(57)【要約】  母体試料を分析し、妊婦の男児胎児が母親からのＸ連鎖変異を受け継いでいるか否かを判定するための方法、装置、およびシステムが提供される。試料中の胎児ＤＮＡパーセンテージが取得され、２つの可能性（胎児が変異または正常対立遺伝子を受け継いでいる）に対するカットオフ値が求められる。次に、Ｘ染色体上の正常対立遺伝子に対する変異対立遺伝子の比率が、カットオフ値と比較され、どちらの対立遺伝子が受け継がれているかの分類が行われる。あるいは、Ｘ染色体上の標的領域由来の対立遺伝子の数が、Ｘ染色体上の参照領域由来の対立遺伝子の数と比較され、欠失または拡大変異が特定される。胎児ＤＮＡパーセンテージは、胎児特異的対立遺伝子との反応を数え、反応における統計分布に対応するようにその数を補正することにより計算できる。【選択図】図１
2014507134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ染色体上の座位で、変異および正常対立遺伝子に対しヘテロ接合である妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するか否かを判定する方法であって、
複数の反応それぞれが生物学的試料由来の１つまたは複数の核酸分子を含み、その生物学的試料が妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含み、データが：
その座位の変異対立遺伝子の第１の量を示す第１の定量的データセット；および
その座位の正常対立遺伝子の第２の量を示す第２の定量的データセット、
を含む複数の反応からのデータの入手；
第１と第２の量の間の相対量を表すパラメータの、第１の量および第２の量からの決定；
生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆの取得；
胎児がその座位で変異対立遺伝子を受け継いでいるか否かの判定用の第１のカットオフ値が少なくとも第１の比率：ｋ／（１＋ｋ−Ｐｆ）（ｋは、妊婦の変異染色体上の変異対立遺伝子の数、ｋは１以上の整数）から算出される計算；
胎児がその座位で正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの判定用の第２のカットオフ値が少なくとも第２の比率：［ｋ（１−Ｐｆ）］／［１＋ｋ−ｋＰｆ）］から算出される計算；および
胎児が変異対立遺伝子または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類を決定するための、パラメータの第１および第２のカットオフ値の内の少なくとも１つとの比較、
を含む方法。
【請求項２】
パラメータが第１および第２のカットオフ値と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分類が、疾患状態、非疾患状態、および分類不能を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
パーセンテージＰｆの取得が、
実験的に得た生物学的試料中の胎児核酸分子パーセンテージの、複数の反応に対し予想される統計的分子分布による補正を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
パーセンテージＰｆの取得が、
妊婦がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合である座位で母親および胎児で共有される第１の対立遺伝子の、反応における検出；
式［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ１）／Ｎ）］＊Ｎによるポアソン補正された濃度Ｐｘの計算（Ｎは、分析された反応の合計数、Ｐ１は、第１の対立遺伝子に対する陽性の反応の数、およびｌｎは、自然対数）；
反応における胎児特異的な第２の対立遺伝子の検出；さらに
式［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ２）／Ｎ）］＊Ｎによるポアソン補正された濃度Ｐｙの計算（Ｎは、分析された反応の合計数、およびＰ２は、第２の対立遺伝子に対し陽性の反応の数）、
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第２の対立遺伝子が染色体Ｙ上にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１の対立遺伝子が染色体Ｘ上にある、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
胎児特異的対立遺伝子が、常染色体上の父性系遺伝性対立遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
胎児特異的対立遺伝子が、胎児に特異的なメチル化マーカーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
Ｐｆの［（２Ｐｙ）／（Ｐｘ＋Ｐｙ）］＊１００％としての計算をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
第１および第２のカットオフ値が、逐次確率比検定（ＳＰＲＴ）を使って決定され、胎児が変異または正常核酸配列を受け継いでいるか否かが判定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
変異核酸配列に連鎖した多形部位の対立遺伝子が、変異核酸配列と同じ母体ハプロタイプ上に位置する対立遺伝子であり、多形部位と変異核酸配列との間の組換えの確率が１％未満である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
正常な核酸配列に連鎖した多形部位の対立遺伝子が、正常な核酸配列と同じ母体ハプロタイプ上に位置する対立遺伝子であり、多形部位と変異核酸配列の間の組換えの確率が１％未満である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
反応が、下記の内のいずれか１つまたは複数を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法：
シーケンシング反応、光学的分析、および蛍光プローブを使ったハイブリダイ
ゼーション、またはナノポアシーケンシング。
【請求項１５】
反応が増幅反応である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
反応が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
平均濃度が、反応当たり１テンプレート分子未満であり、ポアソン分布が、生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆの決定に使われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料が、妊婦由来の血漿、血清、または全血である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異であるか否かを判定する方法であって、
複数の反応のそれぞれが生物学的試料由来の１つまたは複数の核酸分子を含み、生物学的試料が妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含み、
Ｘ染色体上の座位で対立遺伝子に対しホモ接合である妊婦が、変異Ｘ染色体上の対立
遺伝子の拡大変異を有し、変異体Ｘ染色体がその座位の対立遺伝子の正常なコピー
および１つまたは複数の対立遺伝子の追加のコピーを有し、さらに、その座位の対
立遺伝子の正常なコピーの正常なＸ染色体を有し、
データが、
１つまたは複数の追加の対立遺伝子のコピーにより生成された第１の量の追加の
接合部を示す第１の定量的データセット；および
両Ｘ染色体上の対立遺伝子の正常なコピーにより生成された正常な接合部の第２
の量を示す第２の定量的データセット、
を含む、複数の反応からのデータの入手；
第１の量および第２の量から、第１と第２の量の間の相対量を表すパラメータの決定；
生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆの取得；
少なくとも第１の比率：ｎ／（ｎ＋１−Ｐｆ）から算出される、胎児が変異Ｘ染色体を受け継いでいるか否かを判定のための第１のカットオフ値の計算（ｎは、対立遺伝子の追加のコピー数、ｎは、１以上の整数）；
少なくとも第２の比率：［ｎ（１−Ｐｆ）／［ｎ＋２−Ｐｆ（ｎ＋１）］から算出される、胎児が正常なＸ染色体と受け継いでいるか否かの判定のための第２のカットオフ値の計算；さらに
胎児が変異体Ｘ染色体または正常なＸ染色体を受け継いでいるか否かの分類を決定するための、パラメータの第１および第２のカットオフ値の内の少なくとも１つとの比較、
を含む方法。
【請求項２０】
Ｘ染色体上の標的領域で変異および正常対立遺伝子に対しヘテロ接合であり、その変異が、標的領域の欠失または拡大である妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するか否かを判定する方法であって、
複数の反応のそれぞれが生物学的試料由来の１つまたは複数の核酸分子を含み、生物学的試料が妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含み、
データが、
標的領域由来の核酸分子の第１の量を示す第１の定量的データセット；および
Ｘ染色体上の参照領域由来の核酸分子の第２の量を示す第２の定量的データセッ
ト、
を含む複数の反応からのデータの入手；
第１と第２の量の間の相対量を表すパラメータの、第１の量および第２の量からの決定；
生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆの取得；
胎児が変異を受け継いでいるか否かを判定するための、パーセンテージＰｆに依存する第１のカットオフ値の計算；
胎児が正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの判定のための、パーセンテージＰｆに依存する第２のカットオフ値の計算；および
胎児が変異または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類を決定するための、パラメータの第１および第２のカットオフ値の内の少なくとも１つとの比較、
を含む方法。
【請求項２１】
変異が拡大であり、
第１のカットオフ値が、同じ拡大変異を有する非妊婦の第２の量に対する第１の量の比率と比べて、対応する比率が増加するという仮定に基づいて決定され、また、
第２のカットオフ値が、同じ拡大変異を有する非妊婦の第２の量に対する第１の量の比率と比べて、対応する比率が減少するという仮定に基づいて決定される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
変異が欠失であり、
第２のカットオフ値が、同じ欠失変異を有する非妊婦の第２の量に対する第１の量の比率と比べて、対応する比率が増加するという仮定に基づいて決定され、また、
第１のカットオフ値が、同じ欠失変異を有する非妊婦の第２の量に対する第１の量の比率と比べて、対応する比率が減少するという仮定に基づいて決定される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
変異が欠失であり、
第２のカットオフ値が少なくとも第１の比率：１／（２−Ｐｆ）から算出され、
第１のカットオフ値が少なくとも第２の比率：（１−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）から算出される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
変異が重複であり、
第２のカットオフ値が少なくとも第１の比率：（３−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）から算出され、
第１のカットオフ値が少なくとも第２の比率：（３−２Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）から算出される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
パーセンテージＰｆの取得が、複数の反応における予測統計的分子分布を使った生物学的試料中の胎児核酸分子の実験パーセンテージの補正を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
胎児を有する妊婦由来の生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆを取得する方法であって、
複数の反応それぞれが生物学的試料由来の複数の核酸分子を含み、生物学的試料が妊婦由来および胎児由来の核酸分子を含む複数の反応からのデータの入手；
妊婦がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合である座位で母親および胎児により共有される第１の対立遺伝子の、反応における検出；
第１の対立遺伝子に対する陽性の反応の数に基づいて、複数の反応における第１の対立遺伝子の予測統計分布により補正される、第１の対立遺伝子の補正濃度Ｐｘの計算；
胎児に特異的である第２の対立遺伝子の、反応における検出；
第２の対立遺伝子に対する陽性の反応の数に基づいて、複数の反応における第２の対立遺伝子の予測統計分布により補正される、第２の対立遺伝子の補正濃度Ｐｙの計算；さらに
［（２Ｐｙ）／（Ｐｘ＋Ｐｙ）］を使ったＰｆの計算；
を含む方法。
【請求項２７】
Ｐｆが［（２Ｐｙ）／（Ｐｘ＋Ｐｙ）］＊１００％に等しい、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
統計分布がポアソン分布であり、
ポアソン補正される濃度Ｐｘが、式［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ１）／Ｎ）］＊Ｎ（Ｎは、分析する反応の合計数、Ｐ１は、第１の対立遺伝子に対する陽性のウエルの数、およびｌｎは、自然対数）を使用し、また、
ポアソン補正される濃度Ｐｙが、式［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ２）／Ｎ）］＊Ｎ（Ｎは、分析する反応の合計数、Ｐ２は、第２の対立遺伝子に対する陽性のウエルの数）を使用する、
請求項２６および２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
データが、
変異核酸配列に連鎖した多形部位の変異核酸配列または対立遺伝子の第１の量を示す第１の定量的データセット；および
正常な核酸配列に連鎖した多形部位の正常な核酸配列または対立遺伝子の第２の量を示す第２の定量的データセット、
を含み、
２つのデータセットからパラメータの決定；
胎児が変異核酸配列を受け継いでいるか否かの判定用の、パーセンテージＰｆに基づく第１のカットオフ値の決定；
胎児が正常な核酸配列を受け継いでいるか否かの判定用の、パーセンテージＰｆに基づく第２のカットオフ値の決定；
パラメータの、第１および第２のカットオフ値の内の少なくとも１つとの比較；および
比較に基づく、胎児が変異または正常な核酸配列を受け継いでいるか否かの分類の決定、
をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
プロセッサが操作を行うのを制御するための複数の命令を保存する非一時的コンピュータ可読メディアを含み、命令が上記方法のいずれかを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
上記方法のいずれかを実行するように構成されている１つまたは複数のプロセッサを含むシステム。
【請求項３２】
上記方法のいずれかを実行するように構成されているモジュールを含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１月５日出願のＬｏ  ｅｔ  ａｌ．（００８３００ＵＳ）による「胎児の性染色体遺伝子型の非侵襲的出生前同定（Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｐｒｅｎ  ａｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｏｆ  Ｆｅｔａｌ  Ｓｅｘ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）」の名称の米国特許仮出願第６１／４３０，０３２号；および、２０１１年４月１４日出願のＬｏ  ｅｔ  ａｌ．（００８３０１ＵＳ）による「胎児の性染色体遺伝子型の非侵襲的出生前同定（Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｏｆ  Ｆｅｔａｌ  Ｓｅｘ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）」の名称の米国特許仮出願第６１／４７５，６３２号の非仮出願であり、これら仮出願特許の優先権を主張する。これらの特許の全内容は、あらゆる目的において、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、２００８年７月２３日出願のＬｏ  ｅｔ  ａｌ．（００５２１０ＵＳ）による「核酸配列不均衡の測定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｍｂａｌａｎｃｅ）」の名称の、所有者共通の米国特許出願第１２／１７８，１１６号に関し、この開示は、参照によってその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血友病ＡおよびＢは、凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）（Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ  Ｇ、Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ  ＥＧ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：１２８−１３２（１９９７））および凝固因子ＩＸ（Ｆ９）（Ｇｉａｎｎｅｌｌｉ  Ｆ、Ｇｒｅｅｎ  ＰＭ、Ｓｏｍｍｅｒ  ＳＳ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６：２６５−２６８（１９９８））を、それぞれ、コードする染色体Ｘ上の遺伝子のヘテロ変異が原因である。血友病キャリア妊婦が妊娠毎に、罹患した男の胎児を出産する確率は、２５％である。出生前の診断は、血友病家庭の女性の生殖の選択に関する重要な側面である（Ｌｅｅ  ＣＡ、Ｃｈｉ  Ｃ、Ｐａｖｏｒｄ  ＳＲ、ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、１２：３０１−３３６（２００６））。さらに、起こりうる胎児および新生児の出血性合併症を最小限にするために、罹患胎児では、遷延分娩、侵襲的モニタリング技術および器械分娩は避けるべきであることから、出生前の診断は、分娩および出産の間の適切な産科管理にも有益である（Ｌｅｅ  ＣＡ、Ｃｈｉ  Ｃ、Ｐａｖｏｒｄ  ＳＲ、ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、１２：３０１−３３６（２００６））。従って、血友病の出生前の非侵襲的診断法の開発は、産科医および血友病の家族の両方にとって有益である。
【０００４】
現在の出生前の伴性遺伝疾患用診断法は、典型的な例では、侵襲的であり、胎児に危険を及ぼす。母体血漿中の無細胞胎児ＤＮＡの発見は、非侵襲的出生前診断への新しい機会を提供した（ＬｏＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ．、３５０：４８５−４８７（１９９７）；Ｌｏ  ＹＭＤ、Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．、８：７１−７７（２００７））。母体血漿中の遺伝性の父系性遺伝形質の検出に基づく多くの有望な臨床的用途が開発されている。例えば、胎児の性別およびＲＨＤ状態の非侵襲的検出は、伴性遺伝疾患およびＲｈＤ不適合の臨床的管理に有用である（Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ−Ａｒａｇｏｎｅｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、１４：５９３−５９８（２００８）；ＦｉｎｎｉｎｇＫ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＭＪ．、３３６：８１６−８１８（２００８））。軟骨無形成症およびβ−地中海貧血症、等の単一遺伝子疾患に関して、母体血漿中の父系遺伝性変異の存在または非存在の検出は、それぞれ、常染色体優性遺伝病の診断、または胎児常染色体劣性遺伝疾患の排除を可能とするであろう（Ｓａｉｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ．、３５６：１１７０（２０００）；Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ．、３６０：９９８−１０００（２００２）；Ｄｉｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１０１：１０７６２−１０７６７（２００４））。
【０００５】
この分野の急速な発展にもかかわらず、変異を持つ母親から遺伝した胎児対立遺伝子の検出は困難なまま残されている。この困難さは母体血漿中の胎児と母体ＤＮＡの共存に原因があり、母系遺伝性胎児対立遺伝子は、背景にある母体ＤＮＡと区別がつかない（Ｌｏ  ＹＭＤ、Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ、Ｎａｔ  ＲｅＶ  Ｌａｎｃｅｔ．、８：７１−７７（２００７））。
【０００６】
従って、男の胎児にＸ連鎖変異が遺伝しているかどうか判定する正確で効率的な方法の提供が望まれる。
【発明の概要】
【０００７】
母体試料を分析して、妊婦の男児胎児が母親由来の遺伝性Ｘ連鎖変異を持つか否かを判定する方法、装置、およびシステムが提供される。その試料中で、あるパーセンテージの胎児ＤＮＡが得られ、２つの可能性（胎児が変異、または正常な対立遺伝子を受け継ぐ）に対するカットオフ値が求められる。その後、ある比率の変異対立遺伝子が、Ｘ染色体上の正常な対立遺伝子に対してカットオフ値と比較され、どちらの対立遺伝子が遺伝しているかの分類ができる。あるいは、Ｘ染色体上の標的領域の対立遺伝子の数が、Ｘ染色体上の参照領域の対立遺伝子の数と比較され、欠失または拡大を特定することができる。胎児ＤＮＡのパーセンテージは、胎児特異的対立遺伝子との反応を数え、反応中の統計分布に対応するようにその数を補正することにより、計算できる。
【０００８】
一実施形態では、妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するか否かを判定する方法が提供される。妊婦は、Ｘ染色体上の座位で、変異および正常対立遺伝子のヘテロ接合である。データは、それぞれ、生物学的試料由来の１つまたは複数の核酸分子を含む複数の反応から採取される。生物学的試料には、妊婦由来、および男児胎児由来の核酸分子が含まれる。データは、その座位の変異対立遺伝子の第１の量を示す第１の定量的データセット、およびその座位の正常対立遺伝子の第２の量を示す第２の定量的データセットを含む。パラメータは、第１の量および第２の量から決定され、そのパラメータは、第１と第２の量の間の相対的量を表す。生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆが得られる。胎児がその座位で変異対立遺伝子を受け継いでいるか否かを判定するための第１のカットオフ値が計算され、第１のカットオフ値が少なくとも第１の比率、ｋ／（１＋ｋ−Ｐｆ）から算出される（式中、ｋは妊婦の変異染色体上の変異対立遺伝子の数であり、ｋは１以上の整数である）。胎児が、その座位で正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かを判定するための第２のカットオフ値が、計算され、第２のカットオフ値は、少なくとも第２の比率、［ｋ（１−Ｐｆ）］／［１＋ｋ−ｋＰｆ）］から算出される。パラメータは、第１と第２のカットオフ値の内の少なくとも１つと比較され、胎児が変異対立遺伝子、または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類が行われる。
【０００９】
別の実施形態では、妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するか否かの判定方法が提供される。妊婦は、Ｘ染色体上の標的領域で変異および正常対立遺伝子のヘテロ接合である。変異は、標的領域の欠失または拡大である。複数の反応由来のデータが採取される。各反応は、生物学的試料由来の１つまたは複数の核酸分子を含む。生物学的試料は、妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含む。データは、Ｘ染色体上の標的領域由来の核酸分子の第１の量を示す第１の定量的データセット、および参照領域由来の核酸分子の第２の量を示す第２の定量的データセットを含む。パラメータは、第１の量および第２の量から決定され、このパラメータは、第１と第２の量の間の相対量を表す。生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆが得られる。胎児が変異を受け継いでいるか否かを判定するための第１のカットオフ値が計算される。第１のカットオフ値は、パーセンテージＰｆに依存する。胎児が正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かを判定するための第２のカットオフ値が計算される。第２のカットオフ値は、パーセンテージＰｆに依存する。パラメータは、第１と第２のカットオフ値の内の少なくとも１つと比較され、胎児が変異または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類が決定される。
【００１０】
別の実施形態では、胎児を有する妊婦由来の生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆを得る方法が提供される。データは、複数の反応から採取される。各反応は、妊婦由来および胎児由来の核酸分子を含む生物学的試料由来の複数の核酸分子を含む。第１の対立遺伝子は、反応で検出される。第１の対立遺伝子は、妊婦がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合である座位で母親および胎児により共有される。第１の対立遺伝子の補正濃度Ｐｘは、第１の対立遺伝子に対し陽性の反応に基づいて計算され、Ｐｘは、複数の反応の第１の対立遺伝子の予想される統計分布で補正される。第２の対立遺伝子が反応で検出されるが、この場合、第２の対立遺伝子は胎児に特異的である。第２の対立遺伝子の補正濃度Ｐｙは、第２の対立遺伝子に対する陽性の反応に基づいて計算される。Ｐｙは、複数の反応での第２の対立遺伝子の予想される統計分布により補正される。胎児パーセンテージＰｆは、その後、［（２Ｐｙ）／（Ｐｘ＋Ｐｙ）］を使って計算される。
【００１１】
他の実施形態は、本明細書記載の方法に関連するシステム、およびコンピュータ可読メディアに関する。
【００１２】
下記の詳細説明および付随する図の参照により、本発明の特質および利点に関し、さらに深い理解を得ることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】は、母体の生物学的試料を分析し、本発明の実施形態に従って、胎児中のＸ連鎖障害を診断する方法１００を示すフローチャートである。
【図２】図２Ａは、変異対立遺伝子または正常対立遺伝子を受け継いでいる胎児の２つの可能性を示す。図２Ｂは、本発明の実施形態に従って、逐次確率比検定（ＳＰＲＴ）を使って得られた試料分類用カットオフ値のプロット２５０を示す。
【図３】は、本発明の実施形態に従って、妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するか否かを判定する方法３００を示すフローチャートである。
【図４】は、本発明の実施形態に従って、男児胎児がＸ連鎖変異を受け継いでいるか否かを判定する方法４００を示す。
【図５Ａ】は、染色体Ｘ上の変異に対する変異および野性型対立遺伝子の間の遺伝子の量不均衡を示す表５００である。
【図５Ｂ】は、妊娠対象が目的の座位でヘテロ接合である場合の拡大の検出用の第１のシナリオを示す。
【図５Ｃ】は、妊娠対象が目的の座位でホモ接合である場合の拡大の検出用の第２のシナリオを示す。
【図６】は、妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するか否かを判定するための方法６００を示すフローチャートである。
【図７】は、染色体Ｘ上の欠失および重複変異に対する標的および参照座位間の遺伝子量不均衡を示す表７００である。
【図８】は、本発明の実施形態に従って、胎児を有する妊婦由来の生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆを得る方法８００を示すフローチャートである。
【図９】は、血友病変異を持つ７人の妊婦の臨床的情報を含む表９００を示す。
【図１０】は、対立遺伝子判別可能アッセイのためのオリゴヌクレオチド配列およびリアルタイムＰＣＲ条件を示す表１０００である。
【図１１】は、ディジタルＲＭＤにより、母体血漿中のｒｓ６５２８６３３の胎児遺伝子型同定を示す表１１００である。
【図１２】は、人工ＤＮＡ混合物を使った、ディジタルＲＭＤアッセイの検証を示す。
【図１３】は、ディジタルＲＭＤによる母体血漿中の胎児血友病変異の非侵襲的検出を示す表１３００である。
【図１４】は、母体血漿試料中の胎児血友病変異のＳＰＲＴ分析プロットを示す。試料番号は、グラフの上端に示されている。Ｐr：変異対立遺伝子を含む陽性ウエルの比率。
【図１５】は、正常な妊娠由来の母体血漿試料に対するディジタルＲＭＤの結果を示す。
【図１６】は、本発明の実施形態によるシステムと方法で使用可能なコンピュータシステムの例のブロックダイアグラム１６００を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書で使われる用語の「生物学的試料」は、対象（例えば、妊婦、等のヒト）から採取したいずれかの試料を指し、１つまたは複数の目的の核酸分子を含む。
【００１５】
用語の「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらの単鎖または二重鎖型のポリマーを意味する。特に制限がなければ、この用語は、参照核酸に類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。別段の指定がなければ、特定の核酸配列は、また、保存的に改変された（例えば、縮重コドン置換）それらの変異体、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補的配列、ならびに明示的に指定された配列、を暗黙の内に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３つ目の位置が、混合塩基、および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することにより実現できる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８（１９９４））。用語の核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、小分子ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ、および遺伝子または座位によりコードされたショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、と同義に使用される。
【００１６】
用語の「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。それは、コード領域の前および後ろの領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびにそれぞれのコードセグメント（エキソン）の間に、介在する配列（イントロン）を含んでもよい。
【００１７】
本明細書で使われる用語の「反応」は、目的の特定のポリヌクレオチド配列の存在または非存在を示す化学的、酵素的、または身体的作用を含むプロセスを意味する。「反応」の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等の増幅反応である。「反応」の別の例は、合成、連結反応、ハイブリダイゼーションまたは分解によるシーケンシング反応である。「情報価値のある反応」は、１つまたは複数の特定の目的のポリヌクレオチド配列の存在を示す反応、および唯一の目的の配列が存在する場合の反応である。本明細書で使われる用語の「ウエル」は、閉じ込められた構造、例えば、ウエル形状バイアル、細胞、ＰＣＲアレイのチャンバー、乳剤中の液滴、表面上の粒子、ナノポアまたは領域、内の所定の部位での反応を意味する。
【００１８】
本明細書で使われる用語の「不釣り合いに多い核酸配列」は、生物学的試料中の他の配列より多くの存在量である目的の２つの配列（例えば、臨床的に関連する配列および背景配列）間の核酸配列を意味する。
【００１９】
本明細書で使われる用語の「〜に基づく」は、「少なくとも一部は〜に基づく」を意味し、ある方法の入力およびその方法の出力の関係で生ずるような、別の値の決定に使われる１つの値（または結果）を指す。本明細書で使われる用語の「由来する（ｄｅｒｉｖｅ）」は、また、算出が式の計算である場合に生ずるような、ある方法の入力およびその方法の出力の関係を指す。
【００２０】
本明細書で使われる用語の「定量的データ」は、１つまたは複数の反応から採取し、１つまたは複数の数値を与えるデータを意味する。例えば、特定の配列に対する蛍光マーカーを示すウエルの数は、定量的データでありうる。
【００２１】
本明細書で使われる用語の「パラメータ」は、定量的データセット、および／または定量的データセット間の数値的関係を特徴付ける数値を意味する。例えば、第１の核酸配列の第１の量および第２の核酸配列の第２の量の間の比率（または比率の関数）はパラメータである。
【００２２】
本明細書で使われる用語の「座位（ｌｏｃｕｓ）」またはその複数形「座位（ｌｏｃｉ）」は、ゲノム全域で変異を有する任意の長さのヌクレオチド（または塩基対）の位置またはアドレスである。用語の「対立遺伝子」は、同じ物理ゲノム座位の代替ＤＮＡ配列を意味し、これは、異なる表現型形質を生じても、生じなくてもよい。各染色体（男性のヒト対象の性染色体を除いて）の２つのコピーを有するいずれかの特定の二倍体生物では、各遺伝子の遺伝子型は、その座位に存在する一対の対立遺伝子を含み、これら２つは、ホモ接合体では同じで、ヘテロ接合体では異なる。生物体の集団または種は、典型的な例では、種々の個体の間で各座位に複数の対立遺伝子を含む。集団中で２つ以上の対立遺伝子が見つかるゲノム座位は、多形性部位と呼ばれる。ある座位の対立遺伝子変異は、存在する対立遺伝子の数（すなわち、多型の度合）、または集団中のヘテロ接合体の比率（すなわち、ヘテロ接合割合）として測定可能である。本明細書で使われる用語の「多型」は、その頻度に関わらず、ヒトゲノムのいずれかの個体間変異を意味する。このような変異の例には、限定されないが、単一ヌクレオチド多形、単一タンデム反復多形、挿入−欠失多形、変異（疾患の原因であってもよい）およびコピー数変異が含まれる。
【００２３】
本明細書で使われる用語の「カットオフ値」は、生物学的試料の分類の２つ以上の状態（例えば、疾患と非疾患）の間を区分けするのに使われる数値を意味する。例えば、パラメータがカットオフ値より大きい場合は、定量的データに第１の分類（例えば、疾患状態）が適用され；または、パラメータがカットオフ値より小さい場合は、定量的データに異なる分類（例えば、非疾患状態）が適用される。
【００２４】
本明細書で使われる用語の「不均衡」は、少なくとも１つのカットオフ値により定義される臨床的に関連する核酸配列の量中の参照量からの何らかの有意な偏差を意味する。例えば、参照量が３／５の比率とすると、測定比率が１：１の場合には、不均衡が生じていることになる。
【００２５】
本明細書で使われる用語の「配列決定されたタグ」は、核酸分子のいずれかの部分または全体から配列決定されたヌクレオチドの配列を指す。例えば、配列決定されたタグは、核酸断片から配列決定されたヌクレオチドの短い配列でも、核酸断片の両末端のヌクレオチドの短い配列でも、または生物学的試料中に存在する全核酸断片の配列であってもよい。核酸断片は、より大きな核酸分子のいずれかの部分である。断片（例えば、遺伝子）は、より大きな核酸分子の他の部分に対し別々に（すなわち、連結されないで）存在してもよい。
【００２６】
詳細な説明
伴性遺伝疾患に対する現在の出生前診断法は、典型的な例では、侵襲的で、胎児に危険を及ぼす。母体血漿中の無細胞の胎児ＤＮＡ分析は、このような妊娠で胎児性別の評価用の非侵襲的手段を提供する。しかし、変異特異的確認分析が行われない場合には、男児胎児の疾患状態は、未知のままである。これに関し、我々は、母親からの伴性遺伝疾患の原因となる変異を胎児が受け継いでいるか否かを診断する非侵襲的検査を開発した。１つの戦略は、相対的変異遺伝子量（ＲＭＤ）法に基づいている。この方法は、常染色体疾患変異の胎児の変異状態を判定するために以前に確立している。ＲＭＤ法は、変異体または野性型対立遺伝子の濃度が、ヘテロ接合の男児胎児を有する妊婦の血漿中で不釣り合いに多いかどうかを検出することにより、染色体Ｘ上の伴性変異を胎児が受け継いでいるかどうかを推定するために使用される。
【００２７】
実施形態は、Ｘ連鎖障害、例えば、血友病の出生前診断で、ＲＭＤ手法の適用を提供する。常染色体疾患およびＸ連鎖疾患のＲＭＤ分析の間の差異は、前者に対しては、３つの可能な胎児遺伝子型（すなわち、正常ホモ接合、変異ホモ接合、およびヘテロ接合）があるが、他方、後者に対しては、２つの可能な胎児遺伝子型のみがあるということである。Ｘ連鎖疾患では、男児胎児は、ただ１つの染色体Ｘを有し、従って、それは、変異体か、または野性型遺伝子型となる。Ｘ連鎖疾患に対するこの２つの帰結は、常染色体疾患の場合の３つの帰結に比べて、所与の分析精度での、Ｘ連鎖疾患に対しＲＭＤ手法をよりロバストにすることができる。実施形態は、また、限定されないが、以下を含む他の伴性遺伝疾患にも使用できる：デュシェンヌ型筋ジストロフィー、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、全脈絡膜萎縮、ハンター症候群、レッシュ・ナイハン症候群、ノリエ症候群およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症。
【００２８】
我々は、血友病、Ｘ連鎖出血障害を例として使って、概念を説明する。我々は、妊娠の第１１週目の早期から血友病（伴性遺伝疾患）の危険にさらされている妊娠から採取した１２の調査母体血漿試料の全てで、血友病変異の胎児遺伝子型を正確に検出した。この開発により、危険にさらされている家族が、より外傷性の少ない、より安全な出生前の検査を行う決断ができるであろう。
【００２９】
Ｉ．伴性遺伝変異の判定
図１は、本発明の実施形態に従って、胎児中の母体生物学的試料を分析し、Ｘ連鎖障害を診断する方法１００を示すフローチャートである。方法１００は、非侵襲的であり、母体生物学的試料中で循環するＤＮＡを使用することができる。
【００３０】
ステップ１１０では、Ｘ染色体上の既知の変異を有する妊娠対象が特定される。変異は、血友病、等の本明細書記載のいずれのタイプでもよい。変異は、ＤＮＡシーケンシング、サザンブロット分析、ＰＣＲ（対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む）、融解曲線分析、等の種々の方法で決定できる。変異は、唯一の妊娠対象のＸ染色体が変異を有する、すなわち、妊娠対象が変異に関連する座位でヘテロ接合であるものである。実施形態は、また、点変異または配列欠失、重複または反転を伴う他の伴性障害、例えば、全脈絡膜萎縮およびノリエ症候群の非侵襲的出生前診断にも適用できる。
【００３１】
ステップ１２０では、妊娠対象の生物学的試料が入手される。試料は、血漿、尿、血清、および唾液、等の胎児核酸を含むいずれの生物学的試料であってもよい。例えば、母体血漿試料を産科ケアを受けている妊婦キャリアから集めることができる。
【００３２】
ステップ１３０では、胎児の性別が決定される。性別は、ＸおよびＹ染色体を検出することにより判定できる。母体血漿中の染色体ＹのＤＮＡ配列の検出により、妊娠以降７週目から、男児胎児が９７％を越える正確さで特定できる。女児胎児に対し不必要な侵襲的検査を避けることができる。理由は、女児は非罹患か、または疾患キャリアであるからである。
【００３３】
ステップ１４０では、胎児は、女児であると判定でき、その後、ステップ１４５でさらなる分析は行われない。女児胎児は、偏ったＸ染色体不活性化のようなシナリオ以外は、キャリアとして罹患している。
【００３４】
ステップ１５０では、胎児は、男児であると判定され、その後、ステップ１５５で、Ｘ染色体上のＤＮＡ断片が分析される。一実施形態では、胎児変異検出が相対的変異遺伝子量（ＲＭＤ）技術により行われるが、この技術は以降でさらに詳細に説明される。別の実施形態では、標的領域の対立遺伝子の量（これには、母親の変異も含む）を母体中で正常である参照領域の対立遺伝子の量と比較することにより、胎児の欠失または拡大変異が検出される。
【００３５】
ステップ１５７では、胎児が母体対象の変位Ｘ染色体を受け継がなかったことを判定できる。ステップ１５９では、胎児が母体対象の変位Ｘ染色体を受け継いだことを判定できる。胎児ＤＮＡパーセンテージが高い場合には、必要に応じ、妊娠の後の段階で採取された第２の母体血漿試料を使って分類を確認でき（Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５４：１６６４−１６７２（２００８））、さらにロバストな試験が可能となる。
【００３６】
ＩＩ．正常体と変異体の間の分類
方法１００のステップ１５５での分析は、母体試料中のＤＮＡ断片を分析する。母体試料は、胎児ＤＮＡも含むため、男児胎児のＸ染色体の遺伝子型も判定できる。染色体Ｘ上のいずれの変位に対しても、男児胎児を有するヘテロ接合の女性の血漿中の変異型および野性型対立遺伝子の濃度の間の対立遺伝子不均衡が常に存在する。不釣り合いに多い対立遺伝子は、胎児により受け継がれている対立遺伝子である。一実施形態では、胎児の遺伝子型は、ＲＭＤ技術により判定でき、この技術は、母体試料中の変異対立遺伝子の数を正常対立遺伝子の数と比較することを含む。
【００３７】
図２Ａは、変異対立遺伝子または正常対立遺伝子を受け継ぐ胎児の２つの可能性を示す。母体ＤＮＡ２１０は、特定のＸ染色体上の座位に対し示されている。座位２１５は、正常なＮ（野性型）である１つの対立遺伝子および変異体Ｍであるもう一つの対立遺伝子を有するヘテロ接合である。変異は、例えば、異なる配列、欠失、挿入、および反転、等の種々の型でありうる。これらの変異のそれぞれは、座位２１５の正常対立遺伝子以外の、異なる対立遺伝子として特定できる。
【００３８】
胎児ＤＮＡ２２０では、２つの可能性が示される。男児胎児は、唯一Ｘ染色体を有するので、母体ＤＮＡ２１０のＸ染色体の内のただ１つが男児胎児に受け継がれることになる。可能性２２２は、変異対立遺伝子Ｍを受け継ぐ男児胎児を示す。可能性２２４は、正常対立遺伝子Ｎを受け継ぐ男児胎児を示す。Ｘ染色体より小さいＹ染色体もそれぞれの可能性と共に示されている。
【００３９】
母体試料（例えば、血漿）２３０は、胎児が変異体を受け継ぐか、または正常対立遺伝子を受け継ぐかに応じて、正常対立遺伝子に対する変異対立遺伝子の比率が異なるであろう。可能性２２２では、男児胎児が変異対立遺伝子Ｍを受け継ぐので、母体試料はより多い変異対立遺伝子Ｍを持つことになる。これは、統計的に有意な量のＤＮＡが分析される場合、胎児ＤＮＡが、変異対立遺伝子Ｍにのみ寄与するのに対し、母体ＤＮＡが、変異対立遺伝子Ｍおよび正常対立遺伝子Ｎのほぼ同等に寄与することが理由であると思われる。可能性２２４では、母体試料は、男児胎児が、正常対立遺伝子Ｎを受け継いでいるため、より多くの正常対立遺伝子Ｎを持つことになる。
【００４０】
正常および変異対立遺伝子を示すＤＮＡ断片の数は、種々の方法、例えば、ディジタルＰＣＲ、シーケンシング（Ｓａｎｇｅｒシーケンシング、大量並列シーケンシングおよび一分子シーケンシングを含む）、および単一ＤＮＡ分子または増幅群のＤＮＡ分子（例えば、固体表面上のクラスター）の分析を可能とする他の方法、を使って計数できる。ＮおよびＭ対立遺伝子の数が計数されるとすぐに、種々の技術を使って、例えば、罹患、または非罹患（例えば、胎児が血友病であるか、正常であるかの診断）、等の分類を行うことができる。例えば、ＮおよびＭ対立遺伝子の数からパラメータ（例えば、比率または差異）が決定でき、パラメータを１つまたは複数のカットオフ値に対し比較できる。カットオフ値は、種々の統計技術、例えば、逐次確率比検定（ＳＰＲＴ）により得ることができる（ＺｈｏｕＷ、Ｇａｌｉｚｉａ  Ｇ、Ｌｉｅｔｏ  Ｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９：７８−８１（２００１）；Ｚｈｏｕ  Ｗ、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＳＮ、Ｇａｌｉｚｉａ  Ｇ、ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ．、３５９：２１９−２２５（２００２））。
【００４１】
図２Ｂは、本発明の実施形態に従ってＳＰＲＴを使って得られた試料分類用カットオフ値のプロット２５０を示す。Ｙ−軸は、変異している対立遺伝子の比率Ｐr（パラメータの一例）を示す。Ｘ−軸は、計数された座位２１５の対立遺伝子の数を示す。２つの曲線は、胎児が変異（例えば、血友病）を持つか、正常であるか、または分類不能であるかを判定するためのカットオフ値に対応する。上方境界より大きい、および下方境界より小さい変異対立遺伝子比率（Ｐr）を有する試料は、それぞれ、変異型および野性型として分類される。２つの曲線の中間のＰrを有する試料は、分類不能であり、追加のディジタル分析（例えば、追加のＰＣＲウエルからのデータ）が必要である。
【００４２】
使用する特定のカットオフ値は、計数した対立遺伝子の数に依存する。少しの対立遺伝子のみが計数される場合は、より大きな統計的変動がある可能性があり、従って、試料を変異型または正常型として確信を持って分類するためには、カットオフ値として、極端なＰrの値が必要となる。以降でさらに詳細に説明するように、ディジタルＰＣＲが使用可能である（この場合、Ｙ−軸は、変異対立遺伝子を含む陽性のウエルの比率で、Ｘ−軸は、陽性のウエルの数である）。Ｙ−軸上の曲線の位置は、どのようにして、パラメータが計算されたかに応じて変化し、例えば、パラメータが、Ｍ対立遺伝子の数で除算されたＮ対立遺伝子の数である場合、分類不能領域を１．０が中心となるようにできる。
【００４３】
変異が欠失または拡大である場合の別の実施態様では、母体Ｘ染色体の１つが欠失／拡大を有する標的領域（例えば、座位２１５）および参照領域（拡大または欠失のない）の間の断片の数の間の比較を使って、欠失／拡大を特定することができる。このような実施態様は、特定のヘテロ接合の座位に依存せず、従って、妊娠対象は、標的領域でホモ接合であってもよい。欠失に対しては、参照領域由来よりもより少ない標的領域由来の断片が予測できる。拡大に対しては、参照領域由来よりもより多くの標的領域由来の断片が予測できる。カットオフ値は、また、ＳＰＲＴまたは類似の技術を使って決定できる。
【００４４】
ＩＩＩ．ＲＭＤ法
図３は、本発明の実施形態に従って、妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異であるか否かを判定する方法３００を示すフローチャートである。妊婦は、Ｘ染色体上の座位で変異および正常対立遺伝子のヘテロ接合である。方法３００は、相対的量の変異および正常対立遺伝子を使って疾患分類を行う。
【００４５】
ステップ３１０では、複数の反応由来のデータが入手される。各反応は、生物学的試料由来の１つまたは複数の核酸分子を含み、この試料は、妊婦由来、および男児胎児由来の核酸分子を含む。反応は、種々のウエルでのディジタルＰＣＲ反応、等の種々の型であってよい。他の実施形態では、シーケンシング反応（例えば、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＯＬｉＤ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単分子リアルタイムシーケンシングまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、を含む大量並列シーケンシングプラットフォームによる）、プライマー伸長法反応、質量分析、ナノポアを使った分析、光学的方法または蛍光または他のプローブへのハイブリダイゼーション、等の他の反応を使うことができる。従って、データには、ディジタルＰＣＲウエルからの蛍光シグナル、ウエル中の少なくとも一部のＤＮＡ分子のシーケンシングから得た配列決定されたタグ、またはこのような反応から生じた他のデータ、を含むことができる。
【００４６】
反応由来のデータには、その座位の変異対立遺伝子の第１の量を示す第１の定量的データセット、およびその座位の正常対立遺伝子の第２の量を示す第２の定量的データセットを含む。その座位の特定の対立遺伝子の量は、種々の方法、例えば、特定の対立遺伝子を含み、その座位に整列させた（参照ゲノムを使って）配列決定されたタグの数、および配列決定されたヌクレオチド（塩基対）の数または特定の対立遺伝子を含み、その座位に整列させた配列決定されたヌクレオチド（塩基対）の累積長さを計数し、特定の対立遺伝子に対する陽性のウエルの合計数により、測定できる。
【００４７】
ステップ３２０では、パラメータが第１の量および第２の量から決定される。パラメータは、第１と第２の量の間の相対量を表す。パラメータは、例えば、第１の量の第２の量に対する単純比率、または第１の量の第２の量＋第１の量に対する比率であってもよい。一態様では、各量は、ある関数または別の関数に対する引数であってよく、この場合、比率は、次に、これらの別々の関数から算出できる。当業者なら、異なる適切なパラメータの数を理解するであろう。例えば、パラメータは、血漿試料中に存在する変異対立遺伝子の数の、変異および野性型対立遺伝子の合計数に対する比率（Ｐrで示される）であってもよい。
【００４８】
ステップ３３０では、生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆが得られる。パーセンテージＰｆは、母体ＤＮＡに比べて、どのくらい多くの胎児ＤＮＡが母体試料に存在するかの測定値を提供する。パーセンテージＰｆがより高い場合は、受け継がれた不釣り合いに多い対立遺伝子が多くなる。パーセンテージは、１を１００％として、０〜１の分数で表現できる。
【００４９】
ステップ３４０では、胎児がその座位で変異対立遺伝子を受け継いでいるか否かを判定するための第１のカットオフ値が計算される。第１のカットオフ値は、少なくとも第１の比率：１／（２−Ｐｆ）から算出される。ステップ３２０からのパラメータの公式化の方法に応じて、比率：１／（２−Ｐｆ）は、変異対立遺伝子が受け継がれた場合は、第１と第２の量の予測比率に等しくなりうる。予測値を統計関数に入力し、カットオフ値を決定できる。カットオフ値は、多くの異なる形式の方法、例えば、ＳＰＲＴ、偽陽性検出（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、信頼区間、および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析、を使って決定できる。
【００５０】
ステップ３５０では、胎児がその座位で正常対立遺伝子を受け継いだか否かを判定するための第２のカットオフ値が計算される。第２のカットオフ値は、少なくとも第２の比率：（１−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）から算出される。
【００５１】
ステップ３６０では、パラメータが第１および第２のカットオフ値の内の少なくとも１つと比較され、胎児が変異対立遺伝子または正常対立遺伝子を受け継いだかどうかの分類が決定される。上述のように、分類は、罹患（変異を受け継いでいる）および非罹患（正常な遺伝子を受け継いでいる）を含み、さらに、未分類を含めてもよい。正確さの確率も分類に含めることができ、例えば、正確さは、どれくらい多くのパラメータがカットオフ値を越える（越えるまたは下まわる）かによって決定することも可能である。一実施態様では、分類は、後日、例えば、医師により解釈されるスコアであってもよい。
【００５２】
対立遺伝子の量を示すデータは、連鎖性対立遺伝子由来であってもよい。従って、変異または正常対立遺伝子に連鎖した対立遺伝子は、正常および変異対立遺伝子の代わりに使用可能である。例えば、変異核酸配列に連鎖した多形部位の対立遺伝子は、同じ母体ハプロタイプ上に位置する変異核酸配列として対立遺伝子である可能性があり、この場合、多形部位および変異核酸配列の間の組換えの確率は、特定の値、例えば、１％未満である。従って、多形部位は、変異対立遺伝子の直接の測定値と同じまたは類似の定量的データを提供できる。別の例では、正常な核酸配列に連鎖した多形部位の対立遺伝子は、正常な核酸配列と同じ母体ハプロタイプ上に位置する対立遺伝子でありえ、この場合、多形部位および変異核酸配列の間の組換えの確率は、特定の値、例えば、１％未満である。
【００５３】
Ａ．血漿を含むＰＣＲを使った例
上述のように、ディジタルＰＣＲを、変異または正常対立遺伝子を含むＤＮＡ断片を特定する方法として使用可能である。ディジタルＰＣＲでは、試料は複数の区画（例えば、ウエルまたはビーズ）に分割される。平均して、各区画は２つの対立遺伝子のいずれか１つ未満を含む。従って、陽性のウエルが対立遺伝子含有断片のただ１つの事例として計数できる。
【００５４】
図４は、本発明の実施形態に従って、男児胎児がＸ連鎖変異を受け継いでいるかどうかを判定する方法４００を示す。ディジタルＰＣＲを使って、変異対立遺伝子比率および胎児ＤＮＡパーセンテージが決定される。胎児ＤＮＡパーセンテージを使って、変異対立遺伝子比率が比較され、それにより、男児胎児が変異を受け継いでいるか否かの分類を提供するカットオフ値が決定される。変異対立遺伝子比率が決定されるので、実施形態は、ＲＭＤ法と呼ぶことができる。
【００５５】
図示のように、各母体血漿ＤＮＡ試料に対し、変異体ＤＮＡ比率（Ｐr）および胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆの両方がディジタルＰＣＲにより決定されるが、特定の配列を特定できる他の反応も使用可能である。Ｐrを決定するステップは左側で提供され（プロセス４０１）、胎児ＤＮＡ濃度比率Ｐｆの決定ステップは、右側に提供される（プロセス４０２）。示されているように、Ｐrは、母体により保有されている変異を標的にしたリアルタイムＰＣＲアッセイを使って決定でき、他方、胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆは、相同ＺＦＹおよびＺＦＸ遺伝子領域に対するリアルタイムＰＣＲアッセイを使って決定される。
【００５６】
ステップ４１０では、ＰＣＲ混合物が調製される。示されているように、混合物は、２つの測定値に対し異なる。Ｐr測定（プロセス４０１）に対しては、混合物は、検査される座位を含むＸ染色体上の領域を増幅するＰＣＲプライマーを含む。混合物は、また、野性型対立遺伝子を有するＤＮＡ断片の存在を特定する蛍光プローブ、および変異対立遺伝子を有するＤＮＡ断片の存在を特定する蛍光プローブを含む。Ｐｆ測定（プロセス４０２）では、混合物は、ＺＦＹおよびＺＦＸ遺伝子領域に対するプライマーを含む。混合物は、また、ＺＦＸ遺伝子由来の配列を含むＤＮＡ断片の存在を特定する蛍光プローブ、およびＺＦＹ遺伝子由来の配列を含むＤＮＡ断片の存在を特定する蛍光プローブを含む。
【００５７】
ステップ４２０では、反応混合物は、ＰＣＲ装置に供される。一実施形態では、マイクロフルイディクスディジタルアレイ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）中でディジタルＰＣＲを行い、これは、各パネルがさらに７６５の反応チャンバーに分割されている１２パネルからなる。各ＤＮＡ試料（すなわち、１つはＰr用、１つはＰｆ用）が６パネル、すなわち、７６５ｘ６＝４５９０チャンバーを使って分析される。ＰＣＲ混合物は、最初に、マニュアルで各パネルの試料導入口に加えることができる。次に、混合物は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）により各パネル中の７６５チャンバーに自動的に分注される。各チャンバーは、６ｎＬの最終反応容量を含む。母体血漿中の無細胞のＤＮＡ濃度は、典型的な例では、非常に少なく、平均で、１テンプレート分子／チャンバーより少ない程度である。従って、チャンバーへのテンプレート分子の分布は、ポアソン分布に従う。他の試料に対しては、ＤＮＡ試料を分析前に希釈する必要があるかもしれない。また、当業者によく知られた方法、例えば、マイクロフルイディクスチップ、ナノリッターＰＣＲ（ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  ＰＣＲ）マイクロプレートシステム、エマルジョンＰＣＲ（レインダンス（ＲａｉｎＤａｎｃｅ）プラットホームを含む）、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、プライマー伸長法および質量分析、を使ってディジタルＰＣＲを行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【００５８】
Ｐr測定に対し示されているように、野性型対立遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むウエル（チャンバー）は、青で示され、変異対立遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むウエルは、赤で示される。テンプレートＤＮＡ分子を含まない（すなわち、対応するプローブがある対立遺伝子が存在しない）ウエルは、単純に白で示される。Ｐｆ測定に対しても同様に、ＺＦＸ遺伝子を含むウエルは青で示され、ＺＦＹ遺伝子を含むウエルは赤で示される。
【００５９】
ステップ４３０では、リアルタイムＰＣＲを、例えば、ＢｉｏＭａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）上で行った。各ウエルは、対応する混合物中でプライマーに対応するＤＮＡ領域を増幅する一連のサイクルに供される。ほとんどのチャンバーは、０または１つのテンプレートＤＮＡ分子を含むので、ウエルの増幅産物は、１つのテンプレートＤＮＡ分子由来である。
【００６０】
ステップ４４０では、陽性のＰＣＲ増幅チャンバーの数が計数される。プロセス４０１では、野性型対立遺伝子に対し陽性のチャンバーの数が計数でき、また、変異対立遺伝子に対するチャンバーの数が計数できる。プロセス４０２では、ＺＦＸ遺伝子に対し陽性のチャンバーの数が計数でき、また、ＺＦＹ遺伝子に対するチャンバーの数が計数できる。各プロセスでは、両方の対立遺伝子に対し陽性のチャンバーの数もまた、特定できる。陽性のチャンバーの検出は、蛍光シグナル（例えば、各対立遺伝子は、異なる色のシグナルを発光する）の検出、等の種々の方法で行うことができる。例えば、ＺＦＸ遺伝子を含むチャンバーは、青い蛍光のシグナルを発光でき、ＺＦＹ遺伝子を含むウエルは、赤い蛍光のシグナルを発光できる。
【００６１】
ステップ４５０では、ステップ４４０で計数された対応する数を使って、変異体ＤＮＡ比率（Ｐr）および胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆが計算される。例えば、変異対立遺伝子比率が、変異対立遺伝子に対する陽性のチャンバーの数を陽性のウエルの合計数で除算して計算できる。他の例では、分母は、１つの対立遺伝子のみに対し陽性のチャンバーの合計数であってもよい。未加工のカウント数を含む比率の代わりに、値は、分子および分母を上記のいずれかの数値で効果的に除算した、濃度それ自体であってもよい。類似の値を使用して、式［（２Ｙ）／（Ｘ＋Ｙ）］＊１００％に従い胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆを計算できる。式中、Ｙは、ＺＦＹ遺伝子の測定量（例えば、陽性のチャンバーまたは陽性のチャンバーの比率の数）であり、Ｘは、ＺＦＸ遺伝子の測定量である。
【００６２】
反応ウエル当たり、１つ未満のテンプレート分子が存在するため、各反応チャンバーに分配されたテンプレート分子の実際の数は、ポアソン分布に従った。従って、いずれかの対立遺伝子に対するチャンバーの数は、式［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ）／Ｎ）］＊Ｎを使って、ポアソン補正できる。式中、Ｎは、分析反応チャンバーの合計数、Ｐは、対立遺伝子に対する陽性のチャンバーの数であり、ｌｎは自然対数である。次に、ポアソン補正された値を使って、上述と類似の方式で、比率Ｐrおよび胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆを決定できる。
【００６３】
ステップ４６０では、変異体ＤＮＡ比率（Ｐr）および胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆを使って、男児胎児が変異を受け継いだか否かの分類が行われる。方法３００と同様に、カットオフ値が、例えば、ステップ３４０および３５０のように、胎児ＤＮＡパーセンテージＰｆから決定できる。カットオフ値は、また、平均参照テンプレート濃度（ｍr）から算出でき（これは、ｍrに等しい場合も含む）、例えば、実験的に測定した野性型対立遺伝子に対する陽性のチャンバーのパーセンテージを使って、ステップ４６０で使われるカットオフ値を決定できる。この戦略は、確信できる分類に必要な検査の量をさらに最小限にできる。これは、テンプレート量が制限されることが多い血漿核酸分析に特に適切である。
【００６４】
Ｂ．ＳＰＲＴ
ＳＰＲＴは、データが蓄積するに従い、２つの確率的仮説の比較を可能とする方法である。換言すれば、それは、ディジタルＰＣＲの結果を変異または正常対立遺伝子の方向に偏らせることを示唆するようにして、分類する統計的方法である。それは、分析されるウエルの数を最小化して所与の統計的な力と正確さを実現する利点を有する。
【００６５】
代表的ＳＰＲＴ分析では、実験結果は、２つの対立仮説に対して検定される。１つ目の対立仮説は、変異対立遺伝子が不釣り合いに多い場合に採択される。２つ目の対立仮説は、変異対立遺伝子が不当に少なく見積もられた場合に、採択される。測定されたＰrは、２つのカットオフ値の内の少なくとも１つと比較されて、１つ目または２つ目の対立仮説が採択される。いずれの仮説も採択されない場合は、試料は、未分類として標識されることになり、これは、試料を所望の統計的信頼性で分類するには、観察されたディジタルＰＣＲ結果の数が十分ではないことを意味する。より多くのデータを集めて、所望の統計的信頼性を得ることができる。
【００６６】
集めたデータ量に依存する一対の曲線により、仮説を採択するか、または棄却するかの確率的限界（カットオフ値）を定義できる（Ｚｈｏｕ  Ｗ、Ｇａｌｉｚｉａ  Ｇ、Ｌｉｅｔｏ  Ｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９：７８−８１（２００１）；Ｚｈｏｕ  Ｗ、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＳＮ、Ｇａｌｉｚｉａ  Ｇ、ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ．、３５９：２１９−２２５（２００２））。ＳＰＲＴ曲線は、胎児遺伝子型の分類のために、所与の陽性の反応の合計数（ｘ−軸）に対する必要なＰr（ｙ−軸）を図示した。実験値Ｐrが、上方境界を越えた領域、または下方境界より低い領域へ入る場合に、それぞれ、仮説（ｉ）または（ｉｉ）が採択される。ＳＰＲＴ限界を計算する式は、統計的信頼性のレベルを変えて判定できる（例えば、閾値尤度比８に調節して）。一態様では、ＳＰＲＴ曲線のカットオフ値は、試料特異的である。カットオフ値は、上述の胎児ＤＮＡ濃度比率（胎児ＤＮＡパーセンテージ）に依存する。カットオフ値は、また、所与の反応セットに対する平均ＰＣＲウエル当たりの参照テンプレート濃度（ｍr）にも依存する可能性がある（Ｌｏ  ＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７；１０４：１３１１６−１３１２１（２００７）；Ｌｕｎ  ＦＭＦ、Ｔｓｕｉ  ＮＢＹ、Ｃｈａｎ  ＫＣＡ、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１０５：１９９２０−１９９２５（２００８））。参照テンプレートは、試料中のより少ない陽性の増幅数を示した対立遺伝子であってもよい。
【００６７】
ＳＰＲＴは、所与の信頼性レベルに対し、他の統計的方法より少ない試験量で済むという利点を与えることができる。実際面では、ＳＰＲＴは、必要量のデータが蓄積されるとすぐに、いずれかの仮説の採択または拒絶が可能となり、従って、不必要な追加の分析を最小限にする。この特徴は、通常、利用可能なテンプレート分子の数が限られている、低い濃度で存在する血漿核酸の分析に特に適合する。厳密な分類に加えて、分類には、パーセント正確性を含んでもよい。例えば、カットオフ値との比較で得られた分類は、試料が特定のパーセンテージで核酸配列不均衡の尤度を示すこと、すなわち、換言すれば、決定した不均衡は、特定のパーセンテージまたは他の値の程度に正確であることを規定できる。
【００６８】
ＳＰＲＴを使用した実施形態では、Ｅｌ  Ｋａｒｏｕｉ、等のＳＰＲＴ曲線の上方および下方境界の計算に算出式を使用できる（Ｅｌ  Ｋａｒｏｕｉ  Ｎ、Ｚｈｏｕ  Ｗ、Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ  ＡＳ、Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ．２５：３１２４−３１３３（２００６））。さらに、１つ目のまたは２つ目の仮説の採択のために好ましい統計的信頼性のレベルは、式中の閾値尤度比を調節することにより変えることができる。閾値尤度比８は、癌検出との関連で、対立遺伝子不均衡を含む試料、および含まない試料を識別するために、満足できる結果を与えることを示した。従って、一実施形態では、ＳＰＲＴ曲線の上方および下方境界を計算する式は：
上方境界＝［（ｌｎ８）／Ｎ-ｌｎδ］／ｌｎγ
下方境界＝［（ｌｎ１／８）／Ｎ-ｌｎδ］／ｌｎγ
であり、
式中、δ＝（１-θ1）／（１-θ2）、
【数１】
2014507134.tif 000003
ｌｎは、自然対数、すなわち、ｌｏｇeを表す数学記号、Ｎ＝分子の合計数（すなわち、分析される変異および正常分子の合計）、
θ1    ＝１つ目の対立仮説が真の場合（すなわち、胎児が変異対立遺伝子受け継いでいる場合）、変異および正常分子の合計数に対する変異分子の比率；および
θ2    ＝２つ目の対立仮説が真の場合（すなわち、胎児が正常対立遺伝子を受け継いでいる場合）、変異および野性型分子の合計数に対する変異分子の比率
である。
【００６９】
１つ目の対立仮説を採択するためのθ1測定に際し、試料は、変異（Ｍ）対立遺伝子を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から採取したと仮定される。θ1は、１／（２−Ｐｆ）であると判断される。式中、Ｐｆは、試料中の胎児ＤＮＡのパーセンテージである。Ｐｆは、統計分布、例えば、本明細書記載のポアソン分布、で補正できる。
【００７０】
２つ目の対立仮説を採択するためのθ2の測定に際し、試料は、正常な（Ｎ）対立遺伝子を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から採取したと仮定される。θ2は、（１−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）であると判断される。
【００７１】
実験による変異および野性型分子の数の測定後、変異および野性型分子の合計数に対する変異分子の比率（Ｐｒ）が計算できる。次に、Ｐｒの値がカットオフ値と比較され、母体血漿中の変異または野性型対立遺伝子が不釣り合いに多いかどうかが判定される。
【００７２】
Ｃ．カットオフ値のポアソン補正
ディジタルＰＣＲを使った一実施形態では、平均濃度／ウエル（反応または反応混合物）が決定され、その配列を示すウエルの予想数が計算される。この量は、パーセンテージ、分数値、または整数値として表現できる。一実施態様では、例えば、ディジタルＰＣＲ等の測定方法のウエルの反応混合物の中で、正常な（Ｎ）対立遺伝子、または変異対立遺伝子に対しポアソン分布が仮定される。他の実施態様では、二項分布、等の他の分布関数が使われる。
【００７３】
ポアソン方程式は：
【数２】
2014507134.tif 000004
であり、式中、ｎ＝ウエル当たりのテンプレート分子の数；Ｐ（ｎ）＝特定のウエル中のｎテンプレート分子の存在確率；およびｍ＝特定のディジタルＰＣＲ実験における１つのウエル中のテンプレート分子の平均数である。従って、平均正常対立遺伝子濃度０．５で、どのウエルも正常対立遺伝子分子も含まない確率は：
【数３】
2014507134.tif 000005
となるであろう。
【００７４】
従って、いずれかのウエルが少なくとも１つの正常対立遺伝子分子を含む確率は：１-０．６０６５＝０．３９３５、となるであろう。従って、約３９％のウエルは、少なくとも1つの正常対立遺伝子分子を含むことが期待されることになる。一実施形態では、実験的に（例えば、ディジタルＰＣＲを使って）得られた陰性ウエルの比率から変異または野性型に対するＰ（０）が決定できる。その後、Ｐ（０）を使って、ウエル当たりの平均分子数（ｍ）が計算できる。次に、パラメータが、ウエル当たりの平均分子数から、例えば、変異平均を変異および正常対立遺伝子に対する平均の合計で除算することにより計算できる。陽性のウエルの数、および分子の数の間のこの関係を考慮すれば、選択肢は、陽性のウエルの数を補正し、分子の数を得ることである（上述のように、式［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ）／Ｎ）］＊Ｎを使って。式中、Ｎは、分析した反応チャンバー合計数、およびＰは、対立遺伝子に対し陽性のチャンバーの数である）。
【００７５】
ｍrの測定を、当業者に既知の、または今後知られる種々の機序により行うことができる。一実施形態では、ｍrの値は、ディジタルＰＣＲ分析の実験プロセスの間に測定される。ｍrの値および参照対立遺伝子に対し陽性であるウエルの合計数、の間の関係は、分布（例えば、ポアソン分布）により支配される可能性があるので、ｍrは、参照対立遺伝子に対し陽性であるウエルの数から、下記の式を使って計算できる：
ｍr＝−ｌｎ（１−参照対立遺伝子に対し陽性であるウエルの比率）。
この手法は、ディジタルＰＣＲ実験に使われるＤＮＡ試料中のｍrの直接的で、正確な推定を与える。
【００７６】
この方法は、所望の濃度を得るために使用できる。例えば、抽出した試料の核酸を希釈し、特定の濃度、例えば、反応ウエル当たり１つのテンプレート分子の濃度にすることができる。ある実施形態では、ポアソン分布を使って、テンプレートのないウエルの予測比率が下式で計算できる：
【数４】
2014507134.tif 000006
式中、ｍは、ウエル当たりのテンプレート分子の平均濃度である。例えば、ウエル当たり１テンプレート分子の平均濃度で、テンプレート分子のないウエルの予測比率は、
【数５】
2014507134.tif 000007
すなわち、０．３７（３７％）により与えられる。残りの６３％のウエルは、１つまたは複数のテンプレート分子を含むことになる。典型的な例では、次に、ディジタルＰＣＲ操作中の陽性のウエルの数を数えることが可能となろう。情報価値のあるウエルの定義およびディジタルＰＣＲデータが解釈される方法は、用途に依存する。
【００７７】
他の実施形態では、ウエル当たりの平均濃度、ｍr、は、例えば、定量リアルタイムＰＣＲ、半定量競合ＰＣＲ、および質量分析法を使ったｒｅａｌ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ、等の別の定量化方法によって測定される。
【００７８】
一実施態様では、正常対立遺伝子に対する変異対立遺伝子の比率は、補正濃度を使って計算できる。各対立遺伝子に対する濃度ｍは、上述のように計算できる。次に、各対立遺伝子に対する濃度が決定でき、濃度の比率Ｐｒが実験的に算出され、分布補正された比率として使って、各仮説（例えば、変異または野性型遺伝）に対する予測比率と比較できる。例えば、実験的に決定された試験試料のＰｒが式：（変異対立遺伝子の濃度）／（変異体＋野性型対立遺伝子の濃度）、を使って計算できる。別の実施態様では、各対立遺伝子に対するウエルの数の比率が使用される。予測比率（カットオフ値）も統計分布に基づき補正できる。
【００７９】
Ｄ．実例
図５Ａは、本発明の実施形態に従って、染色体Ｘ上の変位に対する変異および野性型対立遺伝子の間の遺伝子量不均衡を説明する表５００を示す。計算を説明するために、合計１００ゲノム当量（ＧＥ）の１０％胎児ＤＮＡを有するＤＮＡを含む母体血漿試料を使用した。母体ゲノムに対しては、１ＧＥは、２コピーの対立遺伝子、すなわち、ＭおよびＮ対立遺伝子それぞれを１コピー含む。これは、９０コピーの各変異および正常対立遺伝子を与える。胎児ゲノムに対しては、１ＧＥは、Ｘ連鎖対立遺伝子の１コピー、すなわち、変異体（Ｍ）または正常な（Ｎ）対立遺伝子のいずれかの１コピーを含む。これは、どちらの対立遺伝子を胎児が受け継いでいるかに応じて、各対立遺伝子の０または１０コピーを与える。
【００８０】
表５００では、上段は、正常対立遺伝子を受け継いでいる胎児に対応し、従って、正常対立遺伝子に対する変異対立遺伝子の比率は１未満である。下段は、変異対立遺伝子を受け継いでいる胎児であり、従って、正常対立遺伝子に対する変異対立遺伝子の比率は１を越える。
【００８１】
Ｅ．欠失、拡大、挿入、および反転
方法３００および４００は、標準的ＳＮＰ以外の、追加の状況で適用できる。実施形態は、例えば、大きなＤＮＡセグメントの欠失、拡大（例えば、重複）、挿入、および反転、等の胎児変異の非侵襲的検出にさらに適用できる。このような変異の例は、Ｘ連鎖疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーおよびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、に関連する。手法は、拡大（例えば、重複）ＤＮＡセグメントの間の、または反転および隣接正常ＤＮＡセグメントの間の、欠失の再結合配列の接合部のターゲティングにより変異対立遺伝子を検出することである。胎児遺伝子型は、正常および変異対立遺伝子の間の遺伝子量不均衡から、本明細書記載の方法を使って推測することができる。
【００８２】
図５Ｂは、妊娠対象が目的の座位でヘテロ接合の場合に、拡大検出用の第１のシナリオを説明する。第１の染色体の拡大に対しては、拡大対立遺伝子Ｂが非拡大対立遺伝子Ａと異なる場合、拡大対立遺伝子Ｂの種々のコピーＢ１およびＢ２に対し、異なる接合部が存在する。これは、拡大コピーＢ１およびＢ２が第１の染色体上の異なる位置にあることが理由である。接合部の１つがユニークである（例えば、Ｂの始点にある、またはＢ２の末端にある接合部がユニークであり、一方、Ｂ−Ｂ１およびＢ１−Ｂ２間の接合部は、同じである）場合、ユニーク接合部は、他の染色体上の正常対立遺伝子との比較のための変異対立遺伝子として使用できる。この方法では、カットオフ値は、ステップ３４０と３５０の場合と同じ方法で算出できる。あるいは、拡大対立遺伝子Ｂの全ての具体例（すなわち、Ｂ、Ｂ１、およびＢ２）が、第１の染色体の部位にかかわらず使用可能である。このような実施形態では、θ1＝（１＋ｎ）／（２＋ｎ−Ｐｆ）、およびθ2＝［（１＋ｎ）（１−Ｐｆ）］／［２＋ｎ−Ｐｆ（１＋ｎ）］であり、式中、ｎは追加コピーの数（示されるように、ｎ＝２）で、ｎは、ゼロ以上の整数である。これらの式は、また、θ1＝ｋ／（１＋ｋ−Ｐｆ）およびθ2＝［ｋ（１−Ｐｆ）］／［１＋ｋ−ｋＰｆ）］のように表すこともでき、ｋは変異染色体上の変異対立遺伝子（新しく形成された接合部でもよい）のコピー数で、ｋは、ゼロ以上の整数である。
【００８３】
接合部は、また、類似の手法で常染色体上の変異に対してＲＭＤ分析にも使用可能であるが、θ1とθ2の値の調節が必要である。例えば、染色体が父親から正常な染色体を受け継いでいると仮定して、胎児が拡大変異を受け継いでいる場合は、試料は母親と同じ比率を持つと思われる。このシナリオでは、θ1の値は、ｋ／（ｋ＋１）となり、ｋは拡大変異により作られた追加の接合部の数であり、追加の接合部は、変異対立遺伝子として使用される（従って、重複または欠失に対しては、１つの変異対立遺伝子が存在し、３倍拡大に対しては、２つの変異対立遺伝子が存在する、等）。胎児が母親から正常な染色体を受け継いでいる場合は、θ2の値は、ｋ（１−Ｐｆ）／［ｋ＋１＋（１−ｋ）Ｐｆ］となる。
【００８４】
図５Ｃは、妊娠対象が、目的の座位でホモ接合の場合に拡大を検出するための第２のシナリオを示す。拡大対立遺伝子および非拡大対立遺伝子が同じ（Ａで示す）の場合、２つの接合部５１０は、同じであり（正常な部位での２つの対立遺伝子に対し）、また、追加の対立遺伝子のコピーの追加の（新規）接合部５２０は、これらの追加の対立遺伝子が、異なるゲノム部位にあると思われるため、異なる。追加の接合部は、変異対立遺伝子として使用可能であり、正常な接合部５１０は、正常対立遺伝子として使用可能である。追加の対立遺伝子に対し、追加の接合部５２０の内の１つのみを使用することができる（重複に対しては１つのみが存在する）。このような実施形態では、θ1＝１／（３−Ｐｆ）；およびθ2＝（１−Ｐｆ）／（３−２Ｐｆ）である。この式では１つの追加の接合部のみが使用されるため、追加のコピーの量は使用されないことに留意されたい。
【００８５】
２つ以上の追加のＡのコピーがある場合は、使用される追加の接合部は、ユニークとなるように選択されるべきである（例えば、Ａの最後の拡大コピー後の接合部）。または、追加の接合部の全て（または２つ以上の一部の数）を合計し、正常な部位の２つの対立遺伝子の接合部と比較できる。このような実施形態では、θ1＝ｎ／（ｎ＋２−Ｐｆ）；およびθ2＝ｎ（１−Ｐｆ）／［ｎ＋２−Ｐｆ（ｎ＋１）］であり、ｎは、使用される新規接合部５２０の数である。この式中では、２つ以上の接合部のみが使用されるため、追加のコピーの量が使用されることに留意されたい。接合部は、また、常染色体上の変異の場合と類似の方法でＲＭＤ分析に対し使用できるが、θ1およびθ2の値は、調節が必要であると思われる。例えば、胎児が拡大変異（拡大）を受け継いでいる場合は、試料は、染色体が父親から変異を受け継いでいないことを仮定して、母親と同じ比率（例えば、重複に対しては１：２）を持つであろう。このシナリオでは、θ1の値は、ｎ／（ｎ＋２）となり、ｎは、拡大変異により作られた追加の接合部の数である。胎児が母親からの正常な染色体を受け継いでいる場合には、値θ2は、ｎ（１−Ｐｆ）／（ｎ＋２−ｎＰｆ）、となる。欠失および拡大を検出する別の手法は、以降で記載される。
【００８６】
ＩＶ．標的領域と参照領域
上述のＲＭＤ法では、変異が欠失、拡大、挿入、または反転である場合、異なる接合部が対立遺伝子として使用できる。欠失および拡大（例えば、重複）変異に適用可能な別の手法は、標的領域（すなわち、欠失または拡大領域）から生じる分子の量を、参照領域から生じる分子の量と比較することである。欠失（または拡大）のない染色体Ｘ上のいずれのゲノム座位、例えば、欠失または拡大がない場合のＺＦＸ遺伝子も、参照座位／領域として使用可能である。
【００８７】
参照領域由来の分子の数に対する標的領域由来の分子の数の比率（Ｒ）（または関連する量を表す他のいくつかのパラメータ）は、変異が受け継がれているか否かを判定するのに使用できる。欠失変異を有する非妊婦では、Ｒの予測値は、０．５である。理由は、Ｘ染色体（正常対立遺伝子を有するもの）の半分のみが、血漿中の標的分子の量に寄与するからである。この欠失変異を有する女性が男児胎児を持つ妊婦の場合は、Ｒの予測値は、男児胎児由来の１つの余分のＸ染色体からのＤＮＡの寄与により、０．５から外れるであろう。Ｒの予測偏差は、変異が欠失か、または拡大かどうかに依存するであろう。
【００８８】
図６は、妊婦の男児胎児がＸ連鎖変異を有するがどうかを判定する方法６００を説明するフローチャートである。妊婦は、Ｘ染色体上の標的領域で、変異および正常対立遺伝子に対しヘテロ接合である。変異は、標的領域の欠失または拡大である。
【００８９】
ステップ６１０では、複数の反応由来のデータが入手される。データは、方法３００のステップ３１０で入手されたものと同じタイプであってよい。各反応は、妊婦由来および男児胎児由来の核酸分子を含む生物学的試料からの１つまたは複数の核酸分子を含む。データは、Ｘ染色体上の標的領域由来の核酸分子の第１の量を示す第１の定量的データセット、および参照領域由来の核酸分子の第２の量を示す第２の定量的データセットを含む。量は、例えば、上述のステップ３１０用のような、種々の方法で計算できる。
【００９０】
ステップ６２０では、パラメータが、第１の量および第２の量から決定される。パラメータは、第１と第２の量の間の相対量を表す。一実施形態では、パラメータは、第２の量に対する第１の量の比率Ｔである。他の実施形態は、本明細書記載のように、例えば、第１の量を第１の量と第２の量の合計で除算したパラメータを使用できる。
【００９１】
ステップ６３０では、生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆが得られる。パーセンテージＰｆは、本明細書記載のようにして計算できる。パーセンテージＰｆは、また、胎児特異的分子の計数用の分布補正（例えば、ポアソン補正）値から決定できる。
【００９２】
ステップ６４０では、胎児が変異を受け継いでいるか否かを判定するための第１のカットオフ値が計算される。第１のカットオフ値は、パーセンテージＰｆに依存する。第１のカットオフ値計算用の特定の式は、変異が欠失であるか拡大であるかに依存する。
【００９３】
ステップ６５０では、胎児が正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かを判定するための第２のカットオフ値が計算される。第２のカットオフ値は、パーセンテージＰｆに依存する。第１のカットオフ値計算用の特定の式は、変異が欠失であるか拡大であるかに依存する。
【００９４】
ステップ６６０では、パラメータは、第１および第２のカットオフ値の内の少なくとも１つと比較され、胎児が変異または正常対立遺伝子を受け継いでいるか否かの分類が決定される。分類は、ステップ３６０と同じタイプでよく、例えば、罹患、非罹患、または未分類（または生のスコア）である。
【００９５】
図７は、染色体Ｘ上の欠失および重複変異に対する標的および参照座位の間の遺伝子量不均衡を示す表７００である。表７００は、対立遺伝子不均衡度の計算を説明する。同じ欠失変異を有する非妊婦のＲと比較した場合、Ｒの増加または減少は、それぞれ正常なまたは罹患した胎児を示すことができる。逆に、部分拡大、例えば、表７００に示すような重複を有する非妊婦では、変異対立遺伝子由来の標的分子の２倍量の寄与により、Ｒの予測値は、１．５になるであろう。この重複変異を有する女性が妊婦の場合、Ｒの増加または減少は、同じ重複変異を有する非妊婦のＲと比較すると、それぞれ、罹患または正常な胎児を示す。
【００９６】
各シナリオのＲの増加または減少の程度は、試料中の胎児ＤＮＡ濃度比率（Ｐｆ）に依存する。一実施形態では、ＳＰＲＴ分析を使って、Ｒが、同じ変異を有する非妊婦女性に比べて、統計的に有意な増加であるか、または減少であるかを判定できる。ＳＰＲＴの上方境界および下方境界（カットオフ値）を計算する式は類似の構造を有する：
上方境界 = [(ln 8)/N - ln δ]/ln γ;
下方境界 = [(ln 1/8)/N - ln δ]/ln γ
式中、δ = (1 - θ1)/(1 - θ2); 
【数６】
2014507134.tif 000008
ｌｎは、自然対数を表す数学記号、すなわち、ｌｏｇe；Ｎ＝変異および参照分子の合計数；
θ1    ＝１つ目の対立仮説が真の場合（すなわち、同じ変異を有する非妊婦のＲの値と比較して、Ｒ1が増加する場合）の参照分子に対する標的分子の比率（Ｒ1）
θ2    ＝２つ目の対立仮説が真の場合（すなわち、同じ変異を有する非妊婦のＲの値と比較して、Ｒ2が減少する場合）の参照分子に対する標的分子の比率（Ｒ2）
である。
【００９７】
θ1は、同じ変異を有する非妊婦の対応する比率に比べて、参照分子の量に対する標的分子の量の比率が増加する状況、例えば、欠失変異に対し正常なケース、または重複変異に対し変異のケースを表している。同様に、θ2は、同じ変異を有する非妊婦の対応する比率に比べて、参照分子の量に対する標的分子の量の比率が低下する状況、例えば、欠失変異に対する変異のケース、または重複変異に対し正常なケースを表すことができる。
【００９８】
一実施形態では、正常な（Ｎ）対立遺伝子を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から試料を入手したと仮定して、欠失変異に対し、θ1が計算される。θ1は、１／（２−Ｐｆ）であると判断される。変異（例えば、欠失変異を有する染色体Ｘ）を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から試料を入手したと仮定して、θ2が計算される。θ2は、（１−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）であると判断される。
【００９９】
重複変異に対する別の実施形態では、変異（すなわち、重複変異を有する染色体Ｘ）を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から試料を入手したと仮定して、θ1が計算される。
θ1は、（３−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）であると判断される。正常な（Ｎ）対立遺伝子を受け継いでいる男児胎児を有する妊婦から試料を入手したと仮定して、θ2が計算される。θ2は、（３−２ｘＰｆ）／（２−Ｐｆ）であると判断される。どのレベルの拡大にも適応できる一般化された式は：θ1が、（ｎ＋２−Ｐｆ）／（２−Ｐｆ）、およびθ2が、［ｎ＋２−Ｐｆ（ｎ＋１）］／（２−Ｐｆ）であり、式中、ｎは、拡大されたセグメントの追加コピーの数である。
【０１００】
Ｖ．胎児パーセンテージの決定
上述のように、特定の対立遺伝子（例えば、染色体Ｘに特異的および胎児特異的配列）の確率Ｐ（ｎ）を使って、試料中の胎児ＤＮＡのパーセンテージ（Ｐｆ）を調節できる。この調節されたＰｆを使って、次に、変異または野性型対立遺伝子が受け継がれているか否かを判定するためのカットオフ値を計算できる。
【０１０１】
図８は、本発明の実施形態に従って、胎児を有する妊婦由来の生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆを得る方法８００を示すフローチャートである。生物学的試料は、妊婦由来および胎児由来の核酸分子を含む。
【０１０２】
ステップ８１０では、データが複数の反応から入手される。各反応は、生物学的試料由来の複数の核酸分子を含む。一態様では、１つまたは複数の対立遺伝子が反応中に存在し、反応が、特定の対立遺伝子に対して陽性であると考えられる場合は、反応は、どのタイプであってもよい。
【０１０３】
ステップ８２０では、反応中の第１の対立遺伝子が検出される。第１の対立遺伝子は、妊婦がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合のいずれかである座位で、母親と胎児の間で共有される。一実施形態では、第１の対立遺伝子は、Ｘ染色体である。
【０１０４】
ステップ８３０では、第１の対立遺伝子の補正濃度Ｐｘが第１の対立遺伝子に対する陽性の反応の数に基づいて計算される。Ｐｘは、複数の反応における第１の対立遺伝子の予想される統計分布で補正される。例えば、Ｐｘは、ポアソン分布に基づいて補正できる。一実施形態では、母親と胎児により共有された第１の対立遺伝子（母親がホモ接合で、胎児がヘテロ接合または半接合のいずれか）に対する第１の補正濃度が、例えば、［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ１）／Ｎ）］＊Ｎのように計算される。式中Ｎは、分析された反応チャンバーの合計数、Ｐ１は、第１の対立遺伝子に対し陽性のチャンバー数、およびｌｎは自然対数である。
【０１０５】
ステップ８４０では、胎児に特異的な第２の対立遺伝子が検出される。一実施形態では、胎児が男児胎児の場合、第２の対立遺伝子は、Ｙ染色体上にある。別の実施形態では、胎児特異的対立遺伝子は、常染色体上の父系遺伝性対立遺伝子である。さらに別の実施形態では、胎児特異的対立遺伝子は、胎児特異的メチル化マーカーを含む。
【０１０６】
ステップ８５０では、第２の対立遺伝子の補正濃度Ｐｙは、第２の対立遺伝子に対し陽性の反応の数に基づいて計算される。Ｐｙは、複数の反応における第２の対立遺伝子の予測統計分布で補正される。例えば、Ｐｙは、ポアソン分布に基づいて補正できる。一実施形態では、胎児がヘテロ接合または半接合性である胎児特異的対立遺伝子に対する第２の補正濃度は、［−ｌｎ（（Ｎ−Ｐ２）／Ｎ）］＊Ｎにより計算できる。式中、Ｎは、分析反応チャンバーの合計数、Ｐ２は、胎児特異的対立遺伝子に対し陽性のチャンバー数、およびｌｎは自然対数である。
【０１０７】
ステップ８６０では、生物学的試料中の胎児核酸分子のパーセンテージＰｆは、［（２Ｐｙ）／（Ｐｘ＋Ｐｙ）］を使って計算され、これは小数値を与える。胎児ＤＮＡパーセンテージは、式：［（２Ｐ２）／（Ｐ１＋Ｐ２）］＊１００％、を使って計算できる。
【０１０８】
ＶＩ．実施例
血友病のキャリアであり、男児胎児を有する妊婦である７人の女性（３人は、血友病Ａのキャリア、４人は、血友病Ｂのキャリア）をＲｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫから集めた。我々は、また、それぞれ単生児の健康な男児胎児を有する２０人の妊婦（血友病ノンキャリア）を集めた。その内の１０人は、Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫから、残りは、Ｐｒｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇから集めた。本件の臨床情報を図９の表９００に示すが、この表は、血友病変異のキャリアである７人の妊婦の臨床情報である。
【０１０９】
全ての女性は、インフォームドコンセントで同意の上、集めた。倫理的承認はそれぞれの組織の委員会から取得した。妊婦から１０ｍＬの末梢血試料をＥＤＴＡチューブに集めた。血友病キャリア妊婦の内の５人に対し、妊娠の間に２回、末梢血試料を採取した（表９００）。この調査で、どの血友病キャリア妊婦も侵襲的出生前検査を受けなかった。胎児の性別および血友病状態は、出産後確認された。Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇで採用された１０人の非罹患妊婦に対しては、出産後、胎盤の組織も集めた。
【０１１０】
我々は、血液サンプルを１６００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離した。血漿部分を、１６００ｇ、４℃で１０分間、再遠心分離した。母体血漿およびバフィコート試料をさらに処理するまで−２０℃で貯蔵した。英国で集めた全試料を、処理し、その場所で、凍結貯蔵し、ドライアイスの上に載せ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇに輸送した。我々は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＳＰ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使って、メーカーのインストラクションに従って、母体血漿からＤＮＡを抽出した。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使ってメーカーのプロトコルに従い、バフィコートＤＮＡを抽出した。
【０１１１】
ｒｓ６５２８６３３  ＳＮＰおよび血友病変異の遺伝子型同定
ＲＭＤ法の可能性を評価するために、我々は、染色体Ｘ上のＳＮＰ（ｒｓ６５２８６３３）を調査した。このＳＮＰは、例示目的で選択されたが、他のＳＮＰも使用可能である。胎児と母体のＳＮＰ遺伝子型が、それぞれ、胎盤および母体バフィコート試料由来のＤＮＡを使って決定された。以前記載のように、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（ｈＭＥ）アッセイ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使って、遺伝子型同定を行った（Ｔｓｕｉ  ＮＢＹ、Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ、Ｄｉｎｇ  Ｃ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５１：２３５８−２３６２（２００５）；Ｔｓｕｉ  ＮＢＹ、Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ、Ｄｉｎｇ  Ｃ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５１：２３５８−２３６２（２００５））。血友病キャリア妊婦の末梢血試料から得たゲノムＤＮＡを使って、血友病変異検出を行った。コード領域、イントロン／エキソン境界、プロモーターおよび３’ＵＴＲを含む全エキソンに対しＰＣＲを行った。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  Ｖ１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使ってサイクルシーケンス法を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１００  Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒで解析した。
【０１１２】
母体血漿分析用ディジタルＲＭＤ反応
ディジタルＲＭＤの実験ワークフローは、本発明の特定の実施形態に従って、図４で説明されている。我々は、以前記載のディジタルＺＦＹ／Ｘアッセイを使って、母体血漿試料中の胎児ＤＮＡ濃度比率を測定した。このアッセイは、染色体ＹおよびＸ上に位置する、それぞれ、相同ＺＦＹおよびＺＦＸ遺伝子座位を定量化した（Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５４：１６６４−１６７２（２００８）；Ｌｕｎ  ＦＭＦ、Ｔｓｕｉ  ＮＢＹ、Ｃｈａｎ  ＫＣＡ、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１０５：１９９２０−１９９２５（２００８））。ｒｓ６５２８６３３ＳＮＰに対しては、２つの対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使ったリアルタイムＰＣＲアッセイを設計し、２つのＳＮＰ対立遺伝子を識別した。血友病の危険がある妊婦の場合の変異に対しては、それぞれの変異に対し、対立遺伝子識別のためのリアルタイムＰＣＲアッセイを設計した。各アッセイには、変異および野性型対立遺伝子用の２つの対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブを含めた。プライマーおよびプローブ配列は、図１０の表１０００に列挙した。この表は、対立遺伝子判別可能アッセイ用のオリゴヌクレオチド配列およびリアルタイムＰＣＲ条件を示す。他の実施形態では、胎児ＤＮＡ濃度比率は、母体血漿中の胎児および母体ＤＮＡの間で異なるようにメチル化された配列を使うことにより測定できる（例えば、Ｃｈｉｍ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１０２：１４７５３−１４７５８（２００５）；Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５２：２２１１−２２１８（２００６）、を参照）。
【０１１３】
我々は、ＢｉｏＭａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）上で、１２．７６５  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｒｒａｙｓ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使ってディジタルＰＣＲ分析を行った（Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５４：１６６４−１６７２（２００８））。ディジタルアレイ上の１２パネルの内の６つを各ＤＮＡ試料用に使ったが、これは４５９０の個別のＰＣＲに相当する。１試料（６パネル）に対する反応を、２Ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って、５２μＬの反応容量で設定した。反応の設定は、図１０の表１０００に挙げたプライマーとプローブ組成物を使って、メーカーのプロトコルに従って行った。各反応混合物には、１８．２μＬのＤＮＡ試料を含めた。反応混合物は、ＮａｎｏＦｌｅｘ  ＩＦＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）により、自動的にディジタルアレイにロードされた。反応をＢｉｏＭａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）上で行った。反応は、５０℃、２分間で開始し、続けて、９５℃、１０分間、および９５℃、１５秒を４５サイクル、およびアッセイ特異的アニール温度（図１０表３）で１分間、行った。１回の４５９０ウエルディジタルＰＣＲセットからのデータによるＲＭＤで未分類のまま残された試料に対しては、遺伝子型判定がなされるまで、追加の４５９０ウエルディジタルＰＣＲセットを実施した。
【０１１４】
結果
Ｘ連鎖多形のためのディジタルＲＭＤの原理
実施形態は、男児胎児を有するヘテロ接合の妊婦の血漿中の変異および野性型対立遺伝子の合計量（母体＋胎児由来）の間の濃度差を測定するディジタルＰＣＲを使用できる。男児胎児は、単一の染色体Ｘを有するので、野性型および変異対立遺伝子の間の相対的濃度は、常に遺伝子量不均衡状態にある（図２Ａ）。変異対立遺伝子の過剰または過小発現量は、罹患または正常な胎児を、それぞれ表す。我々は、遺伝子量不均衡の試験にＳＰＲＴを使用した。１対のＳＰＲＴ曲線を生成した（図２Ｂ）。上方曲線を越える、または下方曲線より小さいデータポイントの試料は、罹患または正常として、それぞれ、分類された。２つの曲線の中間のデータポイントの試料は、不十分な統計的検出力のために分類されず、追加のディジタルＰＣＲが行われるであろう。
【０１１５】
染色体Ｘ上のＳＮＰの胎児遺伝子型の非侵襲的測定
我々は、染色体Ｘ上のＳＮＰ：ｒｓ６５２８６３３（Ａ／Ｔ多型）をモデルとして使用して、染色体Ｘ上の座位の胎児遺伝子型測定に対するＲＭＤ法の実用上の可能性を評価した。現在のＲＭＤ分析は、危険性のある妊婦、すなわち、染色体Ｘ上の変異に対しヘテロ接合で、男児胎児を有する妊婦の場合に適する。従って、我々は、染色体Ｘ上のＳＮＰに対しヘテロ接合で、男児胎児を有する１０人の妊婦由来の血漿試料を調査した。我々は、対立遺伝子判別可能ディジタルリアルタイムＰＣＲアッセイを開発し、各試料中のＡ−およびＴ−対立遺伝子の濃度を測定した。我々は、さらに、胎児ＤＮＡ濃度比率をＺＦＹ／Ｘアッセイで測定した。ディジタルＲＭＤの結果を図１１の表１１００に示す。この表は、ディジタルＲＭＤによる、母体血漿中のｒｓ６５２８６３３の胎児遺伝子型同定を示す。
【０１１６】
全ての場合に、胎児ＳＮＰ遺伝子型はＳＰＲＴ分類と一致した。胎児ＤＮＡ濃度比率（表１１００中の胎児％）は、５％〜２４％の範囲であった。従って、結果は、ディジタルＲＭＤ戦略の可能性を立証した。
【０１１７】
ＤＮＡ混合物中の血友病変異検出用ディジタルＲＭＤ
次に、我々は、ディジタルＲＭＤ法を血友病変異検出に適用した。我々は、Ｆ８遺伝子中の３つの変異、Ｆ９遺伝子中の４つの変異およびそれらの対応する野性型カウンターパートを検出するための７種のデュプレックスディジタルリアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。我々は、大部分の母体ＤＮＡ背景中の少数の男児胎児ＤＮＡ成分を含む母体血漿試料の組成を模擬した人工ＤＮＡ混合物を形成することにより、ディジタルＰＣＲアッセイの性能を評価した。我々は、対応する変異に対しヘテロ接合の女性から入手した血液細胞ＤＮＡを有する非罹患男児胎児由来の１０％または２０％の胎盤のＤＮＡを混合した。図１２は、人工ＤＮＡ混合物を使ったディジタルＲＭＤアッセイの検証を示す。人工混合物は、母体血漿中の胎児および母体ＤＮＡ組成物をシミュレートするように作成された。図１２の表１２００に示すように、全てのＤＮＡ混合物で、ディジタルＲＭＤ分析により、母体血漿中の胎児ＤＮＡを模倣した胎盤ＤＮＡの遺伝子型が正しく検出された。
【０１１８】
母体血漿中の胎児血友病変異の検出
我々は、母体血漿ＤＮＡ分析による血友病変異の胎児遺伝子型の検出用にディジタルＲＭＤ法を試験した。我々は、原因である変異に対しヘテロ接合の７人の妊婦から入手した１２の血漿試料でディジタルＰＣＲを行った（表９００）。全ケースとも、男児胎児を含んでいた。我々は、また、ＺＦＹ／Ｘアッセイにより、母体血漿試料中の胎児ＤＮＡ濃度比率を測定した。ディジタルＲＭＤ結果を図１３の表１３００に示す。この表は、ディジタルＲＭＤによる母体血漿中の胎児血友病変異の非侵襲的検出を示す。
【０１１９】
胎児遺伝子型は、全調査ケースでＳＰＲＴアルゴリズムにより正しく分類された（図１４）。これらのケースの内、３つ（Ｈ２６ａ、Ｈ２５ａおよびＨ１２ａ）で、胎児ＤＮＡ比率が、１０％未満であった。従って、変異および野性型対立遺伝子の量の間の定量的差異の程度があまりにも小さく、４５９０ウエルディジタルＰＣＲセットからのデータでは、分類されなかった。従って、分類できるまで、追加の４５９０ウエルディジタルＰＣＲセットの試験を行った。
【０１２０】
対照として、我々は、５人の正常な妊婦から入手した母体血漿試料についても、それぞれ変異特異的アッセイを使って調査した。図１５は、正常な妊娠由来の母体血漿試料に対するディジタルＲＭＤ結果を示す。図１５の表１５００に示すように、ほとんどの場合、変異対立遺伝子は検出されなかった。３５例の調査母体血漿の内の６例における、変異対立遺伝子を含む陽性のウエルは、実験の陽性のウエル合計数の０．３％未満であった。これらの陽性シグナルは、ＰＣＲ中の蛍光プローブのクロスハイブリダイゼーションから生じた可能性がある。それにもかかわらず、このような少ない変異体陽性のウエルの数が、ＳＰＲＴによるＲＭＤ分類を変えてしまうほどには、変異および野性型対立遺伝子の間の対立遺伝子比率を偏らせることはないであろう。
【０１２１】
考察
この調査で、我々は、血友病を一例として使って、Ｘ連鎖疾患の危険のある妊娠の男児胎児に保有されている原因変異を直接検出する非侵襲的出生前診断法を開発した。染色体Ｘ上の遺伝子座位に対しディジタルＲＭＤ手法を使用することにより、我々は、７人の血友病キャリア妊婦（表１３００）由来の１２の調査母体血漿試料の全てで、男児胎児が受け継いでいる変異または野性型対立遺伝子を正確に同定した。胎児遺伝子型は、妊娠の１１週目（表９００）の早期に検出できる可能性があり、この方法が早期診断への適用に有望であることを証明した。染色体Ｘ上の標的領域および参照領域を使う方法も利用できる。
【０１２２】
この非侵襲的出生前変異検出方法は、既存の非侵襲的胎児性別判定検査と組み合わせて、数侵襲的診断検査が必要とされる危険性のある妊婦の症例の数をさらに最小にできる可能性がある。特定の罹患胎児は、その後の別の侵襲的出生前検査を考慮しなくてもよくなり、妊婦の産科管理を容易にすることができよう。血友病乳児の３〜４パーセントが分娩と出産の間に起こる頭蓋出血を経験する（Ｋｕｌｋａｒｎｉ  Ｒ、Ｌｕｓｈｅｒ  ＪＭ．、Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．、２１：２８９−２９５（１９９９））。長期の分娩と難しい器械分娩がこの合併症の主要な危険因子であり（Ｋａｄｉｒ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、６：３３−４０（２０００）；Ｃｈｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、１４：５６−６４（２００８））、これらは罹患胎児の出産に対しては、避けられるべきである（Ｌｅｅ  ＣＡ、Ｃｈｉ  Ｃ、Ｐａｖｏｒｄ  ＳＲ、ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、１２：３０１−３３６（２００６））。また、罹患胎児は、関連血友病センターを備えた三次医療施設（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｕｎｉｔ）で出産し、患者の管理に必要な専門知識と資源の利用を確実にすることが推奨されている（Ｌｅｅ  ＣＡ、Ｃｈｉ  Ｃ、Ｐａｖｏｒｄ  ＳＲ、ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．、１２：３０１−３３６（２００６））。最近、出生前早期検査に関連する胎児喪失の危険性を受け入れようとしない両親に対し、第三期羊水穿刺による出生前診断が出産方法と場所の適切な計画を支援するとして勧められている（Ｌｅｅ  ＣＡ、ＫａｄｉｒＲＡ、ＫｏｕｉｄｅｓＰＡ、ｅｄｓ．Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｗｏｍｅｎ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ：Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１２２−１４８（２００９）中のＣｈｉ  Ｃ、Ｋａｄｉｒ  ＲＡ．、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．）。胎児が非罹患である場合は、分娩と出産は、何ら制限なく地域の産科病棟で管理できる。しかし、第三期羊水穿刺は、侵襲的方法でもあり、潜在的リスクと合併症に関連している（Ｈｏｄｏｒ  ＪＧ、Ｐｏｇｇｉ  ＳＨ、Ｓｐｏｎｇ  ＣＹ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ  Ｊ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．、２３：１７７−１８０（２００６）；Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．、２７：１０００−１００４（２００７））。胎児ＤＮＡ濃度は、妊娠の第三期の間に最大となり（Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５４：１６６４−１６７２（２００８））、従って、実施形態は、この目的に対し、第三期羊水穿刺に代わる的確な非侵襲的選択肢を提供できる。
【０１２３】
ＶＩＩ．コンピュータシステム
本明細書に記載のいずれのコンピュータシステムでも、どのような適切な数のサブシステムの利用も可能である。このようなサブシステムの例を、図１６のコンピュータ装置１６００に示す。一部の実施形態では、コンピュータシステムは、単一コンピュータ装置を含み、この場合、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素でありうる。他の実施形態では、コンピュータシステムは、複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部構成要素を含むサブシステムであってもよい。
【０１２４】
図１６に示すサブシステムは、システムバス１６７５を介して相互接続される。例えば、プリンター１６７４、キーボード１６７８、固定ディスク１６７９、ディスプレイアダプター１６８２に接続されたモニタ１６７６、等の追加のサブシステム、が示されている。Ｉ／Ｏ制御装置１６７１に接続された周辺装置および入／出力（Ｉ／Ｏ）装置を、当技術分野で既知の任意の数のシリアルポート１６７７、等の手段によりコンピュータシステムに接続できる。例えば、シリアルポート１６７７または外部インターフェイス１６８１を使って、コンピュータシステム１６００をインターネット等の広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナーに接続できる。システムバス１６７５を介した相互接続は、中央処理装置１６７３のそれぞれのサブシステムとの通信、およびシステムメモリー１６７２または固定ディスク１６７９からの命令の実行の制御、ならびにサブシステム間の情報交換の制御を可能とする。システムメモリー１６７２および／または固定ディスク１６７９は、コンピュータ可読メディアを組み入れることができる。本明細書に記載のいずれの値も、１つの装置から別の装置に出力でき、また、ユーザーにも出力できる。
【０１２５】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェイス１６８１または内部インターフェイスにより接続された複数の同じ装置またはサブシステムを含むことができる。一部の実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワークを介して通信できる。このような場合は、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバーと見なすことができ、この場合、それぞれは、同じコンピュータシステムの一部となりうる。クライアントおよびサーバーは、それぞれ複数のシステム、サブシステム、または装置を含んでもよい。
【０１２６】
本発明のいずれの実施形態も、モジュールまたは集積方式のハードウェアおよび／またはコンピュータソフトウェアを使った制御論理の形で実装できることは理解されよう。本明細書で提供される開示と教示に基づいて、当業者なら、ハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使って、本発明の実施形態を実施する他の手段、および／または方法を知り、理解するであろう。
【０１２７】
本出願に記載のいずれのソフトウェア成分または機能も、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ＋＋またはＰｅｒｌ等のいずれかの適切なコンピュータ言語を使い、例えば、従来の、またはオブジェクト指向技術を使って、プロセッサにより実行されるソフトウェアコードとして実装可能である。ソフトウェアコードは、保存、および／または送信用のコンピュータ可読メディア上の一連の指令または命令として保存できる。適切なメディアには、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブもしくはフロッピーディスク、等の磁気メディア、またはコンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）等の光学メディア、フラッシュメモリ、等が含まれる。コンピュータ可読メディアは、このような保存または送信装置のいずれかの組み合わせであってもよい。
【０１２８】
このようなプログラムは、また、インターネットを含む種々のプロトコルに準拠した有線、光学、および／または無線ネットワークを介した送信に適応したキャリアシグナルを使って、コード化および送信できる。従って、本発明の実施形態によるコンピュータ可読メディアは、このようなプログラムでコードされたデータシグナルを使って作成できる。プログラムコードでコードされたコンピュータ可読メディアは、互換性のある装置と一緒にパッケージされても、または他の装置から別々に（例えば、インターネットのダウンロードで）提供されてもよい。いずれのこのようなコンピュータ可読ディアも、単一コンピュータプログラム製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、または全体コンピュータシステム）上にあっても、内部にあってもよく、また、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータプログラム製品の上にあっても、内部にあってもよい。コンピュータシステムは、モニタ、プリンター、または本明細書記載のいずれかの結果をユーザーに提供するための他の適切なディスプレイを含んでもよい。
【０１２９】
本明細書記載の方法のいずれかは、全体的に、または部分的、ステップを実行するように構成できる、プロセッサを含むコンピュータシステムを使って行うことができる。従って、実施形態は、本明細書記載の方法のいずれかのステップを実行するように構成され、場合によっては、それぞれのステップまたはそれぞれのステップ群を実行する異なる装置を備えた、コンピュータシステムを対象にできる。番号を付けたステップとして示したが、本明細書にある方法のステップは、同時にまたは異なる順で行うことができる。さらに、これらのステップの一部は、他の方法由来の他のステップの一部と一緒に使用できる。また、全部または一部のステップは、任意に選択できる。さらに、いずれかの方法のいずれかのステップは、モジュール、回路、またはこれらのステップを実行する他の手段と一緒に行うことができる。
【０１３０】
特定の実施形態の特定の詳細は、本発明の実施形態の趣旨および範囲を逸脱することなく、いずれかの適切な方法で組み合わせることができる。しかし、本発明の他の実施形態は、それぞれの個別態様、またはこれらの個別態様の特定の組み合わせ、に関連する具体的実施形態を対象にできる。
【０１３１】
本発明の代表的実施形態の上記説明は、例示と説明の目的で提示されてきた。それは、網羅的とする意図、または本発明を記載された通りの形態に限定する意図はなく、上記教示を考慮すると多くの修正及び変形が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実際的適用を最良に説明し、それにより、種々の実施形態で、特定の意図された用途に適合されるように種々の変形を用いて、他の当業者が本発明を最良に利用するのを可能とするように選択および記載された。
【０１３２】
特に逆の指示がなければ、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」の記述は、「１つまたは複数の」を意味することが意図されている。
【０１３３】
全ての特許、特許出願、出版物、および上述の記載は、参照によってその全体が、あらゆる目的において、本明細書に組み込まれる。これらのいずれも先行技術であることを認めるものではない。
【図１】
2014507134.tif 000009
【図２】
2014507134.tif 000010
【図３】
2014507134.tif 000011
【図４】
2014507134.tif 000012
【図５Ａ】
2014507134.tif 000013
【図５Ｂ】
2014507134.tif 000014
【図５Ｃ】
2014507134.tif 000015
【図６】
2014507134.tif 000016
【図７】
2014507134.tif 000017
【図８】
2014507134.tif 000018
【図９】
2014507134.tif 000019
【図１０】
2014507134.tif 000020
【図１１】
2014507134.tif 000021
【図１２】
2014507134.tif 000022
【図１３】
2014507134.tif 000023
【図１４】
2014507134.tif 000024
【図１５】
2014507134.tif 000025
【図１６】
2014507134.tif 000026
【国際調査報告】
2014507134.tif 000027
2014507134.tif 000028