(57)【要約】本発明は、一般的に、高濃度のカチオン性脂質を含んでおり、規定の油：脂質比を有するカチオン性水中油型エマルジョンに関する。該カチオン性脂質は、負に荷電した分子と相互作用し、それにより、該分子を該エマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、核酸分子などの負に荷電した分子の細胞への送達、および核酸ベースのワクチンの製剤化に有用である。本発明の水中油型エマルジョンの調製方法であって、（ａ）前記カチオン性脂質を前記油に直接溶解させ、油相を形成すること；（ｂ）該エマルジョンの水相を提供すること；および（ｃ）該油相を該水相中に均質化によって分散させることを含む、方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり；該エマルジョンが油とカチオン性脂質とを含み、
ここで：
（ｉ）油：脂質（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり；
（ｉｉ）該エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭであり；および
（ｉｉｉ）該カチオン性脂質がＤＣ−コレステロールではない、
水中油型エマルジョン。
【請求項２】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１５０ｎｍである、請求項１に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項３】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍである、請求項１または２に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項４】
前記水中油型エマルジョンが安定である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項５】
油：脂質（モル：モル）の比が約１０：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６】
前記水中油型エマルジョンが約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）の油を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項７】
前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項８】
前記粒子が、さらに界面活性剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項９】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項８に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質でない、請求項８または９に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１】
カチオン性水中油型エマルジョンが約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１２】
前記界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１３】
カチオン性水中油型エマルジョンが約０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０および約０．５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含む、請求項１２に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１４】
前記カチオン性脂質の頭部が第４級アミンを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１５】
前記カチオン性脂質が：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１６】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項１５に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１７】
前記エマルジョン中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１６に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１８】
前記エマルジョン中のＤＯＴＡＰの濃度が約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）〜約７．１６ｍＭ（５ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１６に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョンの調製方法であって、（ａ）前記カチオン性脂質を前記油に直接溶解させ、油相を形成すること；（ｂ）該エマルジョンの水相を提供すること；および（ｃ）該油相を該水相中に均質化によって分散させることを含む、方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）がさらに、前記油を約３０℃〜約６５℃の温度まで加熱することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物であって、該粒子が、２５℃で液相である油、およびカチオン性脂質を含み；ここで：
（ｉ）油：脂質（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり；
（ｉｉ）該組成物中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭであり；および
（ｉｉｉ）該カチオン性脂質がＤＣ−コレステロールではない、
組成物。
【請求項２２】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１５０ｎｍである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物のＮ／Ｐ比が少なくとも約４：１である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物のＮ／Ｐ比が約４：１〜約２０：１である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物のＮ／Ｐ比が約４：１〜約１５：１である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
油：脂質（モル：モル）の比が約１０：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記水中油型エマルジョンが約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）の油を含む、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記粒子が、さらに界面活性剤を含む、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質ではない、請求項３１または３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．００５％〜約１．２５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０および約０．２５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記カチオン性脂質の頭部が第４級アミンを含む、請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記カチオン性脂質が：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される、請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約１．２９ｍＭ（０．９ｍｇ／ｍＬ）である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物中のＤＯＴＡＰの濃度が約１．２９ｍＭ（０．９ｍｇ／ｍＬ）〜約３．５８ｍＭ（２．５ｍｇ／ｍＬ）である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＲＮＡ分子が、抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子である、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記自己複製ＲＮＡがアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物の調製方法であって：
（ｉ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョンを提供すること；
（ｉｉ）該ＲＮＡ分子を含む水性溶液を提供すること；および
（ｉｉｉ）（ｉ）の該水中油型エマルジョンと（ｉｉ）の該水性溶液とを合わせ、それにより該組成物を調製すること
を含む、調製方法。
【請求項４５】
（ｉ）の前記カチオン性水中油型エマルジョンと（ｉｉ）のＲＮＡ溶液とを約１：１（ｖ／ｖ）の比で合わせる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液が塩を含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記塩がＮａＣｌである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記水性溶液が約２０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液がバッファーである、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記バッファーがクエン酸バッファーである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記バッファーが約２ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液が非イオン性張度調整剤を含む、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記非イオン性張度調整剤が糖または糖アルコールである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記非イオン性張度調整剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、デキストロースおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記非イオン性張度調整剤がスクロースである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記水性溶液が約５６０ｍＭのスクロースを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＲＮＡ分子を含む前記水性溶液がポリマーを含む、請求項４４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記水性溶液が約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記水性溶液が約１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり、該油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在し；前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭである、水中油型エマルジョン。
【請求項６２】
前記水中油型エマルジョンが安定である、請求項６１に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６３】
前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭである、請求項６１または６２に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６４】
前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６５】
前記粒子が、さらに界面活性剤を含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６６】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項６５に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６７】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質ではない、請求項６６に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６８】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項６９】
前記界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項７０】
前記カチオン性脂質の頭部が第４級アミンを含む、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項７１】
前記カチオン性脂質が：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項７２】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項７１に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項７３】
請求項６１〜７２のいずれか１項に記載のカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項７４】
前記組成物のＮ／Ｐ比が少なくとも約４：１である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物のＮ／Ｐ比が約４：１〜約２０：１である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
前記組成物のＮ／Ｐ比が約４：１〜約１５：１である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ＲＮＡ分子が、抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子である、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記自己複製ＲＮＡがアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍである、請求項７３〜７８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記組成物が緩衝化されており、約６．０〜約８．０のｐＨを有する、請求項２１〜４３および７３〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記組成物がさらに無機塩を含み、該無機塩の濃度が３０ｍＭ以下である、請求項２１〜４３および７３〜８０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記組成物がさらに非イオン性張度調整剤を含み、等張性である、請求項２１〜４３および７３〜８１に記載の組成物。
【請求項８３】
前記水中油型エマルジョンが安定である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項８４】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物であって：
（ｉ）請求項６１〜７２のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョンを提供すること；
（ｉｉ）該ＲＮＡ分子を含む水性溶液を提供すること；および
（ｉｉｉ）（ｉ）の該水中油型エマルジョンと（ｉｉ）の該水性溶液とを合わせ、それにより該組成物を調製すること
を含むプロセスを用いて調製される、組成物。
【請求項８５】
前記ＲＮＡ分子が、２つ以上の抗原をコードするポリシストロン性ＲＮＡである、請求項２１〜４３、７３〜８２および８４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ポリシストロン性ＲＮＡがアルファウイルスレプリコンである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記アルファウイルスレプリコンが、第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列および第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記第１のヌクレオチド配列が第１の制御エレメントに作動可能に連結されており、該第２のヌクレオチド配列が第２の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含んでおり、該第３のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項８７または８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記第３のヌクレオチド配列が第３の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列をさらに含んでおり、該第４のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項８９または９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記第４のヌクレオチド配列が第４の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含んでおり、該第５のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項９１または９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記第５のヌクレオチド配列が第５の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
前記制御エレメントが独立して、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳおよびウイルス２Ａ部位からなる群より選択される、請求項８７〜９４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９６】
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、請求項２１〜４３、７３〜８２および８４〜９５のいずれか１項に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項９７】
単回投与で前記被験体に投与される前記カチオン性脂質の総量が約３０ｍｇ以下である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
単回投与で前記被験体に投与されるＤＯＴＡＰの総量が約２４ｍｇ以下である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
単回投与で前記被験体に投与されるＤＯＴＡＰの総量が約４ｍｇ以下である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり；該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、
ここで：
（ｉ）油：脂質（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり；
（ｉｉ）該エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭであり；
（ｉｉｉ）該油が約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）存在し；および
（ｉｖ）該カチオン性脂質がＤＣ−コレステロールではない、
水中油型エマルジョン。
【請求項１０１】
前記油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在する、請求項１００に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０２】
前記油が約１％〜約３．２％（ｗ／ｖ）存在する、請求項１００または１０１に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０３】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１５０ｎｍである、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０４】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍである、請求項１００〜１０３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０５】
前記水中油型エマルジョンが安定である、請求項１００〜１０４のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０６】
油：脂質（モル：モル）の比が約４：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である、請求項１００〜１０５のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０７】
前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項１００〜１０６のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０８】
前記粒子が、さらに界面活性剤を含む、請求項１００〜１０７のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１０９】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１０８に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１０】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質ではない、請求項１０８または１０９に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１１】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．０１％〜約２．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１２】
前記界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである、請求項１０８〜１１１のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１３】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０および約０．５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含む、請求項１１２に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１４】
前記カチオン性脂質の頭部が第４級アミンを含む、請求項１００〜１１３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１５】
前記カチオン性脂質が：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される、請求項１００〜１１３のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１６】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項１１５に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１７】
前記エマルジョン中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１１６に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１８】
前記エマルジョン中のＤＯＴＡＰの濃度が約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）〜約７．１６ｍＭ（５ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１１６に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１１９】
請求項１００〜１１８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョンの調製方法であって、（ａ）前記カチオン性脂質を前記油に直接溶解させ、油相を形成すること；（ｂ）該エマルジョンの水相を提供すること；および（ｃ）該油相を該水相中に均質化によって分散させることを含む、方法。
【請求項１２０】
ステップ（ａ）がさらに、前記油を約３０℃〜約６５℃の温度まで加熱することを含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物であって、該粒子が、２５℃で液相である油、およびカチオン性脂質を含み；ここで：
（ｉ）油：脂質（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり；
（ｉｉ）該組成物中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭであり；および
（ｉｉｉ）該油が約０．１％〜約４％（ｗ／ｖ）存在し；および
（ｉｖ）該カチオン性脂質がＤＣ−コレステロールではない、
組成物。
【請求項１２２】
前記油が０．３％〜２％（ｗ／ｖ）存在する、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記油が約０．５％〜約１．６％（ｗ／ｖ）存在する、請求項１２１または１２２に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１２４】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍである、請求項１２１〜１２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１５０ｎｍである、請求項１２１〜１２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍである、請求項１２１〜１２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記組成物のＮ／Ｐ比が少なくとも約４：１である、請求項１２１〜１２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記組成物のＮ／Ｐ比が約４：１〜約２０：１である、請求項１２１〜１２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記組成物のＮ／Ｐ比が約４：１〜約１５：１である、請求項１２１〜１２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３０】
油：脂質（モル：モル）の比が約４：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である、請求項１２１〜１２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項１２１〜１３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記粒子が、さらに界面活性剤を含む、請求項１２１〜１３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１３２に記載の組成物。
【請求項１３４】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質ではない、請求項１３２または１３３に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．００５％〜約１．２５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３６】
前記界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである、請求項１３２〜１３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記カチオン性水中油型エマルジョンが約０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０および約０．２５％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５を含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記カチオン性脂質の頭部が第４級アミンを含む、請求項１２１〜１３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記カチオン性脂質が：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される、請求項１２１〜１３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４０】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項１３９に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記組成物中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約１．２９ｍＭ（０．９ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記組成物中のＤＯＴＡＰの濃度が約１．２９ｍＭ（０．９ｍｇ／ｍＬ）〜約３．５８ｍＭ（２．５ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記ＲＮＡ分子が、抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子である、請求項１２１〜１４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記自己複製ＲＮＡがアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子を含む組成物の調製方法であって：
（ｉ）  請求項１００〜１１８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョンを提供すること；
（ｉｉ）該ＲＮＡ分子を含む水性溶液を提供すること；および
（ｉｉｉ）（ｉ）の該水中油型エマルジョンと（ｉｉ）の該水性溶液とを合わせ、それにより該組成物を調製すること
を含む、方法。
【請求項１４６】
（ｉ）の前記カチオン性水中油型エマルジョンと（ｉｉ）のＲＮＡ溶液を約１：１（ｖ／ｖ）の比で合わせる、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記油が約１％〜約３．２％（ｗ／ｖ）存在する、請求項６１に記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１４８】
前記ＲＮＡ分子が、２つ以上の抗原をコードするポリシストロン性ＲＮＡである、請求項１２１〜１４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記ポリシストロン性ＲＮＡがアルファウイルスレプリコンである、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記アルファウイルスレプリコンが、第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列および第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記第１のヌクレオチド配列が第１の制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第２のヌクレオチド配列が第２の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５２】
第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含んでおり、該第３のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５０または１５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記第３のヌクレオチド配列が第３の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５２に記載の組成物。
【請求項１５４】
第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列をさらに含んでおり、該第４のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５２または１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記第４のヌクレオチド配列が第４の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５４に記載の組成物。
【請求項１５６】
第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含んでおり、該第５のヌクレオチド配列が制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５４または１５５に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記第５のヌクレオチド配列が第５の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記制御エレメントが独立して、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳおよびウイルス２Ａ部位からなる群より選択される、請求項１５０〜１５７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５９】
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、請求項１２１〜１４４のいずれか１項に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１６０】
単回投与で前記被験体に投与される前記カチオン性脂質の総量が約３０ｍｇ以下である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
単回投与で前記被験体に投与されるＤＯＴＡＰの総量が約２４ｍｇ以下である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６２】
単回投与で前記被験体に投与されるＤＯＴＡＰの総量が約４ｍｇ以下である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６３】
さらに抗酸化剤を含んでいる、請求項１〜１８、２１〜４３、６１〜８３、８５〜９５、１００〜１１８、１２１〜１４４または１４７〜１５８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョンまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年７月６日に出願された米国仮出願第６１／５０５，１０９号、２０１１年１０月１１日に出願された米国仮出願第６１／５４５，９３６号および２０１２年１月１１日に出願された米国仮出願第６１／５８５，６４１号の利益を主張し、上記各特許出願の全内容は本明細書に参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含み、当該配列表はＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳ−Ｗｅｂによって提出し、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩのコピー（２０１２年７月５日に作成）のファイル名はＰＡＴ５４６９１．ｔｘｔであり、４２４，２０３バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
核酸治療剤は、遺伝性障害から後天性状態の範囲の疾患、例えば、がん、感染性障害（ＡＩＤＳ）、心疾患、関節炎、および神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）などの処置に関して有望である。遺伝的欠損を修復するか、または外来遺伝子産物の発現を誘導するために機能遺伝子を送達することができるだけでなく、内在性遺伝子発現を阻害することによって、治療効果をもたらすために核酸を送達することもできる。遺伝子発現の阻害は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、またはリボザイムによって媒介され得る。
【０００４】
このような療法の重要なステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に核酸分子を送達することである。しかし、核酸分子、特に、ＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、いくつかの技術的なハードルに直面する。第１に、細胞性ヌクレアーゼおよび血清ヌクレアーゼのために、ｉｎ  ｖｉｖｏで注入されるＲＮＡの半減期は、わずか約７０秒である（例えば、非特許文献１を参照）。化学修飾を使用することによって、注入されるＲＮＡの安定性を増大させる努力が行われているが、化学的変化が細胞傷害作用を増大させるか、または機能を喪失もしくは低下させるいくつかの事例が存在する。一具体例では、細胞は、刻々とホスフェートがホスホロチオエートによって置換されるＲＮＡｉ二本鎖の投与に耐性ではない（非特許文献２）。したがって、治療応答を誘発するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏで十分な量であるが、宿主に対して毒性ではない核酸分子（特に、ＲＮＡ分子）を送達することができる送達システムを開発する必要がある。
【０００５】
核酸ベースのワクチンは、ワクチン接種に対する魅力的な手法である。例えば、抗原をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内（ＩＭ）免疫化は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導し、チャレンジから保護することができる。ＤＮＡワクチンは、タンパク質抗原を使用する従来のワクチン、または弱毒化病原体に勝るある特定の利点を提供する。例えば、タンパク質ワクチンと比較した場合、ＤＮＡワクチンは、そのネイティブコンホメーションにおいて適切に折り畳まれた抗原を産生させ、細胞性免疫応答を生じさせることにおいてより有効となり得る。ＤＮＡワクチンにはまた、死滅病原体または弱毒化病原体に付随するいくつかの安全性問題がない。例えば、死滅ウイルス調製物は、残留性の生存ウイルスを含有する場合があり、弱毒化ウイルスは、病原性表現型に変異または復帰する場合がある。
【０００６】
核酸ベースのワクチンの１つの限界は、非ヒト霊長類およびヒトにおいて強力な免疫応答を得るために大用量の核酸が一般に必要とされることである。したがって、核酸ベースのワクチンの効力を増強させるための送達システムおよびアジュバントが必要とされる。細胞内に核酸分子を導入するための様々な方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン（ｐｏｌｙｐｒｅｎｅ）トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびリポフェクションなどが開発されている。
【０００７】
カチオン性脂質は、細胞内に遺伝子を送達するために、リポソームとして製剤化されている。さらに、細胞内にＤＮＡ分子を送達するためのカチオン性脂質エマルジョンが開発されている。例えば、非特許文献３を参照。
【０００８】
非特許文献４は、ＤＮＡの送達システム／アジュバントとしてカチオン性サブミクロンエマルジョンを伴う手法を記載している。サブミクロンエマルジョン手法は、大規模に製造され、商業的に認可された製品Ｆｌｕａｄ（登録商標）の一成分である強力な水中スクアレンアジュバントであるＭＦ５９に基づく。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）が、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を促進するのに使用された。
【０００９】
非特許文献５には、ダイズ油およびカチオン性脂質としてＤＯＴＡＰが使用されたカチオン性水中油型エマルジョンが開示されている。また、一部のエマルジョンにはコレステロール、ＤＯＰＥおよび高分子脂質も含まれた。このエマルジョンは、最大９０％までの血清の存在下でＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションの効率を増強させることが示された。エマルジョン粒子の平均サイズは１８１ｎｍ〜３４４ｎｍの範囲であり、エマルジョンをＰＢＳバッファー中で希釈すると粒子サイズが増大した。
【００１０】
非特許文献６および非特許文献７には、ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクション効率を増強させるために使用された様々な水中油型エマルジョンが開示されている。試験したカチオン性脂質の中ではＤＯＴＡＰで、ＤＮＡ送達のための最も安定で効率的なエマルジョンが形成された。試験した油の中では、スクアレン、軽質鉱油およびホホバ豆油で、小粒子を有する安定なエマルジョンが形成された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションの効率は、エマルジョンの安定性と相関していることが示された（例えば、１００ｍｇ／ｍＬのスクアレンと２４ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰを配合したエマルジョンでは、高いｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率が示された）。エマルジョンは、まずカチオン性脂質を水と混合し、リポソーム懸濁液を（超音波処理によって）形成することにより調製された。次いで、リポソームを油（スクアレンなど）に添加し、混合物を超音波処理し、水中油型エマルジョンが形成された。
【００１１】
抗原またはその誘導体をコードするＲＮＡ分子も、ワクチンとして使用することができる。ＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと比較した場合、ある特定の利点を提供する。しかし、ＤＮＡベースのワクチンと比較して、ＲＮＡベースのワクチンに寄せられる関心は相対的に軽微である。ＲＮＡは、治療剤またはワクチンとして投与される場合、ヌクレアーゼによる分解に非常に感受性である。さらに、ＲＮＡは、細胞内に能動的に輸送されない。例えば、非特許文献８を参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈ．  （２００３年）２７０巻：１６２８〜４４頁
【非特許文献２】Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．  （２００３年）１３巻（２号）：８３〜１０５頁
【非特許文献３】Ｋｉｍら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、（２００５年）２９５巻、３５〜４５頁
【非特許文献４】Ｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００２年、７９巻、１〜５頁
【非特許文献５】Ｙｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）１７巻、３１４〜３２０頁
【非特許文献６】Ｋｉｍら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）１８巻、５４〜６０頁
【非特許文献７】Ｃｈｕｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００１）７１巻、３３９〜３５０頁
【非特許文献８】Ｖａｊｄｙ，  Ｍ．ら、Ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−，  ＤＮＡ−  ａｎｄ  ＲＮＡ  −ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００４年、８２巻（６号）：６１７〜２７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、核酸分子または他の負に荷電した分子の送達システムを提供する必要がある。送達システムは、核酸ベースのワクチン、特に、ＲＮＡベースのワクチンに有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、高濃度のカチオン性脂質を含んでおり、規定の油：脂質比を有するカチオン性水中油型エマルジョンに関する。油とカチオン性脂質とはエマルジョンの別々の成分であり、好ましくは、油はイオン性でない。該カチオン性脂質は、負に荷電した分子と相互作用し、それにより、該分子を該エマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、核酸分子などの負に荷電した分子（例えば、抗原をコードするＲＮＡ分子）の細胞への送達、および核酸ベースのワクチンの製剤化に有用である。
【００１５】
一態様において、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンが：（ａ）前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径であり；（ｂ）該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、ここで（ｉ）油：カチオン性脂質（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭである、（ｉｉｉ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールではないことを特徴とする水中油型エマルジョンを提供する。好ましくは、該水中油型エマルジョンは安定なものである。いくつかの実施形態では、油：脂質（モル：モル）の比が約１０：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である。該水中油型エマルジョンは約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）の油を含み得る。いくつかの実施形態では、油がスクアレンまたはスクアランである。
【００１６】
別の態様では、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンが：（ａ）前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径であり；（ｂ）該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、ここで（ｉ）油：カチオン性脂質（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭであり、（ｉｉｉ）該油が約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）存在する；（ｉｖ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールではないことを特徴とする水中油型エマルジョンを提供する。好ましくは、該水中油型エマルジョンは安定なものである。いくつかの実施形態では、油：脂質（モル：モル）の比が約４：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である。いくつかの実施形態では、油がスクアレンまたはスクアランである。いくつかの実施形態では、該油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在する。いくつかの実施形態では、該油が約１％〜約３．２％（ｗ／ｖ）存在する。
【００１７】
この態様の水中油型エマルジョンに、さらに、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を含めてもよい。好ましくは、界面活性剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質でない。界面活性剤は約０．０１％〜約２．５％（ｗ／ｖ）の量で存在させ得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤はＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート（Ｓｏｒｂｔｉａｎ  Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ））、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、該水中油型エマルジョンは、等しい量のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）とＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を含む（例えば、各々、０．５％（ｗ／ｖ））。
【００１８】
好ましくは、カチオン性脂質の頭部（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）は第４級アミンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、該エマルジョンは：（ａ）該エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径であり；（ｂ）該エマルジョンが油とＤＯＴＡＰを含み、ここで（ｉ）油：ＤＯＴＡＰ（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）または約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）〜約７．１６ｍＭ（５ｍｇ／ｍＬ）であることを特徴とする。油はスクアレンまたはスクアランであり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、該エマルジョンは：（ａ）該エマルジョン粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径であり；（ｂ）該エマルジョンが油とＤＯＴＡＰを含み、ここで（ｉ）油：ＤＯＴＡＰ（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）であり、（ｉｉｉ）該油が約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）存在することを特徴とする。いくつかの実施形態では、油がスクアレンまたはスクアランである。いくつかの実施形態では、ＤＯＴＡＰの濃度が約２．５８ｍＭ（１．８ｍｇ／ｍＬ）〜約７．１６ｍＭ（５ｍｇ／ｍＬ）。いくつかの実施形態では、該油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在する。いくつかの実施形態では、該油が約１％〜約３．２％（ｗ／ｖ）存在する。
【００２１】
また、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンの調製方法であって、該エマルジョンが：（ａ）前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径であり；（ｂ）該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、ここで（ｉ）油：カチオン性脂質（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭである、（ｉｉｉ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールではないことを特徴とし、（ａ）カチオン性脂質を油に直接溶解させ、油相を形成すること；（ｂ）エマルジョンの水相を提供すること；および（ｃ）該油相を該水相中に均質化によって分散させることを含む方法を提供する。油は、油へのカチオン性脂質の溶解を助長させるため約３０℃〜約６５℃の温度まで加熱され得る。また、油またはカチオン性脂質の顕著な分解がない限り、さらに高温を使用してもよい。
【００２２】
また、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンの調製方法であって、該エマルジョンが：（ａ）前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径であり；（ｂ）該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、ここで（ｉ）油：カチオン性脂質（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭであり、（ｉｉｉ）該油が約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）存在する；（ｉｖ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールではないことを特徴とし、（ａ）カチオン性脂質を油に直接溶解させ、油相を形成すること；（ｂ）エマルジョンの水相を提供すること；および（ｃ）該油相を該水相中に均質化によって分散させることを含む方法を提供する。油は、油へのカチオン性脂質の溶解を助長させるため約３０℃〜約６５℃の温度まで加熱され得る。また、油またはカチオン性脂質の顕著な分解がない限り、さらに高温を使用してもよい。
【００２３】
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子（好ましくは、ＲＮＡ分子）を含む組成物であって、該粒子が、２５℃で液相である油、およびカチオン性脂質を含み；（ｉ）油：脂質（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり；（ｉｉ）前記組成物中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭである；（ｉｉｉ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールでないものとする組成物を提供する。好ましくは、エマルジョン粒子の平均直径は約８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍであり、該組成物のＮ／Ｐ比は少なくとも約４：１、または約４：１〜約２０：１、または約４：１〜約１５：１である。ある特定の実施形態では、油：脂質（モル：モル）の比が約１０：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である。該水中油型エマルジョンは約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）の油を含み得る。いくつかの実施形態では、油がスクアレンまたはスクアランである。
【００２４】
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子（好ましくは、ＲＮＡ分子）を含む組成物であって、該粒子が、２５℃で液相である油、およびカチオン性脂質を含むものであり；（ｉ）油：脂質（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり；（ｉｉ）前記組成物中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭであり；（ｉｉｉ）該油が約０．１％〜約４％（ｗ／ｖ）存在する；（ｉｖ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールでない、組成物を提供する。好ましくは、エマルジョン粒子の平均直径は約８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍであり、該組成物のＮ／Ｐ比は少なくとも約４：１、または約４：１〜約２０：１、または約４：１〜約１５：１である。ある特定の実施形態では、油：脂質（モル：モル）の比が約４：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）である。いくつかの実施形態では、油がスクアレンまたはスクアランである。いくつかの実施形態では、該油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在する。いくつかの実施形態では、該油が約１％〜約３．２％（ｗ／ｖ）存在する。
【００２５】
この態様の水中油型エマルジョンに、さらに、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を含めてもよい。好ましくは、界面活性剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質でない。界面活性剤は、約０．００５％〜約１．２５％（ｗ／ｖ）の量で存在させ得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、該水中油型エマルジョンは、等しい量のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）とＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を含む（例えば、各々、０．２５％または０．５％（ｗ／ｖ））。
【００２６】
好ましくは、カチオン性脂質の頭部は第４級アミンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子（好ましくは、ＲＮＡ分子）を含む組成物であって、該粒子が２５℃で液相である油とＤＯＴＡＰとを含み；（ｉ）油：ＤＯＴＡＰ（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり；（ｉｉ）前記組成物中のＤＯＴＡＰの濃度が少なくとも約１．２９ｍＭ、または約１．２９ｍＭ（０．９ｍｇ／ｍＬ）〜約３．５８ｍＭ（２．５ｍｇ／ｍＬ）である組成物を提供する。油はスクアレンまたはスクアランであり得る。必要に応じて、Ｎ／Ｐ比は少なくとも４：１である。
【００２８】
好ましい実施形態では、該組成物は（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーで）緩衝化されており、約６．０〜約８．０、好ましくは約６．２〜約６．８のｐＨを有する。該組成物にさらに無機塩を含めてもよく、無機塩の濃度は好ましくは３０ｍＭ以下である。必要に応じて、該組成物はさらに非イオン性張度調整剤を含んでいてもよく、好ましくは等張性である。
【００２９】
また、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子（好ましくは、ＲＮＡ分子）を含む組成物の調製方法であって：（ｉ）本明細書に記載されるとおりの水中油型エマルジョンを提供すること；（ｉｉ）該ＲＮＡ分子を含む水性溶液を提供すること；および（ｉｉｉ）（ｉ）の水中油型エマルジョンと（ｉｉ）の水性溶液とを合わせ、それにより該組成物を調製することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンとＲＮＡ溶液を約１：１（ｖ／ｖ）の比で合わせる。ＲＮＡ分子を含む該水性溶液は好ましくは（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーで）緩衝化されており、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を含むことができ、該無機塩は好ましくは約２０ｍＭ以下で存在する。一実施形態において、ＲＮＡ分子を含む該水性溶液は、２ｍＭのクエン酸バッファーと２０ｍＭのＮａＣｌとを含む。必要に応じて、ＲＮＡ分子を含む該水性溶液は、さらに非イオン性張度調整剤を含み、等張性である。一実施形態において、該水性溶液はさらに約５６０ｍＭのスクロースを含む。必要に応じて、ＲＮＡ分子を含む該水性溶液はさらに、ポリマーまたは非イオン性界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）で含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含むものであり、前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり、該油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在し；前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭである、水中油型エマルジョンを提供する。好ましくは、該水中油型エマルジョンは安定なものである。いくつかの実施形態では、前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度は少なくとも約２．５ｍＭである。いくつかの実施形態では、油がスクアレンまたはスクアランである。
【００３１】
この態様の水中油型エマルジョンに、さらに、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を含めてもよい。好ましくは、界面活性剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質でない。界面活性剤は、約０．０１％〜約２．５％（ｗ／ｖ）の量で存在させ得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤がＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、該水中油型エマルジョンは、等しい量のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）とＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を含む（例えば、各々、０．２５％または０．５％（ｗ／ｖ））。
【００３２】
好ましくは、カチオン性脂質の頭部は第４級アミンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される。
【００３３】
本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した核酸分子（好ましくは、ＲＮＡ分子）を含む組成物であって、該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり、該油が０．６％〜４％（ｗ／ｖ）存在し；前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約１．２５ｍＭである、組成物を提供する。好ましくは、該水中油型エマルジョンは安定なものである。いくつかの実施形態では、前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度は少なくとも約２．５ｍＭである。いくつかの実施形態では、油はスクアレンまたはスクアランである。好ましくは、該組成物のＮ／Ｐ比は少なくとも約４：１である。
【００３４】
好ましい実施形態では、該組成物は、（例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーで）緩衝化されており、約６．０〜約８．０、好ましくは約６．２〜約６．８のｐＨを有する。該組成物にさらに無機塩を含めてもよく、無機塩の濃度は好ましくは３０ｍＭ以下である。必要に応じて、該組成物はさらに非イオン性張度調整剤を含んでいてもよく、好ましくは等張性である。
【００３５】
また、本発明は、被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、本明細書に記載されるとおりの組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、単回投与で被験体に投与される（該組成物の一成分として）カチオン性脂質の量は約３０ｍｇ以下である。特定の実施形態では、カチオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、単回投与で被験体に投与されるＤＯＴＡＰの総量が約２４ｍｇ以下または約４ｍｇ以下である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、５つのＣＭＶタンパク質をコードするペンタシストロン性ＲＮＡレプリコンＡ５２６、Ａ５２７、Ａ５５４、Ａ５５５およびＡ５５６の模式図である。サブゲノムプロモーターを矢印で示しており、他の制御エレメントは表示している。
【図２】図２は、Ａ５２７  ＲＮＡレプリコンでトランスフェクトされたＢＨＫＶ細胞が、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を発現することを示す蛍光ヒストグラムである。細胞の染色は、該五量体複合体上に存在するコンフォメーショナルエピトープに結合する抗体を用いて行なった。
【図３】図３は模式図およびグラフである。模式図は、ＣＭＶのｇＨおよびｇＬをコードするビシストロン性ＲＮＡレプリコンＡ１６０およびＡ５３１〜Ａ５３７を示す。グラフは、該レプリコンを含むＶＲＰで免疫化されたマウス由来の免疫血清の中和活性を示す。
【図４】図４は、ＶＺＶタンパク質をコードするモノシストロン性ＲＮＡレプリコンまたはＶＺＶのｇＥおよびｇＩ、またはｇＨおよびｇＬをコードするビシストロン性ＲＮＡレプリコンで免疫化されたマウス由来の免疫血清における抗ＶＺＶタンパク質抗体応答を示すグラフである。マウスは、ＣＭＦ３２を配合した７μｇのＲＮＡで免疫化した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
１．概論
本発明は、一般的に、高濃度のカチオン性脂質を含み、規定の油：カチオン性脂質比を有するカチオン性水中油型エマルジョンに関する。油とカチオン性脂質とはエマルジョンの別々の成分であり、好ましくは、油はイオン性でない。カチオン性脂質は、核酸などの負に荷電した分子と相互作用し、それにより、負に荷電した該分子を該エマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、核酸分子などの負に荷電した分子（例えば、タンパク質またはペプチド、低分子干渉ＲＮＡ、自己複製ＲＮＡなどをコードするＲＮＡ分子）の細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達、および核酸ベースのワクチンの製剤化に有用である。
【００３８】
特に、本発明は、高濃度のカチオン性脂質を含み、規定の油：カチオン性脂質比を有する安定なカチオン性水中油型エマルジョンが成功裏に作製され得るという知見に基づいている。高濃度のカチオン性脂質を含むエマルジョンは、より多くの負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）をエマルジョン粒子に配合することが可能であり、それにより送達の効率が増大する。特に、多くの治療薬、例えばワクチンでは、投与には体積が小さいこと（例えば、１用量あたり０．５ｍＬ）が好ましい。本明細書に記載されるとおりの高濃度のカチオン性脂質を含み、規定の油：カチオン性脂質比を有するエマルジョンは、指定の体積以内でより高い用量のＲＮＡの送達が可能である。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子を、該水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成させる。複合体を形成したＲＮＡ分子は安定化され、ＲＮａｓｅ媒介性分解から保護され、遊離の（「裸の」）ＲＮＡと比べて、より効率的に細胞に取り込まれる。
【００４０】
また、該ＲＮＡを送達してコードされたタンパク質の発現を誘導する場合、例えば、ＲＮＡワクチンの状況において、高濃度のカチオン性脂質を含むエマルジョンでは、エマルジョン粒子と複合体を形成したＲＮＡ分子の量を増大させることができる。より多くのＲＮＡ分子が宿主細胞に送達されると、より多量のコードされたタンパク質抗原が産生され、これにより次に、ＲＮＡワクチンの効力および免疫原性が増強される。最後に、コードされたタンパク質の免疫原性は、該エマルジョンのアジュバント効果により増強され得る。したがって、負に荷電した分子（例えば、抗原をコードするＲＮＡ分子）のより効率的な送達に加え、該カチオン性エマルジョンは、アジュバント活性によって免疫応答を増強させることもできる。例えば、本明細書において記載および例示しているように、ＲＮＡ分子（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質をコードする）を高ＤＯＴＡＰエマルジョンと複合体を形成させた製剤では、ＲＳＶのマウスモデルおよびコットンラットモデルにおいて、低ＤＯＴＡＰエマルジョンと複合体を形成したＲＮＡ分子と比べて、より高い免疫応答が生じた。
【００４１】
したがって、一態様において、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンが：（ａ）前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり；（ｂ）該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、ここで（ｉ）油：カチオン性脂質（モル：モル）の比が少なくとも約８：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭであり、（ｉｉｉ）該カチオン性脂質がＤＣ−コレステロールではないことを特徴とする水中油型エマルジョンを提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、連続水相中に分散された粒子を含む水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンが：（ａ）前記粒子の平均直径が約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり；（ｂ）該エマルジョンが油とカチオン性脂質を含み、ここで（ｉ）油：カチオン性脂質（モル：モル）の比が少なくとも約４：１（モル：モル）であり、（ｉｉ）前記エマルジョン中のカチオン性脂質の濃度が少なくとも約２．５ｍＭであり、（ｉｉｉ）該油が約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）存在する；（ｉｖ）ただし、該カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールではないことを特徴とする水中油型エマルジョンを提供する。
【００４３】
該カチオン性エマルジョンに、さらに界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＳＰＡＮ８５またはそれらの組合せ）を含めてもよい。
【００４４】
また、別の態様では、本発明は、高濃度のカチオン性脂質を含み、負に荷電した分子を送達するために使用され得る、カチオン性水中油型エマルジョンのいくつかの特定の製剤を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、（１）カチオン性脂質を油に直接溶解させ、油相を形成すること；（２）エマルジョンの水相を提供すること；および（３）該油相を（例えば、均質化によって）該水相に分散させることを含む、水中油型エマルジョンの調製方法を提供する。所望により、油は、油への脂質の溶解を助長させるため約３０℃〜約６５℃の温度まで加熱され得る。好ましくは、油相における油：カチオン性脂質（モル：モル）の比は少なくとも約８：１（モル：モル）であり、あるいは、またはさらに、前記粒子の平均直径は約８０ｎｍ〜１８０ｎｍである、および／または油相中のカチオン性脂質の濃度は少なくとも約５ｍＭである。
【００４６】
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）を含む組成物の調製方法であって、（ｉ）本明細書に記載されるとおりの水中油型エマルジョンを提供すること；（ｉｉ）該ＲＮＡ分子を含む水性溶液を提供すること；および（ｉｉｉ）（ｉｉ）の水性溶液と（ｉ）の水中油型エマルジョンを合わせ、それにより該組成物を調製することを含む方法を提供する。所望により、ＲＮＡ分子を含む該水性溶液に、塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）、非イオン性張度調整剤（例えば、スクロース、トレハロース、ソルビトールもしくはデキストロース）、ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）またはその任意の組合せを含めてもよい。
【００４７】
本発明のカチオン性エマルジョンは、核酸（例えば、ＲＮＡ）などの負に荷電した分子を送達するのに使用することができる。組成物は、それを必要とする被験体に投与することによって、免疫応答を生じさせるか、または強化することができる。組成物は、誘導される免疫応答の有効性を増強するために、別の免疫原性分子、免疫原性組成物、またはワクチンとともに共送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒ）することもできる。
【００４８】
２．定義
用語「約」は、本明細書において使用される場合、値の＋／−５％を指す。
【００４９】
本明細書において、「抗原」は、１つまたは複数のエピトープ（直鎖状、コンフォメーション、または両方のいずれか）を含有する分子を指す。
【００５０】
「バッファー」は、溶液のｐＨの変化に抵抗する水性溶液を指す。
【００５１】
本明細書において、「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））において、またはこの窒素塩基上に１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。
【００５２】
本明細書において使用される場合、エマルジョン「粒子」は、水中油型エマルジョンの水（連続）相中に懸濁された油滴を指す。該粒子はさらに、カチオン性の液体、および必要に応じてさらなる成分、例えば界面活性剤を含む。
【００５３】
用語「ポリマー」は、一緒に結合されている個々の化学物質部分（同じであっても異なっていてもよい）からなる分子を指す。本明細書において、用語「ポリマー」は、末端間で結合されて直鎖状分子を形成している個々の化学物質部分、ならびに分岐（例えば、「マルチアーム」または「星形」）構造の形態で一緒に結合された個々の化学物質部分を指す。例示的なポリマーには、例えば、ポロキサマーが含まれる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。
【００５４】
本明細書において、「サッカリド」は、直鎖形態もしくは環形態での単糖、オリゴ糖、もしくは多糖、または糖鎖を形成するこれらの組合せを包含する。オリゴ糖は、２個以上の単糖残基を有するサッカリドである。サッカリドの例には、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、スクロース、およびトレハロースが含まれる。
【００５５】
エマルジョンは、エマルジョン粒子が、４℃で少なくとも１ヶ月間、好ましくは少なくとも２ヶ月間にわたって、顕著な密集も凝集もなく離れたままである場合、「安定」である。安定なエマルジョンの平均粒子直径（数平均直径）は、エマルジョンを４℃で１ヶ月間、好ましくは２ヶ月間にわたって保存した場合に１０％より大きく変化しない。
【００５６】
用語「界面活性剤」は、専門用語であり、一般に、エネルギー的に水による溶媒和を選り好む親水性基（例えば、極性基）、および水によってあまり溶媒和にならない疎水性基の両方を有する任意の分子を指す。用語「非イオン性界面活性剤」は、当該技術分野で公知の用語であり、一般に、親水性基（例えば、極性基）が静電気的に荷電していない界面活性剤分子を指す。
【００５７】
エマルジョンの「ゼータ電位」は、エマルジョン粒子の電気泳動移動度によって決定される。単位電界での粒子の速度をその電気泳動移動度と称する。ゼータ電位はヘンリーの式：
【数１】
2014522841.tif 000002
（式中、ＵＥ＝電気泳動移動度、ｚ＝ゼータ電位、ε＝誘電率、η＝粘度およびｆ（ｋａ）＝ヘンリー関数）により電気泳動移動度と関連付けられる。ゼータ電位は、典型的には、電気泳動移動度装置、例えば、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて測定される。
【００５８】
３．カチオン性水中油型エマルジョン
本明細書に開示されるカチオン性水中油型エマルジョンは、一般に、エマルジョンを調製するのに使用される成分の濃度によって、当該技術分野で慣例的な様式で記述される。滅菌および他の下流プロセスを含めたエマルジョンを生成するプロセスの間に、少量の油（例えば、スクアレン）、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）、または他の成分が失われる場合があり、最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージングされ滅菌されたエマルジョン）中のこれらの成分の実際の濃度は、場合により、出発量よりわずかに低い場合があることが（最大約１０％、最大約２０％、最大約２５％、または最大約３５％）、当該技術分野において理解されている。
【００５９】
本発明は一般に、高濃度のカチオン性脂質および規定された油：カチオン性脂質比を含むカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョンは、ＲＮＡ分子などの負に荷電した分子を細胞に送達するのに特に適している。カチオン性脂質は、例えば、静電気力、および疎水性／親水性相互作用を通じて負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、負に荷電した分子、例えば、抗原をコードするＲＮＡ分子、または低分子干渉ＲＮＡなどを、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達するのに有用である。例えば、本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、ワクチンとして、自己複製ＲＮＡを含めた１つまたは複数の抗原をコードするＲＮＡ分子を送達することについて利点をもたらす。
【００６０】
エマルジョンの不連続（discrete）相（または分散相）は油とカチオン性脂質とを含み、ここで、該カチオン性脂質は水（連続）相への該油の分散を助長させる。以下に記載するとおりの１つ以上の必要に応じた成分（界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）など）をエマルジョン中に存在させてもよい。
【００６１】
水中油型エマルジョンの粒子は、１マイクロメートル以下の平均直径（すなわち、数平均直径）を有する。カチオン性エマルジョンの平均粒子直径は、約１８０ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下、例えば、約８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１７０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１６０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１４０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１３０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１２０ｎｍ、約８０ｎｍ〜１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜１００ｎｍであることが特に望ましい。特に好適な平均粒子直径は、約１００ｎｍまたは約１００ｎｍ〜約１３０ｎｍである。
【００６２】
エマルジョン粒子のサイズ（平均直径）は、油に対する界面活性剤の比（比を高くすると、粒子サイズが減少する）、均質化の運転圧（均質化の運転圧を上昇させると、一般的に、粒子サイズが低減する）、温度（温度を上昇させると、粒子サイズが減少する）を変化させることによって、油のタイプによって、ある特定のタイプのバッファーを水相に含めることによって、および以下に詳細に記載される他のプロセスパラメータを変化させることによって、変更することができる。いくつかの場合には、エマルジョン粒子のサイズが、本明細書中に例示するように、ＲＮＡ−エマルジョン複合体の免疫原性に影響する場合もある。
【００６３】
本明細書に記載される水中油型エマルジョン粒子は、安定である。
【００６４】
本明細書に記載されるエマルジョンの粒子は、負に荷電した分子と複合体を形成することができる。負に荷電した分子との複合体形成の前に、粒子の全正味電荷（一般的にゼータ電位として測定される）は、正（カチオン性）であるべきである。粒子の全正味電荷は、エマルジョン中のカチオン性脂質のタイプおよびカチオン性脂質の量、エマルジョン中の油の量（例えば、油の百分率が高いと、一般的に、粒子の表面上の電荷が減少する）に応じて変化する場合があり、エマルジョン中に存在する任意の追加の成分（例えば、界面活性剤（複数可））によっても影響され得る。複合体形成前の粒子のゼータ電位は、約５０ｍＶ以下、約４５ｍＶ以下、約４０ｍＶ以下、約３５ｍＶ以下、約３０ｍＶ以下、約２５ｍＶ以下、約２０ｍＶ以下；約５ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２５ｍＶ、または約１０ｍＶ〜約２０ｍＶであることが好ましい。ゼータ電位は、（ｉ）エマルジョンのｐＨ、（ｉｉ）エマルジョンの伝導率（例えば、塩分）、および（ｉｉｉ）エマルジョンの様々な成分（ポリマー、非イオン性界面活性剤など）の濃度によって影響され得る。カチオン性水中油型エマルジョンのゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して測定される。試料は、水中で１：１００に希釈され（粘度：０．８８７２ｃｐ、ＲＩ：１．３３０、誘電率：７８．５）、ポリスチレンラテックスキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）に添加される。ゼータ電位は、２分の平衡時間とともに２５℃で測定され、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデル（Ｆ（Ｋａ）値＝１．５）を使用して分析される。データは、ｍＶで報告される。
【００６５】
本発明の例示的なカチオン性エマルジョンを本明細書において「ＣＭＦ３２」と称する。ＣＭＦ３２の油はスクアレン（４．３％ｗ／ｖ）であり、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰ（３．２ｍｇ／ｍＬ）である。また、ＣＭＦ３２は界面活性剤ＳＰＡＮ８５（０．５％ｖ／ｖのソルビタントリオレエート）およびＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；０．５％ｖ／ｖ）も含む。したがって、ＣＭＦ３２のエマルジョン粒子はスクアレン、ＳＰＡＮ８５、Ｔｗｅｅｎ８０およびＤＯＴＡＰを含む。ＲＮＡ分子はＣＭＦ３２粒子と、４：１、６：１、８：１、１０：１、１２：１、および１４：１のＮ／Ｐ比で効率的に複合体を形成することが示された。他の例示的なカチオン性エマルジョンとしては、例えば、本明細書において「ＣＭＦ３４」（４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、０．５％のＳＰＡＮ８５、および４．４ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ）、「ＣＭＦ３５」（４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、０．５％のＳＰＡＮ８５、５．０ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ）と称するエマルジョン、ならびに本明細書に記載される他のエマルジョンが挙げられる。
【００６６】
本発明のある特定の例示的なカチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＡＰおよびスクアレンを、それぞれ、２．１ｍｇ／ｍｌ〜２．８４ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、２．２３ｍｇ／ｍｌ〜２．７１ｍｇ／ｍｌ）、および３０．９２ｍｇ／ｍｌ〜４１．９２ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、３２．８２ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含み、さらに等しい量のＳＰＡＮ８５およびＴｗｅｅｎ８０（例えば、各々、約０．５％）を含む。本発明の他の例示的なカチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＡＰおよびスクアレンを、それぞれ、２．７８ｍｇ／ｍｌ〜３．７６ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、２．９４ｍｇ／ｍｌ〜３．６ｍｇ／ｍｌ）、および１８．６ｍｇ／ｍｌ〜２５．１６ｍｇ／ｍｌ（好ましくは、１９．６９ｍｇ／ｍｌ〜約２４．０７ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含み、さらに等しい量のＳＰＡＮ８５およびＴｗｅｅｎ８０（例えば、各々、約０．５％）を含む。好ましくは、こえっらのエマルジョンの粒子は８０ｎｍ〜１８０ｎｍの平均直径を有する。
【００６７】
本発明の水中油型エマルジョンの個々の成分は、当該技術分野で公知であるが、このような組成物が、本明細書に記載される様式で組み合わされたことはない。したがって、個々の成分は、好適な実施形態のために一般に、および少し詳しくの両方で以下に記載されているが、当該技術分野で周知であり、本明細書で使用される用語、例えば、油、界面活性剤などは、さらなる説明なしで、十分に当業者に周知である。さらに、エマルジョンの個々の成分の量の好適な範囲が提供されているが、特定のエマルジョンの成分の実際の比は、所望のサイズおよび物理的特性のエマルジョン粒子が適切に形成されるように調整される必要がある場合がある。例えば、特定の量の油が使用される場合（例えば、５％  ｖ／ｖの油）、界面活性剤の量は、安定なエマルジョンを形成するように水相中に油粒子を分散させるのに十分なレベルであるべきである。水相中に油を分散させるのに必要とされる界面活性剤の実際の量は、エマルジョンに使用される界面活性剤のタイプおよび油のタイプに依存し、油の量も、所望の粒子サイズによって変化する場合がある（これが、２つの相の間の表面積を変化させるので）。所望のエマルジョンの成分の実際の量および相対的な比率は、当業者によって容易に決定することができる。
【００６８】
Ａ．油
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、油を含む。
【００６９】
油は好ましくは１℃以上で液相であり、かつ水に不混和性である。
【００７０】
好ましくは、油は、代謝可能な無毒性の油であり、より好ましくは、それだけに限らないが、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにこれらの対応する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物を含めた、約６〜約３０炭素原子のうちの１つである。油は、エマルジョンが投与されることになる被験体の体によって代謝され得、被験体に毒性ではない任意の植物油、魚油、動物油、または合成的に調製された油とすることができる。被験体は、動物、一般的に、哺乳動物、好ましくは、ヒトとすることができる。
【００７１】
ある特定の実施形態では、油は、２５℃で液相である。油は、２５℃で貯蔵されるとき、流体の特性を示す場合（固体および気体から区別され、明確な容積を有するが、明確な形状を有さない場合）、２５℃で液相である。しかし、エマルジョンは、任意の適切な温度で貯蔵および使用することができる。油は、４℃で液相であることが好ましい。
【００７２】
油は、任意の長鎖のアルカン、アルケン、もしくはアルキン、または遊離酸、その塩もしくはエステルとしてのこれらの酸誘導体もしくはアルコール誘導体、例えば、トリグリセリド、および１，２−プロパンジオールまたは同様のポリヒドロキシアルコールのエステルなどのモノエステル、またはジエステル、またはトリエステルなどとすることができる。アルコールは、一官能性酸または多官能性酸、例えば、酢酸、プロパン酸、クエン酸などを使用してアシル化することができる。油であり、本明細書に示される他の基準を満たす長鎖アルコールに由来するエーテルも使用することができる。
【００７３】
個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般に、約６〜約３０炭素原子を有することになる。この部分は、直鎖または分岐鎖の構造を有することができる。これは、完全に飽和していても、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有していてもよい。モノエステルもしくはポリエステル、またはモノエーテルもしくはポリエーテルに基づく油が使用される場合、約６〜約３０炭素の制限は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用し、合計炭素数に適用しない。
【００７４】
動物、魚、または植物の供給源からの任意の適切な油を使用することができる。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀類が含まれ、適切な油には、ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油などが含まれる。他の適切な種子油として、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類の群では、トウモロコシ油、および他の穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどの油も使用することができる。植物油を得るための技術は、十分に開発されており、周知である。これらの油および他の同様の油の組成は、例えば、メルクインデックス、および食品原料、栄養食品技術（ｓｏｕｒｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｏｎ  ｆｏｏｄｓ、ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に見出すことができる。
【００７５】
グリセロールと１，２−プロパンジオールの約６〜約１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。これらの製品は、ＰＶＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、４１６  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｂｏｏｎｇｏｎ、Ｎ．Ｊ．からＮＥＯＢＥＥＳの名称で、およびその他で市販されている。
【００７６】
動物油および動物性脂肪は、トリグリセリドとして存在し、魚または植物に由来する油より高い程度の飽和度を有するという事実のために、生理的温度で固相であることが多い。しかし、脂肪酸は、部分的または完全にトリグリセリドをけん化することによって動物性脂肪から得られ、このけん化は、遊離脂肪酸をもたらす。哺乳動物乳に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化、および他の手段の手順は、当該技術分野で周知である。
【００７７】
ほとんどの魚は、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書で使用することができる魚油のいくつかを例示する。いくつかの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般に、テルペノイドと呼ばれる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、分岐、不飽和のテルペノイドであり、本明細書で特に好適である。スクアレンの主要な供給源はサメ肝油であるが、アマランサス種子、米糠、コムギ胚芽、およびオリーブ油を含めた植物性油（ｐｌａｎｔ  ｏｉｌ）（主に植物油（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌ））も適切な供給源である。スクアレンもまた、酵母または他の適切な微生物から入手することができる。いくつかの実施形態では、スクアレンは好ましくは非動物性供給源から、例えば、オリーブ、オリーブ油または酵母から入手される。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好適である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当該技術分野で公知の方法によって得ることができる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、油は、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、スクアラン、ヒマワリ油およびコムギ胚芽油からなる群より選択される油を含む。例示的な実施形態では、油は、スクアレンまたはスクアランを含む。
【００７９】
エマルジョンの油成分は、約０．２％〜約１０％（ｖ／ｖ）の量で存在することができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．２％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約９％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約８％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約７％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約６％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約５％（ｖ／ｖ）の油、約０．３％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．４％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．５％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約２％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約３％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約４％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約５％〜約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．２％〜約１０％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約９％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約７％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約６％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約５％（ｗ／ｖ）の油、約０．２％〜約４．３％（ｗ／ｖ）の油、約０．６％〜約４％（ｗ／ｖ）の油、約０．７％〜約４％（ｗ／ｖ）の油、約０．８％〜約４％（ｗ／ｖ）の油、約０．９％〜約４％（ｗ／ｖ）の油、約１．０％〜約４％（ｗ／ｖ）の油、約０．６％〜約３．５％（ｗ／ｖ）の油、約０．６％〜約３％（ｗ／ｖ）の油、約０．５％（ｖ／ｖ）の油、約０．６％（ｖ／ｖ）の油、約０．７％（ｖ／ｖ）の油、約０．８％（ｖ／ｖ）の油、約０．９％（ｖ／ｖ）の油、約１％（ｖ／ｖ）の油、約１．５％（ｖ／ｖ）の油、約２％（ｖ／ｖ）の油、約２．５％（ｖ／ｖ）の油、約３％（ｖ／ｖ）の油、約３．５％（ｖ／ｖ）の油、約４％（ｖ／ｖ）の油、約５％（ｖ／ｖ）の油、約１０％（ｖ／ｖ）の油、約０．５％（ｗ／ｖ）の油、約１％（ｗ／ｖ）の油、約１．５％（ｗ／ｖ）の油、約２％（ｗ／ｖ）の油、約２．５％（ｗ／ｖ）の油、約３％（ｗ／ｖ）の油、約３．５％（ｗ／ｖ）の油、約４％（ｗ／ｖ）の油、約４．３％（ｗ／ｖ）の油、約５％（ｗ／ｖ）の油、約５．５％（ｗ／ｖ）の油、約６％（ｗ／ｖ）の油、約６．５％（ｗ／ｖ）の油、約７％（ｗ／ｖ）の油、約７．５％（ｗ／ｖ）の油、または約８％（ｗ／ｖ）の油を含むことができる。
【００８０】
カチオン性水中油型エマルジョンはまた、約０．２％〜約８％（ｖ／ｖ）の油、例えば、０．６％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）〜約３．２％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．１％（ｗ／ｖ）、約１．２％（ｗ／ｖ）、約１．３％（ｗ／ｖ）、約１．４％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約１．６％（ｗ／ｖ）、約１．７％（ｗ／ｖ）、約１．８％（ｗ／ｖ）、約１．９％（ｗ／ｖ）、約２．０％（ｗ／ｖ）、約２．１％（ｗ／ｖ）、約２．１５％（ｗ／ｖ）、約２．２％（ｗ／ｖ）、約２．３％（ｗ／ｖ）、約２．４％（ｗ／ｖ）、約２．５％（ｗ／ｖ）、約２．６％（ｗ／ｖ）、約２．７％（ｗ／ｖ）、約２．８％（ｗ／ｖ）、約２．９％（ｗ／ｖ）、３．０％（ｗ／ｖ）、約３．１％（ｗ／ｖ）、約３．２％（ｗ／ｖ）、約３．３％（ｗ／ｖ）、約３．４％（ｗ／ｖ）、約３．５％（ｗ／ｖ）、約３．６％（ｗ／ｖ）、約３．７％（ｗ／ｖ）、約３．８％（ｗ／ｖ）、約３．９％（ｗ／ｖ）、または約４．０％（ｗ／ｖ）の油を含むことができる。
【００８１】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約５％（ｖ／ｖ）の油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約４．３％（ｗ／ｖ）のスクアレンを含む。他の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）のスクアレン、例えば、約１％（ｗ／ｖ）〜約３．２％（ｗ／ｖ）のスクアレン、例えば、実施例において示すように、１．０８％（ｗ／ｖ）、２．１５％（ｗ／ｖ）または３．２３％（ｗ／ｖ）のスクアレンを含む。
【００８２】
上記に言及したように、上述した油の百分率は、エマルジョンを調製するのに使用される油の最初の量に基づいて決定される。最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージングされ滅菌されたエマルジョン）中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い（場合によって、最大約１０％、最大約２０％、最大約２５％または最大約３５％低い）場合があることが、当該技術分野において理解されている。
【００８３】
Ｂ．カチオン性脂質
本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、カチオン性脂質を含み、これは、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。
【００８４】
任意の適切なカチオン性脂質を使用することができる。一般に、カチオン性脂質は、生理的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。カチオン性脂質の頭部は、第３級アミンまたは好ましくは第４級アミンを含み得る。特定の適切なカチオン性脂質は、２つの飽和または不飽和の脂肪酸鎖（例えば、約１０〜約３０個の炭素原子を有する側鎖）を含む。
【００８５】
カチオン性脂質は、ｐＨ約１２で、ｐＨ約１１で、ｐＨ約１０で、ｐＨ約９で、ｐＨ約８で、ｐＨ約７で、またはｐＨ約６で、正電荷を有し得る。
【００８６】
適切なカチオン性脂質として、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトリマイド（これは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ならびに場合により少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、第１級アミン、第２級アミン、それだけに限らないが、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパンを含めた第３級アミン、他の第４級アミン塩、例えば、それだけに限らないが、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、塩化デカメトニウム、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタ−ナミニウム（ｂｅｎｚｅｎｅｍｅｔｈａ−ｎａｍｉｎｉｕｍ）クロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、臭化セチルピリジニウムおよび塩化セチルピリジニウム）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォーム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミコハク酸コリンエステル、リポポリアミン、例えば、それだけに限らないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジドデシルエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジテトラデシルエステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオ���性誘導体、例えば、それだけに限らないが、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミン、および３γ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタンカルボモイル］コレステロール）（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【００８７】
好適な実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択される。特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＣ−コレステロールではない。
【００８８】
好ましくは、エマルジョン用に選択されるカチオン性脂質は、該エマルジョン用に選択される油に可溶性である。これにより、移動相への分散前に該脂質を該油に直接溶解させることにより、エマルジョンにおいて高いカチオン性脂質濃度を得ることが可能になる。特定の脂質がその油において可溶性であるか否かを判定し、それに応じて適切な油と脂質との組合せを選ぶことは、当該技術分野の知識の範囲内である。例えば、溶解度は、脂質および油の構造に基づいて予想することができる（例えば、脂質の溶解度は、そのテールの構造によって決定され得る）。例えば、１つまたは２つの不飽和脂肪酸鎖（例えば、オレオイルテールまたはリノリルテール）を有する脂質、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡなどは、スクアレンまたはスクアランにおいて可溶性である。あるいは、溶解度は、所与の量の油中に溶解して飽和溶液を形成する脂質の量によって決定することができる。このような方法は当該技術分野で公知である。スクアレン中の例示的な飽和または不飽和の脂肪酸の溶解度は、実施例中にも提供される。好ましくは、油中の脂質の飽和濃度は、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌである。
【００８９】
好適には、負に荷電した分子と複合体化させる前のエマルジョン中のカチオン性脂質の濃度は、少なくとも約１．２５ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約１．７５ｍＭ、少なくとも約２．０ｍＭ、少なくとも約２．２５ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約２．７５ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約３．２５ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、少なくとも約３．７５ｍＭ、少なくとも約４．０ｍＭ、少なくとも約４．２５ｍＭ、少なくとも約４．５ｍＭ、少なくとも約４．７５ｍＭ、少なくとも約５．０ｍＭ、少なくとも約５．２５ｍＭ、少なくとも約５．５ｍＭ、少なくとも約５．７５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約６．２５ｍＭ、少なくとも約６．５ｍＭ、少なくとも約６．７５ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約７．２５ｍＭ、少なくとも約７．５ｍＭ、少なくとも約７．７５ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約８．２５ｍＭ、少なくとも約８．５ｍＭ、少なくとも約８．７５ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約９．２５ｍＭ、少なくとも約９．５ｍＭ、少なくとも約９．７５ｍＭまたは少なくとも約１０ｍＭである。
【００９０】
特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含み得る。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＡＰを約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約９ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ、約３．８ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約４．２ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ、約４．６ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．２ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約６．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７ｍｇ／ｍｌなどで含み得る。
【００９１】
例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【００９２】
特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＥＰＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＥＰＣを含み得る。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＥＰＣを、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約９ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ、約３．８ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約４．２ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ、約４．６ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．２ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約６．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７ｍｇ／ｍｌなどで含み得る。
【００９３】
特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＤＡＣである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＤＡＣを含み得る。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＤＡＣを約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約９ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ、約３．８ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約４．２ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ、約４．６ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．２ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約６．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７ｍｇ／ｍｌなどで含み得る。
【００９４】
特定の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含み得る。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＯＴＭＡを約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ〜約９ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ、約３．８ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約４．２ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ、約４．６ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．２ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約６．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７ｍｇ／ｍｌなどで含み得る。
【００９５】
上記に言及したように、上述した脂質の濃度は、エマルジョンを調製するのに使用される脂質の最初の量に基づいて求められる。最終生成物（例えば、投与の準備ができているパッケージングされ滅菌されたエマルジョン）中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い（場合によって、最大約１０％、最大約２０％、最大約２５％または最大約３５％低い）場合があることが、当該技術分野において理解されている。
【００９６】
Ｃ．油対脂質の比
本発明のカチオン性水中油型エマルジョンは、規定の油：脂質の比を有する。例えば、エマルジョンの油：脂質（モル：モル）の比は、少なくとも約８：１（モル：モル）、少なくとも約８．５：１（モル：モル）、少なくとも約９：１（モル：モル）、少なくとも約９．５：１（モル：モル）、少なくとも約１０：１（モル：モル）、少なくとも約１０．５：１（モル：モル）、少なくとも約１１：１（モル：モル）、少なくとも約１１．５：１（モル：モル）、少なくとも約１２：１（モル：モル）、少なくとも約１２．５：１（モル：モル）、少なくとも約１３：１（モル：モル）、少なくとも約１３．５：１（モル：モル）、少なくとも約１４：１（モル：モル）、少なくとも約１４．５：１（モル：モル）、少なくとも約１５：１（モル：モル）、少なくとも約１５．５：１（モル：モル）、少なくとも約１６：１（モル：モル）、少なくとも約１６．５：１（モル：モル）、少なくとも約１７：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約９：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約１０：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４９：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４８：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４７：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４６：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４５：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４４：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４２：１（モル：モル）、約８：１（モル：モル）〜約４１：１（モル：モル）、約９：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１０：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１１：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１２：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１３：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１４：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１５：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１６：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約１７：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）などであり得る。
【００９７】
所望の場合、エマルジョンの油：脂質（モル：モル）の比は、少なくとも約４：１（モル：モル）、少なくとも約４．２：１（モル：モル）、少なくとも約４．５：１（モル：モル）、少なくとも約５：１（モル：モル）、少なくとも約５．５：１（モル：モル）、少なくとも約６：１（モル：モル）、少なくとも約６．５：１（モル：モル）、７：１（モル：モル）、少なくとも約７．５：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約５：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約６：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約７：１（モル：モル）〜約５０：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４９：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４８：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４７：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４６：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４５：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４４：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４２：１（モル：モル）、約４：１（モル：モル）〜約４１：１（モル：モル）、約５：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約６：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）、約７：１（モル：モル）〜約４３：１（モル：モル）などであり得る。
【００９８】
場合によっては、カチオン性脂質の濃度を増大させる（それにより、エマルジョン粒子に負荷する核酸分子の量を増大させる）という要望と、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与した場合の該脂質の毒性または忍耐容性とのバランスをとる必要があり得る。例えば、高用量のＤＯＴＡＰは毒性効果を有することがあり得ることが報告されている。例えば、Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら，Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．，１１巻（８）：１１２７−３１（１９９４）参照。具体的なエマルジョンにおける脂質用量の最適な範囲は、熟練医師の知識に従って決定され得る。
【００９９】
油が分子の混合物を含む場合、該油のモル濃度は、該油の平均分子量に基づいて計算され得る。例えば、ダイズ油の平均分子量（２９２．２）は、平均脂肪酸分布（１２％の重量パーセンテージのパルミチン酸；５２％の重量パーセンテージのリノレン酸；など）および各成分の分子量に従って計算され得る。
【０１００】
Ｃ．追加の成分
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、追加の成分をさらに含むことができる。例えば、エマルジョンは、粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、または負に荷電した分子の安定性を増大させる（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防止する）ことができる成分を含むことができる。所望の場合、カチオン性水中油型エマルジョンは、抗酸化剤（例えば、シトレート、アスコルベートまたはそれらの塩）を含むことができる。
【０１０１】
界面活性剤
ある特定の実施形態では、本明細書中に記載されるとおりのカチオン性水中油型エマルジョンは、界面活性剤をさらに含む。
【０１０２】
相当な数の界面活性剤が医薬品科学において使用されている。これらには、天然に由来する材料、例えば、樹木からのゴム、植物タンパク質、アルギネートなどの糖ベースのポリマーなどが含まれる。炭素主鎖上にヒドロキシドまたは他の親水性置換基を有するある特定のオキシポリマーまたはポリマー、例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグリコールエーテルベースの一官能性化合物および多官能性化合物は、界面活性剤活性を有する。イオン性または非イオン性の界面活性剤および長鎖脂肪酸由来化合物もまた、本発明で使用することができる。
【０１０３】
適切な界面活性剤の具体例として、以下のものが挙げられる：
【０１０４】
１．高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）のナトリウム、カリウム、アンモニウム、およびアルカノール−アンモニウムの塩などの水溶性石けん、特に、ナトリウムタロウおよびカリウムタロウならびにココナツ石けん。
【０１０５】
２．その分子構造内に約８〜２２個の炭素原子を含有するアルキルラジカル、ならびにスルホン酸ラジカルおよび硫酸エステルラジカルからなる群より選択されるラジカルを有する有機硫酸反応生成物の水溶性塩によって代表され得るアニオン性合成非石けん界面活性剤。これらの例は、タロウまたはヤシ油に由来するナトリウムまたはカリウムアルキルスルフェート；ナトリウムまたはカリウムアルキルベンゼンスルホネート；ナトリウムアルキルグリセリルエーテルスルホネート；ナトリウムヤシ油脂肪酸モノグリセリドスルホネートおよびスルフェート；高級脂肪アルコール１モルとエチレンオキシド約１〜６モルとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩；１分子当たり１〜１０単位のエチレンオキシドを有し、アルキルラジカルが８〜１２個の炭素原子を含有するナトリウムまたはカリウムアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート；イセチオン酸でエステル化され、水酸化ナトリウムで中和された脂肪酸の反応生成物；メチルタウリド（ｍｅｔｈｙｌ  ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ３−スルホン化されたＣ１０〜Ｃ２４α−オレフィンのナトリウムまたはカリウム塩である。
【０１０６】
３．アルキレンオキシド基を有機疎水性化合物と縮合することによって作製される非イオン性合成界面活性剤。一般的な疎水性基には、プロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合生成物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミンの縮合生成物、８〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコール、および脂肪酸のアミドが含まれる。
【０１０７】
４．半極性特性を有する非イオン性界面活性剤、例えば、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、およびスルホキシドなど。長鎖第３級アミンオキシドの具体例には、ジメチルドデシルアミンオキシド、およびビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンが含まれる。ホスフィンオキシドの具体例は、１９６７年２月１４日に発行された米国特許第３，３０４，２６３号に見出され、これらには、ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル−（２ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドが含まれる。
【０１０８】
５．式Ｒ１−ＳＯ−Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、置換または非置換のアルキル基であり、前者は、約１０〜約２８個の炭素原子を含有し、一方、Ｒ２は、１〜３個の炭素原子を含有する）に対応するものを含めた長鎖スルホキシド。これらのスルホキシドの具体例には、ドデシルメチルスルホキシド、および３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが含まれる。
【０１０９】
６．ナトリウム３−ドデシルアミノプロピオネート、およびナトリウム３−ドデシルアミノプロパンスルホネートなどの両性合成界面活性剤。
【０１１０】
７．３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート、および３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホネートなどの双性イオン性合成界面活性剤。
【０１１１】
さらに、以下のタイプの界面活性剤のすべてを、本発明の組成物中に使用することができる：（ａ）脂肪酸、ロジン酸、およびトールオイルの石けん（すなわち、アルカリ塩）；（ｂ）アルキルアレーンスルホネート；（ｃ）分岐鎖および直鎖疎水性基の両方、ならびに１級および２級スルフェート基を有する界面活性剤を含めたアルキルスルフェート；（ｄ）疎水性基と親水性基との間に中間連結を含有するスルフェートおよびスルホネート、例えば、脂肪アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリドなど；（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖の酸エステル、特にトールオイルエステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；（ｇ）長鎖アルコールとメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。界面活性剤は、１つを超える様式で分類することができるので、この段落で示した界面活性剤のいくつかのクラスは、以前に記載した界面活性剤のクラスと重複する。
【０１１２】
生物学的状況のために具体的に設計され、その状況において一般に使用されるいくつかの界面活性剤が存在する。このような界面活性剤は、４つの基本タイプ、すなわち、アニオン性、カチオン性、双性イオン性（両性）、および非イオン性に分けられる。例示的なアニオン性界面活性剤として、例えば、ペルフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡもしくはＰＦＯ）、ペルフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、アルキル硫酸塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、または硫酸ラウリルアンモニウム、硫酸ラウレスナトリウム（ナトリウムラウリルエーテルスルフェート、ＳＬＥＳとしても公知）、アルキルベンゼンスルホネート、および脂肪酸塩が含まれる。例示的なカチオン性界面活性剤には、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化タロウアミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）が含まれる。例示的な双性イオン性（両性）界面活性剤には、例えば、ドデシルベタイン、コカミドプロピルベタイン、およびココアンホ（ｃｏｃｏ  ａｍｐｈｏ）グリシネートが含まれる。例示的な非イオン性界面活性剤として、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（ポロキサマーまたはポロキサミンと商業的に呼ばれる）、アルキル（ａａｙｌ）ポリグルコシド（例えば、オクチルグルコシドまたはデシルマルトシド）、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、およびポリソルベート、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｕｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、ドデシルジメチルアミンオキシド、およびビタミンＥトコフェロールプロピレングリコールコハク酸（ビタミンＥ  ＴＰＧＳ）が挙げられる。
【０１１３】
界面活性剤の特に有用な群は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ソルビトールを脱水して１，４−ソルビタンを得、次いでこれを、１つまたは複数の当量の脂肪酸と反応させることによって調製される。脂肪酸置換部分を、エチレンオキシドとさらに反応させることによって、第２の群の界面活性剤を得ることができる。
【０１１４】
脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤は、１，４−ソルビタンを、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または同様の長鎖脂肪酸などと反応させて、１，４−ソルビタンモノエステル、１，４−ソルビタンセスキエステル、または１，４−ソルビタントリエステルを得ることによって作製される。これらの界面活性剤の一般名称には、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｅｓｔｅａｒａｔｅ）、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、およびソルビタントリオレエートが含まれる。これらの界面活性剤は、通常、様々なモノエステル、ジエステル、およびトリエステル置換ソルビタンを区別する文字または数値が指定されて、ＳＰＡＮ（登録商標）、またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名称で市販されている。
【０１１５】
ＳＰＡＮ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤は、親水性であり、一般に、油中に可溶性または分散性である。これらはまた、ほとんどの有機溶媒中に可溶性である。水中で、これらは、一般に不溶性であるが分散性である。一般に、これらの界面活性剤は、１．８〜８．６の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）数を有することになる。このような界面活性剤は、当該技術分野で公知の手段によって容易に作製することができ、または市販されている。
【０１１６】
界面活性剤の関係した群は、ポリオキシエチレン（ｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）ソルビタンモノエステル、およびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを含む。これらの材料は、１，４−ソルビタンモノエステル（ｍｏｎｅｓｔｅｒ）またはトリエステルにエチレンオキシドを付加することによって調製される。ポリオキシエチレンを付加すると、親油性のソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤が、一般に水中で可溶性または分散性であり、有機液体中で様々な程度に可溶性である親水性界面活性剤に変換される。
【０１１７】
これらの材料は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）の商標で市販されており、水中油型エマルジョンおよび分散物の調製、または油の可溶化、および水溶性または洗浄可能な無水軟膏の作製に有用である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、関係したソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤と合わせることによって、エマルジョン安定性を促すことができる。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、一般に、９．６〜１６．７に入るＨＬＢ値を有する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、市販されている。
【０１１８】
単独で、またはＳＰＡＮ、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤とともに使用することができる非イオン性界面活性剤の第３の群は、エチレンオキシドを長鎖脂肪酸と反応させることによって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイプの最も一般に入手可能な界面活性剤は、ＭＹＲＪ（登録商標）の名称で販売されており、ステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤のように、親水性であり、水中で可溶性または分散性である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、エマルジョンを形成するのに使用するために、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤と、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）もしくはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤の混合物とブレンドすることができる。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、当該技術分野で公知の方法によって作製することができ、または市販されている。
【０１１９】
ポリオキシエチレンベースの非イオン性界面活性剤の第４の群は、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、脂肪アルコールにエチレンオキシドを付加することによって、上記のように調製される。これらの界面活性剤の商業的な名称は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて、親水性または親油性となり得る。これらの化合物の調製物は、当該技術分野から利用可能であるが、これらは、商業的供給源からも容易に入手可能である。
【０１２０】
潜在的に使用することができる他の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜ろう誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステル、または他の１２〜２２炭素原子の長鎖脂肪酸のポリオキシエチレンの酸アルコールもしくはエーテル誘導体である。
【０１２１】
多相系であることが意図された本発明のエマルジョンおよび製剤として、約７〜１６の範囲内のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオン性界面活性剤を選ぶことが好ましい。この値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤などの単一の非イオン性界面活性剤の使用を通じて得ることができ、あるいはソルビタンモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルベースの界面活性剤などとの界面活性剤のブレンド；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン由来界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル；高ＨＬＢポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤、もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸を使用することによって達成することができる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、エマルジョンは、エマルジョン安定化非イオン性界面活性剤として、単一の非イオン性界面活性剤、最も特にＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエートとして別に公知であるＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む。他の実施形態では、エマルジョンは、２つ以上の非イオン性界面活性剤、特に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤、およびＳＰＡＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０およびＳＰＡＮ（登録商標）８５を含む。
【０１２３】
水中油型エマルジョンは、約０．０１％〜約２．５％の界面活性剤（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約２％の界面活性剤、０．０１％〜約１．５％の界面活性剤、０．０１％〜約１％の界面活性剤、０．０１％〜約０．５％の界面活性剤、０．０５％〜約０．５％の界面活性剤、０．０８％〜約０．５％の界面活性剤、約０．０８％の界面活性剤、約０．１％の界面活性剤、約０．２％の界面活性剤、約０．３％の界面活性剤、約０．４％の界面活性剤、約０．５％の界面活性剤、約０．６％の界面活性剤、約０．７％の界面活性剤、約０．８％の界面活性剤、約０．９％の界面活性剤、または約１％の界面活性剤を含有することができる。
【０１２４】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、０．０５％〜約１％、０．０５％〜約０．９％、０．０５％〜約０．８％、０．０５％〜約０．７％、０．０５％〜約０．６％、０．０５％〜約０．５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｕｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））を含有することができる。
【０１２５】
例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、０．０８％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｕｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））を含有する。
【０１２６】
代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、０．０５％〜約１％、０．０５％〜約０．９％、０．０５％〜約０．８％、０．０５％〜約０．７％、０．０５％〜約０．６％、０．０５％〜約０．５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％（ｗ／ｖ）のＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）を含有することができる。
【０１２７】
水中油型エマルジョンは、本明細書に記載される界面活性剤の組合せを含有することができる。例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）とＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）の組合せを使用することができる。エマルジョンは、様々な量のＴｗｅｅｎ８０およびＳＰＡＮ８５（例えば、上記に例示したもの）または等しい量を含有することができる。例えば、水中油型エマルジョンは、（ｗ／ｖ）で、約０．０５％のＴｗｅｅｎ８０と約０．０５％のＳＰＡＮ８５、約０．１％のＴｗｅｅｎ８０と約０．１％のＳＰＡＮ８５、約０．２％のＴｗｅｅｎ８０と約０．２％のＳＰＡＮ８５、約０．３％のＴｗｅｅｎ８０と約０．３％のＳＰＡＮ８５、約０．４％のＴｗｅｅｎ８０と約０．４％のＳＰＡＮ８５、約０．５％のＴｗｅｅｎ８０と約０．５％のＳＰＡＮ８５、約０．６％のＴｗｅｅｎ８０と約０．６％のＳＰＡＮ８５、約０．７％のＴｗｅｅｎ８０と約０．７％のＳＰＡＮ８５、約０．８％のＴｗｅｅｎ８０と約０．８％のＳＰＡＮ８５、約０．９％のＴｗｅｅｎ８０と約０．９％のＳＰＡＮ８５、または約１％のＴｗｅｅｎ８０と約１．０％のＳＰＡＮ８５を含有することができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質である。他の実施形態では、エマルジョンは、ＰＥＧ−脂質を含まない。ＰＥＧ−脂質、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（ＰＥＧ−ＰＥ）もしくはいくつかの他のリン脂質（ＰＥＧ−リン脂質）とカップリングしたＰＥＧ、セラミドとコンジュゲートしたＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、またはこれらの組合せなども、界面活性剤として使用することができる（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号；米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、および同第２００６／００２５３６６を参照）。他の適切なＰＥＧ−脂質には、例えば、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）脂質、またはＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）脂質が含まれる。例示的なＰＥＧ−ＤＡＧ脂質として、例えば、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール（Ｃ１２）脂質、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４）脂質、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）脂質、またはＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（Ｃ１８）脂質が挙げられる。例示的なＰＥＧ−ＤＡＡ脂質として、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）脂質、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）脂質、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）脂質、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）脂質が挙げられる。
【０１２９】
ＰＥＧは、その分子量によって分類される。例えば、ＰＥＧ２０００は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ならびに他の会社から市販されており、これらには、例えば、以下のものが含まれる：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルコハク酸（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含めた、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートの調製に特に有用である。
【０１３０】
Ｄ．水相（連続相）
水中油型エマルジョンの水相（連続相）は水、または塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）、非イオン性張度調整剤（例えば、糖）、ポリマー、界面活性剤もしくはそれらの任意の組合せを含み得る水性溶液である。複合体を形成する前のエマルジョン（負に荷電した分子の添加前の水中油型エマルジョン）の水相は、複合体を形成した後のエマルジョン（負に荷電した分子がエマルジョン粒子と複合体を形成した水中油型エマルジョン）の水相と異なり得る。一般的に、複合体を形成する前のエマルジョンは、所望の特性（例えば、平均直径など）を有する粒子の形成を促進させる水性溶媒で調製される。複合体を形成する前のエマルジョンを、負に荷電した分子と他の所望の成分を含む水性溶液で希釈し、所望の容量オスモル濃度および張度を有する最終の水相を含む最終のカチオン性水中油型エマルジョンを作製する。水相に、抗酸化剤、例えば、シトレート、アスコルベートまたはその塩を含めてもよい。
【０１３１】
エマルジョンをインビボでの投与のために製剤化する場合、望ましくない投与後の結果（例えば、腫脹または組成物の迅速な吸収）を防止するために、最終的な溶液を、エマルジョンの張度および容量オスモル濃度が通常の生理的液体と実質的に同じとなるように調製することが好ましい。また、ある特定の事例では、エマルジョンのある特定の成分の安定性を保証するために、ｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。例えば、等張性であり、等浸透圧であるエマルジョンを調製することが望ましい場合がある。張性を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を約０．９％（ｗ／ｖ）（生理食塩水）で使用することができる。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。非イオン性張度調整剤も張性を制御するのに使用することができる。いくつかの非イオン性張度調整剤が、通常、当業者に公知である。これらは一般的に様々な分類の炭水化物である（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。アルドースとして分類される単糖、例えば、グルコース、マンノース、アラビノース、およびリボースなど、ならびにケトースとして分類されるもの、例えば、フルクトース、ソルボース、およびキシルロースなどを、本発明における非イオン性張度調整剤として使用することができる。二糖、例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースなども使用することができる。さらに、アルジトール（非環式ポリヒドロキシアルコール、糖アルコールとも呼ばれる）、例えば、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどは、本発明において有用な非イオン性張度調整剤である。非イオン性張度調整剤は、使用される作用物質に応じて、約０．１％〜約１０％または約１％〜約１０％の濃度で存在し得る。
【０１３２】
水相を、緩衝化することができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファー、コハク酸バッファーなどを、本明細書で使用することができる。水性成分のｐＨは、好ましくは、６．０〜８．０、より好ましくは、約６．２〜約６．８である。例示的な実施形態では、バッファーは、６．５のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、ＲＮａｓｅフリー水またはＤＥＰＣ処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。いくつかの場合では、バッファー中の高濃度の塩は、負に荷電した分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉する場合があり、したがって、回避される。他の場合では、バッファーにおいてある特定の量の塩を含めることができる。
【０１３３】
例示的な実施形態では、バッファーは、６．５のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸バッファーである。所望の場合、水相は、ＲＮａｓｅフリー水またはＤＥＰＣ処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。
【０１３４】
水相は、追加の成分、例えば、水相の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の負に荷電した分子を安定化させる分子なども含むことができる。水相の容量オスモル濃度は、非イオン性張度調整剤、例えば、糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど）などを使用して調整していることが好ましい。所望の場合、非イオン性ポリマーポリマー（例えば、ポリ（アルキルグリコール）、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど）、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの水相は、ポリマーもしくは界面活性剤、またはこれらの組合せを含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、商標名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーによっても公知である。ポロキサマーポリマーは、ＲＮＡ複合体形成後のＲＮＡ分子の安定性をより大きくし、ＲＮａｓｅ耐性を増大させることができる。
【０１３６】
代わりにまたはさらに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマー、または約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％〜約５％（ｗ／ｖ）でポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（（エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘ（ＯＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３））ｙ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＯＨ））などのポロキサマー）を含むことができる。
【０１３７】
例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約４％（ｗ／ｖ）、または約８％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む。
【０１３８】
これらの組成物中に使用される水性成分の量は、組成の値を１にするのに必要な量となる。すなわち、１００％にするのに十分な水性成分の量が、上記に列挙された他の成分と混合されることによって、その組成物の容積となる。
【０１３９】
４．負に荷電した分子
負に荷電した分子が送達される場合、これは、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成させることができる。負に荷電した分子は、例えば、負に荷電した分子と粒子の表面上のカチオン性脂質との間の相互作用、ならびに負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性／親水性相互作用によって、エマルジョン粒子と複合体を形成する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望まないが、負に荷電した分子は、非共有結合性イオン電荷相互作用（静電気力）を通じてカチオン性脂質と相互作用し、複合体の強度、ならびに粒子と複合体を形成することができる負に荷電した化合物の量は、粒子中のカチオン性脂質の量に関係すると考えられる。さらに、負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性／親水性相互作用も、役割を果たす場合がある。
【０１４０】
負に荷電した分子の例には、負に荷電したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、核酸分子（例えば、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、小分子（例えば、小分子免疫増強因子（ＳＭＩＰ）、ホスホネート、フルオロホスホネートなど）などが含まれる。好適な態様では、負に荷電した分子は、自己複製ＲＮＡ分子、または低分子干渉ＲＮＡを含めた、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＲＮＡなどのＲＮＡ分子である。
【０１４１】
複合体は、当該技術分野で公知の技法を使用して形成することができ、その例は、本明細書に記載されている。例えば、核酸−粒子複合体は、例えば、ボルテックスすることによって、カチオン性エマルジョンを核酸分子と混合することによって形成することができる。負に荷電した分子およびエマルジョン中のカチオン性脂質の量を調整または最適化することによって、所望の結合強度および結合能力をもたらすことができる。例えば、本明細書に記載され、例として示されているように、例示的なＲＮＡ−粒子複合体は、ＲＮＡ：カチオン性脂質の比（「Ｎ／Ｐ比」で測定した場合）を変更することによって生成された。用語Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡ上のホスフェートの量（モル）によって除された、カチオン性脂質中のプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素原子の量（モル）を指す。
【０１４２】
好適なＮ／Ｐ比は、約１：１〜約２０：１、約２：１〜約１８：１、約３：１〜１６：１、約４：１〜約１４：１、約６：１〜約１２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１または約１６：１である。あるいは、好適なＮ／Ｐ比は、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１１：１、少なくとも約１２：１、少なくとも約１３：１、少なくとも約１４：１、少なくとも約１５：１または少なくとも約１６：１である。より好適なＮ／Ｐ比は約４：１またはそれより高くである。
【０１４３】
各エマルジョンは、所望の効果（例えば、複合体を形成したＲＮＡの所望のレベルの発現）を生じさせるために、それ自体の最適または好適なＮ／Ｐ比を有することができ、これは、実験的に（例えば、ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベルの測定、またはヘパリンの存在下で複合体から放出されるＲＮＡ分子の百分率の測定など、本明細書に記載されるアッセイ、または他の当該技術分野で公知の技法を使用して）求めることができる。一般に、Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡ−粒子複合体が細胞によって取り込まれた場合に、ＲＮＡ分子の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％が、ＲＮＡ−粒子複合体から放出される値であるべきである。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡ−粒子複合体が細胞によって取り込まれる場合に、ＲＮＡ分子の少なくとも０．５％または少なくとも１％が、ＲＮＡ−粒子複合体から放出される放出を提供する値である。
【０１４４】
ＲＮＡ分子にコードされた抗原の発現レベルは、該抗原の免疫原性と必ずしも相関しなくてもよい。このような場合、免疫原性に最適なまたは好ましいＮ／Ｐ比は、例えば、特異的抗体の力価を測定することにより決定され得る。
【０１４５】
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、核酸ベースのワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン）を製剤化するのに特に適している。核酸−エマルジョン粒子複合体の形成は、核酸の宿主細胞への取り込みを促進し、核酸分子をヌクレアーゼ分解から保護する。次いで、トランスフェクション細胞は、核酸分子によってコードされる抗原を発現することができ、抗原への免疫応答を生じさせることができる。生ウイルスまたは弱毒化ウイルスのように、核酸ベースのワクチンは、ＭＨＣ−Ｉ経路およびＭＨＣ−ＩＩ経路の両方に有効に関与し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導を可能にすることができ、一方、組換えタンパク質などの可溶性形態で存在する抗原は、一般に、抗体応答のみを誘導する。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、ＲＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、抗原（ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）をコードし、カチオン性水中油型エマルジョンは、ＲＮＡベースのワクチンとして使用するのに適している。組成物は、抗原をコードする１種を超えるＲＮＡ分子、例えば、エマルジョン粒子と複合体を形成している２、３、５、または１０の異なる種のＲＮＡ分子を含有することができる。すなわち、組成物は、それぞれが異なる抗原をコードする、１つまたは複数の異なる種のＲＮＡ分子を含有することができる。代わりにまたはさらに、１つのＲＮＡ分子、例えば、異なるかまたは同一の抗原をコードするバイシストロニックまたはトリシストロニックなＲＮＡ分子は、１つを超える抗原をコードすることもできる。したがって、カチオン性水中油型エマルジョンは、一価または多価であるＲＮＡベースのワクチンとして使用するのに適している。所望の場合、ＲＮＡ分子はポリシストロン性であってもよい。
【０１４７】
ＲＮＡ分子の配列は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現について最適化または脱最適化された（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドンとすることができる。
【０１４８】
ＲＮＡ分子の配列は、例えば、ＲＮＡの発現もしくは複製の効率を増大させ、または分解に対する追加の安定性もしくは耐性をもたらすために、必要に応じて修飾することができる。例えば、ＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾することができる。ポリＡテール（例えば、約３０アデノシン残基またはそれより多くの）（配列番号２８）は、ＲＮＡの３’テールに結合することによって、ＲＮＡの半減期を増大させることができる。ＲＮＡの５’テールを、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）を有する修飾されたリボヌクレオチドまたはその誘導体でキャッピングすることができ、これは、ＲＮＡ合成の間に組み込むことができ、またはＲＮＡ転写後に酵素的に操作することができる（例えば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒するｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリル−トランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子の安定性および翻訳効率の維持に重要な役割を果たす。ＲＮＡ分子の５’キャップを、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾することができ、これは、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成をもたらし、この構造は、翻訳効率をさらに増大させることができる。
【０１４９】
所望の場合、ＲＮＡ分子は、任意の５’キャップ構造に加えて１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。哺乳動物ＲＮＡに９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見つかっている。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオシドの調製は、例えば、米国特許第４３７３０７１号、同第４４５８０６６号、同第４５００７０７号、同第４６６８７７７号、同第４９７３６７９号、同第５０４７５２４号、同第５１３２４１８号、同第５１５３３１９号、同第５２６２５３０号、同第５７００６４２号から当該技術分野で周知であり、これらの特許のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。
【０１５０】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチド中に組み込むことができ、ＲＮＡ分子中に存在し得る修飾核酸塩基として、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホンニルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾未満（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クエウオシン）；ｏＱ（エポキシクエウオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル−クエウオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエウオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン）；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−ジメチル（ｄｅｍｅｔｈｙｌ）グアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（無塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕが挙げられる。これらの修飾核酸塩基およびこれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的供給者から入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１１／００５７９９を参照。
【０１５１】
所望の場合、ＲＮＡ分子は、ホスホラミデート連結、ホスホロチオエート連結、および／またはメチルホスホネート連結を含有することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを含まず、例えば、修飾核酸塩基を含まず、ＲＮＡ分子中のヌクレオチドのすべては、例えば、７−メチルグアノシンを含むことができる必要に応じた５’キャップを例外として、従来の標準的なリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣである。他の実施形態では、ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含むことができ、最初の１、２、または３つの５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位でメチル化されている場合がある。
【０１５３】
Ａ．自己複製ＲＮＡ
いくつかの態様では、カチオン性水中油型エマルジョンは、自己複製ＲＮＡ分子を含有する。ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来し、またはこれに基づく。
【０１５４】
自己複製ＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、ウイルスの構造タンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と置換することによって生成することができる。自己複製ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、アポトーシス死を起こす前に、短期間、抗原を産生する。この死は、要求される二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ中間体の結果である可能性があり、これらはまた樹状細胞を超活性化することが示されている。したがって、自己複製ＲＮＡの増強された免疫原性は、炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）ｄｓＲＮＡの生成の結果である場合があり、これは宿主細胞のＲＮＡ−ウイルス感染を模倣する。
【０１５５】
有利には、細胞の機構が自己複製ＲＮＡ分子により使用されることによって、タンパク質または抗原などのコードされる遺伝子産物の指数関数的増加が生じ、これらは、細胞内に蓄積することができ、または細胞から分泌され得る。自己複製ＲＮＡ分子によるタンパク質または抗原の過剰発現は、ＲＮＡの複製および増幅、ならびにトランスフェクション細胞のアポトーシスを誘導する翻訳の産物による、トル様受容体（ＴＬＲ）３、７、および８、ならびに非ＴＬＲ経路（例えば、ＲＩＧ−１、ＭＤ−５）の刺激を含めた免疫賦活性アジュバント効果を活用する。
【０１５６】
自己複製ＲＮＡは、一般に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、５’−末端および３’−末端のシス活性複製配列、ならびに必要に応じて、所望のアミノ酸配列（例えば、目的の抗原）をコードする異種配列も含む。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターを、自己複製ＲＮＡ中に含めることができる。必要に応じて、異種配列（例えば、目的の抗原）を、自己複製ＲＮＡ中の他のコード領域にインフレームで融合することができ、かつ／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下とすることができる。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ウイルス様粒子内に被包されない。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができないように設計することができる。これは、例えば、自己複製ＲＮＡ中でウイルス粒子を産生するのに必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を除外することによって達成することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子がアルファウイルス、例えば、シンドビス（Ｓｉｎｅｂｉｓ）ウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などに基づく場合、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などをコードする１つまたは複数の遺伝子を除外することができる。
【０１５８】
所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を、弱毒化された、もしくは伝染性の強い感染性ウイルス粒子の産生を誘導するように、またはその後に１ラウンド感染させることができるウイルス粒子を生成するように、設計することもできる。
【０１５９】
脊椎動物細胞に送達された場合、自己複製ＲＮＡ分子は、それ自体から（またはそのアンチセンスコピーから）転写されることにより複数の娘ＲＮＡの産生をもたらすことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達された後に直接翻訳され得、そしてこの翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをもたらし、次いでこれは、送達されたＲＮＡからの転写物を生成する。したがって、送達されたＲＮＡにより、複数の娘ＲＮＡの産生がもたらされる。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに対してアンチセンスであり、これら自体が翻訳されて、遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすことができ、または転写されて、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物をもたらすことができ、これらが翻訳されて、遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらす。
【０１６０】
自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。アルファウイルスは、トガウイスル科の一連の遺伝的、構造的、および血清学的に関係した節足動物媒介性ウイルスを含む。シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含めた２６の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、アルファウイルス属に分類されている。したがって、本発明の自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼを組み込むことができる。
【０１６１】
アルファウイルスベースの「レプリコン」発現ベクターを、本発明において使用することができる。レプリコンベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えレプリコン粒子を含めたいくつかの形式で利用することができる。このようなレプリコンベクターは、例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３巻：１１８８〜１１９１頁；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０巻：５０８〜５１９頁；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２巻：９５０〜９５８頁；Ｐｏｌｏら（１９９９年）ＰＮＡＳ  ９６巻：４５９８〜４６０３頁）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：１３５６〜１３６１頁；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６巻：５６２〜５６５頁）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９巻：３８９〜４０１頁）を含むアルファウイルスから得られている。アルファウイルス由来レプリコンは一般的に、全体的な特性（例えば、構造、複製）がかなり類似しており、個々のアルファウイルスは、ユニークであるいくつかの特性（例えば、受容体結合、インターフェロン感受性、および疾患プロファイル）を示すことができる。したがって、多岐にわたるウイルス科から作製されるキメラアルファウイルスレプリコンも有用となり得る。
【０１６２】
アルファウイルスベースのレプリコンは、細胞に送達された後に翻訳されてレプリカーゼ（またはレプリカーゼ−転写酵素）をもたらし得る（＋）鎖レプリコンである。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは、自己切断して（＋）鎖で送達されたＲＮＡのゲノム（−）鎖コピーを作り出す複製複合体をもたらす。これらの（−）鎖転写物は、それ自体が転写されることによって、（＋）鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、また、所望の遺伝子産物をコードするサブゲノム転写物を与えることができる。したがって、サブゲノム転写物が翻訳されると、感染細胞によって所望の遺伝子産物がｉｎ  ｓｉｔｕで発現される。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【０１６３】
好適な自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）ポリペプチド抗原をコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼとすることができる。
【０１６４】
天然のアルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼに加えて、構造ビリオンタンパク質をコードするが、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好適である。したがって、自己複製ＲＮＡ分子は、細胞内でそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらすことができるが、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生をもたらすことはできない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己複製ＲＮＡ分子は、感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスの永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡ分子にはなく、その場所は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子（複数可）によって奪われており、その結果、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。
【０１６５】
従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有することができる。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、ポリペプチド抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、例えば、別の所望の遺伝子産物をコードする追加の（下流）オープンリーディングフレームを有することができる。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼと適合性である５’配列を有することができる。
【０１６６】
他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、より好ましくは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリチウイルス、またはコロナウイルスから、またはこれらに基づいて得られる。適切な野生型アルファウイルス配列は、周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄなどの配列受託機関から入手可能である。適切なアルファウイルスの代表的な例として、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバッソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニアウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミドルバーグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）が挙げられる。
【０１６７】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、他のタイプのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）より大きい。一般的に、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも約４ｋｂを含有する。例えば、自己複製ＲＮＡは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂ超を含有することができる。ある特定の例では、自己複製ＲＮＡは、約４ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約７ｋｂ〜約１２ｋｂ、約８ｋｂ〜約１２ｋｂ、約９ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１１ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１１ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約１１ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約１１ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１１ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１１ｋｂである。
【０１６８】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含むことができる。
【０１６９】
自己複製ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド抗原、または必要に応じて、配列のそれぞれが、アミノ酸配列として発現される場合に、その同一性を保持するように一緒に連結された（例えば、連続して連結された）２つ以上のポリペプチド抗原をコードすることができる。次いで、自己複製ＲＮＡから生成されるポリペプチドを、融合ポリペプチドとして生成し、または別個のポリペプチドまたはペプチド配列をもたらす様式で操作することができる。
【０１７０】
本発明の自己複製ＲＮＡは、様々なエピトープを含有する１つまたは複数のポリペプチド抗原をコードすることができる。エピトープは、ヘルパーＴ細胞応答、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答、またはその両方を誘発することができることが好ましい。
【０１７１】
本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子を、２つ以上のオープンリーディングフレームから複数のヌクレオチド配列を発現するように操作することができ、それによって、免疫応答の生成を増強することができるサイトカインまたは他の免疫調節剤を伴った、２つ以上の抗原などのタンパク質の共発現を可能にする。このような自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、二価ワクチンまたは多価ワクチンとして、例えば、様々な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を同時に生成することにおいて特に有用となり得る。
【０１７２】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適切な方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するためのいくつかの適切な方法が当該技術分野で公知である。例えば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、またはＲＮＡ分子中への修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にする、これらのポリメラーゼの変異体を使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）することによって調製することができる。転写反応物は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、ならびに適切なバッファー、および適切な塩などの選択されたポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有することになる。自己複製ＲＮＡ中へのヌクレオチド類似体の組込みは、例えば、このようなＲＮＡ分子の安定性を変更し、ＲＮａｓｅに対する耐性を増大させ、適切な宿主細胞内に導入した後の複製（ＲＮＡの「感染力」）を確立し、かつ／または先天性免疫応答および適応免疫応答を誘導もしくは低減するように操作することができる。
【０１７３】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子を生成するために、適切な合成法を単独で、または１つもしくは複数の他の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術もしくは組換えＲＮＡ技術）と組み合わせて、使用することができる。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成のための適切な方法は、当該技術分野で周知であり、特定の用途に適応させることができる。例示的な方法には、例えば、ＣＥＭなどの適切な保護基を使用する化学合成（Ｍａｓｕｄａら（２００７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５１巻：３〜４頁）、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９巻：２６１９〜２２頁）が含まれる。これらの化学法を、市販されている自動核酸シンセサイザーとともに実施するか、またはこれとともに使用するのに適応させることができる。追加の適切な合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０巻：５４４〜８４頁、およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １巻：１６５頁に開示されている。核酸合成は、クローニング、プロセシング、ならびに／またはポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を含めた、当該技術分野で周知であり、慣例的である適切な組換え法を使用して実施することもできる。ランダム断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計および操作するのに使用することができる公知の技法の例である。核酸およびコードされるタンパク質を変更する、例えば、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選択を変化させ、スプライスバリアントを生成し、変異を導入するためなどに、部位特異的変異誘発を使用することができる。核酸配列の転写、翻訳、および発現のための適切な方法は、当該技術分野で公知であり、慣例的である。（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．、３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８２年；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ��ｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照）。
【０１７４】
自己複製ＲＮＡ分子中の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量を、任意の適切な方法を使用して判定することができる。例えば、自己複製ＲＮＡを消化してモノホスフェートにし（例えば、ヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化することができ（例えば、ＣＩＡＰなどの適切なホスファターゼを使用して）、得られるヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（例えば、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用して、勾配（３０％のＢ（０〜５分）から１００％のＢ（５〜１３分））および１００％のＢ（１３〜４０分）、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）、バッファーＡ（２０ｍＭの酢酸−酢酸アンモニウム  ｐＨ３．５）、バッファーＢ（２０ｍＭの酢酸−酢酸アンモニウム  ｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］）を使用して溶出する）によって分析することができる。
【０１７５】
必要に応じて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が、修飾ヌクレオチドを含有しない対応する自己複製ＲＮＡ分子と比較して、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）内に導入または進入した際により低い免疫調節活性を有することになるように、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０１７６】
所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子をスクリーニングまたは分析することによって、当業者に公知である様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試験法を使用して、その治療特性および予防特性を確認することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子を含むワクチンを、目的の特定のリンパ球型、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞クローンの増殖またはエフェクター機能の誘導に対する、ワクチンの効果について試験することができる。例えば、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を単離することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球の、ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する自己標的細胞を溶解する能力。さらに、Ｔヘルパー細胞分化を、ＥＬＩＳＡにより、ＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）サイトカインならびに／もしくはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの増殖もしくは産生を測定することによって、または細胞質サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞内で直接に分析することができる。
【０１７７】
ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、目的の抗原に特異的な抗体のＢ細胞産生の誘導によって立証されるような、体液性免疫応答を誘導する能力についても試験することができる。これらのアッセイは、例えば、免疫化された個体に由来する末梢Ｂリンパ球を使用して行うことができる。このようなアッセイ法は、当業者に公知である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子を特徴付けるのに使用することができる他のアッセイでは、標的細胞による、コードされる抗原の発現の検出を伴う場合がある。例えば、ＦＡＣＳを使用することによって、細胞表面上または細胞内で抗原発現を検出することができる。ＦＡＣＳ選択の別の利点は、異なるレベルの発現について選別することができることである。場合により、より低い発現が望まれる場合がある。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の適切な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を使用するパニング、またはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。
【０１７８】
Ｂ．抗原
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、抗原をコードする核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）である。適切な抗原には、それだけに限らないが、細菌性抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原生動物（ｐｒｏｔａｚｏａｎ）抗原、植物抗原、がん抗原、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１７９】
適切な抗原には、病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、植物、または腫瘍に由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るウイルス抗原ならびに免疫原として、それだけに限らないが、オルソミクソウイルス、例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣなど；パラミクソウイルス科ウイルス、例えば、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルス、および麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ））など；ニューモウイルス、例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウスの肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管支炎ウイルスなど；パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘニパウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなど；真正痘瘡（それだけに限らないが、大痘瘡および小痘瘡を含む）などのオルソポックスウイルスを含めたポックスウイルス科；メタニューモウイルス、例えば、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）およびトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）など；麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）などの麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）；ピコルナウイルス、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス、およびアフタウイルスなど；エンテロウイルス、例えば、ポリオウイルス１型、２型、または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２型および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス１〜９型、１１〜２７型、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８〜７１など、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルスを含めたブニヤウイルス；リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス；クリミアコンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルス；トガウイルス（風疹）、例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなど；フラビウイルス、例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱（１型、２型、３型、もしくは４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポーワッサン脳炎ウイルスなど；ペスチウイルス、例えば、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ熱（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）など；ヘパドナウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなど；ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス（狂犬病ウイルス）、およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）など、カリシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルスなど、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなど；コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）など；レトロウイルス、例えば、オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなど；レオウイルス、例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなど；パルボウイルスＢ１９などのパルボウイルス；デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）；Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）；Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；ヒトヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）など；パポバウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなど、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｅｓｓ）、ならびにアレナウイルスに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗原は、魚に感染するウイルス、例えば、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚のリンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケのピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀サケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）などに対する免疫応答を誘発する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、抗原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｏｖａｌｅなどに由来する寄生虫に対する免疫応答を誘発する。したがって、本発明は、マラリア対して免疫化するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生虫、例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどのフナムシに対する免疫応答を誘発する。
【０１８２】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る細菌性抗原および免疫原として、それだけに限らないが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ（ボツリヌス中毒）、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、およびＢ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、およびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ（腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ；尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）など）、ならびに／または腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（腸チフス）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０１８３】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る真菌抗原および免疫原として、それだけに限らないが、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）、例えば、
【化２】
2014522841.tif 000003
【化３】
2014522841.tif 000004
に由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０１８４】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る原生動物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０１８５】
自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る植物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０１８６】
適切な抗原として、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（インフルエンザ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｏｒｕｓ）、ノロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス（例えば、エンテロウイルス７１）、エボラウイルス、およびウシ下痢症ウイルスなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域に由来するポリペプチドからなる群より選択されることが好ましい。本発明の他の好適な実施形態では、抗原は、細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどに由来するタンパク質またはペプチドである。
【０１８７】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るＨＩＶ抗原は、１９９０年３月９日に出願された米国出願第４９０，８５８号、公開された欧州出願第１８１１５０号（１９８６年５月１４日）、ならびに米国出願第６０／１６８，４７１号；同第０９／４７５，５１５号；同第０９／４７５，５０４号；および同第０９／６１０，３１３号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１８８】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るサイトメガロウイルス抗原は、米国特許第４，６８９，２２５号、１９８９年６月１６日に出願された米国出願第３６７，３６３号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１４３号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１８９】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得るＣ型肝炎抗原は、ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４１２５、公開された欧州出願第３１８２１６号（１９８９年５月３１日）、１９８８年１１月１８日に出願された、公開された日本国出願第１−５００５６５号、カナダ国出願第５８３，５６１号、およびＥＰＯ３８８，２３２に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。異なるセットのＨＣＶ抗原は、１９９０年３月１６日に出願された欧州特許出願第９０／３０２８６６．０号、および１９８９年１２月２１日に出願された米国出願第４５６，６３７号、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、抗原は、アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草、および草の花粉アレルゲン）；昆虫またはクモ形類のアレルゲン（吸入アレルゲン、唾液アレルゲン、および毒液アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリおよび小昆虫のアレルゲン、膜翅目（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ）毒液アレルゲン）；動物の毛アレルゲンおよびフケアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからの）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）から得られる。樹木、草、ならびにハーブに由来する重要な花粉アレルゲンは、それだけに限らないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）、およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含めたＦａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐｈａｌａｒｉｓ属、Ｓｅｃａｌｅ属、およびＳｏｒｇｈｕｍ属の草を含むＰｏａｌｅｓ目、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属のハーブを含むＡｓｔｅｒａｌｅｓ目およびＵｒｔｉｃａｌｅｓ目が起源であるものである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のイエダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ、およびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓに由来するもの、ゴキブリ、小昆虫、およびノミ、例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ、およびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓに由来するもの、ならびに哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、およびウマなどに由来するもの、ミツバチ（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含む膜翅目の分類学上の目からのものなどの刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｏｒ  ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ）が起源であるものを含めた毒液アレルゲンである。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原もしくは抗原、またはがん免疫原もしくは抗原は、自己複製ＲＮＡ分子によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原および抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、例えば、ポリペプチド腫瘍抗原または糖タンパク質腫瘍抗原である。
【０１９２】
本明細書で使用するのに適した腫瘍免疫原および抗原は、（ａ）ポリペプチド（これは、例えば、長さが８〜２０アミノ酸の範囲とすることができるが、この範囲外の長さも一般的である）、リポポリペプチド、および糖タンパク質を含めたポリペプチド含有腫瘍抗原などの多種多様な分子を包含する。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原は、例えば、（ａ）がん細胞に関連する全長分子、（ｂ）欠失、付加および／または置換された部分を有する分子を含めた、この全長分子の相同体および修飾形態、ならびに（ｃ）この全長分子の断片である。腫瘍免疫原には、例えば、ＣＤ８＋リンパ球によって認識されるクラスＩ制限抗原、またはＣＤ４＋リンパ球によって認識されるクラスＩＩ制限抗原が含まれる。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、（ａ）がん精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２など（これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）、（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部のがんに関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵がん、および結腸直腸がんに関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんに関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱がんに関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんに関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんに関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳房、結腸、肺、および卵巣のがんに関連する）、アルファ−フェトプロテイン（例えば、肝細胞がんに関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガストリン（例えば、膵がん、および胃がんに関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がん、および卵巣がんに関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんに関連する）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんに関連する）、およびがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連する）、（ｄ）共通抗原、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１、およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２など（例えば、黒色腫に関連する）、（ｅ）例えば、前立腺がんに関連する前立腺関連抗原、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２など、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）が挙げられる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含めたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、
【化４】
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（Ｍａｃ−２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。
【０１９６】
Ｃ．負に荷電した分子についての製剤
負に荷電した分子（ＲＮＡなど）は、一般に、水性溶液の形態、または水性溶液中に容易に溶解することができる形態（例えば、凍結乾燥した）で提供される。水性溶液は、水、または塩（例えば、ＮａＣｌ）、バッファー（例えば、クエン酸バッファー）、非イオン性張度調整剤（ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、サッカリド）、ポリマー、界面活性剤、もしくはこれらの組合せを含む水性溶液とすることができる。製剤がｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために意図されている場合、水性溶液は、正常な生理的条件と適合性であるｐＨを維持する生理学的に許容されるバッファーであることが好ましい。また、ある特定の場合では、製剤のある特定の成分の安定性を保証するために、ｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。
【０１９７】
例えば、等張性および／または等浸透圧である水性溶液を調製することが望ましい場合がある。高張性および低張性の溶液は、注入されたとき、組成物と生理学的な液との間でイオン濃度が異なるために、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの厄介な問題および望ましくない影響を場合により引き起こすことがある。張性を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、約０．９％（ｗ／ｖ）（生理食塩水）で使用することができる。存在する場合がある他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。例示的な実施形態では、水性溶液は、１０ｍＭのＮａＣｌ、および他の塩、または非イオン性張度調整剤を含む。本明細書に記載されるように、非イオン性張度調整剤も、張性を制御するのに使用することができる。
【０１９８】
水性溶液を、緩衝化させることができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファーなどを本明細書で使用することができる。水性溶液のｐＨは、好ましくは、６．０〜８．０、より好ましくは、約６．２〜約６．８となる。いくつかの場合では、ある特定の量の塩をバッファー中に含めることができる。他の場合では、バッファー中の塩は、負に荷電した分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉し得、したがって、回避される。
【０１９９】
水性溶液は、追加の成分、例えば、水性溶液の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の負に荷電した分子を安定化させる分子なども含むことができる。例えば、一般に炭水化物であるが、ポリマーとすることもできる非イオン性張度調整剤を使用して、重量オスモル濃度を調整することができる。（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）。適切な非イオン性張度調整剤の例には、糖（例えば、単糖、二糖または多糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース））、糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロール、還元パラチノース）、およびこれらの組合せが含まれる。必要に応じて、非イオン性ポリマー（例えば、ポリ（アルキルグリコール）、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど）、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。これらのタイプの作用物質、特に、糖および糖アルコールは、凍結乾燥されたとき、ＲＮＡ、および他の負に荷電した分子を保護することができる凍結保護物質でもある。例示的な実施形態では、バッファーは、約５６０ｎＭ〜６００ｍＭのトレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む。他の例示的な実施形態では、バッファーは、約５００ｎＭ〜６００ｍＭのトレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む。
【０２００】
いくつかの場合では、高張性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低張性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、混合物は、等張性となる。例えば、ＲＮＡを含む水性溶液を２×高張性溶液とすることができ、カチオン性エマルジョンを、１０ｍＭのクエン酸バッファーを使用して調製することができる。ＲＮＡ溶液とエマルジョンが１：１（ｖ／ｖ）の比で混合されると、組成物は等張性となる。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量（例えば、１：１（ｖ／ｖ）の混合、２：１（ｖ／ｖ）の混合、１：２（ｖ／ｖ）の混合など）に基づいて、等張性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の張性を容易に決定することができる。
【０２０１】
同様に、生理的な重量オスモル濃度を有する組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与にとって望ましい場合がある。生理的な重量オスモル濃度は、水１ｋｇ当たり約２５５ｍＯｓｍ〜水１ｋｇ当たり約３１５ｍＯｓｍである。場合により、高浸透圧性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低浸透圧性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、生理的な重量オスモル濃度が達成される。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量（例えば、１：１（ｖ／ｖ）の混合、２：１（ｖ／ｖ）の混合、１：２（ｖ／ｖ）の混合など）に基づいて、等浸透圧性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の重量オスモル濃度を容易に決定することができる。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、負に荷電した分子を含む水性溶液は、ポリマー、もしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。特に、本発明者らは、カチオン性エマルジョン粒子との複合体形成の前に、ＲＮＡ水性溶液にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ分子の安定性がより大きくなり、ＲＮＡ分子のＲＮａｓｅ耐性が増大することを観察した。ＲＮＡ水性溶液にｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を添加すると、ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体の粒子サイズが小さくなることも見出された。ポロキサマーポリマーはまた、ＲＮＡ分子の適切な脱複合体形成／放出を促進し、エマルジョン粒子の凝集を防止し、免疫調節効果を有することができる。使用することができる他のポリマーには、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、またはＰＥＧ３００が含まれる。
【０２０３】
代わりにまたはさらに、負に荷電した分子を含む水性溶液は、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、０．０５％、０．５％、１％、または５％などで、ポリマー（例えば、ポロキサマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、またはＰＥＧ３００）を含むことができる。
【０２０４】
緩衝系は、２つ以上の上述した分子（塩、バッファー、サッカリド、ポリマーなど）の任意の組合せを含むことができる。好適な実施形態では、バッファーは、５６０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのクエン酸塩を含み、これを、本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンと混合することによって、２８０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのクエン酸塩を含む最終的な水相を生成することができる。
【０２０５】
５．調製方法
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のとおりの水中油型エマルジョンを調製する方法を提供し、この方法は、（１）油およびカチオン性脂質を合わせて、エマルジョンの油相を形成するステップと、（２）水性溶液を提供して、エマルジョンの水相を形成するステップと、（３）例えば、均質化によって水相中に油相を分散させるステップとを含む。均質化は、任意の適した方法で、例えば、市販のホモジナイザー（例えば、ＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザー、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）で入手可能）を使用して達成され得る。
【０２０６】
特定の実施形態では、水中油型エマルジョンは、（１）カチオン性脂質を油中に直接溶解させて油相を形成させること；（２）エマルジョンの水相を提供すること；および（３）均質化によって水相中に油相を分散させること、によって調製される。この方法は、脂質を油に添加する前にカチオン性脂質をまず可溶化させるために有機溶媒（例えば、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２，２，２トリフルオロエタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など）を使用しない。
【０２０７】
脂質の溶解を促進するために、油を約３７℃〜約６５℃の温度に加熱することが望ましい場合がある。カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）の所望の量を測定し、所望の最終濃度に達するように、油中に直接的に添加してもよい。
【０２０８】
エマルジョンが１種または複数の界面活性剤を含む場合には、界面活性剤（複数可）は、当該技術分野における従来の慣例に従って油相に含まれる場合も、水相に含まれる場合もある。例えば、ＳＰＡＮ８５は、油相（例えば、スクアレン）に溶解させることができ、Ｔｗｅｅｎ  ８０は、水相（例えば、クエン酸バッファー）に溶解させてもよい。
【０２０９】
別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるようなカチオン性水中油型エマルジョンを提供するステップと、（ｉｉ）負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む水性溶液を提供するステップと、（ｉｉｉ）負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、（ｉ）の水中油型エマルジョンおよび（ｉｉｉ）の水性溶液を合わせるステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む組成物を調製する方法を提供する。
【０２１０】
例えば、カチオン性水中油型エマルジョンを、水性ＲＮＡ溶液と、任意の所望の相対量、例えば、約１：１（ｖ／ｖ）、約１．５：１（ｖ／ｖ）、約２：１（ｖ／ｖ）、約２．５：１（ｖ／ｖ）、約３：１（ｖ／ｖ）、約３．５：１（ｖ／ｖ）、約４：１（ｖ／ｖ）、約５：１（ｖ／ｖ）、約１０：１（ｖ／ｖ）、約１：１．５（ｖ／ｖ）、約１：２（ｖ／ｖ）、約１：２．５（ｖ／ｖ）、約１：３（ｖ／ｖ）、約１：３．５（ｖ／ｖ）、約１：４（ｖ／ｖ）、約１：１．５（ｖ／ｖ）または約１：１．１０（ｖ／ｖ）などで合わせてもよい。
【０２１１】
粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大し（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防ぎ）、負に荷電した分子（ＲＮＡ分子など）の適切な脱複合体形成／放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防ぐ、さらなる必要に応じたステップが含まれてもよい。例えば、ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）または界面活性剤を、負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む水性溶液に添加してもよい。
【０２１２】
エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比（比を増大すると、粒子のサイズが減少する）、運転圧力（運転圧力を増大すると、粒子のサイズが減少する）、温度（温度を高めると、粒子のサイズが減少する）およびその他の処理パラメータを変更することによって変えることができる。実際の粒子サイズは、使用される特定の界面活性剤、油およびカチオン性脂質によって、選択された特定の運転条件によっても変わる。エマルジョン粒子サイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造された、市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（モデルＮ４ＭＤ）などの分粒機器（ｓｉｚｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用することによって確認でき、粒子の平均直径が、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満または約１００ｎｍ未満となるまで、パラメータを上記で記載されたガイドラインを使用して変更することができる。好ましくは、粒子は、約１８０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下または約１３０ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下、約５０ｎｍ〜２００ｎｍ、約８０ｎｍ〜２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約７０〜１８０ｎｍまたは約８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１７０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１１０ｎｍまたは約８０ｎｍ〜約１００ｎｍの平均直径を有する。平均粒子サイズが約２００ｎｍ以下であるエマルジョンは、無菌濾過が可能である。
【０２１３】
カチオン性水中油型エマルジョン（複合体形成前エマルジョン）または負に荷電した分子−エマルジョン複合体を調製するための必要に応じたプロセスとして、例えば、滅菌、粒子サイズ選択（例えば、大きな粒子を除去すること）、充填、パッケージングおよび標識などが挙げられる。例えば、複合体形成前エマルジョンまたは負に荷電した分子−エマルジョン複合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために製剤化される場合には、それは滅菌され得る。例えば、製剤は、滅菌グレードフィルターを通した（例えば、０．２２ミクロンフィルターを通した）濾過によって滅菌され得る。その他の滅菌技術として、熱プロセスまたは放射線滅菌プロセスまたは滅菌組成物を製造するためにパルス光を使用することが挙げられる。
【０２１４】
本明細書に記載されたカチオン性水中油型エマルジョンを使用してワクチンを製造してもよい。ＭＦ５９について記載されたような同様の方法を使用して、滅菌および／または臨床グレードのカチオン性水中油型エマルジョンを調製できる。例えば、ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＤＪＵＶＡＮＴＳ（Ｏ’Ｈａｇａｎ編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ中の、Ｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００年、第４２巻、２１１〜２２８頁参照のこと。例えば、ＭＦ５９の製造プロセスと同様に、エマルジョンの油相および水相を合わせ、ローターステーターホモジナイザー（ｒｏｔｏｒ  ｓｔａｔｏｒ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）において、またはインラインホモジナイザーにおいて処理して、粗エマルジョンを得ることができる。次いで、粗エマルジョンをマイクロフルイダイザー中に送り、そこでさらに処理して、安定なサブミクロンエマルジョンを得ることができる。粗エマルジョンを、所望の粒子サイズが得られるまで、マイクロフルイダイザーの相互作用チャンバーに繰り返し通してもよい。次いで、バルクエマルジョンを濾過して（例えば、窒素下で０．２２μｍフィルターを通して）、大きな粒子を除去し、エマルジョンバルクを得、これを適した容器（例えば、ガラス瓶）中に充填してもよい。自己貯蔵（ｓｅｌｆ  ｓｔｏｒａｇｅ）について、水中油型エマルジョンの存在下での長期の安定性を実証したワクチン抗原については、抗原およびエマルジョンを合わせ、無菌濾過（例えば、０．２２μｍフィルターメンブランを通して）してもよい。合わせた単一バイアルワクチンを、単回用量容器中に充填してもよい。長期の安定性が実証されていないワクチン抗原については、エマルジョンを別個のバイアルとして供給することができる。このような場合には、エマルジョンバルクを濾過滅菌（例えば、０．２２μｍフィルターメンブランを通して）し、最終単回用量バイアルに充填し、パッケージングしてもよい。
【０２１５】
品質管理は、場合により、エマルジョンバルクまたは混合ワクチンの小サンプルで実施してもよく、サンプルが品質管理試験に合格する場合にのみ、バルクまたは混合ワクチンを用量にパッケージングする。
【０２１６】
６．キット、医薬組成物および投与
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）を含む医薬組成物を提供し、１種または複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる免疫原性組成物である。
【０２１７】
あるいは、本明細書において記載された組成物を使用して、負に荷電した分子を細胞に送達してもよい。例えば、種々の目的のために、例えば、遺伝子療法などのために、所望の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の産生を誘導するために、遺伝子の発現を調節するために、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達することができる。また、本明細書に記載された組成物を使用して、治療目的で、例えば、がんまたは増殖性障害、代謝疾患、心血管疾患、感染、アレルギーなどの疾患を処置するために、免疫応答を誘導するなどのために、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達してもよい。例えば、標的遺伝子の発現を阻害するために、核酸分子を細胞に送達してもよい。このような核酸分子として、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡなどが挙げられる。低分子干渉ＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ分子は、対応する標的遺伝子を特異的にサイレンシングする（遺伝子ノックダウン）ＲＮＡ干渉を引き起こし得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。一般に、アンチセンスＲＮＡは、特定のメッセンジャーＲＮＡ鎖のタンパク質翻訳を、それと結合することによって妨げることができる。アンチセンスＤＮＡを使用して、特異的な、相補的な（コーディングまたは非コーディング）ＲＮＡを標的とすることができる。したがって、本明細書に記載されたカチオン性エマルジョンは、例えば、がんの処置のために（腫瘍学標的の産生を阻害することによる）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡを送達するのに有用である。
【０２１８】
また、本発明は、負に荷電した分子（ＲＮＡなど）とカチオン性水中油型エマルジョンを別々の容器に存在させたキットを提供する。例えば、キットは、負に荷電した分子（ＲＮＡなど）を含む組成物を含む第１の容器と、カチオン性水中油型エマルジョンを含む第２の容器とを含み得る。２つの成分は、投与前、例えば、投与前の約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、約５分間以内に混合され得る。また、２つの成分を投与の約１分前または投与直前に混合してもよい。
【０２１９】
負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）は液状形態であってもよく、固形形態であってもよい（例えば、凍結乾燥された）。固形形態の場合、キットは、負に荷電した分子を再水和させるための適切な水性溶液を含む第３の容器を含んでもよい。適切な水性溶液としては、薬学的に許容されるバッファー、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、上記の水性溶液のいずれか１つが挙げられる。ある特定の実施形態では、特に、張度調整剤および／または重量オスモル濃度調整剤などのさらなる成分を負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）とともに凍結乾燥した場合、滅菌された水が再水和のための水性溶液として使用され得る。あるいは、凍結乾燥された負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）をカチオン性エマルジョンと直接混合してもよい。
【０２２０】
該組成物（例えば、ワクチン）が負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）とタンパク質免疫原などのさらなる成分とを含むものである場合、両方の成分を凍結させ、凍結乾燥し（別々に、または混合物としてのいずれかで）、投与前に再構成してカチオン性エマルジョンと混合してもよい。
【０２２１】
キットに、さらに、エンドユーザーに有用な他の物質、例えば、他の薬学的に許容される製剤化溶液、例えば、バッファー、希釈剤、フィルター、針およびシリンジまたは他の送達デバイスを含めてもよい。例えば、キットは、水またはエマルジョンを一方のチャンバーに含み、負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）を固形（例えば、凍結乾燥）形態で他方のチャンバーに備えたデュアルチャンバーシリンジを含み得る。
【０２２２】
キットは、さらに、アジュバント（アルミニウム含有アジュバントまたはＭＦ５９など）を含む別の容器を含んでもよい。一般的には、アルミニウム含有アジュバントは、負に荷電した分子とカチオン性エマルジョンとの複合体形成に干渉し得るので好ましくない。
【０２２３】
該組成物に適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、多種多様な材料、例えば、ガラスまたはプラスチックで形成され得る。容器は、無菌のアクセスポートを有するものであってもよい（例えば、容器は、静脈内液剤バッグ、または皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。また、負に荷電した分子（例えば、ＲＮＡ）を凍結乾燥し、シリンジ内で水で再構成するか、または本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンで直接再構成するかのいずれかとするデュアルチャンバーシリンジも使用され得る。
【０２２４】
また、キットに、免疫の誘導方法または感染の処置方法の書面による指示を含む添付文書を含めてもよい。添付文書は、未承認の原案添付文書であってもよく、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって承認された添付文書であってもよい。
【０２２５】
本発明はまた、上記の組成物が予め充填された送達デバイスを提供する。
【０２２６】
本明細書において提供された医薬組成物は、単独で投与しても、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。投与法として、それだけには限らないが、経口投与、直腸投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、眼部投与または耳への投与が挙げられる。
【０２２７】
本明細書に記載された組成物の治療上有効な量は、とりわけ、示された疾患、疾患の重篤度、被験体の年齢および関連のある健康状態、投与される化合物の効力、投与様式および所望の処置に応じて変わる。
【０２２８】
その他の実施形態では、本明細書に記載された医薬組成物は、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。さらなる治療薬として、それだけには限らないが、抗生物質または抗菌薬、制吐薬、抗真菌薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、サイトカイン、抗うつ剤、ホルモン、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞増殖抑制剤、抗浸潤薬（ａｎｔｉ−ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生薬、ウイルス複製の増殖因子機能阻害剤の阻害剤、ウイルス酵素阻害剤、抗がん剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、リバビリン、ホルモンおよびその他のトル様受容体モジュレーター、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＩｇ機能を調節する抗体（抗ＩｇＥ（オマリズマブ）など）が挙げられる。
【０２２９】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、性器疣贅、尋常性疣贅、足底疣贅、狂犬病、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、デングウイルス、黄熱病、単純ヘルペスウイルス（ほんの一例として、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶまたはＶＺＶ）、伝染性軟属腫、ワクシニア、痘瘡、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ライノウイルス、エンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１）、アデノウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス（ほんの一例として、ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルスおよびラッサ熱）およびフィロウイルス（ほんの一例として、エボラウイルスまたはマールブルグウイルス）などのウイルス性疾患をはじめとする、本明細書に開示された病原体によって引き起こされる疾患をはじめとする感染性疾患の処置において使用される。
【０２３０】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、マラリア、結核およびｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、ハンセン病；ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉ、クリプトスポリジウム症、ヒストプラスマ症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染、リーシュマニア症、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｈｌａｍｙｄｉａ属の細菌によって引き起こされる感染ならびにカンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症およびクリプトコッカス髄膜炎などの真菌感染症をはじめとする細菌感染症、真菌感染症および原生動物感染症の処置において使用される。
【０２３１】
特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、同種移植片拒絶、自己免疫およびアレルギー、がん、または瘢痕および皺などの損傷を受けた皮膚もしくは加齢皮膚をはじめとする、呼吸器疾患および／または障害、皮膚科障害、眼性疾患および／または障害、泌尿生殖器疾患および／または障害の処置において使用される。
【０２３２】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に開示された組成物を投与するステップを含む、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において、免疫応答を発生させるかまたは強化する方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体および／または細胞媒介性免疫を含む。本方法は、一次免疫応答を誘導するため、および／または免疫応答をブースト（ｂｏｏｓｔ）するために使用してもよい。
【０２３３】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、例えば、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を引き起こすかまたは増強することにおいて使用するための、医薬として使用してもよい。
【０２３４】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を発生させるかまたは強化するための医薬の製造において使用してもよい。
【０２３５】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトであるが、本明細書の範囲内の病原体は、広範な種にわたって問題となり得るので、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ネコまたはイヌであってもよい。ワクチンが、予防的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児または乳児）、十代の若者または成人であり；ワクチンが、治療的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。小児を対象としたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。
【０２３６】
治療的処置の有効性を調べる１つの方法は、本明細書に開示された組成物またはワクチンの投与後に病原体感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を調べる１つの方法は、抗原に対する免疫応答を全身的にモニタリングすること（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生のレベルをモニタリングすることなど）および／または粘膜的にモニタリングすること（ＩｇＡ産生のレベルをモニタリングすることなど）を含む。通常、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後およびチャレンジ後に決定されるのに対し、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後であるが、チャレンジ前に決定される。
【０２３７】
核酸分子（例えば、ＲＮＡ）がタンパク質抗原をコードする、本明細書に開示された組成物またはワクチンの免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えによってタンパク質抗原を発現させることである。タンパク質と患者サンプルとの間の陽性反応は、患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法はまた、免疫優性抗原および／またはタンパク質抗原内のエピトープを同定するために使用してもよい。
【０２３８】
組成物の有効性はまた、目的の感染症の病原体の適切な動物モデルをチャレンジすることによってｉｎ  ｖｉｖｏで決定できる。
【０２３９】
投与量は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／またはブースタースケジュールにおいて使用してよい。複数回用量スケジュールでは、種々の用量を、同一または異なる経路、例えば、非経口の一次免疫および粘膜のブースト、粘膜の一次免疫および非経口のブーストなどによって与えてもよい。複数回用量は、通常、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔で投与する。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、単回投与で被験体に投与されるカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰなど）の総量は約３０ｍｇ以下または約２４ｍｇ以下である。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、単回投与で被験体に投与されるカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰなど）の総量は４ｍｇ以下である。
【０２４２】
１種もしくは複数の抗原を含むか、または１種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、小児および成人の両方を処置するために使用できる。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。組成物を受け取るのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、＞５０歳、＞６０歳、好ましくは、＞６５歳）、若年者（例えば、＜５歳）、入院患者、医療従事者、軍職員および軍人、妊婦、慢性疾患患者または免疫不全患者である。しかし、組成物は、これらの群にのみ適しているのではなく、集団においてより全般的に使用してもよい。
【０２４３】
１種もしくは複数の抗原を含むか、または１種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、その他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同一の医療相談または医療専門家もしくは予防接種センターへの訪問の際に）、例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．インフルエンザｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（四価Ａ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に患者に投与してもよい。
【０２４４】
特定の実施形態では、本明細書において提供された組成物は、１種もしくは複数のアジュバントなどの免疫調節剤を含むか、または場合により含んでもよい。例示的アジュバントとして、それだけには限らないが、以下でさらに論じるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書において提供された免疫原性組成物において使用されるアジュバントとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
１．ミネラル含有組成物；
２．油エマルジョン；
３．サポニン製剤；
４．ビロソームおよびウイルス様粒子；
５．細菌または微生物誘導体；
６．生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）；
７．リポソーム；
８．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；
９．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；
１０．ムラミルペプチド；
１１．イミダゾキノロン化合物；
１２．チオセミカルバゾン化合物；
１３．トリプタントリン化合物；
１４．ヒト免疫調節物質；
１５．リポペプチド；
１６．ベンゾナフチリジン；
１７．微粒子
１８．免疫賦活性ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡなど；例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド）。
【実施例】
【０２４５】
例示
ここで、一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。これらは、単に本発明の特定の態様および実施形態を例示する目的で含まれるのであって、本発明を制限しようとするものではない。
【０２４６】
（実施例１）
カチオン性水中油型エマルジョンの開発
この実施例において、高濃度のカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ）を含むカチオン性ナノエマルジョン（本明細書において「ＣＮＥ」と称する）を自己複製ＲＮＡの送達のために開発した。
【０２４７】
ＣＮＥ製剤を以下の表１にまとめる。これらはＣＮＥ０１をベースにして修正したものである。ＣＮＥ０１、ＣＭＦ４０、ＣＮＥ１６、ＣＮＥ０２およびＣＮＥ１７は、比較試験での参考サンプルとして使用した。
【表１−１】
2014522841.tif 000006
【表１−２】
2014522841.tif 000007
【０２４８】
ＣＮＥは、以前に記載された（Ｏｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７９巻，１〜５頁，２００２）とおりの荷電したＭＦ５９と同様にして、１点大きな修正を行って調製した。ＤＯＴＡＰをスクアレンに直接溶解させ、有機溶媒は使用しなかった。１．６ｍｇ／ｍｌより多くのＤＯＴＡＰを含むエマルジョンに溶媒を含めると、エマルジョンを得るのにマイクロフルイダイズされ得ない泡状の供給原料が生成されることがわかった。スクアレンを３７℃まで加熱するとＤＯＴＡＰをスクアレンに直接溶解させることが可能となり、次いで、油相が（例えば、均質化によって）水相中に成功裏に分散され、エマルジョンが得られた。ＤＯＴＡＰはスクアレンに可溶性であり、表１に示したものより高濃度の、スクアレン中ＤＯＴＡＰが達成され得る。しかしながら、高用量のＤＯＴＡＰは毒性効果を有することがあり得ることが報告されている。例えば、Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１１巻（８）：１１２７−３１（１９９４）参照。
【０２４９】
簡単には、スクアレンを３７℃まで加熱し、ＤＯＴＡＰをスクアレンに直接、ＳＰＡＮ  ８５の存在下で溶解させた。次いで、得られた油相を水相（Ｔｗｅｅｎ８０含有クエン酸バッファー）と合わせ、ＩＫＡ  Ｔ２５ホモジナイザーを用いて２４Ｋ  ＲＰＭで即座に２分間均質化し、均質な供給原料（一次エマルジョン）を得た。この一次エマルジョンをＭ−１１０Ｓ  ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒまたはＭ−１１０Ｐ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に３〜５回、氷浴冷却コイルを伴っておよそ１５Ｋ〜２０Ｋ  ＰＳＩの均質化圧力で通した。２０ｍｌのバッチサンプルをユニットから取り出し、４℃で保存した。
【０２５０】
表１に示したとおりのＣＮＥの成分濃度は、エマルジョンを調製するために使用したこれらの成分の初期の量に従って計算された濃度であることに注意されたい。エマルジョンの作製プロセス中または濾過滅菌プロセス中、少量のスクアレン、ＤＯＴＡＰまたは他の成分が失われることがあり得ること、および最終製品（例えば、投与の準備ができているパッケージングされ滅菌されたエマルジョン）中のこれらの成分の実際の濃度はわずかに低い場合がある（典型的には最大約２０％まで、場合によっては最大約２５％まで、または最大約３５％まで）ことが理解される。しかしながら、当該技術分野における従来の慣例により、最終製品中の実際の濃度の代わりに、エマルジョンを調製するために使用される初期量に基づいた特定の成分の濃度が記載される。
【０２５１】
以下の表２に、スクアレンおよびＤＯＴＡＰの「理論」濃度（エマルジョンを調製するために使用したスクアレンおよびＤＯＴＡＰの初期量に従って計算される）と、最終製品において測定されたスクアレンおよびＤＯＴＡＰの実際の濃度の差を示す。
【表２】
2014522841.tif 000008
【０２５２】
（実施例２）
ＲＮＡ−粒子複合体の調製
１．ＲＮＡ合成
アルファウイルスレプリコン（自己複製ＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡの合成のための鋳型として使用した。各レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要な遺伝子エレメントを含有するが、粒子アッセンブリに必要な遺伝子産物をコードする配列を欠く。アルファウイルスゲノムの構造遺伝子を異種タンパク質（その発現が、アルファウイルスサブゲノムプロモーターによって駆動される）をコードする配列によって置換した。レプリコンが真核細胞へ送達されると、プラス鎖ＲＮＡが翻訳されて、４種の非構造タンパク質が生じ、これはゲノムＲＮＡを一緒に複製し、異種タンパク質をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現がないために、レプリコンは、感染粒子を生成できない。バクテリオファージＴ７プロモーターを、アルファウイルスｃＤＮＡの上流に配置して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでレプリコンＲＮＡの合成を促進し、ポリ（Ａ）テールのすぐ下流に位置するデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムが、その自己切断活性によって正しい３’末端を作製する。
【０２５３】
適した制限エンドヌクレアーゼを用いて、ＨＤＶリボザイムの下流でプラスミドＤＮＡを線状化した後、Ｔ７またはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでランオフ転写物を合成した。転写は、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって提供された使用説明書に従って、７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）または５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）最終濃度の各ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の存在下、３７℃で２時間実施した。転写後、鋳型ＤＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて消化した。レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。非キャッピングＲＮＡを、ユーザーマニュアルに概説されるように、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してワクシニアキャップ形成酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）（ＶＣＥ）を用いて転写後にキャッピングした。転写後キャッピングＲＮＡをＬｉＣｌを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。あるいは、レプリコンを、６ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して）または４ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに対して）のｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、非可逆性キャップ構造類似体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を転写反応物に補充すること、およびグアノシン三リン酸の濃度を１．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して）または１ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに対して）に低下させることによってキャッピングしてもよい。次いで、転写物をＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）消化と、それに続くＬｉＣＬ沈殿および７５％エタノールでの洗浄によって精製してもよい。
【０２５４】
ＲＮＡサンプルの濃度は、２６０ｎｍで光学濃度を測定することによって決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物の完全性は、全長構築物の存在について変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２５５】
２．ＲＮＡ複合体形成
Ｎ／Ｐ比という用語は、ＲＮＡのホスフェートの量と比較したカチオン性脂質中の窒素の量を指す。窒素は、試験したカチオン性脂質内の電荷を有する元素である。ホスフェートは、ＲＮＡ主鎖上に見られ得る。１０／１のＮ／Ｐ電荷比は、ＲＮＡ上の負に荷電した各ホスフェートに対して存在するカチオン性脂質由来の正に荷電した窒素が１０個であることを示す。
【０２５６】
溶液中の窒素数を、カチオン性脂質濃度から算出した。例えば、ＤＯＴＡＰは、分子あたり１個のプロトン化され得る窒素を有する。ＲＮＡ濃度を使用し、ＲＮＡ１マイクログラムあたり３ｎｍｏｌのホスフェートという推定値を使用して溶液中のホスフェート量を算出した。ＲＮＡ：脂質の量を変えることによって、Ｎ／Ｐ比を改変することができる。ＲＮＡを様々な窒素／ホスフェート比（Ｎ／Ｐ）でＣＮＥと複合体形成させた。Ｎ／Ｐ比の算出は、１ミリリットルあたりのエマルジョン中のプロトン化できる窒素のモル数を算出することによって行った。ホスフェート数を算出するために、ＲＮＡ  １マイクログラムあたり３ｎｍｏｌのホスフェートという定数を使用した。値を決定した後、ＲＮＡに適切な割合のエマルジョンを添加した。これらの値を使用して、ＲＮＡを適切な濃度に希釈し、軽くボルテックス処理しながら等容積のエマルジョン中に直接添加した。溶液をおよそ２時間室温に放置した。複合体形成後、得られた溶液を適切な濃度に希釈し、１時間以内に使用した。
【０２５７】
３．粒子サイズアッセイ
エマルジョンの粒子サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。粒子サイズは、多分散指数（ｐｄｉ）とともにＺ平均（ＺＡｖｅ）として報告した。測定の前にすべてのサンプルを水で希釈した。さらに、エマルジョンの粒子サイズは、Ｈｏｒｉｂａ  ＬＡ−９３０粒子サイズ分析計（Ｈｏｒｉｂａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して測定した。測定の前にサンプルを水で希釈した。ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用し、希釈サンプルを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。
【０２５８】
４．ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）
本発明者らは、ＲＮＡワクチンを、リポーター遺伝子または抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を達成するための伝統的なＲＮＡベクターによるアプローチと比較するために、Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ第７７巻：１０３９４〜１０４０３頁（２００３年）によって記載された方法によってＢＨＫ細胞において産生されたウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を利用した。この系では、抗原（またはリポーター遺伝子）レプリコンは、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’ＵＴＲ）およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）（Ｐｅｒｒｉ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ第７７巻：１０３９４〜１０４０３頁（２００３年）の図２参照のこと）を含有するよう遺伝子操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のゲノムに由来するアルファウイルスキメラレプリコン（ＶＣＲ）からなるものであった。これらのレプリコンを、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中に、シンドビスウイルスカプシドおよび糖タンパク質遺伝子（Ｐｅｒｒｉらの図２参照のこと）をコードする欠損ヘルパーＲＮＡとともに共エレクトロポレーションすることによってＶＲＰにパッケージングした。次いで、標準方法によってＶＲＰを収集し、力価測定し、培養液またはその他の等張性バッファー中で動物に接種した。
【０２５９】
（実施例３）
免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果
この実施例は、マウスモデルにおいて、高濃度のＤＯＴＡＰを用いて作製したカチオン性水中油型エマルジョンでは、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードするＲＮＡレプリコンの免疫原性が増大したことを示す。
【０２６０】
１．材料および方法
ヘパリン結合アッセイ
ＲＮＡを上記のようにして複合体を形成させた。ＲＮＡ／ＣＮＥ複合体を様々な濃度のヘパリン硫酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ  ＭＡ）とともに、室温で３０分間インキュベートした。次いで、得られた溶液をＡｉｒｆｕｇｅ高速遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）に１５分間入れた。遠心管をツベルクリンシリンジで穿刺し、浮上分離液を取り出した。次いで、この溶液をＲＮＡ濃度について、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用いて製造業者の指示書に従ってアッセイした。サンプルはＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ４（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）蛍光プレートリーダーで解析した。遊離ＲＮＡの値を、標準曲線を用いて計算した。
【０２６１】
２．ＲＮＡ−粒子相互作用に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果
表３は、（（ＲＮＡ−粒子相互作用の堅固さを測定した）ヘパリン結合アッセイによって測定した場合の）ＲＮＡ−粒子相互作用および免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果を示す。
【表３−１】
2014522841.tif 000009
【表３−２】
2014522841.tif 000010
【０２６２】
表３に示されるように、ＲＮＡ分子は、高濃度のＤＯＴＡＰ（１．８ｍｇ／ｍＬ以上）を用いて作製したエマルジョン粒子に強く結合した。
【０２６３】
３．ＲＮＡ負荷に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果
表４は、ＲＮＡ負荷に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果を示す。ＤＯＴＡＰの濃度を増大させると、より多量のＲＮＡ分子がＲＮＡ−粒子複合体中に配合された。
【表４】
2014522841.tif 000011
【０２６４】
４．免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果
表５は、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるＲＳＶ  Ｆ抗原の免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果を示す。
【０２６５】
ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現するｖＡ３１７レプリコンをこの試験に使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢および体重約２０ｇ，１群あたり１０匹の動物）に、両側筋肉内ワクチン接種を行なった。動物にはすべて、２つの後肢の四頭筋に各々が等価な体積（片脚に５０μＬ）を受けるように、０日目と２１日目に、ＲＳＶ−Ｆを発現する裸の自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７，１μｇ）、４０％のＤｌｉｎＤＭＡ、１０％のＤＳＰＣ、４８％のＣｈｏｌ、２％のＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を含むリポソーム中に配合した１μｇのＡ３１７（ＲＶ０１（１５））、または表示したＣＮＥ中に配合した自己複製ＲＮＡ（１μｇ  ｖＡ３１７）を注射した。各投与ごとに製剤を新たに調製した。血清を、抗体解析のために１４日目（２ｗｐ１）と３５日目（２ｗｐ２）に収集した。
【表５】
2014522841.tif 000012
【０２６６】
表５に示されるように、ＤＯＴＡＰ濃度を増大させると、より多量のＲＮＡがエマルジョン粒子に負荷され、これにより次いで宿主の免疫応答が増大した。ＣＭＦ３１では、ＣＮＥ１７と比べて抗体力価（２ｗｐ２で）の３倍の増大が観察された。このモデルでは、２．６ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＴＡＰ（ＣＭＦ３１）において免疫原性のプラトーが観察された。
【０２６７】
各マウスに投与するＲＮＡの量およびＤＯＴＡＰの量を一定に保持した場合（より高濃度のＤＯＴＡＰを有するエマルジョンでは、より少ない体積のエマルジョンを用いてＲＮＡ／エマルジョン複合体を調製し；次いで、免疫化前に、ＲＮＡ／エマルジョン製剤を、マウスに注射されるＲＮＡ／エマルジョン製剤の体積が同じになるように希釈したことを意味する）、Ｆ特異的総ＩｇＧ力価は異なるＣＮＥ製剤と同等であった（表６）。ｖＡ３１７レプリコンをすべてのＣＮＥ製剤に使用した。ＲＮＡはＡｍｂｉｏｎキットを用いて作製した。ＧＭＴデータは、各群の個々のマウス（８匹のマウス／群）の幾何平均力価を反映している。結果は、エマルジョンのＤＯＴＡＰの濃度を高くすると、必要とされる製剤の量が少なくなったことを示す。
【表６】
2014522841.tif 000013
【０２６８】
各マウスに投与するスクアレンの量およびＮ／Ｐ比（ＤＯＴＡＰ：ＲＮＡ）を一定に保持した場合、Ｆ特異的総ＩｇＧ力価は、製剤中のＲＮＡおよびＤＯＴＡＰの量を増大させるにつれて増大した（表７）。ｖＡ３１７レプリコンをすべてのＣＮＥ製剤に使用した。ＲＮＡはＡｍｂｉｏｎキットを用いて作製した。ＧＭＴデータは、各群の個々のマウス（８匹のマウス／群）の幾何平均力価を反映している。結果は、ＤＯＴＡＰ濃度を増大させると、より多量のＲＮＡがエマルジョン粒子に負荷され、これにより次いで宿主の免疫応答が増大したことを示す。
【表７】
2014522841.tif 000014
【０２６９】
ＣＭＦ３２およびＣＭＦ３４を、異なるＮ／Ｐ比を用いてさらに試験した。表８は、製剤のＦ特異的総ＩｇＧ力価を示す。理論Ｎ／Ｐ比は、製剤を調製するために使用されたＤＯＴＡＰおよびＲＮＡの初期量に従って計算されるＮ／Ｐ比を反映している。実際のＮ／Ｐ比は、エマルジョンの調製中に少量のＤＯＴＡＰが失われたため、理論Ｎ／Ｐ比よりわずかに小さかった。ｖＡ３１７をすべてのＣＮＥ製剤およびＣＭＦ製剤に使用した。ＧＭＴデータは、各群の個々のマウス（８匹のマウス／群）の平均ｌｏｇ１０力価を反映している。製剤はすべて、スクロースで３００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整した。ＣＭＦ３２製剤またはＣＭＦ３４製剤のいずれでも、明白な忍容性の問題は観察されなかった（例えば、体重、初期血清サイトカイン）。
【０２７０】
実際のＮ／Ｐ比は、ＣＮＥバッチまたはＣＭＦバッチ中のＤＯＴＡＰ含有量を、荷電エーロゾル検出器（Ｃｏｒｏｎａ  Ｕｌｔｒａ，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＨＰＬＣを用いて定量することによって決定した。ＣＮＥおよびＣＭＦのサンプルをイソプロパノール中に希釈し、ＸＴｅｒａ  Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ  ３．５ｕｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に注入した。クロマトグラムのＤＯＴＡＰピークから曲線下面積を求め、濃度をＤＯＴＡＰ標準曲線に補間した。実際のＤＯＴＡＰ濃度を使用し、実際のＮ／Ｐ比を計算した。
【表８】
2014522841.tif 000015
【０２７１】
（実施例４）
免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果
この実施例は、高濃度のＤＯＴＡＰを用いて作製したカチオン性水中油型エマルジョンでは、コットンラットモデルにおいて、ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードするＲＮＡレプリコンの免疫原性が増大したことを示す。
【０２７２】
１．材料および方法
ＲＮＡレプリコン。ＲＮＡレプリコンであるｖＡ１４２  ＲＳＶ−Ｆ−ｄｅｌＦＰ−完全長リボザイムの配列
【０２７３】
コットンラットのワクチン接種。雌コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。試験はすべて、Ｎｏｖａｒｔｉｓ動物実験委員会（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に承認されたものであり、当該委員会に従って行なった。動物群に、表示したワクチンを０日目に筋肉内（ｉ．ｍ．，１００μｌ）免疫化した。各免疫化の３週間後に血清サンプルを収集した。免疫化した、またはワクチン接種していない対照動物に、最終の免疫化の４週間後、１×１０５のＰＦＵ  ＲＳＶを鼻腔内（ｉ．ｎ．）チャレンジした。
【０２７４】
ＲＳＶ−Ｆ三量体サブユニットワクチン。ＲＳＶ  Ｆ三量体は、融合ペプチド領域が欠失した（その他の三量体との会合を防ぐ）、ＲＳＶ  Ｆの外部ドメインを含む組換えタンパク質である。得られた構築物は、同種三量体を形成することがサイズ排除クロマトグラフィーによって観察され、融合後Ｆコンホメーションと一致する予測された表現型を有することが電子顕微鏡によって観察された。タンパク質は、昆虫細胞またはＣＨＯ細胞において発現され、構築物のＣ末端と融合したＨＩＳタグ、さらに、従来の技術を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。得られたタンパク質サンプルは、９５％超の純度を示す。Ｆ−サブユニットワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために、１００μｇ／ｍＬ三量体タンパク質を、１０ｍＭヒスチジンバッファー、ｐＨ６．３を使用して２ｍｇ／ｍＬアラム（ａｌｕｍ）上に吸着させ、塩化ナトリウムを用いて等張へ調整した（１５０ｍＭに）。Ｆ−サブユニットタンパク質を、２〜８℃で穏やかに撹拌しながらアラム上に一晩吸着させた。
【０２７５】
ＲＳＶ  Ｆ特異的ＥＬＩＳＡ。個々の血清サンプルを、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によってＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの精製ＲＳＶ  Ｆ（ｄｅｌｐ２３−ｆｕｒｄｅｌ−ｔｒｕｎｃ非切断型）を用いて４℃で一晩コーティングした。洗浄（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）後、プレートを、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃で少なくとも１．５時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、実験または対照コットンラットから得た、アッセイ希釈剤（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および５％ヤギ血清を含むＰＢＳ）での血清の段階希釈物を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ、アッセイ希釈剤で１：５，０００希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を添加した。１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。各血清サンプルについて、光学濃度（ＯＤ）  対  血清希釈の逆数の対数のプロットを、非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）によって作成した。力価は、およそ０．５のＯＤでの血清希釈の逆数として定義した（各プレートに含まれていた、１：２５００の定義された力価を有する、ＲＳＶ感染したコットンラットから得たプールされた標準の血清に正規化された）。
【０２７６】
マイクロ中和アッセイ。血清サンプルを、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって中和抗体の存在について試験した。ＨＩ−血清の２倍段階希釈物（５％  ＨＩ−ＦＢＳを含むＰＢＳ中）を、以前に力価測定された等容積のＲＳＶ  Ｌｏｎｇに添加した（およそ１１５ＰＦＵ／２５μｌを生じる）。血清／ウイルス混合物を３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートして、ウイルス中和が生じるのを可能にし、次いで、２５μｌのこの混合物（およそ１１５ＰＦＵを含有する）を９６ウェルプレート中のＨＥｐ−２細胞の２連のウェルに接種した。３７℃および５％ＣＯ２で２時間後、細胞を０．７５％メチルセルロース／ＥＭＥＭ５％ＨＩ−ＦＢＳで覆い、４２時間インキュベートした。免疫染色とそれに続く自動計数によるシンシチウム形成の検出によって感染性ウイルス粒子の数を決定した。中和力価は、対照（血清なし）に対して、ウェルあたりのシンシチウム（ｓｙｎｃｔｉａ）の数の少なくとも６０％の減少を生じる、血清希釈の逆数として定義される。
【０２７７】
２．免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果
表９は、ｉｎ  ｖｉｖｏコットンラットモデルにおけるＲＳＶ  Ｆ抗原の免疫原性に対するＤＯＴＡＰ濃度の効果を示す。最初の２回のワクチン接種には、表９に示したとおりのＲＮＡ／ＣＮＥ製剤を使用した。３回目のワクチン接種では、３μｇのＲＳＶ  Ｆサブユニットタンパク質（アラム中）を、未処置群以外のすべての動物に使用した。
【表９】
2014522841.tif 000016
【０２７８】
表９のデータは、すべてのＣＮＥ−ＲＮＡ製剤で、宿主において用量依存性の免疫応答が誘導されたことを示す（総ＩｇＧ力価ならびに中和抗体力価）。ＣＭＦ３１−ＲＮＡ製剤の投与とＣＭＦ３４−ＲＮＡ製剤の投与では同様のＦ特異的総ＩｇＧ力価が得られ、各々は、表示した各ＲＮＡ用量においてＣＮＥ１７のものより大きかった。また、すべてのＣＮＥ−ＲＮＡ製剤で、１０μｇのＲＮＡにおいて良好な中和抗体力価が誘導された。ＣＭＦ３１−ＲＮＡ、ＣＭＦ３４−ＲＮＡおよびＣＮＥ１７−ＲＮＡ群の中和抗体力価は、１μｇ  ＲＮＡ／ＣＭＦ３１群での力価が驚くほど高かったこと以外は同様であった。
【０２７９】
（実施例５）
免疫原性に対するバッファー組成の効果の評価
【０２８０】
この実施例では、ＣＭＦ３４をベースとするが異なるバッファー成分を有する様々なエマルジョンを調製した。
【０２８１】
表１０に、ＣＭＦ３４配合ＲＮＡを異なるバッファー系を用いて調製した場合のマウス免疫原性試験の結果をまとめる。
【表１０】
2014522841.tif 000017
【０２８２】
（実施例６）
エマルジョンの安定性
ＣＭＦ３４の安定性を、エマルジョン粒子の平均直径ならびにエマルジョンを作製した後（Ｔ＝０）および４℃で１ヶ月後（Ｔ＝１ヶ月）と４℃で２ヶ月後（Ｔ＝１ヶ月）の多分散性を測定することにより評価した。また、安定性を４℃で３、６および１２ヶ月後にも評価した。表１１に示した結果は、エマルジョンが少なくとも１２ヶ月にわたって安定であったことを示す。
【表１１】
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【０２８３】
（実施例７）
ヘルペスウイルスタンパク質をコードするレプリコンの免疫原性
Ａ．ＣＭＶタンパク質
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の糖タンパク質複合体を発現するビシストロン性およびペンタシストロン性のアルファウイルスレプリコンを、調製した。これを、図１および３に模式的に示す。アルファウイルスレプリコンはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）をベースにした。レプリコンをウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）内にパッケージングし、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入するか、またはＣＭＦ３４を配合した。コードされたＨＣＭＶタンパク質および該レプリコンの各々に由来するタンパク質複合体の発現を、免疫ブロット、免疫共沈降およびフローサイトメトリーによって確認した。フローサイトメトリーは、複合体のタンパク質成分をコードする五量体レプリコンからの五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体の発現を確認するために使用し、該五量体複合体上に存在するコンフォメーショナルエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体を使用した（Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４（２）：１００５−１３）。図２は、これらの抗体が、ＨＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を発現するレプリコンＲＮＡ（Ａ５２７）でトランスフェクトされたＢＨＫＶ細胞に結合することを示す。細胞を同じレプリコン構築物から作製したＶＲＰに感染させた場合にも、同様の結果が得られた。これは、該五量体複合体を発現するように設計されたレプリコンが実際に所望の抗原を発現し、潜在的副生成物ｇＨ／ｇＬは発現しないことを示す。
【０２８４】
ＶＲＰ、ＬＮＰ内に封入したＲＮＡ、およびＣＭＦ３４を配合したＲＮＡを使用し、後肢四頭筋への筋肉内注射によってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。マウスは３週間ずつ間隔をおいて３回免疫化し、血清サンプルを、各免疫化の前ならびに３回目と最後の免疫化の３週間後に収集した。血清をマイクロ中和アッセイで、ワクチン接種によって誘発された中和抗体応答の効力を測定するために評価した。力価は５０％中和力価として示す。
【０２８５】
ＶＲＰ内の可溶性ＨＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ複合体についてのいくつかの異なる構成のビシストロン性発現カセットの免疫原性を評価した。図３は、膜につなぎ留められた完全長ｇＨ／ｇＬ複合体を発現するＶＲＰが、同様のビシストロン性発現カセットから発現された可溶性複合体（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）よりわずかに高い力価において強力な中和抗体を誘発したことを示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードする遺伝子の順序を変更すること、またはサブゲノムプロモーターのうちの１つをＩＲＥＳもしくはＦＭＤＶ  ２Ａ部位で置き換えることによっては、免疫原性は実質的に改善されなかった。
【０２８６】
ｇＨ／ｇＬを発現するビシストロン性レプリコンおよび五量体複合体を発現するペンタシストロン性レプリコンにより種々の製剤で中和抗体が誘発されるかどうかを確認するため、コットンラットを、ＣＭＦ３４と混合したビシストロン性レプリコンまたはペンタシストロン性レプリコンで免疫化した。表１２は、ＣＭＦ３４中のレプリコンにより、ＬＮＰ内に封入した同じレプリコンと同等の中和抗体力価が誘発されたことを示す。
【表１２】
2014522841.tif 000019
【０２８７】
Ｂ．ＶＺＶタンパク質
ＶＺＶタンパク質をコードする核酸をＶＥＥレプリコンベクター内にクローニングし、ｇＢをコードするモノシストロン性レプリコン、ｇＨをコードするモノシストロン性レプリコン、ｇＬをコードするモノシストロン性レプリコン、ｇＥをコードするモノシストロン性レプリコンおよびｇＩをコードするモノシストロン性レプリコンを産生させ、また、ｇＨ／ｇＬまたはｇＥ／ｇＩをコードするビシストロン性レプリコンを産生させた。ビシストロン性レプリコンでは、各ＶＺＶのオープンリーディングフレームの発現は、別々のサブゲノムプロモーターによって駆動された。
【０２８８】
レプリコンＲＮＡを調製するため、該レプリコンをコードするプラスミドをＰｍｅＩでの消化によって線状化し、線状化されたプラスミドをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、酢酸ナトリウム／エタノール中で沈降させ、２０μｌのＲＮａｓｅフリー水中に再懸濁させた。
【０２８９】
ＲＮＡは、１μｇの線状化ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（ＡＭＢＩＯＮ＃  ＡＭ１３３３）を用いて調製した。２０μｌの反応液を、キャップ類似体なしで製造業者の使用説明書に従ってセットアップし、３２℃で２時間インキュベートした。ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（１μｌ）を添加し、混合物を３２℃で３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅフリー水（３０μｌ）および酢酸アンモニウム溶液（３０μｌ）を添加した。この溶液を混合し、−２０℃で少なくとも３０分間冷却した。次いで、この溶液を最大速度で２５分間、４℃にて遠心分離した。上清みを廃棄し、ペレットを７０％エタノールですすぎ洗浄し、最大速度で１０分間、４℃にて再度、遠心分離した。ペレットを風乾し、５０μｌのＲＮａｓｅフリー水中に再懸濁させた。ＲＮＡの濃度を測定し、量を変性ゲルで確認した。
【０２９０】
ＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＃ＳＣＣＥ０６２５）を用いてキャッピングした。反応を、ＲＮＡとＲＮａｓｅフリー水を合わせることによりスケーリング（ｓｃａｌｅ）した。次いで、ＲＮＡを６５℃で５〜１０分間変性させた。この変性ＲＮＡを速やかに氷に移し、以下の試薬を以下に順に添加した：ＳｃｒｉｐｔＣａｐキャッピングバッファー、１０ｍＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  ＳＡＭ（新鮮調製）、ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ  ＲＮａｓｅインヒビター、およびＳｃｒｉｐｔＣａｐキャッピング酵素。混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅフリー水および７．５Ｍ  ＬｉＣｌを添加し、充分に混合し、混合物を−２０℃で少なくとも３０分間保存することにより反応を停止させた。次いで、混合物を最大速度で２５分間、４℃にて遠心分離し、ペレットを７０％エタノールですすぎ洗浄し、最大速度で１０分間、４℃にて再度、遠心分離し、ペレットを風乾させた。ペレットをＲＮａｓｅフリー水中に再懸濁させた。ＲＮＡの濃度を測定し、量を変性ゲル上で確認した。
【０２９１】
ＲＮＡトランスフェクション
細胞（ＢＨＫ−Ｖ細胞）を６ウェルプレートに播種し、トランスフェクションの時点で９０〜９５％コンフルエンスにした。各トランスフェクションでは、３μｇのＲＮＡを第１のチューブ内にて５０ｍＬのＯＰＴＩＭＥＭ培地中で希釈した。リポフェクタミン２０００を、５０ｍＬのＯＰＴＩＭＥＭ培地を入れた第２のチューブに添加した。第１のチューブと第２のチューブとを合わせ、室温で２０分間維持した。６ウェルプレート内の培養培地を新鮮培地と交換し、ＲＮＡ−リポフェクタミン複合体を該細胞上に配置し、プレートを穏やかに揺り動かすことにより混合した。プレートをＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０２９２】
免疫蛍光のため、トランスフェクトした細胞を収集し、９６ウェルプレート内に播種し、市販のマウスｍＡｂ（希釈範囲  １：１００  １：４００）を用いて細胞内染色を行なった。細胞ペレットを固定し、Ｃｉｔｏｆｉｘ−Ｃｉｔｏｐｅｒｍ溶液で透過性にした。二次試薬はＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（１：４００の最終希釈度）を使用した。
【０２９３】
ＶＺＶタンパク質ｇＥおよびｇＩの発現は、モノシストロン性構築物（ｇＥまたはｇＩ）でトランスフェクトされた細胞において検出され、ｇＥおよびｇＩの両方の発現は、市販のマウス抗体である、ｇＥに対する１３Ｂ１およびｇＩに対する８Ｃ４を用いたウエスタンブロットにおいて、ビシストロン性ｇＥ／ｇＩ構築物でトランスフェクトされた細胞において検出された。ＶＺＶタンパク質ｇＢの発現は、ｇＢをコードするモノシストロン性構築物でトランスフェクトされた細胞において、市販の抗体１０Ｇ６を用いて免疫蛍光によって検出された。ＶＺＶタンパク質複合体ｇＨ／ｇＬの発現は、免疫蛍光により、モノシストロン性ｇＨおよびモノシストロン性ｇＬまたはビシストロン性ｇＨ／ｇＬ構築物でトランスフェクトされた細胞において検出された。ｇＨ／ｇＬ複合体は、市販の抗体ＳＧ３を用いて検出した。
【０２９４】
マウス免疫原性試験
８匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（６〜８週齢および体重約２０ｇ）を、ＣＭＦ３２またはＬＮＰ（ＲＶ０１）を配合した７．０または１．０μｇのレプリコンＲＮＡで、０、２１および４２日目に筋肉内免疫化した。免疫化した動物から血液サンプルを、２回目の免疫化の３週間後および３回目の免疫化の３週間後に採取した。群を表１３に示す。
【表１３】
2014522841.tif 000020
【０２９５】
ＶＺＶ抗原に対する免疫応答
血清サンプルを、ｇＢに対する抗体の存在について、ＶＺＶ−レプリコンでトランスフェクトしたＭＲＣ−５細胞の細胞内染色によって試験した。ＭＲＣ−５細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中に維持した。ＶＺＶ  Ｏｋａ株接種材料（ＡＴＣＣから入手）を用いてＭＲＣ−５細胞培養物を感染させ、感染した細胞全体をウイルスの継代培養に使用した。感染細胞と非感染細胞との比は１：１０であった。感染の３０時間後、細胞を、９６ウェルプレート内への播種のためにトリプシンで分散させ、免疫化後に採取したマウス血清プール（希釈範囲は１：２００〜１：８００）での細胞内染色を行なった。感染レベルの定量のための対照としては市販のｍＡｂを使用した。細胞ペレットを固定し、Ｃｉｔｏｆｉｘ−Ｃｉｔｏｐｅｒｍ溶液で透過性にした。二次試薬はＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２を使用した（１：４００の最終希釈度）。
【０２９６】
ｇＢに対する市販の抗体（１０Ｇ６）、ｇＨに対する市販の抗体（ＳＧ３）、ならびにｇＥに対する市販の抗体（１３Ｂ１（ＳＢＡ）および８６１２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を陽性対照として使用し、各々で感染ＭＲＣ−５細胞を細胞内染色した。ＣＭＦ３２を配合した１または７μｇのＲＮＡのいずれかでの３回目の免疫化の３週間後に採取した免疫血清を１／２００、１／４００および１／８００に希釈し、感染ＭＲＣ−５細胞の細胞内染色に使用した。結果を図４に示す（試験１、群１、５、７、９、１１、１３および１５、ＣＭＦ３２製剤）。
【０２９７】
中和アッセイ
各免疫化マウスの血清を増分２倍で連続希釈し（標準的な培養培地中、１：２０で開始）、等しい体積のＶＺＶ懸濁液にモルモット補体の存在下で添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、ヒト上皮細胞株Ａ５４９を添加した。感染細胞は、１週間の培養後、培養物中に形成されたプラークを顕微鏡下で計数することにより測定され得る。プラーク数から、各血清希釈度での阻害％を計算した。阻害％の値を希釈係数の対数目盛に対してプロットすることにより、各血清サンプルについての図表を作成した。続いて、希釈係数と阻害％の関係の近似直線を引いた。次いで、５０％中和力価を希釈係数として求め、このとき、直線の交点が５０％阻害の値である。
【０２９８】
表１４は、モノシストロン性ｇＥ、ビシストロン性ｇＥ／ｇＩ、およびビシストロン性ｇＨ／ｇＬで免疫化されたマウスから得られた血清がロバストな中和抗体力価を含んでいたことを示す。
【０２９９】
【表１４】
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【０３００】
（実施例８）
スクアレン中における脂肪酸の溶解度
この実施例では、スクアレン中における様々な脂肪酸の溶解度を調べ、表１５に示した。表示した量（４０、２０、１０または５ｍｇ／ｍＬ）の脂肪酸をスクアレンと６０℃で混合した。表１５において、（
【化５】
2014522841.tif 000022
）は、脂肪酸が指定の濃度でスクアレンに可溶性であったことを意味し；「ｘ」は、脂肪酸が指定の濃度でスクアレンに可溶性でなかったことを意味し；「−」は、指定の濃度での脂肪酸の溶解度を試験しなかったことを示す（該脂肪酸が、より高濃度で可溶性であったため）。脂肪酸をスクアレンに溶解させた後、溶液を４℃で一晩放置した。４℃一晩と表示した列は、各脂肪酸がその最高濃度にある溶液の溶解性を示す。例えば、オレイン酸は、４０ｍｇ／ｍｌでスクアレンに可溶性であり、４℃で一晩、スクアレン中に可溶性のままであった。
【表１５】
2014522841.tif 000023
【０３０１】
配列
ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする、ｖＡ３１７  ＲＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）。
【０３０２】
ｖＡ１４２  ＲＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）。
【０３０３】
ｖＡ３７５  ＲＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）。
【０３０４】
Ａ５２６ベクター：ＳＧＰ−ｇＨ−ＳＧＰ−ｇＬ−ＳＧＰ−ＵＬ１２８−２Ａ−ＵＬ１３０−２Ａｍｏｄ−ＵＬ１３１（配列番号４）。
【０３０５】
Ａ５２７ベクター：ＳＧＰ−ｇＨ−ＳＧＰ−ｇＬ−ＳＧＰ−ＵＬ１２８−ＥＭＣＶ−ＵＬ１３０−ＥＶ７１−ＵＬ１３１（配列番号５）。
【０３０６】
Ａ５３１ベクター：ＳＧＰ−ｇＨｓｏｌ−ＳＧＰ−ｇＬ（配列番号６）。
【０３０７】
Ａ５３２ベクター：ＳＧＰ−ｇＨｓｏｌ−２Ａ−ｇＬ（配列番号７）。
【０３０８】
Ａ５３３ベクター：ＳＧＰ−ｇＨｓｏｌ−ＥＶ７１−ｇＬ（配列番号８）。
【０３０９】
Ａ５３４ベクター：ＳＧＰ−ｇＬ−ＥＶ７１−ｇＨ（配列番号９）。
【０３１０】
Ａ５３５ベクター：ＳＧＰ−３４２−ＥＶ７１−ｇＨｓｏｌ−２Ａ−ｇＬ（配列番号１０）。
【０３１１】
Ａ５３６ベクター：ＳＧＰ−３４２−ＥＶ７１−ｇＨｓｏｌ−ＥＭＣＶ−ｇＬ（配列番号１１）。
【０３１２】
Ａ５３７ベクター：ＳＧＰ−３４２−ＥＶ７１−ｇＬ−ＥＭＣＶ−ｇＨｓｏｌ（配列番号１２）。
【０３１３】
Ａ５５４ベクター：ＳＧＰ−ｇＨ−ＳＧＰ−ｇＬ−ＳＧＰ−ＵＬ１２８−ＳＧＰ−ＵＬ１３０−ＳＧＰ−ＵＬ１３１（配列番号１３）。
【０３１４】
Ａ５５５ベクター：ＳＧＰ−ｇＨｓｏｌ−ＳＧＰ−ｇＬ−ＳＧＰ−ＵＬ１２８−ＳＧＰ−ＵＬ１３０−ＳＧＰ−ＵＬ１３１（配列番号１４）。
【０３１５】
Ａ５５６ベクター：ＳＧＰ−ｇＨｓｏｌ６Ｈｉｓ−ＳＧＰ−ｇＬ−ＳＧＰ−ＵＬ１２８−ＳＧＰ−ＵＬ１３０−ＳＧＰ−ＵＬ１３１（配列番号１５）。
【０３１６】
ＶＺＶ  ｇＢ（配列番号１６）。
【０３１７】
ＶＺＶ  ｇＨ（配列番号１７）。
【０３１８】
ＶＺＶ  ｇＬ（配列番号１８）。
【０３１９】
ＶＺＶ  ｇＩ（配列番号１９）。
【０３２０】
ＶＺＶ  ｇＥ（配列番号２０）。
【０３２１】
ＶＺＶ  ＶＥＥＲｅｐ．ＳＧＰｇＢ（配列番号２１）。
【０３２２】
ＶＺＶ  ＶＥＥＲｅｐ．ＳＧＰｇＨ（配列番号２２）。
【０３２３】
ＶＺＶ  ＶＥＥＲｅｐ．ＳＧＰｇＬ（配列番号２３）。
【０３２４】
ＶＺＶ  ＶＥＥＲｅｐ．ＳＧＰｇＨ−ＳＧＰｇＬ（配列番号２４）。
【０３２５】
ＶＺＶ  ＶＥＥＲｅｐ．ＳＧＰｇＥ（配列番号２５）。
【０３２６】
ＶＺＶ  ＶＥＥＲｅｐ．ＳＧＰｇＩ（配列番号２６）。
【０３２７】
ＶＺＶ  ＶＥＥｒｅｐ．ＳＧＰｇＥ−ＳＧＰｇＩ（配列番号２７）。
【０３２８】
本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示を踏まえると、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであって、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。当業者ならば、多数のその他の実施形態が、本発明によって包含されることは容易に認識しよう。本開示内容中に引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりその全文が組み込まれる。参照によって組み込まれる材料が、この明細書と相反するかまたは矛盾する範囲においては、本明細書が任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であると認めることではない。
【０３２９】
当業者ならば、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するだろうし、慣例的な実験程度を使用して確認できる。このような等価物は、以下の実施形態によって包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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