(57)【要約】  本発明は、ヒト神経膠細胞由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の新規変異体およびそれらの使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２３：
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ
（配列中、
ｉ）Ｘａａ８４はＫまたはＡであり、
ｉｉ）Ｘａａ８８はＲまたはＫであり、
ｉｉｉ）Ｘａａ９０はＲまたはＫであり、
ｉｖ）Ｘａａ１２５はＫまたはＥであり、
ｖ）Ｘａａ１３０はＲまたはＥである）
のアミノ酸配列を含む、ヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項２】
前記変異体が、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号９）、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号１２）、および
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＥＨＳＡＫＥＣＧＣＩ（配列番号１５）
からなる群から選択される、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項３】
前記変異体が、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号９）
である、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項４】
前記変異体が、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号１２）
である、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項５】
前記変異体が、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＥＨＳＡＫＥＣＧＣＩ（配列番号１５）
である、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項６】
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号２８）および
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号３５）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Δ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体を調製するための中間体。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号３５）である、請求項６に記載の中間体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＧＤＮＦ変異体と、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
有効量の請求項８に記載の組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、パーキンソン病のための治療方法。
【請求項１０】
医薬として使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項１１】
パーキンソン病の治療に使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＧＤＮＦ変異体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるパーキンソン病を治療するための方法。
【請求項１３】
療法として使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＧＤＮＦ変異体。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＧＤＮＦ変異体を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、パーキンソン病を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野、特に治療タンパク質の分野である。具体的には、本発明は、ヒト神経膠細胞由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の新規変異体に関する。ＧＤＮＦの新規変異体は、パーキンソン病の治療に有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＮＦは、インビトロ及びインビボでドーパミン作動性ニューロンに対する栄養支援を提供すると報告されている周知の神経栄養因子である。更に、ＧＤＮＦは、機能改善を提供し、パーキンソン病の齧歯類神経保護作用を有することが報告されている。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来の野生型ＧＤＮＦタンパク質は、パーキンソン病を患っている患者に対して主に投与されており、様々な結果を生じる。２つの小規模な非盲検研究において、野生型ＧＤＮＦは、運動機能の長期にわたる改善をもたらすことが報告された。しかしながら、３４人の患者のランダム化プラセボ対照の第ＩＩａ相検査において、ＧＤＮＦの被殻内送達は６ヶ月で症状の改善を示さなかった。バイオマーカーシグナルの増加は、注入部位周辺の直近組織における事象のみであった。１つの最近の報告では、ＧＤＮＦは、死にかけている神経を救う有望な分子であり得るが、脳の正確な領域に分子を送達することは未だにかなり困難であると述べている（非特許文献１）。
【０００３】
切断型ＧＤＮＦタンパク質は、特許文献１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４９１５）に報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９７／１１９６４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ４６６：２０１０年８月１９日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、所望の薬理学的特性、安定性、及び生体内分布特性を有する新規ＧＤＮＦ変異体が依然として必要とされている。送達装置において安定であり、かつ、所望の脳生体内分布を促進する一方、所望の効能及び受容可能な免疫原性特性を示すＧＤＮＦの変異型が必要とされている。１つ以上のこれらの望ましい特性を提供するＧＤＮＦ変異体は、特にパーキンソン病の治療における使用について、薬学的に有用な新規薬物療法であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、望ましい生体内分布特性及び薬学的に許容可能な免疫原性プロファイルを提供する、安定で適切に有効なＧＤＮＦ変異体を提供するために導入された特定のアミノ酸置換を有する、Ｎ−末端にて最初の３１アミノ酸を欠損した成熟ヒトＧＤＮＦドメインの新規切断型ＧＤＮＦ変異体（「Δ３１−Ｎ−末端切断型ＧＤＮＦ」）を提供する。本発明は、ヒト野生型ＧＤＮＦと比較して、改善された薬学的安定性、並びに改善された生体内分布、減少したヘパリン結合、減少したアミド分解、スクシンイミド形成に対する減少した感受性、及び減少した免疫原性可能性を有する変異体を含む、成熟ヒト野生型ＧＤＮＦより１つ以上の利点を与えるヒトＧＤＮＦの特定の変異体を提供する。特定の新規ＧＤＮＦ変異体は、パーキンソン病患者のための有用な新規治療選択肢であり得る。
【０００８】
本発明は、配列番号２３：
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ（配列番号２３）
（配列中、
ｉ）Ｘａａ８４はＫまたはＡであり、
ｉｉ）Ｘａａ８８はＲまたはＫであり、
ｉｉｉ）Ｘａａ９０はＲまたはＫであり、
ｉｖ）Ｘａａ１２５はＫまたはＥであり、
ｖ）Ｘａａ１３０はＲまたはＥである）
を含むヒトＧＤＮＦ変異体を提供する。
【０００９】
更に、本発明は、前記変異体が、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号：９）、
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号：１２）、および
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＥＨＳＡＫＥＣＧＣＩ（配列番号：１５）
からなる群から選択されるヒトＧＤＮＦ変異体を提供する。
【００１０】
一態様において、本発明は、配列番号９：
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
に示すようなアミノ酸配列を含むヒトＧＤＮＦ変異体を提供する。
【００１１】
更に、本発明は、成熟ヒトＧＤＮＦのΔ３１−Ｎ−末端切断型変異体を調製するのに有用な中間体を提供する。中間体は、配列番号２３：
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ（配列番号２３）
のアミノ酸配列を含み、この配列は、シグナル分泌ペプチドを有し、Ｎ末端で伸長される。多数のシグナル分泌ペプチド配列が本願明細書において使用され得る。例示的なシグナル分泌ペプチド配列は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号２５）の配列を有するマウスカッパリーダーシグナル分泌ペプチド、及びＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（配列番号３２）の配列を有するヒト成長ホルモンシグナル分泌ペプチドを含む。
【００１２】
これらのシグナル分泌ペプチドを有する中間体は、他のリーダー配列を有する切断型ＧＤＮＦ構造物より増加した収率を有する特許請求されたヒトＧＤＮＦ変異体を生成できる。よって、シグナル分泌ペプチドを含む開示された中間体は、
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号２８）；または
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ（配列番号３５）
のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明は、本発明により特許請求されるヒトＧＤＮＦの変異体と、１種以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。本発明は、医薬として使用するためのヒトＧＤＮＦの変異体を提供する。更に、本発明は、パーキンソン病の治療に使用するためのヒトＧＤＮＦの変異体を提供する。本発明は、療法として使用するためのＧＤＮＦの変異体を提供する。
【００１４】
Ｘａａ８４がＡであり、Ｘａａ８８がＫであり、Ｘａａ９０がＫである変異体が好ましい。
【００１５】
Ｘａａ８４がＫであり、Ｘａａ８８がＲであり、Ｘａａ９０がＲである変異体が好ましい。
【００１６】
Ｘａａ１２５がＫであり、Ｘａａ１３０がＲである変異体が好ましい。
【００１７】
Ｘａａ８４がＡであり、Ｘａａ８８がＫであり、Ｘａａ９０がＫであり、Ｘａａ１２５がＥであり、Ｘａａ１３０がＥである変異体が好ましい。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｎ末端の１〜３１個のアミノ酸残基中に位置する正電荷を恐らく介して野生型ＧＤＮＦがヘパリンと細胞外マトリックスに結合し、これによって脳内中の送達時にＧＤＮＦの分布を制限することが報告されている（Ｌｉｎら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６３，７５８−７６８，１９９４；Ｒｉｃｋａｒｄら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３，４１９−４２６，２００３；Ｐｉｌｔｏｎｅｎら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２１９，４９９−５０６，２００９）。また、ＧＤＮＦが、機能改善を提供し、パーキンソン病の齧歯類モデル及び霊長類モデルにおける神経保護作用を有することが報告されている（Ｔｏｍａｃら，１９９５；Ｇａｓｈら，１９９６）。大腸菌由来の野生型ＧＤＮＦタンパク質は、パーキンソン病を患っている患者に対して主に投与され、様々な結果を生じている。２つの小規模な非盲検研究において、ＧＤＮＦは、運動機能における長期にわたる改善をもたらした（Ｇｉｌｌら，２００３，Ｓｌｅｖｉｎら，２００５）。加えて、ドーパミン作動性ニューロン発芽の増加が、無関係の原因（すなわち、心筋梗塞）によって亡くなった一人の患者で証明された（Ｌｏｖｅら，２００５）。しかしながら、Ａｍｇｅｎによって行われた３４人の患者におけるランダム化したプラセボ対照の第ＩＩａ相試験において、ＧＤＮＦ（リアテルミン）の被殻内送達は、６ヶ月で症状の改善を何も示さなかった（Ｌａｎｇら，２００６）。特許請求されたＧＤＮＦ変異体は、以前に試験した大腸菌由来の野生型ＧＤＮＦタンパク質と比較して、改善された特性を示す。
【００１９】
シグナルペプチド（最初の１９個のアミノ酸、配列番号４）、プロドメイン（イタリック、配列番号５）、及び成熟ペプチド（下線、配列番号３）を含有する野生型ＧＤＮＦ完全長構築物配列（２１１ａａ）は、配列番号１のように示される：
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＦＰＬＰＡＧＫＲＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬＧＲＲＲＡＰＦＡＬＳＳＤＳＮＭＰＥＤＹＰＤＱＦＤＤＶＭＤＦＩＱＡＴＩＫＲＬＫＲＳＰＤＫＱＭＡＶＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＤＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ。野生型ＧＤＮＦ完全長ＤＮＡ配列は、配列番号２のように示される：
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ。
【００２０】
本発明の変異体のアミノ酸位置は、成熟ヒト野生型ＧＤＮＦ（配列番号３）の１３４個のアミノ酸ポリペプチドから決定される。変異は、元のアミノ酸、その後にアミノ酸位置の番号、その後に置換アミノ酸が表記される。各変異体の数字表示は、切断前の野生型成熟配列（「成熟ＷＴ  ＧＤＮＦ」）に基づく。例えば、位置８４でＬｙｓ（Ｋ）（すなわち、Ｋ８４）をＡｌａ（Ａ）に置換することは、Ｋ８４Ａと表記される。同様に、位置８４でＬｙｓ（Ｋ）をＡｌａ（Ａ）に置換し、位置８８でＡｒｇ（Ｒ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、位置９０でＡｒｇ（Ｒ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、そして位置９５でＡｓｐ（Ｄ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換する多重置換は、Ｋ８４Ａ／Ｒ８８Ｋ／Ｒ９０Ｋ／Ｄ９５Ｅと表記される。本願明細書において用いられるように、略語「ＫＡＫＫＥ」は、Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅを意味する。
【００２１】
本願明細書において用いられるように、「完全長ＧＤＮＦ」は、シグナルペプチド、プロドメイン、および成熟ドメインを含む、完全タンパク質配列を意味する。
【００２２】
本願明細書において用いられるように、「成熟ＧＤＮＦ」又は「完全長成熟ＧＤＮＦ」は、完全ＧＤＮＦ成熟ドメイン（切断されたシグナルペプチド及びプロドメインを含む）を意味する。
【００２３】
本願明細書において用いられるように、「Δ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ」は、Ｎ末端で最初の３１個のアミノ酸を欠損するＧＤＮＦ成熟ドメインを意味する。本願明細書において用いられるように、「Δ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ」及び「ヒトＧＤＮＦ変異体」（又は「ＧＤＮＦｖ」）は、交換可能に用いられる。
【００２４】
完全長ＧＤＮＦ構築物は、５日間に亘ってＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトされた場合、主に完全長成熟ＧＤＮＦを生成する。完全長ＧＤＮＦ構築物が長期間に亘りかつ安定な細胞株発生の間にＣＨＯ細胞内にトランスフェクトされた場合、ＧＤＮＦの切断型形態は、主要な形態となる（Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，１１３０−１１３２，１９９３）。成熟ヒトＧＤＮＦのデルタ３１（「Δ３１」）切断型変異型（アミノ酸残基数は１から３１までＮ末端で欠失している）は、配列番号８を有し、混合物から精製され得る。
【００２５】
Ｎ末端切断型Δ３１ＧＤＮＦ変異体は、ＤＮＡレベルで成熟ＧＤＮＦペプチドのプロドメインペプチド配列及び最初の３１個のアミノ酸残基の両方を欠損させ、かつ、多数の分泌シグナル配列ペプチド、例えば天然ＧＤＮＦ分泌シグナルペプチド（配列番号４：ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡ）；マウスカッパリーダー分泌シグナルペプチド（配列番号２５：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）；及びヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチド（配列番号３２：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ）を用いることによって、哺乳類又は細菌の発現系において生成され得る。これらの構築物は、一種類の同種３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体を生成することができる。
【００２６】
当業者は、特許請求されたＧＤＮＦ変異体がグリコシル化の可能性を排除しないことを理解するだろう。特許請求されたＧＤＮＦ変異体は、用いられた発現系に依存して、必要に応じ、グリコシル化されてもよい。例えば、哺乳類の発現されたＧＤＮＦ変異体は、Ｎ４９位でグリコシル化されるが、細菌の発現された変異体ではグリコシル化されない。
【００２７】
完全長天然配列構築物（配列番号２）が発現中に用いられる場合、種々のＮ末端切断を有するＧＤＮＦ種の混合物は、プロドメイン領域を有するか又は有さない成熟形態（非切断型）と同様に生成される。
【００２８】
以下の実施例は、実質的に以下に示すように実施され、本発明のヒトＧＤＮＦ変異体の特定の特性を評価するために用いられ得る。
【実施例】
【００２９】
実施例１
タンパク質発現、精製及び免疫原性分析
ａ．大腸菌発現ＧＤＮＦｖのサブクローニング、変異、発現、アンフォールディング、リフォールディング、及び精製
サブクローニング
プラスミドｐＥＴ−３０ａ（＋）／ｒｈＧＤＮＦを保有する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬを、３７℃で一晩、３０μｇ／ｍＬの最終濃度でカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ肉汁培地中で増殖させる。細胞を遠心分離によって収集後、プラスミドベクターを、製造業者のプロトコルに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。次いで、単離プラスミドＤＮＡを、Δ３１−ＧＤＮＦタンパク質（成熟ヒトＧＤＮＦのＮ末端から切断した３１残基）及びΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ＧＤＮＦタンパク質（成熟ヒトＧＤＮＦのＮ末端から切断した３１残基であって、３８位でアスパラギン残基はグルタミンに置換されている）をそれぞれコードするΔ３１−ＧＤＮＦ及びΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ＧＤＮＦ遺伝子のプライマー伸長反応に用いる。これは、遺伝子の５’及び３’末端までアニールするように設計されたＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する、オリゴヌクレオチドプライマーΔ３１−ｆｏｒ、Δ３１−ｒｅｖ、Δ３１−Ｎ３８Ｑ−ｆｏｒ、及びΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ｒｅｖ（それぞれ配列番号６、７、３９、及び４０）を用いて達成され得る。センス及びアンチセンスプライマーの５’末端で導入されたＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位は、Δ３１−ＧＤＮＦ及びΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ＧＤＮＦをベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）の対応部位中にクローニングさせる。プライマー伸長反応を、８０ｎｇのテンプレートＤＮＡと順方向及び逆方向プライマーとＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１０５７２−０１４）を用いることにより、全量１００μｌにおいて、９４℃で３分間実施し、その後、９４℃で１分間、５５℃で０．５分間、そして７２℃で１分間という３ステップサイクルを１６回実施し、７２℃で最後の１０分間実施する。得られた単位複製配列は、アガロースゲル電気泳動で確認し、製造業者のプロトコルに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて洗浄する。
【００３０】
増幅した３１−ＧＤＮＦ又はΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ＧＤＮＦ遺伝子及びｐＥＴ−３０ａ（＋）ベクターの両方を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを用いて３７℃で２時間消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを精製する。次いで、Δ３１−ＧＤＮＦ又はΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ＧＤＮＦを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いかつ製造業者のプロトコルに従ってｐＥＴ−３０ａ（＋）プラスミド中へライゲーションする。２〜５μｌのライゲーション反応混合物を用い、製造業者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＃２３０２８０）に従って、５０〜１００μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ化学的コンピテント細胞に直接、形質転換する。最終濃度３０μｌ／ｍｌでカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート上に播種することで得られた形質転換コロニーを、標準的なＴ７プロモーター及びＴ７ターミネーターオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、抽出されたプラスミドを両方向においてシーケンシングすることで、正確な構築物の存在についてスクリーニングする。
【００３１】
変異
部位特異的突然変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて実施し、Δ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ−ＧＤＮＦ及びΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ−ＧＤＮＦを調製する。この方法は、テンプレートとしてｐＥＴ−３０ａ（＋）中に挿入したΔ３１−Ｎ３８Ｑ−ＧＤＮＦ、並びに順方向および逆方向プライマーとしてそれぞれΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ−ｆｏｒおよびΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ−ｒｅｖオリゴヌクレオチド（表１、配列番号４１及び４２）を使用する。続いて、ｐＥＴ−３０ａ（＋）へ挿入した首尾良く変異したΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ遺伝子をテンプレートとして用い、Δ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ−ｆｏｒ及びΔ３１−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ−Ｄ９５Ｅ−ｒｅｖオリゴヌクレオチド（表１、配列番号：４３及び４４）を順方向と逆方向プライマーとしてそれぞれ用いて、Δ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ−ＧＤＮＦを生成する。ＤＮＡ配列を確認し、プラスミドを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ化学的コンピテント細胞へ形質転換する。
【００３２】
タンパク質発現
プラスミドｐＥＴ−３０ａ（＋）／ＧＤＮＦｖを保有する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬの永久凍結ストックを用いて、３７℃で最終濃度３０μｇ／ｍｌにてカナマイシンを含有する５０ｍｌの２×ＴＹ肉汁培地中に植菌する。９時間後、５ｍｌのスターター培養物を用いて、３７℃で６×２ｌの同じ液体培養培地に植菌する。培養物が６００ｎｍで０．８から１．４の間の吸光度に達すると、典型的には１６時間後に、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで加え、培養物の温度を５時間、２７から３０℃の間に下げる。細胞を１０，０００ｇで２０分間４℃にて遠心分離することで収集し、−８０℃に保存する。
【００３３】
可溶化−リフォールディング
細胞ペーストを、ｐＨ８で２〜３容量の０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５ｍＭのＭｇＣｌ２および５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌの溶液中に懸濁し、氷上で３０分間攪拌しながらインキュベートさせる。得られたスラリーを１０分間氷上で超音波処理する（５秒パルス、２秒インターバル、３０〜４０％振幅）。その後、ＧＤＮＦｖを、２０，０００ｇで２０分間遠心分離することで細胞溶解物から単離する封入体の形態で回収し、４Ｍグアニジン、９０ｍＭシステイン、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５中に可溶化する。タンパク質を、０．２Ｍグアニジン、２Ｍ尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．７５で１０倍希釈することで活性形態までリフォールディングする。リフォールディングした混合物を２日間４℃で維持する。
【００３４】
精製
リフォールディングしたＧＤＮＦｖを、以下の３ステップのカラムクロマトグラフィーによって均質になるまで精製する。
１．ＳＰカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
２．フェニルカラムカラム上での疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
３．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
最初に復元タンパク質を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で平衡化したＳＰセファロース高速流カラムに適用する。ＧＤＮＦｖを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で０．３から１ＭのＮａＣｌまで上昇する線形塩勾配で溶出する。ＣＥＸメインストリームプールに、最終濃度２．５ＭのＮａＣｌを補充し、次いで、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５中でフェニルセファロースＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用する。ＨＩＣカラムを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５中で２．５から０ＭのＮａＣｌまで下降する線形塩勾配で溶出する。ＧＤＮＦｖは、ＨＩＣカラムにきつく結合する。次いで、ＨＩＣメインストリームプールを濃縮し、最終的にＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムに適用し、タンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶出する。最終プールを濃縮し、０．２２ミクロン膜で濾過し、−８０℃で保存する。
【００３５】
ｂ．哺乳類細胞におけるＧＤＮＦｖの発現及び精製
ＧＤＮＦ変異体をコードする遺伝子を、標準的な分子生物学技術を用いるか又はＣＭＶプロモーター駆動哺乳類発現ベクター中の遺伝子合成により調製し得る。組み換えプラスミドを用いて、ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ（ＨＥＫ２９３）細胞へ一過性にトランスフェクトし、培地を５日後に収集する。別の方法では、安定なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を生成して、ＧＤＮＦ変異体を発現する。変異体タンパク質をコードする遺伝子を、製造業者の指示に従って、プロドメインを有する天然ＧＤＮＦシグナル配列を有するフレーム中で、グルタミン合成酵素（ＧＳ）含有発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド，Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）へサブクローニングする。ｐＥＥ１２．４ベースのベクター中の完全長ＧＤＮＦ構築物（配列番号２）をＣＨＯへトランスフェクトし、ＧＤＮＦの切断型形態を生成する。ここで、Δ３１は主要形態であり、混合物から精製し得る。プロドメイン及び最初のＮ末端の３１個のアミノ酸を除去する場合、Δ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体を、完全長及び上述した切断型生成物の混合物から精製する必要なく、哺乳類発現系において効率的かつ清潔に生成する。また、天然ＧＤＮＦ分泌シグナルペプチドを、マウスカッパリーダー分泌シグナルペプチド又はヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチドを含む、複数の分泌シグナルペプチドと置換し得る。Δ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体は、開示された全ての分泌シグナルペプチドと共に効率的かつ清潔に生成し続けるが、発現の可変レベルを有する。所望の変異を組み込んだＧＤＮＦ変異体を、マウスカッパシグナル配列を有するフレーム中で適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＭＫ−ＮＦ２，Ｌｏｎｚａ）へサブクローニングする。
【００３６】
精製
ＧＤＮＦｖを、以下の４ステップのビーズカラムクロマトグラフィーによって均質になるまで精製する。
１．ＳＰカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
２．フェニルカラムカラム上での疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
３．多数モデルＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
４．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
簡潔に言えば、最初に、収集したＧＤＮＦ変異体タンパク質を含有する培養培地を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５で平衡化したＳＰセファロース高速流カラムへ適用する。ＧＤＮＦｖを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で０から１ＭのＮａＣｌまで線形塩勾配で溶出する。ＣＥＸメインストリームプールに、最終濃度２．５ＭのＮａＣｌを補充し、次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中でフェニルセファロースＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用する。ＨＩＣカラムを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で２．５から０ＭのＮａＣｌまで逆線形塩勾配で溶出する。ＧＤＮＦｖは、ＨＩＣカラムに弱く結合する。次いで、フロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）と早期溶出画分のプールを、ｐＨ５でマルチモデル樹脂のＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラムに適用する。カラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８で洗浄し、次いでＧＤＮＦｖを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８中で０から１ＭのＮａＣｌまで線形塩勾配で溶出する。最終的に、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣメインストリームをＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムに適用し、タンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶出する。最終プールを０．２２ミクロン膜で濾過し、２〜８℃で保存する。
【００３７】
【表１】
2014512369.tif 000002
【００３８】
免疫原性可能性のＥｐｉｖａｘ分析
減少した結合ＨＬＡ−ＤＲの可能性を有する選択したヒトＧＤＮＦ変異体を作製し（配列番号１２及び１５）、ＧＦＲα及びヘパリン結合アッセイにおいて野生型ＧＤＮＦと比較する。
【００３９】
実施例２
ＧＤＮＦ野生型及びΔ３１ＧＤＮＦ変異体の安定性
完全長成熟ＧＤＮＦ野生型及びΔ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体の安定性を、複数の分析技術（例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、陽イオン交換ＨＰＬＣ、及び質量分析）を用いて評価して、これらの分子中の任意の分解部位を特定し得る。次いで、変異を行い、化学分解部位を除去し、ヒトＧＤＮＦ変異体の安定性を向上させる。
【００４０】
分析的逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ８  ＳＢ−３００Å、３．５ミクロン、４．６×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃８６５９７３−９０９）において６０℃で加熱する。移動相はＨ２Ｏ中で０．１％ＴＦＡである。ＧＤＮＦｖは、３５分間、１ｍｌ／分の流速で、３０分に亘って５から５０％までの線形アセトニトリル勾配により、１９〜２０分の保持時間で、２１４ｎｍでの単一ピークとして溶出する。
【００４１】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ＴＳＫ−Ｇ−２０００−ＳＷ−ＸＬ、５ミクロン、７．８×３００ｍｍカラム（ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＥＰ  ＃０８５４０）において。３５分間、０．５ｍｌ／分の流速で、移動相：ＰＢＳ＋３５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４。ＧＤＮＦｖは、約１６〜１７分の保持時間で２１４ｎｍでの単一ピークとして溶出する。
【００４２】
分析的陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）
Ｄｉｏｎｅｘ、Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０、４×２５０ｍｍカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  ＃０５４９９３）において。移動相は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ７である。ＧＤＮＦｖは、５２分間、１ｍｌ／分の流速で、４５分に亘って０．１５から０．６ＭのＮａＣｌまでの線形塩勾配により、２５〜３０分の保持時間で、複合ピークとして溶出する。
【００４３】
野生型（完全長細菌ＧＤＮＦ）対野生型ＣＨＯ  ＧＤＮＦｖ（Ｎ末端Δ３１切断型ＧＤＮＦ）の化学的安定分析（ＬＣ−ＭＳ）
野生型（完全長細菌ＧＤＮＦ）対野生型ＣＨＯ  ＧＤＮＦｖ（Ｎ末端Δ３１切断型ＧＤＮＦ）に、４週間、３７℃でストレスを与えて、化学的非安定性に関連し得るアミノ酸を同定する。
【００４４】
サンプル
１．４週間、４℃で１．０ｍｇ／ｍＬの野生型大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）完全長ＧＤＮＦ
２．４週間、３７℃で１．０ｍｇ／ｍＬの野生型大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）完全長ＧＤＮＦ
３．４週間、４℃で１．０ｍｇ／ｍＬの野生型ＣＨＯΔ３１−ＧＤＮＦｖ
４．４週間、３７℃で１．０ｍｇ／ｍＬの野生型ＣＨＯΔ３１−ＧＤＮＦｖ
【００４５】
インタクトかつ部分的な分子分析
１０μＬアリコートの各サンプル（溶液は２０μＬの水又は１０μＬアリコートの各溶液と混合する）を、４０μＬの１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８、１．０μＬの５０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴと、周囲温度で３０分間混合する。各サンプルをＬＣ／ＭＳ分析に供する。
【００４６】
Ｌｙｓ−Ｃ消化物
２０μＬアリコートの各サンプル溶液を、スピードバキュームシステム下で乾燥するために凍結乾燥し、次いで材料を、０．５μＬの５０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ及び４．５μＬの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．５Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８中で再構成する。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで各溶液を９３μＬの水で希釈し、２μＬの０．２ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ）で３７℃にて２時間処理する。ＣＨＯ  ＧＤＮＦｖに関して、３０μＬのトリプシン消化物を３７℃で１時間（炭水化物プロファイルを評価するために）、０．５μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理する。消化物を、ＬＣ／ＭＳ分析前にＨ２Ｏ中で２μＬの１０％ＴＦＡで酸性化する。
【００４７】
ＬＣ／ＭＳ分析
サンプル溶液を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣに連結されたＷａｔｅｒｓ  ＳＹＮＡＰＴ質量分析、又はＷａｔｅｒｓ  ２７９５  ＨＰＬＣに連結されたＷａｔｅｒ  ＬＣＴプレミア質量分析により分析する。
【００４８】
トップ−ダウン分析
野生型ＧＤＮＦについての開裂生成物を、部分的に減少したＧＤＮＦについてのＬＣ−ＭＳ分析により取得する。複数開裂生成物を同定し、これらの開裂に関する定量的データを表２に示す。いくつかの開裂（Ｎ１５／Ｒ１６、Ｎ２２／Ｐ２３、Ｎ２５／Ｓ２６、及びＮ３８／Ｒ３９の間の開裂）は、スクシンイミド形成を介する脱アミドと類似する分解経路を有する。野生型ＣＨＯΔ３１−ＧＤＮＦｖに関して、最初の３１個のアミノ酸残基をＮ末端から切断する。ＣＨＯ  ＧＤＮＦｖは、１つの鎖あたり２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を有しているが、１つの部位のみがＮグリコシル化される。観察された主要グリカンは、異なるガラクトシル化を有するジ−又はトリ−アンテナリーオリゴ糖である。興味深いことに、有意なシアル化グリカンは何も検出されない（表３）。
【００４９】
ボトム−アップ分析（ペプチドマッピング）
減少したＧＤＮＦ安定性サンプルのＬｙｓ−Ｃ消化物のＵＶクロマトグラフは、ＧＤＮＦペプチド１２６〜１２９を除いて、全ての期待されたペプチドが検出されることを示している。ＣＨＯ材料について、Ｎ末端ペプチド（Ｒ３２より前）は検出されない。Ｎ４９を含有するペプチド３８〜６０はグリコシル化され、９５％より多くのＡｓｎ４９で占められる。Ｎ８５を含有するペプチド８５〜９６はグリコシル化されない。これらの結果は、減少したＧＤＮＦサンプルについてのＬＣ／ＭＳ分析と一致している。
【００５０】
全般的に、野生型及びＣＨＯ材料の両方についてのホモダイマーは主要構成要素である。早期に溶出する少数構成要素はモノマーである。質量分析解析によると、ＧＤＮＦ  Ｃｙｓ４１は、モノマーについて遊離Ｃｙｓ残基とのジスフィルド結合を形成する。モノマーピークについての相対的割合は非常に低く、それらは、紫外線分析によると、ＣＨＯについて＜１％であり、野生型について＜０．５％である。モノマー内容物は、ストレスを与えた材料については変化しない。
【００５１】
分解（例えば、酸化、脱アミノ化及び異性化）もまた、ペプチドマッピングから得られる。結果を表４に示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の野生型完全長ＧＤＮＦは、２つのＭｅｔ残基、Ｍ（−１）およびＭ６を含み、これらの部位の酸化は比較的低い。ＧＤＮＦは、Ｔｒｐ残基を何も含まない。ＧＤＮＦは、完全長モノマーについて８つのＡｓｐ残基を有する。主要な脱アミノ部位はＮ２５及びＮ３８である。高いｐＨバッファーでより速く脱アミノ化が起こるので、これらの部位についての相対的割合は、ｐＨ５又は６のバッファー中でストレスを与えた場合、低くなるはずである。１つのアイソマーペプチド８５〜９６を同定したが、これは、Ｉｓｏ−Ａｓｐに対するＡｓｐの異性化、又はアミノ酸残基のラセミ化のいずれが原因かは明確ではない。高いｐＨストレスは、一般的なラセミ化であり、低いｐＨストレスはＡｓｐ異性化であることは周知である。野生型完全長ＧＤＮＦについて、いくつかのペプチドは、コントロール（４℃）サンプル及びストレスを与えた（３７℃）サンプルの両方について異なる質量を示す。それらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生合成中に最も起きやすい誤取り込み（ｍｉｓ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。
【００５２】
【表２】
2014512369.tif 000003
【００５３】
【表３】
2014512369.tif 000004
【００５４】
【表４】
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【００５５】
これらのデータは、ＣＨＯ細胞中で生成されたΔ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体が化学的安定性を向上させていることを示している。これは、４週間３７℃でストレスを与えられた場合の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生成された完全長野生型成熟ヒトＧＤＮＦと比較して、有意な酸化及び脱アミドを起こしやすい部位を含む最初の３１個のアミノ酸残基の欠失が原因である。更に、表５に示すように、変異前の完全長ＷＴ−大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＧＤＮＦ又はΔ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体のいずれかと比較して、変異後では、変異した２つのΔ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体（それぞれＮ３８Ｑ及びＤ９５Ｅ）の生物物理学的かつ生化学的特性において顕著な向上が観察された。
【００５６】
【表５】
2014512369.tif 000006
【００５７】
実施例３
インビトロ結合活性
以下のアッセイは、ヒトＧＤＮＦの特定の変異体が、ＧＦＲα１レセプター結合を維持しながらヘパリン結合を減少させて、種々の異なるヘパリン及びレセプター結合特性を提供することを実証する。
【００５８】
ＢｉａｃｏｒｅでのＧＦＲに対するＧＤＮＦｖの結合反応速度
ＧＤＮＦ変異体（ＧＤＮＦｖ：Ｎ末端−Δ３１−切断型）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（細菌）又は哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞）中で発現し、実施例１に記載されるように精製し得る。変異体のプライマー配列は、用いられる発現系とは関係なく同じままである。
【００５９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置を、ヒト及びラットのＧＤＮＦファミリーレセプター（ＧＦＲα１及びＧＦＲα２）に対するＧＤＮＦｖの結合反応速度を測定するために用いる。測定を２５℃で実施する。サンプルを、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）中に溶解する。タンパク質Ａ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を、アミンカップリング化学を用いて約２００反応単位（ＲＵ）のレベルでＣＭ４センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃ＢＲ−１００５−３９）のフローセル１から４上で固定して、ＧＦＲ  Ｆｃキメラ（組み換えヒトＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ  Ｒα−１  Ｆｃ  キメラ；組み換えヒトＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ  Ｒα−２  Ｆｃキメラ；組み換えラットＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ  Ｒα−１Ｆｃキメラ；組み換えマウスＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ  Ｒα−２  Ｆｃキメラ）を捕捉する。
【００６０】
結合を複数サイクルを用いて評価する。各サイクルは、以下のステップからなる：１）約１．０μｇ／ｍＬ濃度の約１０μＬのＧＦＲの注入、及び１２０〜１５０ＲＵの捕捉を目的とした１０μＬ／分の流速。２）１０ｎＭと０．０４ｎＭとの間の最終濃度範囲における５０μＬ／分の流速で２５０μＬのＧＤＮＦｖの注入、その後分解のために２０分の注入。３）約３０μＬの１０ｍＭグリシン塩酸塩、ｐＨ１．５を用いる再生成。各サイクルに関する会合速度及び解離速度を、ＢＩＡ評価ソフトウェア、バージョン４．１における「１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合」モデルを用いて評価する。
【００６１】
結果を以下の表６〜８に示す。
【００６２】
【表６】
2014512369.tif 000007
【００６３】
【表７】
2014512369.tif 000008
【００６４】
【表８】
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【００６５】
ＥＬＩＳＡを用いるＧＦＲα１に対するヒトＧＤＮＦ変異体の結合
ＧＤＮＦ野生型及び変異体をＥＬＩＳＡアッセイで試験する。この試験において、プレートに結合したレセプター（ＧＦＲα１）に対するＧＤＮＦタンパク質の結合を測定する。「ＧＤＮＦ無し」状態及び／又は「無関係タンパク質」状態をネガティブコントロールとして使用する。
【００６６】
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０８１免疫結合ＥＬＩＳＡプレート）の各ウェルを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中で１μｇ／ｍｌにて７０μｌのヒトＧＦＲα１（組み換えヒトＧＦＲα１−Ｆｃキメラ、担体を含まない）でコーティングする。無関係レセプターがコーティングされる場合、それは無関係Ｆｃキメラであり、ＧＦＲα１と同じ濃度でコーティングされる。プレートを密閉し、一晩４℃でインキュベートする。ウェルを吸引し、自動プレート洗浄器を用いて、洗浄バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で２度洗浄する。プレートを、室温にて少なくとも１時間、ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファー（上述の洗浄バッファー中の３％カーネーションインスタントミルク）でブロックする。プレートを洗浄バッファで２度洗浄する。
【００６７】
ＧＤＮＦタンパク質を、適切な濃度範囲でブロッキングバッファー中へ連続希釈する（典型的には５μｇ／ｍＬから開始して１：１０に連続希釈する）。ブロッキングバッファのみからなるＧＤＮＦコントロールは使用しない。各ＧＤＮＦ溶液の５０μｌを３連でＧＦＲα１でコーティングしたウェルへ加える。プレートを室温で１．５時間インキュベートする。次いで、ウェルを洗浄バッファで３回洗浄する。
【００６８】
ブロッキングバッファー中で１μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した５０μｌアリコートのビオチン化抗ヒトＧＤＮＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ビオチン化ヤギ抗ヒトＧＤＮＦポリクローナル抗体、カタログ番号ＢＡＦ２１２）を各ウェルに加え、室温で４５分間インキュベートする。次いで、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄する。
【００６９】
ブロッキングバッファー中で１：１０００に希釈した５０μｌアリコートのセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６−０３０−０８４）を各ウェルに加え、室温で２０〜３０分間インキュベートする。代わりに、３０〜９０分間のインキュベーション時間で、１：２０００希釈を使用してもよい。次いで、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄する。５０μｌの発色基質（すなわち、ＯＰＤ基質）を各ウェルに加え、室温で２〜３分間展開させた。反応を各ウェルに１００μｌの１ＮのＨＣｌを加えることで停止する。ウェルの吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０プレートリーダー上で４９０ｎｍで読み取る。各状態についての３連のウェルに関する平均吸光度を決定し、得られた値を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＥＣ５０計算のために処理して、９５％の信頼範囲を得る。これらの範囲を以下の表９にまとめる。
【００７０】
ＥＬＩＳＡを用いるヘパリンに対するヒトＧＤＮＦ変異体の結合
ＧＤＮＦ野生型及び変異体をＥＬＩＳＡアッセイで試験する。この試験において、プレートに結合したヘパリンに対するＧＤＮＦタンパク質の結合を測定する。「ＧＤＮＦ無し」状態をネガティブコントロールとして使用する。
【００７１】
９６ウェルのヘパリン結合プレート（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓヘパリン結合プレート、カタログ番号３５４６７６）の各ウェルを、ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌにて７０μｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａからのヘパリンと、Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ、カタログ番号Ｈ−３１４９からのヘパリンナトリウム塩の混合分子量）でコーティングする。プレートを密閉し、光から保護して、一晩室温でインキュベートする。ウェルを吸引し、自動プレート洗浄器を用いて、洗浄バッファーで３回洗浄する。プレートを、３７℃で９０〜１２０分間、ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファーでブロックする（プレートはこのインキュベーションの間、密閉する）。プレートを洗浄バッファで２度洗浄する。
【００７２】
ＧＤＮＦタンパク質を、適切な濃度範囲でブロッキングバッファー中へ連続希釈する（典型的には５μｇ／ｍＬから開始して１：１０に連続希釈する）。ブロッキングバッファのみからなる「ＧＤＮＦ無し」コントロールを使用する。５０μｌアリコートの各ＧＤＮＦ溶液を、３連でヘパリンでコーティングしたウェルに加える。プレートを室温で１．５〜２時間インキュベートする。次いで、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄する。
【００７３】
ブロッキングバッファー中で１μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した５０μｌアリコートのビオチン化抗ヒトＧＤＮＦ抗体を、各ウェルに加え、室温で４５分間から１時間までインキュベートする。次いで、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄する。
【００７４】
ブロッキングバッファー中で１：１０００希釈した５０μｌアリコートのセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンを、各ウェルに加え、室温で２０〜３０分間インキュベートする。代わりに、３０〜９０分間のインキュベーション時間で、１：２０００希釈を使用してもよい。次いで、ウェルを洗浄バッファで３回洗浄する。５０μｌアリコートの発色基質（すなわち、ＯＰＤ基質）を各ウェルに加え、室温で２〜３分間展開させる。反応を各ウェルに１００μｌの１ＮのＨＣｌを加えることで停止する。ウェルの吸光度をプレートリーダー上で４９０ｎｍで読み取る。各状態についての３連のウェルに関する平均吸光度を決定し、得られた値を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＥＣ５０計算のために処理して、９５％の信頼範囲を得る。これらの範囲を以下の表９にまとめる。
【００７５】
【表９】
2014512369.tif 000010
【００７６】
これらのデータは、野生型ＧＤＮＦ（「ＷＴ大腸菌ＧＤＮＦ」と称される）からのＮ末端の３１個のアミノ酸（「ＣＨＯΔ３１ＧＤＮＦ」と称される変異体）の欠失が、ＧＦＲα１レセプター結合を維持しながら、ヘパリン結合を有意に（約１０倍）減少できることを示し、また、これらのデータは、種々の異なるヘパリン及びレセプター結合特性がヒトＧＤＮＦの追加変異体を介して達成され得ることを示している。
【００７７】
実施例４
インビトロ活性
ＮＳ−１神経突起伸長
神経分化についてのＧＤＮＦ活性を、ラット神経スクリーン−１細胞（ＰＣ１２サブクローン）を用いて評価する。細胞を、コラーゲンでコーティングしたフラスコ内で９５％湿度で３７℃にてＦ−１２Ｋ基礎培地、１２．５％の加熱不活性化したウマ血清、２．５％の加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５００６１）、及び１×抗−抗（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２４０）中で維持する。神経突起伸長を測定するため、神経スクリーン−１細胞を、内部６０ウェルのみを用いて、増殖培地中でウェル当たり２２００個の細胞にてコラーゲンＩ９６−ウェルプレートへと播種する。細胞接着の２４時間後、培地を除去し、８点希釈シリーズ中に希釈したＧＤＮＦを加えた１μｇ／ｍｌでＧＦＲα１−Ｆｃを含有する新規成長培地を、１つの濃度当たり３連のウェルまたはの６つのウェルのいずれかでプレートに加える。１μｇ／ｍｌのＧＦＲα１−Ｆｃを加えた培地をネガティブコントロールとして含み、２５ｎｇ／ｍｌの神経突起成長因子を加えた培地をアッセイにおける細胞反応についてのポジティブコントロールとして含む。プレートを３７℃、９５％湿度で９６時間インキュベートし、次いで各ウェルに対して４５μｌの固定液を加え、そして１時間室温でインキュベートすることで固定する。プレートを、Ｎｅｕｒｉｔｅ  Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  Ｈｉｔ  Ｋｉｔ（商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、カタログ番号Ｋ０７−０００１−１）からの１×洗浄バッファーで２度洗浄し、次いでキットからの１×バッファーで２度洗浄する。細胞を製造業者の指示書に従ってキットからの神経突起成長試薬を用いて免疫染色する。プレートをアレイスキャン装置上にロードし、アレイスキャンソフトウェア及びＣｅｌｌｏｍｉｃからの神経プロファイリングアルゴリズムを用いて分析する。アルゴリズムにより生成されたデータを、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＥＣ５０計算のために処理する。
【００７８】
複数の変異体を神経分化における活性について試験して、各変異体について観察されたＥＣ５０を表１０Ａに列挙する。
【００７９】
【表１０Ａ】
2014512369.tif 000011
【００８０】
本願明細書において試験した全てのＧＤＮＦサンプルは、種々の程度で神経突起成長アッセイにおける活性を有する。Δ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ−Ｋ１２５Ｅ−Ｒ１３０Ｅ変異体についての用量曲線は、実施した２つの実験において最大用量における安定期に達しないので、ＥＣ５０を計算できなかった。他の４つのＧＤＮＦ変異体についてのＥＣ５０９５％信頼区間は、このアッセイにおける活性の同様のレベルを示している範囲で重複する。
【００８１】
Ｃ−Ｒｅｔレセプターリン酸化
ｃ−Ｒｅｔレセプターリン酸化アッセイを、Ｙ１０１６位でのｃＲｅｔレセプターリン酸化の誘導を示すために用い得る。ｃ−Ｒｅｔレセプターリン酸化についてのＧＤＮＦ活性を、ヒトｃ−Ｒｅｔを過剰発現させるために安定的にトランスフェクトしたヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ）由来の細胞中で評価する。細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％のＦＢＳ、３μｇ／ｍｌのブラストサイジン中で維持する。ｃ−Ｒｅｔリン酸化について、細胞を、ブラストサイジンを含まない増殖培地中で２４ウェルコラーゲンでコーティングしたプレート内にウェル当たり５×１０５で播種し、一晩付着させる。培地を、２４時間、低グルコースＤＭＥＭ＋０．２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に変更する。飢餓培地を除去し、細胞を、グルコース無しのＤＭＥＭ、０．２５％のＢＳＡ、１μｇ／ｍｌのＧＦＲα１−Ｆｃ中で３０分間３７℃にてＧＤＮＦで処理する。各ＧＤＮＦ変異体を複数濃度で試験する。処理培地を除去し、細胞を、Ｍ−Ｐｅｒ抽出試薬＋プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤１、ホスファターゼ阻害剤カクテル２、及びホスファターゼ阻害剤カクテル３（Ｓｉｇｍａ（商標））の氷冷溶解バッファー中のプレート表面から擦り取る。細胞懸濁液を完全に溶解するためボルテックスし、細胞ペレット残屑まで１４，０００×ｇで遠心分離し、上清を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ試薬を用いてタンパク質濃度について定量化する。各ＧＤＮＦ溶解物について、１０μｇタンパク質を、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２２）により分離し、ＰＶＤＦブロットに移す。チロシン１０１６ホスホ−Ｒｅｔを、ウサギポリクローナル抗体及びヤギ−抗−ウサギ−ＨＲＰ抗体で検出し、ｃ−Ｒｅｔをマウスモノクローナル抗体及びヤギ−抗−マウス−ＨＲＰ抗体で検出する。ブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０８１）試薬で展開し、ｘ線フィルムに曝す。
【００８２】
５つのＧＤＮＦ変異体（ＷＴ−大腸菌−ＧＤＮＦ、ＣＨＯΔ３１ＧＤＮＦ、ＣＨＯΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ  ＧＤＮＦ、ＣＨＯΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ  ＧＤＮＦ、及びＣＨＯΔ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ−Ｋ１２５Ｅ−Ｒ１３０Ｅ  ＧＤＮＦ）を、グルコース無しのＤＭＥＭ、０．２５％のＢＳＡ培地＋１μｇ／ｍｌのＧＦＲα１−Ｆｃ中で、０．８、２．０、４．０、１０、２０、５０及び１００ｎｇ／ｍｌの４つの濃度でｃ−Ｒｅｔリン酸化活性について試験する。培地のみ、培地＋１μｇ／ｍｌのＧＦＲα１−Ｆｃ、及び培地＋１００ｎｇ／ｍｌのＣＨＯΔ３１ＧＤＮＦをまた、ネガティブコントロールとして試験する。５つのＧＤＮＦ変異体の各々を、８〜１５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０でｃ−Ｒｅｔリン酸化を誘導する。これらのデータは、全ての５つのＧＤＮＦ変異体が用量依存的にＹ１０１６にてｃ−Ｒｅｔリン酸化を誘導することを示している。
【００８３】
表１０Ｂにまとめているように、操作したΔ３１−Ｎ末端切断型ＧＤＮＦ変異体は、生物物理学的かつ生化学的特性において顕著な向上を示しており（表５、６、９、及び１０Ａ）、３７℃で４週間のインキュベーション後、最適化された生物学的特性（例えば、同等のＧＦＲα１レセプター結合、減少したヘパリン結合、及び同等の神経突起伸長）を維持した。
【００８４】
【表１０Ｂ】
2014512369.tif 000012
【００８５】
実施例５
ＤＡターンオーバーアッセイにおけるＧＤＮＦ変異体活性
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、イソフルラン（Ｏ２中３％）を用いて麻酔する。頭を剃り、ヨード溶液で殺菌した後、動物を、温度制御マットを備えた定位固定フレーム上に置く。眼を眼科用ゲルで保護し、麻酔をイソフルラン（Ｏ２中１〜２％）を用いて維持する。
【００８６】
正中切開を動物頭部に行い、頭皮及び下層組織が現れ、頭蓋骨をブレグマが可視化できるまで乾燥させる。尾状核についての座標を、ＧＤＮＦを注入するためにブレグマと硬膜表面から測定する。２８ゲージ注入カニューレをこの位置までゆっくりと低下させ、注入をポンプを用いて１分間後に開始する。２μｌボーラスの試験ＧＤＮＦを０．５μｌ／分で４分に亘って左半球へ注入し、カニューレを、注入を中断してから所定の位置に更に３分間残す。カニューレを除去してから、注入部位を閉じ、手術後に鎮痛剤を投与し、動物を温度制御ケージ内で回復させて、その後、ホームケージへ移動させる。動物を、その地域の倫理指針に従って手術後に検査する。注入後の適切な間隔にて、動物を屠殺し、脳を除去し、尾状核を正確に解剖し、秤量し、ドーパミン及び代謝物のＨＰＬＣ分析まで凍結させる。
【００８７】
凍結組織を迅速に解凍させて、０．５ｍｌの均質化バッファー（０．１Ｍの過塩素酸（ＰＣＡ）、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２．５ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸）中で均質化し、その後、２０，０００ｇで１５分間遠心分離する。上清を除去し、シリンジの無い濾過器で濾過する。ドーパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）の分析を、電気化学的検出器と連結したＨＰＬＣを用いて実施する。２０μｌアリコートの各サンプルを注入し、外部校正曲線（ＬＣ４Ｃ、ＢＡＳ、ＵＳＡ）に対して定量化する。移動相は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ（Ｂａｓｅ  Ｄｅａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｉｌｉｃａ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２８１０５）１５０×３．０ｍｍ  Ｃ１８  ３μの粒子カラムを４０℃で用いる、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＨ３ＰＯ４、２ｍＭのＯＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１３％のメタノール（ＭｅＯＨ）、ｐＨ２．８からなる。データをＥｍｐｏｗｅｒクロマトグラフィーソフトウェアを用いて回収する。４パラメータロジスティックフィットを、ｎｇ／ｇ湿潤重量組織として発現前の全てのデータについて実施する。ドーパミンターンオーバー測定は、（ＤＯＰＡＣ＋ＨＶＡ）／ＤＡとして、かつ、左半球（処理済）対右半球（インタクト）を用いて行った比較として表す。
【００８８】
【表１１】
2014512369.tif 000013
【００８９】
データは、表１１中で名付けた各ＧＤＮＦ変異体が、インタクト半球と比較して、処理済み半球におけるドーパミンターンオーバーが有意に増加することを示している。
【００９０】
実施例６
インビボアッセイ
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）により誘導される逆行性損傷モデル
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、イソフルラン（Ｏ２中３％）を用いて麻酔する。頭を剃り、ヨード溶液で殺菌した後、動物を、温度制御マットを備えた定位固定フレーム上に置く。眼を眼科用ゲルで保護し、麻酔をイソフルラン（Ｏ２中１〜２％）を用いて維持する。
【００９１】
正中切開を動物頭部に行い、頭皮及び下層組織が現れ、頭蓋骨をブレグマが可視化できるまで乾燥させた。尾状核についての座標を、１０ｕｇの６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を注入するためにブレグマと硬膜表面から測定する。２８ゲージ注入カニューレをこの位置までゆっくりと低下させ、注入を１分後に開始する。２μｌボーラスの６−ＯＨＤＡを０．５μｌ／分で４分に亘って左半球へ注入し、注入を中断したら、カニューレを更に３分間所定の位置に残す。
【００９２】
６−ＯＨＤＡ注入後の３０分にて試験ＧＤＮＦを、同じプロトコルを用いて注入する。ＧＤＮＦ注入の座標は、上記のようにブレグマ及び硬膜表面から前方−後方＋１．０、ＬＭ−２．５、ＤＶ−４．５ｍｍである。
【００９３】
カニューレを除去すると、切開部位を閉じ、手術後に鎮痛剤を投与し、動物を温度制御ケージ内で回復させて、その後、ホームケージへ移動する。動物を、その地域の倫理指針に従って手術後に検査する。注入後の適切な間隔にて、動物を屠殺し、脳を除去し、尾状核および黒質を正確に解剖し、秤量し、ドーパミン及び代謝物のＨＰＬＣ分析まで凍結させる。
【００９４】
凍結組織を迅速に解凍させて、０．５ｍｌの均質化バッファー（０．１ＭのＰＣＡ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸）中で均質化し、その後、２０，０００×ｇで１５分間遠心分離する。上清を除去し、シリンジのない濾過器で濾過する。ドーパミン（ＤＡ）、ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡの分析を、電気化学的検出器と連結したＨＰＬＣを用いて実施する。２０μｌのアリコートの各サンプルを注入し、外部校正曲線に対して定量化する。移動相は、４０℃にてＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  １５０×３．０ｍｍ  Ｃ１８  ３μ粒子カラムを用いる、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＨ３ＰＯ４、２ｍＭのＯＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１３％のＭｅＯＨ、ｐＨ２．８からなる。データをＥｍｐｏｗｅｒクロマトグラフィーソフトウェアを用いて回収する。４パラメータロジスティックフィットを、ｎｇ／ｇ湿潤重量組織として表す前の全てのデータについて実施する。比較を左半球（処理済）対右半球（インタクト）を用いて行う。
【００９５】
【表１２】
2014512369.tif 000014
【００９６】
【表１３】
2014512369.tif 000015
【００９７】
尾状核への６−ＯＨＤＡの投与は、インタクト側と比較して処理側におけるドーパミンレベルの有意な減少をもたらす（表１２）。有意な欠損もまた、ＧＤＮＦの投与により予防される黒質において観察される（表１３）。本願明細書において試験したＧＤＮＦの全ての変異体は、処理側と比較してビヒクルとは有意に異なっている。
【００９８】
ラット脳における急性生体内分布
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、イソフルラン（Ｏ２中３％）を用いて麻酔する。頭を剃り、ヨード溶液で殺菌した後、動物を、温度制御マットを備えた定位固定フレーム上に置く。眼を眼科用ゲルで保護し、麻酔をイソフルラン（Ｏ２中１〜２％）を用いて維持する。
【００９９】
正中切開を動物の頭部に行い、頭皮及び下層組織が現れ、頭蓋骨をブレグマが可視化できるまで乾燥させる。尾状核についての座標を、ＧＤＮＦ（前方−後方＋０．５、外側内側−３．０、背側腹側−５．５ｍｍ）を注入するためにブレグマと硬膜表面から測定する。３０ゲージの注入カニューレをこの位置までゆっくりと低下させ、注入（ポンプを用いる）を１分後に開始する。２μｌのボーラスの試験ＧＤＮＦを０．５μｌ／分にて４分に亘って左半球へ注入し、カニューレを、注入を中断してから更に３分間、所定の位置に残す。カニューレを除去すると、切開部位を閉じ、手術後に鎮痛剤を投与し、次いで動物を温度制御ケージ内で回復させる。注入後の適切な間隔にて、動物を屠殺し、脳を除去し、免疫組織化学のための低温切開片化まで凍結させる。
【０１００】
ラット脳におけるＧＤＮＦ免疫組織化学（ＩＨＣ）
注入したＧＤＮＦの生体内分布を、免疫組織化学アッセイにおいて試験し、この試験において、注入した抗原（ＧＤＮＦ及びＧＤＮＦ変異体）に対する抗体の結合をラット脳中で測定する。アイソタイプコントロール抗体をネガティブコントロールとして使用する。
【０１０１】
凍結したラット脳の低温切開片化を、平面を作製するためにラット脳マトリクスを用いて、−２０℃にて低温保持装置内に維持しながら、小脳の切り取りにより開始する。Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（商標）（ＯＣＴ、Ｓａｋｕｒａ又は他の同様のベンダー）を、冷却した低温保持装置検体チャック上に置く。ＯＣＴが凍結し始めると、ラット脳の平坦な尾表面を、−２０℃に冷却した鉗子を用いて検体チャック上に置き、これにより、吻側−大部分の脳が検体チャックから外方に向いた状態でＯＣＴが所定の位置に脳を留める。検体チャックを対象ホルダー内に置いて閉める。ミクロトームブレードをナイフホルダー内に挿入した後、低温保持装置上の切り取り機能を用いて、注入トラックに対して吻側の嗅球並びに大脳を捨てる。８ｕｍ厚の切片を３００μｍ間隔で取り、正電荷を帯びたスライドガラス上に置く。２つ又は３つの隣接する間隔の切片を、各ラット脳について各スライドガラス上に置く。次いで、スライドを２０分間室温にて４％パラホルムアルデヒド中に入れ、ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）洗浄バッファー中でリンスする。室温で染色溶液を用いて、二重内因性酵素ブロックとともにスライドを１０分間インキュベートし、ＴＢＳＴ洗浄バッファーでリンスし、アビジン及びビオチンブロックそれぞれを１５分間インキュベートし、ＴＢＳＴ洗浄バッファーで洗浄し、６０分間タンパク質ブロックでブロックし、エアーナイフを用いてスライドを吹く。ビオチン化抗ヒトＧＤＮＦ又はビオチン化ヤギＩｇＧを、バックグラウンド低下剤を用いて２μｇ／ｍｌまで抗体希釈物中で希釈し、６０分間スライド上でインキュベートし、次いでＴＢＳＴ洗浄バッファーで３回リンスする。スライドを標識したストレプトアビジンビオチン２（ＬＳＡＢ２）（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｋ０６０９）とともに１０分間インキュベートし、ＴＢＳＴ洗浄バッファーでリンスする。スライドをＤＡＢ＋（ＤＡＢ希釈物中の２滴のＤＡＢ）とともに５分間インキュベートし、次いでＴＢＳＴ洗浄バッファーでリンスし、その後、蒸留水でリンスする。スライドを自動染色器から除いた後、それらをＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（商標）で対比染色し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ  ＸＹＬ（商標）（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８３１２−４）を用いてカバースリップする。スライドを乾燥させ、次いでＡｐｅｒｉｏ  ＸＴを用いて分析して生体内分布を定量化する。
【０１０２】
ラット脳におけるＧＤＮＦの生体内分布の定量化
スライドの画像を、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒソフトウェアのｖ１０．００．００．１８０５で稼動する）上で２０倍の倍率設定にて取得する。スライドについてのメタデータをＡｐｅｒｉｏのウェブベースのソフトウェア、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ｖ１０．０．１３４６．１８０６）内に保存する。
【０１０３】
各脳切片を、Ａｐｅｒｉｏのイメージ閲覧ソフトウェア、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（ｖ１０．０．３６．１８０５）を用いて手動でアウトライン化する。第一の研究については、最小量の目に見える切片化アーチファクトを有する全ての脳切片をアウトライン化する。第二の研究については、スライドラベルに最も近い全ての脳切片をアウトライン化する。各アウトライン化領域を、Ａｐｅｒｉｏの「ポジティブピクセルカウント（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｉｘｅｌ  Ｃｏｕｎｔ）」アルゴリズム（ｖ９）［画像ズーム＝．０１及び強度閾値弱（上限）＝２３５以外は、全てのパラメータがそれらのデフォルト設定に維持されている状態］を用いて分析する。
【０１０４】
各ラットについてＧＤＮＦ分布領域（ｍｍ２）を、ポジティブピクセルアルゴリズムからのポジティブ及び強いポジティブ領域を合計することで算出する。対応スチューデントｔ検定を統計的有意性を決定するために使用する。
【表１４】
2014512369.tif 000016
【０１０５】
ヘパリン結合に関するＥＬＩＳＡデータ（表９）は、野生型ＧＤＮＦに対する改変が、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）−ＷＴ  ＧＤＮＦと比較してヘパリン結合を減少できることを示している。これらのデータは、上記の表１４に示すように生体内分布データと一緒に、ヘパリン結合を減少させる変異体がラット脳における生体内分布の増加をもたらし得ることを確認する。上記の表で列挙されたＮ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ及びＮ３８Ｑ−Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ変異体は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）−ＷＴ−ＧＤＮＦと比較して生体内分布を増加させた。
【０１０６】
本発明の新規ＧＤＮＦ変異体は、好ましくは、種々の経路により投与される医薬組成物として処方される。最も好ましくは、このようなＧＤＮＦ変異体は非経口投与又は頭蓋内投与用である。このような医薬組成物及び同等物を調製するためのプロセスは当該分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，第１９版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）を参照のこと。
【０１０７】
治療有効量は、患者に対して治療的有効性を与えるのに必要な本発明の新規ＧＤＮＦ変異体の量である。実際に投与されるＧＤＮＦ変異体の量が、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の活性薬剤、年齢、体重、及び個々の患者の反応、並びに患者の症状の重篤度を含む、関連する環境を考慮して医師により決定されることは理解されるだろう。
【０１０８】
配列表
＜配列番号１；ＰＲＴ１；ホモサピエンス＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＦＰＬＰＡＧＫＲＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬＧＲＲＲＡＰＦＡＬＳＳＤＳＮＭＰＥＤＹＰＤＱＦＤＤＶＭＤＦＩＱＡＴＩＫＲＬＫＲＳＰＤＫＱＭＡＶＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＤＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１０９】
＜配列番号２；ＤＮＡ；ホモサピエンス＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１１０】
＜配列番号３；ＰＲＴ１；ホモサピエンス＞
ＳＰＤＫＱＭＡＶＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＮＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＤＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１１１】
＜配列番号４；ＰＲＴ１；ホモサピエンス＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡ
【０１１２】
＜配列番号５；ＰＲＴ１；ホモサピエンス＞
ＦＰＬＰＡＧＫＲＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬＧＲＲＲＡＰＦＡＬＳＳＤＳＮＭＰＥＤＹＰＤＱＦＤＤＶＭＤＦＩＱＡＴＩＫＲＬＫＲ
【０１１３】
＜配列番号６；ＤＮＡ；プライマー＞
ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧ
【０１１４】
＜配列番号７；ＤＮＡ；プライマー＞
ＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴ
【０１１５】
＜配列番号８；ＰＲＴ１；ホモサピエンス＞
ＲＧＱＲＧＫＮＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＤＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１１６】
＜配列番号９；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１１７】
＜配列番号１０；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１１８】
＜配列番号１１；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＦＰＬＰＡＧＫＲＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬＧＲＲＲＡＰＦＡＬＳＳＤＳＮＭＰＥＤＹＰＤＱＦＤＤＶＭＤＦＩＱＡＴＩＫＲＬＫＲＳＰＤＫＱＭＡＶＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１１９】
＜配列番号１２；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１２０】
＜配列番号１３；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１２１】
＜配列番号１４；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＦＰＬＰＡＧＫＲＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬＧＲＲＲＡＰＦＡＬＳＳＤＳＮＭＰＥＤＹＰＤＱＦＤＤＶＭＤＦＩＱＡＴＩＫＲＬＫＲＳＰＤＫＱＭＡＶＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１２２】
＜配列番号１５；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＥＨＳＡＫＥＣＧＣＩ
【０１２３】
＜配列番号１６；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１２４】
＜配列番号１７；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＦＰＬＰＡＧＫＲＰＰＥＡＰＡＥＤＲＳＬＧＲＲＲＡＰＦＡＬＳＳＤＳＮＭＰＥＤＹＰＤＱＦＤＤＶＭＤＦＩＱＡＴＩＫＲＬＫＲＳＰＤＫＱＭＡＶＬＰＲＲＥＲＮＲＱＡＡＡＡＮＰＥＮＳＲＧＫＧＲＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＥＨＳＡＫＥＣＧＣＩ
【０１２５】
＜配列番号１８；ＤＮＡ；ホモサピエンス＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴ
【０１２６】
＜配列番号１９；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１２７】
＜配列番号２０；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１２８】
＜配列番号２１；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１２９】
＜配列番号２２；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１３０】
＜配列番号２３；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ
（配列中：
ｉ）Ｘａａ８４はＫまたはＡであり、
ｉｉ）Ｘａａ８８はＲまたはＫであり、
ｉｉｉ）Ｘａａ９０はＲまたはＫであり、
ｉｖ）Ｘａａ１２５はＫまたはＥであり、
ｖ）Ｘａａ１３０はＲまたはＥである）
【０１３１】
＜配列番号２４；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＫＬＷＤＶＶＡＶＣＬＶＬＬＨＴＡＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ
（配列中：
ｉ）Ｘａａ８４はＫまたはＡであり、
ｉｉ）Ｘａａ８８はＲまたはＫであり、
ｉｉｉ）Ｘａａ９０はＲまたはＫであり、
ｉｖ）Ｘａａ１２５はＫまたはＥであり、
ｖ）Ｘａａ１３０はＲまたはＥである）
【０１３２】
＜配列番号２５；ＰＲＴ１；ハツカネズミ＞
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
【０１３３】
＜配列番号２６；ＤＮＡ；ハツカネズミ＞
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴ
【０１３４】
＜配列番号２７；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１３５】
＜配列番号２８；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１３６】
＜配列番号２９；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１３７】
＜配列番号３０；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１３８】
＜配列番号３１；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ
（配列中：
ｉ）Ｘａａ８４はＫまたはＡであり、
ｉｉ）Ｘａａ８８はＲまたはＫであり、
ｉｉｉ）Ｘａａ９０はＲまたはＫであり、
ｉｖ）Ｘａａ１２５はＫまたはＥであり、
ｖ）Ｘａａ１３０はＲまたはＥである）
【０１３９】
＜配列番号３２；ＰＲＴ１；ホモサピエンス＞
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ
【０１４０】
＜配列番号３３；ＤＮＡ；ホモサピエンス＞
ＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＣＣ
【０１４１】
＜配列番号３４；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１４２】
＜配列番号３５；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＫＮＬＳＲＮＲＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１４３】
＜配列番号３６；ＤＮＡ；人工配列＞
ＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【０１４４】
＜配列番号３７；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＡＮＬＳＫＮＫＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＫＨＳＡＫＲＣＧＣＩ
【０１４５】
＜配列番号３８；ＰＲＴ１；人工配列＞
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＲＧＱＲＧＫＱＲＧＣＶＬＴＡＩＨＬＮＶＴＤＬＧＬＧＹＥＴＫＥＥＬＩＦＲＹＣＳＧＳＣＤＡＡＥＴＴＹＤＫＩＬＸａａ８４ＮＬＳＸａａ８８ＮＸａａ９０ＲＬＶＳＥＫＶＧＱＡＣＣＲＰＩＡＦＤＤＤＬＳＦＬＤＤＮＬＶＹＨＩＬＲＸａａ１２５ＨＳＡＫＸａａ１３０ＣＧＣＩ
（配列中：
ｉ）Ｘａａ８４はＫまたはＡであり、
ｉｉ）Ｘａａ８８はＲまたはＫであり、
ｉｉｉ）Ｘａａ９０はＲまたはＫであり、
ｉｖ）Ｘａａ１２５はＫまたはＥであり、
ｖ）Ｘａａ１３０はＲまたはＥである）
【０１４６】
＜配列番号３９；ＤＮＡ；プライマー＞
ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧ
【０１４７】
＜配列番号４０；ＤＮＡ；プライマー＞
ＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴ
【０１４８】
＜配列番号４１；ＤＮＡ；プライマー＞
ＧＴＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧ
【０１４９】
＜配列番号４２；ＤＮＡ；プライマー＞
ＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＡＧＡＣ
【０１５０】
＜配列番号４３；ＤＮＡ；プライマー＞
ＣＣＴＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＧ
【０１５１】
＜配列番号４４；ＤＮＡ；プライマー＞
ＣＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＡＧＡＣＧＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＧＧ
【０１５２】
配列番号１：ＡＡ−ヒトＧＤＮＦ野生型完全長
配列番号２：ＤＮＡ−ヒトＧＤＮＦ野生型完全長
配列番号３：ＡＡ−ヒト成熟野生型ＧＤＮＦ
配列番号４：ＡＡ−ヒトＧＤＮＦ天然分泌シグナルペプチド
配列番号５：ＡＡ−ヒトＧＤＮＦプロドメイン
配列番号６：ＤＮＡ−Δ３１−順方向プライマー
配列番号７：ＤＮＡ−Δ３１−逆方向プライマー
配列番号８：ＡＡ−変異体１：Δ３１ＧＤＮＦ
配列番号９：ＡＡ−ＧＤＮＦ変異体２：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ（クローンＤ９）タンパク質（１０３ａａ）
配列番号１０：ＤＮＡ構造配列−ＧＤＮＦ変異体２：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ（クローンＤ９）ＤＮＡ（ｐＥＥ１２．４）
配列番号１１：ＡＡ−ＧＤＮＦ変異体２：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ（クローンＤ９）タンパク質構造物（２１１ａａ）．
配列番号１２：ＡＡ−ＧＤＮＦ変異体３：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ（クローンＦ２．１）タンパク質配列（１０３ａａ）
配列番号１３：ＤＮＡ構造配列−ＧＤＮＦ変異体３：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ（クローンＦ２．１）ＤＮＡ配列
配列番号１４：ＡＡ−ＧＤＮＦ変異体３：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ（クローンＦ２．１）タンパク質構造物（２１１ａａ）
配列番号１５：ＡＡ−ＧＤＮＦ変異体４：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ＋Ｋ１２５Ｅ＋Ｒ１３０Ｅ（クローン４．３）タンパク質配列（１０３ａａ）：
配列番号１６：ＤＮＡ構造配列−ＧＤＮＦ変異体４：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ＋Ｋ１２５Ｅ＋Ｒ１３０Ｅ（クローン４．３）ＤＮＡ配列
配列番号１７：ＡＡ−ＧＤＮＦ変異体４：Δ３１＋Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ＋Ｋ１２５Ｅ＋Ｒ１３０Ｅ（クローン４．３）タンパク質構造物
配列番号１８：ＤＮＡ−ヒトＧＤＮＦ天然分泌シグナルペプチド
配列番号１９：ＤＮＡ−天然ペプチド−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ構造物
配列番号２０：ＡＡ−天然ペプチド−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ（１２２ａａ）：
配列番号２１：ＤＮＡ−天然ペプチド−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ
配列番号２２：ＡＡ−天然ペプチド−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ（１２２ａａ）：
配列番号２３：変異体のＡＡ−コンセンサス配列
配列番号２４：変異体のＡＡ−天然ペプチド−コンセンサス配列
配列番号２５：ＡＡ−マウスκリーダー分泌シグナルペプチド（ＭＫＬ）
配列番号２６：ＤＮＡ−マウスκリーダー分泌シグナルペプチド（ＭＫＬ）
配列番号２７：ＤＮＡ−ＭＫＬ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ構造物
配列番号２８：ＡＡ−ＭＫＬ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ（１２３ａａ）：
配列番号２９：ＤＮＡ−ＭＫＬ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ構造物
配列番号３０：ＡＡ−ＭＫＬ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ（１２３ａａ）：
配列番号３１：変異体のＡＡ−マウスκリーダー−コンセンサス配列
配列番号３２：ＡＡ−ヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチド（ｈＧＨ）
配列番号３３：ＤＮＡ−ヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチド（ｈＧＨ）
配列番号３４：ＤＮＡ−ｈＧＨ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ構造物
配列番号３５：ＡＡ−ｈＧＨ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｄ９５Ｅ（１２９ａａ）：
配列番号３６：ＤＮＡ−ｈＧＨ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ構造物
配列番号３７：ＡＡ−ｈＧＨ−Δ３１Ｎ３８Ｑ＋Ｋ８４Ａ−Ｒ８８Ｋ−Ｒ９０Ｋ−Ｄ９５Ｅ（１２３ａａ）：
配列番号３８：変異体のＡＡ−ｈＧＨ−コンセンサス配列
配列番号３９：ＤＮＡ−Δ３１−Ｎ３８Ｑ−順方向プライマー
配列番号４０：ＤＮＡ−Δ３１−Ｎ３８Ｑ−逆方向プライマー
配列番号４１：ＤＮＡ−Δ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ−順方向プライマー
配列番号４２：ＤＮＡ−Δ３１−Ｎ３８Ｑ−Ｄ９５Ｅ−逆方向プライマー
配列番号４３：ＤＮＡ−Δ３１−Ｎ３８Ｑ−ＫＡＫＫＥ−順方向プライマー
配列番号４４：ＤＮＡ−Δ３１−Ｎ３８Ｑ−ＫＡＫＫＥ−逆方向プライマー
【配列表】
2014512369000001.app
【国際調査報告】
2014512369.tif 000017
2014512369.tif 000018
2014512369.tif 000019