(57)【要約】  本発明は、電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡での検査のために切片を作成する方法に関する。従来は、この切片は、例えばＴｏｋｕｙａｍａ方法で作成されていたが、この方法は凍結温度で凍結置換及び固定化を含むものである。問題は、試料から切片を作成するに要する時間であり、従来方法では化学物質（有機溶媒及び固定化剤）の拡散速度が非常に遅かった。本発明は、試料の切片化を凍結温度で行い、固定化をその後に行うというものである。前記切片が前記試料（しばしば１μｍを超える）に比べて非常に薄い（例えば１００ｎｍ以下）ことから、試料から検査可能な状態の切片を作成するための時間は８時間未満である。これにより、１作業日内で健康管理のための関連する結果を出すことが達成される。
2014501906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査するために生体試料を調製する方法であり、前記方法は：
−生体試料を準備し、
−試料を高圧凍結で凍結固定化し、
−凍結切片化で切片を作成し、
−切片を電子顕微鏡グリッド上に配置し、
−室温で免疫ラベル化し、及び
−前記切片を電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査することを含み、
−固定化及び／又は染色を前記電子顕微鏡上に設けられる前記切片で実施することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項に記載の方法であり、前記固定化及び／又は染色が、凍結温度で実施される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であり、さらに、前記切片の凍結置換、続いて前記切片を凍結状態から室温へ戻し、続いて再水和させることを含む、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であり、前記凍結置換が、水と、固定化剤を含む有機溶媒の混合物とを置換すること、より具体的には水と、アセトン及び固定化剤との混合物とを置換することを含む、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であり、前記置換が、凍結温度で、より具体的には−９０℃未満の温度で、最も具体的には−９０℃で実施される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であり、前記方法がさらに、前記凍結断片を凍結水系固定化剤上に設け、続いて融解させて前記切片を前記凍結水系固定化剤を融解させることで固定化し、及び前記切片を氷の融解温度で固定化することを含む、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が蛍光ラベル化剤でラベル化することを含む、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が、電子緻密ラベル化剤、より具体的には、金、銀、パラジウム、白金からの重金属でラベル化することを含む、方法
【請求項９】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が、量子ドットでラベル化することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法であり、前記電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡が１つの装置に組み合わされている、方法。
【請求項１１】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法であり、オスミウム含有物が、固定化剤及び／又は電子緻密染色として使用され、及びオスミウムが、−６０℃未満で前記凍結置換媒体から除去されそれにより抗原性を防止することを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法を実施するための取り扱い装置であり、前記装置は：
−凍結固定化剤及び／又は凍結置換媒体及び／又はラベル化用流体を保持するための容器、
−蓋を含み、前記蓋は前記容器の上部に位置され、前記蓋は、脱着可能に許容するグリッドのためのロク機構を含む、取り扱い装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の取り扱い装置であり、グリッドを取り扱うための強化周縁部を設け、前記グリッドが自動的取り扱いのために好適である、取り扱い装置。
【請求項１４】
請求項２乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、前記固定化及び／又は染色が、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の取り扱い装置で実施される、方法。
【請求項１５】
請求項６に記載の方法であり、前記凍結水系固定化剤上に設けられ、及び融解されることが、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の取り扱い装置で生じる、方法。
【請求項１６】
請求項１４又は１５のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の取り扱い装置で生じる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査のための生体試料の調製方法に関し、前記方法は：
−生体試料を準備し、
−高圧凍結で試料を凍結固定し、
−凍結切片により切片を形成し、
−切片を電気顕微鏡グリッド上に配置し、
−室温で免疫ラベル化し、及び
−前記切片を、電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査することを含む。
【０００２】
かかる方法は、Ｄ．Ｒｉｐｐｅｒらの、「Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ：ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｃｒｙｏｆｉｘａｔｉｏｎ、ｆｒｅｅｚｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００８）、ｐｐ１０９−１２３）、及びその参考文献［１］）から知られた方法である。
【０００３】
ＴＥＭでは試料の薄切片は、電子のエネルギービームに照射される。前記切片は、十分に薄く（通常は１μｍ未満、より具体的には２５０ｎｍ未満、最も具体的には８０ｎｍ未満）、通常８０ｅＶから３００ｋｅＶの間のエネルギーの（他のエネルギーも使用されることが知られているが）電子の一部分が前記切片の表側を通過し、前記電子の一部分が散乱され、一部分は吸収されるが、これらは前記電子と前記切片中の原子、より具体的には原子核との相互作用による。前記切片を通過したこれらの電子から、画像が、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラなどのカメラ上に形成され、又は例えば発光スクリーン上に形成される。
【０００４】
留意すべことは、前記薄切片を微細焦点化ビームでスキャンし、どの程度の電子が前記切片を通過したか、又は反射されたかを観察することも知られている、ということである。この場合には、前記装置はしばしば、走査透過電子顕微鏡と参照される。たいていのＳＥＭは、ＳＴＥＭとして操作され得るし、その逆もそうである。
【０００５】
生体試料は通常は非常に弱いコントラストであり、そのほとんどの構成物質は、陽子と同じ程度の少ないかつ類似する数の原子からなる。したがって通常は、前記切片は、例えばウラニウム（酢酸ウラニウムに前記切片を暴露させることで）重金属でラベル化されるか、又はタンパク質を含む前記切片を電子高密度物質でラベル化される（例えば銀又は金クラスタで）。これらのラベル化のそれぞれは、組織成分の特異性、使用の容易性などの点で利点がある。例として：四酸化オスミウムは、「染色」脂質として知られ、したがって、例えば脂質二重層細胞の可視性を強化する。
【０００６】
前記の通り、ＴＥＭは薄切片を画像化することができる。薄切片などの試料を作製するために、細胞、細菌などは固定化され１μｍ未満、好ましくは２５０ｎｍ、最も好ましくは８０ｎｍ未満の切片に切断される必要がある。切片作成のよく知られた方法は、ガラスナイフ又はダイヤモンドナイフで試料を切断することである。試料切断を成功するためには、試料を最初に凍結するか、又は試料をプラスチックに包埋するかのいずれかで固化することが必要である。
【０００７】
試料を凍結させる場合には、氷結晶が、試料の形態の超構造の変化を起こすこととなり、かつ氷針は細胞膜に穴を形成したり開けたりするから、避けるべきである。氷結晶形成は、例えば高圧凍結により避けることができ、試料は最初に例えば２１００バールに加圧され、次に例えば液体窒素のジェットによりジェット凍結などの急速凍結される（冷却速度は１０４Ｋ／ｓを超える）。高圧凍結の概説については、例えば以下Ｍｏｒｐｈｅｗ［２］と参照するＭ．Ｋ．Ｍｏｒｐｈｅｗの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ、Ｆｒｅｅｚｅ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  ３−Ｄ  Ｆｉｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ  ＭＣＤ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ、  Ｂｏｕｌｄｅｒ、  Ｃｏｌｏｒａｄｏ）特にパラグラフ「Ａ）  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ」の５ページに記載されている。前記試料は次に、ガラス固化試料と呼ばれ、所謂アモルファス氷を含み、かつ、適切に扱われると氷結晶を示すことはない。しかし、前記アモルファス氷を暖めると氷の多くの結晶系の一つに結晶化を誘導する。
【０００８】
Ｒｉｐｐｅｒ［１］は、論文「ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｃｒｙｏｆｉｘａｔｉｏｎ−ＦＳ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈａｗｅｄ  ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ（１１２ページ）」で、切片作成の方法を記載してる。筆者は、試料を最初高圧凍結で凍結固定化し、酸化オスミウム０．１％、０．１から０．２％酢酸ウラニウム及び０．５％グルタルアルデヒド、同じく０．５から１％メタノール及び２から４％水を含むアセトン中で凍結置換される、方法を記載する。
【０００９】
留意すべきは、電子顕微鏡のための染色は通常は、例えば電子緻密マーカー又は染色として酢酸ウラニウム又は四酸化オスミウムで実施されるが、これらの化合物は固定化剤として作用するものではない、ということである。固定化剤は、生体分子（タンパク質、脂質二重層など）をクロスリンクして、これらを次の工程で除去されないようにするために使用される。よく知られる固定化剤はグルタルアルデヒドである。
【００１０】
前記凍結置換を終了後、試料は−３５℃で、２から４％水及び０．５％グルタルアルデヒドを含むアセトン中で洗浄されて固定化剤を除去された。その後試料は、０．２５％グルタルアルデヒド存在下洗浄温度で再水和され、０．２５％グルタルアルデヒドを含む水中にさらに３０から９０分保持された。水中で再度洗浄された後、試料はさらに従来のＴｏｋｕｙａｓｕ凍結切片化、スクロース／ポリビニルピロリドン浸潤、凍結、凍結切片化及び免疫ラベル化のための処理される。
【００１１】
当業者には知られていることであるが、前記方法を用いることで切片作成には数日、通常２日以上必要である。例えば凍結温度で試料の脱水は数日必要である。
【００１２】
従って、特に臨床診断のため、特には疾患の早期診断のために、試料から電子顕微鏡検査の時間を短縮化する方法、好ましくは８時間未満（１作業日）に短縮する方法への要求が存在する。留意すべことは、かかる長いスループット時間は、既にこれまでずっと健康管理上の問題であったということである、よりループット時間をより短縮する方法を見出すための大きな動機付けであった、ということである。
【００１３】
臨床診断のために、特に疾患の初期診断においてはむしろ、恒常性からはずれた比較的少数の細胞を見出すために生体試料のより広い領域を分析する必要がある。これは電子顕微鏡ではほとんど不可能である。従って、試料の広い領域を分析するための蛍光顕微鏡と、疑わしい部分を拡大する電子顕微鏡との組合せが開発されている。蛍光顕微鏡は、蛍光色素を検出し、それにより対象となる領域の位置情報を得る。
【００１４】
本発明者は、さらに、Ｔｏｋｕｙａｓｕ方法により調製された試料は、蛍光顕微鏡での分析が不十分であること、というのは電子顕微鏡のためにコントラストを強化するために使用された重金属が、蛍光顕微鏡で使用される蛍光を消光させるからである、ということに注目した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄ．Ｒｉｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００８）、ｐｐ１０９−１２３
【非特許文献２】Ｍ．Ｋ．Ｍｏｒｐｈｅｗ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ、  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  ３−Ｄ  Ｆｉｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ  ＭＣＤ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者は、より短時間の試料から検査時間を持つ生体試料から染色切片作成のための方法を提供することを意図する。本発明者は、蛍光色素が消光されない方法の提供を意図する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的を達成するために、本発明による方法は、固定化及び／又は染色が、電子顕微鏡グリッド上に配置された前記切片上で凍結温度で実施される、ことを特徴とする。
【００１８】
本発明は、凍結温度で試料を切片化することで、続く処理が、切片上で起こり、したがって化学物質の浸潤時間及び／又は拡散時間を低減する、という知見に基づく。例えば、凍結置換は、従来方法では２日必要であったが８５分で実施される。実験では、本発明の方法により、電子顕微鏡分析用切片が８時間以下で得られることとなり、これは健康管理上重要な短縮である。
【００１９】
本発明の方法の実施態様では、前記固定化／染色は凍結温度で実施される。
【００２０】
非染色／非固定化切片は、例えば、−１５０℃の凍結温度で利用可能であり、前記試料の代わりに切片を染色及び／又は固定化することが可能出る。その違いは、前記切片は薄く、一方試料はずっと厚く、切片の染色／固定化に必要な時間は従って、試料を染色／固定化するために必要な時間よりもずっと短くなる、ということである。
【００２１】
本発明による方法のさらなる実施態様では、前記方法は、前記切片の凍結置換を含み、次に前記切片を再水和するために前記切片を凍結状態から室温へ戻される。
【００２２】
この方法では、本発明者によりＶＩＳ２ＦＩＸＦＳと命名された方法では、ＦＳは自由置換を意味し、前記切片は前記グリッドに付設され、凍結置換に暴露され、かつ加熱される。前記凍結温度から室温へ加熱される際に水はほとんど又は全く存在しないことから、氷結晶は形成されない。好ましくは、前記自由置換が実施される温度は、−９０℃以下であり、前記凍結置換がさらに結晶化を避ける買えに結晶形成を避ける。
【００２３】
本発明よる方法のさらなる実施態様では、前記自由置換は、水を固定化剤を含む有機溶媒と混合することで交換すること、より具体的には水をアセトンと固定化剤と混合することを含む。
【００２４】
水をアセトンなどの有機溶媒と置換することで、前記試料は氷結晶を形成することなく室温まで加熱され得る。また、固定化剤／染色剤は、アセトンなどの有機溶媒中に溶解され得る。
【００２５】
本発明の方法による他の実施態様では、前記方法は、前記凍結切片を、凍結水系固定化剤上に置くこと、続いて解凍し前記切片を前記凍結水系固定化剤により前記切片を固定化し、かつ前記切片を氷融解温度で固定化する、ことを含む。
【００２６】
この実施態様では、前記切片は、凍結固定化剤上に設け、次に前記固定化剤と共に解凍される。驚くべきことに実験は、この実施態様により試料を処理する場合には氷結晶が全く観察されない、ということである。
【００２７】
さらなる実施態様では、前記切片は、蛍光顕微鏡を用いる検査／ナビゲーションを可能にするための蛍光ラベルで、電子顕微鏡のためのラベル化剤としての電子緻密ラベル（金、パラジウム、白金からなる群から選択される重金属を含むラベル化など）で、又は蛍光及び電子顕微鏡のための両方のラベル化剤として作用することが知られている量子ドットで、（好ましくは室温で）ラベル化される。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様では、前記切片の検査は、電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡の組合せである装置で実施され、この装置は又、ｉＬＥＭ（統合光電子顕微鏡）と参照される。
【００２９】
本発明の側面は、前記方法を実施するための装置の取り扱いが、凍結固定化剤及び／又は凍結置換媒体及び／又はラベル化のための流体及び蓋を保持するための容器を含み、前記蓋は動作時は前記容器の上部に配置され、前記蓋は脱着可能に受けられる前記グリッドのためのロック機構を含む、ということで特徴付けられる。
【００３０】
凍結温度で固定化及び／又は染色することは、前記取り扱い装置で実施され、同様に凍結固定化剤上に配置し続いて解凍される。また、ラベル化はこの取り扱い装置で実施され得る。
【００３１】
好ましくは、前記取り扱い装置は、強化グリッド即ち：厚さのある縁部を持つことにより丈夫にされたグリッド、を扱うために装備される。かかるグリッドは、自動化取り扱いのために使用される。
【００３２】
本発明は以下、添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明による方法のフローチャートを模式的に示す。
【図２】図２は、前記方法の少なくとも一部を実施するための取り扱い装置を模式的に示す。
【図３】図３は、ＶＩＳ２ＦＩＸ方法の超構造側面及びＰＤＩの免疫−金ラベル化を示す。
【図４】図４は、ＬＡＭＰ２のためにラベル化されたＶＩＳ２ＦＩＸＦＳのｉＬＥＭ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図１は、本発明による方法のフローチャートを模式的に示す。
【００３５】
前記の通り、本発明の目的は、水の再結晶化の臨界的温度範囲を通過するのもかかわらず前記試料の損卒を避けるようにして試料の分析を可能にする、ことである。さらには、本発明は、生体試料を、電子顕微鏡画像で良好なコントラストのために必要な重金属が、蛍光顕微鏡による画像のために必要な蛍光色素をほとんど消光しないように生体試料を固定化する方法に関する。
【００３６】
本発明者は、現在使用されている方法の欠点を解消するために、２つの異なる、しかし相互に関連する方法（ＶＩＳＦＩＸと呼ばれる、２つの固定化剤へのガラス状切片のため）を開発した。両方の方法とも、グリッドへの凍結切片の静的付着により特徴付けられ、続いて前記切片を、前記生体試料の超構造レベルで目に見える凍結損傷を避けるように固定化される。さらに、本発明は、切片固定化により高圧凍結物の免疫ラベル化を可能にし、その結果重金属による蛍光信号の消光を大きく低減するものである。さらに、前記切片のエピトープのアクセス可能性は、Ｔｏｋｕｙａｓｕ断片（Ｔｏｋｕｙａｓｕ  ＫＴ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９７３、５１、  ５５１−５６５、ｆｕｒｔｈｅｒ  ｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｔｏ  ａ  Ｔｏｋａｙａｓｕ［３］；Ｇｅｕｚｅ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８１、６５３−６６５、ｆｕｒｔｈｅｒ  ｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｔｏ  ａｓ  Ｇｅｕｚｅ［４］）と類似し、効果的ラベル化の機会を増加させる。前記方法の性質により、調製時間は、これまで記載されたいかなる方法に比べても短いものであり、結果は８時間以内に得られ得る。
【００３７】
本発明の両方の方法は最初は同じである：ステップ１０１で、細胞（又はその一部）、細菌、生検などの形で生体試料として試料が準備される。ステップ１０２で、前記試料は高圧凍結され、その結果氷結晶を示さないガラス状試料となる。高圧凍結は当業者に知られている。ステップ１０３で、高圧凍結物質は、例えば−１５０℃の凍結温度で凍結切片化される。ステップ１０４で、前記凍結切片は、次に、好ましくはＬｅｉｃａＣＲＩＯＮ静電防止装置の助けを借りて静的にＴＥＭグリッドに接着される。
【００３８】
続いて、前記切片は、例えば−９０℃の温度でＦＳ（凍結置換）チャンバに、好ましくは例えばＬｅｉｃａＡＦＳ２などの自動化凍結置換ユニット内で、移され、固定化剤上に前記切片が面するように配置される。前記凍結切片は次に固定化され、かつ室温へ、好ましくは制御された温度上昇速度で暖められ、（従来の）免疫ラベル化の準備が完了する。
【００３９】
前記切片の固定化は、２つの方法で達成され得る；ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳ及びＶＩＳ２ＦＩＸＨ方法である。
【００４０】
前記第１の切片固定化方法、ＶＩＳ２ＦＸＦＳ（凍結置換）は、前記凍結切片の凍結置換を可能にする。ステップ１０５では、前記凍結切片の水が、固定化剤を含むアセトンなどの有機溶媒で置換される。これは、−９０℃で行われるので、温度が０℃に上昇した場合、氷結晶を形成するための前記切片中には水はもはや存在しない。凍結置換は生体物質を高圧凍結に続いて通常適用される技術であるが、我々の方法はより小さい（切片はほんの８０ｎｍ厚さ）ことから、ずっと迅速に実施される：即ち、従来の方法の少なくとも２日に比較して８５分未満である。温度が上昇すると、前記アセトン中の固定化剤が前記切片の固定化を開始し、それにより０℃に到達すると切片は安定化されることとなる。ステップ１０６では、前記試料は段階的にアセトンから水へ再水和され、次のステップ：ステップ１０９免疫ラベル化及びステップ１１０：電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡での検査、の準備が整う。
【００４１】
ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳ方法で、新規構成の１つが、凍結切片で凍結置換を実施する可能性があり、より短時間であるが効果的にア凍結置換方法の開発である。この方法の使用は、前記凍結置換方法の長さを変更でき、それを異なるタイプの生体試料に合せて最適化でき、非常に重要なことに、前記凍結置換媒体中の固定化剤混合物の組成を変更することができる。我々は、前記凍結置換を通じて０．１から０．２％の酢酸ウラニウムを使用し（しかし再水和の際に除去される）、四酸化オスミウム及びグルタルアルデヒドの存在は０．１から０．５％の範囲で変更され得る。さらに、−６０℃でオスミウムを前記凍結置換媒体から除去して、前記固定化剤（抗原性に対するオスミウムの効果は−６０℃より高い温度で観測されるだけである）により生じる抗原性への悪影響を防止する。
【００４２】
前記第２の切片固定化方法、ＶＩＳ２ＦＩＸＨ（Ｈは水和の意味）は、０℃で疎水性環境（ＰＨＥＭ緩衝液）中で固定化剤で前記切片を化学的に固定化することを可能にする。
【００４３】
ステップ１０４に続いてステップ１０７で、−９０℃で、前記グリッドに接着した前記凍結切片が凍結固定化剤上に配置される。ステップ１０８で、前記固定化剤及び切片は、次に、固定化剤の表面が液化するまで、例えば４０℃まで暖められて溶解される。次に、前記切片は、１０分間、光から保護された条件で氷上で固体化される。この固定化期間及び洗浄ステップの後、前記切片はステップ１０９：免疫ラベル化の準備が整うこととなる。前記ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳ方法と同じく、ここで、前記固定化剤の組成は使用者の要求に合せて容易に変更することができる。この具体的な方法の大きな利点の一つは、四酸化オスミウムが固定化剤混合物として使用される場合には前記切片中の脂質の保存が観測される、ということである。ＴＥＭ試料調製のさらなる従来の方法は通常は脂質を固定化せず（例えば前記のＴｏｋｕｙａｓｕ方法［３］）、又は固定化される前に、凍結置換と共に脂質の抽出が生じる。これによりリピドミクス分野の研究者のとって、この具体的な方法が、大きな興味の対象となり得る。前記切片は、−１５０℃から約０℃へ、凍結保護又は前もっても固体化をすることなく、温度が変化されることから、前記切片内に氷結晶により誘導された障害の超構造効果が見られるものと予想し得る。前記拡のヘテロクロマチンは凍結障害により細胞内に最も最初に影響を受けやすい構造であるが、前記方法の使用はこの部分及び細胞の他の部分でも何らの損傷も見られない。この驚くべき予想できない知見に対する現在の説明は、おそらく、形成される氷結晶が非常に小さく、細胞構造に影響又は損傷を与えなかった、ということである。ステップ１１０で、前記切片は次に蛍光顕微鏡、電子顕微鏡又は蛍光顕微鏡及び電子顕微鏡の組合せ（ｉＬＥＭ（統合化光電子顕微鏡））で検査され得る。
【００４４】
両方のＶＩＳ２ＦＩＸ方法は、高圧凍結試料及び／又は高圧凍結装置、凍結ミクロトーム及び凍結切片化関連製品、グリッドへの接着のためのＬｅｉｃａＣＲＩＯＮ静電防止装置（又はこの接着を達成するための同様の装置）、自動化凍結置換ユニット（ＡＦＳ）及び備品を必要とするか、又はあれば好ましい。現在、これらの装置は統合化されておらず、各処理を個人的に観察し、手動で実施しなければならない。しかし、当業者には明らかなことは、切片の高圧凍結から始まって最終的固定化まで、統合化し自動化するものが開発され得る、とういうことである。
【００４５】
留意すべきことは、前記試料を凍結ミクロトームの代わりにまた、焦点化イオンビーム（ＦＩＢ）で凍結切片化することができる、ということである。
【００４６】
図２ａには、本発明による方法を実施するための取り扱い装置の断面を模式的に示す。図２ａは、容器（２０１）を示し、これは凍結固定化剤及び／又は凍結置換媒体及び／又はラベル化用流体、及び蓋（２０２）を含み、前記蓋は動作位置で前記容器に上部に配置され、前記蓋は脱着可能なグリッド（２０９ａ＋２０９ｂ）のロック機構（２０３ａ＋２０３ｂ）を含む。
【００４７】
前記蓋は、第１の側を持ち、この上に１以上のグリッドが設けられ、好ましくはインデント（２０４ａ、２０４ｂ）であるが、必須ではない。凍結温度で、前記切片が接着される１以上のグリッドは前記蓋上に設けられる。前記蓋は、脱着可能な形で前記グリッドを保持する構造を持つ。この例では前記構造は、バネ２０３ａとして示され、これは回転可能であり、軸２０３ｂに沿って可動である。一つの回転位置で、バネは前記グリッドを保持／ラッチし、他の回転位置では前記バネは前記蓋２０２に対して静止し、かつ前記グリッドは落下することが可能となり（前記インデントが下方向に向いている場合）、又はグリッドが負荷され得る（前記インデントが上向きの場合）。留意すべきことは、動き（グリッドの脱着又は負荷）は、前記インデントからグリッドに向かい吹き込むか又は内側に吸い込むカナル（図示されていない）を通じる圧力差により緩和され得る。
【００４８】
前記容器は、凍結置換媒体又は固定化剤などの流体が入口２０５を介して満たされ得る。前記容器に温度は、これを凍結流体（エタン、液体窒素）内に置くことで凍結温度へ低下させ得る。留意すべきことは、容器は、凍結流体がこの目的で循環し得るチャンネルを含み得る、ということである。
【００４９】
前記容器は、一連のインデント２０８ａ、２０８ｂを含み、これは前記インデント２０４ａ及び２０４ｂに対応する。これらのインデントが固定化剤又は凍結置換媒体で満たされ、温度が凍結温度に調節されると、その結果、インデント２０８ａ、２０８ｂが凍結温度で凍結置換媒体又は凍結固定化剤を保持し、前記蓋は前記容器上に配置され前記グリッドは前記蓋から離される。前記グリッドは次に前記凍結置換媒体又は凍結固定化剤の上に落下する。
【００５０】
前記装置は次に、制御されて室温まで暖められる。前記温度の制御は、統合加熱装置２０６、又は前記取り扱い装置を温度制御環境下に置くことで達成され得る。好ましくは前記容器は温度測定装置２０７を含む。前記グリッドは、前記グリッドを前記蓋に対してフラッシュすること、及びロック機構４０３ａ＋４０３ｂを活性化することで元に戻る。室温及び氷溶融温度に到達した後、前記ラベル化は、ラベル化剤を前記グリッドに添加することで実施され得る。これは、前記取り扱い装置でその場で（インシチュ）実施され得るが、他の場所でも（エクスシチュ）実施され得る。
【００５１】
前記ロック機構は、例えば個々の酵素をクランプ又はラッチすることで、グリッド対グリッドにより作用し得るものであり、又はグリッドの完全な数で作用し得る。
【００５２】
図２ｂは、動作中に前記容器に面する側から見た前記蓋の図面を示す。
【００５３】
図２ｂは模式的に８つのインデント２０４−ｉを持つ蓋２０２を模式的に示す。インデントの１つにグリッド２０９が置かれ、前記バネ２０３ａが前記軸２０３ｂにより、前記バネが前記インデント内に前記グリッドを保持する位置へ回転される。
【００５４】
留意するべきことは、前記インデント内に前記酵素をよりよく維持するために、前記バネの端部がより好適な形状、例えばループ形状であり得るということであり、及び他のかかる手段は、当業者に明らかなものであって、よりよく及び／又は他の保持機構として採用され得る、ということである。また、前記機構の動きは、異なる原理に基づくものであってもよく、例えば機械的駆動装置、磁気駆動装置、圧電駆動装置などである。
【００５５】
本発明のこの側面による取り扱い装置の利点は、これが自動化取り扱いステーションの部分であり得るものであるか又は自動化試料取り扱いのために好適にするような制御装置及び駆動装置を含み得る。好ましくは、前記装置は次に、米国特許第７、０３４、３１６号に記載されるような、強化周縁部を持つ丈夫なグリッドを扱うために好適化される。
【００５６】
その使用例（非限定的）として本発明による方法以下の例を提供する。
【００５７】
（初期段階の）疾患、特に癌及び心臓血管疾患のためのマーカーとしての循環細胞
循環（血液）細胞は、ヒト及び動物の体の他の組織の全てのタイプの細胞と遭遇する。これらの遭遇の際には、前記循環細胞と「身体」細胞の間に「情報」の交換が生じる。この情報交換は、身体細胞により送られる分子シグナルにより促進され、分子は循環細胞でレセプタータンパク質として認識され、又は身体細胞で生成された分子又はエキソソームが前記循環細胞により捕捉される。両方のプロセスは、循環細胞でのシグナル処理において変化を生じる結果となり、これらのシグナル処理プロセスはこれらのシグナルプロセスにより制御される遺伝子転写物のアップ及びダウンレギュレーションを生じる結果となる。しばしばこれらのプロセスは、循環細胞のタンパク質プロフィールに変化を与える結果となる。さらに、（シグナル）分子は、前記循環細胞に補足され内部化され（Ｈｏｆｍａｎ  Ｅ、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、２００８、ＩＳＢＮ  ９７８−９０−３９３−４９０５）、これはまた循環細胞のタンパク質プロフィールを変化させる。これらのタンパク質プロフィールの変化はしばしば、循環細胞及び細胞表面抗原の形態に影響を与える。また、細胞表面のタンパク質複合体の、二量化などの変化が起こり、その結果細胞外レセプターの活性化又は不活性化が生じ得る。タンパク質プロフィールの変化は、プロテオミック技術でモニターされ得る一方、形態変化は、例えば細胞中で新たな複合体の形成や分解などのようなタンパク質プロフィールの明らかな違いを示さずに生じる。
【００５８】
現在最小侵襲的方法で少量の血液試料を採取することは可能である。少量の試料は、局所で生じている生体プロセスを多かれ少なかれ反映する（サンプリングの位置及び時）。収集された循環細胞の量は、従って、前記サンプル取得領域で、ある細胞がその恒常性状態からの変動を予測するプロセスが生じているかどうかについての統計的に有意な答えを得るために十分である。これまで、かかる試料は主にタンパク質を研究し細胞数測定のためであったが、循環細胞の形態変化又はタンパク質複合体での変化が生じる場合についてはほとんど研究されてこなかった。本発明者は、これらの細胞内及び表面で複合体の変化と同様に形態の変化について分析することを可能にする。
【００５９】
実験結果
高圧凍結、切片化及びＡＦＳへのグリッド移動
白血病細胞株からのＴＨＰ−１ヒト単球細胞はＡＴＣＣ（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｓｅｌ、ドイツ）から入手し、供給者の指示書に従い培養した。高圧凍結のために、前記細胞を遠心（５分、１２００ｒｐｍ）し、得られたペレットをデキストラン（最終濃度１５％）中に再懸濁した。銅試料管をデキストラン中の前記懸濁液で満たし、ＬｅｉｃａＥＭＰＡＣＴを用いて約２０００バールで高圧凍結した。凍結管は切片化に先立ち液体窒素中で保存した。前記管をトリムし、ＬｅｉｃａＣＲＩＯＮ静電防止装置を放電に設定して、−１５０℃でＬＥＩｃａＥＭＵＣ６／ＦＣ６ウルトラムミクロトーム内でダイヤモンドナイフを用いて切片化した。切片化の再、６０から８０ナノメートルの厚さで、長い光沢のあるように見える切片のリボンをＴＥＭグリッド上に整列させた。ｆｏｒｍｖａｒ膜を持ち、カーボンコーティングされグロー放電される前記グリッドは前記Ｌｅｉｃａミクロ操作装置のナイフエッジの近くに保持された。前記リボンが十分に長い場合、ＬｅｉｃａＣＲＩＯＮ静電防止装置で前記グリッドへ静的に接着された。ここで、非常に重要なことは、前記接着が良好かどうかを、前記切片をグリッドから持ち上げられるかどうかでチェックされることであるが、持ち上げ可能であってはならない。ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳ方法を用いる場合、前記切片は、有効な固定化を達成するには少なくとも８０ｎｍの厚さを必要とする、ということが見出された。
【００６０】
切片化に続いて、前記グリッドは、−１５０℃に冷却された前記ＵＣ６のミクロトームチャンバ内に存在するＬｅｉｃａサファイアディスク（ＳＤ）ホルダー（これはＳＤ凍結置換ユニットの一部分）内に置かれた。前記ＳＤホルダーは２４のサファイアディスクを保持することができ、又はこの応用ではグリッドを保持することができる。グリッドの必要量を切片化後、前記グリッドを保持するＳＤホルダーを、前記ミクロトームチャンバからＡＦＳ２（Ｌｅｉｃａ自動凍結置換ユニット）のＦＳチャンバへ移動させた。ここで、前記グリッドは冷却が維持され、前記切片に氷結晶を形成し得る湿気から保護される必要がある。予冷却された缶（Ｌｅｉｃａユニバーサル容器）が、前記底上に１つの冷却リング（Ｌｅｉｃａ底板）を含む前記ミクロトームチャンバ内に存在する。前記グリッドを持つＳＤホルダーが前記缶内に置かれ、ドーナツ形状Ａｃｌａｒホイル（２００μｍＡｃｌａｒ埋め込みフィルム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から切り出したＡｃｌａｒ膜の外部直径は３．５ｃｍであり、中心部に直径９ｍｍの穴を持つ）。さらに２つのリングを上部、最終的にディスク形状Ａｃｌａｒホイル（直径３．５ｃｍ）に配置した。前記缶を迅速にかつ慎重に、−９０℃に冷却されたＡＦＳ２へ移動した。前記ＳＤホルダー（密閉ペトリ皿内に置かれた）、前記缶、前記冷却リング及びＡｃｌａｒは、切片化の前に前記ミクロトームと共に冷却された。部分的に折りたたまれたテープの小片が前記Ａｃｌａｒホイル表面に及びペトリ皿蓋に付着させ、持ち上げ及び移動を容易にするためのハンドルとして作用させた。
【００６１】
ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳ
Ｌｅｉｃａ試薬浴（最小高さを±１ｃｍに最小化するために切断）内に、Ｌｅｉｃａフロースルーリング（最小高さを±６ｍｍに最小化するために切断）を設けた。前記フロースルーリングを含む試薬浴は、前記ＡＦＳ２内の−９０℃での缶（Ｌｅｉｃａユニバーサル容器）内の３つの冷却リング（Ｌｅｉｃａ底板）上に設けられた。この温度で、−９０℃の固定化剤を含む乾燥アセトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、アメリカ）３ｍＬを前記フロースルーリングにピペットで入れて、Ａｃｌａｒホイル（直径３．５ｃｍ）でカバーした。アセトンは、前記試料中のリン脂質の保持がメタノールよりも高いことから、ＦＳ（媒体として選択された。使用された固定化剤は、アセトン中の０．１％酢酸ウラニウム、０．１から０．５％グルタルアルデヒド及び０．２から０．５％の四酸化オスミウムであった。切片化に続いて、前記ＳＤホルダー内のグリッドは前記の通り前記ＦＳチャンバへ移動した。予冷却された曲げられた微細先端ピンセット（カバースリップピンセットと類似）を用いて、それぞれのグリッドは注意深く、前記リングの１つのフロースルー区画内の固定化剤の表面に切片を浮遊させた。１つのフロースルーリングは最大１０のグリッドを保持するが、前記の通り、固定化剤と共に３つまでのフロースルーリングが前記ＡＦＳ２に配置され得る。前記アセトンの低表面張力により、前記グリッドは最終的には前記フロースルー区画の底部に溶液中に沈む。前記最後のグリッドを配置すると直ぐに、前記凍結置換プログラムを開始した。望ましい場合、前記固定化剤組成は前記凍結置換の際いつでも変更され得る。これを達成するため、固定化剤の大部分を前記フロースルーリングの中心から除去するが、いくらかの洗浄ステップを続けてもよい。ここで重要なことは前記グリッドを乾燥させないことである。続いて前記新たな固定化剤を前記グリッドと共にフロースルーリングへ添加され得る。前記固定化剤が、−９０℃から−６０℃で、アセトン中０．１％酢酸ウラニウムと０．２％の四酸化オスミウムから、続いてアセトン中０．１％酢酸ウラニウムと０．２％の四酸化オスミウム及び０．２％グルタルアルデヒドと交換する場合に、良好な形態が達成された。温度が０℃に到達して凍結置換プログラムが終了した時点で、前記グリッドを５回以上、乾燥アセトン中の０．２％グルタルアルデヒドで前記の通り洗浄する。続く再水和ステップは、０℃でＡＦＳ２内で実施され、１から２分の７連続ステップ：水中で９５％アセトン中０．２％ＧＡ、９０％アセトン中０．２％ＧＡ、８０％アセトン中０．２％ＧＡ、７０％アセトン中０．２％ＧＡ、５０％アセトン中０．２％ＧＡ、３０％アセトン中０．２％ＧＡ、及び最後に１０％アセトン中０．２％ＧＡ、で行われた。再水和の後前記フロースルーリング内のグリッドは３回水で洗浄された。前記グリッドは、前記フロースルーリングから、微細先端ピンセットを用いて除去し、前記グリッドの背側をやや湿らせた濾紙で乾燥させた。最後に前記グリッドは、パラフィン片上に置かれた水滴上に浮遊させて１分で７回洗浄した。この点で前記グリッドは、免疫ラベル化又は後の使用のための保存の準備が整った。これらの切片はＴｏｋｕｙａｓｕ切片と同様に保存され得る。保存のために、前記グリッドは、氷上の０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液（６０ｍＭＰＥＰＥＳ、２５ｍＭＰＥＰＥＳ、１０ｍＭＥＧＲＡ及び２ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ６．９へ調節）中のメチルセルロース及び２．３Ｍスクロースの１：１混合物の一滴上で短時間インキュベートされた。前記グリッドは次にゆっくりと前記粘性滴から引き上げパラフィンでカバーされた前記切片を含むガラススライド上に前記滴を下向きにして置かれた。前記グリッドを含むガラススライドは、ガラスペトリ皿に入れてパラフィンで密閉し４℃で保存された。
【００６２】
ＶＩＳ２ＦＩＸＨ
０．０５から０．５％の四酸化オスミウム、０．２％酢酸ウラニウム及び０．２％のグルタルアルデヒドを含む固定化剤の２ｍＬが、氷状で０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液中で調製された。８００μｍｌの最終容積を、前記浴の底をカバーする試薬浴（最小高さ１ｃｍに切断）内に配置された。前記試薬浴は、次にＡＦＳ２（−９０℃に設定）へ移動され、Ａｃｌａｒホイル（直径３．５ｃｍ）でカバーされた缶内の３つの冷却リングの上部に配置された。固定化剤は直ぐに凍結された。前記グリッドは前記の通りＡＦＳ２へ移動され、予冷却された微細先端ピンセットで、静かに切片を前記凍結固定化剤表面に上に下向きに置いた。前記グリッドを含む試薬浴は次に、空気から保護するために冷却されたペトリ皿内に移された。その後ＡＦＳ２から取り出されてガラスペトリ皿に（直径９ｃｍ）でカバーされた４０℃のホットプレート上に置かれた。前記ホットプレート上のペトリ皿を静かに回しながら前記固定化剤を溶融させた。約４から５分間で前記固定化剤の表面が液化するとすぐに前記グリッドは浮遊を始めた。前記固定化剤及びグリッドを含むペトリ皿は次に迅速に氷上に移して、光から保護し、さらに１０分間固定化させた。最後に、前記グリッドを固定化剤から除去して１０回１分間水滴上で洗浄され、免疫ラベル化又は保存（前記のような）のために整った。
【００６３】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び統合化レーザー及び電子顕微鏡（ｉＬＥＭ）のための免疫ラベル化
免疫ＴＥＭのために、ＶＩＳ２ＦＩＸ固定化切片での遊離アルデヒド基は、０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液中０．０２Ｍグリシンで、２分間５回洗浄することで失活させた。前記切片は、前記抗体の非特異的結合から、１５分間、０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液中で１％（体積／重量）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むブロック緩衝液でインキュベートすることでブロックし、続いて、ブロック緩衝液で希釈した第１の抗体（マウスモノクローナル抗ＰＤＩ、１：１９９、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダ）で１時間インキュベートした。０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液中０．１％（体積／重量）ＢＳＡで５回洗浄後、切片を、２０分間、ブリッジング抗体ウサギ抗マウスＩｇ（ブロック緩衝液中１：２００、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）でインキュベートした。前記切片を、ＰＨＥＭ緩衝液中０．１％ＢＳＡで２分間で５回洗浄し、続いてタンパク質Ａ金（ブロック緩衝液中で２０分間インキュベート、Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）でラベル化した。０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液で１５分間１０回洗浄後、前記ラベル化は５分間１％グルタルアルデヒドインキュベートで安定化された。前記緩衝液及びグルタルアルデヒドを除去するために、前記切片は、水滴上で１分間１０回洗浄され、水中（ｐＨ７）２％シュウ酸ウラニウムで５分間染色した。その後切片は水上で短時間２回洗浄された。最後に、切片は、氷上で１．８％メチルセルロース内に０．４％酢酸ウラニウム中に埋め込まれた。
【００６４】
ｉＬＥＭのための関連するラベル化も類似の手順で実施された。
第１抗体としてマウスモノクローナル抗ＬＡＭＰ２が使用された（１：１５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、アメリカ）。タンパク質Ａ金インキュベートステップに続いて、前記グリッドを０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液中０．１％ＢＳＡで２分間５回線上し、続いてＡｌｅｘａ４８８蛍光共役ヤギ抗ウサギ抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、アメイカ）で４５分間インキュベートした。前記切片を０．１ＭＰＨＥＭ緩衝液で２分間５回洗浄し、４％ホルムアルデヒド（固定化剤としてグルタルアルデヒドの使用は、前記切片の自動蛍光が増加し得る）で１５分間固定化された。これは続いて、水で１分間１０回洗浄され、２％シュウ酸ウラニウム及び続いて２％酢酸ウラニウムで染色された。前記切片は、前記染色ステップの間に短く水で２回洗浄された。最後に前記切片は洗浄されて、氷上で１．８％メチルセルロース内に埋め込まれた。
【００６５】
画像化
前記切片は、統合化レーザー及び電子顕微鏡（ｉＬＥＭ）；Ｔｅｃｎａｉ  １２  １２０ｋＶ透過電子顕微鏡（ＦＥＩ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）を用いて画像化された。前記ＩＬＥＭは、カスタム設計の、前記試料ステージに直接面する側の１つに設けられるレーザー走査蛍光顕微鏡を持つ。ＴＥＭ操作の際に、蛍光顕微鏡は前記ＴＥＭカラムからやや傾けられてＴＥＭ画像化や操作を妨げない。前記ＴＥＭ画像は、底部に設けられるＴＥＭＣａｍ−Ｆ２１４（Ｔｉｅｔｚビデオ及び画像処理システム、Ｇａｕｔｉｎｇ、ドイツ）ＣＣＤカメラで８０ｋｅＶで記録された。前記レーザー走査顕微鏡は、４００ｎｍ青色光子シングルモードレーザー（Ｏｍｉｃｒｏｎ  Ｌａｓｅｒａｇｅ  Ｌａｓｅｒｐｒｏｄｕｋｔｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｄｇａｕ−Ｄｕｄｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）及びアバランチ光ダイオード（ＡＰＤ）検出装置を備えている。前記ｉＬＥＭの蛍光顕微鏡は、ＬａｂＶｉｅｗ８．０に基づきＡ．Ｖ．Ａｇｒｏｎｓｋａｉａ博士が独自に設計したソフトウェアを用いて操作された。
【００６６】
図３及び４の説明
図３は、ＶＩＳ２ＦＩＸ方法及び免疫金ラベル化ＰＤＩの超構造的側面を示す。
（ａ）は、脂質液滴（ＬＤ）の中性脂質コアが、ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳ固定化後で失われていることを示す。
（ｂ）は、ＶＩＳ２ＦＩＸＨ後に、脂質コアが、液滴内部に存在する密度して観察される。
（ｃ）は、ＶＩＳ２ＦＩＸＦＳでＥＲ残留タンパク質ＰＤＩの免疫金（１５ｎｍ）ラベル化を示す。
（ｄ）はＶＩＳ２ＦＩＸＨ切片上でのＰＤＩの免疫金（１５ｎｍ）ラベル化を示す。
ここで留意すべきは、（ｃ）及び（ｄ）での全細胞質及び核内に保存されたヘテロクロマチンである。
ここで、Ｌｙ：リソソーム；Ｇ：ゴルジ体；Ｍ：ミトコンドリア；Ｍｖ：多胞体を示す。
倍率を示す線は、（ａ）と（ｂ）では３００ｎｍ、及び（ｃ）と（ｄ）では５００ｎｍである。
【００６７】
図４は、ＬＡＭＰ２のためにラベル化されたＶＩＳ２ＦＸＦＳ切片のｉＬＥＭ画像を示す。
（ａ）は、免疫金及び免疫蛍光（オンライン方法参照）でのＬＡＭＰ２のための切片ラベル化の５０μｍ２領域の蛍光画像を示す。
（ｂ）は、（ａ）で示された領域の蛍光シグナルを、前記同じ領域のＴＥＭ画像と重ねたものである。
（ｃ）（ｂ）で示された領域のより高倍率のＴＥＭ画像である。
前記リソソームの過剰ラベル化に留意すること。
倍率を表す線は、（ａ）では１０μｍ、（ｂ）では１μｍ及び（ｃ）では５００ｎｍである。
（参考文献）
［１］  Ｄ．  Ｒｉｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ：  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｃｒｙｏｆｉｘａｔｉｏｎ、  ｆｒｅｅｚｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ”、  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  （２００８）  ｐｐ  １０９−１２３
［２］  Ｍ．Ｋ．  Ｍｏｒｐｈｅｗ、  “Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ、  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ”．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  ３−Ｄ  Ｆｉｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  ＭＣＤ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ、  Ｂｏｕｌｄｅｒ、  Ｃｏｌｏｒａｄｏ
［３］  Ｋ．Ｔ．  Ｔｏｋｕｙａｓｕ、  “Ａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａｃｒｙｏｔｏｍｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ”、  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９７３  Ｍａｙ  １  ；５７（２）：５５１−５６５
【図１】
2014501906.tif 000003
【図２ａ】
2014501906.tif 000004
【図２ｂ】
2014501906.tif 000005
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
2014501906.tif 000008
【図３ｄ】
2014501906.tif 000009
【図４ａ】
2014501906.tif 000010
【図４ｂ】
2014501906.tif 000011
【図４ｃ】
2014501906.tif 000012
【国際調査報告】
2014501906.tif 000013
2014501906.tif 000014