(57)【要約】  本発明は、核酸配列の存在に基づきＳＴＥＣ細菌を検出および特徴決定する迅速な方法、特に、ＰＣＲベースの検出方法、ならびにそれに有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。本方法は、好ましくは、食物または水試料、例えば、牛肉濃縮物中のＳＴＥＣ細菌を検出するために用いられる。本発明はさらに、本発明の方法を実施するための単離ポリヌクレオチド、複製組成物、キット、および試薬錠剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、
（ａ）配列番号６８８の少なくとも一部の増幅および検出のための第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブのそれぞれは、５’末端および３’末端を含み；前記第１のプライマーは、配列番号１４５の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含み；前記プローブは、配列番号１６０の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む、前記ステップと、
（ｂ）工程（ａ）の前記反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと、
（ｃ）工程（ｂ）の前記増幅を検出するステップと
を含む前記方法。
【請求項２】
第２のプライマーが、配列番号１９１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のプライマーが、配列番号１４６〜１５９からなる群から選択される配列を含み、第２のプライマーが、配列番号１９２〜２０５からなる群から選択される配列を含み、プローブが、配列番号１６１〜１７５からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プローブの３’末端が第１のプライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成し、前記プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応混合物が、配列番号１７６の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
核酸を含む試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、
（ａ）配列番号６８６の少なくとも一部の増幅および検出のための第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブのそれぞれは、５’末端および３’末端を含み；前記第１のプライマーおよびプローブは：
（Ｉ）配列番号１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号１６の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含むプローブ；
（ＩＩ）配列番号１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号４９の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含むプローブ；ならびに
（ＩＩＩ）配列番号５５またはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号５６またはそれと相補的な配列を含むプローブ；
からなる群から選択される、前記ステップと、
（ｂ）工程（ａ）の前記反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと、
（ｃ）工程（ｂ）の前記増幅を検出するステップと
を含む前記方法。
【請求項７】
第２のプライマーが、配列番号５８の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むか、または配列番号７３を含む核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１のプライマーが、配列番号２〜１５、４８からなる群から選択される配列を含み；第２のプライマーが、配列番号５９〜７２からなる群から選択される配列を含み；前記プローブは、配列番号１７〜３０、４９〜５２からなる群から選択される配列を含む。請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プローブの前記３’末端が第１のプライマーの前記５’末端に直接または間接的に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成し、前記プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
反応混合物が、配列番号５３、５４、もしくは５７を含むか、または配列番号３１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸を含む試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、
（ａ）配列番号６８７の少なくとも一部の増幅および検出のための第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブのそれぞれは、５’末端および３’末端を含み；前記第１のプライマーおよびプローブは：
（Ｉ）配列番号７４の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号８９の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含むプローブ；
（ＩＩ）配列番号１２０またはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号１２１もしくは１２２またはそれと相補的な配列を含むプローブ；ならびに
（ＩＩＩ）配列番号１２５またはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号１２６またはそれと相補的な配列を含むプローブ
からなる群から選択される、前記ステップと、
（ｂ）工程（ａ）の前記反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと、
（ｃ）工程（ｂ）の前記増幅を検出するステップと
を含む前記方法。
【請求項１２】
前記第２のプライマーが、配列番号１２８の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むか、または配列番号１４３もしくは１４４を含む核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１のプライマーが、配列番号７５〜８８からなる群から選択される配列を含み；第２のプライマーが、配列番号１２９〜１４４からなる群から選択される配列を含み；前記プローブが、配列番号９０〜１０４からなる群から選択される配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プローブの前記３’末端が第１のプライマーの前記５’末端に直接または間接的に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成し、前記プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
反応混合物が、配列番号１２３、１２４、もしくは１２７を含むか、または配列番号１０５の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料が食物試料または水試料を含む、請求項１、６、または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
プライマー−プローブ複合体を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記プライマープローブ複合体は：
（Ａ）配列番号１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むプライマー領域および配列番号１６の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプローブ領域；
（Ｂ）配列番号４８を含むプライマー領域および配列番号４９〜５２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｃ）配列番号５５を含むプライマー領域および配列番号５６を含むプローブ領域；
（Ｄ）配列番号７４の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプライマー領域および配列番号８９の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプローブ領域；
（Ｅ）配列番号１２０を含むプライマー領域および配列番号１２１〜１２２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｆ）配列番号１２５を含むプライマー領域および配列番号１２６を含むプローブ領域；ならびに
（Ｇ）配列番号１４５の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプライマー領域および配列番号１６０の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプローブ領域
を含み；
前記プローブ領域および前記プライマー領域はそれぞれ、５’および３’末端を有し、前記プローブ領域の前記３’末端は、前記プライマー領域の前記５’末端にリンカー部分を介して結合しており、前記プライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識をさらに含む、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、試料中のＳＴＥＣ細菌の検出のためのキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載の複製組成物を含む試薬錠剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の存在に基づき志賀毒素産生大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）細菌を検出および特徴決定する方法、好ましくは、ＰＣＲベースの検出方法、ならびにそれに有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、グラム陰性桿菌である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のほとんどの株は良性であり、ヒトおよび他の動物の正常な腸内フローラとして見出されているが、一部の株は病原性であり、疾患をもたらし得る。病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株は、それらの疫学、臨床経過および疾患発症を引き起こす潜在性が異なる。
【０００３】
志賀毒素産生大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）は、軽度から重度の腸疾患、腎臓の問題、およびさらには中枢神経系への影響を引き起こし得る腸管出血性細菌の一類型である。これらの細菌株の病原性は、大部分が、それらの志賀様毒素Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の産生に起因する。さらに、ｅａｅ遺伝子によりコードされるインチミン接着タンパク質の産生は、細菌の病原性にリンクしている。それというのも、ある表面抗原、例として、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２１、Ｏ４５、Ｏ１０３、およびＯ１４５抗原を有するためである。
【０００４】
１つの周知の血清型のＳＴＥＣ細菌は、いくつかの食物および水経由発症に関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清Ｏ１５７：Ｈ７である。この細菌血清型は、米国農務省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ））によりゼロトレランス規格で牛挽肉中の混和物として規制される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７についての多数の試験がその厳密な規制のために市場に存在する。しかしながら、多数の他のＳＴＥＣ細菌株も疾患を引き起こし得、それにより他のＳＴＥＣ細菌血清型、または一般のＳＴＥＣ細菌の検出が食物安全の改善に重要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、試料中のＳＴＥＣ細菌の正確な検出および特徴決定のための試験を有することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、前記試料は、核酸を含み：
（ａ）ｅａｅ遺伝子、Ｓｔｘ１Ａ遺伝子、およびＳｔｘ２Ａ遺伝子の１つまたは複数の少なくとも一部の増幅に好適なプライマー対を含む反応混合物を提供するステップと；
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと； 
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む方法である。
【０００７】
ある例において、本発明は、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、前記試料は、核酸を含み、
（ａ）配列番号６８８（ｅａｅ）の少なくとも一部の増幅および検出のための第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブのそれぞれは、５’末端および３’末端を含み；前記第１のプライマーは、配列番号１４５の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含み；前記プローブは、配列番号１６０の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む、ステップと；
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと； 
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む方法に関する。
【０００８】
ある実施形態において、第２のプライマーは、配列番号１９１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む核酸配列を含む。さらなる実施形態において、第１のプライマーは、配列番号１４６〜１５９からなる群から選択される配列を含み、第２のプライマーは、配列番号１９２〜２０５からなる群から選択される配列を含み、プローブは、配列番号１６１〜１７５からなる群から選択される配列を含む。追加の実施形態において、プローブの３’末端は、前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる実施形態において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識することができる。追加の実施形態において、反応混合物は、配列番号１７６の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、食物試料または水試料を含む。
【０００９】
他の例において、本発明は、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、前記試料は、核酸を含み、
（ａ）配列番号６８６（Ｓｔｘ１Ａ）の少なくとも一部の増幅および検出のための第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブのそれぞれは、５’末端および３’末端を含み；前記第１のプライマーおよびプローブは、
（Ｉ）配列番号１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号１６の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含むプローブ；
（ＩＩ）配列番号１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号４９の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含むプローブ；ならびに
（ＩＩＩ）配列番号５５またはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号５６またはそれと相補的な配列を含むプローブ；
からなる群から選択される、ステップと；
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む方法に関する。
【００１０】
ある実施形態において、第２のプライマーは、配列番号５８の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたは配列番号７３を含む核酸配列を含む。他の実施形態において、第１のプライマーは、配列番号２〜１５、４８からなる群から選択される配列を含み；第２のプライマーは、配列番号５９〜７２からなる群から選択される配列を含み；プローブは、配列番号１７〜３０、４９〜５２からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態において、プローブの３’末端は、第１のプライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる実施形態において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識することができる。追加の実施形態において、反応混合物は、配列番号５３、５４、もしくは５７を含むか、または配列番号３１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、食物試料または水試料を含む。
【００１１】
いっそうさらなる例において、本発明は、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、前記試料は、核酸を含み、
（ａ）配列番号６８７（Ｓｔｘ２Ａ）の少なくとも一部の増幅および検出のための第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記第１のプライマー、第２のプライマー、およびプローブのそれぞれは、５’末端および３’末端を含み；前記第１のプライマーおよびプローブは、
（Ｉ）配列番号７４の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号８９の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を含むプローブ；
（ＩＩ）配列番号１２０またはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号１２１もしくは１２２またはそれと相補的な配列を含むプローブ；ならびに
（ＩＩＩ）配列番号１２５またはそれと相補的な配列を含む第１のプライマーおよび配列番号１２６またはそれと相補的な配列を含むプローブ
からなる群から選択される、ステップと；
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと； 
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む方法に関する。
【００１２】
ある実施形態において、第２のプライマーは、配列番号１２８の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドまたは配列番号１４３もしくは１４４を含む核酸配列を含む。他の実施形態において、第１のプライマーは、配列番号７５〜８８からなる群から選択される配列を含み；第２のプライマーは、配列番号１２９〜１４４からなる群から選択される配列を含み；プローブは、配列番号９０〜１０４からなる群から選択される配列を含む。追加の実施形態において、プローブの３’末端は、前記第１のプライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる実施形態において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識することができる。追加の実施形態において、反応混合物は、配列番号１２３、１２４、もしくは１２７を含むか、または配列番号１０５の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、食物試料または水試料を含む。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、プライマー−プローブ複合体を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記プライマープローブ複合体は：
（Ａ）配列番号１の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むプライマー領域および配列番号１６の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプローブ領域；
（Ｂ）配列番号４８を含むプライマー領域および配列番号４９〜５２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｃ）配列番号５５を含むプライマー領域、および配列番号５６を含むプローブ領域；
（Ｄ）配列番号７４の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプライマー領域および配列番号８９の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプローブ領域；
（Ｅ）配列番号１２０を含むプライマー領域および配列番号１２１〜１２２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｆ）配列番号１２５を含むプライマー領域および配列番号１２６を含むプローブ領域；ならびに
（Ｇ）配列番号１４５の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプライマー領域および配列番号１６０の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むプローブ領域
を含み；
前記プローブ領域および前記プライマー領域はそれぞれ、５’および３’末端を有し、前記プローブ領域の前記３’末端は、前記プライマー領域の前記５’末端にリンカー部分を介して結合しており、前記プライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識をさらに含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む、試料中のＳＴＥＣ細菌の検出のためのキットおよび試薬錠剤に関する。
本発明のさらなる態様は、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する方法であって、前記試料は、核酸を含み：
（ａ）
（ｉ）ｅａｅ遺伝子；および
（ｉｉ）Ｓｔｘ１ＡおよびＳｔｘ２Ａ遺伝子の１つまたは複数；
の少なくとも一部の増幅に好適なプライマー対を含む反応混合物を提供するステップと；
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む方法である。
【００１５】
ある例において、ｅａｅ遺伝子の一部の増幅は、配列番号６８８の少なくとも一部の増幅を含む。他の例において、Ｓｔｘ１ＡおよびＳｔｘ２Ａ遺伝子の１つまたは複数の一部の増幅は、配列番号６８６および６８７の一方または両方の少なくとも一部の増幅を含む。ある実施形態において、反応混合物は、配列番号６８６〜６８８の３つ全ての少なくとも一部の増幅に好適なプライマー対を含む。
追加の実施形態において、反応混合物は、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２１、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１４５、およびＯ１５７表面抗原をコードする遺伝子の１つまたは複数の少なくとも一部の増幅に好適なプライマー対をさらに含む。ある例において、このような増幅は、配列番号６８９〜６９６からなる群から選択される１つまたは複数の核酸配列の増幅を含む。
【００１６】
ある例において、配列番号６８６の増幅に好適なプライマー対は、（Ａ）配列番号１〜１５および４８からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、ならびに配列番号５８〜７２からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；または（Ｂ）配列番号５５を含む第１のプライマーおよび配列番号７３を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み：（Ｉ）前記第１のプライマーが配列番号１〜１５から選択される場合、前記プローブは、配列番号３１〜４７からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号４８を含む場合、前記プローブは、配列番号４９〜５２からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号５５を含む場合、前記プローブは、配列番号５６を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号３１〜４７、５３〜５４、および５７からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００１７】
ある例において、配列番号６８７の増幅に好適なプライマー対は、（Ａ）配列番号７４〜８８からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号１２８〜１４２からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；（Ｂ）配列番号１２０を含む第１のプライマーおよび配列番号１４３を含む第２のプライマー；または（Ｃ）配列番号１２５を含む第１のプライマーおよび配列番号１４４を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み：（Ｉ）前記第１のプライマーが配列番号７４〜８８から選択される場合、前記プローブは、配列番号８９〜１０４からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号１２０を含む場合、前記プローブは、配列番号１２１〜１２２からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号１２５を含む場合、前記プローブは、配列番号１２６を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号１０５〜１１９、１２３〜１２４、および１２７からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００１８】
ある例において、前記配列番号６８８の増幅に好適なプライマー対は、配列番号１４５〜１５９からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号１９１〜２０５からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、プローブは、配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号１７６〜１９０からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００１９】
ある例において、配列番号６８９の増幅に好適なプライマー対は：（Ａ）配列番号２０６〜２２０からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号２５８〜２７２からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；（Ｂ）配列番号２５１を含む第１のプライマー、および配列番号２７３を含む第２のプライマー；または（Ｃ）配列番号２５５を含む第１のプライマー、および配列番号２７４を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、プローブは：（Ｉ）前記第１のプライマーが配列番号２０６〜２２０から選択される場合、前記プローブは、配列番号２２１〜２３５からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号２５１を含む場合、前記プローブは、配列番号２５２〜２５３からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号２５５を含む場合、前記プローブは、配列番号２５６を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号２３６〜２５０、２５４、および２５７からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２０】
ある例において、配列番号６９０の増幅に好適なプライマー対は、配列番号２７５〜２８９および３２４からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマーならびに配列番号３２７〜３４１からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、プローブは：（Ｉ）前記第１のプライマーが配列番号２７５〜２８９から選択される場合、前記プローブは、配列番号２９０〜３０６からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号３２４を含む場合、前記プローブは、配列番号３２５を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号３０７〜３２３および３２６からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２１】
ある例において、配列番号６９１の増幅に好適なプライマー対は、配列番号３４２〜３５６からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号３９３〜４０７からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、前記プローブは、配列番号３５７〜３７４からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号３７５〜３９２からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２２】
ある例において、配列番号６９２の増幅に好適なプライマー対は：（Ａ）配列番号４５６を含む第１のプライマー、および配列番号４８０を含む第２のプライマー；（Ｂ）配列番号４５９を含む第１のプライマー、および配列番号４８１を含む第２のプライマー；または（Ｃ）配列番号４６２を含む第１のプライマー、および配列番号４８２を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブを含み、前記プローブは：（Ｉ）前記第１のプライマーが配列番号４５６を含む場合、前記プローブは、配列番号４５７を含み；（ＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号４５９を含む場合、前記プローブは、配列番号４６０を含み；（ＩＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号４６２を含む場合、前記プローブは、配列番号４６３を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号４５８、４６１、および４６４からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２３】
ある例において、前記配列番号６９３の増幅に好適なプライマー対は、配列番号４０８〜４２３からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号４６５〜４７９からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、前記プローブは、配列番号４２４〜４３９からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号４４０〜４５５からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２４】
ある例において、配列番号６９４の増幅に好適なプライマー対は：（Ａ）配列番号４８３〜４９７および５３７からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、ならびに配列番号５４０〜５５４からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；（Ｂ）配列番号５２８を含む第１のプライマー、および配列番号５５５を含む第２のプライマー；（Ｃ）配列番号５３１を含む第１のプライマー、および配列番号５５６を含む第２のプライマー；または（Ｄ）配列番号５３４を含む第１のプライマー、および配列番号５５７を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、前記プローブは：（Ｉ）前記第１のプライマーが配列番号４８３〜４９７から選択される場合、前記プローブは、配列番号４９８〜５１２からなる群から選択される核酸配列を含み；（ＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号５２８を含む場合、前記プローブは、配列番号５２９を含み；（ＩＩＩ）前記第１のプライマーが配列番号５３１を含む場合、前記プローブは、配列番号５３２を含み；（ＩＶ）前記第１のプライマーが配列番号５３４を含む場合、前記プローブは、配列番号５３５を含み；（Ｖ）前記第１のプライマーが配列番号５３７を含む場合、前記プローブは、配列番号５３８を含む。さらなる例において、プローブの３’末端は、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号５１３〜５２７、５３０、５３３、５３６、および５３９からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２５】
ある例において、配列番号６９５の増幅に好適なプライマー対は、配列番号５５８〜５７２からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号６０３〜６１７からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、前記プローブは、配列番号５７３〜５８７からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる例において、前記プローブの３’末端は、前記プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号５８８〜６０２からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２６】
ある例において、前記配列番号６９６の増幅に好適なプライマー対は、配列番号６１８〜６３３からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号６７１〜６８５からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。追加の例において、反応混合物は、プローブをさらに含み、前記プローブは、配列番号６３４〜６５３からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる例において、前記プローブの３’末端は、前記プライマーの５’末端に結合しており、プライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能に標識されている。追加の例において、反応混合物は、配列番号６５４〜６７０からなる群から選択される核酸配列を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２７】
１つの特定の実施形態において：
（Ａ）配列番号６８６の増幅に好適なプライマー対は、
（Ｉ）配列番号１〜１５および４８からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、ならびに配列番号５８〜７２からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；または
（ＩＩ）配列番号５５を含む第１のプライマーおよび配列番号７３を含む第２のプライマー
を含み；
（Ｂ）配列番号６８７の増幅に好適なプライマー対は、
（Ｉ）配列番号７４〜８８からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号１２８〜１４２からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；
（ＩＩ）配列番号１２０を含む第１のプライマーおよび配列番号１４３を含む第２のプライマー；または
（ＩＩＩ）配列番号１２５を含む第１のプライマーおよび配列番号１４４を含む第２のプライマー
を含み；
（Ｃ）配列番号６８８の増幅に好適なプライマー対は、配列番号１４５〜１５９からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号１９１〜２０５からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含み；
（Ｄ）配列番号６８９の増幅に好適なプライマー対は、
（Ｉ）配列番号２０６〜２２０からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号２５８〜２７２からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー
（ＩＩ）配列番号２５１を含む第１のプライマー、および配列番号２７３を含む第２のプライマー；または
（ＩＩＩ）配列番号２５５を含む第１のプライマー、および配列番号２７４を含む第２のプライマー
を含み；
（Ｅ）配列番号６９０の増幅に好適なプライマー対は、配列番号２７５〜２８９および３２４からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、ならびに配列番号３２７〜３４１からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含み；
（Ｆ）配列番号６９１の増幅に好適なプライマー対は、配列番号３４２〜３５６からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号３９３〜４０７からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含み；
【００２８】
（Ｇ）配列番号６９２の増幅に好適なプライマー対は、
（Ｉ）配列番号４５６を含む第１のプライマー、および配列番号４８０を含む第２のプライマー；
（ＩＩ）配列番号４５９を含む第１のプライマー、および配列番号４８１を含む第２のプライマー；または
（ＩＩＩ）配列番号４６２を含む第１のプライマー、および配列番号４８２を含む第２のプライマー
を含み；
（Ｈ）配列番号６９３の増幅に好適なプライマー対は、配列番号４０８〜４２３からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号４６５〜４７９からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含み；
（Ｉ）配列番号６９４の増幅に好適なプライマー対は、
（Ｉ）配列番号４８３〜４９７および５３７からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、ならびに配列番号５４０〜５５４からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー；
（ＩＩ）配列番号５２８を含む第１のプライマー、および配列番号５５５を含む第２のプライマー；
（ＩＩＩ）配列番号５３１を含む第１のプライマー、および配列番号５５６を含む第２のプライマー；または
（ＩＶ）配列番号５３４を含む第１のプライマー、および配列番号５５７を含む第２のプライマー
を含み；
（Ｊ）配列番号６９５の増幅に好適なプライマー対は、配列番号５５８〜５７２からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号６０３〜６１７からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含み；
（Ｋ）配列番号６９６の増幅に好適なプライマー対は、配列番号６１８〜６３３からなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマー、および配列番号６７１〜６８５からなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーを含む。
【００２９】
追加の例において、反応混合物は、配列番号６８６〜６８８および配列番号６８９〜６９６の１つまたは複数の増幅に好適なプライマー対を含む。
特定の例において、試料は、食物試料または水試料を含む。
追加の実施形態において、本発明は、配列番号１〜６８５からなる群から選択される核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、プライマー−プローブ複合体を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記プライマー−プローブ複合体は：
（Ａ）配列番号１〜１５からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号１６〜３０からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｂ）配列番号４８を含むプライマー領域、および配列番号４９〜５２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｃ）配列番号５５を含むプライマー領域、および配列番号５６を含むプローブ領域；
（Ｄ）配列番号７４〜８８からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号８９〜１０４からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｅ）配列番号１２０を含むプライマー領域、および配列番号１２１〜１２２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｆ）配列番号１２５を含むプライマー領域、および配列番号１２６を含むプローブ領域；
（Ｇ）配列番号１４５〜１５９からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号１６０〜１７５からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｈ）配列番号２０６〜２２０からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号２２１〜２３５からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｉ）配列番号２５１を含むプライマー領域、および配列番号２５２〜２５３からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｊ）配列番号２５５からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および、配列番号２５６からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｋ）配列番号２７５〜２８９からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号２９０〜３０６からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｌ）配列番号３２４を含むプライマー領域、および配列番号３２５を含むプローブ領域；
【００３１】
（Ｍ）配列番号３４２〜３５６からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号３５７〜３７４からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｎ）配列番号４０８〜４２３からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号４２４〜４３９からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｏ）配列番号４５６を含むプライマー領域、および配列番号４５７を含むプローブ領域；
（Ｐ）配列番号４５９を含むプライマー領域、および配列番号４６０を含むプローブ領域；
（Ｑ）配列番号４６２を含むプライマー領域、および配列番号４６３を含むプローブ領域；
（Ｒ）配列番号４８３〜４９７からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号４９８〜５１２からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｓ）配列番号５２８を含むプライマー領域、および配列番号５２９を含むプローブ領域；
（Ｔ）配列番号５３１を含むプライマー領域、および配列番号５３２を含むプローブ領域；
（Ｕ）配列番号５３４を含むプライマー領域、および配列番号５３５を含むプローブ領域；
（Ｖ）配列番号５３７を含むプライマー領域、および配列番号５３８をプローブ領域；
（Ｗ）配列番号５５８〜５７２からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号５７３〜５８７からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域；
（Ｘ）配列番号６１８〜６３３からなる群から選択される核酸配列を含むプライマー領域、および配列番号６３４〜６５３からなる群から選択される核酸配列を含むプローブ領域
を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００３２】
ある例において、プローブ領域およびプライマー領域はそれぞれ、５’および３’末端を有し、プローブ領域の３’末端は、プライマー領域の５’末端にリンカー部分を介して結合している。他の例において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識をさらに含む。
いっそうさらなる実施形態において、本発明は、本出願の単離ポリヌクレオチドを含む、試料中のＳＴＥＣ細菌の検出のためのキットに関する。他の実施形態において、本発明は、本出願の複製組成物を含む試薬錠剤に関する。
【００３３】
配列の要約
配列番号１〜３０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ１Ａ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８６として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号１〜３０から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５８〜７２から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号１〜１５の１つはプライマーとして、配列番号１６〜３０から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号３１〜４７から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００３４】
配列番号４８〜５２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ１Ａ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８６として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号４８〜５２から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５８〜７２から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号４８はプライマーとして、配列番号４９〜５２から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５３〜５４から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００３５】
配列番号５５〜５６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ１Ａ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８６として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号５５〜５６から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号７３とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号５５はプライマーとして、配列番号５６を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号５６のプローブの３’末端は、配列番号５５のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５７とともに使用される。
【００３６】
配列番号７４〜１０４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ２Ａ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８７として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号７４〜１０４から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号１２８〜１４２から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号７４〜８８の１つはプライマーとして、配列番号８９〜１０４から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１０５〜１１９から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００３７】
配列番号１２０〜１２２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ２Ａ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８７として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号１２０〜１２２から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号１４３とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号１２０はプライマーとして、配列番号１２１〜１２２から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１２３〜１２４から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００３８】
配列番号１２５〜１２６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ２Ａ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８７として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号１２５〜１２６から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号１４４とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号１２５はプライマーとして、配列番号１２６を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号１２６のプローブの３’末端は、配列番号１２５のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１２７とともに使用される。
【００３９】
配列番号１４５〜１７５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｅａｅ遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８８として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号１４５〜１７５から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号１９１〜２０５から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号１４５〜１５９の１つはプライマーとして、配列番号１６０〜１７５から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１７６〜１９０から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００４０】
配列番号２０６〜２３５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２６表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８９として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号２０６〜２３５から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号２５８〜２７２から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号２０６〜２２０の１つはプライマーとして、配列番号２２１〜２３５から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号２３６〜２５０から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００４１】
配列番号２５１〜２５３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２６表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８９として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号２５１〜２５３から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号２７３とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号２５１はプライマーとして、配列番号２５２〜２５３から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、配列番号２５１のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号２５４とともに使用される。
【００４２】
配列番号２５５〜２５６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２６表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６８９として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号２５５〜２５６から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号２７４とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号２５５はプライマーとして、配列番号２５６を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号２５６のプローブの３’末端は、配列番号２５５のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号２５７とともに使用される。
【００４３】
配列番号２７５〜３０６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９０として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号２７５〜３０６から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号３２７〜３４１から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号２７５〜２８９の１つはプライマーとして、配列番号２９０〜３０６から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号３０７〜３２３から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００４４】
配列番号３２４〜３２５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９０として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号３２４〜３２５から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号３２７〜３４１から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号３２４はプライマーとして、配列番号３２５を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号３２５のプローブの３’末端は、配列番号３２４のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号３２６とともに使用される。
【００４５】
配列番号３４２〜３７４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２１表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９１として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号３４２〜３７４から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号３９３〜４０７から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号３４２〜３５６の１つはプライマーとして、配列番号３５７〜３７４から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号３７５〜３９２から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００４６】
配列番号４０８〜４３９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４５表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９３として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号４０８〜４３９から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号４６５〜４７９から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号４０８〜４２３の１つはプライマーとして、配列番号４２４〜４３９から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号４４０〜４５５から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００４７】
配列番号４５６〜４５７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４５表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９２として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号４５６〜４５７から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号４８０とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号４５６はプライマーとして、配列番号４５７を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号４５７のプローブの３’末端は、配列番号４５６のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識され、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号４５８とともに使用される。
【００４８】
配列番号４５９〜４６０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４５表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９２として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号４５９〜４６０から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号４８１とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号４５９はプライマーとして、配列番号４６０を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号４６０のプローブの３’末端は、配列番号４５９のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号４６１とともに使用される。
【００４９】
配列番号４６２〜４６４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４５表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９２として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号４６４〜４６４から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号４８２とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号４６２はプライマーとして、配列番号４６３を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号４６３のプローブの３’末端は、配列番号４６２のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号４６４とともに使用される。
【００５０】
配列番号４８３〜５１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１０３表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９４として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号４８３〜５１２から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５４０〜５５４から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号４８３〜４９７の１つはプライマーとして、配列番号４９８〜５１２から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５１３〜５２７から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００５１】
配列番号５２８〜５２９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１０３表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９４として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号５２８〜５２９から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５５５とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号５２８はプライマーとして、配列番号５２９を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号５２９のプローブの３’末端は、配列番号５２８のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５３０とともに使用される。
【００５２】
配列番号５３１〜５３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１０３表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９４として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号５３１〜５３２から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５５６とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号５３１はプライマーとして、配列番号５３２を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号５３２のプローブの３’末端は、配列番号５３１のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５３３とともに使用される。
【００５３】
配列番号５３４〜５３５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１０３表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９４として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号５３４〜５３５から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５５７とともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号５３４はプライマーとして、配列番号５３５を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号５３５のプローブの３’末端は、配列番号５３４のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５３６とともに使用される。
【００５４】
配列番号５３７〜５３８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１０３表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９４として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号５３７〜５３８から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号５４０〜５５４から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号５３７はプライマーとして、配列番号５３８を含むプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号５３８のプローブの３’末端は、配列番号５３７のプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識され、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５３９とともに使用される。
【００５５】
配列番号５５８〜５８７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１４５表面抗原遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９５として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号５５８〜５８７から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号６０３〜６１７から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号５５８〜５７２の１つはプライマーとして、配列番号５７３〜５８７から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５８８〜６０２から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００５６】
配列番号６１８〜６５３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７プロファージ病原性因子遺伝子標的、例えば、本明細書において配列番号６９６として提供される標的配列の一部の増幅および検出のためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。配列番号６１８〜６５３から選択されるプライマーを使用する増幅は、好適なリバースプライマー、例えば、配列番号６７１〜６８５から選択されるものとともに実施することができる。ある実施形態において、配列番号６１８〜６３３の１つはプライマーとして、配列番号６３４〜６５３から選択されるプローブとともに使用される。ある他の実施形態において、選択されるプローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、検出可能に標識されており、プローブにハイブリダイズし、その蛍光をクエンチし得る別個のクエンチャーオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号６５４〜６７０から選択されるオリゴヌクレオチドとともに使用される。
【００５７】
配列番号６８６は、試料中のＳｔｘ１Ａ遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ１Ａ遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６８６の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号１〜３０、４８〜５２、５５〜５６、および５８〜７３が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号１〜１５から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号５８〜７２から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号１６〜３０から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号３１〜４７から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。他の実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号４８および配列番号５８〜７２から選択されるリバースプライマーを使用して実施される一方、検出は、配列番号４９〜５２から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号５３〜５４から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。いっそうさらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号５５およびリバースプライマーとしての配列番号７３を使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号５６および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号５７を使用して達成されていてもよい。
【００５８】
配列番号６８７は、試料中のＳｔｘ２Ａ遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｘ２Ａ遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６８７の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号７４〜１０４、１２０〜１２２、１２５〜１２６、および１２８〜１４４が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号７４〜８８から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号１２８〜１４２から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号８９〜１０４から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号１０５〜１１９から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。他の実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号１２０およびリバースプライマーとしての配列番号１４３を使用して実施される一方、検出は、配列番号１２１〜１２２から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号１２３〜１２４から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。いっそうさらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号１２５およびリバースプライマーとしての配列番号１４４を使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号１２６および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号１２７を使用して達成されていてもよい。
【００５９】
配列番号６８８は、試料中のｅａｅ遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｅａｅ遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６８８の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号１４５〜１７５が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号１４５〜１５９から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号１９１〜２０５から選択されるリバースプライマーを使用して実施される一方、検出は、配列番号１６０〜１７５から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号１７６〜１９０から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。
【００６０】
配列番号６８９は、試料中のＯ２６表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２６表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６８９の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号２０６〜２３５、２５１〜２５３、２５５〜２５６、および２５８〜２７４が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号２０６〜２２０から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号２５８〜２７２から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号２２１〜２３５から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号２３６〜２５０から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。他の実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号２５１およびリバースプライマーとしての配列番号２７３を使用して実施される一方、検出は、配列番号２５２〜２５３から選択されるプローブおよび、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号２５４を使用して達成されていてもよい。いっそうさらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号２５５およびリバースプライマーとしての配列番号２７４を使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号２５６および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号２５７を使用して達成されていてもよい。
【００６１】
配列番号６９０は、試料中のＯ１１１表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９０の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号２７５〜３０６、３２４〜３２５、および３２７〜３４１が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号２７５〜２８９から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号３２７〜３４１から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号２９０〜３０６から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号３０７〜３２３から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。他の実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号３２４および配列番号３２７〜３４１から選択されるリバースプライマーを使用して実施される一方、検出は、配列番号３２５を含むプローブおよび、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号３２６を使用して達成されていてもよい。
【００６２】
配列番号６９１は、試料中のＯ１２１表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２１表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９１の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号３４２〜３５６および３９３〜４０７が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号３４２〜３５６から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号３９３〜４０７から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号３５７〜３７４から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号３７５〜３９２から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。
【００６３】
配列番号６９２は、試料中のＯ４５表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４５表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９２の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号４５６〜４５７、４５９〜４６０、４６２〜４６３、および４８０〜４８２が含まれる。ある実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号４５６およびリバースプライマーとしての配列番号４８０を用いて実施される一方、検出は、配列番号４５７を含むプローブおよび、場合により、配列番号４５８を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。さらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号４５９およびリバースプライマーとしての配列番号４８１を使用して実施される一方、検出は、配列番号４６０を含むプローブおよび、場合により、配列番号４６１を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。いっそうさらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号４６２およびリバースプライマーとしての配列番号４８２を使用して実施される一方、検出は、配列番号４６３を含むプローブおよび、場合により、配列番号４６４を含むクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。
【００６４】
配列番号６９３は、試料中のＯ４５表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４５表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９２の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号４０８〜４３９および４６５〜４７９が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号４０８〜４２３から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号４６５〜４７９から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号４２４〜４３９から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号４４〜４５５から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。
【００６５】
配列番号６９４は、試料中のＯ１０３表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１０３表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９４の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号４８３〜５１２、５２８〜５２９、５３１〜５３２、５３４〜５３５、５３７〜５３８、および５４０〜５５７が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号４８３〜４９７から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号５５０〜５５４から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号４９８〜５１２から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号５１３〜５２７から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。他の実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号５２８およびリバースプライマーとしての配列番号５５５を使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号５２９および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号５３０を使用して達成されていてもよい。いっそうさらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号５３１およびリバースプライマーとしての配列番号５５６を使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号５３２および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号５３３を使用して達成されていてもよい。追加の実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号５３４およびリバースプライマーとしての配列番号５５７を使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号５３５および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号５３６を使用して達成されていてもよい。別のさらなる実施形態において、増幅は、フォワードプライマーとしての配列番号５３７および配列番号５５０〜５５４から選択されるリバースプライマーを使用して実施される一方、検出は、プローブとしての配列番号５３８および、場合により、クエンチャーオリゴヌクレオチドとしての配列番号５３９を使用して達成されていてもよい。
【００６６】
配列番号６９５は、試料中のＯ１４５表面抗原遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１４５表面抗原遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９５の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号５５８〜５８７および６０３〜６１７が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号５５８〜５７２から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号６０３〜６１７から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号５７３〜５８７から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号５８８〜６０２から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。
【００６７】
配列番号６９６は、試料中のＯ１５７プロファージ病原性因子遺伝子の存在、および最終的には、試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７プロファージ病原性因子遺伝子の一部のヌクレオチド配列である。配列番号６９６の増幅に有用な好適なプライマーには、配列番号６１８〜６５３および６７１〜６８５が含まれる。ある実施形態において、増幅は、配列番号６１８〜６３３から選択されるフォワードプライマーおよび配列番号６７１〜６８５から選択されるリバースプライマーを用いて実施される一方、検出は、配列番号６３４〜６５３から選択されるプローブおよび、場合により、配列番号６５４〜６７０から選択されるクエンチャーオリゴヌクレオチドを使用して達成されていてもよい。
【００６８】
配列番号６９７〜７００は、一部の例において、陽性対照反応として用いられるＳＶ４０ＤＮＡの増幅に有用なヌクレオチド配列を含む。ある例において、増幅は、フォワードプライマーとして配列番号６９７または６９８をリバースプライマーとしての配列番号７００とともに使用して実施される。ある実施形態において、配列番号６９７または６９８の一方はプライマーとして、プローブとしての配列番号６９９とともに使用される。ある他の実施形態において、配列番号６９９プローブの３’末端は、選択されるプライマーの５’末端に好適なリンカー部分、例えば、１８炭素スペーサーを介して結合している。追加の実施形態において、プローブは、レポーター−クエンチャー対により検出可能に標識されており、プローブ領域をフランキングする自己相補的配列を有し、それにより核酸分子がステムループ構造に自己ハイブリダイズすることが可能になり、したがってクエンチャー分子によるレポーターシグナルのクエンチングが可能になる。
【００６９】
配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ”）に準拠し、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列列記要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８条および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２２に定められる規則に従う。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本出願人らは、本開示における全ての引用文献の全内容を具体的に取り込む。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の列挙のいずれかとして挙げられる場合、範囲が別個に開示されるかにかかわらず、任意の範囲上限値または好ましい値および任意の範囲下限値または好ましい値の任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示するものとして理解すべきである。数値の範囲が本明細書に引用される場合、特に記載のない限り、範囲は、その終点、ならびにその範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する場合に引用される具体値に限定されるものではない。
【００７１】
定義
本開示において、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
本明細書において使用される用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内を意味する。
用語「含む」は、用語「から本質的になる」および「からなる」により包含される実施形態を含むものとする。同様に、用語「から本質的になる」は、用語「からなる」により包含される実施形態を含むものとする。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲの略語である。
用語「単離」は、通常、天然環境中で材料に付随しまたはそれと相互作用する成分を実質的に含まずまたはそうでなければそれらの成分から取り出された材料、例えば、核酸分子および／またはタンパク質を指す。単離ポリヌクレオチドは、それらが天然に生じる宿主細胞から精製することができる。当業者に公知の慣用の核酸精製法を使用して単離ポリヌクレオチドを得ることができる。この用語は、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成ポリヌクレオチドも包含する。
【００７２】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然、または変化したヌクレオチド塩基を含有してもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり得る。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１つまたは複数の鎖、またはそれらの混合物からなっていてよい。
【００７３】
用語「増幅産物」または「アンプリコン」は、プライマー指向増幅反応の間に産生される核酸断片を指す。典型的なプライマー指向増幅の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、が含まれる。ＰＣＲ法が選択される場合、複製組成物は典型的には、核酸複製のための成分、例えば：デオキシヌクレオチド三リン酸、適切な配列を有する２つ（以上）のプライマー、耐熱性ポリメラーゼ、緩衝液、溶質およびタンパク質を含み得る。これらの試薬および核酸の増幅におけるそれらの使用についての手順を説明する詳細は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７，Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）および米国特許第４，６８３，１９５号明細書（１９８６，Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）に提供されている。ＬＣＲ法が選択される場合、核酸複製組成物は、例えば：耐熱性リガーゼ（例えば、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、２組の隣接オリゴヌクレオチド（それぞれの組のうち一方のメンバーは、標的鎖のそれぞれと相補的である）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイトール、およびサケ精子ＤＮＡを含み得る。例えば、Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４−１０７８（１９８５）参照。
【００７４】
用語「プライマー」は、相補鎖の合成がポリメラーゼにより触媒される条件下に置かれる場合、相補鎖に沿っての核酸合成または複製の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（合成または天然）を指す。プライマーは、検出可能な標識、例えば、５’末端標識をさらに含有し得る。ある実施形態において、本発明のプライマーは、８〜６０核酸長である。他の実施形態において、プライマーは、１０〜５０、１４〜４０，または２０〜３０核酸長である。特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、４９、または６０ヌクレオチド長である。
【００７５】
用語「プローブ」は、関心対象のポリヌクレオチドと相補的（必ずしも完全に相補的である必要はない）であり、関心対象のポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖とのハイブリダイゼーションにより二本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチド（合成または天然）を指す。プローブまたはプライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識をさらに含有し得る。ある実施形態において、本発明のプローブは、８〜６０核酸長である。他の実施形態において、プローブは、１０〜５０、１４〜４０、または２０〜３０核酸長である。特定の実施形態において、プローブは、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、４９、または６０ヌクレオチド長である。
プローブは、独立した実体であり得、またはプライマーと複合体化もしくはそうでなければそれに結合していてよく、例えば、プローブはその３’末端を介してプライマーの５’末端に連結される。このような結合は、例えば、結合が、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり得、非増幅性リンカーであり得るリンカー、例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）または１８炭素リンカーを介して達成される場合、直接または間接的のいずれかであり得る。このような場合、これは「プライマー−プローブ複合体」と称される。このようなプライマー−プローブ複合体の一例は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２６，１４５号明細書に見出すことができ、それは「Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ」または「Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー」と称されることが多い。
【００７６】
本明細書において使用される用語「標識」および「検出可能な標識」は、検出することができる分子、例として、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、半導体ナノ結晶、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などを指す。検出可能な標識には、レポーターおよびクエンチャーの組合せも含まれ得る。
用語「レポーター」は、クエンチャーにより抑制することができる検出可能なシグナルを示し得る物質またはその一部を指す。レポーターの検出可能なシグナルは、例えば、検出可能な範囲の蛍光である。用語「クエンチャー」は、レポーターにより産生される検出可能なシグナルを抑制し、低減させ、阻害などし得る物質またはその一部を指す。
本明細書において使用される用語「クエンチング」および「蛍光エネルギー移動」は、レポーターおよびクエンチャーが接近しており、レポーターがエネルギー源により励起される場合、励起状態のエネルギーの実質的な部分は非放射的に（ｎｏｎｒａｄｉａｔｉｖｅｌｙ）クエンチャーに移動し、それは非発光的に消失しまたはレポーターのそれとは異なる発光波長において放出されるプロセスを指す。
【００７７】
好ましくは、レポーターは、オリゴヌクレオチドへの、例えば、末端３’炭素または末端５’炭素への結合に好適な連結基により修飾された蛍光性有機色素から選択することができる。クエンチャーも、本発明の実施形態に応じて、蛍光性であってもなくてもよい有機色素から選択することができる。一般に、クエンチャーが蛍光性でありまたはレポーターからの移動されたエネルギーを非放射崩壊により単に放出するかに関わらず、クエンチャーの吸収バンドは、クエンチングを最適化するためにレポーターの蛍光発光バンドと少なくとも実質的に重複するべきである。非蛍光性クエンチャーまたはダーククエンチャーは、典型的には、励起されたレポーターからのエネルギーを吸収することにより機能するが、エネルギーを発光により放出しない。
【００７８】
特定のプローブに適切なレポーター−クエンチャー対の選択は、公知の技術に従って行うことができる。蛍光性およびダーククエンチャー、ならびに例示的なレポーター−クエンチャー対を選択することができるそれらの関連する光学特性は、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１に列挙および記載されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明におけるオリゴヌクレオチドに付加することができる一般的な反応基を介する共有結合のためにレポーターおよびクエンチャーを修飾する例は、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９２に見出すことができ、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
好ましいレポーター−クエンチャー対は、キサンテン色素、例としてフルオレセインおよびローダミン色素から選択することができる。これらの化合物の多くの好適な形態は、オリゴヌクレオチドへの結合のための結合部位としてまたは結合官能基として使用することができるフェニル基上の置換基とともに市販されている。レポーターとしての使用のための蛍光性化合物の別の好ましい群は、αまたはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物の中には、１−ジメチルアミノナフチル−５スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）−６−ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素には、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；アクリジン、例えば、９−イソチオシアナトアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール；スチルベン；ピレンなどが含まれる。
最も好ましくは、レポーターおよびクエンチャーは、フルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドへの結合のための適切な連結法は、当分野において周知である。
【００８０】
クエンチャーの好適な例は、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、それぞれがＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であるＢＨＱ−０（商標）、ＢＨＱ−１（商標）、ＢＨＱ−２（商標）、およびＢＨＱ−３（商標）、それぞれがＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であるＱＳＹ−７（商標）、ＱＳＹ−９（商標）、ＱＳＹ−２１（商標）およびＱＳＹ−３５（商標）などから選択することができる。
【００８１】
レポーターの好適な例は、色素、例えば、ＳＹＢＲグリーン、５−カルボキシフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能な５−ＦＡＭ（商標））、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な６−ＴＥＴ（商標））、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な６−ＪＯＥ（商標））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＶＩＣ（商標）色素製品、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＮＥＤ（商標）色素製品などから選択することができる。
【００８２】
レポーターおよびクエンチャーを含有するプローブの一例は、単分子または二分子立体構造のいずれかのＳｃｏｒｐｉｏｎプローブである。単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、プライマー−プローブ複合体のプローブ部分は、プローブがその標的ＤＮＡから解放される場合、プローブがステム−ループ構造を形成することを可能にする、自己相補的領域によりフランキングされている。さらに、単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、レポーターは、典型的には、自己相補的領域の一方またはその付近において、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端において結合しており、クエンチャーは、他方の自己相補的領域またはその付近において、例えば、非増幅性リンカーの５’に接して結合しており、その結果、クエンチャーは、プローブがそのステム−ループ構造である場合、クエンチングを引き起こすために十分にレポーターに接近している。二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、自己相補的フランキング領域が典型的には用いられるのではなく、むしろ別個の「ブロッキングオリゴヌクレオチド」または「クエンチングオリゴヌクレオチド」がＳｃｏｒｐｉｏｎプローブとともに用いられる。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、プローブがその標的ＤＮＡから解放される場合、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブのプローブ領域へハイブリダイズし得る。さらに、二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、レポーターは、典型的には、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブのプローブ領域に、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端において結合している一方、クエンチャーは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに、例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端において結合しており、その結果、クエンチャーは、プローブがその標的ＤＮＡから解放され、代わりにブロッキングオリゴヌクレオチドへハイブリダイズしている場合、クエンチングを引き起こすために十分にレポーターに接近している。
【００８３】
レポーターおよびクエンチャーを含有するプローブの別の例は、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ、例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術において使用することができるプローブである。この文脈において、オリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に隣接する十分な数のホスホジエステル結合を有し、その結果、用いられる５’→３’ヌクレアーゼ活性が、結合プローブを効率的に分解してレポーターおよびクエンチャーを分離させ得る。レポーターおよびクエンチャーを含有するプローブのさらに別の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ型プローブであり、これは、プローブの標的配列から解放される場合に、プローブがステム−ループ構造を形成することを可能にする自己相補的領域によりフランキングされたプローブ領域を含有する。このようなプローブは、典型的には、一方の末端またはその付近において結合しているレポーターおよび他方の末端またはその付近において結合しているクエンチャーを有し、その結果、クエンチャーは、プローブがその解放形態、したがってステム−ループ形態である場合、クエンチングを引き起こすために十分にレポーターに接近している。
【００８４】
用語「複製インヒビター部分」は、核酸鎖の複製のための鎖伸長の開始をブロックするオリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシル基に結合している任意の原子、分子または化学基を指す。例には、限定されるものではないが：３’−デオキシヌクレオチド（例えば、コルジセピン）、ジデオキシヌクレオチド、ホスフェート、リガンド（例えば、ビオチンおよびジニトロフェノール）、レポーター分子（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、炭素鎖（例えば、プロパノール）、ミスマッチヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはペプチド核酸単位が含まれる。用語「非関与」は、核酸分子の増幅についての反応におけるプローブまたはプライマーの関与の欠如を指す。具体的には、非関与プローブまたはプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼについての基質としてもＲＮＡポリメラーゼについての基質としても機能せずまたはＤＮＡポリメラーゼによってもＲＮＡポリメラーゼによっても伸長されないものである。「非関与プローブ」は、本質的にポリメラーゼにより鎖伸長され得ない。それは、複製インヒビター部分を有しても有さなくてもよい。
【００８５】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章およびその中の表１１．１（参照により本明細書に完全に組み込まれる）に例示されている。温度およびイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸についての予備スクリーニングについて、５５℃のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を使用することができ、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルク、およびホルムアミド無し；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％のホルムアミド、５×または６×ＳＳＣに対応する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当分野において周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための公式が導かれた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲，９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲，１１．７−１１．８参照）。１つの好ましい実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。より好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸についての最小の長さは、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１３ヌクレオチド、少なくとも約１４ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約２６ヌクレオチド、少なくとも約２７ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約２９ヌクレオチド、または最も好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度を因子、例えば、プローブの長さに従って必要に応じて調節することができることを認識する。
【００８６】
本明細書において使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）；およびＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【００８７】
オリゴヌクレオチド
Ｓｔｘ１Ａ、Ｓｔｘ２Ａ、ｅａｅ、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２１、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１４５、およびＯ１５７から選択される１つまたは複数の遺伝子標的を検出することによりＳＴＥＣ細菌を検出する方法を開発した。ある実施形態において、本方法は、Ｓｔｘ１ＡおよびＳｔｘ２Ａの一方または両方を検出すること、ならびにｅａｅ、および場合により、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２１、Ｏ４５、Ｏ１０３、Ｏ１４５、およびＯ１５７の１つまたは複数を検出することを含んでいてもよい。いっそうさらなる実施形態において、本方法は、配列番号６８６〜６８８の１つまたは複数を検出することを含む。ある実施形態において、本方法は、配列番号６８６〜６８７の一方または両方を検出すること、ならびに配列番号６８８、および場合により、配列番号６８９〜６９６の１つまたは複数を検出することを含んでいてもよい。このようなヌクレオチド配列の検出ならびに後続のＳＴＥＣ細菌の検出および同定のためのオリゴヌクレオチド、例として、フォワードおよびリバースプライマー、プローブ、ならびにクエンチャーオリゴヌクレオチドを開発した。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用することができる。例示的なプライマー対およびそれらの対応する標的、ブロッキングオリゴヌクレオチド、ならびにプローブを表１に示す。
【００８８】
【表１】
2014530011.tif 000002
【００８９】
ある実施形態において、配列番号６８６の増幅および／または検出のためのプライマーは、配列番号１、４８、もしくは５５の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。他の実施形態において、配列番号６８６の増幅および／または検出のためのプローブは、配列番号１６、４９〜５２、もしくは５６の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。さらなる実施形態において、このようなプローブのシグナルのクエンチングに有用なクエンチャーは、配列番号４１、５３、５４、もしくは５７の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。追加の実施形態において、配列番号６８６の増幅および／または検出のための第２のプライマー、またはリバースプライマーは、配列番号５８もしくは７３の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。いっそうさらなる実施形態において、これらの配列の少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続ヌクレオチドを使用することができる。
【００９０】
ある実施形態において、配列番号６８７の増幅および／または検出のためのプライマーは、配列番号７４、１２０、もしくは１２５の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。他の実施形態において、配列番号６８７の増幅および／または検出のためのプローブは、配列番号８９、１２１、１２２、もしくは１２６の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。さらなる実施形態において、このようなプローブのシグナルのクエンチングに有用なクエンチャーは、配列番号１０５、１２３、１２４、もしくは１２７の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。追加の実施形態において、配列番号６８７の増幅および／または検出のための第２のプライマー、またはリバースプライマーは、配列番号１２８、１４３、もしくは１４４の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。いっそうさらなる実施形態において、これらの配列の少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続ヌクレオチドを使用することができる。
【００９１】
ある実施形態において、配列番号６８８の増幅および／または検出のためのプライマーは、配列番号１４５の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。他の実施形態において、配列番号６８８の増幅および／または検出のためのプローブは、配列番号１６０の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。さらなる実施形態において、このようなプローブのシグナルのクエンチングに有用なクエンチャーは、配列番号１７６の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。追加の実施形態において、配列番号６８８の増幅および／または検出のための第２のプライマー、またはリバースプライマーは、配列番号１９１の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を含む。いっそうさらなる実施形態において、これらの配列の少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続ヌクレオチドを使用することができる。
【００９２】
これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、他の核酸増幅法、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，欧州特許第０３２０３０８号明細書；Ｃａｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：３−２０）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃａｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，前掲）；ならびに自家持続配列複製（３ＳＲ）および「Ｑレプリカーゼ増幅」（Ｐｆｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９：３７５−４０７）にも有用であり得る。
【００９３】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、検出可能な標識、例えば、５’末端標識も含有し得る。
【００９４】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブとして使用することもできる。有用なプローブの一部の例を表１に提供する。ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションは、食物、臨床および環境試料中の病原体の検出に使用されることが多く、方法は、当業者に一般に公知である。プローブハイブリダイゼーションの感度および特異性の程度は、既に記載された増幅技術を介して達成されるものよりも低いことが一般に認識されている。本発明の核酸プローブは、検出可能な標識、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイにおいてまたは５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイ、例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにおいて用いられるようなレポーター−クエンチャー組合せも有し得る。
【００９５】
核酸プローブの３’末端ヌクレオチドは、本発明の一実施形態において、核酸ポリメラーゼによる伸長を不可能にすることができる。このようなブロッキングは、例えば、連結部分による核酸プローブの末端３’炭素への複製インヒビター部分、例えば、レポーターもしくはクエンチャーの結合により、または３’−末端ヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにすることにより実施することができる。あるいは、核酸プローブの３’末端は、オリゴヌクレオチドの３’末端上に１つまたは複数の修飾ヌクレオチド間結合を組み込むことにより、ポリメラーゼの３’→５’伸長活性を受けにくくすることができる。最小限には、３’末端ヌクレオチド間結合を修飾しなければならないが、追加のヌクレオチド間結合を修飾することもできる。核酸プローブの３’末端からの伸長を妨げ、および／またはＰＣＲの間にＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をブロックするヌクレオチド間修飾には、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、および他の同様のポリメラーゼ耐性ヌクレオチド間結合が含まれ得る。プローブの３’伸長をブロックする代替法は、マイトマイシンＣまたは他の同様の抗腫瘍性抗生物質、例えば、Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：４７０８−４７１８，１９９３に記載されるものを使用してプローブの３’末端において付加物を形成することである。したがって、核酸プローブの３’末端が開裂から保護される正確なメカニズムは、クエンチャーが核酸プローブから開裂されない限り重要ではない。
【００９６】
核酸プローブ配列はまた、増幅ベース検出技術において、例えば３’−エキソヌクレアーゼアッセイにおいて、本発明のプライマー配列対とともに用いられてもよい。好ましいプライマー／プローブ組合せを表１に示す。
一部の実施形態において、対応するプライマーおよびプローブは、プライマー−プローブ複合体中で一緒に使用される。このような実施形態において、プローブの３’末端は、典型的には、プライマーの５’末端に結合している。本発明のこれらのプライマー−プローブ複合体は、プローブ領域の３’末端をプライマー領域の５’末端に連結する非増幅性リンカーを含有し得る。この非増幅性リンカーは、相補鎖の伸長がプライマー−プローブ複合体のプローブ領域中に進行することを停止させる。このような非増幅性結合の例には、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、および、好ましくは、１８炭素リンカーが含まれる。本発明のプライマー−プローブ複合体は、プローブがその標的ＤＮＡから解放される場合にプライマー−プローブ複合体がステム−ループ構造を形成することを可能にする自己相補的領域も含有し得、これは、例えば、レポーターシグナルをクエンチさせるために十分に互いにレポーターおよびクエンチャーを接近させることにおいて、有用であり得る。一部の例において、クエンチャーオリゴヌクレオチドは、プライマー−プローブ複合体とともに用いることができ、そのクエンチャーオリゴヌクレオチドは、プローブ領域がその標的ＤＮＡから解放される場合、プライマー−プローブ複合体のプローブ領域にハイブリダイズし得る。レポーターがプライマー−プローブ複合体に結合しており、クエンチャーがブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している場合、これは、クエンチングを生じさせるために十分に互いにレポーターおよびクエンチャーを接近させ得る。対応するプライマー、プローブ、およびクエンチャーの例を表１に提供する。
【００９７】
アッセイ方法
配列番号６８６〜６９６により同定される、選択される遺伝子標的および／またはゲノムＤＮＡ領域の検出、ならびに後続の試料中のＳＴＥＣ細菌の存在の検出は、任意の好適な様式で達成することができる。好ましい方法は、プライマー指向増幅法および核酸ハイブリダイゼーション法である。これらの方法は、例えば、汚染が疑われる動物、環境、または食物供給源からの複雑なマトリックスまたは精製培養物のいずれかである試料中のＳＴＥＣ細菌を検出するために使用することができる。
本発明の好ましい実施形態は、（１）非選択的増殖培地において複合試料混合物を培養して標的細菌を蘇生させること、（２）トータル標的細菌ＤＮＡを放出させること、ならびに（３）本発明のプライマー対を用いての、および検出可能な標識を含む核酸プローブを場合により用いての、増幅プロトコルにトータルＤＮＡを供することを含む。
【００９８】
プライマー指向増幅アッセイ方法
本発明において用いることができる種々のプライマー指向核酸増幅法、例として、熱サイクル法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲ）、ならびに等温法および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が当分野において公知である。好ましい方法はＰＣＲである。１つの好ましい実施形態において、表１に列挙される対応するフォワードおよびリバースプライマー対を、関心対象の標的遺伝子および／または配列番号６８６〜６９６の検出、ならびに最終的にはＳＴＥＣ細菌の検出および同定のためのプライマー指向核酸増幅における使用のためのプライマーとして使用することができる。
【００９９】
試料調製：
本発明によるオリゴヌクレオチドおよび方法は、いかなる試料調製も必要とせず、任意の好適な臨床または環境試料を用いて直接使用することができる。より高い感度を達成するため、および時間が制限因子ではない状況において、試料を前処理し、プレ増幅濃縮を実施することが好ましい。
食物経由細菌病原体の検出についての最低業界基準は、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，“Ｆｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡに記載されるように、食物マトリックス２５ｇ中１つの病原体細胞の存在を確実に検出する方法である。このストリンジェントな基準を満たすため、生化学的、標的病原体細胞の増殖を向上させて免疫学的または核酸ハイブリダイゼーション手段によるその検出を容易にするための濃縮法および培地が開発されている。典型的な濃縮手順は、標的細菌の増殖および健康を向上させ、さらには存在する任意のバックグラウンドまたは非標的微生物の増殖を阻害する培地を用いる。例えば、ＵＳＤＡは、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について検査すべき牛挽肉の試料の濃縮のためのプロトコルを記載している（米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）。
【０１００】
種々の細菌病原体についての選択培地が開発されており、当業者は、濃縮すべき特定の生物に適切な培地を選択することを把握する。非選択的培地の全般的な議論およびレシピは、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｕｉｔｅ  ４００，２２００  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｂｌｖｄ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ  ２２２０１−３３０１により出版および配布されたＦＤＡ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ．（１９９８）に記載されている。
選択的増殖後、複雑な混合物の試料をさらなる分析のために取り出す。このサンプリング手順は、当業者に周知の種々の手段により達成することができる。好ましい実施形態において、５μｌの濃縮培養物を取り出し、プロテアーゼを含有する２００μｌの溶解溶液に添加する。ＢＡＸ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥに記載されるとおり、溶解溶液を３７℃において２０分間加熱し、次いで９５℃において１０分間プロテアーゼ不活性化を行う。
【０１０１】
ＰＣＲアッセイ法：
試料中の本発明の遺伝子標的および後続のＳＴＥＣ細菌の存在を検出する好ましい方法は、（ａ）表１に列挙されるプライマー対を使用して、配列番号６８６〜６９６の２つ以上のＰＣＲ増幅を実施してＰＣＲ増幅結果を生成すること：および（ｂ）増幅を検出し、それにより増幅の陽性検出が試料中のＳＴＥＣ細菌の存在を示すことを含む。
別の好ましい実施形態において、ＰＣＲ増幅を実施する前、試料を調製する工程を実施することができる。調製工程は、以下のプロセスの少なくとも１つを含み得る：（１）細菌濃縮、（２）試料からの細菌細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）トータルＤＮＡ抽出。
【０１０２】
増幅条件：
当業者は、任意の一般に許容可能なＰＣＲ条件を、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子標的および標的ＳＴＥＣ細菌を良好に検出するために使用することができ、試験すべき試料および他の実験室条件に応じて、ＰＣＲ条件についての定型的な最適化が、最適な感度および特異性を達成するために必要であり得ることを理解する。最適には、それらは、他の非標的種についてはＰＣＲ結果を提供しない一方、意図した規定の標的の全てからＰＣＲ増幅結果を達成する。
【０１０３】
検出／検査／分析：
配列番号６８６〜６９６のプライマー指向増幅産物は、種々の方法を使用して分析することができる。均一検出は、テンプレートまたはプライマーからの増幅産物の（例えば、ゲル電気泳動による）分離が必要でない、増幅産物の検出の好ましい方法を指す。均一検出は、典型的には、増幅の間またはその直後に反応混合物の蛍光のレベルを計測することにより通常達成される。さらに、検出の間または前に増幅産物の分離を含む不均一検出法を本発明において用いることができる。
【０１０４】
均一検出は、本発明のプライマー対を使用して、「リアルタイム」プライマー指向核酸増幅および検出を実施するために用いることができる（例えば、「リアルタイム」ＰＣＲおよび「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲ）。好ましい「リアルタイム」法は、米国特許第６，１７１，７８５号明細書、米国特許第５，９９４，０５６号明細書、米国特許第６，３２６，１４５号明細書、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，５３８，８４８号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書、および米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されており、これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
特に好ましい「リアルタイム」検出法は、米国特許第６，３２６，１４５号明細書に記載されるようなＳｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイであり、これは参照により全体として本明細書に組み込まれる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイにおいて、ＰＣＲ増幅は、プライマー−プローブ複合体としてＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ（単分子または二分子のいずれか）を使用して実施され、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、レポーターの検出可能なシグナルがプライマーの伸長前にクエンチされることを可能にする適切なレポーター−クエンチャー対を有する。伸長後、クエンチング効果は排除され、存在するシグナルの量が定量化される。増幅産物の量が増加するにつれて、検出可能なシグナルの等価な増加が観察され、したがって、存在する増幅産物の量が、計測される検出可能なシグナルの量の関数として測定されることが可能となる。２つ以上のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブが、本発明のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイにおいて用いられる場合、それぞれのプローブは、結合している異なる検出可能な標識（例えば、レポーター−クエンチャー対）を有し得、したがって、それぞれのプローブが他のプローブと独立して検出されることが可能となる。
【０１０６】
ある実施形態において、配列番号６８６〜６９６の２つ以上の増幅および検出は、区別をつけて標識されたＳｃｏｒｐｉｏｎプローブを使用して実施される。プライマーおよびプローブの例、例として、それらが指向される標的配列を表１に提供する。ＳＴＥＣ細菌の検出に単独または組合せで用いることができるプライマー、プローブ、およびクエンチャーの追加の具体例を表２、３、および８に提供する。
別の好ましい「リアルタイム」検出法は、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，５３８，８４８号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書、および米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されるような、５’−エキソヌクレアーゼ検出法であり、これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイにおいて増幅プライマー対の２つのメンバーの中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｔｏ）またはその間で結合する修飾プローブがＰＣＲの間に用いられる。修飾プローブは、レポーターおよびクエンチャーを有し、ＰＣＲの間にそれが標的核酸配列とハイブリダイズしたことを示すための検出可能なシグナルを生成するように設計される。レポーターおよびクエンチャーの両方がプローブ上に存在する限り、クエンチャーは、レポーターが検出可能なシグナルを放出することを停止させる。しかしながら、ポリメラーゼが増幅の間プライマーを伸長するにつれて、ポリメラーゼの内因性５’→３’ヌクレアーゼ活性はプローブを分解し、クエンチャーからレポーターを分離し、検出可能なシグナルが放出されることが可能となる。一般に、増幅サイクルの間に生成される検出可能なシグナルの量は、それぞれのサイクルにおいて生成される生成物の量に比例する。
【０１０７】
クエンチングの効率はレポーターおよびクエンチャーの近接の強い関数である、すなわち、２つの分子がより接近するほど、クエンチング効率は増加することが周知である。クエンチングはレポーターおよびクエンチャーの物理的近接に強く依存するため、レポーターおよびクエンチャーは、好ましくは、互いの数個のヌクレオチド以内に、通常、互いの３０ヌクレオチド以内に、より好ましくは約６から１６ヌクレオチド離れて、プローブに結合している。典型的には、この分離は、レポーター−クエンチャー対の一方のメンバーをプローブの５’末端に、他方のメンバーを約６から１６ヌクレオチド離れたヌクレオチドに結合することにより達成される。
さらに、２つ以上のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ、例えば、配列番号６８６〜６９６の２つ以上に指向されるものが本発明の５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイにおいて用いられる場合、それぞれのプローブは、結合している異なる検出可能な標識（例えば、レポーター−クエンチャー対）を有し得、したがって、それぞれのプローブが他のプローブと独立して検出されることが可能となる。
【０１０８】
均一検出の別の好ましい方法は、特にＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．からのＢＡＸ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍハードウェアおよび試薬錠剤を用いての、ＤＮＡ融解曲線分析の使用を含む。システムの詳細は、米国特許第６，３１２，９３０号およびＰＣＴ公開公報国際公開第９７／１１１９７号パンフレットおよび国際公開第００／６６７７７号パンフレットに提供されており、これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
融解曲線分析は、選択された時点においてそれぞれの増幅サイクルの間、標的増幅産物（「標的アンプリコン」）の蛍光をモニタリングすることにより二本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出および定量化する。
当業者に周知のとおり、ｄｓＤＮＡの２つの鎖は温度がその融解温度よりも高い場合、分離または融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解はプロセスであり、所与の溶液条件下で、融解がある温度（以後、ＴMSと示す）において開始し、別の温度（以後、ＴMEと示す）において完了する。よく知られている用語であるＴmは、融解が５０％完了する温度を示す。
【０１０９】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡを融解させる変性段階、プライマーが現在一本鎖の標的へ結合するために温度が最適であるプライマーアニーリング段階、およびＤＮＡポリメラーゼが機能するために温度が最適である鎖伸長段階（温度ＴEにおける）を含む。
本発明によれば、ＴMSはＴEよりも高くあるべきであり、ＴMEは、ＤＮＡポリメラーゼが熱不活性化される温度よりも低く（しばしば実質的に低く）あるべきである。融解特性は、所与のｄｓＤＮＡ分子の固有特性、例えば、デオキシヌクレオチド組成およびｄｓＤＮＡの長さにより影響を受ける。
【０１１０】
インターカレーティング色素は、二本鎖ＤＮＡへ結合する。色素／ｄｓＤＮＡ複合体は、色素に依存する光の適切な励起波長に曝露されると蛍光を発し、蛍光の強度は、ｄｓＤＮＡの濃度に比例し得る。ｄｓＤＮＡを検出および定量化するためのＤＮＡインターカレーティング色素を利用する方法は、当分野において公知である。多くの色素が、これらの目的について当分野において公知であり使用されている。本方法はこのような関係も利用する。
【０１１１】
このようなインターカレーティング色素の例には、限定されるものではないが、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＴＯＴＯ（登録商標）−１｛キノリニウム，１−１’−［１，３−プロパンジイルビス［（ジメチルイミノ）−３，１−プロパンジイル］］ビス［４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］］−，テトラヨージド｝、およびＹｏＰｒｏ（登録商標）｛キノリニウム、４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）−プロピル］−、ジヨード｝が含まれる。本発明について最も好ましいものは、非非対称シアニド色素、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）製のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標）である。
融解曲線分析は、温度を増加させながら蛍光の変化をモニタリングすることにより達成される。温度が標的アンプリコンに特異的なＴMSに達すると、ｄｓＤＮＡは変性し始める。ｄｓＤＮＡが変性すると、インターカレーティング色素はＤＮＡから解離し、蛍光が減少する。温度に対してプロットされた温度の変化により割った蛍光の対数の変化の負の数学的解析は、融解曲線として公知のグラフピークをもたらす。
【０１１２】
本発明は、これらの技術の組合せを使用して、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブをある標的領域に指向し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを第２の標的領域に指向することにより操作することができることが理解すべきである。本発明は上記技術に限定されないことも理解すべきである。むしろ、当業者は、当分野において公知であるような増幅を検出するための他の技術を使用することもできることを認識する。例えば、ＰＣＲベース定量的配列検出（ＱＳＤ）などの技術は、核酸プローブを使用して実施することができ、これは、溶液中において一本鎖状態で存在する場合、レポーターおよびクエンチャーがレポーターの発光を実質的にクエンチするために十分に接近するように、構成されている。しかしながら、インタクトなレポーター−クエンチャー核酸プローブと増幅された標的核酸配列とのハイブリダイゼーション時に、レポーターおよびクエンチャーは互いに十分に離れる。結果として、クエンチングは実質的に弱められ、検出される蛍光発光の増加を引き起こす。
【０１１３】
均一検出法に加えて、本発明において用いることができる種々の他の不均一検出法、例として、標準非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドまたはアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、および温度勾配ゲル電気泳動が当分野において公知である。標準非変性ゲル電気泳動は、簡易で迅速なＰＣＲ検出法であるが、全ての用途に好適ではない場合がある。
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、小さなＤＮＡ断片（２００〜７００ｂｐ）の変性挙動の差異を検出する分離法である。分離の原理は、断片長およびヌクレオチド配列の両方に基づく。同一の長さである断片において、１つの塩基対ほどのわずかな差異を検出することができる。これは、ＤＮＡ断片がサイズによってのみ分離される非変性ゲル電気泳動とは対照的である。ＤＮＡ分子間の電荷密度の差異がほぼ中性であり、それらの分離においてほとんど役割を果たさないため、非変性ゲル電気泳動のこの制限が生じる。ＤＮＡ断片のサイズが増加するにつれて、ゲルを通るその速度は減少する。
【０１１４】
ＤＧＧＥは主として、同一サイズのＤＮＡ断片をそれらの変性プロファイルおよび配列に基づいて分離するために使用される。ＤＧＧＥを使用して、熱または化学的変性剤がアプライされると、ＤＮＡ分子の２つの鎖は分離しまたは融解する。ＤＮＡ二本鎖の変性は２つの因子により影響を受ける：１）相補的な塩基対間に形成される水素結合（ＧＣリッチ領域は、ＡＴリッチである領域よりも高い変性条件において融解するため）；および２）同一鎖の隣接する塩基間の引力、または「スタッキング」。結果的に、ＤＮＡ分子は、それらのヌクレオチド配列により決定されるそれらの個々の特徴的な変性条件のそれぞれでいくつかの融解ドメインを有し得る。ＤＧＧＥは、規定の変性ドメイン内の１つのみのヌクレオチドを除き、同一の長さおよびＤＮＡ配列を有する他の点では同一のＤＮＡ分子が、異なる温度またはＴｍにおいて変性するという事実を利用する。したがって、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片が、漸増する化学変性剤の勾配を通って電気泳動される場合、それは、変性し始め、立体構造変化および流動性変化の両方を受ける。ｄｓＤＮＡ断片は、分子の一本鎖部分の分枝鎖構造がゲルマトリックス中で絡まるため、変性した一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ断片よりも速く移動する。変性環境が増加するにつれ、ｄｓＤＮＡ断片は完全に解離し、ゲルを通る分子の流動性は、ＤＮＡ鎖の特定の低変性ドメインが解離する変性剤濃度において妨害される。実際、電気泳動は、一定の温度（約６０℃）において実施され、化学変性剤は、ＤＮＡ分子の１００％を変性させる濃度（すなわち、４０％のホルムアミドおよび７Ｍの尿素）において使用される。この可変の変性勾配は、それぞれのＤＧＧＥゲルの組成が０％の変性剤から最大１００％の変性剤に徐々に変化するように、勾配メーカーを使用して作出される。当然ながら、低減範囲の変性剤（例えば、３５％から６０％）を含有する勾配をＤＮＡの分離増加のために注ぐこともできる。
【０１１５】
ＤＧＧＥにおいて使用される原理は、化学変性剤勾配の代わりに温度勾配を使用する第２法に適用することもできる。この方法は、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）として公知である。この方法は温度勾配を使用してｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの立体構造変化を誘導し、異なる配列を有する等しいサイズの断片を分離する。ＤＧＧＥにおけるように、異なるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片は、ゲル中の異なる位置において不動化される。プライマー設計のバリエーションは、ＰＣＲ産物の特徴決定および同定についてＤＧＧＥの有用性の増加という利点を得るために使用することができる。プライマー設計バリエーションを使用するこれらの方法および原理は、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐａｇｅｓ  ７１  ｔｏ  ８８（１９８８）に記載されている。
【０１１６】
装置の使用：
均一検出が用いられる場合、蛍光のレベルは、好ましくはレーザー蛍光光度計、例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｍｏｄｅｌ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒなどを使用して測定される。しかしながら、試料中の蛍光のレベルを計測するための同様の検出システムが本発明に含まれる。
【０１１７】
試薬およびキット：
任意の形式の任意の好適な核酸複製組成物（「複製組成物」）を使用することができる。ＰＣＲ増幅のための典型的な複製組成物は、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマー、および好適なポリメラーゼを含み得る。
複製組成物が液体形態である場合、当分野において公知の好適な緩衝液を使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，前掲）。
あるいは、複製組成物が錠剤形態で含有される場合、典型的な錠剤化試薬、例えば、安定剤および結合剤を含めることができる。好ましい錠剤化技術は、米国特許第４，７６２，８５７号明細書および米国特許第４，６７８，８１２号明細書に記載されており、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明の好ましい複製組成物は、（ａ）表１から選択される少なくとも１つのプライマー対、および（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。別の好ましい複製組成物は、（ａ）それぞれが異なる標的ＤＮＡ領域に対して指向される、表１から選択される少なくとも２つのプライマー対；および（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態において、配列番号６８６〜６９６の３つ以上に指向されるプライマー対が含まれる。さらなる実施形態において、配列番号６８６〜６９６の４つ以上に指向されるプライマー対が含まれる。いっそうさらなる実施形態において、配列番号６８６〜６９６の５つ以上に指向されるプライマー対が含まれる。
【０１１８】
本発明のより好ましい複製組成物は、（ａ）表１から選択される少なくとも２つのプライマー対および任意の対応するプローブまたはブロッキングオリゴヌクレオチド（用いられるそれぞれの核酸プローブまたはプライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識を含む）；および（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、検出可能な標識は、検出可能なシグナルを放出し得るレポーター、ならびにレポーターおよびクエンチャーが互いに十分に接近している場合、レポーターを実質的にクエンチし、検出可能なシグナルの放出を妨げることができるクエンチャーを含む。
本発明の好ましいキットは、上記の複製組成物のいずれか１つを含む。本発明の好ましい錠剤は、上記の複製組成物のいずれか１つを含む。より好ましくは、本発明のキットは、上記の好ましい錠剤を含む。
【０１１９】
ある場合において、内部陽性対照を反応に含めることができる。内部陽性対照は、対照鋳型核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、対照プライマー、および対照核酸プローブを含み得る。ＰＣＲ反応内に含有される内部陽性対照の利点は、既に記載されており（米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第９７／１１１９７号パンフレット；これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、以下を含む：（ｉ）対照は、単一のプライマーを使用して増幅することができ；（ｉｉ）対照増幅産物の量は、試料中に含有される任意の標的ＤＮＡまたはＲＮＡから独立しており；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡは、手動および自動試験手順の両方における使用容易性および高度の再現性のために他の増幅試薬とともに錠剤化することができ；（ｉｖ）対照は、均一検出について、すなわち、反応物質から産物ＤＮＡを分離することなく使用することができ；（ｖ）内部対照は、反応中の他の潜在的な増幅産物とは異なる融解プロファイル、および／または標的に指向される核酸プローブ上の検出可能な標識とは異なる対照核酸上の検出可能な標識を有する。
【０１２０】
対照ＤＮＡは、プライマー指向増幅反応において増幅を可能にするための適切なサイズおよび塩基組成のものである。対照鋳型ＤＮＡ配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムから、または他の源から得ることができるが、標的増幅産物の増幅を可能にする同一条件下で再現性良く増幅されなければならない。
好ましい対照配列には、例えば、ＳＶ４０ＤＮＡに対して指向される対照プライマーおよびプローブが含まれる。
対照反応は、増幅反応の確認に有用である。対照ＤＮＡの増幅は、試験される試料と同一の反応管内で起こり、したがって試料が標的陰性である場合、すなわち、標的増幅産物が産生されない場合、良好な増幅反応を示す。増幅反応の有意な確認を達成するため、対照ＤＮＡ鋳型の好適な数のコピーをそれぞれの増幅反応に含めなければならない。
一部の例において、追加の陰性対照複製組成物を含めることが有用であり得る。陰性対照複製組成物は、複製組成物と同一の試薬を含有するが、ポリメラーゼを有しない。このような対照の主な機能は、方法が蛍光検出手段を用いる場合、均質形式での擬似バックグラウンド蛍光をモニタリングすることである。
【０１２１】
複製組成物は、それらが標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するために使用されるように設計されるかどうかに応じて修飾することができる。標的ＤＮＡを増幅する複製組成物（試験複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に耐熱性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマー対および（ｉｉｉ）増幅反応の進行に必要な緩衝液を含み得る。対照ＤＮＡを増幅する複製組成物（陽性対照または陽性複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に耐熱性）；（ｉｉ）対照ＤＮＡ；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡにハイブリダイズし得る少なくとも１つのプライマー；および（ｉｖ）増幅反応の進行に必要な緩衝液を含み得る。さらに、標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡ増幅のいずれかのための複製組成物は、好ましくは検出可能な標識を有する核酸プローブを含有し得る。
【０１２２】
核酸ハイブリダイゼーション法
プライマー指向増幅アッセイ法に加えて、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法が、ＳＴＥＣ細菌の検出のために本発明において用いることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素は、プローブ、ＳＴＥＣ細菌を含有することが疑われる試料、および規定のハイブリダイゼーション法を含む。典型的には、プローブ長は、わずか５塩基から診断配列の全長まで変動し得、行うべき規定の試験に依存する。プローブ分子の一部のみが、検出すべき核酸配列と相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列との相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全に相補的な分子間で生じ、ハイブリダイズされた領域中のある一部の塩基が適切な相補的塩基と対形成されていないという結果を伴う。
核酸ハイブリダイゼーション法において特に有用なプローブは、配列番号１〜６９６、またはそれらから誘導される配列のいずれかである。
【０１２３】
試料は、ＳＴＥＣ細菌を含有してもしなくてもよい。試料は、種々の形態をとり得るが、一般に、汚染が疑われる動物、環境または食物源から抽出される。ＤＮＡは直接検出することができるが、最も好ましくは、プローブおよび標的分子の任意のハイブリダイゼーションが生じ得る前に試料核酸をプローブと接触するために利用可能にしなければならない。したがって、生物のＤＮＡは、好ましくは、細胞を含まず、ハイブリダイゼーションが生じ得る前に適切な条件下に置かれる。溶液内ハイブリダイゼーションの方法は、試料ＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを得ることができるようにするためにＤＮＡの精製を必要とする。これは、試料中の標的配列の溶液内検出法の利用が、試料の核酸を最初に精製してタンパク質、脂質、および他の細胞成分を排除し、次いでハイブリダイゼーション条件下でプローブと接触させなければならないことを必要とすることを意味する。試料核酸の精製法は、一般的であり、当分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。
【０１２４】
一つの好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の抽出を必要とせずに細胞溶解物に対して直接実施することができる。これは、試料取扱プロセスからいくつかの工程を排除し、アッセイを迅速化する。粗製細胞溶解物に対してこのようなアッセイを実施するため、典型的にはカオトロピック剤が上記のとおり調製された細胞溶解物に添加される。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することにより核酸を安定させる。さらに、カオトロピック剤は、室温でのＤＮＡにおける短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能とする（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１（１９９１））。好適なカオトロピック剤には、とりわけ、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが含まれる。典型的には、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度において存在する。必要に応じて、ホルムアミドを典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）でハイブリダイゼーション混合物に添加することができる。
【０１２５】
あるいは、プローブハイブリダイゼーション前に試料核酸を精製することができる。種々の方法が当業者に公知である（例えば、フェノール−クロロホルム抽出、ＩｓｏＱｕｉｃｋ抽出（ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）など）。プレハイブリダイゼーション精製が、標準フィルターハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である。さらに、精製は、インビトロＲＮＡ増幅法、例えば、自家持続配列複製（例えば、Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９１），ｐｐ．２５−３３参照）または逆転写酵素ＰＣＲ（Ｋａｗａｓａｋｉ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（１９９０），ｐｐ．２１−２７）を組み込むことによりアッセイ感度を増加させる手段を容易にする。
ＤＮＡが放出されると、それを種々の方法のいずれかにより検出することができる。しかしながら、最も有用な実施形態は、速度、利便性、感度および特異性の少なくともいくつかの特徴を有する。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション法は、当分野において周知である。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で混合しなければならない。これは、適切な濃度および温度条件下で、無機塩または有機塩の存在下でプローブおよび試料を接触させることを含む。プローブおよび試料核酸は、プローブと試料核酸との任意の考えられるハイブリダイゼーションが生じ得るために十分長い時間接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるために必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高くなるほど、必要とされるハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。
種々のハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的には、これらは、極性有機溶媒の約２０から６０％の体積、好ましくは３０％を構成する。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５から１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５から０．１Ｍの緩衝液、例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）、約０．０５から０．２％の界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。さらに、典型的なハイブリダイゼーション溶液中には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの非標識担体核酸、断片化核ＤＮＡ（例えば、ウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および場合により約０．５から２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンが含まれていてもよい。他の添加剤、例えば、種々の極性水溶性または膨潤性の薬剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えば、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、およびアニオン性糖ポリマー（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）を含めることもできる。
【０１２７】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイ形式に適合可能である。最も好適なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合可能である。サンドイッチタイプアッセイの主な構成要素は、固体支持体である。固体支持体は、非標識でＤＮＡ配列の一部と相補的である、支持体に吸着されているまたは支持体に共有結合している固定化核酸プローブを有する。
サンドイッチアッセイは、アッセイキットに包含することができる。このキットは、汚染が疑われる試料の回収のための第１の成分、ならびに試料の分配および溶解のための緩衝液を含む。第２の成分は、標的およびプローブポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための、ならびに洗浄による不所望な非二本鎖形態の除去のための、乾燥または液体形態のいずれかの媒体を含む。第３の成分は、１つまたは複数の関心対象の標的、例えば、配列番号６８６〜６９６の１つまたは複数と相補的である非標識核酸プローブが固定される（またはコンジュゲートしている）固体支持体（ディップスティック）を含む。第４の成分は、第３の成分の固定化非標識核酸プローブがハイブリダイズされる同一のＤＮＡ鎖の第２および異なる領域と相補的である標識プローブを含有する。
【０１２８】
好ましい実施形態において、配列番号１〜６８５またはそれらの誘導体は、均一または不均一アッセイ形式のいずれかで３’ブロックされた検出プローブとして使用することができる。例えば、これらの配列から生成されたプローブは、３’ブロックされておりまたは非関与であり得、核酸増幅反応により伸長されずまたは核酸増幅反応に関与しない。さらに、プローブは、プローブ／分析物ハイブリッドの固定化のための結合点として作用する反応性リガンドとしてまたは検出可能なシグナルを産生させるためのレポーターとして機能し得る標識を組み込む。したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）汚染が疑われる試料から単離されたゲノムまたはｃＤＮＡは、増幅産物を産生するために過剰の３’ブロックされた検出プローブの存在下で標準プライマー指向増幅プロトコルにより増幅される。プローブは３’ブロックされているため、それは、標的の増幅に関与も干渉もしない。最終増幅サイクル後、検出プローブは、増幅されたＤＮＡの関連部分にアニールし、次いでアニールされた複合体は反応性リガンドにより支持体上に捕捉される。
一部の例において、支持体上でのＰＣＲ反応産物の固定化、次いで標識プローブ試薬による固定化産物の検出を容易にするための複製組成物中の標識プローブとともにリガンド標識ｄＮＴＰを組み込むことが望ましい。例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはジゴキシン標識ｄＮＴＰをＰＣＲ反応組成物に添加することができる。次いで、ＰＣＲ産物中に組み込まれたビオチン、ジゴキシゲニン、またはジゴキシンをストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、抗ジゴキシン抗体または抗ジゴキシゲニン抗体支持体上にそれぞれ固定化することができる。次いで、固定されたＰＣＲ産物をプローブ標識の存在により検出することができる。
【実施例】
【０１２９】
本発明を下記の実施例においてさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、説明のためにのみ提供されることが理解すべきである。
【０１３０】
実施例１
ｓｔｘ、ｅａｅ、Ｏ１５７、Ｏ４５、Ｏ１０３、およびＯ１４５プライマーおよびプローブの包含性／排他性の決定
生物の試料を分析してｓｔｘ１／２、ｅａｅ、Ｏ１５７、Ｏ４５、Ｏ１０３、およびＯ１４５標的に対して指向される本発明のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブの包含性および排他性を確立した。包含性については、それぞれのアッセイに適切な、独立した真正のＳＴＥＣ単離株（Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ４５、Ｏ１０３およびＯ１４５、ならびにｓｔｘ1、ｓｔｘ2、およびｅａｅを含有する種々の他の生物）を使用した。排他性については、アッセイの標的でない密接に関連する非標的生物、例として、他のＳＴＥＣ細菌を使用してアッセイが標的生物と他の非標的生物とを区別することを確保した。
【０１３１】
ＤＮＡ溶解物調製
試験材料は、ＢＨＩ培地中で３７℃において増殖させた標的および非標的生物の一晩増殖純粋培養物であった。純粋培養物は、およそ１×１０9ｃｆｕ／ｍｌの細胞密度に一晩増殖させた。排他性については、非希釈一晩培養物を試験した。包含性については、一晩培養物をＴＳＢ中におよそ１：１０，０００に希釈した。２０μｌの試験すべき材料を、２００μｌのＢＡＸ（登録商標）溶解試薬（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）に添加した。混合物を３７℃において２０分間インキュベートし、次いでさらに９５℃において１０分間インキュベートし、最後に５℃に冷却した。
【０１３２】
ＰＣＲ条件
５〜３０μｌのＤＮＡ溶解物を使用して凍結乾燥ＰＣＲ反応成分を水和し、ＤＮＡ溶解物／ＰＣＲ反応成分混合物を得た。ＰＣＲ反応成分は、ＡＰＴＡＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、デオキシヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＢＳＡ、ｓｕｒｆａｃｔａｍｐｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および陽性対照ＤＮＡを含有する凍結乾燥試薬錠剤を含んだ。さらに、表２および３に列挙されるプライマー、クエンチャー、およびＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）を提供される量で含めた。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブについては、５’末端標識およびリンカーも表２および３に提供する。これらのＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブのそれぞれは、その構造が５’蛍光末端標識、プローブ配列、１８炭素非増幅性リンカー、およびプライマー配列を（５’→３’の順序で）含むように、二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）として設計した。表２および３は、対応するクエンチャーオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したクエンチング標識も列挙する。
【０１３３】
【表２】
2014530011.tif 000003
【０１３４】
【表３】
2014530011.tif 000004
【０１３５】
増幅および試験は、ＢＡＸ（登録商標）Ｑ７装置（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）上で実施した。熱サイクリング条件は、以下のとおり：９４℃において２分間、次いで９４℃１０秒間および６３℃４０秒間の４３サイクルであり、それぞれのサイクルにおける６３℃の工程の間に蛍光シグナルを捕捉した。
【０１３６】
結果
表４〜７から把握することができるとおり、個々のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブはそれぞれ、種々の標的と非標的とを区別し得た。
【０１３７】
【表４−１】
2014530011.tif 000005
【０１３８】
【表４−２】
2014530011.tif 000006
【０１３９】
【表５−１】
2014530011.tif 000007
【０１４０】
【表５−２】
2014530011.tif 000008
【０１４１】
【表５−３】
2014530011.tif 000009
【０１４２】
【表６】
2014530011.tif 000010
【０１４３】
【表７−１】
2014530011.tif 000011
【０１４４】
【表７−２】
2014530011.tif 000012
【０１４５】
【表７−３】
2014530011.tif 000013
【０１４６】
実施例２
Ｏ２６、Ｏ１１１、およびＯ１２１プライマーおよびプローブの包含性／排他性の決定
Ｏ２６、Ｏ１１１、およびＯ１２１はＳＴＥＣ細菌の追加の株であるため、生物の試料を分析して本発明のマルチプレックスのＯ２６、Ｏ１１１、およびＯ１２１Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブの包含性および排他性を確立した。包含性については、独立した真正の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２６、Ｏ１１１、およびＯ１２１単離株を使用した。排他性については、非大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種およびそれらの３つの血清型のいずれにも属さない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用してアッセイが標的生物（Ｏ２６、Ｏ１１１、およびＯ１２１）と他の細菌とを区別することを確保した。
【０１４７】
ＤＮＡ溶解物調製
ＤＮＡ溶解物は、実施例１に記載の方法を使用して調製した。
ＰＣＲ条件
実施例１に記載のとおり、３０μｌのＤＮＡ溶解物を使用して凍結乾燥ＰＣＲ反応成分を水和し、ＤＮＡ溶解物／ＰＣＲ反応成分混合物を達成した。表８に列挙されるプライマーおよびプローブを提供される量で含めた。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブについては、５’末端標識、内部標識、およびリンカーも表８に提供する。これらのＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブのそれぞれは、その構造が５’蛍光末端標識、５’ステム配列、プローブ配列、３’ステム配列、内部クエンチャー、１８炭素非増幅性リンカー、およびプライマー配列を（５’→３’の順序で）含むように、単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）として設計し、５’および３’ステム配列は、プローブがその標的から解放されない場合にそれらが５’末端標識のクエンチングをもたらすステム−ループ構造を形成するように、互いのリバース成分である。
【０１４８】
【表８】
2014530011.tif 000014
【０１４９】
増幅および試験は、ＢＡＸ（登録商標）Ｑ７装置（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）上で実施した。熱サイクリング条件は、以下のとおり：９４℃において２分間、次いで、９４℃１０秒間および６３℃４０秒間の４０サイクルであり、それぞれのサイクルにおける６３℃の工程の間に蛍光シグナルを捕捉した。
【０１５０】
結果
表９〜１１に示されるとおり、マルチプレックスのＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブを使用して、本発明の方法は、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびＯ１２１血清型と非標的株、例として、他のＯ型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と非大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株とを区別し得た（空白の結果は、陰性結果を示す）。
【０１５１】
【表９−１】
2014530011.tif 000015
【０１５２】
【表９−２】
2014530011.tif 000016
【０１５３】
【表９−３】
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【０１５４】
【表１０】
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【０１５５】
【表１１−１】
2014530011.tif 000019
【０１５６】
【表１１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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