(57)【要約】  高リスクＨＰＶ型の検出及び定量化のための核酸、アッセイ及び方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列に特異的な核酸プライマー又は核酸プローブであって、
ａ．その全長にわたって、前記標的配列及びその亜型のゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の少なくとも１つの核酸配列の両方に対して８０％以上の同一性を有し、
ｂ．異なるＨＰＶ型に由来する核酸にハイブリダイズしない、
核酸プライマー又は核酸プローブ。
【請求項２】
前記高リスクＨＰＶゲノムがＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸プライマー又は核酸プローブ。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１又は２に記載の核酸プライマー又は核酸プローブ。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列及び／又はその相補体からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸プライマー又は核酸プローブ。
【請求項５】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１８及び配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６】
ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸プライマー。
【請求項７】
配列番号１若しくは配列番号２又はその相補体を含む、請求項６に記載の核酸プライマー。
【請求項８】
ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸プライマー。
【請求項９】
配列番号４又は配列番号５を含む、請求項８に記載の核酸プライマー。
【請求項１０】
ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸プライマー。
【請求項１１】
配列番号７又は配列番号８を含む、請求項１０に記載の核酸プライマー。
【請求項１２】
請求項１〜４及び６〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプライマーを含むプライマーセット。
【請求項１３】
ａ．ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能なプライマー対、
ｂ．ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能なプライマー対、及び、
ｃ．ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能なプライマー対、
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対を含む、請求項１２に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
ａ．配列番号１と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号２と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｂ．配列番号４と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号５と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｃ．配列番号７と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号８と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｄ．配列番号１０と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号１１と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｅ．配列番号１６と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号１７と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｆ．配列番号１９と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号２０と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
からなる群から選択されるプライマー対を含む、請求項１２又は１３に記載のプライマーセット。
【請求項１５】
ａ．配列番号１からなる第１のプライマー、及び配列番号２と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｂ．配列番号４からなる第１のプライマー、及び配列番号５と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｃ．配列番号７からなる第１のプライマー、及び配列番号８と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｄ．配列番号１０からなる第１のプライマー、及び配列番号１１と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｅ．配列番号１６からなる第１のプライマー、及び配列番号１７と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
ｆ．配列番号１９からなる第１のプライマー、及び配列番号２０と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、
からなる群から選択されるプライマー対を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１６】
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及び／又はＨＰＶ４５の検出用のキットであって、請求項１に記載の核酸プライマー又は核酸プローブを含む、キット。
【請求項１７】
少なくとも１つの核酸プライマーと少なくとも１つの核酸プローブとを含み、
ａ．前記核酸プライマーが配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含み、
ｂ．前記核酸プローブが配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１８及び配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む、
請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＨＰＶ１６のプライマー及びプローブのセット、ＨＰＶ１８のプライマー及びプローブのセット、及び／又はＨＰＶ４５のプライマー及びプローブのセットを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ａ．前記ＨＰＶ１６のプライマー及びプローブのセットが、
（ｉ）配列番号１の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
（ｉｉ）配列番号２の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
（ｉｉｉ）配列番号３の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブと、
を含み、
ｂ．前記ＨＰＶ１８のプライマー及びプローブのセットが、
（ｉ）配列番号４の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
（ｉｉ）配列番号５の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
（ｉｉｉ）配列番号６の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブと、
を含み、
ｃ．前記ＨＰＶ４５のプライマー及びプローブのセットが、
（ｉ）配列番号７の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
（ｉｉ）配列番号８の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
（ｉｉｉ）配列番号９の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブと、
を含む、
請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
対照のプライマー及びプローブのセットを更に含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記対照のプライマー及びプローブのセットが、
ａ．配列番号１６の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
ｂ．配列番号１７の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、
ｃ．配列番号１８の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブと、
を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
高リスクＨＰＶをジェノタイピングする方法であって、
ａ．請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸プライマー又は核酸プローブを、第１の高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列の少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、
ｂ．前記第１の高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域に対する前記核酸のハイブリダイゼーションを検出することと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記核酸プライマー又は核酸プローブが、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ．核酸プライマーを前記標的配列にハイブリダイズさせ、
ｂ．増幅反応を行うことを含む方法によってハイブリダイゼーションを検出する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．前記高リスクＨＰＶがＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５からなる群から選択され、
ｂ．前記増幅反応が、ＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分に相当するアンプリコンを生成する、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸プライマーが、その全長にわたって、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補体に対して約７０％〜１００％の同一性を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
核酸プローブを前記標的配列にハイブリダイズさせ、該核酸プローブを任意で検出可能に標識する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ形式で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５の感染を区別することが可能であり、
ａ．高リスクＨＰＶを含む疑いがあるサンプルを準備することと、
ｂ．前記サンプルを、
（ｉ）ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分を増幅することが可能なプライマーセット、
（ｉｉ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分を増幅することが可能なプライマーセット、
（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分を増幅することが可能なプライマーセット、
（ｉｖ）ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識された核酸プローブ、
（ｖ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識された核酸プローブ、及び、
（ｖｉ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識された核酸プローブ、
と接触させることであって、各々の核酸プローブが異なる検出可能な標識を有することと、
ｃ．核酸増幅を行うことと、
ｄ．各々の検出可能な標識の有無を検出することと、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
QIAGENのＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ＰＣＲ装置によって行われる方法を再現することが可能なプラットフォームで行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）（Hologic，Bedford，MA）及びＳｕｒｅＰａｔｈ（商標）（Becton Dickinson，Sparks MD）の有無に影響を受けない、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列にハイブリダイズする、請求項１に記載の核酸プライマー又は核酸プローブを含む組成物。
【請求項３３】
前記高リスクＨＰＶゲノムがＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記核酸プライマー又は核酸プローブが、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９又はその相補体、及び、
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４又はその相補体、
からなる群から選択される配列にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含み、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーである、請求項１〜４、６及び７のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項３６】
請求項３５に記載の少なくとも１つのプライマーを含むキット。
【請求項３７】
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、
を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
配列番号１３のヌクレオチド７５１〜７７５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブを更に含む、請求項３６又は３７に記載のキット。
【請求項３９】
ａ．配列番号１４のヌクレオチド７２４〜７４７又はその相補体、及び、
ｂ．配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０又はその相補体、
からなる群から選択される配列にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含み、ＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーである、請求項１〜４、８及び９のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項４０】
請求項３９に記載の少なくとも１つのプライマーを含むキット。
【請求項４１】
（ａ）配列番号１４の相補体ヌクレオチド７２４〜７４７にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、
（ｂ）配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、
を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
配列番号１４のヌクレオチド７４８〜７７３にハイブリダイズすることが可能なプローブを更に含む、請求項４０又は４１に記載のキット。
【請求項４３】
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１１２〜１３５又はその相補体、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１又はその相補体、
（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド４０２〜４２５又はその相補体、及び、
（ｄ）配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９又はその相補体、
からなる群から選択される配列にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含み、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーである、請求項１〜４、１０及び１１のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項４４】
請求項４３に記載の少なくとも１つのプライマーを含むキット。
【請求項４５】
（ａ）
（ｉ）配列番号１５の相補体ヌクレオチド１１２〜１３５にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、
（ｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、
を含む第１のプライマー対、及び／又は、
（ｂ）
（ｉ）配列番号１５の相補体ヌクレオチド４０２〜４２５にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第３のプライマーと、
（ｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第４のプライマーと、
を含む第２のプライマー対、
を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
（ｉ）配列番号１５のヌクレオチド１３６〜１６５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブ、及び、
（ｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド５１７〜５４２又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブ、
からなる群から選択される少なくとも１つの核酸プローブを更に含む、請求項４４又は４５に記載のキット。
【請求項４７】
配列番号１３のヌクレオチド７５１〜７７５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項４８】
配列番号１４のヌクレオチド７４８〜７７３又はその相補体にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項４９】
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１３６〜１６５若しくはその相補体、又は、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド５１７〜５４２若しくはその相補体、
にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の核酸の存在を決定するためのアッセイ、方法、試薬、システム及びキットに関する。より具体的には、本発明はサンプル中の高リスクヒトパピローマウイルスの検出、ジェノタイピング及び定量化に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１１年１月７日付けで出願された米国仮特許出願第６１／４３０，７９７号（その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発がん性高リスク（ＨＲ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型の持続感染は、高度異形成若しくは子宮頸癌、外陰癌又は膣癌を発症するリスクの増大と関連する。生殖器粘膜に感染し、発癌性と規定される、およそ１８種のＨＲ−ＨＰＶ型が存在する。中でも、ＨＰＶ１６型、１８型及び４５型は最も高い子宮頸部腺癌の発生率を伴う。ＨＰＶ１６型及び１８型は全子宮頸がんの７０％を占め、最も一般的な発癌性ＨＰＶ型であり、新たなＨＰＶワクチンの標的とされている。
【０００４】
独立した又は細胞学的検査の補助としての、ＨＲ−ＨＰＶの存在の分子スクリーニングを利用するスクリーニングプログラムが、標準治療プロセスの有効性を改善することは既知である。さらに、ＨＰＶ量の増大が子宮頸がんにおける疾患進行と相関することが分かっているため、ウイルス量を定量化する試験も重要であり得る。しかしながら、様々なＨＲ−ＨＰＶ型の生物学的挙動が異なることから、ＨＰＶ  ＤＮＡ量の計算の予測値は、存在するＨＰＶ感染の型に応じて異なる場合がある。したがって、ＨＲ−ＨＰＶ量は浸潤性癌の型依存性のリスクマーカーであり得る。このため、ＨＰＶ感染の正確なジェノタイピング及びウイルス量の定量化が可能であることは、有益な手段（tool）であり得る。
【０００５】
残念なことに、大半のＨＲ−ＨＰＶスクリーニング方法では、個々のＨＰＶ型がジェノタイピングされるのではなく、ＨＲ−ＨＰＶ群全体が検出される。様々なＨＲ−ＨＰＶゲノムのＬ１領域の一部分の増幅に基づく、高リスクＨＰＶ型のジェノタイピングのためのＰＣＲベースのアッセイが幾つか存在する。しかしながら、Ｌ１オープンリーディングフレームの一部は低確率でヒトゲノムへの組込み事象の際に失われるため、Ｌ１領域を標的とする試験は偽陰性の結果を生じやすい。このため、Ｌ１ベースのＨＲ−ＨＰＶスクリーニングプログラムの使用は、潜在的な高リスクＨＰＶ感染のモニタリング及び治療を遅らせることになる場合がある。したがって、有益な手段となる、Ｌ１以外のＨＰＶゲノムの領域に基づいてＨＲ−ＨＰＶ感染を正確にジェノタイピング及び／又は定量化するための材料及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書に記載の組成物、核酸、アッセイ、キット及び方法は、高リスクＨＰＶ型のＥ６／Ｅ７領域を特異的に検出するのに適した核酸を提供することによって、上記に記載の欠点に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列に特異的な核酸プライマー又は核酸プローブであって、ａ．その全長にわたって、標的配列及びその亜型のゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の少なくとも１つの核酸配列の両方に対して８０％以上の同一性を有し、ｂ．異なるＨＰＶ型に由来する核酸にハイブリダイズしない、核酸プライマー又は核酸プローブ
【０００８】
一実施の形態では、高リスクＨＰＶゲノムは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５からなる群から選択される。
【０００９】
一実施の形態では、核酸プライマーは、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列及び／又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００１０】
一実施の形態では、核酸プローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１８及び配列番号２１からなる群から選択される配列及び／又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００１１】
一実施の形態では、プライマーは、ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能である。
【００１２】
一実施の形態では、核酸プライマーは、配列番号１若しくは配列番号２又はその相補体を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００１３】
一実施の形態では、プライマーは、ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能である。
【００１４】
一実施の形態では、核酸プライマーは、配列番号４又は配列番号５を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００１５】
一実施の形態では、プライマーは、ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能である。
【００１６】
一実施の形態では、核酸プライマーは、配列番号７又は配列番号８を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００１７】
一実施の形態では、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列及び／又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる少なくとも１つの核酸プライマーを含むプライマーセットが提供される。
【００１８】
一実施の形態では、プライマーセットは、（ａ）ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能なプライマー対、（ｂ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能なプライマー対、及び（ｃ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分を増幅することが可能なプライマー対からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００１９】
一実施の形態では、プライマーセットは、（ａ）配列番号１と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号２と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｂ）配列番号４と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号５と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｃ）配列番号７と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号８と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｄ）配列番号１０と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号１１と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｅ）配列番号１６と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号１７と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｆ）配列番号１９と約７０％〜１００％の同一性を有する第１のプライマー、及び配列番号２０と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマーからなる群から選択されるプライマー対を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。請求項１３に記載のプライマーセットは、（ａ）配列番号１からなる第１のプライマー、及び配列番号２と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｂ）配列番号４からなる第１のプライマー、及び配列番号５と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｃ）配列番号７からなる第１のプライマー、及び配列番号８と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｄ）配列番号１０からなる第１のプライマー、及び配列番号１１と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｅ）配列番号１６からなる第１のプライマー、及び配列番号１７と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマー、（ｆ）配列番号１９からなる第１のプライマー、及び配列番号２０と約７０％〜１００％の同一性を有する第２のプライマーからなる群から選択されるプライマー対を含む。
【００２０】
別の態様では、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及び／又はＨＰＶ４５の検出用のキットであって、高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列に特異的な核酸プライマー又は核酸プローブを含み、ａ．上記核酸プライマー又は核酸プローブが、その全長にわたって、標的配列及びその亜型のゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の少なくとも１つの核酸配列の両方に対して８０％以上の同一性を有し、ｂ．上記核酸プライマー又は核酸プローブが、異なるＨＰＶ型に由来する核酸にハイブリダイズしない、キットが提供される。
【００２１】
一実施の形態では、キットは、少なくとも１つの核酸プライマーと少なくとも１つの核酸プローブとを含み、（ａ）上記核酸プライマーが配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、（ｂ）上記核酸プローブが配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１８及び配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００２２】
一実施の形態では、キットは、ＨＰＶ１６のプライマー及びプローブのセット、ＨＰＶ１８のプライマー及びプローブのセット、及び／又はＨＰＶ４５のプライマー及びプローブのセットを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００２３】
一実施の形態では、（ａ）ＨＰＶ１６のプライマー及びプローブのセットは、（ｉ）配列番号１の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｉｉ）配列番号２の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｉｉｉ）配列番号３の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブとを含み、（ｂ）ＨＰＶ１８のプライマー及びプローブのセットは、（ｉ）配列番号４の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｉｉ）配列番号５の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｉｉｉ）配列番号６の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブとを含み、（ｃ）ＨＰＶ４５のプライマー及びプローブのセットは、（ｉ）配列番号７の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｉｉ）配列番号８の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｉｉｉ）配列番号９の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブとを含む。
【００２４】
一実施の形態では、キットは、対照のプライマー及びプローブのセットを更に含む。一実施の形態では、対照のプライマー及びプローブのセットは、（ａ）配列番号１６の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｂ）配列番号１７の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプライマーと、（ｃ）配列番号１８の配列と７０％〜１００％の同一性を有するプローブとを含む。
【００２５】
別の態様では、高リスクＨＰＶをジェノタイピングする方法が提供され、本方法は、（ａ）請求項１に記載の少なくとも１つの核酸プライマー又は核酸プローブを、第１の高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列の少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、（ｂ）第１の高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域に対する上記核酸のハイブリダイゼーションを検出することとを含む。
【００２６】
一実施の形態では、核酸プライマー又は核酸プローブは、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列又はその相補体と約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００２７】
一実施の形態では、（ａ）核酸プライマーを標的配列にハイブリダイズさせ、（ｂ）増幅反応を行うことを含む方法によってハイブリダイゼーションを検出する。
【００２８】
一実施の形態では、（ａ）高リスクＨＰＶがＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５からなる群から選択され、（ｂ）増幅反応が、ＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分に相当するアンプリコンを生成する。
【００２９】
核酸プライマーが、その全長にわたって、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補体に対して約７０％〜１００％の同一性を有する、請求項２５に記載の方法。
【００３０】
核酸プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、該核酸プローブを任意で検出可能に標識する、請求項２２に記載の方法。
【００３１】
リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ形式で行われる、請求項２２に記載の方法。
【００３２】
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５の感染を区別することが可能であり、（ａ）高リスクＨＰＶを含む疑いがあるサンプルを準備することと、（ｂ）サンプルを、（ｉ）ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分を増幅することが可能なプライマーセット、（ｉｉ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分を増幅することが可能なプライマーセット、（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分を増幅することが可能なプライマーセット、（ｉｖ）ＨＰＶ１８ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１６ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識された核酸プローブ、（ｖ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識された核酸プローブ、及び（ｖｉ）ＨＰＶ１６ゲノム又はＨＰＶ１８ゲノムのＥ６／Ｅ７領域ではなく、ＨＰＶ４５ゲノムのＥ６／Ｅ７領域の標的配列の一部分にハイブリダイズすることが可能な、検出可能に標識された核酸プローブと接触させることであって、各々の核酸プローブが異なる検出可能な標識を有することと、（ｃ）核酸増幅を行うことと、（ｄ）各々の検出可能な標識の有無を検出することとを含む、請求項２８に記載の方法。
【００３３】
別の実施の形態では、本方法は、QIAGENのＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ＰＣＲ装置によって行われる方法を再現することが可能なプラットフォームで行われる。
【００３４】
別の実施の形態では、本方法は、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）（Hologic，Bedford，MA）及びＳｕｒｅＰａｔｈ（商標）（Becton Dickinson，Sparks MD）の有無に影響を受けない。
【００３５】
別の態様では、高リスクＨＰＶゲノムのＥ６／Ｅ７領域中の標的配列にハイブリダイズする、本明細書に記載の核酸プライマー又は核酸プローブを含む組成物が提供される。
【００３６】
一実施の形態では、組成物は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５からなる群から選択される高リスクＨＰＶゲノムを含む。
【００３７】
別の実施の形態では、組成物は、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列及び／又はその相補体と７０％〜１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるプライマー又はプローブを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】例示的なＨＰＶプライマー／プローブセットのアッセイ感度を示す図である。
【図２】例示的なプライマー／プローブセットに対するマルチプレックス抑制研究の結果を示す図である。
【図３】シングルプレックス検出アッセイ及びマルチプレックス検出アッセイの両方における例示的なＨＰＶ１６検出を示す図である。
【図４】シングルプレックス検出アッセイ及びマルチプレックス検出アッセイの両方における例示的なＨＰＶ１６検出を示す図である。
【図５】シングルプレックス検出アッセイ及びマルチプレックス検出アッセイの両方における例示的なＨＰＶ１６検出を示す図である。
【図６】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングオレンジ（ＲＯＸ）の結果、並びに１０３コピー／反応及び１０５コピー／反応でのＨＰＶ１６の特異的検出を示す図である。
【図７】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングオレンジ（ＲＯＸ）の結果（ＣＴ値）、及びＨＰＶ１６の検出を示す図である。
【図８】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングイエロー（ＨＥＸ）の結果、並びに１０３コピー／反応及び１０５コピー／反応でのＨＰＶ１８の特異的検出を示す図である。
【図９】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングオレンジ（ＨＥＸ）の結果（ＣＴ値）、及びＨＰＶ１８の検出を示す図である。
【図１０】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリンググリーン（ＦＡＭ）の結果、並びに１０３コピー／反応及び１０５コピー／反応でのＨＰＶ４５の特異的検出を示す図である。
【図１１】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングオレンジ（ＦＡＭ）の結果（ＣＴ値）、及びＨＰＶ４５の検出を示す図である。
【図１２】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングレッド（Ｃｙ５）の結果、及び対照としてのβグロビンの特異的検出を示す図である。
【図１３】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングオレンジ（Ｃｙ５）の結果（ＣＴ値）、及び対照であるβグロビンの検出を示す図である。
【図１４】例示的なマルチプレックスアッセイの結果、並びに５コピー／反応、１０コピー／反応、１００コピー／反応及び１０３コピー／反応でのＨＰＶ１６の検出を示す図である。
【図１５】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングオレンジ（ＲＯＸ）の結果（ＣＴ値）、及び様々なコピー数／反応でのＨＰＶ１６の検出を示す図である。
【図１６】例示的なマルチプレックスアッセイの結果、並びに５コピー／反応、１０コピー／反応、１００コピー／反応及び１０３コピー／反応でのＨＰＶ１８の検出を示す図である。
【図１７】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリングイエロー（ＨＥＸ）の結果（ＣＴ値）、及び様々なコピー数／反応でのＨＰＶ１８の検出を示す図である。
【図１８】例示的なマルチプレックスアッセイの結果、並びに５コピー／反応、１０コピー／反応、１００コピー／反応及び１０３コピー／反応でのＨＰＶ４５の検出を示す図である。
【図１９】例示的なマルチプレックスアッセイにおけるサイクリンググリーン（ＦＡＭ）の結果（ＣＴ値）、及び様々なコピー数／反応でのＨＰＶ４５の検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示は、サンプル中の核酸分子の存在を迅速に決定するため及び標的核酸分子を定量化するための方法、組成物、試薬、システム及びキットを含む。この方法、組成物、試薬、システム及びキットは臨床診断目的で、及び／又は遺伝子型レベルでのＨＰＶウイルス持続性、ウイルス量の動態及び／又は疾患の再発可能性を特性化するために使用することができる。
【００４０】
本発明による方法、組成物、試薬、システム及びキットは、１６、１８及び／又は４５等のＨＰＶ型のジェノタイピング及び／又は定量化のための初期検査又は追跡検査に対する効率的な試験をもたらす。例えば、方法は、未試験のサンプルを試験することと、陽性サンプル中のＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及び／又はＨＰＶ４５の存在を確認する及び／又は定量化することと、陰性サンプル中のＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及び／又はＨＰＶ４５の非存在を確認することとを含む。
【００４１】
ＨＰＶウイルス量は例えば子宮頸がんにおける疾患進行と関連付けられているため、ＨＰＶウイルス量は浸潤性癌の型依存性のリスクマーカーであり得る。そのため、方法は、がんのリスクを診断し、トリアージを行うために、ウイルス量を定量化及びカテゴリー化すること、例えば治療方法の優先順位を決定することを含む。
【００４２】
Ｅ６及びＥ７は特異的ＨＰＶ型の有無を決定するための標的化領域である場合もあるため、本発明の方法はＬ１欠失／突然変異についてサンプルをスクリーニングすることも含む。
【００４３】
本発明のマルチプレックス設計は、１６、１８及び／又は４５等のＨＰＶ型の通常の個別検査／ジェノタイピングと比較して、時間及びサンプル溶出液を節約する。
【００４４】
プライマー及びプローブ
本発明のプライマー及びプローブは、ＨＰＶ遺伝子型１６、ＨＰＶ遺伝子型１８及びＨＰＶ遺伝子型４５のＥ６領域及びＥ７領域中の遺伝子を標的とすることが可能である。Ｅ６領域及びＥ７領域は、Ｌ１領域ほど組込み時に突然変異誘発事象を起こす傾向が高くはないため、好適な標的領域である。プライマー及びプローブはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に特異的であり、それらの間で又は他のＨＰＶ型といかなる実質的な交差反応性も示さない。プライマー及びプローブは、１反応当たり僅か５コピーの標的配列しか存在しない場合であってもＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８又はＨＰＶ４５の存在の検出に高感度であり得る。
【００４５】
実施形態では、プライマーは約１５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長、例えば約１８ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長〜２６ヌクレオチド長又は約２２ヌクレオチド長〜２４ヌクレオチド長であり得る。例としては、限定するものではないが、プライマーは５０ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下又は２４ヌクレオチド長以下であり得る。プローブは約１５ヌクレオチド長〜約６０ヌクレオチド長、例えば約１８ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長〜３５ヌクレオチド長又は約２２ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長であり得る。例としては、限定するものではないが、プローブは６０ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、３５ヌクレオチド長以下又は３０ヌクレオチド長以下であり得る。
【００４６】
例示的なプライマー及びプローブを、ＨＰＶ１６型、１８型及び４５型の各々について下記表に示す。４５型については、２つのプライマー及びプローブのセットが示され、セット番号１（配列番号７〜配列番号９）が多重化分析の好ましい実施形態である。下記表において、プローブ配列には５’末端上のシグナル及び３’末端上のクエンチャーがコンジュゲートしている。これらの分子を下記に示すが（太字及び下線）、それらはそれぞれの配列番号によって表される核酸配列の一部ではない。
【００４７】
表１−ＨＰＶ１６プライマー／プローブセット
【表１】
2014501535.tif 000002
【００４８】
表２−ＨＰＶ１８プライマー／プローブセット
【表２】
2014501535.tif 000003
【００４９】
表３−ＨＰＶ４５プライマー／プローブセット番号１
【表３】
2014501535.tif 000004
【００５０】
表４−ＨＰＶ４５プライマー／プローブセット番号２
【表４】
2014501535.tif 000005
【００５１】
一部の実施形態では、上記のプライマー及びプローブのセットとともに対照を使用することができる。例えば、βグロビンのプライマー及びプローブのセットを、第４の検出可能なシグナルを有するマルチプレックス系とともに使用することができる。上記に例示したプライマー及びプローブのセットの検出及び定量化を妨げない限り、任意の好適な対照を使用することができる。以下のプライマー及びプローブのセットを対照として使用することができ、セット番号１が多重化分析に好ましい。
【００５２】
表５−βグロビンプライマー／プローブセット番号１
【表５】
2014501535.tif 000006
【００５３】
表６−βグロビンプライマー／プローブセット番号２
【表６】
2014501535.tif 000007
【００５４】
プライマー及びプローブは、様々なプライマー及びプローブと約７０％〜１００％の同一性及び／又は相同性、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有するこれらのプライマー及びプローブも含み得る。例としては、限定するものではないが、プライマー及び／又はプローブは、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列と７０％〜１００％の同一性及び／又は相同性を有し得る。更なる例としては、プローブは、配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１６〜配列番号２１からなる群から選択される配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有し得る。
【００５５】
一実施形態では、配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００５６】
別の実施形態では、配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００５７】
別の実施形態では、配列番号１３のヌクレオチド７５１〜７７５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブがプローブとして使用される。例としては、限定するものではないが、プローブは、配列番号１３のヌクレオチド７５１〜７７５又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。
【００５８】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーとを含むＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００５９】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１３のヌクレオチド６９５〜７１９の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド８１１〜８３４にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、（ｃ）配列番号１３のヌクレオチド７５１〜７７５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブとを含むＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマー／プローブセットが提供される。
【００６０】
一実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド７２４〜７４７又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１４のヌクレオチド７２４〜７４７又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１４のヌクレオチド７２４〜７４７又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００６１】
別の実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００６２】
別の実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド７４８〜７７３又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブがプローブとして使用される。例としては、限定するものではないが、プローブは、配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。
【００６３】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１４のヌクレオチド７２４〜７４７の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーとを含むＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００６４】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１４のヌクレオチド７２４〜７４７の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１４のヌクレオチド８３７〜８６０にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、（ｃ）配列番号１４のヌクレオチド７４８〜７７３又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブとを含むＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００６５】
一実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド１１２〜１３５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１５のヌクレオチド１１２〜１３５又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド１１２〜１３５又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００６６】
別の実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００６７】
別の実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド１３６〜１６５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブがプローブとして使用される。例としては、限定するものではないが、プローブは、配列番号１５のヌクレオチド１３６〜１６５又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。
【００６８】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１１２〜１３５の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーとを含むＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００６９】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１１２〜１３５の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド２０８〜２３１にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド１３６〜１６５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブとを含むＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００７０】
一実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド４０２〜４２５又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１５のヌクレオチド４０２〜４２５又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド４０２〜４２５又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００７１】
別の実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９又はその相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む核酸が、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーとして使用される。例としては、限定するものではないが、３’末端配列は、配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。別の例としては、ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列からなる。
【００７２】
別の実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド５１７〜５４２又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブがプローブとして使用される。例としては、限定するものではないが、プローブは、配列番号１５のヌクレオチド５１７〜５４２又はその相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上及び／又は９８％以上の同一性及び／又は相同性を有する配列を含むか又はそれからなる。
【００７３】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１５のヌクレオチド４０２〜４２５の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーとを含むＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００７４】
別の実施形態では、（ａ）配列番号１５のヌクレオチド４０２〜４２５の相補体にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第１のプライマーと、（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド５４６〜５６９にハイブリダイズすることが可能な３’末端配列を含む第２のプライマーと、（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド５１７〜５４２又はその相補体にハイブリダイズすることが可能なプローブとを含むＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマーセットが提供される。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマー」、「ＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマー」及び「ＨＰＶ４５  Ｅ６／Ｅ７特異的プライマー」という表現は、指定のＨＰＶ型のゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分の増幅を媒介することが可能であるが、異なるＨＰＶ型のゲノムのＥ６／Ｅ７領域の一部分の増幅を媒介することが可能ではない核酸プライマーを指す。
【００７６】
一実施形態では、プローブは、試験対象の遺伝子型の独立検出に好適である検出可能なシグナル、例えば放射性シグナル、ビオチンシグナル又は蛍光シグナルを含むように設計される。任意の好適な検出可能なシグナルを使用することができる。例えば、ＨＰＶ１６を橙色蛍光分子であるＲＯＸで標識することができ、ＨＰＶ１８を黄色蛍光分子であるＨＥＸで標識することができ、ＨＰＶ４５を緑色蛍光分子であるＦＡＭで標識することができ、対照であるβグロビンを赤色蛍光分子であるＣｙ５で標識することができる。実施形態では、上記表に示されるように、プローブは、プローブの５’末端に共有結合したフルオロフォアと、プローブの３’末端で結合したクエンチャーとを有するＴａｑＭａｎプローブであり得る。フルオロフォア及びクエンチャーが近接している場合、あらゆる蛍光がクエンチャーによって阻害される。しかしながら、Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長させると、プローブがポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解され、それによりフルオロフォアがクエンチャーの消光活性から解放される。標識及びクエンチャーの任意の好適な組合せを使用することができる。
【００７７】
別の実施形態では、ハイブリッドキャプチャーに使用されるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを生成するためにプローブを利用する。ハイブリッドキャプチャー技術は、サンプル中の特異的な標的核酸を精製及び検出する様々な方法において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに結合することが可能な或る特定の抗体を利用するものである。ハイブリッドキャプチャー法の様々な反復適用（iterations）が、とりわけ米国特許第５，９９４，０７９号、同第６，０２７，８９７号、同第６，２７７，５７９号、同第６，６８６，１５１号及び同第７，４３９，０１６号；米国特許出願公開第２００６／００５１８０９号、同第２００９／０１６２８５１号及び同第２００９−０２９８１８７号；並びに国際公開第０１／９６６０８号（これらは各々、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。基本的なハイブリッドキャプチャーのプロトコルは、（１）核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを生成することと、（２）標的核酸の単離を容易にするために、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを固相に結合させることと、（３）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを検出することとを含む。様々な反復適用において、工程（２）又は工程（３）において抗ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体を使用することができる。例としては、限定するものではないが、抗ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体を固相に（共有的に又は別の形で）結合させ、それによりＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの固相への「捕捉」を媒介することができる。代替的には、固相に（共有的に又は別の形で）結合した核酸プローブは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを固相に捕捉させ、これを次いで検出可能に標識された抗ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体によって検出することができる。
【００７８】
試料調製
任意の好適な試料調製方法を使用することができる。陽性又は陰性の結果を検証又は定量化するために上記方法を用いる場合、予め精製した試料サンプルを使用してもよい。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及び／又はＨＰＶ４５の初期決定／定量化を行うために上記方法を用いる場合、任意の好適なサンプル精製方法を用いて試料を精製することができる。
【００７９】
ＰＣＲ装置及び条件
リアルタイムＰＣＲ分析が可能な任意の好適なＰＣＲ装置及び条件を、標的ＰＣＲ産物を増幅及び検出するために使用することができる。実施形態では、Qiagen製のＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑを使用することができる。
【実施例】
【００８０】
ＨＰＶ１６プライマー／プローブセット（配列番号１〜配列番号３）、ＨＰＶ１８プライマー／プローブセット（配列番号４〜配列番号６）及びＨＰＶ４５プライマー／プローブセット番号１（配列番号７〜配列番号９）を、シングルプレックスリアルタイムＰＣＲにおいて評価した。高リスク（ＨＲ）及び低リスク（ＬＲ）の両方のＨＰＶ型に対する分析特異性を、清浄なシステム内でプラスミドを用いて１０７コピー／アッセイで試験した。ＨＰＶ６型、１１型、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４０型、４２型、４３型、４５型、５１型、５２型、５３型、５６型、５８型、５９型、６１型、６６型、６７型、６８型、６９型、７１型、７２型、７３型、８１型、８２型、２型、３型、１３型、３０型、３４型、４４型、７０型及び８３型を試験した。結果から、プライマー／プローブセットがそれぞれＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に特異的であることが示された。
【００８１】
プライマー／プローブセットを潜在的な妨害物質、すなわち血液、避妊ゼリー、殺精子剤、保湿剤、直腸麻酔薬、ボディオイル、抗真菌性クリーム、膣液及びフェミニンスプレー（feminine spray）についても試験した。結果から、これらの物質がプライマー／プローブセットの特異性を妨げないことが示された。
【００８２】
プライマー／プローブセットを、ＦＤＡの勧告に従う１６個の非ＨＰＶ病原体についても試験した。
【００８３】
ＨＰＶ１６プライマー／プローブセット、ＨＰＶ１８プライマー／プローブセット及びＨＰＶ４５プライマー／プローブセット番号１をＢＬＡＳＴ分析によって検証した。配列をＮＣＢＩデータベースにおける全ての関連粘膜ＨＰＶ型、並びにＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５の既知の全ての亜型と比較した。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５の既知の亜型はいずれも１０％を超えるミスマッチを生じなかった。既知の全ての亜型は９０％超の相同性を有していた。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５のプライマー及びプローブに対して８０％超の相同性を有する配列を表７に示す。
【００８４】
表７−ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５のプライマー及びプローブに対して８０％超の相同性を有する配列
【表７】
2014501535.tif 000008
【００８５】
サンプル調製
サンプルを、カラム形式のシリカゲル吸着に基づく商業的に利用可能な核酸抽出／精製技術である改良ＱＩＡａｍｐ  Ｍｅｄｉａ  ＭＤｘ  Ｋｉｔを用いて精製した。試料タイプに応じて標準プロトコルとは変更した工程を下記表８に示す。
【００８６】
表８−試料タイプに応じて変更したプロトコル
【表８】
2014501535.tif 000009
【００８７】
リアルタイムＰＣＲ法
次いで、精製サンプルを、βグロビンプローブ／プライマーセット番号１に加えて、ＨＰＶ１６プライマー／プローブセット、ＨＰＶ１８プライマー／プローブセット及びＨＰＶ４５プライマー／プローブセット番号１とともに使用した。ＰＣＲ法の混合物及び条件を下記表９に示す。
【００８８】
表９−ＰＣＲの混合物及びサイクリング条件
【表９】
2014501535.tif 000010
【００８９】
アッセイ感度
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５のマルチプレックスプライマー／プローブセットの各々のダイナミックレンジを、プラスミドモデルを用いて決定した。ダイナミックレンジは少なくとも６桁（magnitudes）であることが決定された。図１に示されるように、０．９７以上の相関係数（Ｒ２値）及び０．９７以上のＰＣＲ効率が、１０７ゲノムコピー／アッセイから１０ゲノムコピー／アッセイまでＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５について一貫して達成された。各々のＨＰＶプライマー／プローブについてのＣｔ値及びＬＯＤは、シングルプレックスアッセイ検出とマルチプレックスアッセイ検出とで同等であることが見出された。
【００９０】
アッセイ特異性
各々のプライマー／プローブ対を、２７個のＨＲ  ＨＰＶ型及びＬＲ  ＨＰＶ型に対する特異性について、１×１０７コピー／アッセイの各々のＨＰＶ型プラスミドでマルチプレックスで試験した。結果を下記表１０及び表１１に示す。
【００９１】
表１０：ＨＲ  ＨＰＶ型に対するアッセイ特異性
【表１０】
2014501535.tif 000011
＊ＨＰＶ１８のプライマー及びプローブによって、１０７個のＨＰＶ４５標的投入物が４０以上のＣｔ値及び５コピー／アッセイ以上の検出数で一貫して検出された。
【００９２】
表１１：ＬＲ  ＨＰＶ型に対するアッセイ特異性
【表１１】
2014501535.tif 000012
【００９３】
マルチプレックスでのアッセイ特異性の抑制／阻害
マルチプレックスアッセイの特異性を更に試験するために、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５を１０コピーから１０７コピーまで１０倍希釈した。これらの希釈物を、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８又はＨＰＶ４５＋ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ６７及びＨＰＶ８３のプラスミドプールにおいて１０７コピー／アッセイの各々のＨＰＶ型で試験した。図２に示されるように、各々の標的ＨＰＶ型に対するアッセイ特異性の抑制は最小であった。
【００９４】
臨床サンプルのパフォーマンス
ＳＴＭ培地、ＰＣ培地及びＳＰ培地からスクリーニングした１０００個を超える子宮頸部試料ＨＣ２及びジェノタイピングしたＧＰ  ＰＣＲ／ＬＭＸを、マルチプレックスアッセイ形式で試験した。ＧＰ  ＰＣＲ結果を下記表１２〜表１４に示す。
【００９５】
表１２−ＧＰ  ＰＣＲについてのＳＴＭ試料の結果
【表１２】
2014501535.tif 000013
【００９６】
表１３−ＧＰ  ＰＣＲについてのＰＣ試料の結果
【表１３】
2014501535.tif 000014
【００９７】
表１４−ＧＰ  ＰＣＲについてのＳＰ試料の結果
【表１４】
2014501535.tif 000015
【００９８】
図３〜図５は、様々なサンプルタイプについてのシングルプレックスアッセイ及びマルチプレックスアッセイでのＨＰＶ１６検出の幾つかの例を示す。
【００９９】
約５００個のサンプルをマルチプレックス及びシングルプレックスの両方で試験した。これらの試験から、標的ＨＰＶ型（１６、１８及び４５）について陽性又は陰性の試料のジェノタイピングにおいて同等の結果が示された。
【０１００】
多重ＨＰＶ感染を有する臨床サンプルを、例えば米国特許第６，３５２，８２５号（その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のＧＰ  ５＋／６＋  ＬＭＸジェノタイピングを用いてジェノタイピングした。約２５μＬのサンプルを用い、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対するプライマー及びプローブのセットを使用してＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５の有無を検出した。結果を下記表１５にまとめる。
【０１０１】
表１５−多重感染を有する臨床サンプルの例
【表１５】
2014501535.tif 000016
【０１０２】
４プレックスアッセイ
βグロビンに対するプライマー及びプローブを、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対するプライマー／プローブセットに加えて内部対照として使用した。様々なサンプルを、４プレックスのプライマー及びプローブとともにランした。サンプルについて下記表１６にまとめる。
【０１０３】
表１６−特異性を試験するために４プレックスのプライマー及びプローブとともにランしたサンプル
【表１６】
2014501535.tif 000017
【０１０４】
これらのサンプルのランの結果を図６〜図１３に示す。アッセイから、
橙色チャネルが、ＲＯＸプローブによって検出されるＨＰＶ１６  ＤＮＡを含有するサンプルに対してのみ特異的であること、
黄色チャネルが、ＨＥＸプローブによって検出されるＨＰＶ１８  ＤＮＡを含有するサンプルに対してのみ特異的であること、
緑色チャネルが、ＦＡＭプローブによって検出されるＨＰＶ４５  ＤＮＡを含有するサンプルに対してのみ特異的であること、
赤色チャネルが、Ｃｙ５プローブによって検出される陰性臨床バックグラウンド±ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８又はＨＰＶ４５のプラスミドに対してのみ特異的であること、
が実証された。
【０１０５】
このため、内部対照のプライマー及びプローブを含むマルチプレックス形式での選択されたフルオロフォアに対する各々のチャネルの特異性が実証された。
【０１０６】
４プレックスアッセイによって、特異性に加えてＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及び／又はＨＰＶ４５の存在の検出における感度が実証される。表１７に挙げる以下のサンプルを、４プレックスのプライマー及びプローブとともにランした。
【０１０７】
表１７−感度を試験するために４プレックスのプライマー及びプローブとともにランしたサンプル
【表１７】
2014501535.tif 000018
【０１０８】
サンプル希釈物の各々を陰性臨床溶出液プールにスパイクした。これらのサンプルのランの結果を図１４〜図１９に示す。各々のプライマー／プローブセットによって、ＨＰＶ陰性臨床バックグラウンドの存在下で少なくとも５コピー／反応のレベルで検出可能であるという感度が実証された。
【０１０９】
サンプルのシークエンシング
上記で試験した多数のサンプルのうち、３４個のサンプル（１７個がマルチプレックス陽性であり、１７個がマルチプレックス陰性である）をシークエンシングした。シークエンシングした全てのサンプルがマルチプレックスのデータと一致するため、マルチプレックスアッセイの特異性、感度及び精度が更に検証された。
【０１１０】
様々な上記に開示の及び他の特徴及び機能、又はその代替物を多くの他の異なるシステム又は用途と望ましく組み合わせることができることが理解されよう。また、現在予見又は予期し得ないその様々な代替形態、変更形態、変形形態又は改良形態が今後当業者によって行われる可能性があり、それらも添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2014501535.tif 000019
【図２】
2014501535.tif 000020
【図３】
2014501535.tif 000021
【図４】
2014501535.tif 000022
【図５】
2014501535.tif 000023
【図６】
2014501535.tif 000024
【図７】
2014501535.tif 000025
【図８】
2014501535.tif 000026
【図９】
2014501535.tif 000027
【図１０】
2014501535.tif 000028
【図１１】
2014501535.tif 000029
【図１２】
2014501535.tif 000030
【図１３】
2014501535.tif 000031
【図１４】
2014501535.tif 000032
【図１５】
2014501535.tif 000033
【図１６】
2014501535.tif 000034
【図１７】
2014501535.tif 000035
【図１８】
2014501535.tif 000036
【図１９】
2014501535.tif 000037
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014501535.tif 000039
2014501535.tif 000040
2014501535.tif 000041
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