(57)【要約】  本発明は哺乳類の骨及び関節結合組織の成長、回復、及び維持を促進する食事サプリメントを提供する。特に、食事サプリメントは少なくとも一種の金属キレート及び少なくとも一種の軟骨保護剤の組み合わせを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に濃縮卵殻膜からなる組成物を哺乳類に投与することを特徴とするこれを要する哺乳類のII型コラーゲンのC-テロペプチド(CTX-II)レベルを減少するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳類の骨及び関節結合組織の成長、回復、及び維持を促進する食事サプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほぼ４千万人のアメリカ人が重度のレベルの関節の堅さ及び痛みを患っている。この堅さ又は痛みはランニング又は水泳の如き活発なアスレチック活動中に経験される慢性の機械的ストレスの累積作用に由来し得る。加えて、関節痛は捻挫、脱臼及び骨折の如き外傷性損傷の結果であり得る。関節痛はまた骨関節炎及び慢性関節リウマチの如き関節性疾患の長期作用のためであり得る。関節の痛みの他に、上記関節症状の多くが外観異常及び運動性の喪失をもたらし得る。ほぼ690 万人のアメリカ人が関節炎に直接起因し得る或る種の仕事制限を有する。
関節痛の治療はその原因及び重度に依存する。反復機械的ストレスによりもたらされる比較的軽度の関節痛について、運動の強さ又は期間を調節することによるストレスの軽減、又は異なるフットウェアーもしくは支持器具の使用が最も簡単な選択肢であるが、これはアスリート又はパーフォーマンス動物について適切ではないかもしれない。更に重度の関節痛について、処方箋なしの非ステロイド系坑炎症薬(NSAID)、例えば、イブプロフェン（アドビル、モトリン）及びナプロキセンナトリウム（アレブ）が役に立ち得る。更に重度の症例では、プレドニゾン又はコルチゾンの如きステロイドが軽減をもたらすが、多くの潜在的副作用、例えば、体重増、高血圧、及び顔面の膨れにより伴なわれる。慢性関節性症状、例えば、慢性関節リウマチの症例では、免疫系の炎症反応を中断するエタネルセプト又はアジュリムマブの如きその他の薬物が有効であるが、免疫系の乱れに関する副作用によりまた伴なわれる。最後の手段として、外科的介入、例えば、軟骨移植又は関節交換が症候を軽減し得る。上記治療の全てが痛みに取り組み、関節への更なるダメージを制限し得るが、関節組織の回復を殆ど促進しない。
関節痛を治療するための別のアプローチは骨及び関節結合組織の成長、回復及び維持を刺激する栄養サプリメントの使用による。サプリメントの一つのクラスは関節結合組織の成分：コラーゲン、グルコサミン、ヒアルロン酸、及びコンドロイチンを含む。その他のサプリメントは骨及び関節結合組織合成のために触媒として作用し、又は原料を供給する：S-アデノシルメチオニン(SAM)、メチルスルホニルメタン(MSM)、並びにその他のビタミン及びミネラル、例えば、ビタミンＣ、マンガン、マグネシウム、亜鉛、カルシウム、鉄、及びビタミンB12。これらのサプリメントの幾つかが若干の軽減を与えるが、それらは典型的には総合の関節の健康に影響する栄養支給の制限されたサブセットのみに取り組む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
それ故、総合の関節の健康を改善するのに利用し得る栄養サプリメントについての要望が存する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は哺乳類の骨及び関節結合組織の成長、回復、及び維持を促進する化合物のバランスのとれた混合物を有する食事サプリメントを提供する。従って、食事サプリメントは骨関節炎、関節滲出、関節侵食、関節炎症及び痛み、滑膜炎、は行、術後関節鏡手術、関節運動性を含む適切な関節機能の劣化、軟骨細胞の代謝活性の低下又は抑制、軟骨を分解する酵素の減少又は抑制、ヒアルロン酸の生成の低下又は抑制を含む（しかし、これらに限定されない）、幾つかの障害又は指示を治療又は予防するために哺乳類の対象に投与されてもよい。食事サプリメントはまた関節軟骨の分解又は関節軟骨の分解から生じる障害もしくは指示を減少するために哺乳類の対象に投与されてもよい。このような障害又は指示の例は慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、及び急性炎症、例えば、エルシニア関節炎、ピロリン酸塩関節炎、及び痛風関節炎（尿酸関節炎）である。
１．  食事サプリメント
本発明の食事サプリメントは少なくとも一種の金属キレート及び少なくとも一種の軟骨保護剤の組み合わせを含む。必要により、食事サプリメントはビタミン、ミネラル、アミノ酸、酸化防止剤、酵母培養物、必須脂肪酸、及び医薬上許される賦形剤からなる群から選ばれた少なくとも一種の付加的な成分を含んでもよい。これらの成分の夫々が以下に詳しく記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】種々の食事治療で給餌されたラットにおけるMIA 誘発関節の膨れの時間経過を示す。示された食事で給餌されたラットについてのMIA 注射後の１日目、３日目、７日目及び14日目のカリパス測定の変化（関節膝マイナス対照膝）がプロットされる。
【図２】種々の食事治療で給餌されたラットにおけるMIA 誘発関節痛の時間経過を示す。示された食事で給餌されたラットについてのMIA 注射後の１日目、３日目、７日目及び14日目の後肢質量分布の変化（対照マイナス関節炎の膝）がプロットされる。
【図３】種々の食事治療で給餌されたMIA 注射ラットにおける血清CTXII の変化を示す。示された食事で給餌されたラットについてのMIA 注射後の７日目及び14日目の血清CTXII のレベル（pg/mL）がプロットされる。
【図４】種々の食事治療で給餌されたMIA 注射ラットにおける血清COMPの変化を示す。示された食事で給餌されたラットについてのMIA 注射後の７日目及び14日目の血清COMPのレベル(U/L) がプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
(a) 金属キレート
本発明の食事サプリメントは少なくとも一種の金属キレート又は金属塩を含む。或る実施態様において、金属キレートは金属イオン、及びアミノ酸リガンド又はそのヒドロキシ類似体を含む。金属イオンは亜鉛イオン、銅イオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、クロムイオン、セレンイオン、カルシウムイオン及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれてもよい。好ましい実施態様において、金属イオンが亜鉛イオン、マンガンイオン、及び銅イオンである。アミノ酸はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン又はそれらのヒドロキシ類似体からなる群から選ばれてもよい。或る実施態様において、銅イオン及び亜鉛イオンが２価であることが好ましく、即ち、それが2+の電荷を有する。キレート分子中のアミノ酸対金属イオンの比は一般に1:1 から3:1 まで、又はそれより高く変化してもよい。典型的には、金属キレートが1:1 種、2:1 種及び3:1 種の混合物を含んでもよい。好ましくは、キレート分子中のアミノ酸対金属イオンの比が一般に1.5:1 から2.5:1 まで変化してもよい。水性媒体中で、これらの種の相対比率が適用可能な安定性定数により測定される。
リガンドの数が金属イオンの電荷に等しい場合、その電荷が典型的にはバランスされる。何とならば、アミノ酸のカルボキシル部分が脱プロトン化形態であるからである。例えば、金属陽イオンが2+の電荷を有し、アミノ酸対金属比が2:1 であるキレート種では、ヒドロキシル基又はアミノ基の夫々が金属への配位共有結合により結合されると理解され、一方、イオン結合がカルボキシレート基の夫々と金属イオンの間で優先する。リガンドの数が、例えば、２価の金属イオンの3:1 キレート中で、金属イオンの電荷を越える場合、電荷を超えるアミノ酸が典型的にはプロトン化状態に留まって電荷を釣り合わせてもよい。他方で、金属イオンの正電荷がアミノ酸の数を超える場合、その電荷が別の陰イオン、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、重炭酸イオン、硫酸水素イオン、リン酸二水素イオン及びこれらの組み合わせの存在により釣り合わされてもよい。２価の陰イオンがまた存在してもよい。
例示の実施態様において、金属キレートが金属イオン及びリガンドを含み、この場合、式１の化合物がリガンドの源である。金属塩が金属イオン及び陰イオンを含み、この場合、式１の化合物が陰イオンの源である。式１の化合物は下記の構造を有する：
【０００７】
【化１】
2014507411.tif 000002
【０００８】
式中、
ｎは０から２までの整数であり、
R1はメチル又はエチルであり、かつ
R2はヒドロキシル及びアミノからなる群から選ばれる。
本発明の種々の実施態様において、ｎが２であり、R1がメチルであり、かつR2がヒドロキシルである（即ち、2-ヒドロキシ-4-メチルチオ-ブタン酸）。金属イオンが亜鉛イオン、銅イオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、クロムイオン、セレンイオン、カルシウムイオン及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれてもよい。例示の実施態様において、金属イオンが亜鉛イオン、マグネシウムイオン、及び銅イオンである。金属イオンが銅イオン、マンガンイオン、クロムイオン、カルシウムイオン、及び鉄イオンである場合、それが２価であることが好ましく、即ち、それが2+の電荷を有する。
例示の実施態様において、式１の化合物が2-ヒドロキシ-4-メチルチオブタン酸（“HMTBA”）を含み、即ち、ｎが２であり、R1がメチルであり、かつR2がヒドロキシルである。特に好ましい実施態様において、金属イオンが銅イオン、亜鉛イオン、又はマンガンイオンである。金属イオンが銅イオン又はマンガンイオンである場合、それが２価であることが好ましく、即ち、それが2+の電荷を有する。Zn陽イオンが実質的に普遍的に２価である。本発明の組成物及び方法に有益なその他の金属キレートでは、金属イオンがまた２価であることが好ましい。キレート分子中のリガンド対金属イオンの比が一般に1:1 から3:1 まで、又はそれより高く変化してもよい。典型的には、金属キレートが1:1 種、2:1 種及び3:1 種の混合物を含んでもよい。好ましくは、キレート分子中のリガンド対金属イオンの比が一般に1.5:1 から2.5:1 まで変化してもよい。水性媒体中で、これらの種の相対比率が適用可能な安定性定数により測定される。ｎが２であり、R2がアミノであり、かつR1がメチルである場合、即ち、式１の化合物がメチオニンである場合には、幾つかの安定性定数が文献から入手し得る。少なくとも幾つかの安定性定数がまたｎが２であり、R2がヒドロキシルであり、かつR1がメチルであり、即ち、式１の化合物がHMTBAであるキレートについてまた入手し得る。
リガンドの数が金属イオンの電荷に等しい場合、その電荷が典型的にはバランスされる。何とならば、リガンドのカルボキシル部分が脱プロトン化形態であるからである。こうして、これらのキレートでは、リガンドの夫々が式(1A)に相当する。
【０００９】
【化２】
2014507411.tif 000003
【００１０】
式中、R1、R2及びｎは先に定義されたとおりであり、即ち、これに関するキレートがまたジカルボン酸塩である。例えば、金属陽イオンが2+の電荷を有し、リガンド対金属比が2:1 であるキレート種では、ヒドロキシル基又はアミノ基(R2)基の夫々が金属に配位共有結合により結合されると理解され、一方、イオン結合がカルボキシレート基の夫々と金属イオンの間で優先する。典型例が二つの2-ヒドロキシ-4-メチルチオブタン酸イオンとのZn2+、Cu2+、Mn2+の錯体である。リガンドの数が、例えば、２価の金属イオンの3:1 キレート中で、金属イオンの電荷を越える場合、電荷を超えるリガンドがプロトン化状態に留まって電荷を釣り合わせてもよい。他方で、金属イオンの正電荷がリガンドの数を超える場合、その電荷が別の陰イオン、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、重炭酸イオン、硫酸水素イオン、リン酸二水素イオン及びこれらの組み合わせの存在により釣り合わされてもよい。２価の陰イオンがまた存在してもよい。
金属が1+又は2+の電荷を有する金属塩がまた使用されてもよい。これらの塩は金属、金属酸化物、金属水酸化物又は金属塩（例えば、金属炭酸塩、金属硝酸塩又は金属ハロゲン化物）が式１の構造を有する一種以上の化合物と反応して金属と得られる陰イオンの間にイオン結合を形成する場合に生成する。一般に、これらの金属塩は金属イオン源をHMTBAと接触させることにより調製し得る。特別な理論により束縛されないが、Znイオン、Cuイオン、Mnイオン、Mgイオン、Feイオン、及びCrイオンとHMTBAの組み合わせが主としてキレートの形態であると考えられる。
本発明の金属キレートは一般に米国特許第4,335,257号及び同第4,579,962号（これらの夫々が参考として本明細書にそのまま含まれる）に記載された方法に従って調製し得る。
【００１１】
(b) 軟骨保護剤
本発明の食事サプリメントは少なくとも一種の軟骨保護剤を含む。本発明における使用に適した軟骨保護剤は一般に軟骨細胞機能を改善する。いずれの特別な理論に束縛されないで、好適な軟骨保護剤は下記のメカニズムの一つ以上により軟骨細胞機能を改善し得る：1)コラーゲン及びプロテオグリカンの軟骨細胞合成だけでなく、ヒアルロナンの滑膜細胞生成を刺激し、2)軟骨分解を抑制し、また3)肋軟骨下の血管及び滑膜血管中のフィブリン生成を防止する。
一実施態様において、軟骨保護剤がグルコサミン、又はグルコサミンの誘導体もしくは塩である。好適なグルコサミン形態として、グルコサミン硫酸塩、グルコサミン塩酸塩、グルコサミンヨウ化水素酸塩、グルコサミンピルビン酸塩、グルコサミンリン酸塩、β-グルコサミン、α-グルコサミン、及びN-アセチルグルコサミンが挙げられる。グルコサミンの毎日の用量は約25mgから約3000mgまで、更に典型的には、約500mg から約1500mgまでの範囲であってもよい。
別の実施態様において、軟骨保護剤がコンドロイチン、又はコンドロイチンの誘導体もしくは塩である。コンドロイチンの好適な形態として、コンドロイチン塩化物、コンドロイチン臭化物、コンドロイチン硫酸塩、及びコンドロイチンヨウ化物が挙げられる。コンドロイチンの毎日の用量は約25mgから約3000mgまで、更に典型的には、約500mg から約1500mgまでの範囲であってもよい。
更に別の実施態様において、軟骨保護剤がヒアルロン酸又はヒアルロン酸の誘導体もしくは塩である。ヒアルロン酸の好適な塩として、アルカリ金属塩だけでなく、アルカリ土類金属が挙げられる。典型的な塩として、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及びヒアルロン酸カルシウムが挙げられる。ヒアルロン酸の典型的な用量は約10mgから約2000mgまでの範囲であってもよい。
更なる実施態様において、軟骨保護剤が緑イ貝（例えば、モエギイ貝）からのエキスである。このようなエキスの毎日の用量は脂質エキスについて約100mg から約300mg まで又は凍結乾燥粉末について約1000mgから約1200mgまでであってもよい。
例示の実施態様において、軟骨保護剤がコンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、グルコサミン、及びコラーゲンの混合物を含むであろう。例示の製剤がトレード名ナチュラル・エッグ・シェル・メンブラン（ESM テクノロジイズ（LLC、カーセージ、ミズーリ州）により販売されるNEM（登録商標））として市販されており、これは濃縮卵殻膜を含む。
【００１２】
(c) ビタミン
必要により、本発明の食事サプイメントは一種以上のビタミンを含んでもよい。食事サプリメント中の使用に適したビタミンとして、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンB12 、ビタミンＫ、リボフラビン、ニアシン、ビタミンＤ、ビタミンB6、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸、及びビオチンが挙げられる。ビタミンの形態として、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンの同じ又は同様の活性を有する化合物、及びビタミンの代謝産物が挙げられる。
食事サプリメントは有効量の本明細書に記載され、又はそれ以外に当業界で知られているビタミンのいずれかの一種以上の形態を含んでもよい。例示のビタミンとして、ビタミンＫ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、及びビオチンが挙げられる。ビタミンの“有効量”は典型的には対象についてのその特別なビタミンの米国推奨の毎日の許容量（“RDA”）の少なくとも約10％の量に相当する。しかしながら、RDA を超える或る種のビタミンの量が或る対象について有益であり得ることが意図されている。例えば、所定のビタミンの量が適用可能なRDA を100％、200％、300％、400％もしくは500％又はそれ以上超えるかもしれない。
【００１３】
(d) ミネラル
I(a) に記載された金属キレート又は金属塩に加えて、食事サプリメントは一種以上のミネラル又はミネラル源を含んでもよい。ミネラルの非限定例として、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、及びセレンが挙げられるが、これらに限定されない。以上のミネラルのいずれかの好適な形態として、可溶性ミネラル塩、わずかに可溶性のミネラル塩、不溶性ミネラル塩、キレート化ミネラル、ミネラル錯体、非反応性ミネラル、例えば、カルボニルミネラル、及び還元ミネラル、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
例示の実施態様において、ミネラルがカルシウムの形態であってもよい。カルシウムの好適な形態として、カルシウムアルファ-ケトグルタレート、酢酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、アスパラギン酸カルシウム、カプリル酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムキレート、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、クエン酸リンゴ酸カルシウム、ギ酸カルシウム、カルシウムグルビオネート、カルシウムグルコヘプトネート、グルコン酸カルシウム、グルタル酸カルシウム、カルシウムグリセロホスフェート、乳酸カルシウム、リシン酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、オロト酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、酸化カルシウム、パントテン酸カルシウム、リン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、コハク酸カルシウム、硫酸カルシウム、ウンデシレン酸カルシウム、サンゴカルシウム、クエン酸二カルシウム、リンゴ酸二カルシウム、リンゴ酸ジヒドロキシカルシウム、リン酸二カルシウム、及びリン酸三カルシウムが挙げられる。
一般に言えば、食事サプリメントは一種以上の形態の有効量の本明細書に記載され、又はそれ以外に当業界で知られているミネラルのいずれかを含んでもよい。ミネラルの“有効量”は典型的には対象についてのその特別なミネラルの米国推奨の毎日の許容量（“RDA”）の少なくとも約10％の量に相当する。しかしながら、RDA を超える或る種のミネラルの量が或る対象について有益であり得ることが意図されている。例えば、所定のミネラルの量が適用可能なRDA を100％、200％、300％、400％もしくは500％又はそれ以上超えるかもしれない。典型的には、食事サプリメント中に含まれるミネラルの量は投与当り約１mgから約1500mgまで、約５mgから約500mg まで、又は約50mgから約500mg までの範囲であってもよい。
【００１４】
(e) 必須脂肪酸
必要により、食事サプリメントは必須脂肪酸の源を含んでもよい。必須脂肪酸は単離されてもよく、又はそれが必須脂肪酸を含むオイル源もしくは脂肪源であってもよい。一実施態様において、必須脂肪酸がポリ不飽和脂肪酸(PUFA)であってもよく、これは一般にシス配置の少なくとも二つの炭素-炭素二重結合を有する。PUFAは少なくとも18個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸であってもよい。PUFAは最初の二重結合が炭素鎖のメチル末端（即ち、カルボン酸基の反対）から３番目の炭素-炭素結合中に生じるオメガ-3脂肪酸であってもよい。オメガ-3脂肪酸の例として、アルファ-リノレン酸（18:3,ALA）、ステアリドン酸（18:4）、エイコサテトラエン酸（20:4）、エイコサペンタエン酸（20:5；EPA）、ドコサテトラエン酸（22:4）、n-3ドコサペンタエン酸（22:5；n-3DPA）、及びドコサヘキサエン酸（22:6；DHA）が挙げられる。PUFAはまた最初の二重結合がメチル末端から５番目の炭素-炭素結合中に生じるオメガ-5脂肪酸であってもよい。例示のオメガ-5脂肪酸として、ミリストール酸（14:1）、ミリストール酸エステル、及びセチルミリストレートが挙げられる。PUFAはまた最初の二重結合がメチル末端から６番目の炭素-炭素結合中に生じるオメガ-6脂肪酸であってもよい。オメガ-6脂肪酸の例として、リノール酸（18:2）、ガンマ-リノレン酸（18:3）、エイコサジエン酸（20:2）、ジホモ-ガンマ-リノレン酸（20:3）、アラキドン酸（20:4）、ドコサジエン酸（22:2）、アドレン酸（22:4）、及びn-6 ドコサペンタエン酸（22:5）が挙げられる。脂肪酸はまたオメガ-9脂肪酸、例えば、オレイン酸（18:1）、エイコセン酸（20:1）、ミード酸（20:3）、エルカ酸（22:1）、及びネルボン酸（24:1）であってもよい。
【００１５】
別の実施態様において、必須脂肪酸源がシーフード由来オイルであってもよい。シーフードは脊椎魚又は海洋生物であってもよく、その結果、油が魚油又は海産油であってもよい。長鎖（20C,22C）オメガ-3脂肪酸及びオメガ-6脂肪酸がシーフード中に見られる。シーフード中のオメガ-3脂肪酸対オメガ-6脂肪酸の比は約8:1 から20:1までの範囲である。オメガ-3脂肪酸に富む油が誘導し得るシーフードとして、アワビ、帆立貝、びんちょうまぐろ、カタクチイワシ、ナマズ、二枚貝、タラ、ジェムフィッシュ、ニシン、レイクトラウト、サバ、メンヘーデン、オレンジラフィー、サケ、イワシ、ボラ、シーパーチ、サメ、シュリンプ、イカ、マス、及びツナが挙げられるが、これらに限定されない。
更に別の実施態様において、必須脂肪酸源が植物由来オイルであってもよい。植物油及び野菜油はオメガ-6脂肪酸に富んでいる。或る種の植物由来オイル、例えば、亜麻実油が、特にオメガ-3脂肪酸に富んでいる。植物油又は野菜油は一般に植物の実から抽出されるが、また植物のその他の部分から抽出されてもよい。調理又は風味料に普通使用される植物油又は野菜油として、アサイーオイル、アーモンド油、アマランスオイル、アプリコット種油、アルガンオイル、アボカドシードオイル、ババスオイル、ベン油、ブラックカラントシードオイル、ボルネオタローナッツオイル、ボラージオイル、バッファローゴールドオイル、カノーラ油、キャロブポッドオイル、カシュオイル、ヒマシ油、ヤシ油、コリアンダー種子油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサオイル、ニセアマ油、亜麻仁油、グレイプシードオイル、ヘーゼルナッツオイル、麻実油、カポック油、ラッレマンチアオイル、リンシードオイル、マカダミアオイル、メドウフォーム種子油、からし油、オクラ種子油、オリーブオイル、パームオイル、パーム核油、落花生油、ペカン種子油、ペキーオイル、シソ実油、松実油、ピスタチオオイル、ポピーシード油、プルーン仁オイル、カボチャ種子油、キノアオイル、ラムティルオイル、米ぬか油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、ひまわり油、ティーオイル、シッスルオイル、胡桃油、又は麦芽油が挙げられるが、これらに限定されない。植物由来油はまた水素化又は部分水素化されてもよい。
更に別の実施態様において、必須脂肪酸源は藻類由来油であってもよい。市販の藻類由来油として、海産渦鞭毛藻及びシゾキトリウム種からの油が挙げられる。油が抽出される藻類のその他の好適な種として、浮遊性藍藻類、珪藻類種、ボツリオコッカス・ブラウニー、緑藻種、オオヒゲマワリ、ミドリムシ、イソクリシス・ガルバナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロリス種、ネオクロリス・オレオアブンダンス、フェオダクチラム・トリコルヌツム、円石藻、赤潮原因藻、緑藻類イカダモ、スピルリナ種、及びテトラシルミス・チュイが挙げられる。
【００１６】
(f) アミノ酸
食事サプリメントは必要により一種から数種までのアミノ酸を含んでもよい。好適なアミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン又はそれらのヒドロキシ類似体が挙げられる。或る実施態様において、アミノ酸が必須アミノ酸から選ばれるであろう。必須アミノ酸は一般に生物によりde novo 合成し得ず、それ故、食事中で与えられる必要があるものと記載される。非限定例として、ヒト用の必須アミノ酸として、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-バリン及びL-スレオニンが挙げられる。例示の実施態様において、利用されるメチオニンは式(1) に相当するメチオニンのヒドロキシル類似体である。
【００１７】
【化３】
2014507411.tif 000004
【００１８】
式中、
ｎは０から２までの整数であり、
R1はメチル又はエチルであり、かつ
R2はヒドロキシル及びアミノからなる群から選ばれる。
この実施態様の例示の別型において、ｎが２であり、R1がメチルであり、かつR2がヒドロキシルである（即ち、2-ヒドロキシ-4-メチルチオ-ブタン酸）。
【００１９】
(g) 酸化防止剤
食事サプリメントは一種以上の好適な酸化防止剤を含んでもよい。当業者により理解されるように、所定の酸化防止剤の適性は食事サプリメントが投与される種に応じて変化するであろう。酸化防止剤の非限定例として、アスコルビン酸及びその塩、アスコルビルパルミテート、アスコルビルステアレート、アノキソマー、N-アセチルシステイン、ベンジルイソチオシアネート、o-,m-又はp-アミノ安息香酸（ｏはアントラニル酸であり、ｐはPABAである）、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、カフェイン酸、カンタキサンチン、アルファ-カロテン、ベータ-カロテン、ベータ-カラオテン、ベータ-アポ-カロテン酸、カルノソール、カルバクロール、カテキン、セチルガレート、クロロゲン酸、クエン酸及びその塩、p-クマリン酸、クルクリン、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、N,N’-ジフェニル-p-フェニレンジアミン(DPPD)、ジラウリルチオジプロピオネート、ジステアリルチオジプロピオネート、2,6-ジ-tert-ブチルフェノール、ドデシルガレート、エデト酸、エラグ酸、エリソルビン酸、ナトリウムエリソルベート、エスクレチン、エスクリン、6-エトキシ-1,2-ジヒドロ-2,2,4-トリメチルキノリン、エチルガレート、エチルマルトール、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、オイゲノール、フェルラ酸、フラボノイド、フラボン（例えば、アピゲニン、クリシン、ルテオリン）、フラボノール（例えば、ダチセチン、ミリセチン、ダエムフェロ）、フラバノン、フラキセチン、フマル酸、没食子酸、ゲンチアンエキス、グルコン酸、グリシン、グアイアカムゴム、ヘスペレチン、アルファ-ヒドロキシベンジルホスフィン酸、ヒドロキシケイ皮酸、ヒドロキシグルタル酸、ヒドロキシキノン、N-ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシトリロソール、ヒドロキシ尿素、乳酸及びその塩、レシチン、レシチンシトレート、R-アルファ-リポ酸、ルテイン、リコペン、リンゴ酸、マルトール、5-メトキシトリプタミン、メチルガレート、モノグリセリドシトレート、モノイソプロピルシトレート、モリン、ベータ-ナフトフラボン、ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)、オクチルガレート、シュウ酸、パルミチルシトレート、フェノチアジン、ホスファチジルコリン、リン酸、ホスフェート、フィチン酸、フィチルビクロメル、プロピルガレート、ポリホスフェート、ケルセチン、トランス-レスベラトロール、ロスマリン酸、セサモール、シリマリン、シナプ酸、コハク酸、ステアリルシトレート、シリング酸、酒石酸、チモール、トコフェロール（即ち、アルファ-、ベータ-、ガンマ-及びデルタ-トコフェロール）、トコトリエノール（即ち、アルファ-、ベータ-、ガンマ-及びデルタ-トコトリエノール）、チロソール、バニリン酸、2,6-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシメチルフェノール（即ち、イオノックス100）、2,4-(トリス-3’,5’-ビ-tert-ブチル-4’-ヒドロキシベンジル)-メシチレン（即ち、イオノックス330）、2,4,5-トリヒドロキシブチロフェノン、ユビキノン、ターシャリーブチルヒドロキノン(TBHQ)、チオジプロピオン酸、トリヒドロキシブチロフェノン、トリプタミン、チラミン、尿酸、ビタミンＫ及び誘導体、ビタミンQ10、ゼアキサンチン、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
食事サプリメントに含まれてもよい自然酸化防止剤として、リンゴムキ皮エキス、ブルーベリーエキス、ニンジン果汁粉末、クローバーエキス、コーヒーベリー、コーヒー豆エキス、クランベリーエキス、ユーカリエキス、ジンジャー粉末、ブドウ実エキス、緑茶、オリーブ葉、パセリエキス、ペパーミント、ピメントエキス、リンゴの絞りかす、ザクロエキス、米ぬかエキス、バラの実、ローズマリーエキス、サルビアエキス、タルトチェリーエキス、トマトエキス、ウコン、及び麦芽油が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
(h) 坑炎症薬
食事サプリメントは必要により少なくとも一種の坑炎症薬を含んでもよい。一実施態様において、坑炎症薬は合成非ステロイド坑炎症薬(NSAID)、例えば、アセチルサリチル酸、ジクロフェナック、インドメタシン、オキサメタシン、イブプロフェン、インドプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、メファマン酸、メタミゾール、ピロキシカム、及びセレコキシブであってもよい。別の実施態様において、坑炎症薬が炎症プロセスを変調するプロホルモンであってもよい。この性質を有する好適なプロホルモンとして、プロホルモンコンバーターゼ１、プロオピオメラノコルチン、プロホルモンＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド、SMR1プロホルモン等が挙げられる。別の実施態様において、坑炎症薬が坑炎症作用を有する酵素であってもよい。坑炎症酵素の例として、ブロメライン、パパイン、セラペプチダーゼ、及びタンパク質分解酵素、例えば、パンクレアチン（トリプシン、アミラーゼ及びリパーゼの混合物）が挙げられる。
更に別の実施態様において、坑炎症薬が坑炎症作用を有するペプチドであってもよい。例えば、ペプチドがホスホリパーゼA2のインヒビター、例えば、アンチフラミン-1、リポコルチンのアミノ酸残基246-254 に相当するペプチド；アンチフラミン-2、ウテログロビンのアミノ酸残基39-47 に相当するペプチド；S7ペプチド（これはインターロイキン６とインターロイキン６受容体の間の相互作用を抑制する）；RP1 、プレニルタンパク質インヒビター；及び同様のペプチドであってもよい。また、坑炎症性ペプチドがコルチスタチン、ソマトスタチンに関連する環状ニューロペプチド、又はSV-IV タンパク質のＮ末端フラグメント、E-、L-、及びP-セレクチンの保存領域に相当するペプチド等であってもよい。その他の好適な坑炎症製剤として、コラーゲン加水分解物及びミルクミクロ栄養濃厚物（例えば、ストル・ミルク・バイオロジックス社（シンシナチイ、OH）から入手し得るミクロラクチン（登録商標））だけでなく、ミルクタンパク質加水分解物、カゼイン加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、及び植物タンパク質加水分解物が挙げられる。
更なる実施態様において、坑炎症薬が炎症を変調すると示されたプロバイオティクスであってもよい。好適な免疫調節プロバイオティクスとして、乳酸バクテリア、例えば、好酸性菌、乳酸桿菌、及びビフィズス菌が挙げられる。更に別の実施態様において、坑炎症薬が坑炎症性を有する植物エキスであってもよい。坑炎症利点を有する好適な植物エキスの非限定例として、ブルーベリー、ボスウェリア、黒カテキュ及びコガネバナ、セロリ種子、カモミル、チェリー、デビルズクロー、ユーカリ、オオマツヨイグサ、ジンジャー、ホーソンベリー、トクサ、ハリギリ樹皮、カンゾウの根、ウコン、シロヤナギ、ヤナギ樹皮、及びユッカが挙げられる。
【００２１】
(i) 賦形剤
食事サプリメント製剤中に普通に使用される賦形剤の種類は活性成分との相溶性に基づいて選ばれてもよい。好適な賦形剤の非限定例として、非発泡性崩壊剤、着色剤、風味改善剤、経口分散剤、安定剤、防腐剤、希釈剤、コンパクション剤、潤滑剤、充填剤、バインダー、味覚マスキング剤、発泡性崩壊剤、及びこれらの薬剤のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた薬剤が挙げられる。
一実施態様において、賦形剤がバインダーである。好適なバインダーとして、澱粉、前膠化澱粉、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、C12-C18 脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びこれらの組み合わせが挙げられる。ポリペプチドは約100 ダルトンから約300,000 ダルトンまでの範囲のアミノ酸のあらゆる配置であってもよい。
別の実施態様において、賦形剤が充填剤であってもよい。好適な充填剤として、炭水化物、無機化合物、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。非限定例として、充填剤が硫酸カルシウム、二塩基性及び三塩基性の両方の、澱粉、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶性セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、変性澱粉、ラクトース、蔗糖、マンニトール、及びソルビトールであってもよい。
【００２２】
賦形剤が非発泡性崩壊剤を含んでもよい。非発泡性崩壊剤の好適な例として、澱粉、例えば、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、前膠化澱粉及びこれらの変性澱粉、甘味料、クレー、例えば、ベントナイト、微結晶性セルロース、アルギネート、ナトリウム澱粉グリコレート、ガム、例えば、アガー、グアー、ロカストビーン、カラヤ、ペクチン、及びトラガカントが挙げられる。
別の実施態様において、賦形剤が発泡性崩壊剤であってもよい。非限定例として、好適な発泡性崩壊剤がクエン酸と組み合わせての重炭酸ナトリウム及び酒石酸と組み合わせての重炭酸ナトリウムを含む。
賦形剤が防腐剤であってもよい。防腐剤の好適な例として、酸化防止剤、例えば、a-トコフェロール又はアスコルベート、及び抗菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール又はフェノールが挙げられる。
別の実施態様において、賦形剤が希釈剤を含んでもよい。使用に適した希釈剤として、医薬上許されるサッカリド、例えば、蔗糖、デキストロース、ラクトース、微結晶性セルロース、フラクトース、キシリトール、及びソルビトール；多価アルコール；澱粉；予備製造直接圧縮希釈剤；並びに以上のいずれかの混合物が挙げられる。
賦形剤が風味料を含んでもよい。外層に混入される風味料は合成風味料油及び風味芳香族化合物及び／又は天然油、植物、葉、花、果実からのエキス、並びにこれらの組み合わせから選ばれてもよい。例として、これらがシナモン油、冬緑油、ペパーミント油、クローバー油、枯草油、亜麻油、ユーカリ、バニラ、シトラス油、例えば、レモン油、オレンジ油、ブドウ及びグレープフルーツ油、リンゴ、桃、梨、ストロベリー、ラズベリー、チェリー、プラム、パイナップル、及びアンズを含む果実エッセンスを含んでもよい。
別の実施態様において、賦形剤が甘味料を含んでもよい。非限定例として、甘味料がグルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フラクトース、及びこれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリン及びその種々の塩、例えば、ナトリウム塩；ジペプチド甘味料、例えば、アスパルテーム；ジヒドロカルコン化合物、グリシジン；ステビア・レバウジアナ（ステビオシド）；蔗糖のクロロ誘導体、例えば、スクラロース；糖アルコール、例えば、ソルビトール、マンニトール、シリトール等から選ばれてもよい。
【００２３】
別の実施態様において、賦形剤が潤滑剤であってもよい。潤滑剤の好適な非限定例として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水添植物油、ステロテックス、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽鉱油が挙げられる。
賦形剤が分散増進剤であってもよい。好適な分散剤として、澱粉、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーゴム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、ナトリウム澱粉グリコレート、イソ無定形シリケート、及び高HLB 乳化剤表面活性剤としての微結晶性セルロースが挙げられる。
実施態様に応じて、着色剤を外層中に用意することが望ましいかもしれない。好適な着色添加剤として、食品、薬品及び化粧品着色剤（FD＆C）、薬品及び化粧着色剤(D＆C)、又は外部薬品及び化粧着色剤（Ext.D＆C）が挙げられる。これらの着色剤又は染料（それらの相当するレーキとともに）、並びに或る種の天然着色剤及び誘導着色剤が実施態様に応じて本発明における使用に適しているかもしれない。
【００２４】
賦形剤が味覚マスキング剤を含んでもよい。味覚マスキング剤として、例えば、セルロースヒドロキシプロピルエーテル(HPC) 、例えば、クルセル（登録商標）、Nisswo HPC及びPrimaFlo HP22；低置換ヒドロキシプロピルエーテル(L-HPC)；セルロースヒドロキシプロピルメチルエーテル(HPMC)、例えば、Seppifilm-LC、ファーマコート（登録商標）、メトロースSR、オパドライYS、PrimaFlo、MP3295A、ベネセルMP824、及びベネセルMP-843；メチルセルロースポリマー、例えば、メトセル（登録商標）及びメトロース（登録商標）；エチルセルロース(EC)及びこれらの混合物、例えば、E461、エトセル（登録商標）、アクアロン（登録商標）-EC、スレリース；ポリビニルアルコール(PVA)、例えば、オパドライAMB；ヒドロキシエチルセルロース、例えば、ナトロソール（登録商標）；カルボキシメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース(CMC)の塩、例えば、アクアロン（登録商標）-CMC；ポリビニルアルコール及びポリエチレングリコールコポリマー、例えば、コリコートIR（登録商標）；モノグリセリド（ミベロール）、トリグリセリド(KLX)、ポリエチレングリコール、変性食品澱粉、アクリルポリマー及びアクリルポリマーとセルロースエーテルの混合物、例えば、エウドラギット（登録商標）EPO、エウドラギット（登録商標）RD100、及びエウドラギット（登録商標）E100；セルロースアセテートフタレート；セピフィルム、例えば、HPMCとステアリン酸の混合物、シクロデキストリン、並びにこれらの材料の混合物が挙げられる。その他の実施態様において、意図される追加の味覚マスキング剤が米国特許第4,851,226号、同第5,075,114号及び同第5,876,759号（これらの夫々が参考として本明細書にそのまま含まれる）に記載されたものである。
種々の実施態様において、賦形剤がpH調節剤を含んでもよい。或る実施態様において、pH調節剤が炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウムを含んでもよい。その他の実施態様において、BHT 又はBHA の如き酸化防止剤が利用される。
食事サプリメント中の賦形剤又は賦形剤の組み合わせの質量分率は医薬組成物の合計質量の約98％以下、約95％以下、約90％以下、約85％以下、約80％以下、約75％以下、約70％以下、約65％以下、約60％以下、約55％以下、約50％以下、約45％以下、約40％以下、約35％以下、約30％以下、約25％以下、約20％以下、約15％以下、約10％以下、約５％以下、約２％以下、又は約１％以下であってもよい。
【００２５】
(j) 例示製剤
一般に言えば、食事サプリメントはI(b) に記載された軟骨保護剤のいずれかと組み合わせてI(a) に記載された金属キレート又は金属塩のいずれかを含んでもよい。必要により、これらの食事サプリメントは更にI(c)(d)(e)(f)(g)(h)又は(i) に詳述された成分のいずれかを含んでもよい。当業者により認められるように、所定の食事サプリメントを生成する成分の型及び量は哺乳類の対象に応じて大きく変化でき、また変化するであろう。食事サプリメントは、一般に知られている方法に従って、幾つかの哺乳類の対象の要望を満たすように製剤化し得る。例えば、哺乳類の対象がヒト、農業動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、又はヤギ）、動物園動物（例えば、有蹄類）、又は伴侶動物（イヌ、ウマ、又はネコ）であってもよい。
食事サプリメントについての一つの例示実施態様において、金属キレートが2-ヒドロキシ-4-メチルチオブタン酸の亜鉛キレート、2-ヒドロキシ-4-メチルチオブタン酸のマンガンキレート、及び2-ヒドロキシ-4-メチルチオブタン酸の銅キレートの混合物を含み、かつ軟骨保護剤がコンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、グルコサミン、及びコラーゲンの混合物を含む。この実施態様の例示別型において、軟骨保護剤がNEM（登録商標）を含むであろう。これらの実施態様の夫々において、食事サプリメントがビタミン、ミネラル、アミノ酸、酸化防止剤、酵母培養物、坑炎症薬、及び必須脂肪酸からなる群から選ばれた一種から数種までの成分を含んでもよい。非限定例として、実施例２はイヌのために製剤化された本発明の例示食事サプリメントを詳述する。実施例３はウマのために製剤化された本発明の例示食事サプリメントを詳述し、実施例６はヒトのために製剤化された本発明の例示食事サプリメントを詳述する。
【００２６】
適当な場合、本発明の食事サプリメントを生成する一種以上の成分が本発明の範囲から逸脱しないで互変異性体形態、幾何異性体形態又は立体異性体形態で存在し得ることが意図されている。本発明はシス幾何異性体及びトランス幾何異性体、E-幾何異性体及びZ-幾何異性体、R-鏡像体及びS-鏡像体、ジアステレオマー、d-異性体、l-異性体、これらのラセミ混合物及びこれらのその他の混合物を含む、全てのこのような化合物を意図している。このような互変異性体形態、幾何異性体形態又は立体異性体形態の医薬上許される塩がまた本発明内に含まれる。本明細書に使用される、“シス”及び“トランス”という用語は、二重結合により連結される２個の炭素原子が二重結合の同じ側（“シス”）又は二重結合の反対側（“トランス”）に水素原子を夫々有する幾何異性の形態を表す。記載された化合物の幾つかがアルケニル基を含み、シス及びトランス幾何異性体形態又は“Ｅ”幾何異性体形態及び“Ｚ”幾何異性体形態の両方を含むと意味される。更に、記載された化合物の幾つかが一つ以上の立体中心を含み、存在する夫々の立体中心についてＲ、Ｓ、及びＲ形態とＳ形態の混合物を含むと意味される。
更に、本発明の食事サプリメントを生成する一種以上の成分が遊離塩基又はこれらの医薬上許される酸付加塩の形態であってもよい。“医薬上許される塩”という用語はアルカリ金属塩を生成し、また遊離酸又は遊離塩基の付加塩を生成するのに普通に使用される塩である。塩の性質は変化してもよいが、但し、それが医薬上許されることを条件とする。本発明の方法における使用に適した化合物の医薬上許される酸付加塩は無機酸又は有機酸から調製し得る。このような無機酸の例は塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及びリン酸である。適当な有機酸は有機酸の脂肪族クラス、脂環式クラス、芳香族クラス、芳香族脂肪族クラス、複素環クラス、カルボン酸クラス及びスルホン酸クラスから選ばれてもよく、これらの例はギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸及びガラクツロン酸である。本発明の方法における使用の化合物の好適な医薬上許される塩基付加塩として、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛からつくられた金属塩又はN,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン-(N-メチルグルカミン)及びプロカインからつくられた有機塩が挙げられる。これらの塩の全てが相当する化合物から通常の手段により、例えば、適当な酸又は塩基を本明細書に示された一種以上の相当する化合物と反応させることにより調製し得る。
【００２７】
II. 食事サプリメント投与形態
本明細書に詳述された食事サプリメントは一種又は数種の投与形態で製造し得る。例示実施態様において、投与形態は経口投与形態であろう。好適な投与形態として、懸濁錠剤、噛み砕き錠剤、発泡性錠剤又はカプレットを含む、錠剤；ピル；粉末、例えば、滅菌包装粉末、分散可能な粉末、及び発泡性粉末；軟質もしくは硬質の両方のゼラチンカプセル又は非動物由来ポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセル（即ち、HPMC）もしくはプルランを含む、カプセル；ロゼンジ；サッシェ；スプリンクル；再生可能な粉末又はシェーク；トローチ；ペレット；顆粒；液体；懸濁液；エマルション；又は半固体及びゲルが挙げられる。また、食事サプリメントは液体との混合のために食品又は粉末に混入されてもよく、又は非食品液との混合後にのみ経口投与されてもよい。当業者により認められるように、食事サプリメントは、多投薬形態の投与に適していることの他に、また種々の投与養生法により投与されてもよい。
これらの投与形態の夫々に有益な成分（即ち、金属キレート、軟骨保護剤、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、酸化防止剤、酵母培養物及び必須脂肪酸）、及びその他の賦形剤の量及び型が明細書及び実施例中に記載されている。成分及び／又は賦形剤の組み合わせ（これらの成分の特別な量を含む）が一つの投与形態で記載されている場合、同じ組み合わせがあらゆるその他の好適な投与形態に使用し得ることが認識されるべきである。更に、当業者が、この出願内に見られる教示により、単一投与形態又は別々の投与形態の組み合わせとして投与され、明細書の異なる部分に記載されるように一緒に投与される量及び型の成分を合わせることにより先にリストされた投与形態のいずれかをつくることができることが理解されるべきである。
【００２８】
食事サプリメントを生成する活性成分の粒子サイズは生物利用能、ブレンド一様性、凝離、及び流動性に影響し得る重要な因子であるかもしれない。一般に、活性成分の一層小さいサイズが、表面積を増大することにより実質的に不十分な水溶性を有する活性成分の生物吸収速度を増大する。活性成分及び賦形剤の粒子サイズはまた食事サプリメントの懸濁特性に影響し得る。例えば、一層小さい粒子はおそらくそれ程沈降せず、それ故、一層良好な懸濁液を生成する。種々の実施態様において、種々の成分の乾燥粉末（これは懸濁のための粉末として、直接投与でき、又は固体投与形態で使用し得る）の平均粒子サイズは直径が約500 ミクロン未満、又は直径が約450 ミクロン未満、又は直径が約400 ミクロン未満、又は直径が約350 ミクロン未満、又は直径が約300 ミクロン未満、又は直径が約250 ミクロン未満、又は直径が約200 ミクロン未満、又は直径が約150 ミクロン未満、又は直径が約100 ミクロン未満、又は直径が約75ミクロン未満、又は直径が約50ミクロン未満、又は直径が約25ミクロン未満、又は直径が約15ミクロン未満である。或る適用において、直径が15ミクロン未満の粒子の使用が有利であるかもしれない。これらの場合には、15ミクロンから10ナノメートルまでの粒子サイズ範囲のコロイド粒子又はナノサイズの粒子が有利に使用されるかもしれない。
本発明の食事サプリメントは通常の薬理学的技術により製造し得る。通常の薬理学的技術として、例えば、下記の方法：(1) 乾式混合、(2) 直接圧縮、(3) 微粉砕、(4) 乾式造粒又は非水性造粒、(5) 湿式造粒、又は(6) 融解の一つ又は組み合わせが挙げられる。例えば、Lachman ら著, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy (1986)を参照のこと。その他の方法として、例えば、噴射造粒、噴霧乾燥、パン被覆、溶融造粒、造粒、ウルスター被覆、接線被覆、トップ噴霧、押出、コアセルベーション等が挙げられる。
下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は本発明の実施に良く機能するように本発明者らにより発見された技術に相当することが当業者により認められるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、多くの変化が開示される特別な実施態様でなし得ることを認めるべきであり、本発明の精神及び範囲から逸脱しないで同様の結果を依然として得、それ故、本明細書に示され、又は添付図面に示される全てのことが例示であり、限定の意味ではないと解されるべきである。
【実施例】
【００２９】
下記の実施例は本発明の種々の実施態様を説明する。
実施例１．成熟したウマによる食事サプリメントの経口摂取の安全性
この研究の目的は成熟したウマによる食事サプリメントの経口摂取の安全性を証明することであった。食事サプリメントはリン酸二カルシウム、NEM（登録商標）（天然卵膜、これはグルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、及びコラーゲンを含む）、アスコルビン酸、MHA（メチオニンヒドロキシ類似体）、HMBTA-Mn、HMTBA-Zn、HMBTA-Cu、ビオチン、ゾリエン・シー（Zorien Se）酵母（SeY）、及びビタミンＤを含んでいた。食事サプリメントを含む食事を挙動観察及び血液サンプルを使用して採取された通常の臨床化学パネルについての効果に関して対照食事と比較した。
食事  ２種の食事をこの研究の経過にわたって全てのウマに与えた。最初の７日間中に、全てのウマにNRC 要件を満足し、又は超える商用ウマ食事（対照食事）を与えた。次の14日間中に、ウマにトップドレス適用として添加される付加的な食事サプリメントとともに同じ商用ウマ食事を与えた。食事サプリメントの投与の初期の比率は500kg のウマについて食事サプリメント50g であった。その研究の最後の７日間中に、ウマに当初の商用ウマ食事を与えた。ウマ飼料濃厚物のサンプルを毎週集めた。食事サプリメントの夫々のバッチをサンプリングし、ミネラル含量（Cu、Mn、Zn）だけでなく、グルコサミン、コンドロイチン、及びヒアルロン酸について分析した。
【００３０】
動物及び実験デザイン  ２箇所からの５匹のウマ（２匹の雄、３匹の雌）がこの研究に関与した。１匹の雄ウマ及び２匹の雌ウマはミズーリ州、ウィンフィールドにあるウェーマイヤー牧場で馬小屋に入れられ、１匹の雄ウマ及び１匹の雌ウマはミズーリ州、トロイにあるハーレル牧場で馬小屋に入れられた。夫々のウマに個々の馬房を指定して所望の量の食事サプリメントの摂取を保証した。試験の完結時に、全てのウマをその研究から解放した。
挙動観察  動物を毎日最低２回観察し、異常観察を記録した。
血液サンプル  10ミリリットルまでの血液を血清分離管中で夫々の動物から集め、少なくとも30分にわたって凝固させた。全てのサンプルを未希釈血清について回転させ、二つのアリコートに分け、凍結した。一つのアリコートをアンテク獣医診断研究所に送り、標準血液化学パネルについて分析した。血液サンプルを全てのウマから研究エントリー時、研究期間中の７日毎に１回、そして研究の終了時に１回抜き取った。
データ分析及び統計  血液データを対の観察として分析した。研究の最初の２週中に採取された基準線食事血液サンプル間の差を、SAS のゼネラル・リニアー・モデルのpdiff 操作を使用して、研究の最後の２週中に採取された実験食事血液サンプルと比較し、結果を平均値±標準偏差として表した。
結果  食事サプリメントは食事サプリメントの存在のために食物摂取に有意な変化を生じないで、この研究で全てのウマにより好まれることがわかった。更に、不利な効果が食事サプリメントを受けるウマのいずれにも観察されなかった。全ての血液化学パネルが全てのウマについて正常な範囲内に入り、食事サプリメントが投与されている間に挙動変化がいずれのウマについても認められなかった。
【００３１】
実施例２．食事サプリメントを含むイヌ治療の嗜好性
下記の研究を行なって食事サプリメントを含むイヌ治療の嗜好性を測定した。イヌのために製剤化された食事サプリメントを含む２種の噛み砕きイヌ錠剤を現行のグッド・マニュファクチャリング・プラクチス（cGMP）を使用して製造した。一種の錠剤（治療Ａ）をチキンダイジェストで風味を付け、第二の錠剤（治療Ｂ）をビーフ及びチーズ嗜好剤で風味を付けた。食事サプリメントはMHA、リン酸三カルシウム、NEM（登録商標）、アスコルビン酸、HMBTA-Zn、ゾリエン・シーＹ、HMTBA-Cu、HMTBA-Mn、ビオチン、及びビタミンＤを含んでいた。
動物  20匹の雄及び雌のビーグルをアニマル・ウェルフェア・アクト下でASDA No. 23-R-126で登録された犬小屋施設に収容した。犬小屋は12時間の照明及び12時間の消灯サイクルを有していた。犬小屋の温度をアニマル・ウェルフェア・アクトに従って目標条件（即ち、10℃から29℃まで）に保った。ケージ及び給餌ボウルを毎日きれいにし、アニマル・ウェルフェア・アクトに従って衛生的にした。
実験デザイン  夫々のイヌに２日間にわたって１日１回でステンレス鋼ボウル中の夫々の治療の一種を与えた。ボウル設置を毎日逆にし、両方のボウルを５分まで、又は最初の治療が消費されるまで与えた。治療の提供の５時間前に、夫々のイヌに30分間にわたって通常のイヌ食事（Joy（登録商標）スペシャル・ミール、Joy Pet Food（オハイオ州、セント・メリーズ））300gを与えた。イヌ食事の平均消費は85％であった。
データ分析及び統計  夫々のイヌを耳の入れ墨及びケージ番号により同定した。最初のアプローチ、最初の消費嗜好、及び最初の治療を消費する時間（秒）を夫々のイヌについて毎日記録した。カイ自乗及びｔ検定分析を使用してデータを分析した。
結果  表１は二つの試験についての夫々のイヌの最初のアプローチ嗜好及び最初の消費嗜好を提示する。イヌは両方の治療にほぼ等しく接近したが、彼らは治療Ｂよりも頻繁に約９倍治療Ａを消費したことがわかった。
表１．イヌ治療嗜好性の要約
【００３２】
【表１】
2014507411.tif 000005
【００３３】
全てのイヌの中で、治療Ａは最初にアプローチされた嗜好23回であり、また治療Ｂは最初にアプローチされた嗜好17回であった。個々のイヌのレベルで、治療Ａは３匹のイヌ（15％）について最初のアプローチ嗜好であり、治療Ｂは０匹のイヌについて最初のアプローチ嗜好であり、また治療Ａ及びＢの両方が17匹のイヌ（85％）について等しくアプローチされた。カイ自乗分析は最初のアプローチ嗜好で統計的有意を見い出さなかった。同様に、ｔ検定分析は有意の95％レベルで最初のアプローチ嗜好の統計的有意を見い出さなかった。Ｐ値は0.08281であった。
総合して、治療Ａは最初の消費嗜好36回であり、また治療Ｂは最初の消費嗜好４回であった。個々のイヌのレベルで、16匹のイヌ（80％）が両方の日で治療Ａを消費し、イヌが両方の日で治療Ｂを消費せず、４匹のイヌ（20％）が１日で治療Ａを消費し、その他の日で治療Ｂを消費した。カイ自乗分析は差書の消費嗜好で統計的有意差を見い出した。同様に、ｔ検定分析は有意の95％のレベルで最初の消費嗜好で統計的有意差を見い出した。Ｐ値は0.00000であった。治療を消費するのに要した時間は３秒から190 秒までの範囲であった。治療Ｂの消費の場合が少なかったので、統計分析が可能ではなかった。
この研究はイヌが食事サプリメントを含むチキン風味の錠剤を好むことを明らかにした。
【００３４】
実施例３．ウマにおける関節疾患の検出及び食事サプリメントの治療利益
この研究の第一の目的は個々内及び個々間の平均レベル及び分散を証明し、関節病に相当し得るパターンを見つけるために、軟骨及び滑膜代謝マーカーだけでなく、炎症及び酸化ストレスについてのマーカーのウマの尿及び／又は血漿／血清レベルを監視することである。その研究の第二の目的は関節疾患を有するウマについての潜在的な代替治療としての食事サプリメントの利益を試験することである。
その研究は同じ時間の期間にわたって食事サプリメントを受けるウマの二つのグループを含むであろう。二つのグループはそれらが治療の前後に監視される時間の期間を異にするであろう。ウマの食事サプリメントは実施例１で先に記載されている。
動物  生後少なくとも２年の成熟した家畜のウマ（エクゥウス・カバッルス）が研究に含まれるであろう。先の120日に関節手術を受けたウマが除かれるであろう。ウマが1)先の30日に全身のグルコサミノグリカン(GAG)、2)先の14日に食事ビタミン、ミネラル、又は関節健康サプリメント、3)先の７日に全身のステロイド、又は4)先の７日に全身の非ステロイド坑炎症薬(NSAID)を受けた場合、それらがまた除かれるであろう。ウマ獣医は先の医療履歴及び肉体検査の両方を使用して研究の開始の前に夫々のウマの全般の健康を評価するであろう。ウマ獣医は関節状態を評価し、ウマ開業医の米国協会(AAEP)は行スケール（例えば、http://www.aaep.orgを参照のこと）を使用しては行スコアを指定するであろう。ウマを水に随時接近させ、試験前のように給餌し、運動させ続けるであろう。
実験デザイン  初期のは行スコアリング後に、ウマをグループＡ又はグループＢにランダムに帰属し、その結果、両方のグループがほぼ同じウマの数を有し、年齢及びは行スコアについてほぼマッチされる。試験は表２に表示されるように、４つの期間を含んでもよい。期間１及び４は夫々、前治療期間及び後治療期間であり、期間２及び３はグループの一方が治療され、他方が治療されない治療期間である。表２中、“０”は無治療を示し、また“Ｔ”は治療を示す。治療期間中、食事サプリメントを１日当り動物当り50グラムの用量で投与してもよい。サプリメントを毎日の飼料に混合してもよい。
表２．実験デザイン
【００３５】
【表２】
2014507411.tif 000006
【００３６】
期間１の開始の前に、薬物及び／又はサプリメント投与を終わらせ、夫々の動物の全般の健康を先に詳述したように、評価するであろう。表３は試験の４つの期間についての詳しいスケジュールを提示する。
表３．実験プロトコル
【００３７】
【表３】
2014507411.tif 000007
【００３８】
血液収集  血液を頸静脈から集め、血清及び血漿収集のための二つの別々の管に入れてもよい。サンプルを分析されるまで-20 ℃で凍結してもよい。血漿及び／又は血清を軟骨代謝のバイオマーカー（例えば、PIIANP、CTX-II、COMP）だけでなく、炎症についてのマーカー（例えば、IL-6）又は酸化ストレスについてのマーカー（例えば、8-イソ-PGF2α、PGE2）について分析してもよい。ビタミンＤ、ビタミンＥ、アスコルビン酸、亜鉛、銅、及びマンガン血清レベルをまた測定してもよい。
尿収集  フリーフロー収集を使用して尿を集め、分析されるまで-20 ℃で凍結してもよい。尿をグリコシル-ガラクトシル-ピリジノリン（滑膜代謝のマーカー）及びCTX-IIについて分析してもよい。尿アッセイからの全てのバイオマーカーレベルを尿クレアチニン濃度により修正するであろう。
熱イメージング  熱画像を製造業者の指示に従ってFLUKE 熱画像撮影システム（Fluke社（ワシントン州、エバレット））で撮影してもよい。画像を全動物から前方、後方、及び両側から撮影してもよい。画像をまた炎症の特定の領域から撮影してもよい。周囲温度及び動物の体温の両方をイメージングの時間に記録してもよい。一般に、画像をその他のサンプルの収集の直前に撮影するであろう。
同時の治療薬  或る種の治療薬（例えば、GAG 、ステロイド、NSAID 、及びその他のサプリメント）が試験中に禁じられるであろう。その他の治療薬がケース・バイ・ケース基準で獣医により評価され、それらが選ばれたバイオマーカーのレベルに影響しないと考えられる場合に許可されるであろう。全ての同時の治療薬が記録されるであろう。加えて、ウマが試験の経過中に針治療、マッサージ、カイロプラクチック治療を受けなくてもよい。
データ分析  バイオマーカーの濃度を平均値±標準偏差として表してもよい。スチューデントｔ検定を使用して統計上の差を測定してもよい。期間１中のバイオマーカーの分析を使用して、年齢及びは行を従属変数として使用して経時の個体間及び個体内の分散を証明してもよい。期間１中に検出されたバイオマーカーのパターンが関節の病気に合致するかもしれない。バイオマーカーのパターン又は濃度の変化及び／又はは行スコアの変化及び／又は熱画像の変化を食事サプリメントによる治療の結果として検出してもよい。
選ばれたバイオマーカーの濃度が減少し、かつ／又はは行スコアが食事サプリメントによる治療の結果として減少する場合、食事サプリメントがウマの関節疾患の治療について治療上の利益を与えると結論されるかもしれない。治療上の利益が関節疾患と関連する痛みの軽減、及び／又は関節組織の成長、回復、及び／又は維持により顕在化されるかもしれない。
【００３９】
実施例４．関節疾患を有するウマにおける食事サプリメントの治療上の利益
下記の研究の目的は食事サプリメントによるは行の履歴を有するウマの治療が関節の健康と関連する臨床症候のコントロールを助ける（即ち、は行スコアを減少し、関節疾患の症候を軽減し、関節組織の更なる劣化を安定化又は防止し、かつ／又は関節組織の成長及び／又は回復を促進する）か否かを測定することである。
二重盲検偽薬対照研究は二つのグループを比較し、一つのグループは試験食事サプリメントで給餌され、また第二のグループは活性成分を含まない比較食事サプリメントで給餌されるであろう。ウマ食事サプリメントは実施例１に先に詳述される。
動物  関節の健康問題を有する生後少なくとも２年の成熟した家畜（プライベートで所有）ウマが研究に含まれるであろう。関節の健康問題として、関節滲出、は行又は変性関節疾患もしくは骨関節炎に共通のその他の臨床症候が挙げられる。含まれるために、ウマが2.0 以上かつ4.0 未満のAAEPは行スコアを有するであろう。両側は行が明らかである場合、一層ひどく冒された肢が冒された肢を顕示されるであろう。先の120 日間に関節手術を受けたウマが除かれるであろう。ウマが1)先の90日間に冒された関節中の関節内注射、2)先の30日間に全身のGAG 、3)先の14日間に食事ビタミン、ミネラル、又は関節健康サプリメント、4)先の７日間に全身のステロイド、5)先の７日間に全身の非ステロイド坑炎症薬(NSAID)、又は6)先の２週間に装ていもしくはトリミングの変化を受けた場合、それらがまた除かれるであろう。ウマが水への随時の接近を与えられ、飼料（枯草、そして必要により、穀物）が体重を維持するために与えられるであろう。
動物が試験の開始前に21日の適合化フェーズにかけられてもよい。動物がウマ獣医により初期の評価を受けてもよい。
【００４０】
実験デザイン  研究はは行グレード及び冒された関節によりブロックされたウマを用いる、ランダム化完全ブロックデザインを含むであろう。夫々のブロック（対）内で、ウマが対照グループ又は治療グループにランダムに指定されるであろう。対照グループは偽薬食事サプリメント（即ち、アルファルファ食、糖蜜、及び亜麻油）を受けるであろう。治療グループは１日当り動物当り50g の食事サプリメントを投与されてもよい。食事サプリメントが飼料に混合されてもよい。ウマが飼料を消費することができず、又はサプリメントが飼料から分離し、完全には消費されない場合、飼料が水又は糖蜜で湿らされて嗜好性を高め、分離を妨げてもよい。臨床調査員が治療指定について隠されて全ての観察がバイアスされない様式で記録されることを確実にするであろう。
研究の期間が６週（42日）であってもよい。表４は研究スケジュールを提示する。
表４．研究活動
【００４１】
【表４】
2014507411.tif 000008
【００４２】
一般獣医評価  同じウマの先の評価が調べられないかもしれない。冒された肢及び対側肢が一般にAAEPは行グレードについて別々にスコアを付けられ、冒された肢のみがパラメーターの残りについてスコアを付けられるであろう。しかしながら、ウマが評価日に両側は行を示す場合、両方の肢が全てのパラメーターについてスコアを付けられるであろう。目視アナログスケール(VAS) パラメーターが10cmの線上に適当なスポットを示す垂直線を使用してマークされてもよい。
は行スコア  は行がAAEPは行等級スケールを使用して評価されてもよい。データ形態は評価中に使用されたフッティングの記載を含む。フッティングは研究の期間にわたって夫々のウマについて変えられなくてもよい。
歩行時のは行(VAS)   歩行時の冒された肢のは行が10cmの目視のアナログスケール(VAS) でスコアを付けられてもよく、この場合、左手側が歩行時の健全性に関するものであり、また右手側が免苛に関するものである。
はや足時のは行(VAS)   はや足時の冒された肢のは行が10cmの目視のアナログスケール(VAS) でスコアを付けられてもよく、この場合、左手側がはや足時の健全性に関するものであり、また右手側が免苛に関するものである。
ストライドの長さ  冒された肢が持ち上げられ、ひずめがきれいにされ、水で噴霧されてもよい。着色チョーク（粉末）がひずめの底部に適用されてもよく、ウマがひずめストライクマークを可視化するのに適した表面（例えば、コンクリート又は路面）ではや足にされるであろう。見える最も遠いマークから測定して、ストライドの長さがテープメジャーを使用して測定されてもよい。最小で３ストライド及び最大で６ストライドがフィート及びインチで記録されてもよい。
関節屈曲  冒された関節がわずかの抵抗又は無抵抗で可能な最も高い程度に軽く曲げられてもよい。屈曲が10cm VASでスコアを付けられてもよく、この場合、０＝正常であり、また10＝屈曲なしである。冒された関節（例えば、つなぎ、ひずめ及び船状）が固有の制限された運動性を有する場合、この測定がなし得ず、“NA”が“適用不能”についてのデータ形態に入れられるであろう。
関節屈曲に対する応答  関節屈曲に対するウマの応答が10cm VASでスコアを付けられてもよく、この場合、０＝正常であり、また10＝極度の応答である（但し、冒された関節が曲げられるものであることを条件とする；上記を参照のこと）。
【００４３】
関節屈曲後のは行  冒された関節が60秒間にわたって曲げられた位置に保たれ、ウマが曲げられた関節の解放直後にはや足にされてもよい。は行が10cm VASで測定されてもよく、この場合、０＝正常であり、また10＝免荷である。
生活の質インデックス  生活の質が全ての上記パラメーターだけでなく、10cm VASによるウマの様子を使用して評価されてもよく、この場合、０＝優れた生活の質；DJD と関連する明らかな不快なしであり、また10＝不十分な生活の質である。
滑膜液  獣医評価後に、冒された関節が外部できれいにされてもよく（必要により、しっかりつかまれてもよく）、滑膜液のサンプルがEDTAを含む管に無菌で集められてもよい。滑膜液がWBC 、全タンパク質、オステオカルシン、IL-6、及びTNF αについて評価されてもよい。
血液  血液がヘパリン処理シリンジ及び管を使用して集められ、血漿について遠心分離されてもよい。血漿が骨及び軟骨マーカー（例えば、オステオカルシン、DPD 、カルシトニン、COMP、CTX-II、PIIANP）だけでなく、炎症の目安（例えば、サイトカイン、例えば、IL-1β、II-6、TNF α、8-イソ-PGF2α、iNOS、COX-2）について評価されてもよい。
研究からの対象の除去  ウマが重大な健康事象の場合には健康事象及び投与されたあらゆる治療の完全な記録でもって研究から除去されてもよい。ウマがスポンサー及び研究モニターとの相談後にケース・バイ・ケース基準を除いて調査員により除去されなくてもよい。
【００４４】
同時治療薬  医療症状を治療するための治療介入が研究の経過中に必要であるかもしれない。何とならば、試験動物がプライベートで所有されているからである。個々のウマの健康及び生活状態が調査員、オーナー／トレイナー、及びあらゆるその他の担当獣医の最優先事項であろう。冒された関節についての関節内治療、PSGAG もしくはヒアルロン酸による全身治療、NSAID もしくはコルチコステロイドによる治療の使用、又は関節の健康のための一種以上の食事サプリメント（例えば、グルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、MSM 、ペルナイガイ）の開始がこの研究中に禁じられ、研究からのそのウマの排除をもたらすであろう。その他の疾患プロセスについての薬物の散発性使用がケース・バイ・ケース基準で評価され、ウマがデータ組中に留まってもよいか、又は排除される必要があるのかを決める必要がある。プロトコルについてのウマの臨床評価がNSAID 投与の７日間以内に行なわれなくてもよい。オーナー／トレイナーは実験期間中に研究ウマについての針治療、マッサージ、カイロプラクチック又はその他の別法を許すべきではない。全ての同時の薬物及び食事サプリメントが記録されるであろう。研究中に、ウマがトリミング／装ていされてもよいが、トリミング又は装ていパターンの変化が許されないであろう（例えば、角度、装てい型、追加／削除又はパッド）。ウマが研究中に運動スケジュールの著しい変化を受けなくてもよい。
データ分析  ウマはそれらのAAEPは行スコアが治療の終了時に１単位以上減少する場合又はは行VAS の一つが２cm以上減少する場合に応答者として分類されるであろう。夫々の治療グループからの応答者及び非応答者の数が比較されるであろう。全てのパラメーターの平均及び標準偏差がまた測定されるであろう。
【００４５】
実施例５．ラット骨関節炎モデルにおける食事サプリメントの有効性
この研究の目的は食事サプリメントが骨関節炎のモノナトリウムヨードアセテート(MIA)ラットモデルで骨関節炎の重度を軽減するか否かを測定することである。
実験デザイン  その研究はラットの三つのグループ：1)食事サプリメントを与えない対照グループ、2)ウマ食事サプリメント（先に詳述された）を与えられたグループ、及び3)NEM（即ち、グルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、及びコラーゲン）を補給されたグループを含んでもよい。一般に、ラットはグループ当り16匹のラットで、約250-300gの雄のウィスターラットであろう。ラットが１ヶ月の長い前治療期間を受けてもよい。研究のために、夫々のラットが右膝にMIA そして左膝に食塩水を注射され、３種の食事のうちの一種で飼育され、56日間にわたって監視されるであろう。表5は研究スケジュールを提示する。
表５．ラット研究スケジュール
【００４６】
【表５】
2014507411.tif 000009
【００４７】
関節の膨れ  関節の膨れはカリパスにより測定されてもよい。また、熱イメージングが膨れを定量するのに有益であるかもしれない。ラットが測定前にイソフルランで軽度に麻酔されるであろう。
血液  血液がヘパリン処理シリンジ及び管を使用する心臓穿刺によりイソフルラン麻酔薬を使用して麻酔されたラットについて集められ、血漿のために遠心分離され、分析まで凍結されてもよい。サンプルが軟骨及び骨代謝のバイオマーカー（PIIANP、CTX-II、COMP、オステオカルシン）、及び炎症の目安（IL-6、IL-1β）について分析されてもよい。
熱イメージング  FLUKA 熱イメージングシステムがラットを示された日に画像撮影するのに使用されてもよい。左膝及び右膝が同じ画像で評価されるであろう。環境温度がまた記録されるであろう。
【００４８】
組織学  サンプルがＨ＆Ｅ、サフラニンＯ、及びトルイジン・ブルー染色液で染色されて結合組織病理学だけでなく、軟骨及び骨バイオマーカーを検出してもよい。
インキャパシタンス試験  インキャパシタンステスターが後肢質量分布分析の推定を生じる。この測定が運動性及び痛みの定量的目安を与えるかもしれない。MIA 注射された膝が一層痛みがあるべきであり、それ故、一層多くの質量が食塩水注射された膝に分布されるべきである。
データ分析  種々のインジケーターが平均及び標準偏差として提示されてもよい。全ての動物が早い時点（注射後まもなく）で炎症及び膨れの徴候を示すかもしれず、一方、骨分解及び合成が後の時点で生じるかもしれないと予想される。治療グループ対対照グループの応答の差は治療が骨関節炎と関連する症候を軽減し、かつ／又は骨関節炎の発生を防止したことを示すかもしれない。
【００４９】
実施例６．ヒト用製剤
ヒト用に製剤化された食事サプリメントを含むHPMCカプセルを、現行のグッド・マニュファクチャリング・プラクチス（cGMP）を使用して製造した。ヒト用食事サプリメントはカルシウム（卵殻カルシウムとして）、マグネシウム（酸化マグネシウムとして）、HMTBA-Zn、ビタミンＣ、NEM（登録商標）、HMTBA-Mn、HMTBA-Cu、ゾリエン・シーＹ、ビタミンＫ、及びビタミンＤを含む。
【００５０】
実施例７．骨関節炎のラットモデルにおける食事サプリメントの効果
下記の研究の目的はモノナトリウムヨードアセテート(MIA) 誘発骨関節炎(OA)のモデルで坑炎症及び／又は軟骨変調サプリメントとしての、NEM （登録商標）及びテラファーム（TelaFirm）（登録商標）（HMTBA、MHA 、及びSe酵母のブレンド；ノブス・インターナショナル）の単独及び組み合わせての効力を評価することであった。MIA OAモデルはヒトOAと関連する痛み及び構造変化を模擬する迅速な、再現性の動物モデルである。従来の研究はこのモデルがヒトOAの挙動の特徴、病的特徴及び薬理学的特徴を模擬することを実証していた。
動物  この研究に使用された操作はノブス・インターナショナル社の動物ケア標準作業操作に従った。雄のウィスターラット（220g；チャールズ・リバー）をトウモロコシ穂軸床を備えた中実底部ケージに収容した。動物を表６に示された食事で給餌し、水が膝注射の28日前に開始して随時に入手し得た。54匹のウィスターラットを４種の食事治療（グループ当りn=12の動物＋６匹の擬似ラット）：1)ラットAIN-93M食、2)食事に混入された0.6％NEMを含むAIN-93M、3)0.75％テラファームを含むAIN-93M、及び4)0.6％NEM＋0.75％テラファームを含むAIN-93Mの一種で給餌した。加えて、６匹のラットが対照（MIA注射なし）として利用でき、食事治療１で給餌した。動物をMIA 注射の28日間にわたって食事治療で給餌し、最終の組織収集までラットがこれらの同じ食事を続けた。
【００５１】
【表６】
2014507411.tif 000010
【００５２】
骨関節炎の誘発  MIA 誘発関節炎の誘発のために、ラットをイソフルランで麻酔し、右膝又は左膝の膝蓋下靭帯中のMIA（シグマ（ミズーリー州、セントルイス）；カタログ#12512）１mgの単一関節内注射を施した。注射の部位（左対右）をランダムに指定し、左膝及び右膝の間で同等にバランスさせた。MIA を生理食塩水に溶解し、26ゲージ、1.3cm（0.5 インチ）の針を使用して50μl の容積で投与した。700 シリーズルアー(luer)チップマイクロリットルシリンジを備えたハミルトンPB 600-1反復ディスペンサー（モデル750;ハミルトン社（ネバダ州、レノ））を自動化容積の正確な注射のために使用した。対照膝に注射しなかった。ラットはMIA 注射時に平均で330gであった。
後肢質量分布の評価  右肢及び左肢の間の後肢質量分布の変化を関節不快のインデックスとして利用した。インキャパシタンステスター（IITCライフ・サイエンス（カリフォルニア州、ウッドランド・ヒルズ））を質量分布測定に使用した。ラットを夫々の後肢が別々のフォースプレートに載るように配置された傾斜プレキシガラスチャンバーに入れた。夫々の後肢により加えられる力(g)を3-5秒の期間にわたって平均にした。結果を対照肢と関節炎の肢の間のｇの差として表す。こうして、その値が高い程、対照膝にかかる質量が大きく、痛みのある関節炎の膝を示唆する。負の値は一層大きい質量が対照膝よりも関節炎の膝にかけられたことを示す。測定をMIA 注射後の１日目、２日目、３日目、7日目及び14日目に行なった。
膝膨れの変化の評価  ばね装填カリパスを使用して膝膨れを測定した。ラットをイソフルランで軽く麻酔し、その後に測定を行なった。測定をMIA 注射後の１日目、２日目、３日目、7日目及び14日目に行なった。
【００５３】
血清バイオマーカー分析  ラットを血液サンプルの収集の前にイソフルランで軽く麻酔した。血液サンプルを心臓穿刺により採取した。血清サンプルをMIA 注射の７日後及び14日後に収集した。全てのサンプルを分析まで-80 ℃で凍結した。分析されたバイオマーカーとして、II型コラーゲンの架橋C-テロペプチド（即ち、CTXII）及び軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（即ち、COMP）が挙げられる。ELISA キットをCTXII（ノルディック・バイオサイエンス・ダイアグノスチック、#3CAL4000）及びCOMP（MDバイオサイエンシズ、#A-COMP.96）の測定に使用した。
統計分析  分散の分析を完全ランダム化デザインに適したGLM（SAS インスティチュート（米国、ノースカロライナ州、ケアリー））を使用して行なった。0.05未満の型Ｉエラーの可能性を有意と考えた；(P<0.10)をトレンドと考えた。
結果  モノナトリウムヨードアセテート(MIA)の注射がカリパスにより測定して関節膨れの時間依存性変化をもたらした（図１）。膨れは１日目に全ての治療について最高であり、その後に減少した。有意差をNEM又はテラファーム単独給餌(P<0.05)に対しNEM＋テラファームの組み合わせ給餌ラット(P<0.05)についてMIA注射の３日後に観察された。
【００５４】
後肢質量分布の変化（図２）を関節不快の間接的目安として使用した。示された値は対照（注射せず）と試験膝の間の差である。一層低い値はラットがその関節炎の膝で一層多くの質量を支持し得ることを示す。有意差がNEM＋テラファーム給餌ラット対対照食給餌ラットの間で１日目に観察され(P<0.05)、トレンドが対照ラット（AIN-93M）に対しNEM＋テラファームの組み合わせで給餌されたラットについて３日目及び７日目に観察された(P<0.10)。
軟骨分解のマーカーである、CTXIIの減少（図３）がNEMのみで給餌されたラットについて７日目(P<0.10)及び14日目(P<0.05)に観察された。CTXIIの減少がまたNEM＋テラファームの組み合わせで給餌されたラットについて７日目に観察された(P<0.10)。また、分解マーカーである、COMPの減少（図４）がテラファーム給餌ラット及びテラファーム+NEMの組み合わせで給餌されたラットについて14日目に観察された(P<0.05)。
結論  二つの独立の測定（減少された膝膨れ及び１日目における関節炎の膝の増大された質量支持）はNEM＋テラファームの組み合わせが骨関節炎(OA)動物で坑炎症作用を有し得ることを示唆する。NEM＋テラファームの組み合わせはNEM又はテラファーム単独給餌よりも有効であった。これらの結果はまたNEM＋テラファームの組み合わせが軟骨分解のマーカーである、CTXII及びCOMPの減少により証明されるように軟骨変調作用を有することを示唆する。
【００５５】
実施例８．骨関節炎のラットモデルにおける食事サプリメントの効果−試験２
下記の実施例を関節健康サプリメントとしてのNEM及びテラファームの組み合わせの２種の異なる用量の効力を試験するために設計した。
方法  雄のウィスターラット(n=56)をMIA注射の前の28日間にわたって食事治療で給餌し、最終の組織収集まで食事を続けた。食事治療（グループ当りn=18）は、1)ラットAIN-93M食（先の表６を参照のこと）、2)AIN-93M＋１％ステッドファストウマ関節サプリメント（SFE;NEM＋テラファームの組み合わせ）、又は3)AIN-93M＋２％SFEであった。骨関節炎を右膝又は左膝の膝蓋靭帯中の50μＬのMIAの関節内注射により誘発した（MIA 0.6 mg）。対側膝に注射しなかった。
関節炎の肢及び対側対照肢の間の後肢質量分布(HPWD)の変化を関節の不快を評価するのに使用した。加えて、炎症をカリペスを使用して測定した（膝の膨れ）。関節炎の膝と対照膝の間の差として表される、膝の膨れをHPWDと同じ時点で測定した。血清バイオマーカーとして、軟骨分解のマーカーである、CTXII及びCOMP、並びに合成軟骨マーカーである、PIIANPが挙げられ、これらを種々の時点で治療当り６匹のラットについて集めた（測定を実施例７に実質的に記載されたように行なった）。
結果  ２％SFE給餌ラットはその他の治療で給餌されたラットに対してMIA注射の14日後にそれらの関節炎の肢で有意に多い質量を支持することができた(P<0.05)。炎症及びHPWDが一つ以外の全ての時点で対照に対し２％SFEで給餌されたラットについて数的に低かった。CTXIIが２％SFE給餌ラットで７日目、14日目及び28日目に減少され(P<0.05)、対照に対し１％SFEで給餌されたラットで28日目に減少された(P<0.05)。
【図１】
2014507411.tif 000011
【図２】
2014507411.tif 000012
【図３】
2014507411.tif 000013
【図４】
2014507411.tif 000014
【国際調査報告】
2014507411.tif 000015