(57)【要約】  電位作動型カルシウムチャネルを標的にする治療剤、及びそのような治療剤を含む組成物が、電位作動型カルシウムチャネルを発現する造血細胞の機能をモジュレートするためのそのような作用物質及び組成物の使用と同様に提供される。標的の電位作動型カルシウムチャネルを発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する、所与の電位作動型カルシウムチャネルを標的にする作用物質をスクリーニングする方法も提供される。作用物質は、例えば、標的の電位作動型カルシウムチャネルの外部ドメインに結合し、したがってカルシウムチャネルの機能をモジュレートすることが可能である、抗体、アプタマー、ペプチド又は小分子であってよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣａＶ１スプライス変異体を発現する細胞の機能をモジュレートするための方法であって、細胞をＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する作用物質と接触させることを含み、ＣａＶ１スプライス変異体への作用物質の結合がＣａＶ１スプライス変異体の活性をモジュレートし、細胞が造血細胞である上記方法。
【請求項２】
ＣａＶ１スプライス変異体への作用物質の結合がＣａＶ１スプライス変異体の活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣａＶ１スプライス変異体への作用物質の結合がＣａＶ１スプライス変異体の活性を活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣａＶ１スプライス変異体がＣａＶ１．４スプライス変異体である、請求項１、２及び３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞がリンパ系の造血細胞である、請求項１、２、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞がＴ細胞である、請求項１、２、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞の機能がＴ細胞成熟を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞の機能が抗原結合を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞がＢ細胞である、請求項１、２、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞の機能がＢ細胞成熟を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の機能がＢＣＲによって誘導される活性化を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
作用物質が抗体又はアプタマーである、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、ＣａＶ１モジュレーターの有効量を対象に投与することを含み、ＣａＶ１モジュレーターが造血細胞で発現するＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに結合する上記方法。
【請求項１４】
造血細胞がリンパ系のものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
造血細胞がＴ細胞又はＢ細胞である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
作用物質が抗体又はアプタマーである、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
治療剤をスクリーニングする方法であって、
−  ＣａＶ１スプライス変異体を発現する造血細胞を試験作用物質と接触させるステップと、
−  試験作用物質がＣａＶ１スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップと
を含み、ＣａＶ１スプライス変異体の活性をモジュレートする試験作用物質が治療剤として同定される上記方法。
【請求項１８】
ＣａＶ１スプライス変異体がＣａＶ１．４スプライス変異体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
造血細胞がリンパ系のものである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
試験作用物質がＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに結合することが可能な作用物質である、請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
作用物質が抗体又はアプタマーである、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する作用物質の、Ｔ細胞機能をモジュレートするための使用。
【請求項２３】
Ｔ細胞機能がＴ細胞成熟を含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
Ｔ細胞機能が抗原結合を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２５】
Ｂ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する作用物質の、Ｂ細胞機能をモジュレートするための使用。
【請求項２６】
Ｂ細胞機能がＢ細胞成熟を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
Ｂ細胞機能がＢＣＲによって誘導される活性化を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
作用物質が抗体又はアプタマーである、請求項２２から２７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
対象において免疫応答を抑制する方法であって、ＣａＶ１．４阻害剤の有効量を対象に投与することを含み、ＣａＶ１．４阻害剤がＴ細胞及び／又はＢ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに結合する上記方法。
【請求項３０】
作用物質が抗体又はアプタマーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
免疫抑制剤をスクリーニングする方法であって、
−  ＣａＶ１．４スプライス変異体を発現するＴ細胞及び／又はＢ細胞を試験作用物質と接触させるステップと、
−  試験作用物質がＣａＶ１．４スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップと
を含み、ＣａＶ１．４スプライス変異体の活性を阻害する試験作用物質が免疫抑制剤として同定される上記方法。
【請求項３２】
試験作用物質がＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに結合することが可能な作用物質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
作用物質が抗体又はアプタマーである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
電位作動型カルシウムチャネルを発現する細胞の機能をモジュレートするための方法であって、細胞を電位作動型カルシウムチャネルに特異的に結合する作用物質と接触させることを含み、電位作動型カルシウムチャネルへの作用物質の結合がチャネルの活性をモジュレートし、細胞が造血細胞である上記方法。
【請求項３５】
対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、電位作動型カルシウムチャネルモジュレーターの有効量を対象に投与することを含み、モジュレーターが造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルに結合する上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬、特に、造血細胞で電位作動型カルシウムチャネル（ＣａＶ）機能をモジュレートする治療薬の分野、及びそれをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム（Ｃａ２＋）イオンは、事実上全ての細胞型で万能のセカンドメッセンジャーとして作用する。電位作動型カルシウム（ＣａＶ）チャネルは、様々な細胞型でＣａ２＋を伝導し、孔形成α１サブユニット、並びに少なくともα２サブユニット、δサブユニット、γサブユニット及びβサブユニットを含む複合体からなる。今では、ＣａＶチャネルは、様々な造血細胞を含む、伝統的に励起しやすいとみなされない多くの細胞に存在することが知られている。
【０００３】
哺乳動物では、電気生理及び薬理特性に基づいて１０個のＣａＶファミリーメンバーが５つのカテゴリー（Ｌ、Ｐ又はＱ、Ｎ、Ｒ、Ｔ）に分類されており、各々はおそらく異なる細胞シグナル伝達経路の役目をする。
【０００４】
マウス及びヒトＴ細胞でのＬ型（長期持続）ＣａＶチャネルの発現及び機能が記載されている（Kotturi et al., J. Biol. Chem. 278:46949-46960 (2003); Kotturi and Jefferies, Mol. Immunol. 42:1461-1474 (2005)）。Ｌ型ＣａＶチャネルの４つのサブタイプが公知である：ＣａＶ１．１、ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３及びＣａＶ１．４。Ｌ型ＣａＶチャネルは、様々な造血細胞で報告されている（総説については、Suzuki, et al., Molec. Immunol. 47:640-648 (2010)を参照）。
【０００５】
ＣａＶ１．４、Ｃａｃｎａ１ｆによってコードされるα１Ｃａ２＋チャネルサブユニットは、齧歯動物及びヒトの網膜、脾臓、胸腺、副腎、脊髄、骨髄、骨格筋及びＴ細胞で発現することが確認されている（Badou et al., PNAS USA 103:15529-15534 (2006); Jha et al., Nat. Immunol. 10:1275-1282 (2009); Kotturi et al., 2003, ibid; Kotturi and Jefferies, 2005, ibid; McRory et al., J. Neurosci. 24:1707-1718 (2004)）。
【０００６】
カルシウムシグナル伝達は、適応免疫で重要な役割を演ずることが公知である。Ｔ細胞への持続的なＣａ２＋流入を媒介する原形質膜チャネルの正体及び数は不明である（Kotturi et al., Trends Pharmacol. Sci. 27:360-367 (2006)）。流入の１つのよく特徴づけられた機構は、Ｃａ２＋遊離活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャネルを経由する（Oh-hora, Immunol. Rev. 231:210-224 (2009)）。リンパ球で作動する他の候補原形質膜Ｃａ２＋チャネルには、Ｐ２Ｘ受容体、一過性受容体電位（ＴＲＰ）カチオンチャネル、ＴＲＰバニロイドチャネル、ＴＲＰメラスタチンチャネル及び電位依存的Ｃａ２＋チャネル（ＶＤＣＣ）が含まれる。
【０００７】
ＣａＶ１．４カルシウムチャネルの２つのスプライス変異体が、ヒトＴリンパ球で同定された（Kotturi and Jefferies, 2005、同上）。ＣａＶチャネルのβ３サブユニットの不在下でのナイーヴＣＤ８＋Ｔリンパ球の欠陥性の生存が記載され、この欠陥はＣａＶ１．４サブユニットの枯渇と相関していた（Jha et al., 2009、同上）。
【０００８】
この背景情報は、出願人が本発明におそらく関連すると考える情報を知らせるために提供される。前出の情報のいずれも本発明に対して先行技術を構成することの承認を必ずしも意図するものではなく、そう解釈されるべきでもない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、電位作動型カルシウムチャネル機能をモジュレートするための方法及び組成物を提供することである。本発明の一態様によれば、電位作動型カルシウムチャネルを発現する細胞の機能をモジュレートするための方法であって、細胞を電位作動型カルシウムチャネルに特異的に結合する作用物質と接触させることを含み、電位作動型カルシウムチャネルへの作用物質の結合がチャネルの活性をモジュレートし、細胞が造血細胞である上記方法が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、ＣａＶ１スプライス変異体を発現する細胞の機能をモジュレートするための方法であって、細胞をＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する作用物質と接触させることを含み、ＣａＶ１スプライス変異体への作用物質の結合がＣａＶ１スプライス変異体の活性をモジュレートし、細胞が造血細胞である上記方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、電位作動型カルシウムチャネルモジュレーターの有効量を対象に投与することを含み、モジュレーターが造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルに結合する上記方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、ＣａＶ１モジュレーターの有効量を対象に投与することを含み、ＣａＶ１モジュレーターが造血細胞で発現するＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに結合する上記方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、治療剤をスクリーニングする方法であって、電位作動型カルシウムチャネルを発現する造血細胞を試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がチャネルの活性をモジュレートするかどうか判定するステップとを含み、チャネルの活性をモジュレートする試験作用物質が治療剤として同定される上記方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、治療剤をスクリーニングする方法であって、ＣａＶ１スプライス変異体を発現する造血細胞を試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がＣａＶ１スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップとを含み、ＣａＶ１スプライス変異体の活性をモジュレートする試験作用物質が治療剤として同定される上記方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、リンパ系又は骨髄系の細胞を含む造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルの外部ドメインに特異的に結合する作用物質の、細胞機能をモジュレートするための使用が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、Ｔ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する作用物質の、Ｔ細胞機能をモジュレートするための使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、対象において免疫応答を抑制する方法であって、ＣａＶ１．４阻害剤の有効量を対象に投与することを含み、ＣａＶ１．４阻害剤がＴ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに結合する上記方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、Ｂ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する作用物質の、Ｂ細胞機能をモジュレートするための使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、対象において免疫応答を抑制する方法であって、ＣａＶ１．４阻害剤の有効量を対象に投与することを含み、ＣａＶ１．４阻害剤がＢ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインに結合する上記方法が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、免疫抑制剤をスクリーニングする方法であって、ＣａＶ１．４スプライス変異体を発現するＴ細胞を試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がＣａＶ１．４スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップとを含み、ＣａＶ１．４スプライス変異体の活性を阻害する試験作用物質が免疫抑制剤として同定される上記方法が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、免疫抑制剤をスクリーニングする方法であって、ＣａＶ１．４スプライス変異体を発現するＢ細胞を試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がＣａＶ１．４スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップとを含み、ＣａＶ１．４スプライス変異体の活性を阻害する試験作用物質が免疫抑制剤として同定される上記方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、電位作動型カルシウムチャネルモジュレーターの有効量を対象に投与することを含み、モジュレーターが造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルに結合する上記方法が提供される。
【００２３】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面が参照される以下の詳細な説明でより明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｃａｃｎａ１ｆのｍＲＮＡの発現を示す図である。（Ａ）リンパ系組織並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞での野生型Ｃａｃｎａ１ｆのｍＲＮＡの発現の検出。（Ｂ）Ｃａｃｎａ１ｆ遺伝子の破壊は、野生型（＋／＋）マウスではなくＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）のＣａｃｎａ１ｆ胸腺転写産物の中でｌｏｘＰ部位を検出する（ターゲティングカセット）ＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認された。ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１５転写産物の検出は、試料負荷対照として用いられた。
【００２５】
【図２】ＣａＶ１．４欠損は、かすかな胸腺発生障害、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ球減少、並びに自発的Ｔ細胞免疫活性化をもたらすことを示す図である。（Ａ）ＷＴ（＋／＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）脾細胞の全細胞抽出物でのＣａＶ１．４タンパク質のイムノブロット分析を示す図。Ｗｅｒｉ網膜芽細胞腫細胞を、ＣａＶ１．４発現陽性対照として用いた。試料負荷の対照としてＧＡＰＤＨ  Ａｂ染色が提供される。（Ｂ）ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−脾臓Ｔ細胞上の表面タンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンセファロースビーズで免疫沈降させた。当量のタンパク質を、ＣａＶ１．４のＡｂでブロットした。等しい負荷を確認するために、同じブロット上の非特異的低分子サイズのバンドを用いた。（Ｃ）ＴＣＲβｈｉ及びＣＤ２４ｌｏ細胞での電子ゲーティングによって判定されるように、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−胸腺は、低減された割合の成熟ＳＰ胸腺細胞を発現する（等高線プロット上の長方形ゲート中に百分率を示す）。（Ｄ）ＣａＶ１．４欠損は、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞の割合を低減する。（Ｅ）ＷＴ（ｎ＝６）及び突然変異体（ｎ＝７）マウスに存在する様々な胸腺亜集団の存在度は、ＣＤ４及びＣＤ８のＡｂで染色することによって判定した。（Ｆ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスの脾臓、リンパ節（ＬＮ）及び血液を含む末梢リンパ器官は、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞の異常な比を提示する。各四半部の中に存在する細胞の百分率は、密度プロットの中に示す。（Ｇ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスの脾臓は、ＷＴと比較して大きく低減されたＴ細胞（ｎ≧６）及びＢ細胞（ｎ＝３）数を示す。ｙ軸は、ログスケールである。（Ｈ）脾臓のＣａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、急性活性化及びＴ細胞記憶のマーカーを発現する。エラーバーは、ＳＤを表す。＊＊ｐ＜０．０１。
【００２６】
【図３】胸腺細胞集団でのマーカーの発現を示す図である。野生型（灰色の陰影）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（細い黒線）ＤＰ、並びに成熟（ＴＣＲβｈｉ）ＳＰ胸腺細胞亜集団の上で発現するＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＲβ及びＣＤ６９の量。
【００２７】
【図４】Ｃａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）マウスのリンパ節（軸性、上腕、鼠径部及び腸間膜の集合）は、野生型（＋／＋）と比較して、大きく低減されたＴ細胞（ｎ≧６）及びＢ細胞（ｎ＝３）の細胞実質性を示すことを示す図である。エラーバーは、ＳＤを表す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２８】
【図５】Ｃａｖ１．４は、ナイーヴＴ細胞によるＴＣＲ及びタプシガルジンの両方によって誘導されるサイトゾル遊離Ｃａ２＋の上昇のために極めて必要とされることを示す図である。ＷＴ（＋／＋；赤線）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−；青線）脾細胞にＣａ２＋指示色素Ｆｌｕｏ−４及びＦｕｒａ  Ｒｅｄを負荷し、表面を染色し、ＲＰＭＩに懸濁した。色素負荷試料の変動の影響を最小化するために、細胞内のＣａ２＋の量を、経時的なＦｌｕｏ−４／Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（ＦＬ−１／ＦＬ−３）の中央比としてプロットした。（Ａ）ＣＤ４４ｌｏ及びＣＤ４４ｈｉのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を識別するために用いた電子ゲーティング（ボックス領域）は、等高線プロットの中に示す。（Ｂ）脾細胞をタプシガルジン（Ｔｇ）で刺激し、細胞外のＣａ２＋は、指示された時点でＥＧＴＡ添加によってキレート化した。（Ｃ）ビオチン化ＴＣＲ  Ａｂでプレコートした脾臓Ｔ細胞を、指示された時間（矢印でマークする）にストレプトアビジン（ＳＡ）又はイオノマイシン（Ｉｍ）で処理した。（Ｄ）ＴＣＲ刺激は、遊離の細胞外Ｃａ２＋の不在下で実施した。ＲＰＭＩ（約０．４ｍＭＣａ２＋）中の細胞外Ｃａ２＋をキレート化するために十分なＥＧＴＡ（０．５ｍＭ）を細胞懸濁液に加え、細胞取り込みを遮断した。
【００２９】
【図６】ＣａＶ１．４は、Ｃａ２＋制限の間の、ＴＣＲによって誘導されるサイトゾルの遊離Ｃａ２＋の上昇のために必要とされることを示す図である。（Ａ）カルシウム指示色素Ｆｌｕｏ−４及びＦｕｒａ  Ｒｅｄを負荷し、ＲＰＭＩに懸濁した野生型（＋／＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）の胸腺細胞（全体）を、ＲＰＭＩ（約０．４ｍＭ）に存在するＣａ２＋をキレート化するのに十分な細胞外のＥＧＴＡ（０．５ｍＭ）の存在下又は不在下でタプシガルジン（Ｔｈａｐｓｉ）で刺激した。色素負荷試料の変動の影響を最小化するために、サイトゾルのＣａ２＋の量を、経時的なＦＬ−１／ＦＬ−３の比としてプロットした。指示された時点で、細胞外のＣａ２＋（０．５ｍＭ）又はＥＧＴＡ（０．５ｍＭ）を刺激の途中で加えた。（Ｂ）胸腺亜集団の識別のためのＣＤ４及びＣＤ８  Ａｂで染色したＦｌｕｏ−４／Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ標識胸腺細胞を、細胞外ＥＧＴＡ（０．５ｍＭ）の存在下及び不在下でＴＣＲ  Ａｂで活性化した。過程の途中で、第２の刺激、細胞外のＣａ２＋（０．５ｍＭ）又はイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を試料に加えた。
【００３０】
【図７】Ｌ型ＣａＶ１．４チャネルは、ナイーヴＴ細胞の原形質膜を横切るＣａ２＋流入を媒介することを示す図である。（Ａ）ＴＣＲ活性化の後のＷＴ（＋／＋、ｎ＝７）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−；ｎ＝５）ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞で記録された内側へのバリウム電流の試料トレースを示す図。細胞は、−８０ｍＶの保持電位から＋１０ｍＶに５００ｍｓのステップ波によって脱分極させた。点線は、電流測定のベースラインを示す。（Ｂ）ＷＴとＣａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞との間の＋１０ｍＶでの電流密度比較を示す図。電流値は、各細胞の容量値に標準化される。（Ｃ）未処理のＷＴのＣＤ４４ｌｏＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ｎ＝８；ＣＤ８＋Ｔ細胞、ｎ＝８）と外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニットＡｂで前処理したＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞：ｎ＝７；ＣＤ８＋Ｔ細胞、ｎ＝６）との間の＋１０ｍＶでの電流密度比較を示す図。（Ｄ）外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニットＡｂは、ＣａＶ１．４を免疫沈降させる。外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニットＡｂによる免疫沈降は、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−脾細胞抽出物で実施し、その後ＣａＶ１．４特異的Ａｂでブロットした（実験手順を参照）。等しい負荷を検証するために、同じブロット上の非特異的低分子サイズのバンドを用いた。（Ｅ及びＦ）ＴＣＲ活性化の後のＷＴのＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に関する試料Ｉ−Ｖの関係は、ランプ波プロトコルで得られた。表示目的のために、電流トレースは、１ｋＨｚにフィルター処理した。（Ｅ）の上部はめ込みは、−８０ｍＶの保持電位からの２００ｍｓでの−１３０〜７０ｍＶの範囲にわたるランプ波プロトコルを示す。（Ｅ）及び（Ｆ）の実線は、改変ボルツマンの式Ｉ＝Ｇ（Ｖ−Ｅｒｅｖ）／（１＋ｅｘｐ（（Ｖａ−Ｖ）／Ｓ））による全細胞Ｉ−Ｖの関係の適合度を示し、式中、Ｉはピーク電流振幅であり、Ｇは最大勾配コンダクタンスであり、Ｖは試験電位であり、Ｅｒｅｖは逆転電位であり、Ｖａは半活性化電位であり、Ｓは勾配因子である。（Ｅ）及び（Ｆ）の下部はめ込みは、ＷＴのＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋（ｎ＝５）及びＣＤ８＋（ｎ＝５）Ｔ細胞から得られた標準化されたＩ−Ｖの関係の平均を表す。（Ｇ及びＨ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋（ｎ＝６）及びＣＤ８＋（ｎ＝６）Ｔ細胞に関する試料Ｉ−Ｖの関係は、上記のようにランプ波プロトコルで判定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。
【００３１】
【図８】ＣａＶ１．４機能は、Ｒａｓ−ＥＲＫ活性化及びＮＦＡＴ可動化を調節することを示す図である。（Ａ）活性化Ｒａｓは、ＴＣＲ  Ａｂ又はＤＡＧ類似体ＰＭＡのいずれかによる刺激後に、ＷＴ（＋／＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／）胸腺細胞でＲＡＦ−１−ＧＳＴプルダウンアッセイで測定した。同等のタンパク質発現を検証するために、全細胞溶解物（ＷＣＬ）を総Ｒａｓについてイムノブロットした。（Ｂ）総胸腺細胞を、指示された期間、ＴＣＲ  Ａｂで刺激した。ＥＲＫ及びＪＮＫ  ＭＡＰキナーゼのリン酸化は、イムノブロッティングで測定した。バンド強度をＯｄｙｓｓｅｙソフトウェアで定量化し、ホスホ−ＥＲＫ２／ＥＲＫ２、ホスホ−ＪＮＫ１／ＪＮＫ１の比を計算した。刺激されていないＷＴ胸腺細胞は、恣意的に１のスコアが与えられた。（Ｃ）特異的胸腺亜集団でＥＲＫシグナル伝達を評価するために、２分間のＴＣＲ  Ａｂ又はＰＭＡ処理のいずれかによる刺激の後のＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞でのＥＲＫ活性化を、フローサイトメトリーによって判定した。刺激されていない（灰色）、ＴＣＲで刺激された（黒色）、ＰＭＡで処理された（太字）細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、各ヒストグラムに示す。（Ｄ）ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスからの胸腺細胞を、ＣＤ３及びＣＤ２８  Ａｂ又は培地単独と一緒に１６時間インキュベートした。ＮＦＡＴｃ１のイムノブロッティングは、核及び細胞質の分画並びに全細胞溶解物（ＷＣＬ）で実施した。リン酸グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）又はヒストン脱アセチル化酵素−１（ＨＤＡＣ１）を、負荷対照として検出した。バンド強度を定量化し、上記のように比を計算した。
【００３２】
【図９】ＣａＶ１．４機能のためのＴ細胞の内在性の必要条件が、正常なＴ細胞ホメオスタシスのために必要とされることを示す図である。照射を受けたレシピエント宿主（Ｔｈｙ１．２＋Ｌｙ５．１＋）に、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−（−／−；Ｔｈｙ１．２＋Ｌｙ５．２＋）及び野生型（＋／＋；Ｔｈｙ１．１＋Ｌｙ５．２＋）骨髄を１：１の比で再移植した。（Ａ）胸腺及び脾臓でのＬｙ５．２＋細胞の起源を調査した（上部パネル）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−細胞（Ｔｈｙ１．２ゲート）は、野生型細胞（Ｔｈｙ１．１ゲート）と比較して低下した生存をレシピエントマウスで示した。Ｔｈｙ１マーカーを用いて、ドナーリンパ球を同定し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的割合を判定した（中央及び下のパネル）。各四半部の中に存在する細胞の百分率は、密度プロットの中に示す。（Ｂ）骨髄移植から１カ月後の宿主マウスの胸腺脾臓に存在するドナー野生型対突然変異体Ｔ細胞の百分率を示す図（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＤを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ドナーリンパ球集団でのＣＤ４４ｌｏ及びＣＤ４４ｈｉのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的割合を示す図。各四半部の中に存在する細胞の百分率は、密度プロットの中に示す。
【００３３】
【図１０】ＣａＶ１．４は、ナイーヴＴ細胞のホメオスタシスの重要な調節因子であることを示す図である。（Ａ）ＷＴ（＋／＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）マウスからの脾臓のＣＤ４＋ＴＣＲβ＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋のＴ細胞の上でのＣＤ４４発現を示す図。（Ｂ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは、ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋のＴ細胞の重大な低減を示す。（Ｃ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋のＴ細胞は、自然発生アポトーシス率の増加を示す。（Ｄ）ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋のＴ細胞の上でのＣＤ６２Ｌ発現を示す図。（Ｅ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋のＴ細胞は、ＩＬ−７Ｒαの低減された量を発現する。（Ｆ）ＣＤ４４ｌｏのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋のＴ細胞によるＢｃｌ−２発現は、細胞内フローサイトメトリーによって測定した。エラーバーは、ＳＤを表す。
【００３４】
【図１１】（Ａ）Ｃａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）ＣＤ４＋ＴＣＲβｈｉ及びＣＤ８＋ＴＣＲβｈｉのＳＰ胸腺細胞は、野生型（＋／＋）に対して増加した自然発生アポトーシス率を示すことを示す図である。指示されたゲートの中に存在する細胞の百分率を示す。（Ｂ）野生型（灰色の陰影）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（細い黒線）のＣＤ４＋ＴＣＲβｈｉ及びＣＤ８＋ＴＣＲβｈｉのＳＰ胸腺細胞の上のＣＤ１２７の量を示す図。野生型（上部）及び突然変異体集団（下部）について、平均蛍光強度をヒストグラムに示す。
【００３５】
【図１２】ＣａＶ１．４は、生存シグナル伝達及びホメオスタシスによって誘導されるＴ細胞増大を促進することを示す図である。（Ａ）ＷＴ（＋／＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）胸腺細胞を、ＩＬ−７の指示された濃度で５分間刺激し、ＳＴＡＴ５をリン酸化する能力についてその後評価した。ホスホ−ＳＴＡＴ５陽性の成熟ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞の頻度を、フローサイトメトリーで判定した。（Ｂ）図５Ａに示すように電子作動型（ＣＤ４４ｌｏ）のＷＴ（Ｔｈｙ１．１＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．１−）のナイーヴＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を細胞選別によって精製し、１：１：１：１の比で混合し、ＩＬ−７の指示された濃度で培養した。２４時間のインキュベーションの後、細胞生存は、Ａｌｅｘａ６４７とコンジュゲートさせたアネキシンＶで染色して判定した。（Ｃ）ＷＴ及び突然変異体のナイーヴＴ細胞を単離し、調製し、ＩＬ−７の代わりにＴＣＲ  Ａｂで刺激したこと以外は（Ｂ）のように培養した。２４時間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養の後に、生存力を評価した。（Ｄ〜Ｆ）ＷＴ（Ｔｈｙ１．１＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．１−）マウスからのナイーヴＴ細胞を精製し、１：１：１：１の比で混合し、ＣＦＳＥで標識し、Ｒａｇ１−／−宿主に同時注入した。（Ｄ）注入前のＷＴとＣａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。（Ｅ）ＣＦＳＥ希釈は、移されたＴ細胞の増殖を示す。ドットプロットの中のボックス領域は、自己ＭＨＣ分子及びＩＬ−７によって駆動される増殖を示す（ホメオスタシス）。（Ｆ）ＷＴ及び突然変異体ドナーのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるホメオスタシス増殖を示すヒストグラム。
【００３６】
【図１３】ＣａＶ１．４は、最適な抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答のために極めて必要とされることを示す図である。組換え体Ｌ．モノシトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）−ＯＶＡによる感染の７日後、ＷＴ（＋／＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−）マウスを屠殺し、抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を評価した。（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞集団でのＣＤ４４＋Ｈ−２Ｋｂ−ＯＶＡ四量体＋細胞の百分率を、密度プロットの中に示す。（Ｂ）抗原特異的ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均数を表す（ｎ＝３）。（Ｃ及びＤ）感染マウスからの脾細胞をＭＨＣクラスＩ（ＯＶＡ２５７〜２６４）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＬＬＯ１９０〜２０１）で制限されたペプチドで刺激し、その後ＩＦＮ−γ分泌について検査した。ＩＦＮ−γを分泌することが可能なＴ細胞の頻度を判定するために、脾細胞をＴＣＲ  Ａｂ単独で別々に刺激した。密度プロットの中の数は、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を表す。（Ｅ）ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−マウス（ｎ＝３）での抗原特異的ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞の平均数を示す累積データ。（Ｆ）感染マウスの脾臓からのＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、未処理かＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドでパルスした５１Ｃｒ標識ＲＭＡ−Ｓ標的と一緒にインキュベートした。エラーバーは、ＳＤを表す。＊ｐ＝０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３７】
【図１４】遮断抗体によるＣａＶ１の阻害は、細胞生存を低減することを示す図である。Ｃ５７ＢＩ／６脾細胞を、ＣａＶ１抗体と一緒（＋ＣａＶ１）か、それなしで（−ＣａＶ１）インキュベートした。２４時間後に、アネキシンＶで染色して生存力を評価した。アネキシンＶ陰性細胞とアネキシンＶ陽性細胞の比として、生存指数を計算した。エラーバーは、ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【００３８】
【図１５】遮断抗体によるＣａＶ１の阻害は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を低減することを示す図である。Ｃ５７ＢＩ／６脾細胞をＣＦＳＥで標識し、ＣａＶ１抗体のあり（＋ＣａＶ１）なし（−ＣａＶ１）で、プレート結合ＣＤ３ε（２０μｇ／ｍｌ）及びＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）抗体で５日間活性化した。ＣＦＳＥ希釈によって増殖を評価した。数は、増殖細胞の％を表す。
【００３９】
【図１６】ヒト電位依存的Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１Ｆ（ＣａＶ１．４）のアミノ酸配列を示す図（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５１７４）である。
【００４０】
【図１７】ヒト電位依存的Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１Ｆスプライス変異体（ＣａＶ１．４ａ）のヌクレオチド配列を示す図である。
【００４１】
【図１８】ヒト電位依存的Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１Ｆスプライス変異体（ＣａＶ１．４ｂ）のヌクレオチド配列を示す図である。
【００４２】
【図１９】（Ａ）ＣａＶ１．４ａスプライス変異体及び（Ｂ）ＣａＶ１．４ｂスプライス変異体の予測された膜トポロジーの模式図である。
【００４３】
【図２０】ヒト電位依存的Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１Ｆスプライス変異体（ＣａＶ１．４ａ）のアミノ酸配列を示す図である。
【００４４】
【図２１】ヒト電位依存的Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１Ｆスプライス変異体（ＣａＶ１．４ｂ）のアミノ酸配列を示す図である。
【００４５】
【図２２】ＣａＶ１．４欠損マウスは、骨髄で正常なＢリンパ球発生を示すことを示す図である。
【００４６】
【図２３】ＣａＶ１．４欠損マウスは、変更された脾臓Ｂリンパ球成熟を示すことを示す図である。
【００４７】
【図２４】ＣａＶ１．４の欠損は、変更された腹腔Ｂ細胞コンパートメントをもたらすことを示す図である。
【００４８】
【図２５】細胞内在性のＣａＶ１．４機能が、正常なＢ細胞発生のために必要とされることを示す図である。
【００４９】
【図２６】ＣａＶ１．４の欠損は、Ｂ細胞でのＢ細胞受容体及びタプシガルジンによって誘導されるＣａ２＋応答の障害をもたらすことを示す図である。
【００５０】
【図２７】ＣａＶ１．４の欠損は、Ｂ細胞受容体によって誘導されるミトコンドリアのＣａ２＋応答の障害をもたらすことを示す図である。
【００５１】
【図２８】ＣａＶ１．４欠損Ｂ細胞は、欠陥のあるＢ細胞受容体媒介活性化を示すことを示す図である。
【００５２】
【図２９】ＣａＶ１．４欠損Ｂ細胞は、低減されたＢ細胞受容体誘導増殖を示すことを示す図である。
【００５３】
【図３０】ＣａＶ１．４欠損脾臓Ｂ細胞は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）受容体の低減された発現及びＢＡＦＦに応じたより低い生存率を示すことを示す図である。
【００５４】
【図３１】ＣａＶ１．４欠損マウスは、ＴＮＰ−フィコール、Ｔ細胞非依存性２型抗原による免疫化の後、抗体応答の障害を発生させることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、電位作動型カルシウムチャネル、例えばＬ型カルシウムチャネルα１サブユニット（ＣａＶ１）の活性及び／又は発現のモジュレーションが、チャネルを発現する細胞の活性を改変することができるとの、本明細書に記載される知見に関する。異なる細胞型は異なる型の電位作動型カルシウムチャネルを発現するので、対象の細胞型によって発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にするように作用物質を設計することができ、これらの細胞の活性を特異的にモジュレートするために用いることができる。例えば、異なる細胞型はＣａＶ１の異なるサブタイプ及びスプライス形を発現するので、対象の細胞型によって発現するスプライス変異体を標的にするように作用物質を設計することができ、これらの細胞の活性を特異的にモジュレートするために用いることができる。
【００５６】
カルシウムチャネルの機能をモジュレートし、したがってチャネルを発現する細胞の活性を改変するために、それに限定されないがＣａＶ１チャネルを含む電位作動型カルシウムチャネルを、カルシウムチャネルの外部ドメイン領域に結合する作用物質の標的にすることができる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、電位作動型カルシウムチャネルの外部ドメインを標的にする作用物質、及び電位作動型カルシウムチャネルを発現する細胞の機能をモジュレートするためのそのような作用物質の使用を提供する。例えば、特定の実施形態では、本発明は、ＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインを標的にする作用物質、及び標的のスプライス変異体を発現する細胞の機能をモジュレートするためのそのような作用物質の使用を提供する。本発明の特定の実施形態は、カルシウムチャネルを発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する所与の電位作動型カルシウムチャネルを標的にする作用物質をスクリーニングする方法も提供する。例えば、本発明の特定の実施形態は、標的のスプライス変異体を発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する所与のＣａＶ１スプライス変異体を標的にする作用物質（「ＣａＶ１モジュレーター」）をスクリーニングする方法を提供する。作用物質は、例えば、それに限定されないがＣａＶ１スプライス変異体を含む、標的の電位作動型カルシウムチャネルの外部ドメインに結合し、したがってカルシウムチャネルの機能をモジュレートすることが可能である、抗体、アプタマー又は小分子であってよい。特定の実施形態では、これらの方法、使用及び組成物は、造血細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞及び／又はナチュラルキラー細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルに関する。特定の実施形態では、これらの方法、使用及び組成物は、造血細胞、例えばＴ細胞及び／又はＢ細胞で発現するＣａＶ１スプライス変異体に関する。
【００５７】
例として、特定の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞（ＣａＶ１．４など）で発現するＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインを標的にする作用物質、及びＴ細胞の活性をモジュレートするためのそのような作用物質の使用を提供する。他の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞（ＣａＶ１．４など）で発現するＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインを標的にする作用物質、及びＢ細胞の活性をモジュレートするためのそのような作用物質の使用を提供する。
【００５８】
それらに限定されないがリンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞）、単球、マクロファージ及び肥満細胞を含む１つ又は複数の型の造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にして、チャネルの活性を阻害する作用物質は、例えば移植拒絶反応の危険を減少させるための自己免疫疾患の処置で、及び免疫系の抑制を必要とする他の障害の処置、例えばアレルギーの処置で適用される、免疫抑制剤として例えば有益であろう。例えば、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞で発現するＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインを標的にして、チャネルの活性を阻害する作用物質は、例えば移植拒絶反応の危険を減少させるための自己免疫疾患の処置で、及び免疫系の抑制を必要とする他の障害の処置で適用される、免疫抑制剤として例えば有益である。別の例では、肥満細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にして阻害する作用物質は、マスト脱顆粒を阻害することができ、したがってアレルギーの処置で有益であろう。
【００５９】
特定の他の実施形態では、それに限定されないがＣａＶ１チャネルを含む電位作動型カルシウムチャネルの活性を刺激する作用物質及び方法が提供される。そのような作用物質及び方法は、がんの処置及び／又は免疫抑制の処置で有益であろう。
【００６０】
特定の他の実施形態では、細胞で電位型チャネルの発現を増加又は減少させる作用物質及び方法が提供される。例えば、それに限定されないがＣａＶ１チャネルを含む電位型チャネルを発現するポリヌクレオチド及びこれらのポリヌクレオチドを含むベクターを、ＣａＶ１チャネルの発現を増加させるために用いることができる。
【００６１】
或いは、それに限定されないがＣａＶ１チャネルを含む電位作動型カルシウムチャネルに特異的なアンチセンスを発現するポリヌクレオチドを、チャネルの発現を減少させるために用いることができる。
【００６２】
定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００６３】
ＣａＶ１スプライス変異体に関して本明細書で用いられ場合、用語「抗体」は、ＣａＶ１スプライス変異体に特異的に結合するか、免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子（又はその組合せ）を指し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作された抗体及び他の方法で改変された形の抗体、例えば、それらに限定されないがキメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（二重特異的抗体、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディなど）、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ＣａＶ１スプライス変異体への特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチド、及び抗体の抗原結合断片が含まれる。抗体断片には、タンパク分解性抗体断片（Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ及びｒＩｇＧなど）、組換え体抗体断片（ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異的ｓＦｖ断片、二重特異的ｄｓＦｖ断片、ダイアボディ及びトリアボディなど）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ラクダ抗体（例えば、米国特許第６，０１５，６９５号；第６，００５，０７９号；第５，８７４，５４１号；第５，８４０，５２６号；第５，８００，９８８号；及び第５，７５９，８０８号を参照）、並びに、軟骨及び硬骨魚によって生成される抗体、及び単離されたその結合ドメイン（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０３０１４１６１号を参照）が含まれる。
【００６４】
用語「キメラ抗体」は、本明細書で用いる場合、別の宿主種からの定常領域の少なくとも一部に連結している、１宿主種からの可変領域の全体又は一部を含むポリペプチドを指す。
【００６５】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒト抗体の改変可変領域を含むポリペプチドを指し、そこで、可変領域の一部はヒト以外の種からの対応配列で置換され、改変可変領域は、ヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結される。一実施形態では、可変領域の一部は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の全体又は一部である。この用語は、ヒト以外の抗体の可変領域又は１つ若しくは複数のＣＤＲを、そのハイブリッド抗体が所望の生物学的活性（すなわち、ＣａＶ１タンパク質に特異的に結合する能力）を示す限り、起源種、タンパク質の種類、免疫グロブリンのクラス又はサブクラス呼称に関係なく、異種タンパク質（単数又は複数）とスプライシングすることによって生成されるハイブリッド抗体も含む。
【００６６】
用語「二重特異的抗体」は、本明細書で用いる場合、１つの抗原部位に特異性を有する第１のアーム及び異なる抗原部位に特異性を有する第２のアームを含む抗体、すなわち二重特異性を有する二官能性抗体を指す。
【００６７】
用語「阻害する」は、本明細書で用いる場合、所与の活性又は機能を低下又は阻止することを意味する。本発明の特定の実施形態によれば、作用物質の存在下で起こる活性又は機能のレベルが、その作用物質がない場合のレベルと比較して少なくとも１０％低下するとき、その作用物質はその活性又は機能を阻害するとみなされる。一部の実施形態では、作用物質の存在下で起こる活性又は機能のレベルが、その作用物質がない場合のレベルと比較して、少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％低下するとき、その作用物質はその活性又は機能を阻害するとみなされる。
【００６８】
本明細書で互換的に用いられるように、用語「療法」及び「処置」は、対象の状態を改善する目的で実施される介入を指す。改善は主観的又は客観的であってよく、処置される疾患に付随する症状を寛解すること、その発生を予防すること、又はその病状を変えることに関係する。したがって、用語療法及び処置は最も広い意味で用いられ、様々な段階の疾患の予防（防止）、緩和、低減及び治癒を含む。対象の状態の悪化を防止することも、本用語に包含される。したがって、療法／処置を必要とする対象には、疾患を既に有している対象、並びにその疾患を起こしやすいか起こす危険のある対象、及び疾患を予防すべき対象が含まれる。
【００６９】
用語「寛解」には、処置する疾患又は障害の症状、徴候及び特徴の１つ又は複数の、一時的又は長期的な阻止、予防、低下又は改善が含まれる。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「対象」及び「患者」は、処置を必要とする動物、例えば哺乳動物又はヒトを指す。
【００７１】
本明細書で用いるように、用語「約」は、所与の値からのおよそ±１０％の変動を指す。そのことが具体的に言及されているか否かを問わず、そのような変動は本明細書で提供される任意の所与の値に常に含まれることを理解すべきである。
【００７２】
本明細書で用語「含む」と一緒に用いられるとき、前置詞「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味することがあるが、それは「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は１つを超える」の意味にも一致する。
【００７３】
本明細書で用いるように、単語「含んでいる（comprising）」（及びその文法上の変異形、例えば「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」）、「有している（having）」（及びその文法上の変異形、例えば「有する（have）」及び「有する（has）」）、「含んでいる（including）」（及びその文法上の変異形、例えば「含む（includes）」及び「含む（include）」）又は「含有している（containing）」（及びその文法上の変異形、例えば「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」）は包括的でオープンエンドであり、列挙されていないさらなる要素又は方法ステップを排除しない。
【００７４】
本明細書で論じられるいかなる実施形態も、本発明の任意の方法、使用又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同じであると考えられる。さらに、本発明の方法及び使用を達成するために、本発明の組成物を用いることができる。
【００７５】
電位作動型カルシウムチャネル
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、ヒト電位依存的カルシウムチャネルである。本発明の特定の実施形態によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、造血細胞で発現するヒト電位依存的カルシウムチャネルである。本発明の特定の実施形態によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、ヒト電位依存的Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１（ＣａＶ１）である。電位作動型カルシウムチャネルは、様々な細胞型で発現する。例えば、ＣａＶ１は、網膜、脾臓、胸腺、副腎、脊髄、骨髄及び骨格筋を含むいくつかの異なる組織で発現する。本発明の一態様によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、それらに限定されないが、造血細胞、例えば骨髄系からの細胞（単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、肥満細胞及び樹状細胞を含む）及びリンパ系からの細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む）で発現するＣａＶ１スプライス変異体（例えば、ＣａＶ１．１、ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３又はＣａＶ１．４スプライス変異体）を含む、電位作動型カルシウムチャネルである。
【００７６】
それらに限定されないがＣａＶ１（ＣａＶ１．１、ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３及びＣａＶ１．４）のサブタイプを含む様々な電位作動型カルシウムチャネルのアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、これらのタンパク質の様々なスプライス形のアミノ酸配列と同様にＧｅｎＢａｎｋ及び文献から入手できる。
【００７７】
例えば、ＣａＶ１．４の網膜形は、受託番号ＮＰ＿００５１７４の下でＧｅｎＢａｎｋに参照配列として掲載されている（図１６）。Ｔ細胞で発現するＣａＶ１．４ａ及びＣａＶ１．４ｂを含む、このタンパク質の様々なスプライス形が同定されている（Kotturi & Jefferies, 2005, Molec. Immunol. 42:1461-1474）。ＣａＶ１．４ａ及びＣａＶ１．４ｂの配列は、それぞれ図２０及び２１として本明細書で提供される（それぞれＣａＶ１．４ａ及びＣａＶ１．４ｂのヌクレオチド配列を提供する、図１７及び１８も参照）。
【００７８】
対象の細胞型で発現する、それに限定されないがＣａＶ１スプライス変異体を含む電位作動型カルシウムチャネルの配列が未知の場合は、それは当技術分野で公知の方法で容易に判定することができ、様々な一般テキストで記載される（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York, NY, 1992 (and Supplements to 2000)；Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999を参照）。例えば、標準の技術を用いて、対象の細胞型を含む組織からｃＤＮＡライブラリーを生成することができる。或いは、ｃＤＮＡライブラリーは、様々な民間供給業者（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃａ．；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ．）の１つから得ることができる。それに限定されないが対象のＣａＶ１サブタイプを含む電位作動型カルシウムチャネルをコードする配列は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＰＣＲ増幅及び配列決定技術、例えばＰＣＲ又はネステッドＰＣＲを用いて、３’及び５’末端からの一般的なプライマーを用いて転写産物を増幅することを含む、ディープシークエンシングを利用することによって単離することができる。
【００７９】
特定の実施形態では、対象の細胞型で発現する、それに限定されないがＣａＶ１スプライス変異体を含む電位作動型カルシウムチャネルを同定するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＤＮＡ配列決定技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．）の使用が企図される。この技術は、効率的で集中した集団ベースの戦略を通してスプライス変動を評価するための、ハイスループットで費用効果がよいアプローチを提供する。
【００８０】
本発明の一態様によれば、治療剤はＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメイン領域を標的にする。外部ドメインの同定を含むＣａＶ１のトポロジーが予測されている（例えば、Kotturi, et al., (2006)、同上及びSuzuki, et al., (2010)、同上を参照）。
【００８１】
ＣａＶ１の特定のスプライス変異体の外部ドメインが、同定されている。例えば、スプライス変異体ＣａＶ１．４ａ及びＣａＶ１．４ｂのチャネルトポロジーが提案されており（Kotturi and Jefferies (2005)同上）、それを図１９Ａ及びＢに示す。
【００８２】
選択されたスプライス変異体の外部ドメインは、必要に応じて標準の予測的コンピューター方法によって同定することができる（例えば、Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, J. Wiley & Sons, New York, NYを参照）。或いは、外部ドメインは、様々な表面マッピング技術によって、例えば、抗体（単数又は複数）が結合するペプチドエピトープを判定し、このように、細胞の表面で見出されるスプライス変異体の配列を同定するために、ＣａＶ１スプライス変異体を発現する未透過性化細胞に結合することが可能な抗体を、ＣａＶ１スプライス変異体からのペプチドライブラリーと比較することによって同定することができる。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、リンパ系からの造血細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を含む）で発現するＣａＶ１スプライス変異体である。一部の実施形態では、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、造血細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体である。一部の実施形態では、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、リンパ系からの造血細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を含む）で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体である。
【００８４】
治療剤
本発明の一の態様は、電位作動型カルシウムチャネルの発現又は活性をモジュレートする治療剤を提供する。特定の実施形態では、造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルの発現又は活性をモジュレートする治療剤が提供される。特定の実施形態では、ＣａＶ１の発現又は活性をモジュレートする治療剤（「ＣａＶ１モジュレーター」）が提供される。特定の実施形態では、治療剤はＣａＶ１に結合してその活性をモジュレートする。特定の実施形態によれば、治療剤はＣａＶ１タンパク質の外部ドメインを標的にし、したがって細胞の表面で作用する。適する治療剤の例には、それらに限定されないが、抗体、アプタマー、合成抗体、合成抗体代用品、ポリペプチド、ペプチド及び小分子治療薬が含まれる。一実施形態では、本発明は、「生物学的製剤」、例えば抗体、アプタマー、阻害ペプチドなどである、ＣａＶ１の活性を標的にしてモジュレートする治療剤を提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチド又はベクターが、抗体、アプタマー、ポリペプチド及びペプチドなどの治療剤を発現する。
【００８５】
本発明の特定の実施形態では、治療剤は、電位作動型カルシウムチャネルの活性を阻害する作用物質である。本発明の特定の実施形態では、治療剤は、ＣａＶ１の活性を阻害する作用物質（「ＣａＶ１阻害剤」）である。これらの作用物質は、ＣａＶ１に結合してその活性を阻害することができる。本発明の特定の実施形態では、治療剤は、電位作動型カルシウムチャネルの活性を活性化する作用物質である。一部の実施形態では、治療剤は、ＣａＶ１の活性を活性化する作用物質（「ＣａＶ１活性化剤」）である。これらの作用物質は、ＣａＶ１に結合してその活性を活性化することができる。
【００８６】
本発明の特定の実施形態では、治療剤は、標的の電位作動型カルシウムチャネルに選択的に結合する抗体である。本発明の特定の実施形態では、治療剤は、標的のＣａＶ１スプライス変異体に選択的に結合する抗体である。抗体は、標的のＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに選択的に結合することができる。本明細書で用いるように、用語「選択的に結合する」は、１つの化合物と別の化合物との特異的結合（例えば、抗体とＣａＶ１タンパク質）を指し、そこにおいて、標準のアッセイ（例えば、イムノアッセイ）で測定される結合のレベルは、アッセイのバックグラウンド対照より統計学的に有意に高い。例えば、イムノアッセイを実施する場合、対照は、抗体だけ（例えば、標的タンパク質がない場合）を含有する反応ウェル／管を含むことができ、そこで、標的タンパク質がない場合の抗体による反応性（例えば、ウェル／管への非特異的結合）の量は、バックグラウンドとみなされる。
【００８７】
結合は、それらに限定されないが以下を含む当技術分野で標準の様々な方法を用いて測定することができる：ウェスタンブロット、イムノブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＭＡ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光性偏光、リン光、免疫組織化学的分析、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化法飛行時間型質量分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、鏡検、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）及びフローサイトメトリー。
【００８８】
ＣａＶ１スプライス変異体などの電位作動型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知の様々な標準方法によって生成することができる。例えば、投与されるタンパク質に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生成を誘導するために、ＣａＶ１スプライス変異体又はその断片をウサギ、マウス、ラットなどの適する宿主動物に投与することによって、ポリクローナル抗体を生成することができる。宿主種に従い、免疫学的応答を増加させるために、当技術分野で公知の様々なアジュバントを所望により用いることができ、そのようなアジュバントには、フロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）及びコリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ、組換え又はファージディスプレイ技術、又はその組合せを用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)で教示されるものなどのハイブリドーマ技術を用いて生成することができる。
【００９０】
例として、マウスは、ＣａＶ１スプライス変異体若しくはその断片、又はＣａＶ１スプライス変異体若しくは断片を発現する細胞で免疫化することができる。免疫応答が、例えばマウス血清中のＣａＶ１スプライス変異体又は断片に特異的な抗体を検出することによって検出されると、マウス脾臓を収集し、脾細胞を単離する。次に、周知の技術によって脾細胞を適する骨髄腫細胞と融合する。限界希釈によってハイブリドーマを選択し、クローニングする。次に、ＣａＶ１スプライス変異体又は断片に結合することが可能な抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によってハイブリドーマクローンを検定する。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することによって、高レベルの抗体を一般に含有する腹水液を生成することができる。
【００９１】
ＣａＶ１スプライス変異体などの電位作動型カルシウムチャネルの特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって生成することができる。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片の生成のため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片の生成のため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断によって生成することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【００９２】
抗体は、例えば、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ方法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面で提示される。そのようなファージは、レパートリー又は組合せ抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現する抗原結合性ドメインを提示するために利用することができる。ＣａＶ１スプライス変異体に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、例えば標識されたタンパク質若しくは断片、又は固体表面又はビーズに結合するか捕捉されるタンパク質若しくは断片を使用して、ＣａＶ１スプライス変異体又はその断片を用いて選択又は同定することができる。一般的に、これらの方法で用いられるファージは、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換えで融合されるＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現するｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。用いることができるファージディスプレイ方法の例には、例えば、Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995)；Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995)；Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994)；Persic et al., Gene 187 9-18 (1997)；Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994)；国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２及びＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号及び第５，９６９，１０８号に記載されているものが含まれる。
【００９３】
ファージ選択の後、ヒト抗体又は所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成するために、ファージからの抗体コード領域を単離して用いることができ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む適当な宿主細胞で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換えで生成する技術が、国際特許出願公開第ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992)；Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995)；及びBetter et al., Science 240:1041-1043 (1988)に記載されている。
【００９４】
単鎖Ｆｖ及び抗体を生成するために用いることができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991)；Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993)；及びSkerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)に記載されているものが含まれる。
【００９５】
キメラ抗体の生成方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985)；Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989)及び米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号及び第４，８１６，３９７号を参照。
【００９６】
ヒト化抗体は、ヒト以外の種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合するヒト以外の種の抗体からの抗体分子である。しばしば、標的タンパク質又はタンパク質断片への結合を変更、好ましくは向上させるために、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知である方法によって、例えば、結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデル化、及び特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号及びRiechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ−グラフト（国際特許出願公開第ＷＯ９１／０９９６７及び米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又はリサーフェシング（Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)及びRoguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)）、及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野で公知の様々な技術を用いてヒト化することができる。
【００９７】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて、上記のファージディスプレイ方法を含む当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９１／１０７４１も参照されたい。
【００９８】
ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生成することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚性幹細胞にランダムに、又は相同組換えによって導入することができる。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えてヒト可変領域、定常領域及び多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入で別々に、又は同時に非機能性にすることができる。詳細には、ＪＨ領域のホモ接合の欠失は、内因性の抗体産生を防止する。キメラマウスを生成するために、改変された胚性幹細胞を増殖し、胚盤胞に微量注入する。次に、ヒト抗体を発現するホモ接合の子孫を生成するようにキメラマウスを繁殖させる。ＣａＶ１スプライス変異体又はその断片で、トランスジェニックマウスを標準の様式で免疫化する。ＣａＶ１スプライス変異体又は断片に対するモノクローナル抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが抱えるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成され、その後クラススイッチング及び体細胞突然変異を経る。したがって、そのような技術を用いて、治療的に有益なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概要については、Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術並びにそのような抗体を生成するためのプロトコルの詳細な論述については、例えば国際特許出願公開第ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号及び第５，９３９，５９８号を参照。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａ．）及びＧｅｎｐｈａｒｍ（ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａ．）などの会社と、選択されたタンパク質に対するヒト抗体を上記のものと類似した技術を用いて提供するように契約することができる。
【００９９】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することもできる。このアプローチでは、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために、マウス抗体などの選択されたヒト以外のモノクローナル抗体が用いられる（Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)を参照）。
【０１００】
一部の実施形態では、本発明によって企図される抗体には、追加の分子がその標的タンパク質への抗体の結合を防止しないような方法で、抗体への追加の分子の共有結合によって改変される誘導体が含まれる。例として、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク分解性切断、又は細胞性リガンド若しくは他のタンパク質への連結によって改変された抗体を含めることができる。１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含む抗体を含む誘導体も、一部の実施形態で企図される。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態では、治療剤は、ＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに選択的に結合するアプタマーである。アプタマーは、ＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインに選択的に結合することができる。アプタマーには、特異的な配列依存性の形状を呈し、高い親和性及び特異性で標的タンパク質に結合する、一本鎖核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）が含まれる。アプタマーは、一般に１００ヌクレオチド以下の長さ、例えば７５ヌクレオチド以下、又は５０ヌクレオチド以下の長さである（例えば約１０〜約１００ヌクレオチド、又は約１０〜約５０ヌクレオチド）。一部の実施形態では、アプタマーは、鏡像アプタマー（ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ（商標）とも呼ばれる）であってよい。鏡像アプタマーは、Ｄ−オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）と比較して酵素的分解に高い抵抗性を示す、高親和性Ｌ−鏡像異性核酸（例えば、Ｌ−リボース又はＬ−２’−デオキシリボース単位）である。アプタマー及び鏡像アプタマーの標的結合特性は、例えばWlotzka et al., PNAS 99(13):8898-90 (2002)に記載されているように、オリゴヌクレオチドのランダムなプールから出発するｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法によって設計される。
【０１０２】
一部の実施形態では、アプタマーはペプチドアプタマーであってよい。ペプチドアプタマーは、タンパク質足場に両端で結合するペプチドループ（例えば、ＣａＶ１スプライス変異体に特異的である）を含む。この二重構造制約は、抗体結合のそれと同等のレベルまで、ペプチドアプタマーの結合親和性を大きく増加させる。可変ループ長は一般的に約８〜約２０アミノ酸（例えば、約８〜約１５又は約８〜約１２アミノ酸）であり、足場は、好適には安定し、可溶性で、小さく、非毒性のタンパク質である。適するタンパク質の例には、それらに限定されないが、チオレドキシン−Ａ、ステフィンＡ三重突然変異体、緑色蛍光性タンパク質、エグリンＣ又は細胞性転写因子Ｓｐ１である。ペプチドアプタマーは、異なる系、例えば酵母−２ハイブリッド系（例えば、Ｇａｌ４酵母−２ハイブリッド系）又はＬｅｘＡ相互作用トラップ系を用いて選択することができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、治療剤は合成抗体又は合成抗体代用品であり、その両方は当技術分野で公知の方法によって調製することができる（例えば、Sidhu and Fellouse, Nature Chemical Biology 2:682-688 (2006)を参照）。合成抗体代用品は、一般にペプチドをベースとする。
【０１０４】
特定の実施形態では、治療剤は、例えば当技術分野で公知であるファージディスプレイ又は酵母２−ハイブリッド技術によって同定することができる、結合ペプチドである。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態は、例えば市販の組合せライブラリー又は天然物ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる小分子である治療剤を提供する。
【０１０６】
治療剤は、標準の技術、例えば「治療剤をスクリーニングする方法」というタイトルのセクションで下に記載される技術を用いて、ＣａＶ１の活性を標的にしてモジュレートするそれらの能力を試験することができる。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態は、リンパ系（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）又は骨髄系の造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にする電位作動型カルシウムチャネルモジュレーターを提供する。本発明の一実施形態は、リンパ系の造血細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）で発現するＣａＶ１スプライス変異体を標的にするＣａＶ１モジュレーターを提供する。これらのモジュレーターは、ＣａＶ１スプライス変異体の外部ドメインを標的にすることができる。特定の実施形態では、これらの治療剤はＣａＶ１阻害剤であり、免疫抑制剤としての用途を有する。特定の他の実施形態では、これらの治療薬は肥満細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルの阻害剤であり、アレルギーの処置で用いることができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明は、リンパ系の造血細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にするＣａＶ１モジュレーターを提供する。これらのモジュレーターは、ＣａＶ１．４スプライス変異体の外部ドメインを標的にすることができる。特定の実施形態では、これらの治療剤はＣａＶ１．４阻害剤であり、免疫抑制剤としての用途を有する。
【０１０９】
ＣａＶ１に結合してその活性をモジュレートする治療剤、並びに１つ又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む医薬組成物も提供される。所望により、組成物に他の有効成分が含まれてもよい。これらの他の有効成分には、例えば他の公知の免疫調整化合物が含まれてもよい。そのような組成物は、ヒトを含む動物への投与のために製剤化される。医薬組成物は、様々な経路による投与のために製剤化することができる。例えば、組成物は、経口、局所、直腸若しくは非経口投与のために、又は吸入若しくは噴霧による投与のために製剤化することができる。本明細書で用いる非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、鞘内、胸骨内の注射又は注入技術を含む。
【０１１０】
様々な経路による投与のための様々な医薬組成物及び医薬組成物を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（旧称「Remingtons Pharmaceutical Sciences」）；Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA (2000)に記載されている。
【０１１１】
治療剤をスクリーニングする方法
本発明の一態様は、スプライス変異体を発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する、所与の電位作動型カルシウムチャネルを標的にする作用物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、スプライス変異体を発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する、所与のＣａＶ１スプライス変異体を標的にする作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１２】
一般に、スクリーニングする方法は、対象の電位作動型カルシウムチャネル、例えば対象のＣａＶ１スプライス形を発現する造血細胞を候補治療剤と接触させること、及び候補治療剤がカルシウムチャネルの活性をモジュレートするかどうか判定することを含む。適当な細胞には、例えば、肥満細胞、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
【０１１３】
特定の実施形態では、この方法は、対象の標的細胞又は組織で発現するＣａＶ１スプライス変異体を同定する初期ステップ（単数又は複数）をさらに含む。これは、例えば上のセクション「ＣａＶ１スプライス変異体」で記載される通りに達成することができる。一部の実施形態では、この方法は、同じくセクション「ＣａＶ１スプライス変異体」で記載されるように、候補治療剤の標的にすることができる、選択されたスプライス変異体の外部ドメインを同定するステップも含む。
【０１１４】
ＣａＶ１スプライス変異体の活性のモジュレーションは、例えば、カルシウムチャネル活性のレベルで、又は細胞機能のレベルで評価することができる。
【０１１５】
特定の実施形態では、スクリーニングする方法は、カルシウムチャネル活性をモジュレートする候補化合物の能力を評価することを含む。一部の実施形態では、この方法は、カルシウムチャネル活性を阻害する候補化合物の能力を評価することを含む。
【０１１６】
カルシウムチャネル活性は、例えば電位固定電気生理法（特に、全細胞「パッチクランプ」アッセイ）及び蛍光ベースのアッセイによって細胞への、又は膜を横切るカルシウム流量を評価するための、当技術分野で公知である様々な方法を用いて決定することができる。
【０１１７】
電位固定電気生理記録のために、ピペット内腔と細胞質を接続するために、ガラスマイクロピペットは細胞膜を破る。このように、原形質膜を越える膜電位を測定することができる。カルシウムチャネルが活性化され、カルシウムが膜を越えて細胞に入るとき、膜電位が変更され、これはこの方法を通して測定される。「パッチクランプ」アッセイは、例えば、Molnar and Hickman, Patch-clamp methods and protocols, Humana Press (2007)に記載されている。
【０１１８】
蛍光ベースのアッセイは、細胞中のカルシウム濃度の増加を測定するために用いることができる。簡潔には、細胞は、原形質膜を通過して細胞の細胞質に存在することができるカルシウム感受性色素（例えば、Ｆｌｕｒｏ−４又はＦｕｒａ−ｒｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている）と一緒にインキュベートされる。カルシウムが膜を越えて細胞に入ることを可能にするカルシウムチャネルの活性化の結果、カルシウムは色素に結合してその蛍光特性を変更する。例えば、Ｆｌｕｒｏ−４色素は蛍光が増加するが、Ｆｕｒａ−ｒｅｄ色素は蛍光が減少する。色素蛍光特性の変化を測定して、細胞質のカルシウム濃度又はカルシウム流量の増加と相関させることができる。蛍光ベースのアッセイ方法は、例えば、June and Moore, Measurement of Intracellular Ions by Flow Cytometry. Current Protocols in Immunology. 5.5.1-5.5.20 (2004)に記載されている。
【０１１９】
さらに、カルシウム流量の測定のための様々な市販のキット、例えばＦｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔ（商標）カルシウムアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ．）及びＢＤ（商標）カルシウムアッセイキット（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）が入手でき、本方法で使用することができる。
【０１２０】
対照に対してカルシウム流量のかなりの変化は、候補作用物質がＣａＶ１スプライス変異体のカルシウムチャネル活性をモジュレートすることを示す。対照は、候補作用物質で処理されていない細胞などの試料中のカルシウム流量の指標となる、既知の値であってよい。例えば、対照と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のカルシウムチャネル活性の低下は、候補作用物質がカルシウムチャネル活性を阻害し、したがって候補作用物質はＣａＶ１活性の阻害剤であることを示す。対照的に、対照と比較して例えば少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のカルシウムチャネル活性の増加は、候補作用物質がカルシウムチャネル活性を活性化し、したがって候補作用物質はＣａＶ１活性の活性剤であることを示す。
【０１２１】
適当な機能的アッセイは、関与する細胞型を考慮する当業者が容易に決定することができる。例えば、細胞生存、細胞増殖、細胞分化及び／又は細胞活性化は、標準技術によって評価することができた。例えば、転写因子（ＮＦκＢ又はＮＦＡＴなど）の誘導、サイトカイン分泌又は細胞溶解能力は、当技術分野で公知の技術を用いて評価することができた。様々な造血細胞の免疫機能を評価するのに適するアッセイは、当技術分野で公知である。
【０１２２】
そのようなアッセイを実行する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Short Current Protocols in Immunology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Immunology, 2005, John Wiley & Sons Inc. New Jersey；Mast Cells: Methods and Protocols, by Krishnaswamy and Chi, 2005, Humana Press；及びNeutrophil Methods and Protocols Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 412, Quinn, et al. (Eds.) 2007, Humana Pressを参照）。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態では、本方法は、電位作動型カルシウムチャネル活性の阻害剤である候補化合物を同定することを含む。本発明の特定の実施形態では、本方法は、ＣａＶ１活性の阻害剤である候補化合物を同定することを含む。本発明の特定の実施形態では、本方法は、ＣａＶ１．４活性のモジュレーターである候補化合物を同定することを含む。本発明の特定の実施形態では、本方法は、ＣａＶ１．４活性の阻害剤である候補化合物を同定することを含む。
【０１２４】
本発明の一部の実施形態では、スクリーニングする方法は、対象のＣａＶ１スプライス変異体を発現するＢ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞又は脾細胞を候補治療剤と接触させること、及びカルシウムチャネル活性を阻害する候補作用物質の能力を評価することを含む。この実施形態によれば、カルシウムチャネル活性を阻害する候補作用物質は、免疫抑制剤として適する治療剤として選択することができる。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態では、本方法は、ＣａＶ１活性の刺激物質である候補化合物を同定することを含む。本発明の特定の実施形態では、本方法は、ＣａＶ１．４活性の刺激物質である候補化合物を同定することを含む。
【０１２６】
本発明の一部の実施形態では、スクリーニングする方法は、対象のＣａＶ１スプライス変異体を発現するＢ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞又は脾細胞を候補治療剤と接触させること、及びカルシウムチャネル活性を刺激する候補作用物質の能力を評価することを含む。
【０１２７】
治療剤の用途
本発明の一態様は、それに限定されないがＣａＶ１スプライス変異体を含む標的の電位作動型カルシウムチャネルを発現する造血細胞の活性をモジュレートするための治療剤の使用を提供する。
【０１２８】
特定の実施形態では、治療剤は、リンパ系の造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にし、免疫機能をモジュレートするために用いることができる。特定の実施形態では、治療剤は、リンパ系の造血細胞で発現するＣａＶ１スプライス変異体を標的にし、免疫機能をモジュレートするために用いることができる。一部の実施形態では、治療剤は、リンパ系の造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルの活性を阻害し、免疫応答を抑制するために（例えば、自己免疫疾患を処置するために、移植拒絶反応の危険を減少させるために）用いることができる。一部の実施形態では、治療剤は、ＣａＶ１スプライス変異体の活性を阻害し、免疫応答を抑制するために（例えば、自己免疫疾患を処置するために、移植拒絶反応の危険を減少させるために）用いることができる。一部の実施形態では、治療剤は、ＣａＶ１．４スプライス変異体の活性を阻害し、免疫応答を抑制するために（例えば、自己免疫疾患を処置するために、移植拒絶反応の危険を減少させるために）用いることができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、治療剤は、骨髄系の造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にし、免疫機能をモジュレートするために用いることができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、治療剤は、造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルの活性を増加させ、免疫応答を増加させるために（例えば、免疫不全対象において）用いることができる。一部の実施形態では、治療剤は、ＣａＶ１スプライス変異体の活性を増加させ、免疫応答を増加させるために（例えば、免疫不全対象において）用いることができる。一部の実施形態では、治療剤はＣａＶ１．４スプライス変異体の活性を増加させ、免疫応答を増加させるために用いることができる。
【０１３１】
一部の実施形態では、治療剤は、Ｔ細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にし、したがって、Ｔ細胞活性をモジュレートするために用いることができる。一部の実施形態では、治療剤は、Ｔ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にし、したがって、Ｔ細胞活性をモジュレートするために用いることができる。特定の実施形態は、抗原へのＴ細胞の結合を阻害するための、Ｔ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にする治療剤の使用を提供する。一部の実施形態は、Ｔ細胞成熟を阻害するための、Ｔ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にする治療剤の使用を提供する。そのような治療剤は、例えば、自己免疫疾患を処置するため、移植拒絶反応の危険を減少させるため、及び免疫系の抑制を必要とする他の障害を処置するために用いることができる、免疫抑制剤としての適用を有する。
【０１３２】
一部の実施形態では、治療剤は、Ｂ細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にし、したがって、Ｂ細胞活性をモジュレートするために用いることができる。一部の実施形態では、治療剤は、Ｂ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にし、したがって、Ｂ細胞活性をモジュレートするために用いることができる。特定の実施形態は、ＢＣＲによって媒介される活性化及び／又はＢＣＲによって誘導される増殖を阻害するための、Ｂ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にする治療剤の使用を提供する。一部の実施形態は、Ｂ細胞成熟を阻害するための、Ｂ細胞で発現するＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にする治療剤の使用を提供する。そのような治療剤は、例えば、自己免疫疾患を処置するか抗体応答の発生を減らすため、及び免疫系の抑制を必要とする他の障害を処置するために用いることができる、免疫抑制剤としての適用を有する。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態に従って処置することができる自己免疫疾患の例には、これらに限定されないが、炎症性（リウマチ様）関節炎、橋本甲状腺炎、悪性貧血、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、乾癬、腎線維症、肺線維症、肝線維症、アジソン病、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群及びグレーブス病が含まれる。これらの疾患ごとに、応答の臨床測定項目を測定することができる。例えば、疼痛の低減、組織（例えば、関節）の炎症の低減、組織（例えば、腎臓）機能の改善、又は食物を消化する能力の向上は、成功した免疫抑制の指標の役目をすることができる。
【０１３４】
特定の実施形態は、公知の抗炎症剤又は免疫抑制剤と併用した、造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルを標的にする治療剤の投与を企図する。特定の実施形態は、公知の抗炎症剤又は免疫抑制剤と併用した、Ｔ細胞のＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にする治療剤の投与を企図する。特定の実施形態は、公知の抗炎症剤又は免疫抑制剤と併用した、Ｂ細胞のＣａＶ１．４スプライス変異体を標的にする治療剤の投与を企図する。免疫抑制剤の例には、非ステロイド系抗炎症剤（ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ又はロフェコキシブなど）、ステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン又はトリアムシノロンなど）及び免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸又はシロリムスなど）が含まれる。他の例には、生体応答調節剤（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタナーセプト）又はＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）など）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（Ａｒａｖａ（登録商標）（レフルノミド）など））、Ｈｙａｌｇａｎ（登録商標）（ヒアルロナン）及びＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）（ヒランＧ−Ｆ２０）が含まれる。
【０１３５】
本発明の特定の実施形態は、免疫不全対象において免疫応答を増加させるために、例えば免疫不全対象において日和見感染を処置又は予防するために、造血細胞で発現するＣａＶ１スプライス変異体などの電位作動型カルシウムチャネルの活性を増加させる治療剤の使用を提供する。免疫不全対象は、日和見感染、例えばウイルス、真菌、原生動物又は細菌による感染、プリオン疾患及び特定の新生物により感受性である。免疫不全とみなすことができる者には、これらに限定されないが、ＡＩＤＳ（又はＨＩＶ陽性）の対象、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）の対象、糖尿病患者、移植を受け、免疫抑制薬をとっている対象、及びがんのための化学療法を受けている対象が含まれる。免疫不全個体には、がんの大部分の形（皮膚がん以外）、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症の対象、脾臓を持たない対象、末期腎臓疾患（透析）の対象、及び過去１年以内に丸薬又は注射によって頻繁にコルチコステロイドをとっている対象も含まれる。重症の肝臓、肺又は心臓の疾患を有する対象も、免疫不全であってよい。
【０１３６】
本明細書に記載される本発明のより深い理解を得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、本発明の例示的実施形態を記載することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してないことが理解されよう。
【実施例】
【０１３７】
（例１）：ＣＡＶ１．４カルシウムチャネルは、Ｔ細胞の受容体シグナル伝達及びナイーヴＴ細胞のホメオスタシスを調節する
Ｔ細胞生物学でのＣａｖ１．４の生理機能を判断するために、以下の実験を実行した。
【０１３８】
実験方法：
全ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ。製造業者によって指示される通りにＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、様々な試料から全ＲＮＡを抽出した。単離したＲＮＡをＤＮアーゼＩで処理して、混入ＤＮＡを除去した。全ＲＮＡの１マイクログラムを用いて、ランダムプライマー及びスーパースクリプトＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。組織でＣａｖ１．４を検出するために、最初のＰＣＲをセンスプライマー（５’−ＣＡＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＧＡＧＴＡＧＡ−３’）で実施した。以降のネステッドＰＣＲ増幅は、センスプライマー（５’−ＧＡＣＧＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡ−３’）で行った。Ｃａｖ１．４突然変異ｍＲＮＡを検出するために、第１回目のＰＣＲをセンスプライマー（５’−ＣＡＴＡＣＴＧＧＡＤＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’ＣＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡ−３’）で実施した。第２のネステッドＰＣＲは、センスプライマー（５’−ＧＣＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡ−３’）で実施した。
【０１３９】
抗体（Ａｂ）。ＣＤ３ｅ（２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＣＤ８ｂ（５３．５８）、ＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）、ＣＤ１９（ｅｂｉｏ１Ｄ３）、ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＣＤ１２７（Ａ７Ｒ３４）、Ｔｈｙ１．１（ＨＩＳ５１）、Ｔｈｙ１．２（５３−２．１）、ＣＤ４５．２（１０４）、ＰＤ−１（Ｊ４３）、ＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ５）及びＣＣＲ７（ＥＢＩ−１）に対するフローサイトメトリーのために用いたモノクローナル抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。以下の抗体を、イムノブロッティングのために用いた：ウサギポリクローナル抗ＣａＶ１．４（McRory et al., 2004）、抗ホスホ−ｐ４４及びｐ４２ＭＡＰＫ（９１０１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＥＲＫ２（ｓｃ−１５４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ホスホ−ＪＮＫ（９２５１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＪＮＫ（９２５２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＮＦＡＴｃ１（７Ａ６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び抗ＨＤＡＣ１（１０Ｅ２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。
【０１４０】
骨髄移植実験。骨髄（ＢＭ）細胞は、Ｔｈｙ１．１野生型（Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４５．２＋）又はＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．２＋ＣＤ４５．２＋）マウスの大腿骨抽出物から調製した。成熟Ｔ細胞をビオチン化Ｔｈｙ１．１又は抗Ｔｈｙ１．２Ａｂで染色し、その後、ストレプトアビジン連結Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で枯渇させた。次に野生型及び突然変異体のＢＭ細胞を５０：５０で混合し、その後亜致命的に照射された（１０００ラド）ＣＤ４５．１＋宿主（Ｔｈｙ１．２＋ＣＤ４５．１＋）の静脈内に移した。脾臓及び胸腺からの細胞を、養子移入の３０日後に回収した；Ｔｈｙ１．１、Ｔｈｙ１．２及びＣＤ４５．２は、野生型及び突然変異体のドナー細胞を識別するための根拠であった。
【０１４１】
マウス。前に記載（Mansergh et al., 2005）のＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスを、少なくとも１３世代、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）バックグラウンドへと繁殖させた。Ｂ６、Ｂ６．ＰＬ−Ｔｈｙ１ａ／Ｃｙ（Ｔｈｙ１．１＋）、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪ（Ｌｙ５．１＋）及びＢ６．Ｒａｇ１−／−を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。全ての試験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａのアニマルケア委員会及びＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅの両方によって設定されたガイドラインに従った。
【０１４２】
フローサイトメトリー。全てのＡｂインキュベーションは、氷上で行った。アネキシンＶ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｂｃｌ−２（３Ｆ１１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びアイソタイプ対照Ａｂの染色は、前に記載（Priatel et al., 2000、2006）の通りに実行した。データは、ＦＡＣＳｃａｎ若しくはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＬＳＲＩＩ及びＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかで得た。データは、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ）で分析した。
【０１４３】
Ｃａ２＋流量アッセイ。２％ＦＣＳ含有ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）中の脾細胞又は胸腺細胞（細胞数１０７個／ｍＬ）を、１μＭのＦｌｕｏ−４、２μＭのＦｕｒａ  Ｒｅｄ及び０．０２％のプルロニック（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）で、室温で４５分間標識した。洗浄後、細胞を氷上で２０分間、ＣＤ４４−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＣＤ４−ＰＥ  Ａｂで染色した。試料をＲＰＭＩ（約０．４ｍＭのＣａ２＋を含有する）に懸濁させ、３７℃で１５分間予熱した。前に記載（Liu et al., 1998）の通りに、タプシガルジン（１μＭ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）による刺激及び遊離の細胞外Ｃａ２＋（０．５ｍＭ）の戻し添加を実施した。細胞外のＣａ２＋のキレート化を、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ含有ＲＰＭＩ培地の補充によって実行した。ＴＣＲ刺激のためには、５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＤ３ε  Ａｂでプレコートした脾細胞（クローン１４５−２Ｃ１１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、２０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンの添加によって活性化した。Ｃａ２＋流量データは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア又はＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒとＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで得、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ）で分析し、指示されたＴ細胞サブセットで電子ゲーティングし、対時間のＦｌｕｏ−４／Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ比をプロッティングした。
【０１４４】
電気生理学的アッセイ。ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスのリンパ節及び脾臓から生成された単細胞懸濁液をＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）及びＣＤ８ａ（５３−６．７）Ａｂで染色し、その後、ＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａで単離した。選別されたＣＤ４４ｌｏＴ細胞の大多数（＞９９％）はＣＤ６２Ｌｈｉであったので、ナイーヴとみなされた。ＴＣＲ刺激は、Ｃａ２＋流量アッセイについて記載されるように実施した。Ｃａ２＋チャネル遮断実験については、細胞をＣａＶ１．３及びＣａＶ１．４の外部ドメインに特異的なＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；ｓｃ−３２０７０）とプレインキュベートした。全細胞パッチクランプ記録及び分析は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器と、ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実行した。パッチ電極は、水平マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の、薄肉ホウ珪酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から引き抜いた。細胞内溶液を充填したとき、電極は４〜８ＭΩの抵抗を有した。全細胞記録の間、アナログ容量補償及び８０％直列抵抗補償を用いた。単一パルス記録のためには、１０秒間隔で−８０ｍＶの保持電位から＋１０ｍＶへ細胞を脱分極させ、Ｐ／４リークサブトラクション手法を用いた。ピーク電流振幅を対応する細胞容量値へ標準化した後に、電流密度は提示される。Ｉ−Ｖの関係を得るために、−８０ｍＶの保持電位での−１３０から７０ｍＶへの２００ｍｓランプ波プロトコル及びＰ／４リークサブトラクション手法を用いた。データを５０ｋＨｚでサンプリングし、１０ｋＨｚでフィルター処理し、全細胞記録を室温（２０℃〜２２℃）で実施した。細胞外溶液は１００ｍＭのＢａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。ピペットで用いた細胞内溶液は１４０ｍＭのＴＥＡ−Ｃｌ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＭｇＡＴＰ２を含有し、ＴＥＡ−ＯＨでｐＨ７．４に調整した。
【０１４５】
ホスホ−フローサイトメトリーシグナル伝達。胸腺細胞は、刺激の前に３０分間、１０ｍＭのＨＥＰＥＳと一緒にＨＢＳＳ中でインキュベートした。細胞を上の通り指示された時間刺激し、２％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、遠心分離によってペレットにし、−２０℃の９０％メタノールで一晩透過性化した。ＳＴＡＴ５リン酸化の判定のために、透過性化された細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートさせた抗ＳＴＡＴ５（ｐＹ６４９）ｍＡｂ、抗ＣＤ８α−ＰＥ及び抗ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７で、室温で１時間処理した。記載される（Priatel et al., 2002）ように、ＥＲＫ活性のフローサイトメトリー計測を実施した。
【０１４６】
イムノブロッティング。ＣａＶ１．４を検出するために、脾細胞をイムノブロットによって分析した。或いは、ＥａｓｙＳｅｐマウスＴ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で、Ｔ細胞を脾細胞調製物から単離した。膜タンパク質を単離し、前に報告される（Woodard et al., 2008）ように、イムノブロッティングの前に試料間のタンパク質量を標準化した。一次Ａｂの結合は、Ａｌｅｘａ６８０−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ  Ａｂ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。タンパク質バンドは、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像化システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。シグナル強度は、Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアで定量化した。シグナル伝達分析のために、指示された時間、胸腺細胞をＴＣＲ刺激（上記のように）によって活性化した。活性化のための陽性対照として、３７℃で１０分間、１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと一緒に胸腺細胞をインキュベートした。Ｒａｓ活性を、前述（David et al., 2005）の通り評価した。リン酸化された全ＥＲＫ及びＪＮＫを、イムノブロッティングによって検出した。リン酸化の増加倍率は、総タンパクの比として表し、刺激されていない野生型対照に標準化した。
【０１４７】
ＮＦＡＴ可動化アッセイ。ＷＴ又はＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスの胸腺からの単細胞懸濁液を調製し、プレート結合ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）及び可溶性ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）と一緒に、又は培地単独で１６時間インキュベートした。ＲＩＰＡ緩衝液で全細胞を１０分間溶解した。核及び細胞質の分画をＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で調製し、イムノブロットによって分析した。一次Ａｂの結合は、上記のように検出した。活性化の増加倍率は、適当な負荷対照の比として表し、活性化されていない野生型対照に標準化した。
【０１４８】
ナイーヴＴ細胞生存アッセイ。ＷＴ（Ｔｈｙ１．１＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．２＋）のＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞を、上記の電気生理学的アッセイに記載される通りに選別した。精製したＷＴ及び突然変異体のナイーヴＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞を同等比（１：１：１：１）で混合し、１ウェルにつき２００，０００個の総細胞を９６ウェル平底プレートで培養した。細胞は、ｍＩＬ−７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の指示量で処理したか、１０μｇ／ｍＬのＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）Ａｂでプレコートされたウェル中で培養した。２４時間後、ＣＤ８及びＴｈｙ１．１  Ａｂで試料を標識し、室温で１５分間、Ｃａ２＋含有緩衝液中でアネキシンＶ−Ａｌｅｘａ６４７（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一緒にインキュベートし、その後ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでデータを取得することによって生存力を判定した。
【０１４９】
養子移入実験。ナイーヴＴ細胞移入については、ＷＴ（Ｔｈｙ１．１＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．２＋）のＣＤ４４ｌｏＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞を上記の電気生理学的アッセイに記載される通りに選別し、１：１：１：１の比で混合し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光標識し、Ｒａｇ１−／−宿主に同時注入した。移入の１週間後、脾細胞を単離し、ドナーＷＴ及び突然変異体Ｔ細胞を識別するための関連Ａｂで染色した。
【０１５０】
細菌感染及び抗原特異的Ｔ細胞の検出。ｒＬＭ−ＯＶＡ（オボアルブミンを発現するリステリア・モノサイトゲネス（Listeria  monocytogenes））の約１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）で、マウスを静脈内（ｉ．ｖ．）感染させた。脾細胞を、ＣＤ８α（５３−６．７）及びＣＤ４４（ＩＭ７）Ａｂ並びにＨ−２ｋｂーＯＶＡ四量体（ｉＴａｇ  ＭＨＣ四量体、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色した。細胞内サイトカイン染色及び細胞傷害性アッセイを記載されている（Priatel et al., 2007）通りに実施した。
【０１５１】
統計分析。ほとんどの分析について、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ検定で判断した。電気生理学的アッセイについては、統計的有意性は反復のない２要因計画のＡＮＯＶＡ検定で測定した。
【０１５２】
結果：
ＣａＶ１．４欠損はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ球減少、並びに自発的Ｔ細胞活性化をもたらす
野生型（ＷＴ）マウスでＣａＶ１．４発現を特徴づけるために、ＲＮＡ分析を実施し、胸腺、脾臓及び末梢のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞での発現を明らかにした（図１Ａを参照）。発生中の及び成熟したＴ細胞でのＣａＶ１．４発現を記載した以前の観察は、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスがＴ細胞表現型を提示するかどうかの調査につながった。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは、終止コドンを挿入し、早期にＣａｃｎａ１ｆ翻訳を終了する遺伝子ターゲッティングを通して以前に生成された（Mansergh et al., 2005）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでの遺伝子ターゲッティングを検証するために、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでｌｏｘＰ部位を運ぶ破壊されたＣａＶ１．４転写産物を特異的に検出する、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した（図１Ｂ）。さらに、ＣａＶ１．４抗体（Ａｂ）ブロッティングは、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−の脾臓全細胞の溶解物でタンパク質喪失を明らかにした（図２Ａ）。マウス脾細胞とＷｅｒｉ網膜芽細胞腫細胞との間のＣａＶ１．４タンパク質サイズの不一致は、代替スプライシング（Kotturi and Jefferies, 2005）又は細胞型特異的翻訳後修飾の結果であるかもしれない。ＣａＶ１．４がＴ細胞の原形質膜に存在するかどうか確立するために、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−の脾臓Ｔ細胞の表面をビオチン化し、ストレプトアビジン結合ビーズ免疫沈降物をＣａＶ１．４  Ａｂでブロットした（図２Ｂ）。ＷＴのＴ細胞でのＣａＶ１．４サイズのバンドの特異的検出は、ＣａＶ１．４チャネルがＴ細胞表面に発現することを示す。
【０１５３】
機能的ＣａＶ１．４チャネルを欠く胸腺細胞の分析は、Ｔ細胞成熟へのいくつかの変化を明らかにした。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−胸腺でのＣＤ４＋とＣＤ８＋単一陽性（ＳＰ）胸腺細胞の比は、ＣＤ８＋系の方へわずかにそれ（図２Ｃ）、ＣＤ２４ｌｏＴＣＲβｈｉとして区別された成熟胸腺細胞の割合は、ＷＴに対して低下した（図２Ｄ）。Ｔ細胞発生に及ぼすＣａＶ１．４欠損の影響も、成熟したＣＤ４＋ＳＰ胸腺細胞数での５０％の減少にも反映されたが、ＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞数はほとんど不変だった（図２Ｅ）。しかし、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−二重陽性（ＤＰ）及びＴＣＲβ＋ＳＰ亜集団の上での様々な成熟及び活性化マーカーの発現は、ＷＴに緊密に対応し、ＴＣＲβ、ＣＤ４４、ＣＤ６９及びＣＤ６２Ｌの同程度の量を発現した（図３）。総合すると、これらの知見は、ＣａＶ１．４機能が陽性選択、特にＣＤ４＋ＳＰ系の分化を促進することを示唆する。
【０１５４】
脾臓、リンパ節（ＬＮ）及び末梢血を含む末梢リンパ系コンパートメントの検査は、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−が、ＷＴマウスに対してＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の低下及びＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の比の低下を示すことを明らかにした（図２Ｆ）。さらに、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは、脾臓（図２Ｇ）及びＬＮ（図４）細胞の回復に基づき、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞サブセットに著しくリンパ球減少性であることがわかった。さらに、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでの末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の喪失は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりかなり劇的だった。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞数の低下と関連して、ＣＤ４＋ＴＣＲβ＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋Ｔ細胞の両方は、自発的な急性のＴ細胞活性化の徴候を示し、増加した量のＣＤ４４、ＣＤ１２２、並びにプログラム死（ＰＤ）−１及び低減されたＣＤ６２Ｌを表した（図２Ｈ）。要約すると、これらの知見は、ＣａＶ１．４依存性Ｃａ２＋シグナル伝達が、ナイーヴＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のホメオスタシス及び静止のために必須であることを実証する。
【０１５５】
ＣａＶ１．４は、ＴＣＲによって誘導され、貯蔵によって作動されるサイトゾルの遊離Ｃａ２＋の上昇のために非常に必要とされる
サイトゾルＣａ２＋を測定するために指標色素を負荷され、ＣＤ４４ｌｏ（ナイーヴ）又はＣＤ４４ｈｉ（記憶）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の識別のためにＣＤ４及びＣＤ８  ＡｂとＣＤ４４  Ａｂで標識されたＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−脾細胞（図５Ａ）を、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでＣａ２＋輸送欠陥を調査するための指示されたアゴニストで刺激した。細胞内貯蔵からのＣａ２＋放出が、原形質膜チャネルを通してＣａ２＋流入を媒介する能力があるかどうか判断するために、脾臓Ｔ細胞をタプシガルジンで処理した（図５Ｂ）。ＥＲのＣａ２＋−ＡＴＰアーゼの阻害剤であるタプシガルジンは、筋形質及び小胞体にＣａ２＋をポンプ輸送する細胞の能力を遮断し、続いて原形質膜結合Ｃａ２＋チャネルを活性化し、細胞外からのＣａ２＋流入を引き起こすことによってサイトゾルのＣａ２＋濃度の上昇を誘導する（Thastrup et al., 1990）。意外なことに、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞は、タプシガルジン刺激の結果サイトゾルＣａ２＋の増加の大きな低下を示し、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏ及びＣＤ４４ｈｉＣＤ８＋Ｔ細胞もそれらのＷＴ対応物に対して著しい減少を示した（図５Ｂ）。他方、Ｃａ２＋キレート化剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の添加を通して実証されるように、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞からのＣａ２＋流出は、ＣａＶ１．４の欠損によって損なわれないようであった。ナイーヴＣＤ４＋Ｔ細胞の間の比較と対照的に、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｈｉＣＤ４＋Ｔ細胞は非常に類似したＣａ２＋応答を示した。合わせて、これらの観察は、ＳＯＣＥのためにＣａＶ１．４チャネルがＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞では極めて必要とされ、ＣＤ４４ｌｏ及びＣＤ４４ｈｉＣＤ８＋Ｔ細胞ではより少ない程度で必要とされることを実証する。
【０１５６】
ＣａＶ１．４チャネルがＴＣＲシグナル伝達を調節するであろうかどうか調査するために、ビオチン化ＣＤ３  ＡｂでプレコートしたＷＴ及び突然変異体脾細胞を、ストレプトアビジン（ＳＡ）添加によって活性化した。ＷＴのＴ細胞では、ＴＣＲ架橋はサイトゾルＣａ２＋濃度を急速に上昇させ、持続した期間中、上昇を維持させた（図５Ｃ）。タプシガルジン処理で観察された応答と逆に、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方は、それらの表面ＣＤ４４表現型に関係なく、ＴＣＲ刺激に非常に弱く応答した。ＴＣＲ応答でなくタプシガルジンについてのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＣａＶ１．４機能に対する差別的依存の根拠は、不明である（図５Ｂ）。さらに、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞、特にＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、イオノマイシン処理の結果ＷＴに対して大きく低下したピークＣａ２＋濃度に到達した。イオノマイシンはそのイオノフォア特性を通してサイトゾルＣａ２＋濃度を増加させ、細胞内Ｃａ２＋貯蔵を放出し、その後原形質膜Ｃａ２＋チャネルの開口及び細胞外からのＣａ２＋流入を刺激する（Morgan and Jacob, 1994）。イオノマイシン応答がＣａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞で大いに鈍くなるとの知見は、ＣａＶ１．４機能が細胞内Ｃａ２＋の貯蔵に寄与するか、細胞内貯蔵からのその放出の後のＣａ２＋の輸入のために重要であることを示唆する。
【０１５７】
ＣａＶ１．４がＣａ２＋応答に関与する前記の過程の１つ又は両方を媒介するかどうか判断するために、細胞外Ｃａ２＋がＥＧＴＡによってキレート化され、Ｃａ２＋取込みを防止し、それによって細胞内貯蔵からのＣａ２＋放出を開放するときの、ＴＣＲ刺激の後のＣａ２＋応答をモニターした。ＥＧＴＡの存在下でＴＣＲライゲーションの後に観察された一過性のサイトゾルＣａ２＋上昇は、ＷＴに対してＣａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞で減少することがわかった（図５Ｄ）。さらに、原形質膜を越えるＣａ２＋流入を促進する細胞外Ｃａ２＋の過多は、ＷＴのＴ細胞で劇的なサイトゾルＣａ２＋の急増をもたらしたが、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞による増加は著しく少なかった。さらに、ＣａＶ１．４が胸腺細胞でも機能し、ＴＣＲ刺激が細胞外Ｃａ２＋の不在下で実施されたときに、サイトゾルＣａ２＋の上昇にとって重要であることが判明した（図６）。
【０１５８】
ＣａＶ１．４が細胞へのＣａ２＋流入を調節することを検証するために、パッチクランプ実験で担体イオンとしてバリウム（Ｂａ２＋）を使用することによって、ＴＣＲ刺激の後にチャネル電流をモニターした。Ｃａ２＋模倣剤として用いられるＢａ２＋は、（１）Ｃａ２＋チャネルを通してより高いコンダクタンスを有すること、（２）カリウムチャネルを効率的に遮断すること、及び（３）Ｃａ２＋流入と関連する二次シグナル伝達を減少させることによって電流を増強するので、いくつかの重要な利点を提供する。Ｃａｃｎａ１ｆ＋／＋及びＣａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣａ２＋電流は、−８０ｍＶから＋１０ｍＶまでの単一のスイーププロトコルで特徴づけた。電流は、ＴＣＲ架橋の後にＷＴで検出されたが突然変異体Ｔ細胞では検出されなかった（図７Ａ及び７Ｂ）。Ｌ型チャネルが原形質膜で機能するかどうか判断するために、ＴＣＲによって誘導された内向き電流を、外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニットＡｂの存在下又は不在下で比較した。ＷＴのＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞へのＡｂの添加は、ＴＣＲ刺激の後に観察された内向き電流を遮断することが見出された（図７Ｃ）。さらに、対照のヤギＡｂによる処理は、内向き電流に及ぼす作用を示さなかった。外部ドメインＣａＶ１α１サブユニットＡｂがＣａＶ１．４を認識することを検証するために、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−脾細胞抽出物を、外部ドメインＣａＶ１α１サブユニットＡｂと一緒にインキュベートし、免疫沈降物をＣａＶ１．４  Ａｂでブロットした（図７Ｄ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−細胞でなくＷＴでのＣａＶ１．４バンドの特異的検出は、ＣａＶ１．４がＴＣＲライゲーションによるＣａ２＋流入のためのパイプの役目をするとの結論を支持する。
【０１５９】
ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞でのＴＣＲによって誘導されるＣａ２＋電流の型をさらに特徴づけるために、ランプ波プロトコルを用いてＴＣＲ架橋後のＩ−Ｖ曲線を測定した（図７Ｅ及び７Ｆ）。Ｉ−Ｖ関係のピーク電位（Ｖｍａｘ）は、ＷＴのＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞についてそれぞれ１６．３±５．２ｍＶ（ｎ＝５）及び２４．４±３．３ｍＶ（ｎ＝５）であった。改変ボルツマン適合度から得られた半活性化電位（Ｖａ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞については−０．２±４．７ｍＶ（ｎ＝５）、ＣＤ８＋Ｔ細胞については１．３±３．５ｍＶ（ｎ＝５）であった。それらのＶａ値は、異種系で発現するＬ型ＣａＶ１．４チャネルの特性を検討する以前の報告と同等だった（Baumann et al., 2004; McRory et al., 2004）。対照的に、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ランプ波に応じて内向き電流を示さなかった（図７Ｇ及び７Ｈ）。総合すると、これらのデータは、ＣａＶ１．４がＴＣＲシグナル伝達によって作動されること、並びに発生中の及びナイーヴＴ細胞で細胞内Ｃａ２＋貯蔵を補充する役目をすることができることを示唆する。
【０１６０】
ＣａＶ１．４機能は、Ｒａｓ−ＥＲＫ活性化及びＮＦＡＴ可動化を調節する
ＣａＶ１．４チャネルが、Ｔ細胞の生存及び分化の制御に深く関係している経路、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかに対処するために（Alberola-Ila and Hernandez-Hoyos, 2003）、ＴＣＲ刺激後のこれらの下流エフェクターの活性化状態を測定する試験を開始した。Ｒａｓシグナル伝達については、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞をＴＣＲ  Ａｂで刺激し、その後、Ｒａｆ−１−ＧＳＴ融合タンパク質によるＲａｓ−ＧＴＰの沈殿によってＲａｓ活性化を評価した（図８Ａ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞は、野生型細胞と比較して５０％より少ないＲａｓ−ＧＴＰを誘導することがわかった。対照的に、ジアセイル（diaceyl）グリセロール（ＤＡＧ）類似体ＰＭＡで細胞が刺激されたときの遺伝子型の間で、活性化されたＲａｓの量はかなり同等だった。次に、ＴＣＲ刺激後の指示された時間における全胸腺細胞での下流作用性のＭＡＰキナーゼＥＲＫ及びＪＮＫの活性化の分析を実施した（図８Ｂ）。ＴＣＲ架橋後のＥＲＫ活性化の強度及び持続時間は、ＷＴと比較してＣａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞で低減された。しかし、ＴＣＲ刺激後のＷＴとＣａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞との間でのＪＮＫリン酸化の比較は、わずかな差だけを明らかにした。対照的に、細胞遺伝子型に関係なく、ＰＭＡ処理は強力なＥＲＫ及びＪＮＫリン酸化を誘導することが見出された。総合すると、これらの試験は、ＣａＶ１．４欠損がＥＲＫの活性化に選択的に影響を及ぼすことを明らかにする。ＥＲＫ活性化がＣａｃｎａ１ｆ−／−成熟ＳＰ胸腺細胞で影響を受けるかどうか評価するために、ＴＣＲ  Ａｂ又はＰＭＡ処理による刺激の前後に、ホスホフローサイトメトリーでＥＲＫ活性を評価した（図８Ｃ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞は、ＰＭＡ刺激でなくＴＣＲ刺激の結果、ＷＴと比較して低減されたＥＲＫ活性化を示した。
【０１６１】
胸腺細胞の発生及びＴ細胞分化の重要な調節因子であるＮＦＡＴタンパク質はリン酸化され、静止Ｔ細胞の細胞質に主に存在する（Oh-hora, 2009）。Ｔ細胞受容体刺激の結果、Ｃａ２＋シグナルはセリン−トレオニンホスファターゼカルシニューリンの活性化を誘導し、ＮＦＡＴ脱リン酸化を触媒し、核へのその以降の転位を引き起こす。ＴＣＲライゲーションの後の欠損Ｃａ２＋放出がＣａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞でＮＦＡＴの転位及び活性化に影響を及ぼすかどうか判断するために、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞のサイトゾル及び核の分画でのＮＦＡＴｃ１の量を調べた（図８Ｄ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−胸腺細胞は、ＷＴ細胞と比較してより少ない核ＮＦＡＴｃ１を有することが見出された。合わせて、これらの実験は、ＣａＶ１．４依存性Ｃａ２＋流入が、ＮＦＡＴ及びＥＲＫ経路の活性化を調節することを実証する。
【０１６２】
Ｔ細胞内在性のＣａＶ１．４機能が、正常なＴ細胞ホメオスタシスのために必要とされる
Ｔ細胞でのＣａＶ１．４機能の喪失が障害性のＴ細胞発生及び／又は末梢Ｔ細胞の維持にそれ自体寄与するかどうか判断するために、同数のＴ細胞枯渇ＷＴ（Ｔｈｙ１．１＋Ｌｙ５．２＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．２＋Ｌｙ５．２＋）骨髄が照射された類遺伝子性の（Ｌｙ５．１＋）宿主に移された、骨髄移入実験を実施した。移入の１カ月後、胸腺及び脾臓でのドナー細胞頻度（Ｌｙ５．２＋）の評価は、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−骨髄細胞が、宿主のＴ細胞再構成に関するＷＴとの競合で非常に劣ることを明らかにした（図９Ａ）。胸腺及び末梢でのＷＴドナーのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、それぞれＣａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のそれより実質的に高かった（図９Ａ及び９Ｂ）。さらに、ＣＤ４４ｌｏとＣＤ４４ｈｉＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の比の比較は、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−の脾臓ドナーＴ細胞が、野生型のドナーＴ細胞に対して記憶表現型の方へ傾くことを示した（図９Ｃ）。さらに、これらの実験は、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでのＣａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｈｉＴ細胞の高い頻度が、リンパ球減少の結果でなく、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＴ細胞の維持の失敗によるものであることを示唆する。合わせて、これらの結果は、効果的なＴ細胞再構成のために必要である、Ｔ細胞の祖先及び／又は成熟Ｔ細胞でのＣａＶ１．４の細胞内在性の機能を実証する。
【０１６３】
ＣａＶ１．４は、ナイーヴＴ細胞のホメオスタシスの重要な調節因子である
Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスがリンパ球減少性であること、及び残りのＴ細胞の大部分は活性化された表現型又は記憶表現型を有するとの知見は、ＣａＶ１．４機能がナイーヴＴ細胞の維持のために必須であることを示唆した。さらに、ＣＤ４４発現に基づくＴ細胞サブセットの比較は、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスがＷＴに対してＣＤ４４ｌｏＴ細胞の激しい喪失を示すが、ＣＤ４４ｈｉＴ細胞数への影響はかなり少ないことを明らかにした（図１０Ａ及び１０Ｂ）。細胞代謝回転速度がコホート間で異なるかどうか判断するために、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞を、アポトーシスマーカーアネキシンＶで染色した（図１０Ｃ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４４ｈｉでなくＣＤ４４ｌｏＴ細胞は、それらのＷＴ対応物に対して増強されたアネキシンＶ反応性を示した。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＴ細胞の表面の表現型調査は、それらが成熟しているようであり、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＲβ及びＣＤ６９発現に関してＷＴのナイーヴＴ細胞に似ていることを示した（例えば図１０Ｄを参照）。合わせて、これらのデータは、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでのＣＤ４４ｌｏＴ細胞の限定された数は、少なくとも一部、それらの低下した適応度の結果であることを示唆する。
【０１６４】
ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）、ＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）のヘテロダイマー、及び一般的なγ−鎖（ＣＤ１３２）を通してのシグナル伝達は、ナイーヴＴ細胞のホメオスタシスで支配的な役割を演じ、マウス及びヒトの両方でのＩＬ−７又はＩＬ-７Ｒのいずれかの喪失は、Ｔ細胞リンパ球減少及び重症の免疫不全をもたらす（Surh and Sprent, 2008）。したがって、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＴ細胞でのＩＬ−７Ｒ発現を調査した（図１０Ｅ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＴ細胞は、ＷＴのＣＤ１３２発現ではなくＷＴのＣＤ１２７の量のわずか約５０％を発現することが見出された。ＷＴとＣａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＣＲβ＋ＳＰ胸腺細胞との間のアネキシンＶ反応性及びＩＬ−７Ｒの分析は、末梢ＣＤ４４ｌｏＴ細胞の比較について上記したのと類似した知見を明らかにした（図１１）。減少したＣＤ１２７発現にもかかわらず、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、生存促進タンパク質Ｂｃｌ−２のＷＴ量を提示した（図１０Ｆ）。これらの知見は、ＣａＶ１．４が一部ＣＤ１２７調節を通してナイーヴＴ細胞の適応度に影響を及ぼすことができることを示唆する。
【０１６５】
ＣａＶ１．４は、生存シグナル伝達及びホメオスタシスによって誘導されるＴ細胞増大を促進する
ＣａＶ１．４欠損及びＩＬ−７Ｒα発現でのその同時低下が機能的に有意であるかどうか判断するために、その下流エフェクターＳＴＡＴ５のリン酸化状態を追跡することによってＩＬ−７Ｒシグナル伝達をモニターした（図１２Ａ）。ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞を、ＩＬ−７の様々な用量で刺激し、ホスホ−Ｙ６４７  ＳＴＡＴ５特異的Ａｂで染色した。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞は、試験した全てのＩＬ−７用量において、ＷＴと比較してＳＴＡＴ５リン酸化の顕著な低減を示した。次に、ＣａＶ１．４欠損がＴ細胞生存を促進するＩＬ−７の能力に影響を及ぼすかどうかを調査した。ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−のＣＤ４４ｌｏＴ細胞を細胞選別によって単離し、指示濃度のＩＬ−７を有する培養に入れ、２４時間後にアネキシンＶ染色を通してそれらの生存力を評価した（図１２Ｂ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの生存を支持するためにＩＬ−７を利用する能力において、ＷＴよりかなり劣ることが見出された。さらに、２４時間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養のためにＴＣＲ  Ａｂでコーティングされたウェルに入れたとき、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞はＷＴに対して低下した生存を示した（図１２Ｃ）。総合すると、これらの知見は、ＩＬ−７又はＴＣＲのいずれかのシグナル伝達の調節を通して、ＣａＶ１．４チャネルタンパク質がナイーヴＴ細胞の生存に影響を与えることを示唆する。
【０１６６】
ナイーヴＴ細胞コンパートメントのサイズは、ＩＬ−７及び自己ペプチド−主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子両方の利用可能性によって制限される（Surh and Sprent, 2008）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４４ｌｏＴ細胞の増殖能力をｉｎ  ｖｉｖｏで検査するために、ＷＴ（Ｔｈｙ１．１＋）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（Ｔｈｙ１．２＋）のＣＤ４４ｌｏＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、１：１：１：１の比で混合し、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、先天的リンパ球減少のＲａｇ１−／−宿主に注入した（図１２Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｖｏで７日の間存在した後に、ドナーＴ細胞を回収し、ＣＦＳＥ希釈を通してそれらの細胞性増殖を評価した（図１２Ｅ）。類遺伝子性のマーカーＴｈｙ１．１を用いることにより、回収されるドナーＷＴ細胞の割合がＣａｃｎａ１ｆ−／−細胞よりかなり大きいことが判明した。ＩＬ−７及び自己ペプチド−ＭＨＣ分子からのキューにおそらく応答するドナーＴ細胞での電子ゲーティングによって（Kieper et al., 2005）、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＷＴのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞より少ない細胞分割を経たことが見出された（図１２Ｆ）。総合すると、これらの試験は、ホメオスタシス及び生存キューに適切に応答するために、細胞内在性のＣａＶ１．４機能がＴ細胞に重要であることを示唆する。
【０１６７】
ＣａＶ１．４機能は、機能的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答のために必要である
免疫応答でのＣａＶ１．４機能の必要条件を調査するために、ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスにオボアルブミンを発現する組換え体リステリア・モノサイトゲネス（ｒＬＭ−ＯＶＡ）を抗原投与した。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは、ｒＬＭ−ＯＶＡによる抗原投与の結果、実質的に減少した数のＯＶＡ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。機能的抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＷＴに対してＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスで大幅に低減した（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。さらに、ＩＦＮ−γ生産ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターの総数も、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスで減少した（図１３Ｅ）。次に、ｒＬＭ−ＯＶＡに感染したＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスからの精製ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性機能を評価した（図１３Ｆ）。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは、ＷＴと比較して、抗原特異的ＣＴＬを生成する、大いに弱められた能力を示した。合わせて、これらの試験は、生産的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を開始させるために、ＣａＶ１．４が重要であることを示す。
【０１６８】
考察：
ＣａＶチャネルは興奮細胞でＣａ２＋流入を制御する主要な通路であり、筋収縮、ニューロンシグナル伝達及び遺伝子転写を含む多数の過程を調節する（Feske, 2007）。しかし、リンパ球などの非興奮性細胞でのＣａＶチャネルの生物学的役割は、十分に規定されていない。鈍感なマウス系で観察される神経及び免疫系の欠陥の根底にあるＶＤＣＣのβ４サブユニットでの突然変異の同定は、免疫調節でのＣａＶ機能を示唆した（Burgess et al., 1997）。さらに、β３調節サブユニット欠損マウスを記載する原稿は、ＴＣＲシグナル伝達及びＣＤ８＋Ｔ細胞ホメオスタシスをモジュレートする役割をＣａＶチャネルが果たすと論じた（Jha et al., 2009）。発生中及び成熟したＴ細胞でのＬ型ＣａＶ１．４チャネルの生理機能を調査するために、その孔形成α１サブユニットが欠損したマウスを分析した。この例で記載した試験は、ＣａＶ１．４チャネルがナイーヴＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び病原体特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成の両方のために重要なことを示す。さらに、ナイーヴＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＯＣＥ、サイトゾルＣａ２＋のＴＣＲによって誘導された上昇及び下流ＴＣＲシグナル伝達のために、ＣａＶ１．４機能に依存することが示された。
【０１６９】
Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスの分析は、発生及び分化の様々な段階のＴ細胞がＣａ２＋応答を媒介するためにＣａＶ１．４への異なる相対的依存を示すことを明らかにした。例えば、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＳＰ胸腺細胞は、末梢のナイーヴ及び記憶ＷＴ及びＣａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞を比較したときに観察されたものより、ＷＴと比較してサイトゾルの遊離Ｃａ２＋のＴＣＲ又はタプシガルジンによって誘導される上昇のより緩やかな減少を示した。
【０１７０】
ＣａＶ１．４チャネルは、ＲａｓＧＲＰ１、Ｒａｓ−グアニルヌクレオチド交換因子に及ぼす作用を通して、Ｒａｓ−ＥＲＫカスケードを調節することができる。ＲａｓＧＲＰ１の２つの「ＥＦハンド」ドメインは、Ｃａ２＋に結合して、その細胞局在化及びＲａｓ−ＥＲＫシグナル伝達の持続時間を命ずることによって機能する（Teixeiro and Daniels, 2010）。さらに、ＣａＶ１．４の喪失がＴＣＲシグナル伝達に影響するとの知見は、中枢又は末梢の許容度がＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスで損なわれる可能性を示唆する。Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＴＣＲトランスジェニックマウスによる陰性選択試験は実施していないが、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスでの、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞と定義される脾臓の調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の数は、ＷＴでのＴｒｅｇ細胞の５０％であった（Ｃａｃｎａ１ｆ−／−＝０．８４±０．２３×１０６対ＷＴ＝１．７５±０．４４×１０６）。しかし、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへと１３世代繁殖させた高齢Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは外見的に健康であり、検査した様々な組織でいかなる肉眼的組織学的異常を欠き、リンパ球減少症のままであるので、胸腺での自己反応性Ｔ細胞の欠失も末梢での調節Ｔ細胞によるそれらの抑制のいずれも、ＣａＶ１．４欠損によって不安定化されないようである。
【０１７１】
ＣａＶ１．４がナイーヴＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ホメオスタシスのために重要であるとの知見は、このチャネルがそれらの生存に必要とされるシグナルをモジュレートすることを示唆する：自己ペプチド−ＭＨＣ分子との接触によるＴＣＲシグナル伝達及びＩＬ−７曝露の後のＩＬ−７Ｒシグナル伝達（Surh and Sprent, 2005）。以前の研究は、樹状細胞上のＭＨＣ分子のナイーヴＴ細胞ＴＣＲ認識が、それらの生存に必要である小さなＣａ２＋応答を誘発することを示唆した（Revy et al., 2001）。その結果、おそらくＴＣＲシグナル伝達の直接的な結果として、又はＳＴＩＭ１との相互作用を通して、自己抗原との低親和性ＴＣＲ相互作用がナイーヴＴ細胞にＣａＶ１．４チャネルを開放するように誘導すると仮定する（Park et al., 2010；Wang et al., 2010）。注目すべきことに、ＣａＶ１．４並びにＣａＶ１．３は、それらの活性化のために強力な脱分極を必要としない低い活性化閾値を有することが見出された（Lipscombe et al., 2004）。細胞の外からのＣａＶ１．４によって媒介されるＣａ２＋流入は、おそらくシグナル伝達カスケードを誘導するだけでなく、ＴＣＲ生存シグナル伝達のために重要な細胞内Ｃａ２＋貯蔵の持続性充填に寄与する。刺激の結果Ｃａｃｎａ１ｆ−／−Ｔ細胞で観察されるＣａ２＋放出欠陥には、少なくとも２つの二次要因が寄与することができると推測する：（１）低減されたＳＯＣＥをもたらすＥＲ  Ｃａ２＋貯蔵の減少及び（２）Ｃａ２＋依存性シグナル伝達を共同で損なう、ＣＲＡＣチャネルを通しての内向きＣａ２＋流量の減少。注目すべきことに、ローグレードのＴＣＲシグナル伝達及びナイーヴＴ細胞のホメオスタシスは、ＲａｓＧＲＰ１に依存性であることが示された（Priatel et al., 2002）。合わせて、これらのデータは、リンパ系で発現するＣａＶ１．４チャネルによって制御されるＣａ２＋電流がナイーヴＴ細胞の生存力に影響し、ＴＣＲの多様なレパートリーを発現するナイーヴＴ細胞集団を保存するために必須である可能性を示唆する。
【０１７２】
（例２）：遮断抗体によるＣＡＶ１の阻害は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の生存を低減する。
Ｔ細胞生存アッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６脾細胞を、外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニット抗体（クローンＳＣ−３２０７０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の有り無しのＲＰＭＩ完全培地に、細胞数５×１０６／ウェルで９６ウェル平底プレートで培養した。この抗体はＣａＶ１．３に対して生成されたが、ＣａＶ１．４と交差反応する。図７Ｄに示すように、この抗体は脾細胞のＣａＶ１．４に結合する。
【０１７３】
２４時間後、ＣＤ８（クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＤ４（クローンＧＫ１．５；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で試料を標識し、室温で１５分間、Ｃａ２＋含有緩衝液中でアネキシンＶ−Ａｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にインキュベートし、その後ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでデータを取得することによって生存力を判定した。この実験の結果を、図１４に示す。
【０１７４】
例１に記載するように、ＣａＶ１．４タンパク質を欠くＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、末梢で低減された生存を示す。ＣａＶ１．４機能の阻害が低下したＴ細胞適応度をもたらすことを検証するために、脾細胞を外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニット抗体の有り無しでインキュベートした。図１４に示すように、遮断抗体の存在下では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、アポトーシスの増加を示す増強されたアネキシンＶ反応性を示した。したがって、この例は、ＣａＶ１．４チャネルがナイーヴＴ細胞の維持に寄与し、遮断抗体によるＣａＶ１．４機能の阻害はＴ細胞生存を損なうことを確認する。
【０１７５】
（例３）：遮断抗体によるＣＡＶ１の阻害は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を低減する。
Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６脾細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、ＣａＶ１  Ａｂ（クローンＳＣ−３２０７０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の有り無しのＲＰＭＩ完全培地に細胞数５×１０６／ウェルで９６ウェル平底プレートで培養した。１０μｇ／ｍＬのプレート結合ＣＤ３ε（クローン１４５−２Ｃ１１）及び５μｇ／ｍｌのプレート結合ＣＤ２８（クローン３７．５１）抗体で細胞を活性化した。５日後に、試料をＣＤ８（クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＤ４（クローンＧＫ１．５；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で標識し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いてＣＦＳＥ希釈によってＴ細胞増殖を評価した。この実験の結果を、図１５に示す。
【０１７６】
例１に示すように、ＣａＶ１．４タンパク質の不在は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力を低減した。細胞表面ＣａＶ１．４の阻害がＴ細胞分裂に影響することを確認するために、ＣＦＳＥで標識した脾細胞を、ＴＣＲを通してプレート結合ＣＤ３及び可溶性ＣＤ２８抗体で活性化し、外部ドメイン特異的ＣａＶ１α１サブユニット抗体の有り無しでインキュベートした。図１５に示すように、遮断抗体の存在下では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞はより少ない細胞分裂を経たことが見出された。この例は、遮断抗体によるＣａＶ１．４機能の阻害が、ＴＣＲ活性化の後にＴ細胞増殖を低減することを実証する。
【０１７７】
（例４）：Ｂリンパ球でのＣＡＶ１．４カルシウムチャネルの役割
Ｂ細胞生物学でのＣａｖ１．４の生理機能を判断するために、以下の実験を実行した。
【０１７８】
実験的方法：
マウス：Ｃａｃｎａ１ｆ−／−マウスは、以前に記載されている（Mansergh et al., 2005）。これらのマウスを、少なくとも１３世代にわたってＣ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２＋）バックグラウンドに戻し交配した。Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１＋）マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＣｏｌｕｍｂｉａのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって設定されたガイドラインに従って試験を実施した。
【０１７９】
フローサイトメトリー：Ｂ細胞発生の分析のために、骨髄、脾臓及び腹腔洗浄液の単細胞懸濁液を調製し、赤血球溶解の後、図に示すように特定のＢ細胞サブセットを同定するために用いた細胞表面マーカーに対する様々な抗体で、細胞を氷上で３０分間染色した。ＢＡＦＦ受容体の表面発現を評価するために、脾細胞をＢＡＦＦ受容体、Ｂ２２０、ＩｇＭ、ＣＤ２１及びＣＤ２３抗体で表面染色した。ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアと用いてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０１８０】
脾臓Ｂ細胞の精製及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激：一次マウスＢ細胞の精製については、野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスの脾臓から単細胞懸濁液を調製した。赤血球溶解の後、製造業者の指示によりＥａｓｙＳｅｐマウスＢ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）を用いて、Ｂリンパ球を負選択した。フローサイトメトリー分析により一般的に＞９０％Ｂ２２０＋であった精製脾臓Ｂリンパ球を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に次に再懸濁した。刺激後の表面活性化マーカーの発現レベルを評価するために、脾臓Ｂ細胞を刺激しないでおいたか、指示された濃度のＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、抗マウスＣＤ４０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で刺激した。２４時間後に、Ｂ２２０、ＣＤ６９及びＣＤ８６抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１８１】
増殖アッセイについては、精製Ｂリンパ球を２ｕＭカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識し、指示された濃度の抗ＩｇＭ又はＬＰＳの存在下又は不在下で培養した。７２時間後、ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１８２】
ＢＡＦＦ刺激後のＢ細胞の生存を評価するために、指示された濃度の組換え体マウスＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下又は不在下で、精製脾臓Ｂ細胞を７２時間培養した。生細胞の百分率は、ヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）による染色の後、フローサイトメトリーによって評価した。ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアと用いてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０１８３】
骨髄キメラ：ＣＤ４５．２＋野生型又はＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスからのドナー骨髄を、ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋類遺伝子性の野生型マウスからの競合骨髄と１：１の比で混合した。１，１００ラドのγ線照射にさらしたレシピエントのＣＤ４５．１＋野生型マウスに、マウス１匹につき合計で３×１０６個の骨髄細胞を静脈内注入した。再構成の８週間後に、分析のために脾臓、骨髄及び腹腔細胞を回収した。
【０１８４】
細胞質及びミトコンドリアのＣａ２＋測定：Ｂ細胞Ｃａ２＋流量でのＣａｖ１．４の関与を調査するために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスからの脾細胞に、２％ＦＢＳを含有するＨＢＳＳ中の細胞内カルシウム色素Ｆｌｕｏ−４及びＦｕｒａＲｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を室温で４５分間負荷した。洗浄後、氷上で３０分間、細胞をＢ２２０抗体で表面染色した。刺激の前に試料をＲＰＭＩに懸濁させ、３７℃で１５分間予熱した。指示された時点で、３０μｇ／ｍＬのＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、１μＭのタプシガルジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）又は１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で細胞を刺激した。細胞外Ｃａ２＋のキレート化を、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の添加によって実行した。脾臓Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）での細胞内Ｃａ２＋レベルを、Ｆｌｕｏ−４／ＦｕｒａＲｅｄの比として経時的にプロットした。Ｃａｖ１．４欠損がミトコンドリアのカルシウム取り込みの変化をもたらすかどうか評価するために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスからの脾細胞に、Ｒｈｏｄ−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ミトコンドリアのＣａ２＋指標、を負荷し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞に負荷する前にＲｈｏｄ−２はｄｉｈｙｄｒｏｒｈｏｄ−２に還元され、それは、サイトゾル及びミトコンドリアに局在する色素の間での識別を向上させることが示された。Ｒｈｏｄ−２標識細胞を次にＢ２２０抗体で染色し、ミトコンドリア膜電位を破壊するために、カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の、又は細胞外Ｃａ２＋をキレート化するためにＥＧＴＡの存在下又は不在下で、上で指示されるように刺激した。細胞内及びミトコンドリアのカルシウムレベルの変化の間での関係を評価するために、細胞内カルシウム色素Ｆｌｕｏ−４及びＦｕｒａＲｅｄを負荷した野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスからの脾細胞で、並行実験を実行した。ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを用いてＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターでデータを取得し、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０１８５】
ＴＮＰ−フィコール免疫化：Ｔ細胞非依存性２型抗体応答を導き出すために、年齢と性別をマッチさせたＣ５７ＢＬ／６及びＣａｃｎａ１ｆ−／−マウスに、５０μｇの２，４，６−トリニトロフェノール（ＴＮＰ）−アミノエチルカルボキシメチル（ＡＥＣＭ）−フィコール（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を腹腔内に注入した。免疫化の前と注射の７日後に血清を回収し、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。ＥＬＩＳＡプレートをＴＮＰ−ＢＳＡで４℃で一晩コーティングし、洗浄し、１％（容量／容量）のＢＳＡにより３７℃で１時間ブロッキングした。血清試料の連続希釈を次に加えて、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＭ又は抗マウスＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、３７℃で１時間さらにインキュベートし、続いてＳｕｒｅＢｌｕｅ貯蔵テトラメチルベンジジン基質溶液（ＫＰＬ）と反応させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１８６】
統計分析。対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで統計的有意性を計算した。ｐ＜０．０５の値は、有意であるとみなした。データは、平均±ＳＤで表す。
【０１８７】
結果
ＣａＶ１．４欠損マウスは、骨髄で正常なＢリンパ球発生を示す。
図２２Ａは、ＣａＶ１．４欠損マウスが骨髄でＢリンパ球の変更されていない頻度及び数を有することを実証する。骨髄でのＢリンパ球の頻度（リンパ球の百分率）及び総数は、Ｂ２２０抗体で標識した骨髄細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。図２２Ｂは、ＣａＶ１．４欠損マウスは、骨髄でプリプロＢ細胞段階から未熟段階までの変更されていない進行を有するが、再循環成熟Ｂリンパ球の著しく低減された数を有することを実証する。骨髄での各Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）サブセットの総数は、様々な抗体で標識した細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。集団は、ハーディゲーティングスキームによって定義した：プリプロＢ、Ｂ２２０＋ＣＤ４３＋ＢＰ−１−ＨＳＡ−；プロＢ、Ｂ２２０＋ＣＤ４３＋ＢＰ−１−ＨＳＡ＋；早期プリＢ、Ｂ２２０＋ＣＤ４３＋ＢＰ−１＋ＨＳＡ＋；後期プリＢ、Ｂ２２０＋ＣＤ４３−ＩｇＭ−ＩｇＤ−；未熟プリＢ、Ｂ２２０＋ＣＤ４３−ＩｇＭ＋ＩｇＤ−；及び、再循環成熟Ｂ細胞（成熟）、Ｂ２２０＋ＣＤ４３−ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋。＊＊ｐ＜０．０１。
【０１８８】
ＣａＶ１．４欠損マウスは、変更された脾臓Ｂリンパ球成熟を示す。
図２３Ａは、ＣａＶ１．４欠損マウスが脾臓Ｂ細胞の低減された頻度及び数を提示することを実証する。脾臓でのＢリンパ球の頻度（リンパ球の百分率）及び総数は、Ｂ２２０抗体で標識した脾細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。図２３Ｂは、ＣａＶ１．４欠損マウスが、辺縁帯Ｂ細胞の劇的に低減された頻度及び数を有する脾臓Ｂ細胞サブセットの変更された百分率を提示することを実証する。脾臓での各Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）サブセットの頻度及び総数は、指示された表面分子に対する抗体で標識した脾細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。Ｂ細胞集団は、以下の通りに定義した：移行性Ｔ１、ＣＤ９３＋ＣＤ２３−ＩｇＭｈｉｇｈ  ＩｇＤ−／ｌｏｗ  ＣＤ２１／３５−／ｌｏｗ；移行性Ｔ２、ＣＤ９３＋ＣＤ２３＋  ＩｇＭｈｉｇｈ  ＩｇＤｈｉｇｈ  ＣＤ２１／３５ｌｏｗ；移行性Ｔ３、ＣＤ９３＋ＣＤ２３＋ＩｇＭｌｏｗ  ＩｇＤｈｉｇｈ  ＣＤ２１／３５ｌｏｗ；小胞Ｉ型（Ｆｏ１）、ＣＤ９３−ＣＤ２３＋ＩｇＭｌｏｗ  ＩｇＤｈｉｇｈ  ＣＤ２１／３５ｉｎｔ．；小胞ＩＩ型（Ｆｏ２）、ＣＤ９３−／ｌｏｗ  ＣＤ２３＋ＩｇＭｈｉｇｈ  ＩｇＤｈｉｇｈ  ＣＤ２１／３５ｉｎｔ．；辺縁帯前駆体（ＭＺＰ）ＣＤ９３−／ｌｏｗ  ＣＤ２３＋ｓＩｇＭｈｉｇｈ  ＣＤ１ｄ＋ＩｇＤｈｉｇｈ  ＣＤ２１／３５ｈｉｇｈ；及び辺縁帯（ＭＺ）ＣＤ９３−ＣＤ２３−ＩｇＭｈｉｇｈ  ＩｇＤｌｏｗ  ＣＤ２１／３５ｈｉｇｈ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１
【０１８９】
Ｃａｖ１．４欠損は、変更された腹腔Ｂ細胞コンパートメントをもたらす。
図２４は、Ｃａｖ１．４欠損は、変更された腹腔Ｂ細胞コンパートメントをもたらすことを実証する。Ａ．腹腔でのＢリンパ球の頻度（リンパ球の百分率）は、Ｂ２２０抗体で標識した細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。Ｂ．腹腔での各Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）サブセットの百分率は、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ５抗体で標識した細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。Ｂ細胞集団は、以下の通りに定義した：従来のＢ２  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ−；Ｂ１ａ  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５＋；及びＢ１ｂ  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５−。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１９０】
細胞内在性のＣａｖ１．４機能が、正常なＢ細胞発生のために必要とされる。
図２５は、細胞内在性のＣａｖ１．４機能が、正常なＢ細胞発生のために必要とされることを実証する。再構成の８週後に分析された、野生型ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋（競合者）と野生型ＣＤ４５．２＋（ドナー）骨髄との１：１混合物、又は野生型ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋（競合者）とＣａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４５．２＋（ドナー）骨髄との１：１混合物を静脈内注入した、致死的に照射された類遺伝子性のＣＤ４５．１＋野生型レシピエントマウスでのＢ細胞発生のフローサイトメトリー。結果は、骨髄（Ａ）、脾臓（Ｂ）及び腹腔（Ｃ）での、ＣＤ４５．２＋ドナーリンパ球とＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋競合者リンパ球との比で示す（＋／＋青四角、野生型ＣＤ４５．２＋ドナー対ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋競合者細胞；−／−赤三角形、Ｃａｃｎａ１ｆ−／−ＣＤ４５．２＋ドナー対ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋競合者細胞）。Ｂ細胞集団は、以下の通りに定義した：骨髄では、全Ｂ細胞、Ｂ２２０＋；プロＢ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ−ＣＤ４３＋；プリＢ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ−ＣＤ４３−；未熟Ｂ細胞、Ｂ２２０ｌｏｗＩｇＭ＋；及び再循環成熟Ｂ細胞、Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋；脾臓では、移行性Ｔ１  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ２１−ＣＤ２３−；移行性Ｔ２  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋；小胞Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭｌｏＣＤ２１ｍｉｄ；及び辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ２１＋ＣＤ２３−；腹腔では、従来のＢ２  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ−；Ｂ１ａ  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５＋；及びＢ１ｂ  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５−。
【０１９１】
ＣａＶ１．４欠損は、Ｂ細胞でのＢ細胞受容体及びタプシガルジンによって誘導されるＣａ２＋応答の障害をもたらす。
図２６は、ＣａＶ１．４欠損は、Ｂ細胞でのＢ細胞受容体及びタプシガルジンによって誘導されるＣａ２＋応答の障害をもたらすことを実証する。野生型（＋／＋；青線）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−；赤線）脾細胞に細胞内Ｃａ２＋色素Ｆｌｕｏ−４及びＦｕｒａＲｅｄを負荷し、Ｂ２２０抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脾臓Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）での細胞内Ｃａ２＋レベルを、Ｆｌｕｏ−４／ＦｕｒａＲｅｄの比として経時的にプロットした。指示された時点で、脾臓のＢリンパ球を、抗ＩｇＭ（ＢＣＲ）、イオノマイシン（Ｉｏｎ）又はタプシガルジン（Ｔｇ）で刺激した。細胞外Ｃａ２＋を、ＥＧＴＡ添加によってキレート化させた。
【０１９２】
Ｃａｖ１．４欠損は、Ｂ細胞受容体によって誘導されるミトコンドリアＣａ２＋応答の障害をもたらす。
図２７は、Ｃａｖ１．４欠損は、Ｂ細胞受容体によって誘導されるミトコンドリアＣａ２＋応答の障害をもたらすことを実証する。野生型（＋／＋、青線）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−、赤線）脾細胞に細胞内Ｃａ２＋色素Ｆｌｕｏ−４及びＦｕｒａＲｅｄ（Ａ）又はミトコンドリアＣａ２＋色素Ｒｈｏｄ−２（Ｂ）を負荷し、Ｂ２２０抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脾臓Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）での細胞内Ｃａ２＋レベルを、Ｆｌｕｏ−４／ＦｕｒａＲｅｄの比として経時的にプロットした。ミトコンドリア膜電位を破壊するためにカルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の存在下又は不在下で、又は細胞外Ｃａ２＋をキレート化するためにＥＧＴＡの存在下又は不在下で、細胞を抗ＩｇＭ（ＢＣＲ）又はイオノマイシン（Ｉｏｎ）によって指示時点で刺激した。
【０１９３】
ＣａＶ１．４欠損Ｂ細胞は、欠陥のあるＢ細胞受容体媒介活性化を示す。
図２８は、ＣａＶ１．４欠損Ｂ細胞は、欠陥のあるＢ細胞受容体媒介活性化を示すことを実証する。野生型（＋／＋、青線）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−、赤線）脾細胞は刺激しないでおいた（灰色）か、指示濃度の抗ＩｇＭ、抗ＣＤ４０又はＬＰＳで２４時間刺激し、Ｂ２２０、ＣＤ６９（Ａ）及びＣＤ８６（Ｂ）抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。括弧に入れた線の上の数字は、表面マーカーを上方制御した脾臓Ｂ細胞（Ｂ２２０＋）の百分率を表す。
【０１９４】
ＣａＶ１．４欠損Ｂ細胞は、低減されたＢ細胞受容体誘導増殖を示す。
図２９は、ＣａＶ１．４欠損Ｂ細胞は、低減されたＢ細胞受容体誘導増殖を示すことを実証する。野生型（＋／＋、青線）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−、赤線）のＣＦＳＥ標識脾細胞は刺激しないでおいた（灰色）か、指示濃度の抗ＩｇＭ又はＬＰＳで７２時間刺激し、次にＢ２２０抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。括弧に入れた線の上の数字は、分裂細胞の百分率を表す。
【０１９５】
Ｃａｖ１．４欠損脾臓Ｂ細胞は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）受容体の低減された発現及びＢＡＦＦに応じたより低い生存率を示す。
図３０は、Ｃａｖ１．４欠損脾臓Ｂ細胞は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）受容体の低減された発現及びＢＡＦＦに応じたより低い生存率を示すことを実証する。Ａ．野生型（＋／＋、黒色）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−、灰色）マウスからの全Ｂ２２０＋脾臓Ｂ細胞及び脾臓Ｂ細胞サブセットでのＢＡＦＦ受容体の表面発現のフローサイトメトリー分析。Ｂ細胞集団は、以下の通りに定義した：移行性Ｔ１  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ２１−ＣＤ２３−；移行性Ｔ２  Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋；小胞Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭｌｏＣＤ２１ｍｉｄ；及び辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ２１＋ＣＤ２３−。Ｂ．野生型（＋／＋、青線）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（−／−、赤線）マウスからの精製脾臓Ｂ細胞を、組換え体マウスＢＡＦＦの指示濃度の存在下又は不在下で７２時間培養し、次にヨウ化プロピジウムで染色した。生細胞（ヨウ化プロピジウム陰性細胞）の百分率を、フローサイトメトリーによって評価した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【０１９６】
ＣａＶ１．４欠損マウスは、ＴＮＰ−フィコール、Ｔ細胞非依存性２型抗原による免疫化の後、抗体応答の障害を発生させる。
図３１は、ＣａＶ１．４欠損マウスは、ＴＮＰ−フィコール、Ｔ細胞非依存性２型抗原による免疫化の後、抗体応答の障害を発生させることを実証する。野生型（ｎ＝５）及びＣａｃｎａ１ｆ−／−（ｎ＝５）マウスにＴＮＰ−フィコールを腹腔内に注入し、免疫化の後に導き出された特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡによって判断した。免疫化から０日目（野生型、＋／＋黒線；Ｃａｃｎａ１ｆ−／−、−／−灰色線）及び７日目（野生型、＋／＋青線；Ｃａｃｎａ１ｆ−／−、−／−赤線）の、ＴＮＰ特異的抗ＩｇＭ（Ａ）及び抗ＩｇＧ３（Ｂ）抗体応答。
【０１９７】
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【０１９８】
本明細書で参照される、公開された特許出願を含む全ての特許、公開文書、及びデータベースエントリーは、そのような各個々の特許、公開文書及びデータベースエントリーが参照により組み込まれることが明示的及び個々に示されるかのように、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。
【０１９９】
本発明は特定の具体的な実施形態に関して記載されたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その様々な改変形態が当業者に明らかになろう。当業者に明らかになるであろうそのような全ての改変形態は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図３】
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【図１６】
2014522664.tif 000003
【図１７−１】
2014522664.tif 000004
【図１７−２】
2014522664.tif 000005
【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図２０】
2014522664.tif 000008
【図２１】
2014522664.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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