(57)【要約】  本発明は、液体培地を受けることができるチャンバ（１００）と、潅流フィルタ（２１０、２１２、２１４）を備えるフィルタアセンブリ（２００）とを含むバイオリアクタ、ならびに、バイオリアクタの動作方法に関する。フィルタアセンブリ（２００）はチャンバ（１００）内に配置され、フィルタアセンブリ（２００）はチャンバ（１００）内で自由に移動する。フィルタアセンブリ（２００）は、前記フィルタ（２１０、２１２、２１４）を通る回収流を結合する手段、及び回収流と比較して反対方向に前記フィルタを通るフィード流を結合する手段を備える。この機構により、潅流フィルタの目詰まり防止を向上させることができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地を受けることができるチャンバ（１００）と、潅流フィルタ（２１０、２１２、２１４）を備えるフィルタアセンブリ（２００）とを含み、前記フィルタアセンブリ（２００）が前記チャンバ（１００）内に配置され、前記フィルタアセンブリ（２００）が前記チャンバ（１００）内で自由に移動するバイオリアクタであって、前記フィルタアセンブリ（２００）が前記フィルタ（２１０、２１２、２１４）を通る回収流を結合する手段、及び前記回収流と比較して反対方向に前記フィルタを通るフィード流を結合する手段を備え、前記フィード流がフィードポンプ（３３０）によって前記バイオリアクタにポンピングされ、前記回収流が回収ポンプ（３４０）によって前記バイオリアクタからポンピングされることを特徴とするバイオリアクタ。
【請求項２】
前記流れを結合する前記手段が前記フィルタアセンブリに取り付けられた可撓性管を備える請求項１記載のバイオリアクタアセンブリ。
【請求項３】
前記フィルタアセンブリ（２００）がそれぞれ前記フィード流と前記回収流を結合する手段を備える請求項１又は２記載のバイオリアクタアセンブリ。
【請求項４】
前記フィルタアセンブリ（２００）が前記フィード流と前記回収流を同軸に結合する手段を備える請求項１乃至請求項３のいずれか記載のバイオリアクタアセンブリ。
【請求項５】
前記フィード流が前記回収流の周囲に同軸に配置される請求項４記載のバイオリアクタアセンブリ。
【請求項６】
前記フィルタアセンブリが２つ以上のフィルタ（２１１、２１２、２１３、２１４）を備える請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のバイオリアクタアセンブリ。
【請求項７】
前記フィード流が前記２つ以上のフィルタ（２１１、２１２、２１３、２１４）の間に流れるように方向付けられる請求項６記載のバイオリアクタアセンブリ。
【請求項８】
液体培地を受けることができるチャンバ（１００）と、潅流フィルタ（２１０、２１２、２１４）を備えるフィルタアセンブリ（２００）とを含み、前記フィルタアセンブリ（２００）が前記チャンバ（１００）内に配置され、前記フィルタアセンブリ（２００）が前記チャンバ（１００）内で自由に移動するバイオリアクタを動作させる方法であって、
回収流を前記潅流フィルタ（２１０、２１２、２１４）を通して前記バイオリアクタから回収ポンプ（３４０）によって除去すること、及び
フィード流を前記潅流フィルタ（２１０、２１２、２１４）を通して前記バイオリアクタにフィードポンプ（３３０）によって供給することを含み、
前記回収流が前記フィード流と比較して反対方向に前記潅流フィルタ（２１０、２１２、２１４）を通って除去される方法。
【請求項９】
前記方法が特定の体積の前記回収流が先ず前記バイオリアクタ（１００）から除去され、次いで実質的に同じ体積の前記フィード流が前記バイオリアクタ（１００）に供給される形式で実施される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記回収流の前記除去と前記フィード流の前記供給が周期的な間隔で行われる請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、潅流フィルタを備えるバイオリアクタ、及び潅流フィルタを備えるバイオリアクタの動作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は、遺伝子工学、及び生物工学の革命により、近年、大きな関心を引き起こしている。細胞を培養して、例えば、治療、研究、及び診断のためのタンパク質、受容体、ワクチン、及び抗体が生成される。
【０００３】
潅流培養は、細胞培養にとって経済的に比較的良好であることが長く認識されている。この動作では、細胞がバイオリアクタ内に保持され、生成物が毒性代謝副産物と共に連続的に除去される。栄養素を含むフィードがバイオリアクタに連続的に加えられる。潅流培養動作では、高濃度の細胞を得ることができ、さらに重要なことには、細胞を生産性の高い状態で数週間にわたり維持することができる。それによって、より高い生産性を得、必要とされるバイオリアクタのサイズを縮小することができる。初代細胞、又は他の成長が遅い細胞を培養するための有用な技法でもある。
【０００４】
潅流動作は、ここ数年で大いに開発された。米国特許第６，５４４，７８８号明細書には、バイオリアクタから細胞を失うことなく液体を除去することができる潅流フィルタを備える従来技術のバイオリアクタが開示されている。潅流フィルタは、培地に対して不偏浮揚であるように構成される。潅流フィルタは、バイオリアクタの振動運動に対して自由に動くことができるように、バイオリアクタ内部に配置される。フィルタの底面は、液体透過性であるが、細胞を保持する膜からなる。可撓性管が、本質的に細胞を含まないろ液をフィルタの内側から取り出すことができるようにする。バイオリアクタが振動すると、フィルタが培地中で前後に素早く動く。この前後運動は、フィルタを洗浄し、フィルタが激しく目詰まりせずに動作することができるようにする働きをする。栄養素フィードがバイオリアクタ内にポンピングされ、回収ろ液が連続的に、又は周期的な間隔で除去される。
【０００５】
上記の潅流フィルタは、フィルタの目詰まりをうまく防止するものであるが、潅流フィルタの目詰まり防止を向上させ、潅流フィルタの動作耐久性を高めることが依然としてさらに望まれている。
【０００６】
文書、米国特許第５０３２５２４号明細書、国際公開第２００７０７６８６５号パンフレット、及び仏国特許第２６７９２４８号明細書は、バイオリアクタのフィルタの目詰まりの問題に対処するものである。各文書では、液体培地の再循環を含むシステムが提案されている。しかし、こうしたシステムは、フィルタアセンブリがチャンバ内で自由に動くバイオリアクタ内で実施するのが難しい。
【０００７】
本発明の目的は、上記のタイプのバイオリアクタを改良して、バイオリアクタ内の潅流フィルタの目詰まり防止を向上させることである。他の目的は、潅流フィルタの動作耐久性を高めることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第２００３００３６１９２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的は、係属中の特許請求の範囲に記載された本発明によるバイオリアクタによって達成される。
【００１０】
本発明により、液体培地を受けることができるチャンバと、潅流フィルタを備えるフィルタアセンブリとを含むバイオリアクタを提供する。フィルタアセンブリはチャンバ内に配置され、フィルタアセンブリはチャンバ内で自由に移動する。フィルタアセンブリは、前記フィルタを通る回収流を結合する手段、及び回収流と比較して反対方向に前記フィルタを通るフィード流を結合する手段を備える。
【００１１】
上記の目的は、液体培地を受けることができるチャンバと、潅流フィルタを備えるフィルタアセンブリとを含み、フィルタアセンブリがチャンバ内に配置され、フィルタアセンブリがチャンバ内で自由に移動するバイオリアクタを動作させる方法によっても達成され、前記方法は、回収流を前記潅流フィルタを通してバイオリアクタから除去し、フィード流を前記潅流フィルタを通してバイオリアクタに供給することを含む。回収流は、フィード流と比較して反対方向に前記潅流フィルタを通って除去される。
【００１２】
それによって、フィルタの目詰まりが低減されるため、動作期間を延長して潅流細胞培養を行うことができる。本発明は、広範なフィルタの目詰まりなく潅流動作が可能な低価格の細胞培養バイオリアクタを提供する。
【００１３】
流れを結合する手段は、フィルタアセンブリに取り付けられた可撓性管を備えることができる。可撓性管により、バイオリアクタ内の潅流フィルタが望ましい方法で移動することができ、可撓性管は有効に流れを供給し、又は回収することができる。
【００１４】
フィルタアセンブリは、それぞれフィード流及び回収流の別個の結合手段を備えることができる。システムを簡素化し、フィード流と回収流が互いに接触しないように保持するため、フィード流はフィードポンプによってバイオリアクタにポンピングされ、回収流は回収ポンプによってバイオリアクタからポンピングされる。こうすると、２つの流れの混合が阻止される。従って、確実に、回収流が望ましい無細胞生成物を含み、回収流中の栄養素の量が最小限に抑えられる。これは、栄養素がしばしば高価であり、栄養素損失の量を最小限に抑えなければならないために重要である。
【００１５】
フィルタアセンブリは、フィード流と回収流を同軸に結合する手段を備えることができる。フィード流を回収流の周囲に同軸に配置することができる。この機構により、可能性のある乱流が防止される。また、この機構により、単一の同軸管連結のみが必要とされ、２つの別個の管を有する機構よりもバイオリアクタバッグ内のフィルタの動きが邪魔されず、すなわちフィルタがバッグ内で自由に移動することができる。
【００１６】
フィルタアセンブリは、２つ以上のフィルタを備えることができ、それによって回収液体のろ過を向上させることができる。次いで、フィード流を２つ以上のフィルタの間を流れるように方向付けることができる。この機構により、フィルタアセンブリ内で捕獲することができるフィード液体の量を最小限に抑えることができる。さらに、乱流を防止することができる。
【００１７】
バイオリアクタを動作させる方法を、特定の体積の回収流を先ずバイオリアクタから除去し、次いで実質的に同じ体積のフィード流をバイオリアクタに供給する形式で実施することができる。こうすると、回収流中の栄養素量を最小限に抑えることができる。回収流の除去、及びフィード流の供給を周期的な間隔で行うことができる。
【００１８】
以下の詳細な説明、及び本発明を実施する方法の例を示す図から、本発明のさらなる態様及び利点が明らかになるであろう。
【００１９】
本発明を示すために、バイオリアクタの従来技術の構成、及び本発明の好ましい実施形態を図面に示したが、理解されるように、本発明は図面に示した正確な形態に限定されないものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】従来技術の潅流バイオリアクタを示す断面図である。
【図１ａ】従来技術のフィルタアセンブリを示す断面図である。
【図２】流れ制御回路を有する本発明によるバイオリアクタの一実施形態を示す概略図である。
【図３】回収流及びフィード流のための同軸結合部を有する潅流フィルタアセンブリの一実施形態を示す概略図である。
【図４】フィード流のための縁部結合部を有する潅流フィルタアセンブリの一実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
波誘発撹拌に基づく潅流バイオリアクタは、限定的ではないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されるＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）システムを含む。こうしたバイオリアクタは、プラスチックバッグなどのチャンバを備え、チャンバは、培地が部分的に充填され、剛直になるまで膨張される。本明細書でバイオリアクタバッグとも呼ばれるチャンバは、振動プラットホーム上に配置され、振動プラットホームは、事前設定角度、及び事前設定振動速度でチャンバを前後に移動させる。振動運動は、培地中に波を誘発し、いずれも良好なバイオリアクタ性能に不可欠な撹拌及び酸素移動を促進する。
【００２２】
潅流フィルタは、培地に対して不偏浮揚に構成され、例えば、米国特許第６，５４４，７８８号に示されているように設計することができる。
【００２３】
図１に従来技術のバイオリアクタが示されている。バイオリアクタは、培地及び細胞１１で部分的に（１０％から８０％）充填されたプラスチックバッグ１０を備える。チャンバの残りは、膨張され、ガスが充填されたヘッドスペース１２からなる。細胞代謝に必要とされる酸素が、滅菌入口フィルタ１３を通して導入される空気（又は他の酸素富化ガス）によって供給される。排気は、チャンバから排出フィルタ１４を通して通気される。バッグ１０は、回転軸１６を中心に前後に移動する振動プラットホーム１５に取り付けられる。通常の振動速度は、水平面から角度２から２０度で１分当たり１０から３０の振動である。潅流フィルタ２０は液体表面１７上に浮揚する。図１ａから分かるように、潅流フィルタ２０の下面は、浸水される液体透過性膜２１からなる。この膜２１は、細胞が通過することができない気孔率を有する。フィルタ膜２１は、平均孔径７ミクロン（Ｐｏｒｅｘ  Ｔ３）を有する焼結多孔性ポリエチレンシートでもよい。ナイロン及びポリエチレンなど、他の適したプラスチックを使用することもできる。ろ過膜２１は、非多孔性上層２６に熱溶接される。ろ液管２２を容易に取り付けることができるように、ホースバルブポート２７が上層２６に取り付けられる。この従来技術の解決法では、可撓性のろ液管２２に吸引を行い、無細胞のろ液２３がフィルタ２０内に取り出され、バイオリアクタから除去される。可撓性管２２はフィルタ２０の唯一の取り付け点である。ポリエチレンメッシュ２４をフィルタ２０内部に配置して、ろ過膜２１が上層２６に対して平坦になって吸引され、流れを妨げるのを防止することができる。フィルタアセンブリ２０全体を熱溶接した継目２５でシールすることができる。栄養素が別の入口ポート３０を介してバイオリアクタに供給される。
【００２４】
本発明では、図２で示したように、潅流フィルタ２１０がフィルタアセンブリ２００に含まれ、フィルタアセンブリ２００は、本明細書でろ液管とも呼ばれる回収流管２２０及びフィード流管３００を、フィルタアセンブリ２００に結合する手段をさらに備えて、回収流と栄養素を含むフィード流とが潅流フィルタ２１０を通って反対方向に流れることができるようにする。振動プラットホーム１５０、バイオリアクタバッグ１００、可撓性管２２０、３００の材料、及び潅流フィルタ２１０のタイプは、上記の従来技術のバイオリアクタに関連して論じならびに図１及び１ａで示した、対応する特徴と同様でもよく、又はそれらを有してもよい。
【００２５】
流管２２０、３００をフィルタアセンブリに取り付ける手段は、例えば、可撓性管２２０、３００を連結するホースバルブポートを含むことができる。当業者には明らかなように、液密且つ／又はガス密連結部を提供する任意の他の適した取り付け手段を使用することもできる。
【００２６】
可撓性管２２０、３００は、バイオリアクタバッグ１００の壁を通して結合される。可撓性管２２０、３００は、フィルタアセンブリ２００が液体表面１７０上で自由に移動できるように十分可撓性である。必要に応じて、バイオリアクタの壁に関する可撓性管２２０、３００の長さ及び位置を、潅流フィルタアセンブリ２００の運動を幾分制限して、例えば、フィルタアセンブリ２００がバイオリアクタ１００の壁に衝突するのを防ぐように配備することができる。そうすると、潅流フィルタの動作耐久性をさらに高めることができる。
【００２７】
潅流フィルタ２００及びバイオリアクタバッグ１００をγ線放射によってその場で滅菌することができる。使用の際は、バッグ１００に成長促進無菌栄養培地が充填される。細胞が加えられ、バッグ１００が振動プラットホーム１５０上に配置される。バイオリアクタが振動され、通気されて、細胞の成長が促進される。
【００２８】
本発明によるバイオリアクタを、さらに図２で示したように、動作させることができる。バイオリアクタは回収される、すなわち、回収ポンプ３４０のスイッチを入れることによって、回収流（無細胞のろ液）がフィルタ２１０内に取り出され、バイオリアクタから除去される。このポンプは、ろ液を潅流フィルタ２１０を通して所望の量だけ吸入し、収集槽３５０内にポンピングする。収集槽は、収集槽３５０の重量を測定するための重量センサなど手段３１０を備えるフックによってつり下げられる。制御装置５００は、収集槽３５０の重量の増加の測定によって、事前設定の、且つ／又は所望の重量の回収物が収集槽３５０に送られるまでポンプ３４０のスイッチを入れた状態にする。次に、フィードポンプ３３０のスイッチを入れる。栄養素が収集槽３５０と同じフックにつり下げられたフィード容器３２０から供給される。供給速度はフィードポンプ３３０によって制御される。このフィードポンプ３３０は、制御装置５００によって断続的に動作され、フィルタアセンブリ２００に結合された可撓性管３００を介してフィードをバイオリアクタバッグ１００にポンピングする。制御装置５００は、フィード容器３２０の重量の減少の測定によって、事前設定の重量のフィードがバイオリアクタバッグ１００に送られるまでフィードポンプ３３０に電源を入れて作動させる。フィード量がバイオリアクタバッグ１００から収集された回収物量と等しくなる。次いで、このサイクルが繰り返される。サイクリングの頻度を調整して、所望の全体の潅流速度を得ることができる。加えたフィードと除去した回収物の蓄積量を重量センサ３１０のサイクリングから容易に計算することができる。
【００２９】
本発明の他の変形形態では、先ず、栄養素のフィード流をバイオリアクタバッグ１００に加え、次いで回収物を収集することによって、バイオリアクタバッグ１００を動作させることができる。制御システム５００は、上記のものに類似して機能する。先ず、フィードが加えられる場合、フィード容器３２０の重量の減少が測定され、次いで回収物の量がリアクタ１００に加えられたフィードと等しくなるように適合される。この機構によって、培養中に栄養素のレベルを比較的高く保持することができる。
【００３０】
本発明の一変形形態では、それぞれフィード容器３２０及び収集槽３５０は、それぞれ重量センサなど重量を測定する手段を含む。こうした機構では、制御システム５００は、それぞれ各センサから情報を受けるように適合され、その後、回収物量とフィード量が等しくなるように適合させる。この機構により、システムの正確さをさらに向上させることができる。
【００３１】
本発明の他の実施形態では、重量センサ、又は計量機構など重量測定手段は、バイオリアクタの振動プラットホーム１５０内に組み込まれる。制御システム５００は、上記のものに類似して機能する、すなわち、制御システムは回収物量がリアクタ１００に加えられたフィードと等しくなるように適合させる。こうした機構により、システムをよりコンパクトに構成することができる。
【００３２】
潅流動作では、細胞がバイオリアクタから流出しないことが重要である。さもなければ、細胞が洗い流されることによって、バイオリアクタ内の細胞濃度が低下する。実際には、少量の細胞損失（＜１０％）は、死細胞、又は瀕死細胞を除去し、低レベルの細胞の再成長を向上させるために許容される。ポンプ又はフィルタの故障を警告するように警報をプログラミングして、価値のある細胞の損失を防ぐことができる。
【００３３】
図３に、フィルタアセンブリ２００’がフィード流３００’及び回収流２２０’のための同軸に配置された可撓性管を備える一実施形態が示されている。可撓性管は単一の同軸結合手段２７０’を介してフィルタアセンブリ２００’に結合される。この結合手段は、回収流とフィード流の両方に入口を設ける任意の適した構成でよく、前記フィルタアセンブリ２００’に取り付けることができるものであるが、図面にさらに詳細に示していない。図３で示したように、フィード流３００’は、回収流２２０’の周囲に配置され、フィルタアセンブリ２００’の周囲から第２の潅流フィルタ２１２に移動するように方向付けられる。回収流２２０’は、ろ液の除去に関連して、フィルタ２１１と２１２の両方を通って移動する。それによって、回収流２２０’は、フィード流３００’と比較して反対方向に潅流フィルタ２１２を通ってバイオリアクタバッグから除去され、回収流のろ過の向上が得られる。この機構により、フィルタアセンブリ内で捕獲することができるフィード流の量を最小限に抑えることができる。また、乱流を回避することもできる。同軸に配置されたフィード流及び回収流を、単一の潅流フィルタを通してバイオリアクタバッグに、すなわち、図２に関連して示したのと同様の方法で向けることもできる。
【００３４】
（図で示していない）他の変形形態では、回収流管とフィード流管を隣り合わせに、又はフィルタアセンブリ上で平行に互いに接近するように取り付けることができる。次いで、フィード流を、図３に関連して示したのと同様の方法で、フィルタアセンブリの周囲を流れ、第２の潅流フィルタを通ってバイオリアクタバッグに供給されるように配置することができる。フィード流を、図２で示したのと同様の方法で、単一潅流フィルタを通って流れるように配置することもできる。フィード流と回収流を隣り合わせに、且つ／又は平行に結合する手段を配置することによって、バイオリアクタ内のフィルタアセンブリの自由な動きを確保することができる。
【００３５】
図４に本発明の他の実施形態が示されている。フィルタアセンブリ２００”は、２つの潅流フィルタ２１３及び２１４を備える。フィルタアセンブリ２００”は、フィード流用の可撓性管３００”及び回収流用の管２２０”を備える。フィード流管３００”はフィルタアセンブリ２００の縁部に取り付けられ、フィード流は２つの潅流フィルタ２１３と２１４の間に向けられる。この機構によっても、フィルタアセンブリ内部で捕獲することができるフィード流の量を最小限に抑えることができる。また、乱流を回避することもできる。
【００３６】
上記のように、本発明によれば、潅流フィルタの表面上に発生させる逆流により、長期間にわたり、潅流フィルタを目詰まりしないように保持することができる。目詰まりが、容易に、経済的に、且つ有効に防止される。
【００３７】
本発明を特定の実施形態及び用途に関して記載してきたが、当業者は、この教示を踏まえて、特許請求する本発明の範囲を超えることなく、又はその精神から逸脱することなく、追加の実施形態を作製することができる。例えば、潅流バイオリアクタシステムの様々な要素の特定の組成物は、限定要因であると考えられるべきではない。従って、理解されるように、本開示の図面及び記載は、本発明の理解を容易にするために提案されるものであり、本開示の範囲を限定するもと解釈すべきではない。
【符号の説明】
【００３８】
１０、１００  バッグ
１１  培地及び細胞
１２  ヘッドスペース
１３  入口フィルタ
１４  排出フィルタ
１５、１５０  振動プラットホーム
１６  回転軸
１７、１７０  液体表面
２０、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４  潅流フィルタ
２１  膜
２２  ろ液管
２３  ろ液
２４  メッシュ
２５  継目
２６  上層
２７  ホースバルブポート
３０  入口ポート
２００、２００’、２００”  フィルタアセンブリ
２２０、２２０”  回収流管
２２０’  回収流
２７０、２７０’  結合手段
３００、３００”  フィード流管
３００’  フィード流
３１０  重量センサ
３２０  フィード容器
３３０  フィードポンプ
３４０  回収ポンプ
３５０  収集槽
５００  制御装置
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2014509194.tif 000008
2014509194.tif 000009
2014509194.tif 000010
2014509194.tif 000011