(57)【要約】  本発明は、全身性強皮症(SSc)(初期型、限局型皮膚、びまん型)または全身性エリテマトーデス(SLE)に冒されている患者を同定するための方法に関する。この方法は、SSc患者間およびSLE患者間における、それぞれ、SScにおける血管潰瘍の存在、およびSLEにおけるレイノー現象の存在の同定を可能にするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における全身性強皮症(SSc)および/または全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するためのin vitro方法であって、
前記対象から取得した試験生体液試料を、固体支持体上に予め固定化した哺乳動物細胞核抽出試薬と、抗原-抗体結合が可能になる条件下で反応させるステップと、
参照試料を、固体支持体上に予め固定化した別の哺乳動物細胞抽出試薬と、抗原-抗体結合が可能になる条件下で反応させるステップと、
洗浄するステップと、
抗原-抗体結合が起こった場合にそれを検出することができる検出手段を加え、検出値を生成するステップと、
試験生体液試料の検出値と参照血清試料の検出値を比較して、平均倍率反応性値を得るステップと、
平均倍率反応性値が予め定義されたカットオフ値よりも高いか低いかを照合するステップと
を含む方法。
【請求項２】
試験生体液試料が、保管、凍結または凍結乾燥されていてもよい、血液、血漿、または血清である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞核抽出試薬が、CHO細胞株、HeLa細胞株、293細胞株およびMRC-5細胞株の群に含まれる細胞から得られる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
細胞核抽出試薬が、
a)哺乳動物細胞を回収するステップと、
b)回収した哺乳動物細胞を、インタクトな核を維持する細胞を溶解することができる溶液中に懸濁させて、インタクトな核を有する哺乳動物細胞溶解物を得るステップと、
c)哺乳動物細胞溶解物をペレット化し、ペレット化したインタクトな核を洗浄するステップと、
d)核を適切な溶液中に溶解させて、哺乳動物の核溶解物を得るステップと、
e)核溶解物を超音波処理し、遠心分離し、不溶性物質を廃棄するステップと
によって得られる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
b)の溶液が、プロテアーゼ阻害剤ミックスで完成させた緩衝低塩濃度低張液である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
d)の溶液が、プロテアーゼ阻害剤ミックスで完成させた緩衝高塩濃度高張液である、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
検出手段が、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート二次抗体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ペルオキシダーゼ-コンジュゲート二次抗体が、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ヒトIgGである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
カットオフ値が参照に対しておよそ1.35倍である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
SScにおける血管潰瘍の存在およびSLEにおけるレイノー現象の存在を同定するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
SScが、初期SSc、限局型皮膚SSc、びまん型SSc、CRESTの群に属する、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか一項に記載の方法に従って全身性強皮症(SSc)および/または全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性強皮症(SSc)(初期型、限局型皮膚、びまん型)または全身性エリテマトーデス(SLE)に冒されている患者を同定するための方法に関する。この方法は、SSc患者間およびSLE患者間における、それぞれ、SScにおける血管潰瘍の存在、およびSLEにおけるレイノー現象の存在の同定を可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
全身性強皮症(SSc)は、結合組織の蓄積によって引き起こされる皮膚の肥厚、ならびに胃腸管、肺、心臓、および腎臓を含めた内臓の構造的異常および機能的異常を臨床的な特徴とする、原因不明の慢性多系統障害である。血管の損傷、免疫活性化、および細胞外マトリックスの過剰な合成および沈着がSScの顕著な特徴である。
【０００３】
SScは世界的に分布し、全ての人種に影響を及ぼしている。全体的に女性が男性よりもおよそ3倍多くSScに冒され、生殖期の中期から後期の間にさらに多く冒される(≧8:1)。年間の発生率は個体百万人当たり19症例であると推定されている。SScについて報告された分布率は、個体百万人当たり50〜300である(1)。SScの顕著な特徴は、コラーゲン、ならびにフィブロネクチン、テネイシン、フィブリリン-1、およびグルコサミノグリカンを含めた他の細胞外マトリックスタンパク質が皮膚および他の臓器において過剰産生され蓄積されることである。疾患過程は、過剰なコラーゲンの産生をもたらす、免疫学的機構、血管内皮細胞の活性化および/または傷害、ならびに線維芽細胞の活性化を伴う。
【０００４】
血清自己抗体が存在することは、患者における疾患転帰および臓器合併症のパターンの強力な予測因子として確立されている。しかし、自己抗体は単に疾患のマーカーであるだけではなく、病原性における役割も有することの証拠体が増えてはいるが、強皮症における自己抗体の病原的役割は不明のままである。自己抗体を検出し、評価するための改善された方法により、強皮症患者におけるリスク層別化の実際の機会が提供され、該患者の大部分について、最初の症状発現時の血清学的プロファイルによって定義することができる(2)。
【０００５】
SScに最も頻繁に関連づけられる3種類の抗核抗体(ANA)である抗セントロメア抗体(ACA)、抗トポイソメラーゼ抗体(ATA)およびRNA-ポリメラーゼIII抗体(ARA)は、疾患を有する患者の50%超において見いだされる。これらの抗体は高度に特異的であり、一般に、互いに排他的に存在するが、少ない割合のSSc患者がACAとATAのどちらに対しても陽性であり得る。複合コホート研究では、SSc患者における特異的な自己抗体と臨床症状発現の関連性に焦点が置かれてきたにもかかわらず、異なる試験技法が用いられること、および臓器合併症の定義が変動することにより、これらの研究の解釈が難しいものになっている。SScを診断すること、およびある特定の臨床的特徴を予測することにおける種々の抗体の感度および特異度は、検出に用いられる方法(間接的な免疫蛍光法、免疫ブロッティング、ELISA、免疫沈降)に相当影響される。SSc患者における種々の自己抗体の種類の発生頻度およびそれらの主要な臨床的関連性がTable 1(表1)において概説されている。
【０００６】
【表１】
2014512009.tif 000002
【０００７】
全身性強皮症は、血管壁への傷害および微小血管の大規模な損傷も特徴とする。血管壁の傷害は、巨大毛細血管(megacapillary)および無血管性領域の形成を特徴とする。毛細血管密度が低下すると、指潰瘍などの臨床症状が導かれる。血流が低下し、酸素分圧レベルが低下するにもかかわらず、逆説的に、SScの患者の皮膚における十分な血管新生の証拠はない。爪郭ビデオ毛細血管顕微鏡検査の変化によって実証される通り、SScでは血管新生が強力に妨げられ、血管損傷は、初期から後期に次第に進展し、異なる形態学的特性によって特徴づけられる。ほとんど全ての患者において、構造的脈管障害と相まって潰瘍および重大な指虚血をもたらすレイノー現象が発生する。SScの重度の内臓合併症の多くは、肺動脈性高血圧症(PAH)および強皮症腎クリーゼを含めた血管性のものである。多くの血管床において構造的な血管の損傷が起こり、これが肺合併症、腎臓合併症、心臓合併症および胃腸合併症に寄与する(3)。
【０００８】
全身性エリテマトーデス(SLE)は、種々の臨床症状に関連づけられる、細胞核の構成成分に対する抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患の原型である。SLEの患者における主要な病理学的所見は、炎症、血管炎、免疫複合体の沈着、および脈管障害の所見である。SLEの正確な病因は不明である(4)。
【０００９】
患者の90パーセントが妊娠可能な女性であるが、いずれの性別の人も感受性であり、またあらゆる年代の人、およびあらゆる民族グループの人が感受性である。米国におけるSLEの分布率は100,000当たり15〜50であり、民族グループの中で分布率が最も高いのはアフリカ系米国人である。
【００１０】
SLEは、感受性遺伝子と環境因子との相互作用によって引き起こされ、これにより異常な免疫応答がもたらされる。免疫応答としては、Tリンパ球およびBリンパ球の活動亢進および過敏性ならびに抗原利用可能性および進行中の抗体応答の調節の無効性が挙げられる。これらの異常の最終結果として病原性自己抗体が持続的に産生され、標的組織に結合する免疫複合体が形成され、その結果、Ig-コートされた循環細胞が隔離され破壊され、補体タンパク質が固定され切断され、ケモタキシン、血管作動性ペプチド、および破壊的酵素が組織内に放出される。SLEの患者では、多くの自己抗体がDNA/タンパク質複合体またはRNA/タンパク質複合体、例えば、ヌクレオソーム、一部の核小体RNA、およびスプライセオソームRNAなどに対して産生される(5)。
【００１１】
疾患経過中の患者の95%において、抗核抗体(ANA)が陽性である。二本鎖DNAに対するIgG抗体の力価が高いことおよびSm抗原に対する抗体の力価が高いことはどちらもSLEに特異的であり、したがって、該当する臨床症状が存在する場合にはSLEの診断を支持する。臨床症候を伴わずに個体に多数の自己抗体が存在するこ場合は、SLEと診断するべきではないが、そのような人はリスクが高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Chifflot H, Fautrel B, Sordet C, Chatelus E, Sibilia J. Incidence and prevalence of systemic sclerosis: a systematic literature review. Semin Arthritis Rheum. 2008 Feb; 37(4): 223-35
【非特許文献２】Nihtyanova SI, Denton CP. Autoantibodies as predictive tools in systemic sclerosis. Nat Rev Rheumatol. 2010 Feb; 6(2):112-6
【非特許文献３】Guiducci S, Giacomelli R, Cerinic MM. Vascular complications of scleroderma. Autoimmun Rev. 2007 Sep; 6 (8): 520-3. Epub 2007 Jan 12.
【非特許文献４】Stacy A Ardoin and David S Pisetsky. Developments in the scientific understanding of lupus. Arthritis Research & Therapy 2008, 10: 218.
【非特許文献５】Davidson A, Diamond B: Autoimmune diasease. N Engl J Med. 2001, 345: 340
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、SSc患者およびSLE患者を非常に高い特異度で同定することができる、細胞抽出物に基づく方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の対象は、対象における全身性強皮症(SSc)および/または全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するためのin vitro方法であって、
前記対象から取得した試験生体液試料を、固体支持体上に予め固定化した哺乳動物細胞核抽出試薬と、抗原-抗体結合が可能になる条件下で反応させるステップと、
参照試料を、固体支持体上に予め固定化した別の哺乳動物細胞抽出試薬と、抗原-抗体結合が可能になる条件下で反応させるステップと、
洗浄するステップと、
抗原-抗体結合が起こった場合にそれを検出することができる検出手段を加え、検出値を生成するステップと、
試験生体液試料の検出値と参照血清試料の検出値を比較して、平均倍率反応性値を得るステップと、
平均倍率反応性値が予め定義されたカットオフ値よりも高いか低いかを照合するステップと
を含む方法である。
【００１５】
本発明の方法は、これらに限定されないが、保管、凍結または凍結乾燥されていてもよい血液、血漿または血清などの任意の試験生体液試料に対して実施することができる。
【００１６】
哺乳動物細胞核抽出試薬は、安定化した細胞株または初代細胞のいずれかの、任意の哺乳動物細胞から得ることができる。適切な細胞株の例はCHO、HeLa、293およびMRC-5である。
【００１７】
本発明による細胞核抽出試薬は、
a)哺乳動物細胞を回収するステップと、
b)回収した哺乳動物細胞を、インタクトな核を維持する細胞を溶解することができる溶液中に懸濁させて、インタクトな核を有する哺乳動物細胞溶解物を得るステップと、
c)哺乳動物細胞溶解物をペレット化し、ペレット化したインタクトな核を洗浄するステップと、
d)核を適切な溶液中に溶解させて、哺乳動物の核溶解物を得るステップと、
e)核溶解物を超音波処理し、遠心分離し、不溶性物質を廃棄するステップと
によって得られる。
【００１８】
b)の溶液は、プロテアーゼ阻害剤ミックスで完成させた緩衝低塩濃度低張液であることが好ましい。
【００１９】
d)の溶液は、プロテアーゼ阻害剤ミックスで完成させた緩衝高塩濃度高張液であることが好ましい。
【００２０】
検出手段はペルオキシダーゼ-コンジュゲート二次抗体であることが好ましく、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ヒトIgGであることがより好ましい。
【００２１】
本発明によると、カットオフ値は、参照に対しておよそ1.35倍である。該方法は、SScにおける血管潰瘍の存在およびSLEにおけるレイノー現象の存在を同定するために特に有用である。SScは、初期SSc、限局型皮膚SSc、びまん型SSc、CRESTの群に属する。
【００２２】
本発明の別の対象は、上に開示された方法を利用することに一義的に対処する、全身性強皮症(SSc)および/または全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するためのキットである。
【００２３】
本発明では、細胞核抽出試薬は、固体支持体上、すなわちELISAプレートに固定化されており、血清試料によって直接プローブされる。
【００２４】
したがって、該方法では、固定化した細胞核抽出物に結合した(自己)抗体の存在が検出される。
【００２５】
この方法の実行には、特定の技術的な専門知識は必要なく、手頃な結果を得るためには典型的なELISA技術装置で十分である。
【００２６】
この方法を実行するために、細胞核抽出物を、標準の培養した哺乳動物細胞株、非限定的な例として、CHO細胞株、HeLa細胞株、293細胞株、MRC-5細胞株から得ることができる。前記細胞株が異なる哺乳動物および組織起源に由来することに留意することには価値がある。
【００２７】
ヒト血清試料が必要である。試料の凍結は性能に影響を及ぼさないので、わざわざ新鮮な材料を得る必要はない。試料は希釈緩衝液中に希釈すると有利である。
【００２８】
手順は容易かつ迅速であり、信頼でき、以下のステップに要約することができる:
希釈緩衝液中でプレートを平衡化するステップ、
3つの異なる希釈緩衝液中血清試料希釈物(1:100、1:250および1:500)を調製するステップ、
3つの異なる希釈緩衝液中参照血清希釈物(1:100、1:250および1:500)を調製するステップ、
試料をプレートに加え、室温で1時間インキュベートするステップ、
洗浄緩衝液中で3回洗浄するステップ、
ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ヒトIgG(または、検出方法に応じて他の二次抗体)を加え、室温で1時間インキュベートするステップ、
洗浄緩衝液中で3回洗浄するステップ、
基質を加え、適切な吸収を読み取るステップ。
【００２９】
ここで、本発明を以下の図面を参照して非限定的な実施例により説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】n=121の健康なドナー、n=135のSSc患者およびn=60のSLE患者についての、参照血清に対する平均倍率反応性結果のプロット分布を示す図である。平均レベルおよび標準偏差が線で示されている。片側スチューデントt検定の結果により、2つの集団間の有意差が高いことが示されている。
【図２】1人の代表的な健康な血液ドナー対象および1人の代表的な強皮症ドナー対象の全身性自己免疫性血管障害試験(SAAT)の試験結果を示す図である。4つの異なる細胞株(CHO、MRC-5、293およびHeLa)由来の抽出物を、プレートを調製し、アッセイを実施するための基質として使用した。参照ミックス(異なる健康な血液ドナー由来の100の異なる血清のミックスに対応する)に対する反応性の倍率増加が示されている。代表的な強皮症ドナー対象の倍率増加は、異なる細胞株の全てと同等である(有意差は見いだされない)。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
材料および方法
細胞
SAAT試験を実行するために適した抽出物の取得について試験される細胞には、CHO細胞株(チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)卵巣由来のCHO-K1、ATCC番号CCL-61)、HeLa細胞株(ヒト(Homo sapiens)子宮頸部腺癌由来のHeLa、ATCC番号CCL-2)、293細胞株(ヒト胚性腎臓由来の293またはHEK-293、ATCC番号CRL-1573)およびMRC-5細胞株(ヒト肺線維芽細胞由来のMRC-5、ATCC番号CCL-171)が含まれる。これらの細胞からの抽出物は、SAAT試験実行に関して同等であった(図2参照)。
【００３２】
核抽出物の調製
細胞を回収し、PBS(137mMの塩化ナトリウム、8.1mMの第二リン酸ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、1.76mMのリン酸二水素カリウム、最終的なpH=7.4)で2回洗浄し、次いで、細胞百万個当たり50マイクロリットルの氷冷した「溶液1」(10mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、pH=7.9、10mMの塩化カリウム、0.1mMの塩化マグネシウム、0.1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH=8.0、0.1mMのジチオスレイトール、100mcMの4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)、80nMのアプロチニン、2mcMのロイペプチン、4mcMのベスタチン、1.5mcMのペプスタチンA、1.4mcMのトランス-エポキシスクニシル-L-ロイシルアミド(4-グアニジノ)ブタン(E-64))に、懸濁液が均質に見えるまで再懸濁させる。次いで、懸濁液を、4℃に温度制御した遠心分離機内、800×gで10分間遠心分離する。生じた上清は細胞質抽出物に対応し、ペレットはインタクトな核に対応する。上清を廃棄し、ペレットを、前のステップと同体積の氷冷した溶液1に穏やかに再懸濁させる。次いで、懸濁液を、4℃に温度制御した遠心分離機内、800×gで10分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを、同体積の氷冷した溶液1にもう一度再懸濁させ、次いで、上記と同じ条件で再度遠心分離する。次いで、ペレットを、同体積の氷冷した「溶液2」(5%体積/体積のグリセロール、20mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、pH=7.9、420mMの塩化ナトリウム、1.5mMの塩化マグネシウム、0.1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH=8.0、0.1mMのジチオスレイトール、100mcMの4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)、80nMのアプロチニン、2mcMのロイペプチン、4mcMのベスタチン、1.5mcMのペプスタチンA、1.4mcMのトランス-エポキシスクニシル-L-ロイシルアミド(4-グアニジノ)ブタン(E-64))に、懸濁液が均質に見えるまで再懸濁させる。懸濁液を氷上で30分間放置し、この間に、懸濁液を、5分ごとに、合計6時間にわたって、1分当たり2000回転で10秒間、ボルテックスする。次いで、懸濁液を、穏やかな超音波処理条件下(一定のデューティサイクル、15%出力)で30秒間超音波処理し、次いで、氷上で30秒間放置し、この超音波処理サイクルを合計8回にわたって繰り返す。次いで、懸濁液を、4℃に温度制御した遠心分離機内、20.000×gで30分間遠心分離する。生じた上清は核抽出物に対応し、ペレットは膜および不溶性物質に対応する。上清を残しておき、次いで、4℃に温度制御した遠心分離機内、20.000×gで10分間遠心分離する。最後に、上清を残しておき、-80℃以下で保管する。
【００３３】
ELISAプレート内への核抽出物の固定化
ポリスチレンの「高結合性」多ウェルプレートを、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、室温(20℃〜25℃)、1分当たり300回転で、PBSを用いて5分間にわたって1回洗浄する。プレートを、ウェル当たり合計2マイクログラムの抽出物でコーティングし、PBS中に溶解させ、最終的な体積をウェル当たり50マイクロリットルにし、抽出物をウェルに結合させるために、プレートを振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり150回転で60分間放置する。次いで、プレートを、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、室温、1分当たり300回転で、PBSを用いて5分間にわたって1回洗浄し、次いで、反応性部位を飽和させるために、ウェル当たり300マイクロリットルのPBS中1%ウシ血清アルブミン溶液と一緒に、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり150回転で60分間インキュベートする。最終的にプレートを、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、室温、1分当たり300回転で、PBSを用いて5分間にわたって1回洗浄する。
【００３４】
免疫測定
血液ドナー由来の血清を、PBS中1%ウシ血清アルブミン溶液中に希釈し、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり150回転で60分間インキュベートする。次いで、プレートを、ウェル当たりPBS中0.05%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween20)溶液200マイクロリットルを用いて、洗浄ごとに、室温、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり300回転で5分間にわたって3回洗浄する。次いで、プレートを、ウェル当たりPBS中1%ウシ血清アルブミン溶液中に溶解させた4mg/mlのペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ヒト免疫グロブリンG溶液200マイクロリットルと一緒に、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり150回転で60分間インキュベートする。その後、プレートを、ウェル当たりPBS中0.05%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween20)溶液200マイクロリットルを用いて、洗浄ごとに、室温、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり300回転で5分間にわたって3回洗浄する。次に、プレートを、ウェル当たり3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)100マイクロリットルと一緒に、室温、振動オービタルプラットフォーム振とう機上、1分当たり150回転で5分間インキュベートする。最後に、発色をブロックするために500mMの硫酸溶液100マイクロリットルを各ウェルに分配する。各ウェルについて450ナノメートルにおける吸収を測定する。
【００３５】
結果
該方法により、健康な個体とSSc/SLE対象を区別することに関して定性的な結果がもたらされ、これは、全体的な反応性、すなわち固定相に結合した(自己)抗体の量に関しては定量的であるが、血清(自己)抗体の量に関しては定量的ではない。
【００３６】
この方法では、各実験において参照健康混合物を試験することによってアッセイ間の変動を克服する。
【００３７】
得られた数値結果は、1と等しい参照血清に対する対象の血清の「平均倍率反応性」を示す。平均倍率反応性は、以下によって算出する。
1:100希釈した試料の吸収値、1:250希釈した試料の吸収値、1:500希釈した試料の吸収値のそれぞれを、それぞれ1:100希釈した参照吸収値、1:250希釈した参照吸収値、1:500希釈した参照吸収値で割ること。これにより、3つの「倍率反応性」値が生じる。参照の結果は1と等しいことに留意されたい。
得られた3つの値の平均を算出すること。これは「平均倍率反応性」を示す。
【００３８】
アッセイ内の変動は有意ではないことが実証された。
【００３９】
健康な個体121人、SSc患者135人およびSLE患者60人を含む試験の数値結果は、この方法が、2つの患者集団を健康な個体集団と有意に区別できるものであったことを示した(図1)。
【００４０】
臨床的に特徴付けられた強皮症患者(初期SSc、限局型皮膚SSc、びまん型SSc、CREST)由来の総数135の血清試料、臨床的に特徴付けられた全身性エリテマトーデス患者由来の60の血清試料および健康なドナー由来の121の血清試料を、参照健康混合物に対する倍率反応性について試験した。
【００４１】
この試験についての陽性に対する感度および特異度を、カットオフ値を参照に対して1.35倍として、ROC分析によって算出した(Table 2(表2))。
【００４２】
【表２】
2014512009.tif 000003
【００４３】
ROC統計分析に従って、「平均倍率反応性」値1.35を、この試験についての陽性に対するカットオフとみなすべきである。しかし、1.28〜1.42にわたる結果(1.35から5%の偏差)は「境界線」とみなし、それらの場合、試験を繰り返すことおよび/または血清自己抗体の存在を評価するための他の試験を実施することを提案する。この方法により、SSc患者(限局型皮膚、および、びまん型)内で、初期にも血管潰瘍を示す対象を同定することもでき、さらに、この試験についての陽性はSLE対象においてレイノー現象が存在することと相関する(Table 3(表3))。総数81の、血管潰瘍の存在について臨床的に特徴付けられた強皮症患者(限局型皮膚、および、びまん型)由来の血清試料およびレイノー現象の存在について臨床的に特徴付けられた50のSLE患者を、参照健康混合物に対する倍率反応性について試験した。
【００４４】
【表３】
2014512009.tif 000004
【００４５】
この試験についての陽性と、SScにおける血管合併症(潰瘍)の存在、およびSLEにおけるレイノー現象の存在との相関に対する感度および特異度を算出した(Table 4(表4))。
【００４６】
【表４】
2014512009.tif 000005
【００４７】
自己免疫を起源とする血管合併症現象の同定の特異度も、上肢および下肢の血管潰瘍を伴う寒冷グロブリン血症に冒されている対象(n=13)および抗内皮抗体の存在を伴う特発性静脈血栓塞栓症に冒されている対象(n=23)、合計n=36の対象を試験することによって検証する。全体的に、これらの対象の88.9%について、SAAT試験の結果が陰性である。
(参考文献)
2014512009.tif 000006
2014512009.tif 000007
【図１】
2014512009.tif 000008
【図２】
2014512009.tif 000009
【国際調査報告】
2014512009.tif 000010
2014512009.tif 000011
2014512009.tif 000012