(57)【要約】  本発明は、軟骨形成増殖因子および深海熱水環境由来の中温性海洋細菌から分泌された海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体を含む軟骨細胞分化培地を提供する。本発明は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞において軟骨細胞分化を誘導するための方法、そのような方法によって得られた軟骨組織、およびそのような軟骨組織の治療目的の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの軟骨形成増殖因子、ならびに
−深海熱水環境由来の中温性海洋細菌から分泌された海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体
を含む軟骨細胞分化培地であって、
前記誘導体は次のステップ：
（ａ）５，０００から１００，０００ｇ／モルの分子量を有する脱重合誘導体を得るための前記天然ＥＰＳのフリーラジカル脱重合からなるステップ、
（ｂ）硫酸化多糖誘導体の総重量に対して重量で１０％から４５％の間の硫酸基置換度を有する硫酸化多糖誘導体を得るために十分な量の少なくとも１つの硫酸化剤を前記脱重合誘導体に添加するステップを含む、脱重合誘導体の硫酸化からなる後続ステップ
を含む工程によって得ることができる、軟骨細胞分化培地。
【請求項２】
前記誘導体は：
−５，０００から６０，０００ｇ／モル、５，０００から５０，０００ｇ／モル、５，０００から４０，０００ｇ／モル、５，０００から３０，０００ｇ／モルまたは１０，０００から２５，０００ｇ／モルの分子量を有し、
−５未満、典型的には１．５から４、より典型的には２未満の多分散性指数を有する、
請求項１に記載の軟骨細胞分化培地。
【請求項３】
前記中温性海洋細菌は、アルテロモナス属、シュードアルテロモナス属およびビブリオ属の細菌からなる群から選択される、請求項１または２に記載の軟骨細胞分化培地。
【請求項４】
前記中温性海洋細菌はアルテロモナス属のＧＹ７８５株である、請求項１から３のいずれか一項に記載の軟骨細胞分化培地。
【請求項５】
前記培地は、５μｇ／ｍＬから２００μｇ／ｍＬ、典型的には２５μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より典型的には２５μｇ／ｍＬから７５μｇ／ｍＬ、最も典型的には約５０μｇ／ｍＬの前記誘導体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の軟骨細胞分化培地。
【請求項６】
前記少なくとも１つの軟骨形成増殖因子は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−９ならびにこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の軟骨細胞分化培地。
【請求項７】
前記培地が線維芽細胞増殖因子、および／またはインスリン様増殖因子、典型的にはＩＧＦ−１をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の軟骨細胞分化培地。
【請求項８】
−形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの軟骨形成増殖因子、ならびに
−深海熱水環境由来の中温性海洋細菌から分泌された海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体
を含むキットであって、
前記誘導体が請求項１から４のいずれか一項で定義される、キット。
【請求項９】
細胞培養培地をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
多能性細胞または多分化能性細胞を請求項１から７のいずれか一項に記載の軟骨細胞分化培地で培養するステップを含む、多能性細胞または多分化能性細胞において軟骨細胞分化を誘導するための方法。
【請求項１１】
多能性細胞または多分化能性細胞を請求項１から７のいずれか一項に記載の軟骨細胞分化培地で培養するステップを含む、軟骨組織を得るための方法。
【請求項１２】
前記細胞はヒト間葉系幹細胞、典型的にはヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＴＳＣ）である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法によって得ることができる軟骨組織。
【請求項１４】
ヒトまたは動物の身体の軟骨損傷を伴う疾患の治療方法における移植組織としての、請求項１３に記載の軟骨組織の使用。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の身体の軟骨損傷を伴う疾患の治療方法における移植組織としての、請求項１３に記載の軟骨組織の使用。
【請求項１６】
軟骨損傷を伴う疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患を治療するための方法であって、請求項１３に記載の軟骨組織を前記対象に配置するステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記対象が軟骨損傷を伴う疾患を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
軟骨損傷を伴う疾患が変形性関節症、外傷性断裂、軟骨の剥離、骨軟骨炎、変形性椎間板症または再発性多発性軟骨炎である、請求項１５に記載の使用または請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年３月１８日出願の欧州特許出願ＥＰ第１１３０５３０６．０号に優先権を主張する。前記欧州特許出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、長管骨端を囲む特殊な組織である。関節軟骨は摩擦を低下させ、関節モビリゼーション（ｊｏｉｎｔ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）における緩衝組織として作用する。軟骨は、ＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型コラーゲンならびにプロテオグリカンから本質的になる大量の細胞外マトリックスの合成に関与する単一の細胞型である軟骨細胞からなる。軟骨細胞は、同化（ａｎａｂｏｌｉｃ）および異化（ｃａｔａｂｏｌｉｃ）プロセスの調節を通して軟骨の完全性を維持するのに主要な役割を演じる。しかし、軟骨は、加齢、外傷および炎症性または変形性疾患に由来する損傷を受けやすい。これらの機能障害はしばしば細胞外マトリックスの分解および最終的には関節機能の喪失をもたらす。
【０００３】
多数の外科的手法が軟骨の乏しい内在性自己修復能力を改善するために開発されている。不運にもこれらの技術では満足できる有効性は証明されていない。このような状況において、生物活性のある合成マトリックスと共に間葉系幹細胞を移植することによる機能的軟骨の再生が検討されている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、最初に骨髄で同定され、その後、例えば脂肪細胞、腱、滑膜、筋肉、骨膜などの種々の他の組織において同定されている。ＭＳＣは、特に再生医療に関して、自己再生、培養物中で増殖する能力および多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）等の多数の魅力的な特性を示す。具体的には、骨髄由来間葉系幹細胞および脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）は、軟骨修復における使用に有望である。しかし、これらの幹細胞株において軟骨細胞分化を強力に誘導するためおよび分化した軟骨細胞が肥大系列へさらに成熟することを阻害するための安定的に再現可能な手法を開発するためにはさらなる理解が必要である。これらの幹細胞株において軟骨細胞分化を誘導するための手法は、適切な軟骨細胞分化培地を含む。Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌ．Ｐｕｅｔｚｅｒらは、科学界によって今日までに提案されたさまざまな軟骨細胞分化培地を概説している（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｖｏｌｕｍｅ１６，Ｎｕｍｂｅｒ４，２０１０）。これらの著者らは、これらの軟骨細胞分化培地は安定に軟骨細胞を産生できるものではないと結論している。
【０００４】
したがって、改善された軟骨細胞分化特性を有する新規軟骨細胞分化培地を提供する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、軟骨細胞分化を誘導することが知られている増殖因子を含む軟骨細胞分化培地の軟骨分化特性が、前記培地に海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の特定の低分子量硫酸化多糖誘導体を添加することによって劇的に増加されうることを示した。
【０００６】
したがって本発明は、
−形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの軟骨形成増殖因子（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ならびに
−深海熱水環境由来の中温性海洋細菌から分泌された海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体
を含む軟骨細胞分化培地であって、前記誘導体は次のステップ：
（ａ）５，０００から１００，０００ｇ／モルの分子量を有する脱重合誘導体を得るための前記天然ＥＰＳのフリーラジカル脱重合からなるステップ、
（ｂ）硫酸化多糖誘導体の総重量に対して重量で１０％から４５％の間の硫酸基置換度を有する硫酸化多糖誘導体を得るために十分な量の少なくとも１つの硫酸化剤を脱重合誘導体に添加するステップを含む、脱重合誘導体の硫酸化からなる後続ステップ
を含む工程によって得ることができる、軟骨細胞分化培地に関する。
【０００７】
本発明は、
−形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの軟骨形成増殖因子、ならびに
−本発明による低分子量硫酸化多糖誘導体
を含むキットにも関する。
【０００８】
さらに、本発明は、多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞において軟骨細胞分化を誘導するための方法であって、多能性細胞または多分化能性細胞を本発明による軟骨細胞分化培地で培養するステップを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、軟骨組織を得るための方法であって、多能性細胞または多分化能性細胞を本発明による軟骨細胞分化培地で培養するステップを含む方法も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明による方法を用いて得られた軟骨組織、およびヒトまたは動物の身体の治療方法における移植組織としてのこれら軟骨組織の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＧＹ７８５ＤＲのノナサッカライド反復単位の構造。ＧＹ７８５ＤＲは、青で示すガラクツロン酸残基のＣ２位で天然に硫酸化される。ＧＹ７８５ＤＲＳは、ＧＹ７８５ＤＲの化学的に過硫酸化された形態である。付加硫酸基（ＳＯ３Ｎａ）の推定位置は矢印で示される。
【図２】ヒトＡＴＳＣ生存率および増殖。ヒトＡＴＳＣを、示された濃度のＧＹ７８５ＤＲ（ＡおよびＣ）、ＧＹ７８５ＤＲＳ（ＢおよびＤ）またはアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍＬ）のいずれかの存在下で７２時間培養した。生存率（ＡおよびＢ）は、ＭＴＳ活性測定によって評価し、未処理対照と比較した相対的ＭＴＳ活性として表した。増殖（ＣおよびＤ）は、トリパンブルー色素排除後の生存細胞の計数によって推定した。＊対照条件（多糖０μｇ／ｍＬ）と比較してＰ＜０．０５。
【図３】ｈＡＴＳＣペレットの組織学的特性決定。ヒトＡＴＳＣを、ＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳ５０μｇ／ｍＬを添加したまたは添加していない対照（ＣＴ）培地または軟骨形成（ＣＨ）培地の存在下で、ペレットで２８日間培養した。ペレット体積は、これらの実体を楕円体と見なすことによって算出した。＊対照条件（多糖０μｇ／ｍＬ）と比較したＰ＜０．０５。ＧＡＧ産生は、ペレット全体のアルシアンブルー染色後の総レベルで評価した。スケールバー：５００μｍ。
【図４】軟骨形成マーカーの発現レベルの分析。ヒトＡＴＳＣペレットを、ＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳ５０μｇ／ｍＬを添加したまたは添加していない対照（ＣＴ）培地または軟骨形成（ＣＨ）培地の存在下で２８日間培養した。軟骨形成マーカーＣＯＬ２Ａ１、ＡＣＡＮ、ＳＯＸ９およびＣＯＭＰの発現をリアルタイムＰＣＲによって調査した。結果を多糖非存在下での軟骨形成培地と比較した相対的発現レベルとして表す。＊軟骨形成培地（ＣＨ）と比較してｐ＜０．０５。＃ＧＹ７８５ＤＲを添加した軟骨形成培地と比較してｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本発明において、用語「軟骨細胞分化培地」は、前記培地で培養された多能性細胞または多分化能性細胞において軟骨細胞分化を誘導できる液体培地を意味する。本発明による軟骨細胞分化培地は、典型的には前記軟骨形成増殖因子（複数可）および前記誘導体（複数可）に加えて細胞の生育（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化および生存を支持するために必要な栄養物を含む。したがって本発明による適切な軟骨細胞分化培地は、典型的には、例えばダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地またはこれらの混合物などの細胞がその中で生育できる最少培地を含み、次の：グルコース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＤ（登録商標）ＩＴＳまたはＩＴＳ＋Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、ヒドロコルチゾン、無機リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、塩化カルシウム、チロキシン、プロリン、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、塩酸ピリドキシン、グルタマックス、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、β−グリセロリン酸、デキサメタゾンの少なくとも１つが添加されている。適切な培地の例は、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌ．ＰｕｅｔｚｅｒらによってＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，２０１０において開示されている。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「軟骨細胞分化」は、軟骨のものに近い細胞外マトリックスを産生する細胞への多能性細胞または多分化能性細胞の分化を意味する。多能性細胞または多分化能性細胞の軟骨細胞分化は、Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃ．らによってＡｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｙｓｉｏｌ，２０１０，２９８（２）：第３５５〜６４ページに十分記載されているとおり、典型的には、ペレット体積、細胞形態ならびにヘマトキシリン−エオシン−サフラン（ＨＥＳ）およびアルシアンブルー染色によるマトリックス組成の測定によって評価される。ＨＥＳ染色は、ペレットを構成する細胞中の細胞核および細胞質の識別を可能にし、それによりペレット中の細胞の構造機構（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の存否が証明され、ここで、構造機構は軟骨細胞分化の指標となる。ＨＥＳ染色は、同様に軟骨細胞分化の指標であるマトリックス中のコラーゲン線維をさらに着色する。アルシアンブルー染色は、軟骨細胞分化の別のマーカーである硫酸化グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の存在を明らかにする。さらに、ＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型コラーゲンならびにアグリカンの免疫組織学的検出も軟骨細胞分化のさらなるマーカーとして用いることができる。多能性細胞または多分化能性細胞の軟骨細胞分化は、軟骨細胞の特異的マーカーであるＣＯＬ２Ａ１（ＩＩ型コラーゲン）、ＡＣＡＮ（アグリカン）、ＳＯＸ９およびＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）をコードするｍＲＮＡの細胞中での発現レベルを測定することによっても評価される。
【００１４】
本明細書で用いられる用語「少なくとも１つの軟骨形成増殖因子」は、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の軟骨形成増殖因子を意味する。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌs）」は、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の種々の異なる細胞系列を生じさせることができる未分化細胞を意味する。典型的には多能性細胞は、次のマーカー、ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ  ３および４、ＴＲＡ１／８１を発現し得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，８０３〜８１６（２００７））を参照されたい。
【００１６】
用語「多分化能性細胞(ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ)」および「前駆細胞」は本明細書で互換的に用いられる。これらは、軟骨細胞を含む、限定された数の異なる細胞系列を生じさせることができる未分化細胞を意味する。本発明による典型的な多分化能性細胞は、間葉系幹細胞である。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「対象」は、軟骨損傷を伴う疾患に冒される可能性があってもなくてもよい哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
【００１８】
本発明において、用語「治療する」または「治療」は、疾患の発症を遅延もしくは予防すること、疾患の症状の進行、憎悪もしくは悪化を逆行、軽減、抑制、減速もしくは停止させること、疾患の症状の回復をもたらすことおよび／または疾患を治癒することを目的とする方法を意味する。
【００１９】
いくつかの好ましい実施形態の詳細な記載
Ｉ．軟骨細胞分化培地
本発明は、
−形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの軟骨形成増殖因子、ならびに
−深海熱水環境由来の中温性海洋細菌から分泌された海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体
を含む軟骨細胞分化培地であって、前記誘導体は次のステップ：
（ａ）５，０００から１００，０００ｇ／モルの分子量を有する脱重合誘導体を得るための前記天然ＥＰＳのフリーラジカル脱重合からなるステップ、
（ｂ）硫酸化多糖誘導体の総重量に対して重量で１０％から４５％の間の硫酸基置換度を有する硫酸化多糖誘導体を得るために十分な量の少なくとも１つの硫酸化剤を脱重合誘導体に添加するステップを含む、脱重合誘導体の硫酸化からなる後続ステップ
を含む工程によって得ることができる、軟骨細胞分化培地に関する。
【００２０】
１．ＥＰＳの低分子量硫酸化多糖誘導体を得るための工程
本発明による海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体を得るための工程は、国際特許出願ＷＯ２００６／００３２９０において、また、Ｃｏｌｌｉｅｃ  Ｊｏｕａｕｌｔ  Ｓ．らによるＢｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００１，１５２８（２〜３）：第１４１〜１５１ページにおいて、およびＧｕｅｚｅｎｅｃ  Ｊ．らによるＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９９８，３７（１）：第１９〜２４ページにおいて十分記載されている。
【００２１】
ある実施形態では、ステップ（ａ）後に得られた脱重合誘導体は凍結乾燥される。
【００２２】
他の実施形態では、工程のステップ（ｂ）に透析ステップが続く。
【００２３】
最初の脱重合ステップにおいて、天然ＥＰＳは液体形態で、すなわち細菌から培養培地中に分泌されたものとして用いることができる。好ましくは、培養培地を遠心分離し、天然ＥＰＳを含有し細菌の細胞片を含まない上清だけを回収する。天然ＥＰＳは、例えば膜限外濾過などの当業者に周知の任意の好適な技術によって回収することができ、任意選択でその後、そのまままたは付加塩の形態で凍結乾燥することができる。
【００２４】
天然ＥＰＳのフリーラジカル脱重合からなるステップは、好ましくは、天然ＥＰＳを含む反応混合物に、好ましくは金属触媒の存在下で、酸化剤溶液を添加することによって実施される。酸化剤は、過酸化物、特には過酸化水素、ならびに過酸、特には過酢酸および３−クロロ過安息香酸から好ましくは選択される。添加は、好ましくは、連続的に、撹拌しながら３０分間から１０時間の間の期間で行われる。反応混合物は、好ましくは、フリーラジカル脱重合反応の期間全体を通して、例えば水酸化ナトリウムなどの塩基性化剤の添加によって６から８の間のｐＨに、およびおよそ３０から７０℃の間の温度に維持される。
【００２５】
本発明の特定の実施形態によれば、このステップでは天然ＥＰＳは、反応混合物１ｍｌあたりおよそ２から１０ｍｇの濃度で反応混合物中に存在する。
【００２６】
好ましい実施形態では、酸化剤は、好ましくは重量でおよそ０．１％から０．５％、好ましくは重量で０．１％から０．２％程度の濃度を有する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の溶液であり、Ｖ１／１０００からＶ１／１０ｍｌ／分、好ましくはＶ１／５０からＶ１／５００ｍｌ／分、より好ましくはＶ１／１００ｍｌ／分程度の流速で添加され、ここでＶ１は過酸化水素溶液が添加される海産菌体外多糖（ＥＰＳ）を含有する反応媒体の体積である。
【００２７】
脱重合ステップにおいて用いることができる金属触媒は、特許出願ＥＰ第０２２１９７７号に具体的に記載されているように、Ｃｕ＋＋、Ｆｅ＋＋およびＣｒ＋＋＋イオンならびにＣｒ２Ｏ７２−アニオンから好ましくは選択される。特定の実施形態によれば、金属触媒は反応混合物中におよそ１０−３Ｍから１０−１Ｍの間の濃度で、好ましくはおよそ０．００１から０．０５Ｍの間の濃度で存在する。
【００２８】
本発明によるおよび上に記載のフリーラジカル脱重合工程は、均一な低分子量多糖誘導体を、単一ステップで高い収率で得ることを可能にする。本発明において、用語「均一な誘導体」は、高速サイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価された場合に、多分散指数Ｉ（Ｍｗ／Ｍｎ）＜５（式中、Ｍｗ＝重量平均分子量、Ｍｎ＝数平均分子量）によって特徴付けられる、サイズに関して均一の多糖鎖の主要集団を表す単一のメインピークを示す誘導体を意味することが意図される。
【００２９】
ある実施形態では、脱重合反応が終了した際に、得られた多糖誘導体は、その還元末端が非常に反応性である鎖を安定化させるために、具体的には「ピーリング」反応による鎖加水分解を回避するために還元剤を用いて還元される。この効果のために用いることができる還元剤の性質は重要ではない。還元剤は、具体的には水素化ホウ素ナトリウムであってよい。
【００３０】
脱重合ステップにおいて用いられる金属触媒は、脱重合反応の最後に（または還元ステップが実施される場合は還元反応の最後に）、任意の好適な方法を用いて、例えばイオン交換クロマトグラフィー、好ましくは予め不動態化した弱カチオン交換樹脂によって、またはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）での処理によって、除去しうる。
【００３１】
ある実施形態では、硫酸化ステップの前に、フリーラジカル脱重合ステップの最後および／または還元ステップの最後に得られるＮ−アセチル化ヘキソサミンを含む多糖誘導体のＮ−脱アセチル化からなるステップが実施される。このＮ−脱アセチル化ステップは、出典Ｚｏｕら（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１９９８，３０９：２９７〜３０１）のプロトコールにより実施される。有利には、Ｎ−脱アセチルステップは、多糖誘導体を含む反応混合物に撹拌条件下で水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加することによって実施される。反応混合物の温度がおよそ８０℃に達したときに、塩基性化剤、好ましくは水酸化ナトリウムを反応媒体に添加する。１時間の反応後、反応媒体はｐＨ５になるまで酢酸を連続的に添加することによって中和される。得られた多糖誘導体は、膜限外濾過によって回収することができ、次いで任意選択で凍結乾燥することができる。
【００３２】
脱重合反応からおよび／または還元からおよび／またはＮ−脱アセチル化から生じた多糖誘導体は、必要な場合は、例えば膜限外濾過または透析などの当業者に周知の任意の好適な技術により回収することができる。次いでそれらは、凍結乾燥され、続く硫酸化ステップを改善するために必要であるそれらの純度を上げるためにサイズ排除クロマトグラフィーによって分画される。最後に、精製された多糖誘導体は、例えばピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウムおよび水酸化ナトリウムから選択されうる弱塩基または強塩基の添加によって塩形態に調製される。凍結乾燥塩は、例えば、例えばＤｏｗｅｘ（登録商標）の名称でＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から販売されているものなどのイオン交換樹脂カラム上で１から８ｍｇ／ｍｌの間の濃度の多糖誘導体水溶液を溶出することによって調製することができる。ｐＨが酸性、例えば５未満である限り、溶出物を回収し、次いでｐＨを上に定義した望ましい塩基でおよそ６．５に調整する。次いで、塩形態の多糖誘導体を、限外濾過および凍結乾燥する。
【００３３】
凍結乾燥した多糖誘導体は、場合によっては付加塩の形態であってよいが、好ましくは、硫酸化ステップの最初に無水溶媒に溶解される；この溶媒は好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ホルムアミドおよびこれらの混合物から選択される。無水溶媒中に存在する多糖誘導体の量は、およそ１から１０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくはおよそ１から５ｍｇ／ｍｌの間であってよく、さらに好ましくはこの量はおよそ２．５ｍｇ／ｍｌである。ＥＰＳの無水溶媒中への溶解は、好ましくは、撹拌しながら、環境温度でおよそ１から２時間、次いで４０から５０℃の間の温度で、好ましくはおよそ４５℃の温度でおよそ２時間、モレキュラーシーブを用いてアルゴンまたは窒素下で実施される。
【００３４】
硫酸化ステップにおいて用いられる１つまたは複数の化学的硫酸化剤は、凍結乾燥形態または溶液形態にある脱重合化および／または還元化および／またはＮ−脱アセチル化ＥＰＳに添加することができる。
【００３５】
硫酸化剤は、ピリジン硫酸塩（遊離またはポリマーに結合している）、ジメチルホルムアミド硫酸塩、トリエチルアミン硫酸塩およびトリメチルアミン硫酸塩の複合体から好ましくは選択される。１つまたは複数の化学的硫酸化剤を、多糖誘導体の溶液に、溶液中の多糖誘導体の質量の好ましくはおよそ４から６倍、より好ましくはおよそ５倍に相当する重量で添加する。次いで、化学的硫酸化反応は、好ましくは、望まれる硫酸化度に応じておよそ２から２４時間の間の期間、撹拌して行われる。望まれる硫酸化度に達したとき、反応媒体を冷却後に、硫酸化反応を：
−塩化ナトリウム飽和アセトンまたはメタノールの存在下での沈殿、続く沈殿物の水への溶解；
−または、好ましくは、好ましくは反応体積の１／１０に等しい比率での水の添加、および例えば水酸化ナトリウム（３Ｍ）などの塩基性化剤での反応媒体のｐＨの９への調整
のいずれかによって停止させる。
【００３６】
特定の実施形態によれば、硫酸化多糖誘導体溶液を、好ましくは、種々の塩を除去するために透析し、次いで凍結乾燥させる。典型的には正確な分子量および２未満の低い多分散指数を有する最終産物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施される分画によって得られる。
【００３７】
本発明による低分子量硫酸化多糖誘導体は、５，０００から１００，０００ｇ／モル、５，０００から６０，０００ｇ／モル、５，０００から５０，０００ｇ／モル、５，０００から４０，０００ｇ／モル、好ましくは５，０００から３０，０００ｇ／モル、より好ましくは１０，０００から２５，０００ｇ／モルの分子量を有する。
【００３８】
本発明による低分子量硫酸化多糖誘導体は、５未満、好ましくは１．５から４、より好ましくは２未満の多分散指数を有する。本発明による多分散指数（ＰＤＩ）は、誘導体の分子質量の分布の尺度である。算出されるＰＤＩは、重量平均分子量を数平均分子量で割ったものである。典型的にはＰＤＩはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。
【００３９】
本発明による硫酸化多糖誘導体は、硫酸化多糖誘導体の総重量に対して重量で１０％から４５％の間の硫酸基置換度を有する。特定の実施形態では硫酸基置換度は、１０％から４０％の間、２０％から４５％の間、または２０％から４０％の間である。
【００４０】
特定の実施形態では本発明による硫酸化多糖誘導体は、５，０００から５０，０００ｇ／モルの分子量、５未満、典型的には１．５から４、より典型的には２未満の多分散指数、および硫酸化多糖誘導体の総重量に対して重量で２０％から４０％の間の硫酸基置換度を有する。
【００４１】
２．中温性海洋細菌
特定の実施形態では本発明による誘導体は、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属およびビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の細菌からなる群から選択される中温性海洋細菌によって分泌される海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）由来である。特定の実施形態ではアルテロモナス属の細菌は、ＧＹ７８５、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ７０８、ＨＹＤ７２１、ＨＹＤ１５４５、ＨＹＤ１６４４、ＳＴ７１６およびＭＳ９０７株からなる群から選択される。別の特定の実施形態では中温性海洋細菌は、ビブリオ属のＨＥ８００株である。
【００４２】
特定の好ましい実施形態では本発明による誘導体は、アルテロモナス属（アルテロモナス・インフェルヌス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ））のＧＹ７８５株由来である。そのような誘導体は「ＧＹ７８５ＤＲＳ」と称される（分子構造について図１を参照されたい）。
【００４３】
３．天然ＥＰＳおよび誘導体の化学的特徴
特定の実施形態では低分子量硫酸化多糖誘導体は、アルテロモナス属の細菌によって分泌された天然ＥＰＳから得られる。天然ＥＰＳは典型的には、重量で２０％から７０％の、好ましくは３０％から６０％、より好ましくは３８％から５７％の中性単糖含有量を有する。さらに、天然ＥＰＳは典型的には、重量で５％から６０％、好ましくは６％から５０％の間の、より好ましくは８％から４２％の酸性単糖含有量を有する。典型的には、天然ＥＰＳはまた、それらのオシド組成物（ｏｓｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）中に重量で０％から１％のアミノ糖含有量を有する。
【００４４】
特定の実施形態では、アルテロモナス属の細菌によって分泌された天然ＥＰＳは：
−重量で２０％から７０％、好ましくは３０％から６０％、より好ましくは３８％から５７％の中性単糖、
−重量で５％から６０％、好ましくは６％から５０％、より好ましくは８％から４２％の酸性単糖、
−重量で０％から１％のアミノ糖
を含むオシド組成を有する。
【００４５】
別の実施形態では本発明の低分子量硫酸化多糖誘導体は、ビブリオ属の細菌によって、好ましくは細菌株ＨＥ８００によって分泌された天然ＥＰＳから得られる。ビブリオ属の細菌によって分泌された天然ＥＰＳは硫酸化されていない。天然ＥＰＳは典型的には、重量で０％から５％、好ましくは０％から１％の中性単糖含有量を有する。天然ＥＰＳはまた、典型的には重量で２０％から５０％、好ましくは２５％から４０％、より好ましくは３０％から３２％の酸性単糖含有量を有する。天然ＥＰＳはまた、典型的には重量で２０％から５０％、好ましくは２５％から４０％、より好ましくは３０％から３５％のアミノ糖含有量を有する。最後に天然ＥＰＳは、典型的には重量で０％から１５％、好ましくは４％から８％、より好ましくは５％から６％のＮ−アセチル化基含有量を有する。
【００４６】
特定の実施形態では、ビブリオ属の細菌によって分泌された天然ＥＰＳは：
−重量で０％から５％、好ましくは０％から１％の中性単糖、
−重量で２０％から５０％、好ましくは２５％から４０％、より好ましくは３０％から３２％の酸性単糖、
−重量で２０％から５０％、好ましくは２５％から４０％、より好ましくは３０％から３５％のアミノ糖、
−重量で０％から１５％の、好ましくは４％から８％、より好ましくは５％から６％のＮ−アセチル化基を含むオシド組成を有する。
【００４７】
さらに典型的には、本発明による中温性海洋細菌によって分泌された天然ＥＰＳは、重量で０％から１５％の、好ましくは０％から５％、より好ましくは０％から１％のタンパク質含有量を有する。
【００４８】
４．軟骨細胞分化培地における誘導体の量
特定の実施形態では、本発明による軟骨細胞分化培地は、５μｇ／ｍＬから２００μｇ／ｍＬ、典型的には２５μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より典型的には５μｇ／ｍＬから７５μｇ／ｍＬ、最も典型的には約５０μｇ／ｍＬの前記誘導体を含む。
【００４９】
５．軟骨形成増殖因子
軟骨形成増殖因子は、先行技術において十分記載されており、当業者に十分周知である。例えばＪｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌ．Ｐｕｅｔｚｅｒ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，２０１０）の総説は、多能性細胞または多分化能性細胞の軟骨細胞分化を誘導するために単独でまたは組合せで用いられるさまざまな軟骨形成増殖因子を開示している。
【００５０】
主な軟骨形成増殖因子ファミリーは、形質転換増殖因子βおよび骨形成タンパク質である。形質転換増殖因子βは、典型的にはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３から選択される。骨形成タンパク質は、典型的にはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−９から選択される。
【００５１】
他の軟骨形成増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、具体的にはＦＧＦ−２、およびインスリン様増殖因子、具体的にはＩＧＦ−１が挙げられる。
【００５２】
本発明による軟骨細胞分化培地に含まれうる具体的な軟骨形成増殖因子または軟骨形成増殖因子の混合物の例は：ＴＧＦ−β１；ＴＧＦ−β２；ＴＧＦ−β３；ＴＧＦ−β１＋ＴＧＦ−β２＋ＴＧＦ−β３；ＴＧＦ−β１＋ＦＧＦ−２；ＴＧＦ−β１＋ＩＧＦ−１；ＴＧＦ−β１＋ＢＭＰ−２；ＴＧＦ−β１＋ＢＭＰ−６；ＴＧＦ−β２＋ＩＧＦ−１；ＴＧＦ−β３＋ＦＧＦ−２；ＢＭＰ−２；ＢＭＰ−４；ＢＭＰ−６；ＢＭＰ−７；ＢＭＰ−９；ＢＭＰ−２＋ＢＭＰ−９；ＴＧＦ−β３＋ＢＭＰ−６；ＴＧＦ−β３＋ＢＭＰ−２；ＴＧＦ−β３＋ＢＭＰ−６＋ＩＧＦ−１；ＴＧＦ−β１＋ＴＧＦ−β３＋ＢＭＰ−６＋ＩＧＦ−１；ＢＭＰ−２＋ＢＭＰ−７；ＴＧＦ−β３＋ＢＭＰ−２＋ＢＭＰ−４＋ＢＭＰ−６＋ＢＭＰ−７＋ＩＧＦ−１；ＴＧＦ−β２＋ＢＭＰ−２＋ＢＭＰ−６＋ＢＭＰ−７である。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明による培地は、典型的にはインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸またはＩＴＳまたはＩＴＳ＋Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔs（ＢＤ（登録商標））も含む。
【００５４】
ＩＩ．軟骨細胞分化のためのキット
本発明は、形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの軟骨形成増殖因子ならびに上に記載のとおり深海熱水環境由来の中温性海洋細菌によって分泌された海産天然菌体外多糖（ＥＰＳ）の低分子量硫酸化多糖誘導体を含むキットにも関する。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明によるキットは、細胞培養培地をさらに含む。細胞培養培地の例は典型的にはダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地またはこれらの混合物などの細胞が生育できる最少培地を含み、グルコース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＤ（登録商標）ＩＴＳまたはＩＴＳ＋Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、ヒドロコルチゾン、無機リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、塩化カルシウム、チロキシン、プロリン、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、塩酸ピリドキシン、グルタマックス、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、β−グリセロリン酸、デキサメタゾンの少なくとも１つが添加されている。好適な細胞培養培地の具体的な例は、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌ．Ｐｕｅｔｚｅｒ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，２０１０）の総説に十分記載されている。
【００５６】
ＩＩＩ．軟骨細胞分化方法
本発明の他の態様は、多能性細胞または多分化能性細胞において軟骨細胞分化を誘導するためのｅｘ  ｖｉｖｏ法に関し、方法は多能性細胞または多分化能性細胞を本発明による軟骨細胞分化培地で培養するステップを含む。
【００５７】
本発明は、軟骨組織を得るためのｅｘ  ｖｉｖｏ法であって、多能性細胞または多分化能性細胞を本発明による軟骨細胞分化培地で培養するステップを含む方法も提供する。
【００５８】
本発明は、本発明による方法を用いて得られた軟骨組織にも関する。
【００５９】
本発明はさらに、ヒトまたは動物の身体の治療方法における使用のための、本発明による方法によって得ることができる軟骨組織にも関する。
【００６０】
本発明はさらに、ヒトまたは動物の身体における軟骨損傷を伴う疾患の治療方法における使用のための、本発明による方法によって得ることができる軟骨組織にも関する。
【００６１】
本発明は、それを必要とする対象における軟骨損傷を伴う疾患の治療方法にも関し、その方法は本発明による方法によって得られた軟骨組織を前記対象に入れるステップを含む。対象にそのような軟骨組織を入れるステップは、移植によって実施することができる。
【００６２】
軟骨損傷を伴う疾患の例は、これだけに限らないが、変形性関節症、軟骨の外傷性断裂または剥離、骨軟骨炎、変形性椎間板症（椎間板の変性症）、再発性多発性軟骨炎を含む軟骨損傷が挙げられる。
【００６３】
本発明の軟骨細胞分化培地で多能性細胞または多分化能性細胞を培養するステップは、軟骨細胞分化を可能にする時間実施されなければならない。典型的には、多能性細胞または多分化能性細胞の本発明の培地での培養は、少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも２５日間、最も好ましくは２８日間実施される。
【００６４】
必要に応じて本発明の軟骨細胞分化培地は、一定間隔で部分的にまたは全体的に入れ換えてよい。典型的には、本発明の軟骨細胞分化培地は、２８日間、２〜３日ごとに本発明の新鮮な軟骨細胞分化培地と入れ換えることができる。
【００６５】
特定の実施形態では軟骨細胞分化培地中でのヒト幹細胞の培養は、三次元培養系を用いて実施される。三次元培養系は、軟骨組織を得るために特に好ましい。三次元培養系の例は、ペレット培養、微量培養、高密度細胞培養および生体材料中での三次元培養であり、Ｖｉｎａｔｉｅｒ  Ｃ．らによってＴｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２７（５）：第３０７〜１４ページに十分記載されている。
【００６６】
ある実施形態では多能性細胞または多分化能性細胞は、ヒトの多能性細胞または多分化能性細胞である。
【００６７】
他の実施形態では多能性細胞または多分化能性細胞は、非ヒト哺乳動物の多能性細胞または多分化能性細胞である。
【００６８】
ある実施形態では多能性細胞または多分化能性細胞は、幹細胞である。
【００６９】
特定の実施形態では多能性細胞または多分化能性細胞は、多分化能性幹細胞、特にはヒト間葉系幹細胞である。ヒト間葉系幹細胞は、典型的には骨髄、脂肪組織、滑膜、臍帯血、筋肉、骨膜または胎盤から単離される。特定の実施形態ではヒト間葉系幹細胞は、ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＴＳＣ）である。
【００７０】
別の実施形態では、前記多能性細胞または多分化能性細胞は多能性細胞、特に胚性幹細胞である。
【００７１】
特定の実施形態では、多能性細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）である。典型的には、下の表に記載されているものなどのｈＥＳ細胞系を本発明の方法の実施において用いることができる。
【００７２】
【表１】
2014509517.tif 000002
【００７３】
一実施形態では、多能性細胞はマウス幹細胞などの非ヒト胚性幹細胞である。
【００７４】
一実施形態では多能性細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、非多能性細胞、典型的には成体体細胞から、特定の遺伝子の「強制的」発現を誘導することによって人為的に誘導される多能性幹細胞の種類である。ｉＰＳ細胞は、２００６年に初めてマウス細胞から（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  ２００６  １２６：６６３〜７６）、２００７年にヒト細胞から（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  ２００７  １３１−８６１−７２、Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７  ３１８：１９１７）産生された。
【００７５】
本発明のさらなる態様および利点は、以下の図および実施例において開示されるが、これらは例示として見なされるべきであり、本出願の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７６】
［材料および方法］
材料
細胞培養プラスチック製品は、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  ＢＶ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｃｈｉｐｏｌ−Ｒｉｊｋ、オランダ）から購入した。ハンクス平衡ナトリウム塩（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ変法イーグル培地高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）（ＤＭＥＭ）、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）、リン酸緩衝塩（ＰＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．５３ｍＭ）、Ｌ−グルタミン、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、ＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）。Ｉｎｖｉｔｒｏｌｏｎ膜は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）から得た。ＭＴＳ試薬はＰｒｏｍｅｇａ（Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ、フランス）からのものである。粗製コラゲナーゼＩＡ型、赤血球溶解緩衝液、トリパンブルー、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、ＩＴＳ培地サプリメント、デキサメタゾン、アルシアンブルーおよびアニソマイシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｅｕｒｏｐｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、オランダ）から得た。ＰＣＲプライマーは、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）によって合成された。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｄｕｔｓｃｈｅｒ（Ｂｒｕｍａｔｈ、フランス）から購入した。ＴＧＦ−β１は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｄｏｎ、英国）から得た。ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔはＱｉａｇｅｎから、ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅはＡｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．から購入し、どちらもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）によって供給された。タンパク質含有量は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。ウサギ抗ホスホ−ＳＭＡＤ２（３１０１）、ホスホ−ＥＲＫ１／２（９１０１）、ホスホ−ＪＮＫ１／２（９２５１）、ホスホ−ｐ３８（９２１１）、ＳＭＡＤ２（３１０２）、ＥＲＫ１／２（９１０２）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ結合（７０７４）抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ウエスタンブロット検出システムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｉｎ−ｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）から得た。他の全ての化学物質は、標準的な研究所供給者から得て、入手可能な最高純度のものであった。
【００７７】
ＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳ多糖の産生、精製および特性決定
２種の低分子量多糖ＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳは、細菌：アルテロモナス・インフェルヌスによって産生され、活発な熱水噴出口の近傍で回収された液体試料から単離された高分子量菌体外多糖（１．５×１０６Ｄａ）ＧＹ７８５由来である。単離手順およびアルテロモナス・インフェルヌス株の特性決定は、Ｒａｇｕｅｎｅｓら（Ｒａｇｕｅｎｅｓ  ＧＨら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７；８２：４２２〜４３０）によってすでに記載されている。天然多糖は、ＧＹ７８５ＤＲを得るためにラジカル脱重合させることができる。次いで他所に記載のとおり（Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ  Ｊら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．１９９８；３７：１９〜２４）、ＧＹ７８５ＤＲは、ＧＹ７８５ＤＲＳを得るために化学的に過硫酸化（ｏｖｅｒ−ｓｕｌｆａｔｅｄ）させることができる。ＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳは、分析用高速サイズ排除クロマトグラフィーおよび元素分析によってそれぞれ決定されたとおり、平均分子質量１５ｋＤａおよび２０ｋＤａならびに１０％および４５％の硫酸基を有する均一な画分である（図１）（Ｃｏｌｌｉｅｃ  Ｊｏｕａｕｌｔ  Ｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００１；１５２８：１４１〜１５１）。
【００７８】
細胞培養
ヒト脂肪組織間質細胞（ｈＡＴＳＣ）は、インフォームドコンセントを与えられた脂肪吸引法を受けている３名の異なる患者から得た吸引脂肪組織のコラゲナーゼ消化によって単離された。全てのプロトコールは、フランス国家倫理委員会によって承認された。簡潔には、また既に記載されているとおり（Ｅｓｔｅｓ  ＢＴら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１０；５：１２９４〜１３１１；Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０；２９８：３５５〜３６４）、吸引脂肪組織は細胞片を除去するためにＨＢＳＳで十分に洗浄した。洗浄した吸引脂肪組織をＨＢＳＳ中のコラゲナーゼ（０．０２５％）で１時間、３７℃で穏やかに撹拌しながら処理した。コラゲナーゼ処理物を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳ（対照培地）を含有する等体積のＤＭＥＭ高グルコースを添加することによって不活性化した。次いで消化産物を間質細胞から脂肪細胞を分離するために２５０×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を対照培地に再懸濁し、７０μｍナイロンメッシュフィルターで濾過した。濾液を遠心分離し、細胞を赤血球溶解緩衝液中に再懸濁した。溶解反応を、対照培地を添加することによって停止した。懸濁液を遠心分離し、細胞は最終的に対照培地に再懸濁し、１ｃｍ２あたり５×１０４細胞で７５ｃｍ２培養フラスコに播種した。細胞を３７℃で、５％ＣＯ２および９５％大気を含有する加湿雰囲気中でインキュベートし、対照培地は非接着細胞を除去するために播種後２４時間で置き換えた。その後対照培地を２〜３日ごとに新しくした。自然分化を防ぐために、ｈＡＴＳＣ初代培養細胞は９０％コンフルエントまで生育させ、次いでトリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞培養フラスコから剥離し、１ｃｍ２あたり１０４細胞で播種した。続く全ての実験においてｈＡＴＳＣは継代数２で用いた。上に記載のプロトコールを用いて単離したヒトＡＴＳＣを本発明者らの研究所においてさらに特性決定した(詳細については、Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０；２９８：３５５〜３６４およびＭｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１１  Ｆｅｂ  ３．，印刷前電子出版を参照されたい）。
【００７９】
生存率および増殖
細胞生存率を、既に記載されているとおり（Ｖｉｎａｔｉｅｒ  Ｃら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５；２６：６６４３〜６６５１）ＭＴＳアッセイを用いて評価した。ｈＡＴＳＣを２４ウエルプレートに１ｃｍ２あたり１×１０４細胞の密度で播種し、２５、５０、７５および１００μｇ／ｍＬのＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳ存在下または非存在下で対照培地中で７２時間培養した。陰性対照として細胞を周知の細胞死誘導因子アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍＬ）の存在下で培養した（Ｖｉｎａｔｉｅｒ  Ｃら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５；２６：６６４３〜６６５１）。簡潔には、培養培地を除去し、製造者による説明書のとおりＭＴＳ試薬を含有する新鮮培地で置き換えた。結果は、対照条件（多糖非存在下で培養された細胞）と比較した相対的ＭＴＳ活性として表した。
【００８０】
また、ＭＴＳ活性を細胞増殖と関連付けるために、生存細胞の数を推算した。既に記載されているとおり、細胞を７２時間培養後にトリプシン／ＥＤＴＡで処理し、トリパンブルー色素排除によって計数した（Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０；２９８：３５５〜３６４；Ｖｉｎａｔｉｅｒ  Ｃら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５；２６：６６４３〜６６５１）。結果は、対照条件（多糖非存在下で培養された細胞）と比較した１ｃｍ２あたりの生存細胞の合計数として表した。
【００８１】
軟骨細胞分化
ｈＡＴＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨細胞分化のために、以前に記載されているとおり、５×１０５細胞を対照培地１ｍＬを含む１５ｍＬポリプロピレンチューブに入れた（Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０；２９８：３５５〜３６４）。次いで、細胞を５分間２５０×ｇで遠心分離した。ガス交換を可能にするためにチューブにベントキャップを取り付け、細胞ペレットを３７℃で５％ＣＯ２および９５％大気を含有する加湿雰囲気中で維持した。２４時間後、ｈＡＴＳＣのペレットを６個の実験群に分け、対照（ＣＴ）培地または軟骨形成（ＣＨ）培地のいずれかの存在下で、単独でまたはＧＹ７８５ＤＲもしくはＧＹ７８５ＤＲＳを添加して培養した。軟骨形成培地は、６．２５μｇ／ｍＬインスリン、６．２５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）、５０ｎＭ  Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、１０−８Ｍデキサメタゾンおよび１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１を添加した無血清対照培地からなる（Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０；２９８：３５５〜３６４；Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１１  Ｆｅｂ  ３．，印刷前電子出版）。培養培地は２８日間、２〜３日ごとに交換した。ペレットを３７℃の加湿雰囲気（５％ＣＯ２および９５％大気）中で維持した。
【００８２】
ヒトＡＴＳＣペレットの特性決定
ペレット体積を測定するために、ペレットを不等辺楕円体（ｓｃａｌｅｎｅ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）と見なした。それらの体積を次の式を用いて概算した。
不等辺楕円体体積＝４／３πａｂｃ
式中、ａ、ｂおよびｃは、各空間面での長軸の半径を表す。
【００８３】
ペレットの総体的な外観について、硫酸化ＧＡＧの産生を２８日後のペレットについてアルシアンブルー染色で調査した。ペレットを氷冷ＰＢＳで洗浄し、２０分間１００％エタノールで固定した。次いでペレットを室温で０．１Ｍ  ＨＣｌ中の０．１％アルシアンブルー溶液で染色した。一晩のインキュベーション後、溶液を廃棄し、非特異的染色を除くためにペレットを０．１Ｍ  ＨＣｌでリンスした。実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＭＺ６、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を用いて写真を撮った。
【００８４】
組織学的分析のために、ｈＡＴＳＣの２８日後のペレットを１０％ホルマリン中で固定しパラフィンに包埋した。パラフィン切片（厚さ５μｍ）をトルエンを用いて脱パラフィンし、一連の段階的エタノールで再水和し、蒸留水でリンスした。組織切片をヘマトキシリン−エオシン−サフラン（ＨＥＳ）およびアルシアンブルーで以前に記載されているとおり染色した（Ｍｅｒｃｅｒｏｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０；２９８：３５５〜３６４）。次いで切片を光学顕微鏡を用いて視覚化した（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）。アルシアンブルーは軟骨性マトリックスを含有しているＧＡＧの存在を明らかにし、ＨＥＳは核を紫に、細胞質をピンクにおよびコラーゲン線維を黄色に染色する。
【００８５】
転写分析
ｈＡＴＳＣの２８日後のペレット由来のトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔを製造者の説明書に従って用いて抽出した。ＤＮａｓｅ消化後に、ＲＮＡをＵＶ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００，Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｐａｌａｉｓｅａｕ、フランス）を用いて定量し、品質はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）で決定した。１試料あたり５００ｎｇのＲＮＡをｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔを用いて総体積３０μＬで逆転写した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を１２．５μＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（１Ｘ）および３０ｎＭのＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎリファレンスダイを含有している総体積２５μＬのＰＣＲ反応混合物中で増幅した。各プライマーセットの配列および濃度を表１に提供する。
【００８６】
【表２】
2014509517.tif 000003
【００８７】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応をＭＸ３０００Ｐ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で次の条件：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、６０℃で１分間および７２℃で３０秒間の４０サイクルで実施した。各プライマーセットの効率および特異性をサイクル閾（Ｃｔ）値対トータルＲＮＡの希釈系列の標準曲線および融解プロファイル評価で確認した。サイクル閾値は、ｃＤＮＡ定量差異を調節するためにβ−アクチンに対して標準化した。結果を軟骨形成培地の存在下で培養した細胞と比較した相対的発現レベルとして報告した。
【００８８】
表面プラズモン共鳴法
実験をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で実施した。ＴＧＦ−β１およびインスリンをＣＭ５  ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のデキストランマトリックスに製造者による推奨のとおり５μＬ／分の流速で共有結合的に固定化した。ＧＹ７８５ＤＲ（１．５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍＬ）ならびにＧＹ７８５ＤＲＳ（０．０３１２、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５０および１μｇ／ｍＬ）の結合アッセイを０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．００５％Ｐ２Ｏ界面活性物質を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４（ＨＢＳ−Ｐ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｉａｃｏｒｅ）中で実施し、解離を１５分間モニターした。各サイクル後にＮａＯＨ（４．５ミリモル／Ｌ）で再生した。得られたセンサーグラムをＢｉａＥｖａｌ  ４．１ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いてフィットさせた。Ｋｄ算出については次の分子量を用いた：ＧＹ７８５ＤＲ：１５，０００ｇ／モルおよびＧＹ７８５ＤＲＳ：２０，０００ｇ／モル。
【００８９】
ウエスタンブロッティング
コンフルエントｈＡＴＳＣをＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）単独またはＧＹ７８５ＤＲもしくはＧＹ７８５ＤＲＳ（５０μｇ／ｍＬ）との組合せの存在下で、低血清レベル（０．５％）を含む対照培地中で１、４、８および２４時間培養した。各時点で、細胞を液体窒素中で急速凍結し、使用まで−８０℃保存した。ウエスタンブロッティング用に、細胞を氷上で融解し、ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ  β−グリセロリン酸、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭ  ＮａＦ）の添加によって溶解した。細胞溶解物のタンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−Ｐｌｕｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙで決定した。総タンパク質３０μｇをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで分離し、製造者のプロトコールに従ってタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロックし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中５％脱脂粉乳中でプローブさせた。一次抗体は１／１０００で希釈し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中５％脱脂粉乳に１／２０００で希釈したヤギ抗ウサギ（ＨＲＰ）−コンジュゲート二次抗体を用いて検出した。ブロットをウエスタンブロッティング検出システムを用いて増強化学発光（ＥＬＣ）発色によって視覚化した。
【００９０】
ＳＭＡＤおよびＭＡＰキナーゼ活性化についての陽性対照として、コンフルエントの造骨性ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を一晩血清飢餓にし、アニソマイシン（５μｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）または無機リン酸（Ｐｉ；１０ｍＭ）で以前に記載されているとおり１５分間処理した（Ｊｕｌｉｅｎ  Ｍら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；２４：１８５６〜１８６８）。
【００９１】
統計解析
各実験は、少なくとも３回繰り返し、同様の結果となった。結果を３回反復測定の平均±ＳＥＭとして表す。平均値の比較検討をｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡに続いてポストホック検定（フィッシャーの制約付最小有意差法）を用いることによって、ｐ＜０．０５を統計的有意として実施した。
【００９２】
［結果］
多糖の存在下で培養したｈＡＴＳＣの生存率および増殖
０、２５、５０、７５および１００μｇ／ｍＬのＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳの存在下で培養したｈＡＴＳＣの生存率および増殖を検討するために、ＭＴＳ活性を測定し、細胞をトリパンブルー色素排除により７２時間後に計測した。陰性対照としてアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍＬ）の存在下で細胞を培養した。アクチノマイシンＤで処理した場合、ｈＡＴＳＣのＭＴＳ活性および増殖はほぼ９０％近く顕著に減少した。５０μｇ／ｍＬの濃度では、ＧＹ７８５ＤＲは、ＭＴＳ活性のわずかだが有意な増加を誘導した（図２Ａ）。ＧＹ７８５ＤＲＳは、ＭＴＳ活性の用量依存的増加を５０μｇ／ｍＬを最大として誘発することが見出された（図２Ｂ）。ｈＡＴＳＣ増殖に関しては、ＧＹ７８５ＤＲがいかなる有益な効果も生じなかった（図２Ｃ）一方で、分子の硫酸化形態（ＧＹ７８５ＤＲＳ）は５０および７５μｇ／ｍＬで対照条件と比較してｈＡＴＳＣ増殖を有意に増加させた（図２Ｄ）。
【００９３】
これらの結果は、ＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳがｈＡＴＳＣの生存率および増殖にわずかだが有意な効果を有することを示す。続く全ての実験においてＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳは、５０μｇ／ｍＬの用量で用いた。
【００９４】
多糖存在下で培養したｈＡＴＳＣの軟骨細胞分化
ｈＡＴＳＣを５０μｇ／ｍＬのＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳを添加した対照（ＣＴ）培地または軟骨形成（ＣＨ）培地の存在下、三次元ペレットで２８日間培養した。軟骨細胞分化をペレット体積の測定によって、およびアルシアンブルー染色を用いた軟骨性マトリックスを含有するＧＡＧの産生によって評価した（図３）。
【００９５】
驚くべきことに、体積推定値は、軟骨形成培地との組合せでＧＹ７８５ＤＲＳに暴露されたペレットが大幅に８倍近く増加したことを明らかにした（図３上欄）。異なる条件の間でのＧＡＧ産生に関する最も高い差異に加えて、ペレットの全体的な外観をアルシアンブルー染色後に観察した。アルシアンブルー染色は、その強い暗青色によって証明されるとおり、軟骨形成培地の存在下では、ＧＡＧ産生が多糖の添加に関係なく上方制御されたことを明らかにした（図３下欄）。
【００９６】
ｈＡＴＳＣ軟骨細胞分化をさらに特性決定するために、続いて、細胞形態およびマトリックス組成をペレット切片のＨＥＳおよびアルシアンブルー染色によって組織学的に検討した。対照培地（ＣＴ）の存在下で、ＨＥＳ染色は細胞核（紫）および細胞質（ピンク）の識別を可能にするが、細胞の特定の機構を裏付けていない。対照的に、軟骨形成培地（ＣＨ）の存在下では、多糖を添加された場合またはされていない場合も、ＨＥＳ染色はペレット内の細胞の特定の構造機構を証明した。外側の領域では、細胞はペレット表面に接線方向に方向付けられており、最も内側の部分では細胞は放射状に配向していると考えられる。さらに、軟骨形成培地の存在下では、マトリックス内でのコラーゲン線維の合成を示す黄色−オレンジ環が見える。アルシアンブルー染色は、対照培地で培養されたペレットのマトリックス内では硫酸化ＧＡＧの存在を示すことができなかった。興味深いことに、ペレット切片は、軟骨形成培地の存在下、特にＧＹ７８５ＤＲＳ多糖を添加した軟骨形成培地の存在下では、濃い深青色染色を観察することができ、硫酸化ＧＡＧ検出について強陽性であった。
【００９７】
本発明者らの組織学的観察結果によって証明されたｈＡＴＳＣペレットの軟骨様外観を確認するために、ＣＯＬ２Ａ１、ＡＣＡＮ、ＳＯＸ９およびＣＯＭＰ転写物の相対的発現をリアルタイムＰＣＲによって決定した（図４）。得られたデータは、多糖を添加したまたは添加していない対照培地（ＣＴ）の存在下では種々の軟骨形成マーカーをコードしている転写物は検出できなかった（ＮＤ）か、またはかろうじて検出可能なレベルに留まったことを示した。分析した各転写物について、その発現レベルは、軟骨形成培地の存在により対照培地と比較して顕著に増加した。興味深いことに、軟骨形成培地と組合せて使用されたＧＹ７８５ＤＲＳは、ＧＹ７８５ＤＲとの比較において、４個の軟骨形成マーカーの発現レベルの顕著な増加を誘導した。ＧＹ７８５ＤＲは、軟骨形成培地とのいかなる相加効果または相乗効果も誘導しなかった。
【００９８】
総合すれば、これらの結果はＧＹ７８５ＤＲＳが軟骨形成培地と同時に用いられた場合にｈＡＴＳＣの軟骨細胞分化を増強することを示している。
【００９９】
ＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳ多糖と軟骨形成培地のＴＧＦ−β１／インスリンとの間の相互作用
ＧＹ７８５ＤＲＳがｈＡＴＳＣ軟骨細胞分化を刺激できるかどうかにさらに検討するために、数回の表面プラズモン共鳴実験を実施した。用いた軟骨形成培地は、ＭＳＣの軟骨細胞分化を推進することが知られている主な２つの構成成分：ＴＧＦ−β１（Ａｗａｄ  ＨＡら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００３；９：１３０１〜１３１２；Ｐｕｅｔｚｅｒ  ＪＬら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．２０１０；１６：４３５〜４４４）およびインスリン（Ｍａｌａｆａｙａ  ＰＢら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１０；１６：７３５〜７４７；Ｗａｎｇ  ＣＹら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．２０１０；１５：４３９〜４４９）を含有した。ＴＧＦ−β１およびインスリンがＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳと特異的に相互作用できるかどうかを調査するために、これらの潜在的な物理的相互作用の定量的測定をＢｉａｃｏｒｅ分析によって実施した。ＴＧＦ−βおよびインスリンをチップに固定し、漸増させた濃度のＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳ多糖をチップ表面に注入した。応答単位で表される結果を各分析物濃度についてセンサーグラムの形態で記録し、解離定数（Ｋｄ）を算出した。ＧＹ７８５ＤＲおよびＧＹ７８５ＤＲＳ多糖は、どちらも固定化ＴＧＦ−βに結合できた。ＴＧＦ−βに対するＧＹ７８５ＤＲの結合親和性は、ＧＹ７８５ＤＲＳ多糖のそれよりも約１００倍低く、それぞれ３，４５．１０−８および５，５．１０−１０ＭのＫｄであった。固定化インスリンとの結合におけるＧＹ７８５ＤＲまたはＧＹ７８５ＤＲＳとの間の相互作用の動力学的パラメーターに変化は観察されなかった（平らなセンサーグラムを示すデータは未記載）。これらの結果は、ＧＹ７８５ＤＲＳはＧＹ７８５ＤＲよりも高い親和性でＴＧＦ−β１に結合できるが、どちらもインスリンとは相互作用しないことを示す。
【０１００】
ＧＹ７８５ＤＲＳのＴＧＦ−β１シグナル伝達経路への効果
ＴＧＦ−β１がＳＭＡＤ２を含むいくつかのシグナル伝達経路を活性化することは知られている（Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０００；１４：６２７〜６４４）。したがって、表面プラズモン共鳴によって証明されたＧＹ７８５ＤＲＳ／ＴＧＦ−β１相互作用がｈＡＴＳＣ中の細胞内事象の特異的活性化を引き起こすことができるかどうかを検討するために、ＳＭＡＤ２のＴＧＦ−β依存的活性化の潜在的上方制御をｈＡＴＳＣで測定した。この目的のために、ｈＡＴＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１および５０μｇ／ｍＬのＧＹ７８５ＤＲＳに単独でまたは同時に１、４、８および２４時間暴露した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を陽性対照として用いた。４℃での溶解の前に細胞を液体窒素中で急速凍結した。得られた試料をＰ−ＳＭＡＤ２、Ｐ−ＥＲＫ１／２、Ｐ−ＪＮＫ１／２およびＰ−ｐ３８に対する特異的抗体、ならびに／またはＳＭＡＤ２およびＥＲＫ１／２に対する抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。細胞溶解物の免疫ブロットは、ＴＧＦ−β１単独またはＧＹ７８５ＤＲＳ多糖との組合せが早くも１時間から２４時間までＳＭＡＤ２のリン酸化を誘導したことを示した。硫酸化多糖単独の存在は、ＳＭＡＤ２活性化を促進するためには十分でなく、ＳＭＡＤ２のリン酸化についてＧＹ７８５ＤＲＳとＴＧＦ−β１との相加効果または相乗効果は検出できなかった。ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８などのＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路がＴＧＦ−β依存性軟骨細胞分化に広く関与していることから（Ｄｅｒｙｎｃｋ  Ｒら、Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２５：５７７〜５８４；Ａｒｉｔａ  ＮＡら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１）、本発明者らは、ＴＧＦ−β１およびＧＹ７８５ＤＲＳでの処理に応答してＭＡＰＫが活性化されうるかどうか解読しようと試みた。
【０１０１】
特に興味深いことに、ＥＲＫ１／２リン酸化は、ＴＧＦ−β１またはＧＹ７８５ＤＲＳ単独ではほとんど刺激されない一方で、ＴＧＦ−β１およびＧＹ７８５ＤＲＳでの細胞の同時処理により早くも４時間でＥＲＫ１／２のリン酸化の顕著な上方制御が誘導された。この刺激は２４時間まで維持された。他のＭＡＰＫのリン酸化の分析では、単独または組合せのＴＧＦ−β１およびＧＹ７８５ＤＲＳ処理に応答してＪＮＫまたはｐ３８のいずれの検出可能なリン酸化も示されなかった。
【０１０２】
ＳＭＡＤ２、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８のリン酸化についての本発明者らの検出方法の信頼性を確実にするために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をアニソマイシン、ＰｉおよびＴＧＦ−β１で処理し、陽性対照として用いた。予測されたとおりこれらの条件において、ｐ３８およびＪＮＫ１／２のリン酸化がアニソマイシン処理後に観察され（Ｊｕｌｉｅｎ  Ｍら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；２４：１８５６〜１８６８）、ＥＲＫ１／２のリン酸化がＰｉ刺激後に観察され（Ｊｕｌｉｅｎ  Ｍら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；２４：１８５６〜１８６８）、ＳＭＡＤ２のリン酸化がＴＧＦ−β１の存在下で観察された（Ｌａｉ  ＣＦら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：３６４００〜３６４０６）。種々のＳＭＡＤおよびＭＡＰＫのリン酸化は、これらのベースレベルにおける変化とは関連しておらず、それらのリン酸化が調節性の上流のキナーゼ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｋｉｎａｓｅｓ）の刺激から生じたことを示唆している。
【０１０３】
これらのデータは、ｈＡＴＳＣにおけるＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２の活性化を刺激するためにＴＧＦ−β１およびＧＹ７８５ＤＲＳが共同して同時に作用する場合があること示唆する。
【０１０４】
本出願全体を通じて、種々の参考文献に本発明に関連する技術分野の状況が記載されている。これらの参考文献の開示は参照により本開示に組み込まれる。
【図１】
2014509517.tif 000004
【図２】
2014509517.tif 000005
【図４】
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【図３】
2014509517.tif 000007
【配列表】
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【国際調査報告】
2014509517.tif 000008
2014509517.tif 000009
2014509517.tif 000010
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