(57)【要約】  本開示は、セルロースおよび／またはヘミセルロースの分解に有用な、Caldicellulosiruptor besciiから単離された耐熱性酵素およびそのフラグメント（耐熱性セルラーゼおよびヘミセルラーゼが挙げられる）を提供する。本開示はさらに、本開示の耐熱性酵素をコードする核酸を提供する。本開示はまた、本開示の耐熱性酵素を用いてセルロースおよびヘミセルロースを発酵性糖へ変換する方法を提供する。本開示はまた、本明細書に開示されている複数の酵素を含んでいる酵素カクテルを提供する。本酵素は、セルロースまたはヘミセルロース中に存在する糖を、その後の、付加価値のある産物を生産するための発酵のために遊離させることに利用され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる、宿主細胞。
【請求項２】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される３つの組換え核酸を含んでいる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される４つの組換え核酸を含んでいる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される５つの組換え核酸を含んでいる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される６つの組換え核酸を含んでいる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、
ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、
ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、
ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、
ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、
ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、および
ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：
からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる、宿主細胞。
【請求項７】
エンドキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、およびアセチルキシランエステラーゼからなる群より選択される少なくとも２つの酵素を生産する方法であって、
請求項１〜６の何れか１項に記載の宿主細胞を、培養培地中、エンドキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、およびアセチルキシランエステラーゼを生産するのに適当な条件下で培養することを含んでいる、方法。
【請求項８】
１つ以上の組換え核酸をさらに含んでおり、当該組換え核酸はＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする、請求項１〜６の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
２つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの２つ以上をコードする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
３つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの３つ以上をコードする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
４つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの４つ以上をコードする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
５つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの５つ以上をコードする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
６つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの６つをコードする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、および４６からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１、および１１１からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１、および７６からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７、および１１３からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９、および１００からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６の配列を有する、請求項８〜１３の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４６の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号１１１の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７６の配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号１１３の配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号１００の配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６の配列を有する、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９、および４７からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３、および１１０からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５、および７７からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９、および１１２からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０、および１０１からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７の配列を有する、請求項８〜１３の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４７の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１０の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号７７の配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１２の配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０１の配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７の配列を有する、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１、および１０７の配列を有する６つの組換え核酸をさらに含んでいる、請求項１〜６の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
配列番号４６、１１１、７６、１１３、１２４、１２６、１２８、および１００からなる群より選択される配列を有する１つ以上のポリペプチドをコードする、１つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる、請求項１〜６の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、
当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする、宿主細胞。
【請求項２１】
２つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの２つ以上をコードする、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
３つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの３つ以上をコードする、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
４つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの４つ以上をコードする、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
５つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの５つ以上をコードする、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
６つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は上記ポリペプチドのうちの６つをコードする、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、および４６からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１、および１１１からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１、および７６からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７、および１１３からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９、および１００からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６の配列を有する、請求項２０〜２５の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４６の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号１１１の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７６の配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号１１３の配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号１００の配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６の配列を有する、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９、および４７からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３、および１１０からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５、および７７からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９、および１１２からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０、および１０１からなる群より選択される配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７の配列を有する、請求項２０〜２５の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
上記Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４７の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１０の配列を有し；
上記Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号７７の配列を有し；
上記Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１２の配列を有し；
上記Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０１の配列を有し；
上記Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７の配列を有する、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
６つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸は配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１、および１０７の配列を有する、宿主細胞。
【請求項３１】
１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸は配列番号４６、１１１、７６、１１３、１２４、１２６、１２８、および１００からなる群より選択される配列を有する１つ以上のポリペプチドをコードする、宿主細胞。
【請求項３２】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる、請求項２０〜３１の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される３つの組換え核酸を含んでいる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される４つの組換え核酸を含んでいる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される５つの組換え核酸を含んでいる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される６つの組換え核酸を含んでいる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、
ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、
ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、
ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、
ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、
ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、および
ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：
からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる、請求項２０〜３１の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
ａ）請求項２０〜３７の何れか１項に記載の宿主細胞を、培養培地中、上記組換え核酸の発現を支持するのに十分な条件下で培養すること；および
ｂ）上記培地および／または上記宿主細胞から、１つ以上のセルラーゼを回収すること：を含んでいる、１つ以上のセルラーゼを生産する方法。
【請求項３９】
上記組換え核酸のうちの２つ以上が、連続的なポリデオキシリボヌクレオチド鎖に存在する、請求項１〜６および８〜３７の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
Escherichia、Pseudomonas、Proteus、Ralstonia、Streptomyces、Staphylococcus、Lactococcus、Bacillus、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Aspergillus、Chrysosporium lucknowense、およびTrichoderma reeseiからなる群より選択される、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
請求項１〜１９の何れか１項に記載の宿主細胞と培養培地とを含んでいる、組成物。
【請求項４２】
２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物であって、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択される、組成物。
【請求項４３】
６つの組換えタンパク質を含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される１つ以上の組換えポリペプチドをさらに含んでいる、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４５】
上記組換えＣｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、および４６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１、および１１１のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１、および７６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７、および１１３のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９、および１００のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
６つの組換えポリペプチドをさらに含んでおり、当該組換えポリペプチドは配列番号４６、１１１、７６、１１３、１００、および１０６のポリペプチドである、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４７】
１つ以上の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、当該１つ以上の組換えポリペプチドは配列番号４６、１１１、７６、１１３、１２４、１２６、１２８、および１００のポリペプチドからなる群より選択される、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４８】
１つ以上の組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該１つ以上の組換えポリペプチドはＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される、組成物。
【請求項４９】
上記ポリペプチドのうちの２つ以上を含んでいる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
上記ポリペプチドのうちの３つ以上を含んでいる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
上記ポリペプチドのうちの４つ以上を含んでいる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
上記ポリペプチドのうちの５つ以上を含んでいる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
上記ポリペプチドのうちの６つ以上を含んでいる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
上記組換えＣｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、および４６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１、および１１１のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１、および７６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７、および１１３のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９、および１００のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである、請求項４８〜５３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
上記組換えＣｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４６のポリペプチドであり；
上記組換えＣｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号１１１のポリペプチドであり；
上記組換えＣｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７６のポリペプチドであり；
上記組換えＣｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号１１３のポリペプチドであり；
上記組換えＣｂ６２９ポリペプチドは、配列番号１００のポリペプチドであり；
上記組換えＣｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
６つの組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該組換えポリペプチドは配列番号４６、１１１、７６、１１３、１００、および１０６のポリペプチドである、組成物。
【請求項５７】
１つ以上の組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該１つ以上の組換えポリペプチドは配列番号４６、１１１、７６、１１３、１２４、１２６、１２８、および１００のポリペプチドからなる群より選択される、組成物。
【請求項５８】
２つ以上の組換えタンパク質をさらに含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択される、請求項４８〜５７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
６つの組換えタンパク質を含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
リグノセルロース含有材料を分解する方法であって、
ａ）リグノセルロース含有材料を、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項４１〜５９の何れか１項に記載の組成物と接触させること；および
ｂ）上記宿主細胞または組成物とリグノセルロース含有材料とを、リグノセルロース分解を支持する条件下でインキュベートすることを含んでいる、方法。
【請求項６１】
上記宿主細胞は、分解されたリグノセルロースを発酵産物に変換するのに必要な酵素をさらに含んでいる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
リグノセルロース含有材料を発酵産物に変換する方法であって、
リグノセルロース含有材料を、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞と接触させること；および、当該宿主細胞を、リグノセルロース含有材料から発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでいる、方法。
【請求項６３】
前処理されたリグノセルロース含有材料の粘度を低下させる方法であって、
前処理されたリグノセルロース含有材料を、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項４１〜５９の何れか１項に記載の組成物と接触させることを含んでいる、方法。
【請求項６４】
上記リグノセルロースはヘミセルロースを含んでいる、請求項６０〜６３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６５】
上記リグノセルロースはセルロースを含んでいる、請求項６０〜６４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６６】
バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、
バイオマスを、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項４１〜５９の何れか１項に記載の組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでいる、方法。
【請求項６７】
バイオマスを燃料に変換する方法であって、
バイオマスを、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項４１〜５９の何れか１項に記載の組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでいる、方法。
【請求項６８】
バイオマスを分解する方法であって、
バイオマスを、請求項１〜６、８〜３７および３９の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項４１〜５９の何れか１項に記載の組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでいる、方法。
【請求項６９】
上記リグノセルロース含有材料またはバイオマスは、請求項１〜６、８〜３７および４０の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項４１〜５８の何れか１項に記載の組成物と接触させる前に前処理に供され、
当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる、請求項６０〜６８の何れか１項に記載の方法。
【請求項７０】
上記リグノセルロース含有材料またはバイオマスは、植物材料である、請求項６０〜６９の何れか１項に記載の方法。
【請求項７１】
上記植物材料は、ススキ（Miscanthus）、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ（Blue Stem）、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケイン（energy cane）からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも一部が４０℃〜８０℃の温度において行われる、請求項６０〜７１の何れか１項に記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも一部が６０℃〜８０℃の温度において行われる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ヘミセルロースを分解する方法であって、
ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；および
ｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、上記ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、
上記ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、
上記処理する工程は、上記１つ以上の官能基を上記キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである、方法。
【請求項７５】
ヘミセルロースを分解する方法であって、
ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；および
ｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、上記ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、
上記ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、
上記処理する工程は、上記１つ以上の官能基を上記キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである、方法。
【請求項７６】
上記１つ以上の官能基は、アラビノース、グルクロニル、およびアセチルからなる群より選択される、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
上記処理する工程は、４０℃〜８０℃の温度において行われる、請求項７４〜７６の何れか１項に記載の方法。
【請求項７８】
上記処理する工程は、６０℃〜８０℃の温度において行われる、請求項７４〜７６の何れか１項に記載の方法。
【請求項７９】
Ｃｂ１５８１ポリペプチドをコードする組換え核酸をさらに含んでいる、請求項１〜６、８〜３７および３９〜４０の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
上記Ｃｂ１５８１ポリペプチドは、配列番号１４６の配列を有する、請求項７９に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
Ｃｂ１５８１ポリペプチドをさらに含んでいる、請求項４１〜４９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
上記Ｃｂ１５８１ポリペプチドは、配列番号１４６の配列を有する、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
上記リグノセルロース含有材料、バイオマス、植物材料、またはヘミセルロースを、Ｃｂ１５８１ポリペプチドと接触させることをさらに含んでいる、請求項６０〜７８の何れか１項に記載の方法。
【請求項８４】
上記Ｃｂ１５８１ポリペプチドは、配列番号１４６の配列を有する、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本願は、参照によって両方の全体が本明細書に援用される米国仮出願第６１／４２５，６２３号（出願日：２０１０年１２月２１日）および米国仮出願第６１／５３２，０６０号（出願日：２０１１年９月７日）の利益を主張する。
【０００２】
〔分野〕
本開示は、セルロース、ヘミセルロース、ならびにセルロースおよび／またはヘミセルロースを含有している材料の分解のための組成物および方法に関する。特に、本開示は、セルロースの分解のための耐熱性の酵素、当該酵素をコードする核酸、およびそれらの使用の方法を提供する。また、本開示は、ヘミセルロースの分解のための耐熱性の酵素、当該酵素をコードする核酸、およびそれらの使用の方法を提供する。本開示は、耐熱性のセルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼの活性を増強させる耐熱性の酵素、当該酵素をコードする核酸、ならびにそれらの使用の方法をさらに提供する。
【０００３】
〔ASCIIテキストファイルによる配列表の提出〕
ASCIIテキストファイルによる提出物（配列表のコンピュータ読取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：658012000940SeqListing.txt、記録日：２０１１年１２月７日、サイズ：５１３ＫＢ））の内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【０００４】
〔背景技術〕
生物燃料（例えばエタノール）へと糖を発酵させるために一般に使用されている微生物は、多くの場合、複雑な多糖（例えば、セルロースおよびヘミセルロース）を利用できない。結果として、リグノセルロース材料の、生物燃料への変換に、著しい支障が生じている。
【０００５】
植物における主要な構成成分であり、地球上における最も豊富な有機化合物であるセルロースは、β（１−４）結合した複数のＤ−グルコース分子の長鎖によって構成されている多糖である。糖を基本とするその組成のために、セルロースは、生物燃料の生産にとって潜在性の高い原料物質である。例えば、セルロース由来の糖は、生物燃料（例えばエタノール）に発酵され得る。生物燃料または他の汎用化学製品の生産のために使用されるセルロース内の糖のために、セルロースは、より小さい分子に分解される必要がある。
【０００６】
セルロースは、セルラーゼの作用によって酵素的に加水分解され得る。セルラーゼとしては、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼが挙げられる。セルラーゼの作用は、セルロースにおける１−４  β−Ｄ−グリコシド結合を切断し、複数のβ−Ｄ−グルコース分子の最終的な遊離をもたらす。個々の糖分子へのセルロースの分解の間に、種々の長さのグルコース重合体が、中間体の分解産物として形成され得る。セルロースの加水分解に由来する長さ約２〜６分子のグルコース重合体は、「セロデキストリン」または「セロオリゴ糖」と呼ばれる。
【０００７】
ヘミセルロースは、多くの植物（例えば、多年生草本であるスイッチグラスおよびススキ（Miscanthus））における多糖のうちの２番目に多い成分をなす。ヘミセルロースは、アラビノース、グルクロニル基およびアセチル基の側鎖を伴っているキシロース結合骨格を有する複雑な多糖である。ヘミセルロースの構造モデルは、β−１，４−結合において互いにつながれているキシロース骨格残基を模式化している（図１）。種々の官能基（アセチル（Ａｃ）基のエステル、アラビノース、グルクロン酸、およびフェロリル基のエステルが挙げられる）が、骨格を修飾している。フェロリル基は、全体の構造をリグニンに連結している。ヘミセルロースを、その主要な構成糖（例えば、キシロース（五炭糖）およびアラビノース（五炭糖））に加水分解する酵素カクテルは、リグノセルロースを基本とする供給原料からの、生物燃料の生産用の発酵性糖を著しく増加させる。また、ヘミセルラーゼによるヘミセルロースの酵素的な除去は、植物の細胞壁またはリグノセルロース供給原料のセルロース成分に対するセルラーゼの接近容易性を向上させる。したがって、ヘミセルロースの分解は、生物燃料の生産用のリグノセルロース供給原料の利用において重要な工程である。
【０００８】
耐熱性酵素は、非耐熱性酵素と比べて、リグノセルロースを基本とする材料を生物燃料に変換することに関する他の処理との適合性であるので、耐熱性酵素は、セルロースおよびヘミセルロースの効率的な分解にとって特に望ましい。例えば、セルロースの結晶性を低下させるための、リグノセルロースを基本とする材料の処理は、非耐熱性酵素を不活性化する高温を必要とし得る。
【０００９】
さらに、耐熱性酵素は、それらの中温性の対応物と比べてより高い比活性を有し、かつ微生物汚染のリスクを低下させるか、または排除する高温において作用し得るので、耐熱性酵素は、セルロースおよび／またはヘミセルロースの分解にとって望ましい。
【００１０】
したがって、セルロースおよび／またはヘミセルロースを分解可能な耐熱性酵素および酵素カクテルに対する要求がある。
【００１１】
〔簡単な要約〕
本開示は、セルロースおよび／またはヘミセルロースの分解が可能な耐熱性酵素に対する要求を満たす酵素および酵素カクテルを提供する。いくつかの局面において、本開示は、セルラーゼ活性を有する酵素を提供する。いくつかの局面において、本開示は、セルラーゼ活性を有する短縮型酵素を提供する。いくつかの局面において、本開示は、セルロース含有材料の分解のための、改良された酵素混合物を提供する。いくつかの局面において、本開示は、ヘミセルラーゼ活性を有する酵素を提供する。いくつかの局面において、本開示は、ヘミセルロース含有材料の分解のための、改良された酵素混合物を提供する。本開示はさらに、セルロースおよびヘミセルロースの両方を含んでいる材料に対する活性が向上した、１つ以上のセルラーゼおよび１つ以上のヘミセルラーゼを含んでいる酵素カクテルであって、セルラーゼとヘミセルラーゼとの混合物が相乗的な活性を有する酵素カクテルを提供する。本開示はさらに、セルラーゼまたはヘミセルラーゼ活性を有する酵素の活性が高められたポリペプチド、および／またはその混合物を提供する。さらに本開示は、本明細書に開示されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。本明細書に開示されているポリペプチドは、単独で、または組み合わせて、または他の酵素と共に利用され得る。
【００１２】
一実施形態において、本開示は、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を提供する。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される３つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞が提供される。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される４つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞が提供される。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される５つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される６つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞が提供される。
【００１３】
別の実施形態において、本開示は、宿主細胞であって、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本開示は、宿主細胞であって、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでおり、１つ以上のセルラーゼをコードする１つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本開示は、宿主細胞であって、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでおり、Escherichia spp.、Pseudomonas spp.、Proteus spp.、Ralstonia spp.、Streptomyces spp.、Staphylococcus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Aspergillus spp.、Chrysosporium lucknowense、またはTrichoderma reeseiからなる群より選択される宿主細胞を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本開示は、エンドキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、およびアセチルキシランエステラーゼからなる群より選択される少なくとも２つの酵素を生産する方法であって、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培養培地中、エンドキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、およびアセチルキシランエステラーゼを生産するのに適当な条件下で培養することを含んでいる方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本開示は、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞、および培養培地を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本開示は、２つ以上の組換えタンパク質を含んでおり、当該組換えタンパク質が配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択される、組成物を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本開示は、６つの組換えタンパク質を含んでおり、当該組換えタンパク質が配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択される、組成物を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本開示は、２つ以上の組換えタンパク質を含んでおり、当該組換えタンパク質が配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択される組成物であって、１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含んでいる組成物を提供する。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得る方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させる前に前処理に供され、当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる方法を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ（Blue Stem）、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケイン（energy cane）からなる群より選択される植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得る方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させる前に前処理に供され、当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる方法を提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインからなる群より選択される植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００２９】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得る方法を提供する。
【００３０】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させる前に前処理に供され、当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる方法を提供する。
【００３１】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００３２】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインからなる群より選択される植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該１つ以上の官能基は、アラビノース、グルクロニル、およびアセチルからなる群より選択される方法を提供する。
【００３５】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は、４０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００３６】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は、６０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである方法を提供する。
【００３８】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該１つ以上の官能基は、アラビノース、グルクロニル、およびアセチルからなる群より選択される方法を提供する。
【００３９】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は、４０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００４０】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は、６０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００４１】
別の実施形態において、本開示は、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該２つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも１つは、配列番号８、１４、２０、２８、および３４のヌクレオチド配列からなる群より選択される、宿主細胞を提供する。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される３つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該３つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも２つは、配列番号８、１４、２０、２８、および３４のヌクレオチド配列からなる群より選択される、宿主細胞が提供される。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される４つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該４つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも３つは、配列番号８、１４、２０、２８、および３４のヌクレオチド配列からなる群より選択される、宿主細胞が提供される。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される５つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該５つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも４つは、配列番号８、１４、２０、２８、および３４のヌクレオチド配列からなる群より選択される、宿主細胞が提供される。別の実施形態において、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８のヌクレオチド酸配列からなる群より選択される６つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該６つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも５つは、配列番号８、１４、２０、２８、および３４のヌクレオチド配列からなる群より選択される、宿主細胞が提供される。
【００４２】
別の実施形態において、本開示は、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該２つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも１つは、配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、および配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸：からなる群より選択される、宿主細胞を提供する。
【００４３】
別の実施形態において、本開示は、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該２つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも１つは、配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、および配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸：からなる群より選択され、１つ以上のセルラーゼをコードする１つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる宿主細胞を提供する。
【００４４】
別の実施形態において、本開示は、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該２つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも１つは、配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、および配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸：からなる群より選択され、Escherichia spp.、Pseudomonas spp.、Proteus spp.、Ralstonia spp.、Streptomyces spp.、Staphylococcus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Aspergillus spp.、Chrysosporium lucknowense、およびTrichoderma reeseiからなる群より選択される宿主細胞を提供する。
【００４５】
別の実施形態において、本開示は、エンドキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、およびアセチルキシランエステラーゼからなる群より選択される少なくとも２つの酵素を生産する方法であって、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培養培地中、エンドキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、およびアセチルキシランエステラーゼを生産するのに適当な条件下で培養することを含んでおり、当該２つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも１つは、配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、および配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸：からなる群より選択される方法を提供する。
【００４６】
別の実施形態において、本開示は、ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該２つ以上の組換え核酸のうちの少なくとも１つは、配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、および配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸：からなる群より選択される宿主細胞、ならびに培養培地を提供する。
【００４７】
別の実施形態において、本開示は、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物であって、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択される組成物を提供する。
【００４８】
別の実施形態において、本開示は、６つの組換えタンパク質を含んでいる組成物であって、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該６つの組換えタンパク質のうちの５つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択される組成物を提供する。
【００４９】
別の実施形態において、本開示は、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物であって、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含んでいる組成物を提供する。
【００５０】
さらに別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得る方法を提供する。
【００５１】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させる前に前処理に供され、当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる方法を提供する。
【００５２】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００５３】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを発酵産物に変換する方法であって、当該バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインからなる群より選択される植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００５４】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得る方法を提供する。
【００５５】
さらに別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させる前に前処理に供され、当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる方法を提供する。
【００５６】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００５７】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを燃料に変換する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、燃料を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインからなる群より選択される植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００５８】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得る方法を提供する。
【００５９】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させる前に前処理に供され、当該前処理は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理からなる群より選択される１つ以上の処理を含んでいる方法を提供する。
【００６０】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態において、本開示は、バイオマスを分解する方法であって、バイオマスを、２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでおり、当該組換えタンパク質は配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該組成物は１つ以上のセルラーゼをさらに含み得、当該バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインからなる群より選択される植物材料を含んでいる方法を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の酵素のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである方法を提供する。
【００６３】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の酵素のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該１つ以上の官能基はアラビノース、グルクロニル、およびアセチルからなる群より選択される方法を提供する。
【００６４】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の酵素のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は４０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００６５】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の酵素のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は、当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は６０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００６６】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである方法を提供する。
【００６７】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該１つ以上の官能基は、アラビノース、グルクロニル、およびアセチルからなる群より選択される方法を提供する。
【００６８】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は４０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００６９】
別の実施形態において、本開示は、ヘミセルロースを分解する方法であって、ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；およびｂ）配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を分泌するトランスジェニック宿主細胞を用いて、当該ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、当該ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、当該２つ以上の組換えタンパク質のうちの少なくとも１つは配列番号７、１３、１９、２７、および３３のポリペプチド配列からなる群より選択され、当該処理する工程は当該１つ以上の官能基を当該キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものであり、当該処理する工程は６０℃〜８０℃の温度において行われる方法を提供する。
【００７０】
一局面において、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸はＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドから選択される１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、または６つのポリペプチドをコードする宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００７１】
別の局面において、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸はＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドから選択される１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、または６つのポリペプチドをコードし、当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、および４６から選択される配列を有し；Ｃｂ１９５３ポリペプチドは配列番号６０、６１、および１１１からなる群より選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは配列番号７４、１２１、および７６からなる群より選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは配列番号８６、８７、および１１３からなる群より選択される配列を有し；当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは配列番号９８、１１９、および１００からなる群より選択される配列を有し；当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６の配列を有する宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００７２】
また、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸は配列番号４６、１１１、７６、１１３、１００、および１０６の配列を有するポリペプチドから選択される１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、または６つのポリペプチドをコードする宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００７３】
１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸はＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドから選択される１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、または６つのポリペプチドをコードし、当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９、および４７から選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３、および１１０から選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５、および７７から選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９、および１１２から選択される配列を有し；当該Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０、および１０１から選択される配列を有し；当該Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７の配列を有する宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００７４】
また、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸はＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドから選択される１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、または６つのポリペプチドをコードし、当該組換え核酸は配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１、および１０７から選択される配列を有する宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００７５】
また、６つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞であって、当該組換え核酸は配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１、および１０７の配列を有する宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００７６】
本明細書において提供される宿主細胞は何れも、配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７から選択される配列を有するヘミセルラーゼをコードする１つ以上の核酸を含み得る。いくつかの局面において、ヘミセルラーゼをコードする核酸は、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４、および３８から選択される配列を有する。いくつかの局面において、本明細書において提供される宿主細胞は、配列番号８、１４、２０、２８、３４、および３８の配列を有する組換え核酸、または配列番号８、１４、２０、２８、および３８の配列を有する組換え核酸を含み得る。
【００７７】
さらに、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドから選択される組成物が、本明細書において提供される。
【００７８】
別の局面において、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドから選択され、当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、および４６から選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１、および１１１から選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１、および７６のポリペプチドから選択される配列を有し；当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７、および１１３のポリペプチドから選択される配列を有し；当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９、および１００のポリペプチドから選択される配列を有し；当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６の配列を有する組成物が、本明細書において提供される。
【００７９】
また、１つ、２つ、３つ、４つ，５つ、６つ、またはそれより多い数の組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該組換えポリペプチドは、配列番号４６、１１１、７６、１１３、１００、および１０６から選択される配列を有する組成物が、本明細書において提供される。
【００８０】
また、６つの組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該組換えポリペプチドは、配列番号４６、１１１、７６、１１３、１００、および１０６の配列を有する組成物が、本明細書において提供される。
【００８１】
また、１つ以上の組換えポリペプチドを含んでいる組成物であって、当該１つ以上の組換えポリペプチドは、配列番号４６、１１１、７６、１１３、１２４、１２６、および１００のポリペプチドからなる群より選択される組成物が、本明細書において提供される。
【００８２】
本明細書において提供される組成物は何れも、１つ以上のヘミセルラーゼポリペプチド（当該ヘミセルラーゼは、配列番号３、７、１３、１９、２７、３３、および３７から選択される配列を有する）を含み得る。いくつかの局面において、本明細書において提供される組成物は、配列番号７、１３、１９、２７、３３、および３７の配列を有するポリペプチド、または配列番号７、１３、１９、２７、および３７の配列を有するポリペプチドを含んでいる。
【００８３】
別の局面において、１つ以上のセルラーゼを生産する方法であって、ａ）Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる、本明細書に開示されている何れかの宿主細胞を、培養培地中、当該組換え核酸の発現を支持するのに十分な条件下で培養すること；および当該培地および／または当該宿主細胞から、１つ以上のセルラーゼを回収すること：を含んでいる方法が、本明細書において提供される。
【００８４】
別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法であって、ａ）当該セルロース含有材料を、本明細書に開示されている何れかの宿主細胞または組成物と接触させること；およびｂ）当該宿主細胞または組成物とセルロース含有材料とを、セルロース分解を支持する条件下でインキュベートすること：を含んでいる方法が、本明細書において提供される。
【００８５】
セルロース含有材料は、本明細書に開示されている組成物または宿主細胞と接触させる前に前処理され得る。前処理工程は、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、高圧による処理、高温による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、およびリン酸による処理：のうちの１つ以上の処理を含み得る。
【００８６】
また、前処理されたセルロース含有材料の粘度を低下させる方法であって、当該前処理されたセルロース含有材料を、本明細書において提供される何れかの宿主細胞または組成物と接触させることを含んでいる方法が、本明細書において提供される。
【００８７】
また、セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法であって、ａ）当該セルロース含有材料を、本明細書において提供される何れかの宿主細胞または組成物と接触させて、糖溶液を得ること；および、当該糖溶液と発酵性微生物とを、発酵産物を生産するのに十分な条件下で培養することを含んでいる方法が、本明細書において提供される。
【００８８】
また、セルロース含有材料を分解する方法であって、ａ）当該セルロース含有材料を、配列番号４６、１１１、７６、１１３、１２４、１２６、１２８、および１００から選択される１つ以上のポリペプチドと接触させること；およびｂ）当該１つ以上のポリペプチドとセルロース含有材料とを、セルロース分解を支持する条件下でインキュベートすることを含んでいる方法が、本明細書において提供される。
【００８９】
いくつかの局面において、本明細書において提供されるセルロース含有材料は、植物材料である。植物材料としては、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの局面において、本明細書において提供される方法は何れも、少なくとも一部が、５０℃より高い温度において行われ得る。いくつかの局面において、本明細書において提供される方法は何れも、少なくとも一部が、４０℃〜８０℃、５０℃〜８０℃、６０℃〜８０℃、７０℃〜８０℃、４５℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、５５℃〜６５℃、６０℃〜７０℃、６５℃〜７５℃、７５℃〜８５℃、または８０℃〜９０℃の温度において行われ得る。
【００９１】
いくつかの局面において、２つ以上の組換え核酸を含んでいる、本明細書に開示されている宿主細胞の何れにおいても、２つ以上の組換え核酸は、連続的なポリデオキシリボヌクレオチド鎖に存在し得る。
【００９２】
上述の何れの組成物または方法においても、Ｃｂ１５８１ポリペプチドは、セルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼと共に、当該組成物または方法において提供され得る。いくつかの局面において、Ｃｂ１５８１ポリペプチドは、配列番号１４６の配列を含んでいるポリペプチドである。また、Ｃｂ１５８１ポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでいる、上述の何れかの宿主細胞が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、Ｃｂ１５８１ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１４７の配列を含んでいる核酸である。
【００９３】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、キシランなどの典型的なヘミセルロースのモデルを示す。
【００９４】
図２、パート（Ａ）は、Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５タンパク質の推定ドメイン構造を示す。パート（Ｂ）は、精製したＣｂ１９３およびＣｂ１９５のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す；分子量マーカーはＭが付されたレーンにある。タンパク質は金属アフィニティクロマトグラフィー、続いてイオン交換クロマトグラフィー、次いでゲル濾過によって精製した。Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５の予想分子量は、それぞれ、７７．７ｋＤａおよび４２．０ｋＤａであった。パート（Ｃ）は、ＴＣＬ分析を用いた、天然基質に対するＣｂ１９３の酵素活性を示す。様々な基質を試した：可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リケナン、グルコマンナン、１、４β−マンナン、およびアラビナン。ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸの場合、Ｃｂ１９３の存在下（＋）では、短いキシロース鎖が遊離した。マイナス（−）レーンでは、酵素を添加しなかったため、加水分解産物は遊離しなかった。Ｘ１（キシロース単量体）、Ｘ２（キシロース二量体または二糖）、Ｘ３（三糖）、Ｘ４（四糖）、および五糖（Ｘ５）を、第１レーン（Ｍ）にマーカーとしてロードした。結果は、この酵素が、複合基質（ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸ）から、より短い鎖またはオリゴ糖を遊離させたことを示した。パート（Ｄ）は、ＴＣＬ分析を用いた、天然基質に対するＣｂ１９５の酵素活性を示す。様々な基質を試した：ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、ＢＷＸ、ＣＭＣ、リケナン、グルコマンナン、１、４β−マンナン、アラビナン。ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸの場合、Ｃｂ１９５の存在下（＋）では、短いキシロース鎖が遊離した。マイナスレーン（−）では、酵素を添加しなかったため、加水分解産物は遊離しなかった。Ｘ１（キシロース単量体）、Ｘ２（キシロース二量体または二糖）、Ｘ３（三糖）、Ｘ４（四糖）、および五糖（Ｘ５）を、第１レーン（Ｍ）にマーカーとしてロードした。結果は、この酵素が、複合基質（ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸ）から、より短い鎖またはオリゴ糖を遊離させることを示した。パート（Ｅ）は、還元糖アッセイからの、天然基質に対するＣｂ１９３およびＣｂ１９５の酵素活性を示す。この実験では、基質からの産物の遊離を測定するために、還元糖についての別のアッセイを用いた。既知のグルコース濃度およびパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの存在下におけるそれらの吸光度（発色）に基づいて、標準を定めた（Cann et al. 1999. J. Bacterial. 181:1643-1651および上述の他の参考文献Laver, M. 1972.）。酵素を基質とインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。
【００９５】
図３、パート（Ａ）はＣｂ１９３の熱安定性を示し、パート（Ｂ）はＣｂ１９５の熱安定性を示す。５ｎＭのＣｂ１９３およびＣｂ１９５を、６５〜９０℃の範囲の種々の温度においてインキュベートした。Ｃｂ１９３については、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、および９０℃において酵素をインキュベートした；Ｃｂ１９５については、６５℃、７０℃、７５℃、および８０℃において酵素をインキュベートした。インキュベートした酵素を、一定の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、１６時間、および２４時間）において取り出し、直ちにコムギアラビノキシラン（最終１％，ｗ／ｖ）と共にインキュベートし、酵素活性を測定した。反応の初速度を算出した。各サンプルの活性を、ゼロ点における初期活性で割ることによって、残存活性（％）を算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【００９６】
図４は、コムギアラビノキシラン、オートスペルトキシラン、およびカバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す。同様に、Ｋｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍも示されている。パート（Ａ）では、５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、７５℃において、実験を行った。パート（Ｂ）では、５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、８５℃において、実験を行った。キシラン基質（最終２．５〜５０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｃｂ１９３（コムギアラビノキシランについては最終５ｎＭ、オートスペルトキシランおよびカバ材キシランについては最終５０ｎＭ）と共にインキュベートした。反応の初速度を算出した。次いで、初速度をキシラン基質の濃度に対してプロットした。Graphpadソフトウェアを用いた非線形フィッティングによって、Ｋｍおよびｋｃａｔを算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【００９７】
図５は、コムギアラビノキシラン、オートスペルトキシラン、およびカバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す。Ｋｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍを同様に示す。パート（Ａ）では、５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、７５℃において、実験を行った。パート（Ｂ）では、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を用いて、７５℃において、実験を行った。キシラン基質（最終２．５〜５０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｃｂ１９５（コムギアラビノキシランについては最終５ｎＭ、オートスペルトキシランおよびカバ材キシランについては最終５０ｎＭ）と共にインキュベートした。反応の初速度を算出した。次いで、初速度をキシラン基質の濃度に対してプロットした。Graphpadソフトウェアを用いた非線形フィッティングによって、Ｋｍおよびｋｃａｔを算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【００９８】
図６、パート（Ａ）は、精製したＣｂ１１７２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。パート（Ｂ）は、還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１１７２の酵素活性を示す。５つの異なるヘミセルロース性基質を試した：アラビナン（テンサイ）、ＳＷＡＸ、ライアラビノキシラン（ＲＡＸ）、ＯＳＸおよび脱分枝アラビナン。酵素を基質とインキュベートすることによって、アラビノース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。アラビナンの加水分解は、他の天然基質の加水分解よりも多かった。パート（Ｃ）は、ＨＰＬＣ分析を用いた、天然基質に対するＣｂ１１７２の酵素活性を示す。５つの異なるヘミセルロース性基質を試した：アラビナン（テンサイ）、ＳＷＡＸ、ＲＡＸ、ＯＳＸおよび脱分枝アラビナン。それぞれの場合において、Ｃｂ１１７２の存在下では、アラビノースが遊離した。Ｃｂ１１７２の非存在下では、ごくわずかな量のアラビノースが脱分枝アラビナンに関してみられた；他の天然多糖については、加水分解産物は遊離しなかった。この結果は、この酵素が、複合基質（アラビナン、ＳＷＡＸ、ＲＡＸ、ＯＳＸおよび脱分枝アラビナン）から、アラビノースを遊離させることを示した。パート（Ｄ）は、Ｃｂ１１７２タンパク質のドメイン構造を示す；Ｃｂ１１７２タンパク質はグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５１触媒ドメインを有する。パート（Ｅ）は、Ｃｂ１１７２の熱安定性を示す。Ｃｂ１１７２は、７０℃、７５℃、８０℃および８５℃において２４時間インキュベートした後、それぞれ５７％、４５％、３５％および２２％の活性を有する。５０ｎＭのＣｂ１１７２を種々の温度（７０℃、７５℃、８０℃、８５℃および９０℃）に保持した。次に述べる時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに酵素活性測定に供した。
【００９９】
図７は、ｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシドの加水分解におけるＣｂ１１７２の反応速度データを示す。同様に、Ｋｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍも示されている。パート（Ａ）では９０℃において実験を行った；パート（Ｂ）では７５℃において実験を行った。種々の濃度のｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシド基質１００μｌを、８５℃において３分間保持して、平衡化した。次いで、２５μｌのタンパク質サンプル（５０ｎＭ）を基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。４００ｎｍにおける光学濃度をCary 300 UV-Visible分光光度計によって２．５分間記録した。次いで、初速度をｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシドの濃度に対してプロットした。Graphpadソフトウェアを用いた非線形フィッティングによって、Ｋｍおよびｋｃａｔを算出した。
【０１００】
図８、パート（Ａ）は、Ｃｂ９０９の推定ドメイン構造を示す。パート（Ｂ）は、精製したＣｂ９０９のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。パート（Ｃ）は、Ｃｂ９０９の活性を示す。基質はアルドウロン酸（ＭｅＧｌｃＡで修飾されたキシロオリゴ糖の混合物）である。Ｃｂ９０９と共に７５℃において６０分間インキュベートした後、Ｃｂ９０９によってＭｅＧｌｃＡ基がアルドウロン酸から切断され、産物として、非修飾のキシロース、キシロビオース、キシロトリオース、およびキシロテトラオースが遊離した。反応の条件は、次に述べるとおりである：６ｎＭのＣｂ９０９、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのアルドウロン酸。パート（Ｄ）は、至適ｐＨアッセイの結果を示す。最大活性はｐＨ５．５において検出された。このアッセイは、次に述べるとおりに行われた：各ｐＨにおいて、１ｍｇ／ｍｌのアルドウロン酸溶液を、６ｎＭのＣｂ９０９と共に７５℃において１０分間インキュベートした。ｐＨ５〜ｐＨ６の範囲では、１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭのクエン酸バッファーを用いた。ｐＨ６〜ｐＨ７の範囲では、１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭのリン酸バッファーを用いた。反応後、温度を１００℃に急上昇させ、反応を終了させた。産物の量をＨＰＬＣによって検出した。パート（Ｅ）は、至適温度アッセイの結果を示す。Ｃｂ９０９の最大活性は、７５℃において検出された（キシロビオースおよびキシロトリオース）。キシロースは７０℃において最も効率的に生成したが、７０℃および７５℃において生成したキシロースの量はほぼ同じであった。このアッセイは次に述べるとおりに行われた：１ｍｇ／ｍｌのアルドウロン酸溶液を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）中で、６ｎＭのＣｂ９０９と共に１０分間インキュベートした。反応後、温度を１００℃に急上昇させ、反応を終了させた。産物の量をＨＰＬＣによって検出した。
【０１０１】
図９、パート（Ａ）は、Ｃｂ２４８７の推定ドメイン構造を示す。Ｃｂ２４８７の推定保存ドメインは、NCBI Conserved Domains Databaseサーチツールを用いて解析したものである。パート（Ｂ）は、精製したＣｂ２４８７のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。パート（Ｃ）は、Ｃｂ２４８７の至適ｐＨを決定する生化学アッセイを示す。至適ｐＨアッセイについては、パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｐＮＰ−Ｘ，０．８ｍＭ）を、Ｃｂ２４８７（濃度１０ｎＭ）と共に７５℃において種々のバッファー中でインキュベートした：ｐＨ４．０〜６．０（クエン酸バッファー，５０ｍＭ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ｐＨ６．０〜８．０（リン酸バッファー，５０ｍＭ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ｐＨ８．５〜９．０（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）。パート（Ｄ）は、Ｃｂ２４８７の至適温度を決定する生化学アッセイを示す。至適温度アッセイについては、ｐＮＰ−Ｘ（０．８ｍＭ）を、Ｃｂ２４８７（１０ｎＭ）と共に、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、種々の温度（４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃）においてインキュベートした。パート（Ｅ）は、基質としてｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシドを用いたＣｂ２４８７の反応速度パラメータを示す。左側のパネルでは、９０℃、ｐＨ６．０において反応速度パラメータを決定した。右側のパネルでは、７５℃、ｐＨ６．０において反応速度パラメータを決定した。これらのアッセイでは、種々の濃度のｐＮＰ−Ｘ（０．０８〜２４ｍＭ）を、Ｃｂ２４８７（１０ｎＭ）と共に、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、７５および９５℃においてインキュベートした。パート（Ｆ）は、キシロオリゴ糖に対するＣｂ２４８７の加水分解活性を示す。Ｃｂ２４８７（０．５μＭ）を、種々のキシロオリゴ糖（Ｘ２−６）と共に、７５℃において１５時間インキュベートし、次いで産物をＴＬＣによって分離した。パート（Ｇ）は、Ｃｂ２４８７についての熱安定性アッセイを示す。Ｃｂ２４８７を、基質を添加せずに、種々の温度（７０、７５、８０、８５、９０、９５℃）において、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０，５０ｍＭ）中でインキュベートし、このタンパク質を種々の時点（０、１０分、３０分、１時間、３時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間）において取り出し、ｐＮＰ−Ｘを基質として用いて残存活性をアッセイした。パート（Ｈ）は、β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）とα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）との相乗作用を示す。アルドウロン酸をＣｂ２４８７（０．５μＭ）およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共に、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で、７５℃において一晩インキュベートし、次いでＨＰＬＣを用いてアッセイした。Ｃｂ９０９の添加によって、アルドウロン酸におけるメチルグルクロン酸修飾が切断され、キシロースおよびキシロオリゴ糖が遊離した。Ｃｂ２４８７の添加によって、利用可能なβ−１，４−キシロシド結合が切断され、より多くのキシロースが遊離した。２つの酵素を混合することによって、Ｃｂ９０９によって遊離したキシロオリゴ糖が、Ｃｂ２４８７��よって、キシロースに転換した。
【０１０２】
図１０、パート（Ａ）は、Ｃｂ１６２のドメイン構造を示す；このタンパク質はアセチルキシランエステラーゼのシングルドメインを有する。パート（Ｂ）は、精製したＣｂ１６２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。パート（Ｃ）は、パラニトロフェノール付加アセテート（ｐＮＰ−アセテート）を基質として用いた、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２のｐＨプロファイルを示す。Synergy 2 Microplate reader（BioTek）を用いて、遊離したｐＮＰを、４００ｎｍの吸光度において継続的にモニターした。加水分解の初速度を酵素活性とした。Ｃｂ１６２におけるｐＨの影響を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、５０ｍＭのクエン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０〜６．０）または５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ６．０〜８．０）の存在下、５０℃において試験した。パート（Ｄ）は、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の温度プロファイルを示す。温度プロファイルは、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、４０℃〜７５℃（５℃刻み）の温度において行った。このアッセイには、０．０４μＭの精製したＣｂ１６２および２ｍＭのｐＮＰ−アセテートを用いた。パート（Ｅ）は、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の熱安定性プロファイルを示す；０．０２μＭの精製したＣｂ１６２（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中）を、６０℃〜８０℃（５℃間隔）の温度において、０〜２４時間インキュベートし、残存活性を測定した。パート（Ｆ）は、Ｃｂ１６２の反応速度実験を示す。０．０４μＭの精製したＣｂ１６２（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中）を、様々な濃度のｐＮＰ−アセテートと共にインキュベートし、加水分解の初速度をグラフ上にプロットした。反応速度パラメータを、Graph Pad Prism v5.01（GraphPad Software）を用いて、ミカエリス−メンテンの式によって決定した。
【０１０３】
図１１は、可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）の加水分解における、C. besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す。ＳＷＡＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、種々のヘミセルラーゼ混合物と共に１５時間インキュベートし、還元糖［パート（Ａ）］およびＨＰＬＣ［パート（Ｂ）］分析に供した。用いたヘミセルラーゼとしては、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）が挙げられる。
【０１０４】
図１２は、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）の加水分解における、C. besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す。ＯＳＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、種々のヘミセルラーゼ混合物と共に１５時間インキュベートし、還元糖［パート（Ａ）］およびＨＰＬＣ［パート（Ｂ）］分析に供した。用いたヘミセルラーゼとしては、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）が挙げられる。
【０１０５】
図１３、パート（Ａ）は、種々の温度における、ヘミセルラーゼカクテルによる可溶性コムギアラビノキシランの加水分解を示す。ＳＷＡＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃において、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ｂ）は、種々の温度における、ヘミセルラーゼカクテルによるカバ材キシランの加水分解を示す。ＢＷＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃において、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ｃ）は、種々の温度における、ヘミセルラーゼカクテルによるオートスペルトキシランの加水分解を示す。ＯＳＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃において、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。
【０１０６】
図１４、パート（Ａ）は、ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＳＷＡＸの加水分解が向上したことを示す。ＳＷＡＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、種々のヘミセルラーゼ混合物と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。種々のヘミセルラーゼ混合物を加水分解において用いた：混合物Ｉ）Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩ）Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；または混合物ＩＩＩ）Ｃｂ１９５（０．２５μＭ）、Ｃｂ１９３（０．２５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）。パート（Ｂ）は、ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＢＷＸの加水分解が向上したことを示す。ＢＷＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、種々のヘミセルラーゼ混合物と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。種々のヘミセルラーゼ混合物を加水分解において用いた：混合物Ｉ）Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩ）Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；または混合物ＩＩＩ）Ｃｂ１９５（０．２５μＭ）、Ｃｂ１９３（０．２５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）。パート（Ｃ）は、ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＯＳＸの加水分解が向上したことを示す。ＯＳＸ（８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、種々のヘミセルラーゼ混合物と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。種々のヘミセルラーゼ混合物を加水分解において用いた：混合物Ｉ）Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩ）Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；または混合物ＩＩＩ）Ｃｂ１９５（０．２５μＭ）、Ｃｂ１９３（０．２５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）。
【０１０７】
図１５は、Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによる可溶性コムギアラビノキシランの加水分解を示す。種々の濃度のＳＷＡＸ（１．０、２．０、４．０、６．０、８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ａ）は、コントロールおよび加水分解混合物における還元糖を示す。パート（Ｂ）は、種々の基質濃度での加水分解混合物における、計算上の還元糖と実際の還元糖の平均との比較を示す。
【０１０８】
図１６は、Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるカバ材キシランの加水分解を示す。種々の濃度のＢＷＸ（１．０、２．０、４．０、６．０、８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ａ）は、コントロールおよび加水分解混合物における還元糖を示す。パート（Ｂ）は、種々の基質濃度での加水分解混合物における、計算上の還元糖と実際の還元糖の平均との比較を示す。
【０１０９】
図１７は、Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるオートスペルトキシランの加水分解を示す。種々の濃度のＯＳＸ（１．０、２．０、４．０、６．０、８．０％，ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、７５℃において、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共に１５時間インキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ａ）は、コントロールおよび加水分解混合物における還元糖を示す。パート（Ｂ）は、種々の基質濃度での加水分解混合物における、計算上の還元糖と実際の還元糖の平均との比較を示す。
【０１１０】
図１８：野生型Ｃｂ１９５２およびその短縮型変異体の概略構成。シグナルペプチドはべた塗りの長方形で示されている。ＧＨ９：ファミリー９グルコシドヒドロラーゼドメイン；ＧＨ５：ファミリー５グルコシドヒドロラーゼドメイン；ＣＢＭ３ｃ：ファミリー３タイプＣ炭水化物結合モジュール；ＣＢＭ３ｂ：ファミリー３タイプＢ炭水化物結合モジュール。
【０１１１】
図１９：Ｃｂ１９５２野生型およびその短縮型変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：タンパク質分子量マーカー；レーン２：Ｃｂ１９５２野生型；レーン３：Ｃｂ１９５２ＴＭ１；レーン４：Ｃｂ１９５２ＴＭ２；レーン５：Ｃｂ１９５２ＴＭ３；レーン６：Ｃｂ１９５２ＴＭ４；レーン７：Ｃｂ１９５２ＴＭ５；レーン８：Ｃｂ１９５２ＴＭ６；レーン９：Ｃｂ１９５２ＴＭ７。２μｇの各酵素を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。
【０１１２】
図２０：還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５２ＷＴの酵素活性。１２の異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、リケニン、マンナン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、コンニャクグルコマンナン（ＫＧＭ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）およびキシログルカン。アビセル、ＰＡＳＣ、ＣＭＣ−Ｎａ、リケニン、マンナン、ＬＢＧ、グアーガム、ＫＧＭ、ＷＡＸおよびＯＳＸ基質と共に酵素をインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。Ｃｂ１９５２ＷＴは、主にグルコース構成基質およびマンノース構成基質を加水分解するが、キシロース構成基質を加水分解しない。
【０１１３】
図２１：還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ１の酵素活性。１２の異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、リケニン、マンナン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、コンニャクグルコマンナン（ＫＧＭ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）およびキシログルカン。アビセル、ＰＡＳＣ、ＣＭＣ−Ｎａ、リケニン、マンナン、ＬＢＧ、グアーガム、ＫＧＭ、ＷＡＸ、ＢＷＸ、ＯＳＸ、およびキシログルカン基質と共に酵素をインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。この結果は、Ｃｂ１９５２ＴＭ１が、主にグルコース構成基質を加水分解することを示す。また、Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、マンノース構成基質に対してもある程度の活性を有する。Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、キシロース構成基質に対して低い活性を有する。
【０１１４】
図２２：還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性。１２の異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、リケニン、マンナン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、コンニャクグルコマンナン（ＫＧＭ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）およびキシログルカン。ＣＭＣ−Ｎａ、リケニン、マンナン、ＬＢＧ、グアーガム、およびＫＧＭ基質と共に酵素をインキュベートすることによって、マンノース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。Ｃｂ１９５２ＴＭ５は、主にマンノース構成基質を加水分解するが、グルコース構成基質またはキシロース構成基質に対する明らかな活性は有しない。
【０１１５】
図２３：グルコースおよびセロオリゴ糖に対する、Ｃｂ１９５２ＷＴ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１およびＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオースを表す。Ｃｂ１９５２ＷＴおよびＣｂ１９５２ＴＭ１は、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオースおよびセロヘキサオースを、グルコースおよびセロビオースに加水分解するが、セロビオースに対する活性は有しない。Ｃｂ１９５２ＴＭ５は、グルコースおよび試した何れのセロオリゴ糖に対する活性も有していない。何れも酵素も、グルコースおよびセロオリゴ糖に対するグリコシル転移活性を有しない。
【０１１６】
図２４：マンノースおよびマンノオリゴ糖に対する、Ｃｂ１９５２ＷＴ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１およびＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、およびＭ６は、それぞれ、マンノース、マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオース、およびマンノヘキサオースを表す。Ｃｂ１９５２ＷＴおよびＣｂ１９５２ＴＭ５は、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオースおよびマンノヘキサオースを、マンノースおよびより小さいマンノオリゴ糖に加水分解するが、マンノビオースに対する加水分解活性は有しない。Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、マンノペンタオースおよびマンノヘキサオースを、マンノースおよびより小さいマンノオリゴ糖に加水分解するが、マンノビオース、マンノトリオース、マンノトリオースおよびマンノテトラオースに対する加水分解活性は有しない。何れも酵素も、マンノースおよびマンノオリゴ糖に対するグリコシル転移活性を有しない。
【０１１７】
図２５：セルロース基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ１の酵素活性のＨＰＬＣ分析。３つの異なるセルロース性基質を試した：アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ。それぞれの場合において、Ｃｂ１９５２ＴＭ１の存在下では、グルコースおよびセロビオースが遊離した。Ｃｂ１９５２ＴＭ１の非存在下では、全ての基質について、グルコースもセロビオースもみられなかった。この結果は、酵素のこの部分またはポリペプチド（Ｃｂ１９５２）が、セルロース性基質（アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ）から、グルコースおよびセロビオースを、最終産物として切断することを示すものであった。
【０１１８】
図２６：Ｃｂ１９５２ＴＭ１によるＰＡＳＣの経時的な加水分解のＨＰＬＣ分析。１００ｎＭのＣｂ１９５２ＴＭ１を、２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共に７５℃においてインキュベートした。種々の時間間隔（０、０．５分、２分、１０分、１時間、４時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに１０分間煮沸して、酵素を失活させた。遠心分離後、サンプルの上清を水で適当に希釈し、ＨＰＬＣ分析にかけた。結果は、Ｃｂ１９５２ＴＭ１が最初にグルコース、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースを遊離させることを示す。時間が経過するにつれて、反応混合物にはグルコースおよびセロビオースだけが残された。
【０１１９】
図２７：活性測定の基質としてＰＡＳＣを用いたＣｂ１９５２ＷＴの熱安定性。Ｃｂ１９５２ＷＴは、７０℃、７５℃、８０℃および８５℃において２４時間インキュベートした後、それぞれ７５％、４３％、１７％および１２％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ１９５２ＷＴを種々の温度（７０℃、７５℃、８０℃および８５℃）に保持した。種々の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。酵素活性を、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５および８５℃において測定した。最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを測定に用い、８．３１μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。グルコース同等物に相当する還元末端を、Lever, M.の方法（A new reaction for colorimetric determination carbohydrates. Anal. Biochem. 1972: 47; 273-279）に従って測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０１２０】
図２８：活性測定の基質としてＰＡＳＣを用いたＣｂ１９５２ＴＭ１の熱安定性。Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、７０℃、７５℃、８０℃および８５℃において２４時間インキュベートした後、それぞれ９４％、７６％、１８％および１３％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ１９５２ＴＭ１を種々の温度（７０℃、７５℃、８０℃および８５℃）に保持した。種々の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。酵素活性を、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５および８５℃において測定した。最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを測定に用い、８．３１μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。グルコース同等物に相当する還元末端を、Lever, M.の方法（上掲）に従って測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０１２１】
図２９：野生型（ＷＴ）Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５３ＴＭ１およびＣｂ１９５３ＴＭ２のドメイン構造。
【０１２２】
図３０：精製した野生型Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５３ＴＭ１およびＣｂ１９５３ＴＭ２タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
【０１２３】
図３１：カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）におけるＣｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２のザイモグラム。ＣＭＣ基質（最終０．１％，ｗ／ｖ）を含む標準的なドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をして、ゲルを用意した。電気泳動によるタンパク質の分画後、ゲルを蒸留水で２回洗浄し、３０ｍＬのリフォールディングバッファー（２０ｍＭ クエン酸，ｐＨ６．０、２．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭのジチオスレイトール、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）中で２５℃において１時間インキュベートし、次いで新たなバッファー中で３７℃において一晩保持した。ゲルを５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で２回洗浄し、次いで０．１％のコンゴレッドによる染色および１ＭのＮａＣｌによる脱色によって、結果を可視化した。図３１に示されるように、Ｃｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２は、予想されるサイズの位置において、セルラーゼ活性を意味する顕著な白いバンドを示したが、Ｃｂ１９５３ＴＭ１タンパク質は示さなかった。
【０１２４】
図３２および３３：還元糖アッセイによる、Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２の天然基質に対する酵素活性。７つの異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、リケニン、コンニャクグルコマンナン、およびマンナン。基質と共に酵素をインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。Thermomixer R（Eppendorf）中で、連続的に混合しながら、チューブを７５℃において１６時間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍ、４℃において、チューブを５分間遠心分離した。５０μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイ用の１．５ｍＬのきれいな遠心管に移した。標準およびサンプルについて、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４０１ｎｍとグルコース濃度とを互いにに対してプロットし、線形回帰を用いてデータに線をフィットさせた。反応物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。ｎ−ブタノール：酢酸：Ｈ２Ｏが１０：５：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）からなる移動相、および１０ｃｍ×２０ｃｍプレートを用いた。還元糖アッセイ（図３２）およびＴＬＣ（図３３）の結果は、Ｃｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２がセルラーゼ活性を有するのに対し、Ｃｂ１９５３ＴＭ１がマンナナーゼ活性を有することを示す。
【０１２５】
図３４：ＰＡＳＣに対するＣｂ１９５３ＴＭ２の酵素活性の経時的なＨＰＬＣ分析。加水分解産物の分析のために、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によってサンプルを分析した。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。分析のために、標準として、グルコースおよび５つの異なるセロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオース）を用いた。反応において、Ｃｂ１９５３ＴＭ２はセロオリゴ糖（Ｃ２−Ｃ４）を遊離させ始め、その後グルコースを遊離させた。この結果は、この酵素が主にＰＡＳＣからセロビオースを遊離させることを示した。
【０１２６】
図３５および３６：ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＷＴ（図３５）およびＣｂ１９５３ＴＭ２（図３６）の熱安定性。５０ｎＭのＣｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２を種々の温度（７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、および９０℃）に保持した。種々の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。Cary 300 UV-Vis分光光度計（Varian）を用いて、酵素活性を８５℃において測定した。最初の１分間において反応の初速度を算出した。時間０における反応の初速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応の初速度を、時間０における反応の初速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）を算出した。その結果から、Ｃｂ１９５３ＷＴ（図３５）およびＣｂ１９５３ＴＭ２（図３６）は、７０℃および７５℃において非常に安定であり、熱処理していないタンパク質の７５〜９０％の活性を維持していた。
【０１２７】
図３７：ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＷＴ（図３７Ａ）およびＣｂ１９５３ＴＭ２（図３７Ｂ）の反応速度実験。０．０５μＭの精製したＣｂ１９５３ＷＴまたはＣｂ１９５３ＴＭ２（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ中）を、様々な濃度のリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）と共にインキュベートし、加水分解の初速度を基質濃度に対してプロットした。データをミカエリス−メンテンの式に当てはめる（Graph Pad Prism v5.01）ことによって、反応速度パラメータ（Ｃｂ１９５３ＷＴについては、Ｋｍ：７．６０３ｍｇ／ｍＬ、ｋｃａｔ：７．５１３ｓ−１およびｋｃａｔ／Ｋｍ：０．９８８ｓ−１ｍＬ／ｍｇ、Ｃｂ１９５３ＴＭ２についてはＫｍ：３．０３２ｍｇ／ｍＬ、ｋｃａｔ：５．４１１ｓ−１およびｋｃａｔ／Ｋｍ：１．７８５ｓ−１ｍＬ／ｍｇ）を決定した。
【０１２８】
図３８：野生型（ＷＴ）Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９５４ＴＭ３およびＣｂ１９５４ＴＭ５ポリペプチドのドメイン構造。
【０１２９】
図３９：パネル（Ａ）：精製したＣｂ１９５４ＴＭ３タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。パネル（Ｂ）：還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５４ＴＭ３の酵素活性。３つの異なるセルロース基質を試した：アビセル、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）およびリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）。基質と共に酵素をインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。ＰＡＳＣの加水分解は、他の基質の加水分解よりも高かった。
【０１３０】
図４０：セルロース性基質に対するＣｂ１９５４ＴＭ３の酵素活性のＨＰＬＣ分析。３つの異なるセルロース性基質を試した：アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ。それぞれの場合において、Ｃｂ１９５４ＴＭ３の存在下では、グルコースおよびセロビオースが遊離した。Ｃｂ１９５４ＴＭ３の非存在下では、全ての基質について、グルコースもセロビオースもみられなかった。この結果は、この酵素が、セルロース性基質（ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ）から、グルコースおよびセロビオース、同様により長鎖のオリゴ糖を、最終産物として遊離させることを示すものであった。
【０１３１】
図４１：Ｃｂ１９５４ＴＭ３の熱安定性。Ｃｂ１９５４ＴＭ３は、７０℃、７５℃、８０℃および８５℃において２４時間インキュベートした後、それぞれ７５％、８７％、６４％および７％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ１９５４ＴＭ３を種々の温度（７０℃、７５℃、８０℃および８５℃）に保持した。酵素活性を、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５および９５℃において測定した。最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを測定に用い、１０μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。グルコース同等物に相当する還元末端を、Lever, M.の方法（上掲）に従って測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応時間を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０１３２】
図４２：野生型（ＷＴ）Ｃｂ１９４６、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２ポリペプチドのドメイン構造。
【０１３３】
図４３：精製した野生型Ｃｂ１９４６、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
【０１３４】
図４４：カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）アガープレートにおけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１、およびＣｂ１９４６ＴＭ２のザイモグラム。アガープレートは、ＣＭＣ基質（最終０．２５％，ｗ／ｖ）を用いて調製した。１μｇの各タンパク質をアガー−ＣＭＣプレート上にスポットした後、プレートを３７℃において一晩インキュベートし、次いで０．１％のコンゴレッドによる染色および１ＭのＮａＣｌによる脱色によって、ゲルを可視化した。図４４に示されるように、Ｃｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ１９４６ＴＭ２は、アガープレート上に、セルラーゼ活性を意味する顕著なハローを示したが、Ｃｂ１９５３ＴＭ１タンパク質は示さなかった。
【０１３５】
図４５および４６：リン酸膨張セルロールにおけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２の酵素活性の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（図４５）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（図４６）分析。各酵素（最終０．５μＭ）を、５０ｍＭ クエン酸−１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、１％最終濃度のリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）と、７５℃において１６時間反応させた。反応物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した（図４５）。ｎ−ブタノール：酢酸：Ｈ２Ｏが１０：５：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）からなる移動相、および１０ｃｍ×２０ｃｍプレートを用いた。図４５において、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースを表す。加水分解産物のより定量的な分析のために、サンプルを高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した（図４６）。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。ＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析のために、標準として、グルコースおよび５つの異なるセロオリゴ糖を用いた：セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオース。ＴＬＣおよびＨＰＬＣの結果に基づくと、Ｃｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２は、ＰＡＳＣ基質からの、グルコース、セロビオース、セロトリオース、およびセロテトラオースなどの産物の顕著な遊離を示し、Ｃｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２がセルラーゼ活性を有することを示したが、Ｃｂ１９５３ＴＭ１は示さなかった。
【０１３６】
図４７：野生型Ｃｂ６２９およびＣｂ６２９ＴＭ１ポリペプチドのドメイン構造。
【０１３７】
図４８：精製したＣｂ６２９ＴＭ１タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
【０１３８】
図４９：還元糖アッセイを用いて測定した産物による、基質に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性。３つの異なるセルロース基質を試した：アビセル、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）およびリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）。基質と共に酵素をインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。ＰＡＳＣの加水分解は、他の基質の加水分解よりも高かった。
【０１３９】
図５０：基質に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性のＨＰＬＣ分析。３つの異なるセルロース性基質を試した：アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ。それぞれの場合において、Ｃｂ６２９ＴＭ１の存在下では、グルコースおよびセロビオースが遊離した。Ｃｂ６２９ＴＭ１の非存在下では、全ての基質について、グルコースもセロビオースもみられなかった。この結果は、この酵素が、セルロース性基質（アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ）から、グルコースおよびセロビオースを、最終産物として遊離させることを示すものであった。
【０１４０】
図５１：セロオリゴ糖に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性のＴＬＣ分析。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオースを表す。
【０１４１】
図５２：Ｃｂ６２９ＴＭ１の熱安定性。Ｃｂ６２９ＴＭ１は、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃および８０℃において２４時間インキュベートした後、それぞれ１０９％、９９％、９６％、８３％および３４％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ６２９ＴＭ１を種々の温度（６０℃、６５℃、７０℃、７５℃および８０℃）に保持した。種々の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。酵素活性を、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５および７０℃において測定した。最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを測定に用い、８．３１μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。グルコース同等物に相当する還元末端を、Lever, M.の方法（上掲）に従って測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応時間を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０１４２】
図５３：パネル（Ａ）：野生型Ｃｂ４８６のドメイン構造。パネル（Ｂ）：精製した野生型Ｃｂ４８６タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
【０１４３】
図５４：キシロオリゴ糖（Ｘ２−Ｘ６）に対するＣｂ４８６の酵素活性のＴＬＣ分析。次に述べるキシロオリゴ糖（Ｘ２−Ｘ６）を試した：キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオースおよびキシロヘキサオース。これは、キシロオリゴ糖を一晩加水分解し、続いてＴＬＣを用いて産物を分析することによって行った。それぞれの場合において、Ｃｂ４８６の存在下では、キシロースおよびキシロビオースが遊離した。Ｃｂ４８６の非存在下では、キシロビオースに関して、ごくわずかな量のキシロースがみられた；他のキシロオリゴ糖については加水分解産物は遊離しなかった。この結果は、この酵素が、キシロオリゴ糖（キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオースおよびキシロヘキサオース）から、キシロースおよびキシロビオースを遊離させることを示した。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６は、それぞれ、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、およびキシロヘキサオースを表す。
【０１４４】
図５５：グルコースおよびセロオリゴ糖に対するＣｂ４８６の酵素活性のＴＬＣ分析。グルコースおよび５つの異なるセロオリゴ糖をアッセイに用いた：セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオースおよびセロヘキサオース。Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５は、それぞれ、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースを表す。
【０１４５】
図５６：パネルＡおよびＢは、それぞれ、Ｃｂ４８６の活性のｐＨプロファイルおよび温度プロファイルを示す。これらのアッセイについて、Ｃｂ４８６の酵素濃度は１０ｎＭであった。ｐＨプロファイルについては、２つのバッファーにおいて反応を行った：５０ｍＭ クエン酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０）、および５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０）。酵素を１ｍＭのｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと共に、所定のｐＨにおける各バッファー中、７５℃においてインキュベートし、３０分間のアッセイにおける活性を測定した。至適温度の決定については、１０ｎＭのＣｂ４８６を１ｍＭのｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと共に、ｐＨ５．５において、４０℃〜９５℃（５℃間隔）の範囲の異なる温度においてインキュベートした。Cary 300 UV-Visible分光光度計（Agilent，カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、４１０ｎＭにおける光学密度の増加をモニターすることによって、ｐＮＰの遊離を記録した。
【０１４６】
図５７：Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼからなるセルラーゼ混合物の、ドメイン構造（上）および精製したタンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（下）。
【０１４７】
図５８：ヘミセルラーゼＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７、およびＣｂ１６２の精製したタンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
【０１４８】
図５９および６０：Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理されたススキ（マイクロ波で前処理された）のサンプルのＴＬＣ（図５９）およびＨＰＬＣ（図６０）分析。図５９は、２％、５％、または８％のススキを含んでいるサンプルを用いたアッセイの分析を示す。図６０は、８％のススキを含んでいるサンプルを用いたアッセイの分析を示す。図５９において、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースを表す。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、およびキシロペンタオースを表す。Ａ１はアラビノースを表す。図６０については、８％の基質の反応サンプルを、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。
【０１４９】
図６１および６２：Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理されたススキ（オートクレーブで前処理された）のサンプルのＴＬＣ（図６１）およびＨＰＬＣ（図６２）分析。図６１は、２％、５％、または８％のススキを含んでいるサンプルを用いたアッセイの分析を示す。図６２は、８％のススキを含んでいるサンプルを用いたアッセイの分析を示す。図５９において、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースを表す。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、およびキシロペンタオースを表す。図６２については、８％の基質の反応サンプルを、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。
【０１５０】
図６３および６４：Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物（混合物はβ−グルコシダーゼＣｂ４８６を欠く）ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理された８％のススキ（マイクロ波で前処理された）のサンプルのＴＬＣ（図６３）およびＨＰＬＣ（図６４）分析。図６３において、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースを表す。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、およびキシロペンタオースを表す。図６４については、反応サンプルを、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。
【０１５１】
図６５および６６：Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物（混合物はβ−グルコシダーゼＣｂ４８６を欠く）ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理された８％のススキ（オートクレーブで前処理された）のサンプルのＴＬＣ（図６５）およびＨＰＬＣ（図６６）分析。図６５において、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５は、それぞれ、グルコース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースを表す。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、およびキシロペンタオースを表す。図６６については、反応サンプルを、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。
【０１５２】
図６７：パネルＡおよびＢは、それぞれ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１の活性のｐＨプロファイルおよび温度プロファイルを示す。ｐＨプロファイルについては、２つのバッファーにおいて反応を行った：５０ｍＭ クエン酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０）、および５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０）。Ｃｂ１９５２ＴＭ１の酵素濃度は０．５μＭであった。酵素を２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共に、所定のｐＨにおける各バッファー中、７５℃においてインキュベートし、１０分間のアッセイにおける活性を測定した。遊離した還元糖はｐＨＢＡＨを用いて測定された。至適温度の決定については、０．５μＭのＣｂ１９５２ＴＭ１酵素を２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共に、ｐＨ５．５において、４０℃〜９５℃（５℃間隔）の範囲の異なる温度においてインキュベートした。
【０１５３】
図６８：Ｃｂ１９５３ＴＭ２をセロヘキサオースと共にインキュベートすることによって生じた切断産物。パネルＡ：反応産物のＴＬＣ分析；パネルＢ：反応産物のＨＰＬＣ分析。データは、Ｃｂ１９５３ＴＭ２がセロヘキサオースをランダムに加水分解することを示す。
【０１５４】
図６９：パネルＡおよびＢは、それぞれ、Ｃｂ１９５４ＴＭ３の活性のｐＨプロファイルおよび温度プロファイルを示す。
【０１５５】
図７０：パネルＡおよびＢは、それぞれ、Ｃｂ６２９ＴＭ１の活性のｐＨプロファイルおよび温度プロファイルを示す。
【０１５６】
図７１：ＰＡＳＣに対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性の経時的なＨＰＬＣ分析。加水分解産物の分析のために、サンプルを高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した。ＨＰＡＥＣ分析については、１００μＬの希釈した各サンプルを、Beckman Coulter（カリフォルニア州フラートン）製のSystem Gold HPLC装置に注入した。System Gold HPLC装置は、Dionex Corporation（カリフォルニア州サニーベール）製のCarboPacTMPA1 guard（4 x 50 mm）および分析用（4 x 250 mm）カラムならびにESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムスフォード）製のCoulochem III電気化学検出器を備えている。分析のために、標準として、グルコース、セロビオース、およびセロトリオースを用いた。
【０１５７】
図７２：Ｃｂ４８６の基質特異性分析。５０ｎＭのＣｂ４８６を、その最適なバッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５）中、それぞれ１ｍＭのｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐＮＰ−β−Ｄ−フコピラノシド、ｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシド、およびｐＮＰ−β−Ｄ−セロビオースと共に、７５℃において３０分間インキュベートした。Cary 300 UV-Visible分光光度計（Agilent，カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、４１０ｎＭにおける光学密度の増加をモニターすることによって、ｐＮＰの遊離を記録した。
【０１５８】
図７３：セルロースおよび／またはヘミセルロース混合物による、処理されたススキの加水分解。パネルＡ：０．５μＭの酵素；２％の基質；パネルＢ：０．５μＭの酵素；５％の基質；パネルＣ：０．５μＭの酵素；８％の基質；パネルＤ：１．０μＭの酵素；１０％の基質。２つの異なる方法（オートクレーブまたはマイクロ波）を用いて前処理された種々の濃度（２％、５％、および８％）のススキを、セルラーゼ混合物（Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、およびＣｂ４８６を０．５μＭずつ含んでいる）もしくはヘミセルラーゼ混合物（Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、およびＣｂ９０９を０．５μＭずつ含んでいる）、または両方の酵素混合物と共に、全量５００μｌにおいて、７５℃において１５時間、往復振とうしてインキュベートした。さらに、両方の前処理方法の、前処理された高濃度（１０％）のススキを、１．０μＭの高濃度の酵素と共に、７５℃において１５時間、往復振とうしてインキュベートした。ｐＨＢＡＨ法を用いて、還元末端を測定した。
【０１５９】
図７４：Ｃｂ４８６を含んでいない酵素混合物による、処理されたススキの加水分解。これらのアッセイについては、０．５μＭの酵素および８％の基質を含んでいる反応混合物を用いた。２つの異なる方法（オートクレーブまたはマイクロ波）を用いて前処理されたススキ（８％）を、セルラーゼ混合物（Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、およびＣｂ６２９ＴＭ１を０．５μＭずつ含んでいるが、Ｃｂ４８６を含んでいない）もしくはヘミセルラーゼ混合物（Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、およびＣｂ９０９を０．５μＭずつ含んでいる）、または両方の酵素混合物と共に、全量５００μｌにおいて、７５℃において１５時間、往復振とうしてインキュベートした。ｐＨＢＡＨ法を用いて、還元末端を測定した。
【０１６０】
図７５：パネルＡ：Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、およびＣｂ４８６ポリペプチドのドメイン構造。パネルＢ：Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、または混合物（Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、およびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる）によって処理された、前処理されたススキ（ＡＣ＝オートクレーブ；ＭＷ＝マイクロ波）のサンプルの分析。２つの異なる方法（オートクレーブまたはマイクロ波）を用いて前処理された最終濃度２％のススキを、個々のセルラーゼ（Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、またはＣｂ４８６，各０．５μＭ）または４つ全てのセルラーゼを含んでいる混合物と共に、全量５００μｌにおいて、７５℃において１５時間、往復振とうしてインキュベートした。ｐＨＢＡＨ法を用いて、還元末端を測定した。
【０１６１】
図７６：Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６、またはＣｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる混合物を用いた還元糖アッセイ。リン酸バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．５）中、０．５μＭのＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６または両酵素を用いて、全量５００μｌにおいて、７５℃において１６時間、往復振とうしてインキュベートして反応を行った。
【０１６２】
図７７：Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６、またはＣｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる混合物により処理したＰＡＳＣ（パネルＡ）またはアビセル（パネルＢ）の分析。リン酸バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．５）中、０．５μＭのＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６または両酵素を用いて、全量５００μｌにおいて、７５℃において１６時間、往復振とうしてインキュベートして反応を行った。７μｌの加水分解産物をＴＬＣ分析に供した。
【０１６３】
図７８：Ｃｂ１９５２ＷＴ（Ａ）、ＴＭ１（Ｂ）およびＴＭ５（Ｃ）による、ＰＡＳＣの経時的な加水分解。２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを、０．５μＭのＣｂ１９５２ＷＴ、ＴＭ１、およびＴＭ５と共に、７５℃においてインキュベートした。種々の時間間隔（０分、２分、１０分、６０分、４時間、および２４時間）においてサンプルを取り出し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析に供した。
【０１６４】
図７９：Ｃｂ１９５２のＧＨ９ドメインのアミノ酸配列、ならびにCloceCel9G（Clostridium cellulolyticum Cel9G，GenBankアクセッション番号：AAA73868）（２６）およびThefuCel9A（Thermobifida fusca Cel9A，GenBankアクセッション番号：AAB42155）（３４）のＧＨ９ドメインのアミノ酸配列。CloceCel9G（非プロセッシブ型）およびThefuCel9A（プロセッシブ型）は、酵素−セロオリゴ糖複合体の構造が解明されている、２つのタイプのファミリー９テーマＢ１エンドグルカナーゼを代表する。アステリスクは、３つの配列内で同一または類似のアミノ酸残基を表す。黒塗りの三角は、保存されていない残基を表す。特定のアミノ酸残基の下の数字は、CloceCel9GおよびThefuCel9A酵素−基質複合体の構造に基づいた、そのアミノ酸残基と相互作用するセロオリゴ糖のサブサイトを表す。
【０１６５】
図８０：Ｃｂ１９５２野生型およびその短縮型変異体の、アビセル（Ａ）およびリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）（Ｂ）との定性的な結合。３０μｇの各タンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー，１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中、４０ｍｇ／ｍｌのアビセルセルロースまたは２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共にインキュベートした。混合物を４℃において１時間、往復振とうした。次いで、混合物を１６，４００ｒｐｍで３分間遠心することによって、結合したタンパク質と結合していないタンパク質とを分離した。セルロースペレットを１ｍｌのバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で４回洗浄した。次いで、ペレットに７０μｌの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーを添加し、５分間煮沸した。各画分の体積の１／１０に相当するタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１６６】
図８１：セルラーゼ活性を有するＣｂ１９５２およびその短縮型変異体の熱安定性。Ａ：Ｃｂ１９５２ＴＭ２；Ｂ：Ｃｂ１９５２ＴＭ３；Ｃ：Ｃｂ１９５２ＴＭ４。Veriti 96-well thermal cycleにおいて、７５℃、８０℃、および８５℃（ＷＴ、ＴＭ１、ＴＭ２、およびＴＭ３）、または４５℃、５０℃、および５５℃（ＴＭ４）において、酵素をインキュベートした。種々の時点においてサンプルを取り出し、それらの残存活性を、基質としてＰＡＳＣを用いて測定した。
【０１６７】
図８２：Ｃｂ１９５２のＣＢＭ３ｃのアミノ酸配列、および他のファミリー９グリコシドヒドロラーゼ由来のＣＢＭ３ｃのアミノ酸配列。Jindou et al. (2006)およびLi et al. (2010)の研究に基づいて、セルロースリガンドの結合に関係すると提唱されているアミノ酸残基を、黒塗りの三角で表している。比較のために用いた酵素の情報源は以下のとおりである。Ｃｂ１９５２：Caldicellulosiruptor besciiの二機能性セルラーゼ／マンナナーゼ（本研究）；ADQ45731：Caldicellulosiruptor kronotskyensisの推定セルラーゼ；ABP66693：Caldicellulosiruptor saccharolyticusの推定セルラーゼ；ADL42950：Caldicellulosiruptor obsidiansisの推定セルラーゼ／マンナンエンド−１，４−β−マンノシダーゼ；AAK06394：Caldicellulosiruptor sp. Tok7B.1のCelE（１１）；AAA73868：Clostridium cellulolyticumのCel9G（２６）；AAC38572：Clostridium cellulovoransのEngH（３８）；CAA39010：Clostridium stercorariumのCel9Z（１８）；ABX43720：Clostridium phytofermentansのCel9（３９、４８）；ABN51860：Clostridium thermocellum DSM 1313のCel9I（５０）；CAB38941：Paenibacillus barcinonensisのCel9B（３２）；BAB33148：Clostridium thermocellum F1のCelQ（２）；AAA23086：Cellulomonas fimiのCenB（２７）；AAW62376：Cellulomonas flavigenaのCBP105（２８）；AAB42155：Thermobifida fuscaのCel9A（１６、３４）。
【０１６８】
図８３：精製したＣｂ１５８１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【０１６９】
図８４：マイクロ波で前処理されたススキの酵素的加水分解を、７０℃（Ａ）または８０℃（Ｂ）において、Ｃｂ１５８１が向上させる効果を示す。前処理されたススキの酵素的加水分解を、各０．５μＭのセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物を用いて、基質として１０％のススキを用いて、全量５００μｌにおいて、ｐＨ６．０において行った。混合物中の酵素としては、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ１６２、ならびに表記されているような様々の量の組換えＣｂ１５８１が挙げられる。マイクロ波で前処理されたススキを酵素によって加水分解した後、Lever, M.の方法に従って、グルコース同等物の濃度を測定した。７０℃および８０℃の何れにおいても、反応混合物におけるＣｂ１５８１の量が増加するに従って、糖の遊離は向上した。
【０１７０】
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
本開示は、耐熱性のセルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素と、セルロース含有材料、ヘミセルロース含有材料、ならびにセルロースおよびヘミセルロースを含有している材料を分解するための、これらの酵素を用いた方法とに関する。また、本開示は、本明細書に開示されている上記酵素をコードする核酸、および本明細書に開示されている種々の酵素を含有している酵素カクテルに関する。
【０１７１】
一局面において、本開示はセルラーゼ活性を有する酵素を提供する。野生型セルラーゼタンパク質を超えて向上されたセルラーゼ活性を有する短縮された酵素が、本明細書に示されている。また、野生型セルラーゼタンパク質と類似のセルラーゼ活性を有する短縮された酵素が、本明細書に示されている。短縮されたタンパク質は、例えば短縮されたタンパク質の生産のより低いコストまたは向上された容易さに起因し、野生型タンパク質より優れ得る。
【０１７２】
別の局面において、本開示はヘミセルラーゼ活性を有する酵素を提供する。本開示のヘミセルロース分解酵素は、単独または組合せにおいて使用されて、ヘミセルロースに存在する構成サブユニット間の結合または連結の切断によって、複数のその構造要素へと、ヘミセルロースを分解（すなわちヘミセルロースを変換）し得る。結合または連結としては、キシロースサブユニット間の結合、キシロースと複数の官能基との間の結合、または官能基間の結合が挙げられ得る。
【０１７３】
別の局面において、本開示は、セルラーゼ活性もしくはヘミセルラーゼ活性を有する酵素の活性を増強させる複数の酵素および／またはそれらの混合物を提供する。セルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼの活性を増強させる酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはセルラーゼとヘミセルラーゼとの混合物に対して単独に供給される。
【０１７４】
本開示の方法を用いて処理されたセルロースまたはヘミセルロースは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％分解され得る。分解産物としては、グルコース、セロビオース、セロデキストリン、キシロース、アラビノース、グルクロニル基およびアセチル基の他に、他の官能基および炭化水素が挙げられ得る。分解産物は、生物燃料または付加価値のある他の化合物としての用途を見出され得る。例えば、セルロースまたはヘミセルロースから遊離する糖は、エタノールの生産のために発酵され得る。
【０１７５】
本開示のセルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素は、耐熱性であり、セルロースおよび／またはヘミセルロースを、糖（例えば、グルコース、キシロースまたはアラビノース）へと、約５０℃以上の温度において好ましく分解可能である。さらに、約５０℃以上の種々の温度に維持されている場合に、上記酵素は十分な活性を保持している。
【０１７６】
理論に縛られることなく、本明細書に記載の酵素カクテルの重要な別の特徴は、同じ生物にそれらが由来し、複数の上記酵素が互いに機能して、セルロースおよび／またはヘミセルロース分解することを保証することである。Caldicellulosiruptor besciiは、セルロース、およびヘミセルロース（例えばキシラン）を分解するための完全な酵素の一組を含んでいる。キシランは、多年生草本（例えば、スイッチグラス）における主要なヘミセルロースであり、おそらく大型の草本であるススキにおける主要なヘミセルロースである。
【０１７７】
一局面において、本開示は、ヘミセルロースを分解する耐熱性酵素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２が挙げられる）を提供する。Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５はエンドキシラナーゼとして機能する。Ｃｂ１１７２は、α−アラビノフラノシダーゼとして機能する。Ｃｂ９０９はグルクロニダーゼとして機能する。Ｃｂ２４８７はβ−キシロシダーゼとして機能する。Ｃｂ１６２はアセチルキシランエステラーゼとして機能する。また、部分的または完全な活性を保持している種々の上記酵素は、本開示によって包含されている。本明細書に開示されている酵素は、種々の組合せにおいて使用され得る。
【０１７８】
一局面において、本開示は、セルロース含有材料の分解について改良された酵素混合物を提供する。セルロース含有材料の分解について改良された酵素混合物は、例えば、セルラーゼおよび／または短縮されたセルラーゼ酵素の改良された混合物を含んでいる。
【０１７９】
別の局面において、本開示は、セルロースおよびヘミセルロースの両方を含有している材料の分解用の酵素混合物を提供する。セルロースおよびヘミセルロースの両方を含有している本明細書に開示されている酵素混合物は、セルロースおよびヘミセルロースの両方を含有している植物材料に対する相乗的な活性という驚くべき結果をもたらす。例えば、後述の実施例１５に示されているように、複数のセルラーゼの混合物および複数のヘミセルラーゼの混合物を含有している本明細書に記載の酵素カクテルは、セルラーゼ単独の同じ混合物より、植物材料に対して優れたセルラーゼ活性を有する。さらに、複数のセルラーゼの混合物および複数のヘミセルラーゼの混合物を含有している酵素カクテルは、ヘミセルラーゼ単独の同じ混合物より、植物材料に対して優れたセルラーゼ活性を有する。
【０１８０】
酵素の組合せ（すなわち酵素カクテル）は、特定の供給原料のセルロース構造および／またはヘミセルロース構造に合わせて、分解レベルを向上させるために調製され得る。本明細書に記載されている酵素カクテルの初期の分析は、工業的な酵素混合物において重要な特性である長い貯蔵安定性を、成分が有することを示唆している。
【０１８１】
＜略語／定義＞
以下の略語が本開示に使用されている：ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＳＷＡＸ（可溶性コムギアラビノキシラン）；ＯＳＸ（オートスペルトキシラン）；ＢＷＸ（カバ材キシラン）；ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）；ＲＡＸ（ライアラビノキシラン）；ＭｅＧｌｃＡ（４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロノシル）；ｐＮＰ−Ｘ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド）;ＧＨ（グリコシドヒドロラーゼ）；ＣＢＭ（炭水化物結合モジュール）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＡＳＣ（リン酸膨張セルロース）；ＣＭＣ−Ｎａ（カルボキシメチルセルロースナトリウム）；ＬＢＧ（ローカストビーンガム）；ＫＧＭ（コンニャクグルコマンナン）；ＷＡＸ（コムギアラビノキシラン）；ＨＰＡＥＣ（高速陰イオン交換クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）。
【０１８２】
本明細書に使用されるとき、「ポリペプチド」は、重合された連続する複数のアミノ酸残基（例えば、重合された連続する少なくとも５つのアミノ酸残基）の鎖である。本明細書に使用されるとき、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「アミノ酸配列」は、交換可能に使用される。
【０１８３】
本明細書に使用されるとき、「セルラーゼ」活性は、セルロースおよび／またはセロオリゴ糖におけるグルコース分子間の１−４  β−Ｄ−グリコシド結合を切断する酵素活性を指す。セルラーゼ活性としては、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性およびβ−グルコシダーゼ活性が挙げられる。
【０１８４】
本明細書に使用されるとき、「ヘミセルラーゼ」活性は、ヘミセルロースの構成要素である分子における結合を切断する酵素活性（エンドキシラナーゼ活性、α−アラビノフラノシダーゼ活性、グルクロニダーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性およびアセチルキシランエステラーゼ活性が挙げられる）を指す。
【０１８５】
＜本開示のポリペプチド＞
いくつかの局面において、本開示のポリペプチドは、好熱性真正細菌Caldicellulosiruptor bescii（正式にはAnaerocellum thermophilum DSMZ 6725）の組換えポリペプチド、それらの短縮型およびバリアントに関する。
【０１８６】
一局面において、本開示は、セルロースの分解に関連している組換えポリペプチドを提供する。いくつかの局面において、本開示は、セルラーゼ活性を有する組換えのＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドを提供する。
【０１８７】
一局面において、本開示は、ヘミセルロースの分解に関連している組換えポリペプチドを提供する。いくつかの局面において、本開示は、ヘミセルラーゼ活性を有する組換えのＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２ポリペプチドを提供する。
【０１８８】
一局面において、本開示は、セルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼを用いたセルロースおよび／またはヘミセルロースの処理の間におけるセルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解を促進する組換えポリペプチドを提供する。一局面において、本開示は、セルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼを用いたセルロースおよび／またはヘミセルロースの処理の間におけるセルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解を促進するヒートショックタンパク質である組換えＣｂ１５８１ポリペプチドを提供する。
【０１８９】
（セルラーゼ）
（Ｃｂ１９５２ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１９５２ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５２ポリペプチド」は、配列番号４４のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１９５２ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドの何れか１つの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５２ポリペプチド」は、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドの何れか１つのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０１９０】
配列番号４４のポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ１９５２遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号４４のＣｂ１９５２ポリペプチドは、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー９触媒ドメイン（セルラーゼドメイン）、３つのファミリー３炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）、および１つのＧＨ５触媒ドメイン（マンナナーゼドメイン）を有するエンドセルラーゼである（図１８）。
【０１９１】
また、本開示は、シグナルペプチド配列のない配列番号４４のＣｂ１９５２ポリペプチドである、配列番号１１４のＣｂ１９５２ポリペプチドを包含している。上記シグナルペプチドは、翻訳された当初のＣｂ１９５２タンパク質の一部として、細胞からの当該タンパク質の分泌を目的として生じるものであり、分泌過程の間に当該タンパク質から切断され得る。また、本開示は、ポリペプチド鎖の最初にメチオニン残基を有する配列番号１１４のＣｂ１９５２ポリペプチドを包含している。
【０１９２】
本開示は、野生型Ｃｂ１９５２の短縮型変異体（「ＴＭ」）である配列番号４６のＣｂ１９５２ポリペプチド（「Ｃｂ１９５２ＴＭ１」）をさらに包含している。Ｃｂ１９５２ＴＭ１ポリペプチドは、野生型Ｃｂ１９５２のセルラーゼドメインおよび複数のＣＢＭを含んでいるが、マンナーゼドメインを含んでいない（図１８）。
【０１９３】
また、本開示は、マンナーゼドメインもＣ末端にあるＣＢＭも含んでいない野生型Ｃｂ１９５２の短縮型変異体である配列番号１２４のＣｂ１９５２ポリペプチド（「Ｃｂ１９５２ＴＭ２」）（図１８）を包含している。
【０１９４】
また、本開示は、マンナーゼドメインも最もＣ末端にある２つのＣＢＭも含んでいない野生型Ｃｂ１９５２の短縮型変異体である配列番号１２６のＣｂ１９５２ポリペプチド（「Ｃｂ１９５２ＴＭ３」）（図１８）を包含している。
【０１９５】
また、本開示は、ＧＨ９セルラーゼドメインを含んでおり、何れのＣＢＭもマンノースドメインも含んでいない野生型Ｃｂ１９５２の短縮型変異体である配列番号１２８のＣｂ１９５２ポリペプチド（「Ｃｂ１９５２ＴＭ４」）（図１８）を包含している。
【０１９６】
本開示のＣｂ１９５２ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５２ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５２ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも６０％保持している。
【０１９７】
（Ｃｂ１９５３ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は組換えＣｂ１９５３ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５３ポリペプチド」は、配列番号６０のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１９５３ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドの何れか１つの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５３ポリペプチド」は、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドの何れか１つのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸配列を有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０１９８】
配列番号６０のＣｂ１９５３ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ１９５３遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号６０のＣｂ１９５３ポリペプチドは、セルロース由来のセロビオースを主に切断するエンドグルカナーゼであり、２つのグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメイン、および３つの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を有する（図２９）。
【０１９９】
また、本開示は、シグナルペプチド配列なしの配列番号６０のＣｂ１９５３ポリペプチドである配列番号６１のＣｂ１９５３ポリペプチドを包含している。上記シグナルペプチドは、翻訳された当初のＣｂ１９５３タンパク質の一部として、細胞からの当該タンパク質の分泌を目的として生じるものであり、分泌過程の間に当該タンパク質から切断され得る。また、本開示は、ポリペプチド鎖の最初にメチオニン残基を有する配列番号６１のＣｂ１９５３ポリペプチドを包含している。
【０２００】
本開示は、野生型Ｃｂ１９５３の短縮型変異体（「ＴＭ」）である配列番号１１１のＣｂ１９５３ポリペプチド（「Ｃｂ１９５３ＴＭ２」）をさらに包含している。Ｃｂ１９５３ＴＭ２ポリペプチドは、野生型Ｃｂ１９５３のＣ末端のＧＨ５ドメインおよび３つのＣＢＭを含んでおり、Ｎ末端のＧＨ５ドメインを含んでいない（図２９）。
【０２０１】
本開示のＣｂ１９５３ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５３ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５３ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２０２】
（Ｃｂ１９５４ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１９５４ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５４ポリペプチド」は、配列番号７４のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物およびセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１９５４ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５４ポリペプチド」は、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２０３】
配列番号７４のＣｂ１９５４ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ１９５４遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号７４のＣｂ１９５４ポリペプチドは、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー９触媒ドメイン（セルラーゼドメイン）、３つの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）、および１つのＧＨ４８触媒ドメインを有するエンドグルカナーゼである（図３８）。
【０２０４】
また、本開示は、シグナルペプチド配列なしの配列番号７４のＣｂ１９５４ポリペプチドである配列番号１２１のＣｂ１９５４ポリペプチドを包含している。上記シグナルペプチドは、翻訳された当初のＣｂ１９５４タンパク質の一部として、細胞からの当該タンパク質の分泌を目的として生じるものであり、分泌過程の間に当該タンパク質から切断され得る。また、本開示は、ポリペプチド鎖の最初にメチオニン残基を有する配列番号１２１のＣｂ１９５４ポリペプチドを包含している。
【０２０５】
本開示は、野生型Ｃｂ１９５４の短縮型変異体（「ＴＭ」）である配列番号７６のＣｂ１９５４ポリペプチド（「Ｃｂ１９５４ＴＭ３」）をさらに包含している。
【０２０６】
本開示のＣｂ１９５４ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５４ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５４ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも６０％保持している。
【０２０７】
（Ｃｂ１９４６ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１９４６ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９４６ポリペプチド」は、配列番号８６のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびセルラーゼ活性を有する短縮型変異体のその相同物を指す。また、「Ｃｂ１９４６ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９４６ポリペプチド」は、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２０８】
配列番号８６のＣｂ１９４６ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ１９４６遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号８６のＣｂ１９４６ポリペプチドは、Ｎ末端領域にグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメイン、Ｃ末端領域にＧＨファミリー４４触媒ドメイン、および２つのＧＨ触媒ドメインの間に２つの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を有するエンドグルカナーゼである（図４２）。
【０２０９】
また、本開示は、シグナルペプチド配列なしの配列番号８６のＣｂ１９４６ポリペプチドである配列番号８７のＣｂ１９４６ポリペプチドを包含している。上記シグナルペプチドは、翻訳された当初のＣｂ１９４６タンパク質の一部として、細胞からの当該タンパク質の分泌を目的として生じるものであり、分泌過程の間に当該タンパク質から切断され得る。また、本開示は、ポリペプチド鎖の最初にメチオニン残基を有する配列番号８７のＣｂ１９４６ポリペプチドを包含している。
【０２１０】
本開示は、野生型Ｃｂ１９４６の短縮型変異体（「ＴＭ」）である配列番号１１３のＣｂ１９４６ポリペプチド（「Ｃｂ１９４６ＴＭ２」）をさらに包含している。Ｃｂ１９４６ＴＭ２ポリペプチドは、野生型の、Ｃ末端のＧＨ４４ドメインおよび２つのＣＢＭを含んでおり、Ｎ末端のＧＨ５ドメインを含んでいない（図４２）。
【０２１１】
本開示のＣｂ１９４６ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９４６ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９４６ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも６０％保持している。
【０２１２】
（Ｃｂ６２９ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ６２９ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ６２９ポリペプチド」は、配列番号９８のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびセルラーゼ活性を有する短縮型変異体のその相同物を指す。また、「Ｃｂ６２９ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドの何れか１つの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ６２９ポリペプチド」は、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２１３】
配列番号９８のＣｂ６２９ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ６２９遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号９８のＣｂ６２９ポリペプチドは、セルロースから、グルコース、セロビオースおよびセロトリオースを最初に切断するエンドセルラーゼであり、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメイン、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）ファミリー１７＿２８ドメイン、および細胞表面への酵素のアンカリングにおそらく使用される３つの表層ホモロジー（ＳＬＨ）モジュールを有する（図４７）。
【０２１４】
また、本開示は、シグナルペプチド配列なしの配列番号９８のＣｂ６２９ポリペプチドである配列番号１１９のＣｂ６２９ポリペプチドを包含している。上記シグナルペプチドは、翻訳された当初のＣｂタンパク質の一部として、細胞からの当該タンパク質の分泌を目的として生じるものであり、分泌過程の間に当該タンパク質から切断され得る。また、本開示は、ポリペプチド鎖の最初にメチオニン残基を有する配列番号１１９のＣｂ６２９ポリペプチドを包含している。
【０２１５】
本開示は、野生型Ｃｂ６２９の短縮型変異体（「ＴＭ」）である配列番号１００のＣｂ６２９ポリペプチド（「Ｃｂ６２９ＴＭ１」）をさらに包含している。Ｃｂ６２９ＴＭ１ポリペプチドは、野生型Ｃｂ６２９の、Ｎ末端のＧＨ５ドメインおよびＣＢＭ１７＿２８ドメインを含んでおり、Ｃ末端のＳＬＨモジュールを含んでいない（図４７）。
【０２１６】
本開示のＣｂ６２９ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ６２９ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ６２９ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも６０％保持している。
【０２１７】
（Ｃｂ４８６ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ４８６ポリペプチドに関する。
【０２１８】
本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ４８６ポリペプチド」は、配列番号１０６のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ４８６ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１０６のポリペプチドの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ４８６ポリペプチド」は、配列番号１０６のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２１９】
配列番号１０６のＣｂ４８６ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号１０６のＣｂ４８６ポリペプチドは、セロビオース（グルコースの二糖）の、２ユニットのグルコースへの加水分解を触媒するβ−グルコシダーゼであり、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１触媒ドメインを有する（図５３Ａ）。
【０２２０】
本開示のＣｂ４８６ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ４８６ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ４８６ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも６０％保持している。
【０２２１】
（ヘミセルラーゼ）
また、本開示は、耐熱性のヘミセルロース分解酵素のポリペプチドＣｂ１９３（配列番号３）、Ｃｂ１９５（配列番号７）、Ｃｂ１１７２（配列番号１３）、Ｃｂ９０９（配列番号１９）、Ｃｂ２４８７（配列番号２７）およびＣｂ１６２（配列番号３３）、またはそれらの部分配列を提供する。本開示は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性、または完全な（１００％の）配列同一性を、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９またはＣｂ１６２に対して有するアミノ酸配列を含んでいる単離されているポリペプチドまたは組換えポリペプチドをさらに提供する。
【０２２２】
本開示のヘミセルラーゼは１つ以上のグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含み得る。また、ヘミセルラーゼは１つ以上の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含み得る。ＣＢＭモジュールは、ＧＨドメインに割り込み得るか、または２つのＧＨドメインの間に配置され得る。また、ヘミセルラーゼは、アセチルキシランエステラーゼドメインを含み得る。特定の実施形態において、ＧＨ、ＣＢＭおよび／またはアセチルキシランエステラーゼドメインの配列は、ポリペプチドバリアントに保存されている。
【０２２３】
（Ｃｂ１９３ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１９３ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９３ポリペプチド」は、配列番号３のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびヘミセルラーゼ活性その相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１９３ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３および／または３７のポリペプチドの何れか１つの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９３ポリペプチド」は、配列番号３および／または３７のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２２４】
配列番号３のＣｂ１９３ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号３または３７のＣｂ１９３ポリペプチドは、ヘミセルロースのキシロース骨格をランダムに切断して、β−１，４−結合を有するより短いキシロースの鎖を生成するエンドキシラナーゼである。これらのキシロオリゴ糖は２つ以上の糖サブユニットに及び得る。Ｃｂ１９３は、おそらく取り除かれ得るシグナルペプチド（配列番号３のアミノ酸１〜４１に相当する）を有する。シグナルペプチドなしのＣｂ１９３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３７に開示されている。当該タンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１０触媒ドメイン内に挿入されている２つの推定炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を有する（図２Ａ）。
【０２２５】
また、本開示は、シグナルポリペプチド配列なしの配列番号３のＣｂ１９３ポリペプチドである配列番号３７のＣｂ１９３ポリペプチドを包含している。上記シグナルペプチドは、翻訳された当初のＣｂタンパク質の一部として、細胞からの当該タンパク質の分泌を目的として生じるものであり、分泌過程の間に当該タンパク質から切断され得る。また、本開示は、ポリペプチド鎖の最初にメチオニン残基を有する配列番号３７のＣｂ１９３ポリペプチドを包含している。
【０２２６】
本開示のＣｂ１９３ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９３ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９３ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２２７】
（Ｃｂ１９５ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１９５ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５ポリペプチド」は、配列番号７のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびヘミセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１９５ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１９５ポリペプチド」は、配列番号７のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２２８】
配列番号７のＣｂ１９５ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号７のＣｂ１９５ポリペプチドは、ヘミセルロースのキシロース骨格をランダムに切断して、β−１，４−結合を有するより短いキシロースの鎖を生成するエンドキシラナーゼである。これらのキシロオリゴ糖は、２つ以上の糖サブユニットを含む範囲に及び得る。
【０２２９】
本開示のＣｂ１９５ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１９５ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２３０】
（Ｃｂ１１７２ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１１７２ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１１７２ポリペプチド」は、配列番号１３のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびヘミセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１１７２ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１１７２ポリペプチド」は、配列番号１３のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２３１】
配列番号１３のＣｂ１１７２ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号１３のＣｂ１１７２ポリペプチドは、ヘミセルロースのキシロース骨格または分枝もしくは脱分枝アラビナンからアラビノース部分を切断し、アラビノースを専ら生成するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである。当該タンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５１触媒ドメインを有する（図６Ｄ）。
【０２３２】
本開示のＣｂ１１７２ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１１７２ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１１７２ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２３３】
（Ｃｂ９０９ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ９０９ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ９０９ポリペプチド」は、配列番号１９のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびヘミセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ９０９ポリペプチド」は、配列番号１９のポリペプチドの配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ９０９ポリペプチド」は、配列番号１９のポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２３４】
配列番号１９のＣｂ９０９ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号１９のＣｂ９０９ポリペプチドは、キシランの４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸およびβ−１，４−キシロシド結合骨格の間のα−１，２−グリコシド結合を切断するα−グルクロニダーゼである。
【０２３５】
本開示のＣｂ９０９ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ９０９ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ９０９ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２３６】
（Ｃｂ２４８７ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ２４８７ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ２４８７ポリペプチド」は、配列番号２７のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびヘミセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ２４８７ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号２７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ２４８７ポリペプチド」は、配列番号２７のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２３７】
配列番号２７のＣｂ２４８７ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号２７のＣｂ２４８７ポリペプチドはβ−キシロシダーゼである。
【０２３８】
本開示のＣｂ２４８７ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ２４８７ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ２４８７ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２３９】
（Ｃｂ１６２ポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、組換えＣｂ１６２ポリペプチドに関する。本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１６２ポリペプチド」は、配列番号３３のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびヘミセルラーゼ活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１６２ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１６２ポリペプチド」は、配列番号３３のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
【０２４０】
配列番号３３のＣｂ１６２ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。配列番号３３のＣｂ１６２ポリペプチドは、ヘミセルロースにおけるキシロースおよびアセチル基の側鎖の間における結合を切断して、他のヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼ）に対する接近容易性を、キシランの骨格に付与するアセチルキシランエステラーゼである。当該タンパク質は、アセチルキシランエステラーゼのシングルドメインを有する（図１０Ａ）。
【０２４１】
本開示のＣｂ１６２ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１６２ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１６２ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、酵素活性の初速度の少なくとも６０％を保持している。
【０２４２】
（セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進させるポリペプチド）
いくつかの局面において、本開示は、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する組換えポリペプチドを提供する。
【０２４３】
一局面において、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する組換えポリペプチドは、組換えＣｂ１５８１ポリペプチドである。
【０２４４】
本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１５８１ポリペプチド」は、配列番号１４６のポリペプチド、ならびにその短縮型変異体、その相同物、およびセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する活性を有するその相同物の短縮型変異体を指す。また、「Ｃｂ１５８１ポリペプチド」は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１４６のポリペプチドの配列に対して有し、かつセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する活性を有するポリペプチドを指す。また、本明細書に使用されるとき、「Ｃｂ１５８１ポリペプチド」は、配列番号１４６のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する活性を有するポリペプチドを指す。
【０２４５】
配列番号１４６のＣｂ１５８１ポリペプチドは、Caldicellulosiruptor besciiにおけるＣｂ遺伝子の産物である（ここで、ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する）。Ｃｂ１５８１ポリペプチドは、小さいヒートショックタンパク質である。
【０２４６】
本開示のＣｂ１５８１ポリペプチドは好熱性および耐熱性である。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１５８１ポリペプチドは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する活性のピークを有する。いくつかの局面において、本開示のＣｂ１５８１ポリペプチドは、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度においてインキュベートされる場合に、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する活性の初速度を、少なくとも２４時間にわたって少なくとも６０％保持している。
【０２４７】
（タンパク質「タグ」を有するポリペプチド）
本開示のポリペプチドは、ポリペプチド「タグ」を有する、本明細書に開示されている任意の組換えポリペプチドさらに包含している。ポリペプチドタグは、遺伝子のクローニングを介して所望のタンパク質に付加され得、「タグ付加」タンパク質の、精製を容易にするか、可溶性を向上させるか、および／または安定性を向上させるために用いられ得るポリペプチドである。タンパク質タグは、当該分野に周知であり、当該タンパク質タグとしては、ポリヒスチジン（例えば、連続する６つのＨｉｓ−残基）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＭＹＣおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のタグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４８】
（ポリペプチドの生産）
上記ポリペプチドは、天然の宿主（Caldicellulosiruptor bescii）において発現され得、当該宿主から精製され得る。また、ポリペプチドは、トランスジェニック発現系において発現され得、当該発現系から精製され得る。トランスジェニック発現系は、原核生物または真核生物であり得る。トランスジェニック宿主細胞としては、酵母およびE. coliが挙げられる。トランスジェニック宿主細胞は、当該宿主細胞外に上記ポリペプチドを分泌し得る。特定の実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、シグナル配列を欠いている。組換えポリペプチドの生産方法は後述されている。
【０２４９】
＜本開示の核酸＞
本開示は、本明細書に開示されているポリペプチドの何れかをコードする組換え核酸をさらに提供する。また、ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書において「遺伝子」と呼ばれる。ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードする核酸との間の関連を決定する方法は、当該技術において周知である。同様に、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を決定する方法は、当該技術において周知である。コドン縮重に起因して、複数の異なる核酸配列は同じポリペプチド配列をコードし得る。
【０２５０】
本明細書に使用されるとき、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」およびそれらのバリアントは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含んでいる）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含んでいる）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他の型、ならびに非ヌクレオチド骨格を含んでいる他の重合体（ただし、当該重合体は、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対合および塩基スタッキングを許容する構成において核酸塩基を含んでいる）に対して包括的である。したがって、これらの用語は、核酸配列修飾の公知の型（例えば、天然に存在するヌクレオチドの、類似物を用いた置換、およびヌクレオチド間の修飾）を包含している。本明細書に使用されるとき、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに対する記号は、IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclatureによって推奨されている記号である。
【０２５１】
本明細書に使用されるとき、２つ以上の「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、単一の連続するポリデオキシリボヌクレオチド鎖／ＤＮＡの鎖に存在し得る。したがって、ＤＮＡの一本鎖（例えば、プラスミドにおける）は、２つ以上の「核酸」または「ポリヌクレオチド」を含み得、したがって２つ以上の異なるポリペプチドをコードする配列を含み得る。
【０２５２】
核酸は、標準的な分子生物学的手法（例えば、Sambrook, J. et al. 2000. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)に記載の手法）を用いて、合成され得るか、単離され得るか、または操作され得る。手法としては、クローニング、ｃＤＮＡライブラリの発現、ならびにｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの増幅が挙げられる。
【０２５３】
本開示の核酸またはこれらの部分配列は、発現カセットまたはベクターを含んでいるクローニング媒体に組み込まれ得る。クローニング媒体は、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体であり得る。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを包含し得る。クローニング媒体は、真正細菌の人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来のベクター（ＰＡＣ）、酵母の人工染色体（ＹＡＣ）、または哺乳類の人工染色体（ＭＡＣ）であり得る。
【０２５４】
核酸はプロモータと作動可能に連結され得る。プロモータは、ウイルスプロモータ、真正細菌プロモータ、哺乳類プロモータまたは植物プロモータであり得る。プロモータは、恒常的なプロモータ、誘導可能なプロモータ、組織特異的なプロモータ、または環境的に制御されるプロモータもしくは発生的に制御されるプロモータであり得る。
【０２５５】
（セルラーゼをコードする核酸）
（Ｃｂ１９５２ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８または４６のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２５６】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２５７】
いくつかの局面において、本開示は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号４５のポリヌクレオチドは配列番号４４のポリペプチドをコードする。配列番号１１５のポリヌクレオチドは配列番号４５のポリペプチドをコードする。配列番号４７のポリヌクレオチドは配列番号４６のポリペプチドをコードする。配列番号１２５のポリヌクレオチドは配列番号１２４のポリペプチド１２４をコードする。配列番号１２７のポリヌクレオチドは配列番号１２６のポリペプチドをコードする。配列番号１２９のポリヌクレオチドは配列番号１２８のポリペプチド１２８をコードする。
【０２５８】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７の配列の何れかに対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７の何れかの配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２５９】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１９５２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２６０】
（Ｃｂ１９５３ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号６０、６１または１１１のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２６１】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２６２】
いくつかの局面において、本開示は、配列番号６２、６３または１１０の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号６２のポリヌクレオチドは配列番号６０のポリペプチドをコードする。配列番号６３のポリヌクレオチドは配列番号６１のポリペプチドをコードする。配列番号１１０のポリヌクレオチドは配列番号１１１のポリペプチドをコードする。
【０２６３】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号６２、６３および１１０の配列の何れかに対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６２、６３または１１０の何れかの配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２６４】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１９５３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２６５】
（Ｃｂ１９５４ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号７４、１２１または７６のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２６６】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２６７】
いくつかの局面において、本開示は、配列番号１１６、７５または７７の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号１１６のポリヌクレオチドは配列番号７４のポリペプチドをコードする。配列番号７５のポリヌクレオチドは配列番号１２１のポリペプチドをコードする。配列番号７７のポリヌクレオチドは配列番号７６のポリペプチドをコードする。
【０２６８】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１１６、７５および７７の配列の何れかに対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１１６、７５および７７の何れかの配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２６９】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１９５４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２７０】
（Ｃｂ１９４６ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号８６、８７または１１３のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２７１】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２７２】
いくつかの局面において、本開示は、配列番号８８、８９または１１２の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号８８のポリヌクレオチドは配列番号８６のポリペプチドをコードする。配列番号８９のポリヌクレオチドは配列番号８７のポリペプチドをコードする。配列番号１１２のポリヌクレオチドは配列番号１１３のポリペプチドをコードする。
【０２７３】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号８８、８９および１１２の配列の何れかに対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号８８、８９または１１２の何れかの配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチド組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２７４】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１９４６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２７５】
（Ｃｂ６２９ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ６２９ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号９８、１１９または１００のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２７６】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号９８、１１９または１００のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示のポリヌクレオチドは、配列番号９８、１１９または１００のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２７７】
いくつかの局面において、本開示は、配列番号９９、１２０または１０１の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号９９のポリヌクレオチドは配列番号９８のポリペプチドをコードする。配列番号１２０のポリヌクレオチドは配列番号１１９のポリペプチドをコードする。配列番号１０１のポリヌクレオチドは配列番号１００のポリペプチドをコードする。
【０２７８】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号９９、１２０または１０１の配列の何れかに対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号９８、１１９または１００のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号９９、１２０または１０１の何れかの配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号９８、１１９または１００のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２７９】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ６２９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２８０】
（Ｃｂ４８６ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ４８６ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号１０６のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２８１】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１０６の配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１０６のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２８２】
いくつかの局面において、本開示は、配列番号１０７の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号１０７のポリヌクレオチドは配列番号１０６のポリペプチドをコードする。
【０２８３】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１０７の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１０６のポリペプチドの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１０７の配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１０６のポリペプチドの配列に対して有し、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２８４】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ４８６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２８５】
（ヘミセルラーゼをコードする核酸）
本開示は、ヘミセルロース分解酵素Ｃｂ１９３（配列番号４）、Ｃｂ１９５（配列番号８）、Ｃｂ１１７２（配列番号１４）、Ｃｂ９０９（配列番号２０）、Ｃｂ２４８７（配列番号２８）およびＣｂ１６２（配列番号３４）またはそれらの部分配列をコードするヌクレオチド配列を提供する。また、本開示は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性または完全な（１００％）配列同一性を、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２をコードする核酸配列に対して有するヌクレオチド配列を提供する。
【０２８６】
本開示のヌクレオチド配列は、１つ以上のグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを有するポリペプチドをコードし得る。また、ヌクレオチド配列は、１つ以上の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を有するポリペプチドをコードし得る。ＣＢＭモジュールは、ＧＨドメインに割り込み得るか、または２つのＧＨドメインの間に配置され得る。また、ヌクレオチド配列は、アセチルキシランエステラーゼドメインを有するポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態において、ＧＨ、ＣＢＭおよび／またはアセチルキシランエステラーゼドメインの配列は、ヌクレオチドバリアントに保存されている。
【０２８７】
（Ｃｂ１９３ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１９３ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号３または３７のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２８８】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３および／または３７のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３および／または３７のポリペプチドの何れかのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２８９】
いくつかの局面において、本開示は配列番号４または３８の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号４のポリヌクレオチドは配列番号３のポリペプチドをコードする。配列番号３８のポリヌクレオチドは配列番号３７のポリペプチドをコードする。
【０２９０】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号４および／または３８の配列の何れかに対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３および／または３７のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４または３８の何れかの配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３および／または３７のポリペプチドの何れかの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２９１】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１９３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２９２】
（Ｃｂ１９５ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１９５ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は配列番号７のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２９３】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示のポリヌクレオチドは、配列番号７のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２９４】
いくつかの局面において、本開示は配列番号８の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号８のポリヌクレオチドは配列番号７のポリペプチドをコードする。
【０２９５】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号８の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７のポリペプチドの配列に対して有し、かつミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続する、配列番号８の配列のヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２９６】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１９５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０２９７】
（Ｃｂ１１７２ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１１７２ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は配列番号１３のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２９８】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１３のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０２９９】
いくつかの局面において、本開示は配列番号１４の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号１４のポリヌクレオチドは配列番号１３のポリペプチドをコードする。
【０３００】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１４の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０３０１】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１１７２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０３０２】
（Ｃｂ９０９ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ９０９ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号１９のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３０３】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１９のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１９のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３０４】
いくつかの局面において、本開示は配列番号２０の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号２０のポリヌクレオチドは配列番号１９のポリペプチドをコードする。
【０３０５】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号２０の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１９のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２０の配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１９のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０３０６】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ９０９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０３０７】
（Ｃｂ２４８７ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ２４８７ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号２７のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示は、本開示のＣｂ２４８７ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号２７のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３０８】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号２７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２７のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３０９】
いくつかの局面において、本開示は配列番号２８の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号２８のポリヌクレオチドは配列番号２７のポリペプチドをコードする。
【０３１０】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号２８の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号２７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２８の配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号２７のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０３１１】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ２４８７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０３１２】
（Ｃｂ１６２ポリヌクレオチド）
本開示は、本開示のＣｂ１６２ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号３３のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３１３】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３３のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３１４】
いくつかの局面において、本開示は配列番号３４の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号３４のポリヌクレオチドは配列番号３３のポリペプチドをコードする。
【０３１５】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３４の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号３３のポリペプチドの配列に対して有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３４の配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の、配列番号３３のポリペプチドの配列に対する同一性を有し、かつヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０３１６】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１６２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０３１７】
（セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進するポリペプチドをコードする核酸）
本開示は、本開示のＣｂ１５８１ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。いくつかの局面において、本開示は、配列番号１４６のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３１８】
本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１４６の配列に対して有し、かつセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１４６のポリペプチドのうちの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０または少なくとも２００の連続するアミノ酸を有し、かつセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを包含している。
【０３１９】
いくつかの局面において、本開示は配列番号１４７の組換えポリヌクレオチドを包含している。配列番号１４７のポリヌクレオチドは配列番号１４６のポリペプチドをコードする。
【０３２０】
また、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１４７の配列に対して有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１４６のポリペプチドの配列に対して有し、かつセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進するポリペプチドをコードする。また、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１４７の配列のうちの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチドを包含しており、当該組換えポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を、配列番号１４６のポリペプチドの配列に対して有し、かつセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進するポリペプチドをコードする。
【０３２１】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているＣｂ１５８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な組換えポリヌクレオチドをさらに包含している。
【０３２２】
（タンパク質「タグ」を有するポリヌクレオチドをコードする組換えポリヌクレオチド）
さらに、本明細書には、ポリペプチド「タグ」を有する本開示のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドが開示されている。ポリペプチド「タグ」をコードするポリヌクレオチドは、標準的な生物学のクローニング手法によって、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに付加され得る（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照すればよい）。
【０３２３】
＜バリアント、配列同一性および配列類似性＞
比較に関する配列のアラインメント方法は、当該技術において周知である。例えば、任意の２配列間における配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いてなされ得る。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、MyersおよびMiller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム；Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の部分的な相同性アルゴリズム；NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453の相同性アラインメントアルゴリズム；PearsonおよびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性検索法；KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877のように変更されている、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムである。
【０３２４】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実施は、配列同一性を決定するために、配列の比較に利用され得る。そのような実施としては、PC/GeneプログラムにおけるCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View、Calif. から入手可能）；ALIGNプログラム（Version 2.0）ならびにWisconsin Genetics Software Package、Version 8におけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive、Madison、Wis., USAから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプログラムを用いたアラインメントは、初期設定のパラメータを用いて実施され得る。CLUSTALプログラムは、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)；Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153；Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65；およびPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によって十分に説明されている。ALIGNプログラムは、上述のMyersおよびMiller (1988)のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較するときに、PAM120 weight residue table、１２のgap length penaltyおよび４のgap penaltyが、ALIGNプログラムと共に使用され得る。Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のBLASTプログラムは、上述のKarlinおよびAltschul (1990)のアルゴリズムに基づいている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTNプログラム、score=100、wordlength=12を用いて実施され得る。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質またはポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTXプログラム、score=50、wordlength=3を用いて実施され得る。比較を目的としたギャップを入れたアラインメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0における）は、ltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように利用され得る。代替的に、PSI-BLAST（BLAST 2.0における）は、分子間の遠い関連性を検出する繰り返しの検索を実施するために使用され得る（上述のAltschul et al. (1997)を参照すればよい）。BLAST、Gapped BLASTまたはPSI-BLASTを利用する場合に、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列用のBLASTN、タンパク質用のBLASTX）の初期設定パラメータが使用され得る。BLASTは、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）から利用可能である。また、アラインメントは、検査によって手動で実施得る。
【０３２５】
本明細書に使用されるとき、「配列同一性」は、分析されるべき複数の配列における同じ位置において同じ残基のパーセンテージを指す。本明細書に使用されるとき、「配列類似性」は、分析されるべき複数の配列における同じ位置において類似の生物物理学的／生物化学的な特徴（例えば、電荷、サイズ、疎水性）を有する残基のパーセンテージを指す。
【０３２６】
酵素バリアントの機能的活性は、標準的な分子生物学的手法（薄層クロマトグラフィーまたは還元糖アッセイが挙げられる）を用いて評価され得る。酵素活性は、セルロース、ヘミセルロースまたは人工基質を用いて決定され得る。
【０３２７】
＜組成物＞
本開示は、明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物をさらに包含している。いくつかの局面において、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に示されている。２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物は、ポリペプチドおよび／または酵素の「カクテル」と呼ばれ得る。
【０３２８】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該１つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０３２９】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該２つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０３３０】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該３つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０３３１】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該４つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０３３２】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該５つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０３３３】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該６つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０３３４】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該１つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３３５】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該２つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３３６】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該３つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３３７】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該４つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３３８】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該５つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３３９】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該６つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。当該Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３４０】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該２つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３４１】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が本明細書に開示されている。当該３つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３４２】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該４つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３４３】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該５つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３４４】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている６つの組換えポリペプチドを含有している組成物が、本明細書に開示されている。当該６つのポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドである。
【０３４５】
本明細書に開示されている１つ以上の組換えセルラーゼを含有している本明細書に開示されている組成物は何れも、１つ以上の組換えヘミセルラーゼをさらに含有し得る。ヘミセルラーゼとしては、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼおよびアセチルキシランエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、ヘミセルラーゼは、配列番号３、７、１３、１９、２７、３３または３７うちの何れかのアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドを包含している。本明細書に開示されている１つ以上の組換えセルラーゼを含有している本明細書に開示されている組成物は何れも、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素をさらに含有し得る。一局面において、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含んでいる。
【０３４６】
本開示は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列の１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１９３の組換えアミノ酸配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列の１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１９５の組換えアミノ酸配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列の１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１１７２の組換えアミノ酸配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列の１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列の１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列の１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる組成物を提供する。
【０３４７】
また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列の２つ以上を含んでいる組成物を提供する。１つの組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５およびＣｂ１１７２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３およびＣｂ１１７２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９３およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５およびＣｂ１１７２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１９５およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２およびＣｂ９０９の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ１１７２およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ９０９およびＣｂ２４８７の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。別の組成物は、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２の組換えアミノ酸配列を含んでいる。
【０３４８】
組成物は、トランスジェニック宿主細胞を含み得、当該宿主細胞は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２をコードするアミノ酸配列の１つ以上を含んでいる。１つ以上のポリペプチドは、トランスジェニック宿主細胞から分泌され得る。
【０３４９】
本開示は、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２をコードする１つ以上の組換えヌクレオチド配列と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１９３をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２をコードする１つ以上の組換えヌクレオチド配列と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１９５をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２をコードする１つ以上の組換えヌクレオチド配列と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１１７２をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２をコードする１つ以上の組換えヌクレオチド配列と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ９０９をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２をコードする１つ以上の組換えヌクレオチド配列と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ２４８７をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。また、本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ９０９をコードする１つ以上の組換えヌクレオチド配列と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１６２をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。
【０３５０】
また、本開示は、Ｃｂ１６２、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７およびＣｂ９０９をコードする２つ以上の組換えヌクレオチド配列を含んでいる組成物を提供する。組成物は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含んでいるベクターを含み得る。
【０３５１】
本明細書に開示されている組換えヘミセルラーゼを１つ以上含有している本明細書に開示されている組成物は何れも、１つ以上の組換えセルラーゼをさらに含有し得る。いくつかの局面において、セルラーゼとしては、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、４６、６０、６１、１１１、７４、１２１、７６、８６、８７、１１３、９８、１１９、１００および１０６の何れかのアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドが挙げられる。本明細書に開示されている組換えヘミセルラーゼを１つ以上含有している本明細書に開示されている組成物は何れも、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素をさらに含有し得る。一局面において、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含んでいる。
【０３５２】
本明細書に開示されている組換えポリペプチドを１つ以上含有している本明細書に開示されている組成物は、任意の形態においてタンパク質を含有し得る。いくつかの局面において、上記ポリペプチドは液体の溶液中にある。いくつかの局面において、上記ポリペプチドは凍結乾燥されている。いくつかの局面において、追加の材料が、本明細書に開示されている組換えポリペプチドを１つ以上含有している組成物に含められて、上記ポリペプチドの安定性の持続に役立っている。いくつかの局面において、追加の材料が、本明細書に開示されている組換えポリペプチドを１つ以上含有している組成物に含められて、上記ポリペプチドの安定性の持続に役立っており、ここで、当該追加の材料は、さらなるポリペプチドである。いくつかの局面において、上記組成物は少なくとも６か月にわたって安定である。いくつかの局面において、上記組成物は少なくとも１年にわたって安定である。
【０３５３】
＜宿主細胞＞
本開示は、本開示の組換えポリペプチドをコードする組換え核酸を含んでいる宿主細胞をさらに提供する。いくつかの局面において、本開示は、本開示の２つ以上の組換えポリペプチドをコードする２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を提供する。
【０３５４】
「宿主細胞」および「宿主微生物」は、本明細書において交換可能に使用されて、組換えＤＮＡまたは組換えＲＮＡの組込みを介して形質転換され得る生物学的な生細胞を指す。そのような組換えＤＮＡまたは組換えＲＮＡは発現ベクター内にあり得る。本明細書に記載の宿主生物または宿主細胞は、原核生物または真核細胞であり得る。
【０３５５】
任意の原核生物または真核生物の宿主細胞は、核酸の配列を用いて形質転換された後に生存性を維持する限り、本開示に使用され得る。上記宿主細胞は、必須の核酸配列の形質導入、続くタンパク質（例えばトランスポータ）の発現、および生じた中間体によって、悪影響を受けないことが好ましい。
【０３５６】
いくつかの局面において、上記宿主細胞は原核細胞である。組換えポリペプチドの発現に好適な任意の原核細胞は、本開示の組換えポリペプチドを生産するために使用され得る。本開示の原核生物の宿主細胞としては、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Corynebacterium spp.、Pseudomonas spp.、Proteus spp.、Ralstonia spp.、Streptomyces spp.、Staphylococcus spp.、Lactococcus spp.、Zymomonas mobilis、Clostridium spp.、Thermoanaerobacterium spp.、Caldicellulosiruptor spp.およびKlebsiella spp.が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５７】
いくつかの局面において、上記宿主細胞は真核細胞である。組換えポリペプチドの発現に好適な任意の真核細胞は、本開示の組換えポリペプチドを生産するために使用され得る。好適な真核細胞としては、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５８】
特定の局面において、上記宿主細胞は真菌株である。本明細書に使用されるとき、「真菌」としては、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ菌門および接合菌門の他に、卵菌門および全ての栄養胞子形成菌が挙げられる。
【０３５９】
特定の実施形態において、上記真菌宿主は酵母株である。本明細書に使用されるとき、「酵母」は、出芽または分裂によって無性的に生殖する単一細胞の任意の菌類を指し、当該酵母としては、子嚢菌門および担子菌門が挙げられる。
【０３６０】
特定の実施形態において、上記真菌宿主は、酵母菌属、分裂酵母属、ロイコスポリジウム属、デケラ／ブレタノミセス属、ジゴサッカロミセス属、ヤロウィア属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、シェッフェルソミセス属（ピキア属）、パンカビ属およびカンジダ属に属する。
【０３６１】
いくつかの局面において、上記宿主細胞は好熱性微生物である。
【０３６２】
本開示の上記宿主細胞は、当該宿主細胞に組換え核酸が導入されている点において遺伝的に改変され得、したがって遺伝的に改変されている宿主細胞は天然に存在しない。好適な宿主細胞は、異なる機能のための１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸コンストラクトを発現可能な宿主細胞である。
【０３６３】
本明細書に使用されるとき、「組換え核酸」、「異種核酸」、「組換えポリヌクレオチド」、「組換えヌクレオチド」または「組換えＤＮＡ」は、以下（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つにあてはまる、核酸の重合体を指す。（ａ）核酸の上記配列は、所定の宿主細胞にとって外来性である（すなわち天然に見られない）；（ｂ）上記配列は、宿主細胞において天然にみられるが、異常な（例えば、予想を超えた）量である；（ｃ）核酸の上記配列は、互いに同じ関連において天然にみられない２つ以上の部分配列を含んでいる；（ｄ）上記ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが天然に存在する生物から単離されている；または（ｅ）上記ポリヌクレオチドは合成的に調製されている。例えば、（ｃ）の場合について、組換え核酸配列は、新たな機能の核酸を作るために並べられている、無関係な遺伝子に由来する２つ以上の配列を有する。特に本開示は、宿主細胞への発現ベクターの導入について説明している。当該発現ベクターは、通常、宿主細胞に見られないタンパク質をコードする核酸配列、または通常、宿主細胞に見られるが、異なる制御配列の制御下にあるタンパク質をコードする核酸を含んでいる。上記宿主細胞のゲノムに関して、上記タンパク質をコードする上記核酸配列は組換え体である。本明細書に使用されるとき、用語「組換えポリペプチド」は、上述した「組換え核酸」、「異種核酸」、「組換えポリヌクレオチド」、「組換えヌクレオチド」または「組換えＤＮＡ」から生成されたポリペプチドを指す。
【０３６４】
いくつかの局面において、上記宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を必然的に生産する。所望のタンパク質をコードする遺伝子は、上記宿主細胞にとって異種であり得るか、または当該遺伝子は当該宿主細胞にとって内因性であり得るが、異種のプロモータおよび／または制御領域と作動可能に連結されており、上記宿主細胞における上記遺伝子のより高い発現を生じる。
【０３６５】
（宿主細胞の構成要素）
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、１つ以上の組換え核酸を含んでいる。当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される１つ以上のポリペプチドをコードする。
【０３６６】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、２つ以上の組換え核酸を含んでいる。当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される２つ以上のポリペプチドをコードする。
【０３６７】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、３つ以上の組換え核酸を含んでいる。当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される３つ以上のポリペプチドをコードする。
【０３６８】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、４つ以上の組換え核酸を含んでいる。当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される４つ以上のポリペプチドをコードする。
【０３６９】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、５つ以上の組換え核酸を含んでいる。当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される５つ以上のポリペプチドをコードする。
【０３７０】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、６つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該組換え核酸は、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドより選択される６つ以上のポリペプチドをコードする。
【０３７１】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、１つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該１つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドをコードする。当該１つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３７２】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、２つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該２つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドをコードする。２つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３７３】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、３つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該３つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドをコードする。３つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３７４】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、４つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該４つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドをコードする。４つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３７５】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、５つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該５つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドをコードする。５つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３７６】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、６つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該６つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドをコードする。６つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択される。ｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドは配列番号１０６のポリペプチドである。
【０３７７】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドをコードする２つ以上の組換え核酸を含んでおり、ここで、２つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３７８】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドをコードする３つ以上の組換え核酸を含んでおり、ここで、３つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３７９】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドをコードする４つ以上の組換え核酸を含んでおり、ここで、４つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３８０】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドをコードする５つ以上の組換え核酸を含んでおり、ここで、５つ以上のポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドより選択される。
【０３８１】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、本明細書に開示されている６つの組換えポリペプチドをコードする６つの組換え核酸を含んでおり、ここで、６つのポリペプチドは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドである。
【０３８２】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、１つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該１つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドをコードする。１つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核は、配列番号６２、６３および１１０のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５および７７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９および１１２のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０および１０１のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７のポリヌクレオチドである。
【０３８３】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、２つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該２つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドをコードする。２つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３および１１０のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５および７７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９および１１２のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０および１０１のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７のポリヌクレオチドである。
【０３８４】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、３つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該３つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドをコードする。３つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３および１１０のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５および７７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９および１１２のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０および１０１のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７のポリヌクレオチドである。
【０３８５】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、４つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該４つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドをコードする。４つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３および１１０のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５および７７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９および１１２のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０および１０１のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７のポリヌクレオチドである。
【０３８６】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、５つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該５つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドをコードする。５つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３および１１０のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５および７７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９および１１２のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０および１０１のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７のポリヌクレオチドである。
【０３８７】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、６つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該６つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドをコードする。６つ以上の組換えポリペプチドは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。Ｃｂ１９５２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号４５、１１５、１２５、１２７、１２９および４７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５３ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号６２、６３および１１０のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９５４ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１１６、７５および７７のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ１９４６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号８８、８９および１１２のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ６２９ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号９９、１２０および１０１のポリヌクレオチドより選択される。Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸は、配列番号１０７のポリヌクレオチドである。
【０３８８】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、２つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該２つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドをコードする。２つ以上の組換え核酸は、配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１および１０７のポリヌクレオチドより選択される。
【０３８９】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、３つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該３つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドをコードする。３つ以上の組換え核酸は、配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１および１０７のポリヌクレオチドより選択される。
【０３９０】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、４つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該４つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドをコードする。４つ以上の組換え核酸は、配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１および１０７のポリヌクレオチドより選択される。
【０３９１】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、５つ以上の組換え核酸を含んでおり、当該５つ以上の組換え核酸は、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドをコードする。５つ以上の組換え核酸は、配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１および１０７のポリヌクレオチドより選択される。
【０３９２】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている宿主細胞は、６つの組換え核酸を含んでおり、当該６つの組換え核酸は、本明細書に開示されている６つの組換えポリペプチドをコードする。６つの組換え核酸は、配列番号４７、１１０、７７、１１２、１０１および１０７のポリヌクレオチドである。
【０３９３】
本明細書に開示されている１つ以上の組換えセルラーゼをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる、本明細書に開示されている宿主細胞は何れも、１つ以上の組換えヘミセルラーゼをコードする１つ以上の組換え核酸をさらに含み得る。いくつかの局面において、ヘミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４または３８の何れかのポリヌクレオチド配列を含んでいる核酸を含んでいる。本明細書に開示されている１つ以上の組換えセルラーゼを含んでいる、本明細書に開示されている宿主細胞は、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素をさらに含み得る。一局面において、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含んでいる。
【０３９４】
本開示は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２をコードする１つ以上の核酸を含んでいる、形質転換されたトランスジェニック宿主細胞をさらに提供する。形質転換細胞としては、真正細菌細胞、哺乳類細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、形質転換細胞はE. coliである。特定の実施形態において、形質転換細胞は好熱性の微生物である。
【０３９５】
本明細書に開示されている１つ以上の組換えヘミセルラーゼをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる、本明細書に開示されている宿主細胞は何れも、１つ以上の組換えセルラーゼをコードする１つ以上の組換え核酸をさらに含み得る。いくつかの局面において、セルラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８、４６、６０、６１、１１１、７４、１２１、７６、８６、８７、１１３、９８、１１９、１００および１０６の何れかのポリヌクレオチド配列を含んでいる核酸を含んでいる。本明細書に開示されている１つ以上の組換えヘミセルラーゼを含んでいる、本明細書に開示されている宿主細胞は何れも、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素をさらに含み得る。一局面において、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素は、配列番号１４６のアミノ酸配列含んでいる。
【０３９６】
（本開示の宿主細胞を作製し、培養する方法）
本開示の宿主細胞を作製し、培養する方法は、本開示の組換え核酸を含んでいる発現ベクターの、宿主細胞への導入または移入を包含し得る。発現ベクターを宿主細胞に移入するそのような方法は当業者にとって周知である。例えば、発現ベクターを用いて細胞を形質転換する１つの方法は、塩化カルシウム処理を包含しており、当該発現ベクターは、カルシウム沈殿を介して導入される。また、他の塩（例えばリン酸カルシウム）は、類似の手法にしたがって使用され得る。さらに、エレクトロポレーション（すなわち核酸配列に対する細胞の透過性を向上させるための電流の印加）は、宿主細胞をトランスフェクトするために使用され得る。また、細胞は、スフェロプラストの使用によって形質転換され得る（Schweizer, M, Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 5086-5090 (1981)）。また、核酸配列のマイクロインジェクションは、宿主細胞をトランスフェクトする能力をもたらす。また、他の手段（例えば、脂質複合体、リポソームおよびデンドリマー）が採用され得る。当業者は、これらまたは他の方法を利用して、所望の配列を用いて宿主細胞をトランスフェクトし得る。
【０３９７】
いくつかの場合に、細胞は、形質転換の前にプロトプラストまたはスフェロプラストとして調製される。プロトプラストまたはスフェロプラストは、例えば細胞壁を分解する酵素を用いて細胞壁を有する細胞を処理することによって、調製され得る。真菌細胞は、例えばチモリアーゼまたはキチナーゼを用いて処理され得る。
【０３９８】
ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち染色体外要素として存在するベクターであり、当該ベクターの複製は染色体の複製から独立している）（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、微小染色体または人工染色体）であり得る。上記ベクターは自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。代替的に、上記ベクターは、宿主に導入された場合に染色体に組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主のゲノムまたはトランスポゾンに導入されるべき全てのＤＮＡを共に含んでいる単一のベクターもしくはプラスミド、または２つ以上のベクターもしくはプラスミドが、使用され得る。
【０３９９】
上記ベクターは、形質転換宿主の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを好ましく含んでいる。選択マーカーは、例えばその産物が殺生剤耐性、ウイルス耐性、重金属に対する耐性、および栄養要求株に対する原栄養性などを与える遺伝子である。真正細菌細胞の選択は、遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、ｔｅｔ、ｃａｍＲおよびｈｙｇ遺伝子）によって与えられている抗生物質耐性に基づき得る。
【０４００】
真菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセタミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル合成酵素）、ならびにこれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。S.cerevisiae宿主にとって好適なマーカーとしては、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。
【０４０１】
上記ベクターは、宿主ゲノムへの当該ベクターの組込みまたは細胞におけるゲノムと独立した当該ベクターの自律的な複製を可能にする（複数の）エレメントを含み得る。
【０４０２】
宿主ゲノムへの組込みのために、上記ベクターは、相同性組換えまたは非相同性組換えによるゲノムへのベクターの組込みのための、遺伝子配列または任意の他のエレメントに依存し得る。代替的に、上記ベクターは、宿主のゲノムへの相同性組換えによる組込みに関するさらなるヌクレオチド配列を含み得る。上記さらなるヌクレオチド配列は、（複数の）染色体上の（複数の）正確な部位において、宿主ゲノムへ上記ベクターが組み込まれることを可能にする。正確な部位における組込みの可能性を向上させるために、組込みエレメントは、相同性組換えの確率を上昇させるための対応する標的配列と高度に相同である十分な数の核酸（例えば、１００〜１０００塩基対、４００〜１００００塩基対、８００〜１００００塩基対）を含んでいる。組込みエレメントは、宿主のゲノムにおける標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、組込みエレメントは、エンコードしてない（non-encoding）ヌクレオチド配列またはエンコードしている（encoding）ヌクレオチド配列であり得る。一方で、上記ベクターは、非相同性組換えによって宿主のゲノムに組み込まれ得る。
【０４０３】
自律的な複製のために、上記ベクターは、問題の宿主において当該ベクターを自律的に複製可能にする複製開始点をさらに含み得る。複製開始点は、細胞において機能的かつ自律的な複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであり得る。用語「複製開始点」または「プラスミドレプリケータ」は、プラスミドまたはベクターをインビボにおいて複製可能にする配列と、本明細書において定義される。
【０４０４】
上記ベクターは、ベクターにおける組換え核酸の発現制御用のプロモータをさらに含み得る。遺伝子の発現制御用のプロモータは、当該技術において周知であり、恒常的なプロモータおよび誘導可能なプロモータを包含している。プロモータは、例えばSambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されている。いくつかの局面において、Saccharomyces spp.における使用のためのベクターは、恒常的かつ強力なプロモータであるＴＤＨ１またはＰＧＫ１プロモータを含んでいる。
【０４０５】
２コピー以上の遺伝子が、遺伝子産物の産生を向上させるために宿主に挿入され得る。遺伝子のコピー数の増加は、少なくとも１コピーのさらなる遺伝子を宿主に組み込むこと、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をヌクレオチド配列と共に含めることによって実現され得、ここで、増幅されたコピー数の選択マーカー遺伝子、したがってさらなる多コピーの遺伝子を含んでいる細胞は、適切な選択薬剤の存在下において細胞を培養することによって選択され得る。
【０４０６】
上述した要素を連結して、本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手法は、当業者にとって周知である（例えば、上述のSambrook et al., 2001を参照すればよい）。
【０４０７】
宿主細胞が発現ベクターを用いていったん形質転換されると、宿主細胞は培養される。培地における宿主細胞の培養は発酵過程を含み得る。本開示の方法は、宿主細胞における組換え核酸が発現されるように当該宿主細胞を培養することを含み得る。培養に好適な培地、温度範囲および他の条件は当該技術において公知である。
【０４０８】
＜本開示の組換えポリペプチドの発現＞
本開示は、本開示のポリペプチドの発現をさらに提供する。本開示のポリペプチドは、標準的な分子生物学的な手法（例えば、本明細書に記載の手法およびSambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載の手法）よって調製され得る。組換えポリペプチドは、トランスジェニック発現系において発現され得、当該発現系において精製され得る。トランスジェニック発現系は、原核生物または真核生物であり得る。いくつかの局面において、トランスジェニック宿主細胞は、当該宿主細胞外にポリペプチドを分泌し得る。いくつかの局面において、トランスジェニック宿主細胞は、当該宿主細胞に発現されたポリペプチドを保持し得る。
【０４０９】
特定の局面において、本開示の組換えポリペプチドは、宿主細胞または当該宿主細胞の成長培地から、部分的または実質的に単離されている。特定の局面において、本開示の組換えポリペプチドは、タンパク質の精製を容易にするためのタンパク質「タグ」（例えば、ＧＳＴタグまたはポリＨｉｓタグ）を伴って調製されている。いくつかの局面において、本開示の組換えポリペプチドは、ポリペプチドの細胞外への輸送に関するシグナル配列を伴って調製されている。いくつかの局面において、組換えポリペプチドは、部分的にのみ精製され得る（例えば、＜８０％の純度、＜７０％の純度、＜６０％の純度、＜５０％の純度、＜４０％の純度、＜３０％の純度、＜２０％の純度、＜１０％の純度、＜５％の純度）。いくつかの局面において、本開示の組換えポリペプチドは、高い純度（例えば、＞９９％の純度、＞９８％の純度、＞９５％の純度、＞９０％の純度など）まで精製され得る。組換えポリペプチドは、当業者にとっての公知の種々の手法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー）を介して精製され得る。
【０４１０】
一局面において、組換え本明細書に開示されているポリペプチド（セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ならびにセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素が挙げられる）の何れかを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、（複数の）組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。
【０４１１】
一局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、（複数の）組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを包含しており、ここで、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドをコードする２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを包含しており、ここで、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドをコードする３つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを包含しており、ここで、３つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドをコードする４つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを包含しており、ここで、４つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドをコードする５つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを包含しており、ここで、５つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドをコードする６つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを包含しており、ここで、６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０４１２】
別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の１つ以上の組換えポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、（複数の）組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の２つ以上の組換えポリペプチドをコードする２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の３つ以上の組換えポリペプチドをコードする３つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の４つ以上の組換えポリペプチドをコードする４つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の５つ以上の組換えポリペプチドをコードする５つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。別の局面において、セルラーゼを生産する方法は、以下の工程：Ａ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の６つ以上の組換えポリペプチドをコードする６つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞を、培地中、複数の組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で培養すること、ならびに上記培地および／または宿主細胞から１つ以上のポリペプチドを回収することを含んでいる。
【０４１３】
＜酵素の耐熱性＞
本開示の酵素は好熱性および耐熱性である。本明細書に使用されるとき、「好熱性」は、高い温度（例えば、５０℃より高い）において活性のピークを有する酵素の特性を指す。本明細書に使用されるとき、「耐熱性」は、高い温度（例えば、５０℃より高い）において相当な期間、活性を維持する酵素の特性を指す。本開示のＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドについて、「酵素」活性は、セルラーゼ活性（β−グルコシダーゼ活性が挙げられる）を指す。本開示のＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２ポリペプチドについて、「酵素」活性はヘミセルラーゼ活性を指す。本開示のＣｂ１５８１ポリペプチドについて、「酵素」活性は、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する活性を指す。
【０４１４】
（セルラーゼ）
特定の局面において、本開示のＣｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９およびＣｂ４８６ポリペプチドの１つ以上は、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、セルロース含有材料またはセルロースに対する酵素活性のピーク速度を有する。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、セルロース含有材料またはセルロースに対する酵素活性のピーク速度を有する。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、セルロース含有材料またはセルロースに対する酵素活性のピーク速度を有する。
【０４１５】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。
【０４１６】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。
【０４１７】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。
【０４１８】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有しており、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、当該カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。
【０４１９】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。
【０４２０】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。
【０４２１】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。
【０４２２】
別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。別の局面において、酵素カクテルが本明細書に示されており、ここで、当該カクテルは、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有しており、かつ約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。
【０４２３】
（ヘミセルラーゼ）
特定の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の１つ以上は、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、酵素活性のピーク速度を有する。他の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素「カクテル」は、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、ヘミセルロースまたはヘミセルロース由来基質に対する酵素活性のピーク速度を有する。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素「カクテル」は、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において、ヘミセルロースまたはヘミセルロース由来基質に対する酵素活性のピーク速度を有する。
【０４２４】
本開示の酵素は、高い温度において相当な期間、有効な酵素活性を保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。
【０４２５】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。
【０４２６】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。
【０４２７】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。
【０４２８】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも９０％保持している。
【０４２９】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも７５％保持している。
【０４３０】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも５０％保持している。
【０４３１】
一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約５５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約６５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約７５℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。一実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを含有している酵素カクテルは、約８０℃の温度においてインキュベートされる場合に、少なくとも２４時間にわたって酵素活性の初速度を少なくとも２５％保持している。
【０４３２】
本明細書に開示されている好熱特性および熱安定特性を有する、本明細書に開示されているセルラーゼカクテルは何れも、本明細書に開示されているヘミセルラーゼの何れか、および／またはセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素をさらに含有し得る。さらに、本明細書に開示されている好熱特性および熱安定特性を有する、本明細書に開示されているヘミセルラーゼカクテルは何れも、本明細書に開示されているセルラーゼの何れか、並びに／またはセルロースおよび／もしくはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進する酵素をさらに含有し得る。
【０４３３】
＜用途＞
（セルロース含有材料を分解する方法）
一局面において、セルロース含有材料を分解する方法が本明細書に示されている。
【０４３４】
一局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、（複数の）ポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、３つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、４つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、５つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０４３５】
別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、（複数の）ポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。当該方法において、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択され、Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択され、Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。当該方法において、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択され、Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択され、Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。当該方法において、３つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択され、Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択され、Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。当該方法において、４つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択され、Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択され、Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。当該方法において、５つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択され、Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択され、Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。当該方法において、６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４、１１４、１２４、１２６、１２８および４６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０、６１および１１１のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４、１２１および７６のポリペプチドより選択され、Ｃｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６、８７および１１３のポリペプチドより選択され、Ｃｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８、１１９および１００のポリペプチドより選択され、Ｃｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである。
【０４３６】
別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの１つ以上を含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、（複数の）ポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの２つ以上を含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの３つ以上を含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの４つ以上を含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの５つ以上を含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの６つを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。
【０４３７】
別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、（複数の）上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドをコードする２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドをコードする３つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、３つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドをコードする４つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。４つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドをコードする５つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、５つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドをコードする６つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０４３８】
別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の１つ以上の組換えポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、（１つまたは複数の）上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の２つ以上の組換えポリペプチドをコードする２つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の３つ以上の組換えポリペプチドをコードする３つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の４つ以上の組換えポリペプチドをコードする４つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の５つ以上の組換えポリペプチドをコードする５つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の６つの組換えポリペプチドをコードする６つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを含んでいる。
【０４３９】
別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物を、セルロース含有材料と接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、複数のポリペプチドおよびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチドまたはＣｂ６２９ポリペプチドより選択され、当該組成物はＣｂ４８６ポリペプチドを含有していない。別の局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、（１つまたは複数の）上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させること、ならびにセルロース分解を支持する条件下で、細胞およびセルロース含有材料をインキュベートすることを包含しており、ここで、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチドまたはＣｂ６２９ポリペプチドより選択され、当該宿主細胞は、Ｃｂ４８６ポリペプチドをコードする組換え核酸を含んでいない。セルロース含有材料を、本明細書に開示されている、Ｃｂ４８６ではない１つ以上のセルラーゼと接触させることは、セルロース含有材料の分解の間にセロビオースおよび／または他のオリゴ糖の蓄積を導き得る。セロビオースおよび／またはオリゴ糖を含有している産物は、セロビオースおよび／またはオリゴ糖を効率的に利用して所望の最終産物（例えば生物燃料）を生成する生物または処理にとっての供給原料として有用であり得る。
【０４４０】
本明細書に使用されるとき、「セルロース含有材料」は、セルロースを含有している任意の材料（バイオマスが挙げられる）を指す。ここに開示されている方法を用いた使用に好適なバイオマスとしては、任意のセルロース含有材料が挙げられ、セルロース含有材料としては、ススキ（Miscanthus）、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ（Blue Stem）、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、エネルギーケイン（energy cane）、古紙、おがくず、林業の廃棄物、都市ごみ、古紙、収穫物の残余物、他の草本および他の木材が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、バイオマスはリグノセルロース材料である。
【０４４１】
また、セルロース含有材料はヘミセルロースを一般的に含有している。例えば、未処理の植物材料または部分的に処理された植物材料は一般的にヘミセルロースを含有している。いくつかの局面において、本明細書に開示されているセルロース含有材料を分解する方法は何れも、セルロース含有材料を、１つ以上のヘミセルラーゼと接触させることをさらに含み得る。
【０４４２】
セルロース含有材料を分解する本明細書に開示されている方法であって、セルロース含有材料を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上のポリペプチドを含有している組成物と接触させることを含んでおり、かつ当該ポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される方法は何れも、セルロース含有材料を、配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つと接触させることをさらに含み得る。一局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させることを含み得る。一局面において、バイオマス含有材料を分解する方法が、本明細書に示されており、当該方法は、（１）セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号３、７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、ならびに（２）セルロース分解を支持する条件下で、上記ポリペプチドおよびバイオマス含有材料をインキュベートすることを含んでいる。
【０４４３】
セルロース含有材料を分解する本明細書に開示されている方法であって、セルロース含有材料を、本明細書に開示されている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの組換えポリペプチドをコードする１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの組換え核酸を含んでいる宿主細胞と、培地中、複数の上記組換え核酸の発現を支持するために必要な条件下で接触させることを含んでおり、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される方法は何れも、セルロース含有材料を、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドと接触させることをさらに含み得る。一局面において、セルロース含有材料を分解する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドをコードする組換え核酸を含有している宿主細胞と接触させることを含んでいる。一局面において、バイオマス含有材料を分解する方法が、本明細書に示されており、当該方法は、（１）セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドをコードする組換え核酸を含有している宿主細胞と接触させること、ならびに（２）セルロース分解を支持する条件下で、宿主細胞およびバイオマス含有材料をインキュベートすることを含んでいる。
【０４４４】
いくつかの局面において、セルロース含有材料を分解する、本明細書に開示されている方法は何れも、高い温度において実施され得る。いくつかの局面において、セルロース含有材料を分解する、本明細書に開示されている方法は何れも、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃において、実施され得る。いくつかの局面において、セルロース含有材料を分解する、本明細書に開示されている方法は何れも、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間にわたって、実施され得る。セルロース含有材料を分解する、本明細書に開示されている方法が、高い温度において実施され、かつ組換え本明細書に開示されているポリペプチドを発現する宿主細胞を使用する場合に、いくつかの局面において、当該宿主細胞は好熱性生物である。
【０４４５】
（前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法）
前処理されたバイオマスの粘度を低下させる方法が、本明細書にさらに示されている。
【０４４６】
構成要素の糖またはオリゴ糖への分解に使用されるバイオマスは、バイオマスのセルロース成分の加水分解を阻害し得る高レベルのリグニンを含有し得る。典型的に、バイオマスは、セルロース成分の加水分解の受けやすさを向上させるために、例えば高温および／または高圧を用いて前処理される。他の前処理としては、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、ならびにアルカリ性水溶液、酸性溶液、有機溶剤、イオン性液体（ＩＬ）、電解水、リン酸またはこれらの組合せによる処理が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、前処理は、高い粘度のバイオマス混合物を一般的に生じる。前処理されたバイオマス混合物の高い粘度は、前処理されたバイオマス混合物を取り扱う困難性を増大させ得、また、前処理されたバイオマス混合物の効率的な加水分解を妨げ得る。有利なことに、本明細書に開示されている組換えポリペプチドは、バイオマスのさらなる分解の前に、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させるために使用され得る。
【０４４７】
したがって、本開示の特定の局面は、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法に関する。当該方法は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることを含んでおり、１つ以上のポリペプチドは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ならびにセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素的加水分解を促進するポリペプチドの１つ以上より選択される。
【０４４８】
本開示の特定の局面は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている１つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法に関する。ここで、１つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている２つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。ここで、２つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている３つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。ここで、３つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている４つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。ここで、４つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている５つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。ここで、５つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、本明細書に開示されている６つ以上の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、および前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。ここで、６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０４４９】
別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの１つ以上を含有している組成物と接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの２つ以上を含有している組成物と接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの３つ以上を含有している組成物と接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの４つ以上を含有している組成物と接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドの５つ以上を含有している組成物と接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。別の局面において、本開示は、初期の粘度を有する前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の６つの組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の初期の粘度を低下させる十分な条件下で、接触させたバイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法を包含している。
【０４５０】
いくつかの局面において、開示されている上記方法は前処理過程の一部として実施される。前処理過程は、バイオマスを前処理するステップの後に、前処理されたバイオマス混合物に対して、本明細書に開示されている組換えポリペプチドの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上を含有している組成物を加えること、ならびに混合物の粘度を低下させる十分な条件下で、前処理されたバイオマスをポリペプチドと共にインキュベートすることのさらなる工程を含み得る。ここで、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。混合物の温度が高いときにか、または混合物の温度が下がった後に、ポリペプチドまたは組成物は、前処理されたバイオマス混合物に加えられ得る。いくつかの局面において、上記方法は、前処理が実施された同じ容器（vessel）または入れ物（container）において実施される。いくつかの局面において、上記方法は、前処理が実施されたのとは別の容器または入れ物において実施される。
【０４５１】
いくつかの局面において、上記方法は、高濃度の塩の存在下（例えば、飽和濃度の塩を含んでいる溶液（少なくとも０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍもしくは４Ｍ、または約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍまたは４Ｍの濃度における塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍもしくは３．２Ｍまたは約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍまたは３．２Ｍの濃度における塩化カリウム（ＫＣｌ）を含んでいる溶液、および／またはイオン性液体（例えば、１，３−ジメチルイミダゾリウム  ジメチルホスフェート（［ＤＭＩＭ］ＤＭＰ）または［ＥＭＩＭ］ＯＡｃ））または界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ）、スルフィドリル試薬（例えば、飽和の硫酸アンモニウムまたは０〜１Ｍもしくは約０〜１Ｍの硫酸アンモニウム）の存在下において実施される。いくつかの局面において、上記方法は、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０℃の温度において実施される。いくつかの局面において、上記方法は、広範な温度範囲（例えば、２０℃〜５０℃、２５℃〜５５℃、３０℃〜６０℃、４０℃〜８０℃、６０℃〜８０℃もしくは６０℃〜１００℃、または約２０℃〜５０℃、約２５℃〜５５℃、約３０℃〜６０℃、約４０℃〜８０℃、約６０℃〜８０℃もしくは約６０℃〜１００℃）おいて実施される。いくつかの局面において、上記方法は、広範なｐＨ範囲（例えば、約４．５〜８．７５のｐＨ、７を超えるｐＨ、８．５のｐＨ、または少なくとも５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０もしくは８．５のｐＨ）において実施される。
【０４５２】
前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる本明細書に開示されている方法であって、前処理されたバイオマス混合物を、ポリペプチドの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上を含有している組成物と接触させることを含んでおり、かつ当該ポリペプチドが、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される方法は何れも、前処理されたバイオマス混合物を、配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つと接触させることをさらに含み得る。一局面において、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法は、前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させることを含んでいる。一局面において、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法が本明細書に示されている。ここで、当該方法は、（１）前処理されたバイオマス混合物を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること、ならびに（２）前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させるために、上記ポリペプチドをインキュベートし、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させることを含んでいる。
【０４５３】
（セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法）
セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法が、さらに本明細書に示されている。一局面において、セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法は、以下の工程：Ａ）セルロース含有材料を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上のポリペプチドを含有している組成物と接触させること；Ｂ）１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上のポリペプチドを含有している組成物と共に、セルロース分解を支持する条件下で、糖を得るためにセルロース含有材料をインキュベートすること；ならびにＣ）発酵産物を生産するのに十分な条件下で、発酵微生物と共に糖を培養することを含んでいる。ここで、上記ポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０４５４】
別の局面において、セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法は、Ａ）セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有している組成物と接触させること；Ｂ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドを含有している組成物と共に、セルロース分解を支持する条件下で、糖を得るためにセルロース含有材料をインキュベートすること；ならびにＣ）発酵産物を生産するのに十分な条件下で発酵微生物と共に糖を培養することを含んでいる。
【０４５５】
セルロース含有材料を発酵産物に変換する本明細書に開示されている方法は何れも、前処理されたバイオマス混合物を、配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つと接触させることをさらに含み得る。一局面において、セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法は、セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させることを含んでいる。一局面において、セルロース含有材料を発酵産物に変換する方法が、本明細書に示されており、当該方法は、以下の工程：Ａ）セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３の組換えポリペプチドならびに配列番号７、１３、１９、２７、３３および３７の組換えポリペプチドを含有している組成物と接触させること；Ｂ）配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１、１１３、７、１３、１９、２７、３３および３７のポリペプチドを含有している組成物と共に、セルロース分解を支持する条件下で、糖を得るためにセルロース含有材料をインキュベートすること；ならびにＣ）発酵産物を生産するのに十分な条件下で、発酵微生物と共に糖を培養することを含んでいる。
【０４５６】
セルロース含有材料の分解から得られる糖としては、グルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、グルクロン酸およびマンノースが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５７】
セルロース含有材料の分解から得られる糖から生産され得る発酵産物としては、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ペンタノールおよびオクタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５８】
発酵微生物としては、Saccharomyces spp.が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５９】
（統合されたバイオプロセシング方法）
統合されたバイオプロセシングによってセルロース含有材料を発酵産物に変換する方法が、さらに本明細書に示されている。統合されたバイオプロセシングは、酵素生成、バイオマスの加水分解および生物燃料の生産を１段階に組み合わせる。一局面において、統合されたバイオプロセシングによってセルロース含有材料を発酵産物に変換する方法は、以下の工程：Ａ）セルロース含有材料を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ以上のポリペプチドをコードする組換え核酸および生物燃料の生産のための生化学的な経路に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を有する細胞と、これらの核酸の発現を支持するのに十分な条件下で接触させること；Ｂ）セルロース分解および発酵を支持する条件下で、発酵産物を生産するためにセルロース含有材料を、組換え核酸を発現する細胞と共にインキュベートすることを含んでいる。ここで、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ以上のポリペプチドは、Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチドまたはＣｂ４８６ポリペプチドより選択される。
【０４６０】
別の局面において、統合されたバイオプロセシングによってセルロース含有材料を発酵産物に変換する方法は、以下の工程：Ａ）セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１および１１３のポリペプチドをコードする組換え核酸、および生物燃料の生産のための生化学的な経路に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を有する細胞と、これらの核酸の発現を支持するのに十分な条件下で接触させること；Ｂ）セルロース分解および発酵を支持する条件下で、発酵産物を生産するためにセルロース含有材料を、組換え核酸を発現する細胞と共にインキュベートすることを含んでいる。
【０４６１】
別の局面において、統合されたバイオプロセシングによってセルロース含有材料を発酵産物に変換する方法は、以下の工程：Ａ）セルロース含有材料を、配列番号４６、７６、１００、１０６、１１１、１１３、７、１３、１９、２７、３３および３７のポリペプチドをコードする組換え核酸、および生物燃料の生産のための生化学的な経路に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を有する細胞と、これらの核酸の発現を支持するのに十分な条件下で接触させること；Ｂ）セルロース分解および発酵を支持する条件下で、発酵産物を生産するためにセルロース含有材料を、組換え核酸を発現する細胞と共にインキュベートすることを含んでいる。
【０４６２】
セルロース含有材料の分解にから得られる糖から生産され得る発酵産物としては、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ペンタノールおよびオクタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６３】
＜ポリペプチドの濃度＞
特定の局面において、本開示のポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも０．０１ｎＭの濃度において基質に供給される。特定の局面において、上記ポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも０．１ｎＭの濃度において基質に供給される。特定の局面において、上記ポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも１ｎＭの濃度において基質に供給される。特定の局面において、上記ポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも１０ｎＭの濃度において基質に供給される。特定の局面において、上記ポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも０．１μＭの濃度において基質に供給される。特定の局面において、上記ポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも１０μＭの濃度において基質に供給される。特定の局面において、上記ポリペプチドは、各ポリペプチドについて少なくとも１００μＭの濃度において基質に供給される。
【０４６４】
＜耐熱性セルラーゼの、耐熱性のヘミセルロース分解酵素との組合せ＞
いくつかの局面において、本開示の耐熱性のセルロース分解酵素は、耐熱性ヘミセルラーゼに供給される。セルロースおよびヘミセルロースの両方を含有している材料（例えば、陸上植物に由来するバイオマス）の分解を向上させるために、耐熱性ヘミセルラーゼは、本開示の耐熱性のセルロース分解酵素に供給され得る。
【０４６５】
本明細書に開示されているいくつかの局面において、本開示のセルラーゼの混合物は、ヘミセルラーゼの混合物と組み合わせられている場合に、驚くべき相乗効果を示す。そのような例において、複数のセルラーゼを含有している混合物は、複数のヘミセルラーゼを含有している混合物を有するカクテルにおいて混合されている場合に、セルラーゼの上記混合物が複数のヘミセルラーゼを含有している混合物と組み合わせられていない場合と比べて、より高いセルラーゼ活性を有する。また、いくつかの例において、ヘミセルラーゼを含有している混合物は、複数のセルラーゼを含有している混合物を有するカクテルにおいて組み合わせられている場合に、複数のセルラーゼを含有している混合物と組み合わせられていない場合のヘミセルラーゼの混合物の活性と比べて、より高いヘミセルラーゼ活性を有する。したがって、本明細書に示されているセルラーゼおよびヘミセルラーゼの混合物は、驚くべき相乗効果を有し得、ここで、酵素の各混合物は、他の混合物と組み合わせられている場合に、酵素の混合物の何れかが基質に対して単独に供給されている場合より高い活性を有する。
【０４６６】
耐熱性ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースを分解可能な生物から入手され得る。一局面において、耐熱性ヘミセルラーゼは、セルロースを分解可能な生物から直接的に単離され得る。別の局面において、耐熱性ヘミセルラーゼは、宿主細胞および耐熱性ヘミセルラーゼ遺伝子を含んでいる発現ベクターの使用によって、組換え的に生産される。耐熱性ヘミセルラーゼおよび／または耐熱性ヘミセルラーゼをコードする遺伝子は、ヘミセルロースを分解可能な種々の生物（古細菌、真正細菌、真菌および原生動物の生物が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。
【０４６７】
いくつかの局面において、耐熱性ヘミセルラーゼは、C.besciiの耐熱性ヘミセルラーゼと関連する組換えポリペプチドである。いくつかの局面において、耐熱性ヘミセルラーゼは、配列番号３、７、１３、１９、２７、３３および３７の何れかのアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの局面において、耐熱性ヘミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４、８、１４、２０、２８、３４および３８の何れかの核酸配列を含んでいる。
【０４６８】
＜ヘミセルラーゼの酵素活性の相乗効果＞
特定の実施形態において、本開示の酵素は、酵素「カクテル」として提供される。ここで、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上は、ヘミセルロースまたはヘミセルロース由来基質を分解するために、共に提供される。特定の実施形態において、複数の上記酵素は、相乗的に機能し、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上の組合せは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、単一の酵素の活性より効率的である。同様に、特定の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の３つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、１つまたは２つの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。特定の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の４つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、１つ、２つまたは３つの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。特定の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の５つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、１つ、２つ、３つまたは４つの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。特定の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。
【０４６９】
他の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の２つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、酵素ユニットの総量が同じであるが１種のみの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。他の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の３つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、酵素ユニットの総量が同じであるが１種もしくは２種のみの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。他の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の４つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、酵素ユニットの総量が同じであるが１種、２種もしくは３種のみの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。他の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の５つ以上を有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、酵素ユニットの総量が同じであるが１種、２種、３種もしくは４種のみの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。他の実施形態において、酵素Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２の６つ全てを有する酵素カクテルは、ヘミセルロースの分解およびヘミセルロースからの単糖の遊離において、酵素ユニットの総量が同じであるが１種、２種、３種、４種もしくは５種のみの酵素を有する酵素カクテルより効率的である。
【０４７０】
＜ヘミセルロースおよびヘミセルロースを含有している材料の処理方法＞
上述したヘミセルラーゼ酵素およびバリアントは、キシロース骨格から１つ以上の官能基を切断することによってヘミセルロースを分解し、切断ヘミセルロースを形成させるために、単独で、または組合せにおいて使用され得る。
【０４７１】
本開示の方法を用いて処理されたヘミセルロースは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％分解されている。ヘミセルロースに存在するサブユニット間に存在する結合または連結を酵素が切断する場合に、ヘミセルロース基質は分解される。分解産物は、キシロース、アラビノース、グルクロニル基、アセチル基に加えて、他の官能基および炭化水素を含み得る。
【０４７２】
一局面において、ヘミセルロースを含有している植物材料または単離されたヘミセルロースは、上述の酵素（例えば、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２）の１つ以上を用いて処理される。一実施形態において、ヘミセルロースは、１つ以上の酵素（Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２が挙げられる）と組み合わせて、Ｃｂ１９３を用いて処理される。一実施形態において、ヘミセルロースは、１つ以上の酵素（Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７およびＣｂ１６２が挙げられる）と組み合わせて、Ｃｂ１９５を用いて処理される。
【０４７３】
理論に縛られることなく、出願人は、本開示の方法が以下の機序を介してヘミセルロースを分解すると考えている。エンドキシラナーゼＣｂ１９３、Ｃｂ１９５またはバリアントを用いたヘミセルロースの処理は、キシロース骨格におけるβ−１，４−キシロース結合を切断して、β−１，４−結合におけるキシロースのより短い鎖を生成する。α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＣｂ１１７２またはバリアントを用いたヘミセルロースの処理は、ヘミセルロースのキシロース骨格または分枝もしくは脱分枝アラビナンからアラビノース部分を切断し、アラビノースを専ら生成する。α−グルクロニダーゼＣｂ９０９またはバリアントを用いたヘミセルロースの処理は、キシランの４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸およびβ−１，４−キシロシド結合骨格の間のα−１，２−グリコシド結合を切断する。β−キシロシダーゼＣｂ２４８７またはバリアントを用いたヘミセルロースの処理は、キシロース骨格におけるβ−１，４−キシロシド結合を切断する。Ｃｂ１６２またはバリアントを用いたヘミセルロースの処理は、ヘミセルロースにおけるキシロースとアセチル基の側鎖との間の結合を切断して、他のヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼ）に対するより良好な接近容易性をキシランの骨格に付与する。組合せ（すなわち２つ以上の酵素）を使用することは、相乗的なヘミセルラーゼの分解活性をもたらすと考えらえる。
【０４７４】
特定の実施形態において、ヘミセルロースを含有している植物材料または単離されたヘミセルロースは、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上、または完全な（１００％の）配列同一性／配列類似性を、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２に対して有するアミノ酸配列を含んでいる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドの１つ以上を用いて処理され得る。
【０４７５】
上記ポリペプチドは、単独で、または組成物として直接的に使用され得る。
【０４７６】
本開示の他の方法において、ヘミセルロースは、１つ以上のポリペプチド（Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ９０９およびＣｂ１６２が挙げられる）を分泌するトランスジェニック宿主細胞との接触によって分解される。いくつかの実施形態において、トランスジェニック宿主細胞は、Escherichia、Pseudomonas、Proteus、Ralstonia、Streptomyces、Staphylococcus、Lactococcus、Bacillus、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、spergillus、Chrysosporium lucknowenseまたはTrichoderma reeseiであり得る。いくつかの実施形態において、トランスジェニック宿主細胞は、好熱性微生物であり得る。一実施形態において、好熱性の宿主細胞は、Caldicellulosiruptor besciiである。
【０４７７】
トランスジェニック宿主細胞は、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ１６２またはそれらのバリアントをコードするベクターを含み得る。いくつかの実施形態において、ヘミセルロースは、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ１６２およびそれらのバリアントの１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１９３またはバリアントを用いて処理することによって分解される。いくつかの実施形態において、ヘミセルロースは、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ１６２およびそれらのバリアントの１つ以上と組み合わせてか、または単独に、Ｃｂ１９５またはバリアントを用いて処理することによって分解される。
【０４７８】
本開示の方法は、ヘミセルロースを含有している任意の植物材料を用いて実施され得る。ここに開示されている方法を用いた使用に好適な植物材料としては、ススキ、スイッチグラス、ミクリ、ライグラス、クサヨシ、エレファントグラス、ヨシ、麦わら、大麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、トウモロコシわら、ダイズわら、エンバク穀、モロコシ、コメ穀、サトウキビバガス、トウモロコシ繊維、可溶性物質添加の乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）、ウシクサ（Blue Stem）、トウモロコシの穂軸、マツ、カバ、ヤナギ、アスペン、ポプラ材、およびエネルギーケインが挙げられる。また、上記方法は、単離されたヘミセルロースに対して実施され得る。
【０４７９】
特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも０．０１ｎＭ  酵素の濃度において基質に供給される。特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも０．１ｎＭ  酵素の濃度において基質に供給される。特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも１ｎＭ  酵素の濃度において基質に供給される。特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも１０ｎＭ  酵素の濃度において基質に供給される。特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも０．１μＭ  酵素の濃度において基質に供給される。特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも１０μＭ  酵素の濃度において基質に供給される。特定の実施形態において、本開示の耐熱性酵素は、各酵素について少なくとも１００μＭ  酵素の濃度において基質に供給される。
【０４８０】
本開示の方法は、ヘミセルロースが分解され得る任意のｐＨおよび温度において実施され得る。しかしながら、特定の実施形態において、本開示の方法は、約５〜約７のｐＨ範囲、および約６０〜約８０℃の温度もしくは約６０〜約８０℃の間の温度において実施される。
【０４８１】
＜耐熱性のヘミセルロース分解酵素の、耐熱性セルラーゼとの組合せ＞
いくつかの実施形態において、本開示の耐熱性のヘミセルロース分解酵素は、耐熱性セルラーゼに供給される。セルラーゼはセルロースを加水分解し得る酵素であり、セルラーゼとしては、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、耐熱性セルラーゼは約５５℃の温度において最良の酵素活性を有する。耐熱性セルラーゼは、セルロースおよびヘミセルロースの両方を含有している材料（例えば、陸上植物に由来するバイオマス）の分解を促進するために、本開示の耐熱性のヘミセルロース分解酵素に供給され得る。例えば限定することなく、一局面において、本開示のヘミセルロース分解酵素および耐熱性セルラーゼを発現する微生物が提供され得る。また、一局面において、本開示のヘミセルロース分解酵素を含有している組成物は、耐熱性セルラーゼを含有し得る。他の局面において、バイオマスを分解する方法、バイオマスを発酵産物に変換する方法、およびバイオマスを燃料に変換する方法が提供され、これらの方法において、バイオマスは、本開示のヘミセルロース分解酵素および耐熱性セルラーゼと接触させられる。
【０４８２】
耐熱性セルラーゼは、セルロースを分解可能な生物から入手され得る。一局面において、耐熱性セルラーゼは、セルロースを分解可能な生物から直接的に入手される。別の局面において、耐熱性セルラーゼは、宿主細胞、および耐熱性セルラーゼをコードする遺伝子を含んでいる発現ベクターの使用を介して組換え的に生産される。耐熱性セルラーゼ、および／または耐熱性セルラーゼをコードする遺伝子は、セルロースを分解可能な種々の生物（例えば、古細菌、真正細菌、真菌および原生動物の生物が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。
【０４８３】
セルロースを分解可能な生物としては、例えば、以下の属Aquifex、Bacillus、Rhodothermus、Thermobifida、Thermotoga、naerocellum、Sulfolobus、Pyrococcus and Caldicellulosiruptorに属する生物が挙げられるが、これらに限定されない。E. coliにおいて生産されたAquifex aeolicusの耐熱性の組換えエンドグルカナーゼは、１００℃において２時間の半減期を伴って、８０℃およびｐＨ７．０において最大の活性を示した（Kim JS, Lee YY, Torget, RW. (2001). Cellulose hydrolysis under extremely low sulfuric acid and high-temperature conditions. Appl. Biochem. Biotechnol. 91-93. 331-340)）。Anaerocellum thermophilumおよびCaldicellulosiruptor saccharolyticusによって生産されたエンドグルカナーゼは、プロリン−スレオニンリッチ領域によって炭水化物結合ドメインに連結されている２つの触媒ドメインから構成されているマルチドメイン酵素である（Zverlov V, Mahr S, Riedel K, Bronnenmeier K (1998a), “Properties and gene structure of a bifunctional cellulolytic enzyme (CelA) from the extreme thermophile 'Anaerocellum thermophilum' with separate glycosyl hydrolase family 9 and 48 catalytic domains,” Microbiology 144 ( Pt 2): 457-465; Te'o VS, Saul DJ, Bergquist PL (1995), “celA, another gene coding for a multidomain cellulase from the extreme thermophile Caldocellum saccharolyticum,” Appl Microbiol Biotechnol 43: 291-296; Saul et al. 1990）。Rhodothermus marinusの組換えエンドグルカナーゼは、６．０〜７．０の至適ｐＨおよび１００℃に至適温度を有する（Halldorsdottir S, Thorolfsdottir ET, Spilliaert R, Johansson M, Thorbjarnardottir SH, Palsdottir A, Hreggvidsson GO, Kristjansson JK, Holst O, Eggertsson G. (1998), “Cloning, sequencing and overexpression of a Rhodothermus marinus gene encoding a thermostable cellulase of glycosyl hydrolase family 12,” Appl Microbiol Biotechnol 49: 277-284）。また、好気性の好熱性真正細菌であるhermus caldophilusは、産物としてセロビオースおよびセロトリオースを伴って、ＣＭＣに対する高い活性を示すエンドグルカナーゼを生産する（Kim D, Park BH, Jung B-W, Kim M-K, Hong SI, Lee, DS (2006) Identification and molecular modeling of a family 5 endocellulase from Thermus caldophilus GK24, a cellulolytic strain of Thermus thermophilus. Int J Mol Sci 7: 571-589）。また、耐熱性セルラーゼは、Bacillus subtilis由来のセルラーゼ（Mawadza, C, Hatti-Kaul, R., Zvauya, R. and Mattiasson, B., 2000. Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains. J. Biotechnol. 83, pp. 177- 187）、Pyrococcus furiosus由来のセルラーゼ（Kengen, S., Luesink, E., Stams, A. and Zehnder, A., 1993. Purification and characterization of an extremely thermostable β-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococccus furiosus . Eur. J. Biochem. 213, pp. 305-312.）、Pyrococcus horikoshi由来のセルラーゼ（Ando, S., Ishida, H., Kosugi, Y. and Ishikawa, K., 2002. Hyperthermostable endoglucanase from Pyrococcus horikoshi. Appl. Environ. Microbiol. 68, pp. 430-433.）、Rhodothermus marinus由来のセルラーゼ（Hreggvidsson, GO., Kaiste, E., Hoist, O., Eggertsson, G., Palsdottir, A. and Kristjansson, J.K., 1996. An extremely thermostable cellulase from the thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus. Appl. Environ. Microbiol. 62, pp. 3047-3049.）、Thermatoga maritema由来のセルラーゼ（Bronnenmeier, K., Kern, A., Libel, W. and Staudenbauer, W., 1995. Purification of Thermatoga maritema enzymes for the degradation of cellulose materials. Appl. Environ. Microbiol. 61, pp. 1399-1407.）、およびThermatoga neapolitana由来のセルラーゼ（Bok, J., Goers, S. and Eveleigh, D., 1994. Cellulase and xylanase systems of Thermatoga neapolitana. ACS Symp. Ser. 566, pp. 54-65; Bok, J., Dienesh, A., Yernool, D. and Eveleigh, D., 1998. Purification, characterization and molecular analysis of thermostable cellulases CeIA and CeIB from Thermatoga neapolitana. Appl. Environ. Microbiol. 64, pp. 4774-4781.）について説明されている。
【０４８４】
いくつかの局面において、耐熱性セルラーゼは、Ｃｂ１９５２、Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９４６、Ｃｂ６２９またはＣｂ４８６ポリペプチドの何れかである。
【０４８５】
いくつかの局面において、本明細書に示されているセルラーゼとの、ヘミセルラーゼまたはヘミセルラーゼの任意の混合物は、Ｃｂ１５８１ポリペプチドをさらに供給され得る。
【０４８６】
＜さらなる用途＞
本明細書に記載の方法は、リグノセルロース材料を生物燃料に変換するために有用な他の方法と組み合わせて、実施され得る。
【０４８７】
例えば、植物材料は前処理に供され得、当該前処理としては、アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）、水蒸気爆発、アルカリ性水溶液による処理、酸性溶液による処理、有機溶剤による処理、イオン性液体（ＩＬ）による処理、電解水による処理、リン酸による処理およびこれらの組合せが挙げられる。植物材料からリグニンを除去する前処理は、ヘミセルロースから遊離する糖の全体量を向上させ得る。
【０４８８】
セルラーゼが植物の細胞壁からグルコースを遊離させるために使用される場合の特定の実施形態において、本開示のヘミセルラーゼ酵素カクテルは、植物材料のヘミセルロース成分を加水分解し、植物材料のセルロース部分に対するセルラーゼカクテルの接近容易性を向上させるために使用され得る。
【０４８９】
典型的に、本開示の組成物および方法は、生物燃料または特殊化学製品を生産するために使用される。一局面において、本開示の組成物および方法は、ヘミセルロースを発酵性糖に分解するために使用される。発酵性糖は、それから生物燃料成分（例えば、エタノール、プロパノールおよびブタノール）または特殊化学製品（例えば、ケトンおよびアルデヒド）に変換される。
【０４９０】
本明細書に記載のヘミセルロースに関連する方法は、セルラーゼと組み合わせて実施され得る。さらなる方法は、単胃動物の農業（ブタおよび家禽の生産が挙げられる）にとっての飼料添加物としてのポリペプチドおよび組成物の使用のために、提供される。
【０４９１】
〔実施例〕
以下に示す例は、単なる説明に過ぎず、いかなる方法による本発明のいかなる側面の制限を意図するものではない。
【０４９２】
＜実施例１：エンドキシラナーゼＣｂ１９３（配列番号３および４）＞
エンドキシラナーゼＣｂ１９３を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ１９３の遺伝子産物である。Ｃｂは、C.besciiを意味する。エンドキシラナーゼは、ヘミセルロースのキシロース骨格をランダムに切断し、β−１，４−結合を有するより短いキシロースの鎖を生成させる。これらのキシロオリゴ糖は、２つ以上の糖サブユニットに渡り得る。Ｃｂ１９３タンパク質は、６７１のアミノ酸長であり、かつ、７７．７ｋＤａの分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋短縮型Ｃｂ１９３タンパク質）。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１０触媒ドメイン（図２Ａ）内に挿入された、２つの推定炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を有する。
【０４９３】
（Ｃｂ１９３のクローニング）
Ｃｂ１９３遺伝子を、iProof HF DNA ポリメラーゼ（BIO-RAD）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９３遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
Cb193For
5’- GACGACGACAAGATGAACTTTGAAGGAAGAGAC-3’（配列番号１３４）
Cb193Rev
5’- GAGGAGAAGCCCGGTTATTTTTTAGCCTTTAC-3’（配列番号１３５）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０４９４】
【表１】
2014509836.tif 000003
【０４９５】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０４９６】
【表２】
2014509836.tif 000004
【０４９７】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ１９３遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。次いで、精製したＰＣＲ産物にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を添加し、適合するオーバーハングを生成させた。
【０４９８】
【表３】
2014509836.tif 000005
【０４９９】
反応の後、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターを用いて、以下のアニーリング反応を行った。
【０５００】
【表４】
2014509836.tif 000006
【０５０１】
インキュベーションの後、反応物にＥＤＴＡを添加した。
【０５０２】
【表５】
2014509836.tif 000007
【０５０３】
Ｃｂ１９３−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアニーリング混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、３つのコロニーを選んで、１０ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップを細胞培養物から作製した。次いで、プラスミド／インサートＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを１％アガロースゲル上で電気泳動した。次いで、ヌクレオチドのシークエンシングによって、遺伝子の完全性を確かめた。
【０５０４】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを１００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌで添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．５ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０５０５】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために数回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ１９３）を、次いで、１５０ｍＭのイミダゾールを添加した溶解バッファーからなる溶出バッファーを用いて、レジンから溶出した。
【０５０６】
Ｃｂ１９３の遺伝子産物は、短縮型として発現した。シグナルペプチドを表す最初の４１アミノ酸は除去した。野生型の生物C.besciiでは、シグナルペプチドは、Ｃｂ１９３の細胞外への輸送を容易にするため、培地中において、そのターゲット基質（キシランまたは植物細胞壁）に作用し得る。通常、シグナルペプチドは、細胞外に輸送された後、タンパク質からプロセシング（切断）される。シグナルペプチドは、組換えタンパク質を作製する際、しばしば問題になり得る。この潜在的な問題に対処するため、すなわち、タンパク質のペリプラズムへの分泌を回避するために、ＰＣＲプライマーは、シグナルペプチドを取り除くように設計される。シグナルペプチドは、触媒活性に影響を与えない。また、ＰＣＲプライマーの設計によって、プラスミドにコードされた６−ヒスチジンにタンパク質が融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、レジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。
【０５０７】
Ｃｂ１９３（アミノ酸配列）
Ｃｂ１９３［エンド−１，４−βキシラナーゼ  Ａ  前駆体（ＥＣ３．２．１．８）］アミノ酸配列は、配列番号３に開示されている。配列番号３のＣｂ１９３のアミノ酸番号１〜４１に対応する、Ｃｂ１９３のシグナルペプチドを、Ｃｂ１９３タンパク質発現ベクターを作製するために除去した。シグナルペプチドのないＣｂ１９３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３７に開示されている。
【０５０８】
Ｃｂ１９３（ヌクレオチド配列）
Ｃｂ１９３のヌクレオチド配列は、配列番号４に開示されている。Ｃｂ１９３のシグナルペプチドに対応する、配列番号４のヌクレオチド番号１〜１２３は、Ｃｂ１９３を作製するためにクローンされた遺伝子には存在しなかった。最初の１２３個のヌクレオチドを欠いたＣｂ１９３遺伝子は、配列番号３８に開示されており、配列番号３７のアミノ酸配列をコードする。
【０５０９】
Ｃｂ１９３遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いタンパク質は、配列番号１５の最初の１５個のアミノ酸を含んでいる。配列番号６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５である。
【０５１０】
Ｃｂ１９３遺伝子を、大腸菌において発現させた。そして、タンパク質を、３つの工程（ＴＡＬＯＮアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過）によって精製した。図２Ｂは、精製したＣｂ１９３のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。分子マーカーは、Ｍが付されたレーンにある。
【０５１１】
（酵素活性）
Ｃｂ１９３の酵素活性を、Ｍｏｒａｇ，Ｅ．，Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．，およびＬａｍｅｄ，Ｒ．の方法（Relationship of cellulosomal and non-cellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum to cellulose degrading enzymes.J.Bacteriol.1990: 172; 6098-6105）に従って測定した。１μＬのサンプル上清（酵素と反応させた基質）を、ＴＬＣプレートにスポットした。それぞれ０．２μＬの１％キシロース／キシロビオース／キシロトリオース／キシロテトラオース／キシロペンタオースを組み合わせて、マーカー混合物を作製した。全ての糖を、Ｍｅｇａｚｙｍｅから購入した。スポットを乾燥させ、それから、ＴＬＣプレートを、養成タンク内で１時間養成した。プレートを、チャンバー内で３０分間乾燥させた。結果を可視化するために、プレートに可視化試薬をスプレーし、５〜１０分間、７５℃でインキュベートした。
【０５１２】
図２Ｃは、ＴＬＣ分析を用いた、天然基質におけるＣｂ１９３の酵素活性を示す。様々な基質を試した：可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リケナン、グルコマンナン、１，４β−マンナン、アラビナンである。ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸの場合、Ｃｂ１９３の存在下（＋）では、短いキシロース鎖が遊離した。マイナス（−）レーンでは酵素を添加しなかったため、加水分解産物は遊離しなかった。Ｘ１（キシロース単量体）、Ｘ２（キシロース二量体または二糖）、Ｘ３（三糖）、Ｘ４（四糖）、五糖（Ｘ５）を、第１レーン（Ｍ）にマーカーとしてロードした。結果は、この酵素が、複合基質（ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸ）から、より短い鎖またはオリゴ糖を遊離させたことを示した。
【０５１３】
ＳＷＡＸおよびＯＳＸの酵素的加水分解の後、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（A new reaction for colorimetric determination carbohydrates.Anal.Biochem.1972: 47; 273-279）に従って、グルコース同等物の濃度を決定した。１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、５±０．１ｍｇのＳＷＡＸまたはＯＳＸを各チューブに添加し、重量を測定して記録した。各チューブに添加する必要がある体積は、重量に基づき算出した。反応バッファーをはじめとして、リン酸ナトリウム反応バッファーおよび酵素を、各チューブに添加した。チューブを、ロティセリエ式チューブミキサー内において、３７℃で１５時間、連続的に混合しながらインキュベートした。チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。１００μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬ遠心チューブに移し、１５０μＬのクエン酸ナトリウム反応バッファーを添加して、最終体積を２５０μＬにした。１ｍＬのグルコースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が２０ｍＭになるように作製し、次の各濃度（２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ、１．２５ｍＭ、０．６２５ｍＭ、０．３１２５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１１２．５μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、３７．５μＬのサンプルおよびグルコース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルにおける、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍとグルコース濃度とを、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。
【０５１４】
図２Ｅは、還元糖アッセイからの、天然基質におけるＣｂ１９３の酵素活性を示す。この実験では、基質からの産物の遊離を決定するために、還元糖についての別のアッセイを用いた。既知のグルコース濃度およびパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの存在下におけるそれらの吸光度（発色）に基づいて、標準を定めた（Cann et al. 1999. J. Bacterial. 181:1643-1651および上述の他の参考文献Laver, M. 1972.）。酵素を基質とインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。
【０５１５】
図３は、Ｃｂ１９３の熱安定性を示す。最終５ｎＭのＣｂ１９３を、７０〜９０℃の種々の温度においてインキュベートした。Ｃｂ１９３酵素は、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、および９０℃でインキュベートした。インキュベートした酵素を、一定の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、１６時間、２４時間）において取り出し、直ちにコムギアラビノキシラン（最終１％，ｗ／ｖ）と共にインキュベートし、酵素活性を測定した。反応の初速度を算出した。各サンプルの活性を、ゼロ点における初期活性で割ることによって、残存活性（％）を算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【０５１６】
図４は、コムギアラビノキシラン、オートスペルトキシラン、およびカバ材キシランにおけるＣｂ１９３の反応速度データを示す。同様に、Ｋｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍも示されている。パート（Ａ）では、５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、７５℃において、実験を行った。パート（Ｂ）では、５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、８５℃において、実験を行った。キシラン基質（最終２．５〜５０ｍｇ／ｍＬ）をＣｂ１９３（コムギアラビノキシランについては最終５ｎＭ、オートスペルトキシランおよびカバ材キシランについては最終５０ｎＭ）と共にインキュベートした。反応の初速度を算出した。次いで、初速度をキシラン基質の濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いた非線形フィッティングによって、Ｋｍおよびｋｃａｔを算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【０５１７】
＜実施例２：エンドキシラナーゼＣｂ１９５（配列番号７および８）＞
エンドキシラナーゼＣｂ１９５を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ１９５の遺伝子産物である。Ｃｂは、C.besciiを意味する。エンドキシラナーゼは、ヘミセルロースのキシロース骨格をランダムに切断し、β−１，４−結合を有するより短いキシロースの鎖を生成させる。これらのキシロオリゴ糖は、２つ以上の糖サブユニットに渡り得る。Ｃｂ１９５タンパク質は、３５１のアミノ酸長であり、かつ、４１．９ｋＤａの分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１９５タンパク質）（図２Ａ）。
【０５１８】
（Ｃｂ１９５のクローニング）
Ｃｂ１９５遺伝子を、iProof HF DNA ポリメラーゼ（BIO-RAD）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiのゲノムＤＮＡから増幅した。
【０５１９】
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０５２０】
【表６】
2014509836.tif 000008
【０５２１】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０５２２】
【表７】
2014509836.tif 000009
【０５２３】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ１９５遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。次いで、精製したＰＣＲ産物にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を添加し、適合するオーバーハングを生成させた。
【０５２４】
【表８】
2014509836.tif 000010
【０５２５】
反応の後、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターを用いて、以下のアニーリング反応を行った。
【０５２６】
【表９】
2014509836.tif 000011
【０５２７】
インキュベーションの後、反応物にＥＤＴＡを添加した。
【０５２８】
【表１０】
2014509836.tif 000012
【０５２９】
Ｃｂ１９５−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアニーリング混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、３つのコロニーを選んで、１０ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップを細胞培養物から作製した。プラスミド／インサートＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。次いで、ヌクレオチドのシークエンシングによって、遺伝子の完全性を確かめた。
【０５３０】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを１００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌで添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍＬのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．５ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０５３１】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために数回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ１９５）を、次いで、１５０ｍＭのイミダゾールを添加した溶解バッファーからなる溶出バッファーを用いて、レジンから溶出した。タンパク質を、３つの工程（ＴＡＬＯＮアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過）によって精製した。図２Ｂは、精製したＣｂ１９５のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。分子マーカーは、Ｍが付されたレーンにある。
【０５３２】
Ｃｂ１９５［エンド−１，４−βキシラナーゼ  Ａ  前駆体（ＥＣ３．２．１．８）］アミノ酸配列は、配列番号７に開示されている。Ｃｂ１９５をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に開示されている。
【０５３３】
タンパク質発現のため、Ｃｂ１９５をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングした。Ｃｂ１９５−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアミノ酸配列は、配列番号１０である。配列番号１０のアミノ酸番号１〜１５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものであり、タンパク質精製を容易にするための一続きの６つのヒスチジンを含んでいる。配列番号１０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に開示されている。配列番号９のヌクレオチド番号１〜４５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものである。
【０５３４】
（酵素活性）
Ｃｂ１９５の酵素活性を、Ｍｏｒａｇ，Ｅ．，Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．，およびＬａｍｅｄ，Ｒ．らの方法（Relationship of cellulosomal and non-cellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum to cellulose degrading enzymes.J.Bacteriol.1990: 172; 6098-6105）によって測定した。１μＬのサンプル上清（酵素と反応させた基質）を、ＴＬＣプレートにスポットした。それぞれ０．２μＬの１％キシロース／キシロビオース／キシロトリオース／キシロテトラオース／キシロペンタオースを組み合わせて、マーカー混合物を作製した。全ての糖を、Ｍｅｇａｚｙｍｅから購入した。スポットを乾燥させ、それから、ＴＬＣプレートを、養成タンク内で１時間養成した。プレートを、チャンバー内で３０分、乾燥させた。結果を可視化するために、プレートに可視化試薬をスプレーし、５〜１０分間、７５℃でインキュベートした。
【０５３５】
図２Ｄは、ＴＬＣ分析を用いた、天然基質におけるＣｂ１９５の酵素活性を示す。様々な基質を試した：可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リケナン、グルコマンナン、１，４β−マンナン、アラビナンである。ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸの場合、Ｃｂ１９５の存在下（＋）では、短いキシロース鎖が遊離した。マイナス（−）レーンでは酵素を添加しなかったため、加水分解産物は遊離しなかった。Ｘ１（キシロース単量体）、Ｘ２（キシロース二量体または二糖）、Ｘ３（三糖）、Ｘ４（四糖）、五糖（Ｘ５）を、第１レーン（Ｍ）にマーカーとしてロードした。結果は、この酵素が、複合基質（ＳＷＡＸ、ＯＳＸ、およびＢＷＸ）から、より短い鎖またはオリゴ糖を遊離したことを示した。
【０５３６】
可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）およびオートスペルトキシラン（ＯＳＸ）の酵素的加水分解の後、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（A new reaction for colorimetric determination carbohydrates.Anal.Biochem.1972: 47; 273-279）に従って、グルコース同等物の濃度を決定した。１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、５±０．１ｍｇのＳＷＡＸまたはＯＳＸを各チューブに添加し、重量を測定して記録した。各チューブに添加する必要がある体積は、重量に基づき算出した。反応バッファーをはじめとして、リン酸ナトリウム反応バッファーおよび酵素を、各チューブに添加した。チューブを、ロティセリエ式チューブミキサー内において、３７℃で１５時間、連続的に混合しながらインキュベートした。チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。１００μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬ遠心チューブに移し、１５０μＬのクエン酸ナトリウム反応バッファーを添加して、最終体積を２５０μＬにした。１ｍＬのグルコースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が２０ｍＭになるように作製し、次の各濃度（２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ、１．２５ｍＭ、０．６２５ｍＭ、０．３１２５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１１２．５μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、３７．５μＬのサンプルおよびグルコース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルにおける、波長４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍとグルコース濃度とを、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。
【０５３７】
図２Ｅは、還元糖アッセイからの、天然基質におけるＣｂ１９５の酵素活性を示す。この実験では、基質からの産物の遊離を測定するために、還元糖についての別のアッセイを用いた。既知のグルコース濃度およびパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの存在下におけるそれらの吸光度（発色）に基づいて、標準を定めた（Cann et al. 1999. J. Bacterial. 181:1643-1651および上述の他の参考文献Laver, M. 1972.）。酵素を基質とインキュベートすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。
【０５３８】
図３Ｂは、Ｃｂ１９５の熱安定性を示す。最終５ｎＭのＣｂ１９５の、６５〜８０℃の種々の温度においてインキュベートした。Ｃｂ１９５酵素を、６５℃、７０℃、７５℃、および８０℃でインキュベートした。インキュベートした酵素を、一定の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、１６時間、２４時間）おいて取り出し、直ちにコムギアラビノキシラン（最終１％，ｗ／ｖ）と共にインキュベートし、酵素活性を測定した。反応の初速度を算出した。各サンプルの活性を、ゼロ点における初期活性で割ることによって、残存活性（％）を算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【０５３９】
図５は、コムギアラビノキシラン、オートスペルトキシラン、およびカバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す。Ｋｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍを同様に示す。パート（Ａ）では、実験は、５０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、７５℃で行った。パート（Ｂ）では、実験は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を用いて、７５℃で行った。キシラン基質（最終２．５〜５０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｃｂ１９５（コムギアラビノキシランについては最終濃度５ｎＭ、オートスペルトおよびカバ材キシランについては最終濃度５０ｎＭ）と共にインキュベートした。反応の初速度を算出した。次いで、初速度をキシラン基質に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いた非線形フィッティングによって、Ｋｍおよびｋｃａｔを算出した。バーは独立した３回の実験についての標準誤差に関して示されている。
【０５４０】
＜実施例３：α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＣｂ１１７２（配列番号１３および１４）＞
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＣｂ１１７２を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ１１７２の遺伝子産物である。Ｃｂは、C.besciiを意味する。α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、ヘミセルロースのキシロース骨格または分枝もしくは脱分枝アラビナンからアラビノース部分を切断し、アラビノースを専ら生成させる。Ｃｂ１１７２タンパク質は、５０５のアミノ酸長であり、かつ、５９．６ｋＤａの分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１１７２タンパク質）。このタンパク質は、グルコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５１触媒ドメインを有する（図６Ｄ）。
【０５４１】
（Ｃｂ１１７２のクローニング）
Ｃｂ１１７２遺伝子を、iProof HF DNA ポリメラーゼ（BIO-RAD）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiＤＳＭ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１１７２遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
Cb1172Forward
5’-GAC GAC GAC AAG ATG AAA AAA GCA AAA GTC ATC TAC-3’（配列番号１３６）
Cb1172Reverse
5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT TCT TTC TTC TTT AAC CTG-3’（配列番号１３７）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０５４２】
【表１１】
2014509836.tif 000013
【０５４３】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０５４４】
【表１２】
2014509836.tif 000014
【０５４５】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ１１７２遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲルにおける、予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、ゲルからＤＮＡを抽出するため、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットにアプライした。
【０５４６】
精製したＤＮＡを処理するために、NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用い、精製したＤＮＡをｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０５４７】
【表１３】
2014509836.tif 000015
【０５４８】
反応の後、７５℃で２０分間インキュベートすることによって、酵素を失活させた。
【０５４９】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした。
【０５５０】
【表１４】
2014509836.tif 000016
【０５５１】
Ｃｂ１１７２−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、エレクトロポレーション法によって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、プラスミドミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養物から作製した。次いで、プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。プラスミドインサート（遺伝子）の配列を読み、その同一性を確かめた。
【０５５２】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．０１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０５５３】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．８、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール、１．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ１１７２）を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、レジンから溶出した。
【０５５４】
Ｃｂ１９３の遺伝子産物は、全長型として発現した。ＰＣＲプライマーの設計によって、プラスミドにコードされた６−ヒスチジンにタンパク質が融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、レジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。
【０５５５】
Ｃｂ１１７２［α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）］アミノ酸配列は、配列番号１３に開示されている。Ｃｂ１１７２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４に開示されている。
【０５５６】
タンパク質発現のため、Ｃｂ１１７２をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングした。Ｃｂ１１７２−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアミノ酸配列は、配列番号１６である。配列番号１６のアミノ酸番号１〜１５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものであり、タンパク質精製を容易にするための一続きの６つのヒスチジンを含んでいる。配列番号１６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に開示されている。配列番号１５のヌクレオチド番号１〜４５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものである。
【０５５７】
Ｃｂ１１７２遺伝子を大腸菌細胞で発現させ、プラスミドによってコードされた６−ヒスチジンを用いたＴＡＬＯＮレジン精製（固定化金属アフィニティクロマトグラフィ）工程と、Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ  カラムを用いた陰イオン交換工程とを含んでいる２つの工程によって、タンパク質を精製した。図６Ａは、精製したＣｂ１１７２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０５５８】
（酵素活性）
図６Ｂは、還元糖アッセイからの、天然基質におけるＣｂ１１７２の酵素活性を示す。５つの異なる基質を試した：アラビナン（サトウダイコン）、可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）、ライアラビノキシラン（ＲＡＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、および脱分枝アラビナンである。酵素を基質と共にインキュベートすることによって、アラビノース同等物として定量化される産物が遊離した。アラビナン（テンサイ）の加水分解は、他の天然基質の加水分解に比べて高かった。
【０５５９】
アラビナン（テンサイ）、ライアラビノキシラン（ＲＡＸ）、可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、および脱分枝アラビナンの酵素加水分解の後、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（A new reaction for colorimetric determination carbohydrates.Anal.Biochem.1972: 47; 273-279）に従って、アラビノース同等物の濃度を決定した。１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、２±０．１ｍｇのアラビナン（テンサイ）、ＳＷＡＸ、ＲＡＸ、ＯＳＸ、および脱分枝アラビナンを各チューブに添加し、重量を測定して記録した。各チューブに添加する必要がある体積は、重量に基づき算出した。反応バッファーをはじめとして、リン酸ナトリウム反応バッファーおよび酵素を、各チューブに添加した。チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内において、反応バッファーと共に、７５℃で１６時間、連続的に混合しながらインキュベートした。チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。５０μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬ遠心チューブに移した。１ｍＬのアラビノースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が１００ｍＭになるように作製し、次の各濃度（５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、および６．２５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１５０μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、５０μＬのサンプルおよびアラビノース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルにおける、波長４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍおよびアラビノース濃度を、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。
【０５６０】
図６Ｃは、ＨＰＬＣ分析を用いた天然基質におけるＣｂ１１７２の酵素活性を示す。５つの異なる基質を試した：アラビナン（テンサイ）、可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）、ライアラビノキシラン（ＲＡＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、および脱分枝アラビナンである。それぞれの場合において、Ｃｂ１１７２の存在下では、アラビノースが遊離した。Ｃｂ１１７２の非存在下では、脱分枝アラビナンについてはごくわずかな量のアラビノースが遊離した。他の天然多糖については、加水分解産物は遊離しなかった。この結果は、この酵素が、複合基質（アラビナン、ＳＷＡＸ、ＲＡＸ、ＯＳＸ、および脱分枝アラビナン）からアラビノースを遊離させることを示す。
【０５６１】
図６Ｅは、Ｃｂ１１７２の熱安定性を示す。Ｃｂ１１７２は、７０℃、７５℃、８０℃、および８５℃で２４時間インキュベートした後、それぞれ５７％、４５％、３５％、および２２％の活性を有する。５０ｎＭのＣｂ１１７２を、異なる温度（７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、および９０℃）に保持した。サンプルを、次の一定の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、および２４時間）おいて取り出し、直ちに酵素活性測定に供した。酵素活性を、Ｃａｒｙ３００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を用いて８５℃で測定した。１．２５ｍＭのｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシド基質１００μＬを、８５℃に３分間保持し、平衡化した。それから、２５μＬのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。４００ｎｍにおける光学密度を、分光光度計によって、２．５分間記録した。そして、最初の１分間において反応の初速度を算出した。時間０における反応の初速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、および２４時間における反応の初速度を、時間０における反応の初速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、および２４時間における残存活性（％）を、それぞれ算出した。
【０５６２】
図７は、ｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシドを加水分解した場合の、Ｃｂ１１７２の反応速度データを示す。Ｋｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍを同様に示す。パート（Ａ）では、実験は９０℃で行った；パート（Ｂ）では、実験は７５℃で行った。１００μＬのｐＮｐ−α−アラビノフラノシド基質を、８５℃に３分間保持し、平衡化した。それから、２５μＬのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。４００ｎｍにおける光学密度を、Ｃａｒｙ３００ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計によって、２．５分間記録した。最初の１分間において反応の初速度を算出した。次いで、初速度を、ｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシダドの濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いた非線形フィッティングによって、Ｋｍおよびｋｃａｔを算出した。
【０５６３】
＜実施例４：α−グルクロニダーゼＣｂ９０９（配列番号１９および２０）＞
α−グルクロニダーゼＣｂ９０９を、Caldicellulosiruptor bsciiにおいて同定した。α−グルクロニダーゼは、キシランにおける、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸とβ−１，４−キシロシド結合骨格との間のα−１，２−グリコシド結合を切断する。
【０５６４】
Ｃｂ９０９遺伝子を、iProofTMHigh-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad)を用いたＰＣＲによって増幅し、Ek/LIC Cloning Kits（Novagen）を用いてpET46 Ek/LICベクターにサブクローニングした。フォーワード（Ｆｏｒ）プライマー配列およびリバース（Ｒｅｖ）プライマー配列は次の通りである。
CB909For
5'- GACGACGACAAGATGATTTTATCAAGGAGCAGTAAC -3'（配列番号１３８）
CB909Rev
5'- GAGGAGAAGCCCGGTTACGGATATATTAGTCTTC -3'（配列番号１３９）
ＰＣＲ混合物および増幅の手順は、次の通りである：
【０５６５】
【表１５】
2014509836.tif 000017
【０５６６】
上述したＰＣＲ増幅の後、１％アガロースゲル電気泳動によって、Ｃｂ９０９遺伝子の増幅を確認した。次いで、精製したＰＣＲ産物にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を添加し、適合するオーバーハングを生成させた。
【０５６７】
【表１６】
2014509836.tif 000018
【０５６８】
反応の後、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターを用いて、以下のアニーリング反応を行った。
【０５６９】
【表１７】
2014509836.tif 000019
【０５７０】
インキュベーションの後、アニーリング反応を停止させるために、ＥＤＴＡを添加した。
【０５７１】
【表１８】
2014509836.tif 000020
【０５７２】
Ｃｂ９０９−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアニーリング混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリンプレート上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、３つのコロニーを選んで、１０ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけるためにそれぞれを用いた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、プラスミドミニプレップを各細胞培養物から作製した。プラスミド／インサートＤＮＡのサイズを確かめるために、個々のプラスミド調製物を次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。次いで、ヌクレオチドのシークエンシングによって、遺伝子の完全性を確かめた。
【０５７３】
Ｃｂ９０９（α−グルクロニダーゼ）のアミノ酸配列は、配列番号１９に開示されている。Ｃｂ９０９をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０に開示されている。
【０５７４】
タンパク質発現のため、Ｃｂ９０９をｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングした。Ｃｂ９０９−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアミノ酸配列は、配列番号２４である。配列番号２４のアミノ酸番号１〜１５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものであり、タンパク質精製を容易にするための一続きの６つのヒスチジンを含んでいる。配列番号２４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３に開示されている。配列番号２３のヌクレオチド番号１〜４５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものである。
【０５７５】
図８Ａは、Ｃｂ９０９の推定ドメイン構造を示す。図８Ｂは、精製したＣｂ９０９のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０５７６】
図８Ｃは、Ｃｂ９０９の活性を示す。基質は、アルドウロン酸であり、これは、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロノシル（ＭｅＧｌｃＡ）によって修飾されたキシロオリゴ糖の混合物である。Ｃｂ９０９と共に７５℃で６０分間インキュベートした後、Ｃｂ９０９によってＭｅＧｌｃＡ基がアルドウロン酸から切断され、産物として、非修飾のキシロース、キシロビオース、キシロトリオース、およびキシロテトラオースが遊離した。反応の条件は次の通りであった：６ｎＭ  Ｃｂ９０９、５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  アルドウロン酸。
【０５７７】
図８Ｄは、Ｃｂ９０９についての至適ｐＨアッセイの結果を示す。最大活性はｐＨ５．５において検出された。このアッセイを、次のように行った：１ｍｇ／ｍｌのアルドウロン酸溶液を、６ｎＭのＣｂ９０９と共に、７５℃で１０分間、各ｐＨにおいてインキュベートした。１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭのクエン酸バッファーを、ｐＨ５〜ｐＨ６の範囲で用いた。１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭのリン酸バッファーを、ｐＨ６〜ｐＨ７の範囲で用いた。反応後、温度を１００℃に急上昇させ、反応を終了させた。産物の量をＨＰＬＣによって検出した。
【０５７８】
図８Ｅは、至適温度アッセイの結果を示す。Ｃｂ９０９の最大活性は、７５℃において検出された（キシロビオースおよびキシロトリオース）。キシロースは７０℃において最も効率的に生成したが、７０℃および７５℃でのキシロース産物の量は、ほとんど同じであった。このアッセイは、次のように行った：１ｍｇ／ｍｌのアルドウロン酸溶液を、６ｎＭのＣｂ９０９と共に、１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭのクエン酸バッファー中でインキュベートした。反応後、温度を１００℃に急上昇させ、反応を終了させた。産物の量をＨＰＬＣによって検出した。
【０５７９】
＜実施例５：β−キシロシダーゼＣｂ２４８７（配列番号２７および２８）＞
酵素カクテルにおける別の酵素は、Caldicellulosiruptor bsciiから増幅したβ−キシロシダーゼ、Ｃｂ２４８７である。
【０５８０】
Ｃｂ２４８７遺伝子を、iProofTMHigh-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad)を用いたＰＣＲによって増幅し、Ek/LIC Cloning Kits（Novagen）を用いてpET46 Ek/LICベクターにサブクローニングした。フォーワード（Ｆｏｒ）プライマー配列およびリバース（Ｒｅｖ）プライマー配列は次の通りである。
CB2487For 
5’-GACGACGACAAGATGTCAATTGAAAAAAGGGTAAAC-3’（配列番号１４０）
CB2487Rev
5’-GAGGAGAAGCCCGGTTATTCACACCATGCA-3’（配列番号１４１）
ＰＣＲ混合物および増幅の手順は、次の通りである：
【０５８１】
【表１９】
2014509836.tif 000021
【０５８２】
上述したＰＣＲ増幅の後、１％アガロースゲル電気泳動によって、Ｃｂ２４８７遺伝子の増幅を確認した。次いで、精製したＰＣＲ産物にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を添加し、適合するオーバーハングを生成させた。
【０５８３】
【表２０】
2014509836.tif 000022
【０５８４】
反応の後、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターを用いて、以下のアニーリング反応を行った。
【０５８５】
【表２１】
2014509836.tif 000023
【０５８６】
インキュベーションの後、反応を停止させるためにＥＤＴＡを添加した。
【０５８７】
【表２２】
2014509836.tif 000024
【０５８８】
Ｃｂ２４８７−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアニーリング混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリンプレート上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、３つのコロニーを選んで、１０ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけるためにそれぞれを用いた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、プラスミドミニプレップを細胞培養物から作製した。プラスミド／インサートＤＮＡのサイズを確かめるために、個々のプラスミド調製物を次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。次いで、ヌクレオチドのシークエンシングによって、遺伝子の完全性を確かめた。
【０５８９】
Ｃｂ２４８７（β−キシロシダーゼ）のアミノ酸配列は、配列番号２７に開示されている。Ｃｂ２４８７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８に開示されている。
【０５９０】
タンパク質発現のため、Ｃｂ２４８７をｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングした。Ｃｂ２４８７−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアミノ酸配列は、配列番号３０である。配列番号３０のアミノ酸番号１〜１５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものであり、タンパク質精製を容易にするための一続きの６つのヒスチジンを含んでいる。配列番号３０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９に開示されている。配列番号２９のヌクレオチド番号１〜４５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものである。
【０５９１】
図９Ａは、Ｃｂ２４８７の推定ドメイン構造を示す。図９Ｂは、精製したＣｂ２４８７のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図９Ｃは、Ｃｂ２４８７の至適ｐＨを決定するための生化学アッセイを示す。図９Ｄは、Ｃｂ２４８７の至適温度を決定するための生化学アッセイを示す。図９Ｅは、ｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした場合のＣｂ２４８７の反応速度パラメータを示す。図９Ｆは、薄膜クロマトグラフィーによる、キシロオリゴ糖の加水分解産物の分析を示す。図９Ｇは、Ｃｂ２４８７についての熱安定性アッセイを示す。図９Ｈは、β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）およびα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）の相乗作用を示す。
【０５９２】
図９Ａは、Ｃｂ２４８７の推定ドメイン構造を示す。Ｃｂ２４８７の推定保存ドメインは、NCBI Conserved Domains Databaseサーチツールを用いて解析したものである。
【０５９３】
図９Ｂは、精製したＣｂ２４８７のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＭＷの隣のレーンは、タンパク質分子量マーカーを示す。Ｃｂ２４８７レーンは、精製したタンパク質を示す。
【０５９４】
Ｃｂ２４８７の精製のため、細胞ペレットを結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、次いで、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ−３細胞ホモジナイザーを通過させることによって、溶解した。細胞残骸を取り除くため、上清を４℃で２０分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。上清を７５℃で３０分間インキュベートし、それから４℃で１５分間、２０，０００×ｇで遠心分離して、熱に不安定なタンパク質を取り除いた。加熱後の上清を、結合バッファーで予め平衡化したＴａｌｏｎ金属アフィニティレジンによって精製し、４℃で１時間、インキュベートした。レジンを５０カラム量の結合バッファーで洗浄し、次いで、１０カラム量の溶出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタユニット（５０，０００ＭＭＣＯ）で濃縮して、３回の連続する濃縮および希釈サイクルによってＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）に交換し、それからＨｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムによって精製した。溶出画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−遠心分離フィルタユニット（５０，０００ＭＭＣＯ）で濃縮して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ）に交換した。次いで、タンパク質を、ＵＶ検知器を備えたＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステムを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ２００  ＨｉｌｏａｄＴＭ１６／６０サイズ排除カラムによって、精製した。
【０５９５】
図９Ｃは、Ｃｂ２４８７の至適ｐＨを決定するための生化学アッセイを示す。至適ｐＨアッセイのために、パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｐＮＰ−Ｘ、０．８ｍＭ）を、種々のバッファー：ｐＨ４．０〜６．０（クエン酸バッファー、５０ｍＭ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、ｐＨ６．０〜８．０（リン酸バッファー、５０ｍＭ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、ｐＨ８．５〜９．０（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、７５℃で、１０ｎＭの濃度のＣｂ２４８７と共に、インキュベートした。
【０５９６】
図９Ｄは、Ｃｂ２４８７の至適温度を決定するための生化学アッセイを示す。至適温度アッセイのため、ｐＮＰ−Ｘ（０．８ｍＭ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、種々の温度（４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃）でＣｂ２４８７（１０ｎＭ）と共にインキュベートした。
【０５９７】
図９Ｅは、ｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした場合のＣｂ２４８７の反応速度パラメータの決定を示す。左側のパネルでは、反応速度パラメータを、ｐＨ６．０、９０℃で決定した。右側のパネルでは、反応速度パラメータを、ｐＨ６．０、７５℃で決定した。これらのアッセイでは、異なる濃度のｐＮＰ−Ｘ（０．０８〜２４ｍＭ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、それぞれ７５℃および９０℃でＣｂ２４８７（１０ｎＭ）と共にインキュベートした。
【０５９８】
図９Ｆは、キシロオリゴ糖におけるＣｂ２４８７の加水分解活性を示す。Ｃｂ２４８７（０．５μＭ）を、７５℃で１５時間、種々のキシロオリゴ糖（Ｘ２−６）と共にインキュベートし、次いで産物をＴＬＣによって分離した。
【０５９９】
図９Ｇは、Ｃｂ２４８７の熱安定性アッセイを示す。基質を添加せずに、異なる温度（７０、７５、８０、８５、９０、および９５℃）で、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０、５０ｍＭ）中で、Ｃｂ２４８７をインキュベートし、タンパク質を異なる時点（０、１０分、３０分、１時間、３時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間）において取り出し、ｐＮＰ−Ｘを基質として残存活性をアッセイした。
【０６００】
図９Ｈは、β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）およびα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）の相乗作用を示す。アルドウロン酸を、７５℃で一晩、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で、Ｃｂ２４８７（０．５μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）と共にインキュベートし、それから、ＨＰＬＣによってアッセイした。Ｃｂ９０９の添加によって、アルドウロン酸におけるメチルグルクロン酸修飾が切断され、キシロースおよびキシロオリゴ糖が遊離した。Ｃｂ２４８７の添加によって、利用可能なβ−１，４−キシロシド結合が切断され、より多くのキシロースが遊離した。２つの酵素を混合することによって、Ｃｂ９０９によって遊離したキシロオリゴ糖が、Ｃｂ２４８７によって、キシロースに転換した。
【０６０１】
＜実施例６：アセチルキシランエステラーゼＣｂ１６２（配列番号３３および３４）＞
アセチルキシランエステラーゼＣｂ１６２を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ１６２の遺伝子産物である。Ｃｂは、C.besciiを意味する。アセチルキシンラエステラーゼは、ヘミセルロースにおけるキシロースとアセチル基の側鎖との間の結合を切断して、他のヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼ）に対する接近容易性を、キシランの骨格に付与する。Ｃｂ１６２タンパク質は、３２１のアミノ酸長であり、かつ、３８．７ｋＤａの推定分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１６２タンパク質）。このタンパク質は、アセチルキシランエステラーゼのシングルドメインを有する（図１０Ａ）。
【０６０２】
（Ｃｂ１６２のクローニング）
Ｃｂ１６２遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１６２遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
Cb162-Fw
5’- GACGACGACAAGATGGTTTTTGAAATGCCACTTGAAAAG -3’（配列番号１４２）
Cb162-Rv
5’-GAGGAGAAGCCCGGTTATTTTATCATCTCCATAAGATACATAAATATCTTGTC -3’（配列番号１４３）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０６０３】
【表２３】
2014509836.tif 000025
【０６０４】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０６０５】
【表２４】
2014509836.tif 000026
【０６０６】
Ｅｋ／ＬＩＣキット（Novagen）を用いた。増幅した遺伝子断片の両末端を、ｄＡＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって、分解した。結果として得た断片を、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにアニールした。
【０６０７】
Ｃｂ１６２−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、ヒートショック法によって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、１０ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけるために、それぞれ用いた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップを細胞培養物から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを１００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌで添加したＬＢプレート上にプレーティングして、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０６０８】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  イミダゾール、および３００ｍＭのＮａＣｌ）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、ニッケル導入レジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために数回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ１６２）を、次いで、２５０ｍＭのイミダゾールを添加した溶解バッファーからなる溶出バッファーを用いて、レジンから溶出した。溶出したタンパク質を、５０ｍＭのＮａ２ＨＰ０４−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）および１００ｍＭのＮａＣｌバッファーの下で、Ｈｉｌｏａｄ１６／２０ｐｒｅｐｇｒａｄｅゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させることによって、さらに精製した。
【０６０９】
Ｃｂ１６２（アセチルキシランエステラーゼ）アミノ酸配列は、配列番号３３に開示されている。Ｃｂ１６２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４に開示されている。
【０６１０】
タンパク質発現のため、Ｃｂ１６２をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングした。Ｃｂ１６２−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのアミノ酸配列は、配列番号３６である。配列番号３６のアミノ酸番号１〜１５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものであり、タンパク質精製を容易にするための一続きの６つのヒスチジンを含んでいる。配列番号３６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５に開示されている。配列番号３５のヌクレオチド番号１〜４５は、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣプラスミドからのものである。
【０６１１】
図１０Ａは、Ｃｂ１６２のドメイン構造を示す；タンパク質は、アセチルキシランエステラーゼドメインを有する。
【０６１２】
Ｃｂ１６２遺伝子を大腸菌において発現させ、プラスミドにコードされた６−ヒスチジンを利用することによって、タンパク質を２つの工程において精製した。図１０Ｂは、精製したＣｂ１６２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。分子量マーカーは、精製したＣｂ１６２の隣にある。
【０６１３】
図１０Ｃは、パラニトロフェノール付加アセテート（ｐＮＰ−アセテート）を基質として用いた、異なるｐＨにおけるＣｂ１６２の酵素活性を示す。Ｓｙｎｅｒｇｙ２  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  リーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、遊離したｐＮＰを４００ｎｍの吸光度で、継続的にモニターした。加水分解の初速度を、酵素活性として採用した。図は、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２のｐＨプロファイルを示す。Ｃｂ１６２におけるｐＨの影響を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、５０ｍＭのクエン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０〜６．０）または５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ６．０〜８．０）の存在下、５０℃において試験した。このアッセイには、０．１μＭの精製したＣｂ１６２および２ｍＭのｐＮＰ−アセテートを用いた。
【０６１４】
図１０Ｄは、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の温度プロファイルを示す。温度プロファイルは、ｐＨ７．０で５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌと１５０ｍＭのＮａＣｌとの存在下において、４０℃と７５℃との間の温度で５℃刻みで行った。このアッセイには、０．０４μＭの精製したＣｂ１６２および２ｍＭのｐＮＰ−アセテートを用いた。
【０６１５】
図１０Ｅは、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の熱安定性プロファイルを示す。５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の０．０２μＭの精製したＣｂ１６２を、６０℃と８０℃との温度の間で５℃間隔で、０〜２４時間、インキュベートし、残存活性を測定した。
【０６１６】
図１０Ｆは、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の反応速度実験を示す。５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の０．０４μＭの精製したＣｂ１６２を、様々な濃度のｐＮＰ−アセテートと共にインキュベートし、加水分解の初速度をグラフ上にプロットした。反応速度パラメータは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ｖ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いたミカエリス−メンテンの式によって決定した。
【０６１７】
＜実施例７：１種類のエンドキシラナーゼを含んでいるCaldicellulosiruptor besciiヘミセルラーゼの酵素カクテルによる多糖の加水分解＞
エンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）、α−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）、β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）、α−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）、およびアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）酵素のうち１つ以上の混合物を、水溶性コムギアラビノキシラン、カバ材キシラン、およびオートスペルトキシランの多糖と共にインキュベートした。各基質において、エンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）、α−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）、β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）、α−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）、およびアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）酵素の全てを含んでいるカクテルと共に基質をインキュベートすると、全ての酵素よりも少ない酵素を含んでいる酵素カクテルと共に基質をインキュベートした場合に比べて、キシランからより多くの単糖が遊離した。
【０６１８】
図１１は、可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）の加水分解におけるC.besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す。ＳＷＡＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、異なるヘミセルラーゼ混合物と共にインキュベートし、還元糖［パート（Ａ）］およびＨＰＬＣ［パート（Ｂ）］分析に供した。用いたヘミセルラーゼとしては、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）が挙げられる。
【０６１９】
図１２は、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）の加水分解におけるC.besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す。ＯＳＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、異なるヘミセルラーゼ混合物と共にインキュベートし、還元糖［パート（Ａ）］およびＨＰＬＣ［パート（Ｂ）］分析に供した。用いたヘミセルラーゼとしては、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）が挙げられる。
【０６２０】
図１３Ａは、異なる温度におけるヘミセルラーゼカクテルによるＳＷＡＸの加水分解を示す。ＳＷＡＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、６５℃、７０℃、７５℃、および８０℃で１５時間、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。
【０６２１】
図１３Ｂは、異なる温度におけるヘミセルラーゼカクテルによるＢＷＸの加水分解を示す。ＢＷＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、６５℃、７０℃、７５℃、および８０℃で１５時間、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。
【０６２２】
図１３Ｃは、異なる温度におけるヘミセルラーゼカクテルによるＯＳＸの加水分解を示す。ＯＳＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、６５℃、７０℃、７５℃、および８０℃で１５時間、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。
【０６２３】
＜実施例８：２種類のエンドキシラナーゼを含んでいるCaldicellulosiruptor besciiヘミセルロースの酵素カクテルによる多糖の加水分解＞
α−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）、β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）、α−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）、アセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）、および一方または両方のエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５）酵素を含んでいる混合物を、水溶性コムギアラビノキシラン、カバ材キシラン、およびオートスペルトキシランの多糖と共にインキュベートした。各基質において、両方のエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５）を含んでいるカクテルと共に基質をインキュベートすると、エンドキシラナーゼの一方のみを含んでいる酵素カクテルと共に基質をインキュベートする場合に比べて、キシランからより多くの単糖が遊離した。
【０６２４】
図１４Ａは、ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＳＷＡＸの加水分解が向上したことを示す。ＳＷＡＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、異なるヘミセルラーゼ混合物と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。種々のヘミセルラーゼ混合物を加水分解において用いた：混合物Ｉ：Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩ：Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩＩ：Ｃｂ１９５（０．２５μＭ）、Ｃｂ１９３（０．２５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）。
【０６２５】
図１４Ｂは、ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＢＷＸの加水分解が向上したことを示す。ＢＷＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、異なるヘミセルラーゼ混合物と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。種々のヘミセルラーゼ混合物を加水分解において用いた：混合物Ｉ：Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩ：Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩＩ：Ｃｂ１９５（０．２５μＭ）、Ｃｂ１９３（０．２５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）。
【０６２６】
図１４Ｃは、ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＯＳＸの加水分解が向上したことを示す。ＯＳＸ（８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、異なるヘミセルラーゼ混合物と共にインキュベートし、そして、還元糖アッセイに供した。種々のヘミセルラーゼ混合物を加水分解において用いた：混合物Ｉ：Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物ＩＩ：Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）；混合物Ｉ：Ｃｂ１９５（０．２５μＭ）、Ｃｂ１９３（０．２５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ９０９（０．５μＭ）、およびＣｂ１６２（０．５μＭ）。
【０６２７】
図１５は、Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによる可溶性コムギアラビノキシランの加水分解を示す。異なる濃度のＳＷＡＸ（１．０、２．０、４．０、６．０、８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ａ）は、コントロールおよび加水分解混合物における還元糖を示し、パート（Ｂ）は、異なる基質濃度での加水分解混合物における、計算上の還元糖と実際の還元糖の平均との比較を示す。
【０６２８】
図１６は、Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるカバ材キシランの加水分解を示す。異なる濃度のＢＷＸ（１．０、２．０、４．０、６．０、８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、７５℃で１５時間、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ａ）は、コントロールおよび加水分解混合物における還元糖を示し、パート（Ｂ）は、異なる基質濃度での加水分解混合物における、計算上の還元糖と実際の還元糖の平均との比較を示す。
【０６２９】
図１７は、Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるオートスペルトキシランの加水分解を示す。異なる濃度のＯＳＸ（１．０、２．０、４．０、６．０、８．０％、ｗ／ｖ）を、クエン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）内において、７５℃で１５時間、Ｃｂ１９３（０．５μＭ）、Ｃｂ１９５（０．５μＭ）、Ｃｂ１１７２（０．５μＭ）、Ｃｂ２４８７（４μＭ）、Ｃｂ１６２（０．５μＭ）、およびＣｂ９０９（０．５μＭ）と共にインキュベートし、還元糖アッセイに供した。パート（Ａ）は、コントロールおよび加水分解混合物における還元糖を示し、パート（Ｂ）は、異なる基質濃度での加水分解混合物における、計算上の還元糖と実際の還元糖の平均との比較を示す。
【０６３０】
＜実施例９：エンドセルラーゼ／マンナナーゼＣｂ１９５２＞
エンドセルラーゼ／マンナナーゼＣｂ１９５２を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ１９５２の遺伝子産物である。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー９触媒ドメイン（セルラーゼドメイン）、３つのファミリー３炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）（１つのＣＢＭ３ｃおよび２つのＣＢＭ３ｂモジュール）、および１つのＧＨ５触媒ドメイン（マンナナーゼドメイン）を有する（図１８）。
【０６３１】
シグナルペプチドを欠いた野生型Ｃｂ１９５２タンパク質、およびいくつかの短縮型変異体（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７）を、機能解析のために体系的に構築した（図１８）。
【０６３２】
図１８に示すように、ＴＭ１は、ＧＨ９モジュールおよび３つのＣＢＭを含み、ＴＭ２は、ＧＨ９モジュールおよび２つのＣＢＭを含み、ＴＭ３は、Ｇ９モジュールおよび１つのＣＢＭ（ＣＢＭ３ｃ）を含み、ＴＭ４は、ＧＨ９モジュールのみで構成されていた。短縮型変異体ＴＭ５は、ＧＨ５モジュールに結合した３つのＣＢＭによって構成されている一方、ＴＭ６およびＴＭ７は、それぞれ、ＣＢＭ３ｃおよびＣＢＭ３ｂによって構成されていた。図１９におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、全てのタンパク質構築物が、水溶性タンパク質としてうまく発現されかつ高い純度を有していたことを示す。
【０６３３】
（Ｃｂ１９５２野生型のクローニング）
Ｃｂ１９５２野生型遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiＤＳＭ６７２５ＴゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５２野生型遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
【０６３４】
Cb1952 wild-type Forward:  5’- GAC GAC GAC AAG ATG GCA ACA ACC TTT AACTAT GGT GAA GCT C -3’（配列番号３９）
Cb1952 wild-type Reverse:  5’- GA GGA GAA GCC CGG TTA TTC AGC ACC AAT CGC ATT AGT TTT ATA CC -3’（配列番号４０）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０６３５】
【表２５】
2014509836.tif 000027
【０６３６】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０６３７】
【表２６】
2014509836.tif 000028
【０６３８】
（Ｃｂ１９５２ＴＭ１のクローニング）
Ｃｂ１９５２ＴＭ１遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiＤＳＭ６７２５ＴゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５２ＴＭ１遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
【０６３９】
Cb1952TM1Forward:  5’- GAC GAC GAC AAG ATG GCA ACA ACC TTT AAC TAT GGT GAA GCT C -3’（配列番号４１）
Cb1952TM1Reverse:  5’- GAG GAG AAG CCC GGT TAG CTA GTA TCT ATC TTC ACT ATT CCA CTG -3’（配列番号４２）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０６４０】
【表２７】
2014509836.tif 000029
【０６４１】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０６４２】
【表２８】
2014509836.tif 000030
【０６４３】
（Ｃｂ１９５２ＴＭ５のクローニング）
Ｃｂ１９５２ＴＭ５遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor besciiＤＳＭ６７２５ＴゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５２ＴＭ５遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
【０６４４】
Cb1952TM5Forward: 5’- GAC GAC GAC AAG ATG A AT TTC AAA GCT ATC GAA AAG CCA AC -3’（配列番号４４）
Cb1952TM5Reverse: 5’- GA GGA GAA GCC CGG TTA TTC AGC ACC AAT CGC ATT AGT TTT ATA CC -3’（配列番号４０）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０６４５】
【表２９】
2014509836.tif 000031
【０６４６】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０６４７】
【表３０】
2014509836.tif 000032
【０６４８】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ１９５２野生型遺伝子、Ｃｂ１９５２ＴＭ１遺伝子、およびＣｂ１９５２ＴＭ２遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲルにおける、予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、ゲルからＤＮＡを抽出するため、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットにアプライした。
【０６４９】
精製したＤＮＡを処理するために、NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用い、精製したＤＮＡをｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０６５０】
【表３１】
2014509836.tif 000033
【０６５１】
反応の後、７５℃で２０分間インキュベートすることによって、酵素を失活させた。
【０６５２】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした。
【０６５３】
【表３２】
2014509836.tif 000034
【０６５４】
Ｃｂ１９５２野生型−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ、またはＣｂ１９５２ＴＭ５−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、化学的な形質転換法によって大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルに導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけるために、それぞれを用いた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養物から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確かめた後、遺伝子の配列を読み、その同一性を確かめた。正しい挿入配列を有するプラスミドを、組換えタンパク質の生産のために選んだ。
【０６５５】
Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ３、Ｃｂ１９５２ＴＭ４、Ｃｂ１９５２ＴＭ６およびＣｂ１９５２７を、適切に異なる工程（例えば、プライマー配列）を伴う、上述と同様の工程によって調製した。
【０６５６】
各酵素の発現のため、野生型、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、またはＴＭ７を含んでいるプラスミドを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した１０ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６時間培養した。１０ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した１０００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．３に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０６５７】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。Ｃｂ１９５２野生型では、次いで、ペレットを溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．８、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール、１．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した。Ｃｂ１９５２ＴＭ１では、次いで、ペレットを溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  イミダゾール、１．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した。他のＣｂ１９５２ＴＭ変異体では、次いで、ペレットをイミダゾールなしの溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライ、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、レジンから溶出した。
【０６５８】
ＰＣＲプライマーの設計によって、各タンパク質が、プラスミドにコードされた６−ヒスチジンにタンパク質が融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、レジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。全ての組換えタンパク質を、製造者の取扱説明書に従って、ＴＡＬＯＮレジン（Ｃｌｏｎｅｔｅｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。Ｃｂ１９５２野生型では、溶出タンパク質を、タンパク質保存バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に対して透析させた。熱に不安定な宿主のタンパク質の共溶出を容易にするために、タンパク質を７５℃で１０分、加熱して、１６，４００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。組換えタンパク質は、Ｈｉｌｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を備えたＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ  ＴＷＩＮ高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムを用いたゲル濾過によって、さらに精製した。Ｃｂ１９５２ＴＭ１では、溶出タンパク質を、タンパク質保存バッファーに対して透析させた。タンパク質は次いで、７５℃で１０分間加熱して、１６，４００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を、上述したゲル濾過によって、さらに精製した。他の変異体では、ＴＡＬＯＮレジンから溶出した組換えタンパク質は、均一に近い精製のため、直接ゲル濾過に供した。図１９は、精製したＣｂ１９５２タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０６５９】
（Ｃｂ１９５２ＷＴ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、およびＣｂ１９５２ＴＭ５の遺伝子およびタンパク質配列）
Ｃｂ１９５２の全長アミノ酸配列
全長のＣｂ１９５２エンドセルラーゼ／マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．４／ＥＣ３．２．１．７８）のアミノ酸配列は、配列番号４４に開示されている。配列番号４４のアミノ酸番号１〜２８に対応する、Ｃｂ１９５２のシグナルペプチドは、全てのＰＣＲ増幅の間に取り除かれた。それゆえ、発現した野生型Ｃｂ１９５２タンパク質は、配列番号４４のアミノ酸番号１〜２８を含んでいなかった。シグナルペプチドのないＣｂ１９５２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１４に開示されている。
【０６６０】
野生型Ｃｂ１９５２遺伝子（シグナルペプチドなし）をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを備えた野生型Ｃｂ１９５２アミノ酸配列（シグナルペプチドなし）は、配列番号５１に開示されている。短いペプチドのアミノ酸は、配列番号５１のアミノ酸１〜１４である。
【０６６１】
Ｃｂ１９５２の全長ヌクレオチド配列
全長Ｃｂ１９５２ヌクレオチド配列は、配列番号４５に開示されている。配列番号４５のヌクレオチド番号１〜８４に対応する、Ｃｂ１９５２のシグナルペプチドは、全てのＰＣＲ増幅の間に取り除かれた。それゆえ、野生型Ｃｂ１９５２タンパク質を発現させるために用いられるヌクレオチド配列は、配列番号４５のアミノ酸番号１〜８４を含んでいなかった。シグナルペプチドなしの野生型Ｃｂ１９５２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１５に開示されている。
【０６６２】
プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有する野生型Ｃｂ１９５２ヌクレオチド配列（シグナルペプチドなし）は、配列番号５０に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号５０のヌクレオチド１〜４２である。
【０６６３】
Ｃｂ１９５２ＴＭ１の全長アミノ酸配列
Ｃｂ１９５２ＴＭ１エンドセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）のアミノ酸配列は、配列番号４６に開示されている。Ｃｂ１９５２遺伝子ＴＭ１をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを備えたＣｂ１９５２ＴＭ１アミノ酸配列は、配列番号５３に開示されている。短いペプチドのアミノ酸は、配列番号５３のアミノ酸１〜１４である。
【０６６４】
Ｃｂ１９５２ＴＭ１のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９５２ＴＭ１ヌクレオチド配列は、配列番号４７に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有するＣｂ１９５２ＴＭ１ヌクレオチド配列は、配列番号５２に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号５２の核酸１〜４２である。
【０６６５】
Ｃｂ１９５２ＴＭ５の全長アミノ酸配列
Ｃｂ１９５２ＴＭ５のアミノ酸配列は、配列番号４８に開示されている。Ｃｂ１９５２遺伝子ＴＭ５をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを備えたＣｂ１９５２ＴＭ１アミノ酸配列は、配列番号５５に開示されている。短いペプチドのアミノ酸は、配列番号５５のアミノ酸１〜１４である。
【０６６６】
Ｃｂ１９５２ＴＭ５のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９５２ＴＭ５ヌクレオチド配列は、配列番号４９に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有するＣｂ１９５２ＴＭ１ヌクレオチド配列は、配列番号５４に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号５４の核酸１〜４２である。
【０６６７】
（酵素活性）
至適ｐＨ、至適温度、および熱安定性の決定
ＰＡＳＣを基質とした場合のＣｂ１９５２ＷＴ、ＴＭ１、ＴＭ２、およびＴＭ３の至適ｐＨは、ｐＨ５．０〜５．５の範囲にあり、これらのタンパク質の至適温度は、８５℃であった。ＴＭ４の場合、ＰＡＳＣに対する至適ｐＨおよび至適温度は、それぞれ６．５および５５℃であった。セルラーゼ活性を有する野生型および短縮型変異体において、熱安定性アッセイを行った。８０℃および８５℃では、２４時間インキュベートの後におけるＷＴ、ＴＭ１、およびＴＭ２の残存活性は２０％未満であったが、例外としてＴＭ３は６１．８％の活性を維持していた。７５℃では、２４時間のインキュベートする後におけるＷＴ、ＴＭ１、ＴＭ２、およびＴＭ３の残存活性は、それぞれ４３．１％、７５．７％、５３．６％、および１０１．７．％であった。ＣＢＭ３ｃの消失によって、酵素の熱安定性は劇的に低下した。短縮型変異体ＴＭ４は、４５℃および５０℃でも安定性を維持していたが、５５℃以上ではこの酵素は急激にその活性を失った（図８１Ｃ）。至適ｐＨおよび温度は、マンナン基質の加水分解についても決定した。野生型酵素では、マンナンの加水分解に対する至適ｐＨおよび温度は、それぞれ５．５〜６、５および９０℃であり、ＴＭ５では、値はそれぞれ６．５および９０℃であった（データは示さず）。
【０６６８】
Ｃｂ１９５２およびその変異体によるリン酸膨張セルロース、セロ多糖、およびマンノ多糖の加水分解
野生型Ｃｂ１９５２、ならびに、そのＴＭ１およびＴＭ５変異体（３つのＣＢＭと共にＧＨ９モジュールを有する変異体および３つのＣＢＭと共にＧＨ５モジュールを有する変異体である（図１８））の、ＰＡＳＣ加水分解に対する能力を、経時変化アプローチによって調べた。図７８のクロマトグラフに示すように、ほとんどがセロビオースおよびグルコースである産物の遊離が、野生型（Ａ）およびＧＨ９モジュールを含んでいるＴＭ１変異体（Ｂ）において観察された。ＴＭ５（Ｃ）（ＧＨ５モジュールを備えた構成）では、ＰＡＳＣの加水分解はほんのわずか検知されたか、またはまったく検知されなかった。セロ多糖の加水分解をさらに試験することによって、ＧＨ９モジュールにβ−１，４−グルコース切断活性が存在することが確認された（図２３）。マンノ多糖の加水分解では、野生型およびＴＭ５は、３以上の重合度（ＤＰ）の多糖の切断活性を示した（図２４）。興味深いことに、活性が野生型酵素およびＴＭ５変異体に比べて低かったにも関わらず、ＴＭ１もまた、５以上のＤＰの基質に対する活性を示した（図２４）。グルコース、セロ多糖、マンノース、およびマンノ多糖に対する野生型、ＴＭ１、およびＴＭ５によるグリコシル転移活性は認められなかった。
【０６６９】
セルロース性基質に対するＣｂ１９５２およびその変異体の活性および反応速度パラメータ
モデル結晶セルロースであるアビセルおよび濾紙を基質とした場合の、野生型タンパク質および各変異体の比活性を決定した。アビセルでは、個々のＣＢＭを除去すると、短縮型変異体（ＴＭ１、ＴＭ２、およびＴＭ３）の比活性が減少した（表１）。２つまたは１つのＣＢＭ３ｂを有する短縮型変異体（それぞれＴＭ１およびＴＭ２）では、ＷＴ酵素に比べて、比活性の減少はほんのわずかであった。それに対して、２つのＣＢＭ３ｂを除去すると、アビセルに対するＷＴタンパク質の半分未満の比活性のタンパク質が得られた。濾紙を基質とした場合の比活性にも同様の傾向がみられたが、活性減少の程度はより低かった（表１）。両方の基質において、ＧＨ９触媒モジュール単独からなる構築物は、アビセルおよび濾紙におけるＷＴタンパク質について観察された活性の、それぞれ３．８％および１６．２％の活性のみを有していた。
【０６７０】
【表３３】
2014509836.tif 000035
【０６７１】
ＷＴタンパク質およびその変異体の反応速度パラメータを試験するため、アビセル由来のリン酸膨張セルロースを用いた（表１）。ＷＴについて見積もられたｋｃａｔ（２．５８ｓ−１）およびその短縮型変異体について見積もられたｋｃａｔ（２．１２〜３．０９ｓ−１）は、非常に小さかった。興味深いことに、ＴＭ１は、野生型に比べて２倍より大きい触媒効率を示した。これは、ＧＨ９およびＧＨ５モジュールの触媒活性が機能的に共役していることを示唆している。同様の、単一ポリペプチド内の異なる触媒モジュールの機能的共役は、別の植物細胞璧分解酵素Prevotella ruminicolaＸｙｎ１０Ｄ−Ｆａｅ１９（９）、深海二枚貝Calyptogena kaikoi由来の２ドメインアルギニンキナーゼ（４０）、およびChaetopterus variopedatus由来の繊毛クレアチンキナーゼ（１３）においても提唱されていた。ＧＨ９モジュールのみを有するタンパク質であるＴＭ４の反応速度パラメータは、ＣＢＭに結合したタンパク質に比べて非常に小さかった。このことは、Ｃｂ１９５２の機能に対するこれらの補助モジュールの重要性を示唆している。
【０６７２】
マンナン様基質に対するＣｂ１９５２およびその変異体の活性および反応速度パラメータ
マンナン様基質に対するＣｂ１９５２およびその変異体の活性も、同様に調べた。試した基質は、ローカストビーンガム、グアーガム、およびコンニャクグルコマンナンであった。野生型酵素は、試した全てのマンノース型基質に対して、非常に高いｋｃａｔを示した。ローカストビーンガム、グアーガム、およびコンニャクグルコマンナンにおいて、ｋｃａｔ値はそれぞれ１４２０ｓ−１、１０６８ｓ−１、および６９６ｓ−１であった（表２）。表２のデータに基づくと、マンナンおよびマンノース構成基質を分解する触媒活性は、ＧＨ５モジュールに位置する。ポリペプチドからＧＨ９モジュールを切断してＴＭ５変異体を作製することによって、この変異体のｋｃａｔが、野生型に比べて、ローカストビーンガム、グアーガム、およびコンニャクグルコマンナンについて、それぞれ、２．４倍、２．８倍、１．６倍に上昇することが観察された。なお、グアーガムでは、ｋｃａｔの標準誤差が非常に大きかった。各マンノース構成基質におけるＴＭ５のＫｍの対応する上昇によって、触媒効率が、野生型タンパク質について決定された触媒効率よりも低くなった。３つ全てのＣＢＭに加えてＧＨ９触媒モジュールを有する短縮型変異体（ＴＭ１）、またはＣＢＭ３ｃのみに加えてＧＨ９触媒モジュールを有する短縮型変異体（ＴＭ３）は、ローカストビーンガムおよびグアーガムに対してほとんど活性を有していなかった。しかしながら、これらの変異体は、コンニャクグルコマンナンに対しては、非常に高い活性を示した。
【０６７３】
【表３４】
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【０６７４】
部位特異的突然変異誘発
ＧＨ９モジュールの構造的多様性は、テーマＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤとして知られる４つの異なるグループに割り当てられてきた（１９）。Ｃｂ１９５２では、ＧＨ９触媒モジュールはＣ末端において、補助的なＣＢＭ３ｃと結合しており、これはテーマＢ１のメンバーの構造である。テーマＢ１では、プロセッシブ型エンドグルカナーゼ（７、１２、３４）および非プロセッシブ型エンドグルカナーゼ（２、１０）が存在する。セルラーゼで加水分解された濾紙の可溶性画分および不溶性画分における還元末端の分布は、セルラーゼのプロセッシブ性を見積もるために一般的に用いられる（１７）。そのような実験に基づく我々の結果は、Ｃｂ１９５２およびその短縮型変異体（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、およびＴＭ４）の末端産物が４０％〜５０％の不溶性還元末端を含んでいたため、これらが、プロセッシブ型ＧＨ９触媒モジュールを有しないことを明らかにした（表３）。
【０６７５】
【表３５】
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【０６７６】
Ｃｂ１９５２のＧＨ９ドメインと、Clostridium cellulolyticumＣｅｌ９Ｇ（非プロセッシブ型エンドグルカナーゼ）およびThermobifida fuscaＣｅｌ９Ａ（プロセッシブ型エンドグルカナーゼ）のＧＨ９ドメインとのアミノ酸配列アラインメントを試験した。これらのC.cellulolyticumタンパク質およびT.fuscaタンパク質は、酵素−セロ多糖共結晶の構造が解明された（２６、３４）、２つのタイプのファミリー９テーマＢ１エンドグルカナーゼを代表する。アミノ酸配列アラインメントによって、セルラーゼ基質の結合に関連する残基のほとんどが、Ｃｂ１９５２のＧＨ９モジュールによく保存されていることが示された（図７９）。しかしながら、サブサイト−３における疎水性スタッキングに寄与する２つの芳香族残基（T.fuscaではＴｒｐ−２０９、C.cellulolyticumではＰｈｅ−３０８）は何れも、Ｃｂ１９５２には存在しなかった。基質との疎水性スタッキング相互作用に関わる芳香族残基は、結晶性基質の加水分解中における酵素のプロセッシブ性に寄与するため、我々は、Ｇｌｙ−２０８をＴｒｐ−２０８に変えることによって、または、Ｇｌｙ−２０８の前にトリプトファンを挿入することによって、Ｃｂ１９５２ＴＭ３における対応するアミノ酸残基を芳香族残基に置換して、ＴＭ３Ｇ２０８ＷおよびＴＭ３Ｇ２０８ＷＧ変異体をそれぞれ得た。これらの変異体は、T.fuscaの酵素を模倣するものであった。加えて、Ｔ−２９８をＰｈｅ−２９８に変えることによって、ＴＭ３Ｔ２９８Ｆ変異体も得た。これは、C.cellulolyticum酵素を模倣するものであった。
【０６７７】
円偏光二色性（ＣＤ）スキャンによって明らかにされたように、３つの変異体の二次構造は、Ｃｂ１９５２ＴＭ３と比べた、いかなる全体的な違いも示さなかった（表４）。これは、変異が、Ｃｂ１９５２ＴＭ３と比べたタンパク質の二次構造要素における全体的な変化をもたらさなかったことを示唆している。タンパク質（ＴＭ３）に比べて、アビセルおよび濾紙に対する３つの変異体の比活性は異ならなかった（表１）。可溶性還元末端と不溶性還元末端との比率に変わりがなかったことから、変異は、ＴＭ３をプロセッシブ型エンドグルカナーゼに改変する手助けにはならなかった（表３）。ＰＡＳＣを基質とした場合の変異体のｋｃａｔ値は、２倍に上昇した。しかしながら、Ｋｍ値も上昇したため、触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）はＣｂ１９５２ＴＭ３のものと同様のままであった（表１）。
【０６７８】
【表３６】
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【０６７９】
予想外なことに、ローカストビーンガムおよびグアーガムを基質とした場合のＴＭ３Ｇ２０８ＷＧのｋｃａｔ値は、ＴＭ３について決定された値に比べて１５倍および１００倍に上昇した（表２）。さらに、ローカストビーンガムおよびグアーガムに対するこの変異体の触媒効率も、それぞれ３４倍および１０倍に上昇した（表２）。ＴＭ３短縮型変異体の部位特異的突然変異誘発によっても、コンニャクグルコマンナンにおけるＴＭ３短縮型変異体のｋｃａｔが２倍またはそれ以上に上昇した（表２）。
【０６８０】
不溶性セルロース基質へのＣｂ１９５２の結合
３つ全てのＣＢＭ（１つのＣＢＭ３ｃおよび２つのＣＢＭ３ｂ）を有するＣｂ１９５２野生型、ＴＭ１、およびＴＭ５は、アビセル（図８０Ａ）およびＰＡＳＣ（図８０Ｂ）に強く結合した。ＣＢＭ３ｃおよび１つのＣＢＭ３ｂを有する短縮型変異体ＴＭ２もまた、２つのセルロース性基質に強く結合した。ＧＨ９モジュールおよびＣＢＭ３ｃからなるＴＭ３の、不溶性セルロースに対する結合は、野生型、ＴＭ１、ＴＭ２、およびＴＭ５に比べて弱かった（図８０Ａ、Ｂ）。減損結合等温式を用いて、ＴＭ３のアビセルに対する解離定数および最大結合能を、それぞれ０．５２±０．２０Ｍ−１および４２３．９±５０．７ｎｍｏｌタンパク質／ｇアビセルであると見積もった。ＴＭ３の２つの構成要素、すなわちＧＨ９モジュールおよびＣＢＭ３ｃが、不溶性セルロースに弱く結合することが観察された（図８０Ａ、Ｂ）。ＣｂＣｅｌ９ＡＭａｎ５Ｂ（ＴＭ６）のＣＢＭ３ｃの、不溶性セルロースに対する結合は期待されなかった。この方法によって特徴付けられる他のＣＢＭ３ｃおいてこの結合がみられなかったからである（７、１０、１２、１６）。しかしながら、結合は弱かったため、ＧＨ９およびＣＢＭ３ｃモジュールのアビセルに対する結合定数を得る妨げとなった。ＣＢＭ３ｂ（ＴＭ７）もまた、結合定数は決められなかったが、アビセルおよびＰＡＳＣに結合した（図８０Ａ、Ｂ）。
【０６８１】
Ｃｂ１９５２ポリペプチドに用いた方法
Ｃｂ１９５２ポリペプチドに対する上記の実験に用いた方法は、次のものを含んでいる：
至適ｐＨおよび温度の決定：Ｃｂ１９５２のｐＨプロファイリングのために、２つのバッファーを用いた：５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０）および５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭである。セルロース基質に対する酵素の至適ｐＨを決定するために、０．５μＭのＣｂ１９５２野生型またはその短縮型変異体を、７５℃かつ規定のｐＨの各バッファー中、２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共にインキュベートし、１０分間のアッセイにおける活性を測定した。遊離した還元糖を、ｐＰＢＡＨアッセイを用いて測定した。至適温度を決定するために、０．５ｍＭの各酵素を、４０℃〜９０との温度の間で５℃間隔で、２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共にｐＨ５．５でインキュベートした。マンノース活性における至適ｐＨおよび温度は、基質としてＰＡＳＣをマンナンに変え、かつ、酵素濃度を１２．５ｎＭに変えた上で、上述した通りに決定した。
【０６８２】
酵素アッセイ：アビセルおよび濾紙に対するＣｂ１９５２野生型およびその変異体の比活性を、酵素に対して最適なバッファー中、７５℃で決定した。各タンパク質の酵素濃度は、ＴＭ４（５μＭ）を除き、０．３μＭであった。９０分間のアッセイにおける異なる時間間隔においてサンプルを取り出し、遊離した産物を、反応混合物に存在する還元末端の量として決定した。比活性を、還元糖と時間との関係が直線である領域において、決定した。
【０６８３】
ＰＡＳＣ、ローカストビーンガム、グアーガム、およびコンニャクグルコマンナンに対するＣｂ１９５２野生型およびその変異体の反応速度を、３０分間のアッセイにおいて決定した。異なる濃度の酵素を、７５℃で、一定範囲の濃度の基質と共にインキュベートした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０１ソフトウェア（ＧｒａｐＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、還元末端の遊離速度を決定し、基質の濃度に対してプロットして、反応速度パラメータを見積もった。
【０６８４】
リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）の加水分解の経時変化：２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを、０．５μＭのＣｂ１９５２ＷＴ、ＴＭ１、およびＴＭ５と共に、７５℃でインキュベートした。異なる時間間隔（０分、２分、１０分、６０分、４時間、および２４時間）において、サンプルを取り出して、先に記述したとおり（２９）、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析に供した。
【０６８５】
オリゴ糖の加水分解およびグリコシル転移活性の分析：最終濃度が各１ｍｇ／ｍｌのグルコース、セロ多糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオース）、マンノース、およびマンノ多糖（マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオース、およびマンノヘキサオース）を、０．１μＭのＣｂ１９５２野生型、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、およびＣｂ１９５２ＴＭ５と共に、クエン酸バッファー（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中、７５℃で１４時間、インキュベートした。反応液の全量は４０μｌであった。反応産物を、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いて乾燥させ、３．５μｌのＨ２Ｏに溶かし、１μｌの産物を、２５０μｍの厚さのＷｈａｔｍａｎシリカゲル６０Ａ（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いた薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。ＴＬＣ法は、我々の以前の報告に記載されているものと同様である（２９）。
【０６８６】
熱安定性アッセイ：セルラーゼ活性を有するＣｂ１９５２およびその短縮型変異体の熱安定性を、Ｖｅｒｉｔｉ９６−ｗｅｌｌサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カールスバッド、ＣＡ）において、酵素を７５℃、８０℃、および８５℃（ＷＴ、ＴＭ１、ＴＭ２、およびＴＭ３）でインキュベートすることによって、または、４５℃、５０℃、および５５℃（ＴＭ４）でインキュベートすることによって、決定した。異なる時点において、反応混合物から一部を取り出し、ＰＡＳＣを基質とした場合の残存酵素活性を決定した。
【０６８７】
部位特異的突然変異誘発および円偏光二色性：部位特異的突然変異誘発のため、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、製造者の取扱説明書に従って用いた。Ｃｂ１９５２ＴＭ３をコードする１００ｎｇのプラスミドを、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。反応混合物は、１００ｎｇの突然変異プライマー、１μｌのｄＮＴＰ混合物、０．７５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ、および１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｉｔｌ酵素混合物を含んでいた。突然変異のために用いた突然変異プライマーのヌクレオチド配列を、補足表１に示す。ＰＣＲ増幅工程を、次のように行った：最初の変性を９５℃で１分間行い、次いで９５℃で１分間、５５℃で１分間、および６５℃で１５分間の３０サイクルを行った。親プラスミドＤＮＡを分解するために、ＰＣＲ産物を、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、３７℃で４時間消化した。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（ＢｉｏＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いたＪＭ１０９コンピテントセルの電気的形質転換に、ＤｐｎＩ消化からの産物を用いた。大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んでいるＬＢプレート上にプレーティングして、３７℃で一晩、インキュベートした。シングルコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した７ｍｌのＬＢ培地に植え付け、１０時間培養した。組換え大腸菌細胞からプラスミドを抽出し、インサートの配列を読み（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ比較機能遺伝学センター、ＵＩＵＣ）、所望の変異の存在を確かめた。変異体タンパク質の円偏向二色性スキャンを、我々の以前の報告に記載した通りに行った。
【０６８８】
加水分解した濾紙の可溶性画分および不溶性画分における還元糖の測定：濾紙の加水分解産物の可溶性画分および不溶性画分における還元糖を、Ｉｒｗｉｎら（１７）によって記述された通りに決定した。Ｃｂ１９５２野生型およびその変異体（各０．５μＭ、ただしＴＭ４は１．０μＭ）を、ＷｈａｔＭａｎ  Ｎｏ．１濾紙（直径０．６ｃｍ）の５つのプレート共に、２００μｌのクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）内において、７５℃（ただしＴＭ４は低い熱安定性を有するので、ＴＭ４では４５℃）でインキュベートした。混合物を、１６時間、往復振とうした。反応産物を遠心分離し、上清（可溶性画分）を、還元末端の量について分析した。不溶性画分における還元糖の決定のため、濾紙をまず、それぞれ１ｍｌのクエン酸バッファーで４回洗浄した。２００μｌのクエン酸バッファーを次いで、不溶性画分（沈殿した濾紙）に添加した。続けて、ｐＨＢＡＨ法によって還元末端についてアッセイを行った。
【０６８９】
Ｃｂ１９５２野生型およびその短縮型変異体の、セルロースへの結合：各ポリペプチドのセルロースへの結合能力の定性的測定するために、３０μｇのＣｂ１９５２野生型およびその変異体を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭの  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中、４０ｍｇ／ｍｌのアビセルセルロースまたは２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣと共にインキュベートした。混合物を、４℃で１時間、往復振とうした。次いで、１６，４００ｒｐｍにおいて混合物を３分間遠心分離することによって、結合したタンパク質および結合していないタンパク質を分離した。セルロースペレットを、１ｍｌのバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で４回洗浄した。７０μｇの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーをペレットに添加し、５分間煮沸して、結合したタンパク質を遊離させた。上清の１／１０の体積に存在するタンパク質（結合していないタンパク質）およびセルロースペレットに存在するタンパク質（結合したタンパク質）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。
【０６９０】
定量的結合アッセイのため、異なる濃度のタンパク質を、２ｍｌチューブ内の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファー内において、２ｍｇ／ｍｌのアビセルに混合した。コントロールとして、同じ濃度のタンパク質を、チューブ内において、アビセルなしでインキュベートした。４℃において１．５時間、往復させながらインキュベートした後、混合物を３分間、１６，４００で遠心分離した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、上清におけるタンパク質濃度を決定した。セルロースなしのチューブからのタンパク質濃度を全タンパク質として、結合したタンパク質の濃度を、全タンパク質濃度から、セルロースありのサンプルのタンパク質濃度を除算することによって、決定した。結合パラメータを決定するために、我々の以前の報告（４６）に記述したミカエリス／ラングミュア方程式（ｑａｄ／ｑ＝Ｋｐ×ｑｍａｘ／（１＋Ｋｐ×ｑ））を用いた。方程式におけるｑａｄは、結合したタンパク質の量（タンパク質（ｎｍｏｌ）／アビセル（ｇ））を表す。ｑは、フリーのタンパク質（μＭ）であり、そしてｑｍａｘはアビセルに結合したタンパク質の最大量である。結合パラメータ算出は、Ｇｒａｐｈａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０１を用いて行った。
【０６９１】
アミノ酸配列アラインメント：Clostridium cellulolyticumＣｅｌ９Ｇ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ７３８６８）（２６）のファミリー９グリコシドヒドロラーゼ触媒モジュールのアミノ酸配列、および、Thermobifida fuscaＣｅｌ９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡＢ４２１５５）（３４）のファミリー９グリコシドヒドロラーゼ触媒モジュールのアミノ酸配列を、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅデータベースおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースから取得し、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて、Ｃｂ１９５２のＧＨ９配列とアラインメントした。同様に、公知文献における別のバクテリア源の特徴付けされたセルラーゼに由来するＣＢＭ３ｃモジュールのアミノ酸配列もアラインメントした。これらには次のものが含まれる：ＡＤＱ４５７３１：Caldicellulosiruptor kronotskyensisの推定セルラーゼ；ＡＢＰ６６６９３：Caldicellulosiruptor saccharolyticusの推定セルラーゼ；ＡＤＬ４２９５０:Caldicellulosiruptor obsidiansisの推定セルラーゼ／マンナンエンド−１，４−β−マンノシダーゼ；ＡＡＫ０６３９４：Caldicellulosiruptor sp.Tok7B.1のＣｅｌＥ（１１）；ＡＡＡ７３８６８:Clostridium cellulolyticumのＣｅｌ９Ｇ（２６）；ＡＡＣ３８５７２：Clostridium cellulovoransのＥｎｇＨ（３８）；ＣＡＡ３９０１０：Clostridium stercorariumのＣｅｌ９Ｚ（１８）；ＡＢＸ４３７２０：Clostridium phytofermentansのＣｅｌ９（３９、４８）；ＡＢＮ５１８６０：Clostridium thermocellumＤＳＭ１３１３のＣｅｌ９Ｉ（５０）；ＣＡＢ３８９４１:Paenibacillus barcinonensisnのＣｅｌ９Ｂ（３２）；ＢＡＢ３３１４８：Clostridium thermocellum F1のＣｅｌＱ（２）；ＡＡＡ２３０８６：Cellulomonas fimiのＣｅｎＢ（２７）；ＡＡＷ６２３７６：Cellulomonas flavigenaのＣＢＰ１０５（２８）；ＡＡＢ４２１５５：Thermobifida fuscaのＣｅｌ９Ａ（１６、３４）。アラインメントした配列は、ＢＯＸＳＨＡＤＥ３．２１を用いて、配列パラメータの比をデフォルト設定の０．５にして解析した。
【０６９２】
追加的なアッセイ
図２０は、還元糖アッセイからの、天然基質に対するＣｂ１９５２野生型の酵素活性を示す。１２の異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、リケニン、マンナン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、コンニャクグルコマンナン（ＫＧＭ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、およびキシログルカンを用いた。酵素を、アビセル、ＰＡＳＣ、ＣＭＣ−Ｎａ、リケニン、マンナン、ＬＢＧ、グアーガム、ＫＧＭ、ＷＡＸ、およびＯＳＸ基質と共にインキュベートすると、グルコース同等物として定量化される産物が遊離した。Ｃｂ１９５２野生型は、主にグルコース構成基質およびマンノース構成基質を加水分解するが、キシロース構成基質は加水分解しない。
【０６９３】
図２１は、還元糖アッセイからの、天然基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ１の酵素活性を示す。１２の異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、リケニン、マンナン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、コンニャクグルコマンナン（ＫＧＭ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、およびキシログルカンを用いた。酵素を、アビセル、ＰＡＳＣ、ＣＭＣ−Ｎａ、リケニン、マンナン、ＬＢＧ、グアーガム、ＫＧＭ、ＷＡＸ、ＢＷＸ、ＯＳＸ、およびキシログルカン基質と共にインキュベートすると、グルコース同等物として定量化される産物が遊離した。この結果は、Ｃｂ１９５２ＴＭ１が、主にグルコース構成基質を加水分解することを示す。Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、また、マンノース構成基質に対しても、ある程度の活性を有する。Ｃｂ１９５２ＴＭ１のキシロース構成基質に対する活性は低かった。
【０６９４】
図２２は、還元糖アッセイからの、天然基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性を示す。１２の異なる基質を試した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、リケニン、マンナン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、コンニャクグルコマンナン（ＫＧＭ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、カバ材キシラン（ＢＷＸ）、オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）、およびキシログルカンを用いた。酵素を、ＣＭＣ−Ｎａ、リケニン、マンナン、ＬＢＧ、グアーガム、およびＫＧＭ基質と共にインキュベートすると、マンノース同等物として定量化される産物が遊離した。Ｃｂ１９５２ＴＭ５は、主にマンノース構成基質を加水分解するが、グルコース構成基質およびキシロース構成基質に対する明らかな活性は有しない。
【０６９５】
図２３は、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）からの、Ｃｂ１９５２野生型、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、およびＣｂ１９５２ＴＭ５の、グルコースおよびセロオリゴ糖に対する酵素活性を示す。グルコースおよび異なる５つのセロオリゴ糖を用いた：セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオース。Ｃｂ１９５２野生型およびＣｂ１９５２ＴＭ１は、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオースを、グルコースおよびセロビオースに加水分解するが、セロビオースに対しては活性を有しない。Ｃｂ１９５２ＴＭ５は、グルコースおよび試した何れのセロオリゴ糖に対しても活性を有しない。何れの酵素もグルコースおよびセロオリゴ糖に対するグリコシル転移活性を有しない。
【０６９６】
図２４は、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）からの、Ｃｂ１９５２野生型、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、およびＣｂ１９５２ＴＭ５のマンノースおよびマンノオリゴ糖に対する酵素活性を示す。マンノースおよび異なる５つのマンノオリゴ糖を用いた：マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオース、およびマンノヘキサオース。Ｃｂ１９５２野生型およびＣｂ１９５２ＴＭ５は、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオース、およびマンノヘキサオースを、マンノースおよびマンノビオースに加水分解するが、マンノビオースに対しては活性を有しない。Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、マンノペンタオースおよびマンノヘキサオースを、より小さいマンノオリゴ糖に加水分解するが、マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、およびマンノペンタオースに対する加水分解活性を有しない。何れの酵素も、マンノースおよびマンノオリゴ糖に対するグリコシル転移活性を有しない。
【０６９７】
天然多糖の酵素的加水分解の後、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（A new reaction for colorimetric determination carbohydrates. Anal. Biochem. 1972: 47; 273-279）に従って、グルコースおよびマンノース同等物の濃度を決定した。１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、２±０．１ｍｇのアビセルまたはマンナンを、各チューブに添加し、重量を測定して記録した。各チューブに添加する必要がある体積は、重量に基づき算出した。ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣでは、ＣＭＣ−Ｎａ（２％）およびＰＡＳＣ（６．１１ｍｇ／ｍｌ）の基質ストック溶液を用いた。リケニン、ＫＧＭ、ＷＡＸ、ＢＷＸ、ＯＳＸおよびキシログルカンでは、２％ストック溶液を用いた。ＬＢＧおよびグアーガムでは、０．５％ストック溶液を用いた。反応バッファーをはじめとして、クエン酸ナトリウム反応バッファーおよび酵素を、各チューブに添加した。チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内において、７５℃で１６時間、連続的に混合しながらインキュベートした。チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。５０μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬ遠心チューブに移した。１ｍＬのグルコースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が１００ｍＭになるように作製し、次の各濃度（２０ｍＭ、１０ｍＭ、および５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１５０μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、５０μＬのサンプルおよびグルコース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルについて、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍとグルコース濃度とを、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。
【０６９８】
図２５は、ＨＰＬＣ分析を用いたセルロース基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ１の酵素活性を示す。３つの異なる基質を試した：アビセル、ＣＭＣ−Ｎａ、およびＰＡＳＣ。それぞれの場合において、Ｃｂ１９５２ＴＭ１の存在下では、グルコースおよびセロビオースが遊離した。Ｃｂ１９５２ＴＭ１の非存在下では、全ての基質について、グルコースおよびセロビオースの遊離は観察されなかった。この結果は、酵素のこの部分またポリペプチドが、セルロース性基質（アビセル、ＣＭＣ−Ｎａ、およびＰＡＳＣ）から、グルコースおよびセロビオースを、最終産物として切断することを示すものであった。
【０６９９】
図２６は、Ｃｂ１９５２ＴＭ１によるＰＡＳＣの経時的な加水分解を示す。１００ｎＭのＣｂ１９５２ＴＭ１を、２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣ共に、７５℃でインキュベートした。異なる時間間隔（０、０．５分、２分、１０分、１時間、４時間、および２４時間）において、サンプルを取り出し、直ちに１０分間煮沸して、酵素を失活させた。遠心分離の後、サンプルの上清を水で適当に希釈して、ＨＰＬＣ分析にアプライした。結果は、Ｃｂ１９５２ＴＭ１が最初にグルコース、セロビオース、セロトリオース、およびセロテトラオースを遊離させることを示す。時間がより経過すると、反応混合物にはグルコースおよびセロビオースのみが残った。
【０７００】
図２７は、活性測定の基質としてＰＡＳＣを用いた場合のＣｂ１９５２野生型の熱安定性を示す。Ｃｂ１９５２野生型は、７０℃、７５℃、８０℃、および８５℃での２４時間のインキュベートの後、それぞれ７５％、４３％、１７％、および１２％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ１９５２野生型を、異なる温度（７０℃、７５℃、８０℃、および８５℃）に保持した。サンプルを異なる時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、および２４時間）で取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。酵素活性は、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５かつ８５℃で測定した。最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを測定に用いた。８．３１μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。グルコース同等物に相当する還元末端を、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（上掲）に従って測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０７０１】
図２８は、活性測定に基質としてＰＡＳＣを用いた場合のＣｂ１９５２ＴＭ１の熱安定性を示す。Ｃｂ１９５２ＴＭ１は、７０℃、７５℃、８０℃、および８５℃での２４時間のインキュベートの後、それぞれ９４％、７６％、１８％、および１３％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ１９５２ＴＭ１を、異なる温度（７０℃、７５℃、８０℃、および８５℃）に保持した。サンプルを異なる時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、および２４時間）で取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。酵素活性は、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５かつ８５℃で測定した。最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌのＰＡＳＣを測定に用いた。８．３１μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。グルコース同等物に相当する還元末端を、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（上掲）に従って測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０７０２】
Ｃｂ１９５２ポリペプチドの結果に関する考察
Ｃｂ１９５２は、ＧＨ９−ＣＢＭ３ｃモジュールに結合する２つのタンデム型ＣＢＭ３ｂによって特徴付けられた、最初のＧＨ９セルラーゼである。ＣＢＭ３ｂモジュール（ＴＭ７）は、不溶性セルロースに結合する（図８０ＡおよびＢ）。ＴＭ１から１つのＣＢＭ３ｂを除去しても（ＴＭ２）、これらの基質に対する結合に顕著な影響はなかった（図８０ＡおよびＢ）。したがって、ＴＭ１およびＴＭ２の比活性および反応パラメータは、セルロース基質について類似している（表１）。他のＣＢＭ３ｂをさらに除去すると（ＴＭ３）、不溶性基質に対する結合と、アビセルおよび濾紙についての比活性との両方が減少した（表１）。したがって、ＣＢＭ３ｂモジュールは、Ｃｂ１９５２による結晶セルロースの分解を容易にする。
【０７０３】
Ｃｂ１９５２およびその短縮型変異体、特にはＴＭ３、は７５℃で２４時間インキュベートした後でも、顕著な活性を維持した。他の超好熱性エンドグルカナーゼについては、Thermoanaerobacter tengcongensisのＣｅｌ５Ａは、６０℃で２４時間インキュベートした後、８０％を超える残存活性を有し（２４）、Clostridium stercorariumのアビセラーゼＩは、８０℃で１２時間インキュベートした後、６０％を超える残存活性を有し（６）、そして、Caldicellulosiruptor saccharolyticusのＣｅｌＢは、７０℃で２９時間の半減期を有する（３５）。多機能酵素の熱安定性プロファイルによって、セルロース性基質から発酵性糖を遊離することに多機能酵素を用いる間のリサイクルを容易にすることができる。セルロースからのエタノール生産に酵素リサイクル工程を導入することによって、付加価値のある産物の生産コストを劇的に下げることができる。
【０７０４】
C.besciiＣｂ１９５４（ＣｅｌＡ）（ＯＲＦ１９５４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＣＭ６０９５５）は、このバクテリアから明らかになった最初のセルラーゼである（４９）。これは、C.besciiがアビセル培地において増殖するときに最も多く分泌されるセルラーゼである（２５）。Ｃｂ１９５４は、Ｃｂ１９５２に類似するが一致しているわけではなく、Ｎ末端に位置するＧＨ９モジュール、Ｃ末端に位置するＧＨ４８モジュール、およびこれら２つの触媒ドメインの間にある３つのＣＢＭ３モジュールによって構成されている。アビセルに対するＣｂ１９５２の比活性（１０．１５μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）は、全長Ｃｂ１９５４／ＣｅｌＡのそれ（５５．０μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）と比べて非常に低かったが、ＧＨ９触媒モジュールおよびＣＢＭを含んでいる短縮型変異体ＣｅｌＡ’の比活性（１８．０μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）に比べるとわずかに低いだけであった（４９）。他の超好熱性エンドグルカナーゼに比べると、Ｃｂ１９５２のこの比活性は、Thermoanaerobacter tengcongensisのＣｅｌ５Ａの比活性（６０．０μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（２４）および、Clostridium stercorariumのアビセラーゼＩの比活性（３０．２μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（６）よりも低く、Pyrococcus horikoshiiのＥＧＰｈの比活性（１２．７μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（１）に匹敵するが、しかしC.saccharolyticusのＣｅｌＢの比活性（１２．７μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（４１）に比べると非常に高かった。濾紙に対するＣｂ１９５２の比活性は、Thermotoga neapolitanaのＣｅｌＢの比活性（２０．８μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（５）、Thermoanaerobacter tengcongensisのＣｅｌ５Ａの比活性（１８．５μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（２４）、およびPyrococcus furiousのＥｇｌＡの比活性（１８．７μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（３）に並ぶが、Thermotoga neapolitanaのＣｅｌＡの比活性（３．２μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（５）およびC.saccharolyticusのＣｅｌＢの比活性（１．８μｍｏｌ糖／分／μｍｏｌ酵素）（４１）に比べると非常に高かった。なお、これらの比活性に対するアッセイ条件（反応温度、バッファー、反応時間、還元糖の測定方法、および実験室設備）は、上述した酵素間で異なり得る。それにも関わらず、Ｃｂ１９５２は、セルロース基質から発酵性糖を高温において遊離する効果的な酵素である。
【０７０５】
興味深いことに、Ｃｂ１９５２をコードする遺伝子が位置する遺伝子クラスター内の９つの遺伝子のうちの７つの遺伝子もまた、Ｃｂ１９５２のＣＢＭ３ｂと一致するかまたは非常に類似したＣＢＭ３ｂモジュール（一致率は９８％を超える）を含んでいる。遺伝子クラスター内の６つのポリペプチドは、２つまたは３つの繰り返しタンデム型ＣＢＭ３ｂを有する。これらのＣＢＭ３ｂモジュールが、植物細胞壁の加水分解を手助けすると推定することは、合理的である。
【０７０６】
Ｃｂ１９５２のマンナナーゼ活性は、主に、ＧＨ５モジュールにある；しかしながら、限定的なマンナナーゼ活性が、ＧＨ９モジュールを触媒モジュールとして含んでいる構築物においても観察された。大半の場合、ファミリー９グリコシドヒドロラーゼは、エンドグルカナーゼ（１０、１６）、セロビオヒドロラーゼ（３６）、１，４−β−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ（３３）、β−グルコシダーゼ（３０）、およびエキソ−β−グルコサミニダーゼ（１４）と説明される。Bacillus licheniformisのＣｅｌ９は、このファミリーのうち、マンナナーゼ活性を有することが報告された唯一のメンバーである（４２）；しかしながら、マンノース構成基質に対するその反応速度データおよび加水分解パターンは未知である。ＧＨ９が、最小で５つの鎖長を必要とし、最短の最終産物としてマンノビオースを遊離した一方、ＧＨ５は、最小で３つの鎖長を必要とし、最短の最終産物としてマンノースを遊離した点において、Ｃｂ１９５２のＴＭ１変異体は、ＴＭ５変異体に比べて異なる加水分解パターンを示した。Ｃｂ１９５２のＧＨ９モジュールにおけるマンノース構成基質を加水分解する能力は、触媒モジュールが、グルコースのエクアトリアルなＣ−２ヒドロキシルを収容することと、マンノースのアキシャルなＣ−２ヒドロキシルを許容することとの両方が可能であることを示唆している。
【０７０７】
−３サブサイト疎水性相互作用にトリプトファンが存在しないことは、ＧＨ９セルラーゼのプロセッシブ性を阻害し得る非生産的な結合を不安定にすることが、提案された（３１）。しかしながら、Ｇ２０８およびＴ２９８に芳香族残基を挿入する変異（ＴＭ３Ｇ２０８ＷＧ、ＴＭ３Ｇ２０８Ｗ、およびＴＭ３Ｔ２９８Ｆ）は、可溶性還元末端と不溶性還元末端との比率に変わりがないこととして表されるように、ＴＭの３プロセッシブ性を変えなかった。結晶セルロース（アビセルおよび濾紙）における変異体の比活性もまた、元のＴＭ３のものに匹敵した。しかしながら、非結晶ＰＡＳＣでは、変異体の全てのターンオーバー数は、約２倍に向上する一方で、触媒効率は変わらなかった。結晶セルロースと非結晶セルロースとの構造の違いが、これらの酵素のパフォーマンスに影響した可能性がある。変異体の１つであるＴＭ３Ｇ２０８ＷＧでは、ローカストビーンガムに対する基質特異性が３５倍に増加した（ＴＭ３：［ｋｃａｔ／Ｋｍ］ＬＢＧ／［ｋｃａｔ／Ｋｍ］ＰＡＳＣ＝７．４×１０−３、ＴＭ３Ｇ２０８ＷＧ：［ｋｃａｔ／Ｋｍ］ＬＢＧ／［ｋｃａｔ／Ｋｍ］ＰＡＳＣ＝０．２６）。このことは、サブサイト−３相互作用のための残基が、基質選択に関与している可能性があることを示唆している。
【０７０８】
ＣＢＭ３ｃがセルロースリガンドに緩やかに結合して、セルロース鎖をＧＨ９触媒モジュールへ送り込むことが、提唱されている（３４）。しかしながら、この結合について、生化学的データは提供されなかった。セロオリゴ糖との複合体におけるファミリー９セルロースの共結晶構造では、セロオリゴ糖のＣＢＭ３ｃへの結合は、全くみられなかった（２６、３４）。我々の結果は、ＣＢＭ３ｃは確かに不溶性セルロースに結合することができるが、その結合は明らかに弱いことを示唆している。Ｃｂ１９５２とそのホモログとの配列アラインメントによって、Ｃｂ１９５２ＣＢＭ３ｃとそのホモログとの間において、リガンドに結合すると提唱されたアミノ酸残基に顕著な相違があることが明らかになった（１９、２２、２３）。Ｃｂ１９５２のＣＢＭ３ｃでは、リガンドに結合すると提唱されたＴｈｅｆｕＣｅｌ９Ａにおける保存Ｑ５５３、Ｒ５５７、Ｅ５５９、およびＲ５６３残基が、それぞれ、対応するＥ５４５、Ｋ５４９、Ｑ５６１、およびＫ５６５に置き換わっている（図８２）。この観察は、Caldanaerobius polysaccharolyticusファミリー１６ＣＢＭ３モジュールにおいて、リガンドとの水素結合に関与する１つの極性残基を変異する（Ｑ１２１からＥ１２１）ことによって示された微調整（３７）に類似する可能性がある。Ｅ５４５、Ｋ５４９、Ｑ５６１、およびＫ５６５残基は、同族の微生物であるC. kronotskyensis、C. saccharolyticus、C. obsidiansis、およびCaldicellulosiruptor sp. Tok7B.1由来の４つのＣＢＭ３モジュールにおいても見出される（図８２）。リガンドとの複合体におけるＣＢＭ３ｃの三次元構造は、未だ明らかではなく、それゆえ、リガンド結合に重要な残基が正確にはどれなのか、わかっていない。ＣＢＭ３ｃモジュールに多様性がある（１９）ため、結晶においてこの複合体を捉えるほど十分強固にセロオリゴ糖を保持することができるＣＢＭ３ｃの他の変異体が存在し得ると想像する余地がある。
【０７０９】
＜実施例１０：エンド−グルカナーゼ／マンナナーゼＣｂ１９５３＞
推定エンドグルカナーゼＣｂ１９５３ＷＴを、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、ｃｂ１９５３の遺伝子産物である。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。エンドグルカナーゼは、主に、セルロース由来のセロビオースを切断する。Ｃｂ１９５３ＷＴタンパク質は、１３９１のアミノ酸長であり、かつ、１５３．６ｋＤａの分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１９５３タンパク質）。Ｃｂ１９５３ＷＴは、２つのグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメインと、３つの炭水化物結合タンパク質とを有する（図２９）。図２９に示されるように、各ＧＨ５モジュールの活性を決定するために、２つの短縮型変異体を作製した。これら短縮型変異体に関して、図２９に示されるように、Ｃｂ１９５３ＴＭ１（９６１アミノ酸、１０３．９ｋＤａ）は、３つの炭水化物結合モジュールと共にＮ末端にＧＨ５触媒ドメインを有する一方、Ｃｂ１９５３ＴＭ２（１１０８アミノ酸、１２１．７ｋＤａ）は、３つの炭水化物結合モジュールと共にＣ末端にＧＨ５触媒ドメインを有する。
【０７１０】
（Ｃｂ１９５３ＷＴのＰＣＲ増幅）
この遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii ＤＳＭ  ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２をコードする配列はそれぞれ、以下のプライマーセットを用いて増幅した。
【０７１１】
Cb1953WTForward:5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GATGGA GTA GTG AAG -3’（配列番号５６）
Cb1953WTReverse:5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT TGC GGC TGG AAC TGG CGC TGG TTC -3’（配列番号５７）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７１２】
【表３７】
2014509836.tif 000039
【０７１３】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７１４】
【表３８】
2014509836.tif 000040
【０７１５】
（Ｃｂ１９５３ＴＭ１のクローニング）
Cb1953TM1Forward:5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GATGGA GTA GTG AAG-3’（配列番号５６）
Cb1953TM1Reverse:5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAT GGC ATT GGT ATT ACT GTC TGC ACC GG -3’（配列番号５８）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７１６】
【表３９】
2014509836.tif 000041
【０７１７】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７１８】
【表４０】
2014509836.tif 000042
【０７１９】
（Ｃｂ１９５３ＴＭ２のクローニング）
Cb1953TM2Forward: 5’-GAC GAC GAC AAG ATG GGTGCCTCTTCAGTACCTACTTCAACACC -3’（配列番号５９）
Cb1953TM2Reverse: 5’- GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT TGC GGC TGG AAC TGG CGC TGG TTC -3’（配列番号５７）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７２０】
【表４１】
2014509836.tif 000043
【０７２１】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７２２】
【表４２】
2014509836.tif 000044
【０７２３】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２の産物を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲル上の予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【０７２４】
NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用いて、精製した各ＤＮＡを処理し、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０７２５】
【表４３】
2014509836.tif 000045
【０７２６】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした：
【０７２７】
【表４４】
2014509836.tif 000046
【０７２８】
Ｃｂ１９５３−ｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養物から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認した後、インサートの配列を読んでそれらの配列の完全性を確かめた。
【０７２９】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０７３０】
（Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２の遺伝子およびタンパク質配列）
野生型Ｃｂ１９５３のアミノ酸配列
野生型Ｃｂ１９５３のアミノ酸配列は、配列番号６０に開示されている。Ｃｂ１９５３のシグナルペプチドは、配列番号６０におけるアミノ酸番号１〜３８に対応し、全てのＰＣＲ増幅中に除去された。それゆえ、発現する野生型Ｃｂ１９５３タンパク質は、配列番号６０におけるアミノ酸番号１〜３８を含まない。シグナルペプチドを有さない野生型Ｃｂ１９５３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６１に開示されている。
【０７３１】
野生型Ｃｂ１９５３（シグナルペプチドなし）の遺伝子をプラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを含んでいる野生型Ｃｂ１９５３のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）は、配列番号６５に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号６５におけるアミノ酸１〜１４である。
【０７３２】
野生型Ｃｂ１９５３のヌクレオチド配列
野生型Ｃｂ１９５３のヌクレオチド配列は、配列番号６２に開示されている。Ｃｂ１９５３のシグナルペプチドは、配列番号６２におけるヌクレオチド番号１〜１１４に対応し、全てのＰＣＲ増幅中に除去された。それゆえ、野生型Ｃｂ１９５３タンパク質を発現するために用いられるヌクレオチド配列は、配列番号６２におけるヌクレオチド番号１〜１１４を含まない。シグナルペプチドを有さない野生型Ｃｂ１９５３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６３に開示されている。
【０７３３】
プラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有する、野生型Ｃｂ１９５３のヌクレオチド配列（シグナルペプチドなし）は、配列番号６４に開示されている。この短いペプチドをコードする核酸は、配列番号６４における核酸１〜４２である。
【０７３４】
Ｃｂ１９５３ＴＭ１のアミノ酸配列
Ｃｂ１９５３ＴＭ１のアミノ酸配列は、配列番号１２２に開示されている。Ｃｂ１９５３ＴＭ１の遺伝子をプラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。ｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドを有するＣｂ１９５３ＴＭ１のアミノ酸配列は、配列番号６７に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号６７におけるアミノ酸１〜１４である。
【０７３５】
Ｃｂ１９５３ＴＭ１のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９５３ＴＭ１のヌクレオチド配列は、配列番号１２３に開示されている。プラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有する、Ｃｂ１９５３ＴＭ１のヌクレオチド配列は、配列番号６６に開示されている。この短いペプチドをコードする核酸は、配列番号６６における核酸１〜４２である。
【０７３６】
Ｃｂ１９５３ＴＭ２のアミノ酸配列
Ｃｂ１９５３ＴＭ２のアミノ酸配列は、配列番号１１１に開示されている。Ｃｂ１９５３ＴＭ２の遺伝子をプラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを有するＣｂ１９５３ＴＭ２のアミノ酸配列は、配列番号６９に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号６９におけるアミノ酸１〜１４である。
【０７３７】
Ｃｂ１９５３ＴＭ２のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９５３ＴＭ２のヌクレオチド配列は、配列番号１１０に開示されている。プラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有する、Ｃｂ１９５３ＴＭ２のヌクレオチド配列は、配列番号６８に開示されている。短いペプチドをコードする核酸は、配列番号６８における核酸１〜４２である。
【０７３８】
（Ｃｂ１９５３ＷＴタンパク質、Ｃｂ１９５３ＴＭ１タンパク質、およびＣｂ１９５３ＴＭ２タンパク質の精製）
Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２を、ヒートショック法によって、大腸菌ＢＬ−２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ（ＤＥ３）  ＲＩＬコンピテントセル内で発現させた。次いで、組換え細胞を、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢアガープレートにおいて一晩生育させた。８時間後、スターター培養液を、６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達するまで、通気しながら、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した新たなＬＢに希釈した。次いで、ＩＰＴＧを０．１ｍＭの最終濃度で添加することによって遺伝子発現を誘導し、培養温度を１６℃まで下げた。１６時間後、細胞ペレットを回収するため、細胞を遠心分離した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．８、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール、１．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化された標的タンパク質）を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、レジンから溶出した。次いで、溶出画分を６５℃で３０分間熱処理し、沈殿したタンパク質を除去するために遠心分離した。次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）によるゲル濾過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ  １６/２０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、タンパク質を精製した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、溶出画分の一部を分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０を用いて染色することによって、タンパク質のバンドを可視化した（図３０）。
【０７３９】
（酵素活性）
図３１は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）におけるＣｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２のザイモグラムを示す。ＣＭＣ基質（最終０．１％、ｗ／ｖ）と共に標準的なドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をして、ゲルを準備した。電気泳動によるタンパク質の分画後、ゲルを蒸留水で２回洗浄し、３０ｍＬのリフォールディングバッファー（２０ｍＭ  クエン酸バッファー  ｐＨ６．０、２．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ  ジチオスレイトール、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で２５℃１時間インキュベートし、新たなバッファー中で、３７℃で一晩保持した。ゲルを５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で２回洗浄し、次いで、結果物を、０．１％コンゴレッドで染色し１Ｍ  ＮａＣｌで脱染することによって可視化した。図３１に示されるように、Ｃｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２は、予想されるサイズの位置において、セルラーゼ活性を意味する顕著な白いバンドを示したが、Ｃｂ１９５３ＴＭ１タンパク質は示さなかった。
【０７４０】
図３２および３３は、還元糖アッセイからの、天然基質におけるＣｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２の酵素活性を示す。７つの異なる基質を試験した：アビセル、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、コムギアラビノキシラン（ＷＡＸ）、リケニン、コンニャクグルコマンナン、およびマンナン。これら基質と酵素とのインキュベーションによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にて連続的に混合しながら、チューブを７５℃において１６時間インキュベートした。チューブを、４℃において５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ｐＨＢＡＨアッセイのために、５０μＬのサンプル上清を、きれいな１．５ｍＬ遠心チューブへ移した。標準およびサンプルについて、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍとグルコース濃度とを、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。反応物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。ｎ−ブタノール：酢酸：Ｈ２Ｏが１０：５：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）からなる移動相、および１０ｃｍ×２０ｃｍプレートを用いた。還元糖アッセイ（図３２）およびＴＬＣ（図３３）の結果は、Ｃｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２がセルラーゼ活性を有するのに対して、Ｃｂ１９５３ＴＭ１はマンナナーゼ活性を有することを示す。様々な基質に対する、ザイモグラム、還元アッセイ、およびＴＬＣ分析を通して、Ｃｂ１９５３ＷＴにおけるＣ末端のＧＨ５はセルラーゼとして機能するのに対して、Ｎ末端のＧＨ５はマンナナーゼとして機能すると結論付けた。
【０７４１】
図３４は、ＨＰＬＣ分析を用いた、ＰＡＳＣに対するＣｂ１９５３ＴＭ２の酵素活性の時間経過を示す。加水分解産物の分析については、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によってサンプルを分析した。ＨＰＡＥＣ分析について、１００μＬのサンプル希釈液を、Ｓｙｓｔｅｍｄ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ,ＣＡ））に注入した。Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣ装置は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）社のＣａｒｂｏＰａｃ（商標）  ＰＡ１  ｇｕａｒｄ（４×５０ｍｍ）および分析（４ｘ２５０ｍｍ）カラム、並びにＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ,ＭＡ）のＣｏｕｌｏｃｈｅｍＩＩＩ電気化学検出器を備えている。ＴＬＣ分析およびＨＰＬＣ分析のために、標準として、グルコース、および５つの異なるセロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、およびセロヘキサオース）を用いた。反応において、Ｃｂ１９５３は、セロオリゴ糖（Ｃ２−Ｃ４）を遊離させ始め、次いでグルコースを遊離させた。この結果から、この酵素は、ＰＡＳＣから主にセロビオースを遊離させることが示された。
【０７４２】
図３５および３６は、ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２の熱安定性を示す。５０ｎＭのＣｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２を異なる温度（７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、および９０℃）に保持した。サンプルは、一定の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間、および２４時間）において取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。Ｃａｒｙ  ３００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を用いて、酵素活性を８５℃で測定した。最初の１分間において反応の初速度を算出した。時間０における反応の初速度を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応の初速度を、時間０における反応の初速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）を算出した。この結果から、Ｃｂ１９５３ＷＴ（図３５）およびＣｂ１９５３ＴＭ２（図３６）は、７０℃および７５℃で非常に安定であり、熱処理していないタンパク質の７５〜９０％の活性を維持していた。
【０７４３】
図３７は、ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２の反応速度実験を示す。５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の０．０５μＭの精製したＣｂ１９５３ＷＴまたはＣｂ１９５３ＴＭ２を、様々な濃度のリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）と共にインキュベートした。そして、加水分解の初速度を基質濃度に対してプロットした。データをミカエリス−メンテンの式に当てはめる（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０１）ことによって、反応速度パラメータ（Ｃｂ１９５３ＷＴについては、Ｋｍ：７．６０３ｍｇ／ｍＬ、ｋｃａｔ：７．５１３ｓ−１、およびｋｃａｔ／Ｋｍ:０．９８８ｓ−１ｍＬ／ｍｇ、Ｃｂ１９５３ＴＭ２については、Ｋｍ：３．０３２ｍｇ／ｍＬ、ｋｃａｔ：５．４１１ｓ−１およびｋｃａｔ／Ｋｍ：１．７８５ｓ−１ｍＬ／ｍｇ）を決定した。
【０７４４】
＜実施例１１：エンドセルラーゼＣｂ１９５４＞
推定エンドセルラーゼＣｂ１９５４を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー９触媒ドメイン（推定セルラーゼドメイン）、３つのファミリー３炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）、および１つのＧＨ４８触媒ドメインを有する（図３８）。Ｃｂ１９５４野生型は、１７４６アミノ酸長であり、１９３．６ｋＤａ（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１９５４野生型タンパク質）の推定分子量を有する。酵素Ｃｂ１９５４ＴＭ３およびＣｂ１９５４ＴＭ５は、Ｃｂ１９５４の遺伝子産物の短縮型変異体である。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。エンドセルラーゼは、セルロースから、最終産物としてグルコースおよびセロビオースを切断する。Ｃｂ１９５４ＴＭ３タンパク質は、７０９アミノ酸長であり、７８．５７ｋＤａ（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１９５４ＴＭ３タンパク質）の分子量を有する。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー９触媒ドメインおよび１つのファミリー３炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ３）を有する。Ｃｂ１９５４ＴＭ５タンパク質は、１２９４アミノ酸長であり、１４２．８２ｋＤａ（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１９５４ＴＭ５タンパク質）の分子量を有する。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー４８触媒ドメインおよび３つのファミリー３炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ３）を有する。
【０７４５】
（Ｃｂ１９５４野生型のクローニング）
Ｃｂ１９５４野生型の遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii ＤＳＭ  ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５４野生型遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
Ｃｂ１９５４野生型遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
Cb1954 wild-type Forward:5’- GAC GAC GAC AAG ATG CAA GAG GTT AGG GCT GGT TCG TTT AAC -3’（配列番号７０）
Cb1954 wild-type Reverse:5’- GA GGA GAA GCC CGG TTA TTG ATT GCC AAA CAG TAT TTC ATA TG -3’（配列番号７１）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７４６】
【表４５】
2014509836.tif 000047
【０７４７】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７４８】
【表４６】
2014509836.tif 000048
【０７４９】
（Ｃｂ１９５４ＴＭ３のクローニング）
Ｃｂ１９５４の遺伝子を、Ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏＴＭＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii ＤＳＭ  ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５４ＴＭ３遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
Cb1954TM3Forward:5’- GAC GAC GAC AAG ATG CAA GAG GTT AGG GCTGGT TCG TTT AAC -3’（配列番号７０）
Cb1954TM3Reverse:5’- GA GGA GAA GCC CGG TTA TAC CTT TAT CTG TCC ACC TGC TAC-3’（配列番号７２）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７５０】
【表４７】
2014509836.tif 000049
【０７５１】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７５２】
【表４８】
2014509836.tif 000050
【０７５３】
（Ｃｂ１９５４ＴＭ５のクローニング）
Ｃｂ１９５４の遺伝子を、Ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏＴＭＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii ＤＳＭ  ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９５４ＴＭ３遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
Cb1954TM5Forward:5’- GAC GAC GAC AAG ATG TTC AAA GCT ATT GAA ACT CCA ACA AAC -3’（配列番号７３）
Cb1954TM5Reverse:5’- GA GGA GAA GCC CGG TTA TTG ATT GCC AAA CAG TAT TTC ATA TG -3’（配列番号７１）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７５４】
【表４９】
2014509836.tif 000051
【０７５５】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７５６】
【表５０】
2014509836.tif 000052
【０７５７】
上述したＰＣＲの後、Ｃｂ１９５４野生型、Ｃｂ１９５４ＴＭ３およびＣｂ１９５４ＴＭ５遺伝子の増幅産物を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲル上の予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ゲルから増幅フラグメントを抽出した。
【０７５８】
NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用いて、精製したＤＮＡを処理し、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０７５９】
【表５１】
2014509836.tif 000053
【０７６０】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした：
【０７６１】
【表５２】
2014509836.tif 000054
【０７６２】
Ｃｂ１９５４野生型−ｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ、Ｃｂ１９５４ＴＭ３−ｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣまたはＣｂ１９５４ＴＭ５−ｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、化学的な形質転換法によって大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルへ導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、細胞培養物からミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認した後、遺伝子の配列を読み、その同一性を確かめた。
【０７６３】
Ｃｂ１９５４の全て構築物について、Ｃｂ１９５４ＴＭ３のみをクローニングすることができた。そして、このタンパク質の発現のために、組換えプラスミドのうち１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍｌのＬＢブロスに添加し、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０７６４】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ１９５４ＴＭ３）を、次いで、溶出バッファー(５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール)を用いて、レジンから溶出した。
【０７６５】
ＰＣＲプライマー設計によって、プラスミドにコードされた６−ヒスチジンにタンパク質が融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、このレジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。
【０７６６】
Ｃｂ１９５４ＴＭ３遺伝子を、大腸菌において発現させた。そして、タンパク質を、プラスミドによってコードされた６−ヒスチジンを利用したＴＡＬＯＮレジン精製工程、Ｈｉｔｒａｐ  Ｑカラムを用いた陰イオン交換工程、およびＨｉｌｏａｄ  １６/６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを用いたゲル濾過工程を含んでいる、３つの工程によって精製した。図３９Ａは、精製したＣｂ１９５４ＴＭ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０７６７】
（Ｃｂ１９５４ＷＴ、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、およびＣｂ１９５４ＴＭ５の、遺伝子およびタンパク質配列）
野生型Ｃｂ１９５４のアミノ酸配列
野生型Ｃｂ１９５４エンドセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）のアミノ酸配列は、配列番号７４に開示されている。Ｃｂ１９５４のシグナルペプチドは、配列番号７４におけるアミノ酸番号１〜２７に対応する。シグナルペプチドがない野生型Ｃｂ１９５４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２１に開示されている。
【０７６８】
野生型Ｃｂ１９５４のヌクレオチド配列
野生型Ｃｂ１９５４のヌクレオチド配列は、配列番号１１６に開示されている。Ｃｂ１９５４のシグナルペプチドは、配列番号１１６におけるヌクレオチド番号１〜８１に対応する。シグナルペプチドがない野生型Ｃｂ１９５４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７５に開示されている。
【０７６９】
Ｃｂ１９５４ＴＭ３のアミノ酸配列
Ｃｂ１９５４ＴＭ３のアミノ酸配列は、配列番号７６に開示されている。Ｃｂ１９５４ＴＭ３の遺伝子をプラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣへクローニングする処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列が、遺伝子に融合する。ｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドを有するＣｂ１９５４ＴＭ３のアミノ酸配列は、配列番号８１に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号８１におけるアミノ酸１〜１４である。
【０７７０】
Ｃｂ１９５４ＴＭ３のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９５４ＴＭ３のヌクレオチド配列は、配列番号７７に開示されている。プラスミドｐＥＴ−４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有する、Ｃｂ１９５４ＴＭ３のヌクレオチド配列は、配列番号８０に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号８０におけるヌクレオチド１〜４２である。
【０７７１】
Ｃｂ１９５４ＴＭ５のアミノ酸配列
Ｃｂ１９５４ＴＭ５のアミノ酸配列は、配列番号７８に開示されている。
【０７７２】
Ｃｂ１９５４ＴＭ５のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９５４ＴＭ５のヌクレオチド配列は、配列番号７９に開示されている。
【０７７３】
（酵素活性）
図３９Ｂは、還元糖アッセイからの、天然基質におけるＣｂ１９５４ＴＭ３の酵素活性を示す。３つの異なる基質を試験した：アビセル、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、およびリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）。これら基質と酵素とのインキュベーションによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。ＰＡＳＣの加水分解は、他の基質の加水分解よりも高かった。
【０７７４】
アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣの酵素的加水分解の後、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．(上掲)の方法に従って、グルコース同等物の濃度を決定した。１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、２±０．１ｍｇのアビセルを各チューブに添加し、質量を測定して記録した。ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣについては、ＣＭＣ−Ｎａ（２％）およびＰＡＳＣ（６．１１ｍｇ／ｍｌ）の基質ストック溶液を用いた。反応バッファーをはじめとして、クエン酸ナトリウム反応バッファーおよび酵素を、各チューブに添加した。チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内において、７５℃で１６時間、連続的に混合しながらインキュベートした。チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。酵素によって遊離した還元末端を決定するために、５０μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬの遠心チューブに移した。１ｍＬのグルコースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が１００ｍＭになるように作製し、次の各濃度（２０ｍＭ，１０ｍＭ，および５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１５０μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、５０μＬのサンプルおよびグルコース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルについて、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍおよびグルコースの濃度を、互いに対してプロットして、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。
【０７７５】
図４０は、ＨＰＬＣ分析を用いた、セルロース性基質におけるＣｂ１９５４ＴＭ３の酵素活性を示す。３つの異なるセルロース基質を試験した：アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ。それぞれの場合において、Ｃｂ１９５４ＴＭ３の存在下では、グルコースおよびセロビオースが遊離した。Ｃｂ１９５４ＴＭ３の非存在下では、全ての基質について、グルコースもセロビオースもみられなかった。この結果は、この酵素が、セルロース性基質（ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ）から、グルコースおよびセロビオース、同様により長鎖のオリゴ糖を、最終産物として遊離させることを示すものであった。
【０７７６】
図４１は、Ｃｂ１９５４ＴＭ３の熱安定性を示す。７０℃、７５℃、８０℃および８５℃で２４時間インキュベートした後、Ｃｂ１９５４ＴＭ３は、それぞれ、７５％、８７％、６４％、および７％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ１９５４ＴＭ３を異なる温度（７０℃、７５℃、８０℃および８５℃）で保持した。ｐＨ５．５およびサーモミキサーにおいて９５℃で、酵素活性を測定した。測定のために、２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度のＰＡＳＣを用いた。１０μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（上掲）に従って、グルコース同等物に相当する還元末端を測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応時間を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０７７７】
＜実施例１２：エンド−グルカナーゼＣｂ１９４６＞
推定エンドグルカナーゼＣｂ１９４６ＷＴを、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ１９４６ＷＴの遺伝子産物である。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。Ｃｂ１９４６ＷＴタンパク質は、１２７１アミノ酸長および１３９．８ｋＤａ（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１９４６タンパク質）の分子量を有する。Ｃｂ１９４６ＷＴは、Ｎ末端領域にグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメイン、および、Ｃ末端領域にグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー４４触媒ドメインを有する。２つの炭水化物結合モジュールは、２つの触媒ドメインの間に位置する（図４２）。短縮型変異体に関して、図４２に示すように、Ｃｂ１９４６ＴＭ１（６５３アミノ酸、７１．３ｋＤａ）は、２つの炭水化物結合モジュールと共にＮ末端にＧＨ５触媒ドメインを有する一方、Ｃｂ１９４６ＴＭ２（１０１５アミノ酸、１１１．０ｋＤａ）は、２つの炭水化物結合モジュールと共にＣ末端にＧＨ４４触媒ドメインを有する。
【０７７８】
（Ｃｂ１９４６ＷＴのクローニング）
野生型遺伝子およびその２つの短縮型変異体（図４２）を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725TのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１、およびＣｂ１９４６ＴＭ２をコードするヌクレオチド配列を、下記のプライマーの組合せおよび手順を用いて増幅した：
Cb1946WT Forward:5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GAT GGA GTA GTG AAG -3’（配列番号８２）
Cb1946WT Reverse:5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT AGT TTG TAC TGA GGT TGA ATA TAA AAC GAT ATG G -3’（配列番号８３）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７７９】
【表５３】
2014509836.tif 000055
【０７８０】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７８１】
【表５４】
2014509836.tif 000056
【０７８２】
（Ｃｂ１９４６ＴＭ１のクローニング）
Cb1946TM1 Forward:5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GAT GGA GTA GTG AAG -3’（配列番号８２）
Cb1946TM1 Reverse:5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAG TTA AAC CTT ATC TGT ATC TCC CCT GTG TC -3’（配列番号８４）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７８３】
【表５５】
2014509836.tif 000057
【０７８４】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７８５】
【表５６】
2014509836.tif 000058
【０７８６】
（Ｃｂ１９４６ＴＭ２のクローニング）
Cb1946TM2 Forward:5’-GAC GAC GAC AAG ATG GTA GGG TAC TTG GAC ATG GTA AAC AAT TGG GA -3’（配列番号８５）
Cb1946TM2 Reverse:5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT AGT TTG TAC TGA GGT TGA ATA TAA AAC GAT ATG G -3’（配列番号８３）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０７８７】
【表５７】
2014509836.tif 000059
【０７８８】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０７８９】
【表５８】
2014509836.tif 000060
【０７９０】
上述したＰＣＲの後、Ｃｂ１９４６遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲルにおける予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【０７９１】
NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用いて、精製した各ＤＮＡを処理し、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０７９２】
【表５９】
2014509836.tif 000061
【０７９３】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした。
【０７９４】
【表６０】
2014509836.tif 000062
【０７９５】
Ｃｂ１９４６−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養物から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。プラスミドにおけるインサートの確認後、遺伝子またはコード配列の配列を読み、それらの同一性および完全性を確かめた。
【０７９６】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍＬのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０７９７】
（Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２の遺伝子およびタンパク質の配列）
Ｃｂ１９４６野生型のアミノ酸配列
野生型Ｃｂ１９４６のアミノ酸配列は、配列番号８６に開示されている。配列番号８６のアミノ酸番号１〜３８に対応するＣｂ１９４６のシグナルペプチドを、全てのＰＣＲ増幅中に除去した。それゆえ、発現させた野生型Ｃｂ１９４６タンパク質は、配列番号８６の１〜３８番のアミノ酸を含んでいなかった。シグナルペプチドのない野生型Ｃｂ１９４６タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８７に開示されている。
【０７９８】
野生型Ｃｂ１９４６（シグナルペプチなし）の遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。短いペプチドを含んでいる野生型Ｃｂ１９４６（シグナルペプチなし）のアミノ酸配列は、配列番号９１に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号９１のアミノ酸１〜１４である。
【０７９９】
Ｃｂ１９４６野生型のヌクレオチド配列
野生型Ｃｂ１９４６のヌクレオチド配列は、配列番号８８に開示されている。配列番号８８のヌクレオチド番号１〜１１４に対応するＣｂ１９４６のシグナルペプチドを、全てのＰＣＲ増幅中に除去した。それゆえ、野生型Ｃｂ１９４６タンパク質を発現させるために用いたヌクレオチド配列は、配列番号８８のヌクレオチド番号１〜１１４を含まない。シグナルペプチドを含まない野生型Ｃｂ１９４６タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８９に開示されている。
【０８００】
プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を有する、野生型Ｃｂ１９４６のヌクレオチド配列（シグナルペプチドなし）は、配列番号９０に開示されている。この短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号９０のヌクレオチド１〜４２である。
【０８０１】
Ｃｂ１９４６ＴＭ１のアミノ酸配列
Ｃｂ１９４６ＴＭ１のアミノ酸配列は、配列番号１１７に開示されている。Ｃｂ１９４６ＴＭ１遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。短いペプチドを含んでいるＣｂ１９４６ＴＭ１のアミノ酸配列は、配列番号９３に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号９３のアミノ酸１〜１４である。
【０８０２】
Ｃｂ１９４６ＴＭ１のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９４６ＴＭ１のヌクレオチド配列は、配列番号１１８に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣに由来する短いペプチドをコードする配列を含んでいるＣｂ１９４６ＴＭ１ヌクレオチド配列は、配列番号９２に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号９２のヌクレオチド１〜４２である。
【０８０３】
Ｃｂ１９４６ＴＭ２のアミノ酸配列
Ｃｂ１９４６ＴＭ２のアミノ酸配列は、配列番号１１３に開示されている。Ｃｂ１９４６ＴＭ２遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。短いペプチドを含んでいるＣｂ１９４６ＴＭ２アミノ酸配列は、配列番号９５に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号９５のアミノ酸１〜１４である。
【０８０４】
Ｃｂ１９４６ＴＭ２のヌクレオチド配列
Ｃｂ１９４６ＴＭ２のヌクレオチド配列は、配列番号１１２に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣに由来する短いペプチドをコードする配列を含んでいるＣｂ１９４６ＴＭ２ヌクレオチド配列は、配列番号９４に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号９４のヌクレオチド１〜４２である。
【０８０５】
（Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２タンパク質の精製）
Ｃｂ１９４６ＷＴ、ならびに、その短縮型変異体Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２を、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ（ＤＥ３）  ＲＩＬコンピテントセルにおいて発現させた。次いで、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢアガーにおいて、組換え細胞を３７℃で一晩増殖させた。８時間後、スターター培養液を、６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達するまで、通気しながら、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した新たなＬＢに希釈した。次いで、ＩＰＴＧを０．１ｍＭの最終濃度で添加することによって遺伝子発現を誘導し、培養温度を１６℃まで下げた。１６時間後、細胞ペレットを回収するため、細胞を遠心分離した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．８、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール、１．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン−標識化された標的タンパク質）を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ  ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、レジンから溶出した。次いで、溶出画分を６５℃で３０分間熱処理し、沈殿したタンパク質を除去するために遠心分離した。次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）によるゲル濾過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ  １６/２０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、タンパク質を精製した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、溶出画分の一部を分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０を用いて染色することによって、タンパク質のバンドを可視化した（図４３）。
【０８０６】
（酵素活性）
図４４は、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）アガープレートにおけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２のザイモグラムを示す。アガープレートは、ＣＭＣ基質（最終０．２５％、ｗ／ｖ）を用いて調製した。１μｇの各タンパク質をアガー−ＣＭＣプレート上にスポットした後、プレートを３７℃において一晩インキュベートし、次いで０．１％のコンゴレッドによる染色および１ＭのＮａＣｌによる脱色によって、ゲルを可視化した。図４４に示されるように、Ｃｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ１９４６ＴＭ２は、アガープレート上に、セルラーゼ活性を意味する顕著なハローを示したが、Ｃｂ１９５３ＴＭ１タンパク質は示さなかった。
【０８０７】
図４５は、リン酸膨脹セルロース（ＰＡＳＣ）におけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２の酵素活性を示している。それぞれの酵素（最終０．５μＭ）を、５０ｍＭ  クエン酸−１５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて１％最終濃度のリン酸膨脹セルロース（ＰＡＳＣ）と、７５℃、１６時間で反応させた。この反応物を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。ｎ−ブタノール：酢酸：Ｈ２Ｏが１０：５：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）からなる移動相、および１０ｃｍ×２０ｃｍプレートを用いた。加水分解の生成物のさらなる定量分析のために、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によってサンプルを分析した（図４６）。ＨＰＡＥＣ分析のために、１００μLの希釈した各サンプルを、Ｓｙｓｔｅｍｄ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ,ＣＡ）に注入した。Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣ装置は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）社のＣａｒｂｏＰａｃＴＭ  ＰＡ1  ｇｕａｒｄ（４ｘ５０ｍｍ）および分析（４ｘ２５０ｍｍ）カラム（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（４ｘ２５０ｍｍ）ｃｏｌｕｍｎｓ）ならびにＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ,ＭＡ）のＣｏｕｌｏｃｈｅｍＩＩＩ電気化学検出器を備えている。ＴＬＣ分析およびＨＰＬＣ分析のために、標準として、グルコースおよび５つの異なるセロオリゴ糖を用いた：セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオースおよびセロヘキサオース。ＴＬＣおよびＨＰＬＣの結果に基づくと、Ｃｂ１９５３ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２は、ＰＡＳＣ基質からの、グルコース、セロビオース、セロトリオース、およびセロテトラオースなどの産物の顕著な遊離を示し、Ｃｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ１９５３ＴＭ２がセルラーゼ活性を有することを示したが、Ｃｂ１９５３ＴＭ１は示さなかった。
【０８０８】
＜実施例１３：エンドセルラーゼＣｂ６２９＞
エンドセルラーゼＣｂ６２９を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。酵素Ｃｂ６２９ＴＭ１は、Ｃｂ６２９の遺伝子産物の短縮型変異体である。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。エンドセルラーゼは、セルロースからグルコース、セロビオースおよびセロトリオースを初めに切断する。Ｃｂ６２９ＴＭ１タンパク質は５６２１アミノ酸長および６３．７ｋＤａ（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ６２９ＴＭ１タンパク質）の分子量を有する。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメイン、および、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）ファミリー１７＿２８ドメインを有する（図４７）。さらに、分泌のためにＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）および細胞表面に対する酵素の固定に用いられていると考えられる３つの表層ホモロジー（ＳＬＨ）モジュールが存在する。ＳＰおよびＳＬＨは触媒ではないため、下記に示すＰＣＲ増幅を通して、それらをポリペプチドから切断した。この遺伝子産物をＣｂ６２９ＴＭ１と名付けた。
【０８０９】
（Ｃｂ６２９ＴＭ１のクローニング）
Ｃｂ６２９ＴＭ１の遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725TのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ６２９ＴＭ１遺伝子を下記のプライマーの組合せを用いて増幅した：
Cb629TM1Forward:5’- GAC GAC GAC AAG ATG CAG AGC ATA CTG TAT GAA AAG G -3’（配列番号９６）
Cb629TM1Reverse:5’- GAG GAG AAG CCC GGT TAC TCA AAA AGG ATA TTG GTA AAT C -3’（配列番号９７）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０８１０】
【表６１】
2014509836.tif 000063
【０８１１】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０８１２】
【表６２】
2014509836.tif 000064
【０８１３】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ６２９ＴＭ１の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲルにおける予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【０８１４】
NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用いて、精製した各ＤＮＡを処理し、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０８１５】
【表６３】
2014509836.tif 000065
【０８１６】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした。
【０８１７】
【表６４】
2014509836.tif 000066
【０８１８】
Ｃｂ６２９ＴＭ１−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣのライゲーション混合物を、化学的な形質転換法によって大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルに導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養物から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認した後、遺伝子の配列を読んで、コーディング配列の完全性を確かめた。
【０８１９】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した１０ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６時間培養した。１０ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した１０００ｍＬのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．３に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０８２０】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットにするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ６２９ＴＭ１）を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ  ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、レジンから溶出した。
【０８２１】
ＰＣＲプライマーの設計によって、タンパク質がプラスミドにコードされた６−ヒスチジンに融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、レジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。
【０８２２】
（Ｃｂ６２９ＷＴおよびＣｂ６２９ＴＭ１の遺伝子およびタンパク質の配列）
Ｃｂ６２９野生型のアミノ酸配列
野生型Ｃｂ６２９エンドセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）のアミノ酸配列は、配列番号９８に開示されている。Ｃｂ６２９のシグナルペプチドは、配列番号９８のアミノ酸番号１〜２９に対応する。シグナルペプチドを備えない野生型Ｃｂ６２９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１９に開示されている。
【０８２３】
Ｃｂ６２９野生型のヌクレオチド配列
野生型Ｃｂ６２９のヌクレオチド配列は、配列番号９９に開示されている。Ｃｂ６２９のシグナルペプチドは、配列番号９９のヌクレオチド番号１〜８７に対応する。シグナルペプチドを備えていない野生型Ｃｂ６２９タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２０に開示されている。
【０８２４】
Ｃｂ６２９ＴＭ１のアミノ酸配列
Ｃｂ６２９ＴＭ１エンドセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）のアミノ酸配列は、配列番号１００に開示されている。Ｃｂ６２９ＴＭ１遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを備えているＣｂ６２９ＴＭ１アミノ酸配列は、配列番号１０３に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号１０３のアミノ酸番号１〜１４である。
【０８２５】
Ｃｂ６２９ＴＭ１のヌクレオチド配列
Ｃｂ６２９ＴＭ１のヌクレオチド配列は、配列番号１０１に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣに由来する短いペプチドをコードする配列を含んでいるＣｂ６２９ＴＭ１ヌクレオチド配列は、配列番号１０２に開示されている。短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号１０２のヌクレオチド１〜４２である。
【０８２６】
Ｃｂ６２９ＴＭ１をコードする配列を大腸菌において発現させた。そして、１工程（すなわち、プラスミドによってコードされている６−ヒスチジンを利用するＴＡＬＯＮレジン精製工程）においてタンパク質を精製した。図４８は、精製したＣｂ６２９ＴＭ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０８２７】
（酵素活性）
図４９は、還元糖アッセイを用いて測定した産物による、基質に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性を示す。３つの異なるセルロース基質を試した：アビセル、カルボキシルメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）およびリン酸膨脹セルロース（ＰＡＳＣ）。酵素を基質とインキュベーションすることによって、グルコース同等物の濃度として定量化される産物が遊離した。ＰＡＳＣの加水分解は、他の基質の加水分解よりも高かった。
【０８２８】
アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣの酵素的加水分解の後、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ.の方法（上掲）に従って、グルコース同等物の濃度を測定した。分析の対照においては、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、２±０．１ｍｇのアビセルをそれぞれのチューブに添加し、重量を測定して記録した。各チューブに添加する必要がある体積は、重量に基づき算出した。ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣでは、ＣＭＣ−Ｎａ（２％）およびＰＡＳＣ（６．１１ｍｇ／ｍｌ）の基質ストック溶液を用いた。反応バッファーをはじめとして、クエン酸ナトリウム反応バッファーおよび酵素を、各チューブに添加した。チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内において、７５℃で１６時間、連続的に混合しながらインキュベートした。チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。５０μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬ遠心チューブに移した。１ｍＬのグルコースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が１００ｍＭになるように作製し、次の各濃度（２０ｍＭ、１０ｍＭ、および５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１５０μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、５０μＬのサンプルおよびグルコース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルについて、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍとグルコース濃度とを、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。
【０８２９】
図５０は、ＨＰＬＣ分析を用いた基質に対するｂ６２９ＴＭ１の酵素活性を示す。３つの異なるセルロースの基質を試した：アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ。それぞれの場合において、Ｃｂ６２９ＴＭ１の存在下では、グルコースおよびセロビオースが遊離した。Ｃｂ６２９ＴＭ１の非存在下では、全ての基質について、グルコースもセロビオースもみられなかった。この結果は、この酵素が、セルロース性基質（アビセル、ＣＭＣ−ＮａおよびＰＡＳＣ）から、グルコースおよびセロビオースを、最終産物として遊離させることを示すものであった。
【０８３０】
図５１は、この酵素が、セロオリゴ糖から二糖（セロビオース）およびグルコースを主に遊離させることもできることを示す。この酵素は、加水分解セロビオースを切断しない（図におけるＧ２）。
【０８３１】
図５２は、Ｃｂ６２９ＴＭ１の熱安定性を示す。６０℃、６５℃、７０℃、７５℃および８０℃で２４時間インキュベートした後、Ｃｂ６２９ＴＭ１は、それぞれ、1０９％、９９％、９６％、８３％および３４％の活性を有する。５００ｎＭのＣｂ６２９ＴＭ１を異なる温度（６０℃、６５℃、７０℃、７５℃および８０℃）に保持した。サンプルを異なる時間（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間）においてサンプルを取り出し、直ちに酵素活性測定に用いた。酵素活性を、サーモミキサーにおいて、ｐＨ５．５および７０℃において測定した。測定のために、２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度のＰＡＳＣを用いた。８．３１μｌのタンパク質サンプルを基質に添加し、数回ピペッティングすることによって混合した。全量は１００μｌであった。Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（上掲）に従って、グルコース同等物に相当する還元末端を測定した。１０分間における反応速度を算出した。時間０における反応時間を１００とし、次いで０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての反応速度を、時間０における反応速度で割って１００を掛けることによって、０．５時間、１時間、２時間、４時間、７時間、１１時間および２４時間についての残存活性（パーセンテージ）をそれぞれ算出した。
【０８３２】
＜実施例１４：β−グルコシダーゼＣｂ４８６＞
推定β−グルコシダーゼＣｂ４８６を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。この酵素は、Ｃｂ４８３の遺伝子産物である。Ｃｂは、Caldicellulosiruptor besciiを意味する。β−グルコシダーゼは、セロビオース（グルコースの二糖）の、２ユニットのグルコースへの加水分解を触媒する。Ｃｂ４８６タンパク質は、４６６のアミノ酸長であり、かつ、５４．９ｋＤａの推定分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ４８６タンパク質）。このタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１触媒ドメインを有する（図５３Ａ）。
【０８３３】
Ｃｂ４８６の遺伝子を、iProofTMHigh-Fidelity DNA ポリメラーゼ（BIO-RAD）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii ＤＳＭ ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。Ｃｂ４８６の遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
Cb486Forward: 5’-GAC GAC GAC AAG ATG AGT TTA CCA AAA GGA TTT CTG TGG GGT GC-3’（配列番号１０４）
Cb1172Reverse: 5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAT GAG TTT TCC TTT ATA TAC TGC TG-3’（配列番号１０５）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０８３４】
【表６５】
2014509836.tif 000067
【０８３５】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０８３６】
【表６６】
2014509836.tif 000068
【０８３７】
上述したＰＣＲ増幅の後、Ｃｂ４８６遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲル上の予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【０８３８】
Novagen  ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ  ｋｉｔを用いて、精製したＤＮＡを処理し、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０８３９】
【表６７】
2014509836.tif 000069
【０８４０】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした。
【０８４１】
【表６８】
2014509836.tif 000070
【０８４２】
Ｃｂ４８６−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認した後、インサートの配列を読み、それらの配列の同一性および完全性を確かめた。
【０８４３】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＤＥ３  ＲＩＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した３ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、４時間培養した。１ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した５００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．２５に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０８４４】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．８、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール、１．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするための遠心分離の後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために数回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ４８６）を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、レジンから溶出した。
【０８４５】
Ｃｂ４８６の遺伝子産物は、完全長型として発現した。ＰＣＲプライマーの設計によって、プラスミドにコードされた６−ヒスチジンにタンパク質が融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、レジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。
【０８４６】
（Ｃｂ４８６ＷＴの遺伝子およびタンパク質の配列）
Ｃｂ４８６野生型のアミノ酸配列
野生型Ｃｂ４８６のβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）のアミノ酸配列は、配列番号１０６に開示されている。野生型Ｃｂ４８６遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを含んでいる野生型Ｃｂ４８６アミノ酸配列は、配列番号１０９に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号１０９のアミノ酸１〜１４である。
【０８４７】
Ｃｂ４８６野生型のヌクレオチド配列
野生型Ｃｂ４８６のヌクレオチド配列は、配列番号１０７に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を含んでいる野生型Ｃｂ４８６のヌクレオチド配列は、配列番号１０８に開示されている。この短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号１０８のヌクレオチド１〜４２である。
【０８４８】
Ｃｂ４８６遺伝子を、大腸菌において発現させた。そして、プラスミドによってコードされている６−ヒスチジンを利用するＴＡＬＯＮレジン精製工程を用いた１工程においてタンパク質を精製した。図５３Ｂは、精製したＣｂ４８６のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０８４９】
（酵素活性）
図５４は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析による、キシロオリゴ糖（Ｘ２−Ｘ６）に対するＣｂ４８６の酵素活性を示す。以下のキシロオリゴ糖（Ｘ２−Ｘ６）を試した：キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、およびキシロヘキサオース。これは、キシロオリゴ糖を一晩加水分解し、続いてＴＬＣを用いて産物を分析することによって行った。それぞれの場合において、Ｃｂ４８６の存在下では、キシロースおよびキシロビオースが遊離した。Ｃｂ４８６の非存在下では、キシロビオースに関して、ごくわずかな量のキシロースがみられた；他のキシロオリゴ糖については、加水分解産物は遊離しなかった。この結果は、この酵素が、キシロオリゴ糖（キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、およびキシロヘキサオース）から、キシロースおよびキシロビオースを遊離させることを示すものであった。
【０８５０】
図５５は、この酵素が、セロビオース（β−１，４−結合によって２ユニットのグルコースが結合している）からセロヘキサオース（β−１,４−結合によって６ユニットのグルコースが共に連結している）までのセロオリゴ糖を、グルコースに切断できることを示す。したがって、この酵素を、グルコースの短い鎖を遊離させるエンドグルカナーゼと組み合わせることで、短い鎖を単糖グルコースへ変換することができるはずである。この多機能的活性（異なる結合の切断）によって、この酵素は、複雑な多糖類を加水分解するために用いる酵素混合物における重要な酵素となるはずである。
【０８５１】
図５６Ａと５６Ｂは、それぞれ、Ｃｂ４８６の活性のｐＨプロファイルおよび温度プロファイルを示す。
【０８５２】
＜実施例１５：ススキの加水分解のためのCaldicellulosiruptor bescii由来のセルラーゼ混合物＞
上記の分析に基づいて、Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３を含んでいるセルラーゼ混合物を、Caldicellulosiruptor besciiのセルラーゼに代わるものとして再構成した（図５７）。また、セルラーゼ混合物との相乗的な効果を試験するために、以前に再構成したCaldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼ（図５８）も用意した。全ての酵素混合物（各０．５μＭ）を、５０ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）中、２％、５％、および８％の前処理（オートクレーブされたススキおよび１％のＮａＯＨ処理＋マイクロ波を照射されたススキ）したサンプルと反応させた。この反応は、７５℃で一晩振とうさせて行った。
【０８５３】
反応物を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析した。ｎ−ブタノール：酢酸：Ｈ２Ｏ＝１０：５：１からなる移動相、および１０ｃｍ×２０ｃｍプレートを用いた（図５９、６１、６３、および６５）。
【０８５４】
加水分解産物をさらに分析するために、８％基質の反応サンプルを、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を用いて分析した（図６０、６２、６４、および６６；例えば、図６０は、図５９からのサンプルのＨＰＡＥＣデータであり、図６２は、図６１からのサンプルのＨＰＡＥＣデータである）。ＨＰＡＥＣ分析は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰＡ１  ガードカラム（４×５０ｍｍ）および分析カラム（４×２５０ｍｍ）と、ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ）製のＣｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩＩ電気化学検出器と、を装備する、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）製のＳｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣ装置に、各希釈されたサンプルを１００μＬ注入して行った。
【０８５５】
ＴＬＣ（図５９、６１、６３、および６５）およびＨＰＬＣ（図６０、６２、６４、および６６）では、標準として、グルコース（Ｃ１）および５つの異なるセロオリゴ糖：セロビオース（Ｃ２）、セロトリオース（Ｃ３）、セロテトラオース（Ｃ４）、セロペンタオース（Ｃ５）、およびセロヘキサオース（Ｃ６）を用いた。キシロースとグルコースとを分離するために、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００×７．８ｍｍ、ＢｉｏＲａｄ）をＬＣ−２０ＡＴ  ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）に装備して行った。この分析では、５ｍＭの硫酸を移動相として用い、流速０．６ｍＬ／ｍＬ、６５℃で行った。
【０８５６】
図５９〜６２におけるＴＬＣおよびＨＰＬＣのデータに基づくと、セルラーゼとヘミセルラーゼとの両方が存在する場合、前処理されたススキのサンプルにおいて、より多くのグルコースおよびキシロースを相乗的に遊離させた。すなわち、セルラーゼとヘミセルラーゼとの混合物を用いた場合、同じセルラーゼ混合のみによって遊離するグルコース量、あるいは、同じヘミセルラーゼ混合物のみによって遊離するキシロース量に比べて、より多くのグルコースおよびキシロースを相乗的に遊離させた。例えば、図６０に示すように、マイクロ波前処理されたススキから、より多くのグルコースを遊離したのは、セルラーゼ混合物が単独でススキに作用した場合（レーン２、Ｃ１ピーク；〜７ｍＭ）よりも、ヘミセルラーゼ混合物が存在する時のセルラーゼ混合物（レーン４、Ｃ１ピーク；〜１１ｍＭ）であった。また、図６０に示すように、より多くのキシロースを遊離したのは、ヘミセルラーゼ混合物が単独でススキに作用した場合（レーン２、Ｘ１ピーク；〜３ｍＭ）よりも、セルラーゼ混合物が存在する時のヘミセルラーゼ混合物（レーン４、Ｘ１ピーク；〜６ｍＭ）であった。図６１および６２に示すように、オートクレーブ前処理されたススキについても、セルラーゼ混合物とヘミセルラーゼ混合物との間の相乗的な効果が得られた。したがって、本明細書において提供される結果物は、本明細書に開示されたセルラーゼ混合物と、本明細書に開示されたヘミセルラーゼ混合物とを含んでいる酵素カクテルが、セルラーゼ混合物とヘミセルラーゼ混合物との間における相乗的な活性を示す、という驚くべき結果を示している。
【０８５７】
図５９〜６２の結果は、また、オートクレーブ前処理されたススキのサンプル（図６１および６２）からよりも、マイクロ波前処理されたススキ（図５９および図６０）からの方が、多くの産物が遊離することを示している（図６１および６２）。
【０８５８】
図６３〜６６では、Ｃｂ４８６（β−グルコシダーゼ）を含まない酵素混合物を、両方の前処理されたサンプルにおいて試験した。その結果、Ｃｂ４８６（β−グルコシダーゼ）を含まない混合物の場合、酵素混合物は主にセロビオースを遊離させた。図６３および図６４のレーン４における結果は、ヘミセルラーゼとβ−グルコシダーゼを含まないセルラーゼとの混合物が、マイクロ波を照射されたサンプルから、キシロースおよび主にセロビオースを生じさせるころを示す。オートクレーブ前処理されたススキを基質とした同じ実験においても同様のデータが得られる（図６５および６６）。
【０８５９】
＜実施例１６：ヒートショックタンパク質Ｃｂ１５８１＞
小さなヒートショックタンパク質Ｃｂ１５８１を、Caldicellulosiruptor besciiにおいて同定した。このタンパク質はＣｂ１５８１の遺伝子産物である。ＣｂはCaldicellulosiruptor besciiを意味する。このタンパク質は、１６２アミノ酸長であり、かつ、１９．６８ｋＤａの分子量を有する（Ｈｉｓ−ｔａｇ＋Ｃｂ１５８１タンパク質）。
【０８６０】
（Ｃｂ１５８１のクローニング）
Ｃｂ１５８１の遺伝子を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲによって、Caldicellulosiruptor bescii  ＤＳＭ  ６７２５ＴのゲノムＤＮＡから増幅した。ｃｂ１５８１遺伝子は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
Cb1581Forward: 5’- GACGACGACAAGATGCTCAGAGACATAGTTCCATTTGGC-3’（配列番号１４４）
Cb1581Reverse: 5’- GAGGAGAAGCCCGGTTATTCTATATCAATTGTTCTTACATC-3’（配列番号１４５）
ポリメラーゼ連鎖反応の混合物は、以下のものを含んでいた：
【０８６１】
【表６９】
2014509836.tif 000071
【０８６２】
ゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅するために、以下のＰＣＲサイクルを用いた：
【０８６３】
【表７０】
2014509836.tif 000072
【０８６４】
上述したＰＣＲ反応の後、ｃｂ１５８１遺伝子の増幅を、１％アガロースゲル電気泳動によって確かめた。ゲル上の予想されるバンドに一致するＤＮＡを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【０８６５】
NovagenのｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣキットを用いて、精製した各ＤＮＡを処理し、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにライゲーションした。精製したＤＮＡの処理は、次の通りである：
【０８６６】
【表７１】
2014509836.tif 000073
【０８６７】
以下のプロトコールを用いて、ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣベクターにインサートをアニールした。
【０８６８】
【表７２】
2014509836.tif 000074
【０８６９】
ｃｂ１５８１−ｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣライゲーション混合物を、エレクトロポレーション法によって大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄに導入し、細胞を、ＬＢ−アンピシリン上にプレーティングした。３７℃において一晩インキュベートした後、４つのコロニーを選んで、６ｍＬのＬＢ−アンピシリン培地に植えつけた。１６時間の激しい通気によって培養物を３７℃で増殖させ、ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）を細胞培養物から作製した。プラスミドＤＮＡのサイズを確かめるために、プラスミドを次いで１％アガロースゲル上で電気泳動した。遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認した後、遺伝子の配列を読んで、その完全性を確かめた。
【０８７０】
遺伝子発現のため、プラスミドの１つを、ヒートショック法によって大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬに形質転換し、そして、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢプレート上にプレーティングし、一晩、３７℃でインキュベートした。５〜６つのコロニーを、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した１０ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６時間培養した。１０ｍＬの培養物を、同じ濃度の２つの抗生物質を添加した１０００ｍｌのＬＢブロスに植えつけ、６００ｎｍにおける吸光度が０．３に達するまで、３７℃で培養した。誘導因子であるＩＰＴＧを次いで、０．１ｍＭの最終濃度で添加し、培養を１６℃で一晩続けた。
【０８７１】
（タンパク質精製）
培養物を遠心分離し、細胞ペレットを回収した。次いで、ペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に懸濁した。細胞中のタンパク質を、フレンチプレス細胞粉砕機を通じて遊離させた。細胞残骸をペレットするために１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を、コバルト導入レジン（ＴＡＬＯＮ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）にアプライし、結合していないタンパク質を除去するために３回洗浄した。結合したタンパク質（６−ヒスチジン標識化Ｃｂ１５８１）を、次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５）を用いて、レジンから溶出した。
【０８７２】
ＰＣＲプライマーの設計によって、タンパク質がプラスミドにコードされた６−ヒスチジンに融合することを確実にした。６つのヒスチジンは、ニッケル導入レジンまたはコバルト導入レジンに結合する。結合したタンパク質は、イミダゾールを含んでいるバッファーを用いて、レジンから除去できる。この方法によって、目的のタンパク質を素早く精製することできる。
【０８７３】
（Ｃｂ１５８１の遺伝子およびタンパク質の配列）
Ｃｂ１５８１野生型のアミノ酸配列
野生型Ｃｂ１５８１のアミノ酸配列は、配列番号１４６に開示されている。野生型Ｃｂ１５８１遺伝子をプラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣにクローニングするための処理によって、６つのヒスチジンを含んでいるペプチドをコードする短いヌクレオチド配列に、遺伝子が融合する。この短いペプチドを含んでいる野生型Ｃｂ４８６のアミノ酸配列は、配列番号１４９に開示されている。この短いペプチドのアミノ酸は、配列番号１４９のアミノ酸１〜１４である。
【０８７４】
Ｃｂ１５８１野生型のヌクレオチド配列
野生型Ｃｂ１５８１のヌクレオチド配列は、配列番号１４７に開示されている。プラスミドｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ由来の短いペプチドをコードする配列を含んでいる野生型Ｃｂ１５８１のヌクレオチド配列は、配列番号１４８に開示されている。この短いペプチドヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、配列番号１４８のヌクレオチド１〜４２である。
【０８７５】
ｃｂ１５８１遺伝子を、大腸菌において発現させた。そして、プラスミドによってコードされている６−ヒスチジンを利用するＴＡＬＯＮレジン精製工程を用いた１工程においてタンパク質を精製した。図８３は、精製したＣｂ１５８１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０８７６】
（マイクロ波前処理されたススキの酵素的加水分解の向上）
図８４は、マイクロ波前処理されたススキの酵素的加水分解を、７０℃（Ａ）または８０℃（Ｂ）において、Ｃｂ１５８１が向上させる効果を示している。加水分解を、ｐＨ６．０で、基質として１０％のススキを添加して全量５００μＬ中に、各０．５μＭのセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物を用いて行った。酵素混合物に含まれる酵素は、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ２４８７、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ１６２である。２ｍＬのマイクロ遠心チューブを、化学天秤において「ゼロ」に合わせた。次いで、５０±０．２ｍｇのマイクロ波前処理されたススキを各チューブに添加した。これらのチューブを、ＥｃｈｏＴｈｅｒｍＴＭＲＴ１１  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｓｐｅｅｄ  Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｍｉｘｅｒｓ（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により連続回転させて、７０℃または８０℃で２４時間、インキュベートした。
【０８７７】
マイクロ波前処理されたススキを酵素によって加水分解した後に、Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．の方法（A new reaction for colorimetric determination carbohydrates. Anal. Chem. 1972: 47; 273-279）に従って、グルコース同等物の濃度を測定した。反応後、チューブを、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。４５μＬの水および５μＬのサンプル上清を、ｐＨＢＡＨアッセイのためのきれいな１．５ｍＬ遠心チューブに移した。１ｍＬのグルコースのストック溶液を、クエン酸ナトリウムバッファーにおける濃度が２０ｍＭになるように作製し、次の各濃度（２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ）になるように、クエン酸ナトリウムバッファーにおいて連続的な希釈を行った。５０ｍｇのｐＨＢＡＨを、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍＬの氷冷クエン酸／ＮａＯＨ溶液に溶かし、この溶液を氷上に保持した。１５０μＬのｐＨＢＡＨ溶液を、５０μＬのサンプルおよびグルコース標準溶液に添加し、チューブを１００℃で１０分間インキュベートした。チューブを、室温で５分間インキュベートした。標準およびサンプルについて、４１０ｎｍにおける波長を測定した。Ａ４１０ｎｍとグルコース濃度とを、互いに対してプロットし、線形回帰を用いて、データに対してフィットする線を求めた。相関係数（Ｒ２）値は、０．９８と１．０との間であった。標準カーブからの式を用いて、サンプルにおける吸光度に基づきサンプルの還元末端の濃度を算出した。７０℃および８０℃の何れにおいても、反応混合物におけるＣｂ１５８１の量が増加するに従って、糖の遊離は向上した。
【０８７８】
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【図面の簡単な説明】
【０８７９】
【図１】キシランなどの典型的なヘミセルロースのモデルを示す図である。
【図２Ａ】Ｃｂ１９３およびＣｂ１９５タンパク質の推定ドメイン構造を示す図である。
【図２Ｂ】精製したＣｂ１９３およびＣｂ１９５のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２Ｃ】ＴＣＬ分析を用いた、天然基質に対するＣｂ１９３の酵素活性を示す図である。
【図２Ｄ】ＴＣＬ分析を用いた、天然基質に対するＣｂ１９５の酵素活性を示す図である。
【図２Ｅ】還元糖アッセイからの、天然基質に対するＣｂ１９３およびＣｂ１９５の酵素活性を示す図である。
【図３Ａ】Ｃｂ１９３の熱安定性を示す図である。
【図３Ｂ】Ｃｂ１９５の熱安定性を示す図である。
【図４ＡＡ】コムギアラビノキシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す図である。
【図４ＡＢ】オートスペルトキシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す図である。
【図４ＡＣ】カバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す図である。
【図４ＢＡ】コムギアラビノキシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す図である。
【図４ＢＢ】オートスペルトキシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す図である。
【図４ＢＣ】カバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９３の反応速度データを示す図である。
【図５ＡＡ】コムギアラビノキシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す
【図５ＡＢ】オートスペルトキシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す図である。
【図５ＡＣ】カバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す図である。
【図５ＢＡ】コムギアラビノキシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す図である。
【図５ＢＢ】オートスペルトキシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す図である。
【図５ＢＣ】カバ材キシランの加水分解におけるＣｂ１９５の反応速度データを示す図である。
【図６Ａ】精製したＣｂ１１７２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６Ｂ】還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１１７２の酵素活性を示す図である。
【図６Ｃ】ＨＰＬＣ分析を用いた、天然基質に対するＣｂ１１７２の酵素活性を示す図である。
【図６Ｄ】Ｃｂ１１７２タンパク質のドメイン構造を示す図である。
【図６Ｅ】Ｃｂ１１７２の熱安定性を示す図である。
【図７Ａ】ｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシドの加水分解におけるＣｂ１１７２の反応速度データを示す図である。
【図７Ｂ】ｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシドの加水分解におけるＣｂ１１７２の反応速度データを示す図である。
【図８Ａ】Ｃｂ９０９の推定ドメイン構造を示す図である。
【図８Ｂ】精製したＣｂ９０９のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８Ｃ】Ｃｂ９０９の活性を示す図である。
【図８ＤＡ】至適ｐＨアッセイの結果を示す図である。
【図８ＤＢ】至適ｐＨアッセイの結果を示す図である。
【図８ＤＣ】至適ｐＨアッセイの結果を示す図である。
【図８ＥＡ】至適温度アッセイの結果を示す図である。
【図８ＥＢ】至適温度アッセイの結果を示す図である。
【図８ＥＣ】至適温度アッセイの結果を示す図である。
【図９Ａ】Ｃｂ２４８７の推定ドメイン構造を示す図である。
【図９Ｂ】精製したＣｂ２４８７のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図９Ｃ】Ｃｂ２４８７の至適ｐＨを決定する生化学アッセイを示す図である。
【図９Ｄ】Ｃｂ２４８７の至適温度を決定する生化学アッセイを示す図である。
【図９ＥＡ】基質としてｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシドを用いたＣｂ２４８７の反応速度パラメータを示す図である。
【図９ＥＢ】基質としてｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシドを用いたＣｂ２４８７の反応速度パラメータを示す図である。
【図９Ｆ】キシロオリゴ糖に対するＣｂ２４８７の加水分解活性を示す図である。
【図９Ｇ】Ｃｂ２４８７についての熱安定性アッセイを示す図である。
【図９Ｈ】β−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）とα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）との相乗作用を示す図である。
【図１０Ａ】Ｃｂ１６２のドメイン構造を示す図である。
【図１０Ｂ】精製したＣｂ１６２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１０Ｃ】は、パラニトロフェノール付加アセテート（ｐＮＰ−アセテート）を基質として用いた、ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２のｐＨプロファイルを示す図である。
【図１０Ｄ】ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の温度プロファイルを示す図である。
【図１０Ｅ】ｐＮＰ−アセテートにおけるＣｂ１６２の熱安定性プロファイルを示す図である。
【図１０Ｆ】Ｃｂ１６２の反応速度実験を示す図である。
【図１１Ａ】可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）の加水分解における、C. besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す図である。
【図１１Ｂ】可溶性コムギアラビノキシラン（ＳＷＡＸ）の加水分解における、C. besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す図である。
【図１２Ａ】オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）の加水分解における、C. besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す図である。
【図１２Ｂ】オートスペルトキシラン（ＯＳＸ）の加水分解における、C. besciiのヘミセルラーゼ酵素の相乗作用を示す図である。
【図１３Ａ】種々の温度における、ヘミセルラーゼカクテルによる可溶性コムギアラビノキシランの加水分解を示す図である。
【図１３Ｂ】種々の温度における、ヘミセルラーゼカクテルによるカバ材キシランの加水分解を示す図である。
【図１３Ｃ】種々の温度における、ヘミセルラーゼカクテルによるオートスペルトキシランの加水分解を示す図である。
【図１４Ａ】ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＳＷＡＸの加水分解が向上したことを示す図である。
【図１４Ｂ】ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＢＷＸの加水分解が向上したことを示す図である。
【図１４Ｃ】ヘミセルラーゼ混合物中に２つのキシラナーゼ（Ｃｂ１９５およびＣｂ１９３）を添加することによってＯＳＸの加水分解が向上したことを示す図である。
【図１５Ａ】Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによる可溶性コムギアラビノキシランの加水分解を示す図である。
【図１５Ｂ】Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによる可溶性コムギアラビノキシランの加水分解を示す図である。
【図１６Ａ】Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるカバ材キシランの加水分解を示す図である。
【図１６Ｂ】Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるカバ材キシランの加水分解を示す図である。
【図１７Ａ】Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるオートスペルトキシランの加水分解を示す図である。
【図１７Ｂ】Caldicellulosiruptor besciiのヘミセルラーゼカクテルによるオートスペルトキシランの加水分解を示す図である。
【図１８】野生型Ｃｂ１９５２およびその短縮型変異体の概略構成を示す図である。
【図１９】Ｃｂ１９５２野生型およびその短縮型変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２０】還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５２ＷＴの酵素活性を示す図である。
【図２１】還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ１の酵素活性を示す図である。
【図２２】還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性を示す図である。
【図２３】グルコースおよびセロオリゴ糖に対する、Ｃｂ１９５２ＷＴ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１およびＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を示す図である。
【図２４】マンノースおよびマンノオリゴ糖に対する、Ｃｂ１９５２ＷＴ、Ｃｂ１９５２ＴＭ１およびＣｂ１９５２ＴＭ５の酵素活性の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を示す図である。
【図２５】セルロース基質に対するＣｂ１９５２ＴＭ１の酵素活性のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図２６】Ｃｂ１９５２ＴＭ１によるＰＡＳＣの経時的な加水分解のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図２７】活性測定の基質としてＰＡＳＣを用いたＣｂ１９５２ＷＴの熱安定性を示す図である。
【図２８】活性測定の基質としてＰＡＳＣを用いたＣｂ１９５２ＴＭ１の熱安定性を示す図である。
【図２９】野生型（ＷＴ）Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５３ＴＭ１およびＣｂ１９５３ＴＭ２のドメイン構造を示す図である。
【図３０】精製した野生型Ｃｂ１９５３、Ｃｂ１９５３ＴＭ１およびＣｂ１９５３ＴＭ２タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図３１】カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）におけるＣｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２のザイモグラムを示す図である。
【図３２】還元糖アッセイによる、Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２の天然基質に対する酵素活性を示す図である。
【図３３】ＴＬＣによる、Ｃｂ１９５３ＷＴ、Ｃｂ１９５３ＴＭ１、およびＣｂ１９５３ＴＭ２の天然基質に対する酵素活性を示す図である。
【図３４】ＰＡＳＣに対するＣｂ１９５３ＴＭ２の酵素活性の経時的なＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図３５】ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＷＴの熱安定性を示す図である。
【図３６】ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＴＭ２の熱安定性を示す図である。
【図３７Ａ】ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＷＴの反応速度実験を示す図である。
【図３７Ｂ】ＰＡＳＣにおけるＣｂ１９５３ＴＭ２の反応速度実験を示す図である。
【図３８】野生型（ＷＴ）Ｃｂ１９５４、Ｃｂ１９５４ＴＭ３およびＣｂ１９５４ＴＭ５ポリペプチドのドメイン構造を示す図である。
【図３９Ａ】精製したＣｂ１９５４ＴＭ３タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図３９Ｂ】還元糖アッセイによる、天然基質に対するＣｂ１９５４ＴＭ３の酵素活性を示す図である。
【図４０】セルロース性基質に対するＣｂ１９５４ＴＭ３の酵素活性のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図４１】Ｃｂ１９５４ＴＭ３の熱安定性を示す図である。
【図４２】野生型（ＷＴ）Ｃｂ１９４６、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２ポリペプチドのドメイン構造を示す図である。
【図４３】精製した野生型Ｃｂ１９４６、Ｃｂ１９４６ＴＭ１およびＣｂ１９４６ＴＭ２タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図４４】カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）アガープレートにおけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１、およびＣｂ１９４６ＴＭ２のザイモグラムを示す図である。
【図４５】リン酸膨張セルロールにおけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２の酵素活性の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を示す図である。
【図４６】リン酸膨張セルロールにおけるＣｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ１９４６ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２の酵素活性の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を示す図である。
【図４７】野生型Ｃｂ６２９およびＣｂ６２９ＴＭ１ポリペプチドのドメイン構造を示す図である。
【図４８】精製したＣｂ６２９ＴＭ１タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図４９】還元糖アッセイを用いて測定した産物による、基質に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性を示す図である。
【図５０】基質に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図５１】セロオリゴ糖に対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性のＴＬＣ分析を示す図である。
【図５２】Ｃｂ６２９ＴＭ１の熱安定性を示す図である。
【図５３Ａ】野生型Ｃｂ４８６のドメイン構造を示す図である。
【図５３Ｂ】精製した野生型Ｃｂ４８６タンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図５４】キシロオリゴ糖（Ｘ２−Ｘ６）に対するＣｂ４８６の酵素活性のＴＬＣ分析を示す図である。
【図５５】グルコースおよびセロオリゴ糖に対するＣｂ４８６の酵素活性のＴＬＣ分析を示す図である。
【図５６Ａ】Ｃｂ４８６の活性のｐＨプロファイルを示す図である。
【図５６Ｂ】Ｃｂ４８６の活性の温度プロファイルを示す図である。
【図５７Ａ】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼからなるセルラーゼ混合物の、ドメイン構造を示す図である。
【図５７Ｂ】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼからなるセルラーゼ混合物の、精製したタンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図５８】ヘミセルラーゼＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、Ｃｂ２４８７、およびＣｂ１６２の精製したタンパク質を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図５９】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理されたススキ（マイクロ波で前処理された）のサンプルのＴＬＣ分析を示す図である。
【図６０】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理されたススキ（マイクロ波で前処理された）のサンプルのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図６１】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理されたススキ（オートクレーブで前処理された）のサンプルのＴＬＣ分析を示す図である。
【図６２】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理されたススキ（オートクレーブで前処理された）のサンプルのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図６３】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物（混合物はβ−グルコシダーゼＣｂ４８６を欠く）ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理された８％のススキ（マイクロ波で前処理された）のサンプルのＴＬＣ分析を示す図である。
【図６４】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物（混合物はβ−グルコシダーゼＣｂ４８６を欠く）ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理された８％のススキ（マイクロ波で前処理された）のサンプルのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図６５】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物（混合物はβ−グルコシダーゼＣｂ４８６を欠く）ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理された８％のススキ（オートクレーブで前処理された）のサンプルのＴＬＣ分析を示す図である。
【図６６】Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ１９４６ＴＭ２、Ｃｂ１９５２ＴＭ１、Ｃｂ１９５３ＴＭ２、およびＣｂ１９５４ＴＭ３セルラーゼを含んでいるセルラーゼ混合物（混合物はβ−グルコシダーゼＣｂ４８６を欠く）ならびに／またはＣｂ１９３、Ｃｂ１９５、Ｃｂ１１７２、Ｃｂ９０９、およびＣｂ２４８７ヘミセルラーゼを含んでいるヘミセルラーゼ混合物を用いて処理された８％のススキ（オートクレーブで前処理された）のサンプルのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図６７Ａ】Ｃｂ１９５２ＴＭ１の活性のｐＨプロファイルを示す図である。
【図６７Ｂ】Ｃｂ１９５２ＴＭ１の活性の温度プロファイルを示す図である。
【図６８Ａ】Ｃｂ１９５３ＴＭ２をセロヘキサオースと共にインキュベートすることによって生じた切断産物についてのＴＬＣ分析を示す図である。
【図６８Ｂ】Ｃｂ１９５３ＴＭ２をセロヘキサオースと共にインキュベートすることによって生じた切断産物についてのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図６９Ａ】Ｃｂ１９５４ＴＭ３の活性のｐＨプロファイルを示す図である。
【図６９Ｂ】Ｃｂ１９５４ＴＭ３の活性の温度プロファイルを示す図である。
【図７０Ａ】Ｃｂ６２９ＴＭ１の活性のｐＨプロファイルを示す図である。
【図７０Ｂ】Ｃｂ６２９ＴＭ１の活性の温度プロファイルを示す図である。
【図７１】ＰＡＳＣに対するＣｂ６２９ＴＭ１の酵素活性の経時的なＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図７２】Ｃｂ４８６の基質特異性分析を示す図である。
【図７３Ａ】セルロースおよび／またはヘミセルロース混合物による、処理されたススキの加水分解を示す図である。
【図７３Ｂ】セルロースおよび／またはヘミセルロース混合物による、処理されたススキの加水分解を示す図である。
【図７３Ｃ】セルロースおよび／またはヘミセルロース混合物による、処理されたススキの加水分解を示す図である。
【図７３Ｄ】セルロースおよび／またはヘミセルロース混合物による、処理されたススキの加水分解を示す図である。
【図７４】Ｃｂ４８６を含んでいない酵素混合物による、処理されたススキの加水分解を示す図である。
【図７５Ａ】Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、およびＣｂ４８６ポリペプチドのドメイン構造を示す図である。
【図７５Ｂ】Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、Ｃｂ４８６、または混合物（Ｃｂ１９５２ＴＭ２、Ｃｂ１９５４ＴＭ３、Ｃｂ６２９ＴＭ１、およびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる）によって処理された、前処理されたススキ（ＡＣ＝オートクレーブ；ＭＷ＝マイクロ波）のサンプルの分析を示す図である。
【図７６】Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６、またはＣｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる混合物を用いた還元糖アッセイを示す図である。
【図７７Ａ】Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６、またはＣｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる混合物により処理したＰＡＳＣの分析を示す図である。
【図７７Ｂ】Ｃｂ１９４６ＷＴ、Ｃｂ４８６、またはＣｂ１９４６ＷＴおよびＣｂ４８６セルラーゼを含んでいる混合物により処理したアビセルの分析を示す図である。
【図７８Ａ】Ｃｂ１９５２ＷＴによる、ＰＡＳＣの経時的な加水分解を示す図である。
【図７８Ｂ】Ｃｂ１９５２ＴＭ１による、ＰＡＳＣの経時的な加水分解を示す図である。
【図７８Ｃ】Ｃｂ１９５２ＴＭ５による、ＰＡＳＣの経時的な加水分解を示す図である。
【図７９】Ｃｂ１９５２のＧＨ９ドメインのアミノ酸配列、ならびにCloceCel9G（Clostridium cellulolyticum Cel9G，GenBankアクセッション番号：AAA73868）（２６）およびThefuCel9A（Thermobifida fusca Cel9A，GenBankアクセッション番号：AAB42155）（３４）のＧＨ９ドメインのアミノ酸配列を示す図である。
【図８０Ａ】Ｃｂ１９５２野生型およびその短縮型変異体の、アビセルとの定性的な結合を示す図である。
【図８０Ｂ】Ｃｂ１９５２野生型およびその短縮型変異体の、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）との定性的な結合を示す図である。
【図８１Ａ】セルラーゼ活性を有するＣｂ１９５２およびその短縮型変異体の熱安定性を示す図である。
【図８１Ｂ】セルラーゼ活性を有するＣｂ１９５２およびその短縮型変異体の熱安定性を示す図である。
【図８１Ｃ】セルラーゼ活性を有するＣｂ１９５２およびその短縮型変異体の熱安定性を示す図である。
【図８２】Ｃｂ１９５２のＣＢＭ３ｃのアミノ酸配列、および他のファミリー９グリコシドヒドロラーゼ由来のＣＢＭ３ｃのアミノ酸配列を示す図である。
【図８３】精製したＣｂ１５８１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８４Ａ】マイクロ波で前処理されたススキの酵素的加水分解を、７０℃において、Ｃｂ１５８１が向上させる効果を示す図である。
【図８４Ｂ】マイクロ波で前処理されたススキの酵素的加水分解を、８０℃において、Ｃｂ１５８１が向上させる効果を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４ＡＡ】
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【図４ＡＢ】
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【図４ＡＣ】
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【図４ＢＡ】
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【図４ＢＢ】
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【図４ＢＣ】
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【図５ＡＡ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＡＣ】
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【図５ＢＡ】
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【図５ＢＢ】
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【図５ＢＣ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８ＤＡ】
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【図８ＤＢ】
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【図８ＤＣ】
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【図８ＥＡ】
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【図８ＥＢ】
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【図８ＥＣ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９ＥＡ】
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【図９ＥＢ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７３Ｃ】
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【図７３Ｄ】
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【図７４】
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【図７５Ａ】
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【図７５Ｂ】
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【図７６】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７８Ｃ】
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【図７９】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８１Ｃ】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月28日(2013.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、
ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、
ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、
ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、
ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、
ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、および
ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：
からなる群より選択される２つ以上の組換え核酸を含んでいる、宿主細胞。
【請求項２】
２つ以上の組換え核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号８のヌクレオチド配列、配列番号１４のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２８のヌクレオチド配列、配列番号３４のヌクレオチド配列、および配列番号３８のヌクレオチド配列からなる群より選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチド、およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチド、およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の組換え核酸を含んでいる、宿主細胞。
【請求項５】
上記組換えＣｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４のポリペプチド、配列番号１１４のポリペプチド、配列番号１２４のポリペプチド、配列番号１２６のポリペプチド、配列番号１２８のポリペプチド、および配列番号４６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０のポリペプチド、配列番号６１のポリペプチド、および配列番号１１１のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４のポリペプチド、配列番号１２１のポリペプチド、および配列番号７６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６のポリペプチド、配列番号８７のポリペプチド、および配列番号１１３のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８のポリペプチド、配列番号１１９のポリペプチド、および配列番号１００のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである、請求項３または４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ａ）配列番号３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸、
ｂ）配列番号７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９５）］をコードする核酸、
ｃ）配列番号１３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−アラビノフラノシダーゼ（Ｃｂ１１７２）］をコードする核酸、
ｄ）配列番号１９のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのα−グルクロニダーゼ（Ｃｂ９０９）］をコードする核酸、
ｅ）配列番号２７のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのβ−キシロシダーゼ（Ｃｂ２４８７）］をコードする核酸、
ｆ）配列番号３３のポリペプチド［Caldicellulosiruptor besciiのアセチルキシランエステラーゼ（Ｃｂ１６２）］をコードする核酸、および
ｇ）配列番号３７のポリペプチド［シグナルペプチドを欠いたCaldicellulosiruptor besciiのエンドキシラナーゼ（Ｃｂ１９３）］をコードする核酸：
からなる群より選択される１つ以上の組換え核酸をさらに含んでいる、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
１つ以上のセルラーゼを生産する方法であって、
ａ）請求項４〜６の何れか１項に記載の宿主細胞を、培養培地中、上記組換え核酸の発現を支持するのに十分な条件下で培養すること；および
ｂ）上記培地および／または上記宿主細胞から、１つ以上のセルラーゼを回収すること：を含んでいる、方法。
【請求項８】
配列番号３のポリペプチド配列、配列番号７のポリペプチド配列、配列番号１３のポリペプチド配列、配列番号１９のポリペプチド配列、配列番号２７のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、および配列番号３７のポリペプチド配列からなる群より選択される２つ以上の組換えタンパク質を含んでいる、組成物。
【請求項９】
Ｃｂ１９５２ポリペプチド、Ｃｂ１９５３ポリペプチド、Ｃｂ１９５４ポリペプチド、Ｃｂ１９４６ポリペプチド、Ｃｂ６２９ポリペプチド、およびＣｂ４８６ポリペプチドからなる群より選択される１つ以上の組換えポリペプチドを含んでいる、組成物。
【請求項１０】
上記組換えＣｂ１９５２ポリペプチドは、配列番号４４のポリペプチド、配列番号１１４のポリペプチド、配列番号１２４のポリペプチド、配列番号１２６のポリペプチド、配列番号１２８のポリペプチド、および配列番号４６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５３ポリペプチドは、配列番号６０のポリペプチド、配列番号６１のポリペプチド、および配列番号１１１のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９５４ポリペプチドは、配列番号７４のポリペプチド、配列番号１２１のポリペプチド、および配列番号７６のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ１９４６ポリペプチドは、配列番号８６のポリペプチド、配列番号８７のポリペプチド、および配列番号１１３のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ６２９ポリペプチドは、配列番号９８のポリペプチド、配列番号１１９のポリペプチド、および配列番号１００のポリペプチドからなる群より選択され；
上記組換えＣｂ４８６ポリペプチドは、配列番号１０６のポリペプチドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
バイオマスを分解する方法であって、
バイオマスを、請求項１〜６の何れか１項に記載の宿主細胞または請求項８〜１０の何れか１項に記載の組成物と接触させて、糖溶液を得ることを含んでいる、方法。
【請求項１２】
少なくとも一部が４０℃〜８０℃の温度において行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃｂ１５８１ポリペプチドをコードする組換え核酸をさらに含んでいる、請求項１〜６の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
Ｃｂ１５８１ポリペプチドをさらに含んでいる、請求項８〜１０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
ヘミセルロースを分解する方法であって、
ａ）ヘミセルロースを含んでいる植物材料を用意する工程；および
ｂ）配列番号３のポリペプチド、配列番号７のポリペプチド、配列番号１３のポリペプチド、配列番号１９のポリペプチド、配列番号２７のポリペプチド、配列番号３３のポリペプチド、および配列番号３７のポリペプチドからなる群より選択される２つ以上の酵素を用いて、上記ヘミセルロースを処理する工程：を含んでおり、
上記ヘミセルロースは、β−１，４−結合を含むキシロース骨格と１つ以上の官能基とを含んでおり、
上記処理する工程は、上記１つ以上の官能基を上記キシロース骨格から切断して、切断ヘミセルロースを形成させるものである、方法。
【国際調査報告】
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