(57)【要約】  イヌ腫瘍壊死因子と特異的に結合してTNFR1レセプターと結合するイヌTNFの能力を阻害する、イヌ化及びキメラ抗体並びにその抗原結合フラグメントが提供される。本発明はさらに、前記をコードする核酸、並びに前記抗体及び／又は核酸を用いて慢性炎症疾患（例えばイヌの関節炎）を治療する方法に及ぶ。
2014526902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ腫瘍壊死因子と特異的に結合するイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
以下の工程を含む方法によって製造される、請求項１に記載のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント：
−イヌ以外の種からドナー抗体を提供する工程であって、該ドナー抗体が腫瘍壊死因子に対し結合特異性を有する前記工程、
−該ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基を、1つ以上のイヌ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在する各アミノ酸残基と比較して、該1つ以上のイヌ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の対応する位置の1つ以上のアミノ酸残基と異なる、該ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；及び
−該ドナー抗体で同定された1つ以上のアミノ酸残基を、該1つ以上のイヌ抗体の対応する位置に存在する該1つ以上のアミノ酸残基により置換する工程。
【請求項３】
同定した1つ以上のアミノ酸残基を置換する工程が、置換される該1つ以上のアミノ酸残基と最高の相同性を有する対応する位置に存在する1つ以上のアミノ酸残基により該1つ以上の同定アミノ酸残基が置換される工程を含む、請求項2に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
方法がさらに、該ドナー抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインをイヌ抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインで置き換える工程を含む、請求項2又は3に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号：1のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗体が、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び／又は配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項5に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗体が、配列番号：4、非グリコシル化配列番号：4、非グリコシル化配列番号：5、非グリコシル化配列番号：6、非グリコシル化配列番号：7及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列、又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
抗体が、配列番号：5及び配列番号：6から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同配列一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号：10のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR1フレームワーク領域、
配列番号：11のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR2フレームワーク領域、
配列番号：12のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR3フレームワーク領域、及び
配列番号：13のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR4フレームワーク領域
の少なくとも1つを含む軽鎖可変領域、及び／又は
配列番号：14のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR1フレームワーク領域、
配列番号：15のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR2フレームワーク領域、
配列番号：16のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR3フレームワーク領域、及び
配列番号：17のアミノ酸配列から成るか又は前記を含むFR4フレームワーク領域
の少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む、
請求項1から4のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：10のFR1領域を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項9に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：5位のアミノ酸残基T（T5）はアミノ酸残基M又はIによって置き換えられ、S7はTであり、A9はL又はPであり、S12はAであり、L13はVであり、S14はT又はRであり、Q15はP又はRであり、E16はDであり、K18はE、A、P、T又はLであり、V19はAであり、T20はSであり、T22はS又はYであり、さらにC23はYである。
【請求項１１】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：11のFR2領域を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項9又は10に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：Y2はF、I又はLであり、Q3はR、L又はIであり、Q4はHであり、K5はRであり、P6はS又はAであり、G7はDであり、A9はS、T又はPであり、K11はQ、E又はRであり、L12はR、P、G、A又はSであり、I14はLであり、さらにY15はF、N、S、E又はVである。
【請求項１２】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：12のFR3領域を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項9から11のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：G1はAであり、V2はAであり、P3はSであり、S4はDであり、F6はL又はVであり、S7はIであり、G8はAであり、T13はAであり、D14はEであり、T16はS又はRであり、L17はFであり、T18はR又はKであり、S21はR、G又はTであり、L22はVであり、P24はAであり、E25はD、G、I又はNであり、V27はA、T、G又はSであり、A28はGであり、さらにV29はI又はLである。
【請求項１３】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：13のFR4領域を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項9から12のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：G2はSであり、Q3はA、P又はTであり、G4はEであり、T5はPであり、K6はQ又はSであり、V7はL又はWであり、E8はD又はRであり、さらにI9はLである。
【請求項１４】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：14のFR1領域を有する重鎖可変ドメインを含む、請求項9から13のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：E1はD又はGであり、V2はG、L、E、I又はMであり、Q3はH、R、A、V、E、K、L、P又はSであり、L4はV又はPであり、V5はA、L、E又はMであり、E6はQ又はAであり、S7はF、L又はTであり、G9はEであり、G10はD、A、N、E又はTであり、L11はQ、R、V又はWであり、V12はA、I又はMであり、Q13はK、R又はNであり、P14はF又はTであり、G15はA、E又はTであり、G16はE又はAであり、S17はT又はPであり、L18はRであり、R19はK、T、G又はVであり、L20はI又はVであり、S21はYであり、A23はV、L、I又はEであり、A24はT、V、G、I又はSであり、S25はP、G又はTであり、G26はD、R又はTであり、さらにF27はL、I、S、D、T又はVである。
【請求項１５】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：15のFR2領域を有する重鎖可変ドメインを含む、請求項9から14のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：W1はCであり、V2はI、A、F又はLであり、Q4はL又はHであり、A5はS、T、G、P、V又はDであり、P6はLであり、G7はE、R又はLであり、K8はR、E、G、A、M又はQであり、G9はE、R、D、T又はVであり、L10はT、P、F又はMであり、E11はQ、H、D、L、P又はRであり、W12はL、C、S、Y、F又はMであり、V13はL、I又はFであり、さらにS14はA、T、G又はLである。
【請求項１６】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：16のFR3領域を有する重鎖可変ドメインを含む、請求項9から15のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：R1はQであり、F2はV又はLであり、T3はA、I又はSであり、I4はV、L、M又はTであり、S5はA、F又はTであり、R6はKであり、D7はE又はNであり、N8はD、T、S、I又はGであり、A9はG、V、S、D、P又はTであり、K10はR、E、N、Q、G又はMであり、N11はD、S、K、H又はRであり、S12はT、M、I又はAであり、L13はV、M、A又はIであり、Y14はF、H、S又はTであり、L15はIであり、Q16はH、E、D、R又はAであり、M17はLであり、N18はD、S、T、H、K、P又はRであり、S19はG、D、R、N又はTであり、L20はVであり、R21はT、G、K、S又はIであり、A22はV、D、T、S、G又はPであり、E23はD、A又はVであり、T25はA、S又はMであり、A26はG又はVであり、V27はM、I、L、F、T、K又はQであり、Y28はHであり、Y29はF又はHであり、A31はV、T、G、M、R、S、C又はLであり、さらにK32はR、S、N、G、A、T、P、D、Q、V、E、I又はMである。
【請求項１７】
以下から成る群から選択されるアミノ酸置換の1つ以上によって改変されている配列番号：17のFR4領域を有する重鎖可変ドメインを含む、請求項9から16のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：W1はLであり、G2はA又はSであり、Q3はP、H、R又はDであり、T5はA、S、I又はNであり、L6はS、Q、P又はRであり、V7はL、I又はPであり、T8はF、I、A、S、L、P又はYであり、V9はAであり、S10はA、C、P又はTであり、さらにS11はL、A又はPである。
【請求項１８】
イヌ腫瘍壊死因子と特異的に結合するキメラ抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号：8のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、前記キメラ抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
配列番号：9のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項18に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項18に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
1ｘ10-8以下の結合親和性（KD）でイヌTNFと結合する、請求項1から20のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
抗体又は抗原結合フラグメントとイヌTNFとの結合が、TNFR1レセプターと結合するイヌTNFの能力を阻害する、請求項1から21のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
単鎖Fv（scFv）抗体フラグメント、Fab抗体フラグメント、Fab’抗体フラグメント及びF(ab’)2抗体フラグメントから成る群から選択される、請求項1から22のいずれか1項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
抗体が多価抗体である、請求項1から22のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
抗体が多重特異性抗体である、請求項1から22のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
以下の工程を含む、免疫媒介症状を治療、緩和又は予防する方法：
−請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程、及び
−前記有効な量の抗体又は抗原結合フラグメントをイヌに投与する工程。
【請求項２７】
免疫媒介症状が慢性炎症疾患である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
慢性炎症疾患が、免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬及び乾癬関節炎、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ぶどう膜炎及び気管支喘息から成る群から選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
免疫媒介症状が、敗血症、敗血症性ショック、真性糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、虚血性心疾患及び筋委縮性側索硬化症から成る群から選択されるTNFアルファ関連疾患である、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも1つのさらに別の治療薬剤を共投与する工程をさらに含む、請求項26から29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの治療薬剤が、メトトレキセート、イヌTNF融合タンパク質、可溶性p55若しくは p75 TNFレセプター又はその誘導体、イヌTNFに対するキメラ抗体若しくはイヌ抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド及び神経増殖因子アンタゴニストから成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも1つの治療薬剤が、抗生物質、抗真菌、抗原虫及び抗ウイルス治療薬剤から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも1つの治療薬剤が、炎症媒介物質の阻害剤、PGEレセプターアンタゴニスト、免疫抑制剤、シクロスポリン、抗炎症グルココルチコイド、認知機能不全又は認知障害の治療に用いられる薬剤、抗高血圧剤、心脈管系機能不全の治療に用いられる化合物、利尿剤、血管拡張剤、ベータアドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト、アンギオテンシンII変換酵素阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー及びHMG-CoAレダクターゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が約0.01mg/kg体重から約10mg/kg体重の範囲の用量でイヌに投与される、請求項26から33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤と一緒に含む、免疫媒介症状を治療、緩和又は予防するための医薬組成物。
【請求項３６】
メトトレキセート、イヌTNF融合タンパク質、可溶性p55若しくは p75 TNFレセプター又はその誘導体、イヌTNFに対するキメラ抗体若しくはイヌ抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド及び神経増殖因子アンタゴニストから成る群から選択される、少なくとも1つのさらに別の治療薬剤をさらに含む、請求項35に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項３８】
配列番号：1のアミノ酸配列を有する抗イヌTNFイヌ化抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：3のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードする、核酸。
【請求項３９】
配列番号：2のアミノ酸配列を有する抗イヌTNFイヌ化抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変ドメイン、又は配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖をコードする、核酸。
【請求項４０】
1つ以上の調節配列に作動できるように連結された、請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項４１】
請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４２】
さらに1つ以上の調節配列を含む、請求項41に記載の発現ベクター。
【請求項４３】
プラスミド又はレトロウイルスベクターである、請求項41又は42に記載の発現ベクター。
【請求項４４】
請求項41から43のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４５】
抗イヌTNF中和抗体を製造する方法であって、請求項44に記載の宿主細胞を培養して、イヌ化抗イヌTNF中和抗体を該細胞に発現させる工程を含む、前記製造方法。
【請求項４６】
請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸の治療的に有効な量をイヌに投与する工程を含む、イヌで免疫媒介症状を治療、緩和又は阻止する方法。
【請求項４７】
イヌの慢性炎症疾患の治療又は予防で使用される、請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、請求項35又は36に記載の医薬組成物、請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項41から43のいずれか1項に記載の発現ベクター。
【請求項４８】
慢性炎症疾患が、慢性関節リウマチ、変形性関節症及び他の多発性関節炎、免疫媒介多発性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎、乾癬及び乾癬関節炎、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ぶどう膜炎、気管支喘息及びアレルギー症状から成る群から選択される、請求項47に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
関節炎の治療で使用される、請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、請求項35又は36に記載の医薬組成物、請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項41から43のいずれか1項に記載の発現ベクター。
【請求項５０】
関節炎が、変形性関節症、免疫媒介多発性関節炎及び慢性関節リウマチから成る群から選択される、請求項49に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５１】
イヌの慢性炎症疾患の治療、緩和又は予防用医薬の製造における、請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、請求項35又は36に記載の医薬組成物、請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項41から43のいずれか1項に記載の発現ベクターの使用。
【請求項５２】
慢性炎症疾患が、慢性関節リウマチ、免疫媒介多発性関節炎、変形性関節症及び他の多発性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬関節炎、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ぶどう膜炎、気管支喘息及びアレルギー症状から成る群から選択される、請求項51に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
【請求項５３】
イヌの関節炎の治療、阻止、緩和又は予防用医薬の製造における、請求項1から25のいずれか1項に記載の抗体又は抗体の結合フラグメント、請求項35又は36に記載の医薬組成物、請求項37から39のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項41から43のいずれか1項に記載の発現ベクターの使用。
【請求項５４】
関節炎が、変形性関節症、免疫媒介多発性関節炎及び慢性関節リウマチから成る群から選択される、請求項53に記載の抗体又は抗体の結合フラグメントの使用。
【請求項５５】
請求項1から25のいずれか1項に記載の抗イヌTNF中和モノクローナル抗体又はそのフラグメントを産生する細胞株、又はその誘導細胞若しくは子孫細胞。
【請求項５６】
請求項1から25のいずれか1項に記載の抗イヌTNF抗体及び前記抗体の使用のための指示書を含む、イヌの慢性炎症疾患の治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ腫瘍壊死因子アルファの阻害物質として作用する結合抗体及びそのフラグメントに関する。本発明は、前記を調製する方法、並びにイヌで腫瘍壊死因子によって媒介される慢性炎症症状（例えば関節炎）の治療におけるこれら結合抗体及びフラグメントの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子アルファ（TNF-アルファ、TNF-α、TNF）は、免疫、炎症、細胞増殖制御、分化及びアポトーシスで多形質発現性機能を示す強力なサイトカインである。腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）−免疫グロブリンFcドメイン融合タンパク質又は抗TNF中和モノクローナル抗体を用いるTNFの阻害は、多様なヒト炎症性疾患（慢性関節リウマチ及び乾癬関節炎を含む）の治療に有効なアプローチであることが証明されている。
コンパニオンアニマル（例えばイヌ）は、類似の炎症性疾患（変型性関節症、免疫媒介多発性関節炎、血中リンパ球性滑膜炎（plasmatic-lymphocytic synovitis）、全身性紅斑性狼瘡（SLE）、血管炎及び多様な自己免疫皮膚疾患を含む）を発症する。米国では5匹の成犬のうち1匹が関節炎を有し、イヌはヒトの関節疾患、例えば変型性関節症、前十字靱帯破壊及び半月板損傷のためのモデルとして用いられてきた。
イヌの炎症発生におけるTNFの役割は詳細に記載されている。例えば、TNF阻害剤エタネルセプト（huTNFR-Fc）を用いたイヌの治療は、閉鎖胸部モデルでバルーン閉塞によって惹起した虚血再灌流の後の心筋損傷を25−40％減少させ、前記は付随する炎症マーカー（例えばICAM-1及びNF-kB）を同時に減少させた。同様に、2mg/kgのTNHR-Fcを用いたとき虚血再灌流の開放胸部イヌモデルで梗塞サイズが60％減少することもまた示された。
【０００３】
さらにまた、後膝関節炎を示すイヌの滑膜液の細胞浸潤物においてTNFアルファ分泌が増加する。TNF及びII型TNFレセプターは、広域炎症応答の部分として緑内障のイヌの中心及び周辺網膜で顕著に上昇することが示されている。抗イヌTNF MAbを用いて、LPS処理イヌPBMC上清で捕捉ELISAにより低レベルのTNFが検出されている。TNFアルファ発現はまた、イヌ血管周囲細胞腫、トリコブラストーマ、脂肪腫及び肥満細胞腫の皮膚サンプルで報告されている。TNFアルファ及びTNFレセプターは、変型性関節症誘発モデルのイヌの関節軟骨に存在する。アダリムマブ（TNFに対するヒト化モノクローナル抗体）が剥脱性皮膚紅斑性狼瘡（ECLE）の2匹のイヌで試験されたが（2週間毎に0.5mg/kgを8週間）、疾患の進行に変化はなく、かつ血清TNFアルファレベルにも変化はなかった。
イヌの広範囲の炎症媒介症状でTNFが密接関係するので、したがって、前記慢性炎症症状を予防及び治療するためにTNFの長期阻害で用いることができるイヌTNF阻害剤が希求される。
【発明の概要】
【０００４】
多大な努力に続いて、驚くべきことに本発明者らは、イヌTNFと特異的に結合し、さらにイヌTNFの生物学的活性を無効にする抗体及び結合フラグメントを生じる抗体の調製方法を見出した。特に、該抗体のフレームワーク領域への多数のアミノ酸改変の導入にもかかわらず、これら改変を実施する新規で刷新的な方法ゆえに、本発明の抗体及び結合フラグメントは高い特異性でイヌTNF結合することが本明細書で明示される。さらにまた、結合は、イヌTNFと細胞膜発現TNFレセプターとの結合を阻害することによってイヌTNFの生物学的活性を停止させることが明示される。前記は、引き続いてイヌの炎症媒介疾患（例えば関節炎）のTNF媒介誘発、発達又は進行の出現を予防することができるであろう。
本発明の抗体は組換えDNAの方法を用いて生成されてイヌTNFに対する結合特異性を示すが、前記はまたイヌのフレームワーク及び定常ドメイン配列を有しイヌ宿主に投与されたときそれらの免疫原性は緩和される。結果として、異種抗体誘発リスクは最小限に留められる。該抗体は標準的な方法論（例えばCDR移植など）を用いて作製されたのではないので、イヌTNFに対する結合特異性は全く驚くべきであり予想に反する。
【０００５】
本発明の第一の特徴にしたがえば、イヌ腫瘍壊死因子（TNF）と特異的に結合するイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
ある実施態様では、抗体は、以下の工程を含むか、又は本質的に以下の工程から成る方法によって調製される：
−イヌ以外の種からドナー抗体を提供する工程（ここで該ドナー抗体は腫瘍壊死因子に対し結合特異性を有する）、
−該ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基を、1つ以上のイヌ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在する各アミノ酸残基と比較して、前記1つ以上のイヌ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の対応する位置の1つ以上のアミノ酸残基と異なる、該ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；及び
−該ドナー抗体で同定された1つ以上のアミノ酸残基を、該1つ以上のイヌ抗体の対応する位置に存在する該1つ以上のアミノ酸残基により置換する工程。
イヌで使用するために、上記の方法は改変された抗体が、該フレームワーク領域内のどの位置でもイヌの当該位置で異質であるようないずれのアミノ酸も含まないような態様でドナー抗体を改変する。したがって、この改変抗体は該標的抗原に対してドナー抗体の特異性及び親和性を保持するが、重要なことには、潜在的に異質なエピトープが作出されないように改変される。改変抗体はしたがってイヌで異質とみなされず、それゆえに（特に長期投与の後で）抗体の効能を無効にし得る免疫応答はイヌで誘導されない。
ある実施態様では、1つ以上の同定アミノ酸残基の置換工程は、置換される1つ以上のアミノ酸残基と最高の相同性を有する対応する位置に存在する1つ以上のアミノ酸残基により1つ以上の該同定アミノ酸残基を置換する工程を含む。
ある実施態様では、該方法はさらに、ドナー抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインを、イヌ抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインで置き換える工程を含む。
上記方法はCDR移植を含まない。上記方法にしたがって調製された抗体は、ドナー抗体のCDR、上記方法にしたがって調製されたイヌ化フレームワーク領域及びイヌ定常ドメインを含む。
【０００６】
本発明は、上記方法にしたがって調製された抗体、例えば下記に記載するもの及びそのフラグメントに及ぶ。
したがって、本発明のさらに別の特徴にしたがえば、ペプチド又はペプチドをコードする核酸配列を含む組成物が提供され、ここで該ペプチドは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8及び配列番号：9から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。典型的には、該ペプチドは腫瘍壊死因子アルファと結合する。ある実施態様では、該ペプチドはイヌ化若しくはキメラ抗体又はその結合フラグメントである。ある実施態様では、該イヌ化抗体は上記に記載の抗体を調製する方法にしたがって調製される。
ある種の特徴では、本発明は、イヌ腫瘍壊死因子アルファ結合薬剤又は腫瘍壊死因子アルファ結合薬剤をコードするオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供し、ここで前記結合薬剤は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8及び配列番号：9から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌ腫瘍壊死因子（TNF）、特にイヌTNFアルファ（TNF-α）と特異的に結合する、イヌ化若しくはキメラ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。典型的には、該イヌ化若しくはキメラ抗体又は前記に由来する抗原結合フラグメントはイヌTNFの生物学的活性を無効にする。特に、イヌ化若しくはキメラ抗体又は結合フラグメントとイヌTNFとの結合は、膜結合イヌTNFレセプターと結合してこれを活性化させるイヌTNFの能力を停止させる。ある実施態様では、該イヌ化又はキメラ抗体は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8及び配列番号：9から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、該イヌ化抗体は上記記載の抗体を調製する方法にしたがって調製される。
【０００７】
本発明のさらにまた別の特徴は、補体と結合してTNF-アルファ発現細胞の補体媒介溶解を開始させるイヌ化抗体を提供する。そのような抗体はTNF発現炎症細胞の数を減少させ、したがってin vivoで長期の抗炎症活性をもたらす。ある実施態様では、該イヌ化抗体は上記記載の抗体を調製する方法にしたがって調製される。
本発明の上記特徴のある実施態様では、イヌ化若しくはキメラ抗体又はその結合フラグメントは、1ｘ10-8以下のKDの結合親和性でTNFと結合する。
本発明のさらに別の又は関連する特徴では、イヌ腫瘍壊死因子アルファ（TNF-アルファ）と特異的に結合できる中和抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。該抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：1のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90，95若しくは99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95若しくは99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか又は本質的に前記から成る。典型的には、該抗体はキメラ又はイヌ化抗体である。
該抗体がイヌ化抗体又はそのフラグメントであるある実施態様では、該抗体は、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85、90、95若しくは 99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含むか、前記軽鎖から成るか、又は本質的に前記軽鎖から成る。
【０００８】
ある実施態様では、重鎖（VH）の可変領域は、少なくとも1つの免疫グロブリン定常ドメインを含むさらに別のアミノ酸配列と連接される。ある実施態様では、該免疫グロブリン定常ドメインは、サブクラスIgG（免疫グロブリンG）の抗体に由来し、本発明のイヌ化抗体の完全な重鎖を形成する。4つの異なるイヌ重鎖定常ドメインが知られている。典型的には、前記定常ドメインは、CH1、CH2及びCH3領域を、CH1及びCH2領域の間に位置する適切なリンカー（又は“ヒンジ”）と一緒に含む。
ある実施態様では、該イヌ化抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95若しくは 99％の同配列一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある実施態様では、該キメラ抗体又は抗体の結合フラグメントは、配列番号：9のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95若しくは 99％の同配列一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る。ある実施態様では、該キメラ抗体は、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22から成る群から選択されるアミノ酸配列、又は前記配列と少なくとも85％、90％又は95％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
該抗体がイヌ化抗体である実施態様では、該抗体は、該残基が欠失、付加及び／又は置換によって変更されて、イヌ対象動物に投与したときそれに対して異種抗体が生成されないように該配列が脱免疫されてあるアミノ酸配列を有する。特に、該抗体は、イヌ由来フレームワーク及び定常ドメインのアミノ酸配列を含む。
【０００９】
さらに別の特徴では、本発明は、イヌ腫瘍壊死因子（TNF）と特異的に結合する中和抗体またはその抗原結合フラグメントに及び、該抗体又は抗体の結合フラグメントは軽鎖及び重鎖を含むか、それらから成るか、又は本質的にそれらからなり、ここで該軽鎖の可変領域（VL）は配列番号：1のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85、90、95若しくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに該重鎖の可変領域（VH）は、配列番号：2のアミノ酸配列と同一又は実質的に相同なアミノ酸配列、又は配列番号：2と少なくとも85、90、95若しくは98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、又は本質的に前記配列から成る。
ある実施態様では、該抗体はイヌ化抗体であり、配列番号：3のアミノ酸配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成る軽鎖、及び／又は配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列、又は前記と少なくとも85％、より好ましくは95％のアミノ酸同一性及びもっとも好ましくは少なくとも98％の同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか又は本質的に前記配列から成る重鎖を含む。典型的には該軽鎖はカッパ軽鎖である。
ある実施態様では、該抗体はキメラ抗体であり、配列番号：8のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは95％のアミノ酸同一性及びもっとも好ましくは少なくとも98％の同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか又は本質的に前記配列から成る軽鎖、及び／又は配列番号：9のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％、より好ましくは95％のアミノ酸同一性及びもっとも好ましくは少なくとも98％の同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか又は本質的に前記配列から成る重鎖を含む。典型的には該軽鎖はカッパ軽鎖である。
【００１０】
さらに別の実施態様では、本発明の抗体又は結合フラグメントは非グリコシル化変種に及び、ここでグリコシル化に適切な定常ドメインのアミノ酸残基は欠失されるか、又はグリコシル化され得ない残基により置換されてグリコシル化が妨げられる。
本発明者らは、相補性決定領域（CDR）と結合できる一連のフレームワーク領域（FR）をさらに規定して、イヌ化重鎖及び軽鎖可変ドメインを形成した。該重鎖及び軽鎖ドメインの各々は、FR1、FR2、FR3及びFR4と称される4つのフレームワーク領域を有する。
抗体分子は、CDR1、CDR2及びCDR3領域を付随する介在フレームワーク領域と一緒に含む重鎖可変ドメインを含むことができる。重鎖可変ドメイン（VH）のCDRはVHCDRとして知られ、これらのCDRはKabat番号付与系にしたがえば以下の位置に見出される：VHCDR1：Kabat残基31−35、VHCDR2：Kabat残基50−65、VHCDR3：Kabat残基95−102（Kabat EA et al. 1991 Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services）。さらにまた、抗体はさらにCDR1、CDR2及びCDR3領域並びに付随する介在フレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインを含む。軽鎖可変ドメイン（VL）のCDRはVLCDRとして知られ、これらのCDRはKabatの番号付与系にしたがえば以下のアミノ酸残基位置で見出される：VLCDR1：Kabat残基24−34、VLCDR2：Kabat残基50−56、VLCDR3：Kabat残基89−97。軽鎖又は重鎖可変ドメインは、以下の構成でCDRが介在する4つのフレームワーク領域、FR1、FR2、FR3及びFR4を含む：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
【００１１】
さらにまた別の特徴では、本発明は、抗イヌTNF抗体又はそのイヌTNF抗原結合フラグメントに及び、該抗体又は抗体のフラグメントは、
配列番号：10のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR1フレームワーク領域、
配列番号：11のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR2フレームワーク領域、
配列番号：12のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR3フレームワーク領域及び
配列番号：13のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR4フレームワーク領域
の少なくとも1つを含む軽鎖可変領域、及び／又は
配列番号：14のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR1フレームワーク領域、
配列番号：15のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR2フレームワーク領域、
配列番号：16のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR3フレームワーク領域及び
配列番号：17のアミノ酸配列から成るか又は前記配列を含むFR4フレームワーク領域
の少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む。
典型的には、該軽鎖及び重鎖CDRは、イヌTNFと結合特異性を有する抗体に由来する。
典型的には、本発明のイヌ化抗イヌTNF抗体の製造は組換えDNAプロセスからもたらされ、前記プロセスは軽鎖又は重鎖可変ドメインのフレームワーク領域への復帰突然変異の導入を必要としない。
【００１２】
ある実施態様では、上記に記載した前記少なくとも１つのフレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインは、イヌ由来軽鎖定常ドメイン（典型的には軽鎖カッパ定常ドメインであるが、場合によってラムダ軽鎖である）に連接される。ある実施態様では、前記軽鎖は、配列番号：10のアミノ酸配列を有するFR1領域、配列番号：11のアミノ酸配列を有するFR2領域、配列番号：12のアミノ酸配列を有するFR3領域、及び配列番号：13のアミノ酸配列を有するFR4領域、又は前述のものと少なくとも60、70、80、90、95又は98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。ある実施態様では、前記同一性は、少なくとも約5アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸に及ぶ。
ある種のさらに別の実施態様では、上記に記載したフレームワーク領域の少なくとも1つを含む重鎖可変領域は、イヌ由来重鎖定常ドメインと連接される。ある実施態様では、該定常ドメインのアミノ酸配列は翻訳後修飾を一切欠くか、又は該定常ドメインがグリコシル化されないようにN-結合又はO-結合グリコシル化を受け得るいずれかの又は全ての残基を除去するために改変され得る。ある実施態様では、該重鎖は、配列番号：14のアミノ酸配列を有するFR1領域、配列番号：15のアミノ酸配列を有するFR2領域、配列番号：16のアミノ酸配列を有するFR3領域、及び配列番号：17のアミノ酸配列を有するFR4領域、又は前述のものと少なくとも60、70、80、90、95又は98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。ある実施態様では、前記同一性は、少なくとも約5アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸に及ぶ。
【００１３】
ある種のさらに別の実施態様では、改変は本明細書に記載したフレームワーク領域に対して実施できる。すなわち、各フレームワーク領域のいくつかの残基について、与えられた位置に存在し得るある選択範囲のアミノ酸残基が存在する。重要なことには、これらフレームワーク領域の改変は、該改変が生じた抗体の結合特異性及び／又は親和性を不利な方向に変化させる可能性があるので、相補性決定領域に対しては立体構造の変化をもたらさない。ある実施態様では、本発明は、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸残基への2つ以上のアミノ酸置換の導入に及ぶ。
したがって、ある種のさらに別の実施態様では、本発明は、ポリペプチド（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）に及び、前記ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変されてある、配列番号：10のアミノ酸配列を含むFR1領域を有する軽鎖可変ドメインを含む（ここでアミノ酸は一文字コードによって表される）：5位のアミノ酸残基T（T5）はアミノ酸残基M又はIによって置き換えられ、S7はTであり、A9はL又はPであり、S12はAであり、L13はVであり、S14はT又はRであり、Q15はP又はRであり、E16はDであり、K18はE、A、P、T又はLであり、V19はAであり、T20はSであり、T22はS又はYであり、C23はYである。
【００１４】
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：11のアミノ酸配列を有する軽鎖FR2領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：Y2はF、I又はLであり、Q3はR、L又はIであり、Q4はHであり、K5はRであり、P6はS又はAであり、G7はDであり、A9はS、T又はPであり、K11はQ、E又はRであり、L12はR、P、G、A又はSであり、I14はLであり、さらにY15はF、N、S、E又はVである。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：12のアミノ酸配列を有する軽鎖FR3領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：G1はAであり、V2はAであり、P3はSであり、S4はDであり、F6はL又はVであり、S7はIであり、G8はAであり、T13はAであり、D14はEであり、T16はS又はRであり、L17はFであり、T18はR又はKであり、S21はR、G又はTであり、L22はVであり、P24はAであり、E25はD、G、I又はNであり、V27はA、T、G又はSであり、A28はGであり、さらにV29はI又はLである。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：13のアミノ酸配列を有する軽鎖FR4領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：G2はSであり、Q3はA、P又はTであり、G4はEであり、T5はPであり、K6はQ又はSであり、V7はL又はWであり、E8はD又はRであり、さらにI9はLである。
【００１５】
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：14のアミノ酸配列を有する重鎖FR1領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：E1はD又はGであり、V2はG、L、E、I又はMであり、Q3はH、R、A、V、E、K、L、P又はSであり、L4はV又はPであり、V5はA、L、E又はMであり、E6はQ又はAであり、S7はF、L又はTであり、G9はEであり、G10はD、A、N、E又はTであり、L11はQ、R、V又はWであり、V12はA、I又はMであり、Q13はK、R又はNであり、P14はF又はTであり、G15はA、E又はTであり、G16はE又はAであり、S17はT又はPであり、L18はRであり、R19はK、T、G又はVであり、L20はI又はVであり、S21はYであり、A23はV、L、I又はEであり、A24はT、V、G、I又はSであり、S25はP、G又はTであり、G26はD、R又はTであり、F27はL、I、S、D、T又はVである。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：15のアミノ酸配列を有する重鎖FR2領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：W1はCであり、V2はI、A、F又はLであり、Q4はL又はHであり、A5はS、T、G、P、V又はDであり、P6はLであり、G7はE、R又はLであり、K8はR、E、G、A、M又はQであり、G9はE、R、D、T又はVであり、L10はT、P、F又はMであり、E11はQ、H、D、L、P又はRであり、W12はL、C、S、Y、F又はMであり、V13はL、I又はFであり、さらにS14はA、T、G又はLである。
【００１６】
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：16のアミノ酸配列を有する重鎖FR3領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：R1はQであり、F2はV又はLであり、T3はA、I又はSであり、I4はV、L、M又はTであり、S5はA、F又はTであり、R6はKであり、D7はE又はNであり、N8はD、T、S、I又はGであり、A9はG、V、S、D、P又はTであり、K10はR、E、N、Q、G又はMであり、N11はD、S、K、H又はRであり、S12はT、M、I又はAであり、L13はV、M、A又はIであり、Y14はF、H、S又はTであり、L15はIであり、Q16はH、E、D、R又はAであり、M17はLであり、N18はD、S、T、H、K、P又はRであり、S19はG、D、R、N又はTであり、L20はVであり、R21はT、G、K、S又はIであり、A22はV、D、T、S、G又はPであり、E23はD、A又はVであり、T25はA、S又はMであり、A26はG又はVであり、V27はM、I、L、F、T、K又はQであり、Y28はHであり、Y29はF又はHであり、A31はV、T、G、M、R、S、C又はLであり、さらにK32はR、S、N、G、A、T、P、D、Q、V、E、I、Mである。
ある種のさらに別の実施態様では、配列番号：17のアミノ酸配列を有する重鎖FR4領域は、以下のアミノ酸置換の1つ以上によって改変できる：W1はLであり、G2はA又はSであり、Q3はP、H、R又はDであり、T5はA、S、I又はNであり、L6はS、Q、P又はRであり、V7はL、I又はPであり、T8はF、I、A、S、L、P又はYであり、V9はAであり、S10はA、C、P又はTであり、さらにS11はL、A又はPである。
【００１７】
ある実施態様では、該抗体はモノクローナル抗体である。典型的には、該抗体はイヌ化抗体又はそのフラグメントである。或いは、該抗体はキメラ抗体又はそのフラグメントである。
ある種のさらに別の実施態様では、本発明のイヌ化又はキメラTNF中和抗体又は前記に由来する結合フラグメントは、1ｘ10-8以下の平衡解離定数（KD）を有する結合親和性でイヌTNFアルファ（腫瘍壊死因子アルファ）と特異的に結合する。さらにまた、該イヌ化又はキメラ抗体はイヌに存在する他のいずれのエピトープとも交差反応せず、さらにまたそれらがイヌに投与されたとき本発明の抗体に対して異種抗体を生じないことが好ましい。さらにまた、短期抗炎症活性がin vivoで所望されない場合は、該イヌTNF結合抗体の定常ドメインは、下流のエフェクター機能（補体固定及び活性化、ADCC並びにFcレセプター結合及び活性化を含むが、ただし前記に限定されない）のいずれも媒介しないことが好ましい。そのような定常ドメインは、配列番号：4、非グリコシル化配列番号：4、非グリコシル化配列番号：5、非グリコシル化配列番号：6、非グリコシル化配列番号：7及び配列番号：7から成る重鎖から選択される。
【００１８】
ある種のさらにまた別の実施態様では、長期抗炎症活性が所望される場合は、該イヌTNF結合抗体の定常ドメインは、in vivoでイヌTNF発現細胞の排除をもたらすエフェクター機能（補体固定及び活性化、ADCC並びにFcレセプター結合及び活性化を含むが、ただし前記に限定されない）を媒介することが好ましい。そのような定常ドメインは、配列番号：5及び配列番号：6から成る重鎖から選択される。
ある種のさらに別の実施体態様では、重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変を本発明の抗体に対して実施できる。前記改変は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換又は欠失を含むことができる。前記アミノ酸変更は、典型的には抗体の機能的特徴を改変するために実施される。例えば、アミノ酸改変を実施して、例えば該抗体のFcレセプター結合能力、補体活性化能力又はADCC誘発能力を妨げることによって該抗体の定常ドメインにより媒介される下流のエフェクター機能を妨げることができる。さらにまた、改変は、イヌに抗体を投与したときの抗体の循環半減期を改変するために、該重鎖定常ドメインのアミノ酸残基に対して実施できる。
【００１９】
本発明は、イヌTNFと結合してTNFRと結合する前記の能力を停止させる抗体フラグメントに及ぶ。
ある実施態様では、該抗体の結合フラグメントは、可撓性リンカーと連結されて単鎖抗体を形成した本発明の重鎖及び軽鎖配列を含むことができる。
単鎖Fv（scFv）はVH及びVLドメインを含む。VH及びVLドメインは合同して標的結合部位を形成する。これら2つのドメインはペプチドリンカーによって共有結合により連結される。scFv分子は、軽鎖可変ドメインがN-末端に必要とされる場合にはVL-リンカー-VHの形態、又はVHドメインがN-末端に必要とされる場合にはVH-リンカー-VLの形態を有することができる。したがって、ある種のさらに別の実施態様では、該抗原結合フラグメントは単鎖Fv（scFv）抗体フラグメントである。ある種のさらに別の実施態様では、該抗体の結合フラグメントは、Fab抗体フラグメント、Fab’抗体フラグメント、F(ab’)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント、scFv抗体フラグメントなどから成る群から選択される（ただし前記に限定されない）。
【００２０】
いくつかの実施態様では、本発明は多重特異性抗体又は多価抗体を提供し、それらは、併用療法で使用するために異なる結合特異性を有する他の抗体と対合又は連接された本発明の抗TNF抗体又は結合フラグメントを含む。多重特異性抗体は、第一のTNFエピトープに特異的な少なくとも1つの抗体又は結合フラグメント、及びTNF上に存在する別のエピトープ又は異なる抗原に特異的な少なくとも1つの結合部位を含む。多価抗体は、同じTNFエピトープに対して結合特異性を有する複数の抗体又は抗体の複数の結合フラグメントを含む。したがって、ある実施態様では、本発明は、本発明のイヌ化抗体の4つ以上のFv領域又はFab領域を含む抗体融合タンパク質に及ぶ。さらにまた別の実施態様は、本明細書に記載の抗体に由来する1つ以上のFab領域を、TNFに特異的な複数の抗体由来の1つ以上のFab又はFv領域と一緒に含む抗体融合タンパク質に及ぶ。ある種のさらに別の実施態様では、本発明は二重特異性抗体に及び、ここで本発明の抗体又はその結合フラグメントは、二次標的（TNFではない）に対し結合特異性を有する第二の抗体又はその結合フラグメントに連結される。好ましくは、前記二次標的は、TNFR1レセプターを介するTNF媒介シグナル伝達の防止を補助する。そのような多価、二重特異性又は多重特異性抗体は、当業者には周知の多様な組換え方法によって作製できる。
【００２１】
本発明のさらにまた別の特徴は、その必要があるイヌで免疫媒介症状を治療又は予防する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−イヌTNFアルファと特異的に結合する、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程、及び
−前記有効な量の本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントをイヌに投与する工程。
ある実施態様では、該抗体はイヌ化抗体である。ある実施態様では、該イヌ化抗体は、配列番号：1のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
ある実施態様では、該イヌ化抗体は、配列番号：3のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖、及び／又は配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％のアミノ酸同一性及びより好ましくは前記配列と少なくとも98％の同一性を有する配列を含むか、前記配列から成るか又は本質的に前記配列から成る重鎖を含む。
ある実施態様では、該抗体はキメラ抗体であり、配列番号：8のアミノ酸配列を有する軽鎖及び／又は配列番号：9のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある実施態様では、該キメラ抗体は、配列番号：20、配列番号：21及び配列番号：22から成る群から選択されるアミノ酸配列、又は前記配列と少なくとも85％、90％又は95％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００２２】
ある実施態様では、該免疫媒介症状は慢性炎症疾患である。前記慢性炎症疾患は、慢性関節リウマチ（RA）、変形性関節症及び他の多発性関節炎、強直性脊椎炎（AS）、クローン病及び潰瘍性大腸炎、乾癬及び乾癬関節炎（PsA）、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全（CHF）、難治性ぶどう膜炎、気管支喘息及びアレルギー性症状から成る群から選択できる（ただしこれらに限定されない）。炎症媒介症状にはまた、敗血症及びショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病）、卒中、及び筋委縮性側索硬化症が含まれ得る。TNFアルファに対するモノクローナル抗体はまた、癌、皮膚腫瘍（例えば基底細胞癌腫）、結直腸癌及び卵巣癌の悪液質の予防又は治療にも用いることができる。
ある種のさらに別の実施態様では、該免疫媒介症状はTNFアルファ関連疾患又はTNFアルファが決定的炎症媒介物質である疾患であり得る。そのような症状には、ベーチェット病、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚炎、中毒性表皮壊死症、全身性血管炎、壊疽性膿皮症、膿疱性皮膚炎、アルコール性肝炎、大脳マラリア、溶血性尿毒症症候群、子癇前症、同種異系移植拒絶、中耳炎、ヘビによる咬傷、結節性紅斑、脊椎形成異常症候群、移植片対宿主病、皮膚筋炎及び多発性筋炎が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２３】
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、その必要があるイヌ対象動物で関節炎又は関節炎症状を治療する方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
−本発明の抗イヌTNF抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程、及び
−前記治療的に有効な量の抗イヌTNF抗体又はその抗原結合フラグメントをイヌに投与する工程。
ある実施態様では、該抗体はイヌ化抗体である。ある実施態様では、該イヌ化抗体は、配列番号：1のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン及び／又は配列番号：2のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
ある実施態様では、該関節炎又は関節炎症状には以下から成る群から選択される症状が含まれる：多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬関節炎、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎及び関連症状。
典型的には、関節炎又は関節炎症状の治療は、該関節炎を引き起こすか、前記に付随するか又は前記の原因となり得る免疫応答の緩和、阻止、軽減又は抑制を含む。
【００２４】
本発明のさらに別の特徴は、イヌTNFの発現増加又はTNFに対する感受性増加によって引き起こされるか、そのような感受性増加に付随するか又はそのような感受性増加をもたらす症状をその必要があるイヌで治療する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−本発明の抗イヌTNF抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量を提供する工程、及び
−前記治療的に有効な量の抗イヌTNF抗体又はその抗原結合フラグメントをイヌに投与する工程。
ある実施態様では、前述の方法はさらに、本発明の抗TNF抗体の有効性を強化及び／又は補充できる少なくとも1つのさらに別の薬剤を共投与する工程を含む。例えば、該抗体又はその抗原結合フラグメントは1つ以上の追加の医薬組成物と一緒に共投与でき、前記追加の組成物は、慢性炎症症状（特にTNFアルファ関連疾患）の治療に有用な医薬を含む。特に追加の医薬組成物は以下であり得る：メトトレキセート、可溶性p55若しくは p75TNFレセプター又はその誘導体、イヌTNFに対するキメラ抗体若しくはイヌ抗体、抗イヌTNF抗体フラグメント、少なくとも1つの鎮痛剤、サイトカイン抑制抗炎症薬である化合物、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド又は神経増殖因子のアンタゴニスト（例えば抗NGF抗体）。
【００２５】
適切な鎮痛剤の例には、ブトルファノール、ブプレノルフィン、フェンタニル、フルニキシンメグルミン、メルピジン、モルヒネ、ナルブフィン及びその誘導体が含まれる（ただしこれらに限定されない）。適切なNSAIDには、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、カルプロフェン、エトドラク、ケトプロフェン、メロキシカム、フィロコキシブ、ロベナコキシブ、デラコキシブなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ある種のさらに別の実施態様では、少なくとも1つのさらに別の薬剤は、抗生物質、抗真菌剤、抗原虫剤、抗ウイルス剤及び類似の治療薬剤から選択される当該群の1つ以上であり得る治療的に活性な薬剤であり得る。さらにまた、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、炎症媒介物質阻害剤（例えばPGEレセプターアンタゴニスト）、免疫抑制剤（例えばシクロスポリン）、又は抗炎症グルココルチコイドであり得る。ある種のさらに別の特徴では、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、認知機能不全又は障害（例えば高齢犬でますます普遍的となり得る記憶低下又は関連症状）の治療に用いられる薬剤であり得る。さらにまた、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、心脈管系機能不全の治療、例えば高血圧、心筋虚血、うっ血性心不全などの治療に用いられる抗高血圧薬又は他の化合物であり得る。さらにまた、該少なくとも1つのさらに別の薬剤は、利尿剤、血管拡張剤、ベータアドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト、アンギオテンシンII変換酵素阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー又はHMG-CoAレダクターゼ阻害剤であり得る。
ある実施態様では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、前述の方法の部分として約0.01mg/kg体重から約10mg/kg体重、特に0.03mg/kg体重から約3mg/kg体重の範囲の用量でイヌに投与される。
【００２６】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、前述の本発明のいずれかの特徴の抗体又はその結合フラグメントを含む組成物に及ぶ。ある実施態様では、該組成物はさらに少なくとも1つの医薬的に許容できる担体を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、痛み又は、慢性痛を生じるか若しくは慢性痛によって引き起こされる症状をイヌで治療するための医薬組成物を提供し、前記組成物は、本発明の抗イヌTNFイヌ化抗体の医薬的に有効な量を少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤と一緒に含む。
ある実施態様では、該組成物はさらに、メトトレキセート又は少なくとも1つの鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド又は神経増殖因子のアンタゴニストを含むことができる。
【００２７】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明の抗体又は抗体の結合フラグメントをコードする単離核酸に及ぶ。
したがって、本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の前述のいずれかの特徴の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離核酸又はポリヌクレオチドを提供する。ある実施態様では、該核酸又はポリヌクレオチドは、配列番号：1のアミノ酸配列を有する抗イヌTNFイヌ化抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変ドメイン、又は配列番号：3のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードする。ある種のさらに別の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：2のアミノ酸配列を有する抗イヌTNFイヌ化抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変ドメイン、又は配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6及び配列番号：7から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖をコードする。
ある種のさらに別の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：8のアミノ酸配列を有する抗イヌTNFイヌ化抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号：9のアミノ酸配列を有する重鎖をコードする。
【００２８】
ある実施態様では、単離核酸はさらに、作動できるように前記に連結された1つ以上の調節配列をコードする。さらに別の特徴では、本発明の重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン又は重鎖及び／又は軽鎖定常ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。ある実施態様では、該発現ベクターはさらに1つ以上の調節配列を含む。ある実施態様では、該ベクターはプラスミド又はレトロウイルスベクターである。さらにまた別の特徴は、本発明の前述の特徴の発現ベクターを取り込んだ宿主細胞を提供する。本発明のさらに別の特徴は、本発明の前述のいずれかの特徴の抗体を産生する宿主細胞を提供する。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌ化抗イヌTNF中和抗体を製造する方法を提供し、前記方法は、本発明の前述の特徴の宿主細胞を培養して、イヌ化抗イヌTNF中和抗体を該細胞に発現させる工程を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、本発明の抗イヌTNFイヌ化抗体を製造する方法を提供し、前記方法は、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖を発現する本発明の前述の特徴のポリヌクレオチド／核酸又はベクターの1つ以上を適切な宿主細胞で発現させる工程、発現された複数のポリペプチドを回収する工程（前記複数のポリペプチドは1つの宿主細胞内で一緒に発現されるか、又は異なる宿主細胞内で別々に発現され得る）、及び抗体を単離する工程を含む。
【００２９】
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌで痛みを治療、緩和又は阻止する方法を提供し、前記方法は、本発明の前述のいずれかの特徴のポリヌクレオチド、抗体又はフラグメントの有効量をイヌに投与する工程を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌで痛みの治療又は予防に使用される、本発明の前述のいずれかの特徴の抗体又は抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は本発明の前述のいずれかの特徴の核酸又は前記を含むベクターを提供する。
ある実施態様では、痛みは急性の痛みである。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは慢性の痛みである。さらにまた、痛みは術後痛又は任意の外科手術から生じる痛みであり得る（前記任意の外科手術はイヌでは整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出術、去勢術などを含むことができるが、ただし前記に限定されない）。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは癌又は癌性症状に付随する慢性痛である。ある種のさらに別の実施態様では、痛みは、慢性関節リウマチ又は変形性関節症に付随するか又は前記から生じる。
本発明のさらにまた別の特徴は、関節炎、特に免疫媒介多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬関節炎、若年性特発性関節炎又は強直性脊椎炎の治療で使用される、本発明の前述のいずれかの特徴の抗体又は抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は本発明の前述のいずれかの特徴の核酸又は前記を含むベクターを提供する。
【００３０】
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの慢性炎症疾患の治療又は予防用医薬の製造における、本発明の前述のいずれかの特徴の抗体又は抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は本発明の前述のいずれかの特徴の核酸又は前記を含むベクターの使用を提供する。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの慢性関節リウマチ又は変型性関節症の治療、阻止、緩和又は予防用医薬の製造における、本発明の前述のいずれかの特徴の抗体又は抗体の結合フラグメント、又は本発明の前述の特徴の医薬組成物、又は本発明の前述のいずれかの特徴の核酸又は前記を含むベクターの使用を提供する。
さらにまた別の特徴では、本発明の抗イヌTNF中和モノクローナル抗体又はそのフラグメントを産生する細胞株、又はその誘導細胞若しくは子孫細胞が提供される。
本発明のさらにまた別の特徴は、イヌの慢性炎症疾患の治療用、又は痛みを伴う症状の治療用、又は変型性関節症若しくは慢性関節リウマチの治療、緩和若しくは阻止用キットを提供し、前記キットは本発明の前述のいずれかの特徴の抗イヌTNF抗体及び前記の使用のための指示を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、液体中の抗イヌTNFモノクローナル抗体をin vitro、ex vivo及びin vivoで検出するため、前記抗体の濃度決定で使用するための診断キットを提供する。該キットは、本発明の抗体又はその結合フラグメントのいずれかを含むことができる。該キットは前記抗体又はその結合フラグメントを使用するための指示書を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のイヌ化抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す配列番号：1である。
【図２】本発明のイヌ化抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す配列番号：2である。
【図３】本発明のイヌ化抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す配列番号：3である。
【図４】イヌ化抗TNF重鎖可変ドメインイヌIgG-A重鎖（caN-HCA）のアミノ酸配列（配列番号：4）を示す。可変ドメイン残基は太字で示されている。
【図５】イヌ化抗TNF重鎖可変ドメインイヌIgG-B重鎖（caN-HCB）のアミノ酸配列（配列番号：5）を示す。可変ドメイン残基は太字で示されている。
【図６】イヌ化抗TNF重鎖可変ドメインイヌIgG-C重鎖（caN-HCC）のアミノ酸配列（配列番号：6）を示す。可変ドメイン残基は太字で示されている。
【図７】イヌ化抗TNF重鎖可変ドメインイヌIgG-D重鎖（caN-HCD）のアミノ酸配列（配列番号：7）を示す。可変ドメイン残基は太字で示されている。
【図８】キメラ抗TNF抗体のイヌカッパ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：8）を示す。可変ドメイン残基は太字で示されている。
【図９】キメラ抗体の重鎖可変ドメインイヌIgG-B重鎖（caN-HCB）のアミノ酸配列（配列番号：9）を示す。可変ドメイン残基は太字で示されている。
【図１０】図10(A)は、プロテインAを用いて精製してSDS-PAGEによって分析した共発現イヌ化抗体（配列番号：3＋配列番号：5）及びキメラ抗体（配列番号：8＋配列番号：9）の結果を示し、一方、図10(B)は、発現された組換えタンパク質とイヌTNFアルファとの結合を示すELISAの結果を示している。5μg/mLから0.05μg/mLの種々の稀釈の抗体を用いた結果が示されている。
【図１１Ａ】NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いたイヌTNF生物活性の阻害を示す。これらの細胞は蛍光によりイヌTNFに応答する。イヌ化（配列番号：3＋配列番号：5）（図11A）及びキメラ（配列番号：8＋配列番号：9）（図11B）MAbは両方ともTNF誘発蛍光を等しく良好に阻害した（図11Cで定量）。
【図１１Ｂ】NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いたイヌTNF生物活性の阻害を示す。これらの細胞は蛍光によりイヌTNFに応答する。イヌ化（配列番号：3＋配列番号：5）（図11A）及びキメラ（配列番号：8＋配列番号：9）（図11B）MAbは両方ともTNF誘発蛍光を等しく良好に阻害した（図11Cで定量）。
【図１１Ｃ】NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いたイヌTNF生物活性の阻害を示す。これらの細胞は蛍光によりイヌTNFに応答する。イヌ化（配列番号：3＋配列番号：5）（図11A）及びキメラ（配列番号：8＋配列番号：9）（図11B）MAbは両方ともTNF誘発蛍光を等しく良好に阻害した（図11Cで定量）。
【図１２（ａ）】CHO細胞で発現させてプロテインAクロマトグラフィーを用いて精製した抗TNF MAbクローン148を土台にしたさらに別のイヌ化MAbとの比較を示す（パネルA、左レーン）。ヒトTNF（パネルB）及びイヌTNF（パネルC）との結合について、前記MAbを図10のイヌ化（Ca）及びキメラ（Ch）D2E7系MAbと比較しながら試験した（バックグラウンドの陰性コントロール結合は矢印により示されている）。この図から分かるように、D2E7を土台にしたイヌ化及びキメラMAb並びに本発明の対象物は、予想に反してヒトTNFとの結合と等価の強いイヌTNFとの結合を示し、一方、イヌ化MAb148はヒトTNFとのみ結合を示す。
【図１２（ｂ）】イヌ化MAb148の重鎖のアミノ酸配列を示す配列番号：18である。
【図１２（ｃ）】イヌ化MAb148の軽鎖のアミノ酸配列を示す配列番号：19である。
【図１３】配列番号：3に加えて配列番号：5を共発現して構築されたイヌ化抗TNFモノクローナル抗体は、TNF発現細胞の補体媒介溶解を誘発できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
広範な実験に続いて、本発明者らはD2E7抗ヒトTNF抗体（イヌTNFと結合することが知られてなかった抗体）を取得し、驚くべきことにイヌTNFアルファと特異的に結合するアンタゴニスト抗体を製造する基礎として前記D2E7抗体が用いられた。得られた非免疫原性抗体（前記は標準的なCDR移植技術では製造されない）は、イヌTNFとの高親和性結合を有することが示された。前記抗体は、イヌTNFの生物学的機能を、もっとも明確にはTNFと細胞膜結合レセプターTNFR1との結合を阻害することによって中和する。さらにまた、前記抗体は該フレームワーク及び定常領域がイヌIgG分子に存在する残基のみを取り込むように設計されてあり、したがってイヌに投与されたとき前記に対して異種抗体が産生されることは考えられない。したがって、本発明のイヌ化抗体は、イヌの慢性炎症疾患の治療のための長期投与に適している。
【００３３】
本発明者らが用いた、本発明の抗体のための重鎖及び軽鎖可変ドメインを作製するプロセスは、当該位置ではイヌにとって異質であることが判明している特定のドナー残基のイヌ残基による置き換えを生じる。前記イヌ残基は、本発明者らの分析にしたがえば、CDR領域の立体構造を維持し、したがって結合特異性及びアビディティを維持する一方で、もし未改変の形態で該抗体がイヌに投与されたならば該抗体に対して中和抗体を生成する可能性がある免疫原性エピトープの存在を減少させるであろう。具体的には、本発明の抗体を調製する方法（ペチセーション（PETisation）として知られている）は、ドナー（例えばヒト）抗体のフレームワーク領域の配列をイヌ由来の抗体又は抗体プールの配列と比較することによって、イヌへの投与の適切性について該ドナー抗体のフレームワーク領域の配列を評価する工程を含む。比較はドナー配列と標的配列のただ1つのメンバーとの間で実施できるが、標的配列プールとの比較が好ましいことは明白であろう。なぜならば、標的配列プールとの比較は、標的種の各Kabatの位置で天然の選択肢の数を増すことになるからである。これは、ドナーと標的との間の“マッチング”のチャンスを増加させるだけでなく、マッチングが存在しない場合に置き換えの選択肢もまた増加させるであろう。結果として、ドナーに可能な限り近い特性をもつ置き換えを選択することができる。ドナー配列とイヌ配列が任意のKabat番号又は対応する位置で異なる場合、ドナー配列は、イヌの当該位置に天然に存在することが判明しているアミノ酸残基で問題のアミノ酸残基を置換して改変される。
【００３４】
ドナーの免疫グロブリンフレームワーク領域に存在するアミノ酸残基の置換が必要な場合、典型的には、置換は保存的置換の原則を用いて実施される（保存的置換では、アミノ酸残基は、イヌで当該Kabatの位置に天然に存在し、かつドナー配列の置換されるアミノ酸とサイズ、荷電及び疎水性が可能な限り近い関係にあるアミノ酸残基で置き換えられる）。その意図は、ドナー抗体の三次元構造に全く混乱又は破壊を引き起こさないか又は少なくとも前記を最小にする置換えを選択することである。ある種の状況では、明瞭な選択肢が存在せず、各選択が利益及び不利益を有するであろう。最終的な決定には三次元モデリング又は多様な代替配列の発現さえ要求され得る。しかしながら、一般的には明瞭な優先性が利用可能であろう。この方法の結果として、ドナー配列の変更は、当該残基が標的内で異質であるときにのみ実施され、置き換えるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と可能な限り近縁である。したがって、異質なエピトープの発生は回避されるが、全体的な三次元構造は保存され、結果として親和性及び特異性もまた保存される。
該軽鎖及び重鎖定常領域は、典型的にはイヌ（標的）由来抗体から誘導される。TNFの短期阻害が所望される場合には、重鎖定常ドメインは、それらが下流のエフェクター機能を媒介しないように選別又は改変される（すなわちHCA、HCD又は非グリコシル化HCB若しくはHCCである）。TNFの長期阻害が所望される場合には、重鎖定常ドメインは、それらが下流のエフェクター機能を媒介するように選別又は改変される（すなわちHCB又はHCCである）。さらにまた、フレームワーク残基の置換は、それがCDR領域の三次元立体構造に影響しないような態様で実施されるので、所望の標的に対する結合特異性に多様性は存在しないであろう。
【００３５】
ヒト及びマウスには4つの主要なIgGアイソタイプが存在し、呼称は類似するが、それらは、作用態様及び機能（細菌生成物（例えばプロテインA及びプロテインG）に対する親和性、それらの補体依存細胞溶解（CDC）活性化能力、並びにそれらの抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）による標的細胞の殺滅誘発能力を含む）に違いがある。CDC及びADCC活性（又は“武装”）定常ドメインを有するIgGアイソタイプを選択することは、標的細胞の同族抗原を有する標的細胞を排除するように抗体を設計するときには臨床的に有利であると考えられる（例えば人間の医療における使用ではIgG1アイソタイプが上記の目的のために好ましい）。対照的に、免疫系の活性化は、他の設定では（例えば炎症、痛み又は自己免疫の除去では）望ましくないと考えられ、したがって最小限のCDC及びADCC活性を示すヒトIgGアイソタイプが好ましい（例えばそのような人間の医療における使用ではIgG4アイソタイプがしばしば好ましい）。4つの別個の免疫グロブリンガンマ（IgG）重鎖定常ドメインアイソタイプが、ただ1つのカッパ及びラムダ定常ドメイン配列とともにイヌ免疫系で記載されている（米国特許5,852,183号、Tang L. et al. 2001. Veterinary Immunology and Immunopathology, 80. 259-270）。前記4つのイヌ重鎖定常ドメインA、B、C及びDは、それらによって媒介される機能的活性の関係では特徴が明らかにされたことはない。該IgGファミリーの全体的な相同性にもかかわらず、イヌIgGをコードするタンパク質は、他の種のファミリーメンバーとの関係よりもより深い関係を互いに有し、したがって上記のいずれかの機能を4つのイヌアイソタイプの各々に帰属せしめることができるとしても、相同性だけで上記機能のどれかを規定することは不可能であった。
【００３６】
本発明の抗体は、イヌ由来の重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。さらにまた、相補性決定領域はD2E7抗体に由来する。D2E7抗体は、Salfeldら（2000）の論文及び米国特許6,090,382号に記載された。
D2E7抗体から誘導されたCDR領域はフレームワーク領域配列と合体される（前記フレームワーク領域配列は、CDR三次元構造が保存されてありしたがって結合特異性は保存されるが、該抗体がイヌに投与されたときには前記に対して異種抗体の生成を妨げることを本発明者らは決定している）。
軽鎖及び重鎖可変領域の各々は4つのフレームワーク領域（FR1−FR4と称される）を含む。これらのフレームワーク領域の各々について、本発明者らは、特定の位置毎に好ましいアミノ酸残基（いわゆる優先残基）、及びさらにまた別の代替アミノ酸残基（前記もまた当該位置で許容し得る）を同定した。表1から8は重鎖及び軽鎖の各々について4つのフレームワーク領域を示す。これらの表は、当該個々のフレームワーク領域に対応するアミノ酸の位置とともに、さらに完全な重鎖又は軽鎖可変ドメインの全長にわたって個々の残基の位置を見分けるために用いられるKabat番号付与システムによるアミノ酸の位置を提供する。アミノ酸残基は一文字システムを用いて識別される。
【００３７】
表1：軽鎖可変ドメインのFR1の残基
2014526902.tif 000003
【００３８】
表2：軽鎖可変ドメインのFR2の残基
2014526902.tif 000004
【００３９】
表3：軽鎖可変ドメインのFR3の残基
2014526902.tif 000005
【００４０】
表4：軽鎖可変ドメインのFR4の残基
2014526902.tif 000006
【００４１】
表5：重鎖可変ドメインのFR1の残基
2014526902.tif 000007
【００４２】
表6：重鎖可変ドメインのFR2の残基
2014526902.tif 000008
【００４３】
表7：重鎖可変ドメインのFR3の残基
2014526902.tif 000009
【００４４】
表8：重鎖可変ドメインのFR4の残基
2014526902.tif 000010
【００４５】
したがって、本発明のイヌ化抗体は、例えば、第一の種に由来する完全な可変領域及び第二の種に由来する定常ドメインから成るキメラモノクローナル抗体、又はCDR移植イヌ化抗体（該イヌ化抗体では、重鎖及び軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）は、ドナー抗体に由来しフレームワーク領域（FR）に導入されたアミノ酸残基並びに標的抗体又はイヌ生殖細胞系列の配列に由来する定常領域（CR）を含む）とは異なる。
イヌ化抗体は、そのCDRが由来した親（ドナー）抗体の結合特性を実質的に保持することが好ましい。このことは、イヌ化抗体が、そのCDRが由来したドナー抗体と同じ又は実質的に同じ結合親和性及びアビディティを示すことを意味する。理想的には、イヌ化抗体の親和性は、標的エピトープに対するドナー抗体の親和性の10％より低くはなく、より好ましくは約30％より低くはなく、もっとも好ましくは、親和性は少なくとも親（ドナー）抗体の親和性であろう。抗原結合親和性をアッセイする方法は当業界で周知であり、1/2最大結合アッセイ、競合アッセイ及びスキャチャード分析が含まれる。
【００４６】
上記で規定したように、本発明は、本発明のイヌ化抗体に由来する結合メンバー又は抗原結合フラグメントに及ぶ。そのような抗原結合フラグメントは、イヌTNFと特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって達成され得ることが示された。ある実施態様では、該結合メンバー又は抗原結合フラグメントは単離された結合メンバーであり得る。本発明の結合メンバー又は抗原結合フラグメントは、本発明の抗体のフラグメント、例えば完全にイヌ化された抗体分子のフラグメント、例えば重鎖若しくは軽鎖のみ、又は例えば重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインを含むことができる。ある実施態様では、結合メンバーは、典型的には抗体のVH及び／又はVLドメインを含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成ることができる。結合メンバーのVHドメインはまた本発明の部分として提供される。VH及びVLドメインの各々には3つの相補性決定領域（“CDR”）が4つの付随フレームワーク領域（“FR”）と一緒に存在する。VHドメインは典型的には3つのHCDR（重鎖相補性決定領域）を含み、VLドメインは典型的には3つのLCDR（軽鎖相補性決定領域）を含む。したがって、結合メンバーは、VHドメイン（複数の付随するフレームワーク領域とともに一列に並んだVH CDR1（又はVHCDR1）、CDR2（VHCDR2）及びCDR3（VHCDR3）領域を含む）を含むことができる。結合メンバーは、前記に加えて或いはまた別に、VLドメイン（付随するフレームワーク領域とともにVLCDR1、CDR2及びCDR3ドメインを含む）を含むことができる。VH又はVLドメインは、典型的には4つのフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3及びFR4）を含む。本明細書で用いられるように、“フレームワーク領域”又は“フレームワーク配列”は、CDRを失った可変領域の残存配列を指す。CDR配列の正確な定義は種々の呼称系（Kabat, Chothiaなど）によって決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、対応する種々の解釈に左右される。6つのCDR（軽鎖のVLCDR1、VLCDR2及びVLCDR3、並びに重鎖のVHCDR1、VHCDR2及びVHCDR3）は、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上でFR1、FR2、FR3及びFR4として知られているサブ領域に分割する。
【００４７】
図1は、本発明の抗TNF抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。CDR1、CDR2及びCDR3領域には下線が付されている。したがって、図1に示すようにVLCDR1はFR1とFR2フレームワーク領域の間に位置し、VLCDR2はFR2とFR3フレームワーク領域の間に位置し、さらにVLCDR3はFR3とFR4フレームワーク領域の間に位置する。図2は本発明の抗TNF抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。CDR1、CDR2及びCDR3領域には下線が付されている。図1に示す軽鎖可変領域のように、VHCDR1はFR1とFR2フレームワーク領域の間に位置し、VHCDR2はFR2とFR3フレームワーク領域の間に位置し、さらにVHCDR3はFR3とFR4フレームワーク領域の間に位置する。
【００４８】
表では、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの残基は、便利なようにKabatらによって考案された番号付与系にしたがって番号が付与されている（Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391）。Kabatの番号付与系は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりも可変性（すなわち超可変性）であるアミノ酸残基に番号を付与する系である。したがって、Kabatの番号付与系は、概して可変ドメインの残基（軽鎖の約1−104残基及び重鎖の1−113残基）を指すときに用いられる。この番号付与系は特段の場合に本明細書で用いられる。Kabatの残基指定は、本明細書に列挙した関連配列で提供する本発明の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸残基の直線的番号付与と常に直接的に一致するとは限らない。特に実際の直線的アミノ酸配列は、フレームワーク領域であれ又は相補性決定領域（CDR）であれ、重鎖又は軽鎖の基本的可変ドメインの構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応して、厳格なKabat番号付与の場合よりも減少した又は付加されたアミノ酸を含み得る。厳密なKabatの残基番号付与は、Kabatの番号付与が適用された標準配列に対して該抗体の配列の残基をアラインメントすることによって決定できる。
【００４９】
先に記載したように、抗体の結合フラグメントは、Fabフラグメント、Fab’フラグメント及びscFv（単鎖可変フラグメント）、ペプチド模倣体、ジアボディ又は関連する多価誘導体を含む群から選択できる（ただしこれらに限定されない）。
ある実施態様では、抗体の結合フラグメントは、Fab又はF(ab')2フラグメント（抗体のVL、VH、CL及びCH1ドメインから成る）である。ある実施態様では、VLドメインは配列番号：1のアミノ酸配列を有し、VHドメインは配列番号：2のアミノ酸配列を有する。ある実施態様では、CL及びCH1ドメインは、イヌ免疫グロブリンのCL及びCH1ドメインのアミノ酸配列を土台にする。
Fab、Fab’及びF(ab')2フラグメントの組換え体作製に用いられる技術は当業者に周知であり、国際PCT特許公開公報WO 92/22324及びSawaiらの論文（Sawai et al., “Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors”, 1995, AJRI 34:26-34）に開示された技術が含まれる。scFv（単鎖Fvフラグメント）の作製に用いることができる技術の例は以下に開示されている：Huston et al., “Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins”, Methods in Enzymology, vol. 203:46-88, 1991（前記文献の内容は参照により本明細書に含まれる）。
ある実施態様では、抗体フラグメントは、モリモトの方法にしたがってタンパク質分解消化により完全長抗体から誘導することができる（Morimoto et al.,“Single-step purification of F(ab')2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins G1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW”Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117, 1992）。抗体フラグメントはまた、宿主細胞によって直接生成することができる（Carter et al., “High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment”Bio/Technology 10:163-167, 1992）。
【００５０】
イヌ化モノクローナル（イヌTNFとの結合特異性を有し、イヌTNF機能と拮抗する）の提供に加えて、本発明はさらに、配列番号：1で規定されるVL（軽鎖可変）領域のアミノ酸配列及び配列番号：2で規定されるVH（重鎖可変）領域のアミノ酸配列を土台とする一対の結合ドメインを含む抗体以外の結合メンバーに及ぶ。特に本発明は、本発明の抗体のイヌ化抗体のVL又はVH領域のどちらかに基づく一結合ドメインに及ぶ。
したがって、本発明のある種のさらに別の実施態様では、本発明のイヌ化抗体に由来する一結合ドメインを含むか、前記ドメインから成るか、又は本質的に前記ドメインから成る結合メンバーが提供される。ある実施態様では、該一結合ドメインは、配列番号：2で規定されるVH（重鎖可変ドメイン）のアミノ酸配列から誘導される。そのような結合ドメインはイヌTNFを標的とする薬剤として用いることができる。
【００５１】
ある実施態様では、さらに別の操作技術を用いて本発明の抗体を改変することができる（例えば、Fc領域（血清半減期を改変できる）、補体結合、Fcレセプター結合及び／又は抗原依存細胞性細胞傷害の改変を含む）。さらにまた、ある実施態様では、グリコシル化パターンが変化した抗体又は抗体フラグメントを生成できる。ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体のグリコシル化の程度を増加又は低下させるために改変される。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN-結合又はO-結合である。N-結合は、アスパラギン残基の側鎖と炭水化物部分との結合を指す。トリペプチド配列、アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、炭水化物部分とアスパラギン側鎖との酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のどちらかの存在は潜在的グリコシル化部位を作出する。O-結合グリコシル化は、糖類、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの1つとヒドロキシアミノ酸（もっとも一般的にはセリン又はスレオニンであるが5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いることができる）との結合を指す。
ある種のさらに別の実施態様では、本発明の抗イヌTNF抗体は、抗体をポリエチレングリコール（PEG）誘導体と反応させることによってPEG化され得る。ある実施態様では、抗体は脱フコシル化され、したがってフコース残基を欠く。
【００５２】
ある実施態様では、抗体の生物学的特性の改変は、（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造（例えばシート又はヘリックスの立体構造としての構造）、（b）該分子の標的部位における荷電又は疎水性、又は（c）側鎖の大きさに影響を与える置換を選択することによって達成できる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性にしたがって以下のように分類できる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York, 1975）：（1）非極性残基：Ala（A）、VaI（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性残基：GIy（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性残基：Asp（D）、GIu（E）；（4）塩基性残基：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。或いはまた、天然に存在する残基は、以下のように共通の側鎖の特性を基準にして分類できる：（1）疎水性残基：ノルロイシン、Met、Ala、VaI、Leu、Ile；（2）中性親水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性残基：Asp、Glu；（4）塩基性残基：His、Lys、Arg；（5）鎖の方向性に影響する残基：Gly、Pro；（6）芳香族残基：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーの別のクラスによる交換を伴うであろう。そのような置換残基はまた、保存的置換部位に又は残りの（例えば非保存）部位に導入することができる。
【００５３】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、パートナー分子と連結された本発明の抗イヌTNF抗体又はその抗原結合部分を含む免疫複合体に及ぶ。ある実施態様では、そのような抗体-パートナー分子結合物は、化学的リンカー（例えばペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー又はジスルフィドリンカー）の手段によって結合される。ある実施態様では、該結合パートナーはエフェクター分子、標識、医薬又は担体分子である。本発明の抗体をペプチジル及び非ペプチジル結合パートナーのどちらとも結合させる適切な技術を当業者は周知しているであろう。適切な標識の例には、検出可能な標識（例えば放射能標識）又は酵素標識（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）又は化学的成分（例えばビオチン）が含まれる。或いはまた、標識は、機能性標識（例えばリシン）又はプロ-ドラッグ（前記は抗体の結合部位でプロドラッグを活性薬剤に変換することができる）であり得る。
【００５４】
多様なさらに別の特徴では、本発明は、本発明のイヌ化抗体、抗体フラグメント及び結合メンバーをコードするポリヌクレオチド、及び特に単離ポリヌクレオチドに及ぶ。本明細書に規定するように、“ポリヌクレオチド”は、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを含み、前記は、未改変RNA若しくはDNAでも又は改変RNA若しくはDNAでもよく、一本鎖及び二本鎖RNA並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNAを含む（ただし前記に限定されない）。本発明のポリヌクレオチド（例えば本発明の1つのポリペプチド又は複数のポリペプチドをコードする）には、その対立遺伝子変種及び／又はそれらの相補鎖（そのようなヌクレオチド配列と中等度の又は高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む）が含まれる。
本発明はさらに、抗体模倣物、例えば本発明のイヌ化TNF抗体を土台にするドメイン抗体、ナノボディ、ユニボディ、バーサボディ及びデュオカリンに及ぶ。極めて多様な抗体模倣技術が当業者には知られている。例えば、いわゆるドメイン抗体（Domantis, UK）は、ヒト抗体の軽鎖又は重鎖のどちらかの可変領域に対応する抗体の小さな機能性結合ユニットである。そのようなドメイン抗体作製の指示は、米国特許6,291,158号、米国特許6,582,915号及び米国特許6,593,081号で見出すことができる。ナノボディは抗体誘導治療タンパク質であり、ラクダ科動物で見出される天然に存在する重鎖抗体の固有の構造的及び機能的特性を含む。ユニボディは、IgG4抗体のヒンジ領域の除去を基礎にした、さらに別の抗体フラグメント技術である。ヒンジ領域の欠損は、伝統的なIgG4抗体のほぼ半分のサイズであって一価の結合領域を有する分子を生じる。ユニボディは、不活性な、したがって免疫応答を誘発しないIgG4抗体の特性を保存する。
【００５５】
抗体の製造
本発明の抗体及び結合メンバーは化学的合成によって全体又はその一部分を製造できる。例えば、本発明の抗体及び結合メンバーは、当業者に周知の技術（例えば標準的な液体ペプチド合成又は固相ペプチド合成の方法）によって調製できる。或いはまた、該抗体及び結合メンバーは、液相ペプチド合成技術を用いて、又はさらに固相、液相及び溶液化学の組合せによって調製できる。
本発明はさらに、本発明の抗体を含む少なくとも1つのアミノ酸をコードする核酸を、所望のペプチド又はポリペプチドをコードし得る適切な発現系で発現させることによって本発明の抗体又は結合メンバーを製造することに及ぶ。例えば、軽鎖アミノ酸をコードする核酸及び重鎖アミノ酸をコードする第二の核酸を発現させ、本発明の抗体を提供することができる。
したがって、本発明のある種のさらに別の特徴では、本発明の抗体又は結合メンバーを形成するアミノ酸配列をコードする核酸が提供される。
典型的には、本発明の抗体又は結合メンバーを形成するアミノ酸配列をコードする核酸は、単離形若しくは精製形で提供されるか、又は天然では当該核酸に付随し得る物質を実質的に含まない（ただし例外として1つ以上の調節配列を有する）形態で提供され得る。本発明の抗体又は結合メンバーを発現する核酸は全体として又は部分として合成でき、前記にはDNA、cDNA及びRNAが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
【００５６】
本発明の抗体又は結合メンバーをコードする核酸は、当業者に周知の技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。前記は、例えば以下に記載されている技術である：Sambrook et al.“Molecular Cloning”, A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001（ISBN-0879695773）及びAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999（ISBN- 0471250929）。前記技術には（i）核酸サンプルの増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用、（ii）化学合成、又は（iii）cDNA配列の調製が含まれる。本発明の抗体又は結合メンバーをコードするDNAは当業者に公知の任意の適切な方法で生成及び使用され得る。前記方法は、コードDNAを採取し、発現されるべき部分のどちらかの側の適切な制限酵素認識部位を同定し、さらに前記部分をDNAから切り出す工程を含む。続いて、前記切り出した部分を適切なプロモーターに作動できるように連結し、さらに適切な発現系（例えば市場で入手できる発現系）で発現させることができる。或いはまた、DNAの関連する部分を適切なPCRプライマーを用いることによって増幅させることができる。DNA配列の改変は部位特異的変異導入を用いて実施できる。
【００５７】
本発明の抗体又は結合メンバーをコードする核酸配列は、上記に記載の少なくとも1つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物として提供することができる。前記構築物は、組換え宿主細胞（上記のような1つ以上の構築物を含む）内に含まれ得る。発現は、便利には適切な条件下で、適切な核酸配列を含む組換え宿主細胞を培養することによって達成できる。発現に続いて、適切な任意の技術を用いて抗体又は抗体フラグメントを単離及び／又は精製し、続いて適切に使用することができる。
多様な種々の宿主細胞でポリペプチドをクローニング及び発現させる系は良く知られている。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現に当業界で利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞及びNS0マウスミエローマ細胞が含まれる。一般的で好ましい細菌宿主は大腸菌（E. coli）である。抗体及び抗体フラグメントの原核細胞（例えばE. coli）での発現は当業界ではしっかりと確立されている。培養真核細胞での発現もまた、結合メンバーの製造のための選択肢として当業者は利用できる。
抗体を製造する一般的な技術を当業者は周知であり、そのような方法は、例えば以下で考察されている：Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497；米国特許4,376,110号；Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor。組換え抗体分子の調製技術は、上記の参考文献に及び例えば欧州特許0,368,684号にも記載されている。
【００５８】
本発明のある実施態様では、抗体又は結合メンバーの重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸が利用される。規定すれば、そのような核酸は、前記コード核酸又はその相補性核酸から成る一本鎖、二本鎖核酸、又はこれら相補性（一本鎖）核酸そのものをコードする。
さらにまた、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に存在する重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメイン又はその変異体をコードする真性の配列を有する、酵素的に又は化学的に合成された核酸であり得る。
本発明の抗体は、組換え手段によって、直接的に製造されるだけでなく異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても製造することができる（前記異種ポリペプチドは、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのN-末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである）。優先的に選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセッシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。本来の抗体のシグナル配列を認識及びプロセッシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核細胞シグナル配列によって代用される。
【００５９】
“単離された”という用語は、本発明のイヌ化抗体、又は前記に由来する結合メンバー、又は前記をコードするポリヌクレオチドに関して用いられるとき、前記抗体、結合メンバー又は核酸（ポリヌクレオチド）が単離及び／又は精製された形態で提供され（すなわちそれらはそれらの天然の環境から分離されてあるか、単離されてあるか、又は精製されてある）、さらに実質的に純粋若しくは均質な形態で提供され、又は核酸の場合には必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源を有する核酸又は遺伝子を含まないか又は実質的に含まない状態を指す。したがって、そのような単離抗体、結合メンバー及び単離核酸は、それらに天然の状態で付随する物質（例えばそれらがその天然の環境で、又はそのような調製が組換えDNA技術によってin vitro又はin vivoで実施されるときそれらが調製される環境（例えば細胞培養）で一緒に見出される他のポリペプチド又は核酸）を含まないか又は実質的に含まないであろう。
抗体、結合メンバー及び核酸は希釈剤又はアジュバントとともに処方することができ、さらに実用的な目的のために単離された形態で提供されると考えられる。例えば、抗体及び結合メンバーは、イムノアッセイで使用するためにマイクロタイタープレートの被覆に用いられる場合にはゼラチン又は他の担体と混合され得る。また前記は、診断又は治療で用いられるときには医薬的に許容できる担体又は希釈剤と混合されるであろう。抗体又は結合メンバーは、天然の態様によって又は異種真核細胞（例えばCHO又はNSO細胞）系によってグリコシル化されていてもよく、またそれらは（例えば原核細胞での発現によって製造される場合には）グリコシル化されてなくてもよい。
抗イヌTNFイヌ化抗体分子を含む不均質調製物もまた本発明の部分を形成する。例えば、そのような調製物は、完全長の重鎖及びC-末端リジンを欠く重鎖を有する抗体、種々の程度のグリコシル化を示す抗体、及び／又は誘導アミノ酸（例えばピログルタミン酸残基の形成のために環化されたN-末端グルタミン酸）を有する抗体の混合物であり得る。
【００６０】
医薬組成物
典型的には、本発明の医薬組成物は、液体処方物、凍結乾燥処方物、液体として再構成される凍結乾燥処方物、又はエーロゾル処方物として処方される。ある実施態様では、処方物中の抗体は、約0．5mg/mLから約250mg/mL、約0.5mg/mLから約45mg/mL、約0.5mg/mLから約100mg/mL、約100mg/mLから約200mg/mL、又は約50mg/mLから約250mg/mLの濃度で存在する。
ある実施態様では、処方物はさらに緩衝剤を含む。典型的には、処方物のpHは約pH5.5から約pH6.5である。ある実施態様では、緩衝剤は約4mMから約60mMのヒスチジン緩衝液、約5mMから約25mMのコハク酸緩衝液、又は約5mMから25mMの酢酸緩衝液を含むことができる。ある実施態様では、緩衝液は、約10mMから300mMの濃度、典型的には125mM周辺の濃度の塩化ナトリウム、及び約5mMから50mM、典型的には25mMの濃度のクエン酸ナトリウムを含む。ある実施態様では、処方物はさらにちょうど0％を超えて0.2％の濃度の界面活性剤を含むことができる。ある実施態様では、界面活性剤は、ポリソルベート-20、ポリソルベート-40、ポリソルベート-60、ポリソルベート-65、ポリソルベート-80、ポリソルベート-85及び前記の組合せから成る群から選択される（ただしこれらに限定されない）。好ましい実施態様では、界面活性剤はポリソルベート-20であり、さらに約125mMの濃度の塩化ナトリウム及び約25mMの濃度のクエン酸ナトリウムを含むことができる。
【００６１】
投与
本発明の抗体又は結合メンバーは単独で投与できるが、好ましくは医薬組成物として投与されるであろう。前記医薬組成物は、一般的には意図する投与経路にしたがって選択される医薬的に許容できる適切な賦形剤、希釈剤又は担体を含むであろう。適切な医薬担体の例には、水、グリセロール、エタノールなどが含まれる。
本発明のモノクローナル抗体又は結合メンバーは、任意の適切な経路により治療の必要があるイヌ患畜に投与できる。典型的には、組成物は注射又は輸液により非経口的に投与できる。非経口的投与の好ましい経路の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜、吸入又は経皮投与。投与経路はさらに、局所及び経腸、例えば粘膜（肺を含む）、口、鼻、直腸を含むことができる。
組成物が、注射用組成物として（例えば静脈内、皮内又は皮下適用で）デリバーされる実施態様では、活性成分は非経口的に許容できる水溶液（発熱因子を含まず適切なpH、張度及び安定性を有する）の形態として存在し得る。当業者は、例えば等張なベヒクル（例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液又は乳酸リンゲル注射液）を用いて適切な溶液を容易に調製できる。保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加物も必要に応じて含むことができる。
組成物はまた微小球、リポソーム、他の微粒子デリバリー系、又は血液を含むある種の組織に配置される徐放性処方物により投与され得る。
【００６２】
上記に記載の技術及びプロトコール並びに本発明で用いることができる他の技術及びプロトコールの例は以下で見出すことができる：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7（前記文献の全内容は参照により本明細書に含まれる）。
本発明の抗体及び組成物は、典型的には“治療的に有効な量”で対象動物に投与される（前記の量は該組成物が投与される対象動物に利益を示すために十分な量である）。投与される実際の用量並びに投与の頻度及びタイムコースは、治療される症状の性質及び重篤性とともに、治療される対象動物の齢、性別及び体重の他に投与経路に左右され、当然それらを参考にして決定できる。さらにまた当然の斟酌が、組成物の特性、例えばその結合活性及びin vivo血中寿命、処方物中の抗体又は結合メンバーの濃度とともにデリバリーの経路、部位及び頻度に対して払われるべきである。
【００６３】
投薬レジメンには、本発明の抗体又は組成物の1回投与、又は抗体若しくは組成物の複数回投与が含まれる。抗体又は抗体含有組成物はさらに、本発明の抗体又は結合メンバーが治療のために投与される当該症状の治療に用いられる他の治療薬及び医薬に連続して又は前記と別々に投与され得る。
対象動物に実施できる投薬レジメンの例は以下を含む群から選択できる（ただしこれらに限定されない）：1μg/kg/日から20mg/kg/日、1μg/kg/日から10mg/kg/日、10μg/kg/日から1mg/kg/日。ある実施態様では、投薬は、1μg/kgから100μg/kgの抗体血中濃度が得られるものであろう。しかしながら実際の組成物の投与用量並びに投与の頻度及びタイムコースは、治療される症状の性質及び重篤性に左右されるであろう。治療の処方（例えば投薬量の決定など）は、最終的には獣医学技術者及び他の獣医師の対応能力の範囲及び自由裁量内にあり、典型的には治療される疾患、個々の患畜の状態、デリバリー部位、投与方法、及び技術者に公知の他の要因が考慮されるであろう。
【００６４】
定義
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明の分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。用語の意味及び範囲は明瞭であるべきであるが、何らかのあいまいさが存在する場合には、本明細書で提供する定義が一切の辞書又は非本質的な定義を超える先例となる。
本明細書を通して、文脈が特段に要求しないかぎり、“comprise”若しくは“include”又は変型、例えば“comprises”若しくは“comprising”、“includes”若しくは“including”は、記述された整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群も排除しないことを暗示すると理解されよう。
本明細書で用いられるように、例えば“a”、“an”及び“the”という用語は、文脈がそうでないことを明瞭に要求しないかぎり単数及び複数の該当語を含む。したがって、例えば、“an active agent”又は“a pharmacologically active agent”と言えば、ただ1つの活性薬剤だけでなく2つ以上の組み合わされた異なる活性薬剤を含み、一方、“a carrier”と言えば、ただ1つの担体と同様に2つ以上の担体の混合物も含まれる。さらにまた、文脈がそうでないことを要求しないかぎり、単数用語は複数形を含み、複数用語は単数形を含むであろう。
【００６５】
本明細書に規定されるように、TNF中和抗体という用語又は類似の用語は、TNFの生物学的活性及びシグナル伝達を中和することができる抗体を指す。中和抗体（アンタゴニスト抗体又は遮断抗体とも称され得る）は、特異的に及び好ましくは選択的にTNFと結合し、TNFの1つ以上の生物学的活性を阻害する。例えば、中和抗体はTNFとその標的リガンド（例えば細胞膜結合TNFレセプター1（TNFR1）レセプター（CD120a））との結合を阻害することができる。
本明細書で用いられるように、“生物学的活性”という用語は、ある分子（in vivoで見出されるように天然に存在するにせよ、または組換え手段によって提供され若しくは与えられるにせよ）の任意の1つ以上の内在的生物学的特性を指す。生物学的特性には、レセプター結合及び／又は活性化、細胞のシグナル伝達又は細胞増殖の誘発、細胞増殖阻害、サイトカイン産生の誘発、アポトーシス及び酵素活性の誘発が含まれるがただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“相補性決定領域（CDR）”という用語は、本来の免疫グロブリン結合部位の天然のFv領域の結合親和性及び特異性を共同して規定するアミノ酸配列を指し、前記はKabatら（Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242）によって正確に示された。本明細書で用いられるように、フレームワーク領域（FR）という用語は、CDRの間に介在するアミノ酸配列を指す。抗体のこれらの部分は、CDRを適切な向きで保持する（CDRが抗原と結合することを可能にする）ために機能する。
【００６６】
本明細書で用いられる“定常領域（CR）”という用語は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。本発明では、定常領域は典型的にはイヌ定常領域を意味し、それは、対象のイヌ化抗体の定常領域はイヌ免疫グロブリンに由来するということである。重鎖定常領域は、4つのアイソタイプ（A、B、C又はD）のいずれかから選択できる。
本明細書で用いられる“キメラ抗体”という用語は、2つの異なる抗体（異なる種に由来する）に由来する配列を含む抗体を指す。もっとも典型的には、キメラ抗体は、ドナー種に由来する可変ドメイン（標的エピトープに特異的に結合する）及び該抗体が投与される標的種から得られた抗体に由来する定常ドメインを含む。
本明細書で用いられる“免疫原性”という用語は、レシピエントに投与されたときに、免疫応答（液性又は細胞性）を誘引するターゲティングタンパク質又は治療部分の能力の強さを指す。本発明は対象のイヌ化抗体の免疫原性に関する。好ましくは、本発明の抗体は免疫原性をもたず、それは、イヌに投与されたときそれらに対して異種抗体が生じないということである。
本明細書で用いられる“同一性”又は“配列同一性”という用語は、アラインメントを実施した配列の任意の個々のアミノ酸残基位置で、アミノ酸残基が該アラインメント実施配列間で同一であることを意味する。本明細書で用いられる“類似性”又は“配列類似性”という用語は、アラインメントを実施した配列の任意の個々の位置で、アミノ酸残基が該配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンはロイシンに置換され得る。前記は保存的置換と称することができる。好ましくは、本発明のアミノ酸配列をその中に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換の態様によって改変するとき、これらの改変は、生じた抗体の結合特異性又は機能的活性に対して未改変抗体と比較して全く影響を及ぼさない。
【００６７】
本発明の（本来の）ポリペプチド及びその機能的誘導体に対する配列同一性は、配列アラインメントを実施し、配列同一性の部分として保存的置換を全く考慮することなく、最大相同性パーセンテージを達成するために必要な場合にはギャップを導入した後の、対応する本来のポリペプチドの残基と同一である該候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージに関する。N-末端若しくはC-末端伸長も挿入も、配列同一性又は類似性の減少とは解されないであろう。2つ以上のアミノ酸配列のアラインメントを実施し、それらの配列同一性又は相同性を決定する方法及びコンピュータープログラムは当業者には周知である。例えば、2つのアミノ酸配列の同一性又は類似性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばBLAST（Altschul et al. 1990）、FASTA（Pearson & Lipman 1988）、又はスミス-ウォーターマン（Smith-Waterman）アルゴリズム（Smith &  Waterman 1981）を用いて容易に計算することができる。
本明細書で用いられるように、第二のアミノ酸残基に対して“最高の相同性”を有するアミノ酸残基と言えば、該第二のアミノ酸残基と共通であるもっとも多くの特徴又は特性を有するアミノ酸残基を指す。あるアミノ酸残基が第二のアミノ酸残基と最高の相同性を有するか否かの決定では、典型的には、複数の因子、例えば電荷、極性、疎水性、サイドアームの質量及びサイドアームの大きさ（ただしこれらに限定されない）に関して評価が実施され得る。
第一の配列の個々のアミノ酸残基と一致する位置で第二の配列に存在するアミノ酸残基を指すために本明細書で用いられる“対応する位置”という用語は、2つの配列間で最大の配列同一性が可能となるように2つの配列でアラインメントを実施したとき、第一の配列の位置と同じ位置である第二の配列の位置を指すことが意図される。対応する位置のアミノ酸残基は同じKabat番号を有する。
【００６８】
本明細書で用いられる“本質的に〜から成る”又は“本質的に〜から成って”という用語は、ポリペプチドが記載されたものの他に追加される特色又は成分を有することができることを意味するが、ただしそのような追加の特色又は成分が、当該抗体又は抗体フラグメントのイヌTNFに対する結合特異性を有する能力に実質的に影響を及ぼさないことを条件とする。すなわち、該ポリペプチドを含む抗体又は抗体フラグメントは、イヌTNFと結合し、さらにイヌTNFの機能的活性と拮抗する該抗体又は抗体フラグメントの能力に干渉しない追加の特色又は成分を有することができる。そのような改変は、該抗体の免疫原性を低下させるためにアミノ酸配列に導入することができる。例えば、本質的に規定配列から成るポリペプチドは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つ以上の追加された、欠失された又は置換されたアミノ酸を該配列のどちらかの末端又は両端に含むことができるが、ただしこれらのアミノ酸が、イヌTNFとの結合及びその生物学的機能の停止における該抗体又はフラグメントの役割に対して干渉、阻害、遮断又は妨害をもたらさないことを条件とする。同様に、本発明のイヌTNFアンタゴニスト抗体に寄与するポリペプチドは1つ以上の官能基で化学的に改変できるが、ただしそのような官能基が、イヌTNFと結合しその機能と拮抗する該抗体又は抗体フラグメントの能力に干渉しないことを条件とする。
【００６９】
本明細書で用いられるように、“有効な量”又は“治療的に有効な量”という用語は、イヌTNFとTNFR1レセプターとの結合の抑制に必要な本発明の物質、結合化合物、小分子、融合タンパク質又はペプチド模倣体の量を意味する。
“ポリペプチド”、“ペプチド”又は“タンパク質”という用語は、本明細書では互換的に用いられ、隣接残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された線状の一連のアミノ酸残基を指す。アミノ酸残基は通常は天然の“L”異性体型である。しかしながら、該ポリペプチドが所望の機能的特性を維持するかぎり、“D”異性体型の残基で任意のL-アミノ酸残基を置換することができる。
本明細書で規定されるように、“抗体”は、問題の標的抗原（この場合は腫瘍壊死因子）と特異的に結合する抗原結合タンパク質（組換えにより調製される1つ以上のポリペプチドを有するか、又は免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって遺伝的にコードされる）を包含する。“抗体”という用語は、モノクローナル抗体及びキメラ抗体（特にイヌ化抗体）を包含し、さらにまたポリクローナル抗体又は任意のクラス若しくはサブタイプの抗体を包含する。“抗体”はさらにハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヘテロ抗体、及び抗原結合を維持する前記の機能的フラグメントに及ぶ。
【００７０】
“特異的に結合する”という語句は、タンパク質の不均質集団中に存在する特異的なタンパク質又は標的と抗体の結合を指す。したがって、特異的な免疫アッセイ条件にあるときは、抗体は特定のタンパク質（この場合にはイヌTNF）と結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質と有意な量では結合しない。
本明細書で規定されるように、“イヌ科の動物（canine）”はまたイヌとも称されることがある。イヌ科の動物は、三名法名称により亜種、カニス・ルプス・ファミリアリス（Canis lupus familiaris）（カニス・ファミリアリス・ドメスチクス（Canis familiaris domesticus））又はカニス・ルプス・ディンゴ（Canis lupus dingo）に属するように分類され得る。イヌ科の動物には任意の犬種が含まれ、さらに野生品種及びペット品種が含まれ、後者はまたコンパニオンアニマルとも称される。
本明細書で規定するように、“異種抗体”は、宿主にとって異質であるエピトープに対して宿主によって生成される抗体を指す。
本発明を以下の実施例を参照しながらこれから説明する。これらの実施例は例証のために提供し、本発明を限定するものと解されることを意図しない。本発明の方法及び技術は、概して、特段の指示がなければ当業界で周知の通常的な方法にしたがい、さらに本明細書中で引用及び考察した多様な一般的及びより具体的な引用文献の記載にしたがって実施される。
【実施例１】
【００７１】
ペチセーション実施イヌ抗イヌTMF MAbをコードするDNAの発現
配列番号：1から配列番号：9の配列を設計し、オリゴヌクレオチドを用いてDNAとして構築し、pcDNA3.1+発現ベクターでサブクローニングし、CHO細胞に多様な組み合わせでトランスフェクトした。
配列番号：3（軽鎖）及び配列番号：5（重鎖）のアミノ酸配列を有するイヌ化抗TNFモノクローナル抗体、及び配列番号：8のアミノ酸の軽鎖及び配列番号：9の重鎖を有するキメラ抗TNFモノクローナル抗体をコードするcDNAをpcDNA3.1+（Invitrogen/Life Technologies）でサブクローニングした。配列番号：3及び配列番号：5のイヌ化重鎖及び軽鎖配列（ca-HCB＋ca-kLC）又は配列番号：8及び配列番号：9のキメラ重鎖及び軽鎖（ch-HCB＋ch-kLC）のどちらかの組合せをCHO細胞にトランスフェクトした。得られた上清をプロテインAで精製し、SDS-PAGEで分析し（図10A）、さらにイヌTNFaとの結合について（5μg/mLで被覆；R&D systems）表示の抗体濃度（μg/mL）でELISAによって試験し、抗イヌポリクローナル抗体-セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合物（Sigma A9042）を用いて検出した（図10B）。陰性コントロールは被覆抗原単独への検出ポリクローナル抗体であった。
【実施例２】
【００７２】
イヌTNF活性の阻害
精製抗体をそれらのイヌTNF活性阻害能力について試験した。前記試験には、蛍光によってヒトTNFに応答するTNF感受性NF-kB-EGFPレポーター細胞株を作製するためにpTRH1をトランスフェクトした293-HEK細胞を用いた（Vince et al, Cell 131, 682, 2007）。イヌTNFはこれらの細胞でGFP発現を活性化することが最初に示され、続いて図11に示したイヌ抗体を1ng/mLのイヌTNFを阻害するそれらの能力について試験した。
図11に示すように、配列番号：3及び配列番号：5の共トランスフェクションにより生成されたイヌ化抗体（ca-HCB＋ca-kLC）並びに配列番号：8及び配列番号：9のトランスフェクションにより生成されたキメラ抗体（ch-HCB＋ch-kLC）は両方ともこのアッセイではイヌTNFの強力な阻害剤である。
これらの結果は共同して、本発明のイヌ化抗体及びヒト-イヌキメラ構築物は、イヌTNFと結合しELISA及び阻害アッセイの両方で等価の能力を有することを示し、このイヌ化プロセスは最初のD2E7抗体の完全な活性を有するイヌバージョンを生じることを示した。
【００７３】
図12(a)は、イヌ化及びキメラD2E7モノクローナル抗体（MAb）と抗ヒトTNF MAbクローン148を土台にしたさらに別のイヌ化抗体との比較を示す。イヌ化抗huTNF MAb148（配列番号：18（ca148＋HCB）及び配列番号：19（ca148＋kLC））をCHO細胞で発現させ、プロテインAクロマトグラフィーを用いて精製した（パネルA、左レーン）。ヒトTNF（パネルB）及びイヌTNF（パネルC）との結合について、前記MAbを図10及び11のイヌ化（Ca）及びキメラ（Ch）D2E7系MAbと比較して試験した（バックグラウンド陰性コントロール結合は矢印で示されている）。パネルB及びCから、イヌ化MAb148はヒトTNFと結合するが（パネルB）、イヌTNFとは結合しない（パネルC）ことが分かる。したがって、D2E7を土台にしたイヌ化及びキメラMAb並びに本発明の対象物は、予期に反してヒトTNFとの結合と等価の強いイヌTNFとの結合を示すが、イヌ化MAb148はヒトTNFとのみ結合することが示された。したがって、イヌ化D2E7系MAbは驚くべきことに、イヌTNFによって媒介されるイヌ疾患の治療に有用である。図12(b)及び12(c)は、イヌ化MAb148の重鎖のアミノ酸配列（配列番号：18）及びイヌ化MAb148の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：19）をそれぞれ示している。
【００７４】
図13は、TNF発現細胞の補体殺滅の媒介におけるイヌ化D2E7モノクローナル抗体の活性を示す。RAW細胞を10ng/mLのLPSで処理（カラム1−3）し又は処理しないで（カラム4−6）、膜結合TNF及び分泌TNF発現を誘導した。続いて、10μg/mLのイヌ化抗TNF抗体（ca-HCB＋ca-kLC）の存在下又は非存在下で、前記細胞を血清で処理した。カラム1及び4は血清＋抗体、カラム2及び5は血清のみ、カラム3及び6は無血清無抗体。細胞の殺滅は、トリパンブルー染色死細胞の計測によって判定した。特異的な細胞殺滅は、イヌ化抗体、血清及びLPS処理（カラム1）でのみ観察された。図13で分かるように、イヌ化抗体及び血清の組合せによるその後の処理はトリパンブルー染色によって測定される特異的細胞死を誘導し、一方、抗体又は血清だけでは細胞死を誘導できなかった。そのような抗体のイヌへの注射はイヌTNF発現細胞数をin vivoで減少させ、長期の抗炎症作用をもたらすであろう。
【００７５】
本明細書に引用した全ての文書類は参照により本明細書に含まれる。本発明に記載した実施態様の多様な改変及び変型が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者には明白であろう。本発明を特定の好ましい実施態様との関連でこれまで説明してきたが、特許請求の範囲に記載した本発明はそのような個々の実施態様に限定されるべきではないことは理解されよう。実際のところ、本発明の実施に関して記載した態様の当業者に明白な多様な改変は本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１Ｃ】
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【図１２（ａ）】
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【図１２（ｂ）】
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【図１２（ｃ）】
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【図１３】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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