(57)【要約】種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍによって主に分泌される１０未満のタンパク質の中で、最も重要な腸プロテアーゼの切断部位を含まない内部断片を含有し、少なくとも５０％のセリンおよびトレオニン含量を有することを特徴とする３０ｋＤａのものがある。ＳＴペプチドと指定されるこの断片内でコードされる遺伝情報が、前記ペプチドを生成および精製するのに使用されており、こうしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な試験を行うことを可能にしている。  要約すると、ＳＴペプチドは、我々の胃腸管の共生細菌に対して我々の胃腸の免疫系の免疫学的無視のプロセスを促進し、したがって経口免疫寛容の機構に有利であると考えられる。したがって、このＳＴペプチドは、とりわけある特定の自己免疫疾患およびある特定の炎症疾患との関連で、免疫療法において使用することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節特性および／または抗炎症特性を有するＳＴペプチドであって、
ａ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌により分離され、
ｂ）そのアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する
ことを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍであることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの株が、以下の群、すなわち、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＣＩＭＢ８８２６、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９Ｖ、およびＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＭＣＭ１２から選択されることを特徴とする、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９０〜１００％の相同性を有することを特徴とする、請求項１および３記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、またはそのオルソログであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項６】
医薬品または医薬組成物を調製するための請求項１から５のいずれか１項記載のペプチドの使用。
【請求項７】
前記医薬品または前記医薬組成物が、腸障害を治療および／または予防するためのものであることを特徴とする、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記腸障害が、炎症性腸疾患、または腹腔炎症の間で選択される炎症疾患であることを特徴とする、請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記炎症性腸疾患が、以下の群、すなわち、クローン病、潰瘍性大腸炎、および回腸嚢炎から選択されることを特徴とする、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記腸障害が、自己免疫疾患、または腸内微生物叢の組成のデレギュレーションを原因とする疾患によって引き起こされることを特徴とする、請求項７記載の使用。
【請求項１１】
機能性食品を調製するための請求項１から５のいずれか１項記載のＳＴペプチドの使用。
【請求項１２】
治療有効量の請求項１から５のいずれか１項記載のＳＴペプチドを含むことを特徴とする、機能性食品。
【請求項１３】
治療有効量の請求項１から５のいずれか１項記載のＳＴペプチドを含むことを特徴とする、医薬組成物または医薬品。
【請求項１４】
化粧品を調製するための請求項１から６のいずれか１項記載のＳＴペプチドの使用。
【請求項１５】
有効量の請求項１から５のいずれか１項記載のＳＴペプチドを含むことを特徴とする、化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバシラスによって分泌されるペプチドのヒト免疫療法における使用を記載するものであり、食品技術部門および医薬の両方に関する。本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ；クローン病、潰瘍性大腸炎、および回腸嚢炎に分けられる）などのある特定の炎症疾患の免疫療法、ならびに経口免疫寛容が損なわれる他の病態（食餌グルテンに関連するセリアック病の場合のように）において使用され得るアミノ酸配列（ＳＴペプチド）に関する。投与経路は、機能性食品中に含めること、またはドナー樹状細胞（樹状細胞のワクチン）の指向性成熟（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を介するものとすることができる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの胃腸管には、多種多様な共生細菌、共生種細菌（ｍｕｔｕａｌｉｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、および病原性細菌が住んでおり、まさに細菌と免疫系との主要な接点の１つがある場所である。この一連の細菌は、食餌中の一連の抗原または抗原と一緒になった異物にかなりの程度まで寄与し、正常な状態では、免疫系は、全身性免疫で起こるように、これらの抗原または異物に対して、これらを排除する目的で反応するであろう。しかし、腸コンパートメントでは、これは、このように起こることはまったくなく、代わりに、粘膜の恒常性を維持するように意図された経口免疫寛容と呼ばれる免疫寛容の機構が前記抗原に対して展開される（ＦｅｎｇおよびＥｌｓｏｎ著（２０１０年）、「Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｄｉａｌｏｇ」、Ｍｕｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻、１５〜２１頁、（非特許文献１））。ある特定の状況では、この恒常性が失われ、免疫系は腸内微生物叢に対して異常に反応し、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などのより重度のもしくはそれほど重度ではない炎症過程を発症し、または食餌中のいくつかの抗原に対して（セリアック病におけるグルテンの場合のように）異常に反応する。さらに、ある特定の自己免疫疾患と腸内微生物叢の組成のデレギュレーションとの間に存在する関係も知られている（Ａｄａｍｓら著（２００８年）、「ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｒｅ  ｍｏｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈａｎ  ＩｇＧ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｎｎａｎ  ｏｒ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ」、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１０３巻、３８６〜３９６頁）（非特許文献２）。
【０００３】
腸内微生物叢に対する寛容のプロセスは、腸粘膜内に取り込まれると腸内微生物叢に由来する抗原の正確なプロセシングおよび認識に関与する２つの細胞型によって主に媒介される。これらは、Ｔリンパ球および樹状細胞（ＤＣ）である。ＤＣは、抗原のプロセシングおよび提示において特殊化された食細胞であり、腸ＤＣの場合では、これらは、管腔に向けて腸上皮の腸細胞間で仮足を出して、腸に存在する微生物の認識に本質的な役割を果たす（Ｒｅｓｃｉｇｎｏら著（２００１年）、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｎｅｔｒａｔｅ  ｇｕｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｔｏ  ｓａｍｐｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻、３６１〜３６７頁）（非特許文献３）。ＤＣは、細菌粒子を貪食し、これらを処理し、成熟と呼ばれる一連の変化を起こし、これらの細菌性抗原をＤＣの表面上に提示し、その結果、これらの細菌性抗原は免疫系の他の細胞によって認識され得る。この変化はさらに、ある特定のサイトカインの産生などのＤＣ内の一連の表現型の変化を伴う。ＤＣは、さらには、Ｔリンパ球の増殖、およびタイプＴｈ１（炎症促進性応答を誘導する）、Ｔｈ２（抗炎症応答を誘導する）、またはＴｈ１７（感染症に対する表面組織の保護に関与する）のエフェクター細胞、あるいはレギュラトリー細胞（Ｔｒｅｇ）へのＴリンパ球の分化に非常に重要である（ＺｈｕおよびＰａｕ著（２００８年）、「ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｆａｔｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｆａｕｌｔｓ」、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻、１５５７〜１５６９頁）（非特許文献４）。Ｔリンパ球は、ＤＣを補完して、細胞性免疫応答に関与する細胞である。
【０００４】
乳酸菌群に属するいくつかの株は、有利に腸内微生物叢の組成を調節することができ、ヒトの健康に有益な効果を有するので、プロバイオティクスとみなされている（Ｒｉｊｋｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．ら著（２０１０年）、「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１４０巻、６７１Ｓ〜６７６Ｓ頁）（非特許文献５）。近年、様々な研究チームが、ある特定の細胞外成分がプロバイオティクスに起因する有益な効果のいくつかの原因となり得ることを示唆する科学的証拠を蓄積している。正常な状態では、健康な個体において、微生物叢は腸細胞の層および／またはＤＣと直接接触していないことを念頭に置くと、これは、より理にかなっている。実際に、微生物叢は、腸の上皮層を覆う粘液の保護層内に埋め込まれている。したがって、プロバイオティクスのこれらの有益な効果は、細菌のＤＣとの直接的な相互作用に起因しないというのが妥当である。反対に、プロバイオティクスは、粘液の層を横断し得るある特定の成分を産生し、ＤＣによるこれらの捕捉を促進することによって、自己の機能を実施することができる。本発明者らは、これらの細胞外成分の中で、エキソポリサッカライド、タイコ酸、インドール、ならびに表面タンパク質および細胞外タンパク質について言及することができる（Ｌｅｂｅｅｒら著（２０１０年）、「Ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８巻、１７１〜８４頁）（非特許文献６）。細胞外タンパク質は、細菌増殖の間に分泌され、これらを囲む媒質に放出されるタンパク質の群として定義される（Ｓａｎｃｈｅｚら著（２００８年）、「Ｅｘｐｏｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ」、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５４巻、１〜１７頁）（非特許文献７）。現在のところ、細胞外タンパク質は、プロバイオティクスの作用の分子機構を同定および特徴付けするための研究の盛んな分野を構成している。
【０００５】
細胞外タンパク質は、２つの主な群に分けることができる。第１の群は、自己のＮ末端部分内に位置し、分泌機構にプレタンパク質をガイドし、分泌機構を介してプレタンパク質が媒質に分泌されるシグナルペプチドを有するタンパク質を含む。第２の群は、シグナルペプチドに加えて、細胞表面結合ドメインを有し、細菌壁再生プロセスの間に媒質に放出されるタンパク質を含む。最後に、何人かの著者は、分泌ドメインを伴わず、細胞外環境へのタンパク質の分泌に関与する機構が未知である中枢代謝のタンパク質を含む第３の群の細胞外タンパク質を同定している。
【０００６】
タンパク質を分泌するための系は、真正細菌門の中で高度に保存されている。これらの系は、グラム陰性菌内で特によく特徴付けられており、少なくとも７つの系が同定されている（タイプ１〜６および「ツインアルギニン」のシステム）（Ｓｉｂｂａｌｄおよびｖａｎ  Ｄｉｊｌ著（２００９年）、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ編、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ出版）（非特許文献８）。プロバイオティクス株の大部分を含む分類群であるグラム陽性菌では、細胞外タンパク質は、同様のシステムによって搬出される。
【０００７】
これまで、バイオインフォマティクスがプロバイオティクス中の細胞外タンパク質を同定するのに使用されるツールとなっており、ごく一部が実験的に十分に同定され、または特徴付けられている。本発明者らは、ビフィズス菌によって産生される細胞外タンパク質の中で、様々な種のビフィズス菌によって産生されるセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）について言及することができる（Ｔｕｒｒｏｎｉら著（２０１０年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｐｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ２１０Ｂ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７６巻、３２０６〜３２１９頁）（非特許文献９）。このタンパク質は、膵外分泌腺によって分泌されるエラスターゼ、および炎症過程に関係する免疫細胞である好中球によって分泌されるエラスターゼの両方を効率的に阻害する。この理由で、セルピンは、ビフィズス菌の抗炎症作用のいくつかに関与している場合があることが仮定されている。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅの株によって分泌されるタンパク質は、ＤＣと相互作用した後、腸上皮のレベルで炎症過程を低減する、おそらく非常に小さいペプチドである可溶性因子を生成することができることも示唆された（Ｈｅｕｖｅｌｉｎら著（２００９年）、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４巻：ｅ５１８４頁）（非特許文献１０）。
【０００８】
これらの研究は、細菌と先天系の免疫細胞との間の細胞間コミュニケーションのプロセスが、どのように我々の腸粘膜、したがって我々の体の免疫学的恒常性をレギュレートすることに向けられた一連の生理反応を媒介し得るかについての単なる例である。本発明に記載した結果によって示されるように、このプロセスの一部は、我々の胃腸管内に存在する乳酸菌によって分泌される主なタンパク質内にコードされるペプチドによって媒介され得る。
【０００９】
データベースで入手可能な同様の特許に関して、本発明者らは、結腸直腸がん細胞に特異的に結合するいくつかの組成物の保護、およびその使用方法に関する欧州特許第９５９００４２１．９号（特許文献１）について言及することができる。この文献には、配列が本発明に記載のペプチドの配列に対応しない他のＳＴペプチド、この場合、細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株によって産生される熱安定性毒素の誘導体の使用が記載されている。この文献では、１３〜２５アミノ酸の間のＳＴ受容体結合ペプチドとして「ＳＴペプチド」が定義されているが、これらのペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来し、放射安定性活性残基（ｒａｄｉｏｓｔａｂｌｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）も含むコンジュゲート化合物中に含まれており、転移結腸直腸がん細胞に特異的に向けられ得る。
【００１０】
一方、国際公開第２００９１３８０９２号パンフレット（特許文献２）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの株２９９ｖに言及し、株Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ２１３７９のプロバイオティクス特性を力説しており、細胞性免疫を改善するための機能性食品および医薬品の開発におけるその使用を記載している。強調されているこの微生物の機能には、動物の免疫系を改善するためのサイトカインの産生を誘導する機能が含まれる。この文献には、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍが免疫系を改善するためのサイトカインをどのように産生するかについて記載されているが、前記サイトカインは炎症促進性である（ＩＬ−６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第９５９００４２１．９号
【特許文献２】国際公開第２００９１３８０９２号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＦｅｎｇおよびＥｌｓｏｎ著（２０１０年）、「Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｄｉａｌｏｇ」、Ｍｕｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻、１５〜２１頁
【非特許文献２】Ａｄａｍｓら著（２００８年）、「ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｒｅ  ｍｏｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈａｎ  ＩｇＧ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｎｎａｎ  ｏｒ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ」、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１０３巻、３８６〜３９６頁
【非特許文献３】Ｒｅｓｃｉｇｎｏら著（２００１年）、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｎｅｔｒａｔｅ  ｇｕｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｔｏ  ｓａｍｐｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻、３６１〜３６７頁
【非特許文献４】ＺｈｕおよびＰａｕ著（２００８年）、「ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｆａｔｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｆａｕｌｔｓ」、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻、１５５７〜１５６９頁
【非特許文献５】Ｒｉｊｋｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．ら著（２０１０年）、「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１４０巻、６７１Ｓ〜６７６Ｓ頁
【非特許文献６】Ｌｅｂｅｅｒら著（２０１０年）、「Ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８巻、１７１〜８４頁
【非特許文献７】Ｓａｎｃｈｅｚら著（２００８年）、「Ｅｘｐｏｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ」、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５４巻、１〜１７頁
【非特許文献８】Ｓｉｂｂａｌｄおよびｖａｎ  Ｄｉｊｌ著（２００９年）、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ編、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ出版
【非特許文献９】Ｔｕｒｒｏｎｉら著（２０１０年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｐｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ２１０Ｂ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７６巻、３２０６〜３２１９頁
【非特許文献１０】Ｈｅｕｖｅｌｉｎら著（２００９年）、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４巻：ｅ５１８４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって現在、腸内微生物叢のデレギュレーションと関連がある疾患、炎症疾患、および／または経口免疫寛容が損なわれる疾患を治療するための、免疫調節機能および抗炎症機能の両方を有する、乳酸菌によって分泌されるタンパク質に由来するＳＴペプチドを同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、乳酸菌、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（これまでに、知られている機能を持たない）によって分泌されるタンパク質の１つの中にコードされるＳＴペプチドの配列であって、３０ｋＤａの前記ペプチドは、最も重要な腸プロテアーゼの切断部位を含まない断片を含有する、配列を記載する。これは、少なくとも５０％のセリンおよびトレオニン含量を有することも特徴とする。このペプチドを血液およびヒト腸生検の両方から得られるＤＣと接触させると、これは、ＩＬ−１２（抗原提示細胞に特徴的な炎症促進性インターロイキン）の産生が遮断され、ＩＬ−１０（Ｔリンパ球などの他の免疫細胞型による炎症促進性サイトカインの合成の遮断を介する抗炎症性サイトカイン）の産生が拡張されるレギュラトリー表現型にＤＣを調節することができる。ＳＴペプチドで処理されたこれらのＤＣは、これらが刺激するＴリンパ球が非炎症促進性サイトカインのプロファイルを伴って皮膚に選択的に向けられる移行プロファイルを取得するので、異なる機能性も取得する。この作用機序は、免疫寛容の機構ではなく、代わりに免疫学的無視の機構をプライミングすることによって、腸恒常性の維持に能動的に寄与する。したがって、腸内のＳＴペプチドによる成熟ＤＣは、エフェクター細胞（Ｔリンパ球）が皮膚に二次移行するのを促進し、それによって胃腸管内の共生微生物叢に対する能動免疫応答の確立を妨害する。
【００１５】
要約すると、ＳＴペプチドは、ＤＣに対するその作用を介して腸恒常性の機構を促進する。ＳＴペプチドは、抗炎症性インターロイキン（ＩＬ−１２）を遮断し、抗炎症性インターロイキン（ＩＬ−１０）の合成を増大させることができるので、腸内微生物叢に対する異常免疫応答があることが知られているある特定の炎症疾患および自己免疫疾患との関連で、ならびに他の抗原に対する経口免疫寛容の機構が失われている他の病態において、免疫療法で使用することができる。それにより、ヒトの健康に対する機能性食品の有益な作用に関与する、プロバイオティクスによって生成される分子を含有するあらゆる種類の機能性食品を創製することの科学的根拠がもたらされるはずである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、免疫調節特性および／または抗炎症特性を有するＳＴペプチドであって、
ａ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌によって分泌され、
ｂ）そのアミノ酸配列が３０〜６０％の間のアミノ酸セリンおよびトレオニンの含量を有し、
ｃ）少なくとも１種の腸プロテアーゼの切断部位を含まない少なくとも３０ｋＤａの断片を含む
ことを特徴とするＳＴペプチドに関する。
【００１７】
本発明では、用語「ＳＴペプチド」は、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、より好ましくは、株Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＣＩＭＢ８８２６、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９Ｖ、およびＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＭＣＭ１２によって分泌され、そのアミノ酸配列が少なくとも５０％のアミノ酸セリンおよびトレオニンの含量を有するものであり、少なくとも１種の腸プロテアーゼの切断部位を含まない少なくとも３０ｋＤａの断片を含む、免疫調節特性および／または抗炎症特性を有する、好ましくは７３アミノ酸のペプチドを指す。このペプチドは、配列番号１またはそのオルソログと少なくとも８０〜１００％の相同性を有することができる。
【００１８】
本発明において、表現「免疫調節特性を有する」は、樹状細胞などのヒト免疫系の細胞の応答を調節し、それが次にＴリンパ球などの他の免疫細胞の機能を調節することができるその能力を指す。免疫応答のこの調節は、遮断を含む。
【００１９】
本発明において、表現「抗炎症特性を有する」は、末梢血およびヒト腸粘膜の両方から単離された樹状細胞内で、強力な抗炎症性サイトカインであるインターロイキン１０の産生を誘導し、ならびに炎症促進性のサイトカインであるインターロイキン１２の産生を遮断するその能力を指す。さらに、前記樹状細胞の存在下で成熟したＴリンパ球も、非炎症促進性サイトカインの産生のプロファイルを取得することになる。
【００２０】
好適な実施形態では、前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである。より好ましくは、前記細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの株は、以下の株の群、すなわち、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＣＩＭＢ８８２６、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９Ｖ、およびＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＭＣＭ１２から選択される。
【００２１】
本発明の好適な実施形態では、前記ＳＴペプチドは、そのアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０〜１００％の相同性を有することを特徴とする。好ましくは、前記ＳＴペプチドは、そのアミノ酸配列が配列番号１と９５％の相同性を有することを特徴とする。より好ましくは、前記ＳＴペプチドは、そのアミノ酸配列が配列番号１またはそのオルソログであることを特徴とする。
【００２２】
本発明において、用語「相同性」は、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の類似性の程度を指す、「配列相同性」の概念を指す。
【００２３】
本発明において、用語「オルソログ」は、高い程度の相同性を共有する、２種の異なる生物に由来する２つのアミノ酸鎖またはヌクレオチド鎖を指す。
【００２４】
本発明の好適な実施形態では、前記ＳＴペプチドは、腸プロテアーゼが以下の群、すなわち、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、およびこれらの組合せから選択されることを特徴とする。
【００２５】
本発明は、腸障害を治療および／または予防するための方法における前記ＳＴペプチドの使用であって、前記方法は、患者に治療有効量の上記に定義したＳＴペプチドを投与して、前記患者の腸の共生細菌に対する免疫学的無視または寛容性のプロセスを活性化することを含むことを特徴とする、使用にも関する。
【００２６】
本発明において、用語「腸障害」は、免疫系がその起源またはその治療に関与する任意の腸の病気を指す。
【００２７】
本発明において、用語「免疫寛容」は、免疫系が内因性または外因性の抗原に応答しない、一連の誘導されるプロセスを指す。
【００２８】
本発明において、用語「免疫学的無視」は、免疫寛容（末梢血およびヒト腸粘膜の両方から単離された樹状細胞をサイトカインレギュラトリープロファイルに向けて分化させる）を促進するだけでなく、Ｔリンパ球が胃腸管の微生物抗原に曝露されることにならない皮膚組織に向けて移行するための能力増大を伴って刺激されたＴリンパ球もプライミングして腸恒常性の機構を促進するその能力を指す。
【００２９】
本発明において、表現「患者の腸の共生細菌」は、ヒト胃腸管内に住む一連の細菌を指す。
【００３０】
本発明の好適な実施形態では、前記腸障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）またはセリアック病の間で選択される炎症疾患である。
【００３１】
本発明のさらにより好適な実施形態では、前記炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、以下の群、すなわち、クローン病、潰瘍性大腸炎、および回腸嚢炎から選択される。
【００３２】
本発明の好適な実施形態では、前記腸障害は、自己免疫疾患、または腸内微生物叢の組成および／もしくは活性／代謝率のデレギュレーションを原因とする疾患によって引き起こされる。
【００３３】
本発明の好適な実施形態では、前記免疫調節特性および／または抗炎症特性は、患者に治療有効量のＳＴペプチドを投与することが、
ａ）前記患者の樹状細胞内で、抗炎症性および恒常性サイトカイン、好ましくはインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生を誘導すること、および／または
ｂ）前記患者の樹状細胞内で、炎症性腸疾患において非常に関連したＩＬ−６などの他の炎症促進性サイトカインに加えて、存在する場合、炎症促進性サイトカイン、好ましくは炎症促進性インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を遮断すること
を含む点でそれぞれ明らかになる。
【００３４】
さらにより好適な実施形態では、上記に定義した治療および／または予防の方法は、前記樹状細胞が次に、
ａ）皮膚への移行のプロファイルを取得し、かつ／または
ｂ）非炎症促進性サイトカインの産生のプロファイルを取得する
Ｔリンパ球の成熟を誘導することを特徴とする。
【００３５】
好ましくは、ａ）に定義した皮膚への移行のプロファイルは、腸粘膜への移行のマーカーインテグリンβ７の発現の減少、および皮膚への移行のマーカーＣＬＡの発現の増大を含む。好ましくは、ｂ）に定義した非炎症促進性サイトカインの産生のプロファイルは、炎症促進性サイトカインＩＦＮγおよびインターロイキン１７（ＩＬ−１７）の発現の減少を含む。
【００３６】
本発明の別の好適な実施形態では、治療有効量のＳＴペプチドの前記投与は、前記ＳＴペプチドが、好ましくはカプセルの形態で、機能性食品（プロバイオティクス）あるいは医薬組成物中に含有されていることを特徴とする。
【００３７】
本発明によって保護される別の態様は、治療有効量の上記に定義したＳＴペプチドを含むことを特徴とする機能性食品に関する。
【００３８】
本発明において、用語「機能性食品」は、これらの栄養特性に加えて、消費者の健康に利益を付与し、または疾患に罹患するのを回避するのに役立つ一連の食品を指す。
【００３９】
本発明によって保護される別の態様は、治療有効量の上記に定義したＳＴペプチドを含むことを特徴とする、組成物、好ましくは医薬品に関する。
【００４０】
本発明において、用語「医薬組成物」は、ヒトに使用するのに適した形式を伴った活性成分と賦形剤の混合物を指す。
【００４１】
本発明は、患者の腸の共生細菌に対する免疫寛容のプロセスを活性化するための、上記に定義した機能性食品または組成物の使用にも関する。
【００４２】
本発明は、化粧用途における前記ＳＴペプチドの使用にも関する。
【００４３】
本発明において、用語「化粧用途」は、ヒトの、特に顔の、皮膚の状態を改善することを意図した化粧品における使用を指す。
【００４４】
本記述および請求の範囲全体にわたって、単語「含む」およびその変形は、他の技術的な特性、添加剤、成分、またはステップを排除するように意図されていない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点、および特徴は、本記述からある程度、かつ本発明の実施からある程度明らかになるであろう。以下の図面および実施例は、実例の目的で提供されており、本発明を限定するように意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの３種の株によって分泌された総タンパク質およびタンパク質を示す、変性条件下のタンパク質ゲルを示す図である。レーン１〜３：株ＮＣＩＭＢ８８２６、２９９ｖ、およびＢＭＣＭ１２の総タンパク質。レーン４：培地中に存在するタンパク質。レーン５〜７：株ＮＣＩＭＢ８８２６、２９９ｖ、およびＢＭＣＭ１２によって分泌されたタンパク質。ＭＭ：タンパク質の分子量（ｋＤａ）のマーカー。
【図２】Ａ．アミノ酸位置７０と１３５の間の、配列番号２として同定されたタンパク質Ｄ１の中央ゾーン内に存在するセリンおよびトレオニンに富むゾーン、ならびにＢ．本特許に記載の配列番号１として同定されたＳＴペプチドのアミノ酸配列を示す図である。配列番号１内の下線を引いたアミノ酸は、配列番号２として同定されたタンパク質Ｄ１の中央ゾーンと比べたＳＴペプチドの変化を表す。
【図３】配列番号２として同定されたタンパク質Ｄ１の中央断片上の主な腸プロテアーゼの理論的な切断部位を示す図である。分かるように（矢印で示した）、断片ＳＴは、理論的な切断部位を含有しない。Ａ．は、配列番号３として同定されたアミノ酸位置６１と１２０の間のタンパク質Ｄ１の断片を表し、Ｂ．は、配列番号４として同定されたアミノ酸位置１２１と１８０の間のタンパク質Ｄ１の断片を表す。
【図４】変性条件下のポリアクリルアミドゲルで精製した、配列番号１として同定されたＳＴペプチドの移行を示す図である。
【図５】ａ）ヒト血液由来の濃縮樹状細胞（ＬＤＣ）内の腸粘膜（インテグリンβ７）および皮膚（ＣＬＡ）への移行のマーカーの産生を示す図である。試験した条件は、ベースライン（シグナル伝達の不在）、０．０、０．１、１．０、または１０マイクログラム／ミリリットルの配列番号１として同定されたＳＴペプチドであった。ｂ）このペプチドを用いて実施した試験により、ヒト血液由来の濃縮樹状細胞上の組織への移行のマーカー（β７およびＣＬＡ）も、タイプＩＩのＭＨＣの分子（ＨＬＡ−ＤＲ）も、ある特定の共刺激分子（ＣＤ４０）または活性化分子（ＣＤ８３）も変化しない。リポ多糖（ＬＰＳ）での刺激を、炎症促進性細菌成分での刺激の対照として使用した。
【図６】様々な濃度の配列番号１として同定されたＳＴペプチドによって誘導される、ヒト血液由来の濃縮樹状細胞の細胞質中で測定されたサイトカインの産生のプロファイルの改変を示す図である。ＬＰＳでの刺激を炎症促進性細菌成分での刺激の対照として使用した。ＩＬ−６：インターロイキン６、ＴＧＦβ：トランスフォーミング増殖因子β、ＩＬ−１０：インターロイキン１０、ＩＬ−１２：インターロイキン１２。
【図７】結腸粘膜生検由来の濃縮樹状細胞（腸のＤＣ）の細胞質中で測定されたサイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生のプロファイルの改変を示す図である。
【図８】左から右に、同種樹状細胞で刺激されたＴ細胞の集団を表すフローサイトメトリーによって得た図である。左パネル：「前方側方散乱」技法による生細胞の検出。中央パネル：マーカーＤＣ３の同定。右パネル：刺激Ｔ細胞を細胞分裂から派生したＣＦＳＥの染色の喪失によって同定した。
【図９】血液由来の濃縮樹状細胞（ＬＤＣ）によって刺激され、配列番号１として同定されたＳＴペプチド（ＬＤＣ  ＢＰ）またはリポ多糖（ＬＰＳ  ＬＤＣ）に曝露されたＴ細胞内で誘導された変化を示すフローサイトメトリーダイアグラムである。すべての場合において、比較は、休止時のＴ細胞（休止Ｔ細胞）内で生じた変化とのものであり、非刺激ＬＤＣ（基底ＬＤＣ）を使用するものであった。Ａ）様々な濃度の配列番号１として同定されたＳＴペプチド（ＢＰ  ＬＤＣ）およびリポ多糖（ＬＰＳ  ＬＤＣ）によって誘導された、腸粘膜への移行のマーカーインテグリンβ７のレベルの変化。Ｂ）様々な濃度の配列番号１として同定されたＳＴペプチド（ＢＰ  ＬＤＣ）およびリポ多糖（ＬＰＳ  ＬＤＣ）によって誘導された、皮膚への移行のマーカーＣＬＡのレベルの変化。Ｃ）３つの独立した実験の結果の棒グラフ表示。
【図１０】血液由来の濃縮樹状細胞（ＬＤＣ）によって刺激され、様々な濃度の配列番号１として同定されたＳＴペプチド（ＢＰ  ＬＤＣ）またはリポ多糖（ＬＰＳ  ＬＤＣ）をパルスされたＴリンパ球内のサイトカインＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、およびＩＬ−１７の産生の変化を示すフローサイトメトリーダイアグラムである。すべての場合において、比較は、休止時のＴ細胞（休止Ｔ細胞）内で生じた変化とのものであり、非刺激ＬＤＣ（基底ＬＤＣ）を使用するものであった。
【図１１】３つの独立した実験の値、およびこれらの偏差を示す図１０中のデータのグラフ表示である。
【図１２】刺激のない状態での結腸生検由来の濃縮樹状細胞（腸ＤＣ）（基底腸ＤＣ）によって刺激され（中央パネル）、または配列番号１として同定されたＳＴペプチド（ペプチド腸ＤＣ）を予めパルスされた（下パネル）Ｔリンパ球内のサイトカインＴＧＦβ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、およびＩＦＮγの産生の変化を示すフローサイトメトリーダイアグラムである。上パネルは、休止時のＴ細胞（休止Ｔ細胞）内での同じサイトカインの産生を示す。
【図１３】刺激のない状態での結腸生検に由来する濃縮樹状細胞（腸ＤＣ）（基底腸ＤＣ）で刺激され（中央パネル）、または配列番号１として同定されたＳＴペプチド（ペプチド腸ＤＣ）を予めパルスされた（下パネル）Ｔリンパ球内の移行のマーカーβ７（腸粘膜）およびＣＬＡ（上皮粘膜）の産生の変化を示すフローサイトメトリーダイアグラムである。上パネルは、休止時のＴ細胞（休止Ｔ細胞）内での移行の同じマーカーの産生を示す。
【図１４】結腸粘膜の樹状細胞がＩＬ−１２の異常産生を呈したドナーにおける、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生を表すフローサイトメトリーダイアグラムである。これらの樹状細胞は、配列番号１として同定されたＳＴペプチドの存在下でインキュベートした（＋ＢＰ）。ベースライン条件（基底）と比較すると、配列番号１として同定されたＳＴペプチドが存在することにより、ＩＬ−１０の産生を誘導し、ＩＬ−１２の産生を遮断することができた。
【実施例】
【００４６】
本特許文献で提供する以下の具体的な実施例は、本発明の性質を例示する機能を果たす。これらの実施例は、単に実例の目的で含められており、本明細書で主張する本発明に対する限定として解釈されるべきでない。したがって、下記の実施例は、本発明の応用分野を限定することなく、本発明を例示する。
【００４７】
Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍによって分泌されるタンパク質および配列番号１として同定されたＳＴペプチドの同定
Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、野菜および乳製品を含めた多数の発酵食品から単離され得る中温性乳酸菌である（Ｔａｌｌｏｎら著（２００３年）、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＥＰ５６」、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５４巻、７０５〜７１２頁）。いくつかの株がヒト胃腸管の条件で生存できることは、一部の研究者がそのプロバイオティクスの潜在性に興味を持っていることを意味している。こうして、現在プロバイオティクスとして販売されているＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのいくつかの株のヒトの健康に対する有益な効果が（株２９９ｖの場合のように）、科学的に実証された（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら著（２００６年）、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ−ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ」、Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．、１６巻、１０１８〜１０２８頁）。
【００４８】
現在のところ、プロバイオティクス細菌によって分泌されるタンパク質は、細菌と宿主免疫系の細胞との間の細胞間コミュニケーションの潜在的なメディエーターであるので、これらを研究することに対する関心が高まっている。Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＣＩＭＢ８８２６、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、およびＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＢＭＣＭ１２によって分泌される主なタンパク質を示す（レーン５、６、および７）図１で分かるように、種Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの異なるメンバーによって分泌されるタンパク質間に相対的な類似性がある。配列番号１として同定された、その配列が図２に示されているＳＴペプチドの配列は、配列番号２として同定された、Ｄ１と指定されたタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ識別番号ｇｉ｜２８２７００５７）の中央ゾーンに由来し、配列番号１で下線が引かれているアミノ酸のいくつかの修飾および包含がある（図２）。このゾーンは、アミノ酸セリンおよびトレオニンのその豊富さを特徴とし、それからその名称が導出され、胃腸管の最も重要なプロテアーゼのいくつか（ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシン）の切断部位がないことを特徴とする（図３）。
【００４９】
配列番号１として同定されたＳＴペプチドのクローニングおよび精製（リポ多糖の欠如の検証）
断片ＳＴをコードするＤＮＡ配列（配列番号２として図２に記したアミノ酸配列に対応）を、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓにクローニングし、標準的なプロトコールに従ってニッケル親和性カラムで精製した。このペプチドは、培養上清に分泌され、ここから単離および精製することができ、変性条件下のアガロースゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でアーチファクトを形成し、約１００ｋＤａに対応するサイズに移行することを特徴とする（図４）。ペプチドの末端アミノの配列をエドマン分解によって検証した。
【００５０】
セリンおよびトレオニンに富む領域は、多くの他の乳酸菌によってコードされるタンパク質、および胃腸管の属（ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）において見つけることができ、本発明から導出される結論を、他の微生物の他の配列に由来するＳＴペプチドに適用することができる。
【００５１】
配列番号１として同定されたＳＴペプチドの樹状細胞との相互作用
腸プロテアーゼまたは抗原提示細胞のプロテアーゼによって放出されるＳＴペプチドは、粘膜に関連する先天免疫系の機能に影響し得る可能性があるので、本発明者らは、主な抗原提示細胞であるＤＣとのこれらの相互作用を調べた。最初に、配列番号１として同定されたＳＴペプチドの試料中のリポ多糖の欠如をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ製の発色キット（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｋｉｔ）を使用して検証した。本発明者らの出発仮説は、腸環境内で産生され、または食品とともに摂取される配列番号１として同定されたＳＴペプチドは、腸粘膜のＤＣと相互作用し、したがって免疫機能に影響を与え得るとみなすことであった。
【実施例１】
【００５２】
配列番号１として同定されたＳＴペプチドの血液由来樹状細胞との相互作用
１．１．材料および方法
自己免疫疾患も、炎症疾患も、アレルギーも、悪性腫瘍も有していなかった健康な患者から樹状細胞を得た。これらの対象から、血液を科学的目的に使用することについての同意書を得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）で分画遠心法によって単離した。ＮｙｃｏＰｒｅｐｅ（商標）溶液中で一晩遠心分離することによって、細胞画分ＬＤＣ（低密度細胞）を得た。このＬＤＣ画分中に存在する細胞は、９８〜１００％の場合でＨＬＡ−ＤＲ陽性であり、ＤＣに一般的な形態学的特徴を有していた（Ｎｇら著（２００９年）、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ５６＋  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄ−ｒｅｌａｔｅｄ（ＨＬＡ−ＤＲ＋）  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻、２０５〜２１８頁）。
【００５３】
１ミリリットル当たり５０万個のＬＤＣを、完全培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＴＣＳ  ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を含有するＤｕｔｃｈ変法ＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ））中で培養した。これらの培養は、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、および０．１μｇ／ｍＬの濃度で精製された配列番号１として同定されたＳＴペプチドの存在下、ならびに陽性対照としてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）の存在下で実施した。結果を、陰性対照として作用する配列番号１として同定されたＳＴペプチドを含まず、ＬＰＳも添加しない並行培養と比較した。
【００５４】
様々な実験について、様々な抗体による細胞の標識（表１）は、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で実施した。標識は、暗所、氷中で２０分間実施した。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、食塩液中１％（ｖ／ｖ）のパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターでデータを取得するまで４℃で貯蔵した。使用した陰性対照は、特異性を持たない、同じ蛍光色素で標識されたアイソタイプ適合抗体であり、これらは、同じ会社から得た（アイソタイプ対照）。
【００５５】
フローサイトメトリーデータをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得、データをＷｉｎＬｉｓｔ  ５．０ソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ、ＭＥ、ＵＳ）で分析した。特定のマーカーに陽性の試料の比率を、アイソタイプ対照と比べて求めた。ヒストグラムの定量については、分析をＷｉｎＬｉｓｔソフトウェアで実施し、この分析で、正規化超強調（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｓｕｐｅｒｅｎｈａｎｃｅｄ）Ｄｍａｘ（ＳＥＤ）減算を使用して、アイソタイプ染色のヒストグラムを特異的染色のヒストグラムから減じた（Ｂａｇｗｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．著（２００５年）、「Ｈｙｐｅｒｌｏｇ−ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｏｇ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ，ｚｅｒｏ，ａｎｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅｄ  ｄａｔａ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、６４巻、３４〜４２頁）。
【００５６】
サイトカインの細胞内染色
モネンシンの存在／非存在下でＤＣを４時間培養した。次いで、これらを、上述したように表面マーカーについて染色した。次に、これらをＬｅｕｃｏｐｅｒｍＡで固定し、ＬｅｕｃｏｐｅｒｍＢで透過処理した後、細胞内染色抗体を添加した。インキュベートした後、ＤＣをＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、上述したように固定し、取得した。上記に詳述したＳＥＤ減算によって分析を実施し、この場合、モネンシンとともにインキュベートしなかったＤＣの各サイトカインのヒストグラムを、モネンシンの非存在下でインキュベートしたＤＣの各サイトカインのヒストグラムから減じた。このプロトコールは、本発明者らの同僚によって広範にバリデートされており（Ｈａｒｔら著（２００５年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２９巻、５０〜６５頁）、ＰＭＡおよび／またはイオノマイシンなどの外的刺激の非存在下でのＤＣによるサイトカインの自然産生の変化を定量することを可能にする。この手法を使用して、各サイトカインの細胞内含量は判定されない。代わりに、４時間の時間窓（モネンシンとのインキュベーション時間）内のサイトカインの産生において誘導された変化が、サイトカインの初期含量とは独立に求められる。
【００５７】
１．２．結果
図５（パネルＡ）で分かるように、配列番号１として同定されたＳＴペプチドは、末梢血で富化されたＤＣの移行のマーカー（インテグリンβ７、腸粘膜マーカー、およびＣＬＡ、皮膚マーカー）の変化を生じさせなかった。このペプチドは、タイプＩＩのＭＨＣ分子（ＨＬＡ−ＤＲ）も、ある特定の共刺激分子（ＣＤ４０）もしくは活性化分子（ＣＤ８３）の誘導の変化も生じさせなかった（図５、パネルＢ）。図５、パネルＢで分かるように、ＬＰＳ（陽性対照）は、これらのすべての過剰発現を確かに誘導した。
【００５８】
ＬＤＣ内のペプチドによって誘導された（細胞内）サイトカインの産生の変化に関して、これは、細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）の制御、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに分化およびアポトーシスのプロセスに関係するレギュラトリー分子ＴＧＦβに影響しなかった。反対に、配列番号１として同定されたＳＴペプチドは、ＩＬ−６（Ｔｈ１７細胞の発生の誘導因子）およびＩＬ−１２（炎症促進性）の合成の低減、ならびにＩＬ−１０（抗炎症性および恒常性）の合成の増大を誘導した（図６）。
【００５９】
結論として、ヒト血液由来の濃縮樹状細胞（ＬＤＣ）内の配列番号１として同定されたＳＴペプチドの存在は、これらが、レギュラトリーサイトカインの産生のプロファイルを取得し、炎症促進性サイトカインＩＬ−１２の産生を低減し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を増大させることを意味する。ＩＬ−６の合成の低減は、タイプＴｈ１７  Ｔ細胞の合成の結果として起こる理論的低減を伴い、ある特定の自己免疫疾患および炎症疾患との関連で、この細胞型の増大が観察されるのでやはり興味深い（ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒおよびＶｅｌｄｈｏｅｎ著（２００７年）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１７  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９巻、２８１〜２８６頁）。
【実施例２】
【００６０】
配列番号１として同定されたＳＴペプチドの腸粘膜の生検から得た樹状細胞との相互作用
配列番号１として同定されたＳＴペプチドの作用部位は、原理上は腸粘膜であるはずなので、本発明者らは、前記位置から単離したＤＣを使用して、実施例１に記載した実験をバリデートしてみることにした。
【００６１】
２．１．材料および方法
本試験に参加する自身の同意書を提出した３人の健康な患者（女性１人および男性２人、３０〜５８歳の年齢範囲）から結腸からの生検を得た。これらの患者は、肉眼的および組織学的の両方で正常な腸を有し、腸管輸送または直腸出血の変化を報告した後、検査を受けた。生検は、得られた後、４℃に冷却した完全培地中に集め、これらを得たときから最初の時間のカウントの前に処理した。１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ）中で２０分間、生検をインキュベートした。次に、上皮細胞ならびに粘液およびその付随する細菌の層の両方を除去するために、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の１ｍＭ溶液中でこれらをインキュベートした。固有層の単核細胞を、ＤＣの表現型または機能に影響しない、完全培地中のコラゲナーゼＤ  １ｍｇ／ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ、Ｌｅｗｅｓ、ＵＫ）の存在下での消化によって抽出した（Ｈａｒｔら著（２００５年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２９巻、５０〜６５頁）。固有層の単核細胞の細胞懸濁液（２０００００細胞／ｍＬ）を、精製した配列番号１として同定されたＳＴペプチドの存在下（１０μｇ／ｍＬ）、およびさらにはモネンシンの存在／非存在下で、これらの対応する陰性対照とともに４時間インキュベートした。固有層のＤＣを、マーカーＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ３−ＣＤ１４−ＣＤ１６−ＣＤ１９−ＣＤ３４−の存在からフローサイトメトリーによって同定した（Ｈａｒｔら著（２００５年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２９巻、５０〜６５頁）。
【００６２】
本実施例で続けた残りの手順は、実施例１の節１と同じであった。
【００６３】
２．２．結果
腸ＤＣのモデルを使用して、実施例１に記載した２つの最も興味深い点、すなわち、ＩＬ−１０の産生の増大およびＩＬ−１２の産生の増大がないことを確認することができた。この時点で、健康な個体の腸粘膜から単離されたＤＣは、炎症促進性サイトカインＩＬ−１２の産生のレベルが非常に低いことを念頭に置かなければならない（図７）。
【実施例３】
【００６４】
配列番号１として同定されたＳＴペプチドで成熟した血液から得た樹状細胞のＴリンパ球との相互作用
３．１．材料および方法
Ｔリンパ球を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得た。ＰＢＭＣを、実施例１で記載したように新たに採取した血液から得、ＭｉｎｉＭＡＣｓ緩衝液（ウシ血清アルブミン  ０．５％（ｗ／ｖ）およびＥＤＴＡ  ２ｍＭを補充したＰＢＳ）中に再懸濁させた。製造者の指示書に従って、免疫磁性ビーズ（ｉｍｍｕｎｏ−ｍａｇｎｅｔｉｚｅｄ  ｂｅａｄ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｓｌｅｙ、ＵＫ）でＣＤ１４陽性、ＣＤ１９陽性、およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を除去することによって、この懸濁液を、Ｔ細胞について富化させた。９４．９１％±１．０６（平均±標準偏差）というＴ細胞の百分率を、すべての抽出／濃縮の平均値として得た。
【００６５】
製造者の指示書に従って、Ｔ細胞を５−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ、ＵＫ）で標識した。こうして標識したＴ細胞（１ウェル当たり４×１０５細胞）を、Ｕ字状底部を有するマイクロタイタープレート内で、０、１、２、または３％のＤＣとともに５日間インキュベートした。増殖性Ｔ細胞を、少量のＣＦＳＥを含有したもの（ＣＦＳＥｌｏｗ）としてフローサイトメトリーによって同定および定量化した（図８）。
【００６６】
残りのフローサイトメトリープロトコールを、実施例１の節１に記載したように実施した。
【００６７】
３．２．結果
ＤＣと接触させなかったＴ細胞の画分（休止Ｔ細胞）は、「ホーミング」（どの組織にこれらのＴ細胞が向けられているかを示すマーカー）、および各ドナーの特徴的なインターロイキン（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７）の産生のプロファイルを呈した。予想されたように、「ホーミング」マーカーの絶対値、および配列番号１として同定されたＳＴペプチドまたはＬＰＳでコンディショニングしなかったＬＤＣ（実施例１）によって産生されるサイトカインの産生の絶対値はともに、やはり各ドナーにおいて異なっていた。
【００６８】
それにもかかわらず、配列番号１として同定されたＳＴペプチドまたはＬＰＳ（陽性対照）とともに予めインキュベートしたＤＣは、様々なドナーに由来するＴ細胞内でサイトカインの産生およびＴ細胞の「ホーミング」マーカーの同じプロファイルを常に誘導した。配列番号１として同定されたＳＴペプチドとともにインキュベートしたＤＣに注目すると、これらは、腸粘膜への移行のマーカーインテグリンβ７の減少をＴリンパ球内で誘導した一方、反対に、マーカーＣＬＡ（皮膚への移行のマーカー）の量は相当に増加した（図９）。したがって、配列番号１として同定されたＳＴペプチドの存在下でインキュベートされた血液で富化されたＤＣは、Ｔリンパ球内で皮膚への移行のマーカーをインプリントする。免疫学的観点から、これは、胃腸管内に存在する抗原の免疫無視（ｉｍｍｕｎｅ  ｉｇｎｏｒａｎｃｅ）の機構として解釈することができる。この意味において、Ｔ細胞は、皮膚内に入ると、これらが腸粘膜内で選択された抗原に決して遭遇しないはずであり、したがって不活性である。
【００６９】
さらに、これらの同じＴ細胞（配列番号１として同定されたＳＴペプチドとともに先にインキュベートしたＤＣとともに共インキュベートした）内のサイトカインの産生のプロファイルは、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７の産生がともに減少したという意味で異なっていた（図１０および図１１）。両サイトカインは、炎症促進性であり、ＩＬ−１７（Ｔｈ１７細胞）の場合では、Ｔ細胞によるその産生は、ある特定の自己免疫疾患および炎症疾患においてより多いことが知られている。
【００７０】
したがって、配列番号１として同定されたＳＴペプチドによってコンディショニングされたＤＣで成熟したＴリンパ球は、非炎症促進性サイトカインの産生のプロファイル、および皮膚への移行のプロファイルを取得する。
【実施例４】
【００７１】
配列番号１として同定されたＳＴペプチドで成熟した腸粘膜から得た樹状細胞の一次Ｔリンパ球との相互作用
本実施例は、腸粘膜から単離したＤＣを使用したことを除いて、先の実施例と同じである。図１２で分かるように、腸ＤＣは、Ｔ細胞上にインプリントするサイトカインのプロファイルがＩＬ−１０（抗炎症性）を誘導することである一方、他のインターロイキン（ＴＧＦβ、ＩＬ−１７、およびＩＦＮγ）の増加がないという意味で既に「恒常性」である。配列番号１として同定されたＳＴペプチドとともにインキュベートされたＤＣは、Ｔ細胞内でＩＬ−１０の産生およびＴＧＦβの産生のさらにより大きい増大を誘導する（図１２ｃ）。
【００７２】
最後に、先の実施例と同じように、このペプチドによってコンディショニングされたＤＣは、皮膚への移行のマーカーを発現するより多数のリンパ球を誘導し（図１３）、その結果、重ねて、配列番号１として同定されたＳＴペプチドは、免疫無視のプロセスを促進するはずであることを実証する。
【実施例５】
【００７３】
炎症性腸疾患、皮膚症状を伴う自己免疫疾患、および化粧品における配列番号１として同定されたＳＴペプチドの潜在的な使用
本発明者らの実験のために結腸の腸粘膜から生検を供与することについての同意書を提出したドナーの１人は、抗原提示細胞の古典的な炎症促進性インターロイキンであるＩＬ−１２を異常に高いレベルで産生したいくつかのＤＣを有していた。図１４で分かるように、配列番号１として同定されたＳＴペプチドは、抗炎症性インターロイキンＩＬ−１０の産生を増大させるだけでなく、これらの樹状細胞内のＩＬ−１２の産生を完全に相殺した。
【００７４】
これは、１つの例であるが、本発明者らは、上記に定義した配列番号１として同定されたＳＴペプチドを、炎症性腸疾患および他の炎症疾患の両方との関連で、ならびに炎症症状とともに進行する自己免疫疾患との関連で、免疫療法のプログラムに含めることができることを提言する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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