(57)【要約】  細胞増殖を阻止もしくは阻害するための、または細胞死を誘導するための活性物質の調製における、式Xの化合物、またはそのそれぞれの異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物であって、式中P1は、１つの６員環および２つの５員環を含む縮合環系であり、vはSもしくはR立体配置を示す化合物。【選択図】図１６
2014527979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖を阻止もしくは阻害するための、または細胞死を誘導するための活性物質の調製における、式Xの化合物、
【化１】
2014527979.tif 000025
[式中、P1は1つの６員環および2つの5員環を含む縮合環系である；ならびに
【化２】
2014527979.tif 000026
はSもしくはRの立体配置を示す]
またはその個別の異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物の使用。
【請求項２】
活性物質が抗腫瘍医薬である、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
抗腫瘍医薬組成物の調製において、P1は次式
【化３】
2014527979.tif 000027
[式中、
【化４】
2014527979.tif 000028
は、連結ポイントを示す；
破線は二重結合であってもよいことを示す；
R1 およびR6は、互いに独立に、H、OH、C1-C6アルキル（ハロゲン原子で置換されていてもよい）、C2-C6 アルケニル、C2-C6 アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、アルキルで置換されていてもよい；
P2は、置換されていてもよい6員環である；
ZおよびYは互いに独立にO、CH、またはNである；ならびに
mおよびnは互いに独立に0または1である；
ただしZがOならば、mは0であり、ZがCHまたはNであるならば、mは1である；ならびに
YがOならば、nは0であり、YがCHまたはNであるならば、nは1である]
を有するものである、
またはその個別の異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物である、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
P2が
【化５】
2014527979.tif 000029
[式中、
R2 またはR5は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、N-一置換もしくはN,N-二置換カルバモイル、アミノ、一置換もしくは二置換アミノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール基、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である；
R3またはR4は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C6アルキル、シクロアルキル、ベンズシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールもしくは置換フェニル、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である；
R7はH、OH、CH3、CH2OH、またはOAcである；
R8はOまたはOHであって、このR8がOならば、その結合は二重結合となる；
R9はH、OH、またはOAcである]
からなる一群から選択される、請求項3に記載の使用。
【請求項５】
式Xの化合物が式Iの化合物
【化６】
2014527979.tif 000030
[式中、R7、R8、およびR9は請求項４に記載のとおりである；ならびに
R10はH、OH、またはOAcである]
である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
P1が次式II
【化７】
2014527979.tif 000031
[式中、
【化８】
2014527979.tif 000032
は、連結ポイントを示す；
破線は二重結合であってもよいことを示す；
R1、R6、P、Q、Z、Y、m、およびnは、請求項3に記載のとおりである；ならびに
R2、R3、R4、およびR5は、請求項４に記載のとおりである]
を有する、請求項1に記載の使用。
【請求項７】
抗腫瘍製剤が、乳癌、肺癌、前立腺癌、もしくは結腸癌、および黒色腫からなる一群から選択される疾患の治療に適している、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
抗腫瘍製剤が、さらに１つもしくは複数の追加の医薬活性化合物を含有する、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
式IIの化合物が、
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)-メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-7-ブロモ-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(2-チエニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-7-(1-メトキシナフタレン-2-イル)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチルシクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、および
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、ならびに
それらの組合せからなる１群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の式Xの化合物、またはその個別の異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を含んでなる、抗増殖組成物。
【請求項１１】
癌幹細胞（CSC）もしくは腫瘍始原細胞（TIC）を死滅させるのに適している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
酵母および真菌の増殖を阻止もしくは阻害し、または酵母および真菌を死滅させるのに適している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
局所、腸内、経口、直腸、または非経口投与に適している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
増殖性疾患を治療する方法であって、治療の必要な患者に、請求項１に記載の式Xの化合物、またはその異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
式Xの化合物が、少なくとも1つの他の治療薬の前、後、または同時に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式Iの化合物が、
【化９】
2014527979.tif 000033
から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項１７】
式Xの化合物が、
【化１０】
2014527979.tif 000034
からなる１群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
抗増殖剤として使用するための、請求項１に記載の
【化１１】
2014527979.tif 000035
式Xの化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖を阻止または阻害するための活性物質として、ストリゴラクトンおよび/またはストリゴラクトンアナログを、単独で、または1つもしくは複数の追加の医薬活性化合物と任意に組み合わせて使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類の全体にわたって言及されるすべての刊行物は、参照することによって本明細書に完全に組み入れられるが、これにはそこに引用されるすべての参考文献が含まれる。
【０００３】
腫瘍性疾患は、新生組織形成に起因する異常な組織塊−異常な細胞増殖で特徴付けられる。それは通常、しこりまたは腫瘍を生じさせる。新生物は良性、前癌状態（上皮内癌）、または悪性（癌）の可能性がある。ヒトの癌疾患、たとえば乳癌および肺癌は、今のところ世界中で毎年数百万人の命を奪っている。最近、癌は、世界で死亡原因の第1位となった。この数十年の間に乳癌および肺癌の治療においてなされた積極的なアプローチにもかかわらず、たとえば肺癌に関する5年生存率は、依然として＜15％である。手術、化学療法、および放射線治療は、概して、特に進行した疾患には不十分であった。したがって、さまざまなタイプの悪性癌の治療効果を改善するために、疾患を生物学的により深く理解することに基づく新薬が、明らかに必要とされている。
【０００４】
植物抽出物に由来する天然化合物またはそうした化合物の誘導体は、乳癌および非小細胞肺癌の治療に使用されている、たとえばパクリタキセルなどのように、ヒト癌細胞増殖阻害剤として用いられる抗癌剤として、活性を有することが明らかになっている。
【０００５】
パクリタキセルは、1967年に米国国立癌研究所で発見され、その研究者らは、タイヘイヨウイチイの木（Taxus brevifolia）の樹皮からパクリタキセルを分離して、タキソールと命名した。この薬は、Bristol-Myers Squibbによって商品として開発されたため、一般名がパクリタキセルに変更された。最近の研究で、パクリタキセルは、Haldar, S. et al., Cancer Res. 56, 1253-1255, 1996に記載のように、プログラム細胞死をもたらすBcl-2リン酸化を癌細胞において誘導することによって、作用することが判明した。もう一つの例は、ビタミンAの天然および合成誘導体を含むレチノイドに関するものであって、これは、たとえば、Amos and Lotan, Methods Enzymol, 190, 217-225, 1990に記載のように、レチノイド依存性転写因子として機能する核内受容体と相互作用することによって、正常上皮細胞および腫瘍上皮細胞の細胞増殖ならびに分化を調節することが明らかになっている。レチノイン酸が、一部の白血病、すなわちPML（前骨髄球性白血病）を治療するために使用されていることは、もっとも注目に値する。
【０００６】
式Iの天然ストリゴラクトンは、
【化１】
2014527979.tif 000003
【０００７】
Dun et al., Trends Plant Sci., 14, 364-372, 2009に記載のように、シュートの分枝抑制に関わり、植物相互作用のためのシグナル伝達分子として関与する、植物ホルモンの一群であって、式中、たとえば、R1はH、OH、もしくはOAcであり、R2はH、OH、もしくはOAcであり、R3はHである。これらの天然に存在する化学物質は、おそらく出発物質としてカロテノイドを用いてほとんどの植物により合成される近縁分子の一群である。ストリゴラクトンは寄生植物種子（たとえばストリゴラクトンの名前のもとになったストライガ属）の発芽を誘引し、共生菌根菌の菌糸分岐を刺激する。
【０００８】
天然に存在するストリゴラクトンのアナログは、合成植物ホルモン(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン (GR-24)であって、これは根分裂組織の細胞周期に影響を与える。この化合物は、天然ストリゴラクトンの生物活性を保持しており、目的の作物を植える前に、寄生種子の発芽を誘導するために使用される可能性がある。
【０００９】
プログラム細胞死は、本来、多細胞生物における環境信号に対する反応として、植物界でよく見られる特徴である。植物のプログラム細胞死の例は、たとえば、秋の落葉、および病原体攻撃時の過敏感反応などである。活性酸素種は、さまざまなタイプの細胞死の制御に関与している。しかしながら、細胞死の開始、およびその後の抑制をもたらすプロセスにおける、活性酸素種の関与の正確なメカニズムは今のところ不明である。ストレス条件下で活性酸素種によって引き起こされる細胞死の制御にシロイヌナズナ（Arabidopsis）タンパク質GRIM REAPERが関与することが示されている。
【００１０】
抗増殖剤は、ヒトおよび動物の健康において、非常に重要な用途を超えた有益な用途があり、植物、酵母、菌類などに応用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Haldar, S. et al., Cancer Res. 56, 1253-1255, 1996
【非特許文献２】Amos and Lotan, Methods Enzymol, 190, 217-225, 1990
【非特許文献３】Dun et al., Trends Plant Sci., 14, 364-372, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、さまざまな生物で細胞増殖を阻止または阻害するための活性物質を提供することである。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、ストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログを含有する薬剤を提供することであり、これは既知の方法および治療と比べて少ない副作用で、さまざまな癌疾患の治療に有効に使用することができる。
【００１４】
本発明のまた１つの目的は、ストリゴラクトンおよび/またはストリゴラクトンアナログを含有する組成物および薬剤、ならびに癌の治療におけるそれらの使用を提供することである。前記組成物および薬剤は、追加の抗癌剤、他の活性物質、および他の添加物を含有してもよい。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、ストリゴラクトンおよび/またはストリゴラクトンアナログを投与することによって癌を治療する方法を提供する。
【００１６】
それに加えて、本発明の使用は、既知の癌治療の望ましくない副作用を軽減または除去する。
【００１７】
上記およびその他の本発明の目的および利点は、説明の進行につれて明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
驚くべきことに、天然ストリゴラクトン（以下「ストリゴラクトン」）および置換されたストリゴラクトンアナログ（以下「ストリゴラクトンアナログ」）は、ヒト癌細胞などの多くの応用において細胞増殖を阻止または阻害するための活性物質として使用することが可能であって、したがって、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌といったさまざまな種類の癌を治療するために使用することができる。
【００１９】
本発明のある実施形態において、細胞増殖を阻止または阻害するための活性物質は、細菌および真菌感染症を治療するのに適しているだけでなく、ヒトを含む動物において、腫瘍性疾患を含むさまざまな疾患および異常の治療に適している。
【００２０】
本発明の特定の実施形態によれば、薬剤は抗腫瘍製剤である。本発明のある実施形態によると、その抗腫瘍製剤は、乳癌、肺癌、前立腺癌、もしくは結腸癌、および黒色腫からなる一群から選択される疾患の治療に適している。場合によっては、抗腫瘍製剤はさらに、1つもしくは複数の追加の活性物質を含有することもできる。
【００２１】
したがって、本発明は、細胞増殖を阻止もしくは阻害するための、または細胞死を誘導するための活性物質の調製に、式Xの化合物、
【化２】
2014527979.tif 000004
【００２２】
またはそのそれぞれの異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を使用することに関するものであって、式中、P1は1つの６員環および2つの5員環を含む縮合環系である；ならびに
【化３】
2014527979.tif 000005
【００２３】
はSもしくはRの立体配置を示す。
【００２４】
本発明のある実施形態によれば、抗腫瘍医薬組成物の調製において、式Xの化合物、またはそのそれぞれの異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物のP1は、次式を有するが、
【化４】
2014527979.tif 000006
【００２５】
式中、
【化５】
2014527979.tif 000007
【００２６】
は、連結ポイントを示す；
破線は二重結合であってもよいことを示す；
R1 およびR6は、互いに独立に、H、OH、C1-C6アルキル（ハロゲン原子で置換されていてもよい）、C2-C6 アルケニル、C2-C6 アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、アルキルで置換されていてもよい；
P2は、置換されていてもよい6員環である；
ZおよびYは互いに独立にO、CH、またはNである；ならびに
mおよびnは互いに独立に0または1である；
ただしZがOならば、mは0であり、ZがCHまたはNであるならば、mは1である；ならびに
YがOならば、nは0であり、YがCHまたはNであるならば、nは1である。
【００２７】
本発明のもう１つの実施形態によれば、式Xの化合物のP2は、下記からなる一群から選択されるが、
【化６】
2014527979.tif 000008
【００２８】
式中、
R2 またはR5は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、N-一置換もしくはN,N-二置換カルバモイル、アミノ、一置換もしくは二置換アミノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール基、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である；
R3またはR4は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C6アルキル、シクロアルキル、ベンズシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールもしくは置換フェニル、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である；
R7はH、OH、CH3、CH2OH、またはOAcである；
R8はOまたはOHであって、このR8がOならば、その結合は二重結合となる；
R9はH、OH、またはOAcである。
【００２９】
特定の実施形態において、式Xの化合物は式Iの化合物であって、
【化７】
2014527979.tif 000009
【００３０】
式中、R7、R8、およびR9は上記のとおりである；ならびにR10はH、OH、またはOAcである。
【００３１】
本発明の別の特定の実施形態において、P1は次式IIを有し、
【化８】
2014527979.tif 000010
【００３２】
式中、
【化９】
2014527979.tif 000011
【００３３】
は、連結ポイントを示す；
破線は二重結合であってもよいことを示す；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、P、Q、Z、Y、m、およびnは、上記の通りである。
【００３４】
特定の実施形態において、式IIの化合物は下記から選択される；
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)-メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-7-ブロモ-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(2-チエニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-7-(1-メトキシナフタレン-2-イル)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチルシクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、および
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、ならびに
それらの混合物。
【００３５】
別の態様において、本発明は、式Xの化合物、またはそのそれぞれの異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を含んでなる、抗増殖組成物に関する。前記組成物は、癌幹細胞（CSC）もしくは腫瘍始原細胞（TIC）を死滅させるのに適しており、局所、腸内、経口、直腸、または非経口投与に適している。前記組成物は、さらに、酵母および真菌の増殖を阻止もしくは阻害し、または酵母および真菌を死滅させるのに適している。
【００３６】
本発明はさらに、増殖性疾患を治療する方法を包含するが、その方法は、治療の必要な患者に式Xの化合物、またはその異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を投与することを含むものである。前記方法は、少なくとも1つの他の癌治療の前、その後、またはそれと同時に、式Xの化合物を投与することを含む可能性がある。
【００３７】
本発明の特定の実施形態において、式Iの化合物は下記から選択される。
【化１０】
2014527979.tif 000012
【００３８】
本発明にしたがって使用することができる式Xのさらに他の天然ストリゴラクトンは、次の式を有する：
【化１１】
2014527979.tif 000013
【００３９】
本発明はさらに、抗増殖剤として使用するための、上記の式Xの化合物
【化１２】
2014527979.tif 000014
【００４０】
に関する。
【００４１】
他に特に規定のない限り、本明細書で使用されるすべての技術および/または科学用語は、本発明の属する分野の当業者が共通して理解する同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似もしくは同等の方法および材料を、本発明の実施形態の実行もしくは実験に使用することができるが、例示的な方法および/または材料を以下に記載する。相反する場合には、定義を含めて本特許明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のためだけのものであって、必ずしも制限することを意図するものではない。
【００４２】
上記の、およびその他の、本発明の特徴および利点は、以下の実施例によって、ならびに添付図を参照することによって、より容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図1は、根端に対するGR-24の影響を表す。GR-24のモル濃度を示す。矢印は膨らんだ根端を指している。スケールバー：50μm。LR-側根。
【図２】図2は、根端の細胞組織化に及ぼすGR-24の影響を表す。GR-24のモル濃度を示す。矢印は異常な細胞分裂の部位を指している。スケールバー：50μm。LR-側根。
【図３Ａ】図3は、乳癌細胞株の増殖に及ぼすGR-24の影響を示す：(A) GR-24に暴露したMDA-MB-231、MDA-MB-436、MCF-7、およびBJ ‘正常’ 線維芽細胞の吸光度のグラフ。
【図３Ｂ】（B) GR-24に7日間暴露した後の吸光度（560 nm）を示すグラフ。略号：Abs. (吸光度)、cont. (対照)、T. (時間)、d. (日)、Fib. (線維芽細胞)。
【図４】図4は、細胞周期の進行に及ぼすGR-24の影響を表す。データは2つの独立した実験を代表するものである。略号：Cell Cyc. Ph. (細胞周期の時期)。
【図５−１】図5は、GR-24存在下でのマモスフェア（mammosphere）の形成を示す。画像は、GR-24存在下、溶媒対照、または未処理（-）で増殖させた初代マモスフェア（A）または第二代マモスフェア（B）またはMDA-MB-231初代マモスフェア（C）の代表的な明視野像（倍率：10x (A, B), 20x (C)）、スケールバー100μM、である。対応する棒グラフは、96ウェルプレートのウェル当たりのマモスフェア（直径100μMより大）の平均数を示すが、これは5xの倍率で可視化されたものである。3連ウェルの平均±標準偏差（SD）として報告されたデータは、少なくとも2回の独立した実験を代表するものである。スチューデントt検定（両側、対応あり）を用いてGR-24処理群を溶媒（対照）群とともに評価し、p < 0.05 (*)ならば有意、p<0.01 (**)ならば非常に有意、p<0.001 (***)ならばきわめて有意であると見なした。  略号：cont. (対照)、conc. (濃度)、Pri. Mam. (初代マモスフェア)、Sec. Mam. (第二代マモスフェア)。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６Ａ】図6は、GR-24処理後の生存率およびALDH発現を示す：(A) GR-24で処理したMCF-7 第二代マモスフェアに関するXTT生存率アッセイ。溶媒対照に対する％として報告されたデータ。棒グラフ、三連サンプルの平均±標準偏差（SD）。スチューデントt検定（両側、対応あり）を用いて5 ppm処理群を対照群とともに評価した、p=0.0065 (**)。
【図６Ｂ】(B) 初代 MCF-7マモスフェアにおけるALDH1発現の分析。  略号：Viab. (生存率)、cont. (対照)、conc. (濃度)、Ad. (付着)、Sec. Mam. (第二代マモスフェア)、Pri. (初代)、exp. (発現)。
【図７Ａ】図7(A)-(C)は、ヒト癌細胞株の増殖および生存率に及ぼすストリゴラクトンアナログの影響を表す。グラフは、それぞれの分析について2連の同型ウェルを用いた2つの独立した実験を代表するものである。  略号：Viab. (生存率)、cont. (対照)、conc. (濃度)。
【図７Ｂ】図７Ａの続きである。
【図７Ｃ】図７Ｂの続きである。
【図８】図8は、ストリゴラクトンアナログで処理された、癌細胞株の細胞周期の分析を示す。略号：Cell Cyc. Dis. (細胞周期分布)、SL Ana. (ストリゴラクトンアナログ)。
【図９−１】図9は、ストリゴラクトンアナログがMDA-MB-231細胞においてアポトーシスを誘導することを示す：(A) ストリゴラクトンアナログST-362で処理したMDA-MB-231細胞のHoechst33342染色（倍率200x。スケールバー、50μM）。(B)-(E) ストリゴラクトン暴露後のXTT生存率アッセイ。  データは、溶媒対照群に対する％として報告される。棒グラフは平均±SDを表す。統計分析、溶媒対照に対するスチューデントt検定（両側、対応あり）は、p<0.05 (*)、p<0.01 (**)、p<0.001 (***)ならば有意であると見なされる。  略号：Vehi. (溶媒)、Viab. (生存率)、cont. (対照)、conc. (濃度)、SL. Rel T. (ストリゴラクトン解除時間)、hr. (時間)。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０−１】図10は、MCF-7マモスフェア形成に及ぼすストリゴラクトンアナログの影響を示す：(A) 直径100μMを超えるマモスフェア数の計数。(B) XTT生存率の評価。(C) 両側スチューデントt検定、p≦0.05 (*)、p≦0.005 (**)、p≦0.001 (***)による、ストリゴラクトンアナログ後のマモスフェア数の統計分析。  略号：Vehi. (溶媒)、Mam. Num. (マモスフェア数)、cont. (対照)、SL ana. (ストリゴラクトンアナログ)、Viab. (生存率)。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１−１】図11は、初代MCF-7マモスフェアの完全性および生存率に及ぼすストリゴラクトンアナログの影響を示す：(A) 2日間のストリゴラクトン処理後の、マモスフェアの代表的な画像（倍率100x、スケールバー、100μM。挿入図、拡大像）。(B)-(C) 5日間ストリゴラクトン処理した後のマモスフェアの数および生存率の統計分析。  統計分析、両側スチューデントt検定、p<0.05 (*), p< 0.01 (**), p<0.001 (***)。  略号：Vehi. (溶媒)、Mam. Num. (マモスフェア数)、cont. (対照)、SL ana. (ストリゴラクトンアナログ)、Viab. (生存率)。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１２−１】図12は、ストリゴラクトンアナログ処理がG2 アレスト（細胞周期進行の停止）を引き起こし、さまざまな癌細胞株のアポトーシスを引き起こすことを示す(A)-(C)。(D)+(G)ストリゴラクトンアナログ処理後の初期（アネキシン-/PI+、グレーの棒グラフ）および後期（アネキシン+/PI+、黒い棒グラフ）アポトーシスにおけるHCT116細胞の分布を示す棒グラフ。(E) ST-357 (中段パネル)またはMEB-55 (下段パネル)によって指定の用量で処理されたHCT116細胞の、DNA含量（横軸）に対するホスホ-Ser10ヒストン-H3（縦軸）の代表的なFACS分析。(F) ストリゴラクトンアナログで処理されたHCT116細胞のFACS分析（アネキシンV染色）。  略号：Cell Cyc. Dis. (細胞周期分布)、Apo. (アポトーシス)、Vehi. (溶媒)。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−２の続きである。
【図１２−４】図１２−３の続きである。
【図１２−５】図１２−４の続きである。
【図１２−６】図１２−５の続きである。
【図１３−１】図13は、ストリゴラクトンアナログがストレス応答を引き起こすことを示す、MDA-MB-231およびHCT116細胞 (A)-(F)、またはDU145細胞 (G)-(L)の免疫ブロット分析である：(A)ST-362または溶媒単独(-)処理後の細胞の免疫ブロット分析。(B) (A)に示すpP38レベルの濃度測定数量化を示す棒グラフ。(C) 溶媒またはST-362（10 ppm）で処理された細胞におけるHSP27リン酸化の免疫ブロット分析。(D) MDA-MB-231細胞をMEB-55 (10 ppm)もしくは溶媒で4時間処理した後のタンパク質発現レベルの免疫ブロット分析。(E) ST-362単独で、またはSBとともに処理された細胞の免疫ブロット分析。(F) MEB-55単独で、またはSBとともに処理された細胞の免疫ブロット分析。(G) MEB-55、または溶媒のみによる処理後の細胞の免疫ブロット分析。(H) (G)に示すさまざまなリン酸化タンパク質の濃度測定数量化を示す棒グラフ。(I) 溶媒もしくはMEB-55で処理された細胞におけるP38、JNK、およびERKリン酸化の免疫ブロット分析。(J) ST-37またはMEB-55で処理した後のpP38の免疫ブロット分析。(K) MEB-55単独で、またはSBとともに処理した後のpHSP27の免疫ブロット分析。(L) MEB-55単独で、またはSBとともに処理された細胞におけるpJNKおよびpHSP27の免疫ブロット分析。(M) MEB-55単独で、またはSBで処理された細胞の生存を示すグラフ。  略号：α-tub. (α-チューブリン)、Fol. Chan. (倍数変化)、Vehi. (溶媒)、Ac. (アセトン)、SB (SB203580)、hr (時間)、Sur. (生存)。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１３−３】図１３−２の続きである。
【図１３−４】図１３−３の続きである。
【図１３−５】図１３−４の続きである。
【図１３−６】図１３−５の続きである。
【図１４】図14は、溶媒単独で、または10 ppmのEG-5もしくはMEB-55で処理されたMDA-MB-231細胞の免疫ブロット分析であって、ストリゴラクトンアナログが生存シグナル伝達を阻害することを示す。
【図１５】図15は、ストリゴラクトンアナログの安定性を示す。略号：Sur. (生存)、Vehi. (溶媒)、cont. (対照)、conc. (濃度)、fr. (新調製)。
【図１６】図16は、基本的なストリゴラクトンである5-デオキシストリゴール、ならびにストリゴラクトンアナログGR-24、EG-5、EG-9C、ST-357、ST-362、およびMEB-55の略図である。
【図１７−１】図17は、結腸(A)または前立腺(B)-(H)細胞が、ストリゴラクトン処理に反応して、G2/M アレストおよびアポトーシスを受けることを示す：(A) ストリゴラクトンアナログで処理されたHCT116細胞におけるサイクリンBの免疫ブロット。(B) MEB-55で処理されたDU145細胞の免疫ブロット。(C) ST-362またはMEB-55で処理されたHCT116細胞の免疫ブロット。(D) MEB-55で処理されたU20S細胞の免疫ブロット。(E) MEB-55で処理されたA549またはHCT116細胞におけるサイクリンB1 mRNAの、GAPDHに対する定量リアルタイムPCR分析。(F) ST-362またはMEB-55で処理されたDU145細胞の免疫ブロット。(G) 細胞周期の進行に及ぼすMEB-55の影響。(H) プロテアソーム阻害剤、ALLN存在下での、ST-362またはMEB-55で処理されたDU145細胞の免疫ブロット。  略号：tub. (チューブリン)、Vehi. (溶媒)、cont. (濃度)、Prop. Iod. (ヨウ化プロピジウム)、hr (時間)、Cell Cyc. Ph. (細胞周期の期)。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−２の続きである。
【図１８】図18は、ST-357またはST-362で処理されたマウスの腫瘍の、平均腫瘍体積を示すグラフである。  略号：Mea. Tum. Vol. (平均腫瘍体積)、cont. (対照)。
【図１９】図19は、ストリゴラクトンアナログ処理が体重に影響を与えないことを示すグラフである。  略号：Wei. (重量)、gr (グラム)、cont. (対照)。
【図２０】図20は、シスプラチンおよびストリゴラクトンアナログの併用治療の相乗効果を示すグラフである。  略号：Sur. Fra. (生存率)、cis. (シスプラチン)。
【図２１】図21は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母培養増殖に及ぼすGR-24の影響を経時的に示すグラフである。  略号：lily (培養増殖培地のみ)、DMSO (溶媒のみ)、H (時間)、OD (光学濃度)、GR-24 μM 濃度を示す。
【図２２】図22は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母培養増殖に及ぼすST-362の影響を示すグラフである。  略号：lily (培養増殖培地のみ)、DMSO (溶媒のみ)、H (時間)、OD (光学濃度)、ST-362 μM 濃度を示す。
【図２３】図23は、カンジダ・オレオフィラ（Candida oleophila）酵母培養増殖に及ぼすST-362の影響を示すグラフである。  略号：lily (培養増殖培地のみ)、DMSO (溶媒のみ)、H (時間)、OD (光学濃度)、ST-362 μM 濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
後に続く実施例は、天然ストリゴラクトン（本明細書では「ストリゴラクトン」と呼ぶ）、ストリゴラクトンアナログ、およびそれらの置換基（本明細書では「ストリゴラクトンアナログ」と称する）の、さまざまな哺乳類系および非哺乳類系における抗増殖剤としての効果、ならびに、ヒト癌細胞の増殖阻害剤としてのそれらの有効性、およびさまざまな種類の癌、たとえば乳癌、結腸癌、肺癌、および/または前立腺癌、または黒色腫の治療におけるそれらの有用性を示す。
【００４５】
本明細書に記載の式Xの化合物は、癌細胞増殖の特異的で顕著な阻害、ならびに腫瘍細胞のプログラム細胞死の誘導を示し、癌疾患の治療に有用である。
【００４６】
後述の説明および実施例において、明細書で「ストリゴラクトンアナログ」と称される式IIの化合物、およびそれらの異性体に言及する（原子の番号はIUPACの系統的番号付け法にしたがって付けられている）。
【００４７】
少なくとも１つの不斉炭素原子が、式IIの化合物の(R)-、(S)-、または(R,S)-立体配置、好ましくは (R)-または(S)-立体配置において存在する可能性がある。したがって、式IIの化合物は、ジアステレオマーの混合物として、またはラセミ混合物として、または純粋な異性体として存在しうるが、エナンチオピュアな異性体、すなわち個別の異性体またはそれらの異性体の混合物として存在することもある。
【００４８】
下記の表１は、本発明のストリゴラクトンアナログの例を一覧表にしたものであって、それらの化学名および記号を挙げている。
【表１】
2014527979.tif 000015
【００４９】
以上および以下で使用される一般用語は、本明細書の文脈において、好ましくは、他に特に指示のない限り以下の意味を有する。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「C1-C6アルキル」という用語は、ハロアルキルなどの置換された炭化水素鎖を含む直鎖もしくは分岐鎖炭化水素鎖であって、少なくとも1個、最大で6個の炭素原子を含有する前記炭化水素鎖を表す。
【００５１】
「アルケニル」という用語は、本明細書では、少なくとも1つの結合が二重結合である、直鎖もしくは分岐鎖炭化水素鎖を指す。
【００５２】
「アルキニル」という用語は、本明細書では、少なくとも1つの結合が三重結合である、直鎖もしくは分岐鎖炭化水素鎖を指す。
【００５３】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書では、非芳香族環状化合物を指す。
【００５４】
「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書では、少なくとも1つの非炭素の環員原子、たとえばN、O、またはS、を含有する非芳香族環状化合物を指す。
【００５５】
「アリール」という用語は、本明細書では、置換もしくは非置換の、少なくとも1つの環が芳香環である環系を表す。
【００５６】
「互換的に」という用語は、本明細書では、入れ替えることができる2つの隣接する化学基を表すが、すなわち2位にP基がある場合、Q基は3位になくてはならず、逆もまたしかりでP基が3位にあれば、Q基が2位になくてはならない。
【００５７】
「アポトーシス」という用語は、本明細書では、多細胞生物で起こるプログラム細胞死のプロセスを表す。
【００５８】
「MCF-7」、「MDA-MB-436」、「MDA-231」、「T47D」などという用語は、本明細書では、異なるタイプの乳癌細胞株を表す。
【００５９】
「マモスフェア」という用語は、本明細書では、特定の状況下で形成される、乳腺細胞の塊を意味する。マモスフェア培養は、乳癌幹細胞（以下、CSC）の濃縮のために使用されている。MCF-7およびMDA-231細胞は、非付着性の無血清増殖条件下で「マモスフェア」として増殖させることができる。
【００６０】
「サイクリンB1」（以下CYCB1）という用語は、M期促進因子の調節サブユニットを指し、これは有糸分裂の開始に必須である。その脱制御は腫瘍性形質転換に関与するので、抗増殖性治療に有用である。
【００６１】
サイクリンB1を標的とする低分子干渉RNA（siRNA）の、さまざまなヒト腫瘍細胞株に及ぼす影響を分析すると、サイクリンB1 siRNAは、HeLa、MCF-7、BT-474、およびMDA-MB-435腫瘍細胞においてサイクリンB1のタンパク質レベルを低下させ、したがってHeLa細胞においてcdc2/サイクリンB1のキナーゼ活性を低下させるので、トランスフェクション後のさまざまな起源の腫瘍細胞の増殖を有意に抑制し、アポトーシスを増加させる。
【００６２】
式IIの化合物の製薬上許容される塩は、たとえば、塩基性窒素原子を有する式IIの化合物から、好ましくは有機酸もしくは無機酸を用いて、酸付加塩として形成される。
【００６３】
適当な無機塩は、たとえば、塩酸もしくは臭化水素酸などのハロゲン酸、硫酸、およびリン酸である。適当な有機酸は、例として、ホスホン酸、スルホン酸、たとえばメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸もしくはスルファミン酸、カルボン酸、たとえば酢酸およびプロピオン酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アダマンタンカルボン酸、フロ酸、トリフェニル酢酸、安息香酸、サリチル酸、フタル酸、マンデル酸、ケイ皮酸、または他の有機プロトン酸、たとえばアスコルビン酸、アミノ酸、たとえばリジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、脂肪酸、たとえばステアリン酸、パルミチン酸、およびラウリン酸である。
【００６４】
式Xの化合物は、腫瘍由来細胞株の増殖を阻害することができるが、正常な線維芽細胞の増殖を阻害しない。これらの化合物は、とりわけ、良性もしくは悪性腫瘍などの腫瘍性疾患の治療に有用である。こうした化合物は、腫瘍退縮に作用し、転移拡散および微小転移増殖を防ぐことができる。具体的には、そうした化合物は、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌、ならびに黒色腫などの疾患を治療するために使用することができる。
【００６５】
GR-24に反応して、細胞周期進行の障害がすべての癌細胞で観察された。それに加えて、GR-24に対する感受性の増加が腫瘍幹細胞培養において顕著であり、その結果として、GR-24低濃度において、スフェアの解離、およびアポトーシスが起こった。GR-24の外部からの適用は、根端における細胞分裂および分化の変化をもたらした。図1に示すように、野生型の苗（seedling）を外から供給されたGR-24、13.5μMに暴露すると、根端の変形が生じ、それが膨らんだように見えた；それに加えて、GD-24を2倍に増加（27μM）させると、柱軸細胞においてデンプン顆粒がなくなった。
【００６６】
本明細書で与えられた実験結果は、GR-24適用時にはっきり見える根端の形態変化が、根端における細胞分裂の変化と関連していることを示す。
【００６７】
図2に示すように、細胞レベルでの実験は、根冠細胞がGR-24処理によって、対照と比べて組織破壊された状態となることを示す。細胞分裂は異常であって、根端の分裂組織ゾーンにおいて細胞列のランダムな分裂を示す；柱軸細胞は膨らみ、その組織は変化している。その上、側根分裂組織は、主根と比べてGR-24により影響を受けにくく、前者の場合は、根端の形態、細胞分裂、および柱軸細胞組織への影響は低下している。
【００６８】
CYCB1転写レベルは、細胞分裂レベルの指標として、根端におけるCYCB1遺伝子転写レベルで判定されるように、GR-24処理によって低下する。低レベルのGR-24処理（2.7μM）では、CYCB1転写は対照と比べて影響を受けない（0.97±0.47）。図2に示すように、このGR-24濃度で処理された根と対照との間に細胞分裂の差異は観察されない。しかしながら、GR-24高濃度（13.5μM）のもとでは、CYCB1転写は、対照と比較して、GR-24処理された根端で顕著に減少する（0.16±0.00）。したがって、上記条件下では、GR-24処理根と対照との間に細胞分裂の相違が認められる（図2）。
【００６９】
3μMのGR-24を外から適用することによって、GRIM REAPER (GRI) [NM_104192]遺伝子発現レベルは有意に増加し、その発現は、GR-24処理で2、3倍に誘導されるが、このGRI遺伝子発現は、細胞死アクチベーターとして、ショウジョウバエにおけるアポトーシスに関連している。
【００７０】
これに対して、前記GRI遺伝子転写は、ストリゴラクトンシグナル伝達に変異のあるmax2-1変異体では、GR-24処理で誘導されず、max2-1はストリゴラクトンアナログに対して感受性ではないので、このことから、GRI発現はストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログシグナル伝達経路に特異的であることが分かる。前記のGRI転写の上昇、ならびに、対応するCYCB1転写の減少は、下記の表2で詳述されるように、定量的PCR実験で検証されるが、この表2は、対照と対比して、GR-24（3μM）で処理された野生型およびmax2-1の実生におけるGRIおよびCYCB1の転写レベルを示すものである。
【表２】
2014527979.tif 000016
【００７１】
ここで詳述される結果は、GR-24の適用が植物根における細胞周期作用の低下、ならびに細胞死関連遺伝子の特異的な誘導をもたらし、後者はWTで起こるが、ストリゴラクトン非感受性変異体では起こらないことを示す。
【００７２】
ST-357およびST-362適用の影響は、CYCB1転写について調べたが、ST-362は、表２に示すように、GR-24と同様に実生の処理でCYCB1転写レベルの著しい低下をもたらす。特定の理論に縛られるつもりはないが、このCYCB1転写の減少は、ストリゴラクトンアナログST-362が、GR-24の効果と同様に、植物根において細胞周期作用の低下をもたらすことを示す。
【００７３】
IC50値は、本明細書では、インキュベーション期間の終了時点でのウェル当たりの細胞数が、対照培養における細胞数のちょうど50％となる、活性成分の濃度として定義される。このようにして決定されるIC50値は、式IIの化合物について、約0.1から50μmol/Lである。管腔（エストロゲン受容体陽性）および基底（エストロゲン受容体陰性）のいずれの乳癌細胞についても化合物GR-24のIC50値は、マイクロモルの濃度範囲内である。
【００７４】
以下の実験の項に記載のように、GR-24は、ヒト乳癌細胞株の増殖を阻害する。癌細胞株の長期間の増殖に及ぼすGR-24の影響は、クリスタルバイオレット法によって評価した。MCF-7（エストロゲン受容体（ER+）、腫瘍形成性、非転移性）、MDA-MB-231、MDA-MB-436（ER-、転移性）およびBJ線維芽細胞（正常、非腫瘍性細胞株）を、0.5から10 ppm（1.65-33μM)の用量範囲で、GR-24により処理した。増殖は、10日までの間モニターした。2.5-5 ppmのGR-24濃度は、溶媒処理された対照と比較して、増殖の有意な減少をもたらした。BJ線維芽細胞は、この期間の終わりまでには、図3Aに示すように最大10 ppmまでの濃度であっても増殖の有意な減少を示さなかった。7日後に長期増殖の50％が阻害されるGR-24の濃度（IC50）を図3Bに示すが、この図では7日目の光学濃度を溶媒対照に対するパーセンテージとしてプロットしている。MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびMCF-7細胞に関するIC50濃度は、それぞれ6.7 ppm (22.1μM)、5.7 ppm (18.8μM)、および5.7 ppm (18.8μM)であった。
【００７５】
以下の実験の項にさらに詳述するように、GR-24は、癌細胞においてG2-アレストおよびアポトーシスを引き起こす。GR-24の細胞周期進行に及ぼす影響を調べるために、図4に示すようにフローサイトメトリーを用いて、ヨウ化プロピジウム（PI）染色によってDNA含量分析を行った。MCF-7、MDA-MB-231、およびMDA-MB-436細胞を、5、2.5、および0.5 ppm濃度のGR-24で48時間処理した。図4は、細胞周期の各期の細胞のパーセンテージを示す。GR-24処理は、アッセイしたすべての癌細胞株において、G2期の細胞パーセンテージの、用量依存的な増加を引き起こし、同時にG1期の細胞パーセンテージの低下を引き起こす。より高濃度（5 ppm）では、GR-24はsub-G1/アポトーシス画分の増加を引き起こすが、これはアポトーシスの増加を示す。これとは逆に、不死化された非形質転換乳房細胞株、MCF10AのGR-24による処理は、G2/M期ではなく、細胞周期のG1期で停止した細胞の増加をもたらし、アポトーシスの増加は観察されなかった。以下の実験の項にさらに詳述するように、GR-24は、乳癌幹細胞の増殖を阻害し、生存率を低下させる。従来の化学療法および放射線療法に対して本来、抵抗性である、腫瘍始原細胞（TIC）もしくは癌幹細胞（CSC）は、前記治療で根絶された元の腫瘍の細胞成分を再生することができるので、結局、再発に至る。GR-24がMCF-7マモスフェア形成を阻害することができるかどうかを判定するために、MCF-7細胞を、図5Aに示すように、GR-24存在下または非存在下で、マモスフェアとして増殖させた。マモスフェア形成は、0.5-2.5 ppmのGR-24の存在下で完全に阻害され、図4に示すように単層増殖を阻害するために必要とされる濃度の5分の1に低い1 ppmで大幅に弱まっていた（p<0.01）。0.5 ppmの濃度では、増殖はそれほど阻害されないが、ただし、マモスフェアは溶媒処理された対照より小さいことが多い（<50μm）（p<0.05）。図5Bに示すように、MCF-7の第二代マモスフェアをGR-24存在下で増殖させると、同様の結果が得られた。別の乳癌細胞株MDA-MB-231を図5Cに示すように検査した。5 ppmでGR-24は、MDA-MB-231マモスフェア形成を完全に阻止した。2.5 ppmでは、マモスフェア増殖はひどく弱まり、マモスフェアは溶媒処理対照群と比較して、かなり小さかった（<50μm）。MCF-7およびMDA-MB-231のマモスフェア形成を阻止するために必要なGR-24の濃度は、単層増殖に関するIC50用量より低く、それぞれ5.7分の1および2.7分の1であった。
【００７６】
特定の理論に縛られるつもりはないが、このマモスフェアは驚くべきことに、単層培養より強い、GR-24増殖阻害作用に対する感受性を示すのに対して、TICは、たとえば、Xiaoxian Li et al., J. Nat. Cancer Inst. (JNCI), Vol. 100(9): 672-679, 2008に示されるように本質的に化学療法に抵抗性であることが示された。
【００７７】
Ginestrier C. et al., Cell Stem Cell, 1: 555-567, 2007は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）活性の増加した正常および癌のヒト乳房上皮細胞が、幹/前駆細胞特性を有すること、ならびに高いALDH活性が、自己複製能力を有し、元の腫瘍の不均一性を再現する腫瘍を形成する能力を有する、腫瘍形成性細胞画分を識別することを報告している。PE Burger and R Gupta, Stem Cells, 27(9): 2220-8, 2009の示すところによれば、他の起源の幹/前駆細胞に見られるいくつかの抗原（CD9、Bcl-2、CD200、CD24、prominin、Oct 3/4、ABCG2、およびネスチン）を同時発現する前立腺上皮細胞のサブセットには、高レベルのアルデヒドデヒドロゲナーゼ1（以下ALDH1）活性が存在する。高レベルのALDH1活性を発現するこうした細胞のほとんどすべてはSca-1も発現するが、そうした細胞の3分の1は、この抗原を高レベルに発現する。高レベルのALDH活性を有する細胞は、低いALDH活性を持つ細胞より高い、in vitro増殖能力を有する。
【００７８】
腫瘍は、その維持および再発の原因となる癌幹細胞（CSC）の小集団を含有する。こうしたCSCの分析は、癌患者を治療するための有効な予後および治療方針をもたらすことができる。Feng Jiang et al., Mol. Cancer Res., 7(3): 330-8, 2009は、Aldefluorアッセイに続いて蛍光活性化セルソーティング分析を用いた、ヒト肺癌細胞からのCSCの同定を明らかにする。比較的高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1（ALDH1）活性を有する、分離された癌細胞はCSCのin vitroでの特徴を示すが、その特徴には、増殖、自己複製、および分化の能力、化学療法に対する抵抗性、ならびにCSC表面マーカーCD133の発現が含まれる。in vivo実験は、ALDH1陽性細胞が、元の癌細胞の不均一性を再現している腫瘍を生じることができたことを示す。したがって、ALDH1は、さまざまな癌型のTICの分離において、機能的マーカーとなることが示された。Aldefluorキットが通常使用されるが、これは、ヒトALDH1との特異的相互作用を通じて、幹細胞の最適な同定および分離のためにデザインされている。したがって、細胞を、非荷電ALDH1-基質およびBODIPY-アミノアセトアルデヒド(BAAA)を含有するAldefluorアッセイバッファー中に懸濁し、それをインキュベートしてから、受動拡散によって生きた細胞によりBAAAを吸収し、続いて、細胞内のALDHにより負電荷を持つ反応生成物BODIPY-アミノ酢酸に変換したが、それは高レベルのALDH1を発現する細胞内部に保持されて、こうした細胞に明るい蛍光を生じさせる。
【００７９】
以下の実験の項にさらに詳述するように、マモスフェア生存率および幹細胞マーカー発現（ALDH1）に及ぼすGR-24の影響は、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-2H-テトラゾリウム分子内塩（以下XTT）アッセイ（ATCC）によって評価した。5 ppmでは、GR-24は生存率を約80％（98.4％＋3.4 から16.4％＋4.6まで）低下させる。2.5 ppmで、マモスフェア形成が完全に阻害される場合、生存率は68.6％＋12.4にとどまるので、この濃度でのマモスフェア形成阻害を細胞死の増加で説明できないことがわかる。GR-24によって引き起こされるマモスフェア形成阻害をさらに検討するために、乳腺幹細胞マーカーの発現を調べた。第二代マモスフェアのALDH活性をアッセイし、付着培養に対して増加を確認した。図6Bに示すように、第二代マモスフェアは2.4倍強いALDH活性を示す。初代マモスフェアは、6％から8％にALDH活性の増加を示す。初代マモスフェアのGR-24処理はALDH活性を6％から2％に低下させる。
【００８０】
特定の理論に縛られるつもりはないが、ALDH活性の減少は、GR-24が、一つには癌幹細胞マーカーを制御することによって、マモスフェア形成を阻害することを示唆する。
【００８１】
以下の実験の項でさらに詳述するように、ストリゴラクトンアナログST-357、ST-362、EG-9c、EG-5、およびMEB-55は、前記ストリゴラクトンアナログの、MCF-7およびMDA-MB-231細胞増殖を阻害する能力を調べることによって実証されるように、さまざまな種類の癌細胞株の有効な増殖阻害剤である。MCF-10A細胞は、非腫瘍形成性細胞株として使用され、他の種類の固形腫瘍に由来するさまざまな細胞株が集められたが、これには結腸（HCT116、HT29、SW480）、前立腺（PC3、DU145、LNCaP）、肺（A549）、骨肉腫（U20S）、および黒色腫（T11）細胞株が含まれる。コホートをさらに多様化するために、非付着性白血病性癌細胞株、K562も含めた（図７）。細胞株は、それぞれのストリゴラクトンアナログに対する細胞株の反応に相当なばらつきを示すが、すべての株がストリゴラクトンアナログ処理によって増殖阻害され、IC50濃度は、MEB-55およびST-362については2.9から12.8 ppm、ならびにEG-5、EG-9c、およびST-357については3.9から18.3 ppmであった。興味深いことに、骨肉腫由来細胞株、U20Sは、5つすべてのストリゴラクトンアナログに対して同様の感受性を示した（IC50 = 2.7〜4.5 ppm）が、ホルモン依存性前立腺細胞株LNCaPは、EG-9cを除くすべてによって増殖阻害された。
【表３】
2014527979.tif 000017
【００８２】
以下の実験の項でさらに詳述するように、ストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログは、G2期アレスト（細胞周期進行の停止）を通じて増殖を阻害し、もっと高い濃度でアポトーシスを引き起こすが、この場合GR-24処理はG2期にあるMCF-7およびMDA-MB-231細胞のパーセンテージの増加を引き起こす。細胞をストリゴラクトンアナログで処理して、それらが同じように細胞周期進行を変化させるか否かを判定した。G2期の細胞パーセンテージの用量依存的な増加が観察された。IC50/72hを25％上回る濃度で、MDA-MB-231においてアポトーシスの増加が観察され、sub-G1画分の細胞パーセンテージが増加した。ヘキスト（Hoechst）染色を用いて、核の変化を分析した。10-15 ppmのST-362処理によって、核の凝縮および断片化、アポトーシスを示す変化が増加する。継続的なストリゴラクトンアナログ暴露が増殖阻害および細胞生存低下のために必要かどうかを判定するために、MDA-MB-231細胞をST-362またはMEB-55により、10 ppmおよび5 ppmで、2、4、および24時間、処理した。それぞれの時点で、ストリゴラクトンアナログを除去し、培地を新鮮な増殖培地で置き換えた。全体として24時間後に、XTTアッセイを行った。4時間のストリゴラクトンアナログ処理後に、生存率の有意な減少が誘導された（p<0.01）。2時間後では有意な変化は観察されなかった。各ストリゴラクトンアナログへの継続的な暴露（24時間）は、4時間暴露より大幅な細胞生存率の減少を誘導した（p<0.001）ので、癌細胞生存率を低下させるのに、長時間処理法がより効果的であることが示された（図9）。
【００８３】
以下の実験の項でさらに詳述するように、ストリゴラクトンアナログST-357、ST-362、EG-9c、EG-5、およびMEB-55は、5 ppm以上の濃度でマモスフェア形成を完全に阻止することができる（図10）。ST-362およびMEB-55は、2.5 ppmでマモスフェア増殖を阻止することができる（p<0.01）。ST-357、ST-362、およびMEB-55は、1 ppmで有意にマモスフェア形成を阻害する（p<0.01）。上記のストリゴラクトンアナログがG2 アレストの誘導因子となる可能性を、MCF-7単層培養において、図8に示す。しかしながら、Gr-24と同様に、マモスフェア形成を阻害するのに必要とされる用量は、単層培養で増殖を阻害するのに必要とされる用量より低い（ST-362およびMEB-55については5分の1に低く；ST-357については3分の1に低い）。ストリゴラクトンアナログ処理に対する感受性がマモスフェア形成に特異的であるか、またはそれが成熟マモスフェアの完全性および生存率にまで及ぶかどうかを判定するために、MCF-7マモスフェアをストリゴラクトンアナログの非存在下で増殖させ、7日後に（または、マモスフェアが100μmを超える直径に達したならば）、図11に示すように、指示された用量で、増殖培地にストリゴラクトンアナログを添加した。48時間後に、ST-362、ST-357、およびMEB-55により2.5-5 ppmの用量で処理されたマモスフェアは、ほぐれた形態を示し、解離しているように見えた。5 ppmの濃度で処理されたマモスフェアの代表的な画像を図11Aに示す。
【００８４】
したがって、本発明のある態様において、疾患治療用の抗腫瘍医薬組成物を調製することを目的とする、式Xの化合物であるストリゴラクトンおよび/またはストリゴラクトンアナログ、または個別の異性体もしくは異性体の混合物、および製薬上許容されるそれらの化合物の塩の使用が与えられるが、それは必要に応じて1つもしくは複数の他の医薬活性化合物と組み合わせてもよく、前記疾患は、細胞増殖の阻害の影響を受けるものであって、その疾患は腫瘍性疾患である。
【００８５】
それに加えて、本明細書で与えられるのは、乳癌、肺癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫の治療用の医薬組成物を調製することを目的とする、式Xのストリゴラクトンおよび/またはストリゴラクトンアナログ、または個別の異性体もしくは異性体混合物、および製薬上許容されるそれらの化合物の塩の使用であって、それは必要に応じて1つもしくは複数の他の医薬活性化合物と組み合わせてもよい。
【００８６】
上記の薬剤は、治療の必要な温血動物に、効果的な腫瘍抑制量の式Xの化合物もしくは製薬上許容されるそれらの塩を投与することによって、腫瘍性疾患を有する温血動物を治療するのにさらに適している。
【００８７】
それに加えて、本発明の医薬組成物は、人体もしくは動物体の治療法に使用するのに適している。種、年齢、個々の状態、投与方法、および個々の症候群に応じて、体重70 kgの温血動物に有効量が投与される。
【００８８】
人体もしくは動物体の治療法に使用するための医薬組成物を調製するための薬剤を製造するために使用することができる、式IIの化合物もしくはそれらの塩の例は、下記のとおりである：(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)-メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、(±)(2E)-7-ブロモ-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(2-チエニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、(2E)-7-(1-メトキシナフタレン-2-イル)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-1,4-ジメチルシクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチルシクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、(±),2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン。
【００８９】
癌幹細胞死滅させるための医薬組成物を調製するために、式Xの化合物、または個別の異性体もしくは異性体混合物、およびそれらの化合物の製薬上許容される塩を使用する方法がさらに提供される。式Xの化合物、または個々の異性体もしくは異性体混合物、およびそれらの化合物の製薬上許容される塩により、癌治療を受けてきた被験体を治療する方法も与えられる。本発明の方法は、被験体において、さまざまな場合に、癌幹細胞を死滅させ、癌の再発リスクを低下させることができる。
【００９０】
本明細書で医薬組成物が与えられるが、これは抗増殖効果のある量、特に限定はしないが、腫瘍性疾患の治療に有効な量の、式Xの活性成分を、製薬上許容される基剤とともに含有するものであって、こうした基剤は、局所、腸内、たとえば経口もしくは直腸、または非経口投与に適しており、無機でも有機でもよく、固体でも液体でもよい。
【００９１】
さらに、本明細書に記載の式Xの化合物、および追加の、製薬上許容される添加物もしくは添加剤を含有する医薬組成物が与えられる。使用可能な添加剤には、固形製剤の剤形を製剤するために当技術分野で知られている任意の添加剤、たとえば、ブドウ糖、乳糖、マンニトール、ソルビトール、エリトリトール、マルトデキストリン、通常のデンプンもしくはアルファー化デンプン、ポビドン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガム、クエン酸、ケイアルミン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリソルベート20、40、60、または80、二酸化チタン、タルクなどが含まれる。
【００９２】
式Xの化合物の調製は、当技術分野で公知であるので、簡潔にするためにここで詳細に説明はしない。式IIの化合物（すなわち、ストリゴラクトンアナログ）は、たとえば、Prandi et al., Eur. J. Org. Chem., 2011, 3781-93; Asami T & Ito S., Design and Synthesis of Function Regulators of Plant Hormones and their Application to Physiology and Genetics, J. Synthetic Org. Chem. Japan, 2012, 70:36-49; Malik H. et al., A new efficient synthesis of GR-24 and dimethyl A-ring analogues, germinating agents for seeds of the parasitic weeds Striga and Orobanche spp., Tetrahedron, 2010, 66:7198-7203; Mwakaboko A.S. et al., Single step synthesis of strigolactone analogues from cyclic keto enols, germination stimulants for seeds of parasitic weeds, Bioorg. & Med. Chem., 2011, 19:5006-5011; Boyer FD, et al., Structure-activity relationship studies of strigolactone-related molecules for branching inhibition in garden pea: molecule design for shoot branching, Plant Physiology, 2012に記載のように、調製することができる。
【００９３】
本明細書において、たとえば式Iで表される、天然のストリゴラクトンは、たとえば、Xie et al., Annu. Rev. Phytopathol., 2010, 48: 93-117、およびその中の引用文献； Yoneyama et al., Plant Growth Regul., 2011, 65: 495-504；およびUeno et al., J. Agric. Food Chem., 2011, 59: 9226-9231; Chen VX et al., Stereochemistry, Total Synthesis, and Biological Evaluation of the New Plant Hormone Solanacol. Chemistry-a European Journal, 2010, 16:13941-13945; Kitahara S. et al., First synthesis of (+/-)-sorgomol, the germination stimulant for root parasitic weeds isolated from Sorghum bicolor, Tetrahedron Lett., 2011, 52:724-726; Reizelman A. et al., Synthesis of all eight stereoisomers of the germination stimulant strigol, Synthesis-Stuttgart, 2000, 1944-1951; Reizelman A. et al., Synthesis of the germination stimulants (+/-)-orobanchol and (+/-)-strigol via an allylic rearrangement, Synthesis-Stuttgart, 2000, 1952-1955; Sasaki M., Synthesis and biological activity of strigolactones, J. Pesticide Science, 2009, 34:315-318に記載のように調製することができる。
【００９４】
以下の実施例は、本発明をさらに詳しく説明するが、決してその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００９５】
本明細書で使用される「ストリゴラクトンアナログ」は、式IIのあらゆる形のストリゴラクトンを含んでおり、それらのpre-form、プロドラッグ、誘導体、組換え体、または天然ストリゴラクトンと同様の活性を有する任意の許容される形を含むことを特記する。
【００９６】
本明細書で使用される「ストリゴラクトン」は、式Iの天然ストリゴラクトンを含めて、あらゆる形の天然ストリゴラクトンを含んでおり、それらのpre-form、プロドラッグ、誘導体、組換え体、または活性を有するそれらの任意の許容される形を含むことを特記する。
【００９７】
「プロドラッグ」という用語は、化合物が投与されると代謝過程で化学的な変換を受けて、薬理学的に活性のある物質となることを意味する。概して、こうしたプロドラッグは、本発明の化合物の機能的誘導体であり、これはin vitroで容易に活性ストリゴラクトンに変換可能である。
【００９８】
本発明の組成物は、腫瘍性疾患もしくはそれによって引き起こされる症状を治療するために、有利に使用することができる。本発明の組成物を使用して、腫瘍性疾患（癌）のヒト（または動物）を治療することができるが、こうした患者は、治療上有効な用量のストリゴラクトンアナログの経口投与を受ける。
【００９９】
本発明の別の態様において、ストリゴラクトンは、あらゆる癌型、たとえば、肺、結腸、乳房、皮膚、黒色腫などを治療するために、有利に使用される。前記治療は、癌関連症状のすべてもしくは一部の消失または緩和をもたらす可能性がある。
【０１００】
特定の実施形態において、ストリゴラクトンもしくはストリゴラクトンアナログ、およびそれらを含有する組成物は、少なくとも1ヶ月から1年までの間安定である。本明細書で使用される「安定な」という用語は、活性成分がその生物活性を維持することを意味する。
【０１０１】
活性物質の「有効な量」という用語は、治療したい疾患、または回避もしくは治療したい病態の1つもしくは複数の症状を、治療、軽減、緩和、改善、除去、または予防するのに有効な量、そうでなければ、疾患もしくは病態の病状において臨床的に認識できる好ましい変化をもたらすのに有効な量である。活性物質は一剤形として有効な量で与えられてもよいが、ほぼ同時に適用される、合わせて有効量となる量の、複数の剤形で与えられてもよい。
【０１０２】
「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳類である。
【０１０３】
本明細書で使用される「治療」、「治療している」、および「治療する」という用語は、それが一般的に受け入れられる意味、すなわち、症状もしくは合併症の緩和もしくは軽減、または疾患、異常、もしくは病態の治癒もしくは除去を含めて、本明細書に記載の疾患、異常、または病的状態の進行または重症度を、予防、阻止、抑制、緩和、改善、緩徐化、停止、遅延、または逆転することを目的とする、患者の管理およびケアを含んでいる。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明のストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログをさらに詳細に説明するために示される。しかしながら、下記の実施例は、決して本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【０１０５】
（実施例）
統計分析
結果は、繰り返し分析の平均±SDとして提示し、少なくとも2つの独立した実験を代表する、または包括する。統計分析は、溶媒対照と対比してスチューデントのt検定（両側、対応あり）を用いて実施したが、P<0.05(*)の場合、有意と見なす。もっと高い検出力（p<0.01, p<0.001）も用いられ、それぞれの図の説明に示している。ストリゴラクトンアナログのIC50 用量は、シグモイド用量反応曲線（Graphpad Prism 4.0ソフトウェア）の内挿によって算出した。簡単に述べると、関連するy軸データポイント間で直線回帰を行い、未知のx軸について内挿を計算した。
【実施例１】
【０１０６】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）種子の発芽
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）野生型（WT; Columbia; Col-0）およびmax2-1変異体（http://abrc.osu.edu/）のホモ接合ラインの種子を表面殺菌し、1％ショ糖を添加して0.7％寒天で固めた1/2ムラシゲ・スクーグ(MS)プレート上で発芽させた。プレートを暗下で4℃にて2日間、垂直にインキュベートして、発芽を同調させた。発芽の3日後、ピンセットを用いて苗をそっと1/2 MSプレートに移したが、このプレートはさまざまな濃度のGR-24を4つのジアステレオマーの混合物として含有した：(±)-GR-24および(±)-2’-epi-GR-24。移し換えられた苗の根端を、プレート上で、マークした。プレートは、ガス（たとえばエチレン）の蓄積を防ぐために、密封しないままとし、45°に立てた位置に置き、22℃にて、白色蛍光管からもたらされる光子50-60 mol m-2 s-1の光の強度で、光照射16時間/暗下8時間の光周期のもとで6-12時間インキュベートした。
【０１０７】
GR-24処理は、2.7x10-6 から13.5x10-6 Mまでの濃度で実施した。ST-357およびST-362処理は3x10-6 Mの濃度で行った。
【０１０８】
GR-24、ST-357およびST-362は、初めにアセトンに溶解し、それぞれ4.5 mM、10μM、および10μM溶液が与えられたが、これを次にさらに再蒸留滅菌水（DDW）で希釈した。したがって、実験対照は、未処理の根に加えて、それぞれGR-24、ST-357、およびST-362処理で使用された濃度のアセトンで処理された根を含めた。それぞれの実験において、未処理根をそれぞれのアセトン対照と比較した。さまざまな対照の間に差異が見られない場合、未処理根を示す。未処理とアセトン対照の間で差異が示された場合、GR-24、ST-357、およびST-362処理とアセトン処理根の間で比較を行った。
【実施例２】
【０１０９】
根端構造および細胞形態の判定
根端の細胞形態およびコルメラ（columella）細胞内のデンプン粒を調べるために、WT根を、実施例1に記載のようにGR-24プレートおよび対照プレート上で生育させた。このプレート上で6日間生育後、根をヨウ素-ヨウ化カリウム（ルゴール液（Lugol's solution）、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）で染色した。高濃度のルゴール液（5 gヨウ素および10 gヨウ化カリウムを85 ml蒸留水と混合）を使用し、続いて再蒸留水で洗浄した。Nikon DS-Fi1カメラを装備したLeica DMLB光学顕微鏡（Leica Microsystems GmbH）を用いて、それぞれの処理から根端の写真を撮影した。実験は4回繰り返した；それぞれの処理において、実験の繰り返しごとに4つの根端を調べた（図１）。
【０１１０】
根冠細胞の順序および構造を調べるために、WT根を実施例1に記載のようにGR-24プレートおよび対照プレート上で生育させた。前記プレートで6日間生育後、根端をアニリンブルー溶液（Sigma-Aldrich）で5分間染色し、その後ただちにカルコフロール（Calcofluor）溶液[5 ml 蒸留水中100 mgカルコフロールホワイト（Calcofluor White）（Sigma-Aldrich）]で染色した。染色された根を、ただちに共焦点顕微鏡（Olympus IX81,東京、日本）を用いて検討した。実験は4回繰り返した；それぞれの処理において、実験の繰り返しごとに4つの根端を調べた（図２）。
【実施例３】
【０１１１】
定量的PCRを用いた遺伝子転写レベルの測定
実施例1に記載のように生育処理された苗からRNAを抽出した。当該遺伝子の断片を増幅することによって、定量的PCRを行った（図6および７）。シロイヌナズナ15SリボソームRNA（GenBank受入番号AT1G04270.1）はRNA量に関する基準遺伝子としての役割を果たし、特異的なプライマー、（フォワード）5’-CAAAGGAGTTGATCTCGATGCTCTT-3’ および（リバース）5’-GCCTCCCTTTTCGCTTTCC-3’を用いて増幅された。本実験は5-6回の生物学的な繰り返し実験で行われた；各回の実験は、8個の植物体を含み、それに対して3回の技術的な繰り返し実験が行われた。平均および標準偏差は、すべての生物学的繰り返し実験から求めた。
【０１１２】
プライマーは、PrimerQuestソフトウェア (Integrated DNA Technologies)を用いてデザインした。RNAはTrizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、メーカーのプロトコールによって抽出した。Superscript First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いて全量20μlで1μg RNAを逆転写した。PCRは、ABI-Prism 7900装置 (Applied Biosystems, Foster City, CA) および SYBR Green I 検出(Applied Biosystems)を用いて、メーカーのプロトコールにしたがって3連で行った。それぞれの標的遺伝子の発現は、GAPDH RNAの発現に対して正規化されて、GAPDH RNAに対する標的遺伝子の比として提示され、2-ΔCtとして表されるが、このCtは、閾値のサイクル数であって、ΔCt = (標的のCt) - (GAPDHのCt)である。
【実施例４】
【０１１３】
クリスタルバイオレット単層増殖アッセイの準備
細胞は、96ウェルプレートのウェル当たり1500細胞（MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびBJ線維芽細胞）または4000細胞として播種した。翌日、培地を、10％活性炭処理済みウシ胎仔血清（以下FBS）、ならびに指示された用量のストリゴラクトンアナログ、もしくは対照として溶媒（アセトン）のみを添加した、フェノールレッドフリーのDMEMで置き換えた。指示された時点で、個々のプレートを固定してクリスタルバイオレット-メタノール溶液（ウェル当たり50μl）で15分間染色し、蒸留水で数回洗浄し、プレートを一晩風乾した。クエン酸ナトリウム溶液（0.1M）を用いて、結合したクリスタルバイオレットを可溶化し、560 nmで光学濃度を測定した（Glomax（登録商標）-Multi Detectionプレートリーダー、Promega）。
【実施例５】
【０１１４】
ヘキスト（Hoechst）33342染色
MDA-MB-231細胞をウェル当たり3000細胞として3連で96ウェルプレートに播種した。翌日、培地を、10％活性炭処理済みFBS、ならびに指示された終濃度のストリゴラクトンアナログもしくは溶媒（アセトン）のみを添加した、フェノールレッドフリーのDMEMで置き換えた。48時間後、培地は吸引除去され、培地で希釈したヘキスト色素（2μg/ml）100μlを細胞に添加して、15分間インキュベートした。蛍光顕微鏡（Zeiss 5 Instruments, Thornwood, NY）下で、染色された細胞が観察された。
【実施例６】
【０１１５】
ストリゴラクトンアナログは、マモスフェアとして増殖させた乳癌細胞株の自己複製および生存の強力な阻害剤であって、たとえ短時間の暴露であってもマモスフェアの解離および細胞死に不可逆の影響をもたらす。免疫ブロット分析は、ストリゴラクトンアナログが、P38およびJNK1/2 MAPK両分子によって仲介されるストレス反応の活性化を誘導すること、ならびにPI3K/AKT活性化を阻害することを明らかにした。総合すると、本実験は、ストリゴラクトンが、ストレスおよび生存シグナル伝達経路の調節を通じて活性をもたらすことができる、有望な抗癌剤であることを示す。ストリゴラクトンアナログは、癌細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する（低いμモル程度で）。ストリゴラクトンアナログは、マモスフェア形成および癌幹様細胞生存の強力な阻害剤である。加えて、ストリゴラクトンアナログは、ホルモン応答性およびホルモン比依存性乳癌細胞株を阻害した。免疫ブロット分析から、ストリゴラクトンアナログはストレス誘導性MAPKであるP38およびJNK1/2を活性化し、PDK1およびAKTを阻害することが明らかになった。
【０１１６】
総合すると、本実験では、ストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログが、その作用メカニズムがストレスおよび生存シグナル伝達の調節に関わる可能性のある、有望な抗癌剤であることを示す。
【０１１７】
方法
細胞培養：
細胞を37℃にて、5% CO2-95%空気の加湿環境で増殖させた。MCF-7、MDA-MB-231、MDA-436、HCT116、SW480、PC3、およびBJ 線維芽細胞 (ATCC, Manassas)は、10% FCSを添加したダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（以下DMEM））中で維持された。HT-29、LNCaP、DU145、PC3、およびA549細胞は10% FCS (Sigma)を添加したRPMI中で維持された。MCF-10Aは5%ウマ血清（Atlanta Biologicals）、20 ng/ml上皮増殖因子（EGF）（Sigma）、10μg/mlインスリン（Sigma）、および500 ng/mlヒドロコルチゾン（Sigma）を添加したDMEM中で維持された。
【０１１８】
マモスフェア増殖：
接着細胞を緩やかにトリプシン処理して（0.05％トリプシン/EDTA）、PBSで2回洗浄し、40μmの細胞シーブを通して濾過し、単個細胞懸濁液を得た。細胞を、5μg/mlウシインスリン、20 ng/ml組換え上皮増殖因子、20 ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子、（Gibco）、1× B27サプリメント、0.5μg/mlヒドロコルチゾン（MEGM Bulletkit, Lonza）を添加した、フェノールレッドフリーの無血清MEBM（MEGM Bulletkit, Lonza）で10,000細胞/mlの濃度に希釈した。MDA-MB-231マモスフェア培養のために、前記のように、増殖添加物を加えたフェノールレッドフリーの無血清CnT-27培地（CellnTEC Advanced Cell Systems, Bern, Switzerland）を使用した。超低接着表面（Ultra-Low Attachment）96ウェルプレートのウェル当たり0.1 mlをシードした。翌日、指示された用量のGR-24（ppm）または溶媒のみ（0.6％アセトンf/c）を添加した。培地を3-4日ごとに補充した。マモスフェアの自己複製能力は、再播種して次の世代のマモスフェアを生じることによって判定した。第二代マモスフェアを培養した。10-14日経過した初代マモスフェアの解離（緩やかなボルテックス攪拌によるトリプシン処理）によって、第二代マモスフェアを培養した。上記のように単個細胞懸濁液が得られた。
【０１１９】
ストリゴラクトン処理：
ストリゴラクトンアナログは、1666.67 ppm (GR-24、MEB-55、ST-362、EG-9c)および7500 ppm (EG-5、ST-357)の原液濃度でアセトン（Sigma）に溶解した。ストリゴラクトンアナログを、適当な増殖培地で、必要とされる最高濃度に希釈することによって、細胞を指示された用量で処理した。それに続くより低い濃度のために段階希釈を行った。SB203580およびSP600125は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から購入した。すべての阻害剤は、メーカーの説明書にしたがってDMSO中に溶解した。
【０１２０】
クリスタルバイオレット増殖アッセイ：
細胞（MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびBJ線維芽細胞）は、96ウェルプレートのウェル当たり1500または4000細胞を播種した。翌日、培地を、10％活性炭処理済みFBS、および指定された用量のGR-24、ストリゴラクトンアナログ、または対照として溶媒（アセトン）のみを添加したフェノールレッドフリーのDMEMで置き換えた。指定された時点で、個々のプレートを固定し、クリスタルバイオレット溶液（0.5％クリスタルバイオレットおよび25％メタノール）で15分間染色し、蒸留水で数回洗浄して一晩風乾した。クエン酸ナトリウム溶液（0.1M）を用いて結合したクリスタルバイオレットを可溶化し、光学濃度を560nmにて測定した（Glomax（登録商標）- Multi Detectionプレートリーダー、Promega）。
【０１２１】
XTT生存率アッセイ：
細胞は、通常の増殖培地に3連として、ウェル当たり1500細胞（MCF-10、PC3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-436、HT-29、SW480）、ウェル当たり1000細胞（K562）、またはウェル当たり4000細胞（MCF-7、HCT116）で、96ウェルプレートに播種した（例外は非接着性白血病細胞株であるK562であって、この細胞株は10％活性炭処理済みFBS添加フェノールレッドフリーDMEMに播種した）。翌日、培地を、10％活性炭処理済みFBS、および指示された終濃度のストリゴラクトンアナログ、または溶媒（アセトン）のみを添加したフェノールレッドフリーDMEMで置き換えた。細胞は3日間インキュベートし、その時点でXTT（2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-2H-テトラゾリウム分子内塩）還元を用いて、メーカーの説明書（ATCC）にしたがって生存率を測定した。細胞をXTT試薬とともに、加湿された5% CO2-95%空気の環境で37℃にて2-3時間インキュベートした。光度計SPEKTRAFluor Plus, Tecan (Salzburg, Austria)で、450 nmにて吸光度を記録し、参照波長は750 nmとした。細胞生存は、等式：％細胞生存 = 100 × (At-Ac) から概算したが、このAtおよびAcは、それぞれ処理および対照培養のXTT比色反応（ATCC）の吸光度（450 nm）から750 nmで測定された非特異的吸収を引いたものである。培地単独の吸光度も個別の表示数値から引き算した。
【０１２２】
細胞周期分析：
接着細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄して、40μm細胞シーブを通して濾過した。DNA含量をフローサイトメトリーで評価した。細胞は、6ウェルプレート培養ディッシュで、10％FBS添加DMEMに、ウェル当たり1.5×105 細胞（MDA-MB-231、MDA-MB-436）、または4x105 細胞（MCF-7およびMCF10A）、または2×105細胞（SW480、HT-29）、または5×105 細胞(HCT116)の密度でシードした。翌日、培地を、指定された濃度のGR-24、または溶媒のみ（アセトン）とともに10％活性炭処理済みFBSを添加したフェノールレッドフリーDMEMで置き換えた。48時間後、細胞をPBS（pH 7.4）で2回洗浄し、4℃にて360gで10分間遠心して、冷却したエタノール（PBS中70％；v/v）中で緩やかにボルテックス混合しながら固定した。DNA含量を測定するために、細胞を40μg/mlヨウ化プロピジウム（以下PI）で染色し、FACSCaliburフローサイトメーター、およびCellQuest解析ソフトウェア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて分析した。ホスホヒストン-H3染色を行う場合、細胞は、ホスホヒストン-H3に対するポリクローナル抗体とともにインキュベートした後、PI染色の前にFITCとコンジュゲートした二次ヤギ抗ウサギIgGとともにインキュベートした。
【０１２３】
アネキシンV染色
細胞は、DNA含量/細胞周期分析に用いたのと同じ条件下で、48時間培養した。すべての細胞を集め、100μl 1 X アネキシンV結合バッファー（Annexin V Binding Buffer）（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）中に再懸濁した。2μl FITC-アネキシンV（BD Biosciences）を添加し、暗下で10分間（室温で）インキュベートした。次に細胞をPI（Sigma, Saint Louis, Missouri, USA）で終濃度5μg/mlとして染色し、細胞を室温にて15分間暗下でインキュベートした。その後、400μlのアネキシンV結合バッファーを添加し、BD FACSCaliburフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーを行った。細胞は、アネキシンV+/PI-（初期アポトーシス）およびアネキシンV+/PI+（後期アポトーシス）であれば、アポトーシスであるとみなされた。それぞれの分析は少なくとも20,000の事象を用いて実施された。
【０１２４】
Aldefour発現：
MCF-7マモスフェアをトリプシン処理し、緩やかにボルテックス攪拌して、40μm細胞フィルターを通し、単個細胞懸濁液を作製した。細胞（5x105）を洗浄し、増殖培地（Lonza）に再懸濁した。ALDH1酵素活性を有する、Aldefluor染色される細胞集団を同定するために、Aldefluorキット（Stem Cell Technologies）を使用したが、これは、ヒトALDH1との特異的相互作用による、幹細胞の最適な同定および分離のためにデザインされたものである。簡単に述べると、非荷電ALDH1基質であるBODIPY-アミノアセトアルデヒド（BAAA）を含有するAldefluorアッセイバッファー中に細胞を懸濁し、37℃にて45分間、15分ごとに緩やかにボルテックス攪拌しながらインキュベートした。BAAAは受動拡散により、生きた細胞に取り込まれ、その後細胞内のALDHによって負電荷を持つ反応生成物BODIPY-アミノアセテートに変換されるが、これは高レベルのALDH1を発現する細胞内に保持されるので、その細胞は明るい蛍光を発するようになる。蛍光性のALDH1発現細胞は、FACScan機器(BD Biosciences)の緑色蛍光チャンネルで検出した。一組の細胞を、特異的ALDH阻害剤、ジエチルアミノベンズアルデヒド（DEAB）を用いて同一条件で染色し、実験のネガティブコントロールとした。PI（Sigma）蛍光は、オレンジ蛍光チャンネルで検出した。BAAAおよびDEABとともにインキュベートした細胞を用いて、細胞およびALDH1陽性画分のベースライン蛍光を確立した。Cell Questソフトウェア (BD Biosciences)を用いてデータを解析した。
【０１２５】
免疫ブロッティング
細胞溶解物は、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、125 mM NaCl、0.5% NP-40、0.1% SDS、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、1 mM EDTA、50 mM NaF、1 mM オルトバナジン酸ナトリウム、2.5 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM βグリセロリン酸ナトリウム、1 mM PMSF、およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche Molecular Biochemicals）を含有する溶解バッファーを用いて調製し、遠心分離により清澄化した。タンパク質濃度は、BCA Protein Assay（Pierce）を用いて測定し、20-50μgの溶解物を4-12％SDS-PAGEゲルで分離した。転写後、膜を、0.1% Tween-20含有Tris緩衝食塩水中5％BSA（Sigma）の中で室温にて15-30分間ブロックした。一次抗体を室温で1.5時間、または4℃で一晩インキュベートした。二次抗体を室温で30-45分間インキュベートし、タンパク質を、West Pico Stable (Pierce)を用いて可視化した。抗体はすべて、特に指定のない限り1:1000希釈として使用した。pT308AKT、AKT、pT180/Y182、pT183/Y185 P38MAPK、pP38MAPK、pT202/Y204 pERK1/2、ERK1、pT183/Y185、pJNK1/2、JNK1、pT71ATF2、pT581MSK1、pT14 Cdc2、Cdc2、pT68Chk2（Cell Signaling）、pT334MAPKAPK、pS82HSP27（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）、α-チューブリン（Biomarkers, 1:50,000）、サイクリンB1 (Santa Cruz Biotechnologies) および西洋ワサビペルオキシダーゼ-結合抗ウサギIgGおよび抗マウスIgG（1:5,000, Pierce）。
【０１２６】
免疫ブロット定量
ImageJソフトウェア(NIMH)を用いて、デンシトメトリー定量を行った。
【０１２７】
結果
GR-24はヒト乳癌細胞株の増殖を阻害する
癌細胞株の長期増殖に及ぼすGR-24の影響（図３）を、クリスタルバイオレットアッセイによって評価した。MCF-7（エストロゲン受容体陽性(ER+)、腫瘍形成性、非転移性）、(A) MDA-MB-231、MDA-MB-436（ER陰性(-)、転移性）、およびBJ線維芽細胞（正常、非腫瘍性株）は、0.5から10 ppm（1.65-33μM）の用量範囲のGR-24により処理した。増殖は、10日に至るまでの間モニターした。指示された時点で、プレートをクリスタルバイオレットにより染色した。データは、溶媒対照に対する吸収パーセント（560 nm）として記録する。平均±標準偏差（SD）。スチューデントt検定（両側、対応あり）を用いて、GR-24処理群を溶媒（対照）群とともに終了時点で評価し、p<0.05 (*)ならば有意、p<0.01 (**)ならば非常に有意、p<0.001 (***)ならばきわめて有意であると見なした。(B) は、指示された用量のGR-24に7日間暴露した後の、吸光度の表示数値（560 nm）を示すグラフである。データは溶媒対照に対するパーセントとして表される。3連サンプルの平均＋SD。水平な線（---）は、溶媒対照に対して吸光度（560 nm）の50％減少を示す。右の表は、7日後に増殖を50％減少させるために必要な阻害濃度（IC50/7 d）を示し、これは関連するy軸データポイント間の内挿による直線回帰によって算出された（GraphPad Prismソフトウェア）。
【０１２８】
2.5-5 ppm濃度のGR-24は、MCF-7、MDA-MB-231、およびMDA-MB-436において、結果として、溶媒処理対照と比較して有意な増殖の減少をもたらした。BJ線維芽細胞は、この全期間にわたって増殖の有意な減少を示さなかった（図３）。最高濃度では少し減少が観察されたが、これは、MCF-7およびMDA-MB-231細胞において同一濃度のGR-24により達成される増殖阻害と比較すると軽微であった。7日後に長期増殖の50％が阻害される、GR-24の濃度（IC50）を求めるために、第7日の光学濃度を溶媒対照に対するパーセンテージとしてプロットし（図３B）、濃度を内挿により計算した。MDA-MB-436、MDA-MB-231、およびMCF-7細胞に関するIC50濃度は、それぞれ5.2 ppm (17.2μM)、5.7 ppm (18.8μM)、および5.7 ppm (18.8μM)であった（図３B）。
【０１２９】
GR-24はG2/M-アレストおよびアポトーシスを誘導する
細胞周期進行に及ぼすGR-24の影響を調べるために、フローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム染色によって全DNA含量分析を行った。MCF-7、MDA-MB-231、およびMDA-MB-436細胞を、5および10 ppmのGR-24で48時間処理して、非腫瘍形成性乳腺細胞株MCF10Aを対照として使用した。GR-24処理は、G2/M期の細胞パーセンテージの、用量依存性の増加を引き起こし、同時にすべての腫瘍形成性細胞株でG1期の細胞のパーセンテージの減少を引き起こすが、MCF10A細胞の細胞周期分布には、GR-24処理で何の変化も見られなかった（図４）。高い方の濃度（10 ppm）では、GR-24は、溶媒対照と比較して、MDA-MB-231 (4.6倍)およびMDA-MB-436細胞(3.4倍)の、sub-G1/アポトーシス画分の増加を引き起こしたが、これはアポトーシスの増加を示した。MCF-7細胞は、10 ppmでsubG1画分の変化を示さなかった。
【０１３０】
GR-24は、乳癌幹様細胞の濃縮マモスフェア培養の増殖を阻害し、生存率を低下させる
腫瘍始原細胞（TIC）もしくは癌幹細胞（CSC）は、従来の化学療法および放射線療法に対して本来、抵抗性である。こうした細胞は、前記治療により根絶された元の腫瘍の細胞成分を再生させることができるので、結局、再発に至る。この細胞集団を標的とすることができることは、有効な治療計画を開発するために重要である。マモスフェア培養は、乳腺CSCを濃縮するために広く行われている。MCF-7は、非接着、無血清の増殖条件下で「マモスフェア」として増殖させることができる。GR-24がMCF-7のマモスフェア形成を阻害することができるかどうかを判定するために、MCF-7細胞をGR-24の存在下または非存在下でマモスフェアとして増殖させた（図５A）。マモスフェア形成は、2.5-5 ppmのGR-24存在下で完全に阻害され、単層増殖を阻害するのに必要な濃度の5分の1に低い1 ppmでは大幅に弱められた（p<0.01）（図５）。0.5 ppm濃度では、増殖阻害の程度は弱かったが、マモスフェアは溶媒処理対照より小さい（<50μm）ことが多かった（p<0.05）。第二代MCF-7マモスフェアをGR-24存在下で増殖させると、同様の結果が得られた（図５B）。GR-24によるマモスフェア増殖阻害の普遍性を評価するために、別の乳癌細胞株MDA-MB-231を調べた（図５C）。GR-24は5 ppmで、MDA-MB-231マモスフェア形成を完全に阻止した。2.5 ppmでは、マモスフェア増殖は大幅に弱められ、マモスフェアは溶媒対照群と比べてかなり小さくなっていた（<50μm）。重要なのは、MCF-7およびMDA-MB-231のマモスフェア形成を阻止するのに必要なGR-24の濃度が、単層増殖のIC50用量よりそれぞれ5.7分の1および2.7分の1に低下していたことである。したがって、マモスフェアは、GR-24の増殖阻害作用に対して単層培養よりも高い感受性を示す。これが興味深い発見であるのは、マモスフェア培養がTIC、ならびに化学療法に対して本質的に抵抗性であると判明している細胞に富んでいると報告されているからである。
【０１３１】
マモスフェア生存率および幹細胞マーカー発現に及ぼすGR-24の影響
マモスフェア生存率は、XTTアッセイ（ATCC）で評価した。指示された濃度のGR-24を添加した5日後、細胞生存率を測定した。5 ppmでは、GR-24は、生存率を約80％（98.4%+ 3.4から16.4%+ 4.6）低下させた（図６A）。興味深いことに、マモスフェア形成が完全に阻害される2.5 ppmでは、生存率は68.6%+12.4にとどまり、このことは阻害の時期が重要であることを示唆している。GR-24により引き起こされるマモスフェア形成阻害をさらに調べるために、乳腺幹細胞マーカーを調べた。
【０１３２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH1）は、多くの癌型のTICの分離において機能的マーカーとなることが判明しており、他の表面マーカーと組み合わせてALDH活性に基づいて、MCF-7 TICを選択することができる。ALDH活性は、接着培養と比べて、初代マモスフェアにおいて強化され、第二代マモスフェア培養はいっそう強化された状態に達した（図６B）：接着MCF-7細胞および8日経過した第二代マモスフェアを、単個細胞懸濁液として調製し、ALDH発現をメーカーの説明書（Aldefluorキット、Stem Cell Echnologies, Vancouver, CA）にしたがって分析した：右のグラフは、MCF-7接着培養、初代（Adh）、5 ppm、1 ppm GR-24もしくは溶媒のみ（cont.）（0.6％アセトン）のいずれかの存在下で培養した初代マモスフェア、ならびに8日経過した第二代マモスフェア（sec.）における、ALDH陽性細胞のパーセンテージを示す。第二代マモスフェアはALDH活性について2.4倍の増加を示す。初代マモスフェアは、ALDH発現について6％から8％へ、陽性の小幅な増加を示す。GR-24処理は、6％から2％へALDH発現の減少を引き起こす。こうしたデータから、GR-24がマモスフェア形成の強力な阻害剤であり、GR-24によるALDHのダウンレギュレーションがこの活性の主原因であるかもしれないことが示唆される。さらに、このデータは、ストリゴラクトンがマモスフェア形成の強力な阻害剤であることを示唆する。
【０１３３】
ストリゴラクトンアナログは、さまざまな癌由来細胞株の有効な増殖阻害剤である
追加の5つの合成ストリゴラクトンアナログを入手し（図１６）、それらが結腸癌、前立腺癌、肺癌、骨肉腫、黒色腫、および白血病の癌由来細胞株の増殖を阻害する能力について調べた。MCF-10A細胞は非腫瘍形成性株の一例として含めた。XTT生存率アッセイは、指定用量のストリゴラクトンアナログ存在下で、3日間処理後に行った。結果として生じるストリゴラクトンアナログ処理後の吸光度計測値の差異は、増殖および細胞生存の変化を反映する（図７A-C）：細胞は、通常の増殖培地中で、96ウェルプレートにシードした。翌日、10％活性炭処理済み血清および指定用量のストリゴラクトンアナログもしくは溶媒のみ（cont.）を添加したフェノールレッドフリーDMEMで、培地を置き換えた。生存率は、3日後にアッセイした（XTT、ATCC）。IC50濃度を示す（上記表３）。細胞株は、それぞれのストリゴラクトンアナログに対する反応に、相当なばらつきを示したが、すべての癌細胞株の増殖は、ストリゴラクトンアナログ処理によって阻害された。ST-362およびMEB-55は、もっとも強力なストリゴラクトンアナログであった。ST-362のIC50濃度は2.9 ppm（MDA-MB-231）という低い値からであり、MEB-55については下は3.9 ppm（MDA-MB-231）からであった。非腫瘍細胞株MCF-10Aは、ストリゴラクトンアナログ処理の影響に対して、15 ppmの濃度までは抵抗性であったが、例外はST-362であって、これは第10日から14日の間に20％の生存率の減少をもたらした。EG-9Cは、テストしたすべての細胞株において、もっとも有効性の低いストリゴラクトンアナログ（IC50>10-15 ppm）であったが、A549は例外であって、IC50=4.3 ppmという値が測定された。A549細胞は、EG-5、MEB-55、ST-357、およびST-362に対しても、IC50=4.8-6.5 ppmで、感受性を示す。ST-357は、PC3（IC50=5.3ppm）およびMDA-MB-231（IC50=5.0 ppm）細胞の強力な増殖阻害剤であった。一部の細胞株は、低用量の濃度でXTT吸光度の増加を示した。対照の溶媒量は、最高用量だけに合わせたので、全溶媒量は低用量には一致しなかった。溶媒レベルに対する感受性が、
おそらくは、一部の細胞株での低用量との関連で、対照において観察された生存率抑制の主な要因である。
【表４】
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【０１３４】
3日間のストリゴラクトンアナログ処理後に生存率の50％阻害を達成するために必要な阻害濃度（IC50）。値は、線形補間によって計算した（Graphpad Prism 4.0）。
【０１３５】
水溶液中でのストリゴラクトンアナログの安定性を評価するために、それぞれのストリゴラクトンアナログを培地中で求められる濃度に希釈し、4℃にて3日間保存して、その時点で、そのストリゴラクトンアナログ含有培地で、MCF-7細胞表面を覆ったが、このMCF-7細胞は、5％活性炭処理済み血清を含有するフェノールレッドフリーDMEM中で96ウェルプレートに播種されたものである。3日間増殖後、生存率を評価し（XTT、ATCC）、結果を、新しく希釈されたストリゴラクトンアナログで処理した細胞と比較した（図１５）（吸光度の計測値は対照に対する％として提示される。平均＋SD）。EG-5を除いてすべてのストリゴラクトンアナログは、この期間の終わりまで同様の活性レベルを保持したが、EG-5はまったくMCF-7増殖を阻害することができなかった。こうした理由から、すべてのストリゴラクトンアナログは、アセトン原液から培地に、新しく望ましい濃度に希釈され、1時間以内に細胞を覆うように加えられた。必要ならば、培地を3日ごとに新しいものに換えた。
【０１３６】
ストリゴラクトンアナログは、細胞周期進行を阻害し、アポトーシスを誘導する
GR-24処理は、G2/M期にあるMCF-7、HCT116、MDA-MB-231、DU145、A549、SW480、およびHT-29細胞のパーセンテージの増加を引き起こし、MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびHCT116細胞ではアポトーシスを引き起こす。これらの追加のストリゴラクトンアナログも同じメカニズムの増殖阻害を引き起こすのかどうかを判定するために、細胞周期分析を行った。結果は、G2/M期の細胞パーセンテージの用量依存性の増加を示す（図１２）：細胞は、10％活性炭処理済み血清、およびIC50/72hもしくはIC50/72h+25％濃度のストリゴラクトンアナログを添加したフェノールレッドフリーDMEM中で、異なる濃度のストリゴラクトンアナログにより48時間処理した。IC50/72h を25％上回る濃度で、subG1画分の細胞パーセンテージが増加し、MDA-MB-231細胞においてアポトーシスが増加している証拠が得られた。MDF-7細胞は、テストした用量では、ストリゴラクトンアナログの作用に対する感受性は低かった。BJ線維芽細胞は、テストした用量では、ストリゴラクトンアナログの作用に対して感受性でなかった（上記表４）。
【０１３７】
有糸分裂における染色体凝縮は、ヒストンH3のリン酸化によって達成される。したがって、細胞がG2もしくはM期で停止しているかどうかを判定するために、ストリゴラクトンアナログ暴露後にpS10ヒストンH3についてHCT116細胞を分析した。結果によれば（図１２E）、ストリゴラクトン処理後に、pヒストンH3について陽性の染色細胞のパーセンテージの用量依存性の減少が見られ（溶媒対照では2.7％、それぞれ7.5 ppmおよび5 ppmのST-357で処理された細胞では0.3％および0.7％、ならびにそれぞれ7.5 ppmおよび5 ppmのMEB-55で処理された細胞では0.9％および1.45％）、これはM期にある細胞の分布の減少を示すものである（図１２E）。in vitroストリゴラクトン処理で観察される増殖阻害がある程度アポトーシスに起因するのかどうかを、さらに数値化するために、HCT116細胞を、アネキシンVおよびPI（ヨウ化プロピジウム）で二重染色した。アネキシンV染色は、アポトーシスの初期事象である細胞膜内葉の反転を示す。後期アポトーシスは、膜の完全性の喪失によって特徴付けられ、細胞はPIに対して透過性となる。図１２Fに示すように、HCT116細胞のストリゴラクトンアナログ処理は、初期（アネキシンV＋/PI−）および後期（アネキシンV＋/PI＋）アポトーシス細胞のパーセンテージを用量依存性に増加させた：HCT116細胞は、ウェル当たり4x105細胞として、10％DMEM培地中で、2つの6ウェルプレートにシードされた。翌日、培地を、10％活性炭処理済み血清および指定されたストリゴラクトンアナログを添加したフェノールレッドフリーDMEMで置き換えた。用いられた用量は、IC50 およびIC50+25％に相当する。細胞は48時間インキュベートした後、アネキシンVおよびPIで同時に染色した（図１２F）。10 ppmおよび15 ppm MEB-55で処理した後、後期アポトーシス細胞のパーセンテージは、3.6％から62％および85％にそれぞれ増加した（図１２F、下図）。10 ppmおよび15 ppm EG-9cで処理した後、後期アポトーシス細胞の画分は、それぞれ12.5％および43.3％に増加した（図１２F、中央図）。このデータは、他のストリゴラクトンアナログ、EG-5、ST-357、およびST-362に関する結果とともに、棒グラフの形でも提示された（図１２G）。アネキシンV/PI二重染色分析は、他の2つの結腸癌細胞株（SW480、HT29）でも、ストリゴラクトン処理後に行った。アポトーシスの増加は、MEB-55処理後にこれらの株においても用量依存性に観察された（図１２D）。
【０１３８】
ヘキスト染色を用いて、核の変化を分析した。5-10 ppmでのST-362処理は、結果として核凝縮の増加、ならびにアポトーシスを示す断片化という変化をもたらした（図９A）。継続的なストリゴラクトンアナログ暴露が増殖阻害および細胞生存率の低下のために必要であるかどうかを判定するために、MDA-MB-231、HCT116、およびU20S細胞を、ST-357、ST-362、もしくはMEB-55のいずれかで、5 ppm、10 ppm、もしくは20 ppmにて、1、2、4、8、もしくは24時間処理した。それぞれの時点で、ストリゴラクトンアナログを除去し、培地を、ストリゴラクトンを含まない新しい増殖培地で置き換えた。その後、細胞を1％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘキスト33342で染色して、細胞収縮、核凝縮、および核フラグメンテーション、ならびに遍在性の核の証拠が観察されることを示した（図９A挿入図）。それに加えて、MDA-MB-231細胞の生存率を、XTTアッセイを使用することによって24時間後に評価した（図９B）。ST-362およびMEB-55は、不可逆的な細胞生存率の減少を、用量依存性、およびインキュベーション時間依存性に、引き起こす：MDA-MB-231乳癌細胞は、指示された濃度のストリゴラクトンアナログで処理した（図９B）。2、4、または24時間後に、培地を除去し、細胞を洗浄し、培地を、ストリゴラクトンを除いた増殖培地で置き換えた。細胞生存率は、24時間時点で評価した：生存率の有意な減少は、ストリゴラクトンアナログ処理の4時間という早い時点でもたらされた（p<0.01）。2時間暴露後では、細胞生存率の変化は観察されなかった。各ストリゴラクトンアナログに対する継続的な暴露（24時間）は、4時間暴露と比較してより大幅な細胞生存率の低下をもたらした（p<0.001）。これらの結果は、ストリゴラクトンアナログが、不可逆的で時間依存性の、細胞生存率の減少を引き起こすことを示す。したがって、ストリゴラクトンは不可逆的で時間依存性の細胞生存率の減少を引き起こすと結論づけることができる。
【０１３９】
HCT116細胞（図９C）において、ST357、ST362、およびMEB55は、1時間後に小幅な生存率の減少を引き起こした（それぞれ10 ppm; 75%、82%、および75%、20 ppm; 63%、80%、および68%）。4および8時間の処理後に、ST-362（20 ppm）は、細胞生存率を60％から30％に減少させた。ST-357は細胞生存率を50％から10％に減少させた。MEB-55は、調べた中でもっとも強力なアナログであって、4時間で生存率に劇的な減少をもたらした（10 ppm、18%、および20 ppm、0%）。DU145細胞において同様の結果が観察された（図９D）。U20S細胞は、1から4時間の間、ストリゴラクトンアナログ処理に対してより大きな感受性を示したが（図９E）、それはこの細胞株における低いIC50値と相関するものである（図７の中の表）。1時間後、生存率は、10 ppm濃度でのST-357、ST-362、およびMEB-55処理細胞において、80％、65％、および52％、ならびに20 ppm濃度で、それぞれ77％、65％、および40％に減少していた。しかしながら、4時間後、生存率は、10 ppm濃度でのST-357、ST-362、およびMEB-55処理細胞において、62％、25％、および0％、ならびに20 ppm濃度で、それぞれ10％、11％、および0％に減少していた。これらの結果は、ストリゴラクトン処理の損傷作用が、短時間暴露後に引き起こされ、ストリゴラクトン除去により不可逆的であることを示す。
【表５】
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【０１４０】
BJ線維芽細胞およびMDA-MB-231細胞の細胞周期進行に及ぼすストリゴラクトンアナログ処理の影響。全DNA含量のフローサイトメトリー分析を用いて、細胞周期のさまざまな時期の細胞の数を評価したが、これはストリゴラクトンアナログ処理後のsubG1ピーク検出を含む。細胞は、指示された用量のEG-5、ST-362、およびMEB-55で48時間処理した。データは2つの独立した実験を代表するものである。
【０１４１】
MCF-7マモスフェア増殖はストリゴラクトン処理で阻害される
GR-24と比較して同様の効果を、他のストリゴラクトンアナログが乳癌細胞株増殖に対して有するならば、ストリゴラクトンアナログがMCF-7初代マモスフェア形成にも同じ効果を有することが見込まれた（図１０）：MCF-7細胞は、ウェル当たり3000細胞として2連で、低接着表面96ウェルプレート内、MEBM培地にシードした。同じ日に指示された用量のストリゴラクトンアナログを添加した。7日後、代表的な画像を撮影した。5つのストリゴラクトンアナログはすべて、マモスフェア形成を、5 ppm以上の濃度で完全に阻止している（図１０A）。ST-362およびMEB-55は、2.5 ppmでマモスフェア増殖も阻止する。ST-357は、2.5 ppmでマモスフェア増殖の有意な減少を示す（p<0.01）。ST-357、ST-362、およびMEB-55も、1 ppmでマモスフェア形成を有意に阻害する（p<0.01）。以上のデータは、これらのストリゴラクトンアナログが、もっとも強力なMCF-7単層増殖の阻害剤であることと一致する（図７、表２）。GR-24と同様に、マモスフェア形成を阻害するのに必要とされる用量は、単層培養の増殖を阻害するのに必要な用量より低い（5分の1に低下している；ST-362およびMEB-55、3分の1に低下している；ST-357）。ストリゴラクトンアナログ処理に対する感受性が、マモスフェア形成に特異的であるのか、またはそれが成熟マモスフェアの完全性および生存にまで拡大されるのかを判定するために、MCF-7マモスフェアをストリゴラクトンアナログ非存在下で増殖させて、7日後に（またはマモスフェアが100μmを越える平均直径に到達したら）、ストリゴラクトンアナログを指定された用量で増殖培地に添加した（図１０）。MCF-7細胞は、MEBM培地中で、低接着表面96bウェルプレートに、2連で、ウェル当たり3000細胞として播種し、初代マモスフェアを7日間増殖させた。その時点で、指示された用量のストリゴラクトンアナログを培地に添加した。図１１Aは、5 ppm濃度で処理されたマモスフェアの代表的画像であるが、これは、ストリゴラクトンアナログに2日間暴露後の解離を示す。EG-9Cで処理されたマモスフェアは、それほど大きな形態変化を示さなかったが、それはこのストリゴラクトンアナログの、マモスフェア形成を阻害する能力の低下と相関している（図１１A）。5日間の処理の後に、マモスフェアを、24および48時間後に視覚的にモニターした。24時間のストリゴラクトンアナログ処理の後に変化は観察されなかった。48時間後に、ST-362、ST-357、およびMEB-55により5および2.5 ppmの用量で処理されたマモスフェアは、ほぐれた形を示し、解離しているように見えた（図１１B）：マモスフェアの数（>100μm）を数えて、溶媒処理対照に対するパーセンテージとしてデータを提示した（図１１B）。5 ppmの濃度で、EG-5、EG-9C、ST-357、ST-362、およびMEB-55は、マモスフェアの数をそれぞれ、86.7+6.8（溶媒対照）から23+5、38+6.2、6+2、8.3+3.5、および9.3+1.5％に減少させる。2.5 ppmの濃度では、マモスフェア数は、35+6.9 (EG-5)、52+12.3 (EG-9C)、22+8.5 (ST-357)、6+1.7(ST-362)、および20.7+8.6 (MEB-55)に減少した。予想したとおり、これらの結果は、アナログがマモスフェア形成を阻害する能力と密接に相関している（図５）。XTT生存率アッセイは、解離したマモスフェアについても実施した。5 ppmの濃度で、EG-5, ST-362 and MEB-55は、生存率をそれぞれ3.7+0.5、25.5+8.8、および4.6+1.1％に低下させた。
【０１４２】
ストリゴラクトンアナログはストレスで活性化されるMAPKを活性化し、生存シグナル伝達を阻害する
癌細胞においてストリゴラクトンアナログによって引き起こされるシグナル伝達機構を調べるために、MDA-MB-231、DU145、およびHCT116細胞をストリゴラクトンアナログで1、4、または8時間処理し、溶解物を免疫ブロッティングにより分析した。MAPK酵素ファミリーは、細胞増殖、生存、および細胞ストレス応答に重要な役割を果たす。もっともよく特徴が判明しているMAPKは、3つのファミリー：(i) ポジティブな増殖シグナルに反応して活性化される、マイトジェン活性化細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK1/2）、(ii) c-Junアミノ（N）末端キナーゼ（JNK1/2/3）、ならびに (iii) p38アイソフォーム（p38α、β、γ、δ）に分類されるが、すべてが、DNA損傷、UV照射、および炎症性サイトカインなどの環境ストレス刺激によって活性化される。
【０１４３】
ストリゴラクトンアナログで処理したMDA-MB-231およびHCT116細胞の免疫ブロット分析を行った。図１３Aは、ST-362により10もしくは5 ppmの濃度で、または溶媒のみ（-）により、指示された時間処理した後のMDA-MB-231細胞の免疫ブロット分析を示す：pERK1/2にはいくつかの用量依存性の変化が示されたが、ERK1/2の全タンパク質レベルには変化はない（図１３A）。しかしながら、ST-362は、時間依存性および用量依存性のpP38レベルの増加を引き起こし、それは4時間のストリゴラクトンアナログ暴露後に最初に明らかになった。4時間および8時間時点で、pP38レベルは、ST-362処理を受けて、溶媒対照と比較して、それぞれ5倍および13倍増加した（図１３B - 図１３Aに示すpP38レベルのデンシトメトリー定量を示す棒グラフ）。pP38レベルが下流のシグナル伝達の活性化につながるかどうかを判定するために、核のP38基質、活性化転写因子２（ATF2）（これは塩基性領域ロイシンジッパータンパク質のATF/cAMP応答配列結合（CREB）タンパク質ファミリーに属す）、MSK1（マイトジェンおよびストレス活性化タンパク質キナーゼ）、および熱ショックタンパク質27（HSP27）を分析した。ATF2およびHSP27のリン酸化が、MDA-231細胞において、MEB-55またはST-362に反応して誘導された（図１３Aおよび図１３C）。ST-362処理後4時間から8時間の間にレベルは著しく増加し、その結果、pP38 MAPKと同様の活性化の経時変化にしたがった。pMSK1に変化はなかった。重要なことは、pT581 MSK1もERK1/2の標的であって、そのリン酸化は、ストリゴラクトンアナログ処理後に不変であったことである。MEB-55およびST-362も、MDA-231細胞において4時間後にP38、ATF2、およびHSP27のリン酸化を誘導することができた（図１３Dおよび図１３F）。P38とJNK1/2の間に有意なクロストークが存在し、これら2つはMAPKKKのサブセットを共有する。ストリゴラクトンアナログ処理はまた、4時間後にpLNK1/2の増加をもたらした（図１３D）。
【０１４４】
P38が、ストリゴラクトンによって誘導されるATF2およびHSP27のリン酸化の、直接的な原因であるかどうかを判定するために、ストリゴラクトンアナログを添加する前に、MDA-231細胞を、薬理学的P38阻害剤、SB203580で1時間、前処理し、その細胞をST-362もしくはMEB-55単独で、またはSB203580とともに4時間処理した。SB203580の機能は、直接的なP38の標的であるpT334 MAPKAPKに関する免疫ブロッティングにより確認した。pT334 MAPKAPKリン酸化は、SB203580暴露後に用量依存性に減少した（図１３E）。pT334 MAPKAPKは、pMSK1のように、MEB-55処理で増加しなかった（図１３Aおよび図１３D）が、これは、ストリゴラクトン処理がP38標的の特異的サブセットの活性化だけを誘導することを示す。ストリゴラクトンアナログ添加前の、2μMおよび10μMの濃度で1時間のSB203580によるMDA-231細胞の前処理は、ST-362およびMEB-55によって誘導されるHSP27のリン酸化を阻害するには十分である（図１３F）が、SB203580は20μMから40μMであっても、ストリゴラクトンアナログ処理後にATF2リン酸化を阻害せず（図１３E）、それどころか、pATF2レベルの用量依存性の増加をもたらした。
【０１４５】
SB203580処理細胞ではpP38 MAPKレベルも増加していたが、試薬のデータシート上にも報告されている現象である（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）。これらの結果から、P38がこの系においてATF2リン酸化の原因でないことは明らかである。ATF2はまた、JNK1/2により直接、またはRas-ERK1/2経路によって、T69およびT71上でリン酸化されることが考えられる。ERK1/2の活性化はストリゴラクトン暴露で変化しなかった（図１３A）ので、JNK1/2が可能性のある候補であると思われる。
【０１４６】
MEB-55はpP38の時間依存性の増加を誘導するが、それは4時間のストリゴラクトンアナログ処理で最初に明白となり、24時間時点で依然として高いままであった（図１３Gおよび１４H）。HSP27はP38の下流標的であって、P38MAPキナーゼ経路の活性化の結果として、MAPKAPキナーゼによりSer15、Ser78、およびSer82で直接リン酸化される。MAB-55に反応して、pSer82 HSP27レベルは、pP38と同様の時間依存性で増加した。JNK1/2は、4時間で急激で大幅な（15倍増加）リン酸化を示したが、このリン酸化は8時間で50％減少し、24時間で基底レベルに戻った。これに対して、pERK1/2レベルは1時間処理後に4分の1に低下し、4時間から8時間までさらに減少して、24時間時点で依然として抑制されたままであった。同様に、pAKTレベルは8時間で6分の1に減少し、24時間では検出できないレベルまで低下した。MAPKの活性化は、「正常な」BJ線維芽細胞株においても検討した（図１３I）。pP38レベルは、ストリゴラクトン処理後、BJ線維芽細胞においてあまり変化のないままであった。pERK1/2レベルは、4時間でのみ減少したが、8時間ではベースラインに戻り、実に24時間ではベースラインを超えて増加しており、DU145細胞とは異なる反応の動態を示す（図１３I）。図１３Jは、ST-357またはMEB-55で4時間処理した後のHCT116細胞におけるP38およびpP38の免疫ブロット分析である。
【０１４７】
ストレスにより活性化されるMAPKの活性化が、ストリゴラクトンアナログにより誘導される増殖阻害およびアポトーシス誘導に必要であるかどうかを判定するために、P38およびJNK1/2の薬理学的阻害剤（それぞれSB203580およびSP600125）を使用した。DU145およびU20S細胞は、ST-362もしくはMEB-55単独で、またはSB203580とともに処理した。pHSP27の免疫ブロット分析から、SB203580は、ストリゴラクトンアナログにより誘導されるP38活性化を完全に阻害することができることが確認された（図１３K）。SP600125を用いた同様の分析は、JNK1/2キナーゼの活性を部分的に低下させただけであったが、SP600125濃度の増加は細胞に対して有害であった（図１３L）。その後のコロニー生存アッセイでは、U20S細胞は、50μM SB203580で2時間前処理するか、または、さまざまな用量のST-362単独で6時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理してから、6ウェルプレート内で2x103細胞/ウェルの限界希釈で再播種した。細胞は14日間コロニーを形成させ、その時までに細胞を固定して、クリスタルバイオレットおよび70％EtOHで染色した。50細胞以上のコロニーを計数し、生存曲線を図１３Mに示す。ST-362の濃度の増加は、細胞生存率を低下させたが、SB203580による細胞の前処理は、細胞生存率をある程度高め、ストリゴラクトンアナログの阻害機能を一部回復させることができた。
【０１４８】
ストリゴラクトンアナログは生存シグナル伝達経路を阻害する
PI3K/AKT経路は、生存および増殖を含めて、広範な細胞機能を調節する。AKT活性化は、2つの重要な残基、カルボキシ末端に近いS473のリン酸化を必要とするが、これは、その後のT308リン酸化および最大のAKT活性化のための必要条件とみなされる。pT308 AKTレベルは、MEB-55で処理した細胞において4時間から8時間までに劇的に減少し、24時間時点で低いままであった（図１４）。あまり強力でないストリゴラクトンアナログ、EG-5で処理した細胞は、AKTリン酸化の阻害にわずかな遅延を示し、8時間から24時間の間に生じた。GSK3α/β活性は、S9のリン酸化により阻害される。pS9/21GSK3α/βは、pAKTと、それほど密接には相関しなかったが、pGSK3α/βの減少が24時間後に観察された（図１４）。PDK1はAKTをT308でリン酸化するが、それ自体はS241のリン酸化によって活性化される。pS241 PDK1のレベルはストリゴラクトン処理で減少し、ストリゴラクトン処理細胞で見られるAKTリン酸化の減少と密接に相関していた（図１４）。これらの結果は、ストリゴラクトンアナログは生存シグナル伝達経路を阻害することを示す。
【０１４９】
結腸細胞はストリゴラクトン処理に反応してG2/M アレストおよびアポトーシスを起こす
G2から有糸分裂（M）への細胞周期進行は、サイクリンB1の蓄積によって成し遂げられる。サイクリンB1はCdk1(Cdc2)とともに複合体を形成し、成熟促進因子（MPF）となるが、これは染色体凝縮、核膜破壊、および紡錘体極集合などの有糸分裂の初期事象に関与するものである。
【０１５０】
HCT116細胞は、3つの6ウェルプレート内に、10％DMEM培地中、ウェル当たり4x105細胞として播種した。翌日、培地を、指定のストリゴラクトンアナログ（10 ppm）または溶媒のみ（vehi.）を添加した増殖培地に置き換えた。細胞は、8時間または24時間インキュベートした。その結果得られた溶解物をサイクリンB1、ならびにローディングコントロールとしてチューブリンについて、免疫ブロットした（図１７A）。
【０１５１】
DU145 （図１７B）、HCT116（図１７C）、およびA549（図１７D）における、サイクリンB1レベルのウェスタンブロット分析によれば、サイクリンB1レベルは24時間ストリゴラクトンアナログ処理後に5分の1から10分の1に減少している。もっと早い時点ではサイクリンB1レベルの変化は検出されなかった。Cdk1(Cdc2)のThr14における脱リン酸化は、その活性化にとって重大な事象であって、有糸分裂開始を可能にするものである。Cdk1タンパク質レベルは、pT14Cdc2レベルと同様に変化のないままであった（図１７B）。定量的リアルタイムPCRを実施して、サイクリンB1阻害がある程度転写レベルであるのかどうかを判定した。10 ppmのMEB-55で処理されたHCT116およびA549細胞において、溶媒対照と比較して、サイクリンB1 mRNAが2分の1に減少することが観察された（図１７E）。
【０１５２】
サイクリンB1の阻害が可逆的であるかどうかを判定するために、DU145細胞をST-362またはMEB-55で24時間処理し、その後細胞をPBSで洗浄して、培地を、ストリゴラクトンアナログを含まない通常の増殖培地で、さらに24時間、置き換えた。MEB-55およびST-362処理は、用量依存性にサイクリンB1レベルを低下させたが、サイクリンB1タンパク質レベルは、ストリゴラクトン除去後に溶媒単独対照のレベルに戻った（図１７F）。ストリゴラクトンアナログによって誘導されるG2停止もストリゴラクトン除去に際して可逆的であるかどうかを判定するために、DU145細胞をMEB-55で24時間処理し、PBSで2回洗浄した後、MEB-55を除いた新しい増殖培地で表面を覆い、さらに48時間インキュベートした（図１７G）。結果から、5および10ppmの濃度で、MEB-55は18％から、それぞれ46％および50％へのG2/M画分の増加を誘導した。ストリゴラクトンアナログ除去の48時間後、G2/M画分は、5および10 ppm処理細胞のいずれにおいても、対照細胞と比較して29％に減少したが、対照細胞のG2/M画分もこの時点で30.7％（未処理）および28.5％（溶媒対照）に増加していた。
【０１５３】
細胞周期の進行中、サイクリンB1レベルは、中期-後期の移行においてAPC/C依存性プロテアソーム分解によって制御される。ストリゴラクトンアナログが、サイクリンB1の安定性の調節を介して細胞周期進行を阻害するのかどうかを判定するために、DU145細胞をMEB-55またはST-362で24時間処理した。その後プロテアソーム阻害剤ALLNを培地に添加して、さらに4時間または8時間おいた（図１７H）。結果によれば、ALLN処理は、ストリゴラクトンアナログ処理後にサイクリンB1レベルの部分的なレスキュー（ST-362；2倍、MEB-55;1.3倍）を誘導する。しかしながら、サイクリンB1レベルは、対照溶解物より低いままであり、これは、ストリゴラクトンアナログがサイクリンB1レベルを、部分的にしか、分解を強めることによって制御していないことを示している。
【０１５４】
ストリゴラクトンおよび他のストリゴラクトンアナログは、乳癌細胞株の増殖および生存に対する阻害作用を有する。示されたストリゴラクトンアナログはすべて、乳癌細胞株において、さまざまな程度のアポトーシスを伴ってG2/M停止を誘導する。非腫瘍性「正常」株（MCF10AおよびBJ線維芽細胞）は、限られた増殖阻害しか示さず、しかも検討した最高用量でのみ示したことから、腫瘍形成性細胞がストリゴラクトンアナログの増殖阻害作用に対してより感受性であること、ならびにストリゴラクトンアナログが癌細胞と正常細胞で異なる反応を誘導することが示唆された。さらに、ストリゴラクトンの阻害作用は、乳癌細胞、ならびに結腸、肺、および前立腺癌細胞に限定されず、ストリゴラクトンアナログの増殖阻害作用に対する感受性の増加も示している。ST-362およびMEB-55は、わずか4時間後に細胞生存率の不可逆的な減少を誘導するが、この減少はP38 MAPK、JNK1/2のリン酸化およびAKTの阻害と相関していた。P38およびJNK1/2は、ストレスで活性化されるMAPKであって、これはストレスシグナル伝達カスケードにおいて重要な役割を担っており、一部の細胞システムにおいて細胞周期の停止およびアポトーシスと関連している。P38 MAPKは、p53に結合してこれを活性化し、p53によって誘導されるアポトーシスを引き起こすことが報告されている。ストリゴラクトンアナログは、野生型（MCF-7）および変異型（MDA-MB-231, MDA-MB-436, T47D）p53の両者を発現する細胞においてアポトーシスを引き起こすことができたが、MCF-7細胞は感受性が低かった。HSP27リン酸化は、P38の薬理学的阻害剤によって阻止されたのに対して、この阻害剤はATF2リン酸化の増加は阻止しなかったが、このATF2リン酸化はJNK1/2によって活性化することも可能であった。
【０１５５】
ストリゴラクトンアナログに対する細胞の反応の差（細胞傷害性と対比した細胞増殖抑制性）は、用量依存性であったが、細胞周期の段階によって決定される可能性もある。例示されたすべてのストリゴラクトンアナログのIC50用量は、MCF-7細胞と対比してMDA-MB-231細胞に関しては2分の1〜3分の1に低くなっていた。このことは、MDA-MB-231株の高い増殖速度と相関しており（S期画分が、MCF-7では2-4％であるのに対して14-18％）、さらに、急速に分裂する細胞を標的とするストリゴラクトンアナログの能力に基づいて、ストリゴラクトンアナログの癌治療上の役割を支持するものである。「幹様細胞が濃縮された」マモスフェアとして増殖した乳癌細胞は、単層増殖した細胞と比較して、ストリゴラクトンアナログに対する感受性の増加を示した。ストリゴラクトンアナログは、マモスフェア増殖を低下させ、マモスフェアの解離を誘導したが、これは生存率を低下させる能力と相関していた。ストリゴラクトンアナログの植物幹細胞に対する同様の影響は、普遍的な作用メカニズムを示しており、天然ストリゴラクトンとの構造的類似性のために、後者は同様に作用することを示す。
【０１５６】
ストリゴラクトンアナログは遺伝子発現の変化を誘導した
ストリゴラクトンアナログが癌細胞の増殖および生存に影響を及ぼすことができる転写プログラムをさらに解明するために、U20S細胞をST-362またはMEB-55（5 ppm）で6時間または24時間処理し、初期および後期の遺伝子発現の変化を区別できるようにした。U20S細胞は、ストリゴラクトン処理に対する感受性の増強に基づいて選択された（図７を参照されたい）。6時間のストリゴラクトンアナログ暴露後、熱ショックタンパク質（HSPA6、HSPA7、HSP1A、HSP1B、HSPB8）および関連遺伝子、HSPA1L、AHSA1、の発現増加によって、顕著なストレス反応が観察された。ストリゴラクトンアナログ暴露は、代謝機能に関わる遺伝子（SLC3A2、SLC44A2、SLC31A2、SLC7A11、ABCB1、CYP24A1、PTGS2/COX2、ALDH1B1）および転写因子（ATF3、FOX01、FOXD1）の発現の変化も誘導した。サイトカイン（CCL3L3, GDF15）および増殖因子（PGF）のアップレギュレーション、ならびにTGFBR11のダウンレギュレーションも指摘された。DDIT3、BIRC3、およびBAG3を含めて、アポトーシスを制御する遺伝子も同定された。DDIT3は、転写因子のCCAAT/エンハンサー結合タンパク質（C/EBP）ファミリーのメンバーをコードしており、他のC/EBPメンバーとヘテロ二量体を形成してそれらのDNA結合活性を妨げることによって、ドミナントネガティブ阻害因子として機能する。DDIT3は、DNA損傷などを含むストレスによって誘導されるが、DDIT3の過剰発現は細胞周期の停止をもたらす可能性がある。MEB-55処理により、6時間後に、p21cip (CDKN1A), Cyclin F (CCNF), Cyclin A2 (CCNA2)の発現が増加し、CDK6の発現が減少したのに対して、ST-362はサイクリンB1（CCNB1）のわずかなダウンレギュレーションを誘導した。したがって、細胞周期制御因子の発現プロファイルの変化は、ストリゴラクトン暴露の網羅的な特徴ではなかった。唯一の例外はサイクリンG2（CCNG2）であったが、この発現はST-362およびMEB-55処理群の両方で高まっていた。サイクリンG2は、増殖阻害と結び付けられる一般的でないサイクリンホモログであり、その発現は、DNA損傷性化学療法により誘導される。
【０１５７】
24時間のストリゴラクトンアナログ処理は、RNAのプロセシングおよび翻訳に関わる遺伝子（RN7SK、SNORD3A、SNORD3C、SNORD 3D）のアップレギュレーション、ならびに細胞接着に関与する遺伝子（LAMA1、AMPH、ITGA2、SPP1/OPN1、ESM1、CYR61）の発現の変化を特徴とした。ESM1の発現は、MEB-55処理群およびST-362処理群においてそれぞれ、2番目（21.2倍）および3番目（6.9倍）に高くアップレギュレートされた遺伝子であった。ESM1は、分泌性プロテオグリカンであって、その発現は炎症性サイトカインによってアップレギュレートされる。ESM1の発現の変化は、細胞周期の停止を誘導することも明らかになっている。6時間時点とは対照的に、24時間のストリゴラクトンアナログ処理は、熱ショックタンパク質のアップレギュレーションをもたらさず、1つの熱ショックタンパク質（HSPA5）がST-362処理群およびMEB-55処理群のいずれにおいてもダウンレギュレートされていた。転写因子（E2F2、EGR1）および増殖因子（TGFB1、CTGF）のみならず、いくつかの代謝関連遺伝子（DHRS2、SLC7A11、DUSP5、SCG5、ABCA13）も発現パターンの変化を示した。BIRC3は、IAPファミリータンパク質の一員をコードしており、アポトーシス阻害因子であるが、これは24時間処理群においても依然としてアップレギュレートされていた。驚くべきことに、ST-362およびMEB-55処理群のいずれにおいても24時間後に変化した、唯一の細胞周期制御に関わる遺伝子はKIF20Aであったが、これは細胞分裂に関わる分裂キネシンである。ST-362処理だけが、他の分裂キネシン（KIF23、KIF4A、KIF11、KIFC1、KIF2C、IF15）および細胞周期制御因子のダウンレギュレーションを伴っていたが、この制御因子にはサイクリン（CCNB2、CCNA2、CCNF）および細胞周期制御タンパク質（CCNBP1、CDKN3、CDC2、CDCA3、CDC20、CDC25C、CDCA2）が含まれる。サイクリンB1も、ST-362単独によって、24時間後に依然としてダウンレギュレートされた状態であった。
【０１５８】
以下の表6および7は、それぞれ6時間および24時間、ストリゴラクトンで細胞を処理したときに発現される、選択された遺伝子の一覧を提供する。
【表６】
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【０１５９】
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【表７】
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【０１６０】
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【実施例７】
【０１６１】
腫瘍生着および処置
皮下腫瘍を生着させるために、活発に増殖しているMDA-MB-231乳癌細胞を収集し、100μl PBS中1.5×106細胞をマウスの乳房脂肪体に注入した（n=15）。病変は、大きさが平均して約4.5 mm × 4.5 mmになるまで（約3週間）増殖させた。その後、溶媒対照および2つのストリゴラクトンアナログ：ST-362およびST-357を含めて、さまざまな処置をするために、マウスを無作為に3群に分けた。処置は第1日から開始し、10 ppm（10 mg/kg）を週2回、全部で4回治療した。ST-362およびST-357を静脈内に投与した（iv）。体重および腫瘍測定は週2回記録した。腫瘍断面積は、長さ×幅のかけ算によって計算し、腫瘍体積は、長さと幅の平均値を三乗することによって計算した。結果をまとめてプロットした。
【０１６２】
統計分析
データは平均±SDとして表される。統計的有意性は、一元置換分散分析法およびGames-Howell事後検定によって評価した。特に指示しない限り、P<0.05の値を有意と見なしたが、これは未処理対照と比較した有意性を表す。データは、Graphpad PRISM5およびSPSSによって解析した。
【０１６３】
結果
ストリゴラクトンアナログは、in vivo異種移植腫瘍モデルの腫瘍細胞の増殖を阻害する。結果から、10mg/kgのストリゴラクトンアナログによる処置は動物の体重に影響を及ぼさないと判断される（図１９）。一元置換分散分析およびKruskai-wallisの検定から、3群すべての体重の平均および中央値は同様であることが確認された。P=0.2181. MDA-MB-231細胞をSCIDマウスに注入して腫瘍を生じさせ、腫瘍が12.5 mm3に達したら、ストリゴラクトンアナログによる処置を開始した。動物を、週2回、全部で4回処置した。図１８に示すように、ST-362およびST-357はいずれも、腫瘍増殖の阻害に有効であった（p<0.0015）。対照群の平均腫瘍体積は、24.2±5.57 mm3であったが、ST-362処理マウスの平均腫瘍体積は17.7±4.28 mm3であり、ST-357処理群の平均腫瘍体積は15.9±2.61 mm3であった。注射を受けた動物の約10％が、注射部位に軽い炎症を示した。4回目の注射後、動物実験指針にしたがって、動物を屠殺した。
【実施例８】
【０１６４】
ストリゴラクトンアナログと標準的化学療法レジメンとの併用療法
癌の全身的治療は、過酷な毒性作用を引き起こすことの多い化学療法レジメンによって主導されてきた。こうした副作用は、治療の中止につながることが多い。本研究は、ストリゴラクトンアナログが低用量の化学療法薬の効果を増強することを実証した最初のものである。もっとも一般的に使用される化学療法薬の１つがシスプラチンである。
【０１６５】
前のXTT生存率アッセイで、MDA-231乳癌細胞に対するST-362のIC50およびIC20濃度が決定されている（それぞれ2.9 ppmおよび1.5 ppm）。これらの濃度のST-362が低用量のシスプラチンの効果を増強することができるかどうかを判定するために、MDA-231細胞を、IC50およびIC20濃度のST-362存在下で、さまざまな濃度のシスプラチンで処理した。0.01から0.1μMまでの低用量シスプラチンとST-362の併用は、それぞれの薬物単独より大きな効果をもたらした（図２０）。CalcuySynソフトウェアパッケージ（BioSoft）によりChouとTalalayにしたがって併用計数（combination Index）（CI）を分析すると（CI<1）、シスプラチンとST-362の間の相乗作用が示唆される（表８）：
【表８】
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【実施例９】
【０１６６】
天然ストリゴラクトンおよびアナログの酵母細胞培養増殖に及ぼす影響の測定
材料および方法
細胞培養および増殖条件
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびカンジダ・オレオフィラ（Candida oleophila）酵母細胞を培養液中で、150 rpmで28℃にて一晩、増殖させた。次にそれを低栄養培養液（Lily）で0.4 ODに希釈し、96ウェルに分注した。細胞をGR-24およびST-362煮より、指定の濃度で処理した。細胞培養増殖は、17時間の間、28℃にて、各ODを読み取る前に緩やかに振盪して、毎時にモニターした。蛍光光度計を用いてODを測定した。
【０１６７】
統計分析
曲線間の統計的差異を、Statistical Modelingパッケージ、statmod（http://bioinf.wehi.edu.au/software/compareCurves/）のcompareGrowthCurves機能を用いて分析し、P≦0.05ならば有意性が決定された。
【０１６８】
結果
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母培養を指示された濃度のGR-24で処理すると、細胞培養増殖の有意な減少が生じたが、それはGR-24適用の8時間後にはすでに明白である（図２１）。
【０１６９】
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母培養のST-362による処理は、0.1μM以上の濃度で細胞培養増殖の有意な減少をもたらした。その効果は適用時から明らかであった（図２２）。その上、カンジダ・オレオフィラ（Candida oleophila）酵母培養のST-362による同様の処理は、10μM濃度で細胞培養増殖の低下をもたらし,その効果はST-362適用の8時間後に明白であった（図２３）。
【０１７０】
これが、新しいタイプの植物ホルモンであるストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログの、細胞増殖および哺乳動物細胞（とくに癌細胞）に及ぼす影響を評価した最初の研究である。本研究は、ストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログが、新しいタイプの抗増殖治療薬、ならびに抗癌治療薬となることを実証しており、これらは、塊としての腫瘍を標的とすることができるが、「癌幹様細胞」を標的とするのにも有効である。作用のメカニズムは、ストレスシグナル伝達の活性化、およびAKTの阻害による生存シグナル伝達の阻害に関わる可能性がある。
【０１７１】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）において、"a"、"an"および"the"という語および同様の指示対象の使用は、他に指示のない限り、または文脈から明確に否定されない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。“comprising”（含んでなる）、“having”（有する）、“including”（含む）、および“containing”（含有する）という語は、特に断りのない限り、範囲を設定しない（すなわち「含んでいるがそれに限定されない」ことを意味する）用語として解釈されるべきである。本明細書において値の範囲の記述は、特に別段の指示がない限り、単に、その範囲の中に入るそれぞれ別々の値を個別に言及する簡略法となるように意図されているだけであって、それぞれ別の値が、本明細書において個別に列挙されているかのように、本明細書に組み入れられる。本明細書に記載のすべての方法は、他に特に指示のない限り、または文脈から明確に否定されない限り、任意の順序で実施することができる。本明細書で与えられるあらゆる例、または例示的な言葉（例としては、「たとえば〜など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを目的としているのであって、ほかに特に断りのない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書のいかなる言葉も、請求されていない要素を本発明の実施に必須であると示唆していると見なされるべきではない。
【０１７２】
本発明は、特定の実施形態と関連づけて上記で説明してきたが、当然のことながら、本発明から逸脱することなく同じ機能を果たすために、他の類似の実施形態を用いてもよく、記載された実施形態に改変および付加を行ってもよい。さらに、記載されたすべての実施形態は、必ずしもどれか１つを選ぶべきものではなく、本発明のさまざまな実施形態は、望ましい特性をもたらすように組み合わせることができる。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく変更を行うことができる。したがって、本発明は、いかなる単一の実施形態にも限定されるべきではなく、それどころか、添付の特許請求の範囲の記載にしたがって広がりと範囲をもって解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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