(57)【要約】  磁気共鳴画像化（通常は磁性核として1Hによる）は疾患の診断に病院で一般的に用いられる重要な診断技術である。MRIは優れた立体的解析を示す軟組織の非侵襲性画像化を可能にする。1Hの代わりに19Fを用いる磁気共鳴画像化は新規な診断可能性をもたらす。19F核は高いジャイロマグネティック比（40MHz/T）及び100％の天然同位体存在比を有する。人間の体では19F含有構造物は例えば歯及び骨において固体塩の形態で独占的に存在する。結果として内因性19F原子のJ2緩和時間は極めて短く、MRシグナルはほとんど検出できない。相対的に高い交軸緩和時間をもつ内因性19F系構造物が存在しないことによって非常に低いMRIシグナルバックグラウンドが担保される。したがって外因性19F系MRI造影剤は他の技術（例えばPET（陽電子放射断層撮影法））と類似の態様で“ホットスポット”画像化を可能にする。その診断的使用の有用な拡張としてMRIはまた生体活性物質（例えば治療薬又は診断薬）のデリバリーのモニタリングのために推奨される。すなわち、MRIは治療計画の立案のために用いることができるだけでなく画像を道標として抹消の薬剤デリバリーを管理するために用いることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MRI画像用19F標識アプタマー。
【請求項２】
癌診断のためのMRI画像用19F標識アプタマー。
【請求項３】
TRAに特異的に結合する請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
c-Metに特異的に結合する請求項３に記載のアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭＲＩによる標的分子イメージングに関する。
【背景技術】
【０００２】
層別化医療は、分子診断検査を用いて最適な治療方法を選択することによって生物学的特徴を共有する患者グループを管理し、当該グループのために可能な最良の医療成果を達成する。層別化治療の成功例は腫瘍学分野に存在する。乳癌、肺癌及び結腸直腸癌患者のHer2及びEGFRタンパク質の測定は適切な治療を選択するために実施される。層別化医療分野が進歩するにつれ、組織由来分子情報（生物マーカー）は、個々の個人病歴、家族歴及び他の検査室試験と一緒にされ、多様な症状についてより効果的な治療が開発されるであろう。生検は、バイオマーカーの同定のために患者から組織材料を収集するために選択される方法である。しかしながら生検はいくつかの限界を有する。すなわちは、侵襲性プロセスと同様で、腫瘍は外科手術によって接近することを必要とすること、組織の単なる部分的分析であること、費用が掛かること、さらに患者はしばしば生検を受けることをよしとしない。さらにまた、生検は患者の層別化にのみ適切で、組織の薬剤に対する感受性の持続的モニタリングには適さない。
標的分子イメージングは、診断及び治療でますます重要な役割を果たす新しい学問分野である。前記は、分子レベル及び細胞レベルにおける生物学的プロセスの可視化、性状決定並びに測定に重点を置く。従来の標的分子イメージング技術は陽電子放射断層撮影法（PET）及び一光子放射コンピューター支援断層撮影法（SPECT）である。
【０００３】
アプタマーは、ほぼ全てのクラスの分子と結合できる一本鎖DNA又はRNAである。アプタマーの規定された剛体的三次元構造は、多様な標的の特異的で強い親和性を示す分子認識を可能にする（Stoltenburgら（2007年）の概論を参照されたい）。アプタマーは長さが15から85ヌクレオチドで変動し、5−25kDaの見かけの分子質量をもたらし得る。
アプタマーは、単離組換えタンパク質（“フィルターSELEX”）又は全細胞（“細胞SELEX”）を基にして選別を実施するSELEXと称されるプロセスによって単離及び同定できる。
いくつかの特徴は、抗体及び他のタンパク質系形式を超える、以下の特異的で競合的なアプタマーの利点を提供する：
−おそらく免疫原性は存在しない。アプタマーは、動物及びヒトの治療的応用で用いられる用量より1000倍高い前臨床用量で投与された場合、弱い免疫原性を示すか又は全く免疫原性を示さない。多くのモノクローナル抗体の有効性は抗体そのものに対する免疫応答によって極めて制限されるが、アプタマーに対する抗体を誘発することは非常に困難であり、これはおそらくT細胞がMHCを介してアプタマーを提示できず、さらに一般的には細胞外核酸を認識するように免疫応答を訓練できないためである。
−高い正確性及び再現性を有する化学合成によって容易で、おそらくは高い費用効率で製造される。製造が異なるごとに変動が生じるとは思われない。アプタマーはストリンジェントな変性条件によって精製され、非常に高い純度が担保される。
−高い親和性及び選択性を達成できる。治療用アプタマーは化学的に強靭である。熱または変性剤によって変性したアプタマーは本質的に数分以内に容易に再生し、凍結乾燥粉末として1年までの長期間の間室温で保存可能であり、したがって非常に長い貯蔵寿命を示す。改変された場合には熱耐性及びヌクレアーゼ耐性である。
−良好な可溶性（＞150mg/mL）及び比較的低分子量である（抗体の150kDaに対してアプタマーは10−50kDa）。
【０００４】
SELEXTM法
アプタマーを作製する適切な方法は、“指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）”（“SELEXTM”）と呼ばれるプロセスによる。SELEXTMプロセスは、標的分子と高い特異性で結合する核酸分子のin vitro進化のための方法で、例えば以下に記載されている：米国特許出願07/536,428（1990年6月11日出願、現時点では放棄）、米国特許5,475,096号（発明の名称“Nucleic Acid Ligands”）及び米国特許5,270,163（WO 91/19813もまた参照されたい）（発明の名称“Nucleic Acid Ligands”）。各SELEXTMが同定した核酸リガンド（すなわち各アプタマー）は、ある標的化合物又は分子の特異的なリガンドである。SELEXTMプロセスは、実質的に任意の化合物（モノマーであれポリマーであれ）のリガンドとして機能するために（すなわち特異的結合対を形成するために）、核酸は多様な二次元及び三次元構造を形成する十分な能力並びにそれらのモノマー内に利用可能な十分な化学的融通性を有するという固有の識見に基づく。任意のサイズ又は組成を有する分子が標的として供され得る。
【０００５】
SELEXTMは、出発点として任意抽出配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリー又はプールに頼っている。前記オリゴヌクレオチドは改変又は未改変DNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドであり得る。いくつかの例では、プールは、100％ランダムな又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、任意抽出配列内に取り込まれた少なくとも1つの固定及び／又は保存配列を含むランダムな又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、その5’及び／又は3’末端に、オリゴヌクレオチドプールの全分子によって共有される配列を含んでもよい少なくとも1つの固定及び／又は保存配列を含むランダムな又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含むことができる。固定配列は、例えばPCRプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、RNAポリメラーゼ（例えばT3、T4、T7及びSP6）のためのプロモーター配列、制限部位、又はホモポリマー配列（例えばポリA又はポリT鎖）、触媒性コア、アフィニティーカラムとの選択的結合のための部位、及び対象のオリゴヌクレオチドのクローニング及び／又は塩基配列決定を促進する他の配列の如き配列である。保存配列は、先に述べた固定配列以外の、同じ標的と結合する多数のアプタマーによって共有される配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは任意抽出された配列部分および効率的な増幅に必要な固定配列を含む。典型的には、出発プールのオリゴヌクレオチドは、固定された5’及び3’末端配列を含み、前記は30−50のランダムヌクレオチドの内部領域とフランキングする。任意抽出ヌクレオチドは、化学合成及びランダム切断細胞性核酸のサイズ選別を含む多数の方法にしたがって作製できる。試験核酸の配列多様性はまた、選別/増幅を反復する前又は反復中に変異導入によって導入するか又は高めることができる。
【０００６】
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は任意の長さを有していてよく、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、さらに、改変若しくは非天然ヌクレオチド又はヌクレオチドアナローグを含むことができる。例えば以下を参照されたい：米国特許5,958,691号；米国特許5,660,985号；米国特許5,958,691号；米国特許5,698,687号；米国特許5,817,635号；米国特許5,672,695号；及びPCT特許公開WO 92/07065号。ランダムオリゴヌクレオチドは、当業界で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いてホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成できる。例えば以下を参照されたい：Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467（1986）及びFroehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578（1986）。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、液相法、例えばトリエステル合成法を用いて合成できる。例えば以下を参照されたい：Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 及び Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449（1978）。自動DNA合成装置で実施される典型的な合成では1014−1016の個々の分子が得られ、前記はほとんどのSELEXTM実験で十分な数である。配列設計時のランダム配列の領域が十分に大きければ、各合成分子が固有配列であるだろうという蓋然性は高くなる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、DNA合成装置による自動化学合成によって作製できる。任意抽出配列を合成するために、4ヌクレオチド全ての混合物を合成プロセス中の各ヌクレオチド添加工程で添加し、ヌクレオチドをランダムに取り込ませる。上述のように、ある実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、他の実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドは、一続きの非ランダム配列又は部分的ランダム配列を含むことができる。部分的ランダム配列は、各添加工程で異なる分子比で4ヌクレオチドを添加することによって作出できる。
【０００７】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーはRNAでもDNAでもよい。出発ライブラリーとしてRNAライブラリーが用いられる場合には、典型的にはT7 RNAポリメラーゼ又は改変T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroでDNAライブラリーを転写することによって作製され、精製される。続いてRNA又はDNAライブラリーを結合に好ましい条件下で標的と混合し、同じ包括的選別体系を用いて結合、分割及び増幅を工程毎に反復し、実質的に任意の所望される結合親和性及び選択性基準を達成する。より具体的には、核酸の出発プールを含む混合物を用いて開始するとき、SELEXTM法は以下の工程を含む：（a）結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程；（b）特異的に標的分子と結合した核酸分子と未結合核酸分子を分離する工程；（c）核酸標的複合体を解離させる工程；（d）核酸標的複合体から解離させた核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得る工程；及び（e）結合、分離、解離及び増幅工程を所望の回数だけ反復して、標的分子に対して高度に特異的で高い親和性を有する核酸リガンドを得る工程。RNAアプタマーを選別する場合には、SELEXTM方法はさらに、（i）工程（d）の増幅の前に、核酸標的複合体から解離させた核酸を逆転写する工程；及び（ii）このプロセスを再度開始する前に工程（d）の増幅核酸を転写する工程を含む。
【０００８】
極めて多数の可能な配列及び構造を含む核酸混合物には与えられた標的に対して広範囲の結合親和性が存在する。例えば20ヌクレオチドの任意抽出セグメントは420の候補物の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を有するものは標的と結合する蓋然性が高い。分割、分離及び増幅後に、より高い結合親和性をもつ候補物のために第二の核酸混合物が作製、濃縮される。得られる核酸混合物がただ1つの配列又は数配列を主として含むまで、選別ラウンドを重ねて最良のリガンドが徐々に選ばれていく。続いてこれら配列をクローニングし、塩基配列を決定し、さらに純粋なリガンド又はアプタマーとして結合親和性について個々に試験する。
選別及び増幅サイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。もっとも一般的な事例では、サイクルを繰り返しても結合強度の顕著な改善が達成されなくなるまで選別/増幅が継続される。本方法は典型的には約1014の異なる核酸種を判断するために用いられるが、約1018の異なる核酸種を判断するためにも用いることができる。一般的には、核酸アプタマー分子は、5から20サイクル工程で選別される。ある実施態様では、不均質性は最初の選別ステージでのみ導入され、反復プロセスでは導入されない。
SELEXTMのある実施態様では、選別プロセスは、選択標的ともっとも強く結合する核酸リガンドの単離に非常に効率的であるので、選別及び増幅サイクルはただ1回しか要求されない。そのような効率的選別は、例えばクロマトグラフィー型プロセスで生じ得るが、このプロセスの場合、カラムに結合させた標的と結合する核酸の能力は、カラムが最高の親和性をもつ核酸リガンドを分離及び単離させるために十分な能力を有するような態様で機能する。
【０００９】
多くの事例で、ただ１つの核酸リガンドが同定されるまでSELEXTMの反復工程を実施することは必ずしも所望されない。標的特異的核酸リガンドの溶液は、多数の保存配列を有する核酸構造又はモチーフファミリー、及び標的に対して核酸リガンドの親和性に顕著に影響を与えることなく置換又は付加することができる多数の配列を含むことができる。完了前にSELEXTMプロセスを終了することによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの塩基配列を決定することが可能である。
多様な核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られている。非ワトソン-クリック型相互作用に含まれることがもっとも一般的に示された構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称性又は非対称性出っ張り、シュードノット及び前記の無数の組合せが挙げられる。そのようなモチーフのほとんど全ての公知の事例が、30ヌクレオチドを超えない核酸配列で形成され得ることを提唱している。この理由から、任意抽出した連続セグメントによるSELEXTM法は、約20から約50ヌクレオチド、いくつかの実施態様では約30から約40ヌクレオチドの任意抽出セグメントを含む核酸配列を用いて開始することがしばしば好ましい。ある実施態様では、5’-固定：ランダム：3’-固定配列は約30から約50ヌクレオチドのランダム配列を含む。
【００１０】
コアのSELEXTM法は、多数の固有の目的を達成するために改変された。例えば、米国特許5,707,796号は、特異的な構造的特徴を有する核酸分子（例えば湾曲DNA）を選別するためにゲル電気泳動と一緒にしたSELEXTMの使用を記載している。米国特許5,763,177号は、標的分子と結合及び／又は光架橋できるか、及び／又は標的分子を光不活化できる光反応基を含む核酸リガンドを選別するためのSELEXTM系の方法を記載している。米国特許5,567,588号及び米国特許5,861,254号は、標的分子に対して高い親和性及び低い親和性を有するオリゴヌクレオチドの非常に効率的な分配を達成するSELEXTM系の方法を記載している。米国特許5,496,938号は、SELEXTMプロセスを実施した後で改善された核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許5,705,337号はリガンドとその標的を共有結合させる方法を記載している。
SELEXTMはまた、標的分子の2つ以上の部位と結合する核酸を得るため、および、標的の固有の部位と結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために用いることができる。SELEXTMは、任意の想定可能な標的と結合する核酸リガンドを単離及び同定する手段を提供し、前記標的には、大小の生物分子（例えば核酸結合タンパク質及びそれらの生物学的機能の部分として核酸と結合することが不明のタンパク質）に加えて補助因子及び他の小分子が含まれる。例えば、米国特許5,580,737号は、カフェイン及び近縁アナローグのテオフィリンと高い親和性で結合することができるSELEXTMによって同定される核酸配列を開示している。
【００１１】
カウンターSELEXTMは、1つ以上の非標的分子と交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターSELEXTMは以下の工程を含む：（a）核酸の候補混合物を調製する工程；（b）前記候補混合物を標的と接触させる工程（ここで候補混合物と比較して標的に対して親和性の増進を示す核酸を候補混合物の残りのものから分割することができる）；（c）親和性増進核酸を候補混合物の残りのものから分離する工程；（d）親和性増進核酸を標的から解離させる工程；（e）親和性増進核酸を1つ以上の非標的分子と接触させて非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドを除去する工程；及び（f）標的分子にのみ特異的親和性を有する核酸を増幅させて、標的分子との結合について相対的に高い親和性及び特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る工程。SELEXTMについて上記で述べたように、選別及び増幅サイクルは所望の目標が達成されるまで必要に応じて繰り返される。
【００１２】
治療薬及びワクチンとして核酸を使用する際に遭遇する潜在的な1つの問題は、ホスホジエステル型オリゴヌクレオチドは、細胞内及び細胞外酵素（例えばエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ）によって所望の効果が出現する前に体液中で迅速に分解され得るということである。したがって、SELEXTM法は、リガンドに改善された特徴（例えばin vivo安定性の改善又はデリバリーにおける特徴の改善）を付与する改変ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような改変の例には、リボース及び／又はリン酸基及び／又は塩基位置での化学的置換が含まれる。改変ヌクレオチドを含むSELEXTM同定核酸リガンドは例えば以下に記載されている：米国特許5,660,985号（リボースの2’位、ピリミジンの5位及びプリンの8位で化学的に改変されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する）、米国特許5,756,703号（多様な2’改変ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する）、及び米国特許5,580,737号（2’-アミノ（2’-NH2）、2’-フルオロ（2’-F）、及び／又は2’-OMe置換で改変された1つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する）。
【００１３】
本発明で意図される核酸リガンドの改変は、新たな電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電気相互作用、及び流動性を取り込む他の化学基を核酸リガンドの塩基に又は全体として核酸リガンドに提供するものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチド集団を作製するための改変はまた、1つ以上の代替ヌクレオチド間結合、変型糖、変型塩基又は前記の組合せを含むことができる。そのような改変には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：2’-位糖改変、5-位ピリミジン改変、8-位プリン改変、環外アミンでの改変、4-チオウリジンの置換、5-ブロモ若しくは5-ヨード-ウラシルの置換；骨格の改変、ホスホロチオエート又はアルキルホスフェートの改変、メチル化及び通常でない塩基対の組合せ、例えばイソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン。改変はまた3’及び5’改変、例えばキャッピングを含むことができる。
アプタマーの選別及び同定に有用なさらに別の方法は例えば米国特許7,803,931号に詳述されている（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
本発明のアプタマーは、DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA又はrRnY 組成から成り得る。Rはプリン、Yはピリミジン、HはA、C、Uであり、DはA、G、Uであり、dは2’デオキシ、ｒは2’ヒドロキシ、ｍは2’メトキシ、fは2’フルオロ、nは2’アミンである。
【００１４】
MRIのための19F標識
磁気共鳴画像化（通常は磁性核として1Hによる）は、疾患の診断に病院で一般的に用いられる重要な診断技術である。MRIは、優れた立体的解析を示す軟組織の非侵襲性画像化を可能にする。1Hの代わりに19Fを用いる磁気共鳴画像化は新規な診断可能性をもたらす。19F核は、高い磁気回転比（40MHz/T）及び100％の天然同位体存在比を有する。人間の体では、19F含有構造物は、もっぱら固体塩の形態で、例えば歯及び骨に存在する。結果として、内因性19F原子のJ2緩和時間は極めて短く、MRシグナルはほとんど検出できない。換言すれば、相対的に高い交軸緩和時間をもつ内因性19F系構造物が存在しないことによって、非常に低いMRIシグナルバックグラウンドが担保される。したがって、外因性19F系MRI造影剤は、他の技術（例えばPET（陽電子放射断層撮影法））と類似の態様で“ホットスポット”画像化を可能にする。その診断的使用の有用な拡張として、MRIはまた、生体活性物質（例えば治療薬又は診断薬）のデリバリーのモニタリングのために推奨される。すなわち、MRIは治療計画立案のために用いることができるだけでなく、画像を道標として抹消の薬剤デリバリーを管理するために用いることもできる。
本発明の好ましい実施態様では、MRIの標的は癌である。この場合は、本発明のアプタマーは腫瘍抗原に向かう。
【００１５】
本発明で有用な腫瘍抗原のタイプは腫瘍特異抗原（TSA）又は腫瘍付随抗原（TAA）であり得る。TSAは腫瘍細胞に固有であり、身体の他の細胞には生じない。TAA関連抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、それどころか、抗原に対して免疫学的耐性状態を誘導できない条件下で正常細胞にも発現する。前記抗原の腫瘍での発現は、免疫系の前記抗原への応答を可能にする条件下で生じ得る。TAAは、免疫系が未成熟で応答能力が無い胎児の発育時に正常細胞で発現される抗原であり得るか、又はそれらは、正常細胞で通常極めて低レベルで存在するが、腫瘍細胞では非常に高レベルで発現される抗原であり得る。TSA及びTAAを一緒にしてTRA又は腫瘍関連抗原と称することができる。
TRAの例は以下である：MUC-1、PSMA、EGFR、ヌクレオリン、シアリルルイスX、PDGFR、VEGF及びVEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、メラノーマプロテオグリカン、p糖タンパク質、エンドグリン、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、ルイスY。
【００１６】
解決されるべき問題：
バイオマーカーの画像化は、患者の層別化及び治療の進行のモニタリングに極めて有望である。従来の侵襲的方法では、治療の進行及び薬剤に対する組織の感受性のモニタリングは不可能である。特異性が強化された非侵襲的画像化技術が強く希求される。
この要請は、驚くべきことにMRI剤として高度にフッ素化されたアプタマーの提供によって解決され得る。
標的分子イメージングのためのフッ素化（19F）アプタマーは、MRI系診断のための新規な非放射性形式である。
フッ素化アプタマーは以下の組成物を含む：
rRfy‐2’‐ヒドロキシ‐プリン/2’‐フルオロ‐ピリミジン
mRfy‐2’‐メトキシ‐プリン/2’‐フルオロ‐ピリミジン
dRfy‐2’‐デオキシ‐プリン/2’‐フルオロ‐ピリミジン
fCmD‐2’‐フルオロ‐C/2’‐メトキシ‐A, G, U。
又は19F標識が化学的に結合された任意の他の非フッ素化アプタマー組成物である。
アプタマーは100％フッ素化されるのが好ましく、例えばdRfYの場合、全てのピリミジン残基でフルオロ置換を保持する。
【００１７】
実験
RNAアプタマー
配列は、全てのピリミジン（U及びC）部位でフルオロリボースを、及び全てのプリン（A及びG）部位でリボースを含む。このヌクレオチド種の2mgを含むサンプルをBioSpring（Furankfurt am Maine, Germany）によって合成した。オリゴヌクレオチドNMRサンプル1.8mgを450mLのPBS緩衝液（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMリン酸ナトリウム、2mMリン酸カリウム（pH7.4））に溶解させた、50mLのD2OをNMRのためのロック物質として添加した。マグネシウムを濃縮100mMストック溶液として添加した。
【００１８】
NMR分光学
全てのNMRスペクトルは室温（25℃）で測定した。19F NMRスペクトルは、倒立ブロードバンドプローブヘッドを搭載したBruker Avance 400分光計により400MHz陽子共鳴周波数（376.5 MHz 19F共鳴周波数）で測定し、19F検出にはブロードバンドコイルを用いた。直接検出19Fスペクトル及び陽子脱カップル19Fスペクトルの両方を記録したが、考察は非脱カップルスペクトルに集中するであろう。400ppmのスペクトルスィープ幅及び-100ppmの19Fオフセットを64Kコンプレックスデータポイント及び2048スキャンに関して用いた。陽子NMRスペクトルは、Bruker Avance 400分光計により400MHzで測定した。ウォーターサプレッションは、2msのシンク型パルスによる水シグナルの選択的励起を用い励起スカルプティングにより達成された（Hwang & Shaka, J Mag Pre, A112, 275-279, 1995）。64Kコンプレックスデータポイントを32ppmのスペクトルスィープ幅及び256スキャンで測定した。
【００１９】
RNAアプタマーによるNMR試験
アニーリングスキーム
単純アニーリングスキームでは、NMRサンプルは約80℃に加熱され、続いてその後ゆっくりと冷却された。結果のセクションで考察するように、この単純スキームは満足な結果をもたらさなかった。Jens Wohnert（Goethe-Universitat Frankfurt）が提唱したより複雑なアニーリングスキームでは以下の工程が用いられた：
−PBS緩衝液で10ｘ希釈、
−1mMのMgCl2を添加（前記NMRサンプルは10mMのMgCl2を含んでいたので、したがってこれは希釈工程で達成された）、
−下記に記載するように加熱及び冷却、
−スピンカラムにて4℃で濃縮。
このスキームの目的は分子間凝縮を回避することである。0.5mg（ざっと25％）のサンプルがUV吸収測定のために失われた。
【国際調査報告】
2014503511.tif 000002
2014503511.tif 000003
2014503511.tif 000004