見積もりされた発現の計算を扱うために定量アルゴリズムに補正因子が必要となる。それはまた、特に生データからの見積もりが標準曲線からのそれよりも正確なあらゆる比較CT法、例えばΔΔCTにとっても重要となる。
【０３８１】
一般に、ハウスキーピング遺伝子は、連続希釈によって標的・参照遺伝子のCTの差が≦0.1となる場合に適当とみなされる。標的遺伝子と類似のPCR有効性を共有していることが同定された1つのハウスキーピング遺伝子は、ALG9であった（図18）。
【０３８２】
血液マイクロアレイ由来の候補ハウスキーピング遺伝子はいずれも、ハウスキーピング遺伝子として機能する上で必要な適当な特徴を示さなかった。対照的に、組織由来の候補ハウスキーピング遺伝子であるALG9は、低い変動性（M値およびDP検定）、適当なトポロジー的特徴を示し、効率的に転写され、そして関心対象の標的遺伝子と類似の増幅特徴を共有していた。したがってこの遺伝子を、循環血中の腫瘍転写物を正規化するのに適したハウスキーピング遺伝子として選択した。
【０３８３】
標的の正規化
標的遺伝子の発現の正規化には、絶対定量および相対定量という2つの主要な方法がある。前者は、標準曲線を必要とし（したがってプレートの空きを使用し尽くし）、より作業が多く、かつ生のCT値に基づくプロトコルよりも正確度が低い。この研究では、相対定量アプローチに着目した。相対定量のために、Gentleモデル、Pfafflモデル、増幅プロットに基づくモデル、Q-GeneおよびgeNormを含む多くのアルゴリズムが開発されている。大部分の方法は、PCR効率の差を見積もりするメカニズムを含むか、多数のハウスキーパーを使用する、例えばgeNorm、かまたは商業的な入手のみが可能である（例えば、Biogazelle製のqBasePLUS）。使用が容易で見積もり要素を必要としない1つの方法は、ΔΔCTプロトコルである。これは、遺伝子発現の変化を実験サンプルと較正サンプル間の相対倍の差として計算する数学的モデルである。これは、ハウスキーパーおよび標的遺伝子の類似する増幅効率（ALG9で同定された特徴）に依存し、小さなPCR産物（150bp未満 - Applied Biosystems Taqmanの特徴）の増幅および最適化されたPCR法（例えば、標的の出発濃度が定められている）を必要とする。ΔΔCTアプローチを、末梢血中の51種の候補遺伝子の正規化のために選択した。このアプローチの有用性は、この方法（ALG9を用いるΔΔCT正規化）をgeNorm（18S、ALG9およびGAPDHを用いる正規化）と比較することで実証された（図19）。
【０３８４】
標的遺伝子発現の変動は、ΔΔCTプロトコルを用いた場合、対照サンプルにおいて有意に低く（p<0.004 対 geNorm）、大部分の標的がALG9を用いる正規化後に正規分布を示した（62% 対 0%、ダゴスティーノ・ピアソン一括正規化検定）。（ALG9を用いる）ΔΔCTプロトコルは、GEP-NEN腫瘍組織における標的発現を適切に正規化することが示された。ハウスキーピング遺伝子としてALG9を用いるΔΔCTアプローチは、51種の候補GEP-NENマーカー遺伝子に最も適した正規化プロトコルであることが分かった。したがって、このアプローチを、血液サンプル中の転写物発現のプロファイリングのために選択した。
【０３８５】
候補腫瘍マーカー遺伝子の同定
潜在的マーカー遺伝子を同定するため、組織ベースおよび血液ベースの両方の組織マイクロアレイを、候補マーカー遺伝子を検出するためのリソースとして、GEP-NENサンプルから得た。多くの生物数学アルゴリズムを適用および構築することによって、遺伝子選択を最適化した。
【０３８６】
最初に、（小腸から得られた）GEP-NENのトランスクリプトームを分析し、これを正常小腸粘膜（U133Aチップ、n=8腫瘍およびn=4対照）と比較した。dCHIP（下限変化倍率≧1.2倍、対応のないt検定およびピアソン相関に基づく階層的クラスタリング）を使用し、腫瘍サンプルにおいて1,451種の上方制御された遺伝子を同定した。上方制御のレベル（3倍超、例えばNAP1L1）、既知の生物学的プロセス（増殖、例えばKi67；生存性、例えばサバイビン）および臨床的意義（例えば、ソマトスタチン受容体の発現、CgA）に基づき、32種の候補マーカーを選択した。別の研究において、GEP-NENの悪性度を予測するものとして、これらの候補マーカーのうちの9種の、腫瘍組織におけるPCRベースの発現を確認した。今回の研究では32種の候補遺伝子をさらに試験し、17種を最終遺伝子パネルに含めた。
【０３８７】
第2のストラテジーとして、腫瘍組織の2つのマイクロアレイデータセット（HUGEおよびU133A、合計でn=30腫瘍およびn=10対照）を利用し、（小腸部位から得られた）GEP-NENを、公的に利用可能なデータベースの他の腫瘍（乳癌、結腸癌、前立腺癌および肝癌）と比較した。GEP-NEN遺伝子の全体景観をさらに描写し、候補マーカーの同定を手助けするために、局所神経内分泌細胞の活動をかく乱することが公知であり、SI-NENのリスクと関連するクローン病由来の小腸物質も評価した。関与する遺伝子の関係を評価するために、遺伝子共発現ネットワークのグラフ理論分析を構築した。このアプローチにより、（2つのプラットフォームU133AおよびHUGEを統合することによって生成された）「GEP-NEN」遺伝子ネットワークが6,244種の遺伝子および46,948個のリンクからなることが決定された。この遺伝子ネットワークは高度にモジュール的（すなわち、相互接続コミュニティを組織する傾向がある遺伝子）であり、したがって機能的に関連する遺伝子を含むものであった（それらは同一コミュニティ内で見られる）。偏りのないコミュニティ検出アルゴリズムにより、各々20種以上の遺伝子を含む20個のコミュニティ（関連遺伝子の集合）が同定された。生物学的プロセスに関する各遺伝子コミュニティの濃縮により、「酸化還元」（クラスター1/2）、「免疫応答」（クラスター5）および「細胞周期」（クラスター18）を含む用語が同定された。重要なことは、GEP-NEN遺伝子ネットワークが他の一般的な（しかし類似性を共有する）癌からクローン病までとはトポロジー的に区分されることが分かったことであった（図20A）。後者は、クローン病における神経内分泌細胞の既知の増殖を反映し得る。
【０３８８】
このトポロジー的区分は、遺伝子または遺伝子相互作用のパネルが腫瘍（GEP-NEN）に特異的であり得るという情報を提供する、インタラクトーム内の各遺伝子を取り巻く特有の接続パターンを反映したものであった。そのような腫瘍特異的シグネチャーは、乳癌、結腸癌、前立腺癌および肝癌の遺伝子ネットワークにおいて見出された遺伝子・遺伝子相互作用をGEP-NEN遺伝子ネットワークから除外することによって生成した。得られたGEP-NEN特異的シグネチャーは、124種の遺伝子および150個の相互作用を示した（図20B）。
【０３８９】
これら124種のGEP-NEN特異的遺伝子をU133A組織ベースのマイクロアレイに戻しマッピングすることにより、41種遺伝子が差次的に発現され、そのうちの21種が上方制御され（図20C）、GEP-NENと対照の間で識別可能である（図20D）ことが分かった。これら21種の上方制御遺伝子をさらに試験し、12種を最終遺伝子パネルに含めた。
【０３９０】
第3のストラテジーとして、追加の候補マーカーを同定するために循環血中GEP-NENトランスクリプトームを試験した。これらの研究のために、末梢血トランスクリプトーム（n=7対照、n=7 GEP-NEN）を、「インハウス」組織アレイ（n=3対照、n=9 GEP-NEN［小腸由来］）およびArrayExpressデータベース由来の1つの公開されたアレイ（アクセッション番号：E-TABM-389：n=6対照、n=3原発性中腸NENおよびn=3 GEP-NEN転移物［MET］）と比較した。
【０３９１】
腫瘍サンプルは、対照から明確に識別され（図21A〜C）、そして差次的に発現される遺伝子が、各グループ：血液（n=2,354）、「インハウス」（n=1,976）および公開データセット（n=4,353）、で同定された（図21D〜F）。
【０３９２】
期待通り、「インハウス」および公開組織データセットにおいて、遺伝子発現の変化の間に大きな相関がみられた（R=0.59、図22A）。血液と「インハウス」および公開データセットの間の相関は低かった（それぞれ、R=-0.11および-0.05）（図22A、B）。483種の有意に変化した遺伝子のうちの157種（33%）（「インハウス」／血液）および947種の有意に変化した遺伝子のうちの423種（45%）（公開／血液）が、正の相関を示した。
【０３９３】
全体として、血液、「インハウス」および公開データセットの間では、85種の遺伝子が血液および組織において相関し、196種が逆または反相関した（図23A）。相関遺伝子は、細胞内シグナル伝達、細胞死および転写調節等のプロセスをエンコードし（図23B）、反相関遺伝子は、テロメア維持、神経管発達およびタンパク質複合体形成等のプロセスをエンコードするものであった（図23C）。
【０３９４】
血液および組織の両方で同程度に発現される85種の遺伝子のうちの39種（46%）は上方制御され、46種の転写物が下方制御されていた。上方制御される遺伝子の分析により、22種が0〜3個のパラログを有し、3倍を超えるレベルで発現されることが分かった。これらの遺伝子を血液インタラクトームに統合することにより、それらが（インタラクトームのより中心で）高度に相互接続されることが確認され、GEP-NENに関するそれらの「推定」生物学的関連性が実証された（図24）。
【０３９５】
腫瘍組織および循環末梢血転写物の分析および統合を含むこれらのアプローチにより、GEP-NENに関連する75種の候補バイオマーカー遺伝子のパネルを同定することができた。次に、GEP-NENの同定におけるこれらの遺伝子の有用性を、末梢血サンプルにおいて研究した。
【０３９６】
循環血中GEP-NENのフィンガープリント（マーカーが51種である遺伝子パネル）
使用可能なマーカーパネルを構築するため、77個の血液サンプル（対照：n=49；GEP-NEN：n=28）から単離したmRNAにおける75種の候補マーカーの各々の転写物レベルを測定した。1段階プロトコルよりも正確である、2段階プロトコル（RNA単離、cDNA生成およびPCR）を構築した。2段階プロトコルの再現性は高い（ピアソン相関>0.97；2段階アプローチにおける相関は0.987〜0.996である）。予備的研究において、血液サンプルからのmRNA単離の好ましい方法は、cDNAをHigh Capacity Reverseトランスクリプターゼキット（Applied Biosystems: cDNA生成2000〜2500ng/ul）を用いて生成する、ミニブラッドキット（Qiagen：RNAの品質>1.8 A260:280比、RIN>5.0、PCR用途に適合37）であった。リアルタイムPCRは、常に、384ウェルプレートおよび16ulの試薬／ウェル（Fast Universal PCRマスターミックス、Applied Biosystems）を用いるHT-7900機において200ng/ulのcDNAを用いて実施した。PCRの検出限界を40サイクルと決定した（200ng/ul cDNAが95.3±0.2%の例で陽性増幅した）。サイクル数を45〜50サイクルに増やすと、陽性発現が標的サンプルの1%未満となることが分かり；偽陰性率は、40のCTカットオフを用いて0.8%と計算された。このサイクル数は、白血病の検出に関して受け入れられている欧州アプローチよりも厳しいが、他のPCRベースの検出プロトコルと同程度である。プライマーは、ゲノムDNAの増幅を最小限にするために、エクソン間を橋渡しする（exon spanning）ようにし、かつ150bp未満とした。市販のApplied Biosystems製プライマー（5'-ヌクレアーゼアッセイ）を使用した。RNA単離、cDNA合成およびリアルタイムPCRでパラメータを一貫させることにより、安定な標的・ハウスキーピング遺伝子分析用プラットフォームが適用される。
【０３９７】
75種の候補マーカーのうちの51種が、血液中で検出可能な産物を産生する（CT<40サイクル）ものと同定された。この、遺伝子が51種であるパネルは：
2014512172.tif 000056
を含んでいた。これら51種のマーカー遺伝子のうちの13種は、以前の研究または他の研究のいずれかにおいて、以前にGEP-NENと関連していたものであった。
【０３９８】
潜在的に有用なマーカー遺伝子パネルを定義した後、GEP-NENトランスクリプトームのリソースを、好ましいハウスキーピング遺伝子を同定し好ましいデータ正規化法を決定するために試験した。適当なハウスキーピング遺伝子を同定し正規化プロトコルを適用することにより、51種の候補転写物の各々の定量が容易になり、それらがGEP-NENマーカー遺伝子のパネルを表すものであるかどうかが決定される。
【０３９９】
実施例5C：全血中の循環血中GEP-NEN細胞およびバイオマーカーの発現の検出
リアルタイムPCR、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞分別（FACS）による分別を用いて、CD164を、全血中の循環血中GEP-NENを検出することができるマーカーとして同定した。リアルタイムPCRによるCD164転写物の発現レベルの検出により、このバイオマーカーが、正常EC細胞および白血球と比較してGEP-NEN患者サンプルにおいて一貫して過剰発現（300〜10,000x）される（29/29個のGEP-NEN細胞および4株のGEP-NEN細胞株）ことが実証され、CD164がヒトサンプル、例えば全血中のGEP-NEN細胞の同定用のバイオマーカーとして有用であることが実証された。
【０４００】
10名のGEP-NEN患者および10名の年齢・性別一致対照から得られた全血サンプルにおいて多パラメータフローサイトメトリーを行った。アクリジンオレンジ（AO）-PE-CY7およびCD164-APCに対して二重陽性を示したGEP-NEN細胞サイズ選択細胞（図25A）の集団は、GEP-NENサンプルにおいては検出されたが、正常対照サンプルには存在しなかった（図25B）。TPH発現に関するこれらの細胞の収集および免疫染色により、これらがセロトニン陽性GEP-NEN細胞であることが確認された（図25C、差し込み図）。
【０４０１】
AOおよびCD164による二重標識の後、血液1mLあたり3〜12個のGEP-NEN細胞をFACSにより分別し収集した。リアルタイムPCRにより、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化された上記の21個のGEP-NENバイオマーカー（MAGE-D2、MTA1、NAP1L1、Ki67、サバイビン、FZD7、Kiss1、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、OR51E1、PNMA2、SPOCK1、HOXC6、CTGF、PTPRN2、SCG5およびTph1）の発現レベルが正常全血サンプルと比較して上昇（2倍超、p<0.03）していることが分かり、これによりこれらの細胞がGEP-NEN腫瘍細胞であることが確認された。転移性疾患を有する6名の患者から得られたサンプルでは、局所疾患を有する4名の患者と比較して有意に高い発現レベル（3〜5倍、p<0.05）が同定された。
【０４０２】
12名の患者から得られた全血から直接調製されたRNAにおいて、GEP-NENバイオマーカーが13種であるパネルの発現をリアルタイムPCRにより検出した。比較のために、（上記の）FACS精製した循環血中GEP-NEN細胞および同研究の12名の患者由来の腫瘍粘膜から精製されたRNAにおいても平行してPCRを行った。全血中で検出されたバイオマーカー転写物の発現レベルは、精製された循環血中GEP-NEN細胞において（R2=0.6、p<0.0001）（図26A）および腫瘍組織において（R2=0.81、p<0.0001）（図26B）検出されたレベルと高度に相関した。
【０４０３】
これらの結果から、循環血中GEP-NEN細胞（CNC）が、血液中に存在すること、ならびに本明細書に提供される方法および組成物による検出、病期分類、予後および予測のために、全血およびその他の血液サンプルから調製されたRNAを用いるPCRによって検出できること、が確認された。
【０４０４】
実施例5D：全血サンプルを用いるGEP-NENバイオマーカー発現の検出および統計分析
1）55名のGEP-NEN患者（すべて外来、高レベル疾患を有する患者および無疾患と判断された患者を含む）ならびに47名の対照患者を含むYale New Haven Hospital由来のトレーニンググループ、2）Berlin由来の独立試験グループ（n=144（n=120患者、n=24対照））ならびに3）Uppsala由来の独立試験グループ（n=34（n=20患者；n=14対照））のそれぞれから得られた3グループのヒトサンプル由来の全血サンプルにおいて、個別のバイオマーカー転写物（VMAT2、NAP1L1およびPNMA2）の発現レベルならびに十三（13）種のGEP-NENバイオマーカー（APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT2）のパネルの総発現レベルを上記のようにしてリアルタイムPCRによって決定した。プライマー対の配列およびプライマーに関するその他の情報は、表1Aおよび1Bに列挙されている。
【０４０５】
表示し易くするために、13種のバイオマーカー転写物の検出された発現レベルをベクトル的に合計し（>+1=Σ過剰発現された遺伝子；>-1=Σ発現が減少した遺伝子）、これをプロットした。
【０４０６】
グループ（1）サンプルでは、GEP-NENの同定のために、ROC曲線ストラテジーを使用した。結果は、GEP-NEN患者サンプルにおける3つの個別のバイオマーカー転写物の曲線下面積（AUC）が0.66〜0.90（総転写物では0.92（V1:p<0.0001））の範囲であったことを示した（各々のROCを示す、図27）。総転写物発現レベルを用いてGEP-NEN疾患を決定する上での感度、特異度、陽性的中度、陰性的中度は、それぞれ、96.1%；90.2%；83.3%；および97.9%であった。予測されたカットオフの使用を、2つの独立試験セット（2）および（3）において試験した。V1の感度および特異度は、95〜97%および81〜87%の範囲であった。血液中で検出された転写物発現（マン・ホイットニースコア=0.11、p=0.19）レベルに性別が関係しないことも観測された。-80℃での保管は、検出された13種のバイオマーカーの転写物発現レベルに有意な効果を示さなかった（R=0.987〜0.996、p<0.0001）。
【０４０７】
ハウスキーピングおよび総GEP-NENバイオマーカーの転写物発現レベルを、29名の対照および患者サンプル（YaleおよびBerlin）において検出し、2回の別個のPCR実施により別の日にアッセイした。ハウスキーピング遺伝子ALG9およびGEP-NENマーカーFZD7の発現は各々、2回の別個の実施により別の日にアッセイした場合に高度に相関し：R2：0.92〜0.97、p<0.0001（図28A〜B）、別の日の対照および腫瘍サンプルにおける正規化されたFZD7間では有意差は見られなかった（図28C〜D）。アッセイ内およびアッセイ間再現性はFDZ7で高く（C.V.=2.28〜3.95%）、これにより、標的遺伝子の血液測定が高度な再現性を有することが実証された。この結果は、全血から得られたRNAに対するリアルタイムPCRを用いるハウスキーピングおよびGEP-NENバイオマーカー検出のアッセイ内およびアッセイ間再現性を実証している。
【０４０８】
これらのデータは、全血中でのGEP-NENバイオマーカーの転写物発現レベルの検出が循環血中GEP-NEN細胞（CNC）の同定に使用できること、全血中で検出された発現レベルが組織発現レベルと良く相関すること、高い感度および特異性ならびに高い再現性でGEP-NEN患者を同定できること、を実証した。
【０４０９】
実施例5E：病変および処置応答の検出
循環血中GEP-NENシグネチャーとしての技術としてのマーカー遺伝子が51種であるパネルの、これらの病変および処置応答を検出する上での有用性を評価するため、130サンプル（対照：n=67、GEP-NEN：n=63［未処置疾患、n=28、処置、n=35］）の試験セットを構築した。すべてのマーカーに対してPCRを行い、そして値を、集団対照（較正サンプル）として対照グループを用いて、ALG9（ΔΔCT）に対して正規化した。マーカーパネルの有用性を明らかにするためのワークフローは、遺伝子発現の正規化（ANOVAは51種の遺伝子のうちの39種が全3セットにおいて差次的に発現されることを明らかにした）およびサポートマシンベースの数学的評価を含んでいた。
【０４１０】
4つのアルゴリズムを用いて、平均88%の正答コール率を決定し（図29）、その性能測定基準が表10に含まれている。正常サンプルとGEP-NEN（処置および未処置の両方）を識別するための分子試験のデータは以下の通りである：全体感度（94.0%）、特異度（85.7%）、陽性的中度（PPV）（87.5%）および陰性的中度（NPV）（93.1%）。
【０４１１】
（表１０）正常サンプルとGEP-NENの区別の性能評価
2014512172.tif 000057
【０４１２】
同じ遺伝子パネルを用いて、以下の性能測定基準で処置および未処置GEP-NENを区別できることを決定した（表11）：感度=85.7%、特異度=85.7%、PPV=88.2%およびNPV=82.8%。
【０４１３】
（表１１）処置と未処置のGEP-NENの区別の性能評価
2014512172.tif 000058
【０４１４】
NENと対照を識別する試験としての全体性能について、そのコール率は94%であり、処置サンプルを同定する能力は85%であった。
【０４１５】
これらの結果は、（グループとしての）51種の候補マーカーの発現の分析を実現するパターン認識プロトコルが、「正常」か「GEP-NEN」かの間を識別する上で有用であることを示している。これにより、腫瘍組織において使用されたアプローチ、例えばSVMが末梢血転写物分析および神経内分泌腫瘍疾患の同定に適用可能であることが確認された。
【０４１６】
実施例5F：GEP-NENの予測因子としての分子フィンガープリントの評価
この51マーカー遺伝子パネルの潜在的試験としての有効性を4つの独立データセットにおいて試験し、GEP-NEN 対 対照を正確に同定できるかどうかを確認した。4つの独立セットを構築した：独立セット1は35個のGEP-NENおよび36個の対照を含み；独立セット2は33個のGEP-NENおよび31個の対照を含み；独立セット3は47個のGEP-NENおよび24個の対照を含み；そして独立セット4は89個のGEP-NENを含み対照を含まなかった。
【０４１７】
各独立セットにおいて血液サンプルがGEP-NENであるか対照であるかを決定する上での有用性について、4つのアルゴリズム：SVM、LDA、KNNおよびベイズ、を評価した。表にまとめられている結果は、（GEP-NENおよび対照の両方を正確に同定する）全体正答コール率が独立セット1において56〜68%、セット2において53〜78%、セット3において82〜92%およびセット4において48〜74%の範囲であることを明らかにした（表12）。全セットの平均コール率は、SVM、LDAおよびベイズの場合67〜69%であり；KNNはより高い73%を記録した。
【０４１８】
（表１２）各独立セットにおける各アルゴリズムの全体コール率（百分率）
2014512172.tif 000059
【０４１９】
このコールのさらなる分析は、正答コール率が対照または腫瘍サンプルの同定に対応したかどうかを明らかにした（表13）。対照に関して最も一貫性のある正答コールはSVM（全体で90%）およびLDA（91%）アルゴリズムであった。GEP-NENに関して最も高い正答コール率は、ベイズアルゴリズムにおいて見られた（85%）。
【０４２０】
（表１３）各独立セットにおける、対照またはGEP-NENの各グループのコール率（百分率）
2014512172.tif 000060
NA=適用可能でない（このセットに対照が含まれていなかった）
【０４２１】
3つの独立セットにおいて各アルゴリズムについて計算された感度、特異度、陽性的中度および陰性的中度が表14に含まれている。
【０４２２】
（表１４）各独立セットにおける各アルゴリズムの性能測定基準
2014512172.tif 000061
A=感度、B=特異度、C=陽性的中度、D=陰性的中度。セット4は対照を有さなかった。
【０４２３】
ベイズアルゴリズムがGEP-NENの検出に関して最高の性能を示し（感度=83%）、SVMアルゴリズムが対照の決定に関して最高の性能を示した（特異度＝96%）。ベイズの弱点は、高い擬陽性であり；SVMの弱点は、多数の十分処置された（完全寛解／安定疾患）サンプルを示すサンプルセットでは十分な性能を発揮しないことである。
【０４２４】
NENと対照を識別する試験としての全体性能に関して、SVM、LDAおよびKNNのアルゴリズムは、約90%の陽性的中度および70%の陰性的中度を有していた。
【０４２５】
実施例5G：GEP-NEN同定のためのマーカー遺伝子が51種であるパネル
マーカー遺伝子が51種であるパネルが有効であることを確認するため、このパネルの正答コール率を各独立セットにおいて比較し（表12）、かつこれをマーカーが13種およびマーカーが25種のサブセットと比較した。マーカーが13種であるサブセットは、組織におけるGEP-NEN悪性腫瘍を予測することが確認された遺伝子に限定され；マーカーが25種であるパネルは、これらの遺伝子と、図20Dで同定された追加の12種のGEP-NEN特異的遺伝子を含むものとした。4つの独立セットの各々において正答コールを試験することにより、マーカーが51種であるパネルが、マーカーが13種またはマーカーが25種のいずれのパネルよりも有意に良い性能を示すことが分かった（図30）。
【０４２６】
これらの結果は、この51種の候補マーカー遺伝子に基づく多くのパターン認識プロトコルが高い効率および感度で対照サンプルとGEP-NENの間を区別できることを示している。
【０４２７】
実施例5H：治療応答の評価および転移の予測のための、全血におけるGEP-NENバイオマーカー発現レベルの検出（CgAとの比較）
治療的介入（摘出およびオクトレオチドLAR）の前および後に、全血において総GEP-NENバイオマーカー転写物発現レベル（バイオマーカーが13種のパネル）の検出を行い、それにより、提供される方法およびシステムの態様の臨床的有用性が実証された。さらに、CgA発現のみの検出と比較することにより、GEP-NENの検出、リスク決定および治療応答の観察における、提供される方法の改善された感度が実証された。CgAは、Modlin IM et al., Chromogranin A-Biological Function and Clinical Utility in Neuro Endocrine Tumor Diease, Ann Surg Oncol. 2010 Sep;17(9):2427-43. Epub 2010 Mar 9に記載されるように、GEP NETの60〜80%に存在するSI GEP-NENマーカーである。
【０４２８】
外科的介入後のGEP-NENバイオマーカーの検出
9名の患者が、小腸および肝臓の転移物の摘出を受けた（それによって腫瘍量がおよそ90%削減された）。GEP-NENバイオマーカー13種の総転写物（APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT2）の発現レベルを、上記のように、外科手術の1日前および次いで術後2週間で採取した全血サンプルから調製したサンプルに対するリアルタイムPCRを用いて決定した。
【０４２９】
結果が図31に示されている（水平バーは外科手術前および後の算術平均発現レベルを表している）。外科手術の2週間後に、（上記の）GEP-NENバイオマーカーレベルの総発現レベルは有意に（手術前の算術平均84から手術後の算術平均19へ、75%超の減少、p<0.02）減少した（図31A）。図31Bに示されているように、CgA発現レベルのみの検出は、有意な減少を示さなかった（算術平均発現で20%の減少）。
【０４３０】
これらの結果は、提供される方法およびシステムによって検出されるバイオマーカー発現レベルが腫瘍の除去を正確に反映し、外科的介入の応答性および有効性の評価に使用できることを実証している。
【０４３１】
ソマトスタチンアナログ（サンドスタチンLAR（登録商標）（酢酸オクトレオチド注射））薬物治療後のGEP-NENバイオマーカーの検出
（上記の）バイオマーカー13種の総発現レベルを、また、ソマトスタチンアナログであるサンドスタチンLAR（登録商標）（酢酸オクトレオチド注射）による処置の前、1ヶ月後および2ヶ月後に、リアルタイムPCRにより8名の患者サンプルにおいて検出した。その結果が図32に示されている。
【０４３２】
結果は、総バイオマーカー転写物の発現が継続処置1ヶ月後に有意（p=0.017）に減少することを示した。継続処置6ヶ月後には、転写物レベルは、さらに50%減少し（p=0.06 対 1ヶ月）、正常範囲となった（図32A）。対照的に、CgA発現レベル単独では、LAR（登録商標）処置1ヶ月後に有意な変化が観測されず（図32B）；この研究では、検出されたCgA発現単独のレベルは、6ヶ月の時点でのみ減少していた。これらの結果は、外科的介入に関して、提供されるバイオマーカー検出システムおよび方法が、LAR（登録商標）処置の観察のために使用できること、単一のGEP-NENバイオマーカー単独、例えばCgAの検出と比較して高い感度を提供することを示している。
【０４３３】
個別患者における少量の微小転移物の早期検出および処置の有効性の評価
それぞれ冷凍アブレーションおよび肝転移物摘出によって処置された2名の個別患者における処置の有効性を評価しリスクを予測するために、（上記のような）13種のGEP-NENバイオマーカー総発現レベルを観察した。
【０４３４】
転移性小腸（SI）GEP-NENを有する63歳男性の患者SKは、定位放射線治療（SRS）／コンピューター断層撮影（CT）によって正常と評価され、無疾患とみなされた。全血における転写物の総発現を、上記のようにしてリアルタイムPCRを用いて評価した。その結果は、図33に示されており、CgAが正常発現レベルであることを示した。対照的に、13種のGEP-NENバイオマーカー（APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAF1、TPH1、VMAT2）のパネルの総発現レベル（「PCR(+)」）は上昇した（図33）。この情報に基づき、患者はスウェーデンにおいて11C-PET-CTを受け、それによっておよそ0.5cmの肝転移物を有していることが確認された。その後、この患者は、Mazzaglia PJ, et al., "Laparoscopic radiofrequency ablation of neuroendocrine liver metastases: a 10-year experience evaluating predictors of survival," Surgery 2007;142(1):10-9に記載されるように、兆候を誘導するGEP-NEN組織を血中に流入させるよう切り離す、冷凍アブレーションを受けた。
【０４３５】
発現レベルを、冷凍アブレーション後6ヶ月の間、毎月、全血から調製したRNAに対するリアルタイムPCRによって観察した。その結果は、冷凍アブレーション後にバイオマーカーパネルの発現レベルが上昇するが、CgA単独のそれは上昇しないことを実証した。冷凍アブレーション後4〜5ヶ月の間に、骨微小転移物が同定され；PCRは、これらの微小転移物の出現がGEP-NENバイオマーカーパネルの転写物発現レベルの上昇と相関することを実証し；CgA発現単独は正常として検出された。（GEP-NEN細胞の分泌および増殖をブロックする）LAR（登録商標）療法後、血中のバイオマーカーパネルの発現レベルを、正規化のために決定した（リアルタイムPCR）。
【０４３６】
この研究は、提供される方法によるGEP-NENバイオマーカーパネルの検出が、急性的なGEP-NEN関連イベントを正確に反映できることを実証し、予後および予測分析ならびに処置の有効性の評価ならびに再発または早期段階の疾患の検出においてGEP-NENバイオマーカーを検出する上での、特に疾患が希な微小転移に限定される場合の、提供される方法およびシステムの改善された感度（例えば、利用可能なバイオマーカーであるCgA単独の検出と比較して）を実証している。
【０４３７】
T2N1M1グレードの転移性小腸GEP-NENを有する69歳女性の患者BGは、小腸および肝転移物の外科的摘出を受け、その後にオクトレオチドLAR（登録商標）による処置を9ヶ月間受けた。CgAおよび13-GEP-NENバイオマーカー（「PCR(+)」）の発現レベルを、外科手術前、術後2週間および12ヶ月間毎月の、上記のような全血サンプルに対するリアルタイムPCRによって観察した。すべての兆候は、処置12ヶ月後に解消した。図34に示されるように、CgA発現レベル単独の検出は、大きな揺れを示したが、これは処置または兆候の減少と相関しなかった。対照的に、バイオマーカーパネルの発現レベル（「PCR(+)」）は、術後2週間の測定で、外科的な腫瘍の摘出後に有意に減少したこと、およびLAR（登録商標）処置後に有意に減少し、その減少が（すべての兆候が解消される時点である）12ヶ月まで維持されること、が検出された。
【０４３８】
この研究は、提供される方法によるGEP-NENバイオマーカーパネルの検出が、疾患の重篤度および処置に対する応答性を高感度で反映でき、利用可能なバイオマーカーを検出する方法を上回る改善を提供することを実証している。提供される方法およびシステムは、処置応答および再発を観察するのに有用であり、GEP-NEN疾患の存在（図33）および非存在（図34）の両方を高い忠実度で検出することができる。これらの結果は、提供されるバイオマーカーの血液中検出が、さらなる診断・処置的価値、例えば外科手術（腫瘍の除去）または標的医薬療法（腫瘍の分泌／増殖の阻害）の効果を観察するための処置有効性の代理マーカーとしての価値、を提供することを実証している。Arnold R, et al., "Placebo-controlled, double-blind, prospective, randomized study of the effect of octreotide LAR in the control of tumor growth in patients with metastatic neuroendocrine midgut tumors: A report from the PROMID study group," ASCO 2009, Gastrointestinal Cancers Symposium, Abstract #121.2009を参照のこと。
【０４３９】
実施例6：処置有効性の指標としての分子フィンガープリントの評価
潜在的試験としてのこのマーカー遺伝子が51種であるパネルの有効性を4つの独立データセットにおいて試験し、処置応答性（臨床的に、完全寛解であるまたは安定疾患を示すと分類されるもの）または未処置（処置ナイーブ）または非応答性（臨床的に、「進行性」と分類される）腫瘍の間を識別できるかどうかを確認した。加えて、マーカー遺伝子が51種であるパネルのうちのマーカーが13種であるサブセットを、治療に対する応答に関する追加情報を提供するのに使用できるかどうか、特に、安定疾患と比較して、進行性、未処置疾患に関してより詳細な情報を提供できるかどうかを決定するために評価した。
【０４４０】
独立セット1は、35名のGEP-NENを含んでいた。完全な臨床的詳細がすべての患者について入手可能であり；サンプルのうちの33名は完全寛解であるまたは安定疾患を有するとみなされた。サンプルの60パーセントは処置中であった（主にLAR：96%）。
【０４４１】
独立セット2は、32名のGEP-NENを含んでいた。完全な臨床的詳細が全員について入手可能であり；サンプルのうちの28名は完全寛解であるまたは安定疾患を有するとみなされた。サンプルの84パーセントは処置中であった（LAR：約40%、外科手術約25%）。
【０４４２】
独立セット3は、47名のNENを含んでいた。完全な臨床的詳細が全員について入手可能であり；サンプルのうちの30名は完全寛解であるまたは安定疾患を有するとみなされた。サンプルの56パーセントは処置中であった（LAR：約75%）。
【０４４３】
独立セット4は、89名のGEP-NENを含んでいた。完全な臨床的詳細がすべての患者について入手可能であり；サンプルのうちの71名は完全寛解であるまたは安定疾患を有するとみなされた。サンプルの46パーセントは処置中であった（主にLAR：85%）。
【０４４４】
血液サンプルが「処置」の表現型（臨床的応答性／安定疾患）に関連するかどうかまたは未処置／進行性疾患を同定できるかどうかの決定における有用性に関して、4つのアルゴリズム：SVM、LDA、KNNおよびベイズ、を評価した。「正常」または「処置」とコールされた腫瘍サンプルは、「処置」または臨床的応答性（「応答体」）の表現型を示すものとみなした。「未処置」とみなされたものは、非応答性（「非応答体」）に分類した。グループとしてのアルゴリズム（「投票」アルゴリズム）を有用性について評価し、そしてこれは4つのアルゴリズムのうちの上位3つからの正答コール率を含むものである。
【０４４５】
表にまとめられている結果は、（適切に処置されたサンプルおよび非応答性のサンプルの両方を同定する）全体正答コール率が独立セット1において73〜94%、セット2において81〜89%、セット3において82〜94%およびセット4において72〜94%であることを示している（表15）。各アルゴリズムの平均コール率は83〜88%であった。上位「3/4」の組み合わせは、同様の（88%）の正答コール率を示した。
【０４４６】
（表１５）各独立セットにおける各アルゴリズムの全体コール率（％）
2014512172.tif 000062
【０４４７】
これらのコールのさらなる分析により、正答コール率が、臨床的応答性の患者または処置に応答性でない個体由来のサンプルの同定に対応することが分かった（表16）。
【０４４８】
（表１６）各独立セットにおける臨床的応答性または非応答体の各グループのコール率（％）
2014512172.tif 000063
*=これら2つのセットの各々においては2名および4名の患者しか「非応答体」に分類されなかったため分析から除外した
【０４４９】
「応答体」に関して最も一貫性のある正答コールは、KNNアルゴリズムにおいて見られた（約97%）。「非応答体」に関する最高の正答コール率は、SVMおよびLDAアルゴリズムであった（約80%）。
【０４５０】
3つの独立セットにおいて各アルゴリズムで計算された感度、特異度、陽性的中度および陰性的中度が表17に含まれている。
【０４５１】
（表１７）各独立セットにおける各アルゴリズムの性能測定基準
2014512172.tif 000064
SENS=感度、SPEC=特異度、PPV=陽性的中度、NPV=陰性的中度、*値なし（計算不能）
【０４５２】
SVM、LDAおよびKNNアルゴリズムは、完全寛解であるかまたは安定疾患を示すかのいずれかとみなされた患者の検出に関して最高の性能を示した（感度=93〜95%）。SVMアルゴリズムはまた、未処置または進行性疾患を有する個体の検出に関して最も高感度のアルゴリズムであった（80%）。上位「3/4」の組み合わせは、寛解／疾患安定の決定に関して平均99%の正答コール率および未処置または進行性疾患の検出に関して75%を示した。
【０４５３】
処置応答性のサンプルと非応答体に分類されたものを識別する上で最良のアルゴリズムは、PPVが約98%およびNPVが約92%のLDAおよびKNNであった。
【０４５４】
その後、臨床記述とPCRベースのスコアの間の関係を試験した。個々のグループを描写するため、以下の記述子を使用した：
「完全寛解」=すべての調査で陰性；
「外科手術後安定疾患」=調査で異常あり、しかし連続評価で変化なし；および
「外科手術+LAR後安定疾患」=調査で異常あり、しかし連続評価で変化なし。
【０４５５】
グループとしての4つの独立セットのすべての処置サンプルの臨床基準（試験、生化学、スキャン）による分析により、以下のことが分かった：
1）完全寛解であるとみなされた患者（すなわち、虫垂腫瘍（n=3）の除去のための外科手術またはリンパ節転移を有さない（n=8）もしくは2個未満のリンパ節転移を有する（n=2）、1.5cm未満の回盲部NENの半結腸切除術の後に）は、このアルゴリズムによって100%の例で、正確に同定された（図35）。全13個のサンプルが、このアルゴリズムによって「正常」とコールされた。
2）（腫瘍除去のための外科手術（半結腸切除術：n=24、胃切除術：n=1、虫垂切除術：n=3、半結腸切除術および肝摘出：n=7、回腸／結腸摘出：n=3、半結腸切除術、肝摘出およびリンパ節郭清：n=2、塞栓：n=2）後に）安定疾患とみなされた患者は、95%の例（40/42）で、正確にコールされた（数学的アルゴリズムによって「処置された」腫瘍とコールされた）（図35）。
3）薬物療法（長時間作用型ソマトスタチンアナログ（SI-NEN=72、PNEN=13、直腸NEN=2、胃NEN=2）、パシレオチド（SI-NEN=1）またはRAD001（SI-NEN=4））後に安定疾患とみなされた患者は、90%の例（70/78）で、正確にコールされた（図35）。
【０４５６】
実施例7：疾患応答を評価する上でのマーカーパネル遺伝子が13種であるパネルサブセットの使用
未処置、進行性疾患と高度に相関した遺伝子のサブセットを、これらが患者グループをさらに定義するのに使用できるかどうかおよび、特に処置を受けたが「進行性」とみなされた患者において、治療に対する応答に関して追加情報を提供できるかどうかを決定するために評価した。
【０４５７】
試験セットの臨床サンプルの分析により、安定疾患を示すとみなされたグループと比較して未処置、進行性グループにおいて選択的に過剰発現される13種の遺伝子を同定した。同定された遺伝子は：AKAP8L、BRAF、CD59、COMMD9、Ki67、MORF4L2、OAZ2、RAF1、SST1、SST3、TECPR2、ZFHX3およびZXDC、であった。これらの遺伝子をアルゴリズムに含めることにより、試験セットの約73%の例で、安定疾患と進行性疾患を識別する正答コール率を得た（図36）。
【０４５８】
独立セット1〜4におけるこの遺伝子パネルの分析（グループとして：進行性疾患 - 処置に無関係：n=26［患者の50%が処置中、50%が処置不能とみなされたために処置中止］：安定疾患：n=143）により、「進行性」疾患を示すとみなされた患者由来のサンプルに対する正答コール率が65%（KNN）であることが分かった。このグループにおける4つの異なるアルゴリズムの感度、特異度、PPVおよびNPVは、それぞれ、34〜65%、96〜100%、64〜100%および89〜94%であった。「進行性」疾患の検出に最良のアルゴリズムはKNNであり、「安定」疾患の検出に最良のアルゴリズムはSVMであった。このことは、マーカーが13種であるパネルサブセットが、特に治療に対して応答しないおよび臨床的に「進行性」とみなされるGEP-NENの同定において、マーカーが51種であるパネルの補助として有用であることを示している。
【０４５９】
これらのアプローチは、このマーカーが51種であるパネルによって処置応答性を90〜100%で正確に定義できることを実証している。臨床的に進行性とみなされる、したがって治療（例えば、LARまたはエベロリムス）に対して応答しないサンプルは、65〜80%で同定することができる。
【０４６０】
実施例8：疾患予測に関するマーカー遺伝子が51種であるパネルと血漿クロモグラニンAレベルの比較
GEP-NENの同定ならびに処置および未処置サンプルの間の識別に関して、PCRベースのアプローチの有用性を、血漿中で測定されたクロモグラニンAレベルと比較した。
【０４６１】
CgAは、汎用のNENマーカーとして広く利用されており、一般に上昇したレベルは、GEP-NENのマーカーとしての感受性があり、約70〜90%の正確度であるとみなされている。しかし、このペプチドの測定は、他の新生物、例えば膵臓および小細胞肺新生物ならびに前立腺癌腫において、さらに、プロトンポンプ阻害剤の使用により様々な心疾患および炎症疾患において、ならびに腎不全においても上昇するため、非特異的である（10〜35%の特異度）。CgAは、神経内分泌細胞の分泌の成分であり、増殖の成分ではなく、したがってその腫瘍成長の代理としての使用が大いに限定されることは明らかである。一般に、GEP-NENの予測におけるこのバイオマーカーの感度は、腫瘍の分化の程度、腫瘍の位置およびそれが転移性かそうでないかに依存する。CgAレベルと肝腫瘍組織量の間には中程度の相関がみられるが、転移物の検出に対する感度の低さ（<60%）、米国で標準化された測定法が存在しないこと、およびFDAがCgAを補助バイオマーカーとして認めていないことから、現時点で、それは、処置有効性（外科手術、肝移植、生物／化学療法、化学／塞栓術、高周波アブレーション）を評価する上で「慣用的に」使用されているマーカーにすぎない。したがってCgAレベルを、PCRベースの試験を評価するための最良の利用可能な「ゴールドスタンダード」同等物として使用した。
【０４６２】
CgA値を、マーカー遺伝子が51種であるパネルの構築に使用した130個のサンプル（対照：n=67、GEP-NEN：n=63［未処置疾患、n=28、処置、n=35］）の初期試験セットにおいて、DAKO ELISAキットを用いて測定した。DAKOキットは、GEP-NEN由来の血漿サンプル中のCgAを検出するものとして、当技術分野で知られている。
【０４６３】
CgAレベルは、スチューデントt検定（図37A）またはノンパラメトリック検定（図37B）のいずれかを用いた場合、未処置（63%）および処置GEP-NEN（32%）の両方において上昇していた（p<0.05）。
【０４６４】
対照と比較してGEP-NENを同定する上でのCgAの有効性は、74%の正答コール率を示した（表18）。処置に無関係にGEP-NENを正確に同定する有効性は、約45%と低かった。
【０４６５】
（表１８）対照と全GEP-NEN（処置および未処置）を判別する上でのCgAレベルの診断能力
2014512172.tif 000065
この試験の性能測定基準は：感度=97%、特異度=46%、PPV=68%およびNPV=93%、であった。
【０４６６】
DAKOは、正常の上限として19単位/Lのカットオフを使用する。この値を用いた場合、感度=45%、特異度=98%、PPV=96%およびNPV=68%の性能測定基準で、56個のGEP-NENのうちの合計25個（45%）が陽性とみなされたのに対して、対照では67個中1個（1.4%）であった（図38）。このカットオフにおける正答コール率は70%であった。
【０４６７】
次に、PCR転写物の発現（マーカーが51種であるパネル）と共にCgAレベルを用いることを、予測に対する付加価値を提供する能力について評価した。CgAレベルを含めることによってマーカー遺伝子の予測能は向上せず、特にKNN分類器の場合、その有効性を低下させた（図39A〜B）。CgAレベルを含めることは、候補マーカー遺伝子パネルの品質を改善しないと結論づけられた。
【０４６８】
これらの結果は、循環血中の複数転写物の分子シグネチャー（腫瘍転写物）の定量が、単一の循環血中タンパク質（CgA）の測定よりも高感度であることを実証している。この分子フィンガープリントにCgA測定を含めても、予測上の「付加」価値は提供されない。
【０４６９】
実施例9：疾患有効性の評価におけるマーカー遺伝子が51種であるパネルと血漿クロモグラニンAレベルの比較
GEP-NENの同定ならびに処置および未処置サンプルの間の識別に関して、PCRベースのアプローチの有用性を、血漿中で測定されたCgAレベルと直接比較した。処置および未処置GEP-NENの間の識別におけるCgAの有効性の分析により、その正答コール率が66%であることが分かった（表19）。その性能測定基準は：感度=69%、特異度=63%、PPV=67%およびNPV=65%、であった。
【０４７０】
（表１９）未処置および処置GEP-NENサンプル間を判別する上でのCgAレベルの診断能力
2014512172.tif 000066
【０４７１】
実例
臨床利用を促進するため、数学的アルゴリズムからのコールに基づく採点システムを構築した。これは、異なるコールである「正常」対「腫瘍」および「処置」対「未処置」の遺伝子発現プロフィールに対する未知サンプルのユークリッド距離を測定する「距離」スコアである。低スコア：0〜25は「正常」に変換され、26〜50は「腫瘍 - 処置」（または安定）であり、51〜100は「腫瘍未処置」である。これは、個々の患者の値が疾患スペクトル（「正常」対「腫瘍」の診断および「処置」対「未処置」の臨床的解釈）のどこに納まるが明確なため、医師に優しい可視化法を提供する。これはまた、処置がその疾患の転写物指数にどのように影響するかをグラフ化する機会も提供する。実施例が図40に提供されている。これらの項目およびスコアは、以下に提供される個々の事例で使用される。
【０４７２】
初発症例1：偶発的に発見された虫垂NEN、その後の腸間膜転移物の形成
JPP（高血圧を有し、以前に脾摘出術［1998］を受けている45歳男性）は、膿瘍および穿孔のために左側半結腸切除術を受けた［12/2009］。外科手術において、リンパ浸潤および虫垂間膜への伸長のある高分化型の0.8cmのNENが発見された［T?N1M1］。この腫瘍は、低い増殖能を示した：Ki67<2%および有糸分裂カウント<1/10HPF）。その後のMRIスキャン（1/2010）により残留する腸間膜インプラントが確認され、結腸瘻閉鎖のために再度の外科手術（4/2010）が行われた。この時に、腸間膜リンパ節転移物（1cm未満）が除去された（Ki67<2%）。
【０４７３】
（表２０）
2014512172.tif 000067
PCRスコア：0〜100（0〜25=正常、26〜50=処置；51〜100=未処置疾患）；診断=正常または腫瘍、解釈=処置 対 未処置。CgA値：単位/リットル（U/L）（DAKO ELISA）
ABNML=異常（上昇）；NML=正常範囲。
【０４７４】
残留（未処置）疾患の同定（診断=「腫瘍」、解釈=「未処置」、PCRスコア68）および転移物の外科的除去の証明（診断=「腫瘍」、解釈=「処置」、PCRスコア40）に関して、PCR試験は、CgAよりも高感度である。血液のPCR試験が外科的切除後に「正常」のコールに戻らなかったことは、残留する転移性疾患の存在を示している（PCRスコアは正常：約40超で維持される）。PCRの値は、2010年から2011年の間に「未処置」表現型に変化しなかったので、この疾患は臨床的に「安定」であると考えられる。
【０４７５】
初発症例2：SI-NEN、外科的摘出
BA(1996年および2006年に貧血を伴う冠動脈疾患、II型糖尿病および緑内障の病歴がある65歳女性。結腸内視術およびCTスキャンにより、回腸末端NENが発見された［5/2009］。彼女は、リンパ浸潤を示すが陽性のリンパ節のない1cmのSI-NEN［T1N0M0］の除去のために右側半結腸切除術を受けた（2/2010）。腫瘍は、低い増殖指数：Ki67=2%および有糸分裂カウント<2/10HPFを示した)。
【０４７６】
（表２１）
2014512172.tif 000068
PCRスコア：0〜100（0〜25=正常、26〜50=処置；51〜100=未処置疾患）；診断=正常または腫瘍、解釈=処置 対 未処置。CgA値：単位/リットル（U/L）（DAKO ELISA）
ABNML=異常（上昇）；NML=正常範囲。
【０４７７】
PCR試験は、小さな容積、低い増殖性の小腸NENを同定した（診断=「腫瘍」、解釈=「未処置」、PCRスコア61）。血液のPCR試験が外科的切除後に「正常」のコールに戻らなかったことは、残留疾患の存在を示しており（PCRスコア26〜30）、不完全な摘出を示唆している（非R0）。
【０４７８】
初発症例3：転移性直腸NEN（内視鏡術により除去）、非区域性肝転移物、LAR処置
AJ（（内視鏡検査-5/2010において）偶発的に直腸NENが発見された47歳男性）。追跡調査（CT/MRIスキャン 6/2010）で、広範囲の非区域性（pan-segmental）肝転移物が認められた。サンドスタチンが開始された［7/2011］。2つの肝転移物を除去する残留疾患（原発性および直腸リンパ節転移物）の外科的摘出が行われた［10/2010］。Ki67<15%の1.5cmの直腸リンパ節転移物）が認められた。肝転移物は、Ki67〜3%を有していた（T2N1M1）。その後に、回腸瘻の閉鎖およびさらなる肝転移物の除去のための外科手術が行われた［2/2011］。連続MRIスキャンは、肝臓量に変化がないことを示した。サンドスタチンが継続された。
【０４７９】
（表２２）
2014512172.tif 000069
PCRスコア：0〜100（0〜25=正常、26〜50=処置；51〜100=未処置疾患）；診断=正常または腫瘍、解釈=処置 対 未処置。CgA値：単位/リットル（U/L）（DAKO ELISA）
ABNML=異常（上昇）；NML=正常範囲。
【０４８０】
PCR試験により、非機能性（非分泌性）病変からの肝転移物および残留疾患が同定される（診断=「腫瘍」、解釈=「未処置」、PCRスコア78）。PCR試験は、疾患の同定および処置応答の観察の両方に関してCgAよりも効果的であった。PCR試験が「正常」のコールに戻らなかったことは、肝転移物の存在と一致する。値は、2010年から2011年の間に「未処置」表現型に変化せず、このことから疾患が「安定」であることが示唆される。この知見（PCRスコア：26〜44）は、安定な非進行性疾患を示す現在の画像化プロトコルと一致している。
【０４８１】
初発症例4：転移性SI-NEN、非区域性肝転移物、半結腸切除術による処置、リンパ節切開および肝摘出およびLAR
BG（71歳女性）は当初、肝結節および約4cmの腸間膜腫瘤（オクトレオスキャン（octreoscan）で陽性）を有することが発見され、これは（肝生検によって）高分化型神経内分泌癌腫であることが確認された［9/2008］。回腸および肝臓の楔状切除術が行われた［12/2008］。1.5cmのNENがあったために8cmの腸間膜結節を除去し、6/9個のリンパ節が転移について陽性であった。腫瘍は、低い増殖能、有糸分裂カウント=2/10hpf、Ki67<2%を有していた（T2N1M1）。2/2009にオクトレオチドが開始され、症状はある程度制御されたが、右上腹部の違和感が増していることが感じられた。オクトレオスキャン［4/2010］によりいくつかの小さな肝病変が発見され、2/2011（オクトレオスキャン）にはさらなる病変が確認された。ERCPおよび括約筋切開術［4/2011］ならびに胆嚢摘出術［6/2011］が行われた。
【０４８２】
（表２３）
2014512172.tif 000070
PCRスコア：0〜100（0〜25=正常、26〜50=処置；51〜100=未処置疾患）；診断=正常または腫瘍、解釈=処置 対 未処置。CgA値：単位/リットル（U/L）（DAKO ELISA）
ABNML=異常（上昇）；NML=正常範囲。
【０４８３】
PCR試験は、広範囲の疾患を同定した（診断=「腫瘍」、解釈=「未処置」、PCRスコア70）。血液のPCR試験（PCRスコア27〜35）は外科手術後に「正常」に戻らず、この結果は残留転移物と一致する。CgAの結果は、疾患の同定および処置応答の観察の両方に関して、PCR試験よりも低い効率を示した。
【０４８４】
初発症例5：再発肝転移（肝切除術後）、LAR処置および塞栓
SK（心房細動、高脂血症および腎結石の病歴がある64歳男性）。顔面紅潮が出た後にSI-NENと診断された［12/2001］。彼は回腸腫瘍および肝転移物の摘出を受けた。その後の外科手術は、腸間膜リンパ節腫瘤［3/2005］およびリンパ節［9/2006］の再摘出を含んでいた。［12/2008］に肝転移物に対する冷凍アブレーションが行われた。PETスキャン［4/2009］により、小さな肝結節および骨病変が確認された。サンドスタチンが開始され［6/2009］、反復的なスキャン［PETおよびMRI］では新たな病変が見られなかった。
【０４８５】
（表２４）
2014512172.tif 000071
PCRスコア：0〜100（0〜25=正常、26〜50=処置；51〜100=未処置疾患）；診断=正常または腫瘍、解釈=処置 対 未処置。CgA値：単位/リットル（U/L）（DAKO ELISA）
ABNML=異常（上昇）；NML=正常範囲。
【０４８６】
PCR試験は、疾患の再発を同定し（診断=「腫瘍」、解釈=「未処置」、PCRスコア63）、冷凍アブレーションの有効性を実証し、そして残留疾患を検出した。血液のPCR試験は「正常」のコールに戻らなかったので、この結果は、13C-PETにより同定された転移物の証拠であるとみなされた（PCRスコア49）。CgAの結果は、疾患の同定および処置応答の観察の両方に関して、PCR試験よりも低い効率であった。
【０４８７】
実施例10：GEP-NENサブタイプ（小腸 対 膵臓NEN）を識別する上での分子シグネチャーの有用性
マーカー遺伝子が51種であるパネルを使用し、GEP-NENと対照を区別する能力およびサンプルが非応答体または処置ナイーブの個体と比較して処置に応答性のある個体由来であるかどうかを識別する能力を試験した。マーカーパネルを、小腸NEN組織および血液マイクロアレイから得られた情報に基づき構築した。その性能測定基準はCgA ELISAよりも有意に良いが、本研究の目的は、この試験が2つの異なる部位、例を挙げると小腸および膵臓、由来のGEP-NEN間を識別できるかどうかを決定することである。これは、原発部位が未知の腫瘍の場合に関連することであり、かつ腫瘍がそれらの起源部位に依存して有意に異なる予後を示す場合にも関連する。SI-NENの5年生存率は約80%であり、死亡率の約50%は疾患特異的でない。対照的に、PNENの5年生存率は約40%であり、患者の約95%はこの疾患が死因となる。したがって、未知の原発部位を決定することは、治療法を決定する上で重要な変数となり得；ソマトスタチンアナログは、SI-NEN 9における有用性が実証されており、スニチニブおよびエベロリムスはPNEN_ENREF_10において有効性を示す。
【０４８８】
マーカー遺伝子が51種であるパネルの試験は、これがかなり大きな発現分散を示すこと（0.54±0.4 対 SI-NENにおける0.38±0.14）を明らかにし、このパネルで選択された遺伝子がPNENではSI-NENほど特異的でないことが示された。発現のマッピングにより、腫瘍が空間的に分離されることが明らかになった（図41A）。
【０４８９】
さらに、このパネルにおける発現は、92%の正確度で2つの腫瘍部位間を識別することができた（図41B）。したがってこの試験は、膵臓と小腸の腫瘍の間を正確に識別することができる。
【０４９０】
実施例11：GEP-NENとGI癌の間を判別する、マーカー遺伝子が51種であるパネルの能力
このPCRベースのアプローチの有用性をさらに評価するため、胃腸腺癌、例えば胃癌および肝癌（食道：n=2、膵臓：n=11、胆嚢：n=3、結腸：n=10、直腸：n=7の分子フィンガープリントを試験した。これは、GI腺癌で過剰発現されかつこのパネルに含まれるいくつかの遺伝子、例えば、KRAS、BRAF、Ki67が、その正確度を損なわせるかどうかを評価するために行った。
【０４９１】
マーカー遺伝子が51種であるパネルの試験は、これが大きな発現分散を示すことを明らかにし（0.5±0.25 対 GEP-NENの0.44±0.17）、このパネルで選択されたNEN特異的遺伝子がGEP-NENよりもGI癌に対して低い特異性であることが示された。PCAにより、腫瘍が空間的に分離されること（図42A）およびNENパネルが83%の正確度でGEP-NENとGI癌の間を識別できること（図42B）が分かった。
【０４９２】
したがってこの試験はGEP-NENとGI癌の間を識別する能力を有し、NENの循環血中の分子シグネチャーはGI腺癌のそれと異なっている。若干の重複は、GI腺癌の約40%が神経内分泌成分を示すという観察と一致する。
【０４９３】
この分子試験とCgA ELISAの直接比較から、このPCRベースの方法がCgAレベルの測定と比較して有意に正確度の高いコール率を示すことが分かった（x2=12.3、p<0.0005）（図43）。
【０４９４】
感度は、GEP-NENの検出と同等であった（94% 対 97%）が、PCR試験の特異度はCgAよりも高かった（85% 対 46%）。処置 対 未処置サンプルの識別に関して、PCRベースの試験は、より高い性能測定基準を示した（85% 対 約65%）。
【０４９５】
CgAは、GEP-NENに関して「処置」を定義する上で、その循環血中の分子フィンガープリントよりも有用性が低かった。これは、このタンパク質（CgA）がすべての神経内分泌細胞の構成的な分泌産物であり、神経内分泌腫瘍、それらの増殖率またはそれらの転移に対して特異的な生物学的関係を有さないという事実を反映している。
【０４９６】
本願を通して、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願および特許が参照されている（ウェブサイトは、ワールドワイドウェブ上の住所であるそれらのユニフォームリソースロケーターまたはURLによって参照されている）。これらの各参照物の開示内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０４９７】
本発明は、本明細書に開示されている態様によってその範囲が限定されず、これらの態様は本発明の個々の局面の単なる実例にすぎないことが意図されており、機能的に等価なあらゆるものが本発明の範囲に含まれる。本明細書に記載されているものに加えて、本発明のモデルおよび方法に対する様々な改変が、前記の説明および教示から当業者に明らかとなるであろうが、それらも同様に本発明の範囲に包含されることが意図されている。そのような改変またはその他の態様は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得るものである。
【図１】
2014512172.tif 000073
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014512172.tif 000080
【図９】
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【図１０】
2014512172.tif 000082
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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