(57)【要約】式（Ｉ）で表される（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩、その製造方法、及び治療薬としての、特にタンパク質キナーゼ阻害剤としてのその用途が提供される。2014507448.tif 000032 【選択図】なし
2014507448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩。
2014507448.tif 000031
［式中、
ｎは1、2又は3であり；及び、
Ｍは酸性分子である。］
【請求項２】
前記塩が無機塩である、請求項１に記載の塩。
【請求項３】
前記無機塩が、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩及び臭化水素酸塩からなる群より選ばれる、請求項２に記載の塩。
【請求項４】
前記無機塩が塩酸塩である、請求項３に記載の塩。
【請求項５】
ｎが2である、請求項４に記載の塩。
【請求項６】
前記塩が有機塩である、請求項１に記載の塩。
【請求項７】
前記有機塩が、p−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、乳酸塩及びL−リンゴ酸塩からなる群より選ばれる、請求項６に記載の塩。
【請求項８】
前記塩がマレイン酸塩である、請求項７に記載の塩。
【請求項９】
ｎが2である、請求項８に記載の塩。
【請求項１０】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドと対応する酸とを反応させ、塩を形成する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の塩の製造方法。
【請求項１１】
前記酸が、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、p−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ナフタレンスルホン酸、乳酸及びL−リンゴ酸からなる群より選ばれる無機酸又は有機酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製薬学的に許容される塩の治療的有効量及び製薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合する工程を含む、請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１４】
タンパク質キナーゼがEGFR受容体チロシンキナーゼ及びHER-2受容体チロシンキナーゼからなる群より選ばれ、前記タンパク質キナーゼ関連疾患治療用の薬物の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製薬学的に許容される塩又は請求項１２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
癌疾患が肺癌、乳癌、扁平上皮癌及び胃癌からなる群より選ばれ、前記癌疾患治療用の薬物の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製薬学的に許容される塩又は請求項１２に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、6−アミノキナゾリン誘導体又は3−シアノキノリン誘導体の製薬学的に許容される塩、その製造方法及びその医学的用途に関する。具体的には、本発明は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩、その製造方法、及び治療薬としての、特にタンパク質キナーゼ阻害剤としてのその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
シグナル伝達は細胞外刺激を細胞内部に中継する基本的な機構であり、増殖、分化及びアポトーシスを含む対応する身体的反応を調節している。これらのシグナル伝達過程の多くは、特異的なタンパク質キナーゼやホスファターゼを含む、タンパク質の可逆的なリン酸化過程を利用している。
【０００３】
タンパク質キナーゼ（PK）にはタンパク質チロシンキナーゼ（PTK）とセリンスレオニンキナーゼ（STK）の2種類がある。PTKはタンパク質のチロシン残基をリン酸化する。STKはセリン又は／及びスレオニン残基をリン酸化する。チロシンキナーゼは、受容体型（受容体チロシンキナーゼ、RTK）か又は非受容体型（非受容体チロシンキナーゼ）かのいずれかに分類される。現在、ヒトゲノム中で約90種のチロシンキナーゼが同定され、そのうち約60種が受容体型に属し、約30種が非受容体型に属している。
【０００４】
受容体チロシンキナーゼ（RTK）ファミリーは、（１）EGFR、HER-2、HER-3及びHER-4を含むEGF受容体ファミリー；（２）インスリン受容体（IR）、インスリン様成長因子−I受容体（IGF-IR）及びインスリン関連受容体（IRR）を含むインスリン受容体ファミリー；（３）血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）、幹細胞因子（SCF）受容体（c-Kit）RTK、fms様チロシンキナーゼ3（Flt3）受容体及びコロニー刺激因子１受容体（CSF-1R）などのクラスIIIファミリーなど、多くのサブファミリーを含む。その他、肝細胞増殖因子受容体c-Met、血管内皮増殖因子（VEGFR）などもRTKファミリーに属する。これらは細胞増殖や分化の調節において重要な役割を果たし、増殖因子などのサイトカイン産生に至る細胞シグナルの重要なメディエーターである（Schlessinger and Ullrich, Neuron 1992, 9,
383）。
【０００５】
EGFR（ErbB、HER）は、細胞の増殖と生存の調節において重要な役割を果たす。これらのRTKは、細胞外グリコシル化リガンド結合領域、膜貫通領域及び細胞内細胞質触媒領域からなる。受容体チロシンキナーゼの酵素活性は、リガンド介在性ホモ二量体化又はヘテロ二量体化により活性化される。二量体化により、触媒領域において受容体のチロシン残基がリン酸化され、将来の結合部位が生成する。その後に、微小管結合タンパク質キナーゼ（MAPキナーゼ）やホスファチジルイノシトール3−キナーゼ（PI3キナーゼ）などを含む細胞内シグナル経路の活性化が続く。これらの経路の活性化は、細胞周期やアポトーシスの制御に関連している。EGFRやHER-2のようなチロシンキナーゼの変異型及び過剰発現型が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、食道癌、卵巣癌及び膵癌などの一般的なヒト癌の多くに存在することが確認されている。発癌と癌増殖において、罹患率とチロシンキナーゼの関連が確認されている。
【０００６】
抗腫瘍細胞増殖活性を有する新規化合物の合成が期待される。これらの化合物は1種以上のRTK又はSTKを阻害することが期待され、RTK又はSTK介在性及び血管新生介在性の細胞過増殖を伴う生理的障害を治療又は改善するのに有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の開示は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される一連の塩と、特にタンパク質キナーゼ阻害剤としての用途に関する。
【０００８】
本発明者らは、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの遊離塩基は通常の溶媒に難溶性であり、医薬品投与剤形へと調製するのに不利であり、体内の生物学的利用率を制限することを見い出した。したがって、投与剤形の通常の製造プロセスに適合させるため、その溶解性及び薬物動態学的吸収を改善することが急務である。（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの遊離塩基と比較して、本化合物の製薬学的に許容される塩の溶解性及び薬物動態は顕著に改善され、また合成プロセスが簡素化された。
【０００９】
本発明は、式（Ｉ）で表される化合物の製薬学的に許容される塩を提供し、それにより、本化合物の物理的／化学的性質及び薬物動態特性を改善する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、式（Ｉ）で表される化合物の製薬学的に許容される塩及びその製造方法の提供に関する。好ましくは式（Ｉ）で表される化合物の二マレイン酸塩が、式（Ｉ）で表される化合物そのもの及び当該化合物のその他の塩と比較して、溶解性、生物学的利用率及び薬物動態において優れている。
【００１１】
【化１】
2014507448.tif 000003
【００１２】
［式中、
ｎは1、2又は3であり；及び、
Ｍは酸性分子である。］
【００１３】
本発明の第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）で表される（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩に関し、当該塩は、当技術分野において通常の無機塩又は有機塩である。さらに、前記無機塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩及びリン酸塩からなる群より選ばれ、好ましくは塩酸塩であり、より好ましくは二塩酸塩であり；前記有機塩は、p−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、乳酸塩及びL−リンゴ酸塩からなる群より選ばれ、好ましくは、L−リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩又はマレイン酸塩であり、最も好ましくはマレイン酸塩である。特に式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩は、式（Ｉ）で表される化合物そのもの及び当該化合物のその他の塩と比較して、溶解性、生物学的利用率及び薬物動態において優れている。
【００１４】
本発明の第２の態様において、本発明は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩の製造方法に関し、当該化合物は、当技術分野において通常の塩化工程に準じて製造することができる。具体的には、前記方法は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドと対応する酸とを反応させ、塩を形成する工程を含み、前記酸は、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、p−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ナフタレンスルホン酸、乳酸及びL−リンゴ酸からなる群より選ばれる無機酸／有機酸である。
【００１５】
本発明の化合物の製薬学的に許容される塩は下記（表１）の例示を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
【表１】
2014507448.tif 000004
2014507448.tif 000005
2014507448.tif 000006
【００１７】
本発明の第３の態様において、本発明は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩の治療的有効量及び製薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。また本発明は、前記の製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合する工程を含む医薬組成物の製造方法に関する。
【００１８】
本発明の第４の態様において、本発明は、タンパク質キナーゼ関連疾患治療用の薬物の製造における（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩又はその医薬組成物の使用に関し、前記タンパク質キナーゼは、EGFR受容体チロシンキナーゼ及びHER-2受容体チロシンキナーゼからなる群より選ばれる。
【００１９】
本発明の第５の態様において、本発明は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩又はその医薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含むタンパク質キナーゼ関連疾患の治療方法に関する。
【００２０】
本発明の第６の態様において、本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤薬物の製造における（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩又はその医薬組成物の使用に関し、前記タンパク質キナーゼは、EGFR受容体チロシンキナーゼ及びHER-2受容体チロシンキナーゼからなる群より選ばれる。
【００２１】
本発明の第７の態様において、本発明は、タンパク質キナーゼ関連疾患治療用の薬物としての（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩又はその医薬組成物の使用に関し、前記疾患は、肺癌、乳癌、扁平上皮癌及び胃癌からなる群より選ばれる癌疾患である。
【００２２】
本発明の第８の態様において、本発明は、（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミドの製薬学的に許容される塩をタンパク質キナーゼと接触させることを含む前記タンパク質キナーゼの触媒活性を調節する方法に関し、前記タンパク質キナーゼは、EGFR受容体チロシンキナーゼ及びHER-2受容体チロシンキナーゼからなる群より選ばれる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は下記の実施例によりさらに説明されるが、本発明の範囲をこれらに限定するものではない。
【実施例】
【００２４】
すべての化合物の構造は、核磁気共鳴（NMR）及び／又は質量分析（MS）により同定した。NMRの化学シフト（δ）はppm（10-6）として表示した。NMRは、ブルカー AVANCE-400スペクトロメータにより測定した。検出溶媒は重ジメチルスルホキシド（d-DMSO）であり、内部標準としてテトラメチルシラン（TMS）を使用し、化学シフトはppm（10-6）として記録した。
【００２５】
MSは、FINNIGAN LCQ Ad（ESI）質量分析計（サーモ、モデル：Finnigan LCQ
advantage MAX）により測定した。
【００２６】
HPLCは、アジレント1200DAD高速液体｛こうあつ えきたい｝クロマトグラフィースペクトロメータ（Sunfire C18
150×4.6 mm クロマトグラフィーカラム）及びウォーターズ2695-2996高速液体｛こうあつ えきたい｝クロマトグラフィースペクトロメータ（Gimini C18
150×4.6 mm クロマトグラフィーカラム）により測定した。
【００２７】
カラムクロマトグラフィーには、通常、煙台黄海（Yantai Huanghai）200〜300メッシュ・シリカゲルを担体として使用した。
【００２８】
本発明の出発物質は既知であり、またABCR社、アクロスオーガニックス（Acros
Organics）、アルドリッチケミカル（Aldrich Chemical）社などから購入することができが、当技術分野で既知の慣用の合成方法により合成することもできる。
【００２９】
特に明記しない限り、下記の反応はアルゴン雰囲気下又は窒素雰囲気下に置いた。
【００３０】
「アルゴン雰囲気」又は「窒素雰囲気」の用語は、反応フラスコに約1 Lのアルゴン又は窒素で満たしたバルーンが装着されていることを指す。
「水素雰囲気」の用語は、反応フラスコに約1 Lの水素で満たしたバルーンが装着されていることを指す。
【００３１】
特に明記しない限り、実施例で使用される溶液は水溶液を指す。
特に明記しない限り、反応温度は室温である。室温は20℃〜30℃であり、最も適切な反応温度である。
【００３２】
実施例の反応過程は、薄層クロマトグラフィー（TLC）により監視した。展開溶媒系は、ジクロロメタン及びメタノール系、n−ヘキサン及び酢酸エチル系、石油エーテル及び酢酸エチル系、並びにアセトンからなる。溶媒量の比率は化合物の極性に従って調整した。
【００３３】
カラムクロマトグラフィーの溶出系は、Ａ：ジクロロメタン、メタノール及びアセトン系；Ｂ：ヘキサン及び酢酸エチル系からなる。溶媒量の比率は化合物の極性に従って調整され、ある場合には、少量のアンモニア及び酢酸も添加した。
【実施例１】
【００３４】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・マレイン酸塩
【００３５】
【化２】
2014507448.tif 000007
【００３６】
【化３】
2014507448.tif 000008
【００３７】
ステップ１
［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］メタノール
水素化アルミニウムリチウム（230 mg、6 mmol）及びN−tert−ブトキシカルボニル−R−プロリノール 1a（400 mg、2
mmol）を、氷水浴中で10 mLの乾燥テトラヒドロフランに分けて溶解した。気体が明らかに放出されなくなった後、反応混合物を2時間加熱還流した。この反応混合物に氷水浴中で5 mLのメタノールを滴下した後、5 mLの水を添加し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、標記化合物［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］メタノール 1b（221 mg、収率77.0％）を無色オイルとして得た。
MS m/z (ESI)：116 [M+1]
【００３８】
ステップ２
（2R）−1−メチルピロリジン−2−ホルムアルデヒド
ジメチルスルホキシド（820 μL、11.46 mmol）をドライアイス浴中で5 mLのジクロロメタンに溶解した後、塩化オキサリル（968 mg、7.64 mmol）をゆっくりと滴下した。45分間撹拌した後、この溶液に対し、2
mLのジクロロメタン中の［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］メタノール 1b（220 mg、1.91
mmol）溶液を添加した。この反応混合物をさらに45分間撹拌し、トリエチルアミン（1.9 mL、13.37 mmol）を添加した。この反応混合物を10分間撹拌した後、室温まで加温して1時間撹拌した。この反応混合物を、水（20 mL）及び飽和食塩水（10 mL）で連続的に洗浄した。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣を溶出系Ａでアルカリアルミナカラムクロマトグラフィーにより精製し、標記化合物（2R）−1−メチルピロリジン−2−ホルムアルデヒド 1c（300 mg）を黄色固体として得た。本品は精製することなく次のステップで直接使用した。
【００３９】
ステップ３
N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−2−ジエトキシホスホリル−アセトアミド
N,N'−カルボニルジイミダゾール（487
mg、3 mmol）を4
mLのテトラヒドロフランに溶解した。この混合物を油浴中で40℃に加温し、テトラヒドロフラン（4 mL）中のジエチルホスホノ酢酸（588
mg、3 mmol）溶液をこの混合物に滴下し、次のステップのために30分間撹拌した。
【００４０】
6−アミノ−４−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−7−エトキシ−キノリン−3−カルボニトリル 1d（446 mg、1
mmol、既知の方法により調製した：国際公開第2005/028443号パンフレット）を4 mLのテトラヒドロフランに40℃で溶解した後、上記反応混合物を滴下した。12時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、ジクロロメタン（50 mL×3）で抽出した。合わせた有機抽出物を飽和食塩水（30 mL×2）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣を溶出系Ａでシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標記化合物N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−2−ジエトキシホスホリル−アセトアミド 1e（624 mg、収率99.9％）を淡黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：624 [M+1]
【００４１】
ステップ４
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド
N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−2−ジエトキシホスホリル−アセトアミド 1e（250 mg、0.40 mmol）をドライアイス浴中で10 mLの乾燥テトラヒドロフランに溶解した後、トルエン（440 μL、0.44 mmol）中のリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（1 M）溶液を滴下した。この反応混合物を30分間撹拌した後、テトラヒドロフラン（5 mL）中の（2R）−1−メチルピロリジン−2−ホルムアルデヒド 1c（90 mg、0.80
mmol）溶液を滴下した。この反応混合物を30分間撹拌した後、室温まで加温して12時間撹拌した。この反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を溶出系Ａでシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（46 mg、収率19.7％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 9.16 (s, 1H), 8.63 (d, 1H),
8.56 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.83-7.80 (dd, 1H), 7.76-7.50 (m, 2H), 7.57-7.56 (m,1H),
7.40 (s, 1H), 7.38(s, 1H),  7.19 (d, 1H), 7 .06-7.03 (m, 2H), 6.34-6.31 (d,
1H), 5.35 (s, 2H), 4.39 (m, 2H), 4.27-4.26 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.10 (m, 1H),
2.73 (s, 3H), 2.37-2.36 (m, 2H), 2.07-2.01 (m, 2H), 1.64 (t,3H)
【００４２】
ステップ５
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・マレイン酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（500 mg、0.86 mmol）及びマレイン酸（109 mg、0.94
mmol）を撹拌しながら5 mLのジクロロメタンに溶解した。室温で1時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・マレイン酸塩 1（609 mg、収率100％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：584.4 [M+1-116]
1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 9.22 (s, 1H), 8.63 (m, 1H), 8.52 (m,
1H), 8.42 (s, 1H), 7.84 (m, 1H), 7.74 (m, 1H), 7.69 (m, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.26
(m, 1H), 7.02 (m, 2H), 6.92 (m, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.25 (s, 2H), 5.27 (s, 2H),
4.27 (m, 2H), 3.90 (m, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.87 (m, 2H), 2.21 (m, 4H), 2.09 (m,
1H), 1.56 (t, 3H, J=8 Hz)
【実施例２】
【００４３】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二マレイン酸塩
【００４４】
【化４】
2014507448.tif 000009
【００４５】
【化５】
2014507448.tif 000010
【００４６】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二マレイン酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（200 mg、0.34 mmol）を撹拌しながら6 mLのエタノールに溶解した後、マレイン酸（80 mg, 0.68 mmol）を添加した。0.5時間撹拌し、室温で12時間静置した後、反応混合物に10 mLのジエチルエーテルを加え、濾過した。得られた固形物をジエチルエーテル（20 mL）で洗浄し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二マレイン酸塩 2（220 mg、収率78.6％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1-232]
1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 9.12 (s, 1H), 8.57 (m, 1H), 8.51 (m,
1H), 8.37 (s, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.71 (m, 1H), 7.63 (m, 1H), 7.52 (m, 1H), 7.21
(m, 1H), 7.00 (m, 2H), 6.90 (m, 1H), 6.57 (m, 1H), 6.25 (s, 4H), 5.23 (s, 2H),
4.21 (m, 2H), 3.91 (m, 2H), 3.11 (m, 1H), 2.85 (m, 2H), 2.22 (m, 4H), 2.01 (m,
1H), 1.54 (t, 3H, J=8 Hz) 
【実施例３】
【００４７】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・L−リンゴ酸塩
【００４８】
【化６】
2014507448.tif 000011
【００４９】
【化７】
2014507448.tif 000012
【００５０】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・L−リンゴ酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（300 mg、0.51 mmol）を撹拌しながら5 mLのジクロロメタンに溶解した後、L−リンゴ酸（75.9 mg、0.56 mmol）を添加した。室温で4時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・L−リンゴ酸塩 3（375 mg、収率100％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1-134]
1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 8.96 (s, 1H), 8.58 (m, 1H), 8.38 (s,
1H), 7.94 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.19 (m, 2H), 6.98
(m, 1H), 6.71 (m, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.28 (m, 2H), 4.34 (m, 2H), 3.64 (m, 2H),
2.92 (m, 2H), 2.67 (m, 3H), 2.58 (m, 1H), 2.31 (m, 1H), 2.17 (m, 1H), 2.09 (m,
2H), 1.98 (m, 1H), 1.58 (t, 3H, J=8 Hz) 
【実施例４】
【００５１】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・メタンスルホン酸塩
【００５２】
【化８】
2014507448.tif 000013
【００５３】
【化９】
2014507448.tif 000014
【００５４】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・メタンスルホン酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（150 mg、0.26 mmol）を撹拌しながら2 mLのエタノールに溶解した後、メタンスルホン酸（1.67 mL、0.26
mmol）を添加した。室温で12時間撹拌した後、反応混合物に2 mLのジエチルエーテルを加え、濾過した。得られた固形物をジエチルエーテル（10 mL）で洗浄し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・メタンスルホン酸塩 4（120 mg、収率69.0％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1-96]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 11.10 (m, 1H), 10.00 (s, 1H), 9.91
(m, 1H), 9.11 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.60 (d, 1H, J=4 Hz), 8.03 (m, 1H),
7.57 (m, 2H), 7.47 (m, 4H), 6.92 (m, 2H), 5.31 (s, 2H), 4.43 (m, 2H), 4.01 (m,
2H), 3.73 (m, 3H), 3.14 (s, 2H), 2.80 (m, 2H), 2.32 (m, 1H), 2.27 (m, 3H), 1.51
(t, 3H, J=8 Hz) 
【実施例５】
【００５５】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二メタンスルホン酸塩
【００５６】
【化１０】
2014507448.tif 000015
【００５７】
【化１１】
2014507448.tif 000016
【００５８】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二メタンスルホン酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（200 mg、0.34 mmol）を撹拌しながら2 mLのエタノールに溶解した後、メタンスルホン酸（4.45 mL、0.68
mmol）を添加した。室温で12時間撹拌した後、反応混合物に2 mLのジエチルエーテルを加え、濾過した。得られた固形物をジエチルエーテル（10 mL）で洗浄し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二メタンスルホン酸塩 5（180 mg、収率67.7％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1-192]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 11.17 (m, 1H), 10.04 (s, 1H), 9.98
(m, 1H), 9.18 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.67 (d, 1H, J=4 Hz), 8.01 (m, 1H),
7.68 (m, 2H), 7.50 (m, 4H), 6.91 (m, 2H), 5.39 (s, 2H), 4.40 (m, 2H), 4.14 (m,
2H), 3.71 (m, 6H), 3.22 (s, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.36 (m, 1H), 2.32 (m, 3H), 1.52
(t, 3H, J=8 Hz) 
【実施例６】
【００５９】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・三メタンスルホン酸塩
【００６０】
【化１２】
2014507448.tif 000017
【００６１】
【化１３】
2014507448.tif 000018
【００６２】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・三メタンスルホン酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（150 mg、0.26 mmol）を撹拌しながら1 mLのエタノールに溶解した後、メタンスルホン酸（5.00 mL、0.78
mmol）を添加した。12時間撹拌した後、反応混合物に2 mLのジエチルエーテルを加え、濾過した。得られた固形物をジエチルエーテル（10 mL）で洗浄し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・三メタンスルホン酸塩 6（140 mg、収率62.5％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1-288]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 10.97 (m, 1H), 9.99 (s, 1H), 9.89
(m, 1H), 9.27 (s, 1H), 9.08 (s, 1H), 8.71 (d, 1H, J=4 Hz), 7.93m, 1H),
7.62 (m, 2H), 7.51 (m, 4H), 6.94 (m, 2H), 5.27 (s, 2H), 4.37 (m, 2H), 4.09 (m,
2H), 3.67 (m, 9H), 3.19 (s, 2H), 2.78 (m, 2H), 2.31 (m, 1H), 2.27 (m, 3H), 1.52
(t, 3H, J=8 Hz) 
【実施例７】
【００６３】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・p−トルエンスルホン酸塩
【００６４】
【化１４】
2014507448.tif 000019
【００６５】
【化１５】
2014507448.tif 000020
【００６６】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・p−トルエンスルホン酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（300 mg、0.514 mmol）を撹拌しながら3 mLのn−プロパノール／水（3／1）混合溶媒に溶解した後、p−トルエンスルホン酸一水和物（117 mg、0.0.617 mmol）を添加した。室温で0.5時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・p−トルエンスルホン酸塩 7（410 mg、収率98.0％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：584.2 [M+1-172]
1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 8.56 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.26 (s,
1H), 7.85 (m, 1H), 7.65 (m, 4H), 7.40 (m, 5H), 7.12 (m, 1H), 7.00 (m, 2H), 6.81
(m, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.14 (m, 4H), 3.54 (m, 7H), 2.83 (m, 3H), 2.33 (m, 6H),
1.56 (t, 3H, J=7.2 Hz) 
【実施例８】
【００６７】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・コハク酸塩
【００６８】
【化１６】
2014507448.tif 000021
【００６９】
【化１７】
2014507448.tif 000022
【００７０】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・コハク酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（400 mg、0.69 mmol）を撹拌しながら5 mLのジクロロメタンに溶解した後、コハク酸（9.0 mg、0.75 mmol）を添加した。室温で0.5時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・コハク酸塩 8（442 mg、収率 90.4％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.4 [M+1-118]
1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 12.21 (s, 2H), 9.62 (s, 1H), 8.96
(s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.47 (m, 1H), 7.87 (m, 1H), 7.59 (m, 1H0,7.39 (m, 2H),
7.25 (m, 2H), 6.66 (m, 1H), 5.76 (m, 1H), 5.29 (s, 2H), 4.31 (m, 2H), 4.03 (m,
1H), 3.32 (m, 2H), 2.50 (m, 2H), 2.24 (m, 1H), 1.48 (t, 3H, J=7.2 Hz)
【実施例９】
【００７１】
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二塩酸塩
【００７２】
【化１８】
2014507448.tif 000023
【００７３】
【化１９】
2014507448.tif 000024
【００７４】
ステップ１
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二塩酸塩
（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド 1f（1000 mg、1.71
mmol）を撹拌しながら5 mLのジクロロメタンに溶解した後、ジエチルエーテル中の塩酸溶液（1 M、3.42
mL、3.42 mmol）溶液を添加した。
氷浴中で0.5時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、減圧乾燥して、標記化合物（E）−N−［4−［［3−クロロ−4−（2−ピリジルメトキシ）フェニル］アミノ］−3−シアノ−7−エトキシ−6−キノリル］−3−［（2R）−1−メチルピロリジン−2−イル］プロプ−2−エナミド・二塩酸塩 9（1500 mg、収率100％）を黄色固体として得た。
MS m/z (ESI)：583.2 [M+1-72]
1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 9.16 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.51 (s,
1H), 8.13 (s, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.68 (m, 1H), 7.45 (m, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.33
(d, 1H, J=4 Hz), 7.25 (m, 1H), 7.13 (m, 1H), 7.01 (m, 1H), 6.98 (m, 1H),
6.19 (m, 1H), 5.31 (s, 2H), 4.35 (dd, 2H, J=8 Hz, J=16 Hz), 4.24 (m,
1H), 3.19 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.33 (m, 4H), 2.09 (m, 1H), 1.60 (t, 3H, J=8
Hz) 
【試験例】
【００７５】
生物的評価
例１：EGFR細胞増殖阻害試験
下記のインビトロ試験は、EGFRを高発現しているヒト類表皮癌A431細胞に対する、本発明の化合物の増殖阻害活性を測定するものである。
【００７６】
下記のインビトロ試験は、EGFRを高発現している癌細胞に対する、試験化合物の増殖阻害活性を測定するものである。活性はIC50値で示した。試験の基本手順は以下に示される：EGFRを高発現している癌細胞A431を選び、96−ウェル細胞培養プレートに適切な密度（例えば、5000細胞／mL培養液）で播種した。その後、細胞を、二酸化炭素インキュベーター中で85％培養密度になるまで培養した。次に細胞培養液を、段階希釈した（通常6〜7濃度）の試験化合物を含む新鮮な培養液と交換した。細胞はインキュベーターに戻し、引き続き72時間培養した。試験化合物の細胞増殖阻害活性は、スルホローダミンＢ（SRB）法により測定した。IC50値は、試験化合物の種々の濃度における阻害率より算出した。
【００７７】
（本発明の化合物の活性）
本発明の化合物の生物活性は、上記の試験法を用いて測定した。IC50値を算出し、下記の表（表２）に示した。
【００７８】
【表２】
2014507448.tif 000025
【００７９】
結論：式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩及びその他の塩並びに遊離塩基は、EGFRを高発現しているA431細胞に対して明らかな増殖阻害活性を有する。
【００８０】
例２：EGFRキナーゼ活性測定
インビトロEGFRキナーゼ活性は、下記の試験法により測定した。
【００８１】
下記の試験は、EGFRキナーゼ活性に対する本発明の化合物の阻害活性を測定することに使用することができる。各化合物の最大半量阻害濃度IC50（酵素活性を50％阻害する試験化合物の濃度）は、いくつかの異なる濃度の試験化合物を、特定の酵素及び基質とともにインキュベートすることにより測定した。この試験で使用されるEGFRキナーゼはヒト由来組換えタンパク質であり、60 mM HEPES（pH
7.5）、5 mM MgCl2、5 mM MnCl2、3 μM Na3VO4、1.25
M DTT（1000×）及び20
μM ATPを含む緩衝液中で、ペプチド基質及び異なる濃度の試験化合物とともに、25℃で45分間インキュベートした。EGFRキナーゼ活性は、時間分解蛍光法により定量的に測定した。
【００８２】
（本発明の化合物の活性）
本発明の化合物の生物活性は、上記の試験法を用いて測定した。IC50値を算出し、下記の表（表３）に示した。
【００８３】
【表３】
2014507448.tif 000026
【００８４】
結論：式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩及びその他の塩並びに遊離塩基は、EGFRキナーゼ活性に対して明らかな阻害活性を有する。
【００８５】
例３：Her-2細胞活性測定
下記のインビトロ試験は、HER-2を高発現しているヒト癌SK-BR-3細胞に対する、本発明の化合物の増殖阻害活性を測定するものである。
【００８６】
下記のインビトロ試験は、HER-2を高発現している癌細胞に対する、試験化合物の血管新生阻害活性及び増殖阻害活性を測定するものである。活性はIC50値で示した。試験の基本手順は以下に示される：HER-2を高発現している株化癌細胞SK-BR-3を選び、この細胞を96−ウェル細胞培養プレートに適切な密度で播種した。その後、細胞を、二酸化炭素インキュベーター中で60％培養密度になるまで培養した。次に細胞培養液を、種々の濃度（6〜7濃度）の試験化合物を含む新鮮な培養液と交換した。細胞はインキュベーターに戻し、引き続き96時間培養した。試験化合物の細胞増殖阻害活性は、スルホローダミンＢ（SRB）法により測定した。IC50値は、試験化合物の種々の濃度における阻害率より算出した。
【００８７】
（本発明の化合物の活性）
本発明の化合物の生物活性は、上記の試験法を用いて測定した。IC50値を算出し、下記の表（表４）に示した。
【００８８】
【表４】
2014507448.tif 000027
【００８９】
結論：式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩及びその他の塩並びに遊離塩基は、Her-2を高発現しているSK-BR-3細胞に対して明らかな増殖阻害活性を有する。
【００９０】
例４：Her-2キナーゼ活性測定
インビトロHer-2キナーゼ活性は、下記の試験法により測定した。
【００９１】
下記の試験は、Her-2キナーゼに対する本発明の化合物の阻害活性を測定することに使用することができる。各化合物の最大半量阻害濃度IC50（酵素活性を50％阻害する試験化合物の濃度）は、いくつかの異なる濃度の試験化合物を、特定の酵素及び基質とともにインキュベートすることにより測定した。この試験で使用されるHer-2キナーゼはヒト由来組換えタンパク質であり、60 mM HEPES（pH
7.5）、5 mM MgCl2、5 mM MnCl2、3 μM Na3VO4、1.25
M DTT（1000×）及び20
μM ATPを含む緩衝液中で、ペプチド基質及び異なる濃度の試験化合物とともに、25℃で45分間インキュベートした。Her-2キナーゼ活性は、時間分解蛍光法により定量的に測定した。
【００９２】
（本発明の化合物の活性）
本発明の化合物の生物活性は、上記の試験法を用いて測定した。IC50値を算出し、下記の表（表５）に示した。
【００９３】
【表５】
2014507448.tif 000028
【００９４】
結論：式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩及びその他の塩並びに遊離塩基は、Her-2キナーゼ活性に対して明らかな阻害活性を有する。
【００９５】
溶解度試験
通常の溶解度測定に従って、  式（Ｉ）で表される化合物及びその塩の溶解度を３種の異なる系、すなわち、水、生理食塩水及びメタノール中で測定した。結果を表５に示した。
【００９６】
【表６】
2014507448.tif 000029
【００９７】
結論：式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩の溶解性は、式（Ｉ）で表される化合物の遊離塩基及びその他の塩と比較して著しく改善された。
【００９８】
薬物動態試験
試験例１：本発明の化合物の薬物動態試験
１．試験目的
試験動物としてラットを使用した。異なる時点における血漿中薬物濃度をLC/MS/MS法により測定するため、式（Ｉ）で表される化合物及び当該化合物のその他の塩を胃内投与し、式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩を尾静脈注射した。本化合物の薬物動態挙動、特性及び経口絶対的生物学的利用率は、ラットにおいて検討し、評価した。
【００９９】
２．手順
２−１  試験サンプル
実施例化合物１ｆ、実施例化合物１、２、４、５、６、７及び９
２−２  試験動物
雌雄半々の28匹の健常成熟SDラットは、SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB.ANIMAL社から購入し（ライセンス番号：SCXK（Shanghai）2008−0016）、7群に分けた（各群4匹）。
２−３  機器
TSQクァンタムウルトラAMトリプル四重極型質量分析装置、サーモフィニガン社（米国）；アジレント1200高速液体クロマトグラフィーシステム、アジレント社（米国）
２−４  試験化合物の調製
静脈注射群：適当量の化合物を秤量してDMSOに溶解し、生理食塩水で最終量まで希釈した。サンプル濃度は2.5 mg/mLとした。
胃内投与群：適当量の化合物を秤量し、0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウム中に加えてすりつぶし、2.5 mg/mL懸濁液を調製した。
２−５  投与
雌雄半々の32匹の健常成熟ＳＤラットを7群に分けた（各群4匹）。一晩絶食させた後、実施例化合物１ｆ、実施例化合物１、２、４、５、６、７及び９を25 mg/kg（塩基部分により算出）の用量及び10 mL/kgの量で胃内投与又は尾静脈注射した。
２−６  サンプル採取
静脈注射群については、血液サンプル（0.2 mL）は、投与前並びに投与後2分、15分、30分、1.0時間、2.0時間、4.0時間、6.0時間、8.0時間、12.0時間、24.0時間及び36.0時間に眼窩静脈叢から採取し、ヘパリン処理チューブに保管し、3,500 rpmで10分間遠心して血漿を分離した。血漿サンプルは−20℃で保存した。
胃内投与群については、血液サンプルは、投与前並びに投与後0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0及び36.0時間に採取した。サンプルの処理方法は静脈注射群と同じとした。ラットには投与後2時間で給餌した。
【０１００】
３．操作
50 μLのラット血漿を50 μLの一連の標準溶液にそれぞれ添加し、50.0、100、200、500、1000、2000、5000 ng/mLの血漿中濃度を得た後、種々の濃度の血漿を50 μLのメタノールとボルテックスミキサーを用いて3分間混合した。この混合物を10分間遠心分離（13,500 rpm）し、上清の10 μLをLC-MS/MSで分析した。
２−９  薬物動態パラメータの算出
【０１０１】
４．薬物動態パラメータの結果
本発明の化合物の薬物動態パラメータを表７に示した。
【０１０２】
【表７】
2014507448.tif 000030
【０１０３】
結論：式（Ｉ）で表される化合物のマレイン酸塩は、式（Ｉ）で表される化合物の遊離塩基及びその他の塩と比較して薬物動態特性及び生物学的利用率が著しく改善され、明らかな薬物動態的な利点を有する。
【国際調査報告】
2014507448.tif 000033
2014507448.tif 000034
2014507448.tif 000035
2014507448.tif 000036
2014507448.tif 000037
2014507448.tif 000038