(57)【要約】  クロチルアルコールからのブタジエンの製造を可能にする、ブタジエンの酵素的製造のための方法を記載する。クロチルアルコールからブタジエンへの酵素的変換を可能にする酵素の組合わせ、およびそのような酵素の組合わせを含有する組成物をも記載する。さらに本発明は、クロチルアルコールからブタジエンを製造できるように遺伝子改変された微生物に関する。さらに本発明は、クロトニル−補酵素Ａからクロチルアルコールを酵素的に製造するための方法に関する。得られたクロチルアルコールをさらに本明細書の記載に従ってブタジエンに変換することができる。クロトニル−補酵素Ａをクロチルアルコールに変換できる酵素の組合わせ、およびそのような酵素の組合わせを発現する（微）生物をも記載する。【選択図】  図１３
2014530615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロチルアルコールを、クロチルリン酸またはクロチル二リン酸を経てブタジエンに酵素的に変換することを含む、ブダジエンの製造方法。
【請求項２】
（ｉ）クロチルアルコールをクロチルリン酸に酵素的に変換し；そして
（ｉｉ）クロチルリン酸をブタジエンに酵素的に変換する
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉ）が、クロチルリン酸をブタジエンに直接変換する単一の酵素反応からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
クロチルリン酸からブタジエンへの酵素的変換がテルペンシンターゼの使用により達成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
テルペンシンターゼが
（ａ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｂ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｃ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｄ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｅ）モノテルペンシンターゼ
である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）が、
（ａ）クロチルリン酸をクロチル二リン酸に酵素的に変換し；そして
（ｂ）クロチル二リン酸をブタジエンに酵素的に変換する
ことを含む２つの酵素反応からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
クロチルリン酸からクロチル二リン酸への酵素的変換がイソペンテニルリン酸キナーゼの使用により達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
クロチル二リン酸からブタジエンへの酵素的変換がテルペンシンターゼの使用により達成される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
テルペンシンターゼが
（ａ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｂ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｃ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｄ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｅ）モノテルペンシンターゼ
である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
クロチルアルコールからクロチルリン酸への酵素的変換が、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）またはチアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）の使用により達成される、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｉ）クロチルアルコールをクロチル二リン酸に酵素的に変換し；そして
（ＩＩ）クロチル二リン酸をブタジエンに酵素的に変換する
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
クロチルアルコールからクロチル二リン酸への酵素的変換が、クロチルアルコールをクロチル二リン酸に直接変換する単一の酵素反応からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
クロチルアルコールからクロチル二リン酸への酵素的変換が、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）またはチアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）の使用により達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
クロチル二リン酸からブタジエンへの酵素的変換がテルペンシンターゼの使用により達成される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
テルペンシンターゼが
（ａ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｂ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｃ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｄ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｅ）モノテルペンシンターゼ
である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの酵素的変換によりクロチルアルコールを供給する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの変換が、
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）；および／または
（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）；および／または
（ｉｉｉ）アルデヒドレダクターゼ；および／または
（ｉｖ）アルド−ケトレダクターゼ
の使用により達成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ａ）（ａ）（ｉ）ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）；または
（ｉｉ）チアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）；ならびに
（ｂ）（ｉ）テルペンシンターゼ；または
（ｉｉ）イソペンテニルリン酸キナーゼおよびテルペンシンターゼ；あるいは
Ｂ）（ａ）（ｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）；または
（ｉｉ）チアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）；ならびに
（ｂ）テルペンシンターゼ
を発現し、クロチルアルコールをブタジエンに変換できる、生物または微生物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の生物または微生物および場合によりクロチルアルコールを含む組成物。
【請求項２０】
Ａ）（ａ）（ｉ）ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）；または
（ｉｉ）チアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）；ならびに
（ｂ）（ｉ）テルペンシンターゼ；または
（ｉｉ）イソペンテニルリン酸キナーゼおよびテルペンシンターゼ；あるいは
Ｂ）（ａ）２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）；および
（ｂ）テルペンシンターゼ
を含む組成物。
【請求項２１】
クロチルアルコールをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ブタジエンをクロチルアルコールから製造するための、
Ａ）（ａ）（ｉ）ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）；または
（ｉｉ）チアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）；ならびに
（ｂ）（ｉ）テルペンシンターゼ；または
（ｉｉ）イソペンテニルリン酸キナーゼおよびテルペンシンターゼ；あるいは
Ｂ）（ａ）２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）；および
（ｂ）テルペンシンターゼ
を含む酵素の組合わせの使用。
【請求項２３】
テルペンシンターゼが
（ａ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｂ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｃ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｄ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｅ）モノテルペンシンターゼ
である、請求項１８に記載の生物、請求項２０もしくは２１に記載の組成物、または請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
クロトニル−ＣｏＡからクロトンアルデヒドへの酵素的変換、およびこれに続くクロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの酵素的変換を含む、クロチルアルコールの製造方法。
【請求項２５】
クロトニル−ＣｏＡからクロトンアルデヒドへの酵素的変換が、
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）；および／または
（ｉｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）；および／または
（ｉｉｉ）アシル−ＣｏＡレダクターゼ
の使用により達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの酵素的変換が、
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）；および／または
（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）；および／または
（ｉｉｉ）アルデヒドレダクターゼ；および／または
（ｉｖ）アルド−ケトレダクターゼ
の使用により達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロトニル−ＣｏＡからクロチルアルコールへの酵素的変換が、アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼの使用により、またはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）の使用により、または短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの使用により達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法によるクロトニル−ＣｏＡからクロチルアルコールへの酵素的変換を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロチルアルコールからのブタジエンの製造を可能にする、ブタジエンの酵素的製造のための方法に関する。本発明はまた、ブタジエンを製造できるように遺伝子改変された微生物に関する。
【０００２】
本発明はまた、クロトニル−補酵素Ａからクロチルアルコールを酵素的に製造するための方法に関する。得られたクロチルアルコールをさらに本明細書の記載に従ってブタジエンに変換することができる。本発明はさらに、クロトニル−補酵素Ａをクロチルアルコールに変換できる酵素の組合わせ、およびそのような酵素の組合わせを発現する（微）生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブタジエン（１，３−ブタジエン）は、式Ｃ４Ｈ６をもつ共役ジエンである（図４を参照）。それは、合成ゴムの製造においてモノマーとして用いられる重要な工業用化学物質である。ブタジエンを製造するためには種々の可能性がある。ブタジエンは、たとえばエチレンその他のオレフィン類を製造するために用いられる水蒸気分解プロセスの副産物として生成する。このプロセスでブタジエンはＣ４流中に生成し、普通は極性非プロトン溶媒、たとえばアセトニトリル中への抽出により他の副産物から単離され、次いでアセトニトリルからストリッピングされる。ブタジエンはノルマルブタンの接触脱水素によって製造することもでき、あるいはそれはエタノールから製造できる。後者の場合、２つの異なる方法が用いられている。１工程法では、エタノールを４００〜４５０℃で金属酸化物触媒上においてブタジエン、水素および水に変換する(Kirshenbaum, I. (1978), Butadiene, M. Grayson (Ed.), Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., vol. 4, pp. 313-337. New York: John Wiley & Sons)。２工程法では、エタノールは酸化されてアセトアルデヒドになり、それはタンタル増強型(tantalum-promoted)多孔質シリカ触媒上において３２５〜３５０℃でさらにエタノールと反応してブタジエンを生成する(Kirshenbaum, I. (1978), 前掲)。ブタジエンは、ノルマルブテン類の接触脱水素により製造することもできる。
【０００４】
この２０年間に、遺伝子工学技術は微生物の代謝の改変を可能にし、したがって他の方法では低収率で製造される鍵物質の製造にそれらを使用できるようになった。自然界に存在する代謝経路を増強することにより、これらの技術は工業的に重要な多数の化合物を生物学的に製造するための新たな道を開く。幾つかの工業用化合物、たとえば動物飼料用、生分解性プラスチック用または紡織繊維用のアミノ酸が、現在では遺伝子改変生物を用いて日常的に製造されている。しかし、主要な石油化学系誘導分子、特にブタジエンの製造のために代わりに微生物を用いる生物学的方法はない；たとえ少量であってもブタジエンを自然に産生するものとして知られている微生物はないからである。世界中で大量のゴムが製造され、環境問題が増大し、化学的方法を用いてブタジエンを製造するための資源が限られているので、ブタジエンの製造のための環境に優しくかつ持続可能な代替法を提供することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kirshenbaum, I. (1978), Butadiene, M. Grayson (Ed.), Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., vol. 4, pp. 313-337. New York: John Wiley & Sons
【発明の概要】
【０００６】
本発明はこの要望に対処するものであり、クロチルアルコールから出発してブタジエンを酵素的に製造できる方法をまず提供する。クロチルアルコール自体はクロトニルＣｏＡの酵素的変換により製造でき、クロトニルＣｏＡは本明細書に記載するように代謝中間体アセチル−補酵素Ａ（以下において、アセチル−ＣｏＡ）から出発して供給することができる。
【０００７】
したがって、第１観点において、本発明はブタジエンをクロチルアルコールの酵素的変換により製造する、ブタジエンの製造方法に関する。クロチルアルコール（クロトニルアルコールまたはクロトノールとも呼ばれる）は、式Ｃ４Ｈ８Ｏの不飽和アルコールである（図１を参照）。クロチルアルコールの別名はブタ−２−エン−１−オールである。それはクロトンアルデヒド（図３を参照）の還元により製造できる。
【０００８】
本発明によれば、中間体としてクロチルリン酸および／またはクロチル二リン酸を伴なう酵素反応により、クロチルアルコールをブタジエンに変換することができる。したがって、本発明の基礎となる原理は、クロチルアルコールをまずクロチルリン酸またはクロチル二リン酸への変換によって酵素的に活性化し、次いでさらに以下に記載するように適切な酵素の使用によりブタジエンに変換することである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、クロトニルアルコールの化学構造を示す。
【図２】図２は、クロチルリン酸およびクロチル二リン酸の化学構造を示す。
【図３】図３は、クロトンアルデヒドの化学構造を示す。
【図４】図４は、ブタジエンの化学構造を示す。
【図５】図５は、３４０ｎｍにおける吸光度の低下によりＮＡＤＨ消費をモニターするＡＤＰ定量アッセイのスキームを示す。
【図６】図６は、大腸菌(E. coli)由来のヒドロキシエチルチアゾールキナーゼを用いた酵素的アッセイの質量スペクトルを示す。
【図７】図７は、酵素を用いない対照アッセイの質量スペクトルを示す。
【図８】図８は、ジメチルアリル二リン酸とクロチル二リン酸との比較、ならびにそれぞれのイソプレン（２−メチル−ブタ−１，３−ジエン）およびブタジエンへの変換を示す。
【図９】図９は、クロトニル−補酵素Ａの式を示す。
【図１０−１】図１０は、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(M. jannaschii)由来のイソペンテニル一リン酸キナーゼにより触媒されたｔｒａｎｓクロチル一リン酸のリン酸化反応（ａ）の質量スペクトル、および酵素を用いない対照アッセイ（ｂ）の質量スペクトルを示す。
【図１０−２】図１０は、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(M. jannaschii)由来のイソペンテニル一リン酸キナーゼにより触媒されたｔｒａｎｓクロチル一リン酸のリン酸化反応（ａ）の質量スペクトル、および酵素を用いない対照アッセイ（ｂ）の質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、テルペンシンターゼにより触媒されたｔｒａｎｓクロチル一リン酸からの１，３−ブタジエンの生成を示す。
【図１２−１】図１２は、市販の１，３−ブタジエン（ａ）の質量スペクトル、およびｔｒａｎｓクロチル一リン酸からユーカリノキ(E. globulus)由来のモノテルペンシンターゼにより触媒された酵素反応で製造された１，３−ブタジエン（ｂ）の質量スペクトルを示す。
【図１２−２】図１２は、市販の１，３−ブタジエン（ａ）の質量スペクトル、およびｔｒａｎｓクロチル一リン酸からユーカリノキ(E. globulus)由来のモノテルペンシンターゼにより触媒された酵素反応で製造された１，３−ブタジエン（ｂ）の質量スペクトルを示す。
【図１３】図１３は、テルペンシンターゼにより触媒されたｔｒａｎｓクロチル二リン酸からの１，３−ブタジエンの生成を示す。
【図１４】図１４は、ハヘラ・チェジュエンシス(Hahella chejuensis)由来のレダクターゼおよび変動濃度のＮＡＤＰＨを用いるクロトニル−ＣｏＡ還元アッセイにおける、ＮＡＤＰＨ酸化のタイムコースを示す。
【図１５】図１５は、ハヘラ・チェジュエンシス由来のアシル−ＣｏＡレダクターゼにより触媒されたクロトニル−ＣｏＡ還元反応のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
したがって、本発明は、第１観点において、クロチルアルコールを、クロチルリン酸またはクロチル二リン酸を経てブタジエンに酵素的に変換することを含む、ブダジエンの製造方法に関する。
【００１１】
クロチルアルコールからブタジエンへの酵素的変換は、種々の別経路で行なうことができる。第１観点（Ａ）において、本発明は、クロチルアルコールを、クロチルリン酸を経てブタジエンに酵素的に変換することを含む、ブダジエンの製造方法に関するものであり、その方法は、
（ｉ）クロチルアルコールをクロチルリン酸に酵素的に変換し；そして
（ｉｉ）クロチルリン酸をブタジエンに酵素的に変換する
工程を含む。
【００１２】
この別法を以下において別法（Ａ）と呼び、異なる工程をＡ（ｉ）およびＡ（ｉｉ）と呼ぶ。
【００１３】
工程Ａ（ｉ）に関して、クロチルアルコールからクロチルリン酸への酵素的変換はリン酸化工程であり、分子上へのホスホ基の伝達を触媒する酵素、たとえばキナーゼにより達成できる。たとえば、この反応に使用できる酵素は、Ｅ．Ｃ．  ２．７．１として分類される酵素、すなわちアルコール基をアクセプターとするホスホトランスフェラーゼ、好ましくは２．７．１．５０（ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ）として分類される酵素、またはＥ．Ｃ．  ２．７．１．８９（チアミンキナーゼ）として分類される酵素である。好ましくは、ＡＴＰがそのような反応におけるホスホ基のドナーである。したがって、１態様において、クロチルアルコールからクロチルリン酸への酵素的変換は、たとえばヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）の使用により達成できる。ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼは、下記の反応を触媒する酵素である：
ATP + 4-メチル-5-(2-ヒドロキシエチル)チアゾール  ⇔
ADP + 4-メチル-5-(2-ホスホエチル)チアゾール
この酵素の存在は、幾つかの生物、たとえば大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)、ピロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii）ＯＴ３、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)について記載されている。
【００１４】
他の態様において、クロチルアルコールからクロチルリン酸への酵素的変換は、たとえばチアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）の使用により達成できる。チアミンキナーゼは、下記の反応を触媒する酵素である：
ATP + チアミン  ⇔  ADP + チアミンリン酸
この酵素の存在は、幾つかの生物、たとえば大腸菌およびサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)について記載されている。
【００１５】
ヒドロキシエチルチアゾールはチアミンの一部であり、クロチルアルコールと下記の共通構造モチーフを共有する：ＣＨ−Ｃ−ＣＨ−ＣＨ２−ＯＨ。
【００１６】
したがって、本発明者らは、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼまたはチアミンキナーゼはこのモチーフを含む他の基質に対しても作用できるであろうと考え、実際に、試験した種々のヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ類およびチアミンキナーゼ類がクロチルアルコールを基質として利用して、それをクロチルリン酸に変換できることを見出した。
【００１７】
原則として、既知のヒドロキシエチルチアゾールキナーゼはいずれも本発明による方法に使用できる。本発明の１観点において、細菌由来のヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ、たとえば大腸菌属(Echerichia)、桿菌属(Bacillus)またはリゾビウム属(Rhizobium)に属する細菌、好ましくは大腸菌、枯草菌またはリゾビウム・レグミノサルムに由来するヒドロキシエチルチアゾールキナーゼを使用する。これらの酵素のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を入手できる。対応するアミノ酸配列の例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３に提示する。特に好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３のいずれか１つにおいて表されるアミノ酸配列を示すいずれかのタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３のいずれかに対して少なくとも８０％相同である配列を示し、かつヒドロキシエチルチアゾールキナーゼの活性を有するいずれかのタンパク質を、本発明による方法に使用できる。
【００１８】
さらに、原則として、既知のチアミンキナーゼはいずれも本発明による方法に使用できる。本発明の１観点において、細菌由来のチアミンキナーゼ、たとえば大腸菌属またはサルモネラ属に属する細菌、好ましくは大腸菌またはサルモネラ・エンテリカに由来するチアミンキナーゼを使用する。これらの酵素のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を入手できる。
【００１９】
この方法の１態様において、工程Ａ（ｉｉ）はクロチルリン酸をブタジエンに直接変換する単一の酵素反応からなる。この選択肢を以下において選択肢Ａ（ｉｉ１）と呼ぶ。クロチルリン酸からブタジエンへのこの変換において、ホスホ基がクロチルリン酸から除去されるのと同時にブタジエンが生成する。この反応を触媒できる酵素をクロチルリン酸  リン酸リアーゼ（ブタジエン形成性）と呼ぶ。クロチルリン酸の脱リン酸を触媒してブタジエンにすることができる酵素の例は、テルペンシンターゼファミリーに属するものとして分類できる酵素である。好ましくは、そのような酵素は植物テルペンシンターゼのファミリーに属する。
【００２０】
テルペンシンターゼ類は、多数の天然物：常に炭素および水素から構成されるもの（テルペン類）、時には酸素その他の元素をも含むもの（テルペノイド類）の形成を触媒する酵素類を含めた酵素ファミリーを構成する。テルペノイド類は構造的に多様な広く分布する分子であり、あらゆる生命界から同定されている３０００をはるかに超える決定された天然化合物に相当する。植物において、テルペンシンターゼファミリーのメンバーは、２つの異性体５炭素−前駆物質“構築ブロック”であるイソプレニル二リン酸およびプレニル二リン酸から多様なテルペン分子を合成するのに関与して、５炭素イソプレン、１０炭素モノテルペン、１５炭素セスキテルペンおよび２０炭素ジテルペンを生成する(Chen et al.; The Plant Journal 66 (2011), 212-229)。
【００２１】
テルペンシンターゼが種々の反応サイクルに際してプレニル二リン酸を含有する基質を多様な生成物に変換する能力は、この酵素クラスの最もユニークな特色のひとつである。あらゆるテルペン類の生合成に共通の鍵工程は、対応する二リン酸エステルに対するテルペンシンターゼの反応である。この酵素クラスの一般的機序には、第１工程として、ジホスフェート基の除去、およびカーボネーションによる中間体生成が含まれる。種々のテルペンシンターゼにおいて、そのような中間体がさらに再編成されて、自然界でみられる多数のテルペン骨格を生成する。特に、生成するカチオン中間体は、プロトン喪失により、または求核体、特にテルペノイドアルコール類の形成のための水の付加により、反応が終了するまで一連の環化、ヒドリドシフトまたは他の再編成を受ける(Degenhardt et al., Phytochemistry 70 (2009), 1621-1637)。
【００２２】
種々のテルペンシンターゼはさまざまな構造特徴を共有する。これらには高度に保存されたＣ末端ドメインが含まれ、これはそれらの触媒作用部位、およびこれらの酵素における二価金属イオン（一般に、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）支援による基質結合に必須のアスパルテートリッチＤＤＸＸＤモチーフを含む(Green et al. Journal of biological chemistry, 284, 13, 8661-8669)。原則として、ＥＣ  ４．２．３酵素スーパーファミリーに属するものとして分類できる既知の酵素はいずれも、クロチルリン酸をブタジエンに変換するために使用できる。
【００２３】
よりさらに好ましくは、本発明による方法はイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）、ミルセン／オシメン(mircene/ocimene)シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）、ファルネセン(farnesene)シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）、またはピネン(pinene)シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）を利用する。一般にモノテルペンシンターゼとして分類される酵素も使用できる。
【００２４】
特に好ましい態様において、クロチルリン酸からブタジエンへの脱リン酸は、イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）により達成される。イソプレンシンターゼは、下記の反応を触媒する酵素である：
ジメチルアリル二リン酸  ⇔  イソプレン + ジホスフェート
この酵素は、多数の生物、特に植物および若干の細菌に存在する。この酵素の存在は、例えば下記について記載されている：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、多数のポプラ属(Populus)種、たとえばウラジロハコヤナギ（ギンドロ）(P. alba) (UniProt寄託番号Q50L36, A9Q7C9, D8UY75およびD8UY76)、セイヨウハコヤナギ(P. nigra) (UniProt寄託番号A0PFK2)、グレイポプラ(P. canescence) (UniProt寄託番号Q9AR86; Koeksal et al., J. Mol. Biol. 402 (2010)も参照）、ヤマナラシ(P. tremuloides)、コットンウッド(P. trichocarpa)、シナノクズ(P. lobata)、フユナラ(Quercus petraea)、ヨーロッパナラ(Quercus robur)、ネコヤナギ(Salix discolour)、タイワンクズ(Pueraria montana) (UniProt寄託番号Q6EJ97)、ハッショウマメ(Mucuna pruriens)、ブドウ(Vitis vinifera)、有胚植物類(Embryophyta)、および枯草菌(Bacillus subtilis)。
【００２５】
原則として、既知のイソプレンシンターゼはいずれも本発明による方法に使用できる。好ましい態様において、本発明による方法に用いるイソプレンシンターゼは、ポプラ属の植物、より好ましくはコットンウッド(Populus trichocarpa)またはウラジロハコヤナギ(Populus alba)に由来するイソプレンシンターゼである。他の好ましい態様において、本発明による方法に用いるイソプレンシンターゼは、タイワンクズ(Pueraria montana)、好ましくはクズ（葛）(Pueraria montana var. lobata)に由来するイソプレンシンターゼ（そのような配列の一例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に提示する）、またはブドウ(Vitis vinifera)由来のイソプレンシンターゼである。本発明に関して用いる好ましいイソプレンシンターゼは、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)のイソプレンシンターゼ(Sasaki et al.; FEBS Letters 579 (2005), 2514-2518)、またはウラジロハコヤナギ由来のイソプレンシンターゼに対してきわめて高い配列相同性を示すコットンウッド(Populus trichocarpa)およびヤマナラシ(Populus tremuloides)由来のイソプレンシンターゼである。特に好ましいイソプレンシンターゼは、クズ（葛）(Pueraria montana var. lobata)由来のイソプレンシンターゼである(Sharkey et al.; Plant Physiol. 137 (2005), 700-712)。特に好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において表されるアミノ酸配列を示すタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対して少なくとも８０％相同である配列を示し、かつイソプレンシンターゼの活性を有するタンパク質を、本発明による方法に使用できる。
【００２６】
イソプレンシンターゼの活性は、当技術分野で既知の方法、たとえばSilver and Fall (Plant Physiol (1991) 97, 1588-1591)の記載の方法に従って測定できる。代表的アッセイ法では、密閉バイアル内で、この酵素をジメチルアリル二リン酸と共に必要な補因子、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋およびＫ＋の存在下でインキュベートする。適宜な時点でヘッドスペース内の揮発性化合物を気密シリンジで採集し、イソプレン生成につきガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析する。
【００２７】
クロチル一リン酸およびクロチル二リン酸は構造的にジメチルアリル二リン酸と近縁である。特に、クロチル二リン酸とジメチルアリル二リン酸の相異はメチル基だけである（図８を参照）。したがって本発明者らは、イソプレンシンターゼはクロチル二リン酸またはクロチル一リン酸も基質として利用できると考える。原則として、既知のイソプレンシンターゼはいずれも本発明による方法に使用できる。
【００２８】
他の特に好ましい態様において、クロチルリン酸からブタジエンへの変換に用いられる酵素はミルセン／オシメンシンターゼ類（ＥＣ  ４．２．３．１５）である。ミルセン／オシメンシンターゼ類（ＥＣ  ４．２．３．１５）は、自然状態で下記の反応を触媒する酵素である：
ゲラニル二リン酸  ⇒  (E)-ベータ-オシメン + ジホスフェート
または
ゲラニル二リン酸  ⇒  ミルセン + ジホスフェート
これらの酵素は、多数の生物、特にたとえば下記の植物および動物に存在する：ミヤコグサ(Lotus japanicus)、アオイマメ(Phaseolus lunatus)、アメリカオオモミ(Abies grandis)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) (UniProt寄託番号Q9ZUH4)、キーウィ(Actinidia chinensis)、エゴマ(Perilla fructescens)、ブドウ(Vitis vinifera)、オクトーデス・セクンディラメア(Ochtodes secundiramea)、およびイプス・ピニ(Ips pini) (UniProt寄託番号Q58GE8)。原則として、既知のミルセン／オシメンシンターゼはいずれも本発明による方法に使用できる。好ましい態様において、本発明による方法に用いるミルセン／オシメンシンターゼは、ミヤコグサ(Lotus japanicus)由来のベータ−オシメンシンターゼ(Arimura et al.; Plant Physiol. 135 (2004), 1976-1983；そのような酵素の一例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に提示する）、またはアオイマメ(Phaseolus lunatus)由来のもの(UniProt寄託番号B1P189；そのような酵素の一例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に提示する）である。特に好ましい態様において、ミルセン／オシメンシンターゼはブドウ(Vitis vinifera)由来の（Ｅ）−ベータ−オシメンシンターゼである（そのような酵素の一例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に提示する）。特に好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０もしくは１２のいずれかにおいて表されるアミノ酸配列を示すいずれかのタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０もしくは１２のいずれかに対して少なくとも８０％相同である配列を示し、かつベータ−オシメンシンターゼの活性を有するいずれかのタンパク質を、本発明による方法に使用できる。
【００２９】
オシメン／ミルセンシンターゼの活性は、たとえばArimura et al. (Plant Physiology 135 (2004), 1976-1983の記載に従って測定できる。この活性を測定するための代表的アッセイ法では、二価金属イオン、たとえばＭｇ２＋および／またはＭｎ２＋、および基質、すなわちゲラニル二リン酸を収容したスクリューキャップ付きガラス試験管に、この酵素を入れる。水層にペンタンを乗せて揮発性化合物を捕獲する。インキュベーション後、アッセイ混合物をペンタンで再び抽出し、両ペンタン画分をプールし、濃縮し、ガスクロマトグラフィーにより分析してオシメン／ミルセンの生成を定量する。
【００３０】
ベータ−ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４７）は、自然状態で下記の反応を触媒する：
(2E, 6E)-ファルネシル二リン酸  ⇒  (E)-ベータ-ファルネセン + ジホスフェート
この酵素は、多数の生物、特にたとえば下記の植物および細菌に存在する：クソニンジン（ニガヨモギ）(Artemisia annua) (UniProt寄託番号Q4VM12)、ユズ(Citrus junos) (UniProt寄託番号Q94JS8)、イネ(Oryza sativa) (UniProt寄託番号Q0J7R9)、オウシュウアカマツ(Pinus sylvestris) (UniProt寄託番号D7PCH9)、ジーア・ディプロペレンニス(Zea diploperennis) (UniProt寄託番号C7E5V9)、トウモロコシ(Zea mays) (UniProt寄託番号Q2NM15、C7E5V8およびC7E5V7)、ジーア・ペレンニス(Zea perennis) (UniProt寄託番号C7E5W0)、およびストレプトコッカス・コエリカラー(Streptococcus coelicolor) (Zhao et al., J. Biol. Chem. 284 (2009), 36711-36719)。原則として、既知のベータ−ファルネセンシンターゼはいずれも本発明による方法に使用できる。好ましい態様において、本発明による方法に用いるベータ−ファルネセンシンターゼは、セイヨウハッカ(Mentha piperita)由来のベータ−ファルネセンシンターゼ(Crock et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 12833-12838)である。
【００３１】
ファルネセンシンターゼ活性の測定方法は当技術分野で既知であり、たとえばGreen et al. (Phytochemistry 68 (2007), 176-188)に記載されている。代表的アッセイ法では、５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ（ＢＴＰ）（ｐＨ７．５）、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴを含有するアッセイ用緩衝液にファルネセンシンターゼを添加する。トリチウム化ファルネシル二リン酸および金属イオンを添加する。タンパク質を含有するアッセイ物に０．５ｍｌのペンタンを乗せ、３０℃で１時間、穏やかに振とうしながらインキュベートする。２０ｍＭのＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して酵素活性を停止した後、アリコートのペンタンをシンチレーション分析のために取り出す。オレフィン生成物をＧＣ−ＭＳによっても分析する。
【００３２】
ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）は下記の反応を触媒する酵素である：
ゲラニル二リン酸  ⇒  (E)-アルファ-ピネン + ジホスフェート
この酵素は、多数の生物、特にたとえば下記の植物に存在する：アメリカオオモミ(Abies grandis) (UniProt寄託番号O244475)、クソニンジン（ニガヨモギ）(Artemisia annua)、タイワンベニヒノキ(Chamaecyparis formosensis) (UniProt寄託番号C3RSF5)、サルビア(Salvia officinalis)およびシトカトウヒ(Picea sitchensis) (UniProt寄託番号Q6XDB5)。
【００３３】
アメリカオオモミ(Abies grandis)由来の酵素については、特別な反応(Schwab et al., Arch. Biochem. Biophys. 392 (2001), 123-136)、すなわち下記の反応もみられた：
6,7-ジヒドロゲラニル二リン酸  ⇔  6,7-ジヒドロミルセン + ジホスフェート
原則として、既知のピネンシンターゼはいずれも本発明による方法に使用できる。好ましい態様において、本発明による方法に用いるピネンシンターゼは、アメリカオオモミ由来のピネンシンターゼ(UniProt寄託番号O244475; Schwab et al., Arch. Biochem. Biophys. 392 (2001), 123-136)である。
【００３４】
ピネンシンターゼ活性の測定方法は当技術分野で既知であり、たとえばSchwab et al. (Archives of Biochemistry and Biophysics 392 (2001), 123-136)に記載されている。代表的アッセイ法において、ピネンシンターゼ用の混合物は、１ｍｇの精製タンパク質を含有する２ｍｌのアッセイ用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール、０．０５％のＮａＨＳＯ３、および１０％のグリセロール）からなる。テフロン（登録商標）(Teflon)製密閉スクリューキャップ付きバイアル内で３００ｍＭの基質の添加により反応を開始する。２５℃で不定期間（０．５〜２４時間）インキュベートした後、混合物を１ｍｌのジエチルエーテルで抽出する。この２相混合物を激しく混合し、次いで遠心して相を分離させる。有機抽出液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ＧＣ−ＭＳおよびＭＤＧＣ分析を行なう。
【００３５】
前記のように、本発明による方法にはモノテルペンシンターゼも使用できる。特に好ましいのは下記のものである：ティーツリー(Melaleuca alternifolia)由来のモノテルペンシンターゼ：Shelton et al. (Plant Physiol. Biochem. 42 (2004), 875-882；そのような酵素の一例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に提示する）に記載；またはユーカリノキ(Eucalyptus globulus)由来のモノテルペンシンターゼ(UniProt寄託番号Q0PCI4;そのような酵素の一例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に提示する)。特に好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１もしくは８のいずれかにおいて表されるアミノ酸配列を示すいずれかのタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１もしくは８のいずれかに対して少なくとも８０％相同である配列を示し、かつモノテルペンシンターゼの活性を有するいずれかのタンパク質を、本発明による方法に使用できる。
【００３６】
本発明者らは、異なるタイプのテルペンシンターゼ、たとえば異なる植物性生物に由来するイソプレンシンターゼ、（Ｅ）−ベータ−オシメンシンターゼおよびモノテルペンシンターゼがクロチルリン酸をブタジエンに変換できることを示した（実施例１２および１３ならびに図１１を参照）。
【００３７】
種々のテルペンシンターゼ、特に上記のテルペンシンターゼにより触媒される反応は、ある共通の特色を示す。たとえば、それぞれイソプレンシンターゼにより、ミルセン／オシメンシンターゼにより、ファルネセンシンターゼにより、ピネンシンターゼにより、およびモノテルペンシンターゼにより触媒される反応はすべて、共通の機序により進行すると考えられる；第１工程では、ジホスフェート（ＰＰｉ）の除去によりカーボカチオンが形成され、次いでこれに続いて直接脱プロトンが起きて、これにより対応するジエンが形成される。本発明者らは、テルペンシンターゼのファミリーに属する酵素はクロチルリン酸をブダジエンに変換できることを示すことができた。
【００３８】
本発明による方法の他の態様において、工程Ａ（ｉｉ）は、下記を含む２つの酵素反応からなる：
（ａ）クロチルリン酸からクロチル二リン酸への酵素的変換；および
（ｂ）クロチル二リン酸からブタジエンへの酵素的変換。
【００３９】
この選択肢を以下において選択肢Ａ（ｉｉ２）と呼び、異なる工程をＡ（ｉｉ２ａ）およびＡ（ｉｉ２ｂ）と呼ぶ。
【００４０】
工程Ａ（ｉｉ２ａ）に関して、クロチルリン酸からクロチル二リン酸への酵素的変換は、分子上へのホスホ基の伝達を触媒できる酵素、たとえばキナーゼにより達成される。好ましくは、ＡＴＰがそのような反応におけるホスホ基のドナーである。この変換は、特にたとえばイソペンテニルリン酸キナーゼの使用により達成できる。この酵素はこれまでまだ分類されておらず、したがってＥＣ番号はない。それはアミノ酸キナーゼスーパーファミリー、特にアスパルトキナーゼスーパーファミリーのメンバーであると推定される。酵素イソペンテニルリン酸キナーゼは下記の反応を触媒する：
イソペンテニルリン酸 + ATP  ⇔  イソペンテニル二リン酸 + ADP
この酵素は、古細菌メタノコックス・ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)において発見されたメバロン酸経路の代替枝路(alternative branch)に関与する。それは小分子キナーゼである。メタノコックス・ヤンナスキイのイソペンテニルリン酸キナーゼの一次アミノ酸配列および結晶構造、ならびにオリゴプレニル一リン酸類を基質として利用できる変異体が既に開示されている(Dellas and Noel, ACS Chem. Biol. 5 (2010), 589-601)。活性部位が解明され、結合およびこの反応の触媒作用に必須のアミノ酸残基が同定されている。イソペンテニルリン酸とクロチルリン酸の高い構造類似性のため、そしてメタノコックス・ヤンナスキイのイソペンテニルリン酸キナーゼの変異体は他のオリゴプレニル一リン酸類を基質として利用できることが既に示されているという事実があるので、この酵素またはその変異体はクロチルリン酸をクロチル二リン酸に変換することもできるであろうと予想できる。メタノコックス・ヤンナスキイ由来のイソペンテニルリン酸キナーゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示す。
【００４１】
イソペンテニルリン酸キナーゼをコードする遺伝子は、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス(Methanothermobacter thermautotrophicus)（ＭＴＨ）由来のもの、およびサーモプラスマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)（ＴＨＡ）由来のもの(Chen and Poulter, Biochemistry 49 (2010), 207-217)も知られている。これら両酵素について結晶構造が決定された(Mabanglo et al., ACS Chem. Biol. 5 (2010), 517-527)。タノサーモバクター・サームオートトロフィカス由来のイソペンテニルリン酸キナーゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す。サーモプラスマ・アシドフィルム由来のイソペンテニルリン酸キナーゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す。特に好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６のいずれかにおいて表されるアミノ酸配列を示すいずれかのタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６のいずれかに対して少なくとも８０％相同である配列を示し、かつイソペンテニルリン酸キナーゼの活性を有するいずれかのタンパク質を、本発明による方法に使用できる。
【００４２】
工程Ａ（ｉｉ２ｂ）に関して、クロチル二リン酸からブタジエンへの酵素的変換は、クロチル二リン酸からのジホスフェート基の除去を伴ない、同時にブタジエンを生成する。この反応を触媒できる酵素をクロチル二リン酸  二リン酸リアーゼと呼ぶ（ブタジエン形成性）。クロチル二リン酸の脱リン酸を触媒してブタジエンにすることができる酵素の例は、テルペンシンターゼファミリーに属するものとして分類できる酵素である。好ましくは、そのような酵素は植物テルペンシンターゼのファミリーに属する。これらの酵素は、クロチルリン酸からブタジエンへの変換に関して既に前記に詳細に開示されており、ここに同じものを適用する。
【００４３】
好ましくは、テルペンシンターゼはイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）、ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）、ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）またはピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）である。一般にモノテルペンシンターゼとして分類される酵素も使用できる。特に好ましいテルペンシンターゼは、イソプレンシンターゼ、（Ｅ）−ベータオシメンシンターゼまたはモノテルペンシンターゼである。
【００４４】
特に好ましい態様において、クロチル二リン酸からブタジエンへの脱リン酸は、イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）の使用により達成できる。この方法に用いるイソプレンシンターゼに関して、本明細書中で前記に述べたものと同じものを適用する。特に好ましい態様において、用いるイソプレンシンターゼはクズ（葛）(Pueraria montana var. lobata)由来のイソプレンシンターゼである。前記に説明したように、クロチル二リン酸は構造的にジメチルアリル二リン酸と近縁である。したがって、イソプレンシンターゼはクロチル二リン酸も基質として利用でき、それをブタジエンに変換できると考えられる。
【００４５】
他の特に好ましい態様において、クロチル二リン酸の脱リン酸は、ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）の使用により達成できる。この方法に用いるミルセン／オシメンシンターゼに関して、本明細書中で前記に述べたものと同じものを適用する。特に好ましい態様において、用いるミルセン／オシメンシンターゼはミヤコグサ(L. japonicus)由来またはアオイマメ(P. lunatus)由来の（Ｅ）−ベータオシメンシンターゼである。
【００４６】
他の特に好ましい態様において、クロチル二リン酸からブタジエンへの脱リン酸は、モノテルペンシンターゼの使用により達成できる。この方法に用いるモノテルペンシンターゼに関して、本明細書中で前記に述べたものと同じものを適用する。特に好ましい態様において、用いるイソプレンシンターゼはユーカリノキ(Eucalyptus globulus)由来のモノテルペンシンターゼである。
【００４７】
本発明者らは、異なるタイプのテルペンシンターゼ、たとえば異なる植物性生物に由来するイソプレンシンターゼ、（Ｅ）−ベータ−オシメンシンターゼおよびモノテルペンシンターゼがクロチル二リン酸をブタジエンに変換できることを示した（実施例１４および１５ならびに図１３を参照）。
【００４８】
他の観点（Ｂ）において、本発明による方法は下記の２つの酵素的工程を含む：
（Ｉ）クロチルアルコールをクロチル二リン酸に酵素的に変換し；そして
（ＩＩ）クロチル二リン酸をブタジエンに酵素的に変換する。
【００４９】
この別法を以下において別法Ｂと呼び、異なる工程をＢ（Ｉ）およびＢ（ＩＩ）と呼ぶ。
【００５０】
この態様において、工程Ｂ（Ｉ）によるクロチルアルコールからクロチル二リン酸への酵素的変換は、クロチルアルコールをクロチル二リン酸に直接変換する単一酵素反応からなる。
【００５１】
１工程でのクロチルアルコールからクロチル二リン酸への直接的な酵素的変換は、たとえばジホスフェート基の伝達を触媒できる酵素、たとえばジホスホトランスフェラーゼ、たとえばＥＣ  ２．７．６（ジホスホトランスフェラーゼ類）として分類される酵素の使用により達成できる。例は、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）およびチアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）である。好ましくは、ＡＴＰがそのような反応におけるジホスフェート基のドナーである。
【００５２】
したがって、１態様において、１工程でのクロチルアルコールからクロチル二リン酸への直接的な酵素的変換は、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）の使用により達成できる。この酵素は下記の反応を触媒する：
2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチル-7,8-ジヒドロプテリジン + ATP  ⇔  2-アミノ-7,8-ジヒドロ-4-ヒドロキシ-6-(ジホスホオキシメチル)プテリジン + AMP
この酵素の存在は、幾つかの生物、たとえば大腸菌、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ネズミマラリア原虫(Plasmodium chabaudi)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、ペスト菌(Yersinia pestis)、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)および、エンドウ(Pisum sativum)について記載されている。
【００５３】
原則として、既知の２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼはいずれも本発明による方法に使用できる。
【００５４】
他の態様において、１工程でのクロチルアルコールからクロチル二リン酸への直接的な酵素的変換は、チアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）の使用により達成できる。この酵素は下記の反応を触媒する：
ATP + チアミン  ⇔  AMP + チアミン二リン酸
この酵素の存在は、幾つかの生物、たとえばサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ（分裂酵母）(Schizosaccharomyces pombe)、鵞口瘡カンジダ(Candida albicans)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、線虫(Caenorhabditis elegans)、ドブネズミ(Rattus norvegicus)、ハツカネズミ(Mus musculus)、およびヒト(Homo sapiens)について記載されている。原則として、既知のチアミンジホスホキナーゼはいずれも本発明による方法に使用できる。
【００５５】
工程Ｂ（ＩＩ）において、得られたクロチル二リン酸をさらにブタジエンに酵素的に変換する。このクロチル二リン酸からブタジエンへの酵素的変換はジホスフェート基の除去を伴ない、たとえば前記のテルペンシンターゼの使用により達成できる。好ましい態様に関しては、前記に述べたものと同じものを適用する。
【００５６】
特に好ましい態様において、イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）をクロチル二リン酸からブタジエンへの変換のために用いる。
【００５７】
本発明によるブタジエンの酵素的製造のための基質として用いるクロチルアルコールは外部から供給されるか、あるいはそれ自体をクロトンアルデヒド（ブタ−２−エナール）の還元により供給できる。この還元は、たとえば当業者に既知の化学反応により達成できる。しかし、本発明によれば、クロチルアルコールの供給はクロトニル−補酵素Ａ（以下において、クロトニル−ＣｏＡ；図９を参照）またはクロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの酵素的変換により達成することが好ましい。
【００５８】
したがって、他の態様において、本発明による方法はさらに、後記に述べるようにクロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの酵素的変換によりクロチルアルコールを供給する工程を含む。クロトンアルデヒド（ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨＣＨＯ；（２Ｅ）−ブタ−２−エナール）は自然界で、たとえばダイズ油中に存在し、またアセトアルデヒドのアルドール縮合により化学合成できる。あるいは、本発明による方法はさらに、後記に述べるようにクロトニル−ＣｏＡからクロチルアルコールへの酵素的変換によりクロチルアルコールを供給する工程を含む。クロトニル−補酵素Ａは、クロトン酸と補酵素Ａとのチオエステルである。それは、酪酸の発酵における、またリジンおよびトリプトファンの代謝における中間体である。これらのアミノ酸の分解に際してα−ケトアジペートが生成し、これが酸化的脱カルボキシルによりグルタリル−ＣｏＡに変換される。グルタリル−ＣｏＡは次いでグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによりクロトニル−ＣｏＡに変換され、これをさらに２工程で２分子のアセチル−ＣｏＡに変換することができる。クロトニル−ＣｏＡは、酪酸を産生するある種の純嫌気性細菌、たとえばクロストリジウム−アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)によるグルコース発酵における代謝産物でもある。さらに、クロトニル−ＣｏＡは、アセテートをいわゆるエチル−マロニル−ＣｏＡ経路で同化するある種の微生物において単離されている。それは、二酸化炭素の同化をもたらすある代謝経路、たとえば３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸サイクルまたはジカルボン酸／４−ヒドロキシ酪酸サイクルの中間体としても生成する。
【００５９】
本発明者らは、クロトンアルデヒドまたはクロトニル−ＣｏＡから出発してクロチルアルコールを酵素的に製造するための方法も開発した。
【００６０】
したがって、第２観点において本発明はクロチルアルコールの製造方法に関する。そのような方法は、クロトニル−ＣｏＡをクロトンアルデヒドに酵素的に変換し、続いてクロトンアルデヒドをクロチルアルコールに酵素的に変換することを含む。最初の反応は、下記のスキームに従って行なうことができる：
クロトニル-CoA + NADH + H+  ⇔  クロトンアルデヒド + CoA + NAD+
または
クロトニル-CoA + NADPH + H+  ⇔  クロトンアルデヒド + CoA + NADP+
この反応は還元であり、多様な酵素により触媒できる。１観点において、上記のクロトニル−ＣｏＡからクロトンアルデヒドへの変換のためにヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）を使用できる。この酵素は普通は下記のスキームを触媒する：
(S)-3-ヒドロキシ-メチルグルタリル-CoA + 2NADPH + H+  ⇔  (R)-メバロネート + CoA + 2NADP+
このクラスに属し、上記の変換を触媒する酵素は、全生物界、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献に広く記載されている。そのような酵素のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が多数の生物、特に細菌性生物について決定されている。原則として、いかなるヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）も本発明に関して使用できる。
【００６１】
あるいは、またはさらに、上記のクロトニル−ＣｏＡからクロトンアルデヒドへの変換は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）と呼ばれる酵素の使用によっても達成できる。この酵素は普通は下記の反応を触媒する：
アセチル-CoA + NADH + H+  ⇔  アセトアルデヒド+ CoA + NAD+
このクラスに属し、上記の変換を触媒する酵素は、幾つかのタイプの細菌、たとえば下記のものに存在する：大腸菌、アシネトバクター属(Acinetobacter)種、リゥコノストック・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、シュードモナス属(Pseudomonas)種、クロストリジウム・ベイジェリンキイ(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)、ランブル鞭毛虫(Giardia intestinalis)、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒイ(Propionibacterium freudenreichii)、およびサーモアンアエロバクター・エタノリティカス(Thermoanaerobacter ethanolicus)。原則として、いかなるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）も本発明に関して使用できる。
【００６２】
あるいは、またはさらに、上記のクロトニル−ＣｏＡからクロトンアルデヒドへの変換は、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼと呼ばれる酵素、たとえばａｄｈＥ遺伝子によりコードされるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼの使用によっても達成できる。そのような酵素は、少なくともアルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼ、たとえばアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとの酵素活性を示すという点で２官能性である。そのような酵素の例は、大腸菌のアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ(adhE; UniProtKB/Swiss-Prot寄託番号P0A9Q7; 2011年7月27日; Version 58)である。他の生物、たとえばリゥコノストック・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides) (Koo et al., Biotechnology Letters 27, 505-510)、ポリトメラ属(Polytomella)種、およびクラミドモナス・レインハルティイ(Chlamydomonas reinhardtii) (Atteia et al., Plant Mol. Biol. 53 (2003), 175-188)に由来する対応する酵素も知られている。そのような酵素をコードする遺伝子が、杆菌(bacilli)およびクロストリジウム(clostridia)のカテゴリーに属する幾つかのグラム陽性細菌のゲノム、幾つかのガンマ−プロテオバクテリア(gamma-proteobacteria)、アクチノバクテリア(actinobacteria)、シアノバクテリア(cyanobacteria)、および若干の無ミトコンドリア原生生物(amitochondriate protist) (参照：Atteia et al., 前掲)中に見出された。
【００６３】
あるいは、またはさらに、上記のクロトニル−ＣｏＡからクロトンアルデヒドへの変換は、アシル−ＣｏＡレダクターゼと呼ばれる酵素の使用によっても達成できる。そのような酵素の例は、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．４４）、長鎖脂肪酸−アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．５０）およびマロニル−ＣｏＡレダクターゼ（マロネートセミアルデヒド形成性；ＥＣ  １．２．１．７５）である。
【００６４】
本発明によれば、生成したクロトンアルデヒドをさらにクロチルアルコールに変換する。クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの酵素的変換は、還元／水素化であり、下記のスキームに従って行なうことができる：
クロトンアルデヒド + NADH + H+  ⇔  クロチルアルコール+ NAD+
または
クロトンアルデヒド + NADPH + H+  ⇔  クロチルアルコール+ NADP+
この反応は多様な酵素により触媒できる。１観点において、上記のクロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの変換のために、この反応を触媒できることが知られている酵素を使用できる。一例は、ｓａｋＲ１遺伝子により触媒されるアルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）である。この酵素はサイネココッカス属(Synechococcus)種ＰＣＣ  ７００２において同定され、Dongyi et al. (Microbiol. 152 (2006), 2013-2021)に記載されている。それはＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋を補因子として使う。他の例は、Ａｔ２ｇ３７７７０遺伝子によりコードされるアルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）であり、これはシロイヌナズナ属(Arabidopsis)において同定された(Yamauchii et al. (J. Biol. Chem. 286 (2011) 6999-7009)。それはＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋を補因子として使う。さらに他の例は、土壌細菌シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ＭＢ−１由来の３２１−ＭＢデヒドロゲナーゼ(Malone et al., Appl. Environm. Microbiol. 65 (1999), 2622-2630)であり、それはＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋を補因子として使う。
【００６５】
他の態様において、上記のクロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの変換のためにヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）も使用できる。この酵素は既に前記に述べられており、したがって前記で述べたことがこの反応にも当てはまる。
【００６６】
あるいは、またはさらに、上記のクロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの変換は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）の使用によっても達成できる。そのような酵素は普通は下記の反応を触媒する：
第一級アルコール + NAD +  ⇔  アルデヒド + NADH + H+
このクラスに属し、上記の変換を触媒する酵素は、全生物界、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献に広く記載されている。そのような酵素のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が多数の生物、特に細菌性生物について決定されている。原則として、いかなるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）も本発明に関して使用できる。
【００６７】
さらに、クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの変換は、アシル−ＣｏＡレダクターゼと呼ばれる酵素の使用によっても達成できる。そのような酵素の例は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋；ＥＣ  １．１．１．２）、アリル−アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．５４）、レチノールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１０５）、スルカトン(sulcatone)デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６０）および３−メチルブタナールレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．２６５）である。
【００６８】
クロトニル−ＣｏＡからクロチルアルコールへの酵素的変換は、下記のスキームに従って行なうこともできる：
クロトニル-CoA + 2NADH + 2H+  ⇔  クロチルアルコール + CoA + 2NAD+
または
クロトニル-CoA + 2NADPH + 2H+  ⇔  クロチルアルコール + CoA + 2NADP+
前記の変換と同様に、この反応は中間体としてのクロトンアルデヒドを経て進行する。しかし、本発明のこの態様において、クロトニル−ＣｏＡからクロチルアルコールへの変換は、還元／水素化の両工程を触媒する１種類の酵素により触媒される。この変換に使用できる酵素は、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ、たとえば既に前記に述べたａｄｈＥ遺伝子によりコードされるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼである。
【００６９】
この変換に使用できる他の酵素は、既に前記に述べたヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）である。
【００７０】
さらに他の好ましい態様において、クロトニル−ＣｏＡからクロチルアルコールへの変換は、短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼである。
【００７１】
本発明に関して、用語“短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼ”または“短鎖デヒドロゲナーゼ類／レダクターゼ類（ＳＤＲ）”は、下記の特色を特徴とする酵素を表わす：
１．それらは脂肪酸  アシル−ＣｏＡが還元されて脂肪アルコールになる２工程反応を触媒する；
２．それらは８個から２０個までの脂肪族鎖を含むアシル−ＣｏＡに対して基質特異性を示す。
【００７２】
好ましくは、そのような酵素はさらに、それらの一次構造、すなわちアミノ酸配列中にＮＡＤＰ（Ｈ）結合のための特異的モチーフを示す、すなわちそれらは２つの特異的グリシンモチーフを示すという特色を特徴とする。
【００７３】
短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼまたは短鎖デヒドロゲナーゼ類／レダクターゼ類（ＳＤＲ）の酵素は酵素ファミリーを構成し、それらの大部分はＮＡＤ−またはＮＡＤＰ−依存性オキシドレダクターゼであることが知られている(Jornvall H. et al., Biochemistry 34 (1995), 6003-6013)。最近、マリノバクター・アクエオライ(Marinobacter aquaeolei)ＶＴ８由来の新規な細菌性ＮＡＤＰ−依存性レダクターゼが解明された(Willis et al., Biochemistry 50 (2011), 10550-10558)。この酵素は脂肪酸  アシル−ＣｏＡ基質から対応する脂肪アルコールへの４電子還元を触媒する。
【００７４】
脂肪酸  アシル−ＣｏＡから脂肪アルコールへの酵素的変換は、下記のスキームに従ってアルデヒドを経て行なわれる：
【００７５】
【化１】
2014530615.tif 000003
【００７６】
この酵素は、長さ８個から２０個までの範囲の脂肪酸  アシル−ＣｏＡ基質（飽和および不飽和の両方）および脂肪アルデヒド基質に対して活性を示す。特徴的に、このファミリーのタンパク質は２つのＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）結合モチーフを備え、それらは保存された配列ＧＸＧＸ（１−２Ｘ）Ｇをもつ(Willis et al., Biochemistry 50 (2011), 10550-10558; Jornvall H. et al., Biochemistry 34 (1995), 6003-6013)。第１パターンＧＴＧＦＩＧはＮ末端付近に同定され、第２シグネチャー配列ＧＸＸＸＧＸＧは残基３８４−３９０間に位置する。
【００７７】
原則として、“短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼ”または“短鎖デヒドロゲナーゼ類／レダクターゼ類（ＳＤＲ）”はいずれも本発明による方法に適用できる。
【００７８】
好ましくは、短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼは海洋細菌由来の、好ましくはマリノバクター属(Marinobacter)またはハヘラ属(Hahella)由来の、よりいっそう好ましくはマリノバクター・アクエオライ(Marinobacter aquaeolei)由来の、より好ましくはマリノバクター・アクエオライＶＴ８、マリノバクター・マンガノキシダンス(Marinobacter manganoxydans)、マリノバクター・アルギコラ(Marinobacter algicola)、マリノバクター属種ＥＬＢ１７、またはハヘリー・チェジュエンシス(Hahelly chejuensis)由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼである。そのような酵素の例は、マリノバクター・アクエオライＶＴ８由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼ(Uniprot寄託番号A1U3L3; Willis et al., Biochemistry 50 (2011), 10550-10558)、マリノバクター・マンガノキシダンス由来の短鎖デヒドロゲナーゼ(Uniprot寄託番号G6YQS9)、マリノバクター・アルギコラ由来の短鎖デヒドロゲナーゼ(Uniprot寄託番号A6EUH6)、マリノバクター属種ＥＬＢ１７由来の短鎖デヒドロゲナーゼ(Uniprot寄託番号A3JCC5)、およびハヘラ・チェジュエンシス由来の短鎖デヒドロゲナーゼ(Uniprot寄託番号Q2SCE0)である。
【００７９】
マリノバクター・アクエオライＶＴ８由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示す。マリノバクター・マンガノキシダンス由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示す。マリノバクター属種ＥＬＢ１７由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す。マリノバクター・アルギコラ由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す。ハヘラ・チェジュエンシス由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す。特に好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜１７のいずれか１つにおいて表されるアミノ酸配列を示すいずれかのタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜１７のいずれかに対して少なくとも８０％相同である配列を示し、かつ短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼの活性を有するいずれかのタンパク質を、本発明による方法に使用できる。
【００８０】
前記の本発明の第１観点と第２観点による方法を組み合わせることもできる；すなわち、ブタジエンをクロチルアルコールから製造するための本発明の第１観点による方法は、さらに前記の酵素反応によりクロチルアルコールを供給するための本発明の第２観点による方法の工程を含むことができる。
【００８１】
他の態様において、本発明の第１および／または第２観点による方法は、クロトニル−ＣｏＡを酵素的に供給するさらなる工程を含むこともできる。これは、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａをクロトニル−補酵素Ａに酵素的に変換することにより達成できる。この反応は下記のスキームに従って行なうことができる：
3-ヒドロキシブチリル-補酵素A  ⇔  クロトニル-補酵素A + H2O
この反応はミカエル(Michael)脱離に相当し、たとえば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼと呼ばれるＥＣ  ４．２．１．５５として分類される酵素により触媒できる。この酵素はリアーゼ、詳細にはヒドロ−リアーゼのファミリーに属し、炭素−酸素結合を開裂する。この酵素クラスの系統名は（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡヒドロ−リアーゼ（クロトノイル−ＣｏＡ−形成性）である。一般に用いられる他の名称には、Ｄ−３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａデヒドラターゼ、Ｄ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル補酵素Ａヒドラーゼ（Ｄ）、および（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡヒドロ−リアーゼが含まれる。この酵素は、ブタノエート代謝に関与する。このクラスに属し、前記に示した３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからクロトニル−補酵素Ａへの変換を触媒する酵素は、たとえばラット(Rattus norvegicus)およびロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)に存在すると記載されている。そのような酵素のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が、たとえばアエロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)について決定された。原則として、いかなる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５５）も本発明に関して使用できる。
【００８２】
あるいは、またはさらに、上記の３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからクロトニル−補酵素Ａへの変換は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）と呼ばれる酵素を用いて達成することもできる。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、普通はアシル−ＣｏＡ上の第２と第３炭素間の二重結合を水和する酵素である。しかし、それは逆方向の反応を触媒するためにも使用できる。クロトナーゼとしても知られるこの酵素は、自然界で脂肪酸を代謝してアセチル−ＣｏＡとエネルギーの両方を産生するのに関与する。このクラスに属する酵素は、たとえばラット(Rattus norvegicus)、ヒト、マウス(Mus musculus)、イノシシ(Sus scrofa)、ウシ(Bos taurus)、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)およびクロストリジウム・アミノブチリクム(Clostridium aminobutyricum)に存在すると記載されている。そのような酵素のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が、たとえばラット、ヒトおよび枯草菌(Bacillus subtilits)について決定された。原則として、いかなるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）も本発明に関して使用できる。
【００８３】
他の態様において、上記の３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからクロトニル−補酵素Ａへの変換のためにエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ  ４．２．１．１１９）またはクロトニル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５８）も使用できる。
【００８４】
他の態様において、本発明の第１および／または第２観点による方法は、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを酵素的に供給するさらなる工程も含むことができる。これは、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａに酵素的に変換することにより達成できる。この反応は下記のスキームに従って行なうことができる：
アセトアセチル-CoA + NADH + H+  ⇔  3-ヒドロキシブチリル-補酵素A + NAD+
または
アセトアセチル-CoA + NADPH + H+  ⇔  3-ヒドロキシブチリル-補酵素A + NADP+
この反応は還元であり、たとえばアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼと呼ばれるＥＣ  １．１．１．３６として分類される酵素により触媒できる。このクラスに属し、上記に示すアセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの変換を触媒する酵素は、全生物界、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献に広く記載されている。そのような酵素のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が多数の生物、特に細菌性生物について決定されている。原則として、いかなるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３６）も本発明に関して使用できる。１態様において、本発明によるこの方法に用いる酵素は大腸菌に由来する。
【００８５】
さらに他の態様において、本発明の第１および／または第２観点による方法は、アセトアセチル−ＣｏＡを酵素的に供給するさらなる工程も含むことができる。これは、２分子のアセチル−ＣｏＡを１分子のアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することにより達成できる。アセチル−ＣｏＡはすべての生存生物に存在する代謝中間体であり、代謝において中心的役割を果たす。したがって、本発明によれば、下記の反応に従ってアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的変換できる：
2 アセチル-CoA  ⇔  アセトアセチル-CoA + CoA
この反応は、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ類と呼ばれるＥＣ  ２．３．１．９として分類される酵素により触媒される。このクラスに属し、上記に示す２分子のアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡおよびＣｏＡへの変換を触媒する酵素は、全生物界、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献に広く記載されている。そのような酵素のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が多様な生物、たとえばヒト、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、およびカンジダ属(Candida)について決定されているが、これは若干例を挙げたにすぎない。原則として、いかなるアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）も本発明に関して使用できる。
【００８６】
あるいは、アセトアセチル−ＣｏＡの供給は、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することによっても達成できる。この反応は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼと呼ばれる酵素により触媒される。この酵素をコードする遺伝子は、土壌から分離したグラム陽性放線菌(Streptomyces)種ＣＬ１９０株におけるテルペノイド産生に関するメバロン酸経路遺伝子クラスター中に同定された(Okamura et al., PNAS USA 107 (2010) 11265-11270, 2010)。さらに、この酵素をアセトアセチル−ＣｏＡ製造に用いる生合成経路が大腸菌において最近開発された(Matsumoto K et al., Biosci. Biotechnol. Biochem, 75 (2), 364-366, 2011, 援用する)。
【００８７】
本発明による方法は、インビトロまたはインビボで実施できる。インビトロ反応は細胞を用いない反応、すなわち無細胞反応であると理解される。したがって、インビトロは好ましくは無細胞系を意味する。用語“インビトロ”は、１態様において、単離した酵素（または要求される可能性がある補因子を場合により含む酵素系）の存在下を意味する。１態様において、本発明方法に用いる酵素は精製された形態で用いられる。
【００８８】
本発明方法をインビトロで実施するためには、反応の基質および酵素を、それらの酵素が活性であって酵素的変換が起きるのを可能にする条件（緩衝液、温度、補助基質、補因子など）下でインキュベートする。ブタジエンの生成に十分な時間、反応を進行させる。ブタジエンの生成は当技術分野で既知の方法、たとえばおそらく質量分析検出に連携させたガスクロマトグラフィーにより測定できる。
【００８９】
酵素は酵素反応が起きるのに適したいずれかの形態であってよい。それらは精製または部分精製されていてもよく、あるいは粗製の細胞抽出物または部分精製した抽出物の形態であってもよい。酵素を適切なキャリヤーに固定化することもできる。
【００９０】
本発明による方法の１態様において、そのようなインビトロ法に用いる基質はクロチルアルコールであり、それを前記酵素の使用によりブタジエンに変換する。他の態様において、そのようなインビトロ法に用いる基質はクロトンアルデヒドであり、それを前記に従ってまずクロチルアルコールに変換し、それを次いで前記に従ってブタジエンに変換する。
【００９１】
本発明によるインビトロ法はワンポット反応で実施できる；すなわち、基質を１つの反応混合物中でブタジエンへの変換に必要な前記の酵素類と組み合わせ、ブタジエンが生成するのに十分な時間、反応を進行させる。あるいは、本発明方法は１以上の酵素工程を連続的に行なわせることによっても実施できる；すなわち、まず基質と１種類以上の酵素を混合し、中間体にまで反応を進行させ、次いで１種類以上のさらに他の酵素を添加してこの中間体をさらに中間体に、またはブタジエンに変換することによる。
【００９２】
本発明によるインビトロ法はさらに、反応から発生する気体生成物、特にブタジエンを採集する工程、すなわちたとえば培養物から気体として発生する生成物を回収する工程を含むことができる。したがって、１態様において、この方法は気体状のブタジエンを反応中に採集するためのシステムの存在下で実施される。
【００９３】
実際にブタジエンは室温および大気圧で気体状態をとる。したがって、本発明による方法は反応混合物からの生成物の抽出を必要としない；これは工業的規模で実施する場合は常に著しい経費がかかる工程である。ブタジエンの排出および貯蔵、ならびにそれに続いて行なわれる可能性のある他の気体物質からの物理的分離およびそれの化学的変換は、当業者に既知であるいずれかの方法に従って実施できる。たとえば、低温でＣＯ２を凝縮させることによりブタジエンをＣＯ２から分離できる。ＣＯ２は、極性溶媒、たとえばエタノールアミンにより分離することもできる。さらに、それは疎水性膜に吸着させることにより単離できる。
【００９４】
他の態様において、本発明による方法は、少なくとも、第１観点による本発明方法に従って前記の別経路ＡまたはＢのうちの１つを用いてクロチルアルコールまたはクロトンアルデヒドのいずれかから出発してブタジエンを製造するのに必要な前記の酵素を産生する生物、好ましくは微生物の存在下での培養で行なわれる。したがって、本発明のそのような態様において、別法ＡまたはＢの記載に際して前記に特定した酵素を産生する生物、好ましくは微生物を使用する。必要な酵素のうち１種類以上を自然に産生する（微）生物を用いて、そのような（微）生物をそれが自然には発現しない酵素をも発現するように遺伝子改変することができる。好ましくは、クロチルアルコールを生成できるように本発明の第２観点に関して前記に述べた遺伝子改変された（微）生物を使用する。
【００９５】
別法Ａ１において、たとえば酵素ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼをコードする遺伝子、およびテルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼをコードする遺伝子をもつ枯草菌を使用できる。そのような細菌を、クロチルアルコールを生成できるように前記に従ってさらに遺伝子改変することができる。
【００９６】
別法Ｂにおいて、たとえば大腸菌またはサッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)（両方とも２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼをコードする遺伝子をもつ）を使用し、そのような微生物にたとえば枯草菌由来のテルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼをコードする遺伝子を導入することができる。同様に、別法Ｂにおいて、微生物として枯草菌を使用し、たとえば大腸菌またはサッカロミセス・セレビシエ由来の２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼをコードする遺伝子でそれを遺伝子改変することができる。この場合も、そのような微生物を、クロチルアルコールを生成できるように前記に従ってさらに遺伝子改変することができる。
【００９７】
必要な酵素活性のひとつを自然に発現する（微）生物を使用する場合、そのような（微）生物をこの活性がその（微）生物において過剰発現するように改変することができる。これは、たとえば対応する遺伝子のプロモーター領域にその遺伝子のより高い発現をもたらすように変異を生じさせることにより達成できる。あるいは、より高い活性を示す酵素になるように遺伝子を変異させることもできる。
【００９８】
前記の別法ＡまたはＢに従って必要な酵素を発現する（微）生物を使用することにより、それらの酵素を分離または精製する必要なしに本発明による方法を培地中で直接実施することができる。
【００９９】
１態様において、クロチルアルコールを内因性産生しかつ別法ＡまたはＢに関して前記に述べた酵素類を発現または過剰発現する自然または人工的な特性をもつ（微）生物を使用し、これにより溶液中に存在する炭素源からブタジエンを直接製造する。他の態様において、使用する（微）生物はクロトンアルデヒドを内因性産生してそれをクロチルアルコールに変換する自然または人工的な特性をもち、それをさらにブタジエンに変換することができる。
【０１００】
１態様において、本発明による方法に使用する生物は、別法ＡまたはＢに関して前記に述べた酵素のうち１種類以上をコードする１以上の外来核酸分子を含むように遺伝子改変された生物、好ましくは微生物である。これに関して用語“外来”は、その核酸分子が自然界ではその生物／微生物中に存在しないことを意味する。これは、それがその生物／微生物中に、同じ構造で、または同じ位置には存在しないことを意味する。好ましい１態様において、外来核酸分子は、プロモーターおよび各酵素をコードするコード配列を含む組換え分子であり、その際、コード配列の発現を駆動するプロモーターはそのコード配列に対してヘテロロガスである。これに関してヘテロロガスは、そのプロモーターがそのコード配列の発現を自然状態で駆動するプロモーターではなく、自然状態では異なるコード配列の発現を駆動するプロモーターであること、すなわちそれは他の遺伝子に由来するか、あるいは合成プロモーターまたはキメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、プロモーターはその生物／微生物に対してヘテロロガスなプロモーター、すなわち自然界ではそのそれぞれの生物／微生物中に存在しないプロモーターである。よりさらに好ましくは、プロモーターは誘導性プロモーターである。異なるタイプの生物、特に微生物において発現を駆動するためのプロモーターは、当業者に周知である。
【０１０１】
さらに他の態様において、核酸分子は、コードされる酵素がその生物／微生物にとって内因性ではない、すなわちその生物／微生物が遺伝子改変されていない場合は自然状態では発現しないという点で、その生物／微生物にとって外来である。言い換えると、コードされる酵素はその生物／微生物に対してヘテロロガスである。外来核酸分子はその生物／微生物中に染色体外形態で、たとえばプラスミドとして、または染色体に安定に組み込まれて存在することができる。安定な組込みが好ましい。したがって、遺伝子改変はたとえば、酵素（単数または複数）をコードする対応する遺伝子（単数または複数）を染色体中へ組み込むか、あるいは酵素コード配列の上流にプロモーターを含むプラスミドから酵素（単数または複数）を発現させる（そのプロモーターとコード配列は、好ましくは異なる生物に由来する）か、あるいは当業者に既知である他のいずれかの方法で構成できる。
【０１０２】
好ましい態様において、本発明の（微）生物はまた、前記のようにクロチルアルコールを生成できるように遺伝子改変される。
【０１０３】
本発明に使用する生物は、原核生物または真核生物であってよく、好ましくはそれらは微生物、たとえば細菌、酵母、真菌もしくは糸状菌、または植物細胞、または動物細胞である。特定の態様において、微生物は、好ましくは大腸菌属(Escherichia)または杆菌属(Bacillus)の細菌、よりさらに好ましくはそれらの種である大腸菌または枯草菌である。
【０１０４】
他の態様において、微生物は、クロチルアルコールを内因性産生してそれをブタジエンに変換するように遺伝子改変された大腸菌属または杆菌属の組換え細菌、好ましくはそれらの種である大腸菌または枯草菌である。
【０１０５】
好極限性細菌(extremophilic bacterium)、たとえばサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、またはクロストリジウム科(Clostridiae)の嫌気性細菌も使用できる。
【０１０６】
１態様において、微生物は真菌、より好ましくは酵母菌属(Saccharomyces)、分裂酵母属(Schizosaccharomyces)、コウジカビ属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ピチア属(Pichia)、またはクルイベロミセス属(Kluyveromyces)の真菌、よりさらに好ましくはそれらの種であるサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、黒色こうじ菌(Aspergillus niger)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、もしくはその種であるクルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)である。特に好ましい態様において、微生物は、別法ＡまたはＢに関して前記に述べた酵素の発現によりクロチルアルコールを生成してそれをブタジエンに変換できる組換え酵母である。
【０１０７】
他の態様において、本発明による方法は、少なくとも別法ＡまたはＢに関して前記に述べた酵素を発現する光合成微生物を利用する。好ましくは、微生物は光合成細菌、または微細藻類である。さらに他の態様において、微生物は藻類、より好ましくは珪藻(diatomeae)に属する藻類である。
【０１０８】
よりさらに好ましくは、そのような微生物はクロチルアルコールを内因性産生する自然または人工的な特性をもつ。この場合、微生物は溶液中に存在するＣＯ２から直接にブタジエンを生成できるであろう。
【０１０９】
他の態様において、いわゆるウッド−リュングデール(Wood-Ljungdahl)経路によりＣＯ（またはＣＯ２＋Ｈ２）を変換してアセチル−ＣｏＡを生成できる酢酸生成細菌(acetogenic bacteria)のグループに属する微生物を使用できる(Koepke et al.; PNAS 10 (2010), 13087-13092)。そのような微生物を使用する発酵法は合成ガス発酵として知られている。絶対的好中温嫌気性菌、たとえばＣ．リュングデール(C. ljungdahlii)、Ｃ．アセチクム(C. aceticum)、アセトバクテリウム・ウッディイ(Acetobacterium woodii)、Ｃ．オートエタノゲナム(C. autoethanogenum)、およびＣ．カルボキシデビロン(C. carboxydeviron)が合成ガス発酵にしばしば用いられている(Munasingheet et al.; Bioresource Technology 101 (2010), 5013-5022)。
【０１１０】
本発明による方法に（微）生物の組合わせを使用することも考えられ、その際、異なる（微）生物は前記の異なる酵素を発現する。さらに他の態様において、微生物のうち少なくとも１種類はクロチルアルコールを生成でき、あるいは別態様においては、クロチルアルコールを生成できるさらに他の微生物をこの方法に使用する。
【０１１１】
他の態様において、本発明による方法は、少なくとも別法ＡまたはＢに関して前記に述べた酵素を発現する多細胞生物を利用する。そのような生物の例は植物または動物である。
【０１１２】
特定の態様において、本発明による方法は微生物を標準的な培養条件（３０〜３７℃、１気圧、細菌の好気性増殖が可能な発酵槽内で）、または非標準的な条件（たとえば、好熱生物の培養条件に対応する、より高い温度）で培養することを伴なう。
【０１１３】
さらに他の態様において、本発明の方法は微好気性(microaerophilic)条件下で実施される。これは、ブタジエンを含有する気体状排出物中の残留酸素濃度を最小限に抑えるように、注入する空気の量を制限していることを意味する。
【０１１４】
他の態様において、本発明による方法はさらに、反応から発生する気体状のブタジエンを採集する工程を含む。したがって、好ましい態様において、この方法は気体状のブタジエンを反応中に採集するためのシステムの存在下で実施される。
【０１１５】
実際にブタジエンは室温および大気圧で気体状態をとる。したがって、本発明による方法は液体培地からのブタジエンの抽出を必要としない；これは工業的規模で実施する場合は常に著しい経費がかかる工程である。ブタジエンの排出および貯蔵、ならびにそれに続いて行なわれる可能性のある物理的分離および化学的変換は、当業者に既知である前記のいずれかの方法に従って実施できる。
【０１１６】
特定の態様において、本発明方法は気相中に存在するブタジエンの検出をも含む。空気または他の気体環境中のブタジエンの存在は、たとえ少量であっても、多様な手法の使用により、特に赤外もしくは水素炎イオン化検出を備えたガスクロマトグラフィーシステムの使用により、または質量分析法との連携により検出できる。
【０１１７】
本発明による方法をインビボで、それぞれの酵素活性を備えた生物／微生物の使用により実施する場合、生物、好ましくは微生物を、酵素反応が起きうる適切な培養条件下で培養する。個々の培養条件は使用する個々の生物／微生物に依存するが、当業者に周知である。培養条件は一般に、各反応に対する酵素をコードする遺伝子の発現を可能にするように選択される。培養の特定の段階での特定の遺伝子の発現を改善および微調整するための多様な方法、たとえば化学的誘発因子によるかまたは温度シフトによる遺伝子発現の誘導が当業者に知られている。
【０１１８】
他の態様において、本発明による方法に使用する生物は植物である。原則として、いずれかの可能な植物、すなわち単子葉植物または双子葉植物を使用できる。農業として有意義な規模で栽培できかつ大量のバイオマスを産生できる植物を使用することが好ましい。例は、草類、たとえばドクムギ属(Lolium)、穀類、たとえばライムギ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、キビ、トウモロコシ、他のデンプン貯蔵植物、たとえばバレイショ、または糖貯蔵植物、たとえばサトウキビもしくはサトウダイコンである。タバコ、または野菜植物、たとえばトマト、コショウ、キュウリ、ナスなどの使用も考えられる。他の可能性は、油貯蔵植物、たとえばナタネ、オリーブなどの使用である。樹木、特に成長の速い樹木、たとえばユーカリ、ポプラ、またはゴムの木(Hevea brasiliensis)の使用も考えられる。特に好ましいのは、クロトンアルデヒドを自然に産生する植物、たとえばダイズの使用である。そのような植物を、好ましくはクロトンアルデヒドをクロチルアルコールに変換できるようにさらに改変する。
【０１１９】
他の態様において、本発明による方法は、炭素源、たとえばグルコースをクロチルアルコールに変換し（好ましくは、クロトニル−ＣｏＡおよびクロトンアルデヒドを経て）、続いてクロチルアルコールをブタジエンに変換することを特徴とする。
【０１２０】
他の態様において、本発明による方法は、大気中のＣＯ２または人為的に培地に添加したＣＯ２からブタジエンを製造することを含む。この場合、この方法は光合成を行なうことができる生物、たとえば微細藻類において実施される。
【０１２１】
前記のように、本発明による方法には、別法ＡまたはＢに関して前記に述べた酵素のうち少なくとも１つをコードする核酸分子を含むように遺伝子改変した（微）生物を使用できる。前記の酵素をコードするそのような核酸分子を、単独で、またはベクターの一部として使用できる。それらの核酸分子はさらに、その核酸分子に含まれるポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結した発現制御配列を含むことができる。本明細書全体で用いる用語“作動可能な状態で連結した(operatively linkedまたはoperably linked)”は、１以上の発現制御配列と発現させるポリヌクレオチドのコード領域との間における、発現制御配列と適合する条件下で発現が達成されるような連結を表わす。
【０１２２】
発現は、ヘテロロガスＤＮＡ配列が好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡに転写されることを含む。真菌および細菌における発現を確実にする調節エレメントが当業者に周知である。それらには、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル、ターゲティングシグナルなどが含まれる。ベクターに関する説明と関連して後記にさらに例を挙げる。
【０１２３】
核酸分子に関連して用いるためのプロモーターは、それの起源に関して、および／または発現させる遺伝子に関して、ホモロガスまたはヘテロロガスであってよい。適切なプロモーターは、たとえばそれ自身を構成性発現するプロモーターである。しかし、外的影響により決定される時点でのみ活性化されるプロモーターも使用できる。人為的および／または化学的に誘導可能なプロモーターもこれに関して使用できる。
【０１２４】
ベクターはさらに、それらのベクターに含まれるポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結した発現制御配列を含むことができる。これらの発現制御配列は、細菌または真菌において翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にするのに適したものであってよい。
【０１２５】
さらに、分子生物学において通常行なわれる方法により、ポリヌクレオチドに種々の変異を挿入して(たとえば下記を参照：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)、おそらく改変された生物学的特性をもつポリペプチドを合成することができる。この点変異の導入は、たとえば、アミノ酸配列の修飾がポリペプチドの生物活性または調節に影響を及ぼす位置において考えられる。
【０１２６】
さらに、改変された基質特異性または生成物特異性を備えた変異体を作製できる。好ましくは、そのような変異体は増大した活性を示す。さらに、前記に定めた酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することにより、遺伝子発現速度および／またはそれらのポリヌクレオチドがコードする酵素の活性を最適化できる。
【０１２７】
細菌または真菌を遺伝子改変するために、前記に定めた酵素またはこれらの分子の一部をコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡ配列の組換えによる変異形成または配列修飾が可能なプラスミドに導入することができる。標準法(参照：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)により、塩基交換を行なうか、あるいは天然配列または合成配列を付加することができる。ＤＮＡフラグメントにアダプターおよびリンカーを付与することにより、それらのフラグメントを互いに結合させることができる。さらに、適切な制限部位を供給し、あるいは余分なＤＮＡまたは制限部位を除去する、工学的手段を使用できる。挿入、欠失または置換が可能な場合、インビトロ変異形成、“プライマー修復”、制限処理またはライゲーションを使用できる。一般に、配列分析、制限分析、ならびに他の生化学的および分子生物学的方法を分析法として実施する。
【０１２８】
（微）生物に導入したポリヌクレオチドを発現させて、これにより前記活性のいずれかをもつポリペプチドを産生させる。種々の発現系についての総説は、たとえば下記に含まれる：Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)およびSawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffithset al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)。酵母発現系についての総説は、たとえば下記に示されている：Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279), Bussineau et al. (Developments in Biological  Standardization 83 (1994), 13-19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745)およびBuckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)。
【０１２９】
発現ベクターは文献に広く記載されている。原則として、それらは選択マーカー遺伝子、および選択した宿主における複製を確実にするための複製起点だけでなく、細菌性またはウイルス性プロモーター、および大部分の場合、転写の終止シグナルをも含む。プロモーターと終止シグナルの間に、コードＤＮＡ配列の挿入を可能にする制限部位またはポリリンカーが一般に少なくとも１つある。対応する遺伝子の転写を自然状態で制御するＤＮＡ配列が選択された宿主生物において活性であれば、それをプロモーター配列として使用できる。しかし、この配列を他のプロモーター配列に交換することもできる。その遺伝子の構成性発現を確実にするプロモーター、およびその遺伝子の発現を計画的に制御できる誘導性プロモーターを使用できる。これらの特性を備えた細菌性またはウイルス性プロモーター配列が文献に詳細に記載されている。微生物（たとえば、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）における発現のための調節配列は文献に十分に記載されている。下流配列の特別に高い発現を可能にするプロモーターは、たとえばＴ７プロモーター(Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89)、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５(DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25)、ｌｐ１、ｒａｃ(Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100)である。好ましくは、誘導性プロモーターがポリペプチドの合成のために用いられる。これらのプロモーターは、しばしば構成性プロモーターの場合より高いポリペプチド収率をもたらす。最適量のポリペプチドを得るために、２段階法がしばしば用いられる。第１に、宿主細胞を比較的高い細胞密度まで最適条件下で培養する。第２工程で、使用するプロモーターのタイプに応じて転写を誘導する。これに関して、ｔａｃプロモーターが特に適切であり、これはラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘導できる(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25)。転写の終止シグナルも文献に記載されている。
【０１３０】
本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターを用いた宿主細胞の形質転換は、たとえば下記に記載された標準法により実施できる：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990。宿主細胞を、特にｐＨ値、温度、塩類濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素などに関して、用いる特定の宿主細胞の要求に適合する栄養培地で培養する。
【０１３１】
本発明はまた、前記の本発明方法の別法ＡまたはＢに従って（第１観点に従って）クロチルアルコールからブタジエンへの変換に必要な酵素を発現できかつクロチルアルコールをブタジエンに変換できる生物、好ましくは微生物に関する。
【０１３２】
したがって、本発明はまた、
Ａ）（ａ）（ｉ）ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）；または
（ｉｉ）チアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）；ならびに
（ｂ）（ｉ）テルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｉｉ）イソペンテニルリン酸キナーゼ、およびテルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；あるいは
Ｂ）（ａ）（ｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）；または
（ｉｉ）チアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）；ならびに
（ｂ）テルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）
を発現し、クロチルアルコールをブタジエンに変換できる（微）生物に関する。好ましい態様に関しては、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１３３】
特に、（微）生物により発現させるテルペンシンターゼおよび好ましい態様のテルペンシンターゼに関しては、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１３４】
したがって、好ましい１態様において、テルペンシンターゼは下記のものである：
（ａ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｂ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｃ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｄ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｅ）モノテルペンシンターゼ。
【０１３５】
本発明はまた、本発明の第２観点に関連して記載したようにクロトニル−ＣｏＡをクロトンアルデヒドおよび／またはクロチルアルコールに変換するのに必要な酵素を発現する生物、好ましくは微生物に関する。したがって、本発明はまた、下記のものを発現する（微）生物に関する：
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）；および／または
（ｉｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）；および／または
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）；および／または
（ｉｖ）アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ；および／または
（ｖ）アシル−ＣｏＡレダクターゼ；および／または
（ｖｉ）アルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）；および／または
（ｖｉｉ）アルデヒドレダクターゼ；および／または
（ｖｉｉｉ）短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼ
（ｉｘ）クロトニル−ＣｏＡをクロトンアルデヒドおよび／またはクロチルアルコールに変換できるもの。
【０１３６】
本発明はまた、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換に必要な酵素をさらに発現できる生物、好ましくは微生物に関する。したがって、本発明はまた、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５５）および／またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）および／またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ  ４．２．１．１１９）および／またはクロトニル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５８）を発現し、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトニル−ＣｏＡに変換できる（微）生物に関する。
【０１３７】
本発明はまた、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換に必要な酵素をさらに発現できる生物、好ましくは微生物に関する。したがって、本発明はまた、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３６）をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換できる（微）生物に関する。
【０１３８】
最後に本発明はまた、アセトアセチル−ＣｏＡの生成に必要な酵素をさらに発現できる生物、好ましくは微生物に関する。この生成は、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換することにより、またはアセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換することにより達成できる。したがって、本発明はまた、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）をさらに発現し、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換できる（微）生物、および／またはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼをさらに発現し、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換できる（微）生物に関する。
【０１３９】
１態様において、本発明による生物は、前記に述べた酵素のうち少なくとも１種類をコードする少なくとも１つの核酸分子の導入により遺伝子改変されているという意味で、組換え生物である。好ましくは、そのような核酸分子はその生物に関してヘテロロガスである；これは、それが自然界ではその生物中に存在しないことを意味する。
【０１４０】
微生物は、好ましくは細菌、酵母または真菌である。他の好ましい態様において、生物は植物、またはヒト以外の動物である。他の好ましい態様に関しては、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１４１】
クロトニル−ＣｏＡを供給できる生物、好ましくは微生物を用いる本発明による態様において、そのような（微）生物は有利にはクロトニル−ＣｏＡが他の経路へそれるのを避けるようにさらに遺伝子改変されている。たとえば、クロトニル−ＣｏＡはさまざまな酵素により還元されてブチリル−ＣｏＡになる可能性があることが知られている。これらの酵素は一般にＥＣ分類ＥＣ  １．３．１に属し、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋；ＥＣ  １．３．１．８）、エノイル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＨ；ＥＣ  １．３．１．９）、エノイル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ；ＥＣ  １．３．１．１０）、ｃｉｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ；ＥＣ  １．３．１．３７）およびｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ；ＥＣ  １．３．１．３８）を含む。したがって、１態様において、クロトニル−ＣｏＡを還元してブチリル−ＣｏＡにし、こうしてクロトニル−ＣｏＡを他の経路へそらす可能性がある酵素の活性を低下させるように、生物を遺伝子改変する。そのような活性低下は当業者に既知の方法により達成でき、たとえばアンチセンス法、ｓｉＲＮＡ法などにより、各酵素（単数または複数）をコードする各遺伝子（単数または複数）の発現を低下させることを含む。その各酵素の活性がその生物の生存に必要ではない場合、たとえばその遺伝子を破壊することにより、またはその遺伝子を完全に欠失させることにより、それを完全にノックアウトすることもできる。
【０１４２】
本発明は下記のものを含む組成物に関する：
Ａ）（ａ）（ｉ）ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）；または
（ｉｉ）チアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）；ならびに
（ｂ）（ｉ）テルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｉｉ）イソペンテニルリン酸キナーゼ、およびテルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；あるいは
Ｂ）（ａ）（ｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）；または
（ｉｉ）チアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）；ならびに
（ｂ）テルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）。
【０１４３】
そのような組成物はクロチルアルコールを含んでもよい。好ましい態様に関して、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１４４】
特に（微）生物により発現させるテルペンシンターゼおよび好ましい態様のテルペンシンターゼ類に関しては、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１４５】
したがって、好ましい１態様において、テルペンシンターゼは下記のものである：
（ｆ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｇ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｈ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｉ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｊ）モノテルペンシンターゼ。
【０１４６】
本発明はまた、下記のものを含む組成物に関する：
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）；および／または
（ｉｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）；および／または
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）；および／または
（ｉｖ）アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ；および／または
（ｖ）アシル−ＣｏＡレダクターゼ；および／または
（ｖｉ）アルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）；および／または
（ｖｉｉ）アルデヒドレダクターゼ；および／または
（ｖｉｉｉ）短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼ。
【０１４７】
さらに、本発明はまた、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５５）および／またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）および／またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ  ４．２．１．１１９）および／またはクロトニル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５８）をさらに含む組成物に関する。本発明はまた、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３６）をも含む組成物に関する。最後に、本発明はまた、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）またはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼをも含む組成物に関する。
【０１４８】
本発明はまた、ブタジエンをクロチルアルコールから製造するための、下記のものを含む酵素の組合わせの使用に関する：
Ａ）（ａ）（ｉ）ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．５０）；または
（ｉｉ）チアミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．８９）；ならびに
（ｂ）（ｉ）テルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｉｉ）イソペンテニルリン酸キナーゼおよびテルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；あるいは
Ｂ）（ａ）（ｉ）２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）；または
（ｉｉ）チアミンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．２）；ならびに
（ｂ）テルペンシンターゼ、たとえばイソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）。
好ましい態様に関して、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１４９】
特に（微）生物により発現させるテルペンシンターゼおよび好ましい態様のテルペンシンターゼ類に関しては、本発明による方法に関連して前記に述べたものと同じものを適用する。
【０１５０】
したがって、好ましい１態様において、テルペンシンターゼは下記のものである：
（ｋ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）；または
（ｌ）ミルセン／オシメンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）；または
（ｍ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６またはＥＣ  ４．２．３．４７）；または
（ｎ）ピネンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）；または
（ｏ）モノテルペンシンターゼ。
【０１５１】
本発明はまた、クロトニル−ＣｏＡをクロトンアルデヒドおよび／またはクロチルアルコールに変換するための、下記のものの使用に関する：
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）；および／または
（ｉｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）；および／または
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）；および／または
（ｉｖ）アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ；および／または
（ｖ）アシル−ＣｏＡレダクターゼ；および／または
（ｖｉ）アルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）；および／または
（ｖｉｉ）アルデヒドレダクターゼ；および／または
（ｖｉｉｉ）短鎖デヒドロゲナーゼ／脂肪酸  アシル−ＣｏＡレダクターゼ。
【０１５２】
さらに、本発明はまた、クロトニル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡから製造するための、下記のものを含む酵素の組合わせの使用に関する：
（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３６）；ならびに
（ｂ）（ｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５５）；および／または
（ｉｉ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）；および／または
（ｉｉｉ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ  ４．２．１．１１９）；および／または
（ｉｖ）クロトニル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５８）。
【０１５３】
本発明はまた、クロトニル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡから製造するための、下記のものを含む酵素の組合わせの使用に関する：
（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）；および／または
（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；ならびに
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３６）；
（ｃ）（ｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５５）；および／または
（ｉｉ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）；および／または
（ｉｉｉ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ２（ＥＣ  ４．２．１．１１９）；および／または
（ｉｖ）クロトニル−［アシル−キャリヤー−タンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５８）。
【０１５４】
本発明の他の観点および利点を以下の実施例に記載する；これらは説明のために示すものであって、限定のためのものではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：クローニング、酵素の発現および精製
クローニング、細菌の培養、およびタンパク質の発現
被験酵素をコードする遺伝子をｐＥＴ  ２５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。長さ６ヒスチジンのコドンをメチオニン開始コドンの後に挿入して、精製のためのアフィニティータグを付与した。コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をヒートショック法によりこれらのベクターで形質転換した。形質転換した細胞を振とうしながら（１６０ｒｐｍ）ＺＹＭ−５０５２自己誘導培地(auto-induction medium) (Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41 (2005), 207-234)で３７℃において６時間増殖させ、タンパク質発現を２８℃または２０℃で一夜（約１６時間）継続した。細胞を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心により採集し、ペレットを−８０℃で凍結させた。
【０１５６】
タンパク質の精製および濃縮
２００ｍｌの培養細胞からのペレットを氷上で融解し、５ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８（３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＤＴＴを含有）に再懸濁した。２０マイクロリットルのｌｙｓｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、そして氷へ戻して２０分間おいた。３×１５秒間の音波処理により細胞溶解を完了した。次いでこれらの細菌抽出物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心により、澄明化した。澄明化した細菌溶解物をＰＲＯＴＩＮＯ−１０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）に装填し、６−Ｈｉｓタグ付きタンパク質を吸着させた。４ｍｌの５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８（３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、２５０ｍＭのイミダゾールを含有）でカラムを洗浄し、目的とする酵素を溶離した。溶出液を次いでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮および脱塩し、０．２５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４（０．５ｍＭのＤＴＴおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）に再懸濁した。タンパク質濃縮物をブラッドフォード(Bradford)法により定量した。こうして精製したタンパク質の純度は５０％から９０％までに及んだ。
【０１５７】
実施例２：クロチルアルコールのリン酸化活性についてのスクリーニング
クロチルアルコールのリン酸化に付随するＡＤＰ放出を、ピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイにより定量した（図５）。大腸菌由来（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、枯草菌(Bacillus subtilis)由来（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)由来（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の精製４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾールキナーゼ類を、それらがクロチルアルコールをリン酸化してＡＤＰを放出する能力について評価した。
【０１５８】
被験酵素反応を下記の条件下に３７℃で実施した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
３Ｕ／ｍｌ  乳酸デヒドロゲナーゼ
１．５Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼ
５０ｍＭ  クロチルアルコール，ｃｉｓとｔｒａｎｓの混合物
ｐＨを７．５に調整した。
【０１５９】
個々の酵素を０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することにより各アッセイを開始し、３４０ｎＭにおける吸光度を追跡することによりＮＡＤＨの消失をモニターした。
【０１６０】
大腸菌およびリゾビウム・レグミノサルムに由来するヒドロキシエチルチアゾールキナーゼを用いたアッセイは、クロチルアルコールの存在下で再現性のある有意のＡＤＰ増加を生じた（表１）。次いで質量分析を用いて大腸菌酵素を用いたアッセイにおけるクロチル一リン酸形成を証明した。
【０１６１】
【表１】
2014530615.tif 000004
【０１６２】
実施例３：クロチルアルコールのリン酸化反応の質量分析
目的とする酵素反応を下記の条件下で実施した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ｃｉｓまたはｔｒａｎｓクロチルアルコール
２０ｍＭ  ＡＴＰ
０．１ｍｇ／ｍｌ  大腸菌由来の精製ヒドロキシチアゾールキナーゼ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
酵素なし、基質なし、およびＡＴＰなしの対照反応を並行して行なった。これらのアッセイ物を振とうせずに３７℃で一夜インキュベートした。常法により、アリコートの反応物２００μｌを取り出し、遠心し、上清を清浄なバイアル内へ移した。質量スペクトルを、イオントラップ質量分析計（Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００，Ｂｒｕｋｅｒ）により負イオンモードで、２ｍｌ／時の流速で作動するシリンジポンプを用いた試料の直接注入によって得た。クロチル一リン酸の存在を評価した。質量分析は、酵素試料からはｍ／ｚ  １５１にクロチル一リン酸に対応する［Ｍ−Ｈ］−イオンを示したが、対照からのものは示さなかった（図６および７）。
【０１６３】
実施例４：精製イソプレンシンターゼ類を用いたクロチル一リン酸からの１，３−ブタジエン生成のスクリーニング
クロチル一リン酸は注文合成に特化した企業（Ｓｙｎｔｈｅｖａｌ，フランス）により依頼に応じて合成される。
【０１６４】
酵素的アッセイを下記の条件下に３７℃で実施する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１〜２００ｍＭ  ｃｉｓまたはｔｒａｎｓクロチル一リン酸
１ｍＭ  ＤＴＴ
１〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１〜５ｍｇ／ｍｌ  イソプレンシンターゼ
酵素を含まない対照反応を並行して実施する。酵素混合物を３７℃で７２時間、密閉バイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）内でインキュベートする。
【０１６５】
反応混合物のヘッドスペース内の揮発性化合物を、逆流防止機構付きガスシリンジにより採集し、ＦＩＤ検出器およびＧＡＳ−ＰＲＯカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＧＣ−４３０ガスクロマトグラフ（Ｂｒｕｃｋｅｒ）にそのまま注入する。酵素反応生成物を、標準１，３−ブタジエン（Ｓｉｇｍａ）との直接比較により同定する。
【０１６６】
このガスの同一性をさらにＧＣ／ＭＳ分析により確認する。
【０１６７】
実施例５：クロチル一リン酸のリン酸化活性のスクリーニング
古細菌の幾つかのメンバー、特に下記のもののゲノムから推測したイソペンテニル一リン酸キナーゼ類の配列：メタノサーモバクター属(Methanothermobacter)（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、メタノカルドコッカス属(Methanocaldococcus)（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびサーモプラスマ属(Thermoplasma)（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を、オリゴヌクレオチド連結(concatenation)により、大腸菌のコドン利用に適合するように作製する。長さ６ヒスチジンのコドンをメチオニン開始コドンの後に挿入して、精製のためのアフィニティータグを付与する。こうして合成した遺伝子をｐＥＴ２５ｂ発現ベクター内にクローニングし、実施例１に記載したプロトコルに従ってタンパク質を産生させる。次いでこれらの酵素を実施例２に記載した方法により、０から５０ｍＭまで変動する濃度のクロチル一リン酸でアッセイする。クロチル一リン酸のリン酸化に付随するＡＤＰ放出をピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイにより定量する。個々の酵素（０．０５ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの最終濃度）の添加により各アッセイを開始し、３４０ｎＭにおける吸光度を追跡することによりＮＡＤＨの消失をモニターする。
【０１６８】
実施例６：クロチル一リン酸のリン酸化反応の質量分析
下記のものを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中において、最終体積０．２５ｍｌで酵素的アッセイを行なう：５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および０から５０ｍＭまでの範囲にわたるクロチル一リン酸。精製したイソプレノール一リン酸キナーゼの添加により反応を開始し、３７〜５５℃で一夜インキュベートする。対照反応は酵素を含有しない。インキュベーション後、試料を質量分析により処理する。アリコートの反応物２００μｌを取り出し、遠心し、上清を清浄なバイアルへ移す。質量スペクトルを、イオントラップ質量分析計（Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００，Ｂｒｕｋｅｒ）により負イオンモードで、２ｍｌ／時の流速で作動するシリンジポンプを用いた試料の直接注入によって得る。
【０１６９】
実施例７：精製イソプレンシンターゼ類を用いたクロチル二リン酸からの１，３−ブタジエン生成のスクリーニング
クロチル二リン酸は注文合成に特化した企業（Ｓｙｎｔｈｅｖａｌ，フランス）により依頼に応じて合成される。
【０１７０】
酵素的アッセイを下記の条件下に３７℃で実施する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１〜２００ｍＭ  ｃｉｓまたはｔｒａｎｓクロチル二リン酸
１ｍＭ  ＤＴＴ
１〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１〜５ｍｇ／ｍｌ  イソプレンシンターゼ
酵素を含まない対照反応を並行して実施する。酵素混合物を３７℃で７２時間、密閉バイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）内でインキュベートする。
【０１７１】
反応混合物のヘッドスペース内の揮発性化合物を、逆流防止機構付きガスシリンジにより採集し、ＦＩＤ検出器およびＧＡＳ−ＰＲＯカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＧＣ−４３０ガスクロマトグラフ（Ｂｒｕｃｋｅｒ）にそのまま注入する。酵素反応生成物を、標準１，３−ブタジエン（Ｓｉｇｍａ）との直接比較により同定する。
【０１７２】
このガスの同一性をさらにＧＣ／ＭＳ分析により確認する。
【０１７３】
実施例８：クロトニル−ＣｏＡを基質として用いたヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（Ｈｍｇ−ＣｏＡ）レダクターゼ類のスクリーニング
原核生物および真核生物のゲノムから推測したヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ類の配列を、大腸菌のコドン利用に適合するように作製する。長さ６ヒスチジンのコドンをメチオニン開始コドンの後に挿入して、精製のためのアフィニティータグを付与する。こうして合成した遺伝子をｐＥＴ２５ｂ発現ベクター内にクローニングし、実施例１に記載したプロトコルに従ってタンパク質を産生させる。次いで、クロトニル−ＣｏＡを基質として用いた精製酵素のレダクターゼ活性を、ＮＡＤＰＨ酸化に起因する３４０ｎｍにおける吸光度の初期低下の測定により決定する。下記のものを含有するｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸緩衝液中で標準アッセイを実施する：１０ｍＭのジチオトレイトール、０．１ｍＭのＮＡＤＰＨ、および０から１０ｍＭまで変動する濃度のクロトニル−ＣｏＡ。
【０１７４】
実施例９：クロチルアルコールのリン酸化の動力学的パラメーター
クロチルアルコールのリン酸化の動力学的パラメーターを、実施例２に記載した分光測光アッセイにより測定した。精製した大腸菌由来の４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾールキナーゼについて得た動力学的パラメーターを表２に示す。
【０１７５】
【表２】
2014530615.tif 000005
【０１７６】
実施例１０：クロチル一リン酸のリン酸化反応の質量分析
酵素反応を下記の条件下で実施した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５０ｍＭ  ｔｒａｎｓクロチル一リン酸
２０ｍＭ  ＡＴＰ
０．１ｍｇ／ｍｌ  精製イソペンテニル一リン酸キナーゼ
酵素を添加しないか、または基質を添加しない、対照アッセイを実施した。これらのアッセイ物を振とうせずに３７℃で一夜インキュベートした。常法により、アリコートの反応物２００μｌを取り出し、遠心し、上清を清浄なバイアル内へ移した。質量スペクトルを、イオントラップ質量分析計（Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００，Ｂｒｕｋｅｒ）により負イオンモードで、２ｍｌ／時の流速で作動するシリンジポンプを用いた試料の直接注入によって得た。クロチル二リン酸の存在を評価した。質量分析は、酵素試料からはｍ／ｚ  ２３１．５にクロチル二リン酸に対応する［Ｍ−Ｈ］−イオンを示したが、対照からのものは示さなかった。メタノコックス・ヤンナスキイ(M. jannaschii)由来のイソペンテニル一リン酸キナーゼを用いた酵素的アッセイおよび酵素を用いない対照アッセイの質量スペクトルの例を図１０ａおよび１０ｂに示す。
【０１７７】
実施例１１：クロチル一リン酸のリン酸化反応の動力学的パラメーター
ｃｉｓクロチル一リン酸およびｔｒａｎｓクロチル一リン酸は、注文合成に特化した企業（Ｓｙｎｔｈｅｖａｌ，フランス）により依頼に応じて合成された。これらの基質のリン酸化の動力学的パラメーターを、実施例２に記載した分光測光アッセイにより測定した。古細菌界の種々のメンバーに由来する精製したイソペンテニル一リン酸キナーゼ類について得た動力学的パラメーターを表３（基質としてｃｉｓクロチル一リン酸）および表４（基質としてｔｒａｎｓクロチル一リン酸）に示す。
【０１７８】
【表３】
2014530615.tif 000006
【０１７９】
【表４】
2014530615.tif 000007
【０１８０】
実施例１２：精製テルペンシンターゼ類を用いた酵素触媒作用によるｔｒａｎｓクロチル一リン酸からの１，３−ブタジエンの製造
酵素的アッセイを下記の条件下に３７℃で実施した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２５ｍＭ  ｔｒａｎｓクロチル一リン酸
２ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
２ｍｇの精製テルペンシンターゼを０．５ｍｌの反応混合物に添加した。酵素を含まない対照反応を並行して実施した。アッセイ物を、密閉した１．５ｍｌバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）内で、３７℃において２４時間、振とうしながらインキュベートした。
【０１８１】
次いで１ｍｌの気相を採集し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＧＣ−４３０ガスクロマトグラフにそのまま注入した。窒素をキャリヤーガスとして１．５ｍｌ／分の流速で用いた。ＲＴ−Ａｌｕｍｉｎａ  Ｂｏｎｄ／Ｎａ２ＳＯ４カラム（Ｒｅｓｔｅｋ）で１３０℃の等温モードを用いて揮発性化合物をクロマトグラフィーにより分離した。酵素反応生成物を１，３−ブタジエン標準品（Ｓｉｇｍａ）との直接比較により同定した。幾つかのテルペンシンターゼ類がｔｒａｎｓクロチル一リン酸からのブタジエン生成を触媒することが示された（図１１）。
【０１８２】
次いでガスクロマトグラフィー−質量分析を用いて、ＧＣ／ＦＩＤにより検出した生成物の同一性を確認した。ユーカリノキ(E. globulus)酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いたアッセイは、Ｖａｒｉａｎ  Ｓａｔｕｒｎ  ３質量選択的検出器を備えたＶａｒｉａｎ  ３４００Ｃｘガスクロマトグラフで分析された。ｔｒａｎｓクロチル一リン酸の酵素的変換により得られた１，３−ブタジエンの質量スペクトルは、市販の１，３−ブタジエンのものと類似していた（図１２ａおよび１２ｂ）。
【０１８３】
実施例１３：酵素触媒作用によるｔｒａｎｓクロチル一リン酸からの１，３−ブタジエン生成の動力学的パラメーター
酵素触媒作用によるｔｒａｎｓクロチル一リン酸からの１，３−ブタジエン生成の動力学的パラメーターを、下記の条件下で測定した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ  ＫＣｌ
２ｍＭ  ＤＴＴ
０〜２５ｍＭ  ｔｒａｎｓクロチル一リン酸
ユーカリノキ(Eucalyptus globulus)由来の精製モノテルペンシンターゼ０．２５ｍｇを０．５ｍｌの反応生成物に添加することにより、反応を開始した。酵素を含まない対照反応を並行して実施した。アッセイ物を、密閉した１．５ｍｌバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）内で、３７℃において０．５〜４時間、振とうしながらインキュベートした。
【０１８４】
１，３−ブタジエンの生成を、実施例１２に記載したＧＣ／ＦＩＤ法により分析した。ユーカリノキ由来のモノテルペンシンターゼは、６ｍＭのＫＭ値および少なくとも０．２×１０−５  ｓｅｃ−１のｋｃａｔをもつことが認められた。
【０１８５】
実施例１４：精製テルペンシンターゼ類を用いた酵素触媒作用によるｔｒａｎｓクロチル二リン酸からの１，３−ブタジエンの製造
酵素的アッセイを下記の条件下に３７℃で実施した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２５ｍＭ  ｔｒａｎｓクロチル二リン酸
２ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
２ｍｇの精製テルペンシンターゼを０．５ｍｌの反応混合物に添加した。酵素を含まない対照反応を並行して実施した。アッセイ物を、密閉した１．５ｍｌバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）内で、３７℃において２４時間、振とうしながらインキュベートした。
【０１８６】
次いで１ｍｌの気相を採集し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＧＣ−４３０ガスクロマトグラフにそのまま注入した。窒素をキャリヤーガスとして１．５ｍｌ／分の流速で用いた。ＲＴ−Ａｌｕｍｉｎａ  Ｂｏｎｄ／Ｎａ２ＳＯ４カラム（Ｒｅｓｔｅｋ）で１３０℃の等温モードを用いて、揮発性化合物をクロマトグラフィー分離した。酵素反応生成物を１，３−ブタジエン標準品（Ｓｉｇｍａ）との直接比較により同定した。幾つかのテルペンシンターゼ類がｔｒａｎｓクロチル二リン酸からのブタジエン生成を触媒することが示された（図１３）。
【０１８７】
実施例１５：酵素触媒作用によるｔｒａｎｓクロチル二リン酸からの１，３−ブタジエン生成の動力学的パラメーター
酵素触媒作用によるｔｒａｎｓクロチル一リン酸からの１，３−ブタジエン生成の動力学的パラメーターを、下記の条件下で測定した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ  ＫＣｌ
２ｍＭ  ＤＴＴ
０〜２５ｍＭ  ｔｒａｎｓクロチル二リン酸
ユーカリノキ由来の精製モノテルペンシンターゼ０．２５ｍｇを、０．５ｍｌの反応生成物に添加することにより、反応を開始した。酵素を含まない対照反応を並行して実施した。アッセイ物を、密閉した１．５ｍｌバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）内で、３７℃において０．５〜４時間、振とうしながらインキュベートした。
【０１８８】
１，３−ブタジエンの生成を、実施例１２に記載したＧＣ／ＦＩＤ法により分析した。ユーカリノキ由来のモノテルペンシンターゼは、７ｍＭのＫＭ値および少なくとも０．３×１０−４  ｓｅｃ−１のｋｃａｔをもつことが認められた。
【０１８９】
実施例１６：クロトニル−ＣｏＡを基質として用いた短鎖デヒドロゲナーゼ類／レダクターゼ類のスクリーニング
原核生物のゲノムから推測した短鎖デヒドロゲナーゼ類／レダクターゼ類の配列を、オリゴヌクレオチド連結により、大腸菌のコドン利用に適合するように作製した。長さ６ヒスチジンのコドンをメチオニン開始コドンの後に挿入して、精製のためのアフィニティータグを付与した。こうして合成した遺伝子をｐＥＴ２５ｂ発現ベクター内にクローニングし、実施例１に記載したプロトコルに従ってタンパク質を産生させた。
【０１９０】
レダクターゼアッセイのために、５０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．５、０．１〜０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのｔｒａｎｓクロトニル−ＣｏＡおよび０．５〜１ｍｇ／ｍｌの酵素を含有する総体積１２０μｌの反応混合物を用い、反応を３７℃で２０分間実施した。酵素を添加しないか、または基質を添加しない、対照アッセイを実施した。各試料をＮＡＤＰＨの減少について、３４０ｎｍにおいてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４  ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で連続的にモニターした。幾つかの酵素が、ＮＡＤＰＨを補助基質とするクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を示した（図１４：これは、ハヘリー・チェジュエンシス(Hahelly chejuensis)由来のレダクターゼ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および種々の濃度のＮＡＤＰＨを用いたクロトニル−ＣｏＡ還元アッセイにおけるＮＡＤＰＨ酸化のタイムコースを示す，表５）。
【０１９１】
【表５】
2014530615.tif 000008
【０１９２】
次いでクロトニル−ＣｏＡの酵素還元の生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
【０１９３】
実施例１７：クロトニル−ＣｏＡの酵素還元のＨＰＬＣ試験
酵素的アッセイを下記の条件下で実施した：
５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．５
１００ｍＭ  ＫＣｌ
２４ｍＭ  ｔｒａｎｓクロトニル−ＣｏＡ
８０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
１５０μｇの精製デヒドロゲナーゼ／レダクターゼを１５０μｌの反応混合物に添加することにより、反応を開始した。アッセイ物を３７℃で０．５〜６時間インキュベートした。６５℃で５分間加熱することにより反応を停止し、反応混合物を遠心し、澄明になった上清１２０μｌを清浄なバイアル内へ移した。次いで反応生成物を等体積の酢酸エチルで抽出した。上方の酢酸エチル相１００μｌをＨＰＬＣ分析のために清浄なバイアル内へ移した。市販のクロトンアルデヒドおよびクロチルアルコールを基準として用いた。ＨＰＬＣ−ＵＶ分析は１２６０  Ｉｎｉｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて実施された。１０μｌの試料を、Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ，粒度３．５μｍ）により移動相の流速１．５ｍｌ／分で分離した。移動相は９５：５（ｖ／ｖ）  Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（８．４ｍＭの硫酸を含有）からなっていた。これらの条件下でのｔｒａｎｓクロチルアルコールおよびクロトンアルデヒドの保持時間は、それぞれ４．３分および５．４分であった。
【０１９４】
ＨＰＬＣは、クロトンアルデヒドおよびクロチルアルコールが酵素触媒作用によるクロトニル−ＣｏＡの還元により形成されたことを示した。ハヘリー・チェジュエンシス(Hahelly chejuensis)由来の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ様タンパク質について得られた代表的なクロマトグラムを図１５に示す。
【０１９５】
これらのデータは、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼがクロトニル−ＣｏＡからアルデヒド中間体を経てクロチルアルコールへの４電子還元を触媒することを示す。
【０１９６】
実施例１８：ｔｒａｎｓクロトニル−ＣｏＡからのクロチルアルコール生成の動力学的パラメーター
ＮＡＤＰＨに対する動力学的パラメーター値を固定濃度のクロトニル−ＣｏＡ（５ｍＭ）および０から０．８ｍＭまで変動する濃度のＮＡＤＰＨで測定した。ＮＡＤＰＨ酸化を実施例１６に記載した方法に従って３４０ｎｍで分光測光法により測定した。
【０１９７】
ハヘリー・チェジュエンシス由来の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ様タンパク質は、基質としてのＮＡＤＰＨに対して１ｍＭのＫＭおよび６．０ｓｅｃ−１のｋｃａｔをもつことが認められた。
【０１９８】
クロトニル−ＣｏＡに対する動力学的パラメーター値を固定濃度のＮＡＤＰＨ（８０ｍＭ）および０から３２ｍＭまで変動する濃度のクロトニル−ＣｏＡで測定した。反応全体についての動力学的パラメーターをクロチルアルコール定量により、実施例１７に記載したＨＰＬＣ法を用いて測定した。ハヘリー・チェジュエンシス由来の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ様タンパク質は、５ｍＭのＫＭおよび少なくとも０．０５ｓｅｃ−１のｋｃａｔをもつことが認められた。
【図１】
2014530615.tif 000009
【図２】
2014530615.tif 000010
【図３】
2014530615.tif 000011
【図４】
2014530615.tif 000012
【図５】
2014530615.tif 000013
【図６】
2014530615.tif 000014
【図７】
2014530615.tif 000015
【図８】
2014530615.tif 000016
【図９】
2014530615.tif 000017
【図１０−１】
2014530615.tif 000018
【図１０−２】
2014530615.tif 000019
【図１１】
2014530615.tif 000020
【図１２−１】
2014530615.tif 000021
【図１２−２】
2014530615.tif 000022
【図１３】
2014530615.tif 000023
【図１４】
2014530615.tif 000024
【図１５】
2014530615.tif 000025
【国際調査報告】
2014530615.tif 000026
2014530615.tif 000027
2014530615.tif 000028
2014530615.tif 000029
2014530615.tif 000030
2014530615.tif 000031
2014530615.tif 000032