(57)【要約】本発明は、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）の改善された製剤、例えばrhBSSLの凍結乾燥製剤を形成するのに適したもの、rhBSSLの凍結乾燥製剤それ自体、rhBSSLの単位用量形態、およびrhBSSLの再構成製剤に関する。本発明の製剤は、rhBSSL、結晶性増量剤、および、該結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤を含む。本発明の製剤は、安定性、溶液中での凝集の低下、および/または不溶性凝集体の形成の低下に関するものを含む、1つまたは複数の所望の特性を有する。本発明の凍結乾燥製剤は、とくにヒト乳児へのrhBSSLの投与に関する薬学的有用性を有する。2014527982.tif 000011
2014527982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）；
（ii）結晶性増量剤；および
（iii）該結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤
を含む、凍結乾燥に適した製剤。
【請求項２】
無定形安定剤が、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-アラニン、およびグリシンからなる群より選択される、請求項1記載の製剤。
【請求項３】
無定形安定剤がグリシンである、請求項2記載の製剤。
【請求項４】
無定形安定剤が10mM〜100mMの濃度で存在している、請求項1〜3のいずれか一項記載の製剤。
【請求項５】
無定形安定剤が35mM〜50mMの濃度で存在している、請求項4記載の製剤。
【請求項６】
結晶性増量剤がマンニトールである、請求項1〜5のいずれか一項記載の製剤。
【請求項７】
結晶性増量剤が100mM〜400mMの濃度で存在している、請求項1〜6のいずれか一項記載の製剤。
【請求項８】
結晶性増量剤が180mM〜210mMの濃度で存在している、請求項7記載の製剤。
【請求項９】
rhBSSLが1mg/mL〜35mg/mLの濃度で存在している、請求項1〜8のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１０】
rhBSSLが10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在している、請求項9記載の製剤。
【請求項１１】
（i）10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在しているrhBSSL；
（ii）180mM〜210mMの濃度で存在しているマンニトール；および
（iii）35mM〜50mMの濃度で存在しているグリシン
を含む、請求項10記載の製剤。
【請求項１２】
6.3〜7.5のpH値を有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１３】
2mM〜20mMのリン酸塩濃度で存在しているリン酸ナトリウムをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１４】
5mM〜50mMの塩化物濃度で存在している塩化ナトリウムをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載の製剤の凍結乾燥によって得ることができる凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
（i）10mg〜20mgの絶対量で存在しているrhBSSL；
（ii）27mg〜62mgの絶対量で存在しているマンニトール；
（iii）2mg〜6mgの絶対量で存在しているグリシン
を含むrhBSSLの再構成製剤であって、該製剤が液体乳児食中で再構成されており、かつ該再構成製剤が6.4〜7.4のpHを有する、rhBSSLの再構成製剤。
【請求項１７】
グリシンではない結晶性増量剤をさらに含む凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSLを安定化するためのグリシンの使用であって、該グリシンが、該凍結乾燥製剤中で実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/または該グリシンが、該凍結乾燥製剤中に該rhBSSL 1mgあたり0.2mg〜0.3mgの相対量で含まれている、グリシンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）の改善された製剤、例えばrhBSSLの凍結乾燥製剤を形成するのに適したもの、rhBSSLの凍結乾燥製剤それ自体、rhBSSLの単位用量形態、およびrhBSSLの再構成製剤に関する。本発明の製剤は、安定性、溶液中での凝集の低下、および/または不溶性凝集体の形成の低下に関するものを含む、1つまたは複数の所望の特性を有する。本発明の凍結乾燥製剤は、とくにヒト乳児へのrhBSSLの投与に関する薬学的有用性を有する。
【背景技術】
【０００２】
成人において、コリパーゼ依存性膵臓リパーゼ（PTL）は、食事性トリグリセリド（TG）の消化に関与する主要な酵素である。新生児、とくに早産児においては、膵外分泌機能は十分に発達していない（Manson & Weaver, 1997; Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 76:206-211）。ゆえに、乳児において、膵臓リパーゼの発現は成人膵臓と比較して低く（Lombardo, 2001; Biochim Biophys Acta, 1533:1-28；Li et al 1007; Pediatr Res, 62:537-541）、確立された脂肪消化の間の腔内PTL活性は成人と比較して非常に低く（Fredrikzon et al, 1978; Paediatr Res, 12:138-140）、脂肪吸収不良は珍しいことではない（Carnielli et al, 1998; Am J Clin Nutr 67:97-103；Chappell et al, 1986; J Pediatr, 108:439-443）。LindquistおよびHernell（1990; Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 13:314-320）は、若齢期における脂質消化および吸収という主題について再検討している。
【０００３】
ヒト乳およびほとんどの乳児用調合乳において総エネルギーの半分を構成する脂肪、すなわちより具体的にはTGは、新生児のための支配的なエネルギー基質としての役割を果たすため、ヒト胎児は、出生時にグルコース主導から脂質主導のエネルギー供給に切り替える。したがって、食事性TGの効率的な消化および吸収は、乳児の成長および発達にとって重大である。母乳で育った乳児において、低いPTL活性は、乳汁分泌乳腺（lactating mammary gland into the milk）および膵臓外分泌腺の両方から分泌される広い特異性を有するリパーゼである胆汁酸塩刺激性リパーゼ（BSSL）（EC 3.1.1.13）によって補われる。早産児において、母乳は、母乳食の間の十二指腸内容物中のBSSLの大部分を提供しているようであり（Fredrikzon et al, 1978）、母乳で育った乳児は、調合乳で育った乳児よりもより効率的に、脂肪、および重要なことに長い長鎖多価不飽和脂肪酸（LCPUFA）を、消化および吸収する（Bernback et al, 1990; J Clin Invest, 85:1221-1226；Carnielli et al, 1998）。
【０００４】
正期産児および早産児に対する栄養源としてのヒト乳の優位性は、多くの調査および専門家グループによる推奨で明示されている。したがって、世界的に推奨される栄養補給法は母乳による栄養補給である。しかしながら、医学的な理由で、母乳による栄養補給および母親自身の母乳を与えることのどちらもが必ずしも可能であるとは限らずまたは推奨されるとは限らず、多くの他の理由で母乳による栄養補給は実践されない可能性がある。乳児が母乳による栄養補給を受けていない場合、乳児用調合乳、またはバンク保存のおよびバンク保存でない低温殺菌母乳および/もしくは冷凍母乳がしばしば用いられる。しかしながら、すべてのものが、いくつかの点で新生児にとって栄養的に最適とはいえない。
【０００５】
ウイルス感染（ヒト免疫不全ウイルス［HIV］、サイトメガロウイルス［CMV］、肝炎）および比較的低い程度の病原性細菌の伝播の危険性が理由で、いわゆる母乳バンクで用いられるドナー乳は、一般的に、それが使用される前に低温殺菌される。しかしながら、ヒト乳の低温殺菌の間にBSSLは不活性化され（Bjorksten et al, 1980; Br Med J, 201:267-272）；そしてまた、それは、早期新生児もしくは満期新生児の栄養摂取のために存在する多くの異なる調合乳のいずれにも存在していない。新鮮な母乳で育った乳児における脂肪吸収、体重増加、および線形成長は、低温殺菌母乳と比較してより高いことが示されている（Andersson et al. 2007；Williams et al, 1978; Arch Dis Child 43:555-563）。これが、自分自身の母親の乳を与えられ得ない新生児、とくに早産児は、他の母親からの非低温殺菌乳を与えられるべきであると提唱されてきた理由の1つである（Bjorksten et al, 1980）。
【０００６】
BlackbergおよびHernell（1981; Eur J Biochem, 116:221-225）、ならびにWangおよびJohnson（1983）によって報告されたように、天然ヒト乳BSSL（hBSSL-MAM）は均一まで精製されており、ヒトBSSLのcDNA配列は、Nilsson（1990; Eur J Biochem, 192:543-550）によって同定され、WO 91/15234およびWO 91/18923に開示された。いくつかの研究室での特徴決定および配列調査によって、タンパク質hBSSL-MAMおよび膵臓カルボン酸エステルヒドロラーゼ（CEH）（膵臓BSSLとしても知られる）は、両方とも同じ遺伝子の産物であると結論付けられた（例えば、Baba et al, 1991; Biochem, 30:500-510；Hui et al, 1990; FEBS Lett, 276:131-134；Reue et al, 1991; J Lipid Res, 32:267-276）。cDNA配列の単離に続いて、US 5716817、WO 94/20610、およびWO 99/54443に記載されるものなど、トランスジェニックヒツジにおけるもの（rhBSSL-OVI）を含めて、rhBSSLならびにその変種が作製されている。
【０００７】
Anderssonら、2007（Acta Paediatr 96:1445-1449）は、母親自身の乳の低温殺菌が、早産児における脂肪吸収および成長を低下させることを示し、かつこれらの作用が、低温殺菌による乳ベースのBSSLの不活性化によるものであることを提言した、無作為調査を報告した。最近では、2つの無作為化対照臨床試験により、低温殺菌母乳へのまたは乳児用調合乳へのrhBSSLの添加、および早産児への投与によって、そのような乳児の成長速度の統計的に有意な改善を示したことが報告されている。例えば、"The Power or Programming Conference 2010: International conference on developmental origins of health and disease", Munich, May 6-8 2010でMaggioらによって提示されたもの、および"The 3rd congress of the European Society of Paediatric Societies", Copenhagen, October 24 2010でCarnielliらによって提示されたもの。後者の提示は、プラセボを含む乳児用調合乳と比較して、乳児用調合乳にrhBSSLを添加した場合、総脂肪吸収係数（CFA）のわずかではあるが統計的に有意な増加、ならびにドコサヘキサエン酸（DHA）およびアラキドン酸（AA）−医学的にかつ発達上重要な2種の長鎖多価不飽和脂肪酸（LCPUFA）−の腸管吸収の改善への傾向も報告した。
【０００８】
上記に記載されるように、母乳由来のBSSLは、成人におけるTG消化に重要である成熟ヒト膵臓によって産生されるCEHと同じリパーゼである。したがって、rhBSSLは、ヒト成人における慢性膵炎または嚢胞性線維症（CF）による膵外分泌機能不全（PI）に対する治療法としても探求されている（例えば、Strandvik et al, 2004; 18th North American Cystic Fibrosis Conference, St Louis MI；Pediatr Pulmonolに刊行された要約、S27:333）。より最近では、CFおよびPIを有する成人患者における脂肪吸収に対する効果を評価するために、5〜6日間1日3回170mgで投薬されるrhBSSLの経口懸濁液（そこでは「ブセリパーゼ（bucelipase）α」と記載されている）を用いたさらなる第II相試験が完了したことが発表されており（clinicaltrials.gov 識別名NCT00743483）、結果はthe 34th European Cystic Fibrosis Society Conference, Hamburg, Germany, 8th to 11th June 2011で提示された。
【０００９】
rhBSSLに関する治療的有用性の証拠が増えるにつれて、特定の特性を有するかつ/または成人へのもしくは乳児への、とくに早産児への投与に有用である、薬学的使用のためのrhBBSLの製剤を提供することが望まれている。例えば、高分子量凝集体の形成の低下の観点からなど、改善したもしくは持続した安定性を示し；現実的もしくは従来的な保存条件を有し；より信頼できかつ一様な再構成特性を有し；より長い保管期間を示し；製造もしくは包装に適した特徴を有し；かつ/または他の望ましい特性を持つ、rhBBSLの製剤を提供することが望ましいと考えられる。
【００１０】
治療用タンパク質は、増量剤、安定剤、および/または塩などの1種または複数種の薬学的賦形剤とともに、ある量の関心対象のタンパク質を含む凍結乾燥製剤として一般に提供される。凍結乾燥（フリーズドライとも称される）とは、低温および圧力を用いて、昇華（すなわち、液相を通過しない固体から蒸気への相の変化）の過程によって液体製剤から溶媒、典型的には水を除去するプロセスを指す。凍結乾燥は、典型的に3つの一般的工程：（1）凍結；（2）一次乾燥；および（2）二次乾燥を含む。
【００１１】
フリーズドライは、タンパク質などの生体分子の生物学的活性にとって破壊的であると一般的に考えられている。ダメージの大きさは、様々な生体分子および様々な条件によって大幅に変わり、多様な研究者が異なる系を調査している。水溶液の凍結は、不安定なタンパク質に対して凍結自体よりもダメージとなり得る、溶液濃度またはpHの初期増加をもたらし得る。増量剤は、固体ケークの形成能および乾燥能を増強することまたはその薬学的洗練性を改善することを追求するために用いられ得る。安定剤は、生体分子の活性を安定化することを追求するために用いられ得るが、系に応じて、限定的かつ変動的な程度の成功を有する。Croweら（1987; Biochem J; 242:1-10）は、糖による乾燥リン脂質二重層およびタンパク質の安定化を記載しており、また"The trehalose myth revisited: Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state" Cryobiology 43, 89-105 (2001)において、細胞のトレハロースによる安定化のメカニズムについての見解も概説している。
【００１２】
様々な研究者が、以下の例を含む、様々な賦形剤および賦形剤の組み合わせを用いて、様々な生体分子を保護することに関して報告している。
【００１３】
WO 03/009817は、IGG抗体の安定な凍結乾燥製剤を形成するための、増量剤としてのマンニトールまたはグリシンの使用を記載している。
【００１４】
WO 2006/075072は、バイオセンサーにおける使用のための、リパーゼのフリーズドライ製剤を含む、様々な酵素のフリーズドライ製剤を記載している。そこでは、グリシンおよびマンニトールは結晶性増量剤として用いられ、一方でタンパク質は概して無定形の状態にある。
【００１５】
EP 1 932 519では、マンニトールを含むものを含めた、骨形態形成タンパク質、とくに組換えヒト増殖分化因子（rhGDF）の凍結乾燥製剤、および約pH4でグリシンを含むrhGDFの分離製剤が記載されている。
【００１６】
WO 2006/023665は、5〜50mg/mLのタンパク質（5-50 mg/mL or protein）および溶解保護剤（lyoprotectant）としての0.25〜3.0％のグリシンを含む前凍結乾燥製剤を含む、IL-1アンタゴニスト製剤を記載している。
【００１７】
Changら（1996; Pharm Res, 13:243-249）は、無定形のタンパク質安定剤、とりわけスクロースと組み合わせて用いられる増量剤としてマンニトールまたはグリシンを試験する工程を含む、組換えヒトインターロイキン（Interlukin）-1受容体アンタゴニスト（rhIL-1ra）の安定なフリーズドライ製剤の開発を記載している。
【００１８】
Hirakuraら（2004; Int J Pharm; 386:53-67）は、リン酸ナトリウム（10mM、pH7.0）およびグリシン（300mM）を含有する、組換えヒトインターロイキン-11（rhIL-11；5mg/mL）の凍結乾燥製剤に対する、凍結プロセスの間の温度変化の影響を検討した。
【００１９】
Leuckelら（1998; Pharm Dev and Tech 3:325-336）は、凍結濃縮物および凍結乾燥物（lyophisate）の特性に対して、無定形安定剤のスクロースまたはトレハロースと組み合わせた結晶化増量剤としてのグリシン、リジン-HCl、またはマンニトールを検討した。あらゆるタンパク質の非存在下で、賦形剤の特定の組み合わせおよびそれらの濃度比によっては、該賦形剤のうちの一方または他方が結晶を形成し得た。
【００２０】
Meyerら（2009; Eur J Pharm Sci, 38:29-38）は、凍結乾燥抗TNFマウスモノクローナルIgGの安定性に対する増量剤の影響を調査した。安定剤としてのスクロースと増量剤のマンニトールまたはグリシンとの組み合わせを、抗体安定性に対するそれらの効果について評価した。
【００２１】
Tianら（2007; Int J Pharmac, 335:20-31）は、アミノ酸製剤中のヒト化モノクローナル抗体の安定性を評価した。抗CD11aおよび抗IgE抗体におけるヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはアスパラギン酸の保護効果を試験した。
【００２２】
WO 99/27983は、使用時に「吹き飛び」がより少ない、ヒト成長ホルモンのフリーズドライ製剤を含有する単回用量シリンジを記載している。各単位用量は、1.4mg未満のタンパク質、ならびにタンパク質1mgあたり約0.2mgのグリシンおよび1.1mgのマンニトールを含めた様々な割合の他の賦形剤を含有し、かつリン酸ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムをさらに含んだ。
【００２３】
WO 2006/081320は、少なくとも20mg/mLのタンパク質、1未満の重量：重量比での結晶性増量剤と無定形溶質とを含む、フリーズドライに適した液体製剤を記載している。そこでは、マンニトールおよびグリシンは、従来的な「結晶性増量剤」であるが、フリーズドライプロセスの後にそれらが無定形の状態のままである限り、それらは安定剤として用いられ得るとも記載されている。一例には、液体製剤中に少なくとも2.0％ w/vの安定剤が含まれた。
【００２４】
US 2006/0275306は、それぞれ250/25mMまたは55/276mMのマンニトール/グリシンとともに21mg/mLの抗体を含むものを含めた、液体製剤から得られた様々な凍結乾燥抗IgGまたは抗HER2抗体製剤を記載している。
【００２５】
Pyneら（2003; J Pharm Sci 92:2172-2283）は、マンニトール−グリシン系における溶質の結晶化、およびフリーズドライ製剤におけるタンパク質安定化に対するその関わりを調査した。凍結材料中でのマンニトールおよび/またはグリシン結晶の形成は、凍結の速度、液体前凍結乾燥製剤中のマンニトールおよびグリシンの相対濃度、ならびにリン酸塩緩衝液の存在/濃度を含む様々な要因によって影響を受けた。
【００２６】
WO 2007/112757は、組換えヒトポルフォビリノーゲン・デアミナーゼ（rhPBGD）を含めたポリペプチドの濃縮のための方法であって、pH7.9（pH範囲7.5〜8.5）で3.67mM Na2HP04、27mMグリシン、250mMマンニトールを含むバルク溶液を含めた様々な液体製剤から、そのようなタンパク質の凍結乾燥製剤を形成するための方法を開示している。
【００２７】
これらの研究者らは、様々な生体分子およびタンパク質に対する様々な方法によって測定される、様々な異なる賦形剤またはそれらの組み合わせを用いることによる様々な程度の成功を報告している。これらの研究者のいずれもrhBSSLの製剤に関して報告していない。
【００２８】
EP 0 317 355は概して、脂肪を含有しかつ胆汁酸塩刺激性リパーゼに乏しい、第一の供給源由来の栄養基剤；および第二の供給源由来の有効量の胆汁酸塩刺激性リパーゼを含む、食事用組成物を開示している。
【００２９】
WO 91/18923は概して、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを含む薬学的組成物を開示しており、 WO 94/20610は概して、ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの変種を含む薬学的組成物を請求しており、およびWO 99/5443は概して、トランスジェニック動物から産生されたヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを含む薬学的組成物を開示している。いずれの場合にも、そのような薬学的組成物は、早産児における食事性脂肪の利用の改善のために、または例えば嚢胞性線維症における膵機能不全に関連した病的状況の治療のために用いられ得ることが記載されている。
【００３０】
同時係属中のWO 2012/052059およびWO 2012/052060（それらの内容は参照によりそれらの全体として本明細書によって組み入れられる）は、ヒト早産児における成長速度を増大させかつ/またはある特定のLCPUFDAの吸収を増大させるための、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの調製およびその薬学的組成物の使用を開示している。そこに開示される単位用量は、注入のために1.3mLの水に溶解した15mg/mLの組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを含む冷凍経口溶液であった。注入のために水に溶解した凍結乾燥バルク組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼから作製された溶液のアリコートから、単位用量を調製した。簡潔には、組換えCHO細胞を用いたタンパク質の作製、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析濾過、濃縮を含む多様な工程を用いた該細胞からの組換えタンパク質の精製、および最終的なフリーズドライによって、凍結乾燥バルク組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを得た。rhBSSL原薬（drug substance）は、rhBSSLのリン酸塩/塩化ナトリウム緩衝バルク溶液から凍結乾燥されるため、凍結乾燥製剤および出来上がった単位用量は、リン酸二水素ナトリウムおよび塩化ナトリウムをさらに含んだ。
【００３１】
ゆえに、タンパク質などの生体分子の溶解保護を与える賦形剤の最適な組み合わせは何であるのかについては相反する証拠が存在し、rhBSSLを含む凍結乾燥製剤に使用するためのものまたはそれを形成するためのものに関する具体的手引きは存在しない。すべてのタンパク質に対して最適である賦形剤の1組の組み合わせは存在せず、むしろ検討中のタンパク質に対して所望の結果を得るためにはかなりの程度の実験が必要とされる。凍結乾燥、保存、および/もしくは使用の間タンパク質を保護するもの、あるいは保管期間、製造および/もしくは再構成特徴を含めた他の望ましい特性、または本明細書において記載される1つもしくは複数の他の特性を提供するものを含めた、rhBSSLに適した1種もしくは複数種、または組み合わせの薬学的に許容される賦形剤の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００３２】
発明の簡単な説明
本明細書においておよび/または添付の特許請求の範囲において定義されるまたは別様に開示される本発明の様々な局面および態様によって、上記の技術的課題のうちの1つまたは複数に対する解決策が提供される。概略的におよび簡単な説明として、本発明の主な局面を以下のように記載することができる。
【００３３】
一局面において、本発明は、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）；結晶性増量剤；および該結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤を含む、凍結乾燥に適した製剤に関する。
【００３４】
別の局面において、本発明は、本発明の液体製剤の凍結乾燥によって得ることができる凍結乾燥製剤に関し、該凍結乾燥製剤は、rhBSSL、結晶性増量剤、および無定形安定剤を含む。関連する局面において、本発明は、そのような凍結乾燥製剤の単位用量にも関する。他の関連する局面において、本発明は、さらに、そのような凍結乾燥製剤を作製する方法に関し、そのような方法によって得ることができる凍結乾燥製剤にも関する。
【００３５】
さらなる別の局面において、本発明は、rhBSSLの再構成製剤を作製する方法に関し、該方法は、本発明の凍結乾燥製剤または単位用量を提供する工程；および該凍結乾燥製剤または単位用量を液体中で再構成する工程を含む。関連する局面において、本発明は、（i）約10mg〜約20mgの絶対量で存在しているrhBSSL；（ii）約27mg〜約62mgの絶対量で存在しているマンニトール；および（iii）約2mg〜約6mgの絶対量で存在しているグリシンを含む、rhBSSLの再構成製剤に関し、該製剤は液体乳児食中で再構成されており、かつ該再構成製剤は約6.4〜約7.4のpHを有する。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、グリシンではない結晶性増量剤をさらに含む凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSLを安定化するためのグリシンの使用に関し、該グリシンは、該凍結乾燥製剤中で実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/または該グリシンは、該凍結乾燥製剤中にrhBSSL 1mgあたり約0.2mg〜約0.3mgの相対量で含まれている。
【００３７】
なおさらなる局面において、本発明は、液体乳児食中に存在している、rhBSSLの不溶性凝集体の形成を低下させかつ/または最小限に抑える方法に関し、該方法は、本発明の凍結乾燥製剤または単位用量を提供する工程；および該凍結乾燥製剤または単位用量を液体乳児食中で再構成する工程を含む。
【００３８】
特定の局面において、本発明は、rhBSSLの凝集の低下を決定する方法にも関し、該方法は、（i）本発明の凍結乾燥製剤または単位用量を提供する工程；（ii）該凍結乾燥製剤または単位用量を保存する工程；および（iii）該凍結乾燥製剤または該単位用量中のrhBSSLの高分子量（high molecule weight）パーセンテージ（％HMW）レベルを1つまたは複数の時点で決定し、それによって該rhBSSLの凝集のレベルを決定する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実験AH7507の凍結乾燥製剤についての、＋5℃で0〜18ヶ月間の保存の間のrhBSSL単量体の不安定性（SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークによって定量化される）を示しており：（a）は、統合させた主要ピークの絶対％の低下を示しており；かつ（b）は、統合させた主要ピークの相対％減少（各製剤に対して、0ヶ月の主要ピークは100％として設定される）の低下を示している。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度の大まかな分類は、77mMの「高い」グリシン濃度を表す黒塗り記号、0mMの「低い」グリシン濃度を表す白抜き記号、ならびに27mM（N6およびN7について）および33mM（N4について）の「中程度の」グリシン濃度を表す斜線記号を用いた、プロット記号の陰影付けによって示される。
【図２】実験AH7507の凍結乾燥製剤についての、＋25℃で0〜18ヶ月間の保存の間のrhBSSL単量体の不安定性（SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークによって定量化される）を示しており：（a）は、統合させた主要ピークの絶対％の低下を示しており；かつ（b）は、統合させた主要ピークの相対％減少（各製剤に対して、0ヶ月の主要ピークは100％として設定される）の低下を示している。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図３】実験AH7507の凍結乾燥製剤についての、＋40℃で0〜9ヶ月間の保存の間のrhBSSL単量体の不安定性（SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークによって定量化される）を示しており：（a）は、統合させた主要ピークの絶対％の低下を示しており；かつ（b）は、統合させた主要ピークの相対％減少（各製剤に対して、0ヶ月の主要ピークは100％として設定される）の低下を示している。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図４】実験AH7507の凍結乾燥製剤についての、＋5℃で0〜18ヶ月間の保存の間のrhBSSL凝集の速度（SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される）を示しており：（a）は、統合させた総HMWピークの絶対％を用いた速度を示しており；かつ（b）は、統合させた総HMWピークの相対％増大（各製剤に対して、0ヶ月の総HMWピークは100％として設定される）を用いた速度を示している。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図５】実験AH7507の凍結乾燥製剤についての、＋25℃で0〜18ヶ月間の保存の間のrhBSSL凝集の速度（SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される）を示しており：（a）は、統合させた総HMWピークの絶対％を用いた速度を示しており；かつ（b）は、統合させた総HMWピークの相対％増大（各製剤に対して、0ヶ月の総HMWピークは100％として設定される）を用いた速度を示している。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図６】実験AH7507の凍結乾燥製剤についての、＋40℃で0〜9ヶ月間の保存の間のrhBSSL凝集の速度（SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される）を示しており：（a）は、統合させた総HMWピークの絶対％を用いた速度を示しており；かつ（b）は、統合させた総HMWピークの相対％増大（各製剤に対して、0ヶ月の総HMWピークは100％として設定される）を用いた速度を示している。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図７】実験AH7507の凍結乾燥製剤について、N4、N5、N6、およびN7から得られたPXRDパターンの重ね合わせを示している。矢印は、製剤N5中のみに存在していることが見出されている結晶性βグリシンに相当するピークを印付けしている。
【図８】＋40℃で9ヶ月間の保存後の、実験AH7507の製剤の前凍結乾燥製剤におけるグリシンの濃度に対する、rhBSSL凝集（SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される）間の関係性を表す散布プロットを示している。各前製剤中に存在しているマンニトールの濃度は、307mMの「高い」マンニトール濃度を表す黒塗りの四角、132mMの「低い」マンニトール濃度を表す白抜きの四角、および220mMの「中程度の」マンニトール濃度を表す斜線の四角を用いた、プロット記号の陰影付けによって示される。
【図９】＋5℃および＋25℃で18ヶ月間の保存後の実験AH7507の製剤からのデータに基づくMLRモデルに対する、SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークについての係数プロットを示している。
【図１０】＋5℃で18ヶ月間の保存後の実験AH7507の製剤からの、SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピーク（rhBSSL単量体）を分析するために用いられたMLRモデルからの等高線表面を示している。
【図１１】＋5℃および＋25℃で18ヶ月間の保存後の実験AH7507の製剤からのデータに基づくMLRモデルに対する、SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）（rhBSSL凝集体）の合計についての係数プロットを示している。
【図１２】＋5℃で18ヶ月間の保存後の実験AH7507の製剤からの、SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）（rhBSSL凝集体）の合計を分析するために用いられたMLRモデルからの等高線表面を示している。
【図１３】＋5℃で0〜12ヶ月間の保存後の実験AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤についての、rhBSSL単量体の不安定性−SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークによって定量化される−を示している：（a）統合させた主要ピークの％の低下；および（b）統合させた主要ピークの相対％低下（各製剤に対して、0ヶ月の主要ピークは100％として設定される）。実験AH7517について留意すべきは、0ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月でのみデータを収集したことである。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度の大まかな分類は、56mMの「高い」グリシン濃度を表す黒塗り記号、0mMの「低い」グリシン濃度を表す白抜き記号、ならびに44mM（G2について）および50mM（G3について）の「中程度の」グリシン濃度を表す斜線記号を用いた、プロット記号の陰影付けによって示される。
【図１４】＋25℃で0〜12ヶ月間の保存後の実験AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤についての、rhBSSL単量体の不安定性−SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークによって定量化される−を示している：（a）統合させた主要ピークの％の低下；および（b）統合させた主要ピークの相対％低下（各製剤に対して、0ヶ月の主要ピークは100％として設定される）。収集された時点および各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図１５】＋40℃で保存した後の実験AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤についての、rhBSSL単量体の不安定性−SE-HPLCによって検出される統合させた主要ピークによって定量化される−を示している：（a）0〜12ヶ月間の保存後の、統合させた主要ピークの％の低下。実験AH7517について留意すべきは、0ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月でのみデータを収集したことである；ならびに（b）0〜6ヶ月間の保存後の、統合させた主要ピークの相対％低下（各製剤に対して、0ヶ月の主要ピークは100％として設定される）。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図１６】＋5℃で0〜12ヶ月間の保存後の実験AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤についての、rhBSSL凝集の速度−SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される−を示している：（a）統合させた総HMWピークの増大；および（b）統合させた総HMWピークの相対％増大（各製剤に対して、0ヶ月の総HMWピークは100％として設定される）。実験AH7517について留意すべきは、0ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月でのみデータを収集したことであり、各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図１７】＋25℃で0〜12ヶ月間の保存後の実験AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤についての、rhBSSL凝集の速度−SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される−を示している：（a）統合させた総HMWピークの増大；および（b）統合させた総HMWピークの相対％増大（各製剤に対して、0ヶ月の総HMWピークは100％として設定される）。収集された時点および各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図１８】＋40℃で保存した後の実験AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤についての、rhBSSL凝集の速度−SE-HPLCによって検出されるすべての統合させた高分子量ピーク（HMW）の合計によって定量化される−を示している：（a）0〜12ヶ月間の保存後の、統合させた総HMWピークの増大。実験AH7517について留意すべきは、0ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月でのみデータを収集したことである；ならびに（b）0〜6ヶ月間の保存後の、統合させた総HMWピークの相対％増大（各製剤に対して、0ヶ月の総HMWピークは100％として設定される）。各前製剤中に存在しているグリシンの濃度は、上記に記載されるものと同じ陰影付けを用いて示される。
【図１９】（a）実験AH7513のrhBSSLの凍結乾燥製剤F1から得られたPXRDパターンを示しており、矢印は、この製剤中に存在している結晶性βグリシンに相当するピークを印付けしている；かつ（b）実験AH7517のrhBSSLの凍結乾燥製剤G3から得られたPXRDパターンを示しており、矢印は、結晶性βグリシンの存在を別様では示すと考えられるピークの予想される位置（この製剤中では不在）を印付けしている。
【図２０】様々な温度で12ヶ月間保存されたrhBSSLの凍結乾燥製剤についての、ならびに（a）実験AH7513の製剤F1およびF2；ならびに（b）実験AH7517の製剤G2およびG3に対する、高分子量（HMW）凝集体のそれらそれぞれの程度についてのSDS-PAGE結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の開示
本発明、とくにその非限定的な局面および/または態様を、概して、以下のようにより詳細に記載することができる。
【００４１】
一局面において、本発明は、（i）組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）；（ii）結晶性増量剤；および（iii）該結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤を含む、凍結乾燥に適した製剤に関する。
【００４２】
以下において提示される用語は、概して、別様に示されない限りそれらの一般的な意味によって理解されるべきである。
【００４３】
本説明および添付の特許請求の範囲において「含む」または「を含む」という用語が用いられる場合、それは他の要素を除外するものではない。本発明の目的で、「からなる」という用語は、「を含む」という用語の好ましい態様であると見なされる。以下において、群が少なくともある特定の数の態様を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの態様のすべてからなるおよび/またはそれらのみからなる群を開示しているとも理解されるべきである。
【００４４】
本発明の文脈において、「約」および「およそ」という用語は、当業者であれば、問題となる特質の技術的効果をさらに確実にするためと理解するであろう精度の間隔を意味する。該用語は、典型的に、示された数値からの±20％、±15％、±10％、好ましくは±5％の逸脱を示す。当業者によって認識されるように、所定の技術的効果についての数値に関するそのような具体的な逸脱は、該技術的効果の性質に依存する。例えば、天然のまたは生物学的な技術的効果は、一般的に、人造のまたは工学的な技術的効果に対するものよりも大きなそのような逸脱を有し得る。
【００４５】
単数名詞を指す際に不定冠詞または定冠詞、例えば「１つの」、「ある」、または「その」が用いられる場合、他のことが具体的に明記されない限り、それはその名詞の複数形を含む。
【００４６】
I．一般的な凍結乾燥
凍結乾燥（フリーズドライとも称される）とは、低温および圧力を用いて、昇華（すなわち、液相を通過しない固体から蒸気への相の変化）の過程によって液体製剤から溶媒、典型的には水を除去するプロセスを指す。凍結乾燥は、化学反応または生物学的増殖をもはや補助しないレベルまで1種または複数種の溶媒成分を低下させることによって、薬学的製剤を安定化するのに役立つ。
【００４７】
フリーズドライプロセスは公知である。フリーズドライは、フラスコ、アンプル、またはバイアルがマニホールドまたは乾燥チャンバーのポートに個別に取り付けられる「マニホールド」プロセスにおいて実施されることがある。フリーズドライは「バッチ」プロセスとして実施されることもあり、ここで、類似産物を含有する1本または複数本の同程度のサイズの管がトレイ乾燥機内に一緒に配置され、「バルク」プロセスで産物がバルク受け皿に注がれ、1単位として乾燥される。産物は、閉鎖前にフリーズドライチャンバーから取り出され、次いで気密容器内に包装される。本明細書において記載される本発明を、これらのプロセスのいずれかと組み合わせて使用することができる。
【００４８】
一般的に、凍結乾燥は、以下の少なくとも3つの段階で行われる：凍結；一次乾燥；および二次乾燥。凍結段階と一次乾燥段階との間にアニーリング工程を含むことが望ましい場合もあり得る。
【００４９】
典型的なフリーズドライプロセスの第一の工程において、水性タンパク質溶液の試料は、溶液が凍結するまで、産物の崩壊温度を下回って冷却される。第二の工程である一次乾燥の間、凍結した材料に真空を適用し、場合によっては凍結塊に熱を伝達することによって、昇華をもたらす。一般的に、フリーズドライは、溶液または製剤から水を除去するために使用される。昇華が生じるにつれて、水蒸気は凍結塊からフリーズドライチャンバーに移動する。温度が高ければ高いほど、飽和蒸気圧が上昇し、これが、乾燥速度の増大をもたらす。これにより、フリーズドライサイクルが短縮される。この段階の間の乾燥温度の上限によって、産物の温度が産物の崩壊温度より下で確実に維持される。
【００５０】
フリーズドライの際の産物の「崩壊」は、乾燥製剤の表面積の減少、容量の低下を伴い、それに続く再構成時間の増加も伴い得る。フリーズドライされた材料が崩壊する事象において、除去されていなかった溶媒が捕捉されることになり得る。これは、最終産物の安定性の望ましくない低下を生じ得、その性能に対して悪影響を有し得る。崩壊温度とは、材料が、それ自身の構造を支持し得ない程度まで軟化する温度である。一般的に、昇華によって溶媒のレベルが低下するにつれて、崩壊温度は上昇する。タンパク質を含有するほとんどの系において、この温度の開始点は十分に定義されておらず、広範な温度にわたって生じ得る。より高い温度でこのより高い構造安定性を維持する材料は、したがって、より速いプロセスを可能にし得る。したがって、混合物の成分は、後に続く保存の間タンパク質を安定化することに加えて、フリーズドライプロセスの間安定性を与え得る。
【００５１】
一次乾燥の間に昇華される遊離氷（free ice）の他に、産物に結合している相当量の水分子が依然として存在する。第三の工程である二次乾燥において、これは除去される（脱離される）水である。遊離氷のすべては一次乾燥で除去されているため、ここでは崩壊を心配することなく産物温度を大幅に増加させることができる。二次乾燥（脱離）は、実際には第一の段階の間に開始しているが、高い温度（典型的に、30℃〜50℃の範囲内）で脱離はよりはるかに迅速に進行する。二次乾燥の速度は、産物温度に依存する。系の真空を、一次乾燥の間に用いられたのと同じレベルで継続してよく、または変更してよい。産物が長期保存のために許容される水分含有率を有するまで、二次乾燥を継続する。用途に応じて、十分に乾燥させた産物中の水分含有率は、典型的に0.5％〜3％である。
【００５２】
凍結乾燥による脱水が完了すると、タンパク質は粉末または「ケーク」となる。凍結乾燥は、有意な速度の化学的または物理的分解をもはや補助しないレベルまでケーク中の1種または複数種の溶媒成分（典型的には水）を低下させることによって、薬学的製剤を安定化するのに役立つ。ケークの構造は、材料（例えば、治療用タンパク質および他の任意の賦形剤）が再構成されるのを可能にするのに重要である。ケークが小さな孔を有する場合、フリーズドライプロセスの間の水の除去は妨げられ得る。結果として、乾燥プロセスは不完全であり、ケークは高い水分含有率を有する。ケークが大きな孔を有して形成される場合、乾燥プロセスはより効率的であり、ケークは低い水分含有率を有する。
【００５３】
II．製剤
上記に記載されるように、凍結乾燥は、凍結乾燥に適した液体製剤をフリーズドライプロセスに供して凍結乾燥（フリーズドライ）製剤を得るプロセスである。フリーズドライ製剤の内容は、活性物質および意図される投与の経路に応じて変わり得る。液体製剤は、溶媒および溶質を一般的に含む。溶質は、典型的に活性物質および任意で1種または複数種の賦形剤を含む。結果として生じたフリーズドライ製剤は、無定形固体マトリックスおよび少量の残存未凍結溶媒を含む。無定形固体マトリックスは、活性物質および任意で1種または複数種の賦形剤を含む。
【００５４】
一般的に、溶媒または活性物質でない、製剤中の任意の成分は「賦形剤」と呼ばれる。多くの賦形剤の主要な機能は、安定な液体環境を活性構成要素に提供すること、または凍結または乾燥プロセスの間活性物質を保護することであるが、「賦形剤」は多くの理由で製剤中に含まれる。いくつかの賦形剤を用いて、製剤において多数の効果を達成し得る。例えば、スクロースなどの二糖は、凍結保護剤、溶解保護剤、増量剤、および等張化調整剤として作用し得る。賦形剤の挙動は、他の賦形剤の存在下の場合に変化し得る。ある組み合わせは、プラスの相乗効果を有し、他はマイナスの相乗効果を有する。一緒に作用する賦形剤の効果の合計が個々の賦形剤の相加効果を上回る場合、プラスの相乗作用が生じる。賦形剤の組み合わせの効果の合計が個々の賦形剤のものに満たない場合、マイナスの相乗作用が生じる。活性物質、溶媒、および賦形剤の例を下記に提供する。
【００５５】
活性物質および組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ：
本明細書において使用する「薬学的製剤」という用語は、その全てがまたはそのうち1つが組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）である少なくとも1種の活性物質を含む製剤の両方を指す。
【００５６】
本明細書において記載、定義、または言及されるタンパク質は、本発明の様々な局面における成分としての組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）である。例えば、それは、当業者によってヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼとして認識可能なポリペプチドを含み、該ヒトリパーゼは、そのようなポリペプチドを作製するために、非ヒト生物などの非ヒト供給源によって産生されもしくはそこから単離され、適合され、または改変されている（例えば、組換え遺伝子技術によって）。
【００５７】
ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（BSSL）は、様々な識別名または別名；例えば、「カルボキシルエステルリパーゼ（CEL）」、「胆汁酸塩活性化リパーゼ（BAL）」、「胆汁酸塩依存性リパーゼ（BSDL）」、「カルボキシルエステラーゼ」、「カルボン酸エステルヒドロラーゼ（CEH）」、ならびに「GeneCards」（www.genecards.org）などの情報源から当業者にとって容易に入手可能であろう多数の他の別名および説明で知られる酵素である。ヒトBSSLの多数の天然アミノ酸配列およびアイソフォームがヒト乳（および膵臓）から同定されており、多数の異なるアミノ酸配列（典型的には、cDNAまたはゲノム配列から予測される）が記載されており、それらのすべては、本明細書において「ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ」という用語に包含される。例えば、ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、天然には、20〜26アミノ酸のシグナル配列を含む前駆体配列としてまず産生され、該タンパク質の成熟全長型は722〜733アミノ酸を有すると記載されている（例えば、Nilsson et al, 1990；WO 91/15234、WO 91/18923；GenBank寄託ID：X54457のcDNA配列から予測されるポリペプチド；GenBank ID：CAA38325.1；「CEL/BSSL」のGeneCardsエントリー；GenBank ID：AAH42510.1；RefSeq ID：NP_001798.2；Swiss-Prot ID：P19835を参照されたい）。さらなる例において、ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの他のより短いアイソフォームは、Venterら（2001; Science, 291:1304-1351）；GenBnk ID：AAC71012.1；Pasqualiniら（1998; J Biol Chem, 273:28208-28218）；GenBank ID：EAW88031.1；WO 94/20610、およびBlackbergら（1995; Eur J Biochem, 228:817-821）に記載されている。
【００５８】
特定の態様において、ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、SEQ ID NO：2を含むアミノ酸配列またはそれによって示されるものを有するタンパク質を含む。他の特定の態様において、（組換え）ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、Nilsson et al, 1990；WO 91/15234、WO 91/18923；RefSeq ID：NP_001798.2；GenBank ID：AAH42510.1；GenBank ID：CAA38325.1；「CEL/BSSL」のGeneCardsエントリー；Swiss-Prot ID：P19835に開示されるものより選択される、BSSLの成熟型または前駆体型のいずれかのアミノ酸配列を有する。さらなるそのような態様において、（組換え）ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、前述の参考文献に開示される配列のうちのいずれかのまたはSEQ ID NO：2の少なくとも720連続アミノ酸であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。他の態様において、（組換え）ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、SEQ ID NO：2もしくはWO 91/15234に開示されるものの少なくとも位置1〜101のアミノ酸配列、またはHansson et al, 1993; J Biol Chem, 35:26692-26698に開示される「変種A」など、SEQ ID NO：2に開示されるものの少なくとも位置1〜535のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、そのようなタンパク質は、例えばBlackbergら（1995; Eur J Biochem 228:817-821）に開示される方法によって決定され得る、胆汁酸塩結合活性および/または胆汁酸塩依存性リパーゼ活性を有する。
【００５９】
したがって、本発明のある特定の態様において、（組換え）ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼのこれらの記載される形態のうちの1つまたは複数が、本発明の様々な局面において有用であり得ることは、今や当業者に明白であろう。さらに、胆汁酸塩依存性脂肪分解活性（例えば、Blackberg et al, 1995に開示される方法によって決定され得るもの）を有し、かつ本明細書において記載、定義、または言及されるそれらのポリペプチド配列とアミノ酸配列が似ている他の（組換え）タンパク質が、本発明においても有用性を有し得、ゆえに「ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ」という用語に包含もされることは、そのような人に明白であろう。ある特定のそのような態様において、タンパク質は、本明細書において記載、定義、または言及される配列と、少なくとも約30、50、100、250、500、600、700、711、720、722、733、または750アミノ酸にわたって、90％、95％、98％、99％、99.5％を上回る配列同一性を示す。他の態様において、本明細書において開示、定義、または言及されるBSSLポリペプチド配列のうちの1つに、1個または複数個のアミノ酸置換をなし得る。例えば、SEQ ID NO：2に開示される配列に、1個、2個、3個、4個、5個、または最高10個までのアミノ酸の置換、欠失、または付加をなし得る。そのようなアミノ酸変化は、中性変化（中性のアミノ酸置換など）であり得、かつ/またはそれらは、ある（所望の）様式でタンパク質のグリコシル化、結合、触媒活性、または他の特性に影響を及ぼし得る。そのような置換を有するタンパク質も、それらが胆汁酸塩依存性脂肪分解活性を有する限り、本発明の意味における「ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ」であると当業者によって認識されるであろう。
【００６０】
他の態様において、ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、適切な核酸配列を有する核酸から発現可能であり、またはそれによって別様にコードされる。非限定的な例として、該リパーゼは、SEQ ID NO：1の位置151〜2316の間の配列を含む核酸、またはWO 94/20610もしくはNilssonら（1990）に開示されるものから発現可能であり、またはそれによって別様にコードされる。当業者によっても認識されるように、「適切な核酸配列」は、前述の核酸配列の変種も包含する。例えば、トリプレットコドンによってコードされるアミノ酸を変化させない1個または複数個のヌクレオチド塩基の変化（3番目のコドン位置におけるものなど）も「適切」であろう。そのような核酸配列の部分断片も、それらが、本明細書において記載されるヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの（短い）アイソフォームをコードする場合には「適切」であろう。さらに、上記に記載されるものなど、SEQ ID NO：2によって示されるアミノ酸配列の変種を有するタンパク質をコードする核酸配列も「適切」であろう。したがって、本発明は、それによって（組換え）ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼが、SEQ ID NO：1の位置151〜2316の間の配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸、または位置151〜755の間の配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によって発現可能であり、またはそれによってコードされるタンパク質である態様を想定し、ここで該タンパク質は胆汁酸塩依存性脂肪分解活性を有する。ある特定のそのような態様において、ハイブリダイゼーションは、当業者に公知であると考えられ、例えば一般的教科書であるJoe SambrookおよびDavid Russellによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（CSHL Press）に記載されるものなどのストリンジェントな条件で行われる。
【００６１】
特定の態様において、（組換え）ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、本明細書において記載、定義、または言及される核酸からの発現によって産生される。
【００６２】
本発明との関連で本明細書において記載、定義、または言及されるヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、組換え胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）であり；すなわち、該ヒトリパーゼは、そのようなポリペプチドを作製するために、非ヒト生物などの非ヒト供給源によって産生されまたはそこから単離され、適合され、または改変されている（例えば、組換え遺伝子技術によって）。特定の態様において、無細胞および/またはインビトロの転写−翻訳技術を用いることによって、本明細書において記載、定義、または言及される単離核酸分子からrhBSSLを作製する。あるいは、組換え非ヒト生物が用いられ、該非ヒト生物は、少なくとも1コピーのそのような核酸を含み、該核酸は、所望のタンパク質：rhBSSLを産生する該非ヒト生物によって発現可能である。例えば、組換え細菌、藻類、酵母、または他の真核細胞を用いてよく、ある特定の態様において、そのような組換え細胞の培養物からrhBSSLを作製する。他の態様において、改変されたまたは特異的に選択されたヒト細胞の体外（extra-corporal）培養によって、例えばそれらのインビトロ培養によって、rhBSSLを産生してよい。さらなる他の態様において、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウサギなどのトランスジェニック動物の乳からのその単離によって、rhBSSLを作製してよい。当業者であれば、組換え技術を用いてヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを作製するために利用可能な数々の技術を知っているであろう。
【００６３】
組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、大腸菌（E. coli）、マウス、およびハムスター（Hansson et al, 1993）、ならびにP.パストリス（P. pastoris）（Trimple et al, 2004; Glycobiol, 14:265-274）細胞の培養物を含めた、組換え細胞培養物から作製可能であることが示されている。組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、トランスジェニックマウスの乳（Stromqvist et al, 1996; Transgen Res, 5:475-485）からおよびトランスジェニックヒツジの乳（WO 99/54443）から作製可能かつ単離可能であることも示されている。本発明のある特定の態様において、そのような組換え細胞の培養物からまたはそのようなトランスジェニック動物の乳から、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを単離する。代替的な態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、トランスジェニックヒツジまたはトランスジェニックマウスの乳から単離されたものではない。
【００６４】
本発明の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、組換えチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株の発現産物から単離され、組換えCHO細胞株によって産生され、または組換えCHO細胞株によって発現可能でありもしくはそれから単離可能である。そのようなリパーゼを産生する組換えCHO細胞株発現系の使用によって、特定の構造、活性、または他の特徴的特質、例えばそれらの内容は参照により本明細書に組み入れられる同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060に記載されるもののうちの1つまたは複数などを呈するrhBSSLを作製することができる。非限定的な例として、本発明において有用なrhBSSLは、本明細書における例示に記載されるまたは同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060に記載される方法を用いて単離され得、かつ/またはそれらに記載されるものに類似したもしくは実質的にそれらに記載される特徴を呈し得る。
【００６５】
本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、例えば国際一般名（International Non-proprietary Name）（INN）の「ブセリパーゼ」系統で識別され（WHO Drug Information, 21 : 62, 2007を参照されたい）、これは、そこに示されるアミノ酸配列を有するからである。本発明において使用される場合、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、SEQ ID NO：2を参照すると、Cys64-Cys80およびCys246-Cys257の位置で1つもしくは複数のジスルフィド架橋を有し得、かつ/またはAsn-187、Thr-538、Thr-549、Thr-559、Thr-576、Thr-587、Thr-598、Thr-609、Thr-620、Thr-631、およびThr-642の潜在的グリコシル化部位のうちの1箇所もしくは複数箇所でグリコシル化される（そのような一態様において、図1.1に概略的に表される）。ある特定のそのような態様において、rhBSSLは糖型の状態であり、例えば「ブセリパーゼα」のINNを有し得る。
【００６６】
本発明の他の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、天然ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（BSSL-MAM）のものとは異なり、かつ/またはWO 99/54443に記載されるものなどのトランスジェニックヒツジの乳からの単離によって作製されている組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL-OVI）の形態とは異なる、構造特性、組成特性、および/または他の特性を有する。異なるそのような構造上のおよび/もしくは組成の差異、または他の特性のいくつかは、同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060に記載されている。非限定的な例として、ある特定のそのような態様において、本発明に有用な組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、他の乳タンパク質または乳成分を（実質的に）含んでいない。本発明の開示によって明白であるように、ある特定の態様において、ヒト乳児への投与前に、rhBSSLを乳ベースの乳児食に添加する。したがって、そのような態様において、「他の乳タンパク質または乳成分を含んでいない」ことは、該乳ベースの乳児食への添加のすぐ前に（直前などに）存在する組換え胆汁酸塩刺激性リパーゼの形態、組成、または製剤に適用される。例えば、そのような態様において、任意の乳児用調合乳および/または低温殺菌母乳への添加に備えて提供されるrhBSSLまたはその量のrhBSSLを含有する本発明の薬学的組成物またはキット成分は、そのような乳ベースの夾雑物を含んでいない。ある特定のそのような態様において、rhBSSLは、乳カゼイン、およびラクトフェリンなどの乳清タンパク質を含んでいない、またはとくにそのような乳由来のタンパク質または他の夾雑物がヒト、ヒツジ、もしくはマウスの乳に由来する場合、乳に由来する他の夾雑物を含んでいない。これらの態様において、いかなる特定のそのようなタンパク質または夾雑物質も「含んでいない」とは、ルーチン検出法によって、そのようなタンパク質または他の夾雑物の実体的量を全く検出できないことを意味する。あるいは、任意のそのような特定の不純物は、約5％未満、例えば約2％、1％、0.5％、もしくは0.1％未満のレベルで存在していてよく、または基本的にもしくは事実上存在しておらず、あるいはすべてのそのような乳由来のタンパク質もしくは他の混合物の総量は、約5％未満、例えば約2％、1％、0.5％、もしくは0.1％未満のレベルで存在している、または基本的にもしくは事実上存在していない。当業者によって理解されるように、組換えCHO細胞からなどの細胞培養物から作製されかつ単離された組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、そのような乳ベースの夾雑物を「含んでいない」と見なされる。
【００６７】
本発明の他のある特定のそのような態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、約70％を上回る純度、例えば約80％、90％、または95％を上回る純度を有する。特定のそのような態様において、そのようなパーセンテージ純度は、総タンパク質に対するパーセント純度である。上記に記載されるように、適用可能な態様において、そのような純度測定は、任意の乳児食または他の投与媒体への添加前の、該リパーゼを含む組成物のものである。そのような純度値は、RP-HPLC、SE-HPLC、またはSDS-PAGE（SyproRubyまたは銀染色を用いた）技術によって決定され得る。
【００６８】
本発明の他の態様において、とくに、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼが組換えCHO細胞を用いて産生される（から発現される）場合、本発明において用いられる際のrhBSSLは、以下に記載されるものなど、1つまたは複数の構造特性、活性特性、または他の特性を特徴とし得る。そのような構造特性、活性特性、または他の特性を決定する方法は、本発明の開示によって当業者に公知であると考えられ、例えば同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060に記載されるものを含む。
【００６９】
本発明のさらなるある特定のそのような態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、天然ヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（BSSL-MAM）よりも低いグリコシル化の（全体/総）レベルを有し、かつ/またはトランスジェニックヒツジの乳から単離された組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL-OVI）を上回るグリコシル化の（全体/総）レベルを有する。BSSL（またはその試料）の単糖のレベルおよび/またはシアル酸含有率などのグリコシル化のレベルは、パルスアンペロメトリック（pulsed amperiometric）検出による高pH陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）を用いて測定され得る。本発明の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの総単糖含有率（モル単糖/モルrhBSSL）は、約20〜100、約25〜65、または約25〜55、例えば約40〜45モル/（モルrhBSSL）である。本発明のある特定の態様において、rhBSSLの総シアル酸含有率（モルシアル酸/モルrhBSSL）は、約20〜35、例えば約25〜30モル/（モルrhBSSL）である。
【００７０】
本発明のさらに他のある特定のそのような態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、BSSL-MAMのものとは異なりかつ/またはrhBSSL-OVIのものとは異なる、例えばO-グリカンのグリコシル化パターンを有する。そのような差異は、レーザー励起蛍光検出によるキャピラリー電気泳動（CE-LIF）および/またはHPAEC-PADを用いて検出され得る。本発明の特定の態様において、rhBSSLは、約20〜50モルのN-アセチルノイラミン酸（NANA＝Neu5Ac）/モルrhBSSL［モル/（モルrhBSSL）］、例えば約25〜40モル/（モルrhBSSL）を有してよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約5モル未満のN-グリコシルノイラミン酸（NGNA＝Neu5Gc）/モルrhBSSL、例えば約2モル/（モルrhBSSL）未満を有してよい、またはNGNAは基本的に検出不能である。本発明において用いられるrhBSSLは、約20モル未満のフコース/モルrhBSSL、例えば約10未満、約5未満、2未満または約2モル/（モルrhBSSL）を有してよく、ある特定の態様において、フコースは基本的に検出不能である。本発明において用いられるrhBSSLは、約5〜25モルのガラクトサミン/モルrhBSSL、例えば約10〜20または約15〜18モル/（モルrhBSSL）を有してよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約10モル未満のグルコサミン/モルrhBSSL、例えば約5未満、約3未満、または約2モル/（モルrhBSSL）を有してよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約5〜25モルのガラクトース/モルrhBSSL、例えば約10〜20または約15〜18モル/（モルrhBSSL）を有してよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約5モル未満のグルコース/モルrhBSSL、例えば約2モル/（モルrhBSSL）未満を有してよい、またはグルコースは基本的に検出不能である。本発明において用いられるrhBSSLは、約2〜8モルのマンノース/モルrhBSSL、例えば約4〜6モル/（モルrhBSSL）を有してよい。本発明の特定の態様において、rhBSSLは、同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060の表1.1に表されるまたは実質的に表される、単糖（monosaccaride）および/またはシアル酸含有率のプロファイルを有してよい。
【００７１】
本発明の他の態様において、本発明に有用な組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、Blackbergら（1995）およびLandbergら（1997）にそれぞれ記載されるアッセイおよびプロファイルなど、レクチン結合またはルイス抗原結合試験のプロファイルまたは量の点でBSSL-MAMおよびrhBSSL-OVIとは異なる。そのようなレクチン結合またはルイス結合試験は、これらの異なる形態のBSSL間でグリコシル化パターンの差異を示し得る。他の技術を用いて、本発明に有用な組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを同定かつ/または特徴決定し得る。例えば、エンドプロテアーゼLys-C消化、それに続く定量的UV検出（214nmにおける）による逆相HPLCを用いた、結果として生じたペプチドの分析、および結果として生じたクロマトグラムの記録/点検によって、rhBSSLを特徴決定し得る（かつ/またはBSSL-MAMもしくはrhBSSL-OVIと区別し得る）。結果として生じたクロマトグラムの差異は、保持時間の特異的差異を有する、rhBSSLを含む特異的ペプチドのグリコシル化の固有の特質によるものであり得、ゆえにそれをさらに反映し得る。
【００７２】
本発明のなおさらなる態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、90kDa〜75kDaの分子量を有する。特定のそのような態様において、該リパーゼの分子量は約84〜86kDa、例えば約85kDaである。分子量は、MALDI-MSを含むルーチン技術によって決定され得る。比較として、同じ検出技術を用いると、BSSL-MAMの分子量は実質的により大きいもの（例えば、100kDa前後）として測定され、rhBSSL-OVIのものは実質的により小さいもの（例えば、78kDa前後）として測定される。
【００７３】
本発明の他のさらなるそのような態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、異なるアミノ酸長の配列を有する組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの集団を含んでよい。そのような態様のいくつかにおいて、最も長いまたは（予測される）全長型（SEQ ID NO：2によって示されるものなど）と比較して、C末端において1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、または最高10アミノ酸短い形態で存在しているリパーゼ分子の量は、そのような最も長いまたは（予測される）全長型で存在しているリパーゼの量の50％を上回る。ある特定のそのような態様において、最も長い（または予測される全長）リパーゼ分子の量の約100％〜500％は、C末端から1アミノ酸または2アミノ酸短いなど、より短いリパーゼ分子として存在している量である。特定のそのような態様において、最も長い（または予測される全長）分子（例えば、SEQ ID NO：2によって示されるもの）の量の約200％〜400％、例えば約300％は、C末端から1アミノ酸または2アミノ酸短いなど、より短いリパーゼ分子として存在している量である。特定の態様または前述において、最も長い（または予測される全長）該リパーゼ分子の量の1％未満は、2アミノ酸短いリパーゼ分子として存在している。他の態様において、最も長い（または予測される）該リパーゼ分子の数の2〜5倍、例えば約3倍は、そのような最も長い（または予測される）分子よりC末端から1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、または最高10アミノ酸短い形態で存在している。
【００７４】
本発明のさらに他のさらなるそのような態様において、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、ヒト乳および/またはrhBSSL-OVIから単離されたBSSLを上回る比活性を有し得る。例えば、rhBSSLの比活性は、BSSL-MAMおよび/またはrhBSSL-OVIより（質量に基づき）約15％〜35％高い、例えば約20％または25％高い比活性であり得る。ヒトBSSLの比活性を測定する技術は、当業者に公知であると考えられ、本明細書における例示に概説される4-ニトロフェニルエステル酪酸（PNPB）アッセイの使用を含む。BSSLに対する他のインビトロアッセイは、例えばBSSLに対する基質としてのアラビアゴム中に乳化されたトリオレオイルグリセロール、および活性化胆汁酸塩としてのコール酸ナトリウム（10mM）の使用として知られている（例えば、Blackberg and Hernell, 1981; Eur J Biochem, 116:221-225によって記載される）。特定の態様において、比活性を測定する前に、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの技術を用いるなどによって、BSSLを高純度に精製してよい。
【００７５】
当業者によって理解されるように、本発明において用いられる組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼは、上記のものなどの本明細書において記載または定義される顕著な特質のうちの1つを上回る特質を特徴とし得る。例えば、そのような特質の2つまたはそれを上回る（3つ、4つ、5つ、またはそれを上回る）数の組み合わせによって、本発明における使用のための組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの特定の態様は一緒に特徴決定され得る。
【００７６】
本発明のこの局面のある特定の態様において、rhBSSLは約1mg/mL〜約35mg/mLの濃度で存在しており；好ましくは該濃度は約10mg/mL〜約15mg/mLであり；より好ましくは該濃度は、約11mg/mL、約12mg/mL、約13mg/mL、および約14mg/mLからなる群より選択される。代替的な態様において、より低い有効量のrhBSSLが所望される場合など、rhBSSLは約1〜約5mg/mL；好ましくは約2、3、または4mg/mLの濃度で存在している。
【００７７】
今や当業者の能力の範囲内であるように、製剤または組成物中に存在しているrhBSSLの量/濃度は、絶対量（例えば、質量またはモル量）でおよび/または活性単位数の観点で表現され得る。rhBSSLの活性は、活性のある標準BSSL分子を参照にして、本明細書において記載されるPNPBアッセイを用いて容易に決定され得る。活性rhBSSLの適切な質量は、上記に規定される範囲内にある。rhBSSLなどの複合タンパク質の分子量は、例えばグリコシル化の差異により変わり得るため、リパーゼの量は、質量の観点以外の方式で、例えば（活性）モルの量の観点で定義され得る。当業者であれば、特定のmg量から相当するマイクロモル量への他の変換を容易になし得るであろう。あるいは、組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼの量は、例えば本明細書において記載されるものなど、BSSL活性に対するインビトロアッセイで決定されるアッセイの条件下で1分間あたり1マイクロモルの産物の形成を触媒するリパーゼの量として定義されるなど、酵素単位（U）でのリパーゼの活性の観点で表現され得る。
【００７８】
溶媒
先に記述されているように、凍結乾燥は、液体製剤から溶媒を除去するプロセスである。本明細書において使用する「溶媒」という用語は、1種または複数種の溶質を溶解させ得るまたは懸濁し得る、製剤の液体成分を指す。「溶媒」という用語は、単一の溶媒または溶媒の混合物を指し得る。薬学的製剤用に一般に用いられる溶媒は、注射用水（WFI）である。製剤またはフリーズドライプロセスに応じて、液体製剤中に1種または複数種の有機溶媒を含めることが望ましい可能性がある。例えば、1種または複数種の活性構成要素の可溶性を増強するために、製剤中に有機溶媒を含めることが望ましい可能性がある。適切な有機溶媒の例には、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、tert-ブチルアルコール、アセトン、シクロヘキサン、およびジメチルスルホキシド（DMSO）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７９】
増量剤
増量剤の目的は、製剤にかさを提供し、かつケーク製剤を改良することである。本明細書において使用する「増量剤」という用語には、「結晶性」および「非結晶性」増量剤の両方が含まれる。「結晶性」増量剤という用語は、典型的な凍結乾燥条件下で結晶構造を形成し得る増量剤を指す。
【００８０】
一般的に、結晶性増量剤は、凍結の間（例えば、約0℃〜約−50℃の温度で）結晶化し得る増量剤を指す。結晶性増量剤は、アニーリング、熱処理工程、または凍結プロセスの間の結晶化を促進する他の成分を必要とし得る。例えば、増量剤は、凍結乾燥プロセスの条件および/または製剤中に存在している他の賦形剤に応じて、凍結乾燥の間に結晶化し得るまたは結晶化し得ない。典型的に、十分量の結晶性増量剤が液体製剤中に含まれ（例えば、無定形溶質/成分（例えば、rhBSSLまたは他の賦形剤）に対する結晶性増量剤の割合が少なくとも約1.0、約1.25、または約1.5である場合）、かつ凍結乾燥プロセスの間の結晶化が可能となる場合、結晶性増量剤は、製剤の無定形成分（例えば、rhBSSL）のための構造的支持マトリックスを形成し得る。本明細書において使用する「構造的支持マトリックス」という用語は、ケークのマクロ構造が、一次乾燥の間の構造的支持マトリックスの隙間内に残存している無定形溶質のいかなる「微小崩壊」によってもほとんど影響を受けないような、結晶性構造が製剤に提供する支持（「足場」に類似した）を指す。この結晶性の構造的支持マトリックスによって、産物温度が産物の無定形成分のガラス転移温度を上回る一次乾燥が、可能となり得る。
【００８１】
この局面のある特定の態様において、rhBSSLに対する結晶性増量剤の相対的質量濃度は、約1対1を上回る、例えば約1.25対1を上回る、約1.5対1を上回る、約2.0対1を上回る、または約2.5対1を上回る、例えば約2.0対1〜5.0対1である。
【００８２】
本発明のすべての局面の特定の態様において、結晶性増量剤はアミノ酸ではなく、ポリオールなどであり、例えば該結晶性増量剤はマンニトールである。
【００８３】
実施例3によって証明されるように、本発明者らは、マンニトールなどの結晶性増量剤の添加によって、結晶性増量剤を含まない液体製剤と比較して、rhBSSLの凍結乾燥製剤の安定性が有意に改善されることを驚くべきことに見出している。
【００８４】
本発明の凍結乾燥に適した製剤の特定の態様において、結晶性増量剤は、約50mM〜約500mMの濃度で存在しているマンニトールであり；好ましくは該濃度は約100mM〜400mM、または150mM〜300mMである。好ましいそのような態様において、マンニトールの濃度は約175mM〜約250mMであり、より好ましくはマンニトールは約180mM〜約210mMの濃度で存在しており；例えばマンニトールの濃度は、約185mM、約190mM、約195mM、約200mM、および約205mMからなる群より選択される。
【００８５】
安定剤
安定剤は、本発明の製剤および/または組成物を構成し得る。特定の態様において、本発明の製剤および/または組成物は、結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤などの安定剤をさらに含んでよい。
【００８６】
「無定形」安定剤という用語は、典型的な凍結乾燥条件下で無定形の形態をとり得る安定剤を指す。「無定形」という用語は、当業者によって一般に理解され、結晶に特徴的な長期間の整列を（検出可能な程度にまで）欠いている固体について記載する意味を含む。
【００８７】
本発明の製剤および/または組成物のある特定の態様において、無定形安定剤はスクロースではなく；好ましくは無定形安定剤は糖類ではなく；より好ましくは無定形安定剤はアミノ酸である。特定のそのような態様において、無定形安定剤は、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-アラニン、およびグリシンからなる群より選択され；最も好ましくは無定形安定剤はグリシンである。
【００８８】
本明細書における実施例によって証明されるように、本発明者らは、グリシンなどの無定形安定剤の添加が、凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSLの安定性に対して相加効果および相乗効果を有することを驚くべきことに見出している。とくに、グリシンがある特定の範囲内の濃度/量で製剤中に存在している場合に、そのような有利な効果が示される。
【００８９】
したがって、本発明の凍結乾燥に適した製剤の特定の態様において、無定形安定剤は、約10mM〜約100mMの濃度でそのような製剤中に存在しているグリシンであり；好ましくはグリシンの濃度は約20mM〜約70mMであり；より好ましくは該濃度は約30mM〜55mMであり；最も好ましくはグリシンは、約35mM〜50mMの濃度で、例えば約36mM、約38mM、約40mM、約42mM、約44mM、約46mM、および約48mMからなる群より選択されるグリシン濃度でそのような製剤中に存在している。
【００９０】
pHまたは緩衝剤
緩衝液は、典型的に、製剤のpHを生理学的に許容されるpHに維持するために薬学的製剤に含まれる。製剤にとって望ましいpHは、活性物質によっても影響を受け得る。例えば、ほとんどのバイオ医薬活性物質は、特異的pH範囲内でより高い活性を有する。一般的に、製剤のpHは、約4.0〜約8.0、約5.5〜約7.5、または約6.0〜約7.2に維持される。典型的に、緩衝液は、約2mM〜約50mM、または約10mM〜25mMの濃度で液体製剤に含まれる。
【００９１】
適切な緩衝液の例には、リン酸塩、アコニット酸、クエン酸、グルタル（gluaric）酸、リンゴ酸、コハク酸、および炭酸などの酸に由来する緩衝液が含まれる。典型的に、緩衝液は、これらの酸のうちの1つのアルカリ塩またはアルカリ土類塩として利用される。高頻度には、緩衝液はリン酸塩またはクエン酸塩、しばしばクエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウムまたはクエン酸である。他の適切な緩衝液には、酢酸塩、Tris、およびヒスチジン緩衝液が含まれる。
【００９２】
凍結乾燥に適した製剤の特定の態様において、製剤は約6.3〜約7.5のpH値を有し；好ましくはpH値は約6.6〜約7.2であり；より好ましくはpH値は、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、および約7.1からなる群より選択される。
【００９３】
ある特定の態様において、凍結乾燥に適した製剤はリン酸ナトリウム緩衝液をさらに含んでよい。特定のそのような態様において、凍結乾燥に適した製剤は、約2mM〜約20mMのリン酸塩濃度で存在しているリン酸ナトリウムを含み；好ましくはリン酸塩濃度は約5mM〜約15mMであり；より好ましくはリン酸塩濃度は、約6mM、約8mM、約10mM、約12mM、および約14mMからなる群より選択される。
【００９４】
リン酸塩の濃度は、pHに応じて、適用可能な相対濃度でのリン酸塩形態（H3PO4、(H2PO4)−、(HPO4)2−、または(PO4)3−）のうちのいずれかまたは3つの形態を包含し、生物学的pH範囲では、典型的に、(H2PO4)−、(HPO4)2−イオンを主なリン酸塩形態として含むと考えられることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、生理学的pHにおいて、リン酸ナトリウム緩衝液は、典型的に、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとの間の平衡によって提供される。
【００９５】
他の賦形剤
本発明の製剤/組成物のいずれかに他の賦形剤を添加してよい。他の賦形剤には、塩などの等張剤、および/または防腐剤、甘味料、着色料、充填剤などが含まれてよい。
【００９６】
特定の態様において、本発明の製剤/組成物は塩化ナトリウムをさらに含んでよい。例えば、凍結乾燥に適した製剤は、約10mM〜30mMの塩化物濃度で存在している塩化ナトリウムを含んでよく；好ましくは塩化物濃度は約15mMおよび25mMであり；より好ましくは塩化物濃度は、約18mM、約20mM、約22mM、および約24mMからなる群より選択される。
【００９７】
III．本発明の特有の製剤および他の局面
本発明者らは、特定範囲内の濃度の賦形剤の特定の組み合わせを有する、凍結乾燥に適した、rhBSSLを含む特定の製剤を本明細書において開示する。実施例において証明されるように、そのような製剤は、本明細書において記載されている1つまたは複数の特徴に改善を示す、rhBSSLの凍結乾燥製剤を形成することにおいて特定の有用性を有する。したがって、特定の態様において、本発明の凍結乾燥に適した製剤は、
・約10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在しているrhBSSL；
・約180mM〜210mMの濃度で存在しているマンニトール；
・約35mM〜50mMの濃度で存在しているグリシン；
・約2mM〜20mM、好ましくは約5mM〜15mMのリン酸塩濃度で存在しているリン酸ナトリウム；および
・約5mM〜50mM、好ましくは約15mM〜25mMの塩化物濃度で存在している塩化ナトリウム
を含み、
・該製剤は約6.3〜7.2のpH値を有する。
【００９８】
本明細書において記載される方法などによって、そのような（液体）製剤をフリーズドライすると、本明細書において記載されている1つまたは複数の特徴の改善を示すrhBSSLの凍結乾燥製剤が形成される。
【００９９】
したがって、本発明の別の局面は、本明細書において記載される、凍結乾燥に適した製剤の凍結乾燥によって得ることができる、例えばそれから得られた、凍結乾燥製剤に関する。
【０１００】
そのような局面のいくつかにおいて、凍結乾燥製剤中のrhBSSLは実質的に非結晶性形態で存在している。例えば、rhBSSLの約20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、または0.1％未満は結晶性形態であってよく、またはrhBSSLの結晶性形態は、例えばX線回折分析によって検出不能であってよい。好ましいそのような態様において、rhBSSLは無定形の形態で存在している。
【０１０１】
凍結乾燥製剤の特定の態様において、結晶性増量剤はマンニトールである。そのような態様のいくつかにおいて、マンニトールは実質的に結晶性形態で存在しており；かつ/またはrhBSSL 1mgあたり約1mg〜約10mgの相対量で含まれる。好ましくは、マンニトールは、rhBSSL 1mgあたり約2mg〜約5mg、より好ましくは約2.7mg〜約3.1mgの相対量で含まれる。成分に関する「実質的に存在している」とは、成分の約5％〜約50％、例えば約10％〜約50％または約25％〜約50％が所定の形態にあることを意味する。好ましい態様において、マンニトールは主に結晶性形態で存在している。成分に関する「主に存在している」とは、成分の約50％を上回る割合、例えば約60％、70％、80％、90％、または95％を上回る割合が所定の形態にあることを意味する。
【０１０２】
本発明者らは、本発明の凍結乾燥製剤のいくつかにおいて、結晶性増量剤以外の他の結晶性形態が驚くべきことに何も検出されなかったことを実証している。とくに、実施例4に記載される製剤に関して、結晶性グリシン、結晶性リン酸ナトリウムの証拠は全く存在せず、結晶性塩化ナトリウムの証拠さえ全く存在しなかった。
【０１０３】
したがって、凍結乾燥製剤の好ましい態様において、マンニトールは、実質的に結晶性形態で存在している、該製剤の唯一の成分である。例えば、マンニトールは、粉末X線回折分析を用いた検出などによって結晶が検出され得る、凍結乾燥製剤内の唯一の成分である。凍結乾燥製剤の代替的な態様において、マンニトールは、実質的に結晶性形態で存在している唯一の賦形剤であり；または、マンニトールは、製剤中に存在している唯一の増量剤であり；かつ/もしくは結晶性形態で存在している、例えば実質的に結晶性形態で存在している唯一の増量剤である。
【０１０４】
本発明の凍結乾燥製剤は、結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤を含む。本発明の凍結乾燥製剤の好ましいそのような態様において、無定形安定剤はグリシンであり；かつ、グリシンは実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/またはグリシンは、rhBSSL 1mgあたり約0.1mg〜約0.5mgの相対量で含まれている。好ましくは、グリシンは、rhBSSL 1mgあたり約0.1mg〜約0.4mg、より好ましくは約0.2mg〜約0.3mgの相対量で含まれる。より好ましい態様において、本発明の凍結乾燥製剤は、無定形安定剤としてグリシンを含み、該グリシンは無定形の形態で存在している。例えば、とくに、結晶性グリシンに特徴的な検出可能なピークが存在しないことにより、例えばD値17.906、23.693、および/または28.429 2θにおいて検出可能な粉末X線回折ピークが存在しないことなどにより、グリシンは粉末X線回折分析によって結晶性形態で全く検出され得ない。
【０１０５】
凍結乾燥製剤の特定のそのような好ましい形態において、グリシンは、製剤中に存在している唯一の安定剤であり、かつ/または実質的に非結晶性形態で存在している唯一の安定剤であり、さらにより好ましい形態において、グリシンは無定形の形態で存在している唯一の安定剤である。
【０１０６】
さらなる態様において、本発明の凍結乾燥製剤はリン酸ナトリウムを含み；好ましくは該リン酸ナトリウムは実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/または該リン酸ナトリウムは、rhBSSL 1mgあたり約0.015mg〜約0.25mgの相対量で含まれている。そのような態様において、リン酸ナトリウムには、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムが含まれてよい。
【０１０７】
本発明者らは、本発明の製剤のいくつかにおけるグリシン（リン酸ナトリウムの結晶化を促進することが知られている賦形剤）の存在にもかかわらず、結晶性リン酸ナトリウムが検出不能であるという驚くべき知見を実証している。したがって、ある特定の態様において、本発明の凍結乾燥製剤は、無定形の形態で存在しているリン酸ナトリウムを含む。
【０１０８】
なおさらなる態様において、本発明の凍結乾燥製剤は塩化ナトリウムを含み；好ましくは該塩化ナトリウムは実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/または該塩化ナトリウムは、rhBSSL 1mgあたり約0.02mg〜約0.3mgの相対量で含まれている。
【０１０９】
本発明者らは、塩化ナトリウムは通常結晶を容易に形成するにもかかわらず、結晶性塩化ナトリウムが検出不能であるという驚くべき知見を実証している。したがって、ある特定の態様において、本発明の凍結乾燥製剤は、無定形の形態で存在している塩化ナトリウムを含む。
【０１１０】
本発明者らは、特定範囲内の相対量で賦形剤の特定組み合わせを有する、rhBSSLを含む特定の凍結乾燥製剤を本明細書において開示する。実施例において証明されるように、そのような凍結乾燥製剤は、本明細書において記載されている1つまたは複数の特徴に改善を示す。したがって、特定の態様において、本発明の凍結乾燥製剤は、rhBSSL 1mgあたり：
・約2mg〜約5mg、好ましくは約2.7mg〜約3.1mgの相対量で存在しているマンニトール；
・約0.1mg〜約0.4mg、好ましくは約0.2mg〜約0.3mgの相対量で存在しているグリシン；
・約0.05mg〜約0.15mgの相対量で存在しているリン酸ナトリウム；および
・約0.06mg〜約0.18mgの相対量で存在している塩化ナトリウム
を含む。
【０１１１】
本発明のそのような特定の凍結乾燥製剤の好ましい態様において、マンニトールは実質的に結晶性形態で存在しており、好ましくはマンニトールは主に結晶性形態で存在しており；グリシンは無定形の形態で存在しており；リン酸ナトリウムは無定形の形態で存在しており；かつ/または塩化ナトリウムは無定形の形態で存在している。
【０１１２】
今や当業者に明白であるように、例えば約100g、約1Kg、約10Kg、約100Kg、約250Kg、または約500Kgのそのような凍結乾燥製剤を調製する大規模な製造バッチでなど、本発明の凍結乾燥製剤を変動的な絶対量で調製してよい。しかしながら、必要としている患者などの個体への投与に関しては、単回または複数回、任意の所定の投与または投与コースにおける個体にそのような量で投与され得る量の中でも、より少ない量が望ましい。
【０１１３】
したがって、別の局面において、本発明は、本明細書において記載される凍結乾燥製剤の単位用量である、そのような所望の量の本発明の凍結乾燥製剤に関し、ここでrhBSSLはそのような単位用量中に約1mg〜約500mgの絶対量で存在している。そのような単位用量の好ましい態様において、rhBSSLは約5mg〜約25mgの絶対量で存在しており、より好ましくは該量は、約8mg、約10mg、約12mg、約14mg、および約16mgからなる群より選択される。そのような単位用量の適用の非限定的な例として、約25mg〜約50mgを含むその単位用量は、成人の嚢胞性線維症および/または膵機能不全の患者の治療における有用性を有し得；約10mg〜約20mgを含むその単位用量は、早産児などの乳児の治療における有用性を有し得る。ある特定の態様において、単位用量全体を補充するのに「半分用量」が必要とされ得る場合、例えば早産児および/または軽量児への投与のためなどの体重に対して正確な用量が必要とされる場合など、本発明の単位用量は、約2mg〜10mgの絶対量で存在しているrhBSSLを含んでよく、例えばrhBSSLの量は、約4mg、約6mg、および約8mgより選択される。本明細書において記載されるように、当業者であれば、例えば本明細書において記載される活性アッセイを用いることによる酵素単位（U）の数などによって、活性rhBSSLの量の観点から、本発明の任意の凍結乾燥製剤または単位用量中のrhBSSLの量を今や容易に表現することができるであろう。
【０１１４】
ある特定の態様において、本発明の単位用量は早産児への投与に有用であり、かつ/または早産児への投与に特異的に適合している。例えば、該投与には消化管を介した液体乳児食の投与が含まれてよく、凍結乾燥製剤の単位用量は、投与前に乳児食中で再構成されている。ある特定の態様において、液体乳児食は、乳ベースまたは脂肪ベース（乳脂肪ベースまたは植物性脂肪ベースなど）の液体乳児食である。特定の態様において、液体乳児食は低温殺菌母乳であり、代替的な態様において、それは、同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060に開示されるものなどの乳児用調合乳である。消化管を介した投与は、哺乳瓶などによる哺乳によって好都合に行われ得る。あるいは、投与は、他の手段によって；例えば、乳児が口の奇形を有する場合に必要とされ得るような、スポイト、シリンジ、スプーン、または湿った布の使用によって達成されてよい。ある特定の態様において、極めて低体重の早産児または虚弱児に関してなど、投与は、胃管、胃瘻管、または十二指腸管を介して消化管へ直接なされてよい。
【０１１５】
早産児はとくに危険な状態であり、ゆえに慎重な哺乳および治療剤の投与を必要とする。よって、安定でありかつ従って長期間にわたってそれらの治療効果を保持する、そのような乳児への投与のための治療剤に対する大きな必要性が存在する。そのような乳児への投与のための治療剤の安定性の有意なまたは実質的な変化は、治療コースの間の、そのような乳児への不十分な投薬、過剰な投薬、または変動し得る投薬につながり得、これは、命に関わる結果を潜在的に有する。
【０１１６】
したがって、ある特定の態様において、本発明は、本明細書において記載される凍結乾燥製剤、または本明細書において記載される単位用量を含み、ここでrhBSSLは安定なrhBSSLを含む。「安定な」とは、rhBSSLおよび/または全体としての製剤の治療活性または治療能力が、推奨される用量で保存すると所望の期間維持されることを意味する。非限定的な例として、そのような所望の期間は少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約12ヶ月間、少なくとも約12ヶ月間、少なくとも約18ヶ月間、少なくとも約24ヶ月間、またはそれを上回る期間、例えば72ヶ月間であってよく；そのような推奨される保存温度は約−18℃、＋4℃、＋18℃、または約＋22℃であってよい。
【０１１７】
本発明のある特定の態様において、安定なrhBSSLを含む凍結乾燥製剤または単位用量は、例えばそのような期間にわたる保存の間および期間の間、凝集体を容易に形成しない。そのような態様のいくつかにおいて、凝集体は不溶性凝集体である。治療用製剤におけるrhBSSLの不溶性凝集体の存在は、たとえ経口で与えられるものであっても、とくに早産児に与えられるものは、投薬量、ゆえに治療の有効性および/または安全性にかなりの影響を及ぼし得る。したがって、rhBSSLの不溶性凝集体の量の低下は、rhBSSLの有効性のより少ない変動およびより安全な治療的使用に寄与し得るので望ましいと考えられる。非限定的な例として、凝集体を「容易に形成しない」には、＋25℃で6ヶ月間の保存後に、約5％未満、例えば約3％、2.5％、または2％未満のrhBSSL凝集体が存在していることが含まれる。例えば、本明細書において記載されるSE-HPLCによって、rhBSSL凝集体の量を定量化することができる。あるいは、凝集体形成の割合は、本明細書において記載される製剤N1について示されるもの未満であり得る。
【０１１８】
ある特定の態様において、凍結乾燥製剤または単位用量における凝集体の形成は、約0℃〜約＋40℃の温度での凍結乾燥製剤の保存の結果であり；好ましくは保存温度は、約＋5℃、約＋10℃、約＋15℃、約＋20℃、および約＋25℃からなる群より選択される。他の態様において、そのような凝集の形成は、表面相互作用、（UV）光、放射線、化学修飾、界面活性剤の存在によって生じ得る。
【０１１９】
ある特定の態様において、凍結乾燥製剤または単位用量の保管期間は、＋4℃、＋18℃、または約＋22℃で保存すると、例えば最高約18ヶ月間、25ヶ月間、または72ヶ月間まで延長される。
【０１２０】
さらに別の局面において、本発明は、rhBSSLの凍結乾燥製剤を作製する方法に関し、該方法は、本明細書において記載、定義、または請求される、凍結乾燥に適した製剤を提供する工程；および該製剤を凍結乾燥する工程を含む。該方法は、凍結乾燥に適した該製剤を凍結する工程；凍結した製剤を一次乾燥する工程；および一次乾燥した製剤を二次乾燥する工程を含んでよい。
【０１２１】
本方法の好ましい態様において、そのような方法の各工程は、本明細書においてそのような工程に対して記載または定義されるパラメーターを用いて行われ得る。例えば、本明細書における実施例4においてより詳細に示されるように、凍結乾燥に適した製剤を約0.8℃/時間の速度で約−50℃に冷却することによって凍結の工程を行ってよく、さらなるそのような態様において、凍結した製剤を、−50℃で5時間維持することによって平衡化してよい。一次乾燥に関して、そのような工程を、0℃の棚温度で約0.2mbarの真空を適用することによって行って、約13時間にわたり、および/または、氷晶の昇華が完了していることを示す棚の温度に試料の温度が到達するまで、継続してよい。チャンバー圧を約0.02mbarに下げ、かつ棚の温度を約1℃/時間の速度で約＋25℃に上げることによって、二次乾燥を開始してよく、産物が約0.8％〜0.2％の水分含有率を有するまで約10時間二次乾燥を継続することができる。凍結乾燥チャンバーに配置されたガラス製バイアル内で液体製剤の凍結乾燥を行ってよく；凍結乾燥が完了した時、次いで、バイアルを真空下でゴム栓で密閉する。
【０１２２】
関連する局面において、本発明は、上記に記載される方法によって得ることができる、例えばそれから得られた、rhBSSLの凍結乾燥製剤にも関する。
【０１２３】
rhBSSLを個体に投与するために、本発明の凍結乾燥製剤は通常再構成される；すなわち、（通常、水性ベースの）溶媒に溶解させて、該個体にとってより容易に生体利用可能であり得るrhBSSLの溶液を形成する。したがって、さらなる局面において、本発明は、rhBSSLの再構成製剤を作製する方法に関し、該方法は、本明細書において記載、定義、もしくは請求される凍結乾燥製剤、または本明細書において記載、定義、もしくは請求される単位用量のいずれかを提供する工程；および液体中で、例えば水性ベースの溶媒などの溶媒中で該凍結乾燥製剤または単位用量を再構成する工程を含む。
【０１２４】
特定のそのような方法において、結果として生じた再構成製剤は、約5.9〜7.9のpHを有し；好ましくは該pHは約6.4〜7.4であり；より好ましくは該pHは、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、および約7.3からなる群より選択される。
【０１２５】
さらなるそのような方法において、結果として生じた再構成製剤は、約2.5mg〜約50mgの量のrhBSSLを含み；好ましくは該量は約5mg〜約25mgであり；より好ましくは該量は、約7.5mg、約10mg、約12.5mg、約15mg、約17.5mg、および約20mgからなる群より選択される。
【０１２６】
本発明のある特定の用途は、ヒト乳児への投与に適したrhBSSLの製剤の提供に関する。したがって、本方法のある特定の態様において、凍結乾燥製剤または単位用量は液体乳児食中で再構成され、かつしたがって、該構成される製剤は液体乳児食中で再構成される。
【０１２７】
本発明のある特定の態様において、液体乳児食とは、低温殺菌母乳において凍結乾燥製剤または単位用量が再構成されて得られた、新鮮でない母乳である。他の態様において、母乳は、例えば低温殺菌後に凍結されている。特定の態様において、本発明において用いられる母乳は母乳バンクに由来する。母乳バンクには、寄付されたヒト乳を収集し、乳の安全性および質を確保し、かつ必要としている乳児にそれを利用可能にする全国組織であるNational Milk Bank（NMB）、または北米における母乳バンクの設立および運営のための基準を設け、かつそれらを容易にするために1985年に設立されたドナーヒト母乳バンクの非営利団体であるHuman Milk Banking Association of North America（HMBANA）が含まれてよい。
【０１２８】
代替的な態様において、凍結乾燥製剤または単位用量は乳児用調合乳中で再構成される。当業者であれば、 Enfamil（商標）、Pregestimil（商標）、Nutramigen（商標）、およびNutramigen AA（商標）（すべてMead Johnsonによって販売または製造されている）；Similac（商標）、Isomil（商標）、Alimentum（商標）、およびEleCare（商標）（すべてAbbott Laboratories, Ross 部門によって販売または製造されている）；世界で最大の調合乳製造業者であるNestleが製造しているGoodStart（商標）（Nestle/Gerber Products Companyによって販売または製造されている）；Farex1（商標）およびFarex2（商標）（Wockhardt Nutritionによって販売または製造されている）を含めた、市販されている多くの乳児用調合乳を知っているであろう。早産児には、Similac Neosure、Entramil Premature、Similac Special Care、Cow & Gate Nutriprem 2、およびEntramil Enfacareなどの他の乳児用調合乳も利用可能である。すべての乳児用調合乳に共通するのは、それらがrhBSSLなどのリパーゼに対する基質である脂質の供給源を含有していることである。特定の態様において、乳児用調合乳は、同時係属中の出願WO 2012/052059およびWO 2012/052060の証拠物件Aに示される仕様、またはESPGHANがコーディネートした国際専門家グループによる推奨（Koletzko et al, 2005; J Ped Gastro Nutr 41:584-599）にほぼ適合する、または実質的に同一である組成（rhBSSLの添加前）を有する。ある特定の態様において、乳児用調合乳は、証拠物件Bに示される成分の1つまたは複数を、およそそれに示されるレベルで含有する。とくに有利な態様において、乳児用調合乳は、（総脂肪に対して）少なくとも0.5％のドコサヘキサエン酸（DHA）および/またはアラキドン酸（AA）を含有し、AAの濃度が少なくともDHAの濃度に達しなければならないさらなるそのような態様において、および/またはエイコサペンタエン酸（C20:5 n-3）が添加される場合、その濃度はDHAの含有率を超えない。
【０１２９】
例えば＋25℃で9ヶ月間保存された本発明の凍結乾燥製剤または単位用量からの再構成rhBSSLを含むそのような液体乳児食は、いずれも＋25℃で9ヶ月間同様に保存された場合、先行技術のrhBSSL製剤（rhBSSLの水溶液）から作製されたか、またはいかなる増量剤もしくは安定剤も含まない凍結乾燥rhBSSLから作製された液体乳児食よりも低いレベルの不溶性凝集体を有すると予想される。
【０１３０】
特定の局面において、本発明は、
（i）10mg〜20mgの絶対量で存在しているrhBSSL；
（ii）27mg〜62mgの絶対量で存在しているマンニトール；
（iii）2mg〜6mgの絶対量で存在しているグリシン
を含む、rhBSSLの再構成製剤に関し、該製剤は液体乳児食中で再構成されており、かつ該再構成製剤は6.4〜7.4のpHを有する。
【０１３１】
本発明者らは、rhBSSLの凍結乾燥製剤におけるグリシンの使用によって、この特定タンパク質のそのような製剤にさらなる驚くべきかつ有利な特性が提供されることを本明細書においてさらに実証している。したがって、別の局面において、本発明は、凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSLを安定化するグリシンの使用に関し、
・該グリシンは、該凍結乾燥製剤中で実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/または
・該グリシンは、該凍結乾燥製剤中に該rhBSSL 1mgあたり約0.1mg〜約0.4mg、好ましくは約0.2mg〜約0.3mgの相対量で含まれている。
【０１３２】
凍結乾燥製剤は、グリシンではない結晶性増量剤をさらに含み、例えば結晶性増量剤はマンニトールである。そのような局面の好ましい態様において、凍結乾燥製剤中に存在しているグリシンは無定形の形態で存在している。
【０１３３】
そのような使用のより好ましいそのような態様において、凍結乾燥製剤は、rhBSSL 1mgあたり、
・約2mg〜約5mg、好ましくは約2.7mg〜約3.1mgの相対量で結晶性増量剤として該凍結乾燥製剤中に含まれるマンニトール；
・約0.05mg〜約0.15mgの相対量で該凍結乾燥製剤中に含まれるリン酸ナトリウム；
・約0.06mg〜約0.18mgの相対量で該凍結乾燥製剤中に含まれる塩化ナトリウム
をさらに含む。
【０１３４】
そのような使用のなおさらなる好ましいそのような態様において、そのような凍結乾燥製剤中に：
・マンニトールは実質的に結晶性形態で存在しており；
・グリシンは無定形の形態で存在しており；
・リン酸ナトリウムは無定形の形態で存在しており；かつ
・塩化ナトリウムは無定形の形態で存在している。
【０１３５】
ある特定の態様において、そのようなグリシンの使用によって、増大した安定性を有するrhBSSLの製剤が提供される。したがって、特定の態様において、rhBSSLの安定化は、該rhBSSLの凝集体の形成の速度によって特徴決定される。例えば、凝集体の形成は、約0℃〜約＋40℃の温度での凍結乾燥製剤の保存の結果であり；好ましくは保存温度は、約＋5℃、約＋10℃、約＋15℃、約＋20℃、および約＋25℃からなる群より選択される。
【０１３６】
したがって、関連する局面において、本発明は、液体乳児食中に存在する、rhBSSLの不溶性凝集体の形成を低下させかつ/または最小限に抑える方法に関し、該方法は、本明細書において記載、定義、または請求される凍結乾燥製剤または単位用量を提供する工程；および該凍結乾燥製剤または単位用量を液体乳児食中で再構成する工程を含む。
【０１３７】
そのような方法のある特定の態様において、製剤または単位用量を液体乳児食に直接添加し、それをその中で溶解させる。代替的な態様において、凍結乾燥製剤または単位用量を第一の液体（水など）にまず溶解させ、次いでそれを液体乳児食に添加する。
【０１３８】
そのような方法の他の態様において、そのような方法を実践して、不溶性凝集体の量と比べて、液体乳児食中に溶液状態で存在している活性rhBSSLの量を増大させ；かつ/または異なる液体乳児食間でのrhBSSLの効力の変動を低下させる。
【０１３９】
本発明の製剤および/または組成物の特徴決定における1つの重要な方法は、rhBSSL凝集の程度の決定である。したがって、本発明のさらなる一局面は、rhBSSLの凝集の低下を決定する方法に関し、該方法は、本明細書において記載、定義、または請求される凍結乾燥製剤または単位用量を提供する工程；該凍結乾燥製剤または単位用量を保存する工程；および該凍結乾燥製剤または該単位用量中のrhBSSLの高分子量パーセンテージ（％HMW）レベルを1つまたは複数の時点で決定し、それによって該rhBSSLの凝集のレベルを決定する工程を含む。rhBSSL凝集の程度および/またはレベルを、任意の適切な方法によって、例えば本明細書における実施例に記載される、rhBSSLの％HMWレベルを検出するためのSE-HPLCなどによって決定かつ/または定量化してよい。
【０１４０】
好ましいそのような方法において、該方法は、凍結乾燥製剤が、＋5℃で18ヶ月間の保存後に、SE-HPLCによって決定される約3.5％、3.0％、2.5％、2.25％、2.0％、1.75％、または1.5％未満のrhBSSLのHMW種を含んでいるかどうかを判定する工程を含む。
【０１４１】
特有の課題または環境への本発明の教示の適用は、本明細書において含有される教示に照らして当業者の能力の範囲内であることは理解されるべきである。本明細書において引用されるすべての参考文献、特許、および刊行物は、参照によりそれらの全体として本明細書によって組み入れられる。本発明の製剤および組成物の例、ならびにそれらの調製または使用のための代表的な方法、使用、またはプロセスは、以下に述べる。
【実施例】
【０１４２】
行われた実験および達成された結果を含めた以下の例示は、現時点における本発明の様々な特定の態様も例証しており、かつ例証目的のためだけに提供されるものであって、本発明を限定するものとして見なされるべきではない。
【０１４３】
実施例1：実験AH7507
実験の設定：rhBSSLの凍結乾燥製剤の特性に対する結晶化増量剤および任意で無定形安定剤の効果を、2つの中心点を有する2水準の完全実施要因計画（full factorial 2 level design）（22）を用いて調査した。様々な組み合わせおよび量の賦形剤を用いて、表1に提示される組成を有する7種の凍結乾燥製剤を作製した。18ヶ月間保存されることになる試料に対する実施要因計画に第三の要因として温度を加え（＋5℃および＋25℃で18ヶ月間の保存）、より短い期間の9ヶ月間について、試料を＋40℃でも保存した。保存の間の定期的な時点で、試料を様々な凍結乾燥製剤から採取し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）、粉末X線回折（PXRD）、および他の技術を用いて調査した。
【０１４４】
（表１）AH7507の凍結乾燥製剤の凍結乾燥粉末中のrhBSSLおよび賦形剤の量
2014527982.tif 000003
*2種のリン酸ナトリウム成分の材料の重量平均分子量および質量から算出されたリン酸ナトリウムの量。
【０１４５】
結果（i）SE-HPLCによって調査されたrhBSSLの単量体化および凝集：長期保存の間、単量体形態のrhBSSLは主要ピークとして検出され、より高分子量のピークとして検出されるrhBSSL凝集体の形成を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）を用いて調査した。2つの応答が凝集として連結されるか、またはrhBSSLが、結果によって、rhBSSL単量体の残存量を低減していると考えられる。図1は、様々な期間にわたり＋5℃で保存した後の様々な凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSL単量体の量を示しており（SE-HPLC主要ピークによって定量化される）、図2は、＋25℃で保存した後の同じものを示しており、図3は、＋40℃で保存した後の同じものを示している。
【０１４６】
驚くべきことに、rhBSSL単量体のパーセンテージが、結晶化増量剤（本実施例ではマンニトール）を含有する試験したすべての製剤について、rhBSSLの別の製剤（実施例3を参照されたい）であるいかなる増量剤もしくは安定剤も含まないバルク凍結乾燥rhBSSL、および/またはrhBSSLの水溶液よりも高いだけでなく、ここで表される結果の点検により、0mg/バイアルを上回るが7.21mg/バイアル未満である量のグリシンを含む凍結乾燥製剤N4、N6、およびN7は特に、グリシンを含まないかまたは1バイアルあたり7.21mgのグリシンを含む他の製剤と比較して、rhBSSL単量体の喪失速度が低下していることが示される。この効果は、＋25℃で約12ヶ月間の保存後に最も明確に観察されるが、＋5℃での同じ期間の保存後、および＋40℃の最も極端な条件での約3ヶ月間〜6ヶ月間の保存後にも証拠は見られる。
【０１４７】
図1〜6において、凍結乾燥前に各液体製剤中に存在していたグリシンの濃度の大まかな分類は、77mMの「高い」グリシン濃度を表す黒塗り記号、0mMの「低い」グリシン濃度を表す白抜き記号、ならびに27mM（N6およびN7について）および33mM（N4について）の「中程度の」グリシン濃度を表す斜線記号を用いた、プロット記号の陰影付けによっても示される。この符号化は、とくに＋40℃の温度において、「中程度の」グリシン濃度から得られた製剤のより高い安定性に関するこれらのグラフの解釈に役立つ。
【０１４８】
特に特定の範囲内の量におけるグリシンのこの驚くべき付加的安定化効果が付加的に見出され、これは、調査された3つの温度での保存後に他の製剤と比較した、製剤N4、N6、およびN7のより低い速度のrhBSSL凝集体の形成により支持されている。図4は、様々な期間にわたり＋5℃で保存した後の様々な凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSL凝集体の量を示しており（SE-HPLCの高分子量の主要ピークによって定量化される）、図5は、＋25℃で保存した後の同じものを示しており、図6は、＋40℃で保存した後の同じものを示している。この効果は、＋25℃および＋40℃のより高い保存温度でよりはっきりと見られる。
【０１４９】
結果（ii）rhBSSLの不溶性凝集体：重要なことに、rhBSSLの凝集体は、例えば0.1％ SDSを含有する緩衝液中で撹拌すると、容易に可溶化されないことが見出されている。
【０１５０】
結果（iii）PXRDによって調査された製剤の成分の結晶化：粉末X線回折（PXRD）を用いて、ゼロ時点から最後の保存試料採取までの実験の間の様々な時点における、実験AH7507の各製剤の成分の結晶性形態を判定した。所定の製剤に対するすべての試料採取の時点で、凍結乾燥試料N1〜N7中の結晶性マトリックスは主にδマンニトールと思われることがPXRDにより示されるという同様の結果が得られ、製剤N4では少量のβマンニトールの出現が検出された。PXRDによって、結晶性rhBSSLの証拠は検出されなかった。
【０１５１】
驚くべきことに、グリシンはフリーズドライの間に容易に結晶化するという先行技術の教示にもかかわらず、製剤N4、N6、またはN7において結晶性グリシンを検出することはできず；それらの製剤は、上記のSE-HPLC調査から、rhBSSL単量体の喪失の低下および（不溶性）rhBSSL凝集体の形成の低下という観点では安定性の改善を示していると思われた。しかしながら、存在しているグリシンの最大量（7.21mg/バイアル）を有する製剤である製剤N5では、結晶性βグリシンが検出された。図7において、製剤N4、N5、N6、およびN7に対するPXRDパターンを比較のために重ね合わせている。製剤N5においてβグリシンの存在を示すピークに矢印を付けているが、驚くべきことにこれは、他のいずれのグリシン含有製剤においても存在しない。
【０１５２】
さらに驚くべきことに、どちらの塩もフリーズドライの際に容易に結晶を形成すると一般的に考えられているにもかかわらず、製剤N4〜N7のいずれにおいても、結晶性の塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウムの証拠は検出されなかった。
【０１５３】
結果（iv）多重線形回帰（MLR）分析：保存の最終時点で試料採取された製剤から得られたデータを、Modde 9.0（Umetrics AB）においてMLR分析によって評価した。＋40℃で保存された9ヶ月の時点、ならびに＋5℃および＋25℃で保存された試料に対する18ヶ月の時点に対して、分析を実施した。＋40℃で9ヶ月間の保存由来の試料を、特異的酵素活性、SE-HPLC主要ピーク（rhBSSL単量体）、およびHMWピーク（rhBSSL凝集体）に基づいて評価した。＋5℃および＋25℃で18ヶ月間保存された試料を、両方の温度由来の試料が同一モデルで評価されるモデルに温度を加えることで、MLRによって評価した。
【０１５４】
＋40℃で保存された試料からのデータに適用されるMLRモデルについて、rhBSSL単量体（SEC-HPLC主要ピーク）の評価において、マンニトールのわずかな効果が観察され：マンニトールの二乗（square）効果は、SE-HPLC主要ピークに対するマイナスの効果を示した（すなわち、マンニトールの量の二乗の増大は、rhBSSL単量体の量の低下と弱く関連している）。このマイナスの効果は低く、95％信頼区間からちょうど分離していた。検討した要因のいずれも、特異的酵素活性に対していかなる有意な効果も示さなかった。
【０１５５】
＋40℃で保存された試料からのデータに適用されるMLRモデルについて、rhBSSL凝集体（SEC-HPLC HMWピーク）の評価において、グリシンの有意な効果が観察され：グリシンの存在および量は、SE-HPLC HMWにおける分散の大部分（R2 0.991）を占めた。単一時点についての本分析から、Q2（交差検証したR2）は−10.032で比較的低かったが、この結果は図6に見られる傾向によって支持され、グリシンは0〜7.21mg/バイアルの中間量で最も効果的な安定化効果を有すると思われる。これは図8においてよりはっきりと見られ、ここで、最も有利でない製剤はグリシンが完全に欠如しているもの（N1、N2、およびN3−「カテゴリー1」）であり、なぜならこれらが最高パーセンテージのSE-HPLC HMWを有する製剤であるからであることが示されている。ほぼ同じくらい高いパーセンテージのSE-HPLC HMWが、同様に本試料における好ましくない製剤を示す試料N5（カテゴリー1）において見られる。中間量のグリシンを有する製剤（N4、N6、およびN7−「カテゴリー2」）において、SE-HPLC HMWのパーセンテージは有意により低い。これらのカテゴリー2の試料はグリシンを含むものであるが、PXRDにおいて、結晶性βグリシンの存在の証拠を何も示さなかった。これらのデータは、グリシンの存在、とくに特定の量の範囲内のかつ/または非結晶性形態のグリシンの存在が、フリーズドライ試料中の凝集体の形成を阻害する/その量を低減する効果を有することを示す。総HMWピークの相対％の増大を用いて提示されたこれらのデータの解釈は、中間のグリシン濃度がrhBSSL凝集体の形成を低下させるのに有利であることだけでなく、（N4に対するN6/N7の比較により、）いくらかのマンニトールの存在が、＋40℃で9ヶ月間の保存後に（不溶性）rhBSSL凝集体の量を低下させることによるさらなる相乗効果を有することを示唆している。
【０１５６】
＋40℃で保存された試料に適用されるMLRモデルを用いて、最低量のSE-HPLC HMWに関して1種の好ましい製剤の組成を設計し、これは該モデルによって、（同じ量/割合の塩およびrhBSSLとともに）1バイアルあたり4mgのグリシンおよび1バイアルあたりおよそ50mgのマンニトールからなると判定された。
【０１５７】
＋5℃および＋25℃で保存された試料からのデータに適用されるMLRモデルについて、図9では、SE-HPLC主要ピーク（rhBSSL単量体）に対する要因の効果によって、保存温度は予想どおりマイナスの効果を有した（すなわち、保存温度の増大は、rhBSSL単量体の減少と関連している）と示されたが、グリシン要因の二乗はマイナスに寄与し、これが該モデルの湾曲（curvature）を示しかつ最適なグリシン濃度の存在を示唆しているとも示されたことを、示している。線形要因としてのグリシンは、それ自体ではSE-HPLC主要ピーク応答に対して有意な効果を有しなかった。モデルは、R2 0.865およびQ2 0.733で記載され、要因によって説明される高比率の分散、および優れた予測可能性の両方を示した。
【０１５８】
＋5℃で保存された試料からのデータに適用されるMLRモデルを用いて、等高線プロットを用いたSE-HPLC主要ピーク（rhBSSL単量体）における最大値に関するグリシンの量についての別の好ましい製剤を設計し、これは、グリシンが2.1〜4.9mg/バイアルの間で変動し得、かつ＋5℃での18ヶ月間後に≧95.9％のSE-HPLC主要ピークを依然としてもたらし得ると判定された。等高線プロットは、グリシン最適条件を見ることができる図10に提示されている。＋25℃での保存からの結果に対して同様の判定を行い、この保存温度において、ほぼ同じグリシン最適条件であるがわずかにマイナスに影響を受けたSE-HPLC主要ピークのパーセンテージを得た。
【０１５９】
変動し得る応答としてのSE-HPLC HMW（rhBSSL凝集体の量）に関する、＋5℃および＋25℃で保存された試料からのデータに適用されるMLRモデルについて、要因の効果は、SE-HPLC主要ピーク（rhBSSL単量体）に対して観察されたものと完全に逆のものに近かった。これは、SE-HPLC HMWおよび主要ピークが同じ分析方法からの応答であり、ある程度つながりがある（rhBSSL凝集体の増大はrhBSSL単量体のいくらかの低下をもたらす）という事実と関係している。したがって、変動し得る応答としてのSE-HPLC HMW（rhBSSL凝集体の量）に関する本モデルにおいて、保存温度およびグリシン量の二乗は、図11に見られるように、SE-HPLC HMW（rhBSSL凝集体）に対して有意な効果を有すると見られ、より高温での保存におけるより多くの凝集形成および該モデルにおけるグリシン量に関する湾曲を有した。＋5℃および＋25℃で18ヶ月間の保存後のrhBSSL凝集体形成を記載する本モデルは、総分散（R2＝0.914）および高い予測可能性（Q2 0.853）の大部分を占めた。
【０１６０】
＋5℃で保存された試料からのデータに適用されるMLRモデルを用いて、等高線プロットを用いたSE-HPLC HMWピーク（rhBSSL凝集体）における最小値に関するグリシンの量についてのさらなる好ましい製剤を設計し、これは、グリシンが2.3〜4.5mg/バイアルの間で変動し得、かつ＋5℃での18ヶ月間後に2.0％未満のrhBSSL凝集体（SE-HPLC HMW）を依然としてもたらし得ると判定された。等高線プロットは、グリシン最適条件を見ることができる図12に提示されている。＋25℃での保存に対して同様の判定を行い、この保存温度において、ほぼ同じグリシン最適条件であるがSE-HPLC HMWピークのパーセンテージが僅かに変動した。
【０１６１】
凍結乾燥：適当な量および濃度でrhBSSLおよびそれぞれの賦形剤を含む適当な液体製剤の凍結乾燥による各製剤N1〜N7に対して、それぞれすべての保存条件および試料採取時間に十分な多数のバイアルを準備した。異なる液体製剤のバイアルを凍結乾燥し、各凍結乾燥製剤N1〜N7の単位用量形態（バイアル）を、以下に概説されるように調製した：下記のように調製された液体前製剤を、それぞれが1.25mLの液体製剤を含有するISO規格（Mglas）の透白色の6mL（6R）ガラスバイアルに分割し、分割されたバイアルのバッチを凍結乾燥機（LyoStar II, FTS systems）内に配置する。試料を、およそ0.8℃/時間の速度で−50℃に冷却し、−50℃で5時間平衡化させ、0℃の棚温度で62時間維持される0.3mbarの真空を適用することによって一次乾燥を行う。この時間の間、試料の温度は棚の温度に到達し、氷晶の昇華が完了していることを示す。チャンバー圧を0.02mbarに下げ、かつ棚の温度を約0.3℃/時間の速度で＋10℃に上げることによって、二次乾燥を開始する。産物が約1％〜0.2％の水分含有率を有するまで約20時間二次乾燥を継続し、その後すぐにバイアルを真空下でゴム栓（West Pharmaceutical Services）で密閉する。
【０１６２】
凍結乾燥に適した液体製剤：凍結乾燥前の様々な液体製剤の最終組成は表2に記載されるとおりであったという点、および各バイアルは1.25mLで満たされていたという点を除いて実施例4の適当な節に概説されたとおりに、凍結乾燥製剤N1〜N7のそれぞれを調製するために用いられた各液体製剤のバッチを同様に調製し、凍結乾燥前に適当な数のバイアルに分割した。各液体製剤のpHは、6.6〜7.2であることが典型的に見出された。
【０１６３】
（表２）凍結乾燥製剤N1〜N7を形成するのに適したrhBSSLの液体製剤の組成
2014527982.tif 000004
*2種のリン酸ナトリウム成分の材料の重量平均分子量および質量から算出されたリン酸ナトリウムのモル濃度。
【０１６４】
保存条件： 各凍結乾燥製剤のバイアルを、＋5℃、＋25℃、および＋40℃の3つの保存温度での保存間で無作為化し、温度毎に用いたバイアルの数は、経時的に試料採取を行うのに十分であった。各保存条件について、所定の時点における分析のためにバイアルが取り出されることになる時にのみ開いている遮光の外部容器またはキャビネット内にバイアルを保存した。以下の範囲内：＋5℃については＋2℃〜＋8℃；25℃については＋23℃〜＋27℃；＋0℃については＋38℃〜＋42℃で、所望の温度を維持した。
【０１６５】
分析（i）PXRD：各凍結乾燥製剤N1〜N7の試料を粉末X線回折（PXRD）分析に供して、さまざまな成分の結晶状態を検討した。簡潔には、Cu Kα1放射線（1.5406Å）を用いた、試料回転能を備えたθ/2θ回折計（疑似集中（parafocusing）Bragg-Brentanoジオメトリー）（X'pert PRO, Philips Analytical, Netherlands）でX線粉末回折分析を実施した。0.013°のステップサイズで5°から50°2θまで試料を検討した。NIST標準参照材料に対して、回折計アライメントを試験した。試料調製：凍結乾燥材料を、ゼロバックグラウンドのシリコンウエハーを含有するスチール製の試料ホルダーに配置し、次いでKaptoneホイルで被覆した。FULLPROF（Rodriguez-Carvajal, 2001 Commission on Powder Diffraction (IUCr) Newsletter 26;12-19）、DICVOL06、TREOR90、X'Pert HighScore Plus、およびMDI JADE 8を含む標準的な結晶学的ソフトウェアを用いて、回折データを評価した（指標付けおよびRietveld精密化）。
【０１６６】
分析（ii）SE-HPLC：保存からバイアルを取り出したらすぐに、それが含有する凍結乾燥製剤を、約5分間拡散することによって1.0mLの脱イオン水中で迅速に再構成し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーに供して、rhBSSL単量体（主要ピーク）またはrhBSSL凝集体（高分子量ピーク）の量の任意の変化を検出した。簡潔には、TSK-gel Super SW3000 30×4.6mm（Tosoh Bioscience）でサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。ダイオードアレイ検出器を備えたAgilent 1100シリーズHPLCを用いて、0.15mL/分の流速で10mMリン酸ナトリウム、0.4M塩化ナトリウム、pH7中でカラムを平衡化して実行した。試料を、不純物を含まないrhBSSLの参照標準物質と比較した。ロードした試料は1μgであり、214nmでのUV吸収をモニターすることによってタンパク質を検出した。データをChemstation PlusおよびChemstoreソフトウェア（Agilent technologies）で評価した。
【０１６７】
実施例2：実験AH7513およびAH7517
実験の設定：rhBSSLの凍結乾燥製剤の特性に対する無定形安定剤としてのグリシンの効果を、2つのさらなる実験AH7513およびAH7517でさらに調査した。様々な組み合わせおよび量の賦形剤を用いて、表3に提示される組成を有するさらなる4種の凍結乾燥製剤を作製した。＋5℃、＋25℃、および＋40℃において様々な時間、試料を保存した。保存の間の定期的な時点で、試料を様々な凍結乾燥製剤から採取し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）、粉末X線回折（PXRD）、および他の技術を用いて調査した。
【０１６８】
（表３）AH7513およびAH7517の凍結乾燥製剤の凍結乾燥粉末中のrhBSSLおよび賦形剤の量
2014527982.tif 000005
*2種のリン酸ナトリウム成分の材料の重量平均分子量および質量から算出されたリン酸ナトリウムの量。
【０１６９】
結果（i）SE-HPCによって調査されたrhBSSLの単量体化および凝集：長期保存の間、単量体形態のrhBSSLは主要ピークとして検出され、より高分子量のピークとして検出されるrhBSSL凝集体の形成を、実施例1に記載されるSE-HPLCを用いて調査した。図13は、様々な期間にわたり＋5℃で保存した後の様々な凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSL単量体の量を示しており（SE-HPLC主要ピークによって定量化される）、図14は、＋25℃で保存した後の同じものを示しており、図15は、＋40℃で保存した後の同じものを示している。
【０１７０】
図13〜図18のすべての図において、凍結乾燥前に各液体製剤中に存在していたグリシンの濃度の大まかな分類は、56mMの「高い」グリシン濃度を表す黒塗り記号、0mMの「低い」グリシン濃度を表す白抜き記号、ならびに44mM（G2について）および50mM（G3について）の「中程度の」グリシン濃度を表す斜線記号を用いた、プロット記号の陰影付けによっても示される。この符号化は、「中程度の」グリシン濃度から得られた製剤のより高い安定性に関するこれらのグラフの解釈に役立つ。
【０１７１】
図16、図17、および図18は、製剤G2およびG3におけるrhBSSL凝集体の蓄積の低下を示している。この効果は、より高い保存温度でより著しい。
【０１７２】
結果（ii）PXRDによって調査された製剤の成分の結晶化：実施例1に概説されたように、粉末X線回折（PXRD）を用いて、ゼロ時点から最後の保存試料採取までの実験の間の様々な時点における、実験AH7513およびAH7517の各製剤の成分の結晶性形態を判定した。
【０１７３】
驚くべきことに、かつ図19から見ることができるように、製剤F1中に存在しているグリシンは結晶性形態で存在していると思われ、一方で製剤G2またはG3において（データ示さず）、PXRDによって結晶性形態のグリシンを検出することはできず、そのような製剤中のグリシンは無定形の形態にあると思われる。製剤G2またはG3における無定形グリシンの存在は、実施例1で最初に検出された有利な特性であるrhBSSL単量体の喪失の低下（図13〜図15）およびrhBSSL（不溶性）凝集体の蓄積の低下（図16〜図18）と相関し、かつそれらを裏付ける。
【０１７４】
結果（iii）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を用いて、rhBSSL凝集を視覚的に明らかにする。図20に示されるように、＋25℃での12ヶ月間後の製剤G2およびG3におけるHMW凝集体の量は、ゼロ時点での製剤F1、または＋5℃で12ヶ月間の保存後のF1もしくはF2で明らかにされたものと同程度であるように思われる。
【０１７５】
凍結乾燥：適当な量および濃度でrhBSSLおよびそれぞれの賦形剤を含む適当な液体製剤の凍結乾燥による各製剤F1、F2、G1、およびG2に対して、それぞれすべての保存条件および試料採取時間に十分な多数のバイアルを準備した。異なる液体製剤のバイアルを凍結乾燥し、各凍結乾燥製剤F1、F2、G1、およびG2の単位用量形態（バイアル）を、実施例1の適当な節に概説されたとおりに、しかしながら1バイアルあたり1.20mLの満容量を用いて、調製した。
【０１７６】
凍結乾燥に適した液体製剤：凍結乾燥前の様々な液体製剤の最終組成は表4に記載されるとおりであったという点、および各バイアルは1.20mLで満たされていたという点を除いて実施例4の適当な節に概説されたとおりに、凍結乾燥製剤F1、F2、G1、およびG2のそれぞれを調製するために用いられた各液体製剤のバッチを同様に調製し、凍結乾燥前に適当な数のバイアルに分割した。各液体製剤のpHは、6.6〜7.2であることが典型的に見出された。
【０１７７】
（表４）凍結乾燥製剤F1、F2、G1、およびG2を形成するのに適したrhBSSLの液体製剤の組成
2014527982.tif 000006
*2種のリン酸ナトリウム成分の材料の重量平均分子量および質量を用いて算出されたリン酸ナトリウムのモル濃度。
【０１７８】
分析：実施例1に概説されたように、凍結乾燥製剤F1、F2、G1、およびG2の試料を、液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）、粉末X線回折（PXRD）を用いて分析した。4-12％勾配PAゲル内での標準的手順を用いて、SDS-PAGEを行った。1％のドデシル硫酸リチウム（LDS）濃度またはおよそ40μg/μgタンパク質（試料中、0.25μgタンパク質/mL）で、試料をLDS緩衝液に溶解させた。
【０１７９】
実施例3：rhBSSLの液体製剤の比較
本発明の凍結乾燥製剤の優位性についてのさらなる証拠として、rhBSSLの液体製剤（下記の実施例4に記載されるように作製された原薬（DS））を、＋25℃で最高3ヶ月間の保存による類似の安定性試験に供した。＋25℃で3ヶ月間の保存後、DSについてのSE-HPLCは、93.3％の主要ピーク（rhBSSL単量体）および3.6％の統合させた総HMWピーク（rhBSSL凝集体を表す）を示した。これは、驚くべきことに、本発明の凍結乾燥製剤のいずれよりも不安定である。例えば、実験AH7505の製剤N1（グリシンを含有しないが、「低」量のマンニトールを含有する）でさえ、同じ温度で18ヶ月間の保存後でさえ、それほどの主要ピーク％を喪失せず、またはそれほどのHMWピーク％を生じなかった（それぞれ図2および図5を参照されたい）。さらに、最適化した凍結乾燥製剤G2およびG3は、＋40℃で6ヶ月間の保存にもかかわらず、95％前後の主要ピークおよび約2.6％を超えない総HMWピークを依然として保持した。
【０１８０】
実施例4：rhBSSLに対する最適化した凍結乾燥製剤およびその単位用量
上記などの実験の結果に基づき、rhBSSLの1種の最適化した凍結乾燥製剤を下記に記載されるように調製し、すべての工程はGMP条件下で行われる。
【０１８１】
原薬の作製：SEQ ID NO：2に示される予測アミノ酸配列を有する原薬であるヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼを、標準的手順に従って、例えば、ヒトBSSLをコードするヌクレオチド配列を含む核酸発現系を含有する組換えチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞からの発現によって作製する。
【０１８２】
そのような方法についての簡潔な記載として、（Nilsson et al, 1990; Eur J Biochem, 192:543-550によって記載される）リーダー配列を含む全長hBSSLをコードする2.3Kb cDNAを、pS146（Hansson et al, 1993; J Biol Chem, 268:26692-26698）から得て、発現ベクターpAD-CMV 1（Boehringer Ingelheim）−遺伝子発現用のCMVプロモーター/SV40ポリAシグナルおよび選択/増幅用のdhfr遺伝子を含む、pBRベースのプラスミド−内にクローニングして、pAD-CMV-BSSLを形成する。次いで、DHFR陰性CHOss細胞（Boehringer Ingelheim）のトランスフェクションのために−ジェネティシン（G418）耐性を選択するネオマイシン耐性をコードするプラスミドpBR3127 SV/Neo pAの共トランスフェクションと一緒での−pAD-CMV-BSSLを用いて、DHFR陽性BSSL産生CHO細胞を生成する。結果として生じたCHO細胞をより大量のrhBSSLを発現する条件およびスケール下で培養する。例えば、マスターセルバンク（MCB）からの細胞を融解し、後にグルタミンおよびグルコースが補充される、グルタミンおよびグルコースを含まないEx-Cell 302培地（SAFC）を用いた振とうフラスコ内で増やし、その後15Lおよび100Lバイオリアクター内で増殖させた後に、流加培養過程でBSSLが構成的に発現かつ産生される700L産生用バイオリアクターに接種する。培養物を単一バッチとして回収し、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含むいくつかの下流工程を介して、成熟rhBSSLポリペプチド（すなわち、リーダー配列を含まない）を細胞、細胞残屑、および他の夾雑物から精製する。低pH処理および乾熱処理工程によって、夾雑ウイルスを不活性化できる。rhBSSL原薬（DS）バルクをダイアフィルターに供し（diafileter）、およそ20〜25mg/mLに濃縮する。
【０１８３】
BSSLに対する基質としての4-ニトロフェニルエステル酪酸（PNPB）、および4-ニトロフェノールの放出の検出を用いて、バルクDSの比活性を決定する。簡潔には、rhBSSLの希釈系列（例えば、20〜160ng活性/mL）を、0.1％ BSAを含むPBSで調製する。これらのrhBSSL溶液の200μlを、0.1％ BSAを含むPBS中に20mMコール酸ナトリウム（胆汁酸塩活性化因子として）を含有する25μlの活性化溶液に添加する。これらの溶液を、＋27℃で5分間、分光光度計内でプレインキュベートする。測定の直前に、PBS-Tween中に5mM PNPBを含有する25μlのよく混合された基質溶液を添加する。4-ニトロフェノールの形成を400nmでのその吸光度によって検出することができ、吸光度の増大を90秒間測定する。rhBSSL参照標準物質の検量線を用いて、BSSLの活性量を決定する。
【０１８４】
凍結乾燥に適した液体製剤：マグネチックスターラーを備えた300L前後の管内で撹拌しながら、10mMリン酸ナトリウム、25mM塩化ナトリウム、pH7を用いて、バルクrhBSSL DSの溶液の濃度を10130U/mLに調整し、表5に一覧にした賦形剤を、凍結乾燥に適したrhBSSLの液体製剤を形成することが示された最終濃度まで添加する。そのような製剤のpHは、典型的に6.6〜7.2である。
【０１８５】
（表５）凍結乾燥に適したrhBSSLの液体製剤の組成
2014527982.tif 000007
*それぞれのリン酸ナトリウム成分の材料の分子量および質量を用いて算出されたリン酸ナトリウムのモル濃度。
【０１８６】
単位用量の凍結乾燥および調製：上記で調製された液体製剤を、それぞれが1.26mLの液体製剤を含有するISO規格（Sofferia Bertolini）の透白色の6mL（6R）ガラスバイアルに分割し、分割されたバイアルのバッチを凍結乾燥機（Lyomax 33, BOC Edwards）内に配置する。試料を、およそ0.8℃/時間の速度で−50℃に冷却し、−50℃で5時間平衡化させ、0℃の棚温度で13時間維持される0.2mbarの真空を適用することによって一次乾燥を行う。この時間の間、試料の温度は棚の温度に到達し、氷晶の昇華が完了していることを示す。チャンバー圧を0.02mbarに下げ、かつ棚の温度を約1℃/時間の速度で＋25℃に上げることによって、二次乾燥を開始する。産物が約0.8％〜0.2％の水分含有率を有するまで約10時間二次乾燥を継続し、その後すぐにバイアルを真空下でゴム栓（West Pharmaceutical Services）で密閉する。
【０１８７】
上記で記載されるように作製された各バイアルは、表6に一覧にした成分とともに、かつ一覧にした量で、rhBSSLを含む凍結乾燥製剤の単位用量形態である。この製剤の粉末X線回折（実施例1に記載される）は、グリシン結晶の証拠を示しておらず（図15を参照されたい）、かつリン酸ナトリウム結晶または塩化ナトリウム結晶の証拠も示していない。
【０１８８】
（表６）rhBSSLを含む最適化した凍結乾燥製剤の1バイアルあたりの組成（単位用量形態）
2014527982.tif 000008
*それぞれのリン酸ナトリウム成分の質量として与えられる量。
【０１８９】
本発明の開示を受けて今や当業者の経験の範囲内にある、前製剤中の賦形剤の濃度および充填容量のわずかな変動によって、rhBSSLを含む他の最適化した凍結乾燥製剤を形成する。例えば、表7に一覧にした成分とともに、かつ一覧にした量で、rhBSSLを含む凍結乾燥製剤。
【０１９０】
（表７）rhBSSLを含む最適化した凍結乾燥製剤の1バイアルあたりの組成（単位用量形態）
2014527982.tif 000009
*それぞれのリン酸ナトリウム成分の質量として与えられる量。
【０１９１】
1バイアルあたりの絶対組成（単位用量形態）は、投与されることになる服用率に依存してよく、とくに早産児に投与される場合、賦形剤のほぼ同じ相対組成を保ちつつ、1バイアルあたりより低い絶対量のrhBSSLが所望され得る。これは、例えば、同じ液体前製剤の少量の充填容量（上記に与えられた容量の約半分など）を用いることによって、ある特定の場合には（服用量を差別化するためなど）、より小さなバイアルまたは異なる色のバイアルを用いることによって達成され得る。したがって、rhBSSLを含む最適化した凍結乾燥製剤（上記に示されるものなど）の組成を、例えばrhBSSL 10,000Uあたりの各賦形剤のmg量など、製剤中に存在しているrhBSSLの量に対して相対的に表してよい。
【０１９２】
（表８）mg/10,000U rhBSSLのrhBSSLを含む、最適化した凍結乾燥製剤の1バイアルあたりの相対組成（単位用量形態）
2014527982.tif 000010
*それぞれのリン酸ナトリウム成分の質量に基づく相対量。
【０１９３】
凍結乾燥製剤の再構成：例えば、100mLの乳児用調合乳の低温殺菌母乳にそのような製剤を溶解させるために添加しかつ振とうすることによって、上記に記載される単位用量を液体乳児食中で再構成する。rhBSSLを含有するそのような液体乳児食を好都合に用いて、有効量のrhBSSLを、それを用いた治療を必要としている乳児に投与することができる。そのような投与は、哺乳瓶による補給によって経口的に、または鼻腔補給を用いることによる消化管を介して生じてよい。本発明の凍結乾燥製剤から再構成された、rhBSSLを含むそのような液体乳児食のpHは、6.4〜7.4であることが典型的に見出されている。
【０１９４】
液体乳児食の代替策として、多数の単位用量形態（またはより多量の各成分を含む1単位用量）をフルーツジュースまたは水中で同様に再構成する。そのような様式で再構成されたrhBSSLを好都合に用いて、膵機能不全、とくに嚢胞性線維症によって引き起こされた膵機能不全に罹患している人など、小児または成人に有効量のrhBSSLを経口的に投与することができる。
【図１】
2014527982.tif 000012
【図２】
2014527982.tif 000013
【図３】
2014527982.tif 000014
【図４】
2014527982.tif 000015
【図５】
2014527982.tif 000016
【図６】
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【図７】
2014527982.tif 000018
【図８】
2014527982.tif 000019
【図９】
2014527982.tif 000020
【図１０】
2014527982.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月29日(2014.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）；
（ii）結晶性増量剤；および
（iii）該結晶性増量剤とは異なる化学的実体でありかつ該rhBSSL 1mgあたり約0.1mg〜約0.5mgの相対量で存在する、無定形安定剤
を含む、凍結乾燥に適した製剤。
【請求項２】
無定形安定剤が、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-アラニン、およびグリシンからなる群より選択される、請求項1記載の製剤。
【請求項３】
無定形安定剤がグリシンである、請求項2記載の製剤。
【請求項４】
無定形安定剤が10mM〜100mMの濃度で存在している、請求項1〜3のいずれか一項記載の製剤。
【請求項５】
無定形安定剤が35mM〜50mMの濃度で存在している、請求項4記載の製剤。
【請求項６】
結晶性増量剤がマンニトールである、請求項1〜5のいずれか一項記載の製剤。
【請求項７】
結晶性増量剤が100mM〜400mMの濃度で存在している、請求項1〜6のいずれか一項記載の製剤。
【請求項８】
結晶性増量剤が180mM〜210mMの濃度で存在している、請求項7記載の製剤。
【請求項９】
rhBSSLが1mg/mL〜35mg/mLの濃度で存在している、請求項1〜8のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１０】
rhBSSLが10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在している、請求項9記載の製剤。
【請求項１１】
（i）10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在しているrhBSSL；
（ii）180mM〜210mMの濃度で存在しているマンニトール；および
（iii）35mM〜50mMの濃度で存在しているグリシン
を含む、請求項10記載の製剤。
【請求項１２】
6.3〜7.5のpH値を有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１３】
2mM〜20mMのリン酸塩濃度で存在しているリン酸ナトリウムをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１４】
5mM〜50mMの塩化物濃度で存在している塩化ナトリウムをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載の製剤の凍結乾燥によって得ることができる凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
（i）10mg〜20mgの絶対量で存在しているrhBSSL；
（ii）27mg〜62mgの絶対量で存在しているマンニトール；
（iii）2mg〜6mgの絶対量で存在しているグリシン
を含むrhBSSLの再構成製剤であって、該製剤が液体乳児食中で再構成されており、かつ該再構成製剤が6.4〜7.4のpHを有する、rhBSSLの再構成製剤。
【請求項１７】
グリシンではない結晶性増量剤をさらに含む凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSLを安定化するためのグリシンの使用であって、該グリシンが、該凍結乾燥製剤中で非結晶性形態で存在しており；かつ/または該グリシンが、該凍結乾燥製剤中に該rhBSSL 1mgあたり0.2mg〜0.3mgの相対量で含まれている、グリシンの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
特定の局面において、本発明は、rhBSSLの凝集の低下を決定する方法にも関し、該方法は、（i）本発明の凍結乾燥製剤または単位用量を提供する工程；（ii）該凍結乾燥製剤または単位用量を保存する工程；および（iii）該凍結乾燥製剤または該単位用量中のrhBSSLの高分子量（high molecule weight）パーセンテージ（％HMW）レベルを1つまたは複数の時点で決定し、それによって該rhBSSLの凝集のレベルを決定する工程を含む。
[本発明1001]
（i）組換えヒト胆汁酸塩刺激性リパーゼ（rhBSSL）；
（ii）結晶性増量剤；および
（iii）該結晶性増量剤とは異なる化学的実体である無定形安定剤
を含む、凍結乾燥に適した製剤。
[本発明1002]
無定形安定剤が、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-アラニン、およびグリシンからなる群より選択される、本発明1001の製剤。
[本発明1003]
無定形安定剤がグリシンである、本発明1002の製剤。
[本発明1004]
無定形安定剤が10mM〜100mMの濃度で存在している、本発明1001〜1003のいずれかの製剤。
[本発明1005]
無定形安定剤が35mM〜50mMの濃度で存在している、本発明1004の製剤。
[本発明1006]
結晶性増量剤がマンニトールである、本発明1001〜1005のいずれかの製剤。
[本発明1007]
結晶性増量剤が100mM〜400mMの濃度で存在している、本発明1001〜1006のいずれかの製剤。
[本発明1008]
結晶性増量剤が180mM〜210mMの濃度で存在している、本発明1007の製剤。
[本発明1009]
rhBSSLが1mg/mL〜35mg/mLの濃度で存在している、本発明1001〜1008のいずれかの製剤。
[本発明1010]
rhBSSLが10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在している、本発明1009の製剤。
[本発明1011]
（i）10mg/mL〜15mg/mLの濃度で存在しているrhBSSL；
（ii）180mM〜210mMの濃度で存在しているマンニトール；および
（iii）35mM〜50mMの濃度で存在しているグリシン
を含む、本発明1010の製剤。
[本発明1012]
6.3〜7.5のpH値を有する、本発明1001〜1011のいずれかの製剤。
[本発明1013]
2mM〜20mMのリン酸塩濃度で存在しているリン酸ナトリウムをさらに含む、本発明1001〜1012のいずれかの製剤。
[本発明1014]
5mM〜50mMの塩化物濃度で存在している塩化ナトリウムをさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかの製剤。
[本発明1015]
本発明1001〜1014のいずれかの製剤の凍結乾燥によって得ることができる凍結乾燥製剤。
[本発明1016]
（i）10mg〜20mgの絶対量で存在しているrhBSSL；
（ii）27mg〜62mgの絶対量で存在しているマンニトール；
（iii）2mg〜6mgの絶対量で存在しているグリシン
を含むrhBSSLの再構成製剤であって、該製剤が液体乳児食中で再構成されており、かつ該再構成製剤が6.4〜7.4のpHを有する、rhBSSLの再構成製剤。
[本発明1017]
グリシンではない結晶性増量剤をさらに含む凍結乾燥製剤中に存在しているrhBSSLを安定化するためのグリシンの使用であって、該グリシンが、該凍結乾燥製剤中で実質的に非結晶性形態で存在しており；かつ/または該グリシンが、該凍結乾燥製剤中に該rhBSSL 1mgあたり0.2mg〜0.3mgの相対量で含まれている、グリシンの使用。
【国際調査報告】
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