(57)【要約】本明細書において、例えばウイルス性カプシドまたはナノケージへの修飾ウイルスコアタンパク質の集合を制御するための方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態では、開示される修飾ウイルスコアタンパク質は、集合が所望されるまで、ウイルスコアタンパク質の集合を実質的に防止することができる少なくとも１つの変異または修飾を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスコアタンパク質の集合は、例えばウイルスコアタンパク質を還元剤と接触させることにより、および／または変性剤の濃度を低下させることにより作動させることができる。ウイルスコアタンパク質は、ウイルス性カプシドまたはナノケージを形成するように自己集合することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質をカプシド構造に集合させるための方法であって、
修飾ＨＢＶコアタンパク質および第１の濃度の変性剤を含む溶液を提供することであって、前記修飾ＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域がシステイン残基を含むことと、
前記溶液に還元剤を添加し、
それによって、集合カプシド構造を形成することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記修飾ＨＢＶコアタンパク質が、アミノ酸配列の配列番号１および配列番号２のうちの少なくとも１つの１つ以上の修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スパイク領域が、配列番号１および配列番号２のうちの少なくとも１つのアミノ酸７４〜８４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾ＨＢＶコアタンパク質が、配列番号１および配列番号２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置７７、７９、または８０にシステインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾ＨＢＶコアタンパク質が、配列番号１および配列番号２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置７７にシステインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記還元剤が、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＡ）、および遊離システインのうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記還元剤の前記濃度が、約０．１モル当量〜約１００モル当量である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１の濃度の変性剤を第２の濃度に希釈し、それによって、集合カプシド構造を形成することをさらに含み、前記変性剤が前記還元剤の添加前、添加中、および添加後のうちの少なくとも１つの時点で希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の濃度の変性剤が、前記還元剤の添加前、添加中、および添加後のうちの少なくとも１つの時点で前記第２の濃度に希釈される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
負に荷電されたポリマーを前記溶液に添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液のｐＨが、約ｐＨ７．０以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
薬物を前記溶液に添加することをさらに含み、前記薬物が前記還元剤の添加前、添加中、または添加後のうちの少なくとも１つの時点で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬物が、前記修飾ＨＢＶコアタンパク質の前記アミノ酸尾部に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬物が、前記還元剤の前記添加後に拡散により前記カプシド構造にカプセル封入される、および前記アミノ酸尾部に結合され、前記還元剤の添加後に前記カプシド構造にカプセル封入される、のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬物が、核酸、ペプチド、タンパク質、および小分子からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
修飾Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質をカプシド構造に集合させるための方法であって、
修飾ＨＢＶコアタンパク質、および第１の濃度の変性剤を含む溶液を提供することと、
前記第１の濃度の変性剤を第２の濃度に希釈し、
それによって、集合カプシド構造を形成することと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記変性剤が、尿素、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、グアニジンチオシアン酸塩（ＧＩＴＣ）、メタノール、エタノール、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、アセトニトリル、およびリチウム過塩化物のうちの少なくとも１つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記変性剤の第１の濃度が、約２Ｍ〜約８Ｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記希釈ステップ後の前記変性剤の第２の濃度が、約０．２５Ｍ〜約４Ｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
負に荷電されたポリマーを前記溶液に添加することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液のｐＨが、約ｐＨ７．０以下である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記希釈ステップ前に薬物を前記溶液に添加することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬物が、前記ＨＢＶコアタンパク質の前記アミノ酸尾部に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬物が、前記アミノ酸尾部に結合され、前記希釈ステップ後に前記カプシド構造にカプセル封入される、および前記希釈ステップ後に拡散により前記カプシド構造にカプセル封入される、のうちの少なくとも１つである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物が、核酸、ペプチド、タンパク質、および小分子からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＢＶコアタンパク質が、アミノ酸配列の配列番号１および配列番号２のうちの少なくとも１つにおいて１つ以上の修飾を含む修飾ＨＢＶコアタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾ＨＢＶコアタンパク質が、Ｃ末端切り詰め変異体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１〜４つのアルギニンに富む反復が、前記修飾ＨＢＶコアタンパク質のカルボキシル末端から切り詰められる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｃ末端切り詰め変異体が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号６のうちの少なくとも１つから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾ＨＢＶコアタンパク質が、カルボキシル末端アミノ酸尾部をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記アミノ酸尾部が、野生型尾部および合成尾部のうちの少なくとも１つである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アミノ酸尾部が、正に荷電される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記正に荷電されたアミノ酸尾部が、リジンに富む尾部およびアルギニンに富む尾部のうちの少なくとも１つである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記リジンに富む尾部が、約４〜約３０リジン、および約４〜約３０リジンのリジンドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記リジンドメインが、約９リジンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記集合カプシド構造の形成を測定すること、および前記集合カプシド構造を精製すること、のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法により生成されるウイルス性カプシド。
【請求項３８】
請求項１６に記載の方法により生成されるウイルス性カプシド。
【請求項３９】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質をカプシド構造に集合させるための方法であって、
修飾ＨＢＶコアタンパク質および第１の濃度の変性剤を含む溶液を提供することであって、前記修飾ＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域がシステイン残基を含むことと、
薬物を前記溶液に添加することと、
還元剤を前記溶液に添加することであって、前記薬物が、前記還元剤の前記添加前に前記溶液に添加されることと、
前記還元剤の前記添加後に前記第１の濃度の前記変性剤を第２の濃度に希釈することであって、前記薬物が前記変性剤の希釈前に前記溶液に添加され、
それによって、集合カプシド構造を形成し、前記薬剤が前記カプシド構造にカプセル封入されることと、を含む、方法。
【請求項４０】
治療の方法であって、
治療を必要とする患者に、適切な治療薬を保持し、薬学的に許容される担体を伴う修飾Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質ウイルス性カプシドを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、Ｍｉｇｕｅｌ  ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｉｏｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｉｏｓ、Ｊａｃｅｋ  Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊ．Ｏｈ、およびＩｌａｎ  Ｚｉｐｋｉｎの「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ  ＡＳＳＥＭＢＬＹ  ＯＦ  ＶＩＲＡＬ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」と題され、２０１１年９月９日に出願された米国仮特許出願第６１５３２９８６号の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ウイルス性カプシドの操作に関し、より具体的にはコアタンパク質修飾ウイルス性カプシドを用いた治療用調製物に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
ウイルスタンパク質系治療薬は、癌、感染性疾患、神経障害、炎症障害および免疫障害、ならびに心臓血管疾患を含む様々な疾患および障害を治療するための有望な新規薬物である。これらの薬物は、ウイルスタンパク質内部への治療薬のカプセル封入、またはウイルスタンパク質への治療薬の遺伝的もしくは生化学的結合をもたらすことができる。しかしながら、ウイルスタンパク質に由来する薬物の生成は、そのようなタンパク質の合成の制御および効率的な集合を必要とする。ウイルスタンパク質（または複数のタンパク質）の多くのコピーから構成されるウイルス性カプシド粒子は、典型的には、それらのサブユニットタンパク質が生体内または生体外で発現されるとき、または生化学的に精製されるとき、自己集合する。自己集合するこの性質のため、これらの粒子は、薬物送達またはリガンド提示の目的に関して操作が難しい。例えば、ペプチドまたはタンパク質活性のスクリーニングのためのファージ提示は、多くの場合、融合タンパク質として、粒子サブユニット自体と同じ細胞のファージ粒子表面上に提示されるリガンド（複数可）の同時発現を必要とする。ウイルス性カプシド粒子から薬物を生成するときの課題は、どの治療薬が粒子と会合し、どのような様式、およびどの位置で治療薬が会合するかを制御することを含む。
【０００４】
そのようなものとして、ウイルス性カプシド粒子の集合がより具体的に制御され、サブユニットタンパク質発現系とは独立し得る系が今も求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前の考察から、ウイルスサブユニットタンパク質の集合を制御する方法および組成物の必要性が存在することは明らかであろう。有利に、そのような方法および組成物は、治療上の使用に含まれるウイルスサブユニットタンパク質の修飾を可能にするだろう。
【０００６】
本発明は、当該技術分野の現状に応じて、特に現在利用可能な方法および組成物により尚十分に解決されていない当該技術分野における問題および必要性に応じて開発された。したがって、本発明は、当該技術分野における上述の欠点の多くまたは全てを克服する、ウイルスタンパク質発現系とは独立したウイルスサブユニットタンパク質の集合を制御するための方法および組成物を提供するために開発された。
【０００７】
本開示は、少なくとも一部、ウイルス性カプシド（本明細書において「ナノケージ」とも称される）を形成するために、ウイルスコアタンパク質の自己集合を制御するための方法および組成物を対象とする。ウイルス性カプシドの自己集合は、操作可能な形態もしくはオリゴマー形態（例えば非カプシド構造）でウイルスコアタンパク質を維持するために、ある修飾をウイルスコアタンパク質に導入することにより、および／または変性溶液中に維持される修飾ウイルスコアタンパク質を、自己集合反応を作動させるある状態に曝すことにより制御され得ることがここで理解される。
【０００８】
一態様では、開示される方法は、修飾ウイルスコアタンパク質（例えば修飾Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質）をウイルス性カプシド構造に集合させるための方法を提供する。本方法は、変性剤を含む溶液中の修飾ＨＢＶコアタンパク質を提供することと、還元剤を溶液に添加して、集合カプシド構造を形成することとを含む。修飾ウイルスコアタンパク質は、集合が所望されるまで、ウイルスコアタンパク質の集合を実質的に防止することができる少なくとも１つの変異または修飾を含み得る。例えば、修飾ＨＢＶウイルスコアタンパク質は、システイン残基、例えば変性条件下でタンパク質を固定された開口状態に維持するためにジスルフィド結合を形成することができる、ＨＢＶ構造コアのスパイク領域にシステイン残基を含み得る。ウイルス性カプシドへのウイルスコアタンパク質の集合は、例えばウイルスコアタンパク質を還元剤と接触させることにより作動させることができる。いくつかの実施形態では、カプシドの自己集合は、集合溶液に存在する変性剤の濃度を減少させる（例えば変性剤の第１の濃度を変性剤の第２の濃度に希釈する）ことによりさらに制御され得る。本方法は、集合溶液に負に荷電されたポリマーを添加することも含み得る。
【０００９】
別の態様では、開示される方法は、集合を制御するためにシステイン修飾を必要としないカプシド構造への修飾ウイルスコアタンパク質（例えば修飾ＨＢＶコアタンパク質）の集合を制御する方法を提供する。本方法は、変性剤を含む溶液中の修飾ＨＢＶコアタンパク質を提供することと、溶液中の変性剤を希釈して、集合カプシドを形成することとを含む。拘束ジスルフィド結合は存在しないため、還元剤は、カプシド形成を開始するために、この方法においては必要とされない。本方法は、集合溶液に負に荷電されたポリマーを添加することも含み得る。
【００１０】
本明細書に開示される方法のそれぞれにおいて、治療薬は、集合プロセス中に集合カプシド構造にカプセル封入され得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、コアタンパク質が固定された開口状態にある間にＨＢＶコアタンパク質に結合され得る（例えば共有結合）。他の実施形態では、治療薬は、集合反応物に添加され、拡散により集合カプシドにカプセル封入され得る（例えば治療薬は、集合中、ＨＢＶコアタンパク質に結合されないが、溶液中の薬剤の濃度に基づき、集合カプシドに捕捉される）。例示的な治療薬は、核酸薬物（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸等）、ペプチド、タンパク質、および小分子を含む。
【００１１】
本開示に添付される特許請求の範囲は、参照により組み込まれ、本開示の一部を形成する。本明細書を通して、特徴、利点、または類似する言語に対する参照は、本発明により実現され得る特徴および利点の全てが本発明のいずれか１つの実施形態にあるべきである、またはそうであることを意味しない。むしろ、特徴および利点に関する言語は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、利点、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味することを理解する。よって、本明細書を通して、特徴および利点ならびに類似する言語の考察は、必ずではないが、同じ実施形態を指し得る。
【００１２】
さらに、本発明の記載される特徴、利点、および特性は、１つ以上の実施形態において、いずれの好適な様式で組み合わされ得る。当業者は、本発明が特定の実施形態の特定の特徴または利点のうちの１つ以上なしに実践され得ることを認識するだろう。他の場合では、追加の特徴および利点は、本発明の全ての実施形態において存在しない可能性がある、ある実施形態において認識され得る。
【００１３】
本発明のこれらの特徴および利点は、次の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるか、または以下に記載される本発明の実践により学ぶことができるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の利点が容易に理解されるために、簡潔に上に記載される本発明のより具体的な説明が、添付の図面に図示される特定の実施形態を参照に提供される。これらの図面は単に本発明の典型的な実施形態を図示し、したがって、その範囲を制限するものと考えられないことを理解し、本発明は、添付の図面の使用を通してさらに具体的かつ詳細に記載され、説明される。
【００１５】
【図１】固定状態のポリリシン尾部（例えばＫ９尾部）を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質二量体を概略的に描写したものである。
【図２】１０×β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在下における修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示す動的光散乱（ＤＬＳ）のプロットである。
【図３】ＢＭＥ添加後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図４】ＢＭＥ添加後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図５】ＢＭＥの添加、および変性剤の希釈後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図６】ＢＭＥの添加、および変性剤の希釈後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図７】ＢＭＥの添加、および変性剤の希釈後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図８】負のポリマーの存在下で変性剤を希釈した後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図９】負のポリマーの不在下でＢＭＥを添加した後の修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの形成を示すＤＬＳのプロットである。
【図１０】４×ＢＭＥ、１０×ＢＭＥ、および４０×ＢＭＥでのカプシド形成の速度を示すＤＬＳのプロットである。
【図１１】ポリ−リジン尾（例えばＫ９尾）部分を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質（薄い点）と、配列番号２変異形にＣ４８Ａ、Ｃ６１Ａ、およびＣ１０７Ａ変異体およびポリ−リジン尾（例えばＫ９尾）部分を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質（暗い点）との間のウイルス性カプシド形成の速度を示すＤＬＳプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書を通して、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、または類似する言語への参照は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書を通して、句「一実施形態では」、「１つの実施形態では」、および類似する言語の出現は全て、必ずではないが、同じ実施形態を指し得る。
【００１７】
さらに、本発明の記載される特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、いずれの好適な様式で組み合わされ得る。以下の説明では、本発明の実施形態の十分な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が提供される。しかしながら、当業者は、本発明が具体的な詳細のうちの１つ以上なしに、または他の方法、成分、材料等と共に実践され得ることを認識する。他の場合では、周知の構造、材料、または操作は、本発明の態様を曖昧にするのを避けるため、示されないか、または詳述されない。加えて、特定の方法が生じる順序は、示される対応するステップの順序に厳密に順守されても、されなくてもよい。
【００１８】
本開示は、少なくとも一部、ウイルス性カプシド構造への修飾ウイルスコアタンパク質の自己集合を制御するための方法および組成物を対象とする。例えば、一実施形態では、ウイルスコアタンパク質の自己集合の速度が制御され得る。別の実施形態では、ウイルスコアタンパク質の自己集合は、自己集合が所望される時点まで本質的に遅らせることができる。ウイルスコアタンパク質は、いくつかの場合では、例えば各カプシドにカプセル封入される薬物の量を制御するために、集合前に治療薬に抱合されるか、または充填され得る。本明細書において、ウイルスコアタンパク質の１つ以上の領域は、ナノケージ形成後と比較して、ナノケージ形成前に治療薬に容易に抱合されるか、または充填され得ることが想定される。例えば、ある実施形態では、ウイルスコアタンパク質は、例えばキメラ治療薬を形成するために、集合前に核酸治療薬で充填され得る。また有利に、高純度（例えば非集合ウイルスコアタンパク質の低多分散性および低画分）のナノケージは、開示される方法を用いて調製され得る。ウイルスコアタンパク質の自己集合は、例えばウイルスコアタンパク質を作動薬（例えば還元剤）と接触させることにより、および／またはウイルスコアタンパク質を含む溶液に存在する変性剤の濃度を減少させる（例えば希釈する）ことにより作動させることができる。
【００１９】
本明細書を通して、本明細書において想定される集合ウイルス性カプシドは、「カプシド」、「ナノケージ」、「ケージ」、「粒子」、「治療用粒子」、および「治療用キメラ粒子」とも称され得る。
【００２０】
ウイルス性カプシドの自己集合
本明細書に想定される方法および組成物は、ウイルス性カプシドへのウイルスコアタンパク質（例えばＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質）の自己集合に対する制御を提供する。例えば、様々な実施形態では、ウイルス性カプシドへの修飾ウイルスコアタンパク質の自己集合を制御するための開示される方法は、（１）修飾ウイルスコアタンパク質を還元剤に曝露すること、（２）還元剤への修飾ウイルスコアタンパク質の曝露と、ウイルスコアタンパク質が保存される（例えば非集合状態を維持するために）変性剤の希釈の組み合わせ、および（３）還元剤を添加せずに保存緩衝剤の変性剤を希釈することを含む。
【００２１】
本明細書において、例えば修飾ＨＢＶコアタンパク質を含むウイルス性カプシドを集合させる開示される方法のいくつかの実施形態では、いくつかの自己集合の方法は、集合溶液のイオン強度（例えば集合溶液のイオン強度を上昇させることにより、例えばウイルス性カプシドの自己集合を促進するためにＮａＣｌを添加することにより）に依存しないことが想定される。
【００２２】
本明細書に提供される、ウイルスコアタンパク質は、集合カプシド構造の形成（例えばナノケージ形成）が所望されるまで本質的に阻害され得るように修飾され得る。例えば、修飾は、ウイルスコアタンパク質の多量体を形成するために、ウイルスコアタンパク質を多量体化させることができる。例えば、いくつかの場合では、２つのウイルスコアタンパク質は二量体を形成し得、３つのウイルスコアタンパク質は三量体を形成し得、４つのウイルスコアタンパク質は四量体を形成し得る。多量体は、ホモ多量体またはヘテロ多量体であり得る。いずれの理論に拘束されるものではないが、ウイルスコアタンパク質の多量体化は、カプシド形成におけるウイルスコアタンパク質の関与を本質的に防止することができる（例えばウイルスコアタンパク質の自己集合の天然の性質を防止する）と考えられる。修飾ウイルスコアタンパク質がオリゴマー形態にあるとき、修飾ウイルスコアタンパク質はカプシド集合を防止する固定状態にあると説明され得る。
【００２３】
ある実施形態では、ウイルスコアタンパク質は、第１のウイルスコアタンパク質を第２のウイルスコアタンパク質に結合して、オリゴマー形態または固定状態になるように使用され得る部分を含むように修飾され得る。例えば、第１のウイルスコアタンパク質は、第２のウイルスコアタンパク質とジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、修飾は、オリゴマー形成を誘導するために、ウイルスコアタンパク質内に置換変異または挿入変異を含み得る。修飾は、コアタンパク質のアミノ酸配列において、いずれの好適な位置で生じ得る。ある実施形態では、修飾は、修飾がオリゴマー形成を誘導する第２のウイルスコアタンパク質と相互作用することができるように、第１のウイルスコアタンパク質の表面上に位置する。
【００２４】
単独で、または別のウイルスコアタンパク質と共にのいずれかで、ウイルス性カプシドへの自己集合を可能にするあらゆるウイルスコアタンパク質が開示される方法における使用に好適である。例示的なウイルスコアタンパク質は、肝炎コアタンパク質（ヒトおよびアヒルのＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質等）を含み、またヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６型Ｌ１およびＬ２タンパク質ならびにササゲクロロティックモトルウイルス被覆されたタンパク質も含み得る。
【００２５】
例示的なウイルスコアタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質（本明細書において、「Ｃタンパク質」または「ＣＰ」とも称される）である。ＨＢＶの異なる株はＣタンパク質の配列においてわずかな変化を有し得、ＨＢＶ  Ｃタンパク質のいずれの株が利用され得ることが理解されよう。ＨＢＶコアタンパク質の例示的な配列は、それぞれ、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受託番号ＢＡＤ８６６２３およびＡＹ７４１７９５に対応するアミノ酸配列１〜１８３を有する配列番号１および２を含む。
【化１】
2014527072.tif 000003
【化２】
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【００２６】
配列番号１および２の対応する核酸配列は、それぞれ、下に示される。
配列番号１の核酸配列
【化３】
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配列番号２の核酸配列
【化４】
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【００２７】
当業者は、ウイルスコアタンパク質が単量体として（例えばウイルスコアタンパク質が単一のアミノ酸鎖を含み得る）、または二量体として（例えばウイルスコアタンパク質が２つのアミノ酸鎖を含み得る）存在し得ることを理解するだろう。二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。
【００２８】
ウイルスコアタンパク質がＨＢＶコアタンパク質であるとき、当業者は、ＨＢＶコアタンパク質が溶液中で自然に二量体を形成することを理解するだろう。ＨＢＶコアタンパク質はカプシド構造集合（例えばナノケージ形成）を防止するために自然に二量体を形成するため、ＨＢＶコアタンパク質は、図１Ａ〜Ｂに示されるように、ＨＢＶコアタンパク質の二量体−二量体複合体を生成するように修飾され得る。
【００２９】
ある実施形態では、ＨＢＶコアタンパク質の二量体−二量体複合体は、ＨＢＶコアタンパク質配列のスパイク領域を修飾することにより形成され得る。ＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域は、配列番号１または配列番号２の約アミノ酸７４〜８４を含む。ある実施形態では、ＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域は、システイン残基を含むように修飾される。例えば、ＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置７７、７９、または８０にシステイン残基を含むように修飾され得る。本明細書において、スパイク領域へのシステイン残基の導入（例えばＥ７７Ｃ変異）がＨＢＶコアタンパク質二量体を、ジスルフィド結合の形成によりナノケージに自己集合する能力がない高次構造に固定することが想定される。このジスルフィド結合の減少時、タンパク質二量体は、高次構造的に、自由に他のコアタンパク質二量体と会合し、ナノケージに自己集合することができる。
【００３０】
１つの実施形態では、ウイルス性カプシドへのＨＢＶコアタンパク質の集合を制御するための方法は、変性剤（例えば修飾ＨＢＶコアタンパク質を保存するために使用される緩衝剤に存在する変性剤）を希釈することなく、修飾ウイルスコアタンパク質を還元剤に曝露することを含む。自己集合方法は、変性剤を含む溶液中の修飾ＨＢＶコアタンパク質を提供することと、還元剤を溶液に添加して、集合カプシド構造を形成することとを含むがこれらに限定されない。例示的な修飾ＨＢＶコアタンパク質は、本明細書に記載されるように、スパイク領域にシステインを含む。例えば、スパイク領域内、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置７７にシステイン残基、およびポリ−リジン尾部を含むように修飾されたコアタンパク質は、還元剤の添加時に強いケージを迅速に形成する。還元剤の添加後にウイルス性カプシドを形成する他の例示的な修飾コアタンパク質は下に記載される。これらの修飾コアタンパク質に関して、還元剤の存在は、変性剤の存在下（例えば２〜６Ｍの尿素）でケージ形成を開始する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ウイルス性カプシドへのＨＢＶコアタンパク質の集合を制御するための方法は、修飾ウイルスコアタンパク質を還元剤に曝露することと、集合溶液に存在する変性剤を希釈することとを含む。自己集合方法は、（１）変性剤を含む溶液中の修飾ＨＢＶコアタンパク質を提供すること、（２）還元剤を溶液に添加すること、および（３）第１の濃度の変性剤から第２の濃度の変性剤に溶液中の変性剤を希釈し、それによって、集合カプシド構造を形成することを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、変性剤は、還元剤の添加前に希釈され得る。他の実施形態では、変性剤は、還元剤の添加後に希釈され得る。
【００３２】
還元剤の添加および変性剤の希釈後にウイルス性カプシドを形成するために自己集合する修飾ＨＢＶコアタンパク質は、下に記載される１つ以上の安定化および／または不安定化変異を含む修飾コアタンパク質を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、例示的な修飾ＨＢＶコアタンパク質は、スパイク領域にシステインと、下に記載されるように、コアタンパク質に安定化および／または不安定化変異とを含む。
【００３３】
ある実施形態では、ウイルス性カプシドへのＨＢＶコアタンパク質の集合を制御するための方法は、還元剤を添加することなく、変性剤を希釈することを含む。自己集合方法は、変性剤を含む溶液中の修飾ＨＢＶコアタンパク質を提供することと、還元剤を溶液に添加して、溶液中の変性剤を希釈して、集合カプシド構造を形成することとを含むがこれらに限定されない。変性剤の希釈後に自己集合する修飾ＨＢＶコアタンパク質は、場合によっては、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含まなくてもよい。これらの修飾ＨＢＶコア間に存在する弱いタンパク質−タンパク質相互作用は、変性剤の存在下でナノケージの形成を防止するのに十分であり、その後の変性剤の希釈（例えば変性剤の開始濃度の約２５％、５０％、７５％、または８０％希釈）は、ナノケージの形成を作動させることができる。例示的な非限定的な修飾ＨＢＶコアタンパク質は下に記載される。
【００３４】
ウイルスコアタンパク質は、自己集合を不安定化させる、および／またはウイルスコアタンパク質の非集合形態もしくは固定形態を安定化させる状態に、ウイルスコアタンパク質を曝すことによって、自己集合するのを本質的に阻害させることができる。例えば、変性剤が、ウイルスコアタンパク質の自己集合を防止するために使用され得る。前述の実施形態のそれぞれにおいて、ＨＢＶコアタンパク質は、カプシド集合の開始前、変性剤（例えば２〜６Ｍの尿素）を含む保存緩衝剤において維持され得る。
【００３５】
ウイルスコアタンパク質の自己集合を本質的に防止するのに好適であるいずれの変性剤および変性剤の濃度が使用され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の不安定化剤、洗剤、離液剤（ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）、有機変性剤、および／または洗剤が変性剤として使用され得る。
【００３６】
不安定化剤の非限定的な例としては、尿素、チオシアン酸塩（例えばグアニジンチオシアン酸塩（ＧＩＴＣ））、トリクロロ酢酸塩、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、硝酸塩、および過塩素酸塩（例えば過塩素酸リチウム）が挙げられる。
【００３７】
離液剤の非限定的な例としては、硫酸塩、リン酸塩、および酢酸塩が挙げられる。
【００３８】
有機変性剤の非限定的な例としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、およびトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）が挙げられる。
【００３９】
洗剤の非限定的な例としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、または双性イオン性の洗剤が挙げられる。アニオン性洗剤は、例えばデオキシコール酸、コール酸、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含み得る。カチオン性洗剤は、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を含み得る。非イオン性洗剤は、例えばジキトニン、トリトン、およびツイーンを含み得る。双性イオン性洗剤は、例えばＣＨＡＰＳを含み得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、変性剤は、例えばウイルスコアタンパク質が特に安定したナノケージを形成することができるとき、本質的に自己集合を防止するために、ウイルスコアタンパク質への修飾と組み合わせて使用され得る。
【００４１】
ナノケージの形成を防止するためにジスルフィド架橋を採用する実施形態では、ジスルフィド架橋を安定化させるために、酸化環境が使用され得る。いくつかの実施形態では、溶液中に溶解された酸素ガスは、酸化環境を維持するのに十分であり得る。しかしながら、酸化環境を維持するいずれの好適な酸化体が添加され得るが、ウイルスコアタンパク質を損傷しないことを理解するべきである。酸化体の非限定的な例はヨウ素である。
【００４２】
ウイルスコアタンパク質の自己集合は、所望される時間点で作動することができる。例えば、自己集合を防止するために（例えばジスルフィド結合）還元部分が使用されるウイルスコアタンパク質の場合において、還元剤が、自己集合を作動させるために使用され得る。よって、ジスルフィド結合は、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２メルカプトエチルアミン（ＢＭＡ）、および／または遊離システイン等のチオールを用いて破壊され得る。他の好適なチオールは、当業者に既知である。場合によっては、ジスルフィド結合を破壊するためにチオレドキシン等のタンパク質が使用され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、還元剤は、ウイルスコアタンパク質に対して過剰なモル比で添加され得る。還元剤の範囲は、約０．１モル当量〜約１００モル当量であり得る。例えば、いくつかの場合では、ウイルスコアタンパク質に対して少なくとも約１モル当量、少なくとも約４モル当量、少なくとも約１０モル当量、少なくとも約２０モル当量、少なくとも約３０モル当量、または少なくとも約４０モル当量の還元剤が添加され得る。いくつかの実施形態では、還元剤の濃度は、約０．１モル当量〜約１００モル当量、約１モル当量〜約１００モル当量、約１モル当量〜約５０モル当量、約１０モル当量〜約１００モル当量、約１０モル当量〜約５０モル当量、または約１０モル当量〜約２０モル当量であり得る。
【００４４】
カプシドの自己集合を少なくとも部分的に阻害するために変性剤を採用する実施形態では、変性剤の濃度の減少（例えば変性剤の少なくとも一部を除去する、および／または変性剤を希釈する）が、ウイルスコアタンパク質の自己集合を作動させるために使用され得る。例えば、変性剤の濃度は、少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％減少され得る。ある実施形態では、変性剤の濃度は、約１０％〜約９０％の範囲で減少され得る。
【００４５】
本明細書で記載されるように、ある実施形態では、変性剤は、集合反応中にカプシド形成を促進するために第１の濃度から第２の濃度に希釈され得る。第２の濃度への希釈は、１つ以上の希釈ステップ（例えば、１、２、３、４、５以上の希釈ステップ）を含み得る。例えば、変性剤の濃度を減少させる（例えば変性剤を希釈する）前、変性剤は、約２Ｍ〜約８Ｍ、約２Ｍ〜約６Ｍ、約２Ｍ〜約４Ｍ、約４Ｍ〜約６Ｍ、および約４Ｍ〜約８Ｍの濃度、または前記範囲内に配置されるいずれの整数を有し得る。変性剤の濃度を減少させた（例えば変性剤を希釈する）後、変性剤は、約０．２５Ｍ〜約４Ｍ、約０．２５Ｍ〜約２Ｍ、約０．２５Ｍ〜約１Ｍ、約０．５Ｍ〜約４Ｍ、約１Ｍ〜約４Ｍ、いくつかの場合では、約０．２５Ｍ未満の濃度、または前記範囲内に配置されるいずれの整数を有し得る。いくつかの実施形態では、変性剤は、還元剤の添加前に希釈され得る。他の実施形態では、変性剤は、還元剤の添加後に希釈され得る。
【００４６】
ウイルス性カプシド構造の集合を調節する方法は、負に荷電された（例えばアニオン性）ポリマーを集合溶液に添加することをさらに含み得る。ある実施形態では、負に荷電されたポリマーは、カプシドにカプセル封入され得るＲＮＡまたはＤＮＡ治療薬（例えばｓｉＲＮＡ）である。他の実施形態では、負に荷電されたポリマーは、ホスホン酸、スルホン酸、アクリル酸、マレイン酸、硫酸塩、および／またはリン酸塩を含み得る。負に荷電されたポリマーは、ポリ（ビニルホスホン酸）、ポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）アンモニウム塩、ポリ（４−スチレンスルホン酸）リチウム塩、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（４スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）ナトリウム塩、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム塩、ポリエポキシコハク酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−ｌ−プロパンスルホン酸）、ポリ（２アクリルアミド−２−メチル−ｌ−プロパンスルホン酸−コ−アクリロニトリル）アクリロニトリル、ポリ（ニソプロピルアクリルアミド）−カルボン酸終結、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸−コ−オクタデシルアクリレート）、ポリ（アクリルアミド−コ−アクリル酸）、ポリ（アクリル酸ナトリウム塩）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸）、部分ナトリウム塩−グラフト−ポリ（エチレンオキシド）架橋、ポリ（アクリル酸−コ−マレイン酸）、ポリ（イソブチレン−コ−マレイン酸）ナトリウム塩、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸モノブチルエステル）、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸モノエチルエステル）、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）ナトリウム塩、ポリ（２エチルアクリル酸）、ポリ［（２−エチルジメチルアンモニオエチルメタクリレートエチル硫酸塩）−コ−（１ビニルピロリドン）］、ポリ［エチルアクリレート−コ−メタクリル酸−コ−３−（１−イソシアナト−１−メチルエチル）ａ−メチルスチレン］、ポリ（ビス（４カルボキシフェノキシ）ホスファゼン）、ポリ（ビス（４カルボキシフェノキシ）ホスファゼン）二ナトリウム塩、ポリ（スチレン）−ブロック−ポリ（アクリル酸）、リグノスルホン酸ナトリウム塩、リグノスルホン酸、酢酸ナトリウム塩、リグノスルホン酸、糖ナトリウム塩、アクリル酸−コ−メチルメタクリレートポリマー（ＡＡＭＭＡ）、ポリ（メチルアクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（エチルアクリル酸）（ＰＥＡＡ）、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）、ポリ（ブチルアクリル酸）（ＰＢＡＡ）、およびヘパリンも含み得るが、これらに限定されない。
【００４７】
ある実施形態では、負に荷電されたポリマーは、アクリル酸ポリマー、アクリル酸−コ−メチルメタクリレートポリマー（ＡＡＭＭＡ）、ポリ（メチルアクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（エチルアクリル酸）（ＰＥＡＡ）、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）、およびポリ（ブチルアクリル酸）（ＰＢＡＡ）のうちの少なくとも１つであり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、集合溶液に添加され得る。カチオン性ポリマーは、ポリ（エチレンイミン）等のアミン系（例えばＰＥＩ系）、または別のポリカチオン性アミノ酸であり得る。ＰＥＩ系ポリマーは分枝状であり得、それぞれ、２５％、５０％、および２５％の割合の１級、２級、および３級アミン基からなる。例示的なカチオン性ポリマーは、ポリ（アクリルアミド−コジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（ジメチルアミン−コ−エピクロロヒドリン−コエチレンジアミン）、分枝状または直鎖状ポリ（エチレンイミン）、ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−ａｌｔ１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、およびポリ（ヒスチジン）を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
集合溶液のｐＨは、約７．０〜約９．５であり得る。例示的な方法では、溶液のｐＨは、約７．０〜約９．０、約７．０〜約８．５、約７．４〜約８．０、および約７．４〜約７．６であり得る。本明細書において、集合溶液のｐＨは、集合反応中に調節され得る（例えばｐＨは、集合反応の開始時には第１のｐＨ（例えばｐＨ９．５）であり得、集合反応の経過中に第２のｐＨ（例えばｐＨ７．４）に調節され得る）ことが想定される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、集合溶液のｐＨは、約ｐＨ７．０以下であり得、例えばカプシド集合は、６．８以下、６．５以下、６．３以下、または６．０以下のｐＨで行われ得る。ある実施形態では、集合溶液のｐＨは、約５．０〜約７．０であり得る。本明細書において、低ｐＨで、例えばヒスチジンのｐＫａを下回るｐＨ、例えば６．０で、二量体−二量体界面でカプシドを不安定化するために、ある変異がＨＢＶコアに導入され得る（例えばＦ１８ＨまたはＡ１３７Ｈ変異）ことが想定される。理論に拘束されるものではないが、二量体−二量体界面でヒスチジンを導入するＨＢＶコアタンパク質における変異は、低ｐＨでケージを形成することができないであろうことが想定される（例えばそのような修飾コアタンパク質は低ｐＨで、例えば約６．０〜約７．０のｐＨで開口状態に固定され得る）。ある実施形態では、カプシド集合は、集合溶液のｐＨを修飾することにより（例えばｐＨは、カプシド集合を防止するために約７．０以下に下げられ、カプシド集合を促進するために約７．０以上に上げられる場合がある）、制御され得る。
【００５１】
様々な実施形態では、ナノケージを形成するためのウイルスコアタンパク質の集合は、管理された速度で生じる。例えば、モル当量の作動薬（例えば還元剤）の数および／または変性剤の希釈速度は、所望される自己集合の速度を達成するように調節され得る。いくつかの場合では、少なくとも約９５％のウイルスコアタンパク質は、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、約３０分未満、約１５分未満、または約１０分未満で自己集合され得る。
【００５２】
ナノケージ（例えばウイルス性カプシド）の形成も測定され得る。例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）は、溶液中の粒子の大きさを測定するために使用され得る（実施例においてより詳細に記載される）。いくつかの実施形態では、集合ウイルスコアタンパク質（すなわち、ナノケージ）は、ＤＬＳにより測定されるように、非集合ウイルスコアタンパク質より小さい大きさを有する。ナノケージの平均粒子半径は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約３０ｎｍ、および約１５ｎｍ〜約２０ｎｍであり得る。
【００５３】
ウイルスコアタンパク質の自己集合により形成されたウイルス性カプシドは精製され得る場合がある。ある実施形態では、集合ウイルス性カプシドは、分子ふるいクロマトグラフィー、遠心分離、および／または濾過により精製される。本明細書において想定される方法は、ナノケージ（例えばウイルス性カプシド）を精製ステップの不在においても高純度で調製することを可能にし得る。例えば、いくつかの実施形態では、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満の多分散性を有する粒子が調製され得る。いくつかの実施形態では、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、および約５％〜約１５％の多分散性を有する粒子が調製され得る。
【００５４】
本明細書において、本明細書に開示される集合ウイルス性カプシド粒子は、実質的に非複製であり、実質的に弱毒化した野生型ウイルスを組み込まないことが想定される。ウイルスコアタンパク質は、実質的に非免疫原性であるように設計され得る、および／または粒子が一旦崩壊し始めると、あらゆる免疫応答を制限するために迅速に分解されるように設計され得る。
【００５５】
本明細書において想定される集合ウイルス性カプシドは、実質的に形態が球体であり得る、および／または正二十面体であり得る。いくつかの実施形態では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、本明細書に記載される、配列番号１または配列番号２の最初の１４９個のアミノ酸を含み得る。ウイルスコアタンパク質が下に論じられる尾部と組み合わされて約１４９個のアミノ酸を含むとき、例えば実質的なＴ＝４幾何学を有するカプシドまたはケージ構造が、例えば複数の修飾ウイルスコアタンパク質から形成され得る。
【００５６】
ある実施形態では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、本明細書に記載される、配列番号１または配列番号２の最初の１３８個のアミノ酸を含み得る。ウイルスコアタンパク質が下に論じられる尾部と組み合わされて約１３８個のアミノ酸を含むとき、例えば実質的なＴ＝３幾何学を有するカプシドまたはケージ構造が、例えば複数の修飾ウイルスコアタンパク質から形成され得る。
【００５７】
第１のウイルスコアタンパク質を第２のコアタンパク質に結合することができるいずれの切断可能な化学種がナノケージ形成を防止するために使用され得ることも、本明細書において想定される。例えば、いくつかの場合では、第１のウイルスコアタンパク質はアルデヒド基を含み得、第２のウイルスコアタンパク質はヒドラジン基を含み得る。アルデヒド基およびヒドラジン基は、第１のウイルスコアタンパク質を第２のウイルスコアタンパク質に結合するヒドラゾン基を形成するように反応することができる。いくつかの実施形態では、ヒドラゾン基は、ウイルスコアタンパク質を、約７未満、またはいくつかの実施形態では、約６未満のｐＨを有する溶液と接触させることにより切断され得る。
【００５８】
ウイルスコアタンパク質を固定状態に維持し、カプシド集合を調節するために、それを修飾するように使用され得るさらなる切断可能な化学種は、光切断可能なリンカー、キレート化リンカー、ｓｓＤＮＡリンカー、ｄｓＤＮＡリンカー、ペプチドリンカー、自己切断可能なリンカー、および糖リンカーの使用を含むが、これらに限定されない。例えば、ビスマレイミド等の光切断可能なリンカーは、集合を防止するために、ウイルスタンパク質を開口状態に固定するために使用され得る。光切断可能なリンカーは、ケージ形成を作動させるために、光を適用することにより切断され得る。キレート化リンカー、例えば第１のウイルスタンパク質上のマレイミド連結、および第２のウイルスタンパク質上のキレート化部分は、集合を防止するために、２つのウイルスタンパク質を開口状態に固定するように金属とリンカーの錯体を作り出すために使用され得る。ケージ形成は、金属を除去することにより調節され得る。（ｓｓ）１本鎖または（ｄｓ）２本鎖ＤＮＡリンカー等のＤＮＡリンカーも使用され得る。例えば、ビス−マレイミド等の切断可能なリンカーは、２つのマレイミド部分間にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかを含み得る。ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡリンカーは、ナノケージ形成を作動させるエンドヌクレアーゼで切断され得る。ＤｓＤＮＡリンカーは、ｄｓＤＮＡの融点まで熱を加えることによっても破壊され得る。同様に、２つのマレイミド部分間のペプチドリンカーが使用され、その後エンドプロテアーゼの添加により切断され得る。糖リンカーも２つのマレイミド部分間に使用され、ケージ形成を作動させるために、その後ＮａＩＯ４を添加することにより切断され得る。
【００５９】
修飾ウイルスコアタンパク質
野生型ＨＢＶコアタンパク質は、典型的に、１８３個のアミノ酸（本明細書において「コアタンパク質１８３」または「ＣＰ１８３」と称される）である。アミノ末端の１４９個のアミノ酸は、球状折り畳み（ｇｌｏｂｕｌａｒ−ｆｏｌｄ）または構造コアを形成する。本明細書において、例えば、１つ以上の修飾を含み得る、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜１４９（本明細書において「構造コア部分」、「コアタンパク質１４９」、または「ＣＰ１４９」とも称される）に基づくＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分が提供される。配列番号１および配列番号２の構造コア部分は、それぞれ、下に示される。
配列番号１に基づくＣＰ１４９は、次のアミノ酸配列を有する。
【化５】
2014527072.tif 000007
配列番号２に基づくＣＰ１４９は、次のアミノ酸配列を有する。
【化６】
2014527072.tif 000008
【００６０】
コアタンパク質に関して使用されるとき、用語「部分」とは、そのタンパク質の断片を指す。数字が続く用語「コアタンパク質」または「ＣＰ」は、ＨＢＶコアタンパク質のアミノ末端部分を指す。例えば、ＣＰ１８３は１８３個のアミノ酸を有するＨＢＶコアタンパク質（例えば野生型ＨＢＶコアタンパク質）を指し、ＣＰ１４９はアミノ末端の１４９個のアミノ酸を有するＨＢＶコアタンパク質（例えばＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分）を指す。
【００６１】
いくつかの実施形態では、構造コア部分は、ＨＢＶコアタンパク質の最初のアミノ末端の１３８個のアミノ酸を含み得ることに留意する。ウイルスコアタンパク質の想定される修飾された構造的部分は、本明細書に記載される１つ以上の修飾を含み得る、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜１３８（「コアタンパク質１３８」、または「ＣＰ１３８」と称される）を含み得ることを理解する。配列番号１および配列番号２に対応するＣＰ１３８配列は、下に示される。
【００６２】
配列番号１に基づくＣＰ１３８は、次のアミノ酸配列を有する。
【化７】
2014527072.tif 000009
【００６３】
配列番号２に基づくＣＰ１３８は、次のアミノ酸配列を有する。
【化８】
2014527072.tif 000010
【００６４】
カルボキシル末端の３４個のアミノ酸は、典型的に、ＨＢＶコアタンパク質の「尾部分」と称される。ＨＢＶコアタンパク質の尾部分は、下に記載されるように、野生型尾部分（例えばＨＢＶコアタンパク質カルボキシル末端の３４個のアミノ酸またはその断片を含む）、もしくは合成の尾部分（例えば非ＨＢＶコアタンパク質配列、例えばリジン尾部、アルギニン尾部）、またはそれらの組み合わせであり得る。ある実施形態では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、ヒスチジンタグを含み得る。
【００６５】
ある実施形態では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、３４個のアミノ酸尾部分の全て、または一部を除去するために、カルボキシル末端で切り詰められる。例えば、配列番号１または配列番号２の約アミノ酸残基１５０〜約アミノ酸残基１８３を含むＣ末端尾部分は、修飾ＨＢＶコアタンパク質から切り詰められ得る。Ｃ末端尾部分は、４つのアルギニンに富む反復をさらに含む。本明細書において、アルギニンに富む反復のうちの１つ、２つ、３つ、または４つが修飾ＨＢＶコアタンパク質のカルボキシル末端から切り詰められ得ることが想定される。例示的な切り詰め変異体（配列番号２に基づく）はＣＰ１７０に変異を含み、１つのアルギニンに富む反復は、下に示されるように、ＨＢＶコアタンパク質のカルボキシ末端から切り詰められる（残りの３つのアルギニンに富む反復には下線が引かれている）：
【化９】
2014527072.tif 000011
【００６６】
ＣＰ１６２での変異は、２つのアルギニンに富む反復が、下に示されるように、ＨＢＶコアタンパク質のカルボキシ末端から切り詰められる（残りの２つのアルギニンに富む反復には下線が引かれている）：
【化１０】
2014527072.tif 000012
【００６７】
ＣＰ１５５での変異は、３つのアルギニンに富む反復が、下に示されるように、カルボキシ末端ＨＢＶコアタンパク質から切り詰められる（残りの１つのアルギニンに富む反復には下線が引かれている）：
【化１１】
2014527072.tif 000013
【００６８】
上述の構造コア部分またはＣＰ１４９は、４つ全てのアルギニンに富む反復がカルボキシ末端から切り詰められるときに生成され得る。
【００６９】
簡潔化のため、本明細書に記載される実施形態は、ＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形配列番号２の切り詰めおよび／または修飾を例示する。同じ切り詰めおよび／または修飾は、ＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形配列番号１内で操作され得ることを理解する。
【００７０】
上述のように、ある実施形態では、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分（例えばＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸１〜１４９）は、カプシド構造の集合を制御するために、例えばＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域にシステイン残基を含むように修飾され得る。スパイク領域は、配列番号１または配列番号２の約アミノ酸残基７４〜約アミノ酸残基８４を含む。ある実施形態では、ＨＢＶコアタンパク質のスパイク領域は、配列番号１または配列番号２の約アミノ酸残基７４〜約アミノ酸残基８４のいずれのアミノ酸位置にシステイン残基を含むように修飾され得、例えば、ＨＢＶコアタンパク質は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置７７、７９、または８０にシステイン残基を含むように修飾され得る。配列番号２のスパイク領域にシステイン残基を含む例示的な構造コアタンパク質配列は、アミノ酸位置７７（下線付き）にグルタミン酸のシステインへの変異を有するＣＰ１４９を含み、これは次のアミノ酸配列を有する：
【化１２】
2014527072.tif 000014
【００７１】
アミノ酸位置７８（下線付き）にアスパラギン酸のシステインへの変異を有するＣＰ１４９は、次のアミノ酸配列を有する：
【化１３】
2014527072.tif 000015
【００７２】
アミノ酸位置８０（下線付き）にアラニンのシステインへの変異を有するＣＰ１４９は、次のアミノ酸配列を有する：
【化１４】
2014527072.tif 000016
【００７３】
本明細書に論じられる実施形態のそれぞれにおいて、野生型ＨＢＶコア配列が存在する場合、野生型ＨＢＶコア配列は、例えば集合を制御するために、システイン残基を含むようにスパイク領域において修飾され得ることが想定されることに留意する。本明細書において、ＨＢＶコアタンパク質は、図１Ａ〜Ｂに図示される、固定されたＨＢＶコアタンパク質二量体−二量体複合体を生成するために、別のＨＢＶコアタンパク質とジスルフィド結合を形成するのに十分ないずれの位置でスパイク領域の外側にシステイン残基を含むように変異され得ることも想定される。
【００７４】
ある実施形態では、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分はまた、例えば、（ａ）ウイルスコアタンパク質、例えばＨＢＶコアタンパク質単量体のカプシドへの集合を強化し、さらに促進する（本明細書において「安定化変異」とも称される）、（ｂ）カプシド構造を不安定化させる、（ｃ）脂質または脂質／コレステロールを含む層で１つ以上のカプシドの被覆を強化し、促進する、（ｄ）他の部分、例えば化学修飾因子および／もしくは標的剤の結合を容易にする、ならびに／または（ｅ）投与後の血流における全カプシドの解体を容易にするためにも、修飾され得る。これらの修飾のそれぞれは、下にさらに詳細に論じられる。
【００７５】
修飾された構造コアタンパク質は、いくつかの実施形態では、配列番号１５により表され得、ここで、Ｘは、各発生に関して独立して、アミノ酸を表す。想定されるウイルスコアタンパク質は、配列番号１５により表される構造部分を含み得、修飾または未修飾の尾部分、例えば下に記載されるもの等の修飾されたＣ末端尾部分をさらに含み得ることを理解する。
【化１５】
2014527072.tif 000017
ここで、Ｘは、所与の位置で、
１４でＸ：Ｘ＝Ｅ、Ｈ
１８でＸ：Ｘ＝Ｆ、Ｈ
２３でＸ：Ｘ＝Ｆ、Ｃ、Ｈ
２９でＸ：Ｘ＝Ｄ、Ｃ
３３でＸ：Ｘ＝Ｔ、Ｃ、Ｈ
３６でＸ：Ｘ＝Ａ、Ｈ
３７でＸ、Ｘ＝Ｌ、Ｃ、Ｈ
４８でＸ：Ｘ＝Ｃ、Ａ
６１でＸ：Ｘ＝Ｃ、Ａ
７７でＸ：Ｘ＝Ｅ、Ｃ
７８でＸ：Ｘ＝Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ｅ
７９でＸ：Ｘ＝Ｐ、Ｃ
８０でＸ：Ｘ＝Ａ、Ｃ
１０７でＸ：Ｘ＝Ｃ、Ａ
１１８でＸ：Ｘ＝Ｙ、Ｈ
１２１でＸ：Ｘ＝Ｓ、Ｃ
１２２でＸ：Ｘ＝Ｆ、Ｈ
１２４でＸ：Ｘ＝Ｖ、Ｃ
１２７でＸ：Ｘ＝Ｒ、Ｃ
１３２でＸ：Ｘ＝Ｙ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｃ
１３７でＸ：Ｘ＝Ａ、Ｈ
１３９でＸ：Ｘ＝Ｉ、Ａ
１４１でＸ：Ｘ＝Ｓ、Ｃから選択される。
【００７６】
カプシド集合修飾
いくつかの実施形態では、ＨＢＶカプシドは、タンパク質二量体から形成され得る。例えば、二量体間の分子間相互作用は、集合を安定化させ、ジスルフィド結合、塩架橋、およびタンパク質間の疎水性相互作用により形成され得る。いくつかの実施形態では、構造コア部分は、相互作用を安定化させる、および／または不安定化するいずれか、したがって、カプシドまたは粒子集合のために、相互作用アミノ酸側鎖に変異を含み得る。ある実施形態では、そのような変異は、そのようなウイルス構造タンパク質を含むウイルスコアタンパク質から形成されたカプシドまたは粒子の長期安定性に影響を及ぼす場合がある。そのような安定化および／または不安定化変異は、例えば単独で、および／または組み合わせで導入され得る。
【００７７】
例えば、安定化変異は、ウイルスタンパク質コアタンパク質間の二量体間の会合を安定化させ得るジスルフィド結合を形成するために、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分のアミノ酸位置１２１および／または１４１（例えば配列番号２のＳ１２１Ｃおよび／またはＳ１４１Ｃ）に導入され得る。いくつかの実施形態では、安定化変異は、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分のアミノ酸位置１４（例えば配列番号２のＥ１４１１）に導入され得る。ＨＢＶコアタンパク質変異形配列番号２のＣＰ１６２に基づく安定化配列は、これらに限定されないが次を含む：
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃ変異を有するＣＰ１６２
【化１６】
2014527072.tif 000018
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＥ１４１１変異を有するＣＰ１６２
【化１７】
2014527072.tif 000019
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＳ１２１Ｃ変異を有するＣＰ１６２
【化１８】
2014527072.tif 000020
【００７８】
上に示される例示的な安定化変異配列は、アミノ酸位置７７にシステイン残基を含む。本明細書において、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得ることが想定される。本明細書において、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得、システイン残基はスパイク領域内の別のアミノ酸位置（例えばスパイク領域の約アミノ酸７４〜約アミノ酸８４）に導入され得ることも想定される。
【００７９】
ある実施形態では、不安定化変異は、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分に導入され得る。例示的な不安定化変異は、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分のアミノ酸位置１８、２３、３３、３６、３７、１１８、１２２、１３７、１３２、および／または１３９（例えば配列番号２のＦ１８１１、Ｆ２３１１、Ｔ３３Ｈ、Ａ３６Ｈ、Ｌ３７Ｈ、Ｙ１１８Ｈ、Ｆ１２２１１、Ｙ１３２Ｆ、Ｙ１３２Ａ、Ｙ１３２Ｖ、Ａ１３７１１、および／またはＩ１３９Ａ）に導入され得る。ＨＢＶコアタンパク質変異形配列番号２のＣＰ１６２に基づく例示的な不安定化配列は、これらに限定されないが、次を含む：
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化１９】
2014527072.tif 000021
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｖ変異を有するＣＰ１６２
【化２０】
2014527072.tif 000022
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｆ変異を有するＣＰ１６２
【化２１】
2014527072.tif 000023
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＩ１３９Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化２２】
2014527072.tif 000024
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＦ１８１１変異を有するＣＰ１６２
【化２３】
2014527072.tif 000025
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＦ２３１１変異を有するＣＰ１６２
【化２４】
2014527072.tif 000026
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＴ３３１１変異を有するＣＰ１６２
【化２５】
2014527072.tif 000027
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＡ３６１１変異を有するＣＰ１６２
【化２６】
2014527072.tif 000028
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＬ３７１１変異を有するＣＰ１６２
【化２７】
2014527072.tif 000029
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１１８１１変異を有するＣＰ１６２
【化２８】
2014527072.tif 000030
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＦ１２２１１変異を有するＣＰ１６２
【化２９】
2014527072.tif 000031
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＡ１３７Ｈ変異を有するＣＰ１６２
【化３０】
2014527072.tif 000032
【００８０】
上に示される例示的な不安定化変異配列も、アミノ酸位置７７にシステイン残基を含む。本明細書において、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得ることが想定される。本明細書において、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得、システイン残基はスパイク領域内の別のアミノ酸位置（例えばスパイク領域の約アミノ酸７４〜約アミノ酸８４）に導入され得ることも想定される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、安定化および不安定化の両方の変異は、ＨＢＶコアタンパク質の構造コア部分に導入され得る。ＨＢＶコアタンパク質変異形配列番号２のＣＰ１６２に基づく安定化および不安定化の両方の変異を有する例示的な構造コアタンパク質は、次を含む：
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｙ１３２Ｆ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃ変異を有するＣＰ１６２
【化３１】
2014527072.tif 000033
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｆ１８Ｈ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃ変異を有するＣＰ１６２
【化３２】
2014527072.tif 000034
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｙ１３２Ａ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃ変異を有するＣＰ１６２
【化３３】
2014527072.tif 000035
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ａ１３７Ｈ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃ変異を有するＣＰ１６２
【化３４】
2014527072.tif 000036
【００８２】
上に示される例示的な安定化および不安定化の変異配列も、アミノ酸位置７７にシステイン残基を含む。本明細書において、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得ることが想定される。本明細書において、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得、システイン残基はスパイク領域内の別のアミノ酸位置（例えばスパイク領域の約アミノ酸７４〜約アミノ酸８４）に導入され得ることも想定される。
【００８３】
ある実施形態では、位置４８、６１、および／または１０７の未変性システイン残基は、コアタンパク質がカプシドまたは粒子を形成する能力に実質的に影響を及ぼすことなく、（例えばアラニンに）変異させることもできる。配列番号２に基づくＨＢＶコアタンパク質変異形のＣＰ１４９構造コア部分に基づく例示的な配列は、次を含む：
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＣ４８Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化３５】
2014527072.tif 000037
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＣ６１Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化３６】
2014527072.tif 000038
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＣ１０７Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化３７】
2014527072.tif 000039
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、およびＣ６１Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化３８】
2014527072.tif 000040
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、およびＣ１０７Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化３９】
2014527072.tif 000041
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｃ６１Ａ、およびＣ１０７Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化４０】
2014527072.tif 000042
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、Ｃ６１Ａ、およびＣ１０７Ａ変異を有するＣＰ１６２
【化４０−２】
2014527072.tif 000043
【００８４】
ウイルスコアタンパク質の構造コア部分の修飾は、例えば形成された二量体のスパイク領域への一対のシステインの導入、または二量体間の結合（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を含み得る。例えば、第１のシステイン（例えばアミノ酸２３）は、隣接する分子において第２のシステイン（この場合アミノ酸１３２）とジスルフィド結合を形成するために、第１の位置に導入される。同様に、第２の位置もジスルフィド結合に関与し得、二量体が４つのジスルフィド架橋および合計１８０の安定化共有結合相互作用に関与することを可能にする。少なくとも４つの異なる種類のジスルフィド結合を作り出すことができる。
【００８５】
例えば、修飾構造コア部分を含む例示的な修飾ウイルスコアタンパク質は、次を含む：
変異１（フェニルアラニン２３をシステイン、チロシン１３２をシステイン）を含む配列番号２のＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形
【化４１】
2014527072.tif 000044
変異１（フェニルアラニン２３をシステイン、チロシン１３２をシステイン）を含む配列番号１のＨＢＶ  Ｃタンパク質
【化４２】
2014527072.tif 000045
変異２（アスパラギン酸２９をシステイン、アルギニン１２７をシステイン）を含む配列番号２のＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形
【化４３】
2014527072.tif 000046
変異２（アスパラギン酸２９をシステイン、アルギニン１２７をシステイン）を含む配列番号１のＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形
【化４４】
2014527072.tif 000047
変異３（スレオニン３３をシステイン、バリン１２４をシステイン）を含む配列番号２のＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形
【化４５】
2014527072.tif 000048
変異３（スレオニン３３をシステイン、バリン１２４をシステイン）を含む配列番号１のＨＢＶ  Ｃタンパク質
【化４６】
2014527072.tif 000049
変異４（ロイシン３７をシステイン、バリン１２０をシステイン）を含む配列番号２のＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形
【化４７】
2014527072.tif 000050
変異４（ロイシン３７をシステイン、バリン１２０をシステイン）を含む配列番号１のＨＢＶ  Ｃタンパク質
【化４８】
2014527072.tif 000051
【００８６】
本明細書において、前述の修飾ＨＢＶコアタンパク質配列のそれぞれにおいて、アミノ酸７７はグルタミン酸であり得、システイン残基はスパイク領域内の別の位置に導入され得、例えば、システイン残基は約アミノ酸位置７４〜約アミノ酸位置８４、例えばアミノ酸位置７８または８０で置換され得ることが想定される。
【００８７】
カプシド結合部位の修飾
いくつかの実施形態では、ウイルスコアタンパク質の構造コア部分は、部分、例えば脂質リンカー部分（例えばマレイミド中間体）等の化学リンカー部分の結合を可能にする抱合部分を含むように修飾され得る。例えば、アミノ酸システインまたはリジンのいずれかは、カプシドまたは粒子に形成されるとき、これらの修飾がカプシド表面から離れて、例えば原形質膜に向かって突出し得るような方式で構造コアに配置され得る。
【００８８】
１つの実施形態では、そのような修飾は、脂質層を促進する、または容易にするように作用する１つ以上の脂質リンカー部分の付加を可能にし得る。集合ウイルス性カプシドは、１つ以上の脂質を含む粒子上に配置された被覆剤の一部または実質的に全てを含み得る。例えば、少なくとも１つの脂質分子は、化学リンカー部分、例えば脂質リンカー部分を通してウイルスコアタンパク質、例えば開示されるウイルスコアタンパク質の構造コア部分に共有結合され得る。非限定的な例として、脂質は、結合または化学リンカー部分を介して、例えば上述のＢ型肝炎構造コア部分のアミノ酸位置７７、７８、または８０で、ウイルスコアタンパク質の構造コア部分上の操作された位置に結合され得る。
【００８９】
ある実施形態では、ウイルスコアタンパク質の構造コア部分上の３つの位置は、１つ以上のシステインおよび／またはリジン、例えばＨＢＶコアタンパク質（例えば配列番号２）上のアミノ酸残基７７のグルタミン酸をシステインもしくはリジンに、アミノ酸残基７８のアスパラギン酸をシステインもしくはリジンに、および／またはアミノ酸残基８０のアラニンをシステインもしくはリジンに導入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、そのようなシステイン修飾はさらに官能化され得る。システイン変異は、Ｃタンパク質の他の位置でも導入され得る。ＨＢＶコアタンパク質変異形配列番号２の例示的な修飾構造コア部分ＣＰ１４９は、以下を含む：
Ｅ７７Ｃ変異（下線付き）を有するＣＰ１４９
【化４９】
2014527072.tif 000052
Ｄ７８Ｃ変異（下線付き）を有するＣＰ１４９
【化５０】
2014527072.tif 000053
Ａ８０Ｃ変異（下線付き）を有するＣＰ１４９
【化５１】
2014527072.tif 000054
Ｄ７８Ｓ変異を有するＣＰ１４９
【化５２】
2014527072.tif 000055
Ｄ７８Ｅ変異を有するＣＰ１４９
【化５３】
2014527072.tif 000056
【００９０】
想定される脂質リンカー部分は、本明細書に論じられるものを含み得る。例示的な脂質リンカー部分は、例えばスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（ＳＭＰＢ）またはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル等のスクシンイミジル誘導体をウイルスコアタンパク質の修飾構造コア部分と接触させることから形成され得る。
【００９１】
１つの実施形態では、化学リンカー、例えば二官能性リンカーは、別の部分を、修飾構造コア部分を含む、例えば１つ以上のシステイン残基を含むウイルスコアタンパク質から形成された粒子に結合することができる。例示的な化学リンカーは、システイン残基をホスファチジルエタノールアミン−マレイミド（ＰＥ−マレイミドまたはＰＥｍａｌ）等のマレイミド含有化合物と接触させることにより形成されるもの等の部分を含む。例えばリン脂質は、例えば脂質分子および／または標的剤を連結するために、化学リンカーを通して修飾構造コア部分に直接連結され得る。
【００９２】
集合カプシドは、１つ以上の脂質、例えば中性脂質、アニオン性脂質、および／もしくはカチオン性脂質を含む層または被覆剤を有し得る。例えば、中性脂質および／または両親媒性脂質、例えばホファチジル（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌ）セリン等のリン脂質は脂質リンカー部分に共有結合され得る。そのような共有結合脂質分子は、例えばさらに１つの中性脂質を含み得る、および／またはＰＯＰＧ等の表面が中性であるアニオン性脂質を含み得る被覆剤の配置を誘導し得る。
【００９３】
使用に好適な例示的なリン脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、モノシアロガンゴリオシド（ｍｏｎｏｓｉａｌｏｇａｎｇｏｌｉｏｓｉｄｅ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書において想定される集合カプシドは、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）等の１つ、２つ以上の脂質を含む、１つ以上の脂質で被覆され得る。想定される脂質は、ポリ（エチレングリコール）−誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）および／またはポリ（エチレングリコール）−誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）を含む、ＰＥＧ−リン脂質を含む。
【００９５】
本明細書において、例えば１つ以上の脂質およびコレステロールを含む被覆剤を含み得、様々な量のコレステロール、ＨＳＰＣ、またはＰＯＰＧを含み得る集合カプシドが提供される。脂質被覆剤は、約５％〜約４０％のコレステロール、約１０％〜約８０％のＨＳＰＣ、および／もしくは約５％〜約８０％のＰＯＰＧ、または前記範囲内のいずれの特定のパーセンテージを含み得る。いくつかの実施形態では、被覆剤は、例えば、（ａ）約２０％のコレステロールと約８０％のＨＳＰＣ、（ｂ）約５０％のコレステロールと約５０％のＨＳＰＣ、（ｃ）約２０％のコレステロールと、約２０％のＨＳＰＣと、約６０％のＰＯＰＧ、（ｄ）約５０％のコレステロールと約５０％のＰＯＰＧ、（ｅ）２０％のコレステロールと８０％のＰＯＰＧ、または（ｆ）約１０％のコレステロールと、約１５％のＨＳＰＣと、約６５％のＰＯＰＧを含み得る。１つの実施形態では、被覆剤は、約２０％のコレステロール、約２０％のＨＳＰＣ、および約６０％のＰＯＰＧを含み得る。
【００９６】
被覆組成物は、粒子質量値に対して総タンパク質（ｗ／ｗ）の約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１５％〜約４０％、約２０％〜約３５％、または記載される範囲のいずれの特定のパーセンテージの被覆剤を有し得る。例えば、脂質被覆組成物は、約３０％〜約１００％（ｗ／ｗ）の質量値で粒子を被覆することができる。
【００９７】
様々な実施形態では、被覆プロセスに好適なタンパク質：脂質（ｗ：ｗ）の比率は、約１：１のタンパク質：脂質〜約１：３０のタンパク質：脂質（ｗ：ｗ）の範囲であり得る。タンパク質：脂質の比率は、時には、０．１：１〜１：１００、またはそのような範囲内のいずれの中間比率であり得る。
【００９８】
用語「脂質」とは、これに限定されないが、脂肪酸のエステルを含む有機化合物の群を指し、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする。それらは、通常、少なくとも３つのクラス：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」、および（３）ステロイド等の「誘導脂質」に分類される。
【００９９】
用語「中性脂質」とは、選択されたｐＨで無電荷または中性双極性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のうちのいずれかを指す。生理学的ｐＨで、そのような脂質は、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールを含む。
【０１００】
用語「両親媒性脂質」とは、一部、脂質性材料の疎水性部分が疎水性相内に配向され、一方で、親水性部分が水相に向かって配向される、いずれの好適な材料を指す。親水性の特性は、炭水化物、リン酸塩、カルボキシル基、スルファト基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基等の極性または荷電基の存在に由来する。疎水性は、これに限定されないが、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基を含む無極性を含むことによって付与され得、そのような基は１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環の基（複数可）によって置換される。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の代表的な例としては、卵ホスファチジルコリンまたは水素添加大豆ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パーニトイル（ｐａｈｎｉｔｏｙｌ）オレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミンジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、モノシアロガンルゴリオシド（ｍｏｎｏｓｉａｌｏｇａｎｌｇｏｌｉｏｓｉｄｅ）、スフィンゴミエリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、および（３−アシルオキシアシド等のリンを欠く他の化合物も、両親媒性脂質として命名される群内である。加えて、上述の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合され得る。
【０１０１】
用語「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨで負に荷電されるいずれの脂質を指す。これらの脂質は、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎグルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＯＰＧ）、および中性脂質に接合された他のアニオン性修飾基を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
用語「カチオン性脂質」とは、生理学的ｐＨ（例えば約７．０のｐＨ）等の選択されたｐＨで正味の正電荷を持つ多くの脂質種のうちのいずれかを指す。カチオン性脂質の例としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、アニオン性脂質は、内部負電荷を有する表面上で中性であり得る。
【０１０３】
カプシド解体修飾
さらなる変更または変異は、例えば生体内投与後、例えばカプシドまたは粒子形成された開示されるウイルスコアタンパク質の解体を容易にし得る、例えばウイルス性構造コアに対して行うことができる。例えば、血液プロテアーゼ認識配列、例えばヒンジ領域およびループ領域でプロテアーゼ認識部位を導入し得る変異が想定される。そのような配列は、例えばＨＢＶ  Ｃタンパク質のスパイク領域に挿入され得る（例えばアミノ酸７９および８０をそれらの１２のアミノ酸挿入ループと置換する）。いくつかの実施形態では、ウイルスコアタンパク質は、最大約４０、または約４６のそのような挿入残基を含み得、またいくつかの実施形態では、粒子またはカプシドを形成することができる。
【０１０４】
例示的な血液プロテアーゼ認識配列は、例えばトロンビン（ＧＰＧＡＰＧＬＶＰＲＧＳ、配列番号５２）および因子Ｘａ（ＧＰＡＳＧＰＧＩＥＧＲＡ、配列番号５３）を含む。例えば、そのような血液プロテアーゼ認識配列を含む配列番号２変異形からの想定されるＨＢＶ  Ｃタンパク質は、
【０１０５】
アミノ酸７８と７９との間に導入されるＥ７７Ｃ変異およびトロンビン認識部位を含むＣＰ１６２
【化５４】
2014527072.tif 000057
アミノ酸７８と７９との間に導入されるＥ７７Ｃ変異および因子Ｘａ認識部位を含むＣＰ１６２
【化５５】
2014527072.tif 000058
によって表され得る。
【０１０６】
修飾尾部分
開示されるＨＢＶコアタンパク質の末端尾部の様々な修飾、および切り詰め変異、またはその構造コア部分が想定される。例えば、Ｂ型肝炎コアタンパク質のＣ末端尾部は、例えば核酸および／またはタンパク質を修飾ウイルスコアタンパク質に結合するための適切な性質を提供するように操作され得る。例えば、修飾尾部分、および例えば修飾尾部分への結合と会合する核酸を有するウイルスコアタンパク質を含む治療用キメラが提供される。
【０１０７】
野生型ＨＢＶ−Ｃタンパク質の３４アミノＣ末端尾部は、完全に形成されたウイルス性カプシド内部に垂れ下り、例えばウイルス性核酸に結合すると推測され、下に示される：
Ｃ末端尾部アミノ酸配列１５０〜１８３：
【化５６】
2014527072.tif 000059
【０１０８】
この野生型尾部は、構造コア部分と一緒に、修飾ＨＢＶウイルス性カプシドの集合に使用するためのウイルスコアタンパク質を提供する、修飾尾部分を提供するように、修飾される、切り詰められ得る、および／または変異され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、修飾尾部分、例えば修飾Ｃ末端尾部分は、１つ以上のポリ−リジンを含む修飾を含み得る。例えば、修飾尾部分は、約４〜約３０のリジン、または約５〜約２０のリジン、例えば約７、８、９、または１０のリジンを含み得る。
【０１１０】
ある実施形態では、修飾尾部分は、１つ以上のリジンドメインを含み得る。例えば、各ポリ−リジンドメインは、約１〜約３０のリジン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ−リジンドメインは、約５つのリジン残基〜約２０のリジン残基を含み得る。２つ以上のポリリシンドメインが存在するとき、ポリ−リジンドメインは、約１〜約２０のアミノ酸残基で分離され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリ−リジンドメインが存在するとき、各ポリ−リジンドメインは、約４つのリジン残基〜約２０のリジン残基（またはその範囲に配置されるいずれの特定のアミノ酸長）を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも４つまたは少なくとも５つの連続するリジン残基が修飾Ｃ末端尾部に含まれる。
【０１１１】
ポリ−リジンおよびポリ−リジンドメインならびに／またはポリ−ヒスチジンタグは、個別に、または組み合わせで、修飾Ｃ末端尾部の一部を形成し得る。ポリ−ヒスチジンタグは、いくつかの実施形態では、タンパク質の精製を容易にし得る。
【０１１２】
例示的なＣ末端尾部分は、例えば５つのリジン（Ｋ５）、７つのリジン（Ｋ７）、９つのリジン（Ｋ９）、１０のリジン（Ｋ１０）、１１のリジン（Ｋ１１）、１３のリジン（Ｋ１３）、２０のリジン（Ｋ２０）を有するものを含む。他の例示的なＣ末端尾部分は、９つのアラニン（ＫＡ９）を有するポリ−アラニン領域と交互に起こる９つのリジンを有するポリ−リジン領域、９つのグリシン（ＫＧ９）を有するポリ−グリシン領域と交互に起こる９つのリジンを有するポリ−リジン領域、および第４と第５のリジン（Ｋ４〜５）との間で少なくとも４つのアミノ酸の配列によって中断される９つのリジンを有するポリ−リジン領域を有するものを含む。いくつかの実施形態では、Ｋ４〜５尾部の第４と第５のリジンとの間の約４つのアミノ酸伸長は、アミノ酸Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号５７）であり得る。例えば、修飾尾部分は、
【化５７】
2014527072.tif 000060
によって表すことができ、ｉは４〜２１の整数であり、ｊは０〜１０の整数である。例えば、ｉは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得、ｊは、０、１、２、３、４、５以上であり得る。
【０１１３】
様々な実施形態では、修飾尾部分は、交互に起こるリジンから形成され得る。例えば、一実施形態では、修飾尾部分は、
【化５８】
2014527072.tif 000061
によって表すことができ、ｐは５〜１２の整数であり、ｊは０〜１０の整数である。例えば、ｐは、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２であり得、ｊは、０、１、２、３、４、５以上であり得る。
【０１１４】
修飾尾部分を有するＨＢＶコアタンパク質の例示的なＣＰ１４９構造コア部分は、以下を含む：
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ５尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化５９】
2014527072.tif 000062
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ７尾部分を有するＣＰ１４９
【化６０】
2014527072.tif 000063
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ９尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６１】
2014527072.tif 000064
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ１０尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６２】
2014527072.tif 000065
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ１１尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６３】
2014527072.tif 000066
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ１３尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６４】
2014527072.tif 000067
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ２０尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６４−２】
2014527072.tif 000068
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、Ｋ４〜５尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６５】
2014527072.tif 000069
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、ＫＡ９尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６６】
2014527072.tif 000070
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ変異、ＫＧ９尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６７】
2014527072.tif 000071
【０１１５】
カプシド集合変異（例えば安定化変異および不安定化変異）、ならびに／または化学結合部位および修飾尾部分の変異を有するＨＢＶコアタンパク質の例示的なＣＰ１４９構造コア部分は、以下を含む：
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＦ１８１１の変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６８】
2014527072.tif 000072
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ａの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化６９】
2014527072.tif 000073
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｖの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７０】
2014527072.tif 000074
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｉの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７１】
2014527072.tif 000075
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｆの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７２】
2014527072.tif 000076
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＩ１３９Ａの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７３】
2014527072.tif 000077
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＣ４８Ａの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７４】
2014527072.tif 000078
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、Ｃ６１ＡおよびＣ１０７Ａの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７５】
2014527072.tif 000079
配列番号２変異形においてＥ７７ＣおよびＳ１２１Ｃの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７６】
2014527072.tif 000080
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７７】
2014527072.tif 000081
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、Ｓ１４１Ｃ、およびＹ１３２Ｆの変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７８】
2014527072.tif 000082
配列番号２変異形においてＥ７７Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、Ｓ１４１Ｃ、およびＦ１８１１の変異、Ｋ９尾部分、ならびにヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化７９】
2014527072.tif 000083
配列番号２変異形においてＤ７８Ｅ変異、Ｋ９尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化８０】
2014527072.tif 000084
配列番号２変異形においてＥ７７Ｋ変異、Ｋ９尾部分、およびヒスチジンタグを有するＣＰ１４９
【化８１】
2014527072.tif 000085
【０１１６】
本明細書において、前述の実施形態のそれぞれのポリ−リジン尾部は、様々な長さ（例えばＫ５、Ｋ７、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｋ１３、もしくはＫ２０）、または交互に起こるリジン配列（例えばＫＧおよびＫＡ）のものであり得、異なるリンカーを含み得、ヒスチジンタグを有しても、有さなくてもよいことが想定される。
【０１１７】
他の実施形態では、修飾尾部分は１つ以上のポリ−アルギニンを含む。例えば、修飾尾部分は、約４〜約３０のアルギニン、または約５〜約２０のアルギニン、例えば約７、８、９、または１０のアルギニンを含み得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、修飾尾部分は、１つ以上のアルギニンドメインを含み得る。２つ以上のポリアルギニンドメインが存在するとき、ポリ−アルギニンドメインは、約１〜約２０のアミノ酸残基で分離され得る。例えば、各ポリ−アルギニンドメインは、約１〜約３０のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリアルギニンドメインが存在するとき、ポリ−アルギニンドメインは、約４つのアルギニン残基〜約２０のアルギニン残基（またはその範囲内に配置されるいずれの特定のアミノ酸長）を含むことができる。いくつかの実施形態では、修飾Ｃ末端尾部は、少なくとも４つまたは少なくとも５つの連続するアルギニン残基を含む。別の実施形態では、修飾Ｃ末端尾部は、アルギニンとリジン、例えば、１つ以上のアルギニンドメインと１つ以上のリジンドメインの混合物を有し得る。
【０１１９】
ポリ−アルギニンドメインおよび／またはポリ−ヒスチジンタグは、別個に、または組み合わせで、Ｃ末端尾部に付加され得る。ポリ−ヒスチジンタグは、いくつかの実施形態では、タンパク質の精製を容易にし得る。例示的なＣ末端尾部分は、５つのアルギニン（Ｒ５）、７つのアルギニン（Ｒ７）、９つのアルギニン（Ｒ９）、１１のアルギニン（Ｒ１１）、１３のアルギニン（Ｒ１３）、および２０のアルギニン（Ｒ２０）を含み得る。ポリ−アルギニンドメインを含むそのような修飾された尾部分は、
【化８２】
2014527072.tif 000086
によって表すことができ、ｑは４〜２１以上の整数であり、ｊは０〜１０の整数である。例えば、ｑは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得、ｊは、０、１、２、３、４、５以上であり得る。
【０１２０】
本明細書において、単独で、または組み合わせてのいずれかで、切り詰め変異、集合突異（例えば安定化変異および／または不安定化変異）、カプシド結合変異、解体変異を含む修飾ＨＢＶコアタンパク質を説明する前述の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載されるポリ−リジン尾部またはポリアルギニン尾部で修飾され得ることが想定される。
【０１２１】
リンカー断片は、任意に、例えば修飾構造コア部分と修飾尾部分との間、例えばアミノ酸残基１４９と別の修飾尾部分ドメインとの間に存在し得る。いくつかの実施形態では、リンカー断片は、長さが約３つのアミノ酸〜約１５のアミノ酸（またはその範囲に配置されるいずれの特定のアミノ酸長）であり、例えばＣ末端尾に柔軟性を提供するために、例えばポリ−リジンドメインおよび／もしくはポリ−アルギニンドメインを含む修飾尾部分を、例えばＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸１４９に連結することができる。例えば、ポリ−リジンドメインには、その後にポリヒスチジンタグが続く、および／またはその後にＸｈｏｌ制限部位が続き得る。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは、Ｃ末端尾に付加される少なくとも６つのヒスチジン残基を含む。例えば、そのようなリンカー断片は、
【化８３】
2014527072.tif 000087
によって表され、ｒ、ｓ、およびｔは、それぞれ独立して、１〜６以上の整数である。
【０１２２】
ある実施形態では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、Ｃ末端システイン残基を含み得る。このシステインは、天然または合成の尾部分のＣ末端上に含まれ、したがって、集合ケージにカプセル封入され得る。Ｃ末端システイン残基は、治療薬への抱合または尾部分の変異を安定化させるために使用され得る。Ｅ７７ＣおよびＦ１８１１の変異を有するＣＰ１６２切り詰め変異体（配列番号２変異形に基づく）に基づくＣ末端システイン残基を含む例示的な修飾ＨＢＶコアタンパク質は、次の通りである：
【化８４】
2014527072.tif 000088
【０１２３】
前述の実施形態のそれぞれにおいて、同じ切り詰めおよび／または修飾がＨＢＶ  Ｃタンパク質変異形配列番号１内で操作され得ることを理解する。
【０１２４】
本明細書において、前述の実施形態のそれぞれに関して、当業者は、開示されるウイルスコアタンパク質に対して例えば約７５％〜約９９％同一、約８０％〜約９５％同一、約８５％〜約９０％同一、もしくは約９５％〜約９９％同一、またはそれらの範囲内に配置されるいずれの特定のパーセントの特定の修飾ウイルスコアタンパク質の核酸およびアミノ酸配列がカプシドを形成することができ、本発明の範囲内であることを認識することも想定される。
【０１２５】
ウイルスコアタンパク質の発現
開示されるウイルスコアタンパク質は、通常の分子生物学および生化学技法を用いて、発現され、精製され得る。例えば、ウイルスコアタンパク質の発現を提供するために、ウイルスコアタンパク質遺伝子を宿主細胞に運ぶように操作され得る組換え発現ベクターを使用することができる。そのようなベクターは、例えば熱ショック、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、またはリポソーム媒介移動を含むがこれらに限定されないトランスフェクション手段により宿主細胞に導入され得る。組換え発現ベクターは、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等の大腸菌系発現ベクター、ＣＤＭ８もしくはｐＤＣ２０１等のＣＯＳ細胞系発現ベクター、ｐＥＤベクター等のＣＨＯ細胞系発現ベクターを含むが、これらに限定されない。例えばＣタンパク質遺伝子コード領域は、選択された細胞系において活性化され得る発現ベクターにおいて任意の数のプロモーターのうちの１つに連結され得る。１つの実施形態では、カセット（カプシド遺伝子およびプロモーター）は、ベクターを受容する細胞が識別され得る選択マーカーを含むベクターによって保持される。
【０１２６】
例えば、細胞系内にカプシドタンパク質を発現させるためのプロモーターは、宿主細胞内で官能的に活性であるものから得ることができる。そのようなプロモーターは、Ｔ７プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ヘルペスＴＫプロモーター、および組換えＤＮＡ技術に既知のその他を含むが、これらに限定されない。誘導プロモーターが使用され得、メタロチオニンプロモーター（ＭＴ）、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、および当業者に既知のその他等のプロモーターを含む。例示的な選択マーカーおよびそれらの付随する選択薬剤は、例えばアンピシリン、カナマイシン、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ／Ｇ４１８、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ／ハイグロマイシン−Ｂ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ／メトトレキサート等の増幅可能な選択マーカー、ならびに当業者に既知のその他を含むが、これらに限定されない群から得ることができる。
【０１２７】
様々な真核生物、原核生物、昆虫、植物、および酵母発現ベクター系（例えばウイルスコアタンパク質コード配列の複製、転写、および翻訳を指示するために必要な要素を含むベクター）が、ウイルスコアタンパク質コード配列を発現するために、当業者によって利用され得る。これらは、カプシドタンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物、カプシドタンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、カプシドタンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）で感染させた、またはカプシドタンパク質コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
治療薬
治療薬（例えば薬物）は、集合ウイルス性カプシド構造にカプセル封入され得る。薬物は、クーロン力または共有結合によって修飾ウイルスコアタンパク質に結合され得る。薬物のカプセル封入は、場合によっては、自己集合前に（すなわち、ウイルスコアタンパク質が集合前の開口された固定状態にあるとき）、薬物をウイルスコアタンパク質の領域に抱合し、その後、得られたウイルス性カプシドが薬物を含むように自己集合を作動させることによって生じ得る。例えば、いくつかの実施形態では、薬物は、修飾ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸尾部分に結合され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸尾部分に結合された薬物は、還元剤の添加後にカプセル封入され得る。
【０１２９】
ある実施形態では、薬物は、集合溶液に添加されるアニオン性またはカチオン性のポリマーに結合され得る。アニオン性またはカチオン性のポリマーに結合された薬物は、アニオン性もしくはカチオン性のポリマーの修飾コアタンパク質もしくは修飾尾部分との会合に基づき、集合ウイルス性カプシドにカプセル封入され得る。
【０１３０】
様々な実施形態では、薬物と非集合ウイルスコアタンパク質の溶液が混合され、カプシドの自己集合は、得られたウイルス性カプシドによって、薬物の一部がカプセル封入され、薬物の一部がカプセル封入されないように作動され得る、すなわち、薬物は作動薬（例えば還元剤）の添加後、拡散によってカプシド構造にカプセル封入され得る。例えば、薬物は、還元剤の添加前に溶液に添加され得る。
【０１３１】
本明細書において、集合ウイルス性カプシドにカプセル封入され得る治療薬は、核酸、ペプチド、タンパク質、および／または小分子を含むことが想定される。核酸薬物の非限定的な例としては、哺乳類に投与されたとき、標的の発現の減少（例えば１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または１００％）をもたらす１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの一部等の阻害性核酸、あるいはそれらの類似体または摸倣物が挙げられる。典型的に、阻害性核酸は、標的核酸もしくは遺伝子、またはそれらのオルソログの少なくとも一部を含むか、またはそれに対応するか、あるいは標的核酸もしくは遺伝子の相補的鎖の少なくとも一部を含む。阻害性核酸は、典型的に、標的核酸に対して実質的に、もしくは完全な同一性または相同性（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％）を有する。本明細書で使用される、用語「標的」とは、治療薬による治療的介入の部位もしくは潜在的な部位であるポリペプチドの発現に必要とされる核酸もしくはその変異形、または微生物、ウイルス、細菌、もしくは単細胞寄生生物（ウイルスの全ゲノムが標的と見なされ得る）を含む非ペプチド実体、および／または天然に存在する干渉ＲＮＡもしくはミクロＲＮＡまたはそれらの前駆体を指す。例えば、標的は、遺伝子のコードｍＲＮＡの部分に対応するヌクレオチドの配列を指し得る。
【０１３２】
ナノケージにカプセル封入され得る薬物の非限定的な例としては、心血管薬、呼吸器薬、交感神経刺激薬、コリン作用薬、アドレナリンもしくはアドレナリン取り込み薬、鎮痛剤／解熱剤、麻酔剤、抗喘息薬、抗生物質、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗真菌、降圧剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍薬、抗不安剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗片頭痛薬、鎮静剤／催眠薬、抗狭心症薬、抗精神病薬、抗躁薬、抗不整脈薬、抗関節炎薬、抗痛風剤、抗凝固薬、血小板溶解薬、抗線溶剤、血液動態薬、抗血小板薬、抗痙攣薬、抗パーキンソン病薬、抗ヒスタミン剤／鎮痒薬、カルシウム調節に有用な薬剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗菌剤、抗感染薬、気管支拡張薬、ホルモン剤、血糖降下薬、低脂血症剤、赤血球生成刺激に有用な薬剤、抗潰瘍薬／抗逆流薬、抗嘔吐薬／制吐薬、および油溶性ビタミン、またはそれらの組み合わせ等の生理活性剤が挙げられる。
【０１３３】
化学療法剤の非限定的な例としては、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブスルファン、シスプラチン、メトトレキサート、ダウノルビシン、メルファラン、クラドリビン、ビンブラスチン、アウリスタチン、ブレオマイシン、カリチアマイシン、およびクロラムブシルが挙げられる。
【０１３４】
使用することができる酵素的に活性な毒素およびその断片の非限定的な例としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカアメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテシンが挙げられる。
【０１３５】
製剤および送達
本明細書において、集合ウイルス性カプシドは、当該技術分野において周知の方法を使用して、治療用組成物に製剤化され得ることが想定される。この技術は、ウイルス性カプシド内部に隔離され得る薬物の送達に適用され得る。非限定的な例として、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）は、カプシドの内部に隔離され、その後、適切な核局在化分子なしに、またはそれと会合するかのいずれかで、所望される時間に放出され得る。用途は、癌療法、痛み制御における制御薬物放出、マーカー送達、および抗炎症送達、ならびに細胞培養物への生体外遺伝子送達、および生体外操作組織へのシグナルまたは薬物送達を含む。
【０１３６】
ウイルス性カプシドは、薬学的に許容される担体または化合物と共にを含んで、送達用に製剤化され得る。本明細書で使用される、用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与と適合性がある溶媒、分散培地、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収剤等を含む。補足的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１３７】
薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性があるように製剤化される。投与形態の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、経鼻、眼球、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下用途に使用される溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：減菌希釈剤（注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等）、抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等）、抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム等）、キレート化剤（エチレンジアミン４酢酸等）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等）、および張度を調節するための薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロース等）。ｐＨは、塩酸および水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い切りシリンジ、または多用量バイアルに封入され得る。
【０１３８】
経口用組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的に関して、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で使用され得る。経口用組成物は、口腔洗浄剤として使用するための液体担体を用いても調製され得る。薬学的に適合性がある結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ剤等は、次の成分、または類似する性質の化合物のうちのいずれかを含むことができる：結合剤（微結晶セルロース、トラガントガム、またはゼラチン等）、賦形剤（デンプンもしくはラクトース等）、  崩壊剤（アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチ等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス等）、流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素等）、甘味剤（スクロースもしくはサッカリン等）、または風味剤（ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味等）。
【０１３９】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、減菌水溶液（水溶性である場合）、または分散液、および減菌注射可能溶液もしくは分散液の即時調製物用の減菌粉末を含む。静脈内投与に関して、好適な担体は、生理学的生理食塩水、静菌性水、クレモフォアＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は減菌でなくてはならず、かつ容易に注射が可能な程度に流体でなくてはならない。製造および保存の状態下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用を防がなければならない。担体は、例えば水、ウイルス性カプシドの一体性を保護するように構成される他の流体、および好適なそれらの混合物を含む溶媒または分散培地であり得る。適切な流動性は、例えばレシチン等の被覆剤を使用することにより、分散の場合は、要求される粒径を維持することにより、および界面活性剤を使用することにより維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウム等の糖類、ポリアルコールが組成物に含まれる場合がある。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含むことによってもたらすことができる。
【０１４０】
減菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上に列挙される成分のうちの１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒に要求される量の活性化合物を組み込み、続いて減菌濾過することにより調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散培地および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含む減菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。
【０１４１】
吸入による投与に関して、化合物は、好適な推進剤、例えば二酸化炭素等のガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザからのエアゾール噴霧の形態で送達される。
【０１４２】
全身投与は、経鼻および眼球を含む経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮の投与に関して、浸透するバリアに適切である浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、一般に、当該技術分野において既知であり、例えば経粘膜投与に関しては、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与に関して、活性化合物は、一般に当該技術分野において既知である、軟膏、油薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。送達ビヒクルは、直腸送達に関して、坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリド等の従来の座剤基材）または滞留浣腸の形態でも調製され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、経口または非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために投薬単位形態に製剤化される。本明細書で使用される、投薬単位形態とは、治療される対象に対する単位投薬量として適切に物理的に分離している単位のものを指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望される治療効果をもたらすように計算された活性化合物の既定量を含む。
【０１４４】
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０値（集団の５０％に対して致死である用量）、およびＥＤ５０値（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において、標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。多くの場合、高い治療指数を示す分子が利用される。毒性副作用を示す分子が使用され得るが、未感染細胞への損傷の可能性を最小にし、それによって、副作用を減少させるために、そのような化合物が患部組織の部位を標的とする送達系を設計する注意が払われるべきである。
【０１４５】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトにおいて使用するための様々な投薬量を製剤化するのに使用され得る。そのような分子の投薬量は、多くの場合、毒性がほとんどない、または毒性がないＥＤ５０値を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される投薬形態および利用される投与形態により、この範囲内で変動し得る。本明細書に記載される方法に使用されるいずれの分子に関して、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定される、ＩＣ５０値（すなわち、症状の最大阻害の半値を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。個体における治療有効量を決定する別の例は、試験対象の血清における「遊離」および「結合」化合物のレベルを直接アッセイする能力である。そのようなアッセイは抗体摸倣物および／またはバイオセンサーを利用し得る。
【０１４６】
抗体抱合体は、所与の生物学的応答を修飾するために使用され得、ウイルス性カプシドを介して送達される薬物部分は、古典的な化学治療薬に限定されるように解釈されない。例えば、薬物部分は、所望される生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えば毒素（アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素等）、ポリペプチド（腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性因子）、または生物学的応答修飾因子（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子等）を含み得る。別の方法としては、抗体は、抗体ヘテロ抱合体を形成するために、第２の抗体に抱合され得る。
【０１４７】
化合物に関して、例示的な用量は、対象またはサンプル重量の１キログラム当りミリグラムまたはマイクログラム量の化合物、例えば１キログラム当り約１マイクログラム〜１キログラム当り約５００ミリグラム、１キログラム当り約１００マイクログラム〜１キログラム当り約５ミリグラム、または１キログラム当り約１マイクログラム〜１キログラム当り約５０マイクログラムを含む。小分子の適切な用量は、特にそれが細胞の細胞基質に分子を直接送達するとき、調節される発現または活性に対する小分子の効力に依存することを理解する。本明細書に記載されるポリペプチドもしくは核酸の発現または活性を調節するために、これらの小分子のうちの１つ以上が動物（例えばヒト）に投与されるとき、医師、獣医、または研究者は、例えば最初に比較的低い用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで、用量を増加する。加えて、いずれの特定の動物対象に対する特定の用量レベルは、採用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、投与の時間、投与形態、排出速度、任意の薬物併用、および調節される発現または活性の程度を含む、様々な因子に依存することを理解する。
【０１４８】
核酸分子は、ウイルス性カプシドに挿入され、これに限定されないが癌を含む治療のための遺伝子療法の方法において使用され得る。遺伝子療法用カプシドは、例えば静脈内注射、および局所投与により対象に送達され得る。遺伝子療法用カプシドの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子療法用カプシドを含むことができるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる持続放出マトリックスを含むことができる。
【０１４９】
薬学的組成物は、投与の説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。活性成分の薬学的組成物は、治療のために治療方法および予防方法に関して本明細書に記載される経路のうちのいずれかによって投与され得る。治療の予防方法および治療方法の両方に関して、そのような治療は、本明細書に記載される薬理ゲノム学的分析から得られた知識に基づき、具体的に調整され、修飾され得る。本明細書で使用される、用語「治療」は、疾患、疾患の症状、もしくは疾患に対する素因を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変更する、矯正する、寛解させる、改善する、または影響を及ぼす目的で、疾患、疾患の症状、もしくは疾患に対する素因を有する患者への治療薬の適用もしくは投与、または患者からの単離された組織または細胞系への治療薬の適用もしくは投与として定義される。治療薬は、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、オリゴヌクレオチド、および鎮痛剤を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
癌を含む障害の治療の成功は、標的遺伝子生成物の発現または活性を阻害するように作用する技法によりもたらされ得る。阻害分子は、ペプチド、ホスホペプチド、小有機分子もしくは小無機分子、または抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、もしくは単鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリ断片、ｓｃＦＶ分子、ならびにそれらのエピトープ結合断片）を含み得るが、これらに限定されない。
【０１５１】
さらに、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンスおよびリボザイム分子は、標的遺伝子の発現レベルを減少させ、よって効率的に標的遺伝子の活性を減少させるためにも使用され得る。またさらに、３重らせん分子は、標的遺伝子の活性レベルを減少させるのに利用され得る。
【０１５２】
変異体遺伝子発現を減少させる、または阻害するためのアンチセンス、リボザイム、および／または３重らせん分子の使用は、存在する正常な標的遺伝子生成物の濃度が正常な表現型に必要である濃度より低くてよいように、正常な標的遺伝子の対立遺伝子により生成されたｍＲＮＡの転写（ｔ３重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を減少させるか、または阻害し得ることも可能である。そのような場合、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし、発現する核酸分子は、本明細書のウイルス性カプシド遺伝子療法の方法を介して細胞に導入され得る。
【０１５３】
核酸分子が異常な遺伝子発現を特徴とする疾患を治療する、または防止するのに利用され得る別の方法は、欠損したポリペプチドに特異的なアプタマー分子の使用を通してである。アプタマーは、ポリペプチドリガンドに特異的に結合することを可能にする３次構造を有する核酸分子である。核酸分子は、多くの場合において、治療用ポリペプチド分子より標的細胞により簡単に導入され得るため、アプタマーは、異常なポリペプチド活性が多能性作用を有し得る薬物または他の分子を導入することなく具体的に減少され得る方法を提示する。
【０１５４】
両方とも標的遺伝子生成物に特異的であり、標的遺伝子生成物の活性を減少させる抗体が生成され得る。したがって、そのような抗体は、負の調節技法が癌および関連する障害の治療に適切である場合に投与され得る。
【０１５５】
標的抗原が細胞内である、および全抗体が使用される場合において、ウイルス性カプシドは、抗体または標的抗原に結合するＦａｂ領域の断片を細胞に送達するために使用され得る。抗体の断片が使用される場合、標的抗原に結合する最小阻害断片が多くの場合利用される。例えば、抗体のＦｖ領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。別の方法としては、細胞内標的抗原に結合する単鎖中和抗体も投与され得る。そのような単鎖抗体は、例えば標的細胞集団内に単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することによって投与され得る。
【実施例】
【０１５６】
次の実施例は、本発明の範囲を決して制限することが意図されないが、本明細書において想定される調製物および治療薬の使用を含む、本発明の異なる特徴を図示するために提供される。本発明の多くの他の実施形態は、当業者には明らかであろう。
【０１５７】
実施例１：ＨＢＶ  Ｅ７７Ｃ  Ｈｉｓタグ付けされたコアタンパク質のクローン化
Ａ．ＨＢＶ  Ｅ７７Ｃ  Ｈｉｓタグ付けされたコアタンパク質
Ｅ７７Ｃ  Ｈｉｓタグ付けされたＨＢＶコアタンパク質は、ベクターｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌ制限部位にクローン化された。このプラスミドは、タンパク質発現のために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換された。Ｅ７７Ｃ  Ｈｉｓタグ付けされたコアタンパク質の核酸および対応するアミノ酸配列は下に示される：
【化８５】
2014527072.tif 000089
【化８６】
2014527072.tif 000090
【０１５８】
Ｂ．ポリ−リジン尾部変異体のクローン化および発現
前述のＫ５、Ｋ７、Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｋ１３、Ｋ２０、ＫＡ９、ＫＧ９、およびＫ４−５コアタンパク質変異体に関する遺伝子を含むＤＮＡ断片は、カセット１のテンプレートおよび表１に記載されるプライマー配列を用いたＰＣＲを介して合成された。各ＰＣＲ反応物は、１２．５μｌの５×ＧＣポリメラーゼ緩衝液（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）、１．２５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１．５μｌの５μＭ順方向プライマー、１．５μｌの５μＭ逆方向プライマー、０．６μｌのＳｔｒａｔａｇｅｎｅミニプレップテンプレート、０．８μｌの２単位／μｌ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）、および４４．２５μｌの水から構成された。ＰＣＲ反応は、９８℃で１分間のインキュベーション１回、続いて９８℃で２５秒間のインキュベーション、７０℃で３０秒間のインキュベーション、ならびに７２℃で１分間および１０秒間のインキュベーションからなる。これらの最後３回のステップは、２４回繰り返され、後に７２℃で７分間のインキュベーションが続いた。
【０１５９】
カセット１のテンプレートは、ベクターｐＥＴ２２ｂのＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌ制限部位に挿入された次の核酸配列からなる：
【化８７】
2014527072.tif 000091
【表１−１】
2014527072.tif 000092
【表１−２】
2014527072.tif 000093
【０１６０】
ＰＣＲ生成物およびｐＥＴ２２ｂベクターは、両方とも３７℃で２時間、制限酵素ＮｄｅｌおよびＸｈｏｌで消化された。消化された生成物はアガロースゲルに泳動され、バンドが切り出され、ゲル抽出（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を介して精製された。連結反応物は、５μｌの消化され、精製されたＰＣＲ生成物、１μｌの消化され、精製されたｐＥＴ２２ｂベクター、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、および２μｌの水から構成され、室温で１２時間インキュベートされた。
【０１６１】
連結反応物は、ＸＬＩ  Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換され、得られたコロニーをＩＸ  ＬＢブロス中で成長させた。プラスミドは、ミニプレップ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を介して精製された。精製されたプラスミドは、配列決定され（下を参照）、タンパク質発現のために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換された。この戦略は、０〜３０のリジン残基を含むタンパク質に使用され得る。
【０１６２】
Ｃ．修飾構造コア変異体のクローン化
Ｋ９構築物の点変異を含むＤＮＡ断片は、Ｋ９テンプレート（または２重もしくは３重変異体の場合、適切な単一もしくは２重変異体Ｋ９テンプレート）および表２に記載されるプライマー配列を用いて、ＰＣＲを介して合成された。各ＰＣＲ反応物は、５μｌの１０×Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１．５μｌの５μＭ順方向プライマー、１．５μｌの５μＭ逆方向プライマー、１μｌのＳｔｒａｔａｇｅｎｅミニプレップテンプレート、１μｌの２．５単位／μｌ  Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および３９μｌの水から構成された。ＰＣＲ反応は、９８℃で１分間のインキュベーション１回、続いて９８℃で３０秒間のインキュベーション、６４〜７２℃で１分間のインキュベーション（プライマーＴｍによる）、および７２℃で６分間のインキュベーションからなる。これらの最後３つのステップは、２０回繰り返された。
【０１６３】
Ｋ９テンプレートは、ベクターｐＥＴ２２ｂのＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌ制限部位に挿入された次の核酸配列からなる：
【化８８】
2014527072.tif 000094
【表２】
2014527072.tif 000095
【０１６４】
ＰＣＲ生成物は、いずれの未変異のテンプレートを排除するために、３７℃で１．５時間、制限酵素ＤｐｎＩで消化された。消化された生成物は１％のアガロースゲルに泳動され、バンドが切り出され、ゲル抽出（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を介して精製された。
【０１６５】
次に、ＰＣＲ生成物は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換され、得られたコロニーを１×ＬＢブロス中で成長させ、プラスミドをミニプレップ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を介して精製した。次に、精製したプラスミドは、核酸配列における変化を確認するために配列決定された。この戦略は、単一のアミノ酸変化、またはポリ−ヒスチジンタグの除去等の、複数のアミノ酸残基の欠失もしくは挿入に適用され得る（表３に示されるプライマー）。
【表３】
2014527072.tif 000096
【０１６６】
実施例２：ＨＢＶコアタンパク質の発現
本明細書に記載される様々な野生型および修飾コアタンパク質は、次のプロトコル１またはプロトコル２に従い、発現され、精製された。
【０１６７】
プロトコル１：完全長ＨＢＶ  Ｃタンパク質遺伝子を含むｐＥＴ−ｌｌａベクターを、大腸菌ＤＥ３細胞に形質転換し、２〜４％のグルコース、微量元素、および２００μｇ／ｍＬのカルベニシリンで強化されたＬＢ培地中で３７℃で成長させた。タンパク質発現は、２ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加することにより誘導された。細胞は、誘導３時間後にペレット化することにより採取された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｃタンパク質の発現を評価するために使用された。
【０１６８】
コアタンパク質は、５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅｌ、および０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅの溶液に再懸濁することにより、大腸菌から精製された。次に、細胞は、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）を通過させることにより溶解された。懸濁液を２６，０００ｘＧで１時間遠心分離した。ペレットを廃棄し、０．１５Ｍの最終濃度になるように固体のスクロースを上清に添加し、１００，０００ｘＧで１時間遠心分離した。ペレットを破棄し、次に固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を４０％飽和の最終濃度に達するように添加した。混合物を１時間攪拌し、次に２６，０００ｘＧで１時間遠心分離した。ペレットを１００ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのスクロース、および２ｍＭのＤＴＴの溶液（緩衝液Ａ）に再懸濁し、緩衝液Ａで平衡されたセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｎｎａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（直径５ｃｍ×９５ｃｍ）上に充填した。カラムを２ｍＬ／分で溶出した。この精製スキームを用いて、ＨＢＶウイルス性カプシドを大きな凝集物および低分子量の可溶性タンパク質から分離した。クロマトグラフプロファイルおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従い、画分をプールした。Ｄｉａｆｌｏ  ＹＭ１００限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて約１０ｍｇ／ｍＬに限外濾過することにより、溶液を濃縮した。濃縮したＣタンパク質を５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、および０．１５Ｍのスクロースに対して透析した。次に、３．５Ｍの最終濃度に達するように１０ＮのＮａＯＨおよび尿素を添加することにより、溶液をｐＨ９．５に調節した。次にＭｉｌｌｅｘ−ＨＡ０．４５μｍ孔径フィルタ単位（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて溶液を濾過し、１００ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）および２ｍＭのＤＴＴからなる溶液で平衡されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のカラム（直径６．０ｃｍ×６０ｃｍ）に適用した。カラムを５ｍＬ／分で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された二量体タンパク質を含む画分をプールした。これらの手順は全てのコアタンパク質変異体の発現および精製に使用することができる。代替的に、このタンパク質の発現は、当業者に周知の方法に従い酵母細胞において行うことができる。
【０１６９】
プロトコル２：Ｃ末端６−ヒスチジンタグを含む全てのタンパク質構築物は次にように精製された。Ｋ９タンパク質の遺伝子を含むｐＥＴベクターを発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ細胞に維持した。初期培養物を１×Ｌｕｒｉａブロス（１×ＬＢ）寒天プレート上のコロニーから、または１０％のグリセロールストックから播種し、−８０℃で保存した。１×ＬＢを２Ｌのフラスコ中でオートクレーブし、冷却した。１００ｍｇのアンピシリン（Ａｍｐ）を１×ＬＢに添加した。初期培養物を播種し、２００ｒｐｍで振盪させながら、最大２４時間３７℃で成長させた。
【０１７０】
０．８Ｌの２×酵母ｔ−トリプトン（２ＸＹＴ）ブロスが入った１５個の２Ｌのフラスコをオートクレーブし、１ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  Ａｍｐを各フラスコに添加した。次に、５０ｍＬの初期培養物を各フラスコに添加した。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．４〜０．６に達するまで、培養物を２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。このプロセスは約２時間かかった。ＯＤが０．４〜０．６に達したとき、培養物を１ｍＬの１Ｍ  ＩＰＴＧで誘導した。ＯＤが２．０以上に達するまで、振盪をさらに４時間続けた。５００ｍＬの遠心分離ボトルで、１１，３００×Ｇで８分間遠心分離することにより細胞を採取した。細菌ペレットを５０ｍＬの三角管２つに移した。各管に日付／構築物／調製番号のラベルを貼り、−２０℃で凍結した。
【０１７１】
５０ｍｌ管２つ（それぞれ約２０ｍＬ）の細胞のペーストを解凍した。次のステップを各管に適用した。４０ｍＬの再懸濁緩衝液（５Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）、１０ｍＭのイミダゾール）を各管に添加した。細胞を連続ピペット操作により再懸濁し、４００ｍＬのビーカーに注いだ。ビーカーの細胞再懸濁液が合計−１００ｍＬになるまで、再懸濁緩衝液をさらに添加した。再懸濁された細胞を含むビーカーを氷浴に設置し、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（負荷サイクル約４０％のパルスモード、および電力設定５）を用いて５分間音波処理した。細胞混合物を数回の間隔で音波処理し、サンプルが室温より高く加熱されたようであれば、氷上で休ませた。細胞可溶化物を合計２００ｍＬに２倍希釈し、２００μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを懸濁液に添加した。この懸濁液を氷上で１０分間攪拌した。音波処理ステップは、氷上にある間、さらに５分間繰り返された。可溶化液を５０ｍＬのプラスチックの遠心分離管６つに移し、３２，０００×ｇで４５分間遠心分離した。上清を破棄した。
【０１７２】
精製のために、５０ｍＬのＮｉ２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを洗浄し、再懸濁緩衝液中で平衡した。カラムの各実行用に、１２Ｌの細胞を溶解した。１２Ｌの細胞からの遠心分離した可溶化液を混合し、再懸濁緩衝液で５００ｍＬに希釈した。遠心分離した細胞可溶化液をカラム上に充填し、タンパク質溶液をニッケルマトリクスの上部に沈ませた。５０ｍＬの再懸濁緩衝液をカラムに通した。任意の塩洗浄は、カラムを２５０ｍＬのＮａＣｌ洗浄緩衝液（５Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）、２０ｍＭのイミダゾール、２５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄することにより実施され得る。この塩洗浄は、最終精製タンパク質のＡ２６０／Ａ２８０比率を値０．１Ａ．Ｕ減少させた。カラムを２５０ｍＬの洗浄緩衝液（５Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）、２０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。その後、２００ｍＬの溶出緩衝液（５Ｍの尿素、２ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）、２５０ｍＭのイミダゾール）をカラムに通した。画分を５ｍＬ毎に収集し、それらのうち、８つの画分のうちの５つがタンパク質を含んだ。
【０１７３】
タンパク質の存在および／または濃度は、画分の吸光度を測定することによって検出された。純度を決定するために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）分析をタンパク質に対して実施した。タンパク質を含む画分をプールし、透析管に移した。透析を４℃で少なくとも４時間、４Ｌの保存緩衝液（５Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５））において実施した。次に、タンパク質をＡｍｉｃｏｎ攪拌型細胞濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において、最大７５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に濃縮した。１２Ｌの細胞成長は、約５００ｍｇの純タンパク質をもたらした。純透析タンパク質は、−８０℃で６〜８ヶ月間保存された。
【０１７４】
実施例３：修飾ＨＢＶコアタンパク質の集合および精製
この実施例は、修飾ＨＢＶコアタンパク質から生成された集合および精製カプシドを形成するための一般方法を説明する。プロトコル１では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、修飾ＨＢＶコアタンパク質、および溶液中の変性剤の量を減少させるための希釈ステップなしの変性剤を含む溶液に還元剤を添加した後、カプシド構造に自己集合した。プロトコル２では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、修飾ＨＢＶコアタンパク質、および溶液中の変性剤の濃度を減少させるための希釈ステップがある変性剤を含む溶液に還元剤を添加した後、カプシド構造に自己集合した。プロトコル３では、修飾ＨＢＶコアタンパク質は、還元剤を添加せず、修飾ＨＢＶコアタンパク質を含む溶液中の変性剤の希釈後にカプシド構造に自己集合した。
【０１７５】
理論に拘束されるものではないが、還元剤の存在下で強いケージを形成することができるＨＢＶコアタンパク質変異体は、プロトコル１を用いてカプシドに集合するが、一方、弱いケージを形成する変異体、例えば二量体−二量体界面で変異が存在するため、プロトコル２および３を用いてカプシドに集合する。
プロトコル１：還元剤に曝露することによるウイルス性カプシドの自己集合の方法
【０１７６】
４Ｍ〜６Ｍの尿素のタンパク質保存緩衝液中で保存された修飾ＨＢＶコアタンパク質を室温で３０分間解凍した。−２０℃で保存されたＳｉＲＮＡも３０分間解凍した。３２ｍｇの修飾ＨＢＶコアタンパク質を測定し、コアタンパク質単量体当たり０．１ｓｉＲＮＡの割合でｓｉＲＮＡをタンパク質に添加し、６０分間結合させた。１０モル当量の１３−メルカプトエタノールをｓｉＲＮＡタンパク質溶液に添加し、１５分間還元させ、カプシド構造を形成させた。さらに１０モル当量の１３−メルカプトエタノールを溶液に添加し、少なくとも１２時間平衡した。
【０１７７】
集合カプシド構造を含む溶液を０．２ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ  ２５ｍｍディスク）で濾過した。ＤＳＢ２緩衝液（１Ｍの尿素、２５ｍＭのグリシン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）の移動相を含む固定相セファロースＣＬ−６Ｂ（１６×３００ｍｍ）カラムを用いて、集合カプシド構造をＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ上で精製した。２０〜３２ｍＬの溶出液を用いて、画分を収集し、プールした。プールした画分を０．２ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ２５ｍｍディスク）で濾過した。次に、一部の集合カプシド構造は表面官能化を受けた。
【０１７８】
プロトコル１は、Ｅ７７Ｃ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質（ＣＰ１８３）；Ｅ７７Ｃ変異およびＫ５（配列番号６０）、Ｋ７（配列番号６１）、Ｋ９（配列番号６２）、Ｋ１０（配列番号６３）、Ｋ１１（配列番号６４）、Ｋ１３（配列番号６５）、Ｋ２０（配列番号６６）、Ｋ４−５（配列番号６７）、ＫＡ９（配列番号６８）、またはＫＧ９（配列番号６９）尾部を含むポリ−リジン尾部を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）；Ｋ９尾部分（配列番号７７）を有するＥ７７Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）；Ｋ９尾部分（配列番号７５）を有するＥ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、Ｃ６１Ａ、およびＣ１０７Ａに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）；Ｅ７７Ｃに変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）：
【化８９】
2014527072.tif 000097
Ｅ７７ＣおよびＦ１２２１１で変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）：
【化９０】
2014527072.tif 000098
Ｅ７７ＣおよびＥ１４１１で変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）：
【化９１】
2014527072.tif 000099
を含む修飾ＨＢＶコアタンパク質を用いてカプシド構造を集合させるために使用され得る。
【０１７９】
プロトコル２：還元剤への曝露および変性剤の希釈によるウイルス性カプシドの自己集合の方法
４Ｍ〜６Ｍの尿素のタンパク質保存緩衝液中で保存された修飾ＨＢＶコアタンパク質を室温で３０分間解凍した。−２０℃で保存されたＳｉＲＮＡも３０分間解凍した。３２ｍｇの修飾ＨＢＶコアタンパク質を測定し、タンパク質単量体当たり０．１ｓｉＲＮＡの割合でｓｉＲＮＡをタンパク質に添加し、６０分間結合させた。１０モル当量の１３−メルカプトエタノールをｓｉＲＮＡタンパク質溶液に添加し、１５分間還元させ、カプシド構造を形成させた。次に、１ｍｌのＤＳＢ２緩衝液（１Ｍの尿素、２５ｍＭのグリシン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を溶液に添加し、１５分間平衡した。１ｍｌの１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのトリス酢酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．８）を溶液に添加し、続いて１５分間平衡した。１ｍｌの０．５×ＰＢＳ（ｐＨ９．５）を溶液に添加して、続いて１５分間平衡した。尿素の最終濃度は１．２５Ｍであった。さらに１０モル当量の１３−メルカプトエタノールを溶液に添加し、少なくとも１２時間平衡した。
【０１８０】
集合カプシド構造を含む溶液を０．２ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ２５ｍｍディスク）で濾過した。ＤＳＢ２緩衝液の移動相を含む固定相セファロースＣＬ−６Ｂ（１６×３００ｍｍ）カラムを用いて、集合カプシド構造をＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ上で精製した。２０〜３２ｍＬの溶出液を用いて、画分を収集し、プールした。プールした画分を０．２ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ２５ｍｍディスク）で濾過した。次に、一部の集合カプシド構造は表面官能化を受けた。
【０１８１】
プロトコル２は、Ｋ９尾部分を有するＥ７７ＣおよびＦ１８Ｈに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）（配列番号７０）；Ｋ９尾部分を有するＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｆに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）（配列番号１３７）；Ｋ９尾部分を有するＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｉに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）（配列番号１３６）；Ｋ９尾部分を有するＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｖに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）（配列番号７２）；Ｋ９尾部分を有するＥ７７Ｃ、Ｆ１８Ｈ、Ｓ１２１Ｃ、およびＳ１４１Ｃに変異を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）（配列番号７９）を含む修飾ＨＢＶコアタンパク質を用いてカプシド構造を集合するために使用された。
【０１８２】
プロトコル２は次のＨＢＶコアタンパク質を集合させるためにも使用された：
Ｅ７７ＣおよびＦ１８Ｈ変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９２】
2014527072.tif 000100
Ｅ７７ＣおよびＹ１３２Ｆ変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９３】
2014527072.tif 000101
Ｅ７７ＣおよびＡ１３７Ｈ変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９４】
2014527072.tif 000102
Ｅ７７ＣおよびＹ１１８Ｈ変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９５】
2014527072.tif 000103
Ｅ７７ＣおよびＬ３７１１変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９６】
2014527072.tif 000104
Ｅ７７Ｃ、Ｃ１７１およびＦ１８１１変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９７】
2014527072.tif 000105
Ｅ７７Ｃ、Ｃ１７１およびＡ１３７Ｈ変異を有するＣＰ１６２タンパク質（配列番号２変異形に基づく）
【化９８】
2014527072.tif 000106
【０１８３】
プロトコル３：変性剤の希釈によるウイルス性カプシドの自己集合の方法
４Ｍ〜６Ｍの尿素のタンパク質保存緩衝液中で保存された修飾ＨＢＶコアタンパク質を室温で３０分間解凍した。−２０℃で保存されたＳｉＲＮＡも３０分間解凍した。３２ｍｇの修飾ＨＢＶコアタンパク質を測定し、タンパク質単量体当たり０．１ｓｉＲＮＡの割合でｓｉＲＮＡをタンパク質に添加し、６０分間結合させた。１ｍｌのＤＳＢ２緩衝液（１Ｍの尿素、２５ｍＭのグリシン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）をｓｉＲＮＡタンパク質溶液に添加し、１５分間平衡し、カプシド構造を形成させた。１ｍｌのＤＳＢ２緩衝液の添加、続く１５分間の平衡化はさらに２回繰り返され、合計３回のサイクルであった。尿素の最終濃度は１．２５Ｍであった。３回のサイクル後、溶液を少なくとも１２時間平衡した。
【０１８４】
集合カプシド構造を含む溶液を０．２ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ２５ｍｍディスク）で濾過した。ＤＳＢ２緩衝液の移動相を含む固定相セファロースＣＬ−６Ｂ（１６×３００ｍｍ）カラムを用いて、集合カプシド構造をＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ上で精製した。２０〜３２ｍＬの溶出液を用いて、画分を収集し、プールした。プールした画分を０．２ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ２５ｍｍディスク）で濾過した。次に、一部の集合カプシド構造は表面官能化を受けた。
【０１８５】
プロトコル３は、Ｅ７７Ｋ変異およびＫ９尾部（配列番号８１）を有するＣＰ１４９タンパク質（配列番号２変異形に基づく）を含む修飾ＨＢＶコアタンパク質を用いてカプシド構造を集合させるために使用された。
【０１８６】
実施例４：ウイルス性カプシド集合を監視するための動的光散乱測定
この実施例は、実施例３に記載されるプロトコル１〜３を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）によりウイルス性カプシド構造の半径を測定する。ＤＬＳは、溶液中の小さい（サブマイクロメートル）粒子の大きさの特性を検査するためのツールである。
【０１８７】
図２は、実施例３のプロトコル１に記載される、タンパク質（Ｅ７７Ｃ変異およびＫ９尾部を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１４９（配列番号６２））および阻害ｄｓＲＮＡ溶液に１０モル当量のＢＭＥを添加した後の時間の関数としての粒子半径の動的光散乱（ＤＬＳ）のプロットを示す。データは、粒径の変化により示されるように、ケージ形成がＢＭＥの存在に依存することを示す。
【０１８８】
図３は、実施例３のプロトコル１に記載される、ＢＭＥを溶液（Ｅ７７Ｃ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１６２（配列番号１３８））および阻害ｄｓＲＮＡ（２０ｓｉＲＮＡ／ケージ）溶液を添加した後の時間の関数としての、粒子半径（ｎｍ）（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（ＣＰＳ）（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。カプシド集合は、粒子半径が約１５〜２０ｎｍに変化したことにより示されるように、１００〜１５０分で観察された。
【０１８９】
図４は、実施例３のプロトコル１に記載される、１０モル当量のＢＭＥをタンパク質（Ｅ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、Ｃ６１Ａ、およびＣ１０７Ａ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１４９（配列番号７５））および阻害ｄｓＲＮＡ溶液を添加した後の時間の関数としての、粒子半径（ｎｍ）（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（ＣＰＳ）（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。（Ａ）阻害ｄｓＲＮＡ（０．１当量）を、２．５Ｍの尿素濃度を有する溶液に添加した。（Ｂ）カプシド集合は、粒子半径が約２０ｎｍに変化したことにより示されるように、ＢＭＥの添加後、３０００〜４０００秒で観察された。（Ｃ）ｐＨ９．５で、０．５×ＰＢＳで１．２５Ｍに尿素濃度を低下させることにより、さらなるカプシドの形成を促進したが、カプシドを形成する必要はなかった。
【０１９０】
図５は、実施例３のプロトコル２に記載される、１０モル当量のＢＭＥをタンパク質（Ｋ９尾部を有するＥ７７ＣおよびＦ１８１１変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１４９（配列番号７０））および阻害ｄｓＲＮＡ溶液を添加した後の時間の関数としての、粒子半径（ｎｍ）（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（ＣＰＳ）（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。（Ａ）阻害ｄｓＲＮＡ（０．１当量）を、２．５Ｍの尿素濃度を有する溶液に添加した。（Ｂ）１０モル当量のＢＭＥを添加した。（Ｃ）カプシド集合は、粒子半径が約１５〜２０ｎｍに変化したことにより示されるように、尿素を０．５×ＰＢＳ（ｐＨ９．５）で１．２５Ｍに希釈した後、秒で観察された。
【０１９１】
図６は、実施例３のプロトコル２に記載される、１０モル当量のＢＭＥをタンパク質（Ｋ９尾部を有するＥ７７ＣおよびＹ１３２Ｆ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１４９（配列番号１３７））および阻害ｄｓＲＮＡ溶液を添加した後の時間の関数としての、粒子半径（ｎｍ）（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（ＣＰＳ）（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。（Ａ）阻害ｄｓＲＮＡ（０．１当量）を、２．５Ｍの尿素濃度を有する溶液に添加した。（Ｂ）１０モル当量のＢＭＥを添加した。（Ｃ）カプシド集合は、粒子半径が約１５〜２０ｎｍに変化したことにより示されるように、尿素を０．５×ＰＢＳ（ｐＨ９．５）で１．２５Ｍに希釈した後に観察された。
【０１９２】
図７は、実施例３のプロトコル２に記載される、１０モル当量のＢＭＥをタンパク質（Ｅ７７ＣおよびＹ１３２Ｆ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１６２（配列番号１４２））および阻害ｄｓＲＮＡ溶液を添加した後の時間の関数としての、粒子半径（ｎｍ）（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（ＣＰＳ）（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。阻害ｄｓＲＮＡ（０．１当量）を添加し、溶液を２．５Ｍの尿素濃度に希釈した（ステップ２）。１０モル当量のＢＭＥを添加した（ステップ３）。カプシド集合は、粒子半径が約１５〜２０ｎｍに変化したことにより示されるように、尿素を０．５×ＰＢＳ（ｐＨ９．５）で１．２５Ｍに希釈した後、秒で観察された（ステップ４〜６）。
【０１９３】
図８は、各ケージ形成反応成分を、監視されるタンパク質溶液に添加した後の時間の関数としての、粒子半径（ｎｍ）（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（ＣＰＳ）（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。簡潔に、実施例３のプロトコル３に記載されるように、６Ｍの尿素を含むタンパク質保存緩衝液中で−８０℃で保存された修飾ＨＢＶコアタンパク質（Ｋ９尾部を有するＥ７７Ｋ変異（配列番号８１））（３８．４ｍｇ／ｍＬストック）を３０分間解凍し、１００μＬをキュベット（ｃｕｖｖｅｔｔｅ）に設置した（Ａ）。次の反応成分が順次キュベットに添加され、大きさおよび強度の両方が各添加間で測定された：３．７５μＬのヘパリン（１００ｍｇ／ｍＬストック）（Ｂ）；１００μＬのＤＳＢ２緩衝液（１Ｍの尿素、２５ｍＭのグリシン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）（Ｃ）；１００μＬの０．５×ＰＢＳ、ｐＨ９．５（Ｄ）、および１００μＬの１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｅ）。粒子の半径測定値は、ＨＢＶカプシドの形成と一致した。十分に形成されたケージは、系を含む最初のＰＢＳの添加後に初めて検出された。これらのデータは、これらのＥ７７Ｋ／Ｋ９ナノケージの形成が尿素の希釈に依存することを示唆する。対照として、ナノケージが形成された後、１．５μＬの１．４２Ｍ（３ＭＥが反応混合物に添加された（Ｆ）。粒径は、還元剤の添加により変化せず、またサンプルの強度も変化せず、ケージ形成プロセスが溶液の酸化還元状態の制御下にないことを示す。
【０１９４】
図９は、負に荷電されたポリマーの不在下で、各ケージ形成反応成分をタンパク質溶液に添加した後の時間の関数としての、粒子半径（右側の垂直軸、暗いデータ点）およびシグナル強度（左側の垂直軸、淡いデータ点）のＤＬＳプロットを示す。Ｅ７７Ｃ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１４９がこの実験に使用された：
【化９９】
2014527072.tif 000107
【０１９５】
簡潔に、６Ｍの尿素を含むタンパク質保存緩衝液中で−８０℃で保存したＥ７７Ｃ変異を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質ＣＰ１４９（３８．４ｍｇ／ｍＬストック）を３０分間解凍し、１００μＬをキュベットに設置した。次の反応成分が順次キュベットに添加され、大きさおよび強度の両方が各添加間で測定された：ｄＨ２０（ポリマーの容量を置換する）（Ｂ）；１０Ｍ当量のＢＭＥ（Ｃ）；１００μＬのＤＳＢ２緩衝液（１Ｍの尿素、２５ｍＭのグリシン、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）（Ｄ）；１００μＬの０．５×ＰＢＳ、ｐＨ９．５（Ｅ）；および１００μＬの０．５×ＰＢＳ、ｐＨ７．４（各添加後の平衡ステップ後５回、１００μＬを添加）（Ｆ＝Ｊ）。粒子の半径測定値は、ＨＢＶカプシドの形成と一致した。十分に形成されたケージは、集合反応物に３回目のＰＢＳを添加した後に初めて検出された（ステップＨを参照）。これらのデータは、ＣＰ１４９が負に荷電されたポリマーの不在下でケージを形成することを示唆する。
【０１９６】
精製された治療用粒子の溶液は、予測された物質が得られたかを確認するために分析された。データは、大きさ排除カラムにより精製された選択画分が単分散されたことを示す。表４は、集合プロセス中修飾ＨＢＶコア（例えば後にケージ形成後に被覆された脂質である、Ｅ７７Ｃ変異およびＫ９尾部を有するＣＰ１４９）に関して得られたデータを示す。
【表４】
2014527072.tif 000108
【０１９７】
実施例５：カプシド形成の速度
この実施例は、様々な還元条件下でのカプシド形成の速度を測定する。
【０１９８】
カプシド形成の速度は、修飾ＨＢＶタンパク質溶液に添加された還元剤の量に基づき制御され得る。修飾ＨＢＶタンパク質二量体は、変性溶液の存在下で開口または固定状態に維持される。図１０に示されるように、１３−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の増加濃度が、ｓｉＲＮＡタンパク質溶液に添加された（すなわち、４×、１０×、および４０×ＢＭＥ）。カプシド形成の速度は、カプシドの半径が経時的に測定された動的光散乱を用いて測定された。データは、ケージ形成の速度が溶液中のＢＭＥの濃度に依存することを示す。４×ＢＭＥで、集合カプシドは４２．９分のｔｉｉ２で、１０×ＢＭＥでは、２．５分のｔ１／２で、４０×ＢＭＥでは、１．６分のｔｉ／２で形成された。
【表５】
2014527072.tif 000109
【０１９９】
表５および１０の結果は、カプシド集合の速度は、ＢＭＥ濃度の増加とともに増加することを示す。
【０２００】
カプシド形成の速度は、修飾ＨＢＶコアタンパク質のある変異の存在によっても影響を受けた。図１１に示されるように、修飾ＨＢＶコアタンパク質、例えばＫ９尾部を有するＥ７７Ｃ、Ｃ４８Ａ、Ｃ６１Ａ、およびＣ１０７Ａ変異（配列番号７５）を有するＣＰ１４９は、Ｅ７７Ｃ変異およびＫ９尾部を有する修飾ＨＢＶコアタンパク質（配列番号６２）より速くカプシドを形成した。両方の修飾ＨＢＶコアタンパク質は、配列番号２変異形に基づいた。
【０２０１】
参考文献の組み込み
下に列挙されるそれらの項目を含む本明細書に記載される全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書のいずれの定義を含む本願が優先する。
【０２０２】
米国特許第７，９６４，１９６号、米国特許公開第ＵＳ２００７−０２６９３７０号、および第２００９−０２２６５２５号、ならびにＰＣＴ特許出願公開第Ｗ０２０１０／１２０８７４号。
【０２０３】
等価物
対象発明の具体的な実施形態が論じられたが、上の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本発明の多くの変形は、本明細書を見直すことにより当業者には明らかとなるであろう。本発明の全範囲は、等価物のそれらの全範囲と共に特許請求の範囲、およびそのような変形と共に本明細書を参照することにより決定されるべきである。特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入る全ての変更は、それらの範囲内に包含される。
【０２０４】
特に記載のない限り、本明細書および特許請求の範囲に使用される成分の量、反応条件等を表す全ての数字は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されるものと理解されるものとする。したがって、逆が示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数的パラメータは、本発明により得られることが求められる所望される性質により変動し得る近似である。
【０２０５】
本発明を記載する文脈において（具体的には、次の特許請求の範囲の文脈において）使用される、用語「ａ」、および「ａｎ」、ならびに「ｔｈｅ」は、本明細書に記載されない限り、または文脈により明確に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の記述は、単に、範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡潔な方法として機能することが意図される。本明細書において特に記載の限り、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に記載のない限り、ないしは別の方法で文脈により明確に矛盾しない限り、いずれの好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるいずれのおよび全ての実施例または例示的な言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることが意図され、主張されなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書における言語は、本発明の実践に不可欠ないずれの主張されない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０２０６】
本明細書を通して、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、または類似する言語への参照は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書を通して、句「一実施形態では」、「１つの実施形態では」、および類似する言語の出現は全て、必ずではないが、同じ実施形態を指し得る。
【０２０７】
さらに、記載される本発明の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、いずれの好適な様式で組み合わされ得る。次の説明において、多くの具体的な詳細が提供される。しかしながら、当業者は、本発明が具体的な詳細のうちの１つ以上なしに、または他の方法、成分、材料等と共に実践され得ることを認識する。他の場合では、当該技術分野において既知の構造、材料、または操作は、本発明の態様を曖昧にするのを避けるため、示されないか、または詳述されない。
【０２０８】
本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の具体的な形態に具体化され得る。記載される実施形態は、全ての点において、単に例示的であり、限定的でないと考慮されるものとする。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、むしろ付属の特許請求により示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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