(57)【要約】【課題】本発明は概して、修飾または変異呼吸器合胞体ウイルス融合（F）タンパク質、その作製方法および使用方法に関し、ＲＳＶ感染の治療および／または予防用のワクチン等の免疫原性組成物を含む。【解決手段】一つの側面において、本発明は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して修飾されたまたは変異したアミノ酸配列を含む組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供する。通常、これらの修飾または変異は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて、発現を増加させ、細胞毒性を低減し、および／またはＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性特性を増強する。特定の例示的実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質はヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質である。【選択図】図１
2014530010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（RSV）融合（F）タンパク質であって、宿主細胞における前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現を増加させる少なくとも１個の修飾または変異を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質であって、宿主細胞における前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞毒性を低減させる少なくとも１個の修飾または変異を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質であって、非修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性特性を増強する少なくとも１個の修飾または変異を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項４】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位残基に対応するアミノ酸の位置でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項５】
前記プロリン１０２位残基がアラニン残基に置き換えられている、請求項４に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項６】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のイソロイシン３７９位残基に対応するアミノ酸の位置でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項４または５に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項７】
前記イソロイシン３７９位残基がバリン残基に置き換えられている、請求項６に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項８】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のメチオニン４４７位残基に対応するアミノ酸の位置でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項４〜７のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項９】
前記メチオニン４４７位残基がバリン残基に置き換えられている、請求項８に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１０】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質がロリポップ形態をとる、請求項１〜９のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１１】
少なくとも１個のフューリン切断部位を不活性化させる変異を含む、請求項４〜１０のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１２】
前記フューリン切断部位が一次切断部位である、請求項１１に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１３】
前記少なくとも１個のフューリン切断部位の不活性化が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位およびアルギニン１３６位に対応する位置に少なくとも１個のアミノ酸置換を導入することにより行われる、請求項１１または１２に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１４】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位およびアルギニン１３６位に対応する位置に少なくとも２個のアミノ酸置換が導入されている、請求項１３に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１５】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位およびアルギニン１３６位に対応する位置に３個のアミノ酸置換が導入されている、請求項１４に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１６】
前記アルギニン１３３位残基がグルタミンに置き換えられている、請求項１３〜１５のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１７】
前記アルギニン１３５位残基がグルタミンに置き換えられている、請求項１３〜１６のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１８】
前記アルギニン１３６位残基がグルタミンに置き換えられている、請求項１３〜１７のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１９】
Ｆ２の潜在的ポリ（A）部位の少なくとも１個の修飾をさらに含む、請求項４〜１８のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２０】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアミノ酸約１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失をさらに含む、請求項４〜１９のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２１】
前記修飾または変異が、
（i）少なくとも１個のフューリン切断部位の不活性化、
（ii）Ｆ２の潜在的ポリ（A）部位の修飾、および
（iii）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアミノ酸約１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失
から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２２】
（i）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位およびメチオニン４４７位に対応する位置での少なくとも１個のアミノ酸置換、
（ii）少なくとも１個のフューリン切断部位の不活性化、
（iii）Ｆ２の潜在的ポリ（A）部位の修飾、ならびに
（iv）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアミノ酸約１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失
から成る群から選択される少なくとも２個の変異を持つ、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２３】
（i）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位およびメチオニン４４７位に対応する位置での少なくとも１個のアミノ酸置換、
（ii）少なくとも１個のフューリン切断部位の不活性化、
（iii）Ｆ２の潜在的ポリ（A）部位の修飾、ならびに
（iv）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアミノ酸約１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失
から成る群から選択される少なくとも３個の変異を持つ、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２４】
（i）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位およびメチオニン４４７位に対応する位置での少なくとも１個のアミノ酸置換、
（ii）少なくとも１個のフューリン切断部位の不活性化、
（iii）Ｆ２の潜在的ポリ（A）部位の修飾、ならびに
（iv）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアミノ酸約１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失
からなる群から選択される４個の変異を持つ、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２５】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位およびメチオニン４４７位に対応する位置に少なくとも２個のアミノ酸置換を持つ、請求項２１〜２４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２６】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位およびメチオニン４４７位に対応する位置に３個のアミノ酸置換を持つ、請求項２１〜２５のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２７】
配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９から成る群から選択される核酸配列によりコードされているＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２８】
配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２９】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて宿主細胞における発現の増加を示す、請求項１〜２８のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３０】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて免疫原性特性の増強を示す、請求項１〜２９のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３１】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１〜３０のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３２】
前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項３１に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３３】
前記昆虫細胞がＳｆ９細胞である、請求項３２に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３４】
ヒトＲＳＶのＡ株、ヒトＲＳＶのＢ株、ウシＲＳＶの株およびトリＲＳＶの株から成る群から選択されるＲＳＶの株に由来する、請求項１〜３３のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を１種または複数含む精製ミセル。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むウイルス様粒子（VLP）。
【請求項３７】
マトリックス（M）タンパク質をさらに含む、請求項３６に記載のＶＬＰ。
【請求項３８】
前記Ｍタンパク質がＲＳＶのヒト株に由来する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項３９】
前記Ｍタンパク質がＲＳＶのウシ株に由来する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項４０】
前記Ｍタンパク質がインフルエンザウイルス株由来のＭ１である、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項４１】
前記インフルエンザウイルス株がトリインフルエンザウイルス株である、請求項４０に記載のＶＬＰ。
【請求項４２】
前記トリインフルエンザウイルス株がＨ５Ｎ１株である、請求項４１に記載のＶＬＰ。
【請求項４３】
前記Ｈ５Ｎ１株がＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５である、請求項４２に記載のＶＬＰ。
【請求項４４】
前記Ｍタンパク質がニューカッスル病ウイルス（NDV）株に由来する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項４５】
ＲＳＶ糖タンパク質（G）をさらに含む、請求項３６〜４４のいずれかに記載のＶＬＰ。
【請求項４６】
ＲＳＶ糖タンパク質（SH）をさらに含む、請求項３６〜４５のいずれかに記載のＶＬＰ。
【請求項４７】
ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質（N）をさらに含む、請求項３６〜４６のいずれかに記載のＶＬＰ。
【請求項４８】
ＶＬＰを形成可能な条件下で真核細胞中において発現する、請求項３６〜４７のいずれかに記載のＶＬＰ。
【請求項４９】
真核細胞が酵母、昆虫、両生類、鳥類、哺乳類または植物の細胞から成る群から選択される、請求項４９に記載のＶＬＰ。
【請求項５０】
請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項５１】
請求項３５に記載の精製ミセルを含む免疫原性組成物。
【請求項５２】
請求項３６〜４９のいずれかに記載のＶＬＰを含む免疫原性組成物。
【請求項５３】
請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む薬学的に許容されるワクチン組成物であって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質が宿主における免疫応答を誘発する能力を有する、薬学的に許容されるワクチン組成物。
【請求項５４】
請求項３５に記載の精製ミセルを含む薬学的に許容されるワクチン組成物であって、ミセルが宿主における免疫応答を誘発する能力を有する、薬学的に許容されるワクチン組成物。
【請求項５５】
請求項３６〜４９のいずれかに記載のＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物であって、ＶＬＰが宿主における免疫応答を誘発する能力を有する、薬学的に許容されるワクチン組成物。
【請求項５６】
請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む、ウイルス感染に対してヒト対象を免疫するためのキット。
【請求項５７】
請求項３５に記載の精製ミセルを含む、ウイルス感染に対してヒト対象を免疫するためのキット。
【請求項５８】
請求項３６〜４９のいずれかに記載のＶＬＰを含む、ウイルス感染に対してヒト対象を免疫するためのキット。
【請求項５９】
ウイルス感染がＲＳＶ感染である、請求項５４〜５６のいずれかに記載のキット。
【請求項６０】
ウイルス感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される製剤中の請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質をヒト対象に投与することを含む方法。
【請求項６１】
ウイルス感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される製剤中の請求項３５に記載の精製ミセルをヒト対象に投与することを含む方法。
【請求項６２】
ウイルス感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される製剤中の請求項３６〜４９のいずれかに記載のＶＬＰをヒト対象に投与することを含む方法。
【請求項６３】
薬学的に許容される製剤がアジュバントを含む、請求項６０〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
アジュバントが非リン脂質リポソームである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ウイルス感染に対する免疫応答を生じさせる方法であって、薬学的に許容される製剤中の請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質をヒト対象に含む方法。
【請求項６６】
ウイルス感染に対する免疫応答を生じさせる方法であって、薬学的に許容される製剤中の請求項３５に記載の精製ミセルをヒト対象に投与することを含む方法。
【請求項６７】
ウイルス感染に対する免疫応答を生じさせる方法であって、薬学的に許容される製剤中の請求項３６〜４９のいずれかに記載のＶＬＰをヒト対象に投与することを含む方法。
【請求項６８】
請求項１〜３０のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項６９】
請求項６８に記載の核酸を含む単離された細胞。
【請求項７０】
請求項６８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７１】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質の作製方法であって、
（a）請求項６８に記載の核酸を発現させるために宿主細胞を形質転換すること、および
（b）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生を促す条件下で前記宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項７２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルの作製方法であって、
（a）請求項６８に記載の核酸を発現させるために宿主細胞を形質転換すること、および
（b）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルの産生を促す条件下で前記宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項７３】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記昆虫細胞が、請求項６８の核酸を含むバキュロウイルスベクターがトランスフェクトされた昆虫細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
動物の肺でのウイルス複製の予防方法であって、請求項１〜３４のいずれかに記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を前記動物に投与することを含む方法。
【請求項７６】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質を筋肉内投与する、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]  本願は、２０１１年９月３０日に出願された米国仮出願第６１／５４２，０４０号、２０１１年１０月３日に出願された米国仮出願第６１／５４２，７２１号、２０１２年３月１６日に出願された米国仮出願第６１／６１１，８３４号、および２０１２年３月２２日に出願された第６１／６１４，２８６号に対する優先権を主張し、それらの開示はそれぞれ、全ての目的のためにそれらの全体が参照により援用される。
【０００２】
[002]  電子的に提出したテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：NOVV_048_04WO_SeqList.txt、記録日：2012年9月27日、ファイルサイズ：７４キロバイト）。
【０００３】
[003]  本発明は概して、ＲＳＶ感染の治療および／または予防用のワクチン等の免疫原性組成物を含む、修飾または変異呼吸器合胞体ウイルス融合（F）タンパク質、その作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
[004]  呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科のニューモウイルス（Pneumovirus）属のメンバーである。ヒトＲＳＶ（HRSV）は、幼児における重度の下気道疾患の主な原因であり、ヒトにおける高い罹患率および死亡率に関与している。ＲＳＶはまた、免疫不全の成人における、および高齢者における疾患の重要な病原体としても認識されている。自然感染後の感染宿主におけるＲＳＶに対する不十分な抵抗性に起因して、小児期および成人期の間にＲＳＶが複数回感染する可能性がある。
【０００５】
[005]  このウイルスは、一本鎖マイナスセンスＲＮＡから構成されているゲノムを有しており、ゲノムはウイルスタンパク質と緊密に会合してヌクレオカプシドを形成する。ウイルスエンベロープは、ウイルスによりコードされた構造タンパク質を含有する、細胞膜由来の脂質二重層から構成されている。ウイルスポリメラーゼはビリオンによりパッケージ化されており、ゲノムＲＮＡをｍＲＮＡに転写する。ＲＳＶゲノムは、３種の膜貫通構造タンパク質であるＦ、ＧおよびＳＨ、２種のマトリックスタンパク質であるＭおよびＭ２、３種のヌクレオカプシドタンパク質であるＮ、ＰおよびＬ、ならびに２種の非構造タンパク質であるＮＳ１およびＮＳ２をコードする。
【０００６】
[006]  ＨＲＳＶと細胞膜との融合は細胞表面で起こると考えられており、感染の初期の間における細胞質中へのウイルスリボ核タンパク質の導入に必須の工程である。このプロセスは融合（F）タンパク質を介して行われており、感染細胞の膜と隣接した細胞の膜との融合も促進して特徴的な合胞体を形成し、これは、顕著な細胞変性効果でもあり、さらなるウイルスの伝搬機序でもある。従って、融合活性の中和が宿主免疫において重要である。実際には、Ｆタンパク質に対して作られたモノクローナル抗体は、ウイルス感染を中和し、および膜融合を阻害することが示されている（Calder他, 2000, Virology 271: 122〜131）。
【０００７】
[007]  ＲＳＶのＦタンパク質は、他のパラミクソウイルスのＦ糖タンパク質と構造的特徴および限定されているが有意なアミノ酸配列同一性を共有している。ＲＳＶのＦタンパク質は、小胞体においてアスパラギンに対して共翻訳的にグリコシル化されている５７４個のアミノ酸の不活性前駆体（F0）として合成されており、会合してホモオリゴマーを形成する。細胞表面に達する前に、Ｆ０前駆体はプロテアーゼによりＮ末端からのＦ２とＣ末端からのＦ１とに切断される。Ｆ２鎖およびＦ１鎖は、１個または複数個のジスルフィド連結により共有結合的に連結されたままである。
【０００８】
[008]  イムノアフィニティー精製した完全長Ｆタンパク質は、他の完全長ウイルス膜糖タンパク質で観察されるものと同様のミセルのフォーム（ロゼットとしても特徴付けられる）で蓄積することが分かっている（Wrigley他, 1986, in Electron Microscopy of Proteins, 第5巻, 103〜163頁, Academic Press, London）。電子顕微鏡下では、ロゼット中の分子は、ロゼットの幅広い先端がロゼットの中心から離れて突出している、逆円錐形のロッド（約７０％）またはロリポップ形（約３０％）のいずれかの構造として現れる。ロッドの立体構造の状態は融合前の不活性化状態でのＦ糖タンパク質に関連しているが、ロリポップの立体構造の状態は融合後の活性状態でのＦ糖タンパク質に関連している。
【０００９】
[009]  Ｃａｌｄｅｒ他、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２７１：１２２〜１３１で示されているように、融合前と融合後と（または前融合および融合と表される）の間で立体構造を区別するために電子顕微鏡写真を使用することができる。リポソーム会合アッセイにより、融合前立体構造を融合（融合後）立体構造と区別することもできる。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前のまたは融合のフォームのいずれか一方では存在するが他方のフォームでは存在しない立体構造エピトープを特異的に認識する抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、融合前立体構造と融合立体構造とを区別することができる。そのような立体構造エピトープは、分子の表面上の抗原決定基の選択的露出に起因することができる。また、立体構造エピトープは、直鎖状のポリペプチドにおいてアミノ酸を非連続的に並べることにより生じることができる。
【００１０】
[010]  Ｆ前駆体が２箇所の部位（部位Ｉ、残基１０９位の後、および部位ＩＩ、残基１３６位の後）で切断されることが既に示されており、両方ともフューリン様プロテアーゼによって認識されるモチーフが先行している。部位ＩＩは融合ペプチドに隣接しており、両部位でのＦタンパク質の切断が膜融合に必要である（Gonzalez-Reyes他, 2001, PNAS 98（17）: 9859〜9864）。両部位での切断が完了したときに円錐形ロッドからロリポップ形ロッドへの移行があると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[011]  本明細書に記載したように、本発明者らは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造に対して特定の修飾が行われる場合、驚くことに融合（F）タンパク質の高レベルの発現を実現することができることを発見した。そのような修飾はまた、宿主細胞におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞毒性を予想外にも低減させる。さらに、本発明の修飾Ｆタンパク質は、融合前の「ロッド」形態に対して融合後の「ロリポップ」形態を呈する能力の向上を示す。そのため、一態様において、本発明の修飾Ｆタンパク質は、野生型Ｆタンパク質と比べて免疫原性の向上を呈することもできる。この修飾は、ＲＳＶの治療および／または予防のためのワクチンの開発ならびに前記ワクチンの使用方法への重要な応用を有する。本発明は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて発現の増加、細胞毒性の低減および／または免疫原性特性の増強を示す組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[012]  一態様において、本発明は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて修飾されたまたは変異したアミノ酸配列を含む組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供する。通常、この修飾または変異は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて、発現を増加させ、細胞毒性を低減させ、および／またはＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性特性を増強する。特定の例示的実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質はヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質である。
【００１３】
[013]  ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば配列番号２に例示される）と比べて修飾されたまたは変異したアミノ酸配列を好ましくは含む。一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＰ１０２位に対応するアミノ酸で修飾または変異を含有する。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＩ３７９位に対応するアミノ酸で修飾または変異を含有する。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＭ４４７位に対応するアミノ酸で修飾または変異を含有する。
【００１４】
[014]  一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、前記位置に対応するアミノ酸で２個以上の修飾または変異を含有する。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、前記位置に対応するアミノ酸で３個の修飾または変異を含有する。
【００１５】
[015]  一つの具体的実施形態において、本発明は、１０２位でプロリンがアラニンに置き換えられているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。別の具体的実施形態において、本発明は、３７９位でイソロイシンがバリンに置き換えられているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。さらに別の具体的実施形態において、本発明は、４４７位でメチオニンがバリンに置き換えられているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。特定の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的実施形態に記載した位置に対応するアミノ酸で２個以上の修飾または変異を含有する。特定の他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的実施形態に記載した位置に対応するアミノ酸で３個の修飾または変異を含有する。ある例示的実施形態において、ＲＳＶタンパク質は、配列番号４に記載したアミノ酸配列を有する。
【００１６】
[016]  一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のコード配列は、適切な宿主細胞においてその発現を増強するためにさらに最適化される。一実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。ある例示的実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００１７】
[017]  一実施形態において、コドン最適化ＲＳＶ  Ｆ遺伝子のコード配列は配列番号３である。別の実施形態において、コドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号４に記載したアミノ酸配列を有する。
【００１８】
[018]  一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、Ｆ２の潜在的(cryptic)ポリ（A）部位において少なくとも１個の修飾をさらに含む。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、一次切断部位（CS）で１個または複数個のアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）またはコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３３位に対応するアミノ酸で修飾または変異を含有する。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）またはコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３５位に対応するアミノ酸で修飾または変異を含有する。さらに別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）またはコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３６位に対応するアミノ酸で修飾または変異を含有する。
【００１９】
[019]  一つの具体的実施形態において、本発明は、１３３位でアルギニンがグルタミンに置き換えられているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。別の具体的実施形態において、本発明は、１３５位でアルギニンがグルタミンに置き換えられているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。さらに別の具体的実施形態において、本発明は、１３６位でアルギニンがグルタミンに置き換えられているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。特定の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的実施形態に記載した位置に対応するアミノ酸で２個以上の修飾または変異を含有する。特定の他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的実施形態に記載した位置に対応するアミノ酸で３個の修飾または変異を含有する。ある例示的実施形態において、ＲＳＶタンパク質は、配列番号６に記載したアミノ酸配列を有する。
【００２０】
[020]  別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号２、配列番号４および配列番号６のアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分に欠失をさらに含む。ある例示的実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号８に記載したアミノ酸配列を有する。ある代替実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１０に記載したアミノ酸配列を有する。
【００２１】
[021]  本発明の範囲内にはヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）以外のＲＳＶ  Ｆタンパク質がさらに含まれており、該ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、前記したものに対応する改変を含有する。そのようなＲＳＶ  Ｆタンパク質として、ヒトＲＳＶのＡ株、ヒトＲＳＶのＢ株、ウシＲＳＶの株およびトリＲＳＶの株に由来するＲＳＶ  Ｆタンパク質を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２２】
[022]  いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２で示したもの等の野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて宿主細胞における発現の増加を示す、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。他の実施形態において、本発明は、配列番号２で示したもの等の野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて宿主細胞における細胞毒性の低減を示す、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、配列番号２で示したもの等の野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて免疫原性特性の増強を示す、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。
【００２３】
[023]  さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載した１種または複数の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、１種または複数の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質から構成されるミセル（例えばRSV  Fミセル）を提供する。
【００２４】
[024]  別の実施形態において、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むウイルス様粒子（VLP）を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、１種または複数の別のタンパク質をさらに含む。
【００２５】
[025]  一実施形態において、ＶＬＰはマトリックス（M）タンパク質をさらに含む。一実施形態において、Ｍタンパク質はＲＳＶのヒト株に由来する。別の実施形態において、Ｍタンパク質はＲＳＶのウシ株に由来する。他の実施形態において、マトリックスタンパク質はインフルエンザウイルス株由来のＭ１タンパク質であることができる。一実施形態において、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザウイルス株である。他の実施形態において、Ｍタンパク質はニューカッスル病ウイルス（NDV）株に由来することができる。
【００２６】
[026]  さらなる実施形態において、ＶＬＰはＲＳＶ糖タンパク質Ｇをさらに含む。別の実施形態において、ＶＬＰはＲＳＶ糖タンパク質ＳＨをさらに含む。さらに別の実施形態において、ＶＬＰはＲＳＶヌクレオカプシドＮタンパク質をさらに含む。
【００２７】
[027]  修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をＲＳＶ感染の予防および／または治療に使用することができる。そのため、別の態様において、本発明はＲＳＶに対する免疫応答の誘発方法を提供する。本方法は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有する組成物の免疫学的有効量をヒト対象または動物対象等の対象に投与することを含む。
【００２８】
[028]  別の態様において、本発明は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を提供する。
【００２９】
[029]  一実施形態において、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１種の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態において、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１種の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。
【００３０】
[030]  別の実施形態において、本発明は、本発明のワクチン製剤の１種または複数の成分が充填された１個または複数個の容器を含む医薬パックまたは医薬キットを提供する。
【００３１】
[031]  別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に対して感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫を誘導するワクチン組成物または抗原組成物の製剤化方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの有効用量を製剤に添加することを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、感染はＲＳＶ感染である。
【００３２】
[032]  本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、感染病原体に対する免疫または実質的な免疫をもたらす免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。そのため、一実施形態において、本発明は、対象における感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を提供する。
【００３３】
[033]  さらに別の態様において、本発明は、対象におけるＲＳＶウイルス感染または少なくとも１種の疾患症状に対する実質的な免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
[034]  本発明の組成物は、脊椎動物（例えばヒト）に投与されると、脊椎動物において実質的な免疫を誘導することができる。そのため、一実施形態において、本発明は、対象おけるＲＳＶウイルス感染または少なくとも１種の疾患症状に対する実質的な免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＲＳＶに対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの防御誘導量を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
[035]  別の実施形態において、本発明は、対象における感染またはその少なくとも１種の症状に対する防御抗体応答の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。
【００３６】
[036]  別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する防御細胞性応答の誘導方法であって、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する防御細胞性応答の誘導方法であって、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する防御細胞性応答の誘導方法であって、ＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含み、ＶＬＰが修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む、方法を含む。
【００３７】
[037]  さらに別の態様において、本発明は、本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。ある例示的実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９から成る群から選択される。
【００３８】
[038]  さらに別の態様において、本発明は、本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。ある例示的実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９から成る群から選択される。
【００３９】
[039]  さらに別の態様において、本発明は、本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。ある例示的実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９から成る群から選択される。一実施形態において、ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００４０】
[040]  さらに別の態様において、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の作製方法であって、（a）本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を発現させるために宿主細胞を形質転換すること、および（b）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生を促す条件下で前記宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９から成る群から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むバキュロウイルスベクターがトランスフェクトされた昆虫細胞である。
【００４１】
[041]  さらに別の態様において、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルの作製方法であって、（a）本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を発現させるために宿主細胞を形質転換させること、および（b）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルの産生を促す条件下で前記宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９から成る群から選択される。一実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。ある例示的実施形態において、宿主細胞は、本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むバキュロウイルスベクターがトランスフェクトされた昆虫細胞である。
【００４２】
[042]  一態様において、本発明はＲＳＶ融合表面糖タンパク質（F）ナノ粒子ワクチンに関する。一実施形態において、ワクチンは完全長Ｆタンパク質を含む。さらなる実施形態において、完全長Ｆタンパク質は、ジスルフィド連結したＦ１三量体およびＦ２三量体に切断される。一実施形態において、Ｆ１三量体およびＦ２三量体は、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの直径を有するミセル中に存在する。
【００４３】
[043]  別の態様において、本発明のワクチンにより生成される抗体が提供される。
【００４４】
[044]  さらに別の態様において、必要とする対象にワクチン接種する方法が提供される。一実施形態において、本方法は、組み換えＲＳＶ融合糖タンパク質（F）ナノ粒子ワクチンを対象に投与することを含む。さらなる実施形態において、ナノ粒子ワクチンは完全長Ｆタンパク質を含む。さらなる実施形態において、完全長Ｆタンパク質は、ジスルフィド連結したＦ１三量体およびＦ２三量体に切断される。一実施形態において、Ｆ１三量体およびＦ２三量体は、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの直径を有するミセル中に存在する。
【００４５】
[045]  一実施形態において、本発明のワクチンは、５μｇ、１５μｇ、３０μｇおよび６０μｇから成る群から選択される用量で投与される。
【００４６】
[046]  別の態様において、必要とする対象にワクチン接種する方法が提供される。一実施形態において、本方法は、完全長Ｆタンパク質およびアジュバントを含む組み換えＲＳＶ融合糖タンパク質（F）ナノ粒子ワクチンを対象に投与することを含む。さらなる実施形態において、アジュバントはミョウバン(alum)である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】[047]図１は、野生型ＨＲＳＶ  Ｆ０タンパク質ならびに一次切断部位（配列番号３２）および二次切断部位（配列番号３３）の構造を示す。
【図２】[048]図２は、配列番号２８（KKQKQQ）、配列番号２９（GRRQQR）、配列番号３０（RAQQ）および配列番号３１（KKQKRQ）に対応する、実施例３に記載した切断部位変異を有する修飾ＲＳＶ  Ｆ０タンパク質の構造を示す。
【図３】[049]図３は、修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃５４１（配列番号６）の一次切断部位における保存的置換（R133Q、R135QおよびR136Q）を示す。
【図４】[050]図４は、修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃５４１（配列番号６）の配列および構造を示す。
【図５】[051]図５は、修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２（配列番号１０）の配列および構造を示す。
【図６】[052]図６は、βＭＥの存在下または不存在下における精製組み換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。
【図７Ａ】[053]図７Ａは、ＲＳＶ  Ｆ融合ドメイン変異体のウエスタンブロット分析を示す。
【図７Ｂ−Ｄ】図７Ｂは、ＲＳＶ  Ｆ融合ドメイン変異体の細胞表面ＲＳＶ  Ｆタンパク質免疫染色を示す。図７Ｃは、修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（配列番号８）の構造を示す。図７Ｄは、親クローンＢＶ＃５４１（Δ0）と、融合ドメインにおいてΔ２、Δ４、Δ６、Δ８、Δ１０（BV#683）、Δ１２、Δ１４、Δ１６およびΔ１８欠失を有する変異体とを示す。ＢＶ＃５４１は、融合ドメインのアミノ酸配列が配列番号６の１３７〜１５４位を含むタンパク質を含む。欠失変異体の融合ドメイン部分のアミノ酸配列は、配列番号６の１３９〜１５４位（Δ2）、配列番号６の１４１〜１５４位（Δ4）、配列番号６の１４３〜１５４位（Δ6）、配列番号６の１４５〜１５４位（Δ8）、配列番号６の１４７〜１５４位（Δ10、BV#683）、配列番号６の１４９〜１５４位（Δ12）、配列番号６の１５１〜１５４位（Δ14）、または配列番号６の１５３〜１５４位（Δ16）を含む。配列番号６の１３７〜１５４位に対応する融合ドメイン全体は、Δ１８欠失を有する変異体において欠失している。
【図８】[054]図８は、βＭＥの存在下または不存在下における精製組み換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２およびＢＶ＃６８３のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左側）およびこれらの構造を示す。
【図９】[055]図９は、βＭＥの存在下または不存在下における精製組み換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左側）およびウエスタンブロット（右側）分析を示す。
【図１０】[056]図１０は、精製組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３の走査デンシトメトリー（左側）およびウエスタンブロット（右側）による純度分析で使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。
【図１１】[057]図１１は、ネガティブ染色電子顕微鏡で撮影した精製組み換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３ミセル（ロゼット）の像を示す。
【図１２】[058]図１２Ａは、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。図１２Ｂは、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３のサイズ排除ＨＰＬＣ分析を示す。図１２Ｃは、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３ミセルの粒径分析を示す。
【図１３】[059]図１３は、粗細胞培養採取物（細胞内）中の、または３０％スクロース勾配分離によるペレット試料中の、ＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現したまたは共発現していない修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２およびＢＶ＃６２３（配列番号２１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左側）およびウエスタンブロット（右側）分析と、ＢＶ＃６２２およびＢＶ＃６２３の構造とを示す。
【図１４】[060]図１４は、粗細胞培養採取物（細胞内）試料中における、ＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現したまたは共発現していない修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２、ダブルタンデムキメラＢＶ＃６３６（BV #541＋BRSV M）、ＢＶ＃６８３、ＢＶ＃６８４（YIAL L−ドメインを有するBV #541）ならびにＢＶ＃６８５（YKKL L−ドメインを有するBV #541）のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左側）およびウエスタンブロット（右側）分析と、分析した各修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造とを示す。
【図１５】[061]図１５は、３０％スクロース勾配分離によるペレット試料中における、ＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現したまたは共発現していない修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２（配列番号１０）、ダブルタンデムキメラＢＶ＃６３６（BV #541＋BRSV M）、ＢＶ＃６８３（配列番号８）、ＢＶ＃６８４（YIAL L−ドメインを有するBV #541）ならびにＢＶ＃６８５（YKKL L−ドメインを有するBV #541）のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左側）およびウエスタンブロット（右側）分析と、分析した各修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造とを示す。
【図１６Ａ】[062]図１６Ａは、実施例９に記載の各修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する構造、クローン名、説明、ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーの結果と、結論とを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、実施例９に記載の各修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する構造、クローン名、説明、ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーの結果と、結論とを示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、実施例９に記載の各修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する構造、クローン名、説明、ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーの結果と、結論とを示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、実施例９に記載の各修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する構造、クローン名、説明、ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーの結果と、結論とを示す。
【図１７】[063]図１７は、実施例１０に記載のＲＳＶ抗原投与(challenge)試験の実験手順を示す。
【図１８】[064]図１８は、ＰＢＳ、生ＲＳＶ、ＦＩ−ＲＳＶ、ＰＦＰ１μｇ、ＰＦＰ１μｇ＋ミョウバン、ＰＦＰ１０μｇ、ＰＦＰ１０μｇ＋ミョウバン、ＰＦＰ３０μｇ、および陽性対照（抗Fヒツジ）で免疫したマウスの３１日目および４６日目でのＲＳＶ中和アッセイの結果を示す。
【図１９】[065]図１９は、感染性ＲＳＶを抗原投与した後４日目における、ＰＢＳ、生ＲＳＶ、ＦＩ−ＲＳＶ、ＰＦＰ１μｇ、ＰＦＰ１μｇ＋ミョウバン、ＰＦＰ１０μｇ、ＰＦＰ１０μｇ＋ミョウバン、およびＰＦＰ３０μｇで免疫したマウスの肺組織におけるＲＳＶ力価を示す。
【図２０】[066]図２０は、２〜８℃で０、１、２、４および５週にわたって保存した精製組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３のクーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】[067]図２１は、生ＲＳＶ（RSV）、ホルマリン不活性化ＲＳＶ（FI-RSV）、アルミニウムを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（PFPおよびPFP＋アルミニウムアジュバント）ならびにＰＢＳ対照による免疫後のＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂ中和抗体応答を示す。
【図２２】[068]図２２は、生ＲＳＶ、ホルマリン不活性化ＲＳＶ（FI-RSV）、アルミニウムを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（F−ミセル（３０μｇ）およびF−ミセル（３０μｇ）＋アルミニウムアジュバント）ならびにＰＢＳ対照で免疫したラットにおいてＲＳＶを抗原投与した後の肺病理を示す。
【図２３】[069]図２３は、コットンラットにおけるＲＳＶ  Ａに対する中和抗体応答（y軸、Log2力価として表される）対様々なワクチン接種処理群（x軸）を示すグラフである。各群の線は、１００％中和したエンドポイント力価の幾何学的平均である。
【図２４】[070]図２４は、コットンラットにおけるＲＳＶ  Ａに対する中和抗体応答（y軸、Log2力価として表される）対様々なワクチン接種処理群（x軸）を示すグラフである。各群の線は、１００％中和したエンドポイント力価の幾何学的平均である。
【図２５】[071]図２５は、コットンラットの肺ウイルス力価（log10pfu／組織（グラム）として表される）対様々なワクチン接種処理群（x軸）を示すグラフである。ウイルス力価は±ＳＥＭで示されている。
【図２６Ａ−Ｂ】[072]図２６Ａは、ＥＬＩＳＡ単位対ワクチン接種群を示すグラフであり、ＲＳＶ  Ｆワクチン、ＦＩ−ＲＳＶ、生ＲＳＶまたはＰＢＳで処理した動物における抗体産生に関する量を示す。図２６Ｂは、ＲＳＶ−Ｆ  ＩｇＧ力価により測定した各ワクチン群における抗体産生を示すグラフである。
【図２６Ｃ−Ｄ】図２６Ｃは、各ワクチン接種群におけるＲＳＶに対する血清中和抗体力価を示すグラフである。図２６Ｄは、各ワクチン接種群からプールした血清由来のパリビズマブ競合ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【図２７】[073]図２７は、本発明のナノ粒子ワクチンで処理し、その後ＲＳＶを抗原投与した後のラットから摘出した肺組織の代表的な顕微鏡写真である。
【図２８】[074]図２８は、パリビズマブエピトープ（配列番号３５）と本発明のワクチンによって産生された抗体との間の結合競合を示すグラフである。
【図２９】[075]図２９Ａは、様々な濃度のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）ｍＡＢのパリビズマブエピトープペプチドへの結合を示すグラフである。図２９Ｂは、様々な濃度のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の組み換えＲＳＶ  Ｆミセルへの結合を示すグラフである。
【図３０】[076]図３０は、本発明のナノ粒子ワクチンの免疫原性を試験するために行った様々なアッセイのスキームを示す。
【図３１】[077]図３１は、本発明のワクチンで処理した対象由来のヒト血清を使用するＥＬＩＳＡ試験の結果を示すグラフである。
【図３２】[078]図３２は、本発明のワクチンで処理した対象由来のヒト血清中で検出した抗ＲＳＶ  Ｆ（A）および抗ＲＳＶ  Ｇ（B）ＩｇＧを示すグラフである。
【図３３】[079]図３３は、ミョウバン処理群に関する抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧレベルにおける幾何学的平均増加倍数を示すグラフである。
【図３４】[080]図３４は、本発明のナノ粒子ワクチンによる処理前後での様々な時点における対象に関するプラーク減少中和力価を示すグラフである。
【図３５】[081]図３５は、プラセボおよび３０μｇ＋ミョウバン群における０日目、３０日目、および６０日目のＰＲＮＴに関する逆累積分布を示す。
【図３６】[082]図３６Ａは、ＲＳＶ  Ｆに関してヒト血清中における抗体の結合活性を評価するために利用したＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲベース抗原結合アッセイ（BIAcore SPR-based antigen binding assay）に関する陽性アッセイ対照を示す。図３６Ｂは、陽性対照パリビズマブと比較した０日目およびプラセボ対照由来の血清に関するセンサーグラムを示す。
【図３７】[083]図３７は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲベース抗原結合アッセイを使用して測定した、パリビズマブとワクチン群からの代表的な試料とに関する結合曲線を示す。
【図３８】[084]図３８は、様々な処理群に関する（１）抗Ｆ  ＩｇＧ（左側のバー）および（２）ＭＮ（右側のバー）の両方の抗体力価レベルにおける幾何学的平均増加を示すグラフである。
【図３９】[085]図３９は、様々な投与量でＲＳＶナノ粒子ワクチンを投与した患者における抗体幾何学的平均力価（GMT）を示すグラフである。抗体応答は、抗原部位ＩＩペプチド２５４〜２７８位に対するものである。
【図４０Ａ】[086]図４０Ａは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ナノ粒子ワクチンにより生成された抗体がパリビズマブと競合することを示すグラフである。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、全てのワクチン群における１回目の服用後および２回目の服用後のパリビズマブ競合抗体を示すグラフである。
【図４１】[087]図４１は、パリビズマブ競合アッセイの結果を示すグラフである。結果は、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン誘導抗体がパリビズマブ結合部位を競合する抗体と関連することを示す。
【図４２】[088]図４２は、示したモノクローナル抗体のＲＳＶ  Ｆ結合力価と、完全長ＲＳＶ  Ｆ抗原に対する各モノクローナル抗体に関する抗体認識部位とを示す。
【図４３】[089]図４３は、ＦＩ−ＲＳＶ、アジュバントを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン、または生ＲＳＶで免疫したコットンラット由来の血清中における免疫後０日目、２８日目および４９日目での抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである。
【図４４】[090]図４４は、ＦＩ−ＲＳＶ、アジュバントを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン、または生ＲＳＶによるコットンラットの免疫化後０日目、２８日目および４９日目での中和抗体応答を示すグラフである。
【図４５】[091]図４５は、ＦＩ−ＲＳＶ、アジュバントを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン、または生ＲＳＶで免疫したコットンラット由来の血清中における融合阻害力価を示すグラフである。
【図４６】[092]図４６は、ＦＩ−ＲＳＶ、アジュバントを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン、または生ＲＳＶで免疫したコットンラット由来の血清中における競合ＥＬＩＳＡ力価を示すグラフである。
【図４７】[093]図４７は、ＦＩ−ＲＳＶ、アジュバントを伴うまたは伴わないＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン、または生ＲＳＶで免疫したコットンラット由来の血清中における、示した中和ＲＳＶ  Ｆ特異的モノクローナル抗体と競合するワクチン誘導抗体の力価を示す。
【図４８】ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンによる免疫化によって誘導された抗ＲＳＶ抗体の結合活性を、ＦＩ−ＲＳＶによる免疫化によって誘導された抗ＲＳＶ抗体の結合活性と比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
[094]  本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は、製剤中の特定の免疫原（例えば修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、または修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLP）と組み合わされて使用される場合に、得られる免疫応答を増強させる、または改変するもしくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾として、抗体応答および細胞性免疫応答の一方または両方の特異性の強化または拡大が挙げられる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低下または抑制も意味することができる。
【００４９】
[095]  本明細書で使用する場合、用語「抗原製剤」または「抗原組成物」は、脊椎動物、特に鳥または哺乳動物に投与される場合に、免疫応答を誘導することができる調製物を指す。
【００５０】
[096]  本明細書で使用する場合、用語「トリインフルエンザウイルス」は、主として鳥類で発見されるが、ヒトまたは他の動物にも感染する可能性があるインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、トリインフルエンザウイルスは、ヒトからヒトへと感染するまたは伝播する可能性がある。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザの大流行を引き起こす可能性、即ちヒトにおける罹患および／または大量死をもたらす可能性を有する。大流行は、新型インフルエンザウイルス（ヒトが自然免疫を有していないウイルス）が現れると起こり、個々の地域を越えて伝播し、場合によっては世界中に伝播し、多くのヒトに同時に感染する。
【００５１】
[097]  本明細書で使用する場合、「有効用量」は概して、免疫を誘導し、感染を予防しおよび／または改善し、または感染もしくは疾患の少なくとも１種の症状を軽減し、ならびに／あるいは修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの別の用量の効果を向上させるのに十分な、本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指す。有効用量は、感染または疾患の発症を遅らせるまたは最小限に抑えるのに十分な、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指すことができる。有効用量はまた、感染または疾患の治療または管理において治療効果を発揮する、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルまたは修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指すこともできる。さらに、有効用量は、単独で、または他の治療との組合せで感染または疾患の治療または管理において治療効果を発揮する、本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰに関する量である。有効用量はまた、感染病原体または疾患への次の暴露に対する対象（例えばヒト）自体の免疫応答を増強させるのに十分な量であることもできる。例えば中和分泌および／または血清抗体の量を例えばプラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイもしくはマイクロ中和アッセイにより測定することによって、または細胞性応答、例えばこれらに限定されないが細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞および／または他の細胞性応答を測定することによって、免疫レベルをモニタリングすることができる。例えば、蛍光フローサイトメトリーまたはＴ細胞アッセイ、例えばこれらに限定されないがＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ、ＴＥＴＲＡＭＥＲアッセイおよび／またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより特異的マーカーを使用して例えばＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の存在量を測定することにより、Ｔ細胞応答をモニタリングすることができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防し、および／または症状の重症度を軽減する用量である。
【００５２】
[098]  本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指す。組成物の有効量は、選択された結果を実現する量であり、そのような量は、当業者により通常の実験として決定することができよう。例えば、感染を予防し、治療し、および／または改善するための有効量は、本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰへの暴露時に免疫系の活性化を引き起こし、それにより抗原特異的な免疫応答を生じさせるのに必要な量であろう。本用語はまた、「十分な量」と同義語でもある。
【００５３】
[099]  本明細書で使用する場合、用語「発現」は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞または生物が選択される場合にはｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。本発明の文脈において、本用語はまた、ＲＳＶ  Ｆ遺伝子ｍＲＮＡおよびその発現後に得られるＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生も包含する。
【００５４】
[0100]  本明細書で使用する場合、用語「Ｆタンパク質」もしくは「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質ポリペプチド」もしくは「融合タンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。同様に、用語「Ｇタンパク質」または「Ｇタンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶ付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。多くのＲＳＶ融合タンパク質およびＲＳＶ付着タンパク質が説明されており、当業者に公知である。その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１１４１４９号パンフレットは、例示的なＦタンパク質バリアントおよびＧタンパク質バリアント（例えば、天然に発生するバリアント）を詳説する。
【００５５】
[0101]  本明細書で使用する場合、用語「免疫原」または「抗体」は、免疫応答の誘発能を有する物質、例えばタンパク質、ペプチドおよび核酸を指す。両方の用語はまたエピトープも包含し、同義的に使用される。
【００５６】
[0102]  本明細書で使用する場合、用語「免疫刺激剤」は、身体自体の化学的メッセンジャー（サイトカイン）を介した免疫応答を増強する化合物を指す。これらの分子は、免疫刺激性、免疫賦活性および炎症誘発活性を有する様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、例えばインターフェロン（IFN-γ）、インターロイキン（例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13）；成長因子（例えば顆粒球マクロファージ（GM）コロニー刺激因子（CSF））；および他の免疫刺激分子、例えばマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等を含む。免疫刺激分子を本発明のＶＬＰと同じ製剤で投与することができ、または別々に投与することができる。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果を生じさせることができる。
【００５７】
[0103]  本明細書で使用する場合、用語「免疫原性製剤」は、脊椎動物、例えば哺乳動物に投与されると免疫応答を誘導することができる調製物を指す。
【００５８】
[0104]  本明細書で使用する場合、用語「感染病原体」は、脊椎動物に感染を引き起こす微生物を指す。通常、生物はウイルス、細菌、寄生生物、原性動物および／または真菌である。
【００５９】
[0105]  本明細書で使用する場合、用語「変異した」、「修飾された」、「変異」または「修飾」は、改変された核酸またはポリペプチドをもたらす核酸および／またはポリペプチドの任意の修飾を示す。変異として、例えば、遺伝子のタンパク質コード領域内に生じる改変、およびタンパク質コード配列の外側の領域、例えばこれらに限定されないが調節配列またはプロモーター配列における改変を含む、ポリヌクレオチドにおける単一のまたは複数の残基の点変異、欠失または挿入が挙げられる。遺伝子改変は、任意のタイプの変異であることができる。例えば、変異は、遺伝子の一部または全ての点変異、フレームシフト変異、挿入または欠失を構成することができる。いくつかの実施形態において、変異は天然に生じる。他の実施形態において、変異は人工的な変異圧の結果である。さらに他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質における変異は遺伝子操作の結果である。
【００６０】
[0106]  本明細書で使用する場合、用語「多価」は、感染病原体または疾患の複数のタイプもしくは株に対する１種または複数の抗原タンパク質／ペプチドまたは免疫原を有する組成物を指す。
【００６１】
[0107]  本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容されるワクチン」は、本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含有する製剤を指し、該製剤は、脊椎動物に投与可能なフォームであり、感染もしくは疾患を予防するおよび／または改善するために、ならびに／あるいは感染もしくは疾患の少なくとも１種の症状を軽減するために、ならびに／あるいは別の用量の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの効果を増強するために免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する。典型的には、ワクチンは従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含み、これらに本発明の組成物が懸濁されるか、または溶解される。このフォームにおいて、本発明の組成物を感染の予防、改善または治療に都合よく使用することができる。宿主への導入時に、ワクチンは免疫応答を誘発させることができ、免疫応答として、抗体および／またはサイトカインの産生、ならびに／あるいは細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化および／または他の細胞性応答が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
[0108]  本明細書で使用する場合、語句「防御免疫応答」または「防御応答」は、脊椎動物（例えばヒト）が呈する、感染病原体または疾患に対して抗体により媒介される免疫応答を指し、該免疫応答は、感染を予防しもしくは改善し、または感染の少なくとも１種の疾患症状を軽減する。本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰは、例えば感染病原体を中和し、感染病原体の細胞への侵入を阻止し、感染病原体の複製を阻止し、ならびに／あるいは宿主細胞を感染および破壊から保護する抗体の産生を刺激することができる。本用語はまた、脊椎動物（例えばヒト）が呈する、感染病原体または疾患に対するＴリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答を指すこともでき、該免疫応答は、感染もしくは疾患を予防しもしくは改善し、または感染もしくは疾患の少なくとも１種の症状を軽減する。
【００６３】
[0109]  本明細書で使用する場合、用語「脊椎動物」または「対象」もしくは「患者」は脊索動物亜門（subphylum cordata）の任意のメンバーを指し、脊索動物亜門としてヒトおよび他の霊長類が挙げられるがこれらに限定されず、霊長類として非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種が挙げられる。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ等の家畜；イヌおよびネコ等の家畜化された哺乳動物；マウス、ラット（コットンラットを含む）およびモルモット等のげっ歯動物を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウ等の家禽、野鳥および狩猟鳥を含む鳥類等も非限定的な例である。用語「哺乳動物」および「動物」はこの定義に含まれる。成人および新生児の両方の個体が包含されることが意図されている。特に、乳児および幼児は、ＲＳＶワクチンに適した対象または患者である。
【００６４】
[0110]  本明細書で使用する場合、用語「ウイルス様粒子」（VLP）は、少なくとも１種の特質がウイルスに類似しているが、伝染性であると実証されていない構造体を指す。本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を有していない。通常、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠いており、従って非伝染性である。さらに、ウイルス様粒子を異種発現により大量に産生して容易に精製することができることが多い。
【００６５】
[0111]  本明細書で使用する場合、用語「キメラＶＬＰ」は、少なくとも２種の異なる感染病原体由来のタンパク質（異種タンパク質）またはその一部を含有するＶＬＰを指す。通常、タンパク質の内の１種は、宿主細胞からのＶＬＰの形成を駆動することができるウイルスに由来する。例示を目的とする例は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質および／またはＨＲＳＶ  ＧもしくはＦタンパク質である。用語ＲＳＶ  ＶＬＰおよびキメラＶＬＰを必要に応じて同義的に使用することができる。
【００６６】
[0112]  本明細書で使用する場合、用語「ワクチンは」、死滅したもしくは弱体化した病原体の、または病原体に対する抗体もしくは免疫の形成を誘導するために使用される派生の抗原決定基の調製物を指す。ワクチンは、疾患、例えばインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザに対する免疫をもたらすために与えられる。さらに、用語「ワクチン」はまた、脊椎動物に投与されることにより防御免疫、即ち感染に関連する疾患を予防しまたは該疾患の重症度を軽減する免疫をもたらす免疫原（例えば修飾もしくは変異RSV Fタンパク質、修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むRSV Fミセル、または修飾もしくは変異RSV Fタンパク質を含むVLP）の懸濁液または溶液も指す。本発明は、免疫原性であり、および感染に関連する疾患に対する防御をもたらすことができるワクチン組成物を提供する。
【００６７】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質
[0113]  ＲＳＶ  Ｆタンパク質および方法は、２００９年１２月９日に出願された米国特許出願第１２／６３３，９９５号（2010年9月23日に公開された米国出願公開第２０１０／０２３９６１７号）、２００８年１２月９日に出願された米国仮出願第６１／１２１，１２６号および２００９年４月１４日に出願された米国仮出願第６１／１６９，０７７号、ならびに２００９年７月１０日に出願された米国仮出願第６１／２２４，７８７号に記載されており、これらの開示はそれぞれ、全ての目的のためにそれらの全体が参照により援用される。
【００６８】
[0114]  ２種の構造膜タンパク質であるＦタンパク質およびＧタンパク質はＲＳＶの表面上で発現し、中和抗体の標的であることが示されている（Sullender, W., 2000, Clinical Microbiology Review 13, 1〜15）。これらの２種のタンパク質はまた、ウイルス認識および標的細胞への侵入にも主として関与しており、Ｇタンパク質は特定の細胞受容体に結合し、Ｆタンパク質はウイルスと細胞との融合を促進する。Ｆタンパク質はまた、感染細胞の表面上でも発現し、合胞体の形成をもたらす他の細胞とのその後の融合に関与する。そのため、Ｆタンパク質に対する抗体は、ウイルスを中和し、もしくはウイルスの細胞への侵入を阻止し、または合胞体の形成を防止することができる。ＡサブタイプとＢサブタイプとの間の抗原性および構造の違いがＧタンパク質およびＦタンパク質の両方に関して記載されているが、Ｇタンパク質にはより顕著な抗原性の違いが存在し、アミノ酸配列は５３％のみが相同であり、抗原関連性は５％である（Walsh他,（1987）J. Infect. Dis. 155, 1198〜1204; および Johnson他（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5625〜5629）。逆に、Ｆタンパク質に対して生じる抗体は、サブタイプＡウイルスとサブタイプＢウイルスとの間で高度な交差反応性を示す。
【００６９】
[0115]  ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ビリオンのエンベロープタンパク質と宿主細胞の細胞膜との間の融合によりＲＳＶの侵入を導く。感染後期では、細胞表面上で発現したＦタンパク質は隣接細胞との融合を媒介して合胞体を形成することができる。Ｆタンパク質は、Ｎ末端が切断されたシグナルペプチドおよびＣ末端付近の膜アンカーを有するＩ型膜貫通表面タンパク質である。ＲＳＶ  Ｆは、会合してホモ三量体となる不活性Ｆ０前駆体として合成され、細胞エンドプロテアーゼによるトランス−ゴルジ複合体における切断によって活性化されて２個のジスルフィド連結サブユニットであるＦ１サブユニットおよびＦ２サブユニットを生じる。切断により生じるＦ１サブユニットのＮ末端は、標的膜に直接挿入されて融合を開始する疎水性ドメイン（融合ペプチド）を含有する。Ｆ１サブユニットはまた、融合中に会合し、ウイルスの膜と細胞膜とをごく近接させる立体構造変化を駆動する７アミノ酸繰り返しも含有する（Collins and Crowe, 2007, Fields Virology,第5巻, D.Mipe他, Lipincott, Williams and Wilkons, 1604頁）。配列番号２（GenBank受託番号AAB59858）は代表的なＲＳＶ  Ｆタンパク質を示し、これは配列番号１（GenBank受託番号M11486）に示される遺伝子によりコードされる。
【００７０】
[0116]  天然では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＦＯと命名された５７４個のアミノ酸の長さの単一ポリペプチド前駆体として発現する。インビボでは、ＦＯは小胞体中でオリゴマー化されており、２個の保存されたフューリンコンセンサス配列（フューリン切断部位）であるＲＡＲＲ（配列番号２３）（二次）およびＫＫＲＫＲＲ（配列番号２４）（一次）においてフューリンプロテアーゼによりタンパク質分解的に処理されて２個のジスルフィド連結フラグメントから成るオリゴマーを生成する。これらのフラグメントの内の小さいものはＦ２と称されており、ＦＯ前駆体のＮ末端部分から生じる。略称ＦＯ、Ｆ１およびＦ２は通常、科学文献ではＦＯ、Ｆ１およびＦ２と命名されることを当業者は認識するであろう。大きいものであるＣ末端Ｆ１フラグメントは疎水性アミノ酸の配列を介して膜中にＦタンパク質を固定し、該疎水性アミノ酸は２４個のアミノ酸の細胞質側末端に隣接する。３個のＦ２−Ｆ１二量体が会合して成熟Ｆタンパク質を形成し、成熟Ｆタンパク質は、標的細胞膜との接触時に立体構造変化を受ける契機となる準安定な前融合性（「融合前」）構造をとる。この構造変化により、融合ペプチドとして知られている疎水性配列が露出し、該疎水性配列が宿主細胞膜と会合してウイルスまたは感染細胞の膜と標的細胞膜との融合を促進する。
【００７１】
[0117]  Ｆ１フラグメントは少なくとも２個の７アミノ酸繰り返しドメインを含有し、これらはＨＲＡおよびＨＲＢと命名されており、それぞれ融合ペプチドおよび膜貫通アンカードメインの近傍に位置する。融合前の立体構造において、Ｆ２−Ｆ１二量体は球状ヘッドおよびストーク構造を形成し、ＨＲＡドメインは球状ヘッドにおける分割型（伸長型）立体構造中にある。一方、ＨＲＢドメインは、ヘッド領域から伸びる三本鎖コイルドコイルストークを形成する。融合前の立体構造から融合後の立体構造への移行の間、ＨＲＡドメインが崩壊し、ＨＲＢドメインに近接して逆平行の６個のヘリックス束が形成される。融合後の状態において、融合ペプチドおよび膜貫通ドメインが並置されて膜融合が促進される。
【００７２】
[0118]  前述した立体構造の説明は結晶学的データの分子モデリングに基づいているが、融合前の立体構造と融合後の立体構造との間の構造上の差異を、結晶学を用いることなくモニタリングすることができる。例えば、技術的教示を目的として参照により本明細書に援用されるＣａｉｄｅｒ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１：１２２〜１３１（２０００）およびＭｏｒｔｏｎ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１１：２７５〜２８８で実証されているように、電子顕微鏡写真を使用して融合前（または前融合型と命名する）の立体構造と融合後（または融合型と命名する）の立体構造とを区別することができる。また、技術的教示を目的として参照により本明細書に援用されるＣｏｎｎｏｌｌｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１７９０３〜１７９０８（２００６）で説明されているように、リポソーム会合アッセイによって融合前の立体構造を融合型（融合後）立体構造から区別することもできる。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前フォームまたは融合型フォームの一方には存在するが他方のフォームには存在しない立体構造エピトープを特異的に認識する抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、融合前の立体構造と融合型立体構造を区別することができる。そのような立体構造エピトープは、分子表面上の抗原決定基の選択的露出に起因することができる。また、立体構造エピトープは、直鎖状ポリペプチド中において非連続的であるアミノ酸の並置により生ずることができる。
【００７３】
修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質
[0119]  本発明者らは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造に対して特定の修飾が行われる場合、驚くことに融合（F）タンパク質の高レベルの発現を実現することができることを発見した。そのような修飾はまた、宿主細胞におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞毒性を予想外にも低減させる。さらに、本発明の修飾Ｆタンパク質は、融合前の「ロッド」形態に対して融合後の「ロリポップ」形態を呈する能力の向上を示す。そのため、一態様において、本発明の修飾Ｆタンパク質はまた、野生型Ｆタンパク質（例えば配列番号２で例示され、GenBank受託番号AAB59858に対応する）と比べて免疫原性の改善（例えば増強）を呈することもできる。この修飾は、ＲＳＶの治療および／または予防のためのワクチンの開発および前記ワクチンの使用方法への重要な応用を有する。
【００７４】
[0120]  本発明に従って、天然のまたは野生型のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対して任意の数の変異を行うことができ、好ましい態様において、複数の変異を行うことにより天然のまたは野生型のＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて発現および／免疫原性特性の改善をもたらすことができる。そのような変異として、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が挙げられ、１個または複数個（例えば１個、２個、３個または４個等）の変異が好ましい。
【００７５】
[0121]  天然Ｆタンパク質ポリペプチドをＲＳＶ  Ａ株、ＲＳＶ  Ｂ株、ＨＲＳＶ  Ａ株、ＨＳＲＶ  Ｂ株、ＢＲＳＶ株もしくはトリＲＳＶ株の任意のＦタンパク質から選択することができ、または（前記に定義したように）それらのバリアントから選択することができる。特定の例示的実施形態において、天然Ｆタンパク質ポリペプチドは、配列番号２（GenBank受託番号AAB59858）で表されるＦタンパク質である。本開示の理解を促進するために、全てのアミノ酸残基の位置は、株にかかわらず、例示的Ｆタンパク質のアミノ酸の位置に対して示される（即ち、アミノ酸残基の位置は例示的Ｆタンパク質のアミノ酸の位置に対応する）。当業者は、容易に利用できて公知であるアライメントアルゴリズム（例えばデフォルトパラメータを使用するBLAST等）を使用して、選択されたＲＳＶ株のアミノ酸配列と例示的配列のアミノ酸配列とを整列させることにより、他のＲＳＶ株由来のＦタンパク質の比較アミノ酸の位置を容易に決定することができる。様々なＲＳＶ株由来のＦタンパク質ポリペプチドの多くの別の例が国際公開第２００８／１１４１４９号パンフレット（これはその全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。別のバリアントが遺伝的浮動によって生じることができ、または部位特異的なもしくはランダムの変異誘発を使用して、または２種以上の既存のバリアントの組み換えにより、別のバリアントを人工的に産生することができる。そのような別のバリアントはまた、本明細書に開示した修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の文脈においても好適である。
【００７６】
[0122]  当業者に既知の任意の方法論を使用して本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質に変異を導入することができる。例えば二価金属イオン補因子としてのマンガンの存在下でＰＣＲ反応を行うことにより、変異をランダムに導入することができる。また、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、コードするＤＮＡ分子に沿った任意の特定部位における全ての可能なクラスの塩基対変化を可能にする変異体または修飾ＦＳＶ  Ｆタンパク質を作成することができる。通常、この技術は、目的のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする一本鎖ヌクレオチド配列と（１個または複数個のミスマッチを除いて）相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングを含む。次に、ミスマッチしたオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、一方の鎖の配列中に所望の変化を含有する二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。配列での変化は、例えば、アミノ酸の欠失、置換または挿入をもたらすことができる。次に、二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入することができ、このようにして変異体または修飾ポリペプチドを産生することができる。前述のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を、例えばＰＣＲにより行うことができる。
【００７７】
別のＲＳＶタンパク質
[0123]  本発明はまた、ＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の疾患症状から脊椎動物（例えばヒト）を防御するためにワクチンまたは抗原製剤に製剤化することができる修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）も包含する。いくつかの実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰは、Ｍ、Ｎ、ＧおよびＳＨ等の別のＲＳＶタンパク質をさらに含む。他の実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰは、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡ、ＮＡおよびＭ１等のウイルスの異種株由来のタンパク質をさらに含む。一実施形態において、インフルエンザウイルスタンパク質Ｍ１は、トリインフルエンザウイルス株に由来する。
【００７８】
[0124]  ＲＳＶ  Ｎタンパク質は、ゲノムＲＮＡおよび複製中間体である抗ゲノムＲＮＡ（replicative intermediate anti-genomic RNA）の両方に緊密に結合してＲＮＡｓｅ抵抗性ヌクレオカプシドを形成する。配列番号１６（野生型）および配列番号１８（コドン最適化）はＲＳＶ  Ｎタンパク質の代表的なアミノ酸配列を示し、配列番号１５（野生型）および配列番号１７（コドン最適化）はＲＳＶ  Ｎタンパク質をコードする代表的な核酸配列を示す。本発明には、配列番号１８と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるＲＳＶ  Ｎタンパク質、ならびにその全てのフラグメントおよびバリアント（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００７９】
[0125]  ＲＳＶ  Ｍタンパク質は、ウイルスの形態形成中にＲＳＶ  Ｆタンパク質および他の因子と相互作用する細胞膜に堆積する非グリコシル化内在性ビリオンタンパク質である。特定の好ましい実施形態において、ＲＳＶ  Ｍタンパク質はウシＲＳＶ（BRSV）  Ｍタンパク質である。配列番号１２（野生型）および配列番号１４（コドン最適化）はＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の代表的なアミノ酸配列を示し、配列番号１１（野生型）および配列番号１３（コドン最適化）はＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をコードする代表的な核酸配列を示す。本発明には、配列番号１２および配列番号１４と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるＲＳＶ（BRSVを含むがこれに限定されない）  Ｍタンパク質、ならびにその全てのフラグメントおよびバリアント（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００８０】
[0126]  ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、切断されていないシグナルペプチドおよび膜アンカーの両方として機能する単一の疎水性領域をＮ末端の近傍に有し、分子のＣ末端の３分の２が外部に向いた状態であるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＲＳＶ  Ｇはまた、ＯＲＦにおける２番目のＡＵＧでの（ほぼアミノ酸４８位における）翻訳開始から生じる分泌タンパク質としても発現し、ＯＲＦはシグナル／アンカー内にある。ＲＳＶ  Ｇの外部ドメインの大部分はＲＳＶ株間で極めて多岐にわたる（同上、1607頁）。配列番号２６は代表的なＲＳＶ  Ｇタンパク質を示し、該代表的ＲＳＶ  Ｇタンパク質は配列番号２５に示す遺伝子配列によってコードされる。本発明には、配列番号２６と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるＲＳＶ  Ｇタンパク質、ならびにその全てのフラグメントおよびバリアント（キメラタンパク質等）が包含される。
【００８１】
[0127]  ＲＳＶのＳＨタンパク質は、６４個のアミノ酸残基（RSV亜群A）または６５個のアミノ酸残基（RSV亜群B）を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＲＳＶ  ＳＨタンパク質がウイルス融合にまたは膜貫通性の変化に関与する可能性があることがいくつかの研究で示唆されている。しかしながら、ＳＨ遺伝子が欠けているＲＳＶは生存可能であり、合胞体形成を引き起こし、野生型ウイルスと同じように成長しており、このことはＳＨタンパク質がウイルスの宿主細胞への侵入または合胞体形成に必須ではないことを示している。ＲＳＶのＳＨタンパク質は、ＴＮＦ−αシグナル伝達を阻害する能力が示されている。配列番号２７は、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質の代表的アミノ酸配列を示す。本発明には、配列番号２７と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ならびにその全てのフラグメントおよびバリアント（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００８２】
ＲＳＶワクチン
[0128]  現在、ＲＳＶ疾患の予防に対して唯一認可された手法は受動免疫法である。ＩｇＧに関する防御的役割を示唆する初期の証拠は、フェレット（Prince, G. A,, Ph.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975）およびヒト（Lambrecht他,（1976）J. Infect. Dis. 134, 211〜217; および Glezen他（1981）J. Pediatr. 98,708〜715）における移行抗体に関する観察から得られた。Hemming他（Morell他, eds., 1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London 285〜294頁）は、新生児敗血症を有することが疑われる新生児における静注免疫ブロブリン（IVIG）の薬物動態に関する研究中に、ＲＳＶ感染の治療または予防にＲＳＶ抗体が有用である可能性を認識した。彼らは、気道分泌物からＲＳＶが得られる１例の幼児がＩＶＩＧ注入後に急速に回復したことに気付いた。その後のＩＶＩＧロットの分析からＲＳＶ中和抗体の著しく高い力価が明らかになった。この同じ研究者グループは次いで、ＲＳＶ中和抗体用に濃縮された高度免疫血清または免疫グロブリンのコットンラットおよび霊長類をＲＳＶ感染から防御する能力を調べた（Prince他,（1985）Virus Res. 3, 193〜206; Prince他（1990）J. Virol. 64, 3091〜3092）。これらの研究の結果は、予防的に投与されたＲＳＶ中和抗体がコットンラットにおけるＲＳＶの気道での複製を阻害することを示唆した。治療的に投与される場合、ＲＳＶ抗体は、コットンラットおよび非ヒト霊長類モデルの両方で肺でのウイルス複製を低減した。さらに、免疫血清または免疫グロブリンの受動注入は、その後にＲＳＶが抗原投与されたコットンラットにおいて肺病理の亢進を引き起こさなかった。
【００８３】
[0129]  脊椎動物に中和抗体を与えることによりＲＳＶ感染を予防することができることから、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むワクチンは、脊椎動物に投与される場合にインビトロで中和抗体を誘導することができる。修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ感染の予防および／または治療に好適に使用される。そのため、本開示の別の態様は、ＲＳＶに対する免疫応答の誘発方法に関する。本方法は、対象（ヒト対象または動物対象等）に修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有する組成物の免疫学的有効量を投与することを含む。組成物の免疫学的有効量の投与により、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に存在するエピトープに特異的な免疫応答が誘発される。そのような免疫応答として、Ｂ細胞応答（例えば中和抗体の産生）および／またはＴ細胞応答（例えばサイトカインの産生）を挙げることができる。好ましくは、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質により誘発される免疫応答は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に存在する少なくとも１個の立体構造エピトープに特異的である要素を含む。一実施形態において、免疫応答は、「ロリポップ」融合後活性状態で見られるＲＳＶ  Ｆタンパク質に存在するエピトープに特異的である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質および組成物を、ＲＳＶとの接触後にウイルス性疾患を亢進させることなく対象に投与することができる。好ましくは、本明細書に開示した修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質および好適に製剤化された免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減しもしくは予防し、および／またはＲＳＶによる感染後の病理学的応答を軽減しもしくは予防するＴｈ１バイアス免疫応答を誘発する。
【００８４】
[0130]  一実施形態において、本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ミセル（例えばロゼット）のフォームで見られる。本発明に従って得られるミセルは、ロゼット様構造を有する免疫原性的に活性のＦスパイクタンパク質の凝集体から成る。ロゼットを電子顕微鏡で見ることができる（Calder他, 2000, Virology 271 : 122〜131）。好ましくは、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む本発明のミセルは、融合後の活性状態を示す「ロリポップ」形態を呈する。一実施形態において、ミセルは宿主細胞中での発現後に精製される。対象に投与される場合、本発明のミセルは、好ましくは中和抗体を誘導する。いくつかの実施形態において、ミセルをアジュバントと共に投与することができる。他の実施形態において、アジュバントなしにミセルを投与することができる。
【００８５】
[0131]  別の実施形態において、本発明は、ＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の疾患症状から脊椎動物（例えばヒト）を保護するためのワクチンまたは抗原製剤に製剤化することができる修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶウイルス様粒子（VLP）を包含する。本発明はまた、宿主細胞中にトランスフェクトされるとＲＳＶタンパク質を含むウイルス様粒子（VLP）を産生することができる、ＲＳＶウイルスの様々な株に由来する野生型および変異ＲＳＶ遺伝子またはこれらの組合せを含むＲＳＶ  ＶＬＰおよびベクターにも関する。
【００８６】
[0132]  いくつかの実施形態において、ＲＳＶウイルス様粒子は、少なくとも１種のウイルスマトリックスタンパク質（例えばRSV  Mタンパク質）をさらに含むことができる。一実施形態において、Ｍタンパク質はＲＳＶのヒト株に由来する。別の実施形態において、Ｍタンパク質はＲＳＶのウシ株に由来する。他の実施形態において、マトリックスタンパク質は、インフルエンザウイルスの株に由来するＭ１タンパク質である。一実施形態において、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザ株である。好ましい実施形態において、トリインフルエンザ株はＨ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５である。他の実施形態において、マトリックスタンパク質はニューカッスル病ウイルス（NDV）由来であることができる。
【００８７】
[0133]  いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むことができる。一実施形態において、Ｇタンパク質はＨＲＳＶ  Ａ群に由来することができる。別の実施形態において、Ｇタンパク質はＨＲＳＶ  Ｂ群に由来することができる。さらに他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｇは、ＨＲＳＶ  Ａ群および／またはＢ群に由来することができる。
【００８８】
[0134]  いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むことができる。一実施形態において、ＳＨタンパク質はＨＲＳＶ  Ａ群に由来することができる。別の実施形態において、ＳＨタンパク質はＨＲＳＶ  Ｂ群に由来することができる。さらに他の実施形態において、ＲＳＶ  ＳＨは、ＨＲＳＶ  Ａ群および／またはＢ群に由来することができる。
【００８９】
[0135]  いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むことができる。一実施形態において、Ｎタンパク質はＨＲＳＶ  Ａ群に由来することができる。別の実施形態において、Ｎタンパク質はＨＲＳＶ  Ｂ群に由来することができる。さらに他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｎは、ＨＲＳＶ  Ａ群および／またはＢ群に由来することができる。
【００９０】
[0136]  さらなる実施形態において、本発明のＶＬＰは、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）のような１種または複数の異種免疫原を含むことができる。
【００９１】
[0137]  いくつかの実施形態において、本発明は、１種または複数のＶＬＰにおける、同一および／または異なる株由来の異なるＲＳＶ  Ｍ、Ｆ、Ｎ、ＳＨ、および／またはＧタンパク質の組み合わせも含む。さらに、ＶＬＰは、免疫応答の増強のための、１種または複数のさらなる分子を含むことができる。
【００９２】
[0138]  本発明の他の実施形態において、ＲＳＶ  ＶＬＰは、核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、化学療法剤、造影剤および／または患者に送達する必要がある他の薬剤のような薬剤を含むことができる。
【００９３】
[0139]  本発明のＶＬＰは、ワクチンおよび免疫原性組成物の調製に有用である。ＶＬＰの一つの重要な特徴は、脊椎動物の免疫系が目的のタンパク質に対する免疫応答を誘導するように目的の表面タンパク質を発現させる能力である。しかしながら、全てのタンパク質がＶＬＰの表面上で発現することができるとは限らない。特定のタンパク質がＶＬＰの表面上で発現しない、または発現しにくい多くの理由がある可能性がある。理由の一つは、タンパク質が宿主細胞の膜を対象としないこと、またはタンパク質が膜貫通ドメインを有していないことである。例えば、インフルエンザ血球凝集素のカルボキシ末端付近の配列は、成熟インフルエンザエンベロープを有するヌクレオカプシドの脂質二重層へのＨＡの取り込みに重要であり、インフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ１とのＨＡ三量体相互作用の組み立てに重要である可能性がある（Ali他,（2000）J. Virol. 74, 8709〜19）。
【００９４】
[0140]  そのため、本発明の一実施形態は、ＲＳＶ由来の修飾または変異Ｆタンパク質と、通常は細胞表面上で効率的に発現しない、または正常なＲＳＶタンパク質ではない少なくとも１種の免疫原とを含むキメラＶＬＰを含む。一実施形態において、修飾または変異ＦＳＶ  Ｆタンパク質は、目的の免疫原と融合することができる。別の実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、異種ウイルス表面膜タンパク質、例えばＭＭＴＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を介して免疫原と結合する。
【００９５】
[0141]  本発明の他のキメラＶＬＰは、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、異種感染病原体由来の少なくとも１種のタンパク質とを含むＶＬＰを含む。異種感染病原体の例として、ウイルス、細菌、原性動物、真菌および／または寄生生物が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、別の感染病原体由来の免疫原は異種ウイルスタンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のタンパク質はエンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、別の異種感染病原体由来のタンパク質はＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む。一実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と共発現する。別の実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質は修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合する。別の実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質の一部のみが修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合する。別の実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質の一部のみが修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の一部と融合する。別の実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合する別の感染病原体由来のタンパク質の一部がＶＬＰの表面上で発現する。
【００９６】
[0142]  本発明はまた、本発明のＶＬＰ上または該ＶＬＰ内で発現するタンパク質のバリアントも包含する。バリアントは、構成タンパク質のアミノ酸配列における改変を含有することができる。タンパク質に関連する用語「バリアント」は、参照配列に対して１個または複数個のアミノ酸により改変されているアミノ酸配列を指す。バリアントは「保存的な」変化を有することができ、置換されたアミノ酸は同様の構造的特性または化学的特性を有しており、例えばイソロイシンによるロイシンの置き換えである。また、バリアントは「非保存的な」変化を有することができ、例えばトリプトファンによるグリシンの置き換えである。類似の小さな変形として、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方を挙げることもできる。生物学的活性または免疫学的活性を失うことなくアミノ酸残基が置換され、挿入され、または欠失されることができるかの判断における指針を、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して見出すことができる。
【００９７】
[0143]  天然のバリアントは、タンパク質における変異に起因して生じることができる。この変異は、感染病原体、例えばインフルエンザの個々の群内の抗原性のばらつきをもたらすことができる。そのため、例えばインフルエンザ株に感染したヒトは該ウイルスに対する抗体を作り、新しいウイルス株が現れると古い株に対する抗体はもはや新しいウイルスを認識せず、再感染が起こる可能性がある。本発明は、ＶＬＰを作製するための感染病原体由来のタンパク質の全ての抗原性のおよび遺伝的なばらつきを包含する。
【００９８】
[0144]  クローニング、変異、細胞培養等の、本発明に適用可能である分子細胞生物学的技術を説明する一般的なテキストとして、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（Berger）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００（「Sambrook」）ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（「Ausubel」）が挙げられる。これらのテキストは、変異誘発、ベクターの使用、プロモーターならびに例えばＲＳＶのＦ分子および／またはＧ分子のクローニングおよび変異導入等に関連する多くの他の関連トピックを説明する。そのため、本発明はまた、本発明のＶＬＰ上または該ＶＬＰ中で発現するタンパク質の特性を改善するまたは改変するためのタンパク質工学および組み換えＤＮＡ技術の既知の方法の使用も包含する。様々なタイプの変異を使用して、タンパク質分子をコードするバリアント核酸を産生しおよび／または単離し、ならびに／あるいは本発明のＶＬＰ中または該ＶＬＰ上でタンパク質をさらに修飾する／変異させることができる。これには、部位特異的なランダム点変異誘発、相同組み換え（DNA混合）、ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡ（gapped duplex DNA）等を使用する変異誘発が挙げられるがこれらに限定されない。別の好適な方法として、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物に関する変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態において、変異誘発を、天然に存在する分子、または改変されたもしくは変異した天然に存在する分子の既知の情報、例えば配列、配列比較、物理的特性、結晶構造等により導くことができる。
【００９９】
[0145]  本発明は、実質的な生物活性を示し、例えば本発明のＶＬＰ上または該ＶＬＰ中で発現する場合に有効な抗体応答を誘発することができるタンパク質バリアントをさらに含む。そのようなバリアントとして、活性にほとんど影響を及ぼさないように当技術分野で既知の通則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復および置換が挙げられる。
【０１００】
[0146]  タンパク質のクローニング方法は当技術分野で既知である。例えば、ＲＳＶウイルスに感染している細胞から抽出したポリアデニル化ｍＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにより、特定のＲＳＶタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。得られた生成物遺伝子をベクターにＤＮＡインサートしてクローニングすることができる。用語「ベクター」は、核酸を増幅させることができ、および／または生物、細胞もしくは細胞成分間で移動させることができる手段を指す。ベクターとして、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等が挙げられ、これらは自己複製するか、または宿主細胞の染色体に組み込まれることができる。ベクターはまた、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡとＲＮＡとの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリジン接合ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド接合ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム接合ＤＮＡ等であることもでき、これらは自己複製しない。全てではないが多くの共通する実施形態において、本発明のベクターはプラスミドまたはバクミドである。
【０１０１】
[0147]  そのため、本発明は、本発明のＶＬＰの形成を誘導する細胞中で発現することができる発現ベクター中にクローニングされた、キメラ分子等のタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、取り込んだ核酸の発現および複製を促進することができるプラスミド等のベクターである。典型的には、発現させる核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「作動可能に連結され」ており、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御を受ける。一実施形態において、ヌクレオチドは、（前述したように）修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする。別の実施形態において、ベクターは、Ｍおよび／またはＧ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、Ｍおよび／またはＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、Ｍ、Ｇおよび／またはＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質および／またはＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質および／またはＧタンパク質あるいはインフルエンザ  ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ヌクレオチドは、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＲＳＶ  Ｇタンパク質をインフルエンザ  ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質と共にコードする。別の実施形態において、発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【０１０２】
[0148]  本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、サイレント置換、付加または欠失を生じるがコードされたタンパク質の特性もしくは活性またはタンパク質の構成のされ方を変えることがない改変を含有する変異を含むことができる。様々な理由、例えば特定の宿主に対してコドンの発現を最適化する（ヒトmRNAにおけるコドンをSf9細胞等の昆虫細胞によって好ましいコドンに変化させる）ことによってヌクレオチドバリアントを産生することができる。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０１１８１９１号を参照。
【０１０３】
[0149]  さらに、ヌクレオチドを配列決定することにより、正しいコード領域がクローニングされたことおよびいなかる不要な変異も含有しないことを確実にすることができる。任意の細胞中で発現させるための発現ベクター（例えばバキュロウイルス）にヌクレオチドをサブクローニングすることができる。前記はＲＳＶウイルスタンパク質をクローニングすることができる方法の一例にすぎない。当業者は、別の方法を利用することができ、および別の方法が可能であることを理解する。
【０１０４】
[0150]  本発明はまた、Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部、および／または前記任意のキメラ分子を含むＲＳＶ構造遺伝子をコードするＲＳＶヌクレオチドを含む構築物および／またはベクターも提供する。ベクターは、例えばファージベクター、プラスミドスベクター、ウイルススベクターまたはレトロウイルスベクターであることができる。Ｆ、Ｍ，Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部および／または前記任意のキメラ分子を含むＲＳＶ構造遺伝子を含む構築物および／またはベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結されなければならず、ＡｃＭＮＰＶポリへドリンプロモーター（または他のバキュロウイルス）、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（E. coli）ｌａｃ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター等が非限定的な例である。他の好適なプロモーターは、宿主細胞および／または所望の発現率に応じて当業者に既知であることができる。発現構築物は、転写開始部位、終結部位、および転写領域中における翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。好ましくは、構築物によって発現した転写産物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの始端に翻訳開始コドンを含み、終端に適切に位置決めされた終止コドンを含むことができる。
【０１０５】
[0151]  発現ベクターは、好ましくは少なくとも１種の選択可能なマーカーを含むことができる。そのようなマーカーとして、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８耐性またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌での培養用のテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。ベクターの中で好ましいのは、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーン痘ウイルス、豚痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えばイヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルス等のウイルスベクターである。本発明により使用することができる他のベクターは、細菌中で使用するベクターを含み、該ベクターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。好ましい真核ベクターの中には、ｐＦａｓｔＢａｃ１  ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧならびにｐＳＶＬがある。他の好適なベクターは当業者に容易に明らかであろう。一実施形態において、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆ遺伝子ならびにＭ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部および／または前記任意のキメラ分子の遺伝子を含む、ＲＳＶ遺伝子をコードするヌクレオチドを含むベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃである。
【０１０６】
[0152]  前述の組み換え構築物を使用してトランスフェクト、感染、または形質転換させることができ、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質および少なくとも１種の免疫原を含むＲＳＶタンパク質を発現させることができる。一実施形態において、組み換え構築物は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部、および／または前記任意の分子を真核細胞および／または原核細胞中に含む。そのため、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆ；および限定されないがＲＳＶ  Ｇ、ＮもしくはＳＨまたはその一部等の少なくとも１種の免疫原、ならびに／または前記任意の分子を含むＲＳＶ構造遺伝子をコードする核酸を含有するベクター（または複数のベクター）を含み、ならびにＶＬＰを形成可能な条件下で宿主細胞中においてＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ、ＭもしくはＳＨまたはその一部、および／または前記任意の分子を含む遺伝子を発現させることができる宿主細胞を提供する。
【０１０７】
[0153]  真核宿主細胞の中には、酵母、昆虫、鳥類、植物、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（または線虫）および哺乳動物の宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定的な例は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Sf）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）細胞、例えばＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞およびショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）（Ｋ．ラクチス（K. lactis））、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）およびＣ．グラブラタ（C. glabrata）を含むカンジダ（Candida）種、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（S.ポンベ（S. pombe））、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）である。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞ならびにアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＶｅｒｏおよびＨｅｐ−２細胞である。アフリカツメガエル卵母細胞または両生類起源の他の細胞も使用することができる。原核宿主細胞の例として、細菌細胞、例えば、大腸菌、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）およびマイコバクテリアが挙げられる。
【０１０８】
[0154]  ベクター、例えば、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質；および限定されないがＲＳＶ  Ｇ、ＮもしくはＳＨまたはその一部を含む少なくとも１種の免疫原および／または前記任意のキメラ分子のポリヌクレオチドを含むベクターを、当技術分野で既知の方法に従って宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクションおよびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションにより、真核細胞に核酸を導入することができる。一実施形態において、ベクターは組み換えバキュロウイルスである。別の実施形態において、組み換えバキュロウイルスは真核細胞中にトランスフェクトされる。好ましい実施形態において、細胞は昆虫細胞である。別の実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【０１０９】
[0155]  本発明はまた、ＶＬＰ産生の効率を高めることができる構築物および方法も提供する。例えば、ＲＳＶ  Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部、および／または前記任意のキメラ分子もしくは異種分子に対してリーダー配列を付加することにより、細胞中におけるタンパク質輸送の効率を向上させることができる。例えば、異種シグナル配列をＦ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部、および／または前記任意のキメラ分子もしくは異種分子と融合させることができる。一実施形態において、シグナル配列を昆虫細胞の遺伝子から得ることができ、該シグナル配列をＭ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部、および／または前記任意のキメラ分子もしくは異種分子と融合させることができる。別の実施形態において、シグナルペプチドはキチナーゼシグナル配列であり、該キチナーゼシグナル配列はバキュロウイルス発現系において効率的に機能する。
【０１１０】
[0156]  ＶＬＰ産生の効率を高める別の方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部、および／または前記任意のキメラ分子もしくは異種分子を含むＲＳＶをコードするヌクレオチドのコドンを特定の細胞型に対して最適化することである。Ｓｆ９細胞における発現のためにコドンを最適化した核酸の例は、配列番号３、５、７、９、１３、１７、１９および２５を参照。
【０１１１】
[0157]  本発明はまた、ＶＬＰの産生方法であって、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、ＲＳＶ  Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部および／または前記任意のキメラ分子もしくは異種分子を含むがこれらに限定されない少なくとも１種の別のタンパク質とを含むＲＳＶ遺伝子を、ＶＬＰを形成可能な条件下で発現させることを含む方法も提供する。選択された発現系および宿主細胞に応じて、ＶＬＰは、組み換えタンパク質が発現してＶＬＰが形成される条件下で発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。一実施形態において、本発明は、ＶＬＰの産生方法であって、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするベクターを適切な宿主細胞中にトランスフェクトすること、およびＶＬＰを形成可能な条件下で修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現させることを含む方法を提供する。別の実施形態において、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類または哺乳動物の細胞からなる群から選択される。適切な成長条件の選択は、当技術分野の技術または当技術分野の通常の技術者の範囲内である。
【０１１２】
[0158]  本発明のＶＬＰを産生するように操作された細胞を成長させる方法として、回分、流加、連続および灌流細胞培養技術が挙げられるがこれらに限定されない。細胞培養は、細胞が増殖して精製および単離用のタンパク質（例えば組み換えタンパク質）を発現するバイオリアクタ（発酵チャンバ）中における細胞の成長および増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクタ中における無菌、制御された温度および気圧の条件下で実施される。バイオリアクタは、温度、気圧、撹拌および／またはｐＨ等の環境条件をモニタリングすることができる、細胞を培養するために使用されるチャンバである。一実施形態において、バイオリアクタはステンレス鋼チャンバである。別の実施形態において、バイオリアクタは、予め滅菌したプラスチック袋（例えばCellbag（登録商標）、Wave Biotech、Bridgewater、NJ）である。他の実施形態において、予め滅菌したプラスチック袋は、約５０Ｌ〜１０００Ｌの袋である。
【０１１３】
[0159]  次に、ＶＬＰは、その完全性を保つ方法を使用して、例えば勾配遠心分離、例えば塩化セシウム、スクロースおよびイオジキサノールならびに例えばイオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術により単離される。
【０１１４】
[0160]  以下は、本発明のＶＬＰを作製し、単離し、および精製することができる方法の例である。通常、ＶＬＰは、細胞が細胞培養液（前記参照）中で成長するとＶＬＰを作成するように操作された組み換え細胞株から産生される。本発明のＶＬＰの作製および精製に利用することができる別の方法があり、そのため本発明は記載した方法に限定されないことを当業者は理解するだろう。
【０１１５】
[0161]  本発明のＶＬＰの産生を、Ｓｆ９細胞（非感染）を振とうフラスコ中に播種し、細胞の成長および増殖に伴い（例えば１２５ｍｌのフラスコから５０ＬのWaveバッグに）細胞を増殖してスケールアップさせることにより開始することができる。細胞を成長させるために使用される培地は、適切な細胞株用に配合される（好ましくは無血清培地、例えば昆虫培地ExCe11-420、JRH）。次に、最も効率的な感染多重度（例えば、細胞当たり約１〜約３プラーク形成単位）で細胞に組み換えバキュロウイルスを感染させる。感染が起こると、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部分、および／または前記任意のキメラ分子もしくは異種分子がウイルスゲノムから発現され、ＶＬＰ内に自己組織化し、感染の約２４〜７２時間後に細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が成長の対数期中期（４〜８×１０６個の細胞／ｍｌ）である際に最も効率的であり、少なくとも約９０％が生存可能である。
【０１１６】
[0162]  細胞培養培地中のＶＬＰのレベルがほぼ最大であるが広範な細胞溶解の前である場合に、本発明のＶＬＰを感染後約４８〜９６時間で採取することができる。採取時点でのＳｆ９細胞の密度および生存率は、色素排除アッセイにより示されるように、少なくとも２０％の生存率で約０．５×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１．５×１０６個の細胞／ｍｌであることができる。次に、培地を取り出して清澄化する。培地にＮａＣｌを約０．４〜約１．０Ｍ、好ましくは約０．５Ｍの濃度まで添加してＶＬＰの凝集を回避することができる。本発明のＶＬＰを含有する細胞培養培地由来の細胞および細胞残屑の除去を、使い捨ての予め滅菌した中空糸０．５もしくは１．００μｍのフィルタカートリッジまたは同様のデバイスによるタンジェンシャルフローろ過（TFF）により達成することができる。
【０１１７】
[0163]  次に、清澄化した培養培地中のＶＬＰを、使い捨ての予め滅菌した５００，０００分子量カットオフ中空糸カートリッジを使用する限外ろ過により濃縮することができる。濃縮したＶＬＰを０．５ＭのＮａＣｌを含有する１０容量ｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に対して透析ろ過して残留培地成分を除去することができる。
【０１１８】
[0164]  濃縮して透析ろ過したＶＬＰを、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中での２０％〜６０％の不連続スクロース勾配において約４℃〜約１０℃で１８時間にわたって６，５００×ｇで遠心分離することにより、さらに精製することができる。通常、ＶＬＰは、約３０％〜約４０％スクロースにまたは（２０％および６０％のステップ勾配における）界面に、勾配から回収して保存することができる特徴的な可視バンドを形成することができる。精製プロセスにおける次の工程のために、この生成物を調製物中に２００ｍＭのＮａＣｌを含むように希釈することができる。この生成物はＶＬＰを含有し、および無傷のバキュロウイルス粒子を含有することができる。
【０１１９】
[0165]  ＶＬＰのさらなる精製を、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、または４４％等密度スクロースクッション遠心分離により達成することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配（前記参照）からの試料を、陰イオンを含む媒体（例えばMatrix Fractogel EMD TMAE）を含有するカラムに負荷し、ＶＬＰを他の混入物（例えばバキュロウイルスおよびDNA/RNA）から分離することができる塩勾配（約０．２Ｍ〜約１．０ＭのNaCl）により溶出する。スクロースクッション法では、ＶＬＰを含む試料を４４％スクロースクッションに添加し、３０，０００ｇで約１８時間にわたって遠心分離する。ＶＬＰは４４％スクロースの最上部にバンドを形成するが、バキュロウイルスは底に沈殿し、他の夾雑タンパク質は最上部の０％スクロース層に留まる。ＶＬＰのピークまたはバンドを回収する。
【０１２０】
[0166]  必要に応じて、無傷のバキュロウイルスを不活性化することができる。不活性化を、化学的な方法、例えばホルマリンまたはβ−プロピオラクトン（BPL）により達成することができる。無傷のバキュロウイルスの除去および／または不活性化を、前記に例示したように当技術分野で既知の選択的沈殿およびクロマトグラフ法を使用することにより概して達成することもできる。不活性化の方法は、ＶＬＰを含有する試料を約２５℃〜約２７℃において３時間にわたって０．２％のＢＰＬ中でインキュベートすることを含む。バキュロウイルスを、ＶＬＰを含有する試料を約３日にわたって約４℃で０．０５％のＢＰＬにおいて、次いで１時間にわたって３７℃でインキュベートすることにより不活性化することもできる。
【０１２１】
[0167]  不活性化／除去工程後、ＶＬＰを含む生成物を別の透析ろ過工程に通すことにより、不活性化工程由来の任意の試薬および／または任意の残留スクロースを除去し、およびＶＬＰを所望の緩衝液（例えばPBS）中に入れることができる。ＶＬＰを含む溶液を当技術分野で既知の方法（例えば滅菌ろ過）により滅菌して冷蔵庫または冷凍庫に保管することができる。
【０１２２】
[0168]  前記技術を様々な規模にわたって実行することができる。例えば、Ｔ型フラスコ、振とうフラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリアクタに至るまで。バイオリアクタは、ステンレス鋼タンクまたは予め滅菌したプラスチック袋（例えばWave Biotech、Bridgewater、NJから販売されるシステム）のいずれかを含むことができる。当業者は、この目的に最も望ましいものが何であるかを分かるであろう。
【０１２３】
[0169]  バキュロウイルス発現ベクターの増殖および産生、ならびに組み換えバキュロウイルスの細胞への感染による組み換えＲＳＶ  ＶＬＰの産生を、昆虫細胞において、例えば前述したＳｆ９昆虫細胞において達成することができる。一実施形態において、細胞は、ＲＳＶ  ＶＬＰを産生するように操作された組み換えバキュロウイルスに感染したＳＦ９である。
【０１２４】
医薬製剤またはワクチン製剤および投与
[0170]  本明細書で有用な医薬組成物は、任意の適切な希釈剤または賦形剤を含む薬学的に許容される担体であって、それ自体が組成物を投与される脊椎動物に有害な免疫応答の発生を誘導しない任意の薬剤を含み、過度の毒性なしに投与されることができる担体と、本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰとを含有する。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されていること、または哺乳動物、特にヒトでの使用に関してＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａもしくは別の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン組成物および／または抗原組成物として有用であることができる。
【０１２５】
[0171]  本発明は、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、ＲＳＶ  Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨもしくはその一部および／または前述した任意のキメラ分子もしくは異種原子を含むがこれらに限定されない少なくとも１種の別のタンパク質とを含むＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を包含する。一実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１種の別の免疫原とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１種のＲＳＶ  Ｍタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１種のＢＲＳＶ  Ｍタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１種のインフルエンザＭ１タンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１種の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１種のトリインフルエンザＭ１タンパク質とを含むＶＬＰを含む。
【０１２６】
[0172]  別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶまたはトリＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むがこれらに限定されないＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶまたはトリＲＳＶ  Ｎタンパク質を含むがこれらに限定されないＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶまたはトリＲＳＶ  ＳＨタンパク質を含むがこれらに限定されないＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。
【０１２７】
[0173]  別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ  Ｍと、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／またはＲＳＶ由来のＧ、ＨもしくはＳＨタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡまたはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰ等のキメラＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を包含し、ＨＡまたはＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。
【０１２８】
[0174]  本発明はまた、前述した修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物も包含する。
【０１２９】
[0175]  一実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１種の別のタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、例えばＢＲＳＶ  Ｍタンパク質であるがこれに限定されないＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＨＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むがこれに限定されないＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶまたはトリＲＳＶ  Ｎタンパク質を含むがこれらに限定されないＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶまたはトリＲＳＶ  ＳＨタンパク質を含むがこれらに限定されないＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と、ＨＲＳＶ  Ａ群由来のＦおよび／またはＧタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来のＦおよび／またはＧタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質とを含むＶＬＰ等のキメラＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を包含し、Ｍタンパク質はインフルエンザＨＡタンパク質と融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ  Ｍと、ＲＳＶ由来のキメラＦおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質とを含むＶＬＰ等のキメラＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を包含し、キメラインフルエンザＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＳＲＶ  Ｍと、ＲＳＶ由来のキメラＦおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡまたはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰ等のキメラＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を包含し、ＨＡまたはＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。
【０１３０】
[0176]  本発明はまた、少なくとも１種のＲＳＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物も包含する。一実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、異種感染病原体または罹患細胞由来の少なくとも１種の免疫原とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、異種感染病原体由来の免疫原はウイルスタンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、ＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む。
【０１３１】
[0177]  本発明はまたヒト対象等の脊椎動物を免疫するためのキットであって、少なくとも１種のＲＳＶタンパク質を含むＶＬＰを含むキットも包含する。一実施形態において、キットは、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む。一実施形態において、キットは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質等のＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、キットはＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質とを含むＶＬＰを含むキットを包含し、Ｍタンパク質はＢＲＳＶ  Ｍと融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質と、異種感染病原体由来の免疫原とを含むＶＬＰを含むキットを包含する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質とを含むＶＬＰを含むキットを包含し、ＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  ＦまたはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡまたはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを含むキットを包含し、ＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。
【０１３２】
[0178]  一実施形態において、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１種の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態において、本発明は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１種の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、前述した修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。
【０１３３】
[0179]  本発明の免疫原性製剤は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。薬学的に許容される担体として、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される担体、希釈剤および他の賦形剤に関する十分な議論がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Mack Pub. Co. N.J.現行版）に示されている。製剤は投与方法に適合していなければならない。好ましい実施形態において、製剤はヒトへの投与に適しており、好ましくは無菌であり、非粒子状であり、および／または非発熱性である。
【０１３４】
[0180]  組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。組成物は、再構成に適した凍結乾燥粉末等の固体状、液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、または粉末であることができる。経口製剤は、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。
【０１３５】
[0181]  本発明はまた、本発明のワクチン製剤の１種または複数の成分が充填された１個または複数個の容器を含む医薬パックまたは医薬キットも提供する。好ましい実施形態において、キットは２個の容器を含み、一方は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含有し、他方はアジュバントを含有する。そのような容器（単数または複数）は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定される形式の注記を伴うことができ、該注記は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売についての機関による承認を反映する。
【０１３６】
[0182]  本発明はまた、組成物の量を示すアンプルまたは小袋等の密封容器中にパッケージされている製剤も提供する。一実施形態において、組成物は液体として供給され、別の実施形態においては乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密封容器中に供給され、例えば水または生理食塩水により、対象への投与に適切な濃度に再構成されることができる。
【０１３７】
[0183]  代替実施形態において、組成物は、該組成物の量および濃度を示す密封容器中に液状で供給される。好ましくは、液状の組成物は、少なくとも約５０μｍ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌで密封容器中に供給される。
【０１３８】
[0184]  例として、本発明の修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むキメラＲＳＶ  ＶＬＰは、それぞれがＲＳＶの１種または複数の株に対する応答である免疫応答を刺激するのに十分な有効量または量（前記で定義した）で投与される。本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、またはＶＬＰの投与により、ＲＳＶに対する免疫が誘発される。典型的には、例えば年齢、健康状態、体重、性別、食生活、投与時間、および他の臨床学的因子に基づいて、用量をこの範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば針およびシリンジを使用する皮下もしくは筋肉注射、または無針注射器具により全身投与される。また、ワクチン製剤は、点滴剤、大粒子エアロゾル（約１０ミクロンより大きい）、または上気道中への噴霧のいずれかにより鼻腔内に投与される。前記送達経路のいずれも免疫応答を引き起こすが、鼻腔内投与は、ＲＳＶおよびインフルエンザ等の多くのウイルスの侵入部位での粘膜免疫の誘発という別の効果をもたらす。
【０１３９】
[0185]  そのため、本発明はまた、哺乳動物に感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫を誘導するワクチン組成物または抗原組成物の製剤化方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの有効用量を製剤に添加することを含む方法も含む。一実施形態において、感染はＲＳＶ感染である。
【０１４０】
[0186]  単回用量による免疫の刺激は可能であるが、同じまたは異なる経路によりさらなる投与量を投与して所望の効果を得ることができる。新生児および乳児では例えば、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回の投与が必要となる可能性がある。投与を必要に応じて小児期を通して間隔をあけて継続することにより、感染、例えばＲＳＶ感染に対する十分なレベルの防御を維持することができる。同様に、繰り返したまたは重篤な感染に特に罹り易い成人、例えばヘルスケア従事者、デイケア従事者、幼児の家族の一員、高齢者、および心肺機能が低下した個人等は、防御免疫応答を確立するためにおよび／または維持するために複数回の免疫化を必要する可能性がある。例えば、中和分泌および血清抗体の量を測定することにより、誘導される免疫のレベルをモニタリングすることができ、所望のレベルの防御を誘発して維持するために必要に応じて投与量が調節され、またはワクチン接種が繰り返された。
【０１４１】
[0187]  修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む組成物（例えばワクチン製剤および／または抗原製剤）の投与方法として、非経口投与（例えば皮内、筋肉内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば鼻腔内および経口もしくは経肺経路または坐薬により）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態において、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、または皮内に投与される。組成物を、任意の従来の経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、尿道、膀胱、および腸粘膜等）を介した吸収により投与することができ、および他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物の投与の鼻腔内経路または他の粘膜経路は、投与の他の経路よりも実質的に高い抗体または他の免疫応答を誘導することができる。別の実施形態において、本発明の組成物の投与の鼻腔内または他の粘膜経路は、ＲＳＶの他の株に対する交差防御を誘導することができる抗体または他の免疫応答を誘導することができる。投与は全身であることができ、または局所であることができる。
【０１４２】
[0188]  さらに別の実施形態において、ワクチン製剤および／または免疫原性製剤は、免疫部位で免疫応答を誘発するために、粘膜組織を標的とするような方法で投与される。例えば、特定の粘膜を標的とする特性を有するアジュバントを含有する組成物の経口投与を使用することにより、消化管関連リンパ系組織（GALT）等の粘膜組織を免疫化の標的とすることができる。鼻咽頭リンパ系組織（NALT）および気管支関連リンパ系組織（BALT）等の別の粘膜組織も標的とすることができる。
【０１４３】
[0189]  本発明のワクチン製剤および／または免疫原性製剤を、ある投与スケジュールで、例えばワクチン組成物の初回投与、それに続くブースト抗原刺激投与で投与することもできる。特定の実施形態において、組成物の第２の用量は、初回投与後２週間から１年の、好ましくは約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月〜約６カ月のどこかで投与される。また、第３の用量を第２の用量後に、および初回投与後約３カ月〜約２年またはより長く、好ましくは約４カ月、約５カ月もしくは約６カ月、または約７カ月〜約１年で投与することができる。第２の用量後に対象の血清および／または尿中において、または粘膜からの分泌物中において特定の免疫グロブリンが検出されない、または該免疫グロブリンの検出レベルが低い場合には、第３の用量を任意選択により投与することできる。好ましい実施形態において、第２の用量が第１の投与後約１カ月で投与され、第３の用量が第１の投与後約６カ月で投与される。別の実施形態において、第２の用量が第１の投与後約６カ月で投与される。別の実施形態において、本発明の組成物を併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明の組成物を、他の免疫原性組成物、抗ウイルス薬および／または抗生物質と共に製剤化することができる。
【０１４４】
[0190]  例えば、例えばウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによりまたは血清試料中もしくは尿試料中または粘膜の分泌物中の抗体の阻害率を測定ことにより予防的または治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を最初に同定することによって、当業者は医薬組成物の投与量を容易に決定することができる。投与量を動物試験から決定することができる。ワクチンの有効性を試験するために使用される動物の非限定的なリストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウスおよびコットンラットが含まれる。大部分の動物は感染病原体に対する天然宿主ではないが、それでも疾患の様々な態様の研究において機能することができる。例えば、任意の前記動物にワクチン候補、例えば本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、またはＶＬＰを投与することにより、誘導した免疫応答を部分的に特徴付けることができ、および／または任意の中和抗体が産生されたかどうかを判断することができる。例えば、マウスは小さいサイズであることから多くの研究はマウスモデルで行われており、その低費用により研究者は研究を大規模で行うことができる。
【０１４５】
[0191]  さらに、当業者はヒト臨床研究を実施してヒトに好ましい有効用量を決定することができる。そのような臨床研究はルーチンであり、当技術分野で公知である。採用される正確な用量を、投与の経路によって決めることもできる。有効用量を、インビトロでまたは動物試験系から得た用量反応曲線から推定することができる。
【０１４６】
[0192]  当技術分野で公知でもあるように、アジュバントとして既知である免疫応答の非特異的刺激剤を使用することにより、特定の組成物の免疫原性を増強させることができる。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫の全般的な増加を促進するために実験的に使用されている（例えば米国特許第４，８７７，６１１号）。免疫プロトコルは、長年にわたって応答を刺激するためにアジュバントを使用しており、そういうものとしてアジュバントは当業者に公知である。いくつかのアジュバントは、抗原の提示の仕方に影響を及ぼす。例えば、ミョウバンによりタンパク質抗原が沈殿すると免疫応答が増加する。抗原の乳化も抗原提示の継続期間を延ばす。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用されるＶｏｇｅｌ他、「Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版）」に記載されている任意のアジュバントが含まれることが、本発明の範囲内で想定される。
【０１４７】
[0193]  例示的なアジュバントとして、完全フロイントアジュバント（死滅させたマイコバクテリウムツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）を含有する免疫応答の非特異的な刺激剤）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰ等のＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（MTP-PE）、リピドＡ、ならびにモノホスホリルリピドＡ（MPL）が含まれる。細菌から抽出した３成分、即ちＭＰＬ、トレハロースジミコレート（TDM）および細胞壁骨格（CWS）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳剤中に含有するＲＩＢＩも検討される。ＭＦ−５９、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＭＨＣ抗原を使用することもできる。
【０１４８】
[0194]  本発明の一実施形態において、アジュバントは、脂質二重層がない大きな無定形の中心腔を囲む水層により分離された、実質的に球状のシェルのフォームで配置された、約２〜１０個の二重層を有する少重膜（paucilamellar）脂質小胞である。少重膜脂質小胞は、非特異的刺激剤として、抗原用の担体として、別のアジュバントの担体として、およびこれらの組合せとして、いくつかの様式で免疫応答を刺激するように作用することができる。例えば、抗原が小胞に対して細胞外に留まるように抗原を予め形成した小胞と混合することによりワクチンが調製される場合、少重膜脂質小胞は非特異的免疫刺激剤として作用する。抗原を小胞の中心腔内に封入することにより、小胞は免疫刺激剤および抗原用の担体の両方として作用する。別の実施形態において、小胞は非リン脂質小胞で主に構成される。他の実施形態において、小胞はＮｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）である。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の少重膜非リン脂質小胞である。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、Ｂｒｉｊ７２、コレステロール、オレイン酸およびスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは、インフルエンザ抗体に有効なアジュバントであることが示されている（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６２９，０２１号、米国特許第６，３８７，３７３号および米国特許第４，９１１，９２８号参照）。
【０１４９】
[0195]  本発明の組成物を「免疫刺激剤」と共に製剤化することもできる。免疫刺激剤は、免疫系の応答を増加させるための生体自体の化学的メッセンジャー（サイトカイン）である。免疫刺激剤として、免疫刺激、免疫増強および炎症性活性を有する様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、例えばインターロイキン（例えばIL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13）；成長因子（例えば顆粒球マクロファージ（GM）コロニー刺激因子（CSF））；および他の免疫刺激分子、例えばマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等が挙げられるがこれらに限定されない。免疫刺激分子を本発明の組成物と同じ製剤で投与することができ、または別々に投与することができる。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して免疫刺激効果を得ることができる。そのため、一実施形態において、本発明は、アジュバントおよび／または免疫刺激剤を含む抗原製剤およびワクチン製剤を含む。
【０１５０】
免疫応答の刺激方法
[0196]  本発明の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、またはＶＬＰは、感染病原体に対する免疫または実質的な免疫をもたらす免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫および細胞性免疫の両方が、感染病原体および疾患に対する免疫に寄与することができる。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主因子である。分泌免疫グロブリンＡ（sIgA）は上気道の防御に関与し、血清ＩｇＧは下気道の防御に関与する。感染によって誘導された免疫応答は、同じウイルスまたは抗原的に類似したウイルス株による再感染に対して防御する。例えば、ＲＳＶは頻繁で予測不可能な変化を受け、従って、自然感染後に宿主の免疫によってもたらされる防御の有効期間は、コミュニティ中で循環するウイルスの新株に対しては数年間にわたってのみ有効であることができる。
【０１５１】
[0197]  そのため、本発明は、対象における感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を包含する。一実施形態において、本方法は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と少なくとも１種の別のタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えばＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＨＲＳＶ  Ａ群および／またはＢ群由来のＦおよび／またはＧタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質またはＭＭＴＶエンベロープタンパク質、例えばインフルエンザウイルス由来のＨＡまたはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含み、ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質あるいはＭＭＴＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザウイルス由来のＨＡまたはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含み、ＨＡまたはＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、対象は哺乳動物である。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。別の実施形態において、ＲＳＶ  ＶＬＰはアジュバントまたは免疫刺激剤と共に製剤化される。
【０１５２】
[0198]  一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫の誘導方法であって、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む、対象におけるＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の疾患症状に対する免疫の誘導方法であって、ＶＬＰが修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、ＳＨおよび／またはＮタンパク質を含む方法を含む。別の実施形態において、対象におけるＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の症状に対する免疫の誘導方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含み、ＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）と、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇおよび／またはＮタンパク質とから本質的に成る。ＶＬＰは、別のＲＳＶタンパク質および／またはタンパク質夾雑物をごく僅かな濃度で含むことができる。別の実施形態において、対象におけるＲＳＶ感染またはその少なくとも１種の症状に対する免疫の誘導方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含み、ＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラMを含む）、ＲＳＶ  Ｇおよび／またはＦから成る。別の実施形態において、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する免疫の誘導方法は、ＲＳＶタンパク質を含むＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含み、ＲＳＶタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラMを含む）、Ｆ、Ｇならびに／あるいはＮタンパク質から成り、該Ｆ、Ｇならびに／あるいはＮタンパク質はキメラＦ、Ｇおよび／またはＮタンパク質を含む。これらのＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラMを含む）、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇおよび／またはＮタンパク質を含み、別の細胞成分、例えば細胞タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物等を含むことができるが、別のＲＳＶタンパク質（BRSV M（キメラMを含む）、BRSV／RSV F、Gおよび／またはNタンパク質のフラグメント以外）は含有しない。別の実施形態において、対象は脊椎動物である。一実施形態において、脊椎動物は哺乳動物である。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。別の実施形態において、本方法は、製剤を１回の服用で投与することによりＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する免疫を誘導することを含む。別の実施形態において、本方法は、製剤を複数回の服用で投与することによりＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する免疫を誘導することを含む。
【０１５３】
[0199]  組成物を適切なタンパク質投与量範囲で投与することができる。いくつかの態様において、タンパク質投与量範囲は、約１００μｇ、約８０μｇ、約６０μｇ、約３０μｇ、約１５μｇ、約１０μｇまたは約５μｇの上限を有する。別の態様において、投与量範囲は、約３０μｇ、約１５μｇ、約５μｇまたは約１μｇの下限を有する。そのため、適切な範囲として、例えば約１μｇ〜約１００μｇ、約５μｇ〜約８０μｇ、約５μｇ〜約６０μｇ、約１５μｇ〜約６０μｇ、約３０μｇ〜約６０μｇおよび約１５μｇ〜約３０μｇのタンパク質が挙げられる。
【０１５４】
[0200]  本開示にわたって使用する場合、用語「約」は表示値の±１０％を意味する。
【０１５５】
[0201]  本発明はまた、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む、感染病原体によって引き起こされた対象における感染またはその少なくとも１種の症状に対する免疫を誘導することも包含する。一実施形態において、本方法は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、異種感染病原体由来の少なくとも１種のタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含む。一実施形態において、本方法は、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、同じまたは異種の感染病原体由来の少なくとも１種のタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、異種感染病原体由来のタンパク質はウイルスタンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質はエンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質はＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質等のＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇおよび／またはＮタンパク質と会合することができる。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇおよび／またはＮタンパク質等のＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部のみが、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇおよび／またはＮタンパク質等のＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部のみが、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇおよび／またはＮタンパク質等のＲＳＶタンパク質の一部と融合する。別の実施形態において、ＲＳＶタンパク質と融合する感染病原体由来のタンパク質の一部はＶＬＰの表面上で発現する。他の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質と融合するＲＳＶタンパク質またはその一部は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質と会合する。他の実施形態において、ＲＳＶタンパク質またはその一部は、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎおよび／またはＰに由来する。別の実施形態において、キメラＶＬＰは、ＲＳＶ由来のＮおよび／またはＰタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、キメラＶＬＰは、同じおよび／または異種の感染病原体由来の複数のタンパク質を含む。別の実施形態において、キメラＶＬＰは複数の感染病原体タンパク質を含み、そのため多価ＶＬＰをもたらす。
【０１５６】
[0202]  本発明の組成物は、脊椎動物に投与される場合に、脊椎動物（例えばヒト）において実質的な免疫を誘導することができる。実質的な免疫は、脊椎動物において感染を防御しもしくは改善し、または該感染の症状を少なくとも軽減する本発明の組成物に対する免疫応答によって生じる。場合によっては、脊椎動物が感染する場合、感染は無症状であるだろう。応答は完全な防御応答ではない可能性がある。この場合、脊椎動物が感染病原体に感染している場合、脊椎動物は、非免疫脊椎動物と比べて症状の軽減または症状の持続時間の短縮を経験することができる。
【０１５７】
[0203]  一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶウイルス感染または少なくとも１種の疾患症状に対する実質的な免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、ＲＳＶに対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの防御誘導量を哺乳動物に投与することを含む方法を含む。一実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質等のＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、例えばＨＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むＶＬＰを投与することをさらに含む。別の実施形態において、本方法は、ＨＲＳＶ  Ａ群由来のＮタンパク質を含むＶＬＰを投与することをさらに含む。別の実施形態において、本方法は、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来のＮタンパク質を含むＶＬＰを投与することをさらに含む。別の実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、ＲＳＶ由来のＦおよび／またはＧタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含み、Ｆおよび／またはＧタンパク質は、Ｍタンパク質の膜貫通および細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含み、Ｆおよび／またはＧタンパク質は、インフルエンザＨＡおよび／またはＮＡタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含み、Ｆおよび／またはＧタンパク質は、ＨＡタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。別の実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質と、任意選択によりインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与することを含み、ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端と融合する。
【０１５８】
[0204]  本発明はまた、感染病原体によって引き起こされた対象における感染または少なくとも１種の疾患症状に対する実質的な免疫の誘導方法であって、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、または修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法も包含する。一実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質等のＲＳＶ  Ｍタンパク質と、別の感染病原体由来の少なくとも１種のタンパク質とをさらに含むＶＬＰを投与することを含む。一実施形態において、本方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と、同じまたは異種の感染病原体由来の少なくとも１種のタンパク質とをさらに含むＶＬＰを投与することを含む。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質はウイルスタンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質はエンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質はＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質と結合することができる。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と結合することができる。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質はＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部のみがＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部のみがＲＳＶタンパク質の一部と融合する。別の実施形態において、ＲＳＶタンパク質と融合する感染病原体由来のタンパク質の一部はＶＬＰの表面上で発現する。他の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質と融合するＲＳＶタンパク質またはその一部は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質と結合する。他の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質と融合するＲＳＶタンパク質またはその一部は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と結合する。他の実施形態において、ＲＳＶタンパク質またはその一部は、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎおよび／またはＰに由来する。別の実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ由来のＮおよび／またはＰタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、ＶＬＰは感染病原体由来の複数のタンパク質を含む。別の実施形態において、ＶＬＰは複数の感染病原体タンパク質を含み、そのため、多価ＶＬＰをもたらす。
【０１５９】
[0205]  別の実施形態において、本発明は、対象における感染またはその少なくとも１種の症状に対する防御抗体応答の誘導方法であって、前述した修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルまたは修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。
【０１６０】
[0206]  本明細書で使用する場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にまたは部分的にコードされる１種または複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それぞれ順に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は２個の同一のポリペプチド鎖対から構成されており、各対は１個の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって産生される多数の十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。
【０１６１】
[0207]  一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する防御細胞性応答の誘導方法であって、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する防御細胞性応答の誘導方法であって、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む方法を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、ＶＬＰの少なくとも１種の有効用量を投与することを含む、対象におけるＲＳＶ感染または少なくとも１種の疾患症状に対する防御細胞性応答の誘導方法であって、ＶＬＰは、前述した修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。細胞性免疫はまた、ＲＳＶ感染からの回復における役割を果たし、およびＲＳＶ関連合併症を予防することもできる。ＲＳＶ特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液中でおよび下気道の分泌物中で検出されている。ＲＳＶ感染細胞の細胞溶解は、ＲＳＶ特異的抗体および相補体と共にＣＴＬにより媒介される。一次的な細胞傷害性応答は、感染したまたはワクチン接種された個体において６〜１４日後の血液中で検出可能であり、２１日目までに消失する（Ennis他, 1981）。細胞性免疫はまた、ＲＳＶ感染からの回復において役割を果たすこともでき、およびＲＳＶ関連合併症を予防することができる。ＲＳＶ特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液中でおよび下気道の分泌物中で検出されている。
【０１６２】
[0208]  前述したように、本発明の免疫原性組成物は、対象におけるＲＳＶ感染の少なくとも１種の症状を予防しまたは軽減する。ＲＳＶの症状は当技術分野で公知である。ＲＳＶの症状として、鼻漏、咽頭炎、頭痛、嗄声、咳、喀痰、発熱、ラ音、喘鳴および呼吸困難が挙げられる。そのため、本発明の方法は、ＲＳＶ感染に関連する少なくとも１種の症状の予防または軽減を含む。例えば対象による自己評価、臨床医による評価、または例えばクオリティオブライフ評価、ＲＳＶ感染もしくは別の症状の進行遅延、ＲＳＶ症状の重症度の軽減または適切なアッセイ（例えば抗体力価および／またはT細胞活性化アッセイ）等の適切なアッセイまたは測定（例えば体温）を行うことにより、症状の軽減を主観的にまたは客観的に判定することができる。客観的な評価は、動物評価およびヒト評価の両方を含む。
【０１６３】
[0209]  限定として解釈してはならない以下の実施例により、本発明をさらに説明する。本願全体を通して引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図および配列表は、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１６４】
（実施例１）
組み換えバクミドの生成、昆虫細胞のトランスフェクションによる組み換えウイルスストックの作製、プラーク精製、および一次ウイルスストックによる昆虫細胞の感染。
[0210]  組み換えウイルスを構築するために、目的のウイルス遺伝子のコドンをＳｆ９昆虫細胞発現のために最適化し、ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ベクターにクローニングした。
【０１６５】
[0211]  所望の構築物を確認して精製した直後に、各構築物に関してＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞の１本のバイアルを氷上で解凍した。所望のｐＦａｓｔＢａｃ（商標）構築プラスミドＤＮＡ約１ｎｇ（５μｌ）を細胞に添加し、静かに混合した。細胞を３０分にわたって氷上でインキュベートした。続いて、振とうすることなく４２℃で４５秒にわたって細胞に熱ショックを与えた。次に、試験管を氷に移して２分にわたって冷却した。続いて室温Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地９００μｌを各試験管に添加した。試験管を４時間にわたって３７℃および２２５ｒｐｍで振とう機にかけた。各ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）の形質転換のために、Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地を使用して細胞の１０倍段階希釈（１０−１、１０−２および１０−３）を調製した。次に、各希釈液１００μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン７μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ１００μｇ／ｍｌおよびＩＰＴＧ４０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。プレートを３７℃で４８時間にわたってインキュベートした。白色コロニーを分析用に採取した。
【０１６６】
[0212]  各構築物用に前記から様々なバクミドＤＮＡを作製して単離した。それらのＤＮＡを沈殿させて５時間にわたってＳｆ９細胞に添加した。
【０１６７】
[0213]  次に、Ｓｆ９昆虫細胞（２×１０６個の細胞／ｍｌ）３０ｍｌを、プラーク溶出液０．３ｍｌにより、目的のウイルスタンパク質を発現するバキュロウイルスに感染させ、４８〜７２時間にわたってインキュベートした。粗培養物（細胞＋培地）約１ｍｌおよび清澄化した培養採取物を発現分析用に保存し、残余を精製目的に保存した。
【０１６８】
（実施例２）
修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現、精製および分析
[0214]  目的の修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする遺伝子を重複オリゴヌクレオチドとしてインビトロで合成し、宿主細胞中でクローニングして発現させた。修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子のクローニングおよび発現を、当技術分野で既知の方法に従って達成した。
【０１６９】
[0215]  目的のウイルスタンパク質を含有する組み換えプラークを採取して確認した。次に、Ｓｆ９昆虫細胞を感染させることにより組み換えウイルスを増幅させた。ある場合には、Ｓｆ９昆虫細胞を、修飾Ｆタンパク質を発現する組み換えウイルスと、他のウイルスタンパク質（例えばBRSV Mタンパク質および／またはHRSV Nタンパク質）を発現する別の組み換えウイルスとに重感染させた。昆虫細胞の培養物に、様々な構築物を有するバキュロウイルスを約３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスffuまたはpfu／細胞）で感染させた。感染後４８〜７２時間で培養物および上清を採取した。粗採取物約３０ｍＬを、約８００×ｇで１５分にわたって遠心分離することにより清澄化した。修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有する、得られた粗細胞採取物を、以下で説明するように精製した。
【０１７０】
[0216]  目的の修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を感染Ｓｆ９昆虫細胞培養採取物から精製した。膜タンパク質抽出プロトコルにおいて、非イオン性界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９（ノニルフェノールエトキシレート）を使用した。粗抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンチルレクチン親和性／ＨＩＣ、および陽イオン交換クロマトグラフィーに通すことによってさらに精製した。
【０１７１】
[0217]  タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシー染色により全タンパク質を染色した。粗採取物からの等量の細胞試料およびβＭＥ（ベータ−メルカプトエタノール）を含有する２×試料緩衝液を、約１５〜２０μｌ（約７．５〜１０μｌの培養物）／レーンでＳＤＳ  Ｌａｅｍｍｌｉゲル上に負荷した。
【０１７２】
[0218]  ある場合には、クロマトグラフィーの代わりに、粗細胞採取物中の修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を３０％スクロース勾配分離法により濃縮し、次に、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。
【０１７３】
[0219]  修飾組み換えＦタンパク質、精製組み換えＦタンパク質、またはスクロース勾配により濃縮した組み換えＦタンパク質を含有する粗細胞採取物を、抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体および／または抗ＲＳＶ  Ｆポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによりさらに分析することができる。
【０１７４】
（実施例３）
Ｆタンパク質ＢＶ＃５４１をコードする修飾ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子
[0220]  完全長ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現させる最初の試みは、高レベルの発現を達成することに成功しなかったことが分かった。発現に使用したＦ遺伝子配列は、配列番号１（野生型HRSV F遺伝子、GenBank受託番号M11486）であった。Ｆ遺伝子配列は、５７４個のアミノ酸の不活性前駆体（F0）をコードする。この前駆体は、成熟の間にフューリン様プロテアーゼにより２度切断されており、２個のジスルフィド連結ポリペプチド、即ちＮ末端からのサブユニットＦ２とＣ末端からのＦ１とが生じる（図１）。２個の切断部位は残基１０９位および１３６位であり、これらにフューリン認識モチーフ（RARR、アミノ酸１０６−１０９位（配列番号２３）およびKKRKRR、アミノ酸１３１−１３６位（配列番号２４））が先行する。配列番号１のＦ遺伝子配列は、Ｓｆ９昆虫細胞中での発現のために準最適コドンを使用しており、および３個のエラーを内包し、これにより最適ではない折り畳みを呈することができるタンパク質（配列番号２、GenBank受託番号AAB59858）が産生される。さらに、Ｆ２サブユニットをコードする領域に、可能なポリ（A）アデニリル化部位（ATAAAA）を確認した。さらに、野生型Ｆ遺伝性配列は約６５％のＡＴリッチであるが、Ｓｆ９昆虫細胞発現系における遺伝子配列の所望のＧＣ−ＡＴ比は約１：１である。
【０１７５】
[0221]  ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の不十分な発現レベルを克服する試みにおいて、新しいＦ遺伝子配列を以下のように設計した：
（a）３個のＧｅｎＢａｎｋシークエンシングエラーを修正した、
（b）Ｆ２サブユニットをコードする領域での潜在的ポリ（A）部位を修飾した、
（c）Ｆ遺伝子コドンを最適化した、および
（d）Ｆ遺伝子は、不活性化した一次切断部位を有する修飾Ｆタンパク質をコードする。
【０１７６】
[0222]  ３個の修正したアミノ酸エラーはＰ１０２Ａ、Ｉ３７９ＶおよびＭ４４７Ｖであった。アミノ酸配列を変化させることなく、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子における潜在的ポリ（A）部位を修正した。
【０１７７】
[0223]  コドン最適化スキームは以下の基準に基づいていた：（１）Ｌｅｖｉｎ，Ｄ．Ｂ，他（Journal of General Virology, 2000, 第81巻, 2313〜2325頁）に記載の所与のアミノ酸のための昆虫細胞の鱗翅類（Lepidopteran）種における特定のコドンに関するアミノアシル−ｔＲＮＡの存在量、（２）遺伝子配列におけるＧＣ−ＡＴ比を約１：１に維持、（３）回文またはステムループＤＮＡ構造の最小限の導入、ならびに（４）転写および転写後抑制エレメント配列の最小限の導入。最適化したＦ遺伝性配列の例を配列番号１９（RSV-F BV #368）として示した。
【０１７８】
[0224]  ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の一次切断部位（1°CS, KKRKRR,アミノ酸131〜136位）を不活性化するために、フューリン認識部位をＫＫＱＫＱＱ（配列番号２８）またはＧＲＲＱＱＲ（配列番号２９）のいずれかに変異させた。そのような切断部位変異を有するいくつかの修飾Ｆタンパク質を評価して切断防止効率を測定した。図２は、評価したいくつかの修飾Ｆタンパク質を示す。結果は、３個の保存的アミノ酸変化Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３５ＱおよびＲ１３６ＱによりＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の一次切断部位を不活性化することができることを示す。極性−荷電の分子であるアルギニン（R）から極性−中性の分子であるグルタミン（Q）へのこれらの保存的アミノ酸変化により、これらの部位で荷電状態が変化し、フューリン様プロテアーゼによる切断が防止されて（図３参照）Ｆタンパク質３Ｄ構造がなお維持される。１°ＣＳでの切断の防止により、Ｆタンパク質の膜融合活性の低減が生じた。
【０１７９】
[0225]  前述した全ての修飾を有するように設計した非限定的な例示的修飾ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子配列を図４に示す。この修飾Ｆ遺伝子（配列番号５、RSV-F BV #541）は、配列番号６の修飾Ｆタンパク質をコードする。遺伝子配列を重複オリゴヌクレオチドとしてインビトロで合成し、宿主細胞中でクローニングして発現させた。修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃５４１を感染Ｓｆ９昆虫細胞培養採取物から精製し、クーマシーにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は実施例２に記載されている。Ｆタンパク質ＲＳＶ−Ｆ  ＢＶ＃５４１（例えばFタンパク質541）の発現レベルは、Ｓｆ９昆虫細胞における野生型Ｆ０タンパク質と比べて向上した。
【０１８０】
（実施例４）
Ｆ１サブユニット融合ドメインの部分欠失を有する修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質
[0226]  ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現をさらに向上させるために、以下の修飾を含む別の修飾ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子を設計した：
（a）３個のＧｅｎＢａｎｋシークエンシングエラーを修正した、
（b）Ｆ２サブユニットをコードする領域での潜在的ポリ（A）部位を修飾した、
（c）Ｆ遺伝子コドンを最適化した、および
（d）Ｆ１サブユニット融合ドメインをコードするヌクレオチド配列を部分的に欠失させた。一実験において、Ｆ１サブユニット融合ドメインの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を欠失させた（配列番号２のアミノ酸137〜146位に対応する）。
【０１８１】
[0227]  配列番号１０の修飾Ｆタンパク質をコードする、配列番号９（RSV-F BV #622、例えばFタンパク質622）と表す、前記修飾を含む非限定的な例示的修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を図５に示す。感染Ｓｆ９昆虫細胞培養採取物から修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２を精製し、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は実施例２に記載されている。図６においてＳＤＳ−ＰＡＧＥに示すように、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２の高発現レベルを観察した。
【０１８２】
（実施例５）
不活性化した一次切断部位とＦ１融合ドメイン部分欠失との両方を有する修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質
[0228]  不活性化した一次切断部位とＦ１融合ドメイン部分欠失との組合せが、特にＳｆ９昆虫細胞においてＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現をさらに促進することができるどうかを判定するために、以下の修飾を含む別の修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を設計した：
（a）３個のＧｅｎＢａｎｋシークエンシングエラーを修正した、
（b）Ｆ２サブユニットをコードする領域での潜在的ポリ（A）部位を修飾した、
（c）Ｆ遺伝子コドンを最適化した、
（d）一次切断部位を不活性化した、および
（e）Ｆ１サブユニット融合ドメインをコードするヌクレオチド配列を部分的に欠失させた。一実験において、Ｆ１サブユニット融合ドメインの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を欠失させた（配列番号２のアミノ酸137〜146位に対応する）。
【０１８３】
[0229]  配列番号８の修飾Ｆタンパク質をコードする、配列番号７（RSV-F BV #683、例えばFタンパク質683）と表す、Ｆ１サブユニット融合ドメインの最初の１０個のアミノ酸が欠失されている（配列番号２のアミノ酸137〜146位に対応する）非限定的な例示的修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を図７に示す。感染Ｓｆ９昆虫細胞培養採取物から修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（例えばFタンパク質683）を精製し、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は実施例２に記載されている。図８においてＳＤＳ−ＰＡＧＥに示すように、発現レベルのさらなる増強が達成された。
【０１８４】
[0230]  配列番号８の修飾Ｆタンパク質をコードする、配列番号７（RSV-F BV #683、例えばFタンパク質683）と表す、Ｆ１サブユニット融合ドメインの最初の１０個のアミノ酸が欠失されている（配列番号２のアミノ酸137〜146位に対応する）非限定的な例示的修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を図７Ａに示す。感染Ｓｆ９昆虫細胞培養採取物から修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（例えばFタンパク質683）を精製し、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は実施例２に記載されている。図８においてＳＤＳ−ＰＡＧＥに示すように、発現レベルのさらなる増強が達成された。
【０１８５】
（代替実施例５）
修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質融合ドメイン欠失
[0231]  Ｐｈｅ１３７〜Ｖａｌ１５４からのΔ２、Δ４、Δ６、Δ８、Δ１０、Δ１２、Δ１４、Δ１６またはΔ１８アミノ酸のＦ１融合ドメインにおける欠失をクローン＃５４１に導入した（図７Ａ）。これらの欠失変異体を発現するバキュロウイルスに感染させたＳｆ９細胞を、非イオン界面活性剤により感染細胞から抽出したＲＳＶ  Ｆタンパク質に関して分析し（図７Ｂ）、ＲＳＶ  Ｆに関して染色した細胞のＦＡＣＳ分析により分析した（図７Ｃ）。１０個以下のアミノ酸Ｐｈｅ１３７〜Ｓｅｒ１４６（図７Ａ、Δ2、Δ4、Δ6、Δ8およびΔ10）の欠失により、親クローンＢＶ＃５４１と比べて、細胞から抽出した可溶性Ｆ１のレベルが増加した（図７Ｂ）。１０個超のアミノ酸の融合ドメインの欠失の増加に伴い、可溶性ＲＳＶ  Ｆにおける大幅な減少が観察されており、これは分子のミスフォールディングに起因すると思われた。これらの結果と一致して、Ｆ１融合ペプチドのΔ２、Δ６およびΔ１０アミノ酸欠失を有する構築物は、ＲＳＶ  Ｆの最も高い細胞表面発現を示した（図７Ｃ）。
【０１８６】
（実施例６）
修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３の発現および精製
[0232]  修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（例えばFタンパク質683、配列番号８）を実施例１に記載したバキュロウイルス発現系で発現させ、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３を発現する組み換えプラークを採取して確認した。次に、Ｓｆ９昆虫細胞を感染させることにより組み換えウイルスを増幅させた。昆虫細胞の培養物に、バキュロウイルスを約３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスffuまたはpfu／細胞）で感染させた。感染後４８〜７２時間で培養物および上清を採取した。粗採取物約３０ｍＬを、約８００×ｇで１５分にわたって遠心分離することにより清澄化した。ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３を含有する、得られた粗細胞採取物を、以下で説明するように精製した。
【０１８７】
[0233]  ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３を感染Ｓｆ９昆虫細胞培養採取物から精製した。膜タンパク質抽出プロトコルにおいて、非イオン性界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９（ノニルフェノールエトキシレート）を使用した。粗抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンチルレクチン親和性／ＨＩＣ、および陽イオン交換クロマトグラフィーに通すことによってさらに精製した。
【０１８８】
[0234]  精製したＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３を、実施例２に記載したように、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。結果を図９に示した。ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（例えばFタンパク質683、配列番号８）の優れた発現レベルが得られた。粗細胞培養物での発現レベルは１０ｍｇ／Ｌより多く、回収したＦタンパク質ＢＶ＃６８３は約３．５ｍｇ／Ｌ細胞培養物であると推定した。ある場合には、２０ｍｇ／Ｌを超える発現レベルが得られ、修飾Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３約５ｍｇ／Ｌを回収した（図１０参照）。回収したＦタンパク質ＢＶ＃６８３の純度は、走査デンシトメトリーにより測定して９８％超に達した（図１０参照）。
【０１８９】
（実施例７）
精製ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３ミセル（ロゼット）
[0235]  精製ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３を、ネガティブ染色電子顕微鏡により分析した（図１１参照）。Ｆタンパク質は、野生型ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質（Calder他, 2000, Virology 271, 122〜131頁）および他の完全長ウイルス膜糖タンパク質（Wrigley他, Academic Press, London, 1986, 第5巻, 103〜163頁）に関して観察したものと同様に、ミセル（ロゼット）のフォームに凝集した。電子顕微鏡下において、Ｆスパイクは、幅広い先端がロゼットの中心から離れて突出しているロリポップ形状のロッド形態を呈した（図１１）。
【０１９０】
（代替実施例７）
精製ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３ミセル（ロゼット）のＨＰＬＣ分析
[0236]  精製ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３をＨＰＬＣにより分析した。逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）分析は、１１．１９５分の保持時間で９０．１％のＦ１＋Ｆ２と、６．２５６分の保持時間で９．９％のＦ１ポリペプチドとから成る精製ＲＳＶ  Ｆミセルを示した（図１２Ａ）。１１．１９５分でのＦ１＋Ｆ２ピークは、様々なグリコシル化種を示す二重ピークを示した。Ｆ１＋Ｆ２とＦ１との同一性を、単離したＨＰＬＣピークフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により確認した。質量分析による完全な質量決定により、Ｆ１およびＦ１＋Ｆ２が、予測した分子量と同様にそれぞれ５０ＫＤａおよび６１Ｋｄａの分子量を有していることが示された。
【０１９１】
[0237]  精製ＲＳＶ  Ｆナノ粒子を、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を使用してさらに分析した。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子は、低レベルの遊離Ｆ１サブユニットを有する、共有結合的に連結されたＦ１およびＦ２（図１２Ｂ、F1+F2）から主に成っていた。Ｆ１＋Ｆ２は全ピーク領域の９５．８％であり、Ｆ１は全ピーク領域の３．８％であった。ＲＳＶ  Ｆ粒子の純度が９８％以上であると推定した。Ｆ１＋Ｆ２ピークはこのＳＥＣカラムの空隙容量中に溶出し、Ｆ１ピークはＦ１三量体に関して予測した約１８０Ｋｄａの質量を有した。超遠心分析（AUC）研究は、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子における種の大部分が約１００万Ｄａ〜約８００万Ｄａの分子量を有することを示した。
【０１９２】
[0238]  単一の三量体の長さは約２０ｎｍであり、ミセル粒子の直径は約４０ｎｍであった（図１２Ｃ参照）。これらの結果は、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３が天然の活性タンパク質に関しての３Ｄ構造を修正していることを示していた。
【０１９３】
[0239]  要約すると、修飾組み換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えばBV #683）を設計し、発現させて精製した。この修飾完全長Ｆをグリコシル化している。一次切断部位および融合ドメインの修飾が共にＦタンパク質の発現レベルを大幅に向上させた。さらに、この修飾Ｆタンパク質を、Ｆ１サブユニットとＦ２サブユニットとに切断することができ、これらはジスルフィド連結している。Ｆ１サブユニットおよびＦ２サブユニットの三量体は、１９．６ｎｍのロリポップ形状のスパイクおよび４０．２ｎｍの粒子を形成する。さらに、この修飾Ｆタンパク質は、Ｓｆ９昆虫細胞において高度に発現する。精製後に、９８％を超えるミセルの純度が達成される。この修飾タンパク質のスパイクがロリポップ形態を有し、さらに４０ｎｍのミセル粒子を形成することができるという事実は、修飾Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３が天然タンパク質の３Ｄ構造を修正していることを示している。
【０１９４】
（実施例８）
ＶＬＰ産生における修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質とＢＲＳＶ  Ｍおよび／またはＨＲＳＶ  Ｎとの共発現
[0240]  本発明はまた、修飾または変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＫＰも提供する。そのようなＶＬＰは、ウイルスタンパク質抗原に対する中和抗体を誘導するのに有用であり、そのため、ＶＬＰを投与してＲＳＶに対する免疫を確立することができる。例えば、そのようなＶＬＰは、修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質および／またはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質とを含むことができる。ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質（配列番号１４）またはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質（配列番号１８）をコードする遺伝子のコドンを、昆虫細胞での発現用に最適化することができる。例えば、最適化したＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子配列を配列番号１３に示し、最適化したＲＳＶ  Ｎ遺伝子配列を配列番号１７に示す。
【０１９５】
[0241]  一実験において、修飾Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２および別の修飾Ｆタンパク質ＢＶ＃６２３（配列番号２１、両方の切断部位が不活性化されるように修飾されている）を、単独で発現させ、またはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現させた。ＶＬＰを含有する粗細胞採取物（細胞内）および３０％スクロース勾配分離から回収したＶＬＰペレットの両方を、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。図１３は、修飾Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２およびＢＶ＃６２３の構造、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の結果を示す。ＢＶ＃６２２はそれ自体で高度に発現し、またはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現するが、ＢＶ＃６２３の発現は極めて不十分であり、このことは、両方の切断部位の不活性化がＦタンパク質の発現を阻害することを示している。
【０１９６】
[0242]  別の実験において、修飾Ｆタンパク質ＢＶ＃６２２、ダブルタンデム遺伝子ＢＶ＃６３６（BV #541 + BRSV M）、ＢＶ＃６８３、ＢＶ＃６８４（YIAL L−ドメインがC末端に導入されているBV #541）およびＢＶ＃６８５（YKKL L−ドメインがC末端に導入されているBV #541）を、単独で発現させ、またはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現させた。Ｌ−ドメイン（後期ドメイン）はレトロウイルスにおける保存配列であり、細胞タンパク質と共に作用して細胞の表面からビリオンを効率的に放出させるＧａｐ内に存在する（Ott他, 2005, Journal of Virology 79: 9038〜9045）。各修飾Ｆタンパク質の構造を図１４に示す。ＶＬＰを含有する粗細胞採取物（細胞内）および３０％スクロース勾配分離から回収したＶＬＰペレットの両方を、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。図１４はＶＬＰを含有する粗細胞採取物（細胞内）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の結果を示し、図１５は３０％スクロース勾配分離から回収したＶＬＰペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の結果を示す。ＢＶ＃６２２およびＢＶ＃６８３はそれ自体で高度に発現し、またはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現したが、ＢＶ＃６３６、ＢＶ＃６８４およびＢＶ＃６８５の発現は不十分であった。
【０１９７】
（実施例９）
高発現であるキメラＨＲＳＶ  Ｆタンパク質のスクリーニング
[0243]  昆虫細胞において可溶フォームで高度に発現することができ、より良好な収率でＶＬＰを形成することができる別のＲＳＶ  Ｆタンパク質のスクリーニングを試みた。様々なＦ遺伝子を設計し、発現させて分析した。ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方を使用して発現を評価した。
【０１９８】
[0244]  図１６Ａ〜図１６Ｄは、各キメラＨＲＳＶ  Ｆクローンに関する構造、クローン名、説明、ウエスタンブロット／クーマシー分析の結果、および結論を要約する。
【０１９９】
[0245]  結果が示すように、野生型完全長Ｆタンパク質の発現は不十分であった；Ｆ１サブユニットを含有するがＦ２サブユニットを含有しないキメラＨＲＳＶ  Ｆタンパク質は良好に発現することができたが、生成物は不溶性であり（これはミスフォールディングに起因する可能性があった）、または重感染後に他のウイルスタンパク質と集合してＶＬＰを良好な収率で形成することができなかった。一次切断部位の不活性化のみでは、発現の実質的な増加は生じなかったが、一次切断部位の不活性化を、潜在的ポリ（A）部位の欠失およびＧｅｎＢａｎｋアミノ酸エラー（例えばBV #541）の修正等の他の修飾と組み合わせた場合、より良好な発現が達成された。ＢＶ＃５４１のＣ末端にＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインを導入することにより、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質およびＨＲＳＶ  Ｎタンパク質との共発現において修飾Ｆタンパク質を含有するＶＬＰの分泌が約２〜３倍に増強された。結果は、ＢＶ＃５４１遺伝子およびＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子から成るダブルタンデムキメラ遺伝子がＢＶ＃５４１タンパク質およびＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の重感染と比較して細胞内発現の向上およびＶＬＰ収率の向上の両方を示すことをさらに示しており、このことは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質はタンデム発現時に昆虫細胞における修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有するＶＬＰの産生を促進することができることを示している。ＢＶ＃５４１、ＢＲＳＶ  ＭおよびＨＲＳＶ  Ｎから成るトリプルタンデムキメラ遺伝子は、前述のダブルタンデムキメラ遺伝子またはＢＶ＃５４１タンパク質、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質およびＨＲＳＶ  Ｎタンパク質の重感染と比較して、さらにより高い細胞内発現およびはるかに良好なＶＬＰ収率を有していた。さらに、結果は、キメラＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（例えばFタンパク質683、配列番号８）が最良の細胞内発現を有することを示唆した。ＢＶ＃６８３遺伝子およびＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子から成るダブルタンデムキメラ遺伝子の発現、またはＢＶ＃６８３遺伝子、ＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子およびＨＲＳＶ  Ｎ遺伝子から成るトリプルタンデムキメラ遺伝子も本明細書で具体化されている。これらのダブルおよびトリプルのタンデムキメラ遺伝子は、重感染と比較してＶＬＰの産生をさらに向上させるはずである。
【０２００】
（実施例１０）
マウスにおけるＲＳＶ中和アッセイおよびＲＳＶ抗原投与試験
[0246]  ＲＳＶ感染の予防における修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３を含むワクチンの効率を試験するために、マウスにおいて中和アッセイおよびＲＳＶ抗原投与試験を行った。実験手順を図１７に示す。
【０２０１】
[0247]  マウス群（n＝10）に、プラセボ（PBS溶液）、生ＲＳＶ（鼻腔内投与）、ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチン（FI-RSV）、精製Ｆ粒子１μｇ（PEP、修飾Fタンパク質BV #683）、ミョウバンを伴う精製Ｆ粒子１μｇ（PEP＋ミョウバン）、精製Ｆ粒子１０μｇ、ミョウバンを伴う精製Ｆ粒子１０μｇ（PEP＋ミョウバン）または精製Ｆ粒子３０μｇを、０日目および２１日目に筋肉内注射した（生RSVを除く）。４２日目（２回目の免疫後２１日目）に各免疫群に生ＲＳＶを抗原投与した。０日目、３１日目（２回目の免疫後１０日目）、および４６日目（生RSVの抗原投与後４日目）に、各群からマウス血清を採取した。
【０２０２】
[0248]  各処理群からのマウス血清を、抗ＲＳＶ中和抗体の存在に関してアッセイした。免疫マウス由来の血清の希釈液を、感染性ＲＳＶと共に９６ウェルマイクロタイタープレート中でインキュベートした。血清を１：２０〜１：２５６０に希釈した。各ウェル中において、希釈血清５０μｌを生ＲＳＶウイルス５０μｌ（４００ｐｆｕ）と混合した。ウイルス／血清混合物を最初に６０分にわたって室温でインキュベートし、次にＨＥｐ−２細胞１００μｌと混合して４日にわたってインキュベートした。次いで、感染性ウイルスプラークの数を、クリスタルバイオレットで染色した後に計数した。各血清試料に関する中和力価を、１００％のＲＳＶ中和（例えばプラークなし）をもたらした血清の最高希釈度の逆数として定義し、各動物に関して測定した。３１日目（ブースト抗原刺激後１０日目）および４６日目（生RSVの抗原投与後４日目）の幾何学的平均血清中和抗体力価をワクチン群ごとにグラフ化した。図１８は中和アッセイの結果を示す。結果は、精製Ｆタンパク質１０μｇまたは３０μｇが生ＲＳＶと比較してはるかに高い中和力価をもたらすことを示した。さらに、ミョウバンアジュバントの共投与によりＰＥＰの中和力価が増強された。
【０２０３】
[0249]  免疫化が免疫動物の肺におけるＲＳＶ複製を予防することおよび／または阻害することができるかどうかを判断するために、ＲＳＶ抗原投与試験を行った。ＨＥｐ−２細胞を使用するプラークアッセイにより、免疫マウスの肺におけるＲＳＶの量を測定した。４２日目（２回目の免疫後１１日目）に、前述したマウスの免疫群に感染性ＲＳＶロング株１×１０６ｐｆｕを鼻腔内感染させた。４６日目（RSV感染後４日目）にマウスの肺を摘出して計量し、ホモジナイズした。ホモジナイズした肺組織を清澄化した。清澄化溶液の上清を希釈し、ＨＥｐ−２細胞を使用するプラークアッセイに供して肺組織におけるＲＳＶ力価を測定した（ｐｆｕ／ｇ肺組織として算出した）。結果を図１９に示し、該結果は、組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３で免疫した全てのマウスは、肺においてＲＳＶが検出不能であり、たとえアジュバントを伴わない精製組み換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３  １μｇでも、ＲＳＶ複製の阻害に優れた効率を示した（プラセボと比べて１０００倍超低減した）ことを示している。
【０２０４】
[0250]  前記で使用したＲＳＶ  ＰＦＰワクチンの安定性を判断するために、ワクチンを２〜８℃で０週、１週、２週、４週、および５週にわたって保存し、次にクーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２０）。結果は、ＲＳＶ  ＰＦＰワクチンが２〜８℃で安定しており、検出可能な分解がないことを示す。
【０２０５】
（実施例１１）
コットンラットにおける組み換えＲＳＶ  Ｆミセル活性
[0251]  本実施例において、群は、生ＲＳＶ（RSV）、ホルマリン不活性化ＲＳＶ（FI-RSV）、アルミニウムを伴うおよび伴わないＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（PFPおよびPFP＋アルミニウムアジュバント）、ならびにＰＢＳ対照によって０日目におよび２１日目に免疫したコットンラットを含んだ。
【０２０６】
[0252]  図２１に示すように、アルミニウムを伴うおよび伴わないＦ−ミセルワクチン（RSV-Fタンパク質BV #683、例えばFタンパク質683、配列番号８）３０μｇによる免疫化は、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの両方に対する暴露後に、頑強な中和抗体応答をもたらした。さらに、アルミニウムが抗体応答を有意に増強することが観察された。さらに、ＲＳＶ  ＡおよびＲＡＶ  Ｂにおいて、それぞれ４６日目または４９日目のブースト抗原刺激後に中和抗体が増加した。
【０２０７】
[0253]  ホルマリン不活性化ＲＳＶ（FI-RSV）で免疫したラットにおいては重大な肺病理が観察されたが、Ｆ−ミセルワクチンによる疾患の亢進は見られなかった（図２２）。Ｆ−ミセルワクチンおよびアジュバントを伴うＦ−ミセルワクチンの使用により、一次ＲＳＶ感染（PBS＋RSV抗原投与）対照群（５．８）よりも低い炎症スコア（それぞれ４．０および２．８）をもたらした。前述したように、ＦＩ−ＲＳＶ処理群は、一次ＲＳＶ感染（PBS＋RSV抗原投与）対照群よりも高い炎症スコアを有した（９．０対５．８）。さらに、ＦＩ−ＲＳＶ処理群は、非抗原投与プラセボ対照、生ＲＳＶ＋ＲＳＶ抗原投与、Ｆ−ミセル＋ＲＳＶ抗原投与およびＦ−ミセル＋アルミニウム＋ＲＳＶ抗原投与よりも有意に高い平均炎症スコア（９．０）を有した。
【０２０８】
（実施例１２）
ラットにおけるＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンの前臨床有効性
[0254]  コットンラットにおいてＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンの有効性を試験した。
【０２０９】
[0255]  ＲＳＶ  Ｆワクチン±ミョウバンで免疫したコットンラットにおいてＲＳＶ−Ａに対する中和抗体応答を評価した。
【０２１０】
[0256]  一試験において、コットンラットは、以下の処理群の１つで免疫された。
（１）ＰＢＳ；
（２）ＲＳＶ；
（３）ホルマリン不活性化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）；
（４）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１μｇ＋ミョウバン）；
（５）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（６μｇ＋ミョウバン）；
（６）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（３０μｇ＋ミョウバン）。
【０２１１】
[0257]  次に、２１日目および４９日目にラットから採血した。プラーク減少中和試験を使用することによる中和アッセイにおいて、４９日目からの血清をＲＳＶ−Ａに対して試験した。この実験の結果を図２３に示す。図２３は、中和力価対各処理群を示すグラフである。各処理群のラインは、ＲＳＶ−Ａウイルスを１００％中和したエンドポイント力価の幾何学的平均を示す。結果は、本発明のワクチンがＲＳＶおよびＦＩ−ＲＳＶよりも大きな程度にＲＳＶを中和することを示した。
【０２１２】
[0258]  別の試験において、コットンラットは、以下の処理群の１つで免疫された。
（１）ＰＢＳ；
（２）ＲＳＶ；
（３）ＦＩ−ＲＳＶ；
（４）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１μｇ）；
（５）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１μｇ＋ミョウバン）；
（６）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１０μｇ）；
（７）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１０μｇ＋ミョウバン）；
（８）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（３０μｇ）。
【０２１３】
[0259]  コットンラットを０日目および２１日目に一度、前記処理群の内の一個で免疫した。その後３１日目にラットから採血した。全ての群からの血清を、ＣＰＥアッセイにおいてＲＳＶ−Ａに対して試験した。図２４は、Ｌｏｇ２力価対各ワクチン接種群（x軸）で表した、コットンラットにおけるＲＳＶ−Ａに対する中和抗体応答を示す。本発明のワクチンは、ＲＳＶおよびＦＩ−ＲＳＶよりも大きな程度にＲＳＶを中和した。さらに、ミョウバンと共に投与したナノ粒子ワクチンは、ミョウバンを伴わないナノ粒子ワクチンよりも多くの中和力価をもたらした。
【０２１４】
[0260]  他の実験において、コットンラットは、以下の処理群の１つで免疫された。
（１）ＰＢＳ；
（２）ＲＳＶ；
（３）ＦＩ−ＲＳＶ；
（４）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１μｇ）；
（５）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１μｇ＋ミョウバン）；
（６）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（６μｇ）；
（７）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（６μｇ＋ミョウバン）；
（８）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（３０μｇ）；
（９）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（３０μｇ＋ミョウバン）。
【０２１５】
[0261]  コットンラットをワクチン処理群（１）〜（９）の内の一個で０日目および２１日目に免疫し、その後４９日目にＲＳＶ  Ａ株ウイルスを抗原投与した。
【０２１６】
[0262]  肺組織を５４日目に摘出した（n＝8／群）。次に、組織をホモジナイズし、感染性ウイルスを検出するために、Ｈｅｐ−２単層プラークアッセイを使用してＲＳＶウイルスの存在に関して評価した。図２５は、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子により誘発された中和抗体が抗原投与動物の肺におけるＲＳＶウイルスの複製の予防に有効であったことを示す。図２５において、ＲＳＶ力価をｌｏｇ１０  ｐｆｕ／肺組織のグラム当たりで表す。
【０２１７】
[0263]  抗ＲＳＶ抗体の存在または不存在を判断するために、前記９個のワクチン群で処理したラット血清に関してＥＬＩＳＡアッセイも行った。各群において動物に関して血清をプールし、ＥＬＩＳＡアッセイに供した。ＥＬＩＳＡ単位（4パラメータフィット希釈曲線上の５０％力価に相当する、図２６Ａ）またはＲＳＶ−Ｆ  ＩｇＧ力価（図２６Ｂ）により測定した結果を図２６Ａおよび図２６Ｂに示す。本発明のワクチンで処理した動物は、ＲＳＶまたはＦＩ−ＲＳＶで処理した動物よりも多くの検出可能な抗ＲＳＶ抗体を産生した。さらに、ミョウバンは抗体応答を増加させた。
【０２１８】
[0264]  ＨＥｐ−２細胞単層上での１００％ＲＳＶ細胞変性活性の阻害能を有する抗血清の希釈度を測定することにより、ＲＳＶ中和アッセイにおいて抗ＲＳＶ  Ｆ抗体の機能的活性を評価した。非アジュバントＲＳＶ  Ｆナノ粒子の全ての用量での免疫化により、ＲＳＶ中和抗体の発生がもたらされる（図２６Ｃ）。抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧに関する結果と一致して、リン酸アルミニウムアジュバントの共投与により、ＲＳＶ中和抗体力価が３．５〜１８倍に増加した。生ＲＳＶで誘導された中和抗体力価は低用量のＲＳＦ  Ｆアジュバント群に匹敵し、おそらく成分はＲＳＶ  Ｇタンパク質を対象とした。ホルマリン不活性化ＲＳＶ（FI-RSV）で免疫したコットンラット由来の血清は、中和活性を呈さなかった（図２６Ｃ、FI-RSV）。
【０２１９】
[0265]  ＲＳＶ  Ｆタンパク質上の抗原部位ＩＩはパリビズマブの標的であることが分かっており、ＲＳＶ疾患の予防のための予防法でヒト化ＲＳＶ中和モノクローナル抗体が使用された。抗原部位ＩＩを対象とする抗体がＲＳＶ  Ｆナノ粒子による免疫化により誘導されたかどうかを判断するために、各群内の個々の動物からプールした血清を使用してパリビズマブ競合ＥＬＩＳＡを行った。生ＲＳＶ処理動物、ＦＩ−ＲＳＶ免疫動物、またはＰＢＳ対照動物のいずれかから得た血清は、パリビズマブ結合を阻害しなかった（図２６Ｄ）。これに対して、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子で免疫した動物から得た血清プールは、パリビズマブのＲＳＶ  Ｆへの結合を阻害する高レベルの抗体を有していた（図２６Ｄ）。この結果は、リン酸アルミニウムアジュバントを伴うまたは伴わない全ての用量由来のプールに関して得られた。これらのデータから、ＲＳＶ  Ｆタンパク質がパリビズマブと同様の特異性を有する抗体を刺激することが実証された。
【０２２０】
組織病理学
[0266]  ＲＳＶを抗原投与したコットンラットの組織病理学も研究した。コットンラットを以下のワクチン接種群の内の１個で０日目および２１日目に免疫した：
（１）ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン（１μｇ、６μｇまたは３０μｇ；＋／−ミョウバン）
（２）ＦＩ−ＲＳＶ
（３）ＲＳＶ
（４）ＰＢＳ
（５）ＰＢＳ
群（１）〜（４）からのラットにその後、４９日目にＲＳＶ  Ａ株ウイルスを抗原投与した。群（５）からのラットにはウイルスを抗原投与しなかった。抗原投与後５日で肺組織を単離した。組織を冷凍し、該組織から薄片を作り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。対照動物および３０μｇ＋ミョウバンワクチン群における細気管支周囲炎状態を示すために、代表的な顕微鏡写真を示す（図２７）。
【０２２１】
[0267]  （Prince GA他、（1986）J Virol 57: 721〜728に記載されている）以下の５個のパラメータ：ａ）細気管支炎、ｂ）血管炎、ｃ）気管支炎、ｄ）肺胞炎およびｅ）間質性肺炎それぞれに関する重症度が増加する順に、０〜４のスコア（0＝なし、1＝最小、2＝軽度、3＝中程度、4＝最大炎症）を使用する盲検方式でスライドを評価した。５個のパラメータのそれぞれに関する集計値を互いに加算して各動物に関する単一の集計スコアを出した。各群に関する集計スコアを使用して、平均値±ＳＥＭとして表される全平均スコア／群を出した。
【０２２２】
[0268]  様々な実験的群に関する組織病理学スコア（表１）の分析により、ＦＩ−ＲＳＶがその後の生ウイルスの抗原投与時に炎症を悪化させることが実証された。ＦＩ−ＲＳＶに関する全組織病理学的スコアは、ＲＳＶを抗原投与した非免疫動物に関して観察されたものよりも有意に高かった（平均5.63、p<0.0001、t検定）。ミョウバンの存在または不存在のいずれかにおける任意のＲＳＶ  Ｆ免疫群において、対照群と比べて病理学での有意な増加は観察されなかった。ＲＳＶに感染したコットンラットおよびＲＳＶが抗原投与されたコットンラットは、０．７５の平均スコアを有していた。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子６μｇまたは３０μｇでそれぞれ免疫したアジュバントワクチン群では、次に低い組織病理学スコアである１．１３および１．４３であった（表１）。これらのデータは、アジュバントＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンがＲＳＶ抗原投与(challenge)後の肺炎症を阻害することを実証する。
【０２２３】
【表１】
2014530010.tif 000003
【０２２４】
（実施例１３）
マウスにおけるＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンの前臨床有効性
[0269]  ＥＬＩＳＡプレートをＲＳＶ  Ｆミセル２μｇ／ｍＬで被覆した。免疫前およびミョウバンを伴うＲＳＶ  Ｆ３０μｇで０日目に免疫したマウスからの２８日目の血清のプールを、ビオチン−パリビズマブエピトープペプチド５０ｎｇ／ｍＬと混合した。次に、これらの試料を連続的に希釈し、精製ＲＳＶ  Ｆ被覆ＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。ストレプトアビジンを使用して、プレートに結合したパリビズマブを測定した。
【０２２５】
[0270]  重み付けしない４パラメータロジスティック回帰曲線を図２８に示す。結果は、本発明のナノ粒子ワクチンにより産生された抗体が標的ＲＳＶへの結合に関してパリビズマブペプチドと競合することを示した。
【０２２６】
（実施例１４）
ＲＳＶナノ粒子ワクチン−パリビズマブアッセイ
[0271]  本発明のＲＳＶナノ粒子ワクチンのＳｙｎａｇｉｓへの結合をアッセイした。
【０２２７】
[0272]  Ｓｙｎａｇｉｓ  ｍＡｂのパリビズマブエピトープペプチドへの結合。ＥＬＩＳＡプレートをストレプトアビジン５μｇ／ｍＬで被覆した。パリビズマブペプチド１μｇ／ｍＬを、ビオチンリンカーを介してストレプトアビジンのプレートに結合させた。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）１０μｇ／ｍＬを４倍に連続的に希釈し、プレート上のペプチドにインキュベートした。抗ヒトＨＲＰ反応を使用してＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）結合を検出した。結果を図２９Ａ（左側のグラフ）に示す。
【０２２８】
[0273]  Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）の組み換えＲＳＶ  Ｆミセルへの結合。ＥＬＩＳＡプレートをＲＳＶ  Ｆミセル抗原２μｇ／ｍｌで被覆した。１０μｇ／ｍＬ濃度のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を４倍に連続的に希釈し、プレート上のＲＳＶ  Ｆと反応させた。抗ヒトＨＲＰ反応を使用して、ＳｙｎａｇｉｓのＲＳＶ  Ｆミセルへの結合を検出した。重み付けしない４パラメータロジスティック回帰曲線を示す（図２９Ｂ、右側のグラフ）。結果は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）が本発明のワクチンを認識して結合することを示した。
【０２２９】
（実施例１５）
ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンの臨床的安全性
[0274]  フェーズ１ランダム化観察者盲検プラセボ対照試験を行って、用量漸増的に健康な成人におけるＲＳＶナノ粒子ワクチンの安全性および免疫原性を評価した。
【０２３０】
[0275]  １５０例の健康な成人に、０日目および３０日目に２度の免疫化を行った。処理群を以下の表２に示す。対象に関する人口統計学的なおよび対象の内訳をそれぞれ表３および表４に示す。
【０２３１】
【表２】
2014530010.tif 000004
【０２３２】
【表３】
2014530010.tif 000005
【０２３３】
【表４】
2014530010.tif 000006
【０２３４】
[0276]  免疫化後１〜７日では、有害事象（AE、局所および全身の両方）は非自発的であった。
【０２３５】
[0277]  プラセボを投与した患者の６．７％で局所的な痛みが報告された。ワクチン群における患者の１５％〜５５％が痛みを報告した。一例の対象が激しい痛みを報告した（３０μｇ＋ミョウバン処理）。これらは用量応答効果ではなかった。
【０２３６】
[0278]  プラセボを投与した患者の１０％で圧痛が報告された。ワクチン群における患者の２０％〜５５％が圧痛を報告した。一例の対象が激しい圧痛を報告した（６０μｇ＋ミョウバン処理）。これらは用量応答効果ではなかった。
【０２３７】
[0279]  プラセボを投与した患者の１６．７％で頭痛が報告された。ワクチン群における患者の１０％〜３５％が圧痛を報告した。これらは用量応答効果ではなかった。
【０２３８】
[0280]  ワクチンは全体的に良好な耐容性を示した。有害事象の大半は局所的な痛みおよび圧痛であり、大部分は軽度であった。局所的な有害事象はプラセボと比べてワクチン群において高かった。ワクチンの用量に基づく有害事象の傾向はなかった。また、重度の有害事象に関連したワクチンはなかった。
【０２３９】
（実施例１６）
ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンの免疫原性
[0281]  実施例１５に記載したフェーズ１試験を行った。
【０２４０】
[0282]  ＲＳＶナノ粒子ウイルスの免疫原性を評価した。免疫原性を評価するために利用した様々なアッセイに関するスキームを図３０に示す。
【０２４１】
【表５】
2014530010.tif 000007
【０２４２】
[0283]  ＥＬＩＳＡプレートを、ストレプトアビジン５μｇ／ｍＬで被覆した。パリビズマブペプチド１μｇ／ｍＬをストレプトアビジンに結合させた。本発明のワクチンで処理した対象由来のヒト血清をプレートに導入した。次に、二次抗体（抗ヒトHRP）を添加し、パリビズマブペプチドに対する抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧを検出した。
【０２４３】
[0284]  図３１はこの試験の結果を示す。各ナノ粒子ワクチン処理群は、対照群よりも著しくより多くのＲＳＶ  ＩｇＧを産生し、ミョウバン群は非ミョウバン群よりも良好に働いた。図３１において、各処理群は３種の測定値を含む：（１）１日目の血清（左側のバー）、（２）３０日目の血清（中央のバー）、（３）６０日目の血清（右側のバー）。
【０２４４】
【表６】
2014530010.tif 000008
【０２４５】
[0285]  ＥＬＩＳＡプレートを、ＲＳＶ  Ｆ抗原またはＲＳＶ  Ｇ抗原２μｇ／ｍＬで被覆した。本発明のワクチンで処理し、その後にＲＳＶを抗原投与した対象由来のヒト血清をプレートに導入した。次に、二次抗体（抗ヒトHRP）を添加し、ヒト血清中における抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧまたは抗ＲＳＶ  Ｇ  ＩｇＧを検出した。
【０２４６】
[0286]  各ナノ粒子ワクチン処理群は、試験した全ての時点でＲＳＶ  Ｆに対してＩｇＧ抗体を産生した（図３２Ａ）。これに対して、ワクチン処理群は、ごく僅かな量の抗ＲＳＶ  Ｇ抗体の産生を誘導した（図３２Ｂ）。図３２ＡおよびＢにおいて、各処理群は３種の測定値を含む：（１）１日目の血清（左側のバー）、（２）３０日目の血清（中央のバー）、（３）６０日目の血清（右側のバー）。
【０２４７】
[0287]  本実験の結果も以下の表５Ａおよび５Ｂに示す。表５Ａは、全ての群における幾何学的平均のＩｇＧレベルを示す。ミョウバン群に関して、ＩｇＧレベルにおける幾何学的平均増加倍数もプロットした（図３３）。有意な用量応答が得られた（p<0.05）。表５Ｂは、６０μｇ＋ミョウバン群における個々の対象に関するＥＬＩＳＡ（ELISA単位として表す）の結果を示す。
【０２４８】
【表７】
2014530010.tif 000009
【０２４９】
【表８】
2014530010.tif 000010
【０２５０】
ＲＳＶプラーク減少中和力価（PRNT）
[0288]  これらの実験の結果を図３４および図３５に示す。図３４は、全ての群に関して６０日目の抗体がプラセボよりも著しく高かったことを示す。ワクチン群における免疫化後のＰＲＮＴは、高齢者、子供および幼児において保護的であると推定されているレベルを超えていた。
【０２５１】
[0289]  図３５は、プラセボおよび３０μｇ＋ミョウバン群における０日目、３０日目および６０日目のＰＲＮＴに関する逆累積分布を示す。０日目での最小の力価は５ｌｏｇ２であり、６０日目でのＲＳＶ  Ｆ組み換えナノ粒子による免疫化後の最小の力価は８．５ｌｏｇ２であった。
【０２５２】
（実施例１７）
ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンにより誘導された抗体の結合活性
[0290]  実施例１５に記載したフェーズ１試験を行った。
【０２５３】
[0291]  ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲベース測定系を使用して、ＲＳＶ  Ｆに関するヒト血清における抗体の結合活性を測定した。ＲＳＶ  Ｆタンパク質をセンサ表面上に固定化し、血清を固定化ＲＳＶ  Ｆ上に通した。センサ表面上の分子量に基づいて、固定化ＲＳＶ  Ｆへの結合を測定した。会合速度および解離速度を時間の関数として測定してセンサーグラム上にプロットし、会合速度および解離速度から解離定数を算出した。
【０２５４】
[0292]  図３６は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲベースアッセイに関する対照を示す。図３６Ａは、陽性対照パリビズマブ抗体およびＲＳＶ参照血清（BEI Resourcesから入手でき、Yang他, 2007, Biologicals 35; 183〜187に記載されている）に関する会合速度（k-On）、解離速度（k-Off）および解離定数（KD）を示す。図３６Ｂは、陽性対照パリビズマブと比べて、０日目およびフェーズ１試験由来のプラセボ対照血清からの否定的な結果を示すためのセンサーグラムを示す。
【０２５５】
[0293]  図３７は、パリビズマブ抗体および代表的なワクチンに関する結合曲線を示す（対象ID番号1112、３０日目）
【０２５６】
[0294]  ワクチン６０μｇ＋アジュバント群における１３例の対象に関する試験の結果を以下の表６に示す。３０日目では、これら１３例の対象に関するＫＤは０．１１ｐｍｏｌ〜９９２ｐｍｏｌの範囲であり、６０日目では、ＫＤは０．００１９４ｐｍｏｌ〜６７５ｐｍｏｌの範囲であった。そのため、パリビズマブ抗体対照のような、ＲＳＶ  Ｆに関するヒト血清中における抗体の結合活性はピコモルの範囲内であった。
【０２５７】
【表９】
2014530010.tif 000011
【０２５８】
（実施例１８）
ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンにより誘導されたパリビズマブ様ＩｇＧ抗体
[0295]  実施例１５に記載したフェーズ１試験を行った。
【０２５９】
[0296]  ６０μｇ＋アジュバント群における１３例の対象由来の血清中におけるパリビズマブ様ＩｇＧ抗体（RSV Fとの結合に関してパリビズマブエピトープペプチドと競合する抗体）を競合結合アッセイにより測定した。以下の表７に示した結果は、３０日目および６０日目の両方で試験した全ての対象においてパリビズマブ様抗体が保護レベル（≧４０μｇ／ｍＬ）をかなり上回っていることを示した。
【０２６０】
【表１０】
2014530010.tif 000012
【０２６１】
（実施例１８）
昆虫細胞中で産生された組み換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ナノ粒子ワクチンの免疫原性：ヒト対象におけるパリビズマブ様活性の誘導
[0297]  本実施例で投与したワクチンは、三量体に会合した、ほぼ完全長のＦタンパク質を含むナノ粒子を含んでいた。組み換えバキュロウイルスに感染させたＳｆ９昆虫細胞中でＦタンパク質を産生させた。細胞を溶解して界面活性剤で可溶化し、Ｆタンパク質をクロマトグラフィーにより精製した。ＡＬＰＯ４に吸着した、または吸着していない抗原を筋肉注射により投与した。
【０２６２】
[0298]  健康な成人（N＝150、平均年齢31.3歳、女性５９％）を、それぞれ２０例の活性ワクチンレシピエントおよび５例のプラセボレシピエントを含む６個のコホートに登録した。被験物質を３０日おきに２回服用させた。
【０２６３】
[0299]  ＲＳＶ  Ｆ抗原を、ＡｌＰＯ４に吸着した５μｇ、１５μｇ、３０μｇおよび６０μｇならびにアジュバントを伴わない３０μｇおよび６０μｇの用量で試験した。各服用後７日にわたって局所症状および全身症状を求めることにより、および６カ月にわたる自発的な有害事象の確認により安全性をモニタリングした。以下の複数の抗原に関して、プラーク減少中和（PRN）アッセイおよびマイクロ中和（MN）アッセイ（これらは同様の結果をもたらす）ならびにＥＬＩＳＡアッセイを使用して機能的抗体を評価した。
【０２６４】
[0300]  試験の結果は、ＭＮ応答が抗Ｆ応答に遅れるように見えることを示した（図３８）。ＭＮ抗体応答は活性群に生じたが、抗Ｆ応答ははるかに動的であった。ベースラインの抗Ｆ  ＩｇＧ力価は、より限定された範囲に及んでいたが、ベースラインのマイクロ中和（MN）力価は、３２倍を超える範囲にわたって変動した。ワクチンは、低いＭＮベースラインで対象における実質的なＭＮ応答を誘導したが（母集団の最低1/3でこれらにおける幾何学的平均の3.9倍の上昇）、高いベースラインの値で対象の1/3により全体的に増加倍数が制限された（2倍未満の応答が確認された）。
【０２６５】
[0301]  試験の結果はまた、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンが抗原部位ＩＩのペプチド２５４〜２７８位に対する抗体応答を誘発することも示した（図３９）。パリビズマブエピトープおよびモタビズマブエピトープを持つ合成ＲＳＶ−Ｆペプチド２５４〜２７８位をビオチン化し、ストレプトアビジン被覆プレートに固定化した。血清の段階希釈液をペプチド被覆プレレートでインキュベートした。酵素コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧでの洗浄後に、結合したＩｇＧを検出した。免疫化前の力価は一様に低かったが、ＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチンの受容により５〜１５倍に増加した。
【０２６６】
[0302]  図４０および表８は、ＲＳＶ−Ｆナノ粒子免疫化前後のヒト血清によるパリビズマブ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。ＥＬＩＳＡプレートをＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原２μｇ／ｍＬで被覆した。免疫化前および免疫化後の血清を連続的に希釈し、ビオチン化パリビズマブ５０ｎｇ／ｍＬを添加し、次に被覆プレート中でインキュベートした。酵素コンジュゲートストレプトアビジンを使用して、プレートに結合したパリビズマブを検出した。４パラメータフィットを行い、５０％パリビズマブ結合阻害を得る血清希釈度を内挿した。正常な成人の血清中において、パリビズマブと競合する抗体が低い力価で存在していたが、該抗体は、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンによる免疫化によって著しく増加した（図４０Ａ）。図４０Ｂは、全ての対象群において１回目の服用後および２回目の服用後でのパリビズマブ結合阻害における幾何学的平均倍数が増加することを示す。アジュバントは、ワクチンが誘導された血清のパリビズマブ阻害を増強し、６０μｇ＋アジュバント群は、最も高いレベルのパリビズマブ阻害を呈した。
【０２６７】
【表１１】
2014530010.tif 000013
【０２６８】
[0303]  試験の結果はまた、抗ＲＳＶ  Ｆ抗体の誘導がパリビズマブ結合部位を競合する抗体の存在と関連していることも示した（図４１）。０日目で抗Ｆ力価が存在したにもかかわらず、大部分の健康な若年成人の血清は、パリビズマブ競合アッセイのＬＬＯＱで、またはその近くで値を得た。６０日目において、プラセボレシピエントの分布は変化していなかったが、活性ワクチン（赤色）は、パリビズマブ競合特異性に富む抗Ｆ抗体における増加を示した。
【０２６９】
[0304]  非標識パリビズマブを正常な血清に添加し、競合ＥＬＩＳＡにおいて２．１μｇ／ｍＬで５０％阻害を得た。これを表９で使用して、ワクチン血清中における「パリビズマブ様」活性の近似等価を算出した。並行して、パリビズマブをまた３種の異なるレベルで５例の正常な成人の血清に添加し、ＭＮ力価に対する影響を測定した；２種の異なる日それぞれでの２回の繰り返しに基づくＧＭＴにおける増加を以下に示す。
【０２７０】
【表１２】
2014530010.tif 000014
【０２７１】
【表１３】
2014530010.tif 000015
【０２７２】
[0305]  昆虫細胞に由来するＲＳＶ  Ｆタンパク質ナノ粒子に対する抗Ｆタンパク質免疫応答は、高度に保存されており臨床的に重要なＦタンパク質抗原部位ＩＩに対する抗体において強化されており、Ｆタンパク質抗原部位ＩＩは、パリビズマブ結合部位およびモタビズマブ結合部位を含有する。
【０２７３】
[0306]  ワクチンによって得られたパリビズマブ様活性のレベルは、幼児に受動的に投与したときに有効であるレベルと同じであった。
【０２７４】
（実施例１９）
ＲＳＶ  Ｆ特異的モノクローナル抗体がＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン抗原に結合する
[0307]  様々なＲＳＶ  Ｆ中和モノクローナル抗体は当技術分野で既知であり、例えばＣｒｏｗｅ  ＪＥら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５２；３７３（１９９８）およびＢｅｅｌｅｒ他、Ｊｏｕｒｏａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６３；２９４１（１９８９）に記載されており、これらは両方とも、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。図４２は、ＲＳＶ  Ｆワクチン抗原の抗体認識領域の略図を示し、該領域は部位Ｉ、部位ＩＩおよび部位ＩＶ／Ｖ／ＩＶである。
【０２７５】
[0308]  ＲＳＶ  Ｆワクチン抗原２μｇ／ｍＬを蒔いた。ＲＳＶ特異的モノクローナル抗体を連続的に４倍に希釈し、ＲＳＶ  Ｆワクチン抗原でインキュベートし、抗マウスＨＲＰを使用して抗体結合を検出した。図４２に示すように、ワクチン抗原は、抗原の部位Ｉ、ＩＩまたはＩＶ／Ｖ／ＶＩに結合する抗体を含む、いくつかの中和ＲＳＶ  Ｆ抗体の結合を誘発することがきた。
【０２７６】
（実施例２０）
コットンラットにおけるＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン誘導免疫応答
[0309]  本実施例では、雌のコットンラットの４個の群（群当たり５匹）においてＲＳＶ  Ｆワクチンの有効性をさらに試験した。群１の動物に、１：２５の希釈度でミョウバン上に吸着したホルマリン不活性化ＲＳＶウイルス（FI-RSV）により２度の筋肉内ワクチン接種をした（０日目に１度および２８日目に１度）。０日目および２８日目に、アジュバント（ＡＩＰＯ４  ２．４ｍｇ／ｍＬ）と共に製剤化した組み換えＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン３０μｇにより、群２の動物に筋肉内ワクチン接種をした。群３の動物に、アジュバントの不存在下で組み換えＲＳＶ−Ｆナノ粒子ワクチン３０μｇによる２度のワクチン接種をした。群４の動物の鼻腔内に、０日目および２８日目においてＲＳＶ−Ａ２  １０５ｐ．ｆ．ｕ（鼻孔当たり０．０５ｍＬ）を感染させた。０日目、２８日目および４９日目で全ての動物から血清を回収した。
【０２７７】
[0310]  免疫したコットンラットおよび感染したコットンラット由来のポリクローナル血清試料を連続的に５倍に希釈し、２μｇ／ｍＬで蒔いたＲＳＶ  Ｆ抗原でインキュベートした。抗ラットＨＲＰを使用して、結合した抗体を検出した。図４３に示すように、ＲＳＶ  Ｆワクチンは、コットンラットにおいて頑強な抗ＲＳＶ  ＩｇＧ抗体を誘導した。両方のＲＳＶ  Ｆワクチン群は、２８日目および４９日目でのＦＩ−ＲＳＶによる免疫化またはＲＳＶ  Ａ２による感染のいずれかと比べて高いＩｇＧ力価を誘発した。アジュバントの存在により、２８日目および４９日目の両方でＩｇＧ力価がさらに増加した（図４３）。
【０２７８】
[0311]  Ｈｅｐ−２細胞株感染アッセイを使用して、コットンラットにおける中和抗体応答を試験した。プレート中において血清希釈液を感染性ＲＳＶでインキュベートし、次いで、ＲＳＶ／血清混合物をＨｅｐ−２細胞でインキュベートした。感染性ウイルスプラークの数を計数し、感染の５０％ＲＳＶ阻害をもたらす血清の最高希釈度の逆数として中和力価を算出した。
【０２７９】
[0312]  いずれの群においても、０日目の血清は測定可能な中和力価を示さなかった。ＦＩ−ＲＳＶ群は、いずれの時点でも中和力価を示さなかった。４９日目では、ＲＳＶ  Ａ２に感染したマウスは、アジュバントの不存在下でＲＳＶ  Ｆにより免疫したマウスと同様のレベルの中和抗体を示した。ＲＳＶ  Ｆワクチン＋アジュバント群において４９日目に最高の中和力価を検出し、これは、アジュバントの存在下においてＲＳＶ  Ｆワクチンを受容する動物で中和力価が最も強固に誘導されたことを示す（図４４）。
【０２８０】
[0313]  ＲＳＶ−Ｆの存在によって中和が阻害されるかどうかを判断するために、中和アッセイにおいて、Ｈｅｐ−２細胞によるインキュベーション前に、コットンラットの血清を、ＢＳＡ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  Ｇタンパク質の両方２０μｇ／ｍＬでプレインキュベートした。表１１に示すように、ＲＳＶ  Ｆタンパク質によるプレインキュベーションにより、アジュバントを伴うまたは伴わない、ＲＳＶ  Ａ２感染マウスおよびＲＳＶ  Ｆワクチンで免疫したマウス由来の血清において、中和力価が検出不能なレベルまたは検出不能なレベル付近まで低下した。
【０２８１】
【表１４】
2014530010.tif 000016
【０２８２】
[0314]  Ｈｅｐ−２細胞株融合阻害アッセイを使用して、ＦＩ−ＲＳＶ、アジュバントを伴うもしくは伴わないＲＳＶ  Ｆワクチン、または生ＲＳＶ  Ａ２により誘導された抗体の融合性ＲＳＶ感染を阻害する能力を試験した。各群由来の血清希釈液によるＨｅｐ−２細胞のインキュベーションの前に、細胞を生ＲＳＶで短時間にわたってプレインキュベートした。感染性ウイルスプラークの数を計数し、融合阻害を、プラーク形成の５０％阻害をもたらす希釈度の逆数として表した。図４５は、Ｈｅｐ−２細胞の融合性感染が、感染ラット、またはアジュバントを伴うもしくは伴わないＲＳＶ  Ｆワクチンにより免疫したラット由来の４９日目の血清により阻害されたことを示す。しかしながら、融合阻害はアジュバントの存在により増強された。さらに、２８日目の時点では、アジュバントを伴うＲＳＶ  Ｆワクチンで免疫したラット由来の血清のみが融合を阻害した。ＲＳＶ  Ｆタンパク質によるラット血清のプレインキュベーションは、表１２に示すように、全ての群における融合阻害能力を抑制しており、このことは、融合の阻害がＲＳＶ  Ｆ特異的抗体により媒介されたことを示している。
【０２８３】
【表１５】
2014530010.tif 000017
【０２８４】
[0315]  個々の動物由来の血清試料の、ＲＳＶ  Ｆへの結合に関してパリビズマブモノクローナル抗体と競合する能力を評価した。プレートに結合したＲＳＶ  Ｆによるインキュベーション前にビオチン化パリビズマブで血清試料の段階希釈液をインキュベートし、その後、結合したパリビズマブをアビジン−ＨＲＰで検出した。パリビズマブ結合の５０％阻害を示す抗体の幾何学的平均力価の逆数としてデータを示した。ＦＩ−ＲＳＶ免疫動物から得た血清は、パリビズマブ結合を阻害しなかった。パリビズマブ結合の最小限の阻害を、生ＲＳＶで処理した動物由来の血清で観察した。これに対して、ＲＳＶ  Ｆワクチンで免疫した動物由来の血清は、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子への結合に関してパリビズマブとの競合を示し、競合は、アジュバントも受容した動物由来の血清でさらに増強された（図４６）。
【０２８５】
[0316]  各群内の動物由来のコットンラット血清の、他のＲＳＶ−Ｆ特異的モノクローナル抗体の結合を阻害する能力も評価した。ＲＳＶ  Ｆタンパク質の部位Ｉ（1243）、ＩＩ（1107および1153）、またはＩＶ、Ｖ、ＶＩ（1112および1269）に結合する抗体１１０７、１１５３、１２４３、１１１２または１２６９の結合の血清媒介阻害を測定した。プレートに結合したＲＳＶ  Ｆによるインキュベーション前にビオチン化抗体１１０７、１１５３、１１１２、１２６９、または１２４３で各群由来の血清の段階希釈液をインキュベートし、その後アビジン−ＨＲＰにより検出した。ＲＳＶ  Ｆへの結合が５０％阻害された最高希釈度の逆数として５０％阻害力価を算出した。図４７に示すように、ＲＳＶ  Ｆに結合する中和ＲＳＶ  Ｆ特異的モノクローナル抗体の阻害は、ＦＩ−ＲＳＶまたは生ＲＳＶ−Ａ２で免疫したラットと比べて、ＲＳＶ  Ｆワクチンで免疫したラット由来の血清により増強され、アジュバントの存在下でさらに増強された。
【０２８６】
[0317]  ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンによる免疫化によって誘導された抗ＲＳＶ抗体の結合活性を、ＦＩ−ＲＳＶによる免疫化によって誘導された抗ＲＳＶ抗体の結合活性と比較した。結合したＲＳＶ抗原を有するプレート中でコットンラット血清の段階希釈液をインキュベートするダイレクトＥＬＩＳＡを行い、尿素７モルの洗浄工程前後で結合した抗体のレベルを測定した。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチン免疫動物由来の血清中の抗体は、ＦＩ−ＲＳＶ免疫動物由来の血清中の抗体と比べてＲＳＶに対する高い結合活性を示した（図４８）。尿素洗浄前後に結合した抗体の量で示すように、ワクチン免疫動物由来の血清中のＲＳＶ特異的抗体のより大きな割合が高結合活性であった（図４８および表１３）。
【０２８７】
【表１６】
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【０２８８】
[0318]  前述した詳細な説明は理解を明瞭にするために与えられているに過ぎず、当業者には変更が明らかであるだろうことから詳細な説明から不必要な限定が解釈されてはならない。これは、本明細書に記載された任意の情報が先行技術であること、もしくは現在特許請求されている本発明に関するものであること、または具体的にもしくは非明示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【０２８９】
[0319]  別途定義されない限り、本明細書で使用した全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２９０】
[0320]  本願は読者の注目が具体的な実施形態に向くように節に分割されているが、そのような節が実施形態の区分であると解釈されてはならない。各節およびそこに記載されている実施形態の教示は、他の節に適用可能である。
【０２９１】
[0321]  本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更が可能であること、ならびに概して本発明の原理に従う本発明のいかなる変形、使用、または適用、および本開示からのそのような逸脱を含む本発明のいかなる変形、使用、または適用を、本発明が関わる技術分野における既知のまたは通常の実践の範囲内にあるものとして、ならびに以上に記載された本質的な特徴に適合されることができるものとして、および添付した特許請求の範囲に従うものとして網羅することを本願が意図していることが理解されるだろう。
【図１】
2014530010.tif 000019
【図２】
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【図３】
2014530010.tif 000021
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2014530010.tif 000025
【図７Ｂ−Ｄ】
2014530010.tif 000026
【図８】
2014530010.tif 000027
【図９】
2014530010.tif 000028
【図１０】
2014530010.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
2014530010.tif 000031
【図１３】
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【図１４】
2014530010.tif 000033
【図１５】
2014530010.tif 000034
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2014530010.tif 000036
【図１６Ｃ】
2014530010.tif 000037
【図１６Ｄ】
2014530010.tif 000038
【図１７】
2014530010.tif 000039
【図１８】
2014530010.tif 000040
【図１９】
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【図２０】
2014530010.tif 000042
【図２１】
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【図２２】
2014530010.tif 000044
【図２３】
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【図２４】
2014530010.tif 000046
【図２５】
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【図２６Ａ−Ｂ】
2014530010.tif 000048
【図２６Ｃ−Ｄ】
2014530010.tif 000049
【図２７】
2014530010.tif 000050
【図２８】
2014530010.tif 000051
【図２９】
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【図３０】
2014530010.tif 000053
【図３１】
2014530010.tif 000054
【図３２】
2014530010.tif 000055
【図３３】
2014530010.tif 000056
【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
2014530010.tif 000059
【図３７】
2014530010.tif 000060
【図３８】
2014530010.tif 000061
【図３９】
2014530010.tif 000062
【図４０Ａ】
2014530010.tif 000063
【図４０Ｂ】
2014530010.tif 000064
【図４１】
2014530010.tif 000065
【図４２】
2014530010.tif 000066
【図４３】
2014530010.tif 000067
【図４４】
2014530010.tif 000068
【図４５】
2014530010.tif 000069
【図４６】
2014530010.tif 000070
【図４７】
2014530010.tif 000071
【図４８】
2014530010.tif 000072
【配列表】
2014530010000001.app
【国際調査報告】
2014530010.tif 000073
2014530010.tif 000074