(57)【要約】    バイオセンシングおよび薬剤供給技術のための方法、構造およびシステムが開示される。一態様において、被分析物の検出および／または生物学的流体中への生化学物質の放出のためのデバイスは、複数の中空針のアレイと、中空針のアレイのプローブへとそれぞれ接続される複数のワイヤのアレイとを含み得る。各針は、外壁と外壁内側のプローブとを有する突出針構造を含み、壁部は内腔と、突出針構造の終端において中空を露出させる開口とを形成し、プローブは、開口を介してプローブと接触する１つ以上の化学または生物学物質と相互作用してプローブ感知信号を生成する。各ワイヤは、導電性であり、各プローブによって生成されたプローブ感知信号を伝送する。【選択図】図１A
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の中空針のアレイであって、各針は、外壁と前記外壁内側のプローブとを有する突出針構造を含み、前記外壁は、内腔と前記突出針構造の終端において前記内腔を露出させる開口とを形成し、前記プローブは、前記開口を介して前記プローブと接触する１つ以上の化学的または生物学的物質と相互作用してプローブ感知信号を生成する、複数の中空針のアレイと、
前記複数の中空針のアレイの前記複数のプローブへそれぞれ接続された複数のワイヤのアレイであって、各ワイヤは、導電性であり、各プローブによって生成された前記プローブ感知信号を伝送する、複数のワイヤのアレイと、
を含む、デバイス。
【請求項２】
１つ以上の前記プローブは、流体中の被分析物と相互作用するように構成された機能性コーティングを含む、請求項１のデバイス。
【請求項３】
前記コーティングは、酵素機能性コーティングまたはイオン選択性コーティングのうちの少なくとも１つを含む、請求項２のデバイス。
【請求項４】
前記被分析物は、生化学物質、代謝産物、電解質、イオン、病原体または微生物のうちの少なくとも１つを含む、請求項２のデバイス。
【請求項５】
前記被分析物と前記１つ以上の機能性プローブの１つの前記コーティングとの間での電気化学的相互作用は、電流測定法、ボルタンメトリーまたは電位差測定法のうちの少なくとも１つを用いて検出される、請求項２のデバイス。
【請求項６】
前記被分析物は、電解重合／ポリマー捕捉、静電相互作用、共有結合または直接吸着のうちの少なくとも１つにより、前記コーティングの界面に固定される、請求項５のデバイス。
【請求項７】
さらに、前記プローブ感知信号を受信し、前記プローブ感知信号をデータとして用いる前記複数のワイヤのアレイと通信する処理ユニットを含む、請求項２のデバイス。
【請求項８】
前記処理ユニットは、前記データを閾値と比較して、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定する、請求項７のデバイス。
【請求項９】
前記処理ユニットは、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを示す前記データ中のパターンを決定する、請求項７のデバイス。
【請求項１０】
前記処理ユニットは、前記プローブからの前記受信されたプローブ感知信号を複合化する、請求項７のデバイス。
【請求項１１】
前記デバイスは、皮膚上に配置するための接着パッチと一体化され、経皮流体中に存在する前記被分析物を検出する、請求項２のデバイス。
【請求項１２】
前記プローブは、炭素繊維、カーボンペースト、導電性金属または導電性ポリマーのうちの少なくとも１つを含む、請求項１のデバイス。
【請求項１３】
一方の側に配置され、内腔を備えるマイクロ針を含む基板であって、前記マイクロ針が前記内腔に対する開口を備える壁を含む、基板と、
前記内腔内に配置されたプローブを含む電極と、
前記プローブへ接続されたワイヤと、
を含み、
前記電極は、前記プローブを覆うコーティングによって機能性とされ、被分析物と相互作用して電気信号を生成する、
デバイス。
【請求項１４】
前記プローブは、炭素繊維、カーボンペースト、導電性金属または導電性ポリマーのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３のデバイス。
【請求項１５】
前記コーティングは、酵素機能性コーティングまたはイオン選択性コーティングのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３のデバイス。
【請求項１６】
前記被分析物は、生化学物質、代謝産物、電解質、イオン、病原体または微生物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３のデバイス。
【請求項１７】
前記被分析物と前記機能性電極の前記コーティングとの間での電気化学的相互作用は、電流測定法、ボルタンメトリーまたは電位差測定法のうちの少なくとも１つを用いて検出される、請求項１３のデバイス。
【請求項１８】
さらに、前記電気信号を受信し、前記電気信号をデータとして用いる前記ワイヤと通信する処理ユニットを含む、請求項１３のデバイス。
【請求項１９】
前記処理ユニットは、前記データを閾値と比較して、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定する、請求項１８のデバイス。
【請求項２０】
前記処理ユニットは、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを示す前記データ中のパターンを決定する、請求項１８のデバイス。
【請求項２１】
前記デバイスは、皮膚上に配置するための接着パッチと一体化され、経皮流体中に存在する前記被分析物を検出する、請求項１３のデバイス。
【請求項２２】
さらに、前記基板の反対側に取り付けられ、可逆的に多孔性を調節可能な複数の孔を有するポリマー膜と、
【請求項２３】
前記基板の前記一方の側に構成された突出構造であって、前記ポリマー膜を露出させる前記基板の開口と前記突出構造の終端にある開口との間の通路を有する、突出構造と、
化学物質を含み、前記突出構造の上方に配置された前記ポリマー膜へ取り付けられ、１つ以上の開口を含む、収容構造と、
前記ポリマー膜へ取り付けられた電極と、
を含み、
前記電極は、電気刺激を付加することにより、前記ポリマー膜の前記複数の孔の開口状態への拡張または前記ポリマー膜の前記複数の孔の閉鎖状態への収縮を誘発する、
請求項１３のデバイス。
【請求項２４】
前記化学物質は、薬剤、ワクチン、ホルモンまたは薬理学的薬剤のうちの少なくとも１つを含む治療薬剤である、請求項２２のデバイス。
【請求項２５】
さらに、前記電気信号を受信してデータとして用いる前記ワイヤと通信するとともに、前記電気刺激を生成するための前記電極と通信する処理ユニットを含む、請求項２２のデバイス。
【請求項２６】
前記処理ユニットは、前記データを処理して、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定する、請求項２４のデバイス。
【請求項２７】
前記処理ユニットは、前記電極を作動させて電気刺激を前記ポリマー膜へ付加して、その透過性を前記閉鎖状態から前記開口状態へ変化させ、これにより、前記化学物質を前記デバイスから放出する、請求項２４のデバイス。
【請求項２８】
さらに、前記基板の反対側へ取り付けられ、可逆的に多孔性を調節可能な複数の孔を有する第２のポリマー膜と、
前記基板の前記一方の側に構成された他の突出構造であって、前記第２のポリマー膜を露出させる前記基板の開口と、前記他の突出構造の終端における開口との間の通路を有する、他の突出構造と、
第２の化学物質を含み、前記他の突出構造の上方に配置された前記第２のポリマー膜へ取り付けられ、１つ以上の開口を含む、第２の収容構造と、
前記第２のポリマー膜へ取り付けられた第２の電極と、
を含み、
前記第２の電極は、第２の電気刺激を付与することにより、前記第２のポリマー膜の前記複数の孔の開口状態への拡張または前記ポリマー膜の前記複数の孔の閉鎖状態のへの収縮を誘発する、
請求項２６のデバイス。
【請求項２９】
前記処理ユニットは、前記プローブからの前記受信された電気信号と、前記電極および第２の電極に対する前記電気刺激の作動とを複合化して、前記化学物質および前記第２の化学物質をそれぞれ放出する、請求項２７のデバイス。
【請求項３０】
被分析物の感知および治療薬剤の供給を行う方法であって、
生物学的流体中の前記被分析物と電気化学的に相互作用するように構成された化学的に機能性のプローブとの界面において、被分析物によって生成され、前記化学的に機能性のプローブにより電気信号へ変換される信号を検出する工程と、
前記電気信号を処理して、前記被分析物のパラメータを決定する工程と、
前記決定されたパラメータに基づいて、可逆的に調節可能な多孔性の複数の孔を有する多孔性ポリマー膜を含み、治療薬剤を含むコンテナと取り付けられた弁に電気刺激を付加する工程と、を含み、
前記電気刺激により、前記複数の孔の透過性を閉鎖状態から開口状態へ変化させ、前記治療薬剤を前記生物学的流体中へ放出する、
方法。
【請求項３１】
前記被分析物は、生化学物質、代謝産物、電解質、イオン、病原体または微生物のうちの少なくとも１つを含む、請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記治療薬剤は、薬剤、ワクチン、ホルモン、ビタミン、抗酸化剤または薬理学的薬剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項２９の方法。
【請求項３３】
前記生物学的流体は、経皮流体、眼内流体、硝子体液、脳脊髄液、細胞外液、間質液、血漿、血清、涙液、唾液、汗、粘液または血液のうちの少なくとも１つを含む、請求項２９の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の信号は、電流測定法、ボルタンメトリーまたは電位差測定法のうちの少なくとも１つを用いて検出される、請求項２９の方法。
【請求項３５】
前記パラメータは、前記被分析物の濃度レベルを含む、請求項２９の方法。
一方の側に配置され、内腔を備える複数のマイクロ針を含む基板であって、各前記マイクロ針は、前記内腔に対する開口を備える壁を含む、基板と、
バイオセンサーモジュールであって、
前記複数のマイクロ針の第１のグループの前記内腔内に設けられ、プローブを含む複数の感知電極であって、前記プローブは、流体中の被分析物と相互作用して電気信号を生成するように構成された機能性コーティングを含む、複数の感知電極と、
複数のワイヤであって、前記複数のワイヤのうちの１つのワイヤが前記感知電極のプローブへ接続される、複数のワイヤと、
を含む、バイオセンサーモジュールと、
前記複数のワイヤと通信して前記電気信号を受信し、前記受信された電気信号をデータとして用いる処理ユニットと、
アクチュエータモジュールであって、
前記基板の反対側へ取り付けられ、可逆的に調節可能な多孔性の複数の孔を有するポリマー膜と、
前記複数のマイクロ針の第２のグループの前記内腔内に配置された複数の突出構造であって、前記突出構造は、前記ポリマー膜を露出させる前記基板の開口と前記突出構造の終端にある開口との間の通路を含む、複数の突出構造と、
化学物質を含み、前記突出構造の上方に配置された前記ポリマー膜へ接続され、１つ以上の開口を含む、収容構造と、
前記ポリマー膜へ取り付けられ、電気刺激を付加することにより、前記ポリマー膜の前記複数の孔の開口状態への拡張または前記ポリマー膜の前記複数の孔の閉鎖状態への収縮を誘発する、アクチュエータ電極と、
を含む、アクチュエータモジュールと、
を含み、
前記処理ユニットは、前記アクチュエータ電極と通信して、前記データに基づいて前記電気刺激を生成する、
デバイス。
【請求項３６】
前記被分析物は、生化学物質、代謝産物、電解質、イオン、病原体または微生物のうちの少なくとも１つを含む、請求項３５のデバイス。
【請求項３７】
前記化学物質は、薬剤、ワクチン、ホルモン、または薬理学的薬剤のうちの少なくとも１つを含む治療薬剤である、請求項３５のデバイス。
【請求項３８】
前記処理ユニットは、前記データを閾値と比較して、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定する、請求項３５のデバイス。
【請求項３９】
前記処理ユニットは、前記被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを示す前記データ中のパターンを決定する、請求項３５のデバイス。
【請求項４０】
前記処理ユニットは、前記アクチュエータ電極を作動させて、前記電気刺激を前記ポリマー膜へ付加して、前記ポリマー膜の透過性を前記閉鎖状態から前記開口状態へ変化させ、これにより、前記流体中へ前記化学物質を放出する、請求項３５のデバイス。
【請求項４１】
前記処理ユニットは、前記プローブからの前記受信された電気信号と、前記アクチュエータ電極に対する前記電気刺激の作動とを複合化する、請求項４０のデバイス。
【請求項４２】
前記処理ユニットは、前記基板上に構成された論理ゲートを含む、請求項４０のデバイス。
【請求項４３】
前記デバイスは、皮膚上に配置するための接着パッチと一体化されて、経皮流体中に存在する前記被分析物を検出する、請求項３５のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[関連出願への相互参照]
本特許出願は、米国仮出願第６１／５３０，９２７号（出願日：２０１１年９月２日）の優先権の利益を主張する。上記特許出願の全内容は、本出願の開示内容の一部として、参照によって組み込まれる。
【０００２】
[連邦支援による研究または開発についての声明]
本発明は、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｎａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＯＮＲ）によって付与された番号第Ｎ０００１４−０８−１−１２０２号およびＳａｎｄｉａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＬＤＲＤ）によって付与された番号第１５１３３７号に基づいて政府の支援によってなされた。よって、政府は、本発明における一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本特許文献は、バイオセンサーおよび薬剤供給デバイスに関する。
【０００４】
[背景]
生物学的事象をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで感知できた場合、生理関連化合物のリアルタイム検出（例えば、代謝産物、電解質、生化学物質、神経伝達物質、医学関連分子、癌バイオマーカー、および病原性微生物のモニタリング）が可能となる。このような生物学的事象の感知を行うデバイスは、バイオセンサーとして公知であり、生物中の生理学的物質およびプロセスのリアルタイム検出を可能にする。バイオセンサーは、検出事象を処理用および／または表示用の信号に変換する変換素子に結合した生物学的感受性成分を使用して、化学物質、物質または有機体を検出することができる分析ツールである。バイオセンサーは、生物学的材料（例えば、生体分子（例えば、酵素、抗体、核酸）および生細胞）を生物学的感受性成分として用い得る。例えば、分子バイオセンサーは、特定の化学特性または分子認識機構を用いて、標的因子を特定するように構成することができる。例を挙げると、組織中での生理学的よび病理学的活性の評価、創薬および薬剤スクリーニングがある。バイオセンサーは、変換素子を用いて、生物学的感受性成分による被分析物の検出から得られた信号を、光学的手段、電子的手段または他の手段によって取り扱い可能な異なる信号へと変換することができる。例えば、変換機構としては、物理化学的手段、電気化学的手段、光学的手段、圧電的手段および他の変換手段がある。
【発明の概要】
【０００５】
バイオセンシングおよび治療行為のための技術、システムおよびデバイスが開示される。
開示の技術の一態様において、デバイスは、複数の中空針のアレイであって、各針は、外壁と外壁内側のプローブとを有する突出針構造を含み、外壁は、内腔と突出針構造の終端において内腔を露出させる開口とを形成し、プローブは、開口を介してプローブと接触する１つ以上の化学的または生物学的物質と相互作用してプローブ感知信号を生成する、複数の中空針のアレイと、複数の中空針のアレイの複数のプローブへそれぞれ接続された複数のワイヤのアレイであって、各ワイヤは、導電性であり、各プローブによって生成されたプローブ感知信号を伝送する、複数のワイヤのアレイとを含む。
【０００６】
態様を任意選択的に挙げると、以下の特徴のうちの１つ以上がある。例えば、プローブのうちの１つ以上は、流体内の被分析物と相互作用するように構成された機能性コーティングを含み得る。被分析物と、１つ以上の機能性プローブのうちの１つの機能性プローブ上のコーティングとの間の電気化学的相互作用は、電流測定法、ボルタンメトリーまたは電位差測定法のうちの少なくとも１つを用いて検出することができる。デバイスは、さらに、ワイヤのアレイと通信する処理ユニットを含み得る。ワイヤのアレイは、プローブ感知信号を受信し、プローブ感知信号をデータとして用いる。処理ユニットは、データを閾値と比較して、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映しているかを決定することができる。処理ユニットは、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映しているかを示すデータ中のパターンを決定することができる。処理ユニットは、プローブからの受信されたプローブ感知信号を複合化することができる。デバイスを皮膚上に配置するための接着パッチと一体化させて、経皮流体中に存在する被分析物を検出することができる。
【０００７】
開示の技術の別の態様において、デバイスは、一方の側に配置され、内腔を備えるマイクロ針を含む基板であって、マイクロ針が内腔に対する開口を備える壁を含む基板と、内腔内に配置されたプローブを含む電極と、プローブへ接続されたワイヤとを含み、電極は、プローブを覆うコーティングによって機能性とされ、被分析物と相互作用して電気信号を生成する。
【０００８】
態様は、任意選択的に以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。例えば、被分析物と、機能性電極上のコーティングとの間の電気化学的相互作用の検出は、電流測定法、ボルタンメトリーまたは電位差測定法のうちの少なくとも１つを用いて行うことができる。デバイスは、さらに、電気信号を受信し、電気信号をデータとして用いるワイヤと通信する処理ユニットを含み得る。処理ユニットは、データを閾値と比較して、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定することができる。処理ユニットは、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを示すデータ中のパターンを決定することができる。デバイスを皮膚上に配置するための接着パッチと一体化させることにより、経皮流体中に存在する被分析物を検出することができる。デバイスは、さらに、基板の反対側へ取り付けられ、可逆的に調節可能な多孔性の複数の孔を有するポリマー膜と、基板の一方の側に構成された突出構造であって、ポリマー膜を露出させる基板の開口と突出構造の終端にある開口との間の通路を有する突出構造と、化学物質を含み、突出構造の上方に配置されたポリマー膜へ取り付けられ、１つ以上の開口を含む収容構造と、ポリマー膜へ取り付けられた電極とを含み、電極は、電気刺激を付加することにより、ポリマー膜の複数の孔の開口状態への拡張またはポリマー膜の複数の孔の閉鎖状態への収縮を誘発する。処理ユニットは、電気信号を受信してデータとして用いるためにワイヤと通信し、電気刺激を生成するために電極と通信し得る。処理ユニットは、データを処理して、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定することができる。処理ユニットは、電極を作動させて、電気刺激をポリマー膜へ付加して、透過性を閉鎖状態から開口状態へ変更して、化学物質をデバイスから放出させる。処理ユニットは、受信された電気信号と、電気刺激の作動とを複合化することができる。
【０００９】
別の態様において、被分析物の感知および治療薬剤の供給を行う方法は、生物学的流体中の被分析物と電気化学的に相互作用するように構成された化学的に機能性のプローブとの界面において、被分析物によって生成され、化学的に機能性のプローブによって電気信号へ変換される信号を検出する工程と、電気信号を処理して、被分析物のパラメータを決定する工程と、決定されたパラメータに基づいて、可逆的に調節可能な多孔性の複数の孔を有する多孔性ポリマー膜を含み、治療薬剤を含むコンテナへ取り付けられた弁に電気刺激を付加する工程とを含み、電気刺激により、複数の孔の透過性を閉鎖状態から開口状態へ変化させ、治療薬剤を生物学的流体中へ放出する。
【００１０】
別の態様において、デバイスは、一方の側に配置され、内腔を備える複数のマイクロ針を含む基板であって、各マイクロ針は、内腔に対する開口を備える壁を含む基板と、バイオセンサーモジュールと、アクチュエータモジュールと、複数のワイヤと通信して電気信号を受信し、受信された電気信号をデータとして用いる処理ユニットとを含む。処理ユニットは、アクチュエータ電極と通信して、データに基づいて電気刺激を生成する。バイオセンサーモジュールは、複数のマイクロ針の第１のグループの内腔内に設けられ、プローブを含む複数の感知電極であって、プローブは、流体中の被分析物と相互作用して電気信号を生成するように構成された機能性コーティング含む複数の感知電極と、複数のワイヤであって、複数のワイヤのうちの１つのワイヤが感知電極のプローブへ接続される複数のワイヤとを含む。アクチュエータモジュールは、基板の反対側へ取り付けられ、可逆的に調節可能な多孔性の複数の孔を有するポリマー膜と、複数のマイクロ針の第２のグループの内腔内に配置された複数の突出構造であって、突出構造は、ポリマー膜を露出させる基板の開口と突出構造の終端にある開口との間の通路を含む複数の突出構造と、化学物質を含み、ポリマー膜の上方に配置され、１つ以上の開口を含む収容構造と、ポリマー膜へ取り付けられたアクチュエータ電極とを含み、アクチュエータ電極は、電気刺激を付加することにより、ポリマー膜の複数の孔の開口状態への拡張またはポリマー膜の複数の孔の閉鎖状態への収縮を誘発する。
【００１１】
態様は、以下の特徴のうちの１つ以上を任意選択的に含み得る。例えば、処理ユニットは、データを閾値と比較して、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを決定することができる。処理ユニットは、被分析物濃度が健康な状態または病的な状態を反映するかを示すデータ中のパターンを決定することができる。処理ユニットは、アクチュエータ電極を作動させて、電気刺激をポリマー膜へ付加して、ポリマー膜の透過性を閉鎖状態から開口状態へ変化させ、これにより、流体中へ化学物質を放出する。処理ユニットは、プローブからの受信された電気信号と、アクチュエータ電極に対する電気刺激の作動とを複合化することができる。処理ユニットは、基板上に構成された論理ゲートを含み得る。デバイスを皮膚上に配置するための接着パッチと一体化されて、経皮流体中に存在する被分析物を検出することができる。
【００１２】
本特許文献中に記載される発明は、以下の特徴のうちの１つ以上が得られるような特定の方法で実施され得る。複合化された感知用途および／または薬剤供給を、自律的、最小侵襲かつ制御された方法で行うためのマイクロ針アレイデバイスおよび技術が記載される。例えば、開示の技術を実施して、マイクロ針アレイを用いた電気化学的方法により、生物中の被分析物を検出することができる。電気化学的方法をパッチと一体化させ、皮膚へ適用することができる。バイオセンシングは、マイクロ針／皮膚界面において直接実施することができ、生物学的流体の採取およびその後の処理は不要である。電位差滴定技術、ボルタンメトリー技術および電流測定技術を用いて、マイクロ針アレイプラットフォームにより生理学的および生化学的物質情報を変換することができる。マイクロ針アレイプラットフォームを１つの包括的プラットフォームとして一体化させることにより、身体流体中の複数の被分析物のバイオセンシングが可能となる。さらに、バイオセンシング機能を作動機能と結合することができる。例えば、治療薬剤（例えば、薬剤、ワクチン、インスリン、ホルモン、ビタミン、抗酸化剤および他の薬理学的薬剤）供給機能を、刺激応答性の導電性ポリマーナノアクチュエータによって誘発することができる。バイオセンサー／アクチュエータプラットフォームを接着パッチ上に一体化させることにより、主要な生理学的／生化学的物質パラメータのモニタリングおよび／または治療行為のオンデマンドでの提供を行うことができる。接着パッチを電子機器と一体化させることにより、信号変換および通信が可能となる。この技術は、多様な用途において用いることが可能な例示的な「感知／作動／治療」フィードバックループプロセスにおいて、「感知」要素および「治療」要素として用いることができる。多様な用途は、無線ヘルスケア、オーダーメイド医療、健康プロファイリング、能力／健康モニタリング、およびアスリート／兵士モニタリングを少なくとも含み得る。
【００１３】
例えば、開示の技術は、リアルタイムでの健康評価が所望される多数の分野および領域内において広範な用途を持ち得る。例えば、本技術は、一般的なヘルスケア、フィットネス、スポーツ、遠隔モニタリング、無線ヘルスケア、オーダーメイド医療、能力／健康モニタリング、および兵士モニタリングの領域において容易に適用することができる。この最小侵襲技術は、強固な構成と組み合わせることにより、多様な生体医学的モニタリング用途（例えば、健康プロファイリングのためのバイオマーカー特性、または能力／フィットネスの目安としての生体被分析物パターンの入手）に適切に用いることが可能である。別の例として、癌細胞（例えば、メラノーマ）の場合、解糖レベルが増加した結果、局所的環境においてｐＨおよびグルコース濃度の低下ならびに乳酸濃度の上昇が発生することが知られている。よって、開示の技術は、同時かつ局所的にグルコース、乳酸およびｐＨを検出することができるので、医療現場における臨床診断デバイスとして用いることにより、皮膚細胞が癌性であるか否かを決定し、長期にわたる生体組織検査を行う前に即値データを提供することができる。例えば、本技術を例示的な「感知／作動／治療」フィードバックループにおいて「感知」要素として用いる場合、本技術を高リスクの患者（例えば、脳卒中、心臓病患者）に関連する生理学的／生化学的物質情報の傾向を得ることができるスマートパッチの要素として用いることができる。さらに、例えば、本技術の特徴は、「戦場病院用パッチ」として適合させることができる。「戦場病院用パッチ」によれば、急性負傷／外傷の発生を決定し、個人の迅速な避難を促し、目的とする治療計画を開始するように適切な人員に警告を出すことができる。本技術を例示的な「感知／作動／治療」フィードバックループにおいて「治療」要素として用いた場合、本技術を高リスクの患者（例えば、脳卒中、心臓病患者）に発生する急性事象に対する目的とする治療を提供することが可能なスマートパッチの要素として用いることができる。これらの例示的な特徴を、負傷者の迅速な避難および治療が実施することができない戦闘状況において治療計画を開始することができる「戦場病院用パッチ」として適合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】は、例示的なマイクロ針アレイデバイスの模式図を示す。
【図１Ｂ】は、例示的なマイクロ針アレイデバイスの模式図を示す。
【図１Ｃ】は、例示的なマイクロ針アレイデバイスの模式図を示す。
【図１Ｄ】は、例示的なマイクロ針およびマイクロ針アレイの画像を示す。
【図１Ｅ−１Ｆ】は、例示的なマイクロ針およびマイクロ針アレイの画像を示す。
【図１Ｇ−１Ｉ】は、生物に施された接着パッチに関する例示的なマイクロ針アレイデバイスの画像を示す。
【図１Ｊ】は、「感知／作動／治療」フィードバックループの例示的な図を示す。
【図１Ｋ】は、異なる機能障害をモニタリングするために個々に指定可能なマイクロ針と、機能障害の検出に応答して治療薬剤を供給するために個々に指定可能なマイクロ針とを用いる例示的なマイクロ針アレイセンサー／アクチュエータの図を示す。
【図１Ｌ】は、目的とする複数の治療薬剤の例示的な複合化された制御放出の図を示す。
【図２Ａ】は、例示的なマイクロ針アレイ片システムの模式図を示す。
【図２Ｂ】は、例示的なマイクロ針アレイ片システムの模式図を示す。
【図２Ｃ】は、例示的なマイクロ針アレイ片システムの模式図を示す。
【図３Ａ−３Ｃ】は、個々のマイクロ針を用いた電気化学的アレイ片に関する多様なバイオマーカーの複合化検出の例示的な結果のデータプロットを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】は、スクリーン印刷およびパターン生成のためのステンシルプロセスを用いて作製された例示的なマイクロ針アレイを示す。
【図５Ａ−５Ｂ】:5Aは中実および中空マイクロ針構成要素を用いた例示的な二要素マイクロ針電極アレイを作製するための例示的なプロセスの図を示す。５Ｂは、完全に組み立てられた例示的な二要素マイクロ針電極アレイの模式図である。
【図５Ｃ】は、中実マイクロ針表面においてグルタミン酸オキシダーゼ（ＧｌｕＯｘ）の機能性ポリ（ｏ−フェニレンジアミン）（ＰＰＤ）膜を成長させるための例示的なプロセスの図を示す。
【図５Ｄ】は、例示的な電解重合されたグルタミン酸オキシダーゼ−ポリ（ｏ−フェニレンジアミン）膜の生体触媒挙動の図を示す。
【図６Ａ−６Ｂ】は、それぞれ、例示的な中実および中空マイクロ針アレイの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【図７】は、例示的なグルタミン酸二要素マイクロ針アレイ電極の流体力学ボルタンモグラムデータプロットを示す。
【図８Ａ】は、グルタミン酸濃度の上昇について記録された例示的なクロノアンペログラムデータプロットを示す。
【図８Ｂ】は、グルタミン酸濃度の上昇について記録された例示的なクロノアンペログラムデータプロットを示す。
【図９】は、０．１Ｍのリン酸緩衝液において記録された例示的なクロノアンペログラムデータプロットを示す。
【図１０】は、長時間にわたるグルタミン酸応答の安定性を示す例示的なデータプロットを示す。
【図１１Ａ】は、例示的なグルコースマイクロ針バイオセンサーの感度を示すデータプロットを示す。
【図１１Ｂ】は、例示的なグルコースマイクロ針バイオセンサーの感度を示すデータプロットを示す。
【図１２Ａ】は、例示的なマイクロ針ベースの多流路の複合化された薬剤供給アクチュエータデバイスの模式図を示す。
【図１２Ｂ】は、例示的なマイクロ針ベースの多流路の複合化された薬剤供給アクチュエータデバイスの模式図を示す。
【図１３Ａ】は、例示的な中空マイクロ針アレイの表面形態のＳＥＭ画像を示す。
【図１３Ｂ】は、例示的な中空マイクロ針アレイの表面形態のＳＥＭ画像を示す。
【図１４】は、例示的なマイクロ針ベースの薬剤供給アクチュエータデバイスの個々に指定可能な複数のリザーバからのメチレングリーンの誘発放出の画像を示す。
【図１５】は、例示的なマイクロ針ベースの薬剤供給アクチュエータデバイスの単一のマイクロ針からのメチレングリーン染料の放出の経時的な静止フレーム画像を示す。
【図１６】は、例示的なマイクロ針からのメチレングリーン染料の放出に対する吸光度を示す例示的な紫外・可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）スペクトルデータプロットを示す。
【図１７】は、薬剤供給時における例示的なマイクロ針の模式図を示す。
【図１８Ａ−１８Ｄ】は、例示的なマイクロ針アレイデバイスの組立のための処理ステップを示す模式図を示す。
【図１９Ａ−１９Ｂ】は、複数の炭素繊維電極のアレイおよび単一の炭素繊維電極の光学画像を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】は、例示的な中空マイクロ針アレイのＳＥＭ画像を示す。
【図２１Ａ】は、例示的なマイクロ針アレイの適用（穿刺）後の皮膚の画像を示す。
【図２１Ｂ】は、皮膚への穿刺前後の中空マイクロ針の光学顕微鏡写真を示す。
【図２１Ｃ】は、皮膚への穿刺前後の中空マイクロ針の光学顕微鏡写真を示す。
【図２２Ａ−２２Ｂ】は、例示的な中空マイクロ針アレイのＳＥＭ画像を示す。
【図２３】は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極に対するＫＣｌ中のフェリシアン化物のサイクリックボルタンメトリー走査のデータプロットを示す。
【図２４】は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極に対する過酸化水素のサイクリックボルタンメトリー走査のデータプロットを示す。
【図２５】は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極に対する緩衝液および緩衝液中のアスコルビン酸のボルタンメトリー走査のデータプロットを示す。
【図２６Ａ】は、未充填のマイクロ針アレイおよびＲｈ−カーボンペースト充填のマイクロ針アレイの光学顕微鏡写真を示す。
【図２６Ｂ】は、未充填のマイクロ針アレイおよびＲｈ−カーボンペースト充填のマイクロ針アレイの光学顕微鏡写真を示す。
【図２７Ａ】は、アレイの未充填およびＲｈ−カーボンペースト充填のマイクロ針構成要素のＳＥＭ画像を示す。
【図２７Ｂ】は、アレイの未充填およびＲｈ−カーボンペースト充填のマイクロ針構成要素のＳＥＭ画像を示す。
【図２８Ａ】は、ロジウム分散カーボンペーストマイクロ針電極における緩衝液および過酸化水素の流体力学ボルタンモグラムのプロットを示す。
【図２８Ｂ】は、例示的なロジウム分散カーボンペーストマイクロ針電極を用いて得られたクロノアンペログラムのプロットを示す。
【図２９】は、過酸化水素濃度について得られた較正曲線のプロットを示す。
【図３０Ａ】は、乳酸について得られたクロノアンペログラムのプロットを示す。
【図３０Ｂ】は、乳酸濃度について得られた較正曲線のプロットを示す。
【図３１】は、生理学的に適切な電気活性干渉物質による影響を示すクロノアンペログラムのプロットを示す。
【図３２】は、乳酸検出に用いられる例示的なマイクロ針アレイの電気化学的応答の安定性を示すデータプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
マイクロ針アレイに基づいたバイオセンサーおよびアクチュエータを用いた被分析物の検出および生物への治療化合物の供給のための技術、システムおよびデバイスが開示される。
【００１６】
一態様において、本技術は、微小構造のアレイを用いたデバイスを含む。これらの微小構造は、生物組織の表面を穿刺して、組織液および／または細胞外液中の特定のバイオマーカーの変動を検出する。このような変動を検出することにより、デバイスを用いて、例えば疾病、病気および急性損傷の進行をモニタリングすることができる。例えば、マイクロ微細構造に、例えば微小針状の電気化学的変換器（マイクロ針、マイクロプローブ、電極、またはプローブとも呼ぶ）を付加することにより、本技術を実施することができる。これらの電気化学的変換器は、生化学的および生理学的な被分析物（例えば、生化学物質、代謝産物、電解質、イオン、病原体、微生物等）に対する異なる化学的機能性を持つことができる。例えば、デバイスは、多様な電気化学的技術を用いて、電気化学的反応を直接マイクロ針／流体界面において行い、生化学的情報をさらに処理され得る電気信号（例えば、ボルタンメトリー、電位差滴定、電流測定、伝導度測定および／またはインピーダンス測定）へ変換する。例えば、アレイの各マイクロ針は、異なる被分析物を検出するように構成し、１つ以上の手段によって指定されるように複合化することができる（例えば、マイクロ針要素のＮアレイにおいて、要素Ｎ１はグルコースを感知し、要素Ｎ２は乳酸を感知し、要素Ｎ３は脂肪酸を感知する等）。また、各被分析物は、ボルタンメトリー、電位差滴定、電流測定、伝導度測定および／またはインピーダンス測定技術のうちのいずれかまたは全てを用いて変換される。
【００１７】
デバイスを用いて、治療行為を実施することもできる。この治療行為においては、マイクロ針を用いて、マイクロ針が穿刺された特定の局所的領域において、化学物質（例えば、薬剤）を制御して流体中に放出する。急性事象に応じてまたは例えばデバイスの感知部によってモニタリングされた慢性状態に基づいて、目的とする治療行為を提供することができる。透過性を調節可能な導電性ポリマー材料と共にマイクロ針アレイを構成することにより、ポリマーの多孔性を制御することができる。例えば、デバイスは、化学物質（単数または複数）を含む１つ以上のリザーバを含むように構成され得る。リザーバ（単数または複数）は、これとマイクロ針アレイの基板との間に配置される透過性を調節可能な導電性ポリマー材料へ接続される。特定の電気化学的刺激下において、ポリマー材料を選択的に多孔性とすることができる（例えば、当該ポリマー材料の間隙率（空孔率）の変更）。このような多孔性の変更は、選択的に開閉される弁として機能して、化学物質をリザーバからマイクロ針（内腔）を通じて組織液中へ供給する役割を効果的に果たすことができる。化学物質放出機構は、例えば可動部分または微小電気機械（ＭＥＭＳ）要素を要せず、電気化学的に作動される。
【００１８】
例示的なデバイスの治療部の作動は、例示的なデバイスの感知部からのフィードバックに基づいた電気刺激を提供可能な一体型論理システムまたは処理ユニットを用いて制御することができる。例えば、例示的なデバイスの記載の感知部は、正常な機能または疾病、病気および急性損傷等を示す機能障害と関連付けられた特定の被分析物の濃度レベル（例えば、平均レベル、最大または最小閾レベルの変動等に基づく）を連続的にモニタリングし、被分析物と関連付けられ、検出された、生化学的情報を電気信号へ変換することができる。この電気信号は、処理ユニットを用いて処理することができる。処理ユニットは、プロセッサおよびプロセッサへ接続されたメモリを少なくとも含み得る。例えば、メモリは、本特許文献中に記載の１つ以上の方法をプロセッサに実行させる１つ以上のプログラムをエンコードすることができる。この方法は、例えば、検出された信号を保存する工程、検出および／または保存された信号を他の保存された値（例えば、健康な状態または機能障害の状態を示す被分析物閾値）を分析する工程および／または例示的なデバイスの治療部を用いて化学物質を放出するか否かを決定する工程を含む。例えば、処理ユニットは、検出された被分析物レベルがメモリ中に保存された閾値を超えたことを確認した後、記載のアクチュエータを作動させて、決定された被分析物レベルに応じて薬剤を放出させることができる。例えば、これは、適切な酸化還元電位を付加することにより行うことができ、例示的なデバイスは、マトリックスの固有の多孔性を変更することにより記載のポリマーを可逆的に「開閉」させることができ、これにより、身体上のリザーバから、直接、経皮流体中へ薬物流出を誘発することができる。多変量／複合化薬剤供給を用いて、薬剤をアレイの各マイクロ針構成要素において供給し得る特有の方法で治療を行うことができる。例えば、マイクロ針構造がアレイ状になっているため、多変量／複合化薬剤供給を実現することができ、特有の被分析物をアレイの各マイクロ針構成要素において検出することができ、または、複数の被分析物を針内の電極アレイを通じて個々の針において検出することができる。さらに、例示的なシステムは、アレイ状になっているため、デバイスを薬剤の混合物に合わせて個別調整することができ、これにより、多様な形態の負傷／外傷を軽減することができる。さらに、付加された酸化還元電位の調節により、薄膜の多孔性を選択的に制御することが可能であるため、一体型バイオセンサーおよび／または論理ゲート感知および処理ユニットを介して、流動速度すなわち用量を必要に応じて制御することができる。
【００１９】
いくつかの例において、例示的なマイクロ針デバイスを皮膚へ適用することにより、記載のマイクロ針バイオセンサー／アクチュエータ技術を経皮的に実施することができる。他の例において、上記マイクロ針バイオセンサー／アクチュエータ技術を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて身体中の他の臓器（例えば、肝臓、眼の強膜）に対して実施することができる。開示の技術のバイオセンシング機能の一例において、デバイスは、皮膚接着パッチ上に一体化され、生物の皮膚へ適用することにより、生理学的および生化学的パラメータ（例えば、グルコース）を経皮的にモニタリングするマイクロ針センサー／アクチュエータのアレイを含み得る。血液グルコースモニタリングの一例において、マイクロ針を導電性ポリマー中に取り込まれたグルコースオキシダーゼ酵素（生体触媒）によって機能化することができる。例えば、電極要素は、導電性であり、生体触媒を含んで機能化（例えば、コーティング）されている。パッチが皮膚へ適用されると、マイクロ針が皮膚を穿刺して、細胞外液（例えば、血液）がマイクロ針中に拡散する。グルコースが拡散するにつれて、生体触媒は、グルコース基質をグルコン酸へ変換することができる。その一方、グルコースからグルコン酸への変換は、酸化還元（レドックス）反応（例えば、グルコースの酸化）であるため、血液中に必然的に存在する酸素および水においても還元が生じ、過酸化水素が生成される。過酸化水素は、電気化学的な活性種であり、電極において特定の電位で酸化または還元され得る。例えば、これを電流測定的に行うことが可能であり、その場合、電位を付加し、電流をモニタリングする。あるいは、これをボルタンメトリー的に行うことも可能であり、その場合、電位を変化させ、電流変化をモニタリングする。例えば、電位が付加された電極において過酸化水素が変化する場合、対応する電流変化を、信号処理技術を用いてさらに処理することができる電気信号としてモニタリングする。
【００２０】
一実施形態において、被分析物を検出するとともに、治療化合物を供給するのための最小侵襲の多要素マイクロ針デバイスは、マイクロ針アレイを電極と共に含み、自律的かつ最小侵襲に制御して、複合化された感知および装置の作動を行うことができる。これらの電極は、例えば、化学的機能性、酵素機能性および／またはイオン選択性の電極であり得る。
【００２１】
図１Ａおよび１Ｂは、プローブを備えた中空針に基づく例示的なデバイスの模式図である。図１Ａは、例示的なマイクロ針アレイデバイス１００の模式図である。図１Ｂは、組立前のデバイスの例示的な模式図である。マイクロ針アレイ１００は、中空の微小サイズの針１０１のアレイを含む。このアレイにおいて、各針１０１は、外壁と外壁内側に形成されたプローブ１０２とを有する突出針構造を含む。外壁は、内腔と、突出針構造の終端において内腔を露出させる開口とを有する。プローブ１０２は、開口を介してプローブ１０２と接触する１つ以上の化学的または生物学的物質と相互作用して、プローブ信号（例えば、感知信号）を生成する。
【００２２】
図１Ｃは、ワイヤのアレイ１０３を含む例示的なマイクロ針アレイ１００を示す。これらのワイヤは、それぞれ、中空針１０１のアレイの対応するプローブ１０２へ接続される。ワイヤのアレイ１０３は、例えば、個々に指定可能なマイクロ針感知電極のアレイを提供し得る。ワイヤのアレイ１０３は、基板１０５（例えば、絶縁材料（いくつかの例において、可撓性でありかつ生物学的組織へ接着し得る材料））内に構成され得る。ワイヤのアレイ１０３の各ワイヤは、導電性であるため、各プローブによって生成されたプローブ感知信号をプローブ感知信号が処理されるセンサー回路へ伝送する。
【００２３】
図１Ｄは、走査電子顕微鏡法によって画像化された、例示的なマイクロ針の画像を示す。図１Ｅは、例示的なマイクロ針アレイのサイズ測定のために、ペニー、プリント回路基板上の電子回路のような対象物の近傍の例示的なマイクロ針アレイの画像を示す。図１Ｆは、例示的なマイクロ針アレイの画像の拡大図である。
【００２４】
例示的なマイクロ針アレイに基づくセンサーアクチュエータデバイスには、マイクロ作製、電気化学、酵素固相化電極およびイオン選択性電極における技術が用いられ得る。電位差滴定、ボルタンメトリー、電流測定、伝導度測定および／またはインピーダンス検出の手法は、例えば、身体流体中に存在する複数の被分析物（例えば、経皮流体を占有している主要なバイオマーカー）の直接的なバイオセンシングを可能とするために、１つの包括的プラットフォームに統合することができる。主要な生理学的および生化学的パラメータを経皮的にモニタリングするために、例えば、マイクロ針アレイプラットフォームを皮膚上に配置される接着パッチと一体化することができる。通信および信号変換を許容するために、例示的な接着パッチをさらに電子機器と一体化させることができる。例えば、化学的情報を電気化学を介して電気ドメインへ変換することが可能であるため、デバイスは、電子的な読出情報と統合することにより、例えば、連続モニタリング血液グルコースデバイスと同等とすることができる。このようにして、例えば、開示の技術により、複数の研究室ベースの試験を単一のアレイ化マイクロ針感知プラットフォームに小型化するとともに統合し、制御された最小侵襲の方法で自律的な治療行為を提供することができ、また、薬剤の混合物を異なる形態の負傷／外傷に合わせて個別に調節することができる。
【００２５】
図１Ｇ〜１Ｉは、生物に装着された接着パッチ上の例示的なマイクロ針アレイデバイスの画像を示す。図１Ｇは、ヒトの腕に装着されたマイクロ針アレイセンサー／アクチュエータデバイスを用いた、例示的な接着パッチの画像を示す。図１Ｈは、動物に装着されたマイクロ針アレイセンサー／アクチュエータデバイスを用いた、別の例示的な接着パッチの画像を示す。図１Ｉは、接着パッチを動物の皮膚から取り外した後の例示的なデバイスの拡大画像を示し、例えば、例示的なマイクロ針が無傷であることを示す。
【００２６】
開示のバイオセンサー／アクチュエータ技術を用いて、関連する生理学的情報を抽出し、検出された生理学的および生化学的情報に基づいて、制御された治療応答を提供することができる。図１Ｊは、「感知／作動／治療」フィードバックループの例示的な図を示す。感知された情報は、アクチュエータを制御して、薬剤供給を調節するのに用いられる。感知動作からの情報は、感知された情報に従って、薬剤供給を個別に調節することができる。図１Ｊ中のバイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０は、マイクロ針の複合化アレイ（例えば、例示的なマイクロ針アレイ１００として構成することが可能なもの）を含み得る。アレイのいくつかのマイクロ針は、感知用として構成され、アレイの他のマイクロ針は、治療行為用として構成される。
【００２７】
図１Ｊに示すように、「感知／作動／治療」フィードバックループは、生物学的流体（例えば、経皮流体）から被分析物の生理学的情報を抽出するために、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０の感知部を含む。例示的な感知の特徴は、電気化学的変換器として機能化された個々に指定可能なマイクロ針を含み得る。この電気化学的変換器は、バイオマーカーのパターン変化（例えば、急性状態または慢性疾患状態）を検出することができる。特定の被分析物を感知アレイ内の各マイクロ針において検出することもできるし、あるいは、複数の被分析物を１つのマイクロ針中に収容されたいくつかの電極によって検出することもできる。例えば、多様な触媒、生体触媒、基質、試薬、補助因子および／または補助試薬を変換器内において固相化することにより、対象とする被分析物に対する選択性を付与することができる。同様に、イオン選択性薄膜（または固体状態のイオン選択性成分）を電気化学的測定と共に用いて、対象とするイオンへの選択性を付与することができる。いくつかの例において、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０の感知部は、例示的な略図１７０に示すように、感知された被分析物情報を直接処理するための被分析物論理ゲート感知も含み得る。例えば、略図１７０は、被分析物感知論理の２つの例示的な入力（例えば、入力１および入力２）を示し、入力１は、第１の反応を検出するように構成されたマイクロ針プローブにおいて生成された検出信号であり、入力２は、第２の反応を検出するように構成された他のマイクロ針プローブにおいて生成された検出信号である。略図１７０は、論理ゲート（例えば、本例において単一のＮＡＮＤゲート）を通過した２つの例示的な入力信号を示し、論理ゲートの出力を、マイクロ針アクチュエータを制御するための信号として用いることができる（例えば、論理ゲート出力信号は、例示的な導電性ポリマーに接続され、リザーバ中に保存された薬剤の多孔性を制御する）。他の例において、感知された被分析物情報を、処理ユニットによって処理し得る。
【００２８】
例えば、軟部組織損傷（ＳＴＩ）用の入力バイオマーカーは、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含み得る。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、略図１７０に示すように、生体触媒カスケードに入り、それぞれ入力１および入力２の代表であり得る。例えば、ＣＫは、クレアチン基質をホスホクレアチンへ変換するのと同時に、ＡＴＰをＡＤＰへ変換する複合物を生成する。ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）が存在すると、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は、ピルビン酸を生成し得る。乳酸脱水素酵素が存在すれば、ピルビン酸が乳酸に変換されるのと同時に、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化される。よって、時間に対するＮＡＤＨの低下を電流測定的にモニタリングすることができる。例えば、ＣＫおよびＬＤＨの双方が存在する場合のみ、ＮＡＤＨが付随して低下するため、例示的なバイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０を用いて入力１および入力２をモニタリングすることにより、ＮＡＮＤブール論理ゲートとして機能させることができる。
【００２９】
図１Ｊに示すように、「感知／作動／治療」フィードバックループは、処理ユニット１７５の例示的な画像を含む。処理ユニット１７５は、感知された被分析物情報をデータとして処理し、論理および／または命令を用いて、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０のアクチュエータ部を制御して、治療薬剤の放出、非放出または放出調節を行う。例えば、処理ユニット１７５は、プロセッサと、プロセッサへ接続されたメモリとを含み得る。処理ユニット１７５は、電源（例えば、バッテリー源、再生可能エネルギー源（例えば、太陽電源）、または自己発電源（例えば、モーションフィードバック電源）を含み得る。処理ユニット１７５は、プロセッサおよびメモリへ接続された入力／出力（Ｉ／Ｏ）ユニットを含み得る。プロセッサおよびメモリも、外部インターフェース、データ保存源または表示デバイスへ接続される。典型的なデータ通信基準（例を非限定的に挙げると、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、ＩＥＥＥ１３９４（ファイヤワイヤ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＩＥＥＥ８０２．１１１、無線ローカルエリアネットワーク（ＷＬＡＮ）、無線パーソナルエリアネットワーク（ＷＰＡＮ）、無線広域ネットワーク（ＷＷＡＮ）、ＷｉＭＡＸ、ＩＥＥＥ８０２．１６（マイクロ波アクセスのための世界規模の相互運用性（ＷｉＭＡＸ）、および並列インターフェース）に適合する多様な種類の有線または無線インターフェースを用いて、Ｉ／Ｏユニットを実行することができる。例えば、有線構成を用いて、処理ユニット１７５のＩ／Ｏユニットと、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０とを通信させることができる。他の例において、処理ユニット１７５のＩ／Ｏユニットは、感知部からデータを受信し、制御をバイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０のアクチュエータ部へと伝送するために、無線通信機能を含み得る。このような例において、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０は、センサー／アクチュエータマイクロ針アレイに有用な基板上に設けられ、または（例えばワイヤによって）基板へ遠隔的に接続された無線送信器／受信器を含み得る。このような例において、無線送信器／受信器は、複合化機能と接続することにより、送信および受信された感知信号および制御信号を複合化し得る。
【００３０】
図１Ｊに示すように、「感知／作動／治療」フィードバックループは、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０のアクチュエータ部を含む。このアクチュエータ部は、（感知部によって感知され）かつ処理された被分析物情報に基づいて、１つ以上の薬剤をマイクロ針が穿刺された領域へ供給する。例示的な薬剤供給機能により、検出された急性または慢性状態に応じて、目的とする治療行為を自律的に提供することが可能になる。例えば、一体型感知または酵素論理システムによって制御される（例えば、処理ユニット１７５によって処理される）自律的な多孔性の変更を通じて、導電性ポリマーナノアクチュエータの透過性を調節することができる。これにより、順次、図１Ｊ中の薬剤供給アクチュエータの略図１８５に示すように、薬剤の放出の制御が可能となる。略図１８５は、０で表される処理信号が薬剤を放出させない（例えば、例示的な導電性ポリマーの多孔性が実質的に閉鎖状態のままである）ことを示す。また、略図１８５は、１で表される処理信号が薬剤を放出させる（例えば、例示的な導電性ポリマーの多孔性が誘発されて開口状態となり、その結果薬剤がポリマー孔を通過し、マイクロ針から組織流体中に放出される）ことを示す。アレイ状のマイクロ針構造により、図１Ｋおよび１Ｌに示すように、多変量／複合化薬剤供給が可能になり、特定の治療をアレイの各マイクロ針構成要素において提供することができる。
【００３１】
図１Ｋは、異なる機能障害をモニタリングするために個々に指定可能なマイクロ針と、機能障害の検出に応答して治療薬剤を供給するために個々に指定可能なマイクロ針とを用いる例示的なマイクロ針アレイセンサー／アクチュエータ１８０を示す。図１Ｋに示すように、バイオセンサー／アクチュエータデバイス１８０の略図は、感知するように構成されたアレイの複数のマイクロ針（例えば、マイクロ針１８１ａ、１８１ｂおよび１８１ｃ）と、治療行為を提供するように構成された他のマイクロ針のアレイ（例えば、マイクロ針１８１ｄ、１８１ｅおよび１８１ｆ）とを含む。本例において、マイクロ針１８１ａは、軟部組織損傷（ＳＴＩ）に関連する被分析物を感知するように構成され、マイクロ針１８１ｂは、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に関連する被分析物を感知するように構成され、マイクロ針１８１ｃは、腹部外傷（ＡＢＴ）に関連する被分析物を感知するように構成される。また、本例において、マイクロ針１８１ｄは、ＳＴＩ治療に関連する薬剤を供給するように構成され、マイクロ針１８１ｅは、ＴＢＩ治療に関連する薬剤を供給するうように構成され、マイクロ針１８１ｆは、ＡＢＴ治療に関連する薬剤を供給するように構成される。
【００３２】
例えば、（例えば、センサー／アクチュエータ１８０を用いて）検出することが可能なＳＴＩに関連する例示的な被分析物を挙げると、クレアチンキナーゼ、乳酸、および乳酸脱水素酵素（例えば、グルココルチコイド、ＮＳＡＩＤｓによって改善されたもの）がある。ＴＢＩに関連する検出可能な例示的な被分析物を挙げると、グルタミン酸、セルロプラスミンがある（例えば、アセトアミノフェンによって改善されたもの）がある。ＡＢＴに関連する検出することが可能な例示的な被分析物を挙げると、乳酸、乳酸脱水素酵素（例えば、アセチルサリチル酸または２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸によって改善されたもの）がある。
【００３３】
図１Ｌは、目的とする治療混合物の複合化された制御放出の図を示す。例えば、ポリマーアクチュエータ（単数または複数）は、目的とする治療行為のためのオンデマンド放出を個々に指定可能である。図１Ｌの略図は、治療行為のために構成されたアクチュエータ部の例示的なマイクロ針（例えば、マイクロ針１８２ｄ、１８２ｅ、および１８２ｆ）を示す。本例において、マイクロ針１８２ｄは、リザーバ１中に貯留された薬剤１８３ｄの制御放出するように構成され、マイクロ針１８２ｅは、リザーバ２中に貯留された薬剤１８３ｅの制御放出するように構成され、マイクロ針１８２ｆは、リザーバ３中に貯留された薬剤１８３ｆの制御放出するように構成される。例えば、処理ユニットから受信された制御信号（例えば、図１Ｌ中の略図１８５に示すもの）に基づいて、薬剤１８３ｄ、１８３ｅおよび／または１８３ｆのうち一部または全ての放出を（例えば複合化を用いて）制御して、目的とする治療混合物を生成することができる。例えば、多孔性のサイズ（例えば、よって流量）と開口状態の継続時間とを制御するように、個々に指定可能なポリマーアクチュエータ（単数または複数）を作動させて、放出された薬剤のそれぞれの濃度を制御する。
【００３４】
図２Ａ〜２Ｃは、例示的なマイクロ針アレイ片システム２００の模式図を示す。本例において、システムは、平坦な可撓性ケーブル（ＦＦＣ）２１０を含み得る。平坦な可撓性ケーブル（ＦＦＣ）２１０は、マイクロ針アレイをコネクタ領域２１８へ接続する複数の導電体２１１（例えば、１０本の銅導電体）を含み得る。例えば、導電体２１１は、長さ１．５インチであり、例えばゼロ挿入力（ＺＩＦ）コネクタを介して、回路基板と接続（例えば、右端において（再）接続）されている。例えば、例示的なマイクロ針アレイ片システムは、１１．０ｍｍ×３８．１ｍｍサイズのＦＦＣ上に構成され得る。左端においてレーザーアブレーションを用いて孔を開口させて、下部配線を露出させることができる。金属電極（例えば、４つの作用電極２０２）および１つのカウンター電極２０７および１つ以上の基準電極（単数または複数）２０６を、開口を覆うように表面上にスパッタ堆積させることができる。４つのベント型の流体チャンバ２１５は、感圧性接着剤を備えるレーザーアブレーションされたマイラーから作製することができる。また、接着剤層により、マイクロ針アレイ（単数または複数）をＦＦＣへ接合することができる。図２Ａは、マイクロ針アレイ片システム２００の模式的な上面図である。図２Ｂは、マイクロ針アレイ片システム２００の模式的な三次元図である。図２Ｃは、回路基板コネクタ２１９へ挿入されたマイクロ針アレイ片システム２００の別の模式的な三次元図である。
【００３５】
別の例において、個々に指定可能な電極（マイクロ針）には、カーボンペースト、炭素繊維または導電性ポリマーの変換器を付加し、最適な健康および／または能力を反映するバイオマーカー変化のパターンの検出に用いることができる。電位差測定法、電流測定、またはボルタンメトリーを用いるために、多様な触媒、生体触媒、基質、試薬、補助因子および／または補助試薬を変換器内に固相化することにより、対象被分析物への選択性を付与し得る。同様に、イオン選択性薄膜（または固体状態のイオン選択性成分）を電気化学的測定と共に用いて、対象イオンに対する選択性を付与し得る。複数のバイオマーカーのモニタリングおよびこれらの種の動的パターンの測定において、顕著な予測および診断情報を、被験者の全体的な健康／能力／適性の尺度として用いることができる。複数のバイオマーカーのパターンを統合し、これらのマーカーの変化を長時間にわたって評価することにより、多くの疾病および病気に加えて、ストレスおよびオーバートレーニングによる悪影響について、より詳細かつ正確な時間特性解析を行うことができる。
【００３６】
例えば、マイクロ針をアレイ状にすることにより、複数の生体被分析物のパターンの測定が可能となる。さらに、強固な手段（例えば、電解重合／ポリマー捕捉、静電相互作用、共有結合および直接吸着）により、被分析物または複数の被分析物（例えば、触媒／生体触媒または他の被分析物またはバイオマーカー物質）を固相化することが可能になる。一例において、平面的に中実状態の変換器は、電極であり得る（例えば、炭素繊維、カーボンペースト、および導電性ポリマーを用いることにより電気化学的変換器を形成し得る）。
【００３７】
例示的なデバイスは、以下のようにして用いることができる。経皮マイクロ針アレイを用いることができる。各マイクロ針構成要素内には、三電極電気化学的感知素子（例えば、電位差滴定、ボルタンメトリー、電流測定、伝導度測定、インピードメトリックなどの感知素子）が収容される貫通した円筒状の空間が設けられ得る。一例において、酵素（特定の生化学成分に対する親和性を有する）が三電極部の作用電極上に固相化され、電流測定を行うことができる。別の例において、イオン選択性薄膜（適切なイオノフォアを有する）または固体状態の機能性膜が作用電極に付加され、電位差測定法またはボルタンメトリーを行うことができる。被分析物、代謝産物、電解質または対象イオンの存在に起因して、検出された電流（酵素電極）または電位（イオン選択性電極）において、それぞれ変化が生じる。
【００３８】
図３Ａ〜３Ｃは、個々のマイクロ針を用いた電気化学的アレイ片上の多様なバイオマーカーの複合化検出の例示的な結果のデータプロットを示す。図３Ａは、ｐＨの複合化検出のデータプロットを示す。図３Ｂは、乳酸の複合化検出のデータプロットを示す。図３Ｃは、グルコースの複合化検出のデータプロットを示す。
【００３９】
図４Ａおよび４Ｂは、マイクロデバイスの裏面側に一体化されたマイクロ電極アレイを通じて指定することができる例示的な個々のマイクロ針マイクロセンサーを示す。例えば、アレイ（単数または複数）は、複数の技術（例えば、フォトリソグラフィー、インクジェット印刷、およびスクリーン印刷）を用いて作製することができる。スクリーン印刷されたマイクロ針アレイの一例を図４Ａに示し、パターン規定するために用いたステンシルプロセスによって作製されたマイクロ針アレイを図４Ｂに示す。
【００４０】
開示の技術の別の実施形態において、電気化学的モニタリングおよびバイオセンシングのための、最小侵襲の多要素マイクロ針デバイスが記載される。本実施形態は、上記と同様の実施形態（単数または複数）を含み得るため、単一の実施形態において個々の実施形態の全機能を実施することができる。例えば、開示の技術は、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸およびグルコースの電気化学的モニタリングおよびバイオセンシングのために実施することができる。この例示的な実施形態において、デバイスは、複数のマイクロキャビティを含む単一のバイオセンサーアレイデバイスにおける中実および中空マイクロ針の強固な一体化を含み得る。このようなマイクロキャビティは、各マイクロ凹部内への認識酵素の電解重合捕捉を促進する。その結果得られたマイクロ針バイオセンサーアレイは、身体上において使用可能な最小侵襲の経皮パッチとして用いることができ、その結果、例えば生物学的流体の採取／サンプリングが不要となり、これによりデバイス要求の簡略化が可能となる。
【００４１】
例示的な態様を実施して、デバイスの多様な機能（例えば、ポリ（ｏ−フェニレンジアミン）（ＰＰＤ）薄膜内へのグルタミン酸オキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼの電解重合捕捉を含む）を実証した。例えば、ＰＰＤベースの酵素捕捉方法を用いることにより、デバイスの感度または応答時間を損なうことなく、共存する電気活性干渉物質を有効に排除することができる。その結果得られたマイクロ針ベースのグルタミン酸およびグルコースバイオセンサーは、緩衝液および未処理のヒト血清の双方において、高い選択性、感度、速度および安定性を示すことができる。例えば、高忠実性グルタミン酸測定の結果（例えば、１０μＭレベルまで）を不希釈のヒト血清において得た。例示的な凹部設計によっても、皮膚への穿刺時において酵素層を保護することができる。記載の強固なマイクロ針設計は、リアルタイム代謝産物モニタリングが主要要求となる多様なバイオセンシング用途において適切に用いられる。
【００４２】
最小侵襲の電気化学的バイオセンサーによる関連生体被分析物の身体上でのモニタリングのためのマイクロデバイスの臨床応用を実証するために、例示的なマイクロ針ベースのグルタミン酸およびグルコースバイオセンサーを実施した。この点について、マイクロ針アレイは、無痛バイオセンシングを提供するように構成することができ、高度に一体化された生体適合デバイスである。これらのデバイスは、産業スケールにおいて低コストで作製することができる。例えば、記載のマイクロ針アレイは、流体サンプリング／採取を伴うことなく、モニタリングおよびバイオセンシングに応用することができる。例えば、本技術の特徴として、従来のマイクロ流体感知システムの場合のような身体流体（例えば、経皮流体）の採取が不要である点がある。マイクロ針／経皮流体界面における電気化学の実行を通じて、有用な化学的情報を抽出し、電子ドメインへ直接変換することができる。このようにして、検出器アレイ／別個の感知ユニットへの流量を調節する高度かつ高コストの機械的デバイスを態様から除去することができる。
【００４３】
例示的なマイクロ針感知アレイデバイスは、凹部ベースのマイクロキャビティ構造を用いることができる。このキャビティ構造は、認識酵素を封じ込め、皮膚穿刺時において認識酵素を保護するように、設計され得る。例えば、二要素マイクロ針バイオセンサーは、作用電極として機能し得る白金コーティングされた中実マイクロ針のアレイと、各中実マイクロ針を包囲するマイクロキャビティを提供し得る中空マイクロ針カバーのアレイとを含むことができる。この例示的な二要素マイクロ針バイオセンサーを、図５Ａ〜５Ｄに示す。また、図５Ａ〜５Ｄは、例示的な二要素マイクロ針バイオセンサーを作製するためのプロセスを示す。
【００４４】
図５Ａは、二要素マイクロ針電極の例示的なアレイの中実マイクロ針構成要素５０１および中空マイクロ針構成要素５０３を示す。中実マイクロ針構成要素を導電性材料でコーティングすることにより、作用電極（例えば、白金作用電極５０２）を形成することができる。また、図５Ａは、白金コーティングされた中実マイクロ針５０２を中空マイクロ針カバー５０３と組み立てるプロセスも示す。いくつかの例において、この組立において、中実マイクロ針構成要素５０１と中空マイクロ針構成要素５０３との間であって、非検出かつ凹部の無い領域に封止材（例えば、エポキシ）を付与する。図５Ｂは、完全に組み立てられた二要素マイクロ針アレイ電極５００を示す。図５Ｂに示すように、アレイの各二要素マイクロ針電極５００は、酵素固相化を促進させ得るように、中実マイクロ針構成要素５０１の針（例えば、白金コーティングされた電極５０２）を露出させる凹部領域を含む。図５Ｃは、ｏ−ＰＤ−ＧｌｕＯｘ溶液のｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ）モノマーからの、マイクロ針電極５００の凹部領域内の中実マイクロ針表面における、グルタミン酸オキシダーゼ（ＧｌｕＯｘ）−機能性ＰＰＤ膜５０４の成長を示す。例えば、二要素マイクロ針電極５００のアレイの作製において、マイクロ針をｏ−ＰＤ−ＧｌｕＯｘ溶液に浸漬することにより、ＧｌｕＯｘ−ＰＰＤ薄膜を白金作用電極５０２へ付加する。図５Ｄは、電解重合されたグルタミン酸オキシダーゼ−ポリ（ｏ−フェニレンジアミン）膜５０４の生体触媒挙動（紫色で示す）を示す。この挙動により、例えば、経皮流体内におけるグルタミン酸レベルの定量が可能となる。これらの例示的な図において、グルコース定量のため、ＧｌｕＯｘの代わりにグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）が用いられている。
【００４５】
凹部ベースのマイクロ針電極５００により、個々のマイクロキャビティ内に酵素の電解重合捕捉が可能となる。その結果、例えば経皮流体の採取の必要が無く、直接的な経皮バイオセンシングを達成することが可能となり、これにより、例えば、デバイス要求および感知プロセスが簡略化される。また、マイクロ針バイオセンサーの二要素凹部の形状により、埋設された平面電極を含むマイクロ針の酵素固相化のためのより大きな表面積を提供することが可能となる。
【００４６】
凹部ベースのマイクロ針電極５００は、電解重合ＰＰＤ薄膜を含み得る。これらの電解重合ＰＰＤ薄膜は、例えば顕著な選択透過特性および安定な応答を付与しつつ、小型電極変換器内への酵素の閉じ込めに用いることができる。一例において、ＰＰＤを、異なるオキシダーゼ酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、およびグルタミン酸オキシダーゼ）の捕捉と、遊離した過酸化水素生成物の選択透過検出とのために用いることができる。選択透過特性が顕著であるため、ＰＰＤ膜により、共存する電気活性干渉物質および身体流体中に通常存在するタンパク質を排除することにより、高い選択性および安定性が得られる。このように、記載のバイオセンサーデバイスは、ＰＰＤ膜を用いることが可能であるため、高い基質選択性、優れた感度、動作安定性および短い応答時間で、過酸化水素の電流測定検出を促進することができる。このようにして、上記酵素機能性ＰＰＤ膜を用いた記載のバイオセンサーデバイスは、本明細書中に記載のような他の固相化技術に基づくものと比較して、顕著な感知における利点を提供することができる。
【００４７】
例えば、開示の二要素マイクロ針アレイプラットフォームの多用性を示すために、電流測定グルタミン酸バイオセンシングのための例示的なバイオセンサーデバイスを示す。この例示的なプラットフォームは、糖尿病の管理のために、グルコースモニタリングに用いることができる。例えば、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸は、多数の病的疾患（例えば、虚血性神経細胞障害、低血糖障害、てんかん、アルツハイマー病、および外傷性脳障害）に関与している。加えて、循環系のグルタミン酸レベルの上昇は、興奮毒性と関連し得る。血液グルタミン酸レベルは、健常人の平均値である３７．５μＭから、頭蓋内損傷に関連する中等度から高度の外傷を受けている被験者の１４１．３μＭまで上昇する。そのため、血清グルタミン酸レベルにより、脳外傷後の中枢神経系の全体的状態についての有用な知見を得ることができる。
【００４８】
例えば、記載のバイオセンシングプラットフォームは、侵襲度の高い（例えば、さらなる分析のためのカテーテルまたはマイクロ透析プローブを介した脳脊髄液（ＣＳＦ）の採取により）グルタミン酸レベルを定量するバイオセンサーよりも有利である。また、例えば、記載のバイオセンシングプラットフォームは、病院において通常臨床的に実施されるバイオセンサーよりも有利である。例えば、臨床分析は、痛みを伴い、時間を要し、また高コストの作業であり得るためである。加えて、記載のバイオセンシングプラットフォームは、特にＣＳＦを利用できない場合、身体上の連続モニタリングに適用することが可能である。血液のグルタミン酸レベルは、ＣＳＦ中のレベルと高く相関するため、開示の実施形態によれば、利用困難な身体流体からの採取は不要である。
【００４９】
記載のバイオセンサーデバイスの例示的な実証において、異なるＰＰＤ成長プロセスを用いて、酵素であるグルタミン酸オキシダーゼ（ＧｌｕＯｘ）およびグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を、例示的なマイクロ針デバイスのマイクロキャビティ内に捕捉することができる。各ＰＰＤ成長プロセスは、特定の用途に合わせて個別に調節可能な固有の特定の利点を有する。ＰＰＤベースのマイクロ針キャビテイ内への酵素閉じ込めにより、緩衝液および不希釈のヒト血清中における病態生理学的レベルにおいて、グルタミン酸およびグルコースの定量を効率的に行うことが可能になる。例えば、例示的なデバイスは、最小侵襲であり、また、酵素捕捉および保護のための簡便な手段と組み合され、また電気分析能力も高いため、実質的なパッチ型の身体上バイオセンサーとして適用可能であることが実証される。
【００５０】
本技術の開示の実施形態を実施するための例示的な材料および方法を提示する。以下の化学物質および試薬：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルタミン酸オキシダーゼ（ＧｌｕＯｘ、Ｅ．Ｃ．１．４．３．１１）（組み換え型）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ、Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）、１、２−フェニレンジアミン（ｏ−Ｐｄ）、Ｌ−グルタミン酸（ＧＬＵ）、Ｄ−（＋）−グルコース（ＧＬＣ）、Ｌ−アスコルビン酸（ＡＡ）、尿酸（ＵＡ）、Ｌ−システイン（ＣＹＳ）、アセトアミノフェン（ＡＣＴ）、硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、およびヒト男性からの血清（ＡＢ型）は、記載の態様において用いられた。例示的な態様（血清較正を除く）を、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）中で行った。超高純度水（１８．２ＭΩ・ｃｍ）を、全ての例示的な態様において用いた。
【００５１】
記載の態様において用いられた器具類は、以下を含み、本明細書中に開示される例示的な条件下において、開示の実施形態の例示的な実証および態様において用いられた。ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）社製のモデル１２３２Ａ電気化学的分析器を、電気化学的測定のために用いた。外部Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極（ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＣＨＩ１１１）および０．５ｍｍ直径の白金ワイヤカウンター電極（ＢＡＳｉ、Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）を用いて、三電極電気化学的システムを構築した。ボルタンメトリーおよびクロノアンペロメトリーによる検討により、室温（２２℃）におけるマイクロ針アレイ電極の電気化学的挙動を評価した。これらの例示的な電気化学的態様において、グルタミン酸（またはグルコース）を２ｍＬのリン酸緩衝液溶液または血清（攪拌）中に付加して、所望の濃度を得た。電位ステップの付加後、クロノアンペロメトリー電流を１５秒間サンプリングした。電界放射型走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、二要素マイクロ針アレイの形態を調査した。スパッタリング装置（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｂｅａｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｍｉｔｅｃｈ  Ｋ５７５Ｘ、Ｅ．Ｇｒａｎｂｙ、ＣＴ）を用いて、試料をクロムでコーティングした後、ＳＥＭ分析を行った。堆積電流１３０ｍＡを３０秒間付加して、１５ｎｍのクロムをサンプル表面上に堆積させた。
【００５２】
例示的な態様において用いられる例示的な中実および中空マイクロ針アレイを、以下のようにして開発した。ＣＡＤソフトウェア（例えば、Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ（Ｄａｓｓｕａｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓ．Ａ．、Ｖｅｌｉｚｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、マイクロ針設計を準備した。Ｍａｇｉｃｓ  ＲＰ  １３（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ  ＮＶ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、基板支持構造を作製した。例えば、円錐形状の中実針を設計および作製した。これらの中実針は、基部の直径が３９０±１４μｍであり、高さが８１８±３５μｍである。中空針は、三角形の基部を備えるピラミッド形状である。各中空マイクロ針の寸法は、縁の長さが１１７４±１３μｍ、高さが１３６６±１５μｍ、ピラミッド構造の１つの面における垂直円筒型孔の直径が３４２±５μｍである。中実および中空針の双方を、２ｍｍ間隔で３×３角のアレイ状に配置した。マイクロ針アレイ用の基板は、１０ｍｍ×１０ｍｍの程度、厚さの値がそれぞれ中実の例で２０００μｍ、中空の例で５００μｍである。３次元コンピュータモデルを、Ｐｅｒｆａｃｔｏｒｙ（登録商標）ＳＸＧＡ標準ＵＶ高速プロトタイピングシステム（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｄｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へ作製のために転送した。本システムにおいては、コンピュータモデルを用いて、１５０Ｗのハロゲン球からの光を光硬化性材料上に高精度に誘導し、これにより、例えば、露出材料の選択重合を行う。いくつかの態様において、Ｅｓｈｅｌｌ  ２００アクリレート系ポリマー（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  ＧｍｂＨ）を構成材料として用いて、マイクロ針アレイを作製することができる。なぜならば、この樹脂は、可視光下において選択的に重合し、弾性のヤング率が３０５０±９０ＭＰａであるからである。さらに、このポリマーは、ＩＳＯ１０９９３に基づくクラスＩＩａの生体適合性を有する。５５０ｍＷの出力ビーム（ステップサイズ＝５０μｍ）をゼロ度の傾斜で用いて、樹脂の重合を行った。作製の後、アレイをイソプロパノールで洗浄して、未重合材料を除去した。これらのアレイをＯｔｏｆｌａｓｈ硬化後システム（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ）内に配置し、構築後硬化を５０秒間行った。１０Ｈｚの繰り返し率および波長２４８ｎｍに操作されたＣｏｍｐｅｘ  ２０１フッ化クリプトン（ＫｒＦ）エキシマレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、市販の高純度Ｐｔターゲットをアブレーションした。本プロセスの結果、Ｐｔ薄膜（１２ｎｍ）が中実マイクロ針アレイの表面上に堆積された。室温において行われた２分間のパルスレーザ堆積（ＰＬＤ）の間、バックグラウンド圧力として５μＴｏｒｒを維持した。
【００５３】
接着剤である非導電性エポキシを中実マイクロ針基板の周囲に付加することができる。その後、中空マイクロ針カバーを中実マイクロ針基板を覆うように配置することができる。この例示的な手順を、図５Ａおよび５Ｂに模式的に示す。例えば、２つの要素（例えば、中実マイクロ針基板および中空マイクロ針カバー）を光学顕微鏡下において配置して、中空マイクロ針の開口内に中実マイクロ針をアライメントさせる。その結果、図５Ｃに示すように、二要素マイクロ針アレイ電極（ＢＭＡＥ）を形成することができ、例えば、３ｍＬのシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と接合することができる。例えば、シリンジのノズル部分を除去することにより、ＢＭＡＥを接着エポキシを用いてシリンジの先端へ固定することができ、取り扱いが容易になる。その後、銅ワイヤをシリンジの開口端部に挿入して、Ｐｔ作用電極に対する電気接触を形成することができる。図５Ｃに示すように、ポリ（ｏ−フェニレンジアミン）（ＰＰＤ）膜をｏ−フェニレンジアミン（ｏ−Ｐｄ）モノマー溶液から電解重合して、例えばＧｌｕＯｘおよびＧＯｘ酵素を電極表面上に固相し、電位電気活性干渉物質を排除する。例えば、１０ｍＭのｏ−Ｐｄ、５ｍＭの硫酸ナトリウムおよび１００Ｕ／ｍＬのＧＯｘを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）溶液を２０分間室温において窒素パージして、ＧＯｘ機能性電極を形成するのに用いることができる。例えば、その後、ＢＭＡＥ、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極、および白金カウンター電極を溶液中に浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．７５Ｖの電位を２０分間付加することにより、図５Ｃに示すように、ＧＯｘ捕捉ＰＰＤ膜を成長させることができる。この例示的なプロセスは、酵素を固相するための高速手段を示し、酵素が充分低コストであるため、電極全体を酵素およびｏ−ＰＤの溶液中に浸漬させることが可能な用途に適している。
【００５４】
他の例において、上記のプロセスの若干の変形例を用いて、例えば、電解重合プロセス時における高コストのＧｌｕＯｘ酵素を節約することができる。この代替的な例示的なプロセスにおいて、ＢＭＡＥ、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極および白金カウンター電極電極を１０ｍＭのｏ−Ｐｄおよび５ｍＭの硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）の溶液中に浸漬させ、その後Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．７５Ｖの電位を５分間付加することができる。その後、電極を洗浄し、室温乾燥させる。その後、７．５Ｕ／ｍＬのＧｌｕＯｘを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）０．５μＬを、ＢＭＡＥの各凹部中に分注することができる。低残留量のマイクロピペットを用いて、このステップを各マイクロ針についてさらに６回繰り返すことができる。本プロセスの後、溶液を室温で乾燥させることができる。ドロップキャスティング手順をさらに５回繰り返すことができる。その後、１０ｍＭのｏ−Ｐｄ、５ｍＭの硫酸ナトリウムおよび１Ｕ／ｍＬのＧｌｕＯｘを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の溶液を、マイクロ針アレイの各マイクロキャビティに分注することができる。その後、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．７５Ｖの電位を１５分間付加して、ＧｌｕＯｘ捕捉ＰＰＤ膜を電解重合することができる。例えば、上記の記載のプロセスは、酵素使用量を犠牲にしても簡素化することが可能であるが、本態様により、より高コストの酵素の電解重合を促進することができる。
【００５５】
各電解重合プロセスの後、ＢＭＡＥを洗浄し、０．１Ｍのリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４）中に３０分間浸漬することにより、モノマーの残留物および未結合の酵素をマイクロ針構造から除去することができる。非使用時においては、ＢＭＡＥをリン酸緩衝液中に４℃で保存することができる。この図５Ｄ中に模式的に示される例示的なプロセスにおいて、グルタミン酸およびグルコースの定量ならびに他の被分析物の定量が可能になる。
【００５６】
記載のマイクロ針アレイバイオセンサーデバイスの例示的な態様は、電極の形状および表面の特徴を確認するために行われたＢＭＡＥの表面形態の評価を含む。ＢＭＡＥ表面形態の詳細な検討をＳＥＭを用いて行った。図６Ａは、中実マイクロ針アレイの例示的な走査型電子顕微鏡写真を示す。図６Ｂは、中空マイクロ針アレイの例示的な走査型電子顕微鏡写真を示す。これらのＳＥＭ画像に示すように、例示的なマイクロ針の特徴は、例示的なコンピュータ支援による設計ファイル中に記載されている特徴に近密に対応する。例えば、中実および中空マイクロ針の均一な分布を、マイクロ針アレイにおいて確認することができる。例示的な中実マイクロ針（図６Ａ）について、顕著な所見としては、Ｅ−ｓｈｅｌｌ  ２００樹脂の重合に用いられた積層法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ａｐｐｒｏｃｈ）に起因し得るリブ構造がある。均一なピラミッド構造および三角形の基部を、中空マイクロ針アレイ（図６Ｂ）の各要素において確認することができ、また、均一なサイズ分布の開口も確認された。マイクロ針同士の間での形状のバラつきは、ほとんどみられなかった。
【００５７】
記載のマイクロ針アレイバイオセンサーデバイスの例示的な態様において、グルタミン酸の電流測定検出に対する二要素マイクロ針電極の電気化学的特徴付けが行われる。ＢＭＡＥの初期の電気化学的特徴付けの目的は、例えば最適な検出電位を選択するための流体力学ボルタンモグラム（ＨＤＶ）の構築にある。クロノアンペロメトリーを用いて、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．１〜０．６Ｖの範囲（５０ｍＶの増加量）で電位を変化させてＨＤＶを得ることができる。１００μＭのグルタミン酸を含むブランク緩衝液において、これらの例示的な特徴付けを行った。電位ステップの１５秒後に、酸化還元電流をサンプリングした。１０ｍＭのグルコースの検出のために、ＧＯｘ−ＢＭＡＥを用いて同じ手順を行った。図７は、グルタミン酸二要素マイクロ針アレイ電極の例示的な流体力学ボルタンモグラムを示し、例えば、電位ステップのｔ＝１５秒後に、酸化還元電流をサンプリングした。図から分かるように、グルタミン酸の存在に起因して、Ｈ２Ｏ２酵素生成物の酸化に対応して陽極電流が上昇する。過酸化物酸化は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．２５Ｖで発生し始め得る。実際のサンプル中の干渉物質の電位酸化を最小にするために、ＢＭＡＥバイオセンサーのさらなる電気化学的態様として、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．４０Ｖの電位を選択することができる。
【００５８】
二要素マイクロ針アレイ電極における緩衝液マトリックスおよびヒト血清中のグルタミン酸のバイオセンシングの例を記載する。クロノアンペロメトリー電位ステップを用いて、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．４０Ｖの選択された電位で、例示的なＢＭＡＥバイオセンサーの感度を評価した。図８Ａは、緩衝液マトリックス中における病態生理学的な全範囲での、グルタミン酸のレベル上昇（例えば、２０μＭの増加量で０〜１４０μＭ、ｔ＝１５秒でのサンプリング）に対するクロノアンペロメトリー実験の３回の平均のデータプロットを示す。調査中の全範囲において、線形較正プロット（Ｒ２＝０．９９５）を観察することができる（図８Ａの差し込み図に示すように）。例示的な較正プロットは、高い感度（ｓｘ＝７．１２９ｎＡ／μＭ）および低い偏差（ＲＳＤ＝３．５１％）を示す。実験データ（Ｓ／Ｎ＝３）の信号−ノイズ特性に基づいて、３μＭの検出限界（ＬＯＤ）を推測することができる。ＬＯＤは、通常の生理学的レベルを大きく下回っており、マイクロ針センサーの能力がグルタミン酸の生理的レベルを検出できることを示している。
【００５９】
緩衝液中の較正実験の後、不希釈のヒト血清サンプル中のグルタミン酸の定量により、記載のＢＭＡＥバイオセンサーの例示的な態様を評価した。図８Ｂは、０〜１４０μＭの範囲（例えば、２０μＭの増加量）でのグルタミン酸レベル上昇に対するヒト血清中におけるクロノアンペロメトリー較正実験の３回の平均のデータプロットを示す。例示的な緩衝液の調査と同様に、全範囲において、線形較正プロット（Ｒ２＝０．９９２）を観察することができる（図８Ｂの差し込み図に示すように）。加えて、例えば、較正データは、高い感度（ｓｘ＝８．０７７ｎＡ／μＭ）および低い偏差（ＲＳＤ＝６．５３％）を示す。これらのデータ（Ｓ／Ｎ＝３）の信号−ノイズ特性に基づいて、１０μＭのＬＯＤを推測することができる。例示的な緩衝液実験と同様に、実験データから得られたＬＯＤは、通常の生理学的レベルの上限を下回っている。未処理の血清サンプル中のＢＭＡＥの興味のある挙動は、ＰＰＤ膜の保護能力を示す。さらに、緩衝液ベースの試験および血清ベースの試験の双方において得られた類似の感度も、タンパク質を豊富に含む血清媒体へバイオセンサーが長時間曝されたにも関わらず、ＰＰＤ固相化手法の強固性を強調することができる。
【００６０】
生理学的に関連する電気活性化合物を用いた干渉調査（単数または複数）について記載する。例えば、ＰＰＤコーティングの別の有利な特徴として、中程度の酸化電位においても共存する電気活性干渉物質を排除できる能力がある。そのため、生理学的レベルのアスコルビン酸（６０μＭ）、尿酸（５００μＭ）、システイン（２００μＭ）およびアセトアミノフェン（２００μＭ）の存在下において、応答の選択性を調査した。図９は、ブランク緩衝液、１００μＭのグルタミン酸、および電気活性生理学的干渉物質であるアスコルビン酸（ＡＡ、６０μＭ）、尿酸（ＵＡ、５００μＭ）、システイン（ＣＹＳ、２００μＭ）およびアセトアミノフェン（ＡＣＴ、２００μＭ）の存在下における１００μＭのグルタミン酸に対して、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）中において記録された例示的なクロノアンペログラムのデータプロットを示す。図８Ａおよび８Ｂ中に示す条件と同じ条件下において、例示的な態様を実施した。図９は、１００μＭのグルタミン酸に対する電流信号に関して、これらの電気活性化合物の存在に起因するごく僅かな影響を示す。生理学的レベルのアスコルビン酸、尿酸、システインおよびアセトアミノフェンは、それぞれ１００μＭのグルタミン酸の電流応答に対して、わずか０．４４％、０．３１％、１．９３％および６．３７％の平均的なズレであった。よって、これらの電気活性種のレベルにおける自然の代謝変動は、例示的なＢＭＡＥデバイスの身体上バイオセンサーとしての使用において、グルタミン酸のiｎ  ｖiｖｏ定量に干渉しないと考えられる。
【００６１】
例示的な二要素マイクロ針電極アレイの安定性分析について、例示的な態様を実施した。例えば、電流応答における最小の劣化によって長時間動作できる能力は、身体上バイオセンサーの別の重要な特徴を示し得る。よって、１００μＭのグルタミン酸溶液を用いて、８時間にわたってＢＭＡＥ応答の安定性を調査した。図１０は、グルタミン酸応答の長時間にわたる安定性を示すデータプロットを示し、ｔ＝０（１００％）における最初の電流レベルを、各デー項目の基準とした。この例示的な態様において、１４０μＭのグルタミン酸を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）で記録されたクロノアンペログラムからデータを作製した。図８Ａおよび８Ｂ中に示す条件と同じ条件下において、例示的な態様を実施した。図１０の例示的な経時的プロファイルから分かるように、例示的なバイオセンサーは、安定した電流応答を示し、連続サンプリング８時間後も、最初の信号レベルの１０５％を保持した。本例において、全期間にわたって、測定された電流が最初のレベルの１１０％を超えることは無かった。その結果、ＢＭＡＥは、身体に装着されるバイオセンサーに必要とされる長期間にわたる確実な動作が期待される。
【００６２】
例示的な二要素マイクロ針電極アレイを用いたグルコースのバイオセンシングの例を示す。例えば、系統的に特徴付けられたグルタミン酸ＢＭＡＥによって、例示的なプラットフォームは、糖尿病モニタリングのためのグルコースバイオセンサーとして転用することができる。記載のＧｌｕＯｘ固相化プロセスを若干変更することにより、ＧＯｘをＢＭＡＥキャビティ内に閉じ込めた。本技術は、上述したように、量に対するコストを考慮して変更することが可能である。図１１Ａは、緩衝液マトリックス中における病態生理学的な全範囲（例えば、１ｍＭの増加量で０〜１４ｍＭ）での、グルコースレベルの上昇に対するクロノアンペロメトリー較正データのデータプロットを示す。明確な応答が全範囲において観察され、線形較正プロット（Ｒ２＝０．９９６）が得られている（図１１Ａ差し込み図に示すように）。加えて、これらの例示的な較正データは、高い感度（ｓｘ＝０．３５３μＡ／ｍＭ）および低い偏差（ＲＳＤ＝６．４４％、ｎ＝３）とともに、０．２ｍＭのＬＯＤ（Ｓ／Ｎ＝３）を示す。ＧＯｘ機能性ＢＭＡＥは、ＧｌｕＯｘ機能性プラットフォームと比較した場合、基質に対する感度が低い。例えば、これは、基質および生成物の移動特性に影響を与える異なるＰＰＤ成長プロセスに起因し得る。そのため、高い感度が所望される場合、ＧｌｕＯｘ固相化プロセスに従えばよい。
【００６３】
図１１Ｂは、例示的なグルコースマイクロ針バイオセンサーの高い選択性を示す。図１１Ｂは、ブランク緩衝液、１０ｍＭのグルコース、および電気活性生理学的干渉物質であるアスコルビン酸（ＡＡ、６０μＭ）、尿酸（ＵＡ、５００μＭ）、システイン（ＣＹＳ、２００μＭ）およびアセトアミノフェン（ＡＣＴ、２００μＭ）の存在下における１０ｍＭのグルコースについて記録された例示的なクロノアンペログラムのデータプロットを示す。図１１Ｂは、１０ｍＭのグルコースに対する電気信号に関して、電位電気活性干渉物質の存在に起因する影響を示す。生理学的レベルのアスコルビン酸、尿酸、システインおよびアセトアミノフェンは、それぞれ１０ｍＭのグルコースの電流応答に対して、１．０７％、０．８８％、１．６５％および２．２１％の僅かなズレであった。よって、グルタミン酸ＢＭＡＥを用いて行われた例示的な干渉態様の場合と同様に、これらの化合物の自然の代謝変動は、グルコースモニタリングに干渉しないことが予測される。
【００６４】
１０ｍＭのグルコースを含む緩衝液を用いて、ＧＯｘ機能性ＢＭＡＥの例示的な安定性評価を８時間にわたって行った。ＧＯｘＢＭＡＥについては、安定した電流応答がみられ、最初の信号レベルの９７％が測定期間の終了時に取り出された。本例において、全調査期間において、測定された電流応答が最初のレベルの８７％を下回ることはなかった。ＧｌｕＯｘ機能性ＢＭＡＥについて上記した結果も同様であることから分かるように、いずれのＰＰＤベースの固相化化手法においても、連続使用期間において安定した応答が得られた。
【００６５】
本実施形態において記載された開示の技術は、最小侵襲でのグルタミン酸およびグルコースの定量に用いることができる二要素マイクロ針アレイバイオセンサープラットフォームを含む。二要素マイクロ針設計と、中実および中空マイクロ針の固有の利点とを組み合わせることにより、酵素の電解重合捕捉が可能なマイクロキャビティを形成することができる。その結果、皮膚穿刺時における酵素層の保護が可能となり、また、生物学的流体の採取が不要となる。酵素グルタミン酸およびグルコースオキシダーゼの捕捉のためにポリ（ｏ−フェニレンジアミン）の薄膜を用いることにより、高い感受性、選択性、安定性を有し、かつグルタミン酸およびグルコースの高速での電気化学的検出がそれぞれ可能となる。不希釈のヒト血清サンプル中のグルタミン酸の高忠実性検出が病態生理学的な全範囲において可能であるため、実際的な身体上バイオセンサーとしてのプラットフォームの有用性がさらに実証される。例示的なパッチ型の身体上バイオセンサーにより、複数の関連する代謝産物の経皮モニタリングが可能となる。
【００６６】
開示の技術の別の実施形態において、最小侵襲の複合化された記載の多要素マイクロ針アクチュエータデバイスにより、複数の治療薬剤の供給制御が可能となる。本実施形態は、上記と同様の実施形態（単数または複数）を含み得るため、単一の実施形態において個々の実施形態の全機能を実施することができる。本記載の実施形態において、デバイスは、負傷／外傷に応答した薬剤供給を、自律的、最小侵襲の制御された方法で行うことができ、その結果、マイクロ針アレイを、スマートナノファーマシー−オン−ア−チップと呼ばれる供給構造として活用することができる。例えば、マイクロ針アレイ（単数または複数）を皮膚上に配置された接着パッチと一体化させることにより、目的とする治療行為をオンデマンドで経皮的に提供することができる。例示的な技術によれば、マイクロ針プラットフォームと、（一体型感知または酵素論理システムによって制御された自律的な多孔性の変更を通じた調節可能な透過性を備えた）刺激応答性導電性ポリマーナノアクチュエータとを組み合わすことができる。例えば、開示のバイオセンサー／アクチュエータデバイスを用いて、複数の治療薬剤の迅速な投与と、多様な生体医学的状態の緩和とを支援することができる。
【００６７】
記載の実施形態は、単一のマイクロ針アレイ上の複数の個々に指定可能な通路を含む。各通路は、固有のリザーバおよび導電性ポリマーナノアクチュエータと対にされ、複数の特有の化学種を多様な順序で供給するために用いられる。例えば、適切な酸化還元電位が選択されたアクチュエータへ付加されると、導電性ポリマーは、可逆的な体積変化を生じ、これにより、モデル化学薬剤を、制御された方法で対応するマイクロ針通路を通じて、放出することが可能になる。開示のバイオセンサー／アクチュエータデバイスの薬剤供給部の例示的な態様を実施し、本明細書中に記載する。例えば、低速度撮影の映像の記録により、機能を切り替える薄膜の直接的な視覚化および特性評価が可能になり、また、較正調査と共に、複数の試薬をアレイの個々のマイクロ針から高精度時間分解能で供給するデバイスの能力の確認が可能になる。本明細書中に記載される分析モデル化により、単一のマイクロ針を通過する体積流量の予測が可能になり、よって、マイクロ針アレイの設計の支援に用いることができる。
【００６８】
いくつかの例において、導電性ポリマー（例えば、ポリピロール（ＰＰｙ）、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）およびポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ））を、記載の制御放出システムおよび薬剤供給アクチュエータの利用のために用いることができる。これらの例示的な材料は、特有の特性（例えば、特にＰＰｙ）を有し、例えば、「人工筋肉」としての可逆的な機械挙動や、付加された電気化学的刺激に応答して多孔性および体積を変化する能力を有する。開示のアクチュエータ技術は、これらの例示的な材料をデバイスおよびシステムにおいて変更することにより、薬物を有効かつ最小侵襲で供給する手段を提供する。この手段は、例えば、急性期における疾病および負傷の改善のために、実際に身体に装着されるデバイスに組込むことができ、これにより、長期間にわたる無痛装着が可能となる。
【００６９】
図１２Ａは、例示的なマイクロ針ベースの多通路の複合化された薬剤供給アクチュエータデバイス１２００の模式図を示す。デバイス１２００は、中空マイクロ針アレイ１２０１を含む。デバイス１２００は、金がスパッタされたポリカーボネート薄膜１２０４を含む。ポリカーボネート薄膜１２０４は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムがドープされたポリピロールにより機能化され得る（ＰＣ／Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ）。デバイス１２００は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）リザーバ１２０７を含む。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）リザーバ１２０７は、化学（治療）薬剤を貯留するための複数のリザーバを含み得る。
【００７０】
図１２Ｂは、組立状態の多通路薬剤供給アクチュエータデバイス１２００の模式図を示す。このデバイス１２００において、リザーバ１２０７は、２つの異なる薬剤（例えば、薬剤１２１１および薬剤１２１２）を含む２つの例示的なリザーバを有するように構成されている。また、図１２Ｂの模式図は、薬剤１２１１および１２１２をそれぞれ含む２つのリザーバに対応する電極接続１２１６および１２１７を含む組立状態の多通路薬剤供給アクチュエータデバイス１２００も示す。
【００７１】
開示のバイオセンサー／アクチュエータデバイスにより、複数の治療薬剤の制御されかつ切り換え可能な供給を行うことが可能になる。記載のデバイスの例示的な態様の静止画像イメージングおよびリアルタイムビデオキャプチャを用いて、同一アレイプラットフォームの異なるマイクロ針からの染料の交互放出を示す。例えば、マイクロ針体積流量の切り換え精度および繰り返し性を実証するために、画像分析ソフトウェア（例えば、ＩｍａｇｅＪ）および紫外・可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）光度分析を用いた。これらの例示的な結果と、単一のマイクロ針を通じた流体流動特性を評価する分析モデルとを相関付けることにより、開示の多要素マイクロ針アレイ技術の他の実施形態の設計および開発を支援することができ、例えばオンデマンドで異なる治療薬剤を供給することが可能な実際の身体上に装着されるデバイスに適用することができる。
【００７２】
開示のバイオセンサー／アクチュエータ技術を用いることにより、特有の薬剤治療をアレイの各マイクロ針構成要素において提供することができ、これにより、薬物の投薬量を個別に調節することができる。記載のバイオセンサー／アクチュエータ技術は、可動部または一体型微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）が不要な活性固体デバイスを含む。その結果、薄型デバイス設計を簡略化し、システム構成の複雑化およびサイズおよびコストの増加の原因となり得る高度マイクロ流体工学ベースの要素も不要となる。さらに、例えば、記載のマイクロ針多薬剤供給技術は、移植可能なデバイスと共に実施することが可能であるため、複合化されたマイクロ針センサーアレイへ接続された自律的な「装着可能なナノ調剤部」の主要要素として機能するように良好に配置される。
【００７３】
本技術の開示の実施形態を実施するための例示的な材料および方法が提示される。記載の態様において、以下の化学物質および試薬：ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＮａＤＢＳ）、メチレングリーン（ＭＧ）、クレゾールレッド（ＣＲ）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、およびリン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を用いた。例えば、これらは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、さらに精製または修飾することなく用いた。ピロールを、電解重合を行うまで、真空下で絶えず蒸留し、４℃で保存した。全試薬を０．１Ｍのリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．００）中に調製した。超高純度水（１８．２ＭΩ・ｃｍ）を、例示的な全態様において用いた。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）から入手し、１０：１のポリマー：固定薬剤比で手作業で混合した。その後、懸濁液を特注の型中に注入し、真空デシケーター中において脱気した。その後、ＰＤＭＳ懸濁液を１１０℃で１５分間焼成した。その結果得られた構造を、ＵＶＯオゾン（Ｊｅｔｌｉｎｅ  Ｃｏ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）に、ガス流量３ｓｃｃｍで５分間曝した。直径２５ｍｍの黒色ポリカーボネート（ＰＣ）トラックエッチング薄膜フィルタを、ＳＰＩ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から入手した。これらのフィルタの孔径は、６００ｎｍであった。
【００７４】
記載の態様において用いられた器具類は以下を含み、本明細書中に開示される例示的な状態下に、開示の実施形態の例示的な実証および態様において用いられた。ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）社製のモデル１２３２Ａ電気化学的分析器を、全電気化学的測定において用いた。Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤ基準電極および白金ワイヤカウンター電極を用いて、三電極電気化学的システムを構築した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）社製のＵＶ−２４５０ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を、全光学測定において用いた。民生のデジタルビデオカメラ／カムコーダーを用いて、静止画像およびビデオを撮影した。Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０電界放射型走査電子顕微鏡（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、マイクロ針アレイの表面形態を調査した。Ｅｍｉｔｅｃｈ（Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）  Ｋ５７５Ｘスパッタリング装置を用いて、これらのアレイを金膜（例えば、１５ｎｍ）でコーティングした後、ＳＥＭ撮影を行った。その結果得られた電子顕微鏡写真を図１３Ａおよび１３Ｂに示す。図１３Ａは、例示的な中空マイクロ針アレイの表面形態の詳細なＳＥＭ画像を示す。図１３Ｂは、良好に規定された円筒型の内腔を有する例示的な中空マイクロ針アレイの単一の針の走査型電子顕微鏡写真の拡大図を示す。Ｅｍｉｔｅｃｈ  Ｋ５７５Ｘスパッタリング装置を用いて、ＰＣ薄膜を金薄膜（７５ｎｍ）でスパッタリングした後、ＮａＤＢＳがドープされたＰＰｙ導電性ポリマーを堆積させた。
【００７５】
記載の態様において用いられる例示的な中空マイクロ針アレイの作製を以下のようにして行った。この中空マイクロ針アレイを作製において、まず、マイクロ針設計を、（Ｄａｓｓｕａｌｔ  ＳｙｓｔｅｍｅｓＳ．Ａ．、Ｖｅｌｉｚｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて調製した。その後、基板支持構造をＲＰ  １３（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ  ＮＶ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって作製した。例えば、中空針は、三角形の基部を備えるピラミッド形状である。例えば、各中空マイクロ針の寸法は、縁の長さが１１７４±１３μｍ、高さが１３６６±１５μｍ、およびピラミッド構造の１つの面における垂直円筒型孔の直径が３４２±５μｍである。これらの中空針を、２ｍｍ間隔で３×３角のアレイ状に配置した。例えば、マイクロ針アレイ用の基板は、１０ｍｍ×１０ｍｍ程度、厚さの値が５００μｍであった。
【００７６】
記載の態様において用いられる、例示的な電気的に作動可能なナノ多孔性薄膜（例えば、ＰＣ／Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ薄膜）の調製を以下のようにして行った。例えば、銀導電性エポキシを用いて、金がスパッタされたＰＣ薄膜（ＰＣ／Ａｕ）（例えば、孔径６００ｎｍ、多孔性０．２）の周囲に銅ワイヤに取り付けた。０．１ＭのＮａＤＢＳの溶液を４０分間窒素パージした後、最終濃度０．２５Ｍに達するようにピロールモノマーを付加した。その後、ＰＣ／Ａｕ薄膜を溶液中に浸漬し、電気化学的セルの作用電極として機能させ、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．６Ｖを１０分間付加した。この例示的な電位を所定の時間付加したところ、ポリピロールポリマーがＰＣ／Ａｕ薄膜上に最適に堆積され、これにより、溶液が「開口」状態下で相当の速度で流れることを可能にしつつ、「閉鎖」状態下で薄膜を通じた溶液の浸出が最小化される。ポリピロール／ＤＢＳ（ＰＰｙ／ＤＢＳ）の電解重合の後、ＰＣ／Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ薄膜を脱イオン水で洗浄し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−１．１Ｖと０．５Ｖとのサイクリングを緩衝液中で１０回繰り返すことにより安定させた。このプロセスにより、薄膜は、可逆的に、還元状態（−１．１Ｖ）で膨張し、酸化状態（０．５Ｖ）で収縮した。非使用時においては、薄膜は、室温で緩衝液中に保存することができる。
【００７７】
記載の態様において用いられる開示のバイオセンサー／アクチュエータデバイスの例示的な薬剤供給アクチュエータ部の作製を以下のようにして行った。ＰＣ／Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ薄膜を、寸法が約１２ｍｍ×４ｍｍの細片に切断した。その後、これらの細片を例示的な３×３マイクロ針アレイの反対側に接着エポキシを用いて固定し、１つの細片が３本のマイクロ針からなる列を完全に被覆するようにした。アレイの中央列をモデリングクレイにより塞ぐことで、図１２Ａの要素レベル模式図に示す２つの個々に指定可能かつ電気的に作動可能な通路を形成することができた。銀エポキシを用いて、導線を２つのＰＣ／Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ薄膜のそれぞれに取り付けて、各アクチュエータのオーミック接触を促進した。その後、ＰＤＭＳ二通路リザーバを薄膜上にアライメントさせ、接着エポキシを用いて固定した。図１２Ｂに示すように、最後に、リザーバに２０μＬのモデル化学薬剤（単数または複数）を供給した。
【００７８】
例示的なマイクロ針アレイアクチュエータデバイスの初期の態様は、ＰＣ／Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ薄膜および二通路動作の切り換え能力の有効化および視覚化を目的とした。例えば、組立状態の複合化された薬剤供給アクチュエータ中の双方のリザーバ（例えば、リザーバ１（Ｒ１）およびリザーバ２（Ｒ２））に、先ず、１２ｍＭのメチレングリーン（ＭＧ）染料を供給し、カウンター電極および基準電極と共に緩衝液中に浸漬した。磁気撹拌子により、連続的攪拌を一定速度（例えば、１４０ｒｐｍ）で行った。ＤＢＳがドープされたＰＰｙ薄膜は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−１．１Ｖのバイアスをかけることにより、還元状態に入るとともに拡張し、その結果、多孔性材料を通じた溶液流出が阻害された。図１４の画像（Ａ）に示すように、この電位において、ＭＧ染料の排出は、いずれの通路においても観察されなかった（「ＯＦＦ」状態として示される）。その後、Ｒ２薄膜ナノアクチュエータは、還元状態（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−１．１Ｖ、「オフ」）に維持され、Ｒ１において薄膜は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．５Ｖの電位を付加することにより、酸化状態（「オン」）へ切り換えられた。この「オン」状態に起因して、ＤＢＳがドープされたＰＰｙ薄膜は、酸化および収縮し、これにより、溶液がナノ多孔性薄膜、その後マイクロ針を通過して流出することが促進される。図１４の画像（Ｂ）から分かるように、Ｒ１からのＭＧ放出は視認されるが、Ｒ２は閉鎖状態のままであり、染料放出はみられなかった。この動作に続いて、Ｒ１を酸化状態（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．５Ｖ、「オン」）に維持するするとともに、Ｒ２を酸化状態（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．５Ｖ、「オン」）へ切り換えると、ＭＧを双方のリザーバから放出した（図１４の画像（Ｃ）に示すように）。その後、図１４の画像（Ｄ）に示すように、Ｒ１を還元状態「オフ」へ切り換え、Ｒ２を酸化状態「オン」で保持した。ナノ多孔性薄膜上への電位の切り換えによる、個々のリザーバからのＭＧの制御された交互の放出をリアルタイムに例示した。「オン−オフ」サイクルが繰り返し実施されていることから分かるように、薬剤供給アレイは、例えば１０回以上繰り返した後でも、周期的に開閉できる能力を維持する。さらに、１０回目のサイクルにおけるＭＧ放出を確認するために必要な時間長さ（３０秒）は、１回目のサイクルと同じであった。例示的な態様において、「オフ」電位の付加の後、完全な流出の遮断にかかる時間長さは、およそ３５秒であった。上記結果に基づいて、Ｒ１にＣＲ染料を供給し、Ｒ２にＭＧ染料を供給した。全４回の「オン／オフ」切り替えが行われた。各ナノ多孔性薄膜へ付加された電位に基づいて、交互にマイクロ針アレイリザーバから染料が制御放出されることが実証された。
【００７９】
例示的な態様においては、画像分析および紫外・可視光度分析技術を用いて、単一のマイクロ針通路からのＭＧ染料の流量を実験的に定量することにより、マイクロ針アレイの薬剤供給能力を分析した。図１５は、３０秒の固定間隔における、単一のマイクロ針から静止緩衝液中へのＭＧの放出を示す。図１５は、別個の時間間隔３０秒（画像（Ａ）に示す）、６０秒（画像（Ｂ）に示す）、９０秒（画像（Ｃ）に示す）および１２０秒（画像（Ｄ）に示す）における、単一のマイクロ針からのメチレングリーン（ＭＧ）の放出の例示的な経時的な静止フレーム画像を示す。例えば、態様時において、０．５Ｖの電位（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）を付加して、ナノ多孔性薄膜を開口させ、染料を放出した。複数の経時的なビデオ静止画像の分析を通じて、放出された染料の例示的な流量を６．３±０．４μＬ／時間（ｎ＝１０）と決定した。この電位の付加３０秒後、染料は、マイクロ針開口から出現し始めた。６０秒後、小さい染料の柱状物が明確に観察された。高さが約０．５ｃｍの明確に規定された染料の柱状物が１２０秒後に観察された。その後、画像処理ソフトウェア（例えば、ＩｍａｇｅＪ）を用いて柱状物の高さ（ｈ）を測定するとともに、流量方程式（方程式１）を併用することにより、放出された染料の推測された実験流量を計算した。
【００８０】
【数１】
2014533523.tif 000003
式中、ｄは、マイクロ針通路直径であり、ｈは、特定時点ｔと関連付けられた柱状物の高さである。
【００８１】
紫外・可視光度分析を用いて、放出された染料の量を定量した後、マイクロ針流量および放出の繰り返し性を評価した。図１６は、２分間の放出間隔で２０分間、単一のマイクロ針からのメチレングリーン（ＭＧ）染料の放出に対する吸光度を示す例示的な紫外・可視スペクトルデータプロットを示す。上側（左上）の差し込み図のデータプロットは、紫外・可視スペクトルを示し、下側（右下）の差し込み図データプロットは、一定の時間放出における１０個の別個の実験態様の吸光度を示す。図１６中の下側（右下）差し込み図のデータプロットは、同一の放出時間における薬剤供給ナノアクチュエータからのＭＧ放出の再現性を実証する。これらの１０回の繰り返し間における最大偏差は、最大波長において測定された最初の吸光度から５．５％である。線形回帰分析を吸光度−時間プロットに対して行ったところ、高い決定係数（Ｒ２＝０．９９３）および低い相対標準偏差（ＲＳＤ＝２．７４％、ｎ＝３）を有する３．５ｍＯＤｍｉｎ−１の傾きが算出された。この結果から、マイクロ針から染料が一定に放出されたことが分かった。これらの態様から、流体流量を計算したところ、５．５±０．２μＬ／時間となり、経時的なビデオ静止画像から収集された画像分析データと良好に一致していた。作製された薄膜は、優れた再現性を示し、例えば、計算された流量の偏差は、同一の電解重合条件下において１０％未満であった。
【００８２】
マイクロ針アレイの流体流動特性についての理解は、経皮薬剤供給時において高精度の量の薬剤を皮下組織へ供給するために重要である。いくつかの例において、この理解を補強し、薬剤供給能力を分析的に評価するために、修正されたベルヌーイ方程式（方程式２）により、単一のマイクロ針の流体流動特性をモデル化することができる。
【００８３】
【数２】
2014533523.tif 000004
式中、Ｐ１およびＰ２は、大気圧およびマイクロ針の出口圧力を示し、Ｖ１およびＶ２は、平均流体速度であり、ｚ１およびｚ２は、リザーバ上部およびマイクロ針出口それぞれにおける高さであり、ｆは、摩擦係数であり、ρは、流体密度であり、Ｌは、通路または孔の長さであり、Ｄは、水力直径である。図１７は、薬剤供給時における単一のマイクロ針１７００の例示的な模式図を示す。この模式図は、リザーバ１７０１（例えば、薬剤のような化学物質）を貯留可能なもの）、内腔構造１７０２（例えば、直径３４２μｍのサイズである管構造のダクトまたはキャビティとなり得るもの）、中空マイクロ針構造１７０３、電気的に作動可能なナノ多孔性薄膜１７０４（例えば、Ａｕ／ＰＰＹ／ＤＢＳナノ多孔性薄膜）、ＰＣ薄膜１７０５、および内腔から出て行く放出された化学薬剤１７０６を含む例示的なマイクロ針要素を示す。
【００８４】
方程式２中の第２の項は、展開式（方程式３）に示すように、作動ナノ孔、ポリカーボネート薄膜およびマイクロ針通路を介した摩擦損失を示す。
【００８５】
【数３】
2014533523.tif 000005
2014533523.tif 000006
Ｄは、単一のマイクロ通路の直径である（例えば、３４２μｍ）。例えば、Ａｕ／ＰＰｙ／ＤＢＳ機能化に起因する孔の縮小により、ＰＣ薄膜１７０５の多孔性は、０．１に設定され、作動ナノ孔の多孔性は、０．４に設定され得る。例えば、ナノ孔によって生成された曲率に起因する通路曲率の増加を考慮して、１．５のおよそのねじれ値をＰＣ薄膜および作動ナノ孔へ割り当てた。マイクロ通路中の水流動に対するストークス流動原理に従って、各摩擦係数を計算した。ここで、円形通路中の大規模層流のために用いられた摩擦係数およびレイノルズ数（ｆＲｅ＝６４）の積を用いる。表１に示すように、マイクロ針通路の３つの流動部分のそれぞれの内部の流体流動について得られレイノルズ数により、各流動部分についての摩擦係数を得ることができる。表１は、単一のマイクロ針通路の寸法および流動特性を示す。
【００８６】
【表１】
2014533523.tif 000007
表１中に示す値は、以下の例示的な考慮事項に従って計算される。例えば、Ａｃは、マイクロ針の断面積である［π（Ｄマイクロ針）４／２]
【００８７】
。室温における水の密度（ρ＝１０００ｋｇ／ｍ３）および粘度（μ＝１．０００Ｎｓ／ｍ２）を用いて、レイノルズ数（Ｒｅ＝ρＶＤ／μ）を計算した。画像分析および紫外・可視光度分析によって得られた実験速度を平均化することにより、推測的に、マイクロ針通路から出て行く流体のレイノルズ数の評価に用いられる速度を決定した。さらに、非圧縮性流体に質量保存（Ｖ１Ａ１＝Ｖ２Ａ２）を用い、平均的な実験速度を併用することにより、ポリカーボネート薄膜およびナノ多孔性薄膜の推測的な速度を得、対応するレイノルズ数を計算した。
【００８８】
2014533523.tif 000008
【００８９】
【数４】
2014533523.tif 000009
式中、ＫｉｎｌｅｔおよびＫｅｘｉｔは、中空マイクロ針と典型的に関連付けられる四角形の縁の入口（０．５）および出口（１）の損失係数である。
【００９０】
リザーバ上部における静的流動（Ｖ１＝０）および流動ネットワーク全体におけるごくわずかな圧力勾配（ΔＰ＝Ｐ１−Ｐ２＝０）を推定することにより、マイクロ針通路から出て行く理論流量の式（方程式５）を得ることができる。
【００９１】
【数５】
2014533523.tif 000010
【００９２】
方程式４によって計算された理論流量と、画像分析および紫外・可視光度分析を通じて得られた実験流量とは良好に対応しており、例えば、表２に示すように、本明細書中に記載されるマイクロ針流体流動モデルの正確さが実証された。表２は、計算された理論マイクロ針流量と、実験的なマイクロ針流量との間の比較を示す。
【表２】
2014533523.tif 000011
【００９３】
複数の薬剤を経皮的に放出する能力は、メタボリック症候群（例えば、高トリグリセリド血症、高血圧およびインスリン依存糖尿病の組み合わせ）、ヒト免疫不全ウイルス、および他の慢性医学的状態の自律的な治療において重要である。開示の実施形態は、自律的な複合化された薬剤供給システムを示す。このシステムは、流体薬剤の制御放出を行う導電性ポリマーナノアクチュエータと接続されたマイクロ針アレイを用いる。付加された電気電位に起因して容積変化する例示的なＰＰｙ／ＤＢＳ導電性ポリマーの能力により、例えば、可動部分または一体型微小電気機械システムを要せず、流体を制御かつ切替可能に放出する。これらのナノ孔作動型のマイクロ針アレイは、コストおよび出力制約の最小化が求められている場合において、装着可能な薬剤供給デバイスとの一体化に適している。
【００９４】
例えば、開示の実施形態に記載のデバイスおよびシステムを用いて実施可能な被分析物の感知および治療薬剤の供給を行う方法が記載される。例示的な方法は、生物学的流体中の被分析物と電気化学的に相互作用するように構成された機能性プローブとの界面において被分析物によって生成される信号を検出するプロセスを含み得る。この信号は、機能性プローブによって電気信号へ変換される。例えば、機能性プローブは、複数の機能性プローブのアレイの１つであり得、機能性プローブを化学的に機能化することにより、流体中の１つ以上の標的被分析物との相互作用が可能となる。例えば、生物学的流体は、有機体中の他の生物学的流体のうち、経皮流体、眼内流体、硝子体液、脳脊髄液、細胞外液、間質液、血漿、血清、涙液、唾液、汗、粘液または血液のうちの少なくとも１つを含み得る。例示的な方法は、電気信号を処理（例えば、信号処理技術を実行）し、被分析物のパラメータ（例えば、被分析物濃度）を決定するプロセスを含み得る。例示的な方法は、例えば決定されたパラメータに基づいて、電気刺激を弁（例えば、この弁は、本明細書中に記載のような可逆的に多孔性を調節可能な孔を有する多孔性ポリマー膜であり得る）へ付加するプロセスを含み得る。弁は、治療薬剤を含むコンテナへ取り付けられる。この例示的な方法は、例えば閉鎖状態から開口状態へ変化させ、治療薬剤を生物学的流体中へ放出する、孔の透過性を変化させる電気刺激を含み得る。例えば、治療薬剤を非限定的に挙げると、薬剤、ワクチン、ホルモン、ビタミン、抗酸化剤または薬理学的薬剤がある。
【００９５】
開示の多薬剤供給マイクロシステムは、記載のマイクロ針センサーアレイと一体化させることができる（例えば、複合化された被分析物検出と、対応する治療行為との結合）。その結果、好位置につける閉ループ感知／薬剤供給マイクロ針の方法論により、複数の治療薬剤をオンデマンド基準で高精度に供給することができる。この種の自律的な「感知／作動／治療」システム、デバイスおよび方法により、目的とする治療によってバイオマーカー変動に応答する手段が提供されるとともに、負傷または疾病の経過の程度に基づいた患者用量を調節することが可能な自己制御型の薬剤供給も提供される。このような応答型の複合化薬剤供給システムを開発することにより、外来患者、在宅の民間治療および軍の医療ケアを変えることができる。
【００９６】
開示の技術の別の実施形態において、電気化学的モニタリングおよびバイオセンシングのための中空マイクロ針アレイ内のカーボンペースト電極を有する最小侵襲の多要素マイクロ針デバイスを記載する。このデバイスは、デジタルマイクロミラーデバイスに基づく光造形技術を用いて作製される。本実施形態は、上記と同様の実施形態（単数または複数）を含み得るため、単一の実施形態において個々の実施形態の全機能を実施することができる。本実施形態において、例示的なマイクロ針バイオセンサー／アクチュエータデバイスを作製するための高速プロトタイピング方法を記載する。この方法は、動的マスク（例えば、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ））を用いる。いくつかの例において、例示的な方法は、感光性アクリレート系ポリマー樹脂に対して選択重合を行って、例示的なマイクロ針センサー／アクチュエータデバイスを得るための動的マスクを用いることができる。例示的な態様を行ったところ、有機体中の皮膚の最外層を穿刺した後、中空マイクロ針は、無傷であることが分かった。例えば、これらの例示的な態様において、炭素繊維に対して化学修飾を行うことにより、過酸化水素およびアスコルビン酸の検出が可能となる。一体型電極中空マイクロ針デバイスを用いて、電気化学的測定が実証された。開示の技術は、感知変換器を生物付着成分から保護しつつ、生物学的サンプル（例えば、間質液）を皮膚を通じて入手可能な例示的なデバイスを用いて、リアルタイムで最小侵襲の医療現場における感知を実施するためのアプローチを含む。このようなデバイスをｉｎ  ｖｉｖｏセンサーとして用いて、生理学的プロセス（例えば、神経伝達物質、医学関連分子、癌バイオマーカーおよび病原性微生物のモニタリング）のリアルタイム検出が可能になる。
【００９７】
本技術の開示の実施形態の作製および実施のための例示的な材料が記載される。例えば、マイクロ針作製のために、シリコン、ガラス、金属（例えば、ステンレススチールおよびニッケル）、および吸収性ポリマー（例えば、ポリグリコール酸およびポリ乳酸）を含む多様な材料を用いることができる（一例において、アクリレート系ポリマー（例えば、ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００）をマイクロ針作製に用いた。この材料は、クラスＩＩａの生体適合の耐水材料であり、肉薄壁の補聴器シェル、中実マイクロ針アレイおよびナノ医療用途において用いられる。ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００は、０．５〜１．５％ｗｔのフェニルビス（２，４，６トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド光開始剤と、１５〜３０％ｗｔのプロピル化（２）ネオペンチルグリコジアクリレートと、６０〜８０％ｗｔのウレタンジメタアクリレートとを含む。エネルギー分散型Ｘ線分光を行ったところ、ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００は、炭素、酸素およびチタンを含み、これらの成分は、生体適合性に優れていることが知られている。ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００は、水吸収値が０．１２％（Ｄ５７０−９８試験法）であり、ガラス転移温度が１０９℃（Ｅ１５４５−００試験法）である。ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００は、引っ張り強さが５７．８ＭＰａ（Ｄ６３８Ｍ試験法）であり、曲げ強度が１０３ＭＰａ（Ｄ７９０Ｍ試験法）であり、破断時の伸びが３．２％（Ｄ６３８Ｍ試験法）である。
【００９８】
例えば、作製方法では、デジタルマイクロミラーデバイス−光造形装置を用いて、中空マイクロ針を作製し、これらの中空マイクロ針の孔内に炭素繊維電極を一体化させる。炭素繊維を化学修飾することにより、２つの医学的に有意な分子である過酸化水素およびアスコルビン酸の検出が可能となる。電気化学的特徴付けを、化学修飾された電極／中空マイクロ針デバイスに対して行った。例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、多数の一般的な酵素ベースの電気化学的センサーにおいてモニタリングされる反応性の酸素種である。例えば、Ｈ２Ｏ２およびグルコノラクトンをグルコースとグルコースオキシダーゼとの間の反応において生成し、放出された過酸化水素のモニタリングにより、グルコースを定量する。例えば、放出された過酸化水素のモニタリングは、脳透析液中のグルタミン酸の定量にも用いることができる。過酸化水素は、グルタミン酸とグルタミン酸オキシダーゼとの間の反応において生成される。グルタミン酸は、興奮性神経伝達物質であり、例えば、攻撃的活性と関連する。アスコルビン酸は、細胞が経験する酸化ストレスの指標であり得る。
【００９９】
以下のプロセスを実施して、マイクロ針アレイデバイスおよびその作製方法の開示の実施形態を実証した。例示的な態様では、ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００表面上のヒト皮膚線維芽細胞および新生児ヒト表皮角化細胞の増殖を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチイルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを用いて評価した。この評価において、例えば、ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによって、黄色のテトラゾリウム塩を紫色のホルマザン染料へ還元する。記載の例示的な態様において、ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００ウェーハ（直径＝１５ｍｍ、厚さ＝２ｍｍ）と、ガラスカバー片（直径＝１５ｍｍ）とを比較した。カバー片およびｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００ウェーハに対して、２回の７０％エタノールによる３０分間の洗浄と、その後の殺菌脱イオン水による洗浄により、洗浄および殺菌を行った。ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００ウェーハを、層流キャビネット中の無菌ペトリ皿内に配置し、紫外Ｂ光で殺菌した。例えば、両面を紫外Ｂ光に曝した。最低２時間の露光後、材料を９０度回転させた。ポリマーを無菌２４ウェル培養皿へ移し、無菌ハンクス緩衝塩溶液で２回、適切な細胞培養培地で１回洗浄した。ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００ウェーハを２ｍＬの適切な細胞培養培地中に配置し、播種までインキュベーター中に保持した。
【０１００】
凍結された新生児ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を入手し、線維芽細胞成長培地（ＦＧＭ−２）およびケラチン生成細胞成長培地（ＫＧＭ−２）も入手した（例えば、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。ヒト皮膚線維芽細胞および新生児ヒト表皮角化細胞を、７５ｃｍ２のフラスコ中において増殖させ（例えば７５％密集度まで成長させ）、その後採取した。ｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００ウェーハ（ｎ＝４）、ガラスカバー片（ｎ＝４）およびポリスチレンウェルプレート（ｎ＝４）上の２４ウェルプレート中に、細胞を播種（例えば、濃度＝４０，０００個／ウェル）した。鉗子を用いて試験器具を一方の溶液から他方の溶液へ移動させることにより、器具の洗浄および全培地交換を行った。４８時間後、これらの器具を新鮮な培地中に配置した。ヒト皮膚線維芽細胞および新生児ヒト表皮角化細胞の場合、この時点で８０％密集度であった。２４時間後、ＭＴＴ生存能力を評価した。細胞を有する器具をハンクス緩衝塩溶液を用いて洗浄した後、イソプロピルアルコールを用いた脱離および攪拌を行った。イソプロピルアルコール（例えば、量＝１００μＬ）を新規の９６ウェルプレートへ移した。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ  プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）を用いて、吸光度を測定した（例えば、λ＝５５０ｎｍ）。パーセント生存率の平均値を計算した。ＰＲＯＣＧＬＭ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＳＡＳ９．１）（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、有意差（ｐ＜０．０５）を決定した。有意差が見られた場合、ｐ＜０．０５レベルの有意水準において、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  Ｓｔｕｄｅｎｔｉｚｅｄ  Ｒａｎｇｅ  ＨＳＤ（Ｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）試験を用いて、複数の比較を行った。
【０１０１】
Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ（Ｄａｓｓｕａｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓ．Ａ．、Ｖｅｌｉｚｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、中空マイクロ針のアレイを３次元図から作製した。Ｍａｇｉｃｓ  ＲＰ  １３（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ  ＮＶ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて生成された３次元図から、支持構造を作製した。四面体形状のマイクロ針設計において、マイクロ針の２つの面は、基板に対して垂直配向を示す。マイクロ針の入力寸法は、１．２ｍｍの辺を有する三角形の基部、高さ１．５ｍｍ、および垂直円筒型通路（直径＝４００μｍ）を含んでいた。これらの針を、２ｍｍのマイクロ針間の間隔で２×２角のアレイ状に配置した。基板入力寸法は、横方向寸法１ｃｍ×１ｃｍおよび厚さ５００μｍを含んでいた。Ｐｅｒｆａｃｔｏｒｙ  ＩＩＩ  ＳＸＧＡ＋  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｄｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マイクロ針アレイの高速プロトタイピングを行った。液状のｅ−Ｓｈｅｌｌ  ２００樹脂の重合用の光源として、１５０Ｗのハロゲン球を用いた。デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）光学素子（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、特に、１２８０×１０２４ピクセル解像度を有するＤＭＤ  ＳＸＧＡ＋  ガイダンスチップを用いて、Ｘ−Ｙ面における樹脂の選択重合を完了した。この素子は、ビルトエンベロープ（９０ｍｍ×６７．５ｍｍ）を含む。作製後、マイクロ針アレイをイソプロパノール中において洗浄して、未重合材料を除去した。２つの光フラッシュランプを含み、３００〜７００ｎｍの波長範囲で露光するＯｔｏｆｌａｓｈ硬化後システム装置（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｄｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、構築後硬化を完了した。
【０１０２】
ロビンソン反射電子検出器を備えるＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ−３２００（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）の可変圧力走査型電子顕微鏡を、例示的なマイクロ針アレイの撮影に用いた。例示的なマイクロ針アレイを、Ｔｅｃｈｎｉｃｓ  Ｈｕｍｍｅｒ  ＩＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｎａｔｅｃｈ、Ｂａｔｔｌｅ  Ｃｒｅｅｋ、ＭＩ）を用いて、６０％金−４０％パラジウムでコーティングした後、撮影した。人間の皮膚および豚の皮膚の構造は、類似しているため、皮膚穿刺試験を、全層の死んだ豚の皮膚を用いて行った。トルイジン系染料であるトリパンブルー（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を用いて、中空マイクロ針アレイの経皮薬剤供給機能を評価した。試験を実施するまで、死んだ全層の離乳児のヨークシャー／ランドレース種の皮膚を３℃で保存した。中空マイクロ針アレイを、全層豚皮膚に穿刺した。アレイ除去後、トリパンブルーを穿刺部位に付加した後、この部位をイソプロパノールぬぐい液で洗浄した。その後、トリパンブルー処理した皮膚を光学顕微鏡を用いて撮影した。豚皮膚への穿刺前および豚皮膚への穿刺後のマイクロ針デバイスの画像を、光学顕微鏡を用いて得た。
【０１０３】
図１８Ａ〜１８Ｄは、開示の実施形態の例示的なマイクロ針アレイデバイスの組立を行う処理ステップを説明するための模式図を示す。本実施形態において、開示のマイクロ針アレイデバイスは、２つの層を含む。上側層は、マイクロ針アレイを含み、下側層は、炭素繊維の支持を提供し、炭素繊維のマイクロ針アレイに対するアライメントを促進する。例えば、支持要素は、厚さ１．６ｍｍのポリ−（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）片から作製することができる。図１８Ａに示すように、６．７５  ６０ワットのＣＯ２レーザーおよびコンピュータ制御のＸＹステージ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）を含むモデルＰＬＳ装置を用いて、孔のアレイをＰＭＭＡ片を貫通してレーザー穿孔することができる。孔を２ｍｍ間隔の四角形パターンで配置することができる。例えば、モデルＨＰＤＦＯ高出力密度の集束光学レンズ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）を用いて、出口表面における例示的な孔の直径を４５μｍに調整した。例えば、支持表面を超える炭素繊維長さを制御するために、支持要素を、深さ１００μｍのウェルの上部（出口側が下）上に配置した。図１８Ｂに示すように、炭素繊維を各孔（入口側）に挿入し、ウェル底部に至るのを許容した。所望のウェル深さに到達した後、図１８Ｃに示すように、ファイバーを、入口側でアクリル接着剤により所定位置に固定することができる。図１９Ａおよび１９Ｂは、それぞれ炭素繊維電極のアレイおよび焦点が合っている単一の炭素繊維電極の光学画像を示す。炭素繊維がマイクロ針の中空軸内に配置されるように、支持層およびマイクロ針層を配置することができる。その後、層を相互に接着することができる。例えば、図１８Ｄに示すように、金属エポキシをファイバー後部に付加して、作用電極の接続を得ることができる。
【０１０４】
例示的な態様は、７μｍの炭素繊維を含む（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。これらの炭素繊維は、ＫＯＨ溶液（濃度＝０．１Ｍ）中においてｐＨ１３および電位１．３Ｖで５分間活性化された。８ｍＭの亜硝酸ナトリウムおよび６ｍＭの２−アミノ−４−ニトロフェノールの溶液を氷上において５分間混合して、対応するジアゾニウム塩を生成することにより、２−アミノ−４−ニトロフェノールのｉｎ  ｓｉｔｕジアゾ化を行った。５分後、活性化された炭素繊維を挿入した。２回のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）走査を、０．４Ｖ〜−０．８Ｖの範囲において０．１Ｖ／ｓで行って、２−ニトロフェノールの電気化学的グラフティングおよびその後のアミノフェノールへの還元を行った。炭素繊維をパラジウムで修飾して、過酸化水素の検出を可能にした。活性化された炭素繊維束を１ｍＭのパラジウム（ＩＩ）塩化物溶液中に配置し、−０．８Ｖの電位を１２０秒間付加することにより、Ｐｄを堆積させた。ＰＧＳＴＡＴ１２  Ａｕｔｏｌａｂ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、電気化学的測定を得た。Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極に対して、データを取得した。
【０１０５】
デジタルマイクロミラーデバイスベースの光造形装置を用いて、約２００個のアレイの作製を３時間行った。図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ炭素繊維電極挿入前の、開示の実施形態の例示的な中空マイクロ針アレイおよび例示的な単一の中空マイクロ針のＳＥＭ画像を示す。ＳＥＭ画像から得られた測定結果によれば、例示的なマイクロ針は、高さが１０３０μｍであり、１１２０μｍの辺の長さを備える三角形の基部であり、孔直径が３７５μｍである。マイクロ針アレイにおいて、マイクロ針同士の間に良好な均一性がみられた。この例示的な態様において、入力寸法と測定寸法との差は、ソフトウェアによるコンピュータ支援設計図面の翻訳に起因するかもしれない。例えば、デジタルマイクロミラーデバイスベースの光造形および他の高速プロトタイピング技術においては、コンピュータ支援設計図面の表面から、一連の多角形への変換（ｔｅｓｓｅｌｌａｔｉｏｎ、ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が行われる。これら一連の多角形は、一連の断面層へ変換された後、マイクロ針デバイスの積層作製に用いられる。どのようにコンピュータ支援設計図面がソフトウェアによって操作されるかは予測不可能である。
【０１０６】
例えば、皮膚穿刺時において、マイクロ針は、屈曲力、圧縮力、剪断力、および皮膚抵抗を受ける。また、人間の皮膚を穿刺するために必要な圧力は、３．０×１０６Ｐａを超え得る。マイクロ針デバイスの皮膚穿刺特性について、マイクロ針機能性の評価のために、モデルとして前に用いられた死んだ豚の皮膚を用いて評価した。図２１Ａは、マイクロ針アレイを使用し、マイクロ針アレイを除去し、トリパンブルーを付与した後の豚の皮膚の画像を示す。トリパンブルースポットは、マイクロ針アレイによって表皮角質層（最外層）が穿刺され、マイクロ針により形成された孔内へのトリパンブルーの局所化を示す。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、それぞれ豚の皮膚への穿刺前および豚の皮膚への穿刺後の中空マイクロ針の光学顕微鏡写真を示す。これらの例示的な画像から分かるように、皮膚穿刺後のマイクロ針は、無傷である。
【０１０７】
例えば、マイクロ針デバイス内において例示的な炭素繊維電極を位置決めすることにより、生物学的サンプルとの相互作用を促進することができ、また、皮膚中へのマイクロ針穿刺と関連するストレスに炭素繊維が曝されるのを最小としつつ、マイクロ針デバイス／皮膚界面における移動も最小とすることができる。生物学的サンプルと炭素繊維電極との間の相互作用を促進するために、炭素繊維電極をマイクロ針の孔の中央に配置することができる。加えて、炭素繊維電極とマイクロ針側壁との間のデッドスペースにより、生物学的サンプルの進入が可能になる。図２２Ａは、中空マイクロ針アレイのＳＥＭ画像を示し、図２２Ｂは、炭素繊維電極を挿入した後の単一の中空マイクロ針のＳＥＭ画像を示す。図２２Ｂの例示的なＳＥＭ画像から分かるように、炭素繊維電極は、マイクロ針の孔の先端を超えて延在しない。炭素繊維をマイクロ針の孔内に配置することにより、マイクロ針の孔および炭素繊維の高精度のアライメントが可能になる（例えば、マイクロ針デバイスの下側層内のレーザーアブレーションされた孔の位置を、マイクロ針デバイスの上側層内のマイクロ針の孔の位置と協調させる）。
【０１０８】
例示的な態様において、５ｍＭのＦｅ（ＣＮ）６３／４／１ＭのＫＣｌに対する電極／中空マイクロ針デバイス内の例示的な炭素繊維の電気化学的応答の評価を行う。図２３は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極のそれぞれに対する１ＭのＫＣｌ中の５ｍＭのフェリシアン化物の１００ｍＶ／ｓの走査速度におけるサイクリックボルタンメトリー走査のデータプロットを示す。例えば、良好に規定された酸化／還元波が観察されたが、これは、マイクロ針の孔中を試験溶液が通過した結果、炭素繊維電極と試験溶液との間に相互作用が発生したことを示す。Ｆｅ（ＣＮ）６３／４に対する平均見掛け電位（Ｅ０’）を、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極および白金カウンター電極のそれぞれに対して２２０ｍＶで測定した。平均ピーク分離は、DＥｐ＝１２５ｍＶであった。これらの例示的な結果から分かるように、電極／中空マイクロ針デバイス内の炭素繊維により、電気化学的測定を行うことができた。
【０１０９】
例示的な態様において、例示的な電極／中空マイクロ針デバイス内の炭素繊維上の過酸化水素のパラジウム触媒による酸化の評価を行った。例えば、１ｍＭのＰｄ／０．５ＭのＨＣｌ中において、０．８Ｖの電位を１２０秒間付加することにより、パラジウムを炭素繊維上に堆積させた後、マイクロ針デバイスへの挿入を行った。図２４は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極のそれぞれに対して１００ｍＶ／ｓの走査速度で、０、５０、１００、３００、および５００μＭの過酸化水素（ピンク曲線、黒色曲線、緑色曲線、青色曲線および赤色曲線それぞれによって示される）に行ったサイクリックボルタンメトリー走査のデータプロットを示す。この図２４に示す例示的なデータは、０、５０、１００、３００および５００μＭの過酸化水素への付加後の還元電流の増加を示し、１００〜５００μＭの線形範囲および１５μＭの検出限界を示す（５０μＭの過酸化水素の応答；Ｓ／Ｎ＝３に基づく）。
【０１１０】
例えば、対応するジアゾニウム塩のｉｎ  ｓｉｔｕジアゾ化および電子グラフティングの後、アミノフェノール（ｏ−ＡＰ）基によって炭素繊維を修飾した。ｏ−ＡＰによる炭素繊維電極の修飾により、一般的な干渉物質（例えば、尿酸およびクエン酸）の存在下におけるアスコルビン酸の電極触媒酸化およびアスコルビン酸の選択酸化が発生し得る。尿酸は、アスコルビン酸の電気化学的分析における周知の干渉物質であり、例えば、尿酸およびアスコルビン酸の酸化電位の値が類似することに起因し得る。Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極およびＰｔカウンター電極のそれぞれに対して１００ｍＶ／ｓの走査速度で、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ブランク溶液）および１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）中の１ｍＭのアスコルビン酸に行った線形掃引ボルタンモグラムを図２５に示す。この例示的な結果から分かるように、電極／中空マイクロ針デバイス内の炭素繊維は、１９５ｍＶでのアスコルビン酸の低電位酸化により、アスコルビン酸被分析物を検出することができる。開示の実施形態の電極／中空マイクロ針デバイス内の炭素繊維による電気化学的測定が実証された。加えて、選択被分析物のための例示的な炭素繊維の化学修飾が示され、これらの修飾炭素繊維を用いた過酸化水素およびアスコルビン酸の検出が実証された。
【０１１１】
開示の技術の別の実施形態において、電気化学的モニタリングおよびバイオセンシングのためのカーボンペースト電極（ＣＰＥ）を用いた最小侵襲の多要素マイクロ針デバイスが記載される。本実施形態は、上記実施形態と同様の実施形態（単数または複数）を含み得るため、個々の実施形態の全機能を単一の実施形態上で行い得る。例示的なカーボンペースト電極は、多様な触媒および生体触媒を含むペーストによって例示的な中空の非平面マイクロ針の充填を行うことにより、再生可能性または機能を示すことができる。例えば、表面を平滑化した場合、マイクロ電極同士の間の均一性が得られる。光学顕微鏡写真および走査型電子顕微鏡写真は、マイクロ針開口における表面形態を示す。開示のマイクロ針電極アレイの例示的な態様において、ロジウム分散カーボンペーストマイクロ針においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで過酸化水素の低電位検出を行い、金属化カーボンペーストマトリックスに乳酸オキシダーゼを含浸することにより、乳酸バイオセンシングを行った。例示的な態様によれば、例えば、カーボンペーストの充填／未充填の連続サイクルによって、高度で繰り返し感知を行うことができた。例えば、例示的なアレイの動作安定性が確認され、生理学的に関連するレベルのアスコルビン酸、尿酸およびアセトアミノフェンの存在下における乳酸の無干渉検出も確認された。記載のマイクロ針設計は、多様なバイオセンシング用途（例えば、複数の生理学関連被分析物の皮下における電気化学的モニタリング）に適している。
【０１１２】
例えば、カーボンペーストは、最適な充填に必要な高レベルの成形性によって特徴付けられ、電気分析に用いられ得る。ＣＰＥの利点を挙げると、低バックグラウンド電流、低コスト、および簡便な表面再生および（例えば、ペースト中への改質剤の付加を介した）修飾がある。開示の実施形態の例示的なマイクロ針アレイは、４２５μｍ直径の開口を有するピラミッド型の中空マイクロ針の９要素アレイを含み得る。この開口を通じて、改質カーボンペーストが押し出され、変換器として機能することができる。例えば、ロジウム分散カーボンペーストは、過酸化水素の低電位検出に用いることができ、マイクロ針中に充填することにより、共存する電気活性干渉物質による影響を最小化することができる。記載のマイクロ針アレイＣＰＥセンサーデバイスにより、一体型マイクロ通路および間質液採取の必要性が回避される。
【０１１３】
本技術の開示の実施形態を実施するための例示的な材料および方法が提示される。記載の態様において、以下の化学物質および試薬：Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来の乳酸オキシダーゼ（ＬＯｘ、Ｅ．Ｃ．１．１３．１２．４）、炭素上ロジウム（５％Ｒｈ重量）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、鉱物油（例えば、ｄ＝０．８３８ｇ／ｍＬ）、Ｌ乳酸、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、Ｌアスコルビン酸（ＡＡ）、尿酸（ＵＡ）、アセトアミノフェン（ＡＣ）、エチルアルコール、リン酸二水素カリウム、およびリン酸水素二カリウムを用いた。これらは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、さらなる精製または修飾することなく用いた。全ての実験を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて行った。超高純度水（例えば、１８．２ＭΩ・ｃｍ）を、例示的な態様において用いた。
【０１１４】
例示的な態様において、例示的な中実および中空マイクロ針アレイを以下のようにして開発した。中空マイクロ針アレイをＳｏｌｉｄｗｏｒｋｓ（Ｄａｓｓｕａｌｔ  ＳｙｓｔｅｍｓＳ．Ａ．、Ｖｅｌｉｚｙ、Ｆｒａｎｃｅ）コンピュータモデルの支援により作製した。Ｍａｇｉｃｓ  ＲＰ  １３（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ  ＮＶ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、基板構造を設計した。例えば、針は、三角形の基部を有するピラミッド形状である。例えば、各マイクロ針の寸法は、縁の長さが１２５０μｍであり、高さが１５００μｍであり、ピラミッド構造の１つの面における垂直円筒型孔の直径が４２５μｍであった。例示的な針を、２ｍｍ間隔で３×３角のアレイ状に配置した。マイクロ針アレイの基板は、１０ｍｍ×１０ｍｍ程度であり、厚さ５００μｍであった。３次元コンピュータモデルを、Ｐｅｒｆａｃｔｏｒｙ（登録商標）ＳＸＧＡ標準ＵＶ高速プロトタイピングシステム（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ＴＥＣＧｍｂＨ、Ｇｌａｄｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へ作製のために転送した。本システムにおいては、これらのコンピュータモデルを用いて、１５０Ｗのハロゲン球からの光を光硬化性材料上に高精度に誘導し、これにより、露出材料の選択重合を行う。Ｅｓｈｅｌｌ  ２００アクリレート系ポリマー（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｄｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を構成材料として用いて、マイクロ針アレイを作製した。なぜならば、この樹脂は、可視光下において選択的に重合し、弾性のヤング率が３０５０±９０ＭＰａであるからである。また、このポリマーは、ＩＳＯ１０９９３に基づくクラスＩＩａの生体適合性も有する。５５０ｍＷの出力ビーム（例えば、ステップサイズ＝５０μｍ）をゼロ度の傾斜で用いて、樹脂重合を行った。作製の後、アレイをイソプロパノールで洗浄して、未重合材料を除去した後、Ｏｔｏｆｌａｓｈ硬化後システム（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｄｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に配置して、構築後硬化を行った。
【０１１５】
例示的な酵素機能性ロジウム分散カーボンペーストマイクロ電極アレイを以下のよに調製した。例えば、ボルテックスおよび超音波処理の５分間サイクルを１０回交互に行うことにより、１００ｍｇの炭素上Ｒｈおよび１０ｍｇのＬＯｘを完全に均質化した。その後、この混合物をさらに１時間ボルテックスした。均質化プロセスの後、１２５ｍｇの鉱物油ペースト溶液および１５ｍｇのＰＥＩ酵素安定剤を固体状の混合物へ付加した。得られたペースト状の混合物を、乳鉢およびすりこぎを用いて、さらに１時間すりつぶすことにより均質化した。
【０１１６】
例えば、３ｍＬのシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を支持体として用いて、金属化カーボンペーストをマイクロ針アレイを通じて押し出すことができる。シリンジのノズル部位を除去することにより、マイクロ針アレイへの取付が容易になり、耐久性のために（例えば接着エポキシを用いて）、切断端部へ固定される。その後、銅ワイヤをシリンジのシリンダーの後端へ挿入して、マイクロ針変換器との電気接触を形成する。この例示的な手順後、カーボンペースト混合物を後端からシリンジ中へ供給した後、ペーストがマイクロ針マイクロ孔を通じて排出され始めるまで、後端からプランジャーを用いて押し出した。余分なペーストを開口から除去した後、ワックスペーパーを用いて表面を平滑化した。応答の繰り返し性を調査するために、マイクロ針を新規ペーストで充填した後、アレイをシリンジから注意深く除去した後、超音波処理下においてエタノール中に浸漬して、不要なカーボンペースト残留物を除去した。０．１５ｍｍ直径のイリジウムワイヤを用いて、マイクロ孔からのペースト除去を促進した。その後、上記した組立および充填プロトコルに従って、清浄されたマイクロ針アレイに新規電極を生成した。
【０１１７】
記載の態様において用いられる器具類は、本明細書中の例示的な状態下における開示の実施形態の例示的な実証および態様において用いられた以下のものを含む。ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）社製のモデル１２３２Ａ電気化学的分析器を、電気化学的測定のために用いた。外部Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極（ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＣＨＩ１１１）および０．５ｍｍ直径の白金ワイヤカウンター電極を用いて、三電極電気化学的システムを構築した。電気化学的実験を７ｍＬのセル中において室温（２２℃）で行った。ボルタンメトリーおよびクロノアンペロメトリー調査を用いて、例示的なカーボンペーストマイクロ針アレイ電極の電気化学的挙動を評価した。これらの電気化学的態様において、Ｈ２Ｏ２または乳酸を、５ｍＬのリン酸カリウム緩衝液溶液へ付加して、所望の濃度を得た。電位ステップの１５秒後に、クロノアンペロメトリー電流のサンプリングを行った。流体力学ボルタンモグラムを得るために、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．２０〜＋０．６０Ｖの範囲で電位（例えば、０．０５Ｖ増加量）を変更することにより、攪拌された所望のＨ２Ｏ２濃度を含むリン酸緩衝液溶液中において、固定電位アンペログラムを記録した。磁気撹拌器を１００ｒｐｍの速度で回転させることにより、この溶液を連続攪拌した。電界放射型走査電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、カーボンペーストマイクロ針アレイの形態を調査した。全試料をクロムでコーティングした後、スパッタリング装置（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｂｅａｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｍｉｔｅｃｈ  Ｋ５７５Ｘ、Ｅａｓｔ  Ｇｒａｎｂｙ、ＣＴ）を用いて分析した。堆積電流１３０ｍＡを３０秒間付加して、１５ｎｍのクロムをサンプル表面上に堆積させた。
【０１１８】
開示の実施形態の例示的な態様において、カーボンペーストマイクロ電極アレイの表面形態の特徴付けを行った。例えば、未修飾および修飾カーボンペーストは、マイクロ針アレイデバイスの非平面開口に容易に適合することができる。初期の態様は、カーボンペーストが供給されたマイクロ針アレイの特徴付けを目標としており、マイクロ電極表面の詳細な調査から開始された。図２６Ａおよび２６Ｂは、それぞれ未充填のおよびＲｈ−カーボンペーストで充填されたマイクロ針アレイの光学顕微鏡写真を示す。例示的な未充填のマイクロ針アレイの光学顕微鏡写真を図２６Ａに示す。この画像は、均一なピラミッドマイクロ針構造（三角形の基部を有する）を示す。この構造は、１５００μｍの高さおよび円筒型開口（４２５μｍ直径）を有する。図２６Ｂは、カーボンペーストで充填された後、研磨された例示的なマイクロ針アレイを示す。これから分かるように、表面が平滑に研磨されることにより、再現性の高い露出領域が得られ、その結果、信頼性のある電気化学的感知が促進される。図に示すように、マイクロ電極同士の間の均一性を確認することができる。
【０１１９】
表面形態の特徴付け後、マイクロ針のＳＥＭ撮影を行った。図２７Ａおよび２７Ｂは、未充填のおよびＲｈ−カーボンペーストで充填されたマイクロ針構成要素のアレイのＳＥＭ画像を示す。図２７Ａは、単一のマイクロ針の電子顕微鏡写真を示す。マイクロ針の構造を確認することができる（例えば、ポリマー樹脂上への光源のラスタリングによって生成されたくり抜かれた円筒型の孔およびリブ構造）。図２７Ｂは、カーボンペーストで充填された単一のマイクロ針の表面の詳細を示す。例えば、図に示すように、良好に形成された表面、比較的平滑な形態、および規定された縁を確認することができ、よって、例えば、円筒型マイクロ孔が有効に充填されていることが確認できる。過剰なペーストを押し出した後に表面研磨を行うことにより、このような表面品質を得ることができる。なお、ＳＥＭ画像を取得した際の斜角により、マイクロ針および開口が細長形状にみえている。
【０１２０】
開示の実施形態の例示的な態様において、過酸化物ベースの電流測定感知に対するカーボンペーストマイクロ電極アレイの電気化学的特徴付けを行った。例えば、初期の電気化学的態様を行うことにより、カーボンペーストマイクロ針アレイに対するＨ２Ｏ２の応答の特徴付けを行った。−０．２０〜＋０．６０Ｖの範囲において流体力学ボルタンモグラム（ＨＤＶ）を記録して、適切な動作電位の推測と、Ｈ２Ｏ２酸化還元プロセスに対するＲｈ−ＣＰＥの高い触媒能力の実証とを行った。図２８Ａに示す例示的結果から分かるように、Ｒｈ−ＣＰＥの使用により、Ｈ２Ｏ２検出を全試験範囲において簡便に行うことができ、交点が０．２２Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）周辺において得られた。図２８Ａは、ロジウム分散されたカーボンペーストマイクロ針電極における、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（データプロット（ａ））および１０ｍＭのＨ２Ｏ２（データプロット（ｂ））の流体力学ボルタンモグラムのプロットを示す。例えば、このような過電圧の低下により、その後のセンサー態様において、Ａｇ／ＡｇＣｌに対する−０．１５Ｖの低動作電位を選択することが可能になる。この例示的な電位において、１０ｍＭのＨ２Ｏ２に対して５．９５μＡの還元電流を得ることができる。一般的な電気活性干渉物質に起因する影響は、ごくわずかであった。
【０１２１】
例示的なマイクロ針ＣＰＥは、Ｈ２Ｏ２検出のための広範な動的範囲を示す。図２８Ｂは、ロジウム分散されたカーボンペーストマイクロ針電極（例えば、５０μＭの増加量での０〜５００μＭのＨ２Ｏ２  ａ→ｋ、ＥＡＰＰ＝Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖ）を用いて得られたクロノアンペログラムのプロットを示す。図２８Ｂの差し込み図中、例示的な較正曲線が図示される。例えば、図２８に示すように、Ｈ２Ｏ２濃度に比例する良好に規定された電流が観察された。電位ステップの１５秒後における電流のサンプリングに基づいて得られた例示的な較正曲線は、高い線形性（差し込み図に示すように、Ｒ２＝０．９９９）を示す。５０μＭのＨ２Ｏ２にに対する応答（曲線ｂ）は、検出限界（ＬＯＤ）が２０μＭ（Ｓ／Ｎ＝３）であることを示す。最小侵襲のオキシダーゼベースのバイオセンサーへ使用する場合、低電位でのＨ２Ｏ２の検出能力は、開示のＲｈ−ＣＰＥマイクロ針アレイの興味深い特徴である。
【０１２２】
開示の実施形態の例示的な態様において、マイクロ電極アレイ内においてカーボンペーストマトリックスを再構築した場合の影響を評価した。例えば、カーボンペーストベースの電極の１つの主要な利点として、容易に再形成可能な再生可能表面がある。このような再形成により、マイクロ針アレイの再利用が促進される。そのため、アレイの充填を繰り返し行った場合の応答への影響を評価した。よって、カーボンペースト表面を連続的再構成に関連する、Ｈ２Ｏ２に対する５回の較正実験を５０〜５００μＭのＨ２Ｏ２範囲において行った。各実験の態様同士の間において、電極を完全に分解、洗浄、再構築および再充填した。その後、電気化学的応答の特徴付けを行った。図２９は、５０μＭの増加量で０〜５００μＭのＨ２Ｏ２濃度に対して得られた較正曲線のプロットを示す（例えば、ＥＡＰＰ＝Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖ、ｔ＝１５秒）。Ｒｈ分散カーボンペーストマイクロ針アレイの再構築による影響を、その後の５回の再構築動作について示す。図２９に示す結果から分かるように、再現性が高い。例えば、連続充填の応答は、調査された濃度範囲における各レベルにおいて、平均電流からわずか５．４％逸脱するにすぎなかった。濃度範囲にわたって極めて低い標準偏差（例えば、σ＜１０ｎＡ）の高い線形性（Ｒ２＝０．９９７）の結果が観察された。これらの例示的データは、マイクロ針アレイ中のカーボンペースト要素の充填／未充填を繰り返しても、再現性のある電気化学的応答が得られることを実証する。
【０１２３】
開示の実施形態の例示的な態様は、マイクロ針ＣＰＥアレイにおける乳酸のバイオセンシングを含む。例えば、乳酸用の例示的なマイクロ針アレイＣＰＥバイオセンサーが開発された。マトリックス内に酵素を静電捕捉するためのＰＥＩを用いて、乳酸オキシダーゼ（ＬＯｘ）分散金属化カーボンペーストを調製した。乳酸レベルの上昇（例えば、１ｍＭの増加量での０〜８ｍＭ）に対するクロノアンペロメトリー較正実験を、ＬＯｘ−Ｒｈ−カーボンペーストマイクロ針アレイを用いて、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖで行った。図３０Ａに示す典型的なクロノアンペログラムは、１ｍＭの増加量での０〜８ｍＭの乳酸濃度（例えば、ＥＡＰＰ＝Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖ）について得られたクロノアンペログラムの例示的なプロットを示す。図３０Ｂは、ｔ＝１５秒におけるクロノアンペロメトリー電流に対応する例示的な較正曲線を示す。例えば、高い線形性（Ｒ２＝０．９９０）および低い偏差（例えば、σ＜１０ｎＡ）が確認された。検出限界は、４２ｍＭ乳酸（Ｓ／Ｎ＝３）と推定され、これは通常の生理学的レベルを大きく下回っているため、関連用途においてきわめて充分である。なお、この例示的な線形濃度範囲は、経皮流体中の乳酸の全生理学的範囲および病理学的範囲を包含し、例えば、マイクロ針ベースの乳酸バイオセンサーの診断上の有用性を示している。
【０１２４】
開示の実施形態の例示的な態様において、一般的な電気活性化合物による干渉に対するマイクロ針ＣＰＥアレイの評価を行った。例えば、経皮流体中に見られる一般的な電気活性物質の存在下において、例示的なバイオセンサーが意図する通りに機能し得ることを確認するために、これらの化合物の生理学的レベルを用いて干渉調査を行った。図３１は、６０μＭのアスコルビン酸（ＡＡ）、５００μＭの尿酸（ＵＡ）、および２００μＭのアセトアミノフェン（ＡＣ）の存在下での１ｍＭの乳酸の検出（例えば、ＥＡＰＰ＝Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖ）に対する生理学関連電気活性干渉物質による影響を示すクロノアンペログラムのプロットを示す。図に示すように、これらの一般的な電気活性干渉物質のうちのいずれかを付加しても、例示的なバイオセンサーデバイスの乳酸応答への影響はごくわずかであった。例えば、ＡＣ付加時における１ｍＭの乳酸レベルからの最大電流偏差は、はわずか１．５％であった。例えば、このような無干渉の乳酸検出は、記載のマイクロ針ペーストバイオセンサーによって検出（例えば、経皮流体中における乳酸のモニタリングのために）することができるＲｈ−ＣＰＥのＨ２Ｏ２に対する強力かつ選択的な電極触媒活性を反映する。
【０１２５】
開示の実施形態の例示的な態様において、マイクロ針ＣＰＥアレイの乳酸応答の安定性を評価した。例えば、２時間にわたる２ｍＭの乳酸に対する反復クロノアンペログラムから、マイクロ針アレイベースのバイオセンサーの安定性を調査した。いくつかの例において、初期の短期の事前調整ステップを行った。本プロセスにおいて、例示的なＣＰＥマイクロ針アレイを、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬させ、６つのクロノアンペログラムの同時記録を行い、その後、２つのクロノアンペログラムを記録しつつ、アレイを２ｍＭの乳酸溶液中に１０分間浸漬した。例示的な事前調整の後、２時間の全安定性試験期間にわたって、電流を１０分毎にサンプリングした。図３２は、得られた電流応答の経時的プロファイルを示す。例えば、ｔ＝０分における初期の読み取り値を、１００％として規格化した。図３２は、２時間にわたる２ｍＭの乳酸（ＥＡＰＰ＝Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖ）に対するマイクロ針アレイの電気化学的応答の安定性のデータプロットを示す。図に示すように、実験の初期設定のほぼ直後に安定電流に達し、２時間の全期間における増加は僅か（９．７％）であった。安定した応答は、例示的なＣＰＥマイクロ針アレイバイオセンサーの健全性を反映する。例えば、ＣＰＥを密に充填することにより、マイクロ針開口内への酵素生成物の電位蓄積を回避することができ、安定した応答へ影響を与えることができる。
【０１２６】
例えば、開示の実施形態において、ＣＰＥ変換器のマイクロ針ホストとの統合により、Ｈ２Ｏ２の低電位検出が得られることが示された。例えば、開示の実施形態の例示的な態様によれば、カーボンペーストマトリックスの逐次の再構築後、再現性のある電流測定応答を達成することができる。例えば、開示の実施形態の例示的な態様によれば、高い線形性の乳酸検出を全生理学的範囲において達成することができ、極めて低い陰極検出電位により、高い選択性が付与される。記載のＣＰＥマイクロ針アレイの高い選択性、感度および安定性は、多様な身体上の感知用途においてこのアレイを実施可能であることを実証する。
【０１２７】
本特許文献において多数の具体例を述べているが、これらの例は、任意の発明の範囲または特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、特定の発明の特定の実施形態の具体的な特徴の記載として解釈されるべきである。本特許文献中に別個の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて実施することも可能である。逆に、単一の実施形態の文脈において記載される多様な特徴を複数の実施形態において別個にまたは任意の適切なさらなる組み合わせで実施することも可能である。さらに、上記特徴は、特定の組み合わせさらには冒頭の特許請求の範囲で機能するものとして記載したが、特許請求の範囲の組み合わせの１つ以上の特徴を場合によっては当該組み合わせから削除してもよく、特許請求の範囲の組み合わせは、さらなる組み合わせまたはさらなる組み合わせの変形例に関連し得る。
【０１２８】
同様に、図面中において動作を特定の順序で示しているが、所望の結果を達成するために、このような動作を記載の特定の順序または逐次的な順序で行うことが必要であると解釈されるべきではなく、また、例示の動作の全てを行う必要があると解釈されるべきでもない。さらに、本特許文献中に記載の実施形態における多様なシステム要素の分離は、全実施形態において必要であると解釈されるべきではない。
わずか数個の態様および例を記載しており、他の態様、向上例および変更例は、本特許文献中の記載および例示に基づいて行うことができる。
【図１Ａ】
2014533523.tif 000012
【図１Ｂ】
2014533523.tif 000013
【図１Ｃ】
2014533523.tif 000014
【図１Ｄ】
2014533523.tif 000015
【図１Ｅ−１Ｆ】
2014533523.tif 000016
【図１Ｇ−１Ｉ】
2014533523.tif 000017
【図１Ｊ】
2014533523.tif 000018
【図１Ｋ】
2014533523.tif 000019
【図１Ｌ】
2014533523.tif 000020
【図２Ａ】
2014533523.tif 000021
【図２Ｂ】
2014533523.tif 000022
【図２Ｃ】
2014533523.tif 000023
【図３Ａ−３Ｃ】
2014533523.tif 000024
【図４Ａ−４Ｂ】
2014533523.tif 000025
【図５Ａ−５Ｂ】
2014533523.tif 000026
【図５Ｃ】
2014533523.tif 000027
【図５Ｄ】
2014533523.tif 000028
【図６Ａ−６Ｂ】
2014533523.tif 000029
【図７】
2014533523.tif 000030
【図８Ａ】
2014533523.tif 000031
【図８Ｂ】
2014533523.tif 000032
【図９】
2014533523.tif 000033
【図１０】
2014533523.tif 000034
【図１１Ａ】
2014533523.tif 000035
【図１１Ｂ】
2014533523.tif 000036
【図１２Ａ】
2014533523.tif 000037
【図１２Ｂ】
2014533523.tif 000038
【図１３Ａ】
2014533523.tif 000039
【図１３Ｂ】
2014533523.tif 000040
【図１４】
2014533523.tif 000041
【図１５】
2014533523.tif 000042
【図１６】
2014533523.tif 000043
【図１７】
2014533523.tif 000044
【図１８Ａ−１８Ｄ】
2014533523.tif 000045
【図１９Ａ−１９Ｂ】
2014533523.tif 000046
【図２０Ａ−２０Ｂ】
2014533523.tif 000047
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
2014533523.tif 000049
【図２１Ｃ】
2014533523.tif 000050
【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
2014533523.tif 000053
【図２５】
2014533523.tif 000054
【図２６Ａ】
2014533523.tif 000055
【図２６Ｂ】
2014533523.tif 000056
【図２７Ａ】
2014533523.tif 000057
【図２７Ｂ】
2014533523.tif 000058
【図２８Ａ】
2014533523.tif 000059
【図２８Ｂ】
2014533523.tif 000060
【図２９】
2014533523.tif 000061
【図３０Ａ】
2014533523.tif 000062
【図３０Ｂ】
2014533523.tif 000063
【図３１】
2014533523.tif 000064
【図３２】
2014533523.tif 000065
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月11日(2014.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2014533523.tif 000068
【図１Ｄ】
2014533523.tif 000069
【図１Ｅ−１Ｆ】
2014533523.tif 000070
【図１Ｇ−１Ｉ】
2014533523.tif 000071
【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図２Ａ】
2014533523.tif 000075
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2014533523.tif 000077
【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
2014533523.tif 000079
【図５Ａ−５Ｂ】
2014533523.tif 000080
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
2014533523.tif 000083
【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2014533523.tif 000088
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2014533523.tif 000098
【図１８Ａ−１８Ｄ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２０Ａ−２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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