(57)【要約】  ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１は、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｃ（ｓｙｎｐｒｏ）、およびＰＡＴをコードする遺伝子を含み、それにより、該イベントを含有するダイズ作物に昆虫抵抗性および除草剤耐性がもたらされ、また、作物の保護および貯蔵生産物の保護のための方法が可能になる。本発明は、ＰＣＲイベント検出方法を提供する。
2014522661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズＤＮＡを含む試料においてダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号１のｂｐ１〜１４００内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号１のｂｐ１４０１〜１８３６内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐの第２のプライマーと接触させ、
前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ、または
（ｂ）前記試料を、配列番号２のｂｐ１〜１５２内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号２のｂｐ１５３〜１５５０内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させ、
前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年７月２６日出願の仮出願第６１／５１１，６５８に対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃ  ｓｙｎｐｒｏ（Ｃｒｙ１Ａｃ）をコードする遺伝子は、昆虫抵抗性、例えば、鱗翅目の昆虫に対する抵抗性をトランスジェニック植物に付与することができ、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシン（グルホシネート）に対する耐性をトランスジェニック植物に付与することができる。ＰＡＴは、昆虫抵抗性トランスジェニック作物の作出における選択マーカーとして、および除草剤グルホシネートに対する商業的なレベルの耐性をトランスジェニック作物に付与するための両方に使用するために、ダイズにおいて首尾よく発現されている。
【０００３】
植物における外来遺伝子の発現は、おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近傍にあることに起因して、植物ゲノムにおけるそれらの位置の影響を受けることが公知である（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻：421〜477頁、1988年）。同時に、ゲノム内の異なる位置に導入遺伝子が存在することが、植物の全体的な表現型に違ったふうに影響を及ぼす。この理由のために、多くの場合、対象の導入された遺伝子の最適な発現を特徴とするイベントを同定するためには、多数のイベントをスクリーニングすることが必要である。例えば、植物および他の生物体において、イベント間で導入された遺伝子の発現のレベルが広範に変動する可能性があることが観察された。発現の空間パターンまたは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写調節エレメントから予測されるパターンに対応しない可能性がある。このために、何百から何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベントを、導入遺伝子の所望の発現レベルおよび発現パターンを有する単一のイベントについて商業目的のためにスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、元の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生長条件によく適合する多数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。
【０００４】
有性交雑の後代が対象の導入遺伝子または導入遺伝子の群を含有するかどうかを決定するために、特定のイベントの存在を検出することができることが望ましい。さらに、特定のイベントを検出するための方法は、例えば、組換え作物に由来する食物の市販前承認および表示を必要とする規制に合致するため、または、環境のモニタリング、圃場内の作物の形質のモニタリング、または作物収穫で得られる生産物のモニタリングにおいて使用するため、ならびに、規制条項および契約条項に従う関係者のコンプライアンスを確実にすることにおいて使用するために役立つ。
【０００５】
トランスジェニックイベントの存在は、これらに限定されないが、核酸プローブを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡのハイブリダイゼーションを含めた当技術分野で公知の任意の核酸検出方法によって検出することが可能である。これらの検出方法では、一般に、多くのＤＮＡ構築物に関して、コード領域を交換することができるの
で、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などの遺伝エレメントを使用することに焦点を合わせることも多い。結果として、そのような方法は、挿入された異種ＤＮＡに近接する隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でなければ、異なるイベント、特に、同じＤＮＡ構築物または非常に類似した構築物を使用して作出されたイベント間を識別するためには有用でない可能性がある。例えば、イベント特異的なＰＣＲアッセイは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７について米国特許出願第２００６／００７０１３９号に記載されている。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を同定するための単純かつ識別力のある方法を有することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１と称される新しい昆虫抵抗性かつ除草剤耐性のトランスジェニックダイズ形質転換イベントを検出するための方法に関する。本開示の一部として、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１を含むダイズ系統の少なくとも２５００種子がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０に寄託された。寄託物、ＡＴＣＣ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＰＴＡ−１２００６が２０１１年７月２１日にＡＴＣＣにより受け入れられた。この寄託物は、特許手続のための種子寄託物に関するブタペスト条約の条項に従い、その下で作製されたものであり、また、それに従い、その下で維持される。
【０００７】
このイベントを含有するダイズ植物のＤＮＡは、ダイズゲノム内の挿入ＤＮＡの位置を特徴付ける本明細書に記載の接合部／隣接配列を含む。配列番号１および配列番号２は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に特徴的である。より詳細には、配列番号１のｂｐ１４００／１４０１およびｂｐ１５３６／１５３７、ならびに配列番号２のｂｐ１５２／１５３にある接合部を取り囲む配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に特徴的である。下のパラグラフ［０００９］には、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を含有するダイズのＤＮＡの特性であるこれらの接合部を含む配列の例が記載されている。
【０００８】
本発明は、ダイズＤＮＡを含む試料においてダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号１のｂｐ１〜１４００内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号１のｂｐ１４０１〜１８３６内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させるステップ、および
（ｂ）前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ、もしくは前記試料を、配列番号２のｂｐ１〜１５２内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号２のｂｐ１５３〜１５５０内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させるステップ、および
（ｃ）前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ
を含む方法を提供する。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に特徴的である、単離されたＤＮＡ分子を提供する。そのような分子は、配列番号１および２に加えて、配列番号１のｂｐ１４００〜１４０１および配列番号１のｂｐ１４００／１４０１接合部から各方向に少なくとも１０ｂｐを含む、長さが少なくとも２５ｂｐの分子；配列番号２の１５２〜１５３および配列番号２のｂｐ１５２／１５３接合部から各方向
に少なくとも１０ｂｐを含む、長さが少なくとも２５ｂｐのアンプリコンを含む。例は、配列番号１のｂｐ１３８５〜１４１５；配列番号１のｂｐ１３５０〜１４５０；配列番号１のｂｐ１３００〜１５００；配列番号１のｂｐ１２００〜１６００；配列番号２のｂｐ１３７〜１６８；配列番号２のｂｐ１０３〜２０３；および配列番号２のｂｐ３〜３０３、ならびにその相補物である。
【００１０】
さらに、本発明は、試料（例えば、ダイズの）中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構築物のＤＮＡ配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。アッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。
【００１１】
本発明は、一部において、ｐＤＡＢ９５８２由来のＴ−ＤＮＡをトランスジェニックダイズ系統に挿入することによって生じる境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関する。これらの配列は独特である。挿入断片配列および接合部配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができ、これを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによってこれらのイベントを同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、本発明のイベントを含むダイズ系統を一意的に同定することができる。
【００１２】
配列の簡単な説明
配列番号１はダイズイベント９５８２．８１４．１９．１についての５’ＤＮＡ隣接境界配列である。ヌクレオチド１〜１４００はゲノム配列である。ヌクレオチド１４０１〜１５３５は、ｐＤＡＢ９５８２から再配置された配列である。ヌクレオチド１５３６〜１８３６は挿入断片配列である。
【００１３】
配列番号２は、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１についての３’ＤＮＡ隣接境界配列である。ヌクレオチド１〜１５２は挿入断片配列である。ヌクレオチド１５３〜１５５０はゲノム配列である。
【００１４】
配列番号３は、ｐＤＡＢ９５８２のＤＮＡ配列であり、下の表１において注釈を付けている。
【００１５】
配列番号４は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１４１９＿ＦＷ３である。
【００１６】
配列番号５は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１４１９＿ＲＶ１である。
【００１７】
配列番号６は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１４１９＿ＲＶ２である。
【００１８】
配列番号７は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１４１９＿ＲＶ３である。
【００１９】
配列番号８は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー５’ＩＲＥｎｄ−０１である。
【００２０】
配列番号９は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー５’ＩＲＥｎｄ−０２である。
【００２１】
配列番号１０は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーＡｔＵｂｉ１０ＲＶ１である。
【００２２】
配列番号１１は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーＡｔＵｂｉ１０ＲＶ２である。
【００２３】
配列番号１２は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー３’ＰＡＴＥｎｄ０５である。
【００２４】
配列番号１３は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー３’ＰＡＴＥｎｄ０６である。
【００２５】
配列番号１４は、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１の確認された配列である。５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖挿入断片、および３’ゲノム隣接配列を含む。
【００２６】
配列番号１５は、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１の３’境界を検出するためのＴＡＱＭＡＮアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプライマー８１４９＿３’Ｆである。
【００２７】
配列番号１６は、３’境界ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１を検出するためのＴＡＱＭＡＮアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプライマー８１４９＿３’Ｒである。
【００２８】
配列番号１７は、３’境界ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１を検出するためのＴＡＱＭＡＮアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプローブ８１４９＿３’Ｐである。このプローブの５’末端にはＦＡＭ蛍光部分が付加されており、３’末端にはＭＧＢクエンチャーが付加されている。
【００２９】
配列番号１８は、内在性参照遺伝子であるＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）を検出するためのＴＡＱＭＡＮアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプライマーＧＭＳ１１６Ｆである。
【００３０】
配列番号１９は、内在性参照遺伝子であるＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）を検出するためのＴＡＱＭＡＮアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプライマーＧＭＳ１１６Ｒである。
【００３１】
配列番号２０は、内在性参照遺伝子であるＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）を検出するためのＴＡＱＭＡＮアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプローブＧＭＳ１１６である。このプローブの５’末端にはＨＥＸ蛍光部分が付加されており、３’末端にはＢＨＱクエンチャーが付加されている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃおよびｐａｔ発現カセットを含有するｐＤＡＢ９５８２のプラスミドマップである。
【図２】ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の５’境界配列および３’境界配列を確認するためのプライマーの位置を示す図である。
【図３】ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１におけるゲノム配列配置を示す図である。
【図４】ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のＴＡＱＭＡＮアッセイのためのプライマーおよびプローブの位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１挿入物の両端を配列決定し特徴付けた。イベント特異的なアッセイを開発した。これは、ダイズゲノムの第０２染色体上にマッピングされた。イベントを別の優良な系統に遺伝子移入することが可能である。
【００３４】
上の背景技術のセクションにおいて言及されている通り、導入遺伝子の植物ゲノムへの導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを伴う（したがって発現される所与の挿入物について「イベント」と称する）。すなわち、多くの形質転換技法、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、微粒子銃形質転換（すなわち遺伝子銃）、および炭化ケイ素媒介性形質転換（すなわちＷＨＩＳＫＥＲＳ）などを用いると、導入遺伝子がゲノム内のどこに挿入されるかは予測不可能である。したがって、挿入断片の両側の隣接植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所与の挿入イベントを有する植物を同定するために重要であり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合領域にわたってＰＣＲアンプリコンを生成するＰＣＲプライマーを設計することができる。このＰＣＲアンプリコンを使用して、独特のまたは別個の種類の挿入イベントを同定することができる。
【００３５】
本発明の説明に役立つように、また当業者が本発明を実施する指針となるために、本明細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第１．８２２条に明記されているＤＮＡ塩基の命名法を使用する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「後代」は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。
【００３７】
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち、対象の導入遺伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することによって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種ＤＮＡを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交雑によって作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質転換された親由来の挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体由来のＤＮＡ、および挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体および自殖によって生じる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統との有性交雑の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むその後代も指す。
【００３８】
「接合部配列」または「境界の配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接するダイズのネイティブなゲノム由来のＤＮＡに連結している点にわたり、植物の遺伝物質中の一方または他方の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である。本明細書に記載のダイズイベントにおける挿入物にわたるＤＮＡ配列および同様の長さの隣接ＤＮＡが包含される。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供されるが、挿入物の接合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする他の配列も特徴的であり、本発明に従って使用することができる。
【００３９】
本発明は、そのような隣接配列、接合部配列、および挿入断片配列を使用してイベントを特定することに一部関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンは、本発明に包含される。本発明に従って、挿入ＤＮＡおよびその端までわたるアンプリコンを使用するＰＣＲ分析方法を使用して、対象の登録商標を持つトランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたトランスジェニックダイズの品種または系統を検出または特定することができる。
【００４０】
隣接／接合部配列は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に特徴的である。これらの配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型においてこれらのダイズ系統を同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。本明細書において同定される配列は独特である。
【００４１】
本発明の検出技法は、植物育種と併せて、１つまたは複数の追加的な対象の形質を後代に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交雑した後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。これらのＰＣＲ分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトランスジェニックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のＰＣＲ検出キットも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管理にも有益である。
【００４２】
さらに、隣接ダイズ／ゲノム配列を使用して、それぞれの挿入断片の遺伝子位置を特異的に同定することができる。この情報を使用して、それぞれのイベントに特異的な分子マーカー系を作製することができる。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖データを確立するために使用することができる。
【００４３】
さらに、隣接配列の情報を使用して、導入遺伝子の組み込みプロセス、ゲノムの組み込み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、およびＭＡＲＳ［マトリックス付着領域］などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連する）を試験し、特徴付けることができる。
【００４４】
本開示全てに照らして、本発明は、パラグラフ［０００５］において識別されるＡＴＣＣ寄託番号の下で入手可能な種子を包含することが明白でなければならない。本発明は、パラグラフ［０００５］において識別されるＡＴＣＣ寄託番号で寄託された種子から生長させた除草剤耐性ダイズ植物も包含する。本発明は、さらに、前記植物の部位、例えば、葉、組織試料、前記植物体によって生産される種子、花粉などを包含する（これらは、ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃ、ｐａｔ、ならびに配列番号１および配列番号２を含む）。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「ダイズ」は、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘを意味し、ダイズ植物を用いて育種することができるその全品種を包含する。
【００４６】
本発明のＤＮＡ分子は、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして使用することができる。本発明のＤＮＡ分子は、当技術分野で公知の通り、遺伝的に連鎖している作物学的に有用な形質を特定する方法（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）において使用することができる。ＭＡＢ法を使用して、本発明のダイズ植物（またはその後代および任意の他のダイズの栽培品種または品種）との交雑の後代において昆虫抵抗性および除草剤耐性形質を追跡するこ
とができる。ＤＮＡ分子はこの形質についてのマーカーであり、当技術分野で周知のＭＡＢ法を使用して、本発明の少なくとも１つのダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡することができる。本発明の方法を使用して、対象イベントを有する任意のダイズ品種を特定することができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について、個体間で遺伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の親から栄養繁殖させることによって創出することができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「栽培品種」および「品種」は同義であり、商業生産のために使用される系統を指す。
【００４９】
「安定性」または「安定な」は、所与の構成要素に関しては、構成要素が代々、好ましくは、少なくとも３世代維持されることを意味する。
【００５０】
「商業的有用性」は、従来の農業設備を使用して農業者が作物を生産することができるように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義される。
【００５１】
「作物学的に優良」は、系統が対象イベント（複数可）に起因する昆虫抵抗性および除草剤耐性に加えて、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有することを意味する。これらの作物学的特性およびデータポイントの全てを使用して、そのような植物を、そのような植物を定義するために使用する特性の範囲内の一点として、または一端もしくは両端で特定することができる。
【００５２】
本開示に照らして当業者に理解されるように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、「接合部配列」または「移行部配列」（ダイズゲノムの隣接配列と挿入断片配列が接する場所）を対象とし、かつ／またはそれを含むプローブおよび／またはプライマーを含んでよい。これは、例えば、上記の表に示されている一方のまたは両方の接合部配列（挿入断片と隣接配列が接する場所）を同定するために設計されたポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および／またはアンプリコンを含む。１つの一般的な設計は、隣接領域内でハイブリダイズする１つのプライマー、および挿入断片内でハイブリダイズする１つのプライマーを有する。そのようなプライマーは、多くの場合、およそ、それぞれの長さが少なくとも約１５残基である。この配置を用いて、プライマーを使用して、本発明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成／増幅することができる。これらのプライマーを使用して、上に示されている接合部配列にわたる（およびそれを含む）アンプリコンを生成することができる。
【００５３】
隣接配列に「接している」プライマー（複数可）は、一般には、約１２００塩基を越えて、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型的な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って１２００塩基の範囲内のどちらかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号１４の塩基対８００〜１４００および／または配列番号１４の塩基対１３，８９７〜１４，４９７由来の（またはそれとハイブリダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、本発明の範囲内である。挿入プライマーは、挿入断片のどこにでも同様に設計することができるが、配列番号１４の塩基対１４００〜２０００および／または配列番号１４の塩基対１３，２９７〜１３，８９６は、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排他的に使用することができる。
【００５４】
当業者は、さまざまな標準のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の下で、ハイブリダイズするようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここでプライマーまたはプローブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう。すなわち、ある程度のミスマッチが容認され得る。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、一般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライマーの内部または末端にある場合、１または２ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくてよい。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体は、プローブにも使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブも使用することができる。重要なのは、そのようなプローブおよびプライマーが、本発明のイベントの存在に対して特徴的である（独自に特定し、区別することができる）ことである。
【００５５】
ＰＣＲ増幅において、例えば、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得ることに留意するべきである。すなわち、別段の指定のない限り、本明細書において列挙されている配列は、ダイズのゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを生成し、次いでそのアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮＡから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本発明の範囲内であることを認識し、留意するべきである。
【００５６】
例えば、イベントを創出する間に配列を挿入する場合、いくらかのゲノム配列が欠失することは珍しくないことにも留意すべきである。したがって、本主題の隣接配列と、例えばＧＥＮＢＡＮＫに列挙されているゲノム配列との間にもいくらかの差異が出現する可能性がある。
【００５７】
ＤＮＡ配列「挿入断片」の構成成分が図面に例示されており、以下の実施例においてより詳細に考察されている。これらの構成要素のＤＮＡポリヌクレオチド配列、またはその断片を、本発明の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００５８】
本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物由来の植物および種子などにおける導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書において提供される本主題の５’導入遺伝子／ゲノムの挿入領域接合部配列（配列番号１４の塩基対８００〜１４００の間）、そのセグメント、ならびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。本明細書において提供される本主題の３’導入遺伝子／ゲノムの挿入領域接合部配列（配列番号１４の塩基対１３，８９７〜１４，４９７の間）、そのセグメント、ならびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域の接合部配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、挿入部位に隣接しているダイズの細胞由来のＤＮＡの接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントに対して特徴的であり得る。
【００５９】
これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができる。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型において本発明のダイズ系統を同定することができることが実証された。これらおよび他の関連する手順を用いて、これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。したがって、そのようなプライマー対に由来するＰＣＲアンプリコンは独特であり、これらのダイズ系統
を同定するために使用することができる。
【００６０】
一部の実施形態では、新規の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の連続した断片を含むＤＮＡ配列は本発明の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチドおよび３つの上述のダイズ植物の１つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列および／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である配列が包含される。
【００６１】
関連する実施形態は、本明細書において特定されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号１およびそのセグメントなど）の導入遺伝子部分の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補物、およびこれらの配列由来の同様の長さのダイズの隣接ＤＮＡ配列、またはその相補物に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅方法において、ＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかに対して特徴的である。したがって、本発明は、そのようなＤＮＡプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも包含する。
【００６２】
本発明は、試料中の、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法も包含する。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記イベント（複数可）に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップと；（ｂ）核酸の増幅反応を実施し、それによって、アンプリコンを生成するステップと；（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含んでよい。
【００６３】
本発明の別の検出方法は、試料中の、前記イベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡとハイブリダイズさせ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物（対象のイベントがないＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと；（ｃ）プローブのＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を包含する。
【００６４】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示されている組成物およびＤＮＡの検出の技術分野で周知の方法を使用して開発することができる。このキットは、試料中の対象のダイズイベントＤＮＡを特定するために有用であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種するための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアンプリコンと相同または相補的であるＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝エレメントに含有されるＤＮＡと相同または相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡのハイブリダイゼーション方法においてプローブとして、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために必要な試薬および材料も含有することができる。
【００６５】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素など）を付着させた単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合では、ダイズ植物由来であるかイベント由来のＤＮＡを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベントの１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖と相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸または
リボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。
【００６６】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖とアニーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離された／合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれらの使用を指す。
【００６７】
プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４
２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを従来の方法によって設計することができる。
【００６８】
プローブおよびプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。ＰＣＲのプライマー対は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用することによって得ることができる。
【００６９】
本明細書に開示されている隣接ＤＮＡおよび挿入断片の配列に基づくプライマーおよびプローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること（および、必要であれば、補正すること）ができる。
【００７０】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅の方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハイブリダイズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、その「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一方のあらゆるヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言える。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「最小限相補的」であると言える。同様に、分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言える。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年に記載されている。したがって、完全な相補性から逸脱することは、そのような逸脱により、二本鎖構造を形成する分子の能力が完全に妨げられない限りは許容できる。核酸分子がプライマーまたはプローブとしての機能を果たすためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成できるために十分に配列内で相補的であることのみが必要である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較されている核酸配列の相補物と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列である。用語「ストリンジェントな条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55において考察されている特定のハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブの標的核酸（すなわち、対象とする特定の核酸配列）とのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambro
okら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、相補的なＤＮＡ断片のひと続きと２重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力に関して使用することができる。
【００７２】
構想される適用に応じて、プローブの標的配列に対する選択性のさまざまな程度を実現するためにハイブリダイゼーションのさまざまな条件を使用することができる。高い選択性を必要とする適用のために、一般には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を用いることがある、例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされるような比較的低塩かつ／または高温の条件を選択することがある。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション濾過器を高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを伴ってよい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することは、当業者に公知である。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシーである５０℃で約２．０×ＳＳＣから高ストリンジェンシーである５０℃で約０．２×ＳＳＣまでから選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件である室温、約２２℃から高ストリンジェンシー条件である約６５℃まで増加させることができる。温度と塩との両方が変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれかは、他方の変数が変化する一方で一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、もしあれば、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を検出することは当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
【００７３】
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー（またはアンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と特異的にハイブリダイズする。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、本明細書において例示された配列の１つに記載されている核酸配列、またはその相補物および／もしくは断片を有する。
【００７４】
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と、８０％から１００％の間または９０％から１００％の間の配列同一性を共有する。本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と９５％から１００％の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を特定するための植物育種方法において、マーカーとして使用することができる。プローブの標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によって検出することができ、それらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを挙げることができる。
【００７５】
特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補物）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件である。
【００７６】
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交雑によって生じたダイズ植物が、本発明のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプライマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を使用して、イベントＤＮＡの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増幅方法に供することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対して特徴的である配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ足す１ヌクレオチド塩基対、および／またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４
３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれ以上のヌクレオチド塩基対（上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは引く）にわたってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンが生成されるように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列に由来してもよい。植物のゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離に位置してよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対までにわたることができる。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成される可能性があるプライマー二量体を特に除外する。
【００７８】
核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で公知の種々の核酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。２２ｋｂに至るまでのゲノムＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野で公知の他の方法を、本発明の実施において使用することができる。本明細書において提供される配列に由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定を行うことにより、本主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または隣接ゲノム配列を検証すること（および必要であれば、補正すること）ができる。
【００７９】
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技法によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のＰＣＲ後（挿入配列内の１つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の１つのプライマーを使用する）、一本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。読み取りは、蛍光またはＥＬＩＳＡに基づいてよい。信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長に起因して、挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
【００８０】
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00巻:18〜24頁、2000年）に記載されているようなパイロシークエンス技法である。この方法では近接するゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿入配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個々に加え、それが取り込まれた結果、測定される光信号がもたらされる。光信号により、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基または多塩基の伸長が上首尾であり、したがって導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
【００８１】
蛍光偏光は、本発明のアンプリコンを検出するために使用することができる別の方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿入ＤＮＡ内の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰが取り込まれる。取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することを示す。
【００８２】
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べると、ゲノムの隣接と挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。特異的な増幅の間に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部分が離れて除かれ、放出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
【００８３】
配列の検出において使用するための分子ビーコンが記載されている。簡単に述べると、隣接ゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの独特の構造により、蛍光部分およびクエンチング部分が極めて近傍に保たれる二次構造が含有される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＰＣＲ増幅が上手くいった後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズすることにより、プローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間的に分離される。蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接ゲノム配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
【００８４】
ダイズゲノム内の挿入するために優れた位置を開示し、本発明は、この遺伝子位置の概ね近くに少なくとも１つの非ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１挿入断片を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も含む。１つの選択肢は、本明細書において例示されているｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１由来の挿入断片を異なる挿入断片で置換することである。これらの一般的な点については、例えば、本発明に従って、標的化相同組換えを使用することができる。この種類の技術は、例えば、ＷＯ０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開された米国特許出願（Ｕ．Ｓ．２００３０２３２４１０）の主題である。したがって、本発明は、本明細書において同定される隣接配列の全てまたは認識できる部分が隣接する異種挿入断片（多コピーのｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃまたはｐａｔ遺伝子の代わりにまたはそれと一緒に）を含む植物および植物細胞を包含する（配列番号１のｂｐ１−１４００および配列番号２のｂｐ１５３−１５５０）。ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃまたはｐａｔの１つの追加的なコピー（または複数の追加的なコピー）も、この／これらのように挿入の標的とすることができる。
【００８５】
本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
以下の実施例は、本発明を実施するための手順を例示するため、および本発明のある特定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示されている技法は、それを実施するための好ましい方式を例示するために使用される特定の手法を表していることが理解されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これらの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の指定のない限り、全ての百分率は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の割合は体積による。
【００８７】
別段の指定のない限り、以下の略語が使用されている。
ｂｐ  塩基対
℃  摂氏温度
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ  キロベース
μｇ  マイクログラム
μＬ  マイクロリットル
ｍＬ  ミリリットル
Ｍ  モル質量
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ  植物転写単位
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＳＣ  塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ  トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３
【００８８】
本発明の実施形態は以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、単に例示として示されていることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、また、その主旨および範囲から逸脱することなく、本発明の実施形態に種々の変更および改変を行って、種々の用法および条件に適合させることができる。したがって、本明細書に示され、記載されている実施形態に加えて、本発明の実施形態の種々の改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような改変も添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【００８９】
本明細書に記載されている各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例）
【実施例１】
【００９０】
ｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１ＡｃダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の形質転換および選抜
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）を、ダイズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。Ｔ鎖ＤＮＡ領域内に選抜マーカー、ｐａｔｖ６および対象の遺伝子ｃｒｙ１Ｆｖ３およびｃｒｙ１Ａｃを含むバイナリーベクターｐＤＡＢ９５８２（図１）を保有する武装解除したアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Hoodら、1993年）を使用して形質転換を開始した。ｐＤＡＢ９５８２のＤＮＡ配列は配列番号３に示され、下の表１において注釈を付けている。
【００９１】
【表１】
2014522661.tif 000003
【００９２】
Zengら（2004年）の手順を改変して用いてアグロバクテリウム媒介形質転換を行った。簡単に述べると、ダイズ種子（Ｍａｖｅｒｉｃｋ栽培品種）を基本培地上で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。アグロバクテリウムを除去するために、苗条誘導（shoot initiation）培地、苗条伸長培地、および発根培地にセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネートによる選択を使用して、形質転換されていない苗条の生長を阻害した。選択された苗条を、根を発生させるために発根培地に移し、次に、小植物を順化させるために土壌混合物に移した。
【００９３】
選択された小植物の頂小葉にグルホシネートを塗布して推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して、気候順化させ、次に葉にグルホシネートを塗布して耐性を再確認し、推定形質転換体であるとみなした。スクリーニングされた植物の試料を採取し、選択マーカー遺伝子および／または対象の遺伝子を確認するための分子解析を行った。Ｔ０植物を温室内で自家受精させてＴ１種子を生じさせた。
【００９４】
このイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１は、独立した形質転換分離株から生成した。Ｔ１植物を戻し交雑し、その後の世代にわたって優良品種に遺伝子移入した。イベントをその独特の特性、例えば、単一の挿入部位、正常なメンデル分離、安定発現、ならびに除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた組合せに基づいて選抜した。以下の実施例は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を特徴付けるために使用したデータを含有する。
【実施例２】
【００９５】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１におけるタンパク質の発現の特徴付け
ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１において発現させた組換え型のＣｒｙ１Ｆ
タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質、およびＰＡＴタンパク質の生化学的性質を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、タンパク質の生化学的性質を特徴付け、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１におけるこれらのタンパク質の発現を確認するために用いることができる、当技術分野の範囲内で公知の生化学的アッセイである。
【００９６】
実施例２．１：植物組織におけるＰＡＴタンパク質、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、およびＣｒｙ１Ａｃタンパク質の発現
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＰＡＴタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、ＰＡＴ  ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現されたＰＡＴタンパク質を測定した。
【００９７】
界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＣｒｙ１Ｆタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Ｃｒｙ１Ｆ  ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現されたＣｒｙ１Ｆタンパク質を測定した。
【００９８】
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＣｒｙ１Ａｃタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Ｃｒｙ１Ａｃ  ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現されたＣｒｙ１Ａｃタンパク質を測定した。
【００９９】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１において、検出解析を実施して発現の安定性および遺伝性を垂直方向（世代間）および水平方向（世代内の系列間）の両方で調査した。
【０１００】
実施例２．２：植物組織におけるＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質、およびＰａｔタンパク質の発現
ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１におけるＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＰＡＴタンパク質のレベルを決定した。ダイズの葉組織から、可溶性の抽出可能なタンパク質を、定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。Ｔ２〜Ｔ６世代のダイズイベント９５８２．８１４．１９．１で発現は安定であり（分離性でない）、系列全てにわたって一貫していた。表２に、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１におけるトランスジェニックタンパク質の平均発現レベルが列挙されている。
【０１０１】
【表２】
2014522661.tif 000004
【実施例３】
【０１０２】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の挿入断片および隣接境界領域におけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の隣接ゲノムＴ−ＤＮＡ境界領域の配列を決定した。１４００ｂｐの５’隣接境界配列（配列番号１）および１３９８ｂｐの３’隣接境界配列（配列番号２）を含むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のゲノム配列を確認した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の境界配列に基づくＰＣＲ増幅により、境界領域がダイズ起源であること、および接合領域がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に独特の配列であることが検証された。接合領域をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のイベント特異的な同定のために使用することができる。さらに、Ｔ鎖の挿入部位を、形質転換されていないダイズのゲノム由来の同定された隣接境界配列の領域に対応するゲノムの断片を増幅することによって特徴付けた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を形質転換されていないゲノム配列と比較することにより、Ｔ鎖の組み込みの間に元の遺伝子座から約５７ｂｐが欠失したことが明らかになった。全体的に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の挿入断片および境界配列を特徴付けることにより、ｐＤＡＢ９５８２由来のＴ鎖のインタクトなコピーがダイズゲノム内に存在することが示された。
【０１０３】
【表３】
2014522661.tif 000005
【０１０４】
【表４】
2014522661.tif 000006
【０１０５】
【表５】
2014522661.tif 000007
【０１０６】
実施例３．１：ダイズのゲノム配列の確認
５’隣接境界および３’隣接境界を第０２染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列に対しアラインメントし、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の導入遺伝子がダイズゲノムの第０２染色体に挿入されたことが示されている。ダイズゲノムからダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の挿入部位を確認するために、異なるプライマー対を用いてＰＣＲを行った（図２、表３、表４、および表５）。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１由来のゲノムＤＮＡおよび他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。５’境界配列が正確であることを確認するために、Ａｔ  Ｕｂｉ１０プロモーター遺伝子エレメント、例えば、ＡｔＵｂｉ１０ＲＶ１に結合するように設計したプライマー、および、ダイズゲノムの第０２染色体上のクローニングされた５’末端境界に結合するように設計したプライマー、８１４１９＿ＦＷ３と称されるプライマーを、Ａｔ  Ｕｂｉ１０プロモーター遺伝子エレメントから５’末端境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。同様に、クローニングされた３’境界配列を確認するために、ｐａｔ特異的なプライマー、例えば、３’ＰＡＴＥｎｄ０５、ならびに、８１４１９＿ＲＶ１、８１４１９＿ＲＶ２および８１４１９＿ＲＶ３と称される、
クローニングされた３’末端境界配列に従って設計した３つのプライマーを、ｐａｔ遺伝子から３’境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。予測されたサイズを有するＤＮＡ断片は、各プライマー対を用いたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のゲノムＤＮＡからのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニック対照由来のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた５’境界配列および３’境界配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のＴ鎖挿入断片の隣接境界配列であることを示している。
【０１０７】
ダイズゲノム内のＤＮＡ挿入物をさらに確認するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のＴ鎖挿入断片を含有しないゲノムＤＮＡにおいてダイズ境界配列にわたるＰＣＲ増幅を完了した。５’末端境界配列に従って設計したプライマー８１４１９＿ＦＷ３、および３’末端境界配列に対して設計した１つのプライマー８１４１９−ＲＶ３を使用して、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖が組み込まれた遺伝子座を含有したＤＮＡセグメントを増幅した。予測通り、８１４１９＿ＦＷ３および８１４１９＿ＲＶ３のプライマー対を用いて完了したＰＣＲ増幅により、全ての他のダイズ対照系統からおよそ１．５ｋｂのＤＮＡ断片が生じたが、ｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１からは生じなかった。同定されたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の５’境界配列および３’境界配列を第０２染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列とアラインメントすることにより、元の遺伝子座からの約５７ｂｐの欠失が明らかになった（図３）。これらの結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ８２９４の導入遺伝子がダイズゲノムの第０２染色体の部位に挿入されたことが実証された。
【実施例４】
【０１０８】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のサザンブロットによる特徴付け
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の組み込みパターンを確立した。これらの実験により、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ導入遺伝子のダイズゲノム内への組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１は、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの単一コピーを含有する全長の、単純な組み込みイベントであると特徴付けられた。
【０１０９】
サザンブロットのデータにより、Ｔ鎖断片がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のゲノムに挿入されたことが示唆された。詳細なサザンブロット分析を、ｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のＴ鎖組み込み領域に含有されるｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ遺伝子に特異的なプローブ、およびプラスミド内に位置する切断部位を有し、プラスミドまたはプラスミドとダイズのゲノムＤＮＡの接合部にわたる断片（境界断片）内にハイブリダイズ断片を生じる説明的な制限酵素を使用して行った。サザンハイブリダイゼーションによって示された制限酵素とプローブの組合せについての分子量は、このイベントに独特であり、その同定パターンを確立した。これらの分析により、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの再配置を伴わずにプラスミド断片がダイズのゲノムＤＮＡに挿入されたことも示された。
【０１１０】
実施例４．１
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を含有する個々のダイズ植物から回収した葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。さらに、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ遺伝子が存在しない物質系統の代表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるＭａｖｅｒｉｃｋからｇＤＮＡを単離した。標準のＣＴＡＢ法（Sambrookら（1989年））の後、凍結乾燥した葉組織から個々のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出した後、ＤＮＡを、ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して
分光蛍光分析によって定量した。次いで、ＤＮＡをアガロースゲル上で可視化してＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ分析からの値を確認し、ＤＮＡの質を決定した。
【０１１１】
実施例４．２
ＤＮＡの消化および分離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１をサザンブロットによって分子キャラクタリゼーションするために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消化した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１および非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、各ＤＮＡ試料にＤＮＡ１μｇ当たりおよそ５ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えることによって消化した。各試料を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。単独消化のために、制限酵素ＡｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｓｉＩ、およびＮｄｅＩを個々に使用した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。二重消化のために制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩを一緒に使用した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＢ９５８２を非トランスジェニックダイズ品種であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ反応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。
【０１１２】
消化物を一晩インキュベートした後、ＱＵＩＣＫ−ＰＲＥＣＩＰ  ＰＬＵＳ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）２５μＬを加え、消化されたＤＮＡ試料を、イソプロパノールを用いて沈澱させた。沈澱したＤＮＡペレットを、１×ローディング緩衝液（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０.０ｍＭのＥＤＴＡ、１０．０％グリセロール、１.０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）１５μＬに再懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いた０．８５％アガロースゲルにより、３５ボルトでおよそ１８〜２２時間、電気泳動して断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外線（ＵＶ）の下で可視化した
【０１１３】
実施例４．３
サザンブロット分析を基本的にＭｅｍｅｌｉｎｋら（１９９４年）に記載されている通り実施した。簡単に述べると、ＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、可視化した後、ゲルを、０．２５ＭのＨＣｌを用い、およそ２０分にわたって脱プリン化し、次いで、変性溶液（０．４ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）におよそ３０分間、その後、中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのトリス、ｐＨ７．５）に少なくとも３０分間曝露させた。ナイロンメンブレンへのサザン転写を、１０×ＳＳＣを伴うウィッキング系を用いて一晩実施した。転写後、ＵＶ架橋によってＤＮＡをメンブレンに結合させ、その後、メンブレンを２×ＳＳＣ溶液で簡単に洗浄した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。
【０１１４】
実施例４．４
ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を検出した（表６）。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識されたヌクレオチド［ＤＩＧ−１１］−ｄＵＴＰを、遺伝子エレメントに特異的なプライマーを使用してプラスミドｐＤＡＢ９５８２から増幅されたＤＮＡ断片にＰＣＲに基づいて組み込むことによってプローブを生成した。ＰＣＲ合成によるＤＮＡプローブの生成を、ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）
を製造者の推奨手順に従って使用して行った。
【０１１５】
標識したプローブをアガロースゲル電気泳動によって解析して、それらの質および数量を決定した。次いで、基本的にＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に関して記載されている手順を用いて、特異的な断片を検出するために、所望の量の標識したプローブをナイロンメンブレン上の標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるために使用した。簡単に述べると、固定されたＤＮＡを含有するナイロンメンブレンブロットを２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、ハイブリダイゼーションビン中の予め温めたＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ２０〜２５ｍＬと、ハイブリダイゼーションオーブン内、およそ４５〜５５℃で約２時間にわたってプレハイブリダイズさせた。次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をデカントし、ウォーターバス中でおよそ５分間煮沸することによって変性させた所望の量の特異的なプローブを含有する予め温めたＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ約１５ｍＬと交換した。次いで、ハイブリダイゼーションステップをハイブリダイゼーションオーブン内、およそ４５〜５５℃で一晩行った。
【０１１６】
プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ  ＳＯＬＵＴＩＯＮを清潔なチューブ内にデカントし、およそ−２０℃で保管した。これらのプローブは、製造者の推奨手順に従って２回まで再使用することができた。メンブレンブロットを簡単にすすぎ、清潔なプラスチック容器中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて室温でおよそ５分にわたって２回洗浄し、その後、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて２回、それぞれおよそ６５℃で１５分間洗浄した。メンブレンブロットを、ＤＩＧ  ＷＡＳＨ  ＡＮＤ  ＢＬＯＣＫ  ＢＵＦＦＥＲ  ＳＥＴ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の１×マレイン酸緩衝液を用いておよそ５分にわたって簡単に洗浄した。その後、１×ブロッキング緩衝液で２時間にわたってブロッキングし、同じく１×ブロッキング緩衝液中の抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と一緒に最低でも３０分間インキュベートした。１×洗浄緩衝液を用いて２〜３回洗浄した後、特異的なＤＮＡプローブはメンブレンブロットに結合したままであり、ＤＩＧ標識されたＤＮＡ標準物質を、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ  ＣＨＥＭＩＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の推奨に従って使用して可視化した。１つまたは複数の時点でブロットを化学発光フィルムに曝露させて、ハイブリダイズした断片を検出し、分子サイズ標準物質を可視化した。フィルムをＡＬＬ−ＰＲＯ  １００  ＰＬＵＳフィルム現像剤（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いて現像し、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを各プローブについて実証した。記載の通りＤＩＧ検出後に可視化されるＤＩＧ−ＬＡＢＥＬＬＥＤ  ＤＮＡ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＷＥＩＧＨＴ  ＭＡＲＫＥＲ  ＩＩ（ＤＩＧ  ＭＷＭ  ＩＩ）およびＤＩＧ−ＬＡＢＥＬＬＥＤ  ＤＮＡ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＷＥＩＧＨＴ  ＭＡＲＫＥＲ  ＶＩＩ（ＤＩＧ  ＭＷＭ  ＶＩＩ）を使用して、サザンブロット上にハイブリダイズした断片サイズを決定した。
【０１１７】
【表６】
2014522661.tif 000008
【０１１８】
実施例４．５
サザンブロットの結果
ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブに関して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表７に示されている。これらの消化およびハイブリダイゼーションから２種類の断片を同定した：公知の酵素部位がプローブ領域に隣接し、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの挿入領域内に完全に含有されている内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置し、第２の部位がダイズゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、ＤＮＡ断片の組み込み部位はそれぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベントごとに変動する。境界断片により、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位を位置づける手段およびＤＮＡ挿入物の数を評価する手段がもたらされる。イベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を含有するダイズの多世代に対して完了したサザンブロット分析により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来の低コピー、インタクトなｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵが、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のダイズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。
【０１１９】
【表７】
2014522661.tif 000009
【０１２０】
制限酵素ＡｓｅＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ９５８２に独特の制限部位を結合および分割する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１におけるｃｒｙ１Ａｃ遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。７２８
６ｂｐより大きいまたは９４７９ｂｐより大きい境界断片は、それぞれＡｓｅＩおよびＮｓｉＩで消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された（表７）。それぞれＡｓｅＩおよびＮｓｉＩ消化を使用したとき、約７４００ｂｐおよび１００００より大きいｂｐの単一のｃｒｙ１Ａｃハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のダイズゲノム内にｃｒｙ１Ａｃ遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆される。制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩを、ｃｒｙ１Ａｃ植物転写単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出し、二重消化をさせるために選択した（表７）。予測された４５５０ｂｐの断片は、ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩ二重消化した後、プローブを用いて観察された。酵素を用いてｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１試料を消化し、その後プローブとハイブリダイズさせることで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のインタクトなｃｒｙ１ＡｃＰＴＵの単一コピーがダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のダイズゲノムに挿入されたことが示された。
【０１２１】
制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ９５８２の制限部位に結合し、切断する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１におけるｃｒｙ１Ｆ遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。５５６９ｂｐより大きい境界断片および９４７９より大きい境界断片は、それぞれＮｄｅＩおよびＮｓｉＩで消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された（表７）。ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩを使用したとき、それぞれ約７５００ｂｐおよび１００００ｂｐより大きい単一のｃｒｙ１Ｆハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のダイズゲノム内にｃｒｙ１Ｆ遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆される。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを、ｃｒｙ１Ｆ植物転写単位（ＰＴＵ；プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出させるために選択した（表７）。予測された７７３２ｂｐの断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後にプローブを用いて観察された。ｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１試料を酵素で消化し、その後プローブとハイブリダイズさせることで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のインタクトなｃｒｙ１Ｆ  ＰＴＵがダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のダイズゲノムに挿入されたことが示された。
【０１２２】
実施例４．６：骨格配列が存在しないこと
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ｓｐｅｃＲ）、Ｏｒｉ  Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡ
（ＴＲｆ  Ａエレメント）が存在しないことを検証するために、サザンブロット分析も行った。適切な陽性対照（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）および陰性対照（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡ）をサザン分析に含めた場合、スペクチノマイシン抵抗性、Ｏｒｉ  Ｒｅｐエレメントまたはｔｒｆ  Ａエレメントに対する特異的なハイブリダイゼーションは予測されなかった。ＮｓｉＩ消化し、ｓｐｅｃＲ特異的なプローブとハイブリダイズさせた後、陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）において、１５３２０ｂｐの、１つの予測されたサイズのバンドが観察された。ｓｐｅｃＲプローブは陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の試料とはハイブリダイズしなかった。同様に、ＮｓｉＩ消化し、ｔｒｆＡプローブとハイブリダイズさせた後、１５３２０ｂｐの、１つの予測されたサイズのバンドが陽性対照試料（ｐＤＡＢ９５８２プラスｍａｖｅｒｉｃｋ）において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の試料では検出されなかった。ＮｄｅＩ消化し、ＯｒｉＲｅｐ特異的なプローブとハイブリダイズさせた後、５３２９ｂｐの、別の予測されたサイズのバンドが陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）において検
出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の試料では検出されなかった。これらのデータは、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ｏｒｉ  Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡが存在しないことを示している。
【実施例５】
【０１２３】
農業形質および収量圃場試験ならびに除草剤耐性
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の農業特性および有効性を試験するために、２０１０年１０月および２０１１年２月のプエルトリコ、サンタイサベルにおける有効性試験において該イベントを植えた。イベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を作出するために最初に形質転換した栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋを各苗床に植え、実験に対照として含めた。Ｔ３苗床の種子はＴ２段階における単一植物選択から得、Ｔ４苗床の種子はＴ３段階における単一植物選択から得た。各世代において４系列のイベントを試験した。作条４つの広さ、７．５フィートの長さの小区画に各系列を植えた。作条間の間隔は３０インチであった。プエルトリコの日の短さを補償するために、小区画を光の下でおよそ２．５週間にわたって生長させた。各苗床にグルホシネートを４１１ｇ  ａｅ／ｈａの比率で噴霧した。対照植物であるＭａｖｅｒｉｃｋの１つの小区画に、グルホシネートを同じ比率で噴霧し、第２の小区画には噴霧せず、イベントに対する対照比較として使用した。
【０１２４】
出芽、全体的な外観、生長力、高さ、倒伏、および成熟度についてデータを収集した。萎黄病、葉の壊死および植物の枯死について視覚的に調べることによって除草剤耐性を評価した（表８）。
【０１２５】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とＭａｖｅｒｉｃｋを比較するために、Ｍａｖｅｒｉｃｋの噴霧していない区域からのデータのみを使用した。噴霧処理と噴霧なし処理を比較するために、所与の処理で噴霧したダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１区域からのデータを、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照の噴霧していない区域からのデータと比較した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１はグルホシネート除草剤施用に対する耐性を示した。対照的に、除草剤処理に対して耐性のＭａｖｅｒｉｃｋ植物は存在しなかった。
【０１２６】
【表８】
2014522661.tif 000010
【実施例６】
【０１２７】
ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１についての殺虫活性の特徴付け
アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ（fall armyworm））を含めた、実験室で飼育したダイズ害虫に対するダイズイベン
トｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１におけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ１Ｆの活性を特徴付けるために、圃場および温室における評価を行った。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を形質転換されていないダイズ品種Ｍａｖｅｒｉｃｋと比較して、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質およびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によってもたらされる植物の保護のレベルを決定した。
【０１２８】
およそ４週齢の植物に対して温室試験を行った。１５の植物を使用してダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照を評価した。試験した各昆虫種（アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、シュードプラシア・インクルデス（Pseudoplusia includes）、およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））について、合計４５のリーフディスク／植物／昆虫種のために各植物から３つのリーフパンチを作製した。１．４ｃｍ（１．５４ｃｍ２）のリーフパンチを２％の素寒天の上部の試験アリーナに置き、新生幼虫１匹を外寄生させ、穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。外寄生させた４日後に死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しなかった幼虫は死亡したとみなした。昆虫に消費されたリーフパンチの百分率を視覚的にスコアリングすることによって葉の損傷を評価した。
【０１２９】
プエルトリコ、サンタイサベルにおける種子増加苗床小区画から葉の試料を収集し、これらの葉を試験するためにＩＮ、インディアナポリスに送ることによって圃場評価を行った。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１のための苗床小区画は２０１１年２月に植え付けされ、４つの作条に配置されたおよそ１８０の植物からなった。各作条は長さ２．３ｍであり、７６．２ｃｍの間隔があけられ、個々の植物は各作条内に５．１ｃｍの間隔で植えられた。２０１１年３月に、１０のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１植物および１０の「Ｍａｖｅｒｉｃｋ」植物から、分裂組織のおよそ４節下に位置する完全に増大した主茎の三出葉を１枚切除した。葉を、ラベルを付けたプラスチックの袋に入れ（袋当たり１枚）、密閉した。袋に入れた葉を包装して実験室に移した。実験室において、各三出葉から直径３．３３ｃｍ（１．３１ｉｎ）のリーフディスク１つまたは２つを押し抜き、合計１６のリーフディスクを準備した。各リーフディスクを２％の寒天の上部の試験アリーナに置き、新生ヨトウガ（S. frugiperda）幼虫１匹を外寄生させ、穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。リーフディスクを、制御された環境のチャンバー内で７日間保持し、７日の時点で死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しない幼虫は死亡したとみなした。昆虫に消費されたリーフパンチの百分率を視覚的にスコアリングすることによって葉の損傷を評価した。
【０１３０】
これらの反復実験から得られた結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１では、試験した昆虫全てに対して、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物と比較して有意に低い損傷が持続されたことを示した。したがって、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１はこの広範な宿主域にわたって殺虫活性を有する。
【実施例７】
【０１３１】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の配列
配列番号１４にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の配列が提供されている。この配列は、５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２のＴ鎖挿入断片および３’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号１４に関して、残基１〜１４００は５’ゲノム隣接配列であり、残基１４０１〜１５３６はｐＤＡＢ９５８２プラスミドからの再配置の残基であり、１５３７〜１３８９６は、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖挿入断片の残基であり、残基１３８９７〜１５２９４は３’隣接配列である。したがって挿入断片の５’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号１４の残基１４００〜１４０１に生じる。したがって挿入断片の３’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号１４の残基１３８９６〜１３８９７に生じる。
【０１３２】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１由来の後代は、配列番号１４からわずかに逸脱した配列を有する可能性があることに留意するべきである。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を植物細胞のゲノムに導入する遺伝子移入および育種プロセスの間に、挿入断片のいくつかの欠失または他の変更が起こることは珍しくない。さらに、ＰＣＲ増幅において、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得る。例えば、本明細書において列挙されている隣接配列は、ダイズのゲノムＤＮＡからアンプリコンを生成し、次いでアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮＡから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本発明の範囲内であることを認識し、留意するべきである。したがって、本明細書において提供されるプラスミド配列の関連するセグメントは、いくつかの軽微な変動を含んでよい。したがって、本主題の挿入断片配列に対していくらかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は本発明の範囲内である。配列番号１４の配列に対する同一性とは、本明細書で例示または記載されている配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。したがって、配列番号１４とダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の後代植物の間のいくつかの差異を同定することができ、それは本発明の範囲内である。
【実施例８】
【０１３３】
イベント特異的なＴａｑＭａｎアッセイ
育種集団においてダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の存在を検出するため、および植物の接合生殖性の状態を決定するためにイベント特異的なＴＡＱＭＡＮアッセイを開発した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１はバイナリーベクターｐＤＡＢ９５８２のＴ鎖を含有する（図１）。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を特異的に検出するために、５’挿入断片−植物接合部（配列番号１）または３’挿入断片−植物接合部（配列番号２）に位置するＤＮＡ配列に従って特異的なＴＡＱＭＡＮプライマーおよびプローブを設計した（図４）。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に対する１つのイベント特異的なアッセイを設計して、２つのプライマーおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）によって合成された５’末端にＦＡＭレポーターを含有する標的特異的なＭＧＢプローブを使用し、３’組み込み接合部にわたる２２９ｂｐのＤＮＡ断片を特異的に検出した。このＴＡＱＭＡＮ検出法のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に対する特異性を、Ｃｒｙ１Ａｃ  ＰＴＵおよびＣｒｙ１Ｆ  ＰＴＵを含有する７つの異なるイベントならびに対照である非トランスジェニックダイズ品種（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）に対して、ダイズ特異的な内在性参照遺伝子であるＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）を用いて二連形式で試験した。
【０１３４】
実施例８．１：ｇＤＮＡの単離
この試験では、７つの異なるダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種のｇＤＮＡ試料を試験した。ゲノムＤＮＡを、改変ＱＩＡＧＥＮ  ＭＡＧＡＴＴＲＡＣＴ  ＰＬＡＮＴ  ＤＮＡ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出した。試料当たり８つの新鮮なダイズのリーフディスクをｇＤＮＡ抽出に使用した。この試験のために、試料をデオキシリボヌクレアーゼを含まない水で希釈し、濃度をおよそ１０ｎｇ／μＬにした。
【０１３５】
実施例８．２：ＴａｑＭａｎアッセイおよび結果
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１特異的なＴＡＱＭＡＮアッセイのために特異的なＴＡＱＭＡＮプライマーおよびプローブを設計した。これらの試薬を以下に列挙されている条件で使用して、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１内の導入遺伝子を検出することができる。表９には、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を検出するために特異的に開発されたプライマーおよびプローブの配列が列挙されている。
【０１３６】
【表９】
2014522661.tif 000011
【０１３７】
増幅するためのマルチプレックスＰＣＲ条件は以下の通りである：反応物総計１０μＬ中、１×Ｒｏｃｈｅ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．４μＭのイベント特異的フォワードプライマー、０．４μＭのイベント特異的リバースプライマー、０．４μＭのプライマーＧＭＳ１１６Ｆ、０．４μＭのプライマーＧＭＳ１１６Ｒ、０．２μＭのイベント特異的プローブ、０．２μＭのＧＭＳ１１６プローブ、０．１％ＰＶＰ、６〜２０ｎｇのｇＤＮＡ。反応混液を以下の条件を用いて増幅した：ｉ）９５℃で１０分、ｉｉ）９５℃で１０秒、ｉｉｉ）６０℃で４０秒、ｉｖ）ステップｉｉ〜ｉｉｉを４０サイクル繰り返し、ｖ）４０℃で保持。ＲＯＣＨＥ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ４８０でリアルタイムＰＣＲを行った。データ解析はＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ４８０ソフトウェアによって決定された、蛍光の変化率が最大に達するＰＣＲサイクル数である交差点（Ｃｐ値）の測定値に基づいた。
【０１３８】
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１に対するＴＡＱＭＡＮ検出法を、Ｃｒｙ１Ａｃ  ＰＴＵおよびＣｒｙ１Ｆ  ＰＴＵを含有する７つの異なるイベントならびに非トランスジェニックダイズ品種に対して、ダイズ特異的な内在性参照遺伝子であるＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）を用いて二連形式で試験した。このアッセイにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１が特異的に検出され、対照（すなわち、Ｃｒｙ１Ａｃ  ＰＴＵおよびＣｒｙ１Ｆ  ＰＴＵを含有するイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種）の偽陽性の結果は生じなかった、または増幅されなかった。イベント特異的なプライマーおよびプローブはダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を検出するために使用することができ、これらの条件および試薬は接合生殖性アッセイに利用可能である。
【０１３９】
本発明の原理が例示され、記載され、本発明は、そのような原理から逸脱することなく取り合わせおよび詳細を改変することができることが当業者には明らかであるはずである。我々は添付の特許請求の範囲の主旨および範囲内に入る全ての改変について特許請求する。
【０１４０】
本明細書において引用されている刊行物および公開特許文書は全て、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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