(57)【要約】バチルス属細菌を含み、かつ接種剤で処理した植物による揮発性有機化合物(VOC)の産生を誘導する接種剤を開示する。2014503517.tif 000015
2014503517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたバチルス属(Bacillus)細菌および担体を含む、植物のための接種剤であって、該接種剤で処理した植物による1種または複数種の揮発性有機化合物(VOC)の産生を誘導する、接種剤。
【請求項２】
細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・モジャベンシス(Bacillus mojavensis)、バチルス・ソリサルシ(Bacillus solisalsi)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の接種剤。
【請求項３】
細菌が植物成長促進根圏細菌(PGPR)である、請求項1記載の接種剤。
【請求項４】
1種または複数種のVOCが、α-ピネン、β-ピネン、β-ミルセン、酢酸シス-3-ヘキセニル、リモネン、β-オシメン、リナロール、(E)-4,8-ジメチル-1,3,7-ノナトリエン、サリチル酸メチル、デカナール、シス-ジャスモン、カリオフィレン、α-フムレン、β-ファルネセン、およびそれらの混合物からなる群より選択される1種または複数種の化合物を含む、請求項1記載の接種剤。
【請求項５】
1種または複数種のVOCが、1種または複数種のVOCに曝露された昆虫の行動を変更する、請求項1記載の接種剤。
【請求項６】
昆虫が草食動物であり、1種または複数種のVOCが植物に対する昆虫の産卵を減少させる、請求項5記載の接種剤。
【請求項７】
昆虫が草食動物であり、1種または複数種のVOCが植物に対する昆虫の摂食を減少させる、請求項5記載の接種剤。
【請求項８】
昆虫が捕食者または捕食寄生者であり、1種または複数種のVOCが捕食者または捕食寄生者を植物へ誘引する、請求項5記載の接種剤。
【請求項９】
細菌が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:6を含む16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１０】
細菌が、SEQ ID NO:1と少なくとも98％同一である16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１１】
細菌が、SEQ ID NO:2と少なくとも98％同一である16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１２】
細菌が、SEQ ID NO:3と少なくとも91％同一である16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１３】
細菌が、SEQ ID NO:4と少なくとも96％同一である16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１４】
細菌が、SEQ ID NO:5と少なくとも93％同一である16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１５】
細菌が、SEQ ID NO:6と少なくとも93％同一である16S rDNA核酸配列を有する、請求項1記載の接種剤。
【請求項１６】
細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス、またはバチルス・アミロリケファシエンスを含む混合物である、請求項1記載の接種剤。
【請求項１７】
細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-136、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-188、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-218、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-219、およびバチルス・アミロリケファシエンス株AP-295からなる群より選択される、請求項16記載の接種剤。
【請求項１８】
細菌が、バチルス・モジャベンシス、またはバチルス・モジャベンシスを含む混合物である、請求項1記載の接種剤。
【請求項１９】
細菌がバチルス・モジャベンシス株AP-209である、請求項18記載の接種剤。
【請求項２０】
細菌が、バチルス・ソリサルシ、またはバチルス・ソリサルシを含む混合物である、請求項1記載の接種剤。
【請求項２１】
細菌がバチルス・ソリサルシ株AP-217である、請求項20記載の接種剤。
【請求項２２】
細菌が、バチルス・プミルス、またはバチルス・プミルスを含む混合物である、請求項1記載の接種剤。
【請求項２３】
細菌がバチルス・プミルス株INR-7である、請求項22記載の接種剤。
【請求項２４】
細菌が、バチルス・シンプレックス、またはバチルス・シンプレックスを含む混合物である、請求項1記載の接種剤。
【請求項２５】
細菌がバチルス・シンプレックス株ABU 288である、請求項1記載の接種剤。
【請求項２６】
細菌がバチルス・サブチリス株MBI 600である、請求項1記載の接種剤。
【請求項２７】
細菌がバチルス属種の混合物を含む、請求項1記載のバチルス属細菌。
【請求項２８】
植物ホルモン、抗菌化合物、またはその両方をさらに含む、請求項1記載の接種剤。
【請求項２９】
植物ホルモンが、アセトイン、2,3-ブタンジオール、およびインドール-酢酸からなる群より選択され、抗菌化合物が、フェニルエタノールおよび4-ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される、請求項28記載の接種剤。
【請求項３０】
請求項1記載の接種剤を、植物に、植物の種子に、または植物を取り囲む土壌に施す段階を含む、植物に対する昆虫行動を変更する方法。
【請求項３１】
昆虫が草食動物であり、前記方法が植物に対する昆虫の産卵を減少させる、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
昆虫が草食動物であり、前記方法が植物に対する昆虫の摂食を減少させる、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
昆虫が捕食者または捕食寄生者であり、前記方法が捕食者または捕食寄生者を植物へ誘引する、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
植物が、アルファルファ、イネ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エンドウマメ、レンズマメ、チコリー、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、テンサイ、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、スカッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、セイヨウナシ、メロン、カンキツ類、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、春コムギ、冬コムギ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビからなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明の主題は、植物成長促進根圏細菌(PGPR)の分野に関する。特に、本主題は、細菌で処理した植物による揮発性有機化合物の産生を誘導するPGPRに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
植物揮発性物質の誘導が、植物ホルモン(de Bruxelles and Roberts, 2001；Ament et al., 2004)、草食動物由来誘発物(Spiteller and Boland 2003)、および病原体を含む関連微生物(Preston et al., 1999；Cardoza et al., 2002)などの生物的因子、ならびに創傷(Mithofer et al., 2005)、重金属(Mithofer et al., 2004)、および温度と光(Takabayashi et al., 1994)などの非生物的因子の相互作用に依存するという証拠にもかかわらず、植物における揮発性有機化合物(VOC)の誘導は実質的に未調査の状態である。植物成長促進根圏細菌(PGPR)とは根に定着する多種の細菌を意味し、これらの細菌の適用は、植物成長速度の上昇(Kloepper, 1992；Zehnder et al., 1997)、土壌病原体の抑制(Schippers et al., 1987)、および害虫に対する全身抵抗性の誘導(Kloepper et al., 1999；Ryu et al., 2004)と関連していることが多い。PGPRが、世界の一部の地域でいくつかの農作物の生産においてますます適用されてきていることを考えれば(Backman et al., 1997；Cleyet-Marcel et al., 2001)、植物におけるVOCの誘導、およびPGPRが植物においてVOCの産生に影響し得るかどうかについての研究が不足していることは、驚くべきことである。Backmanら(1997)は、米国の綿花作物の60〜75％が、フサリウム属(Fusarium)およびリゾクトニア属(Rhizoctonia)土壌病原体の抑制のために用いられるバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)生成物であるPGPR生成物Kodiak(登録商標)で処理されることを報告した。ここで、ワタの揮発性物質の誘導に及ぼすPGPRの潜在的効果、ならびに誘引ワタ草食動物およびそれらの捕食寄生者に対する影響を研究した。驚くべきことに、PGPRは、重要な派生効果を伴って植物VOCの変化を誘発することが観察された。植物揮発性物質の誘導および昆虫-植物相互作用に及ぼすPGPRの効果の知識は、PGPR生成物の採用の増加およびより良好な生成物の開発に寄与する可能性が高く、またこれらの生成物の潜在的悪影響を緩和する可能性が高い。
【発明の概要】
【０００３】
概要
単離された植物成長促進根圏細菌(PGPR)、およびPGPRで処理した植物による1種または複数種の揮発性有機化合物(VOC)の産生を誘導するその接種剤を開示する。適切なPGPRはバチルス属種を含み得る。
【０００４】
植物によって産生されるVOCには、α-ピネン、β-ピネン、β-ミルセン、酢酸シス-3-ヘキセニル、リモネン、β-オシメン、リナロール、(E)-4,8-ジメチル-1,3,7-ノナトリエン、サリチル酸メチル、デカナール、シス-ジャスモン、カリオフィレン、α-フムレン、β-ファルネセン、およびそれらの混合物より選択される化合物が含まれ得るが、これらに限定されない。PGPR処理した植物によって産生されるVOCは、好ましくは、VOCに曝露された昆虫の行動を変更する。いくつかの態様において、昆虫は草食動物であり、VOCは植物に対する昆虫の産卵または摂食を減少させる。さらなる態様において、昆虫は捕食者または捕食寄生者であり、VOCは植物に対して捕食者または捕食寄生者を誘引する。
【０００５】
PGPRは、細菌の単一の株、種、もしくは属であってよく、または細菌の株、種、もしくは属の混合物を含んでもよい。例えば、PGPRは、これらに限定されないが、アクチノバクター属(Actinobacter)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、バチルス属、バークホルデリア属(Burkholderia)、ブティアウクセラ属(Buttiauxella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、クライベラ属(Kluyvera)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ラーネラ属(Rahnella)、ラルストニア属(Ralstonia)、リゾビウム属(Rhizobium)、セラチア属(Serratia)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophomonas)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、およびリシニバチルス属(Lysinibacillus)を含む属より選択され得る。
【０００６】
PGPRはバチルス属細菌を含み得る。バチルス属細菌は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、もしくはSEQ ID NO:4を含む16S rDNA核酸配列を含んでよく、またはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、およびSEQ ID NO:5のうちの1つもしくは複数と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA核酸配列を含んでよい。特定のバチルス属細菌には、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)(例えば、アクセッション番号NRRL B-50614の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス株AP-136；アクセッション番号NRRL B-50615の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス株AP-188；アクセッション番号NRRL B-50618の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス株AP-218；アクセッション番号NRRL B-50619の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス株AP-219；およびアクセッション番号NRRL B-50620の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス株AP-295)；バチルス・モジャベンシス(Bacillus mojavensis)(例えば、アクセッション番号NRRL B-50616の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・モジャベンシス株AP-209)；バチルス・ソリサルシ(Bacillus solisalsi)(例えば、アクセッション番号NRRL B-50617の下で、2011年12月2日に米国農務省に寄託されたバチルス・ソリサルシ株AP-217)；バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)(例えば、バチルス・プミルス株INR-7(他に、アクセッション番号NRRL B-50153の下で、2008年7月23日に米国農務省に寄託されたBU-F22；およびアクセッション番号NRRL B-50185の下で、2008年10月15日に米国農務省に寄託されたBU-F33と称される))；バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)(例えば、アクセッション番号NRRL B-50340の下で、2010年2月18日に米国農務省に寄託されたバチルス・シンプレックス株ABU 288)；およびバチルス・サブチリス(アクセッション番号NRRL B-50595の下で、2011年11月14日に米国農務省に寄託されたバチルス・サブチリス株MBI 600)、ならびにそれらの混合物またはブレンドが含まれ得る。
【０００７】
ここで開示されるPGPRおよび任意で担体を含む接種剤もまた開示する。接種剤は、植物ホルモン(例えば、アセトイン、2,3-ブタンジオール、およびインドール-酢酸)、および抗菌化合物(例えば、フェニルエタノールおよび4-ヒドロキシ安息香酸)などの付加的な有効成分を含み得る。
【０００８】
開示されるPGPRおよびその接種剤は、植物に対する昆虫行動を変更するための方法において使用することができる。いくつかの態様において、本方法は、PGPRを含む接種剤を、植物に、植物の種子、塊茎、もしくは根茎に、または植物を取り囲む土壌もしくは環境に施す段階を含む。本方法は、植物に対する草食動物の産卵もしくは摂食の減少をもたらし得る、および/または植物に対する捕食者もしくは捕食寄生者の誘引をもたらし得る。本方法に適した植物には、アルファルファ、イネ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エンドウマメ、レンズマメ、チコリー、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、テンサイ、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、スカッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、セイヨウナシ、メロン、カンキツ類、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、春コムギ、冬コムギ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビが含まれ得るが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】非処理(対照)のワタ植物と、PGPR株INR-7、PGPRブレンド8、またはPGPRブレンド9で処理したワタ植物からのヘッドスペース揮発性物質のクロマトグラフィープロファイルを示す。同定された化合物：(1) α-ピネン；(2) β-ピネン；(3) β-ミルセン；(4) 酢酸シス-3-ヘキセニル；(5) リモネン；(6) β-オシメン；(7) リナロール；(8) 未知；(9) カリオフィレン；(10) α-フムレン；(11) β-ファルネセン。
【図２】非処理(対照1)で、イモムシを放虫していないワタ植物、非処理(対照2)で、イモムシを放虫したワタ植物、PGPRブレンド9で処理し、イモムシを放虫していなワタ植物、およびPGPRブレンド9で処理し、イモムシを放虫したワタ植物から収集されたヘッドスペース揮発性物質のクロマトグラフィープロファイルを示す。同定された化合物：(1) シス-3-ヘキセナール；(2) トランス-2-ヘキセナール；(3) シス-3-ヘキセン-1-オール；(4) トランス-2-ヘキセン-1-オール；(5) α-ピネン；(6) β-ピネン；(7) ミルセン；(8) 酢酸シス-3-ヘキセニル；(9) 酢酸トランス-2-ヘキセニル；(10) リモネン；(11) β-オシメン；(12) リナロール；(13) 未知；(14) (E)-4,8-ジメチル-1,3,7-ノナトリエン；(15) 酪酸シス-3-ヘキセニル；(16) 酪酸トランス-2-ヘキセニル；(17) n-デカナール；(18) 2-メチル酪酸シス-3-ヘキセニル；(19)2-メチル酪酸トランス-2-ヘキセニル；(20) インドール；(21) チグリン酸イソブチル；(22) チグリン酸(E)-2-ヘキセニル；(23) シス-ジャスモン；(24) カリオフィレン；(25) α-トランスベルガモテン；(26) α-ファルネセン；(27) α-フムレン；(28) β-ファルネセン。
【図３】非処理(対照)のワタ植物と、PGPR株INR-7、PGPRブレンド8、またはPGPRブレンド9で処理したワタ植物の根の表面積(cm2)を示す。異なる文字を付した平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA、チューキー・クレーマー(Tukey-Kramer) HSD多重比較検定、n＝8)。
【図４】非処理(対照)のワタ植物と、PGPR株INR-7、PGPRブレンド8、またはPGPRブレンド9で処理したワタ植物の根の体積(cm3)を示す。異なる文字を付した平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA、チューキー・クレーマーHSD多重比較検定、n＝8)。
【図５】非処理(対照)のワタ植物と、PGPR株INR-7、PGPRブレンド8、またはPGPRブレンド9で処理したワタ植物の根の乾燥重量(g)を示す。異なる文字を付した平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA、チューキー・クレーマーHSD多重比較検定、n＝8)。
【図６】非処理(対照)のワタ植物と、PGPR株INR-7、PGPRブレンド9で処理したワタ植物、またはブランク対照(空チャンバー)に対する、4チャネル型オルファクトメーターにおける無処置の雌オオタバコガコマユバチ(M. croceipes)の反応を示す。毎日32匹の捕食寄生者を試験し、これを5回繰り返した。異なる文字を付した平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA、チューキー・クレーマーHSD多重比較検定、n＝5)。
【図７】非処理(対照)で、放虫されたワタ植物と、PGPRブレンド9で処理し、放虫されたワタ植物、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていないワタ植物、またはブランク対照(空チャンバー)に対する、4チャネル型オルファクトメーターにおける無処置の雌オオタバコガコマユバチの反応を示す。植物には、オオタバコガ(H. virescens)のイモムシ30匹を放虫した。毎日32匹の捕食寄生者を試験し、これを4回繰り返した。異なる文字を付した平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA、チューキー・クレーマーHSD多重比較検定、n＝4)。
【図８】非処理(対照)で、放虫されたワタ植物と、PGPRブレンド9で処理し、放虫されたワタ植物、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていないワタ植物、またはブランク対照(空チャンバー)に対する、4チャネル型オルファクトメーターにおける無処置の雌オオタバコガコマユバチの反応を示す。植物には、オオタバコガのイモムシ2匹を放虫した。毎日32匹の捕食寄生者を試験し、これを4回繰り返した。異なる文字を付した平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA、チューキー・クレーマーHSD多重比較検定、n＝4)。
【図９】産卵される卵塊の数(A)；および産卵される全卵の数(B)に及ぼすPGPRの効果を示す。
【図１０】非処理(対照)のワタ植物と、PGPR株MBI 600またはPGPR株ABU 288で処理したワタ植物からのヘッドスペース揮発性物質のクロマトグラフィープロファイルを示す。矢印は、PGPR処理植物において検出されたが、非処理(対照)の植物では検出されなかった揮発性物質ピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
開示される主題について、以下にさらに説明する。
【００１１】
別に規定されない限り、または文脈によって示されない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その」という用語は「1つまたは複数」を意味する。例えば、別に規定されない限り、または文脈によって示されない限り、「1つのペプチド」は「1つまたは複数のペプチド」を意味すると解釈されるべきである。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、および「有意に」は当業者によって理解され、それらが用いられる文脈によってある程度変わる。この用語が用いられる文脈を所与として、当業者に明確ではない用語の使用がある場合、「約」および「およそ」は、その特定の用語のプラスまたはマイナス≦10％を意味し、「実質的に」および「有意に」は、その特定の用語のプラスまたはマイナス＞10％を意味する。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、「含む(include)」および「含むこと(including)」という用語は、「含む(comprise)」および「含むこと(comprising)」という用語と同じ意味を有する。
【００１４】
本明細書で使用される「植物」という用語は、広く理解されるべきであり、被子植物および裸子植物、双子葉植物および単子葉植物、ならびに樹木を含み得る。被子植物双子葉植物の例には、トマト、タバコ、ワタ、ナタネ、フィールド豆、ダイズ、コショウ、レタス、エンドウマメ、アルファルファ、クローバー、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ、ダイコン、ニンジン、テンサイ、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、スカッシュ、メロン、カンタループ、およびヒマワリが含まれ得るが、これらに限定されない。被子植物単子葉植物の例には、アスパラガス、飼料用トウモロコシおよびスイートコーン、オオムギ、コムギ、イネ、ソルガム、タマネギ、トウジンビエ、ライムギ、カラスムギ、ならびにサトウキビが含まれ得るが、これらに限定されない。木本には、果樹、アカシア、ハンノキ、アスペン、ブナ、カバノキ、モミジバフウ、アメリカスズカケノキ、ポプラ、ヤナギ、モミ、マツ、エゾマツ、カラマツ、ヒマラヤスギ、およびアメリカツガが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００１５】
「植物成長促進根圏細菌」または「PGPR」という用語は、植物の根に定着し、そうすることで植物の成長を促進する、および/または病気もしくは捕食者による損傷を減少させる細菌の群を指す。PGPRである細菌は、これらに限定されないが、アクチノバクター属、アルカリゲネス属、バチルス属、バークホルデリア属、ブティアウクセラ属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、クライベラ属、シュードモナス属、ラーネラ属、ラルストニア属、リゾビウム属、セラチア属、ステノトロフォモナス属、パエニバチルス属、およびリシニバチルス属を含む属に属し得る。
【００１６】
「揮発性有機化合物」または「VOC」という用語は、周囲条件下で通常は気体である有機化合物を指す。本明細書で用いられる場合、VOCには、α-ピネン、β-ピネン、β-ミルセン、酢酸シス-3-ヘキセニル、リモネン、β-オシメン、リナロール、(E)-4,8-ジメチル-1,3,7-ノナトリエン、サリチル酸メチル、デカナール、シス-ジャスモン、カリオフィレン、α-フムレン、β-ファルネセン、およびそれらの混合物が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書で開示されるように、VOCを排出するように植物を誘導するPGPRが同定された。
【００１７】
ここで開示されるPGPRは、植物のための接種剤として製剤化することができる。「接種剤」という用語は、PGPRの単離された培養物および任意で担体を含む調製物を意味し、担体には生物学的に許容される媒体が含まれ得る。
【００１８】
ここで開示されるPGPRは、単離され得るか、または実質的に精製され得る。「単離される」または「実質的に精製される」という用語は、自然環境から取り出され、単離または分離され、それらが天然で会合している他の成分を少なくとも60％含まない、好ましくは少なくとも75％含まない、およびより好ましくは少なくとも90％含まない、さらにより好ましくは少なくとも95％含まない、および最も好ましくは少なくとも100％含まないPGPRを指す。「単離された培養物」とは、その中でPGPRが増殖する、および/またはそこからPGPRが通常得られ得る土壌中に通常見出される他の物質などの、他の物質の有意な量を含まないPGPRの培養物を指す。「単離された培養物」は、「単離された培養物」の複製を妨げるのに十分な量の任意の他の生物種、微生物種、および/または細菌種を含まない培養物であってよい。PGPRの単離された培養物は、PGPRの混合培養物を調製するために組み合わせることができる。
【００１９】
本明細書で用いられるバチルス属とは、ファーミキューテス門のメンバーである、グラム陽性で桿状の細菌の属を指す。ストレス環境条件下において、バチルス属細菌は、長期にわたり休止状態であり得る楕円形の内生胞子を産生し得る。バチルス属細菌は、それらの16S rRNAまたはその断片(例えば、16S rRNAまたはrDNAヌクレオチド配列のおよそ1000 nt、1100 nt、1200 nt、1300 nt、1400 nt、または1500 nt断片)のヌクレオチド配列に基づいて、特徴づけされ同定され得る。バチルス属細菌には、B. アシディセラー(B. acidiceler)、B. アシディコーラ(B. acidicola)、B. アシディプロデュセンス(B. acidiproducens)、B. アエオリウス(B. aeolius)、B.アエリウス(B. aerius)、B. アエロフィルス(B. aerophilus)、B. アガラドハエレンス(B. agaradhaerens)、B. アイディンゲンシス(B. aidingensis)、B. アキバイ(B. akibai)、B. アルカロフィルス(B. alcalophilus)、B. アルギコーラ(B. algicola)、B. アルカリニトリリクス(B. alkalinitrilicus)、B. アルカリセディミニス(B. alkalisediminis)、B. アルカリテルリス(B. alkalitelluris)、B. アルティチュジニス(B. altitudinis)、B. アルベアユエンシス(B. alveayuensis)、B. アミロリケファシエンス、B. アンスラシス(B. anthracis)、B. アクイマリス(B. aquimaris)、B. アルセニカス(B. arsenicus)、B. アリャブハッタイ(B. aryabhattai)、B. アサヒイ(B. asahii)、B. アトロファエウス(B. atrophaeus)、B. アウランティアカス(B. aurantiacus)、B. アゾトフォルマンス(B. azotoformans)、B. バディウス(B. badius)、B. ババリカス(B. barbaricus)、B. バタビエンシス(B. bataviensis)、B. ベイジンゲンシス(B. beijingensis)、B. ベンゾエボランス(B. benzoevorans)、B. ベベリドゲイ(B. beveridgei)、B. ボゴリエンシス(B. bogoriensis)、B. ボロニフィルス(B. boroniphilus)、B. ブタノリボランス(B. butanolivorans)、B. カナベラリウス(B. canaveralius)、B. カルボニフィルス(B. carboniphilus)、B. セセンベンシス(B. cecembensis)、B. セルロシリティカス(B. cellulosilyticus)、B. セレウス(B. cereus)、B. チャガノレンシス(B. chagannorensis)、B. チャガンゲンシス(B. chungangensis)、B. シビー(B. cibi)、B. サークランス(B. circulans)、B. クラキイ(B. clarkii)、B. クラウシイ(B. clausii)、B. コアグランス(B. coagulans)、B. コアフイレンシス(B. coahuilensis)、B. コーニイ(B. cohnii)、B. デシシフロンディス(B. decisifrondis)、B. デコロラティオニス(B. decolorationis)、B. ドレンテンシス(B. drentensis)、B. ファラギニ(B. farraginis)、B. フォスティディオサス(B. fastidiosus)、B. ファーマス(B. firmus)、B. フレクス(B. flexus)、B. フォラミニス(B. foraminis)、B. フォルディイ(B. fordii)、B. フォルティス(B. fortis)、B. フマリオリ(B. fumarioli)、B. フニクルス(B. funiculus)、B. ガラクトシディリティカス(B. galactosidilyticus)、B. ガリシエンシス(B. galliciensis)、B. ゲラティニ(B. gelatini)、B. ギブソニイ(B. gibsonii)、B. ギンセンギ(B. ginsengi)、B. ギンセンギフミ(B. ginsengihumi)、B. グラミニス(B. graminis)、B. ハルマパルス(B. halmapalus)、B. ハロチャレス(B. halochares)、B. ハロデュランス(B. halodurans)、B. ヘミセルロシライティカス(B. hemicellulosilyticus)、B. ハーバートステイネンシス(B. herbertsteinensis)、B. ホリコシイ(B. horikoshi)、B. ホルネッキアエ(B. horneckiae)、B. ホルティ(B. horti)、B. ヒュミ(B. humi)、B. ヒュワジンポエンシス(B. hwajinpoensis)、B. イドリエンシス(B. idriensis)、B. インディカス(B. indicus)、B. インファンティス(B. infantis)、B. インフェルナス(B. infernus)、B. イサベリアエ(B. isabeliae)、B. イスロネンシス(B. isronensis)、B. ジェトガリ(B. jeotgali)、B. コーリエンシス(B. koreensis)、B. コルレンシス(B. korlensis)、B. クリベンシス(B. kribbensis)、B. クルウィチアエ(B. krulwichiae)、B. レヘンシス(B. lehensis)、B. レンタス(B. lentus)、B. リケニフォルミス(B. licheniformis)、B. リトラリース(B. litoralis)、B. ロシサリス(B. locisalis)、B. ルシフェレンシス(B. luciferensis)、B. ルテオルス(B. luteolus)、B. マカウエンシス(B. macauensis)、B. マキアエ(B. macyae)、B. マンナニライティカス(B. mannanilyticus)、B. マリスフラビ(B. marisflavi)、B. マルマレンシス(B. marmarensis)、B. マシリエンシス(B. massiliensis)、B. メガテリウム(B. megaterium)、B. メタノリカス(B. methanolicus)、B. メチロトロフィカス(B. methylotrophicus)、B. モジャベンシス、B. ムラリス(B. muralis)，B. ムリマルティニ(B. murimartini)、B. マイコイデス(B. mycoides)、B. ナンハイエンシス(B. nanhaiensis)、B. ナンハイイセディミニス(B. nanhaiisediminis)、B. ネアルソニイ(B. nealsonii)、B. ネイゾウエンシス(B. neizhouensis)、B. ニアベンシス(B. niabensis)、B. ナイアシニ(B. niacini)、B. ノバリス(B. novalis)、B. オセアニセディミニス(B. oceanisediminis)、B. オデッセイ(B. odysseyi)、B. オクヘンシス(B. okhensis)、B. オクヒデンシス(B. okuhidensis)、B. オレロニウス(B. oleronius)、B. オーシメンシス(B. oshimensis)、B. パナシテラエ(B. panaciterrae)、B. パタゴニエンシス(B. patagoniensis)、B. ペルセポレンシス(B. persepolensis)、B. プラコルチディス(B. plakortidis)、B. ポチェオネンシス(B. pocheonensis)、B. ポリゴニ(B. polygoni)、B. シュードアルカリフィルス(B. pseudoalcaliphilus)、B. シュードファーマス(B. pseudofirmus)、B. シュードマイコイデス(B. pseudomycoides)、B. サイクロデュランス(B. psychrosaccharolyticus)、B. プミルス、B. キングダオネンシス(B. qingdaonensis)、B. リグイ(B. rigui)、B. ルリス(B. ruris)、B. サフェンシス(B. safensis)、B. サラリウス(B. salarius)、B. サリフィルス(B. saliphilus)、B. シュリゲリイ(B. schlegelii)、B. セレナターセナティス(B. selenatarsenatis)、B. セレニティレデュセンス(B. selenitireducens)、B. セオハエアネンシス(B. seohaeanensis)、B. シャクレトニイ(B. shackletonii)、B. シアメンシス(B. siamensis)、B. シンプレックス、B. シラリス(B. siralis)、B. スミシイ(B. smithii)、B. ソリ(B. soli)、B. ソリサルシ、B. ソノレンシス(B. sonorensis)、B. スポロサーモデュランス(B. sporothermodurans)、B. ストラトスフェリカス(B. stratosphericus)、B. サブテラネウス(B. subterraneus)、B. サブチリス、B. タエアンシス(B. taeansis)、B. テキレンシス(B. tequilensis)、B. サームアンタルクティカス(B. thermantarcticus)、B. サーモアミロボランス(B. thermoamylovorans)、B. サーモクロアカエ(B. thermocloacae)、B. サーモラクチス(B. thermolactis)、B. チオパランス(B. thioparans)、B. チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、B. トリポキシリコーラ(B. tripoxylicola)、B. チュスシアエ(B. tusciae)、B. バリスモルティス(B. vallismortis)、B. ベデリ(B. vedderi)、B. ベトナメンシス(B. vietnamensis)、B. ビレティ(B. vireti)、B. ワコーエンシス(B. wakoensis)、B. ウェイヘンステファネンシス(B. weihenstephanensis)、B. シャオシエンシス(B. xiaoxiensis)、およびそれらの混合物またはブレンドが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で開示されるPGPRおよびその接種剤は、B. アミロリケファシエンス、またはB. アミロリケファシエンスと近縁関係にあるバチルス属種を含み得る。B. アミロリケファシエンス株Chilli-1 16SリボソームrDNA(GenBankアクセッション番号HQ021420.1)の部分配列を、SEQ ID NO:1として本明細書に提供する。B. アミロリケファシエンスと近縁関係にあるバチルス属種は、SEQ ID NO:1を含む16S rDNA配列を有するか、またはSEQ ID NO:1と少なくとも約98％もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義され得る。
【００２１】
本明細書で開示されるPGPRおよびその接種剤は、B. モジャベンシス、またはB. モジャベンシスと近縁関係にあるバチルス属種を含み得る。B. モジャベンシス株NBSL51 16SリボソームrDNA(GenBankアクセッション番号JN624928.1)の部分配列を、SEQ ID NO:2として本明細書に提供する。B. モジャベンシスと近縁関係にあるバチルス属種は、SEQ ID NO:2を含む16S rDNA配列を有するか、またはSEQ ID NO:2と少なくとも約98％もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義され得る。
【００２２】
本明細書で開示されるPGPRおよびその接種剤は、B. ソリサルシ、またはB. ソリサルシと近縁関係にあるバチルス属種を含み得る。B. ソリサルシ株YC1 16SリボソームrDNA(GenBankアクセッション番号NR_044387)の部分配列を、SEQ ID NO:3として本明細書に提供する。B. ソリサルシと近縁関係にあるバチルス属種は、SEQ ID NO:3を含む16S rDNA配列を有するか、またはSEQ ID NO:3と少なくとも約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義され得る。
【００２３】
本明細書で開示されるPGPRおよびその接種剤は、B. プミルス、またはB. プミルスと近縁関係にあるバチルス属種を含み得る。B. プミルス株TUB1 16SリボソームrDNA(GenBankアクセッション番号HE613653.1)の部分配列を、SEQ ID NO:4として本明細書に提供する。B. プミルスと近縁関係にあるバチルス属種は、SEQ ID NO:4を含む16S rDNA配列を有するか、またはSEQ ID NO:4と少なくとも約96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義され得る。
【００２４】
本明細書で開示されるPGPRおよびその接種剤は、B. シンプレックス、またはB. シンプレックスと近縁関係にあるバチルス属種を含み得る。B. シンプレックス株NH.259 16SリボソームrDNA(GenBankアクセッション番号EU627171.1)の部分配列を、SEQ ID NO:5として本明細書に提供する。B. シンプレックスと近縁関係にあるバチルス属種は、SEQ ID NO:5を含む16S rDNA配列を有するか、またはSEQ ID NO:5と少なくとも約93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義され得る。
【００２５】
本明細書で開示されるPGPRおよびその接種剤は、B. サブチリス、またはB. サブチリスと近縁関係にあるバチルス属種を含み得る。B. サブチリス株NH.259 16SリボソームrDNA(GenBankアクセッション番号EU627171.1)の部分配列を、SEQ ID NO:6として本明細書に提供する。B. サブチリスと近縁関係にあるバチルス属種は、SEQ ID NO:5を含む16S rDNA配列を有するか、またはSEQ ID NO:6と少なくとも約98％もしくは99％の配列同一性を有する16S rDNA配列を含む種と定義され得る。
【００２６】
バチルス属細菌を含む、本明細書に開示される接種剤のいくつかの態様において、バチルス属種はB. サブチリスではなく、B.サブチリスと近縁関係にあるバチルス属種でもない。B. サブチリスと近縁関係にないバチルス属種は、SEQ ID NO:5と99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、または91％以下の配列同一性を有する16S rDNA配列を有する種と定義され得る。
【００２７】
「配列同一性の割合」は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information；NCBI)ウェブサイトで利用可能である基本的局所アライメント検索ツール(BLAST)(すなわち、Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999)に記載されている「bl2seq」、「Blast 2配列‐タンパク質およびヌクレオチドの配列を比較するための新規ツール」、FEMS Microbiol Lett. 174:247-250、これらは全体として参照により本明細書に組み入れられる)を用いて、同等の長さの2つの配列を整列させることによって決定することができる。例えば、SEQ ID NO:1とSEQ ID NO:5との間の配列同一性の割合は、NCBIウェブサイトで提供されているオンラインBLASTソフトウェアを用いて、これら2つの配列を整列させることによって決定することができる。
【００２８】
2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の「配列同一性の割合」はまた、MEGA 4(Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599)、好ましくはバージョン4.0.2またはそれ以降のもので実行される、4つのヌクレオチド頻度が同じであり、置換率が部位間で異ならないと仮定して、転位および転換置換率を考慮に入れて複数のヒットを補正するKimura 2-パラメータ距離モデルを用いて決定することもできる。ギャップ開始および伸長ペナルティーを、それぞれ15および6.66に設定する。終末ギャップにはペナルティーを科さない。遅延多様配列交換(delay divergent sequences switch)を30に設定する。完全なミスマッチと一致対スコアとの間のバランスとして、転位重みスコアを0.5に設定する。用いられるDNA重み行列はIUBスコアリング行列であり、この場合、xおよびnをいずれかのIUB曖昧表記に対して一致させ、一致はすべてスコア1.9、およびミスマッチはすべてスコア0とする。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「ブレンド8」とは、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-188、バチルス・モジャベンシス株AP-209、バチルス・ソリサルシ株AP-217、およびバチルス・アミロリケファシエンス株AP-218を含むバチルス属細菌の混合物を指す。(表1を参照されたい)。本明細書で用いられる場合、「ブレンド9」とは、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-136、バチルス・モジャベンシス株AP-188、バチルス・ソリサルシ株AP-219、およびバチルス・アミロリケファシエンス株AP-295を含むバチルス属細菌の混合物を指す。
【００３０】
ここで開示されるPGPRを用いて植物を処理して、処理植物においてVOC産生を誘導することができる。例えば、ここで開示されるPGPRを、植物を処理するための接種剤として製剤化することができる。本明細書で企図される処理の方法は、植物の葉、茎、または根を直接処理することを含む、植物を直接処理する段階を含み得る。本明細書で企図される処理の方法は、例えば、植物の種子を植え付ける前にその種子を処理して、処理植物を生産する段階を含み得る。本明細書で企図される方法はまた、例えば、植物を取り囲む土壌または環境を処理することにより(例えば、畝間内の顆粒状または液状適用)、植物を間接的に処理する段階を含み得る。処理の適切な方法は、高圧もしくは低圧噴霧、浸透、および/または注入により、PGPRを含む接種剤を適用する段階を含み得る。植物種子は、低圧もしくは高圧噴霧、被覆、浸漬、および/または注入を適用することによって、処理することができる。植物種子をこのように処理した後、種子を植え付け、栽培して、植物を生産することができる。このような種子から繁殖した植物を、1回または複数回の適用でさらに処理してもよい。適切な適用濃度は、経験的に決定することができる。植物に対する噴霧としてPGPRが適用されるいくつかの態様において、適切な適用濃度は、106〜1018コロニー形成単位(cfu)/植物1ヘクタール、より一般的には107〜1015 cfu/ヘクタールを噴霧することを含み得る。被覆種子については、いくつかの態様において、適切な適用濃度は、102〜108 cfu/種子、好ましくは104〜107 cfu/種子であってよい。他の態様において、PGPRは、約102〜1012 cfu/ml、104〜1010 cfu/ml、または約106〜108 cfu/mlの濃度で、実生根浸液としてまたは土壌水薬として適用することもできる。
【００３１】
PGPRは、組成物(例えば、接種材料など)中で、適切な担体と共に適用することができる。適切な担体には、水またはその他の水溶液、スラリー、固形物(例えば、ピート、コムギ、ふすま、バーミキュライト、および殺菌土)、または乾燥粉末が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、組成物は、102〜1012 cfu/担体1 ml、または104〜1010 cfu/担体1 ml、または106〜108 cfu/担体1 mlを含む。組成物は、緩衝剤、界面活性剤、補助剤、または被覆剤を含む付加的な添加剤を含み得る。
【００３２】
処理植物に対する昆虫行動を変更するために、ここに開示される方法を実施することができる。本明細書で用いられる場合、昆虫行動を「変更すること」は、好ましくない昆虫行動を減少させるかもしくは妨げること、および/または好ましい昆虫行動を増加させることを含み得る。好ましくない昆虫行動を減少させるかまたは妨げることは、昆虫による損傷を減少させるかまたは妨げることを含み得る。例えば、本方法を実行して、処理植物に対する草食性昆虫の摂食を減少させるかまたは妨げることができる。好ましくは、本方法は、処理植物の摂食を、非処理植物に対して少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％減少させる。摂食の減少は、処理植物と非処理植物を摂食する幼虫の体重をある期間にわたって比較することにより、測定することができる。摂食の減少はまた、時間当たりの、昆虫の摂食による植物喪失の質量を比較することによって測定することもできる。本方法を実行して、処理植物に対する草食性昆虫の産卵を減少させるかまたは妨げることもできる。好ましくは、本方法は、処理植物に対する産卵(egg-laying)(すなわち、産卵(oviposition))を、非処理植物に対して少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％減少させる。産卵の減少は、処理植物と非処理植物に対する昆虫1匹当たりの産卵(例えば、卵の総数および/または卵塊の総数)を比較することにより、測定することができる。ここに開示される方法によって行動が変更され得る草食性昆虫には、シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)およびモンシロチョウ(Pieris rapae)が含まれ得るが、これらに限定されない。本方法を実行して、これらに限定されないが、捕食性昆虫または昆虫捕食寄生者を含む、昆虫の天敵を処理植物に対して誘引することもできる。捕食性昆虫には、テントウムシ(すなわち、テントウムシ科)、サシガメ(すなわち、サシガメ科)、オオメカメムシ(すなわち、オオメナガカメムシ科)、ハナカメムシ(すなわち、ハナカメムシ科)、マキバサシガメ(すなわち、マキバサシガメ科)、クサカゲロウ(すなわち、アミメカゲロウ目)、および捕食性ダニ(すなわち、カブリダニ科)が含まれ得るが、これらに限定されない。昆虫捕食寄生者には、コマユバチ(例えば、コテシア マルギニフェントリス(Cotesia marginiventris)、オオタバコガコマユバチ(Microplitis croceipes)、コテシア ルベクラ(Cotesia rubecula)、およびコレマンアブラバチ(Aphidius colemani))、ヒメバチ、コバチ(例えば、エレツモケルス属(Eretmocerus)種およびオンシツツヤコバチ(Encarsia formosa))、およびヤドリバエが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００３３】
説明的態様
以下の態様は説明であって、主張される主題を限定することは意図されていない。
【００３４】
態様1. 植物成長促進根圏細菌(PGPR)で処理した植物による1種または複数種の揮発性有機化合物(VOC)の産生を誘導する単離されたPGPRであって、任意でアクチノバクター属、アルカリゲネス属、バチルス属、バークホルデリア属、ブティアウクセラ属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、クライベラ属、シュードモナス属、ラーネラ属、ラルストニア属、リゾビウム属、セラチア属、ステノトロフォモナス属、パエニバチルス属、およびリシニバチルス属からなる群より選択される属より選択される、PGPR。
【００３５】
態様2. 1種または複数種のVOCが、PGPRおよびその接種剤からなる群より選択される1種または複数種の化合物を含む、態様1または2記載のPGPR。
【００３６】
態様3. 1種または複数種のVOCが、1種または複数種のVOCに曝露された昆虫の行動を変更する、前記態様のいずれかに記載のPGPR。
【００３７】
態様4. 昆虫が草食動物であり、1種または複数種のVOCが植物に対する昆虫の産卵を減少させる、前記態様のいずれかに記載のPGPR。
【００３８】
態様5. 昆虫が草食動物であり、1種または複数種のVOCが植物に対する昆虫の摂食を減少させる、前記態様のいずれかに記載のPGPR。
【００３９】
態様6. 昆虫が捕食者または捕食寄生者であり、1種または複数種のVOCが植物に対して捕食者または捕食寄生者を誘引する、前記態様のいずれかに記載のPGPR。
【００４０】
態様7. B. アシディセラー、B. アシディコーラ、B. アシディプロデュセンス、B. アエオリウス、B.アエリウス、B. アエロフィルス、B. アガラドハエレンス、B. アイディンゲンシス、B. アキバイ、B. アルカロフィルス、B. アルギコーラ、B. アルカリニトリリクス、B. アルカリセディミニス、B. アルカリテルリス、B. アルティチュジニス、B. アルベアユエンシス、B. アミロリケファシエンス、B. アンスラシス、B. アクイマリス、B. アルセニカス、B. アリャブハッタイ、B. アサヒイ、B. アトロファエウス、B. アウランティアカス、B. アゾトフォルマンス、B. バディウス、B. ババリカス、B. バタビエンシス、B. ベイジンゲンシス、B. ベンゾエボランス、B. ベベリドゲイ、B. ボゴリエンシス、B. ボロニフィルス、B. ブタノリボランス、B. カナベラリウス、B. カルボニフィルス、B. セセンベンシス、B. セルロシリティカス、B. セレウス、B. チャガノレンシス、B. チャガンゲンシス、B. シビー、B. サークランス、B. クラキイ、B. クラウシイ、B. コアグランス、B. コアフイレンシス、B. コーニイ、B. デシシフロンディス、B. デコロラティオニス、B. ドレンテンシス、B. ファラギニ、B. フォスティディオサス、B. ファーマス、B. フレクス、B. フォラミニス、B. フォルディイ、B. フォルティス、B. フマリオリ、B. フニクルス、B. ガラクトシディリティカス、B. ガリシエンシス、B. ゲラティニ、B. ギブソニイ、B. ギンセンギ、B. ギンセンギフミ、B. グラミニス、B. ハルマパルス、B. ハロチャレス、B. ハロデュランス、B. ヘミセルロシライティカス、B. ハーバートステイネンシス、B. ホリコシイ、B. ホルネッキアエ、B. ホルティ、B. ヒュミ、B. ヒュワジンポエンシス、B. イドリエンシス、B. インディカス、B. インファンティス、B. インフェルナス、B. イサベリアエ、B. イスロネンシス、B. ジェトガリ、B. コーリエンシス、B. コルレンシス、B. クリベンシス、B. クルウィチアエ、B. レヘンシス、B. レンタス、B. リケニフォルミス、B. リトラリース、B. ロシサリス、B. ルシフェレンシス、B. ルテオルス、B. マカウエンシス、B. マキアエ、B. マンナニライティカス、B. マリスフラビ、B. マルマレンシス、B. マシリエンシス、B. メガテリウム、B. メタノリカス、B. メチロトロフィカス、B. モジャベンシス、B. ムラリス，B. ムリマルティニ、B. マイコイデス、B. ナンハイエンシス、B. ナンハイイセディミニス、B. ネアルソニイ、B. ネイゾウエンシス、B. ニアベンシス、B. ナイアシニ、B. ノバリス、B. オセアニセディミニス、B. オデッセイ、B. オクヘンシス、B. オクヒデンシス、B. オレロニウス、B. オーシメンシス、B. パナシテラエ、B. パタゴニエンシス、B. ペルセポレンシス、B. プラコルチディス、B. ポチェオネンシス、B. ポリゴニ、B. シュードアルカリフィルス、B. シュードファーマス、B. シュードマイコイデス、B. サイクロデュランス、B. プミルス、B. キングダオネンシス、B. リグイ、B. ルリス、B. サフェンシス、B. サラリウス、B. サリフィルス、B. シュリゲリイ、B. セレナターセナティス、B. セレニティレデュセンス、B. セオハエアネンシス、B. シャクレトニイ、B. シアメンシス、B. シンプレックス、B. シラリス、B. スミシイ、B. ソリ、B. ソリサルシ、B. ソノレンシス、B. スポロサーモデュランス、B. ストラトスフェリカス、B. サブテラネウス、B. サブチリス、B. タエ���ンシス、B. テキレンシス、B. サームアンタルクティカス、B. サーモアミロボランス、B. サーモクロアカエ、B. サーモラクチス、B. チオパランス、B. チューリンゲンシス、B. トリポキシリコーラ、B. チュスシアエ、B. バリスモルティス、B. ベデリ、B. ベトナメンシス、B. ビレティ、B. ワコーエンシス、B. ウェイヘンステファネンシス、B. シャオシエンシス、およびそれらの混合物またはブレンドからなる群より選択されるバチルス属細菌である、前記態様のいずれかに記載のPGPR。
【００４１】
態様8. SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:6を含む16S rDNA核酸配列を有する、態様7記載のバチルス属細菌。
【００４２】
態様9. SEQ ID NO:1と少なくとも98％同一である16S rDNA核酸配列を有する、態様7記載のバチルス属細菌。
【００４３】
態様10. SEQ ID NO:2と少なくとも98％同一である16S rDNA核酸配列を有する、態様7〜9のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００４４】
態様11. SEQ ID NO:3と少なくとも91％同一である16S rDNA核酸配列を有する、態様7〜10のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００４５】
態様12. SEQ ID NO:4と少なくとも96％同一である16S rDNA核酸配列を有する、態様7〜11のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００４６】
態様13. SEQ ID NO:5と少なくとも93％同一である16S rDNA核酸配列を有する、態様7〜12のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００４７】
態様14. SEQ ID NO:6と少なくとも98％同一である16S rDNA核酸配列を有する、態様7〜13のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００４８】
態様14. バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ソリサルシ、バチルス・プミルス、バチルス・シンプレックス、バチルス・サブチリス、およびそれらの混合物からなる群より選択される、態様7記載のバチルス属細菌。
【００４９】
態様15. バチルス・アミロリケファシエンスである、態様7記載のバチルス属細菌。
【００５０】
態様16. バチルス・アミロリケファシエンス株AP-136、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-188、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-218、バチルス・アミロリケファシエンス株AP-219、およびバチルス・アミロリケファシエンス株AP-295からなる群より選択される、態様15記載のバチルス属細菌。
【００５１】
態様17. バチルス・モジャベンシスである、態様7記載のバチルス属細菌。
【００５２】
態様18. バチルス・モジャベンシス株AP-209である、態様17記載のバチルス属細菌。
【００５３】
態様19. バチルス・ソリサルシである、態様7記載のバチルス属細菌。
【００５４】
態様20. バチルス・ソリサルシ株AP-217である、態様19記載のバチルス属細菌。
【００５５】
態様21. バチルス・プミルスである、態様7記載のバチルス属細菌。
【００５６】
態様22. バチルス・プミルス株INR7である、態様21記載のバチルス属細菌。
【００５７】
態様23. バチルス・シンプレックスである、態様7記載のバチルス属細菌。
【００５８】
態様24. バチルス・シンプレックス株ABU 288である、態様23記載のバチルス属細菌。
【００５９】
態様25. バチルス・サブチリス株MBI 600である、態様7記載のバチルス属細菌。
【００６０】
態様26. バチルス属種の混合物を含む、態様7記載のバチルス属細菌。
【００６１】
態様27. 前記態様のいずれかに記載のPGPRおよび担体を含む、植物のための接種剤。
【００６２】
態様28. 植物ホルモン、抗菌化合物、またはその両方をさらに含む、態様27記載の接種剤。
【００６３】
態様29. 植物ホルモンが、アセトイン、2,3-ブタンジオール、およびインドール-酢酸からなる群より選択され、抗菌化合物が、フェニルエタノールおよび4-ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される、態様28記載の接種剤。
【００６４】
態様30. 態様27〜29のいずれかに記載の接種剤を、植物に、植物の種子に、または植物を取り囲む土壌に施す段階を含む、植物に対する昆虫行動を変更する方法。
【００６５】
態様31. 昆虫が草食動物であり、方法が、植物に対する昆虫の産卵を減少させる、態様30記載の方法。
【００６６】
態様32. 昆虫が草食動物であり、方法が、植物に対する昆虫の摂食を減少させる、態様30または31記載の方法。
【００６７】
態様33. 昆虫が捕食者または捕食寄生者であり、方法が、植物に対して捕食者または捕食寄生者を誘引する、態様30〜32のいずれかに記載の方法。
【００６８】
態様34. 植物が、アルファルファ、イネ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エンドウマメ、レンズマメ、チコリー、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、テンサイ、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、スカッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、セイヨウナシ、メロン、カンキツ類、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、春コムギ、冬コムギ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビからなる群より選択される、態様30〜33のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は説明であって、主張される主題の範囲を限定することは意図されていない。
【００７０】
実施例1‐ワタ植物揮発性物質の誘導および捕食寄生者の誘引に及ぼす植物成長促進根圏細菌の効果
要約
寄生バチ(捕食寄生者)は、宿主位置の手掛かりとして、様々な種類の宿主関連揮発性シグナルを使用することが知られている。これらの揮発性シグナルは、植物に基づき得るか、草食動物宿主に由来し得るか、または草食動物とそれらの植物宿主との間の相互作用から生じ得る。害虫集団の抑制における捕食寄生者の成功は、複雑な嗅覚および視覚環境において宿主の位置を見つけるそれらの能力に依存する。宿主-捕食寄生者相互作用への強い関心にもかかわらず、この群の昆虫における嗅覚コミュニケーションのある局面は、十分に理解されていない。
【００７１】
ここで、ワタ揮発性物質の誘導および捕食寄生者の応答への影響に対する植物成長促進根圏細菌(PGPR)の可能性を評価するために、研究を行った。3種類のPGPR処理を評価した：i) バチルス・プミルス株INR-7、およびバチルス属細菌の2種類のブレンド。非処理(水)対照もまた試験した。PGPR処理したワタ植物と非処理のワタ植物から収集されたヘッドスペース揮発性物質には、量的および質的な差があった。PGPR処理したワタ植物のヘッドスペースからは、VOCを示す合計11個のピークが検出されたが、非処理のワタ植物では3つのピークしか検出されなかった。PGPR処理した植物と非処理の植物との根の成長の差を記録した。
【００７２】
導入
植物成長促進根圏細菌(PGPR)とは、根に定着する多種の細菌を意味し、これらの細菌の適用は、植物成長速度の上昇(Kloepper 1992、Zehnder et al. 1997、Kloepper et al. 2004)、土壌病原体の抑制(Schippers et al. 1987、Burkett-Cadena et al. 2008)、および害虫に対する全身抵抗性の誘導(van Loon et al. 1998、Kloepper et al. 1999、Ramamoorthy et al. 2001、Zehnder et al. 2001、Ryu et al. 2004、Ji et al. 2006)と関連している場合が多い。PGPRに基づく接種剤には、単一の株、2つの株の混合物、またはバチルス属種の複雑な混合物を含む製剤が含まれる(Lucy et al. 2004、Kloepper and Ryu, 2006)。植物揮発性物質の誘導が多くの因子に依存するという証拠にもかかわらず、処理植物における揮発性有機化合物(VOC)の誘導に及ぼすPGPRの適用の効果は実質的に未調査である。植物ホルモン(de Bruxelles and Roberts, 2001、Thaler et al. 2002、Farmer et al. 2003、Ament et al. 2004)、草食動物由来誘発物(Mattiaci et al. 1995、Alborn et al. 1997、Spiteller and Boland, 2003)、および病原体を含む関連微生物(Preston et al. 1999、Cardoza et al. 2002)を含む相互作用的(interactionsiotic)因子、ならびに創傷(Mithofer et al. 2005)、重金属(Mithofer et al. 2004)、および温度と光(Takabayashi et al. 1994、Gouinguene and Turlings 2002)を含む非生物的因子。PGPRが、米国またはインドで、ワタ(Gossypium hirsutum L.)、トマト(Solanum lycopersicum L.)、スイカ(Citrullus lanatus Thunb.)、およびトウジンビエ(Pennisetum glaucum)を含むいくつかの農作物の生産においてますます適用されてきていることを考えれば(Glick 1995、Backman et al. 1997、Cleyet-Marcel et al. 2001、Kokalis-Burelle et al. 2003、Niranjan Raj et al. 2003、Burkett-Cadena et al. 2008)、植物揮発性物質の誘導に及ぼすPGPRの効果に関する研究が不足していることは、驚くべきことである。1997年にBackmanらは、米国の綿花作物の60〜75％が、フサリウム属およびリゾクトニア属土壌病原体の抑制のために用いられるバチルス・サブチリス生成物であるPGPR生成物Kodiak(登録商標)で処理されていることを報告した。PGPRはこれまで、農作物を処理するために大規模に使用されてきた。
【００７３】
適切な宿主植物の探索においてVOCを用いる草食動物と同様に(Dicke et al. 2000)、寄生性昆虫もまた、採餌のため、およびそれらの草食動物宿主の宿主位置を見つけるために、VOCのブレンドを用いることが知られている(Turlings et al. 1990、McCall et al. 1993、De Moraes et al. 1998)。これらのVOCは、植物、草食動物宿主に由来し得るか、または草食動物と植物との間の相互作用の結果であり得る(McCall et al., 1994、Cortesero et al. 1997)。植物に基づくVOCは、機械的損傷に応答して、または草食動物の摂食の開始時に直ちに放出される緑葉揮発性物質(GLV)と、草食動物摂食損傷に対する遅延反応として排出される草食動物誘導性植物揮発性物質(HIPV)にさらに分類される。タバコガコマユバチ(Microplitis croceipes (Cresson))およびコテシア マルギニフェントリス(Cotesia marginiventris (Cresson))(ハチ目：コマユバチ科)を含む、ワタ草食動物の捕食寄生者に対して高度に誘引性であるVOCのこれらのブレンドは、イモムシの摂食に応答して放出される(De Moraes et al. 1998、Chen and Fadamiro 2007、Ngumbi et al. 2009, 2010)。PGPRが、採餌捕食寄生者、ならびに他の化学的に媒介される昆虫-植物および3者間相互作用に対する重要な影響を伴って、ワタにおけるVOC産生に影響を及ぼし得る可能性がある。
【００７４】
ここで、PGPRがワタ植物VOCの変化を誘発し、ワタ根の成長を変化させ得るという仮説を試験した。加えて、ワタ草食動物の捕食寄生者が、VOCの排出の変化により、非処理のワタ植物と比較して、PGPR処理したワタ植物に対してより高い関心を示すと仮定された。PGPR処理したワタ植物および非処理のワタ植物を温室条件下で成長させ、植え付けから4〜6週間後にヘッドスペース揮発性物質を収集した。連結ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)を用いて、PGPR処理したワタ植物および非処理のワタ植物からのヘッドスペース揮発性物質を同定し解析した。4チャネル型オルファクトメーターを用いて、PGPR処理した植物と非処理の植物を提示された場合のオオタバコガコマユバチの行動を研究した。本発明者らの知る限りでは、これは、ワタ植物によるVOCの産生に影響を及ぼすPGPRの最初の報告である。
【００７５】
材料および方法
PGPR株
表1に示すように、バチルス属種の合計8つの株(すべてオーバーン ユニバーシティ(Auburn University)による)を用いて、研究がなされる3種類のPGPR処理を開発した：i) バチルス・プミルス株INR-7(AP 18)、ii) ブレンド8、バチルス属種の4つの株(AP 188、209、217、218)を含む、およびiii) ブレンド9、バチルス属種の4つの株(AP 136、188、219、295)を含む。
【００７６】
（表１）PGPR調製物
2014503517.tif 000003
【００７７】
植物
従来品種(G. hirsutum) Max-9ワタ種子(All-Tex Seed, Inc.)を、表土/バーミキュライト/ピートモス混合物で満たした円形プラスチック鉢(高さ9 cm、直径11 cm)で個々に成長させた。次いで、25℃±10、15:9 h(L/D)光周期、および50±10％相対湿度の温室(オーバーン ユニバーシティ植物科学温室設備(Auburn University Plant Science Greenhouse Facility))において、種子を個々の鉢(高さ9 cm、直径11 cm)で成長させた。PGPR処理は、水性胞子懸濁液(胞子1×107個/ml)として、播種する際に適用した(1 ml/種子)。週に1度、PGPR処理植物に、水性細菌懸濁液(1×109 cfu/ml)としての1 mlの付加的な処理を受容させた。ヘッドスペース揮発性物質の収集に使用した植物は、植え付け日から4〜6週齢であった。
【００７８】
昆虫
オオタバコガコマユバチの親養殖物は、USDA-ARS、昆虫生物学および個体群管理研究所(Insect Biology and Population Management Research Laboratory) (Tifton, Georgia)によって提供された。オオタバコガコマユバチは、Lewis and Burton (1970)の手順と同様の手順を用いて、その好ましい宿主であるオオタバコガ(Heliothis virescens (Fab.)) チョウ目：ヤガ科の幼虫(Stadelbacher et al. 1984、King et al. 1985)上で飼育した。Benzone Research(Carlisle, PA, USA)から購入した卵を用いて、実験室で調製したウズラ豆食餌上で、オオタバコガの実験室コロニーの飼育を開始した(Shoery and Hale 1965)。コロニーはすべて、25±1℃、75±5％ RH、およびL14:D10光周期で維持した。新たに発生したオオタバコガコマユバチ成虫は、交配前に回収し、性別を判別し、水および糖供給源を供給した直径6-cmのプラスチックペトリ皿内に異性の個体の対(交配個体)として収容した。水は、0.5 ml微量遠心チューブに蒸留水を満たし、チューブのキャップに開けた穴に綿糸を通すことによって提供した。約5滴(2μl/滴)の10％糖溶液を、ペトリ皿カバーの内部に綿棒で塗り付けた。無処置の捕食寄生者(3〜5日齢)をバイオアッセイに使用した。
【００７９】
ヘッドスペース揮発性物質の収集およびGC解析
揮発性物質の収集に使用した方法論およびプロトコールは、いくつかの修正を加えたが、Gouinguene et al. (2005)によって報告されたものと同様であった。PGPR処理したおよび非処理のワタ植物、ならびにPGPR処理したおよび非処理の、イモムシによって損傷したワタ植物の両方から、ヘッドスペース揮発性物質を収集した。PGPR処理したおよび非処理の植物から草食動物誘導性植物揮発性物質(HIPV)を検出するため、オオタバコガ(チョウ目：ヤガ科)の二齢幼虫30匹を鉢植えのワタ植物上で12時間摂食させてから、揮発性物質を収集した。鉢植え用の土壌を含む鉢は、土壌からの水および揮発性物質の蒸発を最小限にするために、アルミホイルで覆った。次に、5 Lガラスジャーからなる揮発性物質収集チャンバー(Analytical Research Systems, Inc.、Gainesville, FL)内に植物を置いた。24時間にわたり室温で、500 ml/分の精製(活性炭を使用)気流をジャーに通した。50 mgのSuper-Q(Alltech Associates、Deerfield, IL)を含むトラップを用いて、ヘッドスペース揮発性物質を収集し、200μlの塩化メチレンで溶出した。溶出物(200μl)は、使用時まで冷凍庫(-20℃)で保存した。鉢植え用の土壌を含むが、植物を含まない別の容器を用いて、種々の不純物およびバックグラウンドノイズを調べた。1μlの各ヘッドスペース揮発性物質抽出物を、フレームイオン化検出器(FID)を備えたShimadzu GC-17Aに注入した。使用したキャピラリーカラムの寸法は、以下の通りであった：Rtx-1MS、内径0.25 mm、膜厚0.25μm(Restek、Bellefonte, PA)。ヘリウムを、1 ml/分の流速で担体ガスとして使用した。GCオーブンを以下のようにプログラムした：40℃で注入、40℃で2分間保持、次に合計40分かけて5℃/分で200℃まで上昇。注射器および検出器はいずれも、温度を200℃に設定した。5回の繰り返しを行った。
【００８０】
GC-MS解析
その後、HP-5msキャピラリーカラム(30 m×内径0.25 mm、膜厚0.25μm)を備えた、5975C質量選択検出器に連結されたAgilent 7890A GCを用いて、GC-MSにより各植物処理のGCプロファイルを同定した。1μlの各ヘッドスペース抽出物を、上記のGC条件を用いて、スプリットレスモードでGCに注入した。電子衝撃(EI、70 eV)を用いて、質量スペクトルを得た。ピークの同定は、NIST 98ライブラリー(米国立標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology)、Gaithersburg, Maryland)、およびワタヘッドスペース揮発性物質の公表されたGCプロファイル(Thompson et al. 1971、Loughrin et al. 1994、McCall et al. 1994)との比較を用いて行った。同定された化合物の構造は、Sigma(登録商標) Chemical Co.(St. Louis, Missouri)から入手した純度＞97％(ラベルに表示)を有する市販の合成標準物質を用いて確認した。
【００８１】
ワタ根の成長の解析
PGPRによるワタの処理がワタ根の成長に差をもたらすかどうかを判定するために、別個の実験を行った。胞子濃度107の1 mlのPGPR(INR-7、ブレンド8、およびブレンド9)を、ワタの種子に適用した。次いで、25℃±10、15:9 h(L/D)光周期、および50±10％相対湿度の温室(オーバーン ユニバーシティ植物科学温室設備)において、PGPR処理した種子を個々の鉢(高さ15 cm、直径21 cm)で成長させた。種子は、表土/バーミキュライト/ピートモス混合物中に植え付けた。加えて、毎週、1 mlの水性細菌懸濁液(109) コロニー形成単位(cfu/ml)を適用した。ワタ根の成長解析に使用した植物は、2週齢であった。根を洗浄した後、スキャナーモデルLA 1600+およびWinRhizoソフトウェア(バージョン2004a)からなるRegent Instruments, Inc.(Sainte-Foy, Quebec)のシステムを用いて、各植物の発根システムについて根構造の解析を行った。2つの根パラメータ：根の表面積および根の体積(0〜0.5および0.5〜1.0 mm)について、得られた解析からデータを収集した。根の乾燥重量についてのデータもまた収集した。8回の繰り返しを行った。
【００８２】
捕食寄生者を用いた4チャネル型オルファクトメーターバイオアッセイ
PGPR処理した植物と非処理の植物、およびPGPR処理しイモムシによって損傷した植物と損傷していない植物の臭気に対するオオタバコガコマユバチの誘引を、4チャネル型オルファクトメーター(Analytical Research Systems、Gainesville, FL)を用いたバイオアッセイで評価した。装置は、Pettersson (1970)およびKalule and Wright (2004)によって記載されているシステムと同様であった。それは、四隅に開口部を有し、そこから精製および加湿された空気を引き入れ、4つの潜在的臭気領域を生み出す中央チャンバー、およびアームからの気流の混合が起こる中央開口部からなる。オルファクトメーターの隅の4つの開口部のそれぞれを通して、500 ml/分の一定した気流を維持した。対照アームからの空気と処理アームからの揮発性物質臭気の混合物は、2.5 l/分の一定した気流で、中央開口部を通してオルファクトメーターから引き出した。揮発性物質臭気は、植え付け後4〜6週齢の植物から発せられた。鉢植え用の土壌を含む鉢は、水および揮発性物質の蒸発を最小限にするために、アルミホイルで覆った。次に、5 Lガラスジャー(高さ32 cm、直径14.5 cm) 揮発性物質収集チャンバー(Analytical Research Systems, Inc.、Gainesville, FL USA)内に植物を置き、精製空気(500 ml/分)を、チャンバーを通過させて、オルファクトメーターの隅の4つの開口部のそれぞれの中に入れた。
【００８３】
すべての実験において、無処置の3〜5日齢の雌オオタバコガコマユバチを使用した。吸引器を用いてケージからハチを取り出し、ガラスチューブ(1.5 cm)中に個々に導入した。ガラスチューブをオルファクトメーターの中央開口部に接続して、ハチを揮発性物質臭気/空気混合物に曝露した。チャンバー内に入れたならば、4つの空気領域の中から選択するよう、捕食寄生者に15分間与えた。捕食寄生者がこの期間内に選択を行わなかった場合には、これを除去し、廃棄し、解析には含めなかった。チャンバー内でのいかなる方向の偏りも取り除くため、8匹の捕食寄生者を試験した後に、オルファクトメーターおよび植物の位置を交換した。毎日、合計32匹の捕食寄生者を試験した(捕食寄生者8匹/交換)。4チャネル型オルファクトメーターでの3セットの実験を実施して、雌オオタバコガコマユバチが、放虫されていないワタ植物と放虫されたワタ植物、およびPGPR処理したワタ植物と非処理のワタ植物に対して異なって反応するかどうかを試験した。第1の実験では、以下の2つの処理および2つの対照を比較した：(1) PGPR INR7で処理した植物、(2) PGPRブレンド9で処理した植物、(3) 非処理(対照)の植物、および(4) ブランク対照(空チャンバー)。非処理(対照)の植物と比較して、PGPRブレンド9で処理した植物に対する捕食寄生者の有意な誘引を示した第1の実験の結果(図6)に基づいて、第2の実験を行い、植物に対して捕食寄生者を誘引する上で、PGPR処理がイモムシの放虫/損傷と同程度に効果的であるかどうかを判定した。この実験では、以前の実験による結果に基づいてPGPR処理(ブレンド9)を選択し、以下からの揮発性物質臭気を比較した：(1) PGPRブレンド9で処理し、放虫された植物、(2) PGPRブレンド9で処理し、放虫されていない植物、(3) 非処理(対照)で、放虫された植物、および(4) 対照(空チャンバー)。各植物には、オオタバコガのイモムシ30匹を放虫した。非処理(対照)で、30匹のイモムシを放虫した植物が、PGPRブレンド9で処理し、30匹のイモムシを放虫した植物と同程度に、捕食寄生者に対して誘引性であったことを示す第2の実験の結果に基づいて、第3の実験を行った。このことから、PGPR処理が、第2の実験において試験されたレベルよりも低レベルの、イモムシによる損傷を示し得ることが示唆された。この仮説を試験するため、および、植物に対して捕食寄生者を誘引する上で、イモムシによる低レベルの損傷と同程度にPGPR処理が有効であるかどうかを判定するために、放虫される各植物には2匹のオオタバコガ幼虫を放虫したこと以外は、実験2で試験したのと同じ処理および対照を比較した。
【００８４】
4チャネル型オルファクトメーターバイオアッセイは、25±1℃、60±5％ r.h.、および250 luxで、毎日10:00〜18:00時の間に行った。第1の実験は5回繰り返し、実験2および3は4回繰り返した。各繰り返しについて、植物の新たなセットを使用した。
【００８５】
統計解析
データは分散分析の重要な仮定を満たしていたため解析前に変換を行わなかった。PGPR処理した(バチルス・プミルス株INR-7、ブレンド8、およびブレンド9)植物と非処理の植物によって排出された各揮発性物質成分の量の有意差は、分散分析(ANOVA)およびそれに続くチューキー・クレーマーHSD多重比較検定を用いて確証した(P＜0.05、JMP 7.0.1、SAS Institute 2007)。ワタ根の成長の有意差は、ANOVAおよびそれに続くチューキー・クレーマーHSD多重比較検定によって確証した(P＜0.05、JMP 7.0.1、SAS Institute 2007)。4チャネル型オルファクトメーターデータは、一元配置ANOVAおよびそれに続くチューキー・クレーマーHSD多重比較検定によって解析した(P＜0.05、JMP 7.0.1、SAS Institute 2007)。
【００８６】
結果
ヘッドスペース揮発性物質のGCおよびGC-MS解析
PGPR処理したワタ植物および非処理のワタ植物に由来するヘッドスペース揮発性物質の抽出物のGCプロファイルを図1に示す。PGPR処理した(INR-7、ブレンド8、およびブレンド9)ワタ植物のヘッドスペースにおいて、合計11個のピーク(揮発性物質成分)が検出された(図1)。これらのピークには、GC-MSによって同定されるように、α-ピネン、β-ピネン、β-ミルセン、酢酸シス-3-ヘキセニル、リモネン、(β)-オシメン、リナロール、カリオフィレン、α-フムレン、およびβ-ファルネセンが含まれた。これらのピークの大部分は、非処理のワタ植物のヘッドスペースにおいて検出されなかったか、またはわずかな量で検出された(図1)。3つのピーク(成分)のみが、非処理のワタ植物において検出可能であり、GC-MSにより、α-ピネン、酢酸シス-3-ヘキセニル、およびカリオフィレンと同定された。しかしながら、3つの成分はすべて、PGPR処理した植物のヘッドスペースにおいてはるかに大量に検出された。加えて、PGPR処理間の有意差も記録された(表2を参照されたい)。
【００８７】
（表２）非処理(対照)のワタ植物と、株INR-7、ブレンド8、またはブレンド9で処理したワタ植物によって排出されたヘッドスペース揮発性物質の組成
2014503517.tif 000004
注記：揮発性物質は24時間収集した。
aガスクロマトグラフィー中の溶出の順
b値(排出量)は、5回の繰り返しの平均ng量±SEである
異なる文字を付した同列の平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA)
【００８８】
PGPR株INR-7で処理したワタ植物は、ブレンド8またはブレンド9で処理した植物よりも有意に多くのα-ピネン、β-ピネン、β-ミルセン、酢酸シス-3-ヘキセニル、およびβ-オシメンを放出した(表2、図1)。加えて、β-オシメンはブレンド9において検出されなかった(表2、図1)。図2は、以下の4つの処理：非処理(対照)で、放虫されていない植物、非処理(対照)で、オオタバコガによる放虫された植物、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていない植物、およびPGPRブレンド9で処理し、オオタバコガによる放虫された植物によって排出されたヘッドスペース揮発性物質のGCプロファイルを示す。
【００８９】
非処理(対照)で、オオタバコガを放虫された植物、およびPGPRブレンド9で処理し、オオタバコガを放虫された植物の抽出物において、同一のピーク(28)が検出された(表3、図2)。しかしながら、非処理(対照)で、放虫されていない植物において検出されたわずか3つのピークと比較して、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていない植物では、10個のピーク(成分)が検出された(図2)。
【００９０】
（表３）非処理(対照)で、放虫されていない植物と、非処理(対照)で、オオタバコガを放虫された植物、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていない植物、またはPGPRブレンド9で処理し、オオタバコガを放虫された植物によって排出されたヘッドスペース揮発性物質の組成
2014503517.tif 000005
注記：揮発性物質は24時間収集した。
1ガスクロマトグラフィー中の溶出の順
2値(排出量)は、5回の繰り返し抽出の平均ng量±SEである
異なる文字を付した同列の平均値は、有意差がある(P＜0.05、ANOVA)。
【００９１】
ワタ根の成長の解析
PGPR処理後に生じたワタ根の成長促進を図2、3、および4に示す。ワタの種子にPGPR株INR-7、ブレンド8、およびブレンド9を接種すると、非処理対照と比較して成長が有意に促進された。根の表面積(F3,7＝74.78、P＜0.0001；図3)、根の体積(F3,7＝50.42、P＜0.0001；図4)、および根の乾燥重量(F3,7＝28.07、P＜0.0001；図5)において、処理間で有意差が記録された。すべての場合において、ブレンド9で処理した植物が、最も大きな根の表面積、根の体積、および根の乾燥重量を有した。INR-7で処理した植物およびブレンド8で処理した植物もまた、非処理の植物よりも有意に高い根の成長パラメータを有した(図3、4、および5)。
【００９２】
捕食寄生者を用いた4チャネル型オルファクトメーターバイオアッセイ
第1の実験で、2つの処理および2つの対照に対する雌オオタバコガコマユバチの反応において有意差が記録された。捕食寄生者は、INR-7で処理した植物(29％)、非処理(対照)の植物(0％)、またはブランク対照(空チャンバー)(0％)と比較して、ブレンド9で処理した植物(69％)に対して有意に(F3,16＝106.64、P＜0.0001)より多く誘引された(図6)。植物に対して捕食寄生者を誘引する上で、PGPR処理がイモムシの放虫/損傷(30匹のオオタバコガ幼虫)と同程度に効果的であるかどうかを判定するように設計された実験2においても、処理間で有意差が記録された(F3,12＝35.92、P＜0.0001)。予測通り、PGPRブレンド9で処理し、30匹のイモムシを放虫した植物(46％)、および非処理(対照)で、30匹のイモムシを放虫した植物(41％)は、捕食寄生者に対して高度に誘引性であった。しかしながら、捕食寄生者は、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていない植物(13%)よりも、非処理(対照)で、30匹のイモムシを放虫した植物(41％)に対してより多く誘引され(図7)、このことから、捕食寄生者を誘引する上で、PGPR処理が30匹のイモムシの放虫ほど強力ではないことが示唆された。低レベルの放虫(植物当たり2匹のオオタバコガ幼虫)で試験した第3の実験の結果もまた、処理および対照の間の有意差を示した(F3,12＝7.12、P＝0.0053)。最も誘引的な処理は、PGPRブレンド9で処理し、2匹のイモムシを放虫した植物であった(58％)。しかしながら、有意により多くの捕食寄生者が、非処理(対照)で、2匹のイモムシを放虫した植物(15％)と比較して、PGPRブレンド9で処理し、放虫されていない植物(25%)に対して誘引された(図8)。これらの結果から、PGPR処理が、植物に対して捕食寄生者を誘引する上で、イモムシによる低レベルの損傷と少なくとも同程度に効果的であることが示された。
【００９３】
考察
これらの結果から、植物成長促進根圏細菌(PGPR)が、ワタ植物における揮発性有機化合物(VOC)産生を変更することが示される。PGPRがワタにおけるVOCの産生を変更するという発見は、根圏細菌による植物揮発性物質産生の誘発に関する未報告の機構を構成する。試験したPGPR処理(INR7、ブレンド8、およびブレンド9)はすべて、非処理のワタ植物では検出されなかったVOCの排出を誘発した。PGPR処理した植物のヘッドスペースにおいて、11個の成分が検出された。非処理植物のヘッドスペースでは、これらの化合物の大部分は検出されなかったか、またはわずかな量で検出された(3つのみが検出された)。VOC産生の変更に加えて、PGPR処理はまた、ワタ植物の根の成長の促進をもたらし、ブレンド9は最も高い根の成長促進を示した。PGPRは、いくつかの植物種において植物成長(根を含む)を促進することが以前に報告された。最も興味深いことには、4チャネル型オルファクトメーター実験の結果から、捕食寄生者が、PGPR処理した植物と非処理の植物を識別することができ、後者よりも前者を好むことが示される。
【００９４】
PGPR処理した植物のヘッドスペース収集物において検出された主要な成分は、α-ピネン、β-ピネン、β-ミルセン、酢酸シス-3-ヘキセニル、リモネン、β-オシメン、リナロール、カリオフィレン、α-フムレン、およびβ-ファルネセンであった(表2、図1)。これらの化合物は、イモムシによって損傷したワタ植物から排出されるVOCのブレンドの構成成分であることが以前に報告された(Loughrin et al. 1994、De Moraes et al. 1998、Ngumbi et al. 2009)。しかしながら、以前の報告とは異なり、PGPRによって誘導されるVOCのブレンドは、イモムシによって損傷した植物によって排出されるVOCとは質的に異なる(表3、図2)。VOCのブレンドの質の相違は、ブレンド中の特定成分の存在および/または成分の比率と定義される。これらの結果から、α-ピネン、β-ピネン、酢酸シス-3-ヘキセニル、リモネン、β-オシメン、リナロール、カリオフィレン、α-フムレン、およびβ-ファルネセンなどのいくつかのVOCが、PGPRによって誘発され得ることが示唆される。以前の研究から、植物におけるVOC産生は、植物ホルモン(de Bruxelles and Roberts, 2001、Thaler et al. 2002、Farmer et al. 2003、Ament et al. 2004)、草食動物由来誘発物(Mattiaci et al. 1995、Alborn et al. 1997、Spiteller and Boland, 2003)、病原体(Cardoza et al. 2002)、創傷(Mithofer et al. 2005)、および重金属(Mithofer et al. 2004)によって誘発され得ることが報告された。これらの知見から、PGPRがVOCの誘導を誘発することが実証され、PGPRによるワタ植物の処理が非処理の植物と異なるVOCの放出を引き起こす機構を理解するためには、さらなる研究が必要とされる。
【００９５】
ワタ根の解析に関するこれらのデータから、PGPR処理がワタ根の成長を増強したことが示唆される。PGPR処理の結果としての根重成長の増加は、スイートバジル(Ocimum basilicum L.)およびトマトを含む他の作物について記録されている(Kloepper 1992、Zehnder et al. 1997、Kloepper et al. 2004、Burkett-Cadena et al. 2008、Banchio et al. 2009、Humberto et al. 2010)。PGPRは、成長増強、ならびに種子発生、耐干性、および植物の苗条および根の重量の増加などの、植物における他の好ましい効果の目的のために、様々な作物に適用されている(Glick 1995、Kloepper et al. 2004、Kokalis-Burelle et al. 2006、Yildirim et al. 2006；van Loon, 2007)。Humbertoら(2010)は、成長促進バチルス・サチルスをトマト植物に接種すると、トマト根の成長促進が起こり、これが接種から3週間後に明白であることを示した。これらの知見は、ワタ根の成長促進が接種から2週間後に明白であったというこれらの結果を裏付ける。根の成長を促進することに加えて、PGPR処理した植物は、誘導全身抵抗性(ISR)としても知られる防御反応を誘発することにより(Kloepper et al. 2004)、または抗生作用により(Zehnder et al. 2001)、昆虫および病原体からそれ自身を防御する植物の能力を増強する。報告された例のうちのいくつかには、キュウリ(Cucumis sativa (L.))における昆虫草食性の減少(Zehnder et al. 1997)、およびタバココナジラミ(Bemicia tabaci)に対する抵抗性(Hanafi et al. 2007)が含まれる。
【００９６】
行動実験の結果から、専門の寄生バチ、オオタバコガコマユバチが、PGPR処理した植物と非処理の植物との相違を検出する、識別する、および利用する能力が明らかに示される。具体的には、PGPR処理した植物は寄生捕食者に対して高度に誘引性であり、ブレンド9で処理した植物が最も誘引性が高かった。さらなる評価により、ブレンド9で処理し、放虫されていない植物が、非処理で、低レベルでイモムシを放虫した植物(植物当たり2匹のオオタバコガ幼虫)よりも、寄生捕食者に対してさらにより誘引性が高いことが実証された。植物によって体系的に排出される揮発性有機化合物(VOC)は、採餌寄生捕食者のための宿主位置の手掛かりとして働き得る(Rose et al. 1998、De Moraes et al. 1998、Ngumbi et al. 2009)。これらの結果から、PGPR処理した植物は、非処理の植物と比較して、寄生捕食者に対して高度に誘引性であることが示された。これらの知見は、非処理植物のヘッドスペース中には存在しない、PGPR処理した植物によって産生されるVOCのブレンドに起因し得る。行動研究および触覚の電気生理学的研究を通して、これらのPGPR誘導性化合物は、天敵の誘引に結びつけられている(Rose et al. 1998、Chen and Fadamiro 2007、Ngumbi et al. 2009)。これらのデータから、専門の寄生バチ、オオタバコガコマユバチが、PGPR処理した植物と非処理の植物との相違を検出する、識別する、および利用する能力が明らかに示された。
【００９７】
試験したPGPR処理のうち、ブレンド9で処理した植物は、寄生捕食者に対して最も誘引性が高かった。興味深いことに、ブレンド9で処理した植物は一貫してβ-オシメンを放出しなかった。したがって、ブレンド9で処理した植物によって排出されるVOCのブレンド中にβ-オシメンが存在しないことが、PGPRブレンド9で処理した植物に対するオオタバコガコマユバチの誘引の増強の原因である可能性がある。以前の研究から、オオタバコガコマユバチと同様の捕食寄生者が、それらの草食動物宿主を探索する場合に、VOCのブレンドにおける質的および量的な相違を検出および利用し得ることが報告された(De Moraes et al. 1998)。モモアカアブラムシ(Myzus persiae)(カメムシ目：アブラムシ科)の天敵に及ぼすPGPRの影響を調べる関連研究において、Boutard-Huntら(2009)は、天敵の密度が、非処理の鉢と比較してPGPRで処理した鉢において有意により高いことを報告した。特異的でかつ信頼性のある化学的シグナルを提供することにより、植物は草食動物天敵の動員において競争優位性を獲得し得る。
【００９８】
要約すると、これらの結果から、PGPR(植物成長促進根圏細菌)の単一の株またはいくつかの株のブレンドによるワタ植物の処理が、採餌寄生捕食者に対する重要な影響を伴って、ワタ植物VOCの変化を誘発することが示される。まとめると、結果から、HIPVの排出増加による可能性が最も高いが、PGPR処理が、植物に対する寄生捕食者の誘引に必要な、イモムシによる低レベルの損傷を示し得ることが示唆される。これらの知見により、昆虫-植物および3者間相互作用の媒介におけるPGPRの新たな機能が確証される。
【００９９】
PGPRによるVOCの排出増加および誘導が、様々な生態学的条件下で、複数の作物における共通の現象であるのかどうかを調べるために、さらなる研究が必要である。他の作付体系における重要な天敵種が、PGPR処理した植物に対して同様の反応を示すかどうかを試験するために、付加的な研究が必要である。確認されたならば、そのような研究の結果は、PGPRによる植物の処理が、多くの農業生態系において害虫の総合的害虫管理の実行可能な構成要素となり得ることを実証するであろう。
【０１００】
実施例2‐シロイチモジヨトウの産卵行動に及ぼすPGPRの効果
要約
植物成長促進根圏細菌(PGPR)による作物の処理が、植物の成長を増加させ、様々な方法で植物の健康を増進することが示されている。これまで、これらの細菌は、PGPRのわずかに1つ〜2つの株を用いたモデルで研究されており、様々な株がいかに相互作用し得るかという我々の理解は限られている。さらに、PGPRが植物昆虫相互作用に及ぼす潜在的効果については、ほとんどわかっていない。PGPR処理したワタ植物上でのシロイチモジヨトウの産卵行動に及ぼすPGPRの効果を判定するため、産卵選択研究を行った。PGPRで処理したワタ植物と非処理のワタ植物上に産卵された卵および卵塊の総数を記録した。ここで、シロイチモジヨトウは、PGPR処理したワタ植物と比較して、非処理のワタ植物に対して産卵嗜好を示した。バチルス・アミロリケファシエンスを含む、試験したPGPR処理のうちの1つでは、卵は記録されなかった。
【０１０１】
材料および方法
様々なPGPRブレンド/株を試験するため、2つの実験を行った。実験1では、ワタ植物の種子を、107 cfu/mlの濃度の、1 mlの3種類の異なる水性胞子種子調製物(ブレンド8、ブレンド9、およびINR-7、実施例1を参照されたい)で処理した。実験2では、PGPR株ABU 288(バチルス・シンプレックス)およびMBI 600(バチルス・サブチリス)を試験した。いずれの実験にも、非処理の対照を含めた。
【０１０２】
雌と雄のシロイチモジヨトウを交配させた。後に分離するために雄に印をつけ、交配させた雌30匹を雄から分離した。8回の繰り返しのそれぞれについて、交配させた雌シロイチモジヨトウ30匹を、14時間にわたり一晩ケージ内に収容した。ケージ(42"×42"×32"高)を暗室に置き、四隅のそれぞれに、4つの処理のそれぞれのワタ植物(4〜5週齢)を個々に置いた。植物の茎は80 cm離して置き、植物は繰り返しごとに交換した。14時間後、植物当たりの卵塊の数および卵の総数を計数した。結果を、実験1については表4および図9に、実験2については表5に示す。
【０１０３】
（表４）PGPR処理した(INR7、ブレンド8、およびブレンド9)ワタ植物と非処理のワタ植物上でのシロイチモジヨトウの産卵
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【０１０４】
（表５）PGPR処理した(株MBI 600またはABU 288)ワタ植物と非処理のワタ植物上でのシロイチモジヨトウの産卵
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【０１０５】
いずれの実験の結果からも、シロイチモジヨトウが、PGPR処理したワタ植物と比較して非処理のワタ植物上に産卵することを好む傾向が示される。PGPRブレンド9(実験1)、ならびに株MBI 600およびABU 288(実験2)上には、卵は産卵されなかった。
【０１０６】
実験2における植物について、ヘッドスペース揮発性物質を収集した。ブレンド8、ブレンド9、およびINR-7で処理した植物と同様に(実施例1、図1を参照されたい)、対照植物と対比して、株MBI 600およびABU 288で処理した植物によるVOCの誘導が観察された(図10)。非処理のワタ植物と比較した場合、どちらの株で処理したワタから収集されたヘッドスペース揮発性物質においても、量的および質的な相違が観察された。対照と対比して、株MBI 600およびABU 288によって誘導されたピークは、モノテルペンおよびセスキテルペンなどの、低分子量のテルペノイド化合物である可能性が高い。
【０１０７】
参考文献
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【０１０８】
本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して種々の置き換えおよび修正を行うことができることは、当業者に容易に明白であろう。本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限の不在下で適切に行うことができる。使用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴の任意の等価物またはその一部を排除する意図はなく、本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明を特定の態様および選択的特徴によって説明してきたが、当業者が、本明細書に開示される概念を修正および/または変形する手段を講じてもよいこと、ならびにそのような修正および変化形が本発明の範囲内であると見なされることが、理解されるべきである。
【０１０９】
本明細書において、いくつかの特許文献および非特許文献の引用がなされる。引用された参考文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における用語の定義と引用された参考文献における用語の定義との間に矛盾がある場合、その用語は本明細書における定義に基づいて解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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