(57)【要約】媒質本発明はキチンの酵素的抽出法に関し、この方法は単一工程で実現されることを特徴とし、この工程ではキチンを含む動物バイオマスから構成される原料を酵素加水分解することによってキチンが得られ、この酵素加水分解では酸性媒質中の活性酵素を用いる。本発明は、キチンの酵素的抽出法の最適化プロセスにも関する。本発明はさらに、この酵素的抽出法によって得られる変換可能なキチンにも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンの酵素的抽出のための方法であって、前記方法が単一工程で実施され、キチンを含む動物バイオマスで構成される原料を酵素加水分解することでキチンが得られ、前記酵素加水分解には酸性媒質中の活性酵素が用いられることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記単一工程が、前記原料の除タンパク及び脱灰を同時に行うための酵素加水分解である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性媒質中で活性の前記酵素が、酸性媒質中で広範な活性を有するプロテアーゼ、好ましくはペプシン又は安定した酸性プロテアーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
加水分解に用いられる前記酵素の濃度が、前記原料に含まれるタンパク質の推定重量に対して、重量にして０．１〜７５％、好ましくは５〜３０％、より好ましくは約２３〜約２７％である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
酸、好ましくは食用酸、より好ましくはリン酸又はギ酸の存在によって前記酸性媒質が得られる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
キチンを含む動物バイオマスが、水産副産物、好ましくは甲殻類、より好ましくはエビ、カニ又はオキアミから得られる水産副産物、又は頭足類、好ましくはヤリイカ又はコウイカから得られる水産副産物を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
キチンを含む前記動物バイオマスが、昆虫の副産物、好ましくは甲虫又は膜翅目から得られる昆虫の副産物を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記原料を洗浄、乾燥及び／又は粉砕するための作業、好ましくは水洗、低温乾燥及び／又は粉砕作業をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記酵素加水分解の最後に反応媒質処理作業をさらに含み、前記作業が、固相と液相とを分離し、不溶部分を洗浄及び／又は乾燥するための作業を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のキチンの前記酵素的抽出法を最適化する方法であって、
ａ）酵素が最大活性を示すｐＨであるｐＨｅｎｚにおいて、前記酸性媒質のｐＨをｐＨｅｎｚ±２、好ましくはｐＨｅｎｚ±１．５、好ましくはｐＨｅｎｚ±１の範囲で選択する、
ｂ）酵素が最大活性を示す温度であるＴｅｎｚにおいて、前記酸性媒質の温度をＴｅｎｚ±２０℃、好ましくはＴｅｎｚ±１５℃、好ましくはＴｅｎｚ±１０℃の範囲で選択する、
ｃ）前記原料の無機塩含有量及びタンパク質含有量を決定する、
ｄ）前記原料の前記無機塩含有量に応じ、前記反応媒質に用いられる酸の濃度を計算することで、前記ｐＨを前記酵素加水分解の間を通じて工程ａ）で選択したｐＨに維持する、
ｅ）用いられる酵素の比率を、前記原料の前記タンパク質含有量に対して計算する、
ｆ）得たいキチン又は前記キチンの誘導体を得るための反応時間を決定する、
工程のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法によって得られうるキチン。
【請求項１２】
請求項１１に記載のキチンを脱アセチル化することによって得られうるキトサン。
【請求項１３】
請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含む化粧用組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含む医療用具。
【請求項１７】
請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含む食品、栄養補助食品組成物、食養生組成物、補助食品又は機能性食品。
【請求項１８】
水処理、濾過及び／又は汚濁除去に使用するための、請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１１に記載のキチン及び／又は請求項１２に記載のキトサンを含むテクスチャリング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス、好ましくは動物バイオマス、より好ましくは水産バイオマス及び／又は昆虫バイオマスの回収の分野に関する。詳細には、本発明は、酸性媒質中の活性酵素を用いて、キチンを含んだ動物バイオマスの要素、好ましくは水産及び／又は昆虫学上の副産物から、単一工程でキチンの酵素的抽出を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水産物、特に甲殻類、中でもエビの産出と消費とは年々増大している。副産物（頭部と甲殻）は、一般に甲殻類の生体重の５０％以上を占める。したがって、これらの利用は、関連する量及びこれらの緩やかな自然の生分解性を考慮すれば、主要な課題の１つである。キチンは、これらの副産物に由来する主生成物である。
【０００３】
さらに、昆虫食性は複数の国に共通する食習慣であり、世界中で拡大しつつある。実際、昆虫は栄養面で良質であるため、有利な食資源である。さらには、他の動物タンパク質の産出と比較すると、昆虫の産出は非常に有利で環境に配慮した選択肢である。昆虫のタンパク質産出から得られる副産物には、甲殻類の場合、キチンを豊富に含む甲殻が含まれる。
【０００４】
キチンは、セルロースに次いで地上で２番目に多い多糖類である。キチンは、Ｎ‐アセチル‐β‐Ｄ‐グルコサミンユニットとＤ−グルコサミン単位からなる多糖を含んでいるため、単一の化学構造ではなく複数の化学構造を有する。
【０００５】
キチンは、昆虫や甲殻類の外骨格及び真菌や細菌の細胞壁の一部を形成する。このように、キチンは、甲殻類の甲殻の２０〜３０％を占めている。キチンのほかには、甲殻類の外骨格は、２０〜４０％のタンパク質、３０〜６０％の無機塩、０〜１４％の脂肪を含んでいる（Ｊ．Ｗａｌｄｅｃｋ，Ｇ．Ｄａｕｍ，Ｂ．Ｂｉｓｐｉｎｇ及びＦ．Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００６，７２（１２），７８７９−７８８５）。このように、キチンは、昆虫の外皮の３〜６０％を占めている。キチンのほかには、昆虫の外骨格は２０〜８０％のタンパク質、１〜２０％の無機塩、１０〜５０％の脂肪を含んでいる（“Ｆｏｒｅｓｔ  ｉｎｓｅｃｔｓ  ａｓ  ｆｏｏｄ：ｈｕｍａｎｓ  ｂｉｔｅ  ｂａｃｋ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ａｓｉａ−Ｐａｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００８年２月１９日〜２１日，チェンマイ，タイ−国連食糧農業機関（ＦＡＯ））。甲殻類であれ、昆虫であれ、各種成分の比率は、種や年齢、属によって変動し、季節や環境条件によって上下することもある。したがって、キチンの抽出条件は、使用する原料に応じて適合されなければならない（Ａ．Ｔｏｌａｉｍａｔｅ，Ｊ．Ｄｅｓｂｒｉｅｒｅｓ，Ｍ．Ｒｈａｚｉ及びＡ．Ａｌａｇｕｉ，Ｐｏｌｙｍｅｒ，２００３，４４（２６），７９３９−７９５２）。
【０００６】
キチンは甲殻類や昆虫の副産物に、キチン／タンパク質／無機塩の複合体の形で見られる。通常は
酸加水分解による脱灰で無機塩の除去
塩基加水分解による除タンパクによるタンパク質の除去
の２つの「化学的抽出」工程で抽出される。
【０００７】
水産副産物からのキチン抽出は、現在、「化学的抽出」によって工業規模で実施されている。昆虫からのキチン抽出は、現在まであまり開発されていないが、すでに研究対象となっており、基本的には化学的プロセスを用いる（ｃｉｃａｄａ  ｃｈｉｔｉｎ：Ｗ．Ｓａｊｏｍｓａｎｇ及びＰ．Ｇｏｎｉｌ，Ｍａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃ，２０１０，３０（３），３５７−３６３；ｓｉｌｋｗｏｒｍ  ｐｕｐａ  
ｃｈｉｔｉｎ：Ａ．Ｐａｕｌｉｎｏ，Ｊ．Ｓｉｍｉｏｎａｔｏ，Ｊ．Ｇａｒｃｉａ及びＪ．Ｎｏｚａｋｉ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００６，６４，９８−１０３；ｂｕｍｂｌｅｂｅｅ  ｃｈｉｔｉｎ：Ｊ．Ｍａｊｔａｎ，Ｋ．Ｂｉｌｉｋｏｖａ，Ｏ．Ｍａｒｋｏｖｉｃ，Ｊ．Ｇｒｏｇ，Ｇ．Ｋｏｇａｎ及びＪ．Ｓｉｍｕｔｈ，Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２００７，４０，２３７−２４１）。
【０００８】
、残余の色素を除去するために、例えば、次亜塩素酸ナトリウムを使用する第３の任意的な漂白工程がよく用いられる。洗浄作業、一般的には水を用いる洗浄が、これらの工程間に必要である。
【０００９】
このようにすると、キチンは、例えば水酸化ナトリウムを用いることで容易に脱アセチル化され、キトサンを生成することができる。
【００１０】
キチンは、従来、医療、製薬、食物、食品、技術（水の濾過及び汚濁除去）など広範囲にわたって応用するために抽出されている。実際、キチン、キトサン及びこれらの誘導体、特にこれらのオリゴマーは、生物適合性、生分解性であり、かつ無毒性である。応用形式は、キチン及びその誘導体の理化学的特性に依存する。詳細には、キトサンは特に、マルチフィルム、胃を保護するゲルの生産だけでなく、有効成分のカプセル化、汚水の濾過、軟骨置換、組織の再生などにも用いられうる。
【００１１】
水産副産物からのキチンの工業的抽出は、主に新興国で実施されている。従来の化学的抽出では、作業者、設備及び環境にとって有害な大量の試薬（主に塩酸、水酸化ナトリウム及び漂白剤）を用いる。さらに、基本的な除タンパク工程は、一般に高熱で行われるため、多量のエネルギー投入が必要である。加えて洗浄工程は、きわめて多量の汚濁した廃水を排出し、この廃水のリサイクルは技術的に困難かつコストが高い。
【００１２】
現在の抽出法に関連する問題の１つは、このプロセスの間にキチンが変性する可能性があることにある（Ｇ．Ｃｒｉｎｉ，Ｐ．Ｂａｄｏｔ及びＥ．Ｇｕｉｂａｌ，Ｃｈｉｔｉｎｅ  ｅｔ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｄｕ  ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ａ  ｌ‘ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２００９，Ｐｒｅｓｓｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅｓ  ｄｅ  Ｆｒａｎｃｈｅ−Ｃｏｍｔｅ）。
【００１３】
研究により、生物学的方法、とりわけ酵素的抽出又は微生物発酵という手段を、特に除タンパク工程に用いてキチンを抽出しうることが示されている。
【００１４】
発酵プロセスに関する研究のうち、Ｂｅａｎｅｙが行った研究では、ヨーロッパアカザエビ（Ｎｅｐｈｒｏｐｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）の外骨格を研究物質として用いている（Ｐ．Ｂｅａｎｅｙ，Ｊ．Ｌｉｚａｒｄｉ−Ｍｅｎｄｏｚａ及びＭ．Ｈｅａｌｙ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００５，８０，１４５−１５０）。この研究では、菌株の存在下で５日間３０℃で乳酸発酵を行い、キチンを抽出している。細菌は除タンパクを行い、その一方では、細菌による乳酸の生成を原因として媒質が酸性化することで、部分的な脱灰が行われる。この研究では、ｐＨの値は、７日間の発酵後に３．５まで減少する。しかし、これらの条件下では、抽出されるキチンはなお１３％のタンパク質と１４％の無機塩を含んでいる。より純粋なキチンは、この後、さらに化学的処理を行うことで得られうる。したがって、この種の方法は、高品質のキチンを直接得るには適しておらず、その応用を限定するものである。
【００１５】
甲羅を２種類の細菌の存在下で共発酵させることによってアカガニの甲羅からキチンを抽出するため、微生物発酵の研究がさらに行われた。２種類の細菌として、第１に乳酸を生成する細菌である、ラクトバチルス・パラカゼイ・トレランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃｃａｓｅｉ  ｔｏｌｅｒａｎｓ）ＫＣＴＣ−３０７４が、第２に細胞外プロテアーゼを生成する細菌である霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＦＳ−３が用いられた（Ｗ．Ｊｕｎｇ，Ｇ．Ｊｏ，Ｊ．Ｋｕｋ，Ｋ．Ｋｉｍ及びＲ．Ｐａｒｋ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，７１，２３４−２３７）。共発酵を３０℃で７日間続けた結果、脱灰率は９７．２％、除タンパク率はわずかに５２．６％であった。この研究では得られたキチンはキャラクタライズされなかったが、除タンパク率の低さはそれらの使用を限定的にする。
【００１６】
同じチームで微生物発酵の研究がさらに行われ、水産副産物の除タンパク及び脱灰のためプロテアーゼを生成する菌株が用いられた（Ｇ．Ｊｏ，Ｗ．Ｊｕｎｇ，Ｊ．Ｋｕｋ，Ｋ．Ｏｈ，Ｙ．Ｋｉｍ及びＲ．Ｐａｒｋ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００８，７４，５０４−５０８）。３０℃で７日間、１０％の菌株の存在下で発酵試験が行われた結果、除タンパク率と脱灰率はそれぞれ８４％と、４７％であった。上述のとおり、脱灰は、細菌による酸の生成と関連して、時間の経過とともにｐＨが減少する（７日間の発酵後のｐＨ５．６）ことに起因する。得られたキチンの純度の低さは、キチンの応用を限定するものであり、この方法は、先の方法と同様に、きわめて長い反応時間が必要であるという欠点を有する。
【００１７】
Ｗａｌｄｅｃｋにより、２工程の発酵プロセスを用いて最大の脱灰収率及び除タンパク収率が得られた（Ｊ．Ｗａｌｄｅｃｋ，Ｇ．Ｄａｕｍ，Ｂ．Ｂｉｓｐｉｎｇ及びＦ．Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００６，７２（１２），７８７９−７８８５）。４２〜５５℃で６日間発酵した後、３時間の乳酸処理を行った場合、タンパク質残余率は１０％未満であり、脱灰率は９８．８％に等しくなる。Ｊｏらによる研究と同じく、反応時間は比較的長い。
【００１８】
したがって、発酵プロセスを用いたキチンの抽出では、化学的抽出の場合よりもキチンのタンパク質残余量が高く、また、脱灰をすすめるためにさらなる処理が必要となることが多い。さらには、反応時間が化学的プロセスの場合よりもはるかに長い。
【００１９】
生物学的プロセスによるキチンの抽出もまた、酵素的抽出を用いて行われうる。
【００２０】
魚の内臓の酵素活性を用いたタンパク質除去を含むキチンの抽出方法が、国際特許申請、国際公開第８６／０６０８２号で提唱された。詳細には、この特許申請に記載の方法には、必要に応じてｐＨ１．２〜２．５で予め貯蔵したエビの殻からのキチン抽出が含まれ、ここでは酸を用いた脱灰の後、魚の内臓を用いて除タンパクが行われる。原料、すなわちエビの殻は、第１に硫酸溶液で貯蔵される。貯蔵によって使用前に原料を保存し、脱灰を行うことが可能になる。第２に、予め貯蔵した殻を、除タンパクのため魚の内臓と接触させて置く。この２工程の方法を用いることで得られるキチンの特性は未特定である。
【００２１】
酵素的抽出は、精製した酵素、一般的にはタンパク質分解酵素を用いても行われうる。これは、例えば、Ｎ．Ｇａｇｎｅが行った研究のケースであり、ここではエビの殻からキチンを抽出するため、キモトリプシン又はパパインが用いられている（Ｎ．Ｇａｇｎｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｆｒｏｍ  ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ  ｗａｓｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｉｄ”，１９９３  ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ）。従来の化学的な脱灰工程が施されたのち、残ったタンパク質は酵素によって加水分解される。除タンパクの最適な条件とは、特にキモトリプシンとパパインが８．０〜８．７のｐＨを有することである。用いられた条件下では、タンパク質の残余量は極めて低い（キモトリプシンとパパインでそれぞれ１．３％と２．８％）。
【００２２】
ＳｙｎｏｗｉｅｃｋｉとＡｌ Ｋｈａｔｅｅｂは、同種の方法を用いて、事前に塩酸で脱灰されたエビの殻を、アルカラーゼを用いて５５℃でｐＨ８．５で酵素的消化を行った（Ｊ．Ｓｙｎｏｗｉｅｃｋｉ及びＡｌ  Ｋｈａｔｅｅｂ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，６８，１４７−１５２）。
【００２３】
酵素加水分解工程を含んだキチンの生成法は既に特許が取得されている（中国特許１７１５２５５号）。この方法では、キチン以外の化合物もエビの殻から抽出されるため、原料を化学処理するための一般的なアプローチを提供している。詳細には、この方法は酵素加水分解の後に溶媒を抽出する工程を含む。得られる固形分はその後に塩酸の存在下に置いて脱灰を行い、キチン抽出が終了する。
【００２４】
ここに記載したキチンの酵素的抽出法は全て、酵素加水分解工程の前後に、別個の従来の化学的な脱灰工程を含む。こなどの方法では、生物学的方法を用いて除タンパク工程が行われたとしても、洗浄作業が必要で、汚濁廃水を排出し、抽出されたキチンの特性に影響を与える傾向がある化学的工程が残ることになる。
【００２５】
したがって現在の方法は十分ではなく、簡単、迅速、効率的、低コストかつより環境に優しいキチン抽出法が必要である。これらの方法は、その純度が食品、食餌又は化粧品産業での利用に適合するキチンの生成に好適でなければならない。さらには、生成されるキチンは、キトサン、オリゴキトサン又はグルコサミン類などへの加工に必要な特定要件を満たさなければならない。特に、キチンの重合度は十分に高いものでなくてはならず、プロセスの間に変性してはならない。
【００２６】
さらに、甲殻類や昆虫の副産物を用いて、特に栄養補助食品、食事療法又は化粧品において、さらなる化合物が回収される可能性がある。実際、これらの水産及び昆虫の副産物は、脂質、色素、糖質、無機塩、アミノ酸又はペプチド類などの可溶性化合物を含んでいる。これらの可溶性化合物の標的抽出、例えば色素の抽出や食産業で利用されているアスタキサンチンの抽出が開発されてきている（米国特許第７，２４１，４６３号）。しかしながら、可溶性化合物の抽出を標的とするこれらの方法では、キチンを抽出するためにさらなる工程が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
現在のキチン抽出法では、キチンは固体状で得られ、潜在的な関心対象である可溶性化合物を含んだ液体の抽出相は回収されない。この回収が得られないことは、特に、液相に存在する可溶性化合物が低質であることから説明されうる。実際、これらのキチン抽出法では、比較的厳しい条件が用いられるため、可溶性化合物は劣化することが多い。
【００２８】
それゆえ、その初期構造をより重視し、かつ可溶な生成物の共抽出と結びつけるのに好適な方法を用いてキチンを精製する必要がある。
【００２９】
本出願人は、キチンを含む動物バイオマス部位の完全な回収、中でも水産副産物、特に甲殻類の甲殻、及び昆虫学上のバイオマス、特に昆虫の外皮を完全に回収するために研究を行った。特に、標的抽出との関係でその利点を視野に入れ、共抽出法が研究された。
【００３０】
このため、本発明は、キチンの酵素的抽出法に関し、この方法が単一工程で行われることを特徴とし、以降「単一工程（single step）」とよぶこの工程では、キチンを含む動物バイオマスを酵素加水分解することによってキチンが得られ、この酵素加水分解では酸性媒質中の活性酵素を用いる。
【００３１】
一実施形態によれば、この単一工程は、水産副産物の除タンパクと脱灰を同時に行うことを目的とした酵素加水分解である。
【００３２】
一実施形態では、酸性媒質中での活性酵素は、酸性媒質中で広範囲の活性を有するプロテアーゼ、好ましくはペプシン又は安定した酸性プロテアーゼである。
【００３３】
一実施形態によれば、加水分解に用いられる酵素濃度は、原料の中に推定されるタンパク質の重量に対して、重量にして０．１〜７５％、好ましくは５〜３０％、より好ましくは約２３〜約２７％である。
【００３４】
一実施形態によれば、酸性媒質は、酸、好ましくは食用酸、より好ましくはリン酸又はギ酸の存在によって得られる。
【００３５】
一実施形態によれば、キチンを含む動物バイオマスは、水産副産物、好ましくは甲殻類から、より好ましくはエビ、カニ又はオキアミから得られる水産副産物、又は頭足類から、好ましくはヤリイカ又はコウイカから得られる水産副産物を含む。
【００３６】
一実施形態によれば、キチンを含む動物バイオマスは、昆虫の副産物、好ましくは甲虫又は膜翅目から得られる昆虫の副産物を含む。
【００３７】
一実施形態によれば、この方法は、さらに、原料の洗浄、乾燥及び／又は粉砕のための作業、好ましくは水洗、低温乾燥及び／又は大きさを１ｍｍ未満の粉末状にする粉砕作業を含む。
【００３８】
一実施形態によれば、この方法はさらに酵素加水分解の最後に反応媒質処理作業を含み、この作業は固相と液相との分離、不溶部分の洗浄及び／又は乾燥のための作業、好ましくは濾過、水洗及び／又は乾燥機での乾燥からなる作業を含む。
【００３９】
また、本発明は、キチンの酵素的抽出法を最適化する方法にも関し、この最適化法が以下の工程のうち少なくとも１つを含むことを特徴とする。
ａ）酵素が最大活性を示すｐＨであるｐＨｅｎｚにおいて、酸性媒質のｐＨをｐＨｅｎｚ±０〜２、好ましくはｐＨｅｎｚ±０〜１．５、好ましくはｐＨｅｎｚ±０〜１の範囲内で選択する、
ｂ）酵素が最大活性を示す温度であるＴｅｎｚにおいて、酸性媒質の温度をＴｅｎｚ±０〜２０℃、好ましくはＴｅｎｚ±０〜１５℃、好ましくはＴｅｎｚ±０〜１０℃の範囲で選択する、
ｃ）原料の無機塩含有量及びタンパク質含有量を決定する、
ｄ）好ましい一実施形態によれば、酵素加水分解の間を通じて反応媒質が工程ａ）で選択したｐＨに維持されるようｐＨが選択されるとの理解の下で、原料の無機塩含有量に応じて反応媒質に用いる酸濃度を計算する、
ｅ）原料のタンパク質含有量に対して、用いられる酵素の比率を計算する、
ｆ）得たいキチン又はキチン誘導体を得るための反応時間を決定する。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明に係る方法によって得られうるキチンに関する。
【００４１】
また、本発明は、本発明によるキチンを脱アセチル化することによって得られうるキトサンに関する。
【００４２】
また、本発明は、本発明によるキチン及び／又は本発明によるキトサンを含む組成物に関する。
【００４３】
また、本発明は、本発明によるキチン及び／又は本発明によるキトサンを含む医薬組成物、本発明によるキチン及び／又は本発明によるキトサンを含む化粧用組成物、本発明によるキチン及び／又は本発明によるキトサンを含む医療用具に関する。
【００４４】
また、本発明は、本発明によるキチン及び／又は本発明によるキトサンを含む食品、栄養補助食品組成物、食養生組成物、補助食品又は機能性食品に関する。
【００４５】
また、本発明は、本発明によるキチン及び／又は本発明によるキトサンを含み、これらを水処理、濾過及び／又は水の汚濁除去に使用する組成物に関する。
【００４６】
また、本発明は、本発明に基づくキチン及び／又は本発明によるキトサンを含むテクスチャリング剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明によりキチンを抽出する方法のスキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
本発明において、以下の用語は次のように定義される。
「キチン」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンの多糖を指す。
「キトサン」とは、キチンの脱アセチル化物を指す。キトサンとキチンとの区分は５０％のアセチル化度である。これを下回る化合物がキトサン、上回るものがキチンとよばれる。
「動物バイオマス」とは、動物に由来するすべての有機体を指す。
「水産副産物」とは、水産物のなかで、食品産業によって使用されない部位、特に甲殻類の甲殻や頭部を指す。
「昆虫学上の副産物」又は「昆虫の副産物」とは、昆虫学上の産物のなかで、食品産業によって使用されない部位、特に昆虫の外皮と頭部を指す。
「重合度」とは、ポリマー鎖、特にキチンの鎖長を指す。重合度は、ポリマー鎖を形成するモノマー単位の数からなる。
「結晶化度」とは、結晶状態にある物質の比率を指す。
「脱灰」とは、無機塩を除去する方法を指す。
「除タンパク」とは、タンパク質を除去する方法を指す。
「解重合」とは、キチンのポリマー鎖長の縮小を指す。
「脱アセチル化」とは、アセチル基の除去を指し、キチンからキトサンへの変換に相当する。
「含水量」とは、試料に含まれる水分の質量％を指す。
「タンパク質含有量」とは、試料に含まれるタンパク質の質量％を指す。
「無機塩含有量」とは、試料に含まれる無機塩の質量％を指す。
「キチン含有量」とは、試料に含まれるキチンの質量％を指す。
「約」とは、数値の前にある場合、その数値の公称値の約１０％を意味する。
特に指定がない限り、パーセントは質量％である。
【００４９】
本発明は、動物バイオマスから得られるキチンを含む原料、好ましくは水産副産物及び／又は昆虫学上の副産物からなる原料から、酸性媒質中の活性酵素、好ましくはプロテアーゼを用いて単一工程で実施するキチンの酵素的抽出法に関し、使用される酸は好ましくは食用酸であることから、脂質、色素、糖質、無機塩、アミノ酸又はペプチド類などの可溶性化合物を抽出するのにも適している。
【００５０】
本発明では、キチンを抽出する従来の方法の重要な２工程、すなわち酸性媒質中での脱灰とアルカリ媒質中での除タンパクとを単一工程に統合する。この単一工程への統合は、至適活性ｐＨが酸性である酵素を使用することで可能となる。この酵素が除タンパクを行う一方で、酸性ｐＨによって脱灰を同時に行うことができる。
【００５１】
本発明に係る方法は、単一の重要な工程のみからなるため、従来の方法の２工程の間に生じる洗浄に関連した材料の損失を減らすという利点を提供する。この方法では、試薬と溶媒の消費を減らし、汚濁物質の排出を制限することもできる。したがって、この方法は、低コストかつ環境にやさしい方法である。
【００５２】
本発明に係る方法で用いられる条件とは、キチンの生物学的活動及びその天然構造が、現存の抽出法よりも良好な状態で保存されることである。
【００５３】
本発明に係る方法は、キチン、タンパク質及び無機塩という本来強固に結びついた３つの主成分を分離することによって、甲殻類及び／又は昆虫の副産物のマトリックスを分解できるという利点を提供する。
【００５４】
本発明に係る方法は、酸性媒質中での酵素加水分解工程を含み、脱灰及び除タンパクを同時に行う。無機塩とタンパク質は、固相から液相へと移行する。
【００５５】
一実施形態によると、本発明に係る方法は、酸性媒質中での酵素加水分解工程に加えて、
原料を調製し、
酵素活性のための最適条件に応じた、少なくとも１つの酸を含む反応媒質を調製し、
調製した原料を反応媒質に混合し、均質化するとともに酵素を加え、
調整された温度、ｐＨ及び撹拌を伴った酵素加水分解工程、すなわち、最適化された時間での除タンパク及び脱灰反応を同時に行い、
「反応液」の可溶部分と不溶部分とを分離し、
「不溶」分を洗浄し、乾燥して容器に入れ、
必要に応じて抽出物をキャラクタライズする、
という、調製及び化学処理作業を含みうる。
原料
【００５６】
本発明によれば、「原料」という用語は、キチンを含み、キチンを抽出するために用いられる動物バイオマス、好ましくはキチンの抽出に用いられる水産副産物及び／又はキチンの抽出のために用いられる昆虫学上の副産物を表す。
【００５７】
一実施形態によれば、本発明に係る方法で用いられる原料は、水産副産物、好ましくは甲殻類、エビ、カニ、オキアミ、より好ましくは甲殻類の甲羅及び頭部を含み、本発明の特定の一実施形態によれば、原料は、頭足類、好ましくはヤリイカ又はコウイカから得られる。
【００５８】
一実施形態によれば、本発明よる方法で用いられる原料は、昆虫の副産物、好ましくはチャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）などの甲虫やアメリカミズアブ（Ｈｅｒｍｅｔｉａ  ｉｌｌｕｃｅｎｓ）などの膜翅目からなる副産物で、より好ましくは昆虫の外皮や頭部を含む。
【００５９】
原料の調製作業は、一方ではこれらの質を保持するのに適していなければならず、また他方ではこの方法の要件も満たしていなければならない。
【００６０】
本発明の一実施形態によれば、原料の調製は、洗浄、乾燥及び／又は粉砕作業を含む。
【００６１】
一実施形態によれば、原料は水で洗浄される。
【００６２】
一実施形態によれば、原料は１〜３６時間、好ましくは約１８時間、好ましくは空気を循環させた状態で、好ましくは５〜３５℃、より好ましくは約１２℃の温度で乾燥される。一実施形態によれば、原料は、最大直径が約１０ｍｍと等しい断片、好ましくは直径が約１ｍｍ未満の粉末になるよう粉砕される。
【００６３】
一実施形態によれば、原料は、好ましくは洗浄、乾燥及び粉砕により調製され、抽出前に−３０〜−１０℃、好ましくは−２０℃の温度で、好ましくは酸素の存在を制限して保存される。
反応媒質
【００６４】
本発明によれば、「反応媒質」という用語は、酸性媒質中で酵素加水分解反応が生じる媒質を表す。
【００６５】
反応媒質の調製は、温度、溶媒及びｐＨなど、用いられる酵素活性条件を考慮する必要がある。これらの条件を選択することにより、反応時間及び収率を最適化することができる。
【００６６】
一実施形態によれば、反応媒質は、酵素加水分解が行われる間、２〜８０℃、好ましくは３５〜４５℃、より好ましくは約３７〜約４０℃の温度に維持される。
【００６７】
一実施形態によれば、反応媒質の温度は用いられる酵素に適合されるため、この酵素の活性は酵素加水分解の間を通じて準最適である。
【００６８】
一実施形態によれば、酵素加水分解が行われる間の反応媒質の温度は、酵素が最大活性を示す温度であるＴｅｎｚにおいて、Ｔｅｎｚ±０〜２０℃、好ましくはＴｅｎｚ±０〜１５℃、好ましくはＴｅｎｚ±０〜１０℃の範囲内で維持される。選択される温度によって酵素の変性が誘発され又はその活性が阻害されてはならない。有利には、エネルギー消費を制限するため、反応媒質の温度はＴｅｎｚを下回る。
【００６９】
一実施形態によれば、反応媒質のｐＨは０．５〜６．５、好ましくは１．８〜３．８、より好ましくは約１．９〜約２．１である。酵素がペプシンである場合、反応媒質のｐＨは約１．９〜約２．１が好ましい。
【００７０】
一実施形態によれば、反応媒質のｐＨは酸性であり、その値を使用する酵素に適合させて、この酵素が至適活性を有するようにする。
【００７１】
一実施形態によれば、反応媒質のｐＨは、酵素が最大活性を示すｐＨであるｐＨｅｎｚにおいて、ｐＨｅｎｚ±２、好ましくはｐＨｅｎｚ±１．５、好ましくはｐＨｅｎｚ±１の範囲内である。選択されるｐＨは、十分なキチン抽出収率を確保するため、酸性でなければならない。
【００７２】
一実施形態によれば、反応媒質の使用準備が整った状態であるのは、酵素加水分解反応のため選択される温度条件とｐＨ条件が安定しているときである。
【００７３】
第１の実施形態によれば、反応媒質は少なくとも１つの酸を含んでいる。第２の実施形態によれば、反応媒質は、水又は水溶液といった溶媒をさらに含んでいる。
【００７４】
本発明の一実施形態によれば、使用される酸は好ましくは食用酸であり、好ましくはリン酸又はギ酸である。
【００７５】
酵素加水分解工程で用いられる酸が食用酸であるとき、本発明に係る方法によって抽出される生成物は、食品分野と化粧品分野でのより簡単な利用に適しているという利点を提供する。
【００７６】
一実施形態によれば、反応媒質中の酸濃度は０．１〜６ｍｏｌ．Ｌ−１であり、好ましくは０．８〜２．８ｍｏｌ．Ｌ−１、より好ましくは０．９〜１ｍｏｌ．Ｌ−１である。
【００７７】
一実施形態によれば、反応媒質中の酸濃度が使用される原料の無機塩含有量に適合されるため、反応媒質のｐＨは酸性で、かつ酵素加水分解の間に一貫して酸性の状態を保つ。
酵素
【００７８】
一実施形態によれば、本発明で使用される酵素は酸性媒質中で活性の酵素であり、好ましくは酸性媒質中で広範囲にわたる活性を有するプロテアーゼ、好ましくはペプシン又は安定した酸性プロテアーゼである。
【００７９】
一実施形態によれば、反応媒質中の酵素濃度は、使用される原料のタンパク質含有量に適合される。一実施形態によれば、酵素濃度は原料に推定されるタンパク質の質量に対して０．１〜７５質量％、好ましくは５〜３０質量％、より好ましくは約２３〜約２７質量％である。
反応条件
【００８０】
一実施形態によれば、原料は反応媒質と混合され、必要に応じてこの混合物は０〜３０分間、好ましくは３〜１０分間、より好ましくは約５分間撹拌して均質化される。
【００８１】
一実施形態によれば、調製される原料の重量と反応媒質の量との比率は１：６０〜２：１で、好ましくは１：７〜１：３、より好ましくは１：５に等しい。
【００８２】
一実施形態によれば、調製される原料の重量と反応媒質の量との比率は、調製される原料の断片の大きさに適合される。詳細には、原料の断片の大きさが小さくなると溶媒による吸収が増大し、その結果、反応媒質の量を増加させる必要があるという事実を考慮に入れる。
【００８３】
酸性の反応媒質に原料を加えることによって、甲殻類や昆虫の外骨格に存在する炭酸カルシウムから二酸化炭素が生成され、気泡が形成されうる。一実施形態によれば、酵素加水分解を行うために使用される容器は、形成される気泡が溢れることを避けるのに適した容積を有している。気泡形成のリスクが増大するのは、混合する前に酸の温度が上昇するときである。
【００８４】
一実施形態によれば、原料を加える前の反応媒質の温度は５〜６５℃、好ましくは２０〜３０℃、より好ましくは約２５℃である。この実施形態では、反応媒質の温度を酵素加水分解が行われる温度未満になるよう選択し、原料を加えるときの気泡形成を制限する。
【００８５】
第１の実施形態によれば、酵素は、必要に応じて原料を含んだ均質化処理済みの反応媒質に直接添加される。
【００８６】
第２の実施形態によれば、酵素は水又は溶液、好ましくは水溶液で可溶化され、原料を含んだ均質化処理済みの反応媒質に添加される。
【００８７】
一実施形態によれば、酵素加水分解反応は、原料と酵素との接触を最適化するよう、撹拌して行われる。
【００８８】
一実施形態によれば、反応媒質の初期のｐＨ条件及び温度条件は、酵素加水分解反応の間、一貫して維持される。さらなる一実施形態によれば、反応媒質の初期のｐＨ条件及び／又は温度条件は、酵素加水分解反応の間に一貫して維持されない。
【００８９】
一実施形態によれば、酵素加水分解反応は、温度制御装置を備えた反応器で行われる。第１の実施形態によれば、この反応器は、伝熱流体が循環する二重ジャケット付き反応器であり、この流体の温度は管理することができる。第２の実施形態によれば、この反応器は加熱エレメントを備えており、このエレメントの温度は管理するのに好適である。
【００９０】
第１の実施形態によれば、ｐＨは酵素加水分解の間安定している。第２の実施形態によれば、ｐＨは、酵素加水分解反応中に、高濃度の酸性溶液を加えることによって、用いられる酸と炭酸カルシウムとのｐＫａ値に適合され、この酸は反応媒質に使用されるものと同一である。
【００９１】
一実施形態によれば、酵素加水分解の継続時間は３０分〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、好ましくは３〜８時間、より好ましくは約６時間である。
【００９２】
一実施形態によれば、酵素加水分解の継続時間は、酵素加水分解反応を行うために用いられる酵素の活性、使用される酸及び原料に適合される。
【００９３】
一実施形態によれば、酵素加水分解の継続時間は、純度、重合度、アセチル化度など、最終生成物に求められる特徴に応じて適合される。
【００９４】
一実施形態によれば、酵素反応は、可溶部分と不溶部分とを含んだ反応液を生成する。
生成物の分離
【００９５】
一実施形態によれば、反応液の可溶部分と不溶部分とは、当業者に公知のいずれかの適当な手段によって分離される。
【００９６】
第１の実施形態によれば、可溶部分と不溶部分とは濾過によって分離される。一実施形態によれば、濾過は、抽出された化合物の構造の完全性を保持する濾過システムにより行われる。さらなる一実施形態によれば、濾過は、膜圧搾濾過システムによって行われる。さらなる一実施形態によれば、濾過は、濾布、好ましくはふるい絹で行われる。
【００９７】
第２の実施形態によれば、可溶部分と不溶部分とは遠心分離によって分離される。
【００９８】
一実施形態によれば、反応液の不溶部分は主にキチンを含み、可溶部分は脂質、色素、糖質、無機塩、アミノ酸又はペプチド類などの各種化合物を含む。
【００９９】
一実施形態によれば、不溶部分は溶媒を用いて洗浄される。第１の実施形態によれば、この溶媒は水又は水溶液である。キチンがその後食用に利用される場合、この実施形態が好ましい。第２の実施形態によれば、不溶部分はまず水又は水溶液で、続いて過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム又は過硫酸カリウムなどの漂白剤で洗浄され、水又は水溶液で再び洗浄される。キチンの漂白が必要な場合、この第２の実施形態が好ましい。この実施形態では、使用される漂白剤は法に従う。
【０１００】
キチンは極めて吸湿性の高い物質であり、その生物活性は温度が上昇すると低下しうる。
【０１０１】
一実施形態によれば、濾過および洗浄処理が施された不溶部分は、その後８〜１６時間、好ましくは約１２時間乾燥器で乾燥され、その温度は好ましくは１００℃未満、好ましくは５０〜９５℃、より好ましくは約９０℃である。
【０１０２】
一実施形態によれば、濾過された不溶部分は水酸化ナトリウムで中和される。一実施形態によれば、この不溶部分は凍結乾燥される。
【０１０３】
一実施形態によれば、乾燥及び／又は凍結乾燥された不溶部分は、ガラスやプラスチック製のビン又は真空容器などの容器に入れられ、好ましくは乾燥した場所で室温で保存される。特定の一実施形態によれば、不溶部分（キチン）は、室温を下回る温度、好ましくは−３０〜０℃、より好ましくは−２０〜−１０℃、より好ましくは約−２０℃で保存される。
【０１０４】
第１の実施形態によれば、可溶部分は遠心分離される。第２の実施形態によれば、可溶部分は透析によって分離され、限外濾過される。第３の実施形態によれば、有機溶媒を用いることで、中和された可溶部分から化合物が抽出される。この有機溶媒又は水溶液はその後、目的の化合物を得るために蒸発される。
【０１０５】
可溶相を化学処理するための技術は、回収される化合物の性質に依存する。
抽出収率
【０１０６】
使用される原料に応じて反応媒質（酵素濃度、ｐＨ及び温度）を調節することによって、得られるキチンの収率と生化学的及び理化学的特性を調節することができる。理論上は、加水分解時間を長くすることで重合度が低下する傾向がある。
【０１０７】
不溶部分の質量抽出収率（ｍａｓｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄ）（Ｙｄ）は、使用される原料、酸及び酵素の性質に依存しており、以下の式を用いて計算される。
Ｙｄ％＝１００＊（不溶部分の乾燥重量）／（原料の乾燥重量）
【０１０８】
一実施形態によれば、不溶部分は、主に、キチンと酵素加水分解反応中に除去されなかった残余のタンパク質及び無機塩を含む。
【０１０９】
本発明に係る方法を用いて得られた不溶部分に従来の化学的抽出処理を適用することによって、不溶部分中に残余の不純物量を推定することができる。実際、この処理は、残余のタンパク質及び無機塩の大部分を除去するのに好適である。
【０１１０】
キチンの純度（Ｄ○ｐｕｒｉｔｙ）は、重量測定、すなわち不溶部分を１．２５ｍｏｌ．Ｌ−１の水酸化ナトリウムで１時間９０℃で処理する前と後に、不溶試料の質量を測定することによって推定される。上述のように、この処理は、残余のタンパク質及び無機塩を除去するのに好適である。推定される純度は、以下の式を用いて計算される。
Ｄ○ｐｕｒｉｔｙ＝１００＊［（処理後の不溶部分の質量）／（処理前の不溶部分の質量）]
【０１１１】
一実施形態によれば、推定されるキチンの純度（Ｄ○ｐｕｒｉｔｙ）は７５％より高く、好ましくは８０％より高く、より好ましくは８５％より高く、より好ましくは９０％より高い。
【０１１２】
一実施形態によれば、乾燥させた不溶部分中に残余のタンパク質含有量は２０％未満で、好ましくは１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満である。
【０１１３】
一実施形態によれば、本発明に係る方法で除去されるタンパク質の質量比率は８０％より高く、好ましくは８５％より高く、より好ましくは９０％より高く、より好ましくは９５％より高い。
【０１１４】
一実施形態によれば、乾燥させた不溶部分中に残余の無機塩の重量は５％未満で、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満である。
【０１１５】
一実施形態によれば、本発明に係る方法により除去される無機塩の重量は９５％より高く、好ましくは９７％より高く、より好ましくは９９％より高い。
【０１１６】
一実施形態によれば、残余のタンパク質部分及び無機塩部分とともに色素を除去するため、追加的な漂白作業が不溶部分に対して行われる。
【０１１７】
一実施形態によれば、キトサンを生成するとともに残余のタンパク質部分を除去するため、追加的な脱アセチル化作業が不溶部分に対して行われる。
抽出したキチンの特徴
【０１１８】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出されたキチンは、そのまま利用され、あるいはキトサン、キチンオリゴマー、キトサンオリゴマー又は必要に応じてＮ−アセチル化グルコサミンに変換されうる。
【０１１９】
本発明に係る方法は、純度および重合度に関して幅広いキチンの質を獲得するのに好適である。他の特徴（パターン分布、α形状、β形状及びγ形状）は原料の性質に依存するものであって、本発明に係る方法の特徴に依存するものではない。
【０１２０】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチンの形状は、キチン本来の形状に類似している。換言すれば、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチンは、本来のキチンとの関連において変性していないか、又は変性はわずかのみである。
【０１２１】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチンの推定純度は８５％より高く、好ましくは９０％より高く、より好ましくは９５％より高い。
【０１２２】
本発明に係る方法を用いて得られるキチンの純度は、このキチンをキトサン、キチンオリゴマー、キトサンオリゴマー及びグルコサミン類に変換するのに十分である。
【０１２３】
一実施形態によれば、キチンの重合度は、当該キチンの平均分子量に基づく計算によって推定される。一実施形態によれば、キチンの平均分子量は固有粘度に基づく計算によって推定される。この固有粘度は、Ｐｏｉｒｉｅｒらが記した方法を用いて決定されうる（Ｍ．Ｐｏｉｒｉｅｒ及びＧ．Ｃｈａｒｌｅｔ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００２，５０，３６３−３７０）。
【０１２４】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチンの重合度は１．１０３〜１．１０９であり、好ましくは１．１０４〜１．１０７、より好ましくは１．１０５〜１．１０６である。
【０１２５】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチンのアセチル化度は８０％〜１００％であり、好ましくは９０％〜９８％、より好ましくは９５％〜９７％である。
【０１２６】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチンの結晶化度は１０％〜７０％であり、好ましくは２０％〜５０％、より好ましくは３０％〜４０％である。
可溶性化合物
【０１２７】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出される可溶性物質は、ペプチド類、色素、糖質及び無機塩でありうる。この方法で食用酸を使用することによって、これら化合物を食品分野、食養生分野及び栄養補助食品分野で使用することができる。
【０１２８】
このように本発明は、本発明に係る方法を用いて抽出されるキチン以外のすべての物質もまた使用又は回収することができるため、廃棄物量を制限するという利点を提供する。
【０１２９】
一実施形態によれば、本発明に係る方法を用いて抽出される色素はアスタキサンチンである。
【実施例】
【０１３０】
本発明は、非限定的な方法で本発明を例証する以下の実施例を読むことで、より明確に理解されるだろう。
【０１３１】
実施例１：リン酸の存在下でペプシンを用いる酵素加水分解
材料
用いられる原料は、未処理のバナメイエビ（Ｐａｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ）の外骨格である。原料を１２℃で空気を循環させた状態で乾燥し、粉砕して１ｍｍ未満の大きさの粉末状にする。調製された原料は、真空状態で−２０℃で保存される。
【０１３２】
酸性ｐＨを維持するために用いられる試薬はリン酸である。酸濃度は、調製された原料の初期の無機塩含有量に基づいて計算される。乾燥した原料の重量に対して初期の無機塩含有量の重量が２５％ならば、反応媒質のｐＨを約２に維持するため、０．９４ｍｏｌ．Ｌ−１のリン酸溶液が用いられる。
【０１３３】
用いる酸性プロテアーゼはペプシンである（ＣＡＳ番号９００１−７５−６、供給業者：シグマ、活性：８１１２Ｕ／ｍｇ）。ペプシンは粉状で＋４℃で保存される。ペプシンは反応媒質に導入される前に１５分蒸留水で可溶化される。この実施例で添加される酵素の量は、初期原料のタンパク質の推定質量の２５％に相当する。このようにして、含水率が約１５％で、タンパク質含有量が４０％近くの原料５ｇの試料の場合、原料に対する酵素の量は８．５％に相当し、すなわちペプシンの量は０．４３ｇである。
手順
【０１３４】
５ｇの原料を上述のように調製して秤量する。乾燥抽出物の組成は、以下に記載する分析法に従って決定される。
【０１３５】
０．９４ｍｏｌ．Ｌ−１のリン酸溶液（２５ｍＬ）を３０℃に予熱し、原料に加える。この混合物を５分撹拌し、均質化する。ｐＨメータで測定されるｐＨは安定的でなければならず、１．９〜２．１にする必要がある。
【０１３６】
１ｍＬの水で予め可溶化されたペプシン（０．４３ｇ）を反応媒質に加える。この混合物を熱板で４０℃に熱し、４０℃±１℃に保たれた乾燥器でインキュベートする。
【０１３７】
６時間インキュベートした後、この混合物をふるい絹で濾過し、多量の蒸留水で洗浄する。残余分を蒸留水で再懸濁し、この混合物を１０分撹拌した後、濾過し、水で再洗浄する。得られた固形分をカップに移し、乾燥器の中で９０℃で一晩乾燥する。得られた乾燥抽出物の質量（ｍ＝１．２９ｇ）は、抽出収率を計算するのに好適であり、これはすなわち３０．２６％ｗ／ｗである。
分析
【０１３８】
試料の含水量は、重量測定、すなわち１０５℃で一晩静置する前と後に試料の質量を測定することで測られる。
【０１３９】
無機塩含有量は、重量測定により、すなわち６００℃で６時間焼却する前と後に試料の質量を測定することにより決定される。
【０１４０】
タンパク質含有量は、ガスクロマトグラフィーでアミノ酸の総量を定量することによって推定される。これは比色分析法（Ｌｏｗｒｙ法、ＢＳＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法又はクーマシーブルー法）又はケルダール法によっても測定されうる。
【０１４１】
キチン含有量は、重量測定により、すなわち、
原料に対しては、１Ｎ  ＨＣｌで６０分室温で処理した後、１．２５Ｎ  ＮａＯＨで１２０分９０℃で処理し、最後に３３％の過酸化水素とアセトンで漂白する処理、および
加水分解物に対しては、１．２５Ｎ  ＮａＯＨで１時間９０℃の処理に限定した処理。
の前と後に試料の質量を測ることにより測定されうる。
【０１４２】
キチンの分子量は固有粘度に基づく計算によって推定される。固有粘度は、Ｐｏｉｒｉｅｒらが記したマルク−ホウインクの式に基づく方法を用いて決定されうる（Ｍ．Ｐｏｉｒｉｅｒ及びＧ．Ｃｈａｒｌｅｔ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００２、５０，３６３−３７０）。この方法では、５％のＬｉＣｌを含んだＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの中で、各種濃度のキチン溶液を用いて還元粘度を測定して、固有粘度を求めた。使用する器具は、ウベローデ型毛細管粘度計である。粘度計の定数Ｋは０．３ｃＳｔ／ｓである。測定容量は１５ｍＬである。
【０１４３】
重合度はキチンの分子量を用いて計算される。
【０１４４】
アセチル化度は、２００８年にＡ．Ｅｉｎｂｕ、Ｋ．Ｖａｒｕｍが記載した方法に従ってタンパク質の液体ＮＭＲによって推定される。キチン（２０ｍｇ）は、１ｍＬのＤＣｌ（Ｄ２Ｏ中７．６Ｎ、Ｅｕｒｉｓｏ−ｔｏｐ社）の中で、室温で５時間磁力により撹拌して可溶化する。１Ｈ
ＮＭＲの解析は、Ｂｒｕｋｅｒ社製ＡＬＳ３００分光計（３００ＭＨｚ、リファレンスＴＭＳＰ０．００ｐｐｍ）を用いて３００○Ｋで行われる。この後、特有のプロトンのＮＭＲシグナルの強度を基に、Ｅｉｎｂｕらの式に従って、アセチル化度が計算される。
【０１４５】
結晶化度はＸ線回折によって決定される。用いられる回折計はブルカー・エイエックスエスＤ８Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（カールスルーエ、ドイツ）である。銅管球（ＣｕＫα１＝１．５４０５Å）で放射線を発生し、発生したビームを１０分ごとに記録する。得られたスペクトルを用いて結晶化度を計算する方法は、全範囲に対する結晶領域の範囲の比率に基づく（Ａ．Ｏｓａｒｉｏ−Ｍａｄｒａｚｏ，Ｌ．Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｔｒｏｍｂｏｔｔｏ，Ｊ．Ｍ．Ｌｕｃａｓ，Ｃ．Ｐｅｎｉｃｈｅ−Ｃｏｖａｓ及びＡ．Ｄｏｍａｒｄ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０１１，８３，１７３０−１７３９）。
結果と考察
【０１４６】
リン酸の存在下でペプシンを用いて酵素加水分解を６時間行った後の抽出収率は３０．２６±０．３２％ｗ／ｗである。得られた乾燥抽出物の組成が、この実施例で用いられた完全乾燥させた原料の組成又は調製した原料の組成と比較されうる（表１）。
【表１】
2014522240.tif 000003
【０１４７】
乾燥した原料の組成を見ると、この方法を用いて除去した無機塩及びタンパク質の量は、それぞれ９８．５％、９１．７％である。
【０１４８】
無機塩及びタンパク質の残余量（表１）は、未処理の最終生成物に見られる、漂白工程を行っていないものである。漂白剤を用いること又は水酸化ナトリウムで洗浄することで純度が増大する。
【０１４９】
ＮＭＲによって測定されるアセチル化度は、この実施例では９５％の範囲である。この試料の分子量はほぼ１０５〜１０６ｇ／ｍｏｌであり、結晶化度は３５％である。この特性は天然のキチンの特性と類似している。
【０１５０】
この実施例の実績は、使用するペプシンの量を増やすことで向上させることができる。この方法では、原料に存在するタンパク質の量に対するペプシンの濃度を、従来の２５％ではなく４１％にして実験が行われた。脱灰（無機塩除去率９９．２３％）とともに除タンパクが高められる（タンパク質除去率９２．００％）ため、キチンの純度が上昇する（８８．４２％ではなく９６．７８％）。
【図１】
2014522240.tif 000004
【国際調査報告】
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