(57)【要約】  本発明は微生物の接種材料に関し、特に微生物の参照培養物を生産するための標準的な接種材料に関する。主に固体円盤形の接種材料としての使用のために開発され、この用途に関して、本明細書に記載される。しかしながら、本発明がこの特定の使用分野に限定されるものでないことが理解されるだろう。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存培地及び所定の量の接種物質を含み、実質的に円盤形である、固体乾燥接種材料。
【請求項２】
前記接種材料が凸状表面を含む、請求項１に記載の接種材料。
【請求項３】
前記凸状表面が対応する凹状表面の反対側にある、請求項２に記載の接種材料。
【請求項４】
前記接種材料が、微生物学的接種ループを用いる容器間の移動を容易にするための大きさおよび形である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項５】
前記接種材料が凍結乾燥接種材料である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項６】
前記凍結保存培地がウシ血清アルブミン及びゼラチンをほぼ同じ割合で含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項７】
前記凍結保存培地が、ウシ血清アルブミン、ミオイノシトール、牛肉エキス、細菌学的ペプトン、ゼラチン、活性炭、及び水を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項８】
前記接種物質が細胞である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項９】
前記接種材料が約108の細胞を含む、請求項８に記載の接種材料。
【請求項１０】
前記接種物質が微生物である、請求項１〜９のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項１１】
前記微生物が、細菌及び真菌からなる群より選択される、請求項１０に記載の接種材料。
【請求項１２】
前記細菌が、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；バチルス・プミルス（B. pumilus）；バチルス・スブチリス（B. subtilis）；バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；ブレブンディモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・ヒラエ（E. hirae）；大腸菌（Escherichia coli）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）；コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）；ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）；リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）亜種；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種；及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）からなる群より選択される、請求項１１に記載の接種材料。
【請求項１３】
前記真菌が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からなる群より選択される、請求項１１に記載の接種材料。
【請求項１４】
以下のステップ：
a）所定の量の接種物質を含む一定分量の液体凍結保存培地を複数、表面に配置すること；
b）前記表面に配置された前記一定分量のそれぞれを乾燥し、複数の固体乾燥接種材料を得ること；及び
c）前記表面から前記接種材料を取り除くこと；
を含む固体乾燥接種材料の製造方法であって、前記接種材料がそれぞれ実質的に円盤形である、固体乾燥接種材料の製造方法。
【請求項１５】
前記接種材料のそれぞれが凸状表面を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記凸状表面が対応する凹状表面の反対側にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記乾燥が凍結乾燥によってなされる、請求項１４〜１６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記一定分量のそれぞれが、約10μL〜約100μLの容量を有する、請求項１４〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記一定分量のそれぞれが、約15μL〜約60μLの容量を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記表面がプラスチック表面である、請求項１４〜１９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面がポリスチレン表面である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接種物質が細胞である、請求項１４〜２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記接種材料が約108の細胞を含む、請求２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記接種物質が微生物である、請求項１４〜２３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物が、細菌及び真菌からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌が、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；バチルス・プミルス（B. pumilus）；バチルス・スブチリス（B. subtilis）；バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；ブレブンディモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・ヒラエ（E. hirae）；大腸菌（Escherichia coli）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）；コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）；ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）；リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）亜種；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種；及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記真菌が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４〜２７のいずれか1項に記載の方法により製造される、実質的に固体で、実質的に乾燥した接種材料。
【請求項２９】
請求項１〜１３又は２８のいずれか1項に記載の実質的に固体で、実質的に乾燥した接種材料を含むパッケージ。
【請求項３０】
比較例を除く実施例のいずれか一以上に関して本明細書に実質的に記載された、請求項１若しくは２８に記載の固体乾燥接種材料；請求項１４に記載の方法；又は請求項２９に記載のパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の接種材料に関し、特に微生物の参照培養物を生産するための標準化された接種材料に関する。
【０００２】
本発明は主に固体円盤形接種材料としての使用のために開発され、この用途に関して、以下に記載される。しかしながら、本発明がこの特定の使用分野に限定されるものでないことが理解されるだろう。
【背景技術】
【０００３】
本明細書を通じて、従来技術に関するいずれの議論も、かかる従来技術が広く知られ、又は本分野において技術常識の一部を形成していることを認めるものと、決してみなすべきでない。
【０００４】
生きている微生物を安定な形態で維持することは、微生物学の研究において重要である。微生物の凍結乾燥方法は、比較的良好なものとなっている。うまく凍結乾燥された細胞は冷凍条件なしに保管され得るので、この手順は液体窒素保管系等の超冷却系と比べてより簡便かつより安価である。一般に、細胞が凍結されるとき、水の結晶による損傷効果を防ぐために凍結保護物質が凍結培地に含まれる。細胞の安定な凍結乾燥接種材料を調製する際の主要な外傷は、凍結及び解凍プロセス中の細胞への物理的衝撃の結果として生じると一般に考えられている。凍結保護物質の成分の変更は、細胞の生存率を改善し得、それにより凍結培地はより安定な定量的接種材料を維持するのに有用な凍結保存培地となる。
【０００５】
微生物学の研究室は、品質管理プロセス、例えば試験方法及び培養培地の有効性を証明するプロセスにおいて、所定の量の微生物を提供する標準化された参照培養物を通常用いる。この参照培養物は、微生物の培養物を希釈して所定数のコロニー形成単位／ミリリットル（CFU/ml）を含む新鮮な細胞懸濁液を得ることによって一般に調製される。コロニー形成単位／ミリリットルの数を決定する際の正確性は、希釈中の少しの測定誤差の外挿(extrapolation)だけでなく、サンプル自身の生物学的変動性によってもしばしば大きく変動する。従って、後に調製された新鮮な参照培養物を使用する事は、必然的に、正しくないか又は無効な結果の可能性を増加させる。というのも、一連の実験において、それぞれの単一の接種材料に対してコロニー形成単位／ミリリットルの数を一貫して決定することは困難だからである。
【０００６】
微生物産業において参照培養物を生産するための既知の接種材料として、Bioball（登録商標）（BTF）等の製品が挙げられる。Bioball（登録商標）は、比較的正確で一貫した数の微生物を含む、再現性のある変動量（平均値から＜2の標準偏差）を有する複数の接種材料を提供し得る。しかしながら、Bioball（登録商標）の生産プロセスは複雑であり、製造中の製品の正確性の要件が、製品の製造を比較的高価にしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術の不利益の少なくとも一つを克服若しくは改善する事、又は有用な代替手段を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、様々な実施形態において、固体円盤形微生物接種材料、改善された凍結保存培地の凍結保護物質製剤、及びかかる接種材料を確実かつ簡単に生産するためのプロセスに関する。接種材料は、より使い勝手の良い形態で製造するのが比較的安価であり、使用者が簡便かつ正確に所定の量の接種物質、例えば所定の数の細胞又は微生物を、標準的な実験室設備を用いて一つの容器から他の容器へ移すことを可能にする形及び大きさである。
【０００９】
第一の側面において、本発明は、凍結保存培地及び所定の量の接種物質を含む固体乾燥接種材料を提供し、ここで前記接種材料は実質的に円盤形である。
【００１０】
本発明の好適な実施形態に従って、実質的に円盤形の接種材料は好適には半球形であり、対応する凹状表面の反対側に凸状表面を含み、これにより標準的な実験室接種ループを用いる一つの容器から他の容器への簡便な移動を容易にする。
【００１１】
便利なことに、接種材料は凍結乾燥により生産される。
【００１２】
凍結保存培地は典型的にウシ血清アルブミン、ミオイノシトール、牛肉エキス、細菌学的ペプトン（bacteriological peptone）、ゼラチン、活性炭、及び水を含む。特に、凍結保存培地の好適な製剤は、ほとんど同じ割合で（すなわち約1:1の比で）ウシ血清アルブミン及びゼラチンを含む。接種物質は典型的に細菌又は真菌等の微生物であり得る細胞であり、それぞれの接種材料は約0〜約108の細胞を含む。細菌細胞は、限定されるものではないが、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；バチルス・プミルス（B. pumilus）；バチルス・スブチリス（B. subtilis）；バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；ブレブンディモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・ヒラエ（E. hirae）；大腸菌（Escherichia coli）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）；コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）；ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）；リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）亜種；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種；及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）からなる群より選択され得る。細胞が真菌細胞である場合には、真菌は限定されるものではないが、以下の株：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からなる群より選択され得る。
【００１３】
第二の側面において、本発明は、以下のステップ：
a）所定の量の接種物質を含む一定分量の液体凍結保存培地を複数、表面上に配置すること；
b）前記表面上に配置された前記一定分量のそれぞれを乾燥し、複数の固体乾燥接種材料を得ること；及び
c）前記表面から前記接種材料を取り除くこと；
を含む固体乾燥接種材料の製造方法を提供し、ここで前記接種材料はそれぞれ実質的に円盤形である。
【００１４】
好適には、接種材料は乾燥ステップの後、半球形である。乾燥は好適には配置された一定分量を凍結乾燥することにより達成される。所望の接種材料を生産するために、前記一定分量は一般に約10μL〜約100μL、好適には約15μL〜約60μLの容量を有し、接種物質として約0〜約108細胞の微生物を含む。
【００１５】
表面は典型的にプラスチック表面、好適には標準的な実験用ポリスチレン皿又はトレー、例えばペトリ皿等のポリスチレン表面である。
【００１６】
第三の側面において、本発明は第二の側面の方法によって製造される固体乾燥接種材料に関する。
【００１７】
第四の側面において、本発明は第一又は第三の側面に従う複数の固体乾燥接種材料を含む容器／パックを提供する。
【００１８】
文脈が他に明確に必要としない限り、発明の詳細な説明及び特許請求の範囲を通じて、単語「含む」、「含み」等は、排他的又は網羅的な意味とは対照的に、包含的な意味；すなわち、「限定されるものではないが、含んで」の意味として解釈される。
【００１９】
本明細書の文脈において、用語「接種材料（inoculum、複数ではinocula）」は、所定の量の接種物質を含む一定分量の凍結保存培地の乾燥により生じる物体を意味する。本発明の一以上の好適な実施形態に従う接種材料は、標準的な実験設備を用いて簡便に取り扱うことを可能とするその半球形、実質的に円盤形の本体によって規定され、培養培地に接種するのに用いられる。
【００２０】
本発明の一以上の好適な実施形態に従う「乾燥」接種材料は、実質的に全ての液体が除去されている。あるいは、用語「乾燥」は、本発明の一以上の好適な実施形態に従う接種材料について言及する際には、接種材料が残留水分を含んでも良いが、標準的な実験設備を用いて簡便に取り扱い得る程度に十分に「乾燥」していることを意味する。
【００２１】
本発明の一以上の好適な実施形態に従う「固体」接種材料は、液体でも気体でもなく、それ自身の重さによって流動しない。あるいは、用語「固体」は、本発明の一以上の好適な実施形態に従う接種材料について言及する際には、その円盤形の本体を維持し、標準的な実験設備を用いて簡便に取扱い得る程度に接種材料が十分に堅いことを意味する。
【００２２】
本発明の文脈における用語「凍結保存培地」は、凍結及び解凍の間の物理的衝撃から、培地に含まれる接種物質を保護及び／又は損傷を最小化し得る液体組成物を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
添付の図面に関する本発明の好適な実施形態を、例としてのみ記載する。
【図１】図1は、本発明の好適な実施形態に従う、対応する凹状表面の反対側に凸状表面を含む、複数の実質的に半球形、円盤形の接種材料の上面図である。
【図２】図2Aは、本発明の好適な実施形態に従う、対応する凹状表面の反対側に凸状表面を含む、実質的に半球形、円盤形の接種材料の側面図を示す、センチメートル／ミリメートル単位での写真である。
【００２４】
図2Bは、図2Aで示される接種材料の上面図である。
【図３】図3Aは、その凹状表面を上に向けて、プラスチックの細菌学的ループにおいて移動されている接種材料を示す、本発明の好適な実施形態に従う接種材料の上面図を示す写真である。
【００２５】
図3Bは、図3Aで示したループの隣に空の細菌学的ループを示す、図3Aの図と同様の上面図である。
【図４】図4は、その凹状表面を上に向けている、本発明の好適な実施形態に従ういくつかの接種材料の斜視図を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図面を参照すれば、本発明に従う固体乾燥接種材料は、対応する凹状表面の反対側に凸状表面を含む、実質的に円盤形の本体を有する。
【００２７】
好適な一実施形態では、図で示される特定の形の接種材料は、無菌条件下の使用者による接種材料の取り扱いを容易にする。例えば、その形は、図3A及び3Bで示される標準的な微生物学的接種ループを用いる接種材料の簡便な取り扱いを可能にし、それにより容器間の接種材料の移動を容易にする。
【００２８】
さらに、好適な実施形態では、接種材料は、約108細胞／接種材料の量の所定量の接種物質、好適には細菌又は真菌等の細胞微生物、並びに接種材料の乾燥及びその後の保管プロセス中に、これらの細胞を生存状態で保護及び保存するための凍結保存培地を含む。この目的のため、凍結保存培地は好適にはウシ血清アルブミン（BSA）及びゼラチンをほとんど同じ割合で含むだけでなく、ミオイノシトール、牛肉エキス、細菌学的ペプトン、活性炭、及び水もまた含む。
【００２９】
好適な一実施形態では、接種材料は、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；バチルス・プミルス（B. pumilus）；バチルス・スブチリス（B. subtilis）；バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；ブレブンディモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・ヒラエ（E. hirae）；大腸菌（Escherichia coli）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）；コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）；ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）；リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）亜種；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種；及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）からなる群より選択される細菌を含む。
【００３０】
他の好適な実施形態では、接種材料は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からなる群より選択される真菌を含む。
【００３１】
本発明のさらなる好適な実施形態によれば、乾燥接種材料は、数ヶ月間にわたって細菌又は真菌細胞の一貫した生存率を維持する。細胞の生存率は、4℃における特定の貯蔵期間後の接種材料あたりの生産されるコロニー形成単位（CFU）の数により評価され得る。従って、細胞の生存率の減少は、接種材料あたりの生産されるCFUの減少により表される（以下の表１を参照されたい）。
【００３２】
本発明の別の好適な実施形態に従う接種材料は、新鮮かつ同等の参照培養物を一貫して製造するための培養培地の一貫したかつ標準化された接種のための、定量的かつ安定な接種材料を提供する。かかる参照培養物は、微生物学的な品質管理プロセスにおいて、通常用いられ得る。
【００３３】
他の好適な実施形態では、本発明は複数の前記実質的に固体の実質的に乾燥した接種材料の製造方法に関する。複数の接種材料は、対応する複数の一定分量の液体凍結保存培地を、約10μL〜約100μL、好適には約15μL〜約60μLの容量を有し、約108の細菌又は真菌細胞を含む液滴の形態で、標準的な実験用ポリスチレンペトリ皿のポリスチレン表面上に配置することによって製造される。接種材料における細菌又は真菌の数は、接種材料の所望の用途に応じて、より高いかより低いものであり得る事が理解されるだろう。その後、それぞれの液滴は凍結され、次にポリスチレン表面上で凍結乾燥され、標準的な微生物学的接種ループによる取り扱いを容易にするために便利な円盤形の固体乾燥接種材料が得られる。具体的には、接種材料はペトリ皿のポリスチレン表面から取り除かれた後、該接種材料は対応する実質的に凹状の表面の反対側に実質的に凸状の表面を含み、前記無菌接種ループを用いて容器間を簡単に移動させ得る。固体乾燥接種材料の終直径は、用いる液滴のサイズによって大部分が左右される。一以上の好適な実施形態では、前記方法によって製造される固体乾燥接種材料は、保管及び販売の為に包装され得る。生産が比較的簡単かつ安価である一方で、かかる包装されたパッケージに含まれるそれぞれの接種材料は、実質的に同一な所定の量の接種物質を含む、安定かつ定量的な接種材料を提供する。
【００３４】
本発明は、非限定例を参照して、以下により詳細に記載される。
【実施例】
【００３５】
１．凍結保存培地（Cryopreservation Medium（CM））
凍結保存培地の成分:
・ウシ血清アルブミン、BSA（Sigma, A9056）   5.0%
・ミオイノシトール（Sigma, I5125）          10.0%
・牛肉エキス（BD, 212303）                  0.3%
・細菌学的ペプトン（Oxoid, LP0037）         0.5%
・ゼラチン（Sigma, G9382）                  5.0%
・活性炭（Sigma, C9157）                    0.3%
凍結保存培地の調製
CM Part A:
イノシトール溶液:
・ミオイノシトール  10g
・牛肉エキス        0.3g
・細菌学的ペプトン  0.5g
・ＤＩ水            40ml
混合物を15分間121℃で熱した（pH 7.4±0.2）。
【００３６】
BSA溶液:
・ウシ血清アルブミン  5g
・ＤＩ水              30ml
溶液を0.22μm濾過により滅菌した。
【００３７】
40mlのイノシトール溶液及び30mlのBSA溶液を混合し、CM Part Aを調製した。7mlのCM Part Aを無菌プラスチックボトルに分注し、-20℃で保管した。
【００３８】
CM Part B:
・ゼラチン  5g
・活性炭    0.3g
・ＤＩ水    30ml
混合物を15分間121℃で熱した。
【００３９】
3mlのCM Part Bを無菌プラスチックボトルに分注し、-20℃で保管した。
【００４０】
２．凍結保存培地に再懸濁するための細胞の調製
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）及びシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）細胞の調製方法
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）
シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）
これらの生物をトリプトンソーヤ寒天（TSA, CM131 Oxoid）プレートにまき、各微生物の細菌叢を形成するために、S. aureusは37℃で24時間、P. aeruginosaは30℃で24時間インキュベートした。
【００４１】
プレート（標準的な90mmのポリスチレンペトリ皿）あたり5mLのペプトン水（Oxoid）を、各細菌叢を洗浄するのに用い、懸濁液を遠心チューブに移し、4500 rpmで6分間遠心した。上清の液体をデカント（及び処分）した。
【００４２】
沈殿物を10mLのペプトン水に再懸濁し、再び遠心し；このプロセスを2回繰り返した。
【００４３】
二回目の洗浄後、上清の液体をデカントし、回収された細胞の総数をフォトスペクトロメトリーによって決定し、細胞を下記液滴形成のための凍結保存培地に再懸濁するために保管した。
【００４４】
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞の調製方法
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
この生物をサブローデキストロース寒天（Sabouraud Dextrose Agar）（SDA, CM41 Oxoid）プレートにまき、30℃で24時間インキュベートした。
【００４５】
プレートあたり5mlのペプトン水（Oxoid）を、真菌叢を洗浄するのに用い、懸濁液を遠心チューブに移して4500 rpmで6分間遠心した。上清の液体をデカント（及び処分）した。
【００４６】
沈殿物を10mLのペプトン水に再懸濁し、再び遠心し；このプロセスを2回繰り返した。
【００４７】
二回目の洗浄後、上清の液体をデカントし、回収された細胞の総数をフォトスペクトロメトリーによって決定し、細胞を下記液滴形成のための凍結保存培地に再懸濁するために保管した。
【００４８】
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）及びクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）の芽胞の調製方法
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）
クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）
バチルス・スブチリス（B. subtilis）を0.3%のMnSO4を含むトリプトンソーヤ寒天（TSA, CM131 Oxoid）プレートにまき、37℃で9日間インキュベートした。
【００４９】
クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）を強化クロストリジウム寒天（RCA, CM151 Oxoid）プレートにまき、37℃で14日間、嫌気条件下でインキュベートした。
【００５０】
プレートあたり5mlのペプトン水（Oxoid）を、真菌叢を洗浄するのに用い、懸濁液を遠心チューブに移して4500 rpmで6分間遠心した。上清の液体をデカント（及び処分）した。
【００５１】
沈殿物を10mLのペプトン水に再懸濁し、再び遠心し；このプロセスを2回繰り返した。
【００５２】
二回目の洗浄後、上清の液体をデカントし、次に沈殿を80℃で20分間熱し、その後氷水中で20分間冷却した。芽胞形成は、芽胞染色（P 642, Merck； Microbiology Manual 12th Edition）によってチェックした。目視検査によって形成された芽胞の割合が90%より高いと確認され、該芽胞を下記液滴形成のために保管した。
【００５３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）芽胞の調製方法
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
この生物をサブローデキストロース寒天（Sabouraud Dextrose Agar）（SDA, CM41 Oxoid）傾斜地（100mLメディカルフラット（medical flats）；Schott-Duran）で増殖させ、培養物の全表面が黒くなるまで、30℃でインキュベートした。
【００５４】
平面あたり5mlのペプトン水（Oxoid）を、コンフルエントな増殖物を平面から洗い落とすのに用い、懸濁液をMcCartneyボトル（Techno Plas, Australia）に移した。懸濁液を、紙フィルター（Whatman No. 2）を通過させ、ろ液を遠心チューブに移し、4500 rpmで6分間遠心した。その後、上清の液体をデカント（及び処分）した。
【００５５】
沈殿物を10mLのペプトン水に再懸濁し、再び遠心し；このプロセスを2回繰り返した。
【００５６】
二回目の洗浄後、上清の液体をデカントし、回収された細胞の総数をフォトスペクトロメトリーによって決定し、細胞を下記液滴形成のための凍結保存培地に再懸濁するために保管した。
【００５７】
３．液滴形成
設備及び材料:
ペトリ皿：  エチレンオキシド（EO）によって滅菌されたポリスチレン（PE）
ピペット：  エッペンドルフ、マルチパータイトプラスリピーターピペット（Multipartite Plus Repeater Pipette）
チップ：    500μL（25×20μL）
方法:
特定の量の細胞懸濁液を7mlのCM Part Aに加え、再懸濁した。細胞懸濁液は、前記方法によって回収された2mL以下の容量に、約0〜約108の細菌又は真菌細胞を含んでいた（必要に応じて最初に回収した細胞を、ペプトン水で希釈した）。
【００５８】
3mLのCM Part Bを混合物に添加し、振盪により十分に混合した。エッペンドルフマルチパータイトプラスピペットを20μLの容量に設定し、500μLのチップを用いた。
【００５９】
20μLの細菌CM懸濁液を、垂直的かつ連続的にPSペトリ皿表面に分注し、それぞれの液滴の偶発的な混合を防ぐために、各液滴を他のものから適切な距離に保持した。
【００６０】
その後、PSペトリ皿をすぐに-20℃冷凍庫に30分間移した（前凍結）。
【００６１】
前凍結が終了した後、PSペトリ皿を-80℃冷凍庫に移し、一晩放置した。
【００６２】
４．凍結乾燥
凍結乾燥機（FD-1B-50, Bi Yi Kang, 中国）を、凍結乾燥サイクルの前に30分間、コンデンサー温度を-50℃まで下げることによって準備した。凍結した液滴を有するPSペトリ皿を、凍結乾燥機に配置した。サイクルを、凍結乾燥機の棚温度が-10℃から25℃まで傾斜するように、かつ最大の真空を用いるように設定した。最大の真空レベルに達したら（20Pa未満）、サイクルを終了した。凍結乾燥ディスク（円盤形接種材料）を、ペトリ皿の背を軽く叩くことにより表面から取り外した。その後、無菌の金属又はプラスチックの細菌学的ループ（Techno Plas, Australia）を、凍結乾燥したディスク全体を無菌ガラス瓶に回収するのに用いた。凍結乾燥したディスクを、各無菌バイアルに分注し、（あらかじめ滅菌した）凍結乾燥栓を、この栓がバイアルを密封しないように各バイアルに注意深く配置した。その後、バイアル全体を凍結乾燥機に配置し、最大の真空を働かせた。最大の真空レベル（20Pa未満）に達したら、凍結乾燥機中でバイアルに蓋をした。保管前に、バイアルをアルミニウムのクリンプ（crimp）で圧着した。
【表１】
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【表２】
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【００６３】
説明した発明は、安価かつより簡便な使用の為の大きさ及び形である、実質的に固体、乾燥接種材料を提供すると理解されるだろう。本発明を、特定の例を参照して記載したが、本発明が他の多くの形態によって具体化され得ると当業者には理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月11日(2013.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存培地及び所定の量の接種物質を含み、凸状表面を含む実質的円盤形である固体乾燥接種材料であって、かつ、微生物学的接種ループを用いる容器間の移動を容易にするための大きさおよび形である、前記接種材料。
【請求項２】
前記凸状表面が対応する凹状表面の反対側にある、請求項１に記載の接種材料。
【請求項３】
前記接種材料が凍結乾燥接種材料である、請求項１又は２に記載の接種材料。
【請求項４】
前記凍結保存培地がウシ血清アルブミン及びゼラチンをほぼ同じ割合で含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項５】
前記凍結保存培地が、ウシ血清アルブミン、ミオイノシトール、牛肉エキス、細菌学的ペプトン、ゼラチン、活性炭、及び水を含む、請求項１〜４のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項６】
前記接種物質が細胞である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項７】
前記接種材料が約108の細胞を含む、請求項６に記載の接種材料。
【請求項８】
前記接種材料が約102の細胞を含む、請求項６に記載の接種材料。
【請求項９】
前記接種物質が微生物である、請求項１〜８のいずれか1項に記載の接種材料。
【請求項１０】
前記微生物が、細菌及び真菌からなる群より選択される、請求項９に記載の接種材料。
【請求項１１】
前記細菌が、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；バチルス・プミルス（B. pumilus）；バチルス・スブチリス（B. subtilis）；バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；ブレブンディモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・ヒラエ（E. hirae）；大腸菌（Escherichia coli）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）；コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）；ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）；リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）亜種；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種；及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）からなる群より選択される、請求項１０に記載の接種材料。
【請求項１２】
前記真菌が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からなる群より選択される、請求項１０に記載の接種材料。
【請求項１３】
以下のステップ：
a）所定の量の接種物質を含む一定分量の液体凍結保存培地を複数、表面に配置すること；
b）前記表面に配置された前記一定分量のそれぞれを乾燥し、複数の固体乾燥接種材料を得ること；及び
c）前記表面から前記接種材料を取り除くこと；
を含む固体乾燥接種材料の製造方法であって、前記接種材料がそれぞれ凸状表面を含む実質的円盤形であり、かつ、前記接種材料が細菌学的接種ループを用いる容器間の移動を容易にするための大きさおよび形である、固体乾燥接種材料の製造方法。
【請求項１４】
前記凸状表面が対応する凹状表面の反対側にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記乾燥が凍結乾燥によってなされる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一定分量のそれぞれが、約10μL〜約100μLの容量を有する、請求項１３〜１５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記一定分量のそれぞれが、約15μL〜約60μLの容量を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面がプラスチック表面である、請求項１３〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面がポリスチレン表面である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記接種物質が細胞である、請求項１３〜１９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記接種材料が約108の細胞を含む、請求２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接種材料が約102の細胞を含む、請求２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記接種物質が微生物である、請求項１３〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物が、細菌及び真菌からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌が、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；バチルス・プミルス（B. pumilus）；バチルス・スブチリス（B. subtilis）；バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；ブレブンディモナス・ディミヌタ（Brevundimonas diminuta）；ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・ヒラエ（E. hirae）；大腸菌（Escherichia coli）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）；コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）；ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）；リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）亜種；シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種；及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記真菌が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１３〜２６のいずれか1項に記載の方法により製造される、実質的に固体で、実質的に乾燥した接種材料。
【請求項２８】
請求項１〜１２又は２７のいずれか1項に記載の実質的に固体で、実質的に乾燥した接種材料を含むパッケージ。
【請求項２９】
比較例を除く実施例のいずれか一以上に関して本明細書に実質的に記載された、請求項１若しくは２７に記載の固体乾燥接種材料；請求項１３に記載の方法；又は請求項２８に記載のパッケージ。
【国際調査報告】
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2014503208.tif 000009
2014503208.tif 000010
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