(57)【要約】本発明は、単為発生的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する幹細胞から得られたＮＳＣ（ｐｈＮＳＣ）を生成する組成物および方法の将来性のある発見に関する。本発明のｐｈＮＳＣは、増殖能および分化能を培養および増大の間維持する。本発明は、単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させた、単離されたニューロン幹細胞を提供する。2014509192.tif 000014
2014509192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させた、単離されたニューロン幹細胞。
【請求項２】
卵母細胞ドナーと組織適合する、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項３】
一致しているハプロタイプに基づいて集団群と組織適合する、請求項２に記載のニューロン幹細胞。
【請求項４】
ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項５】
母系ゲノムのみを含有する、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項６】
卵母細胞ドナーと組織適合し、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有し、かつ母系ゲノムのみを含有する、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項７】
ヒトに移植可能である、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項８】
未分化であるか、部分的に分化させたか、または完全に分化させた、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項９】
ニューロン細胞に分化させることができる、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項１０】
ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択される分化したニューロン細胞であることができる、請求項９に記載のニューロン幹細胞。
【請求項１１】
ニューロンである、請求項１０に記載の分化したニューロン細胞。
【請求項１２】
コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される、請求項１１に記載のニューロン。
【請求項１３】
ドーパミン作動性ニューロンである、請求項１２に記載のニューロン。
【請求項１４】
ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｈａｓｈｉ−１、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５からなる群から選択される神経マーカーを発現する、請求項１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項１５】
単為生殖由来のヒト幹細胞を分化させることによって、ニューロン幹細胞を生成するための方法であって、
（ａ）線維芽細胞のフィーダー層上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも２日間成長させるステップと、
（ｂ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも１日間成長させるステップと、
（ｃ）ニューロン誘導培地中で該細胞を培養するステップと、
（ｄ）（ｃ）からの細胞の単一細胞懸濁液を得るステップと、
（ｅ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で、ニューロン増殖培地中でステップ（ｄ）からの単一細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記ニューロン誘導培地が、
（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液と、
（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、
（ｃ）ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液と、
（ｄ）Ｌ−グルタミンと、
（ｅ）Ｎ２サプリメントと、
（ｆ）ｂＦＧＦと
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニューロン増殖培地が、
（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンと、
（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、
（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉと、
（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントと、
（ｅ）ｂＦＧＦと、
（ｆ）ＥＧＦと
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペトリ皿がＣＥＬＬｓｔａｒｔで被覆される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法によって生成された、ニューロン幹細胞。
【請求項２０】
神経上皮ロゼットが約１〜２週間で形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）線維芽細胞のフィーダー層上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも２日間成長させるステップと、
（ｂ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも１日間成長させるステップと、
（ｃ）ニューロン誘導培地中で該細胞を培養するステップと、
（ｄ）（ｃ）からの細胞の単一細胞懸濁液を得るステップと、
（ｅ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で、ニューロン増殖培地中でステップ（ｄ）からの単一細胞を培養するステップと
を含む方法を使用して単為生殖由来のヒト幹細胞から得られた、単離されたニューロン幹細胞。
【請求項２２】
ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５からなる群から選択される神経マーカーを発現する、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ニューロン幹細胞が、ニューロン表現型を少なくとも２７継代の間維持する、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ニューロン幹細胞が、ニューロン細胞に分化することができる、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２５】
前記ニューロン細胞が、ニューロン、グリア細胞、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
ニューロンである、請求項２５に記載の分化したニューロン細胞。
【請求項２７】
コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される、請求項２６に記載のニューロン。
【請求項２８】
ドーパミン作動性ニューロンである、請求項２７に記載のニューロン。
【請求項２９】
前記卵母細胞ドナーと組織適合する、請求項２１に記載の細胞。
【請求項３０】
ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する、請求項２１に記載の細胞。
【請求項３１】
母系ゲノムのみを含有する、請求項２１に記載の細胞。
【請求項３２】
前記卵母細胞ドナーと組織適合し、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有し、かつ母系ゲノムのみを含有する、請求項２１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項３３】
ヒトに移植可能である、請求項２１に記載のニューロン幹細胞。
【請求項３４】
単為生殖由来の卵母細胞から生成されたニューロン幹細胞を使用して、神経疾患を治療する方法。
【請求項３５】
前記神経疾患が、てんかん、けいれん、神経毒傷害、低酸素症、無酸素症、虚血、脳卒中、脳血管発作、脳もしくは脊髄損傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺水、窒息、周生期仮死、血糖降下イベント、神経変性、アルツハイマー病、老年性認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ダウン症候群、コルサコフ病、統合失調症、ＡＩＤＳ認知症、多発梗塞性認知症、ビンスワンガー認知症、神経損傷、発作、化学毒性、嗜癖、モルヒネ耐性、アヘン耐性、オピオイド耐性、バルビツレート耐性、急性および慢性疼痛、偏頭痛、不安症、大鬱病、躁鬱病、強迫性障害、統合失調症および気分障害、双極性障害、単極性鬱病、気分変調、季節性情動障害、ジストニアまたは他の運動障害、睡眠障害、筋肉弛緩、ならびに尿失禁からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ニューロン幹細胞が、かかる治療を必要とする患者に移植される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ニューロン分化培地中でニューロン幹細胞を培養するステップを含む、ニューロン幹細胞を分化させる方法。
【請求項３８】
前記ニューロン分化培地が、
（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンと、
（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、
（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉと、
（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントと
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ニューロン幹細胞を、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ニューロンである、請求項３９に記載の分化したニューロン細胞。
【請求項４１】
コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される、請求項４０に記載のニューロン。
【請求項４２】
ドーパミン作動性ニューロンである、請求項４１に記載のニューロン。
【請求項４３】
請求項３７に記載の方法によって生成された、分化した細胞。
【請求項４４】
単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させた、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４５】
単為生殖由来のヒト幹細胞を分化させることによってニューロン幹細胞を生成するための方法であって、
（ａ）フィーダーを含まない条件でのヒト多能性幹細胞の培養と、
（ｂ）ニューロン誘導培地への該細胞の曝露と、
（ｃ）部分的に分化した細胞の機械的単離と、
（ｄ）該細胞の成熟までのさらなる増大および維持と
を含む、方法。
【請求項４６】
前記ニューロン誘導培地が、
（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液と、
（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、
（ｃ）ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液と、
（ｄ）Ｌ−グルタミンと、
（ｅ）Ｎ２サプリメントと、
（ｆ）ｂＦＧＦと
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ニューロン増殖培地が、
（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンと、
（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、
（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉと、
（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントと、
（ｅ）ｂＦＧＦと、
（ｆ）ＥＧＦと
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
フィーダーを含まない条件が、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチンを含むがこれらに限定されないＥＣＭ基質を用いる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４５に記載のニューロン幹細胞。
【請求項５０】
神経上皮ロゼットが１〜２週間後に形成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）フィーダーを含まない条件でのヒト多能性幹細胞の培養と、
（ｂ）ニューロン誘導培地への該細胞の曝露と、
（ｃ）部分的に分化した細胞の機械的単離と、
（ｄ）該細胞の成熟までのさらなる増大および維持と
を含む方法を使用して単為生殖由来のヒト幹細胞から得られた、単離されたニューロン幹細胞。
【請求項５２】
ＳＯＸＢ１−ファミリーＮＥＳ、ＭＳＨ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＮＤ１、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、およびＧＡＰ４３からなる群から選択される神経幹細胞マーカーを発現する、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
前記ニューロン幹細胞が、ニューロン表現型を少なくとも３０継代の間維持する、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５４】
前記ニューロン幹細胞が、ニューロン細胞に分化することができる、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５５】
前記ニューロン細胞が、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される、請求項５４に記載の細胞。
【請求項５６】
単為生殖由来の卵母細胞から得られたニューロン幹細胞を使用して、神経疾患を治療する方法。
【請求項５７】
前記神経疾患が、てんかん、けいれん、神経毒傷害、虚血、脳卒中、脳血管発作、脳もしくは脊髄損傷、身体的外傷、アルツハイマー病、老年性認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、統合失調症、神経損傷、偏頭痛、不安症、大鬱病、躁鬱病、強迫性障害、統合失調症および気分障害、双極性障害、単極性鬱病、ジストニアまたは他の運動障害、睡眠障害、筋肉弛緩からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ニューロン幹細胞が、かかる治療を必要とする患者に移植される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ニューロン分化培地中でニューロン幹細胞を培養するステップを含む、ニューロン幹細胞を分化させる方法。
【請求項６０】
前記ニューロン分化培地が、
（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンと、
（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、
（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉと、
（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントと
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ニューロン幹細胞を、ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５９に記載の分化した細胞。
【請求項６３】
単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させた、請求項５９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全体として幹細胞に関し、より具体的には、ヒト幹細胞を使用してニューロン幹細胞を生成するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）細胞は、一連の細胞型に分化することができる多能性細胞である。免疫不全マウスに注入されると、胚性幹細胞は分化した腫瘍（奇形腫）を形成する。しかしながら、胚様体（ＥＢ）を形成するようにインビトロで誘導される胚性幹細胞は、ある成長条件下でいくつかの組織に特徴的な複数の細胞型への分化の影響を受け易い、胚性幹細胞株の供給源を提供する。例えば、ｈＥＳＣは、内胚葉、外胚葉、および中胚葉誘導体に分化している。
【０００３】
ヒトＥＳ細胞およびそれらの分化した子孫は、治療的移植ならびに薬物試験および開発のためのヒト細胞の重要な供給源である。これらの目標の両方に必要なのは、それを必要とする患者または適切な薬理試験に適した組織型に分化させた、十分な細胞の提供である。これと関連して、胚性幹細胞由来の分化した細胞を生成する効率的かつ信頼できる方法が必要である。
【０００４】
哺乳類卵母細胞の単為発生的活性化を使用して、胚性幹細胞生成のための卵母細胞を調製することができる。単為発生的活性化は、雄性配偶子からのいずれの寄与もなく、雌性配偶子から胚細胞を生成することである。
【０００５】
現在、幹細胞研究の焦点は、自然な体組織に代わる人工器官、リハビリテーション装置、またはプロテーゼの開発である。この開発は、概して増大／分化を制御するように幹細胞を操作するための生体適合性材料の使用、すなわち、増殖のための機械的支持を提供することによって組織様機能を模倣する装置を作成するための３Ｄ足場（例えば、ＰＬＧ足場、キトサン足場、ＰＣＬ／ＰＥＧ足場）の使用を想定する。
【０００６】
あるいは、培養された幹細胞または分化した幹細胞の移植が、治療法として想定される。これらの方法は、概して、インビボ組織工学またはインサイチュー生成として知られる。この分野における研究の多くは、培養細胞の直接移植を意味するが、実際問題として、かかる方法は多くの場合、分化した幹細胞を多孔性足場生体材料（例えば、幹細胞およびゲルまたは多孔性アルギネートに由来する心筋細胞）内に播種する必要がある。
【０００７】
未受精のヒト卵母細胞は、適切な化学刺激によって人工的に活性化されて、単為生殖胚盤胞に発展し得る。かかる胚盤胞の内細胞塊は単離され、幹細胞株として増大され得る。Ｒｅｖａｚｏｖａらによって初めて意図的に得られたヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）は、それらの増殖能および多分化能インビトロ分化においてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に類似する［１、２］。ｈｐＳＣは、ゲノムが母系染色体組のみから形成する方法に応じて、ヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかであり得る。ｈｐＳＣ中のＨＬＡ遺伝子の組は、免疫拒絶の影響を受けにくい分化した誘導体を生成することができるため、ホモ接合性ｈｐＳＣは、移植用細胞の供給源として有用であり得る。さらに、ＨＬＡ型が一般的である場合、分化した誘導体は、数百万人もの個人に一致する［２、３］。これらの免疫遺伝学的利点に加えて、単為生殖は生存能力のあるヒト胚の破壊を伴わないため、ｈｐＳＣの使用は、従来のｈＥＳＣと同じ倫理的問題が生じない。したがって、ｈｐＳＣは、多分化能神経幹細胞（ＮＳＣ）を含む体細胞株の供給源として他の多能性幹細胞の魅力的な代替である。
【０００８】
ＮＳＣは、ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトに分化する能力を有する、神経系の自己複製多分化能幹細胞である［４］。ＮＳＣは、胎児および成体中枢神経系から直接、または多能性幹細胞から誘導された神経分化によって得られ得る。ＮＳＣは、それらの分化能を比較的長期間にわたって喪失することなくインビトロで増殖することができる細胞培養物として得られ、したがって、さらなる適用の細胞材料の予備を提供する。ＮＳＣは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病等の神経変性疾患の回復治療、ならびに不動性状態に至る脊髄損傷の見込み療法として考えられる。動物モデルによる良好な実験は、ＮＳＣの使用による細胞治療の有効性を確認している［５］。
【０００９】
ニューロンおよびグリア細胞に分化する能力は、マウス［６］、霊長類［７］、およびヒト単為生殖幹細胞［１、２、８］について実験的に証明された。単為生殖幹細胞は、２組の母系のインプリントされた遺伝子を担持し、３つの胚葉全ての誘導体への分化に関する障害となることが推定される。しかしながら、キメラ動物による実験は、神経系を含む外胚葉起源の組織および器官において、単為生殖細胞の消滅の程度が低いことを明らかにした［９］。Ｃｉｂｅｌｌｉらは、非ヒト霊長類カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）単為生殖幹細胞の確定について説明し、この細胞株は、Ｃｙｎｏ−１と呼ばれた［７］。多能性状態の証明として、Ｃｙｎｏ−１インビトロ分化が行われ、特にニューロン誘導体が得られた。後に、Ｓaｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅらは、指令された分化によってインビトロでＣｙｎｏ−１からドーパミンニューロンを得て、ラットおよびサルのパーキンソン病モデルに対するそれらの有効な治療を示した［１０］。ｐｈＳＣのインビトロでの神経分化は、Ｒｅｖａｚｏｖａら［１、２］およびＨａｒｎｅｓｓら［８］によって示された。これらの研究に関わらず、長い間増殖するヒト単為生殖ＮＳＣは、依然として得られていない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、単為発生的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する幹細胞から得られたＮＳＣ（ｐｈＮＳＣ）を生成する組成物および方法の将来性のある発見に関する。本発明のｐｈＮＳＣは、増殖能および分化能を培養および増大の間維持している。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させた、単離されたニューロン幹細胞を提供する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、母系ゲノムのみを含有する。一態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合し、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有し、かつ母系ゲノムのみを含有する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、一致しているハプロタイプに基づいて集団群と組織適合する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ヒトに移植可能である。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、未分化であるか、部分的に分化させられるか、または完全に分化させられる。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン細胞に分化させられることができる。ニューロン幹細胞は、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させられることができる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。分化したニューロン細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合し、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有し、かつ母系ゲノムのみを含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｈａｓｈｉ−１、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５からなる群から選択される神経マーカーを発現する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）線維芽細胞のフィーダー層上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも２日間成長させることと、（ｂ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも１日間成長させることと、（ｃ）ニューロン誘導培地中で該細胞を培養することと、（ｄ）（ｃ）からの細胞の単一細胞懸濁液を得ることと、（ｅ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で、ニューロン増殖培地中でステップ（ｄ）からの単一細胞を培養することとによって単為生殖由来のヒト幹細胞を分化させることでニューロン幹細胞を生成するための方法を提供する。一態様において、ニューロン誘導培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）で形成される。さらなる態様において、ニューロン誘導培地中に、Ｌ−グルタミンは、２ｍＭで存在し、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液は、０．１ｍＭで存在し、ｂＦＧＦは、４〜２０ｎｇ／ｍＬで存在する。別の態様において、ニューロン増殖培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、および２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で形成される。追加の態様において、ＦＧＦおよびＥＧＦは、ニューロン増殖培地中に２０ｎｇ／ｍＬで存在する。さらなる態様において、ペトリ皿は、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で被覆される。本発明は、この方法によって生成されたニューロン幹細胞も提供する。追加の態様において、神経上皮ロゼットは、約１〜２週間の培養でニューロン誘導培地中に形成する。
【００１３】
さらなる実施形態において、本発明は、（ａ）線維芽細胞のフィーダー層上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも２日間成長させることと、（ｂ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも１日間成長させることと、（ｃ）ニューロン誘導培地中で該細胞を培養することと、（ｄ）（ｃ）からの細胞の単一細胞懸濁液を得ることと、（ｅ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で、ニューロン増殖培地中でステップ（ｄ）からの単一細胞を培養することとによって単為生殖由来のヒト幹細胞から得られる、単離されたニューロン幹細胞を提供する。一態様において、ニューロン幹細胞は、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｈａｓｈｉ−１、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５からなる群から選択される神経マーカーを発現する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン表現型を少なくとも２７継代の間維持する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、母系ゲノムのみを含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ヒトに移植可能である。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、未分化であるか、部分的に分化させられるか、または完全に分化させられる。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン細胞に分化させられることができる。別の態様において、ニューロン幹細胞から分化させたニューロン細胞は、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトであることができる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、単為生殖由来の卵母細胞から生成されたニューロン幹細胞を使用して、神経疾患を治療する方法を提供する。一態様において、神経疾患は、てんかん、けいれん、神経毒傷害、低酸素症、無酸素症、虚血、脳卒中、脳血管発作、脳もしくは脊髄損傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺水、窒息、周生期仮死、血糖降下イベント、神経変性、アルツハイマー病、老年性認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ダウン症候群、コルサコフ病、統合失調症、ＡＩＤＳ認知症、多発梗塞性認知症、ビンスワンガー認知症、神経損傷、発作、化学毒性、嗜癖、モルヒネ耐性、アヘン耐性、オピオイド耐性、バルビツレート耐性、急性および慢性疼痛、偏頭痛、不安症、大鬱病、躁鬱病、強迫性障害、統合失調症および気分障害、双極性障害、単極性鬱病、気分変調、季節性情動障害、ジストニアまたは他の運動障害、睡眠障害、筋肉弛緩、ならびに尿失禁からなる群から選択される。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、かかる治療を必要とする患者に移植される。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、ニューロン分化培地中でニューロン幹細胞を培養することによって、ニューロン幹細胞を分化させる方法を提供する。一態様において、ニューロン分化培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン（ＶＷＲ  Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させられる。本発明は、ニューロン幹細胞から分化させたニューロン細胞も提供する。一態様において、ニューロン幹細胞は、単為生殖由来のヒト幹細胞から生成される。別の態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、母系ゲノムのみを含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ヒトに移植可能である。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、未分化であるか、部分的に分化させられるか、または完全に分化させられる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、（ａ）フィーダーを含まない条件でのヒト多能性幹細胞の培養と、（ｂ）ニューロン誘導培地への該細胞の曝露と、（ｃ）部分的に分化した細胞の機械的単離と、（ｄ）該細胞の成熟までのさらなる増大および維持とによって単為生殖由来のヒト幹細胞を分化させることでニューロン幹細胞を生成するための方法を提供する。一態様において、ニューロン誘導培地は、（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液、（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、（ｃ）ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、（ｄ）Ｌ−グルタミン、（ｅ）Ｎ２サプリメント、および（ｆ）ｂＦＧＦを含む。さらなる態様において、ニューロン誘導培地中に、Ｌ−グルタミンは、２ｍＭで存在し、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液は、０．１ｍＭで存在し、ｂＦＧＦは、４〜２０ｎｇ／ｍＬで存在する。別の態様において、ニューロン増殖培地は、（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン、（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ、（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメント、（ｅ）ｂＦＧＦ、および（ｆ）ＥＧＦを含む。追加の態様において、ＦＧＦおよびＥＧＦは、ニューロン増殖培地中に２０ｎｇ／ｍＬで存在する。追加の態様において、フィーダーを含まない条件は、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチンを含むがこれらに限定されないＥＣＭ基質を用いる。本発明は、本方法によって生成されたニューロン幹細胞も提供する。さらなる態様において、神経上皮ロゼットは、１〜２週間後に形成する。
【００１７】
追加の実施形態において、本発明は、（ａ）フィーダーを含まない条件でのヒト多能性幹細胞の培養と、（ｂ）ニューロン誘導培地への該細胞の曝露と、（ｃ）部分的に分化した細胞の機械的単離と、（ｄ）該細胞の成熟までのさらなる増大および維持とを含む方法を使用して単為生殖由来のヒト幹細胞から得られる、単離されたニューロン幹細胞を提供する。一態様において、細胞は、ＳＯＸＢ１−ファミリーＮＥＳ、ＭＳＨ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＮＤ１、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、およびＧＡＰ４３からなる群から選択される神経幹細胞マーカーを発現する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン表現型を少なくとも３０継代の間維持する。一態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン細胞に分化させることができる。追加の態様において、ニューロン細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明は、単為生殖由来の卵母細胞から得られたニューロン幹細胞を使用して神経疾患を治療する方法を提供する。一態様において、神経疾患は、てんかん、けいれん、神経毒傷害、虚血、脳卒中、脳血管発作、脳もしくは脊髄損傷、身体的外傷、アルツハイマー病、老年性認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、統合失調症、神経損傷、偏頭痛、不安症、大鬱病、躁鬱病、強迫性障害、統合失調症および気分障害、双極性障害、単極性鬱病、ジストニアまたは他の運動障害、睡眠障害、筋肉弛緩からなる群から選択される。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、かかる治療を必要とする患者に移植される。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、ニューロン分化培地中でニューロン幹細胞を培養するステップを含む、ニューロン幹細胞を分化させる方法を提供する。一態様において、ニューロン分化培地は、（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンと、（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉと、（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントとを含む。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させられる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。本発明は、この方法によって生成された、分化した細胞も提供する。一態様において、細胞は、単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ニューロン誘導の第７日目のｈｐＳＣ（黒色の棒グラフ）およびＮＥＰロゼット（灰色の棒グラフ）における相対遺伝子発現を示すグラフである。
【図２】ｐｈＮＳＣ（黒色の棒グラフ）およびｈＮＳＣ  Ｈ９（灰色の棒グラフ）における重要な遺伝子の相対転写活性レベルを示すグラフである。
【図３】同時に分化させたｐｈＮＳＣ（黒色の棒グラフ）およびｈＮＳＣ（灰色の棒グラフ）におけるニューロンマーカーＴＵＢＢ３およびＭＡＰ２、ならびにグリアマーカーＧＦＡＰおよびＦＯＸＯ４の発現を示すグラフである。
【図４】単為生殖由来のドーパミン作動性ニューロンが、活動電位を発生させることができることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、単為発生的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する幹細胞から得られたＮＳＣ（ｐｈＮＳＣ）を生成する組成物および方法の将来性のある発見に関する。本発明のｐｈＮＳＣは、増殖能および分化能を培養および増大の間維持している。
【００２２】
本組成物および方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の組成物、方法、および実験条件は変動し得るため、かかる組成物、方法、および条件に限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、本発明の範囲は、添付の請求項においてのみ限定されるため、限定することを意図しないことも理解される。
【００２３】
この明細書および添付の請求項で使用される、単数形「1つの（ａ）」、「1つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のものを示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」に関する言及は、本明細書で説明される種類の１つ以上の方法および／またはステップを含み、この開示を読む等によって当業者に明らかとなるであろう。
【００２４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で説明されるものに類似または相当する任意の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料がここで説明される。
【００２５】
「分化」は、細胞にある特殊化した機能を担わせ、ある他の特殊化した機能単位に変化する能力を喪失させるように、それらの細胞内で発生する変化を指す。分化することができる細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または多分化能細胞のうちのいずれかであってもよい。分化は、成熟した成体細胞に関して部分的または完全であってもよい。
【００２６】
「単為生殖」（「単為発生的に活性化された（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」および「単為生殖的に活性化された（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」は同義的に使用される）は、それによって卵母細胞の活性化が精子進入の不在下で発生する過程であり、全ての雌起源のＤＮＡを含む、卵母細胞または胚細胞、例えば、割球の活性化によって得られる栄養外胚葉および内細胞塊を含む、初期段階の胚の発達を指す。関連する態様において、「単為生殖体」は、かかる活性化によって得られる結果の細胞を指す。別の関連する態様において、「胚盤胞」は、外側栄養膜細胞および内細胞塊（ＩＣＭ）で形成される細胞の中空球を含む、開裂段階の受精した活性化卵母細胞を指す。さらなる関連態様において、「胚盤胞形成」は、卵母細胞の受精後または活性化後の過程を指し、卵母細胞は続いて培地中でしばらく培養されて、外側栄養膜細胞およびＩＣＭで形成される細胞の中空球に発達させることが可能になる（例えば、５〜６日）。
【００２７】
単為生殖体ゲノムは、後成的にインプリントされた母系染色体の単一または二重の組を含有することができる。父系ゲノムはないため、結果として「単為生殖胚盤胞様構造は、ヒト胚に特徴的であると考えられ得る機能的ゲノムを有しない」［１７］。父系ＤＮＡが胚外組織の発達に及ぼす影響の結果として、父系ＤＮＡの不在下で、哺乳類卵は、自然な胚発生の段階を通じて進行することができない．．．」［１８］。さらに、単為生殖体は全能性ではない［１７］。さらに、ヒトになる過程は、母系および父系ＤＮＡインプリンティングの両方を必要とする。単為生殖体は母系ゲノムのみを含有するため、単為発生的活性化は、父系ＤＮＡインプリンティングを伴わず、したがって異なる生物に至る異なる過程である。適切なＤＮＡインプリンティングの欠失は、分子レベル（胚盤胞段階）および巨視的レベルの両方で、適切な胚外組織（すなわち、胎盤）の欠失を観察することによって測定され得る。
【００２８】
加えて、単為発生幹細胞は、いくつかの重要な態様において、核移植を含む、他の方法を使用して得られる幹細胞とは異なる。最初に、単為生殖由来の幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。単為生殖由来の幹細胞は、卵母細胞のゲノムに対して核およびミトコンドリアの両方の正確な一致を提供する。核移植に由来する幹細胞は、ミトコンドリア遺伝子ではなく核遺伝子に一致する、核ドナーの免疫識別に対してほぼ正確な一致を提供し得る。第２に、単為生殖由来の幹細胞は、減数分裂および有糸分裂の間に明らかになる凝縮した染色体のゲノムＤＮＡにおいて、単一ヌクレオチド多型におけるヘテロ接合性の分布によって反映される接合性の固有パターンを有する。単為生殖体は、成体幹細胞または核移植細胞由来の受精した胚から得られた幹細胞（およびそれらの誘導体）と比較して、ＤＮＡの動原体および遠位端を取り囲む領域において見出されるゲノムの接合性の固有のパターンを呈する。Ｋｉｍらにおいて示されるように［１９］、単為生殖細胞は、動原体周辺のホモ接合性を保持するが、ヘテロ接合性の遠位領域を示すか（卵母細胞における減数分裂ＩＩの間に姉妹染色分体の独立した分離の失敗を反映する）、または遺伝マーカーの動原体周辺のヘテロ接合性を保持し、ホモ接合性の特徴的な遠位領域を有する（父系染色体の卵母細胞における減数分裂Ｉの間の染色体の同種組の分離の失敗を反映する）。動原体周辺のホモ接合性およびヘテロ接合性のこれらのパターンおよび染色体の遠位端は、単為生殖幹細胞およびそれらの誘導体を、受精した胚に由来する細胞と、または染色体の全長を通してヘテロ接合性を示す受精した胚に由来する幹細胞から得られた細胞と区別する。第３に、単為生殖由来の幹細胞は、母系ＤＮＡのみを含有する。正常な哺乳類の発達は、母系染色体および父系染色体の両方からの寄与を必要とする。単為生殖体は、活性化された卵母細胞に排他的に由来する。単為生殖体ゲノム（単為生殖を通して生成されるもの）は、卵母細胞が活性化後に放出しようとする極体における染色体の排出が、それぞれ許可されるか、または抑制されるかに応じて、後成的にインプリントされた母系染色体の単一または二重の組のいずれかを本質的に含有する。単為生殖体は、母系染色体のみを含有するため、父系ゲノムまたは他の追加された遺伝物質はない。第４に、単為生殖由来の幹細胞は、常に母系核型ＸＸを有する。
【００２９】
さらに、単為生殖体は、単一の前核のみを含有する。単一の前核は、受精に必要な遺伝物質、すなわち母系ゲノムの半分のみを含有する。さらに、ヒトになることにおいて開始および成功した過程に由来する生物物質を使用する体細胞核移植とは異なり、単為生殖体は、ヒトになる過程にかつて存在した生物物質を決して使用しない。
【００３０】
「多能性細胞」は、異なる分化した組織型、すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉を生じることができる、長期の理論的に無限の期間に未分化の状態で、インビトロで維持され得る全ての雌または雄起源のＤＮＡを含有する細胞の活性化によって生成された胚に由来する細胞を指す。細胞の多能性状態は、好ましくは、内細胞塊、または適切な条件下でアンドロゲンもしくは雌性発生方法によって、例えば、線維芽細胞フィーダー層または別のフィーダー層もしくは白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培養上で培養することによって生成された胚の内細胞塊に由来する細胞を培養することで維持される。かかる培養された細胞の多能性状態は、様々な方法、例えば、（ｉ）多能性細胞に特徴的なマーカーの発現の確認、（ｉｉ）多能性細胞の遺伝子型を発現する細胞を含有するキメラ動物の生成、（ｉｉｉ）インビボで異なる分化した細胞型の生成を伴う、動物、例えば、ＳＣＩＤマウスへの細胞の注入、および（ｉｖ）インビトロでの胚様体および他の分化した細胞型への細胞の分化の観察（例えば、フィーダー層またはＬＩＦの不在下で培養されるとき）によって確認され得る。
【００３１】
本明細書で使用する、「多分化能」または「多分化能細胞」は、限られた数の他の特定細胞型を生じることができる細胞型を指す。上記のとおり、確定的な内胚葉細胞は、外胚葉または中胚葉から生成された組織に分化しないが、腸管、ならびに腸管に由来する器官に分化する。一実施形態において、確定的な内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。かかる過程は、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、および甲状腺等のヒト内胚葉由来組織の効率的な生成の基礎を提供することができる。例えば、確定的な内胚葉の生成は、機能的インスリン生成β細胞への幹細胞の分化の第１ステップであり得る。有用な量のインスリン生成β細胞を取得するために、膵島／β細胞運命に到達する前に発生する分化ステップのそれぞれに対して、効率性の高い分化が望ましい。確定的な内胚葉細胞への幹細胞の分化が機能的膵島／β細胞の生成への恐らく最初のステップに相当するため、この段階で効率性の高い分化は特に望ましい。
【００３２】
「２倍体細胞」は、全ての雄または雌起源の２倍体細胞ＤＮＡ含有物を有する細胞、例えば、卵母細胞または割球を指す。
【００３３】
「１倍体細胞」は、１倍体細胞ＤＮＡが全て雄または雌起源である、１倍体細胞ＤＮＡ含有物を有する細胞、例えば、卵母細胞または割球を指す。
【００３４】
「活性化」は、受精されたまたは未授精の卵母細胞、例えば、限定されないが、減数分裂の中期ＩＩにおいて、通常、染色分体対の分離、第２の極体の押出を含む過程を経て、それぞれ１つの染色分体を有する半数の染色体を有する卵母細胞をもたらす過程を指す。活性化は、全ての雄または雌起源のＤＮＡを含有する細胞が、多能性細胞を生成するために有用であるが、それ自体は生存可能な子孫に発達することができない可能性がある、識別される内細胞塊および栄養外胚葉を有する胚へと発達するように誘導される方法を含む。活性化は、例えば、以下の条件のうちの１つにおいて行うことができる：（1）第２の極性体の押出を引き起こさない条件、（ｉｉ）極性体の押出を引き起こすが、極性体の押出が阻害される条件、または（ｉｉｉ）１倍体細胞卵母細胞の第１の細胞分割を阻害する条件。
【００３５】
「中期ＩＩ」は、細胞のＤＮＡ含有物が、各染色体が２つの染色分体によって示される半数の染色体で構成される、細胞発達の段階を指す。
【００３６】
一実施形態において、中期ＩＩ卵母細胞は、様々なＯ２圧気体環境下で卵母細胞を培養することによって活性化／培養される。関連する態様において、低いＯ２圧気体環境は、約２％、３％、４％、または５％のＯ２濃度を含む気体混合物によって形成される。さらなる関連態様において、気体混合物は、約５％  ＣＯ２を含む。さらに、気体混合物は、約９０％  Ｎ２、９１％  Ｎ２、または９３％  Ｎ２を含む。この気体混合物は、５％  ＣＯ２気体とは区別され、約５％  ＣＯ２、２０％  Ｏ２、および７５％  Ｎ２である。
【００３７】
「Ｏ２圧」は、液体（すなわち、液体または気体）中の酸素の部分圧（気体混合物の単一成分によってもたらされる圧力）を指す。酸素（ｐＯ２）の部分圧が低い場合、圧力は低く、ｐＯ２が高い場合、圧力は高い。
【００３８】
「定義された培地条件」は、細胞を培養するための環境を指し、最適成長に必要なその中の成分濃度が詳述される。例えば、細胞の使用に応じて（例えば、治療適用）、異種タンパク質を含有する条件から細胞を除去することが重要であり、すなわち、培養条件は、動物を含まない条件であるか、または非ヒト動物タンパク質を含まない。関連する態様において、「インビトロ受精（ＩＶＦ）培地」は、化学的に定義された基質を含有する栄養システムを指し、受精された卵母細胞が該基質上または該基質中で成長され得る。
【００３９】
「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）基質」は、最適な成長を支持する表面下細胞を指す。例えば、かかるＥＣＭ基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチン基質を含むが、これらに限定されない。関連する態様において、かかる基質は、様々な成長因子（例えば、ｂＦＧＦ、上皮成長因子、インスリン様成長因子−１、血小板由来の成長因子、神経成長因子、およびＴＧＦ−β−１）を含むように、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、ヘパリン表面プロテオグリカンを含んでもよい。
【００４０】
「胚」は、任意で改変されてもよい細胞、例えば、卵母細胞または全ての雄または雌起源のＤＮＡを含有する他の胚細胞の活性化をもたらす胚を指し、生存可能な子孫を生じることができない、認識できる栄養外胚葉および内細胞塊を含み、ＤＮＡは、全ての雄または雌起源である。内細胞塊またはそこに含有される細胞は、以前に定義されたとおり、多能性細胞の生成に有用である。
【００４１】
「内細胞塊（ＩＣＭ）」は、胎児組織を生じる胚の内部を指す。本明細書では、これらの細胞を使用して、インビトロで多能性細胞の連続的供給源を提供する。さらに、ＩＣＭは、雄性発生または雌性発生から生じる胚、すなわち全ての雄または雌起源のＤＮＡを含有する細胞の活性化をもたらす胚の内部を含む。かかるＤＮＡは、例えば、ヒトＤＮＡ、例えば、ヒト卵母細胞または精子ＤＮＡとなり、遺伝的に改変されていてもまたは改変されていなくてもよい。
【００４２】
「栄養外胚葉」は、雄性発生または雌性発生に起因する胚、すなわち、全ての雄または雌起源のＤＮＡを含有する細胞の活性化に起因する胚の組織、例えば、ヒト卵巣または精子を含む、胎盤組織を生じる初期段階の胚の別の部分を指す。
【００４３】
「分化した細胞」は、特定の分化した状態、すなわち非胚状態を有する非胚細胞を指す。３つの最も初期の分化した細胞型は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉である。
【００４４】
「実質的に同一」は、差を測定する能力内で本質的にほぼ同一である特定の特徴に関する同一性の質を指す（例えば、ＨＬＡタイピング、ＳＮＰ分析等）。
【００４５】
「組織適合性」は、生物が外部組織の移植片に耐える程度を指す。
【００４６】
別の実施形態において、幹細胞は、単為生殖的に活性化されたヒト卵母細胞から生成される。一態様において、ニューロン幹細胞は、単為生殖的に活性化されたヒト卵母細胞に由来する幹細胞から分化させたニューロン幹細胞から得られる。
【００４７】
自然環境において、卵巣からの未成熟な卵母細胞（卵子）は、減数分裂から減数分裂の中期ＩＩへの進行をもたらす成熟の過程を経る。次に卵母細胞は、中期ＩＩにおいて停止する。中期ＩＩにおいて、細胞のＤＮＡ含有物は、それぞれが２つの染色分体によって示される半数の染色体で構成される。
【００４８】
単為生殖的に活性化された卵母細胞、胚盤胞、ＩＣＭ、および自家幹細胞は、将来必要とされるときに、細胞が再生されるのを可能にする方法で保管または「保存」され得る。単為生殖的に活性化された卵母細胞および自家幹細胞のアリコートは、多くの未分化の細胞の培養物に成長した後、特定の細胞型または組織型に分化させるために、いつでも除去することができ、次にそれを使用して疾患を治療するか、または対象における多機能組織を置き換えてもよい。これらの細胞はドナーから単為生殖的に得られるため、細胞は、個人または近親者が長期間の間、細胞にアクセスできるように保管され得る。
【００４９】
一実施形態において、細胞バンクは、単為生殖的に活性化された卵母細胞、胚盤胞、ＩＣＭ、および／または自家幹細胞試料を保管するために提供される。別の実施形態において、細胞バンク等を投与するための方法が提供される。米国公開特許出願第２００３０２１５９４２号は、参照することによりその全体が本明細書に援用され、幹細胞バンクシステムの例を提供する。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させた、単離されたニューロン幹細胞を提供する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、母系ゲノムのみを含有する。一態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合し、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有し、かつ母系ゲノムのみを含有する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、一致しているハプロタイプに基づいて集団群と組織適合する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ヒトに移植可能である。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、未分化であるか、部分的に分化させられるか、または完全に分化させられる。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン細胞に分化させられることができる。ニューロン幹細胞は、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させられることができる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。分化したニューロン細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合し、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有し、かつ母系ゲノムのみを含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｈａｓｈｉ−１、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５からなる群から選択される神経マーカーを発現する。
【００５１】
「ニューロン細胞」は、脳、脊椎、または中枢神経系の任意の他の部分と関連付けられた任意の細胞を指す。ニューロン細胞は、ニューロン、アストロサイト、グリア細胞、およびオリゴデンドロサイトを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ニューロンは、電気信号および化学信号によって情報を処理および伝送する、電気的に興奮性の細胞である。化学信号は、他の細胞との特殊化した接続であるシナプスを経由して発生する。ニューロンは、互いに接続して神経ネットワークを形成する。ニューロンは、神経系のコア構成要素であり、脳、脊髄、および末梢神経節を含む。多数の特殊化した型のニューロンが存在し、感覚ニューロンは、接触、音、光、および感覚器官の細胞に影響する多数の他の刺激に応答し、次に信号を脊髄および脳に送信する。運動ニューロンは、脳および脊髄から信号を受信して、筋肉の収縮を引き起こし、腺に影響する。介在ニューロンは、脳または脊髄の同一の領域内でニューロンを他のニューロンと接続する。
【００５３】
ニューロンは、それらが製造する神経伝達物質の種類が異なる。いくつかの例は以下のとおりである。
【００５４】
コリン作動性ニューロンは、アセチルコリンを製造する。アセチルコリンは、シナプス前ニューロンからシナプス間隙へ放出される。リガンド依存性イオンチャネルおよび代謝調節型（ＧＰＣＲ）ムスカリン受容体の両方のリガンドとして作用する。ニコチン受容体は、ニコチンを結合するαおよびβサブユニットで構成される五量体リガンド依存性イオンチャネルである。リガンド結合は、チャネルを開いて、Ｎａ＋脱分極の流入を引き起こし、シナプス前神経伝達物質放出の可能性を増加させる。
【００５５】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、γアミノブチル酸（ＧＡＢＡ）を製造する。ＧＡＢＡは、ＣＮＳにおける２つの神経阻害剤のうちの１つであり、他方はグリシンである。ＧＡＢＡは、ＡＣｈに対して相同性機能を有し、Ｃｌ−イオンがシナプス後ニューロンに入るのを可能にする陰イオンチャネルを開閉する。Ｃｌ−は、ニューロン内で過分極を引き起こし、電圧がより負となるにつれて、活動電位を発生させる可能性を減少させる。
【００５６】
グルタミン作動性ニューロンはグルタメートを製造する。グルタメートは、２つの主要な興奮性アミノ酸のうちの１つであり、他方が、アスパルテートである。グルタミン酸受容体は、４つのカテゴリーのうちの１つであり、その３つはリガンド依存性イオンチャネルであり、その１つはＧ−タンパク質共役型受容体である（多くの場合ＧＰＣＲと呼ばれる）。ＡＭＰＡおよびカイニン酸受容体はいずれも、高速な興奮性シナプス伝送を媒介するＮａ＋陽イオンチャネルに対して透過性の陽イオンチャネルとして機能する。ＮＭＤＡ受容体は、Ｃａ２＋に対して透過性の高い別の陽イオンチャネルである。ＮＭＤＡ受容体の機能は、チャネル孔内の共作動薬として結合するグリシン受容体に依存する。ＮＭＤＡ受容体は、両方のリガンドが存在しなければ機能しない。代謝調節型受容体、ＧＰＣＲは、シナプスの伝送およびシナプス後興奮性を調節する。グルタミン酸は、脳への血流が遮断されると興奮毒性を引き起こし、脳損傷を生じ得る。血流が抑制されると、グルタミン酸は、通常、ストレス条件外の場合よりも、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体活性化を引き起こすシナプス前ニューロンから放出され、シナプス後ニューロンに進入するＣａ２＋およびＮａ＋ならびに細胞損傷を上昇させる。
【００５７】
ドーパミン作動性ニューロンはドーパミンを製造する。ドーパミンは、ｃＡＭＰおよびＰＫＡを増加させるＤ１型（Ｄ１およびＤ５）Ｇｓ共役型受容体に作用する神経伝達物質、およびｃＡＭＰおよびＰＫＡを減少させるＧｉ共役型受容体を活性化するＤ２型（Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４）受容体に作用する神経伝達物質である。ドーパミンは、気分および行動に接続され、シナプス前およびシナプス後神経伝達の両方を調節する。黒質におけるドーパミンニューロンの喪失は、パーキンソン病と関係している。
【００５８】
セロトニン作動性ニューロンはセロトニンを形成する。セロトニン、（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、興奮剤または阻害剤として作用し得る。４つの５−ＨＴ受容体クラスのうちの３つは、ＧＰＣＲであり、１つはリガンド依存性陽イオンチャネルである。セロトニンは、トリプトファンヒドロキシラーゼによって、次にさらに芳香族酸デカルボキシラーゼによってトリプトファンから合成される。シナプス後ニューロンにおける５−ＨＴの欠失は、鬱と関係している。ＰｒｏｚａｃおよびＺｏｌｏｆｔ等のシナプス前セロトニン輸送体を遮断する薬物は、治療に使用される。
【００５９】
アストログリアとしても総称されるアストロサイトは、脳および脊髄中の特徴的な星形グリア細胞である。それらは、血液−脳障壁を形成する内皮細胞の生化学支持、神経組織への栄養素の提供、細胞外イオンバランスの維持、ならびに外傷後の脳および脊髄の修復および瘢痕形成過程における役割を含む、多くの機能を行う。
【００６０】
神経膠または単にグリアと呼ばれる場合があるグリア細胞は、ホメオスタシスを維持し、ミエリンを形成し、脳におけるニューロンおよび自律神経系等の神経系における他の部分のニューロンに対する支持および保護を提供する、非ニューロン細胞である。
【００６１】
オリゴデンドロサイトは、脳細胞の一種である。それらは多様な神経膠である。それらの主な機能は、いくつかの脊椎動物の中枢神経系（脳および脊髄）における軸索（神経細胞の長い突起）の絶縁である。
【００６２】
「ニューロン幹細胞」または「ＮＳＣ」または「ニューロン前駆体細胞」または「ＮＰＣ」は、ニューロン細胞において分化し得る任意の細胞を指す。
【００６３】
「単為生殖由来のニューロン幹細胞」または「ｐｈＮＳＣ」は、単為生殖由来のヒト幹細胞から生成されたニューロン幹細胞であったニューロン細胞において分化し得る任意の細胞を指す。
【００６４】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）線維芽細胞のフィーダー層上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも２日間成長させることと、（ｂ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも１日間成長させることと、（ｃ）ニューロン誘導培地中で該細胞を培養することと、（ｄ）（ｃ）からの細胞の単一細胞懸濁液を得ることと、（ｅ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で、ニューロン増殖培地中でステップ（ｄ）からの単一細胞を培養することとによって単為生殖由来のヒト幹細胞を分化させることでニューロン幹細胞を生成するための方法を提供する。一態様において、ニューロン誘導培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）で形成される。さらなる態様において、ニューロン誘導培地中に、Ｌ−グルタミンは、２ｍＭで存在し、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液は、０．１ｍＭで存在し、ｂＦＧＦは、４〜２０ｎｇ／ｍＬで存在する。別の態様において、ニューロン増殖培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、および２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で形成される。追加の態様において、ＦＧＦおよびＥＧＦは、ニューロン増殖培地中に２０ｎｇ／ｍＬで存在する。さらなる態様において、ペトリ皿は、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で被覆される。本発明は、この方法によって生成されたニューロン幹細胞も提供する。追加の態様において、神経上皮ロゼットは、約１〜２週間の培養でニューロン誘導培地中に形成する。
【００６５】
さらなる実施形態において、本発明は、（ａ）線維芽細胞のフィーダー層上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも２日間成長させることと、（ｂ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で単為生殖由来のヒト幹細胞を少なくとも１日間成長させることと、（ｃ）ニューロン誘導培地中で該細胞を培養することと、（ｄ）（ｃ）からの細胞の単一細胞懸濁液を得ることと、（ｅ）線維芽細胞フィーダー層なしのペトリ皿上で、ニューロン増殖培地中でステップ（ｄ）からの単一細胞を培養することとによって単為生殖由来のヒト幹細胞から得られる、単離されたニューロン幹細胞を提供する。一態様において、ニューロン幹細胞は、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓｈａｓｈｉ−１、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５からなる群から選択される神経マーカーを発現する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン表現型を少なくとも２７継代の間維持する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、母系ゲノムのみを含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ヒトに移植可能である。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、未分化であるか、部分的に分化させられるか、または完全に分化させられる。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン細胞に分化させられることができる。別の態様において、ニューロン幹細胞から分化させたニューロン細胞は、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトであることができる。一態様において、分化させたニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００６６】
通常、卵母細胞は、この段階で排卵し、精子によって受精される。精子は、活性化と呼ばれる過程において減数分裂の完了を開始する。活性化の間、染色分体の対は分離し、第２の極性体が押し出され、それぞれ１つの染色分体を有する卵母細胞は半数の染色体を保持する。精子は、単一の染色分体を有する完全な２倍体細胞を形成する染色体の他のハプロイド相補体に寄与する。次に染色体は、第１の細胞周期の間にＤＮＡ合成を通して進行する。次にこれらの細胞は胚に発達する。
【００６７】
対照的に、本明細書に記載される胚は、通常、全ての雄または雌起源のＤＮＡを含有する哺乳類卵母細胞または割球等の細胞の人工的な活性化によって発達される。本発明の背景において論じられるとおり、多くの方法は、未授精の卵母細胞の人工的な活性化に関する文献において報告されている。かかる方法としては、物理的方法、例えば、プリッキング等の機械的方法、培養中の卵母細胞の操作、冷却および加熱等の熱的方法、反復電気パルス、トリプシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ等の酵素処理、浸透処理、二価陽イオンおよびイオノマイシンおよびＡ２３１８７等のカルシウムイオノフォア等によるイオン処理、エーテル、エタノール、テトラカイン、リガノカイン、プロカイン、フェノチアジン等の麻酔剤、チオリダジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、クロロプロマジン等の鎮静剤の使用、シクロヘキシミド、プロマイシン等のタンパク質合成阻害剤の使用、リン酸化阻害剤、例えば、スタウロスポリン、２−アミノプリン、シンゴシン、およびＤＭＡＰ等のタンパク質キナーゼ阻害剤の使用、それらの組合せ、ならびに他の方法が挙げられる。
【００６８】
かかる活性化方法は、当該技術分野においてよく知られており、参照することにより本明細書に援用される米国特許第５，９４５，５７７号において論じられる。
【００６９】
一実施形態において、中期ＩＩのヒト細胞、通常、全ての雄または雌起源のＤＮＡを含む卵母細胞または割球は、卵母細胞の人工的な活性化を生じさせるために人工的に活性化される。
【００７０】
関連する態様において、活性化された細胞、例えば、２倍体である卵母細胞は、栄養外胚葉および内細胞塊を含む胚に発達することが可能にされる。これは、胚盤胞発達を促進する既知の方法および培養培地を使用して達成され得る。
【００７１】
雌性発生胚を培養して認識できる栄養外胚葉および内細胞塊を生成した後、次に内細胞塊の細胞を使用して、所望の多能性細胞株を生成する。これは、内細胞塊または全体内細胞塊に由来する細胞を、分化を阻害する培養物の上に移すことによって達成され得る。これは、内細胞塊細胞、例えば、生後ヒト組織等に由来する線維芽細胞等の線維芽細胞または上皮細胞、またはＬＩＦを生成する他の細胞を、分化を阻害するフィーダー層の上に移すことによって達成され得る。他の因子／構成要素を用いて、条件付けられた培地の追加［２０］、ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β１（ＬＩＦの有無に関係なく）［２１］、ｇｐ１３０／ＳＴＡＴ３経路を活性化する因子［２２］、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＰＫＢ経路を活性化する因子［２３］、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）スーパーファミリーのメンバーである因子［２２］、および正準／β−カテニンＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する因子（例えば、ＧＳＫ−３特異的阻害剤［２４］）を含むが、これらに限定されない、未分化状態の細胞を維持するために適切な培養条件を提供してもよい。関連する態様において、かかる因子は、フィーダー細胞および／またはＥＣＭ基質を含む培養条件を含んでもよい［２２］。
【００７２】
一態様において、内細胞塊細胞は、ヒト包皮もしくは真皮線維芽細胞、または白血病阻害因子を生成する他の細胞上、または白血病阻害因子の存在下で培養される。関連する態様において、フィーダー細胞はＩＣＭを播種する前に不活性化される。例えば、フィーダー細胞は、抗生物質を使用して有糸分裂的に不活性化され得る。関連する態様において、抗生物質はマイトマイシンＣであり得るが、これに限定されない。
【００７３】
細胞を未分化の多能性状態で長期間、理論的には無期限に維持する条件下で培養が達成される。一実施形態において、卵母細胞は、高いＯ２圧下でカルシウムイオノフォアを用いた後、低いＯ２圧下で卵母細胞をセリン−トレオニンキナーゼ阻害剤と接触させることによって単為発生的に活性化される。単為発生的に活性化された卵母細胞に由来するＩＣＭは、高いＯ２圧下で培養され、細胞は、例えば、２０％  Ｏ２を含む気体混合物を使用して維持される。一態様において、培養可能とは、培養され得ること、または培養に適していることを指す。関連する態様において、ＩＣＭ単離は、胚盤胞培養の４日後に機械的に実行され、培養はフィーダー細胞上で実行される。かかる培養は、例えば、免疫手術の場合のように、動物起源に由来する材料を使用する必要性を排除する。
【００７４】
関連する態様において、ＩＣＭの培養培地には、ヒト臍帯血清を含むが、これに限定されない非動物血清が添加され、この血清は定義された培地中に存在する（例えば、ＭｅｄｉＣｕｌｔ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ；Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，Ｓｗｅｄｅｎ；またはＺａｎｄｅｒ  ＩＶＦ，Ｉｎｃ．，Ｖｅｒｏ  Ｂｅａｃｈ，ＦＬから入手可能なＩＶＦ）。別の態様において、提供される培地および過程は、動物生成物を含まない。関連する態様において、動物生成物は、非ヒト起源の血清、インターフェロン、ケモカイン、サイトカイン、ホルモン、および成長因子を含むそれらの生成物である。
【００７５】
本発明によって生成された多能性状態の細胞は、様々な方法によって確認され得る。例えば、細胞は、特徴的なＥＳ細胞マーカーの存在または不在について試験され得る。ヒトＥＳ細胞の場合において、かかるマーカーの例は上記に識別され、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１を含み、当該技術分野において既知である。
【００７６】
また多分化能は、適切な動物、例えば、ＳＣＩＤマウスに細胞を注入し、分化した細胞および組織の生成を観察することによって確認され得る。多分化能を確認するさらに別の方法は、対象の多能性細胞を使用して、キメラ動物を生成し、導入された細胞の異なる細胞型への寄与を観察することである。キメラ動物を生成するための方法は、当該技術分野において既知であり、参照することにより本明細書に援用される米国特許第６，６４２，４３３号において説明される。
【００７７】
多分化能を確認するさらに別の方法は、分化に好都合である条件下で培養されるときの、胚様体および他の分化した細胞型へのＥＳ細胞分化を観察することである（例えば、線維芽細胞フィーダー層の除去）。この方法は用いられており、かつ、それは、対象の多能性細胞が組織培養において胚様体および異なる分化した細胞型を生じることが確認されている。
【００７８】
得られる多能性細胞および細胞株、好ましくは、全体的に雌起源のＤＮＡに由来するヒト多能性細胞および細胞株は、多数の治療適用および診断適用を有する。かかる多能性細胞は、多数の疾患状態の治療において、細胞移植療法または遺伝子治療（遺伝的に改変される場合）に使用することができる。
【００７９】
この点において、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、ほぼ全ての細胞型、例えば、ニューロン幹細胞に分化できることが知られている。したがって、本発明に従って生成されたヒト多能性（ＥＳ）細胞は、同様の分化能を有するはずである。本発明に従う多能性細胞は、既知の方法に従って誘導されて分化し、所望の細胞型を得る。例えば、本発明に従って生成されたヒトＥＳ細胞は、かかる細胞を分化培地中、細胞分化を提供する条件下で培養することによって、ニューロン幹細胞、造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、島細胞、腎細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿管細胞等に分化するように導入されてもよい。ＥＳ細胞の分化をもたらす培地および方法は、適切な培養条件と同様に、当該技術分野において既知である。
【００８０】
例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら［２５］は、かかる細胞の凝集体を、レチノイン酸を欠失する懸濁培養培地中で最初に培養することを含む幹細胞を導入手順に供した後、レチノイン酸を含有する同一培地中で培養し、続いて細胞付着を提供する基質に細胞凝集体を移すことによって、胚細胞株から造血幹細胞を生成することについて教示する。
【００８１】
さらに、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら［２６］は、特に造血細胞、筋肉、心筋、神経細胞を含む様々な分化した細胞型を生成する、胚性幹細胞のインビトロ分化の方法を開示する多数の記事を参照する総説である。
【００８２】
さらなる実施形態において、本発明は、ニューロン分化培地中でニューロン幹細胞を培養することによって、ニューロン幹細胞を分化する方法を提供する。一態様において、ニューロン分化培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン（ＶＷＲ  Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させられる。本発明はまた、ニューロン幹細胞から分化させたニューロン細胞を提供する。一態様において、ニューロン幹細胞は、単為生殖的由来のヒト幹細胞から生成される。別の態様において、ニューロン幹細胞は、卵母細胞ドナーと組織適合する。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ＥＳＣとは異なるパターンの接合性を有する。別の態様において、ニューロン幹細胞は、母系ゲノムのみを含有する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ヒトに移植可能である。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、未分化であるか、部分的に分化させられるか、または完全に分化させられる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００８３】
さらに、Ｂａｉｎら［２７］は、ニューロン特性を有する神経細胞を生成する胚性幹細胞のインビトロ分化について教示する。これらの参照文献は、胚細胞または幹細胞由来の分化した細胞を得るための報告された方法の例示である。これらの参照文献、および特に胚性幹細胞を分化するための方法に関するそこでの開示は、参照することによりそれら全体が本明細書に援用される。したがって、既知の方法および培養培地を使用して、当業者は、遺伝子操作されたまたは遺伝子組換えされたＥＳ細胞を含む、対象のＥＳ細胞を培養して、所望の分化した細胞型、例えば、神経細胞、筋細胞、造血細胞等を得ることができる。本明細書に記載の方法によって生成された多能性細胞を使用して、任意の所望の分化した細胞型を得てもよい。分化したヒト細胞の治療用途は前例がない。例えば、ヒト造血幹細胞は、骨髄移植を必要とする医療処置において使用されてもよい。かかる手順を使用して、多くの疾患、例えば、卵巣癌および白血病等の末期癌、ならびにＡＩＤＳ等の免疫系を障害する疾患を治療する。造血幹細胞は、例えば、男性または女性の癌もしくはＡＩＤＳ患者に由来する雄または雌ＤＮＡを除核卵母細胞に組み込むこと、上述のとおり多能性細胞を得ること、およびかかる細胞を、分化に好都合である条件下で、造血幹細胞が得られるまで培養することによって得られ得る。かかる造血細胞は、癌およびＡＩＤＳを含む疾患の治療において使用されてもよい。
【００８４】
あるいは、対象の多能性細胞を使用して、神経細胞株を生成する分化条件下でかかる細胞を培養することによって、神経疾患のある患者を治療してもよい。かかるヒト神経細胞の移植により治療可能な特定の疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、および脳性麻痺が特に挙げられる。パーキンソン病の特定症例において、移植された胎児脳神経細胞が、周囲の細胞との適切な接続を形成して、ドーパミンを生成することが証明されている。これは、パーキンソン病症状の長期反転をもたらし得る。
【００８５】
幹細胞治療は、疾患または損傷を治療するために、損傷した組織に新しい細胞を導入する介入戦略の一種である。幹細胞が自己複製し、異なる程度の分化能を有する後次生成を生じる能力は、体内の罹患領域および損傷領域を潜在的に置き換えることができる、組織の生成に対する重大な潜在的可能性を提供し、拒絶反応および副作用の危険性が最小である。通常、幹細胞は治療に望ましい領域に移植される。
【００８６】
一実施形態において、本発明は、単為生殖由来の卵母細胞から得られたニューロン幹細胞を使用して神経疾患を治療する方法を提供する。神経疾患は、体の神経系の障害である。脳、脊髄、または他の神経の構造的、生化学的、または電気的異常は、一連の症状をもたらし得る。症状の例としては、麻痺、筋衰弱、協調運動不全、感覚障害、てんかん、混乱、疼痛、および意識水準の変化が挙げられる。多くの認識されている神経障害があり、比較的一般的なものもあるが、多くは稀である。それらは、神経学的診察によって評価されてもよく、神経学および臨床神経心理学の専門内で研究および治療される。
【００８７】
一態様において、神経疾患は、てんかん、けいれん、神経毒傷害、低酸素症、無酸素症、虚血、脳卒中、脳血管発作、脳もしくは脊髄損傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺水、窒息、周生期仮死、血糖降下イベント、神経変性、アルツハイマー病、老年性認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ダウン症候群、コルサコフ病、統合失調症、ＡＩＤＳ認知症、多発梗塞性認知症、ビンスワンガー認知症、神経損傷、発作、化学毒性、嗜癖、モルヒネ耐性、アヘン耐性、オピオイド耐性、バルビツレート耐性、急性および慢性疼痛、偏頭痛、不安症、大鬱病、躁鬱病、強迫性障害、統合失調症および気分障害、双極性障害、単極性鬱病、気分変調、季節性情動障害、ジストニアまたは他の運動障害、睡眠障害、筋肉弛緩、ならびに尿失禁からなる群から選択される。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、かかる治療を必要とする患者に移植される。
【００８８】
対象の発明の１つの目的は、分化した神経細胞を生成するために使用され得る多能性ヒト細胞の本質的に無限の供給を提供することである。不妊治療後に残る胚盤胞に由来するか、またはＮＴを使用して形成される、ヒト胚性幹細胞およびそれらの分化した子孫は、同種細胞移植治療において使用されるとき、レシピエントの免疫系によって拒絶される可能性がある。単為発生由来の幹細胞は、現在の移植方法と関連付けられた重大な問題、すなわち、卵母細胞ドナーに関連する宿主対移植片または移植片対宿主拒絶に起因して発生し得る、移植された組織の拒絶を軽減することができる、分化した細胞をもたらすはずである。従来、拒絶はシクロスポリン等の抗拒絶剤の投与によって予防または低減される。しかしながら、かかる薬物は、例えば、免疫抑制、発癌性等の重大な有害副作用を有するとともに、非常に高価である。開示される方法によって生成された細胞は、卵母細胞ドナーに関連する抗拒絶剤の必要性を排除または少なくとも大幅に低減するはずである。
【００８９】
対象の発明の別の目的は、卵母細胞ドナーのファミリーメンバーへの同種移植に適した分化したニューロン細胞を生成するために使用され得る、多能性ヒト細胞の本質的に無限の供給を提供することである。細胞は、卵母細胞ドナーの直系ファミリーメンバーの細胞と免疫学的かつ遺伝的に類似し、したがってドナーのファミリーメンバーによって拒絶される可能性が低い。
【００９０】
例えば、遺伝子をコードする脳由来の成長因子は、本発明に従って生成されたヒト多能性細胞に導入されてよく、それらの細胞は、神経細胞に分化させられ、パーキンソン病患者に移植されて、かかる疾患の間に神経細胞の喪失を遅延させる。
【００９１】
一実施形態において、分化および／または増殖の制御に対する機械的支持の不在（すなわち、３Ｄ足場の不在）下で、インビトロで生成されたニューロン幹細胞が開示される。一態様において、インビトロで高度に分化したニューロン細胞を含むが、これに限定されないニューロン幹細胞が開示される。
【００９２】
別の実施形態において、ニューロン幹細胞は、単為生殖的に活性化されたヒト卵母細胞から生成され、単為生殖的に活性化された卵母細胞から誘導体化された幹細胞は、ニューロン幹細胞を生成するように人工的に操作される。
【００９３】
一態様において、ニューロン幹細胞は、血清代替物（Ｍ／ＳＲ）、プラスモネート（ｐｌａｓｍｏｎａｔｅ）、およびＤＮＡ阻害剤で処理された線維芽細胞のフィーダー層上のｇｐ１３０／ＳＴＡＴ経路および／またはＭＡＰキナーゼ経路を活性化する少なくとも１つのマイトジェンを含む培地中で、単為生殖的に活性化された卵母細胞から単離された幹細胞を培養することと、Ｍ／ＳＲＰの体積の半分が、合流点付近の細胞が色素沈着を起こしかつドーム状の外観を発達させるまで定期的にＭ／ＳＲと置き換えられる、プラスモネート（Ｍ／ＳＲＰ）を含むＭ／ＳＲ中で、合流点付近までマイトジェンを添加することなく、マイトジェン処理された細胞を培養することと、Ｍ／ＳＲの体積の半分が、ニューロン幹細胞である浮遊細胞塊を発達させるまで定期的にＭ／ＳＲと置き換えられる、Ｍ／ＳＲ中の色素沈着した／ドーム状の細胞をゼラチンで被覆された基質に移すこととによって生成される。関連する態様において、Ｍ／ＳＲは、ＫＯ  ＨｉグルコースＤＭＥＭ、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ、β−メカプトエタノール、および血清代替物を含む。別の関連する態様において、Ｍ／ＳＲＰは、Ｍ／ＳＲおよびプラスモネートの成分を含む。
【００９４】
本発明は、一態様において、ＮＳＣがｈｐＳＣから効率的に生じ得ることを実証することを目的とする。この目的で、接着モデル［１１］は、胚様体を使用するプロトコール［１２］と比較して、神経外胚葉のより均一な同期形成を提供するため、選択した。本来のプロトコール［１１］とは異なり、フィーダー細胞は、ニューロン誘導のための幹細胞コロニーを成長させるために使用されなかった。本発明者らの研究において、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ上で成長したｈｐＳＣコロニーにおけるＮＥＰロゼットの発達は、ＥＳ培地をニューロン誘導のための培地と置き換えた後１週間以内に発生させた。ｈｐＳＣに由来するＮＥＰロゼットは、管腔を良好に形成し、適切な神経マーカーの組を発現させており、これは神経上皮の十分な形成の証拠を提供する。ｈｐＳＣ由来のＮＥＰロゼットにおいて、ＳＯＸ１およびＳＯＸ３の発現の増加が観察されたが、ＳＯＸ２発現のわずかな減少が認められ（図１）、ＯＣＴ４の下方制御と関連付けられ得ることは注目に値する［１３］。
【００９５】
ｐｈＮＳＣの特性を、ｈＥＳＣ  Ｈ９に由来するｈＮＳＣと比較した。ＮＳＣに特異的な主要遺伝子の転写活性は、両方の細胞株に匹敵した。これにも関わらず、ＳＯＸＢ１遺伝子の発現は、ｐｈＮＳＣおよびｈＮＳＣにおいて異なった（図２）。神経前駆細胞の維持およびそれらの分化能の制限におけるＳＯＸＢ１遺伝子の正確な役割は、依然として不明なままである。これらの遺伝子の機能は冗長であることが示され［１３，１４］、したがって、ＮＳＣの特性を維持することにおいて、ＳＯＸＢ１遺伝子の特性が互いに相互補完することが可能である。
【００９６】
大部分のｐｈＮＳＣは、神経外胚葉ＣＤ１１３およびＣＤ１５の発現した表面マーカーを得たが、この発現は均一ではなかった。Ｓｕｎら［１５］は、未分化のヒトおよびマウスＮＳＣが、不均一なＣＤ１１３およびＣＤ１５集団を表し得ること、およびマーカーの発現が細胞周期の相に依存することを示した。これにも関わらず、ＣＤ１１３陰性細胞は、それらの増殖能および神経形成能を維持することができる［１５］。
【００９７】
ＮＳＣ増殖を支持するために、成長因子ｂＦＧＦが必要であるが、これは内因性ＳＨＨを阻害し、ニューロンに分化する能力の急速な喪失をもたらし、神経堤外胚葉系間充織細胞へのＮＳＣの変態を促進する［１６］。神経堤マーカー遺伝子ＦＯＸＤ３およびＳＮＡＩ２、ならびに中胚葉マーカーＡＣＴＡ１の発現レベルは、２７継代までｐｈＮＳＣは高くなく、ｈＮＳＣと比較してさらに低かった（図２）。これらのデータは、外胚葉系間充織細胞へのｈＮＳＣの大規模な変態の不在を示す。
【００９８】
成長因子を含まない培地中の同時分化に起因して、細胞集団の重要な部分は、ｐｈＮＳＣの場合、ならびにｈＮＳＣの場合、ニューロンによって示された。ニューロン分化は、Ｔｕｊ１（チューブリンβＩＩＩ）の陽性の免疫組織化学染色によって、およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって明らかにされたＴＵＢＢ３およびＭＡＰ２遺伝子の高い転写活性により確認された（図３）。特異的なオリゴデンドロサイトマーカーＦＯＸＯ４およびアストロサイトマーカーＧＦＡＰの転写活性は、分化した細胞中のグリア誘導体の存在を示した。したがって、得られたｐｈＮＳＣは、３つの主要な神経誘導体型全ての前駆体として考慮され得る。
【００９９】
したがって、本発明は、多能性ｈｐＳＣがＮＳＣの良好な供給源として機能し得ることを証明した。得られたｐｈＮＳＣは、それらの神経遺伝的可能性および能力を維持して、低温保存およびさらなる実施のために十分な量の細胞を提供しながら、比較的長期の増殖が可能である。
【０１００】
多分化能神経前駆体細胞（ＮＰＣ）は、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである単為生殖幹細胞に由来する神経外胚葉から得られた。単為生殖由来のＮＰＣは、中脳ドーパミン作動性ニューロン（ＤＡ）等のニューロンに分化する。これらのＤＡニューロンは、中脳表現型を呈し、免疫細胞化学およびＲＴ−ＰＣＲによって測定されるように、ＴＨ、ＧＩＲＫ２、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ１、ＬＭＸＡ１、およびＥＮ１を発現する。先行技術から知られているように、ドーパミン作動性ニューロンの主な機能は、ドーパミンを放出することである。体内のドーパミンの主な機能は、報酬によって動かされる学習である。ｈｐＮＰＣに由来するＤＡニューロンはまた、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって決定されるようにドーパミンを放出する。全細胞電気生理学は、単為生殖由来のドーパミン作動性ニューロンが活動電位を発生させることができることを証明した。
【０１０１】
一実施形態において、本発明は、（ａ）フィーダーを含まない条件でのヒト多能性幹細胞の培養と、（ｂ）ニューロン誘導培地への該細胞の曝露と、（ｃ）部分的に分化した細胞の機械的単離と、（ｄ）該細胞の成熟までのさらなる増大および維持とによって、単為生殖由来のヒト幹細胞を分化させることでニューロン幹細胞を生成するための方法を提供する。一態様において、ニューロン誘導培地は、（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液、（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、（ｃ）ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、（ｄ）Ｌ−グルタミン、（ｅ）Ｎ２サプリメント、および（ｆ）ｂＦＧＦを含む。さらなる態様において、ニューロン誘導培地中に、Ｌ−グルタミンは、２ｍＭで存在し、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液は、０．１ｍＭで存在し、ｂＦＧＦは、４〜２０ｎｇ／ｍＬで存在する。別の態様において、ニューロン増殖培地は、（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン、（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ、（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメント、（ｅ）ｂＦＧＦ、および（ｆ）ＥＧＦを含む。追加の態様において、ＦＧＦおよびＥＧＦは、ニューロン増殖培地中に２０ｎｇ／ｍＬで存在する。追加の態様において、フィーダーを含まない条件は、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチンを含むがこれらに限定されないＥＣＭ基質を用いる。本発明は、本方法によって生成されたニューロン幹細胞も提供する。さらなる態様において、神経上皮ロゼットは、１〜２週間後に形成する。
【０１０２】
追加の実施形態において、本発明は、（ａ）フィーダーを含まない条件でのヒト多能性幹細胞の培養と、（ｂ）ニューロン誘導培地への該細胞の曝露と、（ｃ）部分的に分化した細胞の機械的単離と、（ｄ）該細胞の成熟までのさらなる増大および維持とを含む方法を使用して単為生殖由来のヒト幹細胞から得られる、単離されたニューロン幹細胞を提供する。一態様において、細胞は、ＳＯＸＢ１−ファミリーＮＥＳ、ＭＳＨ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＮＤ１、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、およびＧＡＰ４３からなる群から選択される神経幹細胞マーカーを発現する。さらなる態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン表現型を少なくとも３０継代の間維持する。一態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン細胞に分化し得る。追加の態様において、ニューロン細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明は、単為生殖由来の卵母細胞から得られたニューロン幹細胞を使用して神経疾患を治療する方法を提供する。一態様において、神経疾患は、てんかん、けいれん、神経毒傷害、虚血、脳卒中、脳血管発作、脳もしくは脊髄損傷、身体的外傷、アルツハイマー病、老年性認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、統合失調症、神経損傷、偏頭痛、不安症、大鬱病、躁鬱病、強迫性障害、統合失調症および気分障害、双極性障害、単極性鬱病、ジストニアまたは他の運動障害、睡眠障害、筋肉弛緩からなる群から選択される。さらなる態様において、ニューロン幹細胞はかかる治療を必要とする患者に移植される。
【０１０４】
一実施形態において、本発明は、ニューロン分化培地中でニューロン幹細胞を培養するステップを含む、ニューロン幹細胞を分化させる方法を提供する。一態様において、ニューロン分化培地は、（ａ）ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンと、（ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、（ｃ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉと、（ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントとを含む。追加の態様において、ニューロン幹細胞は、ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトからなる群から選択されるニューロン細胞に分化させる。一態様において、分化したニューロン細胞はニューロンである。さらなる態様において、ニューロンは、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびセロトニン作動性ニューロンからなる群から選択される。本発明は、この方法によって生成された、分化した細胞も提供する。一態様において、細胞は、単為生殖的に活性化された卵母細胞から分化させられる。
【実施例】
【０１０５】
以下の実施例は、本発明を例示するが、限定するものではないことが意図される。
【０１０６】
実施例１
ヒト単為発生胚発生幹細胞の生成
材料および方法
ドナーは、金銭的報酬なしで卵子および血液（ＤＮＡ分析用）を自発的に供与した。ドナーは、包括的なインフォームドコンセント文書に署名し、全ての供与された材料は、研究のために使用されるものであり、生殖目的で使用されるものではないことが知らされた。卵巣刺激の前に、卵母細胞ドナーは、ヒト細胞、組織、ならびに細胞および組織に基づいた生成物のドナーの適切性について、ＦＤＡ適格性決定ガイドライン（食品医薬品局（草案）Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｅｌｉｇｉｂｉｌｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｏｎｏｒｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＨＣＴ／Ｐｓ）２００４年５月付）およびロシア保健省規定Ｎ６７（０２．２６．０３）に従って健康診断を受けた。Ｘ線、血液および尿分析、ならびに肝機能試験が含まれた。ドナーは、梅毒、ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶについてもスクリーニングされた。
【０１０７】
卵母細胞は、標準ホルモン刺激を使用して取得し、対象ドナーにおいて過剰排卵を生じさせた。各ドナーの卵子は、各自の月経周期の３日目〜１３日目にＦＳＨによる卵巣刺激を受けた。合計１５００ＩＵのＦＳｈが付与された。ドナーの月経周期の１０日目〜１４日目に、ゴナドリベリン拮抗薬Ｏｒｇａｌｕｔｒａｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ）を０．２５ｍｇ／日で注入した。ドナーの月経周期の１２日目〜１４日目に、７５ＩＵ  ＦＳＨ＋７５ＩＵ  ＬＨ（Ｍｅｎｏｐｕｒ，Ｆｅｒｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を毎日注入した。超音波検査が直径１８〜２０ｍｍの卵胞を示した場合、単回用量８０００ＩＵのｈＧＣ（Ｃｈｏｒａｇｏｎ，Ｆｅｒｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をドナーの月経周期の１４日目に投与した。約１６日目に、ｈＣＧ注射から３５時間後に経膣穿刺を行った。超音波ガイド下の針吸引によって、麻酔されたドナーの膣卵胞から滅菌管へ卵胞液を採取した。
【０１０８】
卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵胞液から選び、洗浄媒体（ＭｅｄｉＣｕｌｔ）中で洗浄した後、ユニバーサルＩＶＦ培地（ＭｅｄｉＣｕｌｔ、表１を参照）中で培養し、３７℃の湿気のある環境下、２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２中で２時間、液体パラフィン（ＭｅｄｉＣｕｌｔ）で覆った。
【０１０９】
（表１）ＩＶＦ培地
2014509192.tif 000003
【０１１０】
活性化前に、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）をＳｙｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｈｙａｄａｓｅ（ＭｅｄｉＣｕｌｔ）で処理して、卵丘細胞を除去した後、パラフィンで覆ったユニバーサルＩＶＦ培地中で３０分間培養する。
【０１１１】
この時点から進んで、卵母細胞および胚の培養は、イオノマイシン処理を除いて、湿気のある環境において３７℃で、Ｏ２還元気体混合物（９０％  Ｎ２＋５％  Ｏ２＋５％  ＣＯ２）を使用して行った。卵母細胞は、５μＭイオノマイシンにおいて５分間、ＣＯ２培養器内で３７℃、２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２の気体環境で培養し、続いてパラフィンで覆ったＩＶＦ培地中で４時間、１ｍＭ  ６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）により、９０％  Ｎ２、５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２の気体環境で、３７℃で培養することによって活性化した。活性化および培養は、液体パラフィン油（ＭｅｄｉＣｕｌｔ，Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で覆った５００μｌの培地中の４ウェルプレートにおいて行った（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。
【０１１２】
活性化された卵母細胞は、５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、および９０％  Ｎ２を含む気体環境においてＩＶＦ培地中で培養し、活性化された卵母細胞から生成された胚は、同一の気体混合物中で培養した。
【０１１３】
活性化された卵母細胞は、胚盤胞評点修正の１ＡＡまたは２ＡＡ（Ｓｈａｄｙ  Ｇｒｏｖｅ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、およびＧｅｏｒｇｉａ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）において内細胞塊（ＩＣＭ）を含有する、完全に増大した胚盤胞が観察されるまで、上記条件下、ＩＶＦ中で培養することが可能になる。
【０１１４】
０．５％プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）処理によって透明帯を除去した。免疫手術によって胚盤胞からのＩＣＭを単離し、ヒト脾臓細胞に対するウマ抗血清を用いて、次にモルモット相補体への曝露によって胚盤胞が培養される。栄養外胚葉細胞は、処理された胚盤胞を静かにピペットで取ることによってＩＣＭから除去した。
【０１１５】
全胚盤胞からのｐｈＥＳＣの誘導体化の場合、ｐｈＥＳＣ培養のために設計された培地中のフィーダー層上に胚盤胞を置いた（すなわち、４ｎｇ／ｍＬ  ｈｒｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ  ｈｒＬＩＦ、および１０％ヒト臍帯血血清を添加したＶｉｔｒｏＨＥＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ））。胚盤胞が付着し、栄養外胚葉細胞が拡散すると、ＩＣＭは目に見えるようになる。３〜４日の追加培養を通して、精細なガラスピペットを使用して、栄養外胚葉増殖物からＩＣＭを機械的にスライスすることによって、ＩＣＭを単離した。さらに、９６ウェルプレートにおいて、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２中３７℃で、１０％ヒト臍帯血血清、５ｎｇ／ｍＬヒト組換えＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ'ｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、４ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＦＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ'ｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／１００μｇ）を添加したＶＩＴＲＯＨＥＳ（商標）培地中で（例えば、ＤＭＥＭ／高グルコース培地，ＶｉｔｒｏＬｉｆｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、有糸分裂的に不活性化された生後皮膚線維芽細胞のフィーダー細胞層上でＩＭＣ細胞を培養した。この気体混合物を使用して幹細胞を培養した。ヒト線維芽細胞培養物は、非動物材料を使用して作製した。線維芽細胞の不活性化は、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して３時間行った。
【０１１６】
別個の方法で、ヒト脾臓細胞に対するウマ抗血清を用いて、胚盤胞を培養した後、ウサギ相補体への曝露によって免疫手術を行った。栄養外胚葉細胞は、処理された胚盤胞を静かにピペットで取ることによってＩＣＭから除去した。さらに単離されたＩＣＭの培養を、ヒト臍帯血血清を含有する培地を使用して得られる、遺伝的に関連のない個人から（親の同意を得て）得られた新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ）のフィーダー層上で行った。ＨＳＦフィーダー層は、マイトマイシンＣを使用して有糸分裂的に不活性化した。
【０１１７】
ＨＳＦの培養のための培地は、９０％  ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ヒト臍帯血血清、およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／１００ｍｇ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含む）で構成される。
【０１１８】
ＩＣＭおよびｐｈＥＳＣの培養の場合、４ｎｇ／ｍＬ  ｈｒｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ  ｈｒＬＩＦ、および１０％ヒト臍帯血血清を添加したＶｉｔｒｏＨＥＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を使用した。ＩＣＭを、新鮮なフィーダー層上に機械的に蒔き、３〜４日間培養した。第１のコロニーを機械的に切断し、培養５日後に再び蒔いた。全ての後次継代は、培養中５〜６日後に生成された。初期継代の場合、コロニーを機械的にクランプに分割して再び蒔いた。ｐｈＥＳＣのさらなる継代は、コラゲナーゼＩＶ処理および機械的解離によって行った。ｐｈＥＳＣの繁殖は、３７℃、５％  ＣＯ２で湿気のある環境において行った。
【０１１９】
卵母細胞の活性化
最初の４人のドナーからの活性化した卵母細胞を、５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、および９０％  Ｎ２を含む気体環境において、ＩＶＦ培地中で培養し、５日間にわたって追跡した。表２は、活性化された卵母細胞の成熟の進行を示す。各卵母細胞は、４ウェルプレートにおいて分離した。
【０１２０】
（表２）培養された活性化卵母細胞＊
2014509192.tif 000004
＊１日目にＭ１培地（ＭｅｄｉＣｕｌｔ）中で、２〜５日目にＭ２培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ）中で細胞を培養した。培地は毎日変えた。Ｍ１およびＭ２は、ヒト血清アルブミン、グルコース、および得られた代謝物、生理食塩、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、ヌクレオチド、重炭酸ナトリウム、ストレプトマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）、ペニシリン（４０．０００ＩＵ／Ｌ）、ならびにフェノール赤を含有する。
【０１２１】
内細胞塊をＮ４から単離し、上で概説されるとおりヒト繊維芽細胞フィーダー細胞に移した。Ｎ１およびＮ２は、６日目に縮退した。さらに６日目に、Ｎ３はＩＣＭ２ＡＢを有する完全に増大した胚盤胞を生成した。次に６日目に、Ｎ３をヒト繊維芽細胞フィーダー細胞に移した。Ｎ４からのＩＣＭは未変化であった。Ｎ３を使用して幹細胞を単離した。
【０１２２】
ＩＣＭ細胞は、５％  ＣＯ２および９５％  Ｎ２を含む気体環境においてＮｉｔｒｏＨＥＳ培地中で培養し、４５日間にわたって追跡した。表２ａは、Ｎ３  ＩＣＭ細胞培養の進行を示す。
【０１２３】
（表２ａ）Ｎ３−ＩＣＭ培養の進行＊
2014509192.tif 000005
＊細胞をＭ２培地（ＭｅｄｉａＣｕｌｔ）上で成長させた。
＊＊これらの継代は、プロナーゼ消化によって生成した。
【０１２４】
幹細胞単離
５人のドナーからの卵母細胞から、ＭｅｄｉＣｕｌｔ培地の使用に続いて、還元酸素下で培養し、培養の５日目または６日目に２３個の胚盤胞の生成を可能にした。胚盤胞のうちの１１個は目に見えるＩＣＭを有していた（表３）。
【０１２５】
（表３）単為生殖体および単為生殖胚性幹細胞株の生成
2014509192.tif 000006
１−２個の卵母細胞が活性化されなかった。２−１個の卵母細胞が活性化後に縮退した。３−１個の卵母細胞が活性化されなかった。４−２個の卵母細胞が中期段階１であり破棄された。
【０１２６】
これらの結果は、単為生殖的に活性化された卵母細胞からの胚盤胞の形成の成功率が約５７．５％であることを示す。
【０１２７】
実施例２
ヒト単為生殖幹細胞の維持
上記と同様の方法で生成されたヒト単為生殖幹細胞株、ｐｈＥＳＣ−１、ｐｈＥＳＣ−３［１］、およびｈｐＳＣ−Ｈｈｏｍ−４［２］は、１５％  ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢ（１００Ｕ／１００μｇ／２５０ｎｇ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および５ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＥＳ培地：ＫＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、マイトマイシン−Ｃ不活性化マウス胚線維芽細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィーダー層上で維持した。ディスパーゼまたはコラゲナーゼＩＶ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて５〜７日おきに、分割比１：４または１：６で細胞を継代した。当研究において使用されたｈｐＳＣ株からの実験結果において明らかな差異はなかったため、データをプールした。
【０１２８】
神経上皮ロゼットを取得することにおける良好な結果は、フィーダー層上でｈＥＳＣを維持することにより達成され得る。ニューロン誘導ｈＥＳＣの前の１つの継代は、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で被覆された容器に引き継がれる。最良の結果は、６０ｍｍペトリ皿を使用して達成された。継代の日は、「０日目」として考慮される。ｈＥＳＣは、１５％  ＫＳＲおよび５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＥＳ細胞の培地中で４〜７日間維持される。コロニーは良好に形成されるはずである。
【０１２９】
実施例３
培養培地調製およびペトリ皿被覆のための材料および方法
材料
ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１２６６０−０１２
ＤＭＥＭ／Ｆ１２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０５６５−０１８（Ｌ−グルタミンの供給源としてＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉサプリメントを添加）
ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉサプリメント，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，３５０５０−０６１
ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１０ｍＭ（１００Ｘ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１１４０−０５０
ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１０１４２−０１
ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞解離試薬，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１１１０５−０１
ＳｔｅｍＰｒｏ  Ｎｅｕｒａｌサプリメント，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１０５０８−０１
Ｎ２サプリメント（１００Ｘ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１７５０２−０４８
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（１Ｘ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１４０４０−１３３（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む）
ＥＧＦ組換えヒト，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＨＧ０３１４
組換えヒトＦＧＦ基本，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，１００−１８Ｂ
ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液（１００Ｘ），ＶＷＲ，１６７４０４９
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（１Ｘ），Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない、ＶＷＲ，１６７７７−１５０
【０１３０】
神経誘導のための培地
培地の表題および組成物は、Ｓｈｉｎらに記載されている［１１］。ニューロン誘導のための培地ＤＮ２は、Ｎ２を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく。
【０１３１】
５ｍＬの１００×ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液を、体積５００ｍＬの培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２の新しいボトルに追加する。＋４で保管する。ＤＮ２培地を調製するために：
−ＰＳＡ溶液を含有する９８ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２を滅菌した培地ボトルに無菌で移す。
−１ｍＬの１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を追加する。
−１ｍＬの１００×Ｎ２サプリメントを追加する。
−培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２は既にＬ−グルタミンを含有するため、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉサプリメントを添加する必要はない。
−＋４で保管する。使用前にｂＦＧＦ溶液を最終濃度４〜２０ｎｇ／ｍＬまで追加する。
【０１３２】
神経増殖のための培地
ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭキットに対するマニュアルに示されるとおり、神経増殖の培地を調製する。またＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地は、別個の成分から調製され得る。
【０１３３】
５ｍＬの１００×ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン溶液を、体積５００ｍＬの培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２の新しいボトルに追加する。＋４で保管する。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を調製するために：
−ＰＳＡ溶液を含有する９７ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２を滅菌した培地ボトルに無菌で移す。
−１ｍＬの１００×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉサプリメントを追加する（１．１．３．）。
−２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌサプリメントを追加する（１．１．７．）。
−＋４で保管する。使用前に、成長因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍＬまで追加する。
注記：ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液は、以下のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示に従って追加されてはならない。
【０１３４】
ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）マトリックスによる培養容器の被覆
ＰＢＳ中のＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）溶液を、希釈因子５０、すなわちそれぞれ１ｍＬのＰＢＳ当たり２０μＬのＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）溶液で希釈する。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の存在は必須である！溶液は保管せず、使用前に即時に調製すること。
【０１３５】
１枚の３５ｍｍペトリ皿当たり０．７〜１．０ｍＬの溶液、または１枚の６０ｍｍペトリ皿当たり２．０ｍＬの溶液を追加する。＋３７℃で２時間培養器内に入れる。１００に等しい希釈因子を使用して、２時間未満または４時間より長く培養するか、または＋４℃で保管することによって、継代後または長期培養中の細胞接着の減少をもたらす。
【０１３６】
使用前にＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）溶液を吸引する。洗浄してはならない。培養培地を即時に追加する。
【０１３７】
成長因子溶液  ＰＢＳ中の０．１％  ＨＳＡ溶液中の成長因子ＥＧＦおよびｂＦＧＦを濃度１０μｇ／ｍＬに希釈する。例えば、ＰＢＳ中の０．１％  ＨＳＡ溶液５ｍＬ中の凍結乾燥された成長因子５０μｇを希釈する。５００μＬの微小遠心管に分取して−２０℃で保管する。反復する冷凍−解凍周期を避け、解凍後１４日以内に使用する。使用前即時に成長因子を培地に追加する。例えば、各１ｍＬの培地当たり２μＬの成長因子を追加して、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬを得る。
【０１３８】
実施例４
ｈｐＥＳＣ、ｐｈＮＳＣおよびｈＮＳＣの分析
ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ自動精製システムを使用し、製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従って総ＲＮＡを単離した。１００〜５００ｎｇの総ＲＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ）と共に逆転写に使用した。遺伝子の転写活性を分析するために、反応当たり２５分の１のｃＤＮＡおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプライマーアッセイ（使用されるプライマーは表４で報告される）をＱｕａｎｔｉｔｅｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）と一緒に使用して、ＰＣＲ反応を重複して行った。逆転写酵素リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。相対定量は、標準曲線に対して行い、定量した値は、ＰＰＩＧ（シクロフィリンＧ）によって決定される入力に対して正規化した。正規化後、２〜７回の遺伝子発現測定の平均の標準誤差を計算した。
【０１３９】
表面マーカーのＦＡＣＳ分析は、ＡＰＣ染色したマウス抗ヒトＣＤ１３３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびマウス抗ヒトＣＤ１５抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて行った（表５を参照）。
【０１４０】
免疫染色の場合、ＮＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する溶液によって、および０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって固定後１時間透過処理した。透過処理後、細胞を３％正常ヤギ血清により＋４℃で一晩遮断した。ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＭｕｓａｓｈｉ−１に対するプライマリー抗体は、それぞれ１：１００、１：２００、および１：３００の希釈で一晩＋４℃で適用した。二次抗体（１：５００）は、２時間室温で適用した。分化したニューロンの一段階染色の場合、抗チューブリンβＩＩＩ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に連結された抗体を製造者の指示（Ｃｏｖａｎｃｅ）に従って適用した。核をＤＡＰＩで染色した。一次抗体および二次抗体の一覧を表５に示す。
【０１４１】
（表４）リアルタイムＰＣＲプライマー
2014509192.tif 000007
【０１４２】
（表５）免疫染色およびＦＡＣＳのための抗体
2014509192.tif 000008
【０１４３】
実施例５
ニューロン誘導および神経幹細胞
接着モデルは、Ｓｈｉｎらによって提案されている［１１］。ヒト胚性幹細胞は、それらが継代される準備ができる前にフィーダー層またはマトリックス上で維持される。この時点で培地をニューロン誘導のための培地と置き換える。かかる条件において、１〜２週間維持した後、神経上皮細胞のロゼットが形成され、それらは神経管の反復発生であると考えられる。ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）上にフィーダーを含まない条件において神経上皮ロゼットを取得するプロトコールは以下に記載される。
【０１４４】
ｈＥＳＣ培養物に継代の準備ができると、培養培地を、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＤＮ２培地と置き換える。培地置き換えの日は、「ＮＩ日」とされる。培地は、少なくとも１日おき、またはそれよりも頻繁に新しいものと置き換えられるべきである。
【０１４５】
３〜４日後、細胞死の割合が著しく増加し、培地の色が赤−オレンジから黄色に素早く変化する。この期間の間、培地は少なくとも１日１回置き換える必要がある。
【０１４６】
細胞死が安定した後、約７〜１０日以内に、細胞が単分子層よりも高密度の「丘」または「隆線」を形成する領域が見出され得る。これらの「丘」において、初期神経上皮ロゼットが形成される。
【０１４７】
ロゼットが形成し始めた後、中心に小さい管腔を有する複数のＮＥＰロゼットを有する十分に目に見える領域が形成されるまで、培養物をさらに３〜７日間培養する必要がある。これらは後期ロゼットまたは確定的な神経外胚葉である。ロゼット構造を含有する領域は、長い管腔を有する分岐クレストを形成することができ、円柱状神経上皮細胞によって取り囲まれる。
【０１４８】
神経分化の場合、固有の重要な修正を加えた接着モデル［１１］を使用した。マウス胎児線維芽細胞フィーダー層上で５日間維持されたｈｐＳＣは、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で被覆された６０ｍｍペトリ皿上でディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）により継代した。次の４日間、ｈｐＳＣのコロニーをＥＳ培地中で培養した後、ニューロン誘導のための培地と置き換えた。ニューロン誘導のための培地は、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、抗生物質溶液、および２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく。培地置き換えの日は、ニューロン誘導の０日目として考慮される。神経上皮細胞の十分に形成されたロゼットを有する領域を機械的に単離し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して単一細胞懸濁液に解離して、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で被覆された２４ウェルプレートのウェルに移し、ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）において、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（いずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。十分な量の細胞を取得した後、上述のとおり添加したＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ培地中で、ＣＥＬＬｓｔａｒｔで被覆された６０ｍｍペトリ皿上で、ＮＳＣのさらなる維持および継代を行った。細胞は、継代の間にＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって解離されている。Ｈ９  ｈＥＳＣ由来のＧＩＢＣＯ（登録商標）ヒト神経幹細胞（さらにｈＮＳＣと呼ばれる、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）は、同一条件下で維持した。
【０１４９】
ＣＥＬＬｓｔａｒｔ上で５日間成長させた後、ｈｐＳＣのコロニーは、完全に形成したように見え、フィーダー上で成長したコロニーと比較して、視覚的な差異はなかった。培地を置き換えた後、神経上皮（ＮＥＰ）ロゼットの最初の兆候は、ニューロン誘導の２日目に現れる。ニューロン誘導のための培地における培養の７日目に、細胞コロニーが、ＮＥＰロゼットのクラスタを含有する大きな領域として現れた。これらのクラスタにおいて、大部分のロゼットは十分に形成された管腔を有した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、主要な神経外胚葉遺伝子ＰＡＸ６およびＳＯＸ１の転写活性が、未分化のｈｐＳＣと比較して、この段階で増加したが、多能性マーカーＯＣＴ４は、著しく下方制御されたことを明らかにした（図１）。特定の神経マーカーＮＥＳ（Ｎｅｓｔｉｎ）およびＭＳ１（Ｍｕｓａｓｈｉ−１）の発現も高かった。内胚葉マーカーＡＦＰおよび中胚葉マーカーＡＣＴＡ１は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、細胞クラスタを含有するＮＥＰロゼット中で検出されなかった（データ図示せず）。
【０１５０】
３５ｍｍペトリ皿を調製するために、最初にそれらを上述のとおりＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で処理した後、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよびＥＧＦの両方を添加した神経増殖のための２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を追加する。＋３７℃、５％  ＣＯ２、湿気のある環境にある培養器に皿を入れる。
【０１５１】
ニューロン誘導の間（ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で処理した容器上に接種してから約２１日後）に得られた管腔を有する後期ロゼットＮＥＰは、立体顕微鏡下で機械的に単離される。シリンジ針を使用することができる。ロゼットを有する領域は、機械的に単一細胞を単離することが不可能であるため切断されるべきである。ロゼットを有しない領域、ならびに単分子層領域は破棄されるべきである。最小体積の培地において得られた細胞クランプを収集する。１枚の３５ｍｍペトリ皿当たり１００〜最大３００μｍの寸法の１５〜２０個のクランプを接種する。
【０１５２】
次に細胞のクランプは、単一細胞懸濁液に練和される必要がある。この目的で、３００μＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を円錐底の１５ｍＬ遠心分離管に入れ、３７℃に加温する。最小体積の培地中の得られた細胞のクランプをＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の入った管に移し、室温で３〜４分間培養して、２００μＬ先端を用いて約１００回上下させて静かにピペットで取る。細胞のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）における合計時間は、１０分を超えてはならない。
【０１５３】
次に成長因子を有しない神経増殖のための温かいＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を６ｍＬ追加する。蓋を閉じて管を静かに６〜８回振動させて細胞を洗浄する。
【０１５４】
１２０〜１３０ｇで４分間遠心分離した後、できる限り多くの上澄み液を慎重に吸引する。２ｍＬの培地を調製した皿から遠心分離管に移し、ペレットを再懸濁して、管の内容物を培養容器に移す。皿を振動させることによって細胞を皿に均等に分配し、＋３７℃、５％  ＣＯ２、湿気のある環境にある培養器に皿を入れる。
【０１５５】
単離の翌日の細胞接着および生存能力を推定し、培地を新しいものと置き換える。受容した細胞は、０継代のＮＳＣとして考慮され得る。
【０１５６】
実施例６
ｐｈＮＳＣのクローン単離
一般に、ＮＥＰロゼットから単離された増殖細胞の集団は均質ではない。それらは、間葉型の細胞で汚染される可能性があり、ＮＳＣの分化を誘導し、高い増殖率に起因してそれらを代用する。個別の細胞クローンの単離は、ＮＳＣの均質な集団の取得を可能にする。ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で処理された培養皿３５ｍｍを調製するために、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したニューロン誘導ＤＮ２の２ｍＬの培地を各皿に追加し、皿を３７℃、５％  ＣＯ２、湿気のある環境にある培養器内に置く。管腔を有する後期ＮＥＰロゼット（ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）上のｈＥＳＣの接種から約２１日後）は、上述のとおり、立体顕微鏡下で機械的に単離する。ＮＥＰロゼットを有する断片の寸法は、１００〜最大３００μｍまで変動するはずである。ＮＥＰロゼットを有する１５〜２０個の断片を各培養皿３５ｍｍに接種し、断片を皿の上に均等に分配して、培地の置き換えなしで２日間培養する。この２日間、断片をＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で処理した皿の表面に付着させて下向きに置くと、多数の細胞は、細胞クラスタの周縁に移動し、間葉細胞（「扁平細胞」）のそれに類似する形態をとる。同時に、付着した細胞クラスタの中心部から退去された細胞の一部は、二次ロゼットを形成する。２４ウェルプレートを調製するために、ウェルをＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で処理した後、成長因子（２０ｎｇ／ｍＬの各ｂＦＧＦおよびＥＧＦ）を添加した神経増殖のための（１．３．を参照）０．５ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を追加して、培養器に入れる。二次ロゼットを有する３５ｍｍ皿から扁平細胞を除去する。２００μＬプラスチック先端を使用して、全ての不要な細胞をスクラッチする。皿を１〜２ｍＬのＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まない温かいＤ−ＰＢＳで洗浄し、新鮮な温かい培地ＤＮ２を追加する。シリンジ針を使用して、二次ロゼットを有する領域を切断し、最小体積の培地中のそれらを、０．１ｍＬの温かいＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を含有する０．５ｍＬの微小遠心管に移す。１本の管当たり二次ロゼットを有する断片を１０個だけ置く。３〜４分間室温で培養した後、２００μＬ先端を用いて約１００回静かにピペットで取る。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）中の細胞の合計時間は、１０分を超えてはならない。各バイアル当たり０．４ｍＬの温かいＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を追加する。管を４分間１２０〜１３０ｇで遠心分離した後、細胞ペレットの分配なしでできる限り慎重に上澄み液を吸引する。２５０μＬの培地を調製した２４ウェルプレートのウェルから、細胞ペレットを有する管に移し、２００μＬ先端を用いて細胞ペレットを再懸濁し、細胞懸濁液をウェルに戻す。細胞を１つの管から単一ウェルに移す。この方法によって得られる細胞クローンは、継代０として考慮される。その後４〜６日間、細胞増殖を観察し、形態的にＮＳＣに類似する、すなわち特定の有角形状の多数の細胞を含有するウェルをマークすることにより、小さいロゼット様構造（アスタリスク）を形成することができると同時に、低密度の細胞を有する領域において、ニューロン様細胞に分化す��ことができる。最初の２〜５継代の間、２４ウェルプレートのウェルにおいて細胞を維持し、１：２または１：１の比率で分割する。細胞が特定の形態を喪失し始めたウェルを破棄する。十分な量の細胞を取得した後、それらを３５ｍｍペトリ皿上、次に６０ｍｍペトリ皿上で培養する。
【０１５７】
実施例７
ｐｈＮＳＣの分化
ＮＳＣの同時分化は、神経基底培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で行い、レチノールを含まないＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗生物質溶液を添加した。
【０１５８】
成長因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含まないＢ２７添加培地において、ｐｈＮＳＣおよびｈＮＳＣの同時分化は４週間以内に発生し、主にニューロン様細胞の生成をもたらした。免疫細胞化学的分析は、ｐｈＮＳＣ誘導体中のニューロン特異的チューブリンβＩＩＩの存在を明らかにした。転写活性分析は、ｐｈＮＳＣおよびｈＮＳＣ誘導体の両方において、ニューロン特異的マーカーＴＵＢＢ３（チューブリンβＩＩＩ）およびＭＡＰ２、ならびにアストロサイトマーカーＧＦＡＰを明らかにした（図３）。同時に、オリゴデンドロサイトマーカーＦＯＸＯ４の発現は、ｐｈＮＳＣから分化させた細胞集団においてより高かった。
【０１５９】
実施例８
ｐｈＮＳＣの維持および表現型
単離と単一細胞懸濁液へのＮＥＰロゼット解離との結果は、増殖する細胞集団であり、一般に、これらの細胞は、４〜５日毎に分割比１：２で４．５ヶ月にわたって継代した。少なくとも２７継代の間、ｐｈＮＳＣはｈＮＳＣに類似する特定形態を維持した。
【０１６０】
具体的には、ＮＳＣの維持および継代は、いくらかの修正を加えて、ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎユーザマニュアル（ＭＡＮ０００１７５８）に記載のとおり行う。
【０１６１】
ＮＳＣは、増殖速度に応じて、３〜５日に１回、分割比１：２で継代した。細胞は低密度で分化する傾向があるため、播種密度は、少なくとも５×１０４／ｃｍ２である必要がある。
【０１６２】
細胞は、緩い単分子層を形成するとき、継代の準備ができている。細胞の異常増殖および高密度の単分子層は、分化および副株の喪失に至り得る。細胞を継代するために：
−必要量の６０ｍｍペトリ皿を調製し、継代する前にＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）で２〜３時間処理する。
−必要量のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地、１枚の６０ｍｍペトリ皿当たり６ｍＬの培地を、＋３７℃、５％ＣＯ２、湿気のある環境にある培養器内で加温する。
−１０ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地の入った１５ｍＬ遠心分離管を、１〜２枚の６０ｍｍペトリ皿当たり１本の管で調製する。＋３７℃、５％ＣＯ２、湿気のある環境にある培養器内に管を入れる。
−必要量のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を継代される各皿当たり１ｍＬで遠心分離管に添加する。それを継代する前に水浴中で２０〜３０分間加温する。
−ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）の添加から２〜３時間後に、成長因子ＥＧＦおよびｂＦＧＦを、両方の最終濃度２０ｎｇ／ｍＬまで添加する。
−ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）溶液を６ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地と置き換え、成長因子を添加して、皿を培養器に戻す。
−継代される皿、成長因子を含まないＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、およびＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地の入った管を取る。
−皿から培地を吸引し、１ｍＬの温かいＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を添加して、室温で４分間培養する。培養中に皿を慎重に振動させる。
−４分後、細胞が表面から分離し始めたかどうかを倒立顕微鏡下でチェックする。分離し始めていない場合は、追加の培養が必要であり、皿を培養器中に１分間置く。
−成長因子を含まない１ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を皿に添加し、１０００μＬ先端のピペットで細胞懸濁液を静かに取り、細胞を分離する。
−細胞懸濁液を、成長因子を含まないＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ  ＳＦＭ培地を含有する管に移す。１本の管は、最大２枚の６０ｍｍペトリ皿に適合する。
−管を慎重に振動させて、内容物を混合する。
−細胞を１２０〜１３０ｇで４分間遠心分離し、すべての上澄みを慎重に吸引する。
−必要量の新しいＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）処理された皿を取る。通常、細胞は１：２で継代するため、１枚の６０ｍｍペトリ皿からの細胞がある場合、２枚の新しい皿を使用する。
−各皿から１ｍＬの培地を遠心分離管に移し、ペレットを再懸濁する。１ｍＬの細胞懸濁液をそれぞれの皿に戻す。
−皿を振動させることによって、細胞を皿内に均等に分配する。＋３７℃、５％ＣＯ２、湿気のある環境にある培養器内に皿を置く。
【０１６３】
継代の翌日に、培養培地を新しいものと置き換える。その後、少なくとも１日おきに培地を置き換える必要がある。
【０１６４】
転写活性ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｈＮＳＣにおける発現レベルに近い、ｐｈＮＳＣ中のＳＯＸ２、ＮＥＳ、ＭＳ１、およびＰＡＸ６の発現レベルを明らかにした。ＯＣＴ４の発現は、ｐｈＮＳＣまたはｈＮＳＣのいずれかにおいて、非常に低いレベルであるが検出可能であり、内胚葉マーカーＡＦＰは、すべてのＮＳＣ株において検出されなかった（データ図示せず）。神経堤外胚葉系間充織に特異的な遺伝子ＦＯＸＤ３およびＳＮＡＩ２、ならびに中胚葉マーカーＡＣＴＡ１の転写活性レベルは、ｈＮＳＣと比較してｐｈＮＳＣにおいてより低かったが、高レベルの神経管神経性ドメインマーカーＯＬＩＧ２発現は、ｐｈＮＳＣにおいて明らかになった。ＳＯＸ２、ＮＥＳ、およびＭＳ１発現はまた、免疫細胞化学によってタンパク質レベルで確認された。表面マーカーＣＤ１３３およびＣＤ１５分析は、ｐｈＮＳＣが陽性および陰性のＣＤ１３３およびＣＤ１５細胞の混合集団を示すことを明らかにした（データ図示せず）。
【０１６５】
実施例９
単為生殖由来のドーパミン作動性ニューロンの生成
多分化能神経前駆体細胞（ＮＰＣ）は、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである単為生殖幹細胞に由来する神経外胚葉から得られた。単為生殖由来のＮＰＣは、中脳ドーパミン作動性ニューロン（ＤＡ）等のニューロンに分化する。これらのＤＡニューロンは、中脳表現型を呈し、免疫細胞化学およびＲＴ−ＰＣＲによって測定されるように、ＴＨ、ＧＩＲＫ２、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ１、ＬＭＸＡ１、およびＥＮ１を発現する。先行技術から知られているように、ドーパミン作動性ニューロンの主な機能は、ドーパミンを放出することである。体内のドーパミンの主な機能は、報酬によって動かされる学習である。ｈｐＮＰＣに由来するＤＡニューロンはまた、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定されたようにドーパミンを放出する。全細胞電気生理学は、単為生殖由来のドーパミン作動性ニューロンが活動電位を発生させることができることを証明した。
【０１６６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるドーパミン放出の測定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、２．１×１００ｍｍ  Ａｔｌａｎｔｉｓ−ｄＣ１８  ２．１×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、培養物中のドーパミンレベルを分析した。幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの培養物から馴化培地を採取し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して、−８０℃で冷凍した。試料を室温で解凍し、２００μＬの試料および標準物質を、２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ８．５中の５００μＬの錯化剤０．２％  ＤＰＢＡ−エタノールアミンエステル＋５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡと混合した。Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢマイクロ溶出プレート３０μｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を０．５ｍＬメタノールに続いて、０．５ｍＬ  ０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ  ｐＨ８．５で馴化した。複合した試料および標準物質を、馴化したＯａｓｉｓ  ＨＬＢマイクロ溶出プレートにおいて、０．５ｍＬ／分未満の速度でゆっくり抽出した。抽出プレートを０．５ｍＬの０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ  ｐＨ８．５、続いて０．５ｍＬの２０：８０メタノール：０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ８．５で洗浄した。次にドーパミンを水中の１００μＬ  ４％ギ酸で溶出し、９６ウェルプレートに採取した。２０μＬをＡｔｌａｎｔｉｓ  ＤＣ−１８  ２．１×１００ｍｍ  ｉ．ｄ．カラムに充填し、注入された試料の分離は、０．１％ギ酸−アセトニトリル移動相中、流速３００μＬ／分で８分間、勾配溶出によって達成した。ＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ４０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ質量分析計（ＳｐｅｃｔｒａＬａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いてピークを分析し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によって定量した。ｈｐＮＰＣに由来するＤＡニューロンもまた、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定されたように、ドーパミンを放出する
【０１６７】
試料番号５は、ｐｈＮＳＣに由来するＤＡニューロンによって放出されるドーパミンレベルである。（表６）
【０１６８】
（表６）
2014509192.tif 000009
ＢＬＱ  定量の下限
【０１６９】
電気生理学
ニューロンが成長しているカバースリップを、最大幅５ｍｍおよび長さ１ｃｍ寸法の紡錘状のテストチャンバ−に適合するように小片に切断した。テストチャンバ−に、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＫＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３０５〜３１５ｍＯｓｍ、ｐＨ  ７．４（５Ｍ  ＮａＯＨで調整）を含有するタイロード溶液をかん流させた。電極は、３〜５ＭＯｈｍ抵抗で調整し、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、５ｍＭ  ＡＴＰ−Ｍｇ、２９５〜３０５ｍＯｓｍ、ｐＨ  ７．２５（１Ｍ  ＫＯＨで調整）で満たした。データを５ＫＨｚ  Ｂｅｓｓｅｌフィルタで処理し、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ａ  増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＰｃｌａｍｐソフトウェアを使用して、１０〜２０ＫＨｚで取得した。すべての実験は、連続流チャンバ内で顕微鏡下、室温で行った。データは図４に示される。全細胞電気生理学は、単為生殖由来のドーパミン作動性ニューロンが活動電位を発生させることができることを証明した。
【０１７０】
参考文献
2014509192.tif 000010
2014509192.tif 000011
2014509192.tif 000012
2014509192.tif 000013
【０１７１】
本発明は、上記の例を参照して説明されたが、修正および変型が本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。
【図１】
2014509192.tif 000015
【図２】
2014509192.tif 000016
【図３】
2014509192.tif 000017
【図４】
2014509192.tif 000018
【国際調査報告】
2014509192.tif 000019