(57)【要約】  放射性核種及びキレーターとコンジュゲートされた単離ポリペプチドを含んでなるイメージング剤であって、単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合するイメージング剤、並びにこれらのイメージング剤の製造方法及び使用方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドをＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターとコンジュゲートして形成されたＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを含んでなるイメージング剤組成物であって、単離されたＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する、イメージング剤組成物。
【請求項２】
請求項１記載のイメージング剤組成物の製造方法であって、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意する段階、（ｉｉ）ポリペプチドをＮＯＴＡキレーターと反応させてＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階、及び（ｉｉｉ）ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドをＡｌ18Ｆ部分と反応させてＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階を含んでなる方法。
【請求項３】
18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターの製造方法であって、ＮＯＴＡキレーターをＡｌ18Ｆ源と反応させる段階を含んでなる方法。
【請求項４】
前記ＮＯＴＡキレーターがＮＯＴＡキレーター部分及びリンカーを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載のイメージング剤組成物の製造方法であって、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意する段階、（ｉｉ）ポリペプチドを、ＮＯＴＡキレーター部分及びリンカーを含むＮＯＴＡキレーターと反応させてＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階、並びに（ｉｉｉ）ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを18Ｆ部分又は18Ｆ源と反応させる段階を含んでなる方法。
【請求項６】
請求項１記載のイメージング剤組成物及び薬学的に許容されるキャリヤーを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ヒト上皮増殖因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２）と結合するイメージング剤並びにかかる薬剤の製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮増殖因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２）は、膜貫通タンパク質であると共に、ｅｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼタンパク質の一員である。ＨＥＲ２は、乳癌、卵巣癌、肺癌、胃癌及び口腔癌を含む多種多様の癌において過剰発現される十分に確立されたバイオマーカーである。したがってＨＥＲ２は、分子標的として、及び患者生存の診断又は予後判定指標、或いは抗腫瘍手術に対する応答の予測マーカーとして大きな価値を有する。
【０００３】
最近の１０年間を通じ、様々なイメージングモダリティーを用いたＨＥＲ２発現の非侵襲的分子イメージングが広範囲に研究されてきた。これらのモダリティーには、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）及び単光子放出断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）による放射性核種イメージングが含まれる。ＨＥＲ２のＰＥＴ及びＳＰＥＣＴイメージング（それぞれＨＥＲ２−ＰＥＴ及びＨＥＲ２−ＳＰＥＣＴ）は、高い感度及び高い空間分解能を与える。ＨＥＲ２のＰＥＴイメージングはまた、強い定量化能力も与える。ＨＥＲ２−ＰＥＴ及びＨＥＲ２−ＳＰＥＣＴは、患者における全体的な腫瘍ＨＥＲ２発現のリアルタイムアッセイ、ＨＥＲ標的化治療（例えば、トラスツズマブに基づく療法）のための患者の選択、治療に対する応答の予測、薬物効力の評価及びその他多くの用途において特に有用である。しかし、臨床用途に適するような化学的性質を有しかつインビボ挙動を示すＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ標識ＨＥＲ２リガンドは開発されていない。
【０００４】
天然のブドウ球菌プロテインＡは、免疫グロブリンアイソタイプＧ（ＩｇＧ）の結晶性領域（Ｆｃ）であるフラグメントと結合する三重ヘリックス構造（足場）を形成するドメインを含んでいる。プロテインＡのＺドメインから導かれるある種のポリペプチドは、ループによって連結された３本のαヘリックスからなる足場を含んでいる。これらのヘリックスの２本上に位置する特定のアミノ酸残基は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合部位をなしている。ヘリックス１及び２上に位置する表面に露出したアミノ酸残基（１３の残基）を置換してこれらの分子の結合能力を変化させることで、別の結合剤分子が製造された。その一例がＨＥＲ２結合分子又はＨＥＲ２結合剤である。これらのＨＥＲ２結合剤がＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ活性の放射性核種で標識された。かかるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ標識結合剤は、患者におけるインビボＨＥＲ２発現パターンを測定する能力を与え、したがって臨床医達及び研究者達にとってＨＥＲ２関連疾患状態を診断、予後判定及び治療する際の助けとなろう。
【０００５】
ＰＥＴ活性の放射性核種18Ｆで放射性標識されたＨＥＲ２結合性Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子は、ＨＥＲ２を過剰発現する悪性腫瘍に関するイメージング剤として評価されてきた。ｍａＧＧＧ（メルカプトアセチルトリグリシル）、ＣＧＧ（システイン−ジグリシル）、ＣＧＧＧ（配列番号６）（システイン−トリグリシル）又はＡＡ３のようなキレーターを介して99mＴｃとコンジュゲートされたＨＥＲ２結合性Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子もまた、診断イメージングのために使用されてきた。標的ＨＥＲ２発現腫瘍に対するこれらの分子の結合はマウスで実証されている。
【０００６】
大抵の場合、信号生成18Ｆ基はチオール反応性マレイミド基を介してＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）中に導入される。チオール反応性マレイミド基は、18Ｆ組込み後に多段階合成法を用いて製造される。しかし、この化学的原理は低い放射化学収率しか与えない。同様に、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）への99mＴｃのコンジュゲーションは多段階プロセスである。加えて、Ｔｃ還元及びキレーターとの錯体形成には、高いｐＨ条件（例えば、ｐＨ＝１１）及び長い反応時間が要求される。
【０００７】
18Ｆ標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子のインビボ性能は適度に良好であるものの、かなりの改良の余地が存在する。例えば、若干の研究では、腫瘍取込みはイメージング剤の注射後２時間で６．３６±１．２６％ＩＤ／ｇにすぎないことが判明した。
【０００８】
したがって、例えば18Ｆのような放射性部分を最終段階で導入でき、ひいては高い放射化学収率を与える放射性標識ポリペプチドを合成するための化学的原理及び方法に対するニーズが存在している。加えて、特に腎クリアランス及び毒性効果に関して改善された性質を有する、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージング用の新規なＨＥＲ２標的化イメージング剤に対するニーズも存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
国際公開第２００８／１１８６０１号パンフレット
【発明の概要】
【００１０】
本発明の組成物は、ＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合し得る新規な種類のイメージング剤である。
【００１１】
１以上の実施形態では、本イメージング剤組成物は、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを、ジアミンジオキシムキレーターを介して99mＴｃとコンジュゲートしたものを含んでいる。ジアミンジオキシムキレーターは、Ｐｎ２１６、ｃＰｎ２１６、Ｐｎ４４又はこれらの誘導体からなり得る。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する。
【００１２】
１以上の実施形態では、本イメージング剤組成物は、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを、ＮＯＴＡキレーターを介して67Ｇａ又は68Ｇａとコンジュゲートしたものを含んでいる。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する。
【００１３】
１以上の実施形態では、本イメージング剤組成物は、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドをＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターとコンジュゲートしたものを含んでいる。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する。
【００１４】
１以上の実施形態では、本イメージング剤組成物は、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを、リンカーを介して18Ｆとコンジュゲートしたものを含んでいる。リンカーは、アミノオキシ基、アジド基及びアルキン基から導かれる基を含んでいる。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する。
【００１５】
１以上の実施形態では、本イメージング剤組成物は、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを、同位体フッ素交換化学によって18Ｆとコンジュゲートしたものを含んでいる。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する。
【００１６】
１以上の実施形態では、本明細書中に記載されるようなイメージング剤組成物の製造方法が提供される。イメージング剤組成物を製造するための本発明の方法の一例は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意する段階、及び（ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させてキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階を含んでいる。別の例では、本方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意する段階、（ｉｉ）ポリペプチドをリンカーと反応させる段階、及び（ｉｉｉ）リンカーを18Ｆ部分と反応させて18Ｆコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階を含んでいる。リンカーは、アミノオキシ基、アジド基又はアルキン基を含み得る。
【００１７】
別の例では、本方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意する段階、（ｉｉ）ポリペプチドをＮＯＴＡキレーターと反応させてＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階、及び（ｉｉｉ）ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドをＡｌ18Ｆ部分と反応させてＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階を含んでいる。
【００１８】
別の例では、本方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意する段階、（ｉｉ）ポリペプチドをフッ化ケイ素（例えば、［18Ｆ］−フッ化ケイ素）含有部分と反応させてフッ化ケイ素コンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階、及び（ｉｉｉ）フッ化ケイ素コンジュゲート化ポリペプチドを18Ｆ部分と反応させて18Ｆ−フッ化ケイ素コンジュゲート化ポリペプチドを形成する段階を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。
【図１Ａ】図１Ａは、８種の濃度の抗ＨＥＲ２ポリペプチドＺ４７７（配列番号３）のヒトＨＥＲ２に対する結合親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、８種の濃度の抗ＨＥＲ２ポリペプチド(Ｚ４７７)2（配列番号５）のヒトＨＥＲ２に対する結合親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｃ６（ラット神経膠腫）の定性的フローサイトメトリーのグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣癌）に対するヒト抗ＨＥＲ２抗体の定性的フローサイトメトリーのグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＳＫＯＶ３及びＣ６細胞株に関する細胞当たりのＨｅｒ２受容体についての棒グラフを示している。
【図３】図３は、腫瘍タイプＳＫＯＶ３  ２−１、ＳＫＯＶ３  ３−１、ＳＫＯＶ３  ３−４のパネル、ＳＫＯＶ３細胞及びブランクに関するＨｅｒ２のＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフである。
【図４】図４は、99mＴｃ標識Ｚ００４７７（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣガンマクロマトグラムである。
【図５Ａ】図５Ａは、ｐＨ９での凝集99mＴｃ(ＣＯ)3(Ｈｉｓ６)Ｚ００４７７（配列番号４）（‘Ｈｉｓ６’は配列番号７として開示されている）のサイズ排除ＨＰＬＣガンマクロマトグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、非凝集99mＴｃ(ＣＯ)3(Ｈｉｓ６)Ｚ００４７７（‘Ｈｉｓ６’は配列番号７として開示されている）標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）標準のサイズ排除ＨＰＬＣガンマクロマトグラムである。
【図６】図６は、経時的な腫瘍：血液比を含む、ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスからの血液、腫瘍、肝臓、腎臓及び脾臓試料におけるＺ００４７７（配列番号３）の体内分布プロファイルのグラフである。
【図７】図７は、Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６リンカーの化学構造の図式である。
【図８Ａ】図８Ａは、精製Ｚ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６に関するエレクトロスプレーイオン化飛行時間質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、精製Ｚ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６に関する質量デコンボリューション結果のグラフである。
【図９】図９は、99mＴｃで標識されたＺ０２８９１−ｃＰＮ２１６（配列番号２）に関する逆相ＨＰＬＣガンマトレースクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスからの血液、肝臓、腎臓、脾臓及び尾試料における、ｃＰＮ２１６を介して99mＴｃで標識されたＺ０２８９１（配列番号２）の体内分布プロファイル（％ＩＤ、％注射量）のグラフである。
【図１１】図１１は、ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスからの腫瘍、血液、肝臓、腎臓、膀胱／尿、尾、腸及び脾臓試料における、ｃＰＮ２１６を介して99mＴｃで標識されたＺ０２８９１（配列番号２）の体内分布プロファイル（％ＩＤ、％注射量）のグラフである。
【図１２】図１２は、ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスにおけるＺ０２８９１（配列番号２）の体内分布プロファイルのグラフであって、腫瘍：血液比を示している。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｂｏｃ保護マルイミド−アミノオキシ（Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ）リンカーの化学構造の図式であって、ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ビロル−１−イル）エチルアミノ）−２−オキソエトキシカルバメート（Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ）の化学構造を示している。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、マルイミド−アミノオキシ（Ｍａｌ−ＡＯ）リンカーの化学構造の図式であって、２−（アミノオキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ビロル−１−イル）エチル）アセトアミド塩酸塩（Ｍａｌ−ＡＯ・ＨＣｌ）の化学構造を示している。
【図１４Ａ】図１４Ａは、２８０ｎｍで分析したＺ００３４２（配列番号１）出発原料の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、２８０ｎｍで分析した精製Ｚ００３４２（配列番号１）−ＡＯイメージング剤組成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、18Ｆ−フルオロベンジル−Ｚ００３４２（配列番号１）及び18Ｆ−フルオロベンジル−Ｚ０２８９１（配列番号２）の粗反応混合物並びに精製最終生成物に関する逆相ＨＰＬＣガンマクロマトグラムである。
【図１６】図１６は、ＳＫＯＶ３腫瘍担持動物における、18Ｆで標識したＺ０２８９１（配列番号２）ポリペプチドの体内分布プロファイル（％ＩＤ、％注射量）のグラフである。
【図１７】図１７は、ＳＫＯＶ３腫瘍担持動物における、18Ｆで標識したＺ０２８９１（配列番号２）ポリペプチドの体内分布プロファイル（％ＩＤ、％注射量）及び腫瘍：血液比のグラフである。
【図１８】図１８は、血液、腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓及び骨試料における、18Ｆ標識Ｚ００３４２（配列番号１）及び18Ｆ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）の体内分布プロファイル（％ＩＤ、％注射量）の棒グラフである。
【図１９】図１９は、Ｍａｌ−ＮＯＴＡリンカーの化学構造の図式である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡに関するエレクトロスプレーイオン化飛行時間質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡに関するＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳの質量デコンボリューション結果のグラフである。
【図２１】図２１は、１時間の反応後における67Ｇａ標識Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡの粗反応混合物に関する逆相ＨＰＬＣガンマトレースのグラフである。
【図２２】図２２は、精製67Ｇａ標識ＮＯＴＡ  Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡポリペプチドに関する逆相ＨＰＬＣガンマトレースのグラフである。
【図２３】図２３は、製剤化２の分析ＨＰＬＣである［上段は２８０ｎｍでのＵＶチャネルであって、０．５分にアスコルビン酸塩及び４．５分にペプチド前駆体３を示しており、下段は放射能チャネルであって、５．１分に２（ＲＣＰ  ９５％）及び４．６分に分解生成物を示している。］。
【図２４】図２４は、ｔＣ２  ＳｅｐＰａｋ精製を用いて２を製造するためのＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットレイアウトである。
【図２５】図２５は、ＦＡＳＴｌａｂ（商標）を用いて製造された製剤化２の分析ＨＰＬＣである［上段は放射能チャネルであって、２（７．７分）、18Ｆ−ＦＢＡ（１０．４分）及び未知不純物（１２．２分）を示しており、中段は２８０ｎｍでのＵＶチャネルであって、ｐ−アミノ安息香酸製剤添加剤（３分）を示しており、下段は３５０ｎｍでのＵＶチャネルであって、ジメチルアミノベンズアルデヒド副生物（１０．２分）及び未知不純物（３．８分）を示している。］。
【図２６】図２６は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ精製を用いて２を製造するためのＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットレイアウトである。
【図２７】図２７は、ＦＡＳＴｌａｂをＳｅｐｈａｄｅｘ精製と共にを用いて製造された製剤化２の分析ＨＰＬＣである［上段は放射能チャネルであって、２（７．１分）、18Ｆ−ＦＢＡ（８．８分）及び未知不純物（１０．２分）を示しており、中段は２８０ｎｍでのＵＶチャネルであり、下段は３５０ｎｍでのＵＶチャネルであって、ジメチルアミノベンズアルデヒド副生物（１０．０分）を示している。］。
【図２８】図２８は、製剤化５の分析ＨＰＬＣである［上段は放射能チャネルであって、生成物（４．７分、９２％）及び副生物（３．９分、８％）を示しており、下段は２８０ｎｍでのＵＶチャネルである。］。
【図２９】図２９は、５の経時試験を表していて、分析ラジオＨＰＬＣによって測定した標識効率を示している。
【図３０】図３０は、ペプチド／ＡｌＣｌ3濃度を高めた後における５の分析ＲＣＹである（Ｐ：生成物、ＢＰ：副生物、図２８参照）。
【図３１】図３１は、５の標識混合物の分析ＨＰＬＣプロファイルである（上段のトレースは放射能チャネルであり、下段のトレースは２８０ｎｍでのＵＶチャネルである。）。
【図３２】図３２は、単離７の分析放射能チャネルＨＰＬＣである（赤色は放射能チャネルであり、青色は２８０ｎｍでのＵＶチャネルである。）。
【図３３】図３３は、免疫組織化学（ＤＡＫＯ社製ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ）による、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＡ４３１異種移植モデルからの腫瘍切片におけるＨＥＲ２タンパク質発現を表している。左側の画像は倍率２×のものであり、右側の画像はハイライトされた正方形の１０×のものである。
【図３４】図３４は、９、２、５及び７のナイーブマウス体内分布を示している。
【図３５】図３５は、ＮＣ８７／Ａ４３１腫瘍担持マウスにおける９、２、５及び７の体内分布を示している。
【図３６】図３６は、二重腫瘍異種移植モデルにおける２の体内分布プロファイルを示している。
【図３７】図３７は、増加する濃度の非放射性前駆体を用いた２のＮＣＩ−Ｎ８７異種移植体内分布プロファイルを示している。
【図３８】図３８は、二重腫瘍異種移植モデルにおける２の予備的イメージング（Ａ）及びＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の９イメージング試験（Ｂ）との比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のイメージング剤組成物は、一般に、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体の単離ポリペプチドを放射性同位体（例えば、18Ｆ、99mＴｃ、67Ｇａ又は68Ｇａ、111Ｉｎ、123Ｉ、124Ｉ、89Ｚｒ或いは64Ｃｕ）とコンジュゲートしたものを含んでいる。また、かかる組成物の製造方法及び使用方法も提供される。かかる単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体と特異的に結合する。一実施形態では、単離ポリペプチドの配列は、配列番号１、配列番号２及びこれらの保存的変異体のいずれかに対して９０％以上の配列類似性を有している。
【００２１】
単離ポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸、又は天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸模倣体を含み得る。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってエンコードされるもの、並びに後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、ホスホトレオニン及びホスホチロシンである。
【００２２】
単離ポリペプチドは、標準的な固相合成技法を用いて製造できる。別法として、ポリペプチドは組換え技法を用いて製造することもできる。組換え技法を用いてポリペプチドを製造する場合には、ポリペプチド又はその保存的変異体をエンコードするＤＮＡを単離すればよい。ポリペプチド又はその保存的変異体をエンコードするＤＮＡをクローニングベクター中に挿入し、宿主細胞（例えば、真核細胞、植物細胞又は原核細胞）中に導入し、当技術分野で認められている任意の発現系を用いて発現させればよい。
【００２３】
ポリペプチドは、実質的にただ１種のキラル形のアミノ酸残基からなり得る。したがって、本発明のポリペプチドは実質的にＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸からなり得るが、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の組合せも使用できる。
【００２４】
本明細書中に示されるポリペプチドはプロテインＡのＺドメインから導かれるので、結合界面上の残基は、結合活性を保存しながら非保存的に置換又は保存的に置換されていてもよい。若干の実施形態では、置換残基は２０の天然アミノ酸のいずれか又はその任意の類似体から導くことができる。
【００２５】
ポリペプチドの長さは、約４９残基乃至約１３０残基であり得る。詳細なポリペプチド配列を表１中に示す。
【００２６】
【表１】
2014507400.tif 000002
選択された機能性を付与するため、末端に追加の配列を付加することができる。即ち、単独の又は（例えば、ポリペプチドにＨｉｓタグを付加することで）結合標的に連結したポリペプチドの精製又は単離を容易にするため、一方又は両方の末端に追加の配列を付加することができる。
【００２７】
表１中に示したポリペプチドは、リンカーを介して18Ｆと、ジアミンジオキシムキレーターを介して99mＴｃと、ＮＯＴＡキレーターを介して67Ｇａ又は68Ｇａと、Ａｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターを介して18Ｆと、ＳｉＦＡ（即ち、フッ化ケイ素アクセプター）又はフッ化ケイ素交換化学によって18Ｆと、ＤＯＴＡキレーター化学によって111Ｉｎと、ヨードベンズアルデヒドを用いるフルオロベンズアルデヒド様化学によって123Ｉと、或いはＮＯＴＡキレーター化学によって64Ｃｕとコンジュゲートすることができる。表２は。これらのポリペプチドの等電点（ｐＩ）を示している。
【００２８】
【表２】
2014507400.tif 000003
１以上の実施形態では、配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドは18Ｆとコンジュゲートし得る。18Ｆは、単離ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端又は中間位置に組み込むことができる。
【００２９】
１以上の実施形態では、18Ｆはリンカーを介して単離ポリペプチドとコンジュゲートし得る。リンカーは、アミノオキシ基、アジド基又はアルキン基を含み得る。リンカーのアミノオキシ基は、アルデヒド（例えば、フッ素置換アルデヒド）と結合し得る。リンカーのアジド基は、フッ素置換アルキンと結合し得る。同様に、リンカーのアルキン基はフッ素置換アジドと結合し得る。リンカーはまた、チオール反応基を含み得る。リンカーは、マレイミド−アミノオキシ基、マレイミド−アルキン基又はマレイミド−アジド基を含み得る。18Ｆコンジュゲート化ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ポリマーラベルを、アミノオキシ基、アジド基又はアルキン基を含むリンカーと反応させてリンカーコンジュゲート化ポリペプチドを形成し、リンカーを18Ｆ部分と反応させて18Ｆコンジュゲート化ポリペプチドを形成することによって製造できる。
【００３０】
18Ｆコンジュゲート化ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ポリマーラベルを、マレイミド−アミノオキシ基、マレイミド−アルキン基又はマレイミド−アジド基を含むリンカーと反応させてリンカーコンジュゲート化ポリペプチドを形成し、リンカーを18Ｆ部分と反応させて18Ｆコンジュゲート化ポリペプチドを形成することによって製造できる。
【００３１】
別の実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）リンカーを用意し、（ｉｉｉ）リンカーを18Ｆ部分と反応させて18Ｆ標識リンカーを形成し、（ｉｖ）18Ｆ標識リンカーを配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体の単離ポリペプチドと反応させて18Ｆコンジュゲート化ポリペプチドを形成することを含み得る。
【００３２】
上述した例を用いて、フッ素又は放射性フッ素原子（例えば、18Ｆ）をポリペプチド上に導入することができる。フッ素置換アルデヒドをリンカーコンジュゲート化ポリペプチドのアミノオキシ基と反応させた場合には、フッ素置換ポリペプチドが得られる。同様に、フッ素置換アジド又はアルキンをリンカーコンジュゲート化ポリペプチドのそれぞれアルキン基又はアジド基と反応させた場合には、フッ素置換ポリペプチドが得られる。放射性フッ素置換アルデヒド、アジド又はアルキンをリンカーコンジュゲート化ポリペプチドのそれぞれアミノオキシ基、アルキン基又はアジド基と反応させた場合には、放射性フッ素標識ポリペプチド又はイメージング剤組成物が得られる。さらに、放射性フッ素標識イメージング剤組成物を製造するため、リンカーは放射性フッ素（18Ｆ）置換基を有し得る。ポリペプチド上にフッ素を導入するための方法は、任意の長さのフッ素化イメージング剤組成物を製造するためにも使用できる。かくして、若干の実施形態では、イメージング剤組成物のポリペプチドは例えば４０〜１３０のアミノ酸残基を含み得る。
【００３３】
本発明のイメージング剤又はイメージング剤組成物の製造で使用するためのリンカーコンジュゲート化ポリペプチド又は18Ｆコンジュゲート化リンカーは、以前に知られていた方法より効率的でありかつ一層高い収率をもたらす本発明の方法によって製造できる。本方法は実施が容易であり、迅速であり、より温和でユーザーフレンドリーな条件下で実行される。例えば、ポリペプチドを18Ｆコンジュゲート化リンカー（例えば、18Ｆ−フルオロベンズアルデヒド）（「18Ｆ−ＦＢＡ」）で標識するための方法は、当技術分野で知られている方法より簡単である。18Ｆコンジュゲート化リンカーは、トリメチルアニリニウム前駆体上への18Ｆの直接求核組込みにより、一段階で製造される。次いで、18Ｆ−リンカー（即ち、18Ｆ−ＦＢＡ）がポリペプチド（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）及び本明細書中に記載されるもの）にコンジュゲートされる。リンカーの製造もまた、当技術分野で以前に知られていた方法より容易である。その上、放射性標識アミノオキシ系リンカーコンジュゲート化ポリペプチド及びｃＰｎファミリーキレーターコンジュゲート化ポリペプチド（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））は、著しく良好な体内分布及び良好な腫瘍取込み並びに肝臓取込みの少ない良好なクリアランスを示す。
【００３４】
フッ素標識イメージング剤組成物は、診断用途において大いに所望される材料である。18Ｆ標識イメージング剤組成物は、ＰＥＴのような確立されたイメージング技法を用いて可視化することができる。
【００３５】
別の実施形態では、ポリペプチドは次の式（１）のジアミンジオキシムキレーターを介して99mＴｃとコンジュゲートし得る。
【００３６】
【化１】
2014507400.tif 000004
式中、Ｒ'、Ｒ''、Ｒ'''及びＲ''''は独立にＨ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10アルキルアミン又はＣ1-10フルオロアルキルであるか、或いは２以上のＲ基がこれらの結合した原子と共に炭素環式又は複素環式の飽和又は不飽和環を形成する。この場合、ＲはＨ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10アルキルアミン又はＣ1-10フルオロアルキルであり得る。一実施形態では、ｎは０〜５であり得る。ジアミンジオキシムキレーターの製造方法の例は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏ  ｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ”と題する国際公開第２００４／０８０４９２号、及び“Ｒａｄｉｏ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ＲＧＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｌｉｃｋ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”と題する国際公開第２００６／０６７３７６号に記載されており、これらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。
【００３７】
99mＴｃは、単離ポリペプチドのＮ末端において、ジアミンジオキシムを介して単離ポリペプチドとコンジュゲートし得る。キレーターは二官能性化合物であり得る。一実施形態では、二官能性化合物はＭａｌ−ｃＰＮ２１６であり得る。Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は、配列番号１又は配列番号２のポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び99mＴｃとのキレート化のためのビス−アミンオキシム基（ジアミンジオキシムキレーター）を含んでいる。Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は次の式（ＩＩ）を有し得る。
【００３８】
【化２】
2014507400.tif 000005
ジアミンジオキシムキレーターコンジュゲート化ペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させてジアミンジオキシムキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成することによって製造できる。ジアミンジオキシムキレーターは、さらに99mＴｃとコンジュゲートし得る。
【００３９】
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ"−三酢酸）キレーターを介して67Ｇａ又は68Ｇａとコンジュゲートし得る。ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ＮＯＴＡキレーターをポリペプチドと反応させてＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成することによって製造できる。ＮＯＴＡキレーターは、さらに67Ｇａ又は68Ｇａとコンジュゲートし得る。
【００４０】
一実施形態では、Ｇａ（具体的には67Ｇａ）はＮＯＴＡキレーターを介して単離ポリペプチドとコンジュゲートし得る。ＮＯＴＡキレーターは、次の式（ＩＩＩ）に示されるように、マレイミド基で官能化することができる。
【００４１】
【化３】
2014507400.tif 000006
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ"−三酢酸）キレーターを介してＡｌ18Ｆとコンジュゲートし得る。ＮＯＴＡコンジュゲート化ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ＮＯＴＡキレーターをポリペプチドと反応させてＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成することによって製造できる。次いで、ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドをさらにＡｌ18ＦとコンジュゲートしてＡｌ18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成し得る。
【００４２】
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡキレーターを介して18Ｆとコンジュゲートし得る。ＮＯＴＡコンジュゲート化ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ＮＯＴＡキレーターを18Ｆ源（例えば、Ａｌ18Ｆ）と反応させて18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターを形成し、（ｉｉｉ）18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターを単離ポリペプチドと反応させて18Ｆ−ＮＯＴＡキレーターコンジュゲート化ポリペプチドを形成することによって製造できる。
【００４３】
１以上の実施形態では、キレーターはキレーター部分（例えば、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ）を単独で含むか、或いは（本明細書中にそれぞれ記載されているような）キレーター部分及びリンカーを含むことができる。例えば、ＮＯＴＡキレーターは、ＮＯＴＡキレーター部分単独或いは本明細書中に記載されているようなリンカーに結合したＮＯＴＡキレーター部分を表すことができる。
【００４４】
１以上の実施形態では、ポリペプチドはＳｉＦＡ化学によって18Ｆとコンジュゲートし得る。18Ｆ−ＳｉＦＡコンジュゲート化ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はこれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意し、（ｉｉ）ポリペプチドを、フッ化ケイ素アクセプター（ＳｉＦＡ）基を含むリンカーと反応させてＳｉＦＡコンジュゲート化ポリペプチドを形成し、（ｉｉｉ）ＳｉＦＡコンジュゲート化ポリペプチドを18Ｆ部分又は18Ｆ源と反応させることによって製造できる。18Ｆ部分又は18Ｆ源は、ＳｉＦＡ基と反応して同位体フッ素交換化学を受けることができる任意のかかる部分又は源であり得る。下記のスキーム１は、［18Ｆ］ＳｉＦカップリングを用いたＺ０２８９１（配列番号２）の放射性標識を示している。
【００４５】
【化４】
2014507400.tif 000007
１以上の実施形態では、本明細書中に記載されているような本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物の製造方法は自動化される。例えば、本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、自動放射合成装置の使用により、自動化方式で簡便に製造できる。かかるプラットホーム装置には、ＴＲＡＣＥＲｌａｂ（商標）（例えば、ＴＲＡＣＥＲｌａｂ（商標）ＭＸ）及びＦＡＳＴｌａｂ（商標）（共にＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ製）をはじめとするいくつかの市販例が存在している。かかる装置は通常、放射化学を実施するための（大抵は使い捨ての）「カセット」を含んでいて、これは放射合成を実施するため装置に取り付けられる。カセットは、普通、流体通路、反応器、及び試薬バイアルを受け入れるためのポート並びに放射合成後の清掃段階で使用される任意の固相抽出カートリッジを含んでいる。任意には、本発明のさらに別の実施形態では、自動放射合成装置を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に連結することができる。
【００４６】
したがって本発明は、本明細書中にそれぞれ記載されているような本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物の自動化合成のためのカセットを提供する。
【００４７】
本発明はまた、被験体の少なくとも一部をイメージングする方法も提供する。一実施形態てば、本方法は、本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物を被験体に投与する段階、及び被験体をイメージングする段階を含んでいる。被験体は、例えば診断装置を用いてイメージングすることができる。
【００４８】
１以上の実施形態では、イメージング方法はさらに、被験体への薬剤又は組成物の送達ょモニターする段階、及びＨＥＲ２関連疾患状態（例えば、乳癌）について被験体を診断する段階を含み得る。一実施形態では、被験体は哺乳動物、例えばヒトであり得る。別の実施形態では、被験体は細胞又は組織であり得る。組織は生検に際して使用できる。診断装置は、磁気共鳴イメージング、光学イメージング、光学コヒーレンス断層撮影、Ｘ線、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）及びこれらの組合せから選択されるイメージング方法を使用できる。
【００４９】
本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、ヒト及び他の動物に、医薬組成物として非経口的に投与できる。本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載されているような放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物、及び薬学的に許容されるキャリヤー、溶媒又は希釈剤を含んでいる。
【００５０】
例えば、非経口注射用の本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される無菌の水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液を含むか、或いは使用直前に無菌の注射可能な溶液又は分散液に再構成するための無菌粉末を含んでいる。好適な水性及び非水性キャリヤー、希釈剤、溶媒又はビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）並びに注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）がある。例えば、レシチンのようなコーティング材料を使用すること、分散液中の粒度を調整すること、及び界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持できる。
【００５１】
本発明の医薬組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤を含み得る。微生物の作用の防止は、各種の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）を含めることによって確保できる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが望ましい場合もある。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることで達成できる。
【００５２】
本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、潜在的な毒性を最小化するため、生理学的に許容されるキャリヤー中に分散させることができる。即ち、イメージング剤は約６〜約８のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させ得る。若干の実施形態では、約７〜約７．４のｐＨを有する生体適合性溶液中に薬剤を分散させる。他の実施形態では、約７．４のｐＨを有する生体適合性溶液中に薬剤を分散させる。
【００５３】
本発明のイメージング剤組成物又は医薬組成物は、化合物を水性媒質中に懸濁又は溶解するため製薬業界で常用される他の添加剤と併用でき、次いで懸濁液又は溶液を当技術分野で知られている技法によって滅菌できる。イメージング剤組成物は各種の形態で投与できると共に、選択された投与経路に合わせて製剤化できる。例えば、薬剤は局所に（即ち、組織又は粘膜経由で）、静脈内に、筋肉内に、皮内に、又は皮下に投与できる。注射に適した形態には、無菌の水性溶液又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液、分散液、リポソーム製剤又はエマルジョン製剤を調製するための無菌粉末がある。吸入用に適した形態には、エーロゾル中に分散させたもののような薬剤がある。局所投与に適した形態には、クリーム、ローション、軟膏などがある。
【００５４】
好ましい量の薬剤を被験体に簡便に送達するため、本発明のイメージング剤組成物又は医薬組成を濃縮し、所望形態の容器内にパッケージすることができる。薬剤を生理学的に許容される溶液中に分散させるための容器内に小分けすることで、被験体の体重１ｋｇ当たり薬剤０．１〜５０ｍｇの濃度で薬剤を投与することが簡便に達成できる。
【００５５】
１以上の実施形態では、薬剤の投与から約４時間後に標的組織をイメージングし得る。代わりの実施形態では、被験体に薬剤を投与してから約２４時間後に標的組織をイメージングし得る。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は例示のみのために示すものであって、本発明を限定するものと解すべきでない。
【００５７】
材料
妥当なＨＥＲ２発現確率を有する腫瘍形成性細胞株のパネルを、表３に記載されるように、利用可能な文献（Ｂｒｕｓｋｉｎ，ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００４：３１：２０５及びＴｒａｎ，ｅｔ．ａｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．２００７：１８：１９５６）に基づいて選択した。
【００５８】
【表３】
2014507400.tif 000008
すべての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、推奨された通りに培養した。細胞を＞９０％のコンフルエンスまで培養した後に使用した。間接免疫蛍光染色の定量分析のために抗ＨＥＲ２一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ＰＮ  ＭＡＢ１１２９）及びＤａｋｏ  ＱＩＦＩＫＩＴ（ＰＮ  Ｋ００７８）を使用しながら、表４に記載した細胞株に関してフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ）を実施した。異なる数のＭａｂ分子を担持する５つの異なる集団を含む較正ビーズを細胞株と共に使用することで、細胞当たりの表面受容体の数を求めた。いずれの場合にも、対応する販売者から適切なアイソタイプ対照が得られた。
【００５９】
細胞表面受容体のタンパク質分解を回避するため、トリプシンではなく細胞解離緩衝液（ＰＢＳ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて付着細胞をフラスコから遊離させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷冷ＦＣ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）中に５〜１０×１０6細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。１００μＬアリコートの細胞を５μｇの一次抗体と混合し、氷上で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を１ｍｌのフローサイトメトリー（ＦＣ）緩衝液（０．２％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で洗浄し、３００×ｇで５分間遠心し、０．５μＬのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。二次抗体フラグメント（Ｆ(ａｂ)2ＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス免疫グロブリン）をＰＢＳで希釈した１：５０希釈液１００μＬを添加し、暗所において氷上で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を１ｍＬの氷冷ＦＣ緩衝液で２回洗浄し、３００×ｇで５分間遠心し、５００μＬのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。フローセルの目詰まりを防止するため、フローサイトメトリーに先立ってすべての染色細胞を１００ミクロンフィルターに通した。
【００６０】
フローサイトメトリーはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ上で実施した。各管について最小５×１０4のイベントを収集した。すべての分析は、ＦＬ１中のＦＩＴＣの検出による単色分析であった。前方散乱（ＦＳ）及び側方散乱（ＳＳ）データは、すべての細胞集団がきっちりと分類されることを実証していた。フローサイトメトリーを用いて、細胞のＨＥＲ２発現をインビトロで評価したところ（図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃ）、ＳＫＯＶ３細胞は最高レベルのＨＥＲ２発現を示した（図３）。図３の結果は再現可能であった（ｎ＝３）。
【００６１】
最高発現細胞株はＳＫＯＶ３であった。これらの細胞を６〜１２週齢の免疫無防備マウスに注射し、腫瘍を増殖させた。腫瘍増殖曲線及び成功率は接種細胞数に依存していた。マウス１頭当たり３〜４百万個の細胞を用いると最適の腫瘍増殖が得られた。
【００６２】
６〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のため、ＰＢＳ中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は右後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で行った。ＳＫＯＶ３に関しては、各マウスに３×１０6〜４×１０6個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【００６３】
摘出によってマウスから腫瘍を集め、全腫瘍を処理まで−２０℃に貯蔵した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにより、腫瘍を氷上においてプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンタクルズ、米国カリフォルニア州＃２４９４８）１ｍｌ中で粉砕した。次に、ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートし、次いで冷却遠心機において１００００×Ｇで１０分間遠心した。上澄み液を集め、さらなる処理まで氷上又は４℃で貯蔵した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３２２５）を用いて、細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定した。細胞溶解物を標準濃度に希釈することで、マイクロタイタープレート中に２０μｇ／ウェルのタンパク質を得た。製造者の指示に従い、市販のヒトＨＥＲ２キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＤＹＣ１１２９）を用いてＥＬＩＳＡを実施した。各試料の三重反復試験を実施し、データをｐｇ  ＨＥＲ２／μｇ総タンパク質として報告し、誤差を標準偏差として報告する。
【００６４】
インビボでの標的発現をＥＬＩＳＡによって測定した。摘出した腫瘍をホモジナイズし、市販のマッチドペアキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＤＹＣ１１２９、ミネアポリス、米国ミネソタ州）を用いてＨＥＲ２について分析した。図３の結果は、ＳＫＯＶ３細胞株が高発現腫瘍を増殖させることを示している。ＥＬＩＳＡ対照は、フローサイトメトリーのために使用した陰性対照株の培養細胞溶解物であった。これらの結果は、ＳＫＯＶ３の腫瘍異種移植片がヒトＨＥＲ２を標的化する分子のインビボ試験のために適切であることを示している。
【００６５】
すべてのポリペプチドはスウェーデンのＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）ＡＢから受け入れた。ポリペプチドは、「Ｚ」に続く内部開発番号コードによって表される。表１には、本明細書中に記載されるポリペプチドが詳しく示されている。かかるポリペプチドは、ポリペプチドＺ００３４２（配列番号１）、ポリペプチドＺ０２８９１（配列番号２）、ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３及び配列番号４）並びにＺ００４７７の二量体、即ち(Ｚ００４７７)2（配列番号５）を含んでいる。
【００６６】
ポリペプチドとＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体との結合相互作用は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、米国ニュージャージー州）上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出を用いてインビボでで測定した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の細胞外ドメインをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、米国ミネソタ州）からヒトＩｇＧのＦｃ領域とのコンジュゲート（Ｆｃ−ＨＥＲ２）として入手し、１０μＬ／分のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）で予備平衡化し、続いてＥＤＣ及びＮＨＳで活性化したＣＭ−５デキストラン官能化センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、米国ニュージャージー州）に共有結合させた。所望の固定化レベル（約３０００共鳴単位）が達成されるまで（２分）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中のＦｃ−ＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）を活性化センサーチップ上に注入した。センサーチップ上の残留活性化基を、エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）の注入によってブロックした。２．５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＯＨで繰返し（５×）洗浄することで、非共有結合コンジュゲートを除去した。屈折率変化及びセンサーチップとの非特異的結合相互作用に関する対照表面として役立てるため、Ｆｃ−ＨＥＲ２の固定化を行わない点を除き、同じセンサーチップ上の第２のフローセルを全く同様に処理した。動態学的試験に先立ち、両表面に関して標的検体の結合を試験すると共に、２．５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＯＨでの処理後における結合検体の十分な除去及びセンサーチップの再生を保証するための表面安定性実験を行った。  ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、米国ニュージャージー州）を用いてＳＰＲセンサーグラムを分析した。各々の計算動態学的パラメーターに関する残差及び標準誤差の評価、「当てはめの良さ」（Χ2＜１０）並びにモデル化センサーグラムと実験データとの直接比較によって動態学的モデルの頑健性を決定した。ＳＰＲ測定値を８種の検体濃度（０〜１００ｎＭタンパク質）で収集し、得られたセンサーグラムを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに当てはめた。
【００６７】
図１は、Ｚ００４７７（配列番号３）及び(Ｚ００４７７)2（配列番号５）をヒトＨＥＲ２官能化表面上で試験した場合に得られた例示的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データを示している。この関係は、親和性が知られているすべてのポリペプチド（表２）に関
して成り立つ。ここで、二量体Ｚ(４７７)2（配列番号５）に関する値は結合活性効果に基づく推定値である。
【００６８】
ｆａｃ−[99mＴｃ(ＣＯ)3]+コアによるＨｉｓ６（配列番号７）タグ付きポリペプチドの標識は、以前に発表された方法（Ｗａｉｂｅｌ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，８９７）の変法を用いて行った。簡単に述べれば、食塩水中のＮａ[99mＴｃＯ4]（４ｍＣｉ、２ｍＬ）をＩｓｏｌｉｎｋ（登録商標）ボラノカーボネートキット（Ａｌｂｅｒｔｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，３１３５）に添加した。得られた溶液を９５℃で１５〜２０分間加熱することでｆａｃ−[99mＴｃ(ＣＯ)3(Ｈ2Ｏ)3]+を得た。溶液の一部（２ｍＣｉ、１ｍＬ）を取り出し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ約７に中和した。３２５μＬのアリコートを取り出し、Ｈｉｓ６−ポリペプチド（配列番号７）（４０μｇ）に添加した。得られた溶液を３５〜３７℃の水浴中で４０分間加熱した。典型的な放射化学収率は、（ＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ社、０．９％ＮａＣｌで測定して）８０〜９５％の範囲内にあった。粗反応生成物をＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１０ｍＭ  ＰＢＳ）上でのクロマトグラフィーに付すことで、放射化学純度＞９９％の生成物を得た。得られた典型的な比放射能は３〜４μＣｉ／μｇであった。次いで、得られた溶液を１０ｍＭ  ＰＢＳで希釈することで、以後の体内分布試験のために適した濃度を得た。
【００６９】
Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４（４．６×２５０ｍｍ）カラム及びＲａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩ放射能検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ上でＨＰＬＣを実施した。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを含む９５：５の水：ＭｅＣＮであり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含む５：９５の水：ＭｅＣＮであった。勾配は次の通りである（すべて直線的に変化する、時間／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０、３１／０。
【００７０】
精製前に、各ポリペプチドをトリカルボニルテクネチウムコアによって高収率（＞９０％）で標識した。ＮＡＰ−５クロマトグラフィーで精製したところ、99mＴｃ標識ポリペプチドの試料が＞９９％の放射化学純度で得られた（表４）。
【００７１】
【表４】
2014507400.tif 000009
ＮＡＰ−５で精製された放射性標識ポリペプチドの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。各放射性標識化学種の保持時間は、（ＵＶ検出器及びγ線検出器の物理的分離に原因する時間差（データは示さず）を除けば）２２０ｎｍ  ＵＶクロマトグラム中での対応する非標識ポリペプチドの保持時間から実質的に変化していなかった。
【００７２】
99mＴｃ(ＣＯ)3(Ｈｉｓ6)−ポリペプチド（‘Ｈｉｓ6’は配列番号７として開示されている）を試験するために使用した動物モデル
６〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のため、ＰＢＳ中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は右後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で行った。ＳＫＯＶ３に関しては、各マウスに３×１０6〜４×１０6個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【００７３】
体内分布
マウスに、約１μｇの99mＴｃ標識ポリペプチド（約３μＣｉ／１μｇ）の尾静脈注射を行った。マウスは、安楽死まで濾紙で内張りしたケージ内に置いた。各時点で３頭のマウスを安楽死させ、検査対象組織を摘出し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注射部位（尾）に関してデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールし、やはりカウントした。残りの組織をカウントし、各動物についてすべての組織及び尿の和を合計して総注射量を得た。この総量に基づいて各器官に関する％注射量を求め、器官を秤量することで１グラム当たりの％注射量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。データは、各時点における全部で３頭のマウスに関する平均値として、群の標準偏差を表す誤差バーと共に報告される。
【００７４】
99mＴｃ標識Ｚ００４７７（配列番号４）ポリペプチドをＳＫＯＶ３マウスに注射した。図６は。これらの実験に関する腫瘍及び血液曲線を示している。Ｚ００４７７（配列番号４）ポリペプチドは、標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において良好な腫瘍取込みを示し、注射後（ＰＩ）３０分で組織１グラム当たり約３％注射量の最大値及び注射後２４０分で８を超えるピーク腫瘍：血液比を有している。
【００７５】
ポリペプチドは、２分未満の半減期を有する血液からの単一指数関数的なクリアランスを示す。このクリアランスは、主として肝臓及び腎臓によって媒介される。表５に示されるように、脾臓へのポリペプチド取込みは中程度であり、肝臓においては中程度乃至高度の取込みが認められる。
【００７６】
【表５】
2014507400.tif 000010
二価ポリペプチドは、恐らくは結合活性効果のため、対応する単量体より高い親和性を示す。しかし、大きいサイズが腫瘍侵入を妨げることがある。ＨＥＲ２ポリペプチドに関しては、４種の高親和性ポリペプチドのそれぞれの二価形態が利用可能であった。Ｚ００４７７（配列番号３）の二量体(Ｚ００４７７)2（配列番号５）を放射性標識し、ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスにおける４時間体内分布実験のために使用した。
【００７７】
一価及び二価ポリペプチドは他の点では同様な体内分布特性を示し、いずれについても１〜２分の範囲内に血中半減期が認められる。結果は、単量体及び二価ポリペプチドの両方がインビボでＨＥＲ２を標的化し得ることを明確に示している。
【００７８】
99mＴｃキレーターｃＰＮ２１６（図７）を導入するため、ポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及び99mＴｃをキレート化するためのアミンオキシム基を含む二官能性化合物Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６を合成した。
【００７９】
ｃＰＮ２１６−アミンは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手した。Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸はＰｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ロックフォード、米国イリノイ州）から購入した。Ｎ−メチルモルホリン、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、重炭酸アンモニウム及び無水ＤＭＦは、Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、米国ウィスコンシン州）から購入した。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、米国カリフォルニア州）から入手した。ＨＰＬＣ精製のためには、ＨＰＬＣ用アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、ＨＰＬＣ用トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水を使用した。
【００８０】
実施例１
０℃の無水ＤＭＦ中のＮ−β−マレイミドプロピオン酸（１０８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、ｃＰＮ２１６−アミン（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）及びＰｙＢｏＰ（３３３ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＤＭＦ中の０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン（１２８μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後に氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩撹拌した後、ＨＰＬＣ精製に付した。生成物Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は白色粉末（２３０ｍｇ、８０％収率）として得られた。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．３５（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，１２Ｈ），１．５６（ｍ，５Ｈ），１．８５（ｓ，６Ｈ），２．３３（ｄｄ，Ｊ１＝８Ｈｚ，Ｊ２＝４Ｈｚ，２Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｄｄ，Ｊ１＝８Ｈｚ，Ｊ２＝４Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｓ，２Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，４Ｈ），１１．２６（ｓ，２Ｈ）；ｍ／ｚ＝[Ｍ＋Ｈ]+に関して４９５．２（Ｃ24Ｈ43Ｎ6Ｏ5，ＭＷ計算値＝４９５．３）。
【００８１】
新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を用いて、ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３）を約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリペプチド中のジスルフィド結合を、新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中のＤＴＴ溶液の添加によって還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間渦動させ、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予備平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に通して過剰のＤＴＴ試薬を除去した。溶出する還元ポリペプチド分子を集め、（ポリペプチド１当量当たり２０当量の）二官能性化合物Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６をＤＭＦ溶液として添加し、混合物を室温で３時間渦動させ、液体窒素で凍結した。反応混合物を一晩貯蔵した後、逆相ＨＰＬＣ精製に付した（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【００８２】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、オーバーン、米国カリフォルニア州）上で行った。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を含む）。勾配：３０分で５〜１００％Ｂ。
【００８３】
所望生成物を含む画分を合わせ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で中和し、凍結乾燥によって溶媒を除去することで、所望のイメージング剤組成物を白色固体（収率４１％）として得た。
【００８４】
精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析によって所望生成物の存在が確認され、ＭＷはポリペプチド構築物にただ１つのｃＰＮ２１６が付加されたことを示唆していた（Ｚ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６、ＭＷ計算値：７４２９Ｄａ、実測値：７４２９Ｄａ、Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６、ＭＷ計算値：７５２４Ｄａ、実測値：７５２４Ｄａ）。
【００８５】
実施例２
２０ｍＬバイアルに１０．００ｍＬの蒸留脱イオン水を添加した。この溶液中に窒素ガスを約３０分間吹き込んだ後、ＮａＨＣＯ3（４５０ｍｇ、５．３６×１０-3ｍｏｌ）、Ｎａ2ＣＯ3（６０ｍｇ、５．６６×１０-4ｍｏｌ）及びｐ−アミノ安息香酸ナトリウム（２０ｍｇ、１．２６×１０-4ｍｏｌ）を添加した。すべての試薬を独立に秤量し、水を含むバイアルに添加した。塩化スズ（１．６ｍｇ、７．０９×１０-6ｍｏｌ）及びＭＤＰ（２．５ｍｇ、１．４２×１０-5ｍｏｌ）を一緒に１ドラムバイアル中に秤取し、続いて約１ｍＬの炭酸塩緩衝液混合物中に手早く懸濁することで移した（続いて１回洗浄した）。１０μＬアリコートを取り出し、窒素流下でシラン化バイアルに移し、直ちに凍結し、凍結乾燥まで液体窒素浴中に保存した。各バイアルをゴム隔膜で部分的にキャップし、トレー式凍結乾燥機内に一晩配置した。バイアルを真空下で密封し、凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムキャップでクリンプシールし、無水窒素で再加圧し、将来の使用までフリーザー内に貯蔵した。
【００８６】
実施例３
テクネチウム用還元剤としての塩化第一スズ、メチレンジホスホン酸、フリーラジカルスカベンジャーとしてのｐ−アミノ安息香酸塩、及び緩衝剤としての重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）の凍結乾燥混合物を含む自家製造した一段階キット配合物（Ｃｈｅｌａｋｉｔ  Ａ＋）を用いて、放射性標識ポリペプチドの合成を行った。手早く連続して、ポリペプチドの２μｇ／μＬ食塩水溶液２０μＬをＣｈｅｌａｋｉｔに添加し、続いて直ちにＣａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社（アルバニー、米国ニューヨーク州）から入手した０．０８０ｍＬ食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中のＮａ99mＴｃＯ4（０．８ｍＣｉ、２９．６ＭＢｑ）を添加した。混合物を１回撹拌し、周囲温度で２０分間静置した。完了後、粗放射化学収率をＩＴＬＣ（ＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ社、０．９％ＮａＣｌ）によって測定した（下記表６）。
【００８７】
【表６】
2014507400.tif 000011
０．３５ｍＬの１５０ｍＭ無菌ＮａＣｌで反応容量を０．４５ｍＬに増加させ、最終生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１０ｍＭ  ＰＢＳを充填）によって精製した。粗反応混合物をＮＡＰ５カラム上に装填し、ゲルベッド中に入れ、０．８ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳで溶出した後に最終精製生成物を単離した。最終放射能は、標準的な線量キャリブレーター（ＣＲＣ−１５Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ社、ラムゼー、米国ニュージャージー州）中で評価した。放射化学収率（表６）及び純度は、ＩＴＬＣ（＞９８．５％）、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（図９）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって測定した。最終生成物（１０〜１５μＣｉ／μｇ、０．２〜０．５μＣｉ／μＬ（０．３７ＭＢｑ／μｇ、７．４ＭＢｑ／ｍＬ））を直ちに体内分布試験で使用した。
【００８８】
この実験のために使用したＨＰＬＣ条件は次の通りであった。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ方法１：溶媒Ａ：９５／５  Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ（蒸留脱イオン水）（０．０５％ＴＦＡを含む）。勾配溶出：０分，０％Ｂ、４分，２０％Ｂ、１６分，６０％Ｂ、２０分，１００％Ｂ、２５分，１００％Ｂ、２６分，０％Ｂ、３１分，０％Ｂ。
【００８９】
Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ方法２：溶媒Ａ：水中０．０６％ＮＨ3、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ。勾配溶出：０分，０％Ｂ、４分，２０％Ｂ、１６分，６０％Ｂ、２０分，１００％Ｂ、２５分，１００％Ｂ、２６分，０％Ｂ、３１分，０％Ｂ。
【００９０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーを有するＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４カラム（Ｓ／Ｎ  Ｅ０５０９２９−２−１、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ線検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で行った。
【００９１】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣ：溶媒：１×（１０ｍＭ）ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ2及びＭｇＣｌ2含有）。３０分間のイソクラティック溶出。分析は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＥＣ−４溶媒環境制御装置、Ｓｅｒｉｅｓ  ４００  ＬＣポンプ、ＩＳＳ  ２００  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＬＣサンプルプロセッサー及びＳｅｒｉｅｓ  ２００ダイオードアレイ検出器上で行った。Ｒａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｃｋｅｔ  ８１０３  ０１１１ピンホール（内径０．７ｍｍで容積２５０μＬ）フローセルγ線検出器が、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＣＩ  ９００  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅを介してインターフェースされた。使用したカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、コード：１７−５１７４−０１、ＩＤ  ｎｏ．０６３９０５９）であった。
【００９２】
ｃＰＮ２１６キレート中に99mＴｃを組み込むために使用したＣｈｅｌａｋｉｔの動作ｐＨ（ｐＨ＝９．２）は、Ｚ００４７７（配列番号３）ポリペプチドの計算ｐＩにほぼ合致していた。これらの条件下での標識は、最終生成物中に凝集を引き起こすことがわかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。凝集はサイズ排除ＨＰＬＣによって確認され、また体内分布試験で観察された血中滞留時間及び肝臓取込みの増加によって確認された。ポリペプチドの等電点を変えることにより、99mＴｃはＺ０２８９１（配列番号２）構築物上に成功裡に組み込まれた。サイズ排除ＨＰＬＣによって適当な分子量を有する化学種の存在が確認され、体内分布試験によって腫瘍異種移植片中へのトレーサーの取込みが示された。
【００９３】
６〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のため、ＰＢＳ中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は右後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で行った。ＳＫＯＶ３に関しては、各マウスに３×１０6〜４×１０6個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【００９４】
マウスに、約１μｇの99mＴｃ標識ポリペプチド（約１０μＣｉ／１μｇ）の尾静脈注射を行った。マウスは、安楽死まで濾紙で内張りしたケージ内に置いた。各時点で３頭のマウスを安楽死させ、検査対象組織を摘出し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注射部位（尾）に関してデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールし、やはりカウントした。残りの組織をカウントし、各動物についてすべての組織及び尿の和を合計して総注射量を得た。この総量に基づいて各器官に関する％注射量を求め、器官を秤量することで１グラム当たりの％注射量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。データは、各時点における全部で３〜４頭のマウスに関する平均値として、群の標準偏差を表す誤差バーと共に報告される。４時間にわたって４つの時点を選択した（注射後５分、３０分、１２０分及び２４０分）。
【００９５】
Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６−99mＴｃポリペプチドは、標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍取込みを示し、注射後（ＰＩ）３０分で組織１グラム当たり注射量の７．１１±１．６９％（ｎ＝５）の値を有し、これは注射後２４０分までの試験期間を通じてかなり一定に保たれる。腫瘍：血液比は、注射後３０分、１２０分及び２４０分においてそれぞれ２、５及び５であった。図１０、図１１及び図１２は、これらの実験に関する腫瘍曲線、血液曲線及び腫瘍：血液曲線を示している。
【００９６】
ポリペプチドは、２分未満の半減期を有する血液からの単一指数関数的なクリアランスを示す。このクリアランスは主として腎臓によって媒介され、注射後（ＰＩ）２４０分において１０．５８±２．９６％（ｎ＝５）ＩＤ／器官である。放射能は主として尿中に排出される。脾臓へのポリペプチド取込みは起こり得る凝集のために中程度乃至高度であり、肝臓においては中程度の取込みが認められ、例えば試験期間を通じて１２％ＩＤ／器官（マウスにおける値は％ＩＤ／ｇと同等）である。
【００９７】
Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６−99mＴｃに関する体内分布の結果
【００９８】
【表７】
2014507400.tif 000012
実施例４
Ｚ００４７７（配列番号４）、Ｚ００３４２（配列番号１）及びＺ０２８９１（配列番号２）−システインポリペプチドを、人工のＣ末端システインを介してアミノオキシ基で官能化した。用意されたポリペプチド分子の純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって＞９５％と測定された。
【００９９】
実施例５
ポリペプチド分子中に18Ｆを組み込むため、２つの直交基（即ち、人工システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びアルデヒド反応性アミノオキシ基（図１３Ａ及び図１３Ｂ））を含む二官能性リンカーＭａｌ−アミノオキシを合成した。このリンカーを製造するためには、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）媒介カップリング条件を用いてＮ−（２−アミノエチル）マレイミドを２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸と反応させてＢｏｃ保護形態のリンカーを生成した。次いで、Ｂｏｃ保護基を酸開裂によって脱保護することで、最終のＭａｌ−ＡＯ生成物を定量的収率で得た。最終生成物は、それ以上精製せずに直接使用した。
【０１００】
一般的記載
ジクロロメタン、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸、トリエチルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びその他すべての標準合成試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（セントルイス、米国ミズーリ州）から購入した。すべての化学薬品は、それ以上精製せずに使用した。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、米国カリフォルニア州）から入手した。精製のためには、ＨＰＬＣ用酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水を使用した。
【０１０１】
実施例６
無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸（３８２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（３０７μＬ、２．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（５０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３０６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を順次に添加した。室温で２４時間撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（３×３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。濾液を濃縮して淡黄色固体とし、これをカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中７０％酢酸エチル）で精製することで、生成物を白色粉末（５００ｍｇ、８０％収率）として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  １．５０（ｓ，９Ｈ），３．５５（ｔｔ，Ｊ１＝６．０Ｈｚ，Ｊ２＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），４．３０（ｓ，２Ｈ），６．３（ｓ，２Ｈ）。
【０１０２】
実施例７
１ｍＬのメタノール中３Ｍ  ＨＣｌに９．３ｍｇのＭａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃを溶解した溶液を室温で１８時間撹拌した。真空下で溶媒を除去することで、Ｍａｌ−ＡＯを淡黄色固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  ３．２７ＣＨ2（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４９ＣＨ2（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３９ＣＨ2Ｏ（ｓ，２Ｈ），７．００ＣＨ＝ＣＨ（ｓ，２Ｈ）；ｍ／ｚ＝[Ｍ＋Ｈ]+に関して２１４．０７（Ｃ8Ｈ12Ｎ3Ｏ4，ＭＷ計算値＝２１４．１１）。
【０１０３】
実施例８
新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を用いて、ポリペプチド（Ｚ００４７７（配列番号４）、Ｚ００３４２（配列番号１）又はＺ０２８９１（配列番号２））を約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリペプチド中のジスルフィド結合を、新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中のジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液の添加によって還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間渦動させ、脱気ＰＢＳ緩衝液で予備平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に通して過剰のＤＴＴ試薬を除去した。還元ポリペプチドを集め、（ポリペプチド１当量当たり２０当量の）二官能性Ｍａｌ−ＡＯ化合物をＤＭＳＯ溶液として添加した。室温で一晩渦動させた後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した（図１４ＡＡ及び図１４Ｂ）。
【０１０４】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、オーバーン、米国カリフォルニア州）上で行った。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を含む）。勾配：３０分で５〜１００％Ｂ。所望生成物を含む画分を合わせ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で中和し、凍結乾燥によって溶媒を除去することで、アミノオキシ修飾ポリペプチドを白色固体として得た。
【０１０５】
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により、予想分子量を有する標的生成物の存在が確認された。即ち、それぞれＺ００４７７（配列番号４）−ＯＮＨ2、Ｚ００３４２（配列番号１）−ＯＮＨ2及びＺ０２８９１（配列番号２）−ＯＮＨ2に関して、ＭＷ計算値：６９６４Ｄａ、８５３１Ｄａ及び７２４３Ｄａ、実測値：６９６３Ｄａ、８５３２Ｄａ及び７２４４Ｄａであった。
【０１０６】
実施例９：18ＦＢＡの製造
方法：すべての反応は、窒素雰囲気下又は使用前に窒素でパージしたクリンプトップ密封バイアル中で実施した。Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２２２（Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＫ2ＣＯ3（ＥＭＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）は購入し、受け入れたままで使用した。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ溶媒及び反応溶媒として使用した。
【０１０７】
Ｋ18Ｆ（精製水中で４０ｍＣｉ・ｍＬ-1（１４８０ＭＢｑ・ｍＬ-1））をＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社（アルバニー、米国ニューヨーク州）及びＰＥＴＮＥＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（アルバニー、米国ニューヨーク州）から入手し、受け入れたままで使用した。［18Ｆ-］フッ化物をまずＣｈｒｏｍａｆｉｘ  ３０−ＰＳ−ＨＣＯ3陰イオン交換カートリッジ（ＡＢＸ社、ラーデベルク、ドイツ）上に固定化し、次いでＫｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２（３７６ｇ・ｍｏｌ-1、８ｍｇ、２．１３×１０-5ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３８．２ｇ・ｍｏｌ-1、２．１ｍｇ、１．５２×１０-5ｍｏｌ）を含むアセトニトリル及び蒸留脱イオンＨ2Ｏ（ｄｄＨ2Ｏ）の４：１混合物１ｍＬを用いてドライダウン容器内に溶出した。穏やかに加熱（約４５℃）しながら部分真空及び窒素流下で溶媒を除去した（約１５分）。次に、Ｋ２２２（８ｍｇ）を含む０．５ｍＬのアセトニトリルで供給源バイアル及び陰イオン交換カートリッジを洗浄し、再び反応混合物を部分真空及び穏やかな加熱下で乾固した（約１０分）。反応器を窒素で再加圧し、さらに０．５ｍＬのアセトニトリルを用いて共沸ドライダウンを１回繰り返した。４−ホルミル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウムトリフレート（３１３．３０ｇ・ｍｏｌ-1、３．１ｍｇ、９．８９×１０-6ｍｏｌ）を０．３５ｍＬの無水ＤＭＳＯ（Ａｃｒｏｓ社）に溶解し、Ｋ18Ｆ・Ｋ２２２及びＫ2ＣＯ3を含む反応器に直接添加した。反応混合物を９０℃で１５分間加熱し、直ちに３ｍＬのｄｄＨ2Ｏで冷却しかつ奪活した。続いて、この混合物を陽イオン交換カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌ  Ｐｌｕｓ  ＣＭ）に通し、ｄｄＨ2Ｏで１０ｍＬに希釈し、逆相Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８）上に装填した。ＳｅｐＰａｋを１０ｍＬのｄｄＨ2Ｏでフラッシュし、次いで３０ｍＬの空気でパージした。［18Ｆ］４−フルオロベンズアルデヒド（18ＦＢＡ）を１．０ｍＬのメタノールで溶出した。
【０１０８】
実施例１０
別途、高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、Ｚ００４７７（配列番号３）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）、Ｚ００３４２（配列番号１）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）又はＺ０２８９１（配列番号２）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）を仕込んだ。固体を２５μＬのｄｄＨ2Ｏ及び８μＬのトリフルオロ酢酸中に懸濁した。メタノール中の18ＦＢＡ（実施例９参照）２５μＬを反応バイアルに移した。容器にキャップを付け、クリンプ加工し、加熱ブロック中に配置し、６０℃に１５分間保った。この時点で分析ＨＰＬＣでの分析のために小アリコート（＜５μＬ）を取り出した。半分取ＨＰＬＣ精製のための準備として、０．１％ＴＦＡを含む４５０μＬのｄｄＨ2Ｏを用いて溶液を約５００μＬに希釈した。18ＦＢ−ポリペプチドを半分取ＨＰＬＣによって単離精製した。生成物（０．１１３ｍＣｉ／４．１８ＭＢｑ）を含むＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏで５：１に希釈し、次いでｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）上に固定化した。ＳｅｐＰａｋをまず５ｍＬのｄｄＨ2Ｏで、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした。まずボイド容積（約０．５ｍＬ）を溶出させ、続いて２５０〜３００μＬの溶出液を独立のフラスコ内に集めることにより、18ＦＢ−ポリペプチドを最小量のエタノール中に単離した。放射化学純度及び化学純度を確定するため、単離した生成物に関してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。通例、製剤化後分析のためには１０μＬの０．１μＣｉ／μＬ溶液を注入した。単離放射化学収率は表９に示されていて、18ＦＢＡへのポリペプチド添加からの崩壊補正値であり、放射化学純度は＞９９％であった。別法として、18Ｆ標識ポリペプチドをＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。即ち、反応混合物を１０ｍＭ  ＰＢＳで約０．５ｍＬに希釈し、ゲル上に装填した。カラムを０．８ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳで溶出することで18Ｆ標識ポリペプチドを単離し、それ以上修飾せずに使用した。結果を表８及び図１５に示す。
【０１０９】
【表８】
2014507400.tif 000013
使用した分析ＨＰＬＣ条件は次の通りである。分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーを有するＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μ、１００Å（Ｓ／Ｎ  ４２０４７７−１０））、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ線検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で行った。９５：５  ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）。勾配溶出（１．０ｍＬ・ｍｉｎ-1）：０分，０％Ｂ、１分，１５％Ｂ、２１分，５０％Ｂ、２２分，１００％Ｂ、２６分，１００％Ｂ、２７分，０％Ｂ、３２分，０％Ｂ、又は勾配溶出（１．２ｍＬ・ｍｉｎ-1）：０分，０％Ｂ、１分，１５％Ｂ、１０分，３１％Ｂ、１０．５分，１００％Ｂ、１３．５分，１００％Ｂ、１４分，０％Ｂ、１７分，０％Ｂ。
【０１１０】
使用した半分取ＨＰＬＣ条件は次の通りである。精製は、ＤＧ−２０８０−５４  ４ラインデガッサー、ＭＸ−２０８０−３２ダイナミックミキサー、２台のＰＵ−２０８６  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｐポンプ、大容量注入キットを取り付けたＡＳ−２０５５  Ｐｌｕｓ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔオートインジェクター、ガード（Ｓ／Ｎ  ２９５８６０−１、Ｐ／Ｎ  ００Ｇ−４２５２−Ｎ０）付きのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ５μ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）１００Å，２５０×１０ｍｍ，５μカラム、ＭＤ−２０５５  ＰＤＡ、及び固体ＳｉＰＩＮフォトダイオードγ線検出器に取り付けたＣａｒｒｏｌ  ＆  Ｒａｍｓｅｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０５Ｓアナログレートメーターを備えたＪａｓｃｏ  ＬＣ上で行った。勾配溶出：０分，５％Ｂ、３２分，２０％Ｂ、４３分，９５％Ｂ、４６分，９５％Ｂ、４９分，５％Ｂ。溶媒Ａ：ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）。
【０１１１】
実施例１１
６〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のため、ＰＢＳ中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は右後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で行った。ＳＫＯＶ３に関しては、各マウスに３×１０6〜４×１０6個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【０１１２】
マウスに、約１μｇの18Ｆ標識ポリペプチド（約４μＣｉ／１μｇ）の尾静脈注射を行った。マウスは、安楽死まで濾紙で内張りしたケージ内に置いた。各時点で３頭のマウスを安楽死させ、検査対象組織を摘出し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注射部位（尾）に関してデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールし、やはりカウントした。残りの組織をカウントし、各動物についてすべての組織及び尿の和を合計して総注射量を得た。この総量に基づいて各器官に関する％注射量を求め、器官を秤量することで１グラム当たりの％注射量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。データは、各時点における全部で３頭のマウスに関する平均値として、群の標準偏差を表す誤差バーと共に報告される。
【０１１３】
ポリペプチドに関し、ＳＫＯＶ３細胞異種移植モデルにおける体内分布試験を行った。４時間にわたって４つの時点を選択した（注射後５分、３０分、１２０分及び２４０分）。完全な体内分布データは、表１２（ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスにおけるＺ０２８９１（配列番号２）18Ｆ−フルオロベンジルオキシムの％ＩＤ／ｇ）及び表１３（ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスにおけるＺ００３４２（配列番号１）18Ｆ−フルオロベンジルオキシムの％ＩＤ／ｇ）中に含まれている。図１６、図１７及び図１８は、これらの試験に関する腫瘍曲線、血液曲線、腫瘍：血液曲線及びクリアランス曲線を示している。
【０１１４】
Ｚ０２８９１（配列番号２）18Ｆ−フルオロベンジルオキシムポリペプチドは、標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍取込みを示し、注射後（ＰＩ）２４０分で組織１グラム当たり注射量の１７．４７±２．８９％（ｎ＝３）の値を有する。腫瘍：血液比は、注射後３０分、１２０分及び２４０分においてそれぞれ３、３４及び１２８であった。Ｚ００３４２（配列番号１）18Ｆ−フルオロベンジルオキシムポリペプチドは、標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍取込みを示し、注射後２４０分で組織１グラム当たり注射量の１２．４５±２．５２％（ｎ＝３）の値を有する。腫瘍：血液比は、注射後３０分、１２０分及び２４０分においてそれぞれ３、３２及び５３であった。
【０１１５】
ポリペプチドは、２分未満の半減期を有する血液からの単一指数関数的なクリアランスを示す。Ｚ０２８９１（配列番号２）のクリアランスは主として腎臓によって媒介され、注射後２４０分において０．９５±０．０７％（ｎ＝５）ＩＤ／器官である。放射能は主として尿中に排出される。脾臓へのポリペプチド取込みは微小であり、肝臓においては低い取込みが認められ、試験期間（注射後４時間）を通じて約１．８％ＩＤ／器官（マウスにおける値は％ＩＤ／ｇと同等）である。
【０１１６】
【表９】
2014507400.tif 000014
【０１１７】
【表１０】
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一般的記載
すべての反応は、窒素雰囲気下又は窒素でパージしたクリンプトップ密封バイアル中で実施する。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ溶媒及び反応溶媒として使用する。
【０１１８】
実施例１２
ポリペプチド−ＯＮＨ2（Ｚ０２８９１、配列番号２、０．３５〜０．５ｍｇ）を含む高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に［123Ｉ］４−ヨードベンズアルデヒド（123ＩＢＡ）を添加する。反応は、ポリペプチドを２５μＬのｄｄＨ2Ｏに溶解し、８μＬのトリフルオロ酢酸を添加し、続いてメタノール中の123ＩＢＡを添加することで開始する。容器にキャップを付け、クリンプ加工し、加熱ブロック中に配置し、６０℃に１５分間保つ。反応状態を評価するため、分析ＨＰＬＣでの分析のためのアリコート（＜５μＬ）を取り出す。半分取ＨＰＬＣ精製のための準備として、０．１％ＴＦＡを含むｄｄＨ2Ｏ及びアセトニトリルの１：１混合物の最小量に反応混合物を希釈する。123ＩＢ−ポリペプチドを半分取ＨＰＬＣ又はＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーによって単離精製する。生成物を含むＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏでさらに希釈（５：１）し、続いてｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）上に固定化する。ＳｅｐＰａｋをまず５ｍＬのｄｄＨ2Ｏで、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした後、まずボイド容積（約０．５ｍＬ）を溶出させ、続いて２５０〜３００μＬの溶出液を独立のフラスコ内に集めることにより、123ＩＢ−ポリペプチドを最小量のエタノール中に得る。放射化学純度及び化学純度を確定するため、単離した生成物に関してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行う。
【０１１９】
実施例１３：67Ｇａ−ＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）の製造
ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３）にＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ"−三酢酸）キレーター（図１９）をコンジュゲートした後、ポリペプチドをＧａ（詳しくは67Ｇａ）で標識した。
【０１２０】
ポリペプチド分子に対するＭａｌ−ＤＯＴＡのバイオコンジュゲーションを次のようにして行った。新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を用いて、ポリペプチドを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリペプチド中のジスルフィド結合を、新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中のＤＴＴ溶液の添加によって還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間渦動させ、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予備平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に通して過剰のＤＴＴ試薬を除去した。溶出する還元ポリペプチド分子を集め、（ポリペプチド１当量当たり１５当量の）二官能性化合物ｍａｌ−ＤＯＴＡをＤＭＳＯ溶液として添加し、混合物を室温で渦動させた。ポリペプチド分子の完全な転化を保証するため、反応を一晩進行させた。
【０１２１】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、オーバーン、米国カリフォルニア州）上で行った。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を含む）。勾配：３０分で５〜１００％Ｂ（図２０Ａ）。
【０１２２】
所望生成物を含む画分を合わせ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で中和し、凍結乾燥によって溶媒を除去することで、コンジュゲート化ポリペプチドを白色固体として得た。
【０１２３】
精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析によって所望生成物の存在が確認され、ＭＷはポリペプチド構築物にただ１つのＮＯＴＡキレーターが付加されたことを示唆していた（Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡに関するＭＷ計算値：７５０４Ｄａ、実測値：７５０６Ｄａ）（図２０Ｂ）。
【０１２４】
続いて、放射性標識を次のようにして行った。最初に２５μｌのＨＥＰＥＳ溶液（６３ｍＭ）をスクリュートップバイアルに添加し、続いて０．０４Ｍ  ＨＣｌ中の67ＧａＣｌ3（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）１０μｌ（４０．５ＭＢｑ）を添加した。次いで、３０μｌのＨ2Ｏ中のＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）３０μｇ（ＭＷ＝７５０６、４．０×１０-9ｍｏｌ）を反応混合物に添加して、６１μＭの最終ＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）濃度及び３．５〜４．０のｐＨを得た。反応バイアルを密封し、反応物を周囲温度に保った。粗反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果、67Ｇａ−ＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）の放射化学純度は室温で２時間後のＨＰＬＣによって９５％であることがわかった（図２１）。67Ｇａ−ＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）を１日の反応時間後にＨＰＬＣで精製した。精製のためには、２２ＭＢｑの67Ｇａ−ＮＯＴＡ−Ｚ００４７７（配列番号３）をＨＰＬＣ上に注入した。かかる精製により、１５ＭＢｑの67Ｇａ標識生成物が得られた（放射化学収率＝６８％）。ＨＰＬＣ溶媒を真空下で除去することで、概略容量０．５ｍＬの溶液を得た。次いで、約１．４５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝食塩水を添加することで、７．７ＭＢｑ／ｍＬの放射能濃度を有するｐＨ６〜６．５の最終溶液を得た（ＨＰＬＣによればＲＣＰ＝９６％）（図２２）。
【０１２５】
使用した分析ＨＰＬＣ条件は次の通りである。Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ4  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５ミクロン，３００Å，４．６×２５０ｍｍ  ＨＰＬＣカラム。溶媒Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の９５／５  Ｈ2Ｏ／ＭｅＣＮ、溶媒Ｂ＝０．０５％ＴＦＡ中の９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ。ＨＰＬＣ勾配（分／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０。
【０１２６】
使用した半分取ＨＰＬＣ条件は次の通りである。カラム：Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５ミクロン，３００Å，４．６×２５０ｍｍ。溶媒Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の９５／５  Ｈ2Ｏ／ＭｅＣＮ、溶媒Ｂ＝０．０５％ＴＦＡ中の９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ。ＨＰＬＣ勾配（分／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０。
【０１２７】
一般的記載
組換えＨＥＲ２−Ｚ２８９２１−ＣｙｓはＡｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ（スウェーデン）から、Ｅｅｉ−アミノオキシ酢酸スクシニックエステルはＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジフルオロシランはＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社から購入した。試薬及び溶媒は、ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｍｅｒｃｋ社、Ｒｏｍｉｌ社及びＦｌｕｋａ社から購入した。
【０１２８】
分析ＬＣ−ＭＳスペクトルは、下記の条件を使用するＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＰＤＡクロマトグラフィーシステムに連結された、正モードで動作するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＳＱ計測器上で記録した。クロマトグラフィーシステムの条件は、特記しない限り溶媒Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μｍ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４／２５４ｎｍであった。
【０１２９】
半分取逆相ＨＰＬＣ操作は、次の条件を使用するＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄクロマトグラフィーシステム上で行った。その条件は、特記しない限り溶媒Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍであった。
【０１３０】
分取逆相ＨＰＬＣ操作は、次の条件を使用するＷａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４０００システム上で行った。その条件は、特記しない限り溶媒Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  １０μｍ  Ｃ１８（２）２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４／２５４ｎｍであった。
【０１３１】
略語
Ａｌａ（Ａ）：      アラニン
Ａｒｇ（Ｒ）：      アルギニン
Ａｓｎ（Ｎ）：      アスパラギン
Ａｓｐ（Ｄ）：      アスパラギン酸
ＡＣＮ：            アセトニトリル
Ｂｏｃ：            ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル        Ｃｙｓ（Ｃ）：      システイン
ＤＩＰＥＡ：        ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：            Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＢ：          ４−ジメチルアミノ−ベンズアルデヒド
ＤＯＴＡ：          １，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０
−四酢酸
ＥＤＴ：            １，２−エタンジチオール
ＥＭＳ：            エチルメチルスルフィド
ＥＳＩ：            エレクトロスプレーイオン化
ｅｑ：              当量
ＦＢＡ：            ４−フルオロベンズアルデヒド
Ｇｌｎ（Ｑ）：      グルタミン
Ｇｌｕ（Ｅ）：      グルタミン酸
ｈｒ（ｓ）：        時間
ＨＥＲ２：          ヒト上皮増殖因子受容体
ＨＯＡｔ：          １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：          高速液体クロマトグラフィー
Ｉｌｅ（Ｉ）：      イソロイシン
ＬＣ−ＭＳ：        液体クロマトグラフィー−質量分析法
Ｌｅｕ（Ｌ）：      ロイシン
Ｌｙｓ（Ｋ）：      リシン
Ｍｅｔ（Ｍ）：      メチオニン
ｍｉｎ：            分
μｍ：              マイクロメートル
ｎｍ：              ナノメートル
ＮＭＰ：            １−メチル−２−ピロリジノン
ＮＯＴＡ：          １，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸
ＰＤＡ：            フォトダイオードアレイ
ＰＥＴ：            陽電子放出断層撮影法
Ｐｈｅ（Ｆ）：      フェニルアラニン
Ｐｒｏ（Ｐ）：      プロリン
ＰｙＡＯＰ：        （７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノ
ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｓｅｒ（Ｓ）：      セリン
ＳｉＦＡ：          ４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフルオロシリル）ベンズアルデヒド  ＴＦＡ：            トリフルオロ酢酸            Ｔｈｒ（Ｔ）：      トレオニン
ＴＩＳ：            トリイソプロピルシラン
Ｔｒｐ（Ｗ）：      トリプトファン
Ｔｙｒ（Ｙ）：      チロシン
Ｖａｌ（Ｖ）：      バリン
実施例１４：化合物２の半自動化放射合成
【０１３２】
【化５】
2014507400.tif 000016
ＦＡＳＴｌａｂ（商標）プラットホーム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて［18Ｆ］フルオロベンズアルデヒド（「［18Ｆ］ＦＢＡ」）を製造することで、エタノール中に通例７ＧＢｑの［18Ｆ］ＦＢＡ（１．５ｍＬ、非崩壊補正収率１２〜５４％）を得た。次いで、シラン化Ｐ６バイアル内において、この［18Ｆ］ＦＢＡ溶液の小部分（９２μＬ）を、水（１３８μＬ）中のアニリン塩酸塩（３．２ｍｇ、２５μｍｏｌ）の存在下でアミノオキシ前駆体３（０．４ｍｇ、５５ｎｍｏｌ）に手作業でコンジュゲートした。Ｐｅｌｔｉｅｒヒーターを用いて、混合物を７０℃で２０分間加熱した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５カートリッジ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によって２を単離した。０．２５ｍＬの食塩水／０．１％アスコルビン酸ナトリウムによる最初の溶出液は廃棄した。続く０．７５ｍＬの２を含む食塩水／０．１％アスコルビン酸ナトリウム溶出液を集め、同じ溶出混合物を用いてｐＨ５〜５．５で製剤化して所望の放射能濃度を得た。コンジュゲーション段階から単離された２の非崩壊補正収率は１７〜３８％であり、手作業で製造した２に関する放射化学純度（ＲＣＰ）値は≧９５％であった。（ＴＬＣシステム：水／３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを移動相としてＣ１８逆相シートを用いるＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ。標識ペプチドは元の位置に残った。）生成物を、Ｇｉｌｓｏｎ  ＵＶ／ＶｉＳ  １５６検出器付きのＧｉｌｓｏｎ  ３２２ポンプ、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ放射能検出器及びＬｕｎａ  Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用いるＨＰＬＣによってさらに分析した。移動相は、直線的勾配（１５分で５〜９５％Ｂ）をもって１ｍＬ／分で流動する溶媒Ａ（０．１Ｍ酢酸アンモニウム）及びＢ（アセトニトリル）からなっていた。ＵＶ吸光度を２８０ｎｍ及び３５０ｎｍで測定した。図２３は、２の製剤の分析ＨＰＬＣトレースの代表例を示している。
【０１３３】
実施例１４ａ：化合物３の製造
（ｉ）Ｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドの製造
【０１３４】
【化６】
2014507400.tif 000017
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（５１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＥｅｉ−ＡＯＡｃ−ＯＳｕ（７７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解した。ｓｙｍ−コリジン（８０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を７０分間撹拌した。反応混合物を水（７ｍＬ）で希釈し、生成物Ｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドを半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で１５〜３０％Ｂ、ここでＡ＝水／０．１％酢酸及びＢ＝ＡＣＮ）を用いた精製により、４３ｍｇ（７５％）の純粋なＥｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミドを得た。精製物質（Ｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミド）をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で１０〜４０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：１．９３分、実測ｍ／ｚ：２８４．１、予想ＭＨ+：２８４．１。
【０１３５】
（ｉｉ）化合物３の製造
組換えＺ０２８９１−Ｃｙｓ（１４４ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ（スウェーデン）から購入）及びＥｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミド（１７ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）に溶解した。溶液を酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ６に調整し、反応混合物を９０分間振盪した。反応混合物を水（７ｍＬ）で希釈し、生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製することで、１２６ｍｇの凍結乾燥Ｅｅｉ保護生成物を得た。アルゴンブランケット下で、Ｅｅｉ保護生成物を２．５％ＴＦＡ／水（１６ｍＬ）で２０分間処理した。溶液を水（１４４ｍＬ）で希釈し、アルゴンブランケット下でイソプロパノール／ドライアイス浴を用いて凍結し、凍結乾燥して１４９ｍｇ（１００％）のＺ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル（３）を得た。凍結乾燥Ｚ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル（３）をＬＣ−ＭＳ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ）によって分析した。ｔR：３．２８分、実測ｍ／ｚ：１８１１．８、予想ＭＨ44+：１８１１．４。
【０１３６】
実施例１５：ｔＣ２  ＳｅｐＰａｋ精製を用いる化合物２の自動化放射合成
第１のバイアル（８．２５ｍｇ／２１．９μｍｏｌのＫｒｙｐｔｏｆｉｘ、１．１６ｍｇ／８．４μｍｏｌのＫ2ＣＯ3、１６５μＬの水、６６０μＬのアセトニトリル）、第２のバイアル（１．５ｍｇ／４．８μｍｏｌのトリフレート１、１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ）、第３のバイアル（５．５ｍｇ／０．７６μｍｏｌの３、８．２ｍｇ／６３μｍｏｌのアニリン塩酸塩、０．７ｍＬの酢酸アンモニウム緩衝液  ｐＨ４．５／０．２５Ｍ）、第４のバイアル（４ｍＬの4％（ｗ／ｖ）アンモニア水）、エタノール（２５ｍＬ）及びリン酸（１％（ｗ／ｗ）、２５ｍＬ）の外部バイアル、プレコンディションドＱＭＡ  ｌｉｇｈｔ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ、ＯＡＳＩＳ  ＭＣＸ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ並びに２つのｔＣ２  ＳｅｐＰａｋカートリッジを含むＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットを組み立てた。生成物バイアルはｐ−アミノ安息香酸の水溶液（０．０８％（ｗ／ｗ）、１９ｍＬ）を含んでいた。カセットレイアウトを図２４に示す。
【０１３７】
必要なプログラムシーケンスをＰＣ制御装置から合成装置モジュールにアップロードし、カセットを機械上に装着した。水バッグ及び生成物バイアルを取り付けた。［18Ｆ］水（３００ＭＢｑ、１ｍＬ）を含むバイアルをＦＡＳＴｌａｂ（商標）モジュールに取り付け、放射合成を開始した。このプロセスは、ＱＭＡカートリッジから溶出される［18Ｆ］−Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ／炭酸カリウム錯体の共沸乾燥段階、［18Ｆ］ＦＢＡの放射合成、ＭＣＸカートリッジ、アンモニア溶液及びエタノールでの溶出を用いる［18Ｆ］ＦＢＡの精製、２を製造するためのコンジュゲーション段階、並びにｔＣ２カートリッジ上でリン酸／エタノールを用いる精製及び製剤化段階を含んでいる。全プロセスは１時間を要し、３３％の非崩壊補正放射化学収率及び９４％の放射化学純度で２を生成した。
【０１３８】
実施例１６：Ｓｅｐｈａｄｅｘ精製を用いる化合物２の自動化放射合成
第１のバイアル（８．２５ｍｇ／２１．９μｍｏｌのＫｒｙｐｔｏｆｉｘ、１．１６ｍｇ／８．４μｍｏｌのＫ2ＣＯ3、１６５μＬの水、６６０μＬのアセトニトリル）、第２のバイアル（１．５ｍｇ／４．８μｍｏｌのトリフレート１、１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ）、第３のバイアル（５．０ｍｇ／０．６９μｍｏｌの３、８．２ｍｇ／６３μｍｏｌのアニリン塩酸塩、０．７ｍＬの酢酸アンモニウム緩衝液  ｐＨ４．５／０．２５Ｍ）、第４のバイアル（４ｍＬの4％（ｗ／ｖ）アンモニア水）、エタノール（２５ｍＬ）及び食塩水（Ｐｏｌｙｆｕｓｏｒ、０．９％（ｗ／ｖ）、２５ｍＬ）の外部バイアル、プレコンディションドＱＭＡ  ｌｉｇｈｔ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ、ＯＡＳＩＳ  ＭＣＸ  ＳｅｐＰａｋカートリッジ、並びに乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０（５００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ．＃Ｇ１０１２０）を含むカスタム充填サイズ排除カートリッジ（２ｍＬ、Ｓｕｐｅｌｃｏ社、Ｃａｔ．＃５７６０８−Ｕ）を含むＦＡＳＴｌａｂ（商標）カセットを組み立てた。カセットレイアウトを図２６に示す。実施例１５に記載したようにして２の放射合成を行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘカートリッジを食塩水（５ｍＬ）でプライミングした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘカートリッジを通して粗反応混合物をポンプ送入し、純粋な２を生成物バイアル中に集めた。合成時間は４０分であり、非崩壊補正放射化学収率は１０％であった。生成物の放射合成純度は９５％であり、ＤＭＡＢのレベルは０．８μｇ／ｍＬであった。図２７は、最終生成物のＨＰＬＣ分析を示している。
【０１３９】
実施例１７：［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)2−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射合成
【０１４０】
【化７】
2014507400.tif 000018
円錐ポリプロピレン遠心バイアル（１．５ｍＬ）内において、酢酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)2−Ｚ０２８９１（４）（７４６μｇ、１００ｎｍｏｌ）の溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3溶液（３μＬ、３．３３μｇ、２５ｎｍｏｌ）と混合した。このバイアルを１００℃で１５分間加熱した。食塩水（１００μＬ）で希釈した後、反応溶液をＮＡＰ５サイズ排除カートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に移した。食塩水（７５０μＬ）を用いて最終生成物をＰ６バイアル中に溶出した。標識ペプチド５を１１％の非崩壊補正放射化学収率で得た。図２８は、製剤化生成物の分析ＨＰＬＣを示している。表１１は個別操作のデータを要約して示している。
【０１４１】
【表１１】
2014507400.tif 000019
実施例１７ａ：化合物４の製造
（ｉ）ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）の製造
【０１４２】
【化８】
2014507400.tif 000020
（ａ）テトラトシル−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミンの合成
【０１４３】
【化９】
2014507400.tif 000021
Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ社、１４．８ｇ、１００ｍｍｏｌ）及びピリジン（Ｆｌｕｋａ社、２００ｍＬ）を窒素下０℃で撹拌しながら、トルエン−４−スルホニルクロリド（Ｆｌｕｋａ社、７７ｇ、４００ｍｍｏｌ）をピリジン（Ｆｌｕｋａ社、１００ｍＬ）に溶解した溶液を７５分かけて上記溶液中に滴下した。温度を室温までゆっくりと上昇させ、４時間撹拌し続けた。溶液を氷（２５０ｍＬ）と塩酸（濃、２５０ｍＬ）との混合物中に撹拌しながら注ぎ込んで、暗色の粘着性油状物を得た。溶媒をデカンテーションによって除去し、粗生成物を水で洗浄し、デカントし、メタノール（２５０ｍＬ）に再溶解した。得られたスラリーを濾過によって単離し、粗生成物を熱メタノール（６０℃、６００ｍＬ）に再溶解し、冷却した。固体生成物を濾別し、真空中で乾燥した。収量３６．３６ｇ（４７．５％）。生成物はＮＭＲによって確認された。
【０１４４】
（ｂ）１−ベンジル−４，７−ジトシル−１，４，７−トリアゾナンの合成
【０１４５】
【化１０】
2014507400.tif 000022
テトラトシル−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン（実施例１７ａ（ｉ）（ａ）参照、２．０ｇ、２．６ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（５００μｌ、４．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（Ｆｌｕｋａ社、７９２ｍｇ、５．７ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ社、２５ｍＬ）を１００℃に加熱し、一晩撹拌した。溶媒を濾過によって固体生成物から除去した。固体をアセトニトリル（２×１０ｍＬ）で洗浄し、溶媒を蒸発除去した。固体を熱エタノール（１５ｍＬ）に溶解し、室温で３日間放置した。結晶を濾過によって集め、真空中で一晩乾燥した。生成物をＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜８０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）によって確認した。ｔR＝３．６６分。収量１ｇ（７２％）。
【０１４６】
（ｃ）（４−ベンジル−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【０１４７】
【化１１】
2014507400.tif 000023
硫酸（Ｓｉｇｍａ社、濃、２５ｍＬ）を１−ベンジル−４，７−ジトシル−１，４，７−トリアゾナン（実施例１７ａ（ｉ）（ｂ）参照、２．５ｇ、４．７ｍｍｏｌ）に撹拌しながら添加し、１００℃に加熱し、２０時間放置した。反応混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル（ＶＷＲ社、５００ｍＬ）中に滴下した。（沈殿した）生成物を濾別し、アセトニトリル、クロロホルム及びジクロロメタンで洗浄した。溶媒を真空中で除去した。粗生成物（９８６．３ｍｇ、４．５４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（５０ｍＬ）中のトリエチルアミン（Ｆｌｕｋａ社、１．４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）と混合した。ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（Ｆｌｕｋａ社、１．４７ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解し、滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ｐＨを調節し、必要ならばトリエチルアミンを添加した。溶媒を真空中で除去し、粗物質をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解し、水（２×２５ｍＬ）、０．１Ｍ塩酸（１×２５ｍＬ）及び水（１×２５ｍＬ）で洗浄した。有機相を濾過し、溶媒を蒸発除去した。粗物質をアセトニトリル／水（１：１）に溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５μ  ２５０×２１．２ｍｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：６０分で１０〜８０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥した。ＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜８０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）：ｔR＝３．９９分、（Ｍ１）４４７．４。生成物はＮＭＲによって確認された。
【０１４８】
生成物をＰｄ／Ｃ（１０％、２３５ｍｇ）及びメタノール（２５ｍＬ）と混合し、アルゴン下で撹拌した。次いで、アルゴンを真空によって除去し、水素ガスの供給を開始した。撹拌及び水素ガスの連続供給を行いながら、反応混合物を３時間放置した。触媒を遠心によって除去し、溶媒を蒸発除去した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５μ  ２５０×２１．２ｍｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：６０分で２〜８０％Ｂ）によって精製した。ＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜８０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）：ｔR＝２．５５分、（Ｍ１）３５７．９。収量１５０ｍｇ。生成物はＮＭＲによって確認された。
【０１４９】
（ｄ）（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル）酢酸［ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）］の合成
【０１５０】
【化１２】
2014507400.tif 000024
（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１７ａ（ｉ）（ｄ）参照、２８０μｍｏｌ、１００ｍｇ）及びブロモ酢酸（Ｆｌｕｋａ社、１ｍｍｏｌ、１３８．２１ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解した。水（１ｍＬ）に溶解した炭酸カリウムを撹拌しながら添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空中で濃縮した。残留物を水（２．５ｍＬ）に溶解し、塩酸（１Ｍ）でｐＨを４に調整した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）５μ  ２５０×２１．２ｍｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：６０分で１０〜８０％Ｂ）によって精製した。ＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜８０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）：ｔR＝２．４０分、（Ｍ１）３５７．９。収量１１７．７ｍｇ。生成物はＮＭＲによって確認された。
【０１５１】
ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）を分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜４０％Ｂ）によって精製することで、７２ｍｇの純粋なＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）を得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で１０〜４０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：３．７５分、実測ｍ／ｚ：４１６．２、予想ＭＨ+：４１６．３。
【０１５２】
（ｉｉ）ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）−マレイミドの製造
【０１５３】
【化１３】
2014507400.tif 000025
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（２３ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）及びＰｙＡＯＰ（５１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２ｍＬ）に溶解した。ｓｙｍ−コリジン（２９μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１時間振盪した。混合物を水／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（６ｍＬ）で希釈し、生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：６０分で２０〜５０％Ｂ）を用いた精製により、３３ｍｇ（８７％）の純粋なＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）−マレイミドを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：４．０９分、実測ｍ／ｚ：５３８．２、予想ＭＨ+：５３８．３。
【０１５４】
（ｉｉｉ）ＮＯＴＡ（ビス−酸）−マレイミドの製造
【０１５５】
【化１４】
2014507400.tif 000026
ＮＯＴＡ（ビス−ｔＢｕ）−マレイミド（３３ｍｇ、６１μｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）中の２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び２．５％水の溶液で４時間３０分間処理した。ＴＦＡを真空中で蒸発させ、残留物を水／０．１％ＴＦＡ（８ｍＬ）に溶解し、生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で０〜２０％Ｂ）を用いた精製により、１５ｍｇ（５８％）の純粋なＮＯＴＡ（ビス−酸）−マレイミドを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で０〜３０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：１．３４分、実測ｍ／ｚ：４２６．０、予想ＭＨ+：４２６．２。
【０１５６】
（ｉｖ）４の製造
組換えＺ０２８９１−Ｃｙｓ（４０ｍｇ、５．７μｍｏｌ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ（スウェーデン）から購入）及びＮＯＴＡ（ビス−酸）−マレイミド（６．１ｍｇ、１４μｍｏｌ）を水（１．５ｍＬ）に溶解した。溶液を酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ６に調整し、混合物を１時間振盪した。反応混合物を水／０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、半分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ）を用いた精製により、３８ｍｇ（９０％）の純粋な化合物４を得た。精製された４を分析ＬＣ−ＭＳ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：３．３１分、実測ｍ／ｚ：１８６４．５、予想ＭＨ44+：１８６４．５。
【０１５７】
実施例１８
［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)3−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５ａ）の放射合成に関する経時的研究
Ｗ．Ｊ．ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１０，２１，１３３１）によって記載されているように、ＱＭＡカートリッジを用いてフッ素−１８を精製し、食塩水で溶出した。18Ｆ−水の溶液（２５μＬ、１２ＭＢｑ）を、酢酸ナトリウム緩衝液（１．５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（１．６６７μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）に溶解した次式の化合物６（３８０μｇ、５８０ｎｍｏｌ）と混合した。
【０１５８】
【化１５】
2014507400.tif 000027
混合物を１００℃で加熱し、アリコートをＨＰＬＣによって分析した。分析データを図２９に示す。
【０１５９】
実施例１８ａ：化合物６の製造
（ｉ）ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）の製造
【０１６０】
【化１６】
2014507400.tif 000028
（ａ）α−ブロモグルタル酸５−ベンジルエステルの合成
【０１６１】
【化１７】
2014507400.tif 000029
０℃に冷却した臭化水素酸水溶液（Ｆｌｕｋａ社、１Ｍ、２２．５ｍＬ）中のＬ−グルタル酸５−ベンジルエステル（Ｆｌｕｋａ社、３．０ｇ、０．０１３ｍｏｌ）及び臭化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ社、４．６ｇ、０．０４４ｍｏｌ）の溶液に、亜硝酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ社、１．６ｇ、０．０２３ｍｏｌ）を少しずつ添加した。０℃で２時間撹拌した後、濃硫酸（Ｍｅｒｃｋ社、１．２ｍＬ）を添加し、続いてジエチルエーテル（Ｅｔｅｒｎｅｌｌ社）を添加した。水相をジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで４回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させた。常相クロマトグラフィー（シリカカラム（４０ｇ）、溶媒：Ａ＝ヘキサン、Ｂ＝酢酸エチル、勾配：２０分で１０〜３５％Ｂ、流量：４．０ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ）を用いて粗生成物を精製することで、１．８１ｇの純粋な生成物を得た。収率４６％。構造はＮＭＲによって確認された。
【０１６２】
（ｂ）α−ブロモグルタル酸５−ベンジルエステル１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０００  １０，２１３３−２１３５）
【０１６３】
【化１８】
2014507400.tif 000030
クロロホルム（Ｍｅｒｃｋ社、５ｍＬ）中のα−ブロモグルタル酸５−ベンジルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ａ）参照、１．２ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液に、シクロヘキサン（Ｍｅｒｃｋ社、５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２，２，２−トリクロロアセチミデート（Ｆｌｕｋａ社、１．５７ｍＬ、８．５２ｍｍｏｌ）の溶液を５分かけて滴下した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｆｌｕｋａ社、０．８８ｍＬ）を添加し、続いて三フッ化ホウ素エチルエーテレート（Ａｌｄｒｉｃｈ社、８０μＬ）を触媒として添加した。反応混合物を室温で５日間撹拌した。ヘキサンを添加し、有機相をブラインで３回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させた。常相クロマトグラフィー（シリカカラム（４０ｇ）、溶媒：Ａ＝ヘキサン、Ｂ＝酢酸エチル、勾配：１５分で１０〜３５％Ｂ、流量：４．０ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ）を用いて粗生成物を精製することで、１．１３ｇ（７９％）の純粋な生成物を得た。構造はＮＭＲによって確認された。
【０１６４】
（ｃ）２−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸５−ベンジルエステル１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【０１６５】
【化１９】
2014507400.tif 000031
クロロホルム（Ｍｅｒｃｋ社、２０ｍＬ）中のα−ブロモグルタル酸５−ベンジルエステル１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ａ）参照、５１３ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の溶液を、クロロホルム（Ｍｅｒｃｋ社、２０ｍＬ）中の１，４，７−トリアザシクロノナン（Ｆｌｕｋａ社、５５７ｍｇ、４．３１ｍｍｏｌ）の溶液に３時間かけて添加した。混合物を室温で３日間撹拌し、真空中で濃縮して淡黄色の油状物とした。常相クロマトグラフィー（シリカカラム（４０ｇ）、溶媒：Ａ＝エタノール：アンモニア水（９５：５）、Ｂ＝クロロホルム：エタノール：アンモニア水（３８５：１７５：２０）、勾配：０％Ｂで６分、１００％Ｂで１２分、流量：４．０ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ）を用いて粗生成物を精製することで、半純粋な生成物（２８９ｍｇ）を得た。収率４９％。生成物をＬＣ−ＭＳ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜５０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）によって確認した。ｔR＝２．５分、ｍ／ｚ（ＭＨ+）４０６．３。
【０１６６】
（ｄ）２−（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸５−ベンジルエステル１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【０１６７】
【化２０】
2014507400.tif 000032
乾燥アセトニトリル（４０ｍＬ）中の２−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸５−ベンジルエステル１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ｂ）参照、６００ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を０℃に冷却した後、乾燥アセトニトリル（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（Ｆｌｕｋａ社、１．５４８ｍｇ、４１４μＬ、２．８１ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下した。反応混合物をさらに１５分間撹拌した後、反応混合物を４時間かけてゆっくりと室温まで温めた。混合物をセライトで濾過し、蒸発乾固して粗生成物を得た。生成物をＬＣ−ＭＳ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜８０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）によって確認した。ｔR＝３．９分、ｍ／ｚ（ＭＨ+）６３４．４。
【０１６８】
（ｅ）２−（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル［ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）］の合成
【０１６９】
【化２１】
2014507400.tif 000033
２−（４，７−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−［１，４，７］トリアゾナン−１−イル−ペンタン二酸５−ベンジルエステル１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（実施例１８ａ（ｉ）（ｃ）参照、９３８ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を２−プロパノール（Ａｒｃｕｓ社、１１５ｍＬ）に溶解し、水（３ｍＬ）中に懸濁した１０％Ｐｄ／Ｃ（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ社、３１５ｍｇ）を添加した。混合物を水素（４気圧）で３時間処理し、セライトで濾過し、蒸発乾固した。残留物をシリカゲル上でのクロマトグラフィー（シリカカラム（４ｇ）、溶媒：２−プロパノール：アンモニア（９５：５）、流量：４０ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ）に付すことで、半純粋な生成物（２２５ｍｇ）を得た。生成物をＬＣ−ＭＳ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、２．０×５０ｍｍ、３μｍ、溶媒：Ａ＝水／０．１％トリフルオロ酢酸及びＢ＝アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、勾配：５分で１０〜８０％Ｂ、流量：０．６ｍＬ／分、ＵＶ検出：２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、ＥＳＩ−ＭＳ）によって確認した。ｔR＝２．４分、ＭＨ+  ５４４．５。
【０１７０】
精製ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）を分析ＬＣ−ＭＳ（勾配：５で１０〜８０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：２．４分、実測ｍ／ｚ：５４４．５、予想ＭＨ+：５４４．４。
【０１７１】
（ｉｉ）ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2の製造
【０１７２】
【化２２】
2014507400.tif 000034
ＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解したＰｙＡＯＰ（９６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ（１ｍＬ）中のＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びエチレンジアミン（１．２ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を１時間振盪し、次いでＰｙＡＯＰの第２のアリコート（３８ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を添加した。振盪を３０分間続けた。２０％ＡＣＮ／水（５ｍＬ）を添加し、生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜５０％Ｂ）を用いた精製により、１２３ｍｇ（９８％）の純粋なＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2を得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で２０〜５０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：１．９５分、実測ｍ／ｚ：５８６．４、予想ＭＨ+：５８６．４。
【０１７３】
（ｉｉｉ）ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミド
【０１７４】
【化２３】
2014507400.tif 000035
ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2（１２３ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、３−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びｓｙｍ−コリジン（３４６μＬ、２．６０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解した。反応混合物を６時間撹拌した。水（６ｍＬ）を添加し、生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜５０％Ｂ）を用いた精製により、１１５ｍｇ（８７％）の純粋なＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミドを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で１０〜６０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：３．３６分、実測ｍ／ｚ：７３７．４、予想ＭＨ+：７３７．４。
【０１７５】
（ｉｖ）ＮＯＴＡ（トリス−酸）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミドの製造
【０１７６】
【化２４】
2014507400.tif 000036
ＮＯＴＡ（トリス−ｔＢｕ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミド（１１５ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）中の２．５％ＴＩＳ及び２．５％水の溶液で４時間処理した。溶媒を真空中で蒸発させ、残留物を水（８ｍＬ）に再溶解し、生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で０〜２０％Ｂ）を用いた精製により、８０ｍｇ（９０％）の純粋なＮＯＴＡ（トリス−酸）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミドを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で０〜３０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：２．７４分、実測ｍ／ｚ：５６９．５、予想ＭＨ+：５６９．２。
【０１７７】
（ｖ）化合物６の製造
（ａ）合成Ｚ０２８９１−Ｃｙｓの製造
０．０５ｍｍｏｌのＮｏｖａＰＥＧ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置上で配列ＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣをアセンブリした。各カップリング段階（７５℃で５分）では、インサイチュ活性化のために０．４５ｍｍｏｌ  ＨＢＴＵ／０．４５ｍｍｏｌ  ＨＯＡｔ／１．０ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡを使用しながら０．５ｍｍｏｌのアミノ酸を適用した。ＦｍｏｃはＤＭＦ中の５％ピペラジンによって除去した。両Ａｒｇの二重カップリングを適用した。Ａｓｐ−Ｓｅｒ及びＬｅｕ−Ｓｅｒプソイドプロリンジペプチド（０．５ｍｍｏｌ）を配列中に組み込んだ。
【０１７８】
２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴ、２．５％のＥＭＳ及び２．５％の水を含むＴＦＡ（４０ｍＬ）中で、側鎖保護基の同時除去及び樹脂からのペプチドの切断を１時間実施した。樹脂を濾過によって除去し、ＴＦＡで洗浄し、合わせた濾液を真空中で蒸発させた。残留物にジエチルエーテルを添加し、生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。切断操作をもう一度繰り返した。乾燥した沈殿を２０％ＡＣＮ／水に溶解し、残留するＴｒｐ保護基を除去するために一晩放置した。溶液を凍結乾燥して１４８ｍｇ（４２％）の粗Ｚ０２８９１−Ｃｙｓを得た。１４８ｍｇの粗Ｚ０２８９１−Ｃｙｓを半分取ＨＰＬＣ（４回の操作、勾配：４０分で２５〜３０％Ｂ）によって精製することで、３３ｍｇ（９％）の純粋なＺ０２８９１−Ｃｙｓを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で１０〜４０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：３．４０分、実測ｍ／ｚ：１７５８．３、予想ＭＨ44+：１７５８．４。
【０１７９】
合成Ｚ０２８９１−Ｃｙｓ（１３．７ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）及びＮＯＴＡ（トリス−酸）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−マレイミド（１１ｍｇ、１９．３μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解した。溶液を酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ６に調整し、混合物を３時間振盪した。反応混合物を水／０．１％ＴＦＡ（６．５ｍＬ）で希釈し、半分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で１５〜３５％Ｂ）を用いた精製により、８．４ｍｇ（５７％）の純粋な６を得た。化合物６を分析ＬＣ−ＭＳ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ）によって分析した。ｔR：３．３１分、実測ｍ／ｚ：１９００．７、予想ＭＨ44+：１９００．２。
【０１８０】
実施例１９：［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)2−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学収率に対するＡｌＣｌ3／ペプチド比の影響
円錐ポリプロピレン遠心バイアル（１．５ｍＬ）内において、酢酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の４（１４０μｇ、２０ｎｍｏｌ）の３つの溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（それぞれ０．３３μｇ，２．４９ｎｍｏｌ、０．６６μｇ，４．９８ｎｍｏｌ及び１．３３μｇ，９．９６ｎｍｏｌ）の溶液と混合した。これらのバイアルに少量の［18Ｆ］フッ化物イオン（１０μＬ）を添加した。バイアルを１００℃で１５分間加熱し、続いてＨＰＬＣによって分析した。組込み収率を表１２に示す。
【０１８１】
【表１２】
2014507400.tif 000037
実施例２０：［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)2−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学収率に対する試薬希釈度の影響
円錐ポリプロピレン遠心バイアル（１．５ｍＬ）内において、酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の４（３７３μｇ、５０ｎｍｏｌ）の溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（１．５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（１．６６μｇ，１２．５ｎｍｏｌ）の溶液と混合した。少量の［18Ｆ］フッ化物イオン（１０μＬ、８０ＭＢｑ）を添加した。酢酸ナトリウム緩衝液（１．５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）を用いてこの混合物の２種の段階希釈液（５０％及び２５％（ｖ／ｖ））を調製した。次いで、３つのバイアルを１００℃で１５分間加熱し、続いてＨＰＬＣによって分析した。組データを表１３に示す。
【０１８２】
【表１３】
2014507400.tif 000038
実施例２１：［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)2−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学収率に対するペプチド／ＡｌＣｌ3濃度の影響
［18Ｆ］フッ化物イオン（２５μＬ、２３〜２５ＭＢｑ）、１．５μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（ペプチド４の１／４当量）、及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の４（５０、１００及び１５０ｎｍｏｌ）を含む３つのバイアルを１００℃で３０分間加熱した。図３０は、１５分及び３０分後の組込みデータを示している。
【０１８３】
実施例２２：［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)2−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５）の放射化学収率に対するマイクロ波加熱の影響
［18Ｆ］フッ化物イオン（２５μＬ、２９ＭＢｑ）、１．５μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（１．６６μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）、及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の４（３７３μｇ、５０ｎｍｏｌ）を含むホイートンバイアル（３ｍＬ）を、マイクロ波装置（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ５２１、設定温度８０℃、５０Ｗ）を用いて５，１０及び１５秒間加熱した。表１４は、これらの時点後におけるＨＰＬＣ分析結果の要約を示している。
【０１８４】
【表１４】
2014507400.tif 000039
実施例２３：［18Ｆ］ＡｌＦ−ＮＯＴＡ(ＣＯＯＨ)3−Ｚ０２８９１（配列番号２）（５ａ）の製造
【０１８５】
【化２５】
2014507400.tif 000040
［18Ｆ］フッ化物イオン（２５μＬ、２９ＭＢｑ）、１．５μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のＡｌＣｌ3（１．６６μｇ、１２．５ｎｍｏｌ）、及び酢酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中の６（３８０μｇ、５０ｎｍｏｌ）を含むＰＰ遠心バイアル（１．５ｍＬ）を１００℃で１５分間加熱した。５ａの分析ＲＣＹは１５〜２０％であった。図３１は、反応混合物のＨＰＬＣプロファイルを示している。
【０１８６】
実施例２４：［18Ｆ］ＳｉＦＡ−Ｚ０２８９１（配列番号２）（７）の製造
【０１８７】
【化２６】
2014507400.tif 000041
ポリプロピレン遠心バイアル（１．５ｍＬ）内において、酢酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、ｐＨ４．０、０．５Ｍ）中のペプチド前駆体８（７５０μｇ、１００ｎｍｏｌ）の溶液を水（５０μＬ）中の［18Ｆ］フッ化物イオン溶液に添加し、９５℃で１５分間加熱した。食塩水（１００μＬ、０．９％（ｗ／ｖ））を添加した後、食塩水でコンディショニングしたＮＡＰ５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて混合物を精製した。２６分後、１８％の非崩壊補正放射化学収率及び８７％の放射化学純度で生成物７を得た。図３２は、最終生成物のＨＰＬＣ分析を示している。
【０１８８】
実施例２４ａ：化合物８の製造
（ｉ）ＳｉＦａの合成
【０１８９】
【化２７】
2014507400.tif 000042
ヘキサン中のｎ−ブチルリチウム（２．５Ｍ、７．９ｍｍｏｌ）を、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６ｍＬ）中の２−（４−ブロモフェニル）−１，３−ジオキソラン（１．８ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の冷却（−７８℃）溶液にアルゴン下で滴下した。−７８℃で２時間撹拌した後、得られた黄色の懸濁液を注射器に吸い込み、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジフルオロシラン（１．５ｍＬ、８．３３ｍｍｏｌ）の冷却溶液（−７０℃）に２０分かけて滴下した。反応混合物を−７０℃で１時間撹拌し、次いで周囲温度まで放温した。２時間３０分後に反応混合物から試料（３ｍＬ）を抜き取り、水／０．１％ＴＦＡで脱活することでジオキソラン保護基を除去した。脱保護生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣ（勾配：６０分で４０〜９５％Ｂ）を用いた精製により、純粋なＳｉＦＡを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で５０〜９５％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：２．０５分、実測ｍ／ｚ：検出せず、予想ＭＨ+：２６７．２。
【０１９０】
（ｉｉ）ＳｉＦＡ−アミノオキシアセチル−マレイミドの製造
【０１９１】
【化２８】
2014507400.tif 000043
Ｅｅｉ−アミノオキシアセチル−マレイミド（２０ｍｇ、７１μｍｏｌ）を、（ＨＰＬＣ分取画分からの）水／ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のＳｉＦＡに添加した。１Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。生成物を半分取ＨＰＬＣによって精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で４０〜８０％Ｂ）を用いた精製により、１５ｍｇ（４５％）の純粋なＳｉＦＡ−アミノオキシアセチル−マレイミドを得た。精製物質をＬＣ−ＭＳ（勾配：５で４０〜７０％Ｂ）によって特性決定した。ｔR：３．００分、実測ｍ／ｚ：４６２．１、予想ＭＨ+：４６２．２。
【０１９２】
（ｉｉｉ）化合物８の製造
組換えＺ０２８９１−Ｃｙｓ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ（２４ｍｇ、３．４μｍｏｌ）及びＳｉＦＡ−アミノオキシアセチル−マレイミド（４．７ｍｇ、１０μｍｏｌ）を５０％ＡＣＮ／水（１ｍＬ）に溶解した。溶液を酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ６に調整し、混合物を１時間振盪した。反応混合物を１０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（８ｍＬ）で希釈し、半分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。半分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜４０％Ｂ）を用いた精製により、２６ｍｇ（１００％）の純粋なＺ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル−ＳｉＦＡ（８）を得た。精製されたＺ０２８９１−Ｃｙｓ−マレイミド−アミノオキシアセチル−ＳｉＦＡ（８）をＬＣ−ＭＳ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ）によって分析した。ｔR：３．８７分、実測ｍ／ｚ：１８７３．６、予想ＭＨ44+：１８７３．５。
【０１９３】
実施例２５：腫瘍モデルの妥当性確認
Ａ４３１及びＮＣＩ−Ｎ８７異種移植モデルの妥当性を、腫瘍増殖及びＨＥＲ２発現に関して確認した。動物モデルの構成は、動物１頭当たり（１００μｌの５０％ＰＢＳ／５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の）２×１０6のＮＣＩ−Ｎ８７細胞又は１０7のＡ４３１細胞を右脇腹に皮下接種し、続いて３０日の接種期間を置くことを含んでいた。これらの腫瘍におけるＨＥＲ２発現は、ＦＤＡ認可のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（Ｄａｋｏ社、Ｋ５２０４）を用いて免疫組織化学により評価した。
【０１９４】
図３３は、推奨強度スケール（０→＋３）によれば、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍は強く染色される（＋３）のに対し、Ａ４３１細胞はかなり弱い染色強度を示すことを表している。これらのデータは、腫瘍モデルが顕著に異なるＨＥＲ２発現を有し、したがってＨＥＲ２標的化Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子の取込みを比較するのに適することを示唆している。ＩＨＣスコアの十分な分離に基づけば、さらなる定量的評価は不要であると考えられた。
【０１９５】
実施例２６：正常マウスにおける化合物２、５及び７の体内分布
食塩水で製剤化したトレーサー化合物２、５及び７を、ナイーブＣＤｌマウスを用いて評価した。３ＭＢｑの放射能（２分の時点で２．５ＭＢｑ）を静脈内注射した後、動物を注射後２分、９０分、１２０分及び１８０分に屠殺し、主要器官における放射性の保持を評価した。体内分布測定では、５は顕著な腎臓保持（注射後９０分で７０．３％ＩＤ）を示したが、２又は７に関しては認められなかった（注射後９０分でそれぞれ４．８％ＩＤ及び１０％ＩＤ）。７の脱フッ素化が認められた（注射後９０分で骨取込み５．３％ＩＤ／ｇ）。図３４は、体内分布データを次式の対応する［111Ｉｎ］ＤＯＴＡ−Ｚ０２８９１（配列番号２）（９）化合物と比較している。
【０１９６】
【化２９】
2014507400.tif 000044
実施例２７：化合物２、５及び７の腫瘍取込み
高いＨＥＲ２レベル及び低いＨＥＲ２レベルを発現する腫瘍細胞を有する腫瘍マウスモデル（それぞれＮＣ８７及びＡ４３１）において、化合物２、５及び７の差別的取込みが予想通りに観察された。図３５、表１５及び表１６は、体内分布データを対応する［111Ｉｎ］ＤＯＴＡ−Ｚ０２８９１（配列番号２）（９）化合物と比較している。
【０１９７】
【表１５】
2014507400.tif 000045
【０１９８】
【表１６】
2014507400.tif 000046
実施例２８：二重腫瘍異種移植モデルにおける２のイメージング
２つの脇腹の各々にＡ４３１及びＮＣＩ−Ｎ８７を移植することにより、二重腫瘍異種移植マウスを生成した。これらのマウスを用いて２の体内分布を評価することで、低ＨＥＲ２発現腫瘍及び高ＨＥＲ２発現腫瘍の両方への取込みを同一動物で評価することを可能にした。時点は注射後３０分及び６０分を含んでいた。
【０１９９】
図３６は、２の性能が単一腫瘍動物試験で観察されたものと同等であり、注射後３０分という早い時期から始めて、Ａ４３１腫瘍とＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍との間には結合剤取込みに良好な分離が見られることを示している。バックグラウンド組織クリアランスに関する限りでは（主要組織の比に関しては表７を参照されたい）、注射後６０分での血中レベルは顕著に低下して４．５２のＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍：血液比を与える一方、３０分では部分的な血中クリアランスが２．３９の比を与えると共に、１．３９という正の腫瘍：肝臓比を与える。これらの性質は、２の薬物動態学が適当なイメージングウィンドウ内でヒト被験体をイメージングするのに十分であることを示唆している。
【０２００】
【表１７】
2014507400.tif 000047
実施例２９：ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウスにおける化合物２のアドバック試験
結合剤効力に対する過剰の非放射性リガンドの効果を評価するためにＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍モデルにおいて実施したアドバック試験に関しては、次の４種の製剤を注射後９０分に評価した。
１．標準の化合物２製剤、
２．標準製剤＋マウスごとに１００μｇ／ｋｇの非放射性前駆体、
３．標準製剤＋マウスごとに５００μｇ／ｋｇの非放射性前駆体、及び
４．標準製剤＋マウスごとに１０００μｇ／ｋｇの非放射性前駆体。
標準製剤中における非放射性前駆体の濃度は１２０μｇ／ｋｇ／マウスであり、したがってこの試験は（マウスにおいて）使用した元の濃度の１０×の非放射性前駆体の効果を調べた。図３７は、腫瘍取込みに対する効果が顕著でなく、また他の組織からのクリアランスも顕著な影響を受けなかったことを示している。
【０２０１】
実施例３０：二重脇腹Ａ４３１／ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウスにおける化合物２のインビボイメージング試験
実施例２８に記載した二重腫瘍マウスモデルを用いて、予備的イメージング試験を実施した。動物ごとに１０ＭＢｑの２を静脈内注射し、注射後１２０分から始めてマウスを３０分間イメージングした。図３８の画像は、以前に体内分布試験で実証されたように、クリアランスが腎臓を通して行われることを示している。横断イメージングは２つの腫瘍中への取込みを示していて、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍はＡ４３１腫瘍より顕著に高い信号強度を示しており、これは実施例２８における二重腫瘍体内分布試験と一致している。
【０２０２】
今回の２イメージング試験をＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の９イメージング試験（図３８）と比較すれば、高ＨＥＲ２発現腫瘍と低ＨＥＲ２発現腫瘍との間における同様な取込みの差が示される。しかし２は、体内分布でも見られる微小な腎臓保持のため、腎臓からのバックグラウンドの顕著な改善を有している。
【０２０３】
上記に論議及び／又は引用されたすべての特許、雑誌論文、刊行物及び他の文書の内容は、援用によって本明細書中に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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