(57)【要約】  本発明は、代謝的に活性な細胞の酸化還元状態を評価するための化合物及び方法、ならびに酸化還元を定義する補因子ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定を組み合わせることにより、酵素活性及び／又は代謝産物レベルを評価するための方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示される化合物。
2014526443.tif 000044
（Ｉ）
（式中、Ａは、生物発光レポーター部分であり、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、Ｃ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである。）
【請求項２】
次式（ＩＩ）、
2014526443.tif 000045
（ＩＩ）
で示される、請求項１に記載の化合物。
式中、
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ3-7環式環、アリール、ベンジル、又は置換ベンジル環、複素環、ヘテロアリール、及び（ＣＨ2）n’−Ｐ（Ｐｈ）3であり、
Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、メチル、及びトリフルオロメチルから独立して選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
ｎ’は、２〜７の整数である。）
【請求項３】
次式（ＩＩＩ）、
2014526443.tif 000046
（ＩＩＩ）
で示される請求項１に記載の化合物。
式中、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、メチル、及びトリフルオロメチルから独立して選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである。）
【請求項４】
次式（ＩＶ）、
2014526443.tif 000047
（ＩＶ）
で示される、請求項１に記載の化合物。
（式中、
Ｒ2は、ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ5は、−ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ7は、−ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである。）
【請求項５】
代謝的に活性な細胞試料の酸化還元状態を分析するための方法であって、
ａ．前記代謝的に活性な細胞試料を請求項１〜４に記載の化合物と接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物の少なくとも一部をルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、及び
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
代謝的に活性な細胞試料の酸化還元状態を分析するための方法であって、
ａ．前記代謝的に活性な細胞試料を請求項１〜４に記載の化合物及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｂ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
代謝的に活性な細胞試料の酸化還元状態を分析するための方法であって、
ａ．前記代謝的に活性な細胞試料を式（Ｖ）による化合物と接触させる工程、
ｂ．蛍光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記代謝的に活性な細胞試料が、細胞、生理液、単離された細胞小器官、ミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体、又は酵素を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記代謝的に活性な細胞試料が、ミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体、又は酵素を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物発光又は蛍光が、細胞生存率を示唆する、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記代謝的に活性な細胞試料が、動物の中に存在する、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の細胞代謝産物を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を、請求項１〜４に記載の化合物、増幅酵素系、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｂ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記試料が、更に、ジアホラーゼ阻害剤と接触させられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物、増幅酵素、ジアホラーゼ、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰが、単一組成物中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記単一組成物が、更に、ジアホラーゼ阻害剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料中の細胞代謝産物を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を、式（Ｖ）による化合物、デヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰと接触させることと、
ｂ．蛍光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記試料が、細胞溶解物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物発光又は蛍光が、定量化される、請求項１６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞毒性、細胞生存率、又は細胞の酸化還元状態に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．細胞を試験化合物と接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、式（Ｉ）〜（Ｖ）による化合物、及び任意選択的に、ルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｃ．生物発光又は蛍光シグナルを検出することであって、前記シグナルは、前記化合物が前記細胞に及ぼす影響を示唆する、検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記細胞は、動物の中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物発光又は蛍光が、定量化される、請求項１９又は２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを検出する方法であって、
ａ．前記試料を、請求項１〜４に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｂ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを検出する方法であって、
ａ．前記試料を式（Ｖ）による化合物及びジアホラーゼと接触させる工程、
ｂ．蛍光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
試料中のＮＡＤ又はＮＡＤＰを検出する方法であって、
ａ．前記試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｂ．前記試料を、請求項１〜４に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｃ．  生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
試料中のＮＡＤ又はＮＡＤＰを検出する方法であって、
ａ．前記試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｂ．前記試料を式（Ｖ）による化合物及びジアホラーゼと接触させる工程、
ｃ．蛍光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成する酵素の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を前記酵素の基質及びＮＡＤ又はＮＡＤＰと接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、請求項１〜４に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成する酵素の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を前記酵素の基質及びＮＡＤ又はＮＡＤＰと接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を式（Ｖ）による化合物及びジアホラーゼと接触させることと、
ｃ．蛍光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成しない酵素の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を前記酵素の基質と接触させて第１の混合物中に生成物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、前記生成物を利用する酵素と接触させて第２の混合物を形成する工程、
ｃ．前記第２の混合物を、請求項１〜４に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｄ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成しない酵素の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を前記酵素の基質と接触させて第１の混合物中に生成物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、前記生成物を利用する酵素と接触させて第２の混合物を形成する工程、
ｃ．前記第２の混合物を式（Ｖ）による化合物及びジアホラーゼと接触させることと、
ｄ．蛍光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
試料中のＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比率を測定する方法であって、
ａ．前記試料からＮＡＤ（Ｐ）及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを差次的に抽出する工程、
ｂ．各差次的に抽出した試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｃ．ｂ）の両方の反応物に、式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物を加える工程、
ｄ．両方の抽出した試料中の生物発光を測定する工程、
ｅ．２つの溶液のシグナルを比較して前記比率を測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
試料中の総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法であって、
ａ．前記試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｂ．ａ）の反応物に、ジアホラーゼ、式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合、及びルシフェラーゼ反応混合物を加える工程、
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法
【請求項３２】
試料中のＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比率を測定する方法であって、
ａ．前記試料からＮＡＤ（Ｐ）及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを差次的に抽出する工程、
ｂ．各差次的に抽出した試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｃ．ｂ）の両方の反応物に、式（Ｖ）による化合物及びジアホラーゼを加える工程、
ｄ．両方の抽出した試料中の蛍光を測定する工程、
ｅ．２つの溶液のシグナルを比較して前記比率を測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
試料中の総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法であって、
ａ．前記試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｂ．ａ）の反応物に、アホラーゼ及び式（Ｖ）による化合物を加える工程、
ｃ．蛍光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記増幅酵素系は、増幅酵素及び前記増幅酵素の基質を含む、請求項２４、２５、及び３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅酵素が、デヒドロゲナーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が、更に、ジアホラーゼ阻害剤と接触させられる、２４、２５、３０〜３２、３４、及び３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記増幅酵素系、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼの反応混合物は、単一組成物中に存在する、２４、２５、３０〜３２、３４、及び３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記単一組成物が、更に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記単一組成物が、更に、ジアホラーゼ阻害剤を含む、請求項３７又は３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
試料中の総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法であって、
ａ．前記試料を、増幅酵素、ジアホラーゼ、及び式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合物、及びルシフェラーゼ検出混合物と接触させる工程、
ｂ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
細胞中のＮＡＤ、もしくはＮＡＤＨ、もしくはＮＡＤＰ、もしくはＮＡＤＰＨ、又はそれらの任意の組み合わせの有無を検出するためあるいは量を測定するための方法であって、
ａ．前記細胞を、細胞溶解試薬及びルシフェラーゼ検出混合物と接触させる工程、
ｂ．ａ）の前記混合物を請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程、
ｃ．生物発光を検出し、それによってＮＡＤ、もしくはＮＡＤＨ、もしくはＮＡＤＰ、もしくはＮＡＤＰＨ、又はそれらの任意の組み合わせの有無を検出することあるいは量を測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記細胞溶解試薬が、界面活性剤を含有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ルシフェラーゼ検出試薬が、ジアホラーゼを含有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ルシフェラーゼ検出試薬が、ジアホラーゼ及び増幅酵素系を含有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記増幅酵素が、デヒドロゲナーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５３０，５５９号（参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張するものである。
本発明は、代謝的に活性な細胞の酸化還元状態を評価するための化合物及び方法、ならびに酸化還元を定義する補因子ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定を組み合わせることにより、酵素活性及び／又は代謝産物レベルを評価するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞生存率
【０００３】
細胞のエネルギー代謝は、細胞が一連の酵素反応及び化学反応を通してエネルギーを産生することを可能にする複雑なプロセスである。真核生物において、代謝は、ミトコンドリアを中心に起こり、解糖及び酸化的リン酸化を含む複数の経路に関与する。細胞の状態及び種々の刺激に対する適応に依存して、特定の代謝経路が活性化され、これらの経路の酵素反応及び代謝産物に関する研究は、研究者が細胞の代謝状態、ならびに細胞の生存率及び毒性を理解するのに役立つ。細胞のエネルギー代謝の本質的な側面の１つは、細胞の酸化還元（レドックス）状態である。細胞のエネルギー代謝の間、エネルギーは、レドックス反応の一環として保存及び放出されることが多い。これらの代謝反応における主要な補因子は、ヌクレオチドＮＡＤ（Ｐ）及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈである。細胞の酸化還元状態は、これらのヌクレオチドの酸化型（ＮＡＤ（Ｐ））と還元型（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）との間のバランスとして説明される。酸化還元状態は、生細胞の代謝状態を判定するために調べられ、酸化還元状態に関与する及び／又はＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈヌクレオチドを直接的又は間接的に利用する酵素及び代謝産物を調べるために使用することができる。現在のところ、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ、ＭＴＳ、及びＸＴＴ）ならびにレサズリンを含む、細胞の酸化還元状態を調べるための方法が存在する。これらの方法は全て、代謝的に活性な細胞内で還元され、比色シグナル又は蛍光シグナルのいずれかを生成する化合物に関与する。これらの方法は、感度の低さにより制限され、シグナルを増幅するために労働集約型のヌクレオチド抽出法及び／又は酵素サイクリング反応を必要とすることが多い。これらの分子は構造的に異なり、どの細胞酵素が各化合物を還元するかが分かっておらず、そのため、酸化還元状態を調べるための新しい分子の設計は明らかではない。
ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
【０００４】
分子ＮＡＤ及びＮＡＤＰ、ならびにそれらの還元型ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、全ての生物に存在する補因子である。これらは、細胞代謝にとって非常に重要な多くの及び複数の酸化還元酵素反応、ならびに他の必要な細胞プロセスにおける機能に関与する。細胞の酸化還元状態、及び処理によるその摂動の指標として、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨのレベルを測定することが望ましいことが多い。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＩＶ）のうちのいずれか１つによる化合物を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して代謝的に活性な細胞試料の酸化還元状態を分析するための方法を提供する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを検出するための方法を提供する。
【０００８】
更に別の態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して試料中のＮＡＤ又はＮＡＤＰを検出するための方法を提供する。
【０００９】
また、一態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成する酵素の存在を検出するための方法を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して、試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成しない酵素の存在を検出するための方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して試料中の細胞代謝産物を検出するための方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して、細胞毒性、細胞生存率、又は細胞の酸化還元状態に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１３】
更に別の態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して試料中のＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比率を測定する方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）の化合物を使用して試料中の総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞における化合物４３１２、４５５０、及び４５６５の分析を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種した。５０μＭの各化合物で細胞を１時間処理した。各化合物について発光（ＲＬＵ）を検出した。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞における化合物４３１２、４５８５、及び４５８６の分析を示す。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルアッセイプレートのウェルに異なる細胞密度で播種した。５０μＭの各化合物で細胞を１時間処理した。発光（ＲＬＵ）を検出し（ａ）、試料のＲＬＵを培地中の各化合物によって生成されたＲＬＵで除すことにより、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を計算した（ｂ）。
【図３】Ａ５４９細胞における化合物４５８５及び４５８６の分析を示す。Ａ５４９細胞を９６ウェルアッセイプレートのウェルに異なる細胞密度で播種し、１００μＭの各化合物で処理した。細胞培地のアリコートを異なる時点で採取し、発光（ＲＬＵ）を検出した（３ａ及び３ｃ）。試料のＲＬＵを、培地のみにおいて各化合物によって生成されたＲＬＵで除すことにより、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を計算した（３ｂ及び３ｄ）。
【図４】ルシフェリン前駆体化合物の滴定を示す。Ｊｕｒｋａｔ（４ａ及び４ｂ）又はＡ５４９細胞（４ｃ及び４ｄ）を９６ウェルアッセイプレートに４０，０００細胞／ウェルで播種し、濃度を上昇させたルシフェリン前駆体化合物４５８５（４ａ及び４ｃ）ならびに４５８６（４ｂ及び４ｄ）で処理した。化合物の添加後５分〜４５分に及ぶ異なる時点で相対発光量（ＲＬＵ）を測定した。
【図５】メナジオンで処理したＡ５４９細胞の酸化還元状態の分析を示す。Ａ５４９細胞を９６ウェルアッセイプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種し、種々の濃度のメナジオンで１時間処理した。次いで、ＰＢＩ−４３１２又は４５８６を細胞に加え、室温で１時間インキュベートした。各処理ごとに発光（ＲＬＵ）を検出した。
【図６】生細胞の蛍光イメージングを示す。ＨｅＬａ細胞をＰＢＩ−４４１２、４４１３、４４４０、又は４４４１で処理し、画像化した。
【図７】ミトコンドリア標的化を示す。ＨｅＬａ細胞をＰＢＩ−４５４３又は４５４７で処理した。培地をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＤｅｅｐＲｅｄ  ＦＭを含有する低血清培地と交換し、画像化した。
【図８】細胞機能アッセイを示す。ＨｅＬａ細胞をＰＢＩ−４５４３又は４５４７で処理し、ＥＴＣ阻害剤である３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ）とともにインキュベートした。
【図９】化合物４６００及び４６０１で測定された発光と細胞数との間の直接的な関係を示唆する、細胞数と発光との間の直線相関を示す。
【図１０】化合物４４４０及び４４１２で測定された蛍光と細胞数との間の直接的な関係を示唆する、細胞数と蛍光との間の直線相関を示す。
【図１１】細胞をジギトニンで処理した際の蛍光シグナルの減少を示す。細胞毒性を誘発するために、細胞をジギトニンで処理した。細胞を化合物４４４０とともにインキュベートすることによりジギトニン処理後の生存細胞の量を測定し、蛍光シグナルを未処理（ジギトニンを含まない）の細胞で測定された蛍光シグナルと比較した。ジギトニン処理後、蛍光シグナルに９０％を上回る減少が見られ、細胞生存率の減少を測定する４４４０化合物の能力が示された。
【図１２】本明細書に記載される方法を使用して、細胞生存率に影響を及ぼす化合物の薬理学的特徴を示す。
【図１３Ａ】式（Ｉ）〜（ＩＶ）による好適な化合物を示す。
【図１３Ｂ】式（Ｖ）による好適な化合物を示す。
【図１４】本発明の方法の一般的なスキームを示す。
【図１５】Ｊｕｒｋａｔ細胞における乳酸測定を示す。ａ）溶解したＪｕｒｋａｔ細胞をルミノメーターの９６ウェルプレートで段階希釈した。ＮＡＤ、ジアホラーゼ、ＰＢＩ−４３１２、乳酸デヒドロゲナーゼを含有する２×反応混合物を加え、発光（ＲＬＵ）を検出した。ｂ）ＰＢＩ−４３１２で測定された発光と乳酸濃度との間の直接的な関係を示唆する、細胞数と発光出力との間の直線相関。
【図１６】生体外でのエタノール測定を示す：ａ）ルミノメーターの９６ウェルプレートにおいて、１×ＰＢＳ中で２×エタノールの段階希釈を行った。ＮＡＤ、ジアホラーゼ、ＰＢＩ−４３１２、及びアルコールヒドロゲナーゼを含有する２×反応混合物を加え、発光（ＲＬＵ）を検出した。ｂ）ルシフェリン前駆体の変換を介して生成された発光とエタノール濃度との間の直接的な関係を示唆する、エタノールの割合（％）と発光出力との間の直線相関。
【図１７】生体外でのグルコース−６−ホスフェート測定を示す。ルミノメーターの９６ウェルプレートでおいて、１×ＰＢＳ中で２×グルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）の段階希釈を行った。ＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、ＰＢＩ−４３１２、及びＧ６Ｐ−デヒドロゲナーゼを含有する２×反応混合物を加え、発光を検出した。グラフは、発光とＧ６Ｐ濃度との間の線形相関を示す。
【図１８】ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコキナーゼ測定を示す。ルミノメーターの９６ウェルプレートで、ＨｅｐＧ２細胞の段階希釈を行った。ＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、ＰＢＩ−４３１２、及びＧ６Ｐ−ＤＨデヒドロゲナーゼを含有する２×反応混合物を加え、発光を検出した。１００ｍＭグルコースによる発光と０．５ｍＭグルコースによる発光との差が、グルコキナーゼの活性である。
【図１９】ラット又はクロストリジウムのジアホラーゼを用いたＮＡＤＨの検出を示す。Ａ）平均ＲＬＵ及びＢ）シグナル対ノイズ比。
【図２０】ＮＡＤＨの滴定を示す。
【図２１】メナジオンによるジアホラーゼ反応の阻害を示す。ＰＢＩ−４３１２、４５５０、又は４５６５をＮＡＤＨ及びラットジアホラーゼとともにインキュベートし、半分の試料はメナジオンで処理した。発光（ＲＬＵ）を検出し、複製試料を平均化した。
【図２２】ジアホラーゼ反応の経時変化を示す。ＰＢＩ−４３１２、４５５０、及び４５６５をＮＡＤＨ及びラットジアホラーゼとともにインキュベートした。メナジオンを含有するルシフェラーゼ検出試薬（ＬＤＲ）を種々の時点で加え、発光（ＲＬＵ）を検出した（ａ）。最大シグナルの割合も測定した（ｂ）。
【図２３】蛍光によるＮＡＤＨ検出を示す。ＰＢＩ−４４１２、４４１３、４４４０、及び４４４１を、ＮＡＤＨ及びラット又はクロストリジウムのいずれかのジアホラーゼとともにインキュベートした。６０分で、各ジアホラーゼを含む各化合物の蛍光シグナル（ＦＬＵ）が増加した。
【図２４】ＰＢＩ−４４１２、４４４０、４４４１、及び４４１３、ならびにラット又はクロストリジウムのいずれかのジアホラーゼを用いた反応の経時変化を示す。
【図２５】ＰＢＩ−４４４０又は４４１２、及びラットジアホラーゼの６０分でのＮＡＤＨ滴定を示す。
【図２６】ＮＡＤＨを測定することによるイソクエン酸デヒドロゲナーゼの検出を示す。Ａ）平均ＲＬＵ及びＢ）シグナル対バックグラウンド比。
【図２７】ＮＡＤＨを測定することによるデメチラーゼ検出の一般的なスキームを示す。
【図２８】Ｈ３Ｋ４を含む又は含まない種々の濃度のＬＳＤ１の、３０及び６０分での平均ＲＬＵを示す。
【図２９】ルシフェラーゼ反応及びジアホラーゼ反応の両方が同時に行われる条件下でのＮＡＤＨの滴定の結果を示す。
【図３０Ａ】ＮＡＤの滴定を示す。
【図３０Ｂ】ＮＡＤＰの滴定を示す。
【図３１】ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ特異的増幅酵素系を本明細書に記載される検出方法と組み合わせたときの、ジヌクレオチド検出における特異性を示す。
【図３２】細胞中に存在する還元されたジヌクレオチドＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの総量の測定を示す。
【図３３】細胞中に存在する総ジヌクレオチド、ａ）ＮＡＤ／ＮＡＤＨ及びｂ）ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの測定を示す。
【図３４】本明細書に記載される方法を使用してＮＡＤ生合成阻害の検出を示す。
【図３５】赤血球（ＲＢＣ）中の総ＮＡＤ／ＮＡＤＨを測定する能力を示す。
【図３６】ミトコンドリア毒素、ロテノン及びアンチマイシンが総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルに及ぼす影響を示す。
【図３７】光シグナルの増加を停止させ、そうすることにより後に光シグナルを読み取ることができるように、時間の経過とともに、又はメナジオンを使用してシグナルを監視する能力を示す。
【図３８】ＮＡＤＰＨの存在下で異なる濃度のＮＡＤＰを検出するためのアッセイの感度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、代謝的に活性な細胞の酸化還元状態を評価するための化合物及び方法、ならびに酸化還元を定義する補因子ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定を組み合わせることにより、酵素活性及び／又は代謝産物レベルを評価するための方法を提供する。
定義
【００１８】
本明細書で使用される場合、以下の用語及び表現は、示される意味を有する。本発明の化合物は、非対称的に置換され炭素原子を含有し、光学的に活性な形態又はラセミ形態に単離することができると理解されたい。どのように光学的に活性な形態を調製するか、例えば、ラセミ形態の分割、又は光学的に活性な出発物質からの合成等は、当該技術分野で周知である。全てのキラル形態、ジアステレオマー形態、ラセミ形態、及びある構造の全ての幾何異性体形態は、本発明の一部である。
【００１９】
ラジカル、置換基、及び範囲に関して以下に記載される特定の値は、例示を目的としているに過ぎず、それらは、他の定義された値、又はラジカル及び置換基に関して定義された範囲内の他の値を排除するものではない。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「置換された」は、「置換された」を用いた表現において示される基の１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５個、いくつかの実施形態において１、２、又は３個、及び他の実施形態において１又は２個）の水素が、示された基（複数可）から選択される基又は当業者に既知の好適な基で置き換えられていることを意味することが意図されるが、但し、示される原子の通常の原子価を超えず、置換によって安定な化合物がもたらされるものとする。好適な示される基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメチル、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、ホスフェート、硫酸、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミン、及びシアノを含む。更に、好適な示される基は、例えば、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ-、−ＮＲ2、−ＮＲ3、＝ＮＲ、−ＣＸ3、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ2、＝Ｎ2、−Ｎ3、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）2ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（式中、各Ｘは、独立して、ハロゲン（「ハロ」）：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基、又はプロドラッグ部分である）を含むことができる。当業者は容易に理解するように、置換基がオキソ（＝Ｏ）又はチオキソ（＝Ｓ）等である場合、置換された原子上の２つの水素原子が置き換えられる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、例えば、１〜３０個の炭素原子、及びしばしば１〜１２個、又は１〜約６個の炭素原子を有する、分岐、非分岐、又は環状の炭化水素を指す。その例は、限定されないが、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等を含む。アルキルは、非置換又は置換であり得る。またアルキルは、任意選択的に、部分不飽和又は完全不飽和であってもよい。そのため、アルキル基の列挙は、アルケニル基及びアルキニル基の両方を含む。上記で説明及び例示したように、アルキルは、一価の炭化水素ラジカルであってもよいか、又は二価の炭化水素ラジカル（すなわち、アルキレン）であってもよい。
【００２２】
用語「アルケニル」は、モノラジカルの分枝鎖又は非分枝鎖部分不飽和炭化水素鎖（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ2二重結合）を指す。一実施形態において、アルケニル基は、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する。その例は、限定されないが、エチレン、又はビニル、アリル、シクロペンテニル、５−ヘキセニル等を含む。アルケニルは、非置換又は置換であり得る。
【００２３】
用語「アルキニル」は、完全不飽和の箇所（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ三重結合）を有するモノラジカルの分枝鎖又は非分枝鎖炭化水素鎖を指す。一実施形態において、アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有することができる。この用語は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１−オクチニル等の基によって例示される。アルキニルは、非置換又は置換であり得る。
【００２４】
用語「シクロアルキル」は、単環式環もしくは複数の縮合環を有する３〜１０個の炭素原子、又は３〜７個の炭素原子、又は５〜６個の炭素原子の乾式アルキル基を指す。そのようなシクロアルキル基は、例として、単環構造、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等、又は多環構造、例えば、アダマンタニル等を含む。シクロアルキルは、非置換又は置換であり得る。シクロアルキル基は、一価又は二価であってもよく、アルキル基について前述したように、任意選択的に置換されてもよい。シクロアルキル基は、任意選択的に１つ以上の不飽和の部位を含むことができ、例えば、シクロアルキル基は、１つ以上の炭素−炭素二重結合、例えば、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン等を含むことができる。
【００２５】
用語「アルコキシ」は、基アルキル−Ｏ−（アルキルは、本明細書に定義される通りである）を指す。一実施形態において、アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキサオキシ、１，２−ジメチルブトキシ等を含む。アルコキシは、非置換又は置換であり得る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「アリール」又は「Ａｒ」は、親芳香環系の単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、親環系の飽和又は不飽和の炭素原子であり得る。アリール基は、６〜３０個の炭素原子、又は６〜２０個の炭素原子、又は６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有することができる。アリール基は、単一の環（例えば、フェニル）又は複数の凝縮（縮合）環を有することができ、少なくとも１つの環は芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、又はアントリル）である。典型的なアリール基は、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等から誘導されるラジカルを含む。アリールは、アルキル基について前述したように、非置換であり得るか、又は任意選択的に置換であり得る。
【００２７】
用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指す。同様に、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。
【００２８】
用語「ハロアルキル」は、同じか又は異なり得る本明細書に定義されるような１つ以上のハロ基によって置換された、本明細書に定義されるようなアルキルを指す。一実施形態において、ハロアルキルは、１、２、３、４、又は５個のハロ基で置換されていてもよい。別の実施形態において、ハロアルキルは、１、２、又は３個のハロ基で置換されていてもよい。ハロアルキルという用語は、ペルフルオロ−アルキル基も含む。代表的なハロアルキル基は、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル、１Ｈ，１Ｈ−ペルフルオロオクチル等を含む。ハロアルキルは、アルキル基について前述したように、任意選択的に置換されてもよい。
【００２９】
用語「ヘテロアリール」は、１つ、２つ、又は３つの芳香環を含有し、芳香環中に少なくとも１つの窒素、酸素、又は硫黄原子を含有し、非置換であり得るか、又は「置換された」の定義において前述したように、例えば、１つ以上の、具体的には１つ〜３つの置換基で置換されていてもよい、単環式、二環式、又は三環式の環系として定義される。典型的なヘテロアリール基は、１つ以上のヘテロ原子に加えて２〜２０個の炭素原子、又は１つ以上のヘテロ原子に加えて５〜１５個の炭素原子、又は１つ以上のヘテロ原子に加えて４〜１０個の炭素原子を含有する。典型的なヘテロアリール基は、６〜３０個の環原子、又は６〜２０個の環原子、又は６〜１２個の環原子、又は６〜１０個の環原子を含有する。好適には、ヘテロアリールは、４個までのヘテロ原子、又は３個のヘテロ原子、又は２個のヘテロ原子を含有する。
【００３０】
ヘテロアリール基の例は、限定されないが、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾイル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、及びキサンテニルを含む。
【００３１】
一実施形態において、用語「ヘテロアリール」は、炭素、ならびに非ペルオキシド酸素、硫黄、及びＮ（Ｚ）（Ｚは、存在しないか、又はＨ、Ｏ、アルキル、アリール、もしくは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアリールである）から独立して選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含有する５個又は６個の環原子を含有する単環式芳香環を意味する。別の実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロアリールから誘導される約８〜１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環、特に、ベンゾ誘導体、又は、プロピレン、トリメチレン、もしくはテトラメチレンジラジカルをヘテロアリールに縮合させることにより誘導される誘導体を意味する。
【００３２】
用語「複素環」は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、任意選択的に、「置換された」という用語の下に本明細書に定義されるような１つ以上の基で置換された、飽和又は部分不飽和の環系を指す。複素環は、１つ以上のヘテロ原子を含有する単環式基、二環式基、又は三環式の基であってもよい。複素環基はまた、環に結合したオキソ基（＝Ｏ）又はチオキソ（＝Ｓ）基を含有してもよい。複素環基の非限定的な例は、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピぺリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、及びチオモルホリンを含む。
【００３３】
用語「複素環」は、限定ではなく例として、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７、及び９章；Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０から現在まで）、具体的には第１３、１４、１６、１９、及び２８巻、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２，５５６６に記載される複素環のモノラジカルを含むことができる。典型的なヘテロアリール基は、１つ以上のヘテロ原子に加えて２〜２０個の炭素原子、又は１つ以上のヘテロ原子に加えて５〜１５個の炭素原子、又は１つ以上のヘテロ原子に加えて４〜１０個の炭素原子を含有する。典型的なヘテロアリール基は、６〜３０個の環原子、又は６〜２０個の環原子、又は６〜１２個の環原子、又は６〜１０個の環原子を含有する。好適には、複素環は、４個までのヘテロ原子を含有する。一実施形態において、「複素環」は、本明細書に記載されるような「炭素環」を含み、１つ以上（例えば、１、２、３、又は４個）の炭素原子は、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、又はＳ）で置き換えられている。
【００３４】
複素環の例は、限定ではなく例として、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサンテニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾイル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、オキサインドリル、ベンゾオキサゾリニル、イサチノイル、及びビス−テトラヒドロフラニルを含む。
【００３５】
限定ではなく例として、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５、もしくは６位、ピリダジンの３、４、５、もしくは６位、ピリミジンの２、４、５、もしくは６位、ピラジンの２、３、５、もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、もしくはテトラヒドロピロールの２、３、４、もしくは５位、オキサゾール、イミダゾール、もしくはチアゾールの２、４、もしくは５位、イソオキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの３、４、もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３、もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、もしくは８位、又はイソキノリンの１、３、４、５、６、７、もしくは８位で結合する。炭素結合複素環は、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル等を含む。
【００３６】
限定ではなく例として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピぺリジン、ピぺラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドール又はイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾール又はβ−カルボリンの９位に結合することができる。一実施形態において、窒素結合複素環は、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、及び１−ピペリジニルを含む。
【００３７】
用語「炭素環」は、単環として３〜８個の炭素原子、二環として７〜１２個の炭素原子、及び多環として約３０個までの炭素原子を有する、飽和、不飽和、又は芳香族環を指す。単環式炭素環は、典型的には３〜６個の環原子、より典型的には５〜６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系として配置された７〜１２個の環原子、又はビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配置された９〜１０個の環原子を有する。炭素環の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、フェニル、スピリル、及びナフチルを含む。炭素環は、アルキル基について前述したように、任意選択的に置換されてもよい。
【００３８】
用語「アルカノイル」又は「アルキルカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、以前に定義した通りのアルキル基である）を指す。
【００３９】
用語「アシルオキシ」又は「アルキルカルボキシ」は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、以前に定義した通りのアルキル基である）を指す。アシルオキシ基の例は、限定されないが、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、及びペンタノイルオキシを含む。上記に定義されるような任意のアルキル基が、アシルオキシ基を形成するために使用されてもよい。
【００４０】
用語「アルコキシカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（又は「ＣＯＯＲ」）（式中、Ｒは、以前に定義した通りのアルキル基である）を指す。
【００４１】
用語「アミノ」は、−ＮＨ2を指す。アミノ基は、用語「置換された」について本明細書に定義されるように、任意選択的に置換されてもよい。
【００４２】
用語「アルキルアミノ」は、−ＮＲ2（式中、少なくとも１つのＲはアルキルであり、第２のＲはアルキル又は水素である）を指す。
【００４３】
用語「アシルアミノ」は、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、各Ｒは、独立して、ハロゲン、アルキル、又はアリールである。
【００４４】
用語「中断される」は、用語「中断される」を用いた表現において言及される特定の炭素鎖の２つの隣接する炭素原子の間（及び、それらが結合する水素原子の間（例えば、メチル（ＣＨ3）、メチレン（ＣＨ2）、又はメチン（ＣＨ）））に別の基が挿入されることを示すが、但し、示される原子の各通常の原子価を超えず、中断によって安定な化合物がもたらされるものとする。炭素鎖を中断することができる好適な基は、例えば、１つ以上の、非ペルオキシドオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ2Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシラト（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）、及びスルホニル（ＳＯ2）を含む。アルキル基は、前述の好適な基のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、又は約６つ）によって中断されてもよい。中断部位はまた、アルキル基の炭素原子と、アルキル基が結合している炭素原子との間であってもよい。
【００４５】
用語「ルシフェラーゼ」は、別途指定のない限り、天然に存在する、組み換えられた、又は突然変異させたルシフェラーゼを指す。天然に存在する場合、ルシフェラーゼは、当業者によって生物から容易に取得され得る。ルシフェラーゼが、天然に存在するルシフェラーゼである場合、又は組み換えもしくは変異ルシフェラーゼ（例えば、天然に存在するルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性を保持するルシフェラーゼ）である場合、ルシフェラーゼをコードする核酸を発現するように形質転換させた細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の培養物から容易に得ることができる。更に、組み換え又は変異ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコードする核酸を使用する生体外の無細胞系から容易に取得することができる。ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「生物発光」又は「発光」は、酵素と光を発生する基質との間の反応の結果として生成される光である。そのような酵素（生物発光酵素）の例は、ホタルルシフェラーゼ、例えば、フォティナス・フィラリス又はフォティナス・ペンシルバニカ、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、発光エビルシフェラーゼ、例えば、トゲオキヒオドシエビ、イクオリン発光タンパク質、オベリン発光タンパク質等を含む。
【００４７】
「生物発光レポーター部分」は、ルシフェラーゼの基質である部分を指す。例えば、生物発光レポーター部分は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、セレンテラジン、又はセレンテラジン誘導体であってもよい。
【００４８】
「ルシフェラーゼ反応混合物」は、ルシフェラーゼ酵素と、ルシフェラーゼ酵素が光信号を発生することを可能にする材料とを含有する。必要な材料、ならびに発光シグナルを発生させるために必要な材料の具体的な濃度及び／又は量は、使用されるルシフェラーゼ酵素、及び実行されるルシフェラーゼベースのアッセイに依存して異なる。一般に、ホタルルシフェラーゼの場合、これらの材料は、ＡＴＰ、マグネシウム（Ｍｇ2+）塩、例えば、硫酸マグネシウム、及びホタルルシフェラーゼ酵素、例えば、熱安定性のホタルルシフェラーゼが含まれる。反応を適切なｐＨに維持するための緩衝液、ルシフェラーゼ活性を維持するのに役立つＰＲＩＯＮＥＸ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の添加剤、還元剤、界面活性剤（例えば、細胞溶解のため）、エステラーゼ、塩、アミノ酸、例えば、Ｄ−システイン等を含む他の材料が溶液に加えられることが多い。例示的なルシフェラーゼ反応混合物は、熱安定性のホタルルシフェラーゼ、ＭｇＳＯ4、ＡＴＰ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−９、及びＴｒｉｃｉｎｅを含有するであろう。代替的な例示的ルシフェラーゼ反応混合物は、発光エビルシフェラーゼ、例えば、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ又はＴｒｉｓベース）、及び任意選択的にバックグラウンド低減剤、例えば、ＴＣＥＰを含有するであろう。
【００４９】
用語「ジアホラーゼ」は、天然に存在する、組み換えられた、又は突然変異させたジアホラーゼを指す。これらは、クロストリジウム・クライベリ由来等の細菌のジアホラーゼであってもよいか、又はヒト及びラット由来等の動物起源であってもよい。ジアホラーゼは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ及びＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手可能である。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「増幅酵素系」は、ジヌクレオチド、例えば、ＮＡＤ又はＮＡＤＰのサイクリング又は増幅に関与する酵素系を指す。増幅酵素系は、増幅酵素及び該酵素の基質を含有する。例えば、ＮＡＤは、増幅酵素の基質、例えば、エタノールの存在下で、デヒドロゲナーゼ増幅酵素、例えば、アルコールヒドロゲナーゼによってＮＡＤＨにサイクリング又は増幅され得る。増幅酵素の例は、アルコールヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、及びグルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）デヒドロゲナーゼを含む。
化合物
【００５１】
本発明は、式（Ｉ）
【化１】
2014526443.tif 000002
（Ｉ）
による化合物であって、
式中、Ａは、生物発光レポーター部分であり、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、Ｃ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである、化合物を提供する。
【００５２】
本発明はまた、式（ＩＩ）
【化２】
2014526443.tif 000003
（ＩＩ）
による化合物であって、
式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ3-7環式環、アリール、ベンジル、又は置換ベンジル環、複素環、ヘテロアリール、及び（ＣＨ2）n’−Ｐ（Ｐｈ）3であり、
Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、メチル、及びトリフルオロメチルから独立して選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
ｎ’は、２〜７の整数である、化合物も提供する。
【００５３】
本発明はまた、式（ＩＩＩ）
【化３】
2014526443.tif 000004
（ＩＩＩ）
による化合物であって、
式中、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、メチル、及びトリフルオロメチルから独立して選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである、化合物も提供する。
【００５４】
本発明はまた、式（ＩＶ）
【化４】
2014526443.tif 000005
（ＩＶ）
による化合物であって、
式中、Ｒ2は、ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ5は、−ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ7は、アリール又はヘテロアリールから選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである、化合物も提供する。
【００５５】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）による好適な化合物は、図１３Ａに示すものを含む。
化合物の合成
【００５６】
本明細書に記載される化合物は、様々な方法を使用して合成することができる。以下に、例示的な合成を一般的に述べる。
【００５７】
典型的なキノンベンジルリンカールシフェリン又はフルオロフォア化合物の場合、標準的な結合方法により、キノンプロピオン酸をアミノベンジルアルコール誘導体に結合させた。得られた生成物キノンベンジルアルコールを臭化ベンジルに変換した。臭化ベンジルをフェノール型フルオロフォアに直接結合させて最終化合物を得るか、又は２−シアノ−６−ヒドロキシルベンゾチアゾールに結合させ、Ｄ−システインと反応させてキノンベンジルリンカールシフェリン化合物（スキーム１）を得た。キノンベンジルリンカールシフェリン及びフルオロフォア化合物の典型的な合成方法をスキーム１に示す。
【化５】
2014526443.tif 000006
スキーム１
【００５８】
典型的なジアミンリンカールシフェリン又はフルオロフォア化合物の場合、標準的な結合方法により、キノンプロピオン酸を好適なＢｏｃ保護ジアミンリンカーに結合した。保護基を除去した後、次いで、過剰なホスゲンと反応させることにより、得られたキノン−アミンＴＦＡ塩を塩化カルボニルに変換した。塩化カルボニルをフェノール型フルオロフォア又はセレンテラジンに直接結合させて、最終化合物キノン−ジアミン−フルオロフォアもしくはキノン−ジアミン−セレンテラジンを得るか、又は２−シアノ−６−ヒドロキシルベンゾチアゾールに結合させ、Ｄ−システインと反応させてキノンジアミンルシフェリン化合物（スキーム２）を得た。キノンジアミンリンカールシフェリン、セレンテラジン、及びフルオロフォア化合物の典型的な合成方法をスキーム２に示す。
【化６】
2014526443.tif 000007
スキーム２
【００５９】
当業者は認識し得るように、本明細書に記載される式の化合物を合成する代替方法は当業者には明白であろう。更に、所望の化合物を得るために、種々の合成ステップが代替のシーケンス又は順序で行われてもよい。本明細書に記載される化合物を合成する際に有用な合成化学変換ならびに保護基方法論（保護及び脱保護）は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）、Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）、及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、ならびにこれらの続版に記載されるもの等を含む。
使用方法
代謝的に活性な細胞の酸化還元状態を測定するための方法
【００６０】
別の態様において、本発明は、代謝的に活性な細胞試料の酸化還元状態を分析するための種々の方法を提供する。一実施形態において、細胞（複数可）、培養液試料、生理液、例えば、血漿、血清、尿等、又はミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体、あるいは酵素（複数可）が、第１の混合物を形成するために本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合物と接触させられる。第１の混合物の少なくとも一部が、ルシフェラーゼ反応混合物と接触させられる。生物発光が検出される。生成された生物発光の量は、酸化還元状態に正比例する。特定の実施形態において、Ｄ−システインが混合物に加えられる。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、細胞（複数可）、培養液試料、生理液、例えば、血漿、血清、尿等、又はミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体（複数可）、あるいは酵素（複数可）が、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合物と接触させられ、ルシフェラーゼ反応混合物が、該接触させた細胞（複数可）、培養液試料、生理液、例えば、血漿、血清、尿等、又はミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体（複数可）、あるいは酵素（複数可）に加えられ、生物発光が検出される。生成された生物発光の量は、酸化還元状態に正比例する。特定の実施形態において、Ｄ−システインも該接触させた試料に加えられる。
【００６２】
さらなる実施形態において、細胞（複数可）、培養液試料、生理液、例えば、血漿、血清、尿等、又はミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体（複数可）、あるいは酵素（複数可）が、式（Ｖ）による化合物と接触させられ、蛍光が検出される。蛍光は、酸化還元状態を示唆する。生細胞のみが本発明の化合物を還元することができ、その結果として、代謝的に活性な細胞の存在下で非蛍光化合物が蛍光化合物に変換される。
【００６３】
本発明の方法はまた、細胞生存率及び細胞毒性を測定するためにも使用され得る。当業者は認識するように、細胞が損傷を受けると、代謝的に活性な状態は必然的に失われる。
【００６４】
更に、本発明の方法は、無傷細胞及び単離された細胞小器官におけるミトコンドリアの酸化還元活性を測定するために使用されてもよい。本発明の方法は、ミトコンドリアタンパク質複合体の酸化還元活性を測定するため、ならびに細胞の酸化還元状態及び／又は細胞生存率に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするために使用されてもよい。
ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレベル及び比率を測定するための方法
【００６５】
本発明は、ジアホラーゼを使用して、還元された補酵素型、すなわち、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを測定するための方法を提供する。一実施形態において、細胞溶解物又は精製された酵素調製物が、ジアホラーゼ及び式（Ｉ）〜（Ｖ）による本明細書に記載される化合物と接触させられる。還元された補酵素型は、ジアホラーゼによって酸化され、同じ酵素反応において生物発光性又は蛍光性キノンが酸化され、生物発光検出又は蛍光検出に好適な生成物を産生する。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量は、ルシフェラーゼ反応によって生成される光又は蛍光生成物によって生成される光をモニタリングすることによって、定量的に測定することができる。
【００６６】
本発明の方法はまた、還元された補酵素型ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを、細胞溶解物又は精製された酵素調製物中で直接測定するためにも使用され得る。還元された補酵素の量は、還元型を事前に抽出する必要なく、細胞溶解物中で直接測定することができる。
【００６７】
更に、本発明の方法は、細胞溶解物又は精製された酵素調製物中に存在する全ての還元及び酸化された補酵素型の存在又は量を測定するために使用されてもよい。存在する全ての酸化型及び還元型、すなわち、ＮＡＤＰ（Ｈ）及びＮＡＤ（Ｈ）は、該型を事前に抽出する必要なく、ジアホラーゼ及び式（Ｉ）〜（Ｖ）による化合物の存在下で、デヒドロゲナーゼ、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）又はグルコース−６−リンデヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ−ＤＨ）を用いて増幅される。いずれのデヒドロゲナーゼ酵素、例えば、アルコールヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を含む他の増幅酵素が使用されてもよい。
【００６８】
本発明の方法はまた、還元された補酵素型と酸化された補酵素型との比率を測定するためにも使用され得る。この方法において、酸化型及び還元型は差次的に抽出される：例えば、酸性溶液中で酸化され、塩基性溶液中で熱を用いて還元される。次いで、各抽出試料、すなわち、還元型を含有する試料及び還元型を含有する試料に増幅酵素が加えられる。次いで、各抽出試料にジアホラーゼ及び本発明の化合物が加えられる。次いで、化合物の変換が検出される。
【００６９】
更に、本発明の方法は、単一の反応容器中の均一試料中の酸化された補酵素及び還元された補酵素を検出するために使用されてもよい。本発明の方法は、遠心により細胞残屑を沈降させ、上清を除去してそれを中和させ、次いで、酵素サイクリング手法を用いてヌクレオチドの量を測定することにより、抽出及び抽出された材料の分離を必要としない。
【００７０】
更に、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料中のＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ補酵素を測定するために必要な操作を１つのステップまで削減する。そのような方法において、サイクリング酵素系、ジアホラーゼ反応、及びルシフェリン／ルシフェラーゼ検出反応に必要な全ての構成要素が、試料に接触する前に合わせられる。
【００７１】
更に、本発明の方法は、還元型の酸化型への変換を測定するために使用することができる。本明細書に記載される方法を使用して、還元型が選択的に排除され、酸化型が検出される。
酵素活性を測定するための方法
【００７２】
ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、及びＮＡＤＰＨは、多くの酵素、例えば、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤを利用する酵素）及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼによって利用及び／又は生成されるため、上記検出方法は、これらの酵素の存在及び活性を評価するために使用することができる。これらの酵素は、精製された酵素、タンパク質複合体中に存在する酵素、単離された細胞小器官中に存在する酵素、又は細胞溶解物中に存在する酵素であり得る。一実施形態において、精製された酵素調製物は、必要に応じて、その基質及びＮＡＤ又はＮＡＤ（Ｐ）と反応させられる。反応物は、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させられる。次いで、生物発光が検出される。生物発光は、試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在を示唆し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成、ひいては酵素の存在及び／又は活性を意味する。
【００７３】
それ自体はＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用又は生成しない酵素も、該酵素の基質又は生成物がそれらを使用又は生成する酵素によって利用され得る場合、検出及び測定することができる。一実施形態において、対象となる酵素は、生成物（複数可）を生成するためにその基質（複数可）と反応させられる。これらの生成物のうちの１つは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成することができる別の酵素によって利用され得る。反応物は、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させられる。次いで、生物発光が検出される。生物発光は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在を示唆し、それは対象となる酵素の存在及び／又は活性を意味する。式（Ｖ）の化合物も使用され得、蛍光が検出される。
細胞代謝産物を測定するための方法
【００７４】
本発明はまた、細胞代謝産物を測定するための方法も提供する。一実施形態において、細胞溶解物、又は対象となる代謝産物を含有する他の試料は、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（Ｖ）による化合物、ジアホラーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）、及びデヒドロゲナーゼ酵素、例えば、ＬＤＨ、ＡＤＨ、Ｇ６Ｐ−ＤＨと接触させられる。化合物が式（Ｉ）〜（ＩＶ）によるものである場合、ルシフェラーゼ検出試薬が加えられ、発光が検出される。化合物が式（Ｖ）によるものである場合、蛍光が検出される。発光又は蛍光は、対象となる細胞代謝産物の存在を意味する。いくつかの実施形態において、特に、ホタルルシフェラーゼを使用する実施形態において、ジアホラーゼ阻害剤が検出される。いくつかの場合、ホタルルシフェラーゼ又は他の生物発光検出法を使用する場合であっても、ジアホラーゼ阻害剤は必要ではない。例えば、補酵素のリアルタイムでの利用から判断した場合、ジアホラーゼ阻害剤は必要ではない。
【００７５】
分析物はデヒドロゲナーゼの基質でなければならないため、デヒドロゲナーゼの選択は検出される分析物に依存する。デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子として用いて分析物の生成物への変換を触媒し、それをＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する。生成されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、式（Ｉ）〜（Ｖ）による化合物の存在下でジアホラーゼによって利用される。
【００７６】
本発明の方法はまた、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成物を結合させることによって検出することができる分析物を測定するためにも使用され得る。更に、本発明の方法は、細胞の酸化還元状態のバランスを反映する主要な代謝産物、例えば、乳酸、ピルビン酸、βヒドロキシ酪酸メチル、アセト酢酸を測定するために使用されてもよい。
【００７７】
本発明の方法はまた、乳酸の生成における変化を測定することにより、細胞の解糖速度を測定するためにも使用され得る。また、本発明の方法は、酸化的リン酸化の速度を測定するためにも使用され得る。
【００７８】
更に、本発明の方法は、他の細胞小器官における遊離ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を測定するために、細胞又はそれらの細胞小器官に特異的な分析物における遊離ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の読み取り値として、乳酸／ピルビン酸比を測定するために使用されてもよい。本発明の方法はまた、グルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）の形成を追跡することにより、グルコースの取り込みを測定するためにも使用され得る。
一般的な情報
【００７９】
これらの実施形態のいずれにおいても、試薬は、経時的に又は同時に加えられ得る。試薬が同時に加えられる場合、それらは単一の溶液又は複数の溶液中に存在し得る。いくつかの実施形態において、増幅酵素、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ検出試薬が、単一の試薬組成物として提供される。いくつかの実施形態において、増幅酵素、本明細書に記載される化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ検出試薬が、単一の試薬組成物として提供される。
【００８０】
シグナルは、必要に応じて定量化されてもよい。シグナルは、標準曲線と比較されてもよい。シグナルの強度は、試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の関数である。生成されたシグナルは、対照と比較されてもよい。好適な対照は、化合物とジアホラーゼとの間の反応又はルシフェラーゼ反応のいずれかに必要な構成要素又は条件のうちの１つ以上が欠落している。そのような構成要素又は条件は、限定されないが、補因子、酵素、温度、及び阻害剤を含む。
【００８１】
本発明の方法は、培養培地中、すなわち生体外、又は動物、例えば、生きた動物の中の細胞、すなわち生体内での細胞増殖に有用である。研究目的で、生体内の細胞における測定のために、式（Ｉ）〜（Ｖ）による本明細書に記載される化合物が投与される：例えば、動物に注射されるか、又は動物によって摂取される水溶液、例えば水、もしくは食餌に加えられる。化合物が式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物である場合、ルシフェラーゼは、動物の中の細胞に発現され得、例えば、トランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、及びマーモセット科のサル）の動物全体画像に表示され得るか、又は動物に投与され得、例えば、動物に注射され得る。本発明の方法は、無傷細胞又は単離された細胞小器官において使用されてもよい。
【００８２】
細胞は、真核細胞、例えば、酵母、トリ、植物、昆虫、又は哺乳類細胞（限定されないが、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、もしくはブタ細胞を含む）、あるいは原核細胞、あるいは２つ以上の異なる生物に由来する細胞、あるいはこれらの細胞溶解物又は上清であってもよい。細胞は、組み換え技術によって遺伝子改変されてもよい。特定の態様において、細胞は、動物、例えば、トランスジェニック動物、又は生理液、例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌等に存在してもよい。培地から試料採取することができるので、細胞の破砕は必要ではない。
【００８３】
本発明の方法はまた、生理液、例えば、血液、血漿、尿等、組織試料、又はＤＮＡ調製物も使用することができる。
【００８４】
更に、本明細書に記載されるアッセイのいずれに関しても、限定されないが、ルシフェラーゼの不活性化を阻害もしくは防止するか、又は別様にシグナルを延長もしくは増強するものを含む、他の試薬が反応混合物に加えられ得る。
【００８５】
好適な基質は、限定されないが、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物を含む。更に、細胞ベースのアッセイには、本明細書に記載される式（Ｖ）の化合物が好適である。
【００８６】
好適な基質は、限定されないが、本明細書に記載される式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物を含む。更に、細胞ベースのアッセイには、式（Ｖ）
【化７】
2014526443.tif 000008
（Ｖ）
の化合物であって、
式中、Ａは、限定されないが、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、ロドール誘導体、レゾルフィン、又はクレシルバイオレットを含む蛍光レポーター部分であり、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−（Ｃ6Ｈ4）ＣＨ2−、又は（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数である、化合物も好適である。
【００８７】
式（Ｖ）による好適な化合物を図１３Ｂに示す。
【００８８】
特定の基質は、本発明の種々の実施形態において使用するのに特に有利であり得る。例えば、ある基質は、生体外で使用するのにより好適であり得、他の基質は、生体内で使用するのにより好適であり得る。当業者には理解されるであろうが、全てのホウ酸が本発明の方法において使用するのに好適であるわけではない。
【００８９】
以下の非限定的な実施例によって、本発明を更に説明する。
実施例
実施例１．ＰＢＩ１４８２の合成
【化８】
2014526443.tif 000009
【００９０】
６−ヒドロキシ−４，４，５，７，８−ペンタメチルクロマン−２−オン
メタンスルホン酸５０ｍｌ中の２，３，５−トリメチルヒドロキノン（１０ｇ、０．０６５７ｍｏｌ）及びメチル１，１−ジメチルアクリレート（７．５ｇ、０．０６５７）の混合物を７０℃まで２時間加熱した。室温まで冷却してから、混合物を１００ｍｌの氷冷水に注ぎ入れた。得られた混合物を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。大半の酢酸エチルを除去した後、混合物を−２０℃に冷却した。濾過により淡白色の固体を収集し、冷酢酸エチルで洗浄し、真空オーブンで乾燥させた。収率は７５％であった。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δｐｐｍ：４．６９（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．５９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．５３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．５７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：２３５（Ｍ+）。
【００９１】
３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタン酸
アセトニトリル（６００ｍｌ）、アセトン（５０ｍｌ）、及び水（３００ｍｌ）の混合物中の６−ヒドロキシ−４，４，５，７，８−ペンタメチルクロマン−２−オン（１５ｇ、０．０６４ｍｏｌ）の溶液に、ＮＢＳ（１１．４ｇ、０．０６４ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３０分撹拌した。ほとんどの有機溶媒を除去した後、濾過により黄色固体を収集し、水で洗浄し、真空乾燥して９６％の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ３．０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４４（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１（Ｍ+）。
【００９２】
Ｎ−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド
１０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタン酸（０．７２ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸イソブチル（０．４４ｇ、３．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（０．３４ｍｌ）を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で３０分撹拌し、６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（０．３６ｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するフラッシュシリカカラムを用いて化合物を直接精製し、１０％の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．５７（ｄ，Ｊ＝２．０，２Ｈ），８．０６（ｄ，Ｊ＝９．０，２Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．９，１Ｈ），３．０８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．２２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．５０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：４０８（Ｍ+）。
【００９３】
キノン−トリメチルロック−アミノルシフェリン（ＰＢＩ１４８２）
ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中のＮ−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド（０．０５ｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）の溶液に、水３ｍｌ中のＤ−システイン（０．４５ｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．０７０ｍｌ）を加えた。混合物を１０分撹拌し、酢酸を用いてｐＨをｐＨ６に調整した。ＣＨ2Ｃｌ2を除去した後、溶出剤として０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を精製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ）δ８．６７（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），８．３８（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．９，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．９，１Ｈ），５．３７（ｔ，Ｊ＝９．２，１Ｈ），３．７４（ｄ，Ｊ＝９．２，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．０８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．１２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９４（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３），１．４８（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：５１２．３（Ｍ+）；ＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９７％。
実施例２．ＰＢＩ  ４２００の合成
【化９】
2014526443.tif 000010
【００９４】
Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド
２０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタン酸（１．７５ｇ、７．４６ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸イソブチル（１．１１ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（０．８２ｍｌ）を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で３０分撹拌し、４−アミノベンジルアルコール（１．３８ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を一晩撹拌した。濾過により固体を除去した後、溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、７４％の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．４０（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ），７．１９（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），４．６１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ），２．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９７（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３），１．５５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：３５６（Ｍ+）。
【００９５】
Ｎ−（４−（ブロモメチル）フェニル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド
塩化メチレン（３０ｍｌ）中のＮ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド（１．３５ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（３．９６ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｈ3Ｐ（１．３０ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、３１％の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．４１（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），７．２５（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），４．５０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｂｒ），３．００（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９５（ｄ，６Ｈ，ＣＨ３），１．４８（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：４１８，４２０（１：１，Ｍ+）。
【００９６】
Ｎ−（４−（（（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）オキシ）メチル）フェニル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド
１５ｍｌの乾燥ＴＨＦ中のＮ−（４−（ブロモメチル）フェニル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド（０．２３ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、６−ヒドロキシ−２−シアノベンゾチアゾール（０．１５ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、２，４，６−コリジン（０．１２５ｍｌ）、及びＡｇ2ＣＯ3（０．２４ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で一晩撹拌した。濾過により固体を除去した後、溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、４０％の収率を得た。ＨＰＬＣにより生成物を更に精製し、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールの小さい汚染物質を除去した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．４−７．５（ｍ，３Ｈ），７．３５−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｄｄ，１Ｈ），７．２５（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），７．１８（ｄｄ，１Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ），２．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３），１．４７（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）．ＭＳ（ｍ／ｅ）：５１４．２（Ｍ+）
【００９７】
キノントリメチルロックベンジルルシフェリン（ＰＢＩ４２００）
１０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ中のＮ−（４−（（（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）オキシ）メチル）フェニル）−３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド（０．０５２ｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）の溶液に、水３ｍｌ中のＤ−システイン（０．０３５４ｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．０４１ｇ、０．０４０５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分撹拌し、次いで、酢酸を用いてｐＨ６に酸性化した。溶出剤として０．１％ギ酸及びアセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を精製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．９９（ｄ，Ｊ＝８．９，１Ｈ），７．５４−７．２８（ｍ，６Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），５．４１（ｔ，Ｊ＝９．４，１Ｈ，ＣＨ），５．０７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ），３．７８（ｄ，Ｊ＝９．６，２Ｈ，ＣＨ２Ｓ），３．０１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．１４（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｓ，６Ｈ），１．４８（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６１８．３（Ｍ+）；ＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９８．３％。
実施例３．ＰＢＩ  ４２６７の合成
【化１０】
2014526443.tif 000011
【００９８】
ＰＢＩ  ４２００の合成（実施例２）と同様の手順を用いることにより、ＰＢＩ  ４２６７を調製した。
【００９９】
キノン−トリメチルロック−Ｎ−メチル−ベンジルアルコール    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．４４（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ），３．１３（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．７２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．２９（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：３７０．１（Ｍ+）。
【０１００】
キノン−トリメチルロック−Ｎ−メチル−臭化ベンジル    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．４８（ｄ，Ｊ＝８．２，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．３，２Ｈ），４．５６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｂｒ），３．１４（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．７４（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９８（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：４３２．１，４３４（１：１，Ｍ+）。
【０１０１】
キノン−トリメチルロック−Ｎ−メチル−ベンジル−２−シアノベンゾチアゾール    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１４（ｄ，Ｊ＝９．５，１Ｈ），７．６２−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．７，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝９．５，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ，−ＯＣＨ２），３．１５（ｓ，３Ｈ，−ＮＣＨ３），２．７５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３１（ｓ，ｂｒ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：５２８（Ｍ+）。
【０１０２】
キノントリメチルロックＮ−メチルベンジルルシフェリン（ＰＢＩ４２６７）    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．０５（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．６４−７．４５（ｍ，３Ｈ），７．２７（ｄ，ｂｒ，３Ｈ），５．４４（ｔ，Ｊ＝９．４，１Ｈ，ＣＨ），５．２０（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．７，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．１６（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．７６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３１（ｓ，ｂｒ，６Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：６３２．４（Ｍ+）；ＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９８．８％。
実施例４．ＰＢＩ  ４２９６の合成
【化１１】
2014526443.tif 000012
【０１０３】
Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド
５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタン酸（２．０ｇ、７．９９ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸イソブチル（１．２ｇ、８．７９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（０．８８ｍｌ）を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で３０分撹拌し、３−Ｎ−メチルプロパノール（０．８５ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、１００％の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ３．２−３．６（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２＋ＣＨ２Ｏ），２．８−３．１（ｍ，５Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．９３（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３），１．５−１．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．４２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ｍ／ｅ）：３２２．１。
【０１０４】
２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル（３−（Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド）プロピル）カーボネート
２０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中のＮ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド（１．０ｇ、３．１１ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（０．３４ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（０．２５ｇ、３．１１ｍｍｏｌ）を０℃で加え、得られた混合物を室温で３０分撹拌した。真空下で溶媒を除去した後、残渣を乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し、ＴＨＦ１０ｍｌ中の２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．５５ｇ、３．１１ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４３３ｍｌ）を０℃で加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、３８％の収率を得た。化合物は、トリメチル基の立体効果によって引き起こされる非自由回転に起因して、２つの回転異性体（７：３）として存在するかもしれない。回転異性体１（大）：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．２１（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝２．３，１Ｈ），７．５０（ｄｄ，Ｊ＝９．０，Ｊ＝２．５，１Ｈ），４．２１（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．４１（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＮＣＨ２），２．９−３．１（ｍ，５Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．８−２．０（ｍ，８Ｈ，２ＣＨ３＋ＣＨ２），１．４２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。回転異性体２（小）：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．２５（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝２．３，１Ｈ），７．５３（ｄｄ，Ｊ＝９．０，Ｊ＝２．５，１Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．４７（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＮＣＨ２），２．９−３．１（ｍ，５Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．８−２．０（ｍ，８Ｈ，２ＣＨ３＋ＣＨ２），１．４２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：５２４（Ｍ+）。
【０１０５】
キノントリメチルロック−Ｃ３−カーボネートルシフェリン（ＰＢＩ  ４２９６）
１０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ中の２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル（３−（Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド）プロピル）カーボネート（０．２３ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）に、水５ｍｌ中のＤ−システイン（０．１１５ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．１３３ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分撹拌し、次いで、酢酸を用いてｐＨ６に酸性化した。溶出剤として０．１％のギ酸及びアセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を精製した。化合物は、２つの回転異性体（７：３）として存在するかもしれない。回転異性体１（大）：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１２（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝３．０，１Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝９．０，Ｊ＝３．０，１Ｈ），５．４６（ｔ，Ｊ＝９，１Ｈ，ＣＨ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．８４（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．４２（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＮＣＨ２），２．９−３．１（ｍ，５Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．８−２．０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３），１．４３（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。回転異性体２（小）：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１５（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝２．３，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝９．０，Ｊ＝２．５，１Ｈ），５．４６（ｔ，Ｊ＝９，１Ｈ，ＣＨ），４．３６（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．８４（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．４７（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＮＣＨ２），２．９−３．１（ｍ，５Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．８−２．０（ｍ，８Ｈ，２ＣＨ３＋ＣＨ２），１．４３（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６２８．２（Ｍ+），６５０．１（ＭＮａ＋）；ＨＰＬＣ純度：２９５ｎｍで９９．５％（２つの回転異性体を分離することはできない）。
実施例５．ＰＢＩ  ４３０８の合成
【化１２】
2014526443.tif 000013
【０１０６】
キノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミン−Ｂｏｃ
３０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタン酸（１．５ｇ、５．９９ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸イソブチル（０．９０ｇ、６．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（０．６７ｇ、６．５９ｍｍｏｌ）を０℃で加え得た。得られた混合物を０℃で３０分撹拌し、モノＢＯＣ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルプロパンジアミン（１．４５ｇ、７．１９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、９１％の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ３−３．３（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．９５（ｍ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．８０（ｍ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），１．８−２．０（ｍ，３Ｈ，Ｃｈ３），１．３５−１．５（ｍ，１５Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：３５５（Ｍ+−Ｂｏｃ）。
【０１０７】
キノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミンＴＦＡ塩
１０ｍｌの二塩化メチレン中のキノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミン−Ｂｏｃ（１．０ｇ、２．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリイソプロピルシラン（０．１ｍｌ）、続いてＴＦＡ１０ｍｌを加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を除去した後、生成物を真空下で乾燥させ、精製せずに直接次のステップで使用した。
【０１０８】
キノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミンカルボニルクロリド
２０ｍｌの乾燥塩化メチレン中のキノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミンＴＦＡ塩（０．３３ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液に、トルエン中のホスゲン溶液（２０％、９．１ｇ）を加えた。次いで、０℃のＴＥＡ（０．１４８ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を滴下で加えた（溶液の酸性が強すぎる場合、より多くのＴＥＡが必要である）。混合物を０℃で３０分撹拌し、ＴＬＣを行って、出発材料が残っていないことを確認した。真空トラップ内でブチルアミンをホスゲン捕捉試薬として使用する濾過により固体を慎重に除去した。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより残渣を精製し、０．２９２ｇ（１００％）の収率を得た。
【０１０９】
キノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミン２−シアノカルバミン酸ベンゾチアゾール
乾燥塩化メチレン（１０ｍｌ）中のキノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミンカルボニルクロリド（０．２９２ｇ、０．７３６ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．１９４ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．１１２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．１３４ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、０．２３３ｇ（５９％）の収率を得た。化合物は、２つの回転異性体（７：３）として存在するかもしれない。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１５−８．２６（ｄ１ｄ２（３：７），Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．８５（ｄ１ｄ２（３：７），Ｊ＝３．０，１Ｈ），７．４−７．５（ｄｄ１，ｄｄ２（３：７），Ｊ＝９，Ｊ＝３，１Ｈ），３．２５−３．５０（ｍ，４Ｈ，２ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＯＣＨ２），２．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．６−１．９（ｍ，８Ｈ，２ＣＨ３＋ＣＨ２），１．４２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：５３７（Ｍ+）。
【０１１０】
キノントリメチルロック−Ｃ３−カルバメートルシフェリン  （ＰＢＩ  ４３０８）
２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ中のキノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミン２−シアノカルバミン酸ベンゾチアゾール（０．１７７ｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）の溶液に、水５ｍｌ中のＤ−システイン（０．１４４ｇ、０．８１９ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．１６４ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分撹拌し、次いで、酢酸を用いてｐＨ６に酸性化した。塩化メチレンを除去した後、溶出剤として０．１％ギ酸及びアセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を精製した。化合物は、２つの回転異性体（７：３）として存在するかもしれない。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１１（ｄｄ（７：３），Ｊ＝９．０，１Ｈ），７．８５（ｄｄ（７：３），Ｊ＝３．０，１Ｈ），７．３８（ｍ，１Ｈ），５．４５（ｔ，Ｊ＝９，１Ｈ，ＣＨ），３．８１（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．４２（ｔ，Ｊ＝６，２Ｈ，ＮＣＨ２），３．２５−３．５０（ｍ，４Ｈ，２ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＯＣＨ２），２．１１（ｓｓ（７：３），３Ｈ，ＣＨ３），１．７−１．９（ｍ，８Ｈ，２ＣＨ３＋ＣＨ２），１．４２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６４１（Ｍ+）。Ｃ１８カラム上のＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９８．５％；キラルカラム上の異性体比（３１％：６９％）。
実施例６．ＰＢＩ  ４５８６の合成
【化１３】
2014526443.tif 000014
【０１１１】
ＰＢＩ  ４３０８の合成（実施例５）と同様の手順を用いることにより、ＰＢＩ  ４５８６を調製した。
【０１１２】
キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミン−Ｂｏｃ    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ３−３．３（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．１（ｍ，８Ｈ，２ｘＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．８−２．０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３），１．３−１．５（ｍ，１５Ｈ，２ｘＣＨ３＋３ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：４２１（Ｍ＋），３２１（Ｍ+−Ｂｏｃ）。
【０１１３】
キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミンカルボニルクロリド    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ３．４−３．６（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ｘＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．１２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３−１．５（ｍ，６Ｈ，２ｘＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：３８３，３８５（Ｍ＋，３：１）。
【０１１４】
キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミン２−シアノカルバミン酸ベンゾチアゾール（ＰＢＩ  ４５８６）    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１５−８．２６（ｄ，１Ｈ），７．８６（ｓ，１Ｈ），７．４−７．５（ｍ，１Ｈ），３．３−３．７（ｍ，４Ｈ，２ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＯＣＨ２），１．７−２．２（ｍ，９Ｈ，３ＣＨ３），１．３−１．５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：５２３（Ｍ+）。
実施例７．ＰＢＩ  ４３１２の合成
【化１４】
2014526443.tif 000015
【０１１５】
ＰＢＩ  ４３１２は、ＰＢＩ  ４３０８の合成（実施例５）について記載されるのと同様の方法を使用して、ＰＢＩ  ４５８６（実施例６）及びＤ−システインの環化によって調製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．０−８．２（ｍ，１Ｈ），７．７−７．９（ｍ，１Ｈ），７．３−７．５（ｍ，１Ｈ），５．４２（ｔ，Ｊ＝９，１Ｈ，ＣＨ），４．１８（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．３−３．７（ｍ，４Ｈ，２ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＯＣＨ２），１．７−２．２（ｍ，９Ｈ，３ＣＨ３），１．３−１．５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６２７（ＭＨ+）。Ｃ１８カラム上のＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９７．７％；キラルカラム上の異性体比：１５．３％：８４．７％。
実施例８．ＰＢＩ  ４５８５の合成
【化１５】
2014526443.tif 000016
【０１１６】
ＫＯＨ（４０％、６ｍｌ）及びエーテル（４０ｍｌ）の混合物に、Ｎ−メチル−Ｎ−ウレア（４．０ｇ、０．０１９４ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。白色固体が消失するまで混合物を０℃で撹拌した。エーテル層は、容器を傾けて別のフラスコに上清を移し、ＫＯＨ上０℃で乾燥させた。次いで、エーテル溶液（約１０ｍｌ）を１５ｍｌのＴＨＦ中のキノントリメチルロック−Ｃ２−ジアミンルシフェリン（ＰＢＩ  ４３１２）（０．２０ｇ、０．３１１ｍｍｏｌ）に加え、ＴＬＣによって確認されるように出発材料が完全に消費されたところで停止した。酢酸を加えることによって反応を停止させた。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、８４％（０．１７ｇ）の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１０（ｄ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，１Ｈ），５．３７（ｔ，Ｊ＝９，１Ｈ，ＣＨ），３．８４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．７６（ｔ，Ｊ＝９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．４−３．６（ｍ，４Ｈ，２ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＯＣＨ２），１．７−２．２（ｍ，９Ｈ，ＣＨ３），１．３−１．５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６４１（ＭＨ+），６６３（ＭＮａ＋）。ＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで８８．４％。
実施例９．ＰＢＩ  ４５１６の合成
【化１６】
2014526443.tif 000017
【０１１７】
（６−ヒドロキシヘキシル）トリフェニルホスホニウムブロミド
１００ｍｌのアセトニトリル中の６−ヒドロキシヘキシルブロミド（１０．３６ｇ、０．０５７ｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（５ｇ、０．０１９ｍｏｌ）の混合物を２日間還流させた。溶媒を除去した後、残渣をエーテルで３回洗浄した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチル及び塩化メチレン／ＭｅＯＨを使用するシリカクロマトグラフィーにより固体を精製し、粘性のある淡白色の物質を得た。
【０１１８】
（Ｓ）−（６−（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（トリチルチオ）プロパノイル）オキシ）−ヘキシル）トリフェニルホスホニウム
Ｂｏｃ−Ｔｒｉｔｙｌ−Ｄ−ｃｙｓ（１．６７ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（２．９８ｇ、１４．４４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．８８１ｇ、７．２２ｍｍｏｌ）、及び（６−ヒドロキシヘキシル）−トリフェニルホスホニウムブロミド（１．６０ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。不溶性の固体を除去した後、溶出剤として塩化メチレン／ＭｅＯＨを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、９３％（２．７８ｇ）の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１７（ｄｄ，Ｊ＝１．６，５．０，２Ｈ），７．９３−７．６４（ｍ，１３Ｈ），７．４６−７．１５（ｍ，１３Ｈ），６．５１（ｄｄ，Ｊ＝１．６，５．０，２Ｈ），５．３３（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｔｄ，Ｊ＝３．０，６．５，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．５７（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ２），２．５５（ｄ，Ｊ＝５．１，２Ｈ，ＰＣＨ２），１．５−２．０（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：８０８（Ｍ+）。
【０１１９】
（Ｓ）−（６−（（２−アミノ−３−メルカトプロパノイル）オキシ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウム
１０ｍｌの二塩化メチレン中の（Ｓ）−（６−（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（トリチルチオ）プロパノイル）オキシ）ヘキシル）−トリフェニルホスホニウム（０．３１５ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリイソプロピルシラン（０．１ｍｌ）、続いてＴＦＡ１０ｍｌを加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。高真空下で溶媒を除去した後、生成物は、更に精製せずに直接次のステップで使用した。
【０１２０】
キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミン−ルシフェリン−Ｃ６−トリフェニルホスホニウム（ＰＢＩ  ４５１６）
上記残渣をＤＭＦに溶解した。キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミン２−シアノカルバミン酸ベンゾチアゾール（ＰＢＩ  ４５８６）（０．１０ｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）を加え、ＴＥＡを用いて溶液のｐＨをｐＨ８に調整した。得られた混合物を室温で３０分撹拌した。溶出剤としてギ酸（０．１％）／アセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を直接精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：９７１（Ｍ+）。
実施例１０．ＰＢＩ  ４５５０の合成
【化１７】
2014526443.tif 000018
【０１２１】
キノン−トリメチルロック−Ｎ−メチル−ベンジルアルコール２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾールカルバメート
１０ｍｌのメチレン中のキノン−トリメチルロック−Ｎ−メチルベンジルアルコール（０．５３ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（０．１５３ｇ、０．５１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（０．１７ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を０℃で加え、混合物を０℃で３０分撹拌した。２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾール（０．３７７ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．３ｍｌ）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。濾過により不溶性の固体を除去した後、溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、２２％（０．１８ｇ）の収率を得た    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．４５（ｄ，Ｊ＝２．３，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝８．９，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），７．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝７．９，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．９７（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．７４（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３０（ｓ，ｂｒ，６Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：５７１（ＭＨ+）。
【０１２２】
キノントリメチルロック−Ｎ−メチル−ルシフェリンカルバメート（ＰＢＩ  ４５５０）
２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ中のキノン−トリメチルロック−Ｎ−メチル−ベンジルアルコール２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾールカルバメート（０．１０ｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）の溶液に、水３ｍｌ中のＤ−システイン（０．０４６ｇ、０．２６２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．０５３ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分撹拌し、次いで、酢酸を用いてｐＨ６に酸性化した。塩化メチレンを除去した後、溶出剤として０．１％ギ酸及びアセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を精製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．３５（ｄ，Ｊ＝２．２，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．９，１Ｈ），７．５−７．７（ｍ，３Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝７．９，２Ｈ），５．４１（ｔ，Ｊ＝９，１Ｈ，ＣＨ），５．２７（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７７（ｄ，Ｊ＝９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．１２（ｓ，ｂｒ，３Ｈ，ＮＣＨ３），２．７２（ｓ，ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３０（ｓ，ｂｒ，６Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６７５（Ｍ+）。ＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９６．６％。
実施例１１．ＰＢＩ  ４５６５の合成
【化１８】
2014526443.tif 000019
【０１２３】
Ｎ，Ｎ’−ジホルミル−２，２−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン
２００ｍｌのギ酸エチル中の２，２−ジメチルプロパニルジアミン（２５ｇ、０．２４５ｍｍｏｌ）の混合物を２日間にわたって還流加熱した。真空下で溶媒を除去した後、溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、５０％（１９ｇ）の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．２０（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），３．０５（ｄ，Ｊ＝６，４Ｈ，ＣＨ２），０．９（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１５９（Ｍ+）。
【０１２４】
Ｎ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミン
２５０ｍＬのエーテル及び１０ｇのＬｉＡｌＨ4（９５％）の混合物（０℃）に、９．８８ｇ（６２．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジホルミル−２，２−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンを少しずつ加えた。添加後、反応混合物を室温で２０時間撹拌した。次いで、エーテル及び水を用いて混合物を加水分解し、Ｃｅｌｉｔｅを通した濾過により白色固体を除去し、無水Ｎａ2ＳＯ4で濾液を乾燥させた。溶媒を除去した後、無色の油として生成物を得た。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１３１（Ｍ+）。
【０１２５】
モノ−Ｂｏｃ−Ｎ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミン
３０ｍｌの塩化メチレン中のＮ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミン（１．３２ｇ、１０．１４ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（２．８３ｍｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−無水物の溶液（１．１０ｇ、５．０４ｍｍｏｌ）を０℃で加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、化合物は、更に精製せずに次のステップで使用した。
【０１２６】
キノントリメチルロックＢｏｃ−Ｎ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミン
３０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタン酸（１．０９ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸イソブチル（０．５９２ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（０．４４ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で３０分撹拌し、モノＢｏｃ−Ｎ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパンジアミン（１．０ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、５２％（１．０２ｇ）の収率を得た。ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６３（Ｍ+）。
【０１２７】
キノントリメチルロックＮ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミンＴＦＡ塩
１０ｍｌの二塩化メチレン中のキノントリメチルロックＢｏｃ−Ｎ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミン（０．８７ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリイソプロピルシラン（０．１ｍｌ）、続いてＴＦＡ１０ｍｌを加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を除去した後、生成物は、精製せずに直接次のステップで使用した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６３（Ｍ＋）。
【０１２８】
キノントリメチルロックＮ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミンカルボニルクロリド
塩化メチレン（２０ｍｌ）中のキノン−トリメチルロックＮ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパンジアミンＴＦＡ塩（０．８９４ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）の溶液に、トルエン（２０％、１４ｇ）中のホスゲン溶液を加え、続いて０℃のＴＥＡ（０．５７ｇ、５．６４ｍｍｏｌ）を滴下で加えた（溶液の酸性が強すぎる場合、より多くのＴＥＡが必要である）。混合物を３０分撹拌し、ＴＬＣを行って、出発材料が残っていないことを確認した。真空トラップ内でブチルアミンをホスゲン捕捉試薬として使用する濾過により固体を慎重に除去した。溶出剤としてヘプタン及び酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより残渣を精製し、０．４２２ｇ（５３％）の収率を得た。
【０１２９】
キノントリメチルロックＮ，Ｎ，２，２−テトラメチルプロパンジアミン−２−シアノカルバミン酸ベンゾチアゾール
１０ｍｌの乾燥塩化メチレン中のキノン−トリメチルロックＮ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパンジアミンカルボニルクロリド（０．４２ｇ、０．９８８ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．２６ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２０６ｍｌ）、及びＤＭＡＰ（０．１８ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を直接精製し、０．１７７ｇ（３２％）の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．１９（ｄ，Ｊ＝８．７，１Ｈ），７．８７−７．７５（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），３．３７−２．９７（ｍ，１２Ｈ，２ＮＣＨ３＋２ＮＣＨ２＋ＣＨ２），１．７−２．２（ｍ，９Ｈ，３ＣＨ３），１．４１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４２（ｓ．３Ｈ，ＣＨ３），１．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：５６５（Ｍ+），５８７（ＭＮａ＋）。
【０１３０】
キノントリメチルロック−Ｎ，Ｎ’，２，２−テトラメチルプロパンジアミンカルバメートルシフェリン（ＰＢＩ  ４５６５）
５ｍｌのＭｅＯＨ中のキノントリメチルロックＮ，Ｎ，２，２−テトラメチルプロパンジアミン２−シアノカルバミン酸ベンゾチアゾール（０．０２０ｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）の溶液に、水２ｍｌ中のＤ−システイン（０．０１６ｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．０１８ｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分撹拌し、次いで、酢酸を用いてｐＨ６に酸性化した。溶出剤として０．１％ギ酸及びアセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を精製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．０２（ｄｄ，Ｊ＝６．０，８．９，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．９，１Ｈ），５．３１（ｔ，Ｊ＝９．６，１Ｈ，ＣＨ），３．７０（ｄ，Ｊ＝１１．９，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．１−３．４（ｍ，６Ｈ，２ＮＣＨ２＋ＣＨ２），３．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．８２−２．２（ｍ，９Ｈ，ＣＨ３），１．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６６９（ＭＨ+）。ＨＰＬＣ純度：３３０ｎｍで９８．５％。
実施例１２．ＰＢＩ  ４３８４の合成
【化１９】
2014526443.tif 000020
【０１３１】
２，５−ジメチル−１，４−ビスフェノール
エーテル／水（４００ｍｌ／２００ｍｌ）中の２，５−ジメチルシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（１０ｇ、７３．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＢＨ4（１１．１２ｇ、０．２９３ｍｏｌ）を０℃で加えた。黄色が消失するまで混合物を振盪した。次いで、酢酸を用いて混合物を酸性化し、エーテルで３回抽出し、合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を除去した後、化合物は直接次のステップで使用した。
【０１３２】
２，５−ジメチルシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン
上記未精製物に、２，５−ジメチルビスフェノールメチルメタクリレート（８．３８ｇ、７３．４５ｍｍｏｌ）及びメタンスルホン酸（１００ｍｌ）を加えた。混合物を９０℃まで２時間加熱した。室温まで冷却してから、混合物を氷冷水中に注ぎ入れ、酢酸エチルを用いて３回抽出し、合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶出剤として酢酸エチル及びヘプタンを使用するシリカクロマトグラフィーにより精製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ４．８４（ｓ，１Ｈ），２．５５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．３２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４６（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：２２１（Ｍ＋）。
【０１３３】
実施例５に記載されるのと同様の手順により、以下の２つの化合物を作製した。
【０１３４】
３−（２，５−ジメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）−３−メチルブタン酸    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ６．７−７．１（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．４７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４４（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：２３５（Ｍ-）。
【０１３５】
（３−（３−（２，５−ジメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）プロピル）（メチル）カルバミルクロリド（収率：８３％）    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ６．３７（ｓ，１Ｈ），３．２２−３．３８（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），１．８−２．２（ｍ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．７−１．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．４２（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：３８３（Ｍ＋）
【０１３６】
キノントリメチルロックデヒドロルシフェリンメチルエステル（ＰＢＩ  ４３８４）
１５ｍｌの乾燥塩化メチレン中のキノン−トリメチルロック−Ｃ３−ジアミンカルボニルクロリド（０．４４ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ルシフェリンメチルエステル（０．３７ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．１２７ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．１８ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．３５（ｓ，１Ｈ），８．０１−８．１５（ｍ，１Ｈ），７．７−７．９（ｍ，１Ｈ），７．３−７．４（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），３．９７ｎ（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．２５−３．５（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．２５（ｍ，８Ｈ，ＮＣＨ３＋ＣＨ２），１．８−２．２（ｍ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．７−１．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．４２（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６３９（Ｍ＋）。（ＮＭＲ及びＭＳにより生成物がデヒドロルシフェリンであることを確認した）。
実施例１３．ＰＢＩ  ４４１２の合成
【化２０】
2014526443.tif 000021
【０１３７】
実施例５に記載されるのと同様の手順を用いることにより、３−（３−（２，５−ジメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）プロピル）塩化カルボニル及びフルオレセインからモノ−キノントリメチルロックジアミンフルオレセイン（ＰＢＩ  ４４１２）を作製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．０２（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８３−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．９４−６．５２（ｍ，５Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），３．３−３．７（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），３．１−２．７（ｍ，８Ｈ），２．２−１．７（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３），１．４６−１．３３（ｍ，６Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６６５（Ｍ＋）。
実施例１４．ＰＢＩ  ４４１３の合成
【化２１】
2014526443.tif 000022
【０１３８】
ＰＢＩ  ４４１２の作製（実施例１３）において使用した３−（３−（２，５−ジメチル−３，６−ジオキシシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）プロピル）塩化カルボニルの反応物からビス−キノントリメチルロックジアミンフルオレセイン（ＰＢＩ  ４４１３）を単離した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．０２（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８３−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．４−７．１（ｍ，３Ｈ），７．０−６．６（ｍ，４Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），３．２−３．７（ｍ，８Ｈ，ＮＣＨ２），３．１−２．７（ｍ，１６Ｈ），２．２−１．７（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ３），１．４６−１．３３（ｍ，１２Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：９９７．６（Ｍ＋）。
実施例１５．ＰＢＩ  ４４４０の合成
【化２２】
2014526443.tif 000023
【０１３９】
実施例５に記載されるのと同様の方法を用いることにより、キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミンカルボニルクロリド及びフルオレセインからモノ−キノントリメチルロックジアミンフルオレセイン（ＰＢＩ  ４４４０）を作製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．８９（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），７．３−７．６（ｍ，３Ｈ），７．０−７．４（ｍ，２Ｈ），６．６−６．８（ｍ，３Ｈ），６．３−６．６（ｍ，３Ｈ），３．２−３．６（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），３．２−２．７（ｍ，８Ｈ），２．２−１．６（ｍ，９Ｈ，ＣＨ３），１．４５−１．３０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６７９．４（Ｍ＋）。
実施例１６．ＰＢＩ  ４４４１の合成
【化２３】
2014526443.tif 000024
【０１４０】
ＰＢＩ  ４４４０（実施例１５）を作製するためのキノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミンカルボニルクロリド及びフルオレセインの反応物からビス−キノントリメチルロックジアミンフルオレセイン（ＰＢＩ  ４４４１）を単離した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．０２（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），７．８３−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．４−７．１（ｍ，３Ｈ），７．０−６．６（ｍ，４Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），３．２−３．７（ｍ，８Ｈ，ＮＣＨ２），３．１−２．７（ｍ，１６Ｈ），２．２−１．７（ｍ，１８Ｈ，ＣＨ３），１．４６−１．３３（ｍ，１２Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１０２５．７（Ｍ＋）。
実施例１７．ＰＢＩ  ４５５２の合成
【化２４】
2014526443.tif 000025
【０１４１】
実施例５に記載されるのと同様の方法を用いることにより、キノン−トリメチルロック−Ｃ２−ジアミンカルボニルクロリド及びフルオレセインアセチルエステルからモノ−キノントリメチルロックジアミンフルオレセインアセチルエステル（ＰＢＩ  ４５５２）を作製した。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ７．８９（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），７．５２−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．１−７．３（ｍ，３Ｈ），６．７−７．０（ｍ，５Ｈ），３．３−３．７（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），３．２−２．７（ｍ，８Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ，ＣＯＣＨ３），２．２−１．６（ｍ，９Ｈ，ＣＨ３），１．４８−１．３０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７２１．４（Ｍ＋）。
実施例１８．ＰＢＩ  ４５４３の合成
【化２５】
2014526443.tif 000026
【０１４２】
（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド
１００ｍｌのアセトニトリル中のｔｅｒｔ−ブチル（３−ブロモプロピル）カルバメート（５．４５ｇ、２２．８８ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（６．０ｇ、２２．８８ｍｍｏｌ）の混合物を２日間還流加熱した。室温まで冷却してから、溶出剤として塩化メチレン／メタノールを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、６４％（６．１５ｇ）の収率を得た。
【０１４３】
（３−アンモニオプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド
トリイソプロピルシラン（０．２ｍｌ）を含有するＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、５０ｍｌ）の溶液を（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（６．１５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を２時間撹拌した。溶媒を除去した後、化合物を真空乾燥し、直接次のステップで使用した。
【０１４４】
ＦＡＭ−Ｃ３−ＴＰＰ（ＰＢＩ  ４５４４）
２０ｍｌのＤＭＦ中の（３−アンモニオプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（０．２８ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（０．１６３ｇ、１．１６４ｍｍｏｌ）及び５，６−ジアセチルＦＡＭ−ＳＥ（０．３０ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩撹拌した。メタノール（１０ｍｌ）を加えてアセチルエステルを加水分解し、得られた混合物を３０分撹拌した。溶媒を除去した後、溶出剤として塩化メチレン／ＭｅＯＨを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：６７９．４（Ｍ＋）
【０１４５】
ビス（キノントリメチルロック）ＦＡＭ−Ｃ３−ＴＰＰ（ＰＢＩ  ４５４３）
ＦＡＭ−Ｃ３−ＴＰＰ（ＰＢＩ  ４５４４）（０．１０ｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）、キノントリメチルロックＣ２−ジアミンカルボニルクロリド（０．２０ｇ、０．５２７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０６４ｇ、０．５２７ｍｍｏｌ）、及びＴＥＡ（０．０５３ｇ、０．０５２７ｍｍｏｌ）の混合物を一晩混合した。シリカクロマトグラフィーにより過剰なキノントリメチルロックＣ２−ジアミンカルボニルクロリドを除去した後、溶出剤として０．１％ギ酸／アセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を更に精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１３７１．４（Ｍ＋）
実施例１９．ＰＢＩ  ４５４７の合成
【化２６】
2014526443.tif 000027
【０１４６】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−ヒドロキシヘキシル）カルバメート
２００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の６−アミノヘキサン−１−オル（１０．０ｇ、８５．３３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１２ｍｌ）の溶液に、５０ｍｌの塩化メチレン中のｂｏｃ無水物の溶液（１８．６２ｇ、８５．３３ｍｍｏｌ）を０℃で加え、混合物を一晩撹拌した。混合物を水で洗浄し、有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を除去した後、真空下で化合物を乾燥させて８７％（１６．０７ｇ）の収率を得、それを更に精製せずに直接使用した。
【０１４７】
６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキシルメタンスルホン酸
１００ｍｌの塩化メチレン中のｔｅｒｔ−ブチル（６−ヒドロキシヘキシル）カルバメート（１２．１８ｇ、５６．０５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（８．５１ｇ、８４．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メタンスルホニル（９．６３ｇ、８４．０８ｍｍｏｌ）を０℃で徐々に加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製した。
【０１４８】
（６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムブロミド
ＡＣＮ／ＤＭＦ（３：１．１２０ｍｌ）中の６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキシルメタンスルホン酸（８．０ｇ、２７．０８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０．６５ｇ、４０．６２ｍｍｏｌ）、及びＫＢｒ（６．４５ｇ、５４．１６ｍｍｏｌ）の混合物を２日間還流加熱した。溶媒を除去した後、溶出剤としてＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨを使用して化合物を精製し、６５％（８．２０ｇ）の収率を得た。
【０１４９】
（６−アンモニオヘキシル）トリフェニルホスホニウムブロミド／ＴＦＡ塩
トリイソプロピルシラン（０．２ｍｌ）を含有するＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、５０ｍｌ）の溶液を（６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムブロミド（８．０ｇ）に加えた。混合物を２時間撹拌した。溶媒を除去した後、化合物を真空乾燥し、直接次のステップで使用した。
【０１５０】
ＦＡＭ−Ｃ６−ＴＰＰ
２０ｍｌのＤＭＦ中の（３−アンモニオヘキシル）トリフェニルホスホニウムブロミド（０．８７ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（０．５４ｇ、５．３７ｍｍｏｌ）及び５，６−ジアセチルＦＡＭ−ＳＥ（１．０ｇ、０．１．７９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩撹拌した。メタノール（１０ｍｌ）を加えてアセチルエーテルを加水分解し、得られた混合物を３０分撹拌した。溶媒を除去した後、溶出剤として塩化メチレン／ＭｅＯＨを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、４６％（０．５９ｇ）の収率を得た。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７２１．４（Ｍ＋）；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍで９４．７％（５−／６−異性体比：４０．９％／５３．８％）。
【０１５１】
ビス（キノントリメチルロック）ＦＡＭ−Ｃ６−ＴＰＰ（ＰＢＩ  ４５４７）
１０ｍｌの二塩化メチレン中のＦＡＭ−Ｃ６−ＴＰＰ（０．１０ｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）、キノントリメチルロックＣ２−ジアミンカルボニルクロリド（０．１９ｇ、０．４９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０６４ｇ、０．５２７ｍｍｏｌ）、及びＴＥＡ（０．０５３ｇ、０．０５２７ｍｍｏｌ）の混合物を一晩撹拌した。シリカクロマトグラフィーにより過剰なキノントリメチルロックＣ２−ジアミンカルボニルクロリドを除去した後、溶出剤として０．１％ギ酸／アセトニトリルを使用するＨＰＬＣにより化合物を更に精製した。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１４１３．５（Ｍ＋）；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍで８５％（５−／６−ＦＡＭ異性体をＨＰＬＣによって分離することはできない）。
実施例２０．ＰＢＩ  ４４４２の合成
【化２７】
2014526443.tif 000028
【０１５２】
２０ｍｌ二塩化メチレン中のセレンテラジンアセチルエステル（０．５０ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、キノントリメチルロックＣ２−ジアミンカルボニルクロリド（０．４３６ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１３９ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、及びＴＥＡ（０．１１５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で一晩撹拌した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、２０％（０．１８４ｇ）の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．４７（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ），７．０−７．５（ｍ，９Ｈ），４．５７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），４．１６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．２−３．７（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＨ２），２．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０−２．２（ｍ，１５Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７９６．５（Ｍ＋）。
実施例２１．ＰＢＩ  ４６００の合成
【化２８】
2014526443.tif 000029
【０１５３】
ＰＢＩ  ４４４２（実施例２０）を調製するのと同様の方法を用いることにより、ＰＢＩ  ４６００を作製した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するシリカクロマトグラフィーにより化合物を精製し、６０％（０．３２ｇ）の収率を得た。    1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）δ８．４７（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄ，２Ｈ），７．１−７．５（ｍ，７Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），６．１７（ｓ，１Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），４．１９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．３−３．７（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＨ２），１．０−２．２（ｍ，１５Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７２８．５（Ｍ＋）。ＨＰＬＣ純度：２６２ｎｍで９０％。
実施例２２．ＰＢＩ  ４６０１の合成
【化２９】
2014526443.tif 000030
【０１５４】
ＰＢＩ  ４４４２を調製する（実施例２０）のと同様の方法を用いることにより、ＰＢＩ  ４６０１を作製した。溶出剤としてヘプタン／酢酸エチルを使用するｄにより化合物を精製し、１７％（０．１５ｇ）の収率を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．４２（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄ，２Ｈ），７．１−７．５（ｍ，１０Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），４．１９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．３−３．７（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２），２．７−３．２（ｍ，８Ｈ，２ＮＣＨ３＋ＣＨ２），１．０−２．２（ｍ，１５Ｈ，ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７３８．５（Ｍ＋）。ＨＰＬＣ純度：２６２ｎｍで９５％。
実施例２３．異なる細胞型における基質の分析
【０１５５】
この実施例は、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴリンパ球細胞株）、及びＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）の３つの異なる細胞株における本発明の基質の使用を示す。
【０１５６】
９６ウェルアッセイプレートのウェル内の１０％血清培地又は無血清培地のいずれかに、Ｊｕｒｋａｔ細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種した。５０μＭのＰＢＩ−４３１２、４５５０、又は４５６５を細胞培地に加え、３７℃で３０分、次いで室温で３０分、細胞をインキュベートした。各ウェルに５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、室温で２０分インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで発光（ＲＬＵ）を検出した（図１）。
【０１５７】
９６ウェルアッセイプレートのウェル内の１０％血清培地に、ＨｅｐＧ２細胞を異なる細胞密度（５０，０００、２５，０００、１２，５００、６２５０、３１２５、１５６２．５、又は７８１．２５細胞／ウェル）で播種した。５０μＭのＰＢＩ−４３１２、４５８５、又は４５８６を細胞培地に加え、３７℃で３０分、次いで室温で３０分、細胞をインキュベートした。各試料に５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、室温で２０分インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで発光（ＲＬＵ）を検出した（図２ａ）。試料のＲＬＵを、培地のみ（細胞を含まない）において各化合物によって生成されたＲＬＵで除すことにより、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ、図２ｂ）を測定した。
【０１５８】
９６ウェルアッセイプレートのウェル内の１０％血清培地に、Ａ５４９細胞を異なる細胞密度（２０，０００、１０，０００、５，０００、２，５００、１，２５０、６２５、３１２．５細胞／ウェル）で播種した。細胞培地に１００μＭのＰＢＩ−４５８５又は４５８６を加え、種々の期間（５、１０、１５、２０、３０、又は４５分）細胞を室温でインキュベートした。各時点で細胞培地の試料（５０μｌ）を採取し、５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。試料を室温で２０分インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで発光（ＲＬＵ）を検出した（図３ａ及び３ｃ）。試料のＲＬＵを、培地のみ（細胞を含まない）において各化合物によって生成されたＲＬＵで除すことにより、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ、図３ｂ及び３ｄ）を測定した。
【０１５９】
化合物の滴定を行うことにより、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＡ５４９細胞中の４５８５及び４５８６の最適濃度を決定した。９６ウェルアッセイプレートのウェルに、Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＡ５４９細胞を４０，０００細胞／ウェルで播種した。濃度を上昇させた（０．１４、０．４１、１．２３、３．７０、１１．１１、３３．３３、及び１００μＭ）ＰＢＩ−４５８５及び４５８６を細胞培地に加えた。種々の期間（５、１０、１５、２０、３０、又は４５分）細胞を室温でインキュベートした。各時点で５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。試料を室温で２０分インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで発光（ＲＬＵ）を検出した（図４ａ〜ｄ）。
実施例２４．酸化還元状態の判定
【０１６０】
この実施例は、代謝細胞の健康を判定するための本発明の基質の使用を示す。メナジオンで処理したＡ５４９細胞における代謝細胞の健康を評価する基質ＰＢＩ  ４３１２及び４５８６の能力についてそれらをスクリーニングした。
【０１６１】
９６ウェルアッセイプレートのウェルに、Ａ５４９細胞を２０，０００細胞／ウェルで播種した。種々の濃度（０、２５、５０、又は１００μＭ）のメナジオンを用いて、３７℃で１時間細胞を処理した。次いで、細胞を５０ｕＭのＰＢＩ−４３１２又は４５８６で処理し、室温で１時間インキュベートした。次いで、５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。試料を室温で２０分インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで発光（ＲＬＵ）を検出した（図５）。
実施例２５．生細胞の蛍光撮像
【０１６２】
８ウェルチャンバースライドのウェルにＨｅＬａ細胞を４０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃＋５％ＣＯ2でインキュベートした。培地（ＤＭＥＭ）を、１０μＭのＰＢＩ−４４１２、４４１３、４４４０、又は４４４１を含有する加温完全培地（１０％ＦＢＳを含む）と交換した。次いで、レーザー出力１０％、λ４８８ｎｍ（４４１２、４４１３、及び４４４１）又はレーザー出力５％（４４４０）を用いた撮像のために、細胞を共焦点顕微鏡に移した。全ての画像（図６ａ〜ｄ）は３０×の倍率である。画像は、基質は、一旦、細胞内に入ってからのみ還元されることを示している。
実施例２６．ミトコンドリア標的化基質
【０１６３】
８ウェルチャンバースライドのウェルにＨｅＬａ細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃＋５％ＣＯ2でインキュベートした。培地（ＤＭＥＭ）を、１０ｕＭのＰＢＩ−４５４３又は４５４７を含有する完全培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）と１時間交換した。次いで、製造業者の指示に従って５０ｎＭのＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  ＤｅｅｐＲｅｄ  ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する低血清培地（１％ＦＢＳ）と培地を交換した。次いで、λ４８８ｎｍレーザーを用いて生存率を撮像するため（４５４３もしくは４５４７）、又はλ６３３ｎｍレーザーを用いてシーケンシャルモードでＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒを撮像するために、細胞を共焦点顕微鏡に移した。全ての画像（図７ａ〜ｂ）は１００×の倍率である。
実施例２７．細胞機能アッセイ
【０１６４】
８ウェルチャンバースライドのウェルにＨｅＬａ細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃＋５％ＣＯ2でインキュベートした。培地（ＤＭＥＭ）を、１０ｕＭのＰＢＩ−４５４３又は４５４７を含有する完全培地（１０％ＦＢＳを含む）と交換した。細胞を３０分インキュベートし、６．８ｍＭ  ３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ、複合体ＩＩを介した電子伝達系（ＥＴＣ）の既知の阻害剤）を細胞に加えた。対照細胞には３−ＮＰＡを含有しなかった。次いで、細胞を８５分インキュベートし、次いで、１０％のλ４８８ｎｍレーザーを用いた撮像のために共焦点顕微鏡に移した。全ての画像（図８ａ〜ｄ）は４０×の倍率である。
実施例２８．キノン誘導体を用いて代謝的に活性な細胞を測定する
【０１６５】
この実施例は、代謝的に活性な細胞の量を測定するための、キノン誘導体、セレンテラジン、及び蛍光誘導体の使用を示す。生存細胞は、細胞が損傷を受けると必然的に失われる代謝的に活性な状態を維持する。生細胞に進入すると、キノンセレンテラジンは、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、例えば、発光エビルシフェラーゼ又はウミシイタケルシフェラーゼの基質である、セレンテラジン誘導体に還元される。キノンセレンテラジンの変換は、代謝的に活性な細胞の数に比例し、したがって、ルシフェラーゼ反応によって生成される光をモニタリングすることによって、定量的に測定することができる。同様に、フルオロフォアに結合したキノン誘導体は、蛍光値の増加を測定することにより、代謝的に活性な細胞の量を測定するために使用することができる。
Ａ．キノンセレンテラジン誘導体
【０１６６】
ＰＢＳ中にＪｕｒｋａｔ細胞の２倍段階希釈物を調製し、９６ウェルプレートのウェルに５０μｌ／ウェルを移した。化合物ＰＢＩ  ４６００及び４６０１をＰＢＳ中で希釈し、それぞれ、５０μＭ及び１００μＭの原液を作製した。調製した化合物原液のうち１０μｌを細胞に加え、該細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターに配置した。３０分のインキュベーション後、細胞をインキュベーターから除去し、室温で１０分冷却し、５０μｌの発光エビルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を直接ウェルに加えた。試料を混合し、室温で２０分インキュベートし、発光を測定した。図９は、細胞数と発光との間の直線相関を示しており、発光と細胞数との間の直接的な関係を示唆している。
【化３０】
2014526443.tif 000031
Ｂ．キノンフルオレセイン誘導体
【０１６７】
ｉ．完全ＤＭＥＭ培地中にＨＥＫ２９３細胞の２倍段階希釈物を調製し、９６ウェルプレートのウェルに１００μｌ／ウェルを移した。化合物ＰＢＩ  ４４４０及び４４１２を完全ＤＭＥＭ培地中で希釈し、それぞれ、２０μＭ及び１０μＭの原液を作製した。調製した化合物原液のうち１００μｌを細胞に加え、該細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで６０分インキュベートした。インキュベーション後、細胞をインキュベーターから除去し、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ５００を用いて４８０ｅｘ／Ｅｍ５３０ｅｍ波長で蛍光を測定した。図１０は、細胞数と蛍光との間の直線相関を示しており、化合物４４４０及び４４１２で測定された蛍光と細胞数との間の直接的な関係を示唆している。
【０１６８】
ｉｉ．細胞毒性を誘発するために、細胞をジギトニンで処理した。９６ウェルプレートのウェルにＡ４５２細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種した。２４時間後、培地を除去し、５０μｇ／ｍｌジギトニンを含むか又は含まない１００μｌの新しい培地を加えた。３７℃、５％ＣＯ2で細胞を３０分インキュベートした。インキュベーション後、２０μＭの化合物４４４０を含有する１００μｌの培地を加えた。細胞を更に３０分インキュベートし、上記のように蛍光を測定した。図１１に見られるように、ジギトニン処理後、蛍光シグナルに９０％を超える減少が見られ、細胞生存率の減少を測定する化合物４４４０の能力を示している。
実施例２９．細胞生存率に影響を及ぼす化合物のスクリーニング
【０１６９】
３８４ウェルアッセイプレートのウェルに、Ａ５４９細胞を２５０細胞／ウェルで播種した。用量曲線のスタウロスポリン又はドキソルビシンで細胞を７２時間処理した。７２時間後、細胞培養物に５０ｕＭ  ＰＢＩ  ４５８６を加え、室温で３０分インキュベートした。ＬＤＲ及び１０ｍＭ  Ｄ−システインを反応物に加え、室温で２０分インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００で発光を測定した。
【０１７０】
結果は、細胞生存率に影響を及ぼす化合物を迅速に同定して特徴付けるために記載される方法の使用を示す（図１２）。
実施例３０．乳酸、エタノール、又はグルコキナーゼの検出
【０１７１】
乳酸、エタノール、又はグルコキナーゼを検出する本発明の基質の能力を実証するために、ルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ−４３１２を、ジアホラーゼ酵素、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、及びデヒドロゲナーゼ酵素（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルコールヒドロゲナーゼ、又はグルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）デヒドロゲナーゼ）と組み合わせた。デヒドロゲナーゼがその基質と反応することにより生成されるＮＡＤＨは、ルシフェリン前駆体基質をルシフェリン（後にルシフェラーゼ検出試薬を使用して検出することができる）に変換するためにジアホラーゼ酵素によって用いられる（図１４）。
Ａ．細胞中の乳酸の検出
【０１７２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を２×濃度でＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ中に溶解した。同じ溶解緩衝液中で段階希釈（５，０００、１０，０００、又は１５，０００細胞当量／ウェル）を行い、ルミノメーターの９６ウェルプレートのウェルに播種した。細胞溶解物の体積は２５μｌであった。細胞溶解物に、２５μｌの２×反応混合物（２．５ｍＭ  ＮＡＤ、１３．４単位／ｍｌジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＰＢＩ−４３１２、１６単位／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＩＩ型、ウサギ筋肉）を加え、室温で１５分インキュベートした。５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）及び０．５ｍＭメナジオンをウェルに加え、室温で１５分インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で発光（ＲＬＵ）を検出した。図１５ａは、反応物から生成された正味のＲＬＵを示す。図１５ｂは、細胞数と発光との間の相関を示しており、ルシフェリン前駆体の変換を介して生成された発光と乳酸濃度との間の直接的な関係を示唆している。
Ｂ．エタノールの検出
【０１７３】
１×ＰＢＳ中の２×エタノールの段階希釈物をルミノメーターの９６ウェルプレートのウェルに加えた。エタノールの体積は１５μｌであった。エタノールに、１５μｌの２×反応混合物、２５μｌの２×反応混合物（２．５ｍＭ  ＮＡＤ、１２．５単位／ｍｌジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＰＢＩ−４３１２、１６単位／ｍｌアルコールヒドロゲナーゼ（酵母）を加え、室温で１５分インキュベートした。３０μｌのＬＤＲ及び０．５ｍＭメナジオンをウェルに加え、室温で１５分インキュベートした。以前に記載したように発光（ＲＬＵ）を検出した。図１６ａは、反応物から生成された正味のＲＬＵを示す。図１６ｂは、ルシフェリン前駆体の変換を介して生成された発光とエタノール濃度との間の相関を示す。
Ｃ．グルコース−６−ホスフェートの検出
【０１７４】
１×ＰＢＳ中の２×グルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）の段階希釈物をルミノメーターの９６ウェルプレートのウェルに加えた。Ｇ６Ｐの体積は１５μｌであった。Ｇ６Ｐに、１５μｌの２×反応混合物（２００μＭ  ＮＡＤ、１３．４単位／ｍｌジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＰＢＩ−４３１２、０．１単位／ｍｌグルコース−６−リンデヒドロゲナーゼ（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｓ）を加え、室温で１５分インキュベートした。３０μｌのＬＤＲ及び０．５ｍＭメナジオンをウェルに加え、室温で１５分インキュベートした。以前に記載したように発光（ＲＬＵ）を検出した。図１７は、ルシフェリン前駆体の変換を介して生成された発光とＧ６Ｐ濃度との間の直線相関を示す。
Ｄ．細胞中のグルコキナーゼの検出
【０１７５】
２×緩衝液（１００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４ｍＭ  ＤＴＴ）中で、ＨｅｐＧ２細胞を加圧及び超音波処理した。２×緩衝液中で段階希釈（０、１２，０００、２５，０００、５０，０００、及び１００，０００細胞密度／溶解物としての反応物）を行い、ルミノメーターの９６ウェルプレートのウェルに加えた。細胞溶解物の体積は２５μｌであった。細胞溶解物に、２５μｌの２×反応混合物（２００μＭ  ＮＡＤＰ、１３．４単位／ｍｌジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＰＢＩ−４３１２、０．２単位／ｍｌグルコース−６−リンデヒドロゲナーゼ（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｓ）を加え、室温で１５分インキュベートした。５０μｌのＬＤＲ及び０．５ｍＭメナジオンをウェルに加え、室温で１５分インキュベートした。１００ｍＭグルコースでの発光と０．５ｍＭグルコースでの発光との間の差がグルコキナーゼの活性を示唆する試料の発光（ＲＬＵ）（図１８）。
実施例３１．ＮＡＤＨの検出及び測定
【０１７６】
次の実施例は、ＮＡＤＨを検出及び測定するための、ルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ−４３１２、４５５０、及び４５６５の使用を示す。生成された発光は、ＮＡＤＨ及びジアホラーゼの存在を示唆する。
Ａ．ＰＢＩ−４３１２、４５５０、又は４５６５を使用するＮＡＤＨの検出
【０１７７】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、０μＭ又は１０μＭのＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）と、０ｕ／ｍｌ又は５ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに、各基質（ＰＢＩ−４３１２、４５５０、及び４５６５）を２０μＭ（体積１０μｌ）でインキュベートした。３８４ウェル白色ルミノメータープレートにおいて４通りの反応を行い、室温で２０分インキュベートした。１０μｌのＬＤＲを各試料に加え、室温で２０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターで発光を検出した。４通りの反応物からのＲＬＵを平均化した（表１）。
【表１】
2014526443.tif 000032
Ｂ．ラットジアホラーゼ又はクロストリジウムジアホラーゼを用いたＮＡＤＨの検出
【０１７８】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、１０μＭ  ＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）と、５ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）又は０．５ｕ／ｍｌクロストリジウムジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに、各化合物を２０μＭ（体積１０μｌ）でインキュベートした。ＮＡＤＨを含まない陰性対照反応物も含まれていた。試料を室温で３０分インキュベートし、１０μｌのＬＤＲを加え、以前に記載したように、１０分ごとに７０分間発光を測定した。７０分での発光（ＲＬＵ）を表２に示す。４通りの反応を行い、ＲＬＵを平均化した（図１９ａ）。ＮＡＤＨを含む反応物からのシグナルを、ＮＡＤＨを含まない反応物からのシグナルで除すことにより、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）も計算した（図１９ｂ）。
【表２】
2014526443.tif 000033
Ｃ．ＮＡＤＨの滴定
【０１７９】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、量を増加させたＮＡＤＨ（表３）（Ｓｉｇｍａ）及び５ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに各化合物を２０μＭ（体積１０μｌ）でインキュベートした。４通りの反応を行った。試料を室温で４０分インキュベートし、１０μｌのＬＤＲを加え、室温で２０分インキュベートした。以前に記載したように発光を検出し、４通りの反応物のＲＬＵを平均化した（表３及び図２０）。
【表３】
2014526443.tif 000034
実施例３２．メナジオンによるジアホラーゼ反応の阻害
【０１８０】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、１０μＭ  ＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）及び５ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに、各基質（ＰＢＩ−４３１２、４５５０、及び４５６５）を２０μＭ（体積１０μｌ）でインキュベートした。各基質につき、８つの同一反応物を調製した。試料を室温で５分インキュベートし、４つの反応物には１０μｌのＬＤＲを入れ、他の４つの反応物には５００μＭメナジオンとともに１０μｌのＬＤＲを入れた。３つの基質の各々とのジアホラーゼ反応のメナジオンによる阻害をモニタリングするために、５分にわたってルシフェリンの生成をモニタリングした。発光を測定し、４つの反応物のＲＬＵを平均化した（表４及び図２１）。ＬＤＲの添加から約１分後に最初の読み取りを行い、その５分後（約６分）に最後の読み取りを行った。
【表４】
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実施例３３．ジアホラーゼ反応の経時変化
【０１８１】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、１０μＭ  ＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）及び５ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに、各基質（ＰＢＩ−４３１２、４５５０、及び４５６５）を２０μＭ（体積１０μｌ）でインキュベートした。４０個の同一反応物を調製した。表５に示される時点で、各化合物につき４つの反応物に、５００μＭメナジオンとともに１０μｌのＬＤＲを加えた。以前に記載したように発光を測定した。４つの反応物のＲＬＵを平均化した（表５及び図２２ａ）。また、各平均シグナルをその化合物で得られた最大シグナルで除し、最大シグナルの割合を計算した（図２２ｂ）。
【表５】
2014526443.tif 000036
実施例３４．蛍光ＮＡＤＨ検出アッセイ
【０１８２】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、０μＭもしくは１０μＭのＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）又はＮＡＤＨの滴定（表８）と、１ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）又は１ｕ／ｍｌクロストリジウムジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに、各蛍光基質（ＰＢＩ−４４１２、４４１３、４４４０、及び４４４１）を９２０μＭ（体積１００μｌ）でインキュベートした。９６ウェル黒色プレートのウェルに室温で単一の反応物を調製した。蛍光プレートリーダーを使用して、それぞれ、４８５及び５２７の励起波長及び放出波長で、２時間にわたって蛍光をモニタリングした。表６及び図２３は、４つの化合物の各々を１０μＭ  ＮＡＤＨと、ラットジアホラーゼ又はクロストリジウムジアホラーゼのいずれかとともにインキュベートした場合、６０分で蛍光シグナル（ＦＬＵ）が増加することを示す。表７及び図２４ａ〜ｂは、１０ｕＭ  ＮＡＤＨを含む各基質の反応の経時変化を示す。表８及び図２５は、ラットジアホラーゼを含むＰＢＩ−４４４０及び４４１２の６０分でのＮＡＤＨの滴定を示す。
【表６】
2014526443.tif 000037
【表７】
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【表８】
2014526443.tif 000039
実施例３５．ＮＡＤＨの測定を介したデヒドロゲナーゼ活性の検出
【０１８３】
ＮＡＤＨの生成を評価することによってデヒドロゲナーゼの活性を測定するために、増加する量のデヒドロゲナーゼを含有する反応物を構築した。反応物は、０〜６０ｎＭに及ぶ濃度のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４２、Ｓｉｇｍａ）、１００μＭ  ＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）、及び１００μＭイソクエン酸（Ｓｉｇｍａ）を含有していた。反応物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液中、１００μｌの最終体積であった。室温で３５分のインキュベーション後、各反応物から３つの２５μｌアリコートを除去し、９６ウェル白色プレートのウェルに加えた。次いで、ラット（最終濃度５ｕ／ｍｌ）又はクロストリジウム（０．５ｕ／ｍｌ）ジアホラーゼと化合物ＰＢＩ  ４３１２（最終濃度２０μＭ）との混合物２５μｌを加えた。３０分室温に置いた後、５０μｌのＬＤＲを加え、２５分後にプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光を測定した。３通りのウェルからのシグナルを平均化した（表９、図２６ａ）。試料の平均シグナルを、０ｎＭイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含むウェルの平均シグナルで除すことにより、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を計算した（表９、図２６ｂ）。
【表９】
2014526443.tif 000040
実施例３６．ＮＡＤＨを測定することによるデヒドロゲナーゼ活性の検出
【０１８４】
この実施例は、ＮＡＤＨを測定することによって、デメチラーゼ酵素、リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）の活性が検出できることを示す。ホルムアルデヒドを生成するデメチラーゼ反応物をホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋と組み合わせることにより、ＮＡＤＨが生成され、本発明の方法によって検出することができる（図２７）。
【０１８５】
ＬＳＤ１（０〜２０ｕｇ／ｍｌ）を、Ｈ３Ｋ４（ｍｅ２、１００μＭ）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（シュードモナス、０．２５Ｕ／ｍｌ）、ＮＡＤ＋（０．２５ｍＭ）、クロストリジウムジアホラーゼ（０．５Ｕ／ｍｌ）、及び化合物ＰＢＩ  ４３１２（２０μＭ）と１×ＰＢＳ中で混合した。反応物を室温で３０分インキュベートした。１ｍＭメナジオンを含むＬＤＲを１：１で加え、３０及び６０分に発光を測定した。図２８は、Ｈ３Ｋ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（ＬＳＤ１のメチル化ペプチド基質（ヒストン３、リジン４））の脱メチル化形態）を含む及び含まない種々の濃度のＬＳＤ１の、３０及び６０分での平均ＲＬＵを示す。
実施例３７．同時のＮＡＤＨ検出及び光生成
【０１８６】
１０μＭから出発して、ＰＢＳ中にＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）の２倍段階希釈物を作製した。各希釈物２５ｕｌを３８４ウェルプレートのウェルに移した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）及び４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）に加えることにより検出試薬を作製した。ＮＡＤＨ試料に２５μｌの検出試薬を加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０１８７】
結果は、ジアホラーゼ酵素は検出試薬中で活性なままであり、ルシフェリン依存性の光発生ルシフェラーゼ反応と同時に、ジアホラーゼによるルシフェリン前駆体のルシフェリンへのＮＡＤＨ依存性還元が起こり得ることを示す（図２９）。
実施例３８．ＮＡＤの検出及び測定
【０１８８】
０．２５μＭから出発して、ＰＢＳ中にＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）の２倍段階希釈物を作製した。各希釈物２５μｌを３８４ウェルプレートのウェルに移した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、ならびに５Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及び４０ｍＭ乳酸（Ｓｉｇｍａ）から構成されるＮＡＤ依存性酵素増幅系をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）に加えることにより検出試薬を作製した。ＮＡＤ試料に２５μｌの検出試薬を加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０１８９】
次の実施例は、ＮＡＤを検出及び測定するためのルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ−４３１２の使用を示す。生成された発光はＮＡＤの存在を示唆し、光出力は、試料中に存在するＮＡＤの量に正比例する。結果は、ジアホラーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ酵素は検出試薬中で活性なままであり、３つ全ての酵素反応が同時に起こり得ることを示す（図３０Ａ）。
実施例３９．ＮＡＤＰの検出及び測定
【０１９０】
０．５μＭから出発して、ＰＢＳ中にＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）の２倍段階希釈物を作製した。各希釈物２５μｌを３８４ウェルプレートのウェルに移した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、ならびに０．５Ｕ／ｍｌグルコース６リンデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）及び５００μＭグルコース６ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）から構成されるＮＡＤＰ依存性酵素増幅系をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）に加えることにより検出試薬を作製した。ＮＡＤＰ試料に２５μｌの検出試薬を加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０１９１】
次の実施例は、ＮＡＤＰを検出及び測定するためのルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２の使用を示す。生成された発光はＮＡＤＰの存在を示唆し、光出力は、試料中に存在するＮＡＤＰの量に正比例する。結果は、ジアホラーゼ及びグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素は検出試薬中で活性なままであり、３つ全ての酵素反応が同時に起こり得ることを示す（図３０Ｂ）。
実施例４０．検出系の特異性
【０１９２】
０．３１３ｕＭから出発して、ＰＢＳ中にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ、及びＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）の２倍段階希釈物を作製した。各希釈物１０ｕｌを３８４ウェルプレートのウェルに移した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０ｕＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、ならびにグルコース−６リンデヒドロゲナーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及びグルコース−６Ｐ（０．５ｍＭ）（ＮＡＤＰの場合）又は乳酸デヒドロゲナーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及び乳酸（４０ｍＭ）（ＮＡＤの場合）から構成されるＮＡＤＰ又はＮＡＤ依存性酵素増幅系をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）に加えることにより検出試薬を作製した。１０ｕｌの適切な検出試薬をジヌクレオチド試料に加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０１９３】
結果は、本明細書に記載される検出方法をジヌクレオチド特異的増幅酵素系と組み合わせると、適切なジヌクレオチドを含有する試料においてのみ光が生成されることを示す（図３１）。
実施例４１．細胞中の還元されたＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ総量の検出
【０１９４】
１０％ＦＢＳを含むＦ１２Ｋ培地中にＰＣ３細胞の２倍段階希釈物を作製した。各希釈物２５ｕｌを３８４ウェルプレートのウェルに移した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）及び４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）に加えることにより検出試薬を作製した。２５μｌの検出試薬を直接細胞に加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０１９５】
図３２は、ルシフェリン前駆体の変換を介して生成された発光と細胞中に存在する還元されたジヌクレオチドＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの総量との間の直線的な関係を示す、細胞数と発光との間の相関を示す。また、この結果は、ルシフェラーゼ検出試薬（ＬＤＲ）と組み合わせたジアホラーゼ及びルシフェリン前駆体ＰＢＩ  ４３１２を含む検出系は、細胞中に存在する還元されたジヌクレオチドの量を測定するために直接細胞に加えることができることを示している。
実施例４２．細胞中の酸化及び還元されたジヌクレオチドの総量の検出
【０１９６】
１０％ＦＢＳを含むＦ１２Ｋ培地中にＰＣ３細胞の２倍段階希釈物を作製した。各希釈物２５ｕｌを３８４ウェルプレートのウェルに移した。ＮＡＤ／ＮＡＤＨの総量を測定するために、１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、５Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及び４０ｍＭ乳酸（Ｓｉｇｍａ）をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号  Ｖ８９２０）に加えることにより検出試薬を作製した。ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの総量を測定するために、１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、０．５Ｕ／ｍｌグルコース６リンデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、及び０．５ｍＭグルコース６ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号  Ｖ８９２０）  に加えることにより検出試薬を作製した。２５μｌの適切な検出試薬を細胞に加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０１９７】
結果は、増幅酵素系（増幅酵素＋その基質）、ジアホラーゼ、及びルシフェリン前駆体ＰＢＩ  ４３１２を含む検出系は、ルシフェラーゼ検出試薬試薬（ＬＤＲ）と組み合わせることができ、細胞中に存在するジヌクレオチドの量を測定するために直接細胞に加えることができることを示す。図３３は、細胞数と発光との間の相関を示しており、ルシフェリン前駆体の変換を介して生成された発光と細胞中に存在するＮＡＤ／ＮＡＤＨ（ａ）又はＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ（ｂ）の総量との間の直線的な関係を示唆している。
実施例４３．ＮＡＤ生合成の阻害のモニタリング
【０１９８】
３８４ウェルプレートのウェルに７．５×１０３細胞／１２．５μｌで細胞を播種した。細胞は、１０％ＦＢＳを含有する完全培地に播種した（Ｆ１２ＫにＰＣ３及びＡ５４９細胞；ピルビン酸を含まないＤＭＥＭにＨｅｌａ、ＭＤ−ＡＭＢ、及びＨＥＴ１１６細胞；Ｅ−ＭＥＭにＨｅｐＧ２細胞；ならびにＲＰＭＩにＪｕｒｋａｔ細胞）。各細胞株に適切な培地中でＦＫ８６６（ＮＡＤ生合成経路の既知の阻害剤）の２倍段階希釈物を作製し、１２．５ｕｌを細胞に加えた。ＣＯ2依存性インキュベーターに細胞を配置した。４８時間の処理後、プレートをインキュベーターから除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）中の１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ、４０ｕＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、１０Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ、及び４０ｍＭ乳酸から構成される検出試薬２５ｕｌを各ウェルに加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。データは、対照（阻害剤を含まない）と比較した阻害の割合（％）として示され、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１．０ソフトウェアとともに供給されるシグモイド用量反応曲線（可変勾配）用モデルを使用してプロットした。対照細胞と、最も高いＦＫ８６６濃度で処理した細胞との間のシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を計算した。
【０１９９】
結果は、本明細書に記載される方法を使用して、ＦＫ８６６によって誘発されるＮＡＤレベルの減少をモニタリングすることができることを示す（図３４）。
実施例４４．ラット赤血球からの総ＮＡＤ＋ＮＡＤＨの測定
【０２００】
等しい体積のラット全血（Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ）をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０８３（Ｓｉｇｍａ）の上に重ね、４００ｘｇで３０分遠心分離した。ペレット化された赤血球（ＲＢＣ）の上の上清を吸引した。ペレット化細胞をＰＢＳ＋５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で２回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中にＲＢＣを再懸濁した。等しい体積の段階希釈したＲＢＣと、１０Ｕ／ｍｌジアホラーゼ、４０ｕＭルシフェリン前駆体ＰＢＩ  ４３１２、８ｍＭ乳酸、及び１０Ｕ／ｍｌＬＤＨを含むＬＤＲ試薬を９６ウェルプレートのウェルに加え、室温で３０分インキュベートした。Ｔｕｒｎｅｒルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０２０１】
結果は、本明細書に記載される方法を使用して、赤血球中のＮＡＤ／ＮＡＤＨの総量を測定することができることを示す（図３５）。
実施例４５．薬物によって誘発される総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルの変化のモニタリング
【０２０２】
３８４ウェルプレートのウェルに、エネルギー源として２２ｍＭグルコース又は１０ｍＭガラクトースを含有する２５ｕｌのＲＰＭＩ培地中、５，０００細胞／ウェルでＨｅｐＧ２細胞を播種した。１ｕＭミトコンドリア毒素アンチマイシン又はロテノンで細胞を処理した。薬物処理から４及び２４時間後、２５ｕｌの適切な検出試薬を細胞に加えた。ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ検出試薬は、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中に、１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ、３２ｕＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、０．５Ｕ／ｍｌグルコース−６−リンデヒドロゲナーゼ、及び０．４ｍＭ  グルコース−６−ホスフェートを含有していた。ＮＡＤ／ＮＡＤＨ検出試薬は、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中に、１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ、３２ｕＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、１０Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ、及び４０ｍＭ乳酸を含有していた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。データは、未処理の細胞と比較した処理後の細胞に残るジヌクレオチドの割合（％）として示される。
【０２０３】
結果は、本明細書に記載される方法を使用して、薬物によって誘発される細胞のＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルの変化を測定することができることを示す（図３６）。
実施例４６．サイクリング反応：動態測定及びメナジオン添加後の測定
【０２０４】
ＰＢＳ中に５０μｌのＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）又はＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）希釈物を作製した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、５Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及び４０ｍＭ乳酸（Ｓｉｇｍａ）を、再構成したＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）に加えることによりＮＡＤ検出試薬を作製した。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、０．５Ｕ／ｍｌグルコース−６−リンデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、及び５００μＭ  グルコース−６−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を、再構成したＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号  Ｖ８９２０）に加えることによりＮＡＤＰ検出試薬を作製した。５０μｌの適切な検出試薬をＮＡＤ又はＮＡＤＰの希釈物に加えた。約５分ごとに発光をモニタリングした。２５分の時点で、１０μｌの２．７５ｍＭメナジオン（Ｓｉｇｍａ）を各希釈物の３つのウェルに加えた。５分及び１０分間隔で発光のモニタリングを続けた。各実験につき６個の複写を使用した。
【０２０５】
結果は、ジヌクレオチドの酸化型と還元型との間の反応サイクルが遊離ルシフェリンの放出をもたらすにつれ、時間とともに発光が増加することを示す。全てのルシフェリン前駆体がルシフェリンに変換されると、発光はそれ以上増加しない。所望の時点で加えられたメナジオンが光シグナルの生成を停止させ、それによって、後に光シグナルを読み取ることができる（図３７）。
実施例４７．還元されたジヌクレオチドの酸化の測定
【０２０６】
アッセイは２つのステップで行った。ＰＢＳ中に２０ｕＭ  ＮＡＤＰＨ及び２０ｕＭ  ＮＡＤＰの原液を作製し、酵素反応によるＮＡＤＰＨからＮＡＤＰへの返還を模倣するように異なる比率で混合した。例えば、４０％のＮＡＤＰ試料は６０％のＮＡＤＰＨを含有し、２０％のＮＡＤＰ試料は８０％のＮＡＤＰＨを含有する等であった。第１のステップにおいて、５ｕｌの０．５Ｎ  ＨＣｌを事前に作製した１０ｕｌのＮＡＤＰＨ−ＮＡＤＰ混合物に加え、試料を室温で３０分インキュベートした。１０Ｕ／ｍｌラットジアホラーゼ、４０ｕＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、０．５Ｕ／ｍｌグルコース−６−リンデヒドロゲナーゼ、及び０．５ｍＭ  グルコース−６−ホスフェートをＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔに加えることにより検出試薬を作製した。２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3及び１００ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3を含有する５ｕｌの緩衝液を２０ｕｌの検出試薬に加え、酸処理を行ったＮＡＤＰＨ−ＮＡＤＰ試料に調製した混合物を加えた。反応物を室温で３０分インキュベートし、Ｔｅｃａｎプレートルミノメーターを使用して発光を測定した。
【０２０７】
結果は、ジヌクレオチドの還元型は、酸処理によって選択的に破壊することができ、ＮＡＤに変換されたＮＡＤＰＨの量は、ＮＡＤの生成を測定することによって判定することができることを示す。このアッセイの感度は、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰへの５〜１０％の変換を検出することができる（図３８）。
実施例４８．酸化及び還元されたジヌクレオチドの混合物の酸抽出は、還元型を除去し、酸化型の測定を可能にする
【０２０８】
ＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）及びＮＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）の試料をＰＢＳ中１２５μＭ及び２５０μＭで調製した。等しい体積のＮＡＤ及びＮＡＤＨを混合して、両方のジヌクレオチドを含有する試料を調製した。各試料２０μｌを３８４ウェル白色ルミノメータープレートの８つのウェルに加えた。１０μｌの０．３Ｎ塩酸を８つのウェルのうちの４つに加えた。１５分後、１０μｌの０．３Ｎ水酸化ナトリウム塩基を加えて酸を中和した。このステップの後に、４０μｌのＮＡＤ検出試薬を加えた。酸処理を行わなかったウェルには、４０μｌのＮＡＤ検出試薬と、事前に混合した２０μｌの０．３Ｎ酸及び０．３Ｎ塩基とを入れた。ＮＡＤ検出試薬は、再構成したＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＤＲ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ８９２０）中の１０Ｕ／ｍｌジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、４０μＭルシフェリン前駆体基質ＰＢＩ  ４３１２、５ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及び４０ｍＭ乳酸（Ｓｉｇｍａ）であった。６０分に、Ｔｅｃａｎルミノメーターを使用して発光を測定した。表１０の結果は、酸処理はＮＡＤＨを破壊するが、ＮＡＤは破壊しないことを示す。これにより、ＮＡＤＨ及びＮＡＤの両方を含有する試料中のＮＡＤの測定が可能となる。ＮＡＤ対ＮＡＤＨの比率は、式：酸処理を行った試料からのシグナル／（酸処理を行わなかった試料からのシグナル−酸処理を行った試料からのシグナル）を用いて測定することができる。このデータの計算を表１１に示す。
【０２０９】
精製したジヌクレオチド試料に加えて、ＰＢＳ中の１０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞も１６ウェルに加えた。８ウェルには酸処理を行い、８ウェルは上記プロトコルに従わなかった。これらの試料の結果及び計算を表１２に示す。
【表１０】
2014526443.tif 000041
【表１１】
2014526443.tif 000042
【表１２】
2014526443.tif 000043
【０２１０】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記において、本発明を、その特定の好ましい実施形態に関連して説明し、例示の目的で多くの詳細を記載してきたが、当業者には、本発明がさらなる実施形態を受け入れることができ、本明細書に記載される詳細のうちのいくらかは、本発明の原則から逸脱することなく大幅に変更されてもよいことは明白であろう。
【図６ａ】
2014526443.tif 000048
【図６ｂ】
2014526443.tif 000049
【図６ｃ】
2014526443.tif 000050
【図６ｄ】
2014526443.tif 000051
【図７ａ】
2014526443.tif 000052
【図７ｂ】
2014526443.tif 000053
【図１３ａ（Ａ）】
2014526443.tif 000054
【図１３ａ（Ｂ）】
2014526443.tif 000055
【図１３ａ（Ｃ）】
2014526443.tif 000056
【図１３ｂ（Ａ）】
2014526443.tif 000057
【図１３ｂ（Ｂ）】
2014526443.tif 000058
【図２０】
2014526443.tif 000059
【図２５】
2014526443.tif 000060
【図１】
2014526443.tif 000061
【図２ａ】
2014526443.tif 000062
【図２ｂ】
2014526443.tif 000063
【図３ａ】
2014526443.tif 000064
【図３ｂ】
2014526443.tif 000065
【図３ｃ】
2014526443.tif 000066
【図３ｄ】
2014526443.tif 000067
【図４ａ】
2014526443.tif 000068
【図４ｂ】
2014526443.tif 000069
【図４ｃ】
2014526443.tif 000070
【図４ｄ】
2014526443.tif 000071
【図５】
2014526443.tif 000072
【図８ａ】
2014526443.tif 000073
【図８ｂ】
2014526443.tif 000074
【図８ｃ】
2014526443.tif 000075
【図８ｄ】
2014526443.tif 000076
【図９】
2014526443.tif 000077
【図１０】
2014526443.tif 000078
【図１１】
2014526443.tif 000079
【図１２】
2014526443.tif 000080
【図１４】
2014526443.tif 000081
【図１５ａ】
2014526443.tif 000082
【図１５ｂ】
2014526443.tif 000083
【図１６ａ】
2014526443.tif 000084
【図１６ｂ】
2014526443.tif 000085
【図１７】
2014526443.tif 000086
【図１８】
2014526443.tif 000087
【図１９ａ】
2014526443.tif 000088
【図１９ｂ】
2014526443.tif 000089
【図２１】
2014526443.tif 000090
【図２２ａ】
2014526443.tif 000091
【図２２ｂ】
2014526443.tif 000092
【図２３】
2014526443.tif 000093
【図２４ａ】
2014526443.tif 000094
【図２４ｂ】
2014526443.tif 000095
【図２６】
2014526443.tif 000096
【図２７】
2014526443.tif 000097
【図２８】
2014526443.tif 000098
【図２９】
2014526443.tif 000099
【図３０Ａ】
2014526443.tif 000100
【図３０Ｂ】
2014526443.tif 000101
【図３１】
2014526443.tif 000102
【図３２】
2014526443.tif 000103
【図３３】
2014526443.tif 000104
【図３４】
2014526443.tif 000105
【図３５】
2014526443.tif 000106
【図３６】
2014526443.tif 000107
【図３７】
2014526443.tif 000108
【図３８】
2014526443.tif 000109
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月22日(2014.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示される化合物。
2014526443.tif 000110
（Ｉ）
（式中、Ａは、生物発光レポーター部分であり、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、Ｃ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は−（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである。）
【請求項２】
次式（ＩＩ）、
2014526443.tif 000111
（ＩＩ）
で示される、請求項１に記載の化合物。
式中、
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ3-7環式環、アリール、ベンジル、又は置換ベンジル環、複素環、ヘテロアリール、及び−（ＣＨ2）n’−Ｐ（Ｐｈ）3であり、
Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、メチル、及びトリフルオロメチルから独立して選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は−（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
ｎ’は、２〜７の整数である。）
【請求項３】
次式（ＩＩＩ）、
2014526443.tif 000112
（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、メチル、及びトリフルオロメチルから独立して選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は−（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである。）又は
次式（ＩＶ）、
2014526443.tif 000113
（ＩＶ）
（式中、
Ｒ2は、−ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ5は、−ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ7は、−ＣＨ2−アリール又は−ＣＨ2−ヘテロアリールから選択され、
Ｒ14は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドであり、
Ｒ9及びＲ10は、Ｃ1-4アルキルから独立して選択され、
Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシル、ブロモ、クロロ、もしくはアミノから独立して選択されるか、又はＲ11及びＲ12は、縮合フェニル環を形成することができ、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、又は直接結合であり、
Ｌは、直接結合、又は−Ｃ6（Ｒ16）4ＣＨ2−、又は−（ＣＨ2）mＣ（Ｒ17）2（ＣＨ2）n−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ16は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
Ｒ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキルであるか、又は両方のＲ17が一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
Ｙは、Ｏ又はＮＲ15であり、
Ｒ15は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシルアルキル、Ｃ2-4アルコキシル、Ｃ2-4カルボン酸、又はＣ2-4アミドである。）
で示される請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
代謝的に活性な細胞試料の酸化還元状態を分析するための方法であって、
ａ．前記代謝的に活性な細胞試料を請求項１〜３に記載の化合物と接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物の少なくとも一部をルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、及び
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記代謝的に活性な細胞試料が、細胞、生理液、単離された細胞小器官、ミトコンドリアもしくはミトコンドリア複合体、又は酵素を含み、前記代謝的に活性な細胞試料が、任意に動物中に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物発光又は蛍光が、細胞生存率を示唆する、請求項４〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料中の細胞代謝産物を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を、請求項１〜３に記載の化合物、増幅酵素系、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｂ．前記試料を、任意に、ジアホラーゼ阻害剤と接触させる工程、
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記化合物、増幅酵素、ジアホラーゼ、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰが、単一組成物中に存在し、前記単一組成物が、任意に、ジアホラーゼ阻害剤を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞毒性、細胞生存率、又は細胞の酸化還元状態に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．細胞を試験化合物と接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、式（Ｉ）〜（Ｖ）による化合物、及び任意選択的に、ルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｃ．生物発光又は蛍光シグナルを検出することによって、前記シグナルは、前記化合物が前記細胞に及ぼす影響を示唆する、検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記細胞は、動物の中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物発光又は蛍光が、定量化される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ又は試料中のＮＡＤ又はＮＡＤＰを検出する方法であって、
ａ．前記試料を、請求項１〜３に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｂ．任意に、前記試料をジアホラーゼ阻害剤と接触させる工程、
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成する酵素の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を前記酵素の基質及びＮＡＤ又はＮＡＤＰと接触させて第１の混合物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、請求項１〜３に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｃ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
試料中のＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨを利用又は生成しない酵素の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記試料を前記酵素の基質と接触させて第１の混合物中に生成物を形成する工程、
ｂ．前記第１の混合物を、前記生成物を利用する酵素と接触させて第２の混合物を形成する工程、
ｃ．前記第２の混合物を、請求項１〜３に記載の化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる工程、
ｄ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
試料中のＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比率を測定する方法であって、
ａ．前記試料からＮＡＤ（Ｐ）及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを差次的に抽出する工程、
ｂ．各差次的に抽出した試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｃ．ｂ）の両方の反応物に、式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合物、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼ反応混合物を加える工程、
ｄ．任意に、前記試料の一方又は両方に、ジアホラーゼ阻害剤を添加する工程、
ｅ．両方の抽出した試料中の生物発光を測定する工程、
ｆ．２つの溶液のシグナルを比較して前記比率を測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
試料中の総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法であって、
ａ．前記試料を増幅酵素系と接触させる工程、
ｂ．ａ）の反応物に、ジアホラーゼ、式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合、及びルシフェラーゼ反応混合物を加える工程、
ｃ．任意に、ジアホラーゼ阻害剤を添加する工程、
ｄ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法
【請求項１７】
前記増幅酵素系は、増幅酵素及び前記増幅酵素の基質を含み、前記増幅酵素が、任意にデヒドロゲナーゼである、請求項７、１５及び１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅酵素系、ジアホラーゼ、及びルシフェラーゼの反応混合物は、単一組成物中に存在し、該単一組成物が、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を任意に含有し、かつ任意にジアホラーゼ阻害剤を含有する、７及び１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
試料中の総ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法であって、
ａ．前記試料を、増幅酵素、ジアホラーゼ、及び式（Ｉ）〜（ＩＶ）による化合物、及びルシフェラーゼ検出混合物と接触させる工程、
ｂ．生物発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
細胞中のＮＡＤ、もしくはＮＡＤＨ、もしくはＮＡＤＰ、もしくはＮＡＤＰＨ、又はそれらの任意の組み合わせの有無を検出するためあるいは量を測定するための方法であって、
ａ．前記細胞を、細胞溶解試薬及びルシフェラーゼ検出混合物と接触させる工程であって、前記細胞溶解試薬が、任意に、界面活性剤を含有する工程、 
ｂ．ａ）の前記混合物を請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程、
ｃ．生物発光を検出し、それによってＮＡＤ、もしくはＮＡＤＨ、もしくはＮＡＤＰ、もしくはＮＡＤＰＨ、又はそれらの任意の組み合わせの有無を検出することあるいは量を測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記ルシフェラーゼ検出混合物が、ジアホラーゼを含有し、前記ルシフェラーゼ検出混合物が、任意に酵素増幅系を含み、該酵素増幅系が、任意に、デヒドロゲナーゼを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物を含む、キット。
【国際調査報告】
2014526443.tif 000114
2014526443.tif 000115
2014526443.tif 000116