(57)【要約】  サンプルにおいて非標的ＤＮＡ配列の存在下で標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するための方法およびシステムであって：ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチド系をサンプルと接触させて、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む反応混合物を形成すること、ここでフォワードまたはリバースプライマーのいずれかは、プライマーと標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾されるものである；オリゴヌクレオチド系のハイブリダイゼーションをサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、プライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすこと；および第一の増幅産物を検出することを含む、方法およびシステム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて非標的ＤＮＡ配列の存在下で標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するための方法であって：
ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチド系をサンプルと接触させて、反応混合物を形成することであって、前記オリゴヌクレオチド系はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで前記フォワードまたはリバースプライマーの１つは、前記プライマーと前記標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾され、前記修飾は修飾された３’末端ヌクレオチドを含むものである；
前記オリゴヌクレオチド系をサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすこと；および
第一の増幅産物を検出すること、ここで前記検出段階は前記標的ＤＮＡ配列を検出するための標的ＤＮＡプローブ成分の使用を含み、前記標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで前記第一の修飾は前記標的ＤＮＡプローブ成分と前記第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである
を含む、方法。
【請求項２】
前記修飾された３’末端ヌクレオチドが、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾されたプライマーが一以上のさらなる修飾されたヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
修飾されたプライマーが、オリゴヌクレオチド配列５’−ＸＹＺ−３’を含み 、ここで：
Ｘは一以上のビオチン基を含み；
Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつ
Ｚは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｚが３’末端に２つの連続したロックド核酸を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
修飾されたプライマーがオリゴヌクレオチド配列５’−ＹＺＹＺ−３’を含み、ここで：
Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつ
Ｚは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ＤＮＡ配列と前記サンプル中の少なくとも数個の前記非標的ＤＮＡ配列が１つの核酸だけ異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的ＤＮＡプローブ成分が、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、第一の増幅産物を検出する段階が：
前記標的ＤＮＡ配列を検出するための前記標的ＤＮＡプローブ成分を含み、かつポジティブコントロールとして機能することが意図される成分およびネガティブコントロールとして機能することが意図される成分をさらに含む、１組の特徴を含む、マイクロアレイを提供する段階；
マイクロアレイを前記サイクルにかけた反応混合物と接触させ、第一の増幅産物が前記標的ＤＮＡプローブ成分に結合するのを可能にする段階、ここでかかる結合は検出可能なシグナルを発する特徴をもたらすものである；および
前記の発した検出可能なシグナルを検出する段階
を含む、方法。
【請求項１０】
サンプルにおいて非標的ＤＮＡ配列の存在下で標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するための方法であって：
ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチド系をサンプルと接触させて、反応混合物を形成すること、ここで前記オリゴヌクレオチド系はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで前記フォワードまたはリバースプライマーの１つは、前記プライマーと前記標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾され、前記修飾は：（ｉ）修飾された３’末端ヌクレオチド、および（ｉｉ）一以上のさらなる修飾されたヌクレオチドを含むものである；
前記オリゴヌクレオチド系をサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすこと；
前記標的ＤＮＡ配列を検出するための少なくとも１つの標的ＤＮＡプローブ成分を含み、かつポジティブコントロールとして機能することが意図される成分およびネガティブコントロールとして機能することが意図される成分をさらに含む、１組の特徴を含む、マイクロアレイを提供すること、ここで前記標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで前記第一の修飾は前記標的ＤＮＡプローブ成分と前記第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである；
マイクロアレイを前記サイクルにかけた反応混合物と接触させ、第一の増幅産物が前記標的ＤＮＡプローブ成分に結合するのを可能にすること、ここでかかる結合は検出可能なシグナルを発する特徴をもたらすものである；および
前記の発した検出可能なシグナルを検出すること、
ここで、前記標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで前記第一の修飾は前記標的ＤＮＡプローブ成分と前記第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである
を含む、方法。
【請求項１１】
標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するためのシステムであって：
非標的ＤＮＡ配列を含み、前記標的ＤＮＡ配列を含む可能性があるサンプル；
反応混合物を形成する、ハイブリダイゼーション条件下でのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むオリゴヌクレオチド系、ここで前記フォワードまたはリバースプライマーの１つは、前記プライマーと前記標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾され、前記修飾は修飾された３’末端ヌクレオチドを含むものである；
オリゴヌクレオチド系をサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすように適合されたサーマルサイクラー；
前記標的ＤＮＡ配列を検出するための標的ＤＮＡプローブ成分、ここで前記標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで前記第一の修飾は前記標的ＤＮＡプローブ成分と第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである；および
第一の増幅産物を検出するように適合された検出器
を備える、システム。
【請求項１２】
前記修飾された３’末端ヌクレオチドが、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記修飾されたプライマーが一以上のさらなる修飾されたヌクレオチドをさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
修飾されたプライマーが、オリゴヌクレオチド配列５’−ＸＹＺ−３’を含み 、ここで：
Ｘは一以上のビオチン基を含み；
Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつ
Ｚは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである、
請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
Ｚが３’末端に２つの連続したロックド核酸を含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記標的ＤＮＡ配列と前記サンプル中の少なくとも数個の前記非標的ＤＮＡ配列が１つの核酸だけ異なる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
標的ＤＮＡプローブ成分が、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１８】
検出器がマイクロアレイである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１９】
検出器が、ポジティブコントロールとして機能することが意図される成分、およびネガティブコントロールとして機能することが意図される成分をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２０】
修飾されたプライマーがオリゴヌクレオチド配列５’−ＹＺＹＺ−３’を含み、ここで：
Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつ
Ｚは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである、
請求項１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体の開示が出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１１年１１月１７日に出願された「選択的分子分析システム」と題する米国仮特許出願番号６１／５６１，０６３号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
１．分野
本明細書は、分子生物学の分野、および、より具体的には、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の特定のアレルを選択的に分析するための方法およびシステム、ならびにそれらの応用に関する。
【０００３】
２．関連技術の説明
遺伝子は、ヌクレオチド塩基の特定の遺伝子の配列におけるバリエーションに基づいて、「野生型」または「変異体」のいずれかであることが決定される。野生型遺伝子は、一般に、特定の遺伝子の最初に同定された配列または特定の遺伝子の最も一般的に生じる配列である。変異体は、野生型遺伝子の配列と少なくとも１つの核酸塩基が異なる配列を有する任意の遺伝子である。任意の特定の遺伝子について、１つまたは多数の変異体が存在する可能性があり、かつ、多くの場合、任意の特定の遺伝子について、１より多くの変異体が存在する。特定の場合において、特定の遺伝子について特定の変異を同定することは重要である。これらの場合における変異は、一般に遺伝し、かつ生物の全ての体細胞において発生する。
【０００４】
生殖細胞変異は遺伝性であり、生物内の全ての細胞に存在する、そして、結果として、ホモ接合性野生型または変異配列がその生物の総ＤＮＡの１００％に存在し、かつヘテロ接合性配列が一般にその生物の総ＤＮＡの５０％に存在するであろう。対照的に、体細胞変異は生物における個々の細胞に発生し、その特定の生物の生存期間中いつでも発生し得る。その結果、細胞およびその子孫内にヘテロ接合性の遺伝子型が存在することになる。多くの場合、変異を含有するＤＮＡは、全試料からの総ＤＮＡの非常に少ない割合を表し、１％程度の低さ、あるいは１％未満であるだろう。変異のこの非常に小さな発生率は、アレル分析のために用いられる古典的な分子生物学的技術を用いて、選択的に検出可能ではないだろう。
【０００５】
それゆえ、特定の単一の生物由来の細胞のサンプルから精製された核酸の混合物において、特定のアレルのみを選択的に同定し、次いで、対象の特定の変異についてそれらのサンプルを分析することができるシステムおよび方法は、研究者や臨床家にとって非常に有用であろう。
【発明の概要】
【０００６】
前述の目的および利点に従って、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の特定のアレルを選択的に分析するための方法およびシステム、ならびにそれらの応用が記載される。
【０００７】
一態様によれば、サンプルにおいて非標的ＤＮＡ配列の存在下で標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するための方法であって：（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチド系をサンプルと接触させて、反応混合物を形成することであって、オリゴヌクレオチド系はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここでフォワードまたはリバースプライマーの１つは、プライマーと標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾され、修飾は修飾された３’末端ヌクレオチドを含むものである；（ｉｉ）オリゴヌクレオチド系をサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすこと；および（ｉｉ）第一の増幅産物を検出すること、ここで検出段階は標的ＤＮＡ配列を検出するための標的ＤＮＡプローブ成分の使用を含み、標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで第一の修飾は標的ＤＮＡプローブ成分と第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである、を含む、方法。
【０００８】
第二の態様によれば、上述の方法は、修飾された３’末端ヌクレオチドが、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである。
【０００９】
第二の態様によれば、上述の方法は、修飾されたプライマーが一以上のさらなる修飾されたヌクレオチドをさらに含むものである。
【００１０】
第三の態様によれば、上述の方法は、修飾されたプライマーが、オリゴヌクレオチド配列５’−ＸＹＺ−３’ を含み、ここで：（ｉ）Ｘは一以上のビオチン基を含み；（ｉｉ）Ｙは一以上の核酸塩基を含み；かつ（ｉｉｉ）Ｚは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである。一態様によれば、Ｚは、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。別の態様によれば、Ｚは修飾されたプライマーの３’末端に２つの連続したロックド核酸を含む。
【００１１】
第四の態様によれば、上述の方法は、修飾されたプライマーが、オリゴヌクレオチド配列５’−ＹＺＹＺ−３’を含み、ここで：（ｉ）Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつ（ｉｉ）Ｚは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである。
【００１２】
第五の態様によれば、上述の方法は、標的ＤＮＡ配列とサンプル中の少なくとも数個の非標的ＤＮＡ配列が１つの核酸だけ異なるものである。
【００１３】
第六の態様によれば、上述の方法は、第一の増幅産物を検出する段階が：（ｉ）標的ＤＮＡ配列を検出するための標的ＤＮＡプローブ成分を含み、かつポジティブコントロールとして機能することが意図される成分およびネガティブコントロールとして機能することが意図される成分をさらに含む、１組の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）を含む、マイクロアレイを提供する段階；（ｉｉ）マイクロアレイをサイクルにかけた反応混合物と接触させ、第一の増幅産物が標的ＤＮＡプローブ成分に結合するのを可能にする段階、ここでかかる結合は検出可能なシグナルを発する特徴をもたらすものである；および（ｉｉｉ）発した検出可能なシグナルを検出する段階、を含むものである。
【００１４】
別の態様によれば、サンプルにおいて非標的ＤＮＡ配列の存在下で標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するための方法であって、標的ＤＮＡ配列とサンプル中の少なくとも数個の非標的ＤＮＡ配列が１つの核酸だけ異なる方法であり：（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチド系をサンプルと接触させて、反応混合物を形成すること、ここでオリゴヌクレオチド系はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここでフォワードまたはリバースプライマーの１つは、プライマーと標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾され、該修飾は：（ｉ）修飾された３’末端ヌクレオチド、および（ｉｉ）一以上のさらなる修飾されたヌクレオチドを含むものである；（ｉｉ）オリゴヌクレオチド系をサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすこと；（ｉｉｉ）標的ＤＮＡ配列を検出するための少なくとも１つの標的ＤＮＡプローブ成分を含み、かつポジティブコントロールとして機能することが意図される成分およびネガティブコントロールとして機能することが意図される成分をさらに含む、１組の特徴を含む、マイクロアレイを提供すること、ここで標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで第一の修飾は標的ＤＮＡプローブ成分と第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである；（ｉｖ）マイクロアレイをサイクルにかけた反応混合物と接触させ、第一の増幅産物が標的ＤＮＡプローブ成分に結合するのを可能にすること、ここでかかる結合は検出可能なシグナルを発する特徴をもたらすものである；および（ｖ）発した検出可能なシグナルを検出すること；（ｖｉ）ここで標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで第一の修飾は標的ＤＮＡプローブ成分と第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである、を含む方法。
【００１５】
別の態様によれば、標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するためのシステムであって：（ｉ）非標的ＤＮＡ配列を含み、標的ＤＮＡ配列を含む可能性があるサンプル；（ｉｉ）反応混合物を形成する、ハイブリダイゼーション条件下でのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むオリゴヌクレオチド系、ここでフォワードまたはリバースプライマーの１つは、プライマーと標的配列の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるために修飾され、修飾は修飾された３’末端ヌクレオチドを含むものである；（ｉｉ）オリゴヌクレオチド系をサイクルにかけ、その結果、標的ＤＮＡ配列がサンプル中に存在する場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ反応混合物が第一の増幅産物をもたらすように適合されたサーマルサイクラー；（ｉｉｉ）標的ＤＮＡ配列を検出するための標的ＤＮＡプローブ成分、ここで標的ＤＮＡプローブ成分は第一の修飾を含み、ここで第一の修飾は標的ＤＮＡプローブ成分と第一の増幅産物の間のハイブリダイゼーションを優先的に増大させるものである；および（ｉｖ）第一の増幅産物を検出するように適合された検出器、を備えるシステム。
【００１６】
別の態様によれば、修飾された３’末端ヌクレオチドは、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
別の態様によれば、修飾されたプライマーは一以上のさらなる修飾されたヌクレオチドをさらに含む。
【００１８】
別の態様によれば、修飾されたプライマーは、オリゴヌクレオチド配列５’−ＸＹＺ−３’ を含み、ここで：Ｘは一以上のビオチン基を含み；Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつＺは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである。一態様では、Ｚは３’末端に２つの連続したロックド核酸を含む。
【００１９】
別の態様によれば、前記標的ＤＮＡ配列とサンプル中の少なくとも数個の非標的ＤＮＡ配列は１つの核酸だけ異なる。
【００２０】
別の態様によれば、検出器はマイクロアレイである。
【００２１】
別の態様によれば、マイクロアレイは、標的ＤＮＡ配列を検出するための標的ＤＮＡプローブ成分、ポジティブコントロールとして機能することが意図される成分、およびネガティブコントロールとして機能することが意図される成分を含む。
【００２２】
別の態様によれば、修飾されたプライマーは、オリゴヌクレオチド配列５’−ＹＺＹＺ−３’を含み、ここで：Ｙは一以上のヌクレオチドを含み；かつＺは一以上の修飾されたヌクレオチドを含むものである。
【００２３】
別の態様によれば、標的ＤＮＡプローブ成分は、ロックド核酸、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸、ジップ核酸、マイナーグルーブバインダー、ペプチド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本明細書は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むことで、より完全に理解され、正しく認識されるだろう：
【００２５】
【図１】図１Ａは、既存の方法に従った、野生型または変異アレル（配列番号１）の検出のためのＰＣＲ反応の概略図である；
【００２６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａにおける四角で囲まれた領域（配列番号２）の拡大図である；
【００２７】
【図２】図２は、既存の方法に従った、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型および／または変異アレルの検出のためのアッセイの概略図である（標的ＫＲＡＳ領域（配列番号３）およびタンパク質の一部分についての翻訳（配列番号４）を含む）；
【００２８】
【図３】図３は、表に編成されるマイクロアレイを用いる、マイクロアレイ分析の結果を示す、ドットはハイブリダイゼーションを表す；
【００２９】
【図４Ａ】図４Ａは、一態様に従った、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型および／または変異アレルの検出のためのアッセイの概略図である（標的ＫＲＡＳ領域（配列番号５）およびタンパク質の一部分についての翻訳（配列番号６）を含む）；
【００３０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａにおける四角で囲まれた領域の拡大図である（標的ＫＲＡＳ領域（配列番号７）およびタンパク質の一部分についての翻訳（配列番号８）を含む）；
【００３１】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、一態様に従った、図４Ａおよび４Ｂに示されたプライマーの配列を示す表である；
【００３２】
【図６Ａ】図６Ａは、図６Ｂに編成されるマイクロアレイを用い、かつ図４Ａから５Ｂに一部分が記載される条件からのアンプリコンを用いる、マイクロアレイ分析の結果を示す、ドットはハイブリダイゼーションを表す；
【００３３】
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａにおけるマイクロアレイの編成を示す表である；
【００３４】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、一態様に従った、１組の実験のために用いられるプライマーの配列を表す表である；
【００３５】
【図８Ａ】図８Ａは、図８Ｂに編成されるマイクロアレイを用い、かつ図７Ａおよび７Ｂに一部分が記載される条件からのアンプリコンを用いる、マイクロアレイ分析の結果を示す、ドットはハイブリダイゼーションを表す；
【００３６】
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａにおけるマイクロアレイの編成を示す表である；
【００３７】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、一態様に従った、野生型または変異ＢＲＡＦアレルの検出のためのＰＣＲ増幅についての概略図である（配列番号２４）；
【００３８】
【図１０】図１０Ａは、一態様に従った、ＫＲＡＳ  ３８Ｇ＞Ａアッセイために用いられるプライマーの配列を示す表であり（図１１Ａおよび１１Ｂに示される結果）、かつ１０ＢはＢＲＡＦ１７９９Ｔ＞Ａアッセイために用いられるプライマーの配列を示す表である（図１１Ａおよび１１Ｂに示される結果）；
【００３９】
【図１１Ａ】図１１Ａは、図１１Ｂに編成されるマイクロアレイを用い、かつ図９Ａから１０Ｂに一部分が記載される条件からのアンプリコンを用いる、マイクロアレイ分析の結果を示す、ドットはハイブリダイゼーションを表す；そして
【００４０】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａにおけるマイクロアレイの編成を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
本発明の一態様によれば、本発明は、特定の遺伝子の特異的なアレルのみを選択的に増幅するための方法およびシステムである。例えば、変異アレルなどの特異的なアレルを選択的に増幅および／または選択的に検出するために、「核酸置換」を一部分用いる、方法およびシステムが本明細書に記載される。
【００４２】
一実施形態によれば、「核酸置換」は、アレル特異的ＰＣＲ（「ａｓＰＣＲ」）、変異アレル特異的増幅（「ＭＡＳＡ」）、および／またはＤＮＡ二本鎖安定化化学反応（ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）等の増幅プライマーに組み込まれる、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸（「ＢＮＡ」）、ジップ核酸（「ＺＮＡ」）、マイナーグルーブバインダー（「ＭＧＢ」）、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）を含むが、これらに限定されない、幅広い種類の置換のいずれかとすることができる。
【００４３】
本システムまたは方法の一実施形態によれば、遺伝子配列を増幅するために用いられるプライマーは、それらが特異的なアレルの特定の遺伝子配列にのみアニールし、それゆえそれらの特定のアレルのみを増幅するように設計されている。本システムまたは方法のほんの一例として、野生型遺伝子を増幅しない（または遺伝子の任意の特定の既知のアレルに対して選択する）が、同じ遺伝子の特定のアレルを増幅する、プライマー（または複数のプライマー、または対象の各変異のためのプライマー）を設計するであろう。選択的増幅から生成された、得られたアンプリコンは、次いで、遺伝子の特定のアレルに対するプローブを組み込むマイクロアレイに適用されてもよい。一実施形態では、プローブはまた、野生型アレルまたはプライマー設計によって選択される任意のアレルに対するプローブを含み、忠実度を増大させ、ハイブリダイズ特異性を改善するために、ＬＮＡ、ｃＬＮＡ、ＢＮＡ、ＺＮＡ、ＭＧＢ、および／またはＰＮＡなどの「核酸置換」を用いる。マイクロアレイは次いで、そのアンプリコンにハイブリダイズしたプローブについて分析される。アンプリコンが野生型プローブまたは選択されたアレルに対するプローブにハイブリダイズする場合、プライマーは、失敗したか、野生型アレルまたは選択された任意の他のアレルの増幅に対して選択するためには適切に構築されていなかったかのいずれかである。好ましい実施形態では、アンプリコンは野生型プローブ（または選択されたアレルに対するプローブ）にほとんど〜全くハイブリダイズせず、それゆえ、プライマーの成功した選択性を示すだろう。アンプリコンが野生型プローブ（または選択されたアレルに対するプローブ）にほとんどまたは全くハイブリダイズしない場合、野生型遺伝子の特定の変異に相補的である配列を有する残りのプローブが分析される。陽性のハイブリダイゼーションが存在する場合、サンプル中の最初の細胞は遺伝的または体細胞突然変異が発生したいくつかの細胞を含んでいた。細胞の集団内の特定の変異（単数または複数）に関する情報は、例えば、特定の疾患およびそれらの進行に関する研究にとって有用であり得る。
臨床現場では、該情報は、疾患状態の特定の疾患のための治療方針を臨床医に知らせることができる。
【００４４】
別の実施形態では、本方法またはシステムは、特定のサンプル中のほんのわずかな量の遺伝物質が変異を含む場合に有用である。例えば、腫瘍が生検される時、得られる組織は、それらの遺伝子構造における特定の変異を含むわずかな割合の細胞を含み得るが、集団の膨大な残りは依然として野生型または元の生殖系列配列である。本明細書に記載の方法およびシステムを用いて、バックグラウンドの野生型または元の生殖系列配列アレルの増幅を選択的に防止し、かつそれによって、その後の分析が、元のサンプルに存在し得る変異からのシグナルをそれによって増大することができる。初期段階で変異を同定することは、例えばそれらが腫瘍内の細胞のごく一部分を表す場合、研究者に特定の疾患およびそれらの進行に関する貴重な情報を、かつ、臨床医に疾患の治療のためのより多くの、かつ多くの場合より効果的な選択肢を、提供することができる。
【００４５】
同様の参照番号が全体を通して同様の部分を指す図面をここで参照すると、図１Ａおよび１Ｂに、従前のＰＣＲ増幅およびプローブ分析のための方法およびシステムが見られる。増幅された遺伝子配列は野生型であってもよく、何らかの方法で変化してもよく（一塩基多型またはＳＮＰなど）、あるいは何らかの方法で変異させてもよい。残念ながら、多くの場合、変異は単に野生型アレルとの単一の塩基対の差だけであるため、２つのオリゴヌクレオチド鎖がほぼ同一の物理的性質を典型的に有するので、配列を区別する能力は非常に困難である。すなわち、変異および野生型（または非変異）の鋳型の両方を含有する複雑な混合物は、ＰＣＲ増幅の後、非常に類似したアンプリコンをもたらす；これらの類似のアンプリコンは、それらがわずか単一の塩基のみが異なり得るため、非常に似た挙動をする。これらの類似のアンプリコンが共通して有するであろう一つの特性は、それらが両方とも、それらのわずかな配列の違いにかかわらず、標的プローブ配列にハイブリダイズし得ることであり、それゆえ、分析者は、２つの異なるオリゴヌクレオチドを区別することができない場合がある。アレル間で最も一般的に類似している物理的特性は、当技術分野で公知の特性のうち、ハイブリダイズした対の融解温度（「Ｔｍ」）またはアレルの分子量である。変異が生物の生殖系列を通して遺伝し、それゆえ、生物におけるあらゆる細胞に存在する場合ではなく、変異が生物の体内の細胞において自然に発生し、それゆえ、生物由来のサンプルの細胞の特定の細胞のみ（多くの場合１％未満）に存在し得る場合には、さらなる複雑化が起こる。体細胞変異の場合には、サンプル中の圧倒的な量のＤＮＡが対象の体細胞変異を含有しないため、古典的なＳＮＰ分析は有用な情報を提供しない。この状況では、上述のように、分析の古典的なシステムまたは方法は、それが大多数のアレルを一般に増幅するため、変異を適切に増幅しないだろう。
【００４６】
図２は、従来技術のシステムまたは方法を用いて、野生型またはバリアントアレルのいずれかであるＫＲＡＳ遺伝子を増幅し、かつ探索する（ｐｒｏｂｅ）、ＫＲＡＳアッセイの概略図である。ＫＲＡＳ遺伝子座の全てまたは一部分を、プライマー対「ＫＲＡＳ＿Ｆｏｒ」および「Ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｂｅ」ならびにプライマー対「ＷＴ＿ｐｒｏｂｅ」および「ＫＲＡＳ＿Ｒｅｖ」を含む従前のプローブを用いて増幅する。
【００４７】
ＫＲＡＳは、「ＧＴＰアーゼＫＲａｓ」または「Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラットサルコーマウイルスオンコジーンホモログ」としても知られる、ＫＲＡＳ遺伝子によってヒトにおいてコードされるタンパク質である。ＫＲＡＳは、単一アミノ酸置換−単一ヌクレオチド置換から生じる−が、ＫＲＡＳの癌遺伝子活性を活性化するのに関与する、癌原遺伝子（変異、発現増大、または他の活性化に起因して癌遺伝子になり得る正常遺伝子）である。ＫＲＡＳは、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌、および結腸直腸癌などを含むが、これらに限定されない、様々なタイプの癌に関与している。実際に、ＫＲＡＳ遺伝子における変異は、膵臓癌の９０％超で起こると推定される。変異は、典型的には、構成的に活性なＧＴＰ結合状態にＫＲＡＳを維持する、ＧＴＰ−ＧＤＰ交換を妨げる、ＫＲＡＳタンパク質のコドン１２、１３および６１に影響を与えることが見出されている。さらに、ＫＲＡＳ遺伝子における変異の活性化は、抗上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）応答に対する応答不良と関連している。従って、これらの活性化変異に関して検査することは、抗ＥＧＦＲ治療の重要な一態様であり得る。細胞の集団（腫瘍など）におけるＫＲＡＳ変異の存在は、現在、リアルタイムＰＣＲおよびモノクローナル抗体検査を含む、様々な方法を介して行われる。
【００４８】
分析できる他の癌遺伝子および癌原遺伝子は、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＳ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＲＡＦ、ＰＩＭ１、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＬＣＫ、ＲＡＦ１、ＭＡＦＢ、ＤＤＢ２、ＤＥＫ、ＳＭＯ、ＲＯＳ１、ＴＥＴ２、ＮＴＲＫ１、ＦＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、およびＭＹＢなど多数を含むが、それらに限定されない。さらに、多数の他のタイプの遺伝子、アレル、または生物のＤＮＡ相補体にわたる他の位置を、本明細書に記載のシステムおよび方法を用いて、探索し、かつ分析することができる。
【００４９】
図２に示された従前の増幅法から生成された、生じたアンプリコンは、次いで、図３に示すように、遺伝子の特定のアレルに対するプローブを組み込むマイクロアレイに適用される。マイクロアレイは、次いで、そのアンプリコンにハイブリダイズしたプローブについて分析される。図２および３に示される実験について、「変異ＤＮＡ」の量は、鋳型の何パーセントかであって、０％から１００％の変異アレル（ＫＲＡＳ  Ｇ３５Ａアレル、ＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｃアレル、またはＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｔアレルのいずれか）の範囲であり、残りの比率（１００％、９０％、７５％、５０％、および０％）は野生型ＫＲＡＳアレルである。生じたアンプリコンは、次いで、特異的なプローブを備えるマイクロアレイに対して実行される。例えば、変異アレルアンプリコンは、一以上の変異プローブ（例えば、ＫＲＡＳ＿３５Ｇ＿Ｔ、ＫＲＡＳ＿３５Ｇ＿Ｃ、またはＫＲＡＳ＿３５Ｇ＿Ａ）で検出され、野生型アレルアンプリコンは、野生型プローブの各々で検出される。
【００５０】
マイクロアレイまたはいくつかの他の検出機構の一つの一部分とすることができるプローブは、非修飾または天然オリゴとすることができ、またあるいは、一以上の修飾を含むことができる。好ましい実施形態によれば、プローブは、Ｔｍの差を増大し、そして選択性を増大させるために、本明細書に記載の修飾のいずれかを含むがこれらに限定されない、一以上の修飾を有するように設計される。修飾はプローブのどこにあってもよい。
【００５１】
図３は、０％／１００％から１００％／０％の範囲である変異／野生型ＤＮＡ混合物における変異アレルの存在を検出するために、従来の増幅方法を用いた一連の実験の結果を示す。１００％未満の変異ＤＮＡでは、３つの異なる変異アレルの各々を検出することはほぼ不可能である。たとえば、０％、１０％、２５％、および５０％変異ＤＮＡの欄は、検出可能な変異アンプリコンをほとんど示していない。また、ＫＲＡＳ３５Ｇ＞Ｔについては、１００％変異ＤＮＡでさえ検出されなかった。ＫＲＡＳ遺伝子の変異型を有する細胞の割合はほぼ確実に著しく低い割合であろうことから、この検出方法は、ほとんどの腫瘍の分析について実現可能ではないだろう。
【実施例１】
【００５２】
実施例１−修飾されたプライマーおよびプローブを用いるＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｘ分析
【００５３】
図４Ａから６Ｂは、一実施形態による修飾されたプライマーおよび修飾されたプローブを用いるＫＲＡＳアッセイの条件および結果を示す。このアッセイでは、図４Ａおよび４Ｂに示されるように、ＫＲＡＳは、対象の部位に特異的なビオチン化ＫＲＡＳ＿ＬＮＡ  ＰＣＲプライマー（例えば、「３４Ｇ−ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ＬＮＡ  ＰＣＲプライマー」、「３５Ｇ−ＬＮＡ  ＰＣＲプライマー」、「３７Ｇ−ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ＬＮＡ  ＰＣＲプライマー」、および「３８Ｇ−ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ＬＮＡ  ＰＣＲプライマー」、全て図４Ａおよび４Ｂに示される）およびビオチン化ＫＲＡＳ  Ｒｅｖプライマー（例えば、「ＫＲＡＳ＿Ｒｅｖ」）の混合物を用いて増幅される。個々の標的位置で野生型「Ｇ」を有する捕捉プローブは、コード鎖配列を用いて作製され、かつ増幅されたビオチン化非コード鎖にハイブリダイズする。標的位置で変異Ａ、Ｃ、またはＴを認識するであろう捕捉プローブは、非コード鎖配列を用いて作製され（従って、それぞれの部位で、Ｔ、Ｇ、またはＡ）、かつ増幅されたビオチン化コード鎖にハイブリダイズする。一実施形態によれば、ビオチン化ＬＮＡ修飾変異プライマーおよびＬＮＡ修飾捕捉プローブは、反対の鎖に作製される。一実施形態によれば、ビオチン化野生型（ジェネリックプライマー）は変異捕捉プローブと同じ鎖から作製でき、野生型捕捉プローブは、変異プライマーと同じ鎖から作製できる。
【００５４】
本明細書のこの実施例および他の実施例はビオチン化プライマーを用いるが、プライマーは、ビオチン化がなくてもよく、または他の方法で修飾してもよい。例えば、当業者は、蛍光、同位体標識、抗体、および量子ドットなど多数を含むが、それらに限定されない、多数の他のタイプの修飾が存在することを認識するであろう。
【００５５】
図５Ａに示されるように、以下のプライマーがＫＲＡＳ遺伝子内の部分的な配列の増幅のために用いられた（ＫＲＡＳアッセイ）：
フォワードプライマー：
【化１】
2014533508.tif 000002
リバースプライマー：
【化２】
2014533508.tif 000003
ここで、「／５Ｂｉｏｓｇ／」はビオチンを表し、「＋［Ａ、Ｃ、またはＴ］」はＬＮＡを表し、下線はマイクロアレイプローブとのホモロジーを示す。図５Ａおよび５Ｂに示されているＴｍは、従来の方法を用いて計算した。好ましい実施形態によれば、ＬＮＡを有する３’末端塩基の修飾は、アレルの野生型形態を増幅しないが、部位３５の変異の選択的増幅を提供する。
【００５６】
別の実施形態では、図５Ｂに示されるように、以下のプライマーがＫＲＡＳ遺伝子内の部分的な配列の増幅のために用いられた（ＫＲＡＳアッセイ）：
フォワードプライマー：
【化３】
2014533508.tif 000004
リバースプライマー：
【化４】
2014533508.tif 000005
ここで、「／５Ｂｉｏｓｇ／」はビオチンを表し、「＋［Ａ、Ｃ、またはＴ］」はＬＮＡを表し、下線はマイクロアレイプローブとのホモロジーを示す。これらのプライマー／プローブは、図５Ａに示されているものとは、１つだけではなく２つの末端ＬＮＡがある点で異なる。図５Ａおよび５Ｂにおける「ＬＮＡ  Ｔｍ」欄に示されるように、このさらなるＬＮＡはさらにプライマーのＴｍに影響を与える。
【００５７】
この実施例では、２つの末端ＬＮＡを示すが、「＋［Ａ、Ｃ、またはＴ］」は本明細書に記載されるまたは当業者に知られた任意の他の修飾とすることができる。さらに、３’末端での修飾されたヌクレオチドに加えて一以上の修飾がプライマーのいたるところに存在し得る。例えば、３５Ｇ＞Ａ検出のためのプライマー配列は、以下のいずれかとすることができる：
【化５】
2014533508.tif 000006
【００５８】
さらに、選択性をさらに最大化するために、複数の修飾が存在できる。例えば、３５Ｇ＞Ａ検出のためのプライマー配列は、以下など多数のバリエーションのいずれかとすることができる：
【化６】
2014533508.tif 000007
プライマーの設計は、Ｔｍの差を十分に変化させ、それによって選択性を増大させる必要がある−標的ＤＮＡ配列を含むがこれらに限定されない−システムの要件に少なくとも部分的に依存するであろう。
【００５９】
上述のように、この実施例においてＫＲＡＳアレルの増幅のために用いられるプライマーは、ビオチンおよび一以上のロックド核酸（「ＬＮＡ」）によって修飾される。ＬＮＡは２’酸素と４’炭素を接続する特別なブリッジを有する修飾されたヌクレオチドである。そのブリッジは効果的に、３’−エンド配座にリボースを「ロック」し、それによりオリゴヌクレオチドの融解温度を増大させる（例えば、図５Ａおよび５Ｂにおける「ＬＮＡ  Ｔｍ」および「ＬＮＡ無し  Ｔｍ」欄を比較のこと）。
【００６０】
この実施例においてＫＲＡＳアレルの増幅のために用いられるプライマーは、ビオチンおよび一以上のＬＮＡよって修飾されているが、プライマーおよび／またはプローブは、ハイブリダイゼーションを増大するために、種々の他の方法で修飾できる。これは、１つまたは複数の ＬＮＡ、ｃＬＮＡ、ＢＮＡ、ＺＮＡ、ＭＧＢ、および／またはＰＮＡなど多数の、プライマーおよび／またはプローブへの組み込みを含むが、これらに限定されない。有益な結果は、体細胞変異を含有する細胞のサンプルを分析する場合に、対象のアレルのみが増幅され、それゆえ、分析される物質が対象のアレルのみを含有するので、その後の分析が容易になることである。遺伝子の特定の既知のアレル選択的に増幅するためにプライマーを修飾することに組み合わせて、プローブ系（マイクロアレイ、蛍光、酵素系など）は、（ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｃＬＮＡ、ブリッジ核酸（ＢＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いて）対象の特定のアレルとのハイブリダイズにおける高い選択性を提供する、修飾されたプローブ配列を含んでもよい。一般に、修飾は、完全マッチと単一塩基ミスマッチとの間のＴｍ差を増大させる。体細胞変異した（ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｍｕｔａｔｅｄ）遺伝子配列の一以上の既知のアレルを選択的に増幅するために、かつ体細胞変異した遺伝子のまばらな集団の存在について元のサンプルを分析するため、増幅産物を選択的に探索するために、一以上の修飾されたプライマーの組み合わせを採用することは、臨床医や研究コミュニティのための有用な情報を提供する。
【００６１】
図６Ａおよび６Ｂは、図４Ａ−５Ｂに記載される実験条件についてのマイクロアレイ結果およびキーを示す。この実施例について、「変異ＤＮＡ」の量は、鋳型の何パーセントかであって、０％から１００％の変異アレル（ＫＲＡＳ  Ｇ３５Ａアレル、ＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｃアレル、またはＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｔアレルのいずれか）の範囲であり、残りの比率は野生型ＫＲＡＳアレルである。生じたアンプリコンは、次いで、特異的なプローブを備えるマイクロアレイに対して実行される。例えば、変異アレルアンプリコンは、一以上の変異プローブ（例えば、ＫＲＡＳ  ３５  Ａ−１、ＫＲＡＳ  ３５  Ａ−３、ＫＲＡＳ  ３５  Ｃ−２、ＫＲＡＳ  ３５  Ｔ−１、ＫＲＡＳ  ３５  Ｔ−３）で検出され、野生型アレルアンプリコンは、「ＫＲＡＳ＿ＷＴ＿ＮｏＬＮＡ」、「ＫＲＡＳ＿３４  ＷＴ」、「ＫＲＡＳ＿３７  ＷＴ」、および「ＫＲＡＳ＿３８  ＷＴ」プローブなどの野生型プローブで検出できる。図６Ａの結果は、変異アンプリコンが、１０，０００コピーの野生型ＤＮＡのバックグラウンドにおける１コピーの変異ＤＮＡに対応する、総ＤＮＡの０．０１％と低く検出されることを実証している。例えば、３つの列の各々における四角で囲まれた結果を参照のこと。さらに、野生型プローブの検出は無く、多くのサンプルにおいて非常に高い濃度（欄１で１００％、欄２で９９．９９％含む）の野生型であるにもかかわらず、変異プライマーが、非特異的に野生型アレルを増幅することなく選択的に変異アレルを増幅することを意味する。ＬＮＡ修飾プローブと組み合わせてＬＮＡ修飾プライマーを用いることは、したがって、野生型の非変異アレルを含有する元のサンプル中に存在するほぼ全てのＤＮＡと一緒でも、所望の変異形態のアレルのみの非常に強力な分析を提供する。示されているように、マイクロアレイは、任意の増幅された野生型アレルにハイブリダイズするハイブリダイゼーションの機会を提供し、かつ、９９．９９％の野生型アレル濃度でも、修飾プライマー配列が野生型アレルから離れて選択されたので、存在する唯一のハイブリダイゼーション事象は、選択された変異アレルに対するものである。
【実施例２】
【００６２】
実施例２−修飾されたプライマーおよびプローブを用いるＫＲＡＳ  Ｇ３４Ｘ分析
【００６３】
図７Ａから８Ｂは、一実施形態による修飾されたプライマーおよびプローブを用いるＫＲＡＳ  Ｇ３４［Ａ、Ｃ、Ｔ、または野生型］アッセイの条件および結果を示す。この実験は、上記および実施例１に記載のプライマー選択および修飾システムおよび方法が、非変異核酸が優勢なバックグラウンドに対して任意の体細胞変異アレルに適用できることを確認する。この実施例では、システムおよび方法は、プライマーの３’末端が一以上のＬＮＡで修飾されているＫＲＡＳ遺伝子の部位３４での体細胞変異に及ぶ。
【００６４】
実施例２に記載のアッセイでは、ＫＲＡＳは、対象の部位に特異的なビオチン化ＫＲＡＳ＿ＬＮＡ  ＰＣＲプライマーおよびビオチン化ＫＲＡＳ  Ｒｅｖプライマーの混合物を用いて増幅される。個々の標的位置で野生型「Ｇ」を有する捕捉プローブは、コード鎖配列を用いて作製され、かつ増幅されたビオチン化非コード鎖にハイブリダイズする。標的位置で変異Ａ、Ｃ、またはＴを認識するであろう捕捉プローブは、非コード鎖配列を用いて作製され（従って、それぞれの部位で、Ｔ、Ｇ、またはＡ）、かつ増幅されたビオチン化コード鎖にハイブリダイズする。一実施形態によれば、ビオチン化ＬＮＡ修飾変異プライマーおよびＬＮＡ修飾捕捉プローブは、反対の鎖に作製される。一実施形態によれば、ビオチン化野生型（ジェネリックプライマー）は変異捕捉プローブと同じ鎖から作製でき、野生型捕捉プローブは、変異プライマーと同じ鎖から作製できる。
【００６５】
図７Ａに示されるように、以下のプライマーがＫＲＡＳ遺伝子内の部分的な配列の増幅のために用いられた（ＫＲＡＳアッセイ）：
フォワードプライマー：
【化７】
2014533508.tif 000008
リバースプライマー：
【化８】
2014533508.tif 000009
ここで、「／５Ｂｉｏｓｇ／」はビオチンを表し、「＋［Ａ、Ｃ、またはＴ］」はＬＮＡを表し、下線はマイクロアレイプローブとのホモロジーを示す。図７Ａおよび７Ｂに示されているＴｍは、従来の方法を用いて計算した。好ましい実施形態によれば、ＬＮＡを有する３’末端塩基の修飾は、アレルの野生型形態を増幅しないが、部位３４の変異の選択的増幅を提供する。
【００６６】
別の実施形態では、図７Ｂに示されるように、以下のプライマーがＫＲＡＳ遺伝子内の部分的な配列の増幅のために用いられた（ＫＲＡＳアッセイ）：
フォワードプライマー：
【化９】
2014533508.tif 000010
リバースプライマー：
【化１０】
2014533508.tif 000011
ここで、「／５Ｂｉｏｓｇ／」はビオチンを表し、「＋［Ａ、Ｃ、またはＴ］」はＬＮＡを表し、下線はマイクロアレイプローブとのホモロジーを示す。これらのプライマー／プローブは、図７Ａに示されているものとは、１つだけではなく２つの末端ＬＮＡがある点で異なる。図７Ａおよび７Ｂにおける「ＬＮＡ  Ｔｍ」欄に示されるように、このさらなるＬＮＡはさらにプライマーのＴｍに影響を与える。
【００６７】
上述の通り、この実施例でＫＲＡＳアレルの増幅のために用いられるプライマーは、ビオチンおよび一以上のＬＮＡにより修飾され、それによりオリゴヌクレオチドの融解温度を増大させる（例えば、図７Ａおよび７Ｂの「ＬＮＡ  Ｔｍ」および「ＬＮＡ無し  Ｔｍ」欄を比較のこと）。
【００６８】
この実施例においてＫＲＡＳアレルの増幅のために用いられるプライマーは、ビオチンおよび一以上のＬＮＡよって修飾されているが、プライマーおよび／またはプローブは、ハイブリダイゼーションを増大するために、種々の他の方法で修飾できる。これは、１つまたは複数の ＬＮＡ、ｃＬＮＡ、ＢＮＡ、ＺＮＡ、ＭＧＢ、および／またはＰＮＡなど多数の、プライマーおよび／またはプローブへの組み込みを含むが、これらに限定されない。有益な結果は、体細胞変異を含有する細胞のサンプルを分析する場合に、対象のアレルのみが増幅され、それゆえ、分析される物質が対象のアレルのみを含有するので、その後の分析が容易になることである。
【００６９】
図８Ａおよび８Ｂは、図７Ａおよび７Ｂに記載される実験条件についてのマイクロアレイ結果およびキーを示す。この実施例について、「変異ＤＮＡ」の量は、鋳型の何パーセントかであって、０％から１００％の変異アレル（ＫＲＡＳ  Ｇ３５Ａアレル、ＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｃアレル、またはＫＲＡＳ  Ｇ３５Ｔアレルのいずれか）の範囲であり、残りの比率は野生型ＫＲＡＳアレルである。生じたアンプリコンは、次いで、特異的なプローブを備えるマイクロアレイに対して実行される。例えば、変異アレルアンプリコンは、一以上の変異プローブ（例えば、３４ＧＡ−１、３４ＧＡ−２、３４ＧＣ−１、３４ＧＣ−２、３４ＧＴ−１、３４ＧＴ−２）で検出され、任意の野生型アレルアンプリコンは、「ＫＲＡＳ  ＷＴ  Ｎｏ  ＬＮＡ」、「ＫＲＡＳ  ３４−ＷＴ」、「ＷＴ−３７」、および「ＷＴ−３８」プローブなどの野生型プローブで検出できる。図８Ａの結果は、変異アンプリコンが、１０，０００コピーの野生型ＤＮＡのバックグラウンドにおける１コピーの変異ＤＮＡに対応する、総ＤＮＡの０．０１％と低く検出されることを実証している（例えば、０．０１％のＫＲＡＳ  Ｇ３４Ｃの検出を参照のこと）。さらに、野生型プローブの検出は無く、多くのサンプルにおいて非常に高い濃度（欄１で１００％、欄２で９９．９９％含む）の野生型であるにもかかわらず、変異プライマーが、非特異的に野生型アレルを増幅することなく選択的に変異アレルを増幅することを意味する。ＬＮＡ修飾プローブと組み合わせてＬＮＡ修飾プライマーを用いることは、したがって、野生型の非変異アレルを含有する元のサンプル中に存在するほぼ全てのＤＮＡと一緒でも、所望の変異形態のアレルのみの非常に強力な分析を提供する。
【実施例３】
【００７０】
実施例３−修飾されたプライマーおよびプローブを用いるＢＲＡＦ  Ｔ１７９９ＡおよびＫＲＡＳ  ３８Ｇ＞Ａ分析
【００７１】
図９から図１１は、一実施形態による修飾されたプライマーおよび修飾されたプローブを用いるマルチプレックスなＢＲＡＦおよびＫＲＡＳ  ３８Ｇ＞Ａアッセイの条件および結果を示す。この実施例では、特定の既知の体細胞変異の存在についてＢＲＡＦ遺伝子を分析することにより、システムおよび方法の普遍性をさらに再度実証する。図９Ａおよび９Ｂに示されるＢＲＡＦ配列は、体細胞突然変異が起こる標的領域と隣接配列を提供する。
【００７２】
ＢＲＡＦ遺伝子は、「プロトオンコジーンＢ−Ｒａｆ」および「ｖ−ＲａｆマウスサルコーマウイルスオンコジーンホモログＢ１」としても知られる、Ｂ−Ｒａｆと呼ばれるタンパク質を産生するヒト遺伝子である。Ｂ−Ｒａｆタンパク質は、細胞増殖の方向付けに関与する細胞内のシグナルを送ることに関与している。ＢＲＡＦは癌遺伝子であり、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異が、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、および／または肺の腺癌などの癌を生じ得る、またはそうでなくともそれらに関与することを意味する。現在までに、ヒトの癌に関連付けられているＢＲＡＦ遺伝子の３０を超える異なる変異が同定されている。その遺伝子における変異を標的とする利用可能な治療法が存在するので、ＢＲＡＦ遺伝子における変異の診断は臨床的に重要であり得る。
【００７３】
この実施例に記載されるアッセイでは、図９Ａおよび９Ｂに示されるように、ＢＲＡＦは、対象の部位に特異的なリバースビオチン化ＢＲＡＦ＿ＬＮＡプライマーおよびビオチン化ＢＲＡＦ  Ｆｏｒプライマーの混合物を用いて増幅される。
【００７４】
図１０Ｂに示されるように、以下のプライマーがＢＲＡＦ遺伝子内の部分的な配列の増幅のために用いられた（ＢＲＡＦアッセイ）：
フォワードプライマー：
【化１１】
2014533508.tif 000012
リバースプライマー：
【化１２】
2014533508.tif 000013
ここで、「／５Ｂｉｏｓｇ／」はビオチンを表し、「＋［Ｔ］」はＬＮＡを表し、下線はマイクロアレイプローブとのホモロジーを示す。この場合、選択的増幅プライマーは非コード鎖配列を用いて作製され、かつ選択的プローブはコード配列を用いて作製される。
【００７５】
図１０Ａに示されるように、以下のプライマーがＫＲＡＳ遺伝子内の部分的な配列の増幅のために用いられた（ＫＲＡＳアッセイ）：
フォワードプライマー：
【化１３】
2014533508.tif 000014
リバースプライマー：
【化１４】
2014533508.tif 000015
ここで、「／５Ｂｉｏｓｇ／」はビオチンを表し、「＋［Ａ、Ｃ、またはＴ］」はＬＮＡを表し、下線はマイクロアレイプローブとのホモロジーを示す。図１０Ａおよび１０Ｂに示されているＴｍは、従来の方法を用いて計算した。好ましい実施形態によれば、ＬＮＡを有する３’末端塩基の修飾は、アレルの野生型形態を増幅しないが、部位３８の変異の選択的増幅を提供する。
【００７６】
上述のように、この実施例においてＫＲＡＳアレルおよびＢＲＡＦアレルの増幅のために用いられるプライマーは、ビオチンおよび一以上のＬＮＡにより修飾され、それによりオリゴヌクレオチドの融解温度を増大させる（例えば、図１０Ａおよび１０Ｂの「ＬＮＡ  Ｔｍ」および「ＬＮＡ無し  Ｔｍ」欄を比較のこと）。この実施例においてＫＲＡＳアレルおよびＢＲＡＦアレルの増幅のために用いられるプライマーは、ビオチンおよび一以上のＬＮＡよって修飾されているが、プライマーおよび/またはプローブは、ハイブリダイゼーションを増大するために、種々の他の方法で修飾できる。これは、１つまたは複数の ＬＮＡ、ｃＬＮＡ、ＢＮＡ、ＺＮＡ、ＭＧＢ、および／またはＰＮＡなど多数の、プライマーおよび／またはプローブへの組み込みを含むが、これらに限定されない。有益な結果は、体細胞変異を含有する細胞のサンプルを分析する場合に、対象のアレルのみが増幅され、それゆえ、分析される物質が対象のアレルのみを含有するので、その後の分析が容易になることである。
【００７７】
図１１Ａおよび１１Ｂは、図９Ａおよび９Ｂに記載される実験条件についてのマイクロアレイ結果およびキーを示す。この実施例について、「変異ＤＮＡ」の量は、鋳型の何パーセントかであって、０％から１％の変異アレル（ＫＲＡＳ  Ｇ３８ＡアレルまたはＢＲＡＦ  １７９９Ｔ＞Ａアレルのいずれか）の範囲であり、残りの比率は野生型ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦアレルである。生じたアンプリコンは、次いで、特異的なプローブを備えるマイクロアレイに対して実行される。例えば、変異アレルアンプリコンは、一以上の変異プローブ（例えば、ＫＲＡＳについて３８ＧＡ−１および３８ＧＡ−２、かつＢＲＡＦについて「ＢＲＡＦ  Ｍｕｔ」）で検出され、任意の野生型アレルアンプリコンは、ＫＲＡＳについて「ＫＲＡＳ  ＷＴ  Ｎｏ  ＬＮＡ」、「ＫＲＡＳ  ３４−ＷＴ」、「ＷＴ−３７」、および「ＷＴ−３８」プローブ、ならびにＢＲＡＦについて「ＢＲＡＦ  ＷＴ」プローブなどの野生型プローブで検出できる。
【００７８】
図１１Ａの結果は、変異ＫＲＡＳアンプリコンが、１，０００コピーの野生型ＤＮＡのバックグラウンドにおける１コピーの変異ＤＮＡに対応する、総ＤＮＡの０．０１％と低く検出されることを実証している（例えば、最上欄の０．１％のＫＲＡＳ  Ｇ３８Ａの検出を参照のこと）。変異ＢＲＡＦアンプリコンは、野生型ＤＮＡの１，０００コピーのバックグラウンドにおける１コピーの変異ＤＮＡに対応する、総ＤＮＡの０．１％と低く検出される（例えば、最下欄の０．１％のＢＲＡＦ  Ｔ１７９９Ａの検出を参照のこと）。さらに、野生型プローブのいずれかによる検出は無く、多くのサンプルにおいて非常に高い濃度（欄１で１００％、欄２で９９．９９％含む）の野生型であるにもかかわらず、変異プライマーが、非特異的に野生型アレルを増幅することなく選択的に変異アレルを増幅することを意味する。ＬＮＡ修飾プローブと組み合わせてＬＮＡ修飾プライマーを用いることは、したがって、野生型の非変異アレルを含有する元のサンプル中に存在するほぼ全てのＤＮＡと一緒でも、所望の変異形態のアレルのみの非常に強力な分析を提供する。
【００７９】
化学反応および試薬デバイス（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｖｉｃｅ）での増幅および分析
【００８０】
本明細書に記載の方法およびシステムは：サンプルの調製（細胞の単離および溶解など）および／または核酸の精製のための第一のデバイスまたは領域；ＰＣＲ反応のための第二のデバイス；マイクロアレイを含む第三のデバイス；マイクロアレイシグナルの検出のための第四のデバイス；および捕捉、処理、分析、可視化、あるいは一以上の分析または実験デバイスから得られるデータを用いる別の方法のための一以上の計算デバイスを備える、物理的に離れたまたは異なる分析または実験デバイスのセットを用いて行うことができる。マイクロアレイ分析が分析の別の方法によって置き換えられる別の実施形態では、これらの実験および／または検出デバイスは、上述のマイクロアレイデバイスを置き換えるだろう。
【００８１】
本発明の一態様によれば、方法は、サンプル調製、ＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションの検出が可能な単一のデバイス内および／またはその上で実施される。様々な実施形態では、デバイスは：生物学的サンプルを受け取り、かつＰＣＲ用サンプルを調製することが可能なサンプル調製コンポーネント；サンプル調製コンポーネントからサンプルを受け取り、ＰＣＲ結果を生成するためにサンプル由来の核酸標的にＰＣＲを行うことが可能なＰＣＲコンポーネント；標的アンプリコンを受け取り、マイクロアレイの表面に結合したプローブへの標的アンプリコンのハイブリダイゼーション事象を検出することが可能なマイクロアレイコンポーネント；ならびにサンプル調製コンポーネント、ＰＣＲコンポーネント、およびマイクロアレイコンポーネントを含む支持体、を備えることができる。
【００８２】
本発明の一態様によれば、方法は、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕらによる「統合型マイクロ流体デバイスおよび方法」と題する、ＰＣＴ国際公開第２００９／０４９２６８  Ａ１号に開示されているものなどの、当技術分野で知られている統合型マイクロ流体デバイスで実施される。本明細書に開示される、サンプル中の標的核酸を検出するための方法は、国際公開第ＷＯ２００９／０４９２６８  Ａ１に開示される方法などの、当技術分野で知られている方法を用いて、アッセイユニット、あるいは商業的にＣＡＲＤ（登録商標）（化学反応および試薬デバイス）と称される統合型マイクロ流体デバイスとの使用に、容易に適合することができる。
【００８３】
「マイクロフルイディクス」とは一般に、流体の少量容量を処理するためのシステム、デバイスおよび方法を指す。マイクロ流体システムは、流体を操作するための幅広い種類の操作を集積することができる。かかる流体は化学的または生物学的サンプルを含む。これらのシステムはまた、生物学的アッセイ（例えば医学診断、創薬およびドラッグデリバリーのため）、生化学的センサ、または一般の生命科学研究、ならびに、環境分析、工業的プロセスモニタおよび食品安全性試験など、多くの応用分野を有する。１つのタイプのマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チップである。マイクロ流体チップは、流体を貯蔵し、チップ上の種々の位置へおよび位置から流体を経路付け、および／または試薬を反応させるための、チャンネル、バルブ、ポンプ、リアクタ、貯槽などのマイクロスケールの特徴（または「マイクロ構造」）を含み得る。
【００８４】
本発明の一態様によれば、出典明示により本明細書に組み込まれる、「自己完結型生物学的アッセイ装置、方法及び応用」と題する、米国特許公開第１３／０３３，１６５号に公開されているような、自己完結型完全自動マイクロ流体デバイスおよびシステムにおいて実施される。デバイスは、ハウジング；前記ハウジング内に設けられる、制御可能−移動可能な試薬分配システムを含む分配プラットフォーム；前記ハウジング内に設けられる試薬供給コンポーネント；前記ハウジング内に前記分配プラットフォームと空間を共有して設けられ、流体輸送層と複数の貯槽と移動可能に接続される、ニューマチックマニホールド、ここで前記流体輸送層、前記貯槽およびそこに導入される試験サンプルは前記ハウジング内に、前記分配プラットフォームから空間的に離れて設けられる；前記ハウジング内に前記分配プラットフォームから空間的に離れて、前記ニューマチックマニホールドに移動可能に接続されるニューマチック供給システム；および前記分配プラットフォームおよび前記ニューマチック供給システムの少なくとも１つに接続され、前記ハウジング内に設けられる制御システム、を含む、自己完結型完全自動、生物学的アッセイ実施装置を含む。ＣＡＲＤ分配プラットフォームは、前記試薬分配システムに作動可能に連結された運動制御システム、ここで前記試薬分配システムは遠位分配端を有する試薬分配システムを含む；および前記貯槽の対象の選択された領域を少なくとも含む視野を有する、試薬分配システムに接続されたカメラをさらに含むことができる。
【００８５】
別の非限定的な態様は、ＣＡＲＤシステムを用いて、標的核酸配列を単離し、増幅し、そして分析するための自動化された処理である。処理は：流体輸送層およびその中に配置された流体チャネル、ならびにそこに取り付けられた貯層を有する、マイクロ流体システムを操作するニューマチックマニホールドを提供する段階；流体試験サンプルを流体チャンネルに導入する段階；流体輸送層と流体接続している少なくとも１つの各貯槽が、前記チャンネルに少なくとも１つの試薬を提供する段階；流体試験サンプルと前記流体輸送層、貯槽または増幅リアクタの領域内の少なくとも１つの試薬を組み合わせる段階；流体輸送層と作動可能に通信している温度制御された増幅／反応リアクタに流体試験サンプルを輸送する段階；標的核酸が増幅されるのを可能にするのに十分な条件下で前記増幅／反応リアクタ内で前記流体試験サンプルをインキュベートする段階；分析貯槽に流体試料サンプルを輸送する段階；および、前記試験サンプル由来の増幅された標的核酸配列を分析する段階、ここで試験サンプルは、任意の他のサンプルから離れて、かつニューマチックマニホールドおよび分配システムから離れて、前記流体輸送層の開始位置から前記分析貯層へ輸送される、を含む。
【００８６】
本明細書に引用の刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別であったのかのように同程度に出典明示により本明細書に組み込まれ、出典明示により組み込まれることが具体的に示され、本明細書にその全体が示される。
【００８７】
本発明の記述の文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）、用語「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」および同様の指示対象の使用は、本明細書に特段に示されない限り、あるいは文脈に矛盾しない限り、単数および複数の両方に及ぶものと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記の無い限り、オープンエンドな用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）と解釈される。用語「接続（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」は、介在する何かがあったとしても、部分的にまたは完全に、内部に含まれ、取り付けられ、または共に結合するものとして解釈されるべきである。
【００８８】
値の範囲の列挙は、本明細書に特段に示されない限り、単に範囲内にある各別個の値を個々に言及する簡便な方法としての役割を果たすように意図され、かつ個別に本明細書に列挙されたかのように、それぞれ別個の値が明細書に組み込まれている。
【００８９】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特段に示されない限り、あるいは文脈に矛盾しない限り、任意の適した順序で実施できる。本明細書で提供される、任意および全ての例または例示的言語（例えば、「のように」）の使用は、単に発明の実施例をより良く照らすように意図され、特段に主張されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。
【００９０】
本明細書中の言葉は、発明の実施に不可欠な任意の非特許請求要素を示すものではないと解釈される。
【００９１】
様々な修正および変更が、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく本発明になされ得ることが当業者には明らかであろう。開示される具体的な形態（単数）または形態（複数）に本発明を限定する意図はなく、それどころか、その意図は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の要旨および範囲内に入る全ての改変、代替構造、およびそれらの等価物を網羅することである。それゆえ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内に入る限り、本発明の改変および変形を網羅することが意図される。
【図１】
2014533508.tif 000016
【図２】
2014533508.tif 000017
【図３】
2014533508.tif 000018
【図４】
2014533508.tif 000019
【図５】
2014533508.tif 000020
【図６】
2014533508.tif 000021
【図７】
2014533508.tif 000022
【図８】
2014533508.tif 000023
【図９】
2014533508.tif 000024
【図１０】
2014533508.tif 000025
【図１１】
2014533508.tif 000026
【配列表】
2014533508000001.app
【国際調査報告】
2014533508.tif 000027
2014533508.tif 000028