(57)【要約】ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントのポリペプチドシグナル配列を開示する。異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む融合タンパク質も開示する。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むシグナル配列をコードしている第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーター、および該第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合した異種ポリペプチドをコードしている第二ＤＮＡ配列を含むタンパク質発現ベクターも開示する。ポリペプチドの製造方法であって、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントのポリペプチドシグナル配列を含む融合タンパク質を発現させること、および該異種ポリペプチドを回収すること、を含む方法を更に開示する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列。
【請求項２】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチドシグナル配列。
【請求項３】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチドシグナル配列。
【請求項４】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチドシグナル配列。
【請求項５】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチドシグナル配列。
【請求項６】
異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質。
【請求項７】
細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
異種ポリペプチドが、一つ以上の酵素、一つ以上の生物学的応答修飾物質、一つ以上の毒素、一つ以上の抗体、一つ以上の異種ポリペプチドのフラグメント、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
酵素が、酸性β−グルコセレブロシダーゼを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
酵素が、酸性α−ガラクトシダーゼを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
酵素が、酸性α−グルコシダーゼを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
生物学的応答修飾物質が、プロインスリンを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
生物学的応答修飾物質が、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
生物学的応答修飾物質が、インターフェロンを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
生物学的応答修飾物質が、治療的抗体を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
生物学的応答修飾物質が、インスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの：酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体およびインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）の一つ以上を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの：酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）の一つ以上を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの：酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）の一つ以上を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの：酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）の一つ以上を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項３５〜３８に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
細胞培養において増加した発現が、酵素活性について３日の時間経過にわたって検定することによって測定される、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
タンパク質発現ベクターであって、（ａ）第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで前記第一ＤＮＡ配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、プロモーター、および（ｂ）前記第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合している第二ＤＮＡ配列であって、異種ポリペプチドをコードしている該第二ＤＮＡ配列、を含むタンパク質発現ベクター。
【請求項４４】
第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項４３に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項４５】
第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項４４に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項４６】
第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項４３に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項４７】
第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項４６に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項４８】
第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項４３に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項４９】
第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項４８に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項５０】
第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の一次アミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項４３に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項５１】
第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項５０に記載のタンパク質発現ベクター。
【請求項５２】
ポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること；および
（ｂ）前記異種ポリペプチドを回収すること
を含む方法。
【請求項５３】
前記製造が、培養細胞中で行なわれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記培養細胞が、酵母細胞を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記培養細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記製造が、トランスジェニックシステム中で行われる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記トランスジェニックシステムが、雌牛、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
回収が、乳からである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記トランスジェニックシステムが、ニワトリを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
回収が、卵からである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
タンパク質発現ベクターの作製方法であって、
（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一ＤＮＡ配列に、プロモーターを作動可能に連結すること、および
（ｂ）第二ＤＮＡ配列であって、異種ポリペプチドをコードしている該第二ＤＮＡ配列を、前記第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合すること
を含む方法。
【請求項６２】
前記第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項６１に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６３】
前記第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項６２に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６４】
前記第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項６１に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６５】
前記第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項６４に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６６】
前記第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項６１に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６７】
前記第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項６６に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６８】
前記第一ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項６１に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項６９】
前記第二ＤＮＡ配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）をコードしている、請求項６８に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
【請求項７０】
タンパク質発現を増加させる方法であって、
（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および
（ｂ）該異種タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項７１】
タンパク質分泌を増加させる方法であって、
（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および
（ｂ）該異種タンパク質を回収すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本明細書中にそのまま援用される２０１０年１１月２２日出願の米国仮特許出願第６１／４１５，９２６号に優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
[0002]治療的用途および他の用途のための組換え酵素および他のタンパク質の発現および分泌。
【背景技術】
【０００３】
[0003]真核生物では、ほとんど全てのタンパク質のためのタンパク質合成は、細胞質中において、リボソームと称されるメガタンパク質複合体によって開始する。いろいろなタンパク質が、それらの合成およびフォールディングを細胞質中で成し遂げ、そしてそこにとどまって機能する。しかしながら、多くの他のものは、細胞質から小胞体（ＥＲ）中へ輸出され、そこで、それらは、必要な翻訳後修飾（例えば、ジスルフィド結合、グリコシル化等）を得て、それらの適当なタンパク質構造および生物学的活性に達した後、それらの予定の細胞内の場所へ（例えば、ゴルジタンパク質、ペルオキシソームタンパク質およびリソソームタンパク質）または細胞表面へ（例えば、受容体、イオンチャンネル等）輸出される、または細胞外に分泌される（例えば、抗体、凝固因子、ホルモン等）。細胞質からの輸出に向かうタンパク質は、シグナル配列と称される、アミノ（Ｎ−）末端にある特殊なタンパク質要素によって、細胞質タンパク質から区別される。
【０００４】
[0004]シグナル配列（シグナルペプチドとも称される）は、共通のアミノ酸配列または長さを有していないが、典型的に、７〜２０の連続する疎水性アミノ酸残基を含む最初の１５〜４０残基をＮ末端に含み、それは、荷電残基がしばしば隣接するαヘリックス二次構造を形成する。シグナル配列は、細胞質中において、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）と称される特殊なマルチサブユニットタンパク質：ＲＮＡ複合体によって識別され、それが、これら新生タンパク質を、トランスロコンと称されるＥＲ膜内の特殊な細孔へ向け、そこで、これらタンパク質は、ＥＲ膜を越えてＥＲルーメン中に輸送される、すなわち、タンパク質トランスロケーションとして知られる過程である。
【０００５】
[0005]タンパク質トランスロケーションは、哺乳動物の場合、タンパク質合成の際に同時に（すなわち、同時翻訳的に）起こるが、他の真核生物（例えば、酵母）の場合、この過程は、同時翻訳的かまたは翻訳後でありうる。シグナル配列で媒介されるタンパク質トランスロケーションは、細菌においても、タンパク質を細胞質からペリプラズム中へ向けるために利用される。哺乳動物の場合、シグナル配列は、それらがリボソームから出てくると同時にＳＲＰによって識別され、それが、タンパク質翻訳を一時的に休止させて、関連ＳＲＰ受容体によるトランスロコンへのＳＲＰ−新生タンパク質−リボソーム複合体全体のターゲッティングを可能にする。タンパク質合成は、ＳＲＰが遊離された後に再開し、そしてリボソーム−新生タンパク質複合体は、トランスロコンにおいて適切にドッキングする。
【０００６】
[0006]大部分の酵素および他のタンパク質の治療薬は、これら組換えタンパク質を細胞から細胞培養物中に分泌して、下流の精製を簡単にするように設計される組換え技術によって製造される。したがって、これら組換え酵素および他のタンパク質は、シグナル配列およびこの同じ細胞経路を分泌のために利用する必要がある。したがって、これらタンパク質の高レベル生産は、ＥＲ膜を越えて効率的なＥＲターゲッティングおよびタンパク質トランスロケーションを媒介することができるシグナル配列を必要とする。しかしながら、シグナル配列は、ＥＲターゲッティングおよびトランスロケーションを容易にするのに均等ではない。ＳＲＰによるシグナル配列の識別は、迅速に且つ効率よく起こると考えられるが、続くＥＲターゲッティングおよびトランスロケーションの段階は、タンパク質の間で極めて異なる。シグナル配列は、２回認識される、すなわち、最初は、ＳＲＰによって、新生タンパク質−リボソーム複合体をＥＲへターゲッティングするために、そして次に、トランスロコンタンパク質（すなわち、Ｓｅｃ６１タンパク質）および他のトランスロコン関連ＥＲタンパク質によって、トランスロケーションを開始するために認識されるので、両方が、可能性のある調節部位である。この後者段階は、はるかに厳密で且つあまり効率的でないことが分かっており、したがって、この過程の主な隘路である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
驚くべきことに、大部分のシグナル配列は、タンパク質トランスロケーションを容易にするのに本質的に非効率的である。結果として、ＥＲを標的とする新生タンパク質−リボソーム複合体の多くは、ＥＲ膜から解離し、そしてタンパク質合成が中断することによって、それらのタンパク質発現および分泌を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
[0007]本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列を提供する。
【０００９】
[0008]本発明は、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む融合タンパク質も提供する。
[0009]更に提供するのは、第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、該第一ＤＮＡ配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、プロモーター；および第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合している第二ＤＮＡ配列であって、異種ポリペプチドをコードしている第二ＤＮＡ配列、を含むタンパク質発現ベクターである。
【００１０】
[0010]本発明は、ポリペプチドを製造する方法であって、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）由来のポリペプチドシグナル配列を含む融合タンパク質を発現させること、および前記異種ポリペプチドを回収すること、を含む方法も提供する。
【００１１】
[0011]更に開示するのは、ポリペプチドを製造する方法であって、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること、および前記異種ポリペプチドを回収することを含む方法である。
【００１２】
[0012]本発明は、更に、第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、前記第一ＤＮＡ配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、プロモーター；および前記第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合している第二ＤＮＡ配列であって、異種ポリペプチドをコードしている前記第二ＤＮＡ配列、を含むタンパク質発現ベクターを提供する。
【００１３】
[0013]更に開示するのは、タンパク質発現を増加させる方法であって、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および異種タンパク質を回収することを含む方法である。
【００１４】
[0014]開示される発明は、タンパク質分泌を増加させる方法であって、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および異種タンパク質を回収することを含む方法も提供する。
【００１５】
図面の簡単な説明
[0015]本発明の前述のおよび他の側面は、添付の図面と合わせて考慮された場合、以下の発明の詳細な説明から明らかである。本発明を説明するために、現在のところ好適である態様を図面に示しているが、しかしながら、本発明が、開示されている特定の手段に制限されないということは理解される。図面は、必ずしも、一定尺度で描かれていない。図面においては、以下である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[0016]図１は、組換え野生型ヒト酸性β−グルコセレブロシダーゼの発現および分泌のためのシグナル配列の約７２時間にわたる機能的効果を示す。
【図２】[0017]図２は、組換え野生型ヒト酸性β−グルコセレブロシダーゼの高細胞密度および枯渇栄養素で約６３時間にわたる選択的発現および分泌を示す。
【図３】[0018]図３は、組換え野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼの発現および分泌のためのシグナル配列の約４３時間にわたる機能的効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0019]本明細書中で用いられる場合、「異種ポリペプチド」は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントではないいずれかのポリペプチドである。
【００１８】
[0020]本明細書中で用いられる場合、「Ｂｉｐ」は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の略語である。
[0021]適切なポリペプチドシグナル配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１９】
[0022]適切な融合タンパク質は、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むことができる。この融合タンパク質は、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができる。これら融合タンパク質の全てが、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることもできる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。異種ポリペプチドは、一つ以上の酵素、一つ以上の生物学的応答修飾物質、一つ以上の毒素、一つ以上の抗体、一つ以上の異種ポリペプチドのフラグメント、またはそのいずれかの組み合わせでありうる。異種ポリペプチドは、酸性β−グルコセレブロシダーゼでありうる。異種ポリペプチドは、酸性α−ガラクトシダーゼでもありうる。異種ポリペプチドは、酸性α−グルコシダーゼでもありうる。異種ポリペプチドは、プロインスリンでもありうる。異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）でもありうる。異種ポリペプチドは、インターフェロンでもありうる。異種ポリペプチドは、治療的抗体でもありうる。異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）でもありうる。
【００２０】
[0023]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、β−グルコセレブロシダーゼを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型β−グルコセレブロシダーゼ（天然のβ−グルコセレブロシダーゼシグナル配列を含むβ−グルコセレブロシダーゼ）と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、β−グルコセレブロシダーゼ活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、β−グルコセレブロシダーゼ活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２１】
[0024]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、酸性α−ガラクトシダーゼを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型α−ガラクトシダーゼ（天然のα−ガラクトシダーゼシグナル配列を含むα−ガラクトシダーゼ）と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、α−ガラクトシダーゼ活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、α−ガラクトシダーゼ活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２２】
[0025]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、酸性α−グルコシダーゼを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型酸性α−グルコシダーゼ（天然の酸性α−グルコシダーゼシグナル配列を含む酸性α−グルコシダーゼ）と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、酸性α−グルコシダーゼ活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、酸性α−グルコシダーゼ活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２３】
[0026]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、プロインスリンを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型プロインスリン（天然のプロインスリンシグナル配列を含むプロインスリン）と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、プロインスリン活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、プロインスリン活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２４】
[0027]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）を含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）（天然のインスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）シグナル配列を含むインスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２））と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２５】
[0028]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、インターフェロンを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型インターフェロン（天然のインターフェロンシグナル配列を含むインターフェロン）と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、インターフェロン活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、インターフェロン活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２６】
[0029]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、治療的抗体を含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型治療的抗体（天然の治療的抗体シグナル配列を含む治療的抗体）と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、治療的抗体活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、治療的抗体活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２７】
[0030]ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）を含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型インスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）（天然のインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）シグナル配列を含むインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１））と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）活性について約３日間にわたって検定することによって測定することができる。
【００２８】
[0031]適切なタンパク質発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーター、および異種ポリペプチドをコードしている第二ＤＮＡ配列であって、第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合しているものを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができる。第二ＤＮＡ配列は、β−グルコセレブロシダーゼをコードすることができる。
【００２９】
[0032]適切なタンパク質発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーター、および異種ポリペプチドをコードしている第二ＤＮＡ配列であって、第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合しているものを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができる。第二ＤＮＡ配列は、酸性α−グルコシダーゼをコードすることができる。
【００３０】
[0033]適切なタンパク質発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーター、および異種ポリペプチドをコードしている第二ＤＮＡ配列であって、第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合しているものを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むことができる。第二ＤＮＡ配列は、酸性α−ガラクトシダーゼなどの他の異種タンパク質をコードすることができる。異種ポリペプチドは、プロインスリンでもありうる。異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）でもありうる。異種ポリペプチドは、インターフェロンでもありうる。異種ポリペプチドは、治療的抗体でもありうる。異種ポリペプチドは、細胞から分泌されるいずれか他のタンパク質でもありうる。
【００３１】
[0034]ポリペプチドを製造する適切な方法は、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること、および前記異種ポリペプチドを回収すること、を含むことができる。ポリペプチドを製造する方法は、培養細胞中で行うことができる。培養細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞でありうる。ポリペプチドを製造する方法は、トランスジェニックシステム中で行うことができる。そのトランスジェニックシステムは、雌牛、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。トランスジェニックシステムからの回収は、乳からでありうる。トランスジェニックシステムは、ニワトリを含むこともできる。トランスジェニックシステムからの回収は、卵からでありうる。
【００３２】
[0035]タンパク質発現ベクターを作成する適切な方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一ＤＮＡ配列にプロモーターを作動可能に連結すること、および異種ポリペプチドをコードしている第二ＤＮＡ配列を第一ＤＮＡ配列にインフレームで融合すること、を含むことができる。タンパク質発現ベクターの作製方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列をコードしている第一ＤＮＡ配列を有することもできる。タンパク質発現ベクターの作製方法は、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−２（ＩＧＦ−２）、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−１（ＩＧＦ−１）、または細胞から分泌される他のタンパク質をコードしている第二ＤＮＡ配列を有することもできる。
【００３３】
[0036]タンパク質発現を増加させる適切な方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および該異種タンパク質を回収すること、を含むことができる。
【００３４】
[0037]タンパク質分泌を増加させる適切な方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および該異種タンパク質を回収することを含むことができる。
【実施例】
【００３５】
実施例１
試薬
[0038]野生型ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（「GlcCerase」）ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００１５７．３）、野生型ヒト酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００１６９．２）、野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００１５２．２）および野生型ヒトインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００６１２．４）は全て、OrigeneＴＭ（Rockville, MD）より購入したが、オリゴヌクレオチドプライマーおよび合成ミニジーンは全て、Integrated ＤＮＡ TechnologiesＴＭ（ＩＤＴＴＭ；Coralville, IA）からであった。ｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡ哺乳動物発現ベクター、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle medium）（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および他の組織培養試薬は、InvitrogenＴＭ（Carlsbad, CA）より入手した。制限エンドヌクレアーゼ、Phusion−ＨＦ  ＤＮＡ polymeraseＴＭ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Antarctic ホスファターゼ、化学的コンピテント大腸菌（E. coli）（ＤＨ５α細胞）は全て、New England BiolabsＴＭ（Ipswich, MA）より購入した。いろいろなグリコシダーゼの蛍光発生基質は、Research Products InternationalＴＭ（Mt. Prospect, IL）より購入し、ＤＮＡ Gel Extraction キットおよび Miniprep ＤＮＡキットは、ＱＩＡＧＥＮＴＭ（Valencia, CA）からであり、PureYield Maxiprep ＤＮＡＴＭキットは、PromegaＴＭ（Madison, WI）からであった。特に断らない限り、化学薬品は、SigmaＴＭ（St. Louis, MO）からであり、Fugene−ＨＤＴＭトランスフェクション試薬は、RocheＴＭ（Indianapolis, IN）からであり、Ｔ抗原で形質転換済みのヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）は、ＡＴＣＣＴＭからであった。
【００３６】
実施例２
プラスミド構築
[0039]ＤＮＡプラスミドを、それらの天然のシグナル配列を含有するかまたは改変ヒトＢｉｐシグナル配列で置き換えられたいろいろなモデルタンパク質をコードするように構築して、試験タンパク質の発現および分泌へのこれらシグナル配列の効果を評価した。
【００３７】
[0040]ヒト酸性β−グルコセレブロシダーゼ（GlcCerase，ＥＣ３．２．１．４５）を評価するために、いくつかの異なったＤＮＡプラスミドを、その天然のシグナル配列かまたはヒトＢｉｐシグナル配列かまたは改変Ｂｉｐシグナル配列を含む野生型 GlcCerase をコードするように構築した。その天然のシグナル配列を含む野生型ヒトGlcCerase を作り出すために、ヒト GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、Phusion−ＨＦ  ＤＮＡ polymeraseＴＭによるＰＣＲによって、プライマー１およびプライマー２（表Ｉ）および GlcCerase ｃＤＮＡクローン（ＮＭ＿０００１５７．３，Origene）を用いて増幅した。プライマー１は、５’ＢｇｌＩＩ、および天然の GlcCerase Kozak 配列の直前にある内部ＥｃｏＲＩ制限部位を含有するように構築したが、プライマー２は、終止コドンの後にある３’ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩの制限部位を含有して、哺乳動物発現ベクター中へのＰＣＲ産物のクローニングを可能にした。約１．６キロベース（ｋｂ）のＰＣＲ産物（Ａ）を、分離し、１％（ｗ／ｖ）アガロース分取用ゲルから切り出し、そしてＱＩＡＧＥＮＴＭのGel Extraction kitＴＭを用いて単離した。次に、ＰＣＲ産物Ａを、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで３７℃において一晩消化し、再精製し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、予めＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、Antarctic ホスファターゼで脱リン酸化したｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡ哺乳動物発現ベクター（InvitrogenＴＭ）中に連結した。ＢｇｌＩＩ制限部位を、プライマー１中に包含させたことで、ｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターの適合するＢａｍＨＩ部位中への、ＢｇｌＩＩで消化した GlcCerase ＰＣＲ産物の連結は、マルチプルクローニングサイト内のＢａｍＨＩ制限部位を消失させたが、この改変発現ベクターを、以下、ｐＥＦ６’と称する。ｐＨＤ１０１と命名したこのＤＮＡコンストラクトを用いて、化学的コンピテントＥ．coli 細胞を形質転換し、個々のアンピシリン耐性細菌コロニーを増殖させ、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩを用いたおよびＢａｍＨＩでの制限消化反応によってそれぞれスクリーニングした。クローン４からの正しいプラスミドＤＮＡ（ｐＨＤ１０１．４と命名した）を、ＤＮＡシークエンシングによって更に確かめ、そして野生型 GlcCerase の発現用に選択した。ｐＨＤ１０１．４を用いて、天然のGlcCerase シグナル配列の代わりにヒトＢｉｐシグナル配列かまたはこのＢｉｐシグナル配列の改変バージョンのいずれかを含む野生型 GlcCerase をコードしている他のプラスミドを構築した。簡単にいうと、二本鎖ＤＮＡミニジーン（表IIにおいてミニジーン１と命名した）を、酵母アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子からの天然の Kozak 配列、（その天然のシグナルペプチダーゼ認識配列：Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ；ＳＡＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を含む）１８残基の天然のヒトＢｉｐシグナル配列全体の遺伝子、および成熟野生型ヒト GlcCerase（ヌクレオチド１１８−４９０）のＮ末端１２３アミノ酸残基、を含有するように構築した（そして Integrated DNA TechnologiesＴＭ，ＩＤＴＴＭで合成した）。ミニジーン１は、更に、ＡＯＸ１ Kozak 配列の前にある５’ＥｃｏＲＩ制限部位、および GlcCerase 遺伝子内の天然ＮｃｏＩ部位を３’末端に含有して、天然の GlcCerase シグナル配列をヒトＢｉｐシグナル配列で置き換えるためにｐＨＤ１０１．４中にクローニングすることを可能にした。更に、この戦略は、（誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある）哺乳動物かまたは酵母のシステムにおいて（Ｂｉｐシグナル配列を含む）野生型 GlcCerase の発現のためのＤＮＡプラスミドの構築を可能にする。この融合タンパク質および他の融合タンパク質の設計は、SignalＰ４．０ＴＭ分析プログラムを利用して、Ｂｉｐシグナル配列が試験タンパク質から切断されるかどうか予想した。
【００３８】
[0041]追加のアミノ酸残基を、シグナル配列切断を容易にするのに必要とされる場合にはコンストラクトに加え、そして適当なシグナル配列切断を有すると予想された配列のみを、これら融合試験タンパク質を作り出すために選択した。哺乳動物システムでの発現のために、天然のヒトＢｉｐ Kozak 配列を含有するＢｉｐ−GlcCerase ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、プライマー３および４、およびミニジーン１ＤＮＡ鋳型を用いて合成した。この約４４０ｂｐのＰＣＲ産物（Ｂ）を、分離し、１％（ｗ／ｖ）アガロース分取用ゲルから切り出し、そしてＱＩＡＧＥＮの Gel Extraction キットを用いて単離した。ＰＣＲ産物Ｂを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで一晩消化し、再精製し、そして前記のように、（天然の GlcCerase シグナル配列を欠いた）成熟野生型 GlcCerase のアミノ酸残基１２４−４９７をコードしているｐＨＤ１０１．４からのＮｃｏＩ→ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメント；および約５．８ｋｂのＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩ  ｐＥＦ６’ベクターＤＮＡフラグメントと連結した。ｐＨＤ２０１と命名したこのＤＮＡコンストラクトを、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩを用いた制限消化によって調べ、そして正しいクローン（ｐＨＤ２０１．２）を、ＤＮＡシークエンシングによって確かめた後、野生型 GlcCerase の発現および分泌へのヒトＢｉｐシグナル配列の効果を評価するのに用いた。同様に、Ｂｉｐシグナル配列の改変バージョン（ミニジーン２）を、ＡＯＸ１酵母遺伝子からの天然の Kozak 配列、天然のヒトＢｉｐシグナル配列の最初の１３残基、その後に、アミノ酸残基４−１３の反復、天然のＢｉｐシグナルペプチダーゼ認識配列（残基１４−１８）、および成熟野生型ヒト GlcCerase（ヌクレオチド１１８−４９０）のＮ末端１２３残基を含有するように構築し、ＩＤＴＴＭで合成した。Ｂｉｐシグナル配列のこの改変（改変Ｂｉｐシグナル配列−１と命名した）は、ＥＲ膜全体を貫通する（spanned）ように疎水性ドメインを増大させ、そしてシグナル配列を１８〜２８残基延長した。哺乳動物システムでの発現のために、天然のヒトＢｉｐ Kozak 配列フラグメントを含有する改変Ｂｉｐシグナル配列−１−GlcCerase ＤＮＡを、ＰＣＲによって、プライマー３および４ならびにミニジーン２ＤＮＡ鋳型を用いて合成した。この約４７０ｂｐのＰＣＲ産物（Ｃ）を、１％（ｗ／ｖ）アガロース分取用ゲルから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで消化し、再精製し、そして前記のように、（天然の GlcCerase シグナル配列を欠いた）成熟野生型 GlcCerase のアミノ酸残基１２４−４９７をコードしているｐＨＤ１０１．４からのＮｃｏＩ→ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメント、および約５．８ｋｂのＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩｐＥＦ６’ベクターＤＮＡフラグメントと連結した。ｐＨＤ２０４と命名したこのＤＮＡコンストラクトを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いた制限消化によって調べ、そして正しいクローン（ｐＨＤ２０４．１）を、ＤＮＡシークエンシングによって確かめた後、野生型 GlcCerase の発現および分泌へのこの改変Ｂｉｐシグナル配列の効果を評価するのに用いた。
【００３９】
[0042]本明細書中においてＤＮＡコンストラクトを作成するのに用いたプライマーを、表１に要約する。
【００４０】
【表１】
2014503198.tif 000002
【００４１】
[0043]次に、改変Ｂｉｐシグナル−１を、他のタンパク質に付加して、それらの発現および分泌へのその効果を評価した。簡単にいうと、ミニジーン３（表II）を、天然のヒトＢｉｐシグナル配列の最初の１３残基、その後に、アミノ酸残基４−１３の反復、および天然のＢｉｐシグナルペプチダーゼ認識配列の残基１４−１７を含有するように構築した。ミニジーン３は、ヒトＢｉｐからの天然の Kozak 配列、更には、５’ＥｃｏＲＩならびに３’ＳｔｕＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含有した。ＳｔｕＩを、ミニジーン３中に組み込んだが、それは、この制限酵素が、ＡＧＧ（アルギニン、Ａｒｇ；Ｒのコドン）の後に平滑３’末端を生じ、それが、天然のＢｉｐシグナルペプチダーゼ切断配列からの残基１７にある天然Ａｒｇとして役立つからである。したがって、追加のアラニンを、Ｎ末端にあるタンパク質配列に加えて、天然ＳＡＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）シグナルペプチダーゼ認識配列を完成するという条件付きで、いずれかのタンパク質を、この改変Ｂｉｐシグナル配列フラグメントに連結することができる。
【００４２】
[0044]Ｂｉｐおよび改変Ｂｉｐのシグナル配列のためのミニジーンのＤＮＡヌクレオチド配列を、表２に要約する。
【００４３】
【表２−１】
2014503198.tif 000003
【００４４】
【表２−２】
2014503198.tif 000004
【００４５】
[0045]酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ，ＥＣ３．２．１．２２）を評価するために、その天然のシグナル配列を含む野生型酵素を、ＰＣＲにより、プライマー５および６を用いて、ＧＬＡ  ｃＤＮＡクローン（ＮＭ＿０００１６９．２，OrigeneＴＭ）鋳型ＤＮＡで増幅した。この約１．３ｋｂのＰＣＲ産物を、アガロース分取用ゲルによって単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで消化して脱リン酸化したｐＥＦ６’に連結した。このＤＮＡコンストラクトを、ｐＨＤ２１４と命名し、そしてＧＬＡ発現を評価するのに用いた。改変Ｂｉｐシグナル配列−１を含むＧＬＡを構築するために、成熟ＧＬＡ酵素を、ＰＣＲによって、プライマー６および７を用いて、ＧＬＡ  ｃＤＮＡクローン鋳型ＤＮＡで合成した。この約１．２ｋｂのＰＣＲ産物（Ｄ）を、ＮｏｔＩで消化し、アガロース分取用ゲルから単離し、そして前記のように、ＥｃｏＲＩ→ＳｔｕＩミニジーン３ＤＮＡフラグメントおよびＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩで消化したｐＥＦ６’ベクターに連結した。このＤＮＡコンストラクトを、ｐＨＤ２１５と命名し、野生型ＧＬＡの発現および分泌へのこの改変Ｂｉｐシグナル配列の効果を評価するのに用いた。
【００４６】
[0046]酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ，ＥＣ３．２．１．０）を評価するために、（その天然のシグナル配列を含む）野生型ＧＡＡ酵素全体を、ＰＣＲによって、プライマー８および９を用いて、ＧＡＡ  ｃＤＮＡクローン（ＮＭ＿０００１５２．２，Origene）鋳型ＤＮＡで増幅した。この約３ｋｂのＰＣＲ産物（Ｅ）を、アガロース分取用ゲルによって単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで消化して脱リン酸化したｐＥＦ６’に連結した。このＤＮＡコンストラクトを、ｐＨＤ２１７と命名し、その天然のシグナル配列を含むＧＡＡの発現を評価するのに用いた。ＧＡＡは、成熟酵素に先立つ複数のプロ配列と共に発現するので（Moreland et al., 2005）、いろいろな長さを有する異なったＧＡＡタンパク質を合成し、そして試験用に改変Ｂｉｐシグナル配列−１に付加した。その天然のシグナル配列を欠いているが、残基２４−９５２を含有するＧＡＡ  ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、プライマー９および１０を用いて合成した。この約３ｋｂのＰＣＲ産物（Ｆ）を、アガロース分取用ゲルから単離し、ＮｏｔＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ→ＳｔｕＩミニジーン３ＤＮＡフラグメントおよびＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩで消化したｐＥＦ６’ベクターに連結した。改変Ｂｉｐシグナル配列−１およびＧＡＡ（２４−９５２）を含有するこのＤＮＡコンストラクトを、ｐＨＤ２１８と命名した。同様に、その天然のシグナル配列を欠いているが、残基５７−９５２を含有するＧＡＡ  ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、プライマー９および１１を用いて合成した。この約２．９ｋｂのＰＣＲ産物（Ｇ）を、アガロース分取用ゲルから単離し、ＮｏｔＩで消化し、そして前記のように、ＥｃｏＲＩ→ＳｔｕＩミニジーン３ＤＮＡフラグメントおよびＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩで消化したｐＥＦ６’ベクターに連結した。改変Ｂｉｐシグナル配列−１およびＧＡＡ（５７−９５２）を含有するこのＤＮＡコンストラクトを、ｐＨＤ２１９と命名した。その天然のシグナル配列を欠いているが、残基７８−９５２を含有するＧＡＡ  ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、プライマー９および１２を用いて合成した。この約２．８ｋｂのＰＣＲ産物（Ｈ）を、アガロース分取用ゲルから単離し、ＮｏｔＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ→ＳｔｕＩミニジーン３ＤＮＡフラグメントおよびＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩで消化したｐＥＦ６’ベクターに連結した。改変Ｂｉｐシグナル配列−１およびＧＡＡ（７８−９５２）を含有するこのＤＮＡコンストラクトを、ｐＨＤ２２０と命名した。したがって、この改変Ｂｉｐシグナル配列−１並びにプロ配列のＧＡＡ発現および分泌への効果は、ＤＮＡコンストラクトｐＨＤ２１７〜２２０を用いて、注意深く調べることができる。
【００４７】
[0047]改変Ｂｉｐシグナル配列−１から誘導される他の改変Ｂｉｐシグナル配列（表III）を設計したが、それを評価して、これら追加の改変が、タンパク質発現および分泌を更に改善することができるかどうか評価する。これらの改変は、疎水性ドメイン内の１４位および１５位にあるセリン残基およびロイシン残基を一つのトリプトファン残基で置き換え且つ１８位および１９位にあるアラニン残基およびメチオニン（methonine）残基を欠失させること（改変Ｂｉｐシグナル配列−２と命名した）；疎水性ドメイン内の１８位および１９位にあるアラニン残基およびメチオニン（methonine）残基を欠失させること（改変Ｂｉｐシグナル配列−３と命名した）；ならびに疎水性ドメイン内の１４位にあるセリン残基をアラニンで置き換え且つ１８位および１９位にあるアラニン残基およびメチオニン（methonine）残基を欠失させること（改変Ｂｉｐシグナル配列−４）が含まれる。これらの改変は、疎水性ドメインの疎水性を増加させることを予定していたが、それは、これらシグナル配列と、重要なリボソームタンパク質およびＥＲトランスロコンタンパク質との相互作用、および組換えタンパク質のためのタンパク質トランスロケーションおよび分泌を改善するためにより効率的なシグナルペプチダーゼ切断部位を作り出すことを更に増強することができる。
【００４８】
[0048]ヒトインスリン、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）、抗体、インターフェロン、アポリポタンパク質等を含めた他の試験タンパク質も評価して、これら改変Ｂｉｐシグナル配列が、それらの発現および分泌を改善すると考えられるかどうか決定する。
【００４９】
[0049]改変Ｂｉｐシグナル配列のためのアミノ酸配列を、表３に要約する。
【００５０】
【表３】
2014503198.tif 000005
【００５１】
実施例３
試験タンパク質の一過性発現
[0050]一過性発現実験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを補充した１ｍｌのＤＭＥＭ培地を含む１２ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、そして３７℃において５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、７０〜１００％密集に達した時点で、消費された培地を、１ｍｌの新鮮ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地と交換し、そして各々のウェルを、個々の試験タンパク質またはＰＢＳ（模擬トランスフェクション陰性対照用）について１μｇのプラスミドＤＮＡおよび３μｌの FugeneＴＭ−ＨＤトランスフェクション試薬で、製造者のプロトコルにしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、２４〜７２時間インキュベートし、そして（培地中に分泌された）個々の組換え酵素の発現について、酵素活性検定で、ならびに／またはウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによって、毎日検査した。
【００５２】
実施例４
酵素活性検定
[0051]組換えヒト酸性β−グルコセレブロシダーゼ（GlcCerase）の細胞培養培地中への発現および分泌を、酵素活性検定によって、一過性トランスフェクション実験による２４時間後、４８時間後または約７２時間における馴化培地および４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵ−β−Ｇｌｃ）蛍光発生基質を用いて評価した。簡単にいうと、各々の試料からの２０μｌの馴化培地を、指定の時点で採取し、そして０．５ｍｌミクロ遠心管中において８０μｌの McIlvane 緩衝液（ＭＩ緩衝液：５０ｍＭクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム（ｐＨ５．２）／０．２５％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００／０．２５％（ｗ／ｖ）タウロコール酸ナトリウム）で希釈した。２５μｌの各希釈試料を、（三連で行った）９６ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし、そして５０μｌの６ｍＭ  ４−ＭＵ−β−Ｇｌｃ基質（ＭＩ緩衝液中で調製）を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらプレートを、カバーテープで密封し、３７℃で１時間インキュベートした。酵素反応は、１２５μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることによって止め、そして遊離した４−ＭＵ蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて３５５ｎｍ励起波長および４６０ｎｍ発光波長をそれぞれ用いて読み取った。模擬トランスフェクションした試料からの４−ＭＵ蛍光は、「バックグラウンド」対照として役立ち、全ての GlcCerase 試料から差し引いた。
【００５３】
[0052]組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の発現および分泌を、酵素活性検定により、一過性トランスフェクション実験による２４時間後、４８時間後または７２時間後の馴化培地および４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵ−α−Ｇｌｃ）蛍光発生基質を用いて測定した。具体的には、各々の試料からの２０μｌの馴化培地を、異なった時点で採取し、そして０．５ｍｌミクロ遠心管中において８０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で希釈した。２５μｌの各希釈試料を、９６ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし（三連）、そして５０μｌの６ｍＭ  ４−ＭＵ−α−Ｇｌｃ基質（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０中で調製）を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらプレートを、カバーテープで密封し、３７℃で１時間インキュベートした。酵素反応を、１２５μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることによって止め、そして遊離した４−ＭＵ蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて３５５ｎｍ励起波長および４６０ｎｍ発光波長をそれぞれ用いて読み取った。模擬トランスフェクションした試料からの４−ＭＵ蛍光は、「バックグラウンド」対照として役立ち、全てのＧＡＡ試料から差し引いた。
【００５４】
[0053]組換えヒト酸性α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）の発現および分泌は、酵素活性検定により、一過性トランスフェクション実験による２４時間後、４８時間後または７２時間後の馴化培地および４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４−ＭＵ−α−Ｇａｌ）蛍光発生基質を用いて測定する。具体的には、各々の試料からの２０μｌの馴化培地を、異なった時点で採取し、そして０．５ｍｌミクロ遠心管中において８０μｌの５０ｍＭクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）で希釈する。２５μｌの各希釈試料を、９６ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし（三連）、そして５０μｌの８ｍＭ  ４−ＭＵ−α−Ｇａｌ基質（５０ｍＭクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．６中で調製）を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加える。それらプレートを、カバーテープで密封し、３７℃で１時間インキュベートする。酵素反応は、１２５μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることによって止め、そして遊離した４−ＭＵ蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて３５５ｎｍ励起波長および４６０ｎｍ発光波長をそれぞれ用いて読み取る。模擬トランスフェクションした試料からの４−ＭＵ蛍光は、「バックグラウンド」対照として役立ち、全てのＧＬＡ試料から差し引く。
【００５５】
実施例５
[0054]特定のタンパク質は、極めて高レベルで天然に発現するが、他のものは不十分にしか発現しないということを確認した。ｍＲＮＡの存在量および安定性は、タンパク質発現に影響することがありうる転写レベルで重要な因子であるが、シグナル配列も、タンパク質レベルで決定的な役割を果たし、この本質的に異なる（disparate）タンパク質発現に貢献するということが次第に明らかになっている。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）は、組換えタンパク質のためのタンパク質発現および分泌を改善する優れたシグナル配列を開発するのに特に好都合であると考えられるという具体的な特徴を有する。一つの改変Ｂｉｐシグナル配列を作成し、モデルタンパク質に付加して、この非天然のシグナル配列が、モデルタンパク質についてのタンパク質発現および分泌を改善するかどうかを決定した。具体的には、疎水性コアを延長して、より長いαヘリックス構造を形成させた。改変Ｂｉｐシグナル配列−１中の疎水性ドメインの延長は、いくつかの利点を有するであろうと予想される。第一に、改変された（より長い）疎水性ドメインは、より長いαヘリックスを形成し、リボソーム出口トンネル全体に広がると考えられ、それが、リボソームタンパク質Ｒｐｌ１７によって容易に識別されて、Ｓｅｃ６１サブユニットなどの他の重要なＥＲタンパク質およびＲＡＭＰ４とのより良い相互作用を容易にすることができる。第二に、より長いαヘリックス疎水性ドメインは、この改変Ｂｉｐシグナル配列が、トランスロコン細孔において新生ポリペプチドを効率よく配向させるＴＲＡＭおよびＳｅｃ６１サブユニットなどの重要なトランスロコンタンパク質と相互作用することを可能にして、必要なタンパク質トランスロケーション適格ループ配向を促進することができる。第三に、より長いαヘリックス疎水性ドメインは、この改変Ｂｉｐシグナル配列が、シグナルペプチダーゼによってより速い速度で切断されうるように、水性トランスロコン細孔から脂質二重層中へより効率よく移動することを可能にすることができる。第四に、改変Ｂｉｐシグナル配列は、トランスロコンからより速い速度で離れて移動して、組換えタンパク質が、その合成の際により早く、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、ＢｉｐなどのＥＲシャペロンタンパク質、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびカルネキシンなどの他の重要なタンパク質と相互作用することを可能にして、タンパク質フォールディングを改善することができる。これら可能性のある利点のいずれかまたは全てが、タンパク質の発現、フォールディングおよび細胞からの輸出の速度を改善すると考えられる。
【００５６】
[0055]他の改変は、伸長した疎水性ドメインの隣接領域に荷電残基を加えることを包含させて、その疎水性を更に増強し、シグナル配列をトランスロコンで適切に配向させることができる。これらの改変は、特定のリボソームタンパク質、特に、Ｒｐｌ１７とのシグナル配列の相互作用を増強することを予定していて、それが、順次、トランスロコンタンパク質Ｓｅｃ６１β、ＲＡＭＰ４およびＴＲＡＭとの相互作用を増加させて、タンパク質トランスロケーション、タンパク質発現および分泌を改善すると考えられる。
【００５７】
[0056]野生型ヒト GlcCerase をコードしているいくつかの異なったＤＮＡコンストラクトを、天然のGlcCerase シグナル配列（ＷＴ GlcCerase）かまたはヒトＢｉｐシグナル配列（ＣＢＰ２０１ GlcCerase）かまたは新規な改変Ｂｉｐシグナル配列−１（ＣＢＰ２０４GlcCerase）のいずれかを含有するように作成した。これらコンストラクト（１μｇ）を、約８０％密集したヒト細胞系（ＨＥＫ２９３Ｔ）における一過性発現実験によって試験した。馴化細胞培養培地（２０μｌ）を、７２時間経過中に毎日採取し、そして GlcCerase 酵素活性について４−ＭＵ−β−グルコース蛍光発生基質を用いて検定して、GlcCerase 発現および分泌へのシグナル配列の効果を評価した。図１で理解されうるように、双方のシグナル配列が、細胞培養培地中への GlcCerase の発現および分泌を促進することができる。しかしながら、操作された改変Ｂｉｐシグナル配列−１（ＣＢＰ２０４ GlcCerase の場合）は、トランスフェクション後７２時間のＷＴGlcCerase に相対して２倍高い GlcCerase 活性を生じることが認められた。基底活性は、模擬トランスフェクションした（エンプティーベクター）陰性対照について認められ、そして増加した酵素活性が、組換えGlcCerase の発現によって生じたことを確かめた。複数のトランスフェクション実験（ｎ＞３）は、新規なシグナル配列が、GlcCerase 発現および分泌を増加させたことを確認した。
【００５８】
実施例６
[0057]タンパク質合成は、栄養素（すなわち、ＡＴＰ、アミノ酸、炭水化物等）並びに他の必須細胞成分（例えば、開始因子および伸長因子、ｔＲＮＡ、タンパク質シャペロン等）の利用可能性によって大きく影響される。前者は、再供給の際に増加させるかまたは細胞培養培地で補給することができるが、後者成分は、細胞中で限られており、タンパク質生産の際に補充することができない。これら生命に必要な成分の枯渇は、顕著な細胞ストレスを引き起こし、それが、大部分のタンパク質の新しいタンパク質合成の減少または停止状態さえももたらす。興味深いことに、いくつかのタンパク質の発現は、これらストレスの多い期間中に適応細胞応答の一部として維持され、そして実際は増加して、ホメオスタシスへ細胞を復帰させている。これら選ばれたタンパク質が、それらの選択的発現を可能にする細胞タンパク質合成機構によってどのように区別されるかは、完全に明らかではないが、シグナル配列は、この過程において重要な役割を果たしていると考えられる。Ｂｉｐは、このストレスの多い期間中にその発現が維持されて、細胞ホメオスタシスを再確立させる重要なＥＲシャペロンタンパク質であるので、本発明者は、この改変Ｂｉｐシグナル配列が、異種組換えタンパク質の選択的発現を、他のタンパク質の発現が減少するかまたは停止される条件下において維持することを可能にするであろうと考えている。この仮説を調べるために、本発明者は、ＫＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、高細胞密度（約１００％密集）においてＷＴ GlcCerase およびＣＢＰ２０４ GlcCerase でトランスフェクションし、そしてそれらの発現および分泌を６３時間にわたって監視した。更に、栄養素を枯渇させる実験中（再供給前のバッチ適用中の低栄養素期間を模擬する実験の後期段階中）に、細胞培養培地を変えないで、ＷＴ GlcCerase およびＣＢＰ２０４ GlcCerase の発現が、栄養素の枯渇に応答して変化するかどうかを決定した。
【００５９】
[0058]本結果は、これら実験条件下において、改変Ｂｉｐシグナル配列−１を含有するＣＢＰ２０４ GlcCerase が、図２に示されるように、６３時間の期間を通して、その天然のシグナル配列を含むＷＴ GlcCerase より良く発現したということを示している。ＣＢＰ２０４GlcCerase レベルは、２４時間後に、ＷＴ GlcCerase より１．９倍高く、４８時間後に２．１倍高く、そして６３時間後に２．５倍高かった。７２時間に外挿した場合、ＣＢＰ２０４ GlcCerase は、ＷＴ GlcCerase より３．３倍高いと考えられる。重要なことに、ＣＢＰ２０４ GlcCerase 発現は、ほぼ一定速度で維持され、その場合、分泌されたタンパク質の倍増が翌日毎に存在した。対照的に、ＷＴ GlcCerase の発現速度は、より後の時点で顕著に遅くなった。この違いは、これら二つの酵素の発現曲線の形状、すなわち、ＣＢＰ２０４ GlcCerase のほぼ線形曲線と、より後の時点で発現速度が横ばいになったようなＷＴGlcCerase の非線形曲線とを比較した時に最も明らかであった。これらデータは、おそらくは、栄養素枯渇に応答したＣＢＰ２０４ GlcCerase およびＷＴ GlcCerase の示差的発現を示しているが、この相違は、より長いインキュベーションで更に増加すると考えられる。ＣＢＰ２０４ GlcCerase とＷＴ GlcCerase との間の唯一の違いは、シグナル配列であるので、これらデータは、改変Ｂｉｐシグナル配列−１が、非最適細胞培養条件中に優先的な発現を可能にしたという仮説を支持する。
【００６０】
実施例７
[0059]異なったモデルタンパク質の発現および分泌への改変Ｂｉｐシグナル配列−１の効果を調べるために、ＤＮＡプラスミドを、野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）であって、その天然のＧＡＡシグナル配列を含有するもの（ＷＴ  ＧＡＡ）かまたは、操作されたＢｉｐシグナル配列−１およびＧＡＡのアミノ酸残基２４−９５２を含有するもの（ＣＢＰ２１８ＧＡＡと命名した）をコードするように構築した。これらＤＮＡコンストラクトを、ＨＥＫ２９３Ｔにおける一過性発現によって約２日間にわたって調べて、野生型ＧＡＡの発現および分泌へのこれらシグナル配列の効果を直接的に比較した。図３で理解されうるように、ＣＢＰ２１８ＧＡＡは、培地中においてトランスフェクション後４３時間のＷＴ  ＧＡＡより２．５倍高い分泌ＧＡＡ活性を有した。基底活性は、模擬トランスフェクションした（エンプティーベクター）陰性対照について認められ、そして培地中の観測酵素活性が、組換えＧＡＡの発現によって生じたことを確かめた。これら結果は、ＣＢＰ２１８  ＧＡＡとＷＴ  ＧＡＡとの間の唯一の違いが、それらのそれぞれのシグナル配列であるので、改変Ｂｉｐシグナル配列−１（ＣＢＰ２１８  ＧＡＡの場合）が、同じ実験条件下においてＧＡＡ発現および分泌を有意に増加させたということを示している。
【００６１】
実施例８
ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ検定
[0060]試験タンパク質の発現および分泌を、ウェスタンブロット分析によって評価する。簡単にいうと、一過性トランスフェクション実験による２４時間後、４８時間後または７２時間後の馴化細胞培養培地を集め、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ニトロセルロースメンブランに移す。そのメンブランを、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水／０．１％（ｖ／ｖ）Tween−２０（ＴＢＳＴ）中の４％（ｗ／ｖ）脱脂乳で、室温において振とうしながら１時間ブロッキングする。次に、メンブランを、ＴＢＳＴ中の４％（ｗ／ｖ）脱脂乳中で適当に希釈した（例えば、１：５０００）一次抗体（例えば、ウサギ抗ヒトＩＧＦ−２）と一緒に、室温で１時間または４℃で一晩振とうしながらインキュベートする。次に、そのブロットを、ＴＢＳＴで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って１時間にわたって洗浄する。次に、ブロットを、ＴＢＳＴ中の４％（ｗ／ｖ）脱脂乳中で適当に希釈した（例えば、１：２０，０００）酵素結合二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体）と一緒に、室温で１時間振とうしながらインキュベートする。次に、そのブロットを、ＴＢＳＴで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って１時間にわたって洗浄する。次に、ブロットを、化学発光基質と一緒に室温で５分間インキュベートし、そして画像化システムによってまたはフィルムによって可視化して、試験タンパク質の発現レベルを評価する。
【００６２】
[0061]同様に、試験タンパク質の発現は、固相酵素免疫検定法（enzyme-linked immunosorbent assays）（ＥＬＩＳＡ）によって評価することができる。簡単にいうと、９６ウェルイムノソルベントプレートを、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中５μｇ／ｍｌのタンパク質濃度の５０μｌの一次抗体（例えば、ウサギ抗ヒトＩＧＦ−２）で被覆する。次に、これらプレートを、２００μｌのＴＢＳＴ中の４％（ｗ／ｖ）脱脂乳で室温において１時間ブロッキングする。一過性トランスフェクション実験による２４時間後、４８時間後または７２時間後の馴化細胞培養培地を集め、これらプレート中において室温で１時間インキュベートする。次に、これらプレートを、２００μｌのＴＢＳＴで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って１時間にわたって洗浄する。次に、これらプレートを、ＴＢＳＴ中で適当に希釈した（例えば、１：２０，０００）酵素結合二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体）と一緒に室温で１時間インキュベートする。次に、これらプレートを、ＴＢＳＴで、複数回の緩衝液交換を伴って室温で１時間にわたって洗浄する。次に、これらプレートを、比色用基質（例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン，ＴＭＢ）と一緒に室温で５〜１５分間インキュベートし、０．１Ｍ硫酸で止め、そしてプレートリーダー中において適当な波長（例えば、４５０ｎｍ）で読み取って、試験タンパク質の発現を評価する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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