(57)【要約】  微生物バイオマスをペレット化し、超臨界条件下でペレット化バイオマスからリファインド脂質組成物を抽出し、リファインド脂質組成物を短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留して脂質含有画分を得る方法が提供される。脂質含有画分をエステル交換および富化することによりそれから脂質含有油濃縮物を作製する方法も開示される。
2014510165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスをペレット化する工程；
（ｂ）工程（ａ）のペレット化された微生物バイオマスを抽出して抽出油を生成する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留する工程
を含み、前記蒸留が、蒸留物画分および脂質含有画分を生成する方法。
【請求項２】
前記含油微生物が、酵母、藻類、菌類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイルおよび卵菌綱からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記含油微生物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物バイオマスの前記水分レベルが、約１から１０質量パーセントの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物バイオマスをペレット化する工程（ａ）が、
（１）前記微生物バイオマスおよび少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して、破砕微生物バイオマスを含む破砕バイオマス混合物を提供する工程；
（２）前記破砕バイオマス混合物を少なくとも１つの結合剤とブレンドして、固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；ならびに
（３）前記固定可能な混合物を固体ペレットに形成して、ペレット化微生物バイオマスを提供する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記破砕微生物バイオマスを、
（ａ）約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の総比エネルギーインプット（ＳＥＩ）；
（ｂ）次第に短くなるピッチ長さを有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および
（ｃ）流動制限を使用する圧縮帯域
を含む２軸スクリュー押出機中で生成し；前記押出機中で前記圧密帯域は前記圧縮帯域よりも先行する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記少なくとも１つの粉砕剤が、
（ｉ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、２．０から６．０のＭｏｈ硬度およびＡＳＴＭ法Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上の吸油係数を有する粒子である；
（ｉｉ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される；ならびに
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約１から２０質量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有し、ならびに／または
（ｂ）前記少なくとも１つの結合剤が、
（ｉｖ）前記少なくとも１つの結合剤は、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物から選択される；ならびに
（ｖ）前記少なくとも１つの結合剤は、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約０．５から１０質量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する、
請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）前記微生物バイオマスを混合する工程（１）および少なくとも１つの結合剤をブレンドする工程（２）は、押出機中で実施し、同時に実施し、または押出機中で同時に実施し；
（ｂ）前記固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程（３）は、
（ｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程；
（ｉｉ）前記ストランドを乾燥および破壊する工程；ならびに
（ｉｉｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程（ｉ）ならびに前記ストランドを乾燥および破壊する工程（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択される工程を含む、
請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記固体ペレットが、
（ａ）前記固体ペレットは、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０から約８．０ｍｍの平均長さを有する；
（ｂ）前記固体ペレットは、約０．１から５．０質量パーセントの水分レベルを有する、ならびに
（ｃ）前記固体ペレットは、前記固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の質量の総和に対して約７０から約９８．５質量パーセントの含油微生物を含む微生物バイオマス、約１から約２０質量パーセントの少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤および約０．５から１０質量パーセントの少なくとも１つの結合剤を含む
からなる群から選択される特性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）において、前記抽出は、有機溶媒により実施して抽出油を生成し、前記抽出油を、前記抽出油を蒸留する前記工程（ｃ）の前に脱ガム処理し、場合により漂白する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において、前記抽出が：
（１）前記ペレット化微生物バイオマスを、液体または超臨界流体二酸化炭素を含む溶媒により処理することであって、含油微生物を含む前記ペレット化微生物バイオマスは、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含む抽出物；および
（ｉｉ）リン脂質を含む残留バイオマス；
を得るために少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中にさらに含むこと；ならびに
（２）工程（１）区分（ｉ）において得られた抽出物を少なくとも１回分別して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むリファインド脂質組成物を有する抽出油を得ることであって、前記リファインド脂質組成物は、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してトリアシルグリセロールが濃縮されていること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）工程（ｂ）の前記抽出油が、ステロール画分を含み、
（ｉｉ）工程（ｃ）の前記蒸留物画分が、前記ステロールを含み、
（ｉｉｉ）工程（ｃ）の前記脂質含有画分が、短行程蒸留に供されなかった前記抽出油中のステロールの量と比較して低減した量の前記ステロールを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステロール画分が、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロールおよびデスモステロールからなる群から選択される１つ以上のステロールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含み、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してトリアシルグリセロールが富化されたリファインド脂質組成物を有する前記抽出油が、少なくとも３００ｍｇ／１００ｇのステロール画分をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
リファインド脂質組成物を有する前記抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留し、前記蒸留が、ステロールを含む蒸留物画分ならびにトリアシルグリセロールおよび短行程蒸留に供されなかったリファインド脂質組成物を有する前記抽出油中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを含む脂質含有画分を生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される多価不飽和脂肪酸の生成について組換え遺伝子操作されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｄ）工程（ｃ）の脂質含有画分をエステル交換する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）のエステル交換された脂質含有画分を富化して油濃縮物を得る工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）前記含油微生物が、微生物油としてそれらの乾燥細胞質量の２５％を超過して蓄積し；
（ｉｉ）前記微生物油が、総脂肪酸の質量パーセントとして計測して３０から７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、実質的にドコサヘキサエン酸を含まず、
（ｉｉｉ）工程（ｅ）の富化が、少なくとも２つのプロセスの組合せによるものであり、前記第１のプロセスは、分留を含み、前記第２のプロセスは、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトグラフィーおよびそれらの組合せからなる群から選択され；
（ｉｖ）前記油濃縮物が、油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、実質的にドコサヘキサエン酸を含まないエイコサペンタエン酸濃縮物である、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
リン脂質を含む前記残留バイオマスをさらに抽出して前記リン脂質を単離する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８３６号明細書、２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８４２号明細書、２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８４９号明細書、２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８５４号明細書、および２０１１年５月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４８７，０１９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、微生物バイオマスから脂質含有画分を得る方法に関する。特に、微生物バイオマスをペレット化し、ペレット化バイオマスから抽出油を抽出し、短行程蒸留条件下で抽出油を少なくとも１回蒸留して脂質含有画分を得る方法が提供される。この脂質含有画分は、さらに富化することができる。
【背景技術】
【０００３】
微生物、例えば糸状菌、酵母および藻類は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、ステロール脂質およびプレノール脂質を含む種々の脂質を生成する。これらの脂質の一部を、脂質が生成される微生物細胞から抽出することが有利であり、したがって種々の方法が実施されている。
【０００４】
微生物から一般に抽出される脂質の１つのクラスは、グリセロールの脂肪酸エステル（「トリアシルグリセロール」または「ＴＡＧ」）を含むグリセロ脂質である。ＴＡＧは、脂肪酸についての一次貯蔵単位であり、したがって長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ならびに短鎖飽和および不飽和脂肪酸および長鎖飽和脂肪酸を含有し得る。ＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；ω−３］およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；ω−３］を医薬品および食品に含めることへの関心が高まっている。したがって、ＰＵＦＡを含む脂質組成物を効率的におよびコスト効率的に抽出、リファインおよび精製する手段が、特に望まれる。
【０００５】
多くの典型的な脂質単離手順は、微生物細胞の破砕（例えば、機械的、酵素的または化学的手段を介する）、後続の有機または低公害溶媒を使用する油抽出を含む。破砕プロセスは微生物細胞から細胞内脂質を放出させ、それらを抽出の間に溶媒により容易に接近可能とする。抽出後、溶媒を典型的には除去する（例えば、蒸発により、例えば、真空の適用、温度または圧力の変化などによる）。
【０００６】
得られる抽出油は、脂肪体中に蓄積する親油性構成成分が富化される。一般に、脂肪体の主要な構成要素は、ＴＡＧ、エルゴステロールエステル、他のステロールエステル、遊離エルゴステロールおよびリン脂質からなる。脂肪体中に存在するＰＵＦＡは、主にＴＡＧ、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、リン脂質および遊離脂肪酸の構成成分としてである。続いて、抽出油をリファインして高度に精製されたＰＵＦＡ富化ＴＡＧ画分を生成することができる。精製ＴＡＧ画分に関する最終規格は、用途依存的であり得、例えば、油を添加剤または補助品（例えば、食料組成物、特殊調製粉乳、動物飼料などにおけるもの）として、化粧または医薬組成物などにおいて使用すべきか否かに依存する。許容可能な汚染物質基準は、自ら課す（特定の汚染物質は、不所望な特性、例えばかすみ／混濁、臭気をもたらす）かまたは外部栄養物審議会（例えば、Ａ  Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ［Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．］，Ｍａｒｃｈ  ２００６は、ω−３ＥＰＡ、ω−３ＤＨＡおよびそれらの混合物についての最大の酸、ペルオキシド、アニシジン、ＴＯＴＯＸ、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシンおよびポリ塩化ジベンゾフランの値を規定する）により決定される。
【０００７】
特許文献１は、高トリグリセリド含有率および高い酸化安定性を有する微生物ＰＵＦＡ含有油を開示する。さらに、低温殺菌された発酵ブロスに由来する微生物バイオマスからそのような油を回収する方法であって、微生物バイオマスを抽出に供して顆粒粒子を形成し、乾燥させ、次いで適切な溶媒を使用して乾燥顆粒から油を抽出する方法が記載されている。
【０００８】
特許文献２は、微生物細胞中に含有される脂溶性構成成分を抽出する方法であって、脂溶性構成成分を含有する微生物細胞を乾燥させ、同時に乾燥微生物細胞を破砕し、押出機の使用によりペレットに成形し、含有される脂溶性構成成分を有機溶媒の使用により抽出することを要求する方法を開示している。
【０００９】
特許文献３は、細胞および水を含む組成物から脂質を得る方法であって、組成物を乾燥剤と接触させ、細胞から脂質を回収することを含む方法を開示している。
【００１０】
特許文献４は、比較的低い割合の、濃縮すべきＰＵＦＡ部分と同一鎖長の飽和および一価不飽和脂肪酸部分を含有する魚油においてＰＵＦＡ部分を濃縮する方法であって、魚油グリセリドを低級アルカノールとエステル交換して低級アルキル脂肪酸エステルの混合物を形成し、前記エステルを超臨界条件下で二酸化炭素（ＣＯ２）により抽出することを含む方法を開示している。
【００１１】
高濃度ＥＰＡを生成する連続向流超臨界ＣＯ２分画法について開発されたプロセスフローダイアグラムは、非特許文献１により開示されている。この方法のための原料は、ニシン油の尿素結晶化エチルエステルであり、設計についての基礎は、９０％の収率における９０％のＥＰＡ（エチルエステル）の生成物濃度である。
【００１２】
ＰＵＦＡ含有脂質組成物においてＴＡＧ、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、および遊離脂肪酸の分布を調整することができる方法が求められている。改善された酸化安定性を有するＰＵＦＡ含有脂質組成物を得る方法が望ましい。ＴＡＧが富化されたＰＵＦＡ含有脂質組成物を得る方法も望ましい。それというのも、そのような組成物を得る経済的な方法であるためである。
【００１３】
特許文献５は、ＰＵＦＡを含む微生物油（例えば、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのもの）を極性溶媒により処理して溶媒中に可溶性である少なくとも１つのステロール（例えば、デスモステロール）を抽出し、次いでステロールを含有する溶媒の少なくとも一部を油から分離し、油は、１．５％未満のステロール含有率を有する方法を記載している。
【００１４】
特許文献６は、微生物バイオマス（例えば、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））からＰＵＦＡを含む中性脂肪を回収する方法であって、抽出プロセスにおいてバイオマスを非極性溶媒と接触させて脂質を回収する工程、脂質組成物をリファインおよび／または漂白および／または脱臭する工程、極性溶媒を脂質組成物に添加する工程、混合物を冷却して少なくとも１つの他の化合物（例えば、三飽和グリセリド、リン含有材料、ワックスエステル、飽和脂肪酸含有ステロールエステル、ステロール、スクアレン、炭化水素）を選択的に沈殿させ、次いで脂質組成物からこの不所望な化合物を除去する工程を含む方法を記載している。
【００１５】
従来の方法は、ＰＵＦＡ、具体的には高度不飽和脂肪酸の高温への曝露を回避し、微生物油からエルゴステロール（エルゴスタ−５，７，２２−トリエン−３β−オール；ＣＡＳ登録番号５７−８７−４））汚染物質を除去する有効な手段として短行程蒸留の技術を利用しなかった。
【００１６】
特許文献７は、フィード混合物を、溶出剤として水性アルコールを含有する複数の連結クロマトグラフィーカラムを有する擬似または実移動床（ａｃｔｕａｌ  ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｄ）クロマトグラフィー装置に導入することを含む、フィード混合物からＰＵＦＡ生成物を回収するクロマトグラフィー分離方法であって、装置が、少なくとも第１の帯域および第２の帯域を含む複数の帯域を有し、それぞれの帯域が、前記複数の連結クロマトグラフィーカラムから液体を回収することができる抽出物流およびラフィネート流を有し、（ａ）ＰＵＦＡ生成物をより極性の構成成分と一緒に含有するラフィネート流を、第１の帯域中のカラムから回収し、第２の帯域中の非隣接カラムに導入し、および／または（ｂ）ＰＵＦＡ生成物をより極性でない構成成分と一緒に含有する抽出物流を、第２の帯域中のカラムから回収し、第１の帯域中の非隣接カラムに導入し、前記ＰＵＦＡ生成物を、それぞれの帯域中でフィード混合物の異なる構成成分から分離する方法を開示している。種々の魚油由来原料は、精製されて８５から９８％超のＥＰＡエチルエステルが生成された。特許文献８は、ＥＰＡおよびＤＨＡを魚油から高純度で回収する方法を実証したが、該開示は、分別に好適なフィード混合物を「遺伝子組換え植物、動物および酵母を含む微生物から得られる油を含む合成源」から得ることができることも記述している。さらに、「遺伝子組換え酵母は、所望のＰＵＦＡ生成物がＥＰＡである場合に特に好適である」。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第６，７２７，３７３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２５８，９６４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０２２７６７８号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６７５，１３２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１６６，２３０号明細書（ＧＩＳＴ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）
【特許文献６】米国特許第７，６９５，６２６号明細書（Ｍａｒｔｅｋ）
【特許文献７】国際公開第２０１１／０８０５０３Ａ２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００１／０８０５０３Ａ２号パンフレット
【００１８】
【非特許文献１】Ｖ．Ｊ．Ｋｒｕｋｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｅａｆｏｏｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．（１９９２），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９８７，１６９−１７９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第１の実施形態において、本発明は、
（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスをペレット化すること；
（ｂ）工程（ａ）のペレット化された微生物バイオマスを抽出して抽出油を生成すること；および
（ｃ）工程（ｂ）の抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留すること
を含み、前記蒸留が、蒸留物画分および脂質含有画分を生成する方法に関する。
【００２０】
本方法の第２の実施形態において、含油微生物は、酵母、藻類、菌類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイルおよび卵菌綱からなる群から選択される。好ましくは、酵母はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）である。
【００２１】
本方法の第３の実施形態において、含油微生物は、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中に含み、多価不飽和脂肪酸は、好ましくは、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。
【００２２】
本方法の第４の実施形態において、微生物バイオマスの水分レベルは、微生物バイオマスは、約１から１０重量パーセントの範囲である。
【００２３】
本方法の第５の実施形態において、微生物バイオマスをペレット化する前記工程（ａ）は、
（１）微生物バイオマスおよび少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して、破砕微生物バイオマスを含む破砕バイオマス混合物を提供すること；
（２）破砕バイオマス混合物を少なくとも１つの結合剤とブレンドして、固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供すること；ならびに
（３）前記固定可能な混合物を固体ペレットに形成して、ペレット化微生物バイオマスを提供すること
を含む。
【００２４】
好ましくは、微生物バイオマスを混合する工程（１）および少なくとも１つの結合剤をブレンドする工程（２）は、押出機中で実施し、同時に実施し、または押出機中で同時に実施し；前記固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程（３）は、
（ｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成すること；
（ｉｉ）前記ストランドを乾燥および破壊すること；ならびに
（ｉｉｉ）前記固定可能な混合物をダイに通して押出してストランドを形成する工程（ｉ）ならびに前記ストランドを乾燥および破壊する工程（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択される工程を含む。
【００２５】
本方法の第６の実施形態において、破砕微生物バイオマスを、（ａ）約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の総比エネルギーインプット；（ｂ）次第に短くなるピッチ長さを有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および（ｃ）流動制限を使用する圧縮帯域を含む２軸スクリュー押出機中で破砕して生成し；押出機内で圧密帯域は圧縮帯域よりも先行する。
【００２６】
本方法の第７の実施形態において、少なくとも１つの粉砕剤は、好ましくは、
（ａ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、２．０から６．０のＭｏｈ硬度およびＡＳＴＭ法Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上の吸油係数を有する粒子である；
（ｂ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される；ならびに
（ｃ）前記少なくとも１つの粉砕剤は、固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の重量の総和に対して約１から２０重量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する。
【００２７】
少なくとも１つの結合剤は、好ましくは、
（ａ）前記少なくとも１つの結合剤は、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物から選択される；ならびに
（ｂ）前記少なくとも１つの結合剤は、固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の重量の総和に対して約０．５から１０重量パーセント存在する、
からなる群から選択される特性を有する。
【００２８】
本方法の第８の実施形態において、ペレットは、
（ａ）前記ペレットは、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０から約８．０ｍｍの平均長さを有する；ならびに
（ｂ）前記ペレットは、固体ペレット中の微生物バイオマス、粉砕剤および結合剤の重量の総和に対して約７０から約９８．５重量パーセントの含油微生物を含む微生物バイオマス、約１から約２０重量パーセントの少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤および約０．５から１０重量パーセントの少なくとも１つの結合剤を含む
からなる群から選択される特性を有する。
【００２９】
本方法の第９の実施形態において、抽出は、有機溶媒により実施して抽出油を生成し、前記抽出油を、抽出油を蒸留する前記工程（ｃ）の前に脱ガム処理し、場合により漂白する。
【００３０】
本方法の第１０の実施形態において、抽出は：
（１）ペレット化微生物バイオマスを、液体または超臨界流体二酸化炭素を含む溶媒により処理すること（含油微生物を含む前記ペレット化微生物バイオマスは、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含む抽出物；および
（ｉｉ）リン脂質を含む残留バイオマス；
を得るために少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を油中にさらに含む）：ならびに
（２）工程（１）区分（ｉ）において得られた抽出物を少なくとも１回分別して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むリファインド脂質組成物を有する抽出油を得ること（リファインド脂質組成物は、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してトリアシルグリセロールが富化されている）
を含む。
【００３１】
本方法の第１１の実施形態において、工程（ｂ）の抽出油は、ステロール画分を含み、工程（ｃ）の蒸留物画分は、ステロールを含み、工程（ｃ）の脂質含有画分は、短行程蒸留に供されなかった抽出油中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを含む。ステロール画分は、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロールおよびデスモステロールからなる群から選択される１つ以上のステロールを含み得る。
【００３２】
本方法の第１２の実施形態において、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含み、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してトリアシルグリセロールが富化されたリファインド脂質組成物を有する抽出油は、少なくとも３００ｍｇ／１００ｇのステロール画分をさらに含む。短行程蒸留条件下での少なくとも１回の蒸留時、ステロールを含む蒸留物画分が生成され、トリアシルグリセロールおよび短行程蒸留に供されなかったリファインド脂質組成物を有する抽出油中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを含む脂質含有画分が生成される。
【００３３】
第１３の実施形態において、本方法は：
（ｄ）工程（ｃ）の脂質含有画分をエステル交換すること；および
（ｅ）工程（ｄ）のエステル交換された脂質含有画分を富化して油濃縮物を得ること
をさらに含む。
【００３４】
第１４の実施形態において、含油微生物は、微生物油としてそれらの乾燥細胞重量の２５％を超過して蓄積し；微生物油は、総脂肪酸の重量パーセントとして計測して３０から７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、実質的にドコサヘキサエン酸を含まず、工程（ｅ）の富化は、少なくとも２つのプロセスの組合せによるものであり、前記第１のプロセスは、分留を含み、前記第２のプロセスは、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトグラフィーおよびそれらの組合せからなる群から選択され；油濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、実質的にドコサヘキサエン酸を含まないエイコサペンタエン酸濃縮物である。
【００３５】
生物寄託
以下の生物材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受託番号および寄託日を有する。
【００３６】
【表１】
2014510165.tif 000003
【００３７】
上記列挙した生物学的材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って寄託された。列挙された寄託株は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行為により付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００３８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８から誘導した。Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２から誘導した。同様に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載の方法論に従ってＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９から誘導した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】特注高圧抽出装置フローシートを説明する。
【図２】ペレット化微生物バイオマスをＣＯ２と接触させて抽出物を得、次いでそれを分別する、抽出の一実施形態を概略的に説明する。
【図３】微生物バイオマスをＣＯ２と接触させて抽出物を得る、抽出の一実施形態を概略的に説明する。
【図４】実施例１２において得られた抽出曲線のグラフ表示である。
【図５】本発明の方法の概要をフローチャートの形態で提供する。具体的には、微生物発酵が未処理微生物バイオマスを生成し、次いでそれをペレット化する。固体ペレットの油抽出は、残留バイオマスおよび抽出油をもたらす。短行程蒸留（ＳＰＤ）条件を使用する抽出油の蒸留は蒸留物画分および脂質含有分画を生成し、それらは場合によりさらにエステル交換および富化して油濃縮物を生じさせることができる。
【図６】以下のもの：ｐＺＫＵＭ；および（Ｂ）ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎのプラスミドマップを提供する。
【００４０】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データについて使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に従う。
【００４１】
配列番号１〜８は、表１に指定するとおり、遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、タンパク質（またはその一部）、またはプラスミドである。
【００４２】
【表２】
2014510165.tif 000004
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書に引用される全ての特許および非特許文献の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００４４】
量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、または好ましい上方値および好ましい下方値の列挙として挙げられる場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関わらず、任意の範囲上限または好ましい上方値と、任意の範囲下限または好ましい下方値との任意のペアから形成される全ての範囲を具体的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が引用されている場合、特に記載のない限り、この範囲は、その終点、および範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。本発明の範囲が、範囲を定義する場合において規定の値に限定されることは意図されない。
【００４５】
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、またはその任意の他の変形は、非排他的包含をカバーするものと意図される。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに必ずしも限定されるものではなく、表現的に列挙されていないかまたはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、表現的に逆の記載がない限り、「または」は、包含的なまたはを指すかまたは排他的なまたはを指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つにより充足される：Ａは真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在せず）、Ｂは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢは真である（または存在する）。
【００４６】
また、本発明の要素または構成成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成成分の例の数（すなわち、出現率）に関して非限定的であると意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含めるように読まれるべきであり、要素または構成成分の単数形の単語形態は、数字が明らかに単数を意味しない限り複数形も含む。
【００４７】
本明細書において使用される用語「発明」または「本発明」は、特許請求の範囲および本明細書に記載の本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されるものと読まれるべきではない。
【００４８】
以下の定義を本開示において使用する：
「二酸化炭素」は「ＣＯ２」と略す。
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略す。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略す。
「リン脂質」は、「ＰＬ」と略す。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略す。
「遊離脂肪酸」は、「ＦＦＡ」と略す。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略す。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略す。
「エチルエステル」は、「ＥＥ」と略す。
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と略す。
「ミリｔｏｒｒ」は、「ｍＴｏｒｒ」と略す。
「短行程蒸留」は、「ＳＰＤ」と略す。
【００４９】
本明細書において使用される用語「微生物バイオマス」は、微生物油を生成するために実施される含油微生物の微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。微生物バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズされた細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または破砕細胞の形態であり得る。好ましくは、微生物油は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む。
【００５０】
用語「未処理微生物バイオマス」は、溶媒による抽出前の微生物バイオマスを指す。場合により、未処理微生物バイオマスは、溶媒による抽出前に少なくとも１つの機械的プロセス（例えば、バイオマスの乾燥、バイオマスの破砕、バイオマスのペレット化、またはそれらの組合せによる）に供することができる。「未処理微生物バイオマスおよび未リファインド微生物バイオマス」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００５１】
「ペレット化する」または「ペレット化」という用語は、固体ペレットを生成するプロセスを指す。
【００５２】
「固体ペレット」という用語は、構造的剛性および形状または容積の変化に対する耐性を有するペレットを指す。固体ペレットは、望ましくは、室温において非粘着性である。固体ペレットの大部分は、ペレット構造の分解なしで、一緒に結合することもなく何日間も一緒に充填することができ；したがって、大部分は、望ましくは、自由流動するペレット化組成物である。固体ペレットは、本明細書において、「ペレット化」のプロセスを介して微生物バイオマスから形成し、したがって、「ペレット化微生物バイオマス」と称することもできる。
【００５３】
「破砕バイオマス混合物」という用語は、微生物バイオマスおよび少なくとも１つの粉砕剤を混合することにより得られる生成物を指す。破砕バイオマス混合物は、破砕微生物バイオマスを含む。
【００５４】
用語「破砕微生物バイオマス」は、破砕のプロセスに供された微生物バイオマスを指し、前記破砕は、微生物バイオマスの少なくとも５０％の破砕効率をもたらす。
【００５５】
用語「破砕効率」は、光学的可視化により定性的に測定されるかまたは以下の式：％破砕効率＝（％遊離油＊１００）を（％総油）で割る（％遊離油および％総油は、固体ペレットについて計測される）に従って定量的に測定される、加工の間に破断または破裂された細胞壁のパーセントを指す。微生物バイオマスの破砕効率の増加は、典型的には、微生物バイオマス内に含有される微生物油の抽出収率の増加をもたらす。
【００５６】
用語「パーセント総油」は、固体ペレット試料内に存在する全ての油（例えば、細胞膜、脂肪体などに存在する中性脂肪画分［ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＴＡＧ］、遊離脂肪酸、リン脂質などからの脂肪酸を含む）の総量を指す。パーセント総油は、機械的破砕に供されたペレット化試料内の全ての脂肪酸を変換し、次いでアシル脂質のメタノリシスおよびメチル化を行うことにより効率的に計測する。したがって、脂肪酸（トリグリセリド形態で表現）の総和は、試料の総油含有量と解釈される。本発明において、パーセント総油は、乳鉢および乳棒を使用して固体ペレットを微粉末に穏やかに粉砕し、次いで分析のためのアリコート（トリプリケートで）を秤量することにより選択的に測定される。試料中の脂肪酸（主としてトリグリセリドとして存在する）は、８０℃における塩化アセチル／メタノールとの反応により対応するメチルエステルに変換する。次いで、Ｃ１５：０内部標準を、較正目的のために既知量でそれぞれの試料に添加する。個々の脂肪酸の測定は、火炎イオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）を用いるキャピラリーガスクロマトグラフィーにより行う。さらに、脂肪酸（トリグリセリド形態で表現）の総和は、試料の総油含有量と解釈される。
【００５７】
用語「パーセント遊離油」は、特定の固体ペレット試料からの抽出に容易に利用可能な遊離および未結合油（例えば、トリグリセリド形態で表現される脂肪酸だが、一部はリン脂質）の量を指す。したがって、例えば、パーセント遊離油の分析は、破砕されていない膜結合脂肪体中に存在する油を含まない。本発明において、パーセント遊離油は、試料をｎ−ヘプタンと撹拌し、遠心分離し、次いで上清を乾燥するまで蒸発させることにより選択的に測定される。次いで、得られた残留油を重量測定し、元の試料の重量割合として表現する。
【００５８】
用語「粉砕剤」は、破砕バイオマス混合物を得るために微生物バイオマスと混合される吸油し得る薬剤を指す。好ましくは、少なくとも１つの粉砕剤は、微生物バイオマス１００部に対して約１から５０部存在する。一部の好ましい実施形態において、粉砕剤はシリカまたはケイ酸塩である。粉砕剤の他の好ましい特性は、以下に考察する。
【００５９】
用語「固定可能な混合物」は、少なくとも１つの結合剤を破砕バイオマス混合物とブレンドすることにより得られる生成物を指す。固定可能な混合物は、溶媒の除去（例えば、乾燥工程における水の除去）時に固体ペレットを形成し得る混合物である。
【００６０】
用語「結合剤」は、固定可能な混合物を得るために破砕バイオマス混合物とブレンドされる薬剤を指す。好ましくは、少なくとも１つの結合剤は、微生物バイオマス１００部に対して約０．５から２０部存在する。一部の好ましい実施形態において、結合剤は炭水化物である。結合剤の他の好ましい特性は、以下に考察する。
【００６１】
本明細書において使用される用語「残留バイオマス」は、溶媒（例えば、無機または有機溶媒）により少なくとも１回抽出された、微生物油を生成するために実施される微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。抽出に供する最初の微生物バイオマスが固体ペレットの形態である場合、残留バイオマスは「残留ペレット」と称することができる。
【００６２】
「低減した」または「枯渇した」という用語は、より小さい量、例えば、元の量よりもほんのわずかに少ない量、または例えば規定材料中で完全に欠落する量を有すること、および中間の全ての量を含むことを意味する。
【００６３】
用語「脂質」は、任意の脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質は、多くの重要な生物学的機能を有する多様な群の化合物、例えば細胞膜の構造的構成成分、エネルギー保存源、およびシグナル伝達経路中間体である。脂質はケトアシルまたはイソプレン基のいずれかに、完全にまたは部分的に由来する、疎水性または両親媒性の小分子として広く定義することができる。Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）分類体系（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づく脂質の一般的概要を以下の表２に示す。
【００６４】
【表３】
2014510165.tif 000005
【００６５】
用語「油」は、２５℃において液体であり、通常は多価不飽和である脂質物質を指す。油性生物において、油は総脂質の大部分を構成する。「油」は主としてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から構成されるが、他の中性脂肪、リン脂質（ＰＬ）および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）も含有し得る。油中の脂肪酸組成および総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００６６】
「微生物油」は、微生物により生成される油である。この一般的用語は、以下にさらに定義される未濃縮微生物油、抽出油、脂質含有画分、精製油または濃縮微生物油を指し得る。微生物油中の規定の脂肪酸の精製または富化後、油は種々の化学的形態で（例えば、トリアシルグリセロール、アルキルエステル、塩または遊離脂肪酸の形態で）存在し得る。
【００６７】
用語「抽出油」は、油が合成される細胞材料、例えば微生物から分離された油を指す。微生物から抽出することができる油の量は、破砕効率に比例することが多い。抽出油は、広範な方法を介して得られ、最も単純なものは物理的手段のみを伴う。例えば、種々のプレス構造（例えばスクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなど）を使用する機械的圧潰が、細胞材料から油を分離し得る。あるいは、油抽出は種々の有機溶媒（例えばヘキサン、イソヘキサン）による処理、酵素的抽出、浸透圧衝撃、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）、鹸化およびそれらの方法の組合せを介して行うことができる。微生物から抽出することができる油の量は、破砕効率に比例することが多い。さらに、抽出油の精製または濃縮は、任意選択である。
【００６８】
「未濃縮微生物油」という用語は、抽出油が１つ以上の脂肪酸について実質的に富化されていないことを意味する。したがって、「未濃縮微生物油」の脂肪酸組成は、微生物により生成された微生物油の脂肪酸組成に実質的に類似する。未濃縮微生物油は、未濃縮抽出油または未濃縮精製油であり得る。
【００６９】
「リファインド脂質組成物を有する抽出油」または「リファインド脂質組成物」という用語は、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書に開示される超臨界二酸化炭素（ＣＯ２）抽出の生成物である微生物油組成物を指す。したがって、リファインド脂質組成物は、抽出油である。リファインド脂質組成物は、中性脂肪および／またはＦＦＡを含み得る一方、実質的にＰＬを含まない。リファインド脂質組成物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＯＣＳ）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃａ  ２０−９９、標題「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｉｎ  Ｏｉｌ  ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＣＳ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＡＯＣＳ，２００９、参照により本明細書に組み込まれる）により測定して好ましくは、３０ｐｐｍ未満のリン、より好ましくは、２０ｐｐｍ未満のリンを有する。リファインド脂質組成物は、微生物バイオマスの油組成物に対してＴＡＧが富化されていてよく、場合によりステロール画分を含み得る。リファインド脂質組成物は、例えば本明細書に記載の短行程蒸留を介するさらなる精製に付して「精製油」または「脂質含有画分」を生成することができる。
【００７０】
「脱ガム処理する」という用語は、抽出油からのリン脂質および他の不純物の濃度を低減させるプロセスを指す。
【００７１】
「漂白する」という用語は、抽出油からの色素／有色化合物および残留金属の濃度を低減させるプロセスを指す。
【００７２】
「ステロール」または「ステロール画分」という用語は、細胞内で膜浸透性に影響する生物構成成分を指す。ステロールは、全ての主要な群の生物から単離されているが、単離される優勢なステロールの多様性が存在する。高等動物における優勢なステロールは、コレステロールである一方、β−シトステロールは一般に高等植物において優勢なステロールである（しかし、カンペステロールおよびスチグマステロールを伴うことも多い）。微生物に見出される優勢なステロールに関する一般化は、より困難である。それというのも、組成が特定の微生物種に依存するためである。例えば、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、主に、エルゴステロールを含み、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ）属の菌類は、主に、コレステロールおよびデスモステロールを含み、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のストラメノパイルは、主に、ブラシカステロールおよびスチグマステロールを含む。ステロール含有微生物油中に見出されることが多いステロールのまとめを以下の表３に示し；対照的に、それらのステロールは、典型的には、魚油中に見出されない。表３のステロールは、ステロール含有微生物油中に存在する場合、高融点およびより低い貯蔵温度において低減した溶解度に起因して抽出油から沈殿する傾向があり、混濁油をもたらす。これらのステロールの濃度を低減させることにより抽出油またはそれから生成される油の不所望な混濁性を最小化することが極めて望ましい。
【００７３】
【表４】
2014510165.tif 000006
【００７４】
「蒸留する」という用語は、混合物を沸騰液体混合物中でのそれらの揮発性の差に基づき分離する方法を指す。蒸留は、単位操作、または物理的分離プロセスであり、化学反応ではない。
【００７５】
「短行程蒸留」（「ＳＰＤ」）という用語は、極端に高い真空下で稼働し、蒸発後に蒸留すべき材料からの揮発性化合物が凝縮表面に短距離のみ移動するようにＳＰＤ装置が蒸発器に近接した内部凝縮器を備える分離法を指す。結果として、この分離法からの熱分解は最小である。
【００７６】
「精製油」という用語は、抽出油中の不純物の濃度と比較して低減した濃度の不純物、例えばリン脂質、微量金属、遊離脂肪酸、有色化合物、少量の酸化生成物、揮発物質および／または臭気化合物、ならびにステロール（例えば、エルゴステロール、ブラシカステロール、スチグマステロール、コレステロール）を有する抽出油を指す。精製プロセスは、典型的には、特定の脂肪酸が実質的に富化されるように微生物油を濃縮も富化もせず、したがって精製油は未濃縮であることが最も多い。
【００７７】
「脂質含有画分」および「ＳＰＤ精製油」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、１つ以上のＰＵＦＡを含むＴＡＧ画分を含有する抽出微生物油であって、ＳＰＤ条件下での少なくとも１回の蒸留のプロセスに付した油を指す。ステロール画分が抽出油中に存在する場合、蒸留プロセスは、短行程蒸留前の油のステロール含有量と比較して脂質含有画分中のステロールの量を低減させる。
【００７８】
ＳＰＤは、エチルエステル、メチルエステルおよび遊離脂肪酸を濃縮し得るが、そのプロセスは、典型的には、ＴＡＧを濃縮しない（例えば、極端に高い温度において稼働させ、次いでＴＡＧの分解をもたらさない限り）。脂質含有画分中の大部分のＰＵＦＡはＴＡＧの形態であるため、ＳＰＤプロセスは、典型的には、特定の脂肪酸が実質的に富化されるようにＴＡＧを濃縮せず、脂質含有画分は、本明細書に記載の目的のために未濃縮であるとみなされることが最も多い。
【００７９】
「エステル交換」という用語は、脂肪酸のエステルを異なる脂肪酸のエステルに変換させる、酸または塩基触媒により触媒される化学反応を指す。
【００８０】
「脂肪酸エチルエステル」［「ＦＡＥＥ」］は、一般に、エステル化またはエステル交換のプロセスにおいて遊離脂肪酸またはそれらの誘導体をエタノールと反応させることにより合成により誘導される脂質の化学形態を指す。
【００８１】
「富化」という用語は、未濃縮微生物油中の１つ以上の脂肪酸の濃度に対して微生物油中の１つ以上の脂肪酸の濃度を増加させるプロセスを指す。例えば、本明細書において考察されるとおり、ＴＦＡの重量％として計測して３０から７０重量％の所望のＰＵＦＡを含む微生物油を富化または濃縮して「油濃縮物」を生成する。
【００８２】
「油濃縮物」という用語は、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％の所望のＰＵＦＡを含む油を指す。好ましくは、油濃縮物は、総脂肪酸の重量％として計測して３０から７０重量％の所望のＰＵＦＡを含む微生物油から得、前記微生物油は、以下に詳述するとおり油として乾燥細胞重量の２５％を超過して蓄積する含油微生物から得る。具体的には、微生物油のエチルまたは他のエステルは、所望のＰＵＦＡを富化することができ、当技術分野において一般に使用される方法により分離することができる。
【００８３】
「エイコサペンタエン酸濃縮物」または「ＥＰＡ濃縮物」という用語は、油濃縮物であり、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないω−３油を指す。ＥＰＡ濃縮物は、総脂肪酸の重量％として計測して３０から７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まない微生物油から得、前記微生物油は、油として乾燥細胞重量の２５％を超過して蓄積する含油微生物から得る。ＥＰＡの少なくとも７０重量％は、遊離脂肪酸、トリグリセリド（例えば、ＴＡＧ）、エステル、およびそれらの組合せの形態である。エステルは、最も好ましくは、エチルエステルの形態である。
【００８４】
「中性脂肪」は、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見出される脂質を指し、細胞のｐＨにおいて脂質は荷電基を担持しないため、そのように称される。一般にこれらは完全に非極性であり、水についての親和性を有さない。中性脂肪は、一般に脂肪酸とのグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）もしくはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とも称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールからＦＦＡを放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００８５】
「トリアシルグリセロール」という用語は、「トリアシルグリセリド」という用語と同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂肪を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに短鎖飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。生物において、ＴＡＧは、脂肪酸についての一次貯蔵単位である。それというのも、グリセロール骨格はＰＵＦＡ分子を貯蔵についてまたは輸送の間に安定化するのを助けるためである。対照的に、遊離脂肪酸は急速に酸化される。
【００８６】
本明細書において用語「総脂肪酸（ＴＦＡ）」は、例えば微生物バイオマスまたは油であり得る所与の試料中において、（当技術分野において公知の）塩基エステル交換法により脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化することができる全ての細胞脂肪酸の総和を指す。したがって、総脂肪酸は、（ＤＡＧ、ＭＡＧ、およびＴＡＧを含む）中性脂肪画分からの、および（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分を含む）極性脂質画分からの脂肪酸を含むが、ＦＦＡは含まない。
【００８７】
細胞の「総脂質含有率」という用語は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含有率は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥ（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）の尺度として近似させることができる。したがって総脂質含有率（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、例えばＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００８８】
総脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書においてＴＦＡの重量パーセント（％ＴＦＡ）、例えば、ＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラムとして表現する。本開示において特に具体的に記載のない限り、微生物細胞中および微生物油中の総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントへの参照は、％ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度と等価である（例えば、総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡと等価である）。
【００８９】
油濃縮物中の脂肪酸エステルの濃度（および／または脂肪酸および／またはトリグリセリド、それぞれ）は、油の重量パーセント［「％油」］、例えば、油濃縮物１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸エステル（および／または脂肪酸および／またはトリグリセリド、それぞれ）のミリグラムとして表現する。この計測単位を使用して例えばＥＰＡ濃縮物中のＥＰＡの濃度を記載する。
【００９０】
場合によっては、細胞中の所与の脂肪酸含有率をその乾燥細胞重量の重量パーセント（％ＤＣＷ）として表現することが有用である。したがって例えばエイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、以下の式に従って求められる：（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００。しかしながら、乾燥細胞重量の重量パーセント（％ＤＣＷ）としての細胞中の所与の脂肪酸含有率は、以下のとおり近似させることができる：
（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００。
【００９１】
「脂質プロファイル」および「脂質組成」という用語は同義であり、特定の脂質画分、例えば総脂質中または油中などに含有される個々の脂肪酸の量を指し、その量はＴＦＡの重量パーセントとして表現される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
【００９２】
用語「脂肪酸」は、変動する約Ｃ１２からＣ２２の鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の両方も公知である。優勢な鎖長は、Ｃ１６からＣ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である）の簡易表記体系により表される。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）、および「ω−６脂肪酸」（「ω−６」または「ｎ−６」）と「ω−３脂肪酸」（「ω−３」または「ｎ−３」）の区別に関する追加的詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。
【００９３】
本明細書でＰＵＦＡを記載するために使用される命名法を表４に示す。「略記法」と題された欄ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、この目的で１番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸ならびにそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略語、ならびにそれぞれの化合物の化学名をまとめる。
【００９４】
【表５】
2014510165.tif 000007
【００９５】
本開示において使用されるＥＰＡ、ＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡという用語は、それぞれ、特に具体的に言及のない限り、それぞれの酸または酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など）を指す。例えば、「ＥＰＡ−ＥＥ」は、具体的には、ＥＰＡエチルエステルを指す。
【００９６】
ＮＤＰＡおよびＨＰＡは、一般に魚油中に見出される。魚油から生成される濃縮ＥＰＡは、最終ＥＰＡ組成物中の不純物としてそれらの脂肪酸を含有することが多い（例えば、米国特許出願公開第２０１０−０２７８８７９号明細書および国際公開第２０１０／１４７９９４Ａ１号パンフレット参照）。
【００９７】
「実質的にＤＨＡを含まない」という用語は、約０．０５重量パーセント以下のＤＨＡを含むことを意味する。したがって、ＥＰＡ濃縮物は、ＤＨＡ（遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステルおよびそれらの組合せの形態）の濃度が、油の重量％として計測して約０．０５重量％以下のＤＨＡである場合、実質的にＤＨＡを含まない。同様に、微生物油は、ＤＨＡの濃度が、ＴＦＡの重量％として計測して約０．０５重量％以下のＤＨＡである場合、実質的にＤＨＡ（遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、およびそれらの組合せの形態）を含まない。
【００９８】
「実質的にＮＤＰＡを含まない」および「実質的にＨＰＡを含まない」という用語は、「実質的にＤＨＡを含まない」という用語について上記に提供される定義と同等であるが、脂肪酸ＮＤＰＡまたはＨＰＡが、それぞれ、ＤＨＡに代えて用いられる。
【００９９】
「高レベルＰＵＦＡ生成」という用語は、微生物宿主の総脂質の少なくとも約２５％のＰＵＦＡ、好ましくは、総脂質の少なくとも約３０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約３５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４０〜４５％のＰＵＦＡ、より好ましくは、総脂質の少なくとも約４５〜５０％のＰＵＦＡ、より好ましくは、少なくとも約５０〜６０％のＰＵＦＡ、最も好ましくは、総脂質の少なくとも約６０〜７０％のＰＵＦＡの生成を指す。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でなく；したがって例えばＰＵＦＡは、ＦＦＡとして、またはエステル化形態、例えばアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質で総脂質中に存在し得る。
【０１００】
「含油微生物」という用語は、微生物油を生成し得る微生物を指す。したがって、含油微生物は、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル、菌類、またはそれらの組合せであり得る。好ましい実施形態において、含油微生物は油性である。
【０１０１】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄＥｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。一般に、油性微生物の細胞油はＳ字形曲線に従い、脂質の濃度は対数後期または初期静止期においてそれが最大に達するまで増加し、次に後期静止期および死滅期中に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％を超えて、油として蓄積することは珍しくない。
【０１０２】
油性生物の例には、限定されるものではないが、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属の生物が含まれる。
【０１０３】
「油性酵母」という用語は、油を生成し得る酵母に分類される油性微生物を指す。油性酵母の例には、決して限定されるものではないが、以下の属：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【０１０４】
本明細書において使用される「医薬」という用語は、合衆国で販売されている場合、連邦食品・医薬品・化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）のセクション５０３または５０５により管理される化合物または物質を意味する。
【０１０５】
「実質的に環境汚染物質を含まない」という用語は、油濃縮物またはＥＰＡ濃縮物がそれぞれ、環境汚染物質を含まず、または多くとも微量のみの環境汚染物質を含むことを意味し、それらには、化合物、例えばポリ塩化ビフェニル［「ＰＣＢ」］（ＣＡＳ番号１３３６−３６−３）、ジオキシン、臭素化難燃剤および殺虫剤（例えば、トクサフェンおよびジクロロジフェニルトリクロロエタン［「ＤＤＴ」］およびその代謝物質）が含まれる。
【０１０６】
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、成長培地内に存在する全炭素対窒素比に応答して誘発される。油性微生物中で遊離パルミテート（１６：０）のデノボ合成をもたらすこのプロセスについては、米国特許第７，２３８，４８２号明細書において詳述されている。パルミテートは、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を介して形成される、鎖長のより長い飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である。
【０１０７】
広範な脂肪酸（飽和および不飽和脂肪酸ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む）を、脂肪酸についての一次貯蔵単位であるＴＡＧ中に取り込むことができる。本明細書に記載の含油微生物において、ＴＡＧ中への長鎖ＰＵＦＡの取り込みが最も望ましいが、ＰＵＦＡの構造的形態は限定されない（したがって、例えば、ＥＰＡが総脂質中でＦＦＡとして、またはエステル化形態、例えばアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質で存在し得る）。より具体的には、一実施形態において、含油微生物は、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する。より好ましくは、少なくとも１つのＰＵＦＡは、少なくともＣ２０鎖長、例えば、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＰＵＦＡを有する。
【０１０８】
一実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡおよびそれらの混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＰＡおよびＤＨＡからなる群から選択される。
【０１０９】
ほとんどのＰＵＦＡは中性脂肪としてＴＡＧ中に取り込まれて脂肪体中に貯蔵される。しかしながら、油性生物中の総ＰＵＦＡの計測は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびＴＡＧ画分中に局在するＰＵＦＡを最低限含むべきであることに留意することが重要である。
【０１１０】
本発明は、
（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスをペレット化すること；
（ｂ）工程（ａ）のペレット化された微生物バイオマスを抽出して抽出油を生成すること；および
（ｃ）工程（ｂ）の抽出油を、短行程蒸留条件下で少なくとも１回蒸留すること
を含み、前記蒸留が、蒸留物画分および脂質含有画分を生成する方法に関する。
【０１１１】
別の実施形態において、上記方法は、以下の工程：
（ｄ）工程（ｃ）の脂質含有画分をエステル交換すること；および
（ｅ）工程（ｄ）のエステル交換された脂質含有画分を富化して油濃縮物を得ること
をさらに含み得る。
【０１１２】
本発明は、ペレット化微生物バイオマスから脂質含有画分または油濃縮物を得る方法に関するが、含油微生物自体を得るために有用であり得る関連方法も図５の概略図に記載する。図５の態様のそれぞれは、以下により詳細に考察し、図中の太字は図５の規定部分を指す。
【０１１３】
含油微生物は、微生物が典型的には微生物発酵を介して成長および繁殖するにつれて微生物バイオマスを生成する。微生物バイオマスは、天然または組換え（「遺伝子操作」）に関わらず、微生物油を生成し得る任意の微生物からのものであり得る。したがって、例えば、含油微生物は、酵母、藻類、ユーグレナ類、ストラメノパイル、菌類、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。好ましくは、微生物は、微生物油内の高レベルＰＵＦＡ生成が可能である。
【０１１４】
例としてＡＲＡ油の商業的供給源は、典型的には、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（糸状菌）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属（紅藻）の微生物から生成される。最も注目すべきことに、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）はＡＲＡ含有真菌油（ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）；米国特許第５，６５８，７６７号明細書）を生成し、これは実質的にＥＰＡを含まず、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）またはピシウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｕｏｓｕｍ）のいずれかに由来する。
【０１１５】
同様に、ＥＰＡは、利用される規定の微生物の天然能力に基づく多数の異なる方法を介して、微生物を利用して生成することができる［例えば、従属栄養珪藻キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種（米国特許第５，２４４，９２１号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）種またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種（米国特許第５，２４６，８４１号明細書）；ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の糸状菌（米国特許第５，２４６，８４２号明細書）；またはモルティエラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、またはＭ．ハイグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）（米国特許第５，４０１，６４６号明細書）；およびナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属の真正眼点藻（Ｋｒｉｅｎｉｔｚ，Ｌ．ａｎｄ  Ｍ．Ｗｉｒｔｈ，Ｌｉｍｎｏｌｏｇｉｃａ，３６：２０４−２１０（２００６））］。
【０１１６】
ＤＨＡも、天然微生物の天然能力に基づく方法を使用して生成することができる。例えばシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（米国特許第５，３４０，７４２号明細書；米国特許第６，５８２，９４１号明細書）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）（米国特許第６，５０９，１７８号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種ＹＳ−１８０（米国特許第６，２０７，４４１号明細書）；スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＬＦＦ１株（米国特許出願公開第２００４／０１６１８３１Ａ１号明細書）；クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）（米国特許出願公開第２００４／００７２３３０Ａ１号明細書；ｄｅＳｗａａｆ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．，８１（６）：６６６−６７２（２００３）およびＡｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６１（１）：４０−４３（２００３））；エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）種（特開平５−３０８９７８号公報（１９９３））；およびジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ＃２８２０７；特開１９９５８８／１９８９号公報］について開発された方法参照。さらに以下の微生物がＤＨＡ生成能を有することが公知である：ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（深海から単離された細菌；ＡＴＣＣ＃１５３８１）；微小藻類キクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）；ならびに鞭毛菌類、例えばスラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３４３０４；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌｉｐｉｄｓ，２７：１５（１９９２））およびＡＴＣＣ＃２８２１１、ＡＴＣＣ＃２０８９０、およびＡＴＣＣ＃２０８９１と称されるスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種。現在、ＤＨＡを商業生成する少なくとも３つの異なる発酵法が存在する：ＤＨＡＳＣＯ（商標）を生成するためのＣ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）；以前にＤＨＡＧｏｌｄとして公知の油を生成するためのシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；およびＤＨＡｃｔｉｖｅ（商標）を生成するためのウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）種の発酵（Ｎｕｔｒｉｎｏｖａ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１１７】
組換え手段を使用する微生物油中のＰＵＦＡの微生物生成は、天然微生物源からの生成と比べて、いくつかの利点を有することが予期される。例えば、宿主中への新しい生合成経路の導入により、および／また不所望な経路の抑制により宿主の天然の微生物脂肪酸プロファイルを変えることができ、それにより所望のＰＵＦＡ（またはそのコンジュゲート形態）の生成レベルの増加および不所望なＰＵＦＡの生成の減少がもたらされるため、油生成に好ましい特徴を有する組換え微生物を使用し得る。第２に組換え微生物は、規定の用途を有し得る特定形態でＰＵＦＡを提供し得る。さらに培養条件を制御することにより、とりわけ微生物により発現される酵素のための特定基質源を提供することにより、または化合物／遺伝子操作を付加して不所望な生化学的経路を抑制することにより、微生物油生成を操作することができる。したがって、例えば、こうして生成されるω−３脂肪酸とω−６脂肪酸との比を改変し、または他のＰＵＦＡの下流もしくは上流生成物の顕著な蓄積なしに、規定のＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の生成を遺伝子操作することが可能である。
【０１１８】
したがって、例えば、適切なＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、例えばδ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよびＣ２０／２２エロンガーゼの規定の組合せを導入することにより、ＥＰＡを生成する天然能力を欠く微生物を遺伝子操作してＰＵＦＡ生合成経路を発現させることができるが、導入される規定の酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）は、本発明を決して限定するものではないと認識されるべきである。
【０１１９】
例として、いくつかの酵母が、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成するように組換え遺伝子操作されている。例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）および油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，４６５，５６４号明細書；米国特許第７，５８８，９３１号明細書；米国特許第７，９３２，０７７号明細書；米国特許第７，５５０，２８６号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書）における研究参照。
【０１２０】
一部の実施形態において、微生物宿主細胞が油性である場合に利点が認識される。油性酵母は天然で油合成および蓄積が可能であり、総油含有率は、細胞乾燥重量の約２５％を超えて、より好ましくは、細胞乾燥重量の約３０％を超えて、最も好ましくは、細胞乾燥重量の約４０％を超えて構成し得る。代替実施形態において、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非油性酵母を、細胞乾燥重量の２５％を超える油を生成し得るように、それを遺伝子操作して油性にすることができる（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
【０１２１】
典型的に油性酵母として同定される属には、限定されるものではないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。より具体的には、例証的な油合成酵母には、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が含まれる。
【０１２２】
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり；さらなる実施形態において、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−４９（２００２））。
【０１２３】
一部の実施形態において、油性酵母は「高レベルＰＵＦＡ生成」が可能であることが望ましいことがあり、生物は総脂質の少なくとも約５〜１０％の所望のＰＵＦＡ（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３および／またはＤＨＡ）を生成し得る。より好ましくは、油性酵母は、総脂質の少なくとも約１０〜７０％の所望のＰＵＦＡを生成する。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でないが、好ましくは、ＴＡＧはＰＵＦＡを含む。
【０１２４】
したがって、本明細書に記載のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、および遺伝子産物は、野生型微生物宿主細胞中または異種微生物宿主細胞中、特に油性酵母細胞（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中で生成することができる。組換え微生物宿主中における発現は、種々のＰＵＦＡ経路中間体を生成するのに、または従来は宿主を使用して可能でなかった新しい生成物を合成するために宿主中に既存のＰＵＦＡ経路をモジュレートするのに、有用であり得る。
【０１２５】
上記に提供される引用教示に基づき、好ましいω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成のために多数の油性酵母を遺伝子操作することができるが、油性酵母の代表的ＰＵＦＡ生成株であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）について表５に記載する。これらの株は、以下のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子：δ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２
０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼの種々の組合せを有するが、導入される規定の酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）および生成される規定のＰＵＦＡは、決して本発明を限定するものではないことが認識されるべきである。
【０１２６】
【表６】
2014510165.tif 000008
【０１２７】
【表７】
2014510165.tif 000009
【０１２８】
ＰＵＦＡ生合成経路を油性酵母中に導入する手段は周知であるため、当業者は、本発明の方法論が、上記のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株にも、本発明が実証される種（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗ
ｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））または属（すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ））にも限定されないことを認識する。それよりむしろ、微生物油（好ましくは、ＰＵＦＡ、例えば、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡを含む）を生成し得る任意の油性酵母または任意の他の好適な微生物が、実施例２６に実証されるとおり本方法論において使用するのに同等に好適である（しかし、取り扱われるそれぞれの新たな微生物について、例えば、それぞれの含油微生物の細胞壁組成の差異に基づき一部のプロセス最適化が要求され得る）。
【０１２９】
脂質が微生物により生成される条件下で、好ましくはＰＵＦＡを含む脂質を生成する微生物種を発酵培地中で培養し、成長させることができる。典型的には、微生物に微生物の成長および／または微生物油（好ましくはＰＵＦＡを含む）の生成を可能にする多数の追加的化学薬品または物質とともに炭素および窒素源をフィードする。発酵条件は、上記引用に記載のとおり、使用される微生物に依存し、得られるバイオマス中のＰＵＦＡを高含有率にするために、最適化することができる。
【０１３０】
一般に、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成期の長さ、油蓄積相の長さ、ならびに細胞回収時期および方法を改変することにより、培地条件を最適化することができる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、複合培地、例えば酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ）中で、または限定最小培地（例えば成長に必要な構成成分を欠き、それによりＰＵＦＡの生成を可能にする所望の組換え発現カセットの選択を強制する、酵母窒素原礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＩＭ））中で成長させる。
【０１３１】
好ましくはＰＵＦＡを含む微生物油の所望量が微生物により生成された場合、発酵培地を機械的に加工して微生物油を含む未処理微生物バイオマスを得ることができる。例えば、発酵培地を濾過し、または別の方法により処理して水性構成成分の少なくとも一部を除去することができる（例えば、乾燥により）。当業者により認識されるとおり、未処理微生物バイオマスは、典型的に水を含む。好ましくは、微生物発酵後に、水の一部を未処理微生物バイオマスから除去して、１０重量％未満の水分レベル、より好ましくは、５重量％未満の水分レベル、最も好ましくは、３重量％以下の水分レベルを有する微生物バイオマスを提供する。微生物バイオマスの水分レベルは、乾燥において制御することができる。好ましくは、微生物バイオマスは、約１から１０重量パーセントの範囲の水分レベルを有する。
【０１３２】
場合により、発酵培地および／または微生物バイオマスを低温殺菌し、または他の手段により処理して、微生物油および／またはＰＵＦＡ生成物を損ない得る、内在微生物酵素の活性を低減させることができる。
【０１３３】
したがって、微生物バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズされた細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または破砕細胞（すなわち、破砕微生物バイオマス）の形態であり得る。
【０１３４】
微生物バイオマスは、例えば、細胞溶解を介して、または物理的手段、例えばビードビーター、スクリュー押出などを介してバイオマスを破砕するように機械的に加工して細胞内容物へのより大きい接近性を提供することができる。
【０１３５】
破砕微生物バイオマスは、含油微生物の少なくとも５０％の破砕効率を有する。より好ましくは、破砕効率は、含油微生物の少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、最も好ましくは、８５〜９０％以上である。好ましい範囲を上記したが、破砕効率の有用な例には、５０％から１００％の任意の整数割合、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の破砕効率が含まれる。
【０１３６】
破砕効率は、光学的可視化により定性的に測定されるかまたは以下の式：％破砕効率＝（％遊離油＊１００）を（％総油）で割る（％遊離油および％総油は、固体ペレットについて計測される）に従って定量的に測定される、加工の間に破断または破裂された細胞壁のパーセントを指す。
【０１３７】
破砕（例えば、スクリュー押出、エキスペラー、ピストン、ビードビーター、乳鉢および乳棒、ハンマーミル処理、エアジェットミル処理などを使用する、例えば、機械的圧潰）のプロセスに供されなかった固体ペレットは、典型的には、低い破砕効率を有する。それというのも、破砕のプロセスが細胞壁および脂肪体を包囲する膜を含む種々のオルガネラの内膜の両方を破壊するまで、ＤＡＧ、ＭＡＧおよびＴＡＧ、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分内の脂肪酸ならびに遊離脂肪酸は一般に微生物バイオマスから抽出不可能であるためである。種々の破砕のプロセスは、そのプロセスにおいて固有に生成される特定の剪断、圧縮、静的および動的な力に基づき種々の破砕効率をもたらす。
【０１３８】
微生物バイオマスの破砕効率の増加は、典型的には、抽出収率（例えば、粗製抽出油の重量パーセントにより計測）の増加をもたらし、それというのも、細胞壁および膜の破砕とともに微生物油の多くが抽出溶媒の存在に影響を受ける可能性が高いためである。
【０１３９】
種々の装置を利用して破砕微生物バイオマスを生成することができるが、好ましくは、破砕は、２軸スクリュー押出機中で実施する。より具体的には、２軸スクリュー押出機は、好ましくは、（ｉ）約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）、より好ましくは、０．０５から０．２ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）、最も好ましくは、約０．０７から０．１５ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）の押出機中の総比エネルギーインプット（ＳＥＩ）；（ｉｉ）次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域；および（ｉｉｉ）流動制限を使用する圧縮帯域を含む。細胞破砕に要求される機械的エネルギーのほとんどは、圧縮帯域中で付与され、例えばリバーススクリューエレメント、制限／ブリスターリングエレメントまたはニーディングエレメントの形態の流動制限を使用して作出される。圧密帯域は、押出機中で圧縮帯域よりも先行する。押出機の第１の帯域は、バイオマスを圧密帯域中にフィードおよび輸送するために存在し得る。
【０１４０】
ペレット化のプロセスは、一般に以下の工程：（１）微生物バイオマスおよび少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して、破砕微生物バイオマスを含む破砕バイオマス混合物を提供する工程；（２）破砕バイオマス混合物を少なくとも１つの結合剤とブレンドして、固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；および（３）前記固定可能な混合物を固体ペレットに形成して、ペレット化微生物バイオマスを提供する工程を含む。
【０１４１】
第１に、ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマスを、少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤と混合して破砕バイオマス混合物を提供する。
【０１４２】
吸油し得る粉砕剤は、２．０から６．０、好ましくは、２．０から約５．０；より好ましくは、約２．０から４．０のＭｏｈ硬度；およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄ１４８３−６０に従って測定される０．８以上、好ましくは、１．０以上、より好ましくは、１．３以上の吸油係数を有する粒子であり得る。好ましい粉砕剤は、約２から２０ミクロン、好ましくは、約７から１０ミクロンの中央粒径；およびＢＥＴ法（Ｂｒｕｎａｕｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６０：３０９（１９３８））により測定される少なくとも１ｍ２／ｇ、好ましくは、２から１００ｍ２／ｇの比表面積を有する。
【０１４３】
好ましい粉砕剤は、シリカおよびケイ酸塩からなる群から選択される。本明細書において使用される用語「シリカ」は、主に（少なくとも９０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％の）ケイ素および酸素原子からなり、約２つの酸素原子と１つのケイ素原子との比であり、したがってＳｉＯ２の実験式を有する固体化学物質を指す。シリカには、例えば、沈殿シリカ、ヒュームドシリカ、アモルファスシリカ、珪藻土としても公知の珪藻シリカおよびそれらのシリカのシラン処理形態が含まれる。用語「ケイ酸塩」は、主に（少なくとも９０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％の）ケイ素、酸素の原子および少なくとも１つの金属イオンからなる固体化学物質を指す。金属イオンは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、またはそれらの混合物であり得る。天然および合成のゼオライトの形態のケイ酸アルミニウムを使用することができる。有用であり得る他のケイ酸塩は、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ナトリウム、およびケイ酸カリウムである。
【０１４４】
好ましい粉砕剤は、約１０〜２０ｍ２／ｇの比表面積および１．３以上の吸油係数を有する珪藻土である。好適な吸油し得る粉砕剤の市販源は、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡから入手可能なＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土である。
【０１４５】
他の粉砕剤は、ポリ（メタ）アクリル酸、ならびにナトリウムまたはカリウム塩基によるポリ（メタ）アクリル酸の部分および完全中和から誘導されるイオノマーであり得る。本明細書において、（メタ）アクリレートという用語は、化合物がアクリレート、メタクリレート、またはその２つの混合物のいずれかであり得ることを意味する。
【０１４６】
少なくとも１つの粉砕剤は、固体ペレット中の構成成分（ａ）微生物バイオマス、（ｂ）粉砕剤および（ｃ）結合剤の総和に対して約１から２０重量パーセント、およびより好ましくは、１から１５重量パーセント、最も好ましくは、約２から１２重量パーセント存在する。
【０１４７】
微生物バイオマスおよび吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供すること［工程（１）］は、当技術分野において公知の任意の方法により実施してエネルギーを混合媒体に適用することができる。好ましくは、混合は、９０℃以下、より好ましくは、７０℃以下の温度を有する破砕バイオマス混合物を提供する。
【０１４８】
例えば、微生物バイオマスおよび粉砕剤は、混合機、例えば単軸スクリュー押出機もしくは２軸スクリュー押出機、撹拌機、単軸スクリューもしくは２軸スクリューニーダー、またはＢａｎｂｕｒｙ混合機中にフィードすることができ、添加工程は、１回における全ての成分の添加またはバッチでの漸次添加であり得る。
【０１４９】
好ましくは、混合は、約０．０４から０．４ＫＷ／（ｋｇ／ｈｒ）のＳＥＩ、次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用する圧密帯域、および流動制限を使用する圧縮帯域を有する上記の２軸スクリュー押出機中で実施する。これらの条件下、最初の微生物バイオマスは全乾燥細胞であり得、含油微生物の少なくとも５０％の破砕効率を有する破砕微生物バイオマスをもたらす細胞破砕のプロセスは、混合工程の開始時または混合工程の間に行うことができ、すなわち、細胞破砕および工程（１）を組み合わせ、同時として破砕バイオマス混合物を生成することができる。粉砕剤の存在は、細胞破砕を向上させるが、ほとんどの細胞破砕は、２軸スクリュー押出機自体の結果として生じる。
【０１５０】
したがって、明確性のために、微生物バイオマスの細胞破砕は、例えば、上記の圧縮帯域を有する２軸スクリュー押出機中で粉砕剤の不存在下で実施することができ、次いで粉砕剤および破砕微生物バイオマスの混合を２軸スクリュー押出機または種々の他の混合機中で実施して破砕バイオマス混合物を提供する。または、微生物バイオマスの細胞破砕は、例えば、圧縮帯域を有する２軸スクリュー押出機中で粉砕剤の存在下で実施することができる。しかしながら、いずれの場合においても、細胞破砕（すなわち、破砕効率）は、後続のプロセス工程において含油微生物からの抽出油の収率の最大化を所望する場合、最大化すべきである。
【０１５１】
次いで、少なくとも１つの結合剤を破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレット（すなわち、ペレット化微生物バイオマス）を形成し得る固定可能な混合物を提供する。
【０１５２】
本発明において有用な結合剤には、水溶性または水分散性の親水性有機材料および親水性無機材料が含まれる。好ましい水溶性結合剤は、２３℃において少なくとも１重量パーセント、好ましくは、少なくとも２重量パーセント、より好ましくは、少なくとも５重量パーセントの水中溶解度を有する。
【０１５３】
結合剤は、好ましくは、１ｘ１０−３モル分率未満；好ましくは、１ｘ１０−４未満、より好ましくは、１ｘ１０−５未満、最も好ましくは、１ｘ１０−６モル分率未満の５００ｂａｒおよび４０℃における超臨界流体二酸化炭素中溶解度を有する。溶解度は、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ」，Ｒａｍ  Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｊａｅ−Ｊｉｎ  Ｓｈｉｍ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ（２００７）開示されている方法に従って測定することができる。
【０１５４】
結合剤は、ペレット化プロセスから形成されたペレットの整合性およびサイズを保持するように作用し、さらにペレットのさらなる加工および輸送において微粉を低減させるように作用する。
【０１５５】
好適な有機結合剤には、０．５から１の置換度を有するアルカリ金属カルボキシメチルセルロース；好ましくは、１，０００未満の平均分子量を有するポリエチレングリコールおよび／またはアルキルポリエトキシレート；リン酸化デンプン；セルロースおよびデンプンエーテル、例えばカルボキシメチルデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよび対応するセルロース混合エーテル；ゼラチンおよびカゼインを含むタンパク質；トラガカント、アルギン酸ナトリウムおよびカリウム、グアムアラビア（ｇｕａｍ  Ａｒａｂｉｃ）、タピオカ、マルトデキストロースおよびデキストリンを含む部分加水分解デンプン、水溶性デンプンを含む多糖；スクロース、転化糖、グルコースシロップおよび糖蜜を含む糖；ポリ（メタ）アクリレート、マレイン酸またはビニル基を含有する化合物とのアクリル酸のコポリマー、ポリビニルアルコール、部分加水分解ポリビニルアセテートならびにポリビニルピロリドンを含む合成水溶性ポリマーが含まれる。上記の化合物が遊離カルボキシル基を含有するものである場合、それらは通常、それらのアルカリ金属塩、より特定すると、それらのナトリウム塩の形態で存在する。
【０１５６】
リン酸化デンプンは、デンプン無水グルコース単位のヒドロキシル基が−−Ｏ−−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２基により置き換えられているデンプン誘導体またはその水溶性塩、より特定するとアルカリ金属塩、例えばナトリウムおよび／またはカリウム塩と理解される。デンプンの平均リン酸化度は、全てのサッカリド単位にわたり平均化されたデンプンのサッカリドモノマー当たりのリン酸基を担持するエステル化酸素原子の数と理解される。好ましいリン酸デンプンの平均リン酸化度は、１．５から２．５の範囲である。
【０１５７】
本発明に関する部分加水分解デンプンは、慣用の例えば酸または酵素触媒プロセスを使用するデンプンの部分加水分解により得ることができる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーと理解される。部分加水分解デンプンは、好ましくは、４４０から５００，０００の平均分子量を有する加水分解生成物である。０．５から４０、より特定すると、２から３０のデキストロース当量（ＤＥ）を有する多糖が好ましく、ＤＥは、デキストロース（１００のＤＥを有する、すなわちＤＥ１００）との比較による多糖の還元効果の標準的尺度である。マルトデキストリン（ＤＥ３〜２０）および乾燥グルコースシロップ（ＤＥ２０〜３７）ならびにさらに約２，０００から３０，０００の比較的高い平均分子量を有するいわゆる黄色デキストリンおよび白色デキストリンの両方をリン酸化後に使用することができる。
【０１５８】
結合剤の好ましいクラスは、水ならびにスクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、および可溶性デンプンからなる群から選択される炭水化物である。好ましい結合剤は、少なくとも５０℃、好ましくは、少なくとも８０℃、より好ましくは、少なくとも１００℃の融点を有する。
【０１５９】
好適な無機結合剤には、ケイ酸ナトリウム、ベントナイト、および酸化マグネシウムが含まれる。
【０１６０】
好ましい結合剤は、「食品グレード」または「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）とみなされる材料である。
【０１６１】
結合剤は、固体ペレット中の（ａ）微生物バイオマス、（ｂ）粉砕剤および（ｃ）結合剤の構成成分の総和に対して約０．５から１０重量パーセント、好ましくは、１から１０重量パーセント、より好ましくは、約３から８重量パーセント存在する。
【０１６２】
当業者が認識するとおり、固定可能な混合物は、容易な取扱（例えば、固定可能な混合物をダイ中に押出すること）を可能とするために最終固体ペレットの水分レベルよりも顕著に高い水分レベルを有する。したがって、例えば、スクロースおよび水の溶液を含む結合剤は、０．５から２０重量パーセントの水を有する固定可能な混合物をもたらす様式で、破砕バイオマス混合物に添加することができる。しかしながら、固定可能な混合物を乾燥させて固体ペレットを形成するとき、固体ペレットの最終水分レベルは５重量パーセント未満の水であり、スクロースは１０重量パーセント未満である。
【０１６３】
少なくとも１つの結合剤を破砕バイオマス混合物とブレンドして固定可能な混合物を提供すること［工程（２）］は、結合剤の溶解および破砕バイオマス混合物とのブレンドを可能とする任意の方法により実施して固定可能な混合物を提供することができる。「固定可能な混合物」という用語は、混合物が乾燥工程における溶媒、例えば水の除去時に固体ペレットを形成し得ることを意味する。
【０１６４】
結合剤は、種々の手段によりブレンドすることができる。１つの方法は、結合剤を溶媒中で溶解させて結合剤溶液を提供し、次いで結合剤溶液を、破砕バイオマス混合物中に制御速度において計量供給することを含む。好ましい溶媒は水であるが、他の溶媒、例えばエタノール、イソプロパノールなどを有利に使用することができる。別の方法は、結合剤を固体または溶液としてバイオマス／粉砕剤に混合工程の開始時またはその間に添加することを含み、すなわち工程（１）および（２）を組み合わせ、同時とする。結合剤を固体として添加する場合、好ましくは、ブレンド工程の間に結合剤を溶解させるために十分な水分が破砕バイオマス混合物中に存在する。好ましいブレンド方法は、結合剤溶液を、押出機中で、好ましくは、上記の圧縮帯域後に破砕バイオマス混合物中に制御速度において計量供給することを含む。圧縮帯域後の結合剤溶液の添加は、破砕バイオマス混合物の急速冷却を可能とする。
【０１６５】
固定可能な混合物からペレット化微生物バイオマスを含む固体ペレットを形成すること［工程（３）］は、当技術分野において公知の種々の手段により実施することができる。１つの方法は、固定可能な混合物をダイ、例えばドーム粗砕機中に押出して均一直径のストランドを形成し、それを振動または流動床乾燥機上で乾燥させてストランドを破壊してペレットを提供することを含む。ペレット化微生物バイオマスは、下流の油抽出、輸送、または他の目的に好適である。
【０１６６】
本明細書に開示される固体ペレットは、望ましくは、室温において非粘着性である。固体ペレットの大部分は、ペレット構造の分解なしで、一緒に結合することもなく何日間も一緒に充填することができる。ペレットの大部分は、望ましくは、自由流動するペレット化組成物である。好ましくは、ペレットは、約０．５から約１．５ｍｍの平均直径および約２．０から約８．０ｍｍの平均長さを有する。好ましくは、固体ペレットは、約０．１％から５．０％の最終水分レベルを有し、約０．５％から３．０％の範囲がより好ましい。最終固体ペレットの水分レベルの増加は、例えばカビの成長に起因する貯蔵の間の困難性をもたらし得る。
【０１６７】
したがって、固体ペレットは、好ましくは、（ａ）約７０から約９８．５重量パーセントの、含油微生物を含む破砕バイオマス；（ｂ）約１から約２０重量パーセントの、吸油し得る粉砕剤；および（ｃ）約０．５から１０重量パーセントの結合剤を含み、重量パーセントは、固体ペレット中の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の総和に対する。固体ペレットは、７５から９８重量パーセントの（ａ）；１から１５重量パーセントの（ｂ）および１から１０重量パーセントの（ｃ）；を含み得、好ましくは、ペレットは、８０から９５重量パーセントの（ａ）；２から１２重量パーセントの（ｂ）および３から８重量パーセントの（ｃ）を含む。
【０１６８】
上記ペレット化方法論は、有効で、高度にスケーラブルで堅牢でユーザフレンドリーある一方、比較的高い収率およびハイスループット速度における生成を可能とすることが証明された。慣用の技術、例えば噴霧乾燥、高剪断混合機などの使用を使用する細胞破砕は、例えば、キチンを含む酵母細胞壁には不適切であることが見出された。現行の湿潤媒体ミル破砕プロセスは、微粉およびコロイド状汚染物を生成し、さらなる分離工程を必要とし、顕著な油損失をもたらした。さらに、湿潤媒体ミル処理工程は、液体担体（例えば、イソヘキサンまたは水）を導入し、固液分離工程を要求することにより下流加工を複雑化し、油損失を伴った。本明細書に記載のペレット化プロセスは、破砕バイオマス混合物の生成に依拠し；しかしながら、有利には、破砕は、液体担体を要求せずに行う。さらに、固体ペレット内の粉砕剤の存在は、高レベルの油抽出を促進すると思われる。ペレットは抽出プロセス全体にわたり耐久性を保持するため、このことは操作性およびサイクル時間を支援する。
【０１６９】
ペレット化微生物バイオマスは、溶媒により抽出して抽出油および抽出ペレット（すなわち、「残留バイオマス」または「残留ペレット」）を提供する。
【０１７０】
油抽出は種々の有機溶媒（例えばヘキサン、イソヘキサン）による処理、酵素的抽出、浸透圧衝撃、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）、鹸化およびそれらの方法の組合せを介して行うことができる。
【０１７１】
一実施形態において、抽出は、有機溶媒により実施して抽出油を生成し、前記抽出油は、抽出油を蒸留する前記工程（ｃ）前に脱ガム処理および場合により漂白する。より具体的には、粗製油をリン脂質ならびに他の極性および中性脂肪複合体の水または酸水和に続く油からの沈殿ガムの分離により脱ガム処理することができる。あるいは、リン脂質および他の水和可能な不純物は、油を極性溶媒、例えばアセトンと接触させることにより、または酵素的脱ガム処理を介して除去することができる。脱ガム処理油は、漂白クレー、シリカまたはカーボンを使用してさらに漂白して有色化合物および残留金属などを除去することができる。
【０１７２】
代替的実施形態において、抽出は、超臨界条件を使用して行う。超臨界流体（ＳＣＦ）は、気体と液体との中間の特性を示す。ＳＣＦの重要な特性は、温度もしくは圧力、またはそれらの組合せを変動させることにより流体密度が液体様から気体様密度に連続的に変動し得ることである。同様に、種々の密度依存性物理的特性は、この領域中で同様の連続的変動を示す。これらの特性の一部には、限定されるものではないが、溶媒強度（ＳＣＦ媒体中の種々の物質の溶解度により証明される）、極性、粘度、拡散性、熱容量、熱伝導性、等温圧縮性、膨張性、収縮性、流動性、および分子充填が含まれる。ＳＣＦの密度変動は、溶質の化学ポテンシャル、ひいては反応速度および平衡定数にも影響する。したがって、ＳＣＦ媒体中の溶媒環境は、種々の密度依存性流体特性を調整することにより規定の用途について最適化することができる。
【０１７３】
系の温度および圧力が、臨界温度（Ｔｃ）および臨界圧力（Ｐｃ）により定義される対応する臨界点値を超過する場合、流体はＳＣＦ状態である。純粋な物質について、ＴｃおよびＰｃは、蒸気および液相が共存し得る最高値である。Ｔｃを超えると、印加される圧力にかかわらず純粋な物質について液体は形成しない。同様に、Ｐｃおよび臨界モル容積は、蒸気および液相が融合する状態に対応するこのＴｃにおいて定義される。多成分混合物についてはより複雑になるが、混合物の臨界状態は、共存する蒸気および液相の特性が区別不能になる条件として同様に同定される。超臨界流体の考察については、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌ．ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄ．，Ｖｏｌ．２３，ｐｇ．４５２−４７７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９７）参照。
【０１７４】
任意の好適なＳＣＦまたは液体溶媒を、油抽出工程、例えば、固体ペレットを溶媒と接触させて微生物バイオマスから油を分離することにおいて使用することができ、それには、限定されるものではないが、ＣＯ２、テトラフルオロメタン、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、イソブタン、イソブテン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、およびそれらの混合物が含まれるが、全ての試薬および生成物に不活性であることを条件とする。好ましい溶媒には、ＣＯ２またはＣ３−Ｃ６アルカンが含まれる。より好ましい溶媒は、ＣＯ２、ペンタン、ブタン、およびプロパンである。最も好ましい溶媒は、ＣＯ２を含む超臨界流体溶媒である。
【０１７５】
好ましい実施形態において、超臨界ＣＯ２抽出は、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書に開示されるとおり実施する。この特定の方法論を適用することにより、ペレット化微生物バイオマスを超臨界油抽出条件に供する。リン脂質（ＰＬ）は、残留バイオマス（すなわち、抽出残留ペレット）内に残留する一方、得られる抽出物（すなわち、実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含む抽出物）を少なくとも１回分別して中性脂肪および／または遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含み得る一方、実質的にＰＬを含まないリファインド脂質組成物を含む抽出油を生成する。リファインド脂質組成物は、溶媒により処理されなかったペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してＴＡＧ（好ましくは、ＰＵＦＡを含む）を富化することができる。リファインド脂質組成物は、さらなる精製に付して精製油を生成することができる。
【０１７６】
この方法において、ＣＯ２を含む超臨界流体は、追加の溶媒の存在または量がプロセスに有害でない限り、例えば、微生物バイオマス中に含有されるＰＬを一次抽出工程の間に可溶化させない限り、少なくとも１つの追加の溶媒（すなわち、共溶媒）、例えば、上記列挙の溶媒の１つ以上をさらに含み得る。しかしながら、極性共溶媒、例えばエタノール、メタノール、アセトンなどを添加して溶媒相に極性を故意に付与して、任意選択の二次油抽出の間に微生物バイオマスからのＰＬの抽出を可能としてＰＬを単離することができる。
【０１７７】
含油破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットは、少なくとも２つの方法に従って好適な抽出条件下で液体または超臨界ＣＯ２と接触させて抽出物および残留バイオマスを提供することができる。米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書の第１の方法によれば、ペレット化微生物バイオマスのＣＯ２との接触を、溶媒密度の増加に対応する抽出条件下で、例えば増加圧力および／または温度減少下で複数回実施して脂質画分がＰＬを実質的に含まないリファインド脂質組成物を含む抽出物を得る。抽出物のリファインド脂質組成物は、ＦＦＡ、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびＴＡＧの分布がそれらの相対溶解度に従って変動し、それは複数の抽出のそれぞれの選択抽出条件に対応する溶媒密度に依存する。
【０１７８】
あるいは、および本方法によれば、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書の第２の方法において、ペレット化微生物バイオマスは、溶媒、例えばＣＯ２と、ＰＬを実質的に含まない脂質画分を含む抽出物を提供するために選択された抽出条件下で接触させ、続いて一連の複数の段階的圧力降下工程に付してリファインド脂質組成物を提供する。これらの段階的圧力降下工程のそれぞれは、分別機容器中で、溶媒密度の減少に対応する圧力および温度条件下において実施して液相リファインド脂質組成物を単離し、それを例えば簡単なデカンテーションにより抽出相から分離することができる。提供されるリファインド脂質組成物は、ＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの分布が、それらの相対溶解度に従って変動し、それは段階的分別機容器の選択条件に対応する溶媒密度に依存する。
【０１７９】
上記第２の方法を使用して得られるリファインド脂質組成物を有する抽出油は、抽出条件が適切に適合する場合、第１の方法において得られる抽出物に対応し得る。したがって、第１の方法の実施を介して本明細書に記載のとおり得ることができるリファインド脂質組成物を例示することが可能と考えられる。
【０１８０】
本方法によれば、含油破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットは、溶媒、例えば液体またはＳＣＦ  ＣＯ２と、ＰＬを実質的に含まない脂質画分を含む抽出物を得るために十分な温度および圧力ならびに接触時間において接触させることができる。脂質画分は、中性脂肪（例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、およびＭＡＧを含む）およびＦＦＡを含み得る。接触および分別温度は、液体またはＳＣＦ  ＣＯ２を提供するように、ＰＵＦＡの熱安定性の範囲内であるように、ならびにＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、およびＦＦＡを可溶化させるために十分なＣＯ２の密度を提供するように選択することができる。一般に、接触および分別温度は、約２０℃から約１００℃、例えば約３５℃から約１００℃であり得；圧力は、約６０ｂａｒから約８００ｂａｒ、例えば約８０ｂａｒから約６００ｂａｒであり得る。十分な接触時間、および適切なＣＯ２と微生物バイオマスとの比は、固体ペレットの特定の試料についての抽出曲線を作成することにより決定することができる。これらの抽出曲線は、温度、圧力、ＣＯ２流速、ならびに可変要素、例えば細胞破砕の程度および微生物バイオマスの形態の抽出条件に依存する。本方法の一実施形態において、溶媒は、液体または超臨界流体ＣＯ２を含み、ＣＯ２と微生物バイオマスとの質量比は、約２０：１から約７０：１、例えば約２０：１から約５０：１である。
【０１８１】
次いで、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含む抽出物を分別して少なくとも１つのＰＵＦＡを含むリファインド脂質組成物を有する抽出油を得ることができ、リファインド脂質組成物は、溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してＴＡＧが富化されている。リファインド脂質組成物は、ＤＡＧ、ＭＡＧ、またはそれらの組合せをさらに含み得る。リファインド脂質組成物は、ＦＦＡをさらに含み得る。分別工程において別個にまたは組合せで得ることができる他のリファインド脂質組成物には、ＦＦＡが枯渇したＴＡＧ富化生成物、ＴＡＧが枯渇したＦＦＡ富化生成物、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧが富化されたＦＦＡ富化生成物、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧが枯渇したＦＦＡ富化生成物、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧが富化されたＴＡＧ富化生成物、ならびにＭＡＧおよび／またはＤＡＧが枯渇したＴＡＧ富化生成物が含まれる。用いられる分別条件によれば、本方法の一実施形態において、リファインド脂質組成物は、ペレット化微生物バイオマスの油組成物に対してＦＦＡを枯渇させることができる。一実施形態において、リファインド脂質組成物は、ペレット化微生物バイオマスの油組成物に対して少なくとも１つのＰＵＦＡを富化させすることができる。一実施形態において、リファインド脂質組成物は、ペレット化微生物バイオマスの油組成物に対して２０個以上の炭素原子を有する少なくとも１つのＰＵＦＡを富化させることができる。
【０１８２】
分別は、分別条件の温度、圧力、または温度および圧力を変えることにより実施することができる。分別は、例えば、超臨界流体リッチ抽出物の連続減圧、一連のミキサーセトラー段階または抽出カラムにおける液体もしくはＳＣＦ溶媒抽出、短行程蒸留、真空蒸気ストリッピング、または溶融結晶化を含むいくつかの分離プロセスの１つにおいて実施することができる。抽出物を分別する工程は、１回以上繰り返して追加のリファインド脂質組成物を提供することができる。
【０１８３】
例えば、抽出物の圧力の低減により、溶解溶質の溶解度を低下させ、それぞれの分離容器中で別個の液相が形成される。それぞれの分離容器にフィードされる抽出物の温度は、例えば、熱交換器の使用を介して調整してそれぞれの分離容器中で所望の溶媒密度および対応する溶質溶解度を提供することができる。初期抽出物は、類似の溶解度パラメーターを示す種々のタイプの脂質構成成分（例えば、ＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧ）の複合混合物からなるため、種々の構成成分の正確な分離が達成されるのではなく、分別工程において得られるそれぞれのリファインド脂質組成物は生成物の分布を含有する。しかしながら、一般に、より小さい溶解性の化合物は、最大圧力において稼働する第１の分離容器中で凝縮し、最大の溶解性の化合物は、最低圧力において稼働する最終分離容器中で凝縮する。最終分離容器は、抽出物相中の残留溶質のバルクを本質的に除去するために十分に抽出物相の圧力を低減させ、この容器の頂部からの比較的純粋なＣＯ２流は、初期抽出容器に戻して再循環させることができる。
【０１８４】
図２は、本明細書の抽出法の一実施形態を概略的に説明する。図２において、ペレット化微生物バイオマスを含む流１０およびＣＯ２を含む流３８が容器１４に流入することが示される。ペレット化微生物バイオマスを含む流１２および流１６は、容器１８に流入することが示される。少なくとも１つのＰＵＦＡを含むペレット化微生物バイオマスのＣＯ２との接触は、容器１４中で初期温度Ｔ１４および圧力Ｐ１４において生じ、容器１８中で温度Ｔ１８および圧力Ｐ１８において生じる。Ｔ１４は、Ｔ１８と同一でも異なってもよく；Ｐ１４は、Ｐ１８と同一でも異なってもよい。平衡化ＣＯ２および抽出物の得られる混合物は、容器１４を流１６として出て容器１８に流入し、バイオマスおよびＣＯ２のさらなる接触が生じて流２０として示される実質的にＰＬを含まない脂質画分を含む抽出物を提供する。残留バイオマス（図示せず）は、容器１４および１６中に残留する。所望により、追加の抽出容器をこのプロセスに含めることができる（図示せず）。あるいは、このプロセスは、所望により１つのみの抽出容器を使用し得る（図示せず）。２つ以上の抽出容器の使用は、有利であり得る。それというのも、これは、抽出容器（図示せず）への溶媒添加の相対順序を変化させることによりプロセスを介する連続ＣＯ２流を可能とし得るためであり、１つ以上の抽出容器をラインから離脱させ（図示せず）、例えばペレット化微生物バイオマスを装填し、または残留バイオマスを除去する。
【０１８５】
抽出容器の下流において、並列に配置された２つの分離容器の容器２２および２８が示され、抽出物の分別を、段階的減圧を介して、場合により、例えば熱交換器（図示せず）の使用を介して温度を調整して実施する。所望により、追加の分離容器をこのプロセスに含めることができる（図示せず）。ＣＯ２および実質的にＰＬを含まない脂質画分を含む抽出物が、容器２２に流２０として流入することが示される。容器２２において、圧力Ｐ２２はＰ１８よりも低く、温度Ｔ２２はＴ１８と同一でも異なってもよく；プロセスの稼働条件下で、より小さい溶解性の脂質構成成分を含む別個の液相が形成される。抽出物の分別から得られる別個の液相は、容器２２を流２４として出ることが示され、それは第１のリファインド脂質組成物を表す。流２６として示される残留抽出物は、次の分離容器２８に導入し、圧力Ｐ２８はＰ２２と比較して低減させ、温度Ｔ２８はＴ２２と同一でも同一でなくてもよい。プロセスの稼働条件は、容器２８中で別個の液相の形成を可能とし、それは流３０として分離容器２８を出ることが示される。流３０は、第２のリファインド脂質組成物を表す。
【０１８６】
容器２８から、流３２として示される比較的純粋なＣＯ２を含む残留抽出物を、抽出容器１４および／または別の抽出容器（図示せず）に再循環させることができる。ＣＯ２の再循環は、典型的には、ワンススルーＣＯ２使用と比べて経済的利益を提供する。流３４として示されるパージ流は、ＣＯ２のプロセスへの連続的再循環により構築され得る揮発構成成分を除去するために使用することができる。補給ＣＯ２は、パージを介して生じたＣＯ２損失を相殺するために添加することができる。補給ＣＯ２は、流３６に加わる補給プＣＯ２流８により、図２に示される再循環ＣＯ２流に添加して組合せＣＯ２流３８を提供することができる。あるいは、追加のＣＯ２を、別個のフィード流として容器１４および／または容器１８に添加することができる（図示せず）。
【０１８７】
図３は、本発明の方法の抽出工程の一実施形態を概略的に説明する。図３において、ＣＯ２を含む流７０を、ペレット化微生物バイオマス（図示せず）を含有する抽出容器７６中に導入する。場合により、共溶媒（流７２として示される）をＣＯ２流にポンプ（図示せず）を使用して添加してＣＯ２および共溶媒を含む組合せ流７４を提供する。共溶媒を使用しない場合、流７０および流７４は同一であり、ＣＯ２のみを含有する。ＣＯ２の、少なくとも１つのＰＵＦＡを含むペレット化微生物バイオマスとの接触は容器７６中で生じ、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含む抽出物を容器から流７８としてＣＯ２溶媒および場合により共溶媒とともに取り出す。残留バイオマス（図示せず）は、抽出容器中に残留する。次いで、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含む抽出物を、図２を参照して上記のとおり少なくとも１つの分離容器中で分別することができ、または場合により、実質的にＰＬを含まない脂質画分を抽出物からＣＯ２および場合により共溶媒を排出することにより単離することができる（図示せず）。
【０１８８】
上記一次抽出からの残留バイオマスは、ＰＬを含む。この残留バイオマスを極性抽出溶媒、例えば極性有機溶媒、例えば塩化メチレンまたはＣＯ２を含む混合溶媒および極性共溶媒、例えばアルコールにより２度目に抽出して中性脂肪を含まないＰＬ画分を得ることができる。極性溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、および／または２−プロパノールを含み得る。ＰＬを含む残留バイオマスおよび抽出ＰＬ画分は、水産養殖飼料としての使用に好適であり得る。
【０１８９】
本明細書に記載のＣＯ２ベースの抽出プロセスは、慣用の有機溶媒ベースのプロセスに対していくつかの利点を提供する。例えば、ＣＯ２は、非毒性、非可燃性、環境に優しく、容易に入手可能であり、安価である。ＣＯ２（Ｔｃ＝３１．１℃）は、熱的に不安定な脂質を微生物バイオマスから比較的低い温度において抽出して油中の脂質分解を最小化し得る。抽出脂質は、有機溶媒をストリッピングさせるための熱処理を介してではなく、ＣＯ２を加圧抽出物から簡単に排出することによりＣＯ２溶媒から単離することができる。リファインド脂質画分は、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含む抽出物から単離することができる。ＰＬを含有する残留微生物バイオマスは、例えば、水産養殖飼料のための販売可能な副産物である。ＰＬは、残留微生物バイオマスから中性脂肪が枯渇した比較的純粋な副産物として抽出することができる。実質的にＰＬを含まない抽出中性脂肪画分は、分別して実質的にＰＬを含まない脂質画分に対してＦＦＡおよびＤＡＧが富化された（ＴＡＧが枯渇した）脂質画分ならびに実質的にＰＬを含まない脂質画分に対してＴＡＧが富化された（ＦＦＡおよびＤＡＧが枯渇した）リファインド脂質組成物を生成することができる。
【０１９０】
蒸留工程は、短行程蒸留（ＳＰＤ）蒸留器を介する抽出微生物油（例えば、リファインド脂質組成物）の少なくとも１回の通過を含む。市販のＳＰＤ蒸留器は、化学エンジニアリングの技術分野において周知である。好適な蒸留器は、例えば、Ｐｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）から入手可能である。ＳＰＤ蒸留器は、蒸発器および凝縮器を含む。典型的な蒸留は、蒸発器の温度、凝縮器の温度、蒸留器中への油のフィード速度および蒸発器の真空レベルにより制御する。
【０１９１】
当業者が認識するとおり、ＳＰＤ蒸留器を介する通過の数は、抽出油の水分のレベルに依存する。含水率が低ければ、ＳＰＤ蒸留器を介する単一の通過で十分であり得る。
【０１９２】
しかしながら、好ましくは、蒸留は、ＳＰＤ蒸発器を介する抽出油（例えば、リファインド脂質組成物）の２回以上の連続通過を含む複数回通過プロセスである。第１の通過は、典型的には、約１から５０ｔｏｒｒ圧、好ましくは、約５から３０ｔｏｒｒ圧下で、蒸発器の比較的低い表面温度、例えば、約１００から１５０℃で実施する。このことは、残留水および低分子量有機材料が蒸留されるため、脱水油をもたらす。次いで、脱水油を蒸発器のより高温およびより低圧において蒸留器を介して通過させてステロールが濃縮された蒸留物画分およびＴＡＧ含有画分（すなわち、脂質含有画分）を提供する。
【０１９３】
一部の実施形態において、抽出油はＳＰＤ条件下での蒸留後に除去することができるステロール画分を含む。より具体的には、抽出油がステロール画分を含む場合、短行程蒸留条件下での少なくとも１回の蒸留は、ステロールを含む蒸留物画分および短行程蒸留に供されなかった抽出油中のステロールの量と比較して低減した量のステロールを含む脂質含有画分をもたらす。上記考察のとおり、ステロール画分は、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロールおよびデスモステロールからなる群から選択される１つ以上のステロールを含み得る。
【０１９４】
ＴＡＧ含有脂質画分の追加の通過は、蒸留器を介して行ってさらなるステロールを除去することができる。それぞれの追加の通過について、蒸留温度は、直前の蒸留の温度に対して増加させることができる。好ましくは、ステロール画分の量の低減が、ステロール含有微生物油のステロール画分と比較して少なくとも約４０％〜７０％、好ましくは、少なくとも約７０％〜８０％、より好ましくは、約８０％超になるように十分な通過を実施する。
【０１９５】
好ましくは、ＳＰＤ条件は、３０ｍＴｏｒｒ以下、好ましくは、５ｍＴｏｒｒ以下の真空レベルにおけるステロール含有微生物油（すなわち、リファインド脂質組成物）の少なくとも１回の通過を含む。好ましくは、ＳＰＤ条件は、約２２０から３００℃、好ましくは、約２４０から２８０℃における少なくとも１回の通過を含む。
【０１９６】
したがって、例えば、一実施形態において、抽出油は、（ｉ）少なくとも１つのＰＵＦＡを含み、（溶媒により処理されていないペレット化微生物バイオマスの油組成物に対して）ＴＡＧが富化され；（ｉｉ）少なくとも３００ｍｇ／１００ｇのステロール画分を含むリファインド脂質組成物である。ＳＰＤ条件下で少なくとも１回蒸留に供した場合、蒸留は、ステロールを含む蒸留物画分およびＳＰＤに供されなかったリファインド脂質組成物と比較して改善された澄明性を有する低減したステロール画分を有するＴＡＧを含む脂質含有画分を生成する。改善された澄明性は、油の混濁性または不透明性の欠落を指す。ステロール含有微生物油は、約１０℃未満の温度における貯蔵時に、低温における油中のステロールの低減した溶解度に起因して混濁する。蒸発プロセスは、得られる脂質含有画分が低減した量の存在するステロールを有し、したがって約１０℃における貯蔵時に澄明なままであるか、または実質的に澄明であるようにステロール画分の実質的部分を除去するように作用する。油の澄明性を評価するために使用することができる試験法は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＯＣＳ）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｃ  １１−５３（“Ｃｏｌｄ  Ｔｅｓｔ”，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＣＳ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＡＯＣＳ，２００９、参照により本明細書に組み込まれる）である。
【０１９７】
驚くべきことに、蒸留プロセスにおけるステロールの除去は、ＰＵＦＡ、例えばＥＰＡリッチの油の顕著な分解なしで達成することができる。油の分解は、ＰＵＦＡ含有率およびクロマトグラフィープロファイリング（以下実施例２３に実証）に基づき評価することができる。
【０１９８】
脂質含有画分の回収は、蒸発器を介する通過の完了後に画分を好適な容器に迂回させることにより達成することができる。
【０１９９】
抽出微生物油またはその生成物（例えば、脂質含有画分）中の脂肪酸は、典型的には、生物学的形態、例えばトリグリセリドまたはリン脂質である。これらの形態の脂肪酸プロファイルを富化することは困難であるため、微生物油の個々の脂肪酸は、通常、当業者に周知の技術を使用するエステル交換により遊離させる。脂肪酸エステル混合物はエステル交換前の微生物油と実質的に同一の脂肪酸プロファイルを有するため、エステル交換プロセスの生成物は、依然として、典型的には、未濃縮微生物油（すなわち、エステル形態）とみなされる。
【０２００】
ＴＦＡの重量％として計測して３０から７０重量％の所望のＰＵＦＡを含む微生物油（微生物油は、油として乾燥細胞重量の２５％を超過して蓄積する含油微生物から得られる）の富化は、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％の所望のＰＵＦＡを含む油濃縮物（すなわち、「油濃縮物」）をもたらす。具体的には、微生物油のエチルまたは他のエステルは、所望のＰＵＦＡ（例えば、ＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ）を富化することができ、当技術分野において一般に使用される方法、例えば：分留、尿素アダクト形成、短行程蒸留、向流カラムを用いる超臨界流体分別、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、酵素的分離および銀塩による処理、擬似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトグラフィーならびにそれらの組合せにより分離することができる。
【０２０１】
したがって、例えば、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を作製する方法であって：
ａ）ＴＦＡの重量％として計測して３０から７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まない本発明の脂質含有画分をエステル交換すること；および
ｂ）工程（ａ）のエステル交換油を富化して油重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を得ること
含む方法が本明細書に開示される。
【０２０２】
例えば、ＴＦＡの重量％として計測して５８．２％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの未濃縮精製微生物油（すなわち、脂質含有画分）を、本明細書の実施例２７に提供する。この脂質含有画分は、実施例２８で尿素アダクト形成法を介して、得られるＥＰＡエチルエステル（ＥＰＡ−ＥＥ）濃縮物が油の重量％として計測して７６．５％のＥＰＡ−ＥＥを含み、実質的にＤＨＡを含まないように富化する。同様に、実施例２９は、液体クロマトグラフィーを介する同一脂質含有画分の富化を実証し、得られるＥＰＡ−ＥＥ濃縮物は、油の重量％として計測して８２．８％または９５．４％のＥＰＡ−ＥＥを含み、実質的にＤＨＡを含まない。実施例３０は、超臨界流体クロマトグラフィーを介する同一脂質含有画分の富化を実証し、油の重量％として計測して８５％または８９．８％のＥＰＡ−ＥＥを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物をもたらす。
【０２０３】
ＴＦＡの重量％として計測して５６．１％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの代替的な未濃縮ＳＰＤ精製微生物油（すなわち、脂質含有画分）を、実施例３１に提供する。実施例３２におけるこの脂質含有画分の富化は、分留を介して行い、それにより油の重量％として計測して７３％のＥＰＡ−ＥＥを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を生成する。分留は、有利には、油中に存在する低分子量エチルエステル（すなわち、主に実施例３２の脂質含有画分中のＣ１８であるが、それに限定されるものではない）の多くを除去する。
【０２０４】
ＴＦＡの重量％として計測して５４．７％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まないヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの代替的な未濃縮ＳＰＤ精製微生物油（すなわち、脂質含有画分）を、実施例３４に提供する。この脂質含有画分の富化は、分留および液体クロマトグラフィーを介して行い、それにより油の重量％として計測して９７．４％のＥＰＡ−ＥＥを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まないＥＰＡ濃縮物を生成する。当業者は、富化プロセス（例えば、分留、尿素アダクト形成、短行程蒸留、逆流カラムを用いる超臨界流体分別、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、酵素的分離および銀塩による処理、擬似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトグラフィー）の他の組合せが本発明のＥＰＡ濃縮物を生成するために利用することができることを認識すべきである。
【０２０５】
例えば、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を作製することが特に有利であり得：前記方法は、（ａ）ＴＦＡの重量％として計測して３０から７０重量％のＥＰＡを含む脂質含有画分のエステル交換反応；（ｂ）低分子量エチルエステル、すなわち、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸を含むものの多くの除去のための分留を含む第１の富化プロセス；ならびに（ｃ）尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトグラフィーならびにそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の富化プロセスを含む。分留の結果としての油試料中の低濃度のＣ１４、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸は、後続の富化プロセスを促進し得る。
【０２０６】
当業者により認識されるとおり、エチルエステル形態の上記のＥＰＡ濃縮物のいずれも、所望により他の形態、例えば、メチルエステル、酸もしくはトリアシルグリセリドなど、もしくは任意の他の好適な形態またはその組合せに容易に変換することができる。ＰＵＦＡのある誘導体から別の誘導体への化学的変換の手段は、周知である。例えば、トリグリセリドは、鹸化により開裂酸のナトリウム塩に、さらに酸性化により遊離脂肪酸に変換することができ、エチルエステルは、グリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化することができる。したがって、ＥＰＡ濃縮物は最初にエチルエステルの形態であることが予期される一方、これは決して限定されるものではない。したがって、ＥＰＡ濃縮物内の油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、およびそれらの組合せの形態のＥＰＡを指し、エステルは、最も好ましくは、エチルエステルの形態である。
【０２０７】
当業者は、所望のＰＵＦＡ濃縮物が油の重量％として計測して少なくとも７０重量％の所望のＰＵＦＡを有するように、任意の好ましいレベルの脂質含有画分のＰＵＦＡ富化をもたらすように処理条件を最適化することができることを認識する（しかし、増加したＰＵＦＡ純度は、ＰＵＦＡ収率に反比例することが多い）。したがって、当業者は、所望のＰＵＦＡの重量％が７０％から１００％まで（１００％を含む）の任意の整数割合（またはその分数）、すなわち、具体的には、油の重量％として計測して７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の所望のＰＵＦＡであり得ることを認識する。
【０２０８】
より具体的には、本発明の一実施形態において、油の重量％として計測して少なくとも８０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物が提供される。別の実施形態において、油の重量％として計測して少なくとも９０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物が提供される。さらに別の実施形態において、油の重量％として計測して少なくとも９５重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物が提供される。
【０２０９】
好ましい実施形態において、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まない上記ＥＰＡ濃縮物は、実質的にＮＤＰＡを含まず、実質的にＨＰＡを含まないとさらに特性決定することができる。
【０２１０】
任意の特定の用途に限定されるものではないが、本発明のＰＵＦＡ濃縮物は、医薬としての使用に特に十分に好適である。当業者に周知のとおり、ＰＵＦＡは、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、飲料中で分散させることができる散剤、または別の固体経口剤形、液体（例えば、シロップ剤）、軟ゲルカプセル剤、コート軟ゲルカプセル剤または他の慣用の剤形、例えばカプセル剤中の経口液体中で投与することができる。カプセル剤は、硬シェル化または軟シェル化のものであり得、ゼラチンまたは獣医源のものであり得る。ＰＵＦＡは、注射または注入に好適な液体中に含有させることもできる。
【０２１１】
さらに、ＰＵＦＡは、１つ以上の非活性医薬成分（本明細書において一般に「賦形剤」としても公知）の組合せにより投与することもできる。非活性成分は、例えば、活性成分を安全で簡便、他の点では使用に許容可能な適用可能および有効な製剤に可溶化、懸濁、増粘、希釈、乳化、安定化、保存、保護、着色、フレーバリング、および適合させるように機能する。
【０２１２】
賦形剤には、限定されるものではないが、界面活性剤、例えばプロピレングリコールモノカプリレート、グリセロールおよび長鎖脂肪酸のポリエチレングリコールエステルの混合物、ポリエトキシ化ヒマシ油、グリセロールエステル、オレオイルマクロゴールグリセリド、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、ポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、共溶媒、例えばエタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびに油、例えばヤシ油、オリーブ油またはベニバナ油が含まれ得る。界面活性剤、共溶媒、油またはそれらの組合せの使用は、一般に、医薬分野において公知であり、当業者に理解されるとおりであるため、任意の好適な界面活性剤を本発明およびその実施形態と同時に使用することができる。
【０２１３】
組成物の用量濃度、用量スケジュールおよび投与期間は、意図される作用の発現に十分であるべきであり、例えば、剤形、投与経路、症状の重症度、体重、年齢などに応じて適切に調整することができる。組成物は、経口投与する場合、１日当たり３つの分割用量で投与することができるが、組成物は、代替的に、単回用量またはいくつかの分割用量で投与することができる。
【０２１４】
少なくとも１つのＰＵＦＡ、例えばＥＰＡ（またはその誘導体）を含む抽出油組成物は、周知の臨床および薬学的価値を有する。例えば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３Ａ１号明細書参照。例えば、ＰＵＦＡを含む脂質組成物を、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を防止もしくは治療するために食事代用品または補助品、特に特殊調製粉乳として使用することができる。あるいは、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）を、通常使用において受容者が食事補給について所望量を受容するように配合された食用油、脂肪またはマーガリン中に取り込むことができる。ＰＵＦＡは、特殊調製粉乳、栄養補助品または他の食品中にも取り込むことができ、抗炎症またはコレステロール低下剤として使用することができる。場合により、組成物は、ヒトまたは動物のいずれかの薬学的使用に使用することができる。
【０２１５】
ヒトまたは動物のＰＵＦＡの補給は、添加ＰＵＦＡ、およびそれらの代謝結果のレベルの増加をもたらし得る。例えば、ＥＰＡによる治療は、ＥＰＡのレベルの増加だけでなく、ＥＰＡの下流生成物、例えばエイコサノイド（すなわち、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）、ＤＰＡｎ−３およびＤＨＡのレベルの増加ももたらし得る。複雑な調節機序は、種々のＰＵＦＡを組み合わせ、またはＰＵＦＡの異なるコンジュゲートを添加してそのような機序を防止、制御または克服して個体における所望レベルの規定のＰＵＦＡを達成することを望ましくし得る。
【０２１６】
あるいは、ＰＵＦＡ、またはその誘導体は、動物および水産飼料、例えば乾燥飼料、半湿潤および湿潤飼料の合成において利用することができる。それというのも、これらの配合物は、一般に、栄養組成物の少なくとも１〜２％がω−３および／またはω−６ＰＵＦＡであることを要求するためである。
【実施例】
【０２１７】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ挙げられるものと理解すべきである。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認してその趣旨および範囲を逸脱することなく本発明の種々の変更および改変を行い、それを種々の使用および条件に適応させることができる。
【０２１８】
以下の略語が使用される：
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーであり、「ＡＳＴＭ」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓであり、「Ｃ」は摂氏であり、「ｋＰａ」はキロパスカルであり、「ｍｍ」はミリメートルであり、「μｍ」はマイクロメートルであり、「μＬ」はマイクロリットルであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「Ｌ」はリットルであり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｍＭ」はミリモル濃度であり、「ｍＴｏｒｒ」はミリＴｏｒｒであり、「ｃｍ」はセンチメートルであり、「ｇ」はグラムであり、「ｗｔ」は重量であり、「ｈ」または「ｈｒ」は時間であり、「ｔｅｍｐ」または「Ｔ」は温度であり、「ＳＳ」はステンレス鋼であり、「ｉｎ」はインチであり、「ｉ．ｄ．」は内径であり、「ｏ．ｄ．」は外径である。
【０２１９】
材料
バイオマス調製
ＰＵＦＡを含む種々の量の微生物油を生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）酵母の株について、下述する。バイオマスは２段階流加発酵プロセスで得、次いで下記のとおり下流加工に供した。
【０２２０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の作製は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ８６７２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約６１．８％のＥＰＡを生成し得た。
【０２２１】
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ８６７２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、およびＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
【０２２２】
上記発現カセットの構造は、簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」により表され、Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結する。略称は、以下のとおりである：ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）δ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）δ−９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成突然変異体δ−８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化δ−８デサチュラーゼ遺伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９  δ−９エロンガーゼ（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）と、δ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍは、δ−９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前出）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する合成突然変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］であり；ＥａＤ５ＳＭは、Ｅ．アナベナ（Ｅ．Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］に由来する合成突然変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）δ−１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、Ｐ．アファニデルマタム（Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１７デサチュラーゼ遺伝子であり；ＹｌＣＰＴ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］であり；ＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来するコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子である。
【０２２３】
Ｙ８６７２株の総脂質含有率および組成の詳述な分析のために、細胞を２段階で合計７日間成長させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ８６７２株は３．３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生成し、細胞の総脂質含有率は２６．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は１６．４であり、それぞれの脂肪酸濃度をＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（パルミテート）は２．３、１６：１（パルミトレイン酸）は０．４、１８：０（ステアリン酸）は２．０、１８：１（オレイン酸）は４．０、１８：２（ＬＡ）は１６．１、ＡＬＡは１．４、ＥＤＡは１．８、ＤＧＬＡは１．６、ＡＲＡは０．７、ＥＴｒＡは０．４、ＥＴＡは１．１、ＥＰＡは６１．８、その他は６．４。
【０２２４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の作製は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ９５０２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを生成し得た。
【０２２５】
野生型Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ９５０２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ｕｎｋｎｏｗｎ９−、ｕｎｋｎｏｗｎ１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹＩＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０２２６】
上記定義されていない略語は、以下のとおり：ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）δ−９エロンガーゼ［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作出されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【０２２７】
Ｙ９５０２株の総脂質含有率および組成の詳述な分析のために、細胞を２段階で合計７日間成長させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ９５０２株は３．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生成し、細胞の総脂質含有率は３７．１［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は２１．３であり、それぞれの脂肪酸濃度をＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（パルミテート）は２．５、１６：１（パルミトレイン酸）は０．５、１８：０（ステアリン酸）は２．９、１８：１（オレイン酸）は５．０、１８：２（ＬＡ）は１２．７、ＡＬＡは０．９、ＥＤＡは３．５、ＤＧＬＡは３．３、ＡＲＡは０．８、ＥＴｒＡは０．７、ＥＴＡは２．４、ＥＰＡは５７．０、その他は７．５。
【０２２８】
Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来し、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、２８〜３２％の総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を有する総脂質に対して約５０〜５２％のＥＰＡを生成し得るヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｆ１Ｂ１株の作製は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に記載されている。具体的には、Ｙ４３０５Ｆ１Ｂ１株は、開示が全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書の一般的方法（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）において既に記載されているＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株に由来する。
【０２２９】
野生型Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ４３０５株の最終遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。
【０２３０】
上記定義されていない略語は、以下のとおり：ＥｇＤ５は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）δ−５デサチュラーゼであり［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］；ＥｇＤ５Ｓは、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来するコドン最適化δ−５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＲＤ５Ｓは、ペリジニウム種（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６［米国特許第７，６９５，９５０号明細書］に由来するコドン最適化δ−５デサチュラーゼである。
【０２３１】
Ｙ４３０５細胞の総脂質含有率は２７．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、脂質プロファイルは以下のとおりであり、それぞれの脂肪酸の濃度はＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］としてである：１６：０（パルミテート）は２．８、１６：１（パルミトレイン酸）は０．７であり、１８：０（ステアリン酸）は１．３、１８：１（オレイン酸）は４．９、１８：２（ＬＡ）は１７．６、ＡＬＡは２．３、ＥＤＡは３．４、ＤＧＬＡは２．０、ＡＲＡは０．６、ＥＴＡは１．７、ＥＰＡは５３．２である。
【０２３２】
Ｙ４３０５株を、スルホニル尿素［「ＳＵＲ」］耐性に基づくＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についての優勢非抗生物質マーカーを用いる形質転換に供した。より具体的には、マーカー遺伝子は、スルホニル尿素除草剤耐性を付与する単一アミノ酸変化、すなわち、Ｗ４９７Ｌを有する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（「ＡＨＡＳ」またはアセトラクテートシンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）である（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットの配列番号２９２）。米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に記載のとおり、ＳＵＲ遺伝子マーカーのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４３０５株中へのランダム統合を使用して、親Ｙ４３０５株に対して油性条件下で成長させた場合に増加した脂質含有率を有する細胞を同定した。
【０２３３】
２リットル発酵条件下で評価した場合、Ｙ４３０５株についての平均ＥＰＡ生成率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、突然変異体ＳＵＲ  Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株についての５０〜５２と比較して５０〜５６であった。Ｙ４３０５株についての平均脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株についての２８〜３２と比較して２０から２５であった。したがって、脂質含有率は、ＥＰＡ生成率に対する最小の影響でＹ４５０３−Ｆ１Ｂ１株について２９〜３８％増加した。
【０２３４】
発酵：振とうフラスコ中で、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の凍結培養物から接種材料を調製した。インキュベーション期間後、培養物を使用して種発酵槽に接種した。種培養物が適切な標的細胞密度に達したとき、次いでそれを使用してより大きな発酵槽に接種した。発酵は、２段階流加法である。第１の段階において、高細胞密度への急速成長を促進する条件下で酵母を培養し；培養培地は、グルコース、種々の窒素源、微量金属、およびビタミンを含むものであった。第２の段階において、酵母を窒素飢餓状態にし、グルコースを連続的にフィードして脂質およびＰＵＦＡの蓄積を促進した。標準操作条件につき温度（３０〜３２℃に制御）、ｐＨ（５〜７に制御）、溶解酸素濃度およびグルコース濃度を含むプロセス可変要素をモニタリングおよび制御して一貫したプロセス性能および最終ＰＵＦＡ油の品質を確保した。
【０２３５】
発酵当業者は、発酵ラン自体、培地条件、プロセスパラメーター、スケールアップなど、ならびに培養物をサンプリングする特定の時点に応じて規定のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の油プロファイルに変動が起きることを把握する（例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書参照）。
【０２３６】
下流加工：加工前に抗酸化剤を発酵ブロスに場合により添加して、ＥＰＡ油の酸化安定性を確保した。酵母バイオマスを脱水し、洗浄して塩と残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小化した。次いで、ドラム乾燥（典型的に８０ｐｓｉｇの蒸気による）または噴霧乾燥のいずれかを実施して水分レベルを５％未満に低減させ、短期貯蔵および輸送の間の油安定性を確保した。約１０から１００ミクロンの範囲の粒子サイズ分布を有するドラム乾燥フレーク、または噴霧乾燥粉末を、以下の比較例および実施例において最初の「含油微生物を含む微生物バイオマス」として使用した。
【０２３７】
粉砕剤：Ｃｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土は、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡから入手可能である。Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土は、ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ａｎ  Ｅａｇｌｅ  Ｐｉｔｃｈｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶから入手可能である。
【０２３８】
他の材料：全ての市販の試薬はそのまま使用した。使用された全ての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。塩化アセチルは、９９＋％であった。ＴＬＣプレートおよび溶媒は、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から入手した。ＨＰＬＣまたはＳＣＦグレード二酸化炭素は、ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から入手した。
【０２３９】
２軸スクリュー押出法
粉砕剤を用いる乾燥酵母バイオマスの破砕および破砕バイオマス混合物の調製において、２軸スクリュー押出を使用した。
【０２４０】
乾燥酵母を押出機、好ましくは、下記稼働を達成するために好適な長さ、通常２１〜３９Ｌ／Ｄを有する２軸スクリュー押出機中にフィードする。押出機の第１の区画を使用して材料をフィードおよび輸送する。第２の区画は、次第に短くなるピッチ長を有するブッシュエレメントを使用してフィードを圧密および圧縮するように設計された圧密帯域である。圧密帯域後、細胞破砕に要求される機械的エネルギーのほとんどを付与するために機能する圧縮帯域が続く。この帯域は、リバーススクリューエレメント、制限／ブリスターリングエレメントまたはニーディングエレメントの形態のいずれかの流動制限を使用して作出される。破砕バイオマスを調製するとき、粉砕剤（例えば、珪藻土）を典型的には微生物バイオマスフィードと、両方が圧縮／圧密帯域を通るように同時にフィードし、こうして破砕レベルを向上させる。圧縮帯域後、結合剤（例えば、水／スクロース溶液）を液体注入ポートを介して添加し、混合エレメントの種々の組合せからなる後続の混合区画中で混合する。最終混合物（すなわち、「固定可能な混合物」）は、端部において開口する最終バレルを介して排出し、こうして押出機中の背圧をほとんど生じさせないかまたは生じさせない。次いで、固定可能な混合物をドーム粗砕機および振動または流動床乾燥機のいずれかにフィードする。これは、下流の油抽出に好適なペレット化材料（すなわち、固体ペレット）をもたらす。
【０２４１】
ＣＯ２によるＳＣＦ抽出
乾燥および機械的に破砕された酵母細胞を、一般に、グラスウールのプラグで充填された抽出容器に装填し、ＣＯ２によりフラッシュし、次いでＣＯ２流下で所望の稼働条件に加熱および加圧した。ＣＯ２を、排出管を備えた市販のシリンダから直接フィードし、高圧ポンプにより計量供給した。圧力は、容器の流出側上の制流子の使用を介して抽出容器上で維持し、油試料は、試料容器中で回収する一方、同時にＣＯ２溶媒を大気に排出する。共溶媒（例えば、エタノール）は、共溶媒ポンプ（Ｉｓｃｏモデル１００Ｄシリンジポンプ）の使用を介して抽出容器にフィードされた抽出溶媒に場合により添加することができる。
【０２４２】
特に記載のない限り、下記の実施例における酵母試料の超臨界ＣＯ２抽出は、特注高圧抽出装置（図１）中で実施した。一般に、乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（自由流動する、またはペレット化されたもの）を、グラスウールのプラグで充填された抽出容器（１）に装填し、ＣＯ２によりフラッシュし、次いでＣＯ２流下で所望の稼働条件に加熱および加圧した。８９ｍｌ抽出容器は、３１６ＳＳ管（２．５４ｃｍのｏ．ｄ．ｘ１．９３ｃｍのｉ．ｄ．ｘ３０．５ｃｍの長さ）から製作し、容器の流出端部上に２ミクロン焼結金属フィルターを備えた。抽出容器を、自動化温度制御装置により制御される４つのｃａｌｒｏｄ加熱カートリッジを備える特注機械加工アルミニウムブロックの内側に設置した。排出管を備える市販のシリンダー（２）からＣＯ２を液体として直接フィードし、冷蔵ヘッドアセンブリ（ＪａｓｃｏモデルＰＵ−１５８０−ＣＯ２）を備える高圧容積式ポンプ（３）により計量供給した。抽出圧力は、容器の流出側上で流動制限を提供する自動背圧調節装置（４）（ＪａｓｃｏモデルＢＰ−１５８０−８１）により維持し、抽出油試料を試料容器中で回収する一方、同時にＣＯ２溶媒を大気に発散させた。
【０２４３】
報告される酵母試料からの油抽出収率は、抽出の間の試料からの質量損失を計測することにより重量測定した。したがって、報告される抽出油は、微生物油および固体ペレットに伴う水分を含む。
【０２４４】
実施例
比較例Ｃ１、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、実施例１、実施例２ならびに比較例Ｃ３およびＣ４：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のドラム乾燥フレークからの破砕バイオマス混合物を作出するための手段の比較
比較例Ｃ１、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ３およびＣ４ならびに実施例１および２は、酵母（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）のドラム乾燥フレークの破砕を最適化するために実施された一連の比較試験を記載する。具体的には、粉砕剤を添加するかまたは添加しないハンマーミル処理を試験し、単軸スクリューまたは２軸スクリュー押出機のいずれかを使用した。結果を総遊離微生物油および微生物細胞の破砕効率、ならびに総抽出収率（超臨界ＣＯ２抽出に基づく）に基づき比較する。
【０２４５】
比較例Ｃ１：
粉砕剤を用いないハンマーミル処理酵母粉末
２４．２％の総油（乾燥重量）を含有する酵母（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）バイオマスのドラム乾燥フレークを、周囲温度においてジャンプギャップ（ｊｕｍｐ  ｇａｐ）分別機を１６０００ｒｐｍにおいて使用して３つのハンマーによりハンマーミル処理（１２Ｋｇ／ｈのフィード速度におけるＭｉｋｒｏｐｕｌ  Ｂａｎｔａｍミル）してミル処理粉末を提供した。ミル処理粉末の粒子サイズは、フラウンホーファーレーザー回折を使用して水中で懸濁させて分析してｄ１０＝３μｍ；ｄ５０＝１６μｍおよびｄ９０＝１０８μｍであった。
【０２４６】
比較例Ｃ２Ａ：
粉砕剤および空気ミル混合を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ１により提供されたハンマーミル処理酵母粉末（８３３ｇ）を、空気（ジェット）ミル（Ｆｌｕｉｄ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｅｔ−ｏ−ｍｉｚｅｒ  ０１０１、６Ｋｇ／ｈのフィード速度）中でＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土（１６７ｇ）と周囲温度において約２０分間混合した。
【０２４７】
比較例Ｃ２Ｂ：
粉砕剤および手動混合を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ１により提供されたハンマーミル処理酵母粉末（８３３ｇ）を、プラスチックバッグ中でＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土（１６７ｇ）と手動で混合した。
【０２４８】
実施例１：
粉砕剤、手動混合、および単軸スクリュー押出機を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ２Ｂからの珪藻土を有するハンマーミル処理酵母粉末（１０００ｇ）を、１７．６重量％のスクロース水溶液（２９１．６ｇの水中６２．５ｇのスクロース）とＨｏｂａｒｔ混合機中で約２．５分間混合し、次いで１ｍｍの開口部を有する単軸スクリュードーム粗砕機に通して押出した（５０〜２００ｐｓｉ、５５０ｉｎ−ｌｂｓを超過しないトルク；４０℃以下の押出物温度）。押出物を流動床乾燥機中で、６５℃に制御された流動空気を使用して５０℃の床温度に乾燥させて、約１４分後に３．９％の残留水を有する非粘着ペレット（８１５ｇ、２から８ｍｍの長さおよび約１ｍｍ直径の寸法を有する）を提供した。
【０２４９】
実施例２：
粉砕剤、空気ミル混合、および単軸スクリュー押出機を用いるハンマーミル酵母処理粉末
比較例Ｃ２Ａからの珪藻土を有するハンマーミル酵母粉末（１０００ｇ）を実施例１に従って加工して、約１０分後に６．９％の残留水を有するペレット（８５５ｇ、２から８ｍｍの長さおよび約１ｍｍ直径の寸法を有する）を提供した。
【０２５０】
比較例Ｃ３：
粉砕剤を用いず、２軸スクリュー押出機を用いるハンマーミル処理酵母粉末
比較例Ｃ１から提供されたハンマーミル処理酵母粉末を、１０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより１５０ｒｐｍおよび６６〜６８の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で２６℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２５１】
比較例Ｃ４：
粉砕剤を用いず、２軸スクリュー押出機を用いる酵母粉末
２４．２％の総油を含有する酵母（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）バイオマスのドラム乾燥フレークを、１０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより１５０ｒｐｍおよび７１〜７３の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で２３℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２５２】
破砕酵母粉末における遊離微生物油および破砕効率の比較
遊離微生物油および破砕効率は、実施例１および２、ならびに比較例Ｃ１〜Ｃ４の破砕酵母粉末において以下の方法に従って測定した。具体的には、押出バイオマス試料の遊離油および総油含有率は、Ｔｒｏｅｎｇ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃ．，３２：１２４−１２６（１９５５））により報告された方法の改変バージョンを使用して測定した。この方法において、押出バイオマスの試料を、計測容積のヘキサンを有するステンレス鋼遠心分離管中に秤量した。総油を測定すべき場合、いくつかのクロム鋼ボールベアリングを添加した。遊離油を測定すべき場合、ボールベアリングは使用しなかった。次いで、管にキャップし、シェーカー上に２時間装入した。振とうさせた試料を遠心分離し、上清を回収し、容積を計測した。一定の重量が得られるまで、ヘキサンを上清から、最初に回転フィルム蒸発により、次いで乾燥窒素流下での蒸発により蒸発させた。次いで、この重量を使用して元の試料中の遊離または総油の割合を計算した。油含有率は、試料の含水率の計測によりパーセント乾燥重量基準で表現し、適宜補正する。
【０２５３】
パーセント破砕効率（すなわち、加工の間に破断した細胞壁のパーセント）は、光学的可視化により定量した。
【０２５４】
表７は、実施例１および２、ならびに比較例Ｃ１〜Ｃ４についての酵母細胞破砕効率データをまとめ、以下のことを表す：
【０２５５】
比較例Ｃ１は、粉砕剤の不存在下でのハンマーミル処理が酵母細胞の３３％の破砕をもたらすことを示す。
【０２５６】
比較例Ｃ２Ａは、粉砕剤の存在下でのハンマーミル処理酵母の空気ジェットミル処理が、酵母細胞の破砕を６２％に増加させることを示す。
【０２５７】
実施例１は、粉砕剤の存在下でのＨｏｂａｒｔ単軸スクリュー混合機中でのハンマーミル処理酵母（比較例Ｃ１からのもの）のさらなる混合が、酵母細胞の破砕を３８％に増加させることを示す。
【０２５８】
実施例２は、Ｈｏｂａｒｔ単軸スクリュー混合機中での空気ミル処理およびハンマーミル処理酵母と粉砕剤（比較例Ｃ２Ａからのもの）とのさらなる混合が、酵母細胞の破砕を５７％に増加させることを示す。
【０２５９】
比較例Ｃ３およびＣ４は、粉砕剤の不存在下、ハンマーミル処理を用いるかまたは用いない場合（それぞれ）、圧縮帯域を有する２軸スクリュー押出を使用すると、酵母細胞破砕は８０％超であったことを示す。
【０２６０】
【表８】
2014510165.tif 000010
【０２６１】
ＳＣＦ抽出
抽出容器に、約２５ｇ（酵母基準）の比較例Ｃ１、Ｃ２ＡおよびＣ４の破砕酵母バイオマスをそれぞれ装填した。酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。酵母をこれらの条件において４．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約６．７ｈｒ抽出し、約７５ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。抽出収率を以下の表に報告する。
【０２６２】
データは、より高い細胞破砕は、粗製抽出油の重量パーセントとして計測された顕著に高い抽出収率をもたらすことを示す。
【０２６３】
【表９】
2014510165.tif 000011
【０２６４】
比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃ：
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から破砕バイオマス混合物を作出するための手段の比較
比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃは、破砕酵母粉末を調製するために実施された一連の比較試験を記載し、最初の微生物バイオマスは、２軸スクリュー押出機中で粉砕剤と混合したかまたは混合しない酵母のドラム乾燥フレークまたは噴霧乾燥粉末であった。
【０２６５】
比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃのそれぞれにおいて、最初の酵母バイオマスは、２．８％の水分レベルを有し、約３６％の総油を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのものであった。乾燥酵母フレークまたは粉末（粉砕剤を有するかまたは有さない）を、１０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより１５０ｒｐｍにおいて稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）にフィードした。得られた破砕酵母粉末を最終水冷バレル中で冷却した。
【０２６６】
次いで、比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃにおいて調製された破砕酵母粉末を超臨界ＣＯ２抽出に供し、総抽出収率を比較した。
【０２６７】
比較例Ｃ５Ａ：
粉砕剤を用いないドラム乾燥酵母フレーク
酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、３４〜３５の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２７℃に冷却した。
【０２６８】
比較例Ｃ５Ｂ：
粉砕剤を用いるドラム乾燥酵母フレーク
９２．５部の酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、７．５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、４４〜４７の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２９℃に冷却した。
【０２６９】
比較例Ｃ５Ｃ：
粉砕剤を用いるドラム乾燥酵母フレーク
８５部の酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、１５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、４８〜５１の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２９℃に冷却した。
【０２７０】
比較例Ｃ６Ａ：
粉砕剤を用いない噴霧乾燥酵母粉末
酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、３３〜３４の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２６℃に冷却した。
【０２７１】
比較例Ｃ６Ｂ：
粉砕剤を用いる噴霧乾燥酵母粉末
９２．５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、７．５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、３７〜３８の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２６℃に冷却した。
【０２７２】
比較例Ｃ６Ｃ：
粉砕剤を用いる噴霧乾燥酵母粉末
８５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、１５部の珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ  ２０９）とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、３８〜３９の％トルク範囲により稼働する２軸スクリュー押出機に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。破砕酵母粉末を２７℃に冷却した。
【０２７３】
ＳＣＦ抽出
抽出容器に、１１．７ｇ（酵母基準）の比較例Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６Ａ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃの破砕酵母バイオマスをそれぞれ装填した。酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において４．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約３．２ｈｒ抽出し、約７５ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。種々の配合物についての抽出収率を表９に報告する。
【０２７４】
データは、粉砕剤としての珪藻土を有する試料（すなわち、比較例Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、Ｃ６ＢおよびＣ６Ｃ）が、珪藻土が存在しない場合（すなわち、比較例Ｃ５ＡおよびＣ６Ａ）よりも高い抽出収率をもたらすことを示す。
【０２７５】
【表１０】
2014510165.tif 000012
【０２７６】
実施例３、４、５、６、７、８、９および１０
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から固体ペレットを作出するための手段の比較
実施例３〜１０は、酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末またはドラム乾燥フレークを、粉砕剤および結合剤と混合して破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットを提供するために実施された一連の比較試験を記載する。
【０２７７】
実施例３〜１０のそれぞれにおいて、最初の酵母バイオマスは、２．８％の水分レベルを有し、約３６％の総油を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのものであった。約１ｍｍ直径×２〜８ｍｍ長さの固体ペレットの調製後、ペレットを超臨界ＣＯ２抽出に供し、総抽出収率を比較した。固体ペレットの機械的圧縮特性および耐摩耗性も分析した。
【０２７８】
実施例３：
８５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、１５部のＣｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１４部の水および５．１部の糖から作製された水／糖溶液を、押出機の破砕帯域後に８．２ｍｌ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび５８〜６０の％トルク範囲において稼働して最終水冷バレル中で２４℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２７９】
次いで、固定可能な混合物を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、７０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を６７．５ｋｇ／ｈｒおよび定常２．７アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１０分間乾燥させて、７．１％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２８０】
実施例４：
実施例３に従って調製された固定可能な混合物を、粗砕機に４５ＲＰＭにおいて導通させた。押出物を３１．７ｋｇ／ｈｒにおいて形成し、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１０分間乾燥させて８．１５％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２８１】
実施例５：
実施例３に従って調製された固定可能な混合物を、粗砕機に９０ＲＰＭにおいて導通させた。押出ペレットをＭＤＢ−４００流動床乾燥機中で１５分間乾燥させて４．５３％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２８２】
実施例６：
８５部の酵母バイオマスの噴霧乾燥粉末を、１５部のＣｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび７０〜７４の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で３１℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２８３】
次いで、破砕酵母粉末を、スクロースおよび水の２２．６％溶液（すなわち、１７．５部の水および５．１部の糖）とＫｉｔｃｈｅｎ  Ａｉｄ混合機中で混合した。総混合時間は４．５分間であり、最初の２分間にわたり溶液を添加した。
【０２８４】
固定可能な混合物を、１ｍｍの穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、７０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機にフィードした。押出物を７１．４ｋｇ／ｈｒおよび定常２．７アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で合計２０分間乾燥させて６．５％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２８５】
実施例７：
実施例６に従って調製された破砕酵母粉末を、スクロースおよび水の２２．６％溶液（すなわち、１７．５部の水および５．１部の糖）を有するＫＤＨＪ−２０回分式シグマブレードニーダー中に装入した。総混合時間は３．５分間であり、最初の２分間にわたり溶液を添加した。
【０２８６】
固定可能な混合物を、１ｍｍの穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機にフィードした。押出物を４７．５ｋｇ／ｈｒおよび定常２．３アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で合計１５分間乾燥させて７．４％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２８７】
実施例８：
酵母バイオマスのドラム乾燥フレークを、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび３８〜４０の％トルク範囲において稼働する１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に１．８ｋｇ／ｈｒにおいてフィードして最終水冷バレル中で３０℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２８８】
破砕酵母粉末（６９．５部）を、１２．２％のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土（１２．２部）および水と糖との比３．３から作製されたスクロース水溶液（１８．３部）とＫｉｔｃｈｅｎ  Ａｉｄ混合機中で混合した。総混合時間は４．５分間であり、最初の２分間にわたり溶液を添加した。
【０２８９】
固定可能な混合物を、１ｍｍの穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機にフィードした。押出物を６８．２ｋｇ／ｈｒおよび定常２．５アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で合計１５分間乾燥させて６．８３％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２９０】
実施例９：
酵母バイオマスのドラム乾燥フレーク（８５部）を、１５部のＣｅｌｉｔｅ  ２０９珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に２．３ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１４部の水および５．１部の糖から作製された水／糖溶液を、押出機の破砕帯域後に８．２ｍｌ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび６１〜６５の％トルク範囲において稼働して最終水冷バレル中で２５℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０２９１】
次いで、固定可能な混合物を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を８１．４ｋｇ／ｈｒおよび定常２．５アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１５分間乾燥させて、８．３％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。
【０２９２】
実施例１０：
酵母バイオマスのドラム乾燥フレーク（８５部）を、１５部のＣｅｌａｔｏｍ  ＮＭ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に４．６ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１４部の水および５．１部の糖から作製された水／糖溶液を、押出機の破砕帯域後に８．２ｍｌ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、３００ｒｐｍおよび約３４の％トルク範囲において稼働して破砕酵母粉末を提供した。
【０２９３】
次いで、固定可能な混合物を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、９０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を８１．４ｋｇ／ｈｒおよび定常２．５アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で１５分間乾燥させて固体ペレットを提供した。
【０２９４】
固体ペレットの圧縮試験および耐摩耗性
圧縮試験を以下のとおり実施した。ＡＳＴＭ規格Ｄ−６６８３に記載の試験装置およびプロトコルを使用して外部負荷、例えばガス圧勾配により負荷されるものに対する固体ペレットの応答を評価した。本試験において、既知質量の容積を機械的に適用される圧密ストレスの関数として計測する。結果の片対数グラフは、典型的には、試料の圧縮を反映する傾きβを有する直線である。βの値が高ければ圧縮が大きいことを反映する。この圧縮は、加工の間に不所望な隔離およびガス流制限をもたらす粒子破損を示し得る。
【０２９５】
ＡＳＴＭ試験の最後、負荷をペレット上でさらに２時間維持し、加工時間の延長を模擬した。２時間後に計測されたクリープは、固体ペレットが変形する見込みのさらなる指標である。クリープが低ければ変形が少ないことを示す。
【０２９６】
次いで、試料を含有する試験セルを反転させ、ペレット試料を注ぎ出した。必要により、セルを穏やかにタップして内容物を放出させた。セルを空にすることの容易性およびペレットの得られるテキスチャー（すなわち、ルーズまたは凝集）を記録した。
【０２９７】
試験後のテキスチャーは、事前の計測において使用された試験セルを空にするのがいかに困難であるかの定性的観察である。最も望ましい試料は直ちに注ぎ出た一方、一部の試料はタップの量の増加を要し、大きい塊になり得た（すなわち、あまり望ましくない）。
【０２９８】
耐摩耗性を測定するため、次いで圧縮試験ＡＳＴＭ試験において事前に圧縮した固体ペレット（１０ｇ）を３インチ直径の５００ミクロンの篩に移した。篩を手作業でタップして５００ミクロンよりも小さいペレットのいかなる最初の断片も除去した。残留ペレットの正味重量を記録した。次いで、それぞれ０．５０インチ直径×０．５０インチ厚でそれぞれ重量５．３グラムの３つの円筒粉砕媒体ビーズを、篩に添加した。篩を自動篩いシェーカー（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ＳＳ−３、「８」の設定、自動化タップ「オン」）に装入し、２、５または１０分の時間振とうさせた。粉砕媒体ビーズは、ペレットにランダムな角度から何度も衝突する。振とう後、篩下のパンを秤量して摩耗し、篩を介して落下した材料の量を測定した。本試験は、油抽出プロセス後のペレットの極めて粗い取扱を模擬するものとする。
【０２９９】
実施例３〜１０からの固体ペレットをそれぞれ分析してそれらの圧縮特性および耐摩耗性を決定した。結果を以下に表１０にまとめる。
【０３００】
【表１１】
2014510165.tif 000013
【０３０１】
ＳＣＦ抽出
抽出容器に、実施例３〜９からの固体ペレット（乾燥重量基準、表１１に列挙）をそれぞれ装填した。ペレットをＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。ペレットをこれらの条件において４．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約６．８ｈｒ抽出し、約１５０ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。一部の実施例において、総抽出時間が１１．６時間になるように第２のランをさらに４．８時間実施した。油抽出収率および抽出に使用された規定のパラメーターを表１１に列挙する。
【０３０２】
【表１２】
2014510165.tif 000014
【０３０３】
残留ペレット（抽出後）の圧縮試験および耐摩耗性
ＳＣＦ抽出後、実施例３〜９からの残留ペレットをそれぞれ分析してそれらの圧縮特性および耐摩耗性を決定した。結果を以下の表１２にまとめる。
【０３０４】
【表１３】
2014510165.tif 000015
【０３０５】
上記に基づき、本明細書に記載の方法［すなわち、（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕バイオマス混合物を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；ならびに（ｃ）固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程を含む方法］は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットを生成するために首尾良く利用することができることが結論づけられる。さらに、本実施例は、固体ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ペレットを溶媒（すなわち、ＳＣＦ抽出）により抽出して微生物油を含む抽出物を提供することができることを実証する。
【０３０６】
実施例１１
Ａ．酵母細胞バイオマス、油、および残留バイオマス試料についての脂質分布を測定する方法
酵母細胞試料および残留バイオマス試料（すなわち、ＣＯ２による抽出後の酵母細胞）を、Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ（Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ２００３に概説された手順に基づく）の方法の改変を使用して抽出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離し、メタノール性塩化水素を使用して直接エステル化／エステル交換した。油試料をクロロホルム／メタノール中で溶解させ、次いでＴＬＣにより分離し、直接エステル化／エステル交換した。エステル化／エステル交換した試料は、ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０３０７】
酵母細胞および残留バイオマス試料は、乾燥粉末として受容した。試料の所定の部分（ＰＵＦＡ濃度に応じて１００〜２００ｍｇ以下）を、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）キャップを有する１３×１００ｍｍガラス試験管中に秤量し、それに３ｍＬ容量の２：１（容量：容量）メタノール／クロロホルム溶液を添加した。試料を十分にボルテックスにかけ、穏やかに撹拌させ、反転させながら室温において１時間インキュベートした。１時間後、１ｍＬのクロロホルムおよび１．８ｍＬの脱イオン水を添加し、混合物を撹拌し、次いで遠心分離して形成された２つの層を分離した。パスツールピペットを使用して、下層を第２のタール塗布１３ｍｍガラスバイアル中に取り出し、水性上層を第２の１ｍＬのクロロホルムの部分により３０分間再抽出した。２つの抽出物を合わせ、「第１の抽出物」とみなした。溶媒は、ＴｕｒｂｏＶａｐ（商標）を使用して５０℃において乾燥窒素を用いて除去し、残留油は適切量の６：１（容量：容量）クロロホルム／メタノール中で再懸濁させて１００ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０８】
上記のとおり得た油（酵母細胞および残留バイオマス試料について）および酵母細胞のＣＯ２抽出からの油試料を、ＴＬＣにより分析した。ＴＬＣは、典型的には、１つの槽を使用して行ったが、個々のＰＬを同定すべき場合には２つの槽の手順も用いた。１つの槽のＴＬＣ手順において、５×２０ｃｍシリカゲル６０プレート（ＶＷＲから得たＥＭＤ＃５７２４−３）を、プレート下部から２ｃｍにわたり薄い鉛筆の線を描くことにより調製した。適切量の試料（約６０μＬ）を、鉛筆の線の頂部上のプレートにわたり完全にスポットし、スポット間にいかなる空間も残さなかった。第２のプレートに既知のスタンダードおよび試料を１〜２μ量を使用してスポットした。プレートを５〜１０分間空気乾燥させ、プレートのラン前に一片のブロッティングペーパーにより槽中で少なくとも３０分間平衡化したヘキサン−ジエチルエーテル酢酸混合物（７０：３０：１容量基準）を使用して展開した。
【０３０９】
プレートを上部の１／４インチ以内に展開させた後、それらをＮ２環境中で１５分間乾燥させた。次いで、スタンダードおよび小さい試料スポットを有する第２のプレートを、ヨウ素結晶により飽和させて調製プレートについての参照として機能する槽中で展開させた。調製プレート上のバンドは、バンドの端部をヨウ素により極めて薄く染色し、鉛筆を使用してバンドをそれぞれの画分（すなわち、ＰＬ画分、ＦＦＡ画分、ＴＡＧ画分およびＤＡＧ画分）に従ってグルーピングすることにより同定した。ＤＡＧバンドは、１，２−ＤＡＧ、１，３−ＤＡＧ、およびＭＡＧバンドの一部の分離を示し得、典型的には、この全領域をＤＡＧバンドとして切り取った。バンドをゲルから切り取り、１３ｍｍガラスバイアルに移した。プレートの残部をヨウ素槽中で展開させて対象のバンドの完全な取り出しを確認した。
【０３１０】
それぞれのバンドを含有するガラスバイアルに、適切量のトルエン中のトリグリセリド内部スタンダードを添加した。それぞれのバンドの可視濃度に応じて、１００μＬの０．１から５ｍｇ／ｍＬ内部スタンダードを通常使用した。共溶媒（この場合、トルエン）を内部スタンダードとともに添加した。内部スタンダードを使用しなかった場合、追加の共溶媒を添加して長鎖脂質のエステル化／エステル交換を完了させた。１ｍＬの１％メタノール性塩化水素溶液（５ｍＬの塩化アセチルを５０ｍＬの冷却乾燥メタノールにゆっくり添加することにより調製）を添加し、試料をキャップし、穏やかに混合し、加熱ブロック中に８０℃において１時間装入した。１時間後、試料を取り出し、冷却させた。１ｍＬの１Ｎ塩化ナトリウム溶液および４００μＬのヘキサンを添加し、次いで試料を少なくとも１２秒間ボルテックスにかけ、遠心分離して２つの層を分離した。次いで、上層を、水性（下）層のいずれによっても汚染しないように慎重に扱い取り出した。上層を、インサートを装着したＧＣバイアル中に装入し、キャップした。
【０３１１】
試料は、火炎イオン化検出器（ＦＩＤ）およびＯｍｅｇａｗａｘ  ３２０カラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ  ＩＤ  ×２５μｍフィルム厚、Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｆｏｎｔｅ，ＰＡ）により製造）を備えたＡｇｉｌｅｎｔモデル６８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して分析した。ヘリウムキャリアガスを、２０：１または３０：１のスプリット比で１〜３ｍＬ／ｍｉｎの範囲内で一定に保持した。オーブン条件は以下のとおりであった：０分間の初期時間および０．５分間の平衡化時間で１６０℃の初期温度。温度傾斜は０分間の最終保持時間について２００℃まで５度／ｍｉｎ、次いで合計１６分間について保持時間の４分間について２４０℃まで１０度／ｍｉｎであった。インレットは２６０℃に設定した。ＦＩＤ検出器も２６０℃に設定した。Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ  ＧＬＣ参照スタンダード（＃４６１）を、滞留時間確認のためにランした。
【０３１２】
ＧＣ結果はＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｒｅｐｏｒｔｓを使用して収集し、それぞれの脂肪酸の面積をそれらの割合の計算のためにＥｘｃｅｌスプレッドシートに移した。次いで、脂質クラス中の脂肪酸の総量を変換するための補正係数を適用することができた。それぞれの構成成分の総割合を、ＴＬＣ前に誘導体化された元の抽出物と比較した。
【０３１３】
Ｂ．抽出法
抽出は、一般的方法に従って実施した。以下の実施例１２〜２０に報告される酵母および抽出油中の種々の脂質構成成分の分析は、本明細書に上記の薄層およびガスクロマトグラフィー法を使用して測定した。酵母試料について、このまとめは、分析手順を使用して試料から抽出された脂質の分析を反映する。抽出酵母試料についてこの手順により分析された脂質の量は、同等のフィード酵母および油抽出物試料の量と比較して比較的小さい（典型的には、出発フィード酵母中の抽出可能な油の＜３％）。結果のまとめの表は、試料のそれぞれについての脂質構成成分の相対分布を示す。表上部にわたり横の列に示されるそれぞれの同定された脂質構成成分について、リン脂質（ＰＬ）、ジアシルグリセリド（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、およびトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）としてのその構成成分の相対分布を、表の欄の下方に示す。それぞれの試料についての第１のラインは、ＴＬＣ前に誘導体化された元の抽出物の分析を示す。続くラインは、ＴＬＣおよびＧＣによるそれぞれの構成成分の分析を挙げ、それぞれの構成成分の総割合をその試料についての最後のラインで表す。
【０３１４】
以下の実施例１２〜２０において、報告された油の抽出収率は、抽出前の酵母試料と抽出後の残留バイオマスとの間の重量差により測定し、割合として表現した。重量差は、ＣＯ２と接触させることにより抽出された油の量に起因すると想定した。得られた油の実重量は、一般に、質量差に基づき予期された重量の約８５％以内と見出された。
【０３１５】
実施例１２
３１１ｂａｒおよび４０℃における抽出曲線
本実施例の目的は、抽出曲線の作成を実証することであった。３１６ＳＳ管（０．９５ｃｍのｏ．ｄ．×０．６２ｃｍのｉ．ｄ．×２６．７ｃｍの長さ）から製作された８ｍＬ抽出容器に、公称２．７ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を一連の抽出のために繰り返し装填して４０℃および３１１ｂａｒにおけるこの酵母試料についての抽出曲線を決定した。それぞれの抽出のため、抽出容器および酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いでＣＯ２により４０℃において３１１ｂａｒに加圧した。表１３に示すとおり、酵母試料をこれらの条件および種々の時間にわたる１．５ｇ／ｍｉｎのＣＯ２流速において抽出して対応する抽出収率をもたらす一連の溶媒フィード比を得た。図４は、これらのデータを抽出曲線でプロットする。約４０ｇのＣＯ２／ｇ酵母の溶媒フィード比における曲線中の中断は、選択温度および圧力においてこの特定の酵母試料中の利用可能な油を効率的に抽出するために少なくともこの溶媒比が要求されることを示す。
【０３１６】
一連の抽出は、異なる温度および／または圧力条件において繰り返して特定の微生物バイオマス試料についての一連の抽出曲線を作成することができ、このことは例えば経済、所望の抽出収率、または使用されるＣＯ２の総量に基づく最適な抽出条件の選択を可能とする。
【０３１７】
【表１４】
2014510165.tif 000016
【０３１８】
比較例Ｃ７
得られた抽出物の分別を用いない酵母細胞の抽出
本比較例の目的は、抽出物の分別も残留バイオマスの連続抽出も用いずにＣＯ２による微生物バイオマスの抽出、およびそうして得られた抽出物の脂質組成を実証することであった。３１６ＳＳ管（１．２７ｃｍのｏ．ｄ．×０．９４ｃｍのｉ．ｄ．×２６．０ｃｍの長さ）から製作された１８ｍＬの抽出容器に、４．９９ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填した。酵母試料をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、２２２ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において２．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において５．５時間抽出し、１４９ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物の収率は１８．２重量％であった。
【０３１９】
以下の表は、出発フィード酵母（微生物バイオマス）、抽出酵母（残留バイオマス）、および得られた抽出物についての脂質分析をまとめる。酵母細胞について、５０重量パーセント（重量％）のＦＦＡおよび５９．８重量％のＴＡＧが、３／６の割合［フィード酵母中のＥＰＡを含むＦＦＡの重量％をフィード酵母中のＦＦＡの総重量％により割ったもの、割合として表現し、両方のパーセント値はＴＬＣ分析から採用した］および４９／８２の割合［フィード酵母中のＥＰＡを含むＴＡＧの重量％をフィード酵母中のＴＡＧの総重量％により割ったもの、割合として表現し、両方のパーセント値はＴＬＣ分析から採用した］としてそれぞれ計算されたＥＰＡを含有することが見出された。抽出物中のＰＬの不存在（０重量％）は、出発フィード酵母中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残留し、ＣＯ２により抽出物中に区分化しないことを示す。結果は、抽出物が９０重量％のＴＡＧ、４重量％のＦＦＡ、および６重量％のＤＡＧを含有することも示す。抽出物について、５０％のＦＦＡおよび５８．９％のＴＡＧが、２／４の割合［抽出物中のＥＰＡを含むＦＦＡの重量％を抽出物中のＦＦＡの総重量％により割ったもの、割合として表現し、両方のパーセント値はＴＬＣ分析から採用した］および５３／９０の割合（抽出物中のＥＰＡを含むＴＡＧの重量％を抽出物中のＴＡＧの総重量％により割ったもの、割合として表現し、両方のパーセント値はＴＬＣ分析から採用した）としてそれぞれ計算されたＥＰＡを含有することが見出された。
【０３２０】
【表１５】
2014510165.tif 000017
【０３２１】
実施例１３
連続圧力抽出による脂質分別
本実施例の目的は、酵母試料の連続圧力抽出および得られた抽出物の脂質組成物を実証することであった。３１６ＳＳ管（１．２７ｃｍのｏ．ｄ．×０．９４ｃｍのｉ．ｄ．×２６．０ｃｍの長さ）から製作された１８ｍＬ抽出容器に、３．５０ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填した。
【０３２２】
抽出物Ａ：酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、１２５ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において２．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において５時間抽出し、その時間において圧力を１５０ｂａｒに増加させた。抽出をさらに１．２時間継続し、２３８ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物Ａの収率は１１．７重量％であった。
【０３２３】
抽出物Ｂ：抽出を、同一の部分抽出酵母試料を用いて圧力を２２２ｂａｒに増加させ、ＣＯ２流を２．３ｇ／ｍｉｎにおいて４．０時間継続することにより継続し、この画分について１５３ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物Ｂの収率は、抽出容器に装填された元の酵母の６．２重量％であった。
【０３２４】
以下の表は、出発フィード酵母および２つの抽出物についての脂質分析をまとめる。結果は、用いられる抽出条件下で、微生物バイオマス油のＦＦＡおよびＤＡＧが抽出物Ａ（９重量％のそれぞれを含有）に選択的に区分化された一方、抽出物ＢはＴＡＧが富化された（１重量％のＤＡＧのみ含有し、ＦＦＡは計測されなかった）ことを示す。より具体的には、抽出物Ｂは、約９９％のＴＡＧであり、ＴＡＧの約６２．６％が、６２／９９の割合［抽出物Ｂ中のＥＰＡを含むＴＡＧの重量％を抽出物Ｂ中のＴＡＧの総重量％により割ったもの、割合として表現し、両方のパーセント値はＴＬＣ分析から採用した］として計算された）ＥＰＡを含有することが見出された。対照的に、酵母細胞のＴＡＧの約５９．８％が、４９／８２の割合（フィード酵母中のＥＰＡを含むＴＡＧの重量％をフィード酵母中のＴＡＧの総重量％により割ったもの、割合として表現し、両方のパーセント値はＴＬＣ分析から採用した）として計算されたＥＰＡを含有することが見出された。これらの結果は、続いて段階的減圧を介して分別される抽出物を提供するための酵母試料のＳＣＦＣＯ２抽出により得ることができる結果と類似することが予期される。
【０３２５】
【表１６】
2014510165.tif 000018
【０３２６】
実施例１４
連続圧力抽出による脂質分別
本実施例の目的は、異なる抽出条件下での酵母試料の連続圧力抽出および得られる抽出物の脂質組成を実証することであった。３１６ＳＳ管（２．５４ｃｍのｏ．ｄ．×１．９３ｃｍのｉ．ｄ．×３０．５ｃｍの長さ）から製作された８９ｍＬ抽出容器に、１５．０ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填した。
【０３２７】
抽出物Ａ：酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、１２５ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において２．３ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において３．９時間抽出し、その時間において流速を４．７ｇ／ｍｉｎのＣＯ２に増加させ、抽出をさらに２．３時間継続した。次いで、圧力を１４１ｂａｒに増加させた。抽出を４．７ｇ／ｍｉｎのＣＯ２においてさらに４．１時間継続し、１５４ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物Ａの収率は８．７重量％であった。
【０３２８】
抽出物Ｂ：抽出を、同一の部分抽出酵母試料を用いて圧力を２２２ｂａｒに増加させ、ＣＯ２流を４．７ｇ／ｍｉｎにおいて８．０時間継続することにより継続し、この抽出物について１５０ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物Ｂの収率は、抽出容器に装填された元の酵母の１５．４重量％であった。
【０３２９】
以下の表は、出発フィード酵母、両方の抽出後の残留バイオマスおよび２つの抽出物についての脂質分析をまとめる。結果は、出発フィード酵母中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残留することを示す。用いられる抽出条件下で、微生物バイオマスのＦＦＡおよびＤＡＧは、抽出物Ａに選択的に区分化した一方、抽出物ＢはＴＡＧが富化された。より具体的には、抽出物Ｂは、約９７％のＴＡＧであり、ＦＦＡは計測されず、ＴＡＧの約６１．９％がＥＰＡを含有することが見出された。対照的に、酵母細胞のＴＡＧの約５９．８％がＥＰＡを含有することが見出された。これらの結果は、続いて段階的減圧を介して分別される抽出物を提供するための酵母試料のＳＣＦＣＯ２抽出により得ることができる結果と類似することが予期される。
【０３３０】
【表１７】
2014510165.tif 000019
【０３３１】
実施例１５
連続圧力抽出による脂質分別
本実施例の目的は、異なる抽出条件下での酵母試料の連続圧力抽出および得られる抽出物の脂質組成を実証することであった。３１６ＳＳ管（２．５４ｃｍのｏ．ｄ．×１．９３ｃｍのｉ．ｄ．×３０．５ｃｍの長さ）から製作された８９ｍＬ抽出容器に、２０．０
ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填した。
【０３３２】
抽出物Ａ：酵母をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、１１０ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において４．７ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において７．１時間抽出し、１００ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物Ａの収率は４．１重量％であった。
【０３３３】
抽出物Ｂ：抽出を、同一の部分抽出酵母試料を用いて圧力を２２２ｂａｒに増加させ、ＣＯ２流を４．７ｇ／ｍｉｎにおいて１５．０時間において継続することにより継続し、この抽出物について２１２ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出物Ｂの収率は、抽出容器に装填された元の酵母の１４．６重量％であった。
【０３３４】
以下の表は、出発フィード酵母、両方の抽出後の残留バイオマスおよび２つの抽出物についての脂質分析をまとめる。結果は、出発フィード酵母中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残留することを示す。用いられる抽出条件下で、微生物バイオマスのＦＦＡおよびＤＡＧは、抽出物Ａに選択的に区分化した一方、抽出物ＢはＴＡＧが富化された（すなわち、油画分Ｂは約９５％のＴＡＧであった）。これらの結果は、続いて段階的減圧を介して分別される抽出物を提供するための酵母試料のＳＣＦＣＯ２抽出により得ることができる結果と類似することが予期される。
【０３３５】
本明細書の実施例１３から１５は、抽出物の脂質構成成分の区分化が多段階抽出における抽出条件の選択により影響を受け得ることを集合的に説明する。そのような区分化は、おそらく、図３に説明されるプロセスにより得られる油抽出物の圧力の連続低減から得られる。
【０３３６】
【表１８】
2014510165.tif 000020
【０３３７】
実施例１６
５００ｂａｒにおけるＳＣＦ抽出
本実施例の目的は、５００ｂａｒにおける超臨界流体としてのＣＯ２による酵母細胞の抽出、および得られる抽出物の組成を実証することであった。そのような抽出条件は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含むリファインド組成物を得る方法であって、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを好適な抽出条件下でＣＯ２と接触させ、続いて抽出物を例えば連続減圧により分別することを含む方法の第１の工程で使用することができた。
【０３３８】
１０ｍＬ抽出容器に、２．０１ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株）を装填し、容器を市販の自動化超臨界流体抽出装置、すなわち、ＩｓｃｏモデルＳＦＸ３５６０抽出器中に設置した。この装置は、抽出容器のそれぞれの端部上に２ミクロン焼結金属フィルターを備えた１０ｍＬのプラスチック抽出容器を利用した。この容器に、抽出すべき基質を装填し、次いで抽出容器の内側および外側に対する圧力を均等化する高圧抽出室中にロードした。ＣＯ２溶媒を、シリンジポンプ（ＩＳＣＯモデル２６０Ｄ）により計量供給し、規定の抽出温度に予熱し、次いで抽出容器を通過させた。抽出室を電気抵抗加熱器により所望の抽出温度に加熱した。圧力は、装置の一体部分である自動化可変制流子により容器上で維持した。
【０３３９】
酵母試料をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、５００ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において０．８６ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において５．８時間抽出し、１５０ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出油の収率は３２．８重量％であった。以下の表は、出発フィード酵母、抽出後の残留バイオマスおよび抽出により得られた油についての脂質分析をまとめる。結果は、出発フィード酵母中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残留し、ＦＦＡ、ＤＡＧ、およびＴＡＧを含むＣＯ２抽出油に区分化しなかったことを示す。
【０３４０】
【表１９】
2014510165.tif 000021
【０３４１】
実施例１７
３１０ｂａｒにおけるＳＣＦ抽出
本実施例の目的は、３１０ｂａｒにおける超臨界流体としてのＣＯ２による酵母細胞の抽出、および得られる抽出物の組成を実証することであった。そのような抽出条件は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含むリファインド組成物を得る方法であって、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを好適な抽出条件下でＣＯ２と接触させ、続いて抽出物を例えば連続減圧により分別することを含む方法の第１の工程で使用することができた。
【０３４２】
３１６ＳＳ管（２．５４ｃｍのｏ．ｄ．×１．９３ｃｍのｉ．ｄ．×３０．５ｃｍの長さ）から製作された８９ｍＬの抽出容器に、２５．１ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株）を装填した。酵母試料をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、３１０ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において５．０ｍＬ／ｍｉｎＣＯ２の流速において４．４時間抽出し、５０ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出油の収率は２８．８重量％であった。以下の表は、出発フィード酵母、抽出後の残留バイオマスおよび抽出により得られた油についての脂質分析をまとめる。結果は、出発フィード酵母中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残留し、ＦＦＡ、ＤＡＧ、およびＴＡＧを含むＣＯ２抽出油に区分化しなかったことを示す。
【０３４３】
【表２０】
2014510165.tif 000022
【０３４４】
実施例１８
２２２ｂａｒにおけるＳＣＦ抽出
本実施例の目的は、２２２ｂａｒにおける超臨界流体としてのＣＯ２による酵母細胞の抽出、および得られる抽出物の組成を実証することであった。そのような抽出条件は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含むリファインド組成物を得る方法であって、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを好適な抽出条件下でＣＯ２と接触させ、続いて抽出物を例えば連続減圧により分別することを含む方法の第１の工程で使用することができた。
【０３４５】
３１６ＳＳ管（２．５４ｃｍのｏ．ｄ．×１．９３ｃｍのｉ．ｄ．×３０．５ｃｍの長さ）から製作された８９ｍＬの抽出容器に、２５．１ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填した。酵母試料をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃に加熱し、２２２ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において４．７ｇ／ｍｉｎＣＯ２の流速において１３．７時間抽出し、１５４ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出油の収率は１８．１重量％であった。この抽出は、さらに４回反復させ、それぞれの時間において新たな酵母試料を用い、５つの抽出物を確立した。残留バイオマス試料および抽出油試料もそれぞれ確立し、混合して５つの抽出からの複合試料を提供した。以下の表は、出発フィード酵母、確立残留バイオマスおよび抽出により得られた確立油についての脂質分析をまとめる。油は、７重量％のＦＦＡ、７重量％のＤＡＧ、および８６重量％のＴＡＧを含むことが見出された。
【０３４６】
【表２１】
2014510165.tif 000023
【０３４７】
実施例１９
８５ｂａｒにおける液体ＣＯ２抽出
本実施例の目的は、８５ｂａｒにおける液体としてのＣＯ２による酵母細胞の抽出、および得られる抽出物の組成を実証することであった。そのような抽出条件は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含むリファインド組成物を得る方法であって、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを好適な抽出条件下でＣＯ２と接触させ、続いて抽出物を例えば連続減圧により分別することを含む方法の第１の工程で使用することができた。
【０３４８】
３１６ＳＳ管（０．９５ｃｍのｏ．ｄ．×０．６２ｃｍのｉ．ｄ．×２６．７ｃｍの長さ）から製作された８ｍＬの抽出容器に、０．９６６ｇの乾燥および機械的に破砕された酵母細胞（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填した。酵母試料をＣＯ２によりフラッシュし、次いで２２℃において液体ＣＯ２により８５ｂａｒに加圧した。酵母試料をこれらの条件において０．６９ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において８．５時間抽出し、３６１ｇのＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒フィード比を得た。抽出油の収率は２１．４重量％であった。以下の表は、出発フィード酵母、残留バイオマスおよび抽出により得られた油についての脂質分析をまとめる。結果は、出発フィード酵母中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残留し、ＣＯ２抽出油に区分化しなかったことを示す。油は、８重量％のＦＦＡ、５重量％のＤＡＧ、および８６重量％のＴＡＧを含んだ。
【０３４９】
【表２２】
2014510165.tif 000024
【０３５０】
実施例２０
ＳＣＦＣＯ２／ＥｔＯＨによる残留リン脂質の抽出
本実施例の目的は、ＰＬ画分および第２の残留バイオマス試料を得るための、抽出剤としての超臨界ＣＯ２およびエタノールの混合物による第１の残留バイオマス試料の抽出を実証することであった。
【０３５１】
３１６ＳＳ管（１．２７ｃｍのｏ．ｄ．×０．９４ｃｍのｉ．ｄ．×２６．０ｃｍの長さ）から製作された１８ｍＬの抽出容器に、実施例１３からの６．３９ｇの残留バイオマス（抽出ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株）を装填し、これを本明細書において第１の残留バイオマスと称する。材料をＣＯ２によりフラッシュし、次いで４０℃においてＣＯ２／メタノール混合物（抽出剤）により２２２ｂａｒに加圧した。ＣＯ２流速は２．３ｇ／ｍｉｎであり、エタノール流速は０．１２ｇ／ｍｉｎであり、抽出容器にフィードされる溶媒中の５．０重量％のエタノール濃度を得た。第１の残留バイオマスをこれらの条件において５．３時間抽出し、残留バイオマス１ｇ当たり１２０ｇのＣＯ２／エタノールの最終溶媒フィード比を得た。油の抽出収率は、この事前に抽出された材料から２．４重量％であった。以下の表は、第１の残留バイオマス（本実施例についての出発試料）、第２の残留バイオマス（本実施例における抽出後の第１の残留バイオマス）、および第１の残留バイオマスの抽出により得られた油についての脂質分析をまとめる。以下の表中のデータから把握することができるとおり、油は、本質的に純粋なＰＬを含むことが見出された。実施例１３において事前に実施された抽出は、酵母細胞からの中性脂肪および遊離脂肪酸を既に除去した。
【０３５２】
【表２３】
2014510165.tif 000025
【０３５３】
実施例２１
本実施例の目的は、本明細書に記載のペレット化、抽出、分別および蒸留法において微生物バイオマスとして利用することができる少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む代替的微生物バイオマスを提供することである。
【０３５４】
ω−３／ω−６ＰＵＦＡの生成について遺伝子操作された多数の油性酵母が本出願に記載の本発明による好適な微生物バイオマスであるが、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の代表的な株を表５に記載する。これらには、ＡＴＣＣにより寄託されている以下の株が含まれる：Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株（ＡＲＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７１８６）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０９６株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７１８４）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２０１株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７１８５）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ３０００株（ＤＨＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７１８７）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８６１４）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２７株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８８０２）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１００２５）；Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１００２６）；およびＹ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９株（ＥＰＡを生成；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１００２７）。
【０３５５】
したがって、例えば、表５は、総脂肪酸の２５．９％から３４％のＧＬＡ、総脂肪酸の１０．９％から１４％のＡＲＡ、総脂肪酸の９％から６１．８％のＥＰＡおよび総脂肪酸の５．６％のＤＨＡを生成する微生物宿主を示す。
【０３５６】
当業者は、本発明の方法論が高レベルのＥＰＡ生成を実証する微生物バイオマスに限定されるのではなく、代替的ω−３／ω−６ＰＵＦＡまたはそれらの組合せまたはＰＵＦＡの高レベルの生成を実証する微生物バイオマスに同等に好適であることを認識する。
【０３５７】
実施例２２Ａ
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株からのＥＰＡを含む未処理微生物バイオマスの調製
本実施例は、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株および２段階流加プロセスを使用するこの株を培養するために使用された手段を記載する。微生物バイオマスを前処理して５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを有する乾燥未処理微生物バイオマスをもたらした。
【０３５８】
Ｙ９５０２株からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の作製
株からのＺ１９７８株の開発は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／２１８，５９１号明細書（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＮＡ、２０１１年８月２６日出願）に記載されている。
【０３５９】
具体的には、Ｙ９５０２株（前出の材料参照）のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図６Ａ；配列番号１；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載）を使用してＵｒａ３突然変異体遺伝子をＹ９５０２株のＵｒａ３遺伝子中に統合した。形質転換は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の方法論に従って実施した。合計２７個の形質転換体（８つの形質転換体を含む第１の群、８つの形質転換体を含む第２の群、および１１個の形質転換体を含む第３の群から選択）を、５−フルオロオロチン酸［「ＦＯＡ」］プレート（ＦＯＡプレートは、１リットル当たり以下を含む：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素原礎培地、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジンおよび１００ｍｇ／Ｌから１０００ｍｇ／Ｌの濃度の範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく適切量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）（それというのも、供給業者から受容したそれぞれのバッチ内で変動が生じるためである））上で成長させた。さらなる実験は、形質転換体の第３の群のみが実際のＵｒａ−表現型を有することを決定した。
【０３６０】
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のため、細胞を遠心分離により回収し、脂質をＢｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載のとおり抽出した。脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を、ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換により調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、続いて３０−ｍ×０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣにより分析した。オーブン温度は３．５℃／ｍｉｎにおいて１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０３６１】
直接的な塩基エステル交換のため、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、蒸留水中で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で真空下で５〜１０分間乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）および既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５，Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に添加し、次いで試料をボルテックスにかけ、５０℃において３０分間ロックした。３滴の１ＭのＮａＣｌおよび４００μｌのヘキサンの添加後、試料をボルテックスにかけ、回転させた。上層を取り出し、ＧＣにより分析した（前出）。
【０３６２】
あるいは、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載の塩基触媒エステル交換法の改変を、発酵またはフラスコ試料からのブロス試料の定型分析に使用した。具体的には、ブロス試料を室温水中で急速解凍し、次いで０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心チューブフィルター（カタログ番号８１６１）を有するタール塗布２ｍＬ微小遠心チューブ中に（０．１ｍｇに）秤量した。予め測定されたＤＣＷに応じて、試料（７５〜８００μｌ）を使用した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４３０遠心分離機を使用して、試料を１４，０００ｒｐｍにおいて５〜７分間または必要な限り遠心分離してブロスを取り出した。フィルターを取り出し、液体を抜き、約５００μｌの脱イオン水をフィルターに添加して試料を洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再度取り出し、液体を抜き、フィルターを再挿入した。次いで、チューブを遠心分離機中に再挿入し、このときは頂部を開放し、約３〜５分間乾燥させた。次いで、フィルターをチューブの約１／２の箇所で切断し、新たな２ｍＬ丸底Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（カタログ番号２２３６３３５−２）中に挿入した。
【０３６３】
切断フィルター容器の周縁に接触するにすぎず、試料またはフィルター材料に接触しない適切なツールによりフィルターをチューブの底部に押圧した。トルエン中の既知量のＣ１５：０ＴＡＧ（前出）を添加し、５００μｌの新たに作製された１％のナトリウムメトキシドのメタノール中溶液を添加した。試料ペレットを適切なツールにより完全に崩壊させ、チューブを密閉し、５０℃加熱ブロック（ＶＷＲカタログ番号１２６２１−０８８）中に３０分間装入した。次いで、チューブを少なくとも５分間冷却させた。次いで、４００μｌのヘキサンおよび５００μｌの１ＭのＮａＣｌの水中溶液を添加し、チューブを２回６秒間ボルテックスにかけ、１分間遠心分離した。約１５０μｌの頂部（有機）層をインサートを有するＧＣバイアル中に装入し、ＧＣにより分析した。
【０３６４】
ＧＣ分析を介して記録されたＦＡＭＥピークを、既知の脂肪酸と比較したその滞留時間により特定し、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部スタンダード（Ｃ１５：０ＴＡＧ）と比較することにより定量した。したがって、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（μｇ）［「μｇＦＡＭＥ」］は式：（規定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／スタンダードＦＡＭＥピーク面積）＊（スタンダードＣ１５：０ＴＡＧのμｇ）に従って計算する一方、Ｃ１５：０ＴＡＧの１μｇは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇＦＡ」］は式：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／スタンダードＦＡＭＥピーク面積）＊（スタンダードＣ１５：０ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３に従って計算する。０．９５０３の変換係数は、０．９５から０．９６の範囲であるほとんどの脂肪酸について決定される値の近似であることに留意されたい。
【０３６５】
それぞれの個々の脂肪酸の量をＴＦＡの重量パーセントとしてまとめる脂質プロファイルを、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の総和により割って１００を掛けることにより決定した。
【０３６６】
このように、ＧＣ分析は、第３群のｐＺＫＵＭ−形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０および＃１１にそれぞれ２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％および２９．６％のＥＰＡのＴＦＡが存在することを示した。これらの７つの株を、Ｙ９５０２Ｕ１２、Ｙ９５０２Ｕ１４、Ｙ９５０２Ｕ１７、Ｙ９５０２Ｕ１８、Ｙ９５０２Ｕ１９、Ｙ９５０２Ｕ２１およびＹ９５０２Ｕ２２株（集合的にＹ９５０２Ｕ）株とそれぞれ命名した。
【０３６７】
次いで、構築物ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ（図６Ｂ；配列番号２）を作製して１つのδ−９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および１つのδ−９エロンガーゼ突然変異体遺伝子をＹ９５０２Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２１）に統合した。ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎプラスミドは、以下の構成成分を含有した：
【０３６８】
【表２４】
2014510165.tif 000026
【０３６９】
ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩにより消化し、次いでＹ９５０２Ｕ１７株の形質転換に使用した。形質転換体細胞を最小培地［「ＭＭ」］プレート上にプレーティングし、３０℃に３〜４日間維持した（最小培地は、１リットル当たり：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸を有さない酵母窒素原礎培地、１．０ｇのプロリン、およびｐＨ６．１（調整不要）を含む）。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線し、次いで液体ＭＭ中に３０℃において接種し、２５０ｒｐｍ／ｍｉｎにおいて２日間振とうさせた。細胞を遠心分離により回収し、高グルコース培地［「ＨＧＭ」］中で再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／ｍｉｎにおいて５日間振とうさせた（高グルコース培地は、１リットル当たり：８０ｇのグルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整不要）を含む）。細胞を上記の脂肪酸分析に供した。
【０３７０】
ＧＣ分析は、選択された９６個のｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎを有するＹ９５０２Ｕ１７の株のほとんどが５０〜５６％のＥＰＡのＴＦＡを生成することを示した。５９．０％、５６．６％、５８．９％、５６．５％、および５７．６％のＥＰＡのＴＦＡを生成した５つの株（すなわち、＃３１、＃３２、＃３５、＃７０および＃８０）を、それぞれＺ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１と命名した。
【０３７１】
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するこれらのｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ形質転換体株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ｕｎｋｎｏｗｎ９−、ｕｎｋｎｏｗｎ１０−、ｕｎｋｎｏｗｎ１１−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０３７２】
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１株のＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２）のノックアウトは、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎによる形質転換により生成されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０３７３】
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１株のＹＰＤプレートからの細胞を、成長させ、以下の方法論に従って総脂質含有率および組成について分析した。
【０３７４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の特定株の総脂質含有率および組成の詳細な分析のため、フラスコアッセイを以下のとおり実施した。具体的には、新たに画線された細胞の１つのループを３ｍＬの発酵培地［「ＦＭ」］培地中に接種し、２５０ｒｐｍおよび３０℃において一晩成長させた（発酵培地は、１リットル当たり：６．７０ｇ／Ｌの酵母窒素原礎培地、６．００ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．００ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２０ｇのグルコースおよび５．００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）を含む）。ＯＤ６００ｎｍを計測し、細胞のアリコートを１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＦＭ培地で０．３の最終ＯＤ６００ｎｍまで添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃におけるシェーカーインキュベーターにおける２日後、６ｍＬの培養物を遠心分離により回収し、１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＨＧＭ中で再懸濁した。２５０ｒｐｍおよび３０℃におけるシェーカーインキュベーターにおける５日後、１ｍＬのアリコートを脂肪酸分析（前出）に使用し、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］測定のために１０ｍＬを乾燥させた。
【０３７５】
ＤＣＷ測定のため、１０ｍＬの培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機中のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ローター中で４０００ｒｐｍにおける５分間の遠心分離により回収した。ペレットを２５ｍＬの水中で再懸濁し、上記のとおり再回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水中で再懸濁し、事前に秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を真空オーブン中で８０℃において一晩乾燥させた。細胞の重量を測定した。
【０３７６】
細胞の総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を計算し、ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］および乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］をまとめるデータとともに考察した。
【０３７７】
したがって、以下の表２４は、フラスコアッセイにより測定されたＺ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０およびＺ１９８１株の総脂質含有率および組成をまとめる。具体的には、この表は、細胞の総乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の総脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］および乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含有率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］をまとめる。
【０３７８】
【表２５】
2014510165.tif 000027
【０３７９】
続いて、Ｚ１９７８株を部分ゲノムシーケンシング（米国特許出願第１３／２１８５９１号明細書）に供した。この作業は、４つ（６つでない）のδ−５−デサチュラーゼ遺伝子がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中に統合されたことを決定した（すなわち、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、およびＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ）。
【０３８０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の発酵
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株を、前出の材料セクションに記載のとおり２段階流加プロセスにおいて成長させた。
【０３８１】
発酵後、酵母バイオマスを脱水および洗浄して塩および残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小化した。次いで、ドラム乾燥させて水分を５％未満に低減させて短期貯蔵および輸送の間の油安定性を確保した。
【０３８２】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株のバイオマスの特性決定
乾燥未処理酵母バイオマスの脂肪酸組成を、以下のガスクロマトグラフィー［「ＧＣ」］法を使用して分析した。具体的には、トリグリセリドを、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用するエステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に変換した。得られたＦＡＭＥを、トルエン／ヘキサン（２：３）中での希釈後に３０−ｍ×０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＯＭＥＧＡＷＡＸ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０  ＧＣを使用して分析した。オーブン温度を５℃／ｍｉｎにおいて１６０℃から２００℃、次いで１０℃／ｍｉｎにおいて２００℃から２５０℃（１０分間保持）増加させた。
【０３８３】
ＧＣ分析を介して記録されたＦＡＭＥピークは、既知のメチルエステル［「ＭＥ」］と比較してそれらの保持時間により同定し、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部スタンダード（Ｃ１５：０トリグリセリド、試料についてエステル交換手順を介して採取）と比較することにより定量した。したがって、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（ｍｇ）［「ｍｇＦＡＭＥ」］は、式：（規定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／１５：０ＦＡＭＥピーク面積）＊（内部スタンダードＣ１５：０ＦＡＭＥのｍｇ）に従って計算する。次いで、ＦＡＭＥ結果を、１．０４２〜１．０５２の適切な分子量変換係数により割ることにより対応する脂肪酸のｍｇに補正することができる。
【０３８４】
ＴＦＡの重量パーセントとしてのそれぞれの個々の脂肪酸の量をまとめる脂質プロファイルは、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の総和により割り、１００を掛けることにより（±０．１重量％以内に）近似させた。
【０３８５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株からの乾燥未処理酵母バイオマスは、以下の表に示すとおり、５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含有した。
【０３８６】
【表２６】
2014510165.tif 000028
【０３８７】
実施例２２Ｂ
未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスからの低減したステロール含有率を有するＳＰＤ精製微生物油の調製
本実施例は、実施例２２Ａの乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスを、押出およびペレット化を介して破砕し、超臨界流体抽出［「ＳＣＦＥ」］を使用して油を抽出し、短行程蒸留条件を使用する蒸留により油のステロール含有率を低減させて脂質含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製微生物油）をもたらすために使用された手段を記載する。
【０３８８】
乾燥未処理酵母バイオマスの押出を介する破砕およびペレット化
実施例２２Ａの乾燥未処理Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスを、２軸スクリュー押出機にフィードした。具体的には、８４重量パーセントの酵母（約３９％の総微生物油を含有）および１６％の珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４；ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）の混合物を、４０ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−４０ｍｍ  ＭＣ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２３ｋｇ／ｈｒの速度においてフィードした。２６．５％のスクロースから作製された水／スクロース溶液を、押出機の破砕帯域後に７０ｍＬ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、３７ｋＷモ−ターおよび高トルクシャフトにより、１４０ｒｐｍにおいて稼働させた。％トルク範囲は１７〜２２であった。得られた破砕酵母粉末を、最終水冷バレル中で３５℃に冷却した。湿潤押出粉末を、１ｍｍ穴径×１ｍｍ厚スクリーンから組み立てられ、８０ＲＰＭに設定されたＬＣＩ  Ｍｕｌｔｉ−Ｇｒａｎｕｌａｔｏｒモデル番号ＭＧ−５５（ＬＣＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）中にフィードした。押出物を、２７ｋｇ／ｈｒ、定常２．２アンペア電流の流れにおいて形成し、慣用の乾燥装置を使用して乾燥させた。約１ｍｍの直径×６から１０ｍｍの長さの乾燥ペレットは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＡ３５水分分析装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により計測して１．７％の最終含水率を有した。
【０３８９】
押出酵母バイオマスの抽出
押出酵母ペレットを、抽出溶媒としての超臨界流体相二酸化炭素（ＣＯ２）を使用して抽出してＥＰＡを含有するトリグリセリドリッチ抽出油を生成した。具体的には、酵母ペレットを３２０Ｌステンレス鋼抽出容器に装填し、ポリエステルフォーム濾過マット（Ａｅｒｏ−Ｆｌｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ＩＮ）のプラグ間に充填した。容器を密封し、次いでＣＯ２を市販の圧縮器（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）により熱交換器（予熱器）を介して計量供給し、垂直抽出容器中にフィードして破砕酵母のペレットからトリグリセリドリッチ油を抽出した。抽出温度は予熱器により制御し、抽出圧力は抽出容器と分別器容器との間に位置する自動制御弁（Ｋａｍｍｅｒ）により維持した。ＣＯ２および油抽出物は、この制御弁を介して低圧に膨張させた。抽出油を膨張溶液から沈殿物として分別器中で回収した。分別器中の膨張ＣＯ２相の温度は、分別器の上流に位置する追加の熱交換器の使用により制御した。この低圧ＣＯ２流は、分別器容器の頂部を流出し、フィルター、凝縮器、および質量流量計を介して圧縮器に再循環させて戻した。抽出油を分別器から周期的に抜き、生成物として回収した。
【０３９０】
抽出容器に、最初に１５０ｋｇの抽出酵母ペレットを装填した。次いで、トリグリセリドリッチ油をペレットから超臨界流体ＣＯ２により５０００ｐｓｉｇ（３４５ｂａｒ）、５５℃、および出発酵母ペレット１ｋｇ当たり３２ｋｇのＣＯ２の溶媒フィード比において抽出した。合計３９．６ｋｇの抽出油を分別器容器から回収し、それに約１０００ｐｐｍの２つの酸化防止剤のそれぞれ：Ｃｏｖｉ−ｏｘ  Ｔ７０（Ｃｏｇｎｉｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）およびＤａｄｅｘ  ＲＭ（Ｎｅａｌａｎｄｅｒｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を添加した。抽出油は、ＧＣ分析（下記）により測定して６６１ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇを含有した。
【０３９１】
具体的には、エルゴステロール含有率は、紫外線（ＵＶ）検出を有する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。抽出油試料（１００ｍｇ）を、１４ｍＬの９：１０の２−プロパノール：１−ヘプタノールにより希釈し、十分に混合した。９６％純度エルゴステロール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）の較正スタンダードを、２−プロパノール中の１０から３００μｇ／ｍＬの範囲で調製した。試料およびスタンダードを、１２．５分間における水中０．０２％の炭酸アンモニウム−６５％から１００％のアセトニトリルのアセトニトリル勾配を使用するＸＤＢ−Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（４．６ｍｍのｉｄ．、１５０ｍｍの長さ、５μｍの粒子サイズ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）上でのクロマトグラフィーにかけた。注入容積は５μＬであり、流速は１．２ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は５０℃であった。エルゴステロールピークのＵＶ（２８２ｎｍ）応答を、同一条件下で分析した較正スタンダードと比較した。
【０３９２】
ＳＰＤ条件下での蒸留
抽出油を脱ガスし、次いで６’’ステンレス鋼分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度を使用して通過させた。残留水を除去した。蒸発器および凝縮器の表面温度は、それぞれ１４０℃および１５℃に設定した。真空は１５ｔｏｒｒに維持した。約３重量％の抽出油を蒸留物中の水として取り出した。脱水抽出油は、実質的にリン脂質を含まず、０．５ｐｐｍのリンを含有した。視覚調査時、脱水抽出油は室温において混濁していた。
【０３９３】
脱水抽出油を６’’分子蒸留器を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度において２回目として通過させた。真空を１ｍｔｏｒｒに低下させ、蒸発器および凝縮器の表面温度をそれぞれ２４０℃および５０℃に維持した。約７重量％の脱水抽出油を蒸留物として取り出し；この画分は主として遊離脂肪酸およびエルゴステロールを含有した。２８４ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇ（抽出油のエルゴステロール含有率と比較してエルゴステロール含有率の約５７％低減）を含有するトリアシルグリセロール含有画分（すなわち、脂質含有画分またはＳＰＤ精製油）も得た。ＳＰＤ精製油は、数日間の１０℃における貯蔵後に澄明であった。
【０３９４】
実施例２３
未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスからの低減したステロール含有率を有するＳＰＤ精製微生物油の調製
本実施例は、乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスを、押出を介して破砕し、超臨界流体抽出［「ＳＣＦＥ」］を使用して油を抽出し、短行程蒸留条件を使用する蒸留により油のステロール含有率を低減させて脂質含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製微生物油）をもたらすために使用された手段を記載する。
【０３９５】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスの調製
Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株を、２段階流加プロセスにおいて培養し、得られた微生物バイオマスを実施例２２Ａに記載の方法論に従って脱水し、洗浄し、乾燥させた。
【０３９６】
乾燥未処理酵母バイオマスの押出を介する破砕
乾燥未処理Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスを、２軸スクリュー押出機にフィードした。具体的には、酵母バイオマス（約３７％の総微生物油を含有）を、７０ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−７０ｍｍ  ＳＣＤ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、２７０ｋｇ／ｈｒの速度において珪藻土の不存在下でフィードした。
【０３９７】
押出機は、１５０ｋＷのモーターおよび高トルクシャフトにより、１５０ｒｐｍおよび総アンペア範囲の３３パーセントにおいて稼働させた。得られた破砕酵母バイオマスを最終水冷バレル中で８１℃に冷却した。破砕バイオマスの含水率は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＡ３５水分分析装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により計測して２．８重量％であった。
【０３９８】
押出酵母バイオマスの抽出
押出酵母バイオマスを珪藻土と混合して床の圧密を防止し、抽出溶媒としての超臨界流体相ＣＯ２を使用して抽出してＥＰＡを含有する粗製トリグリセリド油（すなわち、「抽出油」）を生成した。具体的には、合計８２．７ｋｇの押出酵母バイオマスを、４１ｋｇの珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４；ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）と混合し、実施例２２Ｂに記載のものと同一の様式で構成された３２０Ｌのステンレス鋼抽出容器に装填したが、以下を除いた：（ｉ）抽出温度を予熱器により４０℃に制御し；（ｉｉ）抽出圧力を４５００ｐｓｉｇ（３１０ｂａｒ）に維持し；（ｉｉｉ）抽出に出発酵母１ｋｇ当たり４４ｋｇのＣＯ２の溶媒フィード比を使用した。このようにして、２３．２ｋｇの油を破砕酵母から抽出した。抽出油は、実施例２２Ｂの方法論によるＧＣ分析により測定して７７４ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇを含有した。
【０３９９】
ＳＰＤ条件下での蒸留
抽出油を、２’’ガラス分子蒸留器を介して通過させて脱水抽出油を提供した。流速は、約４８０ｇ／ｈｒに維持した。真空、蒸発器および凝縮器温度は、それぞれ０．２ｍｍＨｇ、１３０℃および６０℃であった。次いで、以下の表に示すとおり脱水抽出油を蒸留器を介して１ｍｔｏｒｒの真空において異なる温度において３回通過させた。それぞれの通過後、トリアシルグリセロール含有画分（すなわち、脂質含有画分またはＳＰＤ精製油）のエルゴステロールレベル、ＥＰＡ含有率（ＴＦＡの重量％として）および総ω−３含有率（ＴＦＡの重量％として）を上記のとおり測定した。
【０４００】
【表２７】
2014510165.tif 000029
【０４０１】
したがって、２１０℃において、ＳＰＤ精製油のエルゴステロールレベルは、１１０ｍｇ／油１００ｇであり、それは２４０℃において約５３ｍｇ／油１００ｇに低減された。エルゴステロールは、温度を２７０℃にさらに増加させた場合に１ｍｇ／油１００ｇにほぼ完全に除去された。このことは、抽出油のエルゴステロール含有率と比較して１回目の通過、２回目の通過および３回目の通過それぞれにおけるエルゴステロール含有率の約５７％、約８６％および約９９．８％の低減に対応する。
【０４０２】
ＳＰＤ精製油のＰＵＦＡ含有率に関して、表２６のデータは、油を２７０℃におけるＳＰＤ蒸留器を介して通過させた場合であっても、ＥＰＡも総ω−３含有物も顕著な分解が生じなかったことを実証する。
【０４０３】
３回目の通過のＳＰＤ精製油を、クロマトグラフィープロファイリングを使用して予想外の構成成分および汚染物質の出現についてさらに分析した。具体的には、試験は、（ｉ）火炎イオン化検出を有するガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＦＩＤ）；（ｉｉ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；および（ｉｉｉ）質量分析、光散乱および紫外線検出を有する液体クロマトグラフィーにより行った（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＥＬＳＤ／ＵＶ）。ＧＣ／ＦＩＤプロファイルは、ＳＰＤ精製油試料のメチルエステルについてランした。ＴＬＣおよびＨＰＬＣ／ＭＳ／ＥＬＳＤ／ＵＶプロファイルは、ＳＰＤ精製油について直接ランした。全ての場合において、ＳＰＤ精製油プロファイルを、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株バイオマス（材料、前出）を用いて調製された参照油と比較した。
【０４０４】
具体的には、参照油は、実施例２２Ａに記載の方法論に従って乾燥未処理Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株バイオマスから生成した。乾燥未処理バイオマスを、油とイソヘキサン溶媒との比を１から７として媒体ミルを使用して機械的に破砕した。残留バイオマス（すなわち、細胞デブリス）を、デカンター遠心分離機を使用して除去し、溶媒を蒸発させてトリグリセリドを含有する抽出油を得た。抽出油を、低温アセトンを使用して、抽出油と溶媒との比を１から１．５として脱ガム処理し、次いで５０％の水性クエン酸により酸脱ガム処理した。次いで、脱ガム処理油を酸活性化クレーにより漂白し、２１０℃において３０分間脱臭して参照油試料を得た。
【０４０５】
３回目の通過のＳＰＤ精製油のクロマトグラフィープロファイルは、参照試料のプロファイル中に見られないいかなるピークも含有しなかった。両方の試料を同日に同一条件下でランした。さらに、参照試料のプロファイルの対応するピークよりも顕著に高い応答を有するＳＰＤ精製油の未同定ピークは存在しなかった。また、３回目の通過のＳＰＤ精製油のピークは、低温（すなわち、それぞれ２１０℃および２４０℃）において生成された１回目の通過または２回目の通過のＳＰＤ精製油の対応するピークよりも高い応答を有さなかった。これらの分析は、ＳＰＤを使用する高温におけるエルゴステロールの除去が、油中に分解生成物の出現をもたらさないことを示し；したがって、この処理技術の適用によってはＰＵＦＡの顕著な分解が生じないことが仮定される。
【０４０６】
実施例２４
未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスからの低減したステロール含有率を有するＳＰＤ精製微生物油の調製
本実施例は、乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスを、媒体ミルを使用する機械的破砕を介して破砕し、イソヘキサン溶媒を使用して粗製油を抽出し、短行程蒸留条件を使用する蒸留によりアセトン脱ガム処理油のステロール含有率を低減させて脂質含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製微生物油）をもたらすために使用された手段を記載する。
【０４０７】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスの調製
Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株を、実施例２２Ａに記載の方法論に従って、２段階流加プロセスにおいて培養し、得られた微生物バイオマスを脱水し、洗浄し、乾燥させた。
【０４０８】
抽出油を生成するための乾燥未処理酵母バイオマスの媒体ミルおよびイソヘキサン溶媒を介する破砕および抽出
乾燥未処理Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスを、イソヘキサン溶媒を用いて媒体ミルを使用して機械的に破砕した。残留バイオマス（すなわち、細胞デブリス）を、デカンター遠心分離機を使用して除去し、溶媒を蒸発させてトリグリセリドを含有する抽出油を得た。
【０４０９】
抽出油を実施例２２Ｂの方法論を使用して分析した。下記の表に示すとおり、微生物油は５８．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含有した。
【０４１０】
【表２８】
2014510165.tif 000030
【０４１１】
抽出油の一部を、低温アセトンを使用して抽出油と溶媒との比を１から１．５として脱ガム処理した。アセトン脱ガム処理油は、８８０ｍｇのエルゴステロール／油１００ｇおよび７４．５ｐｐｍのリンを含有した。
【０４１２】
ＳＰＤ条件下での蒸留
アセトン脱ガム処理油を、実施例２２Ｂの方法論に従って短行程蒸留に供した（但し、蒸発器温度を２５５℃に設定した）。第１の通過の間に蒸留物はほぼ回収されなかった。それというのも、アセトン脱ガム処理油中にほとんど水が存在しなかったためである。第２の通過の間、約１２重量％の蒸留物が回収された。トリアシルグリセロール含有画分（すなわち、脂質含有画分またはＳＰＤ精製油）の最終エルゴステロールレベルは、１０６ｍｇ／１００ｇ（アセトン脱ガム処理油のエルゴステロール含有率と比較してエルゴステロール含有率の約８８％の低減であり；ＳＰＤ精製油は、６６ｐｐｍのリンを含有した。
【０４１３】
実施例２５
総脂肪酸［「ＴＦＡ」］の５６．１％ＥＰＡを含む未濃縮微生物油の調製
本実施例は、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株細胞の微生物バイオマスから得られた未濃縮微生物油の単離を記載する。
【０４１４】
具体的には、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株を、２段階流加プロセスを使用して培養した。次いで、微生物油を乾燥を介してバイオマスから単離し、抽出（押出、ペレット化および超臨界流体抽出の組合せを介して）し、短行程蒸留を介して精製し、５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含む未濃縮トリグリセリドリッチのＳＰＤ精製油（すなわち、脂質含有画分）を得た。
【０４１５】
乾燥未処理ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスの発酵および押出を介する破砕およびペレット化
前出の材料に記載のとおり、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株培養物を発酵させ、微生物バイオマスを回収し、乾燥させた。次いで、乾燥未処理バイオマスを２軸スクリュー押出機にフィードした。具体的には、バイオマスおよび１５％の珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４またはＣｅｌｉｔｅ  ２０９，ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）の混合物を予備混合し、次いでＺＳＫ−４０ｍｍ  ＭＣ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  ＆  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４５．５ｋｇ／ｈｒの速度においてフィードした。２６．５％のスクロースからなる水／スクロース溶液を、押出機の破砕帯域後に１４７ｍＬ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、２８０ｒｐｍにおいて２０〜２３の％トルク範囲で稼働させた。得られた破砕酵母粉末を、最終水冷バレル中で３５℃に冷却した。次いで、湿潤押出粉末を、多孔ドームダイ１ｍｍ直径×１ｍｍ厚スクリーンから組み立てられ、８２ＲＰＭに設定されたＬＣＩドーム粗砕機モデル番号ＴＤＧ−８０（ＬＣＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）中にフィードした。押出物を、４５５〜６００ｋｇ／ｈｒ（乾燥時速度として）において形成した。試料を、１００℃において維持される１１５０標準立方フィート毎分［「ｓｃｆｍ」］の空気流を有する０．５０ｍ２の乾燥帯域および１８℃において５００〜６００ｓｃｆｍと推定される空気流により稼働する０．２４ｍ２の冷却帯域を有する振動流動床乾燥機（ＦＢＰ−７５，Ｃａｒｍａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＩＮ）中で乾燥させた。約１ｍｍ直径×長さ６から１０ｍｍの乾燥ペレットは、２５〜３０℃の範囲で乾燥機を出て、Ｏ’Ｈａｕｓ水分分析装置（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）により計測して５〜６％の最終水分含有率を有した。
【０４１６】
押出酵母バイオマスの油抽出
実施例２２Ｂに記載の３２０Ｌステンレス鋼抽出容器を使用して、押出酵母ペレットを、抽出溶媒としての超臨界流体相ＣＯ２を使用して抽出して未濃縮トリグリセリドリッチ抽出油を生成した。
【０４１７】
抽出容器に、最初に約１５０ｋｇの押出酵母ペレットを装填した。次いで、未濃縮抽出油をペレットから超臨界流体ＣＯ２により５０００ｐｓｉｇ（３４５ｂａｒ）、５５℃および出発酵母ペレット１ｋｇ当たり４０から５０ｋｇのＣＯ２の範囲の溶媒フィード比において抽出した。約３７．５ｋｇの未濃縮抽出油を分別器容器から回収し、それに約１０００ｐｐｍの２つの酸化防止剤のそれぞれ、すなわち、Ｃｏｖｉ−ｏｘ  Ｔ７０（Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）およびＤａｄｅｘ  ＲＭ（Ｎｅａｌａｎｄｅｒｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を添加した。
【０４１８】
ＳＰＤ条件下での蒸留
未濃縮抽出油を脱ガスし、次いで６’’分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度を使用して通過させて残留水を除去した。蒸発器および凝縮器の表面温度は、それぞれ１４０℃および１５℃に設定した。真空は１５ｔｏｒｒに維持した。
【０４１９】
脱水抽出油を分子蒸留器を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度において２回目として通過させ、蒸留物中の不所望な低分子量化合物、例えばエルゴステロールおよび遊離脂肪酸を除去した。真空を１ｍｔｏｒｒに低下させ、蒸発器の表面温度を２４０℃から２７０℃の間に維持した。未濃縮抽出油のステロール含有率に対して低減したステロールを有するトリアシルグリセロール含有画分（すなわち、ＳＰＤ精製油）を得た。未濃縮ＳＰＤ精製油を４０℃未満に冷却してから包装した。
【０４２０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株からの未濃縮ＳＰＤ精製油の特性決定
Ｚ１９７８株からの未濃縮ＳＰＤ精製油（すなわち、脂質含有画分）の脂肪酸組成を、実施例２７の方法論に従ってエステル交換後に分析した。ＳＰＤ精製油は、以下の表２８に示すとおり５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含有し、ＤＨＡは検出不能（すなわち、＜０．０５％）であった。
【０４２１】
【表２９】
2014510165.tif 000031
【０４２２】
実施例２６
ナンノクロロプシス・アルガエ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  Ａｌｇａｅ）からの固体ペレットの作出およびその油抽出
本実施例は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）以外の微生物バイオマスを用いる使用についての本明細書に開示される方法論の適用性を実証するために実施された試験を記載する。具体的には、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）バイオマスを、粉砕剤および結合剤と混合して固体ペレットを提供した。これらのペレットを超臨界ＣＯ２抽出に供し、総抽出収率を比較した。
【０４２３】
Ｋｕｅｈｎｌｅ  Ａｇｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｎｏｌｕｌｕ，ＨＩ）は、購入用の種々の純培養の単藻ストック藻類を提供している。依頼時、少なくとも２０％の脂質含有率を有する適切な微生物バイオマスとして、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種を含む藻類ＫＡＳ６０４株が提案された。バイオマスを標準条件（油含有率について最適化しない条件）下で成長させ、Ｋｕｅｈｎｌｅ  Ａｇｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により乾燥させ、次いで微細藻類粉末を以下の使用のために購入した。
【０４２４】
９１．７部の微細藻類粉末を、８．３部のＣｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４珪藻土とバッグ中で予備混合した。得られた乾燥混合物を、１８ｍｍ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ  ＺＳＫ−１８ｍｍ  ＭＣ）に０．９１ｋｇ／ｈｒにおいてフィードした。乾燥フィードとともに、１０．９部の水および５．０部の糖から作製された糖の３１％水溶液を、押出機の破砕帯域後に２．５ｍＬ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、１０ｋＷモーターおよび高トルクシャフトにより、２００ｒｐｍおよび４６〜８１の％トルク範囲において稼働して最終水冷バレル中で３１℃に冷却された破砕酵母粉末を提供した。
【０４２５】
次いで、固定可能な混合物を、１．２ｍｍ穴径×１．２ｍｍ厚スクリーンにより組み立てられ、２０ＲＰＭに設定されたＭＧ−５５  ＬＣＩドーム粗砕機中にフィードした。押出物を２０ｋｇ／ｈｒおよび６〜７アンペア電流において形成した。試料をＳｈｅｒｗｏｏｄ乾燥機中で７０℃において２０分間乾燥させて４．９％の最終水分レベルを有する固体ペレットを提供した。約１．２ｍｍ直径×２〜８ｍｍ長の固体ペレットは、８２．１％の藻類であり、組成物の残部はペレット化助剤であった。次いで、固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレット中の総油および遊離油の量を測定し、ＳＣＦにより固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットから抽出された油の量と比較した。
【０４２６】
固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットの総油含有率の測定
具体的には、総油は、ペレット化試料について、乳鉢または乳棒を使用してそれを穏やかに微粉末に粉砕し、次いで分析のためのアリコート（トリプリケートで）を秤量することにより測定した。試料中の脂肪酸（主としてトリグリセリドとして存在）を、８０℃における塩化アセチル／メタノールとの反応により対応するメチルエステルに変換させた。次いで、Ｃ１５：０内部標準を、較正目的のために既知量でそれぞれの試料に添加した。個々の脂肪酸の測定は、火炎イオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）を用いるキャピラリーガスクロマトグラフィーにより行った。脂肪酸（トリグリセリド形態で表現）の総和は６．１％であり；これを試料の総油含有率と解釈した。正規化後、ペレット中の藻類は総質量の８２．１％のみを表したため、藻類の総油含有率は７．４％と決定した（すなわち、６．１％を０．８２１で割った）。
【０４２７】
総油試料内の個々の脂肪酸の分布を以下の表に示す。
【０４２８】
【表３０】
2014510165.tif 000032
【０４２９】
固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットの遊離含油率の測定
遊離油は、通常、試料をｎ−ヘプタンと撹拌し、遠心分離し、次いで上清を乾燥するまで蒸発させることにより測定する。次いで、得られた残留油を重量測定し、元の試料の重量割合として表現する。この手順は、ペレット化藻類試料について十分でないことが見出された。それというのも、得られた残留物が顕著なレベルの色素を含有したためである。したがって、上記手順は、上記の残留物を回収し、既知量のＣ１５：０内部標準を添加し、次いで総油測定と同一のパラメーターを使用するＧＣ／ＦＩＤにより分析することにより改変した。このようにして、試料の遊離油含有率を３．７％と測定した。正規化後、藻類の遊離油含有率は４．５％（すなわち、３．７％を０．８２１で割った）と測定した。
【０４３０】
固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットのＳＣＦ抽出
抽出容器に、２４．６０ｇの固体ペレット（乾燥重量基準）を装填し、粉砕剤および結合剤を補正すると約２１．２４ｇの藻類をもたらした。ペレットをＣＯ２によりフラッシュし、次いで約４０℃に加熱し、約３１１ｂａｒに加圧した。ペレットをこれらの条件において３．８ｇ／ｍｉｎのＣＯ２の流速において約６．７ｈｒ抽出し、約７１ｇのＣＯ２／ｇ藻類の最終溶媒フィード（Ｓ／Ｆ）比を得た。抽出収率は装填された藻類の６．２％
であった。
【０４３１】
上記に基づき、本明細書に記載の方法［すなわち、（ａ）ある水分レベルを有し、含油微生物を含む微生物バイオマス、および少なくとも１つの吸油し得る粉砕剤を混合して破砕微生物バイオマスを含む破砕バイオマス混合物を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの結合剤を前記破砕バイオマス混合物とブレンドして固体ペレットを形成し得る固定可能な混合物を提供する工程；ならびに（ｃ）固定可能な混合物から前記固体ペレットを形成する工程を含む方法］は、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）からの破砕微生物バイオマスを含む固体ペレットを生成するために首尾良く利用することができることが結論づけられる。本方法論は、多くの他の含油微生物に好適であることが証明されることが仮定されるが、それぞれの特定の微生物についてのプロセスの最適化が破砕効率の増加をもたらすことが予期される。
【０４３２】
さらに、本実施例は、固体ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）ペレットを種々の手段において溶媒により抽出して油を含む抽出物を提供することができることを実証する。当技術分野において周知のとおり、異なる抽出法は、異なる量の抽出油をもたらし；抽出収率は、抽出プロセスの最適化時に特定の固体ペレットについて増加させることができることが予期される。さらに、抽出油を本明細書の開示に従って短行程蒸留条件下で蒸留に供することができることが予期される。
【０４３３】
実施例２７
総脂肪酸［「ＴＦＡ」］の５８．２％のＥＰＡを含む微生物油の調製
本実施例は、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の微生物バイオマスから得られた微生物油の単離を記載する。次いで、実施例２８〜３０に下記のとおり微生物油を種々の手段により富化する。
【０４３４】
微生物油を、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスからイソヘキサン溶媒を介して単離し、精製し、５８．２ＥＰＡ％ＴＦＡを含む未濃縮トリグリセリドリッチ精製油を得た。
【０４３５】
Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスの発酵およびそれからの微生物油の抽出
材料に従って、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株を、２段階流加プロセスにおいて成長させ、脱水し、洗浄した。次いで、ドラム乾燥させて水分を５％未満に低減させて未処理微生物バイオマスの短期貯蔵および輸送の間の油安定性を確保した。
【０４３６】
次いで、微生物バイオマスを、イソヘキサン溶媒を用いる機械的破砕に供してバイオマスからＥＰＡリッチの微生物油を抽出した。残留バイオマス（すなわち、細胞デブリス）を除去し、溶媒を蒸発させて抽出油を得た。抽出油を、リン酸を使用して脱ガム処理し、２０ボーメ度の腐食剤によりリファインしてリン脂質、微量金属および遊離脂肪酸を除去した。シリカおよびクレーによる漂白を使用して有色化合物および少量の酸化生成物を吸着させた。最終脱臭工程は揮発性、悪臭および追加の有色化合物をストリップ除去してＰＵＦＡをそれらの中性トリグリセリド形態で含む未濃縮精製微生物油を得た。
【０４３７】
Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株からの微生物油の特性決定
未濃縮精製油の脂肪酸組成を、実施例２２Ａに記載のＧＣ法を使用して分析した。
【０４３８】
未濃縮Ｙ８６７２精製油についてのＧＣ分析から得られた結果を、以下の表３０に示す。精製油は、５８．２ＥＰＡ％ＴＦＡを含有し、ＤＨＡは検出不能であった（すなわち、＜０．０５％）。
【０４３９】
【表３１】
2014510165.tif 000033
【０４４０】
当業者は、バイオマスをペレット化、抽出、次いで短行程蒸留条件下での蒸留に供した場合、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株から類似の組成の微生物油を得ることができることを予期する。
【０４４１】
実施例２８
尿素アダクト形成を介する微生物油の富化
本実施例は、油の重量パーセントとして計測して最大７８％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、尿素アダクト形成を介する実施例２７からの未濃縮精製油の富化時に得ることができることを実証する。
【０４４２】
最初にＫＯＨ（２０ｇ）を３２０ｇの絶対エタノール中で溶解させた。次いで、溶液を１ｋｇの実施例２７からの未濃縮精製油と混合し、約６０℃に４時間加熱した。完全な相分離のため、反応混合物を分液漏斗中で一晩平静にした。下層グリセロール画分を除去した後、少量のシリカを上層エチルエステル画分に添加して過剰の石鹸を除去した。エタノールを真空下で約９０℃において回転蒸発器にかけて除去し、澄明であるが淡褐色のエチルエステルを得た。
【０４４３】
エチルエステル（２０ｇ）を４０ｇの尿素および１００ｇのエタノール（９０％水性）と約６５℃において混合した。混合物を、それが澄明な液体に変化するまでこの温度において維持した。次いで、尿素結晶およびアダクトの形成のために混合物を冷却し、室温において約２０時間保持した。次いで、固体を濾過を介して除去し、液体画分を回転蒸発器にかけてエタノールを除去した。回収したエチルエステル画分を２００ｍＬの温水の１回目、次いで２回目の洗液により洗浄した。溶液のｐＨを最初に３〜４に調整してから水性画分をデカント除去した。次いで、エチルエステル画分を乾燥させて残留水を除去した。
【０４４４】
エチルエステル画分の脂肪酸エチルエステル［「ＦＡＥＥ」］濃度を決定するため、ＦＡＥＥをトルエン／ヘキサン（２：３）中での希釈後に実施例２２Ａに上記したのと同一のＧＣ条件および計算を使用して直接分析してＦＡＭＥ濃度を決定した。方法論における唯一の改変は：ｉ）Ｃ１５：０に代えてＣ２３：０ＥＥを内部スタンダードとして使用し；１．０４２〜１．０５２の分子量変換係数が要求されないことであった。
【０４４５】
しかしながら、ＥＰＡエチルエステル［「ＥＰＡ−ＥＥ」］を、上記のものからわずかに改変した手順に供した。具体的には、既知濃度および純度の参照ＥＰＡ−ＥＥスタンダードを、分析試料中で予期されるほぼ同一量のＥＰＡ−ＥＥおよび同一量のＣ２３：０ＥＥ内部スタンダードを含有するように調製した。試料中のＥＰＡ−ＥＥの正確な量（ｍｇ）は、式：（ＥＰＡ−ＥＥピークの面積／Ｃ２３：０ＥＥピークの面積）×（較正スタンダードにおけるＣ２３：０ＥＥピークの面積／較正スタンダードにおけるＥＰＡ−ＥＥピークの面積）×（較正スタンダードにおけるｍｇＥＰＡ−ＥＥ）に従って計算する。全ての内部および参照スタンダードは、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃから入手した。
【０４４６】
このように、ＦＡＥＥ濃度を富化油画分、すなわち、ＥＰＡ濃縮物において決定した。具体的には、表３１に示すとおり、尿素アダクト形成を介する未濃縮精製油の富化により、油の重量パーセントとして計測して７７％のＥＰＡエチルエステルを有し、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を得た。
【０４４７】
【表３２】
2014510165.tif 000034
【０４４８】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して７７％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、当業者に周知の手段を使用して容易に変換して代替的形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができることを認識する（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、およびそれらの組合せに変換することができる）。したがって、例えば、７７％のＥＰＡエチルエステルを、グリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化して油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないトリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物をもたらすことができる。
【０４４９】
実施例２９
液体クロマトグラフィーを介する微生物油の富化
本実施例は、油の重量パーセントとして計測して最大９５．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、液体クロマトグラフィー法を使用する実施例２７からの未濃縮精製油の富化時に得ることができることを実証する。
【０４５０】
実施例２７からの未濃縮精製油を、実施例２８に記載の方法と同様の方法を使用してエチルエステルにエステル交換したが、一部わずかに改変した（すなわち、塩基触媒として水酸化カリウムに代えてナトリウムエトキシドを使用）。
【０４５１】
次いで、エチルエステルをＥｑｕａｔｅｑ（Ｉｓｌｅ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）によりそれらの液体クロマトグラフィー精製技術を使用して富化した。種々の富化度を達成した（例えば、以下の試料＃１および試料＃２についての実験データを参照）。したがって、表３２に示すとおり、液体クロマトグラフィーを介する未濃縮精製油の富化により、油の重量パーセントとして計測して最大９５．４％のＥＰＡエチルエステルを有し、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を得た。
【０４５２】
【表３３】
2014510165.tif 000035
【０４５３】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して８２．８％のＥＰＡエチルエステルまたは９５．４％のＥＰＡエチルエステルのいずれかを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、当業者に周知の手段を使用して容易に変換して代替的形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができることを認識する（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、およびそれらの組合せに変換することができる）。したがって、例えば、８２．８％ＥＰＡのエチルエステルまたは９５．４％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化して油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないトリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物をもたらすことができる。
【０４５４】
実施例３０
超臨界流体クロマトグラフィーを介する微生物油の富化
本実施例は、油の重量パーセントとして計測して最大８９．８％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、超臨界流体クロマトグラフィー［「ＳＦＣ」］法を使用する実施例２７からの未濃縮精製油の富化時に得ることができることを実証する。
【０４５５】
実施例２７からの未濃縮精製油を、塩基触媒としてのナトリウムエトキシドを使用してエチルエステルにエステル交換し、次いで吸着カラムを介して処理して超臨界ＣＯ２中で不溶である化合物を除去した。次いで、処理されたエチルエステル油をＫ．Ｄ．Ｐｈａｒｍａ（Ｂｅｘｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりそれらの超臨界クロマトグラフィー技術を使用して精製した。種々の富化度を達成した（例えば、以下の試料＃１および試料＃２についての実験データを参照）。したがって、表３３に示すとおり、ＳＦＣを介する未濃縮精製油の富化により、油の重量パーセントとして計測して８５％および８９．８％のＥＰＡエチルエステルを有し、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を得た。
【０４５６】
【表３４】
2014510165.tif 000036
【０４５７】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して８５％のＥＰＡエチルエステルまたは８９．８％のＥＰＡエチルエステルのいずれかを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、当業者に周知の手段を使用して容易に変換して代替的形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができることを認識する（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、およびそれらの組合せに変換することができる）。したがって、例えば、８５％のＥＰＡエチルエステルまたは８９．８％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化して油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないトリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物をもたらすことができる。
【０４５８】
実施例３１
総脂肪酸［「ＴＦＡ」］の５６．１％のＥＰＡを含む微生物油の調製
本実施例は、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の微生物バイオマスから得られた微生物油の単離を記載する。次いで、この微生物油を以下の実施例３２に記載のとおり分留により富化した。
【０４５９】
具体的には、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株を、約５８．７ＥＰＡ％ＴＦＡの生成を可能とするように組換え遺伝子操作し、２段階流加プロセスを使用して培養した。次いで、微生物油を乾燥を介してバイオマスから単離し、抽出（押出、ペレット化および超臨界流体抽出の組合せを介して）し、短行程蒸留を介して精製し、５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含む未濃縮トリグリセリドリッチのＳＰＤ精製油（すなわち、脂質含有画分）を得た。
【０４６０】
乾燥未処理Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスの発酵および押出を介する破砕およびペレット化
前出の材料セクションに記載のとおり、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株培養物を発酵させ、微生物バイオマスを回収し、乾燥させた。
【０４６１】
次いで、乾燥未処理バイオマスを２軸スクリュー押出機にフィードした。具体的には、バイオマスおよび１５％の珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４またはＣｅｌｉｔｅ  ２０９，ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）の混合物を予備混合し、次いでＺＳＫ−４０ｍｍ  ＭＣ２軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  ＆  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４５．５ｋｇ／ｈｒの速度においてフィードした。２６．５％のスクロースからなる水／スクロース溶液を、押出機の破砕帯域後に１４７ｍＬ／ｍｉｎの流速において注入した。押出機は、２８０ｒｐｍにおいて２０〜２３の％トルク範囲で稼働させた。得られた破砕酵母粉末を、最終水冷バレル中で３５℃に冷却した。次いで、湿潤押出粉末を、多孔ドームダイ１ｍｍ直径×１ｍｍ厚スクリーンから組み立てられ、８２ＲＰＭに設定されたＬＣＩドーム粗砕機モデル番号ＴＤＧ−８０（ＬＣＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）中にフィードした。押出物を、４５５〜６００ｋｇ／ｈｒ（乾燥時速度として）において形成した。試料を、１００℃において維持される１１５０標準立方フィート毎分［「ｓｃｆｍ」］の空気流を有する０．５０ｍ２の乾燥帯域および１８℃において５００〜６００ｓｃｆｍと推定される空気流により稼働する０．２４ｍ２の冷却帯域を有する振動流動床乾燥機（ＦＢＰ−７５，Ｃａｒｍａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＩＮ）中で乾燥させた。約１ｍｍ直径×長さ６から１０ｍｍの乾燥ペレットは、２５〜３０℃の範囲で乾燥機を出て、Ｏ’Ｈａｕｓ水分分析装置（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）により計測して５〜６％の最終水分含有率を有した。
【０４６２】
押出酵母バイオマスの油抽出
実施例２２Ｂに記載の３２０Ｌステンレス鋼抽出容器および構成を使用して、押出酵母ペレットを、抽出溶媒としての超臨界流体相ＣＯ２を使用して抽出して未濃縮抽出油を生成した。油抽出物を分別器から定期的に抜き、生成物として回収した。
【０４６３】
抽出容器に、最初に約１５０ｋｇの押出酵母ペレットを装填した。次いで、未濃縮抽出油をペレットから超臨界流体ＣＯ２により５０００ｐｓｉｇ（３４５ｂａｒ）、５５℃および出発酵母ペレット１ｋｇ当たり４０から５０ｋｇのＣＯ２の範囲の溶媒フィード比において抽出した。約３７．５ｋｇの未濃縮抽出油を分別器容器から回収し、それに約１０００ｐｐｍの２つの酸化防止剤のそれぞれ、すなわち、Ｃｏｖｉ−ｏｘ  Ｔ７０（Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）およびＤａｄｅｘ  ＲＭ（Ｎｅａｌａｎｄｅｒｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を添加した。
【０４６４】
ＳＰＤ条件下での蒸留
未濃縮抽出油を脱ガスし、次いで６’’分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度を使用して通過させて残留水を除去した。蒸発器および凝縮器の表面温度は、それぞれ１４０℃および１５℃に設定した。真空は１５ｔｏｒｒに維持した。
【０４６５】
脱水抽出油を分子蒸留器を介して１２ｋｇ／ｈｒのフィード速度において２回目として通過させ、蒸留物中の不所望な低分子量化合物、例えばエルゴステロールおよび遊離脂肪酸を除去した。真空を１ｍｔｏｒｒに低下させ、蒸発器の表面温度を２４０℃から２７０℃の間に維持した。未濃縮抽出油のステロール含有率に対して低減したステロールを有するトリアシルグリセロール含有画分（すなわち、脂質含有画分またはＳＰＤ精製油）を得た。未濃縮ＳＰＤ精製油を４０℃未満に冷却してから包装した。
【０４６６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株からのＳＰＤ精製油の特性決定
Ｚ１９７８株からの未濃縮ＳＰＤ精製油の脂肪酸組成を、実施例２７の方法論に従ってエステル交換後に分析した。ＳＰＤ精製油は、以下の表３４に示すとおり５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含有し、ＤＨＡは検出不能（すなわち、＜０．０５％）であった。
【０４６７】
【表３５】
2014510165.tif 000037
【０４６８】
実施例３２
分留を介する微生物油の富化
本実施例は、油の重量パーセントとして計測して最大７４％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、分留法を使用する実施例３１からの未濃縮ＳＰＤ精製油の富化時に得ることができることを実証する。
【０４６９】
２５ｋｇの実施例３１からの未濃縮微生物油を、５０Ｌのガラスフラスコに添加した。次いで、７．９ｋｇの絶対エタノールおよび５８０ｇのナトリウムエトキシド（エタノール中２１％）をフラスコに添加した。混合物を約８５℃において少なくとも３０分間加熱環流させた。反応は、薄層クロマトグラフィー法によりモニタリングし、油の希釈試料をシリカプレート上にスポットし、酢酸／ヘキサン／エチルエーテル溶媒混合物を使用して分離した。未反応ＴＡＧからなるスポットをヨウ素染色により検出した。不存在またはほとんど検出不能なスポットは、反応の完了を表すとみなした。反応終点に到達した後、混合物を５０℃未満に冷却し、相を分離させた。グリセロール含有下層を分離し、廃棄した。有機上層を２．５Ｌの５％クエン酸により洗浄し、次いで回収された有機層を５Ｌの１５％水性硫酸ナトリウムにより洗浄した。水相を再度廃棄し、エチルエーテル相をエタノールにより回転蒸発器中で約６０℃において蒸留して残留水を除去した。エチルエステル形態の約２５ｋｇの油を回収した。
【０４７０】
次いで、エチルエステルを４’’ハイブリッドワイプドフィルム（ｗｉｐｅｄ−ｆｉｌｍ）および分別システム（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）に５ｋｇ／ｈｒのフィード速度においてフィードしてＥＰＡエチルエステルを富化した。蒸発器温度を、０．４７ｔｏｒｒの真空下で約２７５℃に設定した。充填カラムの頭部温度は約１４６℃であった。低分子量エチルエステル、主としてＣ１８を、オーバーヘッドから軽質画分として除去した。抽出されたＥＰＡエチルエステルを重質画分として回収し、主として着色および重合物を除去するために第２の蒸留に付した。第２の蒸留は、６’’分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）中で２０ｋｇ／ｈｒのフィード速度において実施した。蒸発器は、約２０５℃において稼働させ、内部凝縮器温度設定を約１０℃および０．０１ｔｏｒｒの真空とした。約７〜１０重量％のエチルエステルが除去され、澄明な淡色ＥＰＡ濃縮物を得た。最終ＥＰＡ濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して７４％のＥＰＡエチルエステルを含有し、実質的にＤＨＡを含まなかった。
【０４７１】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して７４％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、当業者に周知の手段を使用して容易に変換して代替的形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができることを認識する（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、およびそれらの組合せに変換することができる）。したがって、例えば、７４％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化して油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないトリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物をもたらすことができる。
【０４７２】
実施例３３
ＥＰＡ濃縮物は実質的に環境汚染物質を含まない
本実施例は、油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まないＥＰＡ濃縮物、およびＴＦＡの重量％として計測して３０〜７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡを含まない微生物油の両方が、実質的に環境汚染物質を含まないことを実証する。
【０４７３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株からの未濃縮精製油の同等の試料を、実施例２７に記載のとおり調製した。未濃縮抽出油中のポリ塩化ビフェニル［「ＰＣＢ」］、（ＣＡＳ番号１３３６−３６−３）、ポリ塩化ジベンゾジオキシン［「ＰＣＤＤ」］およびポリ塩化ジベンゾフラン［「ＰＣＤＦ」］のｍｇ／ｇ世界保健機関国際毒性等価量（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）［「ＷＨＯ  ＴＥＱ」］として計測される濃度を、ＥＰＡ法１６６８  Ｒｅｖ  Ａに従って測定した。極端に低いかまたは検出不能なレベルの環境汚染物質が検出された。
【０４７４】
上記結果に基づくと、本明細書において、実施例２７の未濃縮抽出油および実施例３１の未濃縮ＳＰＤ精製油中のＰＣＢ、ＰＣＤＤ、およびＰＣＤＦの濃度も、極端に低いかまたは検出不能なレベルの環境汚染物質を含有することが想定される。同様に、本明細書において、それぞれ尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、ＳＦＣおよび分留を介して富化された実施例２８、２９、３０および３２におけるＥＰＡエチルエステル濃度も、極端に低いかまたは検出不能なレベルの環境汚染物質を含有するはずであることが仮定される。それというのも、それらはそれ自体実質的に環境汚染物質を含まない未濃縮油から生成されたためである。
【０４７５】
より具体的には、表３５は、実施例２８、２９、３０および３２におけるＥＰＡ濃縮物内のＰＣＢ、ＰＣＤＤ、およびＰＣＤＦの予期されるＴＥＱレベルを記載する。比較のため、米国特許第７，７３２，４８８号明細書に記載の汚染物質がストリップされた魚油中の同一化合物の濃度も含める。米国特許第７，７３２，４８８号明細書は、それらの環境汚染物質を許容可能なレベルに低減させる特別な処理法を提供することに留意される。
【０４７６】
【表３６】
2014510165.tif 000038
【０４７７】
上記のとおり、実施例２８、２９、３０および３２におけるＥＰＡエチルエステル濃縮物は、米国特許第７，７３２，４８８号明細書における汚染物質がストリップされた魚油よりも低レベルのＰＣＢ、ＰＣＤＤ、およびＰＣＤＦを有する。実際、ＰＣＤＦの汚染物質レベルは、使用される分析法の検出限界未満であることが予期される。
【０４７８】
実施例３４
分留および液体クロマトグラフィーを介する微生物油の富化
本実施例は、油の重量パーセントとして計測して最大９７．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、分留および液体クロマトグラフィー法の組合せを使用する未濃縮精製油の富化時に得ることができることを実証する。
【０４７９】
脂質含有画分を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株（前出、実施例３１；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書も参照）から得た。具体的には、実施例３１に記載のとおり株を培養し、回収し、押出およびペレット化を介して破砕し、超臨界流体相ＣＯ２を使用して抽出した。次いで、未濃縮抽出油をＳＰＤ条件下（実施例３１）で精製した。
【０４８０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのＳＰＤ精製油の特性決定
Ｙ９５０２株からの未濃縮ＳＰＤ精製油の脂肪酸組成を、実施例２７の方法論に従って分析した。以下の表３６に示すとおり、ＳＰＤ精製油は、５４．７ＥＰＡ％ＴＦＡを含有し、ＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡは検出不能であった（すなわち、＜０．０５％）。
【０４８１】
【表３７】
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【０４８２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのＳＰＤ精製油の富化
ＳＰＤ精製油を、実施例２９に記載の方法と同様の方法を使用してエチルエステルにエステル交換し、実施例３１に記載の分留にさらに供した。分留されたＥＰＡ濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して７１．９％のＥＰＡエチルエステルを含有し、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まなかった（以下の表３７の標題「分留」の欄を参照）。
【０４８３】
次いで、分留されたエチルエステルをＥｑｕａｔｅｑ（Ｉｓｌｅ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）によりそれらの液体クロマトグラフィー精製技術を使用して富化した。液体クロマトグラフィーを介する分留されたＥＰＡ濃縮物の富化により、油の重量パーセントとして計測して最大９７．４％のＥＰＡエチルエステルを有し、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まない最終ＥＰＡ濃縮物を得た（以下の表３７の標題「液体クロマトグラフィー富化」の欄を参照）。
【０４８４】
【表３８】
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【０４８５】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して９７．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＰＤＡおよびＨＰＡを含まないＥＰＡ濃縮物を、当業者に周知の手段を使用して容易に変換して代替的形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができることを認識する（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、およびそれらの組合せに変換することができる）。したがって、例えば、９７．４％のＥＰＡエチルエステルを、グリセロール分解を介してトリグリセリドに再エステル化して油の重量％として計測して少なくとも７０重量％のＥＰＡを含み、実質的にＤＨＡ、ＮＰＤＡおよびＨＰＡを含まないトリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物をもたらすことができる。
【０４８６】
さらに、ＥＰＡの生成について遺伝子操作された組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の任意の微生物バイオマスから本明細書における本発明の方法により調製されたＥＰＡ濃縮物は、実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まないと予期されることが留意される。最終ＥＰＡ濃縮物が実質的にＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡを含まない、Ｙ・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株から得られた微生物油に基づき上記で得られた結果は、実施例２７および実施例３１から得られた微生物油から調製されるＥＰＡ濃縮物から予期される。ＤＨＡ、ＮＤＰＡおよびＨＰＡ不純物が、油として乾燥細胞重量の２５％を超過して蓄積するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から得られた、ＴＦＡの重量％として計測して３０から７０重量％のＥＰＡを含む初期微生物油中に存在しないため、脂肪酸不純物は、それから生成されたＥＰＡ濃縮物中にも存在しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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