(57)【要約】本発明は、神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性の治療において使用するための線維状バクテリオファージ、及び神経変性タウオパシーに罹った患者におけるような、タウタンパク質の原線維の形成を減少させるか又はタウタンパク質の先に形成されている原線維を脱凝集させるためにバクテリオファージを使用する方法に関する。本発明に使用される線維状バクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示していない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性の治療において使用するための線維状バクテリオファージであって、ここで、前記線維状バクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル、（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示しておらず、但し、前記神経変性タウオパシーが、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、及び前駆症状性アルツハイマー病を含むアルツハイマー病；クールー病；クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）；他のプリオン病、又はパーキンソン病ではないことを条件とする、前記線維状バクテリオファージ。
【請求項２】
前記線維状バクテリオファージが、その表面にいずれもの非線維状バクテリオファージポリペプチドを提示していない、請求項１に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項３】
野生型線維状バクテリオファージである、請求項１に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項４】
Ｍ１３、ｆ１、及びｆｄバクテリオファージ、並びにこれらの混合物からなる群から選択される線維状バクテリオファージである、請求項１−３のいずれか１項に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項５】
野生型Ｍ１３バクテリオファージである、請求項１−４のいずれか１項に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項６】
前記神経変性タウオパシーが、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症からなる群から選択される、請求項１−５のいずれか１項に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項７】
脳への直接投与のための医薬中に処方される、請求項１−６のいずれか１項に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項８】
実質内注射又は注入、側脳室内注射、くも膜下空間への注射、或いは側脳室内注入のための医薬中に処方される、請求項１−６のいずれか１項に記載の線維状バクテリオファージ。
【請求項９】
神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性の治療において使用するための医薬組成物であって、請求項１−８のいずれか１項に記載の線維状バクテリオファージ、及び医薬的に受容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含み、但し、前記神経変性タウオパシーが、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、及び前駆症状性アルツハイマー病を含むアルツハイマー病；遺伝性アイスランド症候群；クールー病；クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）；他のプリオン病、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）又はパーキンソン病ではないことを条件とする、前記組成物。
【請求項１０】
患者におけるタウタンパク質の原線維の形成を減少させるか又はタウタンパク質の先に形成されている原線維を脱凝集させるための方法であって、繊維状バクテリオファージを、タウタンパク質の原線維の形成を減少させるか又はタウタンパク質の先に形成されている原線維を脱凝集させることを必要とする前記患者に投与することを含み、ここで：
前記患者は、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、及び前駆症状性アルツハイマー病を含むアルツハイマー病；ＳＡＡアミロイドーシス；遺伝性アイスランド症候群；老衰；多発性骨髄腫；クールー病；クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）；他のプリオン病、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）又はパーキンソン病に罹っておらず、そして
前記線維状バクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル、（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示していない、前記方法。
【請求項１１】
前記線維状バクテリオファージが、その表面にいずれもの非線維状バクテリオファージポリペプチドを提示していない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記線維状バクテリオファージが、野生型線維状バクテリオファージである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記線維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆ１、及びｆｄバクテリオファージ、並びにこれらの混合物からなる群から選択される線維状バクテリオファージである、請求項１０−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記線維状バクテリオファージが、野生型Ｍ１３バクテリオファージである、請求項１０−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が、神経変性タウオパシーに罹っているか、又は神経変性タウオパシーに対して感受性であり、前記タウオパシーが、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症からなる群から選択される、請求項１０−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者への投与が、脳に直接的である、請求項１０−１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者への投与が、実質内注射又は注入、側脳室内注射、くも膜下空間への注射、及び側脳室内注入から選択される、請求項１０−１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
患者におけるアルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）；他のプリオン病、又はパーキンソン病以外の神経変性タウオパシーを治療するための方法であって、下記を含んでなる医薬的に受容可能な医薬組成物を、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）；他のプリオン病、又はパーキンソン病以外の神経変性タウオパシーの治療を必要とする前記患者に投与する段階を含んでなる、方法：
（ａ）（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル、（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示していない、線維状バクテリオファージ；及び
（ｂ）医薬的に受容可能な担体。
【請求項１９】
治療される神経変性タウオパシーが、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記線維状バクテリオファージが、その表面にいずれもの非線維状バクテリオファージポリペプチドを提示していない、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記線維状バクテリオファージが、野生型線維状バクテリオファージである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記線維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆ１、及びｆｄバクテリオファージ、並びにこれらの混合物からなる群から選択される線維状バクテリオファージである、請求項１８−２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記線維状バクテリオファージが、不活化線維状バクテリオファージである、請求項１８−２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者への投与が、脳に直接的である、請求項１８−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者への投与が、実質内注射又は注入、側脳室内注射、くも膜下空間への注射、及び側脳室内注入から選択される、請求項１８−２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、神経変性タウオパシーの治療において使用するための治療学及び組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]タウオパシーは、脳における原線維／フィラメント／線維の形態の微小管結合タウタンパク質の異常な細胞内凝集物の病理学的特徴を伴う神経変性疾患の一群である。これらのタウオパシーは、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症／パーキンソン認知症症候群、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）のような疾病を含む。タウオパシーは、多様な表現型及び臨床的特徴を有するが、これらは、全て共通に原線維／フィラメント／線維の形態、例えば、捩れた、直線の又は対の螺旋状の不溶性の過剰リン酸化（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｓｙｌａｔｅｄ）タウの神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在を共有する。
【０００３】
[0003]タウタンパク質は、１７番染色体中に位置するＭＡＰＴ遺伝子によってコードされる微小管結合タンパク質であり、そしてこれは、ニューロン中で、微小管の重合を安定化し、そして促進することに関係する、可溶性のリン酸化された（ｐｈｏｓｐｈｏｓｙｌａｔｅｄ）タンパク質として存在する。タウの異常な過剰リン酸化は、神経原線維変化において見られるように、タウタンパク質の微小管結合能力を減少させ、そして微小管構築を促進するその能力を阻害する。
【０００４】
[0004]タウオパシーに向けられた治療戦略は、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）によって総括されているように、（ｉ）フェノチアジン化合物メチレンブルー及びＮ３ベンゾチアゾール誘導体のようなタウ凝集の小分子阻害剤、（ｉｉ）タキソール（パクリタキセル）のような微小管安定化剤、（ｉｉｉ）タウ免疫療法、（ｉｖ）不溶性及び病理学的タウ原線維の排除をもたらすラパマイシンのようなオートファジー活性化剤、及び（ｖ）ビタミンＣ及びＥ、グルタチオン、ユビキノン、及びユビキノン誘導体ＭｉｔｏＱのような抗酸化分子を含む。
【０００５】
[0005]線維状バクテリオファージは、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する構造的に関連するウイルスの一群である。線維状バクテリオファージは、溶菌性でも溶原性でもなく、そしてこれらは、増殖性感染中にその宿主を殺戮しない。Ｆ因子を含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに感染するファージは、Ｆｆバクテリオファージと集合的に呼ばれる。これらのバクテリオファージは、哺乳動物細胞を含む真核（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅ）細胞に感染しない。
【０００６】
[0006]線維状バクテリオファージは、長さ約１ないし２ミクロン（Ｆｆバクテリオファージに関しては、長さ僅か約１ミクロン）の、そして直径６ｎｍの、一本鎖の環状ＤＮＡのゲノムコアを包囲するタンパク質サブユニットの螺旋状の殻を有する可動性の杆状体である。Ｆｆファミリーの線維状バクテリオファージ（Ｆ線毛によりＥ．ｃｏｌｉに感染する線維状バクテリオファージ、Ｍ１３、ｆｄ、及びｆ１）に関して、二つの主コートタンパク質、タンパク質ｐＩＩＩ及び主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩは、提示されたタンパク質のコピーの数において異なる。ｐＩＩＩは、３−５コピーで提示されるが、ｐＶＩＩＩは、約３０００コピーで見出される。概略５０残基の主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩサブユニットは、大部分はα螺旋状であり、そしてαヘリックスの軸は、ウイルス粒子の軸と小さい角を作る。タンパク質の殻は、三つの部分と考えることができる：サブユニットのＮ末端領域によって占有され、周囲の溶媒と相互作用する酸性残基に富み、そしてウイルス粒子に低い等電位点を与える、外部表面；タンパク質サブユニットが主として互いに相互作用する無極性側鎖の１９残基の伸展を含む、殻の内部；及びサブユニットのＣ末端領域によって占有され、ＤＮＡコアと相互作用する塩基性残基に富む、内部表面。
【０００７】
[0007]Ｆｆファミリーの線維状バクテリオファージ（特にＭ１３）は、ペプチドのための提示足場として、線維状バクテリオファージの二つの構造タンパク質、ｐＩＩＩ（ｐ３）タンパク質及びｐＶＩＩＩタンパク質を使用するペプチドディスプレイ系として開発された。ペプチドエピトープは、活性な免疫化において使用するための線維状ファージ上に提示されている。
【０００８】
[0008]線維状バクテリオファージ、特にＭ１３が、βアミロイドプラーク（ＷＯ２００６／０８３７９５；米国特許第７，８６７，４８７号；及びＷＯ２００８／０１１５０３）及びαシヌクレイン凝集物（ＷＯ２０１０／０６００７３）を脱凝集させることができることは先に示されている。脳に送達される抗体及び免疫複合体のための結合剤としてのタンパク質Ａを提示する線維状バクテリオファージは、ＷＯ２００７／０９５６１６中に開示されている。
【０００９】
[0009]本明細書中のいずれもの文書の引用は、このような文書が関連する従来の技術であることの承認を意図するか、或いは本出願のいずれもの請求項の特許性にとって重要であると考えるものではない。いずれもの文書の内容又は日付に関するいずれもの声明は、出願の時点で出願人にとって利用可能な情報に基づくものであり、そしてこのような声明の正確さに関する承認を構成するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０８３７９５
【特許文献２】米国特許第７，８６７，４８７号
【特許文献３】ＷＯ２００８／０１１５０３
【特許文献４】ＷＯ２０１０／０６００７３
【特許文献５】ＷＯ２００７／０９５６１６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献２】Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）
【発明の概要】
【００１２】
[0010]本発明は、神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性の治療において使用するための線維状バクテリオファージ、及びタウタンパク質の原線維の形成を減少させるか又はタウタンパク質の先に形成されている原線維を脱凝集させるための方法を提供する。この方法は、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体、を提示していない線維状バクテリオファージをそれを必要とする患者に投与することを含む。
【００１３】
[0011]本発明は、神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性の治療において使用するための線維状バクテリオファージを含有する医薬組成物も提供する。線維状バクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体；或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示していない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0012]図１は、３ＸＴｇマウスにおける、海馬内のＷＴ線維状バクテリオファージＭ１３又はＰＢＳ対照の注射後の、タウプラークの免疫染色を示す。十字縫合から−３．６における３ＸＴｇマウスの脳の断面である。
【図２】[0013]図２は、海馬領域当たりのタウタングルの計算された数を示す、図１の結果のグラフである。
【図３】[0014]図３Ａ−３Ｄは、皮質におけるチオフラビンＳ（ＴｈＳ）染色タングル（図３Ａ及び３Ｂ）及びＰＢＳ処置された大脳半球の海馬ＣＡ２（図３Ｃ及び３Ｄ）の、十字縫合から−３．６における定量的顕微鏡画像解析を示す。図３Ｂ及び３Ｄは、それぞれ図３Ａ及び３Ｂの囲まれた領域の拡大図である。図３Ｅは、ＴｈＳ染色タングルによって占有された面積の％として測定された、ｒＴｇ４５１０＋マウスにおけるＴｈＳタングル負荷を示すグラフである。
【図４】[0015]図４Ａ及び４Ｂは、３ＸＴｇマウスにおけるＴｈＳ染色プラークの定量的画像解析を示す。図４Ａは、ＰＢＳ処置された大脳半球であり、そして図４Ｂは、Ｍ１３ファージ処置された大脳半球である。図４Ｃは、ＴｈＳ染色プラーク負荷の面積の％を示すグラフである。
【図５】[0016]図５Ａ及び５Ｂは、海馬の左（ＰＢＳ処置）及び右（ファージ処置）のＣＡ１領域におけるＮｅｕＮ染色（マウスＮｅｕＮ抗体で標識）の定量的画像解析を示す。図５Ｃは、マウスＮｅｕＮ抗体で標識された面積の％を示すグラフである。
【図６】[0017]図６は、酢酸セルロース膜フィルター遅延アッセイによって決定される、Ｍ１３ファージによるタウ原線維の脱凝集を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
[0018]本明細書及び付属する特許請求の範囲の目的のために、以下の定義が適用される。
【００１６】
[0019]用語“患者”、“対象者”及び“受容者”は、互換的に使用される。これらは、療法的治療の目的であるヒト及び他の哺乳動物を含む。
[0020]用語“タウタンパク質抗原”は、タウタンパク質のアイソフォームの少なくとも一つを認識し、そしてそれに特異的に結合する抗体を誘導するために十分である、ヒト微小管結合タウタンパク質、例えば、タウタンパク質の６個の天然に存在するアイソフォームのいずれか（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１を参照されたい）のいずれもの部分を指す。用語“タウタンパク質に対する抗体”は、タウタンパク質のアイソフォームの一つによって誘導される抗体の抗体結合部位を指す。
【００１７】
[0021]用語“神経変性タウオパシー”は、タウタンパク質の異常なフィラメント／原線維／線維の細胞内蓄積によって神経病理学的に特徴づけられる神経変性疾患又は障害を包含することを意図する。神経変性タウオパシーの非限定的例は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症／パーキンソン認知症症候群、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症を含む。
【００１８】
[0022]神経変性タウオパシーに関する用語“治療すること”は、タウタンパク質の原線維／フィラメント／線維の形成を減少させるか又は阻害する、或いはタウタンパク質の先に形成されている原線維／フィラメント／線維を脱凝集させる；神経変性タウオパシーの一つ又はそれより多い臨床徴候を実質的に改善する、或いは神経変性タウオパシーの臨床徴候の出現を実質的に防止することのような、神経変性タウオパシーの進行を、実質的に阻害するか、遅延させるか又は逆転することを意味することを意図する。
【００１９】
[0023]用語“抗体”は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を伴う抗体組成物、二重特異性抗体、二特異性抗体、又は抗体の他の精製された調製物及び組換え抗体を含む。抗体は、例えばいずれものアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、等）の全体の抗体、又は興味のある抗原を結合する抗体断片であることができる。
【００２０】
[0024]用語“哺乳動物細胞内部移行シグナル”は、細胞接着／細胞への付着の結果として内部移行を容易にする、哺乳動物配列から誘導されたいずれもの細胞接着配列（例えば、野生型線維状バクテリオファージ中に天然に存在しない）を指す。多くの哺乳動物細胞接着配列は既知であり、そしてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列、ＨＩＶからのＴａｔペプチド及びＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＲＥＤ）の配列を含んでなるペプチド、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＲＫＫ）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＬＤＶ；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，１９９２）、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ＬＬＧ；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（ＤＧＥＡ；配列番号：１）、Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（ＩＲＶＶＭ；配列番号：２；Ｋｏｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（ＰＨＳＲＮ；配列番号：３）及びＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号：４；Ｋｏｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を含む。多くの細胞接着配列（細胞接着モチーフとしても知られる）は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、トロンボスポンジン、等のような細胞接着分子中に存在することが知られている。
【００２１】
[0025]用語“βアミロイド抗原”は、βアミロイド抗体の形成を誘発するヒトアミロイド前駆体タンパク質から誘導される“βＡＰ”、“βＡ”、“Ａβ”又は“ＡβＰ”としても知られるプラーク形成“βアミロイドペプチド”のいずれもの部分を指す。“βアミロイド抗体”は、天然に存在するヒトＡβ１−４２ペプチド並びにその変種及び変異体を認識し、そしてそれに特異的に結合するものである。
【００２２】
[0026]本明細書中で使用する場合、“医薬組成物”は、一つ又はそれより多い本明細書中に記載される活性成分の、生理学的に適した担体及び賦形剤のような他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、患者への化合物の投与を容易にすることである。
【００２３】
[0027]互換的に使用することができる語句“生理学的に受容可能な担体”及び“医薬的に受容可能な担体”は、生物に対して有意な刺激を起こさず、そして投与される化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない担体又は希釈剤を指す。
【００２４】
[0028]用語“賦形剤”は、活性成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の非限定的例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖及び各種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールを含む。
【００２５】
[0029]用語“野生型線維状バクテリオファージ”（又はＭ１３のような具体的な線維状バクテリオファージに関しては“野生型”）は、本明細書中で使用する場合、典型的には天然にそれと結合している他の成分から離れて隔絶された、天然に存在する線維状バクテリオファージを意味する。この用語は、“野生型”と特徴づけられた商業的に入手可能な線維状ファージも含む。
【００２６】
[0030]用語“不活化野生型線維状バクテリオファージ”（又はＭ１３のような具体的な線維状バクテリオファージに関しては“不活化野生型”）は、本明細書中で使用する場合、組換えＤＮＡの手段によって遺伝子的に変更されていないが、しかしＵＶ照射によるように、複製を不可能にさせられた野生型線維状バクテリオファージを意味する。ファージを複製不可能にするが、しかしバクテリオファージの線維状構造（嗅覚経路により脳に浸透するその能力を保持する）を妨害しないいずれもの機構が、本発明によって意図されている。
【００２７】
[0031]用語“ＷＴファージ”（又はＭ１３のような具体的な線維状バクテリオファージに関しては“ＷＴ”）は、野生型線維状バクテリオファージ及び不活化野生型線維状バクテリオファージの両方を指す。
【００２８】
治療において使用するための線維状バクテリオファージ及び治療の方法
[0032]一つの態様において、本発明は、神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性の治療において使用するための線維状バクテリオファージ、及び線維状バクテリオファージを患者に投与することによりタウタンパク質の原線維の形成を減少させるか、又はタウタンパク質の先に形成されている原線維を脱凝集させるための方法を提供し、ここで、このバクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル、（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示していない。この態様のある側面において、線維状バクテリオファージは、その表面にいずれもの非線維状バクテリオファージポリペプチドを提示していない。
【００２９】
[0033]幾つかの態様において、治療される神経変性タウオパシーは、筋委縮性側索硬化症、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症から選択される。更に具体的な側面において、タウオパシーは、筋委縮性側索硬化症、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン−ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症から選択される。
【００３０】
[0034]別の態様において、治療される神経変性タウオパシーは、パーキンソン病；早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、及び前駆症状性アルツハイマー病を含むアルツハイマー病；ＳＡＡアミロイドーシス；遺伝性アイスランド症候群；老衰；多発性骨髄腫；並びに例えばクールー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、及び致死性家族性不眠症のようなヒトに、そして例えばスクレイピー及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のような動物に影響することが知られたプリオン病以外のものである。
【００３１】
[0035]なおもう一つの態様において、治療される神経変性タウオパシーは、パーキンソン病；アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、及び他のプリオン病以外のものである。
【００３２】
[0036]この態様の一つの側面において、バクテリオファージは、更に医薬的に受容可能な担体を含んでなる医薬的に受容可能な組成物の一部として患者に投与される。
[0037]この態様のもう一つの側面において、バクテリオファージは、ＷＴファージである。この態様のなおもう一つの側面において、バクテリオファージは、野生型バクテリオファージである。
【００３３】
[0038]一つの態様において、線維状バクテリオファージは、鼻腔内に投与される。理論に束縛されるものではないが、出願人等は、鼻腔内投与が、これらのバクテリオファージが血液脳関門を通過することを可能にすると信じている。次いでファージは、ファージの細胞内分解によって、並びに末梢器官に対する不都合な影響を伴わず尿及び糞からの排除によって、脳及び身体から排除される。
【００３４】
[0039]もう一つの態様において、線維状バクテリオファージは、対象者の脳に直接投与される。“脳への直接”投与は、脳それ自体への注射又は注入、例えば頭蓋内投与、並びに脳脊髄液への注射又は注入を含む。この態様の一つの側面において、投与は、くも膜下腔内注射又は注入、脳室内注射又は注入、実質内注射又は注入、或いは側脳室内注射又は注入による。更に具体的な側面において、投与は、実質内注射；側脳室内注射；又は側脳室内注入による。
【００３５】
[0040]なおもう一つの態様において、本発明において使用される線維状バクテリオファージはＷＴ  Ｍ１３である。更に具体的な態様において、本発明において使用される線維状バクテリオファージは、野生型Ｍ１３である。
【００３６】
[0041]本明細書中に詳述される方法は、患者が特別な記述された治療を必要とすると特定される方法も含む。このような治療を必要とする患者を特定することは、患者又は医療専門家の判断であることができ、そして主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば、試験又は診断法によって測定可能）であることができる。
【００３７】
医薬組成物
[0042]関連する態様において、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）βアミロイド抗原又はβアミロイドに対する抗体、或いは（ｉｉｉ）タウタンパク質抗原又はタウタンパク質に対する抗体を提示していない線維状バクテリオファージを活性成分として含んでなる、神経変性タウオパシー又は神経変性タウオパシーに対する感受性を治療することにおいて使用するための医薬組成物（例えば、パイロジェンフリー）を提供する。この態様のある側面において、組成物中の線維状バクテリオファージは、その表面上にいずれもの非線維状バクテリオファージポリペプチドを提示していない。この態様の更に具体的な側面において、線維状バクテリオファージは、ＷＴ線維状バクテリオファージである。この態様のもう一つの更に具体的な側面において、線維状バクテリオファージは、野生型線維状バクテリオファージである。この態様のなおもう一つの具体的側面において、線維状バクテリオファージは、ＷＴ  Ｍ１３バクテリオファージである。この態様の更に具体的な側面において、線維状バクテリオファージは、野生型Ｍ１３バクテリオファージである。
【００３８】
[0043]薬物の処方及び投与のための技術は、最新版の“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ中に見出すことができ、これは、本明細書中に参考文献として援用され、そして当技術において公知である。
【００３９】
[0044]投与の適した経路は、例えば、経鼻、又は筋肉内、皮下及び髄内注射含む非経口送達、並びに脳への直接投与、例えば、頭蓋内投与、並びに脳脊髄液への注射又は注入を含むことができる。この態様の一つの側面において、投与は、くも膜下腔内注射又は注入、脳室内注射又は注入、実質内注射又は注入、或いは側脳室内注射又は注入による。更に具体的な側面において、投与は、実質内注射；側脳室内注射；又は側脳室内注入による。
【００４０】
[0045]本発明の医薬組成物は、当技術において周知の方法によって、例えば、慣用的な混合、溶解、造粒、ドラジェ製造、ゲル化、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥法によって製造することができる。
【００４１】
[0046]このような本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分の、医薬的に使用することができる調製物への加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含んでなる、一つ又はそれより多い生理学的に受容可能な担体を使用して、慣用的な様式で処方することができる。適切な処方は、選択される投与の経路による。
【００４２】
[0047]注射のために、本発明の活性成分は、水溶液中に、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学的塩緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液中に処方することができる。経粘膜投与のために、透過される障害に対して適当な浸透剤が処方中に使用される。このような浸透剤は、一般的に当技術において既知である。
【００４３】
[0048]鼻腔吸入による投与のために、本発明による使用のための活性成分は、適した噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン又は二酸化炭素の使用を伴う、加圧パック或いは噴霧器からのエアゾール噴霧供給の形態で好都合には送達される。吸入噴霧におけるような加圧パック又は噴霧器を必要としない経鼻噴霧は、別の方法として鼻腔内投与のために使用することができる。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を用意することによって決定することができる。ディスペンサーに使用するための、化合物の粉末混合物及びラクトース又はデンプンのような適した粉末基剤を含有する、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを処方することができる。
【００４４】
[0049]本明細書中に記載される調製物は、非経口投与、又は例えば、ボーラス注射又は連続注入による脳への直接投与のために処方することができる。注射のための処方は、単位剤形、例えば、アンプル又は多数回投与容器で、所望により保存剤を加えて与えることができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳液であることができ、そして懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤のような処方剤を含有することができる。
【００４５】
[0050]非経口投与又は脳への直接投与のための医薬組成物は、水溶性の形態の活性調製物の水溶液を含む。更に、活性成分の懸濁液は、適当な油性又は水基剤注射懸濁液として調製することができる。適した親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、又はオレイン酸エチルのような合成脂肪酸エステル、トリグリセリド或いはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。所望により、懸濁液は、高濃度の溶液の調製を可能にするために、適した安定剤又は活性成分の溶解性を増加させる薬剤も含有することができる。
【００４６】
[0051]別の方法として、活性成分は、使用前に適したビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水基剤溶液による構成のための、粉末の形態であることができる。
[0052]本発明の方法の状況において使用するために適した医薬組成物は、活性成分（複数可）を意図する目的を達成するために有効な量で含有する組成物を含む。更に具体的には、有効な量は、神経変性タウオパシーを治療するために有効な活性成分（複数可）の量を意味する。
【００４７】
[0053]治療的に有効な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
[0054]投与量及び間隔は、特定の神経変性タウオパシーを治療するために十分である線維状バクテリオファージの脳内レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を与えるために、個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物及びそれぞれの特定の神経変性タウオパシー、並びに疾病の重篤度に対して変化するものであるが、しかしｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特徴に依存するものである。
【００４８】
[0055]幾つかの態様において、興味ある領域（例えば、病的タウ凝集物を含有する領域）におけるＭＥＣは、約１０９−１０１３個の線維状ファージ粒子／組織ｍｌである。理論に束縛されるものではないが、出願人等は、このＭＥＣを達成するために必要な投与量は、投与当たり約１０１０−１０１５個のファージ粒子であると信じる。更に具体的な態様において、それぞれの投与におけるファージの投与量は、約１０１２−１０１５個のファージ粒子である。
【００４９】
[0056]投与間隔も、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、治療の過程中の１０−９０％の時間、好ましくは３０−９０％間の時間、そして最も好ましくは５０−９０％間の時間、ＭＥＣより上の脳内レベルを維持する投与計画を使用して投与されるべきである。投与の回数は、治療される疾病の種類及び重篤度によって変わるものである。幾つかの態様において、投与は、症状の改善が達成されるまで、少なくとも月一回であるものである。他の態様において、投与は、２ヶ月毎に一回、３ヶ月毎に一回、４ヶ月毎に一回、６ヶ月毎に一回又は年に一回であるものである。
【００５０】
[0057]患者における治療される神経変性タウオパシーの重篤度及び反応性によるが、投与は、一回、或いは数日から数週間又は神経変性タウオパシー状態の減少が達成されるまで継続される治療の過程で、複数回の投与であることができる。
【００５１】
[0058]投与される組成物の量は、勿論、治療される対象、苦痛の重篤度、担当医師の判断、等に依存するものである。
[0059]本発明の方法において使用される組成物は、所望する場合、活性成分を含有する一つ又はそれより多い単位剤形を含有することができるＦＤＡ認可キットのような、パック又はディスペンサー装置で与えられてもよい。パック又はディスペンサー装置は、投与のための説明書を伴うことができる。パック又はディスペンサーは、医薬物の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式で、容器に伴う通知によって便宜を図られることもでき、この通知は、組成物の形態、或いはヒト又は獣医学的投与の機関による認可を反映する。このような通知は、例えば、処方薬に対する米国食品医薬品局によって認可されたラベル又は認可された添付文書であることができる。適合性の医薬的担体中に処方された本発明の調製物を含んでなる組成物は、指示された症状の治療のために、上記で更に詳細に記述したように、調製し、適当な容器に入れ、そしてラベルを付けることもできる。
【００５２】
[0060]ここに本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することにより更に容易に理解されるものであり、これらは、例示として提供されるものであり、そして本発明を制約することを意図するものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１
遺伝子導入マウスにおけるタウ蓄積に対する線維状ファージ活性
材料及び方法
[0061]動物：これらの実験に、成獣のマウス３ｘＴｇ−ＡＤ系統（Ｏｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）及びｒＴｇ４５１０＋マウス（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を使用した。ホモ接合３ｘＴｇマウス及び野生型非遺伝子導入（ＮｏｎＴｇ）マウスのコロニーを、テルアビブ大学の動物飼育施設で確立した。三重の遺伝子導入ＡＤマウスモデル（３ｘＴｇ−ＡＤ）は、二つの家族性ＡＤ関連遺伝子変異、変異ヒトアミロイド前駆体タンパク質遺伝子／プレセニリンタンパク質１遺伝子（ＡＰＰＫＭ６７０／６７１ＮＬ／ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ）、及びタウ遺伝子変異（ＴａｕＰ３０１Ｌ）を有する。モデルは、年齢依存様式の認知機能障害を伴うプラーク及びタングル病態の両方を発生する。オスの生後１３ヶ月のｒＴｇ４５１０＋のタウ遺伝子導入マウス（ｎ＝５）は、Ｅｄ  Ｓｔｅｒｎ（バル−イラン大学、イスラエル）によって親切にも寄贈された。ｒＴｇ４５１０遺伝子導入マウスは、ＦＴＤＰ−１７に関連づけられた変異（Ｐ３０１Ｌ）ヒトタウタンパク質を、皮質、辺縁系、及び基底核に特異的に過剰発現する。モデルは、生後５．５ヶ月までに海馬の急速進行性ニューロン喪失を伴う、空間記憶欠損、及びタウの特徴的な６４ｋＤａの異常に過剰リン酸化された４Ｒ０Ｎアイソフォームの形成、並びに神経原線維変化（ＮＦＴ）の増加によって特徴づけられる。全ての実験のプロトコルは、テルアビブ大学の実験動物委員会によって認可され、そして全ての動物実験法は、施設内動物実験倫理委員会の指針に従って行った。動物を、１２／１２時間の明／暗条件で、食料及び水は自由に利用可能な条件で、ケージ当たり５匹で飼育した。
【００５４】
[0062]実験方法：生後１５ヶ月のＡＤ  ３ＸＴｇマウス（ｎ＝４）及び生後１３ヶ月のｒＴｇ４５１０＋マウス（ｎ＝５）に、２μｌの野生型ファージＭ１３（１×１０１４個ビリオン／ｍｌ）を同側的に注射し、そして内部対照として０．０１ＭのＰＢＳを対側的に注射した。簡単には、マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、加温カーペット上の定位固定装置（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂ，ＳＲＳ−５）上に置いた。マウスを固定した。鎮静作用を、穏やかなつま先挟み引き抜き反応を使用してモニターした。温度調節を、サーモスタット制御の加熱パッドにより提供し、そして腹部温度計でモニターした。頭部の下毛を剃り、ヨードで清浄にし、そして皮膚の切開（マウスに対し長さ１ｃｍ）を無菌のメスで行い、そして全ての軟組織を、頭蓋骨の表面から除去した。３２ｇ針を持つＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを、十字縫合との関連で置いた。齧歯類手術のために設計された電池式ドリル（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．）で頭蓋骨を通して孔をあけた。ドリルの歯が髄膜又は血管を貫通しないように注意を払った。
【００５５】
[0063] Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｐａｘｉｎｏｓ，１９９７（Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）によって確立された定位座標は：十字縫合−２．５ｍｍ；ニューロン間（Interneural）２ｍｍ；背腹部２ｍｍであった。予熱された０．９％食塩水の乳酸リンゲルのボーラス（３ｍｌ皮下）を、手術の終りに脱水状態を防止するために与えた。ブプレノルフィン（０．１−０．５ｍｇ／ｋｇ皮下）を一回投与した。随伴及び術後感染を防止し、そして回避するために抗生物質注射（テトラサイクリン５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を投与した。
【００５６】
[0064]手術後、動物をそのケージに収容し、食事及び水を自由に利用させた。１週間後、マウスをＣＯ２への暴露によって殺し、そしてその脳を収集し、４％パラホルムアルデヒドへの浸漬によって固定し、続いて３０％スクロースで凍結保護し、乾燥酸化窒素によって冷凍し、そしてクライオスタットによって体軸方向の冠状軸で２５μｍに切断し、そして０．１Ｍのリン酸緩衝液中の３０％グリセリン、３０％エチレングリコールからなる−２０℃の溶液中で、組織学的免疫組織化学的検査のために加工されるまで保存した。
【００５７】
[0065]ＴｈＳ染色：タウ病態に対するファージＭ１３治療の効果を、改良チオフラビン−Ｓ（ＴｈＳ）法（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を使用して評価した。暗所における８分のインキュベーションのために切片を、ＴｈＳ（５０％エタノール中の０．０１％）中に浸漬し、次いで８０％エタノールに１０秒間２回浸し、ｄＨ２Ｏで洗浄し、そしてマウントした。
【００５８】
[0066]免疫組織化学的検査：脳組織を、浮動性切片として加工し、そして抗ＮｅｕＮ及び抗タウＡＴ８抗体で染色した。全ての抗体を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するｐＨ７のＴＢＳ（ＴＢＳ＋）で希釈した。一次抗体も更に３％のロバ血清で補充した（ＴＢＳ＋＋）。使用した一次抗体は：マウスα−ニューロン特異的核タンパク質；（ＮｅｕＮ）（１：２００；ＺｙｍｅｄＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）であり；抗−ＰＨＦ−タウ抗体クローンＡＴ８は、Ｓｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５、セリン１９９及び２０２、並びにセリン２０５及び２０８で二重にリン酸化されたＰＨＦ−タウを検出することが示されていた（１：２５０，Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｈｅｎｔ，．Ｂｅｌｇｉｕｍ）。広範囲なポリマー−ＨＲＰ（既製品、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、光学顕微鏡のための二次抗体として使用し、そして３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ  ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で現像した。
【００５９】
[0067]注射の部位並びに注射の部位に近位及び遠位のそれぞれ１００μｍ増分からの浮動性切片を、それぞれ動物から採取した。切片を、リン酸緩衝液中で３×１０分、そしてＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で３×１０分間洗浄して、凍結保護剤を除去し、続いて無水メタノール中の３％のＨ２Ｏ２で１０分間、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。９０％ギ酸による抗原の回収（５分、室温）は、ＡＴ８抗体に対してのみ適用した。切片を、１０分間ＵＶ  Ｂｌｏｃｋ（既製品、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）で、そして更に３０分間ＰＢＳ中の１０％胎児ウシ血清で室温でブロッキングし、そして続いて一次抗体と共にオービタルシェーカーで、４５ＲＰＭでｏ．ｎ．インキュベーションした。写真プラスポリマー−ＨＲＰ（Picture plus Polymer-HRP）を２０分間適用し、そして次いでＤＡＢで現像した。
【００６０】
[0068]画像解析：顕微鏡評価を、ライカＤＭＬＢ顕微鏡を×４００の倍率で使用して行った。十字縫合から−２．８及び−３．５のレベルにおける明確に定義された二枚の冠状切片の画像は、それぞれ、ＣＣＤカラービデオカメラ（ＰｒｏｇＲｅｓ  Ｃ１４，Ｊｅｎｏｐｔｉｃ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により取得し、そしてＩｍａｇｅＪツールソフトウェア（ＮＩＨ）で解析した。全タウ負荷を、切片の全面積のＴｈＳ＋で染色された面積のパーセントとして測定し、そして表示した。結果を、二つの切片の平均タングル負荷として提示する。リン酸化タウ病態に対するファージＭ１３注射の効果を、３ｘＴｇマウスの海馬領域当たりのＡＴ８＋細胞を数えることによって評価した。海馬のＣＡ１領域のＮｅｕＮ＋ニューロンの面積当たりの明示された物を、３ｘＴｇマウスについて推定した。
【００６１】
[0069]統計的解析：データは、本文中に平均±ＳＥＭとして提示してある。群間の統計的差は、群間（Ｔｇ対照対Ｔｇ処置）の計画された比較を伴う両側ｔ検定によって決定した。三つ又はそれより多い変数の解析に対して、一元配置Ａｎｏｖａを使用し、続いて事後比較検定を行った。全ての解析において、Ｐ＜０．０５を有意と考えた。統計的解析は、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して行った。
【００６２】
結果
３ｘＴｇマウスにおけるリン酸化タウに対するファージＭ１３の効果
[0070]脳のタウタングルに対する処置の効果を評価するために、脳を抗タウＡＴ８抗体で免疫染色した（図１）。海馬領域当たりのタングルの数を計算し、そしてＭ１３の注射を受けた３ＸＴｇマウスの海馬において、ＰＢＳで処置した大脳半球と比較して、有意に減少した（ＡＴ８陽性細胞）ことを示した（図２）。
【００６３】
ｒＴｇ４５１０＋マウスにおける脳のタングル負荷に対するファージＭ１３の効果
[0071]全大脳半球面積当たりのＴｈＳ染色タングル（図３Ａ−３Ｄ）によって占められた面積の測定は、海馬領域におけるタングル負荷の減少に対する強い傾向（ｐ＝０．０７）、及びファージＭ１３で処置した大脳半球の皮質における、ＰＢＳ処置に対して有意な減少（ｐ＝０．０２５）を示した（図３Ｅ）。
【００６４】
３ｘＴｇマウスにおけるＴｈＳプラーク負荷に対するファージＭ１３の有益な効果。
[0072]３ｘＴｇマウスにおけるＴｈＳ染色プラークの定量的画像解析は、ファージＭ１３で処置した大脳半球におけるアミロイドプラーク負荷の、ＰＢＳで処置した大脳半球に対して２６％の減少を示した（図４Ａ−４Ｃ）。ＴｈＳ染色プラーク負荷の減少は、ファージＭ１３で処置された大脳半球に関して、海馬台において観察された。更に、処置した大脳半球におけるアミロイドプラークは、小さい大きさを有していた。
【００６５】
３ｘＴｇマウスにおけるＮｅｕＮ標識化に対するファージＭ１３の効果。
[0073]ＮｅｕＮ負荷の定量的画像解析は、ファージ処置（図５Ｂ）及びＰＢＳ処置（図５Ａ）の大脳半球間で、殆ど同様なＮｅｕＮ陽性ニューロン分布を示した。両方の大脳半球におけるＮｅｕＮ負荷の面積の％を図５Ｃに示す。この結果は、ファージの海馬内注射が、ＰＢＳと同様にニューロンに対して毒性ではなかった証拠を提供する。
【００６６】
[0074]上記の実験の結果から、以下のように結論付けることができる：
１．ファージＭ１３注射は、３ｘＴｇマウスにおけるＡＴ８陽性細胞の数を有意に減少させる。
【００６７】
２．ファージＭ１３注射は、ｒＴｇ４５１０＋マウスの脳におけるタングル負荷に対して有意に有益な効果を有する。
３．ファージＭ１３注射は、３ｘＴｇマウスにおけるアミロイドプラーク負荷の減少を起こした。
【００６８】
４．ファージＭ１３注射は、３ｘＴｇ遺伝子導入及び正常なＣ５７／Ｂマウスの大脳半球間のＮｅｕＮ標識化に対して影響を持たなかった。この発見は、残存するニューロンの数がＰＢＳと同様であることから、ファージＭ１３が毒性ではないことを示唆する。
【００６９】
５．ファージ及びＰＢＳ処置大脳半球間のＮｅｕＮ染色の類似性は、効果が、タウ病態に対するファージの直接的影響から起こることを示唆する。
[0075]従って、ファージＭ１３は、タウに対して直接的な有益な効果を有し、そしてタウＴｇマウスにおけるタングル負荷の減少は、ｉｎ  ｖｉｖｏのタウに対する直接的ファージ作用に対する証拠を提供する。
【００７０】
実施例２
線維状ファージで処置されたタウ原線維の脱凝集
[0076]酢酸セルロース膜フィルターは、タウの原線維コンフォーマーを選択的に保持する。アミロイド様タンパク質凝集体のフィルター遅延アッセイに対する本来のプロトコルの一つは、Ｗａｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）である。
【００７１】
材料及び方法
[0077]タウ線維の調製：タウ線維を、Ｍａｒｇｉｔｔａｉ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｎ（２００６）中に記載されているように構築した。
【００７２】
[0078]タウ線維を、異なった濃度（１×１０１２及び１×１０１３ファージ／ｍｌ）の野生型Ｍ１３バクテリオファージを含有するＰＢＳ（最終濃度２．５μＭ）中に希釈し、そして３日間３７℃でインキュベートした。反応の終りに、タウ原線維の一連の希釈物を、クロスβシートアミロイドを選択的に保持する酢酸セルロース膜フィルターを通す濾過にかけ、続いて免疫ブロット（一次抗体を、供給者によって記載されているように、５％の脱脂乳中に１時間室温で希釈した；二次抗体：Ｓｉｇｍａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓからの抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ複合体を、５％の脱脂乳中に１：３００００に１時間室温で希釈した）して、タウ線維の脱凝集を定量するためにフィルターに保持されたタウ線維の量を示した。免疫ブロットのために使用した抗体は、ｆ−タウを検出するための抗タウ抗体ＥＰ２４５６Ｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。
【００７３】
結果
[0079]図６に示すように、Ｍ１３は、タウの原線維を、濃度依存様式で、酢酸セルロース膜フィルターによって保持できない脱凝集された／分離された種に転換する。
【００７４】
[0080]ここに、本発明を完全に記載してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、そして過度の実験を伴わずに、広い範囲の等価なパラメーター、濃度、及び条件内で、本発明を行うことができることは当業者によって認識されるものである。
【００７５】
[0081]本発明は、その具体的な態様に関連して記載されてきたが、更なる改良が可能であることは理解されるものである。本出願は、一般的に本発明の原理に従う本発明のいずれもの変更、使用又は適合を包含し、そして本発明が属する当技術内の既知の又は通例の習慣となるような、そして付属する特許請求の範囲の範囲中に以下のように記載される、本明細書中の先の本質的特徴に適用することができるような本開示からの逸脱を含むことを意図している。
【００７６】
[0082]公開された学術論文又は要約、或いは対応する米国又は外国特許出願、米国又は外国で発行された特許、或いは他の参考文献を含む本明細書中に引用される全ての参考文献は、引用された参考文献中に提示された全てのデータ、表、図面、及び本文を含み本明細書中に参考文献として全体的に援用される。更に、本明細書中に引用される参考文献内に引用された参考文献の全体の内容も、更に参考文献として全体的に援用される。
【００７７】
[0083]既知の方法の工程、慣用的な方法の工程、既知の方法又は慣用的な方法に対する言及は、本発明のいずれもの側面、記載又は態様が、如何なる方法においても、関連する技術において開示され、教示され、又は示唆されていることの承認ではない。
【００７８】
[0084]具体的な態様の前記の説明は、他のものが、当業の知識を適用することによって（本明細書中に引用した参考文献の内容を含み）、このような具体的な態様を、過度の実験を伴わず、本発明の一般的概念から逸脱することなく、各種の適用のために容易に改変及び／又は適合することができるように、本発明の一般的特質を完全に明らかにするものである。従って、このような適合及び改変が、本明細書中に提示される教示及び指針に基づく開示された態様の等価物の意義及び範囲内であることは意図されている。本明細書中の用語又は術語は、本明細書の術語又は用語が、本明細書中に提示される教示及び指針に照らして、当業者の知識と組合せて当業者によって解釈されるように、説明の目的のためであり、そして制約の目的ではないことは理解されることである。
【００７９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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